"スクロースからの1,3-プロパンジオールの生物学的生産のために遺伝的に改変された微生物であって、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素により、4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートを脱炭酸する第1段階、および、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素により、得られた3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元する第2段階を含んでなる、1,3-プロパンジオールの生産のための二段階代謝経路と、該微生物が、唯一の炭素源としてスクロースを利用できるようにする遺伝子とを含んでなる、微生物。PTSスクロース利用系および/または非PTSスクロース利用系をコードする機能的遺伝子を含んでなる、請求項1に記載の微生物。遺伝子scrKYABRまたはscrKYABの導入により改変されている、請求項2に記載の微生物。遺伝子cscBKARまたはcscBKAの導入により改変されている、請求項2に記載の微生物。2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が内在性遺伝子によりコードされる、請求項1~4のいずれか一項に記載の微生物。2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする内在性遺伝子の発現が増強される、請求項5に記載の微生物。2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が異種遺伝子によりコードされる、請求項1~4のいずれか一項に記載の微生物。請求項1~7に記載の微生物であって、該微生物において、スクロースからの4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートの生産が改善されている、微生物。細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される、請求項1~8のいずれか一項に記載の微生物。腸内細菌科Enterobacteriaceae、クロストリジウム科、バチルス科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリウム科の中から選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の微生物。スクロースからの1,3-プロパンジオールの発酵生産方法であって、スクロースを含んでなる適当な培養培地において、請求項1~10のいずれか一項に記載の微生物を培養する工程および該培養培地から1,3-プロパンジオールを回収する工程を含んでなる、方法。1,3-プロパンジオールがさらに精製される、請求項11に記載の方法。実施例1グルコースおよびスクロースでの1,3-プロパンジオール生産の最大収率の計算1.1-シミュレーションに用いたパラメーターシミュレーションは、METEX社製プロプライエタリソフトウェアMETOPT商標を用いて行った。大腸菌Ecoliの簡易代謝ネットワークを、中央代謝ネットワーク、総てのバイオマス前駆体の代謝経路および上に記載した特定生産経路を含めて用いた。大腸菌用の古典的バイオマス組成を用いた。グルコースまたはスクロース炭素源のいずれかを用いてシミュレーションを行った。スクロース利用については、PTS系および非PTS系の両方をモデル化した。計算した最大収率には差がなかったため、スクロースでの収率は1つだけを報告する。増殖速度、0.1h-1および維持エネルギー、5mmolATP.gDW-1.h-1を考慮して、実際の最大収率の計算を行った。総てのシミュレーションを、グルコース取り込み速度、3mmol.gDW-1.h-1により行った。シミュレーションは好気性条件下で行った。1.2-シミュレーション結果実施例2大腸菌の遺伝子serCによりコードされるL-ホモセリントランスアミナーゼ活性の実証2.1-SerCの特性評価のための株の構築:BL21pPAL7-serCSerCタンパク質を特性評価するために、発現ベクターpPAL7から対応する遺伝子を発現させた。この目的で、serC遺伝子を、オリゴヌクレオチドpPAL7-serCFおよびpPAL7-serCRを用いて、大腸菌Ecoliゲノムから増幅した。このPCR産物を、酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターpPAL7にクローニングした。得られたベクターをpPAL7-serCと呼称した。以下の領域:遺伝子serCの配列956876~956904ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域太字の文字、HindIII制限部位を有する領域下線の文字を有する、以下の領域:遺伝子serC領域の配列957964~957937ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域太字の文字、EcoRI制限部位を担持する領域下線の文字を有する、pPAL7-serCプラスミドを、次に、コンピテントBL21DE3セルに導入した。2.2-タンパク質SerCの過剰生産タンパク質SerCの過剰生産を、2lエルレンマイヤーフラスコで、2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加したLB培養液を用いて行った。2.5g/lのグルコースおよび100mg/lのアンピシリンを添加した50mlのLB培養液を充填した500mlエルレンマイヤーフラスコで前培養物を一晩増殖させた。この前培養物を用いて、OD600nmが約0.15となるように500mlの培養物に植菌した。培養物をまず、37°Cおよび200rpmで増殖させ、OD600nmが約0.5になったら、25°Cおよび200rpmに変え、OD600nmが0.6~0.8になるまで約1時間増殖させ、その後、500μMIPTGでの誘導を行った。培養は、25°Cおよび200rpmで維持し、OD600nmがおよそ4になったら、停止させた。細胞を、4°C、7000rpmで5分間遠心分離し、その後、-20°Cで保存した。2.3-タンパク質SerCの精製2.3.1-ステップ1:無細胞抽出物の調製約280mgの大腸菌Ecoliバイオマスを45mlの100mMリン酸カリウムpH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに入れ各コニカルチューブに15ml氷上で30秒間8サイクル30秒間隔の音波処理を施したBandelin社製sonoplus、70W。音波処理の後、細胞を5mMMgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で30分間インキュベートした。細胞残渣を4°C、12000gで30分間の遠心分離により除去した。2.3.2-ステップ2:アフィニティー精製Profinityカラムバイオラド社製、Bio-ScaleMiniProfinityexactカートリッジ5mlにおいて、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。100mMリン酸カリウムpH7.6で平衡化した5mlProfinityexactカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄し、100mMリン酸カリウムpH7.6、100mMフッ化物とともに室温で30分インキュベートした。100mMリン酸カリウムpH7.6の2カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、100mMTrisHCl、150mMNaClおよび10グリセロールpH8に対して透析した。タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイを用いて測定した。2.4-L-ホモセリントランスアミナーゼアッセイL-ホモセリントランスアミナーゼ活性を、共役酵素アッセイを用いて30°Cで測定した。L-ホモセリントランスアミナーゼ活性アッセイは、420mMリン酸カリウムバッファーpH8.2、2mMアセチルピリジンアデニンジヌクレオチド、3mML-ホモセリン、20単位/mlのウシ肝臓由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、1mMα-ケトグルタル酸中性化および約50μgの粗抽出物を総量1mlで用いて実施した。アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドの消費を、分光光度計により375nmでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質L-ホモセリンを含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。L-ホモセリントランスアミナーゼ活性の1単位は、30°Cで1分間当たりに1μmolのL-ホモセリンのアミノ基転移を触媒するのに必要な酵素の量である。ε375nm=6100M-1cm-12.5-精製酵素の活性実施例3ラクトコッカスラクチスLactococcuslactisの遺伝子kivDによりコードされる4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の実証3.1-KivDの特性評価のための株の構築:BL21pPAL7-kivDllKivDタンパク質を特性評価するために、発現ベクターpPAL7から対応する遺伝子を発現させた。この目的で、kivD遺伝子を、オリゴヌクレオチドpPAL7-kivDllFおよびpPAL7-kivDllRを用いて、ラクトコッカスラクチスゲノムから増幅した。このPCR産物を、酵素HindIIIおよびEcoRIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターpPAL7にクローニングした。得られたベクターをpPAL7-kivDllと呼称した。以下の領域:ラクトコッカスラクチスkivD遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域斜体の文字、精製に有利に働く短いN末端アミノ酸伸長を有するタグフリータンパク質を生成するのに必要なヌクレオチドを有する領域太字の文字HindIII制限部位を有する領域下線の文字を有する、以下の領域:ラクトコッカスラクチスkivD遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域斜体の文字、EcoRI制限部位を有する領域下線の文字を有する、pPAL7-kivDllプラスミドを、次に、BL21DE3コンピテントセル株に導入した。3.2-タンパク質KivDの過剰生産タンパク質kivDの過剰生産を、実施例2.2と同じプロトコールを適用して行った。3.3-タンパク質KivDの精製3.3.1-ステップ1:無細胞抽出物の調製約188mgの大腸菌Ecoliバイオマスを30mlの100mMリン酸カリウムpH7.6およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液を50mlコニカルチューブに入れ各コニカルチューブに15ml氷上で30秒間8サイクル30秒間隔の音波処理を施したBandelin社製sonoplus、70W。音波処理の後、細胞を5mMMgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で30分間インキュベートした。細胞残渣を4°C、12000gで30分間の遠心分離により除去した。3.3.2-ステップ2:アフィニティー精製Profinityカラムバイオラド社製、Bio-ScaleMiniProfinityexactカートリッジ5mlにおいて、製造業者推奨のプロトコールに従い、親和性により粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。100mMリン酸カリウムpH7.6で平衡化した5mlProfinityexactカートリッジに粗抽出物をロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄し、100mMリン酸カリウムpH7.6、100mMフッ化物とともに4°Cで一晩インキュベートした。100mMリン酸カリウムpH7.6の2カラム容量でカラムからタンパク質を溶出した。タグは樹脂としっかりと結合したまま保持され、精製タンパク質は放出された。精製タンパク質を含む画分をプールし、100mMリン酸カリウム、150mMNaClおよび10グリセロールpH8に対して透析した。タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイを用いて測定した。3.4-4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼアッセイ3.4.1-4-ヒドロキシ-2-ケト酪酸の化学合成4-ヒドロキシ-2-ケト酪酸の化学合成は、次の刊行物に記載されている:RSLaneEEDekker2keto4hydroxybutyrateSynthesischemicalpropertiesandasasubstrateforlactatedehydrogenaseofrabbitmuscleBiochemistry829582966。3.4.2-4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼアッセイ4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートの脱炭酸を、共役酵素アッセイを用いて30°Cで測定した。4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性アッセイは、50mMリン酸カリウムバッファーpH6、0.2mMNADH、1mMMgSO4、0.5mMチアミン二リン酸、72単位/mlのサッカロミセスセレビシエ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、10mM4-ヒドロキシ-2-ケト酪酸中性化および約40μgの精製タンパク質を総量1mlで用いて実施した。NADHの消費を、分光光度計により340nmでモニタリングした。基質を含めたアッセイで検出された活性から、基質を含めていない対照アッセイで検出された活性を差し引いた。4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼ活性の1単位は、30°Cで1分間当たりに1μmolの4-ヒドロキシ-2-ケト酪酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素の量である。ε340nm=6290M-1cm-1。3.5-精製酵素の活性実施例4大腸菌Escherichiacoliの遺伝子yqhDによりコードされる3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性の実証4.1-YqhDの特性評価のための株の構築:MG1655ΔyqhD::KmpTRC99A-yqhD4.1.1-MG1655ΔyqhD::Km株の構築yqhD遺伝子を欠失させるために、DatsenkoWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた:以下の領域:yqhD領域の配列3153377~3153456ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域小文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列、を有する、。以下の領域:yqhD領域の配列3154540~3154460ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列を有する、。オリゴヌクレオチドΔyqhDFおよびΔyqhDRを用いて、プラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたPCR産物を、次に、エレクトロポレーションによってMG1655pKD46株に導入する。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドyqhDFおよびyqhDRを用いたPCR分析により確認する。保持した株をMG1655ΔyqhD::Kmと呼称する。配列3153068~3153100と相同。配列3154825~3154797と相同。4.1.2-プラスミドpTRC99A-yqhDの構築YqhDタンパク質を特性評価するために、ベクターpTRC99Aから対応する遺伝子を発現させた。この目的で、yqhD遺伝子を、オリゴヌクレオチドyqhDFpTRC99AFおよびyqhDRpTRC99ARを用いて、大腸菌Ecoliゲノムから増幅した。このPCR産物を、酵素HindIIIおよびBspHIを用いて制限酵素処理し、NcoI-HindIII制限酵素で制限酵素処理したベクターpTRC99Aにクローニングした。得られたベクターをpTRC99A-yqhDと呼称した。以下の領域:遺伝子yqhDの配列3153377~3153408ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域下線の文字、BspHI制限部位太字の文字を有する、。以下の領域:遺伝子yqhDの配列3154540~3154483ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域下線の文字、HindIII制限部位太字の文字を有する、。pTRC99A-yqhDプラスミドを、次に、MG1655ΔyqhD::Km株に導入した。4.2-タンパク質YqhDの過剰生産タンパク質YqhDを、2.5g/lのグルコースおよび50mg/lのアンピシリンおよび50mg/lのカナマイシンを含有するLB培地500mlの入った2lバッフル付エルレンマイヤーフラスコで、好気性条件下、37°Cで過剰生産した。フラスコをオービタルシェーカー上で200rpmにて撹拌した。550nmで測定した光学濃度が0.5単位に達したら、フラスコを25°Cでインキュベートした。光学濃度が1.2単位に達したら、IPTGを終濃度500μMまで添加することによりYqhDタンパク質の生産を誘導した。培養物が3.5単位を上回る光学濃度に達したら、バイオマスを遠心分離により回収した。上清を廃棄し、使用するまでペレットを-20°Cで保存した。4.3-タンパク質YqhDの精製4.3.1-ステップ1:無細胞抽出物の調製400mgの大腸菌Ecoliバイオマスを70mlの50mMHepespH7.5およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をロゼットセルRosettcellRZ3に入れ、氷上で30秒間8サイクル30秒間隔の音波処理を施したBranson社製sonifier、70W。音波処理の後、細胞を1mMMgCl2および1UI/mlのDNアーゼIとともに室温で1時間インキュベートした。細胞残渣を4°C、12000gで30分間の遠心分離により除去した。上清を粗抽出物として取っておいた。4.3.2-ステップ2:硫酸アンモニウム沈殿粗抽出物を50硫酸アンモニウムの濃度で沈殿させた:粗抽出物に氷上で固体硫酸アンモニウム300g/lを加えた。4°Cでの15分のインキュベーション後に、混合物を4°C、12000gで15分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を50mMHepespH7.5、1M硫酸アンモニウム50mlに溶解させた。4.3.3-ステップ3:疎水性クロマトグラフィーAktaPurifierを使用し、前のステップのタンパク質抽出物を、同じバッファーで平衡化した5mlHiTrapPhenylHPカラムにロードした。カラムを同じバッファーの10カラム容量で洗浄した。二段階勾配10カラム容量の1M~0.5M硫酸アンモニウム勾配および20カラム容量の0.5M~0M硫酸アンモニウム勾配を用いてタンパク質を溶出した。溶出後、50mMHepespH7.5の10カラム容量でカラムを洗浄した。カラムの流速は2.5ml/分であり、2.5mlの画分を集めた。タンパク質を含む画分をプールし、50mMHepespH7.5中で透析し、1.14μg/μlの濃度まで濃縮した。4.4-3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性アッセイ3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性を、分光光度計により波長340nmおよび一定温度37°CでNADPH酸化の初速度を測定することによりアッセイした。20mMHepespH7.5、0.1mM硫酸亜鉛、0.2mMNADPH、6μgの精製酵素で、最終量1mlにて、3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドを基質として用いた反応混合を実施した。反応混合物を37°Cで5分間インキュベートした後、基質3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドの終濃度10mMでの添加により反応を開始した。反応ブランクには、精製酵素を除いた、反応混合物の総ての成分を含めた。酵素活性の1単位は、37°Cで1分間当たりに1μmolの基質を消費する酵素の量と定義した。酵素比活性はタンパク質1mg当たりの単位として表した。4.5-精製酵素の活性実施例51,3-プロパンジオール経路フラックスが増大された、4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子、3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子およびL-ホモセリントランスアミナーゼコード遺伝子を発現する株の構築:MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serC5.1-MG1655ΔpykF株の構築pykF遺伝子を欠失させるために、DatsenkoandWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。以下の領域:pykF領域の配列1753689~1753766ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域小文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字、を有する、。以下の領域:pykF領域の配列1755129~1755051ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字を有する。オリゴヌクレオチドΔpykFFおよびΔpykFRを用いて、プラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたPCR産物を、次に、エレクトロポレーションによってMG1655pKD46株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドpykFFおよびpykFRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykF::Kmと呼称した。配列1753371~1753392と相同。配列1755518~1755495と相同。カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのFRT部位に作用するFLPリコンビナーゼを有するプラスミドpCP20を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。42°Cでの一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドpykFF/pykFRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFと呼称した。5.2-MG1655ΔpykFΔmetA株の構築metA遺伝子を欠失させるために、DatsenkoWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。以下の領域:metA領域の配列4212310~4212389ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域小文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列を有する、。以下の領域:metA領域の配列4213229~4213150ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列を有する、。オリゴヌクレオチドΔmetAFおよびΔmetARを用いて、プラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたPCR産物を、次に、エレクトロポレーションによってMG1655pKD46株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドmetAFおよびmetARを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔmetA::Kmと呼称した。配列4212203~4212232と相同。配列4213301~4213272と相同。ΔmetA::Kmを移入するために、ファージP1形質導入法を用いた。MG1655ΔpykF株への形質導入には、MG1655ΔmetA::Km株のファージ溶解液の調製物を用いた。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔmetA::Kmを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドmetF/metARを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFΔmetA::Kmと呼称した。カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのFRT部位に作用するFLPリコンビナーゼを有するプラスミドpCP20を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。42°Cでの一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドpykFF/pykFRおよびmetF/metARを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFΔmetAと呼称した。5.3-MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC株の構築thrLABCオペロンを欠失させるために、DatsenkoWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。以下の領域:thrLABC領域の配列22~86ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域小文字、T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域太字下線の小文字501924、クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列を有する、。以下の領域:thrLABC領域の配列5106~5021ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、BamHI-SfoI-SmaI制限部位の付加に関する領域斜体の大文字クロラムフェニコール耐性カセットの増幅に関する領域太字の大文字を有する、。オリゴヌクレオチドDthrBFおよびDthrCRを用いて、プラスミドpKD3からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。得られたPCR産物を、次に、エレクトロポレーションによってMG1655pKD46株に導入した。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドthrLFおよびthrCRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔthrLABC::Cmと呼称した。配列4639281~4639307と相同。配列5283~5260と相同。ΔthrLABC::Cmを移入するために、ファージP1形質導入法を用いた。MG1655ΔpykFΔmetA株への形質導入には、MG1655ΔthrLABC::Cm株のファージ溶解液の調製物を用いた。次に、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔthrLABC::Cmを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドthrLFおよびthrCRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC::Cmと呼称した。クロラムフェニコール耐性カセットを除去した。クロラムフェニコール耐性カセットのFRT部位に作用するFLPリコンビナーゼを有するプラスミドpCP20を、次に、エレクトロポレーションによって組換え部位に導入した。42°Cでの一連の培養の後、クロラムフェニコール耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドpykFF/pykFR、metAF/metARおよびthrLF/thrCRを用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCと呼称した。5.4-大腸菌のL-ホモセリントランスアミナーゼserCの過剰発現のためのプラスミドの構築:pME101-thrA1-serCプラスミドserC遺伝子の発現を増加させるために、すでに記載されているpME101-thrA1PCT_WO2008707041から、その適正なプロモーターを用いて、その遺伝子を発現させた。この目的で、serC遺伝子を、オリゴヌクレオチドserCFおよびserCRを用いて、大腸菌Ecoliゲノムから増幅した。このPCR産物を、酵素XbaIおよびSmaIを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で制限酵素処理したベクターpME101-thrA1にクローニングした。得られたベクターをpME101-thrA1-serCと呼称した。以下の領域遺伝子serCの配列956619~956644ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、XbaI部位を有する領域太字の大文字を有する、。以下の領域:遺伝子serC領域の配列958028~958004ウェブサイトhttpwwwecogeneorg上に参照配列と相同な領域大文字、HindIII部位を有する領域太字の大文字を有する、。PCR増幅した断片を制限酵素XbaIおよびHindIIIで切断し、ベクターpME101-thrA1のXbaI-HindIII部位にクローニングし、ベクターpME101-thrA1-serCを得た。5.5-大腸菌の3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼyqhD遺伝子およびラクトコッカスラクチスの4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼkivD遺伝子の過剰発現のためのプラスミドの構築:pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07プラスミドpME101-yqhD-kivDll-TT07プラスミドをまず構築した。BsrBIおよびBglIIで制限酵素処理したpME101-kivDll-TT07ベクターPCT/2009/067994のkivDll遺伝子を、SnaBIおよびBglIIで制限酵素処理したpME101VB01-yqhDベクターPCT/2007/000509においてすでに記載されているにクローニングし、得られたプラスミドをpME101-yqhD-kivDll-TT07と呼称した。次に、yqhDおよびkivDll遺伝子を、オリゴヌクレオチドPtrc01-RBS01-yqhDpBBRFおよびkivDpBBRRを用いて、pME101-yqhD-kivDll-TT07プラスミドからPCR増幅した。このPCR産物を制限酵素SpeIおよびSmaIで消化し、同じ酵素で制限酵素処理したベクターpBBR1MCS5Gene166175176にクローニングし、pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07ベクターを得た。SpeI制限部位の付加に関する領域太字の大文字構成型Ptrcプロモーター配列の付加に関する領域太字の小文字BamHI制限部位の付加に関する領域斜体の大文字リボソーム結合部位配列の付加に関する領域下線の小文字MG1655yqhD遺伝子の配列3153377~3153402と相同な領域斜体の小文字SmaI制限部位の付加に関する領域太字斜体の大文字T7ファージ由来のT7Te転写ターミネーター配列に関する領域下線の大文字501924、SnaBI-EcoRI-PacI制限部位の付加に関する領域太字の大文字合成kivD遺伝子の末端と相同な領域斜体の大文字XXMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCpME101-thrA1-serCpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07株の構築。pME101-thrA1-serCおよびpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07プラスミドを、次に、MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC株に導入した。実施例6スクロースでの1.3-プロパンジオール経路フラックスが増大された、4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートデカルボキシラーゼコード遺伝子および3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼコード遺伝子、ならびにスクロース非PTS輸送系を発現する株の構築:MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serCpKJL101-1pKJL101-1プラスミドは他の部分で記載した。pME101-thrA1-serC、pBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07およびpKJL101-1プラスミドをMG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABC株に導入した。実施例71,3-プロパンジオール生産のための培養株の性能を、4.5mMトレオニン、5mMメチオニン、10g/lMOPSおよび10g/lスクロースまたはグルコースを添加し、pH6.8に調整した改変M9培地を用いて、500mlバッフル付エルレンマイヤーフラスコでの培養により評価した。スペクチノマイシンおよび/またはゲンタマイシンは、必要であれば、50mg/lの濃度で加え、および/または、クロラムフェニコールは、必要であれば、60mg/lの濃度で加えた。発現ベクターpME101が存在する場合には、その誘導のために100μMIPTGも加えた。24時間培養した前培養物を用いて、OD600nmが約0.1となるように50mlの培養物に植菌した。培養物は、37°Cおよび200rpmで増殖させ、培養培地中のスクロースが枯渇するまで行った。この時点において、残留する糖および主産物を、分離用のバイオラド社製HPX97Hカラムおよび検出用の屈折計を用いてHPLCにより分析した。1,3-プロパンジオールの生産は、LC/MS/MSにより確認した。異なる株の性能を下表に示す。上表から分かるように、ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼおよび3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼを発現する株は、L-ホモセリンの生産のためのフラックスがpykFの欠失およびthrA1の過剰発現を通じて増大し、L-ホモセリンの形質転換がmetAおよびthrABCの欠失によって減少し、L-ホモセリンの4-ヒドロキシ-2-ケトブチレートへの形質転換がserCの過剰発現によって触媒作用を受ける場合に、スクロースからPDOを生産する。本発明者らが知る限り、野生型大腸菌における任意の炭素源でのPDOの生産は示されておらず、上記改変によって大腸菌野生型PDO非生産株がPDO生産株へと変わることが示される。実施例8MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::KmpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serC株の構築実施例7から分かるように、スクロースでのPDO生産株pKJL101.1によりスクロース輸送系を組み込んでいるは参照株よりも生産するPDOが少ないように思われる。これは、その株に含まれる3つの異なるベクターに起因する安定性問題を示していると考えられる。そのため、本発明者らは、より安定した株を得るために、スクロース輸送系を染色体上に導入することとした。8.1MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKAR::Cm株の構築スクロースを唯一の炭素源として増殖可能な株を構築するために、csc遺伝子を、LJM115株からのP1ファージ溶解液を用いてMG1655株に形質導入した53075316。クロラムフェニコール耐性組換え体を選択し、csc遺伝子の存在を、プライマーOpg0590_yfdCseq配列番号27およびOpg1242_dsdX-dsdAseq配列番号28を用いたPCRにより確認した。確認済みの選択株をMG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKAR::Cmと呼称した。配列2463948~2463967と相同配列2477624~2477604と相同8.2MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Km株の構築cscR遺伝子を欠失させるために、DatsenkoWannerにより記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットを挿入することを可能とする。この目的で、下記のオリゴヌクレオチドを用いた。cscR遺伝子の末端と相同な領域太字の大文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域下線の大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列cscR遺伝子の開始部位と相同な領域太字の大文字、カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域下線の大文字DatsenkoKAWannerBL2000PNAS9766406645に参照配列オリゴヌクレオチドOdi0195_cscR::CmFおよびOdi0196_cscR::CmRを用いて、プラスミドpKD4からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたPCR産物を、次に、エレクトロポレーションによってMG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKAR::Cm株に導入した。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、上記のオリゴヌクレオチドOpg1242_dsdX-dsdAseq配列番号28および下記に定義されるOpg0511_csc8配列番号31を用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Kmと呼称した。cscA遺伝子の配列と相同ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Km染色体改変を移入するために、ファージP1形質導入法を用いた。5.3に記載したMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABC株への形質導入には、MG1655ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Km株のファージ溶解液の調製物を用いた。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Kmを、従前に定義されているオリゴヌクレオチドOpg1242_dsdX-dsdAseq/Opg0511_csc8を用いたPCR分析により確認した。保持した株をMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Kmと呼称した。8.3MG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::KmpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serC株の構築pME101-thrA1-serCおよびpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07プラスミド5.4および5.5に記載したを、最後に、MG1655ΔmetAΔpykFΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::Km株に導入した。得られた株をMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::KmpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serCと呼称した。実施例9スクロースでの新規生産株の培養株1:実施例5.5に記載したMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCpME101-thrA1-serCpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07;株2:実施例8.3に記載したMG1655ΔpykFΔmetAΔthrLABCΔRN/yfdC-dsdX::cscBQ353HKARΔcscR::KmpBBR1MCS5-Ptrc01/RBS012-yqhD-kivDll-TT07pME101-thrA1-serC。生産株を、小エルレンマイヤーフラスコで、4.5mMトレオニン、5mMメチオニンおよび10g.L-1MOPSを添加し、pH6.8に調整した改変M9培地を用いて評価した。株1では、グルコースを10g.L-1の濃度で加え、株2では、スクロースを10g.L-1の濃度で加えた。5mLの前培養物を、混合培地2.5g.L-1グルコースまたはスクロースを含む10LB培地シグマ25および90上記最少培地中で37°Cで6.5時間増殖させた。それを用いて、最少培地においてOD600が0.1となるように50mLの培養物に植菌した。発現ベクターpME101の誘導のために、IPTG100μMも加えた。必要であれば、抗生物質を、カナマイシンおよびスペクチノマイシンは50mg.L-1、ゲンタマイシンは10mg.L-1の濃度で加えた。培養温度は37°Cであった。培養物のOD600が7~9に達したときに、細胞外代謝産物を、屈折率測定検出を用いたHPLCを用いて分析した有機酸およびスクロース。1,3-プロパンジオールの生産は、LC/MS/MSにより確認した。株2については、4反復を行った。上表から分かるように、炭素源としてのスクロースからのPDO生産は、グルコースを炭素源とした場合と同程度である。参照文献本文での引用順"