"細胞中での潜伏性ヒト免疫不全ウィルスHIV感染の再活性化の方法であって、前記方法は、細胞と、NF-κB活性で第2の遅延した増加をもたらすことなく、NF-κB活性のレベルで一過性の第1の増加をもたらす第1の薬剤とを接触させることによって、細胞中のNF-κB活性のレベルを調節することを含む、方法。前記NF-κB活性での第2の遅延した増加が、サイトカイン遺伝子誘導に関連し、前記NF-κB活性での第2の遅延した増加の不在が、サイトカイン遺伝子誘導の不在を伴う、請求項1に記載の方法。前記NF-κB活性での調節が、TNF-α、PMA、PHA-L、IL-2、抗CD3モノクローナル抗体、又は抗CD3と抗CD28モノクローナル抗体との組み合わせによって生じる調節からのパターンとは異なる、請求項1に記載の方法。前記NF-κB活性のレベルでの調節が、NF-κBp50のレベルでの調節として検出される、請求項1に記載の方法。前記NF-κB活性のレベルでの調節が、NF-κBp65のレベルでの調節として検出される、請求項1に記載の方法。前記遺伝子誘導の不在が、1つ以上のTNF-α、IL-8、IFNγ、IL-2、IL-4、及びIL-6の誘導の不在を含む、請求項2に記載の方法。前記NF-κB活性のレベルでの調節が、HIV複製を伴わない、請求項1に記載の方法。前記細胞がインビトロである、請求項1に記載の方法。前記細胞がインビボである、請求項1に記載の方法。前記方法が、前記潜伏性HIV感染を刺激する第2の薬剤に細胞を接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。前記細胞の前記第1の薬剤と接触の前に、前記細胞が前記第2の薬剤と接触される、請求項10に記載の方法。前記第2の薬剤がP-TEFbを複合体から放出させる、請求項10に記載の方法。前記第2の薬剤が、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。前記第2の薬剤が、アクチノマイシンDである、請求項13に記載の方法。前記アクチノマイシンDが、15マイクログラム/キログラム/日μg/kg/日の用量で投与される、請求項14に記載の方法。ヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRFを生成するための単離されたMassilia細菌又はその集団。請求項16に記載のMassilia細菌によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRF。前記Massilia細菌は、16SrRNA配列を含み、前記16SrRNA配列が、Massiliatimonaeと少なくとも95の配列同一性を含む、請求項16に記載のMassilia細菌。前記16SrRNA配列が、Massiliatimonaeと少なくとも99の配列同一性を含む、請求項18に記載のMassilia細菌。ATCC受入番号PTA-10969を有するMassiliatimonae株の精製した集団を含む組成物。請求項20に記載のMassilia株によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRF。前記HRFが、50キロダルトンkDa以上のポリペプチドを含む、請求項21に記載のHRF。前記HRFが、100kDa以下のポリペプチドを含む、請求項21に記載のHRF。ATCC受入番号BAA-703を有するMassiliatimonae株によって生成される単離されたヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRF。Massilia細菌によって生成されるHIV再活性化因子HRF又はMassilia細菌によって生成されるHRFの再活性化断片を投与することを含む、被験者において潜伏性ヒト免疫不全ウィルスHIV感染を再活性化させる方法。前記HRFが、ATCC受入番号PTA-10969を有するMassiliatimonae株によって生成される、請求項25に記載の方法。前記HRFが、ATCC受入番号BAA-703を有するMassiliatimonae株によって生成される、請求項25に記載の方法。前記HRFが、50キロダルトンkDa以上のポリペプチドを含む、請求項25に記載の方法。前記HRFが、100kDa以下のポリペプチドを含む、請求項25に記載の方法。前記方法が、前記潜伏性HIV感染を刺激する薬剤を被験者に投与することを更に含む、請求項25に記載の方法。前記薬剤が、Massilia細菌によって生成される前記HRF又は前記HRFの再活性化断片の投与前に前記被験者に投与される、請求項30に記載の方法。前記薬剤が、複合体からP-TEFbを放出させる、請求項30に記載の方法。前記薬剤が、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。前記薬剤が、アクチノマイシンDである、請求項33に記載の方法。被験者においてHIV感染を治療する方法であり、前記方法は、aNF-κB活性のレベルを調節することによって、潜伏性HIV感染を再活性化する第1の薬剤を被験者に投与することであって、前記NF-κB活性のレベルに調節は、NF-κB活性での第2の遅延した増加をもたらすことなく、NF-κB活性のレベルでの一過性の第1の増加をもたらし、b前記被験者に抗レトロウィルス剤を投与することであって、前記被験者への抗レトロウィルス剤の投与が前記HIV感染を治療する、ことを含む方法。前記抗レトロウィルス剤は、前記潜伏性HIV感染の再活性化の後に、前記被験者に投与される、請求項35に記載の方法。前記抗レトロウィルス剤は、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターNRTI、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターNNRTI、ヌクレオシド同類体逆転写酵素インヒビターNARTI、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインインヒビター、侵入抑制因子、成熟抑制因子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項35に記載の方法。前記方法は、前記被験者において前記潜伏性HIV感染を刺激する第2の薬剤を前記被験者に投与することを更に含む、請求項35に記載の方法。前記第2の薬剤が、前記第1の薬剤の前に投与される、請求項38に記載の方法。前記第2の薬剤が、複合体からP-TEFbを放出させる、請求項38に記載の方法。前記第2の薬剤が、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。前記第2の薬剤が、アクチノマイシンDである、請求項41に記載の方法。前記第1の薬剤が、Massilia細菌から生成されるHIV再活性化因子HRF又はその再活性化断片である、請求項35に記載の方法。前記Massilia細菌が、ATCC受入番号PTA-10969を有するMassiliatimonae株である、請求項43に記載の方法。HIV再活性化因子を生成する方法であり、a培養培地中への前記HRFの分泌を可能にさせる条件下で、Massilia細菌を哺乳類細胞培養培地中で培養させることと、bMassilia細菌調整培地の単離とを含む方法。前記哺乳類細胞培養培地が、RPMI1640培地である、請求項45に記載の方法。前記RPMI1640培地が、哺乳類血清、ウシ血清アルブミンBSA、又はミオグロビンを更に含む、請求項46に記載の方法。前記RPMI1640培地が、約1~約20の哺乳類血清、BSA、又はミオグロビンを更に含む、請求項47に記載の方法。前記哺乳類血清が、ウシ胎児血清FBSである、請求項47に記載の方法。前記RPMI1640培地が、ウシ血清アルブミンBSAを更に含む、請求項47に記載の方法。前記BSAが、約0.1~約20mg/mlの前記RPMI1640培地を含む、請求項50に記載の方法。前記RPMI1640培地が、ミオグロビンを更に含む、請求項47に記載の方法。HIV-1ウィルスが休眠状態又は潜伏状態で長寿命免疫細胞のゲノム中に一体化し得るために、抗レトロウィルス療法ARTは、HIV-1感染を抑制し得るが、根絶し得ない。一体化されたウィルスは永久的に存続し、治療が中止される場合、蔓延する。潜伏性HIV-1感染を根絶するための最も可能性のある方法は、これらのウィルスを再活性化させることである。再活性化ウィルスを有する感染した細胞は、免疫系による破壊に感受性を示すか又はウィルス細胞毒素によって破壊されると思われ、これによって、この残存するウィルス供給源を抹消する。残念なことに、潜伏性HIV-1感染を再活性化する刺激は、アラフィラキシーショックと同等である、致命的なサイトカイン急増を引き起こし得る。しかしながら、本明細書に提供された方法は、致命的なサイトカイン急増を生じることなく、潜伏性ヒト免疫不全ウィルスHIVを再活性化する。更に、HIV-1再活性化化合物に関する従来の薬物スクリーニング又は患者の潜伏性HIV-1感染を治療的に再活性化するための従来の試みは、一薬物一標的説の下で開発され、これは完全な化学的プローブが単一の標的に作用するという前提に基づいている。しかしながら、HIV-1潜伏性を制御する分子メカニズムに関する研究は、複数の成分が、持続性T細胞活性化の不在下でHIV-1再活性化を誘導するために、協調した様式で誘発されねばならないことを示唆している。このことは、全ての遺伝子が他の遺伝子に関連して機能すること又は分子制御メカニズムがネットワークに関連して機能すること、並びに生物学的システムが遺伝子又はメカニズムに相互作用する活性に基づいて動的かつ可変的に応答するために、単一の標的というものは現実にはあり得ないことを考慮すべきである。したがって、本明細書に提供された方法は、潜伏性HIV感染を再活性化するために、任意で薬剤の併用を用いる。本明細書に提供されるものは、新規なヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRF及び新規なHRFを含む組成物である。このような組成物は、Massilia細菌によって生成されたHRFを含む培養基を包含する。更に本明細書で提供されたものは、HRFをコード化することが可能な核酸配列である。任意で、このHRFは、Massilia細菌から生成される。任意で、このHRFは、ATCC受入番号PTA-10969を有する株名称HRFで、ATCC、10801UniversityRoad,Manassas,VA20110によって、ブダペスト条約に基づき、2010年5月18日に寄託されたMassiliatimonae株によって生成される。任意で、このHRFは、ATCC受入番号BAA-703を有するMassiliatimonae株によって生成される。任意で、このHRFは、NF-κB活性のレベルを調節する。選択的に、このHRFは、50キロダルトンkDa以上のポリペプチドを含む。任意により、このHRFは、100kDa以下のポリペプチドを含む。本明細書に提供されているHRFsは、細胞毒性をほとんど又は全く示さず、300を超える治療指数を有する。治療指数は、死亡を引き起こす治療薬剤の量に対する治療的効果をもたらす治療薬剤の量の比較である。治療指数は、集団の50についての最小有効治療的用量ED50で割られた集団の50についての薬物又は薬剤の致死量LD50によって得られる比率である。高治療指数が好ましい。細胞を第1の薬剤と接触させることにより細胞中のNF-κB活性のレベルの調節することは、NF-κBでの遅延した第2の増加をもたらすことなく、NF-κB活性のレベルにおける一過性の第1の増加をもたらす。したがって、NF-κB活性のレベルにおける一過性の第1の増加は、NF-κB活性の持続するレベルに続くことはない。NF-κB活性の持続したレベルは、例えば、サイトカイン遺伝子発現の誘導及び随伴する遅延増加をもたらし得る。本明細書で記載されるように、第1の薬剤は、NF-κB活性のレベルにおける一過性第1の増加を生み出し、NF-κB活性のピークレベルをもたらし、このNF-κBのレベルは後に経時的に減少する。活性の第2のピークはほとんど又は全く発生しない。NF-κB活性の遅延した第2の増加は、サイトカイン遺伝子誘導に関連し得る。NF-κB活性での遅延した第2の増加の不在又は減少は、実質的サイトカイン遺伝子誘導の不在をもたらす。任意で、サイトカイン遺伝子の誘導の不在は、TNF-α、IL-8、IFNγ、IL-2、IL-4及びIL-6のうちの1つ以上の実質的誘導の不在を含む。実質的サイトカイン遺伝子誘導とは、標準統計解析を用いる対照値とは著しく異なる対照全体にわたる増加を意味する。NF-κB活性の調節は、TNF-α、PMA、PHA-L、IL-2、抗CD3モノクローナル抗体、又は抗CD3と抗CD28モノクローナル抗体との組み合わせによって生じる調節とはパターンで異なる。TNF-α、PMA、PHA-L、IL-2、抗CD3モノクローナル抗体、又は抗CD3と抗CD28モノクローナル抗体との組み合わせによって生じるNF-κB活性の調節は、例えば、NF-κB活性の1つのパターンを生み出し得る。任意で、これらの薬剤によって生じるNF-κB活性のパターンは、NF-κB活性のレベルにおける第1の増加で始まり、NF-κB活性の持続性の増加したレベルに続く。NF-κB活性の持続性レベルは、例えば、NF-κB活性の振動レベルであり得る。NF-κB活性の振動パターンは、NF-κB活性のレベルでの増加、NF-κB活性のレベルでの減少、並びに別の増加ではあるがパターンが持続し続けることができるものを含む。任意で、潜伏性HIV感染は、第2の薬剤の投与によって、細胞中で刺激される。第2の薬剤は、潜伏性感染に関する活性化閾値を低下させることによって、再活性化のために潜伏性HIV-1感染を刺激する。次いで、再活性化因子によって、完全な再活性化が誘発され得、この再活性化因子は、低用量ではそれ自体が潜伏性感染には効果をほとんど又は全く有さず、最も重要なことは、これがサイトカイン発現又はいかなる他の有害な副作用も誘発しない又は最少のサイトカイン発現又は副作用を誘発するであろうことである。例として、第2の薬剤の投与は、細胞中での潜伏性HIV感染を再活性化するために必要とされる第1の薬剤の量すなわち投与量を減少させ得る。第2の薬剤は、第1の薬剤に先行して又はそれと同時に被験者に投与され得る。第2薬剤は、例えば、HEXIM-1及び7SKRNAを含む不活性複合体からP-TEFbを放出させることによって、潜伏性HIV感染を刺激することができる。任意で、第2の薬剤は、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンポテリシンB、及びWP631からなる群から選択される。例えば、第2の薬剤は、HRFに限定されない方法で、再活性化されるべき潜伏性HIV感染を刺激することができる。例としては、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、又はWP631で潜伏性HIV感染を刺激することは、例えばTNF-α、IL-2、又はCD3抗体が挙げられる他の薬剤の準最適用量に潜伏性HIV感染を再活性化させることを可能にする。理論に制限されるものではないが、潜伏性HIV感染を刺激することは、TNF-α、IL-2、又はCD3の準最適用量によるNF-κB活性の調節に影響を及ぼし、これがサイトカイン急増を誘発することを回避する。また、本明細書で更に提供されるものは、Massilia細菌の精製集団である。Massiliatimonaeはグラム陰性細菌であり、日和見感染における重度免疫不全患者から初期に単離されたものである。Massiliatimonaeは非病原性であると見なされ、土壌サンプル中、飲料水中、空気中、及び宇宙船組立品の無菌室中でさえも頻繁に見出される。任意で、精製集団は、ATCC受入番号PTA-10969号を有するMassiliatimonae株を含む。任意により、組成物はATCC受入番号BAA-703号を有するMassiliatimonae株を含む。Massiliatimonae株はまた、例えば、HIV再活性化因子HRFを生成する。また、更に本明細書で提供されるものは、本明細書に提供されたMassilia株によって生成されるHRFを含む組成物である。更に提供されるものは、単離されたMassilia細菌又はその集団である。単離されたMassilia細菌又はその集団は、ヒト免疫不全ウィルスHIV再活性化因子HRFを生成することが可能である。任意で、Massilia細菌は、16SrRNA配列を含み、この16SrRNA配列は、Massiliatimonaeの16SrRNA配列と少なくとも95の配列同一性を備える。任意で、この16SrRNAは、Massiliatimonaeの16SrRNA配列と少なくとも99の配列同一性を備える。2種の核酸間の配列同一性の類似性又は配列類似性は、例えば、Zuker著,M.Science244:48~52頁,1989年、Jaegerら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706~7710頁,1989年、Jaegerら著,MethodsEnzymol.183:281~306頁,1989年に開示されたアルゴリズムによって得ることができ、これらは核酸配列化のための少なくとも材料に関して参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に提供されものは、HRFポリペプチドと、HRFsをコード化する核酸と、HRFsを生成可能なMassilia細菌株とを含有し、任意で、1つ以上のプライミング剤と、抗レトロウィルス剤と、本明細書に記載された薬学的に許容可能な担体とを含む組成物である。本明細書で提供されている組成物は、インビトロ又はインビボでの投与に好適である。薬学的に許容可能な担体とは、生物学的に又はその他に望ましくない物質ではない、すなわち、望ましくない生物学的効果を起こすことなく又はその物質が封入される薬学的組成物の成分と有害な方法で相互作用することなく被験者に投与される物質を意味する。この担体は、活性成分の分解を最小化し、並びに被験者での副作用を最小化するよう選択される。好適な担体及びその処方製剤は、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第21版,DavidB.Troy著,LippicottWilliamsWilkins編集2005年に記載されている。典型的には、薬学的に許容可能な塩の適切量が、処方製剤を等張にさせるために用いられる。薬学的に許容可能な担体の例としては、限定されるものではないが、無菌水、生理食塩水、リンガー液のような緩衝溶液、及びデキストローズ溶液が挙げられる。この溶液のpHは、概ね約5~8又は7~7.5である。他の担体としては、免疫原性ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような持続性放出調製物が挙げられる。マトリックスは、成形加工品、例えばフィルム、リポソーム、又はマイクロ粒子のような形態である。特定の担体は、例えば、投与の経路及び投与される組成物の濃度に依存することがより好ましい可能性がある。担体は、プライミング剤、再活性化剤及び/又は抗レトロウィルス剤のヒト又は他の被験体への投与のために好適な担体であり、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸分子、及び/又はペプチド疑似体などである。この組成物は、局所的治療又は全身的治療のいずれかが望ましいか、並びに治療される領域に依存するいくつかの方法で投与される。この組成物は、局所的、経口的、非経口的、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、皮内、肝臓内、頭蓋内投与、噴霧/吸引投与、又は気管支鏡法を介しての導入などが挙げられる投与の任意のいくつかの経路を介して投与される。非経口投与のための調製物としては、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルオレエートのような注入可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、生理食塩水及び緩衝化媒体を含む、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、若しくは不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充物、電解質補充物例えばリンガーデキストロースをベースとしたもの等が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等のような防腐剤及び他の添加剤が、任意で存在する。局所投与のための製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、座剤、スプレー、液剤、及び粉末剤が挙げられる。慣用的な薬剤学的キャリア、水性、粉末若しくは油性基剤、増粘剤等が必要である場合又は望ましい場合もある。経口投与用の組成物としては、粉末又は顆粒、水中又は非水性媒体中の懸濁液又は溶液、カプセル、分包剤、又は錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が、場合によっては望ましい。任意で、核酸分子又はポリペプチドが、核酸分子又はポリペプチドをコード化する核酸配列例えば、本明細書で提供されるMassilia株によって生成されたHRFをコード化する核酸を含むベクターによって投与される。例えば発現ベクターを介して、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞へ核酸分子及び/又はポリペプチドを送達させるために使用され得るいくつかの組成物及び方法がある。これらの方法及び組成物は、大きく2つの部類に分けられ、これらはウィルス系送達システムと非ウィルス系送達システムである。このような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書で記載される組成物及び方法での使用に容易に適用可能である。また、本明細書で提供されているものは、HIV再活性化因子HRFを生成する方法である。この方法は、培養培地へのHRFの分泌を可能にする条件下で、哺乳類細胞培養培地中でMassilia細菌を培養することと、Massilia細菌調整培地を単離することとを含む。任意で、Massilia細菌は、ATCC受入番号PTA-10969を有するMassiliatimonae株を含む。任意で、Massilia細菌は、ATCC受入番号BAA-703を有するMassiliatimonae株を含む。任意で、哺乳類細培養基は、RPMI1640培地を含む。任意で、RPMI1640培地は、哺乳類血清、ウシ血清アルブミンBSA、又はミオグロビンを更に含む。任意で、RPMI1640培地は、約1~20の哺乳類血清、BSA、ミオグロビンを含む。哺乳類血清は、例えばウシ胎児血清FBSであることができる。RPMI1640培地は、約5~約15のFBSを含むことができる。任意で、RPMI1640培地は、約10のFBSを含む。任意で、RPMI1640培地は、ウシ血清アルブミンBSAを更に含む。RPMI1640培地は、例えば約0.1~約20mg/mlのBSAを含むことができる。任意で、RPMI1640培地は、ミオグロビンを更に含む。ミオグロビンは、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヒト、又は任意の他の霊長類から得ることができる。任意で、HRFは、哺乳類培養培地から単離される。哺乳類培養培地からのHRFの単離は、当該技術分野で既知の方法を使用して実行され、例えばWoolley及びAl-Rubeai著,Biotechnol.Bioeng.1043:590~600頁2009年;Kalyanpur著,Mol.Biotechnol.22:87~96頁2002年;Sanchezら著,FEMSMicrobiol.Lett.2952:226~9頁2009年;Dowlingら著,AnticancerRes.273A:1309~17頁2007年及び培地の分画法に関して本明細書で教示されたような方法を参照されたい。また、本明細書で更に提供されるものは、細胞中の潜伏性ヒト免疫不全ウィルスHIV感染を再活性する方法である。この方法は、NF-κB活性での遅延した第2の増加を生じることなくNF-κB活性のレベルでの一過性増加を生じる第1の薬剤に細胞を接触させることによって、細胞中のNF-κB活性のレベルを調節することを含む。NF-κB活性のレベルでの調節は、例えば、NF-κBp50又はNF-κBp65活性のレベルでの調節として検出され得る。NF-κB活性のレベルでの調節は、HIV複製の誘導をもたらさない。任意で、細胞はインビトロ又はインビボにある。任意で、この方法は、潜伏性HIV感染を刺激する第2の薬剤と細胞を接触させることを含む。この第2の薬剤は、例えば複合体からP-TEFbを放出することができる。この複合体は、HEXIM-1及び7SKRNAを含むことができる。任意で、第2の薬剤は、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される。また、本明細書に更に提供されるものは、被験者において潜伏性ヒト免疫不全ウィルスHIV感染を再活性化する方法である。この方法は、Massilia細菌によって生成されたHIV再活性化因子HRF、又はMassilia細菌によって生成されたHRFの再活性化断片を被験者に投与することを含む。任意で、Massilia細菌又はMassilia調整培地を被験者に直接投与することによって、若しくはそれらの分画を被験者に投与することによって、HRFが投与される。任意で、培養されたMassilia細菌から単離された細菌上清として、HRFが被験者に投与される。細菌上清は、当該技術分野で既知の方法又は本明細書に記載されたような方法によって、培養されたMassilia細菌から単離されることができる。任意で、この方法は、被験者において潜伏性HIV感染を刺激する薬剤を被験者に投与することを含む。潜伏性HIV感染を刺激するとは、HRFによるHIV感染のより有効な再活性化をもたらすために、薬剤が潜伏性HIV感染を調節する又は変更することを意味する。例えば、薬剤の投与が、被験者において潜伏性HIV感染を再活性化するために必要とされるHRFの量すなわち投与量を減少することができることである。任意で、この薬剤は、HRFの投与前に、又はHFRの投与と同時に投与される。任意で、第2の薬剤は、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される。アクチノマイシンD、アンフォテリシンB又はアクラシノマイシンは、再活性化剤の前に又はそれと同時に投与される。任意で、アクチノマイシンDは、再活性化剤の投与の約6~30時間例えば12~24時間前に投与される。アンフォテリシンB又はアクラシノマイシンは、例えば再活性化剤の投与前の12時間まで例えば、約6時間に又はその投与と同時に投与され得る。例えば、アクチノマイシンDは、約15マイクログラム/キログラム/日μg/kg/日までの用量で投与される。任意で、アクチノマイシンDは、約400~600ミリグラム/1m2体表面積/日mg/m2/日の範囲で投与され得る。アクチノマイシンDは、1~5日間、この範囲で投与され得るが、治療は5日間の投与期間後に停止及び再開され得る。アクラシノマイシンは、最大で5日間、約100mg/m2/日の投与量で投与される。アンフォテリシンBは、例えば、約1.5mg/kg/日の用量で投与される。任意で、アンフォテリシンBは、1mg/mlの用量で投与される。また、本明細書で更に提供されるものは、被験者におけるHIV感染の治療の方法である。この方法は、NF-κB活性のレベルを調節することによって潜伏性HIV感染を再活性化する第1の薬剤を被験者に投与することここにおいて、NF-κB活性のレベルの調節は、NF-κB活性での第2の遅延した増加を生じることなく、NF-κB活性のレベルにおける一過性の第1の増加を生じることを含みと、更に抗レトロウィルス剤を被験者に投与することとを含む。抗レトロウィルス剤の投与は、HIV感染の治療をもたらす。任意で、抗レトロウィルス剤は、潜伏性HIV感染の活性化の後に又は第1の薬剤と同時に被験者に投与される。任意で、被験者において潜伏性HIV感染を刺激する第2の薬剤を被験者は投与される。第2の薬剤は、第1の薬剤に先立って又はそれと同時に被験者に投与され得る。第2の薬剤は、例えば、HEXIM-1及び7SKRNAの不活性複合体からP-TEFbを放出させることによって、潜伏性HIV感染を刺激する。任意で、第2の薬剤は、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631からなる群から選択される。抗レトロウィルス剤は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターNRTI、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターNNRTI、ヌクレオシド類似体逆転写酵素インヒビターNARTI、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインヒビター、侵入抑制因子、成熟抑制因子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。上述の第2の薬剤又は治療薬のいずれか例えば、アクチノマイシンD又は抗レトロウィルス剤は、本明細書で記載されている組成物との任意の組み合わせで使用され得る。薬剤組み合わせは、同時に混合物として、別個ではあるが逐次的に例えば、別個の静脈内経路を介して同一の被験者に、又は順次に例えば、1つの化合物又は薬剤が先ず初めに投与され、続いて第2番目の化合物又は薬剤が投与される投与される。したがって、用語組み合わせは、2つ以上の薬剤の同時的、逐次的、又は順次的投与を指すように使用される。本明細書で使用するとき、用語ペプチド、ポリペプチド、又は蛋白質は、ペプチド結合によって結合された2つ以上のアミノ酸を意味するために広範に使用される。蛋白質、ペプチド、及びポリペプチドはまた、アミノ酸配列を指すために互換的に本明細書で使用されている。用語ポリペプチドは、分子を含む特定の寸法又は数のアミノ酸を示すために本明細書で使用されてはおらず、本発明のペプチドは数個までのアミノ酸残基以上のアミノ酸残基を含有し得ることが理解されるべきである。本明細書で記載されている方法及び薬剤は、治療的処置のために有用である。治療的処置は、HIV感染の診断後に、本明細書で記載される薬剤の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む。用語有効量と有効投与量とは、互換的に使用される。用語有効量は、所望の生理学的応答を生じるために必要とされる任意の量として定義される例えば、総細胞集団の少なくとも約50で、潜伏性HIV感染を再活性化する再活性化剤の有効量、潜伏性HIV感染を再活性化するために必要な再活性化剤の有効量を減少させることによって、潜伏性HIV感染を刺激するプライミング剤の有効量、及び4~6ヶ月以内に検出限界以下に落ちるウィルス負荷で、6週間以内に30~100倍のHIVウィルス負荷での減少をもたらす抗ウィルス剤の有効量。有効量及び薬剤を投与するためのスケジュールは、経験的に決定され得、このような決定をすることは、当該技術分野の範囲内である。投与のための投与量範囲は、所望の効果例えば、HIV再活性化及び/又はHIV症状の軽減を生み出すために十分に大きな範囲である。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような実質的な重篤な副作用を起こすほど大きなものであるべきではない。HRFの投与量は、例えば、アクチノマイシンD、アクラシノマイシン、アンフォテリシンB、及びWP631のような第2薬剤の刺激投与量で減少され得る。概して、この投与量は、年齢、病状、性、疾患の型、疾患又は疾病の程度、投与の経路、又は他の薬剤がレジメンに含まれているかどうかで変化し、当業者によって決定され得る。投与量は、あらゆる禁忌の事象において個々の医師よって調節可能である。投与用は変化可能であり、毎日1回以上の投与で1日又は数日間投与されることが可能である。医薬品の所与の部類についての適切な投与量に関して、ガイダンスが文献中で確認され得る。本明細書で使用するとき、用語治療:treatment、治療する:treat、又は治療すること:treatingは、疾患又は病状の影響例えば、HIV感染若しくは疾患又は病状の症状を低減する又は遅延させる方法治療がCD4T細胞での増加及びHIV-1ウィルス負荷での減少をもたらすを指す。したがって、開示された方法では、治療は10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100の確立された疾患又は病状、若しくは疾患又は病状の症状の重篤性での軽減を指す。例えば、疾患を治療するための方法は、対照と比較して、被験者での疾患の1つ以上の症状での10の軽減がある場合の治療であると考えられる。したがって、軽減とは、固有レベル又は対照レベルと比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、又は10~100の任意のパーセント軽減であり得る。治療は、疾患、病状、若しくは疾患又は病状の症状の治癒又は完全焼灼を指す必要はないことを理解されたい。本発明で開示されたものは、本発明で使用され得、関連付けて使用され得、調製で使用され得る、又は開示された方法及び組成物の生成物である材料、組成物、及び成分である。これらの材料及び他の材料は本明細書に開示されていて、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物のそれぞれの種々の個々並びに集合的組み合わせ及び置換の特定の参照は、明示的に開示され得るわけではなく、本明細書にそれぞれが具体的に意図されかつ記載されていることを理解されたい。例えば、1つの方法が開示かつ説明され、方法を含むいくつかの分子へと作製され得るいくつかの修正が説明される場合、方法の組み合わせ及び置換のそれぞれ及び全て、並びに可能である修正は、内容が特に逆のことを指示していない限り、具体的に意図されている。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせもまた、具体的に意図されかつ開示されている。この概念は、限定されるものではないが、開示された組成物を使用する方法での工程が挙げられる本開示の全ての態様に適用する。したがって、実施されることが可能な様々な追加的工程がある場合、これらの追加的工程のそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法工程又は方法工程の組み合わせで実行され得ること、並びにこのような組み合わせのそれぞれ又は組み合わせのサブセットは、具体的に意図されていて、並びに開示されているものと考慮されるべきであることを理解されたい。本明細書で引用した出版物及びそこで引用される材料は、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれるものとする。実施例実施例1:サイトカイン遺伝子の誘導がない潜伏性HIV-1感染の再活性化材料及び方法細胞培養及び試薬:全てのT細胞系、並びに潜伏的にHIV-1感染した単核細胞THP89GFP細胞を、2mMのL-グルタミン2mM、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び10熱不活性化ウシ胎児血清を補充したRPMI1640中で維持した。ウシ胎児血清は、HyCloneLogan,Utahから入手し、HIV-1再活性化を自発的に誘発しないことを確認するために、潜伏感染細胞のパネル上でテストしたJonesら著,AssayDrugDev.Technol.5:181~9頁2007年;Kutschら著,J.Virol.76:8776~86頁2002年。フォルボールエステル13-フォルボール-12ミリステートアセテートPMA、LPS及びポリミキシンB-アガロースは、SigmaSt.Louis,MOから購入し、一方組換え体ヒトTNF-αは、RDSystemsMinneapolis,MNから入手した。使用されたEGFPレポーターウィルスHIV-1NLENG1-IRESは別に記載されたKutschら著,J.Virol.76:8776-86頁2002年;Levyら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:4204-9頁2004年。レポータープラスミドpNF-κB-d2EGFPをClontechMountainView,CAから購入した。LTR-GFP構造及びIL-8レポーター構造は、先に記載されているChoiら著,Mol.Cell.Biol.22:724-36頁2002年。TNF-プロモーター構造を、プライマー対5’-BglII;5’-GGCGCGGAGATCTTAACGAAGACAGGGCCATGT-3’配列番号2及び3’-AgeI;5’-GCCAATACCGGTGTGTCCTTTCCAGGGGAGAG-3’配列番号3によって定義されるヒトTNF-αプロモーターエレメントをpd2EGFPClontech中にクローンすることで生成した。MSCV-GFPを、EGFP遺伝子をレトロウィルスpMSCVプロベクターClontech中にクローニングすることで生成した。フローサイトメトリー:細胞培養中の感染レベルを、EGFP発現のフローサイトメトリー解析で監視した。フローサイトメトリー解析をGUAVAEasyCyteMillipore;Billerica,MA又はLSRIIBectonDickinson;FranklinLakes,NJで実行した。BioPlex解析:PHA-L又はHIV-1再活性化因子HRFでの末梢血単核細胞PBMCの刺激に続いて、上清サンプルを、刺激後12時間及び48時間の時点で収集した。予備解析は、ピークサイトカイン分泌は24時間周辺で見られることを示した。したがって、全てのドナーからの培養上清サンプル中のサイトカインレベルを、6つのヒトサイトカインIL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α及びIFN-γの同時解析のために注文製作したMilliplexmAPキットを使用して、24時間の時点で決定した。Luminex100BioRad;Hercules,CAでBioPlex解析を実行した。細胞性及び核蛋白質抽出物の調製:細胞を、10FBS及び1PSGを補充したRPMI培地中で、約5×105細胞/mlまで増殖させた。細胞を遠心分離し、新鮮な予め温めた培地中に再懸濁した。PMA、HRF及び/又はJNKiVを、指示された濃度で直ちに加えた。アッセイのための最終細胞密度は1×106細胞/mlであった。培養フラスコを、37°Cで加湿CO2インキュベーター中に保持した。それぞれの時点について、1mL細胞懸濁液を除去し、テーブルトップ遠心分離機中、最高速度で30秒間、直ちに遠心分離した。細胞ペレットを氷冷PBSの1mlで洗浄し、素早く再度遠心分離し、-80°Cで凍結させた。総蛋白質抽出物を調製するために、凍結細胞ペレットを氷冷RIPA緩衝液CellSignalingTechnology,Danvers,MA中に再懸濁させて、4°Cで40分間インキュベートした。サンプルを、この時間中に10分ごとに攪拌した。16,000gで10分間の遠心分離後に、蛋白質含有上清を注意深く取り出した。細胞性及び核蛋白質抽出物を得るために、NE-PER核及び細胞性蛋白質試薬ThermoFisher;Waltham,MAを製造業者の使用説明書に従って使用した。抽出物の蛋白質濃度を、BCA蛋白質アッセイキットThermoFisherを使用して決定した。簡単に言うと、2μlの総細胞性蛋白質抽出物及び5μlの核蛋白質抽出物を水と混合し、96ウェルプレート中で25μlの最終容量を得た。これに、混合し製造者の使用説明書に従って調製した染色試薬200μlを加え、37°Cで30分~1時間インキュベートした。595nmでの吸光度を、96ウェルプレートリーダーSynergyHT,BIO-Tek:Winooski,VTを使用して決定した。相対的NF-κB活性の直接的定量:核抽出物中のNF-κB活性を、ActiveMotif社Carlsbad,CAから入手したTransAM商標NF-κBファミリーELISAキットを用いて、製造者の使用説明書に従って定量した。細菌単離及び同定:血液寒天プレート上での数ラウンドのクローニングの次に、フェノール抽出物を使用して、単一クローンからの細菌染色体DNAを単離した。簡単に言うと、遠心分離により細胞をペレット状にして、クロロホルム:メタノール3:1中に再懸濁し、攪拌した。同じ容量のTRIS緩衝フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを添加し、GTC緩衝液を添加する前に、混合物を攪拌した。混合の後に、サンプルを攪拌し、9,000gで20分間遠心分離した。上部相を注意深く取り出し、イソプロパノールによってDNAを沈殿させて、70エタノールで洗浄し、真空遠心分離機中で15分間乾燥させて、精製水100μl中に再懸濁させた。プライマー対16SrRNAfor:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’配列番号4;16SrRNArev:5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’配列番号5を使用して16SrRNA遺伝子を増幅させた。これらと次のプライマーを、16SrRNAを配列化するために使用したMass16sF25’-CCCTAAACGATGTCTACTAGTTGT-3’配列番号6;MassRNA55’-TTCGGGCACAACCAAATCTCTTCG-3’配列番号7;及びMassRNA45’-GGCTCAACCTCCCAATTGCGATG-3’配列番号8。16SrRNA配列に基づいて、細菌をMassiliatimonaeNIHBLASTとして同定した。3つのヌクレオチドを除いては、単離されたHRFを生成するMassilia株の16SrRNA遺伝子は、遺伝子配列AY157759及びAY157761LaScolaら著,J.Clin.Microbiol.36:2847~52頁1998年にそれぞれ対応するMassiliatimonaeATCCBAA-701及びATCCBAA-703の配列と同一であった。細菌の成長:種々の供給源からの細菌を、5ヒツジ血液を含有するTSAII寒天プレート上で単離した。次いで細菌単離物を、10FBSを補充したRPMI1640培地中で成長させた。37°Cでの2日間のインキュベーション後、細菌をペレット状にし、RPMI培地中に再懸濁させて、光学密度OD600を8にして、小分けし、-80°Cで凍結させた。別に特記しない限り、Massiliatimonaeは、10FBSを補充したRPMI1640培地中で成長させた。典型的には、培地を凍結保存からのMassiliatimonaeで接種し、0.01のOD600にした。37°Cで48時間後に、培養を3,200gで遠心分離し、培養培地から細菌を分離した。細菌を新鮮な培地中に再懸濁させて、OD600を8とし、参照及び保存培養として使用するために凍結させた。次いで上清を10,000gで20分間遠心分離し、低蛋白質結合能力を有する0.2μmのPVDFフィルターを通過させることによって無菌化した。HRF活性を、CA5細胞中で潜伏性HIV-1感染を再活性化するその能力によって決定した。少なくとも60のCA5細胞中での6μlの再活性化感染の上清のみを、HRF特性を試験するために用いた。HFR特性評価:HRFの化学的性質を決定するために、培養濾液を含有する100μlのHRFを、プロテイナーゼK、トリプシン、DNアーゼ又はRNアーゼの異なる量で、37°Cで15分間処置した。酵素を、95°Cで5分間不活性化した。標準プロトコルを用いて、硫酸アンモニウム沈殿法によってHRFを濃縮した。簡単に言うと、HRF沈降のための最適な濃度を、20、40、60又は80w/vの最終濃度に硫酸アンモニウムを添加することによって決定した。4°Cで14時間後、沈降した蛋白質を、16,000gで40分間の遠心分離によって回収した。ペレットをPBS緩衝液中で再構成させた。上清からの硫酸アンモニウムと沈降した蛋白質を、製造元の推薦に従って、3kDa分子量カットオフメンブレンMicrocon,Milliporeを通過させることによって除去した。サンプルの75の容量がフィルターを通過した時点で、新鮮な氷冷PBSを加えた。この手法を4回繰り返した。潜伏的にHIV-1感染したCA5細胞は、HIV-1再活性化のいかなる兆候も示さず、細胞培養基中で5w/vまでの硫酸アンモニウムに耐性を示した。分子量カットオフMWCO濾過手法の結果として、細胞培養中の最も高い可能性のある硫酸アンモニウム濃度は濾過としての0.3であって、洗浄は256倍の希釈をもたらした。10mlの細菌培養濾液から60w/v硫酸アンモニウムによって、蛋白質が沈降した。ペレットを250mlのPBS中に再懸濁させた。上記のように、硫酸アンモニウムをMWCO濾過により除去した。ペレットを250mlのPBS中に再懸濁させた。BCA蛋白質アッセイキットThermoFisherを用いて、製造業者の推薦に従って、蛋白質濃度を決定した。次いで、標準プロトコルにより、10のポリアクリルアミドゲル上で、15μgの蛋白質を分離した。結果細菌が分泌する新規HIV-1再活性化蛋白質の同定:最初の時点で未知の細菌の細胞培養上清濾液中の蛋白質HIV-1再活性化活性を同定した。その中でGFP発現が、HIV-1発現の直接的かつ定量的マーカーとしての役割を果たす潜伏的HIV-1感染レポーターT細胞系へのこの培養上清の添加Duvergerら著,J.Virol.83:3078~93頁2009年の際に、HIV-1再活性化の高レベルが観測された。フローサイトメトリーFSC/SSC解析によって見られるような細胞生存率に及ぼす影響は観測されなかった図1A。この細菌をクローンし、血液寒天プレート上で単離し、16SrRNAが、この細菌をMassiliatimonaeと同定した1,400塩基対bpまでにわたる99を超える配列相同性;図2A。単離されたMassiliatimonaeは、株名称HRFで、ATCCにより2010年5月18日に寄託された。この株は、ATCC受付番号PTA-10969と命名された。単離された細菌は、Luria-BertaniLB,HartmanDeBondHdB又はブレイン-ハートインフュージョン培地中で成育しない。後者はMassiliatimonaeのための推薦された成育培地である。ATCCで寄託されているMassiliatimonae株のいくつかは、HIV-1再活性化能を全く生み出さないか、又は非常に低いHIV-1再活性可能を生じるかのいずれかであり、これは、蛋白質を培養上清中に分泌するためのこれらの株の全体の減少した活性に関連している図2C。HRF活性は、クロロホルム及びアセトニトリル沈降によって、上清から取り除かれることが可能であった。HRF活性は、40を超える硫酸アンモニウム溶液中で沈降し、水性溶液中で完全に再構成され得た。HRF活性は、トリプシン及びプロテイナーゼK消化に感受性であった図3A。DNアーゼ又はRNアーゼによる上清の処置は、HRFのHIV-1再活性化能力を阻害しなかった図3B。まとめると、これらのデータは、HRFがポリペプチドであることを示唆していて、サイズ排除HPLC及び分子量サイズ排除濾過によって決定されたように、このポリペプチドは、50~100kDの範囲の分子量を有する図3C。潜伏性HIV-1感染に及ぼすHRF効果の初期特徴:先に開発された4種のテストされた潜伏感染レポーターT細胞系において、HRFが潜伏性HIV-1感染を効果的に再活性化することが確認された図1BDuvergerら著,J.Virol.83:3078~93頁2009年;Jonesら著,AssayDrugDev.Technol.5:181~9頁2007年;Kutshら著,J.Virol.76:8776~86頁2002年。他のグラム陰性細菌、例えば緑膿菌又は大腸菌の培養からの培養上清は、これらの細胞系に及ぼす再活性化効果を有さなかった。細菌培養濾液のポリミキシンBでの処置又はポリミキシンB-アガロースカラム上でのエンドトキシン除去によって立証されたように図4A、再活性化は、濃度依存的様式で起こり、任意のエンドトキシン汚染によって誘発されなかった。更に、HRFが、潜伏的にHIV-1感染したレポーターT細胞系及び単核細胞レポーター細胞系THP89GFPにおける潜伏性HIV-1感染を再活性化するがKutschら著,J.Virol.76:8776~86頁2002年、リポ多糖、プロトタイプエンドトキシンは、潜伏的にHIV-1感染した単核細胞THP89GFP細胞におけるHIV-1感染だけを再活性化した図4B。単離されたMassiliatimonae株は、他の細菌例えば、緑膿菌とは対照的に、T細胞培養を過成長させず、細胞によって大抵は排除された。共培養においては、1×106個の潜伏感染T細胞の集団のうちのわずか500個ほどの少ない細菌がHIV-1再活性化を誘発したが、一方では25倍を超える細菌が、T細胞培養の生存率を阻害しないままであった図5。HRFがNF-κB活性スパイクを誘発する:HRFは、TNFα又はPMAのそれと匹敵する効力で、潜伏性HIV-1プロウィルスを活性化した。再活性化動態は、TNF-αのそれと同様であり、PMAによる刺激に続いて見られる再活性化動態よりは迅速性で劣った。しかしながら、これらの非治療薬剤とは対照的に、HRFは、細胞培養中で細胞毒性がはるかに低く、300を超える治療指数を示した。NF-κB経路は、HIV-1活性化にとって重要であると認識されているために、NF-κB活性化を誘発するためのHRFの能力が検討された。HRFが、NOMIレポーターT細胞中の一体化されたLTR-GFP構造のTat非依存性活性を刺激する能力を有することが初めに決定された。これらの細胞において、TNF-αとPMAの双方ともに、潜伏感染細胞における有効なHIV-1再活性化を誘発するために必要な濃度に相関する濃度で、一体化されたLTR-GFP構造のTat非依存性活性を刺激した。NOMI細胞において、HRFは、GFP発現での適度な増加を生み出し、これは、潜伏感染T細胞でのHIV-1再活性化を誘発するために要求されるHRF濃度を超えるHRF濃度でのみで観察された図6B。更に、HRFは、NF-κB応答性IL-8-又はTNF-α-プロモーター、HIV-1LTR-GFP構造及び293T細胞にトランスフェクトされた3つのコンセンサスNF-κB部位の制御下にあるGFP構造が存在する構造によって駆動される弱いGFP発現を誘導したChoiら著,Mol.Cell.Biol.22:724~36頁2002年;Ochsenbauer-Jamborら著,Biotechniques40:91~100頁2006年。対照として、全てのプロモーターは、TNF-αによって効果的に誘導された。TNF-α及びHRFのいずれも、NF-κB応答性要素を欠如するネズミ幹細胞ウィルスLTRの制御下で構造のGFP発現に影響を及ぼさなかった図6C。これらの機能的結果とは対照的に、分子レベルでの強力かつ速い動態によるHRFは、NF-κBp50及びp65活性化を誘導した。Jurket細胞中のHRF仲介NF-κB活性化は、PMA刺激と比較した場合、p50については3倍までの増加の大きさ、並びにp65についても3倍までの増加の大きさを有した。しかしながら、親型JurkatT細胞中のHRF誘導NF-κB活性は、PMA刺激NF-κB活性化と比較して、持続性で劣った図7。持続性NF-κB活性化の欠如は、なぜ細胞性プロモーターだけが弱く誘導されるかの理由を、及びなぜHRFがTat非依存性HIV-1LTR活性の低いレベルを誘導するかの理由を説明することができた図6B。しかしながら、このような低レベルLTR活性でも、Tat発現を開始させるには十分であると思われる。初期低レベルTat生成は次いで完全なTat転写活性化を誘導し、これによって、完全なHIV-1発現への半永久的増加を促進する。TatはNF-κB活性を刺激することが報告されているために、このことがまた、持続性高NF-κB活性へと導くべきであり、これは、効果的なHIV-1再活性化のための必須条件として初期に定義されているWilliamsら著,J.Virol.81:6043~56頁2007年。実際に、HRF刺激に続く潜伏性CA5T細胞中での動的NF-κB活性プロファイルは、親型Jurkat細胞に初めの4時間に見られるものと同一であり、その後HRF誘導NF-κBp50活性は、上昇レベルで安定化し、このことはTat蛋白質発現に似た第2の活性化メカニズムの開始を示唆している。HRFはPBMC中でNF-κBを刺激するが、HRFはPBMC中でのサイトカイン誘導の適切なレベルを促進することに失敗する:PBMC中での潜伏性HIV-1感染の再活性化に着眼した任意の刺激的アプローチに関する重要な問題の1つは、HIV-1活性化が高サイトカイン血症へと強力に導くことが予想されるサイトカイン発現の誘導から切り離し得るかどうかという疑問である。これをテストするために、HRF刺激が、Jurkat細胞中で観察されたNF-κB活性の同じ高ピークを誘導することが初めに決定された。実際には、初代T細胞培養を活性化するために通常使用される植物レクチンであるPHA-Lと比較する場合、HRFは、Jurkat細胞で見られるものに匹敵するような図7、非常に高いが短い寿命のNF-κBp50及びp65活性ピークを誘導した図8A。飽和HRFレベルの存在下でのPBMCにおけるHIV-1複製は、感染後5日間のHIV-1複製レベルを追跡する実験で顕著には増加しなかった。しかしながら、PBMCのHRF刺激がNF-κB活性を誘導する一方で、HRFは炎症誘発性サイトカイン分泌IL-8、TNF-α、及びIFN-γの有意なレベルを誘導しなかった図8C。これらのデータは、プロモーター構造を使用する結果図6Cを立証し、並びにHRF刺激が最小の細胞性プロモーター活性化のみをもたらすことを示唆している。実施例2:HIV-1再活性化剤の組み合わせ:ダクチノマイシンが、再活性化のための潜伏性HIV-1感染を刺激する。材料及び方法細胞培養、プラスミド及び試薬:全てのT細胞系を、2mMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、及び10熱不活性化ウシ胎児血清で補充されたRPMI1640中に維持した。潜伏感染J89GFP細胞、CA5T細胞、及びEF7T細胞は、先に記載されているDuvergerら著,J.Virol.83:3078-93頁2009年。ウシ胎児血清FBSは、HyCloneLogan,Utahから入手し、使用されるFBSバッチがHIV-1再活性化を同時に誘発しないことを確認するために、潜伏感染細胞のパネル上でテストしたDuvergerら著,J.Virol.83:3078-93頁2009年;Kutschら著,J.Virol.76:8776-86頁2002年。フォルボールエステル13-フォルボール-12-ミリステートアセテートPMA、ラバッカマイシン及びオキサリプラチンは、SigmaSt.Louis,MOから購入し、一方組換え体ヒトTNF-αは、RDSystemsMinneapolis,MNから入手した。ダウノルビシン、α-アマニチン、IRCF-193及びカンプトテシンは、CalbiochemEMDChemicalstenGibbstown,NJから購入した。5,6-ジクロロ-β-ドリボフラノシルベンズイミダゾールDRBは、ALEXISBiochemicalsSanDiego,CAから購入した。RFPバーコード化J89GFP細胞集団の生成のために、レトロウィルスMSCV-DsRedExpressプラスミドを用いた。J2574レポーターT細胞:J2574レポーターT細胞を、その中でHIV-1LTRがGFPの発現を制御するHIV-1レポーター構造p2574で、JurkatT細胞をレトロウィルス形質導入することによって生成した。HIV-1LTRとGFP遺伝子は2,500塩基対bpスペーサー要素で分離されている。293T細胞をp2574でトランスフェクトし、gag-pol-rev-tatをトランスに供給することによって、レンチウィルス粒子を生成した。VSV-Gをウィルスのエンベロープの蛋白質として使用した。Jurkat細胞のレンチウィルス形質導入に続いて、GFPを同時に発現した全ての細胞を、細胞選別法によって取り除いた。次いでGFP陰性集団をPMAで活性化し、誘導可能なLTR-GFP-LTR統合事象が存在すると思われる全ての細胞を同定した。刺激後にGFP陽性に転じた細胞を、細胞選別法によって再度選択した。この集団におけるGFP発現は、GFP陰性レポーター細胞の集団を数日間放置した後に自然に無くなった。この集団についての創始細胞の量が、50,000を超える個々の統合事象を示すように計算される。グリセロール勾配沈降分析:1,000万個のJ89GFP又はCA5T細胞を未処置のまま残すか、又は0.004μg/mL、0.01μg/ml又は1μg/mLのダクチノマイシンで18時間又は1時間それぞれ処置した。細胞を冷PBSで2回洗浄し、次いで細胞溶解緩衝液0.5TritonX100、20mMのHEPESpH7.9、150mMのNaCl、20mMのKCl、2mMのMgCl2、1mMのDTT、0.2mMのEDTA、及びプロテアーゼインヒビターカクテルP8340;SIGMA中、氷上で30分間、細胞溶解し、続いて14,000rpmで10分間遠心分離した。蛋白質溶解物の同一量を、SW-Ti55ローターBeckmanCoultertenMiami,FLの溶解緩衝液中、45,000rpmで16時間、5mlの10~45のグリセロール勾配で分画した。分画物を10SDS-PAGE上で分割し、フッ化ポリビニリデン膜に移した。ウェスタンブロット法に使用された抗体は、それぞれウサギ抗-Cdk9sc-484;SantaCruzBiotechnology;SantaCruz,CA及びウサギ抗-HEXIMIab25388;Abcam;Cambrige、MAであった。フローサイトメトリー:細胞培養中の感染レベルを、GFP発現のフローサイトメトリーFCM解析によって監視した。FCM解析を、GUAVAEasyCyteGUAVATechnologies,Inc.;MilliporetenBillerica,MA及びBDFACSCalibur又はLSRIIBectonDickinson;FranklinLakes,NJで実施した。細胞選別実験を、FACSAria商標FlowCytometerBectonDickinsonを使用して実施した。データ解析を、CellQuestBectonDickinson又はGUAVAExpressGUAVATechnologies,Inc.のいずれかを使用して実施した。高スループット薬剤スクリーニング:FACSCaliburフローサイトメーターと組み合わされたHyperCytオートサンプラーを使用して、HTSデータ取得を、図1に記載されたように実施した。統計的に有意なデータ解析を実行するために、十分に高い細胞計数を確実にするように、ライフゲート内での2,000計数までの取得にシステムを調節した。このアッセイは、PMAを活性化剤として用いる、0.83のZ因子によって特徴付けられる。10ng/mlのPMAを用いての3つの集団についての最高に達成可能なHIV-1再活性化レベルは、90±3であった。HyperView商標DataAnalysisSoftwareIntellicyt;Albuquerque,NMを用いて、データ解析を実施した。ヒットの判定は、自己定義されたカラーコードによってHIV-1発現レベルでの変化を示すようプログラムされているヒートマップを使用して、可視的に実行され得る。HyperViewによって発生したデータを、統計的解析のために、SpotfireTIBCO;Somerville,MA又はエクセルマイクロソフト社;Redmond,WAに移した。薬剤スクリーニングの目的のための化合物プレートを、BioTekPrecisionプラットフォームBioTek,Winooski,VTを使用して、親型80,000の化合物ライブラリーChembridge;SanDiago,CAから生成した。更に、既知の分子機能を有する薬剤/化合物の研究所内収集も使用した。結果薬剤スクリーニングアッセイ:高品質高スループット薬剤スクリーニングHTSは、インビボでの治療標的を96ウェル以上のプレート系アッセイフォーマット中に限定する主要な要素を圧縮する。この場合、単一の化合物に対して優れたHIV-1再活性化能力を有する薬剤の組み合わせを直接的に同定するために、HTSが開発された。同定される薬剤の組み合わせは、モジュレーター化合物及び温和なアクチベーターからなるものに着眼した。弱いヒットでも検出するために、フローサイトメトリーは最も敏感に読み取り可能なものを選択され、並びにアッセイは、先に報告された潜伏的HIV-1感染J89GFPT細胞Kutshら著,J.Virol.76:8776~86頁2002年に基づいた。J89GFP細胞を、GFPレポーターウィルスで潜伏的に感染させた。潜伏性状態では、細胞はGFPを発現しないが、抗-CD3/CD28mAb組み合わせ、TNF-α又はPMAのような刺激による再活性化に続いて、細胞は、HIV-1発現の直接的かつ定量的マーカーとしてのGFPの高レベルを発現することを開始する。標的とする薬剤効果のための特異的シグナルとして用いられるGFPによって、J89GFP細胞は、レトロウィルスDsRedExpressRFPベクターで形質導入され、3つの別個のJ89GFP集団J89GFP、J89GFP-R、J89GFP-Rを生成し、これはRFPに基づく蛍光バーコードによって識別可能である図9B。JurkatT細胞中のMSCV-LTR駆動遺伝子発現は、長期間の細胞培養で安定性を維持し、蛍光強度での変化による活性化に応答しないために、レトロウィルス形質導入が、MSCV-LTRに基づくレトロウィルスベクターを使用して、RFPを発現するために実施された。後者の特性は、化合物添加に続く蛍光バーコードの完全性を維持した。モジュレーター化合物のためのスクリーニング:HTSアッセイの品質を限定するように設計された制限されたスクリーニング成果では、限定された活性を備える薬剤/化合物の広範な選択を保持する2,000の化合物ライブラリーを使用した。薬剤スクリーニングは、単一の96-ウェルプレート内の3つの所定のアクチベーターPMA、OKT3、及びHRFWolschendorfら著,J.Virol.8417:8712~20頁2010年の準閾値濃度によって、再活性のために潜伏性HIV-1感染を刺激することが可能であるモジュレーター化合物を同定するように設計した。最終化合物濃度を、我々の80,000の小さな化学的分子ライブラリーChembridgeから誘導された化合物について5μMで選択した。研究所内のライブラリーでの化合物濃度は、それぞれの化合物の既知の有効濃度に従って変化した。モジュレーター化合物スクリーニングについて、1×105/ウェルのJ89GFP、J89GFP-R及びJ89GFP-R細胞のいずれかを保持する3つの個々の96-ウェルプレートを調製した。化合物を個々のウェルに装填し、6時間後に、個々のプレートをアクチベーターとしてのPMA、OKT3又はHIV-1再活性化因子HRFの準最適濃度のいずれかで刺激した。それぞれのアクチベーターの濃度を、それ自体による最小HIV-1再活性化効果を有するか又はHIV-1再活性化効果を全く有さないように調節した。化合物の添加から24時間後に、ロボットのプラットフォームを用いて、3つの対応する個々の96-ウェルプレートを合わせた。このプレートを、時間分解データ取得が可能であるHyperCyt高スループットオートサンプラーを使用して、直ちに高スループットフローサイトメトリー解析にかけた図9A。このセットアップにおいて、個々のサンプルについてのデータは、単一ファイルとして収集されず、時間分解データとして収集された。個々のデータセットの分離は、特殊化された解析ソフトウェアHyperView登録商標DataAnalysisSoftwareを使用して達成された。サンプルの細胞密度及び要求された事象の量の関数として、この技法は非常に高速で即時の多重パラメータ解析を可能にする。確立されたRFPバーコードは、高スループットを達成するためのFACSCaliburフローサイトメトリーと一体化されたNyperCytオートサンプラーを使用する単一解析用ランで、ウェル当たりの数個の薬剤組み合わせの試験を引き続き可能にする。実験のセットアップでは、HTSフローサイトメトリーを蛍光バーコードと組み合わせることによって図9B、集団当たり2×103細胞が取得される場合、1つの96-ウェルプレート又は288の薬剤組み合わせが8分以内で解析される。以下のパラメータが、主要薬剤スクリーニング中に、各プレートで決定された:各集団についてのHIV-1転写活性、ベースラインGFP発現における化合物誘導の変化、個々の蛍光痕跡によって特性化されたような各細胞集団の細胞密度抗増殖化合物効果、及びFSC/SSCプロットにおけるライフゲート解析によって決定されたような全体の細胞生存率化合物毒性。96-ウェルサンプルプレートの結果が、図9Cに示されている。このシステムでのフローサイトメトリーに基づく薬剤スクリーニングの主要な利点は、使用された化合物での重度の毒性にもかかわらず、的確な効果が敏感に検出されることである。RFPバーコードによって決定される1つの集団内の活性感染GFP陽性に対する潜伏性GFP陰性が存在する細胞の比を決定することによってヒットが同定され得るために、アッセイは、解析される細胞の量に大きく非依存性となった。的確な効果は、大容量の化合物毒性の存在下においても検出された。ダクチノマイシンが、有効な再活性化のために潜伏性HIV-1感染を刺激する:最初に限定された2,000の化合物スクリーニング中に、合計で13のモジュレーター化合物が同定された。これらの化合物の80の調節活性が、確認分析によって確かめられた。興味深いことに、HIV-1再活性化を直接的に誘発した先の薬剤スクリーニングで同定された化合物は、細胞毒性副作用の発生に関連する濃度で、ほとんどが排他的にそれらの活性を及ぼした。驚くべきことに、この薬剤スクリーニングで同定された化合物のいくつかは、いかなる細胞毒性副作用も不在の下で、それらの刺激活性を及ぼした。HIV-1潜伏性は、限定された分子標的を提供せず、並びに薬剤スクリーニングが表現型での変化に基づいたために、それぞれの同定されたヒットについての作用のメカニズムは、個々に決定されねばならなかった。本明細書に記載されているように、強力なモジュレーター活性を有する同定されたヒットの1つのダクチノマイシンは、潜伏性HIV-1感染へのその刺激効果を及ぼした図10。潜伏感染対照細胞に対しては、ダクチノマイシンは、それ自体によるHIV-1再活性化能力を表さなかった。しかしながら、アクチベーターここではTNF-αの準最適濃度との組み合わせで、それは再活性化のための潜伏性HIV-1感染を強力に刺激した。活性化刺激の添加の前のダクチノマイシンについての前処置期間の至適処置期間を決定した。この目的のために、ダクチノマイシンを、潜伏的にHIV-1感染した細胞とJ89GFPT細胞に2、6、又は18時間添加した。次いで細胞を、TNF-αの準最適濃度で刺激した。この実験は、最適な前処置時間は、再活性化刺激の添加前の18時間であることを示した。ダクチノマイシンの最適濃度を同定するために、CA5T細胞を、ダクチノマイシンの漸増濃度0.0001及び1μg/mlで前処置し、次いでそれを未処置のまま放置するか、又はHRF又はTNF-αの準最適濃度で刺激した。HRFによる刺激についての代表的結果が図3に示されている。選択されたHRF濃度は、それ自体による最小のHIV-1再活性化効果を有するバックグラウンドにわたって15再活性化。アクチベーター添加後24時間に、細胞生存率を同時決定することが可能なフローサイトメトリー解析を用いて、HIV-1再活性化のレベルをGFP陽性細胞のパーセンテージとして決定した。この実験は、両T細胞系で、ダクチノマイシンは、約4ng/ml3.18nMの濃度で、潜伏性HIV-1感染に対するその最適なプライミング効果を及ぼし、このプライミング効果は、0.5ng/mlの低い濃度でも観測された。最適前処置時間は18時間であった。最大再活性化効果は、刺激後48時間に見られた。TNF-α又はPMAの低濃度が再活性化剤として使用された場合に、ダクチノマイシンのプライミング効果がまた観測された。ダクチノマイシンがその的確な薬剤効果を及ぼす1つの機能は、DNAインターカレーションである。このために、ダウノルビシン、レベッカマイシン、オキサリプラチン又はアマサクリンのような他のDNAインターカレーターの潜伏性HIV-1感染に及ぼす効果をテストし、ダクチノマイシンによって及ぼされる潜伏性HIV-1感染に対するプライミング効果が、DNAインターカレーターとして作用するためのそれ自体の能力に関連しているかどうかを決定した。DNAインターカレーターをCA5T細胞上に滴下し、HRFの準最適化用量による再活性化の誘発前に、種々の時間でインキュベートした。この実験は、この効果はダクチノマイシンに特異的であり、他のテストされたDNAインターカレーターによって再現されなかった18時間の前処置でのダウノルビシンについてのデータは図11Bに示されている。このデータは、DNAインターカレーションが、再活性化のために潜伏性HIV-1を刺激するためにダクチノマイシンによって必要とされる作用の主要モードであることは示唆していない。ダクチノマイシンの第2番目に報告された阻害的機能は、RNAPIIを遮断するその能力であり、すなわち、DNA中に挟まるためのその能力に関連すると思われる活性である。したがって、転写インヒビターであるα-アマニチン、IRCF-193、カンプトテシン、又は5,6-ジクロロ-β-D-リボフラノシルベンズイミダゾールDRBを、再活性化のための潜伏性HIV-1感染を刺激するそれらの能力についてテストした。無効な前処置時間によって、可能性のある化合物の効果が見落とされないことを再度確実にするために、全ての実験を、2時間及び18時間の前処置時間を用いて実施した。いずれのインヒビターも潜伏性HIV-1感染にプライミング効果を及ぼさなかった。DRB及びα-アマニチンについてのデータが図11C及び11Dに示されている。転写インヒビターについて予想されたように、いずれかの薬剤の高濃度が、HRF又はTNF-αによって誘発されたHIV-1再活性化を阻害することが確認され、並びにこの阻害活性は、細胞性転写機構の一般的阻害によって誘発される可能性がある細胞毒性の高レベルと相関した。高濃度例えば、10ng/ml以上でのダクチノマイシンはまた、RNAPIIインヒビターとしてのその機能と一致している、HIV-1発現及び再活性化のインヒビターとしての作用を開始することに注目すべきである。この効果は、薬剤毒性が発生時に観察され、これらのダクチノマイシンの濃度がまた、一般的転写に影響を及ぼすことを開始することを示唆している。図11A参照。活性HIV-1感染へのダクチノマイシンの影響:潜伏性HIV-1感染事象を再活性化することによるHIV-1病原巣の根絶は、全ての新規の感染を防止するであろう治療条件下で達成されなければならない。このことは、HIV-1再活性化剤の適用中に侵入抑制因子又は一体化抑制因子での標準ARTの増強によって達成され得る可能性が高い。それでも、新規の感染の危険性を最小にするために、活性HIV-1感染を増強させないHIV-1再活性化薬剤を開発することは有益である可能性が高い。活性感染でプライミング効果が認められないことを確証するために、ダクチノマイシン及び一連の他のDNAインターカレーターダウノルビシン、レベッカマイシン並びに転写インヒビターICRF-193、DRB、α-アマニチンの効果を、活性HIV-1感染でテストした12図。この目的のために、それぞれの化合物を、2種の慢性的に活性感染したT細胞系JNLG35及びJNJG44に、関連する濃度の範囲にわたって滴下した。これらのクローン細胞系は、GFPレポーターウィルスに感染している。化合物の添加後48時間に、HIV-1転写に及ぼす各化合物の効果を、GFP平均チャンネル蛍光強度MCFを定量するフローサイトメトリー解析によって決定した。ダクチノマイシンは、HIV-1再活性化に関連する濃度で、活性感染を増強せず、むしろ活性感染を阻害した図12A。興味深いことに、HIV-1再活性化を誘発しなかったいくつかの薬剤が、DNAインターカレーターのダウノルビシン又はレベッカマイシンのように、活性HIV-1転写を増強した図12B及び12C。これは、報告されたNF-κB活性を刺激するための能力の結果である可能性が高い。いずれの場合も、テストされた転写インヒビターの効果は、細胞毒性効果の不在下で顕著であった。要約すると、これらのデータは、ダクチノマイシンが、活性HIV-1感染を増強させることなく、HIV-1再活性化のためのそのプライミング効果を達成したことを立証した。ダクチノマイシンの提案されたプライミング効果が、活性HIV-1発現に及ぼす観察された効果を有するDNAインターカレーターのような又は転写インヒビターのようなものであるという兆候はないために、これらのデータは、ダクチノマイシンのプライミング効果が、作用の異なるメカニズムによって達成されるものであることを更に示唆した。潜伏性HIV-1感染を制御する転写干渉効果へのダクチノマイシンの潜在的影響:宿主遺伝子の転写方向に対する一体化された潜伏性ウィルスの配向のセンスを観察し、配向が、再活性化のために潜伏性感染を刺激するダクチノマイシンの能力に影響を及ぼすかどうかを決定した。潜伏的にHIV-1感染したCA5T細胞において、ウィルス及び宿主遺伝子を同一の転写方向で配向し、一方EF7細胞では、ウィルスを宿主遺伝子中に、逆転写方向で一体化させた図13A及び13B。図13に示されるように、それぞれの一体化シナリオで、ダクチノマイシンはそのプライミング効果を及ぼし、このことは、このプライミング効果が、潜伏性感染の制御に追加し得る転写干渉効果によって起こる可能性が低いことを示唆している。このデータは、ダクチノマイシン処置が、直接的LTR活性化又は促進された伸長効力に導くことを、むしろ示唆した。ダクチノマイシンは、潜伏性HIV-2感染にプライミング活性を及ぼす:次に、プライミング効果がHIV-1に特異的であるかどうか又は潜伏性HIV-2感染に対するプライミング効果があるかどうかを決定するために、潜伏性HIV-1感染について観察されたプライミング効果を検討した。潜伏性HIV-2感染を刺激するダクチノマイシンの能力を決定するために、GFPレポーターT細胞の潜伏的にHIV-2感染した集団をテストした。簡単に言うと、潜伏性HIV-2感染集団を作り出すために、J2574レポーター細胞をHIV-27312Aで感染させて、蛍光活性化細胞選別法を用いて、活性的に感染したGFP陽性細胞を除去することによって、潜伏的HIV-2感染細胞の集団を生成した。残存するGFP陰性集団では、PMA刺激によって明らかにであるように、90を超える細胞が潜伏感染ものであった。ダクチノマイシンは、2~8ng/mlの範囲で、再活性のために潜伏性HIV-2感染を効果的に刺激した図14。対照集団におけるバックグラウンド活性感染は1であり、更にHRFの準最適用量の添加は、細胞の10でHIV-2再活性化をもたらした。潜伏的HIV-2感染細胞集団の共刺激は、90に至る再活性化レベルをもたらした。これらのデータは、ダクチノマイシンが、HIV-1及びHIV-2の双方によって共用される転写制御の成分にプライミング効果を及ぼすことを示した。ダクチノマイシンは、HEXIM-1との不活性複合体からP-TEFbを放出させる:潜伏性HIV-1感染に及ぼすダクチノマイシンのプライミング効果が転写伸長のレベルで誘発されることをデータが示しているので、ダクチノマイシンがプラスの転写伸長因子P-TEFbを、HEIM-1とのその不活性複合体から放出させる能力を検討した。RNAPIIへのP-TEFb結合は、効果的な伸長を誘発する上で必須であり、HIV-1LTRと結合したRNAPII複合体でのP-TEFbの存在サイクリンT1及びCDK9の複合体が、効果的な転写伸長には必須条件であると立証されている。HEXIM-1との不活性複合体からのヘキサメチレンビスアセタミドHMBA仲介P-TEFb放出は、HIV-1再活性化を誘発する。HMBAは、潜伏的にHIV-1感染したCA5T細胞においてHIV-1再活性化のいくつかのレベルを誘発させたが、TNF-α、PMA又はHRFのようなアクチベーターと比較した場合、再活性化のレベルは低かった<40。3mMでは、15の細胞でHIV-1は再活性化され、9mMでは再活性化が35の細胞で誘発されたが、この濃度では、再活性化は化合物毒性の発生に相関した。それでも、準毒性濃度でのHMBAは、準最適活性化TNF-α濃度による完全な再活性化のための潜伏性HIV-1感染の刺激において、相対的に強力であった図15。HEXIM-1とP-TEFbとの複合体からのP-TEFbCDK9及びサイクリンT1との複合体の放出によって、ダクチノマイシンが再活性化のための潜伏性HIV-1感染を刺激するという見解をテストするために、潜伏的にHIV-1感染したJ89GFP又はCA5T細胞を、1.0μg/mlのダクチノマイシンで1時間、又は生理学的に最適な濃度である0.004μg/mlで18時間処置した。次いで、細胞溶解物をグリセロール勾配10~45上で分離し、P-TEFb/HEXIM-1複合体の組成での可能な変化を明らかにした。より高いグリセロール含量を有するグリセロール勾配分画で確認される、HEXIM-1との不活性複合体巨大複合体からのP-TEFbの放出は、より低いグリセロール含量を有する勾配分画で認められるより小さな複合体CDK9/CycT1へとシフトすることによって示される。それぞれの勾配分画を、SDS-PAGEゲル上で分離し、ウェスタンブロットにかけた。J89GFP細胞を使用するこれらの実験の結果は、図16に示されている。抗CDK9抗体での染色は、1μg/mlのダクチノマイシンで1時間のJ89GFPの処置は、PTEFbをHEXIM-1とのその複合体から定量的に放出させることを明らかにした。巨大複合体から小複合体までに存在するCDK9のシフトもまた、HIV-1再活性化のための最適条件を示す処置条件下0.004μg/mlのダクチノマイシンで18時間で検出された。抗HEXIM-1抗体を使用して、同様な結果が得られた。しかしながら、HEXIM-1に関しては、0.004μg/mlのダクチノマイシンで18時間の最適条件で、小複合体に対するシフトは観測されなかった。小複合体に対するシフトを誘導するための最小のダクチノマイシン濃度は、0.01μg/mlのダクチノマイシンであった。CDK9以外にも、対照細胞においても、HEXIM-1が小複合体分画中に見出され、このことは、遊離HEXIM-1が多量に存在していることを示唆し、このことは、P-TEFbを不活性化することによって、転写の制御因子としての役割を果たすという見解と一致する。潜伏感染CA5T細胞を使用して、同様の結果が得られた。要約すると、この実験は、ダクチノマイシンのプライミング効果が、P-TEFbとHEXIM-1と複合体からのP-TEFbの放出によって誘導され、これが潜伏性HIV-1LTRで見られる休止期のRNAPII複合体による転写の伸長に導くことを示唆した。"