共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、第一の発光部位と該第一の発光部位と異なる発光波長を有する第二の発光部位とを有する発光粒子を含む試料溶液を調製する過程と、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの前記第一の発光部位の光の強度と前記第二の発光部位の光の強度とを別々に且つ同時に測定して別々に光強度データを生成する過程と、前記光強度データに於いて単一の発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、前記第一の発光部位の光強度データと前記第二の発光部位の光強度データに於いて同時に発生した信号の各々に於いて、前記第一の発光部位の光の強度と前記第二の発光部位の光の強度との比率により単一の発光粒子を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記第一の発光部位が前記試料溶液中の少なくとも一部の発光粒子が共通に有する共通発光部位であり、前記第二の発光部位が前記発光粒子の各々を特徴づける固有発光部位であることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記第一の発光部位の光の強度と前記第二の発光部位の光の強度との比率により前記単一の発光粒子の種類が識別されることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記第一の発光部位の光の強度と前記第二の発光部位の光の強度との比率により前記単一の発光粒子の大きさが決定されることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記第二の発光部位の種類が前記発光粒子の種類によって異なることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記第二の発光部位の数が前記発光粒子の種類によって異なることを特徴とする方法。請求項6の方法であって、前記発光粒子の大きさが大きいほど単一の前記発光粒子の有する前記第二の発光部位の数が多くなることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、更に、前記同定された単一の発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。請求項1乃至8のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。請求項8の方法であって、更に、前記同定された単一の発光粒子の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。上記のFCS、FIDA等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカルボリュームの体積は、1fL程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、1nM程度若しくはそれ以上であり、1nMを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカルボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献6~8に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が1nM未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、FCS、FIDA等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、FCS、FIDA等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域以下、光検出領域と称する。の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子が微小領域内を横切るときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術以下、走査分子計数法と称する。によれば、測定に必要な試料がFCS、FIDA等の光分析技術と同様に微量例えば、数十μL程度であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、FCS、FIDA等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。ところで、上記の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術のうち、FIDAによれば、単一の発光粒子当たりの蛍光強度を見積もることができるので、その単一の発光粒子当たりの蛍光強度の大きさによって、発光粒子の特徴付けcharacterizationをし、その特徴付けに基づいて、試料溶液中の発光粒子の同定発光粒子の種類の特定若しくは識別或いは検出された発光粒子が如何なる発光粒子であるか若しくは何れの発光粒子であるかの確認若しくは決定をすることが可能である。例えば、互いに結合するか否かが未知の二つの粒子に蛍光標識を付加してFIDAを実行する場合、FIDAでは一体的に運動する発光粒子の蛍光強度の大きさが検出されるので、その蛍光強度の大きさから、二つの粒子がそれぞれ単体で存在しているか、結合体として存在しているかを決定できることとなる結合体の蛍光強度は、単体の蛍光強度の2倍となる。。しかしながら、FIDAの場合、既に触れた如く、単一の発光粒子当たりの蛍光強度は、時系列蛍光強度データのヒストグラムに対するフィッティングといった統計的処理を経て決定されるので、試料溶液中の観測対象となる発光粒子の濃度は、通常、1nM程度必要であり、それを大幅に下回る濃度の発光粒子については精度の良い結果を得ることは困難である。例えば、上記の如き二つの粒子の結合反応の検査に於いて結合作用が弱い場合或いは総粒子数が少ない場合には、結合体が僅かしか形成されず、結合体からの光の情報が統計的処理に於いて埋もれてしまう可能性がある即ち、検出されない場合がある。。かかるFIDAに対して、上記の走査分子計数法によれば、試料溶液中の観測対象となる発光粒子の濃度が、FIDAで良好に計測可能なレベルよりも大幅に低い場合でも、単一の発光粒子の発光強度の計測が可能である。走査分子計数法では、時系列の光強度データ上に於いて、単一の発光粒子が光の検出領域へ進入した際に放出する光に対応する山型又は概ね釣鐘状のプロファイルの光強度変化の信号を個別に検出するので、その際、各信号の強度を個別に計測すれば、単一の発光粒子からの発光強度が測定され、単一の発光粒子の発光強度に基づく発光粒子の特徴付け又は発光粒子の同定が達成できそうである。しかしながら、走査分子計数法に於いて計測される単一の発光粒子の発光強度の絶対的な値をそのまま用いて、発光粒子の特徴づけ及び発光粒子の同定を行うことは、困難である。実際の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域、即ち、コンフォーカルボリューム内に於いては、励起光の強度は、均一ではなく、通常、光検出領域の略中心を頂点とした釣鐘型の分布を有している。従って、光検出領域の走査しながらの光の測定過程に於いて、光検出領域内に於ける発光粒子の通過する場所によって、測定される発光強度が異なることとなるので、同一の種類の発光粒子からの発光強度の絶対値にはばらつきが生じ、また、発光強度の弱い粒子が励起光強度の強い部位を通過した際に得られる信号の強度と、発光強度の強い粒子が励起光強度の弱い部位を通過した際に得られる信号の強度との区別が付かないことになる。即ち、走査分子計数法に於いて測定された発光強度の絶対的な値は、発光粒子の固有の値にはならないので、単一の発光粒子の発光強度を発光粒子の特徴付け又は同定に利用しようとする場合には、新規な手法が必要となる。かくして、本発明の一つの課題は、FIDAで良好に計測可能なレベルよりも低い濃度の発光粒子の試料溶液中に於いて、単一発光粒子の発光強度に基づいて、発光粒子の特徴づけ又は発光粒子の同定を可能にする新規な光分析方法を提供することである。また、本発明のもう一つの課題は、走査分子計数法に於いて、個別に計測された単一発光粒子の発光強度を用いてその発光粒子に固有な量を決定し、粒子の特徴づけ又は同定を可能にする新規な光分析方法を提供することである。本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する方法であって、第一の発光部位と該第一の発光部位と異なる発光波長を有する第二の発光部位とを有する発光粒子を含む試料溶液を調製する過程と、前記の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度とを別々に且つ同時に測定して別々に光強度データを生成する過程と、光強度データに於いて単一の発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程と、第一の発光部位の光強度データと第二の発光部位の光強度データに於いて同時に発生した信号の各々に於いて、第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度との比率により単一の発光粒子を同定する過程とを含むことを特徴とする方法により達成される。かかる構成に於いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。。なお、本明細書に於いて、信号という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることとなる。そして、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、既に述べた如く、発光粒子からの光の強度は、その粒子の光検出領域中にて横切った場所に依存して異なり、発光粒子に固有の値ではないので、発光粒子の光強度の絶対値によって発光粒子を特徴づけることは困難である。そこで、本発明に於いては、発光粒子として、少なくとも二つの互いに発光波長の異なる発光部位第一及び第二の発光部位を有する粒子が準備され、かかる発光部位からの光が別々に計測され、第一の発光部位の光強度と第二の発光部位の光強度との比率が参照される。第一の発光部位の光強度と第二の発光部位の光強度は共に、通常、励起光強度の増減に連動して増減するので、単一の発光粒子に於いて、第一の発光部位の光強度と第二の発光部位の光強度の比率は、その発光粒子が通過する光検出領域の場所によらず、励起光強度の変化に対して不変的である。従って、第一の発光部位の光強度と第二の発光部位の光強度の比率は、発光粒子に固有の値であると考えられるので、かかる比率によって、発光粒子が特徴づけられ、その特徴づけに基づいて、発光粒子の同定が可能となる。上記の本発明の構成に於いて、試料溶液中に互いに種類、大きさ又は特性の異なる発光粒子、或いは、互いに識別されるべき発光粒子が存在する場合、第一の発光部位を試料溶液中の少なくとも一部の発光粒子が共通に有する共通発光部位とし、第二の発光部位を発光粒子の各々を特徴づける固有発光部位となるよう発光粒子が調製されてよい。かかる構成によれば、共通発光部位を有する発光粒子については、それらを共通発光部位からの光の強度と固有発光部位からの光の強度との比率によって互いに識別することが可能となる。なお、試料溶液中の観測されるべき発光粒子の全てに共通する共通発光部位が付与されてもよく、或いは、試料溶液中の観測されるべき発光粒子の全てに共通する発光部位が共通発光部位として採用されてよい。その場合、試料溶液内の観測されるべき発光粒子の全てを共通発光部位の光強度と固有発光部位の光強度の比率により互いに識別することが可能となり、種々の分析に於いて有利となる。上記の発光粒子の同定の態様としては、例えば、第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度との比率により単一の発光粒子の種類が同定されるようになっていてよい。即ち、発光粒子の種類によって、第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度との比率が異なるように発光粒子を調製しておくことにより、かかる強度の比率から信号の各々に対応する発光粒子の種類を特定することが可能となる。かかる構成は、例えば、発光粒子の種類によって発光粒子に於ける第二の発光部位の種類又は数が異なるようにすることによって達成されてよい。また、特に、第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度との比率によって、単一の発光粒子の大きさが同定されるようになっていてもよい。後に記載される実施例に於いて見られるように、大きさが大きいほど単一の発光粒子の有する第二の発光部位の数が多くなる形式の発光粒子の場合、第一の発光部位の光の強度に対して第二の発光部位からの光の強度が発光粒子の大きさによって相対的に変化するので、第一の発光部位の光の強度と第二の発光部位の光の強度との比率の増減に対応して、発光粒子の大きさも決定できることとなる。上記の構成に於いて、光強度データ上に於ける単一の発光粒子に対応する信号の検出は、信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有するパルス状の信号が検出されたときに、その信号が1つの発光粒子に対応する信号であり、その信号の発生期間に於いて1つの発光粒子が光検出領域に入ったと判定されるようになっていてよい。二つの光強度データ上で同時に発生した信号の検出は、例えば、第一の発光部位の光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間が第二の発光部位の光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間と重なるとき、それらの信号が同時に発生した信号として検出される態様にて、或いは、第一の発光部位の光強度データに於ける信号のピークの時間と第二の発光部位の光強度データに於ける信号のピークの時間との差が所定の値よりも小さいとき、それらの信号が同時に発生した信号として検出される態様にて実行されてよい。なお、上記の本発明の構成に於いて、同定された単一の発光粒子の数を計数するようになっていてよい粒子のカウンティング。その場合、同定された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。本発明によれば、個々の同時に発生した信号に対して発光粒子の同定が為され、これにより、発光粒子の種類、特性又は大きさ毎に別々に発光粒子の数を計数したり、或いは、濃度若しくは数密度を決定できるので、本発明の方法が種々の分子間相互作用、結合解離状態などの解析に有利に用いられることは理解されるべきである。また、上記本発明の構成に於ける光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、1つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、1つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度ブラウン運動による粒子の平均の移動速度よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が1つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、1つの発光粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と1つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、1つの発光粒子を、1つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性特に、拡散定数に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなくアーティファクトの無い状態で安定した状態にて、光の計測が可能である例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、FCS、FIDA等の場合と同様に微量1~数十μL程度の試料溶液にて計測及び分析が可能である。本発明の方法は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなどの溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。総じて、本発明の方法に於いては、単一の発光粒子が有する二つの発光部位から発せられた光の強度の比が、励起光強度が変化しても不変であり、即ち、発光粒子が共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出範囲内の通過する場所によらない発光粒子の固有の特性となるという点に注目し、走査分子計数法に於いて検出される単一の発光粒子の光の信号の各々に対して、前記の光強度の比率によって発光粒子の同定が為される。既に述べた如く、単一発光粒子からの光を個別に検出する走査分子計数法は、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されず、粒子の数密度又は濃度がFCS、FIDA等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能であるところ、走査分子計数法に於いて発光粒子の同定を可能にする本発明の方法は、FIDAにより分析可能であったレベルよりも低い濃度域にて、単一発光粒子の同定を可能するものであるということができる。また、本発明によれば、走査分子計数法に於いて単一の発光粒子の特徴づけ及び同定が可能となり、従って、種類、特性又は大きさが互いに異なる発光粒子の識別も可能となるので、極低濃度の発光粒子、或いは、比較的弱い分子間相互作用の観測及び分析などの走査分子計数法の応用範囲の拡大が期待される。例えば、試料溶液中の複数の種類の発光粒子の相互作用が弱く、それらの発光粒子の結合体が微量しか形成されない場合例えば、FIDAでは検出困難なレベルでも、結合体の存在の確認、カウンティング等に本発明の方法が有利に用いられるであろう。本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。光分析装置の構成本発明による方法は、基本的な構成に於いて、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。ただし、本発明の方法に於いては、特に、複数の互いに異なる波長帯域の光の測定が実行されるので、図1Aに模式的に例示されている如き、複数の互いに異なる波長帯域の光の測定が可能な装置が用いられる。具体的には、図1Aを参照して、光分析装置1は、光学系2~17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光Exが、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。なお、発光粒子を励起する光の波長によって励起光の波長が適宜選択できるように、図示の如く、光源2に於いて複数の発光源レーザーが設けられていてよい。観測される発光粒子の少なくとも二つの発光部位のための励起光の波長が異なる場合には、同時に複数の発光源から光が出射され、対物レンズ8へ導入される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1~数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域励起領域が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光Emは、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1~10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカルボリュームと称される。コンフォーカルボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aに於いて、一部の波長帯域の光が反射し、残りの波長帯域の光が透過する態様にて波長帯域により分割され、分割された光の各成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター14を透過してここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図1Cに模式的に例示されている如く、反射ミラー7の向きを変更するミラー偏向器17が採用されてよい。かかるミラー偏向器17は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器17は、コンピュータ18の制御の下、光検出器16による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよいコンピュータ18に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。。なお、図示していないが、対物レンズ8を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ図示せずには、観察するウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域光検出領域のみで光の放出があるので、ピンホール13は、除去されてよい。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系2~5が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。本発明の方法の原理発明の概要の欄に記載されている如く、本発明の方法は、端的に述べれば、少なくとも二つの互いに発光波長の異なる発光部位を有する発光粒子に於いて、かかる少なくとも二つの発光部位からの光の強度比が顕微鏡の光検出領域内での発光粒子の位置に依らないという原理に基づき、走査分子計数法に於いて、少なくとも二つの発光部位からの光の強度比により、発光粒子の特徴付けをして、発光粒子の同定を行うというものである。換言すれば、本発明の一つの実施形態は、走査分子計数法を改良するものであるということができる。以下、走査分子計数法及び本発明の方法の原理について説明する。1走査分子計数法の原理FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図9Aに模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度フォトンカウントが検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図9Bに描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号フォトンカウントが、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きFCS、FIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく走査分子計数法を提案した。走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構ミラー偏向器17を駆動して光路を変更し、図2にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間図中、時間to~t2に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際t1には、発光粒子から光が放出され、図2Bに描かれている如く有意な光強度Emのパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如きパルス状の信号有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。2.本発明による発光粒子の同定の原理上記の走査分子計数法が実行される実際の実験系に於いて、光検出領域に於ける励起光の強度は、一様ではなく、通常、光検出領域の中心をピークとして領域の縁に行くほど低減し、また、光検出領域からピンホールを通過して光検出器に到達する間に於いても、光検出領域の全域からの光の強度が一様に光検出器に到達するとは限らない。即ち、或る発光粒子の発する光又は光検出器で検出される光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって変化することとなるそのため、走査分子計数法では、典型的には、検出されたパルス状の信号の強度が発光粒子からの光として想定される有限の範囲内にあるときに、その信号が発光粒子からの光の信号であると判定される。。従って、例えば、二種類の発光粒子を観測する場合、それらの発光粒子の量子収率又は発光能同じ条件で発光される光の強度が互いに異なっていても、両者をそれらの光の強度の絶対値から区別することは困難である。しかしながら、既に触れたように、発光粒子が少なくとも二つの発光部位を有する場合、それらの発光部位の光検出領域内に於ける位置は、発光粒子の大きさが光検出領域に比して十分に小さければ、殆ど一致すると考えて良いので、それらの発光部位からの光の強度比は、顕微鏡の光検出領域内での発光粒子の位置に依らない。例えば、図3Aに模式的に描かれている如く、波長Iの光を発する発光部位αと波長IIの光を発する発光部位βとを有する発光粒子が、光検出領域の略中心を横切るときt1と、光検出領域の周辺近傍を横切るときt2とでは、図3Bに模式的に描かれている如く、各発光部位から発せられ検出される光の強度は、互いに異なることとなるが、波長Iの光の強度と波長IIの光の強度の比は、実質的に等しくなると考えられる。そして、かかる光の強度の比を参照すれば、発光粒子を同定し、或いは、発光粒子の種類の識別が可能となる。そこで、本発明に於いては、観測されるべき発光粒子に発光波長の異なる二つの発光部位を付加するか、或いは、観測されるべき発光粒子が本来的に有している発光部位を利用して、発光粒子上の発光部位のそれぞれから発せられる光の強度の比を参照することにより、その発光粒子の同定が試みられる。上記の発光粒子上の少なくとも二つの発光部位の光の強度の比を参照して発光粒子の同定をする態様によれば、種々の態様にて、互いに異なる発光粒子の識別が可能となる。例えば、図3Cに模式的に描かれている如く、波長Iの光を発する発光部位αと波長IIの光を発する発光部位βとを有する発光粒子aと、波長Iの光を発する発光部位αと二つの波長IIの光を発する発光部位βとを有する発光粒子bが存在するとき即ち、一方の発光粒子の一方の発光部位の数が他方の発光粒子の対応する発光部位の数と異なるとき、仮に発光粒子aが光検出領域の略中心を横切りt1、発光粒子bが光検出領域の周辺近傍を横切りt2、これにより、波長IIの光強度が略等しかったとしても、波長Iの光の強度と波長IIの光の強度の比は、発光粒子aと発光粒子bとの間で互いに異なるので、光の強度比を参照すれば、それぞれの信号が発光粒子aと発光粒子bのうちのいずれの信号であるかが判定できることとなる。そして、発光粒子a、bの信号の数を別々に計数することにより、それぞれの数密度又は濃度及びその他の情報を得ることが可能となる。また、別の態様として、例えば、図3Eに模式的に描かれている如く、波長Iの光を発する発光部位αと波長IIの光を発する発光部位βとを有する発光粒子aと、波長Iの光を発する発光部位αと波長IIの光を発するが発光部位βとは量子収率が異なる発光部位γとを有する発光粒子cが存在するとき即ち、一方の発光粒子の発光部位の種類が他方の発光粒子の対応する発光部位の種類と異なるときには、発光粒子が光検出領域のどこを横切ったとしても、それぞれの発光粒子の発光部位の光の強度比が互いに異なることとなる。従って、それぞれの信号が発光粒子aと発光粒子cのうちのいずれの信号であるかが判定可能であり、互いに区別して参照することが可能となる。そして、発光粒子a、cの信号の数を別々に計数することにより、それぞれの数密度又は濃度及びその他の情報を得ることが可能となる。上記の発光粒子の同定方法又は識別方法は、例えば、或る二つの粒子が互いに結合しているか否かを検査する場合結合解離反応の検出や、分子の大きさによって発光部位の数が変化する分子に於いてその分子の大きさを見積もる場合などに利用可能である下記の実施例1、2参照。なお、上記の本発明の手法を複数種類の発光粒子の識別に利用する場合には、観測対象となる発光粒子の少なくとも一部、好ましくは、全てに於いて、同一の発光部位が存在していると、光の強度比を算出して比較する際に有利である。従って、好適には、観測対象となる発光粒子の全てに共通の発光部位共通発光部位が付与されるようになっていてよい。そして、各発光粒子には、それぞれの発光粒子を同定するため、又は、その他の発光粒子から識別するために、固有の発光部位固有発光部位が設けられ、固有発光部位からの光の強度と、共通発光部位からの光の強度との比により、各発光粒子が特徴づけられ、同定され又はその他の粒子から識別されるようになっていてよい。また、図示の例では、単一の発光粒子上に2種類の発光部位が備えられた場合について説明されているが、単一の発光粒子が三種類以上の発光部位を有し、それらの発光部位からの光の強度比を用いて、発光粒子の特徴付けをして、発光粒子が同定されるようになっていてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。走査分子計数法の処理操作過程図1Aに例示の光分析装置1を用いた本発明の方法に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、1発光粒子を含む試料溶液の調製過程、2試料溶液の光強度の測定処理過程、及び3測定された光強度の分析処理過程とが実行される。図4は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。1試料溶液の調製本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識蛍光分子、りん光分子、化学生物発光分子が任意の態様にて付加された粒子であってよい。また、本発明の方法を実施する場合には、観測対象となる各粒子は、第一及び第二の発光部位、或いは、共通発光部位及び固有発光部位を有している必要がある。特に、上記の如く、観測対象となる各粒子に共通発光部位が設けられていると、検出された粒子を比較又は識別する際に有利であるので、観測対象となる各粒子には、共通発光部位として、任意の発光標識、例えば、蛍光色素が任意の手法で付与されるようになっていてよい。また、観測対象となる各粒子をそれぞれ同定し識別するための特徴付けのために、各粒子には、固有発光部位として、任意の発光標識、例えば、蛍光色素が任意の手法で付与されるようになっていてよい。なお、観測対象となる粒子が本来的に発光部位を有している場合には、かかる発光部位が共通発光部位又は固有発光部位として利用されてよい。重要なことは、観測対象となる発光粒子が発光波長の異なる少なくとも二つの発光部位を有し、後に説明される光測定に於いて検出された各波長の光強度から光の強度比を算出できるということである。観測対象となる粒子を如何に選択するか、或いは、観測対象となる粒子に如何に発光標識を付加するか、検出波長帯域を如何に選択するかは、実験の実施者により適宜選択されてよく、当業者に於いて、本発明の方法を実現する種々の発光粒子又は発光標識の組合せ及び検出波長帯域を選択でき、本発明の教示に従って、発光粒子の同定又は識別が行われる限り、如何なる場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。2試料溶液の光強度の測定本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動試料溶液内の走査を行いながら、複数の波長帯域にて別々に、即ち、第一及び第二の発光部位又は共通発光部位及び固有発光部位の発光波長について別々に、且つ、同時に光強度の測定が為される図4-ステップ100。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置図示せずに記憶されたプログラム試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測を開始する。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射される。特に、本実施形態に於いては、複数の波長帯域の光を検出するので、検出されるべき複数の波長帯域の光が発光粒子から放出されるよう光源2から出射される励起光の波長の選択が為される。なお、発光粒子上の各発光部位の励起光波長が互いに異なる場合には、複数の波長帯域のレーザー光が同時に出射されることとなる。一方、ミラー偏向器17は、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー7ガルバノミラーを駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。特に、本実施形態に於いては、複数の光検出器16の各々が、互いに異なる波長帯域の光を検出し、検出された互いに異なる波長帯域毎に時系列光強度データが生成される。また、典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎BINTIMEに、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行されることが好ましい。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本実施形態に於いて観測対象となる発光粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図5Aに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化発光粒子からの光を表す信号を特定することが困難となる。そこで、好適には、図5Bに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図5Cの上段に例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度拡散移動速度よりも速く設定される。具体的には、拡散係数Dを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Woの光検出領域コンフォーカルボリュームを通過するときに要する時間Δtは、平均二乗変位の関係式2Wo2=6DΔt...1から、Δt=2Wo2/6D...2となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度拡散移動速度Vdifは、概ね、Vdif=2Wo/Δt==3D/Wo...3となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10-10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10-3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sなどと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル典型的には、励起光強度分布と略同様となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。3光強度の分析上記の処理により試料溶液中の発光粒子の発光部位別の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、i各光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、ii検出された信号に於いて発光部位別の時系列の光強度データ上で同時に発生した信号同時発生パルスの検出、iii同時発生パルスに於ける強度比の算出及びiv発光粒子の濃度算出等の各種分析が順に実行される。i発光粒子に対応する信号の検出時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5Bに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、適宜設定される閾値Ioを超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:I=Aexp-2t2/a2...4であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイルバックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイルに対して式4をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。強度A及び幅aが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析に於いて無視されてよい。時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出及びカウンティングを行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ図5C、最上段検出結果未処理に対して、スムージング平滑化処理が為される図4-ステップ110、図5C中上段スムージング。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法例えば、隣接平均法、サビンスキーゴレイ法のアルゴリズム、パーセンタイルフィルタ法、FFTフィルタ法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度走査速度、BINTIMEに応じて適宜設定されてよい。次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号以下、パルス信号と称する。が存在する時間領域パルス存在領域を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算されるステップ120。時系列光強度データの時間微分値は、図5C中下段時間微分に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定されるステップ130。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ図5C下段釣鐘型関数フィッティング、釣鐘型関数のパルスのピーク最大値の強度Imax、パルス幅半値全幅w、フィッティングに於ける最小二乗法の相関係数等のパラメータが算出されるステップ140。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス型関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定されるステップ150。かくして、図6A左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図6A右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ130~150の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されるステップ160。特に、本実施形態に於いては、互いに異なる波長帯域の時系列光強度データの各々について、上記のステップ110~160が実行され、それぞれの波長帯域についての発光粒子に対応するパルス信号の検出が為される。なお、図示していないが、時系列光強度データの全域のパルス信号の探索中に、検出されたパルス信号の数を計数するようになっていてよい。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。ii同時に発生した信号の検出上記の如く複数の波長帯域の時系列光強度データ即ち、発光部位別の時系列光強度データに於ける発光粒子に対応する信号パルス信号の検出が完了すると、検出された信号のうちで、複数の波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号が検出されるステップ170。かかる検出は、具体的には、例えば、図6Bに例示されている如く、一方の波長帯域波長Iの時系列光強度データに於ける発光粒子に対応するパルス信号のピーク最大値の時点tp1と他方の波長帯域波長IIの時系列光強度データに於ける発光粒子に対応するパルス信号のピーク最大値の時点tp2との差ΔTが所定値を下回るとき、波長Iと波長IIに於いて同時に発生したパルス信号が発生したと判定する態様にて為されてよい。そして、かかる判定を時系列光強度データ上で順に繰り返すことにより、複数の波長帯域の時系列光強度データに於ける同時に発生したパルス信号同時発生パルス信号の全てが検出される。また、同時発生パルス信号の検出の別の態様として、一方の時系列光強度データに於ける信号の発生期間始点~終点と他方の時系列光強度データに於ける信号の発生期間始点~終点とが重複したときに、同時発生パルス信号が発生したと判定されてもよい。なお、本発明の方法に於いては、観測対象となる発光粒子は、基本的には、少なくとも二つの互いに発光波長の異なる発光部位を担持しているので、原理的には、全てのパルス信号は、同時発生パルスになるはずである。しかしながら、実際の実験系に於いては、色収差等の要因により、互いに波長の異なる励起光のCVを空間的に完全に一致させることは困難であるため、光検出領域に於いて、一つの波長の励起光のみが照射される領域が生じる場合があり、その場合には、一つの波長帯域の時系列光強度データのみにパルス信号が発生する。従って、上記の如く、同時発生パルスの個別の検出が為される。iii同時発生パルスに於ける強度比の算出上記の如く、同時発生パルスが検出されると、同時発生パルスの各々について、一方の波長帯域に於けるパルス信号の強度と他方の波長帯域に於けるパルス信号の強度との比率第一の発光部位の発光波長のパルス信号の強度と第二の発光部位のパルス信号の強度との比率、或いは、共通発光部位の発光波長のパルス信号の強度と固有発光部位のパルス信号の強度との比率が算出される。かかる比率は、例えば、各パルス信号のピークに於ける強度の比、或いは、各パルス信号の強度の積算値の比などであってよい。例えば、観測対象となる発光粒子に於いて共通発光部位と固有発光部位とが設定されている場合には、強度比率は、共通発光部位の発光波長帯域の信号のピーク強度Imax1と固有発光部位の発光波長帯域の信号のピーク強度Imax2とを用いて、Imax2/Imax1...5により与えられてよい。iv分析濃度の算出等ステップ180既に述べた如く、前記の信号強度光強度の比率は、発光粒子の光検出領域内での通過経路によらず、発光粒子の固有の値であると考えられるので、かかる信号強度の比率によって、発光粒子が特徴づけられ、その同定、即ち、発光粒子が予定された発光粒子であることの確認又はその種類の識別が為される。そして、信号強度の比率によって、又は、同定された結果によって、各信号を分類し、或いは、分類された信号毎にその数が計数されてよい。例えば、二つの粒子の結合反応を確認する実験に於いて、第一の粒子に共通発光部位と固有発光部位を付与し、第二の粒子に固有発光部位を付与しておいた場合、もし両方の粒子が結合すれば、同時発生パルス信号に於いて、両方の粒子の結合体に対応する信号の強度比率は、第一の粒子に対応する信号の強度比率の2倍になるので、強度比を比較することによって、結合体に対応する信号と、第一の粒子に対応する信号とを区別することが可能となり、二つの粒子が結合反応を起こした否かを確認することができる。そして、結合体に対応する信号数と、第一の粒子に対応する信号数とを比較すれば、結合反応の強さを評価することも可能である。また、別の態様として、例えば、核酸、重合性タンパク質又は凝集性タンパク質などの種々の大きさを有し得る分子等に於いて、大きさに応じて固有発光部位の数が増大するように分子を調製した場合、同時発生パルス信号に於いて、信号の強度比率は、分子の大きさと伴に変化するので、信号の強度比率を参照することにより、分子の大きさの見積もりや重合若しくは凝集の程度又は強さの評価が可能となる。ところで、時系列光強度データに於ける発光粒子の数密度又は濃度は、各発光粒子に対応する信号のカウント値信号数と、時系列光強度データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて決定可能である。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。また、既に触れた通り、複数の波長帯域の励起光を同時に照射する場合には、色収差等の要因により、各励起光の焦点領域を互いに完全に一致させることは困難であるため、同時発生パルスが発生する各励起光の焦点領域の重複領域の実効体積を算定することは更に困難となる。そこで、典型的には、発光粒子の濃度が既知の溶液参照溶液について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と参照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の発光粒子としては、好ましくは、各発光粒子と同様の波長特性を有する発光標識蛍光色素等であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度数密度Cの参照溶液について、その発光粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、Vt=N/C...6により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の発光粒子の濃度数密度cは、c=n/Vt...7により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係式6の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。特に、本発明に於いては、同時発生パルス信号に対応する発光粒子を観測するので、参照溶液として、観測される波長帯域の全てに発光波長を有する発光粒子の濃度が既知の溶液が準備され、光強度の測定により得られた時系列光強度データに於いて同時に発生した信号の検出及びカウンティングが実行され、そのカウント値と濃度とから光検出領域の通過した領域の総体積Vtが決定されてよい。かくして、上記の本発明の方法によれば、走査分子計数法に於いて複数の波長帯域の光測定により得られた信号の強度比を参照することによって、発光粒子の同定が可能となり、信号の強度比の変化に基づいて、試料溶液内の粒子の相互作用や大きさの変化等の情報が得られることとなる。なお、上記の方法によれば、FCS、FIDA等と同様に微量の試料溶液を用いて、FCS、FIDA等で良好な計測可能なレベル典型的には1nM程度よりも低い濃度数pM程度の発光粒子についての種々の情報が得られることは理解されるべきである。上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。二色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチドの検出実験本発明の方法に従って、一本鎖のオリゴヌクレオチドと二本鎖のオリゴヌクレオチドとの識別が可能であることを検証した。試料としては、図7A左に模式的に描かれている如き、5’末端に蛍光色素Alexa647を修飾し3’末端に蛍光色素TAMRAを修飾した配列番号1の塩基配列を有する31塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド1T-Aと、図7A右に模式的に描かれている如き、二本鎖のオリゴヌクレオチド2T-A1T-Aと5’末端にTAMRAを修飾した1T-Aの配列に相補的な配列番号2の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド1-Aとが会合してなるオリゴヌクレオチドとを調製した。2T-Aは、1T-Aと1-Aとを10mMTrisHCl5mMEDTA100mMNaClを含む緩衝溶液中にてそれぞれ1μMとなるよう混合し、混合した溶液を94°Cにて5分間に置いて熱変性させ、その後、室温に降温して、アニーリング処理することにより調製した。そして、1T-A及び2T-Aについて、それぞれを前記の緩衝溶液中に於いて約2nMにて含む溶液を別々に調製し試料溶液とした。なお、Alexa647は、633nmの励起光で励起すると、約650~705nmの蛍光を発する。一方、TAMRAは、543nmの励起光で励起すると、約550~620nmの蛍光を発する。本実施形態に於いては、Alexa647が共通発光部位に、TAMRAが固有発光部位に相当する。光の測定及び分析に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF-20オリンパス株式会社を用い、上記の2試料溶液の光強度の測定にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列光強度データフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、543nmのレーザー光と633nmのレーザー光とを用い、バンドパスフィルターを用いて、励起光543nm及び633nmに対して、それぞれ565-595nmと660-710nmの二つの波長帯域の光を別々に同時に測定し、励起光543nm及び励起光633nmのそれぞれに対する時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、15mm/秒とし、BINTIMEを10μ秒とし、各試料溶液について2秒間の測定を行った。光強度の測定後、上記の3i発光粒子に対応する信号の検出に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された各波長帯域の時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、ガウス関数に於けるピーク強度、パルス幅半値全幅、相関係数を決定した。そして、下記の条件20μ秒<パルス幅<400μ秒ピーク強度>1フォトン/10μ秒...A相関係数>0.95を満たすパルス信号のみを発光粒子1T-A、2T-Aに対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。次いで、励起光543nmのデータと励起光633nmのデータ上の発光粒子として判定されたパルス信号を比較して、パルス信号のピーク最大値の時刻の差が30μ秒以内となるパルス信号を同時に発生した信号同時発生パルス信号として判定して抽出し、各信号について、励起光543nmのデータ上の信号のピーク強度Imax2と励起光633nmのデータ上の信号のピーク強度Imax1との比Imax2/Imax1を算出した。図7Bは、上記の手順で得られた同時発生パルスについて、ピーク強度に対する同時発生パルスの発生数を示している。同図から理解される如く、1T-Aについての分布白棒と2T-Aについての分布黒棒とは、それぞれ、略釣鐘状となり、1T-Aのピーク強度比Imax2/Imax1の平均値は、0.73SD=0.22であり、2T-Aのピーク強度比Imax2/Imax1白棒の平均値は、1.52SD=0.50であった。即ち、2T-Aのピーク強度比は、1T-Aのピーク強度比の略2倍であり、ピーク強度比の分布は、発光粒子上のTAMRA固有発光部位の数に対応して、概ね量子化された。この結果に於いて、ピーク強度比が概ね0.8以下の信号が1T-Aに対応し、概ね1.5以上の信号が2T-Aに対応すると識別することができる。また、上記の結果は、1T-Aと1-Aとが会合して2T-Aが形成されたことも示している。かくして、本実施例によれば、本発明の方法に従って、発光粒子の種類によって固有発光部位の数を適宜選択し、個々の同時発生パルス信号の固有発光部位の光強度と共通発光部位の光強度との比を参照することにより、発光粒子の同定、特に発光粒子の種類の識別が可能であることが示された。二色の蛍光色素にて標識された核酸分子の大きさの検出実験本発明の方法により、種々の鎖長の核酸分子が識別できることを検証した。試料としては、5’末端に蛍光色素ATTO647Nが修飾されたDNAであって、配列番号3の塩基配列を有する鎖長が100bp、配列番号4の塩基配列を有する鎖長が200bpのもの、配列番号5の塩基配列を有する鎖長が400bpのもの、配列番号6の塩基配列を有する鎖長が800bpのもの、配列番号7の塩基配列を有する鎖長が1.5kbpのものをそれぞれ準備した以下、それぞれ、A100bp、A200bp、A400bp、A800bp、A15kbpと称する。。これらのDNAの調製に於いては、まず、上記の各DNAを、プラスミドpUC19を鋳型として、共通プライマーとして5’末端にATTO647Nを修飾した配列番号8の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、各鎖長のDNAA100bp、A200bp、A400bp、A800bp及びA15kbpについてのプライマーとして、それぞれ、配列番号9~13の塩基配列を有する未標識のオリゴヌクレオチドと、AmpliTaqGold登録商標とを用いたPCRにより産生した。次いで、WizardSVGelandPCRCleanUpSystemプロメガ社を用いてPCR産物から未反応のプライマーを除去し、バイオアナライザアギレント社を用いた電気泳動により、上記鎖長のDNAの有無及び濃度を確認した。各鎖長のDNAは、緩衝溶液10mMTris-HClpH8.0、5mMEDTA、100mMNaCl中にて10nMとなるよう溶解した後、10nMの蛍光色素SYTOXOrangeインビトロジェンInvitrogen社の存在下でDNA濃度が1pM、10pM、100pM及び1nMとなるよう希釈し30分以上室温に静置したものを試料溶液とした。なお、ATTO647Nは、633nmの励起光で励起すると、約665~700nmの蛍光を発し、SYTOXOrange以下、SYTOXO.は、543nmの励起光で励起すると、約550~630nmの蛍光を発する。特に、SYTOXO.は、DNAの塩基対の入り込むと蛍光強度が約500倍増大するインターカレータ型の蛍光色素であり、従って、図8Aに模式的に描かれている如く、DNAの鎖長が長くなると、DNA一分子当たりのSYTOXO.の結合数が増大し、従って、単位励起光量当たりの1分子当たりの発光量が増大することが期待される。本実施形態に於いては、ATTO647Nが共通発光部位に、SYTOXO.が固有発光部位に相当する。光の測定及び分析は、上記の各試料溶液について、実施例1と同様に行って、同時発生パルスを検出し、検出された同時発生パルスについて、SYTOXO.の信号励起光543nmのデータ上の信号のピーク強度Imax2とATTO647Nの信号励起光633nmのデータ上の信号のピーク強度Imax1との比Imax2/Imax1を算出した。下記の表1は、それぞれの濃度にて各鎖長のDNAを含む試料溶液に於いて、上記の手順により得られた同時発生パルス数を示している。表1に示されている如く、同時発生パルス数は、いずれの鎖長のDNAの試料溶液に於いても、溶液中のDNAの濃度と伴に増大した。このことは、各同時発生パルスがDNA分子に対応する信号であることを示している。なお、同一濃度に於いて、鎖長によって同時発生パルス数が異なるのは、鎖長が長いほど、核酸と結合するインターカレータの数が増加し、インターカレータ由来のパルスが捕らえやすくなるため、見かけの同時パルス数が増加するためである。図8Bは、DNAの各鎖長に於ける上記の各同時発生パルスのピーク強度比Imax2/Imax1の平均値をDNAの各鎖長に対してプロットしたグラフである。同図から理解される如く、ピーク強度比は、DNAの各鎖長に対して略比例した。この結果は、DNAの鎖長の増大と共にDNAの塩基対に入り込むSYTOXO.の数が増大し、これにより、各DNA分子に一つ付加されたATTO647Nの信号の強度に対するSYTOXの信号の強度の比が増大することを示している。即ち、この結果によれば、本発明の方法に従って、ピーク強度比を参照することにより、DNAの鎖長又は一分子の大きさを確認することができ、また、DNAの鎖長又は一分子の大きさに応じて、発光粒子の識別が可能であることが示された。かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の方法に従って、走査分子計数法に於いて単一の発光粒子の少なくとも二つの発光部位からの光の強度の比率を参照することにより発光粒子の同定が可能となり、発光粒子の種類の識別、発光粒子の大きさの検出又は発光粒子の大きさに基づく発光粒子の識別が可能となる。また、本発明によれば、発光粒子からの光を個別に検出しその光強度比を算出するという手法により発光粒子の同定を単一の発光粒子に対応する信号について個別に行うことができるので、発光粒子の相互作用結合反応又は分解反応の検査に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度がFIDAで可能な範囲よりも大幅に低い場合、或いは、相互作用が弱く、結合体又は分解物が相対的に僅かしか生成されないためにFIDAでは検出が困難である場合でも、発光粒子の相互作用の有無の検出及び/又はその強さの程度の評価が可能であることが示された。