"インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させる方法であって、P2Xプリンアゴニストの有効量を前記対象に投与することを含む、方法。前記対象はヒトである請求項1に記載の方法。前記対象は、真性糖尿病を患っている請求項1または2に記載の方法。前記真性糖尿病は2型糖尿病である請求項3に記載の方法。前記P2Xプリンアゴニストは、P2X3アゴニストである請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記P2Xプリンアゴニストは、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイル-ATP、およびα,β-メチレンATPからなる群から選択される請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記P2Xプリンアゴニストは、標的組織において約10μMから1mMの間、例えば約10μMから100μMの間の濃度になる用量で投与される請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。インスリン分泌を必要とする対象においてインスリン分泌を増加させるための医薬組成物における、P2Xプリンアゴニストの使用。前記対象は、真性糖尿病を患っている請求項8に記載の使用。前記真性糖尿病は2型糖尿病である請求項9に記載の使用。前記P2Xプリンアゴニストは、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイル-ATP、およびα,β-メチレンATPからなる群から選択される請求項8に記載の使用。糖尿病の治療のためにインスリン分泌を刺激するためのP2Xプリンアゴニストの有効量を含む、医薬組成物。前記P2Xプリンアゴニストは、P2X3アゴニストである請求項12に記載の医薬組成物。前記P2X3アゴニストは、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイル-ATP、およびα,β-メチレンATPからなる群から選択される請求項13に記載の医薬組成物。霊長類におけるインスリン分泌を増加させるために効果的な化合物/作用物質のためのスクリーニング方法であって、テスト化合物をP2X3受容体に接触させることと、受容体の活性を測定することとを含み、前記受容体の活性の増加が、インスリン分泌を増加させる効果のある候補化合物を示す、方法。前記P2X3受容体は細胞上にある請求項15記載の方法。前記活性は、前記細胞由来のインスリン分泌を測定することにより測定される請求項16記載の方法。前記細胞は、膵島細胞である請求項16記載の方法。前記霊長類はヒトである請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。それぞれ異なった種由来の膵島は、構造および機能に関して著しく異なる。また、膵島生物学におけるプリン作動性シグナル伝達に関するデータは明確ではない。そのため、我々は、ヒトβ細胞におけるプリン作動性シグナル伝達の役割を詳細に研究することにした。我々は、特に、グルコース濃度の増加に伴うβ細胞の刺激時において内因性放出されるATPの役割を明確にすることに関心があった。我々は、動的なダイナミックホルモン放出アッセイの実施、細胞質内の遊離したカルシウムイオン濃度[Ca2]iのイメージ化、RT-PCR、および免疫組織化学により、ATPシグナル伝達の効果について検討した。我々の結果は、ヒトβ細胞がCa2流入とインスリン分泌とを誘導するP2X受容体を発現していることを示している。こうしたCa2流入およびインスリン分泌は、グルコース誘導性のインスリン放出時に自己分泌ポジティブフィードバックを促進する。したがって、β細胞のP2X受容体は、インスリン分泌を高めるための医薬品に関する理にかなったターゲットである。他の治療法とは反対に、β細胞の活性時、すなわち、適切な生理的状況において、P2X受容体の活性化は、内因性のインスリン分泌を高める可能性がある。我々は、β細胞におけるP2X受容体の調節が、薬物治療された糖尿病の管理における補助療法アジュバント療法になることを期待している。P2X受容体活性の調節は、下部尿路機能傷害および過敏性腸症候群などの疾患の治療的介入における可能性のあるポイントとして現れた。我々の研究由来の情報は、2型糖尿病の状況で血糖コントロールを改善するべく、P2X受容体が、単独で、または経口の血糖降下剤例えば、スルホニルウレアとの組み合わせで、または基礎的なインスリン補充とともに、使用され得る医薬品の理にかなったターゲットであることも示唆している。我々は、2型糖尿病を持つ人々における糖尿病の罹患率をこの治療が低下させることを期待している。P2X受容体のポジティブモジュレータを使用することにより、我々は、インスリン分泌を増大させる天然のメカニズムに介入する。インスリン分泌は、糖尿病において損なわれるものである。現在のアプローチとは対照的に、我々の治療法は、適切な生理的な状況において内因性のインスリン分泌を高める。したがって、本発明は、P2Xプリンアゴニスト例えば、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、ベンゾイルベンゾイルATP、例えば、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイルATP、α、β-メチレンATP、2-meSATP、α,β-メチレンATP、またはBzATP2’3’-O-4-ベンゾイルベンゾイルATPの有効量を投与することにより、インスリン分泌を、それを必要とする対象において増加させる方法を提供する。BzATPは、これらプリンアゴニストの中で最も有害性が低いと考えられうる。対象は、インスリン分泌の増加が望ましい状態にあるいかなる哺乳類であることができ、特にヒトなどの霊長類でありうる。一実施形態では、対象は、2型糖尿病などの真性糖尿病を患っている。ある好ましい実施形態では、P2Xプリンアゴニストは、P2X3アゴニストであって、例えば、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイルATP、及びα、β-メチレンATPである。P2Xプリンアゴニストの適切な用量は、当業者による通常の実験により決定されうる。一実施形態では、用量は、標的組織での濃度がおよそ10μM~1mM、例えば、およそ10μM~100μMになることが期待される用量である。また、インスリン分泌を、それを必要とする対象において増加させるための医薬組成物でのP2Xプリンアゴニストの使用が提供される。対象は、例えば、2型糖尿病などの真性糖尿病を患っているヒトである。一実施形態では、P2Xプリンアゴニストは、P2X3アゴニストであって、例えば、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイルATP、及びα、β-メチレンATPからなる群から選択される。また、P2Xプリンアゴニストの有効量を含む医薬組成物が提供される。P2Xプリンアゴニストは、例えば、P2X3アゴニストであって、糖尿病治療のためにインスリン分泌を刺激する。P2X3アゴニストは、例えば、2-メチルチオ-ATP2-meSATP、5-ブロモウリジン5-トリホスフェート、3’-O-4-ベンゾイルベンゾイルATP、及びα、β-メチレンATPからなる群から選択されうる。本発明に従い投与される医薬組成物は、薬学分野において慣例であるように、任意で、薬学的に許容される希釈剤、キャリヤ、および賦形剤を含む。本発明はまた、本発明の方法で使用される薬剤/化合物のためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、β細胞のP2X3受容体に特異的に作用する能力について、テスト化合物をスクリーニングすることによる。化合物は、P2X3アゴニストとしての活性について、本明細書で説明される方法に従ってスクリーニングされうる。そして、そうした活性を示す化合物は、それらがインスリン分泌を増加する医薬品として優れた候補であるか否かを決定するインビトロinvitroおよびインビボinvivoでのさらなるテストのために選択されうる。したがって、哺乳類、特にヒトなどの霊長類においてインスリン分泌を増加する効能を持つ化合物/作用物質を検出するためのスクリーニング方法も提供される。この方法は、化合物をP2X3受容体と接触させること、受容体の活性を測定することを含み、これは例えば、受容体を産生する細胞のインスリン分泌の増加/減少を測定することによる。P2X3受容体活性を刺激する化合物/作用物質は、インスリン分泌を増加させる潜在的な化合物として、また医薬化合物に含められるものとして考慮されるだろう。定義本明細書で使用されるように、約は、±10を意味すると意図されている。薬学的に許容される希釈剤、キャリヤ、および賦形剤により、本発明にかかる医薬化合物に適合するとともに、動物、特にヒトや他の霊長類への局所または全身投与に好適なものとして当業者に知られているような化合物が表される。本明細書で使用されるように、治療治療するなどの用語は、所望の薬理的および/または生理的効果を得ることを意味する。効果とは、病気または疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するといった予防的なものであってもよく、および/または、病気または疾患および/または病気または疾患に起因するいかなる悪影響を部分的にまたは完全に治癒する治療的なものであってもよい。したがって、治療とは、例えば、a病気または疾患にかかりやすい傾向にあるが未だそれを持っていると診断されていない個体において、その病気または疾患が生じることを予防すること;bその病気または疾患を抑制すること、例えば、その進行を止めることなど;およびcその病気または疾患の緩和、軽減、改善すること、例えば、医師により診断されるなど、その病気または疾患で苦しむ個体個人のその病気または疾患を軽減することなど、を含む。標的組織により、本発明の化合物が治療効果を発揮する組織または細胞であって、例えば、膵臓、または膵臓の膵島細胞が表される。薬学的に許容されるキャリヤとの用語は、任意の従来のタイプの無毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入剤、または製剤助剤を意味する。薬学的に許容されるキャリヤは、使用される用量および濃度において受容者に対して無毒であり、製剤の他の成分に適合する。例えば、本発明の治療用化合物および組成物を含む製剤用のキャリヤは、それらに有害であると知られている酸化剤や他の化合物を含まないことが望ましい。好適なキャリヤとしては、これに限定されないが、水、デキストロース、グリセロール、生理的食塩水、エタノール、バッファ、ジメチルスルホキシド、クレマホールCremaphorEL、およびこれらの混合物を含む。キャリヤは、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などの追加の薬剤を含みうる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤など他の物質、および同様の薬剤は、必要に応じて添加されうる。本明細書において薬学的に許容される塩は、酸付加塩例えば、遊離アミノ基と形成されるを含み、無機酸限定されないが、塩酸またはリン酸を含む、または、酢酸、マンデル酸、シュウ酸、酒石酸のような有機酸と形成される。また、遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基由来であったり、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、およびヒスチジンのような有機塩基由来であったりすることができる。薬学的に許容される賦形剤との用語は、ビヒクルvihicle、アジュバント、または希釈剤、または他の補助物質を含み、例えば当技術分野で通常のものであって、一般に容易に入手可能なものである。例えば、薬学的に許容される補助物質には、pH調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などが含まれる。本明細書で使用されるところでは、文脈において別途明確に定められていない限り、1つの、それのなどの単数表現は複数表現を含む。したがって、例えば1つの化合物との言及は、複数のそうした化合物を含む。上述したとおり、医薬化合物の有効量が、個体に投与される。この有効量は、所望の結果を生み出すために十分な用量を意味する。いくつかの実施形態では、所望の結果とは、インスリン分泌を所望のレベルにまで刺激することである。投与される治療剤の量は、投与方法、対象/患者の年齢および体重、および対象の症状や病気に応じて変化する。化合物は、付随する副作用が最小で、医療目的を最も良く達成する用量で投与される。典型的には、本発明で使用される組成物は、約1未満から約99までの有効成分を含む。投与される適切な用量は、対象の全体の健康、対象の年齢、疾患や病気の状態、対象の重さなど、治療される対象に依存する。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、キャリヤ、または希釈剤などであるが、当技術分野で通常のものである。好適な賦形剤のビヒクルは、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノール等、およびこれらの混合物を含む。さらに、必要に応じて、ビヒクルは、少量の補助物質、pH調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤を含みうる。そうした剤形を用意する実際の方法は、当業者に知られており、または明らかであろう。例えば、レミントンの薬学Remington‘sPharmaceuticalSciences、マックパブリシングカンパニーMackPublishingCompany、ペンシルベニア州イーストン、第17版、1985年、を参照されたい。いずれにしても、投与される組成物または製剤は、治療される個体において所望の状態を達成するために十分な量の作用物質を含むであろう。治療用化合物は、水性または非水性の溶剤中にそれらが溶解、懸濁、乳化されることにより、注射液として配合されうる。水性または非水性の溶剤中とは、例えば、植物油または他の同様の油などであって、コーン油、ヒマシ油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルを含む。また、必要ならば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、保存料などの通常の添加物がともに配合されうる。投与の通常の経路は、熟練技能者には明らかであろう。これらは、例えば、経口または皮下投与を含む。投与の他の経路としては、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、呼吸器吸入装置を介してなど、鼻腔内、などが含まれる。有効量は、日常的な通常の手順により決定されうる。例えば、BzATPまたはα、β-メチレンATPは、約50μMの濃度で投与されうる。本実施形態で引用される特許および他の刊行物は、参照により援用される。実験手順膵島の単離。膵島を、先に述べたようにして単離した57。サル膵島を、先に述べたようにして58、膵臓入手の時点で4歳を超えたカニクイザルマカカファシクラリスMacaccafascicularisから単離した。ブタ膵臓を、地元の屠殺場から入手した。マウスC57BL/6およびラットルイスラット;ハーランHarlan膵島を、齧歯類-膵島単離技術59を使用して単離した。すべての動物プロトコルは、マイアミ大学の管理使用委員会CareandUseComitteeにより承認された。ヒト膵島を、糖尿病研究所DiabetesResearchInstituteのヒト膵島細胞処理施設HumanIsletCellProcessingFacility,マイアミ大学ミラー医学校MillerSchoolofMedicineから、または、膵島細胞資源基本科学膵島配布プログラムIsletCellResourcebasicscienceisletdistributionprogram,膵島細胞資源センターコンソーシアムICRs;IsletCellResourceCentersConsortium,臨床研究部門,国立研究資源センター,国立衛生研究所、から入手した。ヒト膵島を、酵素フリーの細胞分離バッファインビトロジェンを用いて単一細胞に分離した。すべての種由来Q:1の膵島および膵島細胞を、CMRL培地-1066インビトロジェン、ナイアシンアミド10mM;シグマ、ITSBDバイオサイエンス、Zn2SO415μM、シグマ、GlutaMAX2mM;インビトロジェン、ヘペスHepes25mM;シグマ、FBS10;インビトロジェン、およびペニシリン-ストレプトマイシン100IU/mL-100μg/mL;インビトロジェン中で同様に37°C、5CO2培養した。[Ca2]iイメージング。[Ca2]iイメージングを先に述べたようにして実施した8,36。分散された細胞を、ヘペスバッファ溶液125mMNaCl,5.9mMKCl,2.56mMCaCl2,1mMMgCl2,25mMヘペス,および0.1BSA、pH7.4に浸漬した。グルコースを、終濃度が3mMになるように添加した。膵島または分散された膵島を、Fura-2AM2μM;1時間中でインキュベートし、閉鎖小容積イメージングチャンバワーナーインスツルメントに置いた。刺激を、ベイジング溶液bathingslolutionとともに適用した。Fura-2でロードされた膵島を、モノクロメータ光源ケルンリサーチオプトスキャンモノクロメータCairnResearchOptoscanMonochromator;ケルンリサーチ社で、340nmおよび380nmにおいて選択的に励起した。イメージを、ツァイスアキシオベルト200ZeissAxiovert200顕微鏡カールツァイスに取り付けられた浜松カメラ浜松で取得した。キネティックイメージングAQMアドバンスソフトウェアキネティックイメージングを用いて、ある期間にわたる340/380蛍光発光比の変化を個々の膵島および分散された細胞において分析した。蛍光比のピークの変化は、応答増幅を構成した。β細胞を、高グルコース濃度に対するそれらの[Ca2]i応答により、他の内分泌細胞と区別した。また、α細胞を、カイニン酸グルタミン酸塩受容体アゴニストに対するそれらの[Ca2]i応答により識別した8,36。インスリンおよびグルカゴン分泌。インスリンおよびグルカゴン分泌を、先に述べたようにして測定した8,36。高容量自動ペリフュージョンperifusionシステムを、膵島からのホルモン分泌を動的に測定するために開発した。ヘペスバッファ溶液125mMNaCl,5.9mMKCl,2.56mMCaCl2,1mMMgCl2,25mMヘペス,および0.1BSA、pH7.4、ペリフュージョン速度100μL/分を、バイオゲルP-4ゲルBio-GelP-4Gelバイオラッドに固定された100個の膵島を含むカラムに、低拍動性蠕動ポンプペリスタポンプにより通過させた。他に述べられていない限り、すべての実験においてグルコース濃度を3mMに調整した。刺激を、ペリフュージョンバッファとともに適用した。潅流液perifusateを、96-ウェルプレート形式用に設計された自動フラクションコレクタに回収した。膵島および潅流液を含むカラムを37°Cで維持し、コレクションプレート内の潅流液を4°C未満で維持した。潅流液を1分ごとに回収した。潅流液中のホルモン放出を、ヒトおよびマウス内分泌LINCOplex登録商標キットを用いて使用説明書リンコリサーチLincoresearchに従い決定した。ヒト膵島の調製物は、それらの質において著しく異なった。したがって、種々の刺激に対する応答の程度を、同一の記録と比較し、または同一の調製物由来の記録を用いて比較した。免疫組織化学。切片14μmを、抗P2X受容体抗体1~7;アロモネラボAlomoneLabs、抗インスリン抗体1:500;アキュレイトケミカルアンドサイエンティフィックAccurateChemicalScientific、抗グルカゴン抗体1:4,000;シグマ、および/または抗ソマトスタチン抗体1:1,000;アキュレイトケミカルアンドサイエンティフィックとともに、オーバーナイトでインキュベートした。ネガティブコントロールとして、精製ペプチド50μgを、プリン受容体の一次抗体1μgとともに、1時間プレインキュベートした室温。膵島を含む膵臓の切片を、ツァイスLSM510走査型共焦点顕微鏡を用いて調べた20倍および40倍の拡大で観察した。インサイチュハイブリダイゼーション。ヒトP2XR1~7のmRNA検出のためのDIGラベルされたRNAプローブQ:3を用いたインサイチュハイブリダイゼーションを、先に述べたようにして実施した60。合計30ngのDIGラベルされたプローブを、150μlのハイブリダイゼーションバッファで希釈し、スライドに適用し、オーバーナイト70°Cでハイブリダイズさせた。その後、0.2SSC溶液アンビオンAmbion登録商標Q:4-アプライドバイオシステムズで、スライドを70°Cで1時間洗い、アルカリホスファターゼ結合抗DIG羊抗体ロシュとともに、オーバーナイト4°Cでインキュベートした。アルカリホスファターゼ反応を、200μlの1MMgCl2、140μlのNBT/BCIPストックロシュを含むポリビニルアルコールPVA中でQ:5実行した。センス鎖Q:6を、それぞれのP2XRについてのネガティブコントロールとして使用した。抗原の免疫蛍光局在、二重標識免疫蛍光法、共焦点顕微鏡検査を、先に述べたようにして実行した60。使用した抗体は、抗インスリンマウス抗体1/1000;シグマ、抗グルカゴンモルモット抗体1/50;ダコDako、アレキサフルオルAlexiaFluor登録商標488結合ヤギ抗マウス抗体1/400;モレキュラープローブMolecularProbes、およびアレキサフルオル568結合ウサギ抗モルモット抗体1/400;モレキュラープローブであった。DAPIを、核の対比染色として使用した。クロモゲンchromogenシグナルをRGBスケールでのカラーシグナルにデジタル変換することにより、ハイブリダイゼーションシグナルと免疫蛍光シグナルとを合わせた。ハイブリダイゼーションシグナルを、赤で擬似的に着色したQ:7。その後、このシグナルを、インスリンシグナル緑と合わせた。フォトショップPhotoshop登録商標を用いて両方の変換を実行した。ウエスタンブロッティング。免疫ブロット分析を、P2X免疫組織化学のために使用される抗体を用いて1:1000、標準的な方法により実行した。コントロール実験として、一次抗体を、対応するコントロールペプチドアロモネラボとともに、50μg抗原ペプチド/1μg抗体の割合で、5時間室温でインキュベートした。統計分析。統計比較のため、我々は、スチューデントt検定、または一元分散分析one-wayANOVAを使用し、続いてボンフェローニt検定で多重比較手法を実行した。適用を通して、データを、平均値±標準誤差SEMとして提示した。実施例1オートクリン/パラクリンシグナルとしてのATPの役割を推定するため、我々は、ATP分解を操作するとともに、これにより単離ヒト膵島において内因性放出されるATPの濃度を操作し、ホルモン分泌における変化を、動的な分泌応答のペリフュージョンアッセイを使用することにより記録した36。放出されたATPは、ATPをアデノシンに変換するアピラーゼなどの膜エクトectoATPアーゼにより迅速に除去される37,38。エクトATPアーゼは、プリンシグナル伝達の持続期間および程度において極めて重要である。機能的なアピラーゼCD39は、ヒトβ細胞に発現されていることが示されてきた。アピラーゼ阻害剤であるARL6715650μMの適用は41,42、低グルコース濃度3mM;図1A、1Bでインキュベートされた膵島からの基礎量のインスリン分泌を増加させ、ヒト膵島細胞がATPを放出したことを示していた。これらの条件下において、内因性のエクトATPアーゼは、完全に有効的である。これは、外因的に添加されたアピラーゼ5U/mLが基礎量のインスリン分泌を低下させなかった図1A、1B理由を説明する。実施例2ATPは、低グルコース濃度においてすでに放出されてインスリン分泌を促す可能性を有しているため、我々は、ATPが、グルコース誘導性のインスリン分泌を早期に増強するとの仮説を立てた。それゆえ外因的に添加されたアピラーゼ5U/mLは、3mMから11mMへのグルコース濃度のステップ増加の間、インスリン放出を~15低下させ図1C、1D、内因性のATP放出が、β細胞応答に寄与していたことを示唆した。しかしながら、グルコース刺激の間における競合的なアピラーゼ阻害剤であるARL67156の添加は、β細胞応答を増大させず図1D、内因性のATP放出が、ATPの増強効果を飽和させるのに十分高いものであることを示唆した。さらに、グルコース濃度が増加される際における外因的なATPによる刺激により、インスリン応答は追加されなかった。アピラーゼは、細胞外ATPを減少させることにより、または、インスリン放出を阻害するようにP1受容体に作用しうるアデノシンを増加させることにより、グルコース誘導性のインスリン放出を低下させている可能性がある43。アデノシンデアミナーゼでアデノシンを分解しても、グルコース誘導性のインスリン分泌に対するアピラーゼの効果は変化しなかった図1D。これは、アデノシンがインスリン応答の阻害に寄与していないことを示唆した。したがって、P1受容体のアンタゴニストであるCGS1594310μM、およびアデノシン100μMのいずれも、グルコース誘導性のインスリン分泌を変更しなかった論考。神経は分断されており、ATPの追加の供給源または標的になりうるニューロンの残部は我々の実験条件下において残存しないため32,44、最も確実らしい解釈は、β細胞から分泌されたATPは、インスリン分泌を増大するためのオートクリンフィードバックループを提供するというものである。実施例3オートクリンフィードバックループに関連する受容体を調べるため、我々は、グルコース濃度を3mMから11mMまで増加させる刺激の間、特異的な受容体アンタゴニストでプリン受容体をブロックした図2A。グルコース刺激に対するインスリン分泌の応答は、スラミン50μM;P2受容体の広範なアンタゴニスト、イソ-PPADSQ:950μM;P2X1受容体、P2X2受容体、P2X3受容体、およびP2X5受容体のアンタゴニスト、酸化ATPoATP;500μM;P2X2受容体、P2X3受容体、およびP2X7受容体のアンタゴニストの存在により、それぞれ40、30、および65まで低下した図2B。グルコース刺激に対するインスリン分泌の応答は、特異的なP2X1アンタゴニストであるMRS215910μM、および2種のP2X7受容体アンタゴニストであるブリリアントブルーG1μMおよびKN-621μMの存在により、有意な低下は生じなかった図2B。P2Y受容体に対するアンタゴニスト[リアクティブブルー250μMおよびMRS217910μM;P2Y1受容体に対して特異的;図2B]、またはP1受容体に対するアンタゴニストは[CGS1594310μM]、グルコース誘導性のインスリン放出を阻害しなかった。実施例4インスリン分泌に対するプリン受容体活性化の直接的な効果を決定するため、我々は、外因性のATPおよび他のアゴニストを適用した。ヒト膵島では、P2プリン受容体の一般的なアゴニストであるATPの適用は、低グルコース濃度3mMおよび高グルコース濃度11mMにおいて同様な閾値で、濃度依存的にインスリン放出を刺激した図2C。濃度―応答関係は、ヒトP2X3受容体について報告されたEC50~0.39μMに好対照の高親和性成分~0.5μMと、P2X7受容体EC50~100μMの活性化に相当しうる100μMと1000μMとの間の第2の増加とを示した45。1mMを超えて細胞外ATPを増加させることにより、インスリン放出がさらに増加することはなかった図2C。ATPに対するインスリン応答は、グルコースにより刺激された応答と同様に、基礎量を超えた増加を示した。ATP1mMにより引き出された増加と比較して、高グルコース11mMに対する応答は、101±30、または、ほぼ同一であった。同様の結果が、サル膵島を使用して取得された。対照的に、ブタ膵島、マウス膵島、およびラット膵島においてテストされたATPおよび他のいずれのプリンアゴニストにより、インスリン放出は刺激されなかった図2C、S2。ラット膵島では、高濃度のATP1mMでのみ、インスリン放出の小さな増加が誘導された図2C。ATPγS50μM;非加水分解性のATPアナログ、特異的なP2X受容体アゴニストであるBzATP50μM、およびP2X1アゴニストおよびP2X3アゴニストであるα,β-メチレンATP50μMは、強いインスリン応答を引き出した図2D。P2Y受容体は、グルコース刺激の間、内因性放出されるATPに対する応答には関連しなかったが、選択的アゴニストのUTP100μM;P2Y2、P2Y4、P2Y6のアゴニストおよびADP100μM;P2Y1、P2Y12、P2Y13のアゴニストにより、インスリン放出を増加するように直接的に活性化されることができた図2D。これは、ヒトβ細胞における複数のATP受容体サブタイプの存在を示唆した。アデノシンは、インスリン放出に対して小さな効果しか持たなかった。これは、P1受容体は、あまり関連しないことを示唆した図2D。高グルコース11mMに維持された膵島における、ATP100μM、ATPγS50μM、BzATP50μM、UTP100μM、およびADP100μMに対するインスリン応答の程度は、低グルコース濃度に維持された膵島で記録されたこれらのアゴニストに対するインスリン応答の程度と同様であった。これは、プリン受容体活性化の効果が、高グルコースレベルにおいても変更されないことを示唆している。実施例5我々の結果は、ヒト膵島が、活性化により強力にインスリン分泌を刺激するP2X受容体を発現していることを示唆している。RTPCRを用いることにより、我々は、すべてのP2X受容体遺伝子がヒト膵島において発現されていることを発見し、β細胞生物学コンソーシアムデータベースBetaCellBiologyConsortiumdatabaseウェブサイト:betacell.org/resources/data/epcondb/からの結果を確証した。膵島におけるP2X受容体発現部位を特定するために、我々は、ヒト膵島切片についてインサイチュハイブリダイゼーションを実施した。ヒト膵島において強力なハイブリダイゼーションシグナルが、P2X3、P2X5、および、P2X7に対して検出された図3A。膵島ホルモンに対する免疫蛍光に、インサイチュハイブリダイゼーションを組み合わせることにより、我々は、これらの受容体はβ細胞において発現されていることを発見した図3A。P2X1、P2X2、P2X4、P2X6、またはコントロールのセンスリボプローブに対してはシグナルが検出されなかった。免疫蛍光とウエスタンブロットとはさらに、P2X3タンパク質がβ細胞に存在することを示した図3B、3C。P2X5およびP2X7の免疫活性は膵島において見られたが、それらは、コントロールペプチドの前吸着によりブロックされなかった。したがって、その染色が、P2X5およびP2X7受容体タンパク質の発現についての信頼しうる示唆であると考えられるのか否かを決定することができなかった。単離されたヒト膵島細胞は、[Ca2]iの測定を用いて、機能的なP2X受容体の存在について調べられた。β細胞は、高グルコース11mMまたは16mMに対するそれらの応答により識別され8、ATPγS50μMおよびBzATP50μMに対して、迅速な[Ca2]i増加で応答した図3D。α細胞特異的刺激であるカイニン酸100μMに応答した細胞のフラクション30は、ATPγS50μMおよびBzATP50μMに対して、迅速な[Ca2]i増加で応答した図3D。これらの結果に一致して、ATPは、ヒト膵島、サル膵島、およびマウス膵島におけるグルカゴン分泌の小さな増加を刺激し、ヒトα細胞のサブセットは、P2X4受容体を発現した図S3。実施例6ATPがヒトβ細胞においてインスリン分泌を誘導するメカニズムは何であろうか。ATP10μMに対するインスリン応答は、一般的なP2受容体アンタゴニストであるスラミン100μM、および特異的なP2Xアンタゴニストであるイソ-PPADS50μM;~98阻害;図4Aにより、阻害された。名目上細胞外のCa2がない状態では、ATPに対するインスリン応答図4Bおよびα,βmeATP100μMに対するインスリン応答は、強力に減少された。対照的に、細胞内蓄積からのCa2放出の寄与をサプシガルジンthapsigargin1μMでブロックすることは、ATPに対するインスリン応答に影響を与えなかった図4B。ATP誘導性インスリン分泌のために必要とされるCa2は、P2X受容体の孔か、電位依存性Ca2チャネルを通じて入った可能性がある。電位依存性Ca2チャネルは、P2X受容体介在性の膜脱分極の結果として活性化される。広範囲の電位作動型Ca2チャネルのブロッカーであるCd2100μM;P2X受容体を通じたCa2の流入には影響しない濃度46,47およびL型Ca2チャネルブロッカーであるニフェジピン10μMは、ATP図4Bまたはα,βmeATPに対するインスリン応答性を消滅させた。実施例7Cd2またはニフェジピンの存在でATPがインスリン分泌を増加できなかったことは、P2X受容体の活性化による十分な脱分極が、電位依存性Ca2チャネル15,17,47、特に、ヒトβ細胞における潜在的な発射potentialfiringに重要なL型Ca2チャネル48の活性化を引き起したことを示唆している。ATP、およびP2X受容体アゴニストであるBzATPならびにα,βmeATPは、グルコースまたはKCl刺激に対する応答に匹敵する、繰り返すことのできる[Ca2]i応答をβ細胞において引き出した図4C。ATPに対する[Ca2]i応答は、イソPPADによりヒトβ細胞において80にまでブロックされた図4C。サプシガルジン1μMは、ATPに対する[Ca2]i応答に影響しなかった。これは、細胞内蓄積からのCa2放出の寄与がほとんどないことを示唆している。名目上細胞外にCa2がない状態、またはニフェジピンの添加10μMは、ATPに対する[Ca2]i応答を低下させた図4D。これは、β細胞の形質膜を通じた主要なCa2流入を示唆している。論考上で詳述された結果は、インスリン分泌のために極めて重要な正オートクリンフィードバックループを仲介するため、ヒトβ細胞が、細胞外ATPのための受容体を発現していることを示すものである。我々は、このオートクリンフィードバックループが、ヒトおよび非ヒト霊長類の膵島においては存在するが、我々が調べた他の種における膵島においては存在しないことの証拠を示してきた。これらの結果は、霊長類では、グルコース濃度の増加に迅速に応答してインスリンの分泌を増大させるといったATPプリンシグナル伝達経路において、P2X受容体が優勢を占めているとの結論を支持している。我々の発見は、ヒトβ細胞におけるATPのためのシグナル伝達経路を明らかにした。我々は、低グルコース濃度においてATPがすでに放出されることを発見した。これは、インスリン保持中の分泌顆粒からATPが放出されうることを示した最近の齧歯類の研究と一致している12,34。したがって、ATPシグナル伝達は、インスリンの分泌に先行し、グルコース刺激に適切に応答するためにβ細胞を感作するのかもしれない。この見解は、シナプス前神経終末における神経伝達物質の放出をATPが促進することを示す研究結果と一致している49,50。我々の結果は、さらに、ATP放出は、グルコース濃度の急増時に最も強力らしいことを示唆している。外因性のATPは、一定のグルコース濃度3mMまたは11mMに保持された膵島において強力な応答を増進させたが、グルコース濃度の急増中では効果的ではなかった。これは、これらの条件下において、内因性放出されたATPにより、受容体が完全に活性化されたことを示唆している。したがって、我々は、グルコース刺激に続いて起こるインスリン放出のためのオートクリン正フィードバックループにおいて、ATPがシグナルサービングsignalservingであることを示した。ATPシグナル伝達に関してヒトβ細胞と齧歯類β細胞との間にかなりの違いを示した我々の結果は、ヒト膵島の構造および機能が他のものと区別を示すものであることを繰り返し述べた31,32。我々の研究は、ATPが霊長類の膵島におけるインスリン放出の刺激物質としての可能性を持つが、他の調べた種の膵島においては可能性を持たないことを明らかにした。我々は、テストされたすべての種について同一の技術的なアプローチを用いたため、最も確実らしい説明は、ATPシグナル伝達は、種の間で異なるということである。プリン作動性シグナル伝達の違いは、それぞれ異なる種のβ細胞が、異なるサブセットのプリン受容体を発現していることを示唆している。我々の結果は、P2X受容体とP2Y受容体との両方がヒトβ細胞において活性化されうるが、P2X受容体により仲介される応答が優勢を占めていることを示している。マウスでは、ATPは、P2X受容体ではなくP2Y受容体を通じたβ細胞での[Ca2]i応答を優勢的に引き出した26,51。いかなる種の膵臓内分泌部においても、P2X受容体の発現について調べた研究はほんのわずかである。最近、単離された単一マウスβ細胞において、P2X1受容体およびP2X3受容体が同定された30。また、P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、およびP2X6が、マウスおよびラットの膵臓において検出された28,52,53。本発明のメカニズムに関するいかなる理論にも縛られるものではないが、P2X3受容体は、ヒトβ細胞の電気的活動の形成に対して寄与している可能性が最も高い。3mMグルコースでのATPの直接適用は、大量のインスリンと[Ca2]i応答とを引き出し、これは、高グルコースまたはKClの脱分極により引き出されるものに匹敵した。P2X受容体アンタゴニストでのATP受容体のブロッキングは、高グルコースに対するインスリン応答を65にまで低下させ図2、応答に対してATP受容体活性化が強く寄与していることを明らかにした。我々の結果は、さらに、ATPに対するヒトβ細胞応答のほとんどは、イオンチャネル型P2X受容体により仲介されることを示唆した図4。この活性化は、非常に大きな内向き電流をnAレンジで促進し、これにより、β細胞の膜を脱分極させる。結果として、増加された電気的活動が生じる30。しかしながら、電流の正確な程度は、放出されたATPの量、受容体の密集状態、および/またはそれらの配置に依存するだろう。技術的なアプローチの組み合わせを用いることにより、我々は、一貫して、ヒトβ細胞においてP2X3受容体を同定した。P2X1受容体、P2X2受容体、P2X4受容体、およびP2X6受容体は、齧歯類β細胞において発現されていると報告されたが28,30,52,53、ヒトβ細胞では検出できなかった。対照的に、我々の研究は、P2X5およびP2X7の存在を明らかにした。したがって、ヒトβ細胞でのP2X受容体は、モノマー、またはP2X3、P2X5、およびP2X7の組み合わせのヘテロマーとして存在している可能性がある。ヒトP2X5遺伝子の重要な位置での多型の存在は、ヒトの少数のサブセットのみが~14、機能的なタンパク質を処理および翻訳するものであり54,55、ほとんどのヒト人間ではβ細胞でのATPシグナル伝達に対してP2X5が寄与することを除外していることを示唆している。P2X7受容体は、P2X3とのヘテロ型の受容体を形成することはなさそうだが、ホモ型の受容体として働く可能性はある。しかしながら、ホモ型のP2X7受容体は、通常のβ細胞の生理機能に参加しなさそうである。それは、それらの活性化が100μMを超えるATP濃度を必要とするからである17。これは、P2X7受容体アンタゴニストが、ATPにより仲介される正オートクリンフィードバックループに影響しなかったことを示す我々の結果に一致する。生理的な条件下において、最も確実らしいシナリオは、P2X3のホモ型の受容体が、我々が述べているインスリン放出のための正オートクリンフィードバックループを仲介しているというものである。正フィードバックのオートクリンループにより、細胞は、外部からの刺激に対するシグナル伝達応答の大きさおよび期間を調節することができる56。血糖の増加により活性化されるとβ細胞分泌応答に対する速さおよび感度が増す自動調節システムにおいてATPが機能することが考えられる。グルコース濃度の増加時に、β細胞はインスリンに加えてATPを分泌する。放出されたATPは、その後、β細胞形質膜のP2X3受容体を活性化する。P2X3受容体の活性化は、Ca2およびNaの流入により仲介される膜の脱分極と17、それに続いて起こる電位作動型のCa2チャネルの開口とを引き起こす。これは、[Ca2]iを増加させ、インスリン分泌を高める結果となる。この正フィードバックにより、β細胞は、血漿中のグルコース濃度の小さな変化をインスリン放出の大きな変化へと転換することができる。したがって、正ATPオートクリンシグナル伝達は、血液グルコース濃度のあまり大きくはない生理的な変化に対する応答において、どのようにして適切で素早いインスリン放出が達成されるのかを説明し得る。参考文献"