"核酸配列を決定する方法であって、a前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を変性させる工程;b一本鎖核酸分子プライマーと前記の変性した二本鎖核酸分子をハイブリダイズさせる工程;c工程bで得られたハイブリダイズしたプライマー/二本鎖核酸分子に張力をかける工程;d工程bで得られたハイブリダイズしたプライマー/二本鎖核酸分子を、少なくとも1回の複製停止をもたらす条件で、ポリメラーゼとともにインキュベートする工程;およびe前記二本鎖核酸の一方の末端に関して前記複製停止の位置を決定する工程を含んでなる、方法。前記二本鎖核酸分子がヘアピンである、請求項1に記載の方法。前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも1つの塩基が表面に直接的または間接的に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも1つの塩基が可動表面に結合される、請求項1または2に記載の方法。前記二本鎖核酸が、工程aにおいて支持体を引き離すことによって変性される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に15pN以上、好ましくは17pN以上、より好ましくは18pN以上の物理的力がかけられる、請求項4に記載の方法。工程cの前記張力が12pN~10pNの間である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。支持体に結合されていない前記二本鎖核酸の末端が、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに物理的に連結される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。工程a~eが数回繰り返される測定値を蓄積し、シグナル/ノイズ比を高めるために、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。工程eが、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離zを測定することを含んでなる、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離zhighを測定するさらなる工程を含んでなる、請求項9に記載の方法。zとzhighを比較する工程、および停止位置を決定する工程をさらに含んでなる、請求項10に記載の方法。前記プライマーが前記ポリメラーゼの活性によって伸長され、この伸長プロセスが、前記ポリメラーゼが前記二本鎖核酸分子のループに到達する前に停止される、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記二本鎖核酸分子にかけられる物理的力を5pN以下まで小さくするさらなる工程を含んでなる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が活性化される、請求項13に記載の方法。新たに合成された鎖を解離するさらなる工程を含んでなる、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。工程a~eが繰り返される、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。前記ポリメラーゼがヌクレオチド選択的酵素であり、工程dの条件が、特定のヌクレオチドに対する前記酵素の前進運動の速度を変更する反応混合物の使用を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。前記工程dの条件が、デオキシヌクレオチドに加えてジデオキシヌクレオチドを含んでなる反応混合物の使用を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。実験例DNAの調製未知の配列であり数十~数千の間の塩基対からなるサイズの二本鎖dsDNA断片を、一方の先端においてDNAループに連結する。そのもう一方の先端をdsDNA断片に連結すれば、その2つの鎖を異なるコーティングの表面に結合させることができる。例えば、一方の鎖の遊離3’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させ、反対の鎖の5’末端はジゴキシゲニンで標識して抗Dig抗体でコーティングした表面に結合させることができる。この末端標識は、例えばビオチンまたはdig修飾ヌクレオチドを付加するためのターミナルトランスフェラーゼの使用、または適切に標識されたオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションなど、当業者に公知の様々な方法で行うことができる。フォースストレッチング機器このDNA構築物を、それが、その標識された例えば、ビオチン一方の末端が結合する適当なビーズ例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたものの溶液中で数分間インキュベートする。このビーズは、後に操作のために光ピンセットが使用されるならば透明であってよく、操作のために磁気トラップまたはピンセットが使用される場合は磁性ビーズであってよい。ビーズ-DNAアセンブリを、例えば分子のもう一方の標識末端と結合するようにその表面が処理された例えば、DNAのDig標識末端に結合させるための抗Digでコーティングされた表面流体チャンバー中に注入する。このようにしてビーズはDNA-ヘアピンを介して表面に固定される図1a参照。次に、ビーズと表面との距離を当業者に公知の様々な手段でモニタリングするが、例えば、それらの距離を推定するために、カメラでのそれらの画像の回折環を使用することができ、あるいはエバネッセントモードで照射された場合にそれらが散乱する光の強度または蛍光の放出を用いてそれらの距離を測定してもよい。あるいは、固定表面上のセンサーまでのそれらの距離を推定するために、それらが発生させる磁界を測定することができる例えばGMRまたはHallセンサーなどの磁気センサーを使用。ビーズに固定されているDNA分子を表面へ引き寄せるために、様々な技術が記載されている。好ましい実施態様では、上記のように、DNAヘアピンにより表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成においては、固定されたビーズに一定の力を加えるために、サンプルの上に配置した小さな磁石が使用され、その位置は<1nmの精度で決定することができる引張力および流体力学的抗力による消散に依存する。この一連の実験では、米国特許第7,052,650号および同第7,244,391号に記載の機器を用いた。さらに、特に断りのない限り、本明細書で報告した実験は、25mMTrispH7.5、150mMKAc、10mMMgCl2、0.2BSA中で行った。どの場合においても、連結しているヘアピンは、約16pNよりも大きい力でビーズを引っ張ることにより、機械的に完全に開くことができる。分子にかける張力を約11pNより小さくすると、ヘアピンが自発的に再び閉じさせることができる開いている状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である。もし、開いている状態の時に、溶液中の分子例えば、タンパク質、またはDNA、RNA、LNAもしくはPNAの相補的オリゴヌクレオチドと延長された一本鎖ssDNAとの結合が見られたならば、力が11pNよりも小さくなった場合に、この分子はヘアピンの再閉を一時的に遮断する。アッセイの原理は2つの力の間の切り替えであり、大きい方のF0penはヘアピンを開き、小さい方のFtestは、再び閉じ、一時的遮断の際の分子の伸長の測定を可能にするために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ftestで測定する。これは、力がFopenからFtestへ低減されたところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置は、塩基対の分解能により測定することができるこれらの再閉の停止のうちの1つの期間におけるDNA分子の伸長ビーズと表面との距離を測定することにより、遮断の位置をナノメーター精度で決定することが可能である1nmはssDNAにおいて10pNの力の下で2つのヌクレオチド1bpにわたる距離に相当する。開いている構造は、塩基対に対する伸長の最大比を示すdsDNAにおいてその比はわずか0.34nm/bpである。この測定の精度は、2つのノイズの関与により限定される:測定方法の精度;ビーズのブラウン運動。ビーズの垂直位置を測定するために様々な技術を使用することができる。最も単純なものは、ビデオ顕微鏡によるものである米国特許第7,052,650号および同第7,244,391号。この方法を用いて得られた図1の結果では、標準的な分解能は平均して1秒あたり1nmに達している。良好な分解能を備えた他の方法としては、例えば分解能0.1nmに達するPSDセンサーを用いるレーザー照射、およびエバネッセント波照射760576102003、LiuetalBiophysJ96381038212009が示されている。分解能における固有の制限は、ssDNA分子を引き寄せるビーズのブラウン搖動によりもたらされる。<x2>=4kBTΔf6πηr/k2ssDNAF、式中、kssDNAFはssDNA分子の剛性、kBはボルツマン定数、Tは絶対温度、ηは水の粘度、rはビーズの半径、Δfは測定の周波数帯域である。kssDNAF=10pN=0.05/NbN/m、式中、NbはssDNAの塩基の数である。84bpのヘアピンに対して、これは平均して1秒間に0.04nmのノイズをもたらすΔf=1Hz。図1におけるより大きなノイズσ約1nmは、本質的に測定装置によるものであり、固有の搖動によるものではない。固有のブラウンノイズはヘアピンのサイズとともに増大し、例えば、1200bpのヘアピンは1秒間に平均して0.6nmのノイズをもたらす。重合の機械的検出による診断および配列決定本発明者らは、力がフォークの不安定化に十分な大きさである場合にFtest、T4DNAポリメラーゼはDNAヘアピンを複製できることを示した。古典的なSangerシークエンシングと同様に、特異的ddNTPの取り込みはT4DNAポリメラーゼによる新生鎖のさらなる伸長を妨げる。本発明者らの方法において、図6に示されるように、この遮断は容易に同定することができる。力を小さくしていくと、T4DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が活性化され、この酵素が新たに合成された鎖を切断する。従って、合成および切断のサイクルを繰り返すことで、分子ヘアピンは、まずddATPの存在下で、次に他の各ddNTP、すなわち、ddTTP、ddCTPおよびddGTPの存在下で、遮断位置を同定することにより配列決定することができる。同様に、二本鎖ヘアピン分子は、4種類のdNTPのうちの1つが他と比較して不足した状態で含まれる、すなわち、他と比較してこのdNTPが極めて低い濃度で存在するバッファー中で配列決定することができる。従って、図7に例示されるように、重合時に、制限されているヌクレオチドの添加が必要な位置にT4DNAポリメラーゼが到達するたびに、一時的な停止が起こる。本明細書に前述されているように、新たに合成された区分は力を小さくすることにより切除することができ、結果として酵素のエキソヌクレアーゼ活性の活性化がもたらされる。従って、合成および切断のサイクルを繰り返すことで、分子ヘアピンは、まず低濃度のdATP例えばの存在下で、次に他の各dNTP、すなわち、dTTP、dCTPおよびdGTPの存在下で、停止位置を同定することにより配列決定することができる。"