"対象とする直鎖核酸分子を、細胞壁を有する植物細胞に導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、対象とする直鎖核酸分子でナノ粒子を被覆する工程、細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子とを互いに接触させて配置する工程、ならびに細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする工程を含む方法。ナノ粒子が、ポリエチレングリコールで被覆されている、請求項1に記載の方法。細胞壁を含む植物細胞のコンパートメントへのナノ粒子の取り込みを可能にすることをさらに含む、請求項1に記載の方法。細胞内コンパートメント標的化タンパク質でナノ粒子を被覆することをさらに含む、請求項3に記載の方法。コンパートメントが、細胞質ゾル、核、液胞膜、色素体、エチオプラスト、有色体、白色体、脂肪体、タンパク質プラスト、アミロプラスト、葉緑体、および二重膜の管腔からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。細胞壁を有する植物細胞が、市販の作物種由来の植物細胞である、請求項1に記載の方法。植物細胞が、タバコ、ニンジン、トウモロコシ、キャノーラ、ナタネ、綿、パーム、ピーナッツ、大豆、オリザ種、シロイヌナズナ種、トウゴマ種、およびサトウキビ細胞からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。植物細胞が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される組織由来である、請求項6に記載の方法。細胞壁を有する植物細胞が、培養細胞である、請求項1に記載の方法。ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項1に記載の方法。半導体ナノ粒子が量子ドットである、請求項10に記載の方法。ナノ粒子の表面を誘導体化することをさらに含む、請求項1に記載の方法。対象とする直鎖核酸分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。対象とする直鎖核酸分子が遺伝子を含む、請求項13に記載の方法。遺伝子が、外来タンパク質遺伝子、農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項14に記載の方法。対象とする直鎖核酸分子が、ヌクレアーゼでの核酸分子の消化から得られる、請求項1に記載の方法。ヌクレアーゼで消化された核酸分子が、プラスミド、コスミド、人工染色体、酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。対象とする直鎖核酸分子を安定に組み込んでいる細胞を選択することをさらに含む、請求項13に記載の方法。選択された細胞が再生可能な細胞である、請求項18に記載の方法。再生可能な細胞から植物を再生することをさらに含む、請求項19に記載の方法。対象とする直鎖核酸分子を植物材料に導入する方法であって、植物細胞、植物組織、および植物からなる群から選択される植物材料を用意する工程、ナノ粒子をポリエチレングリコールで被覆する工程、ナノ粒子を対象とする直鎖核酸分子で被覆する工程、細胞壁を有する植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、ならびに植物材料へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子の取り込みを可能にする工程を含む方法。植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎からなる群から選択される植物組織である、請求項21に記載の方法。形質を植物に遺伝子移入するための方法であって、植物細胞を用意する工程、ポリエチレングリコールでナノ粒子を被覆する工程、植物に形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程、植物細胞と被覆されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、植物細胞へのナノ粒子および植物に形質を発現させるための手段の取り込みを可能にする工程、形質転換された植物細胞から植物全体を再生する工程、ならびに植物を繁殖させる工程を含む方法。形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌性病害に対する抵抗性、真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。本明細書において、細胞壁を有する植物細胞に、対象とする分子を導入するためのナノ粒子および直鎖化された核酸分子を使用するための方法および組成物が記載されている。本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定に形質転換され、遺伝子修飾された稔性植物を生成するために用いてもよい。いくつかの実施形態では、直鎖核酸分子の特徴的性質は、トランスジェニック標的生物用の制御結果を有する場合がある異質な核酸配列なしに、対象とする特異的遺伝子配列の送達を可能にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、直鎖核酸分子を用いてPEG化してもよい。具体的な実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットQDなどの半導体ナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態では、直鎖核酸分子は、直鎖化されたプラスミドDNAであってもよい。他の実施形態では、直鎖核酸分子は、ホスホイノスリシン-N-アセチルトランスフェラーゼPATおよび/または黄色蛍光タンパク質YFPをコードする配列を含んでもよい。また、細胞壁を有する植物細胞に対象とする分子を導入するための方法が開示され、この方法は、細胞壁を有する植物細胞を用意する工程、PEGでナノ粒子の表面を被覆してPEG化されたナノ粒子を製造する工程、少なくとも1つの対象とする直鎖核酸分子で、PEG化されたナノ粒子を被覆する工程、細胞壁を有する植物細胞と、対象とする直鎖核酸分子単数または複数で被覆されたPEG化されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、ならびに細胞壁を含む細胞へのナノ粒子および対象とする直鎖核酸分子単数または複数の取り込みを可能にする工程を含んでもよい。さらに、形質を植物に遺伝子移入するための方法が開示されている。いくつかの実施形態では、この方法は、植物細胞を用意する工程、PEGでナノ粒子の表面を被覆して、PEG化されたナノ粒子を製造する工程、植物に形質を発現させるための手段で、PEG化されたナノ粒子を被覆する工程、植物細胞と、この植物に形質を発現させるための手段で被覆されたPEG化されたナノ粒子を互いに接触させて配置する工程、形質転換された植物細胞を生成するために、植物細胞へのナノ粒子および植物に形質を発現させるための手段の取り込みを可能にする工程、形質転換された植物細胞から植物全体を再生する工程、ならびに植物を繁殖させる工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って遺伝子移入され得る形質は、限定されないが、雄性不稔;除草剤抵抗性;虫害抵抗性;ならびに細菌性病害、真菌性病害、および/またはウイルス性病害に対する抵抗性から選択される形質を含む。また、植物の植物体形質転換に使用してもよい本発明の方法が開示されている。いくつかの実施形態では、植物は、シロイヌナズナ属の植物、例えば、シロイヌナズナAthalianaから選択してもよい。具体的な実施形態では、植物体形質転換によって形質転換される植物は、コロンビアColumbia生態型のシロイヌナズナAthaliana植物から選択され得る。さらに、遺伝子修飾GMされた植物細胞、およびそれらの細胞を生成するための方法が開示され、ここで、植物細胞は、本発明の方法を介して、そこに導入される1または複数の核酸を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子、および選択可能なマーカーを含むプラスミドは、本発明に従ってナノ粒子を介して、細胞壁を有する植物細胞に導入してもよい。さらなる実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子および/または選択可能なマーカーを安定に組み込んでいる安定な形質転換体を選択してもよい。代替の実施形態では、ここで、少なくとも1つの対象とする遺伝子を含む植物細胞は、対象とする分子を含む他の細胞を生成するために繁殖してもよい。他の実施形態では、ここで、対象とする分子を含む植物細胞は、対象とする分子を含む植物全体を再生するために用いてもよい再生可能な細胞であってもよい。さらに、組織培養において使用するための、対象とする分子を含む再生可能な植物細胞を創作する方法が開示されている。組織培養は、再生可能な細胞と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる場合がある。このような組織培養における再生可能な細胞は、例えば、胚;原形質体;分裂組織細胞;カルス;花粉;葉;葯;根;根端;花;種子;鞘;または茎であってもよい。なおさらに、いくつかの実施形態は、本発明の組織培養から再生された植物を提供する。所望の形質または対象とする核酸分子を含む安定化された植物系を生成するための方法がさらに開示され、ここで、所望の形質または対象とする核酸分子は、植物細胞壁を通してナノ粒子を取り込むことによって最初に導入してもよい。安定化された植物系を生成する方法は、当業者に周知であり、限定されないが、自殖;戻し交雑;ハイブリッド生産;集団交雑crossestopopulationsなどの技術を含んでもよい。したがって、また、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みによって、植物細胞またはその先行物predecessorに最初に導入される所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物および植物細胞が開示されている。細胞壁を通したナノ粒子の取り込みによって、植物または細胞またはその先行物に最初に導入される所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物細胞は、他の異なる植物細胞との交配に使用され、所望の特徴を有する第1世代F1のハイブリッド細胞;種子;および/または植物を生成することができる。上記される例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、以下の説明を考慮して明らかとなる。配列表配列番号1は、YFP遺伝子:TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACGを増幅するために用いられたフォワードプライマー配列を示す。配列番号2は、YFP遺伝子:TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCAを増幅するために用いられたリバースプライマー配列を示す。配列番号3は、PAT遺伝子:GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAGを増幅するために用いられたフォワードプライマー配列を示す。配列番号4は、PAT遺伝子:AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTGを増幅するために用いられたリバースプライマー配列を示す。I.いくつかの実施形態の概要非侵襲的な遺伝子移入を可能にする本発明の方法は、所望の形質を有する遺伝子修飾された植物を生成するために非常に有用であり得る。非侵襲的な遺伝子移入は、場所に対して、細胞内に分子部位の特定の標的化および編集を促進することができ、所望のインプット、アウトプット、および農業的形質を作物に組み込むことが挙げられる。また、記載されている方法は、植物の一過性の形質転換について非GMOオプションとして有用であり得、樹木または野菜作物への形質の遺伝子移入および病害抵抗性に関する技術を拡張するが、現在は、この技術は制限されている。最近の特許出願U.S.S.N.60/978,059は、特に、環状プラスミドDNAを送達するために、様々なナノ粒子積載量を用いたナノ粒子に基づくDNA送達の非侵襲的手段を示し、シロイヌナズナ植物のT1種子にトランス遺伝子の安定な組み込みを明確に示している。植物において生成される環状プラスミドDNAを含むトランスジェニック植物は、所望の除草剤耐性表現型を提示し、同時に少なくとも4倍、現場レベルのグルホシネートアンモニウムで噴霧された場合、高レベルの耐性を示した。U.S.S.N.60/978,059は、特に、環状プラスミドDNAを用いた、正に帯電した金ナノ粒子によるシロイヌナズナにおける遺伝形質転換を示した。本研究は、特に、植物の安定な遺伝形質転換のための直鎖核酸分子の使用を記載する。U.S.S.N.60/978,059は、特に、正に帯電したナノ粒子を媒介したプラスミドDNA送達を記載する。しかしながら、直鎖プラスミドに基づく送達を用いたトランス遺伝子の安定なゲノム組み込みの実証は、今まで報告されていない。本開示は、植物における安定な遺伝形質転換のための正に帯電したナノ粒子を媒介した直鎖核酸分子の使用を記載する。分子分析は、本発明の方法によって、pat遺伝子およびyfp遺伝子を用いて形質転換されたトランスジェニックT1シロイヌナズナ植物におけるPATと一緒のYFPの発現を示した。T1トランスジェニック植物は、稔性となり、種子を生産する。これらの種子は、繁殖させてもよく、分離比分析は、分子分析およびタンパク質分析とともに実施することができる。直鎖核酸分子は、それを環状プラスミドDNAから区別する特徴的な性質を有する。例えば、直鎖核酸分子は、ベクター骨格および細菌抗菌性選択可能なマーカーを含まない十分に画定された遺伝子カセットを有してもよい。除草剤であるグルホシネートアンモニウムGLAは、トランスジェニックをスクリーニングするために、現場レベル濃度で噴霧してもよい。本発明の方法を用いて生産されたシロイヌナズナT1苗木は、例えば、発芽後の最初の7日間、隔日で、現場レベル投薬量のグルホシネートの5回塗布に対する除草剤抵抗性を示した。これらのトランスジェニック植物からのゲノムDNAは、PCRによってpatおよびyfpの存在について分析され、結果はpatおよびyfp標的DNA配列を示した。PCR産物の配列決定の結果は、本発明の方法を用いて生産されたT1シロイヌナズナにおけるpatおよびyfpトランス遺伝子の正確な配列を表した。II.用語以下に続く説明および表において、多数の用語が使用される。そのような用語が示す範囲を含めて明細書および特許請求の範囲の明確かつ一致した理解を与えるために、以下の定義が提供される:戻し交雑:本明細書において使用するとき、用語戻し交雑は、育種家がハイブリッド後代をもとの親例えば、F1ハイブリッドの親の遺伝型の内の1つを有する第1世代ハイブリッドF1の内の1つと繰り返し交雑させるプロセスであり得る。胚:本明細書において使用するとき、用語胚は、成熟種子内に含まれる小植物を意味することができる。ナノ粒子:本明細書において使用するとき、用語ナノ粒子は、少なくとも1つのナノスケール次元、例えば、100nm未満である顕微粒子を意味することができる。本発明の使用に適したナノ粒子は、サイズが1nm~0.84μmであってもよい。ナノ粒子の1つの種類は量子ドットQDである。量子ドットは、中央値径が1nm~10nm、例えば、2~4nmであってもよい。ナノ粒子の他の種類には、限定されないが、金ナノ粒子;金被覆ナノ粒子;多孔性ナノ粒子;メソ多孔性ナノ粒子;シリカナノ粒子;ポリマーナノ粒子、例えばデンドリマー;タングステンナノ粒子;ゼラチンナノ粒子;ナノシェル;ナノコア;ナノスフェア;ナノロッド;磁気ナノ粒子;およびそれらの組み合わせが挙げられる。利用可能なナノ粒子のうち、発光性半導体ナノ結晶QDは、生物学的画像および感知における多数の実証された応用を提供する。それらの利用性は、巨大タンパク質と匹敵する、固有の光物理的特徴および大きさの組み合わせに由来する。親水性CdSe-ZnSQDの流体力学半径は、5nm分子リガンドと交換されるナノ結晶キャップについてからブロックコポリマー内にカプセル化されるナノ結晶について20nmまで変化する。単一のQDは、いくつかの生体分子例えば、抗体;ペプチド;および核酸分子にコンジュゲートされ、結合力が増大した多機能性QDバイオコンジュゲートを提供することができる。さらに、化学物質および光崩壊に対するそれらの強い抵抗性は、特定の生物学的プロセスの長期間の蛍光モニタリングを潜在的に可能にできる。NieおよびEmoryScience27511026。金属親和性自己集合およびビオチン-アビジン結合に基づく、複数の非共有コンジュゲーションスキームは、さらなる精製を必要とせずに、同じ複合体内に同時に適用することができ、細胞内環境においてさえ安定である多機能性QDバイオコンジュゲートを生成することができる。YezhelyevらJAmChemSoc130900612。QDあたり平均10個のYFPと名目上50個の細胞透過性ペプチドCPPを利用することによって、少なくとも300kDaの分子量と150オングストロームの空間的伸張を有するタンパク質積荷の細胞内送達を達成することができる。同文献。QD-b-PEコンジュゲートに関する送達された積荷は、非常に広範囲の大きさおよび分子量を有し;例えば、コンジュゲートあたり平均2.5個のストレプトアビジン-b-PEを有し、送達された集合体は、103kDaを潜在的に超える分子量、および500オングストロームに達する全体寸法を有する。より高いb-PE価を有するコンジュゲートが用いられる場合、分子量および大きさは、大幅に増加し得る。核酸分子:ヌクレオチドのポリマー形態であり、RNA、cDNA、ゲノムDNA、人工染色体ACE、および合成形態、ならびに前述の混合されたポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含むことができる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。核酸分子は、本明細書において使用するとき、核酸およびポリヌクレオチドと同義である。核酸分子は、通常、他に指定がなければ、長さは少なくとも10塩基である。この用語は、一本鎖および二本鎖形態のDNAを含む。核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド結合および/または天然に生じないヌクレオチド結合によって連結された天然に生じるヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれか、またはそれらのヌクレオチドの両方を含んでもよい。作動可能に連結された:第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係にある場合、第1の核酸配列が第2の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。組換え的に生成される場合、作動可能に連結された核酸配列は連続的であってもよく、2つのタンパク質コード領域を接続することを必要とする場合、同じ読み取り枠であってもよい。しかしながら、核酸は、作動可能に連結させるために、連続的である必要はない。PEG化された:本明細書において使用するとき、用語PEG化されたは、ナノ粒子の表面が改善された生体適合性のためにポリエチレングリコールPEGを用いて修飾されたナノ粒子例えば、量子ドットを意味することができる。PEG化されたナノ粒子は、特定の細胞および組織への送達効率性を増大させるために、様々な標的リガンド、例えば、ペプチドおよび抗体でさらに被覆してもよい。PEGは、立体安定化効果を介して、例えば、タンパク質の非特異的な吸着を減らすことによって、被覆されたナノ粒子の血中循環時間を伸ばすために、種々の薬物;リポソーム;および高分子ミセルを有するナノ粒子にコンジュゲートされている。量子ドット:本明細書において使用するとき、用語量子ドットQDまたナノ結晶としても知られていることがあるは、3つ空間方向の全部において、伝導帯電子、価電子帯ホール、または励起子伝導帯電子と価電子帯ホールの上下限の動作を制限する半導体ナノ構造を意味することができる。この制限は、例えば、外部電極、薬物使用、緊張、不純物などによって発生した静電ポテンシャル;例えば、コア-シェルナノ結晶系における異なる半導体材料間の接触面の存在;半導体表面例えば、半導体ナノ結晶の存在;またはそれらの組み合わせに起因し得る。量子ドットは、離散的な量子化エネルギースペクトルを有してもよい。対応する波動関数は、量子ドット内に空間的に局在化してもよいが、結晶格子を長期間にわたって拡張し得る。量子ドットは、小さな有限数例えば、1~100オーダーの伝導帯電子;価電子帯ホール;または励起子すなわち、有限数の基本電荷を含む。量子ドットは、II~VI、III~V、またはIV~VI物質の周期群で構成される結晶であってもよい、特別な種類の半導体材料である。それらの大きさは、例えば、直径にして2~10ナノメートル10~50原子の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、量子ドットは、セレン化カドミウム硫化鉛コアシェルCdSe/ZnSで作られてもよく、バルク材の性質とは特徴において異なる、ある範囲の有用な電気的性質および光学的性質を有する。量子ドットナノ粒子は、インビボおよびインビトロにおいて、造影剤として調べられている。これは、それらの高量子収率;高いモル減衰係数;および光退色に対する高い抵抗性のためである。グリホセート抵抗性:ある投薬量のグリホセートに対する抵抗性は、その投薬量のグリホセートまで植物が生存するすなわち、植物が枯れることのない能力を意味する。いくつかの場合において、耐性植物は、一時的に黄変になってもよく、または他にいくらかのグリホセート誘導性障害例えば、分げつ過剰および/または生育阻害を呈するが、回復され得る。安定化された:本明細書において使用するとき、用語安定化されたは、同じ品種の自殖植物の一世代から次世代へ再生可能に継代される植物の特徴を意味することができる。トランス遺伝子:本明細書において使用するとき、用語トランス遺伝子は、外因性の核酸配列を意味することができる。一例において、トランス遺伝子は、遺伝子配列例えば、除草剤抵抗性遺伝子;産業的もしくは医薬的に有用な化合物をコードする遺伝子;または所望の農業的形質をコードする遺伝子である。なお別の例において、トランス遺伝子は、アンチセンス核酸配列であり、ここで、アンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。トランス遺伝子は、トランス遺伝子に作動可能に連結された制御配列を含んでもよい例えば、プロモーター。いくつかの実施形態では、ナノ粒子を媒介した形質転換によって導入されるべき対象とする核酸分子はトランス遺伝子である。しかしながら、他の実施形態では、対象とする核酸分子は、内因性の核酸配列であり、ここで、内因性の核酸配列のさらなるゲノムコピーは望まれ;または、宿主生物における標的核酸分子に対してアンチセンス配向にある核酸分子である。取り込み:本明細書において使用するとき、用語取り込みは、細胞壁または細胞膜を通して、ナノ粒子例えば、量子ドットなどの粒子の移動を意味することができ、ここで、移動は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによって粒子に与えられるモーメントの結果としては単独に生じるのではない。粒子に与えられるモーメントの結果として単独で細胞壁または細胞膜を通して粒子の移動を生じるデバイスまたは方法の非制限的な例は、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、および/またはインペールフェクションimpalefection技術である。III.植物細胞の安定な形質転換のためのナノ粒子を用いたDNA分子送達A.概要本発明は、例えば、遺伝形質転換および安定なトランスジェニック植物の開発のための直鎖化プラスミドDNAのナノ粒子を媒介した移動を用いた植物形質転換のための新規な方法を記載する。ある種の実施形態による方法は、トランスジェニック生物の迅速な生成だけでなく、他の形質転換法と比較したとき、所望のゲノム修飾のためのいくつかの可能性も提供することができる。本発明の実施形態は、ナノ粒子を媒介した直鎖化プラスミドDNA送達を介して生産される、最初に報告される安定に形質転換された植物をもたらした。遺伝子修飾の開示された方法は、植物の遺伝形質転換の伝統的な方法からの逸脱であり、トランスジェニック作物の生成に非常に有用であり得る。B.DNA分子特定のタンパク質またはRNA産物例えば、干渉RNARNAiをコードする遺伝子の単離および特徴付けを可能にしている分子生物学的技術の到来により、植物生物学の分野の科学者らは、例えば、特定のやり方で細胞の形質を変えるために外来遺伝子、または天然もしくは内在遺伝子おそらく異なるプロモーターによって駆動されるの追加的もしくは修飾されたバージョンを含み、発現するために細胞のゲノムを操作することに強い関心を進展させた。このような外来の追加的および/または修飾された遺伝子は、本明細書において総称としてトランス遺伝子と称される。トランス遺伝子は、例えば、対象とするタンパク質をコードしてもよく、またはRNAiに転写されてもよい。最近の15から20年間にわたって、トランスジェニック細胞を生成するためのいくつかの方法が開発されており、具体的な実施形態において、本発明は、細胞壁を通してナノ粒子の取り込みを介して、細胞壁を有する植物細胞に1または複数の直鎖核酸分子を導入することにより、形質転換型の細胞およびそれらを生成する方法に関する。本発明のいくつかの実施形態において、トランス遺伝子は、直鎖化発現ベクターに含まれてもよい。細胞形質転換は、特定の細胞で機能する発現ベクターの構築を伴ってもよい。このようなベクターは、調節エレメント例えば、プロモーター、エンハンサー、終止配列またはそれらの組み合わせの制御下の、またはそれに作動可能に連結された遺伝子を含む核酸配列を含んでもよい。したがって、発現ベクターは、1つまたは複数のそのように作動可能に連結した遺伝子/調節エレメントの組み合わせを含有できる。ベクター単数または複数は、プラスミドの形態であってよく、細胞壁を含む植物細胞の遺伝物質にトランス遺伝子単数または複数を組み込むために、本明細書において記載される形質転換法を用いて形質転換された細胞を提供するために単独でまたは他のプラスミドと組み合わせて用いてもよい。実施形態において、対象とする核酸分子は、直鎖核酸分子であってもよい。直鎖核酸分子は、例えば、制限エンドヌクレアーゼでの環状プラスミドの消化によって生成してもよい。制限エンドヌクレアーゼは、プラスミドヌクレオチド配列内の1または複数の認識部位でプラスミドを開裂する。したがって、プラスミドは、特定の制限エンドヌクレアーゼでの消化によって、1または複数の特定の直鎖核酸分子の生成を可能にするように設計してもよい。あるいは、所定のプラスミドヌクレオチド配列は、1または複数の特定の直鎖核酸分子の生成を可能にする1または複数の特定の制限エンドヌクレアーゼの認識部位について探索することができる。環状プラスミドまたは直鎖核酸分子内の特定の場所で開裂する制限部位を選択することによって、前駆体核酸分子から1または複数の配列を欠損している、得られる直鎖核酸分子を生成することができる。例えば、異質な核酸配列例えば、ベクター骨格;選択マーカー、例えば細菌選択マーカー;および標的細胞のゲノムDNAに相同である不要な核酸配列を欠損している直鎖核酸分子を生成してもよい。あるいは、異質な核酸配列を欠損している直鎖核酸分子を合成してもよい。対象とする分子が1または複数の遺伝子を含む実施形態において、その遺伝子単数または複数は優性または劣性対立遺伝子であってもよい。例えば、その遺伝子単数または複数は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌抵抗性の抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄の妊性、雄性不稔、栄養価の増大、および産業利用としてこのような形質を与えてもよい。これらの形質および他の形質を付与する遺伝子は、当該技術分野において知られ、任意の遺伝子は、本発明の方法に従って、細胞壁を含む細胞に導入してもよい。直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター:マーカー遺伝子発現ベクターは、マーカーを含む形質転換細胞がネガティブ選択すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖阻害、またはポジティブ選択すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングのいずれかによって回収されるようにする例えば調節エレメントに作動可能に連結された少なくとも1つの遺伝子マーカーを任意に含むことができる。形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤に非感受性であり得る変化した標的をコードする遺伝子を含む。また、特定のポジティブ選択方法は当該技術分野において知られている。ある種の核酸分子を用いた植物の形質転換に適していてもよい1つの選択可能なマーカー遺伝子は、カナマイシンへの抵抗性を付与する、場合により植物調節シグナルの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼIInptII遺伝子である。例えばFraleyらProcNatlAcadSciUSA804803を参照されたい。使用してもよい別の選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例えば、VandenElzenらPlantMolBiol5299を参照されたい。本発明の方法に用いてもよい追加的な選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のもの、例えば、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド-3’-アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオマイシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含む。HayfordらPlantPhysiol861216JonesらMolGenGenet21086SvabらPlantMolBiol14197およびHilleらPlantMolBiol7171を参照されたい。他の選択可能なマーカー遺伝子はグリホセート;グルホシネート;またはブロモキシニルなどの除草剤への抵抗性を付与してもよい。ComaiらNature317741744GordonKammらPlantCell2603618およびStalkerらScience242419423を参照されたい。本発明の方法に用いてもよい他の選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のものではないものを含む。これらの遺伝子は、例えば、限定されないが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素;植物5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素;および植物アセト乳酸合成酵素を含む。EichholtzらSomaticCellMolGenet1367ShahらScience233478およびCharestらPlantCellRep8643を参照されたい。植物の形質転換に適したマーカー遺伝子の他の種類は、抗生物質などの毒性物質への抵抗性についての形質転換細胞の直接的な遺伝的選択よりも形質転換されたと仮定される植物細胞のスクリーニングを必要とする場合がある。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子発現の空間分布を定量または可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調査のためにそれらが遺伝子または遺伝子制御配列に融合され得るため、しばしばレポーター遺伝子と称される。形質転換細胞をスクリーニングするために通常使用される遺伝子としては、限定されないが、β-グルクロニダーゼGUS;β-ガラクトシダーゼ;ルシフェラーゼ;およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。JeffersonPlantMolBiolRep5387TeeriらEMBOJ8343KonczらProcNatlAcadSciUSA84131およびDeBlockらEMBOJ31681を参照されたい。近年、植物組織の破壊を必要としないGUS活性を可視化するためのこれらのインビボ法が利用可能になっている。MolecularProbespublication2908ImageneGreen14頁およびNalewayらJCellBiol115151a。より最近になって、蛍光タンパク質をコードする遺伝子例えば、GFP、EGFP、EBFP、ECFP、およびYFPが、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現のためのマーカーとして利用されている。ChalfieらScience263802を参照されたい。したがって、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の突然変異は、いくつかの実施形態において、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。ナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター:プロモーター発現ベクターに含まれる遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの種類は、単独またはプロモーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同様に、形質転換の技術分野において今や周知である。プロモーターは、転写の開始点より上流であってもよく、RNAポリメラーゼおよび/または転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与してもよいDNAの領域である。植物プロモーターは、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり得る。発生調節下のプロモーターの例としては、葉;根;種子;繊維;木部導管;仮導管;または厚壁組織などのある種の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、組織優先的と称される。ある種の組織においてだけ転写を開始するプロモーターは、組織特異的と称される。細胞型特異的プロモーターは、1または複数の器官、例えば根または葉における維管束細胞でのある種の細胞型において主に発現を駆動する。誘導可能なプロモーターは、環境制御下にある場合があるプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、限定されないが、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導可能なプロモーターは、非構成的プロモーターの種類を構成する。構成的プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であってよいプロモーターである。1.誘導可能なプロモーター誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。誘導可能なプロモーターにより、転写速度は誘導剤に反応して増加する。任意の誘導可能なプロモーターは、本発明の実施形態において用いることができる。WardらPlantMolBiol22361366を参照されたい。例示的な誘導可能なプロモーターは、限定されないが、銅に反応するACEI系由来のものMettらProcNatlAcadSciUSA9045674571;ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤に反応するトウモロコシ由来のIn2遺伝子HersheyらMolGenGenetics227229237およびGatzらMolGenGenetics2433238;ならびにTn10由来のTet抑制因子GatzらMolGenGenetics227229237を含む。特に有用な誘導可能なプロモーターは、植物が通常は反応しない誘導剤に反応するプロモーターであってもよい。このような例示的な誘導可能なプロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導可能なプロモーターであり、その転写活性はグルココルチコステロイドホルモンによって誘導され得る。SchenaらProcNatlAcadSciUSA880421。2.構成的プロモーター構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。様々な構成的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示的な構成的プロモーターは、限定されないが、CaMV由来の35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーターOdellらNature313810812;イネアクチン遺伝子由来のプロモーターMcElroyらPlantCell2163171;ユビキチンChristensenらPlantMolBiol12619632、およびChristensenらPlantMolBiol18675689pEMULastらTheorApplGenet81581588MASVeltenらEMBOJ327232730;トウモロコシH3ヒストンLepetitらMolGenGenetics231276285、およびAtanassovaらPlantJournal2291300;ならびにALSプロモーター、Xba1/NcoI断片5’からセイヨウアブラナBrassicanapusALS3構造遺伝子または前記Xba1/NcoI断片と類似のヌクレオチド配列を含む。国際PCT公開第WO96/30530号を参照されたい。3.組織特異的または組織優先的プロモーター組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換された植物は、特定の組織においてトランス遺伝子のタンパク質産物を排他的または優先的に産生され得る。任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、限定されないが、例えば、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーターMuraiらScience2347682、およびSenguptaGopalanらProcNatlAcadSciUSA8233204;例えばcabまたはrubisco由来のプロモーターなどの葉特異的および光誘導プロモーターSimpsonらEMBOJ427232729、およびTimkoらNature31857982;例えば、LAT52由来のプロモーターなどの葯特異的プロモーターTwellらMolGenGenetics2172405、例えば、Zm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーターGuerreroらMolGenGenetics2441618および例えば、apg由来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーターTwellらSexPlantReprod621724を含む。トランス遺伝子によって生成されるタンパク質の、葉緑体;空胞;ペルオキシソーム;グリオキシソーム;細胞壁;もしくはミトコンドリアなどの細胞内コンパートメントへの輸送、またはアポプラストへの分泌は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子のシグナル配列から5’および/または3’領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することによって達成してもよい。その遺伝子の5’および/または3’末端での標的化配列は、例えば、タンパク質合成およびプロセシング中に、コードされたタンパク質がどこで最終的にコンパートメント化され得るかを決定することができる。代わりに、そのような細胞内コンパートメント標的化タンパク質は、所望の細胞内コンパートメントに対象とする核酸分子で被覆されたナノ粒子を指向するために直接ナノ粒子に連結してもよい。シグナル配列の存在は、細胞内小器官もしくは細胞内コンパートメントのいずれか、またはアポプラストへの分泌にポリペプチドを指向してもよい。多数のシグナル配列が当該技術分野において知られている。例えば、BeckerらPlantMolBiol2049ClosePSMastersThesisIowaStateUniversityKnoxらPlantMolBiol9317LernerらPlantPhysiol911249FontesらPlantCell348396MatsuokaらProcNatlAcadSciUSA88834GouldらJCellBiol1081657CreissenらPlantJ2129KalderonらCell39499509SteifelらPlantCell278593を参照されたい。外来タンパク質遺伝子および農学的遺伝子本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrrAnalBiochem114926で検討されている既知の方法によって達成され得る。本発明のいくつかの態様において、外来タンパク質の商業的生産のために提供される植物材料は、植物、植物組織、または植物細胞であってもよい。いくつかの態様において、対象とするバイオマスは植物種子であってよい。より高レベルの発現を示すトランスジェニック植物について、遺伝子地図は、例えば、組み込まれたDNA分子の近似の染色体位置を同定する従来のRFLP、PCRおよびSSR分析を介して作成してもよい。この点に関する例示的な方法について、GlickおよびThompsonMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyCRCPressBocaRaton269284を参照されたい。染色体位置に関する地図情報は、例えば対象のトランスジェニック植物の所有権の保護、またはバイオセーフティ評価において有用であり得る。認可されていない繁殖が行われ、他の生殖質との交雑物が作製され得る場合、組み込み領域の地図は、疑われる植物についての同様の地図と、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうかを決定するために比較され得る。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、RFLP、PCR、SSRおよび配列決定を含み得、その全ては従来型の技術である。同様に、農業的遺伝子は、形質転換された細胞またはそれらの後代において発現され得る。より具体的には、植物は、農業的目的での種々の表現型を発現するために本発明の方法を介して遺伝子操作され得る。この点において使用され得る例示的な遺伝子として、限定されないが、以下に分類されるものが挙げられる。1.有害生物または病害への抵抗性を付与する遺伝子:A植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子Rの産物と病原体中の対応する非病原性Avr遺伝子の産物との間の特定の相互作用によってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するためにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesらScience266789クラドスポリウムフルバムCladosporiumfulvumへの抵抗性のためのトマトCf-9遺伝子のクローニング;MartinらScience2621432シュードモナスシリンゲPseudomonassyringae病原型への抵抗性のためのトマトPto遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする;MindrinosらCell781089シュードモナスシリンゲへの抵抗性のためのRSP2遺伝子を参照されたい。B例えばダイズシストセンチュウsoybeancystnematodeなどの有害生物への抵抗性を付与する遺伝子。例えば、国際PCT公開第WO96/30517号;国際PCT公開第WO93/19181号を参照されたい。Cバチルスチューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、またはそれをモデル化した合成ポリペプチド。例えば、GeiserらGene48109Btδ-エンドトキシン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列を参照されたい。さらに、δ-エンドトキシン遺伝子をコードするDNA分子は、例えばATCC受入番号40098;67136;31995;および31998でAmericanTypeCultureCollectionManassas,VAから購入することができる。Dレクチン。例えば、VanDammeらPlantMolecBiol2425いくつかのクンシランCliviaminiataマンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。E例えばアビジンなどのビタミン結合タンパク質。国際PCT公開第US93/06487号害虫に対する殺幼虫剤larvicideとしてのアビジンおよびアビジン相同体の使用を参照されたい。F酵素阻害剤、例えばプロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤、またはアミラーゼ阻害剤。例えば、AbeらJBiolChem26216793イネシステインプロテイナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列;HuubらPlantMolecBiol21985タバコプロテイナーゼ阻害剤IをコードするcDNAのヌクレオチド配列;SumitaniらBiosciBiotechBiochem571243ストレプトマイセスニトロスポレウスStreptomycesnitrosporeusアルファ-アミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列および米国特許第5,494,813号を参照されたい。G例えばエクジステロイドまたは幼若ホルモン、それらの変異体、それらに基づく模倣物、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン。例えば、HammockらNature344458クローン化された幼若ホルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子のバキュロウイルス発現を参照されたい。H影響を受けた有害生物の生理機能を発現によって破壊する昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。例えば、ReganJBiolChem2699発現クローニングは昆虫利尿ホルモン受容体をコードするDNAを産出する;およびPrattらBiochemBiophysResComm1631243アロスタチンはディプロプテラパンタタDiplopterapuntataにおいて同定され得るを参照されたい。米国特許第5,266,317号昆虫特異的な麻痺性神経毒をコードする遺伝子も参照されたい。I天然でヘビ、スズメバチまたは任意の他の生物によって産生される昆虫特異的毒液。例えば、PangらGene116165サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種性発現を参照されたい。Jモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質性分子の高度集積に関連する酵素。K生物学的に活性な分子、例えば天然または合成での、解糖系酵素;タンパク質分解酵素;脂肪分解酵素;ヌクレアーゼ;シクラーゼ;トランスアミナーゼ;エステラーゼ;ヒドロラーゼ;ホスファターゼ;キナーゼ;ホスホリラーゼ;ポリメラーゼ;エラスターゼ;キチナーゼ;またはグルカナーゼの翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素。国際PCT公開第WO93/02197号カルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。キチナーゼをコードする配列を含むDNA分子は、例えばATCCから受入番号39637および67152で得ることができる。KramerらInsectBiochemMolecBiol23691タバコイモムシキチナーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列;およびKawalleckらPlantMolecBiol21673パセリubi4-2ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列も参照されたい。Lシグナル伝達を刺激する分子。例えば、BotellaらPlantMolecBiol24757リョクトウカルモジュリンcDNAクローンについてのヌクレオチド配列;およびGriessらPlantPhysiol1041467トウモロコシカルモジュリンcDNAクローンのヌクレオチド配列を参照されたい。M疎水性モーメントペプチド。例えば、国際PCT公開第WO95/16776号真菌性植物病原体を抑制するタキプレシンのペプチド誘導体;および国際PCT公開第WO95/18855号病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチドを参照されたい。N膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤。例えば、JaynesらPlantSci8943青枯病菌Pseudomonassolanacearumに抵抗性のトランスジェニックタバコ植物を提供するセクロピン-β溶解性ペプチド類似物の異種性発現を参照されたい。Oウイルス性侵襲性タンパク質またはそれら由来の複合毒素。例えば、形質転換された植物細胞におけるウイルス被覆タンパク質の蓄積は、被覆タンパク質遺伝子が由来し得るウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および/または病害の進行への抵抗性を与える。BeachyらAnnrevPhytopathol28451を参照されたい。被覆タンパク質媒介抵抗性は形質転換植物に、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して与えられている。同文献。P昆虫特異的抗体またはそれら由来の免疫毒素。したがって、昆虫の消化管において重要な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を不活性化し、昆虫を死滅させてもよい。TaylorらAbstract497SeventhIntlSymposiumonMolecularPlantMicrobeInteractions一本鎖抗体断片の生成を介するトランスジェニックタバコにおける酵素の不活性化を参照。Qウイルス特異的抗体。例えば、TavladorakiらNature366469組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物はウイルス攻撃から防御されるを参照されたい。R病原体または寄生生物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、真菌エンドα-1,4-D-ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ-α-1,4-D-ガラクツロナーゼを可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物栄養素の放出を促進する。LambらBioTechnology101436を参照されたい。ToubartらPlantJ2367マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特徴付けも参照されたい。S植物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、LogemannらBioTechnology10305オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物は真菌性病害への抵抗性が増大しているを参照されたい。2.除草剤への抵抗性を付与する遺伝子A成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、LeeらEMBOJ71241、およびMikiらTheorApplGenet80449によってそれぞれ記載される突然変異体ALSおよびAHAS酵素をコードする。B例えば、突然変異体5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素EPSP遺伝子組換え核酸の導入および/または種々の形態の天然EPSP遺伝子のインビボ突然変異誘発を介して;それぞれaroA遺伝子およびグリホセートアセチルトランスフェラーゼGAT遺伝子;他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセスハイグロスコピカスStreptomyceshygroscopicusおよびストレプトマイセスビリジクロモゲネスStreptomycesviridichromogenesを含むストレプトマイセス種由来のグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPAT遺伝子;およびピリジノキシまたはフェノキシプロプリオン酸ならびにシクロヘキソン類ACCase阻害剤をコードする遺伝子によって付与されるグリホセート抵抗性。例えば、米国特許第4,940,835号および米国特許第6,248,876号植物にグリホセート抵抗性を付与し得るEPSPの形態のヌクレオチド配列を参照されたい。突然変異体aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受入番号39256で得ることができる。米国特許第4,769,061号突然変異体aroA遺伝子のヌクレオチド配列も参照されたい。欧州特許出願第0333033号および米国特許第4,975,374号は、L-ホスフィノトリシンなどの除草剤への抵抗性を付与し得るグルタミン合成酵素遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。例示的なPAT遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州出願第0242246号、およびDeGreefらBioTechnology761PAT活性をコードするキメラbar遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成において提供される。フェノキシプロプリオン酸、ならびにセトキシジムおよびハロキシホップなどのシクロヘキソン類への抵抗性を付与する遺伝子の例は、MarshallらTheorApplGenet83435によって記載されているAcc1-S1、Acc1-S2およびAcc1-S3遺伝子を含む。グリホセート抵抗性を付与できるGAT遺伝子は、例えば、WO2005012515に記載されている。2,4-D、fopおよびピリジロキシオーキシン除草剤への抵抗性を付与する遺伝子は、例えばWO2005107437に記載されている。CトリアジンpsbAおよびgs遺伝子またはベンゾニトリルニトリラーゼ遺伝子などの光合成を阻害する除草剤。例えばPrzibilaらPlantCell3169突然変異体psbA遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換を参照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,810,648号に開示され、これらの遺伝子を含むDNA分子はATCC受入番号53435;67441;および67442で入手可能である。HayesらBiochemJ285173グルタチオンS-トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニングおよび発現も参照されたい。3.次のような付加価値のある形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子A例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルACP不飽和化酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸代謝。KnultzonらProcNatlAcadSciUSA892624を参照されたい。Bフィチン酸塩含有量の減少。フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸塩の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸塩を増やしてもよい。例えば、VanHartingsveldtらGene12787クロコウジカビAspergillusnigerフィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を参照されたい。フィチン酸塩含有量を減らす遺伝子を導入してもよい。例えばトウモロコシにおいて、これはクローニング、および続く、フィチン酸の低レベルによって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得る単一対立遺伝子に関連するDNAの再導入によって達成され得る。RaboyらMaydica35383を参照されたい。C例えば、デンプンの分枝様式を変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物を形質転換することによって生じた修飾された炭水化物組成物。例えば、ShirozaらJBacteol170810連鎖球菌突然変異体フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオチド配列;SteinmetzらMolGenGenet20220レバンスクラーゼ遺伝子;PenらBioTechnology10292α-アミラーゼ;ElliotらPlantMolecBiol21515トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列;SogaardらJBiolChem26822480オオムギα-アミラーゼ遺伝子;およびFisherらPlantPhysiol1021045トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素IIを参照されたい。C.ナノ粒子本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む細胞例えば、植物細胞に対象とする直鎖核酸分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、対象とする直鎖核酸分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触させて配置し、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。具体的な実施形態において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする直鎖核酸分子を含み、それで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および/または担持してもよい。ある種の実施形態において、対象とする直鎖核酸分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前にナノ粒子に導入され、または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であってもよい。本発明の実施形態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ドットを単独で、または半導体ナノ粒子;正に帯電したナノ粒子;金ナノ粒子;金被覆ナノ粒子;多孔性ナノ粒子;メソ多孔性ナノ粒子;シリカナノ粒子;ポリマーナノ粒子、例えばデンドリマー;タングステンナノ粒子;ゼラチンナノ粒子;ナノシェル;ナノコア;ナノスフェア;ナノロッド;および磁気ナノ粒子と組み合わせて含む。本発明の実施形態によれば、細胞壁を有する植物細胞は、損傷を受けていない細胞壁全体を含む任意の植物細胞であってもよい。細胞壁を有する植物細胞の例は、限定されないが、藻類;タバコ;ニンジン;トウモロコシ;キャノーラ;ナタネ;綿;パーム;ピーナッツ;大豆;サトウキビ;オリザ種Oryzasp;シロイヌナズナ種Arabidopsissp;およびトウゴマ種Ricinusspを含む。本発明の実施形態は、任意の組織、または、限定されないが、胚;分裂組織細胞;カルス;花粉、例えば、半数体および2倍半数体の小胞体;葉;葯;根;根端;花;種子;鞘;茎;および組織培養物を含めて、その中に見出されるあらゆる箇所由来の細胞壁を含む細胞を含んでもよい。本発明の実施形態において、対象とする直鎖核酸分子は、本発明に係る細胞壁を有する植物細胞に送達され得る任意の核酸分子であってもよい。対象とする核酸分子は、限定されないが、DNA;RNA;RNAi分子;遺伝子;プラスミド;コスミド;YAC;およびBACを含んでもよい。対象とする核酸分子は、細胞壁を有する植物細胞に、例えば、限定されないが、ポリペプチド;酵素;ホルモン;糖ペプチド;糖類;脂肪;シグナル伝達ペプチド;抗体;ビタミン;メッセンジャー;セカンドメッセンジャー;アミノ酸;cAMP;薬剤;除草剤;殺菌剤;抗生物質;および/またはそれらの組み合わせと同時に導入してもよい。本発明の具体的な実施形態において、ナノ粒子の表面は、例えば、標的化された取り込みを可能にできるように、またはナノ粒子の表面への他の物質の可逆的もしくは不可逆的結合を可能にできるように官能化してもよい。非限定的な例として、ナノ粒子例えば、量子ドットの表面は、例えば、さらに官能化または誘導体化され得るアルカンチオレートの自己集合化単分子層で官能化してもよい。さらなる非限定的な例において、ナノ粒子の表面は、それ自体がさらに官能化または誘導体化され得るリンカーを用いて誘導体化してもよい。一実施形態において、ナノ粒子はPEG化してもよい。他の実施形態において、ナノ粒子は、1または複数のコア活性もしくは不活性;ステリック被覆活性もしくは不活性;切断可能な結合および/または標的化分子もしくはリガンドを含んでもよく、またはそれで多官能化してもよい。量子ドットなどのナノ粒子は、DubertretらScience2981759のプロトコールを用いて、または当業者の裁量に従ってそれから修飾されたプロトコールによって、PEGにより官能化してもよい。例えば、TOPOトリ-オクチルホスフィンオキシド被覆されたCdSe/ZnS量子ドットをクロロホルム中のPEG-PEとともに懸濁し、次に、溶媒の蒸発、および得られたPEG化量子ドットを水に可溶化してもよい。本発明の態様において、ナノ粒子は、細胞の様々な部分に取り込まれ得る。ナノ粒子が取り込まれ得る位置の例は、限定されないが、細胞質ゾル;核;液胞膜;色素体;エチオプラスト;有色体;白色体;脂肪体;タンパク質プラスト;アミロプラスト;葉緑体;および二重膜の管腔を含む。他の実施形態では、細胞壁を含む細胞へのナノ粒子の取り込みは、シンプラスト的またはアポプラスト的経路を介して行ってもよい。D.安定に形質転換された植物細胞本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって、対象とする直鎖核酸分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であってもよい。したがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、またはそこから培養してもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい。本発明に係る双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アルファルファ;豆類;ブロッコリ;キャベツ;ニンジン;カリフラワー;セロリ;白菜;綿;キュウリ;ナス;レタス;メロン;エンドウ;コショウ;ピーナッツ;ジャガイモ;カボチャ;ダイコン;ナタネ;ホウレンソウ;大豆;スカッシュ;サトウダイコン;ヒマワリ;タバコ;トマト;およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、コーン;タマネギ;イネ;ソルガム;小麦;ライ麦;キビ;サトウキビ;オートムギ;ライ小麦;スイッチグラスおよび芝草を含む。本発明に係るトランスジェニック植物は、本発明の方法によって生成される安定に形質転換された植物細胞から再生することができる。このような植物は、任意の方法で使用または生育してもよく、対象とする核酸分子の存在が望ましい。したがって、トランスジェニック植物は、とりわけ、ナノ粒子を媒介して形質転換を介した直鎖核酸分子を用いて形質転換し、当業者に知られている任意の方法によって植え付けられ、生育されることによって、1または複数の所望の形質を有するように操作され得る。以下の実施例は、ある種の特定の特徴および/または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、例示された特定の特徴または実施形態に本発明を限定するように構築してはならない。[実施例]植物細胞形質転換のためのナノ粒子の調製プラスミドDNAの調製pDAB3831プラスミドDNA図1を単離し、直鎖DNA/PEG化量子ドットPQDを介した植物形質転換のために調製された。このプラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーターAtUbi10によって駆動されるPAT選択可能なマーカー遺伝子およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターCsVMVによって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子PhiYFPを含む。このプラスミドを含む大腸菌Escherichiacoli株を植菌し、37°Cにてアンピシリンを含むLuria-Bertaniブロス中で濁るまで増殖させた。QiagenPlasmidMidi-PrepキットQiagen,Valencia,CAを用いてDNAを単離した。単離されたDNAを制限酵素消化により直鎖化した。制限酵素であるKpnIを用いてこのDNAを消化し、これにより直鎖化されたプラスミドDNAをもたらした。直鎖DNA-PQD複合体の形成量子ドットは、OceanNanotechnologySpringdale,AZから得られた。2mgのTOPOトリ-オクチルホスフィンオキシド被覆されたCdSe/ZnS量子ドットは、クロロホルム中の0.15gm5.5uMolのPEG-PE1.2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ-ポリエチレングリコール]AvantiPolarLipids,Alabaster,ALとともに懸濁され、次に溶媒を蒸発させ、水に可溶化された。PEGコンジュゲーションを完了し、細胞毒性から保護した。PQDを直鎖プラスミドDNAにコンジュゲートした。2mgのPQDは、4mgのHS-PEG-OCH3Prochimia,Zacisze,Polandとともに一晩約60~70°Cにて懸濁された。溶媒を真空オーブン中で除去した。次に、残渣を1mLの水18Mに懸濁させた。最終段階は、赤色の残渣からオレンジ色、光学的に澄んだ透明な溶液への変化によって達成される。形質転換実験のためにH3CO-PET-SH-QD上で直鎖化プラスミドDNAを被覆するため、0.02mgの精製された直鎖化プラスミドDNApDAB3831は、2mLの水中で得られたPQDコンジュゲートとともに2時間、23°Cにて暗所でインキュベートされた。TorneyらNatureNanotechnol2295300。シロイヌナズナ花芽の形質転換植物体遺伝形質転換について、pDAB3831プラスミドをKpnI制限酵素を用いて消化し、DNAを直鎖化した。制限酵素消化後、直鎖化されたDNAは、特定の比のPEG、QD、および直鎖DNAに用いられた。直鎖化DNAを量子ドット、PEGと混合し、30分間インキュベートした。次に、ナノ粒子と直鎖化されたプラスミドDNA溶液からなるナノ複合体は、0.02~0.04のSilwet-L77を含む水中の5ショ糖溶液を含む作業溶液と混合した。植物体形質転換のための植物材料種子の同期された発芽は、T0植物における花発生の均質性を確実するために重要である。シロイヌナズナAthalianacv.コロンビア種子は、0.1w/v寒天溶液中に懸濁され、4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了した。60mgの種子を計量し、15mLチューブに移した。13mLの0.1w/v寒天溶液を添加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、4.6mg種子/1mLの0.1w/v寒天溶液または約230種子/mLの種子溶液濃度を作製する。6本のチューブ72mL溶液を調製し、各トレイに1831/2インチポットを含む4平面に植え付けた。種子溶液を4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持した。ドームを植え付け日後の5日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下16時間明/8時間暗、120~150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度22°Cおよび湿度40~50下でConviron登録商標モデルCMP4030およびCMP3244、ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canadaにおいて生育した。植物は、植物を植え付けた後の10~14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製した。植物体形質転換シロイヌナズナAthalianacv.コロンビアの直鎖DNA/PQDを媒介した形質転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコールを用いて完了した。CloughおよびBentPlantJ1673543。20mLの懸濁液は、0.5mgの直鎖DNAおよび4nMのPQDの濃度で直鎖DNA/PQD複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ植物大部分は、いくつかの受精した長角果fertilizedsiliqueを有する未成熟な花房の処置に使用された。植物を浸漬する前に、0.05w/v250μL/500mL~0.005の濃度にしたSilwetL-77を直鎖DNA/PQD溶液に添加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖DNA/PQD溶液に30秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に30分間、暗くして22~24°Cにて置かれた。植物は、上述される条件下、Convironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収した。選択トレイ10.5’’×21’’×1’’トレイを用いて、バルク回収種子をT0植物からスクリーニングし、各トレイでは約10,000個の種子があった。2つの対照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認した;Col-0負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照としてPATホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアCol-0野生型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の48時間、0.1w/v寒天溶液に層状化された。選択トレイあたり10,000個の種子を与えるために、200mgの種子を0.1w/v寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスした。次に、層状化された種子は、SunshineミックスLP5で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Hoagland溶液を用いて地下潅漑された。有効である選択噴霧について、40mLの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、植物を選択のために生育した。繁殖ドームは、植え付け後の約5日で除かれた。形質転換されたシロイヌナズナの分析形質転換された植物の選択新たに回収されたT1種子は、室温にて7日間乾燥させた。T1種子は26.5×51cmの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め40mLの0.1w/vアガロース溶液に懸濁され、4°Cにて2日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を確認された、層状化されたT1種子の200mgアリコート約10,000個の種子を受け入れた。SunshineMixLP5は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでHoagland溶液で地下潅漑され、次に重力排水された。層状化された種子の各40mLアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライトに均一に植え付けられ、4~5日間、湿式ドームで覆われた。ドームは、グルホシネートの発芽後噴霧を用いて、初期の形質転換体の選択前1日に取り除かれた。植え付け後の7日DAPに、T1植物それぞれ子葉および2-4-lf段階は、1塗布あたり280gae/haグルホシネートの有効速度で送達するために、DeVilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ703L/haの噴霧体積で、Liberty除草剤200gae/Lグルホシネート、BayerCropSciences,KansasCity,MOの0.2w/v溶液を用いて5日以内に連続して5回噴霧された。生き残ったもの活性に生育している植物は、最終噴霧後の4~7日に同定され、鉢植え媒体MetroMix360を用いて調製された3インチのポットに個別に移された。移された植物は、3~4日間、湿式ドームで覆われ、以前の通り22°Cの生育チャンバーに置かれ、または温室に直接移された。ドームは、その後、取り出され、植物は、温室22±5°C、50±30RH、14時間明:10時間暗、最小500μE/m2s1自然追加の光内で生育された。分子分析および生化学分析分子分析は、植物ゲノムへのPATおよびYFP組み込みについて行われた。PCR増幅産物を配列決定し、トランス遺伝子配列と比較された。シロイヌナズナArabidopsisthalianacvコロンビアのT1後代におけるトランス遺伝子のゲノム組み込みのための分子分析および証拠シロイヌナズナAthalianaトランスジェニック植物由来のゲノムDNAは、製造業者の指示書に従って、植物DNAZOL商標Invitrogenを用いて、6週齢の植物の葉材料から抽出された。PCRプライマーは、YFPおよびPATトランス遺伝子を検出するために設計された。YFPプライマーは配列番号1および配列番号2として示される。PATプライマーは配列番号3および配列番号4として示される。トランス遺伝子のgDNAPCR増幅PATおよびYFPについてのPCR増幅反応は、TaKaRaExTaq商標キットTakara,Otsu,Shiga,Japanを用いて完了された。遺伝子産物は、50μLの全反応体積において増幅された。PCR反応は、100ngゲノムDNA鋳型、1×ExTaq反応緩衝液、0.2mMのdNTP、10pMolの各プライマー、および0.025単位/μLのExTaqを含んだ。以下のPCR条件を用いた:96°Cで5分間の1サイクル、および以下の条件:94°Cで15秒間、65°Cで30秒間、72°Cで1分間、および最終伸長72°Cで7分間の31サイクル。PCR増幅産物は、0.8TAEアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化された。DNA断片は、QIAEX商標IIゲル精製キットQiagen,Valencia,CAを用いて、アガロースゲルから精製された。PCR断片は、高度なSanger配列決定技術MWGBiotech,Huntsville,ALを用いて、PATフォワードプライマー配列番号3とYFPフォワードプライマー配列番号1により配列決定された。配列データは、Sequencherソフトウェアを用いて分析された。PATおよびYFPのPCRアンプリコンの配列決定結果は、これらの遺伝子について予期されたヌクレオチド配列と合致していた。これらの結果は、pDAB3831からのPAT配列およびYFP配列は、PEG化量子ドットおよび直鎖DNA形質転換プロトコールを用いて、シロイヌナズナのgDNAに安定に組み込まれたことを明示する。PATおよびYFP黄色蛍光タグ、Evrogen遺伝子産物についてのPCRは、100ngのゲノム鋳型DNA、1×ExTaq反応緩衝液TaKaRaBio、0.2mMのdNTP、10pmolのプライマー、および0.025単位/μLのExTaqを含む、全反応体積が50μLの混合物において増幅された。以下のPCR条件を用いた:96Cで5分間の1サイクル、および以下のPCRプログラム:94°Cで15秒間;65°Cで30秒間;72°Cでの1分間の31サイクル。最終伸長は、72°Cで7分間行い、PCR産物の合成を完了した。ゲル画像は、BioRadゲルイメージングシステムを用いて得られた。図1および2。増幅された断片は、製造業者の指示書に従って、ゲル精製キットQiagenInc.を用いてゲル精製された。PCR断片は、高度のSanger配列決定技術MWGBiotechnologies,Inc.を用いて、PATフォワードプライマーおよびYFPフォワードプライマーにより配列決定され、配列はSequencherソフトウェアカンパニーを用いて分析された。本結果は、PATおよびYFP配列が実施例1における正に帯電したナノ粒子を媒介した直鎖化DNA送達を通じて送達され、したがって、シロイヌナズナのT1植物のゲノムDNAにおけるトランス遺伝子の安定なゲノム組み込みの証拠を与えることを明示する。培養植物細胞への直鎖核酸分子のナノ粒子を媒介した送達単一細胞植物材料を調製する。例えば、BY2細胞およびNT1細胞の両方を用いる。BY2細胞は、緑色でない、増殖が速いタバコ細胞株である。NT1細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞である。形質転換の3から4日前、1週齢の懸濁培養は、250mLフラスコに50nMのDAS-PMTI-1微小管阻害剤および0.5~0.1v/vのDMSOを含む40mlのNT1BまたはLSBY2培地に、2mlのNT1またはBY2培養物を移すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の4日または7日のいずれかで回収される。使用されるBY2単一細胞は、生存細胞をカウントするために、Beckmanフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体アミロプラストを含むことを決定するために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラストDIC顕微鏡を用いて調べられる。細胞は、3.0OD600の懸濁液1mLを移すことによって、14日ごとに一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。ナノ粒子調製および細胞の処理プラスミドDNAは、直鎖DNA/PEG化された量子ドットPQDを媒介した植物形質転換のために単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーターAtUbi10によって駆動されるPAT選択可能なマーカー遺伝子、およびカッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターCsVMVによって駆動されるフィラジウム黄色蛍光タンパク質遺伝子PhiYFPを含む。プラスミドを含む大腸菌Escherichiacoli株は植菌され、37°Cにてアンピシリンを含むLuria-Bertaniブロス中で濁るまで増殖される。DNAは、QiagenPlasmidMidi-PrepキットQiagen,Valencia,CAを用いて単離される。単離されたDNAは、制限酵素消化を介して直鎖化される。制限酵素であるKpnIを用いてDNAを消化し、それにより直鎖化されたプラスミドDNAをもたらす。量子ドットは、OceanNanotechnologySpringdale,AZから得られる。2mgのTOPOトリ-オクチルホスフィンオキシド被覆されたCdSe/ZnS量子ドットは、クロロホルム中の0.15gm5.5uMolのPEG-PE1.2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ-ポリエチレングリコール]AvantiPolarLipids,Alabaster,ALとともに懸濁され、次に溶媒を蒸発させ、水に可溶化される。PEGコンジュゲーションを完了し、細胞毒性から保護する。PQDを直鎖プラスミドDNAにコンジュゲートする。2mgのPQDは、4mgのHS-PEG-OCH3Prochimia,Zacisze,Polandとともに一晩約60~70°Cにて懸濁される。溶媒を真空オーブン中で除去する。次に、残渣を1mLの水18Mに懸濁させる。最終段階は、赤色の残渣からオレンジ色、光学的に澄んだ透明な溶液への変化によって達成される。形質転換実験のためにH3CO-PET-SH-QD上で直鎖化プラスミドDNAを被覆するため、0.02mgの精製された直鎖化プラスミドDNApDAB3831は、2mLの水中で得られたPQDコンジュゲートとともに2時間、23°Cにて暗所でインキュベートされる。TorneyらNatureNanotechnol2295300。1~3μL/mLのPQDの濃度は、24ウェルマイクロタイタープレート中の500μLの細胞に添加され、20分間、暗所で振とう機上で穏やかに回転させる。ナノ粒子は細胞壁を通じて運搬される。多官能化されたナノ粒子を媒介したシロイヌナズナの植物体形質転換シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBentから修飾されたものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のDNA、ならびにホーミングタンパク質形質導入ドメインPTDおよびNLS単位の分子の濃度は、形質転換効率の増加を達成するために最適化される。植物材料:健康なシロイヌナズナ植物は、開花するまで土壌において、ポットに入れて長日下で生育される。第1の束は刈り取られ、多数の第2の束の増殖を促す。植物は、刈り取られた後のおよそ4~6日で準備される。シロイヌナズナArabidopsisthalianaコロンビアCol-0生態型は、花の植物体形質転換のためにバックグラウンドT0植物として選択される。種子の同調された発芽は、T0植物における花芽発生の均質性を確実にするために重要である。野生型種子は、0.1寒天溶液に懸濁され、4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了する。薬包紙上で60mgの種子を計量し、15mLチューブに移す。13mLの0.1寒天溶液を添加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行う。これは、4.6mg種子/1mL溶液または約230種子/mLの濃度を作製する。6本のチューブ72mL溶液を調製し、各トレイに1831/2インチポットを含む4平面に植え付け、全2ポットを植え付ける。溶液を4°Cにて48時間インキュベートし、層別化を完了する。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられる。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持する。ドームを植え付け日後の5日に除く。種子を発芽させ、植物を長日条件下16時間明/8時間暗、120~150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度22°Cおよび湿度40~50下でConviron登録商標モデルCMP4030およびCMP3244、ControlledEnvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canadaにおいて生育する。植物は、植物を植え付けた後の10~14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持する。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせる。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製する。花の処理のためのナノコンジュゲート調製:2~120nmサイズ範囲のナノ粒子/量子ドットは処置のために選択され、Derufusらに従って、断片精製されたpDAB3138およびホーミングペプチド単位を用いて多官能化される。655または705nmの発光極大を有し、PEGおよびアミノ基を用いて修飾された量子ドットは、QuantumDotCorporationITKアミノから得られる。QD濃度は、供給者によって提供される減衰係数を用いて、595nmでの光学的吸収によって測定される。使用される架橋剤は、スルホ-LC-SPDPスルホスクシンイミジル6-3’-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミドヘキサノエートPierceおよびスルホ-SMCCスルホスクシンイミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートSigmaである。アミノ修飾されたQDは、スルホ-LC-SPDPおよびスルホ-SMCC架橋剤を用いて、チオールを含むプラスミドDNAおよびホーミングペプチドにコンジュゲートされる。QDは、AmiconUltra-4100kDaカットオフフィルターを用いて、50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2に再懸濁される。架橋剤1000倍過剰をQDに添加し、1時間反応させる。試料は、10mMのEDTAを補足された類似の緩衝液にNAP-5重力カラム過剰の架橋剤を除去するため上で濾過される。直鎖化プラスミドDNA、pDAB3831は、0.1MのDTTを用いて1時間処理され、EDTA含有緩衝液にNAP-5カラム上で濾過される。ペプチドは、典型的には、凍結乾燥粉末から使用される。ペプチドおよび直鎖化プラスミドDNAは、濾過されたQDに添加され、一晩4°Cにて反応させる。3つのAmiconフィルターを用いて、生成物は、Dulbeccoリン酸緩衝生理食塩水PBSで2回、高塩緩衝液1.0M塩化ナトリウム、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.2で2回、PBSでさらに2回濾過される。高塩洗浄は、PBS洗浄だけでは取り除かれない、静電的に結合されたDNAおよびペプチドを除くために必要とされる。スルホ-SMCCは、1つの末端に、アミド結合を形成するために、アミノ修飾されたQDと反応するN-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルを有し、他の末端に、チオエーテルを形成するために、チオール化されたプラスミドDNAと反応するマレイミド基を有する。また、スルホ-LC-SPDPは、任意の1級アミン含有分子と急速に反応して、安定なアミド結合を形成するアミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルを含む。植物体形質転換およびT1抵抗性植物のスクリーニング:最終体積が250~500mLの懸濁液は、ナノ粒子、ホーミングペプチドおよびプラスミドDNANHpDコンジュゲート溶液を用いて作製され、次にシロイヌナズナ植物大部分は、いくつかの受精した長角果を有する未成熟な花房を処置に用いる。植物を浸漬する前に、0.05250ul/500ml~0.005の濃度にしたSilwetL-77をNHpDコンジュゲート溶液に添加し、十分に混合する。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、NHpDコンジュゲート溶液に2~30秒間浸漬される。処理された植物は、16~24時間、22~24°Cにてドームまたはカバー下に保持される。植物は、Convironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収する。選択トレイ10.5’’×21’’×1’’トレイを用いて、バルク回収種子をT0植物からスクリーニングし、各トレイでは約10,000個の種子がある。2つの対照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認する、Col-0負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照としてPATホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアCol-0野生型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の48時間、0.1w/v寒天溶液に層状化される。選択トレイあたり10,000個の種子を与えるために、200mgの種子を0.1w/v寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスする。次に、層状化された種子は、SunshineミックスLP5で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Hoagland溶液を用いて地下潅漑される。有効である選択噴霧について、40mLの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、先に言及した条件を用いた選択のために、種子を生育する。繁殖ドームは、植え付け後の約5日で除かれる。苗木は、植え付け後の5日、さらに植え付け、苗木噴霧後の10日に、1塗布あたり280g/haグルホシネートの有効速度で送達するために、DeVilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ703L/haの噴霧体積中のグルホシネートアンモニウムBayerCropSciencesからのLIBERTY登録商標除草剤の0.2v/v溶液20μl/10mldH2Oを用いて噴霧される。調製するためのLiberty登録商標の量は以下のように計算される:703L/ha噴霧体積=280GPA。280gai/ha×1ha/703L×1L/200gaiグルホシネート=0.20溶液または20μL/10mL。10mLの溶液は、噴霧されるべき各トレイのために20mLシンチレーションバイアルにピペットで入れる。噴霧は、水平および垂直の塗布パターンを用いて送達される。第2の噴霧後の4~7日に、除草剤抵抗性植物を同定する。"