"FSH液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用であって、塩が、薬剤的に許容されるNa塩およびK塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される使用。塩がNa塩である、請求項1に記載の使用。塩がNaClまたはNa2SO4である、請求項1または2に記載の使用。塩が塩化ナトリウムである、請求項1または2に記載の使用。塩がNaClとNa2SO4の組合せである、請求項1または2に記載の使用。塩が、20~500mMの量、または30~300mMの量、または50~200mMの量で含まれる、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。FSH製剤がrFSH製剤である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。製剤が、保存剤をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。製剤が、ベンジルアルコール、フェノールおよび/またはm-クレゾールを含む、請求項8に記載の使用。製剤が注射用製剤である、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用。FSH液体製剤の安定化方法であって、薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩を前記製剤に添加するステップを含み、前記塩が薬剤的に許容されるNa塩およびK塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法。塩が、請求項2から6のいずれか一項に記載の塩である、請求項11に記載の方法。安定化させるFSHがrFSHである、請求項11および/または12に記載の方法。製剤が、保存剤をさらに含む、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。保存剤が、ベンジルアルコール、フェノールおよびm-クレゾールからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。したがって、特に、投与されるFSHの投与量は免疫原性応答のような解離または凝集型の副作用のリスクを低下させるべきであるということを考えると、非天然FSHが存在する場合、安定化された製剤を提供することが重要である。しかし、保存剤によって生ずる不安定化事象は、液体製剤内の活性ゴナドトロピン、すなわちFSHの実際のレベルを低下させる。したがって、本発明の目的は、安定なFSH製剤、特に液体製剤およびその安定化方法を提供することである。本発明は、FSH液体製剤を安定化するために、FSH液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用に関する。安定化させる液体製剤は、保存剤を含むまたは含まない製剤であることができる。以下の実施形態が好ましい:1.FSH液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩の使用であって、塩が、薬剤的に許容されるNa塩およびK塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される使用。2.塩がNa塩である、項目1に記載の使用。3.塩がNaClまたはNa2SO4である、項目1または2のいずれかに記載の使用。4.塩がNa2SO4である、項目1または2のいずれかに記載の使用。5.塩がNaClとNa2SO4の組合せである、項目1または2のいずれかに記載の使用。6.塩が、20~500mMの量、または30~300mMの量、または50~200mMの量で含まれる、項目1から5のいずれか1つに記載の使用。7.FSH製剤がrFSH製剤である、項目1から6のいずれか1つに記載の使用。8.製剤が、保存剤をさらに含む、項目1から7のいずれか1つに記載の使用。9.製剤が、ベンジルアルコール、フェノール、および/またはm-クレゾールを含む、項目8に記載の使用。10.製剤が注射用製剤である、項目1から9のいずれか1つに記載の使用。11.FSH液体製剤の安定化方法であって、薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩を前記製剤に添加するステップを含み、前記塩は、Na塩およびK塩、またはそれらの組合せからなる群から選択される方法。12.塩が、上記の項目2から6で定義される、項目11に記載の方法。13.安定化させるFSHがrFSHである、項目11および/または12に記載の方法。14.製剤が、保存剤をさらに含む、項目11から13のいずれか1つに記載の方法。15.保存剤が、ベンジルアルコール、フェノール、およびm-クレゾールからなる群から選択される、項目14に記載の方法。16.液体製剤が、凍結乾燥製剤から得られた再構成液体製剤である、項目1から10のいずれか1つに記載の使用。17.塩を添加するステップが凍結乾燥ステップの前に実施される、項目11から15のいずれか1つに記載の方法。18.再構成ステップが、凍結乾燥ステップの後に実施される、項目17に記載の方法。19.塩が凍結乾燥製剤中に含まれ、または塩が再構成液体中に含まれる、項目17および/または18に記載の方法。したがって、代替的実施形態において、安定化塩を含む製剤は凍結乾燥状態で貯蔵される。凍結乾燥は、当業者に一般的に知られているように実施される。次いで、凍結乾燥製剤を、患者が最終的に使用するまで貯蔵することができる。次いで、凍結乾燥製剤は、投与前に、公知の再構成媒体のいずれか1つ、例えば滅菌水で再構成する。塩は、凍結乾燥製剤中または再構成液体中に含まれる。20.液体製剤が、好ましくは注射用の単回使用製剤または複数回投与製剤である、上記の項目のいずれかに記載の使用または方法。好ましい実施形態において、塩は、凍結乾燥されておらず、液体として貯蔵されている液体製剤それ自体に含まれる。特に、好ましい実施形態において、本発明は、FSH液体製剤の安定化方法であって、アルカリ金属カチオンが、NaとKからなる群から選択される方法に関する。特に好ましくは、塩がNaClまたはNa2SO4である。上述されたように、不妊症の治療にはFSH液体製剤が適している。その関連で、FSH液体製剤が不安定であり得ることが明らかになってきた。これは、単回使用向けのものを含めて、FSH液体製剤全てに当てはまる。FSH液体製剤が、例えば全ての複数回投与製剤に必要な保存剤を含む場合、不安定性ははるかに著しいものとなるおそれがある。この保存剤は、FSH製剤を保存するのに有用なあらゆる保存剤であり得る。したがって、保存剤は、例えばベンジルアルコール、フェノール、および/またはm-クレゾールのようなFSH製剤用にFDAによって認可されたような保存剤、特に例えば非経口FSH製剤用に認可されたFDA認可保存剤であることができる。しかし、保存剤は、決してそれらの例に限定されない。FSHの安定性は、例えばベンジルアルコール、フェノール、および/またはm-クレゾールによって低下する。したがって、本出願において特許請求および記載される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩を、単回使用FSH製剤の安定化のために使用する。さらに、本出願において特許請求および記載される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩を、複数回投与FSH製剤の安定化のために使用する。このような製剤は保存剤を含む必要はないが、保存剤も含んでよい。本出願において特許請求される、薬剤的に許容されるカチオンを含む塩、すなわちNa塩およびK塩の添加によって、FSH液体製剤が安定化する。特に好ましい実施形態において、塩は、薬剤的に許容される塩である。安定化が、単回使用または複数回投与の製剤において、特により長期間におよぶ貯蔵において実現され、別の可能な実施形態においては、ベンジルアルコール、フェノール、および/またはm-クレゾールのような保存剤の不安定化作用に対する対策として有利であり得る。好ましい実施形態において、本発明に従って使用することができる塩としては、NaClまたはNa2SO4が挙げられる。塩は、好ましくは20~500mMの量で含まれ、さらにより好ましくは30~300mMの量で含まれ、特定の好ましい実施形態においては、50~200mMの量で含まれる。塩の最大添加量は、溶液オスモル濃度に制限される。注射時の疼痛を最小限に抑えるには、溶液は、好ましくは等張であるべきであり、または少なくとも高張であるべきでない。溶液中の添加剤は全て、オスモル濃度に寄与するので、溶液に添加することができる塩の最大量は、存在する他成分の量に左右される。塩は、好ましくは最高オスモル濃度350mosmol/kgをもたらす量、さらにより好ましくは最高オスモル濃度320mosmol/kgをもたらす量で含まれ、特定の好ましい実施形態においては、最高オスモル濃度300mosmol/kgをもたらす量で含まれる。オスモル濃度理論オスモル濃度は、溶液中に存在する種々の溶質の、溶液の浸透圧への寄与を測る全体的な基準を示す実用的手段である。オスモル濃度は、ヨーロッパ薬局方2.2.35、第7版、補遺20117.2、Osmolality、01/2008:20235に従って測定することができる。本発明との関連において、塩は、酸から、金属または電気陽性基による水素の全置換または部分置換によって得られる化学物質である。薬剤的に許容される塩のカチオンを有するまたは含む塩の定義は、FDA不活性成分リストに従って筋肉内または皮下送達用に認可されたカチオンによって形成される全ての塩を指す。この群のアルカリ金属カチオンは、ナトリウムNaおよびカリウムKである。本発明者らは、驚くべきことに、まさに2つの特定のカチオンがFSH製剤の安定化に特に適していることを見出した。したがって、塩は、以下の薬剤的に許容されるカチオン:カリウム一塩基性、二塩基性または三塩基性、またはナトリウム一塩基性または二塩基性または三塩基性によって形成することができる。好ましくは、塩はナトリウム塩である。特に好ましいのは、NaClおよびNa2SO4である。本発明に従って安定化することができるゴナドトロピンは、FSH、すなわち卵胞刺激ホルモンであり、別の活性成分と場合によって組み合わせたものである。FSHは、尿由来もしくは血漿由来FSH、または組換えFSHrFSHである。好ましい実施形態において、FSHは、尿由来FSHまたはrFSHであり、特に好ましいのは、rFSHである。前述のように、FSHを組換え技術によって作製することは、現在可能である。したがって、本明細書中でFSHに言及する場合、一般的に尿由来ゴナドトロピンと組換えrゴナドトロピンとを常に包含する。したがって、FSHという言葉はrFSHも包含する。本発明の好ましい実施形態において、製剤は、rFSH液体製剤、最も好ましくは注射用製剤であり、Na2SO4またはNaClで安定化される。本発明の好ましい実施形態において、製剤は、rFSH液体製剤、最も好ましくは注射用製剤であり、Na2SO4またはNaClで安定化される。代替的実施形態において、全ての実施形態のrFSHは、長時間作用型のFSHである。長時間作用型のFSH製剤は、当業者に一般的に知られているように、例えば、FSH分子を修飾するまたは製剤を修飾することによって得ることができる。したがって、本明細書中で、FSHは、可能な全ての尿由来型または組換え型の上記FSH、およびFSHの型の可能な全ての組合せを包含する。単回使用製剤および同じまたは異なるゴナドトロピンの複数回投与使用の1種または複数の別の製剤も包含される。1つの可能な製品は、異なるバイアル中に場合によってはCG、LH、LH活性などを有するFSHを全て含む製剤とすることができる。LH活性が存在する場合それは、LHまたはCGに由来することがある。LHは、等価用量のCGで置換することができ、逆の場合も同様である。それに関連して、等価用量は、PharmacopeiaVanHellBioassayにおける1IUのCGが5~7IUのLHに等しいということに基づいて算出することができるVanHell,Hら、ActaEndocrin.、47巻、409~418、1964年。好ましい組合せは、全てが異なるバイアル中に含まれるrFSH、rLHおよびrhCGの組合せである。異なるバイアル中の可能な組合せにはまた、尿由来uFSHおよびuhCGまたはuFSHおよびuLH;さらにrhCGまたはrLHまたはrFSHおよびuhCGまたはuLHまたはrhCGまたはrLH、ならびに可能な全てのそれらの順列が含まれる。別の好ましい組合せは、それぞれ異なるバイアル中のrFSHおよびrhCGの組合せである。別の好ましい組合せは、それぞれ異なるバイアル中のrFSHおよびrLHの組合せである。本発明のFSH製剤は液体製剤である。好ましくは、製剤は注射用製剤である。製剤は、別々にまたは一緒に投与するためのFSHまたはFSH/hCGを含む1種または2種以上の医薬組成物を有する製品として供給することができる。別々に投与する場合、連続投与とすることができる。製品は、適切な任意のパッケージで供給することができる。例えば、製品には、いくつかの充填済みシリンジを入れることができる。それぞれのシリンジには、FSHFSH組成物、またはさらにhCGhCG組成物が入っており、例えば、注射器をブリスター包装または他の手段で包装して、滅菌状態を維持することができる。製品には、FSH製剤を使用するための指示書を場合によっては入れることができる。別の態様によれば、本発明のFSH製剤は、複数回投与調製物として提供される。しかし、本発明が単回使用向けの製剤も対象とすることは明白である。本発明は、キットの一部分としての製剤の安定化にも関する。このようなキットは、1つもしくは複数の一日量のFSHを含む少なくとも1つの容器、またはそれぞれに異なるゴナドトロピンが含まれている例えば2つの容器例えば、バイアル、ならびに例えば別の指示書例えば、投与用指示書、および例えば注射するための別の手段を備える。好ましい実施形態において、FSH溶液が各カートリッジに充填される頻回注射用のペン型注射器を使用する。好ましい実施形態において、FSHは、35~850IU/ml、好ましくは50~800IU/ml、さらにより好ましくは100~600IU/mlで含まれる。例えば、600IU/mlのrFSHについて特に好ましい製剤は、以下の組成を有する:600IU/mlrFSH0.001~0.05、好ましくは0.005mg/mlポリソルベート200.1~10、好ましくは1.0mg/mlL-メチオニン0.5~50、好ましくは5.0mg/mlフェノール1~100、好ましくは14mg/ml硫酸二ナトリウムすなわち、0.1M0.1~10、好ましくは1mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6~8、好ましくはpH6.5。溶液オスモル濃度は、好ましくは300mosmol/kgである。pHは、溶液全体のpHを指す注射可能なデポー剤形は、生分解性ポリマー中FSHおよび存在する場合には他の作用剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製することができる。ポリマーベースのデポー剤形/徐放性システムは、それらの化学的性質に依存して、例えばマイクロ粒子もしくはナノ粒子、ヒドロゲル、ミセル、エマルジョンまたはインプラントであることができる。FSHとポリマーの比および使用する特定のポリマーの性質に応じて、FSH放出速度を制御することができる。生分解性ポリマーの例としては、ポリラクチド/ポリグリコリドコポリマー系、ポリビニルピロリドン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、多糖、例えばヒアルロン酸ナトリウムNaHAまたはこの他の塩、ゼラチン、キトサンなどが挙げられる。記載のポリマーは全て、誘導体化または修飾して、タンパク薬物送達またはその安定性を最適化することができる。デポー注射用製剤は、FSHを、脂質系に、または体組織と相溶性があるミセル、リポソーム、もしくはマイクロエマルジョンとしてのポリマー脂質混合物に閉じ込めることによっても調製される。注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターに通す濾過によって、あるいは使用する直前に滅菌水または他の注射用滅菌媒体に溶解または分散することができる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。注射用製剤は、上述されたように適切な任意の容器、例えばバイアル、充填済みシリンジ、注射用カートリッジなどで供給することができる。医薬組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は、この分野の慣行に従って調整する。GOODMANandGILMAN’sTHEPHARMACOLOGICALBASISFORTHERAPEUTICES,7theditionを参照のこと。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、非経口投与用の組成物として供給される。非経口製剤を調製する一般方法は、当技術分野において公知であり、REMINGTON;THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY、前掲、780~820頁に記載されている。非経口組成物は、液体製剤で、または投与直前に注射用滅菌媒体と混合される固体として供給することができる。特に好ましい実施形態において、非経口組成物は、投与を容易にし、投与量を均一にするために投与単位形態で供給される。本発明のFSHは、通常の手段で尿から得ることができ、または組換え技術によって作製することができる。可能な作製方法については、例えばWO2009/127826をさらに参照されたい。hCGは、当技術分野において公知である任意の手段で得ることができる。本明細書では、hCGは、ヒト由来hCGおよび組換えhCGを包含する。ヒト由来hCGは、適切な供給源例えば、尿および胎盤から、当技術分野において公知である任意の方法で精製することができる。組換えhCGを発現および精製する方法は、当技術分野において周知である。LHは、当技術分野において公知である任意の手段で得ることができる。本明細書では、LHは、ヒト由来LHおよび組換えLHを包含する。ヒト由来LHは、適切な供給源例えば、尿から、当技術分野において公知である任意の方法で精製することができる。組換えLHを発現および精製する方法は、当技術分野において公知である。医薬組成物は、不妊症の治療、例えば生殖補助医療assistedreproductivetechnologiesART、排卵誘発OI、または子宮内人工授精IUIにおける使用を目的とすることができる。医薬組成物は、例えば、公知のFSH調製物が使用される医学的適応において使用することができる。本発明は、本明細書に記載される本発明の態様による安定化されたFSH調製物の不妊症治療のための使用または不妊症治療用医薬品の製造における使用も提供する。医薬組成物は、任意の薬物投与経路、例えば経口、直腸、非経口、経皮例えば、パッチ技術、静脈内、筋肉内、皮下、嚢内、腟内、腹腔内、局所散剤、軟膏剤、またはドロップ剤投与経路用の、またはバッカルもしくは鼻スプレー剤としての周知の組成物に製剤化することができる。典型的な組成物は、とりわけRemington’sPharmaceuticalSciencesfifteentheditionMattPublishingCompany、1975年、1405~1412頁および1461~87頁、および米国国民医薬品集XIVfourteenthedition米国薬剤師会、1975年に記載されているような、水溶液などの薬剤的に許容される担体、塩および保存剤を含めて非毒性添加剤、緩衝剤などを含む。好適な水性および非水性の医薬担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオールグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの好適な混合物、植物油オリーブ油など、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。組成物は、保存剤、湿潤化剤、乳化剤、緩衝剤、および分散剤などの添加物も含有することができるが、これらに限定されるものではない。微生物の増殖を防止するために、抗菌剤および抗真菌剤を含めることができ、その例としては、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などが挙げられる。さらに、等張化剤を含むことが望ましいことがある。場合によっては、持続性作用をもたらすために、皮下または筋肉内注射からのFSHおよび他の活性成分が存在する場合それらの吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性が不十分な結晶質または非晶質の材料の液体懸濁剤を使用することによって実現することができる。その場合、例えばFSHの吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は結晶サイズおよび結晶形に依存することがある。あるいは、非経口投与されたFSH組合せの形の遅延吸収は、FSH組合せを油ビヒクルに溶解または懸濁させることによって実施される。本発明によれば、本発明者らによって、ゴナドトロピン液体製剤の安定性に対する、ある種の化合物の効果を検討する取組みがなされた。ここで、ある種の化合物の安定化および不安定化作用が検討された。安定性という用語は、アミノ酸配列における共有結合的修飾が関与する化学的安定性を指すことがあるが、タンパク質安定性に関連して、タンパク質のフォールディング状態すなわち、天然状態の変化が関与するが、共有結合の開裂を伴わない物理的安定性を指すこともある。本発明において、安定性という用語は、本発明のゴナドトロピン、特にFSHの製剤の物理的安定性を指す。タンパク質製剤の物理的不安定性は、高次の凝集塊を形成するタンパク質分子の凝集、ヘテロ二量体から単量体への解離、または本発明において含まれているFSHタンパク質の少なくとも1つの生物活性を低減させる他の何らかのコンフォメーション変化によって引き起こされることがある。安定な溶液または製剤とは、その中に存在するタンパク質の凝集、解離、コンフォメーション改変、生物活性の喪失などの程度が、許容できる程度に制御され、経時的に許容できない程度に増加しないものである。安定性は、試料の光散乱、透明度および/もしくは呈色の目視検査、吸光度もしくは光学密度、分子サイズ決定例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはフィールドフローフラクショネーション、インビトロもしくはインビボ生物活性の測定を含めて、当技術分野において周知である方法によって、かつ/または示差走査熱量測定DSCによって評価することができる。安定性を評価する他の方法は、当技術分野において周知であり、本発明に従って使用することもできる。いくつかの保存剤は、ゴナドトロピン製剤に対する不安定化作用が顕著であることが知られており、驚くべきことに、塩、特にNaClまたはNa2SO4など、FSH液体製剤の安定化に適していることが今回明らかになった、薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオン、特にNaまたはKを含む塩がさらに、医学的使用のための複数回投与FSH液体製剤中に含める必要があるベンジルアルコール、フェノール、およびm-クレゾールのような保存剤の不安定化作用を防止するのに有用であることがわかった。本出願において特許請求される塩は、FSH液体製剤に対する安定化作用を示し、その安定化作用は、有利にかつ驚くほど、例えばスクロースのような公知の安定化剤の安定化作用よりはるかに顕著である。スクロースのような公知の安定化剤に比べて改善された安定化作用は、特に驚くべきものである。さらに、全く予想外なことに、本発明の塩の安定化作用はFSH製剤に対して示すことができたが、非常に類似したhCGに対しては安定化作用を示すことができなかった。さらに驚くべきことに、観測された安定性作用は、いわゆるホフマイスター系列下記も参照のことに従うものではなく、実際には反するものであった。FSHの分解がFSH医薬製剤中で起こることは先行技術から公知であり、これは、本実施例の第1のセットで確認された。FSHは、時間に応じてかつ温度に応じて分解する。特に、室温を超える温度では、2次、3次、および4次構造が変化する。加熱したときに起こる3次および2次FSH構造のコンフォメーションのアンフォールディングは、タンパク質凝集が限定されているとき2状態の遷移であると思われる。このアンフォールディングは、サブユニット解離4次構造の変化に依存しないことがある。さらに、ベンジルアルコールまたはフェノールのような保存剤が、例えばFSH液体製剤中に抗菌剤として必要な場合に、このような保存剤を含有するFSHは、複数回投与FSH製剤の安定性に明らかな悪影響を及ぼすことが、本発明で明らかになる。この場合、FSHの長期安定性は低下し、FSHの変性温度は低下し、すでに変性した形態は、2次構造のレベルが保存剤を含有しないFSH製剤より低下する。FSH液体製剤の安定化のための薬剤的に許容されるアルカリ金属カチオン、すなわちNaおよびKを含む塩が、FSH液体製剤の安定性に著しい効果があることも、本発明が初めて示す。これらの塩を含むFSH液体製剤中のFSHの2次構造が、76.5°Cに加熱したとき著しく変化しないことを示すことができた。変性した形態は、例えばNa2SO4の存在下で比較的明確な構造をもち、これによって変性がより可逆的になり、したがって、タンパク質の速度論的安定性が大幅に向上する。これは、本発明において示されたリアルタイム安定性データによって裏付けられる。このデータから、FSHのヘテロ二量体構造に対する安定化作用が顕著であることが明らかである。ここでの結果から、本出願において特許請求される塩、例えば硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムは、FSH分子の解離傾向を制限し、したがって貯蔵安定性を大幅に向上できることが明らかに示される。本発明はまた、FSH液体製剤の安定化方法であって、上記の塩を前記製剤に添加するステップを含む方法に関する。全ての研究は、さらに実施されたリアルタイムデータによって確認された。以下の実施例によって、本発明をさらに説明するが、実施例は、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。実施例1シンクロトロン放射光円偏光二色性分光法SRCD方法デンマークのオルフス大学UniversityofAarhus、Denmarkにて、シンクロトロン設備を使用して、円偏光二色性分光法を行った。全てのCDスペクトルは、光路長0.1mmのスプラシル石英セルHellmaGmbH、Germanyを使用して、波長範囲180~270nmにわたって、ステップ1nmおよび滞留時間3秒/波長で記録した。rFSH試験と参照プラセボ試験の両方の各実験について、3つの同一CD走査を記録した。この報告で提示されたrFSHのCDスペクトルは、対応するプラセボの平均走査を平均タンパク質走査から引き算することによって得られた。CD走査の各セットについて、約120μlの溶液約112μgのrFSHに相当するを使用した。rFSHのCDスペクトルに対する温度の影響を検討中に、加熱室の温度を、5°C間隔および平衡時間5分間で25°Cから85°Cに変更した。較正ファイルから、実際の実験温度スプラシル石英セル中の温度を決定した。CDは、構造的非対称のため生ずる左回転および右回転の円偏光の吸収の差を測定する。タンパク質の2次構造を、CD分光法で遠UV領域約180~250nmにおいて検討することができる。一般に、規則正しい構造ほど、高い強度のCD信号正または負に従う。しかし、異なる2次構造は異なるCDスペクトルを有するものであり、またα-ヘリックスはβ-構造より高いCD信号強度を有するので、異なるタンパク質間で直接比較をして、規則構造の程度について結論を出すことはできない。構造変化に対する感受性が高いため、CD分光法は、タンパク質の物理的安定性を検討する際に強力なツールである。このような研究は、通常、外的要因、例えば温度、pH、変性剤、界面活性剤または安定化剤の濃度の変化に応じて、CDスペクトルを検出することによって行われる。本研究において、rFSHのCDスペクトルは、温度に応じて検討される。さらに、rFSHの2次構造に対するベンジルアルコールおよび硫酸ナトリウムNa2SO4の効果を研究した。この実施例ならびに実施例2および3で使用されるゴナドトロピンは、組換え卵胞刺激ホルモンrFSHであるが、組換えDNA技術を使用して、ヒトPER.C6登録商標細胞株から発現させたヒトホルモンである。rFSHは、FSH、黄体形成ホルモンLH、ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCG、および甲状腺刺激ホルモンTSHに共通している、92個のアミノ酸からなるαサブユニットと、FSHに特異的な111個のアミノ酸からなるβサブユニットの2種類のグリコシル化単量体からなるヘテロ二量体タンパク質である。FSHを含む糖タンパク質ホルモンは全て、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、ホルモンの生物活性を失う。以前の結果から、rFSHの不安定性は、主に二量体解離4次構造の分解と、これに付随して免疫結合反応の低下に基づくことが示された。使用目的に応じて、現在販売されているrFSH製剤は、37.5IU/mlGonal-fの場合、約2.8μg/mlに相当するから少なくとも833IU/mlPuregonの場合、約83.3μg/mlに相当するまでの様々な濃度で提供されている。研究で使用されるrFSHは、皮下注射用の液体医薬品製剤600IUrFSH/ml向けのものである。この製品は、複数回投与注射を目的としているので、保存剤の添加が必要である。検討される製剤は、様々な材料の原液を混合することによって作製した。タンパク質と添加剤の両方の検討される濃度間隔は、使用する方法によって制限される。すなわち、タンパク質濃度は、添加剤濃度に比べて比較的高く維持する必要があった。芳香族化合物が、検討される波長領域においてUV吸収するため、ベンジルアルコール濃度は低く維持する必要があった。下記の表は、本発明者らによる第1の実験計画において検討された異なる3種類の製剤の概要を記す。試料1rFSHの試料1表1を参照のことについて、24°Cから77°Cの間で異なる13の温度において、CDスペクトルを記録した。明確にするため、これらのスペクトルのうち7つだけを図1に示す。試料1は、表1から推論できるように、塩も保存剤も含んでいなかった。スペクトルを図1に示す。結果は、CD信号の強度が温度に応じて低下することを明らかに示し、これは、高温>50°Cにおいては2次構造が分解することを示している。24.0°C→45.9°Cのスペクトル間では有意差は検出されなかった。これは、約46°Cに加熱したとき、測定時間約20分間中では、タンパク質の2次構造が変化していないことを示している。加熱したときのFSHのSRCDスペクトルは、約193nmに等二色点isodichroicpointを示す。等二色点は、試料2のスペクトルについても見られる。図2を参照のこと。試料2rFSHのNa2SO4を含有する試料2表1について、CDスペクトルを記録した。スペクトルは、24°Cから77°Cの間で異なる13の温度において得られ、図2に示される。明確にするため、これらのスペクトルのうち5つだけを図2に示す。結果は、温度に応じた2次構造の分解を示している。データから、実験時間中約46°Cに加熱したとき、試料2中のrFSHの2次構造は変化していないことが明らかである。重要なことに、データから、変性した形態がNa2SO4の存在下で比較的明確な構造をもつことも明らかである。試料3rFSHのベンジルアルコールBAを含有する試料3表1について、CDスペクトルを記録した。ベンジルアルコールは、FSH液体製剤用に非常によく選択される抗菌性保存剤である。例えば、m-クレゾールに比べて保存能力が比較的低いため、BAを高濃度約10~15mg/mlで使用しなければならない。rFSHの使用目的が1カ月以下期間にわたる複数回の注射であり、かつrFSHが通常は室温で貯蔵されるので、保存剤が必要である。0.17mg/mlBAの存在下rFSHのスペクトルは、24°Cから77°Cの間で異なる13の温度で得られ、図3に示される。明確にするため、これらのスペクトルのうちの8つだけを図3に示す。ベンジルアルコールの非常に高いUV吸光度および付随する低いCD信号のため、検討されるBA濃度を上げることはできず、したがってrFSH製剤を保存するのに使用することになる濃度に近づけることができなかった。それにもかかわらず、BAの明らかな不安定化作用が認められた。CDの結果は、試料3中のrFSHの2次構造が、試料1および2中のrFSHの初期変性温度より若干低い42°Cに加熱したとき変化していないことを示している。さらに、および重要なことに、データから、変性した形態には、規則構造が、保存剤の非存在下におけるFSHを著しく上回るほどないことが明らかである。温度誘導構造変化に対する添加剤の効果本出願において特許請求される塩の代表例としてここで使用されたNa2SO4塩は、温度で変性したタンパク質の構造に対して著しい効果を示した。これは、明らかに重要な発見である。変性したアンフォールディングしたまたは部分的にアンフォールディングしたタンパク質は、天然タンパク質より、会合して、凝集塊を形成する傾向が高いFink,A.L.、1998年、FoldDes.、3巻1号:R9~R23頁、結果は、硫酸ナトリウムが、rFSH分子の変性する傾向を制限し、したがって凝集のリスクを制限することができ、それによって貯蔵安定性を大幅に増加させることを示している。一方、ベンジルアルコールBAは、高温において著しい構造分解を引き起こす。規則正しい2次構造は、SRCDで検出されなかった。BAの観測された効果さらにアンフォールディングした構造は、他のタンパク質系でベンジルアルコールを添加したときに見られる凝集の増大の理由を部分的に説明できるMaa,Y.およびHsu,C.C.、1996年、Int.J.Pharm.、140巻:155~168頁;Zhang,Y.ら、2004年、J.Pharm.Sci.、93巻12号:3076~3089頁。しかし、保存剤の添加は、複数回投与製剤の開発に極めて重要であり、rFSH製品が市場に存在していることから、比較的高い含有量のベンジルアルコールを含む場合であっても、より安定な製剤が開発される必要があることがわかっているPuregon登録商標は、10mg/mlベンジルアルコールを含有する。ベンジルアルコールは、rFSHの安定性を低下させ、加熱したとき規則正しい2次構造の喪失を容易にすることがわかった。しかし、保存剤の添加は重要である。この研究によって、本出願において特許請求する塩は、加熱されたrFSH製剤における規則構造のレベルを向上させることが明らかになった。したがって、これらの塩は、rFSH液体製剤中の安定化剤単数または複数として、例えばベンジルアルコールまたは他のフェノール系保存剤の作用を代償するのによく適している。実施例2示差走査熱量測定DSCこの実施例において代表的に使用されるFSHは、実施例1と同じである。一般に、タンパク質の天然生理活性構造は、その周囲の状況、例えば製剤の組成、容器システム、pHおよび温度に非常に感受性である。本実施例において、rFSH変性温度Tmを液体示差走査熱量測定DSCで検討した。rFSH変性温度は、溶液状態のタンパク質の安定性の指標をもたらし、より高いTmは、より安定なタンパク質を示唆する。タンパク質の3次および4次構造は、主に非共有結合的相互作用で安定化される。これらの分子内相互作用の多くは、アンフォールディング時に水分子との非共有結合的相互作用で置換されるので、異なる構造形態すなわち、天然と変性間の熱力学的バランスが微妙である。一般に、これは、天然タンパク質の安定性が限定されることを意味する。多くのタンパク質は、約70°Cで熱アンフォールディングする。タンパク質フォールディングまたは変性は、DSCを使用して直接研究および数量化することができる熱力学パラメータで説明することができる。したがって、DSCは、タンパク質安定性に対する添加剤の効果を研究し、したがってタンパク質治療に最適な製剤を特定するのに重要なツールである。液体示差走査熱量測定DSC理論液体DSCにおいて、タンパク質試料を加熱するすなわち、試料温度を上げると、わずかに上昇するベースラインだけが得られるが、加熱を続けるすなわち、温度の上昇を続けると、熱がタンパク質に吸収され、タンパク質は、その研究されたタンパク質にとって特徴的な温度範囲にわたって熱アンフォールディングする。これによって、吸熱ピークが生じる。タンパク質アンフォールディング時に、より疎水性の鎖が露出されるので、タンパク質を囲む水分子は再編成する。アンフォールディングが完了すると、熱吸収は低下し、新しいベースラインが形成される。試料の熱容量Cpの積算によって、式1のアンフォールディングプロセスに伴うエンタルピー変化ΔΗが得られる。観測されたエンタルピー変化は、水素結合の破断などの吸熱過程およびタンパク質と周囲媒体の間の水素結合の形成などの発熱過程から生じる。熱転移の中点または転移中点Tmタンパク質変性温度と呼ばれることが多いは、タンパク質分子の半分がフォールディングし、タンパク質分子の半分がアンフォールディングしている温度である。DSC測定の生データ、すなわち、温度の関数としての熱発生率単位:Wを、容易に部分モル熱容量単位:J/molKに再計算することができ、使用するタンパク質のモル質量および濃度がわかる。試験方法タンパク質変性温度Tmは、300μlのデュアルキャピラリーセルを装備した液体DSCTAInstrumentsのNanoDSCで、以下のパラメータを使用して測定した:走査速度:0.5~2.0°C/分、他に何も記載されていない場合、走査速度1.0°C/分を使用する実施例4の場合、2.0°C/分開始温度:20°C最終温度:100°C平衡:900sまたは、実施例4の場合、900s1回目走査600s2回目走査定圧:3atm試料は全て、測定前に15分間脱気した。各タンパク質試料後に、試料セルを50ギ酸で清浄した。さらに、各試料のランの後に、セルを1000mlの精製水ですすいだ。試料は全て、対照セル中の対応するプラセボとともに測定した。対照セルと試料セルの両方に充填したプラセボ溶液について別個の走査から得られた結果を、評価前にデータから差し引いた。すなわち、ブランクの差し引きを行った。MALDX-TOFMS酵素シアリダーゼで処理する前後のrFSHの試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法MALDI-ToFMSで分析して、脱シアリル化反応の程度を評価した。AutoflexIIMALDIToFMassSpectrometerBrukerDaltonicsで、スペクトルを取得した。シナピン酸をマトリックスとして使用した。分析は、ディレイドエクストラクションを利用して、正イオンリニアモードで行った。4000~20893Daの走査範囲を、外部較正して使用した。この実施例の目的この実施例の目的は、液体示差走査熱量測定DSCによってrFSHの熱安定性を検討すること、および保存剤フェノールまたはベンジルアルコールが添加された場合と添加されていない場合のrFSHに対する種々の塩の安定化作用を研究することであった。この研究は以前の円偏光二色性CD分光法の研究上記実施例1およびリアルタイム安定性の研究下記の実施例3とともに全て、溶液状態のrFSHの安定性に対する塩および保存剤の作用を研究することを目的とする。研究対象の製品rFSHバッチ情報rFSH原薬バッチ番号08800020およびバッチ番号09PD80010は、Bio-TechnologyGeneralBTG、Israelで製造されたものである。rFSHの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。使用されたrFSHの2バッチの濃度は、それぞれバッチ08800020については13,223IU/mg9,256IU/mlが得られると、バッチ09PD80010については15,109IU/mg10,576IU/mlが得られると決定された。材料添加剤rFSH溶液中で使用される添加剤のリストを、表2に記載する。被検溶液の組成被検rFSHおよびプラセボ溶液の組成を、表3、表4および表5に記載する。保存剤の被検濃度は、ヨーロッパ薬局方、非経口使用を目的とする製剤の保存有効性に関する基準Ph.Eur.Acriteriaconcerningpreservationefficacyofaformulationaimedforparenteraluseを満たすのに要する濃度に基づいて選択される。被検塩濃度は、被検溶液で等張性を得るのに必要とされた硫酸ナトリウムの濃度、すなわち0.1M硫酸ナトリウムに基づいている。他の塩は全て、硫酸ナトリウムと同じモル濃度で試験した。さらに、より高いおよびより低い濃度の塩化ナトリウムを試験して、rFSH変性温度Tmに対する塩濃度の影響を評価する。被検溶液中のリン酸ナトリウム緩衝液の濃度を低く維持して、緩衝塩それ自体の安定化/不安定化作用のリスクを最小限に抑制する。製造手順全ての溶液表3、表4および表5は、FerringPharmaceuticalsA/SCopenhagen,Denmarkにて実験室スケールで製造する。製造手順を以下にまとめる。rFSH原液調製リン酸緩衝液中のrFSH原液は、出発材料としてバッチ08800020またはバッチ09PD80010のrFSH原薬溶液を使用して、濃縮ステップを加えることによって調製する。分画分子量MWCO10kDaの膜を備えたVivaspin20デバイスVivascienceを使用して、濃縮upconcentrationを行う。膜は、1mMリン酸緩衝液pH5.5、6.5または7.5中に0.5mg/mlL-メチオニン、0.005mg/mlポリソルベート20を含有する、対応するプラセボ溶液15mlを、フィルターに通して遠心分離することによって予洗する。遠心分離は、スイングアウト型ローターを使用して、3000×gで20分間行う。濃縮ステップを行うには、合計80mlのrFSH試料を使用して、4個のVivaspin20デバイス20ml/デバイスを満たし、3000×gで15分間遠心分離する。各濃縮分を20mlのメスフラスコに移す。フィルターを、所望のプラセボ溶液の少量ずつで洗浄する。洗浄溶液をメスフラスコに移し、最後に同じプラセボ溶液を使用して一定体積になるまで希釈する。こうして、それぞれ1mMリン酸緩衝液pH5.5、6.5または7.5中に0.5mg/mlL-メチオニン、0.005mg/mlポリソルベート20を含有する2.8mg/mlrFSH原液が得られる。rFSH溶液およびプラセボ溶液の調製保存剤を除く全ての添加剤の原液を、ミリQ水中で調製する。rFSH溶液およびプラセボ溶液の調製には、各添加剤の原液を混合して、表3、表4および表5に記載の所望の濃度を得る。保存剤を溶液に直接添加する。rFSHの脱シアリル化1mMリン酸緩衝液pH6.5中に0.5mg/mlL-メチオニン、0.005mg/mlポリソルベート20を含有する、rFSH濃度2.8mg/mlの濃縮rFSH溶液を使用して、rFSHに結合している糖部分からシアル酸を取り除く。Sigmaのα2→3,6,8,9ノイラミニダーゼシアリダーゼを使用して、酵素的除去を行う。37°Cで振盪しながら、rFSHをノイラミニダーゼで終夜処理する。rFSHの濃縮のために上述したVivaspinデバイスを使用して、試薬を除去する。酵素を含有するrFSH溶液を、予洗されたVivaspinデバイスに移す。デバイスを遠心分離し、濾液を捨て、濃縮分を、1mMリン酸緩衝液pH6.5中に0.5mg/mlL-メチオニン、0.005mg/mlポリソルベート20を含有するプラセボ溶液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離する。この手順を3回繰り返した後、最終濃縮分をメスフラスコに移し、プラセボ溶液で一定体積になるまで希釈する。こうして、1mMリン酸緩衝液pH6.5中に0.5mg/mlL-メチオニン、0.005mg/mlポリソルベート20を含有する、2.8mg/ml脱シアリル化rFSH原液が得られる。結果および考察rFSHTmに対するDSC走査速度の影響rFSH変性温度に対するDSC走査速度の影響を検討するために、異なる3つの走査速度でTm測定を行う。表6でわかるように、rFSHTmは、測定時に使用されるDSC走査速度によって変わる。同一の走査速度で行われた測定から得られた変性温度を比較する限り、Tmが走査速度によって変わることは、データの解釈に影響を及ぼさない。例えば、表7を参照のこと。100°CまでのDSC走査を繰り返すと、rFSHの変性は、実験条件下で部分非可逆的であることが明らかになった図4を参照のこと。これは、リフォールディングが、2回のDSC走査間の平衡時間より遅いこと、またはアンフォールディングが、式2に示すように非可逆的ステップを伴うことを意味する。天然←→アンフォールディング→非可逆的変性2rFSHTmに対する保存剤添加の影響表7でわかるように、保存剤のrFSH溶液への添加によって、変性温度Tmは、使用した保存剤にもよるが2~6°C低下する。これは、他の組換えタンパク質と尿由来FSHとについて以前に報告されたデータとよく符合する。フェノールを含むrFSH溶液に比べて、ベンジルアルコールを含むrFSH溶液は、得られたTmの低下が大きい表7を参照のこと。これは、実験で使用されたフェノール5mg/mlより、ベンジルアルコール15mg/mlの濃度の方が高いことから説明することができる。rFSHTmに対する種々の塩の添加の効果タンパク質溶解性および安定性に対する一般的効果に従った塩のランク付けは、下記の式3のホフマイスター系列またはリオトロピック系列lyothropicseriesと呼ばれる。左側の塩析剤、いわゆるコスモトロピックイオンは、安定化作用をタンパク質にもたらすことが知られている。一方、右側のカオトロピックイオンまたは塩溶イオンは、タンパク質を不安定化させることが知られている。SO42>HPO42>F>Cl>Br>NO3>I>ClO4>SCN3保存剤を含まない溶液への種々の塩の添加がrFSHTmに及ぼす効果種々のナトリウム塩のrFSHTmに対する効果を測定するとき、かなり驚くべきことに、上述されたホフマイスター系列に従って予想される安定化/不安定化作用は、カチオンを変更すると認められなかった。表8および表9を参照のこと。最もコスモトロピックなイオンである硫酸イオンを使用したかまたはカオトロピックなイオンである過塩素酸イオンを使用したかにかかわらず、変性温度の上昇はほぼ同じであった。実際、rFSHに対する不安定化作用が予想される過塩素酸イオンの塩の場合に、rFSHTmの最大の上昇が得られた。Tmの上昇は、硫酸イオン、塩化物イオンおよび過塩素酸イオンのような種々の無機アニオンとクエン酸イオン、酢酸イオンおよび酒石酸イオンのような有機アニオンとについて同じ範囲であった。異なるナトリウム塩を添加したとき、ホフマイスター系列中のアニオンの位置は、rFSHTmの上昇に影響を及ぼさないという観測された傾向は、カリウムの場合にも認められる表8および表9を参照のこと。同じカチオンを有すると、一般にrFSHTmの変化に及ぼすアニオンの影響はわずかでしかなく、まったくホフマイスター系列に従ったものではない。かなり驚くべきことに、他方では、カチオンはrFSHTmにまさに影響を及ぼしている。さらに具体的には、1価のカチオンを含む塩は、一般に2価イオンより高いrFSHTmを示す表8を参照のこと。特に、1価のアルカリ金属イオンは、高いrFSHTmをもたらす。言い換えれば、塩を添加したとき観測された安定化作用すなわち、rFSHTmの上昇は、被検アニオンとはまったく無関係であり表8および9を参照のこと、一方、カチオンは、安定化の程度に大きな影響を及ぼしている。カリウムおよびナトリウムの塩は、特に大きな安定化作用を示す。上記の被検溶液は全て、塩濃度が0.1Mである。rFSHTmに対する塩濃度の影響を検討するために、異なる3つの塩化ナトリウム濃度をもつrFSH溶液のDSC測定値を検討した。塩をrFSH溶液に添加したときの安定化作用は、被検塩濃度の全範囲で認められる表10を参照のこと。FSH製剤に関する既存の特許では、FSHの安定化剤として例えばスクロースが使用されている。0.1MスクロースをrFSH溶液に添加すると、rFSHTmの変化は微小であり表8および表9を参照のこと、カリウム塩またはナトリウム塩を添加したときのrFSHの安定化作用は、スクロースを添加したときに得られる作用より著しく高いことが示唆される。保存剤が添加された溶液への種々の塩の添加がrFSHTmに及ぼす効果保存剤のタンパク質溶液への添加によって、溶液状態のタンパク質の安定性が低下することは周知である。しかし、非経口使用を目的とする複数回投与水性製剤では、保存剤は必要なものである。したがって、保存剤を添加したときのタンパク質安定性の低下を、塩のような安定化剤をrFSH溶液に添加することによって代償することは非常に重要である。表11でわかるように、保存剤をrFSH溶液に添加することによって、rFSH変性温度が2~3°C低下する。保存剤が添加されたrFSH溶液に塩を添加すると、rFSH変性温度が約5°C上昇する。言い換えれば、保存剤をrFSH溶液に添加したとき観測された不安定化作用は、本発明で定義される塩の添加によってよく代償される。実際は、フェノールを含有するrFSH溶液への塩の添加は、rFSHTmに対する保存剤の作用を相殺するのではなく、保存剤または塩が添加されていない水溶液中のrFSHに比べてTmを実際に上昇させている表11を参照のこと。rFSHTmに対するpH変更の影響安定化塩が添加された場合と添加されていない場合のrFSHTmに対するpHの影響を研究するために、異なる3つのナトリウム塩が添加された場合と添加されていない場合のrFSH変性温度をpH5.5、6.5および7.5で決定した表12を参照のこと。表12でわかるように、異なるナトリウム塩を添加したときのrFSHTmの一般的な傾向は、pH5.5~7.5の全範囲にわたって同じである。すなわち、ホフマイスター系列に従った塩の安定化/不安定化作用からの逸脱が、全ての被検pHにおいて認められる。検討されたpH範囲において、観測されたrFSH変性温度は、塩が添加された場合と添加されていない場合との両方で溶液のpHが上昇するにつれて上昇する表12を参照のこと。塩を添加したときのrFSH変性温度の実際の上昇ΔTmは、pHが高くなるほど若干低くなる表12を参照のこと。rFSHTmに対するrFSHシアリル化の影響上記から明らかなように、塩のrFSH溶液への添加の影響は、上記のホフマイスター系列に全く従わず、過塩素酸イオンの塩は、タンパク質を不安定化するものと予想されタンパク質Tmの低下をもたらす、硫酸イオンは、タンパク質を安定化するものと予想されるタンパク質Tmの上昇をもたらす。rFSHは、糖部分に結合している多数のシアル酸残基、したがってかなり高い正味負電荷を有するグリコシル化されたタンパク質であるので、塩の予想外の安定化挙動に対するシアル酸の影響を検討した。異なる塩を添加したときのrFSHTmに対するシアル酸の影響を研究するために、シアル酸の酵素的除去を行った。次いで、塩が添加された場合と添加されていない場合の脱シアリル化rFSHをDSCによって分析した。シアル酸残基の除去が成功したことを検証するために、シアル酸の酵素的除去の前後のrFSH試料を、MALDI-ToFMSによって分析した。MALDI-ToFMSの酸試料条件下で、αサブユニットとβサブユニットを解離させ、したがって別々に測定する。シアリダーゼ処理前のαサブユニットの平均分子量は15000Daである。シアリダーゼで処理した後、平均分子量は14000Daである。シアリダーゼ処理前のβサブユニットの平均分子量は18000Daであり、シアリダーゼ処理後は17000Daである。両サブユニットの質量のシフトは、シアル酸除去の結果であり、質量低減になる。実際に、シアル酸残基は全て、脱シアリル化中にrFSHから除去された。硫酸ナトリウムまたは過塩素酸ナトリウムを添加したときのrFSHTmの上昇は、無修飾rFSHおよび脱シアリル化rFSHで同じ傾向に従う。すなわち、観測された安定化作用rFSHTmの上昇は、上記のホフマイスター系列に従わない。一般に、観測されたTmは、無修飾rFSHより脱シアリル化rFSHの方が2~6°C低い表13を参照のこと。塩を添加したときに観測された安定化作用も、無修飾rFSHより脱シアリル化rFSHの方が低い表13を参照のこと。rFSHの糖部分にシアル酸が存在していることが、rFSH安定性を向上させると考えられるので、得られるTmは、無修飾rFSHより脱シアリル化rFSHの方が低いと予想される。無修飾rFSHも脱シアリル化rFSHも、種々の塩を添加したとき同じ傾向に従うホフマイスター系列に従う安定化/不安定化作用から逸脱するという事実から、この作用を引き起こすのは、rFSHそれ自体におけるシアル酸の存在ではないことがわかる。結論保存剤を添加したときのrFSHで観測された不安定化作用rFSHTmの低下は、この分野における技術水準の認識とよく符合する。しかし、異なるアニオンの塩を添加したときのrFSH変性温度で観測されたホフマイスター系列からの逸脱は、予想外である。ホフマイスター系列に従って、タンパク質溶解性および安定性に対する一般的効果に従って、塩をランク付けする、硫酸イオンのようなコスモトロピックアニオンは、通常タンパク質を安定化しTmの上昇、一方、過塩素酸イオンのようなカオトロピックアニオンはタンパク質を不安定化するTmの低下。この研究では、同じカチオンを有する被検アニオンは全て、rFSH変性温度の同様な上昇を示す。ホフマイスター系列からの予測と全く正反対に、過塩素酸イオンの塩は、rFSH変性温度の最大の上昇を示す。言い換えれば、塩を添加したときに観測された安定化作用すなわち、rFSHTmの上昇は、被検アニオンとはまったく無関係である。ナトリウムおよびカリウムの塩は、特に大きな安定化作用を示す。特に、過塩素酸ナトリウムのrFSH溶液への添加によって、rFSH変性温度の大きな上昇が生じる。しかし、過塩素酸塩は、通常反応性が高く、酸化剤であり、したがって医薬製剤の不活性成分として認可されない。塩の添加時にrFSHについて得られた予想外の安定化作用は、rFSHの糖部分にシアル酸が存在していることでは説明できない。脱シアリル化rFSHについてのrFSH変性温度の決定は、無修飾rFSHとしての塩の添加時のrFSHの安定化作用において同じ傾向を示す。実施例3rFSH溶液についてのリアルタイム安定性研究の目的この研究の目的は、種々の製剤中のrFSHのリアルタイム安定性が、実施例2で説明されたように、液体DSCによるrFSH変性温度の測定、また実施例1で説明されたように、CD分光法で測定された加熱時のrFSHの2次構造の変化で見られるのと同じ傾向に従うかどうかを確立することである。この研究では、いかにrFSHがその単量体に解離しやすいかについて測定して、rFSHの貯蔵中の構造安定性を決定する。rFSH600IU/mlの製剤の、異なる2つの貯蔵温度で貯蔵した後の安定性を、長期にわたる5±3°C/周囲RHおよび促進30±2°C/65±5RH条件で6~12カ月研究した。全てのバイアルを倒立させて貯蔵した。対応する製剤を含有するが、rFSHを添加しないプラセボ対照を、活性rFSHについて説明したのと同じ条件下で貯蔵した。研究対象の製品バッチ情報rFSH原薬バッチ番号08800060およびバッチ番号09800020は、Bio-TechnologyGeneralBTG、Israelで製造されたものである。上記rFSHバッチの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。材料添加剤この研究で使用される添加剤のリストを、表14に記載する。容器および施栓系使用する主要なパッキング材料を、表15に記載する。rFSH原液および異なる製剤rFSHおよびプラセボの組成を、表16、表17、および表18に記載する。いずれの安定化剤/等張化剤も含有しない製剤を除いて、安定化剤/等張化剤の濃度を調整して、等張液を生じる。製造手順全ての溶液表17および表18は、FerringPharmaceuticalsA/SCopenhagen,Denmarkにて実験室スケールで製造する。製造手順を以下にまとめる。rFSHおよびプラセボ製剤の調製全ての添加剤の原液を、ミリQ水中で調製する。プラセボ製剤の調製には、各添加剤の原液を混合して、表18に記載の濃度を得る。一定体積になるまで希釈する前に、各製剤のpHを必要なときには調整する。rFSH製剤の調製には、希釈溶液を各添加剤の原液から調製する。希釈溶液のpHを調整する。希釈溶液をrFSH原液表16を参照のことと混合して、表17に記載の最終濃度を得る。無菌濾過および無菌充填最終製剤は、0.22μmのPVDFフィルターMilliporeを使用して無菌濾過される。オートクレーブ処理したガラス瓶に、Stericupフィルターを使用して、プラセボ製剤を無菌濾過する。オートクレーブ処理したガラスビーカーに、Sterivex-GVフィルターおよび20mlの無菌ルアーロック注射器Braunを使用して、rFSH製剤を無菌濾過する。オートクレーブ処理したバイアルおよびゴム栓を使用して、バイアルの無菌濾過、充填および密封をLAFベンチ中で行う。充填する前後に、0.20μmのMillex-FGPFTEフィルターMilliporeに通した窒素ガスで、バイアルを少なくとも6秒間パージする。バイアルに、バイアル1本あたり試料1.5mlを充填する。全てのバイアルに無菌充填し、直ちにゴム栓およびアルミノフリップオフキャップで閉じる。保存条件rFSH600IU/mlを含有する試料およびプラセボを、5±3°C/周囲RHで6~18カ月貯蔵する。さらに、試料を30±2°C/65±5RHの促進条件で6~18カ月貯蔵する。各貯蔵温度において、バイアルを倒立させて貯蔵する。全てのバイアルを光から保護する。安定性プログラムrFSH600IU/mlおよびプラセボの安定性プログラムを、以下の表19に示す。分析方法この研究で使用される分析方法を、以下に説明する。各試験の際に、rFSHのバイアル2本および対応するプラセボのバイアル1本を、各製剤について分析する。低分子量LMW形態rFSHのLMW形態は、サイズ排除SECカラムで定組成溶離を利用するLC-UVによって決まる。分析は、シリカベースのカラムを使用し、トリス緩衝液を移動相として、UV検出で行う。rFSHのLMW形態は、rFSHの主ピークの分子量より後に低い分子量で溶離するピークである。LMW形態は、全ピーク面積のピーク面積百分率として決定される。保存剤を含有する試料の場合、保存剤は、サイズ排除カラムに入る前に試料溶液から除去される。結果および考察rFSHの貯蔵中の解離rFSHは、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、その生物活性を喪失するので、単量体解離によるrFSH活性の喪失を追跡する簡単明瞭な方式は、溶液状態でrFSHLMW形態の量を測定することである。この情報は、SECクロマトグラフィーから回収することができ、rFSHの主ピーク後に溶離するLMW形態ピークは、解離したrFSHから生じることが知られている。表20でわかるように、保存剤が添加された場合と添加されていない場合の、異なる安定化剤を含有する新たに調製されたrFSH溶液は、同様の相対量の解離rFSHLMW形態を示す。SEC方法の定量下限値は3であるので、この下限値未満では、製剤間の明確な区別を行うことができない。これは、初期の時点で観測されたLMW形態の差が、方法に起因する変動の限界の範囲内であるという意味である。スクロースとともにまたは安定化剤なしでフェノールを含有する試料では、30±2°C/65±5RHで1カ月貯蔵した後すでに、解離rFSHの相対量が増加したが、硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含有する試料では、解離rFSHの著しい増加が全く示されなかった表20を参照のこと。フェノールを含有するが、安定化剤が添加されていないrFSH試料には、30±2°C/65±5RHで6カ月貯蔵した後、20を超える解離rFSHLMW形態が含まれる。フェノールを含有し、スクロースを安定化剤として含むrFSH試料も、解離rFSHの著しい増加を示す10を超える解離rFSHが、フェノールを含有し、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムで安定化されている試料は、解離rFSHの微小の増加しか示さない表20を参照のこと。保存剤を全く含有しない試料は、貯蔵中の解離に対して最も安定である。しかし、非経口使用を目的とする複数回投与水性製剤には、保存剤の添加が必要とされ、したがってこの製剤は、単に比較として加えられているに過ぎない。5±3°C/周囲RHで6カ月貯蔵した後、被検rFSH製剤はどれも、解離rFSHの相対量の増加を示さない表21を参照のこと。しかし、市販のrFSH製品として成功するには、5°Cで少なくとも24カ月貯蔵し、これに付随して室温で1カ月、好ましくは3~4カ月貯蔵することが、必要とされる。rFSH変性温度、2次構造の変化、および解離度この実施例の目的は、リアルタイム安定性研究データと、DSCによるrFSH変性温度決定と、CD分光法で決定されたrFSH2次構造データとの相関関係を決定することであったので、DSCデータの一部分実施例2を参照のことおよびCDデータの一部分実施例1を参照のことを以下に示す。示したDSC結果に関する詳細は全て、実施例2に記載され、CDデータに関する詳細は、実施例1に記載されている。表22でわかるように、DSCで得られたrFSH変性温度は、30±2°C/65±5RHで6カ月貯蔵した後のリアルタイム安定性データとよく相関し、SECで分析されたDSCとリアルタイム安定性の同様の相関関係が、組換え抗体および組換え糖タンパク質について以前に示された例えば、Burtonら、2007年、Pharm,Dev.Technol.、12巻:265~273頁およびRemmeleら、1998年、Pharm.Res.、15巻:200~208頁を参照のこと。保存剤が添加されることなく、硫酸ナトリウムで安定化されたrFSH溶液は、6カ月貯蔵した後に低いrFSH解離度しか示さず、保存剤を含有する溶液より著しく高い変性温度も示す。保存剤フェノールを含有する溶液では、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムの塩が添加されることによって、6カ月貯蔵した後に、スクロースを含有するまたは安定化剤を含有しない溶液より著しく低いrFSH解離度が得られることがさらにわかり得る。安定化剤が添加されていないrFSHの変性温度も、塩を含有する溶液のrFSHTmより著しく低い。しかし、表23からわかるように、フェノールが添加されるとともに、スクロースを含有する溶液のrFSH変性温度は決定されなかったが、保存剤が添加されていない溶液のrFSHTmの測定は、30±2°C/65±5RHで6カ月貯蔵した後、リアルタイム安定性データと同じ傾向を示す表22を参照のこと。結論として、NaClおよびNa2SO4は、構造劣化に対して、スクロースより著しく良好な安定化剤である。これは、Tm測定表23を参照のこととリアルタイム安定性データ表22を参照のことの両方によって明らかである。ベンジルアルコールを保存剤として含有する溶液のリアルタイム安定性データは、決定されなかった。しかし、DSCで決定したrFSH変性温度およびCD分光法で決定した、加熱したときのrFSH2次構造の変化を比較すると、同じ傾向が認められる表24を参照のこと。異なるタンパク質試料のrFSHの2次構造を決定した。24°Cで決定した2次構造を天然構造とみなすことができる。ここで、ベンジルアルコール0.17mg/mlまたは硫酸ナトリウムを添加したとき、rFSH溶液についてrFSH2次構造の差を観測することはできない。しかし、溶液を76.5°Cに加熱すると、rFSH2次構造の観測された喪失は、添加された添加剤によって変わる。保存剤ベンジルアルコールを添加すると、いずれの保存剤も含有しないrFSH溶液の場合より、rFSH2次構造の喪失が大きくなるが、塩硫酸ナトリウムを添加すると、塩が添加されていないrFSH溶液の場合より、rFSH2次構造の喪失が小さくなる。rFSHの規則正しい2次構造の喪失は、タンパク質の部分変性または完全変性として解釈することができる。実施例4hCGの示差走査熱量測定DSCデータヒト絨毛性ゴナドトロピンhCGは、hCG、卵胞刺激ホルモンFSH、黄体形成ホルモンLH、および甲状腺刺激ホルモンTSHに共通している、92個のアミノ酸αサブユニットと、hCGに特異的な145個のアミノ酸βサブユニットの2種類のグリコシル化単量体からなるヘテロ二量体タンパク質である。FSHおよびhCGを含む糖タンパク質ホルモンは全て、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、ホルモンの生物活性を緩める。安定性分析の結果から、組換えFSHrFSHの不安定性は、主に二量体解離4次構造の分解と、これに付随して免疫結合反応の低下に基づくことが示唆された。この実施例の目的は、以前に観測された、DSCで決定され、上記の実施例1~3に説明されているrFSH変性温度への種々の糖および塩の依存が、非常に類似したタンパク質hCGの場合にも観測されているかどうかを確立することである。さらに、この研究で決定されたhCGのDSC変性温度を、以前に公開されたリアルタイム安定性データと比較するSamaritani,F.、1995年、hCG液体製剤。EP0814,841。hCGの変性温度を、0.5mg/mlL-メチオニンおよび0.005mg/mlポリソルベート20を含有する1mMリン酸緩衝液中、0.1Mの種々のナトリウム塩またはスクロースの存在下および非存在下で検討した。スクロース、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および過塩素酸ナトリウムという異なる4種類の糖および塩を検討する。ヒト尿由来絨毛性ゴナドトロピンhCGMassoneS.A.Argentinaのヒト尿から精製されたhCG原薬バッチ番号28232875107059IU/mgを使用した。材料を、2~8°Cで冷蔵して貯蔵した。上記hCGバッチの生物活性の決定は、ヨーロッパ薬局方に従って行った。rFSHおよび別の材料を、実施例2~3で記載されたように使用した。異なるhCG製剤の組成を表26に記載する。製造手順全ての溶液表26は、FerringPharmaceuticalsA/S,Copenhagen,Denmarkにて実験室スケールで製造する。hCG製剤の調製全ての添加剤の原液を、ミリQ水中で調製する。種々の添加剤を含むプラセボ溶液を原液から調製する。hCG原薬をプラセボ溶液に溶解して、表26に記載の濃度を得る。これらの製剤の安定性データは入手できなかったので、DSC分析を、新たに調製された試料について常に行う;試料調製から1時間以内。図4および表27でわかるように、hCGの変性温度TmはrFSHのTmより低い。さらに、変性過程のエンタルピーすなわち、変性ピークのサイズは、rFSHよりhCGの方が著しく小さい。rFSH試料を100°Cに加熱した後の変性過程がほぼ完全に非可逆的であるrFSHの場合と違って、hCGを100°Cに加熱した後の変性過程は、より大部分が可逆的である2。天然←→アンフォールディングした→非可逆的変性2hCG変性過程は、DSC測定の時間枠の中で大部分が可逆的であるが、これはrFSHには当てはまらず、hCG中の2種類のサブユニットが、rFSH中より解離しにくい場合に当てはまることができる。サブユニットがhCG試料を加熱している間に解離しない場合、天然構造は、室温に冷却したとき、より容易に再び再形成することができる。100°Cに加熱したときの転移のΔΗの大きさは、rFSHがhCGより著しく大きく、付随する走査すなわち、試料を100°Cに加熱し、25°Cに冷却し、第2の走査を100°Cまで行うにおける転移のΔΗの大きさは、rFSHとhCGとで同じサイズ範囲にある。hCGおよびrFSHTMに対する糖または塩の添加の効果タンパク質水溶液への塩の添加は、溶液状態のタンパク質の安定性に影響を及ぼし、したがってタンパク質変性温度に影響を与えるものと予想される。種々のナトリウム塩の、hCGおよびrFSHTmに対する効果を測定するとき、かなり驚くべきことに、ホフマイスター系列に従って予想される安定化/不安定化作用が、アニオンを変更すると観測されない。図5、図6、および表27を参照のこと。hCGの場合、硫酸ナトリウムと塩化ナトリウムの両方が、実際にタンパク質を不安定化し、rFSHの場合、これらの塩はタンパク質を安定化する。hCGとrFSHの両方の場合、不安定化作用をタンパク質にもたらすと予想される過塩素酸ナトリウムは、全ての被検糖および塩の中で、実際に最もTmを上昇させた。HCGおよびRFSH純度に対する糖または塩の添加の効果貯蔵中のrFSHサブユニットの解離、rFSH純度rFSHは、非共有結合で結合している単量体が解離したとき、その生物活性を失うので、単量体解離によるrFSH活性の喪失を追跡する簡単明瞭な方式は、溶液状態でrFSHLMW形態の量を測定することである。この情報は、SECクロマトグラフィーから回収することができ、rFSHの主ピーク後に溶離するLMW形態は、解離したrFSHから生じることが知られている。検討された製剤において、rFSH凝集塊など他のタンパク質に関連した化合物が認められる。したがって、rFSHタンパク質純度を下記のように算出することができる。純度=100-LMW形態4表28でわかるように、保存剤が添加された場合と添加されていない場合の、異なる糖または塩を含有する新たに調製されたrFSH溶液は、同様の純度、すなわち同様の相対量の解離rFSHLMW形態を示す。スクロースとともにまたは糖も塩もなしでフェノールを含有する試料では、30°Cで1カ月貯蔵した後すでに、rFSH純度が低下するが、フェノールおよび硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを含有する試料ならびにフェノールが添加されていない試料では、rFSH純度の著しい低下は全く認められなかった表28を参照のこと。30°Cで6カ月貯蔵した後、フェノールを含有するが、糖も塩も添加されていないrFSH試料では、rFSH純度が80未満である。フェノールを含有し、スクロースを安定化剤として含むrFSH試料も、rFSH純度の著しい低下を示すが、フェノールを含有し、塩化ナトリウムまたは硫酸ナトリウムで安定化されている試料は、rFSH純度の微小の低下しか示さない表28を参照のこと。保存剤を全く含有していない試料は、貯蔵中の解離に対して最も安定である。すなわち、これらは、最高の純度を示す。しかし、非経口使用のための複数回投与水性製剤には、保存剤の添加が必要である。貯蔵中のhCG純度貯蔵時のhCG純度の変化に関する以前に公表されたデータを使用して、上記に示されたrFSH安定性データと比較するSamaritani、前掲。50°Cで1カ月貯蔵した後すでに、hCG純度は著しく低下する。これについては、塩化ナトリウムを含有する試料が、スクロースを含有する試料より著しく低下している表29を参照のこと。50°Cで6カ月貯蔵した後、塩化ナトリウムを含有する試料のhCG純度は、スクロースを含有する試料のhCG純度より10を超えるほど低い。hCGおよびrFSHのTMおよび純度の比較表30でわかるように、DSCで得られたrFSHおよびhCGの変性温度は、リアルタイム安定性データから得られたrFSHおよびhCGの純度とよく相関する。DSCと、SECで分析されたリアルタイム安定性との同様の相関関係は、組換え抗体および組換え糖タンパク質について以前に示された。rFSHのリアルタイム安定性データを30°Cで決定する。rFSH製品は、長期冷蔵貯蔵のためのものなので、促進安定性研究には、25~30°Cが好適な範囲である。hCGのリアルタイム安定性データは、50°Cで最高12週間まで貯蔵、25°Cおよび40°Cで11週間貯蔵、ならびに50°C.5で6週間貯蔵しか利用できない。40°C以下の温度では、スクロースおよび塩化ナトリウムを含む両製剤について、hCG純度の低下が貯蔵中6未満であり、したがって11~12週間貯蔵後にすでに、種々の糖および塩の効果間で区別することは困難である。50°Cより低い温度で観測された傾向は、50°Cの場合と同じであるが、50°Cにおいてのみ、様々な製剤を明確に区別することができる。結論高温で貯蔵した後のhCGおよびrFSHの変性温度ならびにhCGおよびrFSHの純度による種々の溶液中におけるhCGおよびrFSHの安定性の研究から、溶液状態でのhCGおよびrFSH安定性に及ぼす異なる糖および塩の影響についての明確な証拠が得られる。使用される2つの技法は液体DSCおよびSECクロマトグラフィーであり、両者は一致した結果を示す。これらの結果は、本リアルタイム安定性データで明らかに確認された。rFSH2次構造の変化CD分光法-実施例1、rFSH変性温度DSCによる3次および4次構造の変化-実施例2、または30±2°C/65±5RHで貯蔵した後に形成された解離rFSHの相対量SECによる4次構造の変化-実施例3による種々の溶液中におけるrFSH安定性の研究から、溶液状態でのrFSHの安定性に及ぼす保存剤および安定化剤の影響についての明確な証拠が得られる。使用される3つの技法は、CD、DSCおよびSECクロマトグラフィーであり、それらは全て一致した結果を示す。実施例1~3の全ての結果の結論としては、保存剤、フェノールまたはベンジルアルコールの添加は、溶液状態でのrFSHの安定性を低下させることが明らかにわかる。m-クレゾールおよびクロロクレゾールのような他のフェノール系保存剤は、同様な不安定化作用をもたらすと予想される。保存剤を添加したときのrFSHで観測された不安定化作用は、この分野における技術水準の認識とよく符合する。薬剤的に許容されるアルカリ金属Na塩またはK塩をrFSH溶液に添加すると、rFSHに対する保存剤の不安定化作用が相殺され、最も有利なことには、保存剤も塩も含有していないrFSH溶液に比べて、溶液状態でのrFSHの安定性が向上する。全ての被検ナトリウム塩およびカリウム塩は、使用するアニオンとは無関係にrFSHの安定性を向上させる。例えば、硫酸イオン、塩化物イオンおよび過塩素酸イオンのような無機アニオン、ならびにまたクエン酸イオン、酢酸イオンおよび酒石酸イオンのような有機アニオン。塩のカチオンを変更すると、rFSHの安定化度に大きな影響がもたらされる。1価のカチオン、特にナトリウムまたはカリウムのカチオンとの塩は、rFSHに対して著しい安定化作用をもたらす。過塩素酸ナトリウムをrFSH溶液に添加すると、最も安定なrFSH溶液が生成する。しかし、過塩素酸塩は、通常反応性が高く、酸化剤であり、したがって医薬製剤の不活性成分として認可されない。したがって、硫酸ナトリウムもしくは硫酸カリウムおよび塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが、最も好ましい安定化剤である。スクロースをhCGまたはrFSH溶液に添加すると、hCGとrFSHの両方で、タンパク質安定性がわずかに向上するが、塩化ナトリウムを添加すると、hCGには不安定化作用が、rFSHには安定化作用がもたらさせる実施例4を参照のこと。過塩素酸ナトリウムをhCGおよびrFSH溶液に添加すると、hCGとrFSHの両方に安定化作用がもたらされる実施例4。rFSH溶液に対するこれらの塩の安定化作用は、驚くべきことに、スクロースで観測される安定化作用より明らかに良好である。これらの結果の結論は、以下である:1研究条件下で、hCGおよびrFSH安定性に対する塩の効果は、ホフマイスター系列に従わない;2hCGおよびFSHは構造的に非常に類似しているすなわち、これらは、同じクラスのタンパク質に属し、両方ともグリコシル化されており、ともに2種類のサブユニットから、そのαサブユニットは、2つのタンパク質において同一であるということにもかかわらず、スクロースおよび塩化ナトリウムのような種々の糖および塩の、タンパク質安定性に対する効果は、hCGとrFSHとで異なる。非常に驚くべきことに、hCGおよびrFSHのような非常に類似したタンパク質について、塩は同じ安定化作用を示さない。3Na塩およびK塩は、FSH溶液に対する安定化作用を、使用するアニオンとは無関係に示す。4FSH溶液に対するNa塩およびK塩の安定化作用は、保存剤の不安定化作用を弱めることができる。略語および定義本文および実施例全体を通して、以下の略語および定義を使用する。ΔTm保存剤または塩を添加したときの変性温度の変化、さらにTmを参照のことARTs生殖補助医療assistedreproductivetechnologiesBAベンジルアルコールBTGBio-TechnologyGeneralCD円偏光二色性CHOチャイニーズハムスター卵巣CoA分析証明書DNAデオキシリボ核酸DSC示差走査熱量測定FSD女性性機能不全FSH卵胞刺激ホルモンhCGヒト絨毛性ゴナドトロピンIU国際単位ヨーロッパ薬局方および米国薬局方に準拠したSteelman-PohleyBioassayで決定したrFSHバイオ活性の尺度IUI子宮腔内授精LC-UV紫外検出を用いた液体クロマトグラフィーLH黄体形成ホルモンLMW主にまたは単独に解離単量体タンパク質からなる低分子量の形態OI排卵誘発p.a.ProAnalysisPh.Eur.ヨーロッパ薬局方RH相対湿度rFSH組換えヒト卵胞刺激ホルモンSECサイズ排除クロマトグラフィーSRCDシンクロトロン放射光円偏光二色性Tm熱転移の中点または転移中点または変性温度タンパク質分子の半分がフォールディングし、タンパク質分子の半分がアンフォールディングしているときの温度。TRIS2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオールTSH甲状腺刺激ホルモンUSP米国薬局方UV紫外線"