"ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母。グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び又はDリブロース5リン酸3エピメラーゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を導入した及び又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。アセチルCoAを基質として酢酸エチルを合成する反応に関与するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を強化したことを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。アセチルCoAを基質としてイソプロパノールを合成する反応に関与するアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、酪酸アセト酢酸CoAトランスフェラーゼのサブユニットA遺伝子、酪酸アセト酢酸CoAトランスフェラーゼのサブユニットB遺伝子、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。請求項1乃至5いずれか一項記載の組換え酵母を培地にて培養する工程を含む物質の製造方法。上記物質は、酢酸、アセチルCoA及びアセチルCoAに由来する物質からなる群から選ばれる1種であることを特徴とする請求項6記載の物質の製造方法。上記アセチルCoAに由来する物質は、酢酸エチル又はイソプロパノールであることを特徴とする請求項7記載の物資の製造方法。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、酵母おいてグルコース6リン酸からアセチルCoA又は酢酸を合成する代謝経路を導入することで、物質生産性に優れた組換え酵母及び当該酵母を用いた物質生産方法を提供することを目的とする。上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、酵母に対して解糖系に関与する遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入することで、酢酸、アセチルCoA及びアセチルCoA由来物質の生産性が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。なお、ホスホケトラーゼとは、キシルロース5リン酸をアセチルリン酸とグリセルアルデヒド3リン酸に変換する反応を触媒する酵素である。すなわち、本発明は以下を包含する。1ホスホフルクトキナーゼ遺伝子が減弱化され、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されてなる組換え酵母。2グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及び又はDリブロース5リン酸3エピメラーゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする1記載の組換え酵母。3ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を導入した及び又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする1記載の組換え酵母。4アセチルCoAを基質として酢酸エチルを合成する反応に関与するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を強化したことを特徴とする1記載の組換え酵母。5アセチルCoAを基質としてイソプロパノールを合成する反応に関与するアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、酪酸アセト酢酸CoAトランスフェラーゼのサブユニットA遺伝子、酪酸アセト酢酸CoAトランスフェラーゼのサブユニットB遺伝子、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする1記載の組換え酵母。6上記1乃至5いずれかに記載の組換え酵母を培地にて培養する工程を含む物質の製造方法。7上記物質は、酢酸、アセチルCoA、アセチルCoAに由来する酢酸エチル及びアセチルCoAに由来するイソプロパノールからなる群から選ばれる1種であることを特徴とする6記載の物資の製造方法。本発明に係る組換え酵母は、フルクトース6リン酸をフルクトース16ビスリン酸に変換する活性が減弱化され、且つ、キシルロース5リン酸をアセチルリン酸へと変換する活性を付与されている。これにより、本発明に係る組換え酵母を利用することにより、酢酸やアセチルCoA由来物質の生産性を向上させることができる。以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。本発明に係る組換え酵母は、解糖系に関与する酵素をコードする遺伝子を減弱化し、且つ、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されることでキシルロース5リン酸をアセチルリン酸へと変換する活性を有している。宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandidaShehatae等のCandida属酵母、Pichiastipitis等のPichia属酵母、Pachysolentannophilus等のPachysolen属酵母、Saccharomycescerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びSchizosaccharomycespombe等のSchizosaccharomyces属酵母が挙げられ、特にSaccharomycescerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株実用株でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。ここで、解糖系に関与する酵素をコードする遺伝子であって減弱化する対象の遺伝子としては、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を挙げることができる。なお、解糖系に関与する酵素としては、ホスホフルクトキナーゼ以外にもヘキソキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、エノラーゼ及びピルビン酸キナーゼが知られている。これらホスホフルクトキナーゼ以外の酵素をコードする遺伝子を減弱化しても良い。ホスホフルクトキナーゼ遺伝子は、図1に示すように解糖系において、フルクトース6リン酸をフルクトース16ビスリン酸に変換する酵素をコードしている。ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとは、ホスホフルクトキナーゼ活性を有意に低下させること、換言すれば、解糖系におけるフルクトース16ビスリン酸の合成量を有意に低下させることを意味する。ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する手段としては、特に限定されないが、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を破壊する又は欠失させる、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子の発現制御領域を破壊する又は欠失させる、ホスホフルクトキナーゼの阻害物質例えばクエン酸を添加する、若しくは、siRNA等のRNA干渉を利用する方法やアンチセンス法によりホスホフルクトキナーゼ遺伝子の発現を抑制するといった手法を挙げることができる。なお、Saccharomycescerevisiaeに内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子としては、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子が知られているTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVol275No52IssueofDecember29pp40952409602000。本発明に係る組換え酵母の宿主としてSaccharomycescerevisiaeを利用する場合、これらPFK1遺伝子及びPFK2遺伝子のいずれか一方を減弱化しても良いし、両方を減弱化しても良い。なお、Saccharomycescerevisiae以外の酵母についても、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。このように、各種の酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を特定することで、上述した手法及び又は手段により特定したホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化することができる。また、本発明に係る組換え酵母は、ホスホケトラーゼ遺伝子PKT遺伝子が外来的に導入されることで、キシルロース5リン酸をアセチルリン酸へと変換する能力を獲得している。なお、キシルロース5リン酸は、酵母が本来的に有しているペントースリン酸系における代謝物質としてリブロース5リン酸から合成される図2。ホスホケトラーゼにより合成されたアセチルリン酸は、酵母が本来的に有している酢酸キナーゼにより酢酸に変換される。したがって、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母においては、培地への酢酸の分泌生産性が大幅に向上する。ホスホケトラーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ヘテロ乳酸発酵の代謝経路を有する乳酸菌やビフィズス菌由来のホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。ここでヘテロ乳酸発酵とは、グルコースから解糖系を経て生成したピルビン酸が乳酸のみならず、エタノールや酢酸と二酸化炭素に代謝される発酵を意味する。ヘテロ乳酸発酵においては、ホスホケトラーゼにより生成したアセチルリン酸からエタノールや酢酸が合成されることとなる。より具体的に、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図3に示すように、各種微生物由来のホスホケトラーゼ遺伝子を使用することができる。なお、図3に示す分子系統樹に割り振った番号と微生物との対応関係を下記表1に示した。また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図3に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。この一群に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子は、主として、ヘテロ乳酸発酵の代謝経路を有する乳酸菌やビフィズス菌に由来する。すなわち、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、図3に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるように、ビフィズス菌であるBifidobacterium属微生物、乳酸菌であるLactobacillus属微生物やLeuconostoc属微生物由来の遺伝子を使用することが好ましい。更に詳細に、図3に示す分子系統樹において破線枠内に分類されるホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号1~19のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含むホスホケトラーゼをコードする遺伝子を使用することができる。配列番号1のアミノ酸配列は、Bifidobacteriumanimalis由来のホスホケトラーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列である。配列番号2~19に示すアミノ酸配列は、それぞれ順にBifidobacteriumlongum、Bifidobacteriumadolescentis、Bifidobacteriumpullorum、Lactobacillusplantarum、Lactobacillusplantarum、Lactobacilluspentosus、Lactobacillussakei、Lactobacillussalivarius、Lactobacillusreuteri、Lactobacillusjohnsonii、Lactobacilluscasei、Bacilluscoagulans、Leuconostocmesenteroides、Leuconostocmesenteroides、Streptococcusgordonii、Clostridiumacetobutylicum、Clostridiumbutyricum及びMycoplasmaagalactiae由来のホスホケトラーゼ遺伝子がコードアミノ酸配列である。すなわち、本発明においては、配列番号1~19のいずれかに記載されたアミノ酸配列をコードするホスホケトラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。なかでも、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、Bifidobacteriumanimalis配列番号1、Bifidobacteriumlongum配列番号2、Bifidobacteriumadolescentis配列番号3及びBifidobacteriumpullorum配列番号4を使用することが最も好ましい。なお、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号1~19のいずれかのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば2~100個、好ましくは2~80個、より好ましくは2~55個、更に好ましくは2~15個のアミノ酸を意味する。また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、配列番号1~19のいずれかのアミノ酸配列に対して80以上、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、更に好ましくは98以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなり、ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、配列類似性とは、BLAST、PSIBLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して2つのアミノ酸配列間の類似性を示す値として算出される値を意味する。ここで、ホスホケトラーゼ活性とは、キシルロース5リン酸をアセチルリン酸に変換する活性である。よって、所定のタンパク質がホスホケトラーゼ活性を有するか否かは、キシルロース5リン酸を基質として含有する反応液を利用してアセチルリン酸の合成量により判定することができる例えば、JOURNALOFBACTERIOLOGYVol183No9May2001p29292936。ところで、本発明に係る組換え酵母は、図2に示したペントースリン酸系に関与する酵素遺伝子の発現を強化することで、導入したホスホケトラーゼ遺伝子によるアセチルリン酸の合成量を向上させることができ、その結果、酢酸の合成量を向上させることができる。図2に示したペントースリン酸系において発現を強化する対象の遺伝子としては、特に限定されないが、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びリブロース5リン酸3エピメラーゼ遺伝子を挙げることができる。なお、これら遺伝子のうち一方の遺伝子の発現を強化しても良いし、両方の遺伝子の発現を強化しても良い。なお、Saccharomycescerevisiaeに内在するグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、ZWF1遺伝子として知られている。また、Saccharomycescerevisiaeに内在するリブロース5リン酸3エピメラーゼ遺伝子としては、RPE1遺伝子として知られている。Saccharomycescerevisiae以外の酵母についても、内在するグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子やリブロース5リン酸3エピメラーゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。ここで、遺伝子の発現を強化するとは、対象となる遺伝子がコードする酵素の活性が有意に向上することを意味し、当該遺伝子の発現量を有意に向上させることを含む意味である。遺伝子の発現を強化する手法としては、当該遺伝子の発現量を有意に向上させる手法を挙げることができる。特定の遺伝子の発現量を向上する手法としては、特に限定されないが、染色体に内在する遺伝子の発現制御領域を改変する手法、活性の高いプロモーターの下流に当該遺伝子を配置したベクターを導入する手法を挙げることができる。一方、本発明に係る組換え酵母は、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子の減弱化及びホスホケトラーゼ遺伝子の導入に加えて、図4に示すように、更にホスホトランスアセチラーゼ遺伝子PTA遺伝子を導入するか、更にアセチルCoAシンテターゼ遺伝子ACS遺伝子を強化することで、アセチルCoAの合成量を向上させることができる。ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子は、本来酵母が有していない遺伝子であり、外来遺伝子として導入される。ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、各種細菌においてPTA遺伝子と呼称されるものを広く適用することができる。より具体的に、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、図5に示すように、各種微生物由来のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子を使用することができる。なお、図5に示す分子系統樹に割り振った番号と微生物との対応関係を下記表2に示した。図5及び表2に示した、Bacillussubtilis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に示し、Bacillusamyloliquefaciens由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号21に示し、Bacilluslicheniformis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に示し、Geobacillusthermodenitrificans由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号23に示し、Listeriainnocua由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示し、Staphylococcusaureus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号25に示し、Lactococcuslactis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号26に示し、Carnobacteriumsp由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号27に示し、Mycobacteriumvanbaalenii由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号28に示し、Clostridiumperfringens由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号29に示し、Enterococcusfaecalis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30に示し、Leuconostocmesenteroides由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号31に示し、Clostridiumacetobutylicum由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号32に示し、Bifidobacteriumanimalislactis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号33に示し、Corynebacteriumglutamicum由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号34に示し、EscherichiacoliK12由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号35に示し、Escherichiacoli53638由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号36に示し、Vibriovulnificus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号37に示し、Haemophilussomnus由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号38に示し、Yersiniapestis由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号39に示し、Shigellasonnei由来のPTA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号40に示す。なお、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、配列番号20~40のいずれかのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、数個のアミノ酸とは、例えば2~35個、好ましくは2~25個、より好ましくは2~15個、更に好ましくは2~10個のアミノ酸を意味する。また、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子としては、配列番号20~40のいずれかのアミノ酸配列に対して80以上、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、更に好ましくは98以上の配列類似性を有するアミノ酸配列からなり、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものであってもよい。ここで、配列類似性とは、BLAST、PSIBLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して2つのアミノ酸配列間の類似性を示す値として算出される値を意味する。ここで、ホスホトランスアセチラーゼ活性とは、アセチルリン酸にCoAを転移する活性である。よって、所定のタンパク質がホスホトランスアセチラーゼ活性を有するか否かは、アセチルリン酸及びCoAを含有する反応液を利用してアセチルCoAの合成量により判定することができる。また、図4に示したアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、酵母が本来有している遺伝子である。よってアセチルCoAシンテターゼ遺伝子を強化するには、染色体に内在する当該遺伝子の発現制御領域を改変する手法、活性の高いプロモーターの下流に当該遺伝子を配置したベクターを導入する手法を適用することができる。なお、Saccharomycescerevisiaeに内在するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子としては、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子が知られている。Saccharomycescerevisiae以外の酵母についても、内在するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は公知であり、既存のGenbank、DDBJ、EMBL等のデータベースを参照して特定することができる。以上のように、本発明に係る組換え酵母は、アセチルリン酸の合成量すなわち酢酸の合成量が顕著に向上しているか図2、アセチルCoAの合成量が顕著に向上している図4。このため、本発明に係る組換え酵母は、酢酸又はアセチルCoAを生産対象とする場合に使用できる。あるいは、本発明に係る組換え微生物は、アセチルCoAを基質として他の物質図4中、アセチルCoA由来の物質と表記を製造できるように更なる改変を行うための宿主として使用することができる。具体的には、アセチルCoA由来の物質としては、特に限定されないが、ブタノール、アルカン、プロパノール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アセトン、アセト酢酸、酢酸エチル、ポリケチド、アミノ酸及びテルペノイドを合成することができる。これらを生産対象の物質としたとき、本発明に係る組換え酵母を利用することによって生産対象の物質の生産性を大幅に向上できる。イソプロパノールを生産対象物質とする場合、例えば、APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGYDec2007p78147818Vol73No24を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。また、ポリケタイドを生産対象物質とする場合、ProcNatlAcadSciUSAVol95pp505509January1998を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。さらに、脂肪酸を生産対象物質とする場合、例えば、EurJBiochem112p431442又はMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYREVIEWSSept2004p501517を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入するか、強化すべき遺伝子例えば、FAS遺伝子を特定することができる。さらにまた、アルカンを生産対象物質とする場合、脂肪酸からアルデヒドの合成、更にアルデヒドからアルカンの合成に関与する遺伝子について例えば、Sciencevol32930julyp559562を参照することで本発明に係る組換え微生物に更に導入すべき遺伝子を特定することができる。また、酵母に内在するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子ATF1遺伝子の発現を更に強化することで、アセチルCoAからの酢酸エチルの合成量を向上できる。すなわち、酢酸エチルを生産対象物質とする場合、内在するATF1遺伝子の発現を強化することが好ましい。また、上述したように、所定の遺伝子の発現を強化する際には、転写活性の高い適当なプロモーターを使用する。このようなプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子TDH3のプロモーター、3ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子PGK1のプロモーター、高浸透圧応答7遺伝子HOR7のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子PDC1のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。その他にも、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを使用することで、下流の遺伝子を強発現させることができる。また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法MethEnzym194p182、スフェロプラスト法ProcNatlAcadSciUSA75p1929、酢酸リチウム法JBacteriology153p163、ProcNatlAcadSciUSA75p1929、Methodsinyeastgenetics2000EditionAColdSpringHarborLaboratoryCourseManualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。以上で説明した組換え酵母を使用して物質を製造する際には、適当な炭素源を含有する培地にて培養を行う。より具体的には、定法に従い前培養した組換え酵母を培地にて培養し、目的物質を生産させる。例えば、目的物質として、ブタノール、アルカン、プロパノール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アセトン、アセト酢酸、酢酸エステル、ポリケチド、アミノ酸及びテルペノイドを製造する際、これら目的物質は培地中に合成される、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分から物質を単離できる。上清画分から物質を単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層から物質を抽出することができる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例では、野生型の酵母及びイソプロパノール生産酵母において、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母、及び更に他の遺伝子を導入又は強化した組換え酵母を作製し、酢酸、酢酸エチル及びイソプロパノールの生産性について検討した。材料と方法宿主ECOSCompetentEcoliJM109、野生型酵母としてScerevisiaeYPH499stratagene社製及びイソプロパノール生産酵母として後述の参考例に開示した1510株を使用した。プラスミド<pESCpgkgapHISの作製>以下の条件でPCRを行った。プライマーEcoRIPgapF:5CACGGAATTCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAA3配列番号41BamHIPgapR:5CTCTGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC3配列番号42PCR条件鋳型:pDI626プラスミド1ng特開2005-52046号公報参照プライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP及び1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C2分×25サイクル72°C3分4°Cストック上記の条件でPCRを行った後、反応液に含まれるPCR産物をQIAGEN社製のMinElutePCRpurificationkitを用いて精製した。その後、PCR産物を制限酵素BamHIとEcoRIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、686bpの断片を切り出してQIAGEN社製MiniEluteGelextractionkitを用いて精製した。また、制限酵素BamHIとEcoRIで消化したpESCHISベクターにライゲーションした。こうして得られたプラスミドをpESCgapHISと命名した。次に以下の条件でPCRを行った。プライマーMunIPpgk1F:5TAGGCAATTGCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG3配列番号43EcoRIPpgk1R:5ATAAGAATTCTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3配列番号44PCR条件鋳型:pDI626PGKプラスミド1ngプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP及び1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C2分×25サイクル72°C3分4°Cストック上記の条件でPCRを行った後、反応液に含まれるPCR産物をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製した。その後、PCR産物を制限酵素MunIとEcoRIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、718bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製した。また、制限酵素EcoRIで消化し、BAP処理したpESCgapHISベクターにライゲーションした。こうして得られたプラスミドをpESCpgkgapHISと命名した。<pESCpgkgapLEUの作製>上記pESCpgkgapHISを制限酵素BamHIとNotIで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素BamHIとNotIで消化したpESCLEUベクターにライゲーションした。<pESCpgkgapTRPの作製>上記pESCpgkgapHISを制限酵素BamHIとNotIで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素BamHIとNotIで消化したpESCTRPベクターにライゲーションした。<pESCpgkgapURAの作製>上記pESCpgkgapHISを制限酵素BamHIとNotIで消化後、1427bpの断片を切り出し、同様に制限酵素BamHIとNotIで消化したpESCURAベクターにライゲーションした。<その他ベクターの作製>ZWF1遺伝子及びRPE1遺伝子の発現を強化するためのpESCHISZWF1RPE1ベクター;PKT遺伝子を導入するためのpESCLeuPKTベクター;PKT遺伝子及びPTA遺伝子を導入するためのpESCLeuPKTPTAベクター;ATF1遺伝子の発現を強化するためのpESCTrpATF1ベクター;及びPFK1遺伝子並びにPFK2遺伝子破壊用ベクターを作製する際には、以下の組成及び条件にてPCRを行った。なお、DNAポリメラーゼは、KODPlusVer2TOYOBO社製を使用した。pESCHISZWF1RPE1ベクターを作製するフローを図6に示した。pESCLeuPKTベクター及びpESCLeuPKTPTAベクターを作製するフローを図7に示した。pESCTrpATF1ベクターを作製するフローを図8に示した。PFK1遺伝子破壊用ベクターを作製するフローを図9に示した。PFK2遺伝子破壊用ベクターを作製するフローを図10に示した。図6~10に示したベクター作製フローにおいて、使用したプライマーを表5に纏めた。なお、PCR産物の精製は、QIAquickPCRPurificationKitQIAGEN社製を使用した。また、図6~10に示したベクター作製フローにおいて、PCR産物のTOPOクローニングは、ZeroBluntTOPOPCRcloningkitinvitrogen社製を使用した。また、pAUR135はタカラバイオより購入した。図6~10に示したベクター作製フローにおいて、アガロースゲルからのDNA断片の切り出しは、QIAquickGelExtractionKitQIAGEN社製を使用した。図6~10に示したベクター作製フローにおいて、ベクターとDNA断片の連結は、LigationconvenienceKitニッポンジーン社製によるライゲーション反応、又はInFusionDryDownPCRCloningKitクロンテック社製によるインフュージョン反応で行った。また、図7に示したベクター作製フローにおいて、pBSKPKT及びpBSKPTAと表記したベクターは、5種類のPKT遺伝子と、3種類のPTA遺伝子を合成してpBluescriptIISKのSmaIサイトに挿入して作製したものである。なお、これら5種類のPKT遺伝子と3種類のPTA遺伝子は全てSaccharomycescerevisiae用コドンに最適化した。5種類のPKT遺伝子とは、Bifidobacteriumanimalissubsplactis由来のphosphoketolase遺伝子配列番号63及び64、AspergillusoryzaeRIB40由来phosphoketolaseI遺伝子配列番号65及び66、AspergillusoryzaeRIB40由来phosphoketolaseII遺伝子配列番号67及び68、NostocpunctiformeATCC29133由来phosphoketolase遺伝子配列番号69及び70、MarinobacteraquaeoleiATCC700491由来phosphoketolase遺伝子配列番号71及び72である。また、3種類のPTA遺伝子とは、Bacillussubtilissubspsubtilisstr168由来phosphateacetyltransferase遺伝子配列番号73及び74、BifidobacteriumanimalissubsplactisAD011由来phosphateacetyltransferase遺伝子配列番号75及び76及びEscherichiacoliK12MG1655由来phosphateacetyltransferase遺伝子配列番号77及び78である。形質転換大腸菌の形質転換は、ECOSCompetentEcoliJM109付属のプロトコルに沿って行った。酵母の形質転換は、FrozenEZYeastTransformationIIKitザイモリサーチ社製付属のプロトコルに沿って行った。PFK1遺伝子並びにPFK2遺伝子破壊用ベクターを用いた酵母の遺伝子破壊は、pAUR135DNAタカラバイオ社製添付のプロトコルに沿って行った。酢酸生産試験形質転換体の培養は、SDHis,Leu寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSDHis,Leu培地に植菌して30°Cで一晩培養オリエンタル技研工業製IFM型,130rpmした前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った100mlのSDHis,Leu培地に1容量接種し培養した。培養液は遠心6000×g、15min、室温し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。酢酸エチル生産試験形質転換体の培養は、SDHis,Leu,Trp寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSDHis,Leu,Trp培地に植菌して30°Cで一晩培養130rpmした前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った100mlのSDHis,Leu,Trp培地に1容量接種し培養した。培養液は遠心6000×g、15min、室温し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。イソプロパノール生産試験形質転換体の培養は、SDHis,Leu,Ura,Trp寒天培地でアクティブコロニーを作り、15ml容量試験管に入った2mlのSDHis,Leu,Ura,Trp培地に植菌して30°Cで一晩培養130rpmした前培養液を、500ml容量三角フラスコに入った50mlのSDHis,Leu,Ura,Trp培地に1容量接種し培養した。培養液は遠心6000×g、15min、室温し、その上清1mlをガラス製バイアルビンにいれ、これを分析用サンプルとした。GC分析条件標品は、酢酸ナカライテスク社製、酢酸エチルナカライテスク社製、イソプロパノールナカライテスク社製を使用した。分析機器、分析条件は酢酸生産試験、酢酸エチル生産試験及びイソプロパノール生産試験の全てについて以下の条件とした。CETOFMSによる酵母のメタボローム解析<前処理>SD-His,Leu,Ura,Trp培地で菌体の培養を行い30°C、試料量が15ODunitになるようにサンプリングした。これをフィルトレーションにより速やかに吸引ろ過した。次にMilliQ水10mL×2回を吸引ろ過し、洗浄した。フィルター上に集菌された酵母菌体は内部標準物質5μMを含んだメタノール2mLに浸した後に、16mLを遠沈管に移した。ここに1600μLのクロロホルム及び640μLのMilliQ水を加え撹拌し、遠心分離2300×g、4°C、5分を行った。遠心分離後、水相を限外ろ過チューブMILLIPORE社製、ウルトラフリーMCUFC3LCC遠心式フィルターユニット5KDaに250μL×6本移し取った。これを遠心9100×g、4°C、120分し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50μLのMilliQ水に溶解して測定に供した。<測定>本試験では陰イオン性代謝物質アニオンモードの測定を以下に示す条件~3参照で行った。装置:AgilentCETOFMSsystemAgilentTechnologies社CapillaryFusedsilicacapillaryid50μm×80cm測定条件:RunbufferAnionBufferSolutionRinsebufferAnionBufferSolutionSampleinjectionPressureinjection50mbar25secCEvoltagePositive30kVMSionizationESINegativeMScapillaryvoltage3500VMSscanrangemz501000SheathliquidHMTSheathLiquid<参考文献、資料>1TSogaDNHeigerAminoacidanalysisbycapillaryelectrophoresiselectrosprayionizationmassspectrometryAnalChem721236124120002TSogaYUenoHNaraokaYOhashiMTomitaetalSimultaneousdeterminationofanionicintermediatesforBacillussubtilismetabolicpathwaysbycapillaryelectrophoresiselectrosprayionizationmassspectrometryAnalChem742233223920023TSogaYOhashiYUenoHNaraokaMTomitaetalQuantitativemetabolomeanalysisusingcapillaryelectrophoresismassspectrometryJProteomeRes248849420034httpvantedipkgaterslebende結果酢酸生産試験酢酸生産試験に供した酵母を表7に纏め、試験結果を図11に示した。表中、PKTとはBifidobacteriumanimalissubsplactis由来のphosphoketolase遺伝子であり、PKTとはAspergillusoryzaeRIB40由来phosphoketolaseI遺伝子であり、PKTとはAspergillusoryzaeRIB40由来phosphoketolaseII遺伝子であり、PKTとはNostocpunctiformeATCC29133由来phosphoketolase遺伝子であり、PKTとはMarinobacteraquaeoleiATCC700491由来phosphoketolase遺伝子である。図11に示した結果より、宿主となる酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入することによって、解糖系ではなくペントースリン酸系図2への流束を高めることができ、酢酸を高生産できることが明らかとなった。また、ホスホケトラーゼ遺伝子としては、ビフィズス菌由来の遺伝子、特にBifidobacteriumanimalis由来の遺伝子が酢酸の生産性の点で優れることが明らかとなった。この結果からホスホケトラーゼ遺伝子としては、図3に示した系統樹において破線枠内にあるホスホケトラーゼ遺伝子が酢酸生産性の点でより好ましいことが明らかとなった。さらに、図11に示した結果より、解糖系への流束を弱めるため、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する場合、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子の両方を破壊することが好ましいことが明らかとなった。さらにまた、ペントースリン酸系図2に関与する酵素遺伝子を強化することで、ペントースリン酸系図2への流束をより高めることができ、酢酸をより高生産できることが明らかとなった。酢酸エチル生産試験酢酸エチル生産試験に供した酵母を表8に纏め、試験結果を図12に示した。表中、PTAとはBacillussubtilissubspsubtilisstr168由来phosphateacetyltransferase遺伝子であり、PTAとはBifidobacteriumanimalissubsplactisAD011由来phosphateacetyltransferase遺伝子であり、PTAとはEscherichiacoliK12MG1655由来phosphateacetyltransferase遺伝子である。なお、本試験において、PKT遺伝子は、Bifidobacteriumanimalissubsplactis由来のphosphoketolase遺伝子を使用した。図12に示すように、野生株YPH499株にATF1遺伝子を導入したコントロール株においても、野生株と比較すると酢酸エチルの生産性が向上している。しかし、宿主となる酵母に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子PTA遺伝子を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子ACS遺伝子を強化することで、コントロールと比較して酢酸エチルの生産性が更に向上していることが判る。この結果及び図4に示した代謝概略マップから、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子PTA遺伝子を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子ACS遺伝子を強化することでアセチルCoAの合成量が顕著に向上していることが示された。そして、合成されたアセチルCoAは、ATF1酵素により酢酸エチルとして菌体外に高蓄積されることが示された。特に、導入するホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、Bacillussubtilis由来の遺伝子がアセチルCoA生産性の観点から好ましいことが判った。また、強化するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子のうちACS1遺伝子のほうが好ましいことが明らかとなった。さらに、図12に示した結果より、解糖系への流束を弱めるため、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化する場合、PFK1遺伝子及びPFK2遺伝子の両方を破壊することが好ましいことが明らかとなった。さらにまた、ペントースリン酸系図2に関与する酵素遺伝子を強化することで、ペントースリン酸系図2への流束をより高めることができ、酢酸エチルをより高生産できることが明らかとなった。イソプロパノール生産試験イソプロパノール生産試験に供した酵母を表9に纏め、試験結果を図13に示した。表中、PTA~は表8と同じ遺伝子を示している。図13に示すように、野生株YPH499株にctfA遺伝子、ctfB遺伝子、adc遺伝子及びipdh遺伝子を導入することで、酵母にイソプロパノール生産能を付与できることが判る。そして、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子PTA遺伝子を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子ACS遺伝子を強化することで、コントロールと比較してイソプロパノールの生産性が顕著に向上していることが判る。この結果及び図4に示した代謝概略マップから、内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにホスホケトラーゼ遺伝子を導入し、更にホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子PTA遺伝子を導入するか又はアセチルCoAシンテターゼ遺伝子ACS遺伝子を強化することでアセチルCoAの合成量が顕著に向上していることが示された。そして、合成されたアセチルCoAは、ctfA、ctfB、adc及びipdhによりイソプロパノールとして菌体外に高蓄積されることが示された。特に、導入するホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、Bacillussubtilis由来の遺伝子がアセチルCoA生産性の観点から好ましいことが判った。また、強化するアセチルCoAシンテターゼ遺伝子は、ACS1遺伝子及びACS2遺伝子のうちACS1遺伝子のほうが好ましいことが明らかとなった。CETOFMSによる酵母のメタボローム解析野生型YPH499株、YPH499株に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにペントースリン酸系図2に関与する酵素遺伝子を強化した株YPH499ΔPFKαZWFRPEと表記及びYPH499株に内在するホスホフルクトキナーゼ遺伝子を減弱化するとともにペントースリン酸系図2に関与する酵素遺伝子を強化し、ホスホケトラーゼ遺伝子及びホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入した株YPH499ΔPFKαZWFRPEPKTPTAと表記について、メタボローム解析した結果を図14に示す。図14中、YPH499株野生株に関するアセチルCoA量は、エタノールを介するアセチルCoA合成経路とミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路の合算値である。なお、酵母におけるアセチルCoA合成経路は、これらエタノールを介するアセチルCoA合成経路とミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路の2つが存在する。一方、YPH499ΔPFKαZWFRPE株では、エタノールを介するアセチルCoA合成経路が機能しなくなる。これは、ZWFでNADPが消費されてしまい、その結果、アルデヒドから酢酸への反応を触媒するALD2が機能しなくなるためである酢酸生産試験図11のコントロール株における酢酸生産性を参照。従って、YPH499ΔPFKαZWFRPE株におけるアセチルCoA合成量の値は、ミトコンドリア内におけるアセチルCoA合成経路で生成されたアセチルCoA量に対応している。なお、ミトコンドリア内で合成されたアセチルCoAは、ミトコンドリア内で消費されるため、酢酸エチルやイソプロパノール等の物質の原料として使用することができない。よって、酵母細胞のサイトゾルにおいてアセチルCoAの合成量を高めなければ、合成されたアセチルCoAを用いた物質の合成量を向上させることはできない。そして、YPH499ΔPFKαZWFRPEPKTPTA株は、YPH499ΔPFKαZWFRPE株にPKT遺伝子及びPTA遺伝子を導入することで新規なアセチルCoA合成経路図2及び4参照を構築した変異株である。したがって、YPH499ΔPFKαZWFRPEPKTPTA株におけるアセチルCoA合成量から、YPH499ΔPFKαZWFRPE株におけるアセチルCoA合成量を差し引くことで、上述した新規なアセチルCoA合成経路によるアセチルCoAの合成量を評価することができる。詳細には、図14に示した結果から621448pmolに相当するアセチルCoAが、新たなアセチルCoA合成経路により合成できたと結論付けられた。参考例本参考例では、上述の実施例で使用したイソプロパノール生産酵母1510の作製について説明する。イソプロパノール合成遺伝子の取得以下の4つの遺伝子をクロストリジウムClostridiumacetobutylicumATCC824株のゲノムよりpT7Blueベクターにクローニングした。adcAcetoacetatedecarboxylasectfAButyrateacetoacetateCoAtransferasesubunitActfBButyrateacetoacetateCoAtransferasesubunitBthiAAcetylCoAacetyltransferasepT7BlueADCの作製以下の条件でPCRを行った。プライマーadcF:5ATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAG3配列番号79adcR:5TTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGCTC3配列番号80反応条件鋳型:04μgのクロストリジウムのゲノムDNAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C5分×30サイクル72°C3分4°Cストック増幅した735bpの断片をNovagen社製PerfectlyBluntCloningKitを用いてpT7Blueベクターにブラントエンドクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridiumacetobutylicumATCC824株のadc配列CAP0165であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7BlueADCと命名した。pT7BlueCTFAの作製以下の条件でPCRを行った。プライマーctfAF:5ATGAACTCTAAAATAATTAGATTTGAAAATTTAAGG3配列番号81ctfAR:5TTATGCAGGCTCCTTTACTATATAATTTA3配列番号82反応条件鋳型:04μgのクロストリジウムのゲノムDNAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C5分×30サイクル72°C3分4°Cストック増幅した657bpの断片をNovagen社製PerfectlyBluntCloningKitを用いて同様にクローニングした。クローニングした配列をシークエンスしClostridiumacetobutylicumATCC824株のctfA配列CAP0163であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7BlueCTFAと命名した。pT7BlueCTFBの作製以下の条件でPCRを行った。プライマーctfBF:5ATGATTAATGATAAAAACCTAGCGAAAG3配列番号83ctfBR:5CTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTC3配列番号84反応条件鋳型:04μgのクロストリジウムのゲノムDNAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C5分×30サイクル72°C3分4°Cストック増幅した666bpの断片をNovagen社製PerfectlyBluntCloningKitを用いてクローニングした。クローニングした配列をシークエンスし、ClostridiumacetobutylicumATCC824株のctfB配列CAP0164であることを確認した。こうして得られたプラスミドをpT7BlueCTFBと命名した。pDI626PGKproの作製以下の条件でPCRを行った。プライマーSacIPpgk1FW:5TAGGGAGCTCCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG3配列番号85SacIIPpgk1RV:5ATAACCGCGGTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG3配列番号86反応条件鋳型:04μgの酵母YPH499のゲノムDNAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C5分×25サイクル72°C3分4°Cストック反応液をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製後、制限酵素SacIとSacIIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、712bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製した。同様に制限酵素SacIとSacIIで消化したpDI626GAPベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKproと命名した。pDI626PGKの作製以下の条件でPCRを行った。プライマーSalITpgk1FW:5TTAAGTCGACATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATC3配列番号87KpnITpgk1RV2:5TTAAGGTACCGCTTCAAGCTTACACAACAC3配列番号88反応条件鋳型:04μgの酵母YPH499のゲノムDNAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C5分×25サイクル72°C3分4°Cストック反応液をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製後、制限酵素SalIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、330bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製した。制限酵素SalIとKpnIで消化したpDI626PGKproベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKと命名した。pDI626PGKTの作製pDI626PGKを制限酵素SbfIで消化し、反応液をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製した。その後、TaKaRaBIO社製Bluntingkitを用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素KpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、3650bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製した。これをライゲーションするためのベクターとした。次にpRS524GAPを制限酵素PmaCIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、765bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製しインサートとした。これらのライゲーションを行ない、得られた配列のつなぎ目をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKTと命名した。pCR21iPDHの作製GenBankhttpwwwnebnihgovGenbankindexhtmlに登録されているClostridiumbeijerinckiiNRRLB593由来のadh:NADPdependentalcoholdehydrogenase遺伝子配列を元にSaccharomycescerevisiaeのコドンに最適化したDNA配列を合成したOperon社。vector部分はpCR21Invitrogen社製である。なお、合成したDNA配列を配列番号89に示し、合成したDNA配列に含まれるコーディング領域によりコードされるアミノ酸配列を配列番号90に示した。このプラスミドをpCR21iPDHと命名した。pDI626PGKTiPDHの作製pCR21iPDHを制限酵素SacIIとSalIで消化し、1080bpの断片を切り出して、同様に制限酵素SacIIとSalIで消化したpDI626PGKTベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626PGKTiPDHと命名した。pENTADCの作製pDI626ADCを鋳型にして、以下のプライマーでPCRを行った。プライマー08189adcattB1Fw:5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAGTTCGAGTTTATCATTATC3配列番号9108189adcattB4Rv:5GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC3配列番号92得られた1809bpのPCR産物をgatewayBP反応によりドナーベクターpDONR221P1P4に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENTADCと命名した。pENTCTFAの作製pDI626PGKCTFAを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。08189ctfAattB4rFw:5GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGGCTTCAAGCTTACACAACACGG3配列番号9308189ctfAattB3rRv:5GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTCAAGAATTACTCGTGAGTAAGG3配列番号94得られた1823bpのPCR産物をgatewayBP反応によりドナーベクターpDONR221P4rP3rに導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENTCTFAと命名した。pDI626CTFBの作製pT7BlueCTFBを制限酵素BamHIとSalIで消化し、771bpの断片を切り出して、同様に制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626CTFBと命名した。プライマー中の変異個所を修正するために以下のプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。BamHIctfBF:5TAGTGGATCCGATGATTAATGATAAAAACC3配列番号95pDI626MCSseqF:5CCTAGACTTCAGGTTGTCTAAC3配列番号96反応条件鋳型:1ngのpDI626CTFBプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C2分×20サイクル72°C3分4°Cストック反応液をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製後、制限酵素BamHIとSalIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、702bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製した。制限酵素BamHIとSalIで消化したpDI626ベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、変異個所が修正されていることを確認した。こうして得られたプラスミドをpDI626CTFBと命名した。pENTCTFBの作製pDI626CTFBを鋳型にして、以下のプライマーを用いてPCRを行った。08189ctfBattB3Fw:5GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGCCGCAAATTAAAGCCTTC3配列番号9708189ctfBattB2Rv:5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAGTTCGAGTTTATCATTATC3配列番号98得られた1737bpのPCR産物をgatewayBP反応によりドナーベクターpDONR221P3P2に導入した。得られたクローンのシーケンスを行ない、インサートの全塩基配列に変異個所が無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpENTCTFBと命名した。pDEST626の作製以下の条件でPCRを行った。プライマーSacIconvAF:5TAGGGAGCTCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTG3配列番号99KpnIconvAR:5TTAAGGTACCATCACCACTTTGTACAAGAAAGC3配列番号100反応条件鋳型:05ngのRfAInvitrogen社製;GatewayVectorConversionSystemのReadingFrameCassetteAプライマー:50pmolprimerDNA反応液:1xPfuUltraIIreactionbuffer、10nmoldNTP、1μlPfuUltraIIfusionHSDNApolymeraseを含む50μl溶液反応:95°C2分×20サイクル72°C3分4°Cストック反応液をQIAGEN社製MinElutePCRpurificationkitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化した。アガロースゲル電気泳動を行ない、1717bpの断片を切り出してQIAGEN社製MinEluteGelextractionkitを用いて精製後、制限酵素SacIとKpnIで消化したpDI626GAPベクターにライゲーションした。得られた配列をシークエンスし、目的とするプラスミドが作製されていることを確認したpEXPADCCTFACTFBの作製得られた3つのエントリークローンpENTADC、pENTCTFA、pENTCTFBをGatewayLR反応により発現ベクターpDEST626に組み込んだ。得られたクローンについて、PCRでインサートサイズの確認を行ない、正しく組換えが行なわれたことを確認した。シークエンスを行ない、配列にエラーの無いことを確認した。こうして得られたプラスミドをpEXPADCCTFACTFBと命名した。317株の作製発現ベクターpEXPADCCTFACTFBを制限酵素AatII、BssHII、で切断、線状化し、エタノール沈殿後01×TEBufferに溶解、FrozenEZyeasttransformationkitZymoresearch社製を用いてSaccharomycescerevisiaeYPH499Stratagene社製を形質転換した。得られたクローンをコロニーPCRし、25クローンでadc、ctfA、ctfB遺伝子が導入されていることを確認した。もっともアセトン生産量が多い株を317と命名した。1510株の作製アセトンからイソプロパノールへの変換が期待される合成遺伝子であるipdh遺伝子の発現ベクターpDI626PGKTiPDHを制限酵素AatII及びBssHIIで切断、線状化し、エタノール沈殿後01×TEBufferに溶解、FrozenEZyeasttransformationkitを用いてアセトン生産酵母317を形質転換した。得られた14クローンをコロニーPCRし、13クローンでipdh遺伝子が導入されていることを確認した。最もイソプロパノール生産量が多かった株を1510と命名した。"