Fab-PEG又はFab’-PEGのFab又はFab’成分の分解によって生成した酸性種を測定する方法であって、a酵素でFab-PEG又はFab’-PEGからPEG及びリンカーを切断するステップと、b場合によっては、ステップaにおいて生成したPEG及びリンカーをFab又はFab’から分離して、Fab又はFab’をもたらすステップと、c切断されたFab若しくはFab’及び/又は切断されたPEGに関連した酸性種を量的に分析するステップとを含む上記方法。酵素がトリプシン又はキモトリプシンである、請求項1に記載の方法。ステップaにおける切断が、37°Cなど、25°C~40°Cの範囲の温度で実行される、請求項1又は2に記載の方法。ステップaの切断が、特にFab又はFab’重鎖のC末端における、リシンとトレオニンの間に起こる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。前記リシン及びトレオニンが、Fab’のC末端に位置するSCDKTHTCAA配列中に見出される、請求項4に記載の方法。酵素が、Fab’のヒンジ部分を切断し、Fab’からPEG及びリンカーを遊離させる、請求項5に記載の方法。ステップaにおいて生成したPEG及びリンカーが、Fab又はFab’から分離されて、Fab又はFab’をもたらす、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。前記分離が、陽イオン交換クロマトグラフィー、cIEF、及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して実施される、請求項7に記載の方法。酸性種の定量化が、CEX-HPLCなどの陽イオン交換クロマトグラフィー又は画像化キャピラリー等電点電気泳動を利用して実行される、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。Fab’が、配列番号10を含む又はから成る、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。本開示の方法は、PEG又はリンカー内ではなくFab又はFab’分子内の脱アミド化/分解の結果生じるFab又はFab’分子中の酸性種の直接的な測定を可能にする。従って、Fab-PEG又はFab’-PEGのFab又はFab’成分の分解によって生成した酸性種を測定する方法であって、a酵素でFab-PEG又はFab’-PEGからPEG及びリンカーを切断するステップと、b場合によっては、ステップaにおいて生成したPEG及びリンカーをFab又はFab’から分離して、Fab又はFab’をもたらすステップと、c切断されたFab若しくはFab’及び/又は切断されたPEGに関連した酸性種を量的に分析するステップとを含む方法を提供する。Fab又はFab’からPEG及びリンカーを取り除くことにより、Fab又はFab’中の酸性種を定量化することによって、タンパク質中の脱アミド化の量を測定できる。本方法は、再現性があり且つ強力であり、さらにPEG及びリンカーの切断はタンパク質内の脱アミド化の量に干渉しない又は変化させない。従って、切断されたFab又はFab’内の脱アミド化は、PEG化Fab又はPEG化Fab’のタンパク質部分の脱アミド化を表すはずである。別の実施形態において、本方法は、Fab-PEG又はFab’-PEGの全酸性種を最初に決定し、その後本方法のステップaで切断し、次いで本方法のステップcで決定したFab又はFab’成分に関連する定量化された酸性種を、全酸性種から減算することによって、PEGリンカーの加水分解の程度を決定できる。本明細書において酸性種とは、カルボン酸を含む、即ち-COOH基を含む部分及び分子を意味するものとする。一実施形態において、酵素はトリプシンなどのプロテアーゼ、例えばトリプシン又はキモトリプシンである。利用する酵素がトリプシンの場合、切断位置は例えばFab’断片の配列SCDKTHTCAA重鎖C末端のKとTの間であると予想される。さらに切断に都合のよいことに、切断されるヒンジの小さな部分はアスパラギン残基を全く含まないので、この位置はタンパク質の脱アミド化の値を変化させない。Fab’は、ヒンジに酵素に適した基質となる配列を天然に有している。Fab分子は酵素の基質配列を天然に有しないが、必要に応じて適切な配列を適当な位置に加工することができ、酵素消化によってFabに結合したPEGを除去可能になる。酵素消化は、25~38°Cなど、20~40°Cの範囲の温度で実行でき、特に37°Cで最適に実行される。一実施形態において、出発物質がPEG化Fab’であるとき、酵素はFab’のヒンジ部分を切断しFab’からPEGとリンカーを遊離させる。酵素消化、例えばトリプシン消化は、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160分又はそれ以上の時間にわたって実施できる。酸性種の定量化にHPLC/cIEFなどの技術を利用する場合、生成した物質は異なる保持時間を有し、従って追加的な分離ステップ無しで個別に定量化できるので、消化によって生成した物質を分離する必要はない。しかし場合によっては、ステップaによって生成した物質を、公知の技術、例えば陽イオン交換クロマトグラフィー、cIEF、サイズ排除クロマトグラフィーなどで分離することが可能である。一実施形態において、Fab、Fab’及び/又はPEGに関連する酸性種が定量化される。一実施形態において、Fab又はFab’の脱アミド化が測定される。一実施形態において、ステップcにおける酸性種が、例えば溶出勾配を利用するHPLC分析を利用して分析される。一実施形態において、HPLC分析は、CEX-HPLC分析である。別法として、切断されたタンパク質中の脱アミド化の量を、キャピラリー電気泳動法で測定することが可能である。一実施形態において、ステップcにおける酸性種は、cIEF分析を利用して分析され、適切なカートリッジにはConvergentBioscienceから入手可能なiCE280がある。本明細書で完全に記載されたかのように参照により組み込まれるべきそれぞれの刊行物を具体的且つ個別に示すように、本明細書に引用される特許及び特許出願を含むがこれに限らない全ての刊行物を本明細書に参照により組み込む。好ましい実施形態において、WO01/094585その内容を参照により本明細書に組み込むに記載されるように、抗体は抗TNF抗体、より好ましくは抗TNF抗体CDP870のFab’である。一実施形態において、ヒトTNFαに対して特異性を有する抗体は重鎖を含み、その可変ドメインはCDRH1に対応する配列番号1に示される配列、CDRH2に対応する配列番号2に示される配列又はCDRH3に対応する配列番号3に示される配列を有するCDRを含む。一実施形態において、抗体は軽鎖を含み、その可変ドメインがCDRL1に対応する配列番号4に示される配列、CDRL2に対応する配列番号5に示される配列又はCDRL3に対応する配列番号6に示される配列を有するCDRを含む。一実施形態において、抗体は、可変ドメインがCDRH1に対応する配列番号1に示される配列、CDRH2に対応する配列番号2に示される配列又はCDRH3に対応する配列番号3に示される配列を有するCDRを含む重鎖と、可変ドメインがCDRL1に対応する配列番号4に示される配列、CDRL2に対応する配列番号5に示される配列又はCDRL3に対応する配列番号6に示される配列を有するCDR含む軽鎖とを含む。一実施形態において、抗体は、CDRH1に対応する配列番号1、CDRH2に対応する配列番号2、CDRH3に対応する配列番号3、CDRL1に対応する配列番号4、CDRL2に対応する配列番号5及びCDRL3に対応する配列番号6を含む。好ましくは、抗体はCDRグラフト化抗体分子であり、通常その可変ドメインはヒトアクセプターフレームワーク領域及びヒト以外のドナーCDRを含む。好ましくは、抗体はCDP870の可変ドメインの軽鎖配列番号7及びCDP870の可変ドメインの重鎖配列番号8を含む。抗体は修飾されたFab断片であることが好ましく、その修飾は重鎖のC末端に対する1つ又は複数のアミノ酸の付加であり、エフェクター又はリポーター分子の結合が可能になる。好ましくは、追加的なアミノ酸は、エフェクター若しくはリポーター分子が結合可能な1個又は2個のシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を形成する。そのような修飾されたFab断片は、好ましくは、配列番号10として示される配列を含む又はから成る重鎖と配列番号9として示される配列を含む又はから成る軽鎖とを有する。本開示は、完全体の特定の混合物を含む実施形態を明示的に開示する。本開示は、基本的に完全体の前記混合物から成る又はから成る実施形態にも及ぶ。技術的に可能な様に、選好及び/又は実施形態を組み合わせることができる。本発明は、以下の実施例を参照してここに記述されることになるが、これら実施例は単なる例証であり決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。トリプシン消化法エッペンドルフチューブに、Fab’PEG1.0mgを50mMNaOAc、125mMNaClpH5.0に添加し、全容量を50μLにする。0.2MNa2HPO450μL、続いてトリプシン再懸濁緩衝液50mM酢酸40μLを添加し、最終pHはpH7.5の範囲にあるべきである。10秒間ボルテックスする。反応は、37°Cで2時間インキューベーションする。CEXHPLC又は画像化キャピラリー等電点電気泳動で分析する。HTRPHPLCによって決定される消化効率HTRPHPLCアッセイに反応物を直ちに注入できるように、37°Cでインキューベーションされたアジレント1100シリーズ自動サンプラを使用して、Fab’PEGを用いたトリプシン消化物を準備した。Fab’Peg及びFab’対照の注入を順次9回実施した。Fab’PEGは、図7に示される消化プロファイルを示した。この図から、Fab’PEG産物含有量が2時間以内に20以下に減少することが実証される。分析消化後にサンプルを取り出し、サンプル希釈緩衝液20mM酢酸ナトリウムpH4.5に1mg/mLとなるように希釈した。図8に示す通り、消化ステップから得られた混合物を前処理すること無しに、Fab’PEG及び切断されたFab’をそれぞれの酸性種と一緒に同定できる。図8で示す通り次の物を順次溶出する;未消化のFab’PEG酸性種、未消化のFab’PEG、切断されたFab’酸性種、及び切断されたFab’。CEXHPLCによる切断されたFab’酸性種の検出に適切なクロマトグラフィー条件溶剤A平衡緩衝液10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸pH6.2溶剤B溶離緩衝液10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸、50mM塩化ナトリウムpH6.2カラムDionexPropacSCX-10カラム流速0.5mL/分停止時間75分最大圧力250バール方法実行圧ガイド60バール以下カラム温度25°C注入量100μL自動サンプラ温度4°C検出波長280nm帯域幅16、スリット幅4nmロード1mg/mLを100μLピークが組み込まれているHPChemstationソフトウェアを使用してデータを分析できる。記述された適切なクロマトグラフィー条件を使用したFab’PEG消化のクロマトグラムの例については図8を参照のこと。次のものが検出される;未消化の酸性Fab’PEG、未消化Fab’PEG、切断された酸性Fab’、切断されたFab’。画像化キャピラリー等電点電気泳動を使用する分析の別法iCE280を使用する分析用のサンプル調製200μL容量の一般的なサンプルの調製は、以下の通りである:トリプシン消化物1mg/mlの濃度で脱塩され自由イオンを含まない-40μl原則:タンパク質の終濃度は、最終的なサンプル混合物において約0.1~0.3mg/mlになるべきである。1メチルセルロース:70μL最終的な混合物中のメチルセルロース濃度は0.35になるべきである両性電解質担体:3-10Pharmalyte-8μL両性電解質担体は最終サンプル混合物において4の濃度を有するべきである。pIマーカー:pI値がタンパク質及びその関連種の両端にあるべき2つの異なるpIマーカーを各1μL添加する。HPLC品質水:容量が200μLになるように必要量のHPLC水を加える。15~30秒間ボルテックスすることによって上記のサンプルを混合して、異なる成分を適当に混合させる。混合物を16000gで10分間遠心して、分析に干渉する気泡及び塵粒を取り除く。iCE280技術を利用する器具の設定及び分析ConvergentbiosciencesIsogenヨーロッパのiCE280は、画像化キャピラリー等電点電気泳動器具であり、この器具を使用して様々なタンパク質サンプル及びその関連種のpIを決定する。陽極及び陰極を使用するキャピラリーを通して高電圧が印加され、両極は陰極液OH-及び陽極液Hを含む小さな容器に浸されている。両性電解質担体を用いてサンプルを調製し、高電圧を印加することによってタンパク質分子はそれぞれのpIに従って移動し最終的にpIに焦束する。陽極液は、0.1メチルセルロースに算出した量のリン酸を加えて最終的に0.08Mリン酸溶液を得ることによって調製できる。陰極液は、0.1メチルセルロース2mlに50重量/重量NaOH溶液10.4μlを加えることによって調製できる。陰極液は、新たに調製しなければならず、再利用するべきでない。通常、容器を一回満たすには2mlで十分である。全ての非PEG化サンプルについて通常、3000vで5~6分間の集束時間は十分であるべきだが、異なるタンパク質は異なる電荷分布を有するので、集束時間もそれに応じて変化させることになる。その場合、設定は2、3個のサンプルを流すことにより最適化される必要がある。データ分析は、EZChromソフトウェアを使用して実施できる。Supercompareを使用して重ね合わせることによってプロファイルを比較でき、EZクロムソフトウェアの方法開発オプションを使用して電気泳動図を統合することができる。Fab’PEG消化の電気泳動図の例については図9を参照のこと。次のものが検出される;低pIマーカー、切断されたFab’酸性種、切断されたFab’種、切断されたFab’塩基性種、高pIマーカー。