"a好適なエネルギー源への暴露により活性化することができる1以上のペンデント光反応成分、及びb相補基と特異的に非共有結合的相互作用が可能な2以上のペンデント生物反応基を含み、光反応成分の活性化によりバルク物質または表面コーティングを形成することにより、前記相補基の牽引を促進すことができる多2官能価試薬。生物材料表面上にコーティングを形成するために、前記光反応成分を活性化して該試薬分子と生物材料表面間に分子間共有結合を形成することができる請求項1の多2官能価試薬。バルク材料を形成するために、光反応成分を活性して近接する該試薬分子間に分子間共有結合を形成することができる請求項1の多2官能価試薬。前記生物活性基が相補的分子または細胞受容体との特異的結合に関与する請求項1の多2官能価試薬。前記生物活性基がそれぞれ独立に、分子または細胞の特異的部位及び相補的部位と非共有結合できる蛋白、ペプチド、アミノ酸、炭水化物及び核酸から成る群より選択される請求項4の多2官能価試薬。前記生物活性基がそれぞれ既知のまたは同定可能な相補的結合パートナーを有し、かつそれぞれが独立に抗血栓作用物質、細胞接着因子、受容体、リガンド、成長因子、抗生物質、酵素及び核酸から成る群より選択される、請求項1の多2官能価試薬。前記生物活性基が、ヘパリン、ヒルジン、リシン、プロスタグランジン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ及びプラスミノーゲン活性化因子から成る群より選択される抗血栓作用物質を含む、請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、表面接着分子及び細胞-細胞接着分子から成る群より選択される細胞接着因子を含む、請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テナスシン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジン、オステオポンチン、フォンウイルブランド因子及び骨シアロ蛋白、及びその活性ドメインから成る群より選択される表面接着分子を含む、請求項8の多2官能価試薬。前記生物活性基が、N-カドヘリン及びP-カドヘリン、及びそれらの活性ドメインから成る群より選択される細胞-細胞接着分子を含む、請求項8の多2官能価試薬。前記生物活性基が、繊維芽細胞成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、血管内皮成長因子、骨形態形成蛋白及び他の骨成長因子、並びに神経成長因子から成る群より選択される成長因子を含む、請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ヘパリン、IV型コラーゲン、プロテインA及びプロテインGから成る群より選択されるリガンドまたは受容体を含む、請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、抗生物質ペプチドから成る群より選択される抗生物質を含む、請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、酵素を含む請求項6の多2官能価試薬。前記生物活性基が、相補的核酸配列と選択的に結合できる核酸配列を含む、請求項6の多2官能価試薬。主鎖がビニルポリマーの様な付加型ポリマーから成る群より選択される合成ポリマーを含む、請求項1の多2官能価試薬。前記各光基がそれぞれ光活性化可能なケトンを含む、請求項1の多2官能価試薬。a光活性化可能なケトンの形の1以上のペンデント光反応成分、及びb蛋白、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、核酸、及び分子または細胞の特異的及び相補的部分と非共有結合できる他の分子から成る群より選択される2以上のペンデント生物活性基、を有する合成ポリマー主鎖を含む多2官能価試薬。ai好適なエネルギー源に暴露することにより活性化できる1以上の光反応成分、及びii相補的な基と特異的、非共有結合できる2以上のペンデント生物活性基を有するポリマー主鎖を含む多2官能価試薬を提供する工程;b表面を試薬と接触させる工程;並びにc試薬分子をそれ試薬自体に、及び/または表面と架橋するために光反応成分を活性化する工程;を含んで成る生物材料表面をコーティングする方法。スプレー、浸漬またはブラッシングにより試薬を表面にコーティングする、請求項19の方法。ai好適なエネルギー源に暴露することにより活性化できる1以上の光反応成分、及びii相補的な基と特異的、非共有結合できる2以上のペンデント生物活性基を有するポリマー主鎖を含む多2官能価試薬を提供する工程;及びbバルク生物材料を形成するために試薬を活性化する工程;を含むバルク生物材料を形成する方法。a好適なエネルギー源への暴露により活性化できる1以の光反応成分、及びb相補的な基と特異的、非共有結合できる2以上のペンデント生物活性基、を有するポリマー主鎖を当初より含む活性化された多2官能価試薬の結合した残基を有するコーティングされた生物材料表面。a好適なエネルギー源への暴露により活性化できる1以上の光反応成分、及びb相補的な基と特異的、非共有結合できる2以上のペンデント生物活性基、を有するポリマー主鎖を当初より含む活性化された多2官能価の結合した残基を含むバルク材料。好適な実施の形態の説明本書に使用される次の用語及び語は下記の意味を有する:生物材料は水性系に本質的に不溶性であり、例えば組織、細胞、または生物分子を含むinvivoまたはinvitroの水性系の様な、生物分子を含む液と接触する1以上の表面を提供する材料を意味し;用具は生物材料より製造される機能性物体を意味し;コーティングは、名詞として用いられる場合には生物材料表面上の1以上のポリマー層を意味し、具体的には本発明の多官能価試薬の活性化により生物材料表面上の1以上の固定化層を意味し;多2官能価試薬は、本発明の試薬と関連し用いられる場合には1以上の光活性成分及び2以上の生物活基が共有結合されるポリマー主鎖を含む分子を意味し;光活性成分は、特異的適用外部エネルギー源に反応して活性種を形成し、近接する分子または生物材料表面と共有結合を生じる化学基を意味し;生物活性基は、結合活性または酵素触媒活性の様な所望の特異的生物活性を有する分子を意味し、ポリマー主鎖は、天然ポリマー、または例えば付加重合反応あるいは縮合重合反応により生じる合成ポリマーを意味する;本発明の好適な試薬は、主鎖として機能する合成ポリマー、活性化され表面または近接したポリマー分子に共有結合を提供する1以上のペンデント光活性成分、及び2以上のペンデント低分子量生物学活性成分生物活性基を含む。主鎖:ポリマー主鎖は合成物または天然物のいずれでも良く、好ましくは付加重合または縮合重合により得られるオリゴマー、ホモポリマー及びコポリマーを含むグループより選択される合成ポリマーである。多糖類及びポリペプチドの様な天然型ポリマーも良好に利用できる。好適な主鎖は生物学的に不活性であり、記載の方法による使用に不適または有害な生物学的機能を提供しない。この様なポリマー主鎖は、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド及びメタクリルアミドが重合したアクリル;ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコールの様なビニル;ポリカプロラクタムの様なナイロン;ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジパミド及びポリヘキサメトキシレンドデカンジアミドの誘導体;及びポリウレタン;ポリエチレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド及びポリブチレンオキサイドの様なポリエーテル;及びポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリアンヒドライド及びポリオルトエーテルの様な生体分解性ポリマー含む。ポリマー主鎖は、1以上の光反応成分と2以上の生物活性基を有することができる主鎖を提供する様に選択される。更にポリマー主鎖は、表面及び各種光反応成分ならびに生物活性基との間にスペーサーを提供する様にも選択される。この様にして、試薬は表面または近接する試薬分子に結合され、最適活性を表すのに十分な運動自由度を持った生物活性基を提供する。ポリマー主鎖は水溶性であることが好ましく、特にポリアクリルアミド及びポリビニルピロリドンが好ましいポリマーである。光反応成分:本発明の多2官能価試薬はポリマー主鎖に共有結合した、1以上のペンデント潜伏反応好ましくは光反応成分を有する。光反応成分はここに定義され、好適な成分は十分に安定であり、その特性を維持する条件下において保存される。ここに参照され、取り込まれる米国特許第5002582号を参照せよ。様々な電磁波スペクトル域に反応する潜伏反応性成分が選択できるが、スペクトルの紫外及び可視域に反応本発明に於いて光活性化と称するするものが特に好ましい。光反応成分は、加えられた特異的な外部刺激に反応し活性種を生じ、例えば同一または異なる分子により提供される近接化学構造と共有結合する。光反応成分とは、保存条件下に於いては共有結合を変化せず維持するが、外部エネルギー源により活性化されると他分子との間に共有結合を形成する分子内の原子群である。光反応成分は外部電子、電磁波あるいは運動熱エネルギーを吸収してフリーラジカルとして活性種、具体的にはニトレン、カルベンおよび励起状態のケトンを生成する。光反応成分は電磁スペクトルの多様な領域に反応する様に選択され、例えばスペクトルの紫外および可視域に対し反応する光反応成分が好ましく、本発明に於いてはしばしば光化学成分と称される。アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロンおよびアントロン様複素環即ち、10位にN、OまたはSを有する様なアントロンの複素環式類似体またはその置換型例えば環置換型誘導体の様な光反応アリールケトンが特に好適である。この様なケトンの官能基は本発明記載の活性化/不活性化/再活性化サイクルを容易に実施できることから好適である。ベンゾフェノンは、三重項状態にシステム間移行する一重項状態を初期形成する光化学励起が可能であることから、特に好適な光活性化成分である。励起三重項状態は水素原子の引き抜くことで例えば支持体表面より炭素-水素結合を挿入することができ、ラジカル対を形成する。反応性結合例えば、炭素-水素が結合に利用できない場合、紫外線により誘導されたベンゾフェノン基励起は可逆的であることから、エネルギー源を除去することで分子は基底状態のエネルギーレベルに戻る。ベンゾフェノンやアセトフェノンの様な光活性化可能なアリールケトンは、これらの基が水中に於いて複数回の再活性化の対象となること、従って高いコーティング効率を提供することから、特に重要である。即ち、光活性化アリールケトンは特に好ましい。アザイドは潜伏反応性成分の好適クラスを形成し、そしてフェニルアザイドのようなアリールアザイドC6R5N3、特にベンゾイルアザイド及びp-メチルベンゾイルアザイドの様なアシルアザイド、エチルアザイドフォルメートの様なアザイドフォルメートOCON3、フェニルアザイドフォルメート、ベンゼンスルフォニルアザイドの様なスルフォニルアザイドSO2N3、及びジフェニルフォスフォリルアザイドやジエチルフォスフォリルアザイドの様なフォスフォリルアザイドRO2PON3を含む。ジアゾ化合物は別のクラスの光反応成分を形成し、そしてジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタンの様なジアゾアルカンCHN2、ジアゾアセトフェノン及び1-トリフロロメチル-1-ジアゾ-2-ペンタノンの様なジアゾケトンCOCHN2、t-ブチルジアゾアセテート及びフェニルジアゾアセテートの様なジアゾアセテートOCOCHN2、及びt-ブチルアルファジアゾアセトアセテートの様なベータ-ケト-アルファ-ジアゾアセテートCOCN2COOを含む。その他の光反応成分には、アゾビスイソブチロニトリルの様な脂肪族アゾ化合物、3-トリフルオロメチル-3-フェニルジアジリンの様なジアジリンCHN2、ケテンおよびジフェニルケテンの様なケテン類CHCOが含まれる。光反応成分の活性化により、光反応基の残基を介した共有結合によりコーティング接着分子は相互、または材料表面に共有結合される。代表的な光反応基、およびその活性化残基を以下に示す。生物活性基:本発明の典型的な低分子量生物活性基は、生理学的環境に於いて特定の生物医療用具の機能または性能を向上または変更する為のものである。特に好ましい実施態様に於いては、生物活性基は細胞接着因子、成長因子、抗血栓因子、結合受容体、リガンド、酵素、抗生物質及び核酸を含むグループより選択される。本発明の試薬は、少なくとも1のペンデント生物活性基を含む。しかし現時点に於いては、試薬分子当たり複数のこれら基存在することがこれら試薬の利用を促進する傾向にあることから、2以上のペンデント生物活性基を利用することが好ましい。好ましい細胞接着因子には、接着ペプチド以下に定義される、ならびに天然状態において基質、または近接細胞と堅牢に結合でき、特異的細胞表面受容体に結合し、そして細胞を基質または近接細胞に機械的に接着することができる巨大蛋白または糖蛋白典型的には100~1000キロダルトンの大きさが含まれる。天然に生成する接着因子は元来大分子量蛋白であり、その分子量は100000ダルトン以上である。接着因子は特異的細胞表面受容体と結合し、そして機械的に細胞を基質以下基質接着分子と称するまたは近接細胞以下細胞-細胞接着分子と称するに機械的に接着させる[AlbertsBら、MolecularBiologyoftheCell2ndedGrarlandPublIncNewYork1989]。細胞接着の促進に加え、各タイプの接着因子は細胞運動および分化を含む他の細胞反応も促進できる。本発明に好適な接着因子には、蛋白であるラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、テナスシン、フィブリノーゲン、トロンボプラスチン、オステオポンチン、フォンフィルブランド因子および骨シアロ蛋白の様な基質接着分子が含まれむ。その他の好適な接着因子には、N-カドヘリンおよびP-カドヘリンの様な細胞-細胞接着分子カドヘリン類が含まれる。本発明に有用な典型的な接着因子は、天然の接着因子の特異的ドメインの生物活性を有するアミノ酸配列またはその機能類似体を含み、その接着ペプチドの長さは典型的には約3ないし約20アミノ酸である。天然の細胞接着因子は、典型的には細胞表面受容体と結合し、親分子の細胞接着、運動および分化活性を生成するドメインを1以上含む。これらドメインは特異的アミノ酸配列を含み、その内の幾つかは合成され細胞の接着、伸展および/または増殖を促進することが報告されている。これらドメインおよびこれらドメインの機能的類似体は接着ペプチドと称される。フィブロネクチン由来の接着ペプチドの例には、RGDargglyasp[KleinmanHKら、VitaminsandHormones471611861993]、REDVarggluaspval[HubbellJAら、AnnNYAcadSci6652532581992]、及びCHVペプチドポリマーの合成への利用に好適な方法には、各ペプチドペプチドモノマーを含むN-置換型メタクリルアミドモノマー及び置換型ベンゾフェノン4-ベンゾイル安息香酸、BBAを含むメタクリルアミドモノマーの合成がある。ペプチドモノマーは、各ペプチドのスルフヒドリル成分をN-[3-6-マレイミジルヘキサナミドプロピル]メタクリルアミドMalMAmのマレイミド成分と反応させ、調整する。次に、各ペプチドモノマーをアクリルアミドとBBABBA-APMAと共重合し、最終の潜伏反応性ペプチドポリマーを生成する。各種パラメータをコントロールして、希望するポリマー主鎖、光反応性成分および生物活性基比率molesまたは重量に基づくを持つ試薬を提供できる。例えば、主鎖自体は典型的には、光反応基当たり約40から約400個の間の炭素原子、好ましくは約60から約300個の間の炭素原子を提供する。生物活性基に関しては、主鎖の長さは生物活性基の長さ、及び所望するコーティング密度といった要因に依存し変更することができる。例えば相対的に小さい生物活性基分子量が3000未満の場合、ポリマー主鎖は典型的には生物活性基当たり約5ないし約200個の炭素原子、好ましくは10ないし100個の炭素原子の範囲にある。分子量が約3000から50000の範囲の分子量を持つ、より大きな生物活性基の場合、好適な主鎖は生物活性基の間に平均して約10から約5000個の炭素原子を、好ましくは約50から1000個の炭素原子を提供する。いずれの場合も、当業者は本明細書により、生物活性基密度と運動自由度の最適な組合せを提供するに好適な条件を決定できるだろう。コーティング法:当業者公知の技術例えば浸漬、スプレー、ブラッシングにより本発明の試薬を生物活性表面にコートすることができる。好適な実施態様では、最初に多2官能価試薬を合成し、続いて事前に形成しておいた生物材料と接触させる即ち、十分に近接させ結合する。外部刺激例えば、好適な光源に暴露するにより光反応基を活性化し、遊離状態の活性種を形成せしめ、試薬と他の多2官能価試薬分子または生物材料表面との間に共有結合を生成する。光活性型結合化学が発明のポリマーを性靴材料表面に結合せしめ、生物活性基を付加する追加工程を必要としないことから、ここでは本コーティング法を1段階コーティング法と称する。好ましく使用される外部刺激は電磁波照射であり、さらに紫外、可視または赤外域の電磁波スペクトルの照射が好ましい。光活性化される発明のポリマーはまた、例えば大きさが50-350nmである特徴を持ったコーティングパターンの生成に報告されている技術を利用して生物成分を生物材料の表面上にパターンを描き固定化することにも利用できるMatsudaT及びTSugawaraJBiomedMaterRes29749756。例えば、内皮細胞の接着と増殖を阻害する親水性パターンを1潜伏反応性親水性ポリマーを合成し、2潜伏反応性ポリマーを組織培養ポリスチレン製プレートに付加し、3パターンの光マスクを通してポリマーに光照射し、そして4適当な溶媒により線上し固定化されていないポリマーを除き、作ることができる。このような方法を利用し、本発明のポリマーを特異的生物材料のパターンを固定することができる。例えば、特異的結合分子例えば抗体、抗原/ハプテン、核酸プローブ等のマイクロアレーを光学、電気化学、または半導体センセー表面に固定し、単独分析体に対し同時多分析アッセイ能または多感度域アッセイを提供することができる。パターン化固定はさらに多段階微量アッセイシステム内の液流路に沿って連続処理/反応工程が生起するチップ検査の開発にとっても有益な手段である。細胞接着因子、例えば神経細胞の電極への接着を促進する因子のパターン化により、1新世代超高感度バイオセンサー、および2患者神経系により直接制御される人工四肢の開発が可能になるだろう。本発明の試薬は、形成済み生物材料と共有結合でき、表面コーティングに利用できる。本試薬分子はまた近接分子にも共有結合でき、フィルムまたはバルクの生物材料が形成できる。光反応成分を介した結合により生じる表面コーティング、フィルム、バルク生物材料は、得られた生物材料の表面に有益な密度の生物活性基を提供する。用具の利用:本発明の生物活性ポリマーは既存生物材料の表面の変更、または新規生物材料の生成に利用される。得られた生物材料を含む生物活性用具は様々なinvitroおよびinvivo応用に利用される。例えば、生物成分として細胞接着基または増殖因子を持つ生物活性用具は、invitro細胞培養用具上の細胞接着及び/または増殖を促進し、人工血管、整形外科用インプラント、歯科用インプラント、角膜レンズ及び胸部インプラントの様なインプラント用具の組織適合性を向上させる。抗血栓因子を生物成分として有する生物医療用具は、カテーテル、心臓弁、血管ステント、人工血管、移植用ステント、人工心臓および血液酸素供給装置といった血液接触用具表面の血栓を防止する。生物成分として受容体またはリガンドを有するレジンまたはメンブレンは、広範囲の生物分子のアフィニティー精製に利用できる。例えば、ヘパリン抗血栓成分でもあるは、幾つかの凝固因子、蛋白分解酵素阻害剤、リポ蛋白、成長因子、脂質分解酵素、細胞外マトリックス蛋白およびウイルスコート蛋白の特異的結合および精製に利用される。ブドウ球菌プロテインAは特異的に免疫グロブリンに結合し、抗体の精製に極めて有用であることが証明されている。ストレプトアビジンはビオチンと極めて高い親和性で特異的に結合する蛋白である。ストレプトアビジンとビオチンは診断アッセイの二次的結合ペアーとして極めて有用な試薬のペアーである。固定化されたストレプトアビジンを利用することで、高いシグナル増幅、感度増幅および迅速試験性能が得られる。抗体または抗原でコートされた表面を有する生物医療用具は、結合特異性に依存した、相補的な抗原または抗体を高感度に検出するための診断試験に利用できる。抗体または抗原はメンブレン、プラスチック製チューブ、マイクロプレートのウエルまたは固相バイオセンサー用具上に固定できる。固定された抗体は、各種生物医薬品の精製にも重要である。遺伝子工学技術による細菌または真菌内に生成された蛋白は、固定された抗体によりアフィニティー精製できる。凝固因子VIII抗血友病因子の様な血液分画もまた固定された抗体で生成される。核酸配列でコートされた表面を持つ生物医療用具は、相補的核酸配列を選択的に結合するのに利用できる。この様な用具は試験サンプル中の相補的核酸配列の存在を同定する診断アッセイに利用できる。生物成分の様な酵素がコートされた表面を持つ用具は、合成工程例えばキラール医薬品の製造または分解/転換工程例えば高フルクトースコーンシロップを製造するための澱粉の分解、およびグルコースのフルクトースへの変換を触媒する、広い範囲の酵素反応器に利用できる。コートされた抗生物質は用具表面上での細菌増殖を阻害するのに利用できる。この様な抗菌表面は、幾つかのタイプのカテーテル血管内、腹膜、血液透析、水頭症および泌尿器、動脈静脈シャント、心臓弁、人工血管、気管切開チューブ、整形外科用および陰茎用インプラントを含むインプラント用具に伴う感染率を減少できる。幾つかのinvitro用具はまた、例えば生物フィルム形成の阻害による様な利益を、これら表面から得ることができる。これらにはコンタクトレンズ、食料の包装、テーブルの表面、その他食物を取り扱う表面及び空気フィルターが含まれる。以下、限定されない実施例を参照し、本発明をさらに説明する。本発明の範囲より逸脱することなく、記載された実施態様に多くの変更が可能であることは当業者には明らかであろう。特記ない限り、パーセントは全て重量による。実施例1.ペプチドポリマーA.4-ベンゾイルベンゾイルクロライドBBAClの合成4-ベンゾイル安息香酸BBA、2000g0884molesを乾燥した2リットルの丸底フラスコに加え、さらに273mlの塩化チオニルを加えた。続いてジメチルフォルムアミドDMF684μlを加え、混合液を3-4時間還流した。冷却後、過剰の塩化チオニルを水アスピレーター圧のロータリーエパボレーターで除いた。残存する塩化チオニルは、3×100mlのトルエンを用い、繰り返し蒸発し除いた。次に最終産物を51のヘキサン:トルエンより再結晶化し、典型的なBBAClの収率は>90、融点は92~94°Cであった。B.N34オキソ5アザ2ウンデセンディック酸、1500g0654moles、無水酢酸68ml735g、0721moles及びフェノチアジン500mgをオーバーヘッドスターラーを装備した2リッターの3つ口丸底フラスコに加えた。トリエチルアミンTEA91ml0653moles及びテトラヒドロフランTHF600mlを加え、混合液を攪拌しながら加熱し還流した。合計4時間還流した後、暗色の混合液を<60°Cまで冷却し、3リットルの水に12NのHClを250ml加えた液に注ぎ入れた。この混合液を室温で3時間攪拌した後、濾過パッドCelite545、JTBaker社、Jackson、TNで濾過し固形物を除いた。濾液を4×500mlのクロロフォルムで抽出し、一つにまとめた抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥した。重合を阻止するために15mgのフェノチアジンを加えた後、減圧し溶媒を除いた。6-マレイミドヘキサン酸をヘキサン:クロロホルム21より再結晶化し、典型的な収率5560、融点8185°Cを得た。10g473mmolesの6-マレイミドヘキサン酸及び0572g497mmolesのN-ヒドロキシスクシンイミドNHSを10mlの乾燥ジオキサンに溶解し、さらに107g521mmolesの1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミドDCCを加えて、6-マレイミドヘキサン酸のN-オキシスクシンイミドエステルNOSを調整した。反応混合液は一晩、室温で攪拌した。副産物の1,3-ジシクロヘキシル尿素は濾過して除き、濾過ケーキを3×10mlのジオキサンで濯いだ。フェノチアジン02mgを加えてから溶液を減圧し、蒸発した。得られた固形物をヘキサンで抽出し過剰のDCCを除き、さらに精製することなく本産物を用いた。414mg134mmolesのNスクシンイミジル6マレイミドヘキサノン酸、200mg112mmolesのNより得、それそれ96、48および24ウエル型培養プレートのウエル内側に適合する直径6,10および15mmの円盤に打ち抜いた。この円盤は放射標識アッセイおよび生物活性アッセイの両方に利用した。ペプチドペプチドポリマーまたはペプチド試薬コントロールを生物材料に適用するために、光照射し潜伏反応基を活性化する前に生物材料上でペプチドを乾燥させるか否かが主要な差である2種類の方法を用いた。乾燥固定法では、照射前にペプチドを50vvイソプロパノールIPA水溶液に希釈し、以下示す如くに生物材料に付加し、乾燥した。湿潤固定法では、照射前にペプチドを水に希釈し、以下示す如くに生物材料に付加し、乾燥させた。各固定法では、ペプチド成分の最終付加濃度は50μgmlであり、各タイプの培養プレートのウエル当たりの付加量は次の通りであった:96ウエルプレート、50μlウエル、48ウエルプレート、100μlウエル、24ウエルプレート、200μlウエル。上記の如く、コーティング及び評価することを目的に、PU及びSRの円盤をプレートの底部に置いた。サンプルは、ヘラウスバルブWCHeraeusGmbHHanauFederalRepublicofGermanyが組み込まれたDymaxlampRockwilleMDより得て、ATCCの指示に従い培養した。接着アッセイは48ウエルPS培養プレートで実施した。PU及びSRを評価する場合、各材料の円盤コーティングの有り、または無しを培養プレートのウエルの底に入れた。PSを評価する場合、ウエルの底はコーティングされた。各アッセイ毎に、未コーティングおよびペプチドコーティング済み生物材料PS、PU及びSRに、2mgmlのウシ血清アルブミンV型分画BSA、SigmaChemical社、StLouis、MOを含む無血清培地中の細胞をウエル当たり50000個播いた。細胞は2時間各生物材料に接着させた。続いて、未接着細胞を吸引して除き、ウエルを2回ハンクス液CeloxCorpHopkinsMNで洗浄した。最後に、生細胞が存在すると黄色のテトラゾリウム塩から不溶性の紫色のホルマザンに変換する代謝色素、MTT325ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]を含む培養培地を加え、接着細胞を定量した。MTTを含む培養培地内で2時間反応した後、培地を除き、生細胞内に蓄積したフォルマザンを可溶化し酸性イソプロパノールにて、分光光度計で570nmの吸光を測定した。フォルマザンの吸収はウエル内の接着生細胞の数と直接相関する。下表に固定化ペプチドポリマーと吸着パプチド試薬コントロールを比較した、細胞接着アッセイの結果をまとめた。いずれの場合も、ペプチドコートされた生物材料に接着した細胞の相対数MTT色素により決定を無コーティングUC生物材料に接着した細胞数で除し、相対細胞接着スコアを得た。各値は、各3または4重測定した実験1ないし4回の平均値である。ペプチドは本書記載の湿潤固定法によりPS上に固定化され、ペプチドは乾燥固定法によりSR及びPU上に固定化された。固定ペプチドポリマーは、光照射ペプチドポリマーを表す。吸着ペプチド試薬は非光照射ペプチド試薬を表す。ND未測定。これらの結果は、光固定ペプチドポリマーが3種類全ての生物材料に対する細胞接着を促進することを示している。最大の改善は3種類全ての生物材料上にRGDポリマーを光固定した場合と、F9ポリマーをPS上に光固定した場合43ないし10倍の改善であり、最も改善が小さい例はPU上へのF9ポリマーとSR及びPU上へのCHVポリマーの光固定13ないし19倍であった。光固定ペプチドと吸着ペプチド試薬コントロールを比較した場合、いずれについても細胞接着はペプチドポリマーに対する方が大きかった。I.固定ペプチドの細胞増殖活性増殖アッセイは24ウエルPS培養プレートで行った。PU及びSRを評価する場合には、各材料コーティング有り無しでの円盤を培養プレートの底に置き実施した。PSを評価する場合、ウエルの底がコーティングされた。各アッセイについて、コーティング無しとペプチドをコートした生物材料PS、PU及びSRに、ウエル当たり1500個のCPAE細胞を播いて、4ないし7日間invitroにて増殖させた。続いて、培地を吸引し、細胞増殖をMTT色素を用いて定量した。次表に結果をまとめ、コーティングしていない基質、吸着ペプチド及びペプチドポリマー上での細胞増殖を比較した。接着アッセイと同様に、各ペプチドでコーティングされた生物材料上で増殖する細胞の相対数を、コーティングしていないUC生物材料上で増殖した細胞数で除し、相対細胞増殖スコアを得た。各値は、1ないし4回の実験の平均値であり、各実験は3または4重測定で行った。評価対象のペプチドは全て、本書に記載した乾燥固定法を用い固定した。固定ペプチドポリマーは光照射ペプチドポリマーを表す。吸着ペプチド試薬は非光照射ポリペプチド試薬を表す。ND未測定。上記の表に示したペプチドに加え、CHII及びHEPIIIに関しPS上の増殖について調べた。これら2種類のペプチドの場合、吸着ペプチド上の増殖は未コーティングPSに比べ10及び11倍であり、ペプチドポリマー上の増殖は未コーティングPSに比べ105および13倍であった。これら2種類のペプチドポリマー及び試薬コントロールは、湿潤固定法により固定された。CHII及びHEPIIIの結果は、1および2回の実験の平均であり、各実験について4重測定した。これら増殖アッセイより、PS上に光固定されたペプチドポリマー5種類全てが増殖を、未コーティングPS上の増殖に比べ105ないし175倍促進した。また、3種類のペプチドポリマーがPU上の細胞増殖を39ないし94倍促進した。SR上では細胞増殖の改善は極僅かであった。実施例2.ヒルジンポリマーA.Nスクシンイミジル6より得た。ATUの定義は下記参照ヒルジンはトロンビンに結合し、その蛋白分解活性を阻害する抗血栓剤である。ヒルジン105mg、152μmoleを01Mの炭酸緩衝液中1mlに溶解した。NOSポリマー上記の如く調整をDMSO中に4mgmlになる様溶解した。続いて、2mgのNOSポリマーをヒルジン液に加え、一晩混合した。反応混合液の半量をSpectraPro50000MWCOチューブに入れ水に対し透析した後、凍結乾燥した。50mgのヒルジン及びヒルジン1モル当たり02モルのBBAを含む合計59mgのヒルジンポリマーを回収した。ヒルジンはBCA蛋白アッセイキットPierceChemicalCompanyRockfordILより購入を用い測定し、BBA含有量は分光光度計により決定した。コントロールポリマーエナンチオマーポリマーは、NOSポリマーにヒルジンの代わりにエタノールアミンを加え調整した。得られたエタノールアミンポリマーは電荷を持たず、ヒルジンの代わりにエタノールアミンを含む同様のポリマーとトロンビンとの結合を比較したコントロール実験に利用した。C.溶液中のヒルジン及びヒルジンポリマーの活性のアッセイヒルジン及びヒルジンポリマーの特異活性は、Transgene社より提供された標準的な方法により決定し、ヒルジン1mg当たりの抗血栓単位ATUで表した。1ATUは、トロンビン1NIH単位の蛋白分解活性を阻害するのに必要なヒルジン量である。これらアッセイでは、ヒルジンまたはヒルジンポリマーの希釈系列と既知量のウシトロンビン175350NIH単位mg、SigmaChemical社製、StLouisMOを前反応させ、発色基質、ChromozymTHBoehringerMannheimCorpIndianapolisIN社製を用い残存トロンビン活性を決定した。ヒルジンポリマーに取り込まれる前後のヒルジンの特異活性は、それぞれ11710及び10204ATUmgであった。従って、生成されたポリマー内に取り込まれたヒルジンの活性減少は13にすぎなかった。D.生物材料へのヒルジンポリマー及びエタノールアミンポリマーの結合3種類の生物材料のフラットシートを利用した:1ポリエチレンPE、米国国立保健研究所、Bethesda、MD提供の一次参照材料、2SRDowCorning社製、Midland、MI、医療等級SILASTICR及び3PUThermoCardiosystems、WoburnMA社製、TecoflexR。各生物材料のサンプルは直径6mmの円盤、または1×1cmの正方形にカットされた。コーティング前に表面汚染を除くため、PU及びPEサンプルはIPAに短時間浸し、SRは1時間ヘキサンで抽出してから一晩乾燥した。さらに、SRサンプルはヒルジンポリマーまたはエタノールアミンポリマーを適用する直前にアルゴンプラズマで処理3分、250ワット、250mtorrした。ヒルジンポリマーを水;IPA7525vv中に1~25μgmlになる様希釈し、各生物材料サンプルの上記洗浄または抽出した側に加えた。加えられたヒルジンポリマー液を乾燥させ、次にDymaxランプで光照射した。コーティング作業後に残っていた緩く接着したヒルジンポリマーを除くため、各サンプルを3回15分間洗浄し、続いて一晩1のTween20のPBS液に浸した。次に脱イオン水中でサンプルを濯ぎTween20を除いた。3種類のコントロールサンプルも同時に調整した:1ヒルジンポリマーを付加しない未コーティングコントロール、2ヒルジンポリマーを付加したが、光照射を行わなかったサンプル、及び3エタノールアミンポリマーでコーティングしたSRサンプル。後者のコントロールについては、エタノールアミンポリマー本書記載の如く調整したを脱イオン水中に1または5μg/200μlに希釈した。次に、各保存液の一部200μlをSRの1cm2サンプルの一面に加え、乾燥させ、光活性化し、ヒルジンポリマーに関する本書記載の如くにTween20PBSおよび脱イオン水で洗浄した。E.生物材料上のヒルジン負荷量の測定ヒルジンを還元メチル化により放射線標識し、本書記載の如くにしてヒルジンポリマーに取り込ませ、本書記載の3種類の生物材料それぞれの上に固定されたヒルジンポリマー量の測定に用いた。残存トリチウム量を測定するため、サンプルをTHFに溶解し、Aquasol内に希釈、Packard1900CA液体シンチレーションカウンターにて測定した。下表に示した結果は、ヒルジンポリマー残留量は添加量に比例すること、そして光活性化を行わない場合の残留量に比べ光活性化後の残留量は23から66倍高いことを示している。各結果は4回測定の平均値である。NAアッセイせず。F.生物材料上のヒルジンポリマーコーティング活性のアッセイトリチウムで標識されていないヒルジンポリマーを、本書記載に従い各生物材料上にコーティングした。次にトリチウム標識されたトロンビン3HThrを加え、その結合を測定し固定されたヒルジンポリマーの活性を定量した。3HThrは還元メチル化法によりヒトトロンビン4000NIH単位/mg蛋白、SigmaChemical社製を標識し調整した。各コーティング済みサンプルを2μgmlの3HThrを含むトリス緩衝液005MTrisHCl01MNaCl01PEG3350pH85内で1時間反応し、トロンビンを含まない同一緩衝液で濯ぎ結合していないトロンビンを除いた。次いでサンプルをTHFに溶解し、Aquasol中に希釈、測定した。下表に示した結果より、ヒルジンコーティングされた生物材料に保持されたトロンビン量は固定ヒルジン量に比例することが示された。各結果は4回測定の平均値である。SREP1及びSREP5は、それぞれ10及び5μgcm2のエタノールアミンポリマーでコーティングされたSRサンプルであることを示す。NAはアッセイしなかったことを示す。コントロール実験は、トロンビンを未コーティング生物材料に加え実施したが、未コーティングのPE、PU及びSRに結合したトロンビン量はそれぞれ001、0012および0006μgcm2であった。未コーティングPE及びPUと、25μgcm2のヒルジンポリマーでコーティングされた同一生物材料へのトロンビン結合の比較から、後者がそれぞれ200倍及び23倍高いトロンビン結合が示された。最後に、エタノールアミンポリマーでコーティングされたSRの結果から、ヒルジン成分がとトロンビン結合に必須であることが示された。実施例3.ヘパリンポリマーA.N-スクシンイミジル6-マレイミドヘキサノエートの合成6-マレイミドヘキサン酸200g947mmoleを100mlのクロロフォルムに溶解し、続いて601g0473molの塩化オキサリルを加えた。次に得られた溶液を2時間、室温で攪拌した。過剰の塩化オキサリルを減圧下に除き、得られた酸性塩化物を4×25mlのクロロフォルムと共沸し過剰の塩化オキサリルを除いた。酸性塩化物を100mlのクロロフォルムに溶解し、続いて120g0104molesのNHSを加え、1148g0113molのTEAをゆっくり加えた。混合液を室温で一晩攪拌した。反応混合液を4×100mlの水で洗浄した後、硫酸ナトリウム上でクロロフォルム液を乾燥した。溶媒の除去により、240gの産物を得、収率は82であった。NMR分光計分析結果は所望物質と一致し、更に精製することなく使用した。B.ヒドラジドリガンド含有光反応ポリアクリルアミドヒドラジドポリマーの合成アクリルアミド8339g0117molを112mlのTHFに溶解した後、0241g150mmolのAIBN、0112ml074mmolのTEMED、1284g370mmolのBBAAPMA本書記載に従い調整及び0377g12mmolのN-スクシンイミジル6-マレイミドヘキサノエート本書記載に従い調整を加えた。溶液にヘリウムを4分間スパージして脱酸素し、さらにアルゴンガスを4分間スパージした。次に密封容器を一晩、55°Cで加熱し、完全に重合した。沈殿したポリマーを濾過して分離し、100mlのTHFと30分間攪拌し、線上した。最終産物を濾過して回収し、真空オーブン内で乾燥し、収率96、964gの固形物を得た。上記ポリマー10gを50mlの005Mリン酸緩衝液、pH8に溶解し、その溶液を50mlの005Mリン酸緩衝液、pH8中に0696g589mmolのシュウ酸ヒドラジンを含む第2液に加えた。混合した溶液は一晩、室温で攪拌した。産物を分子量カットオフ6000~8000の透析チューブを用い、脱イオン水に対し透析した。2日間に6回水を交換した後、凍結乾燥してポリマーを分離し、850mgの産物を得た。このポリマーについてヒドラジド基分析を行った結果、ポリマーのNH2gは00656mmolで、理論値の55であった。C.ヘパリンリガンドを含む光反応ポリアクリルアミドヘパリンポリマーの合成ヘパリン中のウロン酸残基を適当に過ヨウ素酸塩で酸化された場合、アルデヒド官能基が生ずるが、ヘパリン活性は十分残ることが知られている。152単位/mgの活性を持つ未漂白ヘパリンCelsusLaboratoriesCincinnatiOHを250mgmlの01Mアセテート緩衝液pH55に溶解し、20mgmlの過ヨウ素ナトリウムで30分間酸化し、遊離アルデヒド基を生成した。残存する過ヨウ素酸塩は、過剰のエチレングリコールを加え不活性化した。次に、エチレングリコールと低分子量の反応産物を一晩、4°にて、分子量カットオフ6000のSpectraPor透析チューブSpectrumMedicalIndustriesを用い、01Mのアセテート緩衝液pH55に対し透析し除いた。酸化ヘパリンの残留活性はは95単位mgであった。酸化ヘパリン濃度を01Mアセテート緩衝液中pH5515mgmlに調整し、等量の20mgmlのフォトポリヒドラジド水溶液を室温で一晩反応させた。さらに精製することなくヘパリンポリマーを用い、生物材料をコーティングした。ヘパリンは本書記載の如くに合成され、孔サイズ045mmの再生セルロールRCメンブレン上に固定された。直径1インチのRCメンブレンをヘパリンポリマーと15分間反応させ、風乾し、続いて両面、45秒づつ光照射した。円盤をまず10PBSで洗い、続いてPBS中にて未結合のヘパリンポリマーを除去した。E.ヘパリンコートされたメンブレンによるトロンビン阻害の評価ヘパリンの抗血栓活性は、それが持つ凝固カスケードへの関わりが知られているプロテアーゼであるトロンビンの阻害に依存している。ヘパリンはまず抗トロンビンIIIATIIIに結合し、トロンビン活性を阻害する。次にヘパリン/ATIII複合体はトロンビンに結合してこれを不活性化し、その後ヘパリンは放出され別のATIIIに結合できる。固定されたヘパリンによるトロンビンの阻害のアッセイは、トロンビン及び既報の方法による発色性ペプチド基質の切断を測定することで実施される。各アッセイは、085mgのBSASigmaChemical社、10mUのヒトトロンビンSigmaChemical社、100mUmlのATIIIBaxterBiotechChicagoIL及び017μmoleの発色性トロンビン基質S2238KabiPharmaciaFranklinOHを含む1mlのPBS中で実施した。このアッセイ液に未コーティングあるいはヘパリンコーティングしたメンブレンメンブレン上のヘパリン活性を測定するあるいは標準濃度のヘパリンヘパリン含有量に対する吸光度の標準曲線を作製するを加えた。加えたヘパリン量は、25ないし25mUの範囲である。37°Cで2時間反応させた後、トロンビンによるS2238の分解により生じた、405nmの吸光として測定される発色を分光光度計を用いて読みとった。吸光度はトロンビンの活性に直接相関し、従って溶液中ヘパリンまたは基質表面上に固定されたヘパリンにより誘導されたATIII活性化量に逆相関していた。表面に結合したヘパリンの活性は、メンブレン作用時に生じた吸光度値と、既知量のヘパリン添加時に生じた吸光度値を比較し計算された。次に本アッセイを用いてコーティング済及び未コーティングRCメンブレン上に存在するヘパリン活性を調べた。コーティング済みメンブレンのヘパリン活性は255mU平方cmであり、一方未コーティングの活性は<01mU平方cmであった。実施例4.リシンポリマーA.Nα6IPA水溶液中に250μgmlまで希釈し、生物材料サンプルに加えたPU、SRおよびPE。各ポリマーには、各生物材料の表面を過不足無く覆うの容積のマガイニンポリマーが加えられた約100μlcm2。ポリマー液をサンプル表面上で乾燥させ、その後各サンプルに1~2分間光照射した。コーティングされたサンプルは01規定のHClで洗浄し、さらにPBSで洗浄した。固定されたマガイニンポリマーの抗細菌活性は遠心分離アッセイにより測定した。生物材料シートを直径15cmの円盤に切り出し、マガイニンポリマーでコーティングし、24ウエル型培養プレートの各ウエル内に入れた。細菌大腸菌及び表皮ブドウ球菌をPBS中に200400コロニー形成単位/mlで懸濁した。細菌懸濁液の一部1mlをマガイニンコーティングされた生物材料が入ったウエルに加え、プレートを3500×g、4°Cで20分間遠心分離し、細胞をコーティング生物材料円盤上に沈殿させた。次にこの円盤をトリプシン大豆寒天TSA細菌培養プレートに入れ、TSAの薄層を重層した。一晩37°Cで培養した後、円盤上で増殖した細菌コロニーの数を測定した。マガイニンポリマーコーティングは細菌の増殖を阻止し、非コーティングコントロールに比べ増殖する細菌のコロニー数は少ないと考えられた。実施例11.β-ガラクトシダーゼポリマーA.β-ガラクトシダーゼを含む光反応ポリアクリルアミドβ-ガラクトシダーゼポリマーの合成NOSポリマー実施例6の如くに調整50mgml、及びβ-ガラクトシダーゼBoehringerMannheimIndianapolisIN64mgmlを含む、01M炭酸ナトリウム液、pH9の混合体を調整した。混合液を室温で1時間反応させ、一晩4°Cに保存した。得られたβ-ガラクトシダーゼポリマー液は、精製せず架橋フィルム生成に使用した。B.架橋フィルム生成フィルムは、β-ガラクトシダーゼポリマー液本書記載の如く合成の一部40mlをテフロン登録商標ブロック上に置き、各液を乾燥させ生成した。得られたフィルムに上記同様に05または4分間光照射した。C.フィルム集結度のアッセイフィルム集結度は、PBS液内におかれた後もフィルムがその形状を維持するか否か決定し、アッセイした。05分間光照射されたフィルムは生理食塩水暴露で溶解した;4分間光照射したフィルムはその形状を維持した。これらの結果は、BBA基の光活性化により本発明のポリマー分子に共有結合の架橋が生成されたことを示す。架橋されたβ-ガラクトシダーゼポリマーを1mlのPBSで3回洗浄し、取り込まれなかった酵素を除いた。最後の洗浄液02ml及び回収したフィルムそれぞれの酵素活性を、1mgmlのo-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシドoNPGPierce、Rockford、ILより入手水溶液を用い、ウォ-シントン酵素マニュアルWorthingtonEnzymeManualWorthingtonBiochemicalCorpFreeholdNJ1977に記載の方法を利用し分析した。最終洗浄液はβ-ガラクトシダーゼ活性を示さなかったが、フィルムは黄色のニトロフェノール産物を生じた。この結果は、本発明のポリマーを架橋し不溶性生物材料を形成した後もβ-ガラクトシダーゼ成分が活性を持つことを示した。実施例12.DNAポリマー主要組織適合性複合体のH2Kb遺伝子のエクソン1に由来する配列を持つモデルオリゴデオキシヌクレオチドプローブオリゴDNAを合成し、捕捉プローブとして使用した。オリゴDNA捕捉プローブの配列は5GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCA3で、5末端に一級アミンで終止する脂肪族C12スペーサーを付し合成された。オリゴDNA捕捉プローブ80μg、または6nmoleは、C12スペーサーの末端アミノ基を介し、50mMリン酸緩衝液pH85、1mMEDTA、最終容積024ml中の160μgの本書記載のNOSと室温で25時間結合した。得られたDNAポリマーは追加精製または検査することなく使用した。DNAポリマーをウエル当たり10pmole01ml液中、マイクロタイタープレートのウエルポリプロピレンプレート、CornignCostar社、Cambridge、MAに加え、10~30分間反応した。300nm以下の波長の光を除去するフィルターを使用した以外は本書記載と同様にして、Dymaxランプを利用しDNAポリマー液を含むプレートに光照射した。コントロールでは、オリゴDNA捕捉プローブ50mMリン酸緩衝液、pH85、1mMEDTA、01ml中に10pmoleをウエルに加え25時間吸着させるが、光照射は行わなかった。プレートを005Tween20のPBS液を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、未結合のDNAポリマーまたはコントロールのオリゴDNA捕捉プローブを除いた。本書記載の捕捉プローブに相補的配列を持つ検出プローブを、5末端にビオチンを付し合成し、固定されたDNAポリマーの活性評価に用いた。検出プローブの配列は、5CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC3である。H2Kb遺伝子のエクソン2由来の非相補的配列を含み、5末端にビオチン成分持つコントロールの検出用プローブも合成した。各検出プローブの結合は、続いてストレプトアビジン-西洋わさびパーオキシダーゼ標識体SAHRP、Pierce社製、Rockford、ILを加え、結合したHRPの活性を測定し、アッセイした。本アッセイでは、コーティングしたプレートはハイブリダイゼーション緩衝液075MNaCl0075Mクエン酸、pH70、01ラウロイルサルコシン、1カゼイン及び002ナトリウムドデシル硫酸で55°C、30分間ブロックされた。相補的及び非相補的検出プローブをウエル当たり、01mlのハイブリダイゼーション緩衝液当たり50fmole加え、1時間、55°Cで反応した。次にプレートを01SDSを含む03MのNaCl、003Mの酢酸、pH70で5分間、55°Cにて洗浄した。SAHRPを05μgml加え、30分間、37°Cで反応した。次にプレートを005Tween20のPBS液で洗浄し、続いてパーオキシダーゼの基質KirkergarrdPerryLaboratoriesGaithersburgMD社製TMBMicrowellPeroxdasesubstratesystemを加え、マイクロプレートリーダーモデル3550、BioRadLabsCambridgeMAにて655nmの吸光度を測定した。ポリプロピレンプレートは不透明であるため、反応後の基質液はポリスチレンプレートに移し、吸光度を測定した。光固定DNAポリマーでコーティングされた、またはオリゴDNA捕捉プローブを吸着させたポリプロピレン製マイクロウエルn3のハイブリダイゼーションシグナルA655。上記の表の結果は、光固定したDNAポリマーまたは吸着オリゴDNA捕捉プローブn3でコーティングしたポリプロピレンマイクロウエルのハイブリダイゼーションシグナルを示す。これら結果は、光固定DNAポリマーは吸着コントロールに比べ32倍相補的検出プローブを結合し、いずれのコーティングも非相補的プローブは結合しないことを示している。"