"a少なくとも1つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、b複数のキャリア粒子と、c前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、を含む組成物であって、この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも1つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、組成物。前記シグナル粒子は、凝集によって測定可能な変化を生じる粒子を含む、請求項1に記載の組成物。前記測定可能な変化は、光学的吸収における変化を含む、請求項2に記載の組成物。前記シグナル粒子は、マイクロ粒子およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。前記ナノ粒子は、球状ナノ粒子、ナノチューブおよびナノロッドからなる群から選択される、請求項4に記載の組成物。前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、コアシェルナノ粒子、およびポリマーナノ粒子からなる群から選択される、請求項4または5に記載の組成物。前記ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄もしくはコバルト系金属を含むナノ粒子、量子ドット、ポリマーマイクロカプセル、およびポリマーナノカプセルからなる群から選択される、請求項6に記載の組成物。前記少なくとも1つの結合部位は、炭化水素またはポリマーを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物。前記ポリマーはポリペプチドである、請求項8に記載の組成物。前記ポリペプチドは、ヘリックス-ループ-ヘリックスポリペプチドである、請求項9に記載の組成物。前記ヘリックス-ループ-ヘリックスポリペプチドは、配列番号1:に少なくとも90相同な配列を有する、請求項10に記載の組成物。前記キャリア粒子は、表面層により包囲された液状コアを含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の組成物。前記表面層は、両親媒性分子を含む、請求項12に記載の組成物。前記両親媒性分子は、脂質および人工両親媒性分子からなる群から選択される、請求項13に記載の組成物。前記キャリア粒子は、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、マイクロカプセル、およびポリマー粒子からなる群から選択される、請求項1~14のいずれか1項に記載の組成物。前記キャリア粒子の前記表面層は、酵素または抗微生物ペプチドにより特異的に分解可能なものである、請求項12~15のいずれか1項に記載の組成物。前記酵素がリパーゼである、請求項16に記載の組成物。前記リパーゼがホスホリパーゼである、請求項17に記載の組成物。前記ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD1、およびホスホリパーゼD2からなる群から選択される、請求項18に記載の組成物。それぞれのリンカー分子は、第1のシグナル粒子上の少なくとも1つの結合部位、および、第2のシグナル粒子上の少なくとも1つの結合部位と会合することができるものである、請求項1~19のいずれか1項に記載の組成物。前記リンカー分子は、それぞれのシグナル粒子上の2以上の結合部位と会合することができるものである、請求項1~20のいずれか1項に記載の組成物。前記リンカー分子がポリマーである、請求項1~21のいずれか1項に記載の組成物。前記ポリマーがポリペプチドである、請求項22に記載の組成物。前記ポリペプチドは、配列番号2:に少なくとも90相同な配列を有する2つのポリペプチドを含むダイマーである、請求項23に記載の組成物。酵素活性の速度または程度を調節する化合物をさらに含む、請求項1~24のいずれか1項に記載の組成物。保存料をさらに含む、請求項1~25のいずれか1項に記載の組成物。表面層により包囲された液状コアを含むキャリア粒子であって、配列番号2:に少なくとも90相同な配列を有する2つのポリペプチドを含むダイマーを含有する、キャリア粒子。前記キャリア粒子がリポソームを含む、請求項27に記載の組成物。請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物または請求項27もしくは28に記載のキャリア粒子の使用。試料中の分析物を検出するためのアッセイ装置であって、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物を含み、前記分析物は、前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させることができるものである、アッセイ装置。試料中の分析物を検出するためのキットであって、a少なくとも1つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、b複数のキャリア粒子と、c前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、を含み、この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも1つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、キット。酵素活性の速度または程度を調節する化合物をさらに含む、請求項31に記載のキット。前記化合物がアルブミンを含む、請求項32に記載のキット。試料中の分析物を検出する方法であって、以下の工程:i前記試料を、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程この際、前記分析物は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、方法。前記分析物が酵素である、請求項30に記載のアッセイ装置、請求項31~33のいずれか1項に記載のキット、または請求項34に記載の方法。前記酵素がリパーゼである、請求項35に記載のアッセイ装置、キット、または方法。前記リパーゼがホスホリパーゼである、請求項36に記載のアッセイ装置、キット、または方法。前記ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD1、およびホスホリパーゼD2からなる群から選択される、請求項37に記載のアッセイ装置、キット、または方法。被験者における酵素の調節異常に関連する疾患または症状を診断する方法であって、以下の工程:i前記被験者由来の試料を、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程この際、前記酵素は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、方法。前記酵素がPLA2である、請求項39に記載の方法。前記疾患または症状が、アテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、および癌からなる群から選択される、請求項40に記載の方法。酵素活性の調節剤をスクリーニングする方法であって、以下の工程:i前記酵素を、被検物質または被検混合物、および、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程;並びにii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、方法。前記調節剤が阻害剤である、請求項42に記載の方法。前記工程iが、酵素活性の速度または程度を調節する化合物を添加することをさらに含む、請求項39~43のいずれか1項に記載の方法。前記工程iが、前記試料または前記酵素を請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させた後に、ヒト血清アルブミンHSAを添加することをさらに含む、請求項44に記載の方法。前記工程iiが、光学的吸収、光学散乱、蛍光、発光、光減衰、磁気特性、電気化学ポテンシャル、粘度、拡散速度論、または偏光における測定可能な変化を検出することを含む、請求項39~45のいずれか1項に記載の方法。抗微生物ペプチドの候補をスクリーニングする方法であって、以下の工程:i被検物質または被検混合物を、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、方法。毒素を検出する方法であって、以下の工程:i被検物質または被検混合物を、請求項1~26のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、方法。本発明の第一の態様は、a少なくとも1つの結合部位で機能化された複数のシグナル粒子と、b複数のキャリア粒子と、c前記キャリア粒子内に含まれる複数のリンカー分子と、を含む組成物であって、この際、前記リンカー分子は、前記シグナル粒子上の少なくとも1つの結合部位と会合して前記シグナル粒子の凝集を引き起こすことができるものである、組成物を提供する。トランスデューサー粒子としても知られている、シグナル粒子は、リンカー分子と接触しておかれると凝集できる適当な粒子を含みうる。シグナル粒子の重要な特性は、凝集によって検出可能なまたは測定可能な変化を引き起こすことである。適当なシグナル粒子としては、マイクロ粒子及びナノ粒子がある。好ましくは、粒子は、有意な大きさに依存する光学特性を発揮するのには十分大きいが、溶液中で分散し続けるには十分小さい。好ましくは、粒子は、2nm~100nmの範囲の直径を有するナノ粒子を含む。ナノ粒子は、例えば、球状のナノ粒子、ナノチューブまたはナノロッドを有してもよい。適当なナノ粒子としては、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、コアシェルナノ粒子及びポリマーナノ粒子がある。好ましい金属ナノ粒子としては、金、銀、鉄金属またはコバルト系金属を含むものがある。適当な半導体ナノ粒子としては、量子ドットがある。適当なコアシェルナノ粒子としては、金属シェル及び誘電性若しくは半導体コア、または誘電性若しくは半導体シェル及び金属コア、または誘電性若しくは半導体シェル及び誘電性若しくは半導体コアを有するものがある。適当なポリマー粒子としては、コア及びシェルが明確に分かれている粒子を有するポリマーマイクロカプセル及びナノカプセルがある23,24。好ましくは、シグナル粒子は金ナノ粒子である。使用されるシグナル粒子は、問題となる特定のアッセイによってもよい。例えば、金及び銀ナノ粒子は、所望の測定可能な変化が光吸収の変化を有するような用途に特に適切である。金及びコバルト系金属を有するナノ粒子は、所望の測定可能な変化が磁性の変化を有するような用途に特に適切である。場合によっては、シグナル粒子の大きさによって、凝集前後の組成物の吸収スペクトルを測定できる。これは、金ナノ粒子及び量子ドットに特にいえる。シグナル粒子の大きさは、電磁スペクトルの特定の領域内のスペクトルシフトを形成するのに最適化されうる。例えば、サンプルによって吸収されない可視スペクトルの領域内に吸収スペクトルを形成する大きさのシグナル粒子を提供することが望ましい。場合によっては、赤外線に相当するものに近い磁性スペクトルの領域内に吸収スペクトルを形成する大きさのシグナル粒子を提供することが望ましい。生体組織はこれらの波長に対して容易に透明であるため、このようなシグナル粒子はインビボ用途に特に有用であろう。シグナル粒子は、少なくとも1つの結合部位で機能化される。好ましくは、各シグナル粒子は、1、2、3、4またはそれ以上の結合部位で機能化される。当該結合部位は、適当な手段によってシグナル粒子の表面に一時的にまたは永久的に結合してもよい。例えば、結合部位は、シグナル粒子に共有結合しても、またはシグナル粒子の表面に吸着若しくは固定化しても、またはこれに共役してもよい。結合部位は、好ましくはリンカー分子に相補的であり、シグナル粒子の凝集を促進するようにリンカー分子と会合できる。この会合は、ホモ会合結合部位及びリンカー分子が同じタイプの分子である場合であっても、またはより好ましくは、ヘテロ会合結合部位及びリンカー分子が異なるタイプの分子である場合であってもよい。結合部位は、シグナル粒子の表面に付着でき、リンカー分子と会合できる。適当な結合部位としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、ペプチド核酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの合成誘導体等の炭水化物及びポリマーがある。適当なタンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、キャプトアビジン、及び抗体がある。適当なポリペプチドとしては、超分子集合したものがあり、コイルドコイルポリペプチド及びヘリックス-ループ-ヘリックスポリペプチド、特に2量化等の2次元またはそれ以上の次元の相互作用を有するものがある。特に好ましいポリペプチドは、JR2ECと称する、配列番号1のポリペプチドである。結合部位はまた、配列番号1と少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95または少なくとも99一致したポリペプチドを有してもよい。他の適当な結合部位としてはビオチン、およびリンカー分子が抗体である場合には、これに結合する抗原がある。好ましくは、結合部位はオリゴヌクレオチドではない。一実施形態においては、2、3、4またはそれ以上の異なるタイプの結合部位がシグナル粒子の表面で一緒に固定化されてもよい。シグナル粒子はまた、さらなる有用な部位を用いて一緒に機能化されてもよい。例えば、シグナル粒子は、非特異的な吸着を低減するためにポリエチレングリコールPEG等のタンパク質排斥分子またはスペーサー分子を用いて一緒に機能化されてもよい。キャリア粒子は、リンカー分子を含み、その後放出物質と接触するとリンカー分子を放出することが可能である適当な粒子を有していてもよい。本明細書中で使用される、放出物質というフレーズは、キャリア粒子を分解または透過してリンカー分子を溶液中に流出させ、シグナル粒子と接触させることができる物質を意味する。例としては、抗微生物ペプチド、毒及び酵素がある。好ましくは、酵素は、PLA2等のホスホリパーゼを含む、リパーゼである。本明細書中で使用される、キャリア粒子のまたはこの表面層の分解ということばは、リンカー分子の放出を促進するキャリア粒子の構造変化を意味する。キャリア粒子は、固体粒子または表面層により包囲された液状コアを有してもよい。表面層は、好ましくはポリマー薄膜または両親媒性分子の層である。適当な両親媒性分子としては、操作されたブロック共重合体等の人工的に生じた両親媒性分子、およびリン脂質等の脂質がある。キャリア粒子の表面層は、好ましくは脂質混合物を含む。一実施形態においては、この脂質混合物は、細胞または組織から抽出された不明確な混合物であってもよい。または、脂質混合物は、十分規定されていてもよい。脂質は、合成物であってもよいが、好ましくは天然の脂質に化学的及び分子的に同じであるまたはほとんど同じである。一実施形態においては、表面層は、0~35コレステロールを含む。コレステロールの量が増えると、リパーゼ分解速度が減少することが知られており、ゆえに感受性の低いことが例えばより高い酵素レベルを検出するのに望ましい場合には系の応答を調整するのに使用されてもよい。他の実施形態においては、表面層は、0~25の、ポリエチレングリコールPEG等のポリマーでグラフト化された脂質を含む。実施例9に記載されるように、PEGによるグラフト化により、HSAを必要とせずにプラズモンピークのレッドシフトがより大きくなる。加えて、実施例15に記載されるように、PEGによるグラフト化により、ペプチドの放出がより早くなるため、誘導期が減少し、全体の応答が若干高くなる。好ましくは、キャリア粒子の表面層は、酵素放出物質によって特異的に分解可能である。好ましくは、酵素は、リパーゼであり、より好ましくはPLA2等のホスホリパーゼである。キャリア粒子の表面層は、分子のタイプ、分子の相状態及び分子の充填密度がそれに対する表面層が酵素基質であろう特定の酵素を測定するであろうから、問題となる特定のアッセイによってもよい。ゆえに、標的酵素がリパーゼである場合には、分子は、主に脂質を含んでもよい。標的酵素がホスホリパーゼである場合には、脂質は、主にリン脂質を含んでもよい。キャリア粒子の液状コアは、好ましくは油状のまたは水性の溶液を含む。キャリア粒子が表面層により包囲された液状コアを有する実施形態では、リンカー分子は、液状コア内に、または表面層内に含まれてもよい。他の適当なキャリア粒子が当業者には既知であろうが、キャリア粒子は、リポソーム、ミセル、ナノカプセル、マイクロカプセル及びポリマー粒子からなる群より選択されることが好ましい。好ましくは、キャリア粒子はリポソームである。リンカー分子は、シグナル粒子の凝集を促進できる適当な分子を含んでもよい。したがって、リンカー分子は、シグナル粒子上の一以上の結合部位と会合できる必要がある。本明細書中で使用される、会合できるというフレーズは、リンカー分子が、適当な条件下で、即ち、キャリア粒子から放出後結合部位と接触させる際に、シグナル粒子の結合部位と会合するであろうことを意味する。好ましくは、各リンカー分子は、第1のシグナル粒子上の1以上の結合部位、及び第2のシグナル粒子上の1以上の結合部位と会合できる。第1のシグナル粒子上の1以上の結合部位、及び第2のシグナル粒子上の1以上の結合部位とのリンカー分子の会合は、第1及び第2のシグナル粒子と連結するであろう。ゆえに、複数のシグナル粒子上の結合部位との複数のリンカー分子の会合により、シグナル粒子の凝集が形成するであろう。好ましくは各リンカー分子は、各シグナル粒子の2、3、4またはそれ以上の結合部位と会合できる。一実施形態においては、リンカー分子はまた、他のリンカー分子とホモ会合または架橋できる。例えば、特定の条件下で、JR2KC2等のリンカー分子は繊維を形成してもよい。キャリア粒子内での繊維の形成は、放出物質の不存在下でキャリア粒子からのリンカー分子の漏出を低減することによって系の安定性を促進する可能性がある。リンカー分子は、ポリマーを含んでもよい。好ましくは、ポリマーは、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドである。適当なタンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、キャプトアビジン、及び抗体がある。適当なポリペプチドとしては、コイルドコイルポリペプチド及びヘリックス-ループ-ヘリックスポリペプチド、特に2量化等の2次元またはそれ以上の次元の相互作用を有するものがある。特に好ましいポリペプチドは、配列番号2の配列を含むまたは有する、JR2KCポリペプチドの共有結合した対2量体を有する、JR2KC226である。JR2KC2は、2つの別のシグナル粒子上の2つの結合部位と会合して、2つのジスルフィド結合した4つのヘリックスバンドルに折りたたまれてもよい。リンカー分子はまた、配列番号2と少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95または少なくとも99一致した配列を含むまたは有するポリペプチドの2量体を有してもよい。他の適当なリンカー分子としてはビオチン、および結合部位が抗体である場合には、これに結合する抗原がある。リンカー分子及び結合部位は、以下に記載するように、例えば、ビオチン-アビジン共役対、抗体-抗原共役対またはJR2EC-JR2KC2-JR2EC共役対を形成してもよい。本発明の特に好ましい実施形態においては、シグナル粒子は、JR2ECで機能化され、リンカー分子はJR2KC2を有する。本実施形態では、結合部位及びリンカー分子の架橋反応の分子基盤は、合成denovo設計ポリペプチド間の折りたたみに依存したヘテロ会合である。JR2EC及びJR2KCは、ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフに折りたたまれ、溶液中で4つのヘリックスバンドルにヘテロ2量化するように設計される。双方のペプチドは、金ナノ粒子にJR2ECを固定化するために及びジスルフィド架橋を介して2つのJR2KCモノマーを共有結合するために利用されるループ領域に位置するシステイン残基を有する。溶液中では、酸化形態のJR2KCJR2KC2と称するは、2つの相補ペプチドJR2ECと会合して、2つのジスルフィド結合した4つのヘリックスバンドルにおりたたまれるヘテロ3量コンプレックスを形成する。双方のペプチドが酸化されると、ヘテロ会合がジスルフィド結合した4つのヘリックスバンドルのペプチド繊維の集合体を誘導する16。JR2ECで機能化された金ナノ粒子は、ナノモル濃度のJR2KC2の存在下で素早くかつ多量に凝集する。プラズモンピークの得られたレッドシフトは、リンカー分子の濃度によって変化する26。本組成物は、さらにキャリア粒子の表面層の酵素による分解速度を促進するように設計された分子、またはキャリア粒子の漏出速度を促進するように設計された分子を含んでもよい。例えば、本組成物は、ヒト血清アルブミンHSAまたはウシ血清アルブミンBSA等のアルブミンをさらに含んでもよい。実施例4及び実施例13に記載されるように、HSAを使用することにより、キャリア分子の分解をより良好により早くすることができる。本組成物はまた、成分の保存を助ける1以上の保存料を含んでもよい。特に、本組成物は、乾燥または凍結乾燥の際にリポソーム等の成分を保護する保存料を含んでもよい。適当な保存料としては、脱水及び再水和中に脂質2重層及びタンパク質を安定化する、トレハロース等の糖がある。本組成物は、上記成分の分散溶液を含んでもよい。好ましくは、分散溶液は、水性溶液を含む。本組成物、またはこの溶液は、好ましくは6~8のpHを有する。より好ましくは、pHは、7~8の範囲である。最も好ましくは、pHは、7.2~7.6の範囲であり、約7.4が好ましい。好ましい実施形態においては、本組成物は、複数のナノ粒子、複数のリポソーム及び前記リポソーム内に封入された複数のリンカー分子を含む。特に好ましい実施形態においては、本組成物は、複数のJR2ECポリペプチドで機能化された金ナノ粒子、複数のリポソーム及び前記リポソーム内に封入された複数のJR2KC2ポリペプチドを含む。本発明の第一の態様に係る組成物は、保存の際に非常に安定である。実施例3および実施例10に記載されているように、JR2KC2をカプセル化したリポソームを含む組成物は、CFに配置したリポソームと対比して、保存の際に顕著な安定性を示している。4°Cで15週間保存した後であっても、バックグラウンド漏出は検出されず、PLA2へのすべての反応性を維持した。本発明の第一の態様に係る組成物はまた、使用する原料が相対的に安価であり、かつ、分析物の試料をテストするための十分な組成物の提供に必要な各成分がごく少量であることから、相対的に安価である。本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様と関連して記載されるキャリア粒子を提供する。好ましくは、前記キャリア粒子は、表面層により包囲された液状コアを含み、JR2KC2または配列番号2:に少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または少なくとも99相同な配列を有するポリペプチドのダイマーを含む。好ましくは、前記表面層は、両親媒性分子を含む。好ましくは、前記キャリア粒子はリポソームである。本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様に係る組成物、または本発明の第二の態様に係るキャリア粒子の使用を提供する。上述したように、本発明に係る組成物が、酵素、抗微生物ペプチド、または毒素等の基質の放出状態にある場合、前記キャリア粒子からの前記リンカー分子の放出によって、シグナル粒子の凝集が検出できる。本発明の第一の態様に係る組成物は、したがって、酵素等の分析物の検出、酵素活性調節剤のスクリーニング、候補抗微生物ペプチドおよび毒素のスクリーニングを含む、多くの用途を有する。これらの用途は、下記により詳細に詳述される。本発明に係る第四の態様は、試料中の分析物を検出するためのアッセイ装置を提供する。前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物を含む。本明細書において、試料中の分析物の検出のための段階は、試料中の分析物の有無の検出、試料中の分析物の量または濃度の測定、試料中の分析物の活性の検出、および試料中の分析物の活性の量の測定を含む。好ましくは、前記分析物は酵素である。前記酵素は、好ましくはリパーゼであり、より好ましくはホスホリパーゼであり、最も好ましくはPLA2である。本発明の第一の態様に係る組成物またはその成分の1以上は、水溶液として提供されうる。あるいは、前記組成物またはその成分の1以上は、保存のために凍結乾燥され、次いで使用前に再溶解されうる。一実施形態において、前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物でコートされたディップスティックを含みうる。他の実施形態において、前記アッセイ装置は、本発明の第一の態様に係る組成物を含む側方流装置を含む。好ましくは、前記組成物は、ディップスティックまたは側方流装置の表面上で乾燥または凍結乾燥される。前記スティックまたは前記側方流装置の液体試料への暴露により、前記成分が溶解されて液体に戻る。本発明の第5の態様は、本発明の第一の態様に係る組成物またはその個別の成分を含む試料中の分析物を検出するためのキットを提供する。好ましくは、前記分析物は酵素である。好ましくは、前記酵素はリパーゼであり、好ましくはPLA2等のホスホリパーゼである。前記キットは、本発明の第一の態様に係る組成物またはその個別の成分を含む、さらに1以上の区画を含みうる。好ましくは、前記各成分は別個の区画内に含有される。各区画は、溶媒として、または凍結乾燥形態で保存されうる。第一の態様に係る組成物を提供するため、使用直前で前記いくつかの成分の溶液が好適な量で混合されうる。本発明の第六の態様は、i前記試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程この際、前記分析物は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、試料中の分析物を検出する方法を提供する。好ましくは、前記分析物は酵素である。前記酵素は、不安定な前記表面層により、前記キャリア粒子を分解しうる。好ましくは、前記酵素の酵素活性は、前記リンカー分子の放出を介して、前記キャリア粒子の前記表面層に穴または多孔を形成する。前記酵素は、好ましくはリパーゼであり、より好ましくはPLA2等のホスホリパーゼである。図1には本発明の一実施形態を示す。この際、前記組成物は、シグナル粒子1と、キャリア粒子2と、リンカー分子3と、を含む。前記シグナル粒子1は、1以上の結合部位5で固定化されるコア4を含む。前記キャリア粒子2は、内容積7を包囲する両親媒性分子6の表面層を含む。PLA2に加えて、任意のHSAの存在により、キャリア粒子2の破裂、およびリンカー分子3の放出が生じる。前記リンカー3は、次いで前記シグナル粒子1における結合部位5とヘテロ結合し、前記シグナル粒子の凝集を引き起こす。次いで試料中の酵素活性の指標とするため、前記シグナル粒子の凝集が検出および/または測定されうる。好ましくは、前記試料は液体試料である。前記液体試料は、工業資源、環境資源、農業資源、または生物資源等の任意の資源から供給されうる。前記試料は、合成または製造試料を含みうる。あるいは、前記試料は体液を含みうる。前記試料は、血液、血清、血漿、間質液、唾液、痰、眼球レンズ液ocularlensliquid、汗、尿、母乳、アスコット液ascotsliquid、粘液、髄液、腹膜液、皮膚滲出液、咽頭滲出液、気管支肺胞洗浄液、気管吸引物trachealaspirations、脳脊髄液、精液、頸管粘液、膣または尿道分泌物、および羊水を含む生体資源から供給または構成されてもよい。前記液体試料は、水溶液による希釈、処理、または抽出により、半固形または固形資源から供給されてもよい。一実施形態において、前記方法は、前記キャリア粒子の表面層の酵素分解の速度を高めるように設計された分子、またはキャリア粒子の漏出の速度を高めるように設計された分子の存在下で行われる。例えば、前記溶液は、ヒト血清アルブミンHSAまたはウシ血清アルブミンBSA等のアルブミンをさらに含みうる。上述したように、HSAが存在すると、キャリア分子からのリンカー分子の放出の速度が向上することが見出されている。よって、第六の態様に係る前記方法は、好ましくは、前記試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させた後、アルブミンを添加する工程をさらに含む。好ましくは、前記シグナル粒子の凝集は、系内における測定可能な変化を介して検出される。前記系内における測定可能な変化は、光学的吸収、光学散乱、蛍光強度もしくは放出ピーク、蛍光、光減退、磁気特性、電気化学ポテンシャル、表面電荷、粘度、拡散動力学、または可視偏光における変化を含みうる。蛍光における変化は、蛍光光度計を用いて測定されうる。しかしながら、多くの生物学的に関連のある溶液は、それ自体が発光する分子、または低分子量の有機色素の蛍光収率を変化させる分子を含む。実施例6に記載されるように、試料中の血清タンパク質は、蛍光色素であるカルボキシフルオレセインCFに基づくアッセイにより得られた蛍光シグナルを著しく低下させる。そのため、蛍光における変化の測定は、使用に制限を有しうる。より好ましい測定可能な変化は、光学的吸収における変化を含む。前記吸収における変化は、吸収ピークのシフト等の組成物の吸収プロファイルの形状の変化を含む。好ましくは、前記吸収における変化は、電磁スペクトルの可視領域内で生じる。かような変化は、さまざまな方法を用いて定量されうる。例えば、レシオメトリック分析法は、2つの特定波長例えば、520nmおよび570nmにおける吸収の比率を算出することを含む。あるいは、ピーク位置解析方においては、吸収ピークが最大の波長が、凝集の程度の指標として採用されうる。ピークシフトΔλmaxは、紫外可視スペクトルの最大励起波長における変化の測定値であり、この時点において記録したスペクトルにおける最大励起波長から、T=0の時点において記録したスペクトルにおける最大励起波長を差し引くことにより算出される。実施例2に記載されるように、レシオメトリック分析法は、ノイズの結果が少なく、低レベルのシグナルで細かく分離できることから好ましい。かような光学的変化は、測色技術を用いることにより検出および測定されうる。例えば、定量的測定は分光計を用いて行うことができ、また、一定の基準に対し、溶液の色を目視で比較することにより行うこともできる。あるいは、測定は試料および本発明の第一の態様に係る組成物の混合物を、紙、プラスチック、ニトロセルロース膜、または薄層クロマトグラフィー板等の固体基板上に適用することにより行うことができる。図2には、本発明に係る組成物の吸収スペクトルにおける、シグナル粒子の凝集によって生じる典型的な変化を示す。典型的なナノ粒子の分散溶液において、リポソームの破裂の前は、前記リンカー分子およびナノ粒子は完全に分離されており、プラズモン吸収ピークは520nmである。PLA27nM等の酵素の添加により、トラップされたリンカー分子が放出され、ナノ粒子の広範な凝集が引き起こされる。数分以内にこの凝集が吸収ピークの最大吸収波長が570nmとなる劇的なレッドシフトを誘導する。前記系内における変化の範囲は、試料における分析物の濃度または試料における分析物の活性の測定に用いられうる。分析物が存在しない場合、前記キャリア粒子の表面層は原形を保ち、前記リンカー分子は放出されず、前記シグナル粒子の凝集も生じない。前記分析物が存在する場合には、前記キャリア粒子は分解され、リンカー分子が放出され、結果として前記シグナル粒子の凝集が生じる。前記凝集物の存在する割合がより大きいと、前記キャリア粒子もより分解され、前記リンカー分子もより放出されて、シグナル粒子のより広範な凝集が起こり、そして系内においてより大きな変化が生じる。公知の方法を用いることにより、分析物の濃度または分析物の活性を決定することが可能となる、系内の変化に対する標準的な曲線が得られうる。実施例5に記載されるように、図4は、PLA2とともに30分間インキュベーションした後の酵素濃度に係る関数として、ナノ粒子スペクトルのシフトの大きさに係る検量線を示す。実施例14に記載されるように、図13dは、PLA2およびHSAとともに10分間インキュベーションした後の酵素濃度の関数として、前記アッセイのシグモイド反応を示す。試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触すると、シグナル粒子の凝集が検出される前に、通常、遅延が観測される実施例11を参照。この遅延は、遅滞期または遅延時間として知られている。前記遅滞期は、二重層における加水分解生成物、特に脂肪酸の蓄積によるものであると推測されている。脂肪酸分子は、脂質二重層において、PLA2が高親和性で結合するために、分離したドメインを形成する傾向がある。前記遅滞期の終わりにおける突然の破裂は、前記加水分解生成物の集積が表面結合酵素に近接することによって生じる局所的な生成物の阻害の除去と関連しうる。膜結合PLA2の量の増加はまた、遅滞期の終わりにおける高速な加水分解の開始と一致することが観測されている。実施例12第1節に記載されるように、前記遅滞期の長さは、試料中のPLA2の濃度と相関がある。特に、対数線形の依存性が、前記遅滞期および前記PLA2の濃度の間で実証されている。よって、前記遅滞期の長さの測定は、試料におけるPLA2等の分析物の濃度または活性を測定する代わりの方法を提供する。前記遅滞期の長さの測定はまた、実施例16に記載されるように、遅滞期の長さの増加の効果を有する阻害剤のスクリーニングに用いられうる。前記遅滞期の長さに影響する数多くのパラメータは、例えば、アッセイ成分の相対濃度を変化させることによって、アッセイのダイナミックレンジの調節をするための多くの可能性をさらに提示する。前記遅滞期の長さの測定は、相対的に短いタイムスケールで再現性の高い結果を与えるため、当該方法は多くのルーチンアプリケーションに適している。しかしながら、最高感度が要求される場合には、長いインキュベーション期間を考慮して、例えば、最大比色分析応答等の系内における10または30分後の変化の程度を測定することが好ましい。上記本発明の第六の態様に係る方法は、多くの理由から特に有利である。リポソーム等のキャリア粒子の使用は、生物学的に関連のある基質と作用する酵素を研究することができる。当該方法は、PLA2等のホスホリパーゼの検出に特に好適である。わずかな基質の構造および化学的性質の変化に対するPLA2の感度のため、リポソームの脂質二重層等の未修飾リン脂質との相互作用の基づくアッセイの使用は有利である。キャリア粒子からのリンカー分子の放出の要因に関するアッセイの使用もまた、極めて適応性がある。前記方法は、酵素基質キャリア粒子の表面層が、基本原理を修正することなく変更できるため、広範囲の酵素に適用されうる。実施例5において実証されているように、前記アッセイは非常に鋭敏であり、リポソームの酵素反応からたった5分後に、10nM未満のPLA2の検出を可能にする。単一のキャリア粒子の分解が数多くのリンカー分子を放出し、結果として数多くのシグナル粒子の凝集が生じるため、この感度は、少なくとも一部において、前記シグナルの増幅に起因する。より高感度な測定をするため、反応時間を長くすることができる。例えば、実施例8で実証されているように、前記アッセイは、長時間のインキュベーションでわずか70pMの酵素濃度の検出に用いられうる。前記アッセイは室温16~25°Cで行われうるが、高い温度例えば、37°Cにおけるアッセイは、反応時間を短縮し、アッセイの感度を向上させうる。前記酵素基質はシグナル粒子-リンカー分子共役体と化学的に結合しないため、前記酵素およびシグナル成分のデカップリングは、基質の化学的性質、温度、溶液条件、またはインキュベーションの時間を変化させることなく、所望の濃度範囲となるようにアッセイを調整するために利用されうる。アッセイの感度は、アッセイ組成物におけるキャリア粒子の濃度、キャリア粒子により生じたリンカー分子の濃度、またはリポソームのナノ粒子の比率を変更することによって、ピコモル~マイクロモルのレベルに調整されうる。前記放出速度は、例えば、リポソーム中のペプチドのローディング率を変化させることによって変化しうる。シグナル粒子を凝集するためのリンカー分子の使用は、高度に特異的、かつ、しっかりとした変換メカニズムを提供する。前記アッセイは、溶液条件の広い範囲において機能することができ、所定の培地、10ヒト血清、または細胞溶解物全体において機能しうる。これは、血清タンパク質等の分子の存在により前記シグナルの産生が顕著に低下する多くの公知のアッセイ方法とは対照的である。また、特許請求されたアッセイの方法は、必要とする工程数が少なく、直線的な混合手順であることから、当該方法は簡便で容易に自動化される。上述したように、酵素の異常調節は、多様な疾患および症状に関係する。問題となる疾患または症状に応じて、前記病態は、異常に高いもしくは異常に低い酵素の濃度、または異常に高いもしくは異常に低い酵素活性に起因または関連しうる。前記酵素の異常は、疾患の原因となり、または限局性炎症等の病変の簡易な指標でありうる。試料中の酵素濃度または酵素活性の測定は、したがって、かような疾患の診断に用いられうる。本発明の第七の態様は、i前記被験者由来の試料を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程この際、前記酵素は前記キャリア粒子を分解して前記キャリア粒子から前記リンカー分子を放出させる;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、被験者の酵素の調節異常に関連する疾患または症状を診断する方法を提供する。前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。前記シグナル粒子の凝集の程度は、試料中の酵素濃度または酵素活性と直接関連する。前記凝集の程度測定可能な変化を通して評価されるは、酵素濃度または酵素活性が異常に高いか異常に低いかを決定するために、正常の酵素濃度例えば、健常者における平均酵素濃度によって得られた凝集の程度と対比されうる。正常酵素濃度または活性からの偏差は、酵素の調節異常に関連した疾患または症状を診断するために、当業者に用いられうる。問題となる酵素は、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ、またはトリアシルグリセロールリパーゼでありうる。ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼB、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD1、およびホスホリパーゼD2を含む。トリアシルグリセロールリパーゼは、膵リパーゼ、胃リパーゼ、および舌リパーゼを含む。目的とする他の酵素は、ジアシルグリセロールリパーゼ、コレステラーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、肝性リパーゼ、内皮リパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、胆汁酸塩依存性リパーゼ、およびホルモン感受性リパーゼを含む。上述したように、特定の目的とする酵素はPLA2である。PLA2の濃度は、アテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、および癌を含む数多くの疾患および症状の指標である。したがって、本発明の第七の態様は、好ましくはアテローム性動脈硬化症、膵炎、急性敗血症、または癌を診断する方法を提供する。診断目的における酵素レベルの研究に加えて、酵素アッセイの他の重要な適用は、酵素の活性を調節する剤の高スループットスクリーニングである。したがって、本発明の第八の態様は、i前記酵素を、被検物質または被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程;並びにii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、酵素活性の調節剤をスクリーニングする方法を提供する。前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。前記凝集の程度測定可能な変化を通して評価されるは、前記被検物質または前記被検混合物が酵素活性を向上させるか低下させるかを決定するために、被検物質または被検混合物の非存在下で得られた凝集の程度と対比されうる。被検混合物は、合成化合物の既知の混合物、または潜在的に未知もしくは同定されていない組成物の天然由来試料でありうる。前記酵素を、被検物質/被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程は、組成物の同時混合または逐次混合を含む。一実施形態において、前記被検物質/被検混合物、および、本発明の第一の態様に係る組成物は、はじめに混合され、次いで酵素が添加されうる。好ましい逐次混合は、問題となる成分に依存する。特に興味深いことは、酵素の潜在的な阻害剤である。阻害剤存在下、シグナル粒子の凝集の程度は、被検物質/被検混合物の非存在下における凝集の程度と対比すると、減少する。実施例16に記載されるように、阻害剤はまた、シグナル粒子が検出される前に、遅滞期の長さが長くなることが見出されている。前記方法は、溶液に基づく阻害剤および基質に基づく阻害剤の両者のスクリーニングに用いられうる。両親媒性の競合阻害剤MJ33等の基質に基づく阻害剤のスクリーニングの場合には、前記被験物質は好ましくは1以上のキャリア粒子の表面層内に含有される。これらのキャリア粒子はまた、リンカー分子を含み、または酵素活性と競合するキャリア粒子の分離集団となりうる。前記第八の態様に係る方法は、前記酵素基質キャリア粒子の表面層がシグナル粒子-リンカー分子共役体と化学的に結合しないため、極めて適応性がある。スクリーニングが溶液に基づく阻害剤に対するものであっても、基質に基づく阻害剤に対するものであっても、前記シグナル粒子に基づく変換はほとんど同じであり、シグナル粒子、結合部位、またはキャリア粒子のカプセル化のいずれについても再構築は不要である。この適応性により、溶液および基質の両者に組み込まれた酵素阻害剤の定量的な研究が可能となる。また、電気活性または蛍光分析の系とは異なり、荷電または高度に共役した酵素を使用した場合であっても、酵素よりも読み出し機構に作用するため、誤った結果が得られることはほとんどない。上述したように、前記放出物質はまた、膜の浸透、漏出、および破裂を誘導するペプチド等の誘導性抗微生物部分を含みうる。本発明の第九の態様は、i被検物質または被検混合物を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、抗微生物ペプチドの候補をスクリーニングする方法を提供する。前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。前記シグナル粒子の有意な凝集は、被検物質/被検混合物が、リンカー分子を放出するためのキャリア粒子の表面層の浸透、漏出、または破裂を十分に誘導し、その結果、被検物質/被検混合物が抗微生物ペプチドの候補である、または含む指標となる。毒素の多くは、細胞膜の破壊を介して損傷効果を与える。例えば、黄色ブドウ球菌Staphylococcusaureusアルファ毒素は、膜に細孔を形成することによって、溶血および組織損傷を生じさせる膜破壊毒素である。Staphylococcusaureusアルファ毒素は、ホスホリパーゼC活性を有する膜破壊毒素であり、ガス壊疽および筋壊死の直接的な原因となる。本発明の第一の態様に係る組成物は、したがって、キャリア粒子の表面層における毒素の作用を介して、当該毒素の検出またはスクリーニングに用いられうる。よって、本発明の第十の態様は、i被検物質または被検混合物を、本発明の第一の態様に係る組成物と接触させる工程;およびii前記シグナル粒子の凝集を検出する工程、を含む、毒素を検出する方法を提供する。前記シグナル粒子の凝集は、第六の態様において前述したように検出および測定されうる。リンカー分子を放出するためのシグナル粒子の有意な凝集は、被検物質または被検混合物が、キャリア粒子の表面層を破壊または分解した指標となり、結果として、前記被検物質/被検混合物は、毒素である、または含む。この方法は、よって、潜在的な毒素のスクリーニングにも使用されうる。好ましくは、前記キャリア粒子の表面層は、脂質またはリン脂質を含み、動物細胞における毒素の作用と似た症状を示すように、組成物において、十分に通常の細胞膜と類似する。本発明の詳細は、発明の詳細な説明および下記実施例によって説明され、本発明に係るすべての実施形態は、適宜変更して適用される。本発明に係る態様を以下の非限定的な実施例により説明する。実施例1:材料の準備ポリペプチド:ポリペプチドであるJR2EC配列番号1およびJR2KC配列番号2は、標準フルオレニルメトキシカルボニルFmoc化学プロトコルおよびFmoc-Gly-ポリエチレングリコール-ポリスチレン樹脂を用いてパイオニア自動化ペプチド合成器AppliedBiosystemsで合成した。粗生成物は予備HICHROMC-8カラムを用いて逆相HPLCで精製し、MALDI-TOF質量分析によって同定した。JR2KC2を得るために、凍結乾燥されたペプチドモノマー1mMをpH8の0.1M重炭酸アンモニウムバッファー中に溶解し、90分間通気し、使用前に少なくとも24時間4°Cでインキュベートした。合成は先行文献16中に詳細に記述されている。他の化学物質:リン酸緩衝生理食塩水PBS、カルボキシフルオレセインCF、ムフェジコブラ由来のホスホリパーゼA2、ヒト血清アルブミンHSAはシグマアルドリッチ社Dorset,UKから購入し、精製することなく用いた。PLA2阻害剤クロルプロマジンおよびMJ33もシグマアルドリッチ社から購入した。脂質はAvantiPolarLipids社Alabaster,ALから購入した。ナノ粒子:ブリティッシュバイオセルインターナショナル社BBIから購入した金ナノ粒子20nmを10μMJR2ECとともに16時間インキュベートした。未結合のJR2ECの濃度を<0.1nMまで減らすために、粒子を15,000Gで繰り返し遠心し、30mMビス-トリスpH7中で再懸濁した。リポソーム:ポリペプチドが充填されたloaded大きな単層リポソームを先行文献20中で述べられているように、押出しによって準備した。各バッチは、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンPOPC5mgからクロロホルム10mg/ml中で準備した。脂質はアルゴン流下で初めに乾燥し、残余の溶剤を除去するために少なくとも2時間真空下に静置した。乾燥した脂質フィルムを次いでPBS10mMリン酸塩,150mMNaCl,pH7.4中の0.25mMJR2KC21mLで再水和し、ボルテックスした。得られた多重膜小胞溶液を100nm細孔を有するNucleoporeポリカーボネート膜を用いて19回押出した。溶離液としてPBSを用いてSephadexG-100カラムによりゲルろ過することによって捕捉されなかったペプチドをリポソーム懸濁液から除去した。再水和溶液がNaOHでpH7に調整した50mMCF,20mMリン酸塩であること以外は、カルボキシフルオレセイン充填リポソームを同様に準備した。溶離液としてPBSを用いてSephadexG-25カラムによりろ過することによって捕捉されなかった色素を除去した。全ての試料中の全脂質濃度はStewartassayを用いて決定した。21これらの材料を下記実施例で適宜用いた。実施例2:レシオメトリックおよびピーク位置データ分析法の比較方法論:実施例1にしたがって準備された、JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2-充填リポソーム5mg/mlリン脂質をリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。ナノ粒子-リポソーム混合物をPLA2およびHSA4mg/mlで処理した。各試料に対して、PLA2の下記濃度を用いた:i500ng/ml;ii250ng/ml;iii100ng/ml;iV25ng/ml。UV-可視スペクトルは、PerkinElmerLambda25UV-Vis分光光度計で記録した。時間をかけて集めて得られた吸収スペクトルは2つの異なる方法を用いて分析した:aレシオメトリック分析方法この方法において、520nmおよび570nmでの吸収の比プラズモンシフトplasmonshiftは式1を用いて計算した:この際、Aaggは570nmで測定された凝集粒子による吸収、Adispは520nmで測定された分散粒子による吸収、およびAscatは800nmで正規化した散乱による吸収である。bピーク位置分析方法この方法では、吸収ピークの絶対最大値の波長が凝集の度合いを示すと考えられる。結果:各方法を用いて得られたデータを図6に示す。線は、レシオメトリック法aを用いて得られたデータを示し、一方、点はピーク位置分析法bを用いて得られたデータを示す。レシオメトリック法はノイズの結果をあまり拾わなかっただけでなく、低-レベルシグナルの分離がよりよくなった。実施例3:ペプチド-充填リポソームの安定性方法論:1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンPOPCをPBSバッファー10mMリン酸塩、140mMNaCl、pH7.4中で100nm細孔を有するポリカーボネート膜を用いて5mg/mlPOPCの押出によって準備した。得られたリポソームは、動的光散乱によって測定された平均流体力学半径RHが49±2nmの狭いサイズ分布を有しており、ゼータ電位ζが-6.6±0.4mVであった。これらの両性イオンPOPCリポソームの負のゼータ電位は従前の報告27とよく一致している。ペプチド-充填リポソームの準備において、実施例1で述べたように脂質を再水和し、0.25mMのJR2KC2を含むPBS中で押し出した。捕捉されないペプチドはSephadexG100ゲルろ過カラムを用いて除去した。ペプチド-充填リポソームの流体力学半径およびゼータ電位はそれぞれ51±6nmおよび-7.6±1.2mVであった。これらの値は、バファーのみを含むリポソームと顕著に変わるものではなく、これは、ペプチドが脂質膜の外葉outerleafletに結合していないことを示す。CF-充填リポソームを実施例1の方法にしたがって準備した。結果:リポソームおよびこれらのペプチド充填物は貯蔵において顕著な安定性を示した。4°C4週間後でさえ、リポソーム溶液はPLA2なしでナノ粒子の凝集を引き起こさず、これはペプチドがリポソーム内から漏れていないことを示す。しかしながら、界面活性剤のTritonX100の0.1体積をナノ粒子-リポソーム混合物に添加すると、ナノ粒子はプラズモンバンドの劇的な40nmレッドシフトを示し、これは、ペプチド-リポソームシステムが損傷を受けておらず、活性であることを示す。貯蔵の間に顕著なバックグラウンドリークが起こったので、この安定性はより慣用的なCF放出アッセイによっては見出せなかった。わずか4°C24時間でCF-充填リポソームは15の内容物を放出し、これは、ペプチド-リポソームシステムが顕著によい安定性を示すことを表す。JR2KC2配列番号2のより緩やかな放出は、ポリペプチドがCFよりも顕著に大きいという事実によるかもしれない。ペプチドもまたCFよりも多くの極性および極性基を有し、これにより、疎水性二重層コアを横断するエネルギー障壁を増大させる。実際、リポソームシステムは、ポリペプチドを保持する際に効果的であるので、この特定例において、PLA2の添加だけが、顕著なナノ粒子架橋を誘発するのには不十分なごく少量のペプチドを放出した。実施例4:アッセイ性能における溶液条件の影響方法論:実施例1にしたがって、20nmJR2EC-機能化金ナノ粒子および100nmJR2KC2-充填リポソームの混合溶液を準備した。吸収スペクトルは下記に述べるように種々の溶液条件下の溶液に対して測定した。図3A中で示すように、吸収スペクトルを測定した:iPLA2存在下;iiPLA2およびEDTA存在下;およびiiiペプチドリンカー分子非存在下。結果A:酵素PLA2によってリポソーム切断が起こり、捕捉されたペプチドは放出され、ナノ粒子吸収スペクトルをレッドシフトさせた。570および520nmでの吸収比のプロットはこのシフトを表す。本研究で用いられたホスホリパーゼはカルシウム依存性である。予期されるように、溶媒中にEDTAが含まれることで、おそらく酵素的なリポソーム分解を阻害することによって凝集を抑制した。PLA2の添加はまたリポソーム中にペプチドリンカー分子が含まれなかった時には何ら凝集を引き起さず、これは、酵素自体が観察されたスペクトルシフトに直接的に関与しているものではないことを示す。図3Bに示されるように、吸収スペクトルもまた測定された:iHSA非存在下;iiHSA添加に続いてPLA2を添加したとき;およびiiiPLA2添加に続いてHSAを添加したとき。HSAは血清中の普遍的なタンパク質であり、他の役割の中で、肝臓に脂肪酸を輸送する。結果B:PLA2とともにリポソームをインキュベーションした後、ヒト血清アルブミンHSAを添加すると、キャリア粒子からリンカー分子を放出する速度が大きく増加することが見出された。ペプチド-充填リポソームにPLA2の添加後すぐに30秒HSAを4mg/ml添加すると、ペプチドが急速に放出され、大きな粒子凝集につながった。HSAだけでは何ら粒子凝集を引き起こさなかった。興味深いことに、PLA2前にHSAを添加してもペプチドの放出は抑制され、これは、リポソームへのHSAの結合がリポソームへのPLA2の結合を妨げる可能性があることを示す。上述したように、ペプチドリンカー分子なしのブランクリポソームを用いた図3Aに示されるコントロール実験は、ナノ粒子架橋を何ら起こさなかった。用いたPLA2はCa2-依存的であるので、Ca2非存在下で行った実験は同様に何ら架橋を起こさなかった。したがって、我々は、HASの存在によって支持されて、JR2EC-改変ナノ粒子の凝集の原因は、PLA2-依存性JR2KC2放出であると考えることができる。実施例5:アッセイの定量性能システムの挙動を最適化し、検証した後、アッセイの定量性能を決定した。方法論:JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2-充填リポソーム5mg/mlリン脂質を含む組成物を実施例1にしたがって準備した。組成物は種々の濃度のPLA2溶液を用いて30分間インキュベートした。ナノ粒子吸収スペクトルは式1を用いて分析した:この際、Aaggは570nmで測定された凝集粒子による吸収、Adispは520nmで測定された分散粒子による吸収、およびAscatは800nmで正規化した散乱による吸収である。結果:得られた反応は添加されたPLA2の量およびこの酵素がリポソームとともにインキュベートされる時間に主として依存していることが見出された。HSAの添加後の反応はほとんどすぐなので、HSAとともにインキュベートする時間は重要な因子ではなかった。アッセイはリポソーム上の酵素作用のわずか5分後に10nM未満のPLA2を検出することができた。酵素濃度の範囲に対する結果を図4に示す。最大シフト強度は各点に対する±SEMでプロットした。結果は濃度ともにS字状の反応を示す。これらの条件ナノ粒子濃度0.3nM、ペプチド充填濃度0.5mMおよびリポソーム濃度0.1mg/mlでは、検出のより低い限界が約1nMであった。高いPLA2レベルではペプチドリンカー分子がナノ粒子を飽和させるのに十分に濃縮され、よって凝集量を減少させるという事実により、定量の上限は約50nMであった。しかしながら、用いられるリポソームの濃度、またはリポソームに充填されるリンカー分子の濃度を変えると反応カーブが移動するので、この範囲は可変である。したがって、基質化学、温度、溶液条件またはインキュベーション時間を変えることなく、所望の濃度範囲にアッセイを調整することが可能となる。実施例6:従来のカルボキシフルオレセイン-系アッセイにおける血清タンパク質の影響方法論:PBS中のカルボキシフルオレセインCF0.75μM溶液を準備した。蛍光放射をこの溶液の波長の機能として初めに測定した。次いで引き続いての30μMHASの添加後---、および0.17mMTritonX-100の添加後-にスペクトルを集めた。結果:図5に示すように、CF溶液に対するHSA添加により、色素の放出プロファイルが変わった。最大ピーク位置は変わらなかったが、ピーク強度は顕著に変わった。HSAはCF放出をほぼ1/3に減少させたが、HASおよびTritonX-100は協同して作用し、放出をほぼ2/3に減少させた。TritonX-100だけの添加は放出強度に何ら影響を与えなかったデータは示さない。したがって、血清タンパク質の存在により、従来のCF-系アッセイを用いて得られる蛍光シグナルが顕著に減少した。さらに、状況を複雑にしていることは、小胞を溶解し、システムを修正するために添加される界面活性剤がタンパク質と協同して作用し、さらに蛍光量を減ずるという事実である。これらの影響は所定のタンパク質レベルで補うことが可能であるけれども、臨床アッセイにおいてかようなことを行うと各試料中のタンパク質レベルを測定する追加的な段階を必要とする。影響が生体試料中で共通して見出される多数のタンパク質で同様な所定の異なる比であることも明らかではない。したがって、従来のCF-系アッセイの安定性および適応性は限定的である。実施例7:酵素濃度の作用としてカルボキシフルオレセインアッセイからの反応酵素濃度の作用として先行技術のカルボキシフルオレセインCF放出アッセイからの反応を調べた。方法論:50mMカルボキシフルオレセイン含有リポソームを実施例1で述べたように準備した。試料中の最終脂質濃度は30μg/mlであった。脂質は種々の濃度で30分間、PLA2溶液とともにインキュベートした。実験はPerkinElmer蛍光光度計で励起波長490nmおよび発光波長520nmで行った。スリット幅10nmを双方のケースで用いた。全ての実験は22°Cで行い、恒温バスによって維持された。TritonX-100を用いてリポソームが破断するコントロール実験によって最大反応が示された。結果:結果を図7に示す。放出は線形にPLA2濃度に依存し、1nMの低レベルでの検出を可能にした。調べた条件下で、200nMPLA2は、30分間でほぼ全てのリポソームを破裂させるのに十分であった。実施例8:アッセイの感受性本発明のアッセイの感受性をインキュベーション時間を延長して試験した。方法論:JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2-充填リポソーム5mg/mlリン脂質を含む組成物を実施例1にしたがって準備した。この溶液を室温で12時間70pMPLA2溶液とともにインキュベートした。PLA2なしで同一の溶液をインキュベートした。次いで、双方の溶液にHSAを添加し、20分後、光吸収を測定した。結果:得られたデータを図8に示す。実線-はPLA2とともにインキュベートした溶液の光減衰を示し、点線---は、PLA2非存在下でインキュベートした溶液の光減衰を示す。本アッセイがインキュベーションを延長することで、70pMの低い酵素濃度を検出するために用いることができることを結果は示す。反応条件を最適下することによって、この検出限界をより低くすることが可能となる。実施例9:PEG-グラフト脂質の影響PEG-グラフト脂質を含む表面層を有するリポソームが与える影響を調べた。方法論:1.5molPEG-脂質を含むリポソームを準備した。光吸収は、PLA2添加前およびii0.7nMPLA2の添加後8分で測定した。HSAは添加しなかった。結果:図9に得られたデータを示す。実線-はPLA2添加前の溶液の光減衰を示し、点線---は、PLA2添加後の溶液の光減衰を示す。PEG-脂質の1.5モル含有リポソームはHSAを必要とすることなくプラズモンピークの顕著に大きなレッドシフトを起こした。実施例10:ペプチド-充填リポソームIIの安定性実施例1にしたがって準備された、JR2EC-機能化ナノ粒子およびJR2KC2-充填リポソームをリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。JR2KC2-充填リポソームを全脂質濃度0.1mg/mlにまで希釈した。リポソーム中に充填されたJR2KC2の濃度は0.25mMであり、100放出の際にはJR2KC2の約0.1μMの濃度となる。リポソームはエッペンドルフチューブでPBSバッファー中に分散され4°Cで15週間貯蔵した。リポソームは暗中で貯蔵したが、機械的振動または偶発的光曝露からは保護しなかった。1.4nMPLA2を添加し、アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて2分間隔で30分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。ピークシフトΔλmax;UV-可視スペクトル中で最大吸光波長における変化は、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。特に述べられていない限り、全ての測定は室温約25°Cで行った。コントロールは:iCa2なしおよび:iiペプチドが折り重ならず、ヘテロ三量体複合体を形成できない状態にする、L-アラニンがD-アラニンに置換された改変されたJR2EC型で機能化したナノ粒子を用いて行った。結果:JR2KC2のこの濃度で、JR2EC改変シグナル粒子の広範囲の凝集が誘発された。図10aに示すように、PLA2に暴露するとリポソームの分解により、金ナノ粒子の局在化した表面プラズモン反応LSPRバンドの顕著なレッドシフトを誘発する捕捉されたJR2KC2ペプチドの放出が起こった。この速い変換および大きな光学シフトにより、酵素活性のリアルタイムモニタリングが可能となった。ペプチド充填リポソームは驚くべき安定性を示した。貯蔵の15週間後にも何らJR2KC2のバックグランドリークが検出されなかった一方、7nMPLA2の添加後は大きな反応が得られた図11a参照。データはPLA2なしでは何らJR2KC2の自然発生的な放出はなく、リポソームがPLA2に対する完全な反応を維持することを示す。ここで用いられたムフェジコブラPLA2触媒活性はCa2のミリモル濃度の存在に大きく依存するため、Ca2なしで実験を繰り返すことは有用なネガティブコントロールである。期待されるように、PLA2の添加の際にCa2なしでは粒子凝集が何ら見られなかった図10b参照。この観察により、粒子凝集が単に酵素の存在よりもむしろPLA2が介する脂質の加水分解に依存することが確認される。さらに、改変された、折りたたまれていないJR2ECペプチドで被覆された粒子はPLA2が介するJR2KC2の放出の際に凝集しなかった図10b参照。実施例11:遅滞期LagPhase方法論:実施例1にしたがって準備した、JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2充填リポソーム5mg/mlリン脂質をリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。1.4nMPLA2を添加した。アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて2分間隔で60分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。PLA2はT=5分の時点で添加した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。結果:1.4nMPLA2の添加はすぐに粒子凝集を引き起こさなかったが、例えば、遅滞-爆発挙動lag-burstbehaviour、すなわち、短い爆発相burstphaseが続く遅滞期を示した図10b参照。これは、JR2KC2の放出が濃度依存的遅滞期だけ先行することを示す。実施例12:遅滞期における被分析物濃度および温度の影響遅滞期の持続は、試料中のホスホリパーゼの濃度および活性に依存する重要な動的パラメーターである。この点を考慮して、適切なアッセイ基準assaymetricとして遅滞期が用いられうるかどうかを決定するために体系的調査を行った。材料:実施例1にしたがって準備したJR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2-充填リポソーム0.1mg/mlリン脂質をリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。i被分析物濃度の影響方法論:PLA2を以下の濃度:i7nM、ii3.5nM、iii1.4nM、またはiv700pMで添加した。アッセイ反応は、37°CでPerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて2分間隔で60分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。PLA2はT=5分の時点で添加した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。結果:遅滞期の長さはPLA2の濃度に明らかに依存していて、37°Cで0.5mMCa2の存在下で7nM-700pMの範囲の濃度で5から40分にまで拡張したことが見出された図12a参照。ii温度の影響方法論:PLA27nMを以下の条件:i室温、およびii37°Cで添加した。アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて2分間隔で60分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。PLA2はT=5分の時点で添加した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。結果:図13aで示されるように、温度もまた遅滞期の長さに重要な影響を与えた。7nMのPLA2濃度で、室温の遅滞期は37°Cの場合よりも約20分間長くなった。実施例13:アッセイ性能に対するヒト血清アルブミンの影響方法論:実施例1にしたがって準備した、JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2充填リポソーム0.1mg/mlリン脂質をリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。PLA27nMを以下の条件:iPLA2の添加5分後ペプチド充填リポソームに対してヒト血清アルブミンHSAの4mg/mlの添加とともに、およびiiHSAの添加なしで添加した。アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて2分間隔で30分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。PLA2はT=5分の時点で添加した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。4mg/mLHSAおよび70nMPLA2を用いて、室温で実験を繰り返し、コントロールはiCa2なし、およびiiJR2KC2なしで行った。結果:ペプチド充填リポソームに対してHSAを添加することによってペプチドがほとんどすぐに放出され、大きな粒子凝集が起こった図13b参照。HSAだけでは何ら粒子凝集が起こらなかった。同様に、図13cに示されるように、JR2KC2を充填していないリポソームと同様に、Ca2非存在下でPLA2後にHSAを添加しても凝集は起きなかった。したがって、我々はリン脂質の酵素加水分解、リポソームの不安定化、そしてより速い分解の結果、HSAがリポソーム表面に結合して膜内で蓄積した脂肪酸を除去すると仮定する。プラズモンピークのシフトはHSA存在下でもより大きくなり、これは、高濃度の脂肪酸の存在がポリペプチドの結合および折りたたみを妨げることを示す。実施例14:アッセイ性能に対するPLA2濃度の影響方法論:実施例1にしたがって準備した、JR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMおよびJR2KC2充填リポソーム0.1mg/mlリン脂質をリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて4mg/mLHASの添加10分後種々のPLA2濃度に対して400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。結果:酵素レベルの範囲に対する結果は図13dに示し、これは濃度とともにS字状反応を示す。アッセイ反応は試料中に存在する活性PLA2量およびこの酵素がリポソームとともにインキュベートされる時間量に主として依存した。HSAを用いると室温で酵素活性わずか5分後で10nM未満のPLA2を検出することができた。実施例15:遅滞期に対するPEG-グラフト化脂質の影響方法論:実施例1にしたがって準備した、21,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングルコール]PEG,分子量=4000g/molを有するJR2KC2充填リポソームおよびJR2EC-機能化ナノ粒子0.1nMをリン酸緩衝生理食塩水PBSpH7.4中に0.5mMCa2とともに懸濁した。アッセイ反応は、PLA2あり、およびなしで、室温で、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて、2分間隔で30分間、400~800nmの範囲で全スペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定した。ピークシフトΔλmaxは、PLA2添加後のλmaxからPLA2添加前の最大吸光波長λmaxを引くことによって得た。結果:PEG-グラフト化リポソームにおいて、ペプチドの顕著に速い放出が室温で観察された図11b参照。遅滞期はPOPCリポソーム中約25分から2PEG化脂質の添加で10分にまで減少した。全反応は純POPCリポソームと比較してわずかに高くもなった。ポリエチレングリコールPEGで改変された脂質を含めることは、溶液中に存在するリポソームとタンパク質との間の非特異的相互作用を減少させるので、ドラッグデリバリー用途では一般的な改変である。興味深いことに、非特異的相互作用は減少するにもかかわらず、ホスホリパーゼによる脂質の特異的加水分解はPEG末端脂質を一部含むリポソームにおいて実質的に増加する。この効果は、PEG-脂質によって運ばれる負の正味電荷によって介される可能性が高い。実施例16:遅滞期における阻害剤の影響単にその濃度を測定するよりもむしろ酵素の活性を測定することが重要である一適用は、阻害剤に対するハイスループットスクリーニングである。クロルプロマジンは、PLA2の典型的な水溶性小分子阻害剤であり、したがってかようなスクリーニングにおけるこのアッセイの有用性に対して良好なテストケースである。方法論:JR2KC2充填リポソーム、カルボキシフルオレセインCF-充填リポソームおよびJR2EC-機能化金ナノ粒子は、実施例1で述べたように準備した。PLA2およびクロルプロマジンの混合物はリポソームの懸濁に対して添加した。アッセイ反応は、種々の濃度のクロルプロマジンをPLA27nM、機能化金ナノ粒子0.1nMおよびリポソーム1.4nMとともに37°Cで10分間インキュベートした後、分光学的にUV-可視範囲で測定した。JR2KC2充填リポソームに対して、アッセイ反応は、PerkinElmerLambda25Spectrophotometerを用いて、2分間隔で、400~800nmの範囲でスペクトルを記録することによって、分光学的にUV-可視範囲で測定し、次いで、Δλmaxを引いた。結果:これらの実験により、クロルプロマジンに対するIC50が6.5μMとなった図14。この値は単相ヒル方程式monophasicHillequationにデータを適合させることによって得た。この際、minは完全に阻害された値で、maxは阻害されていない値で、xは阻害剤の濃度であり、nはヒル係数である。遅滞期は阻害剤なしの約5分から10μMクロルプロマジンの存在下約15分まで増加した図15参照。この遅滞期は活性非阻害PLA2の濃度が試料中に存在する実際のPLA2濃度の約半分であったことを示す図12b参照。クロルプロマジンによる阻害はCF-充填リポソームを用いて確認し、10μMのIC50値であった図14参照。わずかに高い濃度がクロルプロマジンに対して以前報告されIC50=10-100μM、用いられたアッセイ方法が得られたIC50値の大きさに影響を与えることを示す。この相違は、関連する相対的時間スケールに依存しうる。多くの従来のアッセイ例えば、放射性アッセイは非常に時間がかかり、酵素活性の連続的モニタリングができないので、遅滞期が終了し、爆発相が始まった後に評価を行う場合がある。したがって、比較的少量の残余の活性酵素が大きな反応となり、それ故、より速いアッセイ中と同じ見掛け阻害を得るためにより高濃度の阻害剤が必要となる場合がある。この相違が他の阻害剤システムと一致することがわかっている場合、このアッセイによって提供されるリアルタイム測定に加えて天然基質提示の利点が薬剤候補の将来的な開発において重要であることがわかる。さらに、電気活性または蛍光分析システムを用いる場合と異なり、本システムは電荷を帯びた、または高共役系阻害剤によってかき乱される可能性が低い。"