"下記Aのアミノ酸配列が、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のN末端側に結合されてなるポリペプチド。A配列番号1に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも1位~44位までの領域を含むアミノ酸配列前記目的タンパク質又はポリペプチドが、インターフェロンである請求項1記載のポリペプチド。前記Aのアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列の1位~49位までのアミノ酸配列である請求項1又は2記載のポリペプチド。請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列。宿主微生物に、請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入した組換え微生物。前記宿主が、バチルスBacillus属に属する微生物である請求項5記載の組換え微生物。請求項5又は6記載の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法。請求項5又は6記載の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上方法。本発明は、優れた分泌能を有するポリペプチドを提供することを課題とする。また、本発明は当該ポリペプチドをコードする塩基配列を導入した組換え微生物を提供することを課題とする。さらに、本発明は当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することを課題とする。本発明者等は上記課題に鑑み、優れた分泌能を有するシグナル配列シグナルペプチドについて鋭意検討を行った。その結果、配列番号1に示すアミノ酸配列中の少なくとも1位~44位までの領域を含むアミノ酸配列が、シグナルペプチドとして機能し優れた細胞外分泌能を有すること、このアミノ酸配列の下流に目的タンパク質を結合することで、当該目的タンパク質の分泌生産性が向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。本発明は、下記Aのアミノ酸配列が、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のN末端側に結合されてなるポリペプチドに関する。A配列番号1に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも1位~44位までの領域を含むアミノ酸配列また、本発明は、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列に関する。また、本発明は、宿主微生物に、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を導入した組換え微生物に関する。さらに、本発明は当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法、及び当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上方法に関する。なお、本発明において、上記Aのアミノ酸配列をペプチド付加プレプロ配列とも称する。本発明のポリペプチドは、N末端側に細胞外への分泌能に優れたアミノ酸配列領域ペプチド付加プレプロ配列を有し、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく細胞外に分泌させることができる。本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を導入した微生物では、当該ペプチド付加プレプロ配列の働きによって目的タンパク質又はポリペプチドの分泌生産性が向上する。当該微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの製造方法は、培養物から容易に目的タンパク質等を回収することができ、製造工程の簡便化と高い生産性とが得られる。しかも、当該製造方法により生産された組換えタンパク質又はポリペプチドは、野生型と同等の活性を維持でき、各種用途に好適に用いることができる。本発明のポリペプチドは、配列番号1に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも1位~44位までの領域を含むアミノ酸配列ペプチド付加プレプロ配列と、枯草菌のAmyEタンパク質以外の目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列とを含んでなる。ペプチド付加プレプロ配列は、目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の上流、すなわちN末端アミノ末端側に結合し、目的タンパク質又はポリペプチドを細胞外へ輸送分泌するシグナルペプチドとして機能する。[ペプチド付加プレプロ配列]本発明のポリペプチドが有するペプチド付加プレプロ配列は、配列番号1に示すアミノ酸配列中の連続した一部分又は全部のアミノ酸配列であって、少なくとも1位~44位までの領域を含むアミノ酸配列である。配列番号1に示すアミノ酸配列は、枯草菌のα-アミラーゼAmyE由来のシグナル配列、プロ配列、及び成熟領域のN末端側の一部分からなるアミノ酸配列である。AmyEは、枯草菌体内でシグナル配列、プロ配列及び成熟領域が連結した前駆体として合成され、菌体外に分泌時にシグナル配列が、分泌後にプロ配列がそれぞれ切断されて成熟酵素となる。配列番号1において、1位~33位のアミノ酸配列がAmyEのシグナル配列に、34位~41位のアミノ酸配列がAmyEのプロ配列に、42位~59位のアミノ酸配列がAmyEの成熟タンパク質領域の上流18アミノ酸に相当する。本発明においては、AmyEのシグナル配列及びプロ配列をまとめてプレプロ配列と呼び、当該配列にAmyEの成熟領域の1部分が付加されているのでペプチド付加プレプロ配列と称した。AmyEのシグナル配列のアミノ酸配列を配列番号2に、プロ配列のアミノ酸配列を配列番号3に、成熟タンパク質領域のアミノ酸配列を配列番号4にそれぞれ示す。また、AmyEのシグナル配列、プロ配列、及び成熟タンパク質領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号5に示す。本発明で用いるペプチド付加プレプロ配列は、少なくとも配列番号1において1位~44位までのアミノ酸配列を含む。すなわち、AmyEのシグナル配列及びプロ配列をこの順で有し、さらに、プロ配列の後ろに成熟タンパク質領域のN末端側から少なくとも3アミノ酸以上最大で18アミノ酸までが付加されてなることを特徴とする。プロ配列の下流に成熟タンパク質のN末端側の3~18アミノ酸を付加することで、後述の実施例で実証されているように、分泌効率が向上する。AmyEのシグナル配列及びプロ配列については、これを付加した融合タンパク質において菌体外への分泌性が向上することも報告されている前記非特許文献14。また、枯草菌α-アミラーゼのシグナル配列と成熟領域の間に人為的にアミノ酸配列を付加して生産性の効果を検証した報告があるItohYKanohKNakamuraKTakaseKYamaneKArtificialinsertionofpeptidesbetweensignalpeptideandmatureproteineffectonsecretionandprocessingofhybridthermostablealphaamylasesinBacillussubtilisandEscherichiacolicellsJGenMicrobiol13615511558。しかしながら、本発明者らが検討したところ、付加されているアミノ酸配列は任意に選択されたものであり、AmyEの成熟タンパク質領域のアミノ酸配列とは全く異なるものであった。また、α-アミラーゼの成熟体領域に目的タンパク質を融合した融合タンパク質の生産性を評価した報告もあるHondaKFujiedaHOgawaKImaiMYamamotoHIkedaTYamaneKExtracellularproductionofhumanhepatitisBviruspreS2antigenashybridproteinswithBacillussubtilisalphaamylasesinhighsaltconcentrationmediaApplMicrobiolBiotechnol40341347。しかしながら、付加している成熟体領域が長く本発明のペプチド付加プレプロ配列とは異なり、GSTをキャリアとして使用したタンパク質生産と同じ効果、すなわち発現量の増加や可溶化しやすくする効果を目的として付加されていると考えられ、その効果は本発明とは異なるものである。また、タンパク質生産が特殊な培養分泌条件下で行われている点においても本発明の製造方法とは異なる。分泌生産性向上の観点から、ペプチド付加プレプロ配列として好ましくは、AmyEのシグナル配列及びプロ配列の下流にAmyEの成熟領域のN末端側3~10アミノ酸を付加したアミノ酸配列配列番号1において1位~44位から1位~51位までの各アミノ酸配列であり、より好ましくはプロ配列の後ろにN末端側8~10アミノ酸を付加したアミノ酸配列配列番号1の1位~49位から1位~51位までの各アミノ酸配列であり、さらに好ましくはプロ配列の後ろにN末端側8又は10アミノ酸を付加したアミノ酸配列配列番号1の1位~49位のアミノ酸配列又は1位~51位までのアミノ酸配列であり、特に好ましくはプロ配列の後ろにN末端側8アミノ酸を付加したアミノ酸配列配列番号1の1位~49位のアミノ酸配列である。[目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列]本発明のポリペプチドは、前述のペプチド付加プレプロ配列のC末端側に、目的タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列が結合してなる。本発明において、当該目的タンパク質又はポリペプチドとは、枯草菌のAmyEタンパク質以外のタンパク質又はポリペプチドである。前述のように、AmyEとは枯草菌のα-アミラーゼであり、その成熟タンパク質領域のアミノ酸配列は配列番号4で示される。目的タンパク質又はポリペプチド以下、目的タンパク質等ともいうとしては、枯草菌のタンパク質AmyE以外であれば特に制限されず、例えば、インターロイキン、上皮成長因子、ケモカイン、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、インシュリン、インターフェロン等が挙げられる。なかでも、本発明では目的タンパク質等としてインターフェロンを用いることが好ましい。インターフェロンInterferon、IFNとも略記するは、多くの動物細胞にみられるタンパク質で、I型、II型、III型の3つのタイプに大別される。本発明の目的タンパク質等として用いられるのは、I型インターフェロンが好ましい。I型インターフェロンとしては、IFN-αIFN-α1,2,4,5,6,7,8,10,13,14,16,17,21の13種類、IFN-βIFN-β1、IFN-ωIFN-ω1、IFN-εIFN-ε1、IFN-κIFN-κが挙げられる。I型インターフェロンのなかでも、ヒトI型インターフェロンがより好ましく、ヒトI型インターフェロン-αhIFN-α2a、hIFN-α2bなど及びβhIFN-β1、hIFN-β2bなどがさらに好ましく、ヒトI型インターフェロン-αが特に好ましい。上記インターフェロンのアミノ酸配列情報、及びインターフェロン遺伝子の塩基配列情報は、DDBJ、EMBL、GenBank等の公共の塩基配列データバンク等から得ることができる。一例として、ヒトインターフェロン-α2bの成熟領域のアミノ酸配列を配列番号6に、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を、配列番号17にそれぞれ示す。本発明のポリペプチドに含まれる目的タンパク質等のアミノ酸配列は、当該タンパク質等の成熟領域のみでもよく、当該タンパク質の機能に影響を与えない範囲で他の配列を有していてもよく、例えば、当該アミノ酸配列の合成調製の際や宿主微生物への導入の際などに人為的に付加した配列例えば、リンカー配列、アダプター配列などを適宜有していてもよい。また、成熟領域のN末端側又はC末端側にヒスチジンタグ、FLAGタグ、HAタグやmycタグといったアフィニティタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、緑色蛍光タンパク質GFP、マルトース結合タンパク質MBPといったキャリアタンパク質の配列等を有するものであってもよい。[ポリペプチド]本発明のポリペプチドは、上述したペプチド付加プレプロ配列が、目的タンパク質等のアミノ酸配列のN末端側に結合されたものである。本発明のポリペプチドにおいては、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等とが細胞内で融合タンパク質として発現するように連結されていればよい。ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域のアミノ酸配列とが直接結合している場合はもちろん、前述のように、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等のアミノ酸配列とがリンカーを介して結合していてもよいし、ペプチド付加プレプロ配列と目的タンパク質等の成熟領域との間に、制限酵素に由来するアミノ酸、各種のタグや小DNA断片に由来するアミノ酸等の配列を有していてもよい。本発明のポリペプチドは、配列番号1に示すアミノ酸配列情報、及び目的タンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、通常の遺伝子工学的手法により作製できる。具体的には、化学合成による方法、PCR反応による方法、該当配列を含むDNA断片やプラスミドより得る方法などが挙げられる。本発明のポリペプチドは、目的タンパク質等のアミノ酸配列のN末端側にペプチド付加プレプロ配列が結合した構造により、これを発現した微生物では菌体内でペプチド付加プレプロ配列が付加した融合タンパク質が合成され、分泌シグナルの働きにより菌体外に分泌される。ペプチド付加プレプロ配列は、優れた分泌能を有しており、目的タンパク質等を効率よく菌体外に分泌することができる。そのため、ペプチド付加プレプロ配列を結合することにより、菌体内での目的タンパク質前駆体の蓄積が減少する。さらに、菌体外に分泌されたタンパク質は、野生型と同等の生理活性を維持することができる。[ポリペプチドをコードする塩基配列]本発明の塩基配列は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもので、ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列の下流に、目的タンパク質等をコードする塩基配列が結合した塩基配列である。上述した本発明のポリペプチドと同様、細胞内で融合タンパク質として発現するよう配列番号1のペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列と目的タンパク質等コードする塩基配列とが連結されていればよく、リンカー配列等を含むものであってもよい。ペプチド付加プレプロ配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号5の塩基配列において1位~132位から1位~177位までの領域の各塩基配列が挙げられる。目的タンパク質等をコードする塩基配列として、例えば、配列番号17hIFN-α2bの塩基配列が挙げられる。本発明の塩基配列は、配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩基配列、目的タンパク質等をコードする塩基配列の情報をもとに、通常の手法により調製することができる。例えば、塩基配列情報をもとに適当なプライマーを設計し、枯草菌の染色体DNAや目的タンパク質等の遺伝子を有する生物の染色体DNAをそれぞれ鋳型として、PCR反応により合成することができる。また、塩基配列情報をもとに化学合成することもできる。[組換え微生物]本発明の組換え微生物は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列遺伝子を、宿主微生物に導入したものである。宿主微生物としては、グラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれを用いてもよいが、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点からグラム陽性菌が好ましい。グラム陽性菌の中でもバチルス属細菌がより好ましく、具体的には、枯草菌、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Bacillusstearothermophilus、Bacillusthuringiensis、Bacillussubtilisnattoなどが好ましく用いられる。特に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点から、枯草菌を宿主とすることが好ましい。宿主に導入する塩基配列は、上述した本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列であり、その調製方法も前述のとおりである。本発明の組換え微生物には、本発明のポリペプチド配列をコードする塩基配列の他に、発現制御のために有用な塩基配列が適宜導入されていてもよい。例えば、転写、翻訳に関わる制御領域として、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位SDShineDalgarno配列等及び開始コドンを含む翻訳開始領域、ターミネーター等を、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列と適正な形で結合し導入してもよい。また、選択マーカー等を導入してもよい。宿主微生物への塩基配列の導入は、通常の組換えDNA技術を用いて行うことができる。例えば、ポリペプチド配列をコードする塩基配列をベクターに組み込んで、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませて導入してもよいし、塩基配列に宿主微生物ゲノムの相同領域を結合したDNA断片を用いて、相同組換えにより宿主微生物ゲノムに直接組み込んでもよい。ベクターを用いる場合、プラスミド等の染色体外で自立増殖複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有する発現ベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。具体的には、pHY300、pWH1520、pUB110、pC194、pT127、pE194等のベクターを挙げることができる。プロモーターやターミネーター、選択マーカー等の種類も特に限定されず、通常使用されるものを適宜選択して用いることができる。プロモーターとしては、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、spacプロモーター、xylプロモーター、T7プロモーター等が用いられる。選択マーカーとしては、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、エリスロマイシン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。目的塩基配列のベクターへの組み込みは、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法により行うことができる。次いで、構築した組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列が導入された組換え微生物を作製する。形質転換方法は特に限定されず、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法J.Bacterial.93,19251967、プロトプラスト形質転換法Mol.Gen.Genet.168,1111979、エレクトロポレーション法FEMSMicrobiol.Lett.55,1351990、LP形質転換方法T.Akamatsu及びJ.Sekiguchi,ArchivesofMicrobiology,1987,146,p353357;T.Akamatsu及びH.Taguchi,Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,2001,65,4,p823829等通常の方法を用いることができる。目的の塩基配列が導入されたことの確認は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。[目的タンパク質等の製造]得られた組換え微生物を用いて、目的タンパク質等を製造する。例えば、組換え微生物を適切な培地を用いて適切な条件下にて培養して、目的タンパク質を産生させ、培養物から目的タンパク質を精製回収すればよい。本発明では、菌体内で合成された目的タンパク質等が効率よく菌体外に分泌されるので、培養液から目的タンパク質等を回収することができ、精製単離作業を容易に行うことができる。組換え微生物の培養条件は、宿主の種類に応じて適宜好ましい培養条件を採用することができる。また、用いるベクターやプロモーターに応じて、組換えタンパク質の発現誘導を適宜行ってもよい。例えば、宿主として枯草菌を用いた場合は、2×L培地実施例参照を用い、30°C前後で培養を行えばよい。培養物から目的タンパク質等を精製単離する方法は特に限定されず、例えば、カラム精製、硫安沈殿、組換えタンパクにタグを付加した場合はタグを用いた精製、透析、フィルター精製等の方法で行うことができる。以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。下記の手法によって、本発明のペプチド付加プレプロ配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を導入した組換え微生物を構築し、目的タンパク質の発現を行った。目的タンパク質として、ヒトインターフェロンαhIFN‐αを用いた。[使用菌株、プラスミドベクター及び培地]1使用菌株大腸菌エシェリヒアコリC600株タカラバイオ大腸菌エシェリヒアコリJM109株タカラバイオ枯草菌168株枯草菌Dpr8株8種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株ΔeprΔwprAΔmprΔnprBΔbprΔnprEΔvprΔaprE;KodamaらEffectofBacillussubtilisspo0AmutationoncellwalllyticenzymesandextracellularproteasesandpreventionofcelllysisJBiosciBioeng2007103p1321参照2プラスミドpWH1520;耐性マーカーアンピシリン、テトラサイクリン、MoBiTec社製pHKK3100;耐性マーカーアンピシリン、テトラサイクリン、挿入配列枯草菌アミラーゼAmyEのシグナル配列pHKK3101;耐性マーカーアンピシリン、テトラサイクリン、挿入配列枯草菌アミラーゼAmyEのシグナル配列、及びhIFN‐α2bの成熟体領域の配列pHKK3200;耐性マーカーアンピシリン、テトラサイクリン、挿入配列枯草菌アミラーゼAmyEのシグナル配列及びプロ配列pHKK3201;耐性マーカーアンピシリン、テトラサイクリン、挿入配列枯草菌アミラーゼAmyEのシグナル配列及びプロ配列、及びhIFN‐α2bの成熟体領域の配列3培地L培地;バクトトリプトン1、イーストエクスラクト0.5、NaCl和光0.52×L培地;バクトトリプトン2、イーストエクスラクト1、NaCl和光11.異種タンパク質hIFN-α発現用ベクターの構築枯草菌アミラーゼAmyEのシグナル配列配列番号2及びプロ配列配列番号3をコードするDNA配列を組み込んだ基本ベクターpHKK3200を、特開2008271956号公報の実施例2の記載に従って構築した。枯草菌168株の染色体を鋳型に、プライマーamyESF-1に懸濁し、等量のサンプルバッファを加えて加熱処理した。その後、遠心して得られた上清をサンプルとした。ウエスタンブロッティングは、セミドライシステムバイオラッドを用いて行った。SDS-PAGEによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロンPVDF膜ミリポアに転写した。タンパク質の検出は、イムノスターLD検出システム商品名、和光純薬工業株式会社製を用いた。抗インターフェロンα抗体は、PeproTechECLTDのものを、HRP標識二次抗体は、GEヘルスケアのものを使用して検出した。インターフェロンの分泌量及び細胞内蓄積量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡を、ImageJにより数値化することで行った。1-1インターフェロン分泌量の測定各導入株のMediumサンプルを用いて、菌体外に分泌されたインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した図2a。次いで、得られたインターフェロンのバンドの濃淡を、ImageJにより数値化し、各導入株のインターフェロン分泌量とした図3。なお、コントロールにはシグナル配列とプロ配列を持つpHKK3201導入株を用い、pHKK3201導入株での分泌量を100として、各導入株における分泌量を相対値で示した。図3から明らかなように、シグナル配列とプロ配列に成熟領域の3アミノ酸残基を付加したpHKK3221導入株、及び8アミノ酸残基を付加したpHKK3222導入株では、コントロールのpHKK3201導入株に比べインターフェロン分泌量生産量が大きく上昇した。また、シグナル配列とプロ配列に18アミノ酸残基を付加したpHKK3223導入株でも、コントロールpHKK3201導入株と同程度の生産性があった。特に、8アミノ酸残基を付加したpHKK3222導入株では、インターフェロンの生産量が最大となり、シグナル配列のみのpHKK3101導入株と比べて9.5倍、シグナル配列とプロ配列を有するpHKK3201導入株と比べて2.9倍の生産性向上が確認された。また、35アミノ酸残基を付加したpHKK3224導入株は、シグナル配列のみのpHKK3101導入株と比べて生産性は向上しているものの、シグナル配列とプロ配列を有するpHKK3201導入株に比べると多少生産性が低下した。63アミノ酸残基以上を付加した導入株では、インターフェロンの分泌はほとんど確認されなかった。1-2菌体内のインターフェロン蓄積量の測定各導入株のLysateサンプルを用いて、菌体内のインターフェロンをウエスタンブロッティング法により検出した図2b。その結果、各サンプルにおいて、菌体内に前駆体型インターフェロンと成熟型インターフェロンの両者が確認された。なお、前駆体型インターフェロンとは、シグナル配列が切断されていない状態であり、成熟型インターフェロンとは、付加したアミノ酸配列からシグナル配列が切断された状態である。菌体外へ分泌されるタンパク質は、シグナル配列シグナルペプチドをアミノ末端側に持ち、これは菌体外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼよって切断される。細胞内への前駆体の蓄積は、シグナルペプチドが切断されておらず、菌体外への正常な分泌ができていないことを示している。宿主自体が持つ分泌タンパク質が菌体内に蓄積する現象は、分泌輸送経路構成因子の欠損や変異による機能不全があった場合に見られるもので、通常は観察されない。異種タンパク質発現においても、菌体内に前駆体タンパク質が蓄積していることは、分泌効率が悪いことを示している。異種タンパク質の細胞内蓄積は宿主への負荷となるため、効率的な異種タンパク質生産という点からは、蓄積が少ない状態が好ましい。次いで、得られた前駆体型インターフェロンと成熟型インターフェロンのバンドについて、濃淡をImageJにより数値化し、菌体内の前駆体型インターフェロン蓄積量及び成熟型インターフェロン蓄積量を算出した。これらをもとに、菌体内の総インターフェロン生産量前駆体型インターフェロン蓄積量と成熟型インターフェロン蓄積量の和に対する前駆体型インターフェロン蓄積量の比率を求め、前駆体型インターフェロン蓄積率とした図4。図4から明らかなように、シグナル配列とプロ配列に3アミノ酸残基を付加したpHKK3221導入株、8アミノ酸残基を付加したpHKK3222導入株、18アミノ酸残基を付加したpHKK3223導入株では、シグナル配列とプロ配列を有するpHKK3201導入株に比べて、前駆体型インターフェロンの蓄積が減少していた。前駆体の蓄積減少は、特にpHKK3222導入株及びpHKK3223導入株で顕著であった。この結果から、菌体内での前駆体の蓄積解消が、インターフェロン生産量及び分泌効率の向上につながっている可能性が高いと考えられる。1-3インターフェロン分泌効率前記1-1で得られた培養液中に分泌されたインターフェロン量、及び1-2で得られたライゼート中のインターフェロン総量前駆体蓄積量成熟体蓄積量から、各導入株における分泌効率を下記式により求めた。結果を図5に示す。分泌効率=培地中に分泌されたインターフェロン量/インターフェロン総生産量インターフェロン総生産量=培地中に分泌されたインターフェロン量ライゼート中のインターフェロン総生産量前駆体成熟体図5から明らかなように、シグナル配列とプロ配列を有するpHKK3201導入株に比べて、pHKK3221導入株、pHKK3222導入株、pHKK3223導入株では分泌効率が向上していた。特に、シグナル配列とプロ配列に8アミノ酸残基を付加したpHKK3222導入株では分泌効率が約4倍と飛躍的に向上した。2ELISA法による菌体外分泌されたインターフェロン量の測定上記1ウエスタンブロッティングに用いたMediumサンプルと同様の調製手順で、pHKK3201導入株及びpHKK3222導入株の培養液を遠心して集菌し、得られた上清液をELISA用サンプルとした。測定には、IFNαHumanELISAキットRDsystems,Incを使用した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行われた。ELISA法により算出された培養液上清中に含まれるインターフェロンの総量を、表1のインターフェロン総量欄に示した。3インターフェロン活性測定前記1-1でインターフェロン生産量が最大であったpHKK3222を用いて、シグナル配列とプロ配列に8アミノ酸残基が付加された組換えインターフェロンの生理活性を測定した。測定実験は、鎌倉テクノサイエンスに委託して行った。上記2のELISA法と同様の手順で、pHKK3201導入株及びpHKK3222導入株の培養上清液を調製して、測定試料とした。なお、バックグラウンドとして、インターフェロンをコードする遺伝子を有しないプラスミドを導入した株を用いて測定し、100IU/mL以下であることを確認している。生理活性測定は、FL細胞に対するSindbisウイルスの感染を指標として計測した。標準品には、インターフェロンA注射用hIFNα2b、シェリングプラウ株式会社現MSD株式会社製を使用した。単位は、国際単位IUを使用した。インターフェロンの生理活性は、インターフェロンに接触させたFL細胞にシンドビスウイルスを感染させることによる抗ウイルス作用を指標とした生理活性測定法を用いた。無血清培地A5ウシ胎児血清、10mMHEPES緩衝液で4×105cells/mLの細胞液を調製し、マイクロプレートに10μL/well播種した。炭酸ガスインキュベーター5CO2、37°C内で20~28時間培養後、2倍段階希釈した標準品または測定試料5μL/wellを添加した。炭酸ガスインキュベーター内でさらに20~28時間培養した後、マイクロプレート内の培養液を除去し、培地B100μL/wellで1回洗浄後除去した。各試料に、無血清培地B0.5BSA、20mMHEPES緩衝液で適宜希釈したウイルス液100μL/wellを添加し、マイクロプレートをインキュベーター内37°Cで18~28時間培養した。マイクロプレート内のウイルス液を廃棄し、染色固定液0.05w/vクリスタルバイオレット、10v/vエタノールを含む中性ホルマリン液に1~2時間浸し、水洗後、乾燥した。得られたサンプルを、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度波長595nmを測定した。CellControlの吸光度を100、VirusControlの吸光度を0とし、各wellの吸光度を算出した。吸光度50の希釈倍数を力価とし、標準品インターフェロンA注射用300IFN-α2b、市販品の力価により測定試料の力価を補正し、試料のIFN力価を相対的に算出した。上記測定により算出された培養上清液サンプル中の総インターフェロン活性を、表1の総インターフェロン活性欄に示した。次いで、この培養上清中の総インターフェロン活性と、上記2ELISA法により算出された培養液上清中に含まれるインターフェロン総量とから、分泌された組換えインターフェロンの比活性を算出した。比活性=総インターフェロン活性/インターフェロン総量として算出し、結果は表1の比活性欄に示した。当該比活性は、同タンパク質量における組換えインターフェロンタンパク質の活性能を示している。表1から明らかなように、比活性の値はpHKK3201導入株を用いた系とpHKK3222導入株を用いた系とで同程度であった。このことから、pHKK3222導入株シグナル配列プロ配列8アミノ酸残基を付加により菌体外に産出された組換えインターフェロンは、pHKK3201導入株シグナル配列プロ配列を付加により菌体外に産出された組換えインターフェロンと同等の生理活性を有することが確認された。なお、本発明者らは以前に、シグナル配列インターフェロン導入株本発明のpHKK3101株に相当、菌体外分泌時に当該シグナル配列は切断済み及びシグナル配列プロ配列インターフェロン導入株本発明のpHKK3201導入株に相当を用いて、上記2及び3と同様のインターフェロン活性測定を行っており、両導入株により菌体外に産出された組換えインターフェロンが、野生型と同等の生理活性を有することを既に確認済みである前記非特許文献14参照。これらの結果から、pHKK3222導入株シグナル配列プロ配列8アミノ酸残基を付加により菌体外に産出された組換えインターフェロンは、野生型と同等の生理活性を保持しており、成熟領域の8アミノ酸残基を付加したことによる機能的な悪影響はないことが確認された。"