以下の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスクを予測する方法。a被検者より採取された肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程;以下の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法。aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程;以下の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法。aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程;転写制御領域が、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-723bpから、下流の500bpまでの領域であることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載の方法。転写制御領域が、以下のi~vから選択される1以上の領域であることを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の方法。iABCB6遺伝子の転写開始点より下流の183bpから309bpまでのMSP1領域;iiABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域;iiiABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域;ivABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-268bpから-173bpまでのMSP4領域;vABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-433bpから-330bpまでのMSP5領域;以下のi~vから選択される1以上のプライマーセットとプローブとの組合せを用いて、ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出することを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載の方法。i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスク予測用のキット。ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスク予測用のキット。プライマーセットとプローブとが、以下のi~vから選択される1以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とする請求項7又は8のいずれかに記載のキット。i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;本発明の課題は、肝細胞癌HCCの発症又は再発に関与するゲノムDNAのメチル化領域を特定し、より簡単な操作で検出することが可能な、HCCの発症又は再発のマーカーを提供することにある。本発明者らは、HCC患者より切除された癌部及び/又は非癌部肝臓組織における遺伝子発現を網羅的に解析し、1年以内に再発が認められた患者由来の肝臓組織再発有り肝臓組織におけるABCB6mRNA発現量が、1年以内に再発が認められた患者由来の肝臓組織再発無し肝臓組織と比較して有意に高いことを見い出した図9。一般的に遺伝子発現は、プロモータ領域のDNAメチル化により抑制されることが知られていることから、発明者らは、再発有り肝臓組織におけるABCB6遺伝子の発現の増加に、プロモータ領域の低メチル化が関与している可能性があると考え、ABCB6遺伝子に関するメチル化解析を行った。本発明者らは、ABCB6遺伝子近傍のDNA配列を解析してABCB6遺伝子のプロモータ領域にCpGアイランドの存在することを明らかにし、該CpGアイランドにおけるメチル化率を調べた。また、非癌部においてはABCB6mRNA発現とメチル化率との相関は見られなかったが、癌部においてはmRNA発現とメチル化率との間に逆相関関係が見られた図4。しかしながら、再発の有無に基づいて解析を行った結果は予想外なことに、C型肝炎ウイルスキャリア由来の再発有り肝臓組織の癌部においてはメチル化率が高いことが明らかとなった。さらに、該CpGアイランドのメチル化率は、C型肝炎ウイルスキャリア由来の再発無し肝臓組織の非癌部においては低いこと、B型肝炎ウイルスキャリア由来の肝臓組織においては癌部及び非癌部のいずれのメチル化率も、再発の有無との関連が認められないことを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は1a被検者より採取された肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスクを予測する方法や、2aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法や、3aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法や、4転写制御領域が、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-723bpから、下流の500bpまでの領域であることを特徴とする上記1~3のいずれかに記載の方法や、5転写制御領域が、iABCB6遺伝子の転写開始点より下流の183bpから309bpまでのMSP1領域;iiABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域;iiiABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域;ivABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-268bpから-173bpまでのMSP4領域;vABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-433bpから-330bpまでのMSP5領域;のi~vから選択される1以上の領域であることを特徴とする上記1~4のいずれかに記載の方法や、6i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;のi~vから選択される1以上のプライマーセットとプローブとの組合せを用いて、ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出することを特徴とする上記1~5のいずれかに記載の方法や、7ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスク予測用のキットや、8ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスク予測用のキットや、9プライマーセットとプローブとが、i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ;のi~vから選択される1以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とする上記7又は8のいずれかに記載のキットに関する。本発明によると、C型肝炎ウイルスキャリアのHCC患者より採取された肝臓組織を用いて、HCCの再発リスクを予測することが可能となり、術後の治療方針を決定する上で有用な情報を提供することができる。また、本発明によると、C型肝炎ウイルスキャリアの被検者より採取された肝臓組織を用いて、HCC発症リスクを予測することができ、該被検者におけるHCCの予防及び早期発見のために有用な情報を提供することができる。本発明の肝細胞癌の発症リスクを予測する方法としては、a被検者より採取された肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える方法以下、発症リスク予測方法ということもあるであれば特に制限されず、また、本発明の肝細胞癌の再発リスクを予測する方法としては、aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える方法以下、再発リスク予測方法Iということもあるや、aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測する方法以下、再発リスク予測方法IIということもあるであれば特に制限されず、ここで、発症とは、癌化していない肝細胞、若しくは前癌状態にある肝細胞が癌化して癌組織を形成することを意味し、再発とは、治療のために癌部を除去した後の非癌部肝臓組織において、癌化していない肝細胞、若しくは前癌状態にある肝細胞が新たに癌化することや、癌部より転移した癌細胞が非癌部肝臓組織中で増殖して新たに癌組織が形成されることを意味する。本発明の発症リスク予測方法の工程aにおけるC型肝炎ウイルスに感染している被検者としては、C型肝炎ウイルスHCVに感染しているHCVキャリアであれば特に制限されず、肝炎の臨床的症状のない持続的なHCVウイルスキャリアであっても、HCVによる慢性肝炎及び/又は肝硬変を発症しているHCVウイルスキャリアであってもよい。また、本発明の再発リスク予測方法Iの工程b、及び再発リスク予測方法IIの工程bにおけるC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者としては、C型肝炎ウイルスHCVに感染しているHCVキャリアであって、且つ、肝細胞癌を発症している肝細胞癌患者であれば特に制限されないが、HCVによる慢性肝炎及び/又は肝硬変を発症しているHCVウイルスキャリアであることが特に好適である。上記本発明の発症リスク予測方法の工程b、再発リスク予測方法Iの工程b、及び再発リスク予測方法IIの工程bにおいて、ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する方法としては、ABCB6遺伝子の転写制御領域の全部又は一部に含まれるCpG配列のシトシンのうち、メチル化されているシトシンを定量又は半定量的に検出する方法であれば特に制限されず、上記転写制御領域としては、例えば、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の723bp-723bpから、下流の500bp500bpまでの領域を好適に例示することができるが、なかでも、ABCB6遺伝子の転写開始点より下流の183bpから309bpまでのMSP1領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-268bpから-173bpまでのMSP4領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-433bpから-330bpまでのMSP5領域等であることが好ましく、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域であることがさらに好ましい。また、上記シトシンのメチル化の程度の検出方法としては、定量的又は半定量的なメチル化検出方法であれば特に制限されず、具体的には、Methylight法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化特異的PCR法MSP法、CombinedbisulfiterestrictionassayCOBRA法、HighResolutionMeltingHRM法等を例として好適に挙げることができるが、なかでも、Methylight法を特に好適に挙げることができる。上記本発明の方法において、Methylight法を用いてABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する場合には、例えば、i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ等を用いることができる。本発明の肝細胞癌の発症リスク予測用のキットとしては、ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるものであれば特に制限されず、また、本発明の肝細胞癌の再発リスク予測用のキットとしては、ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるものであれば特に制限されず、上記ABCB6遺伝子の転写制御領域としては、上記転写制御領域としては、例えば、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の723bp-723bpから、下流の500bp500bpまでの領域の全部又は一部を好適に例示することができるが、なかでも、ABCB6遺伝子の転写開始点より下流の183bpから309bpまでのMSP1領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-268bpから-173bpまでのMSP4領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-433bpから-330bpまでのMSP5領域等であることが好ましく、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の71bpまでのMSP2領域や、ABCB6遺伝子の転写開始点より上流の-50bpから下流の57bpまでのMSP3領域であることがさらに好ましい。また、上記プライマーセットとプローブとしては、ABCB6遺伝子の転写制御領域のシトシンのメチル化の程度を検出するためのものであれば特に制限されないが、具体的には、i配列番号5及び6に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号7に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、ii配列番号8及び9に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号10に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、iii配列番号11及び12に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号13に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、iv配列番号14及び15に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号16に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、v配列番号17及び18に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号19に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ等を例として好適に挙げることができる。また、ABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるキットを、肝細胞癌の発症リスクの予測又は肝細胞癌の再発リスクの予測に使用する方法も本発明の実施の変形とすることができる。また、本発明は、aC型肝炎ウイルスに感染している被検者より採取された肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える肝細胞癌の発症リスクを予測するためのデータを収集する方法以下、発症リスク予測データ収集方法ということもあるや、aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法以下、再発リスク予測データ収集方法Iということもあるや、aC型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムDNAを抽出する工程;b上記ゲノムDNAのABCB6遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程;c上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程;の工程a~cを順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法以下、再発リスク予測データ収集方法IIということもあるを実施の変形として含むことがある。本発明の発症リスク予測データ収集方法、再発リスク予測データ収集方法I、及び再発リスク予測データ収集方法IIを実施する際の操作は、データを収集することを除き、上記本発明の発症リスク予測、再発リスク予測方法I、及び再発リスク予測方法IIを実施する際の操作と同様である。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。ABCB6遺伝子のメチル化解析ABCB6遺伝子の転写調節領域付近をコンピュータ解析した結果、CpGアイランドが存在することが明らかとなった。図1に、ABCB6遺伝子領域における、CpG配列の位置、及びCpGアイランド領域を示す。このCpGアイランドにおけるシトシンのメチル化について、6種の肝癌細胞株HLE、SK-HEP-1、Hep3B、HuH-6、HuH-7、HepG2を用いて解析を行った。図2に、バイサルファイトシークエンスの結果を示す。以上の解析結果に基づいて、Methylight法による解析に用いる5箇所のメチル化解析領域MSP1~5を決定した図3。肝臓組織におけるABCB6遺伝子のメチル化解析1.サンプル肝臓癌患者より外科的に切除して得られた肝臓組織から、非癌部及び癌部HCC組織を採取した。得られた非癌部及び癌部HCCサンプルは-80°Cにて保存し、RNA及び/又はDNAの抽出に用いた。2.RNA及びゲノムDNA抽出上記の48例再発なし:35例、再発有り:13例のサンプルから、TRIzolReagentインビトロジェン社製とPureLinkMicrotoMidiTotalRNAPurificationKitインビトロジェン社製を用いてtotalRNAを抽出した。また、46例再発なし:35例、再発有り:11例のサンプルから、UltraCleanTissueDNASpinKitMOBIO社製を用いてDNA抽出を行った。上記サンプルのうち、33例のサンプルはRNAとDNAの両方の抽出に用いた。3.逆転写反応とABCB6発現レベルの算出上記のようにして抽出されたtotalRNAから、PrimeScriptRTreagentKitタカラバイオ社製を用いてcDNAを合成し、リアルタイムPCRによりABCB6mRNA発現レベルを調べた。リアルタイムPCRの反応は、cDNA10ngのinitialRNAに相当、プライマー10pmol、及び加水分解プローブ2pmolを含む20μLの反応液を用い、LightCycler480IIロシュ社製によって行った。ΔΔCq法ΔΔCt法により、非癌部サンプルにおけるABCB6mRNA発現量の平均値N=48を1.0として、癌部サンプルにおけるABCB6mRNA発現レベルを相対値として示した。また、リファレンス遺伝子としてGAPDH遺伝子の発現レベルを確認した。リアルタイムPCRに用いたプライマー及び加水分解プローブの配列を以下に示す。<ABCB6>センスプライマー配列番号1:5GGACCAAGATGTGGAAAGGA3アンチセンスプライマー配列番号2:5CCAAAATCTCGCCAGGTAGA3プローブ:UniversalProbeLibrary66RocheDiagnostics社製<GAPDH>センスプライマー配列番号3:5AGCCACATCGCTCAGACAC3アンチセンスプライマー配列番号4:5GCCCAATACGACCAAATCC3プローブ:UniversalProbeLibrary60RocheDiagnostics社製4.バイサルファイト処理とABCB6遺伝子領域のメチル化率の算出各サンプルにおけるABCB6遺伝子領域のメチル化率を検討する目的で以下の実験を行った。上記1で抽出したDNAをEZDNAMethylationGoldKitZYMORESEARCH社製によりバイサルファイト処理した。これによって、ゲノムDNA中のメチル化されていないシトシンはチミンへと変換され、メチル化されているシトシンは変換されずに残る。メチル化率の測定はMethylight法を若干改変し、リアルタイムPCR装置とプライマー10pmol及び加水分解プローブ2pmolを用いて20μL反応系でのメチル化特異的PCRMSPによって行った。鋳型には100ngのバイサルファイト処理したゲノムDNAを用いた。ABCB6遺伝子領域のメチル化率は、ΔΔCq法ΔΔCt法によりMSP5のメチル化率に対する相対値としてMSP1~4について求めた。あるいは、ABCB6遺伝子領域のメチル化率をRPPH1ribonucleasePRNAcomponentH1NR0023121X15624又はALUAlurepeatThemostplentifulshortinterspersednucleotideelementSINEinhumanDNA配列のメチル化率に対する相対値としてMSP5について求めた。また、全ての実験においてコントロールとして100メチル化コントロールDNAQIAGEN社製を鋳型に用いた。リアルタイムPCRに用いたプライマー及び加水分解プローブの配列を以下に示す。<MSP1>センスプライマー配列番号5:5TAAGGTATTCGGATGTTCGC3アンチセンスプライマー配列番号6:5TCGACCTCGCAATAATTACC3プローブ配列番号7:5FAMAGTGTTCGTAGTTTCGGTCGGCGTTTBHQ3<MSP2>センスプライマー配列番号8:5GGGGTTATAGTCGTGGAGC3アンチセンスプライマー配列番号9:5AAAACACGTACGCCGTCT3プローブ配列番号10:5FAMGTGGGTTTGTAGTTGGTAGGAGGGTTBHQ3<MSP3>センスプライマー配列番号11:5GGGGTTATAGTCGTGGAGC3アンチセンスプライマー配列番号12:5GTCTCAACACGACCCCG3プローブ配列番号13:5FAMGTGGGTTTGTAGTTGGTAGGAGGGTTBHQ3<MSP4>センスプライマー配列番号14:5GTGTTTTGTTTCGAGTTAGGATTTC3アンチセンスプライマー配列番号15:5GAAAAATCTAACGACCAAACCG3プローブ配列番号16:5FAMTTTCGAGTTACGATTTCGTGGAGGBHQ3<MSP5>センスプライマー配列番号17:5TAGATTTTTTGTTGTTTCGC3アンチセンスプライマー配列番号18:5TCTAAACGACGACCTAAACA3プローブ配列番号19:5FAMAAGAGAAATGGGATGGGGATTTTGBHQ3<RPPH1>センスプライマー配列番号20:5AATGAGGTGTAGAAGGTTGATGGT3アンチセンスプライマー配列番号21:5CATAATTAAATCACTTCCCACCAAA3プローブ:UniversalProbeLibrary10Rochediagnostics社製<ALU>センスプライマー配列番号22:5GCGCGGTGGTTTACGTTT3アンチセンスプライマー配列番号23:5AACCGAACTAATCTCGAACTCCTAAC3プローブ配列番号24:56FAMAAATAATCCGCCCGCCTCGACCTBHQ35.再発無再発診断能の評価MSP5に対する相対値としてMSP1~4について求めたABCB6遺伝子領域のメチル化率を用いて解析した。非癌部においてはABCB6mRNA発現とメチル化率との相関は見られなかったが、癌部においてはmRNA発現とメチル化率との間に逆相関関係が見られた図4。また、再発の有無に基づいて、ReceiveroperatingcharacteristicROC曲線におけるAreaUndertheCurveAUCを用いて比較した図5~10。感度特異度はROC曲線において最区分点の最大値での値を示した。C型肝炎ウイルスキャリア由来の1年以内再発有り肝臓組織の癌部においてはメチル化率が高いことが明らかとなった。さらに、該CpGアイランドのメチル化率は、C型肝炎ウイルスキャリア由来の1年以内再発無し肝臓組織の非癌部においては低いこと、B型肝炎ウイルスキャリア由来の肝臓組織においては癌部及び非癌部のいずれのメチル化率も、1年以内再発の有無との関連が認められないことが示された。次に、RPPH1に対する相対値としてMSP5について求めたABCB6遺伝子領域のメチル化率を用いて解析した結果を図11、12に示す。癌の2年以内の再発については、全体及びC型肝炎ウイルスキャリアの群で非癌部の肝臓組織におけるABCB6遺伝子領域のメチル化率に有意差が認められた。また、非癌部の肝臓組織におけるABCB6遺伝子領域のメチル化率からReceiveroperatingcharacteristicROC曲線を作成して再発予測性能を評価した結果により、C型肝炎ウイルスキャリアの群で癌の2年以内の再発予測精度が高いことが示された図13。さらに、癌患者から採取した肝臓組織におけるABCB6遺伝子mRNA発現量をABCB6遺伝子転写制御領域のDNAメチル化率で除した値を用いてReceiveroperatingcharacteristicROC曲線を作成して再発予測性能を評価した図14。ABCB6遺伝子mRNA発現量とABCB6遺伝子転写制御領域のDNAメチル化率を組合せてマーカーとすると、C型肝炎ウイルスキャリアの群で、癌の1年以内及び2年以内の高い再発予測精度を得られることが示された。6.癌の診断マーカーとしての性能の解析癌患者から採取した癌部及び非癌部の肝臓組織において、ALU配列に対する相対値としてMSP5について求めたABCB6遺伝子転写制御領域のDNAメチル化率は、C型肝炎ウイルスキャリアの有無に係らず癌部において高いことが示された図15。また、ReceiveroperatingcharacteristicROC曲線を作成して診断マーカーとしての性能を評価した結果、ALU配列に対する相対値としてMSP5について求めたABCB6遺伝子転写制御領域のDNAメチル化率は、C型肝炎ウイルスキャリアの有無に係らず、高性能に診断マーカーとして用いることができることが示された図16。