"単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下:a配列番号1、5、9、11、13、もしくは15、またはそれらの相補的配列を含む、単離された核酸分子;b高度にストリンジェンシーの条件下でaの核酸分子と特異的にハイブリダイズする、単離された核酸分子;およびcaまたはbによるTGF-β結合タンパク質をコードする、単離された核酸、からなる群より選択される、単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号2のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号6のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号10のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号12のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号14のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。前記核酸分子が、配列番号16のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離された核酸分子。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む、発現ベクター。前記プロモーターが、CMVI-Eプロモーター、SV40初期プロモーターおよびMuLVLTRからなる群より選択される、請求項8に記載の発現ベクター。前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項8に記載の発現ベクター。TGF-β結合タンパク質を産生する方法であって、該方法は、請求項8に記載のベクターを含む細胞を、該タンパク質を産生するために十分な条件下および時間にわたって培養する工程を包含する、方法。前記タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子の発現を指向し得る、ウイルスベクター。前記ベクターが、単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項13に記載のウイルスベクター。請求項8~14のいずれか一項に記載のベクターを保有する、宿主細胞。前記宿主細胞が、ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞およびマウス細胞からなる群より選択される、請求項15に記載の宿主細胞。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるTGF-β結合タンパク質を含む、単離されたタンパク質。請求項17に記載のタンパク質と特異的に結合する、抗体。前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項18に記載の抗体。前記モノクローナル抗体がマウス抗体またはヒト抗体である、請求項19に記載の抗体。前記抗体がFab’2、Fab2、Fab’、FabおよびFvからなる群より選択される、請求項18に記載の抗体。請求項19に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。融合タンパク質であって、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるTGF-β結合タンパク質を含む第一のポリペプチドセグメント、または少なくとも10アミノ酸長の該ポリペプチドセグメントの部分、および非TGF-β結合タンパク質を含む第二のポリペプチドセグメントを包含する、融合タンパク質。前記第一のポリペプチドセグメントが、少なくとも20アミノ酸長である、請求項23に記載の融合タンパク質。前記第一のポリペプチドセグメントが、少なくとも50アミノ酸長である、請求項23に記載の融合タンパク質。前記第二のポリペプチドセグメントが、複数のアニオン性アミノ酸残基を含む、請求項23に記載の融合タンパク質。配列番号1、3、5、7、9、11、13、もしくは15に記載の核酸分子、またはその相補体と高度にストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、単離されたオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド長である、請求項27に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも30ヌクレオチド長である、請求項27に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも50ヌクレオチド長である、請求項27に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが、50と100との間のヌクレオチド長である、請求項27に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子の全てまたは一部を特異的に増幅する、プライマー対。請求項17に記載のタンパク質をコードするRNAを切断する、リボザイム。前記タンパク質が配列番号2のタンパク質を含む、請求項33に記載のリボザイム。前記タンパク質が配列番号6のタンパク質を含む、請求項33に記載のリボザイム。前記RNAが配列番号10のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項33に記載のリボザイム。前記RNAが配列番号12のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項33に記載のリボザイム。前記RNAが配列番号14のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項33に記載のリボザイム。前記RNAが配列番号16のタンパク質を含むタンパク質をコードする、請求項33に記載のリボザイム。前記リボザイムがリボ核酸からなる、請求項33に記載のリボザイム。1つ以上の前記リボ核酸が2’-O-メチルリボ核酸である、請求項40に記載のリボザイム。前記リボザイムが、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の混合物からなる、請求項33に記載のリボザイム。前記リボザイムが、ホスホチオエート結合を有する核酸からなる、請求項33に記載のリボザイム。請求項33に記載のリボザイムをコードする核酸配列を含む、核酸分子。前記核酸がDNAまたはcDNAである、請求項44に記載の核酸分子。前記核酸を転写するプロモーターの制御下にある、請求項44に記載の核酸分子。請求項33のリボザイムを含む、宿主細胞。請求項44に記載の核酸分子を含む、ベクター。前記ベクターが、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾンまたはコスミドである、請求項48に記載のベクター。前記ウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスからなる群より選択される、請求項49に記載のベクター。請求項48~50のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。前記宿主細胞が、前記ベクターを用いて安定的に形質転換される、請求項51に記載の宿主細胞。前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項51に記載の宿主細胞。プロモーターの転写制御下で請求項33に記載のリボザイムをコードするDNAを提供する工程、および該リボザイムを産生するために該DNAを転写する工程を包含する、リボザイムを産生するための、方法。前記リボザイムがインビトロで産生される、請求項54に記載の方法。前記リボザイムを精製する工程をさらに包含する、請求項54に記載の方法。請求項33~43のいずれか一項に記載の有効量のリボザイムを、温血動物に導入する工程を包含する、骨鉱化作用を増加するための、方法。請求項44に記載の有効量の核酸分子を、リボザイムを産生するための該核酸分子の転写を支持する条件下で、患者に導入する工程を包含する、骨鉱化作用を増加するための、方法。請求項33~43のいずれか一項に記載のリボザイム、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子の全てまたは一部を特異的に増幅し得る、プライマー対。請求項27~31のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを、高度にストリンジェンシーの条件下でインキュベートする工程、および該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する、TGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を検出するための、方法。前記オリゴヌクレオチドが標識される、請求項61に記載の方法。前記オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合される、請求項61に記載の方法。TGF-β結合タンパク質を検出するための方法であって、該方法は、請求項18~21のいずれか一項に記載の抗体を、該抗体がTGF-β結合タンパク質と結合し得るために十分な条件下および時間にわたってインキュベートする工程、および該結合を検出する工程を包含する、方法。前記抗体が固体支持体に結合される、請求項64に記載の方法。前記抗体が標識される、請求項64に記載の方法。前記抗体が、酵素、蛍光タンパク質、および放射性同位体からなる群より選択されるマーカーを用いて標識される、請求項66に記載の方法。トランスジェニック動物であって、該動物の生殖細胞および体細胞は、前記遺伝子の発現に効果的なプロモーターに作動可能に連結される、請求項1に記載のTGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を含み、該遺伝子は、胚性段階において、該動物、または該動物の祖先に導入されており、ただし、該動物はヒトではない、トランスジェニック動物。TGF-β結合タンパク質が、請求項8~10のいずれか一項に記載のベクターから発現される、請求項68に記載のトランスジェニック動物。トランスジェニックノックアウト動物であって、該動物の生殖細胞および体細胞が、請求項1に記載の核酸分子とハイブリダイズする内因性の核酸分子の少なくとも1つの対立遺伝子の破壊を含む動物を包み、該破壊が、該破壊を伴わない動物と比較して、該対立遺伝子からのメッセンジャーRNAの転写を防ぎ、ただし、該動物がヒトではない、トランスジェニックノックアウト動物。前記破壊が核酸欠失、核酸置換、または核酸挿入である、請求項70に記載のトランスジェニック動物。前記動物がマウス、ラットおよびイヌからなる群より選択される、請求項68または70に記載のトランスジェニック動物。候補分子が、骨鉱物量を増加し得るか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下:a1つ以上の候補分子を、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるTGF-β結合タンパク質およびTGF-βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーと混合する工程;b該候補分子が、該TGF-βファミリーメンバーのシグナル伝達を変化するか否か、また該TGF-β結合タンパク質の該TGF-βファミリーメンバーとの結合を変化するか否かを決定する工程を包含する、方法。前記TGF-βファミリーのタンパク質のメンバーがBMP6である、請求項73に記載の方法。候補分子が、骨鉱物量を増加し得るか否かを決定する方法であって、該方法は、候補分子がTGF-β結合タンパク質の骨、またはそのアナログとの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する、方法。前記骨のアナログがヒドロキシアパタイトである、請求項75に記載の方法。TGF-β結合タンパク質遺伝子発現の検出のためのキットであって、該キットは、核酸分子を含む容器を備え、ここで、該核酸分子が、a配列番号1、5、7、9、11、13、または15のヌクレオチド配列を含む核酸分子;baのヌクレオチド配列の相補体を含む核酸分子;c少なくとも20ヌクレオチド長のaまたはbのフラグメントである核酸分子、からなる群より選択される、キット。請求項18~21のいずれか一項に記載の抗体を含む容器を備える、TGF-β結合タンパク質の検出のための、キット。アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、もしくは15に記載の核酸分子、またはその相補体とハイブリダイズする核酸分子を含み、ここで、該オリゴヌクレオチドが、請求項17に記載のTGF-β結合タンパク質の発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが15ヌクレオチド長である、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが20ヌクレオチド長である、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが50ヌクレオチド長である、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが1つ以上の核酸アナログからなる、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが1つ以上のリボ核酸からなる、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドが1つ以上のデオキシリボ核酸からなる、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチド配列が1つ以上の修飾された共有結合を含む、請求項79に記載のオリゴヌクレオチド。前記修飾された共有結合が、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチレンメチルイミノ結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合および複素環式糖間結合、からなる群より選択される、請求項86に記載のオリゴヌクレオチド。現状では行われない治療計画としては、新しい骨質量の成長を刺激するかまたは増強する薬物が挙げられる。本発明は、骨鉱化作用を増大させ、るために利用され得、従って、骨質量を増大させるが望ましい広範な種々の状態を処置するために利用され得る、組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、他の、関連する利点を提供する。発明の要旨上述のように、本発明は、TGF-β結合タンパク質の新規のクラスまたはファミリー、ならびに骨鉱物量および骨鉱物密度量を増大させる化合物を選択するためのアッセイ、骨鉱物量および骨鉱物密度量を増大させる化合物ならびに広範な種々の状態の処置または予防においてこのような化合物を利用するための方法を提供する。本発明の1つの局面において、単離された核酸分子が提供され、ここで上記核酸分子は、以下:a配列番号1、5、7、9、11、13、または15を含む単離された核酸分子またはその相補的な配列;b高度にストリンジェンシーな条件下でaの核酸分子へ特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子;およびcaまたはbに従うTGF‐β結合タンパク質をコードする単離された核酸分子、から成る群より選択される。本発明の関連した局面において、単離された核酸分子は、上記の同定された配列の1つの一部のみへのハイブリダイゼーションに基づいて提供される例えば、aに関しては、ハイブリダイゼーションは、配列番号1のヌクレオチド、156~539、または555~687より選択される少なくとも20、25、50、または100のヌクレオチドのプローブに対するものであり得る。。容易に明らかなように、ハイブリダイゼーションに利用される必要なストリンジェンシーは、プローブの大きさに基づいて変化し得る。例えば、25マーのプローブについて高度にストリンジェンシーな条件としては以下が挙げられる:60mMTrispH8.0.2mMEDTA、5×デンハート液Denhardt’、6×SSC、0.1w/vN-ラウリルサルコシン、0.5w/vNP-40ノニデットnonidetp-40を45°Cにて一晩、続いて0.2×SSC/0.1SDSを用いての45~50°Cでの2回の洗浄。低度にストリンジェンシーな条件下の100マーのプローブについては、適切な条件としては、以下が挙げられ得る:5×SSPE、5×デンハート液、および0.5SDSで42~50°C一晩、続いて、2×SSPEまたは2×SSC/0.1SDSを用いる、42~50°Cでの2回の洗浄。本発明の関連した局面において、配列番号1、5、7、9、11、13または15に対して、Wilbur-Lipmanアルゴリズムを利用する相同性の50レベル、60レベル、75レベル、80レベル、90レベル、95レベル、または98レベルで、相同性を有する単離された核酸分子が、提供される。例えば、このような単離された分子の代表的例としては、配列番号2、6、10、12、14、または16を含むタンパク質をコードする核酸分子、あるいはLipman-Pearsonアルゴリズムを利用する相同性の50レベル、60レベル、75レベル、80レベル、90レベル、95レベル、または98レベルのレベルで、これらの配列に対する相同性を有する核酸分子が挙げられる。単離された核酸分子は、代表的に100kb未満の大きさであり、そして特定の実施形態において、50kb未満、25kb未満、10kb未満、またはさらに5kb未満の大きさである。さらに、他の実施形態において、単離された核酸分子は、他の無関係な核酸分子のライブラリーlibrary例えば、GenBank登録番号AC003098およびEMB番号AQ171546において記載されるようなサブクローンBACにおいて存在しない。しかし、単離された核酸分子は、関連した分子のライブラリーにおいて見出され得る例えば、米国特許第5,837,458号;同第5,830,721号;および同第5,811,238号に記載されるようなシャッフリングに関して。最後に、本明細書中に記載される単離された核酸分子は、Dan、Cerberus、Gremlin、またはSCGFをコードする核酸分子米国特許第5,780,263号を含まない。上述の核酸分子を含むクローニングベクターおよび上述の核酸分子の1つに作動可能にに連結されたプロモーター例えば、制御配列を含む発現ベクターもまた、本発明によって提供される。適切なプロモーターの代表例としては、組織特異的プロモーター、およびウイルスベースのプロモーター例えば、CMVI-E、SV40初期プロモーターおよびMuLVLTRのようなCMVベースのプロモーターが挙げられる。発現ベクターはまた、ウイルスに基づくか、または由来であり得る例えば、ウイルスベクター。ウイルスベクターの代表的な例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。上述のベクターのいずれかを含むか、または含有する宿主細胞例えば、ヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウス起源の宿主細胞を含むもまた、提供される。本発明の他の局面において、TGF-β結合タンパク質を産生する方法が、提供され、この方法は、TGF-β結合タンパク質を産生するのに十分な条件下または時間でベクターを含む上述の宿主細胞を培養する工程を包含する。さらなる実施形態において、この方法によって産生されるタンパク質は、例えば、カラムクロマトグラフィー、アフィニティー精製などによりさらに生成され得る。それ故、上述の核酸分子例えば、配列番号2,4,6,8,10,12,14,または16によってコードされる単離されたタンパク質は、本出願の開示を考えれば、容易に産生され得る。上記のタンパク質、またはそれらのフラグメントが、融合タンパク質として産出され得る、ということもまた留意されるべきである。例えば,一つの局面において、第一のポリぺプチドセグメント上記の核酸分子によりコードされるTGF-β結合タンパク質を含む、または少なくとも10、20、30、50、もしくは100アミノ酸長である第一のポリぺプチドセグメントの一部、および第二のポリぺプチドセグメント非-TGF-β結合タンパク質を含むを含む融合タンパク質が、提供される。特定の実施形態では、この第二のポリぺプチドは、精製または認識に適したタグ例えば、多重アニオン性アミノ酸残基を含むポリぺプチド米国特許第4,851,341号を参照のこと、マーカー例えば、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼ、または毒性分子例えば、リシン、であり得る。本発明の別の局面では、上記のクラスのTGF-β結合タンパク質例えば、ヒトBEERに特異的に結合し得る抗体が、提供される。種々の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体例えば、ヒトまたはマウス起源であり得る。さらなる実施形態では、抗体は抗体全体の結合特性を保持する抗体のフラグメントである例えば、Fab’2、Fab2、Fab’、Fab、またはFvフラグメント、もしくはCDRさえも。また上記の抗体を産生または発現する能力がある、ハイブリドーマおよびその他の細胞も提供される。本発明の関連する局面では、TGF-β結合タンパク質を検出する方法が提供され、そしてこの方法は、上記の抗体を、この抗体がTGF-β結合タンパク質に結合することを可能にするために十分な条件下および時間でインキュベートする工程、および結合を検出する工程、を包含する。種々の実施形態では、抗体は、洗浄または分離を容易にするために固体支持体に結合され得、そして/または標識され得る例えば、酵素、蛍光性タンパク質、および放射性同位体からなる群から選択されるマーカーを用いて。本発明のその他の局面では、単離されたオリゴヌクレオチドが提供され、このオリゴヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、もしくは18による核酸分子、またはそれらの補体に、高ストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする。さらなる実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、または16をコードする配列において見出され得る。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも15、20、30、50、または100ヌクレオチド長である。さらなる実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、別の分子例えば、酵素、蛍光性分子、または放射性同位体で標識される。また、TGF-β結合タンパク質をコードする上記の核酸分子の全てまたは一部を特異的に増幅し得るプライマーが提供される。本明細書中で使用される場合、用語特異的に増幅するとは、上記のTGF-β結合タンパク質を増幅するプライマーのことをいうと理解されるべきであり、他のTGF-β結合タンパク質例えばDan、Cerberus、GremlinまたはSCGF米国特許第5,780.263号のようなを増幅するプライマーではない。本発明の関連する局面では、TGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を検出するための方法が提供され、この方法は、上記のオリゴヌクレオチドを高ストリンジェントな条件下でインキュベートする工程、およびこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。特定の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、標識され得、そして/または固体支持体に結合し得る。本発明のその他の局面では、上記のTGF-β結合タンパク質の一つをコードするRNA例えば、配列番号2、6,8,10,12、14、または16を切断し得るリボザイムが提供される。このようなリボザイムは、DNA、RNA2’-O-メチル-リボ核酸を含む、核酸アナログ例えば、ホスホロチオエート結合を有する核酸またはそれらの混合物からなり得る。これらのリボザイムをコードする核酸分子例えば、DNAまたはcDNAおよびそのリボザイムを発現または産生し得るベクターもまた提供される。ベクターの代表的な例としては、プラスミド、レトロトランスポゾン、コスミド、およびウイルスベースのベクター例えば、少なくとも部分的にレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ関連ウイルスから生成されるウイルスベクター、が挙げられる。また、これらのベクターを含む宿主細胞例えば、ヒト、イヌ、ラット、またはマウス細胞も提供される。特定の実施形態では、この宿主細胞は、ベクターで安定に形質転換され得る。本発明のさらなる局面において、リボザイムを、合成的にか、またはインビトロもしくはインビボの転写によるいずれかで産生するための方法が提供される。さらなる実施形態において、こうして産生されたリボザイムは、さらに精製され得、そして/または薬学的組成物例えば、薬学的に受容可能なキャリアーまたは希釈剤を伴う、リボザイムまたはリボザイムをコードする核酸分子に処方され得る。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体または本明細書中に記載されたその他の選択された分子は、薬学的組成物に処方され得る。本発明の他の局面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、もしくは15に従う核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、またはそれに対する補体を含んで提供され、そして上記オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載するようなTGF-β結合タンパク質例えば、ヒトBEERの発現を阻害する。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチド長である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは100、75、または60ヌクレオチド長未満である。容易に明白であるように、オリゴヌクレオチドは1つ以上の核酸アナログ、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸から構成され得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の結合例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、メチレンメチルイミノ結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間intersuger結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合、および複素環式糖間結合のような共有結合を含む、により改変され得る。キメラオリゴヌクレオチドの1つの代表的な例が、米国特許第5,989,912号において提供される。本発明のさらに別の局面において、骨鉱化作用を増加させるための方法が提供され、その方法は、上述のような有効量のリボザイムを温血性動物に導入する工程を包含する。関連する局面において、このような方法は、本明細書中に記載のような有効量の核酸分子またはベクターを患者内に導入する工程を包含し、その核酸分子またはベクターは、所望のリボザイムを、リボザイムを産生するための核酸分子の転写に好ましい条件下で産生することが可能である。本発明の他の局面において、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。1つの実施形態において、動物はヒトではないという条件で、トランスジェニック動物が提供され、その生殖細胞および体細胞は、遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結される上述のようなTGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を含み、その遺伝子は、動物、またはその動物の祖先に、胚段階で、導入される。他の実施形態において、動物はヒトではないという条件で、トランスジェニックノックアウト動物が提供され、その生殖細胞および体細胞が、核酸分子本明細書中に記載するようにTGF結合タンパク質をコードするにハイブリダイズする内因性核酸分子の少なくとも1つの対立遺伝子の破壊を含む動物を含み、ここでその破壊は、破壊のない動物と比較して、上記対立遺伝子からのメッセンジャーRNAの転写を防止する。種々な実施形態において、破壊は核酸の欠失、置換または挿入である。他の実施形態において、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、またはイヌである。本発明のさらなる局面において、TGF-β結合タンパク質遺伝子発現の検出のために、キットが提供され、そのキットには核酸分子を含むコンテナを含む。ここで、その核酸分子は以下からなる群から選択される:a配列番号1、3、5、7、9、11、13、または15のヌクレオチド配列を含む核酸分子;baのヌクレオチド配列の補体を含む核酸分子;c少なくとも15、20、30、50、75、または100ヌクレオチド長のaまたはbのフラグメントである核酸分子。また、TGF-β結合-タンパク質の検出のためのキットが提供され、そのキットには、本明細書中に記載される1つのTGF-β結合タンパク質抗体を含むコンテナを含む。例えば、本発明の1つの局面において、選択された分子が骨鉱物含有量を増加させることが可能か否かを決定するための方法が提供され、その方法はa1つ以上の候補分子を、請求項1に記載の核酸分子によりコードされたTGF-β-結合-タンパク質、およびTGF-βファミリーのタンパク質の選択されたメンバー例えば、BMP5または6と混合する工程、bその候補分子が、TGF-βファミリーメンバーのシグナル伝達を変えるか否か、またはTGF-β結合-タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を変えるか否かを決定する工程を包含する。特定の実施形態において、その分子は、間葉細胞分化の正の調節因子として機能するようにTGF-βの能力を変える。本発明のこの局面において、候補分子は、シグナル伝達もしくは結合を減少させる例えば、阻害するか、または増加させる例えば、高めることにより、シグナル伝達、もしくは結合を変え得る。さらに別の局面において、選択された分子が骨鉱物含有量を増加させることが可能であるか否かを決定するための方法が提供され、その方法は、選択された分子が、TGF-β結合-タンパク質の、骨またはそのアナログへの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。骨またはそのアナログの代表的な例は、ヒドロキシアパタイトおよび生検から得られた主要な人骨のサンプルを含む。上述に列挙された方法の特定の実施形態において、選択された分子は分子の混合物中に含まれ、そしてその方法はさらに、アッセイにおいて機能的な1つ以上の分子を単離する工程を包含し得る。さらに他の実施形態においては、TGF-βファミリーのタンパク質が固体支持体に結合され、そしてそのTGF-β結合タンパク質の結合が測定されるか、またはTGF-β結合タンパク質が固体支持体に結合され、そしてTGF-βタンパク質の結合が測定される。上記のような方法を利用して、広範に種々の分子が、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーのタンパク質への結合を阻害することにより骨鉱物含有量を増加させるその能力についてアッセイされ得る。このような分子の代表的な例は、タンパク質またはペプチド、有機分子、および核酸分子を含む。本発明の他の関連する局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、治療的に有効な量の本明細書中に列挙されるアッセイにより同定される分子を、温血動物に投与する工程を包含する。別の局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、治療的に有効な量の、TGF-β結合タンパク質のTGF-βスーパーファミリータンパク質骨形態形成タンパク質BMPを含むへの結合を阻害する分子を、温血動物に投与する工程を包含する。適切な分子の代表的な例としては、アンチセンス分子、リボザイム、リボザイム遺伝子、および抗体例えば、ヒト化抗体が挙げられ、これらは、TGF-β結合タンパク質の活性を特異的に認識し、そして変化させる。本発明の別の局面においては、温血動物の骨鉱物含量を増加させるための方法が提供され、その方法は、a骨に移動するhometo細胞に、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリータンパク質および骨形態形成タンパク質BMPへの結合を阻害する分子の発現を指向するベクターを導入する工程、およびbこのベクター含有細胞を温血動物に投与する工程、を包含する。本明細書中で利用される場合、末梢の投与の後、細胞が骨マトリックス中に局在化する場合に、細胞は骨に移動するhometoboneことが理解されるべきである。1つの実施形態においては、このような方法は、導入する工程の前に、骨に移動する骨の骨髄から細胞を単離する工程をさらに包含する。さらなる実施形態においては、骨に移動する細胞は、CD34細胞および骨芽細胞からなる群から選択される。本発明の他の局面においては、TGF-β結合タンパク質のTGF-βスーパーファミリータンパク質への結合を阻害する分子が提供される好ましくは単離される。さらなる実施形態においては、この分子は、組成物として提供され得、そして骨吸収のインヒビターをさらに含み得る。このようなインヒビターの代表的な例としては、カルシトニン、エストロゲン、ビスホスホネート、抗吸収活性を有する成長因子およびタモキシフェンが挙げられる。上記の治療的状況において利用され得る分子の代表的な例としては、例えば、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンス分子、および/または抗体例えば、ヒト化抗体が挙げられる。このような分子は、本明細書中に記載されるようなTGF-β結合タンパク質ファミリーメンバーのシグナル伝達または結合を、変化させるため、アンタゴナイズするため、またはアゴナイズするために使用される、これらの選択に依存し得る。本発明の種々の実施形態においては、上記の分子および処置方法または予防方法は、骨粗鬆症、骨軟化症、歯周病、壊血病、クッシング病、骨折などの状態ならびに四肢不動化およびステロイドの使用に起因する状態において利用され得る。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面の参照により明らかになる。さらに、特定の手順または構成物例えば、プラスミドなどをより詳細に記述する種々の参考文献が本明細書中に記載され、そして従って、それらは、その全体が参考として援用される。実施例1ヒト第17染色体のロングアームに対する硬化狭窄症マップヒトの硬化狭窄症に対して重大な欠失の遺伝マッピングは、新規なTGF-β結合タンパク質ファミリーメンバーをコードするヒト第17染色体の領域に、この障害に対して重大な遺伝子を局在化した。硬化狭窄症において、骨格骨は、非羅患の個体の鉱物密度に対して鉱物密度の実質的増加を示す。頭部の骨は同様に過成長を示す。硬化狭窄症患者は、一般に健康であるが、それらは生まれつき合指の可変度および頭蓋骨の頭蓋圧縮および神経圧縮の可変度を示し得る。硬化狭窄症と関連した遺伝子欠失の連結分析は、疾患が生じる24の南アフリカAfrikaanerファミリーから収集されたDNAサンプルに同型接合性マッピング法を適用することによって行われた。Sheffieldら、1994、HumanMolecularGenetics3:1331-1335.IdentificationofaBardet-Biedlsyndromelocusonchromosome3andevaluationofanefficientapproachtohomozygositymappinng。南アフリカのAfrikaaner集団は、遺伝的に同種である;この集団は数世紀前にその領域に植民した少数の先祖の子孫であり、そしてそれはその創始以来、地理的および社会的障害によって孤立されてきた。硬化狭窄症は、Afrikaaner群集の外側のどの世界においても稀であり、このことは遺伝子の変異がこの先祖集団に存在し、この集団の増加と共に数が増加したことを示唆する。同型接合性マッピングの使用は、劣性変異に隣接したDNAマッピングマーカーが血族ファミリーおよび孤立された集団由来の影響された個体において同型接合性であり得るという仮説に基づく。常染色体由来の371マイクロサテライトマーカーのセットResearchGenetics,Set6を、硬化狭窄症の患者サンプル由来のDNAのプールを分類するために選択した。この分析のためのDNAサンプルは、24ファミリー中の29名の硬化狭窄症患者、59の羅患していないファミリーメンバー、および同一の集団由来の無関係のコントロール個体のセットに由来する。プールは、4~6個の個体羅患した個体、血縁家族、親および羅患していない兄弟由来の羅患した個体、または無関係のコントロールのいずれかから構成される。無関係の個体のプール、および羅患した個体またはファミリーメンバーを含むプールのほとんどにおいて、マーカーの分析は、いくつかの対立遺伝子は各マーカーの大きさに合わせて分けられることを示した。1つのマーカー、D17S1299は、ホモ接合性の指標、すなわち羅患した個体のいくつかのプールにおける1つのバンドを示した。24個全ての硬化狭窄症ファミリーを、D17S1299の領域17q12-q21において全部で19のマーカーで分類した。全てのファミリー由来の羅患個体は、この領域においてホモ接合性であり、そして29個の個体のうち25個体はコアハプロタイプについてホモ接合性であり;それらは、各々、D17S1787とD17S930との間に同一の対立遺伝子を有することを示した。他の4個体は、このハプロタイプに適合した1つの染色体、およびこのハプロタイプに適合していない第2の染色体を有した。つまり、このデータは、この3メガベース領域は硬化狭窄変異を含むことを示唆した。この3メガベース領域におけるほとんどのエキソンの配列分析は、新規のTGF-データ結合タンパク質コード配列におけるナンセンス変異を同定した配列番号1の位置117におけるC>T変異は、終止コドンを生じる。この変異は、硬化狭窄症患者およびアフリカーナーのキャリアに独特であることが示された。この遺伝子の同一性は、そのイントロンにおける変異そのイントロンの位置3におけるA>T変異を同定することによってさらに確認され、この変異は、硬化狭窄症と診断された一人の無関係の患者において、不適切なmRNAプロセシングを生じた。実施例2TGFβ結合タンパク質遺伝子発現の組織特異性A.RT-PCRによるヒトBeer遺伝子の発現第1鎖cDNAを、市販のキットSuperscriptPreamplificationSystemforFirst-StrandcDNASynthesis、LifeTechnologies,Rockville,MDを使用して、以下の全RNAサンプルから調製した:ヒト脳、ヒト肝臓、ヒト脾臓、ヒト胸腺、ヒト胎盤、ヒト骨格筋、ヒト甲状腺、ヒト下垂体、ヒト骨芽細胞CloneticsCorp.,SanDiego,CA製のNHOst、ヒト骨肉腫細胞株Saos-2,ATCCHTB-85、ヒト骨、ヒト骨髄、ヒト軟骨、ベルベットモンキー骨、Saccharomycescerevisiae、およびヒト末梢血単核細胞。全てのRNAサンプルは、社内で調製した以下のものを除いて、市販の供給源Clontech,PaloAlto,CAから購入した:ヒト骨芽細胞、ヒト骨肉腫細胞株、ヒト骨、ヒト軟骨およびベルベットモンキー骨。これらの社内RNAサンプルは、市販のキットTRI試薬、MolecularResearchCenter,Inc.,Cincinnati,OHを使用して調製した。これらのサンプル、およびさらにコントロールとしてヒトゲノムサンプルを用いて、PCRを行った。センスBeerオリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3’配列番号19を有した。アンチセンスBeerオリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’-GCACTGGCCGGAGCACACC-3’配列番号20を有した。さらに、ヒトβ-アクチン遺伝子についてのプライマーをコントロールとして使用して、PCRを行った。センスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3’配列番号21を有した。アンチセンスβ-アクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、配列5’-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3’配列番号22を有した。25μl反応物において、61°Cのアニーリング温度の標準的な条件を使用して、PCRを行った。Beerプライマーを用いて32サイクルのPCRを行い、そしてβ-アクチンプライマーを用いて24サイクルを行った。増幅した後、各反応物の12μlを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって、分析した。図2Aを参照のこと。B.マウス胚切片のRNAインサイチュハイブリダイゼーション全長マウスBeercDNA配列番号11を、製造業者のプロトコルを使用して、アンチセンスおよびセンス方向で、pCR2.1ベクターInvitrogen,Carlsbad,CAにクローン化した。35S-α-GTP-標識cRNAセンスおよびアンチセンス転写物を、Ambion,IncAustin,TXにより供給されるインビトロ転写試薬を使用して合成した。LyonsらJ.CellBiol.111:2427~2436,1990のプロトコルに従って、インサイチュハイブリダイザーションを行った。マウスBeercRNAプローブは、発生中のマウス胚の神経管、肢芽、血管および骨化軟骨において発現した特異的なメッセージを検出した。図3のパネルAは、肢芽l、血管bvおよび神経管ntの外胚葉隆線aerにおける発現を示す。パネルBは、下顎骨ma、頸椎cv、後頭骨oc、口蓋paおよび血管bvにおける発現を示す。パネルDは、肋骨rおよび心臓弁vaにおける発現を示す。パネルAは、10.5dpcの胚の横断面である。パネルBは、12.5dpcの胚の矢状切片であり、そしてパネルCおよびDは、15.5dpcの胚の矢状切片である。ba=鰓弓、h=心臓、te=終脳前脳、b=脳、f=前頭鼻骨塊、g=腸、h=心臓、j=顎、li=肝臓、lu=肺、ot=耳胞、ao=、sc=脊髄、skm=骨格筋、ns=鼻洞、th=胸腺、to=舌、fl=前肢、di=横隔膜。実施例3組換えBEERタンパク質の発現および精製A.COS-1細胞中での発現:全長ヒトBeerタンパク質をコードするDNA配列を、以下のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した:5’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列を有し、HindIII制限酵素部位ボールドを含み、推定アミノ末端開始コドンATGの前の6塩基対で開始する19ヌクレオチドのBeer遺伝子が続く。3’オリゴヌクレオチドプライマーは、配列を有し、HindIII制限酵素部位ボールドを含み、逆相補性停止コドンCTAが続き、Beerのカルボキシ末端5アミノ酸をコードするヌクレオチドの逆相補性によって隣接されるFLAGエピトープの逆相補性下線、Sigma-AldrichCo.,StLouis,MOが続く。PCR産物を、TAクローニングしOriginalTACloningKit、Invittrogen,Carlsbad,CA、個々のクローンをDNA配列決定によってスクリーニングした。次いで、配列確定クローンを、HindIIIによって消化し、市販の試薬QIAquickGelExtractionKit、QiagenInc.,Valencia,CAを使用して1.5アガロースゲルで精製した。次いで、このフラグメントを、T4DNAリガーゼを有する、HindIII消化され、ホスファターゼ処理されたpcDNA3.1Invitrogen,Carlsbad,CAプラスミドに連結した。DH10BE.coliを、形質転換し、LB、100μg/mlアンピシリンプレート上にプレートした。適切な配向の所望の組換え体を有するコロニーを、pcDNA3.1のT7プロモーター/プライミング部位に対応する5’プライマーおよび内部BEER配列の逆相補体に対応する配列5’-GCACTGGCCGGAGCACACC-3’配列番号25を有する3プライマーを使用するPCRベースのスクリーニングによって同定した。クローニングされたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認した。COS-1細胞ATCC番号CRL-1650をトランスフェクションのために使用した。50μgの発現プラスミドpcDNA-Beer-Flagを、製造業者によって提供されるプロトコールに従って市販のキットDEAE-DextranTransfectionKit、SigmaChemicalCo.,St.Louis,MOを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションに続く最終培地は、0.1ウシ胎仔血清を含むDMEMLifeTechnologies,Rockville,MDであった。培養の4日後、培地を除去した。組換えBEERの発現は、抗FLAGM2モノクローナル抗体Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MOを使用して、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析した。組換えBEERタンパク質の精製を、抗FLAGM2アフィニティーカラムMammalianTransientExpressionSystem,Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MOを使用して実施した。カラムプロフィールを、抗FLAGM2モノクローナル抗体を使用してSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析した。B.SF9昆虫細胞での発現:ヒトBeer遺伝子配列を、標準的な条件下で以下のプライマーを使用してPCRを用いて増幅した:得られたcDNAは、2つの改変を有するBeerのコード領域を含んだ。N末端分泌シグナルを除去し、そしてFLAGエピトープタグSigmaを挿入物のC末端へインフレームで融合した。BamH1およびHindIIIクローニング部位を付加し、この遺伝子を、標準的な方法を使用して、バキュロウイルス発現ベクターに移すためにpMelBacベクターInvitrongenにサブクローニングした。組換えバキュロウイルス発現Beerタンパク質を、Bac-N-BlueトランスフェクションキットInvitrogenを使用して行い、製造業者に指示に従って精製した。SF9細胞Invitogenを、10ウシ胎仔血清を含むTNFFH培地Invitogenで維持した。タンパク質発現について、スピナーspinnerフラスコ中のSF9培養物を、10より大きいMOIで感染させた。培地および細胞のサンプルを、5日間毎日取り、そしてBeer発現を抗FlAGM2モノクローナル抗体Sigmaまたは抗Beerウサギポリクローナル抗血清を使用するウェスタンブロットによってモニターした。五日後、バキュロウイルス感染SF9細胞を遠心分離によって収穫し、そして細胞関連タンパク質を高塩hightsalt抽出緩衝液1.5MNaCl、50mMTrispH7.5を使用して細胞ペレットから抽出した。抽出物300ml培養物当たり20mlを、遠心分離によって清澄化し、4lのTris緩衝化生理食塩水150mMNaCl、50mMTrispH7.5に対して3回透析し、再び遠心分離によって清澄化した。この高塩画分を、HitrapHeparinPharmacia;5mlベッド体積に適用し、HEPES緩衝化生理食塩水25mMHEPES7.5、150mMNaClで広範に洗浄し、結合したタンパク質を、150mMNaCl~1200mMNaClの勾配で溶出した。Beer溶出は、約800mMNaClで観察された。Beer含有画分を、10グリセロールおよび1mMDTTに追加し、-80°Cで凍結させた。実施例4BEER、GREMLINおよびDANに対するポリクローナル抗体の調製および試験A.抗原の調製:ヒトBeer、ヒトGremlin、およびヒトDanのDNA配列を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる標準的なPCR方法を使用して増幅した:各場合において、列挙したプライマーは、コード領域の分泌シグナル配列を除いた全体を増幅した。これらは、BeerおよびGremlinについてはBamHI/HindIIIの部位に、そしてDanについてはSacI/HindIIIの部位に、細菌発現ベクターpQE-30QiagenInc.、Valencia、CAへのサブクローニングのための制限部位を含む。pQE30は、6xHisタグのコード配列を、このクローニング領域の5’末端に含む。完成した構築物を、E.coli菌株M-15/pRepQiagenIncに形質転換し、そして個々のクローンを配列決定により検証した。M-15/pRepにおけるタンパク質発現および精製Sepharoseに結合されたNi-NTAに結合する6xHisアフィニティータグを、製造業者Qiagen、TheQIAexpressionistにより記載されるように実施した。E.coli誘導Beerタンパク質を、6Mグアニジンへの可溶化を使用して有意な量で回収し、そして2~4Mに透析して、貯蔵中の沈殿を防止した。GremlinおよびDanタンパク質を、6Mグアニジンへの可溶化によってより高い量で回収し、そして精製後、グアニジン濃度を0.5Mにした。B.ポリクローナル抗体の産生および試験:これら3つの抗原の各々に対するポリクローナル抗体を、ウサギおよびニワトリの宿主において、標準的なプロトコルRRAntibody、Stanwood、WA;standardprotocolforrabbitimmunizationandantiserarecovery;ShortProtocolsinMolicularBiology.第2版.1992.11.37~11.41.HelenM.CooperおよびYvonnePaterson寄稿;ニワトリ抗血清は、StrategicBiosolutions、Ranoma、CAを用いて生成したを使用して産生した。ウサギ抗血清および鶏卵Igy画分を、ウェスタンブロットによって活性に関してスクリーニングした。これら3つの抗原の各々をPAGEにより分離し、そして0.45μmのニトロセルロースNovex、SanDiego、CAに移した。この膜を各小片が約75ngの抗原を含むように小片に切断した。これらの小片を3BlottingGradeBlockBio-RedLaboratories、Hercules、CA中でブロックし、そして1×Tris緩衝化生理食塩水TBS/0.02TWEEN緩衝液中で3回洗浄した。一次抗体ブロッキング緩衝液中1:100~1:10,000の範囲の希釈物中の予備免疫出血、ウサギ抗血清または鶏卵IgYを、その小片と共に、穏やかに振動させながら1時間インキュベートした。1×TBS/0.02TWEENでの3回の洗浄のうちの第2回目に続いて、二次抗体ペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ウサギ、AmershamLifeScience、Piscataway、NJ;またはペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ニワトリ、JacksonImmunoResearch、WestGrove、PAと1時間インキュベートした。1×TBS/0.02TWEENでの3回の洗浄のうちの最終サイクルを実施し、そして小片をLumi-LightWesternBlottingSubstrateRocheMolecularBiochemicals、Mannheim、Germanyを用いて現像した。C.抗体交叉反応性試験:上記節に記載のプロトコルに続いて、Beer、GremlinまたはDanのニトロセルロース小片を、それらのそれぞれのウサギ抗血清または鶏卵IgYの希釈物1:5000および1:10,000ならびに残り2つの抗原に対して作製した抗血清または鶏卵Igy1:1000および1:5000の希釈物と共にインキュベートした。増加した濃度においてのみ見られ得る、対応しない抗体による低親和性の結合を検出するために、それらの対応しない抗体のレベルを増加して行った。現像のプロトコルおよび持続時間は、上に記載したプロトコルを使用する3つ全ての結合事象に対して同一である。試験したいずれの抗原についても、抗原交叉反応性は観察されなかった。実施例5BeerとTGF-βスーパーファミリータンパク質との相互作用Beerの、TGF-βスーパーファミリーの異なる系統発生的アーム由来のタンパク質との相互作用を、免疫沈降法を使用して研究した。精製したTGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびGDNFを、販売源RDsystems;Minneapolis、MNから入手した。代表的なプロトコルは、以下の通りである。部分的に精製したBeerを、HEPES緩衝化生理食塩水25mMHEPES7.5、150mMNaCl中に透析した。免疫沈降を、300μlのIP緩衝液150mMNaCl、25mMTrispH7.5、1mMEDTA、1.4mMβ-メルカプトエタノール、0.5tritonX100、および10グリセロール中で行った。30ngの組換えヒトBMP-5タンパク質RDsystemsを、500ngのFLAGエピトープタグ化Beerの存在下および非存在下で、15μlのFLAGアフィニティーマトリックスSigma;StLouisMOにアプライした。これらのタンパク質を4°Cで4時間インキュベートし、次いでアフィニティーマトリックス会合タンパク質をIP緩衝液1回の洗浄あたり1ml中で5回で洗浄した。結合したタンパク質を、60μlの1×SDSPAGEサンプル緩衝液中でアフィニティーマトリックスから溶出した。これらのタンパク質をSDSPAGEにより分離し、そしてBeer会合BMP-5を、抗BMP-5抗血清ResearchDiagnostics、Incを使用してウェスタンブロットにより検出した図5を参照のこと。Beerリガンド結合アッセイ:FLAG-Beerタンパク質20ngを100μlPBS/0.2BSAに添加し、そして予め抗FLAGモノクローナル抗体Sigma;StLouisMOでコーティングした96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させ、そしてPBS中10BSAでブロックする。これを、室温で60分間行う。このタンパク質溶液を除去し、そしてウェルを洗浄して、結合していないタンパク質を除去する。BMP-5を、PBS/0.2BSA中10pM~500nMの範囲の濃度で各ウェルに添加し、そして室温で2時間インキュベートする。この結合溶液を除去し、そしてプレートを200μl容量のPBS/0.2BSAで3回洗浄する。次いで、BMP-5抗血清を使用してELISAF.M.Ausubelら1998CurrentProtocolsinMolBiol.第2巻、11.2.1~11.2.22によりBMP-5レベルを検出する。特異的な結合を、全結合から非特異的結合を減算することにより算出し、そしてLIGANDプログラムにより分析するMunsonおよびPodbard、Anal.Biochem.、107、220~239頁、1980。この方法の改変において、Beerを操作してヒトFc融合タンパク質として発現させる。同様に、リガンドBMPを操作してマウスFc融合物として発現させる。これらのタンパク質を一緒にインキュベートし、そしてアッセイを、Mellorらにより記載されたように、均一な時間分解蛍光検出homogeneoustimeresolvedfluorescencedetectionG.W.Mellorら、JofBiomolScreening、3291~99、1998を使用して、行う。実施例6TGF-βファミリーメンバーに対するTGF-β結合-タンパク質結合の阻害についてのスクリーニングアッセイ上記のアッセイは、2つの例外を伴い繰り返す。第1に、BMPの濃度を、以前に決定したKdに固定したままにする。第2に、アンタゴニスト候補の収集物を、一定の濃度で添加する低有機分子収集物の場合20μM、および抗体の研究の場合1μM。TGF-β結合-タンパク質結合のこれらの候補分子アンタゴニストは、多様な化学構造を示す市販の収集物または内部の収集物由来の有機化合物を含む。これらの化合物を、DMSO中のストック溶液として調製し、そして標準アッセイ条件下の最終体積の1以下で、アッセイウェルに添加する。これらを、BMPおよびBeerと共に室温で2時間インキュベートし、この溶液を取り除き、そして結合したBMPを記載のように定量化する。化合物または抗体の非存在下、観察されるBMP結合の40を阻害する薬剤を、この相互作用のアンタゴニストとみなす。これらを、さらに、それらの阻害定数およびTGF-β結合-タンパク質結合親和性に対するそれらの影響を決定するための滴定研究に基づいて、潜在的なインヒビターとして評価する。比較可能な特異性コントロールアッセイをまた、BMPリガンド作用に依存するアッセイを使用する研究を通じて、同定したアンタゴニストについての選択性プロフィールを確立するために実施し得る例えば、BMP/BMPレセプター競争研究。実施例7骨基質へのTGF-β結合-タンパク質局在化の阻害骨基質へヒドロキシアパタイトの局在化の阻害の評価は、Nicolasの方法Nicolas,V.CalcifTissueInt57:206,1995の改良を使用して実施される。簡単に、125I-標識TGF-β結合タンパク質を、Nicolas前出によって記載されるようにして調製する。ヒドロキシアパタイトを、ポリプロピレン濾過膜Polyfiltroninc,WeymouthMAを備えた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。TGF-β結合タンパク質を、PBS緩衝液中の0.2アルブミンに添加した。基質を含むウェルを、この緩衝液で3回洗浄した。吸着されたTGF-β結合-タンパク質を、0.3MのNaOHを使用して溶出し、そして定量化した。インヒビターの同定を、試験分子と共にTGF-β結合-タンパク質をインキュベートし、そしてこの混合物を、上記の基質にアプライすることによって実施した。この基質を、PBS緩衝液中の0.2アルブミンで3回洗浄する。吸着されたTGF-β結合-タンパク質を、0.3MのNaOHを使用して溶出し、そして定量化した。化合物または抗体の非存在下で観察されるTGF-β結合-タンパク質結合の40を阻害する薬剤を、骨局在化インヒビターとみなす。これらのインヒビターを、さらに、それらの阻害定数およびTGF-β結合-タンパク質結合親和性に対するそれらの影響を決定するための用量応答研究を介して、特徴づける。実施例8TGF-β結合-タンパク質変異体の構造A.変異誘発pBluescriptSK中の完全長のTGF-β結合-タンパク質cDNAは、変異誘発のテンプレートとして有用である。簡単には、適切なプライマー上に提供された議論を参照のことを利用して、VentDNAポリメラーゼを使用するポリメラーゼNewEnglandBiolabs,Beverly,MA連鎖反応により、DNAフラグメントを生成する。ポリメラーゼ連鎖反応は、57°Cのアニーリング温度を使用して、製造者により提供される緩衝液中で23サイクルで実施する。次いで、この産物を、2種の制限酵素に曝露し、そしてアガロースゲル電気泳動を使用して単離した後に、その整合する配列を酵素的消化により取り除いた、pRBP4-503に連結した。この変異体の完全性を、DNA配列決定によって確認する。B.変異体TGF-β結合-タンパク質の哺乳動物細胞発現および単離変異体TGF-β結合-タンパク質cDNAを、実施例3に記載のpcDNA3.1哺乳動物発現ベクター内に転移する。この配列を確認した後に、生じる構築物を、COS-1細胞中にトランスフェクトし、そして分泌タンパク質を、実施例3に記載されるように精製する。実施例9動物モデル-IBeer遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製CIBTマウスゲノムDNAライブラリ-ReserchGenetics,Huntsville,ALによって分配されたから単離された約200キロベースkbのBACクローン15G5を使用して、マウスBeer遺伝子ならびにその5’および3’隣接領域の完全配列を決定した。遺伝子全体、ならびに約17kbの5’隣接配列および約20kbの3’隣接配列を含む41kbSalIフラグメントを、SuperCosIコスミドベクターStratagene,LaJolla,CAのBamHI部位にサブクローニングし、そしてE.coli株DH10B中で増殖させた。次いで、このコスミド構築物から、マウスBeer遺伝子全体、ならびにそれぞれ17kbおよび14kbの5’および3’隣接配列を含む35kbMluI-AviII制限フラグメント配列番号6を、従来の手段を使用してゲル精製し、そしてマウス接合体の微量注入に使用したDNXTransgenics;米国特許第4,873,191号。クローン化したDNAフラグメントがランダムにゲノムに組み込まれた創始動物founderanimalを、生存新生児の5~30の頻度で得た。トランスジーンの存在を、少量のマウス組織例えば、尾部の先端から抽出されたゲノムDNAのサザンブロット分析を実施することにより確認した。DNAを、以下のプロトコールを使用して抽出した:組織を200mMのNaCl、100mMのTrispH8.5、5mMのEDTA、0.2のSDS、および0.5mg/mlのプロテイナーゼKを含む溶解緩衝液中、55°Cで一晩消化した。翌日、このDNAをフェノール/クロロホルム50:50で一回、クロロホルム/イソアミルアルコール24:1で一回抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。TE10mMのTrispH7.5、1mMのEDTA中での再懸濁して、8~10μgの各DNAサンプルを、制限エンドヌクレアーゼ例えば、EcoRIで消化し、ゲル電気泳動に供し、そしてHyBondNAmersham,ArlingtonHeights,ILのような荷電したナイロン膜に転移させた。次いで、この得られるフィルターに、マウスBeer遺伝子座由来のDNAの放射活性標識フラグメントをハイブリダイズさせ、そして、内因性遺伝子座由来のフラグメントとトランスジーン由来の異なるサイズのフラグメントの両方を認識し得る。創始動物を、Beer遺伝子の過剰発現の効果を決定するのに、十分な数のトランスジェニック子孫および非トランスジェニック子孫を生じるために、正常の非トランスジェニックマウスに交配した。これらの研究のために、種々の年齢例えば、1日、3週間、6週間、4ヶ月の動物を、全体の骨格形成、骨鉱物密度bonemineraldensity、骨鉱物含量bonemineralcontent、破骨細胞および骨芽細胞の活性、軟骨内骨化の程度、軟骨形成などを確認するために設計された多数の異なるアッセイに供する。トランスジーン由来の転写活性は、種々の組織由来のRNAを抽出し、そしてトランスジーンが由来するマウス株129Sv/JとDNA微量注入のために使用されるマウス株[C57BL5/J×SJL/JF2]との間の一ヌクレオチド多型を利用するRT-PCRアッセイを使用することによって決定され得る。動物モデル-II相同組換えによるマウスBEER遺伝子の破壊胚性幹ES細胞における相同組換えが、内因性マウスBeer遺伝子を不活性化し、そして引き続いて機能喪失変異loss-functionmutationを保有する動物を産生するために、使用され得る。E.coliβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子が、標的ベクターへ操作され、その結果、その発現が、内因性Beer遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始シグナルによって制御される。この様式で、Beer遺伝子発現の空間的パターンおよび時間的パターンが、標的化対立遺伝子を保有する動物において、決定され得る。標的ベクターを、薬物選択的ホスホグリセレートキナーゼPGKプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子neoカセットをpGT-N29NewEnglandBiolabs,Beverly,MAからクローニングベクターpSP72Promega,Madson,Wlへまずクローニングすることによって構築した。PCRを、このPGKneoカセットをバクテリファージP1loxP部位の側面に位置させるために使用した。これらの部位は、P1Creリコンビナーゼについての認識部位であるHoessら、PNASUSA,79:3398,1982。このことによって、標的化ES細胞またはES細胞誘導動物におけるneo耐性マーカーを引き続いて除去することが可能となる米国特許第4,959,317号。これらのPCRプライマーは、34個のヌクレオチドntdloxP配列、このPGKneoカセットの5’および3’末端に対して相補的な15~25ntd、ならびにpSP72へのクローニングのための制限酵素認識部位センスプライマーにおけるBamHIおよびアンチセンスプライマーにおけるEcoRIから構成された。このセンスプライマーの配列は、5’-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3’配列番号34であり;このアンチセンスプライマーの配列は、5’-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3’配列番号35であった。次の工程は、3.6kbのXhol-HindIIIフラグメントE.coliβ-ガラクトシダーゼ遺伝子およびSV40ポリアデニル化シグナルを含むを、pSVβClontech,PaloAlto,CAから、pSP72-PGKneoプラスミドへクローニングすることであった。マウスBeer遺伝子座由来の相同性のショートアームを、BACクローン15G5由来の2.4kbのフラグメントを増幅することによって産生した。このフラグメントの3’末端は、Beer遺伝子の翻訳開始部位と一致し、そしてPCRにおいて使用したアンチセンスプライマーもまた、β-ガラクトシターゼ遺伝子の5’末端と30ntd相補性を含み、その結果、そのコード領域は、Beer開始部位にインフレームで融合され得た。ショートアームをpSP72-βgal-PGKneoプラスミドへ導入するために採るアプローチは、β-gal遺伝子の上流の部位でこのプラスミドを線状化し、次いでこのショートアームPCR産物でこのフラグメントを同時形質転換し、そしてPCR産物が相同組換えによって組み込まれたプラスミドについて選択することであった。ショートアーム増幅のためのセンスプライマーは、この組換え現象を可能にするためのpSP72ベクターに対して相補的な30ntdを含んだ。このセンスプライマーの配列は、5’-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3’配列番号36であり、そしてアンチセンスプライマーの配列は、5’-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3’配列番号37であった。Beer遺伝子座位由来のロングアームは、BACクローン15G5由来の6.1kbのフラグメントを、稀な切断rare-cutting制限酵素部位SgrAI、FseI、AsclおよびPaclもまた導入するプライマーで増幅することによって、産生した。具体的には、このセンスプライマーの配列は、5’-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3’配列番号38であり;このアンチセンスプライマーの配列は、5’-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3’配列番号39であった。得られたPCR産物を、中間工程として、TAベクターInvitrogen,Carlsbad,CAへクローニングした。このマウスBeer遺伝子標的構築物はまた、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復エレメントRSVLTRの制御下で、第2の選択マーカーI型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子HSVTKを含んだ。この遺伝子の発現は、哺乳動物細胞を、ガンシクロビルに対して感受性および生存不能にする;したがって、それは、この構築物が非相同現象によって組み込まれたネオマイシン耐性細胞に対して選択するための簡便な様式である米国特許第5,464,764号。このRSVLTR-HSVTKカセットを、ロングアーム-TAベクタープラスミドのFseI部位およびAscI部位へ引き続いてクローニングすることを可能にするプライマーを使用して、pPS1337から増幅した。このPCRについて、このセンスプライマーの配列は、5’-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGATCTGA-3’配列番号40であり;このアンチセンスプライマーの配列は、5’-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3’配列番号41であった。標的ベクターの構築における最終工程は、ロングアームおよびRSVLTR-HSVTK遺伝子を含む8.8kbのSGRAl-AscIフラグメントを、pSP72-ショートアーム-βgal-PGKneoプラスミドのSgrAI部位およびAscI部位へクローニングすることを包含する。この標的ベクターを、ES細胞へのエレクトロポレーションの前に、AscIまたはPaclのいずれかでの消化によって直線化した。実施例10アンチセンス-媒介BEER不活性化17-ヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第1のオリゴヌクレオチドの5’末端がBeer転写の翻訳開始AUGと重複し、そして連続するオリゴヌクレオチドの5’末端が、BeerAUGに対して5’方向へ50ヌクレオチド隔てるまで5ヌクレオチド増加移動が生じるような様式で、重複形式で調製する。対応するコントロールオリゴヌクレオチドは、等価な塩基組成物を使用して設計および調製されるが、コードmRNAへのいずれの有意なハイブリダイゼーションをも阻害するために配列において再分配される。試験細胞系への薬剤送達が、カチオン性脂質送達を通して実施されるP.L.Felgner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413,1987。2ugのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、100ulの還元血清媒体Opti-MeMI還元血清媒体;LifeTechnologies,GaithersburgMDへ添加し、そしてこれを、100ulの還元血清媒体中でリポフェクション薬剤6ulLifeTechnologies,GaithersburgMDと混合する。これらを混合し、30分間、室温で複合体化させ、そしてこの混合物を、予め播種したMC3T3E21細胞またはKS483細胞へ添加する。これらの細胞を培養し、そしてこのmRNAを回収する。BeermRNAを、Beer特異的プライマーと組み合わせたRT-PCRを使用してモニタリングする。さらに、個々の実験ウエルを収集し、そしてタンパク質レベルを、実施例4に記載されるウエスタンブロット方法によって特徴付ける。これらの細胞を収穫し、溶解緩衝液50mMTrispH7.5、20mMNaCl、1mMEDTA、1SDS中に再懸濁させ、そしてこの可溶性タンパク質を収集する。この物質を、10~20勾配変性SDSPAGEへ適用する。これらの単離されたタンパク質をニトロセルロースへ移し、そしてウエスタンブロットを記載した抗体薬剤を使用して上記のように行う。並行して、コントロールオリゴヌクレオチドを、同一のクラスターへ添加し、そして実験操作を繰り返す。BeermRNAまたはタンパク質レベルの減少は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が、このコントロールスクランブル化scrambledオリゴヌクレオチドと比較する場合のいずれかで50の変化が生じる場合、有意であると考えられる。この方法は、この組織培養モデルにおける鉱化ノジュールnoduleの選択的遺伝子不活性化および引き続く表現型特徴付けを可能にする。上述から、本発明の特定の実施形態が、本明細書中で例示の目的のために記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、制限されない。"