"ヒトPDX1陽性膵臓内胚葉細胞およびヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物であって、ヒト胚体内胚葉細胞の95個ごとに、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも5個存在する、細胞培養物。ヒト多能性細胞をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養物。前記ヒト多能性細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項2に記載の細胞培養物。前記ヒト多能性幹細胞が、桑実胚、胚の内部細胞塊ICMまたは胚の生殖隆起に由来する、請求項3に記載の細胞培養物。前記ヒト多能性幹細胞が、胎生期を過ぎ発達した多細胞構造の生殖組織に由来する、請求項3に記載の細胞培養物。前記細胞培養物がレチノイドを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞培養物。前記細胞培養物が、TGFβスーパーファミリーのノーダル/アクチビンサブグループの増殖因子を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の細胞培養物。前記細胞培養物が、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および/または神経系細胞を実質的に含まない、請求項1~7のいずれか1項に記載の細胞培養物。前記細胞培養物がヒト中胚葉細胞を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の細胞培養物。前記中胚葉細胞が5未満の濃度で存在する、請求項9に記載の細胞培養物。細胞療法の用途において有用な細胞を生成する出発物質としてhESCを使用するためには、上述の問題を克服することが有益である。例えば、膵島細胞移植治療に必要なレベルの細胞材料となるためには、分化のかなり初期段階で、膵島/β細胞系列の方向にhESCを効率的に誘導することが有益である。また、分化プロセスの効率的な誘導に加えて、膵島/β細胞系列への分化経路にそって中間細胞型を単離し特徴付けることや、そのような細胞を分化の更なる段階のために適した系列前駆細胞として使用することも有益である。本発明のいくつかの実施形態は、PDX1発現PDX1陽性内胚葉細胞を含む組成物、およびその作製方法に関連するものである。他の実施形態は、PDX1陽性内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団と、その細胞集団の作製方法に関連するものである。また、他の実施形態は、内胚葉細胞でPDX1の発現を高める方法と、PDX1陰性および/又はPDX1陽性の内胚葉の更なる分化に有用な因子を同定する方法に関連するものである。本明細書記載の前記組成物、およびその作製方法に関して、いくつかの実施形態において、PDX1陽性内胚葉細胞は、PDX1陽性前腸/中腸内胚葉細胞である。好適な実施形態においては、PDX1陽性内胚葉細胞は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞であり、他の好適な実施形態においては、PDX1陽性内胚葉細胞は、PDX1陽性前腸後方部の内胚葉細胞である。本発明のいくつかの実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物であって、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物に関する。いくつかの実施形態において、当該細胞培養物はヒト細胞を含む。このようなヒト細胞培養物において、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、培養物中のヒト細胞の少なくとも約2、約5、約10または約25を含む組成とすることができる。いくつかの実施形態において、この少なくとも約2、約5、約10または約25とは、培養物中に存在する支持細胞フィーダー細胞を除いて算出された割合である。本明細書の細胞培養物のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、ホメオボックスA13HOXA13遺伝子、ホメオボックスC6HOXC6遺伝子およびSOX17からなる群から選択されるマーカーを発現する。他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物は、臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および/又は神経系細胞を実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、前記細胞培養物はさらに、レチノイン酸RAなどのレチノイド化合物、FGF-10またはB27の1又は2以上を含む。本発明の他の実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含み、または当該細胞が単離もしくは実質的に精製された細胞集団に関するものであって、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞などの多分化能細胞由来である。本発明の他の実施形態は、構成細胞の少なくとも約90がPDX1陽性前腸内胚葉細胞であって、当該PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞集団に関する。好適な実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、細胞集団中の細胞の少なくとも約95であり、さらに好適な実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、細胞集団中の細胞の少なくとも約98である。本発明の他の実施形態は、PDX1を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団に、レチノイドなどの前腸分化促進因子を供給することによって、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を作製する方法に関する。たとえばRAであるレチノイドは、約0.01μMから約50μMまでの範囲の濃度で供給される。いくつかの実施形態において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化は、細胞培養物又は細胞集団に、FGF-10および/又はB27を供給することによって高められる。FGF-10は、約5ng/mlから約1000ng/mlまでの範囲の濃度で供給することができる。いくつかの実施形態において、B27は、培地全体の約0.1から約20までの範囲の濃度で、細胞培養物又は細胞集団に供給することができる。FGF-10および/又はB27は、前記レチノイドとほぼ同時に、あるいはそれぞれの因子の添加について、各添加ごとに数時間の間をおいて、細胞培養物又は細胞集団に添加することができる。ある実施形態によると、レチノイドは、PDX1陰性胚体内胚葉培養開始後約4日で添加され、他の実施形態では、レチノイドは、PDX1陰性胚体内胚葉培養開始後約5日で添加される。さらに他の実施形態は、RAなどのレチノイドを加えた細胞培養物又は細胞集団でのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の生産をさらに向上するため、前腸分化促進因子を使用する方法に関する。そのような実施形態において、PDX1陰性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉への分化は、アクチビンAおよび/又はアクチビンBを細胞培養物又は細胞集団に供給することによって向上される。アクチビンAおよび/又はアクチビンBは、約5ng/mlから約1000ng/mlまでの範囲の濃度で供給することができる。他の実施形態は、レチノイドを含む培地でPDX1陰性細胞を分化させることによって、細胞培養物又は細胞集団でのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の生産を向上する方法に関するものであって、前記培地は、ある細胞タイプの成長又は維持によって条件付けられている。そのような細胞タイプは、特に限定されるものではないが、胚性幹細胞や、血清またはアクチビンA、アクチビンB、ノーダルおよび/又は骨形成タンパク質BMPなどの増殖因子TGFβスーパーファミリーのメンバーを含む培地で分化させたその他の多分化能細胞を含んでいる。いくつかの実施形態では、条件培地が、成長培地全体の約1から約100までの範囲の濃度で、細胞培養物又は細胞集団に供給される。TGFβスーパーファミリーの増殖因子および/又は条件培地は、前記レチノイドとほぼ同時に、あるいはそれぞれの因子の添加について、各添加ごとに数時間の間をおいて、細胞培養物又は細胞集団に添加することができる。本発明の実施形態はまた、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団を生産する方法に関する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、多分化能細胞の集団当該多分化能細胞集団の少なくとも1つの細胞が、PDX1プロモーターの制御下にある少なくと1コピーの核酸を含むを得る工程を含むものであり、前記核酸は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードする配列またはその生物活性をもつ断片を含む。他の実施形態では、前記多分化能細胞を分化させて、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を作製する付加的工程と、当該PDX1陽性細胞をPDX1陰性細胞から分離する工程とを含んでいる。また、いくつかの実施形態において、前記分化工程は、前記多分化能細胞からPDX1陰性胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を、前記多分化能細胞集団に供給する工程と、前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量の前腸分化促進因子を、前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞に供給する工程とをさらに含んでいる。本発明のいくつかの実施形態は、SOX17発現SOX17陽性胚体内胚葉細胞においてPDX1遺伝子産物の発現を高める方法に関するものであって、当該胚体内胚葉細胞に、PDX1遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる工程を含んでいる。ある実施形態によると、前記分化促進因子は、RA、FGF-10およびB27から選択される。本発明の他の実施形態は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、候補分化促進因子をPDX1陰性胚体内胚葉細胞に接触させ、前記候補分化促進因子との接触後に、細胞集団でのPDX1発現が、当該接触前の細胞集団でのPDX1発現よりも増加したかどうかを決定する。細胞集団でのPDX1発現の増加から、前記候補分化促進因子は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつと判断される。いくつかの実施形態において、PDX1発現は、定量ポリメラーゼ連鎖反応Q-PCRにより決定される。ある実施形態によると、前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのHOXA13および/又はHOXC6遺伝子の発現を決定する工程をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、前記候補分化促進因子は、低分子、たとえばRAなどのレチノイドであり、他の実施形態において、前記候補分化促進因子は、ポリペプチド、たとえばFGF-10などの増殖因子である。本発明のさらに他の実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、候補分化促進因子をPDX1陽性前腸内胚葉細胞に接触させ、前記候補分化促進因子との接触後に、細胞集団でのマーカーの発現が、当該接触前の細胞集団での前記マーカーの発現よりも増加したか減少したかを決定する。前記マーカーの発現の増加または減少から、前記候補分化促進因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつと判断される。ある実施形態によると、前記マーカーの発現は、Q-PCRにより決定される。いくつかの実施形態において、前記候補分化促進因子は、低分子、たとえばRAなどのレチノイドであり、他の実施形態において、前記候補分化促進因子は、ポリペプチド、たとえばFGF-10などの増殖因子である。なお、本明細書において使用される含むという語は、いわゆる開かれた用語として使われており、他の付加的な要素を含んでいてもよい趣旨である。この点に留意しつつ、本発明の具体的態様について、以下番号を付した項目を参照して説明する。1.ヒト細胞を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約2がPDX1pancreaticduodenalhomoeboxfactor1陽性前腸内胚葉細胞であり、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞培養物。2.前記ヒト細胞の少なくとも約5が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目1に記載の細胞培養物。3.前記ヒト細胞の少なくとも約10が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目1に記載の細胞培養物。4.前記ヒト細胞の少なくとも約25が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目1に記載の細胞培養物。5.ヒト支持細胞フィーダー細胞が培養物中に存在し、当該ヒト支持細胞以外のヒト細胞の少なくとも約2が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目1に記載の細胞培養物。6.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスA13HOXA13遺伝子を発現する項目1に記載の細胞培養物。7.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、ホメオボックスC6HOXC6遺伝子を発現する項目1に記載の細胞培養物。8.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、SOX17を発現する項目1に記載の細胞培養物。9.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞において、PDX1の発現が、α-フェトプロテインAFP、SOX7、SOX1、ZIC1およびNFMからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目1に記載の細胞培養物。10.臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞および神経系細胞からなる群から選択される細胞を実質的に含んでいない項目1に記載の細胞培養物。11.当該細胞培養物において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞の約10個ごとに、PDX1陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約1個存在する項目1に記載の細胞培養物。12.当該細胞培養物において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞の約5個ごとに、PDX1陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約1個存在する項目1に記載の細胞培養物。13.当該細胞培養物において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞の約4個ごとに、PDX1陽性前腸内胚葉細胞が少なくとも約1個存在する項目1に記載の細胞培養物。14.胚性幹細胞をさらに含む項目1に記載の細胞培養物。15.前記胚性幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊ICMおよび胚の生殖隆起からなる群から選択される組織に由来する項目14に記載の細胞培養物。16.レチノイドをさらに含む項目1に記載の細胞培養物。17.前記レチノイドは、レチノイン酸RAである項目16に記載の細胞培養物。18.FGF-10をさらに含む項目1に記載の細胞培養物。19.B27をさらに含む項目1に記載の細胞培養物。20.RAおよびFGF-10の双方を含む項目1に記載の細胞培養物。21.B27をさらに含む項目20に記載の細胞培養物。22.細胞を含む細胞集団であって、前記細胞の少なくとも約90が、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞であり、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である細胞集団。23.前記細胞の少なくとも約95が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目22に記載の細胞集団。24.前記細胞の少なくとも約98が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目22に記載の細胞集団。25.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、HOXA13遺伝子を発現する項目22に記載の細胞集団。26.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、HOXC6遺伝子を発現する項目22に記載の細胞集団。27.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、SOX17を発現する項目22に記載の細胞集団。28.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞において、PDX1の発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1およびNFMからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目22に記載の細胞集団。29.PDX1陽性前腸内胚葉細胞の作製方法であって、前記方法は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程と、前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の、PDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを前記細胞集団に供給する工程とを含み、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸内胚葉細胞の作製方法。30.PDX1陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を与える工程を含み、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞を形成するための十分な時間を、前記細胞集団におけるPDX1陽性前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより決定する項目29に記載の方法。31.前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約2が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目29に記載の方法。32.前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約5が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目29に記載の方法。33.前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約10が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目29に記載の方法。34.前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞の少なくとも約25が、PDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化する項目29に記載の方法。35.前記細胞集団におけるPDX1陽性前腸内胚葉細胞の存在の検出が、PDX1の発現を検出することを含む項目29に記載の方法。36.前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞において、PDX1の発現が、α-フェトプロテインAFP、SOX7、SOX1、ZIC1およびNFMからなる群から選択されるマーカーの発現より高い項目35に記載の方法。37.前記PDX1の発現が、定量ポリメラーゼ連鎖反応Q-PCRにより決定される項目35に記載の方法。38.前記PDX1の発現が、免疫細胞化学により決定される項目35に記載の方法。39.前記レチノイドはRAである項目29に記載の方法。40.RAは、約0.01μMから約50μMまでの範囲の濃度で供給される項目39に記載の方法。41.RAは、約0.04μMから約20μMまでの範囲の濃度で供給される項目39に記載の方法。42.RAは、約0.1μMから約10μMまでの範囲の濃度で供給される項目39に記載の方法。43.RAは、約0.2μMから約2.5μMまでの範囲の濃度で供給される項目39に記載の方法。44.RAは、約0.5μMから約1.5μMまでの範囲の濃度で供給される項目39に記載の方法。45.RAは、約1μMの濃度で供給される項目39に記載の方法。46.RAは、培養開始後約4日で供給される項目39に記載の方法。47.FGF-10、FGF-4、アクチビンA、アクチビンB、B27、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される因子を、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の産生を促進するのに十分な量で前記培養に供給することを含む項目29に記載の方法。48.前記因子は、FGF-10、FGF-4、アクチビンAおよびアクチビンBからなる群から選択される項目47に記載の方法。49.前記因子は、約10ng/mlから約500ng/mlまでの範囲の濃度で供給される項目48に記載の方法。50.前記因子は、約20ng/mlから約200ng/mlまでの範囲の濃度で供給される項目48に記載の方法。51.前記因子は、約25ng/mlから約75ng/mlまでの範囲の濃度で供給される項目48に記載の方法。52.前記因子は、約50ng/mlの濃度で供給される項目48に記載の方法。53.前記因子は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目48に記載の方法。54.前記因子はB27である項目47に記載の方法。55.B27は、培地全体の約0.1から約20までの範囲の濃度で供給される項目54に記載の方法。56.B27は、培地全体の約0.2から約5までの範囲の濃度で供給される項目54に記載の方法。57.B27は、培地全体の約0.5から約2までの範囲の濃度で供給される項目54に記載の方法。58.B27は、培地全体の約1の濃度で供給される項目54に記載の方法。59.B27は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目54に記載の方法。60.前記因子は条件培地である項目47に記載の方法。61.条件培地は、培地全体の約10から約100までの範囲の濃度で供給される項目60に記載の方法。62.条件培地は、培地全体の約20から約80までの範囲の濃度で供給される項目60に記載の方法。63.条件培地は、培地全体の約40から約60までの範囲の濃度で供給される項目60に記載の方法。64.条件培地は、培地全体の約50の濃度で供給される項目60に記載の方法。65.条件培地は、前記レチノイドとほぼ同時に供給される項目60に記載の方法。66.条件培地は、分化したヒト胚性幹細胞hESCを約24時間細胞培養培地に接触させることによって調製される項目60に記載の方法。67.hESCは、3の血清を添加したRPMI、アクチビンAを添加した低血清RPMI、およびBMP4を添加した低血清RPMIからなる群から選択される細胞培養培地で約5日間分化させる項目66に記載の方法。68.項目29に記載の方法によって作製されたPDX1陽性前腸内胚葉細胞。69.PDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団を作製する方法であって、多分化能細胞の集団を得る工程当該多分化能細胞集団の少なくとも1つの細胞が、PDX1プロモーターの制御下にある少なくと1コピーの核酸を含み、当該核酸は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードする配列またはその生物活性をもつ断片を有すると、前記多分化能細胞を分化させて、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸内胚葉細胞を作製する工程と、当該PDX1陽性前腸内胚葉細胞を、PDX1陰性細胞から分離する工程とを含む方法。70.前記細胞集団は、少なくとも約95のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む項目69に記載の方法。71.前記細胞集団は、少なくとも約98のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む項目69に記載の方法。72.前記分化工程は、前記多分化能細胞からPDX1陰性胚体内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のTGFβスーパーファミリーの少なくとも1つの増殖因子を、前記多分化能細胞集団に供給する工程と、前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な量のレチノイドを、前記PDX1陰性胚体内胚葉細胞に供給する工程とをさらに含む項目69に記載の方法。73.前記レチノイドは、RAである項目72に記載の方法。74.項目69に記載の方法によって作製されたPDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団。75.SOX17発現胚体内胚葉細胞においてPDX1遺伝子産物の発現を高める方法であって、当該胚体内胚葉細胞に、PDX1遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる工程を含む方法。76.前記分化促進因子は、レチノイドである項目75に記載の方法。77.前記分化促進因子は、RAである項目76に記載の方法。78.前記分化促進因子は、FGF-10、FGF-4、アクチビンA、アクチビンB、B27、条件培地およびこれら因子の組み合わせからなる群から選択される項目75に記載の方法。79.PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、PDX1陰性胚体内胚葉細胞の集団を得る工程と、候補分化促進因子を、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、前記候補分化促進因子との接触後に、前記細胞集団でのPDX1発現が、当該接触前の細胞集団でのPDX1発現よりも増加したかどうかを決定する工程とを含み、前記細胞集団でのPDX1発現の増加から、前記候補分化促進因子は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞から腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつと判断する方法。80.PDX1発現は、Q-PCRにより決定される項目79に記載の方法。81.前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのHOXA13遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む項目79に記載の方法。82.前記候補分化促進因子との接触前後における、前記細胞集団でのHOXC6遺伝子の発現を決定する工程をさらに含む項目79に記載の方法。83.前記候補分化促進因子は、低分子である項目79に記載の方法。84.前記低分子は、レチノイドである項目83に記載の方法。85.前記レチノイドは、RAである項目84に記載の方法。86.前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである項目79に記載の方法。87.前記候補分化促進因子は、増殖因子である項目79に記載の方法。88.前記候補分化促進因子は、FGF-10である項目79に記載の方法。89.PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法であって、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む集団を得る工程と、候補分化促進因子を、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む前記集団に接触させる工程と、前記候補分化促進因子との接触後に、前記集団でのマーカーの発現が、当該接触前の細胞集団での前記マーカーの発現よりも増加したか減少したかを決定する工程とを含み、前記集団での前記マーカーの発現の増加または減少から、前記候補分化促進因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつと判断する方法。90.前記マーカーの発現は、Q-PCRにより決定される項目89に記載の方法。91.前記候補分化促進因子は、低分子である項目89に記載の方法。92.前記候補分化促進因子は、ポリペプチドである項目89に記載の方法。93.前記候補分化促進因子は、増殖因子である項目89に記載の方法。94.PDX1制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含むベクター。95.前記レポーター遺伝子は、EGFPである項目94に記載のベクター。96.項目94に記載のベクターを含む細胞。97.PDX1制御領域と機能的に結合したレポーター遺伝子を含む細胞。98.前記PDX1制御領域と機能的に結合した前記レポーター遺伝子は、染色体に組み込まれている項目97に記載の細胞。99.前記レポーター遺伝子は、EGFPである項目97に記載の細胞。100.前記細胞は、多分化能である項目97に記載の細胞。101.前記細胞は、hESCである項目100に記載の細胞。102.前記細胞は、胚体内胚葉細胞である項目97に記載の細胞。103.前記細胞は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞である項目97に記載の細胞。104.分化したhESC当該hESCは、3の血清を添加したRPMI、アクチビンAを添加した低血清RPMI、およびBMP4を添加した低血清RPMIからなる群から選択される細胞培養培地で約5日間分化させたものの集団を約24時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したhESCの集団を培地から除去する工程とによって調製された条件培地。105.前記新鮮細胞培養培地は、RPMIである項目104に記載の条件培地。106.前記RPMIは、低血清RPMIである項目105に記載の条件培地。107.分化したhESC当該hESCは、3の血清を添加したRPMI、アクチビンAを添加した低血清RPMI、およびBMP4を添加した低血清RPMIからなる群から選択される細胞培養培地で約5日間分化させたものの集団を約24時間、新鮮細胞培養培地に接触させる工程と、当該分化したhESCの集団を培地から除去する工程とによって培地を条件付ける方法。108.前記新鮮細胞培養培地は、RPMIである項目107に記載の方法。109.前記RPMIは、低血清RPMIである項目108に記載の方法。当然のことながら、上記方法および組成物は、生体外で培養される細胞に関する。しかしながら、上記の生体外で分化させた細胞組成物は、生体内用に使用してもよい。本発明の更なる実施形態は、2003年12月23日に出願された、名称DEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉の米国仮特許出願第60/532,004号、2004年4月27日に出願された、名称PDX1EXPRESSINGENDODERMPDX1発現性内胚葉の米国仮特許出願第60/566,293号、2004年7月9日に出願された、名称CHEMOKINECELLSURFACERECEPTORFORTHEISOLATIONOFDEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体の米国仮特許出願第60/586,566号、2004年7月14日に出願された、名称CHEMOKINECELLSURFACERECEPTORFORTHEISOLATIONOFDEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉分離用ケモカイン細胞表面受容体の米国仮特許出願第60/587,942号、および、2004年12月23日に出願された、名称DEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉の米国特許出願第11/021,618号にも記載されている場合があり、それらの全内容を引用することにより本明細書の一部とする。原腸形成と呼ばれるヒト発生初期における極めて重要な段階は、受精後2~3週間で生じる。原腸形成が極めて重要である理由は、三つの一次胚葉が初めて特定化され組織化されるのがこの時だからであるLuetal.,2001;SchoenwolfandSmith,2000。外胚葉は、体の外皮および全神経系の最終形成をつかさどる一方で、心臓、血液、骨、骨格筋、および他の結合組織は、中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃、小腸および大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、および膵臓などの腸管に由来する器官の形成をつかさどる胚葉と定義されるGrapin-BottonandMelton,2000;KimelmanandGriffin,2000;Tremblayetal.,2000;WellsandMelton,1999;WellsandMelton,2000。胚体内胚葉と、原始内胚葉と呼ばれる、完全に別個の系列の細胞とを区別することは非常に重要である。原始内胚葉は、主として、胚体外組織、主に、ライヘルト膜の細胞外マトリックス物質と胎盤の卵黄嚢の壁側および臓側内胚葉部分の形成をつかさどる。原腸形成の間、胚体内胚葉形成の過程は、中内胚葉細胞中胚葉または内胚葉を形成することのできる細胞が原始線条と呼ばれる構造を通って移動する、細胞移動現象から始まる。胚体内胚葉は、線条前部を通り、そして結節線条最前部における特殊構造を通って移動する細胞に由来する。移動が生じるにつれ、胚体内胚葉は、まず、腸管最前部に位置し、腸管後端の形成で終了する。発生中のPDX1遺伝子発現PDX1STF-1、IDX-1およびIPF-1とも呼ばれるは、膵臓および吻側十二指腸の発生に必要な転写因子である。PDX1は最初に、前腸内胚葉の後方から生じ、外分泌および内分泌細胞を作る膵臓内胚葉にて発現し、それはマウスではE8.5期に始まる。その後、PDX1はベータ細胞やデルタ細胞の一部に限局するようになり、この発現パターンは成体で維持される。PDX1は発生初期において形成中の膵臓に隣接する十二指腸内胚葉、次いで、十二指腸エンテロサイトと腸内分泌細胞、胃腔部、総胆管、胆嚢管および胆管でも発現する。この発現領域は、膵臓での発現が制限される時点で、吻側十二指腸に優勢的に限定されるようになる。PDX1陽性細胞とこれに関連するプロセス本発明の実施形態は、新規で明確なPDX1陽性内胚葉細胞の生産方法に関するものであって、PDX1陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸/中腸部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸/中腸内胚葉。ここで、多分化性や多分化能細胞の語は、他の特定の細胞型細胞タイプを限定数発生させる細胞型の意味で用いている。また、前腸/中腸の語は、前腸/中腸接合部の細胞を含む、腸管前方部および中央部の細胞の意味で用いている。本発明の好適な実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の生産方法に関するものである。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞であるPDX1陽性前腸内胚葉。他の好適な実施形態は、前腸後方部のPDX1陽性内胚葉細胞の生産方法に関するものである。いくつかの実施形態において、これらのPDX1陽性内胚葉細胞は、腸管前腸領域後方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞である。本明細書記載の方法にしたがって生産されるようなPDX1陽性前腸内胚葉細胞は、十分に分化したインシュリン産生ベータ細胞の生産に利用可能である。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、実質的にPDX1を発現しない胚体内胚葉細胞本明細書において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞または胚体内胚葉という。を分化させ、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を形成することによって生産される。PDX1陰性胚体内胚葉細胞は、本明細書に記載されるようにヒト胚性幹細胞などの多分化能細胞を分化させることによって、あるいは他の公知の方法によって調製可能である。多分化能細胞からPDX1陰性胚体内胚葉細胞を生産するための簡便で効率性の高い方法が、2004年12月23日に出願された、名称DEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉の米国特許出願第11/021,618号に開示されている。PDX1陽性前腸内胚葉細胞の生産方法は、多分化能細胞から腺房細胞、導管細胞および膵島細胞などの膵臓組織を効率よく生産するための基礎を提供するものである。ある好適な実施形態において、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞は、ヒトPDX1陰性胚体内胚葉細胞に由来し、この胚体内胚葉細胞は、hESCに由来する。そして、このヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞は、機能的なインスリン産生β細胞の生産に利用できる。有用な量のインスリン産生β細胞を得るため、膵島/β細胞への分化到達前に生じる各分化段階において、効率よく分化させることが望ましい。PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化は、機能的な膵島/β細胞の作製に向かう初期の段階に相当するため図1に示すように、この段階で効率よく分化させることは特に望ましい。PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を効率よく行うことは特に望ましいため、本発明のいくつかの態様は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞の約2-25をPDX1陽性前腸内胚葉細胞へ転換させるインビトロ生体外の方法に関する。この典型的な方法として、時間的に特定された所定のやり方における培養物や増殖因子に関する条件の適用が含まれる。PDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的に結合する試薬を使用することで、細胞集団内の他の細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞を分離および/または精製することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の細胞集団をさらに豊富化することができる。選択的なものとして、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、PDX1発現を検出できるように、緑色蛍光タンパク質GFPなどのレポーター遺伝子で標識することができる。そのような蛍光標識細胞は、蛍光活性細胞分離法FACSによって精製することができる。本発明の他の態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物、その豊富な細胞集団、PDX1陽性前腸内胚葉からまたは同内胚葉への分化に有用な因子を同定する方法に関する。細胞培養物または細胞集団内のPDX1陽性前腸内胚葉細胞の量を決定するためには、培養物または集団において、他の細胞からこの細胞型を識別する方法が望ましい。従って、本発明のある実施形態は、その存在、不在および/または相対的発現量がPDX1陽性前腸内胚葉細胞に特異的である細胞マーカーと、そのようなマーカーの発現を検出および測定する方法とに関する。本明細書において使用する、発現とは、材料または物質の生成、並びに材料または物質の生成レベルまたは量のことを言う。よって、特異的なマーカーの発現を測定するということは、マーカーの存在または不在を簡易に検出すること、あるいは発現するマーカーの相対量または絶対量のいずれかを検出することを言う。本明細書に使用する、マーカーは、観察または検出できるあらゆる分子のことを指す。例えば、マーカーは、特異的遺伝子の転写物などの核酸、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物のポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質,リポタンパクまたは小分子例えば、10000amu未満の分子量をもつ分子を含むが、これらに限定されるものではない。本発明のいくつかの実施形態において、マーカーの発現の有無および/または量は、定量PCRQ-PCRにより測定される。例えば、PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α-フェトプロテインAFP、ホメオボックスA13HOXA13、ホメオボックスC6HOXC6などの一定の遺伝子マーカーや、本明細書に記載している他のマーカーにより産生される転写物の量は、定量Q-PCRにより測定される。他の実施形態においては、上記遺伝子により発現したタンパク質の検出に免疫組織化学法が使用される。さらに別の実施形態において、そのようなマーカーの量または相対的比率の確認および測定には、Q-PCRおよび免疫組織化学法の両方を利用する。上記のような分化と検出方法を利用することにより、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を同定するだけでなく、細胞培養物あるいは細胞集団におけるPDX1陽性前腸内胚葉細胞の比率を求めることも可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、作製されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、PDX1陰性細胞またはその細胞集団より約2桁多い量のPDX1遺伝子を発現する。他の実施形態において、作製されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、PDX1陰性細胞またはその細胞集団より3桁以上多い量のPDX1遺伝子を発現する。さらに別の実施形態において、作製されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞またはその細胞集団は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞またはその細胞集団より約2桁または3桁以上多い量の、PDX1、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される一以上のマーカーを発現する。本明細書に記載している組成物および方法には、いくつかの有用な特性がある。例えば、PDX1陽性前腸内胚葉を含む細胞培養物および細胞集団、並びにそのような細胞培養物および細胞集団を作製する方法は、ヒト発生の初期段階をモデル化する上で有用である。さらに、本明細書に記載の組成物と方法は、糖尿病などの病状における治療行為にも役立つ。例えば、PDX1陽性前腸内胚葉は、限られた数の組織のみの源となるため、純粋な組織または細胞型の発生に使用することができる。多分化能細胞からPDX1陰性胚体内胚葉胚体内胚葉の作製PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および/又は細胞集団は、多分化能細胞から、まずPDX1陰性胚体内胚葉胚体内胚葉ともいう。を作製することによって、作製することができる。多分化能細胞を分化させ、胚体内胚葉を豊富に含む細胞培養物および/又は細胞集団を作製する方法については、2004年12月23日に出願された、名称DEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉の米国特許出願第11/021,618号に詳細に開示されているが、以下簡単に説明する。これらの方法のいくつかでは、出発材料として用いられる多分化能細胞は、幹細胞である。いくつかの方法において、胚体内胚葉細胞培養物および胚体内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、胚性幹細胞から作製される。本明細書で使用している、胚性、胚のembryonicとは、単一の接合体に始まり、成長した配偶子細胞以外に多能性または全能性細胞をもはや含まない多細胞性構造体に終わる、生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により誘導された胚に加え、用語胚性、胚のembryonicは、体細胞核移植により誘導された胚も指す。胚体内胚葉細胞を誘導する好ましい方法では、胚体内胚葉作製のための出発物質として、ヒト胚性幹細胞hESCを利用する。この方法で使用される多分化能細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起から得られたものに由来する細胞であってもよい。ヒト胚性幹細胞は、当技術分野において周知の方法を用いて、実質的に分化することなく多能性の状態で培養物中に維持できる。そのような方法は、例えば、米国特許第5,453,357号明細書、第5,670,372号明細書、第5,690,926号明細書、第5,843,780号明細書、第6,200,806号明細書および第6,251,671号明細書に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。本明細書に記載されている胚体内胚葉作製方法のいくつかの実施形態において、hESCは、支持細胞層で維持される。そのような方法においては、hESCを多能性の状態で維持できるいかなる支持細胞層も使用することができる。ヒト胚性幹細胞の培養に一般に使用される一支持細胞層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに最近では、ヒト線維芽細胞の支持細胞層が、hESCの培養に使用するために開発されている米国特許出願第2002/0072117号明細書参照。この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。胚体内胚葉作製方法の別の実施形態は、支持細胞層を使用することなく、多能性hESCの維持を可能にする。そのような支持細胞層を使用しない条件下で多能性hESCを維持する方法は、米国特許出願第2003/0175956号明細書に記載されており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。ここで使用されるヒト胚性幹細胞は、血清の有無にかかわらず培養物中に維持することができる。いくつかの方法においては、血清代替物血清リプレースメントが使用される。別の方法においては、米国特許出願第2003/0190748号明細書に記載されているような、無血清培養技術が使用される。この特許出願の全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。幹細胞は、胚体内胚葉への分化が望まれるまで、定期的な継代培養によって、培養物中、多能性の状態で維持される。いくつかの方法においては、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量のTGFβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物に提供することにより、胚体内胚葉に分化させる。胚体内胚葉の作製に有用なTGFβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル/アクチビンまたはBMPサブグループから選択される。いくつかの好適な分化方法において、増殖因子は、ノーダル、アクチビンA、アクチビンBおよびBMP4からなる群から選択される。さらに、増殖因子Wnt3aおよび他のWntファミリーメンバーは、胚体内胚葉細胞の作製に有用である。このような分化方法において、上記増殖因子はいかなる組み合わせでも使用できる。多分化能幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化方法のいくつかに関して、上記増殖因子は、幹細胞の少なくとも一部の、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な濃度で培養物中に存在するよう、細胞に提供される。いくつかの方法において、上記増殖因子は、少なくとも約5ng/ml、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、少なくとも約1000ng/ml、少なくとも約2000ng/ml、少なくとも約3000ng/ml、少なくとも約4000ng/ml、少なくとも約5000ng/mlまたは約5000ng/ml以上の濃度で細胞培養物中に存在する。多分化能幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化方法のいくつかにおいて、上記増殖因子は、添加後、細胞培養物から除去する。例えば、増殖因子は、添加後、約1日以内、約2日以内、約3日以内、約4日以内、約5日以内、約6日以内、約7日以内、約8日以内、約9日以内又は10日以内に除去してもよい。好適な方法において、増殖因子は、添加の約4日後に除去する。胚体内胚葉細胞の培養物は、少量の血清を含むか、あるいは、血清を含まない培地で増殖させることができる。ある培養条件において、血清濃度は、約0.05v/v~約20v/vの範囲であればよい。例えば、ある分化方法において、培地の血清濃度は、約0.05v/v未満、約0.1v/v未満、約0.2v/v未満、約0.3v/v未満、約0.4v/v未満、約0.5v/v未満、約0.6v/v未満、約0.7v/v未満、約0.8v/v未満、約0.9v/v未満、約1v/v未満、約2v/v未満、約3v/v未満、約4v/v未満、約5v/v未満、約6v/v未満、約7v/v未満、約8v/v未満、約9v/v未満、約10v/v未満、約15v/v未満または約20v/v未満であってもよい。いくつかの方法において、胚体内胚葉細胞は、血清なしで、あるいは、血清代替物を用いて増殖させる。さらに別の方法において、胚体内胚葉細胞は、B27の存在下で増殖させる。そのような方法において、B27サプリメントの濃度は、約0.1v/v~約20v/vの範囲であればよい。多分化能細胞からPDX1陰性胚体内胚葉胚体内胚葉への分化のモニタリングhESC培養物の胚体内胚葉への進行は、胚体内胚葉に特有のマーカーの発現を測定することによりモニターすることができる。いくつかの方法において、あるマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することにより測定される。また、あるマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞内におけるマーカーの存在量を測ることにより測定される。そのような方法において、マーカーの発現測定は、定性的測定であっても定量的測定であってもよい。マーカー遺伝子により作られる発現マーカーを定量化する一方法は、定量PCRQ-PCRを利用したものである。Q-PCRを行う方法は、当技術分野においては周知である。また、当技術分野において周知となっている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量化に使用できる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異な抗体を使用することにより検出することができる。いくつかの方法において、胚体内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現のほかに、hESCや他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の著しい発現の欠如も測定される。以下の実施例においてさらに説明するように、胚体内胚葉の信頼できるマーカーは、SOX17遺伝子である。そのため、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、SOX17マーカー遺伝子を発現することにより、SOX17遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1およびCRIP1である。いくつかの方法において、SOX17およびSOX7の発現がモニターされ、胚体内胚葉細胞は、原始および臓側内胚葉に特有のSOX7マーカー遺伝子表1参照より高いレベルでSOX17マーカー遺伝子を発現する。さらに、いくつかの方法においては、SOX17マーカー遺伝子と、hESCに特有のOCT4マーカー遺伝子の発現がモニターされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、AFP、SPARCまたはトロンボモジュリンTMマーカー遺伝子より高いレベルでSOX17マーカー遺伝子を発現するので、これらの遺伝子の発現をモニターしてもよい。胚体内胚葉の別のマーカーは、CXCR4遺伝子である。CXCR4遺伝子は、リガンドが化学誘引物質SDF-1である細胞表面ケモカイン受容体をコードする。成体における、CXCR4受容体を有する細胞の主な役割は、造血細胞の骨髄への移動、リンパ球輸送および様々なB細胞とマクロファージ血液細胞系列の分化であると考えられている[Kim,C.およびBroxmeyer,H.J.LeukocyteBiol.65、6-151999]。また、CXCR4受容体は、HIV-1のT細胞侵入のための共同受容体としても機能する[Feng,Y.etal.Science、272、872-8771996]。[McGrath,K.E.etal.Dev.Biology213、442-4561999]により行われた広範囲に及ぶ一連の研究では、ケモカイン受容体CXCR4とその特異なリガンド、SDF-1[Kim,C.,およびBroxmyer,H.,J.LeukocyteBiol.65、6-151999]の発現は、マウスの初期発生および成体期において認められた。いずれかの遺伝子が、トランスジェニックマウス内で壊されたときに、後期胚の致死を引き起こすことが実証されたので[Nagasawaetal.Nature、382、635-6381996]、Ma,Q.,etalImmunity、10、463-4711999]、発生過程におけるCXCR4/SDF1の相互作用が明らかになった。McGrathetal.は、RNase保護とinsituハイブリダイゼーション法を組合せて使用し、CXCR4が、初期原腸陥入胚E7.5のときに検出される最も大量のケモカイン受容体メッセンジャーRNAであることを実証した。原腸陥入胚では、CXCR4/SDF-1シグナル伝達は、原条胚葉細胞の移動を誘導することに主に関与しているようであり、このとき存在する胚体内胚葉、中胚葉および胚外中胚葉で見られる。E7.2~7.8のマウス胚において、CXCR4とアルファフェトプロテインは互いに排他的であり、臓側内胚葉において発現しないことを示している[McGrath,K.E.etal.Dev.Biology213、442-4561999]。多分化能細胞を分化させることにより作られるいくつかの胚体内胚葉細胞は、CXCR4マーカー遺伝子を発現し、胚体内胚葉細胞の作製を調べるため、CXCR4の発現がモニターされる。さらに、本明細書に記載されている方法により作製される胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。他のマーカーとしては、SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1およびCRIP1が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの胚体内胚葉細胞は、SOX7マーカー遺伝子より高いレベルでCXCR4マーカー遺伝子を発現し、CXCR4およびSOX7の発現がモニターされる。他の方法においては、CXCR4マーカー遺伝子と、OCT4マーカー遺伝子の発現がモニターされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、AFP、SPARCまたはトロンボモジュリンTMマーカー遺伝子より高いレベルでCXCR4マーカー遺伝子を発現するので、これらの遺伝子の発現をモニターしてもよい。当然のことながら、内胚葉細胞におけるCXCR4の発現が、SOX17の発現を妨げることはない。このように、本明細書記載の方法によって作られる胚体内胚葉細胞は、SOX17およびCXCR4を実質的に発現し、AFP、TM、SPARCまたはPDX1を実質的に発現しない。胚体内胚葉の豊富化、分離および/または精製前述のいずれかの方法により作られた胚体内胚葉細胞は、そのような細胞に特異な親和性標識を使用することにより、濃縮豊富化、分離および/または精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異な親和性標識の例としては、胚体内胚葉細胞の細胞表面には存在するが、本明細書に記載されている方法により作製される細胞培養物において見られる他の細胞型には実質的に存在しないポリペプチドなどのマーカー分子に特異的な抗体、リガンドまたは他の結合剤が挙げられる。いくつかの方法においては、CXCR4に結合する抗体が、胚体内胚葉細胞の濃縮、分離または精製のための親和性標識として使用される。また、他の方法においては、ケモカインSDF-1または他のSDF-1系分子も、親和性標識として使用することができる。そのような分子としては、SDF-1断片、SDF-1融合物、またはSDF-1模倣物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体を作製する方法、およびそれらを細胞分離に使用する方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法は、本明細書に記載されている胚体内胚葉細胞や抗体を用いて実施することができる。ある方法において、CXCR4に結合する抗体は、磁気ビーズに付着させた後、細胞間および基質接着性を低下させるよう酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に結合させる。そして、細胞/抗体/ビーズ複合体を、ビーズ結合胚体内胚葉細胞を非結合細胞から分離するために使用する変動磁界に曝す。一旦、胚体内胚葉細胞を培養物中の他の細胞から物理的に分離すると、抗体結合を解き、その細胞を適切な組織培養培地に再度蒔き培養する。濃縮、分離または精製された胚体内胚葉細胞培養物または集団を得るため、他の方法を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、CXCR4抗体は、細胞間および基質接着性を低下させるよう処理された胚体内胚葉含有細胞培養物と共にインキュベートされる。その後、細胞を洗浄し、遠心分離し、再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、一次抗体に結合し得るFITC標識抗体などの二次抗体と共にインキュベートする。その後、その細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液中に再懸濁させる。そして、細胞懸濁液を、蛍光活性化細胞選別装置FACSを用いて分析選別する。CXCR4陽性細胞を、CXCR4陰性細胞とは別に回収することにより、そのような細胞型を分離することができる。必要に応じて、分離された細胞組成物は、親和性を利用した別の方法を利用するか、あるいは胚体内胚葉に特異的な、同じまたは別のマーカーを用いてさらに一連の選別を行なうことにより、さらに精製することができる。さらに他の方法において、胚体内胚葉細胞は、CXCR4に結合するリガンドまたは他の分子を用いて、濃縮、分離および/または精製される。いくつかの方法において、その分子は、SDF-1、或いはその断片、融合物または模倣物である。好適な方法において、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が、胚体内胚葉系列に沿って分化するよう誘導された後、濃縮され、他の非胚体内胚葉細胞から分離および/または精製される。当然のことながら、上記濃縮、分離および精製方法は、分化のどの段階においても、上記のような培養物で採用することができる。また、上述の方法に加え、胚体内胚葉細胞は、細胞を分離する他の技術により分離してもよい。さらに、胚体内胚葉細胞は、前記胚体内胚葉細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する増殖条件で、連続継代培養法により濃縮または分離してもよい。本明細書に記載されている方法を用いて、濃縮、分離および/または精製された胚体内胚葉細胞の集団および/または組織は、少なくともいくらか分化した、幹細胞培養物または集団などの多能性細胞培養物またはその細胞集団から生体外で作製することができる。いくつかの方法において、細胞は、ランダムに分化する。しかしながら、好適な方法において、細胞は、主として胚体内胚葉に分化するように誘導される。いくつかの好適な濃縮、分離および/または精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の生体外での作製に関する。本明細書に記載されている方法を用いて、細胞集団または細胞培養物の胚体内胚葉含有量を、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約2倍から約1000倍に濃縮することができる。PDX1陰性胚体内胚葉胚体内胚葉を含む組成物本明細書記載の方法によって作製される細胞組成物は、胚体内胚葉を含む細胞培養物と、胚体内胚葉を豊富に含む細胞集団とを包含する。例えば、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が、その培養物中の細胞の少なくとも約50~80が胚体内胚葉細胞であるものを作製可能である。分化方法の効率は、一定のパラメーターを変更することにより調整できるため、本明細書に記載した分化方法では、多能性細胞の胚体内胚葉への転換は、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、または約95以上でありうる。前記一定のパラメーターとしては、細胞増殖条件、増殖因子濃度および培養段階のタイミングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。胚体内胚葉細胞の単離方法では、例えば、CXCR4受容体に結合する親和剤を使用して、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団を得ることができる。PDX1陰性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉の作製本明細書記載のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および細胞集団は、前述のように多分化能細胞から得られるPDX1陰性胚体内胚葉から作られる。好適な方法は、出発材料としてヒト胚性幹細胞を使用する。ある実施形態によると、hESCをまずPDX1陰性胚体内胚葉に変換し、次にPDX1陽性前腸内胚葉細胞に変換する。しかし、PDX1陽性前腸内胚葉作製のための出発材料は、多分化能細胞分化法により作られた胚体内胚葉細胞に限定されるものではない。PDX1陰性胚体内胚葉細胞は、その起源にかかわらず、本明細書記載の方法で得られるものを使用できる。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団は、さらにPDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞培養物および/又は細胞集団に分化させるために用いることができる。例えば、ヒトPDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を用いることができる。いくつかの実施形態において、細胞培養物または細胞集団は、先の分化工程すなわち、多分化能細胞から胚体内胚葉細胞への分化工程において使用したアクチビン、ノーダルおよび/又はBMPなどの分化促進因子を含むものであってもよい。他の実施形態において、先の分化工程において使用した因子は、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化のために使用される因子の添加前に細胞培養物または細胞集団から除去される。いくつかの実施形態において、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞作製のための材料として使用される。PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に、PDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する分化促進因子前腸分化促進因子を加えることによって、培養物中のPDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性内胚葉細胞へと分化させる。本発明のいくつかの実施形態において、前腸分化促進因子は、レチノイン酸RAなどのレチノイドである。いくつかの実施形態において、レチノイドは、FGF-4やFGF-10などの線維芽細胞増殖因子と組み合わせて使用される。他の実施形態において、レチノイドは、TGFβスーパーファミリーの増殖因子メンバーおよび/又は条件培地と組み合わせて使用される。条件培地とは、基礎培地と比較して変更された培地を意味する。例えば、培地の条件付けは、栄養因子および/又は増殖因子などの分子を加えたり、基礎培地の元のレベルから低下させることによってもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ある期間ある条件の下で培地のある細胞型を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。例えば、所定時間、所定温度にて所定組成の培地中でhESCを増殖、分化または維持させることによって、培地は条件付けされる。当業者にとって理解できるように、細胞、培地のタイプ、時間および環境条件の様々な組み合わせが、殆ど無限の種類の条件培地作製に使用することができる。本発明のいくつかの実施形態において、血清濃度が約1から約20の培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。他の実施形態において、約1ng/mlから約1000ng/mlのアクチビンAを含む培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。さらに他の実施形態において、約1ng/mlから約1000ng/mlのBMP4を含む培地で、分化した多分化能細胞を成長または維持させることによって、培地は条件付けされる。好適な実施形態において、約25ng/mlのアクチビンAと約2μMのRAを含むRPMIなどの培地で24時間、分化したhESCを成長または維持させることによって、条件培地は調製される。本発明のいくつかの実施形態において、培地の条件付けに使用され、PDX1陰性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉への分化を高めるために使用される細胞は、hESCなどの多分化能細胞から、約0-約20の血清および/又はTGFβスーパーファミリーの増殖/分化促進因子を1以上含むRPMIなどの培地で約5日間にわたって分化される細胞である。アクチビンAおよびBMP4などの分化促進因子は、約1ng/mlから約1000ng/mlの範囲の濃度で供給される。本発明のある実施形態において、培地の条件付けに使用される細胞は、hESCから、低血清RPMIで約5日間にわたって分化される細胞である。いくつかの実施形態によると、低血清RPMIとは、血清濃度が所定期間にわたって徐々に増加する低血清培地のことである。例えば、ある実施形態によると、低血清RPMIは、細胞増殖の初日は約0.2のウシ胎児血清FBS、細胞増殖の2日目は約0.5のFBS、細胞増殖の3-5日目は約2のFBSを含んでいる。他の実施形態では、低血清RPMIは、初日は約0、2日目は約0.2、3-6日目は約2のFBSを含んでいる。ある好適な実施形態では、低血清RPMIは、アクチビンAおよびBMP4などの分化促進因子を1以上含んでいる。培地の条件付けに使用される細胞の調製での使用に加えて、低血清RPMIは、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化のための培地として使用することができる。条件培地は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の成長または維持を妨げるものでない限り、RPMI以外の培地から調製できること、また、培地の条件付けに使用できる細胞には種々のタイプのものを使用できることが、当業者に理解されるだろう。新たに分化させた細胞を培地の条件付けに使用する場合、そのような細胞の分化は、当該細胞の成長または維持を妨げるものでない限り、RPMI以外の培地で行うことができる。さらに、条件付けの期間、条件付けのための細胞の調製期間は、それぞれ24時間、5日間である必要はなく、他の期間であっても同様の効果を得ることが可能であることが、当業者に理解されるだろう。概して、線維芽細胞増殖因子、TGFβスーパーファミリーの増殖因子メンバー、条件培地、またはこれら前腸分化促進因子の組み合わせのいずれかと、レチノイドとを組み合わせて使用すると、レチノイド単独に比べて、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を高める。好適な実施形態では、RAおよびFGF-10の双方が、PDX1陰性胚体内胚葉細胞培養物に供給される。他の好適な実施形態では、条件培地、アクチビンA、アクチビンBおよびRAを含む培養物においてPDX1陰性胚体内胚葉細胞を分化させる。本明細書記載の分化方法の実施形態において、前記前腸分化促進因子は、これらの因子がPDX1陰性胚体内胚葉の細胞培養物または細胞集団の少なくとも一部のPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進するのに十分な濃度で細胞培養物または細胞集団に存在するように、細胞に供給される。一部という用語は、細胞培養物または/又は細胞集団と組み合わせて使用される場合、細胞培養物又は細胞集団の単一細胞から全体までにわたる、量的にゼロでない細胞培養物又は細胞集団を意味する。本発明のいくつかの実施形態において、レチノイドは、少なくとも約0.01μM、少なくとも約0.02μM、少なくとも約0.04μM、少なくとも約0.08μM、少なくとも約0.1μM、少なくとも約0.2μM、少なくとも約0.3μM、少なくとも約0.4μM、少なくとも約0.5μM、少なくとも約0.6μM、少なくとも約0.7μM、少なくとも約0.8μM、少なくとも約0.9μM、少なくとも約1μM、少なくとも約1.1μM、少なくとも約1.2μM、少なくとも約1.3μM、少なくとも約1.4μM、少なくとも約1.5μM、少なくとも約1.6μM、少なくとも約1.7μM、少なくとも約1.8μM、少なくとも約1.9μM、少なくとも約2μM、少なくとも約2.1μM、少なくとも約2.2μM、少なくとも約2.3μM、少なくとも約2.4μM、少なくとも約2.5μM、少なくとも約2.6μM、少なくとも約2.7μM、少なくとも約2.8μM、少なくとも約2.9μM、少なくとも約3μM、少なくとも約3.5μM、少なくとも約4μM、少なくとも約4.5μM、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、少なくとも約30μM、少なくとも約40μM、または少なくとも約50μMの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。ここでレチノイドとは、レチノール、レチナール、レチノイン酸およびこれら化合物の誘導体を意味する。好適な実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。本発明の他の実施形態においては、線維芽細胞増殖因子ファミリーの分化促進因子が、1又は2以上細胞培養物に存在する。例えば、いくつかの実施形態では、FGF-4は、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、または少なくとも約1000ng/mlの濃度で細胞培養物に存在させることができる。本発明のさらに他の実施形態においては、FGF-10は、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、または少なくとも約1000ng/mlの濃度で細胞培養物に存在させることができる。いくつかの実施形態では、FGF-4またはFGF-10のいずれかが、RAと一緒に細胞培養物に供給される。好適な実施形態では、RAの細胞培養物での濃度は1μMであり、FGF-10の濃度は50ng/mlである。本発明のいくつかの実施形態においては、TGFβスーパーファミリーの増殖因子、および/又は条件培地が、細胞培養物に存在する。これらの分化促進因子は、RAおよび/又は他の中腸―前腸分化促進因子FGF-4、FGF-10を含むが、これに限定されないと組み合わせて使用できる。例えば、いくつかの実施形態においては、アクチビンAおよび/又はアクチビンBが、少なくとも約5ng/ml、少なくとも約10ng/ml、少なくとも約25ng/ml、少なくとも約50ng/ml、少なくとも約75ng/ml、少なくとも約100ng/ml、少なくとも約200ng/ml、少なくとも約300ng/ml、少なくとも約400ng/ml、少なくとも約500ng/ml、または少なくとも約1000ng/mlの濃度で細胞培養物に存在する。本発明のさらに他の実施形態においては、条件培地が、培地全体の少なくとも約1、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100の濃度で細胞培養物に存在する。いくつかの実施形態においては、アクチビンA、アクチビンBおよび条件培地が、RAと一緒に細胞培養物に供給される。好適な実施形態では、約1μMのRA、約25ng/mlのアクチビンA、および分化したhESC約100ng/mlのアクチビンAを含む低血清RPMIで約5日間分化させたものによって約24時間条件付けられた低血清RPMI培地を含む細胞培養物において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞をPDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化させる。他の好適な実施形態では、アクチビンBおよび/又はFGF-10もまた、それぞれ25ng/mlと50ng/mlの濃度で培養物に存在する。本発明のいくつかの実施形態において、前記前腸分化促進因子は、添加後、細胞培養物から除去される。例えば、前腸分化促進因子は、添加後、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、または約10日以内に除去することができる。PDX1陽性前腸内胚葉細胞クラスターは、低血清培地にて増殖可能である。血清濃度は、約0.05v/vから約20v/vの範囲にすることができる。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物で増殖される。例えば、いくつかの実施形態において、培地の血清濃度は、約0.05v/v未満、約0.1v/v未満、約0.2v/v未満、約0.3v/v未満、約0.4v/v未満、約0.5v/v未満、約0.6v/v未満、約0.7v/v未満、約0.8v/v未満、約0.9v/v未満、約1v/v未満、約2v/v未満、約3v/v未満、約4v/v未満、約5v/v未満、約6v/v未満、約7v/v未満、約8v/v未満、約9v/v未満、約10v/v未満、約15v/v未満、または約20v/v未満とすることができる。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、血清なしで増殖される。他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替物で増殖される。さらに他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、B27存在下で増殖される。そのような実施形態において、B27は、約0.1v/vから約20v/vの範囲あるいは約20v/v以上の濃度で、細胞培養物に供給することができる。いくつかの実施形態において、培地のB27の濃度は、約0.1v/v、約0.2v/v、約0.3v/v、約0.4v/v、約0.5v/v、約0.6v/v、約0.7v/v、約0.8v/v、約0.9v/v、約1v/v、約2v/v、約3v/v、約4v/v、約5v/v、約6v/v、約7v/v、約8v/v、約9v/v、約10v/v、約15v/v、または約20v/vとすることができる。選択的に、添加したB27サプリメントの濃度は、商業的に入手可能なB27ストック溶液の強度によって測定できる。例えば、B27は、Invitrogen社CarlsbadCAの50Xストック溶液を利用できる。十分な容量の増殖培地に、このストック溶液を十分量加えると、所望の量のB27が供給された培地とすることができる。例えば、90mlの増殖培地に、50XB27ストック溶液を10ml加えると、50XB27が供給された増殖培地とすることができる。培地へのB27供給濃度は、約0.1X、約0.2X、約0.3X、約0.4X、約0.5X、約0.6X、約0.7X、約0.8X、約0.9X、約1X、約1.1X、約1.2X、約1.3X、約1.4X、約1.5X、約1.6X、約1.7X、約1.8X、約1.9X、約2X、約2.5X、約3X、約3.5X、約4X、約4.5X、約5X、約6X、約7X、約8X、約9X、約10X、約11X、約12X、約13X、約14X、約15X、約16X、約17X、約18X、約19X、約20X、または約20X以上とすることができる。PDX1陰性胚体内胚葉からPDX1陽性内胚葉への分化のモニタリング多分化能細胞から胚体内胚葉への分化と同様に、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉からPDX1陽性前腸内胚葉への分化の進行は、これらの細胞型に特有のマーカーの発現を測定することによりモニターすることができる。そのようなモニタリングによって、例えば、1又は2以上の分化促進因子の濃度や環境条件など、種々の条件下での所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の生産に十分な時間を決定することができる。好適な実施形態では、所望量のPDX1陽性前腸内胚葉の生産に十分な時間は、PDX1発現を検出することによって決定される。本発明のいくつかの実施形態において、あるマーカーの発現は、マーカーの有無を検出することにより測定される。また、あるマーカーの発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞内におけるマーカーの存在量を測ることにより測定される。そのような実施形態において、マーカーの発現測定は、定性的測定であっても定量的測定であってもよい。前述のように、マーカー遺伝子により作られる発現マーカーを定量化する好適な方法は、Q-PCRを利用したものである。ある実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現、および他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の発現欠如を定量化することによって、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉培養物の細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への進行をモニターするため、Q-PCRを使用する。また、当技術分野において公知となっている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量化に使用できる。例えば、マーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異な抗体を使用することにより検出することができる。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉に特有のマーカー遺伝子の発現のほかに、PDX1陰性胚体内胚葉、hESCおよび他の細胞型に特有のマーカー遺伝子の著しい発現の欠如も測定される。以下の実施例においてさらに説明するように、PDX1は、PDX1陽性前腸内胚葉に関係するマーカー遺伝子である。そのため、本発明のいくつかの実施形態において、PDX1の発現が測定される。他の実施形態では、PDX1陽性前腸内胚葉にて発現する他のマーカー遺伝子SOX17、HOXA13および/又はHOXC6を含むが、これに限定されないの発現が測定される。PDX1はまた、他の所定の細胞型臓側内胚葉および所定の神経系外胚葉で発現する場合があるので、本発明のいくつかの実施形態は、臓側内胚葉および/又は神経系外胚葉と関係するマーカー遺伝子の発現欠如または実質的な発現欠如を確かめている。例えば、いくつかの実施形態では、臓側内胚葉および/又は神経系細胞で発現するマーカー遺伝子SOX7、AFP、SOX1、ZIC1および/又はNFMを含むが、これに限定されないの発現が測定される。いくつかの実施形態では、本明細書記載の方法によって作製されるPDX1陽性前腸内胚葉の細胞培養物は、SOX7、AFP、SOX1、ZIC1又はNFMマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。ある実施形態では、本明細書記載の方法によって作製されるPDX1陽性前腸内胚葉の細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉および/又は神経系細胞を実質的に含まない。PDX1陽性前腸内胚葉の豊富化、分離および/または精製本発明の更なる態様として、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、濃縮豊富化、分離および/または精製することができる。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を豊富に含む細胞集団は、当該細胞を培養物から分離することによって作製される。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、蛍光標識され、その後、蛍光活性化細胞選別装置FACSを用いて非標識細胞から分離される。そのような実施形態において、緑色蛍光タンパク質GFPをコードする核酸または発現性蛍光マーカー遺伝子をコードする他の核酸が、PDX1陽性細胞を標識するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、PDX1プロモーターの下流に、GFPまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする少なくとも1コピーの核酸が、多分化能細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞に導入され、PDX1プロモーターの制御下に、GFP遺伝子産物またはその生物活性をもつフラグメントを発現させるようにする。いくつかの実施形態では、PDX1をコードする核酸の全コード領域が、GFPまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする核酸に置換される。他の実施形態では、GFPまたはその生物活性をもつフラグメントをコードする核酸は、PDX1をコードする核酸の少なくとも一部と融合され、融合タンパク質を生じさせる。そのような実施形態では、融合タンパク質は、GFPと同様の蛍光活性を保持する。上記多分化能細胞のように蛍光標識された細胞は、前述したように、胚体内胚葉、さらにPDX1陽性前腸内胚葉へと分化される。PDX1陽性前腸内胚葉細胞は蛍光マーカーを発現する一方、PDX1陰性細胞は発現しないので、これら2つの細胞型を分離することができる。いくつかの実施形態では、蛍光標識されたPDX1陽性細胞と非標識のPDX1陰性細胞との混合物を含む細胞懸濁液から、FACSを用いて選別する。PDX1陽性細胞は、PDX1陰性細胞と分離して回収され、その細胞型が分離される。必要に応じて、分離された細胞組成物は、PDX1陽性前腸内胚葉に特異的な、同じまたは別のマーカーを用いてさらに一連の選別を行なうことにより、さらに精製することができる。また、上述の方法に加え、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、細胞を分離する他の技術により分離してもよい。さらに、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する増殖条件で、連続継代培養法により濃縮または分離してもよい。当然のことながら、上記濃縮、分離および精製方法は、分化のどの段階においても、上記のような培養物で採用することができる。本明細書に記載されている方法を用いて、濃縮、分離および/または精製されたPDX1陽性前腸内胚葉細胞の集団および/または組織は、少なくともいくらか分化した、PDX1陰性SOX17陽性胚体内胚葉細胞培養物またはその細胞集団から生体外で作製することができる。いくつかの方法において、細胞は、ランダムに分化する。しかしながら、好適な方法において、細胞は、主としてPDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化するように誘導される。いくつかの好適な濃縮、分離および/または精製方法は、ヒト胚性幹細胞からのPDX1陽性前腸内胚葉細胞の生体外での作製に関する。本明細書に記載されている方法を用いて、細胞集団または細胞培養物のPDX1陽性前腸内胚葉細胞含有量を、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約2倍から約1000倍に濃縮することができる。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約5倍から約500倍に濃縮することができる。他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約10倍から約200倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約20倍から約100倍まで濃縮することができる。さらに他の実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約40倍から約80倍まで濃縮することができる。ある実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して、少なくとも約2倍から約20倍まで濃縮することができる。PDX1陽性前腸内胚葉を含む組成物本発明のいくつかの実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものであって、前記PDX1陽性前腸内胚葉細胞が、腸管前方部由来の細胞、組織または器官に分化し得る多分化能細胞PDX1陽性前腸内胚葉である。いくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好適な実施形態において、胚体内胚葉はヒト細胞である。本発明の他の実施形態は、hESC、PDX1陰性胚体内胚葉細胞、PDX1陽性前腸内胚葉細胞および中胚葉細胞からなる群から選ばれる1又は2以上の細胞型の細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。いくつかの実施形態において、hESCは、培養物の全細胞の約5未満、約4未満、約3未満、約2未満、または約1未満である。他の実施形態において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞は、培養物の全細胞の約90未満、約85未満、約80未満、約75未満、約70未満、約65未満、約60未満、約55未満、約50未満、約45未満、約40未満、約35未満、約30未満、約25未満、約20未満、約15未満、約10未満、約8未満、約6未満、約5未満、約4未満、約3未満、約2未満、または約1未満である。さらに他の実施形態において、中胚葉細胞は、培養物の全細胞の約90未満、約85未満、約80未満、約75未満、約70未満、約65未満、約60未満、約55未満、約50未満、約45未満、約40未満、約35未満、約30未満、約25未満、約20未満、約15未満、約10未満、約8未満、約6未満、約5未満、約4未満、約3未満、約2未満、または約1未満である。本発明のさらに他の実施形態は、本明細書記載の方法によって作られ、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を主要な細胞型として含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。いくつかの実施形態において、本明細書記載の方法は、少なくとも約99、少なくとも約98、少なくとも約97、少なくとも約96、少なくとも約95、少なくとも約94、少なくとも約93、少なくとも約92、少なくとも約91、少なくとも約90、少なくとも約85、少なくとも約80、少なくとも約75、少なくとも約70、少なくとも約65、少なくとも約60、少なくとも約55、少なくとも約54、少なくとも約53、少なくとも約52、または少なくとも約51のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および/又は細胞集団を作製する。好適な実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含んでいる。他の実施形態では、本明細書記載の方法は、少なくとも約50、少なくとも約45、少なくとも約40、少なくとも約35、少なくとも約30、少なくとも約25、少なくとも約20、少なくとも約19、少なくとも約18、少なくとも約17、少なくとも約16、少なくとも約15、少なくとも約14、少なくとも約13、少なくとも約12、少なくとも約11、少なくとも約10、少なくとも約9、少なくとも約8、少なくとも約7、少なくとも約6、少なくとも約5、少なくとも約4、少なくとも約3、少なくとも約2、または少なくとも約1のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物および/又は細胞集団を作製する。好適な実施形態では、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含んでいる。いくつかの実施形態において、細胞培養物又は細胞集団におけるPDX1陽性前腸内胚葉細胞の割合は、培養物に残存する支持細胞を除いて計算される。本発明のさらに他の実施形態は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞とPDX1陰性胚体内胚葉細胞との混合物を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものである。例えば、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約95個につき、少なくとも約5個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。他の実施形態においては、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約5個につき、少なくとも約95個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。また、PDX1陰性胚体内胚葉細胞に対し、他の割合のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を作製できる。例えば、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1000000個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約100000個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約10000個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1000個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約500個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約100個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約10個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約5個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約4個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約2個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約1個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約2個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約4個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約5個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約10個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約20個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約50個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約100個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約1000個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約10000個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、少なくとも約100000個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞、PDX1陰性胚体内胚葉細胞約1個につき、および少なくとも約1000000個のPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物を作製できる。本発明のいくつかの実施形態において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を作るためのPDX1陰性胚体内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞などのヒト多分化能細胞由来である。ある実施形態では、ヒト多分化能細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊または胚の生殖隆起に由来する。他の実施形態では、ヒト多分化能細胞は、胎生期を過ぎ発達した多細胞構造の生殖組織に由来する。本発明のさらに他の実施形態は、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉を含むヒト細胞を有する細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物に関するものであって、前記ヒト細胞の少なくとも約2において、PDX1マーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。他の実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約5、ヒト細胞の少なくとも約10、ヒト細胞の少なくとも約15、ヒト細胞の少なくとも約20、ヒト細胞の少なくとも約25、ヒト細胞の少なくとも約30、ヒト細胞の少なくとも約35、ヒト細胞の少なくとも約40、ヒト細胞の少なくとも約45、ヒト細胞の少なくとも約50、ヒト細胞の少なくとも約55、ヒト細胞の少なくとも約60、ヒト細胞の少なくとも約65、ヒト細胞の少なくとも約70、ヒト細胞の少なくとも約75、ヒト細胞の少なくとも約80、ヒト細胞の少なくとも約85、ヒト細胞の少なくとも約90、ヒト細胞の少なくとも約95、またはヒト細胞の少なくとも約98において、PDX1マーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、細胞培養物または細胞集団において、PDX1の発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高いヒト細胞の割合は、支持細胞を除いて計算される。本発明のいくつかの実施形態は、ヒトPDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、当該ヒト細胞の少なくとも約2から少なくとも約98以上において、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される1又は2以上のマーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、ヒト細胞の少なくとも約5、ヒト細胞の少なくとも約10、ヒト細胞の少なくとも約15、ヒト細胞の少なくとも約20、ヒト細胞の少なくとも約25、ヒト細胞の少なくとも約30、ヒト細胞の少なくとも約35、ヒト細胞の少なくとも約40、ヒト細胞の少なくとも約45、ヒト細胞の少なくとも約50、ヒト細胞の少なくとも約55、ヒト細胞の少なくとも約60、ヒト細胞の少なくとも約65、ヒト細胞の少なくとも約70、ヒト細胞の少なくとも約75、ヒト細胞の少なくとも約80、ヒト細胞の少なくとも約85、ヒト細胞の少なくとも約90、ヒト細胞の少なくとも約95、またはヒト細胞の少なくとも約98において、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される1又は2以上のマーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。いくつかの実施形態では、細胞培養物または細胞集団において、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される1又は2以上のマーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高いヒト細胞の割合は、支持細胞を除いて計算される。本発明の他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、前記内胚葉細胞の少なくとも約2において、PDX1マーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。他の実施形態では、内胚葉細胞の少なくとも約5、内胚葉細胞の少なくとも約10、内胚葉細胞の少なくとも約15、内胚葉細胞の少なくとも約20、内胚葉細胞の少なくとも約25、内胚葉細胞の少なくとも約30、内胚葉細胞の少なくとも約35、内胚葉細胞の少なくとも約40、内胚葉細胞の少なくとも約45、内胚葉細胞の少なくとも約50、内胚葉細胞の少なくとも約55、内胚葉細胞の少なくとも約60、内胚葉細胞の少なくとも約65、内胚葉細胞の少なくとも約70、内胚葉細胞の少なくとも約75、内胚葉細胞の少なくとも約80、内胚葉細胞の少なくとも約85、内胚葉細胞の少なくとも約90、内胚葉細胞の少なくとも約95、または内胚葉細胞の少なくとも約98において、PDX1マーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。本発明のさらに他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞などの哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの組成物に関するものであって、前記内胚葉細胞の少なくとも約2において、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される1又は2以上のマーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。他の実施形態では、内胚葉細胞の少なくとも約5、内胚葉細胞の少なくとも約10、内胚葉細胞の少なくとも約15、内胚葉細胞の少なくとも約20、内胚葉細胞の少なくとも約25、内胚葉細胞の少なくとも約30、内胚葉細胞の少なくとも約35、内胚葉細胞の少なくとも約40、内胚葉細胞の少なくとも約45、内胚葉細胞の少なくとも約50、内胚葉細胞の少なくとも約55、内胚葉細胞の少なくとも約60、内胚葉細胞の少なくとも約65、内胚葉細胞の少なくとも約70、内胚葉細胞の少なくとも約75、内胚葉細胞の少なくとも約80、内胚葉細胞の少なくとも約85、内胚葉細胞の少なくとも約90、内胚葉細胞の少なくとも約95、または内胚葉細胞の少なくとも約98において、SOX17、HOXA13およびHOXC6からなる群から選択される1又は2以上のマーカーの発現が、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカーの発現より高い。本明細書に記載されている方法を用いて、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含み、実質的に他の細胞型を含まない組成物を作製することができる。細胞培養物または細胞集団内の細胞に関して、実質的に含まないという表現は、細胞培養物または細胞集団が含まない特定の細胞型が、細胞培養物または細胞集団に存在する細胞総数の約5未満の量で存在することを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されている方法により作製されるPDX1陽性前腸内胚葉細胞集団または細胞培養物は、AFP、SOX7、SOX1、ZIC1および/又はNFMマーカー遺伝子を著しく発現する細胞を実質的に含まない。本発明の一実施形態において、マーカー遺伝子の発現に基づいてPDX1陽性前腸内胚葉細胞を表した場合、PDX1高、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低、NFM低となる。SOX17陽性胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を高める方法本発明のいくつかの態様は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団においてPDX1遺伝子産物の発現を高める方法に関する。そのような実施形態において、SOX17陽性胚体内胚葉細胞に、PDX1遺伝子産物の発現を高めるのに十分な量の分化促進因子を接触させる。分化促進因子と接触させると、SOX17陽性胚体内胚葉細胞は、PDX1陰性またはPDX1陽性となる。いくつかの実施形態において、分化促進因子はレチノイドであり、SOX17陽性胚体内胚葉細胞に、約0.01μMから約50μMの濃度範囲のレチノイドを接触させる。好適な実施形態では、レチノイドはRAである。本発明の他の実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団において、PDX1遺伝子産物の発現は、SOX17陽性細胞に線維芽細胞増殖因子ファミリーの分化促進因子を接触させることによって高められる。そのような分化促進因子は単独で用いてもよいし、RAと組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、SOX17陽性胚体内胚葉細胞に、約10ng/mlから約1000ng/mlの濃度範囲の線維芽細胞増殖因子を接触させる。好適な実施形態では、線維芽細胞増殖因子はFGF-10である。本発明のいくつかの実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団において、PDX1遺伝子産物の発現は、SOX17陽性細胞にB27を接触させることによって高められる。この分化促進因子は単独で用いてもよいし、分化促進因子であるレチノイン酸および線維芽細胞増殖因子ファミリーの一方または両方と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態において、SOX17陽性胚体内胚葉細胞に、約0.1v/vから約20v/vの濃度範囲のB27を接触させる。好適な実施形態では、SOX17陽性胚体内胚葉細胞に、RA、FGF-10およびB27を接触させる。SOX17陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団においてPDX1遺伝子産物の発現を高める方法は、低血清または無血清の増殖培地にて行うことができる。いくつかの実施形態において、血清濃度は、約0.05v/vから約20v/vの範囲であり、他の実施形態では、SOX17陽性細胞は、血清代替物で増殖される。PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る分化促進因子を同定する方法本発明の他の態様は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る1又は2以上の分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を得た後、細胞培養物または細胞集団でのPDX1の発現が決定される。PDX1の発現を決定した後、細胞培養物または細胞集団の細胞に、候補分化促進因子を接触させる。いくつかの実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後のPDX1の発現が決定される。PDX1発現はまた、細胞と候補分化促進因子との接触後に、1回または2回以上決定される。候補分化促進因子との接触後に、PDX1発現が、当該接触前のPDX1発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。いくつかの実施形態において、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進し得る因子を同定する前記方法は、細胞培養物または細胞集団でのHOXA13遺伝子および/又はHOXC6遺伝子の発現をさらに決定する方法を含む。そのような実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触前後における、HOXA13および/又はHOXC6の発現を決定する。候補分化促進因子との接触後のPDX1およびHOXA13の発現が、当該接触前のPDX1およびHOXA13の発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。同様に、候補分化促進因子との接触後のPDX1およびHOXC6の発現が、当該接触前のPDX1およびHOXC6の発現より増加した場合には、当該候補分化促進因子は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつものと同定される。好適な実施形態では、細胞培養物または細胞集団の細胞と候補分化促進因子との接触前後のPDX1、HOXA13およびHOXC6の発現を決定することによって、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性前腸内胚葉細胞への分化を促進する能力をもつ分化促進因子を同定する。好適な実施形態では、PDX1、HOXA13および/又はHOXC6の発現は、Q-PCRによって決定される。いくつかの実施形態では、PDX1、HOXA13およびHOXC6の1又は2以上の発現は、細胞培養物または細胞集団の細胞と候補分化促進因子との接触前ではなく、当該接触時または接触直後において決定してもよい。そのような実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後におけるPDX1、HOXA13およびHOXC6の1又は2以上の発現は、当該接触後の1回または2回以上のPDX1、HOXA13およびHOXC6の1又は2以上の発現と比較される。上記方法のいくつかの実施形態では、細胞と候補分化促進因子との接触後にPDX1発現が決定される1回または2回以上は、約1時間から約10日の範囲である。例えば、PDX1発現は、細胞と候補分化促進因子との接触後約1時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約2時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約4時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約6時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約8時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約10時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約12時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約16時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約24時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約2日、細胞と候補分化促進因子との接触後約3日、細胞と候補分化促進因子との接触後約4日、細胞と候補分化促進因子との接触後約5日、細胞と候補分化促進因子との接触後約6日、細胞と候補分化促進因子との接触後約7日、細胞と候補分化促進因子との接触後約8日、細胞と候補分化促進因子との接触後約9日、細胞と候補分化促進因子との接触後約10日、または細胞と候補分化促進因子との接触後約10日以上で決定することができる。本明細書記載の方法に使用できる候補分化促進因子は、ポリペプチドおよび低分子などの化合物から選択することができる。例えば、候補ポリペプチドは、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックスタンパク質および合成ペプチドを含むことができるが、これに限定されるものではない。好適な実施形態では、増殖因子は、FGFファミリー、例えばFGF-10である。候補低分子は、コンビナトリアルケミストリー合成から生ずる化合物、および、ステロイド、イソプレノイド、テルペノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイドおよびフラビノイドなどの天然産物を含むが、これに限定されるものではない。当業者にとっては、何千分類にもわたる天然および合成低分子が入手でき、本明細書記載の方法に使用可能であって、上記例示のものに限定されないことがわかるであろう。典型的には、低分子は、分子量10000amu未満のものである。好適な実施形態では、低分子は、RAなどのレチノイドである。PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る因子を同定する方法本発明の他の態様は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る1又は2以上の分化促進因子を同定する方法に関する。そのような方法において、PDX1陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物または細胞集団を得た後、細胞培養物または細胞集団でのマーカーの発現が決定される。前記マーカーの発現を決定した後、細胞培養物または細胞集団の細胞に、候補分化促進因子を接触させる。いくつかの実施形態において、細胞と候補分化促進因子との接触時または接触直後のマーカーの発現が決定される。同マーカーの発現はまた、細胞と候補分化促進因子との接触後に、1回または2回以上決定される。候補分化促進因子との接触後に、マーカーの発現が、当該接触前のマーカーの発現より増加または減少した場合には、当該候補分化促進因子は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力をもつものと同定される。好適な実施形態では、前記マーカーの発現は、Q-PCRにより決定される。上記方法のいくつかの実施形態では、細胞と候補分化促進因子との接触後に前記マーカーの発現が決定される1回または2回以上は、約1時間から約10日の範囲である。例えば、マーカーの発現は、細胞と候補分化促進因子との接触後約1時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約2時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約4時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約6時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約8時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約10時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約12時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約16時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約24時間、細胞と候補分化促進因子との接触後約2日、細胞と候補分化促進因子との接触後約3日、細胞と候補分化促進因子との接触後約4日、細胞と候補分化促進因子との接触後約5日、細胞と候補分化促進因子との接触後約6日、細胞と候補分化促進因子との接触後約7日、細胞と候補分化促進因子との接触後約8日、細胞と候補分化促進因子との接触後約9日、細胞と候補分化促進因子との接触後約10日、または細胞と候補分化促進因子との接触後約10日以上で決定することができる。前述のように、本明細書記載の方法に使用できる候補分化促進因子は、ポリペプチドおよび低分子などの化合物から選択することができる。以上説明した各方法は、PDX1陽性前腸内胚葉細胞についてのものであったが、いくつかの実施形態では、前述のPDX1陽性前腸/中腸内胚葉細胞および/又は前述の前腸後方部のPDX1陽性内胚葉細胞を含む組成物の生産において、当該方法を使用できることがわかるであろう。さらに、本明細書記載のいずれのPDX1陽性内胚葉細胞タイプも、前述のスクリーニング方法に使用することができる。本発明について、一般的に説明してきたが、ある特定の実施例を参照することにより一層理解を深めることができる。それら実施例は、あくまでも説明のみを目的としてここに挙げられており、何ら限定することを意図するものではない。以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用について説明している。多能性ヒト細胞の作製方法は、当技術分野において周知であり、米国特許第5,453,357号明細書、第5,670,372号明細書、第5,690,926号明細書、第6,090,622号明細書、第6,200,806号明細書および第6,251,671号明細書、並びに米国特許出願公開第2004/0229350号明細書を含む多数の科学出版物に記載されており、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。実施例1ヒトES細胞内胚葉発生に関して研究するため、正常な核型を維持しながら、培養物中、一見無制限に分裂可能な、多能性のヒト胚性幹細胞を用いた。ES細胞は、分離に際し免疫学的または機械的方法のいずれかを使用し、5日目の胚の内部細胞塊から得た。具体的には、患者によるインフォームドコンセントを得た後、体外受精サイクルの余剰の凍結受精卵から、ヒト胚性幹細胞株hESCyt-25を得た。解凍すると同時に、孵化した胚盤胞は、ES培地DMEM、20FBS、非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノール、ITSサプリメントにおいて、マウスの胚線維芽細胞MEF上に蒔き培養した。胚は培養皿に付着し、約2週間後、未分化hESCの領域を、MEFを入れた新しい皿に移植した。移植は、機械的に切離し、ディスパーゼを用いて短時間分解し、引き続き細胞クラスターを機械的に除去し、洗浄し、そして再度蒔くことにより行った。誘導以後、hESCyt-25は、100回に渡り連続継代した。胚体内胚葉を作製するための出発物質としてhESCyt-25ヒト胚性幹細胞株を用いた。当技術分野における当業者にとっては当然のことであるが、幹細胞または他の多能性細胞も、本明細書に記載されている分化方法のための出発物質として使用することができる。例えば、当技術分野において周知の方法により分離することのできる、胚の生殖隆起から得られる細胞を、多能性細胞出発物質として使用することができる。実施例2hESCyt-25特性ヒト胚性幹細胞株のhESCyt-25は、培養物中において、18カ月に渡り正常な形態、核型、増殖、および自己複製特性を維持した。この細胞株は、OCT4、SSEA-4およびTRA-1-60抗原に対し強い免疫反応を示し、それら全抗原は、未分化hESCに特有なものであり、また、他の樹立したhESC株と同一の形態およびアルカリホスファターゼ活性を示す。さらに、ヒト幹細胞株hESCyt-25はまた、懸濁培養をした場合、容易に胚様体EBを形成する。多能性を実証するがごとく、hESCyT-25は、3つの主要な胚葉に対応する様々な細胞型に分化する。外胚葉の産生は、ZIC1に関してはQ-PCRにより、またネスチンおよびさらに成熟したニューロンマーカーに関しては免疫細胞化学ICCにより立証した。β-IIIチューブリンの免疫細胞化学的染色が、初期ニューロンの特徴である細長い細胞のクラスターにおいて観察された。先に、レチノイン酸を用いてEBを懸濁処理し、多能性幹細胞の、胚外系列の臓側内胚葉VEへの分化を誘導した。処理した細胞は、54時間の処理によりVEの二つのマーカーである、アルファフェトプロテインAFPおよびSOX7を高いレベルで発現した。単層で分化した細胞は、免疫細胞化学的染色により示されるように、弧発的な斑状にAFPを発現した。また、下記に説明するように、hESCyT-25細胞株は、AFPが発現することなく、SOX17に対するリアルタイムの定量ポリメラーゼ連鎖反応Q-PCRと免疫細胞化学により確認されるように、胚体内胚葉を形成することもできた。中胚葉への分化を立証するために、いくつかの時点で、Brachyury遺伝子の発現に関し、分化EBを分析した。Brachyuryの発現は、実験の間、漸次増加した。上記の点から、hESCyT-25株は、三つの胚葉に対応する細胞を形成する能力により示されるように、多能性を有する。実施例3SOX17抗体の作製hESC培養物において胚体内胚葉を同定する上での主要な障害は、適切な手段がないことである。そこで、ヒトSOX17タンパク質に対して産生される抗体の作製を行なった。マーカーSOX17は、原腸形成の間に形成されるにつれ、胚体内胚葉全体において発現し、その発現は、器官形成が開始される頃まで、発現量は、A-P軸に沿って異なるが腸管内で維持される。また、SOX17は、胚外内胚葉細胞のサブセットにおいても発現する。中胚葉または外胚葉では、このタンパク質の発現は観察されていない。現在、SOX17は、胚外系列を除外するためのマーカーと併用した場合、胚体内胚葉系列に対する適切なマーカーであることが分かっている。ここに詳細に説明するように、SOX17抗体は、SOX17陽性胚体内胚葉細胞の作製を目的とした、各種処理と分化方法の効果を具体的に調べるのに利用した。また、AFP、SPARCおよびトロンボモジュリンに反応する他の抗体も、臓側および壁側内胚葉胚外内胚葉の産生を除外するために使用した。SOX17に対する抗体を作製するため、SOX17タンパク質図2のC末端のアミノ酸172-414配列番号:2に対応するヒトのSOX17cDNA配列番号:1の一部を、抗体製造会社、GENOVAC社フライベルク、ドイツにおいて、そこで開発された方法により、ラットでの遺伝子による免疫化に用いた。遺伝子による免疫化方法は、米国特許第5,830,876号明細書、第5,817,637号明細書、第6,165,993号明細書および第6,261,281号明細書、並びに国際公開第WO00/29442号および第WO99/13915号に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。また、遺伝子による免疫化のための他の適切な方法は、非特許文献にも記載されている。例えば、Barryetal.は、Biotechniques16:616-620、1994に、遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の作製theproductionofmonoclonalantibodiesbygeneticimmunizationについて記載しており、その全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。特定のタンパク質に対して抗体を産生する遺伝子免疫法の具体的な例は、例えば、Costagliaetal.、1998Geneticimmunizationagainstthehumanthyrotropinreceptorcausesthyroiditisandallowsproductionofmonoclonalantibodiesrecognizingthenativereceptor、J.Immunol.160:1458-1465;Kilpatricketal1998GenegundeliveredDNA-basedimmunizationsmediaterapidproductionofmurinemonoclonalantibodiestotheFlt-3receptor、Hybridoma17:569-576;Schmolkeetal.、1998IdentificationofhepatitisGvirusparticlesinhumanserumbyE2-specificmonoclonalantibodiesgeneratedbyDNAimmunization、J.Virol.72:4541-4545;Krasemannetal.、1999Generationofmonoclonalantibodiesagainstproteinswithanunconventionalnucleicacid-basedimmunizationstrategy、J.Biotechnol.73:119-129;およびUlivierietal.、1996GenerationofamonoclonalantibodytoadefinedportionoftheHeliobacterpylorivacuolatingcytotoxinbyDNAimmunization、J.Biotechnol.51:191-194に見られ、これらの全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。SOX7およびSOX18は、図3に示す関係系統樹に描かれているように、SOX17に対し最も近いSoxファミリーである。SOX17抗体が、SOX17に特異的であり、尚且つ、その最も近いファミリーメンバーと反応しないことを立証するために、陰性対照として、ヒトのSOX7ポリペプチドを使用した。具体的には、遺伝子免疫化により作製された抗体が、SOX17に特異的であることを立証するために、SOX7および他のタンパク質を、ヒト線維芽細胞において発現させた後、ウェスタンブロットおよびICCによりSOX17抗体との交差反応を分析した。SOX17、SOX7およびEGFP発現ベクターの作製、それらのヒト線維芽細胞への形質移入、およびウェスタンブロットによる分析には、例えば、以下の方法を用いた。SOX17、SOX7およびEGFPの作製に使われた発現ベクターは、それぞれpCMV6OriGeneTechnologiesInc.、ロックヴィル、メリーランド州、pCMV-SPORT6Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州およびpEGFP-N1Clonetech社、パロアルト、カリフォルニア州であった。タンパク質の製造には、テロメラーゼ不死化MDXヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン2000Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州の存在下で、スーパーコイルDNAで一過性に形質移入した。形質移入後36時間で、プロテアーゼ阻害剤カクテルRocheDiagnosticsCorporation、インディアナポリス、インディアナ州を含む、50mMのTRIS-HClpH8、150mMのNaCl、0.1のSDS、0.5のデオキシコール酸塩を用いて、全細胞溶解物を回収した。NuPAGE4~12の勾配ポリアクリルアミド、Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州を用いてSDS-PAGEにより分離し、エレクトロブロッティングによりPDVF膜Hercules社、カリフォルニア州に移した細胞タンパク質100μgのウェスタンブロット分析では、10mMのTRIS-HClpH8、150mMのNaCl、10のBSA、0.05のTween-20Sigma社、セントルイス、ミズーリ州において、1/1000に希釈したラットのSOX17抗血清、引き続き、アルカリホスファターゼ標識抗ラットIgGAlkalinePhosphataseconjugatedanti-ratIgGJacksonImmunoResearchLaboratories、ウエストグローブ、ペンシルバニア州で検出し、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色VectorBlackAlkalinePhosphatasestainingVectorLaboratories、バーリンゲーム、カリフォルニア州により明らかにした。使用したタンパク質サイズ基準は、広範囲のカラーマーカーSigma社、セントルイス、ミズーリ州であった。図4において、SOX17、SOX7またはEGFPcDNAが一過性に形質移入されたヒト線維芽細胞から作製した抽出タンパク質を、SOX17抗体を用いてウェスタンブロット上で検出した。hSOX17形質移入細胞からの抽出タンパク質のみが、ヒトのSOX17タンパク質の予測分子量46Kdaに近い51Kdaまでのバンドを生じさせた。ヒトのSOX7またはEGFP形質移入細胞のいずれかから作られた抽出物に対するSOX17抗体の反応は全くなかった。さらに、SOX17抗体は、hSOX17発現コンストラクトを形質移入されたヒト線維芽細胞の核を明確に標識したが、EGFPのみを形質移入された細胞は標識しなかった。このように、SOX17抗体は、ICCにより特異性を示した。実施例4胚体内胚葉のマーカーとしてのSOX17抗体の検証SOX17抗体が、ヒトSOX17タンパク質に対して特異的であり、さらには、胚体内胚葉を標識する証拠として、部分的に分化したhESCを、SOX17とAFP抗体で同時標識した。SOX遺伝子ファミリーサブグループF図3の近縁関係にあるメンバーであるSOX7やSOX17およびAFPは、それぞれ臓側内胚葉で発現することが実証されている。しかしながら、AFPおよびSOX7は、胚体内胚葉細胞において、ICCにより検出できるレベルでは発現しないため、本物の胚体内胚葉細胞に対する陰性マーカーとして用いることができる。SOX17抗体は、離散的にグループ化した細胞として存在するか、或いはAFP陽性細胞と混ざり合う細胞集団を標識することが明らかにされた。特に、図5Aは、少数のSOX17細胞が、AFPで同時標識されたことを示している。しかしながら、SOX17細胞の場にAFP細胞が、殆どまたは全くない領域も見られた図5B。同様に、壁側内胚葉も、SOX17を発現すると報告されているため、壁側マーカーSPARCおよび/またはトロンボモジュリンTMと共にSOX17を同時標識する抗体は、壁側内胚葉であるSOX17細胞を同定するのに使用することができる。図6A~Cに示すように、トロンボモジュリンとSOX17とで同時標識された壁側内胚葉細胞は、hES細胞のランダムな分化により産生された。上記の細胞標識実験から見て、胚体内胚葉細胞は、マーカープロファイルSOX17hi/AFPlo/[TMloまたはSPARClo]により同定することができる。すなわち、SOX17マーカーの発現は、臓側内胚葉に特有のAFPマーカーおよび壁側内胚葉に特有のTMまたはSPARCマーカーの発現より多い。従って、SOX17に対しては陽性であるが、AFPおよびTMまたはSPARCに対しては陰性である細胞が、胚体内胚葉である。胚体内胚葉を予測するSOX17hi/AFPlo/TMlo/SPARCloマーカープロファイルの特異性の更なる証拠を得るべく、SOX17およびAFP遺伝子発現を、量的に抗体標識細胞の相対数で比較した。図7Aに示されているように、レチノイン酸臓側内胚葉誘導物質またはアクチビンA胚体内胚葉誘導物質で処理したhESCでは、SOX17mRNAの発現量に、10倍の差が生じた。この結果は、SOX17抗体標識細胞数における10倍の差を反映していた図7B。さらに、図8Aに示されているように、hESCのアクチビンA処理により、AFP遺伝子発現は、処理しなかった場合に比べ6.8倍抑制された。これは、図8B~Cに示されているように、これらの培養物におけるAFP標識細胞の数の著しい減少により、視覚的に示された。さらにこれを定量化するために、AFP遺伝子発現におけるこの約7倍の減少が、フローサイトメトリーにより測定したAFP抗体標識細胞数が同様に7倍減少した結果であることが立証された図9A~B。この結果は、Q-PCRにより確認される、遺伝子発現における量的変化が、抗体染色により観察される、細胞型の特異性における変化を反映することを示す点において極めて重要である。ノーダルファミリーメンバーノーダル、アクチビンAおよびアクチビンB-NAAの存在下におけるhESCの培養により、SOX17抗体標識細胞は、時間と共に著しく増加した。5日間継続したアクチビン処理により、50を超える細胞が、SOX17で標識された図10A~F。5日間のアクチビン処理後、AFPで標識された細胞は、ほとんどまたは全くなかった。つまり、ヒトのSOX17タンパク質のカルボキシ末端242アミノ酸に対して産生された抗体は、ウェスタンブロットでヒトのSOX17タンパク質を同定したが、その最も近いSOXファミリー類縁体である、SOX7は認識しなかった。SOX17抗体は、主としてSOX17/AFPlo標識細胞の95を超えるである分化hESC培養物中の細胞の一部、並びにSOX17およびAFP臓側内胚葉で同時標識されるわずかなパーセンテージ<5の細胞も認識した。hESC培養物のアクチビン処理により、SOX17遺伝子発現およびSOX17標識細胞が著しく増加し、AFPmRNAの発現やAFP抗体で標識された細胞の数は著しく抑制された。実施例5Q-PCR遺伝子発現測定以下の実験では、hESC分化に対する様々な処理の効果を調べる主な測定法として、リアルタイム定量RT-PCRQ-PCRを採用した。具体的には、遺伝子発現のリアルタイム測定結果を、Q-PCRにより複数の時点で、複数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態に関する理解を深めるために、望ましいおよび望ましくない細胞型に特有のマーカー遺伝子を評価した。Q-PCR分析の長所としては、その感度が極めて高いことや、ゲノム配列が容易に入手可能であるため、必要なマーカーの開発が比較的容易であることが挙げられる。さらに、Q-PCRの極めて高い感度により、非常に大きな集団内の比較的少数の細胞から遺伝子発現を検出することが可能となる。また、極めて低レベルの遺伝子発現を検出する性能により、その集団内での分化傾向が示される。これらの細胞表現型の明らかな分化に先立って、免疫細胞化学技法を用いては、特定の分化経路に沿った傾向を認識することはできない。このため、Q-PCRは、分化処理の成果を調べる免疫細胞化学技法を少なくとも補完するものであり、尚且つ、その技法より潜在的にはるかに優れた分析方法を提供する。さらに、Q-PCRは、分析の準ハイスループットスケールでの定量フォーマットにおける分化プロトコルの成果を評価するメカニズムを提供する。ここで取ったアプローチは、RotorGene3000装置CorbettResearchでSYBRGreenケミストリを用い、且つ、ツーステップRT-PCRフォーマットを使用して、相対的な定量化を行うことであった。このようなアプローチにより、将来、更なるマーカー遺伝子を分析するためのcDNAサンプルを保存することが可能となり、よって、サンプル間の逆転写効率におけるばらつきを避けることができる。プライマーは、極力、エキソン同士の境界上に位置するか、或いは少なくとも800bpでイントロンにまたがるように設計した。これは、汚染ゲノムDNAからの増幅を排除するように実験的に決定されたものである。イントロンを含まないマーカー遺伝子を採用した場合、またはマーカー遺伝子が偽遺伝子を有する場合、RNAサンプルのデオキシリボヌクレアーゼI処理を行なった。我々は、細胞サンプルにおける遺伝子発現に関する幅広いプロファイルの説明を提供するために、標的または非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現の測定には、通常Q-PCRを利用した。hESC分化具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉、および胚外内胚葉の初期段階に関するマーカーで、そのための有効なプライマーセットが入手可能なものを下記表1に挙げている。また、これらのプライマーセットのヒト特異性も立証された。これは、hESCが多くの場合マウス支持細胞層で増殖することから、重要な事である。最も一般的には、それぞれの条件において三組のサンプルを採取し、個別に、各定量に関連した生物学的変動を評価するためにそれぞれのサンプルを二つずつ分析した。PCRテンプレートを作成するために、総RNAは、RNeasyQiagen社を用いて分離し、RiboGreenMolecularProbes社を用いて定量した。総RNA350~500ngからの逆転写は、oligo-dTおよびランダムプライマーの混合物を含むiScript逆転写酵素キットBioRad社を使用して行なった。各20μLの反応物は、その後、総量100μLまで希釈し、3μLを、400nMの順方向および逆方向プライマーと5μLの2XSYBRGreenマスターミックスQiagen社とを含む、各10μLのQ-PCR反応物に使用した。2段階のサイクリングパラメータを使用し、85~94°C各プライマーセットの単位複製配列の融解温度によって具体的に選択されたで5秒間の変性と、引き続き、60°Cで45秒間のアニール/伸長を採用した。蛍光データは、各伸長段階の最後の15秒間に収集した。3ポイント10倍希釈シリーズthreepoint、10-folddilutionseriesを、各回ごとに検量線を作成するために使用し、この検量線に基づいて、サイクル閾値Ctを定量値に変換した。各サンプルの定量化された値を、ハウスキーピング遺伝子能力に対して規準化した後、三組のサンプルに関して平均および標準偏差を計算した。PCRサイクルの終わりに際し、融解曲線分析を行い、反応物の特異性を確認した。単一の特定産物が、そのPCR単位複製配列に適したTmで単一のピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで行われた反応は、陰性対照としての役目を果たし、増幅しない。Q-PCR法を確立する上での第一段階は、実験系に適したハウスキーピング遺伝子HGを検証することであった。RNAインプット、RNAの完全性および逆転写効率に関する全サンプルの規準化にHGが使用されるため、規準化が有意であるためには、HGが、全種類のサンプルにおいて、長期に渡り一定レベルで発現することが重要であった。我々は、分化hESCにおいて、サイクロフィリンG、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1HPRT、ベータ-2-ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビアンhydroxymethylbianeシンターゼHMBS、TATA結合タンパク質TBP、およびグルクロニダーゼglucoronidaseベータGUSの発現量を測定した。我々の得た結果は、ベータ-2-ミクログロブリンの発現量が、分化するにしたがって上昇することを示した。従って、規準化のためのこの遺伝子の使用は除外した。他の遺伝子は、長時間に渡り、且つ全処理を通して一定の発現量を示した。我々は、通常、サイクロフィリンGおよびGUSの双方を使用し、全サンプルに関する規準化因子を計算した。多数のHGを使用することにより、規準化プロセスに伴う変動性を低減すると同時に、相対的な遺伝子発現値の信頼性を高める。規準化に使用する遺伝子を得た後、Q-PCRを使用し、様々な実験処理を施す全サンプルにおいて、多くのマーカー遺伝子の相対的な遺伝子発現量を求めた。使用したマーカー遺伝子を選択したのは、それらが、初期胚葉の典型的な特定集団において豊富にみられるからであり、特に、胚体内胚葉および胚外内胚葉において、特異的に発現する遺伝子グループに集中したためである。これらの遺伝子およびそれらの相対的な発現分析結果を、表1に示す。多くの遺伝子が、一以上の胚葉で発現するため、同一実験において、多くの遺伝子の発現量を定量的に比較することが有益である。SOX17は、胚体内胚葉において発現し、臓側および壁側内胚葉では少しばかり発現する。SOX7およびAFPは、この初期発生の時点において臓側内胚葉で発現する。SPARCおよびTMは、壁側内胚葉で発現し、Brachyuryは初期中胚葉で発現する。胚体内胚葉細胞は、SOX17mRNAを高度に発現し、AFPおよびSOX7臓側内胚葉、SPARC壁側内胚葉およびBrachyury中胚葉の発現レベルは低いものと予想された。さらに、ZIC1をここで使用し、初期外胚葉の誘導をさらに排除した。また、GATA4およびHNF3bが、胚体および胚外内胚葉の両方において発現した。従って、それらは、胚体内胚葉におけるSOX17の発現と相関する表1。典型的な実験を、図11~14に示している。図11~14は、表1に記載されているマーカー遺伝子が、各種サンプル間でいかに互いに相関しているかを示しており、それにより、胚体内胚葉および胚外内胚葉、並びに中胚葉および神経細胞型に特異的な分化パターンを明示している。上記のデータから、アクチビン投与量の増加が、SOX17遺伝子発現の増加をもたらしたことは明らかである。さらに、このSOX17発現は、主に、胚外内胚葉ではなく胚体内胚葉を示した。この結論は、SOX17遺伝子発現がAFP、SOX7およびSPARC遺伝子発現と逆相関にあるという観察結果に基づいている。実施例6ヒトES細胞の胚体内胚葉への誘導分化ヒトES細胞培養物は、それらの未分化の状態が能動的に維持されない条件下で培養された場合、ランダムに分化する。この不均一な分化により、壁側および臓側内胚葉AFP、SPARCおよびSOX7発現の双方からなる胚外内胚葉細胞、並びにZIC1、ネスチン外胚葉およびBrachyury中胚葉の発現によって示される、初期の外胚葉および中胚葉誘導体が産生される。胚体内胚葉細胞の出現は、ES細胞培養物における特異的な抗体マーカーの欠如により、従来検証または特定されていない。そのため、ES細胞培養物における初期胚体内胚葉の産生は、あまりよく研究されていない。胚体内胚葉細胞に対するよい抗体試薬の入手が不可能なため、性質決定のほとんどは、外胚葉および胚外内胚葉に集中している。概して、ランダムに分化したES細胞培養物には、SOX17hi胚体内胚葉細胞と比較すると、非常に多くの胚外および神経外胚葉細胞型がある。未分化hESCコロニーは、繊維芽細胞フィーダーの上で増殖するため、コロニーの縁部は、コロニーの内側に存在するそれらの細胞とは異なる別の形態を呈する。これらの外縁細胞の多くは、それほど均一ではなくより大きな細胞体の形態や、OCT4の高発現量により識別できる。ES細胞は、分化し始めると、未分化ES細胞と比較してOCT4発現量が増加または減少するとされている。未分化閾undifferentiatedthresholdに対するOCT4発現量の上下変化は、多能性の状態から脱した分化の初期段階を意味する可能性がある。未分化のコロニーを、SOX17免疫細胞化学により調べた際、時折SOX17陽性細胞の小さな10~15個の細胞集団が、その周辺のランダムな場所、および未分化のESCコロニー間の接合部で検出された。上述のように、これらのコロニー外縁に散在したポケットは、コロニーがサイズ的に大きくなり、より多くなるにつれ、古典的ESC形態とは異なった分化をする最初の細胞の数個となるようであった。若くて小さな完全に未分化のコロニー<1mm;4~5日目には、コロニー内または縁部においてSOX17陽性細胞は全く見られなかった。一方、古くて大きいコロニー直径1~2mm、>5日目には、いくつかのコロニーの周辺、または先に説明した古典的hESC形態とは異なって分化した縁部の内側の領域において、散在し孤立した斑状のSOX17陽性AFP陰性細胞があった。これが有効なSOX17抗体の最初の発生であったとすれば、そのような初期の未分化ESC培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまで立証されたことはない。Q-PCRによるSOX17およびSPARC遺伝子発現量の逆相関に基づくと、大部分のSOX17陽性AFP陰性細胞は、抗体同時標識により壁側マーカーに対し陰性を示すであろう。これは、図15A~Bで示されているように、TMを発現している壁側内胚葉細胞に関して明確に立証された。ノーダル因子アクチビンAおよびBへの暴露により、TM発現強度およびTM陽性細胞数は著しく減少した。アクチビン処理培養物におけるSOX17、AFPおよびTM抗体を用いた三重標識により、AFPおよびTMに対しても陰性であったSOX17陽性細胞のクラスターが観察された図16A~D。これらは、分化ESC培養物におけるSOX17陽性胚体内胚葉細胞の最初の細胞を示すものである図16A~Dおよび図17。上述のSOX17抗体およびQ-PCRのツールを使用し、SOX17hi/AFPlo/SPARC/TMlo胚体内胚葉細胞になるようにESCを効果的にプログラムミングすることのできる数々の手法を調べた。我々は、SOX17遺伝子発現に関するQ-PCRによる集団レベルと、SOX17タンパク質の抗体標識による個々の細胞レベルとで測定した、これら細胞の数および増殖能力を増強することを目的とした様々な分化手順を適用した。生体外の細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を作製する際に使用する、ノーダル/アクチビン/BMPなどのTGFβファミリー増殖因子の効果を分析し、説明したのは、我々が初めてであった。典型的な実験では、アクチビンA、アクチビンB、BMPまたはそれら増殖因子の組み合わせを、未分化ヒト幹細胞株hESCyt-25の培養物に添加し、分化プロセスを開始させた。図19に示されているように、100ng/mlのアクチビンAを添加したところ、分化開始後4日目までに、未分化hESCに対し、19倍のSOX17遺伝子発現の誘導が起きた。アクチビンファミリーの第二のメンバーであるアクチビンBをアクチビンAと共に添加したところ、混合アクチビン処理後4日目までに未分化hESCに対し、37倍の誘導が起きた。最後に、ノダール/アクチビンおよびBMPサブグループBMP4からTGFβファミリー第三のメンバーを、アクチビンAおよびアクチビンBと共に添加したところ、発光量比は未分化hESCの57倍まで増加した図19。アクチビンおよびBMPを用いたSOX17の誘導を、因子無添加培地である対照と比較した場合、4日目の時点で、5倍、10倍および15倍の誘導が起きていた。アクチビンA、BおよびBMPを用いた三重処理後5日目までに、SOX17は、hESCに比べ70倍を超えて誘導された。これらのデータは、ノーダル/アクチビンTGFβファミリーメンバーの高投与量および長時間処理により、SOX17発現が増加することを示している。ノーダルおよび関連分子アクチビンA、BおよびBMPは、生体内または生体外における胚体内胚葉形成およびSOX17の発現を促進する。さらに、BMPを添加することにより、SOX17の誘導が高まるが、これはおそらく、ノーダルコレセプターであるクリプトCriptoの更なる誘導によるものであろう。我々は、BMP4とアクチビンAおよびBの組み合わせにより、SOX17の誘導、引いては、胚体内胚葉形成が、相加的に増強されることを立証した。アクチビンAおよびBとの組み合わせで、長時間>4日BMP4を添加していると、壁側および臓側内胚葉、並びに胚体内胚葉においてSOX17が誘導されることもある。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、添加4日以内に、前記処理においてBMP4を除くことが大切である。個々の細胞レベルでTGFβ因子を用いた処理の効果を求めるため、SOX17抗体標識を使用し、TGFβ因子添加の経時変化を調べた。先に図10A~Fで示したように、SOX17標識細胞の相対数は、時間と共に著しく増加した。相対的に定量化図20した場合、SOX17標識細胞は、20倍を超える増加を示している。この結果は、細胞数およびSOX17遺伝子発現量のいずれも、TGFβ因子への暴露時間とともに増加していることを示している。図21に示されているように、ノーダル、アクチビンA、アクチビンBおよびBMP4への暴露4日後、SOX17誘導のレベルは、未分化hESCの168倍に到達した。また、図22は、SOX17陽性細胞の相対数もまた、投与量に依存していたことを示している。アクチビンAの投与量が100ng/mL以上である場合、SOX17遺伝子発現および細胞数を強力に誘導することができた。TGFβファミリーメンバーに加えて、Wnt分子ファミリーが、胚体内胚葉の特異化および/または維持に役立つ場合もある。アクチビンのみで処理したサンプルに対し、アクチビンとWnt3aとを用いて処理したサンプルにおいて、SOX17遺伝子発現が増加したことにより示されているように、Wnt分子の使用も、hESCを胚体内胚葉に分化させるのに有益であった図23。上記実験の全ては、添加因子と共に10の血清を含む組織培養培地を使用して行なった。驚くべきことに、図24A~Cに示されているように、血清濃度が、添加アクチビンの存在下におけるSOX17発現量に影響を及ぼすことを発見した。血清レベルを10から2に低下させた場合、SOX17発現は、アクチビンAおよびBの存在下、3倍になった。最後に、図25A~Dに示したように、アクチビンにより誘導されたSOX17細胞が、培養物中において分裂することを立証した。矢印は、PCNA/DAPIで標識された有糸分裂プレートパターンmitoticplatepatternおよび位相差有糸分裂プロファイルphasecontrastmitoticprofileからも明らかなように有糸分裂中のSOX17/PCNA/DAPIで標識された細胞を示す。実施例7ケモカイン受容体4CXCR4発現は、中胚葉、外胚葉または臓側内胚葉用のマーカーではなく、胚体内胚葉用マーカーと相関する上述のごとく、TGFβファミリー、より具体的には、アクチビン/ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、ESCは胚体内胚葉細胞層に分化すべく誘導される。さらに、分化培養培地におけるウシ胎児血清FBSの割合が、ESCからの胚体内胚葉分化の効率に影響することを明らかにした。この影響とは、培地においてアクチビンAが所定の濃度である場合、FBSレベルが高くなると、胚体内胚葉への最大分化が阻害されるというものである。外因性アクチビンAの不在下では、胚体内胚葉系列へのESCの分化は非常に非効率的であり、FBS濃度がESCの分化プロセスに及ぼす影響は、かなり緩やかである。これらの実験では、hESCは、100ng/mLアクチビンAを含むまたは含まない、0.5、2.0または10のFBSを添加したRPMI培地インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州;カタログ番号61870-036で6日間増殖させることにより分化させた。さらに、分化の最初3日間は、アクチビンA100ng/mLと併せて、0.5から2.0の範囲のFBS勾配も採用した。6日後、各培養条件の複製サンプルを収集し、リアルタイム定量PCRにより相対的遺伝子発現を分析した。残りの細胞は、SOX17タンパク質の免疫蛍光検出用に準備した。CXCR4の発現量は、使用した7つの培養条件により、著しく変化した図26。一般に、CXCR4発現量は、アクチビンAで処理した培養物で多くA100、外因性アクチビンAを入れなかった培養物では少なかったNF。さらに、A100で処理した培養物において、CXCR4発現は、FBS濃度が最も低い時、最も高かった。相対的発現がアクチビンAを加えなかった状態NFにむしろ近いほど、10FBSの条件下でCXCR4レベルは著しく低下した。上述のごとく、SOX17、GSC、MIXL1およびHNF3β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特性と一致する。7つの分化条件の全てにおいて、これら4つの遺伝子の相対的発現は、CXCR4のそれと酷似している図27A~D。これは、CXCR4も、胚体内胚葉のマーカーであることを示している。外胚葉および中胚葉系列は、それらの各種マーカーの発現により胚体内胚葉と識別される。初期中胚葉は、BrachyuryおよびMOX1遺伝子を発現し、一方、新生神経外胚葉はSOX1およびZIC1を発現する。図28A~Dは、外因性アクチビンAを添加しなかった培養物が、中胚葉および外胚葉遺伝子の発現で選択的に濃縮され、アクチビンAで処理した培養物の中では、10のFBS条件においても、中胚葉および外胚葉マーカー発現のレベルが増加したことを示している。これらの発現パターンは、CXCR4とは逆であり、CXCR4が、この発生時期においてESC由来の中胚葉または外胚葉ではあまり発現しないことを明らかにした。哺乳類発生の初期、胚外系列への分化も起こる。ここで特に関連性があるのは、SOX17を含む、胚体内胚葉と共通の多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化である。胚体内胚葉を胚外臓側内胚葉と識別するためには、これら二つの間で異なったマーカーを調べなくてはならない。SOX7は、臓側内胚葉では発現するが、胚体内胚葉系列では発現しないマーカーの代表である。よって、SOX7発現の不在下で、強度のSOX17遺伝子発現を示す培養状態は、臓側内胚葉ではなく、胚体内胚葉を含む傾向にある。SOX7はアクチビンAを加えなかった培養物で高度に発現しており、また、SOX7はFBSが10含まれたときアクチビンAの存在下でも発現の増加を示したことが、図28Eに示されている。このパターンは、CXCR4の発現パターンとは逆であることから、CXCR4が、臓側内胚葉では高度に発現されないことを示唆している。上記各分化条件下で存在するSOX17免疫反応SOX17細胞の相対数も求めた。hESCを、高用量アクチビンAの存在下、低FBS濃度0.5~2.0で分化させた場合、SOX17細胞は、培養物全体に渡り偏在的に分布した。高用量アクチビンAを使用するが、含まれるFBSが10v/vである場合、SOX17細胞の出現頻度はかなり低く、培養物全体に渡り均等に分布するのではなく、常に孤立したクラスターとして出現した図29AおよびC並びにBおよびE。外因性アクチビンAを使用しなかった場合、SOX17細胞の更なる減少が見られた。これらの条件下でも、SOX17細胞は、クラスターとして出現した。これらクラスターは、高用量アクチビンA、低濃度FBSで処理した場合に見られるものより小さく、はるかにまれであった図29CおよびF。これらの結果は、CXCR4の発現パターンが、胚体内胚葉遺伝子発現と一致しているだけでなく、各条件下における胚体内胚葉細胞の数とも一致していることを立証している。実施例8胚体内胚葉を増加する分化条件は、CXCR4陽性細胞の比率を増加させるアクチビンAの投与量も、胚体内胚葉がESCから誘導される効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンAの投与量増加により、培養物中のCXCR4細胞の比率が高くなることを実証している。hESCは、0.5~2FBS分化の最初の3日間で0.5から1.0へ、そして2.0へと増加したおよび0、10または100ng/mLのアクチビンAを添加したRPMI培地で分化させた。7日間分化させた後、細胞を、室温で5分間、2FBSおよび2mMEDTAを含みCa2/Mg2を含まないPBSにおいて分離させた。細胞は、35umのナイロンフィルターを通して濾過し、数を数え、ペレット状にした。ペレットは、少量の50のヒト血清/50の正常なロバ血清で再懸濁させ、非特異的抗体結合部位を遮断するために氷上で2分間培養した。これに、50μL約105個の細胞を含むにつき、1μLのマウス抗CXCR4抗体アブカムAbcam社、カタログ番号ab10403-100を添加し、45分間氷上で標識化を行なった。細胞を、2のヒト血清緩衝液を含むPBS5mLを添加することにより洗浄し、ペレット状にした。緩衝液5mLで2回目の洗浄を完了し、その後、細胞は、105個の細胞ごとに緩衝液50μLに再懸濁させた。二次抗体FITC標識ロバ抗マウス;JacksonImmunoResearch、カタログ番号715-096-151を、最終濃度5μg/mLで加え、30分間標識化し、その後、上述のように緩衝液で二度洗浄した。細胞は緩衝液中、5×106個の細胞/mLで再懸濁させ、フローサイトメトリーコアファシリティーflowcytometrycorefacilityTheScrippsResearchInstituteにおいて、スタッフによりFACSVantageBecktonDickenson社を使用して分析および選別した。細胞は、リアタイム定量PCRにより、遺伝子発現解析のために総RNAを引き続き分離するため、RLT溶解緩衝液Qiagen社の中に直接回収した。分化培養培地において、アクチビンAの投与量が増加するにつれ、フローサイトメトリーにより求めたCXCR4細胞の数の著しい増加が観察された図30A~C。CXCR4細胞は、R4ゲート内にあったものであり、このゲートは、イベントの0.2がR4ゲート内に位置する二次抗体のみの対照を使用して設定した。CXCR4細胞数の著しい増加は、アクチビンAの投与量が増加するにつれて生じた胚体内胚葉遺伝子発現の力強い増加と相関する図31A~D。実施例9CXCR4陽性細胞の分離により胚体内胚葉遺伝子発現を増加し、中胚葉、外胚葉および臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を減少させる上記実施例8において同定したCXCR4およびCXCR4細胞を回収し、相対的な遺伝子発現を分析し、母集団の遺伝子発現を同時に測定した。CXCR4遺伝子発現の相対量は、アクチビンAの投与量の増加と共に著しく増加した図32。これは、CXCR4細胞のアクチビンA用量依存的な増加と非常によく相関した図30A~C。各集団から分離したCXCR4細胞が、その集団におけるCXCR4遺伝子発現ほぼ全ての原因であったことも明白である。これは、これらの細胞を回収するFACS法の効率の良さを立証している。遺伝子発現解析は、CXCR4細胞に、CXCR4遺伝子発現の大部分のみでなく、胚体内胚葉のマーカーに関する他の遺伝子発現も含まれることを明らかにした。図31A~Dに示されているように、CXCR4細胞は、SOX17、GSC、HNF3BおよびMIXL1に関して、親A100集団よりもさらに豊富であった。さらに、CXCR4画分には、これらの胚体内胚葉マーカーに関する遺伝子発現は殆どなかった。また、CXCR4およびCXCR4集団は、中胚葉、外胚葉および胚外内胚葉のマーカーに関し逆パターンの遺伝子発現を示した。図33A~Dは、Brachyury、MOX1、ZIC1およびSOX7の遺伝子発現に関して、A100母集団と比較し、CXCR4細胞では激減したことを示している。このA100母集団においては、アクチビンAの投与量が少ないかまたは全くない条件に比べ、これらのマーカーの発現はもともと低かった。これらの結果は、高用量アクチビンAの存在下で分化させたhESCからCXCR4細胞を分離することにより、胚体内胚葉で高度に濃縮され、且つ、実質的に純胚体内胚葉である集団が得られることを明らかにしている。実施例10CXCR4を用いた、細胞集団内の胚体内胚葉細胞の定量化細胞培養物または細胞集団に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量化を確認するために、CXCR4および胚体内胚葉の他のマーカーを発現している細胞をFACSにより分析した。前記比率の定量化は、本明細書において先に求めたもの、並びに、2003年12月23日に出願された、名称DEFINITIVEENDODERM胚体内胚葉の米国仮特許出願第60/532,004号明細書において求められたものであり、この全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。上記実施例で説明したような方法を用いて、hESCを分化させ胚体内胚葉を作製した。具体的には、分化細胞培養物において示される収率および純度を増加させるため、培地の血清濃度を以下のように制御した:1日目は0.2FBS、2日目は1.0FBS、そして3~6日目は2.0FBSとした。分化した培養物は、三つの細胞表面エピトープ、E-カドヘリン、CXCR4、およびトロンボモジュリンを用いて、FACSで分取した。そして、分取した細胞集団は、Q-PCRにより分析し、胚体および胚外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対的発現量を求めた。最適に分化した培養物から採取したCXCR4分取細胞は、純度98を超える胚体内胚葉細胞を分離する結果となった。表2は、ここで説明した方法を用いてhESCから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果示す。具体的には、表2は、CXCR4およびSOX17陽性細胞内胚葉が、細胞培養物中の細胞の70~80を占めることを示している。これらのSOX17を発現している細胞のうち、2未満がTM壁側内胚葉を発現し、1未満がAFP臓側内胚葉を発現した。SOX17/CXCR4陽性細胞の比率から、TM陽性およびAFP陽性細胞壁側および臓側内胚葉の合計:3の比率を差し引くと、細胞培養物の約67から約77が胚体内胚葉であったことが分かる。細胞の約10は、hESCのマーカーであるE-カドヘリンECADに陽性であり、細胞の約10~20は他の細胞型であった。FACS分離前に得られる分化細胞培養物中の胚体内胚葉の純度は、FBS濃度を5~6日間の分化過程を通して0.5以下に維持することにより、上記の低血清処理と比較して改善できることが分かった。しかしながら、5~6日間の分化過程を通して0.5以下に細胞培養物を維持することは、作製される胚体内胚葉細胞総数を減少させることにもなる。ここに記載した方法により作製された胚体内胚葉細胞は、それほど分化を伴わず、50日間を超えてアクチビンの存在下、培養物中に維持し増殖させた。そのような場合、SOX17、CXCR4、MIXL1、GATA4、HNF3βの発現は、培養期間中維持される。さらに、TM、SPARC、OCT4、AFP、SOX7、ZIC1およびBRACHは、これらの培養物において検出されなかった。そのような細胞は、それほど分化を伴わず、実質的に50日を越えて培養物中で維持し、増殖させることができるようである。実施例11胚体内胚葉細胞の更なるマーカー以下の実験では、RNAを、精製した胚体内胚葉およびヒト胚性幹細胞集団から分離した。その後、精製した各集団から得たRNAの遺伝子チップ分析により遺伝子発現を分析した。また、Q-PCRも行い、胚体内胚葉のマーカーとして、胚体内胚葉では発現するが、胚性幹細胞では発現しない遺伝子の可能性をさらに調査した。ヒト胚性幹細胞hESCを、20のノックアウト血清リプレースメント、4ng/mLの組換え型ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、0.1mMの2-メルカプトエタノール、L-グルタミン、非必須アミノ酸、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地で維持した。hESCは、100ng/mLの組換え型ヒトアクチビンA、ウシ胎児血清FBS、およびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地で5日間培養することにより、胚体内胚葉に分化させた。FBSの濃度は、以下のように日毎に変化させた:0.1一日目、0.22日目、23~5日目。遺伝子発現解析用にhESCおよび胚体内胚葉の精製集団を得るため、蛍光活性細胞分離法FACSにより細胞を分離した。hESCは、SSEA4抗原RDSystems社、カタログ番号FAB1435Pを使用して、胚体内胚葉は、CXCR4RDSystems社、カタログ番号FAB170Pを使用して、免疫精製を行なった。細胞は、トリプシン/EDTAInvitrogen社、カタログ番号25300-054を用いて分離し、2のヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水PBS中で洗浄し、非特異的結合を遮断するために10分間氷上で100のヒト血清中に再懸濁させた。800μLのヒト血清中、5×106個の細胞に対し、フィコエリトリン標識抗体200μLを添加することにより、氷上で30分間染色を行なった。細胞は、PBS緩衝液8mLで二度洗浄し、PBS緩衝液1mL中に再懸濁させた。FACSVantageBDBiosciencesを使用し、TheScrippsResearchInstituteのコアファシリティにより、FACS分離が行われた。細胞は、RLT溶解緩衝液中に直接回収し、RNAは、製造業者Qiagen社の使用説明に従いRNeasyにより分離した。アフィメトリクスAffymetrix社製プラットフォームおよびU133Plus2.0高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用し、発現プロファイルデータを作製するため、ExpressionAnalysis社ダラム、ノースカロライナに、精製したRNAを2コピー提出した。提示されたデータは、hESCおよび胚体内胚葉の2つの集団の間で、特異的に発現した遺伝子を同定する群比較である。hESCにおいて見られた発現量を超えて、力強い上昇変化を示した遺伝子を、胚体内胚葉に極めて特有である新しいマーカー候補として選択した。選択した遺伝子は、上述のように、Q-PCRにより分析し、遺伝子チップ上で見られる遺伝子発現変化を検証し、またhESCが分化する間のこれら遺伝子の発現パターンも調べた。図34A~Mは、一定のマーカーに関する遺伝子発現結果を示している。結果は、100ng/mlのアクチビンAの添加後1日目、3日目および5日目に分析した細胞培養物、5日間の分化過程の終わりに精製したCXCR4発現胚体内胚葉細胞CXDE、および精製ヒト胚性幹細胞HESCについて示している。図34Cおよび図34G~Mを比較することにより、六つのマーカー遺伝子FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1およびCRIP1が、互いにほぼ等しく、またCXCR4およびSOX17/SOX7の発現パターンとも等しい発現パターンを示すことが立証されている。先に説明したように、SOX17は、胚体内胚葉およびSOX7発現胚外内胚葉の両方において発現する。SOX7は胚体内胚葉で発現しないため、SOX17/SOX7の比率により、全体として集団内で見られるSOX17発現に対する胚体内胚葉の寄与について信頼性のある推定が得られる。パネルG~LおよびMのパネルCに対する類似性は、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1およびCRIP1が、胚体内胚葉のマーカーである可能性が高く、胚外内胚葉細胞においては著しく発現することはないことを示している。当然のことながら、ここに記載したQ-PCRの結果は、ICCによりさらに確認することができる。実施例12レチノイン酸およびFGF-10は、胚体内胚葉培養物において特異的にPDX1を誘導する以下の実験は、レチノイン酸およびFGF-10が、胚体内胚葉細胞においてPDX1の発現を誘導することを示すものである。アクチビン存在下または非存在下に、ヒト胚性幹細胞を4日間培養した。4日目に、RAを1μM、FGF-10を50ng/ml、細胞培養物に添加した。RAおよびFGF-10を添加して48時間後、PDX1マーカー遺伝子および前腸内胚葉に非特異的な他のマーカー遺伝子の発現が、Q-PCRによって定量化された。胚体内胚葉細胞へのRAの添加は、臓側内胚葉SOX7、AFP、神経性SOX1、ZIC1あるいはニューロン性NFMの遺伝子発現マーカーの発現を増加させることなく図36A-F、PDX1遺伝子発現の顕著な増加をもたらした図35。RAを1μM、FGF-10を50ng/ml添加して48時間後、PDX1遺伝子発現は、胚体内胚葉で観察されたレベルより約500倍高いレベルにまで誘導された。さらに、RA添加前にアクチビン処理していない培養物に対して、アクチビン処理した細胞培養物において約160倍高いPDX1発現が見られたように、これらの結果は、先に胚体内胚葉SOX17へ分化した細胞培養物でのみ実質的なPDX1誘導が生じたことを示している。実施例13FGF-10は、RA単独よりもPDX1発現をより増加させる本実施例は、RAおよびFGF-10の組み合わせが、RA単独よりも大幅にPDX1発現を増加させることを示すものである。先の実施例と同様に、hESCをアクチビン存在下または非存在下に4日間培養した。4日目に、細胞を次のいずれかで処理した。すなわち、RAのみ1μM、RAを1μMとFGF-4またはFGF-10のいずれかとの組み合わせ、あるいは、RAを1μMとFGF-4およびFGF-10の双方との組み合わせ、である。RAまたはRA/FGFを添加して96時間後、PDX1、SOX7およびNFMの発現が、Q-PCRによって定量化された。hESC培養物をアクチビン、ついでレチノイン酸で処理すると、PDX1遺伝子発現が約60倍の増加に誘導された。RA処理にFGF-4を加えると、PDX1発現はわずかではあるがRA単独の約3倍、さらに誘導された。一方、FGF-10とレチノイン酸を共に加えると、PDX1の誘導は、RA単独の60倍へと更に増強された図37A。この非常に強力なPDX1誘導は、アクチビン処理やRA/FGF処理のない場合に比べて、1400倍以上の強さであった。興味深いことに、FGF-4およびFGF-10の同時添加は、FGF-10の有利な効果を減殺し、FGF-4添加の場合のように、わずかにPDX1発現を増加させるのみであった。RA/FGF-4またはRA/FGF-10を組み合わせて添加しても、添加しなかった細胞に比べて、前腸内胚葉と関係しないマーカー遺伝子の発現は増加しなかった図37B-C。実施例14レチノイン酸用量は、インビトロでの前方―後方A-P位置に影響を及ぼすRAの用量が、インビトロでの細胞培養物のA-P位置に影響を及ぼすかどうかを決定するため、以下の実験を行った。アクチビン存在下または非存在下に、ヒト胚性幹細胞を4日間培養した。4日目に、FGF-10を50ng/mlと、RAを0.04μM、0.2μMまたは1.0μMのいずれかを組み合わせて、細胞培養物に添加した。PDX1マーカー遺伝子および前腸内胚葉に非特異的な他のマーカー遺伝子の発現が、Q-PCRによって定量化された。FGF-10を50ng/mlと組み合わせて、種々の用量でレチノイン酸を加えると、異なった遺伝子発現パターンを誘導した。これら遺伝子発現パターンは、特異的な前方―後方位置パターンと相関する。RAの最も高い用量1μMは、前方内胚葉マーカーHOXA3の発現を誘導し、また最も強力にPDX1発現を増加させた図38A-B。RAの中レベルの用量0.2μMは、中腸内胚葉マーカーCDX1、HOXC6の発現を誘導した図38Cおよび図41E。一方、RAの最も低い用量0.04μMは、後腸内胚葉マーカーHOXA13の発現を誘導した図38D。RAの用量は、神経系SOX1またはニューロン性NFMマーカーの相対的発現に実質的影響を及ぼさなかった図38F-G。これらの結果は、RAがインビトロでモルフォゲンとして使用できること、特に分化したhESCの内胚葉誘導体のモルフォゲンとして使用できることを示している。実施例15B27の使用は、PDX1発現を増強するたくさんの因子および細胞増殖/分化条件を用いることによって、胚体内胚葉でのPDX1発現に影響を与えることができる。以下の実験は、B27の使用が、胚体内胚葉細胞でのPDX1発現を増強することを示すものである。未分化hES細胞を高用量のアクチビンA0.5-2FBS/DMEM/F12中、100-200ng/mlで処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で4日間成長させることによって、胚体内胚葉への分化を誘導した。アクチビンAなしのコントロールは、0.5-2FBS/DMEM/F12中に、アクチビンAを添加しないものであった。4日目に、培養物を、2FBSなし中または2血清リプレースメントSR中にアクチビンAなし、あるいは、2FBS/DMEM/F12なし、FBS、B27中または2血清リプレースメントSR中に、2μMのRA、50ng/mlのFGF-10と共に、50ng/mlのアクチビンAのいずれかにした。B27サプリメントGibco/BRLは、1/50に希釈して、2FBS/DMEM/F12B27に直接添加した。各場合に細胞サンプルを複数用意し、全RNAを回収し、前述同様にQ-PCRによって定量した。図39A-Eは、無血清でB27を加えたものが、PDX1遺伝子発現の誘導をさらに有利にしたことを示している。前腸内胚葉に非特異的なマーカー遺伝子の発現については、無血清で成長した細胞でのマーカー遺伝子の発現と比べて、増加を誘導しなかった。実施例16アクチビンBの使用は、PDX1誘導を増強する本実施例は、アクチビンBの使用が、インビトロでの細胞培養物における、PDX1陰性細胞からPDX1陽性細胞への分化を増強することを示す。未分化hES細胞を低血清RPMIにおいて高用量のアクチビンA50ng/mlで処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で6日間成長させることによって、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。FBSの用量は、1日目0、2日目0.2、3-6日目2であった。胚体内胚葉作製のためのネガティブコントロールNFは、アクチビンAを添加しない2FBS/RPMIであった。PDX1発現を誘導するために、6日目、各培養物の2FBS/RPMIにレチノイン酸2μMを加えた。1-5日目にアクチビンA処理された培養物は、アクチビンA単独50ng/mlのほか、異なる用量のアクチビンAおよびアクチビンBの組み合わせで処理された。アクチビンAなしのコントロール培養物NFは、アクチビンAやアクチビンBで処理されなかった。RA/アクチビン処理は3日間行われ、その後各複数の細胞サンプルについてPDX1遺伝子発現がQ-PCRによって測定された。図40Aに示すように、25ng/mlA25または50ng/mlA50のアクチビンA存在下に10-50ng/mlの範囲の用量のアクチビンBa10、a25、a50を加えると、アクチビンA単独50ng/mlで処理した培養物の少なくとも2倍にPDX1発現が増加した。アクチビンBを加えた結果、発生のこの時点での肝臓ならびに膵臓のマーカーであるHNF6の発現は増加することなく図40B、PDX1発現が増加した。この結果は、肝臓に比べて、膵臓に分化する細胞の割合が増加したことを示している。実施例17PDX1誘導を増強する用量での血清の使用胚体内胚葉細胞でのPDX1発現は、分化プロセスにおいて、細胞培養物に存在する血清量によって影響を受ける。以下の実験は、hESCからPDX1陰性胚体内胚葉への分化における培養物での血清量が、PDX1陽性内胚葉へのさらなる分化におけるPDX1発現に影響を与えることを示すものである。未分化hES細胞を低血清RPMIにおいて高用量のアクチビンA100ng/mlで処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で5日間成長させることによって、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。FBSの用量は、1日目0.1、2日目0.5、3-5日目は0.5、2および10のいずれかであった。アクチビンAなしのコントロールNFは、アクチビンAを添加しない同用量のFBS/RPMIであった。PDX1発現は、6日目からRAを添加して誘導された。培養物は、6-7日目、0.5FBS/RPMI中にレチノイン酸2μMとし、8日目1μM、9-11日目0.2μMとした。レチノイン酸処理中、アクチビンAは50ng/mlと低くし、アクチビンAなしのコントロールNFでは、なしのままにした。図41Aに示すように、胚体内胚葉誘導の3日間3,4,5日におけるFBSの用量は、引き続きレチノイン酸処理においてPDX1遺伝子発現の誘導を変える能力を持った。またこれは、ZIC1図41BまたはSOX7図41C遺伝子発現の発現パターンを実質的に変えなかった。実施例18PDX1誘導を増強する条件培地の使用胚体内胚葉細胞でのPDX1発現に影響を与える他の因子および増殖条件についても検討した。以下の実験は、PDX1陰性胚体内胚葉細胞からPDX1陽性内胚葉細胞への分化における条件培地の影響を示すものである。未分化hES細胞を低血清RPMIにおいて高用量のアクチビンA100ng/mlで処理し、マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で5日間成長させることによって、ヒト胚性幹細胞から胚体内胚葉への分化を誘導した。FBSの用量は、1日目0.2、2日目0.5、3-5日目2であった。5日間のアクチビンA処理で得られた胚体内胚葉培養物は、その後4日間25ng/mlのアクチビンAを含有する2FBS/RPMIにRAを添加することによって、PDX1発現内胚葉への分化を誘導した。RAの添加は、最初の2日間は2μMとし、3日目1μM、4日目0.5μMとした。PDX1誘導のためのこの基礎培地は、新鮮なもの2A25Rまたは4つの異なる細胞集団の1つによって24時間条件付けられた後のものであった。条件培地CMは、マウス胚性線維芽細胞MEFCMまたは、i3FBS/RPMICM2、iiアクチビンACM3もしくはiii骨形成タンパク質4BMP4CM4の3つの条件の1つによって最初に5日間分化させたhESCのいずれかによって作製された。アクチビンAまたはBMP4因子は、前記同様のFBS用量0.2、0.5、2の下で、100ng/ml加えられた。これら3つの異なる分化条件は、3つの非常に異なるヒト細胞集団を生じさせ、それによってPDX1誘導培地を調節することができる。増殖因子を添加しない3FBSNFは、大部分が胚外内胚葉、外胚葉および中胚葉細胞からなる不均一な集団を生じさせた。アクチビンA処理培養物A100は胚体内胚葉の大集団を生じさせ、BMP4処理培養物B100は主要なものとして栄養外胚葉を、さらに胚外内胚葉を生じさせた。図42Aに示すように、新鮮培地および条件培地において、最初の2日間のRA処理で、PDX1は同様に誘導された。しかし、3日目に、新鮮培地およびMEF条件培地において、PDX1発現は減少しはじめた。分化hESCにより作製した条件培地は、PDX1遺伝子発現を維持し、または新鮮培地より3,4倍高いレベルで発現をさらに増加させた。hESC条件培地でPDX1高発現を維持した効果は、4日目にRA処理することでさらに増強され、新鮮培地より6,7倍高いレベルとなった。図42Bに示すように、条件培地処理すると、PDX1発現内胚葉の領域では発現しない遺伝子である、CDX1遺伝子発現のレベルは非常に低くなった。このことは、分化hESC培養物から作製した条件培地で胚体内胚葉を処理することによって、PDX1発現内胚葉全体の純度が非常に高められたことを示している。図43に示すように、PDX1遺伝子発現は、胚体内胚葉細胞に添加された条件培地の量に対して、用量依存的応答を示した。各プレートに添加された培地全量は5mlであり、条件培地の各量図43が新鮮培地A25Rに希釈された。注目すべきことに、4mlの新鮮培地に1mlの条件培地を加えたものも、5mlの新鮮培地のみに比べてPDX1発現の高レベルを誘導し維持することができた。このことは、PDX1発現内胚葉を誘導するための条件培地の有利な効果が、細胞から条件培地に放出される1又は複数の物質に依存しており、この物質群の用量依存的にPDX1発現内胚葉の生産が高まることを示している。実施例19PDX1と結合する抗体の有効性PDX1と結合する抗体は、細胞集団でのPDX1の発現誘導をモニターするのに有効なツールである。そこで、本実施例は、PDX1に対するウサギポリクローナルIgY抗体が、PDX1タンパク質の存在を検出するのに利用できることを示す。最初の実験では、細胞溶解物中のPDX1と結合するIgY抗PDX1抗体IgYα―PDX1の有効性がウェスタンブロットによって調べられた。この実験では、MDX12ヒト線維芽細胞または24時間前にPDX1発現ベクターを感染させたMDX12細胞からの細胞溶解物全50μgに対するIgYα―PDX1抗体の結合性が比較された。細胞溶解物はSDS-PAGEによって分離され、エレクトロブロッティングによって膜に転写された後、まずIgYα―PDX1抗血清をプローブとして反応させ、次にアルカリホスファターゼ共役ウサギ抗IgYRbα―IgY2次抗体と反応させた。1次抗体および2次抗体の希釈度は、以下のように異なる組み合わせのものであった。A1次抗体500x希釈,2次抗体10000x希釈、B2000x10000x、C500x40000x、D2000x40000、E8000x40000xPDX1発現ベクター感染細胞PDX1陽性での結合性は、使用した抗体の組み合わせすべてで検出された。非感染PDX1陰性の線維芽細胞では、高濃度の1次抗体および2次抗体を共に使用した場合組み合わせAでのみ結合性が認められた。非特異的な結合として、感染および非感染の線維芽細胞双方で、PDX1よりわずかに高い分子量での付加的バンドが検出された。第2の実験では、ウサギポリクローナル抗PDX1抗体Rbα―PDX1のPDX1に対する結合性が免疫細胞化学法によって調査された。PDX1発現細胞を作製するため、PDX1―EGFP発現ベクターClontechのpEGFPN1を用いて作製を、MS1-V細胞ATCCCRL-2460に一過性に感染させた。その後、感染細胞は、Rbα―PDX1およびα―EGFP抗血清で標識された。感染細胞は、EGFPの蛍光と、Cy5共役2次抗体を用いたα―EGFP免疫細胞化学法との双方によって可視化された。PDX1の免疫蛍光は、α―RbCy3共役2次抗体を用いて可視化された。その結果、Rbα―PDX1およびα―EGFP抗体の結合は、GFP発現と共局在した。実施例20ヒト膵臓組織の免疫細胞化学法本実施例は、PDX1に対し特異性をもつ抗体が、免疫細胞化学法によってヒトPDX1陽性細胞を同定するのに利用できることを示す。最初の実験では、ヒト膵臓のパラフィン包埋切片に対し、1/200倍希釈したモルモット抗インシュリン1次抗体Gpα-Insと、1/100倍希釈したCy2共役イヌ抗モルモット2次抗体Dα-Gpとを用いて、インシュリンを染色した。第2の実験では、同じくヒト膵臓のパラフィン包埋切片に対し、1/4000倍希釈したIgY抗PDX1一次抗体と、1/300倍希釈したAF555共役ウサギ抗IgY2次抗体とを用いて、PDX1を染色した。第1および第2の実験で得られた画像を重ね合わせて、両発現の関係を調べた。第3の実験では、IgY抗PDX1抗体で染色した細胞をさらにDAPI染色した。ヒト膵臓切片の解析の結果、ランゲルハンス島での強い染色の存在が認められた。最も強いPDX1シグナルはインシュリン陽性の膵島で認められたが、インシュリン陰性の腺房組織においても弱い染色が認められた。DAPIとPDX1をともに染色した結果、PDX1は多く、しかし全部ではないが、核に局在していた。実施例21レチノイン酸処理細胞からのPDX1の免疫沈降RA存在下に分化させた胚体内胚葉細胞でのPDX1発現と、RA存在下に分化させなかった胚体内胚葉細胞でのPDX1の不存在とをさらに確かめるため、ウサギ抗PDX1抗体Rbα-PDX1を用いて、RAによる分化および未分化胚体内胚葉細胞からPDX1を免疫沈降した。免疫沈降したものから、IgY抗PDX1抗体を用いたウェスタンブロット解析により検出を行った。免疫沈降に供する分化および未分化胚体内胚葉細胞の溶解物を得るため、hESCが低血清において100ng/mlのアクチビンAで5日間処理され胚体内胚葉細胞、その後、50ng/mlのアクチビンAと、alltransRAを2日2μM、1日1μMおよび1日0.2μMで処理されたPDX1陽性前腸内胚葉。ポジティブコントロールとして、PDX1発現ベクターを感染させたMS1-V細胞ATCCCRL-2460からの細胞溶解物も調製された。各溶解物にウサギ抗PDX1抗体とウサギ特異的2次抗体を加えて、PDX1を免疫沈降した。沈降物を遠心分離に供し、SDS含有バッファーに溶解した後、ポリアクリルアミドゲルにロードした。分離後、エレクトロブロッティングによりタンパク質を膜に転写し、IgY抗PDX1一次抗体および標識ウサギ抗IgY2次抗体を用いて検出した。MS1-V陽性コントロール細胞および8日目レーンd8、RA処理から3日および9日目レーンd9、RA処理から4日の同細胞から得られた免疫沈降物は、PDX1タンパク質陽性であった図44。未分化胚体内胚葉細胞図44でAと示された、アクチビンA処理した5日目の細胞および未分化hESC図44でNFと示された、未処理5日目の細胞から得られた免疫沈降物は、PDX1陰性であった。実施例22PDX1プロモーターEGFPトランスジェニックhESC細胞の作製細胞単離のためのPDX1マーカーを使用するため、発現性レポーター遺伝子をもつタグつきのPDX1陽性前腸内胚葉細胞を遺伝子工学的に作製した。本実施例では、PDX1調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを有するベクターを作製した。また、上記ベクターを感染させたヒト胚性幹細胞やレポーターカセットがゲノムに組み込まれた細胞などの細胞を調製した。PDX1遺伝子の調節領域プロモーターの制御下にGFPレポーター遺伝子を配置し、レポーター遺伝子を遺伝子工学的にタグ付けしたPDX1発現胚体内胚葉細胞系統を作製した。最初に、pEGFPN1ベクターClontechのCMVプロモーターを、PDX1の転写開始部位から約4.4キロ塩基対bp上流から約85塩基対bp下流までの範囲の核酸配列を含むヒトPDX1調節領域GenbankAccessionNoAF192496に置換することによって、ヒトPDX1遺伝子プロモーターによりEGFP発現が制御されるプラスミドコンストラクトを作製した。この領域は、PDX1遺伝子の特徴的な調節エレメントを含んでおり、トランスジェニックマウスに通常のPDX1発現パターンを付与するのに十分である。得られたベクターでは、EGFP発現がPDX1プロモーターにより調節され、実験においてこのベクターをhESCに感染させることができる。PDX1プロモーター/EGFPカセットを上記ベクターから切り出し、ホスホグリセレートキナーゼ-1プロモーター制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む選択ベクターにサブクローニングした。選択カセットは、カセットを除去できるようにflpリコンビナーゼ認識部位に隣接して配置した。この選択ベクターを直鎖化して、通常のリポフェクタミン法によりhESCに導入した。G418により10-14日間選択した後、未分化トランスジェニックhESCクローンを単離し、増やした。実施例23PDX1陽性前腸内胚葉の単離本実施例は、PDX1プロモーター/EGFPカセットを含むhESCがPDX1陽性前腸内胚葉細胞に分化可能であり、これを蛍光活性細胞分離法FACSによって単離可能であることを示すものである。PDX1プロモーター/EGFPトランスジェニックhESCを、5日間はアクチビンA含有培地、その後2日間はアクチビンAおよびRA含有培地で分化させた。分化した細胞をトリプシン消化し、BectonDickinsonFACSDivaでRNA溶解バッファーまたはPBSに直接分離した。EGFPに対するゲーティングなしで単一生細胞のサンプルをとりLive、EGFP陽性GFPおよびGFP陰性Negの集団へ単一生細胞をゲートさせた。1つの実験では、EGFP陽性フラクションを蛍光強度HiとLoに応じて2つの等しい大きさの集団に分離した。分離後、細胞集団はQ-PCRおよび免疫細胞化学法で分析された。Q-PCR解析では、QiagenRNeasycolumnsを用いてRNAを調製し、cDNAを作製した。Q-PCRは前記同様に行った。免疫細胞化学法では、細胞をPBSに分離し、4パラホルムアルデヒドで10分間固定し、Cytospincentrifugeを用いてスライドガラスに固定した。サイトケラチン19KRT19に対する1次抗体はChemiconから、Hepatocytenuclearfactor3betaHNF3βに対するものはSantaCruzから、GlucoseTransporter2GLUT2に対するものはRDsystemsからのものを使用した。FITC緑又はRhodamine赤で標識した2次抗体を、1次抗体との直接結合に使用した。典型的な分化細胞のFACS分離結果を図45に示す。本実施例で単離されたPDX1陽性細胞の割合はおよそ7であったが、分化効率に応じて約1から約20まで変化した。分離した細胞はさらにQ-PCR解析に供された。分化した細胞は、EGFP蛍光と内因性PDX1遺伝子発現との相関を示した。非蛍光細胞と比較すると、EGFP陽性細胞は、PDX1発現レベルが20倍以上増加していた図46。EGFP強度の高低で分離すると、EGFP発現レベルはPDX1発現レベルと相関を示した図47。PDX1マーカー解析に加えて、分離した細胞について、膵臓内胚葉にて発現するいくつかの遺伝子のQ-PCR解析を行った。これらのマーカー遺伝子NKX2.2、GLUT2、KRT19、HNF4α、HNF3βそれぞれの産物はすべて、EGFP陽性フラクションにおいて豊富であった図48A-E。対照的に、神経系マーカーZIC1およびGFAPは、分離されたEGFP発現細胞では豊富でなかった図49AおよびB。免疫細胞化学法によって、実質的にすべての単離されたPDX1陽性細胞において、KRT19およびGLUT2が発現していた。この結果から、膵臓内胚葉系統の細胞であると考えられる。これらの細胞の多くはまた、抗体染色でHNF3β陽性であった。本明細書に記載した方法、組成物および装置は、好適な実施形態の現時点での代表的および模範的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。当技術分野における当業者は、本発明の精神に包含され、開示内容の範囲により明確にされる変更および他の用途を考え付くこともあろう。よって、種々の代替および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、ここに開示した本発明に帰することは当業者にとっては明らかであろう。請求項および本開示事項全体に渡って使用されている、本質的に~から成るという表現により、その表現の中に記載されたあらゆる要素を含み、記載されている要素に関する開示において特定した働きあるいは作用を妨げたり寄与したりすることのない他の要素に限定された、あらゆる要素を含むことを意味する。よって、本質的に~から成るという表現は、記載されている要素は必要、すなわち必須であるが、他の要素は任意であり、記載されている要素の働きまたは作用に影響するかどうかによって存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示している。本特許出願においては、多数の文献および特許参考文献が引用されている。本特許出願において引用された全ての参考文献は、その全内容を引用することにより本明細書の一部とされる。いくつかの参考文献に関しては、本文中、完全な典拠を記載している。その他の参考文献に関しては、本文中、著者および年度により言及しており、その完全な典拠を以下に示す。AlexanderJRothenbergMHenryGLandStainierDYCasanovaplaysanearlyandessentialroleinendodermformationinzebrafishDevBiol215343357AlexanderJandStainierDYAmolecularpathwayleadingtoendodermformationinzebrafishCurrBiol911471157AokiTOMathieuJSaintEtienneLRebagliatiMRPeyrierasNandRosaFMRegulationofnodalsignallingandmesendodermformationbyTARAMAaTGFbetarelatedtypeIreceptorDevBiol241273288BeckSLeGoodJAGuzmanMBenHaimNRoyKBeermannFandConstamDBExtraembryonicproteasesregulateNodalsignallingduringgastrulationNatCellBiol4981985BeddingtonRSRashbassPandWilsonVBrachyuryageneaffectingmousegastrulationandearlyorganogenesisDevSuppl157165BongsoAFongCYNgSCandRatnamSIsolationandcultureofinnercellmasscellsfromhumanblastocystsHumReprod921102117ChangHBrownCWandMatzukMMGeneticanalysisofthemammaliantransforminggrowthfactorbetasuperfamilyEndocrRev23787823ConlonFLLyonsKMTakaesuNBarthKSKispertAHerrmannBandRobertsonEJAprimaryrequirementfornodalintheformationandmaintenanceoftheprimitivestreakinthemouseDevelopment12019191928DouganSTWargaRMKaneDASchierAFandTalbotWSTheroleofthezebrafishnodalrelatedgenessquintandcyclopsinpatterningofmesendodermDevelopment13018371851FeldmanBGatesMAEganESDouganSTRennebeckGSirotkinHISchierAFandTalbotWSZebrafishorganizerdevelopmentandgermlayerformationrequirenodalrelatedsignalsNature395181185FengYBroderCCKennedyPEandBergerEAHIV1entrycofactorfunctionalcDNAcloningofaseventransmembraneGproteincoupledreceptorScience272872877FutakiSHayashiYYamashitaMYagiKBonoHHayashizakiYOkazakiYandSekiguchiKMolecularbasisofconstitutiveproductionofbasementmembranecomponentsGeneexpressionprofilesofengelbrethholmswarmtumorandF9embryonalcarcinomacellsJBiolChemGrapinBottonAandMeltonDAEndodermdevelopmentfrompatterningtoorganogenesisTrendsGenet16124130HarrisTMandChildsGGlobalgeneexpressionpatternsduringdifferentiationofF9embryonalcarcinomacellsintoparietalendodermFunctIntegrGenomics2105119HoganBLBonemorphogeneticproteinsindevelopmentCurrOpinGenetDev6432438HoganBLPluripotentembryoniccellsandmethodsofmakingsameHoweCCOvertonGCSawickiJSolterDSteinPandStricklandSExpressionofSPARCosteonectintranscriptinmurineembryosandgonadsDifferentiation372025HudsonCClementsDFridayRVStottDandWoodlandHRXsox17alphaandbetamediateendodermformationinXenopusCell91397405ImadaMImadaSIwasakiHKumeAYamaguchiHandMooreEEFetomodulinmarkersurfaceproteinoffetaldevelopmentwhichismodulatablebycyclicAMPDevBiol122483491KanaiAzumaMKanaiYGadJMTajimaYTayaCKurohmaruMSanaiYYonekawaHYazakiKTamPPandHayashiYDepletionofdefinitivegutendoderminSox17nullmutantmiceDevelopment12923672379KatohMExpressionofhumanSOX7innormaltissuesandtumorsIntJMolMed9363368KikuchiYAgathonAAlexanderJThisseCWaldronSYelonDThisseBandStainierDYcasanovaencodesanovelSoxrelatedproteinnecessaryandsufficientforearlyendodermformationinzebrafishGenesDev1514931505KimCHandBroxmeyerHEChemokinessignallampsfortraffickingofTandBcellsfordevelopmentandeffectorfunctionJLeukocBiol65615KimelmanDandGriffinKJVertebratemesendoderminductionandpatterningCurrOpinGenetDev10350356KuboAShinozakiKShannonJMKouskoffVKennedyMWooSFehlingHJKellerGDevelopmentofdefinitiveendodermfromembryonicstemcellsincultureDevelopment131165162KumarANovoselovVCelesteAJWolfmanNMtenDijkePandKuehnMRNodalsignalingusesactivinandtransforminggrowthfactorbetareceptorregulatedSmadsJBiolChem276656661LaboskyPABarlowDPandHoganBLEmbryonicgermcelllinesandtheirderivationfrommouseprimordialgermcellsCibaFoundSymp182157168discussion168178LaboskyPABarlowDPandHoganBLMouseembryonicgermcelllinestransmissionthroughthegermlineanddifferencesinthemethylationimprintofinsulinlikegrowthfactor2receptorgenecomparedwithembryonicstemcelllinesDevelopment12031973204LickertHKutschSKanzlerBTamaiYTaketoMMandKemlerRFormationofmultipleheartsinmicefollowingdeletionofbetacateninintheembryonicendodermDevCell3171181LuCCBrennanJandRobertsonEJFromfertilizationtogastrulationaxisformationinthemouseembryoCurrOpinGenetDev11384392MaQJonesDandSpringerTAThechemokinereceptorCXCR4isrequiredfortheretentionofBlineageandgranulocyticprecursorswithinthebonemarrowmicroenvironmentImmunity10463471McGrathKEKoniskiADMaltbyKMMcGannJKPalisJEmbryonicexpressionandfunctionofthechemokineSDF1anditsreceptorCXCR4DevBiol21344256MiyazonoKKusanagiKandInoueHDivergenceandconvergenceofTGFbetaBMPsignalingJCellPhysiol187265276NagasawaTHirotaSTachibanaKTakakuraNNishikawaSKitamuraYYoshidaNKikutaniHandKishimotoTDefectsofBcelllymphopoiesisandbonemarrowmyelopoiesisinmicelackingtheCXCchemokinePBSFSDF1Nature382635638NiwaHMolecularmechanismtomaintainstemcellrenewalofEScellsCellStructFunct26137148OguraHArugaJandMikoshibaKBehavioralabnormalitiesofZic1andZic2mutantmiceimplicationsasmodelsforhumanneurologicaldisordersBehavGenet31317324ReubinoffBEPeraMFFongCYTrounsonAandBongsoAEmbryonicstemcelllinesfromhumanblastocystssomaticdifferentiationinvitroNatBiotechnol18399404RodawayAandPatientRMesendodermanancientgermlayerCell105169172RodawayATakedaHKoshidaSBroadbentJPriceBSmithJCPatientRandHolderNInductionofthemesendoderminthezebrafishgermringbyyolkcellderivedTGFbetafamilysignalsanddiscriminationofmesodermandendodermbyFGFDevelopment12630673078RohrKBSchulteMerkerSandTautzDZebrafishzic1expressioninbrainandsomitesisaffectedbyBMPandhedgehogsignallingMechDev85147159SchierAFNodalsignalinginvertebratedevelopmentAnnuRevCellDevBiol19589621SchoenwolfGCandSmithJLGastrulationandearlymesodermalpatterninginvertebratesMethodsMolBiol135113125ShamblottMJAxelmanJWangSBuggEMLittlefieldJWDonovanPJBlumenthalPDHugginsGRandGearhartJDDerivationofpluripotentstemcellsfromculturedhumanprimordialgermcellsProcNatlAcadSciUSA951372613731ShapiroAMLakeyJRRyanEAKorbuttGSTothEWarnockGLKnetemanNMandRajotteRVIslettransplantationinsevenpatientswithtype1diabetesmellitususingaglucocorticoidfreeimmunosuppressiveregimenNEnglJMed343230238ShapiroAMRyanEAandLakeyJRPancreaticislettransplantationinthetreatmentofdiabetesmellitusBestPractResClinEndocrinolMetab15241264ShapiroJRyanEWarnockGLKnetemanNMLakeyJKorbuttGSandRajotteRVCouldfewerisletcellsbetransplantedintype1diabetesInsulinindependenceshouldbedominantforceinislettransplantationBmj322861ShiozawaMHiraokaYKomatsuNOgawaMSakaiYandAisoSCloningandcharacterizationofXenopuslaevisxSox7cDNABiochimBiophysActa13097376SmithJBrachyuryandtheTboxgenesCurrOpinGenetDev7474480SmithJCArmesNAConlonFLTadaMUmbhauerMandWestonKMUpstreamanddownstreamfromBrachyuryagenerequiredforvertebratemesodermformationColdSpringHarbSympQuantBiol62337346TakashWCanizaresJBonneaudNPoulatFMatteiMGJayPandBertaPSOX7transcriptionfactorsequencechromosomallocalisationexpressiontransactivationandinterferencewithWntsignallingNucleicAcidsRes2942744283TaniguchiKHiraokaYOgawaMSakaiYKidoSandAisoSIsolationandcharacterizationofamouseSRYrelatedcDNAmSox7BiochimBiophysActa1445225231TechnauUBrachyurytheblastoporeandtheevolutionofthemesodermBioessays23788794ThomsonJAItskovitzEldorJShapiroSSWaknitzMASwiergielJJMarshallVSandJonesJMEmbryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocystsScience28211451147TremblayKDHoodlessPABikoffEKandRobertsonEJFormationofthedefinitiveendoderminmouseisaSmad2dependentprocessDevelopment12730793090VandesompeleJDePreterKPattynFPoppeBVanRoyNDePaepeAandSpelemanFAccuratenormalizationofrealtimequantitativeRTPCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenesGenomeBiol3RESEARCH0034VarletICollignonJandRobertsonEJnodalexpressionintheprimitiveendodermisrequiredforspecificationoftheanterioraxisduringmousegastrulationDevelopment12410331044VincentSDDunnNRHayashiSNorrisDPandRobertsonEJCellfatedecisionswithinthemouseorganizeraregovernedbygradedNodalsignalsGenesDev1716461662WeilerGuettlerHAirdWCRayburnHHusainMandRosenbergRDDevelopmentallyregulatedgeneexpressionofthrombomodulininpostimplantationmouseembryosDevelopment12222712281WeilerGuettlerHYuKSoffGGudasLJandRosenbergRDThrombomodulingeneregulationbycAMPandretinoicacidinF9embryonalcarcinomacellsProceedingsOfTheNationalAcademyOfSciencesOfTheUnitedStatesOfAmerica8921552159WellsJMandMeltonDAVertebrateendodermdevelopmentAnnuRevCellDevBiol15393410WellsJMandMeltonDAEarlymouseendodermispatternedbysolublefactorsfromadjacentgermlayersDevelopment12715631572WillisonKThemouseBrachyurygeneandmesodermformationTrendsGenet6104105ZhaoGQConsequencesofknockingoutBMPsignalinginthemouseGenesis354356ZhouXSasakiHLoweLHoganBLandKuehnMRNodalisanovelTGFbetalikegeneexpressedinthemousenodeduringgastrulationNature361543547"