"神経が損なわれているか、傷つけられているか、もしくは損傷しているか、または神経が損なわれるか、傷つけられるか、もしくは損傷する危険性がある哺乳動物における疾患または状態を処置または改善するのに使用するための単離ヒトIgM抗体またはその断片であって、該抗体またはその断片は、ニューロンに特異的に結合し、ニューロンを細胞死から保護し、かつ再ミエリン化を促進せず、ここで、該抗体または断片は、以下の配列:a図5に示される、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36、またはb図6に示される、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む、単離ヒトIgM抗体またはその断片。配列番号1に示される可変重鎖アミノ酸配列および配列番号11に示される可変軽鎖アミノ酸配列を含むか、または配列番号17に示される可変重鎖アミノ酸配列および配列番号27に示される可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離抗体。可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む、請求項1に記載の単離抗体またはその断片。図6に示される、配列番号17に示される可変重鎖アミノ酸配列および配列番号27に示される可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項3に記載の単離抗体。組換え抗体rHIgM42である、請求項1、3、または4に記載の単離抗体。請求項3に記載の単離抗体または断片であって、該単離抗体または断片は、配列番号17および27のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗体断片、またはそれらの相同性の高いバリアントであり、該バリアントは、ニューロン結合活性および神経保護活性を保持する、単離抗体または断片。可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む、請求項1に記載の単離抗体またはその断片。ヒトJ鎖配列をさらに含む、請求項1または7に記載の単離抗体。前記J鎖が配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体。配列番号1に示される可変重鎖アミノ酸配列および配列番号11に示される可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項7または8に記載の抗体。組換え抗体rHIgM12である、請求項1、7、8、または10に記載の単離組換え抗体。請求項7に記載の単離抗体または断片であって、該単離抗体または断片は、配列番号1および11のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む完全ヒト抗体もしくはその抗体断片、またはそれらの相同性の高いバリアントであり、該バリアントは、ニューロン結合活性および神経保護活性を保持する、単離抗体または断片。脊髄損傷SCI、外傷性脳損傷TBI、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症MS、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、出産前低酸素症/周産期虚血、脳性まひ、脳症、脊髄症、または運動ニューロン疾患において使用するためのものである、請求項1から12のいずれかに記載の単離抗体またはその断片。中枢神経系の神経が損なわれているか、傷つけられているか、もしくは損傷しているか、または神経が損なわれるか、傷つけられるか、もしくは損傷する危険性がある哺乳動物における疾患または状態を処置または改善するのに使用するために、再ミエリン化抗体と組み合わせて処方されている、請求項1に記載の単離抗体。組み合わされる前記再ミエリン化抗体がIgM22およびIgM46から選択される、請求項14に記載の単離抗体。組み合わされる前記再ミエリン化抗体が、配列番号43および44に示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むか、または配列番号45および46に示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む、請求項15に記載の抗体。検出可能な標識または機能的な標識で標識されている、請求項1から12のいずれかに記載の抗体。前記標識が酵素、特異的結合パートナー、リガンド、色素、蛍光タグ、および/または放射性元素である、請求項17に記載の抗体。請求項1から12のいずれかに記載の抗体または断片をコードする配列を含む、単離核酸。請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体または断片を調製する方法であって、該抗体または断片の発現をもたらす条件下で、請求項17に記載の核酸を発現させるステップと、該抗体または断片を取り出すステップとを含む、方法。請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体または断片と、薬学的に許容されるビヒクル、キャリア、または希釈剤とを含む、医薬組成物。動物被験体における神経細胞の傷害、損傷、または死滅を処置または改善するためのキットであって、請求項21に記載の医薬組成物の医薬投薬形態と、1または複数のさらなる向神経活性剤もしくは治療用抗炎症剤、神経伝達物質放出調節剤、神経受容体リガンドもしくは神経受容体アゴニストもしくは神経受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル剤、免疫調節剤、または他のCNS反応性抗体を含む別個の医薬投薬形態とを含む、キット。前記他のCNS反応性抗体が、IgM22および/またはIgM46から選択される再ミエリン化抗体である、請求項22に記載のキット。CNS損傷を結果としてもたらす疾患、状態、または合併症を患う哺乳動物における神経の傷害、死滅、または損傷の存在または程度を検出するための方法であって、A.神経の傷害、死滅、または損傷の存在が疑われる哺乳動物に由来する生物学的試料を、請求項1から12のいずれかに記載の抗体または断片と、該抗体または断片の該試料中のニューロンへの結合を可能とする条件下で、接触させるステップと、B.該試料に由来する該ニューロンと該抗体との間で結合が生じたか否か検出するか、または該試料に由来する該ニューロンおよび該抗体により生じた結合の量を決定するステップとを含み、該結合の検出により該試料中の神経細胞の傷害、死滅、または損傷の存在が示され、該結合の量により神経細胞の傷害、死滅、または損傷の相対量が示される、方法。哺乳動物のCNSにおけるニューロンの傷害、死滅、もしくは損傷を、またはニューロンの傷害、死滅、もしくは損傷の危険性がある細胞を標的とするための、および決定するための方法であって、該哺乳動物に、検出可能に標識したある量の、請求項1から12のいずれかに記載の抗体を投与するステップと、該哺乳動物のCNSにおける該標識の量および/または該標識の位置を決定するステップとを含む、方法。中枢神経系において活性を呈示し、特に、再ミエリン化の刺激と関連するヒトモノクローナル自己抗体が同定されている。CNSにおける活性を伴うヒトモノクローナル抗体、特に、これらの活性、ならびに神経再生を促進し、かつ/またはニューロンを疾患、傷害、損傷、および/もしくは死滅から保護する能力を伴う組換え抗体を同定し、特徴付け、開発することが所望されるであろう。これは、本発明が対象とする目的に向けたものである。本明細書における参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明に先行することの容認としてはみなされないものとする。本発明は、CNSにおける特定の有効性を伴う神経調節剤であって、IgM亜型の抗体、その活性断片、その単量体、そのアゴニスト、およびこれらの組合せからなる群から選択される物質を含む薬剤に関する。本発明の神経調節剤または抗体は、以下の特徴のうちの1または複数を有する:本発明の神経調節剤または抗体は、ニューロンを保護し、かつ/またはこれを安定化させる;本発明の神経調節剤または抗体は、CNSまたは神経細胞の損傷、障害、または傷害における部位を標的とする;本発明の神経調節剤または抗体は、細胞死、例えば、過酸化水素誘導性細胞死を低減または遮断する。本発明は、中枢神経系における診断目的および治療目的のための、神経突起伸長を促進し、神経再生において作用し、かつ/またはニューロンを損傷から保護する能力を伴うニューロン結合モノクローナル抗体を提供する。特に、特異的な組換え抗体であって、皮質ニューロン、海馬ニューロン、小脳顆粒細胞、および網膜神経節細胞を含めたニューロンを認識し、これらに結合することが可能な抗体が提供される。本明細書では、組換え完全ヒト抗体が提供される。本発明の抗体は、神経の障害、損傷または傷害と関連する状態または疾患において診断的および治療的に用いられる。一般的な態様では、本発明が、皮質ニューロン、海馬ニューロン、小脳顆粒細胞、および網膜神経節細胞を含めたニューロンにおける1または複数のエピトープを指向し、これらに結合することが可能な抗体を提供する。広範な態様では、本発明が、単離された特異的結合メンバー、特に、ニューロンを認識し、これらに結合し、かつ/またはこれらを標的とする組換えヒト抗体を含めた抗体またはその断片を提供する。本発明は、ニューロンに特異的に結合し、ニューロンを細胞死から保護し、再ミエリン化を促進しないヒト抗体、特に、ヒト抗体、特に、IgM抗体を提供する。本発明の抗体は、脊髄損傷SCI、外傷性脳損傷traumaticbrianinjuryTBI、筋萎縮性側索硬化症AmyolotropicLateralSclerosisALS、多発性硬化症MS、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、出産前低酸素症/周産期虚血、脳性まひ、脳症、脊髄症、または運動ニューロン疾患における使用、および、特に、これらの疾患におけるニューロンおよび神経の能力の保護、存続、または維持における使用を含め、神経が損なわれているか、傷つけられているか、もしくは損傷しているか、またはその危険性がある哺乳動物における疾患または状態を処置または改善するのに使用される。特定の態様では、本発明が、抗体12または42、特に、血清由来または組換えのIgM12またはIgM42である抗体またはその断片を提供する。本発明の態様では、図5および/または6に示される可変領域のCDR配列を含む、組換えまたは合成のニューロン結合抗体が提供される。抗体12は、図5に示される、重鎖CDR配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む。抗体42は、図6に示される、重鎖CDR配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む。したがって、本明細書で同定される抗体複数可のCDRに基づく組換え抗体は、ニューロン、特に、疾患またはがんにおいて感受性であるか、障害され、損傷されまたは傷害されたニューロンを標的とし、保護するのに有用である。したがって、本発明は、神経が損なわれているか、傷つけられているか、もしくは損傷しているか、またはその危険性がある哺乳動物における疾患または状態を処置または改善するのに使用される、ニューロンに特異的に結合し、ニューロンを細胞死から保護し、再ミエリン化を促進しない単離ヒトIgM抗体複数可またはその断片複数可であって、a図5に示される可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36、またはb図6に示される、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む抗体または断片を提供する。さらなる特定の態様では、本発明の抗体が、図5および/または図6に示されるアミノ酸配列を含めた抗体12または42のアミノ酸配列を含む。本発明の組換え抗体であるIgM12は、図5に示される可変重鎖配列配列番号1および可変軽鎖配列配列番号11を含む。本発明の組換え抗体であるIgM42は、図6に示される可変重鎖配列配列番号17および可変軽鎖配列配列番号27を含む。本発明の特定の態様では、組換え抗体は、ヒト重鎖可変領域、定常領域、およびヒトJ鎖を含む、完全ヒト組換え抗体である。本明細書では、図5に示される、可変領域配列番号1またはそのCDR、ヒト定常領域、特に、カッパ配列配列番号3、5、7、および9およびヒトJ鎖配列番号15を含むヒト免疫グロブリン重鎖を含む完全ヒト組換えIgM12抗体が提供される。さらなる態様では、本発明が、抗原に結合することが可能な単離抗体またはその断片であって、本明細書および図6に実質的に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド結合ドメインを含む抗体またはその断片を提供する。本発明は、ニューロンに結合することが可能な単離されたヒト抗体またはその断片であって、重鎖可変領域配列番号17もしくはそのCDR、および軽鎖可変領域配列番号27もしくはそのCDRを含む抗体もしくはその断片、または本明細書および図6に実質的に示されるアミノ酸配列を含む抗体もしくはその断片を提供する。さらなる態様では、本発明が、抗原に結合することが可能な単離された完全ヒト抗体またはその断片であって、実質的に本明細書および図5に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド結合ドメインを含む抗体またはその断片を提供する。本発明は、ニューロンに結合することが可能な単離された完全ヒト抗体またはその断片であって、重鎖可変領域配列番号1もしくはそのCDR、および軽鎖可変領域配列番号11もしくはそのCDRを含むか、または実質的に本明細書および図5に示されるアミノ酸配列を含む抗体またはその断片を提供する。本発明は特に、単離ヒトIgM抗体またはその活性断片であって、図5に示される、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む抗体またはその活性断片を提供する。特定の態様では、本発明が、単離された完全ヒト組換えIgM抗体またはその活性断片であって、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36、ヒト定常領域および配列番号15に示されるヒトJ鎖配列を含む抗体またはその活性断片を提供する。さらなる態様では、本発明が、ニューロン結合ポリペプチドまたは上記で規定した抗体をコードする配列を含む単離核酸、および本発明のポリペプチドまたは抗体を調製する方法であって、前記ポリペプチドまたは抗体の発現をもたらす条件下で前記核酸を発現させるステップと、これらのポリペプチドまたは抗体を取り出すステップとを含む方法を提供する。このような一態様では、図5もしくは6に示されるアミノ酸配列を有する抗体の可変領域配列をコードする核酸が提供されるか、または図5もしくは6に示されるCDRドメイン配列を有する抗体が提供される。一態様では、図5または6の核酸配列を含む核酸が提供される。さらなる態様では、図5または6に示される重鎖可変領域であるVH鎖または軽鎖可変領域であるVL鎖をコードする核酸が提供される。本発明はまた、本発明の抗体をコードする組換えDNA分子もしくはクローニングされた遺伝子またはその縮重バリアント、好ましくは、核酸分子、特に、抗体のVH鎖およびVL鎖、特に、図5または6に示される配列を有するかまたはこれをコードすることが可能なCDR領域の配列をコードする組換えDNA分子またはクローニングされた遺伝子にも関する。好ましい態様では、本発明が、IgM12の重鎖可変領域配列配列番号2および軽鎖可変領域配列配列番号12をコードする核酸、ならびにIgM42の重鎖可変領域配列配列番号18および軽鎖可変領域配列配列番号28をコードする核酸を提供する。本発明の態様では、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む抗体またはその断片をコードする核酸が提供される。さらなる態様では、核酸が、ヒト定常領域およびヒトJ鎖、特に、配列番号15のJ鎖をさらにコードする。本発明の態様では、可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む抗体またはその断片をコードする核酸が提供される。さらなる態様では、核酸が、ヒト定常領域およびヒトJ鎖、特に、配列番号15のJ鎖をさらにコードする。本発明による可変領域配列を含む抗体、それらの断片、および組換え抗体は、哺乳動物における神経保護の方法であって、前記哺乳動物に有効量の本発明の抗体、それらの断片、および組換え抗体を投与するステップを含む方法など、ヒトまたは動物の身体に対する処置法、防止法、または診断法において用いることができる。本発明によるCDRドメイン領域の配列を含む組換え抗体またはそれらの断片は、哺乳動物における神経保護の方法であって、前記哺乳動物に有効量の本発明の抗体、それらの断片、および組換え抗体を投与するステップを含む方法において用いることができる。本発明の薬剤、特に、組換え抗体またはそれらの断片は、神経傷害、神経損傷または神経障害、および結果としてCNS損傷をもたらすことが可能であり、可能性があるかまたは実際にもたらす合併症を防止、処置、または改善するための方法における神経保護剤として用いることができる。本発明の処置法または防止法は、脳傷害または脳外傷、脊髄損傷SCI、神経傷害、頭部傷害、脳への血液供給が低減されるかまたは障害された状態、脳の感染性疾患、神経変性疾患を含めた、ニューロンの構造、機能、または生存の喪失が関与するかまたは関連する場合に適用可能である。本発明の方法に従い処置、防止、または改善するための例示的なこのような疾患または状態には、脊髄損傷SCI、外傷性脳損傷TBI、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症MS、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、出産前低酸素症/周産期虚血、および/または脳性まひ、脳症、脊髄症、ならびに運動ニューロン疾患が含まれる。したがって、本発明は、神経が障害され、傷害されもしくは損傷した哺乳動物における疾患もしくは状態、または神経もしくはニューロンが障害、傷害もしくは損傷に感受性であるかもしくはこの危険性がある状況を処置または改善する方法であって、IgM12およびIgM42から選択される組換え抗体もしくは完全ヒト抗体またはその断片を投与するステップを含む方法に関する。本発明の態様では、本発明による可変領域配列を含む抗体、それらの断片、および組換え抗体を、神経が障害され、傷害されもしくは損傷した症例、疾患、もしくは状態、または神経もしくはニューロンが障害、傷害もしくは損傷に感受性であるかもしくはこの危険性がある状況における神経機能または運動機能を改善または安定化させる方法において用いることもでき、このための組成物により投与することもできる。特定の態様では、歩行などの運動または想起もしくは認識などの認知機能を含めた、またはこれらから選択される神経機能または運動機能の改善または安定化を促進するかまたは維持するように、抗体またはそれらの断片を、疾患または状態の早期もしくは初期において用いるかもしくは投与するか、または疾患または状態の経過または持続時間にわたり反復使用する。本発明の方法は、抗体IgM12および抗体IgM42の組合せを含めた複数の抗体または断片の投与を含みうる。本発明の態様では、1または複数の抗体またはそれらの断片を投与するステップを含み、抗体がa可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36、またはb可変重鎖アミノ酸CDRドメイン配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む方法が提供される。さらなるこのような方法では、抗体IgM12および/または抗体IgM42のうちの1または複数、特に、抗体rHIgM22および/または抗体rHIgM46のうちの1または複数を含めた他のCNS作用抗体と組み合わせることができる。rHIgM22抗体は、配列番号43および44に示されるアミノ酸配列またはこれらの配列番号のCDRを含む。rHIgM46抗体は、配列番号45および46に示されるアミノ酸配列またはこれらの配列番号のCDRを含む。したがって、抗体IgM12および/または抗体IgM42のうちの1または複数は、aCDR1配列であるSSGMH、CDR2配列であるVIISYDGSRKYYADSVKG、およびCDR3配列であるGVTGSPTLDYを含む重鎖可変領域のCDR、ならびにCDR1配列であるSGSSSNIGNNFVS、CDR2配列であるDITKRPS、およびCDR3配列であるGETWDSSLSAVVを含む軽鎖可変領域のCDR;またはbCDR1配列であるSGFTFSSYW、CDR2配列であるIKKDGSEK、およびCDR3配列であるARPNCGGDCYLPWYFDを含む重鎖可変領域のCDR、ならびにCDR1配列であるQSVLYSSNNKNY、CDR2配列であるYWAS、およびCDR3配列であるQQYYNTPQAを含む軽鎖可変領域のCDRを含む1または複数の再ミエリン化抗体と組み合わせることができる。抗体の組合せは、まとめて投与することもでき、逐次的に投与することもでき、多様な回数および多様な量または濃度で投与することができる。二重特異性抗体を用いることもでき、多重特異性抗体を用いることもできる。特定のこのような態様では、抗体12および/または抗体42を、抗体22および/もしくは抗体46ならびに/またはIgM22またはIgM46のCDR領域のCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を有する抗体と組み合わせて、併用投与を介して、または数時間、数日間、もしくは数週間を含めた短時間もしくは長期間を隔てて逐次的に投与する。このような特定の一態様では、神経変性を伴う疾患または状態、および、特に、脱髄を含めた疾患または状態を処置または改善するために、抗体12および/または抗体42を、抗体22および/または抗体46と組み合わせて、併用投与を介して、または逐次的に投与する。さらなるこのような態様では、脱髄性疾患または脱髄性状態を処置または改善するために、抗体12および/または抗体42を、抗体22および/または抗体46と組み合わせて、併用投与を介して、または逐次的に投与する。特定の態様では、多発性硬化症を処置または改善するために、抗体12および/または抗体42を、抗体22および/または抗体46と組み合わせて、併用投与を介して、または逐次的に投与する。このような一態様では、MS症の測定可能な臨床的側面において、相乗効果を含めた組合せ効果のために再ミエリン化および神経保護を達成する。本発明の薬剤の神経保護能および/または神経変性能の点から述べると、本発明はさらに、皮質ニューロン、海馬ニューロン、小脳顆粒細胞、および網膜神経節細胞の増殖を含めたニューロンの増殖を、invitroにおいてもたらし、刺激する方法にも関する。このような増殖したニューロンは、移植および神経細胞の治療プロトコールおよび治療法に適切でありうる。本発明の診断的有用性は、invitroおよびinvivoにおける診断アッセイおよび画像化アッセイを含めた、CNSにおける神経傷害もしくは神経損傷を特徴付けるか、または神経傷害もしくは神経損傷もしくは神経死滅壊死性死滅またはアポトーシス性死滅を含めたを伴う疾患もしくは状態についてスクリーニングするかもしくは評価するアッセイおよび方法における本発明の抗体の使用まで拡張される。イムノアッセイでは、対照量の抗体などを調製し、酵素、特異的結合パートナー、リガンド、色素、蛍光タグ、および/または放射性元素で標識し、次いで、細胞試料へと導入することができる。標識した物質またはその結合パートナー複数可に試料内の部位と反応する機会を与えた後、結果として得られる物質塊を、結合させる標識の性質と共に変化しうる公知の技法を介して観察することができる。invivoにおける診断適用または画像化適用では、抗体またはそのニューロン結合断片を調製し、酵素、特異的結合パートナー、リガンド、色素、蛍光タグ、および/または放射性元素で標識し、次いで、動物へと導入することができる。標識した物質またはその結合パートナー複数可に動物内の部位と反応する機会を与えた後、この動物を、結合させる標識の性質と共に変化しうる公知の技法を介して観察することができる。放射性標識した特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片は、invitroの診断法およびinvivoの放射性画像化法において有用である。本発明のさらなる態様では、放射性標識した特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片、特に、ラジオイムノコンジュゲート、特に、放射性標識した抗体としてのラジオイムノコンジュゲートが、神経傷害の修復、神経変性の回復、がん、もしくはCNS腫瘍の治療のための放射性免疫治療、または、代替的に、特定の症例において損傷した神経組織またはニューロンを切除するための放射性免疫治療において有用である。invivoの態様では、抗体またはそのニューロン結合断片を標識し、神経傷害を位置特定するかまたは損傷されもしくは傷害された残りの神経組織を評価するための、定位固定法または侵襲性が最小限の技法を含めた手術もしくは外科法の前、手術もしくは外科法の間、または手術もしくは外科法の後に動物に投与する。このような一態様では、放射性標識した特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片が、放射免疫ガイド下手術法において有用であり、この場合、これらにより、障害され、損傷され、傷害され、または死滅する神経細胞もしくはニューロンまたは神経組織の存在および/または位置を、手術前、手術中、または手術後に同定および指示して、このような細胞を標的とするか、同定するか、または除去することもできる。本発明に包含されるイムノコンジュゲートまたは抗体の融合タンパク質であって、本発明の特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片を、他の分子または薬剤にコンジュゲートするかまたは結合させたイムノコンジュゲートまたは融合タンパク質にはさらに、神経活性薬、化学的切除剤、毒素、免疫調節剤、サイトカイン、細胞傷害薬、化学療法剤または化学療法薬にコンジュゲートした結合メンバーも含まれるがこれらに限定されない。本発明は、例として挙げると、ニューロンの損傷、障害、もしくは傷害の程度もしくは存在についての定量的解析のための試験キット、または試料中のニューロンを定量化するための試験キットの形態で調製しうるアッセイ系を包含する。系または試験キットは、本明細書で論じられる放射法および/または酵素法のうちの1つを介して調製される標識された成分と、標識の、抗体、および、場合によって、それらのうちの少なくとも1つを遊離成分複数可もしくは固定化成分複数可とする1または複数のさらなる免疫化学試薬、またはそれらの結合パートナー複数可への連結とを含みうる。本発明の抗体、ならびに、特定の実施形態では、本明細書の図5および6に示される重鎖配列および/または軽鎖配列を含む組換え抗体複数可、またはそれらの活性断片、ならびに、特に、図5および6に示されるCDR領域の配列を含む、これらに由来する単鎖抗体、組換え抗体、または合成抗体を、ニューロンの障害、損傷、傷害、または死滅を伴う状態または疾患を処置または改善するためなど、治療が適切な症例において投与するための、適切なビヒクル、キャリア、または希釈剤を含めた医薬組成物に調製することができる。このような医薬組成物はまた、PEG化など、当技術分野において公知の方法を介する、抗体または断片の半減期を調節する方法も包含する。このような医薬組成物はさらに、さらなる抗体または治療剤も含みうる。本発明はまた、他の分子または薬剤と共有結合するかまたは他の形で会合する、抗体およびそれらの断片も包含する。これらの他の分子または薬剤には、異なる認識特徴を伴う分子抗体または抗体断片を含めた、毒素、リガンド、向神経活性剤、および化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない。さらなる態様では、本発明の抗体または断片を用いて、治療用分子または他の薬剤を標的化するかまたは方向付ける、例えば、ニューロン、例えば、創傷部位、虚血部位、腫瘍部位、炎症性領域、または神経変性病変におけるニューロンを含めた、皮質ニューロン、海馬ニューロン、網膜神経節細胞、または小脳顆粒細胞を、分子または薬剤の標的とすることができる。当業者には、以下の例示的な図面および付属の特許請求の範囲を参照しながらなされる後続の詳細な説明の検討から、他の目的および利点が明らかであろう。本発明に従い、当技術分野内にある従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法が用いられうる。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual1989年;CurrentProtocolsinMolecularBiologyI~III巻[Ausubel,R.M.編1994年];CellBiology:ALaboratoryHandbookI~III巻[J.E.Celis編1994年];CurrentProtocolsinImmunologyI~III巻[Coligan,J.E.編1994年];OlygonucleotideSynthesisM.J.Gait編、1984年;NucleicAcidHybridization[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編1985年];TranscriptionAndTranslation[B.D.HamesおよびS.J.Higgins編1984年];AnimalCellCulture[R.I.Freshney編1986年];ImmobilizedCellsAndEnzymes[IRLPress1986年];B.Perbal、APracticalGuideToMolecularCloning1984年を参照されたい。したがって、本明細書に現れる場合、以下の用語は、下記に示される定義を有するものとする。A.用語特異的結合メンバーという用語は、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーについて記載する。特異的結合対のメンバーは、天然由来の場合もあり、全体的または部分的な合成により生成させる場合もある。分子対の1つのメンバーは、その表面上に領域を有するか、または凹部を有するか、その表面上に、分子対の他のメンバーに特異的な空間構成および極性構成に特異的に結合し、したがってこれと相補的な構成要素を有する。したがって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の種類の例は、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質である。この適用は、抗原-抗体型の反応に関与する。抗体という用語は、天然の場合であれ、全体的または部分的な合成により生成させる場合であれ、免疫グロブリンについて記載する。この用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはこれと相同的な結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も対象とする。この用語はまた、CDR移植抗体も想定する。抗体とは、特異的エピトープに結合する抗体およびそれらの断片を含めた任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体を包含し、最後に言及された抗体は、米国特許第4,816,397号および同第4,816,567号においてさらに詳細に記載されている。抗体複数可という用語は、一般に4つの全長ポリペプチド鎖、2つの重H鎖および2つの軽L鎖、またはこれらと同等なIg相同体例えば、重鎖だけを含むラクダ科によるナノボディーを含む野生型の免疫グロブリンIg分子を包含し、これらには、Ig分子の本質的なエピトープ結合の特徴を保持するこれらの機能的な全長変異体、バリアント、または誘導体が含まれ、これらには、二重特異性dualspecific、bispecific抗体、多重特異性抗体、および二重可変ドメイン抗体が含まれ、免疫グロブリン分子は、任意のクラス例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY、またはサブクラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2でありうる。抗体という用語の意味にはまた、任意の抗体断片も包含される。抗体断片とは、i軽鎖可変VLドメイン、重鎖可変VHドメイン、軽鎖定常ドメインCL、および重鎖定常1CH1ドメインからなる一価断片であるFab断片;iiヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結される2つのFab断片を含む二価断片であるFab’2断片;iiiVHドメインおよびCH1ドメインからなるFabの重鎖部分Fd断片;iv抗体の1本のアームのVLドメインおよびVHドメインからなる可変領域断片Fv断片;v単一の可変ドメインを含むドメイン抗体dAb断片Ward、E.S.ら、Nature、341巻、544~546頁1989年;viラクダ科抗体;vii単離された相補性決定領域CDR;viiiVHドメインおよびVLドメインが、2つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーを介して連結された単鎖Fv断片Birdら、Science、242巻、423~426頁、1988年;Hustonら、PNASUSA、85巻、5879~5883頁、1988年;ixVHドメインおよびVLドメインを単一のポリペプチド鎖において発現させるが、同じ鎖における2つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用い、これにより、これらのドメインに別の鎖の相補性ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異性抗体であるダイアボディーWO94/13804;P.Holligerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻、6444~6448頁1993年;ならびにx相補性の軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成するタンデムのFvセグメントVH-CH1-VH-CH1の対を含む直鎖抗体;xi多価抗体断片scFvの二量体、三量体、および/または四量体PowerおよびHudson、JImmunol.Methods、242巻:193~204頁2000年;ならびにxii単独または任意の組合せによる、重鎖および/もしくは軽鎖、またはそれらの変異体、バリアント、もしくは誘導体の他の全長でない部分を含めた、全長でない少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む分子を意味する。抗体は多くの方法で修飾しうるので、抗体という用語は、任意の特異的結合メンバー、または要請される特異性を伴う結合ドメインを有する物質を対象とするものとして解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然であれ、全体的または部分的に合成であれ、免疫グロブリンの結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含めた抗体断片、抗体の誘導体、機能的同等物、および相同体を対象とする。したがって、別のポリペプチドに融合させた免疫グロブリンの結合ドメインまたは同等物を含むキメラ分子が包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現については、EP-A-0120694およびEP-A-0125023、ならびに米国特許第4,816,397号および同第4,816,567号において記載されている。抗体の結合部位とは、抗原に特異的に結合する、軽鎖または重鎖および軽鎖可変領域および超可変領域を含む抗体分子の構造的部分である。本明細書で用いられるその多様な文法的形態における抗体分子という語句は、完全免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的活性部分の両方を想定する。例示的な抗体分子は、完全免疫グロブリン分子、実質的な完全免疫グロブリン分子、ならびにFab部分、Fab’部分、Fab’2部分、およびFv部分など、当技術分野において公知の部分であって、本明細書で記載される治療法に用いるのに好ましい部分を含めた、パラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分である。抗体はまた、抗体の1つの結合ドメインが、本発明の特異的結合メンバーであり、他の結合ドメインが異なる特異性、例えば、エフェクター機能などを動員する特異性を有する二重特異性の場合もある。本発明の二重特異性抗体は、抗体の1つの結合ドメインを、その断片を含めた本発明の特異的結合メンバーとし、他の結合ドメインを、異なる抗体または異なる抗がん特異的抗体もしくは抗腫瘍特異的抗体の断片を含めたその断片とする二重特異性抗体を包含する。他の結合ドメインは、神経細胞特異的抗体または神経膠細胞特異的抗体における場合の通り、特定の細胞型を認識する抗体の場合もあり、これを標的とする抗体の場合もある。本発明の二重特異性抗体では、本発明の抗体の1つの結合ドメインを、他の結合ドメイン、または特定の細胞受容体を認識する分子および/もしくは細胞を特定の形で調節する分子、例として挙げると、免疫調節剤例えば、インターロイキン複数可、増殖調節剤、またはサイトカイン例えば、腫瘍壊死因子TNF、および、特に、その全体において本明細書に組み込まれる、2002年2月13日に出願されたU.S.S.N.60/355,838において裏付けられている、TNF二重特異性モダリティー、または毒素例えば、リシン、または抗有糸分裂剤もしくは抗アポトーシス剤、または因子と組み合わせることができる。したがって、本発明の抗FAP抗体を用いて、薬剤、標識、他の分子、もしくは化合物、または抗体を、間質部位、特定の創傷治癒領域、炎症、がん、または腫瘍へと方向付けるかまたは標的化することができる。その多様な文法的形態におけるモノクローナル抗体という語句は、特定の抗原と免疫反応することが可能な抗体の結合部位のうちの1つの分子種だけを有する抗体を指す。したがって、モノクローナル抗体は典型的にそれが免疫反応する任意の抗原に対して単一の結合アフィニティーを提示する。モノクローナル抗体はまた、抗体の複数の結合部位であって、各々が異なる抗原に対して免疫特異性である結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性キメラモノクローナル抗体も含有しうる。抗原結合ドメインという用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合するかまたはこれと相補的な領域を含む抗体の一部について記載する。抗原が高分子である場合、抗体は、その部分をエピトープと称する、抗原の特定の一部だけに結合しうる。抗原結合ドメインは、1または複数の抗体可変ドメインによりもたらされる場合がある。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域VLおよび抗体重鎖可変領域VHを含むことが好ましい。本発明において用いられる抗体、抗体分子、またはこれらの断片を、他の分子または薬剤にコンジュゲートするかまたは結合させた、本発明のイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質にはさらに、化学的切除剤、毒素、免疫調節剤、サイトカイン、細胞傷害薬、化学療法剤、抗菌剤または抗菌ペプチド、細胞壁および/もしくは細胞膜破壊剤、または細胞壁および/もしくは細胞膜破壊薬にコンジュゲートされたこのような抗体、分子、または断片が含まれるがこれらに限定されない。特異的という用語は、特異的結合対の1つのメンバーが、その特異的結合パートナー複数可以外の分子にそれほどの結合を示さない状況を指すのに用いることができる。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多くの抗原により保有される特定のエピトープに対して特異的な場合であって、抗原結合ドメインを保有する特異的結合メンバーが、エピトープを保有する多様な抗原に結合することが可能な場合にも適用可能である。~を含むという用語は一般に、~を包含するの意味で用いられ、すなわち、1または複数の特徴または構成要素の存在を許容する。~から本質的になるという用語は、大型の生成物に共有結合しない、規定数の残基による生成物、特に、ペプチド配列を指す。しかし、上記で言及された本発明のペプチドの場合、当業者は、例えば、C末端のアミド化などの保護基を付加する末端の化学的修飾など、ペプチドのN末端またはC末端に対するわずかな修飾を想定しうることを察知するであろう。単離されたという用語は、本発明の特異的結合メンバー、またはこのような結合メンバーをコードする核酸が、本発明に従い存在する状態を指す。メンバーおよび核酸は、それらがそれらの天然の環境、または、このような調製がinvitroまたはinvivoにおいて実施される組換えDNA法を介する場合は、それらが調製される環境例えば、細胞培養物において共に見出される他のポリペプチドまたは核酸など、それらが天然で会合する物質を含まないかまたは実質的に含まない。メンバーおよび核酸は、希釈剤または補助剤と共に処方することができ、なお実際的な目的では、単離することもできる例えば、イムノアッセイにおいて用いられるマイクロ滴定プレートをコーティングするのに用いる場合、メンバーは通常、ゼラチンもしくは他のキャリアと混合するか、または診断もしくは治療において用いる場合、薬学的に許容されるキャリアもしくは希釈剤と混合する。本明細書で用いられるpgはピコグラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、ugまたはμgはマイクログラムを意味し、mgはミリグラムを意味し、ulまたはμlはマイクロリットルを意味し、mlはミリリットルを意味し、lはリットルを意味する。本明細書では、抗体、ニューロン結合抗体、IgM12抗体、IgM42抗体、抗体12、抗体42、sHIgM12、sHIgM42、rHIgM12、rHIgM42という用語、および具体的に列挙されていない任意のバリアントを用いる場合があり、本出願および特許請求の範囲の全体で用いられる通り、単一または複数のタンパク質を含めたタンパク質性の物質を指し、本明細書で記載され、図5および6に示されるアミノ酸配列データを有し、それらの活性プロファイルが本明細書および特許請求の範囲に示されるタンパク質にまで拡張される。特に、IgM12抗体、抗体12、rHIgM12とは、特に、ポリペプチドもしくは抗体または断片、特に、図5に示される配列を含む組換え抗体または断片を指す。IgM12抗体、抗体12、rHIgM12とは、特に、ポリペプチドもしくは抗体または断片、特に、配列番号31~33に示される重鎖可変領域のCDR配列および配列番号34~36に示される軽鎖可変領域のCDR配列を含む組換え抗体または断片を指す。IgM12抗体、抗体12、rHIgM12は、配列番号1の重鎖可変領域配列および配列番号11の軽鎖可変領域配列を有する抗体を包含する。特に、IgM42抗体、抗体42、rHIgM42とは、特に、ポリペプチドもしくは抗体または断片、特に、図6に示される配列を含む組換え抗体または断片を指す。IgM42抗体、抗体42、rHIgM42とは、特に、ポリペプチドもしくは抗体または断片、特に、配列番号37~39に示される重鎖可変領域のCDR配列および配列番号40~42に示される軽鎖可変領域のCDR配列を含む組換え抗体または断片を指す。IgM42抗体、抗体42、rHIgM42は、配列番号17の重鎖可変領域配列および配列番号27の軽鎖可変領域配列を有する抗体を包含する。したがって、実質的に同等な活性または変化した活性を提示するタンパク質も同様に想定される。これらの改変は、例えば、部位指向変異誘発を介して得られる改変など、意図的なものの場合もあり、宿主における変異を介して得られる、複合体またはその命名されたサブユニットをもたらす改変など、偶発的なものの場合もある。抗体、ニューロン結合抗体、IgM12抗体、IgM42抗体、抗体12、抗体42、sHIgM12、sHIgM42、rHIgM12、rHIgM42という用語はまた、とりわけ本明細書で列挙されるタンパク質のほか、実質的に相同な類似体および対立遺伝子変異の全てもそれらの範囲内に包含することを意図する。本明細書で記載されるアミノ酸残基は、L異性体形態とすることが好ましい。しかし、ポリペプチドにより免疫グロブリン結合に所望される機能的特性が保持される限りにおいて、D異性体形態の残基を、任意のL-アミノ酸残基で置換することができる。NH2とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COOHとは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチドの命名法J.Biol.Chem.、243巻:3552~59頁1969年に準拠して、アミノ酸残基の略記法を以下に示す。本明細書では、全てのアミノ酸残基の配列は、その左から右の配向が、従来のアミノ末端からカルボキシ末端の方向にある書式により表されることに注意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の始点または終点におけるダッシュ記号が、1または複数のアミノ酸残基によるさらなる配列へのペプチド結合を示すことにも注意されたい。上記の表は、本明細書で代わる代わるに現れうる、3文字表記と1文字表記とを相互に関連付けるために提示する。レプリコンとは、invivoにおけるDNA複製の自律的な単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製が可能な任意の遺伝子エレメント例えば、プラスミド、染色体、ウイルスである。ベクターとは、結合させたセグメントの複製をもたらすように別のDNAセグメントを結合させうる、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。DNA分子とは、その一本鎖形態であれ、二本鎖螺旋であれ、デオキシリボヌクレオチドアデニン、グアニン、チミン、またはシトシンの多量体形態を指す。この用語は、この分子の一次構造および二次構造だけを指すものであり、この分子を任意の特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状のDNA分子例えば、制限断片、ウイルス、プラスミド、および染色体において見出される二本鎖DNAを包含する。特定の二本鎖DNA分子の構造について論じる場合、本明細書では、配列を、DNAの非転写鎖すなわち、mRNAと相同的な配列を有する鎖に沿った5’から3’の方向にある配列だけを与える通常の慣例に従って記載することができる。複製起点とは、DNA合成に関与するDNA配列を指す。DNAによるコード配列とは、適切な制御配列の制御下に置かれると、invivoにおいてポリペプチドへと転写および翻訳される二本鎖のDNA配列である。コード配列の境界は、5’アミノ末端における開始コドンおよび3’カルボキシル末端における翻訳終止コドンを介して決定される。コード配列には、原核生物配列、真核生物のmRNAに由来するcDNA、真核生物例えば、哺乳動物のDNAに由来するゲノムDNA配列、およびまた合成DNA配列が含まれうるがこれらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列の3’側に位置する。転写制御配列および翻訳制御配列とは、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど、DNAの制御配列である。プロモーター配列とは、細胞内のRNAポリメラーゼに結合し、下流3’方向のコード配列の転写を開始することが可能なDNAの制御領域である。本発明を規定する目的で述べると、プロモーター配列には、その3’末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンドを上回って検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを包含するように、上流5’方向へと伸長する。プロモーター配列内には、転写開始部位ヌクレアーゼS1によるマッピングを介して規定されて好都合であるのほか、RNAポリメラーゼの結合の一因となるタンパク質結合ドメインコンセンサス配列も見出される。真核生物プロモーターは、TATAボックスおよびCATボックスを含有することが多いが、常に含有するわけではない。原核生物プロモーターは、-10および-35のコンセンサス配列に加えて、シャイン-ダルガルノ配列を含有する。発現制御配列とは、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列である。RNAポリメラーゼによりコード配列がmRNAへと転写され、次いで、これが、コード配列によりコードされるタンパク質へと翻訳されるとき、コード配列は、細胞内の転写制御配列および翻訳制御配列の制御下にある。シグナル配列は、コード配列の上流に包含されうる。この配列は、ポリペプチドに対してN末端側にあり、宿主細胞にコミュニケートしてポリペプチドを細胞表面へと方向付けるか、またはポリペプチドを培地へと分泌させる、シグナルペプチドをコードするものであり、このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から放出される前に宿主細胞により切り離される。シグナル配列は、原核生物および真核生物に天然の多様なタンパク質と関連することが見出されうる。本発明のプローブに言及しつつ本明細書で用いられるオリゴヌクレオチドという用語は、2つ以上のリボヌクレオチド、好ましくは3つを超えるリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは、多くの因子に依存し、これらの因子は、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。本明細書で用いられるプライマーという用語は、精製された制限消化物中などに天然で存在する場合であれ、合成により生成させた場合であれ、核酸鎖と相補的なプライマーの伸長産物の合成を誘導する条件下に置かれると、すなわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で適切な温度およびpH下に置かれると合成開始地点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、誘導剤の存在下において所望の伸長産物の合成をプライミングするのに十分な程度の長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および用いられる方法を含めた多くの因子に依存する。例えば、診断適用では、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、より少数のヌクレオチドも含有しうるが、典型的には15~25ヌクレオチド以上を含有する。本発明のプライマーは、特定の標的DNA配列の異なる鎖と実質的に相補的となるように選択される。これは、プライマーが、それらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分な程度に相補的でなくてはならないことを意味する。したがって、プライマー配列が、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの5’末端に結合させ、プライマー配列の残りは鋳型鎖と相補的とすることができる。代替的に、プライマー配列が、これとハイブリダイズし、これにより、伸長産物を合成するための鋳型を形成する鎖の配列と十分な相補性を有する場合は、非相補的な塩基または非相補的な長い配列を、プライマー内に散在させることもできる。本明細書で用いられる制限エンドヌクレアーゼおよび制限酵素という用語は、それらの各々が特異的ヌクレオチド配列において、またはその近傍において二本鎖DNAを切断する細菌酵素を指す。このようなDNAが細胞内に導入されている場合、この細胞は、外因性DNAまたは相同的DNAにより形質転換されている。形質転換DNAは、細胞のゲノムを構成する染色体のDNAへと組み込まれる共有結合する場合もあり、組み込まれない場合もある。例えば、原核細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞では、形質転換DNAを、プラスミドなどのエピソームエレメントに維持することができる。真核細胞について述べると、安定的な形質転換細胞とは、形質転換DNAが、染色体の複製を介して娘細胞により遺伝するように染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換DNAを含有する娘細胞の集団を含む細胞系またはクローンを確立する能力により裏付けられる。クローンとは、有糸分裂を介して単一の細胞または共通の原細胞から派生する細胞集団である。細胞系とは、invitroにおいて何世代にもわたり安定的に成長することが可能な初代細胞のクローンである。ヌクレオチドのうちの少なくとも約75好ましくは少なくとも約80、および最も好ましくは少なくとも約90または95が、規定された長さのDNA配列にわたりマッチする場合、これらの2つのDNA配列を実質的に相同とする。実質的に相同的な配列は、配列データバンクにおいて入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより同定することもでき、その特定の系について規定された、例えば、厳密な条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験により同定することもできる。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当技術分野の範囲内にある。例えば、Maniatisら、前出;DNACloning、IおよびII巻、前出;NucleicAcidHybridization、前出を参照されたい。また、本発明の特異的結合メンバー抗体をコードするDNA配列であって、例えば、図2もしくは10に提示されるのと同じアミノ酸配列を有する抗体、または本明細書もしくは図10に示されるがこれらと縮重するCDRドメイン領域の配列を含む抗体をコードするDNA配列も本発明の範囲内にあることを察知されたい。~と縮重するとは、異なる3文字コドンを用いて、特定のアミノ酸を指定することを意味する。当技術分野では、以下のコドンを互換的に用いて各特定のアミノ酸をコードさせうることが周知である:上記で指定されたコドンは、RNA配列のためのコドンであることを理解されたい。対応するDNAのためのコドンでは、UをTで置換している。アミノ酸、抗体断片、図5もしくは6に示されるCDR領域の配列をコードする配列、または図5もしくは6に示される核酸配列では、特定のコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンへと変化させるように、変異を発生させることができる。このような変異は一般に、可能な最小のヌクレオチド変化をもたらすことにより発生させる。この種の置換変異は、結果として得られるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存的な形で例えば、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸から、別の群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより変化させるようにもたらすこともでき、保存的な形で例えば、コドンを、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の群分けに属するアミノ酸から、同じ群分けに属するアミノ酸へと変化させることにより変化させるようにもたらすこともできる。このような保存的変化は一般に、結果として得られるタンパク質の構造および機能においてもたらす変化が小さい。非保存的変化は、結果として得られるタンパク質の構造、活性、または機能を変化させる可能性が高い。本発明は、結果として得られるタンパク質の活性または結合特徴をそれほど変化させない保存的変化を含有する配列を包含すると考えるべきである。以下は、アミノ酸の多様な群分けの一例である。非極性R基を伴うアミノ酸アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン帯電していない極性R基を伴うアミノ酸グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン帯電した極性R基Ph6.0で負に帯電しているを伴うアミノ酸アスパラギン酸、グルタミン酸塩基性アミノ酸pH6.0で正に帯電しているリシン、アルギニン、ヒスチジンpH6.0で正に帯電している。別の群分けは、フェニル基を伴うアミノ酸でありうる。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。別の群分けは、分子量すなわち、R基のサイズによる場合もある。特に、好ましい置換は、正の電荷が維持されうるような、LysによるArgの置換およびこの逆の置換;負の電荷が維持されうるような、GluによるAspの置換およびこの逆の置換;遊離-OHが維持されうるような、SerによるThrの置換;および遊離NH2が維持されうるような、GlnによるAsnの置換である。例示的で好ましい保存的アミノ酸置換は、グルタミンQによるグルタミン酸Eの置換およびこの逆の置換、ロイシンLによるバリンVの置換およびこの逆の置換、セリンSによるトレオニンTの置換およびこの逆の置換、イソロイシンIによるバリンVの置換およびこの逆の置換、リシンKによるグルタミンQの置換およびこの逆の置換、イソロイシンIによるメチオニンMの置換およびこの逆の置換、セリンSによるアスパラギンNの置換およびこの逆の置換、ロイシンLによるメチオニンMの置換およびこの逆の置換、リシンLによるグルタミン酸Eの置換およびこの逆の置換、アラニンAによるセリンSの置換およびこの逆の置換、チロシンYによるフェニルアラニンFの置換およびこの逆の置換、グルタミン酸Eによるアスパラギン酸Dの置換およびこの逆の置換、ロイシンLによるイソロイシンIの置換およびこの逆の置換、リシンKによるアルギニンRの置換およびこの逆の置換のうちのいずれかを包含する。また、特に好ましい特性を伴うアミノ酸で置換するように、アミノ酸置換を導入することもできる。例えば、Cysは、別のCysを伴うジスルフィド架橋のための潜在的な部位に導入することができる。Hisは、特に触媒部位すなわち、Hisは、酸または塩基として作用することが可能であり、生化学的触媒反応において最も一般的なアミノ酸であるとして導入することができる。Proは、タンパク質構造におけるβターンを誘導する、特に平面的なその構造のために導入することができる。アミノ酸残基のうちの少なくとも約70好ましくは少なくとも約80、および最も好ましくは少なくとも約90または95が同一であるか、または保存的置換を表す場合、2つのアミノ酸配列を実質的に相同とする。1または複数のアミノ酸が、類似のアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換で置換されており、その1つの/複数の抗体が、本明細書で開示されている、IgM12またはIgM42のうちの1または複数の結合プロファイルおよび活性プロファイルを示す場合、2つの抗体のCDR領域を実質的に相同とする。DNA構築物の非相同領域とは、天然ではこの大型の分子と会合して見出されることはない、大型のDNA分子内の同定可能なDNAセグメントである。したがって、非相同領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、その供給源である生物のゲノム内の哺乳動物ゲノムDNAには隣接しないDNAに隣接する。非相同的なコード配列の別の例は、天然ではコード配列自体が見出されない構築物例えば、ゲノムのコード配列がイントロンを含有するcDNA、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列である。対立遺伝子変異または天然の変異イベントは、本明細書で定義されるDNAの非相同領域をもたらさない。発現制御配列によりDNA配列の転写および翻訳が制御および調節される場合、このDNA配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるという用語は、発現させるDNA配列の上流に適切な開始シグナル例えば、ATGを有し、発現制御配列の制御下におけるDNA配列の発現およびDNA配列によりコードされる所望の産物の生成を可能とする適正なリーディングフレームを維持することを包含する。組換えDNA分子へと挿入することが所望される遺伝子が、適切な開始シグナルを含有しない場合は、このような開始シグナルを遺伝子の上流に挿入することができる。標準的ハイブリダイゼーション条件という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のいずれについても、5倍濃度のSSCおよび65°Cと実質的に同等な塩条件および温度条件を指す。しかし、当業者は、このような標準的ハイブリダイゼーション条件が、緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さ、および濃度、ミスマッチの百分率、ホルムアミドの百分率などを含めた特定の条件に依存することを察知するであろう。標準的ハイブリダイゼーション条件の決定においてはまた、ハイブリダイズする2つの配列が、RNA-RNAであるか、DNA-DNAであるか、RNA-DNAであるかも重要である。このような標準的ハイブリダイゼーション条件は、周知の処方であって、ハイブリダイゼーションが、所望の場合、高度な厳密性の洗浄により予測または決定されるTmを、典型的には10~20°C下回る処方に従い、当業者により容易に決定される。薬剤という用語は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化合物、および低分子を含めた任意の分子を意味する。特に、薬剤という用語は、被験化合物または薬物候補化合物などの化合物を包含する。アゴニストという用語は、その最も広い意味において、リガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。アッセイという用語は、化合物の特定の特性を測定するのに用いられる任意の工程を意味する。スクリーニングアッセイとは、化合物を特徴付けるか、または化合物をそれらの活性に基づき化合物のコレクションから選択するのに用いられる工程を意味する。~を防止することまたは防止という用語は、疾患の発症に先立って、病原体に曝露されている場合もあり、疾患に素因を示す場合もある被験体における、疾患または障害に罹患するかまたはこれを発症する危険性の低減すなわち、疾患の臨床症状のうちの少なくとも1つを発症させないことを指す。予防という用語は、防止という用語と関連し、これに包含され、その目的を、疾患を処置するかまたは治癒させることとするのではなくて、これを防止することとする措置または手順を指す。予防的措置の非限定的な例には、ワクチンの投与;例えば、病臥に起因する血栓の危険性にある入院患者への低分子量ヘパリンの投与;および、マラリアが風土病であるか、またはマラリアに罹患する危険性が高い地域を訪れるのに先立つ、クロロキンなどの抗マラリア剤の投与が含まれうる。治療有効量とは、医師または他の治療者により探索されている、被験体の生物学的応答または医学的応答を誘発する薬物、化合物、薬剤、抗体、または医薬剤の量を意味する。特に、神経疾患または神経状態に関して述べると、有効量という用語は、疾患の臨床的に関与性のパラメータにおいて生物学的に有意義な変化をもたらす抗体またはその断片など、化合物または薬剤の有効量を包含することが意図される。これは、画像化すると観察可能となるかまたは評価可能となる神経傷害または神経死滅の量の変化、運動、発話、もしくは認知などの機能的パラメータの変化、または危険性もしくは感受性の条件下におけるこのような変化の非存在もしくは低減を包含しうる。本明細書では、治療有効量という語句を用いて、測定可能もしくは評価可能な現象、または病態の特徴、または機能の評価における臨床的に有意な変化を、少なくとも約20パーセント、少なくとも約30パーセント、より好ましくは少なくとも50パーセント、より好ましくは少なくとも70パーセント、より好ましくは少なくとも80パーセント、最も好ましくは少なくとも90パーセント改善または防止し、好ましくはこれを低減するのに十分な量を意味する。一実施形態では、任意の疾患、状態、傷害、または感染を処置することまたはこれらの処置という用語が、その疾患、状態、傷害、または感染の改善すなわち、細胞もしくは組織の死滅、または細胞もしくは組織に対する損傷を停止させるか、あるいはこれらの臨床症状のうちの少なくとも1つの徴候、程度、または重症度を軽減することを指す。別の実施形態では、~を処置することまたは処置が、被験体により識別不能な場合もある少なくとも1つの物理的パラメータの改善を指す。さらに別の実施形態では、~を処置することまたは処置が、疾患、状態、傷害、または感染を、物理的に例えば、識別可能な症状の安定化により、生理学的に例えば、物理的パラメータの安定化により、またはこれらの両方により調節することを指す。さらなる実施形態では、~を処置することまたは処置が、疾患の進行を緩徐化するか、または細胞または組織に対する傷害、損傷、死滅の量を低減することに関する。薬学的に許容されるという語句は、ヒトに投与した場合に、生理学的に忍容可能であり、典型的にはアレルギー反応または同様の有害反応、例えば急性胃蠕動、めまいなどをもたらさない分子的実体および組成物を指す。本明細書で用いられるpgはピコグラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、ugまたはμgはマイクログラムを意味し、mgはミリグラムを意味し、ulまたはμlはマイクロリットルを意味し、mlはミリリットルを意味し、lはリットルを意味する。B.詳細な開示神経保護剤は、結果としてCNS損傷をもたらす合併症を防止および処置することを目的とする。神経保護能を伴う化合物または薬剤は、脳卒中および神経系の傷害などの急性障害のほか、神経変性障害などの慢性疾患においても適用される。これらの状態では、神経組織に対する損傷の根底にある機序のうちの多くが類似しており、神経保護化合物または神経保護剤であれば、複数の障害において用いうるであろう。疾患には、脳血管障害、外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症、てんかん、運動ニューロン疾患複数可、および虚血性神経障害が含まれる。他の適用には、麻酔時および手術時における神経保護が含まれる。フリーラジカルスカベンジャー、抗興奮毒性剤、アポトーシスプログラム細胞死阻害剤、抗炎症剤、神経栄養因子、金属イオンキレート化剤、イオンチャネル調節剤、および遺伝子治療の類型に由来する医薬品を含め、多くの医薬品が神経保護効果について探索されている。NMDAアンタゴニストおよび神経伝達物質の放出を低減する薬剤を含め、神経保護的医薬品の複数の候補医薬品が、臨床試験に到達しているが、有意性を示すことに失敗しているClarkWMら2000年、Stroke、31巻6号:1234~9頁;SarcoRIら2001年、JAMA、285巻13号:1719~28頁;Albers,GWら2001年、JAMA、286巻21号:2673~82頁。神経保護剤についての1つの難題は、薬剤の効果が、正常細胞に対してそれほどの活性を伴わずに、これにより、望ましくない副作用、なお潜在的には有害な副作用を伴わずに、傷害されまたは損傷した/障害されたニューロンを指向するような特異性およびターゲティングである。ここで、本発明は、血液脳関門を越え、傷害、障害、または損傷の領域を標的とし、正常ニューロンに対する望ましくない作用を最小限として保護をもたらすことが可能な、特異的で忍容可能な薬剤複数可を提供する。本発明は一般に、特異的結合メンバー、特に、ニューロンへの結合を裏付け、神経変性状態、神経細胞死、および神経傷害を含め、ニューロンまたは神経細胞が障害された疾患および状態の診断、モニタリング、改善、および処置において用いられる神経保護剤として適用される抗体を提供する。本発明の抗体は、それらを特に神経保護および/または神経再生において有用とし、神経疾患および神経状態のための診断剤および治療剤において適用可能とする、特定で固有の目覚ましい特質を有する。本明細書では、新規の本発明の抗体、特に、組換え抗体が、血液脳関門を効果的に、かつ、改変されずに越え、ニューロンを細胞死から保護し、CNSにおける神経病変および傷害部位を標的とすることが裏付けられる。抗体は、神経機能を改善し、慢性軸索傷害および脱髄の動物モデルにおいて軸索を維持する。動物モデルにおいて評価される通り、抗体は、動物における毒性が最小限であり、自己免疫状態を増悪させない。本発明は一般に、神経変性状態、神経細胞死、および神経細胞傷害を含めた、ニューロンまたは神経細胞が障害された疾患および状態を改善および処置するための、単独の、または他の向神経活性剤もしくは代替的な向神経活性剤と組み合わせた治療剤としての適用を伴う特異的結合メンバー、特に、ニューロンへの結合を示す抗体を提供する。本出願は、神経疾患または神経欠損の動物モデルにおける、IgM12を含めた本発明の抗体の能力および治療的に関与性の活性についての証拠を提示する。特に、本明細書で提示される研究は、運動ニューロン疾患、特に、ALSの認知された動物モデルであるTMEVモデルにおける能力および活性を裏付け、脊髄傷害モデルにおける研究を提示する。このような疾患のうちのいずれかの改善もしくは処置、または障害もしくは障害の危険性の症例における神経傷害の防止もしくは神経の保護において用いられる組成物が提供される。IgM12およびIgM42による先行研究は、CNSのニューロンに結合する血清由来抗体が、抗体でコーティングした基質における神経突起伸長を支持し、invitro研究においてCNSミエリンによる神経突起伸長の阻害を凌駕することを示したWarringtonAら2004年、JNeuropathExpNeurol、63巻5号:461~473頁。TMEV動物に注射されたsHIgM12についての研究は、夜間における自発活動の増大を示したが、動物におけるウイルス力価は評価しておらず、可能な抗ウイルス効果を決定することはできていないRodriguesMら2009年、Neurology、72巻:1269~1276頁。本明細書で記載される研究は、完全ヒト組換え抗体12の配列および抗体42の配列のほか、組換え抗体rHIgM42の配列も提示する。動物および疾患の動物モデルにおけるこれらの血清由来抗体および組換え抗体の目覚ましい神経保護効果および治療関与性効果のほか、それらの神経傷害部位への特異的結合/ターゲティングを裏付ける研究が今や提示される。抗体、組成物、および治療法自己反応性ヒトmAbは、ヒト天然自己抗体NatAbに分類されるCohenI.R.2007年、JAutoimmun、29巻:246~249頁。NatAbは、本発明者らのヒト免疫グロブリンレパートリーの一部でありCohen、I.R.およびM.Schwartz1999年、Journalofneuroimmunology、100巻:111~114頁、通常は体細胞変異なしに、ヒト固有の遺伝子から天然で作製され、細胞過程を刺激するように機能する場合もあり、細胞残屑を除去するように機能する場合もあるLutz,HU2007年、JAutoimmun、29巻:287~294頁。NatAbが、自己抗原に反応するのに対し、従来の抗体は、外因性抗原に反応する。NatAbは、比較的低アフィニティーであり、通常は多重反応性であり、しばしばIgMである。これらのヒトIgMの作用機構は、同様であり、膜のマイクロドメインを介して作用すると考えられる。NatAbは、定義により多重反応性であり、したがって、invivoにおける特異的機能について関与性の抗原を同定することは、難題でありうる。理論に束縛されずに述べると、現在のところ、これらのIgMは、細胞表面における膜のマイクロドメインの架橋形成分子に結合することが理解されている。通常これに関与しない分子は、まとまってシグナル伝達複合体をなすRodriguez,M.、A.E.Warrington、およびL.R.Pease2009年、Neurology、72巻:1269~1276頁。したがって、抗体媒介性疾患を伴わずにmAbを高濃度で保有する個体の血清に由来する自己反応性ヒトモノクローナル抗体mAbについてスクリーニングすることにより、治療用分子を同定した。このようなmAbを、神経系細胞の表面への結合について、抗原について考慮せずに調べる。次いで、mAbを、疾患モデルを調節する能力について調べる。この生物学的有効性を伴うmAbを同定する方法は、製薬業界で一般に用いられる方法と異なるRodriguez,M.、A.E.Warrington、およびL.R.Pease2009年、Neurology、72巻:1269~1276頁。特定のヒトIgMが再ミエリン化を促進しうることが裏付けられているWarringtonAEら2000年、ProcNatlAcadSciUSA、97巻:6820~6825頁。例えば、1つのこのようなIgMは、再ミエリン化を促進する、組換えヒトモノクローナルrHIgM22であるMitsunagaYBら2002年、FasebJ、16巻:1325~1327頁。抗体rHIgM22は、希突起膠細胞およびミエリンに結合し、MSのウイルス誘導性および毒素誘導性モデルにおけるCNSの再ミエリン化を促進するWarringtonAEら2000年、ProcNatlAcadSciUSA、97巻:6820~6825頁;BieberAJら2002年、Glia、37巻:241~249頁。脊髄の再ミエリン化は、rHIgM22の単回低量投与の後に誘導されるWarringtonAEら2007年、JNeurosciRes、85巻:967~976頁。寿命の短いマウスにおける半減期が15時間と推定される分子による1回の腹腔内i.p.処置が、生得の自発的修復はほとんど見られないMSモデルにおいて、5週間以内に最大限の組織修復を促進することは注目に値する。末梢への注射後、rHIgM22は、血液脳関門BBBを越え、脱髄を伴うマウスの脳病変および脊髄病変内に蓄積される。invivoの病変では、フェリチンビーズで標識したrHIgM22が、MRIを介して検出されているPirkoIら2004年、FasebJ、18巻:1577~1579頁。また、再ミエリン化能を伴うさらなるヒト血清IgM抗体であるsHIgM46、およびその組換え対応物であるrHIgM46についても記載されている。血清由来抗体であるsHIgM22およびsHIgM46、ならびにそれらの組換え形、および再ミエリン化のための方法については、例えば、WO0185797において記載されている。rHIgM22抗体およびこれによる方法は、例えば、米国特許第7,473,423号および同第7,807166号で対象とされている。本発明は、モノクローナル抗体、および、特に、中枢神経系におけるニューロンの促進、刺激、保護、および/または再生において活性を示す組換え抗体を含めたヒト自己抗体を提供する。本発明の態様では、それらの断片を含めた本抗体が、中枢神経系における傷害を介する神経細胞死を防止または低減するときの神経保護、ニューロンおよび軸索の保存および再生において活性を示す。抗体は、疾患もしくは状態の処置もしくは改善、または疾患もしくは状態、特に、神経が損傷され、傷害され、もしくは他の形で障害された疾患もしくは状態と関連する神経細胞欠損および神経細胞死またはアポトーシスの防止または低減において適用可能である。本発明の抗体が使用または適用される状態または疾患には、脳傷害または脳外傷、脊髄損傷SCI、神経損傷、頭部傷害、脳への血液供給が低減されるかまたは障害された状態、脳の感染性疾患、神経変性疾患を含めた、ニューロンの構造、機能、または生存の喪失が関与するかまたは関連する状況が含まれる。例示的なこのような疾患または状態には、脊髄損傷SCI、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症MS、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、出産前低酸素症/周産期虚血および/または脳性まひ、脳症、脊髄症、ならびに運動ニューロン疾患が含まれる。本発明の神経調節剤または抗体は、以下の特徴のうちの1または複数を有する:それらが、ニューロンを保護し、かつ/もしくはこれを安定化させること;それらが、CNSもしくは神経細胞の損傷、障害、もしくは傷害における部位を標的とすること;および/またはそれらが、細胞死、例えば、過酸化水素誘導性細胞死を遮断すること。本発明は、本発明のニューロン結合モノクローナル抗体が、中枢神経系における診断目的および治療目的のために、神経突起伸長を促進し、ニューロンを損傷から保護することが可能であることを提示する。特に、組換え抗体であって、皮質ニューロン、海馬ニューロン、小脳顆粒細胞、および網膜神経節細胞を含めたニューロンを認識し、これらに結合することが可能な抗体が提供される。本発明は、例示的な抗体複数可またはその断片複数可である抗体12および抗体42、特に、血清由来または組換えのIgM12またはIgM42を提供する。さらなる特定の態様では、本発明の抗体が、図5および/または図6に示されるアミノ酸配列を含めた抗体12または42のアミノ酸配列を含む。本発明の組換え抗体であるIgM12は、図5に示される、可変重鎖配列配列番号1および可変軽鎖配列配列番号11を含む。本発明の組換え抗体であるIgM42は、図6に示される、可変重鎖配列配列番号17および可変軽鎖配列配列番号27を含む。本発明の態様では、図5および6に示される可変領域のCDR配列を含む、組換えまたは合成のニューロン結合抗体が提供される。抗体12は、図5に示される、重鎖CDR配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む。抗体42は、図6に示される、重鎖CDR配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む。ニューロン、特に、ヒトニューロンを認識することが可能な、Fab断片を含めた組換え抗体もしくはそれらの断片のパネル、またはファージディスプレイライブラリーを、多様な特性、すなわち、アフィニティー、アイソタイプ、エピトープ、安定性などについてスクリーニングすることができる。例示的な抗体であるIgM12およびIgM42の活性を模倣し、ニューロンに結合し、ニューロンを例えば、過酸化物媒介性細胞死などの細胞死または細胞傷害から保護する能力を有する抗体が特に対象である。このような抗体は、特異的結合アッセイおよび活性アッセイにおいて、容易に同定および/またはスクリーニングすることができる。本抗体である、IgM12および/またはIgM42の抗原結合領域または重鎖CDR領域および/もしくは軽鎖CDR領域を含む組換え抗体を生成させ、活性についてスクリーニングすることができる。一般に、図5および6のCDR領域として実質的に示されるアミノ酸配列を含むCDR領域は、CDR領域のニューロンの表面への結合、またはニューロンの表面における結合、および、特に、哺乳動物のニューロン、特に、ヒト、サル、ヒヒ、ラット、および/またはマウスのニューロンへの結合を可能とする構造において保有される。~として実質的に示されるとは、本発明の可変領域配列、および/または、特に、CDR配列が、図5および6の指定した領域と同一であるか、またはこれらと相同性が高いことを意味する。相同性が高いとは、可変領域配列および/またはCDR配列において少数カ所の置換、好ましくは1~8カ所、好ましくは1~5カ所、好ましくは1~4カ所、または1~3カ所、または1もしくは2カ所の置換だけを施しうることを想定する。~として実質的に示されるという用語は、特に、本抗体の特異性および/または活性に実質的なまたは重大な影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を包含する。CDR以外の可変領域配列では、CDR配列を保持するような置換を施すことができる。したがって、CDR配列は維持し、可変領域配列の残りは置換しうるように、可変領域配列の変化、または代替的な、非相同的であるかもしくはベニア化された可変領域配列を導入することもでき、これらを用いることもできる。代替的に、置換は、特に、CDRにおいて施すこともできる。本発明の抗体のCDR配列は、図5および6を含め、本明細書において示され、記載されている。抗体12は、図5に示される、重鎖CDR配列CDR1GGSVSLYY配列番号31、CDR2GYIYSSGST配列番号32、およびCDR3ARSASIRGWFD配列番号33、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QSISSY配列番号34、CDR2AAS配列番号35、およびCDR3QQSYHTPW配列番号36を含む。抗体42は、図6に示される、重鎖CDR配列CDR1GFTFSTYA配列番号37、CDR2INVGGVTT配列番号38、およびCDR3VRRSGPDRNSSPADF配列番号39、ならびに軽鎖CDR配列CDR1QGIG配列番号40、CDR2TTS配列番号41、およびCDR3QKYNSAPRT配列番号42を含む。上に記載し想定した置換を有する本発明の抗体は、抗体IgM12および抗体IgM42を含め、本明細書および特許請求の範囲で示される特徴を有する例示的な抗体と同等の活性および特異性を維持するように選択される。本発明のCDRを保有する構造は一般に、抗体の重鎖配列もしくは軽鎖配列またはその実質的な部分の構造であって、CDR領域が、再構成された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然抗体のVH可変ドメインおよびVL可変ドメインのCDR領域に対応する位置に配置される構造である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat,E.A.ら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、4版、USDepartmentofHealthandHumanServices、1987年、および、現在はインターネットimmuno.bme.nwu.eduで入手できるその改定版を参照することにより決定することができる。可変ドメインは、任意の生殖細胞系列または再構成されたヒト可変ドメインに由来する場合もあり、公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインの場合もある。前出の段落で定義した、本発明のCDRに由来する配列は、組換えDNA法を用いて、CDR領域を欠く可変ドメインレパートリーへと導入することができる。例えば、MarksらBio/Technology、1992年、10巻:779~783頁は、抗体可変ドメインのレパートリーを生成させる方法であって、可変ドメイン領域の5’端を指向するかまたはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトVH遺伝子の第3のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、1つ/複数のCDRを欠くVH可変ドメインのレパートリーをもたらす方法について記載している。Marksらは、どのようにすればこのレパートリーを、特定の抗体のCDRと組み合わせうるかについてもさらに記載している。次いで、適切な特異的結合メンバーを選択しうるように、レパートリーを、WO92/01047のファージディスプレイシステムなど、適切な宿主系において提示することができる。レパートリーは、約104を超える個別のメンバー、例えば、106~108または1010のメンバーからなる。また、StemmerNature、1994年、370巻:389~391頁により、類似のシャフリング法またはコンビナトリアル法も開示されているが、Stemmerは、β-ラクタマーゼ遺伝子との関連でこれらの技法について記載し、これらの手法を、抗体を生成させるのに用いうることに気付いている。さらなる代替法は、例えば、可変ドメイン全体の内で変異を発生させる、抗体のVH遺伝子またはVL遺伝子に対するランダム変異誘発を用いて、本発明のCDRに由来する配列を保有する新規のVH領域またはVL領域を生成させる。このような技法については、エラープローンPCRを用いたGramら1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻:3576~3580頁により記載されている。用いうる別の方法は、変異誘発をVH遺伝子またはVL遺伝子のCDR領域へと方向付ける方法である。このような技法は、Barbasら1994年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91巻:3809~3813頁およびSchierら1996年、J.Mol.Biol.、263巻:551~567頁により開示されている。当技術分野では、上記に記載した技法の全てがそれ自体として公知である。当業者は、このような技法を、当技術分野において日常的な方法を用いて本発明の特異的結合メンバーをもたらすのに用いことが可能であろう。免疫グロブリンの可変ドメインのうちの実質的な部分は、それらに介在するフレームワーク領域と併せて、少なくとも3つのCDR領域を含む。この部分はまた、第1のフレームワーク領域および第4のフレームワーク領域の両方のうちの少なくとも約50も包含し、この50は、第1のフレームワーク領域のうちのC末端側の50および第4のフレームワーク領域のうちのN末端側の50とすることが好ましい。可変ドメインの実質的部分のN末端またはC末端におけるさらなる残基は、天然の可変ドメイン領域と通常は関連しない残基でありうる。例えば、組換えDNA法により作製される本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニングまたは他の操作ステップを容易とするために導入されるリンカーによりコードされるN末端残基またはC末端残基の導入を結果としてもたらしうる。他の操作ステップには、本発明の可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン例えば、ダイアボディーを生成させる場合、または本明細書で示されるタンパク質標識および/もしくは当業者に公知のタンパク質標識を含めたさらなるタンパク質配列へと接合するリンカーの導入が含まれる。本発明の好ましい態様では、図5および/または6に実質的に示される配列に基づく結合ドメインの対を含む組換え抗体が好ましいが、これらの配列のうちのいずれかに基づく単一の結合ドメインも、本発明のさらなる態様を形成する。図5および/または6に実質的に示される配列に基づく結合ドメインの場合は、免疫グロブリンのVHドメインは、標的抗原に特異的な形で結合することが可能なことが公知であるので、このような結合ドメインを、CNSにおけるニューロン、特に、神経損傷または傷害部位を標的とする薬剤として用いることができる。本発明の特異的結合メンバーは、抗体の定常領域またはそれらの一部をさらに含みうる。例えば、図5および6のVH配列およびVL配列に基づく組換え抗体は、それらのC末端において、図5または6に示されるそれぞれの定常領域ドメインと異なるか、またはこれらに由来するバリアントである定常領域ドメインを含め、ヒトCκ鎖またはヒトCλ鎖、好ましくは、Cλ鎖を含めた抗体の軽鎖定常領域ドメインに結合させることができる。同様に、図5または6の配列に基づく組換え抗体は、それらのC末端において、任意の抗体アイソタイプ、例えば、IgG、IgA、IgE、IgD、およびIgM、ならびにアイソタイプのサブクラスのうちのいずれか、特に、IgG1、IgG2b、およびIgG4に由来する免疫グロブリン重鎖の全部または一部に結合させ、次いで、これらを調べて同等および/または適切な活性および能力を確認または決定することもできる。IgMが好ましい。抗体またはそれらの任意の断片は、任意の細胞毒素、細菌毒素、または他の毒素、例えば、緑膿菌外毒素、リシン、もしくはジフテリア毒素とコンジュゲートすることもでき、これらと組換えにより融合させることもできる。用いられる毒素の一部は、毒素の全体の場合もあり、毒素の任意の特定のドメインの場合もある。このような抗体-毒素分子は、異なる種類のがんの標的化および治療に用いられて成功している例えば、Pastan、BiochemBiophysActa.、1997年10月24日;1333巻2号:C1~6頁;Kreitmanら、NEnglJMed.、2001年7月26日;345巻4号:241~7頁;Schnellら、Leukemia.、2000年1月;14巻1号:129~35頁;Ghetieら、MolBiotechnol.、2001年7月;18巻3号:251~68頁を参照されたい。二重特異性および三重特異性の多量体は、異なるscFv分子を会合させることにより形成することができ、T細胞を腫瘍へと動員するための架橋形成試薬免疫療法、ウイルスの再標的化遺伝子治療、および赤血球凝集試薬免疫診断剤としてデザインされている例えば、Todorovskaら、JImmunolMethods.、2001年2月1日;248巻1~2号:47~66頁;Tomlinsonら、MethodsEnzymol.、2000年;326巻:461~79頁;McCallら、JImmunol.、2001年5月15日;166巻10号:6112~7頁を参照されたい。本発明の抗体は、検出可能な標識または機能的な標識で標識することができる。検出可能な標識には、抗体画像化の技術分野において公知の従来の化学反応を用いて本発明の抗体に結合させうる放射性同位体である、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、121I、124I、125I、131I、111In、117Lu、211At、198Au、67Cu、225Ac、213Bi、99Tc、および186Reなどの放射性標識が含まれるがこれらに限定されない。標識にはまた、蛍光標識例えば、フルオレセイン、ロダミン、TexasRedおよび当技術分野においてMRI-CTによる画像化のために従来用いられている標識も含まれる。これらにはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-グルコロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどの酵素標識も含まれる。標識にはさらに、検出可能な特異的同族部分、例えば、標識したアビジンへの結合を介して検出されうるビオチンなどの化学的部分も含まれる。機能的標識には、障害部位、損傷または傷害部位を標的とし、神経組織の破壊に対して保護をもたらすようにデザインされた物質が含まれる。このような機能的標識には、5-フルオロウラシルまたはリシンなどの細胞傷害薬、および細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼなど、プロドラッグを機能部位において活性薬物へと転換することが可能な酵素が含まれる。本発明のイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質であって、他の分子または薬剤にコンジュゲートするかまたは結合させた抗体およびそれらの断片に、化学的切除剤、毒素、免疫調節剤、サイトカイン、細胞傷害薬、化学療法剤または化学療法薬にコンジュゲートした結合メンバーがさらに含まれるがこれらに限定されないイムノコンジュゲートまたは抗体融合タンパク質が想定される。放射性標識を用いる場合、公知の現在利用可能なカウンティング手順を用いて、特異的結合メンバーを同定および定量化することができる。標識を酵素とする場合には、現在用いられている、当技術分野において公知の比色法、分光法、蛍光分光法、電流測定法、またはガス定量法のうちのいずれかを介して検出を達成することができる。当業者は、結果として神経細胞の傷害または損傷を含めたCNS損傷をもたらす合併症、または神経変性状態のinvivoにおける動物モデルを用いて、本発明の抗体、もしくはそれらの断片、それらのバリアント、またはこれらの組合せ、または他のCNS反応性抗体との組合せを、さらにまたは加えてスクリーニング、評価、および/または検証することもできる。このような動物モデルには、神経細胞の損傷、障害、変化、死滅、傷害、または変性と関連する状態または疾患のモデルが含まれるがこれらに限定されない。モデルには、脳卒中、脳傷害、虚血、MS、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、認知症、脳炎、髄膜炎、ALS、または運動ニューロン疾患のモデル、またはこれらの側面を模倣するモデルが含まれる。ヒヒ、サル、またはマカクザルなど、霊長動物における中脳動脈の閉塞を用いる脳卒中モデルは、当技術分野において公知であり、適切でありうるYoungAら1997年、Stroke、28巻:1471~1476頁;delZoppoGJら1986年、Stroke、17巻:1254~1265頁;MarshallおよびRidley1996年、Neurodegeneration、5巻:275~286頁。TMEVなどのMSモデルも公知であり、本明細書でも記載されて用いられる。ALSおよび運動ニューロン疾患についてのSODマウスモデルも公知であり、本明細書でも記載されて用いられるGurneyMEら1994年、Science、264巻:1772~1775頁。本発明による可変領域配列を含む抗体、それらの断片、および組換え抗体は、哺乳動物における神経保護の方法であって、前記哺乳動物に有効量の本発明の抗体、それらの断片、および組換え抗体を投与するステップを含む方法など、ヒトまたは動物の身体に対する処置法、防止法、または診断法において用いることができる。本発明によるCDRドメイン領域の配列を含む組換え抗体またはそれらの断片は、このような方法において用いることができる。本発明の薬剤、特に、組換え抗体またはそれらの断片は、神経傷害、神経損傷または神経障害、および結果としてCNS損傷をもたらすことが可能であり、可能性があるかまたは実際にもたらす合併症を防止、処置、または改善するための方法における神経保護剤として用いることができる。本発明の方法は、脳傷害または脳外傷、脊髄損傷SCI、神経傷害、頭部傷害、脳への血液供給が低減されるかまたは障害された状態、脳の感染性疾患、神経変性疾患を含めた、ニューロンの構造、機能、または生存の喪失が関与するかまたは関連する場合に適用可能である。本発明の方法に従い処置、防止、または改善するための例示的なこのような疾患または状態には、脊髄損傷SCI、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症MS、アルツハイマー病、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、出産前低酸素症/周産期虚血、および/または脳性まひ、脳症、脊髄症、ならびに運動ニューロン疾患が含まれる。本発明は、神経が損なわれているか、傷つけられているか、もしくは損傷している哺乳動物における疾患もしくは状態、または神経もしくはニューロンが障害、傷害もしくは損傷に感受性であるかもしくはこの危険性がある状況を処置または改善する方法であって、IgM12およびIgM42から選択される組換え抗体もしくは完全ヒト抗体またはその断片を投与するステップを含む方法を提供する。本発明の方法は、抗体IgM12および抗体IgM42の組合せを含めた、複数の抗体または断片の投与を含みうる。さらなるこのような方法では、抗体IgM12および/または抗体IgM42のうちの1または複数を、特に、抗体rHIgM22および/またはrHIgM46のうちの1または複数を含めた、別のCNS作用抗体と組み合わせるcombinedことができる。抗体の組合せは、まとめて投与することもでき、逐次的に投与することもでき、多様な回数および多様な量または濃度で投与することができる。したがって、抗体12および/または抗体42は、抗体22および/または抗体46と組み合わせて、併用投与を介して投与することもでき、数時間、数日間、または数週間を含めた短時間または長期間隔てて逐次的に投与することもできる。神経変性を伴う疾患または状態、および、特に、脱髄を含めた疾患または状態を処置または改善するために、抗体12および/または抗体42は、特に、抗体22および/または抗体46sHIgM22、rHIgM22、sHIgM46、またはrHIgM46と組み合わせて、併用投与を介して投与することもでき、逐次的に投与することもできる。このような一方法では、特に多発性硬化症MSを含めた脱髄性疾患または脱髄性状態を処置または改善するために、抗体12および/または抗体42を、抗体22および/または抗体46と組み合わせて、併用投与を介して、または逐次的に投与する。抗体IgM22の可変重鎖および軽鎖配列は、それぞれ、配列番号43および配列番号44に示される。抗体IgM46の可変重鎖および軽鎖配列は、それぞれ、配列番号45および配列番号46に示される。抗体IgM12および/または抗体IgM42のうちの1または複数は、aCDR1配列であるSSGMH、CDR2配列であるVIISYDGSRKYYADSVKG、およびCDR3配列であるGVTGSPTLDYを含む重鎖可変領域のCDR、ならびにCDR1配列であるSGSSSNIGNNFVS、CDR2配列であるDITKRPS、およびCDR3配列であるGETWDSSLSAVVを含む軽鎖可変領域のCDR;またはbCDR1配列であるSGFTFSSYW、CDR2配列であるIKKDGSEK、およびCDR3配列であるARPNCGGDCYLPWYFDを含む重鎖可変領域のCDR、ならびにCDR1配列であるQSVLYSSNNKNY、CDR2配列であるYWAS、およびCDR3配列であるQQYYNTPQAを含む軽鎖可変領域のCDRを含む1または複数の再ミエリン化抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体は、処置を必要とする患者に、腹腔内注射、血流もしくはCSF中への注射、または傷害部位または障害部位への直接の注射を含めた、任意の適切な経路を介して投与することができる。例示的な本発明の抗体の特定の利点は、それらがBBBを越え、したがって、腹腔内投与であっても、CNSを標的としうることである。正確な用量は、抗体が診断用であるのか処置用であるのか、傷害のサイズまたは程度および位置、抗体の正確な性質全抗体であるのか、断片であるのか、ダイアボディーであるのかなど、および抗体に結合させた任意の検出可能な標識または機能的標識の性質を含めた多くの因子に依存する。放射性核種を治療に用いる場合、適切な単回の最大用量は、約45mCi/m2、~約250mCi/m2の最大量とすることができる。好ましい用量は、15~40mCiの範囲とし、さらに好ましい用量範囲は、20~30mCiまたは10~30mCiとする。このような治療は、骨髄置換または幹細胞置換を要請する場合がある。臨床的に容認されるネイキッド抗体は一般に、mg単位の量で投与し、成体用量を、投与1回当たり20~2000mgのタンパク質、投与1回当たり20~1500mgのタンパク質、または投与1回当たり20~1000mgのタンパク質、または投与1回当たり20~500mgのタンパク質、または投与1回当たり20~100mgのタンパク質とする。臨床的に容認される注射用モノクローナル抗体は、mg単位の量で投与し、投与1回当たり3~5mg/kg、5~10mg/kg、投与1回当たり300~400mg、投与1回当たり300~500mgとするNewsomeBWおよびErnstoffMS2008年、BrJClinPharmacol、66巻1号:6~19頁;herceptin.net、tysabri.net、avastin.net、remicade.com。再ミエリン化抗体IgM22は、μgの範囲の比較的著明な低用量で有効であり、抗体の単回投与によっても、BBBを越え、CNSにおいて活性となることが可能であると示されていることが注意されるWO2004/110355;WarringtonAEら2007年、JNeurosciRes、85巻5号:967~976頁。組換えIgM12抗体は、動物モデルにおいてμgの範囲での単回腹腔内投与されると、治療的に関与性の活性を示すことが本明細書で示されている。したがって、本発明の抗体の投与は、単回投与で適用可能かつ有効な場合もあり、複数回投与および/または定期的投与で適用可能かつ有効な場合もあり、投与1回当たりμgまたは投与1回当たりμg/kgの範囲で適用可能かつ有効な場合もあり、投与1回当たりmg単位の低量投与1回当たり100μg~1mg、1mg未満、1mg~5mg、1mg~10mg、5mg~15mg、10mg~20mgで適用可能かつ有効な場合もある。成体患者に対する単回処置のための用量を、小児および乳児のために比例調整することができ、また、他の抗体フォーマットのために、例えば、分子量に比例して調整することもできる。処置は、医師の裁量下、毎日、毎週2回、毎週、または毎月の間隔で反復することができる。例示的な抗体の1つの利点は、それらがBBBを越えて、損傷または傷害部位を標的とし、したがって、適切な効果を達成するために、低用量および潜在的に少ない投与回数の使用を容易とすることである。医薬組成物および治療用組成物本発明の抗体または断片は通常、本発明の抗体複数可または断片に加えて少なくとも1つの成分を含みうる、医薬組成物の形態で投与する。したがって、本発明による医薬組成物および本発明に従って用いられる医薬組成物は、有効成分に加えて、当業者には周知である、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、緩衝液、安定化剤、または他の物質も含みうる。このような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性に干渉するべきではない。キャリアまたは他の物質の正確な性質は、経口経路の場合もあり、注射、例えば、静脈内注射を介する場合もあり、腫瘍部位におけるデポ剤を介する場合もある、投与経路に依存する。経口投与用の医薬組成物は、錠剤形態の場合もあり、カプセル形態の場合もあり、粉末形態の場合もあり、液体形態の場合もある。錠剤は、ゼラチンまたは補助剤など、固体のキャリアを含みうる。液体の医薬組成物は一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱物油、または合成油など、液体のキャリアを含む。生理食塩液、デキストロース、あるいは他の糖溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれうる。静脈内注射または罹患部位における注射では、有効成分が、発熱物質を含まず、pH、等張性、および安定性が適切な、非経口的に許容される水溶液の形態でありうる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および/または他の添加剤も、要請に応じて包含されうる。組成物は、単独で投与することもでき、他の処置、治療剤、または薬剤と組み合わせて、処置される状態に応じて同時的または逐次的に投与することもできる。本明細書で記載される1または複数の組換え抗体またはその断片の組合せを含む組成物が想定される。加えて、本発明は、本明細書で記載される抗体またはその断片、および向神経活性剤もしくは神経治療剤、抗炎症剤、神経伝達物質放出調節剤、神経受容体のリガンドもしくはアゴニストもしくはアンタゴニスト、カルシウムチャネル剤、免疫調節剤、または他のCNS反応性抗体など、他の薬剤または治療剤を含む組成物も想定し、包含する。本明細書で記載される1または複数の組換え抗体またはその断片の組合せを含む組成物が想定される。他の処置または治療剤には、適切な用量の非ステロイド系抗炎症薬例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、またはケトプロフェンなどの鎮痛薬、またはモルヒネなどのアヘン剤、または制吐剤の投与が含まれうる。加えて、組成物は、免疫反応およびがん細胞または腫瘍の軽減または消失を刺激する、インターロイキン、腫瘍壊死因子TNF、または他の増殖因子、コロニー刺激因子、サイトカイン、またはデキサメタゾンなどのホルモンなどの免疫調節剤と共に投与することもできる。組成物はまた、特に、rHIgM22および/またはrHIgM46を含めた再ミエリン化抗体を含めた他のCNS反応性抗体と共に投与することもでき、これらとの組合せを包含する場合もある。本発明はさらに、本発明の治療法を実施するのに有用な治療用組成物も想定する。対象の治療用組成物は、混合剤中に、薬学的に許容される賦形剤キャリア、および有効成分としての、本明細書で記載される抗体、そのポリペプチド類似体またはその断片のうちの1または複数を包含する。好ましい実施形態では、組成物が、本結合メンバー/抗体の標的細胞との特異的結合を調節することが可能な抗原を含む。当技術分野では、抗体、ポリペプチド、または活性断片を有効成分として含有する治療用組成物または医薬組成物の調製について十分に理解されている。典型的には、このような組成物を溶液または懸濁液としての注射剤として調製する。しかしまた、液体中で溶液に適するか、または液体中で懸濁液に適する固体形態を、注射の前に調製することもできる。調製物はまた、乳化させることもできる。治療的有効成分は、薬学的に許容され、この有効成分と適合性である賦形剤と混合させることが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。加えて、所望の場合、組成物は、有効成分の有効性を増強する保湿剤または乳化剤、pH緩衝剤など、微量の補助物質も含有しうる。抗体または活性断片は、薬学的に許容される中和された塩形態としての治療用組成物へと処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基により形成されるが含まれ、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸中で形成される。また、遊離カルボキシル基から形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。治療的抗体または活性断片を含有する組成物は従来、例えば、単位用量の注射を介して腹腔内投与または静脈内投与されている。本発明の治療用組成物に言及して用いられる場合の単位用量という用語は、各単位が、要請される希釈剤、すなわち、キャリアまたはビヒクルとの関連で、所望の治療的効果をもたらすように計算した所定量の活性物質を含有する、ヒト用の単位用量として適切な物理的に個別の単位を指す。組成物は、処方と適合的な形で、かつ、治療有効量で投与する。投与される量は、処置される対象、対象の系が有効成分を用いる能力、および所望のニューロン結合能の程度または神経傷害の程度に依存する。投与するように要請される有効成分の正確な量は医師の判断に依存し、各個体に特有である。初回投与および追加投与に適するレジームもまた可変的であり、初回投与の後に、その後の注射または他の投与を介して1もしくは複数時間、1もしくは複数日間、1もしくは複数週間、または1もしくは複数カ月間の間隔で反復される投与を包含しうる。代替的に、血液、CNS、または所望の治療部位において適切かつ十分な濃度を維持するのに十分な持続的注入または持続的投与も想定される。投与時期は、規格による教示、患者または対象の臨床パラメータ、状態または疾患の状況または重症度、または神経傷害、神経病変または障害の程度もしくは性質に基づき、当業者または医師が変化させ、決定することができる。したがって、神経機能の改善、または、例えば、死滅もしくは障害からのニューロン保護の増強は、神経損傷または神経障害の程度を最小化するように、疾患の早期に投与することにより増強することもでき、疾患が発症または臨床的に顕在化したときに増強することもできる。ある態様では、神経機能障害または神経損傷による疾患の進行を最小化または緩和するように、投与時期を、神経機能の評価、状態の決定、および/または他の臨床評価と協調させる。診断アッセイ本発明はまた、神経細胞の損傷、傷害または障害を検出または決定する方法を含めた多様な診断的適用にも関する。本発明の抗体および断片を用いて、invitroまたはinvivoにおけるニューロンを評価し、定量化し、標的化し、かつ/または画像化することができる。それらの断片を含めた本抗体、ならびに特異的結合メンバー、抗体および/またはそれらのサブユニットの生成または活性を調節する薬物は、特定の診断適用を保有することが可能であり、例えば、ニューロンの障害、変性、傷害、損傷、または死滅を伴う状態または疾患を検出し、かつ/または測定する目的に用いることができる。放射性標識した抗体およびそれらの断片を含め、標識した抗体およびそれらの断片は、invitroの診断法およびinvivoの放射性画像化法、ならびに放射性免疫治療において有用である。invivoにおける画像化の例では、本発明の抗体または断片を、例として挙げると、抗体分子にキレート化基を介して多数の常磁性イオンをロードした磁気共鳴造影剤が含まれるがこれらに限定されない、放射性同位体複数可以外の造影剤にコンジュゲートすることができる。キレート化基の例には、EDTA、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、およびポリオキシムが含まれる。常磁性イオンの例には、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタニウム、ホルミウム、およびフェルビウムが含まれる。本発明のさらなる態様では、放射性標識した抗体およびそれらの断片、特に、ラジオイムノコンジュゲートが、特に、細胞療法のための放射性標識した抗体として、放射性免疫治療において有用である。なおさらなる態様では、放射性標識した特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片が、放射免疫ガイド下手術法において有用であり、この場合、これらにより、障害されもしくは損傷したニューロンもしくは神経傷害部位の存在および/または位置を、手術中、または手術後に同定および指示して、このような細胞を標的とするかまたは除去することもでき、これらの特定の部位に細胞を移植または投与することもできる。放射性免疫治療RAITは、臨床に導入され、多様な抗体イムノコンジュゲートを用いて有効性を裏付けている。131Iで標識したヒト化抗がん胎児性抗原抗CEA抗体hMN-14が結腸直腸がんにおいて評価されておりBehrTMら2002年、Cancer、94巻増刊4号:1373~81頁、90Y標識を伴う同じ抗体が甲状腺髄様がんにおいて評価されているSteinRら2002年、Cancer、94巻1号:51~61頁。また、非ホジキンリンパ腫および膵臓がんのためのモノクローナル抗体を用いる放射性免疫治療も評価および報告されているGoldenbergDM2001年、CritRevOncolHematol、39巻1~2号:195~201頁;GoldDVら2001年、CritRevOncolHematol、39巻1~2号:147~54頁。また、特定の抗体による放射性免疫療法も、米国特許第6,306,393号および同第6,331,175号において記載されている。また、抗CEA抗体および腫瘍関連抗原を指向する抗体を用いることを含めた放射免疫ガイド下手術RIGSも臨床治療に導入され、有効性および有用性を裏付けているKimJCら2002年、IntJCancer、97巻4号:542~7頁;SchneebaumSら2001年、WorldJSurg、25巻12号:1495~8頁;AvitalSら2000年、Cancer、89巻8号:1692~8頁;McIntoshDGら1997年、CancerBiotherRadiopharm、12巻4号:287~94頁。放射性標識した抗体およびそれらの断片は、invitroの診断法およびinvivoの放射性画像化法において有用である。抗体およびそれらの断片、特に、ラジオイムノコンジュゲートは、放射性免疫治療において、特に、神経傷害の修復、神経変性の回復、がん、またはCNS腫瘍の治療のための放射性標識した抗体として、または代替的に、特定の症例において損傷した神経組織もしくはニューロンを切除するための放射性標識した抗体として有用である。invivoの態様では、抗体またはそのニューロン結合断片を標識し、神経傷害を位置特定するかまたは損傷しまたは傷害された残りの神経組織を評価するための、定位固定法または侵襲性が最小限の技法を含めた手術もしくは外科法の前、手術もしくは外科法の間、または手術もしくは外科法の後に動物に投与する。このような一態様では、放射性標識した特異的結合メンバー、特に、抗体およびそれらの断片が、放射免疫ガイド下手術法において有用であり、この場合、これらにより、障害され、損傷され、傷害され、または死滅する神経細胞もしくはニューロンまたは神経組織の存在および/または位置を、手術前、手術中、または手術後に同定および指示して、このような細胞を標的とするか、同定するか、または除去することもできる。本発明の抗体およびそれらの断片の診断的適用は、当業者に周知で標準的であり、本記載に基づく、invitroおよびinvivoにおける適用を包含する。invitroにおいてニューロンまたは神経組織を評価assessmentおよびevaluationするための診断アッセイおよびキットを用いて、神経細胞が障害され、損傷しまたは傷害された神経状態または神経疾患を有するかまたはこれらを有することが疑われることが公知の患者試料を含めた患者試料を診断、評価、およびモニタリングすることもでき、患者または対象に由来する試料における場合を含め、細胞死もしくは細胞損傷の程度またはCNS腫瘍もしくはがんの程度を決定することもできる。神経学的疾患状態の評価assessmentおよびevaluationはまた、患者の薬物についての臨床試験に対する適性、または、これらの組合せを含めた、特定の神経治療剤もしくは化学療法剤もしくは本発明の抗体の投与に対する、異なる薬剤もしくは抗体の投与に対する適性と対比した適性を決定するのにも有用である。本発明は、例として挙げると、ニューロンの損傷、障害、もしくは傷害の程度もしくは存在についての定量的解析のための試験キット、または試料中のニューロンを定量化するための試験キットの形態で調製しうるアッセイ系を包含する。系または試験キットは、本明細書で論じられる放射法および/または酵素法のうちの1つを介して調製される標識された成分と、標識の、抗体、および、場合によって、それらのうちの少なくとも1つを遊離成分複数可もしくは固定化成分複数可とする1または複数のさらなる免疫化学試薬、またはそれらの結合パートナー複数可への連結とを含みうる。本発明のさらなる実施形態では、上記に基づき、試料中のニューロンの状態を決定するために医療従事者が用いるのに適する市販の試験キットを調製することもできる。上記で論じた試験法に従い、このようなキットのうちの1つのクラスは、少なくとも標識した抗体またはその結合パートナー、例として挙げると、標識した抗体に特異的な抗体、および選択される方法、例えば、競合法、サンドウィッチ法、およびDASP法などに当然ながら依存する指示書を含有する。キットはまた、緩衝剤、安定化剤などの周縁的試薬も含有しうる。したがって、ニューロンの存在を裏付けるか、またはその状態を決定するための試験キットであって、a本抗体もしくは断片またはこれに対する特異的結合パートナーの、検出可能な標識への直接的または間接的な結合により得られる、所定量の、少なくとも1つの標識した免疫化学反応性の成分と、b他の試薬と、c前記キットの使用についての指示書とを含むキットを調製することができる。神経細胞の傷害、損傷または障害の存在を裏付けるための試験キットであって、a本抗体またはこれに対する特異的結合パートナーの、検出可能な標識への直接的または間接的な結合により得られる、所定量の、少なくとも1つの標識した免疫化学反応性の成分と、b他の試薬と、c前記キットの使用についての指示書とを含むキットを調製することができる。核酸本発明はさらに、本発明の抗体、特に、組換え抗体、特に、完全ヒト抗体をコードする単離核酸を提供する。核酸は、DNAおよびRNAを包含する。好ましい態様では、本発明が、図5もしくは6に示されるポリペプチドを含め、上記で規定した本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはそのCDR領域をコードすることが可能な核酸を提供する。本発明はまた、少なくとも1つの上記のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセット、または発現カセットの形態である構築物も提供する。本発明はまた、1または複数の上記の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。提供される任意の抗体または断片をコードする核酸は、特異的結合メンバーを生成させる方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む方法と同様に本発明の態様をなす。発現は、その核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成することができて簡便である。発現を介する生成の後、特異的結合メンバーは、任意の適切な技法を用いて単離および/または精製し、次いで、必要に応じて用いることができる。本発明による抗体およびコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に純粋または均一の形態で単離および/または精製して提供することもでき、核酸の場合は、要請される機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外に由来する核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まない形で提供することもできる。本発明による核酸は、DNAを含む場合もありRNAを含む場合もあり、完全に合成の場合もあり、部分的に合成の場合もある。異なる多様な宿主細胞においてポリペプチドをクローニングし、発現させるための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルス系が含まれる。相同的なポリペプチドを発現させるために当技術分野において利用可能な哺乳動物の細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、がん細胞、卵巣がん細胞、および他の多くの細胞が含まれる。一般的な、好ましい細菌宿主は、E.coliである。当技術分野では、E.coliなどの原核細胞における抗体および抗体断片の発現が確立されている。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列を含めた適切な制御配列、マーカー遺伝子、および他の配列を必要に応じて含有する適切なベクターを、選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドベクターの場合もあり、ウイルスベクター、例えば、ファージベクターまたはファージミドベクターの場合もある。さらなる詳細については、例えば、MolecularCloning:aLaboratoryManual、2版、Sambrookら、1989年、ColdSpringHarborLaboratoryPressを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入、および遺伝子の発現、ならびにタンパク質の解析において核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコールについては、ShortProtocolsinMolecularBiology、2版、Ausubelら編、JohnWileySons、1992年において詳細に記載されている。SambrookらおよびAusubelらによる開示は、参照により本明細書に組み込まれている。したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸を含有する宿主細胞を提供する。なおさらなる態様は、このような核酸を宿主細胞へと導入するステップを含む方法を提供する。導入するステップには、任意の利用可能な技法を用いることができる。真核細胞の場合、適切な技法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAE-デキストラン法、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、牛痘ウイルス、もしくは、昆虫細胞では、バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適切な技法には、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。導入の後、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸から発現させ、または発現を可能にしうる。本発明はまた、上記の特異的結合メンバーまたはポリペプチドを発現させるための発現系において、上記で言及した構築物を用いることを含む方法も提供する。本発明の別の特徴は、本明細書で開示されているDNA配列の発現である。当技術分野において周知の通り、DNA配列は、それらを適切な発現ベクター内の発現制御配列へと作動的に連結し、この発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換することにより発現させることができる。本発明のDNA配列を発現させるのに、多種多様な宿主/発現ベクターの組合せを用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のDNA配列、染色体以外のDNA配列、および合成DNA配列のセグメントからなることが可能である。適切なベクターには、SV40の派生体および公知の細菌プラスミド、例えば、E.coliのプラスミドであるcolEl、pCR1、pBR322、pMB9、およびこれらの派生体、RP4などのプラスミド;ファージDNA、例えば、ファージλの多くの派生体、例えば、NM989、および他のファージDNA、例えば、M13および線状の一本鎖ファージDNA;2uプラスミドまたはその派生体などの酵母プラスミド;昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなど、真核細胞において有用なベクター;ファージDNAまたは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミドなど、プラスミドとファージDNAとの組合せに由来するベクターなどが含まれる。これらのベクターにおいて、多種多様な発現制御配列それに作動可能に連結されたDNA配列の発現を制御する配列のうちのいずれかを用いて、本発明のDNA配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、SV40初期プロモーターまたはSV40後期プロモーター、CMV、牛痘ウイルス、ポリオーマウイルスまたはアデノウイルス、lac系、trp系、TAC系、TRC系、LTR系、ファージλの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター例えば、Pho5、酵母接合因子のプロモーター、および原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの多様な組合せが含まれる。また、多種多様な単細胞の宿主細胞も、本発明のDNA配列を発現させるのに有用である。これらの宿主は、E.coli、Pseudomonas属、Bacillus属、Streptomyces属の株、酵母などの真菌、ならびにCHO細胞、YB/20細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、RI.1細胞、B-W細胞、およびL-M細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞例えば、COS1細胞、COS7細胞、BSC1細胞、BSC40細胞、およびBMT10細胞、昆虫細胞例えば、Sf9細胞、およびヒト細胞、および組織培養物中の植物細胞などの動物細胞など、周知の真核生物宿主、および原核生物宿主を包含しうる。全てのベクター、発現制御配列、および宿主が、本発明のDNA配列を発現させるのに同等に良好に機能するわけではないことが理解されるであろう。また、全ての宿主が、同じ発現系により同等に良好に機能するわけでもない。しかし、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなしに所望の発現を達成するのに必要以上の実験を行わずに、適正なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することが可能であろう。発現制御配列の選択では、通常多様な因子を考慮する。これらには、例えば、系の相対強度、その制御可能性、および発現させる特定のDNA配列または遺伝子との、特に、潜在的な二次構造に関するその適合性が含まれる。適切な単細胞宿主は、例えば、それらの選択したベクターとの適合性、それらの分泌特徴、それらがタンパク質を適正にフォールドする能力、およびそれらの発酵要件のほか、発現させるDNA配列によりコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物を精製する容易さを考慮することにより、選択される。これらの因子および他の因子を考慮すると、当業者は、本発明のDNA配列を、発酵により、または大スケールの動物培養物により発現させる、多様なベクター/発現制御配列/宿主の組合せを構築することが可能である。抗体またはその断片をコードするDNA配列は、クローニングではなく合成により調製することができる。DNA配列は、特異的結合メンバーのアミノ酸配列に適切なコドンによりデザインすることができる。一般に、配列を発現のために用いる場合は、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法を介して調製され、完全なコード配列へと組み立てられる、重複するオリゴヌクレオチドから組み立てる。例えば、Edge、Nature、292巻:756頁1981年;Nambairら、Science、223巻:1299頁1984年;Jayら、J.Biol.Chem.、259巻:6311頁1984年を参照されたい。合成DNA配列により、特異的結合メンバーの類似体または変異タンパク質を発現させる遺伝子の簡便な構築が可能となる。代替的に、天然の特異的結合メンバー遺伝子またはcDNAに対する部位指向変異誘発を介して変異タンパク質をコードするDNAを作製することもできるが、変異タンパク質は、従来のポリペプチド合成を用いて直接作製することができる。本発明は、本発明の例として提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解することができる。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示されるものであり、本発明の広範な範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。本発明は、本発明の例として提示される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解することができる。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示されるものであり、本発明の広範な範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。実施例1自己神経系細胞に結合する天然自己抗体NatAbの同定ニューロンに結合する天然血清のヒトIgMを、モノクローナルIgGまたはモノクローナルIgMの高スパイク血中に10mg/mlを超えるを伴う候補血清について、45年間にわたり収集された140,000を超える試料を含有するMayoClinic血清バンクをスクリーニングし、次いで、血清を抗体の生存大脳皮質および生存小脳のスライスへの結合について調べることにより同定した31。次いで、このようなIgMを陽性試料から精製し、1単離された初代ニューロンの表面への結合、2神経突起伸長を支持するための基質として、3ストレッサー分子に対するニューロンをアポトーシスから保護する能力についてさらに調べた。このスクリーニングプロトコールは、希突起膠細胞に結合し、MSモデル22、およびWO0185797において記載されているにおける再ミエリン化を促進するヒトIgMを同定するのに使用されるプロトコールに基づく。適切な組織または細胞の表面の認識は、治療用IgMの特徴を規定するのに重要であると考えられる。2つの新規で異なる血清由来ヒトニューロン結合IgMsHIgM12およびsHIgM42を同定した。これらの血清由来抗体の特定の特徴を表1に列挙する。血清に由来するsHIgM12およびsHIgM42はまず、神経突起伸長ならびに強力な基質であるラミニンを支持し、CNSミエリンによる神経突起成長の阻害を凌駕することがinvitroにおいて示されている23。さらなる研究は、マウスにおける夜間1時間当たりの平均自発活動を介して評価される通り、血清由来のsHIgM12が、TMEV感染マウスにおける自発的機能を改善することを示している21。既に同定されているIgMNatAbsHIgM22およびsHIgM46と異なり、sHIgM12もsHIgM42も脊髄の再ミエリン化を促進しない。自己抗体は、病原性であると考えられることが多い。これに対し、本明細書で裏付けられる通り、ニューロンに対する自己抗体sHIgM12およびsHIgM42ならびにこれらに基づく組換え抗体は、ニューロンを死滅させない。そうではなくて、これらのIgMは、ニューロンを死滅から保護し、神経突起伸長を促進し、invivoにおけるNAAを増大させ、invivoのTMEVモデルにおいて軸索を保護し、TMEV罹患マウスの夜間における自発的機能を改善する。ニューロン結合抗体であるIgM12およびIgM42は、CNS病変におけるニューロンを標的とし、ニューロンの喪失を可逆化し、かつ/またはニューロン損傷またはニューロン疾患の影響を改善するのに適用可能である。ニューロン結合ヒトIgMは、多様な疾患および神経変性、ニューロン損傷、またはニューロン死滅を伴う状態に対する固有の適用を伴う治療剤の新たなクラスを代表する。限定せずに述べると、このような疾患には、MS、脊髄損傷、ALS、アルツハイマー病、外傷性脳損傷、脳血管事象、または脳卒中が含まれる。これらのヒトIgMは、動物に全身投与した場合の抗原性が最小限となっている。複数種類の生存ニューロンの表面に結合するヒトIgMの同定および特徴付け:高濃度のIgGまたはIgM>10mg/mlを伴う血清試料を、抗体の、生存CNS組織のスライスにおけるニューロン層皮質および小脳への結合についてスクリーニングした。152例の被験血清のうち、17例のヒト血清が、組織スライスにおいて陽性であった23。抗体sHIgM12および抗体sHIgM42は、ニューロンマーカーであるニューロフィラメントまたはβIIIチューブリンで共標識される多種多様なニューロンの表面に結合する。これらには、ヒト側頭葉の生検に由来する小脳顆粒細胞23、皮質ニューロン、海馬ニューロン、ニューロン図1、および網膜神経節細胞データは示さないが含まれる。rHIgM12は、海馬ニューロンの神経細胞体、神経突起、および成長円錐を染色させるデータは示さない。この交差反応性は、ヒトIgMが、MS、筋萎縮性側索硬化症、または脳卒中など、多くの神経学的状態/疾患において影響を受けるCNS細胞において作用しうることを示唆する。本データは、sHIgM12またはsHIgM42のニューロン表面への結合が炭水化物依存性であることを示す。培養物中のニューロンに対するシアリダーゼ処置によりいずれのヒトIgMの細胞表面への結合も消失する一方、FumonisinB1によりスフィンゴ脂質の合成を遮断するか、またはPIPLCによりGPI結合タンパク質を除去しても、IgMの結合は消失しなかった23。ガングリオシドは、これらのヒトIgMの抗原の候補物質である。共標識実験では、rHIgM12が、ニューロン膜におけるGM1と共に共局在化する実施例11および図21Cを参照されたい。sHIgM12およびsHIgM42は、神経突起成長の誘発など、特定の機能的特徴を共有するが、差異を裏付けており、各々が固有の抗体である。これは、結合研究および免疫蛍光研究において明らかであり、sHIgM12およびsHIgM42により、小脳顆粒細胞の表面が異なるパターンで標識される。培養物中のラット小脳顆粒細胞についての免疫蛍光研究では、ニューロン膜がこれらの2つの抗体により標識されるパターンが異なる図2。神経突起膜の小領域には、sHIgM12が結合する結果として、点状のパターンがもたらされる。神経突起膜の大領域には、sHIgM42が結合する結果として、分節化の高いパターンがもたらされる。実施例2ヒトIgMは皮質ニューロンを過酸化物誘導性死滅から保護する再ミエリン化促進ヒトIgMは、培養物中の希突起膠細胞を、活性アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ3の過酸化物誘導性活性化から保護することが示されている33。本明細書で示される通り、sHIgM12またはsHIgM42も、類似のプロトコールにより評価した。sHIgM12またはsHIgM42のそれぞれ、および過酸化物を、マウス初代皮質ニューロンの培養物へと併せて添加し、24時間後にカスパーゼ3の活性化度をアッセイした図3。培養されたニューロンをrHIgM12で処置した結果として、カスパーゼ3活性化のうちの80に対する保護がもたらされた。また、ニューロンのsHIgM42による処置も、カスパーゼ3活性化のうちの約40に対して保護的であった。これらの結果は、結果としてカスパーゼ3活性化からの保護が10未満となる対照のヒトIgMと比較して有意に異なったP<0.01。したがって、ニューロン結合sHIgM12またはニューロン結合sHIgM42は、皮質ニューロンを、過酸化物により誘導される細胞死から保護した。したがって、神経細胞損傷または死滅誘導剤または神経細胞損傷または死滅剤を供給した場合、IgM12およびIgM42は、損傷または死滅が生じることを個別かつ有意に防止した。実施例3sHIgM12に由来する組換え抗体sHIgM12の2つの組換え形態を構築した。各形態では、重鎖および軽鎖についての組換えIgM22抗体rHIgM22について既に用いた発現ベクターと同じ発現ベクターを用いた22、28、WO0185797。ベクターは、SV40プロモーターの制御下で発現させた選択用dHfR遺伝子を包含する。マウスJ鎖を伴う部分ヒト組換えIgM12抗体の形態を、まず以下の通りに構築し、その後、ヒト/マウスハイブリドーマ系であるF3B6細胞により抗体を生成させた。組換えIgM12抗体PAD12用ベクターの構築は、ヌクレオチドデータベースに由来するリーダー配列を伴う重鎖可変領域のcDNAと、ヌクレオチドデータベースに由来するリーダー配列を結合させた完全軽鎖cDNAとを、下記のプライマーを用いる既に記載された形6と同様の形で挿入することにより実施した。ベクターを図4に示す。組換えヒトIgM12抗体に用いた重鎖および軽鎖の配列を、可変領域および定常領域に言及して図5に示す。rHIgM12VHを作製し、これを、データベースM29812に由来する、イントロンを伴うリーダー配列小文字へと重複伸長を介してスプライシングするのに用いたプライマーHortonRMら1989年、Gene、77巻:61~68頁は、以下の通りである。rHIgM12Vkを作製し、これを、データベースに由来する、リーダー配列小文字、受託番号:X59312へと重複伸長を介してスプライシングするsoeのに用いたプライマーは、以下の通りである。合成の抗体遺伝子を伴うベクターを、電気穿孔を介してF3B6ハイブリドーマ細胞へと導入し、既に記載されている通り6に、メトトレキサートMTXによる増幅を実施した。略述すると、8百万個のF3B6マウス/ヒトヘテロハイブリドーマ細胞AmericanTypeCultureCollection:ATCCを、BglIIで直鎖化した10μgのPAD12ベクターと共に、800μlの無血清培地中で10分間にわたりインキュベートした後で、BioradGenePulser商標Biorad、Hercules、CA、USAにより0.2Vで電気穿孔した。氷上で10分間のインキュベーション後、細胞を、10のウシ胎仔血清FCGibco、Carlsbad、CA、USAを含有するRPMI-1640中で24mlまで希釈し、24ウェルプレートに播種して37°Cでインキュベートし、48時間後、ベクターを含有する細胞を、1μMのメトトレキサートCalbiochem、LaJolla、CA、USAを用いて選択した。2週間にわたるインキュベーション後、コロニーを新たなプレートへと採取し、コンフルエントまで増殖させた。この時点で、上清を採取し、酵素免疫測定アッセイELISAを介して、ヒトIgMの存在についてアッセイした。陽性コロニーを、さらに2カ月間にわたり、メトトレキサートの用量を1μM~200μMの範囲で増大させて選択した。このようにして、細胞を生成し、これにより、10μg/mlを超えるIgMを産生した。上記の通りに構築した最初の組換え抗体は、完全ヒト抗体ではない。完全ヒト形態を生成させるため、CHO細胞GibcoBRL;型番:11619を、E1AプロモーターおよびpCIPromegaにおいてヒトJ鎖を発現させる構築物の制御下で組換え重鎖および組換え軽鎖をコードするベクターで共トランスフェクトした。細胞は、10のコスミドcosmicクローンを伴うPowerCho1とIMDMとの50/50混合物中で、メトトレキサートの用量を増大させて選択し、ELISAを介する測定で抗体を最も多く生成させた2つのクローンをサブクローニングした。サブクローンを増殖させ、バイアルを凍結させた。いずれの組換えIgM12形態も、ニューロンへの結合および血清から単離されたIgMのinvivoにおける有効性の特徴を維持するが、マウスにおける半減期は短いこれは、グリコシル化の差異に起因する可能性がある。同様で同等の手順を用いて、同等のベクターにより組換えHIgM42抗体を構築した。ヒトIgM42抗体の重鎖配列および軽鎖配列を、可変領域および定常領域について言及して図6に示す。実施例4rHIgM12の単回末梢投与は多発性硬化症MSのTMEVモデルにおける神経機能を改善したrHIgM12により、培養物中の初代ニューロンが保護され、MSのTMEVモデルにおける身体障害が軸索喪失と相関する2という事実に照らして、TMEV感染マウスのrHIgM12による処置を用いて、神経欠損の進行を緩徐化する能力を評価した。軸索の喪失が始まる時点である、TMEV感染の90日後におけるマウス5匹の群を、rHIgM12100μgまたは対照のヒトIgM100μgの単回投与で処置した。5匹の感染マウスは、各群について無作為に選択し、処置前の機能記録を用いて、ベースラインの活性が群間で異ならないことを確認した。マウスは、複数週間における連続3日間にわたり、活動ボックスを用いて群として追跡した34、35。夜間挙動の変化は、TMEV媒介性疾患における神経欠損の高感度の尺度である。活動ボックスとは、筐体全体に格子を創出する赤外線ビームを対向させる透明のアクリル製ボックスであって、水平方向および垂直方向全ての運動を記録するボックスである。アッセイの感度は、後肢による立脚および歩行を測定する能力を反映する。TMEV感染マウスでは、後肢がこわばり、後肢による立脚が低減される。しかし、ケージ内の自発歩行が重度に影響を受けることはない。後肢がこわばったマウスは、後肢で立脚するより歩く方が容易であり疾患が進行したマウスでもなお、夜間には極めて活動的でありうる。各処置群は無作為に組み立て、処置前に活動ボックス内に72時間にわたり収容し、次いで、処置後各週につき72時間にわたり収容した。解析時間である72時間における午後6時~午前6時の12時間にわたり、水平方向および垂直方向の活動について、1時間当たりの平均ビーム遮断回数を計算した。マウスが入眠するので、典型的には遮断が600回/時間未満となる、昼間における水平方向および垂直方向の活動に処置群間の差異は見られなかった。しかし、rHIgM12による処置群では、夜間における水平方向の自発活動のそれらの処置前のベースラインと比較した増大が記録された3~7週間にわたり:P<0.01図7。細胞に結合しない対照のヒトIgMは、活動を改善しなかった。同様の研究において、血清由来のsHIgM12について見られる効果、および、今やまた、組換え抗体rIgM12について見られる効果とも異なり、ヒト抗体sHIgM42は、同じ条件下で、TMEV感染マウスの夜間活動を変化させなかった。同じアッセイフォーマットにおけるsHIgM42のための代替的な投与パラメータは、夜間活動に対して異なり、かつ、より肯定的な結果をもたらす。機能の改善についての1つの可能な説明は、有効なIgMが、ウイルス負荷に干渉し、その結果として、疾患の軽減がもたらされるということである。しかし、これは、説明であるとは考えられない。慢性TMEV疾患を伴うマウスを、rHIgM12、sHIgM42、または対照のIgMの単回投与で処置し、5週間後に脳および脊髄を採取し、次いで、TMEVRNAゲノムの転写物レベルを、ウイルスタンパク質2に対するプローブによるPCRを介して測定した。ウイルス転写物は、群間で異ならなかったP<0.01データは示さない。実施例5脊髄疾患を伴うマウスの脳幹におけるNAAレベル:脊髄全体における軸索保存の非侵襲的サロゲートマーカーNAAとは、ニューロン機能と関連する代謝物質である36、37。NAAは、脳において2番目に豊富なアミノ酸であり、ほぼもっぱらニューロンに限定される。脳幹におけるNAAレベルの保存は、本発明者らのグループによりTMEVマウスモデルを用いて検証された脊髄軸索全体の健康の尺度である8。脊髄下部の軸索が損傷すると、脳幹の細胞が死滅し、NAAが低減される。MRSを介して測定されるNAAレベルは、主にニューロン密度を反映する。NAAは、他の神経細胞でも発現するが、NAAの主な発現は、ニューロンにおいてである。精製されたCNS細胞のMRSプロファイルを研究すると、NAAシグナルの振幅がニューロンにおいて優勢であるのに対し、希突起膠細胞または星状細胞のNAAシグナルの振幅は、ニューロンにおけるシグナルの、それぞれ、5および10であることが示される38。sHIgM12およびIgM42が軸索機能を保存することによりマウスの活動を改善する能力をさらに評価するため、本発明者らは、非侵襲的画像化アッセイおよび従来の形態解析を用いて脊髄軸索を評価した。逆行追跡を用いて、TMEV媒介性疾患の脱髄後における脊髄軸索の機能不全を裏付けた5。胸部軸索~脳幹核における逆行標識の劇的な低減が測定された。脳幹とは、細胞体の多くが存在する場所であって、脊髄の全長に沿って長い軸索路を展出させる場所である。その後、既に報告されたプロトコール8を用いて、TMEV感染マウスにおいて、磁気共鳴分光法MRSを介して、脳幹におけるN-アセチルアスパラギン酸NAAレベルを評価した図8。本発明者らは、TMEV誘導性疾患を伴うマウスにおいてある時間にわたる脳幹NAAの低減を観察した図9。NAAレベルは、感染後最初の45日間にわたり低下し、感染の270日後まで低レベルを保った。TMEVに感染したSJLマウスでは、脊髄脱髄の程度が感染の90日後までプラトー状態を保つ39。このモデルにおいて軸索喪失が組織学を介してされるのは、この時点においてである2。したがって、NAAは、軸索における機能不全の高感度の尺度である。最後のMRS収集の後、軸索を、T6レベルにおける脊髄断面内の外見が正常な白質の6つの領域から体系的にサンプリングした。このレベルは、これにより脊髄全体においてランダムに分布する複数の脱髄病変に由来する軸索喪失が全体的に表される39ために選択した。本発明者らは、TMEV感染の270日後のSJLマウスにおける軸索は、非感染対照と比較して30.5少ないp<0.001ことを見出した。脳幹NAAレベルと脊髄のT6レベルにおける軸索カウントとの間には、正の相関r=0.823が存在することが見出された8。ニューロン結合ヒトIgMの単回投与は脳幹におけるNAAレベルおよび脊髄における軸索を保存する:ヒトニューロン結合IgMがTMEV感染マウスにおけるNAAレベルまたは軸索カウントを変化させる能力を評価した。これにより、TMEV感染マウスを、脊髄軸索の脱落の開始時感染の90日後に、ニューロン結合IgMであるsHIgM12またはsHIgM42100μgずつの単回投与で処置したところ、10週間後に測定したときの胸部脊髄の正常白質における有髄軸索密度が増大することが見出された。感染の90日後におけるマウス10~15匹の群を、sHIgM12、sHIgM42、対照のヒトIgM、または生理食塩液100μgずつの単回投与で処置した図10。処置前ならびに処置の5および10週間後、各マウスを小型のボア磁石に入れ、脳幹におけるMRSを収集した。10週間後、マウスを屠殺し、脊髄を回収し、プラスチック包埋し、T6レベルで切断した断面をパラフェニレンジアミンparaphenylamindiamineで染色して、髄鞘を可視化し、400,000μmの外見が正常な白質を包含する切片1つ当たり6枚の画像を収集し、軸索を自動式でカウントした。2つのニューロン結合IgMsHIgM12、sHIgM42のうちのいずれで処置した群においても、NAAレベルは、5週間後および10週間後のいずれにおいても処置前のレベルと比較して増大した。対照のIgMで処置したマウスは低下傾向を示し、生理食塩液で処置したマウスは変化を示さなかった。sHIgM12およびsHIgM42で処置した群のNAAレベルは、それぞれ、9.13および9.3mMまで増大したが、これらの各々は、非感染マウスの12.0mMのレベルを大きく下回った。T6レベルにおける軸索を処置群間で比較した表2ところ、sHIgM12またはsHIgM42で処置したマウスは、生理食塩液で処置した群より多くの軸索を含有した15,198本の軸索と比較して、17,303本および17,771本の軸索:P=0.008およびP<0.001が、非感染マウスにおいてカウントされた軸索数21,284本の軸索より少なかった。TMEVモデルにより証拠立てられる通り、これらの結果は、sHIgM12抗体およびrHIgM12抗体の各々により、軸索の保存を介して機能が改善されることを示した。TMEVモデルでは、sHIgM42抗体により軸索が保存されたが、初期試験の夜間活動の評価では、裏付け可能な変化が観察されなかった。用量範囲探索研究の後、sHIgM42はまた、夜間活動試験における活動の増大も達成することが見出された。脳幹MRSを用いて、脊髄疾患のマウスモデルにおける軸索状態を評価することにより、本発明がさらに検証され、したがって、脳幹におけるNAAは、臨床試験でこれらのヒト抗体を用いるための優れた評価項目として用いられる。sHIgM42およびsHIgM12で処置してNAAレベルが改善されたマウスはまた、胸部中央の脊髄において含有する軸索も増大した。TMEV感染SJLマウス10~15匹の群を、感染の90日後に、rHIgM22、sHIgM42、sHIgM12、対照のsHIgM39、および生理食塩液100μgずつの単回投与で処置した。処置の10週間後、脊髄を摘出し、胸部中央の切片をPPDで染色してミエリンを可視化した。各マウスから、400,000μm2の白質を包含する6つの領域をサンプリングし、有髄軸索数をカウントした1。T6断面1つ当たりの有髄軸索絶対数の平均±SEMを表2に列挙する。実施例6ニューロン結合IgMは再ミエリン化を促進することなしに軸索を保存する希突起膠細胞に結合し、再ミエリン化を促進する複数のヒトIgM例えば、sHIgM22およびsHIgM46が同定されている22、40、41。下記で示される通り、ニューロン結合IgMは、ニューロン数を増大させ、ニューロン機能を改善するが、明白な再ミエリン化は伴わない。理論に束縛されずに述べると、作用機構は、軸索の直接的な活性化保護、神経突起伸長に起因し、かつ/または生得的免疫系または獲得的免疫系を活性化させてニューロンを保護する因子を分泌させることを介すると理解される。上記で提示した結果は、抗体が軸索/ニューロンに対して直接的な効果を及ぼすことを明確に裏付ける。sHIgM12およびsHIgM42を介する軸索保存および/または再成長が測定された同じ脊髄内では、脱髄、再ミエリン化、および炎症の全体が、処置群間で異ならなかった図11。これらの属性は、脊髄の全長に沿って試料を代表する10の脊髄断面の四半部を等級づけすることにより定量化した6。rHIgM22処置群陽性対照が、予測される再ミエリン化の増大を示したのに対し、sHIgM12およびsHIgM42で処置したマウスは、脊髄の再ミエリン化をほとんど含有しなかった。したがって、TMEVモデルにおける神経欠損が、著明な再ミエリン化を要請することなしに改善され例えば、IgM12、さらに、検討された時間枠内では、軸索の保存および/または再成長のために再ミエリン化が必要ではない。実施例7rHIgM12ヒトJ鎖を伴うおよびsHIgM42の血清半減期ヒトIgM、rHIgM12ヒトJ鎖を伴う、およびsHIgM42の半減期を決定するために、200μlの生理食塩液中に100μgのヒトJ鎖を含有するrHIgM12、または100μgのsHIgM42を、正常CD-1マウスの尾静脈へと注射した図12。規定された間隔15分間、1、4、8、24、48時間で、マウス3匹ずつの群から、心穿刺を介して血液を回収した。血清を回収し、サンドウィッチELISAを用いて、ヒトIgMミュー鎖の存在についてアッセイした。rHIgM12では、15分後における初回の回収と8時間後における回収との間における半減期が、3.8時間であった。sHIgM42では、15分後における初回の回収と24時間後における回収との間における半減期が、20.5時間であった。これらの値は、マウスにおける半減期を15時間とし29、ウサギにおける半減期を90時間とする、再ミエリン化を促進するrHIgM22の半減期を一括する。半減期は、式:kelim=lncpeak-lnclow/tintervalおよびt1/2=0.693/kelimを用いて計算した。実施例8放射性標識したヒトモノクローナルIgMは血液脳関門を越える分子量が百万に近いIgMは、循環から血液脳関門BBBを越え、これにより、CNSに入るには大型に過ぎる可能性があることがしばしば受け入れられている42、43。しかし、一部のIgMはBBBを越えるという特定の証拠は存在する。正常SJLマウスおよびTMEV感染SJLマウスの組織における35S標識したrHIgM12の分布を測定した図13。50μgのrHIgM121×107cpmを腹腔内投与した。4または24時間後にマウスを生理食塩液で潅流し、組織を迅速に採取し、細断し、シンチレーション液中に溶解させた。非感染マウスの脳および脊髄は、いずれの時点においても放射性標識を含有した。TMEV感染マウスのCNSは、4時間後の時点で非感染マウスの2倍の放射性標識を含有した。これは、24時間後までに4倍に増大した。また、rHIgM12ヒトJ鎖を伴うrHIgM12、およびヒトJ鎖を伴わないrHIgM12の両方およびsHIgM42は、正常マウスおよびアルツハイマー病のモデルであるSAMP8マウスにおいてBBBを越えうることも見出された。したがって、125I標識したヒトIgMを静脈内注射し、2時間後に脳を回収した。これらの抗体の各々は、正常マウスおよび疾患マウスの脳に蓄積される。これらの抗体はまた、IgMを、脳内注射を介して送達した場合であれ、静脈内注射を介して送達した場合であれ、アルツハイマー病のマウスモデルにおける認知障害も可逆化する。実施例9腹腔内送達されたヒトニューロン結合IgMは脱髄した脊髄病変に入り、ニューロフィラメント陽性の軸索に局在化する同位体で標識した、再ミエリン化を促進するマウスIgMである、SCH94.03についてのHunterによる研究44は、オートラジオグラフィーを用いて、放射性標識が、invivoにおいてTMEV感染マウスの脊髄、とりわけ、微細構造的に希突起膠細胞と同定された細胞に局在化することを裏付けた。35SrHIgM12による同様のオートラジオグラフィー研究も実施されている。本発明者らは、従来の免疫細胞化学を用いて、脊髄病変内のニューロン結合ヒトIgMを検出した図14。したがって、1.0mgのrHIgM12ヒトJ鎖を伴う、sHIgM42、または市販される対照のヒトIgMJacksonImmunoResearch慢性脱髄を伴うTMEV感染マウスに腹腔内投与した。4時間後、マウスをパラホルムアルデヒドで潅流し、凍結させた脊髄を縦方向に切片化し、ヒトIgMミュー鎖の存在について免疫染色した。rHIgM12またはsHIgM42を施されたマウスでは、ヒトミュー鎖が、脱髄病変の軸索線維を示唆する並列経路に局在化した。対照のヒトIgMは、病変内にも、非病変脊髄にも見出されなかった。したがって、ニューロン結合ヒトIgMであるrHIgM12またはsHIgM42がTMEV感染マウスにおいてBBBを越えることが明らかとなった。次いで、隣接する脊髄切片を、抗ニューロフィラメントNF抗体SMI-32およびSMI-34、Sternbergerの後、蛍光二次抗体である抗ヒトミュー鎖-FITC抗体および抗マウス-TRITC抗体で免疫標識した。共焦点顕微鏡法は、rHIgM12およびsHIgM42が、線維による経路の形で、および断続的に切断される軸索の神経線維束として、病変内のNF軸索に共局在化することを裏付けた図15。実施例10疾患の発症時に施された場合、rHIgM12またはsHIgM42はMOGペプチド誘導性EAEを増悪させない自己反応性のCNS結合IgMを自己免疫が活性な動物に投与することにより、疾患を増悪させうるという憂慮に対処するため、EAEを伴うマウスにおけるrHIgM12およびsHIgM42の効果を調べた。MOGペプチド200μg誘導性EAEを伴うC57BL6マウス10匹の群に、rHIgM12、sHIgM42、対照のヒトIgM、または生理食塩液100μgずつの単回静脈内投与を施した。個々のマウスは、それらの臨床スコアが1に到達した尾の引きずり時点で処置した。次いで、マウスを、処置群に対して盲検として、1日おきに体重を記録し、臨床スコアを評価する試験実施者が、マウスが免疫化の28日後に到達するかまたは臨死状態となるまで追跡した。体重または平均の臨床スコアにおいて、処置群間の差異は見られなかった図16:P=0.14。加えて、各マウスの脊髄の全体を包含する10の脊髄断面を、脊髄の各四半部における髄膜炎および脱髄の存在について、盲検により評価した6。髄膜炎P=0.825または脱髄P=0.766を伴う四半部の百分率に、処置群間で差異は見られなかった図17。したがって、TMEVモデルにおいて軸索を保護するのに有効なニューロン結合ヒトIgMの単回投与は、EAEによる臨床的欠損を増悪させたり、欠損の進行を加速化させたり、脊髄病態を悪化させたりしないことが見出された。実施例11ヒトIgM抗体であるrHIgM12は軸索の形成を促進し、微小管を標的とする脂質ラフトと相互作用する抗体sHIgM12は、初代培養小脳顆粒ニューロンにおける神経突起成長を促進した。本例では、初代海馬ニューロンを用いて、完全ヒト抗体ヒトJ鎖を有するrHIgM12が、軸索の形成を促進することを見出した。rHIgM12は、ニューロン膜に結合し、コレステロールおよびガングリオシドであるGM1のクラスター形成を誘導する。さらに、膜結合rHIgM12は、2つのプールで分布し、1つのプールは脂質ラフトドメインと会合し、他のプールは、細胞骨格に富む洗浄剤に不溶性のペレットと会合する。洗浄剤による抽出の後、rHIgM12は、微小管には共局在化するが、線維状アクチンには共局在化せずに凝集する。共免疫沈降研究は、rHIgM12とβ3-チューブリンとが複合して存在することを裏付けた。これらの結果は、rHIgM12が、微小管細胞骨格にシグナル伝達する膜ドメインをクラスター形成させることにより軸索の形成を規定することを示す。ニューロンは、神経突起成長の制御を介して軸索を発生させるBarnesおよびPolleux、2009年。線維状アクチンF-アクチンおよび微小管を包含するニューロンの細胞骨格は、神経突起成長および成長円錐の経路探索において極めて重要な役割を果たす。血清由来抗体は、大スケールの研究に適切でない場合があり、特に、大量に生成させることができず、抗体をもたらす患者から使用のたびごとに単離しなければならない場合は、同等の活性および能力を示す組換え形態の生成が有利である。本研究は、組換えの完全ヒトIgM12抗体rHIgM12が、軸索形成を促進し、したがって、培養された海馬ニューロンにおけるニューロンの極性化を駆動することを裏付けた。rHIgM12は、コレステロールおよびガングリオシドであるGM1を含有するニューロン膜ドメインをクラスター形成させる。スクロース密度勾配の画分化は、ニューロン膜結合rHIgM12が、カベオリン-1を含有する、洗浄剤耐性の軽い画分と会合する1つのプールと、細胞骨格に富むペレットを伴う他のプールとの2つのプールへと分別されることを示した。洗浄剤による生存ニューロンの抽出は、rHIgM12が、微小管と会合することを裏付けた。rHIgM12はまた、β3-チューブリンとも共免疫沈降した。まとめると、rHIgM12は、微小管と会合する膜ドメインに結合することが理解される。表面における基質として存在する場合、rHIgM12は、ニューロン膜における微小管のアンカリングを促進し、これにより、神経突起成長および軸索形成が促される。組換えヒトIgM12rHIgM12:rHIgM12は、CHO細胞GibcoBRL、型番:11619において発現させた。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症患者12例の血清において発現した主要な抗体の重鎖および軽鎖のコード配列を発現させるプラスミドを、ヒトJ鎖トランス遺伝子と共に、CHO-S細胞へとトランスフェクトした。結果として得られるCHO細胞を、メトトレキサートの用量を増大させて選択し、ELISAを介して測定される抗体を生成させる安定的なクローンを、サブクローニングし、増殖させた。培養物上清に由来するrHIgM12抗体を、クロマトグラフィーを介して、HPLC解析を介して測定される通りに97まで精製した。細胞の培養および神経突起成長アッセイ:FVBマウスから初代海馬ニューロンを調製した。胎生期15日目の海馬ニューロンをトリプシン-EDTA中で解離させ、ガラス製のカバースリップに結合させたニトロセルロース膜の薄層にコーティングしたポリ-D-リシンPDL基質、ラミニンを伴うPDL基質、またはrHIgM12基質上に播種し、2v/vのB27を含有するNeurobasal培地中で増殖させた。ニューロンを播種した12時間後、神経突起成長をアッセイした。ニューロンを4のパラホルムアルデヒドで固定し、抗β3-チューブリン抗体で染色した。線維状アクチンF-アクチンはTexas-Redファロイジンで標識し、核はDAPIで標識した。NeuronJソフトウェアを用いて神経突起長を測定し、ExcelMicrosoftで処理し、PrismGraphPadで統計学的に解析した。ステージ3のニューロンとは、Tau1染色を介して軸索として決定される最も長い神経突起Dottiら、1988年が、2番目に長い神経突起の長さの少なくとも2倍である、複数の神経突起を伴うニューロンとして定義した。Tau1は、軸索の遠位部分において非対称的に濃縮された。これに対し、ステージ2のニューロンは、複数の対称的な神経突起を有した。初代培養ニューロンの免疫染色、免疫沈降、およびスクロースの密度勾配による画分化:invitroにおいて1~3日間DIVにわたり培養した海馬ニューロンを、4のパラホルムアルデヒドで固定して、0.2のTritonX-100で透過処理した後に免疫染色した。Olympus製の正立顕微鏡を用いて画像を収集し、PhotoshopAdobeを用いて処理した。rHIgM12の分布は、不連続的なスクロース勾配中の超遠心分離を介して決定した。略述すると、rHIgM12を、DIV7の生存皮質ニューロンに4°Cで30分間にわたり結合させ、次いで、氷冷溶解緩衝液50mMのTris.HCl、pH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1のTritonX-100、およびプロテアーゼ阻害剤によるカクテル中で30分間にわたり溶解させた。ニューロン溶解物を、等容量の100w/vスクロースと混合した。混合物を遠心分離管に移し、35のスクロース8mlと5のスクロース3.5mlとを随時重ね合わせた。4°C、6画分各画分2mlずつ、2×105gで20時間にわたり遠心分離した後、勾配の最上画分から回収した。各画分およびペレットを、SDS-試料緩衝液中で溶解させ、ウェスタンブロット法にかけた。rHIgM12を細胞骨格タンパク質と共免疫沈降させるため、DIV7の生存皮質ニューロンを、4°Cで30分間にわたりrHIgM12により処置し、0.5のNP-40を含有する緩衝液中で溶解させた。rHIgM12は、プロテインL-アガロースビーズにより捕捉し、β3-チューブリンは、プロテインG-樹脂Thermoにより捕捉した。二重標識するために、生存ニューロンを固定した後、氷上でrHIgM12により染色し、0.2のTritonX-100で透過処理した。生存ニューロンの抽出および固定は、60mMのPipes、25mMのHepes、5mMのEGTA、1mMのMgCl2、4のパラホルムアルデヒド、および0.1のTritonX-100を含有する緩衝液中で実施した。この例における抗体および他の試薬:抗β3-チューブリン抗体Promega;抗アクチン、EDTA、ポリ-D-リシン、メチル-β-シクロデキストリン、およびフィリピンSigma;抗Tau1抗体、抗カベオリン-1抗体、および抗トランスフェリン受容体抗体Millipore;TexasRed-ファロイジン、コレラ毒素B、Neurobasal培地、およびB27Invitrogen;プロテアーゼ阻害剤錠Roche。組換えヒトIgMであるrHIgM12は軸索形成を促進した:IgMのニューロンの分化および根底的な分子機構に対する効果をさらに理解するために、組換えrHIgM12を用いて、培養された海馬ニューロンによる神経突起成長アッセイを実施した。海馬ニューロンは、3つの分化段階を経て軸索を形成するDottiら、1988年。複数の過程が細胞体から始まる。急速に成長しつつある神経突起は、その後、そのうちの一方が軸索へと分化し、他方が樹状突起へと分化し、これは、それぞれ、Tau1およびMAP2の示差的分布を介して同定することができるLewisら、1989年;KanaiおよびHirokawa、1995年。本発明者らは、基質として存在する場合のrHIgM12が、ニューロンの分化を実質的に促進することを見出した。播種後12時間以内に、rHIgM12上で成長しつつある海馬ニューロンが複数の神経突起を発生させ、それらのうちの1つは、近傍の神経突起と比較してはるかに長かった。これに対し、ポリ-D-リシンPDL上に播種されたニューロンは、複数の対称的な神経突起を示した図18A、B。神経突起長を測定した後、本発明者らは、rHIgM12上に播種されたニューロンn=86の全神経突起長が、PDL上に播種されたニューロンn=74と比較して有意に長い195.8μm対150.7μm:p=0.0056ことを見出した図18C。最も長い神経突起長は2倍を超えた117.1μm対51.8μm:p<0.0001図18Dが、2番目に長い神経突起長には有意な差異が見出されなかった38.7μm対33.3μm:p=0.0782図18E。rHIgM12上で成長しつつあるニューロンが保有する初代神経突起は少数であり2.9対4.1:p<0.0001図18F、それらの大半の表現型は、ステージ3のニューロンであったrHIgM12上の72対PDL上の18図18G。これらの結果は、基質として存在する場合のrHIgM12が、ニューロンの分化を促進することを示した。ニューロン分化に特徴的な特徴は、極性化された軸索成長および樹状突起からの分離である。本発明者らは、rHIgM12が1つの有意に長い神経突起を伴う神経突起伸長を促進することを観察した。ステージ3のニューロンに由来するこれらの最も長い神経突起が、軸索へと発生することをさらに検証するため、異なる基質上に播種された海馬ニューロンを、抗Tau1抗体および抗MAP2抗体で染色した図19。Tau1染色は、PDL上で成長したニューロンにおいては弱かった図19A、Dが、PDL-ラミニン図19B、EまたはrHIgM12図19C、F上に播種されたニューロンにおいてははるかに強かった。ラミニンは、ニューロン分化および軸索形成についての古典的な基質でありChenら、2009年、陽性対照として用いた。PDL上で成長したニューロンによるTau1強度図19Dを比較すると、PDL-ラミニン図19EまたはrHIgM12図19F上に播種されたニューロンにおけるTau1の分布は、最も長い神経突起の遠位部分において非対称的に濃縮され、はるかに大きかった。これに対し、MAP2は、全ての神経突起の近位部を染色した図19A2~C2。この結果は、rHIgM12上およびラミニン上の両方で成長したステージ3のニューロンに由来する最も長い神経突起が軸索であることを示した。これらの研究は、rHIgM12が複数のニューロン型に由来する神経突起成長を支持し、rHIgM12が軸索形成を駆動することを裏付ける。rHIgM12はニューロン膜のマイクロドメインのクラスター形成を誘導した基質としてのrHIgM12上で成長しつつある海馬ニューロンは、分化の増強を示した図18および19。しかし、本発明者らは、rHIgM12を培養液に適用しても、rHIgM12が神経突起成長を誘導することを観察しなかったデータは示さない。この観察は、rHIgM12は、その機能を果たすために、細胞外マトリックス分子として提示するように要請されることを示唆する。rHIgM12-ニューロン膜間相互作用をさらに理解するために、生存ニューロンを、まず、rHIgM12で処置し、次いで、固定し、それぞれ、コレステロールまたはガングリオシドであるGM1に結合する、フィリピンまたはコレラ毒素BCTBで二重染色したShogomoriおよびFuterman、2001年。rHIgM12、CTB、およびフィリピンは、非処置の対照ニューロンの細胞表面を均等に標識した図20A。これに対し、37°CのrHIgM12による処置は、30分後にニューロン膜の再組織化を誘導した図20B、C。第1に、rHIgM12は、非処置のニューロン図20A、またはニューロン膜に結合しない対照のIgM抗体で処置したニューロンデータは示さないでは観察されない、膜におけるパッチ様構造図20B1、C1へと凝集した。第2に、クラスター形成したコレステロール図20B2およびGM1図20C2のいずれもが、細胞体、神経突起軸、および成長円錐のニューロン膜において形成された。第3に、凝集したrHIgM12は、とりわけ、成長円錐の中央ドメイン図20B~C、高拡大率ではクラスター形成したが、成長円錐の末梢ではクラスター形成しなかった、コレステロール図20B3またはGM1図20C3と共局在化した。これらの結果は、液浴で適用したrHIgM12が、神経突起/軸索伸長は支持しないが、ニューロン膜の再構成を誘導することを示した。基質として提示された場合のrHIgM12は、膜分子を、rHIgM12-ニューロン膜間接触部位へと動員する結果として、方向付けのシグナル伝達を生成させうる可能性がある。脂質ラフトに結合するrHIgM12低温状態における非イオン性洗浄剤による抽出に基づく生化学的研究を用いてコレステロールおよび糖スフィンゴ脂質を含有する脂質ラフトの存在が裏付けられているChichiliおよびRodgers、2009年。しかし、ナノスケールのサイズは光学顕微鏡の解像度を超えるため、脂質ラフト内の形態的情報は限定されたものであるLingwoodおよびSimons、2010年。rHIgM12が膜のクラスター形成を誘導し、コレステロール含有膜ドメインおよびGM1含有膜ドメインと共局在化する図20ことの観察により、rHIgM12が脂質ラフトドメインと会合する可能性が立ち上がった。ニューロン膜は融点Tmが高いコレステロールおよび糖スフィンゴ脂質に富むSamsonovら、2001年ので、Tmを下回る膜温度の低下は、37°Cではより動的な脂質ラフトおよびその関連分子の可視化を促進しうる。この仮説を検証するために、生存ニューロンを4°Cまで冷却した後、rHIgM12で染色した。rHIgM12が均等に結合した、ニューロンを37°Cで固定する場合図21Aと異なり、4°Cでは、rHIgM12により、はるかに大型の点状構造が標識される。加えて、ニューロンの成長円錐も収縮した図21B。本発明者らは、脂質ラフトがコレステロール依存性の膜ドメインであり、コレステロールの枯渇によりそれらの構造が破壊されるという事実を利用したChichiliおよびRodgers、2009年。培養された海馬ニューロンを、まず、メチル-β-シクロデキストリンMβCDで処置してコレステロールを枯渇させ、次いで、4°Cまで冷却するのに続いて、固定した後、rHIgM12およびCTBで染色したKoら、2005年。コレステロールを枯渇させ、CTB標識したGM1と共局在化させた後、rHIgM12は、ニューロン膜における点状構造に結合した図21C。GM1は脂質ラフトマイクロドメイン内に常在し、rHIgM12により、GM1のクラスター形成が誘導される図20ため、本発明者らは、rHIgM12が、ニューロン膜のコレステロールからは独立するGM1含有マイクロドメインに結合することを結論付けた。これらの実験により、脂質ラフトが、膜内に均等に挿入される、異なる形態的構造として存在する図20Aおよび図21Aか、または凝集して大型のドメインを形成する図20BおよびC、図21BおよびCことが確認された。これらの結果は、rHIgM12が、他の分子との生物物理的相互作用に応じて、ラフトドメインと非ラフトドメインとの間を往復する分子複数可に結合することを示す。本発明者らはさらに、rHIgM12が脂質ラフトに結合するという仮説も調べた。脂質ラフトは、低温において、非イオン性洗浄剤耐性膜DRM内に局在化するSamsonovら、2001年ため、4°Cで調製した皮質ニューロン溶解物におけるrHIgM12の局在化を解析した。ニューロン溶解物を、抗ヒトIgM二次抗体でブロッティングしたところ、膜結合rHIgM12が、ペレットおよび上清のいずれにおいても見出されるのに対し、ニューロンに結合しない対照のIgM抗体は、洗浄溶出物だけに見出される図22Aことが明らかとなった。これらの観察は、rHIgM12が、一方は上清中の洗浄剤可溶性画分に局在化し、他方は洗浄剤不溶性ペレットと会合する、2つのプールへと分別されることを示した。第2の実験では、皮質ニューロンを、まず、rHIgM12で標識し、次いで、4°Cのスクロース密度勾配を介して画分化した。異なる画分のブロッティングは、rHIgM12が、脂質ラフトのマーカーであるカベオリン-1もまた含有する軽い画分に局在化するが、トランスフェリン受容体に富む非ラフト画分には局在化しないことを示した図22B。しかし、この厳密な画分化工程1のTritonX-100および2×105gにおける超遠心分離においてもなお、一部のrHIgM12は、主に洗浄剤不溶性細胞骨格を含有するペレット中に検出された図22B。主に洗浄剤不溶性細胞骨格を含有するチューブリンSoriceら、2009年およびアクチンLevitanおよびGooch、2007年のいずれもが存在するが、ラフト中ではβ3-チューブリンだけが検出され、アクチンの大半は、非ラフト画分へと移行した図22B。これらのデータは、一方は脂質ラフト中に存在し、他方はペレット中に存在する、膜結合rHIgM12の2つのプールの存在を示した。rHIgM12は微小管と会合する本発明者らのデータは、凝集したrHIgM12が、微小管が優越する細胞体、神経突起軸、および成長円錐の中央ドメインなどの領域図20に局在化することを示したForscherおよびSmith、1988年。膜結合rHIgM12が、これらのいずれもがβ3-チューブリンを含有する脂質ラフト画分およびペレット画分へと分別されたという事実図22Bと併せて述べると、これらの知見は、rHIgM12が、細胞骨格の構成要素複数可と会合しうることを示唆する。この仮説を検証するために、海馬ニューロンを、rHIgM12で処置して、膜の再構成を誘導し、次いで、37°Cで0.1のTritonX-100を含有する4のパラホルムアルデヒドにより同時に固定および抽出した。抽出後、rHIgM12で標識した洗浄剤不溶性膜の点が、神経突起軸に束ねられた微小管束に沿って並んだ図23A2。成長円錐では、rHIgM12が、脱束生微小管により占められる中央ドメインに主に局在化したが、F-アクチンに富む成長円錐末梢には局在化しなかった図23A3およびA4。これらの結果は、rHIgM12が微小管と会合しうることを示した。本発明者らは、rHIgM12が、GM1と共局在化することを見出した図21C。GM1は、小脳顆粒ニューロンの膜におけるチューブリンによりアンカリングされ、架橋形成後に抗チューブリン抗体によりプルダウンされることが示されたPalestiniら、2000年。したがって、rHIgM12が、チューブリンを含有する膜のマイクロドメインと会合することが可能である。この仮説をさらに検証するため、4°CでrHIgM12により処置した生存皮質ニューロンに由来する細胞溶解物により、改変プルダウン実験を実施した。本発明者らは、rHIgM12およびβ3-チューブリンの両方が、互いに共免疫沈降する図23Bことから、rHIgM12とβ3-チューブリンとが、複合体として存在すると示唆されることを見出した。IgM分子は五量体構造を有し、分子量を約900kDaとする。rHIgM12が、ニューロン溶解物中でチューブリンまたは微小管と直接会合する可能性を除外するため、rHIgM12に結合するが、β3-チューブリンを発現するN2A神経芽細胞腫細胞によりプルダウンアッセイを実施した図25A。rHIgM12は、β3-チューブリンと会合することも、ペレット中に存在することもなかった。rHIgM12は、N2A神経芽細胞腫細胞溶解物の上清だけで検出された図25B。まとめると、これらの結果により、脂質ラフトが、rHIgM12と、その抗原と、微小管との会合を媒介することが確認された。本明細書のデータは、基質として存在する場合の完全ヒト組換えIgMであるrHIgM12が、初代培養海馬ニューロンにおける軸索成長を促進することにより、ニューロンの極性化を駆動することを裏付けた図18および19。rHIgM12は、ニューロン表面に凝集し、コレステロールおよびガングリオシドであるGM1のクラスター形成を誘導した図20。rHIgM12は、GM1と共局在化する図21。スクロース勾配によるニューロン溶解物の画分化は、膜結合rHIgM12が、一方は脂質ラフトと会合し、他方はペレットと会合する2つのプールへと分別されることを示した図22。生存ニューロンを非イオン性洗浄剤で抽出することにより、本発明者らはさらに、膜結合rHIgM12が、微小管と共局在化し、β3-チューブリンと共免疫沈降することを示した図23。前出は、rHIgM12が、脂質ラフトマイクロドメインに結合し、これらと相互作用することを示し、さらに、rHIgM12会合ラフトドメインが、微小管へのシグナル伝達を担うことも示す。結果として、rHIgM12は、軸索成長を駆動する微小管の安定化を媒介する。この例は、rHIgM12が、初代海馬ニューロンの軸索成長を選択的に促進することを裏付けた図18および19。近年、本発明者らは、ヒト血清IgMであるsHIgM12が、広範な軸索変性および軸索喪失を発症する多発性硬化症の動物モデルの神経機能を改善したことを示したRodriguezら、2009年。これらの研究は、HIgM12が、軸索成長を促進することによりその機能を果たすという概念を裏付ける。ニューロンは、神経突起伸長を制御する制御された内因性のプログラムを介して軸索を特化させる。発生しつつあるニューロンは、複数の神経突起を誘発する。神経突起のうちの一方は軸索へと分化し、他方は樹状突起へと分化する。近傍の神経突起は、互いに競合し合う。また、伸長速度も最も速い神経突起である、最も長い神経突起が、まず対称的な神経突起伸長を遮断して軸索へと発生するのに対し、他の神経突起は伸長がはるかに遅く、後に樹状突起へと発生するDottiら、1988年;GoslinおよびBanker、1989年。F-アクチンと微小管とは、神経突起伸長および軸索形成に関与する2つの主要な細胞骨格である。軸索の特化についての本発明者らの理解も、伸展しつつある。主に成長円錐の末梢に局在化するF-アクチンが主要な役割を果たすと考えられていた。神経突起軸において優越し、成長円錐の中央ドメインに局限される微小管は、F-アクチンに対して二次的であると考えられていた。近年、微小管はまた、軸索成長において極めて重要な役割も果たすことが見出された。微小管は、成長円錐のアクチンメッシュワークを動的に探索することが可能である。微小管の安定化は、軸索形成を誘導するのに十分であるWitteおよびBradke、2008年。本発明者らのrHIgM12とβ3-チューブリンとが共免疫沈降したという結果、rHIgM12が微小管と共局在化したという結果、およびrHIgM12が洗浄剤による抽出後にペレット中に存在したという結果は、微小管を、中心的な役割を果たすものとして裏付けるだけではない。加えて、このデータは、当技術分野において、微小管がニューロン膜と直接相互作用することの最初の証拠ももたらした。これらの知見は、rHIgM12が、細胞外シグナルを微小管へと伝達する膜貫通カスケードと相互作用するかまたはこれに結合するという概念を裏付ける。微小管が、例えば、成長円錐において、増進および退縮する動的特性により、それらがニューロン膜の運動を駆動することが可能となるDentおよびKalil、2001年。安定化した微小管は、ニューロン膜にアンカリングする。動的微小管および安定化した微小管の存在、ならびに/またはこれらの2つの状態の間の移行により、神経突起成長が軸索を特化させる過程が組織化される。したがって、IgM12は、微小管の安定性をもたらすことにより、軸索の伸長を増強する。脂質およびタンパク質は、持続的に細胞膜へと組み込まれ、次いで、マイクロドメイン、いわゆる脂質ラフトへと分割される。膜ラフトは一般に、ステロールおよびスフィンゴ脂質で濃縮された、ナノスケール10~200nmのであり、異質で、動的な膜コンパートメントとして定義されるLingwoodおよびSimons。本発明者らは、rHIgM12が、脂質ラフトに結合することを提起する。第一に、本発明者らは、rHIgM12が、ニューロン膜に凝集し、コレステロールまたはガングリオシドであるGM1のクラスター形成を誘導することを観察した図20。これらの結果は、rHIgM12が、コレステロールおよびGM1を含有する脂質ラフトドメインに結合することを示す。低分子であるラフトは、脂質および/またはタンパク質と相互作用しうる。個別の微量のラフトは、シグナルを統合し、シグナル伝達経路の強度および振幅を制御する、高分子のプラットフォームを安定化させ、これらに融合することが可能である。五量体構造を保有するIgM抗体は、隣接する抗原受容体に架橋形成し、かつ/または抗原を架橋形成または相互作用を増強するのに十分な程度に近接させることにより、シグナルを増幅しうる。したがって、架橋された抗原および会合したシグナル伝達分子は、クラスター形成しうる。第二に、本発明者らは、海馬ニューロンを4°Cまで冷却したところ、rHIgM12が、ニューロン膜上のはるかに大型の斑点に結合することを示した図21。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は、融点が高いTm。Tmを下回る温度においてニューロンを処置すると膜の動態が減殺され、これにより、凝集した脂質ラフトの可視化が促進される。rHIgM12が、コレステロールを枯渇させた後においてもなおGM1と共局在化するという知見図21と併せると、これらの結果は、rHIgM12が、GM1と共局在化するニューロン膜の分子に結合し、これらと相互作用することを示唆する。培養されたラット小脳顆粒ニューロンをシアリダーゼ処置するとsHIgM12の結合が消失するという本発明者らによる以前の知見は、sHIgM12が結合したエピトープが炭水化物であることを示唆するが、正確な識別は明らかでないWarringtonら、2004年。第三に、ニューロン溶解物をスクロースにより画分化した後、膜結合rHIgM12は、脂質ラフトマーカーであるカベオリン-1もまた含有する軽い画分へと局在化した。まとめると、本発明者らの結果は、rHIgM12が脂質ラフトに結合するという仮説を裏付ける。ニューロン膜の外葉から細胞内の細胞骨格へのシグナルカスケードは、軸索の特化にとって中心的である。rHIgM12の凝集物は、微小管が優越し、線維状アクチンは優越しない図23、神経突起軸および成長円錐の中央ドメインへと分配された図20。rHIgM12の凝集物の一部は、洗浄剤不溶性であり、洗浄剤による抽出の後、束生微小管の束に局在化した図23A。これらの観察は、脂質ラフトと会合するプールとは異なりうる、rHIgM12結合分子の別のプールの存在を示す。スクロース画分化研究により、洗浄剤不溶性ペレット中に局在化するrHIgM12会合分子のプールが存在し図22B、これは、図23Aで検出された微小管と共に局在化するプールでありうることがさらに確認された。これらの結果は、rHIgM12のうちの一部が、細胞骨格成分複数可、おそらくは微小管と会合することを裏付けた。上清中の洗浄剤可溶性分子と会合する図22Aおよび図23BrHIgM12が、β3-チューブリンとも共免疫沈降した図23Bという知見は、rHIgM12結合分子複数可と、β3-チューブリンとが、脂質ラフト中に複合体として存在しうることを示す。しかし、rHIgM12が結合しないN2A神経芽細胞腫細胞において、rHIgM12は、β3-チューブリンをプルダウンしなかった図25ため、rHIgM12が、β3-チューブリンと直接相互作用することは可能ではない。したがって、細胞骨格および脂質ラフトの両方に会合するrHIgM12は、チューブリンの近傍に局在化する分子に結合する。この概念は、rHIgM12が、GM1と共局在化するという観察図21C、およびGM1が架橋形成反応後において抗チューブリン抗体によりプルダウンされたという観察によりさらに強化されたPalestiniら、2000年。脂質ラフトドメイン内のrHIgM12結合分子は、神経突起成長過程および軸索伸長過程の間常に細胞骨格へと組み込まれうる。この仮説は、rHIgM12が、成長円錐領域では中央ドメインに凝集し図3および6A、37°Cで洗浄剤不溶性であった図23Aという知見により裏付けられる。まとめると、HIgM12は、HIgM12から微小管へのシグナル伝達を媒介する脂質ラフトに結合し、この動態に影響を及ぼすことが開示される。F-アクチンがrHIgM12誘導性シグナル伝達に関与するかどうかは明らかでない。アクチンおよびアクチン結合タンパク質の両方が、脂質ラフトと会合することを示す筋の証拠は多いLevitanおよびGooch、2007年。アクチン線維と微小管とは、ニューロンもまた包含する協調的な細胞運動において活発に相互作用するRodriguezら、2003年。したがって、アクチンはまた、rHIgM12誘導性シグナル伝達において役割を果たすことも可能である。β3-チューブリンと共に、少量のアクチンが、rHIgM12によりプルダウンされた図26B。したがって、rHIgM12は、アクチンおよびβ3-チューブリンの両方を含有する脂質ラフトに結合する。しかし、ニューロンを4°Cで処理したところ、rHIgM12で標識された点が成長円錐の最外縁部にとどまったのに対し、F-アクチンのネットワークは成長円錐の末梢から収縮した図26A。スクロース勾配による画分化の後、アクチンは主にラフト以外の画分に局在化し、洗浄剤不溶性ペレット中には少量のアクチンだけが検出された図22B。これらの観察は、F-アクチンが極めて動的であり、低温状態において、かつ/または洗浄剤抽出を介して、その大半が脱重合化することを示す。したがって、アクチンが、rHIgM12を介するシグナル伝達に関与しうる。本発明者らは、ヒトIgMであるrHIgM12が、脂質ラフトに結合し、これらを認識すること、および微小管が下流の標的のうちの1つであることを結論付ける。rHIgM12は、基質として提示される場合に限り、軸索の伸長を促進する。基質としてのrHIgM12を固定化し、そのニューロン膜との相互作用に制約した。モルフォゲン誘導性シグナル伝達においてしばしば観察される通り、固定化されたrHIgM12は、ニューロン膜にわたりシグナル勾配を創出した可能性があるSchmittら、2006年。これに対し、液浴によるrHIgM12の適用は、脂質ラフトのランダムなクラスター形成図20を促進しうるに過ぎず、対称的な神経突起成長を遮断し、軸索の伸長を増強するのに十分ではありえない。略述すると、本発明者らの結果は、図24で提起したモデルを裏付ける。ニューロン膜は、両方ラフトラフトマイクロドメインおよび非ラフトマイクロドメインを含有する。ラフトドメインの2つのプールが存在し、それらのうちの1つは微小管と会合する図24A。2rHIgM12は、ラフトドメインに結合し、クラスター形成させ、これにより、微小管の安定化および膜へのアンカリングが促進される図24B。3成長円錐では、rHIgM12により誘導されたラフトのクラスター形成が、成長円錐の末梢の中央ドメインへの移行、軸索形成を特化させる対称的な神経突起成長の遮断を増強しうる図24C。実施例12脊髄損傷に有益なヒトモノクローナル抗体についてのナノ細孔光学バイオセンサーアッセイ脊髄損傷SCI後における軸索の保護および修復は、運動ニューロンの喪失および永続的な身体障害を防止するのに有効な戦略としての大きな可能性を保持する。ニューロンの保護は、傷害後における軸索の損傷を防止し、軸索の修復を促進するために標的化される栄養因子を用いて達成されている。これらの分子は主に、特異的な低分子である神経栄養因子の標的化に焦点を当てるinvitro系に基づく選択戦略を用いて同定された。天然の自己反応性モノクローナル抗体は、損傷および疾患の複数のモデルを用いて、CNS細胞における有益な生物学的機能を裏付けている。抗体を介するニューロン生存の促進、軸索の再生、および機能回復が、マウスモノクローナルIgMであるIN-1を用いて、invivoにおいて裏付けられているBregman、1995年;CaroniおよびSchwab、1988年。同様の結果が、CNS損傷に先立つ脊髄ホモジネートSCHの免疫化を用いて得られたEllezam、2003年;Huang、1999年。IgM12および再ミエリン化抗体IgM22を含めたニューロン結合ヒト抗体による本発明者らのデータに基づき、ニューロン生存および機能を促進することにより軸索を損傷から保護し、SCIなどのCNSの損傷および/または疾患を処置するのに有益なヒトモノクローナル抗体の相互作用が、病理学的/生理学的状態下における表面の細胞質膜タンパク質-脂質二重層間相互作用に依存することが開示される。神経傷害または損傷例えば、SCIにおける後においてニューロンの生存を促進するか、またはニューロンを傷害または死滅から保護する結果として、各症例において神経機能の保存をもたらすヒト抗体を、病理学的/生理学的表面の細胞質膜タンパク質-脂質二重層を維持する技法を用いて評価し、特徴付け、かつ/または同定した。本研究において、本発明者らは、タンパク質-脂質二重層表面プラズモン共鳴SPRセンサーを用いて、表面におけるヒトモノクローナル抗体の結合相互作用の反応速度を決定する。ヒトモノクローナル抗体は、脊髄損傷後における齧歯動物に由来するexvivoの組織切片の脊髄病変における結合を用いて特徴付けるかまたは同定する。次に、齧歯動物の脊髄挫滅損傷モデルを用いて、ヒト抗体が、invivoにおいてニューロンの生存、神経突起伸長、または再ミエリン化を促進する結果として、病態を軽減し、神経機能を改善する能力をさらに評価する。新規のSPR脂質二重層センサーは、表面のタンパク質-脂質間における、有益なヒトIgM抗体の結合反応速度および結合アフィニティーの特徴付けを可能とする迅速な無標識法を提供する。この表面プラズモン共鳴SPRセンサー法は、生理学的な平面的脂質二重層と組み合わせた金属膜における周期的なナノ細孔アレイに基づき開発された。SPR法は、迅速な無標識によるIgM抗体の関与性の抗原との結合反応速度および結合アフィニティーの特徴付けを可能とした。小さな差異を定量化するのに重要な結合反応速度は、開発時におけるリード分子を選択する根拠がもたらし、invivoにおける治療用分子の用量および効力のいずれに対しても影響を及ぼす。SPRは、業界環境および研究環境で標準的な方法として受容されており、これにより、典型的には、可溶性結合パートナー対の間の分子的相互作用が特徴付けられる。しかし、この技法は、膜結合抗原の必要に適合し始めたばかりである。SPRセンシングにおいて用いられる金基質は、脂質膜を支持して形成するのには適さない。さらに、金表面と直接接触する膜タンパク質は、それらの機能性を喪失することが多い。しかし、周期的なナノ細孔アレイで穿通された金薄膜を用いる新規のナノ細孔センシング構築法の開発は、これらの難題を克服している例えば、図27を参照されたい。各ナノ細孔は、ガラス製の基質上に配置され、微小なウェルを形成して、支持される脂質膜を閉じ込める一方、周囲の金膜は、SPR効果をもたらして、分子の膜への結合を動的にモニタリングする図27B。力学的安定性を維持し、両面を緩衝液に取り囲ませながら、ナノ細孔上に薄い脂質二重層を懸濁させうるので、金膜に圧し延ばされたナノ細孔アレイにより、固有の形状がもたらされる図27B。これにより、膜タンパク質を、金によるナノ細孔アレイのSPRセンシング能と継ぎ目なく統合することができ、これにより、それらの天然状態をより緊密に模倣する環境におけるそれらの機能性が維持される。さらに、自立的な脂質二重層に組み込まれた膜タンパク質は、両面からの接近が容易となりうることが、この手法を、細胞表面における抗原-抗体間結合が、結果として細胞シグナル伝達をもたらす機構を研究するのにより魅力的なものとしている図27B。このSPR脂質二重層センサーは、表面のタンパク質-脂質間における、治療用ヒトIgM抗体の結合反応速度および結合アフィニティーを評価し、同定し、特徴付けるのに用いられる迅速な無標識法を提供する。このセンサープラットフォームは、脊髄損傷の動物モデルにおける試験ために、表面のタンパク質-脂質間における、治療用ヒトIgM抗体の結合反応速度および結合アフィニティーを特徴付ける。本発明者らは、小脳組織およびCNS内の細胞の固定されない生存表面への結合を介して同定される特定のIgM抗体を広範に特徴付けた。これらのIgM抗体IgM22およびIgM46により例示されるは、invitroにおいてカルシウム流を刺激し、invivoにおいて再ミエリン化を促進した。同じ基準に基づき、MayoClinicにおけるタンパク異常血症の血清バンク試料をスクリーニングすることにより、ヒト抗体が同定されている。さらなるヒトIgM抗体本明細書では、IgM12およびIgM42により例示されるは、invitroにおいてニューロンの表面に結合し、神経突起成長を促進し、ニューロンの死滅を防止した。CNS損傷およびCNS疾患についての複数のマウスモデルに由来する、固定されていない生存皮質切片を用いたところ、ニューロン結合抗体は、特定のCNS細胞に対する特異的免疫反応性、損傷の構造、および疾患の病態を呈示した。天然のヒトモノクローナル抗体は、損傷および疾患についての複数のモデルに由来するCNS細胞において有益な生物学的機能を強化することが示されている。ヒトモノクローナル抗体は、小脳ニューロン、皮質ニューロン、網膜神経節ニューロン、および脊髄ニューロンを含めた培養物中の多種多様なニューロンの表面に結合する例として挙げると、ヒト抗体IgM12およびIgM42。これらの抗体は、CNSニューロンからの神経突起伸長を誘導し図28、CNSミエリンの神経突起成長に対する阻害を凌駕するWarringtonら、2004年。invitroにおける研究は、ヒトモノクローナル抗体の、ニューロン表面の細胞膜への結合を裏付けている。特徴的な結合が0°Cで均一となるのに対し、表面の再構成形態である点状構造は15°Cで均一となる図29。細胞表面における結合は、シグナルカスケードを誘発するシグナル伝達分子と会合してクラスター形成する膜のマイクロドメインに特徴的であるHoweら、2004年。ヒトモノクローナル抗体は、脊髄組織に入り、静脈内投与の4時間後に損傷部位に蓄積される図30。ビブラトームによる脊髄切片に対して実施する免疫細胞化学により、ニューロン結合抗体を投与した後の病変内にはヒトIgMが検出されるが、対照のヒトIgMを投与した後の病変内にはヒトIgMが検出されない。慢性脊髄疾患を伴うマウスTMEV感染マウスに、腹腔内を介してsHIgM420.5mgを施し、4時間後に脊髄を摘出し、脊髄断面におけるヒトIgMの存在を検出した図30。sHIgM42を施されたマウスに由来する脊髄の損傷領域は、蛍光タグ付けした抗ヒトIgMに結合する並列線維を示す図30A。対照のヒトIgMを施されたマウスに由来する脊髄の損傷領域は、ヒトIgMを含有しない図30B。ヒトモノクローナル抗体は、MayoClinicのタンパク異常血症血清バンクに由来する試料をスクリーニングするための生物学的機能アッセイを用いて同定した。40年間にわたり収集された115,000例の血清試料は、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う患者に由来する高濃度のモノクローナル抗体を含有する。本発明者らは、動物モデルにおいて再ミエリン化促進活性を有する組換えヒトIgM22Mitsunaga、2002年;Warrington、2000年を合成し、調べた。一実施形態では、本実施例により、ヒトSCIまたはCNSのニューロンを露出させる脱髄性状態などの神経変性状態、神経傷害および/または損傷における治療適用、予後診断適用、診断適用、および/または予防適用に有用なGMP品質のモノクローナル抗体を生成させる。これらの研究はさらに、外傷性SCI後においてニューロンの生存を促進する結果として、神経機能の保存をもたらすヒトIgM抗体も特徴付けて評価する。SCI後における行動学的試験および軸索数の形態的測定を評価し、神経機能の内因性保存と神経機能の抗体を介する保存との差異を決定する。SCI後において抗体対照と比較した軸索保護抗体および軸索伸長抗体による処置を用いて、神経機能保存の差異を、特異的抗体を介する活性について特徴付ける。細胞膜タンパク質-脂質二重層を含有する膜小胞を、生理学的条件下で細胞から単離する。SPRセンサーのナノ細孔を、正常CNSおよび脊髄損傷組織から単離されたニューロン、神経膠、シナプトソーム、およびミエリン膜の微小胞調製物を用いてコーティングする。ヒトモノクローナル抗体血清試料および組換え抗体試料をスクリーニングして、特定の膜の種類の結合反応速度を決定する。SPRセンサーを用いて確認される通り、生理学的条件下で、凍結されず固定されていない生存細胞および生存組織表面の細胞膜に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を、SCI後における、凍結されず固定されない病理学的生存組織を用いて、特異的結合について調べる。脊髄病変への結合を裏付けるヒトモノクローナル抗体を、齧歯動物のSCI後の処置における適用可能性および活性についてさらに特徴付ける。プロトコールデザイン:改変動脈瘤クリップFEJOTAマウスクリップ:閉止力を3gまたは8gとするを用いて、10週齢の雌18~22gC57BL/6JマウスJacksonLaboratoriesのT9レベルにおいて圧迫損傷を生成させる。このSCIモデルは、初期影響だけでなく、小球性microcysticキャビテーション、軸索変性、および頑強なアストログリオーシス、ヒト外傷性SCIの全ての顕徴を促進する持続的な圧迫期も包含するJoshiおよびFehlings2002年。ラット用のBasso,Beattie,BresnahanBBB運動評価スケール、および運動のBassoマウススケールBMSを用いて、行動学的試験を決定して、SCI後における神経欠損を評価する。図31に技法を示す。次いで、凍結させず、固定させていないexvivoの生存組織切片を、齧歯動物における脊髄圧迫損傷後における病理学的病変から調製する。生理学的条件下で維持した切片に対する免疫蛍光IF染色を用いて、ヒトIgM抗体結合の免疫反応性をスクリーニングする。脊髄圧迫損傷後迅速に、マウスを、腹腔内投与されるrHIgM12およびsHIgM42またはrHIgM42を含めたヒト抗体で処置する。ヒト抗体が軸索保存または組織修復を促進する能力を測定する。BBBスケールおよびBMSスケールを用いる行動学的試験を、SCI後の5週間において定期的な間隔で実施する。SCIの30分後に、ヒト抗体0.5mgの単回投与を、腹腔内を介してマウスに施す。マウスの群15匹のマウスに、ニューロン保護、神経突起成長を促進するヒト抗体、細胞に結合しない対照のヒト抗体、または対照を施す。個別のマウスを毎週1回一晩にわたり自動式赤外線活動ボックスに収容しMikamiら、2002年、後肢を引きずる身体障害の尺度である後肢による自発的立脚と水平方向の活動とを記録したAccuscanInc、Ohio。また、従来のBBBスコアも毎週収集した。機能的評価は、盲検により実施する。処置の4週間後、Fluoro-GoldおよびFastBlueを、マウス4匹の胸部下方の脊髄へと注射する。1週間後、マウスを潅流し、脳および脊髄を摘出する。脳幹の網様核、前庭神経核、および赤核において逆行標識された細胞体を、蛍光顕微鏡を介して群を通してカウントするUreおよびRodriguez、2002年。脳幹ビブラトーム切片内で標識された細胞体の数は、脊髄全体における機能的軸索のレベルを反映する。脊髄に沿って1mmごとに採取した組織断面において、βアミロイドタンパク質の蓄積についての免疫細胞化学を実施する。切片中のβアミロイド凝集物の数は、胸部下方において機能障害を来した軸索輸送、および胸部下方における軸索の機能不全を反映する。損傷の5週間後、残りのマウスをホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドgluteraldehydeで潅流し、脊髄を摘出した。脊髄病変部位を含む1mmのブロックを1つおきにAralditeプラスチック中に包埋し、切片化1ミクロンし、パラフェニレンで染色して、ミエリンにより取り囲まれて保存された軸索を可視化した。MicrosuiteソフトウェアOlympusを用いて、病変領域の断面、保存された軸索数、および病変への免疫細胞浸潤を測定する。軸索の頻度を測定し、群間で比較したMcGavernら、2000年;Rodriguezら、1987年。全ての解析は、実験群について知らされずに、コード化および盲検化された試料について行う。保存された軸索は、病変1mm2当たりの保存された軸索数として表す。実験群間および対照群間におけるデータの対比較では、マン-ホイットニーランクサム検定を用いる。実施例13多発性硬化症モデル:用量反応評価IgM抗体を、それらがマウスの多発性硬化症モデルにおいて機能的改善を促進し、再ミエリン化過程、神経突起成長過程、またはこれらの両方の過程を増強する能力について評価する。モデルは、Warringtonら、2007年と同様の方法を用いてヒトMSにおいて見出される病変と同様の特徴を伴う、CNSの遷延性、慢性で進行性の脱髄性病変を誘導する、ピコルナウイルスのサイラーマウス脳脊髄炎ウイルスTMEVの使用を伴う。雌マウスおよび雄マウス約8週齢:SJL/J株に、サイラーマウス脳脊髄炎ウイルス2×105プラーク形成単位のDaniel株:10μLの脳室内注射を注射する。処置のための無作為化の前に、マウスを6カ月間にわたり回復させる。次いで、マウスを、被毛状態、歩行、および立ち直り反射について観察し、処置群へと無作為に割り付ける処置表に示す。次いで、マウスを、ビヒクル通常の生理食塩液または組換えヒトIgM抗体0.025~2.5mg/kgの単回静脈内注射で処置する。神経機能を、処置の2週間後、1カ月後、および2カ月後にモニタリングする。機能的評価項目は、被毛状態、歩行、およびロータロッド能力に基づく評価を包含した。被毛外観については、評価を以下の通り:疾患なし0、最小の被毛変化1、つやのない被毛2、失禁および被毛浸潤3とする。活動の変化は、自動式活動ボックスにより定量化する。さらに、歩行は、歩行速度>90cm/秒を用いるディジタル式の歩行捕捉法DigiGaitを用いて解析する。定量的な歩行解析評価項目は、立幅および持続時間、歩幅および頻度、足の角度のほか、揺れ、制動および推進の持続時間を包含する。歩行のベースラインからの変化を定量化する。ロータロッド能力回転軸上の速度および持続時間との関係で運動を測定する回転軸上を動物が歩く能力を介して、感覚および平衡調整の尺度を評価するは、動物が一連の試行にわたり回転装置上にとどまる時間の合計として定量化する。実験が終了したら、動物を、CO2への過剰曝露を介して安楽死させる。1髄鞘形成の程度プラスチック包埋してパラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドで固定してオスミウム処置した組織の、電子顕微鏡による解析および2神経突起成長立体評価法を介する神経突起密度の評価を評価するために、脳および脊髄を摘出する。第1の実施形態では、組換えヒト抗体を、表3Aおよび表3Bに示す3つの用量レベルにおいて単独で投与する。Xは改善を示し、Xは一層の改善を示し、Xはなお一層の改善を示す。改善スコアの値は、所与の抗体の用量と関係する。したがって、Xを、その同じ抗体についてXより大きな改善とする。1つの抗体についての改善Xは、他の抗体についてのX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではない。この実施例では、組換え抗体であるIgM12、IgM42、IgM22、およびIgM46の各々が、被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目の各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意でp<0.05用量依存的な改善をもたらすことが見出される。ビヒクルで処置される動物は、TMEV損傷の6カ月間以内に、被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目における安定的な欠損をもたらす。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時の感覚運動の評価項目における改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときの感覚運動の評価項目におけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときの感覚運動の評価項目におけるなおより大きな改善Xを伴う、感覚運動の評価項目における有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。したがって、抗体IgM12、IgM42、IgM22、およびIgM46の各々は、被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について:p<0.05で用量依存的な改善をもたらす。性別に基づく改善の差は見出されない。この実施例では、IgM12およびIgM42が、立体法を介してビヒクルによる処置の対照と比較して評価した、TMEV感染マウスに由来する脳切片および脊髄切片における神経突起成長の統計学的に有意で用量依存的な増大をもたらすことが見出される。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時の神経突起成長における改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときの神経突起成長におけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときの神経突起成長におけるなおより大きな増大Xを伴う、神経突起成長の有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。IgM22およびIgM46は、立体法を介してビヒクルによる処置の対照と比較して評価した、TMEV感染マウスに由来する脳切片および脊髄切片における再ミエリン化の統計学的に有意で用量依存的な増大をもたらすことが見出される。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時の再ミエリン化における改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときの再ミエリン化におけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときの再ミエリン化におけるなおより大きな増大Xを伴う、再ミエリン化の有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。実施例14多発性硬化症モデル:抗体の組合せこの実験では、用量比を固定した組換えIgM抗体の多様な組合せを、前出の例で記載したMSのTMEVモデルにおける神経学的転帰の改善について検討する。TMEVへの曝露の6カ月後、マウスにおける組換えIgMの組合せによる処置を開始する。この一連の研究では、マウスに単独のビヒクルまたはIgMの多様な組合せを静脈内単回投与混合剤により施す。上記の通りに、感覚運動の評価項目をモニタリングする。髄鞘形成および神経突起成長を評価して、抗体の組合せによりもたらされる変化を検討する。評価される組合せを表4Aおよび表4Bに示す。Xは改善を示し、Xは一層の改善を示し、Xはなお一層の改善を示す。改善スコアの値は、所与の抗体の用量と関係する。したがって、Xを、その同じ抗体についてXより大きな改善とする。1つの抗体についての改善Xは、他の抗体についてのX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではない。この実施例では、組換え抗体の組合せであるIgM12IgM42、IgM22IgM46、IgM12IgM22、IgM12IgM46、IgM42IgM22、およびIgM42IgM46が、被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらす。性別に基づく改善の差は見出されない。さらに、これらの組合せの各々による感覚運動の評価項目の改善度は、抗体の各々単独により予測される相加的改善と比較して統計学的に有意で用量依存的な形で相乗的相乗作用が呈示されるである。ここでもまた、性別に基づく改善の差は見出されない。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM42の組合せは、神経突起成長を、ビヒクルによる対照と比較して有意にp<0.05増強した。神経突起成長度は、単独で投与される各抗体の相加的効果と比較して相乗的である。したがって、これらの抗体は、異なる作用機構を介して成長を誘発し、これは、これらの抗体の神経組織へのそれぞれに異なる結合パターンと符合することが理解される。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM22IgM46の組合せは、髄鞘形成を、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらした。さらに、再ミエリン化度は、単独で投与されるIgM22またはIgM46について予測される相加的効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM22の組合せは、損傷している脊髄における髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM12またはIgM22それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM46の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM12またはIgM46それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM22IgM42の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM22またはIgM42それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM46IgM42の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM46またはIgM42それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。実施例15脊髄損傷モデルIgM抗体を、それらがラットの脊髄損傷モデルにおいて機能的改善を促進し、再ミエリン化過程、神経突起成長過程、またはこれらの両方の過程を増強する能力について評価する。モデルは、脊髄を、幅を2.5mmとするカバースリップ用ピンセットを改変したブレードの間で側方から、あらかじめ設定したブレード間隔である0.9mmまで、15秒間にわたり圧迫することを伴う。結果として得られる病変は、ヒトSCIにおいて見出される特徴と同様の特徴を示すGrunerら、1995年。雄ラットおよび雌ラット約200~225g、LongEvansに手術を施して、上記の脊髄損傷をもたらす。手術の10分後、組換えIgM抗体またはビヒクルによる処置を、静脈内を介して施す。BBB運動評価スケールを用いて、後肢における運動機能および歩行を12週間にわたり評価する例えば、BassoDM、BeattieMS、BresnahanJC、AndersonDK、FadenAI、GrunerJA、HolfordTR、HsuCY、NobleLJ、NockelsR、PerotPL、SalzmanSK、YoungW.1996年、MASCISevaluationofopenfieldlocomotorscores:Effectsofexperienceandteamworkonreliability、JournalofNeurotrauma、13巻:343~359頁;BassoDM、BeattieMS、BresnahanJC.1995年、Asensitiveandreliablelocomotorratingscaleforopenfieldtestinginrats、JournalofNeurotrauma、12巻:1~21頁を参照されたい。ラットを、1、3、5、7、および10日後に調べ、次いで、SCI後9~12週間にわたり毎週、ベースラインからのBBB変化を定量化する。実験が終了したら、動物を、CO2への過剰曝露を介して安楽死させる。1髄鞘形成の程度プラスチック包埋してパラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドで固定してオスミウム処置した組織の、電子顕微鏡による解析および2神経突起成長立体評価法を介する神経突起密度の評価を評価するために、脳および脊髄を摘出する。実施例16脊髄損傷モデルにおける個別の抗体の使用この実験では、組換えヒト抗体を、表5Aおよび表5Bに示す通り、3つの用量レベルにおいて単独で投与する。Xは改善を示し、Xは一層の改善を示し、Xはなお一層の改善を示す。改善スコアの値は、所与の抗体の用量と関係する。したがって、Xを、その同じ抗体についてXより大きな改善とする。1つの抗体についての改善Xは、他の抗体についてのX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではない。この実施例では、改良型BBBパラメータにより、組換え抗体であるIgM12、IgM42、IgM22、およびIgM46の各々が、後肢における運動機能の、統計学的に有意で各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05用量依存的な改善をもたらすことが見出される。ビヒクルで処置される動物は、中等度レベルの脊髄損傷の6週間以内に、安定的なBBBスコアをもたらす。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時のBBBレベルにおける改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときのBBBにおけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときのBBBにおけるなおより大きな改善Xを伴う、BBBスコアにおける有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。したがって、改良型BBBにより、抗体IgM12、IgM42、IgM22、およびIgM46の各々は、後肢における運動機能の、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目についてp<0.05で用量依存的な改善をもたらす。性別に基づく改善の差は見出されない。IgM12およびIgM42が、立体法を介してビヒクルによる処置の対照と比較して評価した、TMEV感染マウスに由来する脳切片および脊髄切片における神経突起成長の統計学的に有意で用量依存的な増大をもたらすことが見出される。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時の神経突起成長における改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときの神経突起成長におけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときの神経突起成長におけるなおより大きな増大Xを伴う、神経突起成長の有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。IgM22およびIgM46は、立体法を介してビヒクルによる処置の対照と比較して評価した、TMEV感染マウスに由来する脳切片および脊髄切片における再ミエリン化の統計学的に有意で用量依存的な増大をもたらすことが見出される。各抗体について、0.025~2.5mg/kgの用量範囲にわたり、低用量時の再ミエリン化における改善Xの増大、用量を0.25mg/kgとするときの再ミエリン化におけるより大きな改善Xの増大、および用量を2.5mg/kgとするときの再ミエリン化におけるなおより大きな増大Xを伴う、再ミエリン化の有意で用量依存的な変化[評価中、Xを改善とする]が見出される。この傾向は、動物を12匹とする群サイズについて、検出力0.8のレベルおよび0.05のアルファレベルで観察される。実施例17脊髄損傷:抗体の組合せこの実施例では、用量比を固定した組換えIgM抗体の多様な組合せを、本明細書の実施例14で記載した脊髄損傷モデルにおける神経学的転帰の改善について検討する。したがって、IgM抗体の組合せ混合剤としてまたはビヒクル対照による静脈内処置を、損傷の10分後に施す。運動評価項目を、上記の通りにモニタリングする。さらに、髄鞘形成および神経突起成長を評価して、抗体の組合せによりもたらされる変化を検討する。評価した組合せを、表6Aおよび表6Bに示す。Xは改善を示し、Xは一層の改善を示し、Xはなお一層の改善を示す。改善スコアの値は、所与の抗体の用量と関係する。したがって、Xを、その同じ抗体についてXより大きな改善とする。1つの抗体についての改善Xは、他の抗体についてのX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではなく、1つの抗体のX値は、他の抗体のX値と必ずしも同じではない。この実験では、組換え抗体の組合せであるIgM12IgM42、IgM22IgM46、IgM12IgM22、IgM12IgM46、IgM42IgM22、およびIgM42IgM46の各々が、BBBパラメータを介して見出される後肢機能運動評価項目の統計学的に有意で用量依存的な改善をもたらすことが見出される。性別に基づく改善の差は見出されない。さらに、これらの組合せの各々は、運動機能を、同じ用量における抗体の各々単独による改善と比較して相加的を超えるすなわち、相乗的な形で改善することが見出される。ここでもまた、性別に基づく改善の差は見出されない。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM42の組合せは、神経突起成長を、ビヒクルによる対照と比較して有意にp<0.05増強した。神経突起成長度は、単独で投与される各抗体の相加的効果と比較して相乗的である。したがって、これらの抗体は、異なる作用機構を介して成長を誘発し、これは、これらの抗体の神経組織へのそれぞれに異なる結合パターンと符合することが理解される。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM22IgM46の組合せは、髄鞘形成の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらした。さらに、再ミエリン化度は、単独で投与されるIgM22またはIgM46について予測される相加的効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM22の組合せは、損傷している脊髄における髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM12またはIgM22それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM12IgM46の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM12またはIgM46それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM22IgM42の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM22またはIgM42それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。被毛状態、歩行パラメータ、およびロータロッドスコアを含めた多様な感覚運動の評価項目において、ビヒクルによる処置と比較して統計学的に有意各評価項目について、ビヒクルによる処置と比較して:p<0.05で用量依存的な改善をもたらすことに加えて、IgM46IgM42の組合せは、髄鞘形成ならびにニューロン成長の、ビヒクルによる処置の対照と比較して有意なp<0.05増大をもたらす。さらに、ニューロン成長および再ミエリン化の程度は、この例で用いられる用量において単独で投与されるIgM46またはIgM42それぞれの効果と比較して相乗的である。理論に束縛されずに述べると、これは傍分泌活性の結果であると理解される。したがって、成長しつつあるニューロンおよび成長しつつある希突起膠細胞の各々が存在する場合、これらの細胞は、それぞれ、評価される他の細胞型に正の影響を及ぼす傍分泌生成を誘発する。実施例18ヒトニューロン結合IgMである組換えrHIgM12抗体は脊髄軸索を保護する本発明者らは、天然ヒト血清抗体であるsHIgM12が、invitroにおいてニューロンに結合し、神経突起成長を促進することを裏付けた。本発明者らは、同一の特性を伴う組換え形態であるrHIgM12を生成させた。サイラーマウス脳脊髄炎ウイルスTMEVによる感受性マウス株の脳内感染は、多発性硬化症の進行性の形態と同様の進行性の軸索喪失および神経機能不全を伴う慢性脱髄性疾患を引き起こす。このモデルを、希突起膠細胞に結合するIgMクラスの抗体で処置すると、CNSの再ミエリン化が改善されるWarringtonら2007年、JNeurosciRes、85巻:967~976頁。これに対し、ニューロンに結合する血清由来のヒトモノクローナル抗体sHIgM12は、ラミニンと同程度に頑健な神経突起成長を促進し、CNSミエリンの神経突起成長に対する阻害効果を低減するWarringtonら2004年、JNeuropatholExpNeurol、63巻5号:461~473頁。より近年には、上記と同一の生物学的特性を伴うヒトsHIgM12の組換え形態rHIgM12を生成させた。rHIgM12の脊髄軸索の完全性に対する効果を研究するために、本発明者らは、解剖学的に連続であり、機能的に保存された軸索に依拠する技法である逆行標識法を実施した。方法逆行標識法:マウスに麻酔をかけた後、下部胸椎T10~11において背部椎弓切除を実施した。脊髄を右側において片側切断し、片側切断部位に4Fluorogoldの滅菌溶液を充填した。手術の1週間後、マウスを屠殺し、脳を摘出した。脳幹の連続切片40mm厚を作製し、切片を4枚ごとに解析した。16枚の脳幹スライスから、大型で明るい蛍光ニューロンを、200倍の拡大率下でカウントした。結果TMEVモデルは、神経保護を促進し、軸索喪失を防止する戦略を開発するためのプラットフォームをもたらす。疾患の早期は炎症および脱髄を包含し、後期は軸索喪失および機能欠損を提示する。前出例で詳述し、共焦点顕微鏡画像図15を介して確認される通り、1mgの単回腹腔内注射の後、rHIgM12は脊髄に入り、ニューロフィラメントNFの軸索に局在化する。rHIgM12はまた、クロスカット形としてNF神経線維束にも共局在化する図15D。動物研究では、rHIgM12が、逆行標識した脳幹ニューロン数を増大させる。感染の90日後dpiに、rHIgM12または生理食塩液をSJLマウスに投与した。処置の9週間後に、逆行標識法のための脊髄手術を実施した。手術の1週間後、マウスを屠殺し、脳幹の連続切片により、蛍光標識したニューロンを定量化した。rHIgM12は、生理食塩液対照と比較して逆行標識した脳幹ニューロン数を増大させるデータは示さない。したがって、rHIgM12で処置したマウスの逆行標識した脳幹ニューロンは、生理食塩液で処置した対照と比較して増大した。実施例19ニューロン結合ヒトモノクローナル抗体の単回投与はマウス脱髄モデルにおける自発活動を改善する本発明者らの実験室は、天然ヒト血清抗体であるsHIgM12が、invitroにおいてニューロンに結合し、神経突起成長を促進することを裏付けた。本発明者らは、同一の特性を伴う組換え形態であるrHIgM12を生成させた。サイラーマウス脳脊髄炎ウイルスTMEVによる感受性マウス株の脳内感染は、結果として、多発性硬化症の進行性の形態と同様の進行性の軸索喪失および神経機能不全を伴う慢性脱髄性疾患をもたらす。rHIgM12のTMEV感染マウスの運動機能に対する効果を研究するため、本発明者らは、夜間における自発活動を、何週間にもわたってモニタリングした。通常は活動的な夜間のモニタリング時間において最大限の活動変化が生じることが予測されるため、夜間挙動は、齧歯動物の神経機能についての高感度の尺度である。ベースラインの自発活動についてまとめるため、マウスを、処置前に8日間にわたり活動ボックスに入れた。処置後、各群における活動を8週間にわたり持続的に記録した。本発明者らは、以下の2つの理由で8週間にわたる長期のモニタリング期間を選択した:1本発明者らは既に、IgM誘導性再ミエリン化が、処置後5週間までに示されると裏付けたこと、および2この株におけるTMEV誘導性脱髄性疾患の進行は極めて遅いこと。長期の観察期間および大規模なデータセットに起因して、フィルタリングされていない元の記録を研究しながら、処置群間の差異を察知することは困難でありうる。高度に変動的な元のデータにおける変化を明確に詳述するために、本発明者らは、3つの異なる方法:1ビニング法、2ガウスローパスフィルターGFの適用、および3多項式近似を適用した。3つの方法の各々を用いて、本発明者らは、rHIgM12による早期の処置が、水平方向の運動機能および垂直方向の運動機能のいずれにおいても、対照のIgMおよび生理食塩液と比較して改善を誘導するのに対し、後期の処置が改善するのは水平方向の活動だけであることを示した。rHIgM12は、正常な非感染マウスの活動を変化させなかった。この研究は、ニューロン結合IgMによる処置は、invitroにおいてニューロンを保護するだけでなく、また、運動機能の改善にも影響を及ぼすという仮説を裏付ける。序説齧歯動物の疾患モデルにおける、長期にわたる神経機能のモニタリングおよび解析は、依然として難題である。通常は活動的な夜間のモニタリング時間において最大限の活動変化が生じることが予測されるため、夜間挙動は、齧歯動物の神経機能についての高感度の尺度である[1]。しかし、進行が緩徐な疾患の動物モデルでは、機能状態のモニタリングが数週間にわたることが多い。本発明者らは既に、希突起膠細胞結合抗体rHIgM22が、処置後5週間までに、再ミエリン化を増強することを報告した[2]。疾患および修復の発生のいずれもが緩徐な過程であることを考え合せ、かつ、活動における任意の変動を確かに考慮に入れるために、本発明者らは、短期のモニタリングにおいて用いられるサンプリング密度と同じサンプリング密度で、長期にわたる活動をモニタリングする。これにより、大規模で高度に変動的なデータセットが創出された図32A、C。処置後の変化を明確に詳述し、長期の活動における一般的な傾向を復元するために、本発明者らは、MathematicaWolframResearch,Inc.を用いることにより、データビニング、ガウスフィルタリング、および多項式近似の使用を比較した。サイラーマウス脳脊髄炎ウイルスTMEVによる感受性マウス株の脳内感染は、結果として、多発性硬化症の進行性の形態と同様の進行性の軸索喪失および神経機能不全を伴う慢性脱髄性疾患をもたらす[3]。このモデルを、希突起膠細胞に結合するIgMクラスの抗体で処置すると、CNSの再ミエリン化が改善される[4]。これに対し、ニューロンに結合する血清由来のヒトモノクローナル抗体sHIgM12は、ラミニンと同程度に頑健な神経突起成長を促進し、CNSミエリンの神経突起成長に対する阻害効果を低減する[5]。より近年には、上記と同一の生物学的特性を伴うヒトsHIgM12の組換え形態rHIgM12を生成させた。本発明者らは、rHIgM12の半減期は3.6時間であるが、なおも血液脳関門を越え、神経組織に結合することを既に示した未刊行の観察。rHIgM12のTMEV感染マウスの活動に対する効果を研究するため、本発明者らは、AccuScan活動ボックスAccuscanInstruments,Inc.、Columbus、OHを用いて夜間における自発活動を数週間にわたってモニタリングした。本発明者らは、以下の2つの理由で8週間にわたる比較的長期のモニタリング期間を選択した:1IgM誘導性再ミエリン化が、処置後5週間までに示されること、および2この株におけるTMEV誘導性脱髄性疾患の進行は、MSの純粋に自己免疫的なEAEモデルと比較して極めて遅いこと[6]。既に刊行された研究と比較して長期の観察期間表7に起因して、生データの目視により変化を同定することは、困難であるとわかった。材料および方法マウス:SJL/JマウスJacksonLaboratories、BarHarbor、MEを、MayoClinicの動物ケア施設に収容し、飼育した。動物用のプロトコールは、MayoClinicのInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeにより承認された。脱髄のサイラーウイルスモデル:脱髄性疾患は、6~8週齢の雌マウスにおいて、TMEVの脳内注射を介して誘導した。27ゲージの注射針により、Daniel株のTMEV2.0×105プラーク形成単位を含有する10μlを送達した。この結果、発症率を>98とするが致死性はまれな感染がもたらされた。全ての動物は、2週間以内に消失する軽度の脳炎を発症した。動物は、次の6~8カ月間において、慢性脊髄脱髄性疾患により増悪した。軸索損傷および軸索喪失は感染の3カ月後に始まり、神経機能不全と相関する[3]。抗体による処置:SJLマウス非感染、感染の45日後および90日後を、0.5mlのPBS中に溶解させた抗体rHIgM12またはアイソタイプのIgM対照200μgの単回腹腔内投与で処置した。第3群は、0.5mlのPBSだけで処置した。自発活動のモニタリング:自発運動の活動は、DigiscanopenfieldOF装置OmnitechElectronics;Columbus、OHおよびVersamaxソフトウェア、v.4.12-1AFEAccuscanInstruments,Inc.、Columbus、OHにより記録した。この装置は、2セットの光電管を保持する金属製フレームにより支持される6つのアクリル製ケージ40×40×30.5cmからなる。このデバイスは、投射された赤外線ビームの遮断回数を集計することにより、水平方向の運動および垂直方向の運動の個別の数を測定する。全てのケージにおいて、マウスを、以下の同一の環境状態に曝露した:a食物および水を自由に摂取可能とすること、b通常の12時間の明/暗周期、c周囲温度を70°Fとすること。各実験において、活動過剰の動物、および、まれな場合には、体重過剰の動物は除外し、残りのマウスを無作為化した。SJLマウス5匹ずつの複数の群を各ケージの中央に入れ、連続8日間にわたり、ベースラインの自発活動についてまとめた。この期間の後、ベースラインの活動が最も類似する3つの群のマウスを、rHIgM12、対照のIgM抗体、または生理食塩液で処置し、次いで、8週間にわたりモニタリングした。1時間のブロック当たりのビーム遮断回数としてデータを収集した。水平方向および垂直方向の全活動は、Versadatプログラム、v.3.02-1AFEAccuscanInstrumentsを用いて記録した。本発明者らは、これがInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeIACUCにより許容される最大限の動物数であるため、活動ボックス1つ当たりに5匹を超える動物を入れることができなかった。データ解析:フィルタリングされていない元の記録を研究しながら、処置群間の差異を察知することは困難でありうる図32A~C。高度に変動的な元のデータにおける緩徐な傾向を復元するために、本発明者らは、3つの異なる方法:1ビニング法、2ガウスローパスフィルターGFの適用、および3多項式近似を適用した。データビニングとは、最も単純な方法であり、あらかじめ選択したビン内のデータ点の群を、それらの平均値で置換する。本発明者らの場合、本発明者らは、マウスの活動が夜間にピークとなることを踏まえ、夜間におけるビンを選択した。したがって、本発明者らは、図33A、33B、35C、35D、37C、および37Dに示す通り、全ての夜間におけるリーディング12時間/日を、それらの平均値で置換した。群の比較は、処置1回当たり12時間にわたる有効な試料サイズを伴う平均の差異についての単純なt検定を介して実施することができる。これらの比較は単純であるが、各時点における試料サイズが小型である結果として標準誤差が大きくなり、統計学的な比較の使用は限定されたものとなる。全体的に、データビニングは、ノイズの多いデータを可視化するのに有効な方法であるが、統計学的検定のための使用は限定されたものとなる。ガウスフィルタリングGFまた、ローパスフィルタリング、データの平滑化、または感度の増強としても公知であるは、フーリエ変換分光法および画像処理において一般に用いられるノイズ低減手順である[7]。ガウスブロードニングGB、日単位の適切な選択により実施されるGFにより、高頻度の変動が、所望のレベルで除去された。フィルターの選択は任意であり、予測される活動変化の割合を指針とすることができる。GFは、影響がガウス関数に従い減衰するように、両側の値から採取した点からの情報を用い、これらの点の影響を考慮する平滑化法である。コンピュータ利用について述べると、GFは、以下の2つの同等な方式で実装することができる:1データをフーリエ変換FTした後、ガウス関数で乗じ、この積のFTの逆数を取る方式、および2ガウス核によるデータの直接的なコンボリューション。高レベルのソフトウェアパッケージMatlabMathworksまたはMathematicaWolframでは、ガウスフィルター関数が、使用者によるプログラミングを最小限とするかまたはプログラミングを伴わずに利用可能である。GBを適切に選択すれば、上記で詳述したGF法により、高度に複雑かつ異質なデータの単純な可視化が可能となる。GFの1つの限界は、GFにより傾向の容易な可視化が可能となる一方で、GBを選択することにより、統計学的な比較が複雑化することである。比較のために、かつ、単純な統計学的比較を可能とする方法を裏付けるために、本発明者らは、多項式でデータを近似する。これらのモデルは、任意の次数xnまでの多項式の項を許容し、各処置群について個別の形態パラメータ相互作用項を推定した。本発明者らによる6次多項式の選択は、複数の選択肢を探索した後の恣意的なものであったが、ある時間にわたる非線形効果をモデル化するのに十分な柔軟性を可能とした。次数を変化させる多項式を用いて異なる処置群を最適な形で近似したため、本発明者らは、高次における柔軟性を可能とすることを選択した。AkaikeInformationCriteriaAICを用いて、多項式系による複数の処置群にわたる最良の近似を決定した[8]。AICとは、さらなる項を足し合わせることによりR2の増分を相殺するが、過剰複雑性すなわち、自由度の使用にはペナルティーを科すモデル比較の方法である。AICによれば、一般に、3次の近似が、データの傾向を捕捉するのに十分とされ、場合によっては、2次近似、なおまたは線形近似が最良とされた。しかし、本発明者らの主な目標は、観察される時点における処置群を比較することであった。データ点が多数であり、本発明者らは、多項式近似を用いて、本発明者らの観察データ以外の処置値を予測するまたは外挿するわけではないため、結果に対する過剰近似の影響は最小限である。多項式近似の1つの利点は、処置群の統計学的な比較が単純であり、指定した時点において、予測されるモデル値およびそれぞれの標準誤差を用いて処置を比較しうることである。直接的な対応のある処置の比較は、時間枠の全体にわたり、定期的な間隔で実施して、処置群が有意に異なったときを決定することができる。最後に、多項式近似は、さらなる中程度頻度および低頻度のノイズを除去し、これにより、時間枠の全体にわたり、視覚的注意の焦点が一般的な傾向に当てられる。しかし、実験の各々においては、一部の群のマウスのベースラインにおける水平方向および垂直方向の活動8日間が、何らかの形で異なっていた。したがって、本発明者らはまず、Z値を用いて、各群について個別にベースラインの活動を標準化し、次いで、これらの値に対して、ガウスフィルタリングを実施するか、または多項式を近似するした。統計学的な解析:MathematicaWolframで書かれたマクロプログラムを用いることにより、データのビニングおよびガウスローパスフィルターによるデータの平滑化を実施した。マクロプログラムおよび指示書は、mayoresearch.mayo.edu/mayo/research/rodriguez_lab/software.cfmにおいて入手可能である。z統計SASInstitute,Inc.に基づいて予測されるモデル値およびそれぞれの標準誤差を用いて、多項式回帰モデルおよび処置群の統計学的比較を実施した。直接的な対応のある処置の比較は、時間枠の全体にわたる各日において実施し、統計学的な有意性は、閾値を典型的なα=0.05として決定した。多重比較のための調整は行わなかった。結果感染の90日後において施すと、rHIgM12はSJLマウスにおける水平方向の活動を改善する感染の90日後dpiにおけるSJLマウス5匹ずつの3つの群を活動ボックスに入れ、連続8日間にわたりベースラインの活動を測定した。2つの群のマウスを、rHIgM12またはアイソタイプの対照IgM200μgずつの単回投与で処置した。第3群は、生理食塩液で処置した。処置後、自発活動を、8週間にわたり持続的に記録した。データは、1時間のブロックで収集したため、本発明者らは、各群について約900ずつのデータ点を得た。この元の生データ図32A~Cは高度に変動的であるので、処置群間の差異を察知することは困難でありうる。3つの方法ビニング法、ガウスフィルタリング、および多項式近似全てにより、rHIgM12で処置したマウスが、水平方向の活動における改善を示すのに対し、対照のIgMおよび生理食塩液で処置したマウスは、8週間にわたり活動の変化を示さないことが明らかとなった図33A、C、およびE。多項式近似の後、本発明者らは、3つの処置についての直接的な対応のある比較を用いて、rHIgM12処置マウスにおける水平方向の運動機能の改善が、処置の7日後対照のIgMと比較しておよび11日目において生理食塩液と比較して統計学的に有意となることを決定した図34。rHIgM12処置動物の水平方向の夜間活動において観察される改善は、約30日間にわたり持続し、次いで、ベースラインレベルに戻った。生理食塩液処置群の対照IgM処置群と対比した対応のある比較は、38~52日目にわたり統計学的な有意性を示した。しかし、rHIgM12処置群と対照との間で観察される主要な差異と比較した場合、本発明者らは、対照群間におけるこれらの差異は、生物学的に有意ではないと考える。他方、垂直方向の活動は、主要な差異を示さず、3つの群全てにおいて同様であった図33B、D、およびF。感染の45日後に施すと、rHIgM12はSJLマウスにおける水平方向および垂直方向の活動を改善する以前の研究では、垂直方向の活動後肢による立脚挙動を主要なリードアウトとして用いた[1]。慢性TMEV感染マウスでは、軸索の脱落に起因して、後肢が徐々に脆弱となり、こわばるので、後肢による立脚が低減された。この研究の第1の実験では、rHIgM12を、脱髄が最大となり、進行性の軸索喪失が始まる時点で投与した感染の90日後ところ、水平方向の活動だけが改善された。後肢による立脚挙動は影響を受けず、3つの処置群全てにおいて同等であった。したがって、本発明者らは、早期の時点における処置がより有益でありうるか否か問うた。第2の実験では、マウス5匹の群を、感染の45日後に、rHIgM12、アイソタイプの対照IgM、または生理食塩液200μgずつの単回投与で処置した。同一の実験デザインを用い、ベースラインの活動を8日間にわたり収集し、処置後の活動を8週間にわたり収集した。処置の約2週間後に始まるこの実験では、rHIgM12で処置したマウスが、水平方向および垂直方向のいずれの活動においても明らかな改善を示した。これは、3つの方法の全て:データの平均化、ガウスフィルターまたは多項式近似の適用を用いた後で明らかとなった図35C~H。対照のIgMおよび生理食塩液で処置したマウスは、研究の終了まで同様の活動レベルを示した。rHIgM12で処置したマウスでは、実験が終了するまで、水平方向の活動の改善が明らかであった。他方、垂直方向の活動の改善は、約4週間にわたって続き、次いで、ベースライン値へと低下した。3つの処置についての直接的な対応のある比較は、rHIgM12で処置したマウスにおける水平方向の運動機能の改善が、処置の13日後において対照のIgMと比較して、および処置の9日後において生理食塩液と比較して有意に異なることを示した図36AおよびC。同様に、rHIgM12で処置したマウスにおける垂直方向の運動機能の改善も、処置の14日後において対照のIgMと比較して、および処置の6日後において生理食塩液と比較して有意に異なった図36BおよびD。対照のIgM処置群を生理食塩液処置群と対比する比較は、水平方向の活動または垂直方向の活動のいずれについても大きな生物学的差異を明らかにしなかった図36EおよびF。rHIgM12は正常の非感染マウスにおける自発活動を変化させない以前の2つの実験におけるrHIgM12による処置は、神経障害を来した感染マウスにおいて明らかに有益な効果を示した。この抗体が刺激性の特性を有し、したがって、運動機能の増大を誘発する可能性を除外するために、本発明者らは、非感染マウスによる同様の実験を実施した。週齢を一致させた非感染マウスの3つの群を、rHIgM12、対照のIgM、または生理食塩液で処置した。感染マウスにおける活性の増強と比較して、rHIgM12、ならびに、他の2つの処置は、正常マウスの運動機能の増大を誘導しなかった図37。3つの群全てが、自発活動の低下傾向を示した。この結果は、いずれの抗体も、正常マウスにおける活動の増大に影響を及ぼさないことを示す。考察多発性硬化症のほか、他の脱髄性疾患および神経変性疾患のための神経保護療法を開発することが火急に必要とされている。炎症性CNS疾患における軸索損傷の軽減を間接的にもたらしうる抗炎症薬も存在するが、ニューロン/軸索のレベルで直接作用する薬物は存在しない。神経保護の主要な目標は、ニューロンの機能不全を限定し、ニューロンおよび軸索の機能的完全性を維持しようと試みることである。多年にわたり、MSの病理学的顕徴である脱髄は、永続的な神経欠損の原因であると考えられた。今日では、脱髄が永続的な軸索喪失に必要ではあるが十分ではないことが明らかである[9]。脱髄だけが、露出された軸索に、T細胞の細胞傷害作用または死滅した希突起膠細胞に由来する局所性の神経栄養性の支持の喪失により引き起こされる続発的損傷に対する素因を与える[10]。ニューロン結合抗体であるsHIgM12が、頑健な神経突起伸長を促進したという以前の観察[5]は、invitroにおける明らかに有益な応答を表す。この抗体の組換え形が、invitroにおいて同様の特性を示したため、本発明者らは、それがTMEV誘導性脱髄性疾患を伴うマウスの運動活動に影響を及ぼすか否か問うた。運動機能の解析は、夜間における自発活動をモニタリングすることにより実施した。第一に、本発明者らは、脱髄が最大となり、軸索喪失が始まる時点感染の90日後において、マウスを処置した。処置の8週間後、rHIgM12が、水平方向の運動活動だけを改善したのに対し、垂直方向の活動は影響を受けなかった。しかし、疾患の早期に感染の45日後にマウスを処置したところ、rHIgM12は、水平方向および垂直方向のいずれの活動も改善した。慢性TMEV誘導性疾患では、後肢による立脚挙動垂直方向の活動への影響が最も重度であり、この活動の一因となる軸索の変性および喪失は、不可逆性であると考えられる。この結果、これらの軸索の損傷が不可逆的ではない疾患の早期が、処置に理想的な時点であると考えられる。Jonesらは、EAEモデルを用い、軸索の脱落と運動機能とを研究することにより、神経保護薬による処置は、疾患の早期、運動欠損が始まるさらに前に開始すべきであるという同一の枠組みを提起した[11]。第二に、機能的改善が生じるのは処置後2週間以内であり、約25~30日間後には減衰し始めるため、運動機能を維持するには、処置を反復することが必要でありうる。本発明者らの研究では残念ながら、結果としてアナフィラキシーをもたらす、マウスにおける抗ヒト抗体免疫反応のために、ヒトIgMの複数回投与を検証することが可能ではなかった。A2B5とは、神経突起成長もまた促進する[5]マウスモノクローナル抗体であり、機能的転帰およびその作用の持続時間に対する複数回投与対単回投与を検証することが可能な候補抗体を表す。最後に、いずれの処置も、非感染の正常動物の運動機能には効果を及ぼさなかった。処置に関わらず、正常マウスの全ての群は、自発活動の漸進的な低下を示したが、これは、環境への馴化により説明することができる。正常動物におけるこの活動の低下は、rHIgM12により誘導される、疾患マウスの活動の増大をさらにより印象的なものとする。本発明者らは、神経欠損の発症を防止することが一般に極めて困難であった、炎症性脱髄性疾患の慢性進行性モデルにおける運動機能の改善を裏付けた。したがって、ニューロン結合モノクローナル抗体rHIgM12は、ヒトMSを処置するだけでなく、また、他の脱髄性障害または神経変性障害を処置するためにも極めて有望な治療剤を表す。加えて、臨床的に無症状のMSによる侵襲例も見られるため[12、13]、本発明者らは、神経保護的化合物を免疫調節剤で補完すべきであることも提起した[11]。本発明者らは、免疫調節剤薬とrHIgM12とによる組合せ処置が、軸索損傷後におけるCNSの保存および修復の著明な増強を結果としてもたらしうることを提起する。まとめると、この研究による結果は、以下の3つの重要な結論を提示する:1処置を施す病期が極めて重要である早期の処置ほど有益性が増大すること;2運動機能の改善をさらに維持するには、処置の反復が必要でありうること;および3rHIgM12が毒性ではなく、正常な非感染動物における運動機能には影響を及ぼさないこと。これらの知見は、ニューロンを標的とする組換え抗体が、慢性軸索脱髄モデルにおける神経機能を改善するという仮説と符合する。実施例20運動ニューロン疾患であるALSを処置するためのニューロン保護的ヒトモノクローナル抗体筋萎縮性側索硬化症ALSとは、主に前角細胞および皮質脊髄路ニューロンを損なう深刻な神経疾患である。ALSとは、脳および脊髄における運動細胞の進行性の変性を特徴とする運動ニューロン疾患である。運動細胞ニューロンは、個体が動き回り、話し、呼吸し、嚥下することを可能とする筋肉を制御する。神経がそれらを活性化しなければ、筋肉は徐々に脆弱化し、失われる。広範な研究にもかかわらず、この障害の病因は、大部分未知であり、有効な処置は見られない。ALSのまれな遺伝子形態を伴う少数の患者において関与する遺伝子により、この障害に対する潜在的な鍵がもたらされる[1]。同定された1つの遺伝子変異は、Cu/ZnSOD銅/亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ変異であり、これは、ALSの遺伝子形態を伴う患者のうちのわずかな比率において存在する[2]。SOD変異を保有する患者は、関連の遺伝子変異を伴わずにこの疾患を自発的に発症する患者と比較して、神経学的転帰が酷似することが明らかである[3]。この酵素は、スーパーオキシドを触媒して、酸素および過酸化水素をもたらす。SOD1とは、ALSと関連する酵素形態である。軸索輸送を急速に損なうSOD1の機能獲得が認められると考えられている[4]。家族性ALSにおけるSOD変異の頻度は12~23で変化し、この遺伝子は通常、常染色体優性遺伝子として遺伝する。この遺伝子を同定することにより、新たな薬物をデザインし、調べるための、ALSの疾患特徴を伴う動物モデルの開発が可能となった。ALSの遺伝形態と非遺伝形態とは類似の疾患であるため、根底的な原因は、関連している可能性がある。したがって、遺伝性ALSのマウスモデルにおいて有効な薬物はまた、ALSのより一般的なランダム形態を伴う患者においても作用する。ヒトSOD1遺伝子およびALSの病理学的特徴を伴うトランスジェニックマウスモデルの利用可能性により、この疾患のための薬物の開発が推進されてきた[5]。これらのトランスジェニックマウスは、進行性の運動ニューロン喪失および神経欠損を発症する。ALSの遺伝形態と非遺伝形態とは臨床的に類似するため、運動ニューロン機能における根底的な欠損が関連している可能性がある。SOD1関連ALSにおいて有効な試薬はまた、有病率の高いALSの散発形態の一助ともなる。現在のところ、ALS用に市販されている薬物は、グルタミン酸遮断薬であるRilutek登録商標Riluzole錠の1つに過ぎない。しかし、研究により、この薬物は、患者の生活の質を改善せず、寿命を平均2カ月間延長しうるに過ぎないことが示されている。より有効な薬物が火急に必要とされていることが明らかである。本発明者らの実験室では、中枢神経系CNSの脱髄性障害および変性障害を処置するための新規の療法を開発し[6]、CNSにおける修復を誘導することが示されている、希突起膠細胞[7]またはニューロン[8]に結合する一連のヒトモノクローナル抗体mAbを同定した。これらの抗体は、クローニングされ、配列決定され[9]、将来の臨床試験のためにGMPグレードの施設で大量に作製されている[10]。組換えヒト抗体IgM12rHIgM12は、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症を伴う患者から単離された抗体に由来する[11]。この抗体は、CNSのニューロンおよび軸索を特異的に標識する[8]。IgM抗体であるにもかかわらず、上記の実施例で示した通り、IgM12は、血液脳関門を越え、CNS内の軸索およびニューロンに特異的に結合する。Invitroにおいて、rHIgM12は、小脳顆粒ニューロン、皮質ニューロン、海馬ニューロン、および網膜神経節細胞ニューロンを含めた広範なニューロンに結合する[12]。invitroにおける実験は、rHIgM12が、ニューロンを細胞死から保護することを裏付ける。ALSALSの遺伝形態および自発形態の両方の早期に患者に投与されたモノクローナル抗体であるrHIgM12は、前角細胞を保護し、軸索損傷を防止し、これにより、身体障害の開始を遅らせ、生存を改善するように作用しうる。結果本発明者らは、G86RhSOD1変異FVBTgSOD1G86RM1Jwg、JacksonLabs[13]を伴うマウスを、ヒト抗体rHIgM12で処置する実験を実施した。G86Rマウスは、出生時は正常に見える。しかし、約90~100日齢から、G86Rマウスは、顕著な体重減少を経て、著明な筋肉の萎縮を発症し、急激な体重減少から数週間以内に呼吸器不全で死滅する。LUDOLPH無作為化盲検試験では、これらのマウスが55日齢のときに、GMPグレードで精製されたrHIgM12を、単回腹腔内投与200μgとして施した。これに対し、プラセボ群には、リン酸緩衝生理食塩液PBSを施した。少数のマウスは未処置のまま放置して、人為的な操作を伴わない疾患の自然経過を決定した。PBS処置マウスおよび非処置マウスについてのデータは同様であったため、これらの群を統計学的な解析のために併合した。マウスは、本発明者らの実験室の1人の試験実施者による処置のために無作為化し、それらが臨死となるまで、別の盲検処理された試験実施者に神経欠損について観察させた。処置する試験実施者と、病理学的解析を実施する他の試験実施者とは、コードが解読されるまで無作為化プロトコールについて知らされなかった。動物は毎週ベースで秤量して、ヒトmAbによる処置が、生存を延長するだけでなく、また、体重減少の開始も遅らせるか否か決定した。結果は驚くべきものであり、rHIgM12を施された動物における生存の、PBSを施された動物と比較して統計学的に有意な延長を示した。試験実施者は、平均で25~30日間にわたる生存の増大これは、カプラン-マイヤー曲線図38を介して統計学的な有意性P=0.008を示したを記録した。加えて、rHIgM12で処置したマウスは、動物の疾患進行の評価において一般に評価されるパラメータである体重の減少[18]がそれほど顕著ではなかった図39。本発明者らの知る限り、これは、ニューロンを指向する完全組換えヒトモノクローナル抗体が、ALS表現型を伴う動物の生存を延長するのに有効であることについての最初の実証である。動物が臨死期に到達したら、それらを屠殺し、Trump固定剤で潅流した。脊髄を摘出し、1mmのブロックへと切断し、1μm厚の切片用のAralditeプラスチック内に包埋した。これらの切片を組織学的に検討した。SOD変異に由来するALSを発症した動物は、軸索が分解されるときに比較的容易に同定されるミエリン渦が脊髄白質において発生するように、白質路において著明な軸索変性を示した。rHIgM12を施された動物の胸部切片における脊髄渦変性軸索の数を、PBSを施された動物の場合と対比して定量化したところ、モノクローナル抗体療法で処置した動物におけるミエリン渦の数は、統計学的に有意に少なかった図40。また、脊髄切片を、CNSにおけるニューロンを特異的に標識し、前角細胞のほか、後角細胞におけるニューロンも極めて良好に明確化するマーカーであるNeuNに対する抗体でも染色した。多くの前角細胞を、rHIgM12を施された動物の脊髄胸部において、PBSと比較して定量化した図41、左。rHIgM12を施された動物において保存された前角細胞の数の増大には、PBSと対比して高度に統計学的な差異が見られた。また、後角細胞におけるニューロンについての同様の解析も、rHIgM12で処置したマウスのニューロンの有意な増大を明らかにした図41、右。ヒト抗体であるrHIgM12は、マウス、ヒト図42、ウサギ、および霊長動物を含めた多くの種から得られた多くの種類のCNSのニューロンの表面に結合する。これにより、rHIgM12によるニューロンのシグナル伝達が、マウスからヒトを含めた哺乳動物において保存されていることの証拠が提示される。SODマウスによる本発明者らの研究は、前角細胞および後角細胞を死滅から保護することにより、脊髄軸索の変性が減少し、動物の生存が増大しうることを示唆する。上記の前出の実施例において記載した培養物中の皮質ニューロンによる実験は、ニューロンをrHIgM12で処置することにより、ニューロンを細胞死から保護しうることを裏付ける図3を参照されたい。新生仔マウスから増殖させた皮質ニューロンを、ごく高濃度の過酸化水素に曝露して、ニューロンのうちの90が死滅する濃度を決定した。過酸化水素に曝露したニューロンを、rHIgM12またはニューロンに結合しない別のヒトIgMで同時に処置した。rHIgM12による処置は結果として、ニューロンのうちの80の保存をもたらした。これに対し、対照のIgMによる処置は結果として、過酸化水素への曝露後におけるニューロンのうちの90の死滅をもたらした。本発明者らは、rHIgM12が、ニューロンを細胞死から保護することにより、ALSを伴う動物における寿命を延長すると仮定した。ヒト抗体はまた、組織培養プレート上における基質としても調べ、小脳ニューロンまたは皮質ニューロンからの正常な細胞伸長過程を促進する能力について比較した。ニューロンの表面に結合する抗体であるrHIgM12およびsHIgM42と、ニューロンに結合しない抗体であるrHIgM22およびsHIgM39とを、この過程を強力に支持する細胞外マトリックス分子であるラミニンと比較した。ヒト抗体であるrHIgM12またはsHIgM42の基質上で成長しつつあるニューロンは結果として、ラミニンにより観察される場合と同様の、ニューロン成長の劇的な拡大をもたらした[8]。この研究はまた、rHIgM12の存在下では、ニューロンの挙動が正常であることも示した。分子量が百万に近いIgMは、循環から血液脳関門BBBを越えてCNSに入るには大型に過ぎるというのが一般に受容された定説であった[15][16]。しかし、一部の抗体は、BBBを確かに越えるという証拠が蓄積されつつある。本発明者らは上記で、末梢への注射後に、rHIgM12を脊髄内で検出することについて記載した。rHIgM12または対照のヒトIgM1.0mgを、脱髄性脊髄病変を伴うマウスへと腹腔内投与した。4時間後、マウスを屠殺し、脊髄切片を、ヒトIgMミュー鎖および抗ニューロフィラメント抗体の存在について免疫染色した。rHIgM12を施されたマウスでは、共焦点顕微鏡法により、脱髄病変内のヒトミュー鎖が、並列経路内に末端で切断された束として、軸索のマーカーである抗ニューロフィラメント抗体と共局在化することが裏付けられた図15を参照されたい。対照のIgMを施されたマウスの脊髄病変内では、ヒトIgMが見出されなかった。提示される研究は動物モデルにおける研究であるが、これらの研究結果のうちの多くの興味深い側面により、この新規の手法がヒト患者において有効であることがさらに示される。本明細書で記載されて用いられるIgM12抗体が、完全ヒト、モノクローナル抗体であることは重要である。結果として、マウスでこの抗体を用いうるのは単回投与だけである。その後も投与すれば、動物に抗体に対する免疫反応を発生させる結果として、rHIgM12の中和またはアナフィラキシーに起因する動物の死がもたらされる。しかし、これらは真のヒト抗体であるので、rHIgM12で処置したヒト患者は、それらに対する免疫反応を発生させる可能性が低い。rHIgM12はまた、有害作用または抗体遮断反応の発生を伴わずに、潜在的に持続的な間欠的ベースで患者に施すこともできる。rHIgM12は、天然ヒト自己抗体であるため、有害な副作用が生じる可能性が低く、したがって、本発明者らは、この薬剤の毒性が最小限となることを予測する。rHIgM12がヒトにおいて安全であることの証拠が多く存在する。ALSモデルにおいてこれらの肯定的な結果がもたらされる前に、本明細書の上記の通り、神経疾患の複数のモデルにおいて、抗体の血清形態であるsHIgM12を調べたが、毒性は生じなかった。これらの研究において、本発明者らは、11mgの投与後、ウイルスを介する脱髄を伴うマウスにおけるCNS病態の増大が見られないこと、2200μgの投与後、活性EAEを伴うマウスにおける臨床スコアの重症度に増大が見られないこと、および3300μgの投与後、正常CD-1マウスでは、血液化学反応および組織病態に異常がないことを見出した。そうであってもなお、ALSの認知された動物モデルにおけるマウスへの単回投与が、目覚ましい結果をもたらしたことが注意される。rHIgM12は既に、GMPグレードの施設で、FDAのガイドラインに従い増殖させており、安定的な、トランスフェクト細胞系を、FDAのガイドラインに準拠して生成し、外膜感染を伴わずに保管している。これらの細胞系を、>50の感染性生物によるパネルに対して調べたところ、全ての細胞系が陰性の結果を示した。加えて、これらの細胞系により、組織培養物150μg/ml中に大量の抗体が作製される。rHIgM12を、FDAのガイドラインに従い、外膜のウイルス、DNA、RNA、または他の外因性物質を伴わずに、純度>97まで精製する方法が確立されたことから、前臨床段階におけるrHIgM12の、早期ALSを伴う患者における将来の第I相臨床試験のための強力な基礎がもたらされている。進行中の研究上記で、組換えヒトモノクローナル抗体rHIgM12が、前角細胞および軸索の喪失を防止することにより、ヒトALSのトランスジェニックモデルにおける生存を延長しうることを示したので、ALS患者における第I相臨床試験へと向かって、薬物動態および毒性を介する前臨床データを作成する研究が進行中である。プラセボ抗体と対比した盲検研究ALSの表現型を伴うSODマウスの2つの株SOD1G86RおよびSOD1G93Aにおいて、組換えヒト抗体rHIgM12を、アイソタイプ対照のヒト抗体であるsHIgM39と対比して調べる、決定的な盲検プラセボ対照研究を実施する。組換えヒト抗体であるrHIgM12200μgの単回投与の、疾患を軽減する有効性を、G86RSOD1およびG93ASOD1両方[14]B6Cg-TgSOD1G93A1Gur、JacksonLabsの変異体トランスジェニックマウスモデルにおいて、アイソタイプ対照のヒト抗体であるsHIgM39200μgの投与と比較して調べる。ENMCによる発症前処置の推奨に従い、抗体による処置を55日齢で行った[18]ところ、rHIgM12をPBSと比較するパイロット研究を反映する結果がもたらされた図38~41。主要評価項目は、生存および体重減少の防止である。各実験群は、上記データに基づく差異を検出するのに十分な24匹のマウスからなる。加えて、屠殺後の全てのマウスにおけるCNSも検討し、NeuNについての標識を用いて胸部中央の脊髄における前角細胞の数を決定した。異常なミエリン渦により示される、変性した軸索の数をカウントした。G93ASOD1変異体モデルB6.Cg-TgであるSOD1G93A1Gur/J型番004435;JacksonLaboratoryは、これが、ALSについての、最初の、遺伝子ベースで、最も広く用いられ、最もよく特徴付けられたモデルであり、rHIgM12についての結果を、処置の枠組みについての広範なデータベースと比較することを可能とするために包含した。G86Rマウスは、疾患の発症が遅く7カ月後、進行が速いのに対し、G93Aマウスは、発症が速く3~4カ月後、進行が遅い。この研究は、SOD1マウスへの外来タンパク質の導入について調整し、また、作用機構の概念についても取り組むものである。rHIgM12のニューロン結合特徴は、極めて重要であり、ニューロンに結合しないIgMは、疾患を改善しないはずである。本研究における主要評価項目は、生存の増大10以上:P<0.05および体重減少の軽減10以上:P<0.05である。SOD1マウスのうちの少なくとも1つの株で改善が見られれば、成功と考える。全てのマウスを、いずれかの側に仰臥させて15~30秒間以内に自ら直立できなくなる時点で屠殺する。副次評価項目では、ミエリン渦の異常、および脊髄胸部T6レベルにおけるNeuN陽性前角細胞の密度により示される、変性した軸索の数を測定する。1rHIgM12で処置したマウスの体重減少が対照と比較して20多い場合、2rHIgM12で処置したマウスが発作を発症する場合、3rHIgM12で処置したマウスの死亡率が対照より20高い場合は、有害事象を考慮した。用量滴定研究上記の研究における肯定的な結果に続き、SOD1マウスを死滅から保護するのに要請される最小限の用量を決定するために、用量滴定研究55日齢のマウス1匹当たり0、5、50、100、および250μgの単回投与を施すを企図する。マウス脳幹についてのMR分光法を用いて、N-アセチルアスパラギン酸NAAを測定する。本発明者らは、他の神経疾患モデルにおいて、脳幹内のNAAが、脊髄全体における軸索健康の優れたサロゲート指標であることを示した[17]。MR分光法のデータは、rHIgM12を用いる潜在的なヒト試験における抗体有効性についてのサロゲートマーカーとしてのNAAを検証する一助となる。55日齢のSOD1マウス20~24匹の群に、腹腔内を介して0、5、50、100、および250μgの単回投与を施す。主要評価項目および副次評価項目ならびに有害事象については上記と同じとするが、N-アセチルアスパラギン酸NAAを測定する、脳幹におけるMR分光法が加わる。MR分光法は、100日齢時および屠殺直前の抗体による処置日において、各マウスについてまとめる。100日後または最終走査時の任意のrHIgM12処置群の脳幹におけるNAA濃度の、生理食塩液で処置したマウスと比較した10P<0.05の増大を改善と考える。薬物動態研究およびBBB研究は、正常マウス血液免疫グロブリンのバックグラウンドにおけるヒトIgMを特異的に検出する、確立されたELISA検出システムを用いて、200μgの静脈内単回投与の50~70日[18]後のSOD1G86RマウスおよびSOD1G93Aマウスにおいて実施する。ヒトIgMは、投与後の多様な時点0、15分間、30分間、1時間、4時間、8時間、12時間、18時間、24時間、2日間、3日間、5日間、および7日間の血液中で測定する。マウスの血液量は、少量全血液量<1.5mlであるため、各回収時点では、3つの個別のマウスを用いる。rHIgM12は、末梢への注射後、血液脳関門を越え、ニューロンと相互作用して、それらを死滅から保護しながら、神経系に直接作用することが提起される。ヒト抗体が血液脳関門を越えず、免疫反応の側面を刺激し、次いで、軸索保護をもたらす可能性もあるが、その可能性は高くない。この問題に十分に取り組むために、invivoにおける35S標識したrHIgM12の追跡を用いる。35S標識したrHIgM12の2つの用量レベルである、250μgと、上記で確立された最小有効用量とを、50~70日齢のSOD1マウスにおいて追跡する。35S標識したrHIgM12の静脈内投与後、血液脳関門を越え、注射の4、8、24、48、および72時間後の脳/脊髄実質において見出される35Sの百分率を決定した。加えて、既に公表されているオートラジオグラフィー法[19]を用いて、脳/脊髄における35Sの局在化部位も決定した。血清半減期研究rHIgM12が有効性を裏付けた、SOD1株複数可における200μgの投与を用いて、rHIgM12についての血中反応速度試験を実施する。研究は、静脈内注射後7日間にわたる13の回収点において、1時点当たり3匹ずつのSOD1マウス群により実施する。50~70日齢のSOD1マウスを処置して、処置時点における抗体反応速度を理解する。rHIgM12の血清半減期、曝露の飽和、および中和抗体であるIgMの存在について決定する。放射性同位体35S標識したrHIgM12を追跡する研究では、上記の最小限の有効用量の決定が要請される。50~70日齢のSOD1マウスに、rHIgM12250μgおよびrHIgM12の最小限の有効用量少なくとも1×107cpmを含有する[19]の単回静脈内投与を施して、rHIgM12が、治療的処置の時点でCNSに入るかどうかに取り組む。注射の4、8、24、48、および72時間後において、脳、脊髄、肝臓、心臓、肺、胃、腸、筋肉、脾臓、肝臓、膵臓を含めた主要な組織を迅速に摘出する。組織部分150mgを摘出し、秤量し、SolvablePerkinElmer中で溶解させ、シンチレーション液UltimaGold、PerkinElmer中でcpmを決定した。同位体で標識したrHIgM12を、オートラジオグラフィーを用いて脊髄切片中で局在化させる[19]。この実験では、主要評価項目を、rHIgM12を注射した4、8、24、48、および72時間後に対照のゼロ時点と比較した、マウスの脳または脊髄における35S同位体の蓄積とする。任意の時点の脳または脊髄の全体1mg当たりの35Sのカウントの50P<0.05の増大を有意と考え、rHIgM12がCNSに入りうることの証拠であると考えた。オートラジオグラフィー研究では、マウスに標識したrHIgM12を投与し、rHIgM12がCNS内で増大する時点において脊髄を摘出した。脊髄切片中のニューロン全体1mm2当たりの銀目の50の増大を、invivoにおける抗体ターゲティングの有意な証拠と考えた。初期毒性研究rHIgM12により実験を実施して抗体が正常CD-1マウスおよび正常ウサギにおいて毒性であるか否か決定する:両方の性別の正常CD-1マウス10匹の群に、上記で決定したrHIgM12の最小限の有効用量の1倍1×、10倍10×、および20倍20×、または生理食塩液を、1回または7日間にわたり毎日静脈内投与する。2週間後、完全剖検を介して血液および組織を回収して解析する。主要な器官全ての組織切片を、毒性評価において熟練した獣医科の病理学者が盲検により検討する。血液を、肝臓酵素、心臓酵素、電解質および血液学グループに対する効果についての血液研究を含めた、通常の毒性スクリーンパネルのための化学および血液学で特徴付ける。同一の曝露研究を齧歯動物以外の種において実施し、各性別のウサギ2匹ずつを各用量で調べる。加えて、rHIgM12を用いる組織の交差反応性研究を、抗体が他の任意の組織または器官に結合するか否か決定するのに用いる。マウス、ウサギ、霊長動物、およびヒトZymedに由来するパラフィン包埋した組織切片のパネルを、rHIgM12または対照のヒトIgMで免疫標識する。invivoにおける状況をより緊密に模倣するので、各組織内の結合の強度および構造を画像化し、rHIgM12および対照のIgMによる組織チョッパーで切断した生存組織スライスの標識化と比較する[7]。加えて、FDAへの治験薬申請の予備的毒性試験部門と一致して、rHIgM12および対照抗体の結合も、凍結ヒト組織および凍結霊長動物組織において調べる。組織交差反応性研究は、マウスおよびウサギにおける曝露研究の間、特に、器官をモニタリングするための鍵をもたらす。組織への結合有効性を決定した後、これらの研究では、標的組織および標的以外の組織への結合に取り組む。ヒトおよびカニクイザルCharlesRiverの市販される組織アレイZymedおよび切片を、10μg/mlのrHIgM12および対照のヒトIgMであるsHIgM39で免疫標識する。ディジタル画像を用いて標識の強度を比較する。rHIgM12の、パラフィン包埋して固定した組織アレイおよび凍結させたヒトおよび霊長動物の脳および脊髄への結合を、生存マウスの小脳スライスにおいて観察される抗体結合と比較する。本発明者らは、標準的な効力アッセイである生存小脳スライスへの抗体結合を用いたが、これは、rHIgM12の血清形態が同定された最初のスクリーンである。本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱しない限りにおいて、他の形態で実施することもでき、他の方式で実行することもできる。したがって、本開示は、例示的なものであり限定的なものではない全ての態様、付属の特許請求の範囲により示される本発明の範囲にあるものと考えられ、同等性の意味および範囲内に収まる全ての変化がその中に包含されることを意図する。本明細書全体では多様な参考文献が引用されるが、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。"