"ヒト被験者が炎症性腸疾患inflammatoryboweldisease:IBDを発症するリスクの上昇またはヒト被験者にIBDが存在する可能性の上昇を決定する方法であって、i前記被験者のサンプルにおいて、図1で提供された、少なくとも1つの特異的に発現したmiRNAの濃度を測定する工程と、ii工程iの前記サンプル中の少なくとも1つのmiRNA濃度を対照サンプルの濃度および/または内部標準miRNAと比較する工程であって、工程iiの対照濃度と比較した前記サンプル中の少なくとも1つのmiRNA遺伝子産物濃度の上昇が、前記被験者のIBD発症リスクが上昇していること、またはIBDが存在する可能性の上昇を示しているものである、前記比較する工程とを有する方法。請求項1記載の方法において、発現濃度の前記上昇はクローン病と関連しているものである方法。請求項1記載の方法において、1若しくはそれ以上のmiRNAの量の上昇を検出する工程は、i前記被験者の血清サンプルから単離した全RNAまたは小型RNAのmiRNAを標識する工程と、ii前記標識されたmiRNAをmiRNAマイクロアレイでmiRNAプローブにハイブリダイズする工程と、iii前記マイクロアレイを洗浄する工程と、iv前記マイクロアレイに残った前記標識されたmiRNAを検出する工程とを有するものである方法。IBDを有するヒト被験者において、治療に対する反応を決定する方法であって、i前記被験者の血清サンプルにおいて、図1で提供された、少なくとも1つの特異的に発現したmiRNAの濃度を測定し、且つ前記被験者にIBDの治療に有用な治療薬を投与する工程と、ii工程iの前記サンプルの少なくとも1つのmiRNAの濃度を治療後の濃度と比較する工程であって、工程iiの治療前濃度と比較した、前記サンプル中の少なくとも1つのmiRNA遺伝子産物濃度の減少は、前記治療薬がIBDの治療に有用であることを示しているものである、前記比較する工程とを有する方法。本発明では、ヒト被験者が炎症性腸疾患IBDを発症するリスクの上昇またはヒト被験者にIBDが存在する可能性の上昇を決定する方法が提供される。典型的な方法では、i図1に提供され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8種類、またはそれ以上、またはすべての特異的に発現されたmiRNA濃度を被験者のサンプルで測定する工程と、ii工程iの前記サンプル中の前記miRNA濃度を対照サンプルの濃度および/または少なくとも1種類の内部標準miRNA例えば、miR-150および/またはmiR-342-3pと比較する工程において、工程iiの対照濃度と比較した前記サンプルのmiRNA濃度の上昇が、前記被験者のIBD発症リスクの上昇、またはIBDが存在する可能性の上昇を示している工程とが必要である。特定の実施形態では、前記miRNA発現濃度の上昇がクローン病の存在と関連している。特定の実施形態では、前記特異的に発現されたmiRNAが図1で発現量の差が最も大きいmiRNAである。患者のIBD治療に対する反応性を測定する方法も提供される。典型的な方法では、i図1に提供され、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8種類、またはそれ以上、またはすべての特異的に発現されたmiRNA濃度を被験者の血清サンプルで測定し、前記被験者にIBDの治療に有用な治療薬を投与する工程と、ii工程iの前記サンプル中の前記miRNA濃度を治療前および/または治療後の濃度と比較する工程において、工程iiの投与前濃度と比較した前記サンプル中の少なくとも1種類のmiRNA遺伝子産物濃度の減少が、前記治療薬がIBDの治療に有用であることを示している工程とが必要である。特定の実施形態では、前記特異的に発現されたmiRNAが図1で発現量の差が最も大きいmiRNAである。最後に、IBD、特にクローン病の診断および治療上の検査で有用な、一連の特異的に発現されたmiRNAが提供される。循環血液中のmiRNAは、小児クローン病の高感度で特異的な指標となることが確認された。これらのmiRNAは、血清または血漿の無細胞液に存在する。血清miRNAをバイオマーカーとして利用する利点は、数回凍結/解凍サイクルを行っても室温で数時間安定であること、正常者では変化が少ないことなどである。従って、本発明に従い、IBDのバイオマーカーを調べる新規非侵襲的アッセイが開示される。このアッセイは、1治療を開始するために不可欠な、迅速で正確な診断を提供し、2UCおよびIBDの診断と関連した他の疾患とCDを区別するために効果的であり、3利用できる選択肢の範囲から治療の選択を導くために必要な転帰の予測を容易にすることができる。最後に、本明細書で開示される一連のmiRNAの特徴により、そのようなマーカーを標的とすることができる新規治療の開発が可能となる。多数のIBDのバイオマーカーが報告されているが、これらは感度が低い、疾患活動性との関連性が低い、および/またはコストのため制限されている。定義:炎症性腸疾患またはIBDの表現は、主に潰瘍性大腸炎UCおよびクローン病CDを指す。これらは原因が不確定の慢性疾患であり、腹痛が頻発することで特徴付けられ、下痢が伴うことが多い。潰瘍性大腸炎およびクローン病にはいずれも明確な病理学的所見があるが、炎症性腸疾患IBD患者のかなりの割合で所見が予測できない。クローン病は限局性腸炎、末端回腸炎、または肉芽腫性回結腸炎とも呼ばれる。マイクロRNAまたはmiRNAは、およそ22個の小さなヌクレオチド非コードRNAのファミリーを指す。miRNAは特異的遺伝子から転写され、一般に2回の開裂段階を経て、成熟miRNAとなる。miRNAは、mRNAの分解を亢進するか、翻訳を抑制することにより、転写後遺伝子抑制を引き起こす。本明細書で説明するとおり、miR特異的インヒビターの用語は、マイクロRNA分子の少なくとも一部に相補的、または基本的に相補的で、標的遺伝子転写産物への結合または活性を阻害する核酸分子を指す。miR特異的インヒビターは前記miRNAと直接相互作用するか、標的転写産物のmiRNA結合部位と相互作用して、miRNAとの相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、前記miR特異的インヒビターが、マイクロRNA分子のシード領域にすなわち、前記マイクロRNA分子5’末端の1~10位に相補的な少なくとも5個の連続したヌクレオチド、少なくとも6個の連続したヌクレオチド、少なくとも7個の連続したヌクレオチド、少なくとも8個の連続したヌクレオチド、または少なくとも9個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態では、前記miR特異的インヒビターが、2~8位でマイクロRNA分子のシード領域に相補的な、少なくとも6個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。前記マイクロRNAに相補的な、これらの連続したヌクレオチドは、マイクロRNA結合部位とも呼ばれる。miR特異的インヒビターは一本鎖分子と考えられる。前記miR特異的インヒビターは化学的に合成するか、プラスミドによってコードされている。一部の実施形態では、前記miR特異的インヒビターがRNAを有する。他の実施形態では、前記miR特異的インヒビターがDNAを有する。他の実施形態では、前記miR特異的インヒビターが化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含む。例えば、Brenneckeetal.,2005,PLOSBiol.33:pe85を参照。一部の実施形態では、miR特異的インヒビターが抗miRNA抗miRオリゴヌクレオチドであるWO2005054494;Hutvagneretal.,2004,PLoSBiol.2:E98;Orometal.,2006,Gene372:137-141を参照。抗miRは一本鎖分子と考えられる。抗miRはRNAまたはDNAを有し、非ヌクレオチド成分を有する。抗miRに関する別の実施形態は、miR特異的インヒビターについて上述したとおりである。抗miRは、広範な配列相補性により成熟マイクロRNAとアニーリングし、これを阻害する。一部の実施形態では、抗miRが全miRNAと完全に相補的なヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、抗miRが2~8位でマイクロRNA分子と相補的であり、前記miRNAの残りの配列と少なくとも50、60、70、80、または90相補的な、少なくとも6個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、前記抗miRがさらにフランキング配列を有し、隣接する一次pri-miRNA配列と相補的である。抗miRについては、2’-O-メチル;LNA;および2’-O-メチル,ホスホロチオエート,コレステロールantagomir;2’-O-メトキシエチルなどの化学的修飾が報告されているWO2005054494;Hutvagneretal.,2004,PLoSBiol.2:e98;Meisteretal.,2004,RNA10:544-50;Orometal.,2006,Gene372:137-41;WO2005079397;Krutzfeldtetal.,2005,Nature438:685-689;Davisetal.,2006;NucleicAcidRes.34:2294-2304;Esauetal.,2006,CellMetab.3:87-98。化学的に修飾された抗miRは、これに限定されるものではないが、Sigma-Proligo、Ambion、Exiqon、およびDharmaconを含む様々な供給業者から市販されている。miRNA模倣体は、化学的に合成された核酸ベースの分子であり、好ましくは、細胞への移入後の成熟内因性miRNAを模倣した二本鎖RNAである。遺伝子変化の用語は、1若しくはそれ以上の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を指す。遺伝子変化には、制限なく、既知配列の核酸分子から、少なくとも1つのヌクレオチドで塩基対置換、付加、および欠失が起こった場合を含む。本明細書で用いるとおり、固体基質の用語は、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェルまたは試験管、ディップスティック、またはフィルターの表面など、何らかの形態を指す。前記基質の材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースとすることができる。特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を指す場合の基本的に~から成るという表現は、特定の配列ID番号:の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に関して使用される場合、前記表現はそれ自体の配列と、前記配列の機能的および新しい特徴に影響しない分子修飾を含む。本発明で使用される核酸に関して、単離核酸の用語が使用されることもある。この用語はDNAに当てはめた場合、由来する生物の天然型ゲノムに5’および3’方向ですぐ隣接した配列から単離されるDNA分子を指す。例えば、前記単離核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されるか、原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれるDNA分子を有することがある。単離核酸分子はcDNA分子も有する。ベクターに挿入された単離核酸分子は、本明細書において、組み換え核酸分子と呼ばれることもある。RNA分子に関して、単離拡散の用語は主に、上記に定義した単離DNA分子にコードされるmiRNA分子を指す。代わりに、前記用語が、天然の状態でつまり、細胞または組織中で関連するだろうRNA分子から十分分離され、実質的に純粋な形態で存在するRNA分子を指すこともある。核酸と関連して濃縮の用語を使用することで、特定のDNAまたはRNA配列が、正常細胞または配列を取り出した細胞よりも、有意に高い割合2~5倍の全DNAまたは全RNAが対象の細胞または溶液に存在することを意味する。これは、存在する他のDNAまたはRNAの量を優先的に減少させる、または、前記特定のDNAまたはRNA配列の量を優先的に増加させる、または、前記2つの方法を組み合わせることで、人為的に引き起こすことができる。しかし、濃縮は他のDNAまたはRNA配列が存在しないということは意味せず、単に対象配列の相対量が大きく増加しているだけであることに注意する必要がある。一部の目的においては、ヌクレオチド配列が精製された形態であることも好都合である。核酸と関連した精製の用語は、均質な調合液のように完全に純粋である必要はなく、代わりに、その配列が自然環境よりも自然の濃度と比較して。この濃度は例えばmg/mlで少なくとも2~5倍高いはずである相対的に純粋であることを示す。cDNAライブラリーから単離した個々のクローンは、電気泳動で均質な程度まで精製することができる。これらのクローンから得られる請求項のDNA分子は、全DNAまたは全RNAから直接得ることができる。前記cDNAクローンは天然型ではないが、好ましくは部分的に生成した天然型物質メッセンジャーRNAを操作することで得られる。mRNAからのcDNAライブラリーの作成には、合成物質cDNAの作成が関与し、純粋な個々のcDNAクローンは、前記cDNAライブラリーを持つ細胞をクローン選択することで、前記合成ライブラリーから単離可能である。従って、mRNAからのcDNAライブラリーの作成と異なるcDNAクローンの単離が含まれるプロセスでは、天然型の伝達よりも約10-6倍精製される。従って、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、および、より好ましくは4または5桁の精製が明示的に意図される。相補的の用語は、2つのヌクレオチドが互いに複数の好ましい相互作用を形成することができることを説明する。例えば、アデニンは2つの水素結合を形成することができるため、チミンと相補的である。同様に、グアニンとシトシンは3つの水素結合を形成することができるため相補的である。従って、核酸配列にチミン、アデニン、グアニン、およびシトシンの塩基配列が含まれる場合、この核酸分子の相補体はチミンの位置にアデニン、アデニンの位置にチミン、グアニンの位置にシトシン、シトシンの位置にグアニンを含む分子となる。前記相補体は親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、そのような相補体はその親分子と高い親和性で結合することができる。一本鎖核酸、特にオリゴリボヌクレオチドについて、特異的にハイブリダイズするという用語は、当該分野で利用される事前に決定された条件下、そのようなハイブリダイゼーションが可能となるような十分相補的な配列の一本鎖ヌクレオチド2分子間の関連性を指す実質的に相補的と呼ばれることもある。特に、前記用語は、事実上、非相補的配列の一本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを除き、本発明の一本鎖DNAまたはRNA分子内に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを指す。相補性が様々な一本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションが可能となる適切な条件も、当該分野で周知である。例えば、特定の配列相同性を有する核酸分子間でハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密な条件を計算するための、1つの一般式を以下に示すSambrooketal.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory1989:Tm=81.5°C16.6Log[Na]0.41GC-0.63ホルムアミド-600/bp二本鎖上式の説明として、[Na]=[0.368]およびホルムアミドを50とし、GCの含有量を42、平均プローブサイズを200塩基とすると、前記Tmは57°Cである。DNA二本鎖のTmは相同性が1低下するごとに1~1.5°C低下する。従って、約75以上の配列同一性を有する標的は、ハイブリダイゼーション温度42°Cで観察されることになる。前記ハイブリダイゼーションおよび洗浄の厳密性は、主に前記溶液の塩濃度および温度に依存する。一般に、前記プローブのその標的へのアニーリング速度を最大限とするため、前記ハイブリダイゼーションは通常、前記ハイブリッドについて計算したTm未満の20~25°Cの塩および温度条件で行う。洗浄条件は、前記標的に対する前記プローブの同一性について、可能な限り厳密にする必要がある。一般に、洗浄条件は前記ハイブリッドのTm未満の約12~20°Cに選択する。本発明の核酸について、中等度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、42°Cでの6XSSC、5Xデンハート液、0.5SDS、および変性したサケ精子DNA100μg/mlにおけるハイブリダイゼーションと定義し、2XSSCおよび0.5SDSにおいて55°Cで15分間洗浄した。高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、42°Cでの6XSSC、5Xデンハート液、0.5SDS、および変性したサケ精子DNA100μg/mlにおけるハイブリダイゼーションと定義し、1XSSCおよび0.5SDSにおいて65°Cで15分間洗浄した。非常に高度の厳密性のハイブリダイゼーションとは、42°Cでの6XSSC、5Xデンハート液、0.5SDS、および変性したサケ精子DNA100μg/mlにおけるハイブリダイゼーションと定義し、0.1XSSCおよび0.5SDSにおいて65°Cで15分間洗浄した。オリゴヌクレオチドの用語は、本明細書で使用するとおり、2若しくはそれ以上、好ましくは4つ以上のリボ-またはデオキシヌクレオチドを含む核酸分子として定義される。前記オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な要因によって、および前記オリゴヌクレオチドの特定の応用および使用によって決まる。プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドは、3ヌクレオチドから前記核酸分子の全長までのあらゆる長さとすることができ、明確に、前記ポリヌクレオチドの3から全長までのあらゆる可能な連続核酸数を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは少なくとも約10ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド長である。典型的なmiRNAは約22リボヌクレオチド長である。本明細書に用いるプローブの用語は、精製された制限酵素の消化で自然に発生するか、合成されたかによらず、前記プローブに相補的な配列を有する核酸とアニーリングするか、特異的にハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはRNAまたはDNAいずれかの核酸を指す。プローブは一本鎖または二本鎖の可能性がある。前記プローブの正確な長さは、温度、プローブ供給源、および前記方法の利用を含む多くの要素によって決まる。例えば、診断に応用する場合、標的配列の複雑さにより、前記オリゴヌクレオチドプローブは典型的に15~25またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それよりも少ないオリゴヌクレオチドを含むこともある。本明細書のプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に相補的となるように選択される。これは、一連の事前に決定された条件下、前記プローブがそれぞれの標的鎖と特異的にハイブリダイズするまたはアニーリングすることができるよう、十分相補的である必要があることを意味する。従って、前記プローブの配列は前記標的の厳密に相補的な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントが前記プローブの5’または3’末端に結合し、前記プローブ配列の残りの部分が前記標的鎖と相補的となることも考えられる。代わりに、前記プローブ配列が前記標的核酸の配列と十分相補的で、それと特異的にアニーリングするという条件で、非相補的塩基またはそれよりも長い配列が前記プローブに散在する可能性もある。本明細書に用いられるプライマーの用語は、RNAかDNAかであり、一本鎖か二本鎖かであり、生態系に由来するか制限酵素消化で作成したか合成したオリゴヌクレオチドを指し、適切な環境に置いた場合、鋳型依存的核酸合成のイニシエーターとして機能することができる。適切な核酸の鋳型、適した核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適した補助因子、および適した温度およびpHなどの条件を提示した場合、ポリメラーゼの作用またはプライマーが伸長した生成物を生じる同等の活性により、ヌクレオチドを添加することで、前記プライマーをその3’末端で伸長することができる。前記プライマーの長さは、特定の条件および応用の要件によって変化する可能性がある。例えば、診断に応用する場合、前記オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド長は典型的には15~25またはそれ以上となる。前記プライマーは、望みの伸長生成物の合成を開始するため、つまり、ポリメラーゼまたは同様の酵素による合成開始に利用する場合と適切に並べ、前記プライマーの3’ヒドロキシ部分を提供するのに十分な方法で望みの鋳型鎖とアニーニングできるように、望みの鋳型に十分相補的である必要がある。前記プライマー配列が望みの鋳型と正確に相補的である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列は、それ以外は相補的なプライマーの5’末端に結合することができる。代わりに、前記プライマー配列が望みの鋳型鎖の配列と十分相補的で、前記伸長生成物の合成に用いられる鋳型プライマー複合体を機能的に提供するという条件で、非相補的塩基が前記オリゴヌクレオチドプライマー配列に散在することも可能である。ポリメラーゼ連鎖反応PCRについては、米国特許第4,683,195号、第4,800,195号、および第4,965,188号に報告があり、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ベクターの用語は、細胞に感染、移入、または形質転換し、独立してまたは宿主細胞ゲノム内で複製することのできる、一本鎖または二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は、制限酵素で処理すると、切断し、それによって直線化することができる。各種ベクター、制限酵素、および制限酵素の標的となる前記ヌクレオチド配列の知識は、当業者が容易に利用することができ、別の遺伝子配列または要素DNAまたはRNAが結合し、前記結合した配列または要素を複製することができる、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなどのレプリコンを含む。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、2つの遺伝子片を結合することで、ベクターに挿入することができる。前記発現構成物を原核生物または真核生物に形質転換、移入、または形質導入しやすくする多くの技術を当業者は利用できる。形質転換、移入、および形質導入の用語は、核酸および/または発現構成物を細胞または宿主生物に挿入する方法を指す。これらの方法には、前記細胞を高濃度の塩、電界、または界面活性剤で処理し、前記宿主細胞の外膜または細胞壁に対象の核酸分子、マイクロインジェクション、PEG融合などに対する透過性を与えるなど、様々な技術が関与する。プロモーター要素の用語は、ベクターに組み込まれ、一度適切な細胞に入ると、転写因子および/またはポリメラーゼの結合、およびその後、ベクターDNAの一部のmRNAへの転写を促すことができるヌクレオチド配列を説明する。1つの実施形態では、本発明のプロモーター要素が対象核酸分子の5’末端の前にあり、対象核酸分子がmRNAに転写される。この後、宿主細胞の機構によりmRNAがポリペプチドに翻訳される。当業者は、核酸ベクターには、前記プロモーター要素および前記対象核酸分子以外の核酸要素が含まれる可能性があることを認めるだろう。これらの他の核酸要素には、これに限定されるものではないが、複製開始点、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またポリペプチドの精製に有用なシグナルをコードする核酸配列を含む。レプリコンは例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、またはウイルスなどの遺伝的要素であり、大部分は独自の制御で複製することができる。レプリコンはRNAまたはDNAである可能性があり、一本鎖または二本鎖である可能性がある。発現オペロンは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル例えば、ATGまたはAUGコドン、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど、転写および翻訳制御配列を有し、宿主細胞または生物のポリペプチドコード配列の発現を促す核酸セグメントを指す。本明細書で使用するとおり、レポーター、レポーター系、レポーター遺伝子、またはレポーター遺伝子産物の用語は、核酸が遺伝子を有し、この遺伝子は、発現されると、例えば、生物学的試験、免疫測定、放射免疫測定、または比色分析、蛍光発生的、化学発光、または他の方法により、容易に測定できるレポーターシグナルを発する生成物をコードする、有効な遺伝子系を意味する。前記核酸はRNAまたはDNA、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンスまたはセンスの方向性とすることができ、前記レポーター遺伝子産物を発現させるために必要な制御要素と有効な結合を持つ。前記必要な制御要素は、レポーター系の性質、および前記レポーター遺伝子がDNAの形態かまたはRNAの形態かによって異なるが、これに限定されるものではないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリA付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素を含む。導入された核酸は、受容細胞または生物の核酸に組み込む共有結合することができる場合とできない場合がある。細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞では、例えば、前記導入された核酸がエピソーム要素、またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持される。代わりに、前記導入された核酸が前記受容細胞または生物の核酸に組み込まれ、この細胞または生物で安定に維持され、さらに前記受容細胞または生物の子孫細胞または生物に伝搬または受け継がれることもある。最後に、前記導入された核酸は前記受容細胞または宿主生物に一時的にしか存在することができない。選択可能なマーカー遺伝子の用語は、発現されると、抗生物質耐性などの選択可能な表現型を形質転換細胞に与える遺伝子を指す。操作により結合されるの用語は、コード配列の発現が行われるように、DNA分子中の前記コード配列に対して適切な位置に、前記コード配列の発現に必要な制御配列を入れることを意味する。これと同じ定義は、発現ベクター中の転写単位の配列および他の転写制御要素例えば、エンハンサーにも当てはまることがある。組み換え生物またはトランスジェニック生物の用語は、新しい組合せの遺伝子または核酸分子を有する生物を指す。遺伝子または核酸分子の新しい組合せは、当業者が利用できる多様な核酸操作法により生物に導入することができる。生物の用語は、少なくとも1つの細胞を有するすべての生体に関する。生物は、1つの真核細胞のように単純なもの、または哺乳類のように複雑なものである可能性もある。従って、組み換え生物の表現は、組み換え細胞、および真核または原核生物も含む。単離タンパク質または単離および精製タンパク質の用語が本明細書で使用されることもある。この用語は主に、単離核酸分子が発現することで生成したタンパク質を指す。代わりに、この用語が、天然で関連するだろう他のタンパク質と十分分離され、実質的に純粋な形態で存在するタンパク質を指すこともできる。単離は、他の化合物または物質との人工または合成混合物、または、基本的活性に干渉せず、例えば、不完全な精製、安定剤の追加、または例えば、免疫原性調合液または薬学的に許容される調合液に混合したために存在する不純物の存在を排除することは意味しない。特異的結合ペアは特異的な結合成分sbmと結合パートナーbpを有し、互いに独特の特異性を持ち、通常の状態では、他の分子に優先して互いに結合する。特異的結合ペアの例は、抗原と抗体、リガンドと受容体、および相補的ヌクレオチド配列である。当業者は多数の他の例を知っている。さらに、特異的結合ペアの用語は、特異的な結合成分およびその結合パートナーのいずれかあるいは両方が高分子の一部を有する場合にも当てはまる。特異的結合ペアが核酸配列を有する実施形態では、前記アッセイの条件下で互いにハイブリダイズできる長さとし、好ましくは10ヌクレオチド長以上、より好ましくは20~30ヌクレオチド、および、最も好ましくは22ヌクレオチド長となる。サンプルまたは患者サンプルまたは生体サンプルは、特定分子を検査することができるサンプルを指す。サンプルには、これに限定されるものではないが、細胞、また血液、血清、血漿、尿、唾液、胃腸液などの体液を含む。試薬および試験化合物の用語は本明細書では同義で使用され、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌、または動物特に哺乳類の細胞または組織など、生物由来物質から作られた抽出物を意味する。生体高分子には、miRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド/DNA複合体、および本明細書で説明される標的核酸またはそのコードタンパク質の活性を調節することができる核酸を基本とした分子が含まれる。試薬の考えられる生物活性については、本明細書で以下に説明するスクリーニングアッセイに含めることで評価される。IBDの発症傾向を診断する方法特定のマイクロRNA分子がIBDを有する患者では特異的に発現されるという発見は、そのような疾患の発症傾向を診断または検出する方法を提供する。図1に示した、他の特異的に発現されたmiRNAの発現レベルは、対象の生体サンプルで評価することができる。1つの実施形態では、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のmiRNAの発現レベルが測定される。特定の実施形態では、発現量の差が最も大きく異なるmiRNAの発現が測定される。特定の実施形態では、前記患者から単離されたmiRNAの発現レベルを、事前にCDの存在を示すと判断されたレベルと比較している。特定の実施形態では、前記IBD関連miRNA濃度を患者自身のmiR-150および/またはmiR-342-3p内部標準miRNA濃度と比較し、それによって対照サンプルと比較する必要がなくなる。これに限定されるものではないが、体液血清、胃腸液、および痰など、すべての細胞タイプ腸細胞、白血球、単核細胞など、または体組織を含むあらゆるタイプの生体サンプルで、miRNA発現レベルを検出するアッセイを行うことができる。好ましい実施形態では、miRNA濃度が血清サンプルで評価される。IBD関連miRNAをスクリーニングする特定の実施形態では、含まれる全RNAが1μg以下の少量サンプルを分析することのできる新しい検出法により、前記miRNAが同定される。例えば、ABITaqmanは、miRNAの逆転写に全RNAの10ngを利用するキットおよび方法を提供している。従来の蛍光技術とは対照的に、共鳴光散乱RLS技術を利用し、ビオチン標識しハイブリダイズした標的および抗ビオチン抗体を用い、数回の測定で少量のRNAを検出することができる。PCR増幅に代わる別の方法には、シグナル/ノイズ比を増加させ、バックグラウンド干渉を抑制する平面波ガイド技術planarwaveguidetechnology:PWGが含まれる。いずれの技術もQiagenInc.米国から市販されている。従って、上述の技術すべてを利用し、IBD関連miRNAマーカーの発現を検出または定量し、それに従って、IBDなどの炎症性疾患の発症傾向を診断することができる。キットおよび製造品前述の製品はすべて、陽性対照miRNAまたはGeneChipに埋め込まれた1若しくはそれ以上の前記マーカー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ラベル、マーカー、またはレポーター、薬学的に許容される担体、生理的に許容される担体、使用説明書、血清の容器、投与容器、アッセイ基質、またはそのいずれかの組合せを含むことができるキットに組み入れることができる。治療薬を開発するため、miRNAの調節を利用する方法本発明者は、数種類のmiRNA分子がIBD患者で特異的に発現され、これは血清サンプルで検出可能であることを発見した。特に、これらのmiRNA分子は炎症の調節および制御に関与する様々なタンパク質と相同性を示すため、様々な異なる医学的疾患で観察される異常炎症経路を抑制または軽減する治療薬として利用することができる。そのような試薬は、IBDなどの炎症性疾患を含む様々な疾患の治療に有用である。分子モデリングは、本明細書で開示されるmRNAおよび本明細書で開示される他の特異的に発現されたmiRNAの作用を模倣した特異的有機分子を同定しやすくするはずである。コンビナトリアルケミストリーのアプローチを利用し、活性が最も高い分子を同定し、次にこれらの分子を複製してさらにスクリーニングサイクルを行う。特定の実施形態では、候補薬物を合成または天然化合物の大きなライブラリーからスクリーニングすることができる。1つの例は、ヒトに使用することのできる化合物のFDA承認ライブラリーである。さらに、化合物ライブラリーは、これに限定されるものではないが、MaybridgeChemicalCo.英国コーンウォール州Trevillet、Comgenex米国ニュージャージー州Princeton、Microsource米国コネティカット州NewMilford、Aldrich米国ウィスコンシン州MilwaukeeI、AKosConsultingandSolutionsGmbHスイス、Basel、Ambinterフランス、Paris、Asinexロシア、Moscow、Auroraオーストリア、Graz、BioFocusDPI、Switzerland、Bionet英国、Camelford、ChemBridge米国カリフォルニア州SanDiego、ChemDiv米国カリフォルニア州SanDiego、ChemicalBlockLtロシア、Moscow、ChemStarロシア、Moscow、ExclusiveChemistry,Ltdロシア、Obninsk、Enamineウクライナ、Kiev、Evotecドイツ、Hamburg、Indofine米国ニュージャージー州Hillsborough,Interbioscreenロシア、Moscow、Interchimフランス、Montlucon、LifeChemicals,Inc.米国コネティカット州Orange、MicrochemistryLtd.ロシア、Moscow、Otavaカナダ、オンタリオ州Toronto、PharmExLtd.ロシア、Moscow、PrincetonBiomolecular米国ニュージャージー州MonmouthJunction、ScientificExchange米国ニューハンプシャー州CenterOssipee、Specsオランダ、Delft、TimTec米国デラウェア州Newark、TorontoResearchCorp.カナダ、オンタリオ州NorthYork、UkrOrgSynthesisウクライナ、Kiev、Vitas-Mロシア、Moscow、ZelinskyInstituteロシア、Moscow、およびBicoll中国、上海を含む多数の企業から市販されている。細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは市販されており、または、当業者に既知の方法で容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉および樹皮を含む植物資源、および海洋サンプルなどの天然資源から単離した化合物は、潜在的に有用な医薬品の存在を示す候補資源としてアッセイできると提案されている。スクリーニングされる前記医薬品は、化学的組成または人工化合物に由来するか、これらから合成できることは理解される。いくつかの市販ライブラリーを前記スクリーニングに使用することができる。薬物スクリーニングアッセイに利用される試薬は、溶液中で遊離しているか、固体支持材に加えてあるか、細胞内にある。薬物スクリーニングの1つの方法では、好ましくは競合的結合試験において前記miRNAを発現した組み換えポリヌクレオチドまたはその模倣体により安定して形質転換される真核または原核宿主細胞を利用する。そのような細胞は、生存可能な形態または固定された形態で、標準的な結合試験に利用することができる。例えば、前記miRNAと被験試薬の間の複合体形成を決定する、または、前記miRNAと前記標的mRNAの3’末端の間の複合体形成は前記被験試薬にどの程度干渉されるかを検討することができる。薬物をスクリーニングするためのさらなる技術には、非機能的または変化したIBD関連miRNA分子を有する上述したような宿主真核細胞株または細胞の利用が関与する。これらの宿主細胞株または細胞は不完全なmiRNA機能を示す。前記宿主細胞株または細胞は薬物化合物存在下で増殖し、前記細胞は、未処理細胞と比較した処理細胞における化合物で誘導される変化を評価する。本発明で使用することを意図した宿主細胞には、これに限定されるものではないが、哺乳類細胞、特に胃腸管に存在する細胞タイプを含む。核酸分子を導入する方法も当業者に周知である。そのような方法はAusubeletal.eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NY,N.Y.1995に説明されており、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。修飾して本発明のmiRNAを発現することのできる、様々な発現ベクターが利用できる。本明細書で例示されている具体的なベクターは単に説明のためのものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。発現方法は、Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManualorCurrentProtocolsinMolecularBiology16.3-17.441989に説明されている。サッカロミセス属の発現方法も、CurrentProtocolsinMolecularBiology1989に説明されている。本発明の発現ベクターで使用するプロモーターには、真核細胞で使用可能なプロモーターが含まれる。真核細胞で使用可能なプロモーターには、エプスタインバーウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスCMVプロモーター、AcMNPVポリヘドリンプロモーターなどのバキュロウイルスプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーターなどのピキアプロモーター、およびgal4誘導プロモーターおよびPGK構成的プロモーターなどのサッカロミセスプロモーター、およびThy-1プロモーターが含まれる。さらに、本発明のベクターには、形質転換宿主細胞の選択を容易にする、様々な多数のマーカーのうちのいずれか1つを含む。そのようなマーカーには、温度感受性に関係する遺伝子、薬剤耐性、または前記宿主生物の表現型の特徴に関与する酵素が含まれる。本発明のmiRNAを発現した宿主細胞は、炎症の発症を調節できる可能性のある化合物または薬物をスクリーニングする系を提供する。従って、1つの実施形態では、本発明の核酸分子を利用し、炎症性腸疾患経路の態様を調製する薬物を同定するアッセイに利用する、組み換え細胞株を作成することができる。別の実施形態では、前記特異的に発現されたmiRNAが腸の炎症プロセスに関与していることを特定すれば、そのようなmiRNAの発現濃度が変化した実験マウス系を作成することができる。これらのmiRNA分子を発現したトランスジェニックマウスは、IBDの発症およびIBDへの進行における前記miRNAの役割を検討するためのモデル系を提供する。実験マウスにトランス遺伝子を導入する方法は当業者に周知である。一般的な方法は3つあり、1.初期胚に対象の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを組み込む、2.新たに受精した卵の前核にDNAを注入する、および3.初期胚に遺伝子操作した胚幹細胞を組み込むなどである。上述のトランスジェニックマウスの作成は、標的タンパク質が様々な細胞炎症プロセスに果たしている役割の分子的解明を促す。そのようなマウスは、動物モデル全体で想定される治療薬を研究するinvivoスクリーニングツールを提供し、本発明に含まれる。動物の用語は本明細書で使用され、ヒトを除くすべての脊椎動物を含める。この用語には、胚および胎仔の段階を含むすべての発達段階にある個々の動物も含む。トランスジェニック動物は、組み換えウイルスによる標的組み換えまたはマイクロインジェクションまたは感染など、細胞以下のレベルでの意図的遺伝子操作により直接的または間接的に変化または受け取った遺伝子情報を有する、1若しくはそれ以上の細胞を含む動物である。トランスジェニック動物の用語は古典的な交雑育種またはinvitroでの受精を含むことを意味しないが、1若しくはそれ以上の細胞が組み換えDNA分子により変化しているか、組み換えDNA分子を受け取っている動物を含むことを意味する。この分子は、規定の遺伝子座を特異的に標的とし、染色体内に無作為に組み込まれ、または染色体外の複製DNAである可能性がある。胚細胞株トランスジェニック動物の用語は、前記遺伝子変化または遺伝子情報が胚細胞株に導入されることで、前記遺伝子情報を子孫に伝える能力が与えられるトランスジェニック動物を指す。そのような子孫が、実際前記変化または遺伝子情報の一部またはすべてを有する場合、この子孫もトランスジェニック動物である。遺伝子情報の変化は、受容者が属する動物種と異質であるか、または特定の個々の受容者と異質であるか、または前記受容者がすでに有している遺伝子情報である。最後のケースでは、前記変化または導入された遺伝子は自然の遺伝子とは異なって発現される。そのような変化したまたは異質の遺伝子情報は、ヌクレオチド配列をコードするmiRNAの導入を含む。標的遺伝子を変化させるために使用されるDNAは、様々な技術によって得られ、これに限定されるものではないが、遺伝子源の単離、単離したmRNAテンプレートからのcDNAの調製、直接的合成またはその組合せを含む。トランス遺伝子を導入する標的細胞の好ましい種類は、胎児幹細胞ESである。ES細胞は、invitro培養した移植前の胚から得られるEvansetal.,1981Nature292:154-156;Bradleyetal.,1984Nature309:255-258;Gossleretal.,1986Proc.Natl.Acad.Sci.83:9065-9069。トランス遺伝子は、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスを介した形質導入など、標準的な方法により前記ES細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ES細胞は、この後、ヒト以外の動物の胚盤胞と合わせることができる。前記導入されたES細胞はこの後前記胚に定着し、得られたキメラ動物の生殖系列に寄与する。個々の遺伝子およびその発現生成物の寄与を決定する際の問題に対する1つのアプローチは、遺伝子をコードする単離miRNAを挿入カセットとして使用し、上述したような全能性ES細胞の野生型遺伝子を選択的に不活化し、トランスジェニックマウスを作成するものである。遺伝子標的トランスジェニックマウスの作成に遺伝子標的ES細胞を利用する方法については報告があり、別の文献でレビューされているFrohmanetal.,1989Cell56:145-147;Bradleyetal.,1992Bio/Technology10:534-539。標的相同的組み換えを利用し、染色体対立遺伝子に特異的変化を挿入することで、遺伝子領域を不活化する、または望みの変異に変化させる方法が利用できる。しかし、100に近い頻度で発生する相同的染色体外組み換えと比較し、相同的プラスミド-染色体組み換えは、当初、10-6~10-3の頻度でしか検出されないと報告された。非相同的プラスミド-染色体相互作用は、同等の相同的挿入よりも105~102倍高い頻度で発生する。このように、マウスES細胞の標的組み換えの割合が低いことを克服するため、まれな相同的組み換えを検出または選択する様々な戦略が開発された。相同的な変化のイベントを検出する1つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを利用し、相同的挿入が起こった形質転換細胞プールをスクリーニングし、この後個々のクローンをスクリーニングする。代わりに、マーカー遺伝子を作成する正の遺伝子選択アプローチが開発され、このアプローチでは相同的挿入が起こる場合にしか活性化しないマーカー遺伝子が作成され、これらの組み換えを直接選択することが可能となっている。相同的組み換えを選択するために開発された最も強力なアプローチの1つは、変化の直接的な選択が行われない遺伝子用に開発されたポジティブネガティブセレクションPNS法である。前記PNS法は、前記マーカー遺伝子が独自のプロモーターを有するため、高濃度で発現されない遺伝子のターゲティングに、さらに効率的である。非相同的組み換えは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼHSV-TK遺伝子を用い、ガンシクロビルGANCまたは1-2-デオキシ-2-フルオロ-B-Dアラビノフルラノシル-5-ヨードウラシルFIAUなど、有効なヘルペス薬を用い、非相同的挿入と対抗選択することで、選択する。この対抗選択により、生存形質転換細胞の相同的組み換えの数が増加する可能性がある。本明細書に用いるとおり、ノックイン動物は、外因性のマウス遺伝子が、例えば本発明の遺伝子をコードするヒトmiRNAと置換された動物である。そのようなノックイン動物はIBD発症に関する研究に理想的なモデル系を提供する。本明細書で用いるとおり、miRNAをコードする核酸配列を、特定の組織または細胞タイプに前記コードされたmiRNAを発現させる制御配列例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーに操作により結合させるベクターを用い、miRNAをコードする核酸の発現を組織特異的にまたは細胞タイプ特異的にターゲティングことができる。そのような制御要素を用い、invitroおよびinvivoの用途の両方で利益をもたらすことができる。組織特異的タンパク質を管理するプロモーターは当該分野で周知であり、本明細書に説明されている。前記miRNAをコードする核酸配列には、トランスジェニック動物の発現に関わる、様々な異なるプロモーター配列を操作により結合させることができる。そのようなプロモーターには、これに限定されるものではないが、Thy-1プロモーター、PGKプロモーター、およびCMVプロモーターを含む。本発明のトランスジェニックマウスを使用する方法についても、本明細書で提供する。前記miRNAをコードする核酸が導入されたトランスジェニックマウスは、例えばIBDの発症を調節することができる治療薬を特定するスクリーニング法の開発に有用である。医薬品およびmiRNA療法本明細書で説明するとおり、炎症にmiRNAが果たしている役割を解明することで、IBDなどの炎症性疾患の治療および診断に有用な医薬品の開発が促される。これらの組成は、上記基質の1つに加え、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を有する。そのような材料は非毒性であり、前記活性成分の有効性に干渉しない。前記担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、経皮または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存する。個体に投与されるものがポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または本発明の他の薬学的に有用な化合物であろうとなかろうと、投与は予防的に有用な量または治療上有用な量であることが好ましくただし、場合によっては、予防が治療と考えられることもある、これは前記個体に利益を示すのに十分な量である。本明細書で説明した特定のmiRNAは治療に用いることができる。これらは、膜透過配列に選択的に結合できる。膜透過ペプチド配列は、細胞膜のmiRNAの貫通および侵入を容易にするペプチド配列を指す。典型的なペプチドには、制限なく、カポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列、HIVtatペプチドVivesetal.,JBiol.Chem.,272:16010-16017,1997、プロタミンの非毒性膜移行ペプチドParketal.,FASEBJ.1911:1555-7,2005、CHARIOT登録商標輸送試薬ActiveMotif;USPatent6,841,535、および抗菌ペプチドBuforin2を含む。本発明に関する1つの実施形態では、治療上の利益を示すようにmiRNAが送達される。本発明のmiRNAをinvivoで投与し、IBDなどの炎症性疾患を治療する方法はいくつかあり、これに限定されるものではないが、裸のmiRNA送達、miRNAの接合および送達、リボソーム担体を介した送達、ポリマー担体の送達、ナノ粒子組成、プラスミドによる方法、ウイルスの利用を含む。本発明のmiRNA組成は、被験者に投与するためのリポソームを含む送達媒体、担体および希釈剤およびその塩を有することができ、および/または薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。これは、miRNAが細胞膜を貫通し、分解を逃れるために必要である可能性がある。核酸分子の送達法については、Akhtaretal.,1992,TrendsCellBio.,2,139;DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar,1995,Maureretal.,1999,Mol.Membr.Biol.,16,129-140;HoflandandHuang,1999,Handb.Exp.Pharmacol.,137,165-192に報告されており、Leeetal.,2000,ACSSymp.Ser.,752,184-192;Beigelmanetal.,米国特許第6,395,713号およびSullivanetal.,PCTWO94/02595では、さらに、核酸分子を送達する一般的方法について説明している。これらのプロトコールは、事実上すべての核酸分子の送達に利用することができる。前記miRNAの患者への投与頻度は、これに限定されるものではないが、治療する炎症性疾患の種類および重症度、投与経路、患者の年齢および全体的な健康状態、miRNAの性質などを含む、いくつかの要因によって決まる。前記miRNAの患者への投与頻度は、1ヵ月約1回から、1週間約1回、1日約1回、1日約数回まで異なると考えられる。本発明の方法に有用な医薬品は、非経口、経口固体および液体製剤で全身投与するか、眼科用剤、坐剤、エアロゾル、局所製剤、または他の同様の製剤で投与することができる。前記適切なmiRNAに加え、これらの医薬品は、薬物の投与を亢進および促すことが知られている、薬学的に許容される担体および他の成分を含むことができる。従って、そのような組成は選択的に、例えば、水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液といった補助剤、および/または食塩水など他の薬学的に許容される担体など、他の成分を含む。ナノ粒子、リポソーム、再封赤血球resealederythrocyte、および免疫学的系など、他の考えられる製剤を使用し、本発明の方法に従い、患者に適切なmiRNAを投与することもできる。miRNAを送達するためのナノ粒子の使用、および使用できる細胞膜透過性ペプチド担体については、Crombezetal.,BiochemicalSocietyTransactionsv35:p442007に報告されている。特異的に発現されたmiRNAまたはその模倣体を有する医薬品を、例えば、経口または静脈内i.v.、筋肉内、皮下、眼窩内、鼻腔内、関節包内、腹腔内i.p.、大槽内、気管内i.t.、または関節内などの非経口、または受動または促進吸収を含む様々な経路で被験者に投与することができることは、当業者の理解するところである。同じ投与経路を、例えば、上述の小さな分子、核酸分子、ペプチド、抗体、およびポリペプチドなどの他の薬学的に有用な化合物に利用することができる。望ましい場合は、そのような特異的に発現されたmiRNAまたは模倣体を有する医薬組成物もリポソーム、ミクロスフェア、微小気泡、または他のポリマー基質に組み込むことができるGregoriadis,LiposomeTechnology,Vols.ItoIII,2nded.,CRCPress,BocaRatonFla.1993。例えば、リン脂質または他の脂質から成るリポソームは、作成および投与が比較的簡単な、薬学的に許容でき、代謝可能な非毒性担体である。miRNAまたは模倣体分子を発現する発現ベクターでは、好ましくは構成的または調節性の強いプロモーターを利用する。そのようなプロモーターは当該分野で周知であり、これに限定されるものではないが、RNAポリメラーゼIIプロモーター、T7RNAポリメラーゼプロモーター、およびRNAポリメラーゼIIIプロモーターU6およびH1を含む例えば、Myslinskietal.2001Nucl.AcidsRes.,29:250209を参照。核酸分子は、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン例えば、Gonzalezetal.,1999,BioconjugateChem.,10,1068-1074;Wangetal.、国際PCT公開第WO03/47518号および第WO03/46185号を参照、乳酸グリコール酸共重合体PLGAおよびPLCAミクロスフェア例えば、米国特許第6,447,796号および米国特許出願公開第US2002130430号を参照、生分解性ナノカプセル、および生体接着ミクロスフェア、またはタンパク性ベクターO’HareおよびNormand、国際PCT公開第WO00/53722号など、他の媒体に組み込むことで細胞に投与することができる。陽イオン性脂質およびポリマーは、負電荷のmiRNAまたは模倣体と複合体を形成することのできる、2種類の非ウイルスmiRNAまたは模倣体送達系である。miRNAを凝縮、保護するため、自己集合PEG化ポリカチオン性ポリエチレンイミンPEIも利用されてきたSchiffelersetal.,2004,Nuc.AcidsRes.32:141-110。前記miRNAまたは模倣体複合体をナノ粒子に凝縮し、前記miRNAまたは模倣体をエンドサイトーシスにより効率的に取り込むことができる。また、プロタミンの核酸凝縮性を特異的抗体と組み合せることでmiRNAまたは模倣体を送達し、本発明に利用することができるSongetal.,2005,NatBiotech.23:709-717。miRNAを有する医薬組成物はエアロゾル製剤として投与することができ、この製剤には噴霧剤または溶媒と噴霧剤との混合物に溶解、懸濁、または乳化した形態で前記miRNAを含む。前記エアロゾル製剤は、次に呼吸系または鼻腔に投与する。炎症性疾患、特に前記疾患のより重症な形態に罹患した患者では、miRNAの投与を、例えば、そのような疾患を治療する従来型の薬物または炎症プロセスに関与するタンパク質の発現または機能を調節する別のmiRNAと併用投与とした場合に特に有用である可能性がある。当業者は、前記患者に示された臨床徴候および症状に基づき、単独、または第2の薬物またはmiRNAとの併用でmiRNAを投与し、ルーティンな方法によりそのような治療の有用性をモニターすることができる。miRNAは、例えば、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、およびブデソニドなどのコルチコステロイドを含むステロイド性抗炎症薬と併用投与することができる。miRNAは、アスピリンアセチルサリチル酸、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、スリンダク、オキサプロジン、ジフルニサル、ブロムフェナク、ピロキシカム、エトドラク、およびフェノプロフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬と併用投与することもできる。miRNAは、サイトカイン受容体の阻害薬または作動薬、サイトカインまたはその受容体に対する抗体、または免疫系シグナル伝達経路に作用する薬物など、他の免疫調節因子と投与することもできる。miRNAが別の抗炎症薬と併用される場合、miRNAと抗炎症薬のいずれかまたは両方を低用量で投与することができる。miRNAを1若しくはそれ以上の他の抗炎症薬と併用投与する場合、前記miRNAおよび他の抗炎症薬は、同じ製剤で同時に投与することができる。代わりに、前記miRNAおよび他の抗炎症薬は、別の製剤で同時に投与することもできる。前記医薬品の投与は、好ましくは予防的に有効な量または治療上有効な量ただし、場合によっては、予防が治療と考えられるとし、前記患者に利益を示すのに十分である。この量は、患者のIBD症状を予防、軽減、寛解し、またはその重症度を低下させる。前記医薬品は、投与しやすく、投与量を均一にするため、投与単位に製剤化する。投与単位形態は、本明細書で使用するとおり、治療を受ける患者に適した医薬品の物理的に個別の単位を指す。各投与単位には、選択された薬学的担体と関連して望みの作用を生成するように計算された一定量の活性成分を含む必要がある。前記適切な投与単位を決定する方法は、当業者に周知である。以下の材料と方法は、本発明を実施しやすくするために示す。血清サンプル小児CD患者および健常対照者の血清は、PhiladelphiaResearchInstituteのChildren’sHospitalM.T.およびM.B.L.で施設内審査委員会により承認された研究の一環として得られ、CDの診断はこれまでに報告されたとおり、標準的なパラメーターにより確認された47-49。疾患部位はモントリオール分類により定義した50。CD活性は小児CD活性指標PediatricCrohnDiseaseActivityIndex:PCDAIにより評価した51。対照群は成長および栄養状態の研究のため募集し、身長および体格指数は正常で慢性疾患の既往はなかった。CD患者および対照の特徴は表1にまとめている。小児セリアック病の血清サンプルおよび対照はメリーランド大学医学部のAlessioFasano博士から入手した。溶血の根拠が確認されたサンプルは本研究から除外した。血清はRNAを単離するまで-80°Cで保存した。RNAの単離製造業者の使用説明書に従い、mirVanamiRNA単離キットAmbion、米国テキサス州Austinを用いて、血清60mLから全RNAを単離した。外因性CaenorhabditiselegansおよびヒトmiRNAを、血清が変性した直後に正規化の対照として加えた。RNAは、-80°Cで100mLの溶出液95°Cにより溶出し、保存した。全RNA製剤の品質は、RNA6000PicoキットAgilentTechnologies、米国カリフォルニア州SantaClaraにより、Agilent2100Bioanalyzerを用いて確認した。低密度アレイによるmiRNA分析製造業者の使用説明書に従い、TaqManヒトマイクロRNAアレイAppliedBiosystems、米国カリフォルニア州FosterCityを用いて血清miRNAの内容量を定量した。逆転写RT生成物を事前に増幅し、アレイをABIPRISM7900HT配列検出システムAppliedBiosystemsにより処理、分析した。miRNA濃度は、RNA単離時に等量で加えた外因性ヒト胎児特異的miRNAプールAのアレイではmiR-302aおよびmiR-372、プールBのアレイではmiR-302dに対して正規化し、アレイのばらつきをコントロールした52。qRT-PCR製造業者の使用説明書に従い、TaqManマイクロRNA逆転写およびmiRNAアレイキットAppliedBiosystemsを用いてRNA量1.33μLを逆転写し、増幅した。反応は2回ずつ行った。miRNA濃度は、RNA単離時に加えたヒト配列celmiR-54およびcel-miR-238と相同性のない2種類の外因性C.elegansmiRNA濃度に対して正規化した36。酵素免疫抗体法製造業者の使用説明書に従い、市販の酵素免疫抗体法キットCalbiotech、米国カリフォルニア州SpringValley;ALPCO、米国ニューハンプシャー州Salemを用いて対照およびCD患者のCRPおよびASCAIgGの血清レベルを決定した。統計解析前記低密度アレイLDA実験から有意に変化したmiRNAを、SignificanceAnalysisofMicroarraysソフトウェアStanfordUniversity、米国カリフォルニア州Stanfordを用いて同定した。他の統計計算はすべて、Stata11.0StataCorp、米国テキサス州CollegeStationを用いて行った。フィッシャーの直接確率検定、マンホイットニー検定、およびウィルコクソンの符号付順位和検定を用い、有意性を決定した。12種類のLDAサンプルすべてで検出された68種類のmiRNAを用い、階層的クラスター分析ユークリッド距離L2を用いた完全連結法を行った。受信者動作特性ROC曲線の解析を利用し、診断的有用性を決定した。miRNA間の相関は、スピアマンの相関を用いて決定した。以下の例は、本発明を実施しやすくするために提供される。これらの例はいかなる方法でも、本発明を制限する意図はない。低密度アレイqRT-PCRを用いたCDと関連した循環血液中miRNAの発見667種類の成熟ヒトmiRNAを検出可能なマイクロ流体定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法qRT-PCRのLDAプラットホームを使用し、年齢および性別をマッチさせた健常対照群と比較し、活動性疾患を有するCD患者の探索的コホート12.5±1.4歳、男児67、PCDAI=32.5±8.4、n=6におけるCD関連miRNAを特定した。階層的クラスター分析では、対照と比較したCD患者の血清miRNAプロフィールの変化が明らかになった図1A。群による個別患者の血清miRNA値の差は、マイクロアレイの有意性解析により特定した54。CD患者において、合計24種類のmiRNAが少なくとも50上昇し、偽発見率は6であった。24種類のmiRNAのうち10種類が発癌性を持つ3種類のパラロガスゲノムmiRNAクラスター、つまり、miR-17-92、miR-106b-25、およびmiR-106a-36355-57の構成要因であった。CD患者では、循環血液中miRNAは有意に低下しなかった。qRT-PCRにより直接確認するため、一連の11種類のmiRNAを選択した。3種類のパラロガスmiRNAクラスターからそれぞれ1種類ずつmiR-20a、miR-93、およびmiR-106aを含めた。前記アレイと個々のqRT-PCRの検証結果では良好な一致が観察された図1B。選択したmiRNAのうち、1種類を除くすべてがCD血清で少なくとも2.5倍と有意に増加した図1C。独立したサンプルセットにおけるCDと関連した循環血液中miRNAの確認CD患者と対照群との血清miRNA濃度の差を確認するため、人口統計学的特徴および疾患の特徴が探索的コホートと同等のCD新規発生例のより大規模で明確な群n=46、および対照被験者n=46において、qRT-PCRを行った表1。対照群と比較し、CD患者の血清では、選択した11種類のmiRNAそれぞれがP0.0001で有意に上昇していた2.7~8.7倍の範囲表2。miR-106aおよびmiR-484の結果が図2Aに示されている。miRNA値または白血球数または赤血球数の間に関連性は認められず、miRNA値の変化は単に血液学的変化を反映しているのではないことを示している。miRNA値もアルブミン濃度、赤血球沈降速度、またはCRP値と関連していなかったデータ図示せず。CDの血清は健常対照患者の血清と比較したため、あらゆる種類の腸炎時に観察された一連のmiRNAの上昇が起こる可能性がある。この可能性を取り上げるため、活動性セリアック病小児およびセリアック病に罹患していない、年齢、人種、および性別をマッチさせた対照群の血清において、miRNA値を測定した表3。CDの血清で上昇していた一連のmiRNA11種類はすべて、健常対照者と比較し、セリアック病患者の血清では変化していなかった表2および図2A。データからは、活動性セリアック病には近位小腸粘膜の炎症による障害が関与しているため、CDと関連した循環血液中のmiRNA値上昇は、腸管炎症および破壊後の一般的な結果ではないことが示唆される。スピアマンの順位相関では、各CD関連miRNAに他のCD関連miRNAそれぞれと正の相関が認められるP0.0001ことが明らかとなった。前記miRNAの中で、最もmiRNA-miRNA相関が強かったのはr=0.983、それぞれmiR-20aとmiR-106a、パラロガスクラスターの構成要因miR-17-92とmiR-106a-363であり、一方、相関が最も弱かったのはr=0.709、miR-192とmiR-484であった。対照的に、CD関連miRNA濃度は、PCDAIスコアで決定される疾患活動性とは関連していなかった。興味深いことに、食道疾患の関与は8種類のCD関連miRNAの血清濃度が高いことと有意に関連していたmiR-16、miR-192、およびlet-7bを除くすべて、P0.05。CDのバイオマーカーとしての循環血液中miRNAの臨床成績CD関連miRNAの診断的有用性を評価するため、その受信者動作特性を決定した。ROC曲線からは、前記CD関連miRNAが有望な診断特性を有し、ROC曲線下面積AUC値は0.82~0.92表4および図2B、感度は70~83、特異度は75~100あることが明らかとなった表5。これらの値は、標準的な診断閾値を用い、赤血球沈降速度の値およびCRP、ASCAIgG、およびアルブミンの血清値と比べても遜色がなかった。CDと関連した循環血液中miRNA濃度は投与により変化するか否かを決定するため、診断時および6ヵ月後の時点で、人口統計学的データおよび疾患重症度の点から、我々の大規模コホートと同様の新規発生CD患者24例の血清を分析した。ベースラインから6ヵ月までに、PCDAIスコアの中央値は有意に低下したP0.001。6ヵ月の研究のための診察の時点で、この間隔に投与した薬物と治験被験者の割合は、全身ステロイド1667、メトトレキセート14、6-メルカプトプリンまたはアザチオプリン1042、およびインフリキシマブ28であった。miR-484濃度とmiR-195濃度には有意な減少が観察された図3。他の一連のmiRNAはすべて、投与後も有意な変化を示さなかったが、ほとんどは低下する傾向があった図3B。一連のmiRNA濃度およびPCDAIスコアの変化には有意な関連性がなかった。これらの結果は、CDと関連した循環血液中miRNAが、治療介入に対する反応のマーカーを提供することを示している。内部標準miRNAを用いた、CDと関連した循環血液中miRNAの分析バイオマーカーとして循環血液中miRNAを臨床的に利用することの1つの障害は、その細胞がない性質に由来する。細胞miRNAのアッセイでは、様々なハウスキーピングRNA種を一般的に用い、組織重量、RNA収量、または品質の差を補正する。循環血液中miRNAのアッセイではそのような内部標準がないため、我々の初期アッセイでは、2種類の人工CelegansmiRNAをRNA精製時に加え、代理標準として用いた患者と方法を参照。しかし、我々のLDA分析では、miR-150およびmiR-342-3pがCD患者と対照に同等レベルで存在することが認められた。従って、我々は、これらを内部標準miRNAとして使用できるか否かを検討した。内因性標準miRNAを用いて得られた結果は、外因性標準miRNAを用いて得られた結果とほぼ同一であった。これらの結果は、今後の研究では外因性miRNAの利用を排除できることを示している。考察循環血液中miRNAは、最近、疾患、特に癌のバイオマーカー候補として浮上した36,37,39,58。本研究は、小児CDの非侵襲的バイオマーカーとしての循環血液中miRNAの可能性を証明した初の研究である。マイクロ流体qRT-PCRアレイによるCD患者の初期スクリーニングでは、健常対照者と比較し、血清miRNAプロフィールが有意に変化していることを特定した。その後、これらの所見は、はるかに大きな症例および対照セットにおいて妥当性が確認された。CDの血清で有意に変化していた24種類のmiRNAはすべて上昇した。IBDの発症機序は、炎症のシグナル伝達、腸のリンパ球浸潤、および上皮細胞の障害が関与した複雑なプロセスである。これらの各プロセスにより、循環血液中miRNA濃度が上昇する可能性がある。例えば、炎症シグナル伝達の過程で分泌されたエキソソームは、血液循環に特異的miRNAを運ぶ。腸は非常に血管に富んだ臓器であるため、固有層中の活性化リンパ球が循環血液中miRNAに寄与している可能性がある。さらに、心臓または肝臓の損傷で組織miRNAに観察された事象と同様、腸管上皮の損傷により、血液循環中の上皮特異的miRNAが増加する可能性がある39,59。例えば、我々は、CDでは循環血液中のmiR-192が上昇し、miR-192は腸管上皮で最も多く発現されたmiRNAであることも発見した31。CDにおける腸のmiRNA濃度に関する研究では、Wuら35がアップレギュレートされているmiRNAをいくつか同定し、これには我々が報告したmiRNAのうち4種類miR-16、-20a、-21、および-106aが含まれている。Let-7b、miR16、およびmiR-21は、ヒト樹状細胞で多く発現され、CDの慢性炎症の一因となっている可能性がある60,61。対照的に、内部標準のmiRNAmiR-150およびmiR-342-3pは、腸管上皮に検出されない62。一連のmiRNAの中で単一の細胞タイプに限定されているものはないが、それでもこれらは互いに大きく関連しており、CDが炎症および腸炎をいずれも反映する特定の循環血液中miRNAの特徴と関連している可能性があることを示唆している。この患者集団では、現在のマーカーはスクリーニングツールとしては最適ではないことが根拠から示されているが、IBDが疑われる小児の診断には血清学的検査が利用されることが多く、感度は55~71の範囲であることが報告された63-65。従って、CDの診断は最終的に組織病理学的根拠から行う必要があるが、改良された非侵襲的検査を導入することで、症状の発症と最終的な診断とのギャップを埋める役に立ち、早期治療が可能となる可能性がある。逆に、スクリーニング検査の結果が陰性であれば、不必要な内視鏡検査/結腸内視鏡検査を減らす役に立つ可能性がある。ここで検討した血清miRNAは、有望な診断的有用性を示し、一部の標準的血清学的マーカーと比較して好ましい性能を示した。健常対照者と比較し、MiR-484およびlet-7bそれぞれの感度は80を超え、3種類は特異度が90を超えていた。さらに、一連のmiRNAそれぞれは、年齢、人種、および性別をマッチさせた対照群と比較し、セリアック病患者の血清で変化がなく、これらのmiRNAは、一般に単純な腸炎の指標というより、IBDまたはCDに特異的であることを示唆していた。この所見は、非IBD腸疾患に存在することが多い、現在のIBD血清学的マーカーと対比される。例えば、ASCAは高い割合のセリアック病患者で検出されるが、核周囲の抗好中球細胞質抗体もセリアック病または顕微鏡的大腸炎に存在する可能性がある9,12,13。一度IBDと診断されると、成人および小児患者のいずれにおいても、現在のCDの血清学的マーカーは疾患の活動性または転帰とあまり関連していないため、限定的にしか利用されていない66,67。循環血液中miRNAに関する研究では、より動的なバイオマーカーであることが示唆され、例えば、心臓で最も豊富に発現されているmiRNAである血漿miR-1濃度68は、急性心筋梗塞と診断された時点で上昇し、退院時までに正常に戻る38。同様に、腫瘍細胞から放出されるmiRNAは、循環血液中miRNA濃度を有意に変化させる可能性があり、循環血液中miRNA濃度は腫瘍の切除後は正常化する42,69,70。我々は、6ヵ月の治療後、血清miR-484およびmiR-195濃度は診断時に観察された濃度から有意に低下することを見出した。一連のmiRNA濃度の低下は、PCDAIスコアの改善と有意に関連していなかった。しかし、臨床スコア化システム、また他の代理マーカーとして、血清miRNAは正確に粘膜レベルで改善を示し、粘膜治癒とはあまり関連していない可能性が依然としてある71,72。まとめると、この予備的研究では、小児CD患者の血清で多数のmiRNAが有意に上昇していることを特定した。これらのCD関連miRNAは、有望な臨床的有用性を見せている。従って、循環血液中miRNA、および他のCDの臨床検査マーカーおよび遺伝的マーカーを決定することで、全体的にIBD、特にCDの感度と特異度が改善した複合モデルができる。参考文献1DotanISerologicmarkersininflammatoryboweldiseasetoolsforbetterdiagnosisanddiseasestratificationExpRevGastroenterolHepatol20071265742KoutroubakisIEPetinakiEMouzasIAetalAntiSaccharomycescerevisiaemannanantibodiesandantineutrophilcytoplasmicautoantibodiesinGreekpatientswithinflammatoryboweldiseaseAmJGastroenterol200196449543PeetersMJoossensSVermeireSetalDiagnosticvalueofantiSaccharomycescerevisiaeandantineutrophilcytoplasmicautoantibodiesininflammatoryboweldiseaseAmJGastroenterol20019673044QuintonJFSendidBReumauxDetalAntiSaccharomycescerevisiaemannanantibodiescombinedwithantineutrophilcytoplasmicautoantibodiesininflammatoryboweldiseaseprevalenceanddiagnosticroleGut199842788915DubinskyMWhatistheroleofserologicalmarkersinIBDPediatricandadultdataDigDis200927259686VermeireSJoossensSPeetersMetalComparativestudyofASCAassaysininflammatoryboweldiseaseGastroenterology2001120827337ReumauxDSendidBPoulainDetalSerologicalmarkersininflammatoryboweldiseasesBestPractResClinGastroenterol20031719358AnandVRussellASTsuyukiRetalPerinuclearantineutrophilcytoplasmicautoantibodiesandantiSaccharomycescerevisiaeantibodiesasserologicalmarkersarenotspecificintheidentificationofCrohn’sdiseaseandulcerativecolitisCanJGastroenterol2008223369DesplatJegoSJohanetCEscandeAetalUpdateonAntiSaccharomycescerevisiaeantibodiesantinuclearassociatedantineutrophilantibodiesandantibodiestoexocrinepancreasdetectedbyindirectimmunofluorescenceasbiomarkersinchronicinflammatoryboweldiseasesresultsofamulticenterstudyWorldJGastroenterol2007132312810OlivesJPBretonAHugotJPetalAntineutrophilcytoplasmicantibodiesinchildrenwithinflammatoryboweldiseaseprevalenceanddiagnosticvalueJPediatrGastroenterolNutr199725142811ProujanskyRFawcettPTGibneyKMetalExaminationofantineutrophilcytoplasmicantibodiesinchildhoodinflammatoryboweldiseaseJPediatrGastroenterolNutr199317193712DamoiseauxJGBoutenBLindersAMetalDiagnosticvalueofantiSaccharomycescerevisiaeandantineutrophilcytoplasmicantibodiesforinflammatoryboweldiseasehighprevalenceinpatientswithceliacdiseaseJClinImmunol200222281813FreemanHJPerinuclearantineutrophilcytoplasmicantibodiesincollagenousorlymphocyticcolitiswithorwithoutceliacdiseaseCanJGastroenterol1997114172014BeattieRMWalkerSmithJAMurchSHIndicationsforinvestigationofchronicgastrointestinalsymptomsArchDisChild199573354515PoullisAPZarSSundaramKKetalAnewhighlysensitiveassayforCreactiveproteincanaidthedifferentiationofinflammatoryboweldisordersfromconstipationanddiarrhoeapredominantfunctionalboweldisordersEurJGastroenterolHepatol2002144091216WalkerTRLandMLKartashovAetalFecallactoferrinisasensitiveandspecificmarkerofdiseaseactivityinchildrenandyoungadultswithinflammatoryboweldiseaseJPediatrGastroenterolNutr2007444142217PfefferkornMDBooneJHNguyenJTetalUtilityoffecallactoferrininidentifyingCrohndiseaseactivityinchildrenJPediatrGastroenterolNutr201051425818JoishyMDaviesIAhmedMetalFecalcalprotectinandlactoferrinasnoninvasivemarkersofpediatricinflammatoryboweldiseaseJPediatrGastroenterolNutr200948485419TibbleJASigthorssonGFosterRetalUseofsurrogatemarkersofinflammationandRomecriteriatodistinguishorganicfromnonorganicintestinaldiseaseGastroenterology20021234506020WangYRussellIChenCMicroRNAandstemcellregulationCurrOpinMolTher200911292821VasilatouDPapageorgiouSPappaVetalTheroleofmicroRNAsinnormalandmalignanthematopoiesisEurJHaematol20108411622CaiBPanZandLuYTherolesofmicroRNAsinheartdiseasesanovelimportantregulatorCurrMedChem2010174071123FinebergSKKosikKSDavidsonBLMicroRNAspotentiateneuraldevelopmentNeuron200964303924YiRFuchsEMicroRNAmediatedcontrolintheskinCellDeathDiffer2010172293525IorioMVCroceCMMicroRNAsincancersmallmoleculeswithahugeimpactJClinOncol20092758485626PandeyAKAgarwalPKaurKetalMicroRNAsindiabetestinyplayersinbigdiseaseCellPhysiolBiochem2009232213227HebertSSDeStrooperBAlterationsofthemicroRNAnetworkcauseneurodegenerativediseaseTrendsNeurosci20093219920628LatronicoMVCondorelliGMicroRNAsandcardiacpathologyNatRevCardiol200964192929KatoMArceLNatarajanRMicroRNAsandtheirroleinprogressivekidneydiseasesClinJAmSocNephrol2009412556630PauleyKMChaSChanEKMicroRNAinautoimmunityandautoimmunediseasesJAutoimmun2009321899431McKennaLBSchugJVourekasAetalMicroRNAscontrolintestinalepithelialdifferentiationarchitectureandbarrierfunctionGastroenterology20103965416641664e165132UedaTVoliniaSOkumuraHetalRelationbetweenmicroRNAexpressionandprogressionandprognosisofgastriccanceramicroRNAexpressionanalysisLancetOncol2010111364633SlabyOSvobodaMMichalekJetalMicroRNAsincolorectalcancertranslationofmolecularbiologyintoclinicalapplicationMolCancer2009810234WuFZikusokaMTrindadeAetalMicroRNAsaredifferentiallyexpressedinulcerativecolitisandalterexpressionofmacrophageinflammatorypeptide2alphaGastroenterology20083562435e162435WuFZhangSDassopoulosTetalIdentificationofmicroRNAsassociatedwithilealandcolonicCrohn’sdiseaseInflammBowelDis20101617293836MitchellPSParkinRKKrohEMetalCirculatingmicroRNAsasstablebloodbasedmarkersforcancerdetectionProcNatlAcadSciUSA200810510513837ChenXBaYMaLetalCharacterizationofmicroRNAsinserumanovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseasesCellRes200818997100638AiJZhangRLiYetalCirculatingmicroRNA1asapotentialnovelbiomarkerforacutemyocardialinfarctionBiochemBiophysResCommun201039173739WangGKZhuJQZhangJTetalCirculatingmicroRNAanovelpotentialbiomarkerforearlydiagnosisofacutemyocardialinfarctioninhumansEurHeartJ2010316596640ChimSSShingTKHungECetalDetectionandcharacterizationofplacentalmicroRNAsinmaternalplasmaClinChem2008544829041WangKZhangSMarzolfBetalCirculatingmicroRNAspotentialbiomarkersfordruginducedliverinjuryProcNatlAcadSciUSA20091064402742TsujiuraMIchikawaDKomatsuSetalCirculatingmicroRNAsinplasmaofpatientswithgastriccancersBrJCancer20101021174943KongXDuYWangGetalDetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsinserumofpancreaticductaladenocarcinomapatientsmiR196acouldbeapotentialmarkerforpoorprognosisDigDisSci201156602944SilvaJGarci ́aVZaballosAetalVesiclerelatedmicroRNAsinplasmaofNSCLCpatientsandcorrelationwithsurvivalEurRespirJ2011376172345NgEKChongWWJinHetalDifferentialexpressionofmicroRNAsinplasmaofpatientswithcolorectalcancerapotentialmarkerforcolorectalcancerscreeningGut20095813758146WuFGuoNJTianHetalPeripheralbloodmicroRNAsdistinguishactiveulcerativecolitisandCrohn’sdiseaseInflammBowelDis2011172415047ThayuMDensonLAShultsJetalDeterminantsofchangesinlineargrowthandbodycompositioninincidentpediatricCrohn’sdiseaseGastroenterology2010139430848ThayuMShultsJBurnhamJMetalGenderdifferencesinbodycompositiondeficitsatdiagnosisinchildrenandadolescentswithCrohn’sdiseaseInflammBowelDis2007131121849DubnerSEShultsJBaldassanoJetalLongitudinalassessmentofbonedensityandstructureinanincidentcohortofchildrenwithCrohn’sdiseaseGastroenterology20091361233050SatsangiJSilverbergMSVermeireSetalTheMontrealclassificationofinflammatoryboweldiseasecontroversiesconsensusandimplicationsGut2006557495351HyamsJSFerryGDMandelFSetalDevelopmentandvalidationofapediatricCrohn’sdiseaseactivityindexJPediatrGastroenterolNutr1991124394752SuhMRLeeYKimJYetalHumanembryonicstemcellsexpressauniquesetofmicroRNAsDevBiol20042704889853PavlidisPNobleWSMatrix2pngautilityforvisualizingmatrixdataBioinformatics200319295654TusherVGTibshiraniRChuGSignificanceanalysisofmicroarraysappliedtotheionizingradiationresponseProcNatlAcadSciUSA20019851162155HeLThomsonJMHemannMTetalAmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogeneNature20054358283356KanTSatoFItoTetalThemiR106b25polycistronactivatedbygenomicamplificationfunctionsasanoncogenebysuppressingp21andBimGastroenterology2009136168970057UrenAGKoolJMatentzogluKetalLargescalemutagenesisinp19andp53deficientmiceidentifiescancergenesandtheircollaborativenetworksCell20081337274158TanKSArmugamASepramaniamSetalExpressionprofileofMicroRNAsinyoungstrokepatientsPLoSOne20094e768959WangKZhangSMarzolfBetalCirculatingmicroRNAspotentialbiomarkersfordruginducedliverinjuryProcNatlAcadSciUSA20091064402760CekaiteLClancyTSioudMIncreasedmiR21expressionduringhumanmonocytedifferentiationintoDCsFrontBiosci201028182861SilvaMALopezCBRiverinFetalCharacterizationanddistributionofcolonicdendriticcellsinCrohn’sdiseaseInflammBowelDis2004105041262DavidsonLAWangNShahMSetaln3PolyunsaturatedfattyacidsmodulatecarcinogendirectednoncodingmicroRNAsignaturesinratcolonCarcinogenesis20093020778463RuemmeleFMTarganSRLevyGetalDiagnosticaccuracyofserologicalassaysinpediatricinflammatoryboweldiseaseGastroenterology1998115822964HoffenbergEJFidanzaSSauaiaASerologictestingforinflammatoryboweldiseaseJPediatr19991344475265SaberyNBassDUseofserologicmarkersasascreeningtoolininflammatoryboweldiseasecomparedwithelevatederythrocytesedimentationrateandanemiaPediatrics200719e193966TemlAKratzerVSchneiderBetalAntiSaccharomycescerevisiaeantibodiesastablemarkerforCrohn’sdiseaseduringsteroidand5aminosalicylicacidtreatmentAmJGastroenterol20039822263167DesirBAmreDKLuSEetalUtilityofserumantibodiesindeterminingclinicalcourseinpediatricCrohn’sdiseaseClinGastroenterolHepatol200421394668LagosQuintanaMRauhutRYalcinAetalIdentificationoftissuespecificmicroRNAsfrommouseCurrBiol200212735969HuangZHuangDNiSetalPlasmamicroRNAsarepromisingnovelbiomarkersforearlydetectionofcolorectalcancerIntJCancer20101271182670YamamotoYKosakaNTanakaMetalMicroRNA500asapotentialdiagnosticmarkerforhepatocellularcarcinomaBiomarkers2009145293871AfzalNAVanDerZaagLoonenHJArnaudBattandierFetalImprovementinqualityoflifeofchildrenwithacuteCrohn’sdiseasedoesnotparallelmucosalhealingaftertreatmentwithexclusiveenteralnutritionAlimentPharmacolTher2004201677272EfthymiouAViazisNMantzarisGetalDoesclinicalresponsecorrelatewithmucosalhealinginpatientswithCrohn’sdiseaseofthesmallbowelAprospectivecaseseriesstudyusingwirelesscapsuleendoscopyInflammBowelDis20081415427本発明の好適な実施例のいくつかは上述し、具体的に例示してきたが、本発明をそのような実施例に限定する意図はない。以下の請求項に示すとおり、本発明の範囲と精神から離れずに、そこに様々な修正を加えることができる。"