"NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応するS-ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、a配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNA、b配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするDNA、及び、c配列番号9に記載のアミノ酸配列に対し、70よりも大きな同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするDNAからなる群から選択されるDNAによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。前記DNAは、配列番号9に記載のアミノ酸配列に対し、80~99.5の同一性を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、請求項1記載の酸化還元酵素。前記DNAは、配列番号9に記載のアミノ酸配列に対し、90~99.5の同一性を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、請求項1記載の酸化還元酵素。NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応するS-ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNAまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応するS-ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒する酸化還元酵素をエンコードし、a配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNAまたはその相補鎖、及び、b配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNAまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる群から選択されることを特徴とする、単離DNA。NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応するS-ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、エチル-4-クロロ-3-オキソブタン酸からR-エチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸への還元反応によって見積もられる比活性が1μmol/mgタンパク質を超え、a配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNA、b配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするDNA、及び、c配列番号9に記載のアミノ酸配列に対し、70よりも大きな同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするDNAからなる群から選択されるDNAによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応するS-ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、エチル-4-クロロ-3-オキソブタン酸からR-エチル-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸への反応によって見積もられる比活性が1μmol/mgタンパク質を超える酸化還元酵素をエンコードし、a配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNAまたはその相補鎖、及び、b配列番号8に記載のヌクレオチド配列を有するDNAまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなる群から選択されることを特徴とする、単離DNA。カルボニル化合物を対応するヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に還元する方法であって、NADH及び水の存在下で、請求項1~7のいずれか1項に記載の酸化還元酵素によってカルボニル化合物を対応するヒドロキシ化合物に還元することを特徴とする、方法。実施例1:S特異的アルコール脱水素酵素用酵母のスクリーニングスクリーニングのために,多数の様々な酵母菌株を次の培地:酵母エキス3,麦芽エキス3,ペプトン5及びグルコース10で培養したデータは全てg/L。培地を121°Cで殺菌し,更なるpH調整を行わずに振盪機にて25°C,160回転/分rpmで酵母を培養した。次いで,125mgの細胞を800μLの消化バッファー100mMトリエタノールアミンTEA,pH=7.0で再懸濁させ,1gのガラスビーズと混合し,グローブミルRetschにて4°Cで10分間min消化させた。12,000rpmで2分間遠沈した後に得た上清ライセートを次の活性スクリーニング及びエナンチオマー過剰率ee値の測定に用いた。エチル-4-クロロアセトアセテート及び2-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オンを基質として用いた。活性スクリーニング用バッチ:860μL0.1MKH2PO4/K2PO4,pH=7.0,1mMMgCl220μLNADPH或いはNADH10mM20μLライセート100μL各基質100mM反応は波長340nmで1分間追跡した。ee値測定用バッチ:20μLライセート100μLNADH或いはNADPH50mM60μL基質エチル-4-クロロアセトアセテート100mM24時間h後,ee測定用バッチをクロロホルムで抽出し,エナンチオマー過剰率をガスクロマトグラフィーGCによって測定した。エナンチオマー過剰率は次のように計算する。ee=R-アルコール-S-アルコール/R-アルコールS-アルコール×100DSMZは,DeutscheSammlungfuerMikroorganismenundZellkulturen,MascheroderWeg1b,38124Braunschweigを示す。酵素単位の定義:1Uは,1分当たり基質1μmolを反応させるのに必要な酵素量に相当する。実施例2:ピキアカプスラータからのNADH依存性S特異的酸化還元酵素の単離ピキアカプスラータP.カプスラータからNADH依存性酸化還元酵素を単離するため,実施例1に記載したように微生物を培養した。定常期に達した時点で,細胞を採取し,遠沈によって培地から分離した。ガラスビーズを用いた湿式粉砕によって酵素の遊離を行ったが,酵素遊離は他の消化方法によって行うこともできる。この目的のために,100gのP.カプスラータを400mLの消化バッファー100mMトリエタノールアミン,1mMMgCl2,pH=7.0で懸濁させ,フレンチプレスによってホモジナイズした。遠沈7000rpm後に得られた粗抽出物を更に精製し,FPLC高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって再処理した。本発明に係る酸化還元酵素は,Q-SepharoseFastFlowMessrs.ファルマシア及びUnoQバイオラッド,ドイツ,ミュンヘンを用いたイオン交換クロマトグラフィーによって2連続工程で精製することができた。この目的のために,50mMのリン酸カリウムバッファーpH=7.0で平衡化したQ-SepharoseFF-カラムへ遠沈後に得られたライセートを直接適用し,線形塩勾配を増加させながら溶出させた。その際,該酸化還元酵素は0.2~0.3MNaClで溶出した。酸化還元酵素含有画分を集め,限外ろ過排除限界:10kDaによって適切な体積まで濃縮した。次いで,濃縮した酸化還元酵素画分を再処理し,更に上述同様のバッファーを用い,UnoQによって精製した。これにより,該酵素は0.1MNaClで溶出した。その直後,得られた精製酸化還元酵素の分子量をゲル浸透Superdex200HR;ファルマシア,100mMトリエタノールアミン,pH=7,0.15MNaClによって測定した。カタラーゼ232kDa,アルドラーゼ158kDa,アルブミン69.8kDa及びオボアルブミン49.4kDaを分子量標準品として用いた。得られた結果を次の表2にまとめる。酸化還元酵素の酵素活性は実施例1に記載の試験系活性スクリーニング用バッチにて測定し,タンパク質量の測定については,ローリーLowryら,JournalofBiologicalChemistry,1931951年:265~275,或いはピーターソンPetersonら,AnalyticalBiochemistry,1001979年:201~220に従って行った。酵素活性をタンパク質量で割った商によって比活性が得られるが,ここでは1μmol/minの転化反応が1単位Uに相当する。ゲル浸透によって測定した本発明に係る酸化還元酵素の分子量は,天然状態で140±10kDaであった。実施例3:本発明に係る酸化還元酵素のN末端配列の決定ゲル浸透後,実施例2に記載の酵素調製物を10ドデシル硫酸ナトリウムSDSゲルに分画し,ポリビニリデンジフルオライド膜PVDF膜上に移した。約35~45kDaにおける明確なバンドをエドマン分解Procise492PE-バイオシステムによるN末端配列決定に付した。次のN末端配列が得られた。配列番号10KTQAGYIFKKGA実施例4:ピキアカプスラータ由来酸化還元酵素のクローニング真核微生物ピキアカプスラータは,サッカロマイセタセアSaccaromycetaceaのファミリーに属する。該微生物のゲノム構造は,エキソン-イントロン配列を示す。従って,エナンチオ選択的酸化還元酵素をコードする遺伝子配列を同定するため,ピキアカプスラータの活性細胞からcDNAライブラリーを調製した。4.1ピキアカプスラータ細胞からの全RNAの調製ピキアカプスラータ由来の新鮮細胞600mgを2.5mLの氷冷LETS10mMtris-HCl,pH=7.4,10mMEDTA,100mMLiCl,0.2SDSバッファーに再懸濁させた。得られた細胞浮遊液に,硝酸で洗浄し3mLのフェノールpH7.0で平衡化した5mL約20gのガラスビーズを添加した。その直後,バッチ全体に対して,1回30秒間secの振盪VortexGenie2,ScientificIndustries社,米国,ニューヨークと30秒間の氷上冷却とを交互に行い,この処理を合計10分間行った。次いで,更に氷冷LETSバッファー5mLを添加した。得られた細胞浮遊液を11,000g,4°Cで5分間遠沈した。水相を除去し,抽出を2回,同体積のフェノール:クロロホルム:3-メチル-1-ブタノール24:24:1で行った。その後,クロロホルムで抽出を行った。最終抽出を行った後,1/10vol.の5MLiClを添加して,得られた全RNAを-20°Cで4時間沈殿させた。1mgの単離RNAを用いて,オリゴ-dTセルロースmRNAPrepKit,キアゲンによるmRNA回収を行った。引き続き沈殿を行った後,5μgのmRNAを用いて,cDNA合成pBluescriptIIXRcDNALibraryConstructionKit,ストラタジーンを行った。該メーカーの指示に従って構築したライブラリーをXL-10Gold大腸菌に形質転換し,S-ADH活性について検討した。NADHを補因子として用い,エチル-4-クロロアセトアセテートを基質として用いて,吸光度の減少に基づき2種類のクローン2/1及び2/2を同定し単離した。プライマーT7配列番号3及びプライマーT3配列番号4を用い,該クローンに含まれるプラスミドの多重クローニング部位によって配列決定を行った結果,サイズ1175bpの断片配列番号1が得られた。前記断片は,366個のアミノ酸を含む融合タンパク質配列番号2をコードし,β-ガラクトシダーゼのa断片と本発明に係る酸化還元酵素の配列とから構成される。4.2ピキアカプスラータ由来S-ADHをコードする全長転写物のPCRポリメラーゼ連鎖反応による合成配列番号1に基づき,特定のプライマーを構築した後,全長転写物を適切な発現系にクローニングした。その際,NdeI或いはSphIの認識配列を有する5’-プライマーとHindIIIの認識配列を有する3’-プライマーとを修飾した配列番号5,配列番号6,配列番号7。オリゴ1-NdeI:5’-GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’オリゴ2-SphI:5’-CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC-3’オリゴ3-HindIII:5’-CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT-3’ピキアカプスラータの発現ライブラリーのクローン2/1から単離したプラスミドDNAをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。増幅については,PCRバッファー[30pMolのプライマー及び2.5UのPlatinumPfxDNA-ポリメラーゼインビトロジェン当たり,10mMtris-HClpH8.0;50mMKCl;10mMMgSO4;1mMdNTP混合物Nは塩基A,T,C或いはGを表わす]において50ngの鋳型を用い,次の温度サイクルで行った。サイクル1:94°C,2分間サイクル2×30:94°C,15秒間58°C,30秒間68°C,75秒間サイクル3:68°C,7分間4°C,∞精製後,得られたPCR産物を,エンドヌクレアーゼNdeI及びHindIII或いはエンドヌクレアーゼSphI及びHindIII1アガロースゲルを用いて消化し,pET21aベクターノバジェン或いはpQE30ベクターキアゲンのバックボーン同エンドヌクレアーゼで処理済に連結した。連結バッチの2イルilを大腸菌Top10F’細胞インビトロジェンに形質転換した後,エンドヌクレアーゼNdeI及びHindIII或いはエンドヌクレアーゼSphI及びHindIIIを用いた制限解析によってアンピシリン耐性コロニーのプラスミドDNAを試験し,1,100bpのサイズを有するインサートの存在について確認した。発現構築物pET21-PC10について配列決定を行った。本発明に係る酸化還元酵素をコードするピキアカプスラータ由来転写物は,全部で1026bpのオープンリーディングフレーム配列番号8を有するが,これは341個のアミノ酸から成るタンパク質配列番号9に対応する。4.3P.カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素のStarBL21De3大腸菌細胞における発現コンピテント大腸菌StarBL21De3細胞インビトロジェンを本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物pET21-PC10で形質転換した。500nmで測定される光学密度が0.5となるまで,形質転換菌株の培養をアンピシリン50ig/mLを含有するLB培地1トリプトン,0.5酵母エキス,1NaClにて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は,イソプロピルチオガラクトシドIPTGの添加最終濃度1mMによって開始した。誘導バッチを25°C,220rpmで更に15時間インキュベートした。得られた酵素活性は約6000U/g湿細胞質量となった。4.4P.カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素のRB791大腸菌細胞における発現コンピテント大腸菌RB791細胞を本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物pQE30-PC12で形質転換した。500nmで測定される光学密度が0.5となるまで,形質転換菌株の培養をアンピシリン50ig/mL含有LB培地1トリプトン,0.5酵母エキス,1NaClにて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は,IPTGの添加最終濃度0.1mMによって開始した。誘導バッチを25°C,220rpmで更に15時間インキュベートした。得られた酵素活性は約1000U/g湿細胞質量となった。実施例5:P.カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の特徴付け5.1最適pH値表3に示すバッファーを調製した。各バッファーにおいて各バッファー成分の濃度は50mMとなった。測定用バッチ30°C:870μL表3に記載の各バッファー系20μLNADH10mM8.6mg/mL水10μL希釈酵素インキュベーションを約2~3分間続け,その直後,100μLの基質溶液100mMエチル-4-クロロ-3-オキソブタン酸を添加した。最適pH値を求めるため,表3に示した各バッファーにおいて酵素反応を確認した。酸化反応における最適pH値を求めるため,NADHを補因子として用い,S-メチル-3-ヒドロキシブタン酸を基質として用いた。本発明に係る酵素の場合,還元反応における最適pH値は6.5~7であり,酸化反応における最適pH値は7.8~8.2であることが確認できた。5.2pH安定性組換え酸化還元酵素の活性については,表3に記載のバッファー系へ中における保存性によって確認した。この目的のために,各種バッファー50mMをpH領域4~11で調製し,実施例4で産生した酸化還元酵素を該バッファーで希釈した。インキュベーションを30分間,60分間及び300分間行った後,各バッチから10μLを採取し,実施例1に記載の活性試験に用いた。これにより,該酵素をリン酸カリウムバッファー50mMpH=7.0に希釈1:20した直後に得られた測定値が初期値となる。上述の条件下で,前記初期値は約0.70/分の吸光度変化量に相当し,これを100値として設定し,以降の測定値は全て初期値に対して求めた。その際,P.カプスラータ由来組換え酸化還元酵素はpH5.5~8.5で安定であり,実質的に活性を失うことなく少なくとも5時間インキュベート可能であることが認められた。pH9.0超又は5.0未満でインキュベーションを行った場合,該酵素は直ちに失活した。5.3最適温度最適試験温度を求めるため,標準的な測定用バッチにて温度範囲15°C~70°Cで酵素活性を測定した。表4から分かるように,45°Cで酵素活性は最大となり,その後,活性は急速に低下する。5.4温度安定性温度安定性については,実施例5.2で記載した方法と同様に15°C~70°Cの範囲で確認した。この目的のために,精製酸化還元酵素の1:20希釈物を各温度で60分間及び180分間インキュベートした後,上述の試験用バッチを用いて30°Cで測定を行った。本例においても,精製酸化還元酵素をリン酸カリウムバッファー50mMpH=7.0に希釈した直後に得られた測定値を初期値として用いた。本例においても,前記初期値を100値として設定した。ここで,該酵素は温度範囲15°C~40°Cでは完全に安定であり,3時間のインキュベーション後,如何なる活性損失も見られない。55°Cにおいては,30分後には既に酵素活性が検出できない。5.5基質スペクトル/エナンチオマー過剰率本発明に係る酸化還元酵素の基質スペクトルについては,多数のケトンやオキソ酸及びそのエステルを用いて酵素活性を測定することによって確認した。この目的のために,実施例5.1に記載の標準的な測定用バッチを様々な基質と共に用いた。エチル-4-クロロアセトアセテートの場合の活性を100とし,これに対して他の基質全ての場合の活性を求めた。ee値を測定するため,選択した基質に対して次の反応バッチを用いた。100μLNADH50mM60μL基質100mM1~2Uの本発明に係る酸化還元酵素24時間後,ee測定用バッチをクロロホルムで抽出し,得られたアルコールのエナンチオマー過剰率をGCによって測定した。表5から分かるように,広範囲の2-及び3-オキソ酸エステルや芳香族ケトン及び脂肪族ケトンが,本発明に係る酸化還元酵素によって立体選択的に還元される。5.5溶媒安定性P.カプスラータ由来酸化還元酵素の酵素安定性については有機溶媒の存在下で検討した。この目的のために,該酸化還元酵素を後述の各溶媒混合物水混和性有機溶媒の場合で1:20希釈し,室温20°C~24°C;RTでインキュベートした。次いで,10μLの酵素溶液を標準的な試験バッチに用いた。本例においても,バッファーリン酸カリウムバッファーKPP100mM,pH=7.0で希釈後の初期値を100とし,他の値全てを前記初期値に対して求めた。水不混和性有機溶媒の場合も同様にリン酸カリウムバッファーで希釈を行い,同体積の有機溶媒をバッチに添加し,このバッチをサーモミキサーにて170rpm,RTでインキュベートした。活性については水相で測定した。結果を表6に示す。表6から分かるように,P.カプスラータ由来酸化還元酵素は,有機溶媒に対して驚くべき安定性を示す。確立された学説とは対照的に,本発明に係る酸化還元酵素は,純粋なバッファーでのインキュベーションと比べて,水混和性有機溶媒及び水不混和性有機溶媒においても安定している。従って,本発明に係る酸化還元酵素は,DE10119274A1に記載の二相系に用いることができる。5.7調製における転化反応Preparativeconversions5.7.1エチル-4-クロロアセトアセテートからエチル-R-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸への還元調製用バッチとして,34Lのバッファー100mMTEA,pH=7,1mMZnCl2,10グリセロール,4Lのイソプロパノール,4Lの4-クロロアセトアセテート,4gのNAD及び360万Uのピキアカプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら,室温で24時間インキュベートした。24時間後,用いた4-クロロアセトアセテートの99が還元された。次いで,得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し,溶媒をロータリーエバポレータによって除去し,粗生成物を蒸留した。このようにして,エナンチオマー過剰率が99のエチル-R-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸を2.8L3.4kg回収した。この場合,用いた抽出物量に対する収率は70となる。5.7.22-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オンからR-2-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オールへの還元調製用バッチとして,164mLのバッファー100mMTEA,pH=7,1mMZnCl2,20グリセロール,16mLのイソプロパノール,メチルtert-ブチルエーテルMTBE20mLに溶解した20gの2-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オン,10mgのNAD及び20,000Uのピキアカプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら,室温で24時間インキュベートした。24時間後,用いた2-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オンの96が還元された。次いで,得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し,溶媒をロータリーエバポレータによって除去した。このようにして,エナンチオマー過剰率が100のR-2-クロロ-1-3-クロロフェニルエタン-1-オールを15g回収した。この場合,用いた抽出物量に対する収率は77となる。"