高いエタノール生産を可能にするように改変された好熱性微生物であって、当該改変が野生型好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化である、前記微生物。前記微生物が、制限系を含まない、請求項1に記載の微生物。前記微生物がゲオバチルス種である、請求項1又は2に記載の微生物。前記微生物がゲオバチルスサーモグルコシダシウスである、請求項1~3のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、胞子形成菌である、請求項1~4のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、最大30エタノールを含む培養培地中で安定である、請求項1~5のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、セロビオース及び/又はスターチ、又はそれらのオリゴマーを代謝できる、請求項1~6のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、高頻度で形質転換される、請求項1~7のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、40°C~85°C、好ましくは50°C~70°Cの温度で増殖する、請求項1~8のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、非天然pdc遺伝子を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、非天然adh遺伝子を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の微生物。前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はその一部が欠失された、請求項1~11のいずれか一項に記載の微生物。前記微生物が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子において組込み要素を含まない、請求項1~12のいずれか一項に記載の微生物。NCIMB寄託番号第41275号として寄託された微生物。C3、C5、又はC6の糖、又はそれらのオリゴマーが存在する適切な状況の下で、請求項1~14のいずれか一項に記載の微生物を培養することを含む、エタノールの生産方法。前記方法が、40°C~70°Cの温度で行われる、請求項15に記載の方法。前記温度が、52°C~65°Cである、請求項16に記載の方法。前記微生物が、4~75のpHの培養物中に維持される、請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。pUB190ldhとして本明細書中に定義されるプラスミド。請求項19に記載のプラスミドを含む好熱性微生物。請求項1~14のいずれか一項に記載の微生物を含む動物飼料。本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を妨げるために、野生型好熱性微生物を改変することに基づく。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することは、ピルビン酸を乳酸へと分解することを妨げるために役立ち、その結果、ピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼを用いてピルビン酸をエタノールへと分解することを促進する。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、当該遺伝子中における欠失又は当該遺伝子の欠失により妨げられる場合が好ましい。野生型の微生物は、任意の好熱性微生物であってもよいが、当該微生物がバチルスsppの微生物である場合が好ましい。特に、当該微生物が、ゲオバチルス種、特にゲオバチルスサーモグルコシダシスである場合が好ましい。改変用に選択された微生物は、野生型と呼ばれており、つまり、当該微生物は、実験室で生産された突然変異体ではない。微生物は、好熱菌を含むと予測される環境サンプルから単離されてもよい。単離された野生型微生物は、エタノールを生産する能力を有するが、改変されていないと、乳酸が主要な発酵産物となるようである。単離株は、高温でヘキソース及び又はペントース糖、並びにそれらのオリゴマー上での増殖能力について選択される。本発明の微生物を発酵過程において使用することを可能にするある望ましい特性を、当該微生物が有するということが好ましい。当該微生物は、好ましくは、制限系を有すべきではなく、それによりinvivoメチル化についての必要性を避ける。さらに、当該微生物は、少なくとも3エタノールで安定であるべきであり、そして基質として、セルビオース及びスターチを含むC3、C5、及びC6糖を利用する能力を有するべきである。当該微生物が高頻度で形質転換可能である場合が好ましい。さらに、当該微生物は、03h1及びそれより高い希釈割合を支える連続培養における増殖割合を有するべきである。当該微生物は好熱性であり、そして40°C~85°Cの温度範囲で増殖する。好ましくは、当該微生物は、50°C~70°Cの温度範囲で増殖する。さらに、当該微生物が、pH72以下の条件、特にpH69~pH45の条件で増殖する。当該微生物は胞子形成体であってもよいし、又は胞子形成できなくともよい。発酵過程の成功は、必ずしも微生物の胞子形成能に依存することはないが、特定の状況では、発酵過程の最後において当該微生物を動物飼料として使用することが望まれる場合、胞子形成菌を用いることが好ましい。これは、動物飼料として使用される場合に、胞子形成菌が良好な免疫刺激を提供するという能力のためである。胞子形成微生物はまた、発酵の間に胞子形成を開始する能力を有し、その結果遠心を必要とすることなく単離できる。したがって、微生物は、複雑又は高価な分離方法を必要とすることなく、動物飼料に使用できる。乳酸デヒドロゲナーゼの核酸配列が現在知られている。当該配列を用いて、当業者は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を標的として、様々なメカニズムを介して当該遺伝子の不活性化を達成することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、トランスポゾンの挿入により、又は好ましくは、遺伝子配列、又は遺伝子配列の一部が欠失することにより不活性化される場合が好ましい。欠失が好ましい。なぜなら、欠失は、遺伝子配列の再活性化についての問題を避けることができ、この問題はトランスポゾンによる不活性化が使用される場合にしばしば生じるからである。好ましい実施態様では、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、温度感受性プラスミドの組込みにより不活性化され、当該プラスミドは、プラスミドと微生物染色体との自然の相同組換え又は組込みを達成する。染色体組込み体は、抗菌剤への組込み体の抵抗性に基づいて選択できる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子への組込みは、一重交差相同組換え又は二重交差組換えcrossrecombinantにより生じてもよい。好ましい実施態様では、微生物は、異種アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び異種ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む。これらの異種遺伝子の発現は、エタノールが主な発酵産物となるように代謝を仕向ける酵素群の生産をもたらす。これらの遺伝子は、典型的に嫌気発酵をもたらす微生物、例えば、ジモモナス種、例えばジモモナスモビリスから得られてもよい。これらの遺伝子を微生物へと取り込ませる方法が知られており、例えば、Ingramら、BiotechBioEng199858204214及びUS5916787に知られており、これらの内容は、本明細書に援用される。遺伝子は、当業者により認められるように、プラスミド中に導入されてもよいし、又は、染色体中に組込まれてもよい。本発明の微生物は、選択された好熱性微生物にしたがって、慣用される培地条件下で培養されてもよい。基質、温度、pH、及びほかの増殖条件の選択は、既知の培地要件に基づいて選択できる。例えば、WO0149865及びWO0185966を参照のこと。それぞれの内容は、本明細書に援用される。本発明は、一例として、添付の図面を参照して以下の実施例に記載される。LDH遺伝子の不活性化実施例1一重交差突然変異誘導LDHノックアウトベクターの開発約800bpのldh遺伝子断片の一部を、HindIII及びXbaIを用いて温度感受性デリバリーベクターpUB190にサブクローニングして、77kbのpUB190ldhプラスミドを得た。pUB190プラスミドは、以下に記載されるようにNCIMBに寄託された。10個の推定の大腸菌JM109形質転換体を制限酵素分析により確認し、そして2個の培養物を用いて形質転換用のプラスミドDNAを得た。pUB190ldhをHindIII及びXbaIで切断することにより、予期されたldh断片が放出される。ゲオバチルスサーモグルコシダシウス11955をpUB190ldhで形質転換したカナマイシン選別を用いて、54°Cで24~48時間後に、3個全ての被験プラスミドを有する形質転換体を得た。ldh形質転換体を、ゲオバチルスサーモグルコシダシス11955から単離し、そしてHindIII及びXbaIを用いて制限酵素分析により確かめた。LDH遺伝子ノックアウト温度感受性プラスミドを染色体上のldh遺伝子中に組込むことにより、遺伝子ノックアウトを行った。プラスミドpUB190ldhは、Gt11955において54°Cで複製されるが、65°Cでは複製されなかった。選別を、カナマイシンを用いて維持した。次に増殖温度を65°Cに増加させた。自然の組替え又は組込みは、プラスミドと染色体との間で生じる。染色体への組込み体をカナマイシンに対する組込み体の抵抗性について選別した。相同配列がプラスミド上に存在するので、組込みがldh遺伝子に対してされる。ldh遺伝子への標的組込みは、一重交差組換えとして知られる方法により生じた。プラスミドは、ldh遺伝子に取込まれて、不活性ldh遺伝子をもたらす。タンデムの繰り返しは、数コピーのプラスミドが組み込まれる場合に生じうる。方法論及び結果2個の異なる方法が組込み体を得るために試みられた:方法1:4×50mlのTGP培養物を54°Cで12~18時間増殖させた。細胞を遠心によりペレット化し、そして1mlのTGPに懸濁する。懸濁液をTGPプレート上に撒きそして一晩68°Cでインキュベートした。組込み体を取り、そして新たなTGPプレート上の50平方グリッド上に撒き、そして68°Cで一晩インキュベートした。方法2:1×50mlのTGP培養物を54°Cで12~18時間増殖させた。1mlの培養物を用いて、50mlの新たなTGP培養物へと植菌し、当該培養物を68°Cで12~18時間増殖させた。次の日当該培養物を50mlの新たなTGP培養液上で前培養し、そして68°Cでさらに12~18時間増殖させた。培養物をTGPプレート上に撒き、そして68°Cで一晩インキュベートした。プレート上でコンフルエントにまで増殖させた。単一のコロニーを、新たなTGPプレートの50平方グリッド上に撒き、そして一晩68°Cでインキュベートした。スクリーニング推定の組込み体を、以下のアッセイを用いて、ldh遺伝子ノックアウトについてスクリーニングした。1プレート選別68°Cで、SAM2プレートkanを伴う上に数百の組込み体をレプリカプレートする。乳酸陰性細胞は、少ない酸しか産生せず、そして緩衝液を伴わない発酵培地中で野生型に対して増殖利得を有するであろう。2PCR選別コロニーPCRを用いて、プラスミドがldh遺伝子中に組み込まれたかを決定する。組込み部位に隣接するプライマーを選択することにより、ldh遺伝子組込みが生じたかを決定することができる。3乳酸アッセイこのアッセイは、組込み体が、68°CでSAM2中で一晩増殖したときに、乳酸を産生するかを決定する。この培養上清を、乳酸決定用のSigma乳酸試薬を用いて乳酸濃度を試験した。乳酸陰性組込み体をさらに、PCRにより特徴決定し、そして発酵容器内での安定性について評価した。ゲオバチルスサーモグルコシダシスNCIMB11955についての電気穿孔プロトコルTGP培地中で一晩培養物を増殖させ、等量の20グリセロールを加え、そして1mlの一定量へと分け、そして80°Cでクリオチューブ中で貯蔵することにより、NCIMB11955の凍結ストックを作成した。250mlのコニカルフラスコ中の50mlのTGPに植菌するために、1mlの当該ストックを使用し、培養物がOD60014に達するまで、55°C250rpmでインキュベートした。フラスコを氷上で10分間インキュベートし、次に培養物を20分間4°C4000rpmで遠心した。ペレットを50ml氷冷電気穿孔培地中に懸濁し、そして20分間4000rpmで遠心した。さらに3回洗浄を行い1×25ml及び2×10ml、次にペレットを15ml氷冷電気穿孔培地中に懸濁し、そして60μlの一定量に分ける。電気穿孔のために、1~2μlのDNAを、氷上に維持されたエッペンドルフチューブ中の60μlのエレクトロコンピテント細胞に加え、そしてゆっくり混合した。この懸濁液をあらかじめ冷却された電気穿孔キュベットに移し、そして2500V、10μF容量及び600Ωの抵抗で電気穿孔した。パルスをかけたすぐ後に、1mlのTGPを加え、混合し、そして懸濁液をスクリュー式の蓋のチューブに移し、そして52°Cで1時間、振盪水浴中でインキュベートした。インキュベート後、懸濁液は、直接撒かれるか又は4000rpmで20分間遠心され、200μl~500μlのTGPで懸濁し、そして適切な抗生物質を含むTGPアガー上に撒かれた。LDH遺伝子の不活性化二重交差突然変異利用可能な11955LDH配列に基づきプライマーを設計した。ノックアウト戦略は、2つのアプローチによりLDH遺伝子内で内部欠失を作成することに基づく。戦略1:LDHコード配列の中間付近の2個の固有制限部位を、欠失を作り出すために用いた。利用可能なLDH配列の大部分をカバーするゲノムDNAから1の大きいPCR産物を作成し、そしてpUC19のマルチプルクローニングサイトのSmaI部位にクローニングした。次にpUC19クローンをBstEII及びBsrGIで順次切断し、そしてクレノー切断後に再ライゲーションして、LDH遺伝子内にBstEIIとBsrGIとの間の内部欠失を作成した。戦略2実施例2を参照のこと:LDH遺伝子を2個のPCR産物としてクローニングし、オリゴプライマーにNotI部位を導入して、2個のPCR産物が一緒にpUC19にライゲーションすることを可能にし、LDH配列の中間に欠失を作り出した。内部欠失を有する2個のLDH遺伝子を、ゲオバチルス用の潜在的な3個のデリバリーシステムにサブクローニングした。デリバリーベクターは、電気穿孔により11955に形質転換された。遺伝的戦略情報:相同組替えについてのデリバリーシステムの開発ノックアウトを作成するために、突然変異された遺伝子を標的生物へとデリバリーし、そして標的野生型遺伝子と相同組換えをすることによりゲノムへと組込むように選択される効率的なシステムが必要とされる。原理的に、当該効率的なシステムは、グラム陽性レプリコンを伴わないが、グラム陽性選択可能マーカーを有する大腸菌ベクター上に当該DNAを導入することによって達成できる。これは、高い形質転換効率を必要とする。ゲオバチルス11955用に開発された電気穿孔方法は、pNW33Nを用いて、1μgのDNAあたり3×104形質転換体を作成する。グラム陽性レプリコンは、BGSCカタログのpBC1から得られ、そして配列データベース中のpTHT15から得られる。pNW33N上のcat遺伝子は、大腸菌とゲオバチルスの両方において選別のために使用される。プラスミドをStratageneXL1red突然変異誘発株を通して継代することにより、pNW33Nの温度感受性突然変異体を作成した。実施例2遺伝子置換によるLDH突然変異体の作成遺伝子置換により、ゲオバチルスサーモグルコシダシウスNCIMB1955において、LDH遺伝子の安定した突然変異を作成するためにさらなる戦略を設計した。当該戦略は、コード配列の中央部付近の42bp欠失を作成し、そしてこの位置に新規のNot1制限酵素切断部位を導入する7bpを挿入することに関した。この挿入された配列は、下流のフレームシフト突然変異を引き起こすことを意図した。当該戦略は、2個のPCR断片を用い、新規のNotI部位を導入するオリゴプライマーを用いて、欠失を作成することに関した。プライマーは、11955由来のLDHコード領域の部分配列上に基づくように設計された。使用されるプライマーの配列は以下に示される。ゲノムDNAの調製ゲノムDNAを11955から調製して、PCRについてのテンプレートとして用いた。52°CでTGP培地中で増殖した11955の20mlの一晩培養した培養物から得た細胞を、4000rpmで20分間遠心することにより回収した。細菌ペレットを5mlのSTE緩衝液03Mスクロース、25mMトリス塩酸及び25mMEDTA中で懸濁し、26mgのライソザイム及び50μlの1mg/mlリボヌクレアーゼAを含有するpH80に調節した。これを、30°Cで1時間インキュベートし、次に5mgのプロテイナーゼKを加え、そして50μlの10SDSを加え、1時間37°Cでインキュベートした。溶解した培養物を次に連続的に等体積のフェノール/クロロホルムで抽出し、続いてクロロホルムで抽出し、次にイソプロパノールで沈殿した。氷冷70エタノールで2回洗浄した後に、DNAペレットを05mlTE緩衝液中に再溶解した。LDH欠失コンストラクトの作成RobocyclerGradient96を用いてPCRを行った。そして反応条件は以下のとおりである:サイクル1;95°Cで5分間変性、47°Cで1分間アニーリング、72°Cで2分間伸張、サイクル230回;95°Cで1分間変性、47°Cで1分間アニール、72°Cで2分間伸張、そしてさらに72°Cで5分間インキュベート。使用される酵素は、Pfuポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼの等量混合物であった。使用される緩衝液及びdNTP組成及び濃度は、販売元によりPfuについて推奨されているものであった。NCIMB11955由来のゲノムDNAをテンプレートとして用いて得られたPCR産物は、アガロースゲル電気泳動により精製され、そして、QIAquickGelExtractionKitを用いることによりアガロースゲルから溶出される。精製されたPCR産物を、前もってSmaIで切断されたpUC19にライゲーションし、そしてライゲーション混合物を、大腸菌DH10Bを形質転換するために使用した。アンピシリン耐性のコロニーを選別し、そして含まれたプラスミドが単離され、そして制限酵素分析により特徴付けられ、そしてインサートの向きを確認した。pUC19に挿入された断片2を有するプラスミド中のPstI部位の最も近くにプライマー4上に導入された新規のPstI部位を有するをNotI及びPstIで切断した。得られた断片を、プラスミドを直線化するためにNotI及びPstIで切断された断片1を有するpUC19プラスミドにライゲーションした。このライゲーション混合物を大腸菌DH10Bを形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性のコロニーを選択し、そして含まれるプラスミドを単離し、そして制限酵素分析により特徴決定した。所望されるコンストラクトLDHコード領域は欠失と導入されたNotI部位有するについての予期される制限酵素パターンを有するプラスミドを同定し、そしてM13mp18リバース及びフォワードプライマーを用いて配列決定することにより確かめた。突然変異されたLDH遺伝子を、HindIII及びEcoRIでの切断により、pTM003から切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製し、続いてQIAquickゲル切り出しキットを用いてアガロースから溶出した。当該断片を、クレノーポリメラーゼで処理して、平滑末端を作成し、そしてpUB190ベクターに導入した。これは、XbaIで切断し、次にクレノー処理し、続いて上で記載されるようにゲル精製することにより直線化されたpUB190と平滑末端ライゲーションすることにより達成された。ライゲーション混合物は、大腸菌SCS110を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性コロニーを選別し、そして含まれるプラスミドを単離し、そして制限酵素分析により特徴決定した。切断コンストラクトについて予期される制限酵素パターンを有するプラスミドを同定し、そして実施例1に記載されるように電気穿孔プロトコルを用いて電気穿孔することにより、NCIMB11955を形質転換するために使用した。二重交差による遺伝子置換LDH突然変異体の作成と特徴決定この様式で得られたpTM014の推定の第一組込み体を用いて二重組換え体を得た。これは、TM15をカナマイシンを含まないTGP培地中で連続的に継代することにより達成された。5回の継代振盪培養物を用い、54°Cで8時間から52°Cで16時間に変更し、250rpmで5mlのTGPを入れた50mlチューブを用い、各段階で1のトランスファーを用いた。これらの5回の継代の後に、得られた培養物をTGP中で連続的に希釈し、そして54°Cでのインキュベートのために100μlのサンプルをTGPアガープレートに撒いた。12μg/mlのカナマイシンを含むTGPアガー上に得られたコロニーをレプリカプレートを用いて、カナマイシン感受性のコロニーを同定した。精製するためにアガー上に単一のコロニーをストリーキングしたのちに、これらのカナマイシン感受性誘導株を、乳酸産生について試験し、そして予期されるように、LDH及びLDHの混合物であることが証明された。1のLDH誘導株であるTM89は、さらにPCR及びサザンブロットにより特徴付けられた。ゲノムDNAをTM15及びTM89から製造し、そして上で記載される条件を用いて、プライマー1及び4を使用してPCR用のテンプレートとして使用した。11955由来のゲノムDNAを対照として用いた。PCR産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてQIAquickゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから溶出した。サンプルをNotIで切断し、そして07アガロースゲル上で電気泳動して生成物を可視化した。11955のPCR産物は、予期される様にNotI切断の証拠を示さない一方、TM89のPCR産物は、04kb付近の2個のバンドを与え、突然変異されたアレルを有する野生型の遺伝子の置換を指す。第一の組み込み体であるTM15のPCR産物のNotI切断は、主に、TM89で見られる2個のバンドと、微量の未切断バンドについて、2個のバンドを与える。これは、TM15ゲノムDNAのサザンロットで得られる結果により説明できる。11955のゲノムDNA、TM15及びTN89をNotI、PstI及びNotI、並びにHindIII及びNotIで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動にかけた。DNAを正に荷電されたナイロン膜に転写し、そしてDIG標識プローブとハイブリダイズさせた。当該DIG標識プローブは、製品説明書に従ってプライマー1及び4をDIG標識dNTPと供に用いて11955LDH遺伝子をPCRすることにより作成された。ハイブリッドを形成したバンドを、市販される検出キットを用いて可視化した。サザンブロットにより、TM15のNotI切断における約75kbの多く増幅されたバンド、HindIII/NotI及びPstI/NotIのTM15切断における約7及び04kbの同様に増幅されたバンドの証拠を示し、第一組込み体におけるLDH位で組み込まれたpTM014の複数のタンデムコピーの組込みを指し示す。3個全ての制限酵素切断について、TM89は、11955に比較して追加されたハイブリダイズしているバンドを示す異なる制限酵素パターンの証拠を示し、遺伝子置換と一致した。TM89は、以下に記載されるように寄託番号第41275号で寄託された。実施例3野生型好熱菌によるエタノール生産再現性のある増殖及び生成物の生産は、野生型好熱菌について、流加培養及び連続培養で達成された。表1、2、及び3は、発酵過程において使用される条件を示す。実施例4好熱菌によるエタノール生産の増加標的であるエタノール収率及び生産力を達成するために、ldh遺伝子の不活性化によりL乳酸デヒドロゲナーゼのノックアウトを通して乳酸産生は最小化された。ldh遺伝子を不活性化するために2つのアプローチが取られた:マーカーDNAの染色体のldh領域への一重交差組換えをして転写を防止すること、又は当該遺伝子領域内に突然変異体を作り出すためのDNAのldh遺伝子への相同領域への二重組換えをして遺伝子を機能しないものとすることである。一重交差アプローチは、野生型株と比べた場合、エタノール生産の増加を示すLDH陰性突然変異体を迅速に作成した。LDH突然変異体によるエタノール生産の改善LDH活性のノックアウトから得られるエタノール生産の増加を計測するために作られた最小培地中で、LDH陰性突然変異体を流加培養で増殖させた。LDH突然変異体の代謝プロファイルの変化が表5に示され、野生型株の最適エタノール生産と比較される。2つのLDH突然変異株の代謝産生プロファイルが図1及び図2において示される。表6は、LDH活性のノックアウトにより引き起こされるエタノール生産の増加を示す。LDH突然変異は、野生型に比べて有意に高いエタノール収量を産生し、これらの好熱菌の代謝をうまく経路変更したことを示す。LDH突然変異株についての培養条件と培地内容物の更なる最適化は、高いエタノール収率をもたらす。連続培養におけるLDH突然変異体によるエタノール生産最も安定な一重交差乳酸突然変異体は、連続培養において増殖して、エタノール生産菌としてのその長期間の安定性を評価する。当該株をグルコースを炭酸源として有する最小培地中で培養した。乳酸産生への逆戻りをするまでに、定常培養が約290時間観測された。実施例5二重交差突然変異体TM89を、実施例4に記載されるエタノール生産についてアッセイした。結果を表8に示し、そして突然変異体が、かなりのレベルのエタノール生産を達成したということを示す。突然変異体は、グルコース又はキシロースを炭素源として使用するエタノール生産について評価される。結果を表7に示す。グルコースは、最良の炭素源として示されたが、当該微生物がさらなる改変をすることなく、キシロースを発酵できるということがこの結果により明らかに示される。乳酸デヒドロゲナーゼ陰性突然変異体の安定性は、1500時間の期間にわたり連続培養において様様な条件下で試験された。結果を図6に示し、そして、乳酸デヒドロゲナーゼ陰性表現型が、培養物へのかなりのチャレンジにもかかわらず、安定なままであり、そして当該表現型に留めるために抗生物質選別に依存していないということを示す。この連続的な実行の間に、希釈率は、01hr1~05hr1で変わり、そして培養を有酸素及び無酸素条件との間で変化させたが、乳酸濃度において変化がなかった。さらに重要なことに、培養物のpHを変化させ、そして野生型生物の増殖の通常のpH範囲から外れているpHであるpH44に低下させたが、培養物は、表現型において何ら変化を示さずすぐに正常な状態に戻った。つまり乳酸濃度は変化しなかった。本明細書にTM89と定義される微生物及びプラスミドpUB190ldhは、それぞれNCIMB寄託番号第41275号及び41276号で寄託された。寄託機関は、NCIMBLtdFergusonBuildingCraibstoneEstateBucksburnAberdeenAB219YAUnitedKingdomである。