"患者を治療する方法であって、生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理学的に許容できるその塩を含む医薬製剤を患者に投与する工程を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、A4およびA8に1組のヒスチジン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるA21の置換とを有し、さらに6個のインスリン類似体分子につき少なくとも約4個の亜鉛イオンの相対濃度で亜鉛イオンを有するものである、方法。請求項1記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、pH6.5~7.5において微結晶インスリン懸濁液である、方法。請求項1記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容できるその塩は、pH3.5~5において透明な緩衝化されていない溶液として製剤化され、インスリン類似体分子6個につき4~6個の亜鉛イオンの相対濃度で亜鉛イオンと、フェノールおよびメタクレゾールから選択される保存剤と、添加物とを含むものである、方法。請求項1記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき4~6個の亜鉛イオンを含むように修飾された微結晶インスリン懸濁液として製剤化されるものである、方法。請求項1~4のいずれか1つに記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でグリシン置換による修飾を受けているものである、方法。請求項1~4のいずれか1つに記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でアラニン、セリン、またはトレオニン置換による修飾を受けているものである、方法。請求項6記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、B鎖伸長による修飾を受け、1または2つのC末端塩基性残基を含むものである、方法。請求項6記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、B鎖伸長による修飾を受け、少なくとも1つのN末端塩基性残基を含むものである、方法。請求項6記載の方法において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A鎖伸長による修飾を受け、少なくとも1つのN末端塩基性残基を含むものである、方法。インスリンA鎖ポリペプチドをコードする核酸であって、前記A鎖ポリペプチドは配列ID番号4を有するものである、核酸。請求項10記載の核酸配列を有する発現ベクター。請求項10記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき少なくとも約4個の亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、A4およびA8の1組のヒスチジン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるA21の置換とを含むインスリンA鎖配列を含み、前記製剤の形態が長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。請求項13記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、pH6.5~7.5において微結晶インスリン懸濁液として製剤化されるものである、医薬製剤。請求項13記載の医薬製剤であって、この医薬製剤は、pH3.5~5において透明な緩衝化されていない溶液として製剤化され、さらにフェノールおよびメタクレゾールから選択される保存剤と、添加物とを有するものである、医薬製剤。請求項13記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき4~6個の亜鉛イオンを含むように修飾された微結晶性インスリン懸濁液として製剤化されるものである、医薬製剤。請求項14記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でGly置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。請求項15記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でGly置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。請求項16記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でGly置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。請求項14、15、または16のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A21の位置でAla、Ser、またはThr置換による修飾を受けているものである、医薬製剤。請求項13、17、または20のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、B鎖伸長による修飾を受け、1または2つのC末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。請求項13、17、または20のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、B鎖伸長による修飾を受け、1または2つのN末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。請求項13、17、または20のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、A鎖伸長による修飾を受け、1または2つのN末端塩基性残基を含むものである、医薬製剤。インスリン類似体の結晶製剤であって、前記インスリン類似体は、インスリン類似体分子6個につき少なくとも約4個の亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、A4およびA8に1組のヒスチジン置換と、選択的にA21の置換とを含むインスリンA鎖配列を含み、前記製剤は長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成し、前記インスリン類似体はpH約6~7.4で結晶性懸濁液を形成するものである、結晶製剤。請求項1記載の方法において、前記インスリン類似体は皮下注射により長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成するものである、方法。請求項13、17、または20のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記製剤は皮下注射により長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤を形成するものである、医薬製剤。請求項13、17、または20のいずれか1つに記載の医薬製剤において、前記インスリン類似体またはその生理学的に許容されるその塩は、無亜鉛製剤において、同種の野生型インスリンと比較してI型インスリン様成長因子受容体に対する親和性が低く、且つ同種のインスリン受容体に対する野生型インスリンの少なくとも20の親和性を示すものである、医薬製剤。医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき少なくとも約4個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、A4およびA8の1組のヒスチジン置換と、B28のリジンまたはアスパラギン酸置換と、選択的にB29のプロリン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるA21の置換とを含むインスリンA鎖配列を含み、前記製剤の形態が長時間作用型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。医薬製剤であって、インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、前記インスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき少なくとも約4個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、A4およびA8の1組のヒスチジン置換と、B28のシステイン、リジン、またはアスパラギン酸以外のアミノ酸置換と、選択的にB29のプロリン置換と、選択的にグリシン、アラニン、セリン、およびトレオニンから成る群から選択されるA21の置換とを含むインスリンA鎖配列を含み、前記製剤の形態が中間型亜鉛依存性皮下デポー剤である、医薬製剤。医薬製剤であって、2若しくはそれ以上のインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を有し、少なくとも1つのインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩は、インスリン類似体分子6個につき少なくとも約4個亜鉛イオンを含む薬学的に許容される緩衝液中に、A4およびA8の1組のヒスチジン置換を含むインスリンA鎖配列を含み、前記製剤が長時間作用型、中間型、および/または短時間作用型の混合型亜鉛依存性皮下デポー剤を提供するものである、医薬製剤。本発明は、亜鉛インスリン類似体の六量体表面および六量体間に新規亜鉛結合部位を形成するため、またそのようにすることで、長時間作用型の皮下タンパク質デポー剤を形成するために組み合わせることができる複数のヒスチジン置換を含むインスリン類似体製剤に関する。より詳しくは、本発明はA21に置換がある場合とない場合でA4およびA8に1組のヒスチジン置換を含むインスリン類似体を提供し、その皮下投与製剤を提供することで作用持続時間の延長を可能とする。いかなる特定の理論の特許性も条件として設けることは望まないが、これらの部位の側鎖は、それぞれがインスリン六量体に会合する時にA鎖表面から溶媒に突出していると考えられるため、新しい亜鉛イオン結合部位の一部を提供し、この結合部位を隣接する六量体からの相補的な側鎖の突出と合わせると、隣接するインスリン六量体間で亜鉛イオンが架橋する相互作用が可能になる。図1Eに示すとおり、野生型T3Rf3インスリン六量体は上の列T3三量体、角の丸い長方形と下の列Rf3三量体、角のとがった長方形を有し、それぞれ軸上に亜鉛イオンを含む灰色の丸。図1Fは、本製剤のHisA4およびHisA8置換が起こると考えられる結晶格子における変異六量体の積み重ねを表した図を示している。架橋亜鉛イオン黒丸の層には、それぞれ各T状態プロトマー図示せずの残基HisA4およびHisA8と上記Rf状態プロトマーのHisA4’側鎖が配位している。いかなる特定の理論の特許性も条件として設けることは望まないが、この置換の組み合わせも前記インスリン類似体の受容体結合選択性を向上させ、IGF-1Rの絶対的親和性を低下させる。本発明の別の観点では、pH約4の長時間作用型インスリン類似体製剤が提供され、そのpHが約6~7.4にシフトすると、微結晶懸濁液が生成する。特定の一実施例では、前記製剤がインスリン類似体分子6個あたり亜鉛イオン少なくとも約4個の相対濃度で亜鉛イオンを含む。したがって、前記製剤は生理学的pHに曝露したために皮下デポーが形成するとすぐに、患者への皮下注射が可能である。前記製剤はさらに、同じ種の野生型インスリンと比較し、前記IGF受容体に対する親和性が低く、同種のインスリン受容体に対する野生型インスリンの親和性を少なくとも20で維持すると考えられる。インスリンの自然構造では、残基A1-A8がα-へリックスを有する。このセグメントは、インスリンおよびインスリン類似体のIRとIGF-1Rの両方への結合に寄与すると考えられる。理論の特許性を条件として設けることは望まないが、溶媒が曝露した残基GluA4およびThrA8の置換IGF-Iでは保存されていないは、インスリン類似体の前記IRへの結合に対して十分耐性があるが、まだホルモン-受容体界面に近いと考えられる。GlyによるAsnA21の置換は、当該分野において、酸性条件で製剤化した場合にインスリン類似体の化学的分解を遅らせることが知られている。したがって、亜鉛依存性長時間作用型皮下タンパク質デポー剤を提供し、I型IGF受容体に対する交差結合が抑制され、インスリン受容体に対して高い親和性を保持しているインスリン類似体を提供することが望ましい。理論による制約を受けることは望まないが、インスリン類似体六量体の結合非軸上亜鉛イオンの2つの正電荷が、会合に依存した等電点のさらなるシフトに寄与する、インスリン類似体を提供することも望ましい。A4およびA8の位置にある1組のヒスチジン側鎖が、結晶格子中のインスリン類似体六量体間の界面亜鉛イオン結合部位に寄与できるインスリン類似体を提供することも望ましい。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、このような界面亜鉛イオンは六量体間の高次接触による会合を遅らせ、インスリン類似体の作用持続時間を延長すると考えられる。インスリンまたはインスリン類似体のA1-A8α-へリックスは、荷電部位、中性部位、α-へリックス双極子モーメント、および静電相互作用と組み合わさることで、その等電点pIに寄与する。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、pH6.5を超えないpIの上方シフトは、HisのGluA4置換によって起こるような酸性残基の除去で予想される。pIのわずかな変化は、前記置換ヒスチジンの局所pKa通常は6~7によって、A4またはA8の位置におけるヒスチジン残基の挿入と関連している可能性がある。ここでも理論による制約を受けることは望まないが、ヒトインスリンでは位置A4で酸性残基が観察される。Gly、Alaまたは他の中性側鎖によるAsnA21の置換は、pIに大きな変化を引き起こすと予想され、塩基性側鎖ArgまたはLysによる置換はpIをさらに上方シフトさせると予想され、酸性溶液で保存した場合に天然AsnA21側鎖の脱アミド化で起こるようなAspの置換は、pIを下方シフトさせると予想される。インスリン類似体の六量体表面に結合、または亜鉛インスリン類似体六量体間の界面部位に結合した非軸上亜鉛イオンも、前記六量体またはマルチ六量体複合体の全荷電に寄与することができ、皮下デポー剤同様、pH7.4で溶解性に影響する可能性がある。したがって、上記の受容体結合特性を示し、また等電点が上方シフトしているが、中性を超えておらず、インスリン類似体六量体表面または六量体間の非古典的亜鉛イオンの結合において、前記アミノ酸置換とさらなる結合亜鉛イオンを組み合わせた効果のため、前記複合体がpH7.4で皮下デポー剤として不溶性となるようなインスリン類似体を提供することも望ましい。したがって、透明な溶液として酸性pHで前記インスリン類似体の可溶性製剤を提供し、取り扱いが簡便で、シリンジにより皮下注入の投与量を正確に調節することができ、ペンにより正確な定量送達を提供することが望ましい。また、中性pHでインスリン類似体の微結晶懸濁液を作る基礎として、結晶化の方法を提供することも望ましく、初回使用後の室温での有効期間および製剤の安定性が追加される。一般に、患者を治療する方法は生理学的に有効な量のインスリン類似体または生理学的に許容されるその塩を患者に投与する工程を有し、前記類似体または生理学的に許容されるその塩は、A4およびA8の位置で1組のヒスチジン置換により修飾し、A21でさらに修飾が可能なインスリンA鎖配列を含む。1つの実施例では、前記A21側鎖が天然型Asn残基である。別の実施例では、前記A21側鎖がGlyである。別の例では、前記A21置換をAla、Thr、またはSerとすることができる。インスリン類似体は、何らかの脊椎動物のインスリンの類似体または当該分野で既知の修飾B鎖を含むインスリン類似体とすることができ、皮下注入後の吸収が変化する。1つの実施例では、前記インスリン類似体が、ヒト、マウス、齧歯類、ウシ、馬、またはイヌインスリン類似体など、哺乳類のインスリン類似体である。1つの実施例では、前記インスリン類似体が、ヒツジ、クジラ、ラット、ゾウ、モルモット、またはチンチラのインスリン類似体である。具体的なインスリン類似体には、配列ID番号4~6または14のいずれか1つで示されるA鎖配列と配列ID番号7~12のいずれか1つで示されるB鎖配列を含むものが含まれる。核酸は、これらの配列の1つを有するポリペプチドをコードする。そのような核酸は、宿主細胞の変換に利用される発現ベクターの一部と考えられる。本発明は、インスリン類似体製剤の作用持続時間を延長させる、インスリン六量体間の非軸上界面亜鉛イオンの新しい利用法に関する。本発明は、長時間作用型皮下デポー剤を作成する新しい系を提供する。本発明では、インスリン類似体六量体表面およびインスリン類似体六量体間で結合し、これらの類似体のデポー剤が単量体のインスリン類似体を血流に放出させるのにかかる時間を延長させる、新規非軸上亜鉛イオンを利用する。本発明では、1型IGF受容体に対するインスリン類似体の絶対的および相対的結合量を同時に減少させる方法についても提供する。この特徴を組み合わせることで、特に癌リスクについて、糖尿病治療の有効性および安全性が向上する。そのため、本発明は、pH4では透明な溶液として、または中性pH付近で微結晶の懸濁液として、亜鉛含有製剤とともに、A4およびA8の位置に1組のヒスチジンアミノ酸置換が含まれるインスリン類似体を提供する。前記1組のA4-A8置換はGly、Ala、Ser、またはThrなど、A21の置換と組み合わせることができる。本発明のインスリン類似体には、他にも修飾が含まれてもよい。本明細書およびその請求項で使用されているとおり、インスリン類似体の様々な置換は、置換されるアミノ酸、続いて選択的に上付き文字で示す前記アミノ酸の位置を示す慣習により記すことができる。問題となる前記アミノ酸の位置には、置換が位置するインスリンA鎖またはB鎖を含む。例えば、本発明のインスリン類似体には、B鎖のアミノ酸28B28におけるアスパラギン酸AspまたはDまたはリジンLysまたはKのプロリンProまたはPとの置換、またはB鎖のアミノ酸29B29におけるProのLysとの置換、またはその組み合わせを含む可能性がある。これらの置換は、それぞれAspB28、LysB28、およびProB29と示される。同様に、本発明のインスリンには、A鎖アミノ酸A0つまり、GlyA1のN末端におけるアルギニンArgまたはR、ヒスチジンHisまたはH、またはリジンLysまたはKの付加も含むことができる。これらの付加は、それぞれArgA0、HisA0、またはLysA0と示すことができる。さらに、本置換は置換PheB1→Hisの導入と組み合わせることもできる。他の記載がない限り、または内容から明らかであれば、本明細書で示すアミノ酸はLアミノ酸とみなす。本明細書で用いるとおり、金属ステープルまたは金属ジッパーは、2若しくはそれ以上の分子または分子複合体の2若しくはそれ以上のアミノ酸側鎖が問題の金属と結合している場合に形成される金属結合部位である。例えば、第1分子の1つの側鎖を第2分子の2つの側鎖と組み合わせ、亜鉛結合部位を形成することができる。したがって、インスリン三量体は軸上亜鉛イオンと一緒に金属ステープルとなることは当該分野で周知である。しかし、亜鉛結合部位が導入されると、特定インスリン類似体の六量体によって六量体間に亜鉛ステープルが形成されるかもしれないことは、これまで知られていなかった。本発明は、新規亜鉛ステープルを形成するインスリン六量体複合体を形成し、IGF-1Rへの親和性低下を示すが、IRに対する親和性の少なくとも一部を保持し、したがって生物活性を保持するインスリン類似体を提供する。本発明は、亜鉛ステープル六量体複合体を形成する、相対的亜鉛濃度が高いこれらの類似体製剤、および亜鉛濃度がさらに高い、これらの六量体複合体のランテ様結晶も提供する。いくつかの実施形態では、前記インスリン類似体が、前記インスリン類似体の六量体1個につき少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、または少なくとも8個の亜鉛イオンを含む。患者を治療する方法は、前記患者にインスリン類似体を投与する工程を有する。1つの実施形態では、前記インスリン類似体が、同時に中性への等電点pIの上方シフトを引き起こし、すなわち亜鉛ステープルインスリン六量体を会合させる、前記A鎖の修飾を含むインスリン類似体である。別の実施形態では、前記修飾が前記無亜鉛単量体のIGF-1Rへの親和性も低下させる。別の実施形態ではまた、前記インスリン類似体がA21の位置に置換を含み、酸性条件で製剤化する際に前記インスリン類似体の化学的分解を防ぐ。前記インスリン類似体は、シリンジ、定量ペン、または他の適切な装置を用いて皮下注射により投与される。また、酸性pHで十分な濃度の亜鉛イオンを用いて製剤化した類似体のA4およびA8の位置に1組のヒスチジン置換を導入することも可能であり、2つの同時メカニズム、つまり主にGluA4の負電荷がなくなったために等電点が高くシフトしおよそ6.5~6.6、古典的軸上亜鉛イオンに加えて非軸上亜鉛イオンが結合するため、亜鉛インスリン六量体の純等電点がさらにシフトするというメカニズムにより、pH7.4で類似体に不溶性を与えると想定される。皮下デポー剤のインスリン類似体の溶解性を低下させる目的でA4およびA8に同じ置換を導入すると、インスリンおよびインスリン類似体と1型IGF受容体との交差結合との関連性が提案された、潜在的癌リスクが低下する。また、上記類似体と1型IGF受容体との交差結合を減少させるという1若しくはそれ以上の目的のため、これに限定されるものではないが、これらのタイプの混合物を含め、通常型、NPH、セミ-ランテ、およびランテなど他のクラスのインスリン類似体製剤において、A21における置換の有無に関係なく、A4およびA8の位置に同時に置換を導入することも可能であると想定される。pH7.4で通常の可溶性製剤とする目的では、1組のヒスチジン置換をA鎖またはB鎖の別の位置の置換と組み合わせる必要があり、この置換では1若しくはそれ以上の正電荷がなくなるか、または1若しくはそれ以上の負電荷が加わり、これによって、これに限定されるものではないが、塩化亜鉛、フェノール、メタクレゾール、グリセロール、リン酸ナトリウム緩衝液、および注射用水を含む当該分野で既知の添加物存在下、pH7.4でヒトインスリン製剤などを可溶性とするため、前記pIを十分低下させる。A4およびA8における1組のヒスチジン置換と組み合わせた場合、pIを低下させる置換の例には、これに限定されるものではないが、GluA14、AspA21、GluA21、AspB9、GluB9、AspB10、GluB10、AlaB22、SerB22、AspB28、AspB28-ProB29、AspB28-AlaB29、AlaB29、およびProB29、またはその組み合わせを含む。A4およびA8における1組のヒスチジン置換は、インスリン類似体と1型IGF受容体との交差結合を減少させ、前記インスリン類似体に対する固有の親和性を維持しながら、pIを中性に上方シフトさせる可能性があることが発見された。pH7.4で亜鉛を含まないようにすると、[HisA4、HisA8]-インスリンは非常に溶けやすいが、インスリン類似体分子6個につき4~6個の亜鉛イオンを追加すると、亜鉛-タンパク質複合体が沈殿することも発見された。この複合体はpH7.0~8.4では不溶性であるか、やや溶けにくいが、pH約4では可溶性である。理論による制約を受けることは望まないが、このpH依存性の不溶性は、軸上および非軸上結合亜鉛イオンをいずれも含む亜鉛タンパク質複合体がinvitroで等電的に沈殿するためである。[HisA4、HisA8]-インスリンは、pH4.0で緩衝化されていない、モル比で6個のインスリン分子につき5.2個の亜鉛イオンを含む溶液に製剤化し、その後、ストレプトゾトシンにより糖尿病とした雄Lewisラットに皮下注射すると、ランタス登録商標の薬理作用と同等の期間および範囲に血糖濃度の管理が延長されることも発見された。理論による制約を受けることは望まないが、この長期的作用は、軸上および非軸上結合亜鉛イオンをいずれも含む亜鉛タンパク質が等電的に皮下沈殿するためである可能性が高い。1個の六量体につき2個の軸上亜鉛イオンと3個の非軸上亜鉛イオンを含む亜鉛インスリン類似体六量体は、前記R3結晶格子の連続する六量体間で結合するため、[HisA4,HisA8]-インスリンの結晶は容易に成長することも発見された。後者の界面亜鉛イオンは、1個の六量体中のHisA4およびHisA8による4面体配位、隣接する六量体のHisA4’、および結合塩化物イオンを示す。前記3つの結合亜鉛および塩化物イオンは前記六量体にそれぞれ6および-3の正式電荷を加え、正味の正式電荷は3となる。これらの追加電荷は、HisによるGluA4の置換によって達成される正式電荷6に追加される。理論による制約を受けることは望まないが、3つの非軸上亜鉛イオンがあるために上記のpH依存性の不溶性が得られ、亜鉛タンパク質複合体は推定上、皮下等電沈殿する可能性がある。一般に、脊椎動物のインスリン類似体または生理的に許容されるその塩はインスリン類似体を有し、インスリンA鎖およびB鎖を含む。本発明のインスリン類似体は、残基B1および/またはB31のB鎖における伸長塩基性アミノ酸の置換など、他の修飾を含んでもよい。1つの例では、前記脊椎動物のインスリン類似体がヒト、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、またはウマインスリン類似体などの哺乳類インスリン類似体である。その開示がこの参照により本明細書に組み込まれる、同時係属の米国特許第12/419,169号明細書でより詳細に説明されるとおり、本発明のインスリン類似体には、B鎖C末端とA鎖N末端の間のつなぎなど、他の修飾も含むことができる。薬学的組成は、上記インスリン類似体を有することもでき、作用時間を延長させるためには、亜鉛イオンまたはタンパク質集合体および六量体の界面ステープリングを導くことができる他の二価金属イオンを含んでいる必要がある。亜鉛イオンは、前記インスリン類似体の六量体1個につき4.0~7.0のモル比または5.0~6.0のモル比のレベルで、そのような組成に含まれることもある。さらに遅い吸収でも六量体複合体を形成するため、亜鉛イオンはより高いモル比で含まれる可能性もあり、そのような高いモル比では、亜鉛イオンが界面[HisA4,HisA8]関連亜鉛ステープル結合部位に加え、弱い亜鉛結合部位を占めることになる。そのような製剤では、前記インスリン類似体濃度は典型的には約0.1~約3mMと考えられる。添加物には、グリセロール、グリシン、他の緩衝剤および塩、およびフェノールおよびメタクレゾールなどの抗菌性保存剤を含むことができ、後者の保存剤は前記六量体の安定性を高めることが知られている。そのような薬学的組成を用い、前記組成の生理的有効量を糖尿病または他の病状を有する患者に投与することで、前記患者を治療することができる。A鎖をコードする配列を含むインスリン類似体コード化ポリぺプチドをコードする配列を有する核酸は、A4およびA8にヒスチジン置換の組み合わせを有し、A21にさらに置換を有する場合と置換がない場合がある。特定の配列は、核酸配列が導入される種の好適なコドンの利用によって変化する可能性がある。前記核酸は、野生型インスリンの他の修飾もコードする。前記核酸配列は、前記ポリペプチドまたは修飾プロインスリン類似体の別の位置に関連のない置換または伸長を含む修飾A鎖またはB鎖配列をコードすることもある。前記核酸は発現ベクターの一部でもあり、このベクターは大腸菌細胞株などの原核宿主細胞、または出芽酵母S.cereviciaeまたはメタノール資化酵母Pischiapastoris菌株または細胞株などの真核細胞株のような宿主細胞に挿入される可能性がある。本発明の類似体内では関連性のない置換または鎖の伸長が組み合わさり、B13の位置の置換、またはA0、A22、B0、またはB31の位置でのArgまたはLysによる鎖の伸長によってその等電点をさらに上方に、または負電荷を挿入するか、正電荷を除く置換により下方に変化させる可能性があると想定される。例えば、前記置換はAlaB31-HisB32-HisB33-ArgB34、HisB31-HisB32、HisB31-HisB32-ArgB33、またはAlaB31-HisB32-HisB33と組み合わさっているかもしれない。この後者の場合、さらなる六量体内亜鉛結合が本発明の六量体内亜鉛結合を補い、前記亜鉛を六量体比に引き上げ、前記六量体複合体をさらに安定化させる。本発明の置換はB鎖の修飾と組み合わせることもでき、この好ましくない性質を軽減するIGF-1R交差結合を増加させるが、この例には、1若しくは2塩基性残基ArgB31、LysB31、ArgB31-ArgB32、ArgB31-LysB32、LysB31-ArgB32、およびLysB31-LysB32などによるB鎖の伸長またはAspまたはGluによるHisB10の置換が含まれる。例は、これに限定されるものではないがインスリングラルギンランタス登録商標によって提供され、インスリングラルギンはpH4で製剤化されるが、皮下デポー剤では生理的pHで凝集する。さらに、本発明の1組のヒスチジン置換は、既存のインスリン類似体または修飾インスリンに存在するいずれかの変化、または通常のインスリン、NPHインスリン、ランテインスリン、またはウルトラランテインスリンなど、様々な医薬製剤と組み合わせて利用することができると想定される。本発明のインスリン類似体は、ヒトインスリン類似体に存在する置換を含み、臨床的には利用されていないが、AspB10、LysB28、およびProB29の置換またはAspB9置換を含むDKP-インスリンなど、まだ実験的には有用である。ただし、本発明はヒトインスリンおよびその類似体に限定されない。また、これらの置換は、限定されない例により、ブタ、ウシ、ウマ、およびイヌインスリンなどの動物インスリンで行われると想定される。さらに、ヒトインスリンと動物インスリンとの類似性、および過去のヒト糖尿病患者における動物インスリンの利用を考慮し、インスリン配列中の他のわずかな修飾、特に保存的置換と考えられるこれらの置換が導入されるとも想定される。例えば、本発明から離れずに、同様の側鎖を持つアミノ酸グループ内でアミノ酸のさらなる置換が行われることもある。これには、アラニンAlaまたはA、バリンValまたはV、ロイシンLeuまたはL、イソロイシンIleまたはI、プロリンProまたはP、トリプトファンTrpまたはW、フェニルアラニンPheまたはFおよびメチオニンMetまたはMなどの中性疎水性アミノ酸が含まれる。同様に、中性極性アミノ酸はグリシンGlyまたはG、セリンSerまたはS、トレオニンThrまたはT、チロシンTyrまたはY、システインCysまたはC、グルタミンGluまたはQ、およびアスパラギンAsnまたはNの群内で互いに置換される可能性がある。塩基性アミノ酸はリジンLysまたはK、アルギニンArgまたはR、およびヒスチジンHisまたはHを含むと考えられる。酸性アミノ酸はアスパラギン酸AspまたはDおよびグルタミン酸GluまたはEである。比較のため、配列ID番号1として、ヒトプロインスリンのアミノ酸配列を示す。配列ID番号2としてヒトインスリンA鎖のアミノ酸配列を示す。比較のため、配列ID番号3としてヒトインスリンB鎖のアミノ酸配列を示す。配列ID番号1プロインスリンPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号2A鎖Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号3B鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr本発明のインスリン類似体は天然型インスリンと同様のインスリン受容体親和性を有するが、1型IGF受容体に対する親和性は低下していると想定される。インスリンまたはインスリン類似体の活性は、以下に本明細書でより詳細に説明するとおり、受容体結合アッセイにより決定することができる。相対活性は、競合的置換アッセイの曲線を当てはめることで得られるとおり、ホルモン-受容体解離定数Kdに関して、または放射活性物質で標識したヒトインスリン125I標識インスリンなどまたは放射活性物質で標識した高親和性インスリン類似体など、特異的に結合する標識ヒトインスリンの50パーセントを移動するために必要な非標識インスリンまたはインスリン類似体の濃度であるED50値に関して定義することができる。代わりに、活性は単純に通常のインスリンの割合として表すことができる。インスリン様成長因子受容体に対する親和性は、測定されるIGF-1Rとの置換と同じ方法で測定することもできる。特に、インスリン類似体は通常のインスリンの25、50、110、120、130、140、150、または200パーセント以上など、インスリンの20~200パーセントの活性を有するが、IGF-1Rに対する親和性は、通常のインスリンの10、20、30、または50パーセントなど、通常のインスリンの50パーセント以下であることが望ましい。クリアランスが遅いため、invitro受容体結合活性が20の低さであるとしても、インスリン類似体はまだ糖尿病治療に有用である可能性がある。インスリン類似体の合成。ジチオスレイトール7mg存在下、0.1Mグリシン緩衝液中pH10.6、10mlで、A鎖41mgおよびB鎖類似体21mgのSスルホン化誘導体の相互作用により鎖を組み合わせた。各組み合わせの混合物のCM-52セスロースクロマトグラフィーにより、遊離B鎖が混入したタンパク質の塩酸塩を一部単離することができる。最終的な精製は、逆相HPLCにより達成される。[HisA4,HisA8]-インスリンの予想される分子量は、MALDI質量分析により確認された。最終的な収率6.1mgは、野生型インスリンの制御合成で得られた収率と同等であった。[HisA4,HisA8]-DKP-インスリンの対応する収率は8.8mgであった。等電点電気泳動。天然の状態でのインスリンおよびインスリン類似体のpI値は、pH3~10のプレキャストIEFゲルを用い、IEFゲル電気泳動により測定した125×125mm、300μm、SERVALYT登録商標Precotes登録商標、SERVAElectrophoresisGmbHハイデルベルク製、CrescentChemicalCo.米国ニューヨーク州Hauppaugeより入手。製造業者のプロトコールによれば、Precotes登録商標は水平型IEF装置であるMultiphorIIPharmaciaBiotechに構成する。この装置は、予め循環型水浴Brinkmanを用いて4°Cに冷却してから、熱交換効率を上げるため、PRECOTEIEFゲルは軽油でコーティングした電気泳動ベッドに入れた。前記ゲルは、ろ紙の芯を用い、ゲルの両端をAnodeFluidpH3およびCathodeFluidpH10いずれもSERVAで湿らせて電極に接続した。サンプルをローディングする前に、高電源供給LKBモデル2197を用いて30分間、200ボルトの初期電圧設定および500ボルトの最終設定で前記ゲルをプレフォーカスした。サンプルとIEFの標準品をローディングした後5~10μL、ローディングするタンパク質濃度は5~10μg、等電点電気泳動法は500~2000ボルトで2時間、または最終電圧の2000ボルトに達するまで行い、この後さらに15分間電気泳動を続けた。IEFの後、SERVAマニュアルのプロトコールに従い、前記ゲルを20分間20トリクロロ酢酸200mlで固定し、脱イオン水200mlで1分間洗い流し、ServaViolet17溶液で染色し、86リン酸で脱染した。使用したIEF標準タンパク質SERVA製は以下のとおりであり、それぞれのpI値を括弧に示す:ウマ心臓チトクロムC10.7、ウシ膵臓リボヌクレアーゼA9.5、レンズマメレクチン8.3、8.0、7.8、ウマ筋肉ミオグロビン7.4、6.9、ウシ赤血球炭酸脱水酵素6.0、牛乳β-ラクトグロビン5.3、5.2、大豆トリプシンインヒビター4.5、クロカビグルコースオキシダーゼ4.2、クロカビアミログルコシダーゼ3.5。前記タンパク質サンプルのpI値は、前記IEFの泳動距離とpH勾配の線形回帰プロットを比較することにより決定した。受容体発現プラスミド。エピトープタグを付けたIRおよびIGF-1Rの発現については、前記哺乳類発現ベクターpcDNA3.1ZeoをInVitrogenから入手し、BamHIとXbaI制限部位の間にあるFLAGM2エピトープAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lysのインフレーム3回繰り返し配列をコードするインフレームオリゴヌクレオチドカセットをサブクローニングすることで、C末端エピトープのタグを修飾した。IGF-1RおよびIRのBイソ型をコードするそれぞれのcDNAについては、すでに報告されているWhittaker,J.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol84,pp.5237-52411987。部位特異的突然変異誘発による停止コドンの直前にある3’末端のインフレームC末端Gly-SerリンカーをコードするBamHI部位の導入により、修飾発現ベクターにサブクローニングするため、修飾した。受容体cDNAの発現。トランスフェクションDNAはすでに説明したとおりに調製した。前記受容体cDNAは、ポリエチレンイミンを用いて一時的にPEAKrapid細胞に発現させた。細胞はトランスフェクション後3日で採取し、この時受容体の発現が最大となった。溶解は、0.15MNaClおよび0.1MTris-ClpH8.0から成り、1v/vTritonX-100およびプロテアーゼ阻害薬カクテルRocheを含む緩衝液中で達成した。溶解物はアッセイで必要になるまで-80°Cで保存した。受容体結合アッセイ。IGF-1RおよびIR-B結合アッセイは、Whittakerらがすでに説明したマイクロタイタープレート抗体捕獲法の変法により行った。抗FLAGIgGリン酸緩衝生理食塩水中40μg/ml溶液が100μl/ウェルを用い、マイクロタイタープレートNuncMaxisorbを一晩4°Cでインキュベートした。洗浄およびブロッキングはすでに説明したとおりに行った。IR-BまたはIGF-1Rの全長をコードし、C末端FLAGタグが付いたcDNAを用いて一時的にトランスフェクトした293PEAK細胞の洗剤溶解物detergentlysatesは、コムギ胚芽凝集素WGAクロマトグラフィーにより部分的に精製し、受容体前駆体の溶解物を枯渇させた。次に、抗体でコーティングしたプレートにおいて、コムギ胚芽溶出物を1時間室温でインキュベートし、受容体を固定化した。結合していないタンパク質を除去するため広範に洗浄した後、説明したとおり、標識インスリントレーサー125I-[TyrA14]-インスリンまたは標識IGF-Iトレーサー125I-Tyr31-IGF-Iと非標識インスリン類似体を用いた競合的結合アッセイを行った。アッセイの同じセットでコントロールリガンドとしてインスリンまたはIGF-I受容体を用い、すべてのインスリン類似体をアッセイした。相同競合的アッセイの結合データは2部位連続モデルを用いた非線形回帰分析により分析し、インスリンおよびIGF-Iの解離定数を求めた。異種競合的実験の結合データはWangの方法により分析したが、この方法では、正確な数学的表現を用いて2つの異なるリガンドの受容体への競合的結合を説明する。当該分野で周知のインスリン類似体に関する代表的な結合研究を表1にまとめている。IRイソ型Bに対するインスリンの親和性はIGF-1Rに対するIGF-Iの親和性と同等であるためそれぞれの場合でKdは約0.04nM、カラム4に示すとおり、IRとIGF-1Rそれぞれの親和性カラム2および3の比から、前記インスリン類似体の絶対的特異性の推定が示される。ヒトインスリンの特異性列1に対して正規化すると、相対的特異性の推定が得られる。相対的特異性が1以上1未満であると、受容体結合の厳密性が上昇低下したことが示される。このアッセイでは、AspB10-インスリンのIGF-1Rに対する親和性が上昇したことが示されるが、IRに対する親和性はより顕著に上昇しているため、相対的特異性は1以上である。インスリングラルギンランタス登録商標にはAsnA21→Glyの置換とB鎖の2残基の伸長ArgB31およびArgB32が含まれ、これにより、IGF-1Rに対する絶対的親和性が上昇、IRに対する絶対的親和性が低下し、受容体結合の相対的厳密性が低下したことが示される。本発明のインスリン類似体は反対の性質を示し、IGF-1Rに対する絶対的親和性が低下し、受容体結合の相対的厳密性が上昇する。A鎖アミノ酸置換の新規組み合わせを含むインスリンのA鎖類似体は、変異型A鎖の化学的全合成によって作成した。野生型B鎖は酸化的亜硫酸分解によりヒトインスリンの市販製剤から入手し、DKPB鎖は同様に化学的全合成により作成した。各ケースのインスリン類似体はインスリン鎖を組み合わせて入手し、その後クロマトグラフィー精製を行った。各ケースの分子量予測値を質量分析により確認した。A4およびA8の位置に1組のヒスチジン置換を含み、AsnA21のGlyによる置換があるインスリン類似体とAsnA21の置換がないインスリン類似体を合成し、野生型ヒトB鎖配列ID番号3との関連で配列ID番号4として示す。ヒトインスリンとこれらの類似体の特性を比較すると、A1、A8の置換がIGF-1Rに対する類似体の親和性を低下させ、IRとIGF-1Rに対する親和性の比を増加させる一般的効果が示される表2。配列ID番号4A4およびA8の1組のヒスチジン置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-XaaXaa=Asn,Gly,Ala,Ser,Thr配列ID番号5または6および20~21のA鎖ポリペプチド配列を有するインスリン類似体は、野生型インスリンB鎖配列ID番号3またはインスリングラルギンなどのインスリン類似体と共に同様に調整した。亜鉛イオンの非存在下、無亜鉛ヒトインスリンに認められるベースライン値の5.6から等電点の値が6.6に上方シフトすることは、等電点ゲル電気泳動により確認した。この目的を達成するため、研究ではpH3~10のプレキャストIEFゲル125×125mm、300μm、SERVALYT登録商標Precotes登録商標、SERVAElectrophoresisGmbHハイデルベルク製、CrescentChemicalCo.米国ニューヨーク州Hauppaugeより入手を利用した。製造業者のプロトコールによれば、Precotes登録商標は水平型IEF装置であるMultiphorIIPharmaciaBiotechに構成する。この装置は、予め循環型水浴Brinkmanを用いて4°Cに冷却してから、熱交換効率を上げるため、PRECOTEIEFゲルを軽油でコーティングした電気泳動ベッドに入れた。前記ゲルは、ろ紙の芯を用い、ゲルの両端をAnodeFluidpH3およびCathodeFluidpH10いずれもSERVAで湿らせて電極に接続した。サンプルをローディングする前に、高電源供給LKBモデル2197を用いて30分間、200ボルトの初期電圧設定および500ボルトの最終設定で前記ゲルをプレフォーカスした。サンプルとIEFの標準品をローディングした後5~10μL、ローディングするタンパク質濃度は5~10μg、等電点電気泳動法は500~2000ボルトで2時間、または最終電圧の2000ボルトに達するまで行い、この後さらに15分間電気泳動を続けた。IEFの後、SERVAマニュアルのプロトコールに従い、前記ゲルを20分間20トリクロロ酢酸200mlで固定し、脱イオン水200mlで1分間洗い流し、ServaViolet17溶液で染色し、86リン酸で脱染した。使用したIEF標準タンパク質SERVA製は以下のとおりであり、それぞれのpI値を括弧に示す:ウマ心臓チトクロムC10.7、ウシ膵臓リボヌクレアーゼA9.5、レンズマメレクチン8.3、8.0、7.8、ウマ筋肉ミオグロビン7.4、6.9、ウシ赤血球炭酸脱水酵素6.0、牛乳β-ラクトグロビン5.3、5.2、大豆トリプシンインヒビター4.5、クロカビグルコースオキシダーゼ4.2、クロカビアミログルコシダーゼ3.5。ヒトインスリンまたは本発明のインスリン類似体のpI値は、前記IEF標準品の泳動距離とpH勾配の線形回帰プロットと比較することにより決定した。配列ID番号5HisA4,HisA8置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号6HisA4,HisA8,GlyA21置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly配列ID番号7HisB1B鎖His-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr受容体結合アッセイ―相対活性は、野生型および変異型ホルモン―受容体複合体に関する解離定数の比として定義する。データは非特異的結合1mMヒトインスリン存在下、関連する膜に残った放射能量について補正した。すべてのアッセイについて、競合するリガンドがない状態で結合したトレーサーの割合は、リガンドを枯渇させた人工物を回避するため、15未満とした。単離したインスリンハロ受容体イソ型Bに対するインスリン類似体の相対的親和性は、当該分野で周知のマイクロタイタープレート抗体捕獲法により検討した。マイクロタイタープレートNuncMaxisorbは、AU5IgGリン酸緩衝生理食塩水中、40mg/mlを100μl/ウェルを用いて4°Cで一晩インキュベートした。結合データは2部位連続モデルにより分析した。IGFI型受容体を用いた対応するマイクロタイタープレート抗体アッセイを利用し、この相同的受容体への交差結合を評価した。齧歯類のアッセイ―オスLewisラット平均体重約300gは、ストレプトゾトシンにより糖尿病にした。皮下注射後の血糖濃度に対するインスリン類似体の作用は、臨床用血糖測定器HypoguardAdvanceMicro-Drawメーターを用い、野生型インスリンまたは緩衝液のみグリセリン16mg、メタクレゾール1.6mg、フェノール0.65mg、およびリン酸ナトリウム3.8mgpH7.4;Lilly希釈剤との関連で評価した。野生型インスリンおよび[HisA4,HisA8]-インスリンは、上述の緩衝液において無亜鉛で作られた。また、[HisA4,HisA8]-インスリンおよびインスリングラルギンは、5.2:1の比のZnCl2:インスリン単量体、25mMメタクレゾール、および185mMグリセロールを含む希釈HCpH4に溶解した。ラットには、ラット1匹野生型インスリンでは、これは2IU/kg体重に相当につき3.44nmolesのインスリンまたはインスリン類似体約12~13.7nmolesを用い、100μlの緩衝液中、時間t=0で皮下注射した。中性の無亜鉛製剤については、時間0および90分まで10分ごとにクリップを止めた尾の先端から採血した。酸性亜鉛製剤については、時間0、1、2、4、6、10.8、および24時間で採血した。[HisA4,HisA8]-インスリンの結晶構造は以下に説明するとおり決定し、1六量体あたりの亜鉛イオン数を計測、視覚化し、A4およびA8の位置での1組のヒスチジン置換が結晶格子中で六量体間の界面亜鉛イオンを結合させるか否かを検討した。亜鉛イオンおよびフェノール存在下、結晶を増殖させ、T3Rf3六量体を生成した。前記構造は解像度1.9Åで分子置換により得られた表3。類似体の六量体会合様式図2dは、野生型インスリン図2cと同一である。TおよびRfプロトマーのそれぞれの立体配座は、野生型インスリンと基本的に同一である。提案された受容体結合表面では、摂動の伝達は起こらない。野生型および変異型六量体は、それぞれ2つの軸上Znイオンを含み、T3およびRf3三量体に1つずつ含まれる図2c、2dでは、中心の球が重なっている。各部位の配位は、三量体が関連したHisB10側鎖と歪んだ四面体構造を介する図2c、dの六量体の中心の薄灰色。前記Rf3三量体では、第4リガンドが塩化物イオンであり、一方T3三量体では、この部位はRf3三量体よりも露出している、塩化物イオンまたは結合した水イオンが部分的に占有している。これらの特徴は野生型構造と一致している。同様の条件で成長した野生型結晶でも観察されるとおり、前記Rf3三量体は3つの結合フェノール分子を含む図示せず。したがって、前記A4およびA8の置換は、受容体結合に対するインスリン再編成の古典的モデルであるTR転位を阻害しない。前記変異型T3Rf3六量体には、T状態の表面でさらに3つの三量体関連Znイオンが含まれる図2bおよび2dにおける赤紫色の球。これらの新規Znイオンには、界面部位のHisA4およびHisA8が部分的に配位している。末梢Zn結合部位の典型的な電子密度は、歪んだ4面体の位置を定義する図2e。配位は塩化物イオン、および隣接する六量体のRfプロトマーに属するステープルHisA4側鎖によって完了する図2eの標識A4’および図3bの茶色矢印。隣接する六量体の相対するTおよびRf面の図は、図3cに示している図3bに示した方向から90°回転。前記塩化物イオンの結合は、Rfプロモーターに結合した3つの水分子図3dの立体ペアの小さな球のネットワークによっても安定化し、RfのHisA8は亜鉛結合部位から移動している。そのため、3つの非古典的Znイオンは格子中の隣接する六量体のT3およびRf3三量体を結合し大きな球、図3bおよびd、一部は野生型の界面で通常結合する水分子を移動する図3aの小さな球。N-Zn2の結合距離および角度は、軸上金属イオン結合部位と同様である。HisA4およびHisA8の側鎖の立体配座はTプロトマーとRfプロトマーでは異なる。IRおよびIGF-1Rへのホルモンの結合研究は、相対的親和性および受容体結合の選択性を評価するために行われた図3eおよび表2。リガンドは無亜鉛単量体として特徴付けられた。ヒトインスリンのIRおよびIGF-IRへの結合と比較しそれぞれ、図3eの×印でデータポイントを記した実線と点線、インスリングラルギン四角印でデータポイントを記した実線と点線は、IRへの親和性が2倍低下し、IGF-1Rへの親和性が3倍上昇していることが示される。一方、[HisA4,HisA8]-インスリンはIRに対して天然型同様の親和性を示したが図3eの逆三角印の実線、IGF-1Rへの親和性は6倍低下した逆三角印の点線、右へシフトしている。そのため、インスリングラルギンの受容体結合選択性は約6倍低下しているが、[HisA4,HisA8]-インスリンは7.5±2.5倍上昇している。これは、インスリングラルギンと比較し、少なくとも30倍改善したことを示している。[HisA4,HisA8]-インスリンの力価および作用持続時間は、インスリングラルギンと比較し、ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットで検討した図3f。齧歯類における長時間作用型インスリン類似体による血糖管理5~10時間はヒト18~24時間よりも短く、これはおそらく皮下デポー剤のサイズが小さいためである。[HisA4,HisA8]-インスリンおよびインスリングラルギンは、ランタス登録商標同様希釈HClpH4.0に溶解し、Zn2:インスリンのモル比は5.2:1であった。血糖管理の時間経過および範囲は2つの類似体を注射した場合で同様であった図3fの点線および点線/波線。速効性の管理は、Lilly希釈液の無亜鉛ヒトインスリンによって提供された図3fでは、約3時間で線が終わっている。ラットは夜間しか摂食しないため、昼間のインスリン注入の効果は昼間絶食であることの影響を受け、希釈液のみを注入して管理を行った図3fの波線。無亜鉛中性Lilly希釈液において[HisA4,HisA8]-インスリンの対照研究も行い、その時間経過は野生型インスリンの管理と同様であった図示せず。無亜鉛グラルギンはやや溶けにくいため、中性pHでは検討しなかった。X線結晶学-1:1.7の比のZn2とタンパク質単量体および3.5:1の比のフェノールとタンパク質単量体存在下、Tris-HCl緩衝液中で懸滴蒸気拡散により結晶を成長させた。液滴の構成は、1mlのタンパク質溶液0.02MHCl中8mg/mlと1mlの貯留液0.38MTris-HCl、0.1Mクエン酸ナトリウム、9アセトン、4.83mMフェノール、および0.8mM酢酸亜鉛、pH8.4を混合したものであった。各液滴は1mlの貯留液に懸濁した。結晶は室温で2週間後に得られた。データはレーヨンループに取り付けた単一の結晶から収集し、100 ゚Kに急速冷凍した。バークレー国立研究所において、CCD検出装置を用い、シンクロトロン放射で32.05~1.90Åの反射を測定した。データはDTREKプログラムで処理した。前記結晶は空間群R3に属し、単位格子のパラメータはa=b=78.09Å、c=36.40Å、α=β=90Å、γ=120Åである。前記構造は、CNSを利用した分子置換により決定した。したがって、天然型TR二量体を用いてモデルを得た水分子、亜鉛および塩化物イオンをすべて除いた後のタンパク質データバンクProteinDatabank:PDBの識別コード1RWE。15.0~4.0Åの解像度でデータを解析後、回転関数の最適な解の座標を用い、並進関数検索を行った。全体の異方性温度因子およびバルク溶媒の補正により、CNSを利用した剛体の微調整では、解像度19.2~3.0ÅのデータでRおよびRfreeの値はそれぞれ0.325および0.344となった。微調整のサイクル間では、2Fo-FcおよびFo-Fcマップは解像度3.0Åまでのデータを用いて計算し、亜鉛および塩化物イオンとフェノール分子をプログラムOにより前記構造に構築したJonesetal.,ActaCrystallogr.A.,Vol.4,pp.110-1191991。水分子はDDQプログラムにより計算および確認したFoccoVanAkkerandWimHol,ActaCryst.1999,D55,206-218。その配置はPROCHECKにより連続的にモニターしLaskowskietal.,J.Appl.Crystallogr.,Vol.26,pp.283-2911993、微調整が進むと亜鉛イオンおよび水分子は異なるマップに構築された。特に、各単量体のB鎖N末端の最初の8残基に関するomitmapの計算、さらに微調整はCNSを利用して行い、最大尤度でのねじれ角の動態および共役勾配の微調整を行った。前記インスリン類似体のpH依存性の溶解性は、DiMarchiらの方法の変法により評価したKohn,W.D.,Micanovic,R.,Myers,S.L.,Vick,A.M.,Kahl,S.D.,Zhang,L.,Strifler,B.A.,Li,S.,Shang,J.,Beals,J.M.,Mayer,J.P.,andDiMarchi,R.D.Peptides28,935-482007。手短に言えば、野生型ヒトインスリン、インスリングラルギン、または[HisA4,HisA8]-インスリンはpH4.0の希釈HClを含む緩衝化されていない溶液中、0.60mMで作成し、溶液の組成は医薬製剤のランタスSanofi-Aventisに採用されているものと同様であり、0.52mMZnCl2、20mg/mlの85vol/volグリセロール溶液最終濃度185mM、および抗菌性保存剤として2.7mg/mlメタクレゾール25mMを含んでいた。3つのタンパク質は、それぞれこのpH4.0の溶液では0.60mMを超える溶解性を示す。同一の一定量10mlを取り除き、様々なpH値5.0~9.0の範囲で緩衝液中に50倍希釈し、最終容積を500mlとした。それぞれのpH値を5.0、6.0、7.4、8.0、8.5、および9.0に再調整した。前記希釈液は10mMTris-HClおよび140mMNaClで構成され、pH値は希釈HClまたはNaOHで調整した。次に、複数のサンプルを20回反転させて混合し、微小遠心分離で5分間、14,000rpmで遠心分離した。次に、上清200mlを各試験管から2回取り除き、分析用逆相HPLCC4カラム、25cm×0.46cmに注入し、0.1トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの溶出勾配をつけた。各ケースにおいて、単一の溶出ピークが観察され、製造業者のソフトウェアWaters,Inc.を用い、積分によりその面積を定量化した。前記野生型インスリンのpH7.4~9.0での値では、溶解性と関係のない消失をコントロールでき、回復率は典型的には85~90の範囲であった。DiMarchiらの結果と一致し、pH7.4におけるインスリングラルギンの溶解性は1~2mMであることが分かった。この限定的な溶解性は、亜鉛対類似体のモル比5.2:6すなわち、六量体1個につき亜鉛5.2個と2.2:6六量体1個につき亜鉛2.2個で同様であり、グラルギン六量体において亜鉛イオンが軸上にあることの役割と一致していた。pH7.4における[HisA4,HisA8]-インスリンの溶解性は、六量体1個につき亜鉛イオン5.2個のモル比で1~2mMであることも分かった。本発明の製剤は中間型インスリン類似体を提供し、これにはリスプロインスリンヒューマログ登録商標のLysB2およびProB29も含まれ、亜鉛イオンおよびフェノールとともにpH4で透明な溶液として容易に製剤化される。A4およびA8の位置にリスプロおよびヒスチジン置換を含むインスリン類似体HisA4,A8KP-insおよび野生型ヒトインスリンHIの代表的な結合研究は、ヒトインスリン受容体イソ型AHIRA、ヒトインスリン受容体イソ型BHIRA、およびインスリン様成長因子受容体IGF-1Rとの関連で、表4に示している。表4に示したとおり、HisA4,A8KP-insはHIRAおよびHIRBに対する親和性がHIと同等であるが、HIと比較し、IGF-1Rに対する親和性は大きく低下している4倍以上低下。図4は、図3fに列挙した条件下での、糖尿病雄ラットの血糖値の時間経過を示している。[HisA4,HisA8]-KPインスリン、リスプロインスリン、およびインスリングラルギンはランタス登録商標同様希釈HClpH4.0に溶解し、Zn2:インスリンのモル比は5.2:1であった。[HisA4,HisA8]-KPインスリンの血糖管理の時間経過は、インスリングラルギンはランタス登録商標よりも短いが、リスプロインスリンヒューマログ登録商標よりも長く、この製剤が中間型インスリン類似体製剤となることを示している。さらに、HisA4,A8KP-insの結晶は、上述の条件と同様の条件下で得られた。理論に縛られることは望まないが、リスプロ置換の六量体不安定化効果は[HisA4,HisA8]置換の六量体複合体安定化効果とは異なり、少なくとも部分的に相殺され、中間型類似体になると考えられる。[HisA4,HisA8]インスリン類似体にはAspB28などの他の置換も含まれ、他の中間型インスリン類似体製剤が得られることも想定される。タンパク質構造の表面にヒスチジン側鎖など、1組の亜鉛配位アミノ酸側鎖を組み込む方法は、他のタンパク質でも利用され図5、インスリン同様、タンパク質六量体などの高次構造を安定化できることも、さらに想定される。より詳しくは、我々は、αへリックスを含むタンパク質における1組のヒスチジン置換によってできた側鎖は、他のポリマーの相補的側鎖と配位し、マルチポリマー複合体を形成することができると予想した。治療に有用なαへリックスを含むタンパク質の例は、エリスロポエチンおよび哺乳類の成長ホルモンである。前述の開示に基づき、本明細書で提供されるとおりA鎖置換の組み合わせを含むインスリン類似体は、インスリン受容体のヒトインスリンに対する親和性を少なくとも20保持しながら、亜鉛イオン存在下で製剤化するとインスリン作用の持続時間が長くなり、同時に、I型IGF受容体に対する絶対的および相対的親和性が低下を示すことは、今や明らかであろう。配列配列ID番号1プロインスリンPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号2A鎖Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号3B鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr配列ID番号4A4およびA8に1組のヒスチジン置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-XaaXaa=Asn,Gly,Ala,Ser,Thr配列ID番号5HisA4,HisA8置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn配列ID番号6HisA4,HisA8,GlyA21置換Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly配列ID番号7HisB1B鎖His-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr配列ID番号8リスプロ-B鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr配列ID番号9アスパルト-B鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr配列ID番号10AspB10-B鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr配列ID番号11DKPB鎖配列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr配列ID番号12グラルギンB鎖Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg配列ID番号13グラルギンA鎖Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly配列ID番号14ArgA0,HisA4,HisA8,GlyA21置換Arg-Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly"