"GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:aニューロペプチドQポリペプチドのGALR2ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドと接触させる工程;及びbGALR2ポリペプチドのニューロペプチドQポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、候補調節剤非存在下での相互作用に対する、候補調節剤存在下での相互作用の増大又は減少が、候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:aニューロペプチドQポリペプチドのGALR2ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドに接触させる工程;及びbGALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節剤非存在下における活性に対する、候補調節剤の存在下における活性の変化が、候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:aGALR2ポリペプチドを候補調節剤と接触させる工程;b候補調節剤の存在下で、GALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;及びc候補調節剤の存在下で測定した活性を、GALR2ポリペプチドがニューロペプチドQポリペプチドと接触するサンプル内で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、EC50で存在するニューロペプチドQポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも50である場合に、当該候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。GALR2の機能を調節する当該作用剤がサンプル中に存在する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。当該測定が、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光及び蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。当該GALR2ポリペプチド配列がSEQIDNo.2であり、かつ当該ニューロペプチドQポリペプチド配列がSEQIDNo.13、SEQIDNo.14又はSEQIDNo.15であり、そして当該ニューロペプチドQポリペプチドが当該GALR2ポリペプチドに特異的に結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。当該GALR2ポリペプチド配列がSEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.8及びSEQIDNo.10から成る群より選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。当該ニューロペプチドQポリペプチド配列が、SEQIDNo:13、SEQIDNo:14、SEQIDNo:15、SEQIDNo:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40及びSEQIDNO:41から成る群より選択される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。当該ニューロペプチドQポリペプチド配列が、SEQIDNo:13、SEQIDNo:14、SEQIDNo:15及びSEQIDNo:16から成る群より選択される、請求項1~5又は7のいずれか1項に記載の方法。当該ニューロペプチドQポリペプチドが検出可能に標識された、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。当該GALR2ポリペプチドが細胞内又は細胞上で発現する、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。当該GALR2ポリペプチドが細胞膜内に存在する、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。当該細胞が、COS-7-細胞、CHO細胞、U2OS細胞、LMTK-細胞、NIH-3T3細胞、HEK細胞、K-562細胞及び1321N1星状細胞種細胞から成る群より選択される、請求項11又は12のいずれか1項に記載の方法。当該GALR2ポリペプチドが、合成リポソーム又はウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部に存在する、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。当該方法が、さらにGα16の存在下で行われる、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。当該作用剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子から成る群より選択される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチドの結合又は交換、アデニルシクラーゼ活性、cAMP、ベータ-アレスチン1の移動、ベータ-アレスチン2の移動、プロテインキナーゼC活性、ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性又はレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。本発明の詳細な記述本発明は、GALR2GPCRのリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの識別に関する。これらのリガンド-レセプター相互作用は、内在リガンドのGALR2との相互作用を調節する作用剤のスクリーニングアッセイに有用である。既知のニューロペプチドQポリペプチド及びそれらのレセプターとの相互作用もまた、異常なレセプター活性に関連する状態の診断のためのツールを提供する。I.GALR2の活性を調節する作用剤の識別のためのアッセイGALR2の活性を調節する作用剤は、レセプターのニューロペプチドQポリペプチドとの相互作用を利用する多くの方法において識別することができる。例えば、GALR2/ニューロペプチドQポリペプチド相互作用をinvitro、培養細胞上で又はinvivoで再構成する能力は、結合を阻害する作用剤の識別のためのターゲットを提供する。相互作用の遮断に基づくアッセイは、かかる分子のライブラリー又は集合から、有機低分子等の作用剤を識別できる。あるいは、かかるアッセイは、天然資源からのサンプル又は抽出物、例えば、植物、真菌若しくは細菌抽出物中の、又はヒトの組織サンプル例えば、腫瘍組織中の作用剤を識別することができる。1つの側面において、抽出物は、例えば、ニューロペプチドQポリペプチド自体の変異を含む、変異核酸、ペプチド又はポリペプチドのライブラリーを発現する細胞から作ることができる。次いで、GALR2/ニューロペプチドQポリペプチド相互作用の調節剤は、レセプターを介した下流のシグナル伝達を測定する結合性アッセイbindingassay又は機能性アッセイfunctionalassayを用いてスクリーニングすることができる。結合性アッセイbindingassay及び機能性アッセイの双方とも、ニューロペプチドQポリペプチドを用いて検証される。GALR2機能を調節する作用剤を識別するための、GALR2/ニューロペプチドQポリペプチド相互作用をより直接的に使用する別のアプローチは、候補作用剤又は候補調節剤により誘導されるGALR2下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能性アッセイは、単離細胞膜核分中又は表面にレセプターを発現する細胞上で行うことができる。以下の記述は、GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用に基づく結合性及び機能性アッセイの双方の方法を提供する。A.GALR2ポリペプチドGALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用を用いるアッセイは、GALR2ポリペプチド源を必要とする。ヒトGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:1及び2として表される。マウスGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:3及び4として表される。ラットGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:5及び6として表される。アカゲザルGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:7及び8として表される。チンパンジーGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:9及び10として表される。GALR2ポリペプチド配列はまた、Swissprotデータベースに、寄託番号O43603、A5JUU4及びQ32MN8で記録されている。関連配列は、ヒトGALR2GenBankAccessionNO.NPNP003848ポリペプチド配列及びGenBankAccessionNO.AF040630ヌクレオチド配列、マウスGALR2GenBankAccessionNO.AF042784ヌクレオチド配列及びSwissprotAccessionNO.O88854ポリペプチド配列、ラットGALR2GenBankAccessionNO.AF010318ヌクレオチド配列及びSwissprotAccessionNO.O08726ポリペプチド配列、アカゲザルEnsemblAccessionNO.ENSMMUT00000012422ヌクレオチド配列及びEnsemblAccessionNO.ENSMMUP00000011651ポリペプチド配列及びチンパンジーEnsemblAccessionNO.ENSPTRT00000017739ヌクレオチド配列及びEnsemblAccessionNO.ENSPTRP00000016435ポリペプチド配列のものを含む。当業者は、既知の配列に基づいてデザインしたプライマー又はプローブを用いて、基本的なPCR及び分子クローン技術を介して、そのタンパク質をコードするmRNAを含むサンプルからのGALR2配列を容易に増幅することができる。組み換えポリペプチドの発現は、当該技術分野においてよく知られている。当業者は、本発明の有用なGALR2ポリペプチドの真核又は前核細胞内での発現のためのベクター及び発現制御配列を容易に選択することができる。結合性又はシグナル伝達機能を持つためには、GALR2は、細胞膜又は界面活性剤様の合成リポソームに結合していなければならない。細胞膜画分を調製する方法は当業者によく知られており、例えば、Hubbard及びCohnJ.CellBiol.、64:461-479、1975によって報告された方法である。GALR2を含有する膜を製造するためには、かかる技術を、内因的にendogenously又は組み換えによりGALR2を発現する細胞に適用するだけでよい。あるいは、膜遊離GALR2は、ポリペプチドの界面活性剤溶液の希釈により、膜調製物中に組み込むことができる例えば、Salamonら、Biophys.J.、71:283-294、1996。B.ニューロペプチドQポリペプチドヒトプレプロニューロペプチドQのポリヌクレオチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:11として表される。ヒトプレプロニューロペプチドQのポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:12として表される。ヒトニューロペプチドQのポリペプチド配列は、本明細書において、SEQIDNO:13として表される。ヒトプレプロニューロペプチドQのポリペプチド配列はまた、Swissprotデータベースに寄託番号Q9BT56にて記録されている。ヒトのポリヌクレオチド配列はまた、寄託番号BC004336.1にて記録されている。関連ポリペプチド配列は、図42~47においてEnsembl寄託番号及び配列として記述した異なる種からの配列が含まれる。GALR2と同様に、ニューロペプチドQポリヌクレオチドは、既知の配列を増幅プライマー又はプローブとして用いて、標準的なPCR及び分子クローニング技術を介してクローンすることができる。同様に、クローンされたニューロペプチドQポリペプチドは、当該技術分野で知られているように、真核又は前核細胞中で発現することができる。非限定的な例として、哺乳類ニューロペプチドQ発現ベクター系は、Mishizuma及びNagata、Nucl.AcidsRes.、18:5322、1990により記載されたヒトEFlaのプロモーター、ポリリンカー、ECMV配列内リボソーム進入部位IRES、Ghattasらにより記載、Mol.Cell.Biol.、11:5848-5859、1991及びSV40ポリシグナルが続くネオマイシン耐性遺伝子を含むバイシストロン性発現ベクターを含むことができる。ニューロペプチドQポリペプチドはまた、invitroでの転写及び翻訳を介して、invitroで発現させることもできる。さらに、そのアッセイ又は技術において望ましい場合には、本発明のニューロペプチドQポリペプチドは、融合タンパク質又はタグ結合タンパク質として製造することができる。ニューロペプチドQポリペプチドの精製又は検出を容易にするために、例えば、全長ニューロペプチドQポリペプチド又はその一部すなわち、少なくとも10アミノ酸、好ましくは、少なくとも13アミノ酸以上で、全長ニューロペプチドQポリペプチドより1アミノ酸少ないものまでを、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、分泌型アルカリホスファターゼSEAP、FLAGタグ、Mycタグ又は6X-Hisペプチドに融合することができる。タグ結合又は融合タンパク質の製造のための方法又はベクターは、当業者によく知られており、かかる融合又はタグ結合タンパク質を単離し検出する方法も同様である。ニューロペプチドQポリペプチド及び特に切断形態はまた、当該技術分野で知られているように、化学合成により製造することもできる。組み換えニューロペプチドQポリペプチドは、精製して用いることができる。あるいは、ニューロペプチドQをトランスフェクトした細胞からの調整培地を使用できる。本発明において、その結合性又は機能性アッセイに必要なニューロペプチドQの量は、アッセイによって変わる。タグ結合ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2に対するアフィニティー及びEC50値は、全長野生型ニューロペプチドQポリペプチドSEQIDNO:12、13又は14に比べて変わるかもしれず、従って、そのアッセイに必要な量は、野生型の値に対して調整することができる。そのアッセイにおいて必要な場合には、ニューロペプチドQポリペプチドは、合成の間に、培地中で、放射標識されたアミノ酸、例えば、35S-Met等の35S-標識アミノ酸、14C-Leu等の14C-標識アミノ酸、3H-標識トリチウム標識したアミノ酸又は適宜な他のアミノ酸、を取り込ませることによって標識することができる。化学標識の方法は、当該技術分野で知られている。蛍光標識はまた、標準的標識技術を用いて、ニューロペプチドQポリペプチド又は他のGALR2リガンドに結合することができる。C.GALR2活性の調節剤を識別するためのアッセイGALR2レセプターのリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの識別は、レセプター活性のアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストを識別するためのスクリーニングアッセイを可能にする。スクリーニングアッセイには2つの一般的なアプローチがある。1GALR2を発現する細胞、かかる細胞からの膜抽出物又はGALR2を含有する固定化脂質膜を、標識ニューロペプチドQポリペプチド及び候補化合物に暴露するリガンド結合アッセイ。インキュベーションに続いて、反応混合物を、標識ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2レセプターへの特異的結合について計測する。標識ニューロペプチドQポリペプチドに干渉するか又はそれを置換する化合物は、GALR2活性のアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストでありえる。これらのカテゴリーのいずれが適合するかを確かめるためには、陽性化合物に対して機能性分析を行うことができる。2GALR2のシグナル伝達活性を測定する機能性アッセイ。aアゴニストのスクリーニングについては、GALR2を発現する細胞又はそれから調製した膜を、候補化合物と共にインキュベートし、そしてGALR2のシグナル伝達活性を測定する。アッセイは、アゴニストとしてのニューロペプチドQポリペプチドを用いて検証し、レセプター活性を調節する化合物によって誘起された活性を、ニューロペプチドQポリペプチドによって誘起された活性と比較する。アゴニスト又は部分的アゴニストが存在する場合、アゴニスト又は部分的アゴニストは、野生型ヒトニューロペプチドQポリペプチドSEQIDNO:12、13又は14の最大活性の少なくとも10に相当する最大生物学的活性を持ち、そして好ましくは、50、75、100又はそれ以上の活性を持ち、野生型ヒトニューロペプチドQポリペプチドよりも2-倍、5-倍、10-倍又はそれ以上の高い活性を有する場合も含まれる。bアンタゴニスト又はインバースアゴニストのスクリーニングについては、GALR2を発現する細胞又はそれから単離した膜を、ニューロペプチドQポリペプチドの存在下にて、候補化合物の存在下又は非存在下で、シグナル伝達活性についてアッセイする。アンタゴニスト又はインバースアゴニストは、アンタゴニスト又はインバースアゴニストを欠いた反応に比べ、ニューロペプチドQポリペプチド-刺激レセプター活性のレベルを少なくとも10減少させる。cインバースアゴニストスクリーニングについては、恒常的なGALR2活性を発現する細胞又はそれから単離した膜を、候補化合物の存在下及び非存在下にて、レセプター活性を測定する機能性アッセイにおいて使用することができる。インバースアゴニストは、レセプターの恒常的な活性を少なくとも10減少させる化合物である。GALR2の過剰発現すなわち、invivoで細胞において自然に発現されるレベルに対し、GALR2ポリペプチドの5倍以上過剰な発現は、恒常的な活性化につながるかもしれない。GALR2は、強い構成的プロモーターconstitutivepromoter、例えば、CMVearlypromoterの制御下に置くことにより過剰発現させることができる。あるいは、保存GPCRアミノ酸又はアミノ酸部位の特定の突然変異は、恒常的な活性を導く傾向があるKjelsbergら、J.Biol.Chem.、267:1430-1433、1992;McWhinneyら、J.Biol.Chem.、275:2087-2097、2000;Renら、J.Biol.Chem.、268:16483-16487,1993;及びParmaら、Nature、365:649-651、1993。リガンド結合及び置換アッセイligandbindinganddisplacementassay:ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2への結合を阻害する化合物をスクリーニングするためには、細胞上で発現するGALR2ポリペプチド又はレセプターポリペプチドを含む単離した膜を、ニューロペプチドQポリペプチドと共に使用することができる。結合又はニューロペプチドQポリペプチドの置換のみを測定するアッセイで識別された場合には、化合物は、それらがアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストのいずれとして作用するのかを決めるために、機能性試験に付されなければならない。置換実験については、GALR2ポリペプチドを発現する細胞を、候補調節剤の濃度上昇の存在下又は非存在下で、標識ニューロペプチドQポリペプチドと共に結合バッファー中でインキュベートする。アッセイを検証し較正するためには、非標識ニューロペプチドQポリペプチドの濃度上昇を用いた対照競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞をよく洗い、そして結合している標識ニューロペプチドQポリペプチドを、その標識について適宜な方法で測定する例えば、シンチレーション計測、酵素アッセイ、蛍光等。候補調節剤存在下における、結合した標識ニューロペプチドQポリペプチドの量の少なくとも10の減少は、候補調節剤による結合の置換を示す。標識ニューロペプチドQポリペプチドの50を置換する場合準飽和sub-saturatingニューロペプチドQポリペプチド用量には、候補調節剤は、本明細書に記載した本アッセイ又は他のアッセイにおいて、特異的に結合すると考えられる。あるいは、結合又は結合の置換は、表面プラズモン共鳴SPRでモニターすることができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、ニューロペプチドQポリペプチドの、水相からの、センサー上の膜内に固定化されたGALR2ポリペプチドへの結合又は結合の喪失により引き起こされる、固定化センサー近傍の質量の変化により、2つの分子の間の結合を測定する定量的方法として使用することができる。この質量変化は、ニューロペプチドQポリペプチド又は候補調節剤の注入又は除去後に、時間に対する共鳴単位resonanceunitsとして計測され、そして例えば、BiacoreBiosensorBiacoreABを用いて測定することができる。GALR2は、Salamonらによって記述された方法BiophysJ.71:283-294;Biophys.J.、80:1557-1567、2001;TrendsBiochem.Sci.、24:213-219、1999に従って、薄層脂質膜中のセンサーチップ例えば、リサーチグレードCM5チップ;BiacoreAB上に固定化することができる。Sarrioらは、チップ上の脂質層中に固定化したクラスAのGPCRA1アデノシンレセプターに対するリガンドの結合を検出するためにSPRを使用することができることを示した。当業者は、Sarrioらにより報告された条件Mol.Cell.Biol.、20:5164-5174、2000を出発点として用いて、SPRアッセイにおける、ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2への結合の条件を微調整することができる。SPRは、結合の調節剤について、少なくとも2つの方法でアッセイを行うことができる。第一に、ニューロペプチドQポリペプチドを、固定化GALR2ポリペプチドに予め結合させ、次いで、10μl/minの流速及び1nMから100μMの範囲の濃度で候補調節剤を注入することができる。結合ニューロペプチドQポリペプチドの置換は定量化でき、調節剤の結合の検出を可能にする。あるいは、膜結合GALR2ポリペプチドを候補調節剤と予めインキュベートし、そしてニューロペプチドQポリペプチドと接触させる。調節剤に予め暴露されていないチップ上の結合に対する、調節剤に暴露されたGALR2へのニューロペプチドQポリペプチドの結合の違いが結合性を示す。いずれのアッセイにおいても、候補調節剤非存在下におけるニューロペプチドQポリペプチドの結合量に対する、候補調節剤存在下におけるニューロペプチドQポリペプチドの結合量の10以上の減少は、候補調節剤が、GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用を阻害することを示す。ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2への結合の阻害を測定する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー転移FRETを用いる。FRETは、蛍光供与体fluorescencedonorDの発光スペクトルが蛍光受容体fluorescenceacceptorAの励起スペクトルと重複する場合に、互いに近接した通常、<100オングストロームの距離DとAの間で起こる量子力学的現象である。試験を行う分子、例えば、ニューロペプチドQポリペプチド及びGALR2ポリペプチドを、供与体及び受容体蛍光体の相補的ペアで標識する。GALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用により密接に結合している間は、供与体蛍光体の励起に伴って発光される蛍光は、ポリペプチドが結合していない場合にその励起波長に反応して発光された蛍光とは異なる波長を有し、各波長での発光強度の測定により、非結合ポリペプチドに対する結合ポリペプチドの定量化を可能にする。ポリペプチドを標識する蛍光体の供与体:受容体ペアは、当業者によく知られている。CyanFPCFP、供与体D及びYellowFPYFP、受容体Aとして知られるA.victoriaGFPの変異体は、特に有用である。GFP変異体は、タンパク質-タンパク質相互作用を測定するためのFRETスキームのD-Aペアとして供するために、結合ペアのそれぞれのメンバーを用いて融合タンパク質として作ることができる。融合体としてのGFP変異体の発現のためのベクターは、当該技術分野で知られている。例として、CFP-ニューロペプチドQポリペプチド融合体とYFP-GALR2融合体を作ることができる。標識ニューロペプチドQポリペプチドとGALR2タンパク質の混合物への候補調節剤の添加は、候補調節剤を欠いたサンプルと比べて、例えば、YFP蛍光の減少により裏付けられるエネルギー転移の阻害を引き起こす。GALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用の検出のためのFRETを用いたアッセイにおいて、候補調節剤を欠いたサンプルと比べた、候補調節剤を含むサンプル中における受容体波長での蛍光発光強度の10以上の減少は、候補調節剤がGALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用を阻害することを示す。FRETの変法は、分子相互作用をモニターするために蛍光消光を使用する:相互作用するペアの一方の分子を蛍光体で標識し、そして他方を、近接状態になった場合に蛍光体の蛍光を消光する分子で標識することができる。励起に伴う蛍光の変化は、蛍光体を結合した分子:消光体ペアの結合の変化を示す。一般的に、標識GALR2ポリペプチドの蛍光の増大は、消光体を保持するニューロペプチドQポリペプチドが置換されたことを示す。消光アッセイについては、候補調節剤を欠いたサンプルと比べた、候補調節剤を含むサンプル中における蛍光発光強度の10以上の増大は、候補調節剤がGALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用を阻害することを示す。表面プラズモン共鳴及びFRET法に加えて、蛍光偏光測定は、タンパク質-タンパク質結合を定量化するのに有用である。蛍光タグを付された分子の蛍光偏光値は、回転相関時間therotationalcorrelationtime又は反転速度tumblingrateに依存する。蛍光標識されたニューロペプチドQポリペプチドと結合するGALR2により形成された複合体等のタンパク質複合体は、複合体ではない標識ニューロペプチドQポリペプチドよりも高い偏光値を有する。GALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用の候補阻害剤を含ませることにより、もしその候補阻害剤が、GALR2のニューロペプチドQポリペプチドとの相互作用を撹乱し又は阻害するならば、候補阻害剤を欠いた混合物と比較して、蛍光偏光が減少する。蛍光偏光は、ポリペプチド又はタンパク質複合体の形成を撹乱する小分子の識別に好適である。候補調節剤を欠いたサンプルの蛍光偏光に比べた、候補調節剤を含むサンプルにおける蛍光偏光の10以上の減少は、候補調節剤がGALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用を阻害することを示す。GALR2-ニューロペプチドQポリペプチド相互作用をモニターする別の代替法は、バイオセンサーアッセイを使用する。ICSバイオセンサーは、AMBRIAustralianMembraneBiotechnologyResearchInstituteによって記述されている。この技術において、GALR2及びニューロペプチドQポリペプチド等のマクロ分子の会合は、懸架した膜二重層中のグラミシジン促進イオンチャンネルの閉鎖と結び付いており、従って、バイオセンサーのインピーダンスと類似するアドミッタンスの測定可能な変化と関連付けられる。このアプローチは、6桁を超えるアドミッタンスの変化において直線的であり、小分子コンビナトリアルライブラリの大規模なハイスループットスクリーニングhighthroughputscreeningに理想的である。候補調節剤を欠いたサンプルのアドミッタンスに比べた、候補調節剤を含むサンプルにおけるアドミッタンスの10以上の変化増大又は減少は、候補調節剤が、GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用を阻害することを示す。タンパク質-タンパク質相互作用のアッセイにおいては、相互作用の調節剤は、必ずしもタンパク質の物理的に相互作用する部位と直接的に相互作用する必要はなくてもよいということに留意することが重要である。調節剤が、タンパク質-タンパク質相互作用の部位から除かれた部位で相互作用し、例えば、GALR2ポリペプチドのコンフォメーションの変化を引き起こすこともありえる。それでもやはり、このように作用する調節剤アンタゴニスト又はアゴニストは、GALR2の活性を調節する作用剤として重要である。記載した結合性アッセイのいずれもが、GALR2レセプター分子に結合し、又はニューロペプチドQポリペプチドのレセプターへの結合に影響を与えるサンプル、例えば組織サンプル中の作用剤の存在を決定するのに用いることができる。そのために、GALR2ポリペプチドを、サンプルの存在下又は非存在下でニューロペプチドQポリペプチド又は別のリガンドと反応させ、そしてニューロペプチドQポリペプチド又はリガンドの結合を、使用する結合性アッセイに適した方法で測定する。ニューロペプチドQポリペプチド又は他のリガンドの結合の10以上の減少は、サンプルが、GALR2又はリガンドのレセプターポリペプチドへの結合を調節する作用剤を含むことを示す。レセプター活性の機能性アッセイi.GTPアーゼ/GTP結合性アッセイ:GALR2等のGPCRに関しては、レセプター活性は、そのレセプターを有する細胞膜によるGTP結合により測定される。Traynor及びNahorskiにより記述された方法Mol.Pharmacol.、47:848-854、1995においては、標識されたGTPの結合を測定することにより、膜に結合したG-タンパク質を本質的に測定する。GTP結合性アッセイでは、レセプターを発現する細胞から単離した膜は、それ自体35S-GTP-ガンマ-S及びGDPを含むバッファー中でインキュベートしてもよい。インキュベーションの後、非結合標識GTPをろ過により除く。Gタンパク質に結合した標識GTPを、液体シンチレーション計測により測定する。ニューロペプチドQポリペプチド-誘導GALR2活性の調節について試験するために、GALR2ポリペプチドを発現する細胞から調製した膜を、ニューロペプチドQポリペプチドと混合し、そしてGALR2活性の候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GTP結合アッセイを行う。候補調節剤を含むこの種のアッセイにおける、シンチレーション計測により測定された標識GTP結合の、調節剤を含まないアッセイに比べた10以上の減少は、候補調節剤がGALR2活性を阻害することを示す。アゴニストとして作用する化合物を識別するために、類似のGTP-結合性アッセイをニューロペプチドQポリペプチド無しで行うことができる。この場合、ニューロペプチドQポリペプチド-刺激GTP結合を標準として用いる。化合物が10μM以下で存在するときに、ニューロペプチドQポリペプチドにより誘導されるGTP結合のレベルの少なくとも50を誘導する場合に、その化合物はアゴニストと考えられ、そして、ニューロペプチドQポリペプチドにより誘導されるレベルと同じか又はより高いレベルを誘導することが好ましい。GTPアーゼ活性は、GALR2ポリペプチドを含む膜をガンマ-32P-GTPとインキュベートすることにより測定される。活性GTPアーゼは、標識を無機リン酸として放出し、それは、分離後、シンチレーション計数により検出される。候補化合物の非特異的効果を除外するために、対照は、GALR2を発現しない細胞モック-感染から単離された膜を用いたアッセイを含む。GALR2-調節GTPアーゼ活性に対する候補調節剤の効果についてアッセイするために、膜サンプルを、調節剤の存在下又は非存在下でニューロペプチドQポリペプチドとインキュベートし、次いでGTPアーゼアッセイを行う。調節剤を含まないサンプルと比べた、GTP結合又はGTPアーゼ活性のレベルの10以上の変化増大又は減少は、候補調節剤によるGALR2の調節を示す。ii.下流経路活性化アッセイ:a.カルシウム流動-イクオリン-アッセイ:イクオリンアッセイは、GPCRの活性化により誘導された細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアのアポイクオリンの応答を利用するStablesら、Anal.Biochem.、252:115-126、1997;Detheuxら、J.Exp.Med.、1921501-1508、2000。要約すると、GALR2-発現クローンを、ミトコンドリアのアポイクオリンとGα16を同時発現するようにトランスフェクトする。細胞をセレンテラジンHMolecularProbesとインキュベートし、洗浄し例えば、DMEM-F12培養培地中で、そして所定の濃度にて再懸濁する例えば、約0.5×106細胞/ml。次いで、細胞をニューロペプチドQペプチドと混合し、そしてイクオリンによる光照射をルミノメーターで記録する。結果を相対発光量RelativeLightUnitsRLUとして表す。候補化合物の非特異的効果を除外するために、対照は、GALR2を発現しない細胞モック-感染から単離された膜を用いたアッセイを含む。GALR2ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞のサンプルにおいて、GALR2ポリペプチドを発現するが、候補調節剤で処理しなかった細胞のサンプルに比べ又はGALR2ポリペプチドを発現しないがモック-感染細胞、候補調節剤で処理した細胞のサンプルに比べて、光強度が10以上増大又は減少した場合には、イクオリン活性又は細胞内カルシウムレベルは変化する。ニューロペプチドQポリペプチドの非存在下で行う場合には、このアッセイは、GALR2活性のアゴニストを識別するために使用することができる。このアッセイをニューロペプチドQポリペプチドの存在下で行う場合には、アンタゴニスト又はアロステリック調節剤のアッセイに用いることができる。b.アデニルシクラーゼアッセイ:アデニルシクラーゼ活性のアッセイは、KenimerNirenbergMol.Pharmacol.、20:585-591、1981に記載されている。本発明によれば、GALR2活性の候補調節剤で処理した細胞から得たサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない細胞の類似のサンプルと比較して、又はGALR2ポリペプチドを発現しないがモック-感染細胞、候補調節剤で処理した細胞のサンプルと比較して、10以上増大又は減少する場合には、アデニルシクラーゼ活性は変化する。c.cAMPアッセイ:細胞内又は細胞外cAMPは、cAMPラジオイムノアッセイRIA又はcAMP結合タンパク質又はcAMP結合抗体を用いて、当該技術分野において広く知られた方法に従って測定される。例えば、Horton及びBaxendaleMethodsMol.Biol.、41:91-105、1995は、cAMP測定に対するRIAアッセイを記述する。cAMPを測定するための多くのキットが市販されている。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞の抽出物を用いて行うべきである。GALR2ポリペプチドを発現し、GALR2活性の候補調節剤で処理した細胞において又はかかる細胞の抽出物において、Horton及びBaxendaleMethodsMol.Biol.、41:91-105、1995のRIA-ベースアッセイを用いて検出されたcAMPのレベルが、候補調節剤で処理しない類似の細胞におけるcAMPレベルと比べて、少なくとも10増大又は減少する場合には、cAMPのレベルは変化する。d.リン脂質の分解、ジアシルグリセロール及びイノシトール三リン酸の産生:リン脂質の分解を活性化するレセプターは、リン脂質の分解及び結果としての2次メッセンジャー、ジアシルグリセロールDAG及び/又はイノシトール三リン酸IP3の生成をモニターすることにより、GALR2の既知の又は被疑調節剤の活性の変化についてモニターできる。これらの生成物の各々を測定する方法は、IanM.Bird.Totowa、NJ、HumanaPress、1998により編集されたPhospholipidSignalingProtocolsに記載されている。ホスファチジルイノシトールの分解のアッセイについても記載するRudolphらJ.Biol.Chem.、274:11824-11831、1999も参照されたい。アッセイは、候補調節剤の存在下又は非存在下で、ニューロペプチドQポリペプチドで処理し又は処理しないGALR2を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて行うべきである。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。本発明によれば、GALR2ポリペプチドを発現しかつ候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しないGALR2ポリペプチド発現細胞からのサンプルにおいて観察されるレベルに比べて、少なくとも10増大又は減少する場合には、ホスファチジルイノシトールの分解及びDAG及び/又はIP3レベルは変化する。e.PKC活性化アッセイ:成長因子レセプターチロシンキナーゼは、リン脂質-及びカルシウム-依存プロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼCPKCの活性化が関与する経路を介してシグナル伝達を行う傾向がある。PKCの活性化は、最終的には、c-fos、c-myc及びc-junを含む数々のプロトオンコジーン転写因子をコードする遺伝子、プロテアーゼ、I型コラゲナーゼ及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子を含むプロテアーゼ阻害因子並びに細胞内接着分子IICAMIを含む接着分子の転写に帰結する。PKCによって誘導された遺伝子産物の増大を検出するためにデザインされたアッセイは、PKCの活性化、そしてそれによってレセプター活性をモニターするために用いることができる。加えて、PKCを介してシグナルを伝達するレセプターの活性は、PKCの活性化による遺伝子の活性化のための制御配列によって主導されるレポーター遺伝子コンストラクトを通じてモニターすることができる。このタイプのレポーター遺伝子-ベースのアッセイについて、以下により詳細に議論する。PKC活性のより直接的な測定については、KikkawaらJ.Biol.Chem.、257:13341、1982の方法を用いることができる。このアッセイは、PKCの基質ペプチドのリン酸化を測定するもので、基質ペプチドは、その後、ホスフォセルロースろ紙への結合により分離される。このPKCアッセイ系は、精製したキナーゼの活性又は粗細胞抽出物の活性を測定するために使用できる。可能なアッセイの1つにおいて、基質は、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼC基質タンパク質MARCKS由来のペプチドAc-FKKSFKL-NH2である。このペプチドの酵素のKmは約50μMである。当該技術分野で知られる他の塩基性のプロテインキナーゼC-選択性ペプチドを、それらのKmの少なくとも2~3倍の濃度にて使用することもできる。アッセイに必要な補助因子は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ATP、ホスファチジルセリン及びジアシルグリセロールを含む。ユーザーの意図により、アッセイは、存在するPKCの量活性化条件又は存在する活性PKCの量非活性化条件を決定するために行うことができる。本発明のほとんどの目的に対しては、活性化しえるPKCを測定するよりも、単離した場合にサンプル中で活性なPKCを測定するような非活性化条件が使用される。非活性化条件において、EGTAを選択するアッセイでは塩化カルシウムは省略される。アッセイは、HEPES、DTT、MgCl2、ATP、ガンマ-32P-ATP、ペプチド基質、ホスファチジルセリン/ジアシルグリセロール膜及び塩化カルシウム又はEGTAを含む混合物中で行われる。反応は、適宜な温度例えば、約30°Cにて適宜な時間例えば、約5-10分行い、次いでATP及びEDTAを添加して反応を止める。反応を止めた後、各反応液の一部をWhatmanP81リン酸セルロースフィルター上にスポットし、次いで、希釈リン酸、そして最後に95EtOHで洗浄する。結合した放射活性をシンチレーション計数で測定する。標識ATPの比活性cpm/nmolを、反応液のサンプルをP81ペーパー上にスポットし、そして洗浄することなく計測することにより決定する。PKC活性の単位は、1分当たりに転移したphosphateのnmol数と定義される。あるいは、アッセイは、PanVeraにより販売されるプロテインキナーゼCアッセイキットを用いて行うことができる。アッセイは、候補調節剤の存在下又は非存在下にて、ニューロペプチドQポリペプチドで処理し又は処理しない、GALR2ポリペプチドを発現する細胞からの抽出物について行ってもよい。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。本発明によれば、GALR2を発現し、かつ候補調節剤で処理した細胞からの抽出物において、候補調節剤で処理しない細胞からの類似のサンプルで行った反応に比べて、上記のいずれかのアッセイにより測定したPKCの単位が、少なくとも10増大又は減少する場合は、PKC活性は候補調節剤により変化する。f.キナーゼアッセイ:マイトジェン活性化タンパク質MAPキナーゼ活性は、市販の幾つかのキット、例えば、NewEnglandBiolabsにより販売されるp38MAPキナーゼアッセイキットCat♯9820又はPerkin-ElmerLifeSciencesにより販売されるFlashPlateMAPキナーゼアッセイのいずれかを用いてアッセイすることができる。GALR2ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない類似の細胞からのサンプルにおけるMAPキナーゼ活性に比べて、活性のレベルが10以上増大又は減少する場合は、MAPキナーゼ活性は変化する。既知の合成又は天然チロシンキナーゼ基質及び標識phosphateを用いたチロシンキナーゼ活性の直接的なアッセイはよく知られており、他のタイプのキナーゼアッセイ例えば、Ser/Thrキナーゼと類似である。キナーゼアッセイは、GALR2ポリペプチドを発現し、候補調節剤の存在下又は非存在下にて、ニューロペプチドQポリペプチドで処理し又は処理しない細胞からの精製キナーゼ及び粗抽出物の双方で行うことができる。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。基質は、全長タンパク質又は基質を代理する合成ペプチドのいずれであってもよい。PinnaRuzzeneBiochem.Biophys.Acta.1314:191-225、1996は、キナーゼ活性の測定に有用な多くのリン酸化基質部位を挙げている。多くのキナーゼ基質ペプチドは市販されている。特に有用なのは、市販のSrc-関連ペプチドRRLIEDAEYAARGであり、これは、多くのレセプター及び非レセプターチロシンキナーゼの基質である。下記のアッセイはペプチド基質のフィルターへの結合を必要とするので、ペプチド基質は、結合を促進するために正味の正電荷を持つべきである。一般的に、ペプチド基質は、少なくとも2つの塩基性残基と遊離アミノ末端を持つ。一般に、アッセイは、キナーゼバッファーBSA、トリス-Cl、MgCl2;アッセイを行うキナーゼによって、MgCl2の代わりに又はそれに加えて、MnCl2を用いることができる。、ATP、32P-ATP、ペプチド基質、試験を行うキナーゼを含む細胞抽出物キナーゼアッセイに用いる細胞抽出物は、オルトバナジン酸ナトリウム等のホスファターゼ阻害剤を含むべきである。及びH2Oを含む適宜な体積で行われる。反応は約30°Cで行われ、そして細胞抽出物の添加により開始される。キナーゼ反応は30秒から約30分行い、次いで希釈、冷トリクロロ酢酸TCAを添加する。サンプルを小型遠心機で回転し、そして上清画分をWhatmanP81リン酸セルロース円形フィルターにスポットする。フィルターは希釈リン酸、次いでアセトンで洗浄する。フィルターを乾燥し、そして取り込まれた32Pをシンチレーション計数により測定する。キナーゼ反応液中のATPの比活性例えば、cpm/pmolでを、反応液の少量のサンプルをP81円形フィルター上にスポットし、洗浄することなく直接計数することにより測定する。次いで、キナーゼ反応液において得られた分当たりの計数cpmブランクを差し引く。を比活性で割って、反応において転移したphosphateのモル数を決定する。GALR2ポリペプチドを発現し、候補調節剤で処理した細胞からのサンプルにおいて、候補調節剤で処理しない類似の細胞からのサンプルにおけるキナーゼ活性と比べて、キナーゼ活性のレベルが10以上増大又は減少する場合に、チロシンキナーゼ活性は変化する。g.下流経路活性化の転写レポーター:アゴニストのレセプター、例えばGALR2、の結合により開始された細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを始動させ、それは、最終的に、1又は2以上の遺伝子の転写又は翻訳の急速かつ検出可能な変化を引き起こす。従って、レセプターの活性は、GALR2活性化に応答する制御配列により主導されるレポーター遺伝子の発現を測定することによりモニターできる。本明細書で使用するプロモーターは、遺伝子発現のレセプター-介在制御に必要な転写制御要素を意味し、基本的なプロモーターのみならず、レセプター-制御発現に必要ないかなるエンハンサー又は転写因子結合部位をも含む。アゴニストの結合により生じる細胞内シグナルに応答し、そして選択されたプロモーターを、その転写、翻訳又は最終的な活性を容易に検出しかつ測定できるレポーター遺伝子に作動的につなげるプロモーターを選択することにより、転写ベースのレポーターアッセイは、そのレセプターが活性化されるか否かの指標を迅速に与える。ルシフェラーゼ、CAT、GFP、ベータ-ラクタマーゼ又はベータ-ガラクトシダーゼ等のレポーター遺伝子は、これらの産物の検出に対するアッセイと同様に、当業者によく知られている。レセプター活性のモニターに特によく適合する遺伝子は、迅速に;一般的には、レセプターとエフェクタータンパク質又はリガンドの間の数分の接触の間に誘導される即初期遺伝子である。即初期遺伝子の転写の誘導は、新しい制御タンパク質の合成を必要としない。リガンドの結合に対する急速な応答に加えて、レポーターコンストラクトを作成するために有用な好ましい遺伝子の特徴は、静止期quiescent細胞における低い又は検出不可能な発現;遷移的かつ新しいタンパク質の合成と独立した誘導;転写のその後のshut-offが新しいタンパク質合成を必要とすること;そしてこれらの遺伝子から転写されたmRNAが短い半減期を有すること、を含む。転写制御要素が有用なものであるためには、これらの特性のすべてを有することが好ましいが、必須ではない。多くの異なる刺激に応答する遺伝子の例は、c-fosプロトオンコジーンである。c-fos遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化特異剤differentiation-specificagents、ストレス及び細胞表面タンパク質の他の既知の誘導剤により、タンパク質-合成-依存的に活性化される。c-fos発現の誘導は、極端に速く、しばしばレセプター刺激から数分以内でおこる。この特徴は、レセプター活性化のレポータとしての使用にとって特に魅力的なc-fos調節領域をつくる。転写因子CREB環状AMP応答要素結合タンパク質は、名前が意味するように、細胞内AMPのレベルに応答する。従って、cAMPレベルの調節を介してシグナルを伝達するレセプターの活性化は、転写因子の結合又はCREB結合要素CRE又はcAMP応答要素と称されるに連結するレポータ遺伝子の発現のいずれかを測定することによりモニターすることができる。CREB結合活性に応答するレポーターコンストラクトは、U.S.PatentNo.5,919、649に記載されている。他のプロモーター及び転写コントロール要素は、c-fos要素及びCREB応答コンストラクトに加えて、血管作動性腸管ペプチドVIP遺伝子プロモーターcAMP応答;Finkら、Proc.Natl.Acad.Sci.、85:6662-6666、1988;ソマトスタチン遺伝子プロモーターcAMP応答;Montminyら、Proc.Natl.Acad.Sci.、8.3:6682-6686、1986;プロエンケファリンプロモーターcAMP、ニコチン性アゴニスト及びホルボールエステルに応答;Combら、Nature、323:353-356、1986;ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼPEPCK遺伝子プロモーターcAMP応答;Shortら、J.Biol.Chem.、261:9721-9726、1986を含む。GPCR活性の変化に応答する転写制御要素のさらなる例は、AP-1転写因子に応答するもの及びNF-kB活性に応答するものが含まれるが、これらに限定されるものではない。プロモーターコンストラクトは、そのコンストラクトでトランスフェクトしたGALR2発現細胞をニューロペプチドQポリペプチドに暴露することによって試験されるべきである。ニューロペプチドQポリペプチドに応答するレポーターの発現の少なくとも2倍の増加は、そのレポータがGALR2活性の指標であることを示す。GALR2活性をニューロペプチドQポリペプチド-応答転写レポーターコンストラクトと共にアッセイするには、GALR2ポリペプチドを安定に発現する細胞を、コンストラクトで安定にトランスフェクトする。アゴニストのスクリーニングを行うには、細胞を未処理で放置するか、候補調節剤に暴露するか又はニューロペプチドQポリペプチドに暴露し、そしてレポーターの発現を測定する。ニューロペプチドQポリペプチド-処理培養を、既知のアゴニストにより誘導された転写のレベルの標準として用いる。候補調節剤存在下における、レポーターの発現の少なくとも20の増大は、候補がGALR2活性の調節剤であることを示す。アゴニストは、少なくとも20、そして好ましくはニューロペプチドQポリペプチドと同量以上のレポーターの発現を誘導する。細胞が、ニューロペプチドQポリペプチド又は別のアゴニストの非存在下にて、レポーターの基礎的活性が上昇するようなレベルでGALR2ポリペプチドを発現する場合には、このアプローチは、インバースアゴニストをスクリーニングするために用いることもできる。候補調節剤存在下における、その非存在の場合と比べた、レポーター活性の10以上の減少は、その化合物がインバースアゴニストであることを示す。アンタゴニストをスクリーニングするためには、GALR2を発現し、レポーターコンストラクト細胞を担持する細胞を、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、ニューロペプチドQポリペプチド又は別のアゴニストに暴露する。候補調節剤存在下における、候補調節剤の非存在の場合と比べた、レポーター発現の10以上の減少は、その候補がGALR2活性の調節剤であることを示す。転写アッセイのための対照は、GALR2を発現するが、レポーターコンストラクトを担持しない細胞並びにプロモーターの無いレポーターコンストラクトを有する細胞を含む。GALR2-制御転写調節剤として識別された化合物については、それらの活性の特異性及びスペクトラムを決定するために、それらが、他の制御配列により又は他のレセプターにより主導される転写に影響を与えるか否かを測定するための分析も行うべきである。転写レポーターアッセイ及びほとんどの細胞ベースのアッセイは、GALR2活性の調節剤について、タンパク質の発現ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。ライブラリーは、例えば、天然のソース、例えば、植物、動物、細菌等からのcDNAライブラリーであってもよく、又は1又は2以上のポリペプチドの突然変異型をランダムに又は体系的に発現するライブラリーであってもよい。GALR2のスクリーニングに用いる異なるライブラリーにおいて、ウイルスベクター中のゲノムライブラリーを、1つの細胞又は組織のmRNAcontentを発現させるために用いることもできる。GTP-結合、GTPアーゼ、アデニル酸シクラーゼ、cAMP、リン脂質-分解、DAG、IP3、PKC、キナーゼ及び転写レポーターアッセイを含むレセプター活性のアッセイのいずれもが、サンプル、例えば組織サンプル中の、GALR2レセプター分子の活性に影響を与える作用剤の存在を測定するために用いることができる。そのためには、GALR2ポリペプチドを、サンプル又はサンプルの抽出物の存在下及び非存在下にて、活性についてアッセイを行う。サンプル又は抽出物の存在下における、サンプルの非存在下と比べたGALR2活性の増大は、サンプルがレセプター活性のアゴニストを含むことを示す。ニューロペプチドQポリペプチド又は別のアゴニスト及びサンプルの存在下における、ニューロペプチドQポリペプチドのみが存在する場合のレセプター活性に比べたレセプター活性の減少は、サンプルがGALR2活性のアンタゴニストを含むことを示す。所望ならば、次いで、サンプルを分画し、さらに試験を行い、アゴニスト又はアンタゴニストを単離又は精製することができる。サンプルが調節剤を含んでいると言うために必要な、測定した活性の増大又は減少の量は、用いたアッセイのタイプに依存する。一般的に、サンプルの非存在下で行ったアッセイに比べた10以上の変化増大又は減少は、サンプル中の調節剤の存在を示す。好ましくは、アゴニストは、ニューロペプチドQポリペプチドの少なくとも20、そして好ましくは75又は100以上、例えば、2-倍、5-倍、10-倍以上のレセプターの活性化を刺激する。他の機能性アッセイは、例えば、マイクロフィジオメーター又はバイオセンサーアッセイHafner、Biosens.Bioelectron.、15:149-158、2000を含む。II.GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用に基づく診断アッセイ:GPCRシグナル伝達異常は、多くの疾患及び障害の病理の進行において重要である。GALR2は、免疫不全症ウイルスのコレセプターとして作用し、免疫プロセス、障害又は疾患において役割を担うことが示された。GALR2の発現パターンはまた、このレセプターが他の疾患、障害又はプロセスにおいて役割を担っている可能性を示唆するが、当該GALR2-関連疾患又はGALR2-関連障害は前記の通りである。GALR2のニューロペプチドQポリペプチドとの相互作用は、GALR2シグナル伝達が関与する疾患、障害又はプロセスの診断又はモニターのためのアッセイの基礎として使うことができる。GALR2-関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイは、いくつかの異なる形態を有しえる。第一に、診断アッセイは、組織サンプル中のGALR2及び/又はニューロペプチドQポリペプチド又は遺伝子の量を測定することができる。これらのポリペプチドのいずれか一方又は双方をコードするmRNAの量を測定するアッセイもまた、このカテゴリーに適合する。第二に、アッセイは、レセプター又はリガンドの質を評価することができる。例えば、ある固体が、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドのいずれか又は双方の突然変異又は変異型を発現するか否かを測定するアッセイは、診断に用いることができる。第三に、GALR2ポリペプチドの1又は2以上の活性を測定するアッセイは、診断に用いることができる。従って、本発明は、GALR2-関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイに関する。GALR2-関連疾患、GALR2-関連障害又はGALR2-関連プロセスは、前記した群からの一部であってもよい。本発明はまた、当該ニューロペプチドQポリペプチド-関連疾患又はニューロペプチドQポリペプチド-関連障害が前記した通りである、ニューロペプチドQポリペプチド-関連疾患、障害又はプロセスの診断アッセイにも関する。この方法によれば、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13で表されるポリペプチドに対して、少なくとも31の相同性、そして好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも75、最も好ましくは少なくとも95、そして特に100の相同性を有するポリペプチドであってもよく;かつ、当該ポリペプチドは、SEQIDNO:2の配列を持つGALR2ポリペプチドに特異的に結合し、そしてそのシグナル伝達活性を活性化する。あるいは、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13の全長ポリペプチドのフラグメントであって、SEQIDNO:13の全長ポリペプチドの結合活性及び/又はシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも10好ましくは少なくとも50を保持する当該フラグメントであってもよい。本発明によれば、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13に対し1又は2以上の付加、挿入、欠失又は置換を含んでもよい。当該ニューロペプチドQポリペプチドは、追加の配列を含んでニューロペプチドQ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質GFP、ヒスチジンタグ例えば、6X以上のHis又はエピトープタグ例えば、HAタグ、Mycタグ、FLAGタグ配列から成る群より選択してもよい。A.GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドの量を測定するアッセイレセプター又はそのリガンドの異常なレベルがサンプル中に存在するか否かを測定するために、GALR2及びニューロペプチドQポリペプチドレベルを測定し、標準と比較することができ、そのいずれもが、GALR2シグナル伝達の障害の可能性を示す。ポリペプチドレベルは、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学により測定される。GALR2活性により特徴づけられる疾患又は障害を患うと疑われる個体から単離したサンプルを、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドの抗体と接触させ、そして抗体の結合を、当該技術分野で知られているように例えば、二次抗体と複合した酵素の活性の測定により測定する。GALR2及び/又はニューロペプチドQポリペプチドレベルの測定に対する別のアプローチは、影響を受けた組織からの細胞のフローサイトメトリー分析を用いる。GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドに特異的な抗体の蛍光標識を含むフローサイトメトリーの方法は、当業者によく知られている。他のアプローチは、ラジオイムノアッセイアッセイ又はELISAを含む。これらのそれぞれに対する方法も当業者によく知られている。検出した結合の量を、健常な個体からの、又は影響を受けた個体の影響を受けていない又は影響の少ない好ましくは影響を受けていない部位からの類似の組織のサンプルにおける結合と比較する。標準と比べた10以上の増大は、GALR2の異常により特徴づけられる疾患又は障害と診断される。GALR2及びニューロペプチドQポリペプチドの発現はまた、組織のサンプル中の当該ポリペプチドのいずれか又は双方をコードするmRNAの量を決定することによっても測定することができる。mRNAは、定量的又は準定量的PCRによって定量することができる。定量的増幅の方法は、当業者によく知られており、そしてGALR2及びニューロペプチドQポリペプチドの双方の増幅のためのプライマー配列を本明細書に開示する。通常の定量的PCR法は、同じプライマーを用いて制御配列の既知の量を同時に共増幅co-amplifyingすることを含む。これにより、PCR反応を較正するために用いることができる内部標準が得られる。定量的PCRについての詳細なプロトコルは、PCRProtocols、AGuidetoMethodsandApplications、Innisら、AcademicPress、Inc.N.Y.、1990中に記載されており、これは、参考文献として本明細書に取り込まれる。健常な個体からの同様の組織のサンプル中の、又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位からの組織のサンプル中の発現量と比較した、サンプル中のGALR2又はニューロペプチドQポリペプチドをコードするmRNAの量の10以上の増大は、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害であると診断される。B.定性的アッセイGALR2ポリペプチド又はそれをコードするmRNAが野生型であるか否かを評価するアッセイは、診断に用いることができる。GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドの異常により特徴づけられる疾患又は障害をこのように診断するために、サンプルから単離したRNAを、ニューロペプチドQポリペプチド及び/又はGALR2のPCR増幅の鋳型として用いる。増幅した配列を、標準的な方法を用いて直接シークエンスするか、又はベクター中にクローンし、シークエンスする。野生型GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドの配列に対する、1又は2以上のコードされたアミノ酸を変える配列中の違いは、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断となりえる。コードされた配列の変化がサンプル中で同定される場合には、変異レセプター又はリガンドを発現させ、そしてその活性を野生型GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドのものと比較することは有用でありえる。他の利点に加えて、このアプローチにより、恒常的に活性な突然変異体及びヌル突然変異体を含む新規な突然変異体が得られる。標準的なシークエンス法に加え、例えば、野生型と変異配列を区別するmolecularbeaconsのハイブリッド形成hybridizationを用いて、特定の突然変異体の存在について増幅配列をアッセイすることができる。1個のヌクレオチドほどの小さな変化に基づいて区別を行うハイブリッド形成アッセイは、当業者によく知られている。あるいは、例えば、U.S.PatentUS5,888,819、US6,004,744及びUS6,013,431に記載されたものを含む、多くのミニシークエンスminisequencingアッセイのいずれかを行うことができる。当該技術分野で知られるこれらのアッセイ及び他のアッセイにより、そのサンプル中における、既知の多形性を有する核酸の存在を測定することができる。所望であれば、アレイ又はマイクロアレイ-ベースの方法を用いて、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド配列における突然変異の発現又は存在を分析することもできる。核酸の発現をミニシークエンスし、定量するためのアレイ-ベースの方法は当業者によく知られている。C.機能性アッセイGALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断は、機能性アッセイを用いて行うこともできる。それを行うためには、組織サンプルから調製した細胞膜又は抽出物を、本明細書に記載したようなGALR2活性のアッセイに用いる例えば、リガンド結合アッセイ、GTP-結合アッセイ、GTPアーゼアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、cAMPアッセイ、リン脂質の分解、DAG若しくはIP3アッセイ、PKC活性化アッセイ又はキナーゼアッセイ。検出した活性を、健常な個体又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位から得た標準サンプル中のものと比較する。代替法として、サンプル又はサンプル抽出物をGALR2を発現する細胞に適用し、次いで標準サンプルと比較したGALR2シグナル伝達活性を測定することができる。これらのアッセイのいずれかにおいて測定した活性における、標準の活性に対する10以上の違いは、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害と診断される。本発明に従う、細胞中のGALR2活性の調節GALR2のリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの同定により、細胞内でGALR2ポリペプチドの活性を調節する方法が得られる。GALR2ポリペプチドの機能を調節する作用剤をその細胞に与えることにより、細胞内のGALR2活性は調節される。この調節は、さらなる調節剤の識別のためのアッセイの一部として培養細胞中で、又は例えば、ヒトを含む動物中で行うことができる。作用剤には、本明細書で定義したニューロペプチドQポリペプチド並びに本明細書に記載したスクリーニング方法を用いて識別されたさらなる調節剤が含まれる。作用剤は、培養細胞に添加することにより細胞に与えることができる。与える量は、その作用剤の相同性及びそれを与える目的に応じて変わる。例えば、GALR2活性のアンタゴニストを識別するための培養アッセイにおいては、好ましくは、レセプターを最大値の半分活性化するニューロペプチドQポリペプチドの量例えば、約EC50を、好ましくはレセプターの飽和に必要な用量を超えることなく、添加する。この用量は、ニューロペプチドQポリペプチドのさらなる添加がGALR2活性にさらなる効果を及ぼさない点を測定するために、ニューロペプチドQポリペプチドの量を設定するtitratingことにより決定することができる。GALR2活性の調節剤を、疾患又は障害の治療のために動物に投与する場合には、投与量は、望まれる結果に基づいて当業者が調整することができる。1又は2以上の測定可能な病理的側面例えば、腫瘍細胞の増殖、炎症性細胞の蓄積が、治療前の値と比較して少なくとも10変わる場合には、成功裏な治療が達成されている。本発明の有用な候補調節剤候補調節剤は、いかなる大きさ又は起源の合成又は天然化合物のライブラリーからもスクリーニングすることができる。莫大な数の方法が、現在、糖類、ペプチド、脂質、炭水化物及び核酸ベースの化合物のランダム及び指向性合成randomanddirectedsynthesisに用いられている。有機低分子のライブラリーを含む、異なる大きさの合成化合物ライブラリーは、よく知られたコンビナトリアル又はパラレル化学技術を用いて調製してもよく、又は多くの企業から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、多くの企業から入手可能であるか、又は当業者によく知られた方法により容易に製造できる。加えて、天然又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を用いて容易に修飾される。前記したように、候補調節剤は、既知のポリペプチド例えば、ニューロペプチドQポリペプチド、抗体又は核酸ライブラリーにおいてコードされる核酸例えば、アプタマーaptamersの変異体であってもよい。ライブラリーでトランスフォームされた細胞例えば、細菌、酵母又はより高等な真核細胞は、増殖させ、そして抽出物として調製し、次いでGALR2結合性アッセイ又はGALR2活性の機能性アッセイに適用される。本発明の有用な抗体本発明は、GALR2及びニューロペプチドQポリペプチドの抗体を提供する。抗体は、当該技術分野で知られた標準的なプロトコル例えば、Antibodies:ALaboratoryManualed.byHarlowandLaneColdSpringHarborPress:1988を見よ。を用いて作成することができる。マウス、ハムスター又はウサギ等の哺乳動物は、ペプチドの免疫原性フォーム例えば、抗体反応を誘起できるGALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又は抗原性フラグメント又は本明細書に前記した融合タンパク質を用いて免疫できる。抗体を生成させるための免疫原は、ポリペプチド例えば、単離した組み換えポリペプチド又は合成ペプチドをアジュバントと混合することにより調製できる。あるいは、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又はペプチドは、より大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質として製造される。ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシニアンkeyholelimpethemocyanin等の他のより大きな免疫原性タンパク質に共有結合させることもできる。あるいは、CostagliolaらJ.Clin.Invest.、105:803-811、2000に記載されているように、GALR2若しくはニューロペプチドQポリペプチド又はこれらのタンパク質のフラグメントをコードするプラスミド又はウイルスベクターを、ポリペプチドを発現させ、そして動物中で免疫反応を起こすために用いることもできる。抗体を生成させるためには、典型的には、免疫原を、ウサギ、ヒツジ又はマウス等の実験動物の皮内、皮下又は筋肉内に投与する。上記の抗体に加えて、単鎖抗体等の遺伝子改変した抗体誘導体を製造することができる。免疫化の進展は、血漿又は血清中の抗体の力価を検出することによりモニターできる。抗体のレベルを評価するために、免疫原を抗原として用いた標準的なELISA、フローサイトメトリー又は他の免疫アッセイを使うこともできる。抗体調製物は、単に、免疫化した動物からの血清であってもよく、又は、所望であれば、例えば、固定化免疫原を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、ポリクロナル抗体を血清から単離することができる。モノクロナル抗体を作るためには、抗体-産生脾細胞を免疫化した動物よりハーヴェストし、そして標準的な体細胞融合法により、ミエローマ細胞のような不死化したimmortalizing細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当業者によく知られており、そして、例えば、ハイブリドーマ技術KohlerとMilsteinにより最初に開発された、Nature、256:495-497、1975、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozbarら、ImmunologyToday、4:72、1983及びヒトモノクロナル抗体を製造するためのEBV-ハイブリドーマ技術Coleら、MonoclonalAntibodiesandcancerTherapy、AlanR.Liss、Inc.pp.77-96、1985を包含する。ハイブリドーマ細胞は、ニューロペプチドQポリペプチド又はGALR2ペプチド又はポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングすることができ、そして、モノクロナル抗体は、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養の培地から単離される。本発明の有用なトランスジェニック動物GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又はその変異体を発現するトランスジェニック動物は、GALR2を介したシグナル伝達の研究並びにGALR2の活性を調節する薬剤又は作用剤の研究に有用である。トランスジェニック動物は少なくとも1つの外来遺伝子を含む非ヒト動物であり、その外来遺伝子はトランスジーンと呼ばれ、トランスジェニック動物の遺伝物質の一部である。好ましくは、トランスジーンは動物の生殖細胞系に含まれ、その動物の子孫に伝えられることができる。トランスジーンを動物の遺伝物質中に導入するためには多くの技術を用いることができ、そのような技術には、トランスジーンの受精卵の前核へのマイクロインジェクション及び胚性幹細胞の操作U.S.PatentNo.US4,873,191;PalmiterandBrinster、Ann.Rev.Genet.、20:465-499、1986;フランス特許出願FR2593827が含まれるが、それらに限定されるものではない。トランスジェニック動物は、そのすべての細胞内にトランスジーンを担持でき、又は遺伝的にモザイクでありえる。従来の遺伝子導入法によれば、正常な又は修飾した遺伝子の追加のコピーを、接合子zygoteの雄性前核中に注入し、そして受容体recipientマウスのゲノムDNA中に取り込ませる。トランスジーンは、確立されたトランスジェニック株内で、メンデル則に従って伝えられる。トランスジーンは恒常的に発現され、又は組織特異的に若しくは外因性の薬剤に反応して発現され、例えば、1つのトランスジーンを発現するテトラサイクリンAトランスジェニック動物は、2番目のトランスジーンを発現する2番目のトランスジェニック動物と交配させることができ、それらの子孫は両方のトランスジーンを担持し、そして発現する。ノックアウト動物GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又は変異体のいずれかをコードする染色体配列中にホモ接合型欠失homozygousdeletionを有する動物は、レセプター及びリガンドの機能を研究するために有用でありえる。さらに、特定の生理学的及び/又は病理学的過程におけるGALR2/ニューロペプチドQポリペプチドの同定は特に重要である。i.標準的ノックアウト動物ノックアウト動物は、相同的組み換えを用いて遺伝子欠失を創る方法により製造することができる。この技術は、胚に由来し、培養で維持され、そしてホストの胚盤胞に導入された場合に、動物のすべての組織の形成に関与する能力を有する胚性幹ES細胞の開発に基づく。ノックアウト動物は、相同的組み換えをES細胞中の特定のターゲット遺伝子に向け、それによりヌル対立遺伝子を作ることにより製造される。ノックアウト動物を作る技術は、十分に記載されている例えば、Huszarら、Cell、88:131、1997;及びOhki-Hamazakiら、Nature、390:165、1997を見よ。。当業者は、遺伝子標的コンストラクトを作成するために、本明細書に記載され、そして当該技術分野で知られたGALR2及びニューロペプチドQの配列を用いて、ホモ接合GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドノックアウト動物例えば、マウスを作ることができる。ii.組織特異的ノックアウト部位指定相同的組み換えtargetedhomologousrecombinationの方法は、バクテリオファージP1、部位特異的リコンビナーゼCreに基づく、部位特異的組み換えのためのシステムの開発によって改善されてきた。バクテリオファージP1からのCre-loxP部位特異的DNAリコンビナーゼは、特定の組織又は成長段階に限定した遺伝子のノックアウトを作成するために、トランスジェニックマウスアッセイにおいて使用される。全体的な遺伝子ノックアウトに対し、部位に限定された遺伝的欠失は、フェノタイプを特定の細胞/組織にわりあてることができるという利点がある。Cre-loxP系においては、1番目のトランスジェニックマウス株は、loxP部位を、興味の対象である遺伝子の1又は2以上のエクソンに並べて配置するように設計する。このいわゆるfloxed遺伝子のホモ接合体を、細胞/組織型転写プロモーターの制御下でCre遺伝子を発現する2番目のトランスジェニックマウスと交配させる。次いで、Creタンパク質がloxP認識配列の間のDNAを切除し、そして標的遺伝子機能を効果的に除去する。現在では、例えば、哺乳動物組織特異的遺伝子の誘導的不活性化を含む、この方法の多くのinvivoの実例があるWagnerら、NucleicAcidsRes.、25:4323、1997。従って、当業者は、GALR2又はニューロペプチドQが、選択した組織又は細胞型内で組織特異的に除去されたノックアウト動物を作ることができる。本発明に従う有用なキット本発明は、GALR2活性の調節剤のスクリーニングに有用なキットを提供する。加えて、本発明は、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断に有用なキットを提供する。本発明に従う有用なキットは、例えば、単離した膜上、GALR2を発現する細胞又はSPRチップ上等、膜-又は細胞-結合GALR2ポリペプチドを含む単離したGALR2ポリペプチド及び単離したニューロペプチドQポリペプチドを含むことができる。キットは、GALR2に特異的な抗体及び/又はニューロペプチドQポリペプチドの抗体を含むこともできる。あるいは又は加えて、キットは、GALR2ポリペプチドを発現するようにトランスフォームした細胞及び/又はニューロペプチドQポリペプチドを発現するようにトランスフォームした細胞を含むことができる。さらなる態様において、本発明に従うキットは、GALR2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び/又はニューロペプチドQポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。なおさらなる態様において、本発明に従うキットは、以下に記載するように、GALR2又はニューロペプチドQの増幅に有用な特異的なプライマーを含んでもよい。本発明に従うすべてのキットは、上記のアイテム又はアイテムの組み合わせ及びそれらのための包装材を含む。キットは使用説明書を含んでもよい。本キットによれば、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13で表されるポリペプチドに対して、少なくとも31の相同性、そして好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも75、最も好ましくは少なくとも95、そして特に100の相同性を持つポリペプチドであってもよく、当該ポリペプチドは、SEQIDNO:2の配列を持つGALR2ポリペプチドに特異的に結合し、かつそのシグナル伝達活性を活性化する。あるいは、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13の全長ポリペプチドのフラグメントであって、SEQIDNO:13の全長ポリペプチドの結合活性及び/又はシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも10好ましくは少なくとも50を保持する当該フラグメントであってもよい。本発明によれば、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15又はSEQIDNO:16特に、SEQIDNO:13に対し、1又は2以上の付加、挿入、欠失又は置換を含んでもよい。SEQIDNO:14に対するニューロペプチドQポリペプチドのフラグメントの例は、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21及びSEQIDNO:22のポリペプチドである。SEQIDNO:14に対して置換を含むニューロペプチドQポリペプチドの例は、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40及びSEQIDNO:41のポリペプチドである。当該ニューロペプチドQポリペプチドは追加の配列を含んでニューロペプチドQ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質GFP、ヒスチジンタグ例えば、6X以上のHis又はエピトープタグ例えば、HA-タグ、Mycタグ、FLAGタグ配列から成る群より選択してもよい。生物学的アッセイInvitroアッセイニューロペプチドQポリペプチドによるヒトGALR2レセプター活性の調節を、下記の実験方法に従って測定する。実験方法:放射性リガンド結合アッセイ:GALR2への競合結合アッセイは、結合バッファー25mMのHEPES、pH7.4、5mMのMgCl2、1mMのEDTA、0.5のプロテアーゼフリーBSA、ヒトGALR2膜タンパク質0.5μg/チューブ、[125I]ガラニン最終濃度、1,3nMを含むポリエチレンMiniSorpチューブNunc内で行う。低濃度から高濃度までの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドを添加する。サンプルを、0.1mlの最終体積で、25°Cにて60minインキュベートし、次いで、多層膜フィルターmultiplemembranefilterLincaLamonInstrumentation、テルアビブ、イスラエルを用い、0.5PEI中に少なくとも1h前もって浸したGF/Cフィルター上でろ過する。フィルターを、4mlの氷冷洗浄バッファー結合バッファーと同じ組成で3回洗浄し、乾燥し、ガンマカウンターで計測する。イクオリンアッセイ:抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期mid-logphaseまで増殖した、ミトコンドリアアポイクオリン、Gα16及び組み換えヒトGALR2レセプターを共発現するCHO-K1細胞を、PBS-EDTAを用いて剥がし、遠心分離し、アッセイバッファーHEPESを含み、フェノールレッドを含まず、プロテアーゼフリーのBSAを0.1含むDMEM/HAM’sF12に、1×106細胞/mlで再懸濁する。細胞を、セレンテラジンHと共に、室温で少なくとも4hインキュベートする。試験の各日に、ニューロペプチドQポリペプチドを試験してアッセイの成績を評価し、EC50を決定する。アゴニストの試験については、96-ウェルプレート内で、50μlの細胞懸濁液を50μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドと混合する。放射された光を、HamamatsuFunctionalDrugScreeningSystem6000FDSS6000luminometerを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、100μlのニューロペプチドQポリペプチドを、そのEC80にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後15minインキュベートする。放射された光を、HamamatsuFunctionalDrugScreeningSystem6000FDSS6000luminometerを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドQポリペプチドのEC100濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、EC80濃度におけるニューロペプチドQポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。FLIPRアッセイ:培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、Gα16及び組み換えヒトGALR2レセプターを共発現するCHO-K1細胞をPBS-EDTAで剥がし、遠心分離し、細胞培養培地HEPES、10v/vのウシ胎児血清を含むHAM‘sF12に再懸濁し、384-ウェルFLIPRプレート中に、各ウェル当たり15’000細胞を播く。37°C/5CO2加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした後、培地を廃棄し、フェノールレッドを含まず、HEPES、Fluo4-AM及びプロベネシドを含むDMEM染色溶液で置換する。37°C/5CO2加湿インキュベーター内で1時間インキュベートした後、染色溶液をアッセイ培地フェノールレッドを含まないHBSS/DMEMで置換した。ニューロペプチドQを含むペプチドは、それらの標的であるGALR2に結合した後の細胞内カルシウムの放出における成績について評価するために試験される。放射された蛍光をFLIPRテトラを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、100μlのニューロペプチドQポリペプチドを、そのEC80にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後15minインキュベートする。放射された蛍光をFLIPRテトラを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドQポリペプチドのEC100濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、EC80濃度におけるニューロペプチドQポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。cAMPHTRFアッセイ試験に先だって、抗生物質を含まない培地中で増殖させたヒト組み換えGALR2レセプターを発現するCHO-K1細胞を、PBS-EDTA5mMのEDTAで静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファーKRH:5mMのKCl、1.25mMのMgSO4、124mMのNaCl、25mMのHEPES、13.3mMのグルコース、1.25mMのKH2PO4、1.45mMのCaCl2、0.5g/lのBSAに再懸濁する。ニューロペプチドQポリペプチドに対して容量反応曲線を作成する。アゴニストの試験96ウェルについては:12μlの細胞を低濃度から高濃度までの候補調節剤6μl及び6μlのホルスコリンと混合し、次いで、室温で30minインキュベートする。溶解バッファーlysisbufferを添加し、1時間インキュベートした後、HTRFキットを用い、製造業者の仕様書に従ってcAMP濃度を推定する。アンタゴニストの試験96ウェルについては:12μlの細胞を、低濃度から高濃度までの候補調節剤6μlと混合し、次いで、10minインキュベートする。その後、ホルスコリンとニューロペプチドQポリペプチドの混合物6μlを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。次いで、プレートを室温で30minインキュベートする。溶解バッファーを添加し、1時間インキュベートした後、HTRFキットを用い、製造業者の仕様書に従ってcAMP濃度を推定する。IP1HTRFアッセイ抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、ヒト組み換えGALR2レセプターを発現するCHO-K1細胞を、PBS-EDTAを用いて剥がし、遠心分離し、抗生物質バッファーを含まない培地中に再懸濁する。20,000個の細胞を96ウェルプレート中に分配し、5CO2下、37°Cにて一晩インキュベートする。アゴニストの試験については、培地を除き、20μlのアッセイバッファーに加えて、20μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドを各ウェルに添加する。プレートを、5CO2下、37°Cにて60minインキュベートする。次いで、IP1-D2試薬と抗IP1クリプテートanti-IP1cryptate試薬をウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、IP1濃度を測定する。アンタゴニストの試験については、20μlの候補調節剤又は対照アンタゴニストを添加し、プレートを、5のCO2を含む95の空気の加湿雰囲気下、37°Cにて15minインキュベートし、次いで、20μlのニューロペプチドQポリペプチドを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。プレートを、5CO2下、37°Cにて60minインキュベートする。次いで、IP1-D2試薬と抗IP1クリプテートをウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、IP1濃度を測定する。GTP-γ-Sシンチレーション近傍アッセイscintillationproximityassayアッセイバッファーは、20mMのHEPES、pH7.4;200mMのNaCl、10μg/mlのサポニン、1mMのMgCl2及び0.1w/vのBSAからなる。組み換えヒトGALR2レセプターを発現するCHO-K1細胞から、膜を調製する。膜抽出物をアイスの上で融かし、アッセイバッファーで希釈し、アイスの上に保つ。GDPを、アッセイバッファーで、1μMの最終濃度に希釈する。PVT-WGABeadsAmersham、RPNQ001を、アッセイバッファーで、50mg/ml0.5mg/10μlに希釈する。GTP-γ-35SPerkinElmerNEG030Xを、アッセイバッファーで0.1nMに希釈する。アゴニストの試験については、膜12.5μlをGDP12.5μlと混合する。並行して、反応を開始する直前に、GTP-γ-35S12.5μlをbeads12.5μlと混合する。以下の試薬をOptiplatePerkinElmerのウェルに連続的に添加する:50μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドリガンド、25μlの膜:GDPミックス及び25μlのGTP-γ-35S:ビーズミックス。プレートをトップシールで覆い、オービタルシェイカー上で2min混合し、次いで、室温にて1時間インキュベートする。次いで、プレートを2000rpmにて10min遠心し、室温にて1時間インキュベートし、PerkinElmerTopCountリーダーを用いて、各ウェル当たり1min計測する。TANGO登録商標β-アレスチンアッセイTANGOGALR2細胞を、PBS-EDTA5mMEDTAを用いて静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファー10のチャコールデキストラン処理FBSを含むDMEM,0.1mMのNEAA、25mMのHEPES、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン中に、312,500細胞/mlの密度で再懸濁する。32μlの細胞懸濁液10,000細胞を、ブラッククリアボトムblackclear-bottom384-ウェル培養プレートのウェルに添加する。アゴニストの試験については、0.5のDMSOを含むアッセイバッファーで5倍に濃縮したニューロペプチドQポリペプチド又は候補調節剤8μlを、培養プレートのウェルに添加する。アンタゴニストの試験については、0.5のDMSOを含むアッセイバッファーで10倍に濃縮した候補調節剤4μlを、培養プレートのウェルに添加する。室温で30分間インキュベートした後、0.5のDMSOを含むアッセイバッファーで10倍に濃縮したニューロペプチドQポリペプチド4μlを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。次いで、プレートを、37°C/5CO2の加湿インキュベーター内で16時間インキュベートする。データの読み取りのために、6倍に濃縮したLiveBlazerTM-FRETB/GCCF4-AM基質ミックスを調製し、8μlを培養プレートの各ウェルに添加する。暗室内で室温にて2時間インキュベートした後、青色励起光409/420nm、蛍光460/440nm及び緑色励起光409/420nm、蛍光530/530nmの蛍光を測定する。背景蛍光細胞を含まない対照用ウェルを差し引き、青色/緑色蛍光比を、各ウェルについて計算する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドQポリペプチドのEC100濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、EC80濃度におけるニューロペプチドQポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。DiscoveRxベータ-アレスチン2アッセイ:組み換えヒトGALR2レセプター及びベータ-アレスチン2CHO-K1-hGALR2-ベータ-アレスチン2を発現する細胞を、384-ウェル組織培養プレート中に、20.000細胞/ウェルの密度、25μlの細胞培養培地キット中のOCC2培地体積にて、OCC2培地P/N30-409中にプレートした。細胞をマイクロプレート中にシードした後、試験前に、それらを37°C、5CO2の加湿インキュベータ内に24時間置いた。OCC2培地を廃棄し、そして各ウェル当たり20μlのHBSS1XGibco、14065、20mMHEPESGibco、16530、0.1BSASigma、A3803、pH7.4で置き換えた。候補調節剤のストック溶液をDMSO中に10mMの濃度で調製し、そしてHBSS1XGibco、14065、20mMHEPESGibco、16530、0.1BSASigma、A3803、pH7.4で、活性化用量反応曲線に必要な濃度に段階希釈した。PathHuntereXpress細胞をインキュベータから除き、化合物プレートから5μlを移した。37°Cにて90分間インキュベートした。インキュベーションの間、各384ウェルプレート用の検出試薬の検量線用溶液を、下記の試薬を混合することにより調製した:細胞アッセイバッファー19部、基質試薬15部及び基質21部。調製した検出試薬をウェル当たり12.5μl添加し、そして室温23°Cで90分間インキュベートした。サンプルを、標準蛍光プレートリーダーFluostarにて、下記の条件下で読んだ:測定インターバルmeasurementinterval:0.1秒、intervaltime:0.1秒、インターバル数numberofinterval:1、ゲイン:自動調整、発光フィルター:レンズ。生データをGraphPadPrismsoftwareで分析して、曲線を作成し、そしてEC50を算出した。GALR2レセプターに関し、ニューロペプチドQポリペプチドのアゴニスト活性EC50値を表1に示す。略語ATP:アデノシン三リン酸BSA:ウシ血清アルブミンcAMP:環状アデノシン一リン酸CAT:クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCDR:相補性決定領域CNS中枢神経系CPM分当たりの計数CRE:cAMP応答配列CRE:環化組み換えCyclizationRecombinationCRF副腎皮質刺激ホルモン放出因子DAG:ジアシルグリセロールDMEM:ダルベッコ修正イーグル培地DMSO:ジメチルスルホキシドDR:背側縫線DRN:背側縫線核DTT:ジチオスレイトールEDTA:エチレンジアミン四酢酸EGTA:エチレングリコール-ビスベータ-アミノエチルエーテル-N,N,N’,N’-テトラ酢酸ELISA:酵素免疫測定法FBS:ウシ胎児血清FLIPR:蛍光イメージングプレートリーダーFLP:フリッパーゼ組み換え酵素FLiPpaseRecombinaseEnzymeFRET:蛍光エネルギー転移GALR1:Galaninレセプター1GALR2:Galaninレセプター2GALR3:Galaninレセプター3GDP:グアノシン二リン酸GFP:緑色蛍光タンパク質GPCR:Gタンパク質共役レセプターGTP:グアノシン三リン酸HBSS:ハンクス平衡塩類溶液HEPES:4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HIV:ヒト免疫不全症ウイルスHTRF:均一時間分解蛍光測定HomogeneousTimeResolvedFluorescenceicv:脳室内KRH:KrebsRinger-HepesNEAA:非必須アミノ酸NPQ:ニューロペプチドQKd:解離の平衡定数LC:青斑核MAPkinase:マイトジェン活性化タンパク質キナーゼPBS:リン酸緩衝生理食塩水PCR:ポリメラーゼ連鎖反応PEI:ポリエチレンイミンPNS末梢神経系RT/PCR:逆転写酵素/ポリメラーゼ連鎖反応RLU相対発光量RelativeLightUnits"