"メナキノン-7の製造方法において、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキアコリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン-7が発酵されるエシェリキアコリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする、メナキノン-7の製造方法。メナキノン-7をエシェリキアコリを用いて工業的に製造するためのメナキノン-7-産生プラスミドであって、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むことを特徴とする、メナキノン-7-産生プラスミド。同種もしくは異種のプロモーターを含むことを特徴とする、請求項2に記載のメナキノン-7-産生プラスミド。異種のプロモーターが、エシェリキアコリ由来のgapA遺伝子のプロモーター又はエシェリキアコリ由来のtufB遺伝子のプロモーター又はlac-プロモーター、tac-プロモーター、trc-プロモーター、λ-プロモーター、ara-プロモーターもしくはtet-プロモーターであることを特徴とする、請求項3に記載のメナキノン-7-産生プラスミド。バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが、エシェリキアコリ由来のgapA-プロモーターの制御下に存在するオペロン構築物を含むことを特徴とする、請求項2から4までのいずれか1項に記載のメナキノン-7-産生プラスミド。プラスミドとして、エシェリキアコリ内で染色体外で複製でき、かつ選択マーカーを含むDNA分子が使用されることを特徴とする、請求項2から5までのいずれか1項に記載のメナキノン-7-産生プラスミド。エシェリキアコリ内で高い細胞内コピー数を有するプラスミド又はエシェリキアコリ内で中程度のコピー数を有するプラスミド又はエシェリキアコリ内で低いコピー数を有するプラスミドが使用されることを特徴とする、請求項6に記載のメナキノン-7-産生プラスミド。請求項2から7までのいずれか1項に記載のプラスミドを含むか、又はバシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の複数の染色体コピーを含む、エシェリキアコリ菌株。発酵の後に、発酵培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きメナキノン-7を細胞から抽出することによりメナキノン-7を分離し、メナキノン-7をクロマトグラフィーにより精製し、濃縮、配合もしくは錯化を行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。本発明の課題は、エシェリキアコリを用いてメナキノン-7の製造を可能にする方法を提供することである。前記課題は、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むエシェリキアコリ菌株の細胞を発酵培地中で発酵させ、そしてその際にメナキノン-7が発酵されるエシェリキアコリ菌株の細胞中に蓄積されることを特徴とする方法によって解決される。該エシェリキアコリ菌株は、好ましくは名称が挙げられた3種の遺伝子の複数の機能的コピーを含む。好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた3種の遺伝子の1~700コピーを含む。特に好ましくは、前記菌株は、名称が挙げられた3種の遺伝子の1~20コピーを含む。それらの遺伝子は、1種以上のプラスミドに存在してよいが、それらは同様に染色体中に組み込まれていてよい。従って、本発明は、同様に、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを含むプラスミドを包含する。かかる産生プラスミドは、メナキノン-7のエシェリキアコリ中での工業的製造を可能にする。前記の3種の遺伝子は、以下のように定義される:前記のバシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子は、好ましくは、配列番号1並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のHepSサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号1並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。前記のバシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子は、好ましくは、配列番号2並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルシンターゼ中のHepTサブユニットの機能を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号2並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のHepSサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号2を有するhepT遺伝子によってコードされるHepTタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号1を有する遺伝子によってコードされるHepSと配列番号2を有する遺伝子によってコードされるHepTとからのヘテロダイマーの少なくとも1種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。その際、好ましくは、一方のタンパク質は、ヘプタプレニルシンターゼ中のHepTサブユニットの機能を有するが、それは、配列番号1を有するhepS遺伝子によってコードされるHepSタンパク質と一緒に、ヘプタプレニルシンターゼ活性を有するヘテロダイマーを形成する場合であり、前記活性は、配列番号2を有する遺伝子によってコードされるHepTと配列番号1を有する遺伝子によってコードされるHepSとからのヘテロダイマーの少なくとも1種のヘプタプレニルシンターゼ活性に相当する。バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号3並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された又はヘプタプレニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする変異体によって特徴付けられる。特に好ましくは、前記遺伝子は、配列番号3並びにこの配列の変異体であって、縮重した遺伝子コードによって制約された変異体である。エシェリキアコリにおける本発明によるヘプタプレニルシンターゼ及びヘプタプレニルトランスフェラーゼの機能は、間接的に、生成物であるメナキノン-7を介して特徴付けることができる。それというのも、エシェリキアコリの野生型菌株は、メナキノン-7を産生しないからである。検出法としては、実施例5に記載されるHPLC法を使用することができる。好ましくは、メナキノン-7の製造のためには、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とを1個のプラスミド上でエシェリキアコリにおいて発現させることが必要となる。これらの遺伝子の発現は、好ましくは同種もしくは異種のプロモーターによって達成される。異種、という概念は、配列番号1と、配列番号2と、配列番号3によって特徴付けられる遺伝子に対するものである。相応の異種のプロモーターは、例えばエシェリキアコリ由来のgapA遺伝子のプロモーター又はエシェリキアコリ由来のtufB遺伝子のプロモーターである。更に、異種のlac-プロモーター、tac-プロモーター、trc-プロモーター、λ-プロモーター、ara-プロモーターもしくはtet-プロモーターは当業者に公知である。好ましくは、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、エシェリキアコリ由来のgapA遺伝子のプロモーターによって達成される。従って、本発明によるプラスミドは、好ましくは、上述のプロモーターを含む。その際、該プロモーターは、該1つのプラスミド上で、それらが、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を調節するように存在する。特に好ましくは、該プラスミドは、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子が、エシェリキアコリ由来のgapAプロモーターの制御下に存在するオペロン構成を含む。かかる構築物を、図1に例示する。しかしながら、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のためのプロモーター領域として、これらの遺伝子の天然の同種のプロモーター領域を用いてもよい。バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子とが導入されたプラスミドとしては、エシェリキアコリ内で染色体外で複製され、選択マーカーを含む、全ての使用可能なかつ遺伝子工学的に得られるDNA分子を使用してよい。ここで、例えばエシェリキアコリ中での高い細胞内コピー数を有するプラスミド例えばpUC系列のプラスミド、pQE系列のプラスミド、pBluescript系列のプラスミド、エシェリキアコリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド例えばpBR系列のプラスミド、pACYC系列のプラスミド又はエシェリキアコリ中での低いコピー数を有するプラスミド例えばpSC101もしくはpBeloBAC11を使用することができる。好ましくは、エシェリキアコリ中での中程度のコピー数を有するプラスミド例えばpBR系列のプラスミド、pACYC系列のプラスミドが使用される。特に好ましくは、pACYC系列のプラスミドが使用される。メナキノン-7の産生のためには、本発明によるプラスミドは、エシェリキアコリ菌株に導入される。それは、例えば通常の形質転換法、例えばエレクトロポレーションもしくはCaCl2法などの形質転換法によって行われる。プラスミドを有するクローンは、引き続き抗生物質耐性によって選択される。当業者に公知の選択マーカーは、例えばクロラムフェニコールに対する耐性を取り持つクロラムフェニコール-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンに対する耐性を取り持つネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、テトラサイクリンに対する耐性を取り持つテトラサイクリン排出遺伝子又はアンピシリンとカルベニシリンに対する耐性を取り持つβ-ラクタマーゼ遺伝子である。本発明によるプラスミドの発現に代えて、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、エシェリキアコリ菌株の染色体中にも、既に存在するメナキノン生合成遺伝子に加えて又は該遺伝子の代わりに組み込んでよい。組み込み方法としては、好ましくは、当業者に公知の溶原性バクテリオファージを有する系、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みが用いられる。従って、また、本発明は、1個の本発明によるプラスミド又は複数の、好ましくはそれぞれ1個ないし5個の、バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子と、バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の染色体コピーを含むエシェリキアコリ菌株に関する。本発明によるエシェリキアコリ菌株を用いたメナキノン-7の産生は、発酵器中で自体公知の方法に従って行われる。発酵器中でのエシェリキアコリ菌株の培養は、連続培養として、回分培養として、もしくは好ましくは流加培養として行われる。炭素源としては、好ましくは、糖、糖アルコールもしくは有機酸が用いられる。特に好ましくは、本発明による方法では、炭素源として、グルコース、ラクトース、サッカロースもしくはグリセリンが使用される。炭素源の含有率が、発酵中に発酵器内で0.1g/L~50g/Lの範囲で保持されることが保証される形態で、炭素源を計量供給することが好ましい。特に、0.1g/L~10g/Lの範囲が好ましい。窒素源としては、本発明による方法では、好ましくはアンモニア、アンモニウム塩もしくはタンパク質加水分解物が使用される。pH調節のための矯正剤Korrekturmittelとしてアンモニアを使用する場合には、発酵の間に、規則的に、この窒素源を後計量供給する。更なる培地添加剤としては、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄といった元素の塩を添加してよく、微量にすなわちμM濃度でモリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛、銅及びニッケルといった元素の塩を添加してよい。更に、有機酸例えば酢酸塩、クエン酸塩、アミノ酸例えばL-ロイシン、D/L-メチオニン及びビタミンビタミンB1、ビタミンB6、ビタミンB12を培地に添加してよい。複合栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉もしくは麦芽エキスを使用してよい。エシェリキアコリのためのインキュベート温度は、好ましくは28~37°Cであり、特に30~32°Cのインキュベート温度が好ましい。発酵培地のpH値は、発酵の間に、好ましくは5.0~8.5のpH範囲にあり、特に7.0のpH範囲が好ましい。エシェリキアコリ菌株のインキュベートは、好気的な、嫌気的なもしくは微好気的な培養条件下で、16時間~150時間の時間にわたり、かつその都度の菌株に最適な増殖温度の範囲で行われる。特に、48時間~96時間の培養時間が好ましい。発酵は、好ましくは、好気的なもしくは微好気的な増殖条件下で実施される。培地からのメナキノン-7の分離は、当業者に公知の方法、例えば培地を遠心分離して細胞を分離し、引き続きバイオマスからメナキノン-7を抽出すること、クロマトグラフィーによる精製、生成物の濃縮、配合Formulierungもしくは錯化Komplexierungなどの方法に従って行うことができる。本発明による方法で産生されるメナキノン-7の検出及び定量化は、例えばHPLC法によって行われる。実施例1:プラスミドpKG82の構築ahepS遺伝子の増幅:バシラスサチリスDSM1088由来のhepS遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって、TaqDNAポリメラーゼロシュ、マンハイムを使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラスサチリス菌株DSM1088の染色体DNAが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドM7-Operon-hepS-for配列番号4及びM7-Operon-hepS-rev配列番号5を使用した。PCRで得られる、783塩基対の長さを有するDNA断片を、引き続きQIAprepSpinMiniprepキットQiagen、ヒルデンのDNA吸着ミニカラムAdsorptionssaeulchenを用いて製造元の指示に従って精製した。bhepT遺伝子の増幅:バシラスサチリスDSM1088由来のhepT遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって、TaqDNAポリメラーゼロシュ、マンハイムを使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラスサチリス菌株DSM1088の染色体DNAが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドM7-Operon-hepT-for配列番号6及びM7-Operon-hepT-rev配列番号7を使用した。PCRで得られる、1075塩基対の長さを有するDNA断片を、引き続きQIAprepSpinMiniprepキットQiagen、ヒルデンのDNA吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。c推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅:バシラスサチリスDSM1088由来の推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって、TaqDNAポリメラーゼロシュ、マンハイムを使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型としては、バシラスサチリス菌株DSM1088の染色体DNAが用いられる。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドM7-Operon-pHPTG-for配列番号8及びM7-Operon-pHPTG-rev配列番号9を使用した。PCRで得られる、966塩基対の長さを有するDNA断片を、引き続きQIAprepSpinMiniprepキットQiagen、ヒルデンのDNA吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。dエシェリキアコリ由来のgapAプロモーターの増幅:エシェリキアコリW3110ATCC27325由来のgapAプロモーターを、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって、TaqDNAポリメラーゼロシュ、マンハイムを使用しつつ、当業者に公知の通常の作業に従って増幅させた。鋳型として、エシェリキアコリ菌株W3110ATCC27325の染色体DNAを用いた。プライマーとしては、オリゴヌクレオチドM7-Operon-gapA-for配列番号10及びM7-Operon-gapA-rev配列番号11を使用した。PCRで得られる、319塩基対の長さを有するDNA断片を、引き続きQIAprepSpinMiniprepキットQiagen、ヒルデンのDNA吸着ミニカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。e遺伝子hepSと、hepTと、推定ヘプタプレニルトランスフェラーゼ遺伝子の、gapAプロモーターの制御下での、プラスミドベクターpACYC184-LHへのクローニング:前記のa、b、c及びdからのDNA断片を、T4-DNAリガーゼロシュ、マンハイムでのライゲーションバッチの前に、以下の制限エンドヌクレアーゼロシュ、マンハイムによって切断した:I:前記のaからの断片を、SacI及びApaIで切断II:前記のbからの断片を、ApaI及びBfrIで切断III:前記のcからの断片を、BfrI及びBglIIで切断IV:前記のdからの断片を、BglII及びPacINewEnglandBiolabs、フランクフルトアムマインで切断クローニングベクターpACYC184-LHDSM10172を、制限エンドヌクレアーゼSacIロシュ、マンハイム及びPacINewEnglandBiolabs、フランクフルトアムマインで切断し、引き続き精製を行った後に、前記のI、II、III及びIVからの切断された断片と、1つのライゲーションバッチでライゲーションした図1を参照。こうして得られたプラスミドを、サンガーによる配列決定によって、正確な同一性に基づき調査した。完成したメナキノン-7-産生プラスミドは、pKG82と呼称した図2を参照。メナキノン-7の産生に使用したプラスミドpKG82は、2009年11月27日にDSMZドイツ微生物細胞培養コレクションDeutscheSammlungfuerMikroorganismenundZellkulturenGmbH、D-38142ブラウンシュヴァイクでDSM23159の番号でブタペスト条約に従って寄託した。実施例2:メナキノン-7-産生菌株の製造実施例1に記載されるプラスミドpKG82を、CaCl2法によってエシェリキアコリ菌株W3110ATCC27325の形質転換のために使用した。20mg/Lのテトラサイクリンを有するLBアガープレート上で選択した後に、該プラスミドを形質転換体から再単離し、制限エンドヌクレアーゼで切断し、そして調査した。この菌株を、W3110/pKG82と呼称し、それはメナキノン-7の産生に適している。実施例3:発酵のためのメナキノン-7-産生菌株の第一の前培養一日培養Tageskulturグルコースを有する20mLのLB培地10g/Lのトリプトン、5g/Lの酵母エキス、5g/LのNaCl、15g/Lのグルコース;オートクレーブ済みを、滅菌100mLエルレンマイヤーフラスコ中でテトラサイクリン×HClと混合したテトラサイクリン×HClの最終濃度:15mg/L;テトラサイクリン×HClのストック溶液:50のエタノール中で10mg/mL濾過滅菌済み。白金耳Impfoeseを用いて、生産菌株の細胞を、前記アガープレートから、最大でも薄い混濁が確認できるまでだけ取り除いた。前培養は、8時間にわたり、32°Cで菌株W3110及びW3110/pKG82あるいは30°Cで菌株DSM1088、かつ150rpmで培養した。実施例4:発酵のためのメナキノン-7-産生菌株の第二の前培養一晩培養Uebernachtkultur第二の前培養一晩培養は、2Lの発酵器中で、B.BraunBiotechInternationalメルズンゲン、ドイツ社のBiostat登録商標-B-DCU機器を用いて行った。実施例3からの20mLのLB前培養を、25g/Lのグルコース、0.015g/Lのチアミン×HCl、0.015g/Lのテトラサイクリン×HCl、3g/LのNH42SO4、0.25g/LのNaCl、0.9g/LのL-イソロイシン、0.6g/LのD/L-メチオニン、30g/LのコーンスティープリカーRoquette、Lestrem、Frankreich、0.03g/LのCaCl2×2H2O、0.6g/LのMgSO4×7H2O、0.15g/LのNa2MO4×2H2O、2.5g/LのH3BO3、0.7g/LのCoCl2×6H2O、0.25g/LのCuSO4×5H2O、1.6g/LのMnCl2×4H2O、0.3g/LのZnSO4×7H2O、0.15g/LのFeSO4×7H2O、1g/Lのクエン酸Na3×2H2O及び1.7g/LのKH2PO4から成る産生培地980mLの接種のために用いた。培地成分は、滅菌的に2Lの発酵器中に装入した。17時間の培養の間に、温度は、32°C菌株W3110及びW3110/pKG82もしくは30°C菌株DSM1088に保持し、同様にpH値は、7.0に矯正剤25のアンモニアによって一定に保持した。抑泡剤としては、StruktolJ673SchillSeilacher、ハンブルクを、1:6の希釈で滅菌水中で使用した。培養を、無菌の圧縮空気を用いて5容量/容量/分で通気して、400rpmの撹拌機回転数をもって撹拌した。50の値にまで酸素飽和を下げた後に、回転数は、発酵器の制御ユニットを介して、50の酸素飽和を得るために、1500rpmの値にまで高めた。酸素飽和は、400rpmで100の飽和に校正されたpO2-プローブで測定した。発酵器中のグルコース含有率が約5g/Lにまで低下したら、56質量/容量のグルコース溶液の供給を行った。グルコース供給は、6~12mL/hの流速で行った。その際、発酵器中のグルコース濃度は、0.1g/L~10g/Lで一定に保持した。グルコース測定は、アナライザーYSI7100MBSYSI、YellowSprings、オハイオ、USAをもって行った。実施例5:メナキノン-7の発酵的製造メナキノン-7の製造は、前記発酵器中で、B.BraunBiotechInternationalメルズンゲン、ドイツ社のBiostat登録商標-B-DCU機器を用いて行った。主要発酵器に、一晩培養からの100mLの培養実施例4を参照を接種した。発酵条件は、実施例4からの前発酵器の条件に相応した。発酵時間は、96時間であった。メナキノン-7の測定は、Suvarna他2008,JournalofBacteriology180,第10巻,第2782頁~第2787頁に記載されるように行った。サンプル採取は、それぞれ24時間後、48時間後、72時間後、そして96時間後に行った。該キノン類の分析は、Agilent社ベーブリンゲン、ドイツのHPLCHP1200で実施した。分離カラムとして、Phenomenex社アシャッフェンブルク、ドイツのLunaC182RP-HPLCカラム5μ100mm×4.6mmを用いた。サンプルは、イソプロパノール-アセトニトリル1:3[容量/容量]を用いて、温度40°C及び流速0.7mL/分で定組成溶離させた。キノン類は、UVデテクターを用いて、207nm及び280nmの波長で検出した。第1表は、種々の菌株で得られたメナキノン-7の達成された含有率を示している。第1表:BTM=生体乾燥重量1=菌株の顕著な発泡に基づき、空気流を、培養8時間後に1容量/容量/分に、かつ撹拌回転速度を、400rpmに制限せねばならなかった。2=発酵を72時間後に終えた。3=検出できず"