"本明細書中に記載される発明。本発明の目的は、これらのタンパク質の異種発現のための代替的なおよび改善されたアプローチを提供することである。これらのアプローチは、代表的には、発現のレベル、精製の容易さ、発現の細胞局在、および/または発現されたタンパク質の免疫学的特性に影響を及ぼす。また、本発明は以下を提供する:項目1本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、a該タンパク質の少なくとも1つのドメインが欠失されており、そして必要に応じて、b融合パートナーが使用されない、方法。項目2前記本発明のタンパク質がORF46である、項目1に記載の方法。項目3ORF46が、第1のドメイン1~433のアミノ酸と第2のドメイン433~608のアミノ酸に分割される、項目2に記載の方法。項目4前記本発明のタンパク質が564である、項目2に記載の方法。項目5タンパク質564が図8に示したようなドメインに分割される、項目4の方法。項目6前記本発明のタンパク質が961である、項目1に記載の方法。項目7タンパク質961が図12に示されるようなドメインで分割される、項目6に記載の方法。項目8前記本発明のタンパク質が502であり、そして前記ドメインがMC58配列に従った番号において28~167のアミノ酸である、項目1に記載の方法。項目9前記本発明のタンパク質が、287である、項目1に記載の方法。項目10本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここでa該タンパク質のN末端ドメインの一部分が欠失されている、方法。項目11タンパク質287が、図5にしめされるドメインA、ドメインB、およびドメインCに分割される、項目9または10に記載の方法。項目12iドメインA、iiドメインAおよびB、またはiiiドメインAおよびCが、欠失される、項目11の方法。項目13項目11に記載の方法であって、ここで、ドメインAにいて、i1~17のアミノ酸、ii1~25のアミノ酸、iii1~69のアミノ酸、またはiv1~106のアミノ酸が、欠失される、方法。項目14本発明のタンパク質の異種発現の方法であって、ここでa融合パートナーが使用されないか、およびb存在する場合、該タンパク質の天然のリーダーペプチドが使用される、方法。項目15項目14に記載の方法であって、ここで、前記本発明のタンパク質が以下:111、149、206、225-1、235、247-1、274、283、286、292、401、406、502-1、503、519-1、525-1、552、556、557、570、576-1、580、583、664、759、907、913、920-1、936-1、953、961、983、989、Orf4、Orf7-1、Orf9-1、Orf23、Orf25、Orf37、Orf38、Orf40、Orf40.1、Orf40.2、Orf72-1、Orf76-1、Orf85-2、Orf91、Orf97-1、Orf119、Orf143.1、NMB0109、NMB2050、008、105、117-1、121-1、122-1、128-1、148、216、243、308、593、652、726、926、982、Orf83-1およびOrf43-1、からなる群より選択される、方法。項目16本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここでa該タンパク質のリーダーペプチドが、異なるタンパク質由来のリーダーペプチドにより置換され、そして、必要に応じてb融合パートナーが使用されない、方法。項目17前記異なるタンパク質が、961、ORF4、E.coliOmpA、またはE.carotovoraPelBであるか、または前記リーダーペプチドがMKKYLFSAAである、項目16に記載の方法。項目18前記異なるタンパク質が、E.coliOmpAであり、そして前記本発明のタンパク質がORF1である、項目17に記載の方法。項目19前記本発明のタンパク質が911であり、そして前記異なるタンパク質がE.carotovoraPelBまたはE.coliOmpAである、項目17に記載の方法。項目20前記異なるタンパク質が、ORF4であり、そして前記本発明のタンパク質が287である、項目17に記載の方法。項目21本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、a該タンパク質のリーダーペプチドが欠失されており、そして必要に応じて、b融合パートナーが使用されない、方法。項目22前記本発明のタンパク質が919である、項目21に記載の方法。項目23本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで本発明のタンパク質の発現が、該タンパク質の有毒活性が現れない温度で、実行される、方法。項目24タンパク質919が30°Cで発現される、項目23に記載の方法。項目25本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、タンパク質が有毒活性を減少するか、または除去するように変異される、方法。項目26前記本発明のタンパク質が、907、919、または9222である、項目25に記載の方法。項目27907が、Glu-117で変異例えば、Glu→Glyした、項目26に記載の方法。項目28919が、Glu-255での変異例えば、Glu→Glyおよび/またはGlu-323での変異例えば、Glu→Glyをした、項目26に記載の方法。項目29922が、Glu-164での変異例えば、Glu→Gly、Ser-213での変異例えば、Ser→Glyおよび/またはAsn-348での変異例えば、Asn→Glyをした、項目26に記載の方法。項目30本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここでベクターpSM214が使用されるか、またはベクターpET-24bが使用される、方法。項目31前記本発明のタンパク質が953であり、そして前記ベクターがpSM214である、項目30に記載の方法。項目32本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで、タンパク質が特定の多量体形態を取るように、該タンパク質が発現されるか、または精製される、方法。項目33タンパク質953が単量体形態で発現され、そして/またはタンパク質953が単量体形態で精製される、項目32に記載の方法。項目34タンパク質961が四量体形態で発現され、そして/またはタンパク質961が四量体形態で精製される、項目32に記載の方法。項目35タンパク質287が二量体形態で発現され、そして/またはタンパク質287が二量体形態で精製される、項目32に記載の方法。項目36タンパク質919が単量体形態で発現され、そして/またはタンパク質919が単量体形態で精製される、項目32に記載の方法。項目37本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここで該タンパク質が、脂質化タンパク質として発現される、方法。項目38前記本発明のタンパク質が919、287、ORF4、406、567またはORF25である、項目37に記載の方法。項目39本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、ここでa該タンパク質のC末端領域が変異されており、そして必要に応じてb融合パートナーが使用されない、方法。項目40前記変異が、置換、挿入、または欠失である、項目39に記載の方法。項目41前記本発明のタンパク質が、730、ORF29またはORF46である、項目40に記載の方法。項目42本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、該タンパク質のリーダーペプチドが変異される、方法。項目43前記本発明のタンパク質が919である、項目42に記載の方法。項目44本発明のタンパク質の異種発現のための方法であって、該タンパク質中のポリグリシンストレッチが変異された、方法。項目45前記タンパク質が、本発明のタンパク質である、項目44に記載の方法。項目46前記本発明のタンパク質が、287、741、983またはTbp2である、項目45に記載の方法。項目47Gly6が287または983から欠失された、項目46に記載の方法。項目48Gly4がTbp2または741から欠失された、項目46に記載の方法。項目49リーダーペプチドもまた欠失された、項目47または48に記載の方法。項目50前記異種発現がE.coli宿主の中に存在する、項目1~49のいずれか1項に記載の方法。項目51項目1~50のいずれか1項に記載の方法により発現されたタンパク質。項目52N末端アミノ酸配列MKKYLFSAAを含む、異種タンパク質。発明の開示本明細書中での用語WO99/24578、WO99/36544およびWO99/57280において開示された2166のタンパク質配列は、以下の配列番号により本明細書中で言及される:この配列番号の番号付けに加えて、WO99/24578、WO99/36544およびWO99/57280において用いられた命名の取り決めもまた用いられる例えば、WO99/24578およびWO99/36544で用いられようにORF4、ORF40、ORF40-1など;WO99/57280において用いらるようにm919、g919およびa919など。Tettelinら[Science2000287:1809-1815]の2160のタンパク質NMB0001~NMB2160は、本明細書中で配列番号2167~4326として言及される[WO00/66791もまた参照のこと]。本明細書中で用いられる場合、用語本発明のタンパク質とは、以下を含むタンパク質をいう:a配列番号1~4326の配列のうちの1つ;またはb配列番号1~4326の配列のうちの1つに対する配列同一性を有する配列;またはc配列番号1~4326のうちの1つのフラグメント。bにおいて言及される配列同一性の程度は、好ましくは、50より大きい例えば、60、70、80、90、95、99以上。これは、変異体および対立遺伝子改変体を含む[例えば、WO00/66741を参照のこと]。同一性は、好ましくは、MPSRCHプログラムOxfordMolecularで実行されるようなSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムにより、パラメーター、ギャップオープンペナルティー=12およびギャップ伸長ペナルティー=1を用いたアフィンギャップ検索を用いて決定される。代表的には、2つのタンパク質間の50以上の同一性が、機能的等価の指標とみなされる。cで言及されるフラグメントは、配列番号1~4326の1つに由来する少なくともn個の連続するアミノ酸を含むべきである。そして特定の配列に依存して、nは7以上である例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100以上。好ましくは、このフラグメントは、配列番号1~4326のうちの1つに由来するエピトープを含む。好ましいフラグメントは、WO00/71574およびWO01/04316に開示されるフラグメントである。本発明の好ましいタンパク質は、N.meningitidis血清群Bにおいて見出される。本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清群BのN.meningitidis2996株または394/98株NewZealand株のタンパク質である。他に述べられなければ、本明細書中で言及されるタンパク質は、N.meningitidis2996株に由来する。しかし本発明は、概して株により限定されないことが理解される。特定のタンパク質例えば、287、919などに対する言及は、任意の株に由来するタンパク質を含むとみなされ得る。非融合物発現異種発現に対する第1のアプローチにおいて、融合パートナーは用いられず、ネイティブのリーダーペプチド存在する場合が用いられる。これは、代表的には、融合パートナーに由来する任意の干渉を防止し、異種宿主における細胞局在および/または翻訳後修飾および/または折りたたみを変化させ得る。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法において、a融合パートナーは用いられず、そしてbそのタンパク質のネイティブなリーダーペプチド存在する場合が用いられる。この方法は、代表的には、本発明のタンパク質を発現するベクターを調製し、その結果、第1の発現されたアミノ酸がこのタンパク質の最初のアミノ酸メチオニンであり、そして最後に発現されたアミノ酸がこのタンパク質の最後のアミノ酸すなわち、ネイティブな停止コドンの前にあるコドンである工程を包含する。このアプローチは、好ましくは、ネイティブなリーダーペプチドを用いて以下のタンパク質の発現について用いられる:111、149、206、225-1、235、247-1、274、283、286、292、401、406、502-1、503、519-1、525-1、552、556、557、570、576-1、580、583、664、759、907、913、920-1、936-1、953、961、983、989、Orf4、Orf7-1、Orf9-1、Orf23、Orf25、Orf37、Orf38、Orf40、Orf40.1、Orf40.2、Orf72-1、Orf76-1、Orf85-2、Orf91、Orf97-1、Orf119、Orf143.1、NMB0109およびNMB2050。タンパク質の名称において本明細書中で用いられる接尾辞Lは、ネイティブなリーダーペプチドを用いた様式における発現を示す。好ましくは、融合パートナーを用いないこのアプローチを用いて発現され、かつネイティブなリーダーペプチドを有さないタンパク質としては、以下が挙げられる:008、105、117-1、121-1、122-1、128-1、148、216、243、308、593、652、726、926、982、Orf83-1およびOrf143-1。有利には、ORF25またはORF40の発現について用いられ、GST融合物またはHis融合物より良好な抗細菌抗体を誘導するタンパク質を生じる。このアプローチは、特に、リポタンパク質を発現するために適切である。リーダーペプチド置換異種発現に対する第2のアプローチにおいて、本発明のタンパク質のネイティブなリーダーペプチドは、異なるタンパク質のリーダーペプチドにより置換される。さらに、融合パートナーを用いないことが好ましい。タンパク質自身のリーダーペプチドを異種宿主において用いると、しばしばその天然の細胞位置にこのタンパク質を局在させることができるが、いくらかの場合、リーダー配列は、異種宿主によって効率的に認識されない。そのような場合、タンパク質を効率的に標的化させることが公知のリーダーペプチドが、代わりに用いられ得る。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法において、aこのタンパク質のリーダーペプチドは、異なるタンパク質由来のリーダーペプチドにより置換され、そして必要に応じて、b融合パートナーは用いられない。この方法は、代表的には、本発明のタンパク質をコードする核酸を得る工程;この核酸を操作して、このタンパク質のリーダーペプチドをコードする核酸を除去し、異なるタンパク質のリーダーペプチドをコードするヌクレオチドを導入する工程を包含する。得られた核酸は、発現ベクターに挿入されるか、または既に発現ベクターの一部分であり得る。発現されたタンパク質は、N末端における置換リーダーペプチド、続いて、リーダーペプチドがない本発明のタンパク質からなる。このリーダーペプチドは、好ましくは、本発明の別のタンパク質例えば、配列番号1~4326のうちの1つに由来するが、例えば、E.coliタンパク質由来例えば、OmpAリーダーペプチドまたはErwiniacarotovaraタンパク質PelBリーダーペプチドでもあり得る。特に有用な置換リーダーペプチドは、ORF4のリーダーペプチドである。このリーダーは、E.coliにおける脂質化を方向付け得、細胞局在を改善し得、そしてタンパク質287、919およびΔG287の発現に特に有用である。このリーダーペプチドおよび961のN末端ドメインはまた、特に有用である。別の有用な置換リーダーペプチドは、E.coliOmpAのリーダーペプチドである。このリーダーは、E.coliの膜局在化を方向付け得る。これはORF1の発現について特に有利であり、融合物および自身のリーダーペプチドから発現されたタンパク質の両方より良好な抗細菌抗体を誘導するタンパク質を生じる。別の有用な置換リーダーペプチドは、MKKYLFSAAである。これは、分泌物を培養培地へ方向付け得、そして非常に短くかつ活性である。このリーダーペプチドの使用は、Neisseriaタンパク質の発現に限定されない。すなわち、任意のタンパク質特に、細菌タンパク質の発現を方向付けるために用いられ得る。リーダーペプチド欠失異種発現に対する第3のアプローチにおいては、本発明のタンパク質のネイティブなリーダーペプチドが、欠失される。さらに、融合パートナーを用いないことが好ましい。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、この方法において、aこのタンパク質のリーダーペプチドを欠失し、そして必要に応じてb融合パートナーを用いない。この方法は、代表的には、以下の工程を包含する:本発明のタンパク質をコードする核酸を得る工程;この核酸を操作して、このタンパク質のリーダーペプチドをコードするヌクレオチドを除去する工程。得られる核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。発現されたタンパク質の最初のアミノ酸は、成熟なネイティブタンパク質のアミノ酸である。この方法は、発現のレベルを増大させ得る。タンパク質919に関しては、例えば、E.coliにおける発現レベルは、リーダーペプチドが欠失される場合にはるかに高い。増加した発現は、リーダーペプチドの非存在下での変化した局在の原因であり得る。この方法は、好ましくは、919、ORF46、961、050-1、760および287の発現のために用いられる。ドメインベースの発現異種発現に対する第4のアプローチにおいて、このタンパク質は、ドメインとして発現される。これは、融合系と関連して用いられ得る例えば、GST融合物またはHisタグ融合物。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法においてaこのタンパク質の少なくとも1つのドメインが欠失され、そして必要に応じてb融合パートナーは用いられない。この方法は、代表的には、以下の工程を包含する:本発明のタンパク質をコードする核酸を得る工程;この核酸を操作して、このタンパク質内の少なくとも1つのドメインを除去する工程。得られる核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。融合パートナーが用いられない場合、発現されたタンパク質の最初のアミノ酸は、このタンパク質のドメインの最初のアミノ酸である。タンパク質は、代表的には、このタンパク質をデータベースにおける公知の配列と整列させ、次いで、互いに異なる整列パターンを示すタンパク質の領域を決定することにより概念的なドメインに分けられる。この方法は、好ましくは、タンパク質287の発現に用いられる。このタンパク質は、3つのドメインA、BおよびCといわれる図5を参照のことに概念的に分割され得る。ドメインBは、IgAプロテアーゼと強く整列し、ドメインCは、トランスフェリン結合タンパク質と強く整列し、そしてドメインAは、データベース配列との強い整列は示さない。287の多型形態の整列は、WO00/66741に開示される。一旦タンパク質がドメインに分けられると、これらは、a単に発現され得るか、bタンパク質から欠失され得る例えば、タンパク質ABCD→ABC、ACD、BCDなどか、またはc再配置例えば、タンパク質ABC→ACB、CABなどされ得る。これらの3つのストラテジーは、所望の融合パートナーと組み合わされ得る。ORF46はまた、概念的に、2つのドメイン-種と血清群との間で十分に保存されている第1のドメインアミノ酸1-433、および十分に保存されていない第2のドメインアミノ酸433-608、に分けられる。第2のドメインは、好ましくは欠失される。ORF46の多型形態のアラインメントは、WO00/66741に開示されている。タンパク質564はまた、複数のドメインに分けられ図8、タンパク質961図12およびタンパク質502MC58タンパク質のアミノ酸28-167も同様である。ハイブリッドタンパク質異種発現についての第5の取り組みにおいて、本発明の2つ以上例えば、3,4,5,6、またはそれ以上のタンパク質が、単一のハイブリッドタンパク質として発現される。非ナイセリア融合パートナー例えば、GSTまたはポリHisが用いられることが好ましい。これは、2つの利点を提供する。第1に、それ単独では不安定であり得るか、またはほとんど発現され得ないタンパク質が、この問題を克服する安定なハイブリッドハートナーを加えることにより、補助され得る。第2に商業的な製造が簡易化される-2つの別々に有用なタンパク質を製造するために、1回のみの発現および精製が行なわれることが必要とされる。従って、本発明は、2つ以上の本発明のタンパク質の同時異種発現のための方法を提供する。この方法において、2つ以上の本発明のタンパク質は、融合されるすなわち、それらは、単一のポリペプチド鎖として翻訳される。この方法は、代表的に以下の工程を包含する:本発明の第1のタンパク質をコードする第1の核酸を獲得する工程;本発明の第2のタンパク質をコードする第2の核酸を獲得する工程;第1の核酸および第2の核酸を連結する工程。得られる核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。好ましくは、本発明に従うハイブリッドタンパク質の構成タンパク質は、同じ株由来である。ハイブリッドにおいて融合されるタンパク質は、直接的に連結され得るか、またはリンカーペプチドを介して例えば、ポリグリシンリンカーすなわち、Gn、ここでn=3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上を介して、またはクローニングを容易にする短いペプチド配列を介して連結され得る。ポリグリシンリンカーのC末端にΔGタンパク質を連結しないことが、明らかに好ましい。融合タンパク質は、ネイティブのリーダーペプチドを欠失し得るか、またはN末端融合パートナーのリーダーペプチド配列を含み得る。この方法は、タンパク質orf1、orf4、orf25、orf40、Orf46/46.1、orf83、233、287、292L、564、687、741、907、919、953、961、および983の発現に十分適している。NH2-A-B-COOH形態の、以下の表においてXにより示される42個のハイブリッドが好ましい。従って、ハイブリッドとして発現される好ましいタンパク質は、ORF46.1、287、741、919、953、961、および983である。これらは、それらの本質的な全長形態で用いられ得るか、またはポリグリシン欠損ΔG形態が用いられ得るか例えば、ΔG-287、ΔGTbp2、ΔG741、ΔG983など、もしくは、短縮された形態が用いられ得るか例えば、Δ1-287、Δ2-287など、あるいは、ドメイン欠損バージョンが用いられ得る例えば、287B、287C、287BC、ORF461-433、ORF46433-608、ORF46,961cなど。特に、以下が好ましい:a919および287を含むハイブリッドタンパク質;b953および287を含むハイブリッドタンパク質;c287およびORF46.1を含むハイブリッドタンパク質;dORF1およびORF46.1を含むハイブリッドタンパク質;e919およびORF46.1を含むハイブリッドタンパク質;fORF46.1および919を含むハイブリッドタンパク質;gORF46.1、287、および919を含むハイブリッドタンパク質;h919および519を含むハイブリッドタンパク質;およびiORF97および225を含むハイブリッドタンパク質。さらなる実施形態は、図14に示される。287が用いられる場合、ハイブリッドのC末端で用いられることが好ましい;287がN末端で用いられる場合、287のΔG形態が用いられる例えば、ORF46.1、919、953、または961とのハイブリッドのN末端としてことが好ましい。287が用いられる場合、好ましくはこれは、2996株由来であるか、または394/98株由来である。961が用いられる場合、好ましくはこれは、そのN末端である。961のドメイン形態が用いられ得る。ORF46、287、919、および953の多型形態のアラインメントは、WO00/66741に開示されている。任意のこれらの多型が、本発明に従い用いられ得る。温度異種発現についての6番目の取り組みにおいて、本発明のタンパク質は、低温にて発現される。発現されたナイセリアタンパク質例えば919は、E.coliに対して有毒であり得、これは、その有毒活性が現れない温度にて、その有毒なタンパク質を発現させることにより、回避され得る。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、この方法において、本発明のタンパク質の発現は、このタンパク質の有毒な活性が現れない温度にて実施される。好ましい温度は、30°C付近である。これは、919の発現に特に適している。変異上記のように、発現されたナイセリアタンパク質は、E.coliに対して有毒であり得る。この毒性は、この有毒な活性を減少または消滅させるようにこのタンパク質を変異することにより回避され得る。特に、毒性の酵素活性を減少または消滅させるための変異が、好ましくは、部位特異的変異誘発を使用して、用いられ得る。従って、異種発現についての7番目の取り組みにおいて、発現されたタンパク質は、有毒な活性を減少または消滅させるために変異される。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、この方法において、タンパク質は、有毒な活性を減少または消滅させるために変異される。好ましくはこの方法は、タンパク質907、919、または922の発現のために用いられる。907における好ましい変異は、Glu-117での変異例えば、Glu→Glyであり;919における好ましい変異は、Glu-255での変異例えば、Glu→Glyおよび/またはGlu-323での変異例えば、Glu→Glyであり;922における好ましい変異は、Glu-164での変異例えば、Glu→Gly、Ser-213での変異例えば、Ser→Gly、および/またはAsn-348での変異例えば、Asn→Glyである。代替のベクター異種発現についての8番目の取り組みにおいて、代替のベクターが、このタンパク質を発現させるために用いられた。これは、発現の収率を改善するためであり、例えば、GMPでの使用についてすでに承認されているプラスミドを利用することであり得る。従って、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供し、この発明において、代替のベクターが用いられる。この代替のベクターは、好ましくはpSM214であり、融合パートナーを伴わない。リーダーペプチドは、含まれても含まれなくてもよい。このアプローチは、特にタンパク質953に有用である。pSM214から発現された953のネイティブなリーダーペプチドを有する953の発現および局在化は、pETベクターよりもかなり良好である。pSM214はまた、以下:ΔG287、Δ2-287、Δ3-287、Δ4-287、Orf46.1、961L、961、961MC58、961c-L、919、953およびΔG287-Orf46.1とともに用いられ得る。別の適切なベクターは、pET-24bNovagen;カナマイシン耐性を用いるであり、ここでも融合パートナーを用いない。pET-24bは、以下:ΔG287、Δ2-287K、Δ3-287K、Δ4-287K、Orf46.1K、Orf46A-K、961-KMC58、961a-K、961b-K、961c-K、961c-L-K、961d-K、ΔG287-919-K、ΔG287-Orf46.1-KおよびΔ287-961-Kとともに用いるのに好ましい。多量体形態異種発現に対する9番目のアプローチでは、タンパク質が、特定の多量体形態をとるように、発現されるかまたは精製される。このアプローチは、タンパク質953に特に適切である。953単量体形態の特定の1つの多量体形態の精製によって、他の形態二量体形態よりも大きい殺菌活性を有するタンパク質が得られる。タンパク質287および919は、二量体形態で精製され得る。タンパク質961は、180kDaのオリゴマー形態例えば、テトラマー四量体で精製され得る。脂質化lipidation異種発現に対する10番目のアプローチでは、タンパク質が脂質化されたタンパク質として発現される。このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法では、タンパク質は脂質化されたタンパク質として発現される。これは、特に919、287、ORF4、406、576-1およびORF25の発現に有用である。919、287、およびORF4のポリマー形態は、WO00/66741に開示される。この方法は、代表的に、N末端融合パートナーは用いないで、適切なリーダーペプチドの使用を包含する。C末端欠失異種発現に対する11番目のアプローチでは、本発明のタンパク質のC末端が変異している。さらに、融合タンパク質を用いないことが好ましい。このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法では、aタンパク質のC末端領域が変異しており、そして必要に応じて、b融合タンパク質を用いない。この方法は、代表的に、以下の工程:本発明のタンパク質をコードする核酸を入手する工程;この核酸を操作して、タンパク質のC末端部分をコードするヌクレオチドを変異させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現ベクター中に挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。発現されたタンパク質の最初のアミノ酸は、成熟したネイティブタンパク質の最初のアミノ酸である。この変異は、置換、挿入、または好ましくは欠失であり得る。この方法は、特にタンパク質730、ORF29、およびORF46について、発現のレベルを増大させ得る。タンパク質730について、C末端領域の、およそ65~およそ214のアミノ酸が欠失され得る;ORF46については、C末端領域のおよそ175アミノ酸が欠失され得る;ORF29については、C末端が欠失されて、およそ230~370のN末端アミノ酸が残され得る。リーダーペプチド変異異種発現に対する12番目のアプローチでは、本発明のタンパク質のリーダーペプチドが変異している。これは、特にタンパク質919の発現に有用である。このように、本発明は、タンパク質のリーダーペプチドが変異している、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法は、代表的に、以下の工程:本発明のタンパク質をコードする核酸を入手する工程;この核酸を操作して、リーダーペプチド内のヌクレオチドを変異させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現ベクター中に挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。ポリグリシン欠失異種発現に対する13番目のアプローチでは、野生型配列におけるポリグリシンpoly-glycineストレッチが変異している。これが、タンパク質発現を強化する。このポリグリシンストレッチは、配列Glynを有し、ここでn≧4例えば、5、6、7、8、9またはそれ以上である。このストレッチは、Glynをバラバラにするかまたは除去するように変異される。これは、欠失例えば、CGGGGS→CGGGS、CGGS、CGSまたはCS、置換例えば、CGGGGS→CGXGGS、CGXXGS,CGXGXSなど、および/または挿入例えば、CGGGGS→CGGXGGS、CGXGGGS、などによるものであってもよい。このアプローチは、Neisserialタンパク質ナイセリアのタンパク質には限定されない。このアプローチは、異種発現を強化するため、任意のタンパク質特に細菌タンパク質に用いられ得る。しかし、ナイセリアのNeisserialタンパク質について、このアプローチは、特に287、741、983およびTbp2を発現するのに適切である。287の多量体形態の整列は、WO00/66741に開示されている。このように、本発明は、本発明のタンパク質の異種発現のための方法を提供する。この方法では、aタンパク質内のポリグリシンストレッチが変異されている。この方法は、代表的に、以下の工程:本発明のタンパク質をコードする核酸を入手する工程;この核酸を操作して、タンパク質内のポリグリシンストレッチをコードするヌクレオチドを変異させる工程、を包含する。得られた核酸は、発現ベクター中に挿入され得るか、またはすでに発現ベクターの一部であり得る。逆に、反対のアプローチすなわち、ポリグリシンストレッチの導入を用いて、所定の異種タンパク質の発現を抑制または減弱し得る。異種宿主本発明のタンパク質の発現は、ネイティブな宿主すなわち、このタンパク質が天然に発現される生物体に生じ得るが、本発明は異種の宿主を利用する。異種宿主は、原核生物または真核生物であり得る。E.coliが好ましいが、他の適切な宿主としては、Bacillussubtilis、Vibriocholerae、Salmonellatyphi、Salmonennatyphimurium、Neisseriameningitidis、Neisseriagonorrhoeae、Neisserialactamica、Neisseriacinerea、Mycobacteria例えば、M.tuberculosis、酵母など、が挙げられる。ベクターなど上記の方法に加えて、本発明は、以下:aこれらの方法に有用な核酸およびベクター、bこのようなベクターを含む宿主細胞、cこの方法によって発現されるかまたは発現可能なタンパク質、dこれらのタンパク質を含む組成物これは、例えば、ワクチンとして、または診断試薬として、または免疫原性組成物として適切であり得る、e医薬例えば、ワクチンとして、または診断試薬としての使用のためのこれらの組成物、f以下の製造におけるこれらの組成物の使用:1ナイセリア細菌による感染を処置または予防するための医薬、2ナイセリア細菌の存在、もしくはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬、および/または3ナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬、g患者を処置する方法であって、これらの組成物の治療上有効な量をこの患者に投与する工程を包含する、方法、を提供する。配列本発明はまた、以下の実施例に記載される任意の配列を有するタンパク質または核酸を提供する。本発明はまた、これらに同一な配列を有するタンパク質および核酸もまた提供する。上記のように、配列同一性の程度は、好ましくは、50より大きい例えば、60、70、80、90、95、99、またはそれ以上。さらに、本発明は、好ましくは、高ストリンジェンシーな条件例えば、0.1×SSC、0.5SDS溶液中で65°C下で、この実施例中に開示された核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。本発明はまた、本発明によるタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明が上記の核酸に相補的な配列を含む核酸を例えば、アンチセンスまたはプローブの目的で提供することも理解されるべきである。本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの方法で例えば、ゲノムまたはcDNAのライブラリーから、生物体自体からの、化学合成などによって調製され得、そして種々の形態例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなどをとり得る。さらに、用語核酸は、DNAおよびRNAを含み、そしてまたそれらのアナログ例えば、改変骨格を含むものを含み、そしてまたペプチド核酸PNAなども含む。発明を実行するための様式実施例1-919および919のリーダーペプチドN.meningitidis血清型B、2996株由来のタンパク質919は、以下の配列を有する。リーダーペプチドには、下線を付した。他の株由来の919の配列は、WO00/66741の図7および図18に見出され得る。WO99/57280の実施例2は、E.coliにおけるHis-融合としてのタンパク質919の発現を開示する。このタンパク質は、良好な表面曝露抗原である。3つの代替の発現ストラテジーが919に対して用いられた:1そのリーダーペプチドN末端の成熟したシステインなしのおよびいかなる融合パートナーも有さない919919タグなし:このリーダーペプチドおよびシステインを、予測リーダー配列から下流の5’末端増幅プライマーを設計することによって除外した。2919自体のリーダーペプチドを有するが、いかなる融合パートナーも有さない919919L;および3ORF4由来のリーダーペプチドを有する919919LOrf4を、919に対して使用した。この構築物を作製するために、ORF4リーダーペプチドをコードする全配列を、テイルとして5’-プライマー中に含んだプライマー919Lorf4For。NheI制限部位を、ORF4リーダーをコードする配列における2個のヌクレオチド変化によって作製しアミノ酸改変はない、異なる遺伝子がORF4リーダーペプチド配列に融合されることを可能にした。終止コドンを、3’末端プライマー配列の全てに含んだ。このタンパク質の3つの形態全てを発現し、精製し得た。919Lおよび919LOrf4発現産物を、[3H]-パルミテート標識の取り込みによって示されるように、両方とも脂質化lipidateした。919タグなしは、3H標識を取り込まず、そして細胞内に位置した。919LOrf4を、919Lより容易に精製し得た。これを精製し、マウスを免疫するために使用した。生じた血清は、FACSおよびELISA試験において、また、殺菌性のアッセイにおいても優れた結果を与えた。リポタンパク質が、外膜に局在することを示した。919タグなしは、優れたELISA力価および高い血清の殺菌性活性を与えた。FACSは、919タグなしの細胞表面の位置を確認した。実施例2-919および発現温度919LOrf4タンパク質を発現するE.coliの37°Cでの増殖は、細菌の溶解を生じた。この問題を克服するため、組換え細菌を30°Cで増殖させた。溶解を、発現を妨げることなく回避した。実施例3-907、919および922の変異タンパク質907、919および922は、ムレイン加水分解酵素、より詳細には溶解性トランスグリコシラーゼであると仮定された。ムレイン加水分解酵素は、外膜に存在し、そしてペプチドグリカンの分解に関与する。従って、精製されたタンパク質919タグなし、919Lorf4、919-Hisすなわち、C末端のHisタグを有するおよび922-Hisを、ムレイン加水分解酵素活性について試験した[UrsinusHoltje1994J.Bact.176:338-343]。2つの異なるアッセイを使用した。1つは、可溶ムロペプチドへの不溶ムレイン網状袋の分解を決定し、他は、ポリMurNAc-GlcNAcn>30グリカン鎖の崩壊を測定する。第一のアッセイは、基質としてメソ-2,6-ジアミノ-3,4,5-[3H]ピメリン酸で放射性標識したムレイン網状袋を使用する。酵素合計3~10μgを、10mMのトリスマレアートpH5.5、10mMのMgCl2、0.2v/vのTritonX-100および[3H]A2pm標識ムレイン網状袋約10000cpmを含む、100μlの合計容積で37°Cで45分間インキュベートした。このアッセイ混合物を、15分間の1w/vのN-アセチル-N,N,N-トリメチルアンモニウム100μlと共に氷上に15分間置き、そして10000gで15分間遠心分離してペレット化した材料を沈殿させた。上清における放射能を、液体シンチレーションカウントによって測定した。E.coliの可溶な溶解性トランスグリコシラーゼSlt70を、このアッセイの陽性コントロールとして使用した;陰性コントロールは、酵素なしの上記のアッセイ溶液を含んだ。919-His以外の全てのタンパク質は、第一のアッセイにおいて陽性の結果を与えた。第二のアッセイは、ポリMurNAc-GlcNAcグリカン鎖の加水分解をモニターする。精製された鎖である、N-アセチル-D-1-[3H]グルコサミンで標識されたポリMurNAc-GlcNAcn>30を、10mMのトリスマレアートpH5.5、10mMのMgCl2、0.2v/vのTritonX-100中の3μgの919Lと共に、37°Cで30分間インキュベートした。この反応を、5分間煮沸することによって停止させ、そしてこのサンプルのpHを、10μlの20v/vリン酸の添加によって約3.5に調整した。基質および産物を、Harzら、[Anal.Biochem.1990190:120-128]に記載されるように、Nucleosil300C18カラム上で逆相HPLCによって分離した。E.coliの溶解性トランスグリコシラーゼ、MltAを、このアッセイにおいて陽性コントロールとして使用した。陰性コントロールを、酵素の非存在下で実行した。このアッセイによって、単離されたグリカン鎖を加水分解する919LOrf4の能力を、無水二糖類サブユニットがHPLCによってオリゴ糖から分離された場合に、実証した。タンパク質919Lorf4を、動力学的分析のために選択した。919Lorf4の活性は、アッセイ緩衝液中の0.2v/vのTritonX-100の添加によって、3.7倍増強した。TritonX-100の存在は、919タグなしの活性に効果を有さなかった。酵素活性に対するpHの効果を、トリスマレアート緩衝液中で、5.0~8.0の範囲にわたって決定した。反応のために最適なpHが、5.5であることを決定した。18°C~42°Cの範囲の温度にわたって、最大の活性を、37°Cで観察した。ムレイン加水分解酵素活性に対する種々のイオンの効果を、10mMの最終濃度での種々のイオンの存在下で反応を実行することによって決定した。最大の活性はMg2で見出され、これは、活性を2.1倍刺激した。Mn2およびCa2もまた、酵素活性を類似の程度に刺激したが、Ni2およびEDTAの添加は、有意な効果を有しなかった。対照的に、Fe2およびZn2の両方は、酵素活性を有意に阻害した。未標識のE.coliのムレイン網状袋の消化から生じる反応産物の構造を、Glauner[Anal.Biochem.1988172:451-464]に記載のように、逆相HPLCによって分析した。ムラミダーゼCellosylで消化したムレイン網状袋を、HypersilODSカラムを較正し、そして標準化するために使用した。主な反応産物は、1,6無水二糖テトラペプチドおよび1,6無水二糖トリペプチドであり、1,6無水ムラミン酸の分子内結合の形成を実証する。これらの結果は、919がムレイン加水分解酵素であり、特に酵素の溶解性トランスグリコシラーゼファミリーのメンバーであることを、実験的に実証する。さらに、ムレイン網状袋を加水分解する922-Hisの能力は、このタンパク質がまた、溶解性トランスグリコシラーゼであることを示唆する。この活性は、E.coliにおいて発現された場合の919の毒性効果を説明する助けになり得る。酵素活性を除外するため、合理的な変異誘発を使用した。907、919および922は、E.coli由来の3つの脂質化された膜結合ムレイン溶解性トランスグリコシラーゼに、かなり低い相同性を示す:919441アミノ酸は、E.coliMLTAP46885に対して440アミノ酸重複にわたり、27.3同一である。922369アミノ酸は、E.coliMLTBP41052に対して310アミノ酸重複にわたり、38.7同一である。907-2207アミノ酸は、E.coliMLTCP52066に対して149アミノ酸重複にわたり、26.8同一である。907-2はまた、ペリプラズム空間に位置する可溶な溶解性トランスグリコシラーゼである、E.coliのMLTDP23931およびSlt70P03810と相同性を共有する。有意な配列相同性は、919、922および907-2間に検出され得ず、対応するMLTAタンパク質、MLTBタンパク質およびMLTCタンパク質間で、同じである。結晶構造は、Slt70[1QTEA;1QTEB;Thunnissenら1995Biochemistry34:12729-12737]およびSlt35[1LTM;1QUS;1QUT;vanAsseltら1999StructureFoldDes7:1167-80]これは、40kDaのMLTBの可溶形態であるについて利用可能である。この触媒性残基グルタミン酸は、Slt70およびMLTBの両方について同定されている。Slt70の場合、変異誘発研究は、グルタミンGlnによる触媒性Glu505の保存的置換さえ、酵素活性の完全な喪失を引き起こすことを実証した。Slt35は、Slt70に対する明らかな配列の類似を有さないが、Slt35の触媒ドメインは、驚くべき類似性を示す。MLTBにおけるこの対応する触媒性残基は、Glu162である。酵素のクレフトの正しい折り畳みにおいて重要な役割を果たすと考えられる別の残基は、グルタミン酸の下流のよく保存されたグリシンGlyである。最近、Terrakら[Mol.Microbiol.199934:350-64]は、触媒性グルタミン酸の下流の70~75残基あたりに位置する芳香族アミノ酸である、別の重要な残基の存在を示唆した。Slt70と907-2との配列アラインメント、およびMLTBと922との配列アラインメントを、MenB抗原において対応する触媒性残基を同定するために、実行した。この触媒性ドメイン領域における2つのアラインメントを、以下に報告する。これらのアラインメントから、907-2において対応する触媒性グルタミン酸が、Glu117であり、一方922においてはGlu164であるという結果になる。両方の抗原がまた、酵素のクレフトの折り畳みにおいて構造的役割を有し得る下流のグリシン太字を共有し、そして922は、70アミノ酸ほど下流の保存された芳香族残基太字を有する。タンパク質919の場合、このタンパク質のE.coliのホモログである、MLTAについて利用可能な3次元構造は存在せず、そして潜在的触媒性残基については何も知られていない。それにもかかわらず、919における3つのアミノ酸が、MLTAとのアラインメントにより、触媒性残基として予測される。これら3つの潜在的触媒性残基を、記号下向きの黒三角によって示す:13つの保存されたグリシンGly263、Gly265およびGly272ならびに約75~77残基下流に位置する3つの保存された芳香族残基の前のGlu255MLTAにおいてはAsp。これら下流の残基を、□で示す。22つの保存されたグリシンGly347およびGly355ならびに84~85残基下流に位置する2つの保存された芳香族残基Tyr406またはPhe407の前のMLTAにおいて保存されたGlu323。これら下流の残基を、◇によって示す。31つのグリシンGly369および保存された芳香族残基Trp428の前のAsp362予測されるGluの代わり。これら下流の残基を、○によって示す。919の多型形態のアラインメントは、WO00/66741に開示される。触媒性残基の予測に基づき、各々単一のアミノ酸置換を含む919の3種の変異体および907の1種の変異体を、作製した。919タンパク質における255位および323位でのグルタミン酸、ならびに362位でのアスパラギン酸、そして907タンパク質における117位でのグルタミン酸を、PCRベースのSDMを使用してグリシン残基で置換した。これを行うために、GluまたはAspからGlyへのコドンの変化を含む内部プライマーを、設計した。グリシンのヌクレオチドコードに下線を付した;変異したヌクレオチドは、小文字である。919-E255変異体、919-E323変異体および919-E362変異体を作製するために、鋳型として20ngのpET919-LOrf4DNAを使用し、そして以下のプライマー組:1Orf4Lfor/919-E255rev2919-E255for/919Lrev3Orf4Lfor/919-E323rev4919-E323for/919Lrev5Orf4Lfor/919-D362rev6919-D362for/919Lrevを使用してPCRを実行した。2回目のPCRを、PCR1~2、3~4または5~6の産物を鋳型として使用し、そしてOrf4Lforおよび919Lrevをそれぞれ前向きおよび逆向きのプライマーとして使用して実行した。変異体907-E117については、PCRを、鋳型として2996株の染色体DNA200ngを使用し、そして以下のプライマー組:7907Lfor/907-E117rev8907-E117for/907Lrevを使用して実行した。2回目のPCRを、PCR7および8の産物を鋳型として使用し、そしてオリゴ907Lforおよび907Lrevをプライマーとして使用して、実行した。各変異を含むPCRフラグメントを、標準的な手順に従って進め、NdeIおよびXhoI制限酵素で消化し、そしてpET-21bベクターにクローニングした。各変異の存在を、配列決定分析によって確認した。907におけるGlu117のGlyへの変異を、同様に実行し、922における残基Glu164、Ser213およびAsn348の変異も同様である。919のE255G変異体は、活性において50の減少を示す;E323G変異体は、活性において70の減少を示す;E362G変異体は、活性において減少を示さない。実施例4-多量体形態287-GST、919タグなしおよび953-Hisを、四次構造の分析または調製目的のために、ゲル濾過に供した。ネイティブなタンパク質の分子量を、FPLCSuperose12H/R10/30またはSuperdex75ゲル濾過カラムPharmaciaのいずれかを使用して、評価した。287、919および953についてのクロマトグラフィーに使用された緩衝液は、それぞれ、50mMのトリスHClpH8.0、20mMのビシンpH8.5および50mMのビシンpH8.0であった。さらに、各緩衝液は、150~200mMのNaClおよび10v/vのグリセロールを含んだ。タンパク質を、適切な緩衝液に対して透析し、そして200μlの容積でアプライした。ゲル濾過を、0.5~2.0ml/分の流速で実行し、そして溶出を280nmでモニターした。画分を回収し、そしてSDS-PAGEによって分析した。青色デキストラン2000および分子量標準リボヌクレアーゼA、キモトリプシンAオボアルブミン、アルブミンPharmaciaを使用してカラムを較正した。サンプルの分子量を、Kav対標準のログMrの較正曲線から概算した。ゲル濾過の前に、287-GSTを、GST部分を切断するためにトロンビンで消化した。287、919および953-Hisについて概算した分子量は、それぞれ73kDa、47kDaおよび43kDaであった。これらの結果は、919が単量体であるが、287および953の両方が主に自然状態で二量体であることを示唆する。953-Hisの場合、ゲル濾過中に2つのピークを観察した。大きいピーク80は953の二量体構造を示し、小さいピーク20は、予測された単量体の大きさを有した。953の単量体形態が、二量体より大きい殺菌性活性を有することを見出した。実施例5-pSM214およびpET-24bベクターそのネイティブなリーダーペプチドを含みかつ融合パートナーfusionpartnerを含まない953タンパク質を、pETベクターからおよびpSM214ベクターからも発現させた[VelatiBelliniら、1991J.Biotechnol.18,177-192]。953配列を、E.coliMM294-1株を宿主細胞として使用して、pSM214の中へ全長遺伝子としてクローン化した。これを行うために、953遺伝子の全DNA配列ATG~終止コドンを、以下のプライマーを使用するPCRによって増幅した:953Lfor/2CCGGAATTCTTATGAAAAAAATCATCTTCGCCGCEcoRI953Lrev/2GCCCAAGCTTTTATTGTTTGGCTGCCTCGATTHindIIIこれらは、それぞれEcoRIおよびHindIII制限酵素部位を含む。この増幅されたフラグメントをEcoRIおよびHindIIIで消化し、そして同様の2つの酵素で消化したpSM214ベクターを使用して、ライゲーションを行った。ライゲーションされたプラスミドをE.coliMM294-1細胞へ形質転換し37°Cで65分間、氷中でインキュベーションすることによって、そして細菌細胞を、20μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天上へプレーティングした。20μg/mlクロラムフェニコールを含む4mlのLB培養液中で、組換えコロニーを一晩中37°Cにて増殖させ;細菌細胞を遠心分離し、そしてプラスミドDNAを抽出し、そしてこれをEcoRIおよびHindIIIを用いる消化によって分析した。このタンパク質を発現する組換えコロニーの能力を分析するために、これらの組換えコロニーを20μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培養液中へ接種し、そして37°Cで16時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離し、PBS中で再懸濁した。タンパク質の発現をSDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって分析した。pSM214プラスミドからの発現レベルは、予想外に高かった。配列をpSM214ベクターにクローン化するために使用したオリゴは、以下のようであった:953Lについて記載されるように、これらの配列を操作し、クローン化し、そして発現させた。pET-24ベクターに関しては、pET-21について以下に記載されるように、pET-24中で配列をクローン化し、そしてタンパク質を発現させた。pET-2は、pET-21と同様の配列を有するが、アンピシリンカセットの代わりにカナマイシン耐性カセットを含む。配列をpET-24bベクターへクローン化するために使用されるオリゴヌクレオチドは、以下であった:このプライマーを全287型のためのリバースプライマーとして使用した。§ΔG278Kリバースプライマーと共に使用したフォワードプライマー。実施例6-ORF1およびそのリーダーペプチドN.meningitidis由来のORF1血清群B、株MC58を外膜か、または分泌タンパク質であると予測した。これは以下の配列を有する:リーダーペプチドに下線を引いている。ORF1の多型は、WO99/55873において開示されている。3つの発現方法をORF1に対して使用した:1His標識を使用するORF1WO99/24578ORF1-Hisに従って;2それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まないORF1ORF1F;および3E.coliOmpA由来のリーダーペプチドMKKTAIAIAVALAGFATVAQAを含むORF1Orf1LOmpAこの構築物を作製するために、クローンpET911LOmpA以下を参照のことをNheIおよびXhoI制限酵素で消化し、そしてOmpAリーダー配列を有するベクターに対応するフラグメントを精製したpETLOmpA。成熟タンパク質をコードするORF1遺伝子をオリゴヌクレオチドORF1-ForおよびORF1-Revそれぞれ、NheIおよびXhoI制限酵素認識部位を含むを用いて増幅し、NheIおよびXhoIで消化し、そして精製されたpETOmpAフラグメントへライゲーションした図1を参照のこと。さらなるASジペプチドをNheI部位の側に導入した。タンパク質の全ての3つの型を発現させた。His標識化されたタンパク質を精製し得、そして暴露され、そして分泌される可能性がある表面として確認した図3を参照のこと。このタンパク質を、マウスを免疫化するために使用して、そして生じた血清は、殺菌性のアッセイにおいて優れた結果を与えた。ORF1LOmpAを全膜として精製し、そして膜の内側および外側の両方において局在化させた。予想外に、ORF1LOmpAに対して惹起された血清は、His標識化されたタンパク質に対して惹起した血清よりも、さらにより良いELISAおよび抗殺菌性の性質を示した。ORF1Lを、ORF1Lが局在している外膜として精製した。実施例7-タンパク質911およびそのリーダーペプチドN.meningitidis由来のタンパク質911血清群B、MC58株は、以下の配列を有する:リーダーペプチドに下線を引いている。3つの発現方法を911に対して使用した:1それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない911911L;2E.coliOmpA由来のリーダーペプチドを含む911911LOmpAこの構築物を作製するために、OmpAリーダーペプチドをコードする全体配列を5’プライマー中にテールとして含んだプライマー911LOmpAForward。NheI制限酵素認識部位を、OmpAリーダーペプチドをコードする配列と予想される成熟タンパク質をコードする911遺伝子との間に挿入し1つのアミノ酸セリンの挿入、この構築物の使用によりOmpAリーダーペプチド配列の下流の異なる遺伝子をクローン化を可能にした。3ErwiniacarotovoraPelB由来のリーダーペプチドMKYLLPTAAAGLLLAAQPAMAを含む911911LpelB。この構築物を作製するために、5’末端PCRプライマーをリーダー配列から下流に設計し、そしてPelBリーダー配列に対して直接的に融合される911を有するために、NcoI制限酵素認識部位を含め;3’末端プライマーに終止コドンを含めた。使用した発現ベクターはpET22bNovagenであり、これは、PelBリーダーペプチドについてのコード配列を有する。NcoI部位は、PelB配列の後に、さらなるメチオニンを導入する。タンパク質の全ての3つの型を発現させた。ELISA力価は911Lを用いた場合に最も高く、919LOmpAもまた良好な結果をもたらした。実施例8-ORF46N.meningitidis由来の完全なORF46タンパク質血清群B、2996株は、以下の配列を含む:リーダーペプチドに下線を引いている。他の株由来のORF46の配列は、WO00/66741中に見出され得る。3つの発現方法をORFに対して使用した:1それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まないORF46ORF46-2L;2リーダーペプチドを含まず、かついずれの融合パートナーも含まないORF46ORF46-2であって、以下の予想されるリーダー配列から下流に5’末端増幅プライマーを設計することによってリーダーペプチドが除かれた、ORF46:3最初の433アミノ酸ORF46.1Lからなる短縮型タンパク質として、aa1~433に対応する部分配列を増幅させるためのPCRプライマーを設計することによって構築した、ORF46。終止コドンを3’末端プライマー配列中に含めた。ORF46-2Lを、E.coliに対して非常に低いレベルで発現させた。このリーダーペプチドORF46-2の除去は、この問題を解決しない。しかしながら、短縮型ORF46.1L型血清群および種の間でよく保存されている最初の433アミノ酸は、良く発現し、そしてELISA試験および殺菌アッセイにおいて優れた結果を与える。ORF46.1をまた、ハイブリッドタンパク質の基礎として使用した。ORF46.1を287,919、およびORF1と融合させた。このハイブリッドタンパク質は、一般的に不溶性であるが、ELISAおよび殺菌性ホモログの2996株に対してのいくつかの良い結果を与えた:比較のために、ORF46.1、287GST融合としてか、またはΔG287型でのいずれかでおよび919の3重ハイブリッドを構築し、この3つの抗原の単一混合物に対比して、種々の株ホモログの2996株を含むに対して試験した。FCAをアジュバントとして使用した:さらに、このハイブリッドは、同等かまたは優れた免疫学的活性を示す。2つのタンパク質株2996のハイブリッドを、種々の異種株に対して、個々のタンパク質と比較した:さらに、このハイブリッドは、同等かまたは優れた免疫学的活性を示す。実施例9-タンパク質961N.meningitidis由来の完全な961タンパク質血清群B、MC58株は、以下の配列を含む:リーダーペプチドに下線を引いている。961発現に対して3つの方法を使用した:1GST融合を融合を用いる961WO99/57280に従うGST961;2それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない961961L;および3リーダーペプチドを含まず、かついずれの融合パートナーも含まない961961標識化されていないであって、以下の予想されるリーダー配列から下流に5’末端増幅プライマーを設計することによってリーダーペプチドが除かれた、961:このタンパク質の全ての3つの型を発現した。GST融合タンパク質を精製し得、そしてこれに対する抗体によって961が暴露された表面であることを確認した図4。マウスを免疫化するためにこのタンパク質を使用し、そして生じた血清は、殺菌アッセイにおいて優れた結果を与えた。961Lもまた精製しそして非常に高いELISA力価を得た。タンパク質961は、相変異phasevariableであるようである。さらに、このタンパク質は、N.meningitidisの全ての株において見出されない。実施例10-タンパク質287N.meningitidis血清群B、2996株のタンパク質287は、以下に示す配列を含む:リーダーペプチドに下線を引いている。他の株由来の287の配列は、WO00/66741の図5および図15中に見出され得る。WO99/57280の実施例9は、E.coli中でのGST融合として287の発現を開示する。E.coli中で287発現させる多くのさらなる方法を使用し、以下を含む:1His標識化された融合体としての287287-His;2それ自身のリーダーペプチドを含むがいずれの融合パートナーも含まない287287L;3PRF4リーダーペプチドを含みかついずれの融合パートナーも含まない287287LOrf4;および4リーダーペプチドを含まずかついずれの融合パートナーも含まない287287標識化されていない:これらの全てのタンパク質を発現および精製し得た。287Lおよび287LOrf4をリポタンパク質として確認した。図2に示すように、NdeIおよびXhoIを用いて919LOrf4を消化することによって、287LOrf4を構築した。287コード配列に融合された、5’末端プライマー287LOrf4中のテールとしての、欠損しているアミノ酸をコードするDNA配列の、添加によって、全体のORF4リーダーペプチドを修復した。成熟タンパク質をコードする287遺伝子を、オリゴヌクレオチド287LOrf4ForおよびRevそれぞれ、NdeI部位およびXhoI部位を含むを用いて増幅し、NdeIおよびXhoIで消化し、そして精製されたpETOrf4フラグメントにライゲーションした。実施例11-ネイティブなリーダーペプチドを含む/含まないさらなる非融合タンパク質WO99/24578、WO99/36544およびWO99/57280由来のさらなるタンパク質のE.coli発現について、同様の方法を採用した。以下は融合パートナーを含まずに発現された:008、105、117-1、121-1、128-1、148、216、243、308、593、652、726、982、およびOrf143-1。タンパク質117-1は、FACSによって暴露された表面として確認され、そして高いELISA力価を与えた。以下は、ネイティブなリーダーペプチドを含むが融合パートナーを含まずに発現された:111、149、206、225-1、235、247-1、274、283、286、292、401、406、502-1、503、519-1、525-1、552、556、557、570、576-1、580、583、664、759、907、913、920-1、926、936-1、953、961、983、989、Orf4、Orf7-1、Orf9-1、Orf23、Orf25、Orf37、Orf38、Orf40、Orf40.1、Orf40.2、Orf72-1、Orf76-1、Orf85-2、Orf91、Orf97-1、Orf119、Orf143.1。これらのタンパク質に接尾語Lを加えた。Hisタグ化されたタンパク質760を、リーダーペプチドを含むかまたは含まずに発現させた。シグナルペプチドの欠失は、発現レベルを大いに減少させた。このタンパク質は、可溶化のための2M尿素を使用して最も容易に精製され得た。Hisタグ化されたタンパク質264は、それ自身のシグナルペプチドを用いて良好に発現し、その30kDaタンパク質はウェスタンブロットの陽性な結果を与えた。全てのタンパク質は、首尾よく発現した。593、121-1、128-1、593、726、および982の細胞質内の局在を確認した。920-1L、953L、ORF9-1L、ORF85-2L、ORF97-1L、570Lおよび580Lおよび664Lのペリプラズム中の局在を確認した。ORF40Lの外膜中の局在、および内膜中の008および519-1Lの局在を確認した。ORF25L、ORF4L、406L、576-1Lは全て、膜に局在することものとして確認された。タンパク質206は、リポタンパク質でないことが見出された。ORF25およびORF40はネイティブリーダーペプチドを含むが、融合パートナーを含まずに発現し、そしてタンパク質593は、そのネイティブリーダーペプチドを含まずかつ融合パートナーも含まずに発現し、良い抗細菌血清によって惹起された。驚くべきことに、ORF25およびORF40の形態は、融合タンパク質を含まずに発現し、そしてそれ自身のリーダーペプチドすなわちORF25LORF40Lを使用することで、細菌性アッセイにおいて融合タンパク質よりも良い結果を与えた。タンパク質920Lおよび953LをN末端配列決定にかけ、それぞれHRVWVETAHおよびATYKVDEYHANARFAFを得た。この配列決定によって、予想されるリーダーペプチドが開裂されたことを確認し、そしてペリプラズム位置で結合される場合、ネイティブリーダーペプチドから発現されるとき、このタンパク質がE.coliによって正しくプロセスおよび局在化されることを確認した。内膜に局在しているタンパク質519.1LのN末端配列は、MEFFIILLAであり、リーダー配列が開裂されていないことを示した。それゆえ、未開裂のリーダー配列および膜透過アンカーの両方として、N.gonorrhoeae由来のPBP1のリーダーペプチドト同様の様態で、機能し得る[RoppおよびNicholas1997L.Bact.179:2783-2787.]。実際に、N末端領域は、強い疎水性の特徴を示し、そしてTmpred.プログラムによって、膜貫通であることが予想される。実施例12-リポタンパク質組換えリポタンパク質中のパルミチン酸塩の結合を、Kreftら、[J.Bact.1998180:3441-3447.]の方法によって、実証した。目的のプラスミドを内部に含む単一コロニーを、一晩中、37°Cで、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中で、増殖させた。この培養液を、5.0mlの新しい培地LB/Amp培地5μC/ml[3H]パルミチン酸塩Amershamを含む中で、0.1のOD500になるまで希釈した。培養物のOD500が0.4~0.8に達した時に、組換えリポタンパク質を、IPTG終濃度1.0mMを用いて1時間誘導した。細菌を、卓上遠心機の中で、2700gで15分間遠心分離することによって回収し、そして、1.0ml氷冷PBSで2回洗浄した。細胞を120μlの20mMTris-HCLpH8.0、1mMEDTA、1.0w/vSDS中へ再懸濁し、10分間煮沸することによって破砕した。13000gで10分間遠心分離した後、上清を回収し、そして1.2mlの氷冷アセトンを添加しそして1時間-20°Cで静置することによって、タンパク質を沈殿させた。タンパク質は、13000gで10分間遠心分離することによってペレットを形成し、そして20~50μl培養液の終濃度によって負荷量を標準化するように計算されるの1.0w/vSDSに再懸濁した。15μlのアリコートを5μlのSDS-PAGEサンプル緩衝液と共に煮沸し、そしてSDS-PAGEによって分析した。電気泳動ゲルを10v/v酢酸中で1時間固定化した後、増幅溶液Amersham中で30分間浸した。このゲルを熱の下で減圧乾燥し、そしてハイパーフィルムKodakに-80°Cで一晩中暴露した。脂質化lipidationを確実にする、[3H]パルミチン酸塩標識の結合を、以下のタンパク質について見出した:Orf4L、Orf25L、287L、287LOrf4、406.L、576L、926L、919Lおよび919LOrf4。実施例13-287中のドメイン異なる機能クラスに属するタンパク質に対する287の異なる領域の相同性に基づいて、図5に示されるような3つのドメイン分けられる。2番目のドメインは、IgAプロテアーゼに対して相同性を示し、3番目のドメインは、トランスフェリン結合タンパク質に対して相同性を示す。3つのドメインの各々は、N.meningitidis株との間で、異なる程度の配列保存性を示し、ドメインCは98同一、ドメインAは83同一、一方ドメインBはわずかに71同一である。株MC58中のタンパク質287は、株2996のタンパク質287よりも61アミノ酸長い。2つの配列の整列は、図7に示され、そして種々の株についての整列は、WO00/66741中に開示されている本明細書中の図5および図15を参照のこと。3つのドメインをC末端でHisタグ化されたタンパク質として、個々に発現させた。これを、以下の構築物を使用して、MC58株および2996株に対して行った:287a-MC58aa1-202、287b-MC58aa203-288、287c-MC58aa311-488。287a-2996aa1-139、287b-2996aa140-225、287c-2996aa250-427。これらの構築物を作製するために、終止コドン配列を3’末端プライマー配列中から除いた。NdeI-XhoI、NheI-XhoI、またはNdeI-HindIII制限酵素認識部位を使用して、それぞれの増幅されるフラグメントを、発現ベクターpET19bへクローン化するために、5’プライマーはNheI制限酵素認識部位を含み、そして3’プライマーはXhoIをテールとして含んだ。全ての6つの構築物を発現させたが、287b-MC8は、可溶化のための変性および再折り畳みリフォールディングを必要とした。ドメインAの欠失を以下に記載するΔ4287-His。また、2996株由来の種々のドメインを使用して、MenAF6124株およびMenC株BZ133株と同様に、同種および異種のMenB株に対して、免疫学的データ血清殺菌性アッセイを得た:株MC58のドメインを使用して、以下の結果が得られた:。実施例14-287における欠失個々のドメインを発現することと同様に、第1のドメイン内の漸進的欠失を作製することによって、287をまた発現したC末端Hisタグタンパク質として。菌株2996由来のタンパク質287のこれらの4つの欠失変異体を使用した図6:1アミノ酸18-427すなわち、リーダーペプチドが欠失したからなる287-His;2アミノ酸26-427からなるΔ1287-His;3アミノ酸70-427からなるΔ2287-His;4アミノ酸107-427からなるΔ3287-His;および5アミノ酸140-427=287-bcからなるΔ4287-His;Δ4タンパク質はまた、菌株MC58Δ4287MC58-His;aa203-488について作製した。この構築物を、上記のように、287a/b/cと同じ様式で、作製した。全ての6つの構築物は発現され得、そして、タンパク質は精製され得る。しかし、287-Hisの発現は、非常に乏しかった。発現はまた、C末端Hisタグが省略された場合に、非常に高かった。相同なMenB菌株2996および異種MenB菌株、ならびにMenAF6124菌株およびMenCBZ133菌株に対する、免疫学的データ血清殺菌性アッセイをまた、欠失変異体を使用して得た:Δ4欠失についての同じ高い活性は、菌株MC58に由来する配列を使用して、見られた。従って、より優れた発現特徴を示すと同様に、この変異体は、免疫学的に等価または優れている。実施例15-ポリグリシン欠失以前の実施例のΔ1287-His構築物は、短いN末端欠失GGGGGGSによってのみ、287-Hisおよび287未標識と異なる。しかし、欠失したセリンをNheクローニング部位に存在するコドンで置換する発現ベクターを使用することは、Gly6のみの欠失と等しい。従って、このGly6配列の欠失は、タンパク質発現に対して劇的な効果を有することを示している。GGGGGGまでのN末端アミノ酸を欠失しているタンパク質は、ΔG287と呼ばれる。菌株MC58において、その配列リーダーペプチドは下線を引かれているは、以下のようである:ΔG287Hisタグを有するまたは有さないそれぞれ、ΔG287-HisおよびΔG287Kは、287-Hisまたは287未標識と比較して、非常に良好なレベルで発現される。遺伝子可変性データに基づいて、ΔG287-Hisの改変体を多数のMenB菌株由来特に菌株2996、MC58、1000、およびBZ232由来のE.coli中で発現した。結果はまた良好であった。ポリGly欠失が、発現を改善するための一般的なストラテジーであり得ることが仮定された。従って、同様のGlynモチーフN末端の近く、システインの下流を含む他のMenBリポタンパク質主に、Tbp2NMB0460、741NMB1870および983NMB1969が同定された:Tbp2遺伝子および741遺伝子は菌株MC58由来であった;983遺伝子および287遺伝子は、菌株2996由来であった。これらは、pETベクター中にクローン化され、そして、それらのリーダー配列ペプチドについてコードする配列なしで、またはΔG形態共にC末端Hisタグに融合されるとして、E.coli.中で発現される。各場合において、同じ効果ポリグリシンストレッチの欠失を保有するクローンにおいて、発現は、良好であったが見られ、そして、グリシンが発現されたタンパク質に存在する場合、発現は乏しいかまたは存在しなかった。タンパク質のSDS-PAGEを図13に示す。ΔG287およびハイブリッドΔG287タンパク質を、菌株MC58、1000およびBZ232について作製および精製した。これらの各々は、高いELISA力価を与え、そしてまた、8192を超える血清殺菌性力価を与えた。ΔG287KpET-24bから発現されるは、ELISAおよび血清殺菌性アッセイにおいて優れた力価を与えた。ΔG287-ORF46.1Kはまた、pET-24bにおいて、発現され得る。ΔG287はまた、919、953、961配列は以下に示されるおよびORF46.1の上流でインフレームで、直接融合された。ハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌性効力相同な菌株を、919およびORF46.1についての成分抗原287-GSTを使用するの簡単な混合物に対して惹起された抗体と比較した:異種MenB菌株に対する、ならびに血清型AおよびCに対する殺菌性活性についてのデータをまた得た:従って、N末端にΔG287を有するハイブリッドタンパク質は、簡単な混合物より免疫学的に優れており、ΔG287-ORF46.1は、異種菌株に対してでさえ、特に効果的である。ΔG287-ORF46.1Kは、pET-24b中で発現され得る。同じハイブリッドタンパク質は、2996ではなく、ニュージーランド菌株394/98を使用して、作製した。ΔG983およびハイブリッドΔG983His融合物に応答して生成された殺菌性力価を、種々の菌株相同な2996菌株を含むに対して測定した:ΔG983はまた、そのC末端にORF46.1、741、961、または961cを有する、ハイブリッドとして発現された。ΔG741およびハイブリッドΔG741His融合物に応答して生成された殺菌性力価を、種々の菌株相同な2996菌株を含むに対して測定した:見られ得るように、ΔG741誘導性抗殺菌性力価は特に、異種菌株MC58に対して特に高かった。ΔG741はまた、タンパク質961、961c、983およびORF46.1の上流にインフレームで直接融合された。実施例16-287/ΔG287とのC末端融合物ハイブリッド本発明に従って、2つのタンパク質ABのハイブリッドは、NH2-A-B-COOHまたはNH2-B-A-COOHのいずれかであり得る。この差異の影響を、919、953およびORF46.1に対するタンパク質287のC末端287-His形態でまたはN末端ΔG287形態-上に示される配列のいずれかを使用して調査した。相同菌株2996を含む、菌株のパネルを使用した。FCAをアジュバントとして使用した:より良い殺菌性力価は、一般に、N末端でΔG形態で287を使用して見られる。タンパク質961[NH2-ΔG287-961-COOH-上に示される配列]に融合される場合、得られたタンパク質は不溶性であり、そして精製のために変性および再生されなければならない。再生に従って、約50のタンパク質が、不溶性のままであることが見出された。可溶性および不溶性タンパク質を比較し、そして、はるかに高い殺菌力価が、可溶性タンパク質アジュバントとしてのFCAを用いて得られた:しかし、不溶性形態を用いる力価は、代わりにミョウバンアジュバントを使用することによって改善した。実施例17-287へのN末端融合物ハイブリッドC末端Hisタグを有するか、またはそのリーダーペプチドは有さないが、C末端Hisタグを有する全長としてのタンパク質287の発現は、かなり低い発現レベルを与える。より良好な発現は、N末端GST融合を使用して達成される。N末端融合パートナーとしてGSTを使用することに対する代替として、287を、タンパク質919919-287、タンパク質953953-287およびタンパク質ORF46.1ORF46.1-287のC末端に配置した。両方の場合において、リーダーペプチドを欠失させ、ハイブリッドは、直接インフレーム融合物であった。953-287ハイブリッドを生成するために、2つのタンパク質のリーダーペプチドを、各配列のリーダーから下流の順方向プライマーを設計することによって除外した;停止コドン配列を953逆方向プライマーでは除外したが、287逆方向プライマーには含まれた。953遺伝子について、増幅に使用される5’および3’プライマーは、それぞれNdeIおよびBamHI制限部位を含み、故に、287遺伝子の増幅のために5’および3’プライマーは、それぞれBamHIおよびXhoI制限部位を含んだ。この方法において、NdeI-BamHI第一の遺伝子をクローン化するためにそしてこれに引続いてBamHI-XhoI第二の遺伝子をクローン化するためにを使用して、pET21bにおける2つの遺伝子の配列指向性クローニングを達成し得た。919-287ハイブリッドを、287の成熟部分をコードする配列をpET21b中の919-Hisクローンの3’末端でXhoI部位にクローニングすることによって得た。287遺伝子の増幅に使用されるプライマーを、PCRフラグメントの5’末端でSalI制限部位を、そしてPCRフラグメントの3’末端でXhoI制限部位を導入するために設計した。SalIおよびXhoI制限酵素によって生成された結合性の末端は適合性であるので、SalI-XhoIで消化された287PCR産物は、XhoIで切断したpET21b-919クローン中に挿入され得た。ORF46.1-287ハイブリッドを同様にして得た。ハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌効果相同菌株を、成分抗原の単純な混合物に対して惹起された抗体と比較した:異種MenB菌株ならびに血清型AおよびCに対する殺菌活性データをまた、919-287および953-287について得た:ORF46.1および919のハイブリッドをまた構築した。最良の結果4倍高い力価が、N末端での919で達成された。ハイブリッド919-519His、ORF97-225Hisおよび225-ORF97Hisをまた試験した。これらは、中程度のELISA力価fitreおよび殺菌性抗体応答を与えた。実施例18-ORF4由来のリーダーペプチド上に示されるように、ORF4のリーダーペプチドを他のタンパク質例えば、タンパク質287および919の成熟配列へ融合し得る。このことは、E.coliにおける脂質化を指向し得る。実施例19-564中のドメインタンパク質564は、非常に大きく2073aa、そして完全な形態でそれをクローン化および発現することが困難である。発現を容易にするために、このタンパク質を図8に示すように4つのドメインに分けたMC58配列に従う:これらのドメインは、以下の相同性を示す:ドメインAは、他の細菌性毒素に対して相同性を示す:ドメインBは、相同性を示さず、564に特異的である。ドメインCは、以下に相同性を示す:ドメインDは、他の細菌性毒素に対して相同性を示す:gb|AAF84955.1|AE004032_14HA-likesecrectedproteinXylellafastidiosa29MC58菌株配列を使用して、564abの良好な細胞内発現をGST融合物精製なしおよびhisタグ化タンパク質の形態で得た;このドメイン対をまたリポタンパク質として発現した。このリポタンパク質は、膜外/上清画分で中程度の発現を示した。bドメインは、his-タグ化タンパク質精製なしとして発現された場合に、中程度の細胞内発現、およびGTS-融合物として良好な発現を示した。cドメインは、GST-融合物として良好な細胞内発現を示したが、不溶性であった。dドメインは、his-タグ化生成物精製なしとして中程度の細胞内発現を示した。cdタンパク質ドメイン対は、GTS融合物として中程度の細胞内発現を示した精製なし。良好な殺菌性アッセイ力価を、cドメインおよびbc対を使用して観察した。実施例20-919リーダーペプチド919由来の20マーリーダーペプチドが、上の実施例1で論じられる:MKKYLFRAALYGIAAAILAA実施例1で示されるように、このリーダーの欠失は、ORF4リーダーペプチドと置換される場合のように、異種発現を改善する。発現に対する919リーダーの影響を、MorganellaMorganii由来のPhoCレセプター遺伝子にコード配列を融合することによって調査したThallerら1994Microbiology140:1341-1350。構築物をNdeIとXhoI部位の間のpET21-bプラスミド中にクローン化した図9:このプラスミドからのPhoCの発現レベルは、同じ構築物ではあるがネイティブなPhoCシグナルペプチドを含む構築物について見出された発現レベルよの200分の1未満である。同じ結果が、T7プロモーターをE.coliPlacプロモーターで置換した後でさえ得られた。このことは、発現に対する919リーダー配列の影響が、使用されるプロモーターに依存しないことを意味する。観察された結果が、919シグナルペプチドヌクレオチド配列のいくつかの特性二次構造の形成、RNAaseへの感受性などに起因するか、またはこのシグナルペプチドの存在によって誘導されるタンパク質の不安定性に起因するか否かを調査するために、多くの変異体を作製した。使用されるこのアプローチは、縮重コドンを含む合成リンカーをクローニングすることによる919シグナルペプチド配列のヌクレオチド置換であった。この方法においては、変異体をヌクレオチドおよび/またはアミノ酸置換によって得た。2つの異なるリンカーを使用して、最初の19塩基対L1中および塩基20~36S1の間に919シグナルペプチド配列の2つの異なる領域における変異を作製するように設計した。得られた変異体のいくつかのアラインメントを以下に示す。配列アラインメントに示されるように、分析されたほとんどの変異体は、宿主細胞により予想外に生成されたインフレーム欠失を含む。変異体の選択を、L1およびS1の変異クローンの混合物から調整されたDNAでE.coliBL21DE3を形質転換することによって行った。単一の形質転換体を、100μg/mlアンピシリン、50μg/mlメチルグリーン、1mg/mlPDPフェノールフタレインジホスフェートを含むLBプレートに単一形質転換体を描画することによって、高いPhoC活性についてスクリーニングした。この培地上でPhoC産生細胞は、緑色になる図10。これらの変異体によって生成されたPhoCの定量分析を、pNPPをPhoC活性の基質として使用する液体培地中で実施した。液体培地中で0、30、90、180分間増殖した細胞抽出物および変異体上清中で測定された比活性は以下であった:細胞抽出物上清変異体のいくつかは、大量のPhoCを生成し、特に変異体9L1aは、培養培地中にPhoCを分泌し得る。これは、この変異体のシグナルペプチド配列が、たった9アミノ酸長であるので、注目すべきである。これは、今日までに記載された最も短いシグナルペプチドである。実施例21-Maf関連タンパク質のC末端欠失MafB関連タンパク質として730、ORF46およびORF29が挙げられる。MC58由来の730タンパク質は、以下の配列を有する:リーダーペプチドを下線で示す。730は、ORF46と同様の特徴を示す上の実施例8を参照のこと:-Orf46に関しては、MenB、MenAおよび淋菌の間の730配列の保存は、N末端部分でのみ高い>80。~340からのC末端は、高度に相違している。-その予測される二次構造は、この分子の中心領域aa.227~247にわたる疎水性セグメントを含む。-E.coli中の全長遺伝子の発現は、非常に低いタンパク質収率を与える。シグナルペプチド配列を除外したタグ化または非タグ化構築物からの発現は、宿主細胞に対して毒性効果を有する。言い換えると、細胞質中の全長成熟タンパク質の存在は、宿主細胞に対して高度に毒性であるが、一方、周辺質への移行シグナルペプチドによって媒介されるは細胞の生存度への検出可能な影響を有さない。リーダーのない730の発現についてのクローンが、recAの遺伝的背景E.coli菌株:クローニングについてHB101;発現についてHMS174DE3を使用して非常に低い頻度でしか得られ得ないために、730のこの細胞内毒性は特に高い。この毒性を克服するために、ORF46について実施例8に記載されたアプローチと同様のアプローチを730について使用した。4つのC末端短縮形態を得、そのそれぞれを十分に発現する。すべてを、His-タグ化したリーダーのない730の細胞内発現から得た。形態Aは、成熟タンパク質aa.28~226のN末端親水性領域から構成される。これを、予測されたよりも大きなMWを有する可溶性Hisタグ化産物として精製した。形態Bは、血清型aa.28~340間で保存された領域の末端まで伸長する。これを不溶性Hisタグ化産物として精製した。C1およびC2と命名されたC末端が短縮された形態を、菌株HMS174DE3中で高レベルの730-Hisクローンを発現するクローンについてのスクリーニングの後に得た。簡単には、全長成熟730タンパク質をコードするHisタグ化配列を含むpET21bプラスミドを使用して、recA菌株HMS174DE3を形質転換した。形質転換体を低頻度で得た。これは、2つの表現型を示した:大きなコロニーおよび非常に小さなコロニー。いくつかの大きいコロニーおよび小さなコロニーを730-Hisクローンの発現について分析した。大きなコロニー由来の細胞のみが、抗730A抗体によって認識されるタンパク質を過剰発現した。しかし、異なるコロニーで過剰発現されたタンパク質は、異なる分子質量を示した。2つのクローンの配列決定は、両方の場合において、E.coliIS配列の組込みが、730のC末端領域をコードする配列内に生じたことを明らかにした。この2つの組込み事象は、C1の場合において1つの付加コドン、そしてC2の場合において12の付加コドンを有するインフレーム融合物を精製した図11。生じた730の変異形態は、以下の配列を有する:挿入によって生成された付加アミノ酸を下線で示す。挿入によって生成された付加アミノ酸を下線で示す。結論として、730-C1形態の細胞内発現は、非常に高いレベルのタンパク質を与え、そして宿主細胞に対して毒性作用を有さないが、ネイティブなC末端の存在は毒性である。これらのデータは、730の細胞内毒性がタンパク質のC末端の65アミノ酸と結合することを示唆する。ORF29の最初の231アミノ酸または368アミノ酸への等価な短縮を、リーダーペプチドアミノ酸1~26;欠失は、細胞質発現を与えるを用いてかまたはリーダーペプチドなしで、およびHisタグ化を用いてまたはHisタグなしでの発現を使用して実施した。実施例22-961中のドメイン上の実施例9に記載されるように、961のGST融合物は、E.coliで最も良好に発現した。発現を改善するために、タンパク質をドメインに分けた図12。961のドメインを、YadAYersiniaによって生成される付着因子、これは、表面の突起を作製するオリゴマーを形成する細菌表面上に局在化される付着因子であることが実証されているHoiczykら2000EMBOJ19:5989~99に基づいて設計し、これらは:リーダーペプチド、ヘッドドメイン、コイル状コイル領域茎、および膜アンカードメインである。これらのドメインを、リーダーペプチドを用いて、または用いずに発現し、そして必要に応じてC末端HisタグまたはN末端GSTのいずれかに融合した。961の異なるドメインを発現するE.coliクローンを、一晩o/n培養物から、またはIPTGで3時間インキュベーションした後の、発現されたタンパク質の生成および局在化についてのSDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって分析した。結果は以下である:この結果は、E.coliにおける以下のことを示す:961-Lは、外膜で高度に発現されそして局在化される。ウエスタンブロット分析によって、2つの特異的結合が検出された:1つは、~45kDa予測された分子量および1つは~180kDaであり、このことは、961-Lがオリゴマーを形成し得ることを示す。さらに、これらの凝集物は、一昼夜の培養物IPTG誘導なしにおいてより発現される。このクローンのOMV調製物を使用してマウスを免疫化し、そして血清を得た。一昼夜培養物主にオリゴマー形態を使用して、その血清は殺菌性であった;IPTG誘導化培養物主に単量体は、殺菌性ではなかった。961Δ1-Lアンカー領域における部分的な欠失を有するは、外膜で高度に発現され、そして局在化されるが、オリゴマーを形成しない;961c-Lアンカー領域なしは、可溶性形態で生成され、そして上清中に搬出される。ELISAでの力価およびHis-融合物を使用する血清殺菌性アッセイでの力価は以下のようであった:異なる形態の961を発現するE.coliクローン961、961-L、961Δ1-Lおよび961c-Lを使用して、961が接着因子YadAを参照のことであるか否かを調査した。接着アッセイを、aヒト内皮細胞およびb一晩培養物または3時間のIPTG誘導のいずれかの後のE.coliクローンを使用して実施した。一晩増殖した961-L961Δ1-LおよびIPTG誘導961c-L表面にタンパク質を発現するクローンは、ヒト内皮細胞に付着する。961cをまた、ハイブリッドタンパク質に使用した上記を参照のこと。961およびそのドメイン改変体は、効率的な発現を指向するので、それらは、理想的には、ハイブリッドタンパク質のN末端部分として適する。実施例23-さらなるハイブリッド本発明のさらなるハイブリッドタンパク質を、以下に示すまた図14も参照のこと。これらは、個々のタンパク質と比較した場合、有利である。本発明は、例示の目的でのみ記載されており、そして本発明の範囲および精神の範囲内にとどまったまま改変がなされ得るということが理解される。例えば、他の系統由来のタンパク質の使用が、予想される[例えば、ORF4、ORF40、ORF46、225、235、287、519、726、919および953の多型配列については、WO00/66741を参照のこと]。実験の詳細FPLCタンパク質の精製以下の表は、使用したFPLCタンパク質精製のまとめである:緩衝溶液は、20~120mMのNaCl、5.0mg/mlのCHAPSおよび10v/vグリセロールを含んだ。この透析液を、13000gで20分間遠心分離し、そして、モノQFPLCイオン交換樹脂またはモノSFPLCイオン交換樹脂のいずれかに適用した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的のタンパク質のpIおよびFPLCプロトコールマニュアル[Pharmacia:FPLCIonExchangeandChromatofocussing;PrinciplesandMethods.PharmaciaPublication]の推薦に従って選択した。タンパク質を、段階的NaCl勾配を使用して溶出した。精製物を、SDS-PAGEによって分析し、そしてタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。プロトコール列中の文字は、以下をいう:FPLC-A:クローン121.1、128.1、593、726、982、周辺タンパク質920Lおよびハイブリッドタンパク質919~287、953~287を、細胞の破壊の後に得られたE.coliの可溶化分画から精製した。目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中で、37°Cで一晩増殖させた。細菌を、1.0Lの新鮮な培地中で1:30に希釈し、そして30°Cまたは37°Cのいずれかで、OD550が0.6~0.8に達するまで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、1.0mMの最終濃度でIPTGを用いて誘導した。3時間のインキュベーションの後、細菌を、8000gで15分間、4°Cで遠心分離することで収集した。必要な場合、細胞を-20°Cで保存した。全ての一連の手順を、氷上または4°Cで行った。細胞質ゾルタンパク質121.1、128.1、593、726、および982ならびに周辺タンパク質920Lについて、細菌を、完全プロテアーゼインヒビターBoehringer-Mannheimを含有する25mlのPBSに再懸濁した。細胞を、BransonSonifier450を使用した超音波処理によって溶解した。分裂した細胞を、8000gで30分間遠心分離して、破壊されない細胞および封入体を沈降させ、そしてこの上清を3.9MNH42SO4の添加によって35v/v飽和にした。この沈殿物を、8000g、30分間で沈降させた。この上清を、3.9MNH42SO4の添加によって70v/vの飽和にし、そしてこの沈殿物を上記のように収集した。目的のタンパク質を含むペレットを、SDS-PAGEによって同定し、そして適切なイオン交換緩衝液以下を参照のことに対して6時間または一晩透析した。953Lを発現するE.coli由来の周辺分画を、Evansら、[Infect.Immun.197410:1010~1017]のプロトコールに従って調製し、そして適切なイオン交換緩衝液に対して透析した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的のタンパク質のpIおよびFPLCプロトコールマニュアルPharmaciaの推薦に従って選択した。緩衝溶液は、20mMのNaClおよび10v/vのグリセロールを含有した。この透析物を、13000gで20分間遠心分離し、そしてモノQFPLCイオン交換樹脂またはモノSFPLCイオン交換樹脂のいずれかに適用した。緩衝液およびイオン交換樹脂を、目的のタンパク質のpIおよびFPLCプロトコールマニュアルPharmaciaの推薦に従って選択した。タンパク質を、イオン交換樹脂から、段階的NaCl勾配または連続的NaCl勾配のいずれかを使用して溶出した。精製物を、SDS-PAGEによって分析し、そしてタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。周辺タンパク質のリーダーペプチドの切断を、NH2末端の配列決定によって実証した以下を参照のこと。FPLC-B:これらのタンパク質を、E.coliの膜分画から精製した。目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中で、37°Cで一晩増殖させた。細菌を、1.0Lの新鮮な培地中で1:30に希釈した。クローン406.1Lおよび919LOrf4を30°Cで、そしてOrf25Lおよび576.1Lを37°Cで、OD550が0.6~0.8に達するまで増殖させた。919LOrf4の場合、30°Cでの増殖が必須であった。なぜなら37°Cでの組換えタンパク質の発現は、細胞の溶解を生じたからである。組換えタンパク質の発現を、1.0mMの最終濃度でIPTGを用いて誘導した。3時間のインキュベーションの後、細菌を、8000gで15分間、4°Cで遠心分離することで収集した。必要な場合、細胞を-20°Cで保存した。全ての一連の手順を、4°Cで行った。細菌を、完全プロテアーゼインヒビターBoehringer-Mannheimを含有する25mlのPBSに再懸濁し、そしてFrenchPressを2~3回通過する浸透圧ショックによって溶解した。分解されない細胞を、5000gで15分間遠心分離することにより除去し、膜を100000gBeckmanTi50、38000rpmで45分間遠心分離して沈降させた。Dounceホモジナイザーを使用して、膜ペレットを、20mMのTris-HClpH8.0、1.0MのNaCl、および完全プロテアーゼインヒビターの7.5ml中に再懸濁した。この上清を24時間混合し、100000gで45分間遠心分離し、このペレットを20mMのTris-HClpH8.0、1.0MのNaCl、5.0mg/mlのCHAPS、10v/vのグリセロールおよび完全プロテアーゼインヒビターの7.5ml中に再懸濁した。この溶液を一晩混合し、100000gで45分間遠心分離し、この上清を6時間、適切に選択された緩衝液に対して透析した。Orf25.Lの場合、CHAPS抽出の後に得たこのペレットが、組換えタンパク質を含むことを見出した。この分画を、さらなる精製なしに、マウスを免疫化するために使用した。FPLC-C:FPLC-Aと同様であるが、しかし精製物は、細胞破壊の後よりもむしろ、ポリミキシンBを有するE.coliの透析の後に得た可溶化分画に由来した。FPLC-D:目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中で、37°Cで一晩増殖させた。細菌を、1.0Lの新鮮な培地中で1:30に希釈し、そして30°Cで、OD550が0.6~0.8に達するまで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、1.0mMの最終濃度でIPTGを用いて誘導した。3時間のインキュベーションの後、細菌を、8000gで15分間、4°Cで遠心分離することで収集した。必要な場合、細胞を-20°Cで保存した。全ての一連の手順を、氷上または4°Cで行った。細胞を、20mMのBicinepH8.5、20mMのNaCl、10v/vグリセロール、完全プロテアーゼインヒビターBoehringer-Mannheimに再懸濁し、BransonSonifier450を使用して破壊した。この超音波処理物を、8000gで30分間遠心分離して破壊されない細胞および封入体を沈降させた。この組換えタンパク質を、3.9MNH42SO4の添加によって、35v/vと70v/vとの間の飽和である溶液から沈殿した。この沈殿物を、8000g、30分間で沈降させ、20mMのBicinepH8.5、20mMのNaCl、10v/vグリセロールに再懸濁し、この緩衝液に対して6時間または一晩透析した。この透析物を13000gで20分間遠心分離し、そしてFPLC樹脂に適用した。このタンパク質を、カラムから段階的NaCl勾配を使用して溶出した。精製物を、SDS-PAGEによって分析し、そしてこのタンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。クローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチドの設計目的の抗原をコードする遺伝子を、N.meningitidisBMC58のゲノム配列に基いて設計したオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した。2996株からのゲノムDNAを、別段特定しなければ、常にPCRのテンプレートとして使用し、そして他の増幅したフラグメントを発現ベクターpET21bNovagenにおいてクローン化して、C末端のHisタグ産物としてこのタンパク質を発現させるか、またはpET-24Novagenにおいてクローン化して無タグ形態例えば、ΔG287Kとしてこのタンパク質を発現した。タンパク質を融合パートナーがなく、そしてもし存在する場合独自のリーダーペプチドを有して発現した場合、オープンリーディングフレームATG~終止コドンの増幅を実施した。タンパク質が、無タグ形態で発現された場合、このリーダーペプチドを、推定されたリーダーペプチドから下流の5’末端増幅プライマーを設計することにより、取り除いた。PCRで使用するプライマーの融点は、プライマー全体においてハイブリダイズするヌクレオチドの数と種類に依存し、以下の式によって決定した:Tm1=4GC2AT尾部排除Tm2=64.90.41GC-600/Nプライマー全体選択されたオリゴヌクレオチドの融点は、オリゴ全体に対して通常65~70°Cであり、そしてハイブリダイズする領域単独について50~60°Cである。オリゴヌクレオチドを、PrkinElmer394DNA/RNA合成機を使用して合成し、2.0mlのNH4OHでこのカラムから溶出し、そして56°Cで5時間のインキュベーションにより脱保護した。このオリゴを、0.3Mの酢酸ナトリウムと2容量のエタノールを添加することにより沈澱させた。この試料を遠心分離し、そしてこのペレットを水中に再懸濁した。このプライマーを、Hisタグに対する287の全てのC末端融合逆方向プライマーとして使用した。§278-Hisリバースプライマーと組合せて使用された順方向Forwardプライマー。NB-全PCR反応は、別段特定例えば、MC58株しない限り2996株を使用した。ATGで開始する全ての構築物は、特異なNheI部位の後に存在せず、ATGコドンはクローニング部位について使用したNdeI部位の一部である。5’端におけるクローニング部位としてNheIを使用して例えば、これら全てが、N末端に287を含んでいるをつくられたこの構築物は、抗原のコード配列に融合された2つのさらなるコドンGCTAGCを有している。染色体DNAテンプレートの調製N.meningitidis株2996、MC58、394.98、1000およびBZ232およびその他を、100mlのGC培地中で対数期まで増殖させ、遠心分離で回収し、そして5mlの緩衝液20w/vスクロース、50mMTris-HCl、50mMTris-HCl、50mMEDTA、pH8中に再懸濁した。氷上での10分間のインキュベーション後、細菌を10mlの溶解溶液50mMNaCl,1Na-Sarkosyl、50μg/mlProteinaseKの添加によって溶解し、そしてこの懸濁液を37°Cで2時間インキュベートした。2回のフェノール抽出pH8で平衡化および1回のCHCl3/イソアミルアルコール24:1抽出を実施した。DNAを、0.3M酢酸ナトリウムおよび2容量のエタノールを添加することによって沈澱させ、そして遠心分離によって収集した。このペレットを70v/vエタノールで1回洗浄し、4.0mlTE緩衝液10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8.0で再溶解した。DNAの濃度は、OD260を読取ることで測定した。PCR増幅標準PCRプロトコールは、以下のとおりであった:200ngの2996、MC581000、もしくはBZ232株由来のゲノムDNAまたは10ngの組換えクローンのプラスミドDNA調製物を、40μMの各オリゴヌクレオチドプライマー、400~800μMのdNTP溶液、1×PCR緩衝液1.5mMMgCl2を含む、2.5単位のTaqIDNAポリメラーゼPerkin-ElmerAmpliTaQ、BoerhingherMannheimExpandTMLongTemplateを使用するの存在下でテンプレートとして使用した。95°Cにて予め3分間の全混合物のインキュベーション後、各サンプルに、以下の二工程増幅を行った:最初の5サイクルを、プライマーの制限酵素テールを除くハイブリダイゼーション温度Tm1を使用して行った。これに続いて、全長オリゴについて算出したハイブリダイゼーション温度Tm2に従って30サイクル行った。伸長時間68°Cまたは72°Cで実施したを、増幅されるOrfの長さによって変化させた。Orf1の場合、伸長時間3分から開始するを、サイクル毎に15秒ずつ増加させた。これらのサイクルを、72°Cでの10分の伸長工程で完了させた。増幅したDNAを、1アガロースゲルに直接ロードした。正確なサイズのバンドに対応するDNAフラグメントを、QiagenGelExtractionKitを製造業者のプロトコルに従って使用し、ゲルから精製した。PCRフラグメントおよびクローニングベクターの消化増幅フラグメントに対応する精製DNAを、pET-21b、pET22bまたはpET-24bへのクローニングのために適切な制限酵素を用いて消化した。消化されたフラグメントを、QIAquickPCR精製キット製造業者の指示書に従ってを使用して精製し、そして、水または10mMのTris-HClpH8.5のいずれかを用いて溶出した。プラスミドベクターを、適切な制限酵素を用いて消化し、1.0アガロースゲルにロードし、そしてこの消化されたベクターに対応するバンドをQiagenQIAquickGelExtractionKitを使用して精製した。クローニング予め消化して、そして精製した各遺伝子に対応するフラグメントを、pET-21b、pET22bまたはpET-24bに連結した。モル比3:1のフラグメント/ベクターを、製造業者によって供給された連結緩衝液中でT4DNAリガーゼとともに使用した。リガーゼ反応溶液および細菌を40分間氷上でインキュベートし、次に、37°Cで3分間インキュベートして、組換えプラスミドをコンピテントE.coliDH5またはHB101中に形質転換した。これに続いて、800μlのLBブロスを添加して、37°Cで20分間インキュベートした。細胞を、Eppendorfの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、そして約200μlの上清に再懸濁して、LBアンピシリン100mg/ml寒天上にプレートした。組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択したコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを加えた4.0mlのLBブロス中で37°Cにて一晩増殖させることにより行った。次に、細胞をペレットにして、そしてプラスミドDNAをQiagenQIAprepSpinMiniprepKitを製造業者の指示書に従って使用して、抽出した。各々個々のミニプレップの約1μgを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして消化物を、1~1.5アガロースゲル予想されるインサートサイズに依存するに、分子量マーカー1kbDNALadder、GIBCOと並行してロードした。陽性クローンのスクリーニングを、インサートサイズに基づいて行った。発現発現ベクター中に各遺伝子をクローニングした後、組換えプラスミドを、組換えタンパク質産物の発現に適切なE.coli株中に形質転換した。1μlの各構築物を使用して、E.coliBL21-DE3を、上記のように形質転換した。単一の組換えコロニーを、Amp100μg/mlを加えた2mlのLBに接種し、37°Cで一晩でインキュベートし、次に、100mlのフラスコ中でAmp100μg/mlを加えた20mlのLB中に1:30で希釈し、OD600が0.1と0.2との間にした。これらのフラスコを、OD600が、発現の誘導に適切な指数増殖0.4~0.8ODを示すまで回転型水浴振とう機中で30°Cまたは37°Cでインキュベートした。タンパク質の発現を1.0mMIPTGの添加によって誘導した。30°Cまたは37°Cでの3時間のインキュベーションの後、OD600を測定し、そして発現を試験した。サンプルの最最終濃度を、ODによって確認した。1.0mlの各サンプルを微量遠心機において遠心分離し、そのペレットをPBS中に再懸濁してSDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって分析した。Gatewayクローニングおよび発現GATE標識された配列を、GATEWAYクローニング技術GIBCO-BRLを用いてクローニングし、そして発現させた。組換えクローニングRCは、E.coliゲノム中へのファージの組込みおよびE.coliゲノムからのファージの切り出し、それぞれを媒介する組換え反応に基づく。組込みは、細菌のゲノム中に位置するattB部位内へのファージDNAのattP部位の組換えBP反応を含み、そしてattL部位およびattR部位に隣接して組み込まれたファージゲノムを生成する。切り出しは、attP部位およびattB部位の後にattL部位およびattR部位を組換えるLR反応。組み込む反応は、2つの酵素[ファージタンパク質インテグラーゼIntおよび細菌タンパク質組込み宿主因子IHF]BPクロナーゼclonaseを必要とする。切り出し反応は、Int、IHF、およびさらなるファージ酵素、切り出し酵素XisLRクロナーゼを必要とする。25bpの細菌のattB組換え部位の人工誘導体B1およびB2と称されるを、ナイセリアのORFを増幅するPCR反応に用いられるプライマーの5’末端に付加した。得られた産物を、BPクロナーゼを用いて、ファージattP組換え部位P1およびP2の相補的誘導体を含むドナーDonorベクター中にBPクローニングした。得られた侵入entryクローンは、attL部位L1およびL2の誘導体に隣接するORFを含み、これらのクローンをLRクロナーゼを用いて、attL適合性attR部位R1およびR2の誘導体を含む発現目的destinationベクター中にサブクローニングした。これは、発現クローンを生じ、ここで、ORFは、B1およびB2に隣接し、そしてGSTまたはHisのN末端タグにインフレームで融合した。GATEWAY発現のために用いたE.coli株は、BL21-SIである。この株の細胞を、塩0.3MのNaClを含む培地中での増殖によってT7RNAポリメラーゼの発現を誘導する。ここで留意すべき点は、この系がN末端Hisタグを与えることである。膜タンパク質の調製内膜、外膜または全部の膜のいずれかから主に構成される画分を、膜局在化リーダー配列で発現された組換えタンパク質を得るために単離した。組換えタンパク質について富化された膜画分の調製のための方法を、Filipら[J.Bact.1973115:717-722]およびDaviesら[J.Immunol.Meth.1990143:215-225]から適応した。目的のプラスミドを保有する単一コロニーを、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中で37°Cにて一晩で増殖させた。細菌を、新鮮な培地1.0L中で1:30に希釈し、OD550が0.6~0.8に達するまで、30°Cまたは37°Cのいずれかで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、最終濃度1.0mMでIPTGを用いて誘導した。3時間インキュベート後、細菌を8000gで4°Cにて15分間遠心分離することによって収集し、そして20mlの20mMTris-HClpH7.5および完全プロテアーゼインヒビターBoehringer-Mannheimに再懸濁した。全ての引き続く手順を4°Cまたは氷上にて実施した。細胞を、BransonSonifier450を使用して超音波処理することにより破砕し、そして5000gで20分間遠心分離して破砕されていない細胞および封入体を沈降させた。この上清膜および細胞の残骸を含むを50000gBeckmanTi50、29000rpmで75分間遠心分離し、20mMのBis-trisプロパンpH6.5、1.0MのNaCl、10v/vグリセロールで洗浄し、そして50000gで75分間、再び沈降させた。このペレットを、20mMのTris-HClpH7.5、20v/vSarkosyl、完全プロテアーゼインヒビター1.0mMのEDTA、最終濃度に再懸濁し、そして20分間インキュベートして内膜を溶解した。細胞の残骸を、5000gで10分間遠心分離することによってペレットにし、そして上清を75000gBeckmanTi50、33000rpmで75分間遠心分離した。タンパク質008Lおよび519Lを上清中に見出した。このことは、内膜に局在化したことを示唆する。これらのタンパク質の代わりに内膜および全膜画分の両方上記のようにNaClで洗浄したを用いて、マウスを免疫した。75000gのペレットから得た外膜小胞を、20mMのTris-HClpH7.5で洗浄し、そして75000gで75分間または一晩遠心分離した。OMVを、500μlの20mMのTris-HClpH7.5、10v/vグリセロール中に最終的に再懸濁した。Orf1LおよびOrf40Lを、両方とも外膜の画分に局在化および富化させ、この画分を、マウスを免疫するために用いた。タンパク質濃度を、標準的BradfordアッセイBio-Radによって評価し、一方、内膜画分のタンパク質濃度を、DCタンパク質アッセイBio-Radを用いて決定した。単離手順からの種々の画分を、SDS-PAGEによってアッセイした。Hisタグ化タンパク質の精製287の種々の形態を2996株およびMC58株からクローニングした。それらを、C末端Hisタグ化融合体と構築し、成熟形態aa18~427、欠失Δ1、Δ2、Δ3およびΔ4を有する構築物およびBドメインまたはCドメインのいずれかから構成されるクローンを含んだ。His-融合体として精製した各クローンについて、単一のコロニーを画線し、LB/Amp100μg/ml寒天プレート上で37°Cにて一晩増殖させた。このプレートから単離したコロニーを、20mlのLB/Amp100μg/ml液体培地中に接種し、振とうさせながら37°Cにて一晩増殖させた。一晩の培養物を1.0LのLB/Amp100μg/ml液体培地中に1:30で希釈し、そして最適な温度30°Cまたは37°CにてOD550が0.6~0.8に達するまで増殖させた。組換えタンパク質の発現を、IPTG最終濃度1.0mMの添加によって誘導し、そして、培養物をさらに3時間インキュベートした。細菌を8000g、4°Cにて15分間の遠心分離によって収集した。細菌のペレットを、i可溶性タンパク質について、冷緩衝液A300mMのNaCl、50mMのリン酸緩衝液、10mMのイミダゾール、pH8.0、またはii不溶性タンパク質について、緩衝液B10mMのTris-HCl、100mMのリン酸緩衝液、pH8.8および、必要に応じて8Mの尿素のいずれか7.5mlに再懸濁した。可溶性形態で精製したタンパク質は、287-His、Δ1、Δ2、Δ3およびΔ4の287-His、Δ4の287MC58-His、287c-Hisならびに287cMC58-Hisを含んだ。タンパク質287bMC58-Hisは、不溶性であり、これをそれに応じて精製した。この細胞を、Bransonsonifier450を用いて、氷上で、30秒間、40Wで4回、超音波処理によって破砕し、そして13000×gで4°Cにて30分間、遠心分離した。不溶性タンパク質について、ペレットを、2.0mlの緩衝液C6Mの塩酸グアニジン、100mMのリン酸緩衝液、10mMのTris-HClpH7.5に再懸濁し、そしてDounceホモジナイザーの10パスで処理した。ホモジネートを13000gで30分間遠心分離し、そして上清を保持した。可溶性調製物および不溶性調製物の両方についての上清を、150μlのNi2樹脂適切なように、緩衝液Aまたは緩衝液Bのいずれかで予め平衡にしたと混合し、そして30分間、穏やかに撹拌しながら、室温でインキュベートした。この樹脂は、ChelatingSepharoseFastFlowPharmaciaであり、製造業者のプロトコルに従って調製した。回分式調製物を、700gで4°Cにて5分間遠心分離し、上清を捨てた。この樹脂を、2回回分式、10mlの緩衝液Aまたは緩衝液Bを用いて10分間洗浄し、1.0mlの緩衝液Aまたは緩衝液B中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、i4°Cにて緩衝液Aまたはii室温にて緩衝液Bのいずれかを用いて、流入のOD280が0.02~0.01に達するまで、洗い続けた。この樹脂を、i冷緩衝液C300mMのNaCl、50mMのリン酸緩衝液、20mMのイミダゾール、pH8.0またはii緩衝液D10mMのTris-HCl、100mMのリン酸緩衝液、pH6.3および、必要に応じて8Mの尿素のいずれかを用いて、流入のOD280が0.02~0.01に達するまで、さらに洗浄した。His-融合タンパク質を、i冷溶出緩衝液A300mMのNaCl、50mMのリン酸緩衝液、250mMのイミダゾール、pH8.0、またはii溶出緩衝液B10mMのTris-HCl、100mMのリン酸緩衝液、pH4.5および、必要に応じて8Mの尿素のいずれか700μlの添加によって溶出し、そしてOD280が全ての組換えタンパク質を得たことを示すまで画分を収集した。20μlの各溶出画分のアリコートをSDS-PAGEによって分析した。タンパク質濃度をBradfordアッセイを用いて評価した。変性したHis融合タンパク質の再生変性が、287bMC8を可溶化するために必要とされたので、再生工程を、免疫化の前に用いた。グリセロールを、上記で得た変性画分に添加して、10v/vの最終濃度にした。このタンパク質を、透析緩衝液I10v/vのグリセロール、0.5Mのアルギニン、50mMのリン酸緩衝液、5.0mMの還元型グルタチオン、0.5mMの酸化型グルタチオン、2.0Mの尿素、pH8.8を使用して200μg/mlになるまで希釈し、そして同じ緩衝液に対して、4°Cで12~14時間透析した。さらなる透析を、透析緩衝液II10v/vのグリセロール、0.5Mのアルギニン、50mMのリン酸緩衝液、5.0mMの還元型グルタチオン、0.5mMの酸化型グルタチオン、pH8.8に対して4°Cで12~14時間実施した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて評価した:タンパク質mg/ml=1.55×OD280-0.76×OD260アミノ酸配列分析タンパク質のNH2末端の自動化配列分析を、製造業者の勧告書に従って、オンラインフェニルチオヒダントイン-アミノ酸分析機器SystemGoldを備えたBeckmanシークエンサーLF3000で実施した。免疫化Balb/Cマウスを、抗原を用いて、0、21および35日目に免疫し、そして血清を49日目に分析した。血清分析-ELISAアッセイ無莢膜のacapsulatedMenBM7株およびカプセル化された株を、チョコレート寒天プレート上にプレートし、そして5CO2とともに37°Cで一晩インキュベートした。細菌のコロニーを寒天プレートから滅菌ドラコンdraconスワブを用いて収集し、そして0.25グルコースを含有するMueller-HintonブロスDifco中に接種した。細菌の増殖を30分毎に、OD620を追跡することによりモニターした。細菌をODが0.4~0.5の値に達するまで増殖させた。培養物を4000rpmで10分間遠心分離した。上清を捨て、そして細菌をPBSを用いて2回洗浄し、0.025のホルムアルデヒドを含有するPBS中に再懸濁し、そして37°Cで1時間インキュベートし、次いで4°Cにて一晩攪拌しながらインキュベートした。100μlの細菌細胞を、96ウェルGreinerプレートの各ウェルに添加し、そして4°Cで一晩でインキュベートした。次いでそのウェルをPBT洗浄緩衝液PBS中の0.1Tween-20を用いて3回洗浄した。200μlの飽和緩衝液水中の2.7のポリビニルピロリドン10を各ウェルに添加し、そしてプレートを37°Cで2時間インキュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。200μlの希釈血清希釈緩衝液:PBS中に1BSA、0.1Tween-20、0.1NaN3を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを37°Cで2時間インキュベートした。ウェルをPBTで3回洗浄した。希釈緩衝液中に1:2000に希釈した100μlのHRP結合体化ウサギ抗マウスDako血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを37°Cで90分間インキュベートした。ウェルを、PBT緩衝液で3回洗浄した。HRPに対する100μlの基質緩衝液25mlのクエン酸緩衝液pH5、10mgのO-フェニルジアミンおよび10μlのH2O2を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを室温で20分間放置した。100μlの12.5H2SO4を各ウェルに添加し、そしてOD490を追跡した。ELISAの力価を、免疫前の血清のレベルを超える0.4のOD490値を与える血清の希釈として任意に算出した。0.4のOD490を有する血清の希釈が、1:400より高い場合、ELISAが陽性であるとみなした。血清分析-FACSScan細菌結合アッセイ無莢膜MenBM7株をチョコレート寒天プレートにプレートし、そして5CO2とともに37°Cで一晩インキュベートした。細菌のコロニーを寒天プレートから滅菌ドラコンdraconスワブを用いて回収し、そして0.25グルコースを含有する8mlの各Mueller-HintonブロスDifcoを含む4本のチューブに中に接種した。細菌の増殖を30分毎に、OD620を追跡することによりモニターした。細菌を、ODが0.35~0.5の値に達するまで増殖させた。培養物を10分間4000rpmで遠心分離した。上清を捨て、ペレットをブロッキング緩衝液PBS中1BSA、0.4NaN3中に再懸濁し、そして5分間4000rpmで遠心分離した。細胞をOD620が0.05に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。100μlの細菌細胞を、Costar96ウェルプレートの各ウェルに添加した。100μlの希釈1:100、1:200、1:400血清ブロッキング緩衝液中を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを4°Cで2時間インキュベートした。細胞を5分間4000rpmで遠心分離し、その上清を吸引し、そして各ウェルに200μl/ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、細胞を洗浄した。100μlのR-フィコエリトリン結合体化Fab2ヤギ抗マウス1:100希釈を各ウェルに添加し、そしてプレートを1時間4°Cでインキュベートした。細胞を、4000rpmで5分間の遠心分離によって遠心沈殿させ、そして200μl/ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、洗浄した。その上清を吸引し、そして細胞を200μl/ウェルのPBS、0.25のホルムアルデヒドに再懸濁した。そのサンプルをFACScanチューブに移して、そして読み取った。FACScanレーザーパワー15mW設定の条件は、以下のとおりであった:FL2オン;FSC-H閾値:92;FSCPMT電圧:E01;SSCPMT:474;増幅器ゲイン6.1;FL-2PMT:586;補正値:0。血清分析-殺菌性アッセイN.meningitidis株2996をチョコレート寒天プレート上で、5CO2とともに37°Cで一晩増殖させた凍結ストックから開始した。コロニーを回収し、そしてこれを用いて、0.25のグルコースを含有する7mlのMueller-Hintonブロスに接種して、OD620が0.05~0.08に達した。この培養物を、OD620の値が0.23~0.24に達するまで、振とうしながら37°Cにて約1.5時間インキュベートした。細菌を、105のCFU/mlの作業希釈で10mMのMgCl2、10mMのCaCl2および0.5w/vBSAを含有する50mMのリン酸緩衝液pH7.2アッセイ緩衝液中に希釈した。最終反応混合物の全容量は、25μlの連続2倍の希釈の試験血清、作業希釈での12.5μlの細菌、12.5μlの乳仔ラビット補体最終濃度25を有する50μlであった。コントロールは、補体血清とともにインキュベートした細菌、細菌および56°Cにて30分間加熱することによって不活化された補体とともにインキュベートした免疫血清を含んだ。乳仔ウサギ補体の添加直後に、10μlのコントロールを、傾斜法tiltmethodを用いてMueller-Hinton寒天プレート上にプレートした時間0。96ウェルプレートを、37°Cにて1時間回転させながらインキュベートした。7μlの各サンプルを、Mueller-Hinton寒天プレート上に斑点状にプレートしたのに対して、10μlのコントロールを、傾斜法を用いて、Mueller-Hinton寒天プレート上にプレートした時間1。寒天プレートを、37°Cにて18時間インキュベートし、時間0および時間1に対応するコロニーを計数した。血清分析-ウェスタンブロットMenB株2996由来の精製タンパク質500ng/レーン、外膜小胞5μgおよび全細胞抽出物25μgを、12SDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜に転写した。この転写を、2時間、150mA、4°Cにて転写緩衝液0.3のTrisベース、1.44のグリシン、20v/vメタノールを用いて行った。この膜を飽和緩衝液PBS中の10のスキムミルク、0.1のTritonX100中での4°Cの一晩のインキュベーションにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液PBS中の3のスキムミルク、0.1のTritonX100を用いて2回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に1:200に希釈したマウス血清とともに、37°Cにて2時間インキュベートした。この膜を2回洗浄し、そして1:2000希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgとともに90分間インキュベートした。この膜をPBS中の0.1TritonX100を用いて2回洗浄し、そしてOpti-4CN基質キットBio-Radを用いて、発色させた。この反応を水を添加して停止させた。OMVを以下のように調製した:N.meningitidis株2996を、5つのGCプレート上で5CO2とともに37°Cで一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして10mlの20mMTris-HClpH7.5、2mMのEDTA中に再懸濁した。熱不活化を56°Cにて45分間行い、そして細菌を5分間氷上で超音波処理することにより破砕した50の衝撃係数、50の出力、Bransonsonifier3mmmicrotop。破砕されなかった細胞を5000g、10分間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を含む上清を回収し、そしてさらに50000g、4°Cにて一晩遠心分離した。膜を含むペレットを、2サルコシル、20mMのTris-HClpH7.5、2mMのEDTA中に再懸濁し、そして室温で20分間インキュベートして、内膜を可溶化した。この懸濁液を、10000gで10分間遠心分離し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに50000gで3時間、遠心分離して、このペレット外膜を含むをPBSで洗浄し、そして同じ緩衝液中に再懸濁した。タンパク質濃度を、D.C.Bio-RadProteinアッセイ改変されたLowry法によって、BSAを標準物として用いて測定した。全細胞抽出物を以下のように調製した:N.meningitidis株2996を、GCプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして1mlの20mMTris-HCl中に再懸濁した。熱不活化を56°Cにて30分間行った。961ドメインの研究細胞画分の調製961の種々のドメインを発現するE.coliクローンの全溶解物、ペリプラズム、上清およびOVMを、一晩培養した細菌かまたはIPTGを用いた誘導から3時間後の細菌を用いて調製した。簡潔には、ペリプラズムを、100μg/mlのポリミキシンpolimixineを有する25サッカロースおよび50mMのTrispH8中に細菌を懸濁することで得た。室温にて1時間後、細菌を13000rpmで15分間遠心分離し、そしてその上清を収集した。培養物上清を、0.2μmでろ過し、そして氷中にて2時間50TCAを用いて沈澱させた。遠心分離13000rpmにて30分間後ペレットを70エタノールで2回リンスし、そしてPBS中に懸濁した。OMV調製を既に記載したように実施した。各細胞画分をSDS-PAGEまたはGST-961に対して惹起されるポリクローナル抗血清を用いてウェスタンブロットで分析した。接着アッセイChang上皮細胞Wong-Kilbourne誘導体、クローン1-5c-4、ヒト結膜を、10の熱不活性化FCS、15mMのL-グルタミンおよび抗生物質を補給したDMEMGibco中に扶養した。接着力アッセイについて、サブコンフルエントな培養物のChang上皮細胞を、PBSでリンスし、そしてトリプシン-EDTAGibcoを用いて処理してプラスチックの支持体からこれらの細胞を剥離した。次いで、これらの細胞を、PBS中に懸濁し、計数し、そして5×105細胞/mlとなるまでPBS中に希釈した。一晩培養した細菌またはIPTGを用いて誘導した後の細菌を、ペレット化し、そして13000で5分間遠心分離することによってPBSで2回洗浄した。約2~3×108cfuを0.5mg/mlのFITCSigmaとともに1mlの緩衝液50mMのNaHCO3および100mMのNaClpH8を含む中で、暗下で室温にて30分間インキュベートした。FITC標識した細菌を2~3回洗浄し、そしてPBS中に1~1.5×109/mlで懸濁した。200μlのこの懸濁液2~3×108を、37°Cにて30分間、200μl1×105の上皮細胞とともにインキュベートした。次いで、細胞を、2000rpmで5分間遠心分離して非接着細菌を除去し、200μlのPBS中に懸濁し、FACScanチューブに移し、そして読み取った。"