"a5’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、bアルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列と、c5’から3’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター-IRES-目的の異種核酸NOIであるカセットと、d3’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸とを含む組換えレプリコン核酸。前記bの核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3およびnsp4をコードする連続ヌクレオチド配列である、請求項1に記載の組換えレプリコン核酸。前記bの核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1、nsp2およびnsp3をコードする連続ヌクレオチド配列であり、前記組換えレプリコン核酸は、前記bの核酸と連続していないアルファウイルス非構造タンパク質nsp4をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1に記載の組換えレプリコン核酸。前記IRESエレメントは、細胞IRES、植物IRES、哺乳動物ウイルスIRES、合成IRESおよび昆虫ウイルスIRESからなる群より選択される、請求項1~3のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。前記cのアルファウイルスサブゲノムプロモーターは、最小または修飾アルファウイルスサブゲノムプロモーターである請求項請求項1~4のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。前記cの異種NOIは、タンパク質、ペプチド、免疫原、アンチセンス配列、またはリボザイムをコードする請求項1~5のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。前記アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列、前記aの核酸配列、前記bの核酸配列、前記cの核酸配列、および前記dの核酸配列の1つ以上が、シンドビスSindbisウイルス、SFV、VEE、S.A.AR86ウイルス、ロスリバーRossRiverウイルス、EEEおよびWEEからなる群より選択されるアルファウイルス由来である、請求項1~7のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。前記核酸がRNAである、請求項1~8のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。前記核酸がDNAである、請求項1~8のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。弱毒化突然変異を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。a5’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、bアルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列と、c5’から3’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター-IRES-NOIである第1のカセットと、d5’から3’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター-IRES-NOIである第2のカセットと、e3’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸とを含む組換えレプリコン核酸。アルファウイルスパッケージングシグナルをさらに含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸。感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団であって、各粒子が請求項1~13のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸を含む集団。前記集団が、細胞培養上での継代によって測定されるような、検出可能な複製コンピテントウイルスを有していない、請求項14に記載の感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団。医薬上許容される担体中に請求項14または15に記載の前記集団を含む医薬組成物。請求項1~13のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸を含むアルファウイルス粒子。弱毒化突然変異を含む、請求項17に記載のアルファウイルス粒子。a5’アルファウイルス複製認識配列と、b5’から3’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター-IRES-NOIであるカセットと、ここで、前記NOIは1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、c3’アルファウイルス複製認識配列とを含む組換え核酸。請求項19に記載の核酸を含む細胞。感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に以下の、i請求項1~13のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸と、iiアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸と、ここで、前記1つ以上のヘルパー核酸は、前記アルファウイルス構造タンパク質の全部を生成し、を導入するステップと、b前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップとを含む方法。前記組換えレプリコン核酸は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む請求項21に記載の方法。前記ヘルパー核酸は、5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および3’アルファウイルス複製認識配列を含む組換え核酸である、請求項21に記載の方法。前記ヘルパー核酸は、プロモーターと1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸である、請求項21に記載の方法。前記ヘルパー核酸はDNAである請求項24に記載の方法。前記プロモーターはCMVプロモーターである請求項25に記載の方法。前記ヘルパー核酸は、前記アルファウイルス構造タンパク質の全部をコードするヌクレオチド配列を含む請求項24に記載の方法。前記ヘルパー核酸は、5’アルファウイルス複製認識配列、IRESエレメント、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および3’アルファウイルス複製認識配列を含む組換え核酸である、請求項21に記載の方法。感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に、i5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする1つ以上の核酸配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、異種核酸配列および3’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレプリコンRNAと、ii請求項19に記載の組換え核酸を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸とを導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が前記細胞内で生成されるステップと、b前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップとを含む方法。感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に、i請求項1~13のいずれか1項に記載の組換えレプリコン核酸と、ii請求項19に記載の組換え核酸を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸とを導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が前記細胞内で生成されるステップと、b前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップとを含む方法。請求項21~28または30のいずれか1項に記載された方法により産生された、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子。本発明は、IRESエレメントの指令下でキャップ構造非依存性メカニズムを介してタンパク質翻訳レベルでの1つ以上の異種核酸配列の発現を制御するために組み換えられたアルファウイルスレプリコンおよびヘルパーベクターを提供する。1つの実施形態では、本発明は、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも1つの第2核酸配列と、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも1つのIRESエレメントと、少なくとも1つの異種核酸と、3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、および該レプリコンが粒子内にパッケージングされるのを許容するアルファウイルスパッケージングシグナルと、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。他の実施形態では、本発明は、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、IRESエレメントと、1つもしくは2つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、を含む組み換えヘルパー核酸を提供する。本明細書では、さらにまた本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンRNAを含むアルファウイルス粒子が提供される。また別の実施形態において、本明細書では感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団が提供されるが、各粒子は本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンRNAを含有する。一部の実施形態では、本発明は感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団を提供するが、各粒子は本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンRNAを含有し、そして該集団は細胞培養上の継代によって測定されるように、検出可能な複製コンピテントウイルスreplication-competentvirusを有していない。特定の実施形態では、本発明の粒子は1つ以上の弱毒化突然変異を含有していてよい。さらに、医薬上許容される担体中に本発明の粒子および集団を含む医薬組成物が含まれる。他の実施形態では、本発明は、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞集団内にi本発明の組み換えレプリコン核酸と、iiアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸であって、該アルファウイルス構造タンパク質の全部が細胞内で提供されるヘルパー核酸とを導入するステップと、およびb該細胞集団内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法を提供する。本発明の方法は、該細胞から前記アルファウイルス粒子を収集するステップをさらに含むことができる。一部の実施形態では、本発明のヘルパー核酸はさらにまた本発明の組み換えレプリコン核酸であってよい。例えば、本発明の組み換え核酸は、異種核酸として、および/または異種核酸に加えて、1つのアルファウイルス構造タンパク質または1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。そのような実施形態では、該組み換えレプリコン核酸は、他のヘルパー核酸および/または本発明の他の組み換え核酸と一緒に該細胞内に存在しうる組み換えレプリコンヘルパー核酸であると考えられる。そこで、特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸はさらに1つのアルファウイルス構造タンパク質または2つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をさらにコードする。この組み換えレプリコン核酸は、該組み換えレプリコン核酸および1つ以上の該ヘルパー核酸がアルファウイルス構造タンパク質の全部を生成し、そして該組み換えレプリコン核酸が前記細胞内の粒子内にパッケージングされるように、1つ以上のヘルパー核酸と一緒に細胞集団内に導入できる。さらに、被験者において免疫反応を誘導する方法であって、本発明の免疫原性量の核酸、ベクター、粒子集団および/または組成物を該被験者に投与するステップを含む方法が提供される。また別の実施形態では、本発明は、核酸の転写を指令するプロモーターと;IRESエレメントと;およびコード配列を含む核酸と、を含む組み換え核酸であって、IRESエレメントが、コード配列の翻訳がIRESエレメントによって指令されるキャップ構造非依存性メカニズムを介して発生するが、キャップ構造依存性メカニズムを介して発生しないように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。本明細書で使用する1つのおよびそのは、それが使用される状況に応じて、1つまたは2つ以上を意味することがある。例として、1つの細胞は、1つの細胞または複数の細胞を意味することができる。そして1つの異種核酸は1つの異種核酸または複数の異種核酸を意味することがある。本発明は、核酸の転写および核酸の翻訳を分離することができるという驚くべき予想外の発見に基づいている。そこで、1つの実施形態では、本発明は、転写を指令するプロモーターと、IRESエレメントと、およびコード配列と、を含み、このとき該IRESエレメントが、コード配列の翻訳がIRESエレメントによって指令されるキャップ構造非依存性メカニズムを介して発生するが、キャップ構造依存性メカニズムを介して発生しないように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。本発明のためには、用語転写は、それ自体がRNA分子であってよい組み換えレプリコン核酸のアルファウイルスサブゲノムプロモーターからのRNAの生成を含む。すなわち、本発明の組み換えレプリコンRNA分子上のサブゲノムプロモーターは、異種NOIをコードするメッセンジャーRNAの転写を指令できる。これとは別に、組み換えレプリコン核酸は複製することができる、すなわち5’複製認識配列から3’複製認識配列までをコピーすることができる。他の実施形態では、本発明は、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも1つの第2核酸配列と、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも1つのIRESエレメントと、少なくとも1つの異種核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。特定の実施形態では、該組み換えレプリコン核酸は、該レプリコンが粒子内にパッケージングされるようにアルファウイルスパッケージングシグナルをさらに含む。さらにまた別の実施形態では、該組み換えレプリコン核酸は、IRESエレメントの上流に位置していてよいスペーサー核酸配列を含むことができる。様々な実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸のエレメントは本明細書に記載した順番で存在してよい、および/またはあらゆる順番で存在してよいと理解されている。そこで例えば、1つの実施形態では、本発明は以下の順序で、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも1つの第2核酸配列と、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも1つのIRESエレメントと、少なくとも1つの異種核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。本明細書で使用するように、5’アルファウイルス複製認識配列および3’アルファウイルス複製認識配列は、アルファウイルスゲノムの複製を制御する5’および3’配列5’および3’の記号表示はアルファウイルス核酸におけるそれらの位置を表しているである。特定の実施形態では、5’および3’アルファウイルス複製認識配列の片方または両方は、アルファウイルスゲノムの複製におけるそれらの機能が無傷で残っていることを前提に、いずれの末端でも切断することができる。同様に本明細書に記載するように、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも1つの第2核酸配列には、少なくとも1つ、およびもしかすると2つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列が含まれる。例えば、本発明の第2核酸配列は、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1、nsp2、nsp3およびnsp4をコードする連続ヌクレオチド配列、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1、nsp2およびnsp3をコードする連続ヌクレオチド配列、アルファウイルス非構造タンパク質nsp2、nsp3およびnsp4をコードする連続核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1およびnsp2をコードする連続核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp3およびnsp4をコードする連続核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp2およびnsp3をコードする連続核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1をコードする核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp2をコードする核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp3をコードする核酸、アルファウイルス非構造タンパク質nsp4をコードする核酸、および/または組み換えレプリコン核酸がnsp1、nsp2、nsp3およびnsp4の全部をコードするヌクレオチド配列を含むようなあらゆる組み合わせおよび/またはその順序であってよい。特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸は、該組み換えレプリコン核酸がnsp1、nsp2、nsp3およびnsp4の全部をコードするヌクレオチド配列を含むように、1つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸をあらゆる組み合わせおよび相互に対してあらゆる場所で含んでいてよい。例えば、本発明の組み換えレプリコン核酸は、以下の順序で、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質nsp1、nsp2およびnsp3をコードする第2核酸配列と、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも1つのIRESエレメントと、少なくとも1つの異種核酸と、アルファウイルス非構造タンパク質nsp4をコードするまた別の第2核酸配列と、および3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、を含んでいてよい。同様に本明細書で使用するように、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、サブゲノムプロモーター、または26Sプロモーターは、正常なアルファウイルス複製プロセスにおいてサブゲノムメッセージの転写を指令する、アルファウイルスゲノム内に存在するプロモーターである。アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、当分野において知られている方法によって、例えば、最小のアルファウイルスサブゲノムプロモーターを生成するために切断できる、および/またはその活性が低下する、維持される、または増加するように修飾することができる。本発明の組み換え核酸は、本明細書に記載したように、そして当分野において周知のように、キャップ構造非依存性メカニズムを介してタンパク質内への核酸の翻訳を指令する、内部リボソームエントリー配列IRESエレメントを含むことができる。特に本発明の組み換えレプリコン核酸では、翻訳レベルでの核酸発現の制御は、内部リボソームエントリー部位IRESをアルファウイルス26Sサブゲノムプロモーターの下流および翻訳されるコード配列の上流へ導入するステップによって遂行される。IRESエレメントは、それがmRNAの翻訳を指令し、それによってサブゲノムmRNAの5’末端キャップに存在するメチル-7-グアノシン5’pppN構造からのmRNAの翻訳の開始を最小限に抑える、制限するまたは防止するように配置される。このIRES指令キャップ構造非依存性翻訳は、複製および転写を変化させるであろうアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子の重大な修飾を必要としない、または生じさせない。ゲノム複製またはサブゲノム転写を変調させる例、阻害する、覆す、混乱させる、中断させる、増加させる、増強する、減少させる、最小限に抑えることなく異種核酸の発現レベルを制御するために設計されたアルファウイルスベクターは、以前のベクターデザインより優れたいくつかの長所を有している。第一に、ゲノム複製を変調させると、粒子内にパッケージングするために利用できるゲノムRNAの数を制限することによってVRP生成にマイナスの影響を及ぼすことができる。第二に、26Sプロモーターを変化させること例えば、切断、欠失、付加および/または置換によってサブゲノム転写を変調させると、ゲノムRNA複製を変化させることができ、同様に粒子内へパッケージングするために利用できるゲノムRNAの数の制限を生じさせる。第三に、アルファウイルス複製は、mRNAのキャップ構造依存性翻訳の減少を生じさせることのできる細胞内のストレス反応を誘導する。アルファウイルスサブゲノムmRNAのキャップ構造依存性翻訳からIRESエレメントによって提供されるキャップ構造非依存性メカニズムへの切り替えは、このNOI発現へのマイナスの影響を最小限に抑える。本発明のIRESエレメントには、ピコルナウイルス、例えばポリオウイルスPVもしくはヒトエンテロウイルス71、例えばその7423/MS/87株およびBrCr株由来;脳心筋炎ウイルスEMCV由来;口蹄疫ウイルスFMDV由来;フラビウイルス、例えばC型肝炎ウイルスHCV由来;ペスチウイルス、例えば古典的ブタコレラウイルスCSFV由来;レトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルスMLV由来;レンチウイルス、例えばサル免疫不全ウイルスSIV由来のウイルスIRESエレメント;翻訳開始因子、例えばeIF4GもしくはDAP5;転写因子、例えばc-MycYangandSarnow,NucleicAcidsResearch25:2800-28071997もしくはNF-κB抑制因子NRF由来;成長因子、例えば血管内皮成長因子VEGF、線維芽細胞成長因子FGF-2および血小板由来成長因子BPDGFB由来;ホメオティック遺伝子、例えばアンテナペディアAntennapedia由来;生存タンパク質、例えばアポトーシスのX連鎖阻害剤XIAPもしくはApaf-1由来;シャペロン、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質BiPMartinez-Salasetal.,JournalofGeneralVirology82:973-984,2001由来などの細胞mRNAIRESエレメント、植物ウイルス由来、ならびに現在知られている、もしくは後になって同定されるいずれか他のIRESエレメントを含むことができるが、それらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のIRESエレメントは、例えば、脳心筋炎ウイルスEMCV、GenBankアクセッション番号NC001479、コオロギ麻痺病ウイルスGenBankアクセッション番号AF218039、ショウジョウバエDrosophilaCウイルスGenBankアクセッション番号AF014388、チャバネアオカメムシPlautiastali腸管ウイルスGenBankアクセッション番号AB006531、ムギクビレアブラムシRhopalosiphumpadiウイルスGenBankアクセッション番号AF022937、ヒメトビHimetobiPウイルスGenBankアクセッション番号AB017037、急性ハチ麻痺病ウイルスGenBankアクセッション番号AF150629、Blackqueen細胞ウイルスGenBankアクセッション番号AF183905、サシガメTriatomaウイルスGenBankアクセッション番号AF178440、エンドウヒゲナガアブラムシAcyrthosiphonpisumウイルスGenBankアクセッション番号AF024514、感染性軟化病ウイルスGenBankアクセッション番号AB000906、および/またはサックブルードSacbroodウイルスGenBankアクセッション番号AF092924から誘導することができる。さらに、本発明は、天然型IRESエレメントの機能を模倣するために当分野において知られている方法Chappelletal.,ProcNatlAcadSciUSA.2000974:1536-41を参照によって設計できる合成IRESエレメントを提供する。特定の実施形態では、IRESエレメントは、本発明の組み換えアルファウイルス粒子をパッケージングするために選択された特定ヘルパー細胞系において機能的である昆虫IRESエレメントまたは他の非哺乳動物IRESエレメントであってよいが、標的宿主細胞内では機能的ではない、または最小限に機能的であろう。昆虫ウイルスIRESエレメントは昆虫細胞内で最適に機能するように進化してきており、同様に哺乳動物ウイルスIRES配列は哺乳動物細胞内で最適に機能する。そこで、翻訳の制御は、昆虫ウイルス特異的IRESエレメントをレプリコンRNA内に挿入することによってレプリコンベクターシステムに導入できる。この方法で、レプリコンベクターからの異種NOIの翻訳は、哺乳動物細胞内では調節する弱毒化することができ、昆虫細胞内では増強することができる。これは、パッケージング細胞にとって毒性、またはアルファウイルスパッケージングプロセスにとって有害のどちらかであるそれらのNOIのために有用である。この作用を達成するためのまた別の方法は、昆虫細胞培養系内にパッケージングされるレプリコンベクター内の哺乳動物IRESエレメントを使用し、それによってさらにパッケージング中に発生する可能性のある異種NOIの重大な翻訳を回避する方法である。特定の仮説または理論に固執せずとも、細胞因子および培養環境は、IRESの活性および機能において何らかの役割を果たす可能性がある。このため、同一細胞内の相違するIRES種の追加のレベルの制御/調節は所定の細胞因子の供給/除去を通して、または第2のIRESに比較して1つのIRESへの翻訳を優先的に指令する培養環境例、温度における変化によって達成され得ると予想される。一部の実施形態では、ヘルパーもしくはパッケージング細胞系の細胞環境は、IRESの特異的活性が増強する、または低下するように変化させることができる。典型的には、IRESエレメントは、eIF-2αキナーゼのレベル上昇がキャップ構造依存性翻訳の減少およびIRES構造依存性翻訳/活性における逆増加を生じさせる細胞ストレス条件下で機能するように進化してきた。そのような条件は、選択されたIRESエレメントからの発現を増加させることができるように、低酸素、低体温、栄養/アミノ酸飢餓、ERストレス誘導例えば、タプシガルギンThapsigarginを用いる、インターフェロンもしくはPKRエレメントの誘導例えば、ポリICを用いる、tRNA依存型合成の遮断例えばエデインEdeineを用いる、または過酸化水素およびソルビトールを含むがそれらに限定されない当分野において知られている他の一般的細胞ストレッサーを含むがそれらに限定されない方法を含む様々な方法によって細胞パッケージングシステム内で人工的に誘導できる。他の実施形態では、NOIのIRESエレメント指令翻訳は、例えば当分野において知られていて本明細書に記載された多数の標準方法によってパッケージング細胞内にトランスフェクトできる、または形質導入する/一過性に発現させることができるIRESエレメント/スペーサもしくはNOIに対して特異的なアンチセンスsiRNAを使用することで変調させることができる。また別の実施形態として、NOIの発現はさらにまたリガンド結合対、例えば核酸エレメントと分子すなわちリガンドを使用することによっても変調させることができる例えば、米国特許第6,242,259号を参照されたい。このため、本発明は、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする1つ以上の第2核酸配列と、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも1つのIRESエレメントと、リガンドによって結合されるとサブゲノムRNAの転写および/またはIRESからの翻訳を変化させる非アルファウイルスヌクレオチド配列と、少なくとも1つの異種核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸と、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。特定の実施形態として、該リガンドはRNA結合タンパク質例、R17コートタンパク質、アンチセンス配列、色素例、ヘキスト色素H33258もしくはH3342、および/または抗生物質例、トブラマイシンもしくはカナマイシンであってよい。これらは当業者に知られている方法によってパッケージング細胞内に導入できる、またはパッケージング細胞内で生成できる米国特許第6,242,259号を参照。本発明の状況の中で利用されるように、アルファウイルスサブゲノムプロモーターもしくはIRESの近位に位置する非アルファウイルスヌクレオチド配列へのリガンド結合の作用に起因するサブゲノムRNAの転写の減少、またはIRESによって指令されたNOIの翻訳の減少は、選択されたリガンドの存在下では転写または翻訳各々のいずれかの統計的に有意な減少を意味すると理解すべきである。一部の実施形態では、細胞内でのサブゲノムRNAの転写もしくはIRES指令NOI翻訳のいずれかのレベルは、結合リガンドの存在を伴わない場合のレベルに比較して少なくとも25、50、75、もしくは90、または3倍、5倍、もしくは10倍減少させられる。例えばレポーター遺伝子の酵素アッセイ、ノーザンブロット、代謝性RNA標識化などを含む当分野において知られている極めて様々なアッセイを利用すると、転写または翻訳のレベル減少を評価することができる。本発明の組み換えレプリコン核酸は1つ以上のIRESエレメントを含むことができ、そして2つ以上のIRESエレメントを含む実施形態では、IRESエレメントは同一であってよい、またはいずれかの順序および/または組み合わせで相違していてもよい。特定の実施形態では、組み換えレプリコン核酸は、各カセット内のプロモーター、IRESおよび異種NOIが相違していても同一であってもよい2つ以上のプロモーター-IRES-異種NOIカセットを含むことができる。あるいはまた、組み換えレプリコン核酸は2つ以上のNOIをコードしていてもよいが、それらの一方はプロモーター-IRESカセットによって制御されるが、他方の1つ以上のNOIはサブゲノムプロモーター単独またはIRES単独によって制御することができる。本発明の異種核酸は、野生型アルファウイルスのゲノム内には存在しない、および/または野生型アルファウイルスのゲノム内で本発明の組み換えレプリコン核酸内に存在する順序と同一順序では存在しない核酸である。例えば、特定の実施形態では、本発明の異種核酸は1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質例、C、PE2/E2、E1、E3、6Kおよび/または異種核酸に加えて1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードすることができる。本発明の組み換えレプリコン核酸が1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含む場合は、組み換えレプリコン核酸は本明細書に記載するように感染性の複製欠損アルファウイルス粒子のアッセンブリー内の組み換えレプリコンヘルパー核酸として機能することができる。本発明の異種核酸は、抗原、免疫原、もしくは免疫原性ポリペプチドもしくはペプチド、融合タンパク質、融合ペプチド、癌抗原などであってよいがそれらに限定されないタンパク質またはペプチドをコードすることができる。本発明の異種核酸によってコードされるタンパク質および/またはペプチドの例には、被験者を微生物症、細菌症、原虫症、寄生虫症、およびウイルス疾患を含むがそれらに限定されない疾患から保護するために適合する免疫原性ポリペプチドおよびペプチドが含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、例えば、異種核酸によってコードされるタンパク質もしくはペプチドはオルトミクソウイルス免疫原例、インフルエンザウイルスヘマグルチニンHA表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルスタンパク質もしくはペプチドなどのインフルエンザウイルスタンパク質、またはパラインフルエンザウイルス免疫原、またはメタ肺炎ウイルス免疫原、またはRSrespiratorysyncytialウイルス免疫原、またはライノウイルス免疫原、レンチウイルス免疫原例えば、ウマ感染性貧血ウイルスタンパク質もしくはペプチド、サル免疫不全ウイルスSIVタンパク質もしくはペプチド、またはHIVもしくはSIVエンベロープGP160タンパク質、HIVもしくはSIVマトリックス/キャプシドタンパク質、およびHIVもしくはSIVgag、polおよびenv遺伝子産物などのヒト免疫不全ウイルスHIVタンパク質もしくはペプチドであってよい。タンパク質もしくはペプチドは、さらにまたアレナウイルス免疫原例えば、ラッサLassa熱ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルスタンパク質もしくはペプチド、ピコルナウイルス免疫原例えば、口蹄疫ウイルスタンパク質もしくはペプチド、ポックスウイルス免疫原例えば、ワクシニアL1もしくはL8タンパク質などのワクシニアタンパク質もしくはペプチド、オルビウイルス免疫原例えばアフリカウマ病ウイルスタンパク質もしくはペプチド、フラビウイルス免疫原例えば、黄熱ウイルスタンパク質もしくはペプチド、西ナイルウイルスタンパク質もしくはペプチド、または日本脳炎ウイルスタンパク質もしくはペプチド、フィロウイルス免疫原例えば、エボラウイルスタンパク質もしくはペプチド、またはNPおよびGPタンパク質などのマールブルクMarburgウイルスタンパク質もしくはペプチド、ブンヤウイルス免疫原例えば、RVFV、CCHF、およびSFSタンパク質もしくはペプチド、またはコロナウイルス免疫原例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルスタンパク質もしくはペプチド、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルスタンパク質もしくはペプチド、またはニワトリ伝染性気管支炎ウイルスタンパク質もしくはペプチドであってよい。本発明の異種核酸によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドは、さらにまたポリオ抗原、ヘルペス抗原例、CMV、EBV、HSV抗原、流行性耳下腺炎抗原、麻疹抗原、風疹抗原、水痘抗原、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア抗原、百日咳抗原、肝炎例、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、もしくはE型肝炎抗原、または当分野において知られている他のワクチン抗原であってよい。本明細書で使用する免疫反応を誘導するおよび被験者を免役化するには、被験者における本発明のタンパク質および/またはポリペプチド例えば、免疫原、抗原、免疫原性ペプチド、および/または1つ以上のエピトープに対する体液性および/または細胞性免疫反応の発生が含まれる。体液性免疫反応という用語は、当分野において周知のように、抗体を含む免疫反応を意味するが、他方細胞性免疫反応という用語は、当分野において周知のように、T-リンパ球および他の白血球を含む免疫反応、特にHLA拘束細胞溶解性T細胞、すなわちCTLによる免疫原特異的反応を意味する。細胞性免疫反応は、処理された免疫原、すなわちペプチド断片が、2つの一般的タイプであるクラスIおよびクラスIIの主要組織適合性複合体MHCHLAタンパク質と一緒に提示されたときに発生する。クラスIHLA拘束CTLは、一般的に9merのペプチドに結合し、細胞表面上でそれらのペプチドを提示する。HLAクラスI分子の状況におけるこれらのペプチド断片は、Tリンパ球上の特異的T細胞受容体TCRタンパク質によって認識され、T細胞の活性化を生じさせる。この活性化は、細胞毒性もしくはアポトーシス事象、または非破壊的メカニズムの活性化、例えばインターフェロン/サイトカインの生成を直接的に通してHLA-ペプチド複合体を有する細胞の破壊を結果として生じさせる特異的T細胞サブセットへの拡大を含むがそれに限定されない多数の機能的転帰を生じさせる可能性がある。クラスIMHCタンパク質を介する免疫原の提示は、典型的にはCD8CTL反応を刺激する。細胞性免疫反応のまた別の態様は、それらの表面上のMHC分子との関連においてペプチド断片を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性を刺激して集中させるヘルパーT細胞の活性化を含むHLAクラスII拘束T細胞反応を含む。少なくとも2つのタイプのヘルパー細胞:サイトカインであるインターロイキン2IL-2およびインターフェロン-γを分泌するTヘルパー1細胞Th1ならびにサイトカインであるインターロイキン4IL-4、インターロイキン5IL-5、インターロイキン6IL-6およびインターフェロン10IL-10を分泌するTヘルパー2細胞Th2が認識される。クラスIIMHCタンパク質を介しての免疫原の提示は、典型的にCD4CTL反応、ならびに抗体反応をもたらすBリンパ球の刺激を誘導する。本明細書で使用する免疫原性ポリペプチド、免疫原性ペプチド、または免疫原には、被験者において免疫反応を誘導するあらゆるペプチド、タンパク質またはポリペプチドが含まれ、特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは被験者に疾患に対するある程度の保護を提供するために適切である。これらの用語は、用語抗原と互換的に使用できる。特定の実施形態では、本発明の免疫原は1つ以上のエピトープを含んでいてよい、本質的に1つ以上のエピトープから構成されてよい、または1つ以上のエピトープから構成される。エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に含まれる1セットのアミノ酸残基である。T細胞の状況において、エピトープはT細胞受容体タンパク質および/またはMHC受容体による認識のために必要なアミノ酸残基セットであると定義されている。免疫系のインビボまたはインビトロ状況においては、エピトープは、免疫グロブリン、T細胞受容体および/または受容体および/またはHLA分子によって認識される部位を一緒に形成する一次、二次および/または三次ペプチド構造、および/または電荷などの分子の集合的機能を意味する。B細胞抗体エピトープの場合は、典型的には最小3~4個のアミノ酸、好ましくは少なくとも5個の、およそ50個までのアミノ酸である。好ましくは、体液性反応誘導性エピトープは5から30個のアミノ酸、通常は12から25個のアミノ酸、および最も一般的には15から20個のアミノ酸である。T細胞エピトープの場合は、1つのエピトープは少なくとも約7~9個のアミノ酸、およびヘルパーT細胞エピトープの場合は少なくとも約12~20個のアミノ酸を含む。典型的には、そのようなT細胞エピトープは約7から15個のアミノ酸、例えば7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15個のアミノ酸を含むであろう。本発明は、被験者において免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させるため例、ワクチン接種のため、または免疫療法のため例、癌もしくは腫瘍を有する被験者を治療するために使用できる。そこで、ワクチンの場合は、本発明はそれによって、本発明の免疫原性量の核酸、粒子、集団および/または組成物を被験者に投与するステップを含む、被験者において免疫反応を誘導する方法を提供する。さらにまた、本発明の核酸、粒子、集団および医薬組成物は被験者内の細胞であってよい細胞へ目的のNOIを送達する方法において使用できると考えられている。そこで、本発明は有効量の本発明の核酸、粒子、集団および/または組成物を細胞内へ導入するステップを含む異種核酸を送達する方法を提供する。さらにまた、有効量の本発明の核酸、粒子、集団および/または組成物を被験者へ送達するステップを含む、被験者内の細胞へ異種核酸を送達する方法が提供される。そのような方法は、周知の遺伝子療法のプロトコールによって、本発明の細胞および/または被験者に治療作用を与えるために使用できる。本発明の被験者には、温血動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタ、ラット、およびマウスが含まれるが、それらに限定されない。本発明の様々な組成物例、核酸、粒子、集団、医薬組成物の投与は、数種の相違する経路のいずれかによって遂行できる。特定の実施形態では、組成物は、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、鼻腔内、頭蓋内、舌下、膣内、直腸内、経口、または局所的に投与することができる。本明細書の組成物は、皮膚擦過法、またはパッチもしくは液体により経皮的に投与されてよい。該組成物は、経時的に組成物を遊離する生体分解性物質の形状で皮下送達することができる。本発明の組成物は、疾患を予防するために予防的に、または疾患を治療するために治療的に使用できる。治療できる疾患には、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって惹起される感染性疾患、および癌が含まれる。例えばアルツハイマー病、多発性硬化症、脳卒中などの異所性もしくは異常なタンパク質の発現または正常タンパク質の過剰発現に関係する慢性疾患もまた治療できる。本発明の組成物は最適化して他のワクチン接種レジメンと組み合わせると極めて広範囲すなわち、上記に記載した機能を含む、免疫反応の全ての態様の細胞性および体液性反応を提供することができる。特定の実施形態では、これは本発明の組成物を以下の、病原体もしくは腫瘍由来の免疫原、組み換え免疫原、裸の核酸、脂質含有成分を用いて調製された核酸、非アルファウイルスベクターポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含むがそれらに限定されない、およびその他のアルファウイルスベクターの1つ以上を含む組成物と組み合わせて使用される異種プライムブースト法の使用を含むことができる。これらのウイルスベクターは、ウイルス様粒子または核酸であってよい。これらのアルファウイルスベクターは、レプリコン含有粒子、DNA型レプリコン含有ベクターときにはELVIS系と呼ばれる、例えば米国特許第5,814,482号を参照または裸のRNAベクターであってよい。本発明の組成物は、それらが被験者において強力な免疫反応を誘導することができないために典型的には生残する、慢性もしくは潜在性感染性物質に対する免疫反応を生成するためにも使用できる。代表的な潜在的もしくは慢性的感染性因子には、B型肝炎、C型肝炎、エプスタインバーEpstein-Barrウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、およびヒト乳頭腫ウイルスが含まれるが、それらに限定されない。これらの感染性因子由来のペプチドおよび/またはタンパク質をコードするアルファウイルスベクターは、本明細書に記載した方法によって細胞または被験者に投与できる。あるいは、免疫原性タンパク質もしくはペプチドはいずれかの腫瘍もしくは癌細胞抗原であってよい。好ましくは、腫瘍もしくは癌細胞抗原は癌細胞の表面上で発現する。特異的乳癌に対する代表的な癌抗原はHER2およびBRCA1抗原である。その他の代表的な癌および腫瘍細胞抗原はS.A.Rosenberg,1999,Immunity10:281に記載されており、MART-1/MelanA、gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15およびp53抗原、ウィルムスWilms腫瘍抗原、チロシナーゼ、胎児性癌抗原CEA、前立腺特異抗原PSA、前立腺特異膜抗原PSMA、前立腺幹細胞抗原PSCA、ヒトアスパルチルアスパラギニルβ-ヒドロキシラーゼHAAH、およびEphA2上皮細胞チロシンキナーゼ、国際特許公開第WO01/12172号を参照が含まれるが、それらに限定されない。本発明の免疫原性ポリペプチドもしくはペプチドは、さらにまた、このような抗原について教示するために全体として参照して組み込まれる国際特許公開第WO99/51263号に記載されたように汎発性もしくは人工癌抗原もしくは腫瘍細胞抗原であってよい。様々な実施形態では、本発明の異種核酸はアンチセンス核酸配列をコードすることができる。アンチセンス核酸は、アンチセンス核酸の作用による生成の阻害もしくは減少を目的とするポリペプチドをコードする核酸をコードする、もしくは核酸の発現に関係する核酸例、遺伝子、cDNAおよび/またはmRNAの全部もしくは一部に相補的すなわち、インビボまたはストリンジェントなインビトロ条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子すなわち、DNAもしくはRNAである。所望であれば、従来法を使用すると望ましい修飾を含有するアンチセンス核酸を生成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、インビボでヌクレアーゼによるアンチセンスオリゴヌクレオチドの変性を阻害するためのアンチセンス核酸として使用できる。アンチセンス核酸が標的とされるポリペプチドをコードする核酸の一部に相補的である場合は、アンチセンス核酸は、機能的ポリペプチドの翻訳を阻害するようにポリペプチドをコードする核酸の5’末端の十分近くへハイブリダイズするはずである。典型的には、これはそれにハイブリダイズする核酸の5’の半分もしくは3分の1以内である配列にアンチセンス核酸が相補的なはずであることを意味する。本発明のアンチセンス核酸はさらにまた、標的遺伝子産物をコードするmRNAを加水分解することによって細胞内の標的核酸の発現を阻害する触媒性RNAすなわち、リボザイムをコードすることができる。さらに、ハンマーヘッドRNAは、イントロンスプライシングを防止するためのアンチセンス核酸として使用できる。本発明のアンチセンス核酸は、アンチセンステクノロジーのための当分野において慣例的であるプロトコールによって生成および試験することができる。本明細書に記載する用語アルファウイルスは当分野における通常の意味を有し、東部ウマ脳炎EasternEquineEncephalitisEEEウイルス、ベネズエラウマ脳炎VenezuelanEquineEncephalitisVEEウイルス、エバグレーズEvergladesウイルス、ムカンボMucamboウイルス、ピクスナPixunaウイルス、西部脳炎WesternEncephalitisウイルスWEE、シンドビスSindbisウイルス、南アフリカアルボウイルスSouthAfricanArbovirus第86号S.A.AR86、ガードウッドGirdwoodS.A.ウイルス、Ockelboウイルス、セムリキ森林SemlikiForestウイルス、ミドルバーグMiddleburgウイルス、チクングンヤChikungunyaウイルス、オニョンニョンO’Nyong-Nyongウイルス、ロスリバーRossRiverウイルス、バーマ森林BarmahForestウイルス、ゲタGetahウイルス、サギヤマSagiyamaウイルス、ベバルBebaruウイルス、マヤロMayaroウイルス、ウナUnaウイルス、アウラAuraウイルス、ワタロアWhataroaウイルス、Babankiウイルス、Kyzlagachウイルス、HighlandsJウイルス、FortMorganウイルス、ヌドゥムNdumuウイルス、BuggyCreekウイルス、およびその他の国際ウイルス分類委員会ICTVによってアルファウイルスであると分類された任意の他のウイルスを含む。本発明の特定実施形態では、本発明の核酸によってコードされる核酸および/またはタンパク質は弱毒化突然変異を含むことができる。本明細書で使用する熟語弱毒化突然変異および弱毒化アミノ酸は、当分野における専門用語によって、その宿主内で疾患を引き起こす確率の減少を生じさせる突然変異を含有するヌクレオチド配列、または突然変異を含有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を含む。例えば、Davisetal.,MICROBIOLOGY1323ded.1980を参照されたい。熟語弱毒化突然変異からは、ウイルスにとって致死的であろう突然変異または突然変異の組み合わせが除外される。しかし、さもなければ致死性であるが弱毒化表現型をもたらす突然変異を蘇生させる、もしくは救済する突然変異と組み合わせて組み込むことのできる突然変異を含む。適切な弱毒化突然変異は使用されるアルファウイルスに依存するが、当業者には知られているであろう。代表的な弱毒化突然変異には、それらの各々の開示が本明細書に全体として参照して組み込まれるJohnstonetal.への米国特許第5,505,947号、Johnstonetal.への米国特許第5,185,440号、Davisetal.への米国特許第5,643,576号、Johnstonetal.への米国特許第5,792,462号、およびJohnstonetal.への米国特許第5,639,650号に記載された弱毒化突然変異が含まれるが、それらに限定されない。本発明の様々な実施形態では、本発明のアルファウイルス粒子の1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、例えば米国特許第5,792,462号および第6,156,558号に規定されたように1つ以上の弱毒化突然変異を含むことができる。VEEE1糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、E1アミノ酸の位置81、272および/または253のいずれか1つに弱毒化突然変異を含むことができる。VEE-3042変異体から作製されたアルファウイルス粒子はE1-81でイソロイシン置換を含んでおり、そしてVEE-3040変異体から作製されたウイルス粒子はE1-253で弱毒化突然変異を含む。VEEE2糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、E2アミノ酸の位置76、120または209のいずれか1つに弱毒化突然変異を含むことができる。VEE-3014変異体から作製されたアルファウイルス粒子はE1-272およびE2-209の両方で弱毒化突然変異を含有している米国特許第5,792,492号を参照。VEEE3糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、E3アミノ酸56-59の欠失からなる弱毒化突然変異を含む。VEE-3526変異体から作製されたウイルス粒子は、E3aa56-59におけるこの欠失ならびにE1-253での第2弱毒化突然変異を含有している。S.A.AR86E2糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、E2アミノ酸の位置304、314、372、または376のいずれか1つに弱毒化突然変異を含む。あるいは、弱毒化突然変異は、例えばいずれかの組み合わせでの以下の、158、159、160、161および162アミノ酸位置のいずれか1つ以上で、E2糖タンパク質におけるアミノ酸の置換、欠失および/または挿入であってよいその全内容が参照して本明細書に組み込まれるPoloetal.への国際特許公開第WO00/61772号を参照されたい。本発明のまた別の弱毒化突然変異はVEEゲノムRNAのヌクレオチド3、すなわち5’メチル化キャップに続く第3ヌクレオチドでの弱毒化突然変異であってよい例えば、nt3でのG→C突然変異について記載している米国特許第5,643,576号を参照されたい。。この突然変異は、G→A、UまたはCであってよいが、一部の実施形態ではG→A突然変異であってもよい。アルファウイルス構造タンパク質および/または非構造タンパク質がS.A.AR86由来である場合は、構造タンパク質および/または非構造タンパク質における代表的な弱毒化突然変異には弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp1アミノ酸538としてのイソロイシンを特定するnsp1アミノ酸位置538でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはE2アミノ酸304としてのトレオニンを特定するE2アミノ酸位置304でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはE2アミノ酸314としてのリシンを特定するE2アミノ酸位置314でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはE2アミノ酸残基372でのロイシンを特定するE2アミノ酸372でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはE2アミノ酸376としてのアラニンを特定するE2アミノ酸位置376でのコドン;組み合わせて、上記に記載した弱毒化アミノ酸を特定するE2アミノ酸残基304、314、372および376でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸96としてのグリシンを特定するnsp2アミノ酸位置96でのコドン;および弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸372としてのバリンを特定するnsp2アミノ酸位置372でのコドン;組み合わせて、上記に記載したnsp2アミノ酸残基96および372で弱毒化アミノ酸をコードするnsp2アミノ酸残基96および372でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸残基529でのロイシンを特定するnsp2アミノ酸残基529でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸残基571でのアスパラギンを特定するnsp2アミノ酸残基571でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸残基682でのアルギニンを特定するnsp2アミノ酸残基682でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp2アミノ酸残基804でのアルギニンを特定するnsp2アミノ酸残基804でのコドン;弱毒化アミノ酸、好ましくはnsp3アミノ酸残基22でのアルギニンを特定するnsp3アミノ酸残基22でのコドン;および組み合わせて、上記に記載したような弱毒化アミノ酸を特定するnsp2アミノ酸残基529、571、682および804ならびにnsp3アミノ酸残基22でのコドンが含まれるが、それらに限定されない。他の例示的弱毒化突然変異には国際特許公開第PCT/US01/27644号その開示は参照して全体として本明細書に組み込まれるに記載された弱毒化突然変異が含まれる。例えば、弱毒化突然変異はS.A.AR86nsp3タンパク質のアミノ酸位置537での弱毒化突然変異であってよいが、より好ましくはこの位置での置換突然変異、さらにいっそうより好ましくは停止コドンの置換を生じさせるナンセンス突然変異であってよい。翻訳停止すなわち、終止コドンは当分野において知られており、オパールUGA、アンバーUAGおよびオーカーUAA終止コドンが含まれる。本発明の実施形態では、弱毒化突然変異はS.A.AR86nsp3アミノ酸位置537でCys→オパール置換を生じさせることができる。また別の代表的な弱毒化突然変異は、S.A.AR86nsp3タンパク質のアミノ酸385に続く弱毒化挿入突然変異を含むことができる。挿入は、少なくとも2、4、6、8、10、12、14、16もしくは20個のアミノ酸の挿入を含むことができる。本発明の一部の実施形態では、挿入されたアミノ酸配列は、セリン/トレオニンキナーゼによるリン酸化のための基質として機能するセリンおよびトレオニン残基に富む例えば、少なくとも2、4、6、もしくは8個のそのような部位を含む。特定の実施形態では、弱毒化突然変異はnsp3のアミノ酸385に続くアミノ酸配列Ile-Thr-Ser-Met-Asp-Ser-Trp-Ser-Ser-Gly-Pro-Ser-Ser-Leu-Glu-Ile-Val-Asp配列番号1の挿入を含むことができるすなわち、第1アミノ酸はnsp3におけるアミノ酸386と指定される。本発明の他の実施形態では、挿入突然変異は弱毒化表現型を生じさせる配列番号1の断片の挿入を含むことができる。この断片は、配列番号1からの少なくとも4、6、8、10、12、14、15、16もしくは17個の連続アミノ酸を含むことができる。当業者であれば、上述した配列の断片を含む、または上述した配列内へ保存的アミノ酸置換を組み込んでいる他の弱毒化挿入配列は慣例的方法によって慣例的に同定できることを理解するであろう上記のように。本発明のいずれかの理論によって結び付けることを望まなくても、配列番号1の挿入配列は、弱毒化表現型を与えるセリン残基で高度にリン酸化されると思われる。そこで、セリンもしくはトレオニンリン酸化のための基質として機能する他の弱毒化挿入配列は当分野において知られている従来技術によって同定できる。あるいは、または追加して、S.A.AR86nsp3タンパク質のアミノ酸385すなわち、上述した挿入配列の直前でのTyr→Ser置換がある。この配列は、非毒性シンドビス群ウイルス内では保存されているが、S.A.AR86からは欠失している。他の実施形態では、本発明のアルファウイルスは、いずれかのシンドビスウイルス株例、TR339、VEEメチル化キャップに続くゲノムRNAのヌクレオチド3で突然変異を有する、S.A.AR86ウイルス、ガードウッドS.A.ウイルス、Ockelboウイルス、および/またはそのキメラウイルスであってよい。多数のアルファウイルスについて、完全ゲノム配列、ならびに様々な構造タンパク質および非構造タンパク質の配列は当分野において知られており、シンドビスウイルスゲノム配列GenBankアクセッション番号J02363、NCBIアクセッション番号NC_001547、S.A.AR86ゲノム配列GenBankアクセッション番号U38305、VEEゲノム配列GenBankアクセッション番号L04653、NCBIアクセッション番号NC_001449、ガードウッドS.Aゲノム配列GenBankアクセッション番号U38304、セムリキ森林ウイルスゲノム配列GenBankアクセッション番号X04129、NCBIアクセッション番号NC_003215、およびTR339ゲノム配列Klimstraetal.1988,J.Virol.72:7357;McKnightetal.1996,J.Virol.70:1981が含まれる。本発明の特定実施形態では、本発明のアルファウイルス構造タンパク質は、シンドビスウイルス構造タンパク質、SFV構造タンパク質、VEE構造タンパク質、ロスリバーウイルス構造タンパク質、S.A.AR86構造タンパク質、EEE構造タンパク質および/またはWEE構造タンパク質であってよい。これらは、相互とのいずれかの組み合わせで存在していてよく、そして本発明のキメラ組み換えアルファウイルス粒子およびまたはキメラ組み換え核酸を生成するためのこれらおよび/または他のアルファウイルスのいずれかからの5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーターおよび3’アルファウイルス複製認識配列などのいずれかのアルファウイルス非構造タンパク質および/または他のアルファウイルス配列との組み合わせで存在していてよい。また別の実施形態では、本発明のIRESエレメントは、異種核酸によってコードされる遺伝子産物の翻訳の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99もしくは100が該IRESエレメントの活性によって制御されるように、本発明の組み換え核酸の異種核酸によってコードされる遺伝子産物の翻訳を指令する。該IRESによって制御されるような本発明の組み換えレプリコン核酸中の異種核酸によってコードされる遺伝子産物の翻訳のパーセンテージは、当分野において周知であり、本明細書に提供した実施例のセクションに記載したアッセイによって決定できる。その上、本発明のIRESエレメントが本発明のヘルパー構築物内に存在するアルファウイルス構造タンパク質の翻訳を指令する本発明の実施形態では、本発明のIRESエレメントは、構造タンパク質の翻訳の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99または100が該IRESエレメントの活性によって制御されるように、1つ以上の構造タンパク質の翻訳を指令できる。本発明のIRESエレメントによって制御される1つ以上の構造タンパク質の翻訳のパーセンテージは、当分野において周知であり、本明細書に提供した実施例のセクションに記載したアッセイによって決定できる。本発明の核酸はRNAまたはDNAであってよい。本発明のまた別の実施形態では、一連のヘルパー核酸ヘルパー構築物またはヘルパー分子、すなわち1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現する組み換えDNAまたはRNA分子が提供される。1セットのRNA実施形態では、該ヘルパー構築物はi5’アルファウイルス複製認識配列と、ii転写プロモーターと、iii少なくとも1つの、しかし全部ではないアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、およびivアルファウイルス3’複製認識配列と、をコードする第1核酸配列を含む。特定の実施形態では、E1およびE2糖タンパク質は1つのヘルパー構築物によってコードされ、そしてキャプシドタンパク質は他の別個のヘルパー構築物によってコードされる。また別の実施形態では、E1糖タンパク質、E2糖タンパク質、およびキャプシドタンパク質は各々別個のヘルパー構築物によってコードされる。他の実施形態では、キャプシドタンパク質および糖タンパク質の1つは1つのヘルパー構築物によってコードされ、そして他の糖タンパク質は別個の第2ヘルパー構築物によってコードされる。さらにまた別の実施形態では、キャプシドタンパク質および糖タンパク質E1は1つのヘルパー構築物によってコードされ、そしてキャプシドタンパク質および糖タンパク質E2は別個のヘルパー構築物によってコードされる。特定の実施形態では、本発明のヘルパー構築物はアルファウイルスパッケージングシグナルを含んでいない。あるいは、上述したヘルパー核酸は、ヘルパー細胞のゲノム内に安定性で統合できる、またはエピソーム例、EBV由来エピソームから発現させることのできるDNA分子として構築される。DNA分子はさらにまた細胞内で一過性に発現させることができる。DNA分子は、プラスミドなどの非組み込み型DNAベクター、またはウイルスベクターを含むがそれらに限定されない当分野において知られているいずれかのベクターであってよい。DNA分子は、本明細書で記載するように、アルファウイルス構造タンパク質の1つまたは全部をあらゆる組み合わせでコードすることができる。本発明のヘルパー構築物は、本発明のアルファウイルス粒子を生成するために使用されるヘルパー細胞内に導入される。上述したように、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸はヘルパー細胞内に一過性で、またはヘルパー細胞のゲノム内への安定性組込みによって存在してよい。本発明のアルファウイルス粒子を生成するために使用されるアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸は、構成性および/または誘導性プロモーターの制御下にあってよい。同様に上述したように、アルファウイルス構造タンパク質コード配列は組み換えレプリコン核酸上および/またはIRESエレメントを含むヘルパー構築物上で提供することができ、そしてこれらのコード配列の翻訳はIRESエレメントの活性によって制御することができる。そのような実施形態では、IRESエレメントは特異的ヘルパー細胞タイプ内で活性であっても、活性でなくても、または他の細胞タイプでは活性が極めて小さくてもよい。特定の実施形態では、本発明のヘルパー細胞は、組み換えレプリコン核酸がそれによってアルファウイルス構造タンパク質が生成されて組み換えレプリコン核酸が本発明のアルファウイルス粒子内にパッケージングされる条件下で細胞内に導入されるときに、本発明のアルファウイルス粒子を生成するためにある組み合わせおよび/または十分な量でアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含む。本発明の実施形態の全部において、組み換えレプリコン核酸および/またはヘルパー分子によってコードされる少なくとも1つのアルファウイルス構造タンパク質および/または非構造タンパク質、および/または組み換えレプリコンおよび/またはヘルパー核酸の非翻訳領域は、本明細書に記載されており、そして文献において周知のように、あらゆる組み合わせで1つ以上の弱毒化突然変異を含有することができると意図される。本発明の特定構築物では、DNAからのRNAの転写を指令するためのプロモーター、すなわちDNA依存性RNAポリメラーゼが使用される。本発明のRNAヘルパーおよびレプリコン実施形態ではプロモーターを利用してインビトロ転写反応においてRNAが合成され、この使用のために適切な特異的プロモーターにはSP6、T7、およびT3RNAポリメラーゼプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。DNAヘルパー実施形態では、このプロモーターは細胞内で機能してRNAの転写を指令する。該構築物のインビボ転写のための潜在的プロモーターには、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーターなどの真核生物プロモーター、またはMMTVおよびMoSVLTR、SV40早期領域、RSVもしくはCMVなどのウイルスプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。本発明のために多数の他の適切な哺乳動物およびウイルスプロモーターが利用可能であり、当分野において知られている。あるいは、細菌もしくはバクテリオファージ例えばSP6、T7、およびT3由来のDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーターは、別個のプラスミド、RNAベクター、またはウイルスベクターのいずれかを介して、細胞へ提供される適合するRNAポリメラーゼと一緒にインビボで使用するために利用できる。特定の実施形態では、適合するRNAポリメラーゼは誘導性プロモーターの制御下でヘルパー細胞系に安定性で形質転換させることができる。細胞内で機能する構築物は細胞内に形質転換させた自律プラスミドとして機能することができる、および/またはそれらはゲノム内に安定性で形質転換させることができる。安定性で形質転換された細胞系では、プロモーターは誘導性プロモーターであってよいので、その結果として細胞は、細胞が適切な刺激誘導因子へ曝露させられると安定性で形質転換させられた構築物によってコードされるRNAポリメラーゼだけを生成するであろう。ヘルパー構築物は、該誘導因子と同時に、前に、および/または後に安定性で形質転換された細胞内へ導入され、それによってアルファウイルス構造タンパク質の発現に影響を及ぼす。あるいは、細胞内で機能するように設計された構築物を、哺乳動物polIIプロモーターとともに例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、SV40、レトロウイルス、ノダウイルスnodavirus、ピコルナウイルス、水疱性口内炎vesicularstomatitisウイルス、およびバキュロウイルスなどのウイルスベクターを介して細胞内に導入することができる。本明細書に提供した本発明の特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸および/またはヘルパー核酸は、本発明の組み換えレプリコン核酸および/またはヘルパー核酸内のIRESエレメントの上流に位置していてよいスペーサー核酸を含むことができる。スペーサー核酸は、翻訳が次にIRESによって一部または全部が指令されるように、メッセンジャーRNAの5’キャップからの少なくとも一部、および一部の実施形態では全部の翻訳を防止するために十分な長さであるいずれかのランダムもしくは特異的非コーディング核酸配列を含んでいてよい、本質的にそれらから構成されてよい、または構成される。あるいは、スペーサー核酸は、メッセンジャーRNAの5’キャップからの少なくとも一部およびもしかすると全部の翻訳活性を防止するために核酸へ十分な二次構造を付与する長さおよび配列構造であってよい。1つの例として、市販で入手できるプラスミドpCDNA3.1-は、このプラスミド内で頻回に切断する制限酵素AluIを用いて消化されたので、したがって多数のランダムおよび様々なサイズの断片を生成する詳細については、実施例3を参照されたい。pCDNAプラスミドは長さが5427ヌクレオチドであり、挿入された核酸の発現のための様々なプロモーターCMV、T7、SV40ならびにポリアデニル化シグナルおよび抗生物質耐性遺伝子を含む真核生物発現ベクターである。AluI酵素はこれらのエレメント全体で切断し、ある範囲のランダム断片を提供する。以下では、この実施例から生成された、そしてこのプラスミドからのいずれかの機能的エレメントをコードしない数種のスペーサーの実施例およびそれらの配列を提供する。357ヌクレオチドスペーサー:CTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAG342ヌクレオチドスペーサー:CTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG257ヌクレオチドスペーサー:CTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAG383ヌクレオチドスペーサー:CTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCCTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCCGAAAATGGATATACAAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG579ヌクレオチドスペーサー:CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAG749ヌクレオチドスペーサー:CTGCAATAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAG関連しないプラスミドから生成されたランダム核酸断片上述したAluI断片におけるようにの使用に加えて、スペーサーとして、細胞もしくはウイルス遺伝子から、例えば遺伝子の5’非コーディング領域からの断片を使用することも可能である。1つのアプローチは、現在あるIRESを取り囲んでいる非コード配列を使用する方法である実施例4B.4を参照。もう1つのアプローチは、アルファウイルス遺伝子、例えばキャプシド遺伝子の5’非コーディング領域を使用する方法である実施例4A.2を参照。そこで、本発明のスペーサー核酸は最小であってよい、長さが少なくとも25核酸であってよい、および所与の組み換えレプリコン核酸内で許容される限りの長さでよいことが企図されている。例えば、本発明のスペーサー核酸は、特定の実施形態では、長さがおよそ25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、175、180、190、200、210、220、225、230、235、240、245、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、または10,000ヌクレオチドであってよい。およそは、スペーサー核酸は長さが10、15、20および/または25まで変動する可能性があることを意味する。本発明のスペーサー核酸はメッセンジャーRNAの転写を開始するために3’から5’へ配置された、および5’から機能的IRESエレメントへ置かれたヌクレオチド配列であってもよいが、前記IRESエレメントから指令された翻訳のレベルは非機能的IRESエレメントから入手されたレベルより少なくとも約5倍高い。好ましい実施形態では、翻訳のレベルは少なくともおよそ10倍、20倍、50倍、100倍、150倍、180倍、200倍、300倍、400倍もしくは500倍以上である。他の実施形態では、異種核酸によってコードされる遺伝子産物および/またはIRES含有ヘルパー構築物によってコードされる1つ以上の構造タンパク質の翻訳の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、92、94、95、96、97、98、99もしくは100は、該IRESエレメントの活性によって制御される。本発明は、さらにまた本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルス粒子を提供する。さらにまた、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団が提供されるが、このとき各粒子は本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンRNAを含有する。一部の実施形態では、本発明の集団は、細胞培養上の継代および/または複製コンピテントウイルスを検出するために周知の他のアッセイによって測定されるように、検出可能な複製コンピテントウイルスを有していない。本発明はさらに、医薬上許容される担体中に本発明の核酸、ベクター、粒子および/または集団を含む医薬組成物を提供する。医薬上許容されるは生物学的または他の点で有害ではない物質を意味する。すなわちこの物質は、実質的に有害な生物学的作用を引き起こさずに、またはその中に含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用せずに選択されたペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクターもしくは細胞と一緒に個々に投与することができる。その上に、本発明のいずれかの組成物は医薬上許容される担体および適切なアジュバントを含むことができる。本明細書で使用する適切なアジュバントは被験者または被験者の細胞に有害な作用をもたらすことなく免疫反応をいっそう増強するために本発明のペプチドまたはポリペプチドと組み合わせることのできるアジュバントを意味する。適切なアジュバントは、リン酸緩衝食塩水中の5wt/volスクアレンDASF社、ニュージャージー州パーシッパニー、2.5Pluronic、L121ポリマーAldrichChemical社、ミルウォーキー、および0.2のポリソルベートTween80、Sigma社から構成されるSYNTEXアジュバント調製物1SAF-1であるMONTANIDEISA51Seppic,Inc.社、ニュージャージー州フェアフィールドであってよいが、それに限定されない。その他の適切なアジュバントは当分野において周知であり、QS-21、完全および不完全フロイントのアジュバントFreund’sadjuvant、アルミニウム塩ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミール-L-トレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-nor-ムラミール-L-アラニル-D-イソグルタミンCGP11637、nor-MDPと呼ばれる、N-アセチル-ムラミール-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンCGP19835A、MTP-PEと呼ばれる、および2スクアレン/Tween80エマルジョン中に細菌から抽出された3種の成分、モノホスホリル脂質A、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格MPLTDMCWSを含有するRIBIが含まれる。アジュバントは、本発明の組成物と、または本発明の組成物と組み合わせて使用できる他のワクチン組成物のいずれかと組み合わせることができる。アジュバントの例には、水中油エマルジョン調製物、細菌細胞壁成分もしくは合成分子などの免疫刺激剤、またはまた別の骨格成分、オリゴヌクレオチド例、CpGsおよび例えばポリビニルポリマーを組み込むことのできる核酸ポリマー二本鎖および一本鎖RNAおよびDNAの両方が含まれるが、それらに限定されない。本発明の組成物は、さらにまた他の医薬品、医薬物質、担体、希釈剤、免疫刺激性サイトカインなどを含むことができる。そのような剤形を調製する実際的方法は、当業者には知られている、または明白であろう。本発明によって企図されるアルファウイルスレプリコン粒子のために好ましい用量範囲は、投与1回当たり103から1010個の粒子であってよい。ヒトのためには、106、107または108が好ましい用量である。用法は、被験者への本発明の組成物の投与によって達成される所望の予防作用および/または治療作用を達成するために必要と見なされる1時間毎、1日毎、1週間毎、1カ月毎、1年毎などの1回以上の投与であってよい。特定投与の有効性は、当分野において周知の方法によって決定できる。本発明は、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に以下の、i本発明の組み換えレプリコン核酸と、iiアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸であって、該1つ以上のヘルパー核酸が該アルファウイルス構造タンパク質の全部を生成するヘルパー核酸と、を導入するステップと、およびb該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法をさらに提供する。一部の実施形態では、該組み換えレプリコン核酸はアルファウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも1つの異種核酸を含むことができる。本発明の方法の他の実施形態では、該ヘルパー核酸は5’アルファウイルス複製認識配列と、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列と、を含む組み換え核酸であってよい。さらにまた別の実施形態では、該ヘルパー核酸は、プロモーター例、CMVプロモーターおよび全部を含む1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸DNAであってよいであってよい。本発明のヘルパー核酸は、いずれかの順序および/またはいずれかの組み合わせでアルファウイルス構造タンパク質C、E1、E2のいずれか1つ以上をコードする核酸配列を含むことができる。そこで、ヘルパー細胞はアルファウイルス粒子を生成するために必要なアルファウイルス構造タンパク質の全部を提供するために必要とされるできる限り多数のヘルパー核酸を含むことができる。ヘルパー細胞は、ヘルパー例、パッケージング細胞のゲノム内に安定性に組み込まれた1つ以上のヘルパー核酸を含むことができる。そのようなヘルパー細胞では、アルファウイルス構造タンパク質は誘導性プロモーターであってよいプロモーターの制御下で生成できる。一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるヘルパー核酸は、5’アルファウイルス複製認識配列と、IRESエレメントと、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列と、を含む組み換え核酸であってよい。さらにまた別の実施形態では、該ヘルパー核酸は5’アルファウイルス複製認識配列と、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、IRESエレメントと、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および3’アルファウイルス複製認識配列と、を含む組み換え核酸であってよい。さらに、本明細書では、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に以下の、i5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする1つ以上の核酸配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、異種核酸配列および3’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレプリコンRNAと;およびii5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、IRESエレメント、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および3’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸と、を導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が該細胞内で生成されるステップと、およびb該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法が提供される。さらに本明細書では、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、a細胞内に以下の、i5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする1つ以上の核酸配列、少なくとも1つのアルファウイルスサブゲノムプロモーター、少なくとも1つのIRESエレメント、少なくとも1つの異種核酸配列および3’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレプリコンRNAと;およびii5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、IRESエレメント、1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および3’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする1つ以上のヘルパー核酸と、を導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が該細胞内で生成されるステップと、およびb該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法が提供される。本発明のアルファウイルス粒子を作製する方法は、さらに該細胞から前記アルファウイルス粒子を収集するステップをさらに含むことができる。本発明は、5’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、IRESエレメント、いずれかの組み合わせおよび/または順序で1つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および3’アルファウイルス複製認識配列を含む組み換え核酸をさらに提供する。一部の実施形態では、この組み換えヘルパー核酸は、IRESエレメントの上流に位置していてよいスペーサーヌクレオチド配列を含むことができる。さらにまた、この組み換え核酸を含むベクターおよび/または細胞が提供される。追加して本明細書では、5’アルファウイルス複製認識配列をコードする第1核酸配列と;アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも1つの第2核酸配列と、第1アルファウイルスサブゲノムプロモーターと;第1IRESエレメントと、第1異種核酸と;第2アルファウイルスサブゲノムプロモーターと;第2IRESエレメントと、3’アルファウイルス複製認識配列をコードする第3核酸と、を含む組み換え核酸が提供される。一部の実施形態では、第1および第2アルファウイルスサブゲノムプロモーターは同一であっても相違していてもよく、該第1および第2IRESエレメントは同一であっても相違していてもよく、および/または該第1および第2異種核酸は同一であっても相違していてもよい。この組み換え核酸はアルファウイルスパッケージングシグナルおよび/またはIRESエレメントの上流であってよいスペーサーヌクレオチド配列を含むことができる。この組み換え核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質コード配列の4つ全部が組み換え核酸上に存在するように、いずれかの順序および/または組み合わせでアルファウイルス非構造タンパク質をコードする1つ以上の第2核酸配列をさらに含むことができる。この組み換え核酸は本発明のアルファウイルス粒子内に存在していてよく、そしてそのような粒子は本発明の集団として、および/または本発明の医薬組成物内に存在していてよい。さらにまた、第3以降の追加のアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、第3以降の追加のIRESエレメントと、および/または第3以降の追加の異種核酸と、をさらに含む上述したような組み換えレプリコン核酸が提供される。この組み換え核酸は本発明のアルファウイルス粒子内に存在していてよく、そしてそのような粒子は本発明の集団として、および/または本発明の医薬組成物内に存在していてよい。この実施形態の組み換え核酸を含むアルファウイルス粒子は、本発明のいずれかの方法によって生成することができ、免疫反応を誘導するおよび/またはNOIを細胞へ送達する方法のいずれかにおいて使用できる。また別の実施形態として、本発明は、核酸の転写を指令するプロモーターと;IRESエレメントと;およびコード配列を含む核酸とを含み、IRESエレメントは、コード配列の翻訳がIRESエレメントによって指令されるキャップ構造非依存性メカニズムを介するように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。この実施形態では、該核酸の転写は該核酸の翻訳から解除される。上述した詳細な説明は単に例示するために提供されており、そして本発明の精神および範囲から逸脱せずにその中で修飾および変更を加えることができることを理解されたい。トランスファークローニングベクターの構築A.EMCVIRES含有ベクター脳心筋炎EMCVIRES配列およびいずれかのNOIを導入できるトランスファーベクターpCDNA3.3を調製した。制限酵素Batheを用いてプラスミドpCDNA3.1Nitrogen社を消化し、T4DNAポリメラーゼを用いて処理して固有のBathe制限部位を除去すると、pCDNA3.2が生成した。さらに制限酵素Bayを用いてpCDNA3.2DNAを消化し、同様にT4DNAポリメラーゼを用いて処理して固有のBay制限部位を除去すると、pCDNA3.3が得られた。~250bpのApaI/NotIMCS断片をApaI/NotI直線化pBluescriptKSStratagene社DNA内へライゲートしてpKS-rep2を生成することによって、VEEレプリコンベクター由来の多重クローニング部位MCSを含有する中間クローニングベクターを調製した。制限酵素EcoRIおよびBamHIを用いてEMCVIRESをpD123から消化しKaminskietal.,1995、EcoRIおよびBamHI直線化pKS-rep2DNA内にライゲートして、pKS-rep2/EMCVを生成した。プライマーEMCVFAscI.2およびEMCVRAscI.1を使用してpKS-rep2/EMCVベクター由来のEMCVIRESおよびMCS配列をPCR増幅させた表1。AscI制限酵素を用いてEMCVPCR産物を消化し、AscI直線化VEEレプリコンpERKベクターDNA内にライゲートし、pERK/EMCVを生成した。トランスファークローニングベクターを完成するために、EcoRVおよびNotI制限酵素を用いてpERK/EMCVDNAを消化し、862bpEcoRV/NotI断片をEcoRVおよびNotI直線化pCDNA3.3DNA内にライゲートし、pCDNA3.3/EMCVを生成した。EMCVIRESおよび関連する多重クローニング部位の配列は、それを用いてまた別の構築物を調製する前にpCDNA3.3/EMCVベクター内で確認した。B.XIAPIRES含有ベクター推定IRESエレメントを含有するアポトーシスXIAP遺伝子5’非コーディング領域NCRのX連鎖阻害剤エレメントの配列およびサイズについてはHolciketal.1999NatureCellBiol1:190-192;HolcikandKorneluk2000MolCellBiol20:4648-57およびHolciketal.2003MolCellBiol23:280-288を参照は、cDNAを補給したアダプタープライマーおよびXIAPリバースプライマーXIAP-Rを用いてヒト胎児肝marathonreadycDNAClontech社、カリフォルニア州パロアルトからPCR増幅させ、次にXIAPIRES特異的プライマーを用いるネストPCRを実施した。プライマーは表2に列挙した。結果として生じたおよそ1007および241bpのPCR産物は市販で入手できるキットInvitrogenCorporation社;カリフォルニア州カールズバッドを用いてTAクローニングした。これらの構築物は、163ヌクレオチド推定XIAPIRESに加えて、XIAP遺伝子非コーディング領域の各々844ヌクレオチドまたは78ヌクレオチドのどちらかを有する。各構築物についての配列は、全自動DNAシーケンシングによって確認した。VEEレプリコン内へクローニングするためのシャトルベクターを生成するために、XIAP配列をpKS-rep2の等価部位内へEcoRI断片として移し、pKS-rep2/XIAP1007およびpKS-rep2/XIAP241DNAを生成した。1007bpXIAP5’NCRACACGTGGGGCAACCCTGATTTATGCCTGTTGTCCCAGTGTGATTATTACTAGTGTAATTTTTCACTTTGAGAAGTGTCCAGGTTTGGAGGATAAATTATCTTTCTAATAATTGATACCCTTCTCATAACCTAACGGGTTCCTTTTAGTATTTTATCTGGGTTAAAATTACCAGCTGTAATTTGGCAGCTCTAATAAGACTGCAGCAATACTTATCTTCCATTTGAACAGATTGTTACTTGACCAAGGGAAGTTAATAGCAAAAGTAACTGCAGGGCACATGTATGTCATGGGCAAAAAAAAAAAAGTAACAGCAATTAAGGTTTGCAGGTACTTAGAATTTTTCCTGAGCCACCCTCTAGAGGGCAGTGTTACATATATATCTGTAATTATCCAGTTACAACAAAAAAAGGGCTCTCATTCATGCATGAAAATCAGAAATATTTCATACTCTTAAAGAACACATTGGAACCAATATTATGATTAAAACATATTTTGCTAAGCAAAGAGATATTAAAAATTAATTCATTAACATTCTGAACATTTTTTAACTTGTAAAAACAACTTTGATGCCTTGAATATATAATGATTCATTATAACAATTATGCATAGATTTTAATAATCTGCATATTTTATGCTTTCATGTTTTTCCTAATTAATGATTTGACATGGTTAATAATTATAATATATTCTGCATCACAGTTTACATATTTATGTAAAATAAGCATTTAAAAATTATTAGTTTTATTCTGCCTGCTTAAATATTACTTTCCTCAAAAAGAGAAAACAAAAATGCTAGATTTTACTTTATGACTTGAATGATGTGGTAATGTCGAACTCTAGTATTTAGAATTAGAATGTTTCTTAGCGGTCGTGTAGTTATTTTTATGTCATAAGTGGATAATTTGTTAGCTCCTATAACAAAAGTCTGTTGCTTGTGTTTCACATTTTGGATTTCCTAATATAATGTTCTCTTTTTAGAAAAGGTGGACAAGTCCTATTTTCAAGAGAAGAT改良されたレプリコンベクターの構築A.EMCVIRESを含有する構築物機能的アルファウイルス26Sプロモーターの下流に配置されたIRES配列の機能性を証明するために、レポーター遺伝子をpCDNA3.3/EMCVトランスファーベクター内にサブクローニングし、次にEMCV/レポーター遺伝子カセットをpERKレプリコンベクター内へ移動させた。最初の実験は、クロラムフェニコール-アセチル-トランスフェラーゼCATレポーター遺伝子を発現するレプリコンベクターを用いて実施した。プライマーのF’-CATBamHIおよびR’-CATXbaIを用いてCAT遺伝子を増幅させた表1。BamHIおよびXbaI制限酵素を用いてPCR産物を消化し、BamHI/XbaI直線化pCDNA3.3/EMCVDNA内にライゲートし、pCDNA3.3/EMCV/CATを生成した。CAT遺伝子の配列を確認した後、AscI制限酵素を用いてpCDNA3.3/EMCV/CATDNAを消化して1303bpのEMCV/CAT断片を遊離させた。次にAscI消化EMCV/CAT断片をAscI直線化pERKベクターDNA内にライゲートし、pERK/EMCV/CATを生成した。EMCVIRESは指向性活性を有し、それがNOIに関して間違った方向にある場合は、キャップ構造非依存性翻訳は認められないことが証明されているRobertsandBelsham1997Virology227:53-62。さらに、EMCVIRESの5’末端配列の欠失はジシストロニック発現ベクターとの関連でのキャップ構造非依存性翻訳を無効にするVanderVeldenetal.1995Virology214:82-90;JangWimmer1990GenesDevelopment4:1560-72。CAT遺伝子のキャップ構造非依存性翻訳が発生していることを証明するために、アンチセンス方向にEMCVIRESだけを伴うpERK/anti-EMCV/CAT、またはEMCVIRESの末端配列5’欠失を伴うpERK/ΔAvr/CAT、pERK/EMCV/CATと同一である2つのpERKベクターを調製した。EMCVIRESのアンチセンスバージョンは、プライマーのanti-EnEcoRIおよびanti-EnBamHI表1を用いてpKSrep2/EMCVDNAからPCR増幅させた。EcoRIおよびBamHI制限酵素を用いて増幅させたEMCVIRES断片を消化し、EcoRI/BamHI直線化pKS-rep2DNA内にライゲートし、pKS-rep2/anti-EMCVを生成した。上述したとおりのBamHI/XbaI消化CAT遺伝子をBamHI/XbaI直線化pKS-rep2/anti-EMCVDNA内にライゲートし、pKS-rep2/anti-EMCV/CATを生成した。プライマーEMCVRAscI.1およびanti-EnAscI表1を用いて1295bpのanti-EMCV/CAT遺伝子カセットをpKS-rep2/anti-EMCV/CATDNAからPCR増幅させた。最後に、AscI制限酵素を用いてanti-EMCV/CAT断片を消化してAscI直線化pERKベクターDNA内にライゲートし、pERK/anti-EMCV/CATを生成した。その後の実験を実施する前に、anti-EMCV/CAT遺伝子領域の配列を確認した。ΔAvr/CATpERKベクターを生成するために、最初にpKS-rep2/EMCV中間ベクター内に見いだされるEMCVIRES内でΔAvr欠失を作製した。この欠失は、EMCVIRESの5’領域からの145bpを欠失しているEcoRIおよびAvrII両方の制限酵素を用いてpKS-rep2/EMCVDNAを消化することによって実施した。平滑末端を作り出すためにT4DNAポリメラーゼを用いて直線化DNAを処理し、再ライゲートしてpKS-rep2/ΔAvrDNAを生成した。CAT遺伝子は、上述したBamHI/XbaICAT遺伝子をBamHIおよびXbaI制限酵素直線化pKS-rep2/ΔAvr内へライゲートすることによって中間ベクター内にクローニングし、pKS-rep2/ΔAvr/CATDNAを生成した。プライマーEMCVRAscI.1およびdAvrEnAscIR表1を用いて、1177bpのΔAvr/CAT遺伝子カセットをpKS-rep2/ΔAvr/CATDNAからPCR増幅させた。最後に、AscI制限酵素を用いてΔAvr/CAT断片を消化し、AscI直線化pERKベクターDNA内にライゲートし、pERK/ΔAvr/CATを生成した。その後の実験を実施する前に、ΔAvr/CAT遺伝子領域の配列を確認した。B.EV71IRESを含有する構築物ヒトエンテロウイルス71EV71IRESエレメントThompsonandSarnow2003Virology315:259-266をセンスおよびアンチセンス両方向にスペーサーレプリコンベクター内へクローニングし、CATレポーター遺伝子の発現について解析した。プライマーを用いてEV71IRESエレメント7423/MS/87株をpdc/MSDNAThompsonandSarnow,2003からPCR増幅させて、センス断片dc/MSEcoRIFおよびdc/MSBamHIRならびにアンチセンス断片dc/anti-MSEcoRIRおよびdc/anti-MSBamHIF表3を生成した。EcoRIおよびBamHI制限酵素を用いてセンスおよびアンチセンスEV71-MSIRESPCR産物を消化し、EcoRIおよびBamHIを用いて直線化したpCDNA3.3実施例1を参照内にライゲートし、pCDNA3.3/MSおよびpCDNA3.3/anti-MSを生成した。各pCDNA3.3ベクター内のEV71-MSIRES領域をシーケンシングして、その後の実験を開始する前にPCR増幅中にヌクレオチド変化が導入されなかったことを立証した。上記のA.に記載したCATレポーター遺伝子をBamHIおよびXbaI直線化pCDNA3.3/MSおよびpCDNA3.3/anti-MSベクター内にクローニングし、各々pCDNA3.3/MS/CATおよびpCDNA3.3/anti-MS/CATを生成した。AscI制限酵素を用いてpCDNA3.3/MS/CATおよびpCDNA3.3/anti-MS/CATDNAを消化し、MS-CATまたはanti-MS-CATAscI断片をスペーサーレプリコンベクター内にライゲートすることによって、スペーサーレプリコン構築物を生成した。各ベクター内のスペーサー-IRES-CAT領域をシーケンシングして、その後の実験を開始する前にクローニング中にヌクレオチド変化が導入されなかったことを立証した。C.XIAPIRESを含有する構築物CATF5’-GGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3’およびCATRBam5’-GGGGATCCTTACGCCCCGCCCTGCCAC-3’プライマーを用いてCAT遺伝子をPCR増幅させた後に、CAT遺伝子をpKS-rep2/XIAP1007のEcoRVおよびBamHI部位内にクローニングし下記の実施例4を参照、pKS-rep2/XIAP/CAT1007を生成した。この方法は野生型XIAP遺伝子開始部位を再構成する。次に中間物をApaI/SphI断片としてpERK内にクローニングしてpERK/XIAP/CAT1007を生成した。インビトロ転写およびVero細胞内へのエレクトロポレーション後に、感染細胞内でのVRP収率およびCATタンパク質発現を測定し、pERK/EMCV/CAT342と比較した。VRP収率はどちらの構築物についても同等であった。この特定構築物では、EMCVIRES1.08e6ng/μgを用いた場合と比較してXIAPIRES3.97e5ng/μgを用いてCATタンパク質発現のレベルを修飾することが可能であったので、このため本明細書で要求した発明における様々なIRESの有用性を証明している。D.HIVgp160を発現する構築物HIVgp160の翻訳がEMCVIRESから指令されるHIVgp160cladeC遺伝子を発現するレプリコンを構築した。この構築物では、pH1500A/EMCV/Vcapヘルパー構築物実施例4.B.1.を参照からの167bpスペーサーを下記のとおりにEMCVIRESレプリコン構築物内にクローニングした。ApaI制限酵素を用いてpH1500A/EMCV/VcapDNAを消化して167bpスペーサーおよびEMCVIRESの一部分を含有する194bp断片を遊離させた。同様にApaI制限酵素を用いてpERK/EMCV749ベクターを消化し、遊離させた749bpのスペーサーApaI断片を167bpのスペーサーApaI断片で置換し、pERK/EMCV167ベクターを生成した。異種遺伝子もまた効率的に発現させることができ、pERK/EMCV167レプリコンベクターからパッケージングできることを証明するために、HIVcladeCgp160遺伝子WilliamsonCetal.2003AIDSResHumRetroviruses19:133-44を下記のとおりにこのベクター内にクローニングした。HIVgp160遺伝子を増幅させプライマーenv-5’-XbaIおよびDU151gp1603’-XbaIを用いて表4、そしてpCR-XL-TOPOInvitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド内にクローニングし、pCR-XL-TOPO/gp160を生成した。gp160遺伝子をシーケンシングして、その後の実験を開始する前にPCR増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。XbaI制限酵素を用いてpCR-XL-TOPO/gp160DNAを消化し、次にgp160断片をXbaI直線化pCDNA3.3/EMCV内にライゲートし、pCDNA3.3/EMCV/gp160を生成した。AscI制限酵素を用いてpCDNA3.3/EMCV/gp160DNAを消化してEMCV/gp160断片を遊離させた。次にEMCV/gp160断片をAscI直線化pERK/EMCV167ベクターDNA内にライゲートし、pERK/EMCV/gp160167ベクターを生成した。E.複数のNOIを発現する二重サブゲノムIRESレプリコンの構築連続する2つの26S-スペーサー-IRES-NOIカセットをコードするIRESレプリコンベクターを構築した。二重サブゲノムIRESレプリコンpERKMCS2を生成するために使用した塩基pERKベクターは26Sプロモーターの下流の342bpスペーサー領域を含有し、そのMCS内の下記の制限部位5’AscI、SnaBI、SphI3’をコードした。ボツリヌス神経毒AおよびBbotulinumneurotoxinsAおよびBBoNTAおよびBoNTBの重鎖HcのC末端部分をBamHI/XbaI断片としてのpCDNA3.3/EMCV内にクローニングし、pCDNA3.3/EMCV/BoNTAおよびpCDNA3.3/EMCV/BoNTBを各々生成した。AscI制限酵素を用いてBoNT遺伝子をpCDNA3.3/EMCVベクターから消化し、AscIEMCV/BoNTカセットをAscI直線化pERKMCS2DNA内にライゲートし、pERK/BoNTAMCS2およびpERK/BoNTBMCS2一価ベクターを生成した。挿入の方向は制限分析によって測定し、センス方向における挿入を備えるクローンを単離した。EMCVIRESおよびBoNT遺伝子をシーケンシングしてその後の実験を開始する前のクローニング中にエラーが導入されなかったことを検証した。二重サブゲノムBoNTA/BIRESレプリコン構築物pERK-BoNTA/BMCS2を生成するために、一価pERKBoNTMCS2ベクターを利用した。PspOMI制限酵素を用いてpERK/BoNTBMCS2ベクターを部分的に消化し、両端はT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端にした。さらにSphI制限酵素を用いてpERK/BoNTBMCS2DNAを消化して26S-342bpスペーサー-EMCV-BoNTB断片を遊離させた。26S-342bpのスペーサー-EMCV-BoNTB断片を次にSnaBI/SphI消化pERK/BoNTAMCS2DNA内へライゲートし、pERK-BoNTA/BMCS2ベクターを生成した。この構築物の最終構造は、5’NCR-nsP1,2,3,4-26S-342bpスペーサー-EMCV-BoNTA-26S-342bpスペーサー-EMCV-BoNTB-NCR3’である。二重サブゲノムIRESレプリコンの配列は、発現およびVRPパッケージング試験を実施する前に検証した。F.IRES含有S.A.AR86レプリコンの構築S.A.AR86pRep89;Heiseetal.,JVirol.2003772:1149-56に記載された由来のレプリコンベクターを、26Sプロモーターの下流でスペーサ-EMCV-HIVgagカセットを含有するように修飾した。プライマーのスタッファー342ClaIおよび3-42.pr4表5を用いて342bpのスペーサー-EMCV-HIVgag断片をpERK/EMCV/gag342DNAからPCR増幅させた。3-42.pr4プライマーを用いての増幅は、pERK/EMCV/gag342DNA内のHIVgag遺伝子からのすぐ下流に存在する3’ClaI部位の組込みを可能にする。次にClaI制限酵素を用いてPCR産物を消化し、ClaI直線化pRep89内にライゲートし、pRep89/EMCV/gag342ベクターを生成した。全挿入領域をシーケンシングして、PCR増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。IRES指令レプリコンからのNOI発現分析A.EMCVIRESレプリコンの発現1:CATの発現pERK/EMCV/CAT、pERK/anti-EMCV/CAT、およびpERK/ΔAvr/CATレプリコン構築物を用いて、CATタンパク質発現について試験した。T7RiboMaxキットPromegaCorporation社;ウィスコンシン州マディソン;製品番号P1300を用いてキャップドレプリコンRNAをインビトロ転写した。RNeasy精製カラムQiagenCorporation社、メリーランド州ジャーマンタウンを製造業者の取扱説明書にしたがって用いてRNAを精製した。Vero細胞6×106細胞を0.4mLのInVitrus商標化学規定細胞培養培地CellCultureTechnologies社、スイス国チューリッヒ;製品番号IVT中に懸濁させ、15μgのpERK/EMCV/CATまたはpERK/anti-EMCV/CATRNAのどちらかを用いてBioRadGenePulserBioRadLaboratories社、カリフォルニア州ハーキュリーズを使用してエレクトロポレーションした。290ボルトおよび25マイクロファラッドに設定したエレクトロポレーターを用いて細胞を4回パルシングした。CAT発現は、メタノール固定細胞上のウサギanti-CAT抗体を使用するIFAならびにエレクトロポレーションした細胞溶解液および市販で入手できるCATELISAキットBoehringerMannheim社、インディアナ州インディアナポリスを使用するELISAによって検出した。ランダムDNA断片は、pERKベクター内に位置する固有のEcoRV部位でEMCVIRES配列とVEEサブゲノムプロモーターとの間にクローニングした。26SプロモーターとEMCVIRESとの間にクローニングした短鎖DNA断片はAluI制限酵素消化pCDNA3.1-DNAから生じた。AluI制限酵素は、pCDNA3.1-DNA内で頻回に切断し、706bpから6bpのサイズ範囲内にある平滑末端断片を生じさせた。AluI消化pCDNA3.1-断片をEcoRV直線化pERK/EMCV/CAT、pERK/anti-EMCV/CAT、およびpERK/ΔAvr/CATDNA内にライゲートした。個々のクローンをシーケンシングして、どのスペーサー断片が各新規ベクター内へクローニングされていたのかを決定した。ベクター内で見いだされる一部のスペーサー断片のサイズは、これらのレプリコンのスペーサー領域内への複数の断片をライゲーションしたために、予想された最大のpCDNA3.1-AluI断片より大きかった。上述したように各スペーサー-IRESレプリコンを転写し、そしてVero細胞内にRNAエレクトロポレーションにした。CATタンパク質発現をCATELISAによって監視し、その結果を表6にまとめた。これらの結果は、スペーサー断片を含有するpERK/IRES/CATレプリコン構築物からのCAT発現は、スペーサー断片CAT/全タンパク質およそ4~7ng/μgを含有していない類似のベクターと比較して強固で、IRESによって指令されることを示している。異種遺伝子の最高レベルの発現は、およそ200ヌクレオチドより大きなスペーサー断片を26SプロモーターとEMCVIRES配列との間に導入したときに発生した。2.単一レプリコンからの多重NOI発現pERK-BoNTA/BMCS2レプリコンの発現およびパッケージングをVero細胞内で実施した。キャップドpERK-BoNTA/BレプリコンRNAを上述したとおり転写し、精製した。30μgのレプリコンRNA、30μgのキャプシドヘルパーRNAおよび30μgの糖タンパク質ヘルパーRNAをVero細胞1×108細胞にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションした細胞は、VRPを採取する前にウマanti-BoNTAおよびBoNTB抗体Perimmune社、メリーランド州ロックビルを用いてIFAによって分析した。IFAの結果および生成したVRPの滴定は表7に示した。3.HIVgp160の発現pERK/EMCV/gp160167レプリコン実施例2Dをgp160遺伝子の発現およびVRP生成について分析した。上記に記載したとおり、レプリコン、GPヘルパーおよびキャプシドヘルパーのために精製RNAを調製した。RNAをVero細胞にエレクトロポレーションにより導入し、エレクトロポレーションの20~24時間後にVRPを収集した。IFAの結果およびVRPの滴定は表8にまとめた。比較のために、26Sプロモーターから直接的にgp160を発現するpERKレプリコンについても評価した。4.S.A.AR86レプリコンからのHIVGAGの発現キャップドレプリコンRNAを生成するために、SP6RiboMaxキットPromegaCorporation社;ウィスコンシン州マディソン;製品番号P1280を用いてpRep89/EMCV/gag342DNAをインビトロ転写した。RNeasy精製カラムQiagenCorporation社、メリーランド州ジャーマンタウンを製造業者の取扱説明書にしたがって用いてRNAを精製した。30μgのRep89/EMCV/gag342RNAを用いてVero細胞1×108細胞をエレクトロポレーションし、次にエレクトロポレーションの~18時間後にGagタンパク質発現について分析した。Rep89/EMCV/gag342エレクトロポレーションした細胞のanti-GagIFA分析はGagタンパク質発現について陽性であった。B.EV71-MSIRESレプリコンの発現各EV71-MS含有レプリコンからのCATタンパク質の発現をVero細胞内で実施した。キャップドレプリコンRNAを上述したとおり転写し、精製した。30μgのレプリコンRNAを用いてVero細胞2~3×107細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーションのおよそ18時間後にanti-CATCortexBiochem社、カリフォルニア州サンリアンドロおよびanti-VEEnsp2抗体AlphaVax社を用いるIFAによって分析した。さらに、CAT発現を上述したとおりELISAによって監視した。pERK/EMCV/CAT342およびpERK/MS/CAT342レプリコンから検出された活性を比較したIFAならびにCATELISAの結果は表9に示した。様々なスペーサーを用いたIRES指令翻訳A.レプリコン構築物1.EMCVIRES含有構築物正確に同一のスペーサー領域を含有する、EMCVまたはアンチセンス-EMCVIRES配列のどちらかをコードする対のレプリコン構築物を調製した。これらの比較は、センス方向におけるすなわち、配列がウイルス内で見いだされる5’-3’方向におけるEMCVIRES配列だけがキャップ構造非依存性翻訳を指令することを証明している;すなわち、IRESがアンチセンス方向にある場合は極めてわずかな翻訳しか発生せず、これはこれらの構築物内で有意なCAT発現を入手するには正しく方向付けられたIRESエレメントが必要とされることを示している。これらのレプリコン構築物は上述したとおりに調製した。各スペーサー-IRESレプリコンをインビトロ転写し、上述したとおりに30μgの各精製RNAを~1×107細胞のVero細胞内にエレクトロポレーションした。CATタンパク質発現はCATELISAによって監視し、その結果は表10にまとめた。これらのデータは、レプリコンがCAT遺伝子の上流でスペーサーおよびアンチセンスEMCVIRESを含有する場合はCATタンパク質発現が大きくほとんどの場合に>95減少したことを示している。その上、これらのデータは、IRES指令タンパク質発現系がNOIの発現レベルを最適化する能力を証明している。この最適化はNOI特異的であるが、本明細書に記載の教示を利用すれば、当業者にはいずれか所与のNOIのための所望の発現レベルを提供するスペーサー-IRESの組み合わせの同定は慣例的であろう。2.5’非コーディング領域由来のスペーサーの使用Cap5’Fおよび3-1.1pr1プライマー表11を用いてpH500A/Vcap由来のキャプシド配列をPCR増幅させることによって、全長VEEキャプシドタンパク質遺伝子を含有するようにpERKレプリコンを組み換えた。結果として生じたPCR産物をpERKのEcoRVおよびSphI制限酵素部位内に挿入した。市販で入手できるキットStratagene社を用いて部位指向性突然変異のために、さらにAscIFおよびAscIRプライマー表11を用いてキャプシド遺伝子の3’末端で固有のAscI制限酵素を含有するようにpERK/Capsidを修飾した。次にnsP4遺伝子内にアニーリングするフォーワードプライマー13-82.2.16およびAscI制限酵素部位を含有するように組み換えられているリバースプライマー表11を用いてpERK/Capsidからの配列のPCR増幅によってVEEキャプシド配列の連続切断を生成させた。ApaIおよびAscIまたはSwaIおよびAscIを用いてPCR産物を消化し、pERK/Capsid内へクローニングし戻してpERK/Cap200、pERK/Cap400およびpERK/Cap600を生成した。これらのレプリコンは、26Sプロモーターと挿入される下流構築物との間でスペーサーとして機能するためにキャプシド遺伝子の5’末端からの増加した量の配列を維持している。上述したpERK/Capベクター各々の中にEMCV/CATカセットを導入するために、AscI制限酵素を用いてpCDNA3.3/EMCV/CATDNAを消化して1303bpのEMCV/CAT断片を遊離させた。AscI消化EMCV/CAT断片を次にAscI直線化pERK/CapベクターDNA内にライゲートし、pERK/EMCV/CATCap200、pERK/EMCV/CATCap400およびpERK/EMCV/CATCap600を生成した。VEEキャプシド遺伝子の5’領域の部分を含有するこれらのレプリコンを直線化し、インビトロ転写し、Vero細胞内にエレクトロポレーションし、そしてIFAおよびELISAによってCATタンパク質発現について分析した。CATタンパク質発現はCAT特異的抗体を用いてIFAによって検証した;しかし免疫蛍光の強度は使用したキャプシド遺伝子スペーサーの長さに依存して変動した。これらの結果はCATELISAに反映された表12。B.ヘルパー構築物1.EMCVIRESを含む構築物VEE糖タンパク質遺伝子GPまたはVEEキャプシド遺伝子のどちらかを個別に発現するヘルパーを構築した。最初に、キャプシドおよびGPヘルパーを含有するスペーサー-IRESの構築を促進するために2つの空ヘルパー骨格ベクターを生成した。ApaIおよびRsrII制限酵素を用いてpERKベクターを消化することによって1つの空ヘルパーを生成して6989bpの非構造的タンパク質コーディング領域を除去した。T4DNAポリメラーゼを用いてこのDNAを処理して平滑末端を生成し、その後に非構造的遺伝子欠失pERKベクターをライゲートしてpH500Gを生成した。pH500G空ヘルパーはおよそ500ヌクレオチドの5’非コーディング領域NCRを含有していた。pERKベクターをSwaIおよびRsrII制限酵素を用いて消化することによって第2の空ヘルパーを生成して6449bpの非構造的タンパク質コーディング領域を除去した。T4DNAポリメラーゼを用いてこのDNAを処理して平滑末端を生成し、その後にそのDNAをライゲートしてpH1500Gを生成した。pH1500G空ヘルパーは、pH500Gヘルパー内には存在しない26Sプロモーターのすぐ上流に追加の540bpのnsp4遺伝子を含むおよそ1500ヌクレオチドの5’NCRを含有していた。さらにヌクレオチド3でGではなくむしろAをコードする空ヘルパー構築物を調製したpH500AおよびpH1500A。これらの構築物は、pH500GおよびpH1500Gにおける同一領域の代わりにヌクレオチド3でAを含有する、キャプシドヘルパーpH500A/Vcapからの5’NCR領域をサブクローニングすることによって調製した。これは、XbaIおよびSacI制限酵素を用いてpH500A/Vcapを消化し、430bp断片を収集し、それをXbaIおよびSacI消化pH500GおよびpH1500GDNA内にライゲートし、各々pH500AおよびpH1500Aを生成することによって遂行した。キャプシドおよびGP遺伝子を上述したとおりにBamHIおよびXbaI断片としてpCDNA3.3/EMCVおよびpKS-rep2/anti-EMCV内にクローニングした。EMCV/キャプシド、anti-EMCV/キャプシド、EMCV/GPおよびanti-EMCV/GPカセットは、上述したとおりにAscI断片としてのpH500G、pH500A、pH1500GおよびpH1500A空ヘルパー構築物内にクローニングした。各ヘルパーの配列は、その後の実験を開始する前に確認した。ランダムスペーサー断片は、前述したとおりに固有のEcoRV部位で各ヘルパー内の26SプロモーターとEMCVまたはanti-EMCVIRESとの間にクローニングした。挿入されたスペーサー断片の配列および長さを各新規ヘルパーについて決定し、スペーサーインサートの長さを構築物の名称の最後に含めた。スペーサー15、16、および22についてはそれ以上特性解析しなかった。構築物pH500A/EMCV/GPおよびpH500A/anti-EMCV/GPはスペーサーを含有していない。2.EMCVIRES含有GPおよび/またはキャプシドヘルパーの組み合わせを用いたパッケージングおよび力価様々な組み合わせのGPおよびキャプシドヘルパーを使用してHIV-GAGタンパク質、pERK-342/EMCV/gagを発現するVEEレプリコンをパッケージングしたこのレプリコンの構築の説明については実施例7を参照。表13に示した結果については、580Vおよび25μFで4パルスを用いて、0.8mLのエレクトロポレーションキュベット内のVero細胞内へ30μgの各RNAヘルパーおよび30μgのレプリコンRNAを共エレクトロポレーションし、そして細胞を室温で10分間にわたり回復させた。エレクトロポレーションした細胞は、抗生物質とともに50mLのEMEM10FBSを含有するT-175フラスコ内に播種し、37°Cでインキュベートした。20~24時間後、VEEレプリコン粒子VRPを収集し、免疫蛍光アッセイIFAを用いてGAGタンパク質発現を測定することによって96ウエルプレート内のVero細胞上で滴定した。各エレクトロポレーションからのVRP収率表13は、比較のためにIU/mLベースで表示した。他の実験では、GPヘルパーRNAの量はエレクトロポレーション環境において変動した;VRP生成についての他の全部の条件は上述したとおりであった。結果は表14に示した。3.スペーサーを含まない26S-IRESGPヘルパーこの実験は、翻訳からの転写を解除するためにGPヘルパーにおいてスペーサーが必要かどうかを判定するために実施した。Vero細胞は、下記の混合物各々を用いて個別にエレクトロポレーションした。a.Gagレプリコンベクター実施例6を参照pH500A/anti-EMCV/GPpH500A/anti-EMCV/Vcap291b.GagレプリコンベクターpH500A/EMCV/GPpH500A/EMCV/Vcap291前述のとおりにVRP生成を可能にするために細胞をインキュベートし、VRPを採取し、IFAによってVero細胞上で滴定した。センス方向にIRESを含むヘルパーの場合はb.混合物、VRP収率は3.3e6であった;IRESがアンチセンス方向に置かれているヘルパーの場合は、VRP収率は5.3e2であった。4.XIAPIRESを含有するVEEヘルパー構築物の生成および使用PFUpolStratagene社;カリフォルニア州ラホーヤおよびCap5’Fまたは13-87pr1フォーワードプライマーおよび3-1.1pr1リバースプライマー表2、実施例1Bを参照を用いてVEEキャプシドVcapおよび糖タンパク質VGP遺伝子をpH500A/VcapおよびpH500A/GP各々からPCR増幅させた。結果として生じたPCR産物をpKS-rep2のEcoRVおよびSphI部位内にクローニングした。この戦略は、XIAP遺伝子の野生型開始部位でVEE構造タンパク質開始コドンを再構成する。各プラスミド内のVEE構造タンパク質配列を全自動DNAシーケンシングによって検証し、結果として生じたプラスミドをインビトロ転写のために使用した。QiagenRNeasyカラムを用いてRNAを精製し、タンパク質の発現の分析およびパッケージングのためにVero細胞内にエレクトロポレーションした。全ヘルパーはIFAによって測定されたようにVEEキャプシドまたは糖タンパク質のどちらかを発現し、HIVGAGタンパク質を発現するVEEレプリコンについて回収された力価の範囲は1×105から総計1×107に及んだ。上述したXIAP1007-VEE構造タンパク質構築物をさらにまたApaI/SphIDNA断片としての第2ヘルパープラスミド、pH1500A内へクローニングすると、pH1500A/XIAP/Vcap1007およびpH1500A/XIAP/GP1007が生成した。これらのプラスミドを使用してRNAを作製し、上述したとおりにVero細胞内へエレクトロポレーションし、タンパク質発現およびVRPパッケージングを分析した。同様に、結果として生じたヘルパーはIFAによって測定したようにVEEキャプシドまたは糖タンパク質のいずれかを発現し、そして力価は総計1×108から1×109VRP超に及び、これは26SプロモーターからのサブゲノムmRNAの転写からの利得を証明していた。その中にレプリコンRNAをエレクトロポレーションにより導入したVero細胞から収集した全細胞RNAについてノーザン分析を実施した。スペーサー-IRESレプリコン構築物をインビトロ転写し、上述したとおりに、30μgのRNAeasyカラム精製RNAをおよそ1×107のVero細胞内にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションした細胞を10mLのDMEM培地中に再懸濁させ、次に7mLおよそ7×106細胞を1つの25cm2フラスコ内に播種した。エレクトロポレーションの16時間後にRNAwiz抽出キットAmbion社を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて細胞から全細胞RNAを収集した。RNAを定量し、各々の10μgを1グリオキサールアガロースゲル上でランし、その後で受動転移によってBrightstar-Plus膜Ambion社へ移した。RNAをその膜へUV架橋結合させ、45°Cで1時間かけてUltraHybAmbion社溶液を用いてブロッキングし、45°Cで3’UTRのVEEサブゲノムRNAIntegratedDNATechnologies社、アイオワ州コラルビルに対して特異的なビオニチル化アンチセンスプライマー3’UTR4Xビオチン、表1を含有するUltraHyb溶液を用いて一晩かけて調査した。一晩にわたるハイブリダイゼーション後にBrightstarBiodetectキットAmbion社を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて化学蛍光RNA検出そしてEpiChemiIIDarkroomUVPInc.社、カリフォルニア州アップランドを用いて視認した。pERK/EMCV/CAT257、pERK/anti-EMCV/CAT257、pERK/EMCV/CAT579、またはpERK/anti-EMCV/CAT579を用いてエレクトロポレーションしたVero細胞からのRNAのノーザン分析の結果は図1に示した。EMCVおよびanti-EMCVレプリコン構築物はどちらもほぼ同等の強度のサブゲノム転写産物を生成したが、これはスペーサー-anti-EMCV/CATレプリコン構築物からのCATタンパク質発現の欠如がサブゲノムRNAにおける実質的減少に起因していないことを示していた。HIVgag遺伝子IRES指令レプリコンベクターの構築HIVサブタイプCgag遺伝子を、上述したとおりに342bpのスペーサーpERK-342を含有するpERK/EMCVベクター内にクローニングした。プライマーGAG-FおよびGAG-R表1を用いてGag遺伝子をpERK/HIVgagDNAからPCR増幅させた。これらのプライマーは、PCR産物が5’および3’末端でこの部位をコードするようにBamHI制限部位を含有するように組み換えた。BamHI制限酵素を用いてPCR産物を消化し、BamHI直線化pCDNA3.3/EMCVDNA内へライゲートした。gag遺伝子の方向付けを制限分析によって決定し、正しい方向付けにある遺伝子を備える構築物を選択してpCDNA3.3/EMCV/gagを生成した。AscI制限酵素を用いてEMCV/gag遺伝子カセットをpCDNA3.3/EMCV/gagDNAから消化し、AscI直線化pERK-342DNA内にライゲートした。EMCV/gag遺伝子カセットの方向付けを制限分析によって決定し、正しい方向付けにある遺伝子を備える構築物を選択してpERK-342/EMCV/gagを生成した。その後の実験を開始する前にEMCV/gag領域の配列を検証した。IFAおよびウェスタンブロットによるgagタンパク質発現の分析は、pERK-342/EMCV/gagレプリコンにおけるIRESの指令下で発現したタンパク質は、翻訳および転写の両方が26SVEEサブゲノムプロモーターによって指令されるpERK/HIVgagレプリコンから発現したタンパク質から識別不能であることを示した。さらに、VRPを滴定することによって測定された発現レベルは、26Sプロモーター指令系に比較してIRES指令系を用いると増加した表15。IRES指令HIVgagレプリコン粒子が接種されたマウスにおける体液性および細胞性免疫反応pERK/EMCV/gag342レプリコンは、動物にワクチン接種されると強固な体液性および細胞性反応を惹起する。4~5週齢の雌性BALB/cマウスをCharlesRiver社から入手し、あらゆる手順の前に1週間にわたり馴化させた。プライムおよびブーストのために、複数のマウス群の左右両方の足蹠にイソフルオレン麻酔下で1v/vヒト血清アルブミンおよび5w/vスクロースを含むPBSを含有する希釈液中のVRPを5×105IFUの目標用量で接種した。足蹠注射は、30.5G注射針および0.100mLのHamiltonシリンジを用いて各後足蹠に20μLを注射することによって実施した。血清サンプルは、第1回接種前出血前の第0日、第21日第1回接種20日後および第29日ブーストの7日後にイソフルオレン麻酔下で眼窩後出血により入手した。ワクチン接種スケジュールは表16にまとめられている。IFN-γELISPOTアッセイのために、ブーストの14日後に脾臓を採取した。A.ワクチン接種後に実施された免疫学的アッセイGagELISA:抗原コートとしてHIV-1サブタイプC単離物DU-422由来の精製組み換えヒスチジン標識his-p55を使用した。血清を標準間接的ELISAによってGag特異的抗体の存在について評価した。GagELISPOTアッセイ:anti-IFN-γモノクローナル抗体AN18ラットIgG1、MabTech社、オハイオ州マリーモントをプレコートしたMultiscreenImmobilon-PELISPOTプレートELISPOT認定96-ウエル濾過プレート、Millipore社、マサチューセッツ州ベッドフォード内の個別ELISPOTアッセイウエル内へ脾臓から採取した生育可能なリンパ球を播種し、そして16~20時間にわたりインキュベートした。バッファーを用いた複数回の洗浄によって細胞を取り出し、ウエルをビオチニル化anti-IFN-γモノクローナル抗体R4-6A2ラットIgG1、MabTech社と一緒にインキュベートし、その後に洗浄し、アビジン-ペルオキシダーゼ複合体VectastainABCPeroxidaseキット、VectorLaboratories社、カリフォルニア州バーリンゲームと一緒のインキュベーションを実施した。複合体が形成されるのを許容するために、二次抗体とのインキュベーション期間の完了する少なくとも30分前にアビジン-ペルオキシダーゼ複合体を調製し、室温で保存した。インキュベーション後、培養中に個々のIFN-γ分泌細胞の位置を表すスポットの形成を促進するためにウエルを洗浄して室温で4分間にわたり基質AEC錠剤、Sigma社と一緒にインキュベートした。蒸留水によるリンスによってスポット発生を停止させた。HIVgagVRPを用いて免役化させたマウス由来のリンパ球中のGag特異的IFN-γ分泌細胞を計数するために、免疫優性CD8CTLH-2Kd-制限HIV-GagペプチドAMQMLKETIまたはMHCクラスIに結合する非関連性HAインフルエンザ血球凝集素CD8CTLH-2Kd-制限ペプチドIYSTVASSLを用いて16~20時間にわたりリンパ球を刺激した37°Cで5CO2濃度。細胞からペプチドを抜いたものがバックグラウンドコントロールとして機能する。陽性コントロールとして、細胞を類似期間にわたり4μg/mLのコンカナバリンAを用いて刺激した。遊離末端を含むようにペプチドを合成し、NewEnglandPeptideによって>90へ精製した。HIVgagVRPの力価滴定:Vero細胞に感染させたHIVgagVRPのGag特異的IFAを使用してワクチンの力価または感染力価を測定した。力価は1mL当たりの感染単位IFU/mLとして測定した。各注射日に、残留接種材料を逆滴定して各動物が受容した実際の用量を測定した表17。ワクチン接種試験の結果は、anti-Gag抗体ELISAおよびGag特異的ELISPOTアッセイによって測定されたように、342/EMCV/gagVRPをワクチン接種した動物がHIV-Gagへの強い体液性および細胞性免疫反応を展開することを示している。数種の昆虫ウイルスIRES配列の活性を多数の昆虫細胞系内での哺乳動物ウイルスIRESEMCVの活性と比較した。26Sサブゲノム転写産物がバイシストロニックであるようにレプリコンベクターを設計した。26SサブゲノムRNAがキャッピングされているが、これはバイシストロニックRNA上の第1遺伝子クロラムフェニコール-アセチル-トランスフェラーゼCATの翻訳はキャップ構造依存性であり、第2遺伝子ルシフェラーゼLUCの翻訳がIRES配列依存性キャップ構造非依存性であることを意味している。シンドビスウイルスに基づくレプリコンベクターは、以下のエレメント:5’NCR、nsp1、2、3、4、26Sプロモーター、CAT遺伝子、IRES、LUC遺伝子、NCR3’を含有するように組み換えた。1つはエンドウヒゲナガアブラムシウイルスAcyrthosiphonpisumvirusAPV由来およびもう1つはムギクビレアブラムシウイルスRhopalosiphumpadivirusRhPV由来の2つの昆虫ウイルスIRES配列をCATおよびLUC遺伝子の間に組み換えた。比較するために、哺乳動物ウイルスIRESEMCVを同一シンドビスレプリコンベクター内のCATおよびLUC遺伝子間に組み換えた。SP6RNAポリメラーゼを用いて各レプリコン構築物のためのRNAおよびシンドビス構造タンパク質遺伝子キャプシド-E3-E2-6K-E1の全部をコードするRNAヘルパーをインビトロ転写した。ヘルパーRNAおよびバイシストロニックRNAの各々を8×106BHK-21細胞内へエレクトロポレーションにより導入することによって、シンドビスレプリコン粒子を調製した。溶媒を収集し、清浄化し、そして20蔗糖クッションを通して遠心分離することによってレプリコン粒子を精製した4°Cで3時間にわたり24,000RPM。ウサギanti-CAT抗体CortexBiochem社、カリフォルニア州サンリアンドロを用いてレプリコン粒子を滴定した。EMCVIRESに比較して昆虫ウイルスIRES配列の活性を測定するために、精製シンドビスレプリコンのバイシストロニック粒子を使用して培養中で増殖している様々な昆虫細胞を感染させた。これらの実験で使用した昆虫細胞は、Toxorhynchitesamboinensis、Anophelesalbimanusマラリア媒介蚊の一種、Anophelesgambiaeマラリア媒介蚊の一種、およびAedesalbopictusヒトスジシマカであった。昆虫細胞はレプリコンのバイシストロニック粒子を用いて0.1のMOIで感染させた。感染からおよそ16時間後に細胞溶解液を調製し、CATELISAキットRoche社、インディアナ州インディアナポリスを製造業者の取扱説明書にしたがって用いて溶解液中に存在するCATタンパク質の量を測定した。並行して、ルシフェラーゼアッセイキットRoche社を用いて溶解液中に存在するLUCタンパク質の量を測定した。2つの数値の比較を可能にするために各アッセイにおいて使用したタンパク質の量について各溶解液中で検出されたCATおよびLUCの量を正規化した表17。各細胞タイプにおいて検出されたCatタンパク質は、使用したレプリコンとは無関係に類似であった。これらのデータは、レプリコン粒子を含有する3種のIRES各々について細胞タイプ内で類似の感染効率が達成されること、したがって各細胞タイプ内で検出されたLUC活性がその細胞タイプ内のIRES配列の活性を直接的に反映することを示している。分析した昆虫細胞タイプの各々において、昆虫ウイルスIRESはEMCVIRESより高度の活性85~95以上を有していた表17。霊長類におけるIRESレプリコンに対する体液性および細胞性免疫反応メリーランド州フレデリックに所在するSouthernResearchInstituteでカニクイザルcynomolgusmacaqueにおいてVRPを含有するpERK/EMCV/gag342実施例6の免疫原性に関する試験も実施した。各ワクチンは皮下注射および筋肉内注射によって6匹の動物に投与した動物3匹/経路。動物は第0月および1カ月後に1×108個のワクチン粒子の接種を2回受けた。第2回接種の4週間後に体液性免疫反応を分析し実施例7Aに記載したとおり、表18に示した。比較のために、26SプロモーターpERK/gagから直接的にgagタンパク質を発現するVEEレプリコンについても評価した。本発明を特定の実施形態の特定の詳細を参照しながら記載してきたが、そのような詳細は添付の特許請求の範囲に含まれる範囲および程度を除いて本発明の範囲に関して制限されると見なされることは企図していない。本特許出願を通して、様々な特許、特許公報、雑誌出版物およびその他の出版物が参照されている。これらの出版物の開示は、本発明が関与する当分野の最新状態をより完全に記載するため、そしてこれらの参考文献がこの特許出願に現れる文章の主題についての文書による説明を提供するために、本特許出願に全体として参照して組み込まれる。"