"明細書に記載の発明。発明の要旨3p2l.3における腫瘍サプレッサー遺伝子は、現在開示されている:Gene26CACNA2D2Gaoら、2000、PL6、BetaBLU、LUCA-1HYALl、LUCA-2HYAL2、123F2RASSF1、Fus1、101F6、Gene21NPRL2、およびSEMA3。腫瘍増殖および腫瘍進行の抑制、アポトーシスの誘導、細胞周期動力学の変更、およびテロメラーゼ活性抑制における個々の3pの遺伝子の機能は、インビトロおよびインビボにおける3pの遺伝子のリポソーム媒介移入および組換えアデノウイルスベクター媒介移入によって特徴付けられた。これはまた、Beta遺伝子の最初の開示である。従って、3p2l.3の染色体位置を有する腫瘍サプレッサーを使用する方法を提供することが本発明の目的である。腫瘍サプレッサー、Betaを提供することがまた、目的である。さらに、これらの腫瘍サプレッサーが挿入され得る組換えアデノウイルスを構築する方法を提供することが目的の方法である。本発明の実施形態は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドである。配列番号1の配列を有する核酸がまた提供される。配列番号2のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドがさらに提供される。別の実施形態は、配列番号1の15の連続した塩基対またはこれの相補体を含む15~約100塩基対の核酸である。さらなる実施形態は、配列番号1の約20、25、30、40、50または100の連続した塩基対、またはこれの相補体を含む。本発明の別の実施形態は、配列番号2の10と約50との間の連続した残基を有する単離されたペプチドである。さらに、このペプチドは、配列番号2の15、20、25、または30の連続した残基を含み得る。本願において、約は、±2アミノ酸の以内であるとして定義される。なお別の実施形態は、配列番号2を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであり、ここで、このポリペプチドは真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下にある。別の実施形態において、この発現カセットのプロモーターは、コード配列に対して異種である。このプロモーターは、組織特異的かつ誘導的なプロモーターであり得る。別の実施形態において、発現カセットは、ウイルスベクターに含まれ得る。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターであり得る。さらなる実施形態において、この発現カセットはポリアデニル化シグナルを含み得る。別の実施形態は、配列番号2の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む細胞であり、ここで、このポリヌクレオチドは、真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に存在し、このプロモーターは、このポリヌクレオチドに対して異種である。本発明のなお別の実施形態は、配列番号2の配列を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントに免疫学的に結合するモノクローナル抗体である。検出可能な標識を有するモノクローナル抗体がまた、提供される。この標識は、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、および酵素であり得る。本発明の別の実施形態は、配列番号2を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞である。さらなる実施形態は、ポリクローナル抗血清であり、この抗血清の抗体は、配列番号2を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントに免疫学的に結合する。なお別の実施形態は、配列番号1を含むDNAセグメントまたはこの相補体に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されかつ精製された核酸である。さらなる実施形態において、この核酸は、約15、17、20または25の塩基長である。本発明の別の実施形態は、組換えアデノウイルスを構築する方法であって、この方法は、以下を包含する:aシャトルベクターを提供する工程であって、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリA配列を含む発現カセット、このプロモーターの制御下にある導入遺伝子、およびこのITR-プロモーター-導入遺伝子-ポリAセグメントの5’末端および3’末端の独特の制限部位を含む、工程;bこの制限酵素部位で切断する工程;cE1領域およびE3領域全体を欠くアデノウイルスベクターにこの放出されたセグメントを連結し、この得られたベクターで細菌性宿主細胞を形質転換する工程;dこの細菌性宿主細胞からベクターを得て、そしてこのベクターを消化してE1/E3欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程;およびeこのアデノウイルスゲノムをE1発現宿主細胞中にトランスフェクトする工程。さらなる実施形態において,この導入遺伝子は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3である。別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルスCMVプロモーターであり得、そしてこのポリA配列は、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列であり得る。本発明のなお別の実施形態は、組換えアデノウイルスを構築するための方法であって、この工程は、以下を含む:aシャトルベクターを提供する工程であって、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリAシグナル配列を含む発現カセット、このプロモーターの制御下にある導入遺伝子、テトラサイクリン耐性-off応答エレメントおよびこのIRT-プロモーター-導入遺伝子-ポリAセグメントの5’末端および3’末端の独特の制限部位を含む、工程;bこの制限酵素部位で切断する工程;cテトラサイクリン耐性-offトランス活性化因子遺伝子を含み、E1領域およびE3領域全体を欠くアデノウイルスベクターにこの放出されたセグメントを連結し、この得られたベクターで細菌性宿主細胞を形質転換する工程;dこの細菌性宿主細胞からベクターを得て、そしてこのベクターを消化してE1/E3欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程;およびeこのアデノウイルスゲノムをE1発現宿主細胞中にトランスフェクトする工程。さらなる実施形態において,この導入遺伝子は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3である。別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルスCMVプロモーターであり得、そしてこのポリA配列は、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列であり得る。なお別の実施形態において、シャトルベクターがまた提供され、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリA配列を含む発現カセット、Tet-Off応答エレメントおよびこのITR-プロモーター-ポリAセグメントの5’末端および3’末端の独特の制限部位を含む。本発明の別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルスCMVプロモーターであり、そしてこのポリA配列はウシ成長ホルモンBGHポリA配列である。上記のセグメント中の複数目的のクローニング部位がまた提供され、この部位は、上記のプロモーターと上記のポリA配列との間に位置付けられる。なお別の実施形態は、テトラサイクリン耐性off活性化因子遺伝子を含み、そしてE1領域およびE3領域の全体を欠くアデノウイルスベクターである。本発明の別の実施形態は、被験体における癌を診断する方法であって、以下の工程を包含する:iこの被験体から生物学的サンプルを得る工程;およびiiサンプル中の機能的な、Gene26産物、PL6産物、Beta産物、LUCA-l産物、LUCA-2産物、123F2産物、Fusl産物、101F6産物、Gene21産物、またはSEMA3産物の発現を評価する工程。さらなる実施形態において、このサンプルは、組織サンプルである。この組織サンプルは、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、腎臓組織、リンパ節、小腸組織、血液細胞組織、膵臓組織、結腸組織、胃組織、子宮頸部組織、胸部組織、子宮内膜組織、前立腺組織、精巣組織、卵巣組織、皮膚組織、頭頸部組織、食道組織、口腔組織、骨髄組織または血液組織であり得る。別の実施形態において、この評価する工程は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする核酸を検出する工程を包含する。検出する工程は、この核酸の増幅、核酸ハイブリダイゼーション、または配列決定を含み得る。別の実施形態において、この評価する工程は、Gene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、Betaポリペプチド、LUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fus1ポリペプチド、101F6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、またはSEMA3ポリペプチドを検出する工程を含む。Gene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、Betaポリペプチド、LUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fus1ポリペプチド、101F6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、またはSEMA3ポリペプチドを検出する工程は、ELISAまたは免疫組織化学を含み得る。なお別の実施形態において、この評価する工程は、野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み、このオリゴヌクレオチドはチップまたはウエハ上に配置される。本発明の別の実施形態において、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現は、正常組織中の、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現と比較される。別の実施形態において、この比較は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現のレベルを評価する工程を包含する。別の実施形態は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の機能的な対立遺伝子の1つまたは両方を欠失した非ヒトトランスジェニック動物である。類似の非ヒトトランスジェニック動物と比較して、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3を過剰発現する非ヒトトランスジェニック動物が提供される。さらなる実施形態は、ゲノムが、誘導的プロモーターの制御下にある、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3を含む発現カセットを含む、非ヒトトランスジェニック動物である。本発明の実施形態は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:この細胞を発現カセットに接触させる工程であって、この発現カセットは、以下:aGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする核酸;およびbこの腫瘍細胞で活性であるプロモーターを、この腫瘍細胞によるこの核酸の取り込みを可能にする条件下で含む工程。別の実施形態において、この腫瘍細胞は、以下に由来する:脳腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、脾臓腫瘍、腎臓腫瘍、リンパ節腫瘍、小腸腫瘍、血球腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、子宮頸部腫瘍、乳房腫瘍、子宮内膜腫瘍、前立腺腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、頭頸部腫瘍、食道腫瘍、口腔組織腫瘍、または骨髄腫瘍。さらなる実施形態において、この核酸は、ウイルスベクターに含まれる。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルぺスウイルスベクターであり得る。なお別の実施形態において、この核酸は、リポソームに含まれる。本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞の表現型を変更する工程であって、この方法は、以下の工程を包含する:この細胞を発現カセットに接触させる工程であって、この発現カセットは、以下:aGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする核酸;およびbこの腫瘍細胞で活性であるプロモーターを、この腫瘍細胞によるこの核酸の取り込みを可能にする条件下で含む工程。別の実施形態において、この表現型は、以下からなる群より選択される:増殖、移動、接触、阻害、軟寒天増殖、細胞周期、浸潤性、腫瘍形成、および転移性潜在能力。なお別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルスCMVプロモーターである。別の実施形態は、癌に苦しむ被験体中の癌を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:aGene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、Betaポリペプチド、LUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fus1ポリペプチド、101F6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、またはSEMA3ポリペプチドをコードする核酸;およびbこの被験体の腫瘍細胞で活性なプロモーターを含む発現カセットを被験体に投与する工程であって、これによってこのポリペプチドの発現が癌を阻害する、工程。さらなる実施形態において、この被験体は、ヒトである。他の実施形態において、この核酸は、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする。別の実施形態において、この癌は、以下からなる群より選択される:脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血球癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、口腔組織癌、および骨髄癌。なお別の実施形態において、この発現カセットは、ウイルスベクターに含まれる。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ならびにヘルペスウイルスベクターであり得る。別の実施形態において、この発現カセットは、リポソームに含まれる。別の実施形態において、この発現カセットは、ポリA配列をさらに含む。このポリA配列は、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列であり得る。さらなる実施形態において、この発現カセットが、腫瘍内、腫瘍脈管構造内、腫瘍に対する局部、腫瘍の領域に、または全身的に投与される。この被験体に化学療法剤を投与することがまた、癌を阻害する方法において提供される。別の実施形態において、この化学療法は、シスプラチンCDDP、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォファミドifosfamide、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレアnitrosurea、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシンplicomycin、マイトマイシン、エトポシドVP16、タモキシフェン、ラロキシフェンraloxifene、エストロゲンレセプター結合試薬、タキソール、ゲムシタビエンgemcitabien、ナベルビンnavelbine、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビターfrnesyl-proteintansferaseinhibitor、トランスプラチナtransplatinum、5-フルオロウラシル、ビンクリスチンvincristin、ビンブラスチンおよびメトトレキサート。被験体に放射線を与える工程がまた、提供される。別の実施形態において、この放射線は、癌部位に対して局所的に送達されるか、または全身照射である。この放射線は、γ線、X線、加速したプロトン、マイクロ波放射、UV放射、または、腫瘍細胞に対する指向された放射性同位体の送達を含み得る。なお別の実施形態において、第二の抗癌遺伝子が、被験体に投与され得る。この第二の抗癌遺伝子は腫瘍サプレッサーであり得る。この第二の抗癌遺伝子は、アポトーシスのインヒビターであり得る。別の実施形態において、この第二の抗癌遺伝子は、癌遺伝子アンチセンス構築物であり得る。本発明の実施形態は、癌を有する被験体を処置する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:Gene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、Betaポリペプチド、LUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fusiポリペプチド、101F6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、SEMA3ポリペプチドを被験体に投与する工程。別の実施形態において、この癌は、以下からなる群より選択される:脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血球癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、口腔組織癌、および骨髄癌。さらなる実施形態において、このポリペプチドは、リポソームに含まれる。このリポソームは、N-1-[2,3-ジオレオイルオキシ]プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムDOTAPおよびコレステロールからなり得る。別の実施形態において、この被験体は、ヒトである。本発明の別の実施形態は、抗腫瘍活性のために候補物質をスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:i機能的な、Gene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、BetaLUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fusiポリペプチド、101F’6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、またはSEMA3ポリペプチドを欠く細胞を提供する工程;iiこの細胞を、この候補物質と接触させる工程;およびiiiこの細胞におけるこの候補物質の効果を決定する工程。別の実施形態において、この細胞は、腫瘍細胞である。別の実施形態において、この決定する工程は、候補物質の存在下にあるこの細胞の1以上の特徴を、この候補物質の非存在下にある類似の細胞の同じ1以上の特徴と比較する工程を包含し得る。さらなる実施形態において、この特徴は、以下からな群より選択される:Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、SEMA3の発現、ホスファターゼ活性、増殖、転移、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期調節、腫瘍形成、腫瘍進行、転移、および組織浸潤。別の実施形態において、この候補物質は、化学療法剤または放射線療法剤である。低分子ライブラリーから選択される候補物質がまた、提供される。さらなる実施形態において、この細胞は、インビトロまたはインビボで接触される。本発明の実施形態は、抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:i細胞を提供する工程;iiこの細胞を、この候補物質と接触させる工程;およびiiiGene26ポリペプチド、PL6ポリペプチド、Betaポリペプチド、LUCA-1ポリペプチド、LUCA-2ポリペプチド、123F2ポリペプチド、Fus1ポリペプチド、101F6ポリペプチド、Gene21ポリペプチド、またはSEMA3ポリペプチドの発現における、この候補物質の効果を決定する工程。別の実施形態は、宿主細胞中にBetaポリペプチドを生成する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:aこの宿主細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結したBetaをコードする核酸を含む発現カセットを提供する工程;bこの発現カセットをこの宿主細胞に移入する工程;およびcこのBetaポリペプチドの発現を可能にする条件下でこの宿主細胞を培養する工程。本発明のなお別の実施形態は、被験体の癌を診断する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する:iこの被験体から生物学的サンプルを得る工程;およびiiGene26、PL6、Beta、LUCA-l、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3のプロモーター領域の過剰メチル化を検出する工程。本発明の他の、目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変は、この詳細な説明から当業者にとって明らかとなるからである。配列の要約配列番号1=BetaBLUヌクレオチド配列配列番号2=BetaBLUアミノ酸配列例えば、本発明は以下の項目を提供する。項目1配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。項目2前記ポリヌクレオチドが、配列番号1の核酸配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。項目3配列番号2のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。項目4配列番号1の15の連続する塩基対、またはその相補体を含む、15~約100の塩基対の核酸。項目5配列番号1の約20の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目6配列番号1の約25の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目7配列番号1の約30の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目8配列番号1の約40の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目9配列番号1の約50の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目10配列番号1の約100の連続する塩基対、またはその相補体を含む、項目4に記載の核酸。項目11配列番号2の、10と約50との間の連続する残基を有する、単離されたペプチド。項目12配列番号2の15の連続する残基を含む、項目11に記載のペプチド。項目13配列番号2の20の連続する残基を含む、項目11に記載のペプチド。項目14配列番号2の25の連続する残基を含む、項目11に記載のペプチド。項目15配列番号2の30の連続する残基を含む、項目11に記載のペプチド。項目16配列番号2の50の連続する残基を含む、項目11に記載のペプチド。項目17配列番号2の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットであって、該ポリヌクレオチドが、真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下にある、発現カセット。項目18前記プロモーターが前記コード配列に対して異種である、項目17に記載の発現カセット。項目19前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求項18に記載の発現カセット。項目20前記プロモーターが誘導性プロモーターである、項目18に記載の発現カセット。項目21前記発現カセットがウイルスベクターに含まれている、請求項18に記載の発現カセット。項目22前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、項目21に記載の発現カセット。項目23前記発現カセットが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目17に記載の発現カセット。項目24配列番号2の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、細胞であって、該ポリヌクレオチドが、真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下にあり、該プロモーターが、該ポリヌクレオチドに対して異種である、細胞。項目25配列番号2を含むポリペプチド、またはその免疫学的フラグメントに免疫学的に結合する、モノクローナル抗体。項目26前記抗体が、検出可能な標識をさらに含む、項目25に記載のモノクローナル抗体。項目27前記標識が、蛍光標識、化学発光標識、放射線標識、および酵素からなる群より選択される、項目26に記載のモノクローナル抗体。項目28配列番号2を含むポリペプチド、またはその免疫学的フラグメントに免疫学的に結合するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。項目29ポリクローナル抗血清であって、該ポリクローナル抗血清の抗体が、配列番号2を含むポリペプチド、またはその免疫学的フラグメントに免疫学的に結合する、ポリクローナル抗血清。項目30高ストリンジェンシーな条件下で、配列番号1を含むDNAセグメント、またはその相補体にハイブリダイズする、単離および精製された核酸。項目31前記核酸が約15塩基長である、項目30に記載の核酸。項目32前記核酸が約17塩基長である、項目30に記載の核酸。項目33前記核酸が約20塩基長である、項目30に記載の核酸。項目34前記核酸が約25塩基長である、項目30に記載の核酸。項目35組換えアデノウイルスを構築するための方法であって、以下:aシャトルベクターを提供する工程であって、該シャトルベクターが、アデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリA配列を含む発現カセット、該プロモーターの制御下にある導入遺伝子、ならびにITR-プロモーター-導入遺伝子-ポリAセグメントの5’末端および3’末端における独特の制限部位を含む、工程。;b該制限酵素部位を切断する工程;c放出されたセグメントを、E1領域およびE3領域の全体を欠くアデノウイルスベクターに連結し、そして得られるベクターを細菌宿主細胞に形質転換する工程;d該細菌宿主細胞からベクターを得、そして該ベクターを消化して、E1/E3欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程;ならびにe該アデノウイルスゲノムをE1発現宿主細胞にトランスフェクトする工程、を包含する、方法。項目36前記導入遺伝子が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3である、項目35に記載の方法。項目37前記プロモーターがサイトメガロウイルスCMVプロモーターであり、そして前記ポリA配列が、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列である、項目35に記載の方法。項目38組換えアデノウイルスを構築するための方法であって、以下:aアデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリAシグナル配列を含む発現カセット、該プロモーターの制御下にある導入遺伝子、テトラサイクリン耐性off応答性エレメント、ならびにIRT-プロモーター-導入遺伝子-ポリAセグメントの5’末端および3’末端における独特の制限部位を含む、シャトルベクターを提供する工程;b該制限酵素部位を切断する工程;c放出されたセグメントを、テトラサイクリン耐性offトランス活性化遺伝子を含み、そしてE1およびE3領域の全体を欠く、アデノウイルスベクターに連結し、そして得られるベクターを、宿主細胞に形質転換する工程;d該細菌宿主細胞からベクターを得、そして該ベクターを消化して、E1/E3欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程;ならびにe該アデノウイルスゲノムをE1発現宿主細胞にトランスフェクトする工程、を包含する、方法。項目39前記導入遺伝子が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3である、項目38に記載の方法。項目40前記プロモーターが、サイトメガロウイルスCMVプロモーターであり、そして前記ポリA配列が、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列である、項目38に記載の方法。項目41アデノウイルス逆方向末端反復ITR配列、プロモーターおよびポリA配列を含む発現カセット、TetR-Off応答性エレメント、ならびにITR-プロモーター-ポリAセグメントの5’末端および3’末端における独特の制限部位を含む、シャトルベクター。項目42前記プロモーターが、サイトメガロウイルスCMVプロモーターであり、そして前記ポリA配列が、ウシ成長ホルモンBGHポリA配列である、項目41に記載のシャトルベクター。項目43前記セグメントにおいて、前記プロモーターと前記ポリA配列との間に位置する多目的クローニング部位をさらに含む、項目41に記載のシャトルベクター。項目44テトラサイクリン耐性offトランス活性化遺伝子を含み、そしてE1領域およびE3領域の全体を欠く、アデノウイルスベクター。項目45被験体において癌を診断する方法であって、以下の工程:i該被験体から生物学的サンプルを得る工程;ならびにiiGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の機能的産物の、サンプル中での発現を評価する工程、を包含する、方法。項目46前記サンプルが組織サンプルである、項目45に記載の方法。項目47前記組織サンプルが、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織、骨髄および血液組織からなる群より選択される、項目46に記載の方法。項目48前記評価する工程が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする核酸を検出する工程を包含する、項目45に記載の方法。項目49前記検出する工程が、前記核酸を増幅する工程を包含する、項目48に記載の方法。項目50前記検出する工程が、核酸ハイブリダイゼーションを包含する、項目48に記載の方法。項目51前記検出する工程が、配列決定する工程を包含する、請求項48に記載の方法。項目52前記評価する工程が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3ポリペプチドを検出する工程を包含する、項目45に記載の方法。項目53ELISAをさらに包含する、項目52に記載の方法。項目54免疫組織化学をさらに包含する、項目52に記載の方法。項目55前記評価する工程が、野生型または変異体のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを包含し、そして該オリゴヌクレオチドが、チップまたはウエハ上にアレイに配置される、項目45に記載の方法。項目56Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現を、正常サンプルにおけるGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現と比較する工程をさらに包含する、項目45に記載の方法。項目57前記比較する工程が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現のレベルを評価する工程を包含する、項目56に記載の方法。項目58少なくとも1つのGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21,またはSEMA3の機能的対立遺伝子を欠く、非ヒトトランスジェニック動物。項目59前記動物が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の機能的対立遺伝子の両方を欠く、項目58に記載の非ヒトトランスジェニック動物。項目60類似の非トランスジェニック動物と比較して、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3を過剰発現する、非ヒトトランスジェニック動物。項目61非ヒトトランスジェニック動物であって、該非ヒトトランスジェニック動物のゲノムが、誘導性プロモーターの制御下にある、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3を含む発現カセットを含む、非ヒトトランスジェニック動物。項目62腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、該細胞を、以下:aGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする、核酸;およびb該腫瘍細胞において活性な、プロモーター、を含む発現カセットと、該腫瘍細胞による該核酸の取り込みを可能にする条件下で接触させる工程を包含する、方法。項目63前記腫瘍細胞が、脳腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、脾臓腫瘍、腎臓腫瘍、リンパ節腫瘍、小腸腫瘍、血液細胞腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、子宮頸部腫瘍、乳房腫瘍、子宮内膜腫瘍、前立腺腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、頭頸部の腫瘍、食道腫瘍、口腔組織腫瘍、ならびに骨髄腫瘍からなる群より選択される腫瘍由来である、項目62に記載の方法。項目64前記核酸がウイルスベクターに含まれている、項目62に記載の方法。項目65前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、項目64に記載の方法。項目66前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、項目65に記載の方法。項目67前記核酸がリポソームに含まれている、項目62に記載の方法。項目68腫瘍細胞の表現型を変更する方法であって、該細胞を、以下:aGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3をコードする、核酸;およびb該腫瘍細胞において活性な、プロモーター、を含む発現カセットと、該腫瘍細胞による該核酸の取り込みを可能にする条件下で接触させる工程を包含する、方法。項目69前記表現型が、増殖、移動、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期決定、侵襲性、腫瘍形成、および転移可能性からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。項目70前記プロモーターがサイトメガロウイルスCMVプロモーターである、項目68に記載の方法。項目71癌を罹患する被験体において、癌を阻害する方法であって、該被験体に、以下:aGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3ポリペプチドをコードする、核酸;およびb該被験体の腫瘍細胞において活性な、プロモーター、を含む発現カセットを投与し、これによって、該ポリペプチドの発現が該癌を阻害する工程を包含する、方法。項目72前記被験体がヒトである、項目71に記載の方法。項目73前記核酸がGene26をコードする、項目71に記載の方法。項目74前記核酸がPL6をコードする、項目71に記載の方法。項目75前記核酸がBetaをコードする、項目71に記載の方法。項目76前記核酸がLUCA-1をコードする、項目71に記載の方法。項目77前記核酸がLUCA-2をコードする、項目71に記載の方法。項目78前記核酸が123F2をコードする、項目71に記載の方法。項目79前記核酸がFus1をコードする、項目71に記載の方法。項目80前記核酸が101F6をコードする、項目71に記載の方法。項目81前記核酸がGene21をコードする、項目71に記載の方法。項目82前記核酸がSEMA3をコードする、項目71に記載の方法。項目83前記癌が、脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血液細胞癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部の癌、食道癌、口腔組織癌、ならびに骨髄癌からなる群より選択される、項目71に記載の方法。項目84前記発現カセットが、ウイルスベクターに含まれている、項目71に記載の方法。項目85前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、項目84に記載の方法。項目86前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、項目85に記載の方法。項目87前記発現カセットがリポソームに含まれている、項目71に記載の方法。項目88前記発現カセットが、ポリA配列をさらに含む、項目71に記載の方法。項目89前記ポリA配列がウシ成長ホルモンBGHポリA配列である、項目88に記載の方法。項目90前記発現カセットが、腫瘍内に、腫瘍脈管構造内に、腫瘍に局在させて、腫瘍に局所的に、または全身に投与される、項目71に記載の方法。項目91前記被験体に化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、項目71に記載の方法。項目92前記化学療法剤が、シスプラチンCDDP、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンplicomycin、マイトマイシン、エトポシドVP16、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソールtaxol、ゲムシタビンgemcitabien、ナベルビンnavelbine、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランス白金transplatinum、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサートを含む、項目91に記載の方法。項目93前記被験体に放射線を投与する工程をさらに包含する、請求項71に記載の方法。項目94前記放射線が、癌の部位に局所的に送達される、項目93に記載の方法。項目95前記放射線が全身放射線である、項目93に記載の方法。項目96前記放射線が、γ線、X線、加速されたプロトン、マイクロ波放射線、UV放射線、または腫瘍細胞に指向された放射性同位体の送達を含む、項目93に記載の方法。項目97前記被験体に、第2の抗癌遺伝子を投与する工程をさらに包含する、項目71に記載の方法。項目98前記第2の抗癌遺伝子が、腫瘍サプレッサーである、請求項97に記載の方法。項目99前記第2の抗癌遺伝子が、アポトーシスのインヒビターである、項目97に記載の方法。項目100前記第2の抗癌遺伝子が、癌遺伝子アンチセンス構築物である、項目97に記載の方法。項目101癌を有する被験体を処置する方法であって、該被験体に、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3ポリペプチド.投与する工程を包含する、方法。項目102前記癌が、脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血液細胞癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部の癌、食道癌、口腔組織癌、ならびに骨髄癌からなる群より選択される、項目101に記載の方法。項目103前記ポリペプチドがリポソーム内に含まれる、項目101に記載の方法。項目104前記リポソームが、N-1-[2,3-ジオレオイルオキシ]プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムDOTAPおよびコレステロールから構成される、項目103に記載の方法。項目105前記被験体がヒトである、項目101に記載の方法。項目106抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程:iGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の機能的ポリペプチドを欠く細胞を提供する工程;ii該細胞を、該候補物質と接触させる工程;およびiii該細胞に対する該候補物質の影響を決定する工程、を包含する、方法。項目107前記細胞が腫瘍細胞である、項目106に記載の方法。項目108前記決定する工程が、前記候補物質の存在下での前記細胞の1つ以上の特徴を、該候補物質の非存在下での類似の細胞の同じ1つ以上の特徴と比較する工程を包含する、項目106に記載の方法。項目109前記特徴が、Gene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3の発現、ホスファターゼ活性、増殖、転移、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期調節、腫瘍形成、腫瘍抑制、転移および組織侵襲である、請求項108に記載の方法。項目110前記候補物質が、化学療法剤または放射線治療剤である、項目106に記載の方法。項目111前記候補物質が、低分子ライブラリーから選択される、項目106に記載の方法。項目112前記細胞がインビトロで接触される、項目105に記載の方法。項目113前記細胞がインビボで接触される、項目106に記載の方法。項目114抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程:i細胞を提供する工程;ii該細胞を、該候補物質と接触させる工程;およびiiiGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3のポリペプチドの発現に対する、該候補物質の影響を決定する工程、を包含する、方法。項目115宿主細胞においてBetaポリペプチドを産生する方法であって、以下:a該宿主細胞において活性なプロモーターに作動可能に結合したBetaをコードする核酸を含む発現カセットを提供する工程;b該発現カセットを該宿主細胞に移入する工程;およびc該宿主細胞を、該Betaポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、を包含する、方法。項目116被験体において癌を診断する方法であって、以下の工程:i該被験体から生物学的サンプルを得る工程;およびiiGene26、PL6、Beta、LUCA-1、LUCA-2、123F2、Fus1、101F6、Gene21、またはSEMA3のプロモーター領域の、過剰のメチル化を検出する工程、を包含する、方法。以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証することが意図される。本発明はまた、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの1つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。発明の詳細な説明腫瘍サプレッサー遺伝子TSGは、ヒト肺癌および他の癌の病因において主要な役割を果たす。肺癌細胞は、複数の公知の優性および劣性の癌遺伝子における変異および欠失を有するSekidoら、1998、Virmaniら、1998。肺癌において変化されていることが見出されている他のTSGは、p53、p16、Rb、およびFHIT-1Mabryら、1998である。公知のTSG例えば、Rb、p53などは、染色体領域3p、5q、6p、8p、9pおよび11p、ならびに他の部位に見出されているSekidoら、1998、Gazdarら、1994、Minnaら、1994。新鮮な肺腫瘍および腫瘍細胞の細胞遺伝子学研究および対立遺伝子型決定研究は、複数の部位での腫瘍細胞対立遺伝子欠損を示し、これは、1以上のこのようなTSGの存在を示唆するSekidoら、1998、Virmaniら、1998、Gazdarら、1994、Minnaら、1997。これらの遺伝子座は、喫煙者の肺癌に対する素因を理解するにおいて重要であるMabryら、1998。ヘテロ接合性の損失LOHは、他の固形腫瘍と同様に、肺癌において一般的である。肺癌においてヘテロ接合性の損失を受ける染色体遺伝子座のいくつかは、以下である:9p21-p22、13q14、17p13.1、3p12-p14、3p21、3p25、5q21、11q12-q24および22q。肺癌に対する脆弱性は、複数の遺伝子座で生じる遺伝的差異に起因し得る。これらの遺伝子は、タバコの発癌物質の代謝において役割を果たし得る。第3染色体のショートアーム3p上の細胞遺伝的変化および対立遺伝子の損失は、最も頻繁には、小細胞肺癌SCLSの約90において、および50を超える非小細胞肺癌NSCLCにおいて関与することが示されているSekidoら、1998、Gazdarら、1994、Minnaら、1997、Dalyら、1993。さらに、より小さい3pの変化は、いくつかの他の癌例えば、腎Bernuesら、1998、Zbarら、1987、胸部Gazdar,1998、Sekidoら、1998、頭頸部Buchhagenら、1996、膵臓Gorunovaら、1998、腎臓Hughsonら、1998、口腔Uzawaら、1998、および子宮頸癌Kersemaekerら、1998、Wistubaら、1997において確認されている。近年、ヒト染色体帯3p21.3が、いくつかのSCLC株およびNSCLC株において重複するホモ接合性欠失を受けることが示された。TSGの候補は、いくつかのヒトの癌において、この重要な領域に位置付けられ、これは、さらにTSG領域を規定するSekidoら、1998、Minnaら、1997、Wistubaら、1999、vandenBergら、1997。この証拠は、この3p21の重要な領域における遺伝子が、肺癌細胞、腎癌細胞および乳癌細胞におけるテロメラーゼ媒介性の細胞不死化経路の調節に関与することを示すShay、1997、Shay、1998。細胞ハイブリッドおよび微小核体第3染色体移入研究は、ヒト肺癌細胞株、腎癌細胞株および卵巣癌細胞株において悪性を抑制するヒトの第3染色体遺伝子の能力を実証しているSekidoら、1998、Sanchezら、1994。3p欠失が、喫煙患者の肺腫瘍組織においてより頻繁に生じることも示されている。さらに、3p21.3での発癌物質ベンゾ[a]ピレンジオールエポキシドに対する感受性の上昇が、肺癌の危険性の増加に関連付けられ、これは、3p21.3が、肺癌における発癌物質の分子標的であり得ることを示唆するWuら、1998。本発明は、肺癌に関与する遺伝子座を同定する。肺癌におけるホモ接合性欠失によって定義されるような、TSGのグループFus1、101F6、Gene21、Gene26、PL6、Luca1、Luca2、123F2、BetaおよびSEMA3は、3p21.3において450kb領域中に位置付けられそして単離されているSekidoら、1998、Minnaら、1997、Hungら、1997、Sekidoら、1996、Wistubaら、1999。肺癌新生物発生前の研究は、3p21対立遺伝子欠損が、これまでに検出された中で、肺癌において最も早期の遺伝子異常であることを示す。1以上の3p劣性癌遺伝子は、多くのヒトの癌肺癌を含むの分子性病因におけるゲートキーパーとして機能し、おそらく、全症例の50を超えて関与しているSekidoら、1998、Minnaら、1997、Hungら、1997、Sekidoら、1996、Wistubaら、1999、Kohnoら、1999、Wistubaら、1999図3。13p21.3において450kb領域中に位置付けられた3p遺伝子が、肺癌におけるホモ接合性欠失によって規定され;23p21対立遺伝子欠損が、肺癌および他の腫瘍において検出された最も早期の遺伝子異常のうちの1つであり;3これらの3p遺伝子のヘテロ接合性の欠損、ホモ接合性欠失および異常が、肺癌を含む多くのヒトの癌の病因に関連しおそらく、前症例の50を超えて関与している;そして4複数の3p遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子として機能するか、またはこの3p21.3領域が腫瘍サプレッサー領域として機能するので、これらの3p遺伝子の遺伝的/細胞遺伝的な状態および機能に基づいて開発された技術および分子ツールは、種々のヒトの癌の早期検出、診断、およびモニタリング、ならびに予防および治療的試行のために極めて価値がある。I.腫瘍サプレッサー遺伝子領域としての3p遺伝子の機能腫瘍サプレッサー遺伝子として遺伝子の機能を規定するための基準の1つは、それらの遺伝子の不活性化によって特徴付けられる腫瘍表現型が、これらの遺伝子の野生型対立遺伝子の置換によってレスキューされ得ることを実証することである。頻繁なヘテロ接合性の欠損LOH、ホモ接合性欠失、またはいくつかの場合において、遺伝子の異常な転写物および変異が、発癌物質の標的であり、そしてその遺伝子の機能の欠損が、ヒトの癌を導く場合、野生型遺伝子でのそれらの異常な遺伝子の置換が、Rbまたはp53腫瘍サプレッサー遺伝子によって示される腫瘍抑制と同様の腫瘍抑制インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍形成能および腫瘍増殖の抑制、ならびにインビボでの腫瘍細胞の浸潤および転移の阻害を含むを生じるPellegataら、1996、Polyaら、1996、Wangら、1996。腫瘍サプレッサー遺伝子としての3p遺伝子の同定は、複数の部位での腫瘍細胞対立遺伝子欠損およびこれらの領域におけるホモ接合性欠失を示す、新鮮な腫瘍および腫瘍細胞株の細胞遺伝学的研究および対立遺伝子型決定研究に基づいた。これらの3p遺伝子のいくつかは、現在利用可能なデータベース中のいくつかの公知の遺伝子に対して、DNAおよびその推定アミノ酸配列における種々の程度の相同性を共有するが;癌の病因および腫瘍形成能におけるこれらの3p遺伝子または3p21.3領域の機能は、以前は未知であった。細胞ハイブリッドおよび微小核体第3染色体移入研究は、ヒト肺癌細胞株、腎癌細胞株および卵巣癌細胞株、ならびにマウスA9線維肉腫細胞において悪性を抑制する、ヒトの第3染色体遺伝子の能力を実証しているが、A549ヒト肺癌細胞への第3染色体全体の導入に関連する1例のみが、報告されているだけであるMinnaら、1997、Sanchezら、1994、Killaryら、1992、Killaryら、1995、Satohら、1993。本発明において、腫瘍増殖および腫瘍進行の抑制、アポトーシスの誘導、細胞周期運動の改変、ならびにテロメラーゼ活性の抑制における個々の3p遺伝子の機能が、インビトロおよびインビボでの3p遺伝子のリポソーム媒介移入および組換えアデノウイルスベクター媒介移入によって初めて特徴付けられ、そして腫瘍サプレッサー領域としての3p遺伝子の機能の概念が、この重要な3p21.3領域における複数の3p遺伝子に関与する腫瘍サプレッサー活性に基づいて初めて展開された。これらの3p腫瘍サプレッサーの知見は、関連する癌を処置するための新しい治療剤の開発を可能にする。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボでの最も効率的な遺伝子送達系であることが見出されているAdamsら、1996、Fangら、1999。組換えアデノウイルスベクターは、基本研究の遺伝子移入および臨床適用のために広範に使用されているRothら、1998、Roth、1998、Chengalvalaら、1991。しかし、アデノウイルスDNAのインビトロ操作は、その大きいゲノムサイズおよび限定された固有かつ有用な制限部位これらが、組換えアデノウイルスベクターの構築を、比較的時間のかかる労力を要するものにするに起因して、非常に困難である。このような組換えアデノウイルスを構築するための以下の2つの従来の方法が、よく実証されている:インビトロ連結法Berkner,1998およびインビボ相同組換え法Bettら、1994。インビトロ連結法は、導入遺伝子をプラスミドベクターにサブクローニングして、ウイルスゲノムの左末端および哺乳動物遺伝子発現カセットを含むセグメントを構築する第1の工程からなり、次いで、組換えベクターが、ウイルスゲノムへのそのセグメントのインビトロ連結によって生成され、次いで、再構築された組換えウイルス分子を許容性の293細胞にトランスフェクトする。HiroyukiおよびKayは、インビトロ連結法を開示するMizuguchiら、1998。もう一方の方法は、重複するフラグメントを有する2つのプラスミドを使用して、293細胞における相同組換えによる相同組換えによって組換えウイルスを生成する。これらの方法についての主要な制限は、非組換えウイルスのバックグラウンドの生成、インビボ相同組換えの低い頻度、および純粋な組換えベクターを単離するための繰り返しのプラークスクリーニングである。293細胞において同時トランスフェクトされた2つのプラスミドの相同組換えBettら、1994、酵母細胞中の感染性酵母人工染色体YACにおけるアデノウイルスゲノムの標的化された改変Ketnerら、1994、コスミドパッケージング細菌におけるコスミドアデノウイルスベクターFuら、1997、およびrecA細菌株におけるプラスミドChartierら、1996、Heら、1998に基づく、組換えアデノウイルスベクターの構築のためのいくつかの代替手段が存在する。これらの方法は、より効率的であるが、より複雑であり、さらなる酵母宿主または特別な細菌株の使用を必要とし、これらの宿主における相同組換えの低い効率およびrecA細菌株によって保持されるプラスミド中の組換えアデノウイルスゲノムの不安定性に直面する。比較すると、現在のAd-RAP系は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの構築について、非常に簡単であり、効率的であり、そして迅速である。これらの系は、通常の分子生物学的試薬および通常使用される細胞株を使用する、簡単なインビトロ連結を必要とする。得られた組換えアデノウイルスゲノム含有プラスミドは、容易にスクリーニングされ得、かつ安定である。その後の、許容性の293細胞への、リポソームDOTAPによって媒介される直線化した組換えアデノウイルスDNAのトランスフェクションは、非常に効率的であり、そして組換えアデノウイルスの均質な集団が、迅速に生成され得る。組換えアデノウイルスベクターAd-3pを使用して、任意の他の利用可能な遺伝子送達系および遺伝子送達技術よりもはるかに高い効率で、インビトロおよびインビボによって3p遺伝子を送達し得る。アデノウイルスベクターによって媒介される種々の細胞型における形質導入の高い効率および導入遺伝子の高レベルの発現に起因して、Ad-3pベクターは、インビトロおよびインビボでこれらの腫瘍細胞サプレッサー遺伝子の生物学的機能および機構を研究するための効果的なツールとして使用され得る。Ad-3pは、Ad-3pベクターまたはプロタミン-Ad-3p複合体の静脈内注射または腫瘍内注射のいずれかによって、種々の腫瘍肺、結腸、乳房、胃、子宮頸部、ならびに頭頸部、前立腺、および膵臓における腫瘍形成能、腫瘍抑制、および転移プロセスの制限を限定するために使用され得る。多くの場合、いくつかの遺伝子例えば、Bak、Bax、FasLの発現は、宿主293細胞に対して高度に毒性であり、これは、上記のいずれかの方法および手順による、このような遺伝子を保有する組換えアデノウイルスの構築および生成を極めて困難なものにし、そして時折、不可能なものにする。現在のAd-RAP-TetR-Off系は、このような組換えアデノウイルスベクターを首尾よく構築および生成するために使用され得る。アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現は、細胞培養培地へのテトラサイクリンの添加によって停止され得、宿主細胞に対する遺伝子の毒性効果は、回避され得、そして組換えアデノウイルスは、通常どおり、293細胞において生成される。いくつかの他の系例えば、二成分アデノウイルスベクター系Kagawaら、1999が、このような組換えアデノウイルスベクターを首尾よく構築するために開発されている。しかし、一方のウイルスベクター中の導入遺伝子の発現が、もう一方のウイルスベクターのトランス活性化因子遺伝子の発現に依存し、つまり、2つのアデノウイルスベクターが、インビトロおよびインビボで導入遺伝子発現に必要とされ、これは、次いで、インビボでのこのような系の適用を制限してきた。比較すると、Ad-TetR-Offベクター系において、トランス活性化因子TetR-Off遺伝子およびTetR-Off応答エレメントTREが、同じアデノウイルスベクターに共存し、そして従って、導入遺伝子の発現が、テトラサイクリンインデューサーの非存在下および存在下で1つのベクターにおいて開始または停止され得る。さらに、導入遺伝子は、TRE調節プロモーターの制御下にあるので、導入遺伝子の発現のレベルは、インビトロおよびインビボでのテトラサイクリン投与によって効率的に調節される。まとめると、Ad-RAP-Tet-Off系のこれらの新規な特徴は、この系を、細胞傷害性遺伝子を保持する組換えアデノウイルスベクターの迅速かつ首尾よい構築および生成のための有用な新しいツールにする。3p領域のヘテロ接合性欠失またはホモ接合性欠失のいずれかを含む肺癌細胞株への、リポソーム媒介またはアデノウイルス媒介の一過性のトランスフェクションによる、個々の野生型3p21.3遺伝子の導入は、ヌードマウスにおいて、腫瘍細胞増殖を制限し、アポトーシスを誘導し、そして細胞周期運動を改変し、腫瘍増殖および腫瘍進行を抑制した。種々のレベルの細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、および細胞周期運動の改変が、Ad-Fus1、Ad101F6およびAd-Gene21形質導入ヒト肺癌細胞H1299、A549およびH460これらは、3p遺伝子を欠失しているか、または異常な3p遺伝子を有するにおいて観察された。しかし、Ad-Fus1、Ad101F6およびAd-Gene21形質導入正常HBEC細胞およびH358細胞これらは、野生型3p遺伝子を含むにおいては、細胞増殖に対する有意な阻害効果は観察されなかった。従って、観察された細胞増殖阻害は、これらの遺伝子の通常の細胞傷害性に起因しなかった。これらのAd-3pトランスフェクト体における3p遺伝子の過剰発現は、定量的リアルタイムRT-PCRによって確かめられた。腫瘍増殖は、ヌードマウスにおけるH1299およびA549異種移植片中のAd-101F6、Ad-Fus1およびAd-Gene21ベクターの腫瘍内注射を介する、101F6、Fus1およびGene21の過剰発現によって、有意に抑制された。さらに、肺転移性腫瘍増殖もまた、実験的A549転移を保有するヌードマウスにおけるプロタミン-複合体化Ad-101F6、Ad-Fus1およびAd-Gene21の全身注射によって、有意に阻害された。まとめると、これらの結果は、複数の3p遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子としてかまたは腫瘍サプレッサー領域として、インビトロおよびインビボで機能すること、およびこれらの新しく同定され特徴付けられた3p腫瘍サプレッサー遺伝子またはこの3p腫瘍サプレッサー領域が、リポソーム-3p複合体、3p遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター、および本発明において開発された局所的または全身的遺伝子送達系のような、分子ツールを使用して、癌遺伝子治療のために使用され得ることを示す。肺癌および他の癌における野生型3p21.3遺伝子およびそれらの変異形態の同定および機能的特徴付けは、肺癌および他の腫瘍のための治療の開発における重要な段階を提供する。A.3p21.3の背景肺癌におけるホモ接合性欠失によって定義されるような、TSGのグループは、3p21.3において450kb領域中に位置付けられそして単離されているSekidoら、1998、Minnaら、1997、Hungら、1995、Sekidoら、1996、Wistubaら、1999。肺癌新生物発生前の研究は、3p21対立遺伝子欠損が、これまでに検出された中で、肺癌において最も早期の遺伝子異常であることを示し、これは、過形成病変を生じる。1以上の3p劣性癌遺伝子は、多くのヒトの癌肺癌を含むの分子性病因におけるゲートキーパーとして機能し、おそらく、全症例の50を超えて関与しているSekidoら、1998、Minnaら、1997、Hungら、1995、Sekidoら、1996、Wistubaら、1999、Kohnoら、1999、Wistubaら、1999。近年、ヒト染色体帯3p21.3が、いくつかのSCLC株およびNSCLC株において重複するホモ接合性欠失を受けることが示された。TSGの候補は、いくつかのヒトの癌において、この重要な領域に位置付けられ、これは、さらにTSG領域を規定するSekidoら、1998、Minnaら、1997、Wistubaら、1999、Kohnoら、1999、Wistubaら、1999、vandenBergら、1997。この3p21の重要な領域における遺伝子は、肺癌細胞、腎癌細胞および乳癌細胞におけるテロメラーゼ媒介性の細胞不死化経路の調節に関与するShay、1997、Shay、1998。3p欠失が、喫煙患者の肺腫瘍組織においてより頻繁に生じることも示されている。さらに、3p21.3での発癌物質ベンゾ[a]ピレンジオールエポキシドに対する感受性の上昇が、肺癌の危険性の増加に関連付けられ、これは、3p21.3が、肺癌における発癌物質の分子標的であり得ることを示唆するWuら、1998。B.3p21.3タンパク質Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3分子全体に加えて、本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメントに関し、これらのフラグメントは、腫瘍抑制活性を維持してもしなくてもよい。各タンパク質の全長は、Fus1=161アミノ酸、101F6=222アミノ酸、Gene21=203アミノ酸、Gene26=1205アミノ酸、Beta=440アミノ酸、Luca1=435アミノ酸、Luca2=473アミノ酸、PL6=351アミノ酸、123F2=431アミノ酸、およびSEMA3=749アミノ酸である。その分子のN末端を含むフラグメントは、コード領域内の翻訳終止部位の遺伝子操作によって生成され得る以下に議論する。あるいは、プロテアーゼとして公知のタンパク質分解酵素でのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3分子の処理は、種々のN末端フラグメント、C末端フラグメントおよび内部フラグメントを生成する。フラグメントの例としては、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100またはそれ以上のアミノ酸長のBeta配列の連続する残基が挙げられ得る。これらのフラグメントは、公知の方法例えば、沈殿例えば、硫酸アンモニウム、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー免疫アフィニティークロマトグラフィーを含むまたは種々のサイズ分離沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過に従って精製され得る。1.3p.21.3タンパク質の精製Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3またはそれらの改変体を精製することが望ましくあり得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、1つのレベルでの、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離して、目的のポリペプチドは、部分精製または完全精製または均質なまでの精製を達成するために、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用してさらに精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適切な分析方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー;ドデシル硫酸ナトリウム/ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS/PAGE;等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーFPLCまたはHPLCである。タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法は、本開示を考慮して当業者に公知である。これらには、例えば、活性画分の比活性の決定、またはSDS/PAGE分析により画分内のポリペプチドの量の評価が挙げられる。タンパク質精製における使用に適切な種々の技術が、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などを用いる沈殿、または熱変性とその後の遠心分離;クロマトグラフィー工程例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー;等電点電気泳動;ゲル電気泳動;ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせが挙げられる。当該分野で一般に知られるように、種々の精製工程を実施する順序が変更され得るか、または特定の工程が省略され得、そしてこれらは、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法をなお生じると考えられる。SDS/PAGEの異なる条件によって、ポリペプチドの移動が時には有意に変動し得ることが公知であるCapaldiら、1977。従って、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製された発現産物の見かけの分子量が変動し得ることが理解される。高速液体クロマトグラフィーHPLCは、並外れたピーク分解能を有する非常に迅速な分離によって特徴付けられる。これは、非常に微細な粒子および高い圧力の使用を使用して、十分な流速を維持することによって達成される。分離は、約数分またはせいぜい1時間で完了され得る。さらに、非常に少ない容量のサンプルのみが必要とされるだけである。なぜなら、ボイド容量がベッド容量の非常に少ない割合であるほどに、粒子は、非常に小さくかつ密集されているからである。また、サンプルの濃度は、低くあり得る。なぜなら、バンドは、サンプルの非常にわずかな希釈物が存在するほどに狭いからである。ゲルクロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーは、分子サイズに基づく特別のタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーを支持する理論は、そのカラムこれは、小さな孔を含む不活性物質の小さな粒子で調製されるが、より小さな分子からより大きな分子を、それらが孔の中または周辺を通り抜ける際に、それらのサイズに依存して分離することである。粒子が作製される材料がこれらの分子を吸着しない限り、流れの速度を決定する唯一の因子は、そのサイズである。従って、形状が比較的一定である限り、分子は、減少サイズ様式でカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を分離することについて卓越している。なぜなら、分離は、pH、イオン強度、温度などのような全ての他の因子に依存しないからである。また、実質的に吸着は存在せず、ゾーンの広がりも小さく、そして溶出容積は、単純に分子量に関連する。アフィニティークロマトグラフィーは、単離されるべき物質とそれが特異的に結合し得る分子との間の特異的な親和性に依存するクロマトグラフィー手順である。これは、レセプター-リガンド型の相互作用である。カラム材料は、不溶性マトリクスに結合パートナーの1つを共有結合カップリングさせることにより合成される。次いで、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着させ得る。溶出は、結合が生じない条件に、条件を変えるpH、イオン強度、温度などを変更することによって生じる。マトリクスは、それ自体で有意な程度で分子を吸着せず、かつ広範囲の化学的、物理的および熱安定性を有する物質であるべきである。そのリガンドは、その結合特性に影響しないようにカップリングされるべきである。そのリガンドはまた、比較的強固な結合を提供するべきである。サンプルまたはリガンドを破壊することなく物質を溶出することが可能であるべきである。アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な形態の1つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従う使用に適切な抗体の生成を、以下に議論する。本発明はまた、本発明の種々の実施形態における使用のための、より小さいFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3関連ペプチドを記載する。これらの比較的小さいサイズに起因して、本発明のペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販されており、公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、StewartおよびYoung,1984;Tamら、1983;Merrifield、1986;ならびにBaranyおよびMerrifield1979これらの各々は、参考として本明細書中に援用されるを参照のこと。本明細書中に記載の選択された領域に対応する、短いペプチド配列、または重複ペプチドのライブラリー通常約6アミノ酸から約35~50アミノ酸までは、容易に合成され得、次いで、反応性のペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。あるいは、組換えDNA技術を使用し得る。ここでは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。本発明はまた、抗体の産生に関連する動物の免疫のための抗原としての、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のタンパク質またはペプチドの使用を提供する。生体特異的biospecificまたは多価組成物あるいはワクチンが生成される。これらの組成物の調製において使用される方法は、当業者に知られており、そして動物への投与に適切すなわち、薬学的に受容可能であることが想定される。2.Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3の改変体これらのポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換改変体、挿入改変体または欠失改変体であり得る。欠失変異体は、機能または免疫学的活性に必須でない、ネイティブタンパク質の1以上の残基を欠失する。別の一般的なタイプの欠失改変体は、分泌シグナル配列またはタンパク質が細胞の特定の部分に結合するのを指向するシグナル配列を欠失する欠失改変体である。挿入変異体は、代表的に、ポリペプチドの非末端点での物質の付加を包含する。これには、免疫反応性エピトープの挿入または単なる一残基の挿入が挙げられ得る。末端付加は、融合タンパク質と呼ばれる。置換改変体は、代表的には、タンパク質内の1以上の部位でのあるアミノ酸の別のアミノ酸での交換を含み、そしてこれは、ポリペプチドの1以上の特性例えば、タンパク質分解性切断に対する安定性を、他の機能または特性の損失を伴うことなく調節するように設計され得る。この種の置換は、好ましくは、保存的であり、すなわち、あるアミノ酸が、類似の形状および電荷のアミノ酸と置換される。保存的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらには、以下の変化が含まれる:アラニンからセリン;アルギニンからリジン;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン;アスパラギン酸からグルタミン酸;システインからセリン;グルタミンからアスパラギン;グルタミン酸からアスパラギン酸;グリシンからプロリン;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン;イソロイシンからロイシンまたはバリン;ロイシンからバリンまたはイソロイシン;リジンからアルギニン;メチオニンからロイシンまたはイソロイシン;フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン;セリンからスレオニン;スレオニンからセリン;トリプトファンからチロシン;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン;およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。以下は、等価的またはさらには改善された第2世代の分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸変化に基づく議論である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能力の顕著な損失を伴うことなく、特定のアミノ酸が、他のアミノ酸で置換され得る。タンパク質の生物学的機能を規定するのはタンパク質の相互作用性の能力および性質であるので、特定のアミノ酸の置換は、タンパク質配列およびその基本となるDNAコード配列において作製され、そしてそれにも拘らず、同様の特性を有するタンパク質を獲得し得る。従って、以下に議論されるように、それらの生物学的有用性または活性の顕著な損失を伴うことなく、種々の変化が、遺伝子のDNA配列において作製され得ることが、本発明者よって意図される。表1は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特性を考慮する例示的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらには、以下が挙げられる:アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびスレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。C.核酸Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3は、450kbの重要な領域における、3p21.3の染色体位置で見出される。これらは、3p21.3において以下の順序で見出される:Gene26、PL6、101F6、Gene21、Beta、123F2、Fus1、Luca2、Luca1、およびSEMA3。各々の長さは、Fus1=1696核酸、101F6=1117核酸、Gene21=1696核酸、Gene26=5482核酸、Beta=1746核酸、Luca1=2565核酸、Luca2=1783核酸、PL6=1860核酸、123F2=1502核酸、およびSEMA3=2919核酸である図5。さらに、本発明は本明細書中に開示される特定の核酸に限定されないことが明らかでであるはずである。以下に議論されるように、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3遺伝子は、種々の異なる塩基を含み得、そしてなお、本明細書中に開示された遺伝子と機能的に識別不能ないくつかの場合において構造的に識別不能な対応するポリペプチドを生成する。本発明に従う核酸は、本明細書中に開示される、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3の遺伝子全体、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のドメイン、またはFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3の配列の任意の他のフラグメントをコードし得る。核酸は、ゲノムDNAに由来し得るすなわち、特定の生物のゲノムから直接的にクローニングされ得る。しかし、他の実施形態において、この核酸は、相補的DNAcDNAを含む。用語cDNAは、テンプレートとしてメッセンジャーRNAmRNAを使用して調製されるDNAをいうことが意図される。ゲノムDNAあるいはゲノムのテンプレート、プロセシングされていないRNAテンプレート、または部分的にプロセシングされたRNAテンプレートから重合されるDNAに対して、cDNAを使用する利点は、cDNAは、対応するタンパク質のコード配列を主に含むということである。非コード領域が最適な発現に必要とされる場合、またはイントロンのような非コード領域がアンチセンス手法で標的化される場合のように、全長ゲノム配列または部分ゲノム配列が好ましい場合はあり得る。所定の種由来の所定のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3が、わずかに異なる核酸配列を有するが、それでもなお同じタンパク質をコードする天然の改変体表1によって表され得ることがまた意図される。本願において使用される場合、用語配列番号1の核酸配列を有するポリヌクレオチドは、全ての細胞性核酸を含まない単離された核酸分子をいう。機能的に等価なコドンは、同じアミノ酸をコードするコドン例えば、アルギニンまたはセリンについての6つのコドン表1であり、そして生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンもまたいう。本発明のDNAセグメントは、上記のように、生物学的に機能的に等価なFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のタンパク質およびペプチドをコードするものを含む。このような配列は、核酸配列およびそれによりコードされるタンパク質内に天然に存在することが公知である、コドン縮重およびアミノ酸の機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術の適用を介して作製され得、ここで、タンパク質構造における変化は、交換されるアミノ酸の特性の考慮に基づいて、操作され得る。ヒトによって設計された変化は、以下に記載のように、部位指向型変異誘発技術の適用を介して導入され得るか、またはランダムに導入されそして所望の機能について後にスクリーニングされ得る。D.ハイブリダイゼーション当然、本発明はまた、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3をコードする配列に相補的であるかまたは本質的に相補的であるDNAセグメントを包含する。相補的である核酸配列は、標準的なワトソン-クリック相補性規則に従って塩基対形成し得る核酸配列である。本明細書中で使用される場合、用語相補的なは、上に示されるヌクレオチド比較によって評価され得るように規定されるような、または本明細書中に記載されるような比較的にストリンジェントな条件下で上述の核酸セグメントにハイブリダイズし得るような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。このような配列は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のタンパク質全体、またはそれらの機能的もしくは非機能的なフラグメントをコードし得る。あるいは、ハイブリダイズするセグメントは、より短いオリゴヌクレオチドであり得る。17塩基長の配列は、ヒトゲノム中に一度のみ生じるはずであり、従って、固有の標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーがインビボでの接近性を作製および増加するのにより容易であるが、多数の他の要因が、ハイブリダイゼーションの特異性を決定することに関与している。オリゴヌクレオチドのその相補的な標的に対する結合親和性および配列特異性の両方は、長さの増加と共に増加する。他のオリゴヌクレオチドも意図されるが、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100またはそれより大きい塩基対の例示的なオリゴヌクレオチドが使用されることが意図される。250、500、または1000塩基およびそれより大きいものをコードするより長いポリヌクレオチドも同様に意図される。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット、インサイチュ組織ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして、そして増幅反応におけるプライマーとしての用途が見出される。従って、本発明のヌクレオチド配列は、DNAおよび/またはRNAの相補的なストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するこれらの能力について、またはサンプル由来のDNAまたはRNAの増幅のためのプライマーを提供するために、使用され得る。想定される適用に依存して、標的配列についてのプローブまたはプライマーの種々の程度の選択性を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが所望される。特定の適用例えば、部位指向型変異誘発によるアミノ酸の置換において、より低いストリンジェンシー条件が必要とされることが理解される。これらの条件下で、プローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でなくても、ハイブリダイゼーションは生じ得るが、1つ以上の位置において不一致である。条件は、塩濃度を増加させそして温度を低下させることによって、よりストリンジェントでない条件となり得る。例えば、培地ストリンジェンシー条件は、約37°C~約55°Cの温度で約0.1~0.25MNaClによって提供され得るが、低ストリンジェンシー条件は、約20°C~約55°Cの範囲の温度で約0.15M~約0.9M塩によって提供され得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般的に所望の結果に依存して選択される方法である。他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、約20°C~約37°Cの間の温度で、50mMTris-HClpH8.3、75mMKCl、3mMMgCl2、10mMジチオスレイトールの条件下で達成され得る。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、約40°C~約72°Cの範囲の温度で、約10mMTris-HClpH8.3、50mMKCl、1.5mMMgCl2を含み得る。ホルムアミドおよびSDSはまた、ハイブリダイゼーション条件を変更するために使用され得る。E.プライマーおよびプローブ本明細書中で定義される場合、用語プライマーは、テンプレート依存性のプロセスにおいて新生核酸の合成を開始し得る任意の核酸を包含することを意味する。代表的に、プライマーは、10~20塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が使用され得る。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。プローブは異なって定義されるが、これらはプライマーとして作用し得る。プローブはおそらくプライミングし得る間に、標的DNAまたはRNAに結合するように設計され、そして増幅プロセスにおいて使用される必要はない。他の実施形態において、プローブまたはプライマーは、放射性種32P、14C、35S、3H、または他の標識、発蛍光団ローダミン、フルオレセインまたは化学発光ルシフェラーゼで標識される。本発明のプローブおよびプライマーを使用する1つの方法は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3に関連する遺伝子、またはより詳細には、他の種由来のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のオルソログorthologについての検索における方法である。通常、標的DNAは、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーであるが、スクリーニングは、RNA分子の分析を含み得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、およびプローブの領域を変化させることによって、種々の程度の相同性が発見され得る。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するための適切な手段例えば、標識と組み合わせて、本発明の規定の配列の核酸を使用することは、有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素学的リガンドまたは他のリガンド例えば、アビジン/ビオチンこれらは、検出され得るを含む、広範な種々の適切な指示手段が、当該分野で公知である。他の実施形態において、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが所望であり得る。酵素タグの場合、相補的な核酸を含有するサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するための、可視検出可能であるかまたは分光光度的に検出可能である検出手段を提供するために使用され得る比色指示基質が、公知である。本発明のプローブおよびプライマーを活用する別の方法は、部位指向型変異誘発または部位特異的変異誘発における方法である。部位特異的変異誘発は、基礎をなすDNAの特異的変異誘発を介する、個々のペプチド、または生物学的に機能的な等価なタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技術である。この技術はさらに、1つ以上のヌクレオチド配列変化をDNAに導入することによって、前述の1つ以上の考慮を組み込んで、配列改変体を迅速に調製および試験する能力を提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介する変異体の生成を可能にし、妨害されている欠失結合部の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズかつ十分な配列複雑性のプライマー配列を提供する。代表的に、配列の結合部の両側の約5~10残基が変更された、約17~25ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。一般に、本明細書中で記載されるプローブまたはプライマーは、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、PCRTMにおいて、対応する遺伝子の発現の検出のために、ならびに固相を使用する実施形態において、試薬として有用であることが想定される。代表的な固相ハイブリダイゼーション方法は、米国特許第5,843,663号、同第5,900,481号、および同第5,919,626号において開示されている。本発明の実施において使用され得るハイブリダイゼーションの他の方法は、米国特許第5,849,481号、同第5,849,486号、および同第5,851,772号において開示されている。明細書中の本節において同定されるこれらおよび他の参考文献の関連部分は、参考として本明細書中に援用される。F.テンプレート依存性増幅方法多数のテンプレート依存性プロセスが、所定のテンプレートサンプル中に存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も知られた増幅方法の1つは、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,800,159号、ならびにInnisら、1990これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用されるにおいて詳細に記載される、ポリメラーゼ連鎖反応RCRTMと称されるである。他の増幅方法は、リガーゼ鎖反応LCR、Qbetaレプリカーゼ、等温増幅、鎖置換増幅SDA、捕捉部分または検出部分を有するプライマーを使用するPCRTM様テンプレート依存性合成ならびにPCRTM様酵素依存性合成、転写ベースの増幅システムTAS、一本鎖および二本鎖DNAの循環的cylical合成、RACE、片側PCRTM、ならびに2オリゴヌクレオチド増幅である。手短に言うと、PCRTMにおいて、マーカー配列の反対側の相補鎖上の領域に相補的である2つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、DNAポリメラーゼ例えば、Taqポリメラーゼと共に反応混合物に添加される。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドの付加によって、プライマーをマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸長したプライマーは、マーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーは、マーカーおよび反応産物に結合し、そしてプロセスが繰り返される。逆転写酵素PCRTM増幅手順は、増幅されたmRNAの量を定量するために行なわれ得る。RNAをcDNAへ逆転写する方法は周知であり、そしてSambrookら、1989において記載される。逆転写のための代替的な方法は、耐熱性のRNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。これらの方法は、1990年12月21に出願されたWO90/07641において記載される。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。G.ベクター用語ベクターは、核酸配列が細胞ここで、核酸配列が複製され得るへの導入のために挿入され得る、キャリア核酸分子をいうために使用される。核酸配列は、外因性であり得、これは、核酸配列が、ベクターが導入される細胞に対して外来であること、またはこの配列が細胞中の配列に対して相同であるが、この配列が通常見出されない宿主細胞の核酸中の位置に存在することを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスバクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス、および人工染色体例えば、YACが挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するように十分に備えており、これらの技術は、Maniatisら、1988およびAusubelら、1994両方とも参考として本明細書中に援用されるにおいて記載される。用語発現カセットは、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターをいう。いくつかの場合において、RNA分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成の際に、翻訳されない。発現ベクターは、種々の制御配列を含み得、これは、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列をいう。転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も同様に果たす核酸配列を含み得、そして以下に記載される。H.プロモーターおよびエンハンサープロモーターは、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。これは、調節タンパク質および分子が、例えば、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子に結合し得る遺伝子エレメントを含み得る。成句作動可能に位置する、作動可能に連結した、制御下、および転写制御下は、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および/または発現を制御するために、正確な機能的位置および/または配向であることを意味する。プロモーターは、エンハンサーと組み合わせて使用されてもよいし使用されなくてもよく、エンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をいう。プロモーターは、コードセグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することによって獲得され得るように、遺伝子または配列に天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、内因性として称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列と天然に関連し得るものであり得る。あるいは、特定の利点は、組換えプロモーターまたは異種プロモーターこれらは、その天然の環境において核酸配列と通常関連しないプロモーターをいうの制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーはまた、その天然の環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーをいう。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核生物細胞、ウイルス細胞、または真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および天然に存在しないプロモーターまたはエンハンサーすなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび/または発現を変更する変異を含むが挙げられ得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書中に開示される組成物と組み合わせて、PCRTMを含む、組換えクローニング技術および/または核酸増幅技術を使用して生成され得る米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号各々が参考として本明細書中に援用されるを参照のこと。このようなプロモーターは、レポーター遺伝子としての使用のためにβ-ガラクトシダーゼ発現を駆動するために使用され得る。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどのような非核細胞小器官中で配列の転写および/または発現を指向する制御配列もまた同様に使用され得ることが意図される。もちろん、発現のために選択された細胞型、細胞小器官、および生物におけるDNAセグメントの発現を効率的に指向するプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせの使用を知っている例えば、Sambrookら1989参考として本明細書中に援用されるを参照のこと。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、そして/または導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指向する適切な条件下で有用であり得る組換えタンパク質および/またはペプチドの大規模生成における利点のような。プロモーターは、異種であってもよいし内因性であってもよい。表2は、遺伝子の発現を調節するために、本発明の文脈中で使用され得るいくつかのエレメント/プロモーターを列挙する。この列挙は、発現の促進に関与する全てのあり得るエレメントを網羅することを意図するのではなく、単にそれらの例示的な列挙である。表3は、誘導性エレメントの例を提供し、これらは、特定の刺激に応答して活性化され得る核酸配列の領域である。組織特異的プロモーターまたは組織特異的エレメントの同定、ならびにこれらの活性を特徴付けるアッセイは、当業者に周知である。このような領域の例としては、ヒトLIMK2遺伝子Nomotoら、1999、ソマトスタチンレセプター2遺伝子Krausら、1998、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子Lareyreら、1999、ヒトCD4Zhao-Emonetら、1998、マウスα2XIコラーゲンTsumakiら、1998、D1Aドーパミンレセプター遺伝子Leeら、1997、インスリン様増殖因子IIWuら、1997、ヒト血小板内皮細胞接着分子-1Almendroら、1996が挙げられる。I.開始シグナル特定の開始シグナルはまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接する配列を含む。外因性の翻訳制御シグナルATG開始コドンを含むが、さらに提供される必要があり得る。当業者は、容易にこのことを決定し得、そして必要なシグナルを提供し得る。開始コドンは、完全な挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレームでなければならないことが周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含むことによって高められ得る。J.スプライシング部位ほとんどの転写された真核生物RNA分子は、第1の転写物からイントロンを除去するためにRNAスプライシングを起こす。ゲノムの真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするための、ドナースプライシング部位および/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る。Chandlerら、1997参考として本明細書中に援用されるを参照のこと。K.ポリアデニル化シグナル発現において、転写物の適切なポリアデニル化を行なうためのポリアデニル化シグナルが代表的に含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施に重要はないと考えられ、そして/または任意のこのような配列が使用され得る。特定の実施形態は、簡便でありそして/もしくは種々の標的細胞において十分に機能することが公知のSV40ポリアデニル化シグナルおよび/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。転写終止部位もまた、発現カセットのエレメントとして意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強するように、そして/またはカセットから他の配列への読み過ごしreadthroughを最小にするように機能し得る。L.複製の起点宿主細胞においてベクターを増殖するために、ベクターは、複製部位の1つ以上の起点しばしばoriと称されるを含み得、これは、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母である場合、自律的複製配列ARSが使用され得る。M.検出マーカーおよびスクリーニングマーカー本発明の特定の実施形態において、細胞は、本発明の核酸構築物を含み、細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含む細胞の簡単な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであるが、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を止めさせるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーの例は、当業者に周知である。N.宿主細胞異種核酸配列を発現させる状況において、宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞をいい、そしてこれは、ベクターを複製し得るそして/またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現し得る任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用され得、そしてそのように使用されてきた。宿主細胞は、トランスフェクトされてもよいし形質転換されてもよく、これは、異種核酸が宿主細胞に移入されるかまたは導入されるプロセスをいう。形質転換された細胞は、最初の被験体細胞およびその子孫を含む。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターにコードされた核酸配列の一部または全ての発現であるかに依存して、原核生物細胞または真核生物細胞から誘導され得る。多数の細胞株および培養物が、宿主細胞としての使用のために利用可能であり、そしてこれらは、AmericanTypeCultureCollectionATCCこれは、生きている培養物および遺伝物質についての保管所として機能する組織であるwww.atcc.orgから獲得され得る。適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づいて、当業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多数のベクターの複製のための原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および/または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、DH5α、JM109、およびKC8、ならびにSURE登録商標コンピテント細胞およびSOLOPACKTMGold細胞STRATAGENE登録商標,LaJollaのような多数の市販の細菌宿主が挙げられる。あるいは、E.coliLE392のような細菌細胞は、ファージウイルスのための宿主細胞として使用され得る。ベクターの複製および/または発現のための真核生物宿主細胞の例としては、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos、およびPC12が挙げられる。種々の細胞型および生物由来の多数の宿主細胞が利用可能であり、そして当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターは、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞特に、ベクターの複製または発現に許容的な宿主細胞のいずれかと組み合わせて使用され得る。いくつかのベクターは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において複製および/または発現されるのを可能にする制御配列を使用し得る。当業者はさらに、上記宿主細胞全てを維持しそしてベクターの複製を可能にするためにこれらをインキュベートする条件を理解する。ベクターの大規模生成、ならびにベクターによってコードされた核酸およびこれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生成を可能にする技術および条件もまた、理解されそして公知である。O.発現系上で議論された組成物の少なくとも一部または全てを含む多数の系が存在する。原核生物および/または真核生物に基づく系が、核酸配列、またはこれらの同族のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを生成するために、本発明を用いる使用のために利用され得る。多数のこのような系が、市販されておりそして広範に利用可能である。昆虫細胞系/バキュロウイルス系は、米国特許第5,871,986号、同第4,879,236号共に参考として本明細書中に援用されるにおいて記載されるように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生成し得、そしてこれらは、例えば、INVITROGEN登録商標からのMAXBAC登録商標2.0およびCLONTECH登録商標からのBACPACKTMバキュロウイルス発現系の名称で購入され得る。発現系の他の例としては、STRATAGENE登録商標のCOMPLETECONTROLTM誘導性哺乳動物発現系これは、合成エクジソン誘導性レセプターを含む、またはそのpET発現系E.coli発現系が挙げられる。誘導性発現系の別の例は、INVITROGEN登録商標から入手可能であり、これは、T-REXTMテトラサイクリン調節発現系全長CMVプロモーターを使用する誘導性哺乳動物発現系を保有する。INVITROGEN登録商標はまた、Pichiamethanolica発現系これは、メチロトローフの酵母Pichiamethanolicaにおける組換えタンパク質の高レベル生成のために設計されると呼ばれる酵母発現系を提供する。当業者は、核酸配列またはその同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを生成するための、ベクター例えば、発現構築物を発現する方法を知っている。P.発現ベクターの送達発現ベクターを細胞に導入し得る多くの方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、この発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の操作された構築物を含む。特定のウイルスが、レセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に進入して、宿主細胞ゲノムに入りそしてウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルスは、外来遺伝子を哺乳動物細胞に移入するための魅力的な候補物となるRidgeway,1988;NicolasandRubenstein,1988;BaichwalおよびSugden,1986:Temin,1986。遺伝子ベクターとして用いた最初のウイルスは、パポーバウイルスシミアンウイルス40、ウシ乳頭しゅウイルス、およびポリオーマRidgeway,1988;BaichwalおよびSugden,1986、およびアデノウイルスRidgeway,1988;BaichwalおよびSugden,1986を含めたDNAウイルスであった。これらは、外来DNA配列については比較的低い能力を有し、そして限定された宿主スペクトルを有する。さらに、許容性細胞におけるその腫瘍形成性能力および細胞変性効果によって安全性の懸念が生じる。それらのウイルスは、外来の遺伝物質を8kbまでしか受け入れられないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入され得るNicolasおよびRubenstein,1988;Temin,1986。インビボ送達のための方法の1つとして、アデノウイルス発現ベクターの使用が挙げられる。アデノウイルス発現ベクターとは、a構築物のパッケージングを支持するため、そしてbそのなかにクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を包含することを意味する。この文脈では、発現には遺伝子産物が合成されることを必要としない。1.アデノウイルス発現ベクターこの発現ベクターは、遺伝子操作型のアデノウイルスを含む。アデノウイルス36kb、直線状、二本鎖DNAウイルスの遺伝的組織の知識によれば、アデノウイルスDNAの大きい断片の、7kbまでの外来配列による置換が可能であるGrunhausおよびHorwitz,1992。レトロウイルスと対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み換えを生じない。なぜならアデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そしてゲノム再配列は大規模な増幅後に検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期段階にかかわらず、実質的に全ての上皮細胞に感染し得る。1つの系システムでは、組み換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組み換えから生成される。2つのプロウイルスベクターの間の可能性のある組み換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークから単一クローンのウイルスを単離し、そしてそのゲノム構造を試験することが重要である。現在のアデノウイルスベクター複製欠損であるの生成および増殖は、特有のヘルパー細胞株293と名付けられたに依存する。この細胞株は、Ad5DNAフラグメントによってヒト胚性腎細胞からトランスフォームされ、そしてE1タンパク質を構成的に発現するGrahamら、1977。ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Vero細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、好ましいヘルパー細胞株は293である。アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、または少なくとも条件付で欠損であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の首尾よい実施のために重要であるとは考えられない。このアデノウイルスは、42の異なる既知の血清型またはサブグループA~Fのいずれかであり得る。サブグループCの5型アデノウイルスは、本発明の使用のための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発物質である。この理由は5型アデノウイルスがヒトアデノウイルスであり、それについて多量の生化学的情報および遺伝子情報が既知であるからであり、そしてこれはベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物について伝統的に用いられてきた。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現研究Levreroら、1991;Gomez-Foixら、1992およびワクチン開発GrunhausおよびHorwitz,1992;GrahamおよびPrevec,1991において使用されてきた。最近、動物研究によって、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用され得ることが示唆されたStratford-PerricaudetおよびPerricaudet,1991;Stratford-Perricaudetら、1990;Richら、1993。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究としては、以下が挙げられる:気管点滴注入Rosenfeldら,1991;Rosenfeldら、1992、筋肉注射Ragotら、1993、末梢静脈注射HerzおよびGerard,1993、および脳への定位的な接種LeGalLaSalleら、1993。2.レトロウイルス発現ベクターレトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAに変換する能力で特徴付けられる、一本鎖RNAウイルスの群であるCoffin、1990。次いで、生じたDNAは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を指向する。この組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。このレトロウイルスゲノムは、3つの遺伝子gag、pol、およびenvを含有し、これらはそれぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする。gag遺伝子の上流に見出される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングについてのシグナルを含む。2つの長末端反復LTR配列が、このウイルスゲノムの5’末端および3’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた、宿主細胞ゲノムにおける組み込みに必要とされるCoffin、1990。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築するMannら、1983。cDNAを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共に例えば、リン酸カルシウム沈降によりこの細胞株に導入される場合、このパッケージング配列は、この組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされるのを可能にし、次いでこのウイルス粒子が培養培地中に分泌されるNicolasおよびRubenstain,1988;Temin,1986;Mannら、1983。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とするPaskindら、1975。3.他のウイルスベクター他のウイルスベクターが、本発明における発現構築物として使用され得る。ワクシニアウイルスRidgeway,1988;BaichwalおよびSugden,1986;Couparら,1988、アデノ随伴ウイルスAAVRidgeway,1988;BaichwalおよびSugden,1986;HermonatおよびMuzycska,1984およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが使用され得る。これらは、種々の哺乳動物細胞についていくつかの魅力的な特徴を提供するFriedmann,1989;Ridgeway,1988;BaichwalおよびSugden,1986;Couparら,1988;Horwichら,1990。センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現をもたらすため、この発現構築物を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換トランスフォームするための実験手順においてのように、インビトロで、または特定の疾患状態の処置においてのようにインビボもしくはエキソビボで達成され得る。送達の1つの機構は、ウイルス感染を介しており、ここで発現構築物は、感染性ウイルス粒子にキャプシド形成される。4.発現構築物の移入のための非ウイルス方法培養された哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス方法がまた本発明によって意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿GrahamおよびVanDerEb、1973;ChenおよびOkayama、1987;Rippeら、1990、DEAEデキストラン法Gopal、1985、エレクトロポレーションTur-Kaspaら、1986;Potterら、1984、直接マイクロインジェンクションHarlandおよびWeintraub、1985、DNA充填化リポソームNicolauおよびSene、1982;Fraleyら、1979およびリポフェクタミン-DNA複合体、細胞超音波処理Fechheimerら、1987、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメントYangら、1990、およびレセプター媒介トランスフェクションWuおよびWu、1987;WuおよびWu、1988が挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用に首尾よく適用され得る。一旦、発現構築物が細胞に送達されれば、目的の遺伝子をコードする核酸は、異なる部位に配置されそして発現され得る。特定の実施形態において、この遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組み換え遺伝子置換を介した同系の位置および方向であり得るか、または無作為の非特異的位置に組み込まれ得る遺伝子増大。なおさらなる実施形態において、核酸は、DNAの別々のエピソームセグメントとして細胞中に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたはエピソームは、宿主細胞の周期と独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達されるか、そしてこの核酸が細胞のどこに保持されるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。本発明のなお別の実施形態において、その発現構築物は、単に、裸の組換えDNAまたはプラスミドからなり得る。その構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の任意の方法によって行われ得る。これは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、インビボでの使用にも適用され得る。Dubenskyら1984は、リン酸カルシウム沈降物の形態で、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓へとポリオーマウイルスDNAを首尾良く注入し、活性なウイルス複製および急性の感染を実証した。BenvenistyおよびNeshif1986はまた、リン酸カルシウム沈降したプラスミドの直接腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現をもたらしたことを実証した。これによって、目的の遺伝子をコードするDNAがまた、インビボで同様の様式で移入されて遺伝子産物を発現し得ることが予想される。なお別の実施形態において、裸のDNA発現構築物の細胞への移入は、微粒子銃ボンバードメントを含み得る。この方法は、DNAで被覆された微量子銃マイクロプロジェクタイルを高速に加速する能力に依存し、それらが細胞を死滅させずに細胞膜を貫通し、そして細胞に侵入することを可能にするKleinら、1987。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが開発されている。1つのこのようなデバイスは、電流を生成するための高電圧放電に依存し、これは、次いで推進力を提供するYangら、1990。使用される微粒子銃は、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされているYangら、1990;Zeleninら、1991。銃と標的器官との間のなんらかの介在組織を排除するためすなわち、エキソビボ処置、この方法には、組織または細胞の外科的曝露を必要とし得る。再度、特定の遺伝子をコードするDNAは、この方法を介して送達され得、そして本発明によってなお組み込まれ得る。本発明のさらなる実施形態において、その発現構築物は、リポソームに捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自発的に形成する。その脂質成分は、閉鎖された構造を形成する前に、自己再配置を経て、そして水および溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉するGhoshおよびBachhawat,1991。リポフェクタミンDNA複合体もまた意図される。リポソーム媒介核酸送達およびインビトロでの外来DNAの発現は非常に成功している。Wongら1980は、培養ニワトリ胚、HeLa細胞、および肝癌細胞において、外来DNAのリポソーム媒介送達および発現の可能性を実証した。Nicolauら1987は、静脈内注射後のラットにおいて首尾よいリポソーム媒介遺伝子移入を達成した。本発明の特定の実施例において、そのリポソームは、センダイウイルスHVJと複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にすること、およびリポソームカプセル化DNAの細胞への侵入を促進することが示されているKanedaら、1989。他の実施形態において、そのリポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質HMG-1と複合体化され得るか、または組み合わせて利用され得るKatoら、1991。なおさらなる実施形態において、そのリポソームは、HVJおよびHMG-1の両方と複合体化され得るか、または組み合わせて利用され得る。このような発現構築物がインビトロおよびインビボにおいて核酸の移入および発現において首尾よく使用されたという点で、それらは本発明に適用可能である。細菌のプロモーターがDNA構築物中で利用される場合、それはまた、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含めることが所望される。特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために利用され得る他の発現構築物は、レセプター媒介送達ビヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核生物細胞におけるレセプター媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布のために、その送達は、高度に特異的であり得るWuおよびWu、1993。レセプター媒介遺伝子標的化ビヒクルは、一般的に以下の2つの成分からなる:細胞レセプター特異的リガンドおよびDNA結合剤。いくつかのリガンドが、レセプター媒介遺伝子移入のために使用されている。最も広汎に特徴づけられているリガンドは、アシアロオロソムコイドASORWuおよびWu、1987およびトランスフェリンWagnerら、1990である。最近、ASORと同じレセプターを認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達ビヒクルとして使用されておりFerkolら、1993;Peralesら、1994、そして上皮増殖因子EGFはまた、扁平上皮癌細胞に対して遺伝子を送達するために用いられているMyers,EPO0273085。他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Nicolauら1987は、ラクトシル-セラミド、ガラクトース-末端アシアロガングリオシドリポソームに組み込まれたを使用し、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。従って、特定の遺伝子をコードする核酸はまた、リポソームを伴うかまたは当該分野もなわない多数のレセプター-リガンド系によって、肺細胞、上皮細胞または腫瘍細胞のような細胞型に特異的に送達され得ることが可能である。例えば、上皮増殖因子EGFは、EGFレセプターの上方制御アップレギュレーションを示す多くの腫瘍細胞において遺伝子をコードする核酸の媒介送達のためのレセプターとして用いられ得る。マンノースは、肝臓細胞上のマンノースレセプターを標的化するために使用され得る。また、CD5CLL、CD22リンパ腫、CD25T細胞白血病およびMAA黒色腫に対する抗体は、同様に、標的化部分として使用され得る。特定の実施形態において、遺伝子移入は、エキソビボ条件下でさらに容易に実施され得る。エキソビボ遺伝子治療とは、動物からの細胞の単離、インビトロでのこの細胞への核酸の送達、次いで動物へのこの改変した細胞の戻しをいう。これは、動物からの組織/器官の外科的取り出し、または細胞および組織の初代培養を包含し得る。初代哺乳動物細胞培養物は、種々の方法において調製され得る。細胞がインビトロでかつ発現構築物と接触していながら生存しているためには、その細胞が、酸素と二酸化炭素と栄養素と正確な比率で接触して維持されるが、微生物の汚染からは保護されていることを確実にすることが必要である。細胞培養技術は、十分に文献に報告されており、そして本明細書において参考文献として開示されているFreshner,1992。前記の1つの実施形態は、タンパク質の産生のための細胞を不死化するために遺伝子移入の使用を包含する。目的のタンパク質の遺伝子は、上記のように適切な宿主細胞に移入され得、その後、適切な条件下で細胞培養される。実質的に任意のポリペプチドについてのその遺伝子は、このようにして利用され得る。組換え発現ベクターおよびその中に含まれる要素の生成は、上記で議論した。あるいは、産生されるべきタンパク質は、問題の細胞によって通常合成される内因性のタンパク質であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、VeroおよびHeLa細胞およびチャイニーズハムスター卵巣の細胞株、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、NIH3T3、RIN、およびMDCK細胞である。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式でその遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾例えば、グリコシル化およびプロセシング例えば、切断は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングおよびタンパク質の修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。多数の選択系が使用され得、それらには、それぞれtk-、hgprt-、またはaprt-細胞における、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、抗代謝物抵抗性は、以下に対する選択性を基礎として使用され得る:抵抗性を付与するdhfr;ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt;アミノグリコシドG418に対する抵抗性を付与するneo;およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygro。動物細胞は、以下の2つの態様でインビトロで増殖され得る:培養のバルクを通じて懸濁液中において増殖する非足場依存性細胞として、またはそれらの増殖のための固相基質への付着を必要とする足場依存性細胞すなわち、細胞増殖の単層型として。Q.抗体本発明の抗体は、免疫沈降による抗原の単離に有用である。免疫沈降は、複合混合物からの標的抗原成分の分離を含み、そして少量のタンパク質の識別または単離のために用いられる。膜タンパク質の単離のため、細胞を界面活性剤ミセルに溶解しなければならない。胆汁塩のような他の因子が酸性のpHかまたは二価カチオンの存在下で沈殿するので、非イオン性塩が好ましい。抗体およびその用途を以下にさらに考察する。別の局面において、本発明は、本発明のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、もしくはSEMA3分子と免疫反応性である抗体、またはその任意の部分を意図する。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。1つの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。抗体を調製および特徴付けるための手段は当該分野で周知である例えば、HowellおよびLane,1988を参照のこと。要するに、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む免疫原を用いて動物を免疫すること、およびその免疫された動物から抗血清を収集することによって調製される。広範な動物種が、抗血清の生成のために用いられ得る。代表的には、抗-抗血清の生成のために用いた動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、またはウマを含む非ヒト動物である。ウサギの比較的大量の血液のおかげで、ウサギはポリクローナル抗体の生成のために好ましい選択である。抗原のアイソフォームに特異的な抗体ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、当業者に一般に公知であるように、従来の免疫技術を用いて調製され得る。本発明の化合物の抗原性エピトープを含む組成物は、1つ以上の実験動物例えば、ウサギまたはマウスを免疫するために用いられ得る。次いで、これらの動物は本発明の化合物に対して特異的な抗体を生成するように進行する。ポリクローナル抗血清は、抗体生成のための時間経過後、単にこの動物を放血して全血から血清サンプルを調製することによって、入手され得る。本発明のモノクローナル抗体は、標準的な免疫化学手順例えば、ELISAおよびウエスタンブロット方法において、および免疫組織化学手順例えば、組織染色において、ならびに異なる種の特定のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3に関連する抗原性エピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順において、有用な用途を見出すことが提唱される。さらに、異なる種の特定のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3に特異的なモノクローナル抗体が、他の有用な用途において利用され得ることが提唱される。一般に、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方とも、種々の実施形態において用いられ得る。例えば、これらの抗体は、他のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3をコードするcDNAまたは遺伝子を得るための抗体クローニングプロトコールにおいて使用され得る。それらの抗体はまた、細胞または動物におけるFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3が関連するペプチドの効果を分析するための阻害試験において用いられ得る。抗-Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の抗体はまた、種々の細胞事象の間、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の分布を分析するための免疫学的局在決定試験において、例えば、細胞周期における異なる時点でのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、およびSEMA3のポリペプチドの細胞特異的または組織特異的な分布を決定するために有用である。このような抗体の特に有用な用途は、例えば、抗体親和性カラムを用いて、ネイティブまたは組み換えのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3を精製することである。このような免疫学的技術の全ての操作は、本開示に照らして当業者に公知である。抗体を調製および特徴付けるための手段が当該分野で周知である例えば、HarlowおよびLane,1988本明細書において参考として援用されているを参照のこと。モノクローナル抗体調製のさらに具体的な例は、以下の実施例に記載している。当該分野で周知のように、所定の組成物はその免疫原性において変化し得る。従って、キャリアに対してペプチドまたはポリペプチド免疫原を結合することによって達成され得るように、宿主免疫系をブーストすることがしばしば必要である。例示的かつ好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびウシ血清アルブミンBSAである。他のアルブミン例えば、オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。キャリアタンパク質にポリペプチドを結合体化させるための手段は、当該分野において周知であり、そしてこれには、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルm-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimideester、カルボジイミド、およびビス-ビアゾ化ベンジジンbis-biazotizedbenzidineが挙げられる。また当該分野において周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、免疫応答の非特異的刺激物質アジュバントとして公知を使用することによって増強され得る。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント殺傷されたMycobacteriumtuberculosisを含有する、免疫応答の非特異的刺激物質、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。ポリクローナル抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原および免疫に使用される動物の性質に応じて変動する。種々の経路を使用して、免疫原を投与し得る皮下、筋内、皮内、静脈内、および腹腔内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で、免疫された動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。第2のブースター注射もまた、与えられ得る。追加免疫ブーストおよび力価測定のプロセスを、適切な力価が達成されるまで繰り返す。所望されるレベルの免疫原性が獲得された場合に、この免疫された動物を採血し得、そして血清を単離および保存し得、そして/または、この動物を使用して、モノクローナル抗体mAbを生成し得る。mAbは、米国特許第4,196,265号これは、本明細書中で参考として援用されるに例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製され得る。代表的に、この技術は、選択された免疫原組成物例えば、精製されたまたは部分的に精製された、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、あるいは高レベルのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3を発現する細胞を用いて適切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を与え得るGoding、1986が、マウスが好ましい。BALB/cマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物を与えるので最も好ましい。免疫後に、抗体を産生する潜在能を有する体細胞詳細には、Bリンパ球B細胞が、mAb産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器でこの脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約5×107~2×108のリンパ球を含む。次いで、免疫した動物由来の抗体産生Bリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、所望の融合細胞ハイブリドーマのみの増殖を支持する特定の選択培地中でその細胞株を増殖し得なくさせる酵素欠損を有する。当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得るGoding、1986;Campbell、1984。例えば、免疫した動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NSl/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、およびS194/5XX0Bulが使用され得;ラットについて、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F、4B210が使用され得;そしてU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、およびUC729-6はすべて、細胞融合に関連して有用である。抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子化学的または電気的の存在下で、2:1の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包含するが、この比率はそれぞれ約20:1~約1:1まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、記載されておりKohlerおよびMilstein;1975;1976、そしてポリエチレングリコールPEG例えば、37v/vPEGを使用する融合方法は、Gefterら1977に記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切であるGoding、1986。融合手順は通常、低い頻度約1×10-6~1×10-8で生存可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞特に、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞から識別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを倍地に補充するHAT培地。アザセリンが使用される場合、ヒポキサンチンを培地に補充する。好ましい選択培地は、HATである。ヌクレオチドサルベージ経路を機能し得る細胞のみが、HAT培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTを欠損し、そしてそれらは生存し得ない。B細胞はこの経路を機能し得るが、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約2週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびB細胞から形成されたハイブリッドである。この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の反応性について個々のクローンの上清を試験すること約2~3週間後によって、実施される。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイdotimmunobindingassayなど。次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々の抗体産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンは無限に増殖されて、mAbを提供し得る。細胞株は、2つの基本的様式でmAb産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射しばしば、腹膜腔内へされ得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この動物の体液例えば、血清または腹水を穿刺により採取して、高濃度でmAbを提供し得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、mAbは培養培地中に自然に分泌され、ここからmAbは高濃度で容易に獲得され得る。いずれの方法によって産生されたmAbも、所望であれば、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー方法例えば、HPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用して、さらに精製され得る。R.Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3に関わる癌を診断することFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2およびSEMA3、ならびにそれらの対応する遺伝子は、癌の診断指標または予後指標として使用され得る。より詳細には、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2およびSEMA3に関連する、点変異、欠失、挿入、または調節の混乱perturbationは、癌を引き起こし得るかまたは癌の発達を促進し得、原発部位において腫瘍の進行を引き起こすかまたは促進し得、そして/または転移を引き起こすかまたは促進し得る。Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2およびSEMA3の発現によって影響され得る悪性疾患に関連する他の現象としては、新脈管形成および組織侵襲が挙げられる。1.遺伝子診断本発明の1つの実施形態は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の発現における変動を検出するための方法を包含する。これは、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、もしくはSEMA3のレベルを決定する工程、または発現される産物における特定の変化を決定する工程を包含し得る。明らかに、この種類のアッセイは、関連する癌の診断において重要性を有する。このような癌としては、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血球、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口組織、骨髄および血液組織の癌が挙げられ得る。生物学的サンプルは、任意の組織または流体であり得る。種々の実施形態は、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血球、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口組織、骨髄および血液組織の細胞を含む。他の実施形態は、末梢血液、リンパ液、腹水、漿液、胸水、痰、脳脊髄液、涙液、糞便または尿のような流体サンプルを含む。使用される核酸は、標準的な方法論Sambrookら、1989に従って、生物学的サンプルに含まれる細胞から単離される。核酸は、ゲノムDNAまたは分画された細胞RNAもしくは全細胞RNAであり得る。RNAが使用される場合には、このRNAを相補DNAに転換することが、所望であり得る。1つの実施形態においては、このRNAは、全細胞RNAであり;別の実施形態では、RNAは、ポリARNAである。通常、核酸は、増幅される。形式に依存して、目的の特異的核酸は、増幅を使用して直接的に、または増幅に続いて第2の公知の核酸を用いてサンプル中で同定される。次に、同定された産物が検出される。特定の適用においては、この検出は、可視的な手段例えば、ゲルのエチジウムブロミド染色によって実施され得る。あるいは、この検出は、化学発光によるか、放射性標識または蛍光標識の放射性シンチグラフィーによるか、あるいは電子的化または熱的なインパルスシグナルを使用するシステムAffymaxTechnology;Bellus,1994によってさえの、産物の間接的な同定を包含し得る。検出に続いて、所定の患者において見られる結果を、正常な患者およびFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3関連の病理を有する患者の統計的に有意な参照群と、比較し得る。この様式で、検出されるFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の量または種類と、種々の臨床状態とを相関付けることが可能である。遺伝子の変更は、欠失、挿入、点変異および重複を含む。点変異は、終止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換を生じる。体細胞変異は、非生殖系列組織において生じる変異である。生殖系列組織は、任意の組織において生じ、そして遺伝する。コード領域内および外側の変異はまた、ともに、遺伝子の転写を変えるか、または不安定化するか、またはそうでなければ転写物mRNAもしくはタンパク質のいずれかのプロセシングを変えることによって、産生されるFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の量に影響し得る。種々の異なるアッセイがこれに関して意図され、これには、限定しないが、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISH、直接的DNA配列決定、PFGE分析、サザンまたはノーザンブロッティング、一本鎖コンフォメーション分析SSCA、RNAse保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドASO、ドットブロット分析、変性勾配ゲル電気泳動、RFLPおよびPCRTM-SSCPが挙げられる。2.サザン/ノーザンブロッティングブロッティング技術は、当業者に周知である。サザンブロッティングは、標的としてDNAの使用に関し、一方、ノーザンブロッティングは、標的としてRNAの使用に関する。それぞれが、異なる型の情報を提供するが、多くの局面において、cDNAブロッティングは、ブロッティングまたはRNA種に類似する。簡単に述べると、適切なマトリクスしばしば、ニトロセルロースのフィルターに固定されたDNA種またはRNA種を標的化するためにプローブが使用される。異なる種は、分析を促進するために空間的に分離されるべきである。これは、しばしば、核酸種のゲル電気泳動、続くフィルター上でのブロッティングによって達成される。引き続いて、ブロットされた標的が、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ通常、標識されるとともにインキュベートされる。プローブが標的との塩基対を形成するように設計されるので、プローブは、再生条件下で標的配列の部分に結合する。次いで、結合していないプローブは、除去され、そして検出が上記のように達成される。3.分離方法通常、1つの段階でまたは別の段階で、特異的な増幅が行われたか否かを決定するために、テンプレートおよび過剰なプライマーから増幅産物を分離することが所望される。1つの実施形態において、増幅産物を標準的な方法を用いて、アガロース、アガロースアクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。Sambrookら、1989を参照のこと。あるいは、クロマトグラフィー技術を使用して、分離を達成し得る。本発明において用いられ得る、多くの種類のクロマトグラフィーが存在する:吸着、分配、イオン交換、およびモレキュラーシーブ、ならびにカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを用いるための多くの専門的技術Freifelder、1982。4.検出方法マーカー配列の増幅を確認するために、産物を、可視化し得る。代表的な可視化方法の1つは、臭化エチジウムを用いたゲルの染色およびUV光下の可視化を含む。あるいは、増幅産物が、放射線標識ヌクレオチドまたは蛍光定量的に標識されたヌクレオチドを用いて完全に標識されれば、増幅産物は、分離後、X線フィルムに曝露されるか、または適切な刺激スペクトルの下で可視化され得る。5.キット構成要素Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3およびその改変体を検出および配列決定するのに必要な全ての基本的な物質および試薬を、キットの中に一緒に組合せ得る。これは、一般に、事前選択プライマーおよびプローブを含む。核酸を増幅するのに適切な酵素もまた含まれ得、これは増幅のために必要な反応混合物を提供するための種々のポリメラーゼRT、TaqSequenaseTMなど、デオキシヌクレオチド、および緩衝液を含む。このようなキットは、一般的に、適切な手段で、それぞれの個々の試薬および酵素ならびにそれぞれのプライマーまたはプローブに対して異なる容器を含む。6.RT-PCRTM相対的定量的cDNAへのRNAの逆転写RTおよびそれに続く相対的な定量PCRTMRT-PCRTMを使用して、患者から単離された特定のmRNA種の相対的な濃度を測定し得る。特定のmRNA種の濃度が変化することを決定することによって、この特定のmRNA種をコードする遺伝子が、示差的に発現されることが示される。PCRTMにおいて、ある試薬が限界になるまで、増幅される標的DNAの分子数は、反応のサイクル毎にほぼ2倍に増加する。その後、サイクル間で増幅される標的の増加がなくなるまで、増幅速度は、次第に減少する。サイクル数をX軸に、そして増幅される標的DNAの濃度のlogをY軸にして、グラフをプロットすると、このプロットした点を繋ぐことによって、特徴的な形の曲線が形成される。1回目のサイクルによる開始時では、この曲線の傾きは、正でありかつ一定である。これは、この曲線の直線部分といわれる。ある試薬が限界になった後、この曲線の傾きは、減少し始めそして最終的に0になる。この時点で、増幅された標的DNAの濃度は、ある固定値に漸近する。これは、この曲線のプラトー部分といわれる。このPCRTM増幅の直線部分における標的DNAの濃度は、反応を開始する前の標的の開始濃度に、正比例する。同じサイクル数を完了しそして直線範囲にあるPCRTM反応において、標的DNAの増幅産物の濃度を決定することによって、元のDNA混合物中の特定の標的配列の相対的な濃度を決定することが可能である。これらのDNA混合物が、異なる組織または細胞から単離されたRNAから合成されたcDNAである場合、この標的配列が由来する特定のmRNAの相対的な存在量が、それぞれの組織または細胞について決定され得る。このPCRTM産物の濃度と相対的なmRNAの存在量との正比例は、このPCRTM反応の直線範囲にのみ当てはまる。曲線のプラトー部分における標的DNAの最終濃度は、反応混合物中の試薬の利用能によって決定され、そして標的DNAの元の濃度に非依存的である。従って、mRNA種の相対的な存在量が、RNA集団の収集物についてRT-PCRTMによって決定され得る前に、満たされなければならない第1の条件は、このPCRTM反応がこのPCRTM反応曲線の直線部分にあるときに、増幅されたPCRTM産物の濃度がサンプリングされなければならないというということである。特定のmRNA種の相対的な存在量を首尾よく決定するためのRT-PCRTM実験について満たされなければならない第2の条件は、増幅可能なcDNAの相対的な濃度が、ある独立した標準に対して正規化されなければならないということである。RT-PCRTM実験の目標は、サンプル中の全mRNA種の平均存在量に対する、特定のmRNA種の存在量を決定することである。以下に記載の実験において、β-アクチン、アスパラギンシンテターゼおよびリポコルチンIIのmRNAを、外部標準および内部標準として使用し、これらに対して、他のmRNAの相対的な存在量を比較する。競合的PCRTMについてのほとんどのプロトコルは、標的とほぼ同量の内部PCRTM標準を利用する。これらのストラテジーは、PCRTM増幅産物がPCRTMの直線期にサンプリングされる場合に、効果的である。反応がプラトー期に近づいている時に産物をサンプリングする場合、低量の産物が比較的過度に現われる。多くの異なるRNAサンプルについて行われる相対的な存在量の比較例えば、示差的発現についてRNAサンプルを試験する場合は、RNAの相対的な存在量において差異を生じるよう歪められ、その存在量は、実際に存在するよりも少なく現われる。これは、内部標準が標的よりもはるかに豊富に存在する場合には、重要な問題ではない。内部標準が標的よりも豊富に存在する場合、直接的な直線比較が、RNAサンプル間でなされ得る。上記の議論は、臨床的に由来する物質についてのRT-PCRTMアッセイについての理論的考察を記載する。臨床サンプルに固有の問題は、それらの量が可変的である正規化に問題を生じること、そしてそれらの質が可変的である信頼できる内部コントロール好ましくは、標的よりも大きいサイズのの同時増幅を必要とすることである。これらの両方の問題は、RT-PCRTMが、内部標準を用いる相対的な定量RT-PCRTMとして行われ、この内部標準が、標的cDNAフラグメントよりも大きい、増幅可能なcDNAフラグメントであり、そしてこの内部標準をコードするmRNAの存在量が、標的をコードするmRNAよりもほぼ5~100倍高い場合に、克服される。このアッセイは、それぞれのmRNA種の絶対的存在量ではなく、相対的な存在量を測定する。他の研究は、外部標準プロトコルを用いる、より通常の相対的な定量RT-PCRTMアッセイを使用して行われ得る。これらのアッセイは、増幅曲線の直線部分におけるPCRTM産物をサンプリングする。サンプリングに最適なPCRTMサイクル数は、各標的cDNAフラグメントについて経験的に決定されなければならない。さらに、種々の組織サンプルから単離された各RNA集団の逆転写酵素産物は、等濃度の増幅可能なcDNAに対して注意深く正規化されなければならない。この考慮は非常に重要である。なぜなら、このアッセイは、絶対的なmRNAの存在量を測定するからである。絶対的なmRNAの存在量は、正規化されたサンプルのみにおける、示差的な遺伝子発現の尺度として使用され得る。増幅曲線の直線範囲の経験的な決定およびcDNA調製物の正規化は、退屈な時間のかかるプロセスであるが、このRT-PCRTMアッセイの結果は、内部標準を用いる相対的な定量RT-PCRTMアッセイからの結果よりも優れたものであり得る。この利点についての1つの理由は、内部標準/競合因子を用いないので、全ての試薬が、増幅曲線の直線範囲において、単一のPCRTM産物に変換され得、従って、これが、アッセイの感度を増加するということである。別の理由は、1つのPCRTM産物のみを用いるので、電気泳動ゲル上での産物の提示または他の提示方法の複雑性が低下し、バックグラウンドが少なくなり、より容易に理解されることである。なお他の研究は、リアルタイムRT-PCRTMHiguchiら、1993を使用して実行され得る。これらのアッセイは、PCRTM産物が、固定された数のサイクルの後に蓄積するPCRTM産物の量を検出する代わりに、それらが蓄積する時、そのPCRTM産物を検出する。それぞれのPCRTMサイクルの後に、蛍光検出する方法が必要とされる。蛍光シグナルは、サイクル数に対してプロットされる。サイクル数は、閾値サイクルCTとして表現される。最初の蛍光は、プロットのベースラインを規定し、そして蓄積されたPCRTM産物は、ベースラインの上の蛍光の増加によって示される。サンプル中の標的の量の定量は、開始コピー数を決定するために、CTを測定し、検量線と比較することによって決定される。リアルタイムRT-PCRTMHiguchiら、1993は、終点よりもむしろ、PCRTMの対数期の間に決定されるので、標的の量のより正確な定量を提供する。CT値の使用によって、より大きな動的範囲が可能になるので、これはまたより高いスループットを可能にする。それぞれのサンプルの希釈は、もはや必要ではない。7.免疫診断本発明の抗体は、ELISAおよびウェスタンブロッティングのような技術によって、健康な組織および疾患状態の組織のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3の量を特徴付ける際に使用され得る。これは、悪性疾患の存在または非存在についてあるいはさらなる癌の指標としてのスクリーンを提供し得る。本発明の抗体の使用が、ELISAアッセイにおいて、考慮される。例えば、抗Fus1抗体、抗101F6抗体、抗Gene21抗体、抗Gene26抗体、抗Beta抗体、抗Luca1抗体、抗Luca2抗体、抗PL6抗体、抗123F2抗体、または抗SEMA3抗体は、選択された表面好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面に固定される。不完全に吸着された材料を除くために洗浄された後、ウシ血清アルブミンBSA、カゼイン、または粉ミルクの溶液のような試験抗血清に関して抗原的に中性であることが公知の非特異的タンパク質でアッセイプレートウェルを結合またはコーティングすることが望ましい。これは、固定表面の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、従って、表面への抗原の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを減少する。ウェルへ抗体を結合し、バックグラウンドを減少させるために非反応性物質でコーティングし、そして非結合物質を洗浄により除去した後に、固定表面を、免疫複合体抗原/抗体形成を導く様式で、試験されるサンプルと接触させる。試験サンプルと結合抗体との間の特異的な免疫複合体の形成、引き続く洗浄に続いて、免疫複合体形成の存在および量さえも、これを、一次抗体とは異なるFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2、またはSEMA3に対する特異性を有する二次抗体に供することによって決定され得る。適切な条件は、好ましくは、サンプルを希釈剤例えば、BSA、ウシガンマグロブリンBGGならびにリン酸緩衝生理食塩水PBS/Tween登録商標で希釈することを含む。これらの加えられる薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向がある。次いで、層状の抗血清を、約2~約4時間、好ましくは約25°C~約27°Cのオーダーの温度でインキュベートし得る。インキュベーションに続いて、抗血清接触表面を、非免疫複合材料を除去するために洗浄する。好ましい洗浄手順は、PBS/Tween登録商標またはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄することを含む。検出手段を提供するために、二次抗体は、好ましくは、適切な色素原性基質を用いるインキュベーションの際に色の発色を生成する関連酵素を有する。従って、例えば、免疫複合体形成の発生を支持する時間の間および条件下例えば、PBS/Tween登録商標のようなPBS含有溶液中、室温での2時間のインキュベーションでのウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGとの二次抗体結合表面の接触およびインキュベーションが望まれる。二次酵素タグ化抗体を用いるインキュベーションの後、そして未結合材料を除去するための洗浄に続いて、標識の量は、酵素標識のようなペルオキシダーゼの場合において、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは2,2’-アジノazino-ジ-3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸ABTSおよびH2O2のような色素原性基質とのインキュベーションによって定量される。次いで、定量は、色生成の程度を測定すること例えば、可視スペクトル分光光度計を使用することによって達成される。先の形式は、サンプルをアッセイプレートに最初に結合することによって変更され得る。次いで、一次抗体が、このアッセイプレートとともにインキュベートされ、続いて、一次抗体に対する特異性を有する標識された二次抗体を使用して結合した一次抗体を検出する。本発明の抗体組成物は、免疫ブロット分析またはウェスタンブロット分析において大きな用途を見出す。抗体は、固体支持マトリクス例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはその組み合わせ上に固定されたタンパク質の同定のための高親和性の一次試薬として使用され得る。免疫沈降、続くゲル電気泳動とともに、これらは、抗原の検出に使用される二次試薬が有害なバックグラウンドを引き起こす抗原を検出する際に使用するための単一工程試薬として使用され得る。ウェスタンブロットとともに使用される免疫学に基づいた検出法は、これに関して特定の使用であると考慮される、毒素部分に対する酵素タグ化二次抗体、放射線標識二次抗体または蛍光タグ化二次抗体を含む。8.他のマーカーとの腫瘍サプレッサーの組み合わせ腫瘍は、特に腫瘍進行の進んだ段階において、不均一であることが周知であるMortonら、1993;FidlerおよびHart、1982;Nowell、1982;Elderら、1989;Bystrynら、1985。原発性腫瘍または転移内の腫瘍細胞は全て、同じマーカー遺伝子を発現し得るが、特定のmRNAの発現レベルは、かなり異なるElderら、1989。特定の例において、一連の不均質なマーカーの整列を処理し得る検出システムを使用することが必要である。従って、本発明は、マーカーとして種々の腫瘍サプレッサーを例示するが、癌の存在または非存在に相関する任意のマーカーが、腫瘍の検出および処置の効力を改善するために、これらのマーカーと組み合わせて使用され得る。本明細書中で使用される場合、マーカーは、その産生または産生の欠如が癌細胞の特徴である任意のタンパク質分子または対応する遺伝子である。所定の分析において使用されるマーカーの特定のセットに依存して、統計学的分析は異なる。例えば、特定の組み合わせのマーカーが、黒色腫または乳癌に非常に特異的である場合、陽性結果の特形学的有意性は高い。しかし、このような特異性は、感受性を犠牲にして達成される。すなわち、陰性の結果は、黒色腫または乳癌の存在下でさえ生じ得る。同様に、異なる組み合わせは、非常に敏感であり得る。すなわち、陰性になることはほとんどないが、低い特異性を有する。新規マーカーが同定されると、異なる民族集団もしくは性別、異なる地理的分布、異なる疾患段階、異なる程度の特異性または異なる程度の感受性で最適な機能を示す異なる組み合わせが、開発され得る。疾患の進行に対する治療レジメンの効果に対して特に敏感なマーカーの組み合わせもまた、開発され得る。患者は、手術、遺伝子治療、高熱、免疫療法、サイトカイン治療、遺伝子治療、放射線療法または化学療法の後に、特定の治療が有効であるか否か決定するためにモニターされ得る。黒色腫のための特に有用なマーカーの組み合わせの1つは、チロシナーゼおよびMAGEファミリーのメンバー特にMAGE-1またはMAGE-3である。ヒトチロシナーゼは、ヒトの皮膚および眼の褐色または黒色の色素の群である、メラニンの産生を調節する、必須の酵素であるNordlundら、1989;Hoonら、1993。より詳細には、チロシナーゼは、チロシンのDopaへの変換およびDopaのドーパキノンへの変換を触媒する。これらおよび他のマーカーと組み合わせて使用され得る、多くの他のマーカーが存在する。例えば、b-ヒト絨毛性ゴナドトロピンb-HCG。b-HCGは、妊婦の胎盤の栄養膜細胞によって産生され、そして、初期段階での妊娠の維持に必須であるPierceら、1981;Talmadgeら、1984。b-HCGは、栄養膜または生殖系列起源の腫瘍例えば、絨毛癌または精巣癌腫細胞によって産生されることが公知であるMadersbacherら、1994;Coleら、1983。b-HCGの異所的発現もまた、種々の非生殖腺の腫瘍例えば、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌および膵臓癌などにおいて、多くの異なるイムノアッセイによって検出されているMcManusら、1976;Yoshimuraら、1994;Yamaguchiら、1989;Marcillacら、1992;Alfthanら、1992。これらの腫瘍におけるb-HCG産生の機能は、未だ未知であるが、癌細胞によるが、非生殖腺起源の正常細胞にはよらないb-HCGの隔世遺伝的発現は、b-HCGが、黒色腫および乳癌の検出において潜在的に優れたマーカーであることを示唆するHoonら、1996;Sarantouら、1997。マーカーの別の例示的な例は、グリコシルトランスフェラーゼb-1、4-N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼGalNAcである。GalNAcは、それぞれ、GM2およびGD2を生成するための、b1r4結合によるN-アセチルガラクトサミンの、ガングリオシドGM3およびGD3の両方への転移を触媒するNagataら、1992;Furukawaら、1993。これはまた、N-アセチルガラクトサミンの他の炭水化物分子例えば、ムチンへの転移も触媒する。ガングリオシドは、細胞分化、接着および悪性形質転換において重要な役割を果たす、シアル酸含有グリコスフィンゴリピドである。黒色腫において、ガングリオシドGM2およびGD2の発現は、しばしば、非常に高いレベルに増強され、そして転移腫瘍を含む腫瘍進行に関連するHoonら、1989;Andoら、1987;Carubiaら、1984;Tsuchidaら、1987a。ガングリオシドはまた、黒色腫、腎臓癌腫、肺癌腫、乳癌腫の細胞において発現される。ガングリオシドGM2およびGD2は、ヒトにおいて免疫原性であり、そして特定の免疫療法例えば、ヒトモノクローナル抗体または癌ワクチンのための標的として使用され得るTsuchidaら、1987b;Irie、1985。GalNAcmRNAは、GM2およびGD2の発現マーカーとして使用され得、そして結果的に、黒色腫または乳癌細胞のいずれかのマーカーとして使用され得る。GalNAcは、一般に、正常なリンパ球、上皮細胞、メラノサイト、結合組織またはリンパ節の細胞においては発現されない。検出されるとしても、非常に低レベルである。前立腺特異的抗原は、前立腺癌に十分特徴付けられたマーカーであるGomellaら、1997。白血病についてのbrc/abl遺伝子は、HOJ-1と組み合わせて有用であることが意図される、さらに十分に特徴付けられたマーカーである。本発明によって意図される他のマーカーとしては、細胞溶解性Tリンパ球CTL標的が挙げられる。MAGE-3は、黒色腫細胞および乳癌細胞において同定されたマーカーである。MAGE-3は、多くの黒色腫および他の腫瘍において発現され、そしてCTL標的であるGauglerら、1994。MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-12、MAGE-Xpは、MAGE遺伝子ファミリーの他のメンバーである。MAGE-1遺伝子の配列は、MAGE-3と73の同一性を示し、そしてCTLによっても認識される抗原を発現するGauglerら、1994。MART-1は、別の潜在的なCTL標的でありRobbinsら、1994、そしてまた、本発明において含まれ得る。MUC18は、黒色腫細胞の同定において有用である、別のマーカーであるLehmanら、1989;Lehmanら、1987。MUC18は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質であり、そして神経細胞接着分子NCAMに対して配列相同性を有する。他のムチンファミリーのメンバーとしては、MUC1、MUC2、MUC3およびMUC4が挙げられる。これらは、特定の腫瘍細胞株で高レベルで発現されることが見出されHollingsworthら、1994、そしてまた、本発明の新規HOJ-1マーカーと組み合わせてマーカーとして使用され得る。黒色腫転移の発生に関連する接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーDentonら、1992は、本発明において使用され得る。例としては、細胞間接着分子-1ICAM-1、NCAM、VCAM-1およびELAMが挙げられる。別の実施形態としては、癌腫細胞関連分子および他の転位性疾患に関連する分子例えば、癌胎児抗原CEA;LinおよびGuidotti、1989が挙げられる。他の癌腫または皮膚癌に関連するタンパク質およびその対応する核酸もまた、本発明において使用され得る。好ましい例としては、黒色腫抗原gp75Vijayasardahiら、1990、ヒトサイトケラチン20、高分子量黒色腫抗原Nataliら、1987およびサイトケラチン19K19Dattaら、1994が挙げられる。本明細書中で有用であり得る他のマーカーとしては、サイクリン依存性キナーゼCDKのインヒビターが挙げられる。例えば、CDK4は、細胞周期のG1期を通じて進行を調節する。CDK4の活性は、活性化サブユニットD型サイクリンおよび阻害サブユニットによって制御され、p16INK4は、CDK4に特異的に結合して阻害するタンパク質として、生化学的に特徴付けられているSerranoら、1993;Serranoら、1995。他のCDK阻害タンパク質としてはまた、p16、p21WAF1およびp27KIP1が挙げられる。この列挙は、本発明において使用され得る潜在的なマーカーの型および数について、網羅的であることを意図せず、例示のみである。メラニン合成経路に関する他のタンパク質およびその対応する核酸は、マーカーとして使用され得る例えば、チロシナーゼ関連タンパク質1および2、ならびにpMel17遺伝子ファミリーのメンバーKwonら、1993。本発明の好ましい実施形態は、癌細胞の検出のための、多くの異なる組み合わせのマーカーを含む。細胞中の新生物を示す任意のマーカーが、本発明において含まれ得る。S.トランスジェニック動物/ノックアウト動物本発明の1つの実施形態において、機能的なFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3ポリペプチドあるいはこれらの改変体をコードする機能的導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が、作製される。Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物、このような動物に由来する組換え細胞株およびトランスジェニック胚は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の機能を誘導または抑制する薬剤を、スクリーニングおよび同定するための方法において有用であり得る。本発明のトランスジェニック動物はまた、癌のような指標を研究するためのモデルとして使用され得る。本発明の1つの実施形態において、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3導入遺伝子を非ヒト宿主に導入して、ヒトまたはマウスのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製する。このトランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする様式でゲノムに導入遺伝子を組み込むことにより作製される。トランスジェニック動物を作製する方法は、一般に、WagnerandHoppe米国特許第4,873,191号;本明細書中に参考として援用される、Brinsteretal.1985;本明細書中にその全体が参考として援用される、およびManipulatingtheMouseEmbryo;ALaboratoryManual2ndeditioneds.,Hogan,Beddington,CostantimiandLong,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994;本明細書中にその全体が参考として援用されるに記載される。導入遺伝子と内因性遺伝子との間での相同組換えにより内因性Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3を置き換えることが望ましい;またはこの内因性遺伝子を、ノックアウト動物の作出において欠失により除去し得る。代表的には、ゲノム配列に隣接するFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3遺伝子は、マイクロインジェクションにより受精卵へと移入される。マイクロインジェクションを受けた卵は、宿主雌性動物に移植され、そして導入遺伝子の発現について子孫がスクリーニングされる。トランスジェニック動物は、受精卵から作製され得、これらとしては、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物および魚類が挙げられるが、これらに限定されない動物から作製され得る。特定の好ましい実施形態において、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3を過剰発現するか、または変異形態のポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスが作製される。あるいは、ノックアウトマウスにFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3が存在しないことにより、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3タンパク質の喪失がインビボで細胞に与える影響の研究が可能になる。ノックアウトマウスはまた、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3関連の癌の発生についてのモデルを提供する。上記のように、トランスジェニック動物およびこのような動物に由来する細胞株は、特定の試験実験における用途を見出し得る。これに関して、野生型または変異体のFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3を発現し得るトランスジェニック動物および細胞株は、試験物質に曝され得る。これらの試験物質は、野生型Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3発現を増強する能力/および/またはFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の発現もしくは機能を機能させるかもしくは損なう能力についてスクリーニングされ得る。本明細書中で言及されるプロモーター配列は、β-ガラクトシダーゼ発現を駆動するために使用され得る。トランスジェニックマウスにおけるβ-ガラクトシダーゼレポーター構築物の使用は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の発現を調節する因子を同定するために使用され得る。T.Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3を使用する癌を処置するための方法別の実施形態において、本発明はまた、癌の処置を包含する。本発明に従って処置され得る癌の型は、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の関与によるのみで制限される。関与によって、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3が変異されることも異常であることさえも必要とせず、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の過剰発現が、細胞内の他の病変を実際に克服し得る。従って、広範な種々の癌細胞が、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3治療を使用して処置され得、これらには、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、胸部、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織、骨髄および血液組織が挙げられる。多くの状況下で、癌細胞は、殺傷されることも、正常な細胞死またはアポトーシスを受けるよう誘導されることも必要ではない。むしろ、意味のある処置を達成するために、必要なことは、腫瘍増殖をある程度に遅くさせることである。腫瘍増殖は、部分的または完全にブロックされてもよいが、いくらかの腫瘍退行が達成されてもよい。腫瘍負荷の寛解および減少のような臨床用語はまた、それらの通常の用語法を考慮して意図される。1.遺伝子ベースの治療本発明者らによって意図される治療実施形態の1つは、いくつかの癌の腫瘍形成に関連する事象への分子レベルでの介入である。詳細には、本発明者らは、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3を癌細胞に提供し得る発現カセットを、それらの癌細胞に提供することを意図する。発現ベクターおよびそれに使用される遺伝子エレメントの長期にわたる考察が、参考としてこの節において援用される。特に好ましい発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスベクターである。リポソームにカプセル化した発現ベクターもまた、好ましい。種々の経路が、種々の腫瘍型について意図される。経路についての以下の節は、可能な経路の広範なリストを含む。実質的に任意の腫瘍について、全身送達が意図される。これは、微視的な癌または転移性の癌を攻撃するために特に重要であることを示す。別々の腫瘍塊が同定され得る場合、種々の直接的、局所的および領域的なアプローチが採用され得る。例えば、腫瘍に、発現ベクターを直接注射し得る。腫瘍床は、切除前、切除中または切除後に処置され得る。切除後は、一般に、手術後に設置されたカテーテルによってベクターを送達する。腫瘍の血管系を利用して、支持する動脈または動脈に注射することによって腫瘍内にベクターを導入し得る。より遠位な血液供給経路もまた、利用され得る。異なる実施形態において、エキソビボ遺伝子治療が意図される。このアプローチは、骨髄に関連する癌の処置に特に適切であるが、これらに限定されない。エキソビボの実施形態において、患者由来の細胞を取り出し、そして少なくともいくらかの時間体外で維持する。この期間の間、治療が送達され、その後、細胞を患者に再導入し;望ましくは、サンプル中の任意の腫瘍細胞は、殺傷されている。2.タンパク質治療別の治療アプローチは、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3のポリペプチド、活性フラグメント、合成ペプチド、模倣物またはそれらの他のアナログを被験体に提供することである。タンパク質は、組換え発現手段によって生成され得るか、また十分に小さい場合、自動ペプチド合成機によって生成され得る。処方物は、投与経路および目的に基づいて選択され得、これらには、リポソーム処方物および古典的な薬学的調製物が挙げられるが、これらに限定されない。3.免疫療法、従来の化学療法または放射線療法との組み合わせ治療DNA損傷剤に対して耐性のある腫瘍細胞は、臨床腫瘍学における主要な問題を提示する。現在の癌研究の1つの目標は、化学療法および放射線療法の効力を改善する方法を見出すことである。1つの方法は、このような従来の治療法を遺伝子治療と組み合わせることによる。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼHS-tk遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達された場合、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘導したCulverら、1992。本発明の状況下で、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3置換療法は、化学療法または放射線療法の介入と組み合わせて同様に使用され得ることが意図される。上記のように、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3遺伝子治療と免疫療法とを組み合わせることもまた効果的であることが示され得る。本発明の方法および組成物を使用して、細胞を殺傷するため、細胞増殖を阻害するため、転移を阻害するため、脈管形成を阻害するため、あるいは腫瘍細胞の悪性表現型を逆転または減少するために、一般に、標的細胞にFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3発現構築物および少なくとも1つの他の薬剤を接触させる。これらの組成物は、細胞の増殖を殺傷または阻害するのに効果的な組み合わせの量で提供される。このプロセスは、細胞に、発現構築物およびこれらの薬剤または因子を同時に接触させることを包含し得る。これは、細胞に、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的処方物を接触させることによってか、または細胞に、2つの別々の組成物または処方物ここで、一方の組成物が、発現構築物を含み、そして他方が、薬剤を含むを接触させることによって達成され得る。あるいは、遺伝子治療処置は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置に先行または後続し得る。他の薬剤および発現構築物を細胞に別々に適用する実施形態において、一般に、その薬剤および発現構築物が、細胞に対して有利な組み合わせの効果をなお発揮し得るように、各送達の時点間で有意な期間が経過しないことを確保する。このような例において、互いに約12~24時間内、より好ましくは、互いに約6~12時間以内に、その両方の様式を細胞に接触させることが意図され、約12時間のみの遅延時間が、最も好ましい。いくつかの状況において、処置期間を有意に延長することが望ましくあり得るが、その場合、それぞれの投与間で、数日2、3、4、5、6または7日から数週間1、2、3、4、5、6、7または8週間経過させる。Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3あるいは他の薬剤のいずれかの1回以上の投与が望ましいこともまた、想定される。以下に例示するような種々の組み合わせが使用され、ここでは、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3がAであり、そして他の薬剤がBである:A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BB/B/B/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B。他の組み合わせが、意図される。また、細胞殺傷を達成するために、両方の薬剤が、細胞を殺傷するのに効果的な組み合わせの量で細胞に送達される。組み合わせ治療における使用に適切な薬剤または因子は、細胞に適用された場合にDNA損傷を誘導する任意の化学化合物または治療方法である。このような薬剤および因子としては、DNA損傷を誘導する放射線および波動例えば、γ-照射、X線、加速プロトン、UV照射、マイクロ波、電子放出などが挙げられる。化学療法剤としても記載される、種々の化学化合物は、DNA損傷を誘導するよう機能し、これら全ては、本明細書中に開示される組み合わせの処置方法における使用に意図される。使用されることが意図される化学療法剤としては、例えば、以下が挙げられる:シスプラチンCDDP、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブルスファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシンplicomycin、マイトマイシン、エトポシドVP16、タモキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソール、ゲンタマイシン、ナベルビンnavelbine、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチンtransplatinum、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、ならびに過酸化水素。本発明はまた、1以上のDNA損傷剤放射線ベースまたは実際の化合物のいずれでもの組み合わせの使用例えば、シスプラチンとのX線の使用またはエトポシドとnシスプラチンの使用を包含する。特定の実施形態において、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3発現構築物と組み合わせたシスプラチンの使用は、この化合物として特に好ましい。本発明に従う癌の処置において、腫瘍細胞に、発現構築物に加えて、薬剤を接触させる。これは、局在化した腫瘍部位に放射線例えば、X線、加速プロトン、UV光、γ線、またはマイクロ波でさえを照射することによって達成され得る。あるいは、腫瘍細胞に、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、より好ましくは、シスプラチンのような化合物を含む治療有効量の薬学的組成物を被験体に投与することによって、薬剤を接触させ得る。上記のように、薬剤は、それをFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3発現構築物と組み合わせることによって、組み合わせ治療組成物またはキットとして調製および使用され得る。核酸特に、DNAを直接架橋する薬剤は、DNA損傷を促進することが想定され、これは、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3との相乗的な抗腫瘍性の組み合わせを導く。シスプラチンのような薬剤および他のDNAアルキル化剤が、使用され得る。シスプラチンは、癌を処置するために広範に使用されており、その有効用量は、計3つの過程で3週間毎に5日間、20mg/m2の臨床的適用において使用される。シスプラチンは、経口的には吸収されず、従って、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内の注射を介して送達されるべきである。DNAを損傷する薬剤としてはまた、DNA複製、有糸分裂および染色体分離に干渉する化合物が挙げられる。このような化学療法化合物としては、アドリアマイシンドキソルビシンとしても公知、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。これらの化合物は、新生物の処置のための臨床設定において広範に使用され、アドリアマイシンについては21日間隔で25~75mg/m2の範囲の用量で静脈内にボーラス注射を介して投与され、エトポシドについては35~50mg/m2で静脈内またはその2倍の静脈内用量を経口的に投与される。核酸の前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を破壊する薬剤もまた、DNA損傷を導く。そのような多くの核酸前駆体が、開発されている。広範な試験を受けそして容易に利用可能な薬剤が、特に有用である。それ自体で、5-フルオロウラシル5-FUのような薬剤は、新生物組織によって優先的に使用され、このことが、この薬剤を、新生物細胞に標的化するために特に有用なものとする。非常に毒性であるが、5-FUは、広範なキャリア中で適用可能あり、3~15mg/kg/日の範囲の用量での局所的ではあるが静脈内投与で通常使用される。DNA損傷を引き起こし、そして広範に使用されている他の因子としては、γ線、X線、加速プロトン、として一般的に公知のもの、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達が挙げられる。DNA損傷因子の他の形態例えば、マイクロ波およびUV照射も意図される。ほぼおそらく、これらの因子の全ては、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対して、広範なDNA損傷をもたらす。X線についての投与量範囲は、長期期間3~4週間についての50~200レントゲンの日量から、2000~6000レントゲンの単回用量にまでわたる。放射性同位体についての投与量範囲は、広範に変化し、そしてその同位体の半減期、放出される照射の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。当業者は、Remington’sPharmaceuticalSciences第15版、第33章特に、624~652頁に従う。投薬におけるいくつかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。いずれにしろ、投与を担う人は、個々の被験体についての適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与については、調製物は、FDAOfficeofBiologicsStandardsに要求される、滅菌基準、発熱基準、一般的な安全基準および純度基準を満たすべきである。本発明者らは、3p21.3に関連する癌を有する患者へのFus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3発現構築物の局所的送達が、この臨床疾患を相殺するための治療効果的な遺伝子を送達するための非常に有効な方法であることを提唱する。同様に、化学療法または放射線療法は、被験体の身体の特定の罹患した領域に指向され得る。あるいは、発現構築物および/または薬剤の全身送達は、特定の状況下例えば、広範な転移が生じている場合で適切であり得る。Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3標的化治療と化学療法および放射線治療との組み合わせに加えて、他の遺伝子治療との組み合わせが有益であることもまた考えられる。例えば、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3およびp53変異またはp16変異を同時に標的化することにより、改良された抗癌処置を行い得る。おそらく、任意の他の腫瘍関連遺伝子例えば、p21、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、BCRA2、p16、FHIT、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bclおよびablは、この様式で標的化され得る。前記の治療のいずれも、Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3関連障害を処置する際にそれら自体で有用であると証明され得ることもまた示されるべきである。この点に関して、化学療法および非Fus1、101F6、Gene21、Gene26、Beta、Luca1、Luca2、PL6、123F2またはSEMA3の遺伝子療法の組み合わせへの言及はまた、これらのアプローチが別々に用いられ得ることを考慮して解釈されるべきである。4.患者に投与するための処方および経路臨床適用が企図される場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体および薬物を意図された適用に適切な形態で調製することが必要である。一般的に、これは、本質的に発熱物質、およびヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。一般的に、送達ベクターを安定にし、かつ標的細胞による取り込みを可能にする、適切な塩および緩衝液を用いることが望ましい。緩衝液はまた、組換え細胞が患者に導入される場合に用いられる。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性培地に溶解または分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。このような組成物はまた、接種材料としても好ましい。句薬学的にまたは薬理学的に受容可能なとは、動物またはヒトに投与される場合、有害反応、アレルギー反応または他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、薬学的に受容可能なキャリアは、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤および等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。少しでも従来の媒体または薬剤が、本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除いて、治療的組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、組成物中に組込まれ得る。本発明の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を包含し得る。本発明に従うこれらの組成物の投与は、その標的組織がその経路を介して利用可能な限り、任意の一般的な経路を介する。この経路としては、経口、鼻、口腔、直腸、腟内または局所が挙げられる。あるいは、正常注射orthotopic、皮内注射、皮下注射、筋内注射、腹腔内注射または静脈内注射によって投与され得る。このような組成物は、標準的には、薬学的に受容可能な組成物として投与される。処方の際に、溶液は投薬処方に適合した様式、および治療的に有効であるような量で投与される。実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のために好ましい形態を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、多数の変化が、開示される特定の実施形態においてなされ得、なお本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られ得ることを認識すべきである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連した特定の試薬が、本明細書中に記載される試薬と置換され得るが、同じかまたは類似の結果が得られることは、明らかである。当業者に明らかな、全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神、範囲および概念の中にあるとみなされる。実施例1.3p21.3クリティカル領域における3p遺伝子の同定および3p遺伝子のcDNAの単離3p腫瘍サプレッサー領域を、適合した腫瘍/正常組織対におけるLOH領域を調査し、かつホモ接合欠失の異常な例を試験するために設計された対立形質によって同定した図4。肺癌において対立遺伝子欠失を示す、最も頻繁に関与した領域を3p21.3領域にマッピングした。さらに、複数の重複したホモ接合欠失は、SCLC株H740およびSCLC株H1450における3p21.3染色体領域において見出され、これにより3p21.3領域における約750kbに隣接する腫瘍サプレッサー遺伝子に調査が絞られた。9つの遺伝子Fus1、101F6、NPRL2Gene21、CACNA2D2Gene26、HYAL1Luca1、HYAL2Luca2、PL6、123F2およびBetaは、分裂されるか、または3p21.3領域において見出される約35kbのホモ接合欠失に直接隣接していた。SEMA3もまた、3p21.3領域に存在する。これらの遺伝子のcDNAは、単離およびクローン化され、そしてこれらの遺伝子における変異を、種々の腫瘍ならびに一本鎖コンホメーション多型SSCPおよびDNA配列決定分析による腫瘍細胞株において決定した表4。cDNAクローンの一部は、GenBankにおいて公知の遺伝子に対して約50のアミノ酸相同性を示し、いくらかは、GenBankにおいてランダム配列タグ化部位に対する完全なDNA配列の相同性が実証され、そして、1つの遺伝子、Betaは、以前は未知であった表4。表4.125kbの3p21.3クリティカル領域において同定された遺伝子およびそれらのcDNA配列決定および変異分析の状態他の公知の遺伝子に対する、予測されるアミノ酸配列の相同性としては、以下が挙げられる:CACNA2D2Gene26、電位型Ca2チャネルα2δ調節サブユニット;NPRL2Gene21、窒素パーミアーゼ制御因子;123F2、Ras結合タンパク質のMaxp1/Norelホモログ;HYAL2LUCA-2およびHYAL1LUCA-1、ヒアルロニダーゼのファミリー。アミノ酸配列を変更した変異のみが示される。さらに、1つより多くの腫瘍において見出され、かつアミノ酸配列を変更しなかった多型は、示されない。実施例2.3p遺伝子の組換えアデノウイルスベクターの構築アデノウイルスベクターは、インビトロ、動物モデル、臨床前調査、およびヒト臨床遺伝子治療試行において、遺伝子送達のために広く使用されている。形質導入の高い有効性および種々の細胞型におけるアデノウイルスベクターによって媒介される導入遺伝子の高レベルの発現のために、3p遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターAd-3psは、機能的な野生型3p遺伝子を、3pまたは3p遺伝子の異常性を伴う腫瘍または腫瘍細胞株に導入するための有効なツールとなる。3p21遺伝子の組換えアデノウイルスベクターとしては、Gene21、Fus1、101F6、Gene26、123F2S、Luca1、およびBetaが挙げられ、このアデノウイルスベクターは、本発明者らが近年開発したライゲーション媒介プラスミド-アデノウイルスベクター構築系、pAd-RAPおよびpAd-RAP-Shuttleを使用して、構築された。本発明者らは、この系を使用して、首尾良くかつ迅速に、3p21.3領域における10個全ての遺伝子について組換えアデノウイルスベクターおよび多数の他の組換えベクターを構築した。組換えAd-3psは、インビトロで標的細胞を直接感染させることによって、およびインビボでベクターの静脈内注射または局所注射によって、効果的に3p遺伝子を種々の細胞型に送達し、そしてこれら種々の細胞型において3p遺伝子を発現し得る。染色体3pにおける腫瘍サプレッサー3p21.3遺伝子の相対的なゲノム位置、および3p遺伝子の組み換えアデノウイルスベクターの構造は、概略的に実証される図5。本発明者らは、pAd-RAPおよびpAd-RAP-Shuttleと命名した、新規のライゲーション媒介プラスミド-アデノウイルスベクター構築系を開発した。この系を使用して、細菌Escherichiacoliにおいて組換えアデノウイルス含有プラスミドを迅速に構築し得、次いで、首尾良く、哺乳動物宿主293細胞において同種アデノウイルスを産生し得る図1。この系において、導入遺伝子Xを、まず、プラスミドシャトルベクターpAd-RAP-Shuttle中に配置する。このベクターは、アデノウイルス逆方向反復末端IRT配列、サイトメガロウイルスCMVプロモーターおよびウシ成長ホルモンBGHポリAシグナル配列の発現カセット、ならびに、IRT-CMV複数クローニング部位BGH配列の5’末端および3’末端において、それぞれ、2つの特有な制限部位BstBIおよびClaIを含む。次いで、IRT-CMV-X-BGHを含むBstBI/ClaI放出DNAフラグメントをアデノウイルスプラスミドスベクターpAd-RAPに挿入する。このベクターは、BstBI部位およびClaI部位を用いたインビトロでのライゲーションにより、完全なE1およびE3欠失アデノウイルス5型ゲノムおよび3つの特有な制限部位PacI、BstBIおよびClaIを含む。Escherichiacoliへの形質転換の後、90の形質転換体が正確な挿入を有する。最終的に、得られたプラスミドのPacI/BstBI消化によって、3p遺伝子を含む全体のアデノウイルスゲノムの放出が可能になる。次いで、組換えAd-XDNAを293細胞にトランスフェクトし、組換えAd-Xの同種集団を得る。他のプロモーター、ポリA配列および制限部位を使用し得る。この系を使用して、2~4週間以内に組換えアデノウイルスを迅速に構築し得る。比較した場合、哺乳動物細胞において同種組換えを使用するような従来の方法は、通常、3~12ヶ月かかる。宿主293細胞における導入遺伝子の可能な細胞傷害性に起因して、特定の組換えアデノウイルスを産生するのに失敗した場合、図2に実証されるような、テトラサイクリンの存在下で導入遺伝子発現を遮断し得るテトラサイクリン調節エレメントTREを用いる、pAd-RAP-TetR-OffおよびpAd-RAP-TRE-CMV-Shuttleと命名した類似システムが開発されており、このようなベクターの産生のために使用され得る。Ad-CMV-GFPAd-GFPおよびAd-CMV-LacZベクターを、ウイルスベクターによる形質導入の有効性をモニタリングするため、そして非特異的導入遺伝子発現コントロールとして使用した。Ad-E1-Ad-EV空のE1ベクターを、陰性コントロールとして使用する。ウイルスタイターを、光学密度測定およびプラークアッセイの両方によって決定した。野生型ウイルスによるウイルス調製物の潜在的な汚染を、ポリメラーゼ連鎖反応PCR分析によってモニタリングした。ウイルスベクターにおける3p遺伝子の配列を、自動化DNA配列決定によって確認した。得られたAd-3psを、それぞれ、Ad-101F6、Ad-Gene26、Ad-Gene21、Ad-Fus1、Ad-PL6、Ad-Luca1、Ad-Luca2、Ad-123F2S、Ad-Beta、およびAd-SEMA3と命名した。実施例3.PAD3psの調製プロタミン-アデノウイルスPAD複合体の調製ならびにインビトロおよびインビボでのPADによる形質導入の有効性の増大が報告されているClarkら、1999、Lanutiら、1999。プロタミン-アデノウイルス複合体を、1×1010ウイルス粒子を50μgの硫酸プロタミン10mg/mlと単純に混合することによって調製した。この複合体を10分間室温でインキュベートして、次いでこの複合体化アデノウイルスを、指定のインビトロまたはインビボ実験のために、適切な容量のPBS中に希釈した。実施例4.LDC3psおよびLPD3psの調製リポソームDOTAP:コレステロールLDC、プラスミドDNAおよびLDC-3pDNA複合体LDC3psをTempletenらTempletonら、1997によって記載されるように調製した。LDC3psを、1匹のマウスに対する静脈注射用に80nmolのリポソーム:100μlの全容量において5Dextral水D5W中の50μgのDNAとして処方した。リポソームDOTAP:Cholesterol:プロタミン:DNALPDをHungliら、1998の方法に基づいて調製した。実施例5.腫瘍細胞増殖に対する3p遺伝子の過剰発現の影響新規な腫瘍サプレッサー遺伝子の生物学的機能を研究するために、野生型遺伝子発現プラスミドによって過渡的にまたは安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞株において、実験を通常通りに行った。Ad-3pベクターは、インビトロおよびインビボでの3p遺伝子送達に関するプラスミドに対して、いくつかの利点を提供し得る。1形質導入の高い有効性>80および高レベルの3p遺伝子発現は、標的細胞に対するウイルス粒子の感染多重度MOIを単純に調節することによって、細胞型の広いスペクトルにおいて容易に達成され得る。従って、Ad-3psを使用して、個々の領域または全領域として3p遺伝子の有効性を評価し得る;2Ad-3ps形質導入を、腫瘍細胞に直接適用して、安定に形質導入されたコロニーの選択なしに動物において腫瘍形成能に対するそれらの影響を研究し得、これによって、コロニー選択プロセスに関連した問題および得られた細胞コロニーにおいて生じる未知のエフェクターまたは因子を回避し得る;そして、3Ad-3psを直接使用して、個々のAd-3pベクターまたは組み合わせたAd-3pベクターを用いて動物に静脈内注射または腫瘍内注射することによってインビボでの腫瘍サプレッサー遺伝子領域としての3p遺伝子の役割を評価し得る。これらの新規に単離された3p遺伝子の生物学的機能は、インビトロおよびインビボの両方で、リポソーム媒介遺伝子移入および組換えアデノウイルスベクター媒介遺伝子移入によって、本発明において特徴付けられる。ヒト肺癌細胞株H1299、H358、H460およびA549は、様々な状態の染色体3pまたは個々の3p遺伝子および正常なヒト気管支上皮細胞HBEC株を伴い、これらを、細胞増殖阻止、増幅、アポトーシスおよびインビトロでの細胞周期動力学に対する3p遺伝子の効果、ならびに動物モデルにおける一次腫瘍および転移性腫瘍の増殖に対する効果を評価するために使用した。3p遺伝子がインビトロで腫瘍サプレッサーとして機能するという仮説を試験するために、本発明者らは、種々のヒト非小細胞肺癌細胞、ならびにリポソーム媒介3p遺伝子移入もしくはアデノウイルスベクター媒介3p遺伝子移入により様々な状態の3p染色体構造または遺伝子および遺伝子産物表5を有する正常ヒト気管支上皮細胞株HBECにおいて、細胞増殖に対する3p遺伝子の過剰発現の効果を研究するために、一連の実験を行った。これらの株の1つは、H1299p53の内部ホモ接合欠失を含むNSCLC細胞株であり、3p対立遺伝子のLOHを有する染色体3の正常なコピーを有さず、非常に高レベルのテロメラーゼ発現および活性を有する。A549は、異常な3p対立遺伝子を有する野生型p53を含む肺癌細胞株であり;H358は、2つの3p対立遺伝子を有する野生型p53を含む肺癌細胞株であり;そして、H460は、3p21.3領域のnoe対立遺伝子欠失を有する野生型p53を含む肺癌細胞株である表5。正常なHBECまたは繊維芽細胞CloneticsInc.,Walkersville,MDをまた使用して、3p遺伝子およびAd-3pの一般的な細胞傷害性を評価し得る。293細胞株をアデノウイルスベクターの構築、増幅および滴定に使用し得る。細胞を、10FBSを有する4.5g/lのグルコースを含むDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM中に維持した。表5.ヒト肺癌細胞株および正常HBECにおける3p遺伝子の状態略語:HBEC、ヒト気管支内皮細胞、NSCL、非小細胞肺癌、LOH、ホモ接合欠損、WT、野生型。本発明において開発されたAd-3pベクター、プロタミン-Ad-3p複合体PAD3pまたはリポソームDOTAP-3pプラスミドDNA複合体LPD3pを使用して、効率的に3p遺伝子を、インビトロでの直接形質導入によって腫瘍細胞に、およびインビボでの全身投与によって原発性腫瘍部位および遠位の肺腫瘍部位または他の転位性腫瘍部位に送達し得る。ヒト肺癌H1299およびA549ならびに他の癌の自発性または実験的な肺転位性モデルを使用して、腫瘍進行に対する3p遺伝子の効果、ならびにPAD3pまたはLPD3p複合体の静脈内注射を介してマウスの肺転移性腫瘍の全身処置による転位を研究し得る。H1299細胞におけるリポソーム媒介3p遺伝子移入の実験において、9個の遺伝子からの6個の遺伝子Fus1、101F6、Luca1、123F2S、Beta、およびGene21が、非トランスフェクトおよび空のCMVベクターでトランスフェクトされたコントロールと比較して、トランスフェクションの48時間後に、H1299形質転換体において細胞増殖阻害の様々な程度20~65を実証した。3つの他の遺伝子Gene26、PL6およびLuca2は、同じ実験条件下でH1299細胞増殖に対して有意な効果を示さなかった表6。H1299細胞増殖に対するFus1、Beta、123F2SおよびGene21の観察された阻害効果は、同じ実験条件下で、高度に細胞傷害性の遺伝子Bakの阻害効果と比較可能であった表6。3つの他の遺伝子Gene26、PL6およびLuca2は、同じ実験条件下でH1299細胞増殖に対する有意な効果を示さなかった。アポトーシス誘導の変化した程度10~40、および変更した細胞周期動力学G0、G1およびS相で細胞集団の変化を、TUNEL反応およびPI染色を用いるFACS分析によって遺伝子Fus1、101F6、123F2S、LucaおよびBetaを含むプラスミドでトランスフェクトしたH1299細胞において観察した。表6.H1299細胞に対するDOTAP媒介3p遺伝子発現の効果48時間1空のプラスミドトランスフェクト細胞のものに対する、3p遺伝子発現プラスミドDNAトランスフェクト細胞におけるコロニー形成アッセイからのデータ。ND、未決定;STDEV、反復実験の平均からの標準偏差。腫瘍細胞増殖に対する3p遺伝子の効果を、種々の肺癌細胞株および正常なHBEC株における組換えアデノウイルスベクター媒介3p遺伝子移入によってさらに特徴付けた。腫瘍細胞増殖に対する101F6、Fus1およびGene21過剰発現の観察された阻害効果の特異性、ならびに過剰に発現された3p遺伝子の潜在的な細胞傷害性を試験するために、本発明者らは、Ad-3p形質導入された野生型3p含有H358細胞および正常なHBEC細胞における細胞増幅に対するこれらの3p遺伝子の影響を分析した図6。各株における細胞を、ウイルス粒子/細胞vp/cにおいて種々の感染多重度MOIで投与されたAd-101F6、Ad-fus1、およびAd-Gene21ベクターによってインビトロで形質導入した;PBSで処理した細胞をモックmockとして、空ベクターAd-EVをネガティブとして、Ad-LacZを非特異的として、そしてAd-p53を陽性コントロールとして、それぞれ使用した。非形質導入コントロール細胞と比較した場合、種々のMOIで、Ad-3p形質転換HBECにおいて10未満の細胞生存度損失、およびH358細胞において20未満の細胞生存度損失が観察された。類似の損失もまた、Ad-EV形質導入細胞およびAd-LacZ形質導入細胞において観察され、形質導入後の時間経路の全体を通じて、Ad-p53形質導入細胞においてわずかに高い損失が観察され、全般的な細胞傷害性がこれらの3p遺伝子の過剰発現に関連していないことが示唆される。形質導入の効率を、蛍光顕微鏡下でAd-GFP形質導入細胞集団におけるGFP発現細胞を試験することによって決定した。アデノウイルスベクターの形質導入の効率は、各細胞株に適用された最も高いMOIにおいて80よりも高かった。細胞増殖を、それぞれ、形質導入後1日、3日および5日での細胞生存度を決定することによって分析した。細胞生存度は、Ad-101F6、Ad-Fus1およびAd-Gene21を形質導入した、A549細胞およびH460細胞において有意に減少し、これらは3p領域においてLOHを阻害するが、3p領域およびp53のホモ接合欠失を含む野生型p53およびH1299細胞を含む図6。全ての場合において、形質導入細胞の生存度を、非形質導入PBS処置コントロール細胞この生存度は100に設定されたの生存度と比較した。これらのAd-3p形質転換体における3p遺伝子の過剰発現を、定量的リアルタイムRT-PCRによって評価し、そしてβアクチンDNAについてのヒト全RNA、プライマーおよびTaqManプローブの既知の濃度を、標準としておよび内部コントロールとして使用した図7。3p遺伝子のTaqManプローブおよびプライマーを、PrimerexpressソフトウエアPerkinElmerAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して設計した。ヒトゲノムDNAまたは全RNAを、テンプレート標準として使用し、そしてヒトβアクチンまたはグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼGAPDHTaqManプローブおよびプライマーをコントロールとして使用した。全RNAを、TRIZOLを使用して、Ad-3p形質導入腫瘍細胞または腫瘍試料から単離した。リアルタイムRT-PCRおよびRT-PCR産物の定量化を行い、そしてTaqManGoldRT-PCRKit,anABIPrism7700SequenceDetectionSystemおよび備え付けのソフトウエアを使用して分析した。これらの結果は、これらの3p遺伝子の過剰発現がインビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し得ることを示している。実施例6.腫瘍細胞増殖および増幅に対する3p遺伝子の影響3pまたは3p遺伝子の異常性を有する種々の肺癌細胞の増殖特性が、野生型3p遺伝子の導入によって変更され得るか否かを試験するために、指定した形質導入後時間間隔における種々のMOIでのAd-3p形質導入腫瘍細胞における細胞生存度を、以前に記載されたようなHeら、1998、XTT染色によってアッセイし、非形質導入細胞およびAd-EV-、Ad-GFP-またはAd-LacZ形質導入細胞を、コントロールとして使用した。各実験を、二連または三連に与えられた各処置によって、少なくとも3回繰返した。Ad-3p形質導入細胞の増幅を、ブロモデオキシウリジンBrdUの細胞内への取り込みについて免疫蛍光酵素結合イムノソルベント検定法によって分析した。Ad-3p形質導入した正常なHBECを使用して、インビトロでの3p遺伝子およびAd-3pの可能な一般の細胞傷害性を評価した。Ad-3p形質導入細胞における3p遺伝子の転写および発現を、抗3pタンパク質ポリクローナル抗体を用いた逆転写酵素連鎖反応またはノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析によって試験した。実施例7.Ad-3p形質導入細胞における3p遺伝子の発現のウエスタンブロット分析Ad-3p形質導入細胞における3p遺伝子電子の発現を、推定3pアミノ酸配列から誘導されたポリペプチドに対するポリクローナル抗体、または3p融合タンパク質におけるFLAGタグのc-mycに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。60mmディッシュ1~5×106/ウェルにおいて増殖した細胞を、Ad-3pを用いて処理し、そしてPBS単独をコントロールとして使用した。タンパク質を、SDS-PAGEによって分離した。各レーンを、約60μg細胞溶解物タンパク質で充填し、100Vで1~2時間電気泳動した。次いで、タンパク質をゲルからHybond-ECLTM膜に移した。膜をブロッキング溶液3乾燥乳、PBS中の0.1Tween20中で、室温で1時間ブロックした。次いで、膜を、ウサギ抗ヒト3pペプチドまたは、抗mycまたはFLAGモノクローナル抗体の1:1000の希釈液と共にインキュベートし、そして、マウス抗βアクチンモノクローナル抗体の1:1000の希釈液と共にインキュベートした。免疫複合体を、ECLTMキットAmershamInternationalを使用して、二次HRP標識化ウサギ抗マウスIgG、またはヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて検出した。実施例8.Ad-3p形質導入腫瘍細胞における3p遺伝子によるアポトーシスの誘導外因性3p遺伝子のアポトーシス誘導能およびAd-3p形質導入H1299、A549、H460、H358およびHBEC細胞における細胞周期プロセスに対するそれらの効果を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識TUNEL反応を使用したFACSによって分析した図8。アポトーシスの誘導を、Ad-3p形質導入H1299図8A、A549図8BおよびH460図8C細胞において検出したが、H358図8DおよびHBEC図8E細胞においては検出されなかった。細胞の15~20、40~65および75より多くが、それぞれ、形質導入H1299、A549およびH460細胞においてAd-101F6、Ad-Fus1およびAd-Gene21を用いての形質導入後5日で死んだのに対して、それぞれ、PBS単独で処理され、そしてAd-EVベクターで形質導入された細胞のわずか約7および10が、同じ期間でTUNEL陽性であった。Ad-3p形質導入細胞におけるアポトーシスの誘導レベルは、形質導入後の時間と共に増加し、そして細胞の生存度と相関した図6。3p遺伝子による腫瘍細胞増幅の阻害は、アポトーシスの誘導を介して直接または間接的に媒介される。実施例9.アポトーシスの誘導および細胞周期動力学Ad-3p形質導入細胞の変更腫瘍サプレッサー遺伝子による腫瘍細胞成長および増殖の阻害は、一般的に、アポトーシスの誘導および細胞周期プロセスの変更によって特徴付けられる。従って、3p遺伝子誘導アポトーシスおよび細胞周期動力学を、フルオレセインソチオシアネート標識化dUTPRocheMolecularBiochemicalsを用いる末端デオキシトランスフェラーゼデオキシウリジルトリホスフェートdUTPニック末端標識化TUNEL反応を使用するフローサイトメトリおよびヨウ化プロピジウム染色によってそれぞれ分析した。簡潔には、細胞1×106/ウェルを6つのウェルプレートに播種し、そして、Ap-3p構築物を用いて形質導入し;未処理の細胞、Ad-EV形質導入細胞、Ad-GFP形質導入細胞またはAd-LacZ形質導入細胞を、コントロールとして使用した。細胞を設計した形質導入後の設定した時間に収集し、次いで、前記のように、DNA断片化およびアポトーシスについてTUNEL反応により、ならびにDNA含有量および細胞周期状態についてフローサイトメトリを使用するヨウ化プロピジウム染色によってそれぞれ、分析した。Ad-101F6、Ad-Fus1およびAd-Gene21形質導入細胞における細胞周期プロフィールは、形質導入後3日目での非形質導入およびAd-EV形質導入コントロールにおけるものと比較して、後期G2期およびS期段階でのこれらの遺伝子の過剰発現によって有意に影響を受けるようであった図9。実施例10.インビボでの3p遺伝子の過剰発現による腫瘍増殖の抑制3p遺伝子101F6、Fus1、およびGene21の腫瘍サプレッサー機能を、ヌードマウスのA549皮下腫瘍にこれらのAd-3pベクターを直接的に腫瘍内注入することにより、インビボで評価した図10。腫瘍の増殖を最初の注入から最後の注入後20日目まで記録した。Ad-101F6、Ad-Fus1、およびAd-Gene21で処理したマウス中の全ての腫瘍の増殖は、腫瘍と比較して有意に抑制されたことが示された。実施例11.インビボでの腫瘍形成および腫瘍増殖に対する3p遺伝子の発現の効果腫瘍形成研究のために、H1299細胞またはA549細胞を、モックコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水PBS、陰性コントロールとしてAd-EV、および非特異的コントロールとしてAd-LacZを用いた適切なMOIで、Ad-3pを用いてインビトロで形質導入した。形質導入した細胞を、それぞれ、形質導入後24時間および48時間で収集した。細胞の生存性を、トリパンブルー排除染色により決定した。次いで、生存細胞1×107を、6~8週齢の雌ヌードマウスの右側腹部に皮下注入した。マウスにおける腫瘍形成を、週に2または3回、3ヶ月間まで観察した。腫瘍の寸法を2または3日毎に測定した。腫瘍増殖に対する3p遺伝子の効果を研究するために、H1299細胞またはA549細胞を用いて、ヌードマウスにおいて皮下腫瘍を構築した。簡潔にいうと、1×107細胞を、6~8週齢の雌ヌードマウスの右側腹部に注入した。腫瘍が直径5~10mmに達したとき注入後約2週間、この動物に、Ad-3pベクターおよびコントロールベクターを、それぞれ10~12日以内に4~5回、単位腫瘍あたり総用量3~5×1010pfuで腫瘍内注入した。腫瘍の大きさを、上記のようにして測定および算出した。この実験の最後に、この動物を殺傷し、そして腫瘍を切り出し、病理学的および免疫組織化学的分析のために処理した。実施例12.インビボでのプロタミン-アデノウイルス複合体媒介の3p遺伝子の移入による肺転移性腫瘍増殖の阻害本発明者らは、インビトロでのアデノウイルス媒介性遺伝子移入の有効性の増強のため、およびプロタミン/アデノウイルス複合体の静脈内注入によるインビボでの組換えアデノウイルスの肺および他の器官への全身送達のために、新規のプロタミン/アデノウイルス複合体を開発した。プロタミンProtemine-Ad-3p複合体PAD3pを用いて、ヌードマウスのA549実験用肺転移モデルにおける肺転移性腫瘍増殖に対する3p遺伝子の過剰発現の効果を研究した図11。転移性腫瘍増殖は、PAd-101F6処理マウス、PAd-Fus1処理マウス、およびPAd-Gene21処理マウスにおいて、コントロール群におけるこれらと比較して有意に阻害された。これらのデータは、Ad-3p処理皮下腫瘍から獲得された結果と一致する。従って、3p遺伝子は、インビボでの腫瘍増殖の抑制および腫瘍進行の阻害において役割を果たす。実施例13.インビボでのLPD3p媒介またはPAD3p媒介の3p遺伝子移入による転移性腫瘍増殖に対する3p遺伝子の効果H1299細胞またはA549細胞の実験用肺転移モデルを用いて、PAD3pまたはLPD3pのいずれかの複合体の静脈内注入を通じた肺転移性腫瘍の全身性処置による、腫瘍の進行および転移に対する3p遺伝子の効果を研究した。200μlPBS中のA549細胞1~2×106を用いてヌードマウスを、そしてH1299細胞1~2×106を用いてSCIDマウスを、それぞれ微量intravenially接種した。実験用転移性腫瘍コロニーは、接種後7~10日目に形成された。PAD3p複合体およびコントロール複合体を、2日毎に3回、各々2~5×1010ウイルス粒子/200~500μgプロタミンの用量単位動物当たり総容量200μlで静脈内注入により動物に投与した。あるいは、LPD3pを、1日毎に6回、各々120nmリポソーム:6μgプロタミン:50μgDNAの用量単位動物当たり総容量200μlで静脈内注入により適用した。動物を、最後の注入後2週間で殺傷した。肺転移性腫瘍を、インディアンインクLiら、1998を用いて染色し、肺の表面上の腫瘍コロニーを、解剖顕微鏡の下で計数し、次いで肺組織を、さらなる病理学的および免疫組織化学的分析のために切り出した。実施例14.テロメラーゼ活性および細胞不死の分析細胞不死に関連する酵素テロメラーゼの活性化は、ヒト癌の発症における重要な工程を構成し得る。肺癌細胞におけるテロメラーゼのほぼ普遍的に調節されない発現、およびテロメラーゼ抑制調節経路における3p遺伝子の関与についての証拠に起因して、野生型3p21.3遺伝子の導入により与えられる腫瘍細胞の増殖growthおよびproliferationの変化が、Ad-3p形質導入体における抑制されたテロメラーゼ活性に関係するか否かを研究することが重要である。テロメラーゼ活性をアッセイするために、形質導入されていない細胞およびAd-3pで形質導入された細胞ならびにコントロールベクターで形質導入された細胞105を、以前に記載された通りに収集および調製したWuら、1998。およそ103、102、または101個の細胞に相当する細胞抽出物を、各々のテロメラーゼアッセイに使用した。10~100個程度の肺癌細胞におけるテロメラーゼ活性を検出し得る、標準的なテロメア反復増幅プロトコル手順を、記載されるように改変して実施したPellegataら、1996、Mizuguchiら、1998、Kagawaら、1999。実施例15.肺癌および乳癌ならびに悪性表現型の抑制における123F2RASSF1A339I.123F2RASSF1遺伝子の特徴付け123F2RASSF1A遺伝子が、肺癌および乳癌において変異しているか否かを決定するために、本発明者らは、ゲノムDNAに対する一本鎖コンホメーション多型アッセイを使用して、RASSF1Aアイソフォームの広範な変異分析を実施した。本発明者らは、以前に、77の肺癌細胞株サンプルにおいてRASSF1C変異を見出せなかった346。参照としてRASSF1A配列を使用することにより、本発明者らは、以下に挙げるいくつかの多型を見出した:コドン21AAGからCAG、LysからGln;コドン28CGTからCGA、アミノ酸変化なし;コドン49GGCからGGT、アミノ酸変化なし;コドン53CGCからTGC、ArgからCys;コドン129GACからGAG、AspからGlu;コドン133GCTからTCT、AlaからSer;およびコドン325TATからTGT、TyrからCys。123F2RASSF1遺伝子を、図12に示す。II.肺癌細胞株および乳癌細胞株におけるRASSFIAおよびRASSF1Cの発現123F2RASSF1は、肺、乳房、頭頸部、腎臓、ならびに子宮頸部の腫瘍の増殖の間の対立遺伝子の欠失によりしばしば影響を受ける領域内に位置する341~345。本発明者らは、123F2RASSF1AおよびRASSF1Cが肺癌細胞株および乳癌細胞株において発現されるか否かを調査した。本発明者らは、アイソフォーム特異的RT-PCRを用いて、肺腫瘍細胞株および乳房腫瘍細胞株ならびに正常な肺上皮培養物および正常な乳房上皮培養物における123F2RASSF1AおよびRASSF1Cの発現を試験した図13。アイソフォーム特異的RT-PCRアッセイを、RASSF1AおよびRASSF1Cの発現の分析のために使用した。RASSF1Cに対するプライマーは、Nox35’-CTGCAGCCAAGAGGACTCGG-3’およびR182であり、RASSF1Aに対するプライマーは、PKCDFまたはNF5’-TGCAAGTTCACCTGCCAC-3’のいずれかおよびR182であった図12C。総RNAを、5ウシ胎仔血清を補充したRPMI-1640培地完全培地中で増殖された、以前に記載された肺癌細胞株および乳癌細胞株から、Trizol抽出により単離した。4μgの総RNAを、GIBCO-BRLSuperscriptFirstStrandcDNAKitを使用して逆転写した。全てのcDNA調製物を、RASSF1A転写物の第1エキソンのすぐ上流の転写されないゲノム配列を増幅する能力について試験した。この配列由来の産物を生成する任意のcDNAを、ゲノムDNAが混入しているという理由で廃棄した。本発明者らはまた、5-アザ-2’-デオキシシチジンDNAのメチル化を阻害する薬物に曝露した後のRASSF1Aの発現を評価した。本発明者らは、RASSF1Aを発現しないNSCLC株NCI-H157のサブコンフルーエントカルチャーを、0.5pM5-アザ-2’-デオキシシチジンに48時間曝露し、その後、総RNAを単離し、そしてRASSF1A、RASSF1C、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPDHに対してRT-PCRを実施した。GAPDH転写物のRT-PCRを正方向プライマーGAPDH-C5’-CATGACAACTTTGGTATCGTG-3’および逆方向プライマーGAPDH-D5’-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3’を使用して実施した。RTPCR産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、そしてエチジウムブロミドを用いて染色した後に可視化した。123F2RASSF1Aは、正常な肺上皮培養物NHBEおよびSAB培養物、正常な乳房上皮培養物において発現された図13、Cが、32個のSCLC株のうちの32個100、26のNSCLC細胞株のうちの17個65、および25個60の乳癌細胞株のうちの15個60においては発現されなかった。代表的なデータを図13に示す。対照的に、RASSF1Cは、試験したほぼ全ての肺癌細胞株および乳癌細胞株において発現された123F2RASSF1遺伝子座を含む既知のホモ接合性欠失を有するいくつかの肺癌細胞株および乳癌細胞株を除く。切除した肺腺癌において123F2RASSF1Aは、5つの癌のうちの2つでしか発現されず、RASSF1Cは、全ての癌において発現された図13C。123F2RASSF1AについてのRT-PCR分析の間、本発明者らは、RASSF1Aを発現する腫瘍およびNHBE培養物における2つの狭い間隔のバンドにしばしば注目した図13。本発明者らは、これらのRT-PCR産物を配列決定し、そして大きい方のバンドが123F2RASSF1Aに対応し、小さい方の産物が異なる転写物RASSF1FGenBank登録番号AF286217を示すことを見出した。この転写物は、エキソン1Cが除かれており、DAG結合ドメイン内で終了する92アミノ酸の推定短縮ペプチドをコードするmRNAを産生する図12D。ほぼ全てのサンプルにおいて、RASSF1Fは、123F2RASSF1Aが発現される場合に発現される。しかし、いくつかの乳癌および正常な乳房上皮培養物において図13、123F2RASSF1Aは、RASSF1Fの発現を伴わずに発現される。III.123F2RASSF1Aプロモーター領域のメチル化状態腫瘍における異常なプロモーターのメチル化は、ヒトの癌においていくつかの腫瘍サプレッサー遺伝子の遺伝子発現の欠失を引き起こすことが見出されている348。肺癌における123F2RASSF1A発現の欠失が、プロモーターの過剰なメチル化の結果であるか否かを評価するために、本発明者らは、8つの肺癌細胞株由来の亜硫酸ナトリウム改変DNAを配列決定することにより、123F2RASSF1Aの5’領域推定123F2RASSF1A転写開始部位の-800~600bpにおけるCpGメチル化状態を決定した。推定RASSF1AおよびRASSF1Cのプロモーター領域のメチル化状態を、メチル化特異的PCRにより決定した。RASSF1Aを発現しない肺癌細胞株NCI株H1299、H1184、H1304、H841、H2108、およびH128またはRASSF1Aを発現する肺癌細胞株H1792およびH2009由来のゲノムDNAを、亜硫酸ナトリウム処理により改変した352、353。亜硫酸塩処理は、シトシン塩基をウラシル塩基に変換するが、メチルシトシン塩基に対する影響はない。PCR増幅後のPCRフラグメントの配列決定により、メチル化により改変されたプロモーター領域における特異的なCpGジヌクレオチドが同定される352、354、355。PCRプライマーを、RASSF1AコスミドLucal2;GenBank登録番号AC002481ヌクレオチド17730-18370およびRASSF1CGenBank登録番号AC002481ヌクレオチド21022-21152および21194-21332の推定プロモーター領域中のゲノム配列を増幅するよう設計した。得られたPCRフラグメントを、自動化された蛍光に基づくDNA配列決定により配列決定し、メチル化状態を決定した。RASSF1Aを発現しない肺癌細胞株におけるCpGメチル化についてのデータを用いて、RASSF1A5’プロモーター領域に対するメチル化特異的PCR352プライマーを設計した。メチル化形態を検出するためのプライマーは、5’-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3’正方向および5’-GCTAACAAACGCGAACCG-3’逆方向であり、そして非メチル化形態を検出するためのプライマーは、5’-GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3’正方向および5’-CACTAACAAACACAAACCAAAC-3’逆方向であった。各プライマーセットは、169塩基対bp産物を生成した。メチル化特異的PCRサイクル条件は、95°Cにて15分間のインキュベーション1回、続いて、94°Cにて30秒間の変性、アニーリング温度メチル化特異的プライマーについては64°C、そして非メチル化特異的プライマーについては59°Cにて50秒間、72°Cにて30秒間の伸長のサイクルを40回、そして72°Cにて10分間の最終伸長から構成される。PCR産物を、2アガロースゲル中で分離した。製造業者の指示に従い、CpGSssIメチラーゼNewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MAによりインビトロでメチル化したリンパ球DNAを、陽性コントロールとして使用した。水のブランクを、陰性コントロールとして使用した。123F2RASSF1Aを発現しない6つ全ての肺癌細胞株は、推定プロモーター領域におけるほぼ全てのCpGジヌクレオチド部位のメチル化を示した。123F2RASSF1Aを発現した2つの肺癌細胞株は、これらのCpG部位でメチル化されなかったか、または限定されたメチル化を示したかのいずれかであった。対照的に、これらの8つの細胞株の推定RASSF1Cプロモーター領域のCpGにおいて、メチル化は見出されなかった。プロモーターの過剰なメチル化が、肺癌細胞株における123F2RASSF1Aの発現の欠失に寄与することを確認するために、本発明者らは、123F2RASSF1A発現に対する5-アザ-2’-デオキシシチジンDNAメチラーゼを阻害する薬物の効果を評価した。本発明者らは、RASSF1Aを発現しないNSCLC株NCI-H157を、5-アザ-2’-デオキシシチジンに曝露し、そしてこの細胞株による123F2RASSF1Aの再発現を見出したが、ハウスキーピング遺伝子GAPDHまたはRASSF1Cの発現における変化はほとんどなかったか、または全くなかった図14。IV.肺癌および乳癌における123F2RASSF1Aのプロモーター領域のメチル化特異的PCR分析原発性の肺癌および乳癌におけるRASSE1Aのプロモーター領域のメチル化状態を決定するために、本発明者らは、メチル化特異的PCR分析を使用した。多くの原発性の切除されたNSCLC由来のゲノムDNA、同一の患者から切除されたが癌に関与していない一対の肺組織、原発性の切除された乳癌、および肺癌細胞株ならびに乳癌細胞株の大パネルを、亜硫酸水素ナトリウムで処理し、そして123F2RASSF1Aのプロモーター領域におけるメチル化CpGジヌクレオチドおよび非メチル化CpGジヌクレオチドの存在について試験した図15。原発性の切除されたNSCLCおよび非腫瘍対サンプルは全て、非メチル化プロモーター配列を含んだ。このことは、これらの切除された腫瘍が顕微解剖されず、間質細胞が混入していたことが理由であると考えられた。しかし、107個の原発性NSCLCのうちの32個30、47個のSCLC株のうちの47個100、および39個の原発性乳癌のうちの19個49が、メチル化RASSF1A対立遺伝子を示した図15;表7。対照的に、104個の切除された非悪性肺組織の対において、メチル化対立遺伝子は検出されなかった図15;表7。表7.肺癌および乳癌におけるRASSF1ACpU島-メチル化対立遺伝子の検出のための、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイの頻度NSCLC=非小細胞肺癌;SCLC小細胞肺癌。本発明者らは、肺癌細胞株および乳癌細胞株のパネルにおいて、高頻度のメチル化123F2RASSF1A対立遺伝子を見出した表7。肺癌細胞株および乳癌細胞株は、正常細胞が混入していない癌細胞の本質的なクローン集団を表わす。本発明者らは、メチル化123F2RASSF1A対立遺伝子および非メチル化123F2RASSF1A対立遺伝子の頻度を表にした表8。肺癌株および乳癌株は、しばしば、平均的な腫瘍の集団よりも臨床的により攻撃的な病巣に由来する349~351が、本発明者らの以前の研究350、351は、癌細胞株が、それらの由来となった培養されていない癌標本において見出される遺伝子的変更を保持し続けることを示した。メチル化対立遺伝子のみの存在は、両方の親の対立遺伝子のメチル化またはメチル化対立遺伝子の保持のいずれか、および非メチル化3p対立遺伝子の喪失と一致する。全てのSCLC細胞株は、ホモ接合性の欠失が理由で、メチル化対立遺伝子のみを有するか、または123F2RASSF1Aを完全に欠失した。このことは、SCLCにおいて、ほぼ普遍的である3p21.3対立遺伝子の欠失と一致する341、350、および356。NSCLC細胞株のうち、27個のうちの13個48表8は、メチル化123F2RASS1A対立遺伝子のみを有し、そして27個のうちの10個37は、非メチル化対立遺伝子のみを有した。このことは、この腫瘍細胞型におけるより低い割合の3p21.3対立遺伝子の喪失と一致する341。同様に、乳癌細胞株の22個のサンプルのうちの10個45表8は、メチル化対立遺伝子のみを有し、そして22個のうちの7個32は、非メチル化対立遺伝子のみを有した。再度、このことは、乳癌において見出された3p21.3対立遺伝子の欠失の割合と一致する351。予測した通り、3p21.3領域に関与するホモ接合性欠失を有することが以前に示された2つの腫瘍株は、メチル化および非メチル化の両方の対立遺伝子に対して陰性である表8346、347。表8.97個の肺癌細胞株および乳癌細胞株におけるメチル化および非メチル化RASSF1A対立遺伝子の存在SCLC=小細胞肺癌~NSCLC=非小細胞肺癌;BCCL=乳癌細胞株。†メチル化および非メチル化の両方の対立遺伝子を欠失したメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応遺伝子型を有する2つの腫瘍細胞株SCLC株NCIH740および乳癌株11CC1500は、染色体領域3p21.3におけるRASSFI遺伝子座を含むホモ接合性欠失を有することが知られていた。61個の肺癌細胞株および乳癌細胞株のサブセットについて、本発明者らは、発現分析およびメチル化分析の両方を実施し、そしてメチル化RASSF1A対立遺伝子の存在と123F2RASSF1A発現の欠失との間に統計的に有意な関係P<0.001、Fisherの直接確率法を見出した。12個のサンプルにおいて、123F2RASSF1Aは、メチル化対立遺伝子の非存在下で発現され;44個のサンプルにおいて、123F2RASSF1Aは、メチル化対立遺伝子の存在下で発現されず;4個のサンプルにおいて、123F2RASSF1Aは、メチル化対立遺伝子の非存在下で発現されず;そして1個のサンプル乳癌細胞株において、123F2RASSF1Aは、メチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の両方の存在下で発現された。これらのデータは、123F2RASSF1Aのメチル化と123F2RASSF1A発現の欠失との重要な関係を示す。次に、本発明者らは、123F2RASSF1Aプロモーターのメチル化と原発性NSCLCを有する患者における臨床的知見との間に任意の関係が存在するか否かを評価した。本発明者らは、107個の切除されたNSCLCにおいて、123F2RASSF1Aのメチル化と、年齢、性別、腫瘍-結節-転移TNM病理段階、または腫瘍組織学との間に統計的に有意な関係を見出さなかった。さらに、本発明者らは、39個の原発性の切除された乳癌において、123F2RASSF1Aのメチル化と、年齢、TNM病理段階、腫瘍組織学、エストロゲン、もしくはプロゲステロンレセプター状態、またはHER2/Neuの発現との間に統計的に有意な関係を見出さなかった。肺癌患者の間の生存率は、123F2RASSF1Aのメチル化状態により異なったP=0.046図16。また、一変量分析によって、治療的外科切除を試みて処置されたNSCLCを有するこの107人の患者の群において、腫瘍T1、T2、およびT3、リンパ節段階N1およびN2、および報告された体重減少は、反生存性の統計的に有意な予測因子であった。喫煙歴の差異はい/いいえ、または1年に40箱のカットオフでの年間箱数も処置の差異全ての患者は葉切除または肺切除の外科的切除を受け、そして5人のみ以前に放射線療法または化学療法を受けたも、いずれも反生存性を説明しなかった。多変量分析は、小さなサンプルの大きさでの使用に制限されるので、本発明者らは、123F2RASSF1Aのメチル化および主要な一変量因子腫瘍、リンパ節段階、および体重喪失の使用により、Cox比例的障害回帰分析Coxproportionalhazardsregressionanalysisを実施した。123F2RASSF1Aのメチル化は、生存の非依存的な予後因子であることが見出されなかった。しかし、この結果は、少数であることに起因し得る。なぜなら、リンパ節段階公知の予後因子さえもまた、もはやこの分析において非依存性因子でなかったからである。V.腫瘍細胞表現型に対する123F2RASSF1Aの外因性発現の効果本発明者らは、腫瘍細胞表現型に対するRASSF1Aの効果を3つの方法により試験した。本発明者らは、増殖の尺度として足場依存性のコロニー形成を、そして悪性潜在性の尺度として足場非依存性のコロニー形成を使用した。本発明者らはまた、インビボでの腫瘍形成を直接的に評価した。RASSF1Aを発現するNSCLCNCI-H1299クローンのインビトロでの増殖の特徴を、足場依存性増殖および足場非依存性軟寒天増殖について試験した。非選択培地における増殖の48時間後、一過的にトランスフェクトしたNSCLCNCI-H1299細胞をトリプシンを用いて取り外し、そして800μg/mLのG418を含む完全培地中に希釈通常は、10~25倍し、そして新鮮な100mmディッシュにプレートした。培地を週に二度交換した。14日後、培地を除き、プレートをリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、そしてコロニーを1メチレンブルーを含有する50vol/volエタノールで染色した。足場非依存性の軟寒天増殖アッセイについて、1000個のRASSFIA発現細胞を懸濁し、そして600μg/mLG418を補充した0.33Noble寒天SigmaChemicalCo.,St.Louis,MOを含む完全培地にプレートし、そして0.50寒天ベースを含む完全培地の上に重層した。21日後、直径0.2mmよりも大きいコロニーを計数した。レトロウイルス感染細胞について、足場非依存性増殖アッセイを以下の通り実施した:各々の感染由来の1000個の生存可能な選択された細胞を、0.50寒天ベースの上に0.33軟寒天を含むDulbeccoの改変Eagle培地LifeTechnologies,Inc.10熱不活性化ウシ胎仔血清を含むにプレートした。21日後、直径0.2mmよりも大きいコロニーを計数した。本発明者らはまた、インビボでヌードマウスにおいて増殖するRASSF1A感染細胞の能力を試験した。雄BALB/cヌードnu/nu3~6週齢マウスを、セシウム源からの350cGyへの5分間の曝露によって、5匹の動物の群における実験の0日目に照射した。次の日、107個の生存可能な親のベクターコントロールまたはRASSF1Aレトロウイルスを感染させたNSCLCNCI-H1299腫瘍細胞を含む0.2mLの滅菌PBSを用いて、各マウスに、側腹部で皮下注入した。マウスを、腫瘍の大きさについて2~3日毎にモニタリングし;一旦、腫瘍が1500mm3より大きくなった場合、そのマウスを殺傷した。本発明者らは、最初に、RASSF1AcDNAをpcDNA3.1選択マーカーを含む発現ベクター中にクローニングし、そして内因性の123F2RASSF1A発現を欠くNCI-H1299細胞をトランスフェクトした。14~21日間の選択後、本発明者らは、足場依存性アッセイおよび足場非依存性アッセイの両方において、NCI-H1299細胞のコロニー形成を決定した。NCI-H1299細胞における123F2RASSF1Aの発現は、pcDNA3.1ベクター単独でトランスフェクトした細胞と比較して、足場依存性コロニー形成における40~60の減少および足場非依存性コロニー形成におけるおよそ90の減少を引き起こした図17A。NCI-H1299細胞は、遺伝子内p53ホモ接合性欠失を有するので34、野生型p53の一過的な発現は、増殖阻害についての陽性コントロールとして機能し得る。実際、NCI-H1299細胞における野生型p53の発現は、足場依存性アッセイおよび足場非依存性アッセイにおけるコロニー形成において、それぞれ80および95の減少を引き起こした図17A。123F2RASSF1AでトランスフェクトしたNCI-H1299細胞のいくつかのコロニーを選択培地中で単離し、そしてノーザンブロット分析により123F2RASSF1Aを発現することを見出した図17B。これらのコロニーはインビトロで十分に増殖したが、各々は、ベクターでトランスフェクトしたコントロールクローンと比較して、足場非依存性コロニー形成をおよそ90減少した図17C。pcDNA3.1ベクターが増殖抑制効果を媒介する可能性を排除するために、本発明者らは、123F2RASSF1AまたはRASSF1Cを含むレトロウイルス発現ベクターを用いてNCI-H1299細胞を感染させ、そして足場非依存性の様式で増殖するこれらの細胞の能力を試験した。123F2RASSF1Aを発現する細胞は、空のレトロウイルスベクターまたはRASSF1Cを含むレトロウイルスベクターを用いて感染させた細胞と比較して、軟寒天コロニーを形成する能力における顕著な減少を有した図17D。このレトロウイルスベクターを発現する細胞は、プレートした10000個の細胞当たり3200個のコロニーを形成した。123F2RASSF1A発現細胞は、ベクターコントロールコロニーの19のみを形成したが、RASSF1Cは、ベクターコントロールの108を形成した。RASSF1A感染細胞およびRASSF1C感染細胞はインビトロで十分に増殖し、そして毒性またはアポトーシスの徴候を示さなかった。最後に、本発明者らは、レトロウイルス感染NCIH1299細胞の、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成する能力を試験した。ベクターでトランスフェクトした細胞親細胞は、迅速に腫瘍を形成した図17E.対照的に、123F2RASSF1Aレトロウイルスベクターで感染し、そして123F2RASSF1Aタンパク質を発現する細胞は、インビボでずっと低い腫瘍形成性を有した図17E。実施例16.ヒト染色体3p21.3ホモ接合性欠失領域におけるいくつかの遺伝子は、インビトロおよびインビボで腫瘍サプレッサー活性を示すI.腫瘍細胞増殖に対する、3p遺伝子の強制的発現の効果3p遺伝子の1つ以上が、インビトロで腫瘍サプレッサーとして機能するという仮説を試験するために、本発明者らは、いくつかの型のAd-3p形質導入されたヒトNSCLC細胞および正常HBEC株における細胞増殖に対する、3p21.3遺伝子の発現の効果を研究するために、一連の実験を行った。各株における細胞を、vp/cの単位の種々のMOIで、Ad-101F6、Ad-FUS1、Ad-NPRL2、Ad-BLU、Ad-RASSF1、Ad-HYAL2およびAd-HYAL1ベクターによってインビトロで形質導入した;細胞を、偽コントロール、陰性コントロール、非特異的コントロール、または陽性コントロールとして、それぞれPBS、Ad-EV、Ad-LacZ、またはAd-p53で処理した。形質導入効率を、蛍光顕微鏡下でAd-GFP形質導入細胞集団中のGFP-発現細胞を試験することによって決定し、そして各細胞株に適用した最も高いMOIで、80より高いことを見出した。細胞増殖を、XTTアッセイを使用して分析して、形質導入の1、2、3、および5日後に残ってる生存細胞の数を決定した{5日目については、最も高いMOIそれぞれ、A549について5000vp/c、H1299について1000vp/c、H460について5000vp/c、H358について2500vp/c、およびHBEについて1000vp/cについてのデータのみ示す}図19。全ての場合において、形質導入した細胞の生存度を、形質導入していないPBS処理コントロール細胞の生存度これらの生存度を100に設定したと比較した。図22において見られ得るように、細胞の生存度は、Ad-101F6-、Ad-Fus1-、およびAd-NPRL2形質導入したA549およびH460細胞において有意に減少し、これらは、複数の3p21.3マーカーに対するホモ接合性を示し、そして野生型のp53、およびH1299細胞を含むこれらは、3p21.3ホモ接合性を示すが、p53のホモ接合性欠失もまた有する。細胞生存度の緩やかな減少は、Ad-RASSF1C形質導入したH1299細胞において示される。しかし、Ad-HYAL1、Ad-HYAL2、Ad-BLU、Ad-EVまたはAd-LacZで形質導入されたこれらの細胞のいずれにおいても、増殖に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、いくつかの野生型3p21.3遺伝子の外因的発現が、3p欠乏性腫瘍細胞の増殖を阻害し得るか、またはこれらの3p21.3遺伝子のインビトロでの腫瘍サプレッサー機能を回復し得ることを示唆する。腫瘍細胞増殖に対して観察された阻害効果の特異性を明らかにし、そして正常細胞上で外因的に発現された3p21.3遺伝子の潜在的な細胞傷害性を試験するために、本発明者らは、3p21.3ヘテロ接合性H358細胞および正常HBECにおける細胞増殖に対する、これらの3p21.3遺伝子の効果を分析した図19。図19に示されるように、最も高いMOIですべてのAd-3p遺伝子で形質導入されたHBECは、10未満の細胞生存度の損失を有するが、同じベクターで形質導入されたH358細胞は、形質導入されていないコントロール細胞と比較した場合、20未満の細胞生存度の損失を有した。細胞数の同様のレベルの損失を、Ad-EVおよびAd-LacZで形質導入したH358細胞およびHBEC細胞において観察した。p53を欠失するH358細胞は、Ad-p53コントロールで形質導入される場合に、細胞生存度が減少した。これらの結果は、Ad-LacZ、Ad-HYAL2、Ad-HYAL1、Ad-RASSF1、およびAd-BLUを用いる効果の欠如と関連し、3p欠乏性腫瘍細胞における3p21.3遺伝子、FUS1、NPRL2、101F6の腫瘍抑制機能の特異性を実証し、そして全般的な細胞傷害性はこれらの野生型3p21.3遺伝子の外因的発現と関連しないことを示す。Ad-3pトランスフェクト体における3p21.3遺伝子の発現を、定量的リアルタイムRT-PCRによって確認し、そして既知濃度のヒト総RNAおよびプライマーならびにβ-アクチンDNAおよびGAPDHcDNAのためのTaqManプローブを、それぞれ、標準および内部コントロールとして使用した図20。FUS1図20A、101F6図20B、NPRL2図20C、およびHYAL1図20Dの転写を、これらの3p21.3遺伝子の増大した発現レベルと、形質導入されたH1299細胞における対応するAd-3pベクターの増大したMOIとの間の関連性を示すことによって定量的に実証した。他の3p21.3遺伝子HYAL2、HYAL1、BLU、およびRASSF1の転写もまた、リアルタイムRT-PCRによって検出した。FUS1タンパク質および101F6タンパク質の発現もまた、その推定アミノ酸配列由来のオリゴペプチドに対して惹起された利用可能なポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって検出した。II.Ad-3p形質導入した腫瘍細胞中の3p遺伝子による、アポトーシスの誘導Ad-3p形質導入したH1299、A549、H460、H358、およびHBEC細胞においてアポトーシスを誘導する、外因的に発現された3p21.3遺伝子の能力を、TUNEL反応を使用して、FACSによって分析した図21。アポトーシスの誘導を、Ad-101F6-、Ad-FUS1-、およびAd-NPRL2形質導入したA549図21A、H1299図21B、およびH460図21C細胞において検出したが、H358図21DおよびHBEC図21E細胞においては検出されなかった。アポトーシス細胞集団は、形質導入の持続時間の増加に伴って増加した;形質導入されたH1299、A549、およびH460細胞において、それぞれ、Ad-101F6、Ad-FUS1、およびAd-NPRL2で形質導入した5日後に、細胞の15~20、40~65、および75より多くがアポトーシス細胞であったが、一方、PBS単独で処理した細胞およびAd-EVベクターで形質導入した細胞のうち、それぞれ7および10のみが、同じ時間間隔の後でTUNEL陽性であった。Ad101F6、Ad-FUS1、およびAd-NPRL2によるアポトーシス誘導レベルは、p53遺伝子を欠失するH1299細胞株図21Bにおいてよりも、野生型p53を有するA549およびH460細胞株図21Aおよび21Cにおいて、20~50より有意に現れた。A549細胞およびH460細胞におけるアポトーシスのレベルは、p53欠乏性のH1299細胞およびH358細胞におけるAd-p53によって誘導されるレベルに匹敵した図21Bおよび21D。しかし、Ad-BLU、Ad-RASSF1、Ad-HYAL2、およびAd-HYAL1によって形質導入された腫瘍細胞株のいずれにおいても、アポトーシスの有意な誘導は観察されなかった図21。これらのAd-3pベクターによって形質導入された細胞におけるアポトーシスのレベルおよび誘導時間は、同じベクターで処理した細胞における細胞増殖阻害のレベルおよび誘導時間と十分に関連し図19、これは、3p21.3遺伝子による腫瘍細胞増殖の抑制が、アポトーシス誘導の機構を直接的または間接的に介して媒介されることを示唆する。III.Ad-3pベクターの腫瘍内注射による腫瘍増殖の抑制インビトロで観察されたこれらの3p21.3遺伝子の腫瘍細胞増殖に対する阻害効果が、インビボでの腫瘍増殖に対しても実証され得るか否かを決定するために、本発明者らは、コントロールとしてPBSおよびAd-EV、Ad-LacZ、およびAd-p53ベクターと共に、nu/nuマウスにおけるA549またはH1299腫瘍異種移植片に、Ad-3p21.3遺伝子ベクターを直接腫瘍内注射することによって、腫瘍増殖の抑制における3p21.3遺伝子の効力を評価した図22。腫瘍の増殖を、最初の注射から最後の注射の20日後まで記録した。腫瘍容積を、各群における処置の開始時の容積に対して、処置後の腫瘍容積の増加のパーセンテージを算出することによって正規化した。A549図22AおよびH1299図22B腫瘍モデルの両方において、Ad-101F6、Ad-FUS1、またはAd-NPRL2で処置した腫瘍の全ては、Ad-LacZまたはAd-EVコントロールで処置したマウス群と比較して、有意な増殖の抑制を示したP<0.001が、Ad-BLU、Ad-RASSF1、およびAd-HYAL1-処置した腫瘍においては、有意な効果は観察されなかった。Ad-HYAL2で処置したA549H1299腫瘍ではなくH1299A549腫瘍異種移植片は、処置の終点でのみ有意な減少を示したP=0.036。さらに、Ad-p53ベクターで処置した腫瘍よりも有意に強力な腫瘍増殖阻害が、Ad-101F6およびAd-NPRL2ベクターで処置したA549腫瘍において示された図22A。IV.プロタミン-アデノウイルス複合体-媒介3p21.3遺伝子移入による、実験的な肺転移の発生の阻害全身的転移を抑制する際の3p21.3遺伝子の潜在能力をさらに探索するために、インビボでの組換えアデノウイルスの全身的送達を増大するための、プロタミン/アデノウイルス複合体P-Adと名付けるを使用する新規な処方物を開発した。実験的なA549転移性ヒト肺癌モデルを使用して、nu/nuマウスにおける肺転移の発生に対する3p21.3遺伝子移入の効果を研究した図23。アデノウイルス3p21.3遺伝子ベクターをプロタミンと複合体化し、そして静脈内注射を介して送達した。A549転移の発生は有意に阻害され、そしてA549を接種したマウス由来の肺表面上の転移性腫瘍コロニーの形成は、コントロール処置群における形成と比較して、P-Ad-101F6、P-Ad-FUS1、P-Ad-NPRL2、P-Ad-BLUまたはP-Ad-HYAL2で処置した動物において80より多く減少した図23A。しかし、P-Ad-HYAL1およびP-Ad-RASSF1P-Ad-BLUで処置した動物においては、転移性コロニー形成の有意な減少は観察されなかった。これらのデータは、Ad-3pで処置した皮下腫瘍から得られた結果と一致しており、腫瘍増殖の抑制およびインビボでの腫瘍の進行の阻害における、これらの3p21.3遺伝子の役割をさらに支持する。実施例17.3p21.3ホモ接合性欠失領域から単離された候補腫瘍サプレッサー遺伝子FUS1の過剰発現は、G1停止および肺癌細胞の増殖の阻害を導く小肺癌SCLCおよび非小細胞肺癌NSCLCの両方における染色体アーム3pの1つの対立遺伝子の非常に頻繁な損失は、この染色体領域における腫瘍サプレッサー遺伝子TSGの存在についての強力な証拠を提供する363;364;367;371;372。単離された対立遺伝子損失を示す複数の異なる3p領域を、詳細な対立形質決定allelotyping研究によって同定し、これにより3p上に位置するいくつかの異なるTSGが存在することを示唆される361;362;372。肺癌細胞株および乳癌細胞株におけるネスト化したホモ接合性欠失は、3p21.3において見出され、TSG候補としての25の新しい遺伝子の同定、注釈付けannotationおよび評価を含む本発明者らの検索の焦点を、630kbの領域にあてた357;365;366;368;369;370。乳癌の欠失は、この領域をさらに120kbにまで狭め、そして9つのTSG候補CACNA2D2,PL6,106F6,NPRL2/g21,BLU,RASSF1,FUS1,HYAL2,HYAL1を、この領域内またはこの領域の境界に位置付けた369。これらの候補TSGの1つ、FUS1AF055479既知遺伝子のいずれとも相同性を示さないは、肺癌においてほんのわずかの変異しか有さないこと、そして通常は肺癌におけるmRNAレベルで発現されることが見出された366。いくつかのNSCLCNCI-H322およびNCI-H1334は、同じ非センスの変異を示し、この変異は、異常なmRNAのスプライシングから生じる。この異常な形態は、FUS1エキソン2の3’末端で28bpのmRNAを欠失し、野生型における110アミノ酸と比較して、82アミノ酸の短縮された推定タンパク質を生じる図24。肺癌細胞株DNAについて以前に行われてた本発明者らの変異分析を確認するために、本発明者らは、一次非培養肺癌中のFUS1における他の変異を探索した。一本鎖構造多型SSCP分析を、40の一次非培養肺癌のゲノムDNA9のSCLCおよび31のNSCLCを使用して行った図24360。変異は検出されなかったが、本発明者らは、イントロン2において1つのヌクレオチド多型を見出し、これはFUS1のアミノ酸配列を変更しなかった。次に、本発明者らは、TSGの不活化を導く後成的機構として、CpG島プロモーター領域のメチル化を考えた。実際、このような腫瘍後天性プロモーター領域のメチル化は、FUS1のすぐ動原体側centromericに存在するRASSFIAmRNAアイソフォームを生じることが見出された354;358。しかし、FUS1mRNAは、このようなCpGのメチル化を起こす大部分の肺癌において発現され、FUS1の不活化の方法について見込みがない366。さらに、FUS1のCpG島を含む5’推定プロモーター領域を、6つの肺癌由来の亜硫酸水素ナトリウム処理した355DNAを使用して配列決定し、本発明者らは、FUS1タンパク質の発現を検出せず以下を参照のこと、そしてCpGメチル化を見出さなかった。この遺伝子が肺癌の病因に関与する別の機構として、FUS1の単独機能不全haploinsufficiencyまたは発現の減少の可能性を考えた356;359;373。本発明者らは、最初に、抗Fus1抗ペプチド抗体これは、外因的に発現されるFus1を容易に検出するを使用して肺癌細胞株のパネルのウエスタンブロット分析を行ったが図25、肺癌においていずれの内因的FUS1発現も検出され得なかったネガティブなデータの例として与えら得るH1299NSCLCについては、図25。この検出の欠如は、種々の要因抗体の品質を含むに起因し得る。それにもかかわらず、FUS1タンパク質発現の欠如または低レベルのFUS1タンパク質発現が肺癌の病因に関与する場合、本発明者らは、Fus1の内因的導入および発現が悪性の表現型を抑制し得ると結論付けた。コロニー形成アッセイを、FUS1発現ベクターのトランスフェクション後に行った。本発明者らは、PCRによってC末端FLAGタグ化FUS1構築物を作製し、そしてこれを発現ベクターpcDNA3.1Invitrogen,CarlsbadCAに連結した。空のベクター、ならびに野生型FUS1、FLAG-タグ化FUS1、および82aaの変異FUS1を含む発現ベクターを、NSCLCNCI-H1299細胞これは、3p21.3630kb領域についての対立遺伝子を喪失し、そして検出可能なFUS1タンパク質を発現しない図25、およびNSCLCNCI-H322細胞これは、FUS11の内因性のホモ接合性の非センス短縮変異の発現を含み、そしてまた、検出可能なFUS1タンパク質を発現しないにトランスフェクトした。H1299細胞中のFUS1構築物の、一過性のトランスフェクション後の発現を、抗Flag抗体および抗N末端FUS1抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって確認した図25。肺癌コロニー形成に対する、neo耐性遺伝子でのFUS1のトランスフェクションの効果を試験した。FUS1トランスフェクションにおけるG418耐性コロニーの数は、空のベクターでのトランスフェクションと比較して、劇的に減少した図25。対照的に、変異FUS1トランスフェクト体において形成したコロニーの数は、わずかに減少したのみであり、これにより、この肺癌に関連した変異FUS1が、機能的に不活性であったことが示唆される図25。H1299細胞中でエクジソン誘導性哺乳動物発現系を発生させて、FUS1の過剰発現が腫瘍細胞増殖を阻害し得ることを確認した。この系において、FUS1の発現を、PonasteroneAの存在下で誘導する。調節可能なホルモンレセプターベクターpVgRXRのみを有するH1299親ECR9細胞を、さらなるコントロールとして役立てた。H1299ECR9細胞を、pINDsp1-FUS1-FLAGneoでトランスフェクトし、PonasteroneAの存在または非存在下でG418を用いて選択し、そしてG418耐性コロニーの数を比較した。FUS1誘導条件下で発現が誘導された、細胞中に形成されたコロニーの数は、非誘導条件下での細胞中でのコロニーの数と比較して、平均75±8減少した。これは、FUS1の増殖阻害活性の別の確認confirmingationを提供する。20の安定なG418耐性コロニーを、非誘導条件下で単離し、そしてFUS1-FLAGの誘導可能な発現を試験した。その中で、6つのコロニーが、ある程度のFUS1誘導を示し、そして2つの安定なコロニーを選択しCl.13およびCl.16、このコロニーにおいて、FUS1-Flagの発現は、PonasteroneAによって明らかに誘導性であった図26。しかし、両方の細胞株は、非誘導条件においてある程度のFUS1を発現した。これはFUS1発現の調節が漏出性であることを示す。MTTアッセイによって、誘導条件および非誘導条件における細胞増殖速度を試験した。PonasteroneAは、親細胞株であるH1299ECR9細胞の増殖に対しては何の効果も有さないが、Cl.13細胞およびCl.16細胞の増殖は、PonasteroneAの存在下で阻害された図26。Fus1の発現の誘導および腫瘍細胞増殖の阻害は、PonasteroneAの用量に依存するようであり、この両方は、PonasteroneAの濃度の増加と共に増加する図26。Fus1誘導の場合、この腫瘍細胞の倍加時間もまた、両方のクローンにおいて増加したそれぞれ、Cl.13については、22時間から46時間、そしてCl.16については、21時間から45時間。これらの結果はまた、Fus1の過剰発現が、インビトロでのH1299肺癌細胞の増殖を抑制することを示した。TUNELアッセイによって、誘導条件下でのH1299細胞におけるアポトーシスの増加は観察されなかった。しかし、細胞がPonasteroneAによって誘導されて48時間にわたってFus1を発現し、そしてFACS分析によって蛍光発色セルソーターFACS分析詳細には、図26の説明文を参照のことによって分析した場合、本発明者らは以下を見出した:親H1299-ECR9細胞が、細胞周期パラメーターの変化を有さないことG151、S18、G2/M31非誘導およびG150、S18、G2/M32誘導;一方、Fus1誘導クローンは、G1停止を示したH1299クローン13は、G150、S17、G2/M33非誘導、およびG165、S10、G2/M25誘導を示し;そしてH1299クローン16は、G156、S16、G2/M28非誘導およびG165、S12、G2/M23誘導を示した。G1における増加は有意であったP<0.05、スチューデントt検定。これらの細胞周期分析の結果は、H1299細胞におけるFUS1の過剰発現がG1停止および細胞周期動力学の変更に関連することを示すことを示唆する。肺癌細胞株は、検出可能な内因的レベルのFus1タンパク質を発現せず、そして過剰発現によるFus1の内因的導入は、インビトロで肺癌細胞の増殖を阻害した。この増殖阻害は、この領域について対立遺伝子を喪失した肺癌株およびFUS1のホモ接合性の短縮変異を有する別の株において見られた。さらに、本発明者らは、この短縮Fus1タンパク質が、腫瘍増殖抑制活性を喪失していたことを見出した。急性トランスフェクション研究に加えて、本発明者らは、Fus1誘導系を確立し、そして腫瘍増殖阻害がFus1タンパク質の発現レベルに相関したことを示した。さらに、同じ発現調節系を使用する細胞周期分析は、細胞増殖の阻害についての機構が、G1停止に関連し、そしてアポトーシスの誘導には関連しなかったことを示した。最後に、本発明者らは、FUS1の体細胞性変異が、原発性肺癌においては珍しい0/40ことを確認し、これは、以前の研究3/79の肺癌が、FUS1遺伝子における変更を有することを示す2つの非センス変異および1つの欠失と一致している。実際に、本発明者らがこの600kbの3p21.3領域において詳細に研究した25の候補遺伝子のうち22のいずれかにおける変異の頻度は、この遺伝子座での高頻度のLOHと比較して、低い。この低い変異の頻度を説明する1つの可能性は、FUS1の発現の喪失、または腫瘍プロモーターの後天性メチル化による3p21.3遺伝子の他の喪失である。同じ3p21.3欠失領域から単離されたRASSF1AmRNAアイソフォームの発現およびFUS1の15.5kb動原体性は、この遺伝子についての後天性CpG島プロモーターDNAのメチル化によって、多くの肺癌において阻止された354;358。RASSF1Aの置換は、インビトロおよびインビボでの腫瘍細胞増殖を阻害し、これは、RASSF1Aが、この遺伝子座における別の候補腫瘍サプレッサーであることを示す。しかし、本発明者らは、FUS1mRNA発現の損失366または肺癌におけるFUS1についての5’領域のCpGメチル化を見出さなかったので、FUS1遺伝子についての不活化機構として腫瘍後天性プロモーターのメチル化を除外した。FUS1は、単独機能不全腫瘍サプレッサー遺伝子として作用し得る356。本発明者らの実験は、FUS1の過剰発現が、H1299におけるG1停止を引き起こすことを示した。いくつかのシグナルまたは環境的なキューcueは、正常細胞においてFus1の発現を誘導し、そしてG1停止を導き得るが、悪性細胞における3p対立遺伝子の損失およびFUS1のいくつかの他の変更は、肺腫瘍におけるFUS1の単独機能不全および/または発現の損失を導き得、そして細胞周期の停止から脱出し得る。本明細書中に開示されそして特許請求される全ての組成物および/または方法は、本開示を鑑みて、過度の実験なく作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および/または方法、ならびにこの方法の工程または工程の順序において、変更が適用され得ることが当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の因子が、本明細書中に記載の因子の代わりに使用され得、その上、同じかまたは同様の結果が達成され得ることが明らかである。当業者に明白な全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念に含まれるとみなされる。参考文献以下の参考文献は、これらが本明細書中の記載に対する例示的な手順的または補足となる他の詳細を提供する程度まで、本明細書中で詳細に参考として援用される:配列表"