"生理学的に許容される非毒性賦形剤と共に連鎖球菌C5aペプチダーゼSCPの免疫原性量を含んでなるワクチンであって、前記SCPが野生型SCPの変異体であり、前記量がβ溶血連鎖球菌属Streptococcusに対して感受性哺乳動物を免疫するのに有効な量であるワクチン。前記SCPがSCPをコードする単離されたDNA配列より発現される、請求項1に記載のワクチン。前記DNAが特異性クレバスまたは触媒ドメインをコードする、請求項2に記載のワクチン。前記DNAが特異性クレバスをコードする、請求項3に記載のワクチン。前記DNAがほぼ残基260から残基417までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項4に記載のワクチン。前記DNAがアミノ酸残基260261262415416または417のうちの1つ以上をコードする、請求項4に記載のワクチン。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、前記変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512のうちの1つ以上の箇所に変更を有する、請求項1に記載のワクチン。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、前記変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512のうちの1つ以上の箇所に置換を有する、請求項7に記載のワクチン。前記置換が保存的置換である、請求項8に記載のワクチン。前記DNAが触媒ドメインをコードする、請求項3に記載のワクチン。前記DNAがほぼ残基130から残基512までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項10に記載のワクチン。前記DNAがアミノ酸残基130193295または512の1つ以上をコードする、請求項10に記載のワクチン。前記SCPがSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49である、請求項2に記載のワクチン。前記SCPがSCPA1S512Aである、請求項13に記載のワクチン。前記DNAが、シグナル配列を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項2に記載のワクチン。前記DNAが、細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項2に記載のワクチン。前記SCPが酵素活性を示さない、請求項1に記載のワクチン。前記ワクチンが野生型SCPに比べて減少した結合活性を有する連鎖球菌C5aペプチダーゼの変異体を含んでなる、請求項1に記載のワクチン。有効量の免疫アジュバントを更に含んでなる、請求項1に記載のワクチン。前記哺乳動物がヒト、イヌ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項1に記載のワクチン。前記哺乳動物がヒトである、請求項20に記載のワクチン。前記β溶血連鎖球菌属がA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌である、請求項1に記載のワクチン。前記β溶血連鎖球菌属がA群連鎖球菌である、請求項22に記載のワクチン。前記SCPがA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌由来のSCPの変異体である、請求項1に記載のワクチン。前記連鎖球菌がA群連鎖球菌である、請求項24に記載のワクチン。ペプチドに接合または連結された連鎖球菌C5aペプチダーゼの組換え変異体を含んでなる、請求項1に記載のワクチン。多糖に接合または連結された連鎖球菌C5aペプチダーゼの変異体を含んでなる、請求項1に記載のワクチン。β溶血連鎖球菌の定着または感染に対して感受性哺乳動物を保護する方法であって、生理学的に許容される非毒性の賦形剤と共に免疫原性量の連鎖球菌C5aペプチダーゼを含んでなるワクチンの有効量を前記哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで前記SCPが野生型SCPの変異体であり、前記量が連鎖球菌に対して前記感受性哺乳動物を免疫するのに有効な量であることを特徴とする方法。前記ワクチンが酵素活性を示さない連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項28に記載の方法。前記ワクチンが野生型SCPに比較して減少した結合活性を有する連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項28に記載の方法。前記SCPがSCPをコードする単離されたDNA配列から発現される、請求項28に記載の方法。前記DNAが特異性クレバスまたは触媒ドメインをコードする、請求項31に記載の方法。前記DNAが特異性クレバスをコードする、請求項32に記載の方法。前記DNAがほぼ残基260から残基417までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項33に記載のワクチン。前記DNAがアミノ酸残基260261262415416または417のうちの1つ以上をコードする、請求項33に記載の方法。前記DNAが触媒ドメインをコードする、請求項32に記載の方法。前記DNAがほぼ残基130から残基512までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項36に記載の方法。前記DNAがアミノ酸残基130193295または512のうちの1つ以上をコードする、請求項36に記載の方法。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416または417の1つ以上の箇所に変更を有する、請求項28に記載の方法。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に置換を有する、請求項39に記載の方法。前記置換が保存的置換である、請求項40に記載の方法。前記SCPがSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49である、請求項31に記載の方法。前記SCPがSCPA1S512Aである、請求項42に記載の方法。前記DNAが、シグナル配列を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項31に記載の方法。前記DNAが、細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項31に記載の方法。前記ワクチンが有効量の免疫アジュバントを更に含んでなる、請求項28に記載の方法。前記ワクチンが皮下または筋肉内注射により投与される、請求項28に記載の方法。前記ワクチンが経口摂取により投与される、請求項28に記載の方法。前記ワクチンが鼻腔内投与される、請求項28に記載の方法。前記β溶血連鎖球菌属がA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌である、請求項28に記載の方法。前記β溶血連鎖球菌属がA群連鎖球菌である、請求項28に記載の方法。前記SCPがA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌由来のSCPの変異体である、請求項28に記載の方法。前記連鎖球菌がA群連鎖球菌である、請求項52に記載の方法。前記哺乳動物がヒト、イヌ、ウシ、ブタまたはウマである、請求項28に記載の方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項54に記載の方法。前記ワクチンがペプチドに接合または連結された組換え連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項28に記載の方法。前記ワクチンが多糖に接合または連結された組換え連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項28に記載の方法。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に変更を有する、請求項22に記載の方法。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に置換を有する、請求項22に記載の方法。酵素的に不活性なSCPを含んでなる単離精製されたペプチド。前記ワクチンが野生型SCPに比べて減少した結合活性を有する連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項60に記載のペプチド。前記SCPがSCPをコードする単離されたDNA配列から発現される、請求項60に記載のペプチド。前記SCPが特異性クレバスまたは触媒ドメインを有する、請求項60に記載のペプチド。前記SCPが特異性クレバスを含んでなる、請求項63に記載のペプチド。前記DNAがほぼ残基260から残基417までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項64に記載のペプチド。前記DNAがアミノ酸残基260261262415416または417のうちの1つ以上をコードする、請求項64に記載のペプチド。前記SCPが触媒ドメインを有する、請求項63に記載のペプチド。前記DNAがほぼ残基130から残基512までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項67に記載のペプチド。前記DNAがアミノ酸残基130193295または512のうちの1つ以上をコードする、請求項67に記載のペプチド。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に変更を有する、請求項60に記載のペプチド。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に置換を有する、請求項70に記載のペプチド。前記置換が保存的置換である、請求項71に記載のペプチド。前記SCPがSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49である、請求項60に記載のペプチド。前記SCPがSCPA1S512Aである、請求項73に記載のペプチド。前記ペプチドがシグナル配列を含まないという点で生来のSCPとは異なっている、請求項60に記載のペプチド。前記ペプチドが細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPとは異なっている、請求項60に記載のペプチド。前記SCPがA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌由来のSCPの変異体である、請求項60に記載のペプチド。前記連鎖球菌がA群連鎖球菌である、請求項77に記載のペプチド。酵素的に不活性なSCPをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離精製されたポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項79に記載のポリヌクレオチド配列。前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項79に記載のポリヌクレオチド配列。前記DNAが特異性クレバスまたは触媒ドメインをコードする、請求項80に記載のポリヌクレオチド配列。前記DNAが特異性クレバスをコードする、請求項82に記載のポリヌクレオチド配列。前記DNAがほぼ残基260から残基417までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項83に記載のポリヌクレオチド。前記DNAがアミノ酸残基260261262415416または417のうちの1つ以上をコードする、請求項83に記載のポリペプチド。前記DNAが触媒ドメインをコードする、請求項82に記載のポリヌクレオチド配列。前記DNAがほぼ残基130から残基512までの連続アミノ酸残基を含んでなるSCPをコードする、請求項86に記載のポリヌクレオチド。前記DNAがアミノ酸残基130193295または512のうちの1つ以上をコードする、請求項86に記載のポリヌクレオチド。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に変更を有する、請求項79に記載のポリヌクレオチド。前記SCPが野生型SCPの変異体であり、ここで変異体SCPがアミノ酸残基260261262415416417130193295または512の1つ以上の箇所に置換を有する、請求項89に記載のポリヌクレオチド。前記置換が保存的置換である、請求項90に記載のポリヌクレオチド。前記核酸配列がSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49をコードする、請求項80に記載のポリヌクレオチド。前記核酸配列がSCPA1S512Aをコードする、請求項92に記載のポリヌクレオチド。前記DNAが、シグナル配列を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項80に記載のポリヌクレオチド。前記DNAが、細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPとは異なっているSCPをコードする、請求項80に記載のポリヌクレオチド。前記SCPがA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌由来のSCPの変異体である、請求項79に記載のポリヌクレオチド。前記連鎖球菌がA群連鎖球菌である、請求項96に記載のポリヌクレオチド。前記ワクチンが野生型SCPに比較して減少した結合活性を有する連鎖球菌C5aペプチダーゼ変異体を含んでなる、請求項80に記載のポリヌクレオチド。発明の要約本発明は、β溶血連鎖球菌属Streptococcusに対して感受性哺乳動物を免疫するのに有効なワクチンおよびワクチン接種方法を提供する。感受性哺乳動物はヒトまたは家畜、例えばイヌ、ウシ、ブタまたはウマであることができる。そのような免疫は、哺乳動物におけるβ溶血連鎖球菌属の定着の発生を予防、改善または削減することができる。ワクチンは、生理学的に許容される非毒性の賦形剤と共に免疫原性有効量の連鎖球菌C5aペプチダーゼSCPを含み、ここで前記SCPは野生型SCPの変異体である。SCPの変異体は、生来のSCPと完全には同一でないポリペプチドまたはオリゴペプチドSCPである。そのような変異体SCPは、1または複数のアミノ酸の挿入、削除または置換によってアミノ酸配列を変更することにより得ることができる。タンパク質のアミノ酸配列は、生来のポリペプチドに比較した時に実質的に同じかまたは改善された性質を有するポリペプチドを作製するために、例えば置換によって変更される。置換は保存的置換であることができる。保存的置換とは、或るアミノ酸を似た側鎖を有する別のアミノ酸により置換することである。保存的置換は、ペプチド全体がそれの立体構造を保持しているが変更された生物活性を有するような、アミノ酸の電荷またはアミノ酸の側鎖のサイズの可能な最小限の変更あるいは、側鎖の中の化学基のサイズ、電荷または種類の変更を生じるアミノ酸での置換であろう。例えば、一般的な保存的置換はAspからGluAsnまたはGlnへ;HisからLysArgまたはPheへ;AsnからGln,AspまたはGluへ;およびSerからCysThrまたはGlyへであろう。アラニンは別のアミノ酸の置換によく用いられる。20種の必須アミノ酸は次のように分類される:無極性側鎖を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン;無電荷の極性側鎖を有するグリシン、セリン、スレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン;酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸;並びに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニンおよびヒスチジン。LStryerBiochemistry第2版p1415LehningerBiochemistryp7375。アミノ酸変更は対応する核酸配列のコドンを変更することにより達成される。そのようなポリペプチドは、抗原性または免疫原性活性を変更または改良するためにポリペプチド構造中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置換することに基づいて入手できることは知られている。例えば、別のアミノ酸の置換を通して、高められた活性や増強された免疫応答を生じるような小さなコンホメーション変化をポリペプチドに付与することができる。あるいは、或るポリペプチド中のアミノ酸置換を使って別分子を連結させることのできる残基を提供し、別の目的に有用であるに十分な程度の出発ポリペプチドの抗原性を保持しているペプチド-分子接合体を提供することができる。相互作用する生物学的機能をポリペプチドに付与するのにアミノ酸のヒドロパシー指数を利用することができる。その場合、同様な生物活性を保持したままで、或るアミノ酸を同様のヒドロパシー指数を有する別のアミノ酸により置換することができることは認められる。あるいは、特に免疫学的環境での使用を意図してポリペプチドに所望する生物学的機能を付けようとする場合、疎水性に基づいて類似アミノ酸による置換を行うこともできる。隣接アミノ酸の親水性により決定される、タンパク質の最大局所平均親水性は、それの免疫原性と相関関係がある。米国特許第4554101号明細書。従って、各アミノ酸に割り当てられる親水性に基づいて置換を行うことができる。各アミノ酸に数値を割り当てる親水性指数またはヒドロパシー指数のいずれかを使う場合、それらの値が±2であるようなアミノ酸置換を行うことが好ましく、±1が特に好ましく、そして±05以内の置換が最も好ましい置換である。変異体SCPは、少なくとも7アミノ酸残基、好ましくは約100~約1500残基、より好ましくは約300~約1200残基、更により好ましくは約500~約1180残基を含んでなり、変異体SCPは対応する生来のSCPのアミノ酸配列に対して少なくとも50、好ましくは少なくとも約80、より好ましくは少なくとも約90で且つ100未満の連続アミノ酸配列相同性または同一性を有する。変異体SCPポリペプチドのアミノ酸配列は生来のSCPアミノ酸配列に本質的に一致する。本明細書中で用いる本質的に一致するとは、生来のSCPによって誘導される免疫応答と実質的に同じである防御免疫応答を惹起するであろうポリペプチド配列を言う。そのような応答は、生来のSCPにより惹起されるレベルの少なくとも60であることができ、生来のSCPにより惹起されるレベルの少なくとも80であることもできる。組成物またはワクチンに対する免疫応答は、着目のポリペプチドまたはワクチンに対する宿主による細胞性免疫および/または抗体媒介免疫応答の発生である。普通、そのような応答は、着目の組成物またはワクチン中に含まれる1または複数の抗原に特異的に向けられた、宿主産生抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞および/または細胞傷害性T細胞から成る。SCPはA群連鎖球菌SCPA、B群連鎖球菌SCPB、C群連鎖球菌SCPCまたはG群連鎖球菌SCPGからのSCPの変異体であることができる。本発明の変異体は、対応する生来のSCP中に存在しないアミノ酸残基を含むことができまたは対応する生来のSCPに比較して欠失を含むことができる。変異体は対応する生来のSCPに比較して先端が切り取られた断片であってもよく、すなわち、全長タンパク質の一部分のみであってもよい。例えば、変異体SCPは、細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPと異なっていてもよい。SCP変異体には少なくとも1つのDアミノ酸を有するペプチドも包含される。ワクチンの変異体SCPは、該変異体SCPをコードする単離されたDNA配列から発現させることができる。例えば、変異体SCPはそれがシグナル配列または細胞壁貫通部を含まないという点で生来のSCPと異なってもよい。DNAが特異性クレバスまたは触媒ドメインをコードしてもよい。特に、該DNAは触媒ドメインのアミノ酸残基130193295もしくは512または特異性クレバスの260261262415416もしくは417をコードすることができ、あるいはそのような残基における置換をコードすることができる。特に、該DNAはSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49をコードすることができる。上記列挙において、SCPA49H193Aとは、残基番号193のところのHisがAlaにより置換されている、A群連鎖球菌血清型49からのSCPを意味する。ワクチンのSCPは酵素C5アーゼまたはペプチダーゼ活性を欠いていてもよい。ワクチンは免疫アジュバントを含んでもよい。該ワクチンはA群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌またはG群連鎖球菌による感染を予防するために使うことができる。該ワクチンは免疫原性ペプチドもしくは免疫原性多糖に接合または連結された免疫原性組換え連鎖球菌C5aペプチダーゼを含むことができる。組換え体は、遺伝子操作法により製造されたペプチドまたは核酸として定義される。用語タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは本明細書中互いに交換可能に用いられる。連鎖球菌C5aペプチダーゼワクチンは皮下または筋肉内注射により投与することができる。あるいは、該ワクチンは経口摂取または鼻腔内接種により投与することができる。本発明は更に、野生型SCPの変異体である単離精製されたSCPペプチド、および変異体SCPをコードする単離精製されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、SCPは触媒ドメインのアミノ酸残基130193295もしくは512または特異性クレバスの260261262415416もしくは417を含むことができる。SCPはSCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512AまたはΔSCPA49であることができる。発明の具体的説明様々な病原菌による感染に対する重要な第一防御ラインは、感染部位における食作用性多形核白血球PMNと単核細胞の蓄積である。これらの細胞の誘引は、走化性刺激物質、例えば宿主因子または侵略生物により分泌される因子によって媒介される。C5a化学誘引物質は哺乳類におけるこの免疫反応の刺激の中枢である。C5aは補体の第五成分C5から開裂される74残基の糖ペプチドである。食細胞は直接的にC5aの勾配に反応し、感染部位に蓄積する。C5aは炎症過程中最も直接的な食細胞誘引物質であるかもしれない。PMNが炎症部位に浸潤するにつれて、それらは別のケモカイン、例えばIL8を分泌し、それが更に炎症反応を増強する。連鎖球菌C5aペプチダーゼSCPは、C5aが局所的に生産されると、病原性連鎖球菌の表面上に存在しそこでC5aを破壊するタンパク質分解酵素である。SCPは、C5a走化性因子をPMN結合部位のところC5aのHis67-Lys68残基の間で特異的に開裂せしめ、C5aの最もC末端の7残基を遊離させる。PMN結合部位のこの開裂は走化性シグナルを除去する。ClearyP他、StreptococcalC5apeptidaseisahighlyspecificendopeptidaseInfectImmun6052195223WexlerDE他、MechanismofactionofthegroupAstreptococcalC5ainactivatorProcNatlAcadSciUSA8281448148。A群連鎖球菌からのSCPは、124814ダルトンのMrを有し、且つ多数のグラム陽性菌表面タンパク質に共通である細胞壁固定モチーフを有するズブチリシン様セリンプロテアーゼである。C5aペプチダーゼの構造を図1に示す。ストレプトコッカスピオゲネスの連鎖球菌C5aペプチダーゼ遺伝子の完全ヌクレオチド配列は既に発表されている。ChenCClearyPCompletenucleotidesequenceofthestreptococcalC5apeptidasegeneofStreptococcuspyogenesJBiolChem26531613167。ズブチリシンとは異なり、SCPは非常に狭い基質特異性を有する。この狭い特異性は、両者の触媒ドメイン間に顕著な類似性があることから見ると驚くべきことである。ClearyP他、StreptococcalC5apeptidaseisahighlyspecificendopeptidaseInfectImmun6052195223。結合ポケットの両側の残基のように、電荷移動に関係する残基は保存されているが、しかしSCPの残りの残基はズブチリシンの残基とは無関連である。A群連鎖球菌の40種以上の血清型がSCPタンパク質を生産するかまたはその遺伝子を所有することがわかった。ClearyP他、AstreptococcalinactivatorofchemotaxisanewvirulencefactorspecifictogroupAstreptococciRecentAdvancesinStreptococciandStreptococcalDiseasep179180PodbielskiA他、ThegroupAstreptococcalvirR49genecontrolsexpressionoffourstructualvirregulongenesInfectImmun63920。SCPの触媒ドメインまたは活性部位は電荷移動系と特異性クレバスから構成される。触媒ドメインとも呼ばれる電荷移動系は、残基Asp130His193Asn295およびSer512を含有する図1と図2。それらのアミノ酸のいずれか1つの変更、すなわち欠失、挿入または置換が該酵素を不活性化するであろう。他方で、特異性クレバスはSer260Phe261Gly262Ile415Tyr416およびAsp417により構成されると推定される。これらのアミノ酸の置換は酵素の基質特異性を変更するかタンパク質分解活性を完全に除去し得る。これらのアミノ酸の欠失による変更も酵素を不活性化するだろう。触媒ドメインは、成熟酵素をその活性状態へと折り畳むときに形成されるタンパク質の三次構造に依存する。このドメインはアミノ酸残基の連続直鎖状アレイから構成されない。あるいは、変更は変異体SCPの結合も減少させることができる。結合は50、70または80さえも減少させることができる。B群連鎖球菌に関連するC5aペプチダーゼ酵素も同定されている。HillHR他、GroupBstreptococciinhibitthechemotacticactivityofthefifthcomponentofcomplementJImmunol14135513556。scpBヌクレオチド配列の制限マッピングと比較は、scpBがscpAと97~98同じであることを示した。A群連鎖球菌血清型49、A群連鎖球菌血清型12、B群連鎖球菌およびA群連鎖球菌血清型1からのSCPのアミノ酸配列それぞれ配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号23の比較については図2を参照のこと。B群連鎖球菌の全血清型に相当する30株以上がscpB遺伝子を担持する。ClearyP他、SimilaritybetweentheGroupBandAstreptococcalC5aPeptidasegenesInfectImmun6042394244SuvorovAN他、C5apeptidasegenefromgroupBstreptococciGeneticsandMolecularBiologyofStreptococciLactococciandEnterococcip230232。G群およびC群連鎖球菌のヒト分離株もscpA様遺伝子を所有する。幾つかのG群株はそれらの表面上にC5a特異的プロテアーゼ活性を発現することが証明された。ClearyPP他、VirulenthumanstrainsofgroupGstreptococciexpressaC5apeptidaseenzymesimilartothatproducedbygroupAstreptococciInfectImmun5923052310。従って、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌、C群連鎖球菌およびG群連鎖球菌の全血清型>80がSCP酵素を生産する。SCPは、感染部位への貧食白血球の流入を阻害することにより、連鎖球菌が潜在的感染部位例えば鼻咽頭粘膜に定着するのを助ける。これは宿主による連鎖球菌の初期クリアランスを妨げる。プロテアーゼ構造遺伝子中に明確に限定された変異を有する連鎖球菌株を使って、炎症、C5a白血球走化性および連鎖球菌ビルレンス毒力に対するSCPの影響を調べた。標的プラスミド挿入によりおよび特定の内部欠失を含むscpAと野性型遺伝子との置換によりSCP変異体を作製した。それらの変異体はC5aプロテアーゼ活性を欠き、C5aに対するヒトまたはマウスPMNの試験管内走化性応答を阻害しなかった。マウス結合組織気嚢airsacモデルを使って、SCPが貧食細胞の流入および感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせることを確かめた。結合組織気嚢は、25ゲージ注射針を使って少量の空気とPBSその中に連鎖球菌を含むかまたは含まないをマウスの背中の皮下に注入することにより作製する。BoyleMDP他、MeasurementofleukocytechemotaxisinvivoMethEnzymol162101115。実験の終わりに、マウスを頸部脱臼により安楽死させ、マウスから気嚢を切開し、気嚢を緩衝液中でホモジナイズした。気嚢モデルの利点は、気嚢が数日間膨張したままであり且つ刺激原を注射しない限り炎症から免れることである。よって、注入した細菌およびそれから生じる炎症反応が短期感染期間に渡って局在化されたままである。野性型SCPとSCP連鎖球菌すなわち、非機能形の変異型SCPを有するA群連鎖球菌のクリアランスを比較しそして感染初期の細胞浸潤物を分析するために気嚢モデルを変更した。組織懸濁液を血液寒天平板上で生存可能連鎖球菌について分析し、蛍光標示式細胞分取法FACSにより細胞浸潤物を分析した。FACS分析法では、懸濁液中の個々の細胞を特異的蛍光モノ抗体で標識する。標識細胞のアリコートをFACScan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器特有の蛍光に基づいて細胞を計数する中に注入する。気嚢モデルを使った実験は、SCP連鎖球菌がSCP連鎖球菌よりも一層毒性であることを示した。ヒト血清および唾液中のSCPに対するIgAとIgGの両方のヒト抗体の産生を測定する研究を行った。OConnorSP他、TheHumanAntibodyResponsetoStreptococcalC5aPeptidaseJInfectDis163109116。一般に、未感染の乳幼児からの血清および唾液はSCPに対する抗体を欠いていた。対照的に、健康な成人からの血清試料と唾液試料の大部分が、測定可能なレベルの抗SCPIgGおよびSCP特異的分泌IgA抗SCPsIgAを有した。連鎖球菌性咽頭炎を有する患者からの急性および回復期の対合血清は、健康な個体からの血清には含まれなかった高レベルの抗SCPIgGを有した。高濃度の抗SCP免疫グロブリンを含む血清はSCP活性を中和することができた。連鎖球菌性咽頭炎に最近かかった小児から得られた唾液試料の>90においてこの抗体が検出されたことは、小児が抗体応答を生じ得ることを証明した。ヒト被検者が自然連鎖球菌感染に応答してSCPに対するIgGおよびIgAを生産したとしても、抗SCP免疫グロブリンが感染に対する何らかの防御を提供するかどうかはわからなかった。更にSCPタンパク質がβ溶血連鎖球菌の定着または感染に対するワクチンとして機能できるかどうかもわからなかった。まず最初に、鼻咽頭への定着におけるSCPの役割を調べるために実験を行った。生存A群連鎖球菌による鼻腔内感染の後、10日目まで毎日咽頭培養物を採取した。野性型連鎖球菌および同系SCP欠損変異型連鎖球菌を、この10日間に渡り咽頭に存続する能力について比較した。予想通り、SCP欠損変異型連鎖球菌の方がより迅速に鼻咽頭から浄化された。同じ鼻腔内マウスモデルを使って、定着を予防する免疫を誘導するSCPの能力を試験した。Thr63をコードするヌクレオチドで始まる組換えscpA49遺伝子の変異型をクローニングした。この変異体をΔSCPA49と命名し、それは長さ2908bpである下記実施例4参照。変異体SCPタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによりE.コリ組換え体から精製した。このタンパク質製剤を皮内にワクチン接種したウサギの血清は、試験管内でSCP活性を中和した。精製タンパク質40μgを5週間に渡りマウスに鼻腔内投与した。免疫処置マウスは1~2日間で連鎖球菌を浄化し、一方で非免疫処置マウスの咽頭培養物は10日間まで陽性のままであった。3種の異なるSCPタンパク質製剤をワクチン接種した3組のマウスにおいてこの実験を繰り返した。単一抗原を使った動物の免疫処置が複数の血清型による定着を予防するかどうかを調べるために別の実験を行った。ΔSCPA49を発現ベクター中でクローニングし、E.コリ中で発現させた。アフィニティー精製した変異体ΔSCPA49タンパク質は、マウスおよびウサギにおいて高度に免疫原性であることが証明された。精製変異体ΔSCPA49免疫原は酵素活性を欠くけれども、それはM1,M6,M12およびM49連鎖球菌に関連したペプチダーゼ活性を試験管内で中和することができる高力価のウサギ抗体を誘導した。これにより、抗ペプチダーゼ抗体が血清型特異性を欠くことが確かめられた。次いで、4組のマウスを精製済変異体ΔSCPA49で免疫処置し、各々を異なる血清型のA群連鎖球菌によりチャレンジした。ΔSCPA49タンパク質によるマウスの免疫は、有意なレベルの特異的唾液sIgA抗体と血清IgG抗体の生産を刺激し、そして野性型M1,M2,M6,M11およびM49連鎖球菌の定着力コロニー形成活性を減少させた。この実験は、連鎖球菌C5aペプチダーゼワクチンによる免疫処置が鼻咽頭への定着を予防するのに有効であることを確証する。M1OF株とM49OF株からの変異体SCPを開発する実験も行った。活性SCPは宿主に対して有害となり得るので、変異体タンパク質が酵素活性を欠くことは重大であった。触媒活性に必要とされるアミノ酸を、該酵素を不活性化すると予想されるアミノ酸により置き換えた。変異体タンパク質の2つの性質を評価した。第一に、野生型タンパク質と変異型タンパク質の比活性をPMN付着アッセイにより測定した。この実験は、置換したアミノ酸が酵素活性を90超減少させたことを示した。第二に、野生型酵素に対して向けられた抗体を結合する能力について、変異体タンパク質と野生型タンパク質とを比較した。この目的には競合ELISAアッセイを使った。その結果は、アミノ酸置換が変異体タンパク質に結合する抗体の能力を変更しなかったことを示した。アフィニティー精製したΔSCPA49タンパク質をアジュバントなしで鼻腔内投与することにより、初期防御実験を行った。しかしながら、歴史的には、抗原の筋肉内または皮下SQ注射が好ましく且つより受け入れられるワクチン投与方法である。従って、モノホスホリルリピドAMPLまたはミョウバンAlPO4を伴うΔSCPAのSQ注射が防御免疫応答を誘導するかどうか、そしてA群連鎖球菌のチャレンジ株がSCPAワクチンの入手源とは血清型で異なる場合、その応答が定着を減少させるかどうかを調べるために実験を行った。培養によるかまたは鼻組織切片のサンプリングにより、口-鼻咽頭粘膜から連鎖球菌を浄化する免疫マウスの浄化力を評価した。鼻組織に関係する連鎖球菌の数は、予想通り時間と共に減少し、その減少はSCPA抗原で免疫処置したマウスにおいて一層迅速で且つ完全であった。この結果は、単一のSCPA抗原が非相同血清型に対しても防御を誘導できることを確証した。防御は、細菌表面上のペプチダーゼ活性を中和する抗体によって供給される。これは、連鎖球菌が粘膜組織上に付着した時点から数時間内に食細胞の流入を増加させる。食細胞による連鎖球菌の迅速なクリアランスは、その後の細菌の増殖や存続を防止すると予想される。かくして、アジュバントを使ったSCPAのSQ注射は一貫して活発な抗体応答を誘導した。従って、本発明は、β溶血連鎖球菌属の定着または感染に対して哺乳類を防御するために用いられるワクチンを提供する。本発明の一態様では、ワクチンに通例であるように、変異体連鎖球菌C5aペプチダーゼは薬理学的に許容される賦形剤中で哺乳類に投与することができる。本発明のワクチンは、免疫応答を増強することが知られている有効量の免疫アジュバントを含むこともできる。SCPは別のペプチドにもしくは多糖に接合または連結せしめることができる。例えば、当業界で周知である免疫原性タンパク質担体としても知られるを使うことができる。有用な免疫原性タンパク質としては、アオガイヘモシアニンKLH、ウシ血清アルブミンBSA、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ヒトγグロブリン、ニワトリ免疫グロブリンG、およびウシγグロブリンが挙げられる。有用な免疫原性多糖類としては、A群連鎖球菌多糖、B群連鎖球菌からの多糖C、または肺炎連鎖球菌Streptococcipneumoniaeの莢膜多糖が挙げられる。あるいは、ワクチンとして用いられる別の病原体の多糖またはタンパク質をSCPに接合もしくは連結せしめることができまたはSCPと混合することができる。本発明は更に、連鎖球菌C5aペプチダーゼの少なくとも一部分をコードする、すなわち本明細書中に記載のSCPもしくはそれの変異体、例えばSCPA49S512A、SCPA49D130A、SCPA49N295A、SCPA1S512A、SCPA1D130A、SCPA1N295A、ΔSCPA49、SCPBS512A、SCPBD130A、SCPBH193AもしくはSCPBN295A、またはそれらの変異の任意組合せをコードする、予め決められた核酸セグメントを含んでなる単離精製された核酸分子、例えばDNA分子を提供する。例えば、本発明は、伝令RNA標的mRNAの全部または一部と実質的に同一センスであるRNA分子すなわち内因性SCPmRNAまたは生来のSCPmRNAをコードする選択されたDNAセグメントを含んでなる発現カセットを提供する。発現カセット中の予め選択されたDNAセグメントはプロモーターに作用可能に連結される。本明細書中で用いる配列に関する実質的に同一とは、2つの核酸配列が互いに少なくとも約65、好ましくは約70、より好ましくは約90、更に好ましくは約98の連続ヌクレオチド配列同一性を有することを意味する。好ましくは、予め選択されたDNAセグメントは、ハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、対応する生来のSCPをコードする核酸分子にハイブリダイズする。本明細書中で用いる実質的に純粋とは、対象の種が優勢存在種であるすなわち、モルに基づいて組成物中の別の個々の種よりもずっと豊富であることを意味し、好ましくは、実質的に純粋な画分は、対象の種が存在する全巨大分子種の少なくとも約50モルに基づきを占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、該組成物中に存在する全巨大分子種の約80、より好ましくは約85、約90、約95、そして約99超を含んでなるだろう。最も好ましくは、対象の種が本質的に均一にまで精製され通常の検出方法により組成物中に夾雑種が検出できない、その場合は組成物は単一の巨大分子種から本質的になる。本明細書中で用いる組換え核酸または予め選択された核酸、例えば組換えDNA配列またはセグメントまたは予め選択されたDNA配列またはセグメントとは、任意の適当な入手源より誘導または単離されており、その配列が天然に存在しないように、または外因性DNAにより形質転換されてないゲノム中にそれらが位置しているのと同じようには位置しない天然配列に対応するように、続いて試験管内で化学的に変更することができる核酸、例えばDNAを指していう。或る入手源より誘導された予め選択されたDNAの一例は、与えられた生物中に有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形で化学合成されるDNA配列であろう。そのような或る入手源より単離されたDNAの一例は、遺伝子操作方法論によって本発明での使用のためにそれを更に操作例えば増幅できるように、化学的手法により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により、前記入手源から切除または分離される有用なDNA配列であろう。制限消化物からのDNAの特定断片の回収または単離は、電気泳動によるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上での消化物の分離、既知分子量のマーカーDNA断片の移動度に対する着目の断片の移動度の比較による着目の断片の同定、所望の断片を含むゲル切片の切除、およびDNAからのゲルの分離を利用する。Lawn他、NucleicAcidsRes96103およびGoeddel他、NucleicAcidsRes84057を参照のこと。従って、予め選択されたDNAには、完全合成DNA配列、半合成DNA配列、生物源から単離されたDNA配列、およびRNAから誘導されたDNA配列、並びにそれらの混合物が包含される。本明細書中でRNA分子に関して用いる誘導されたという用語は、RNA分子が特定のDNA分子に対する相補的配列同一性を有することを意味する。SCPのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法により調製される。それらの方法としては、非限定的に、天然源からの単離天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合、SCPの予備調製変異体または非変異体形のオリゴヌクレオチド指令または部位特異的突然変異誘発、PCR突然変異誘発およびカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。被検体を免疫するために、変異体SCPは、非経口的に、通常は適当な賦形剤中での筋肉内もしくは皮下注射により、投与される。しかしながら、別の投与方法、例えば経口投与または鼻腔内投与も受け入れられる。有効量は、β溶血連鎖球菌定着の発生を予防、改善または低減するのに十分な量である。ワクチン製剤は賦形剤中に有効量の活性成分を含有するだろう。その有効量は当業者により容易に決定され得る。活性成分は典型的には組成物の約1~約95の範囲であり、または適当ならばそれより多くまたは少なくてもよい。投与すべき量はワクチン接種を考えている動物またはヒト被検体の年齢、体重および体調といった要因に依存する。投与すべき量は抗体を産生する動物の免疫系の能力、および所望する防御の度合にも依存する。有効量は用量応答曲線を作成する通常の試験を通して当業者により容易に決定することができる。まずSCPまたはその断片を1回または複数回投与することにより被検者を免疫する。連鎖球菌に対する免疫の状態を維持するために必要とされるように多数回量投与してもよい。鼻腔内用製剤は、鼻粘膜に刺激を引き起こしたり繊毛機能を有意に妨害したりしない賦形剤を含むことができる。希釈剤、例えば水、食塩水または既知の他の物質を本発明と共に使用できる。鼻用製剤は、非限定的にクロロブタノールや塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含んでもよい。鼻粘膜による目的タンパク質の吸収を高めるために界面活性剤が存在してもよい。経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性の懸濁液剤、液剤、乳剤、シロップ剤もしくはエリキシル剤の形であってもよく、あるいは錠剤形に乾燥した製品としてまたは使用前に水もしくは他の適当な賦形剤で再構成される製品として提供してもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤食用油を含んでもよいまたは保存剤といった常用の賦形剤を含んでもよい。ワクチンを調製するために、精製SCPを単離し、凍結乾燥しそして安定化することができる。次いでSCPペプチドを適当な濃度に調整し、所望により適当なワクチンアジュバントと組合せ、そして使用のために包装することができる。適当なアジュバントとしては、非限定的に、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、N,N-ジオクタデシル-N’,N-ビス2-ヒドロキシエチルプロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール;ポリアニオン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、カルボポール;ペプチド、例えばムラミルジペプチド、MPL、ジメチルグリシン、タフトシン、油状乳剤、ミョウバン、並びにそれらの混合物が挙げられる。別の可能なアジュバントとしては、E.コリ熱不安定性毒素のまたはコレラ毒素のBペプチドサブユニットが挙げられる。McGheeJR他、OnvaccinedevelopmentSemHematol30315。最終的に、免疫原性生成物はワクチン製剤用のリポソーム中に組み込まれるか、あるいはアオガイヘモシアニンKLHもしくはヒト血清アルブミンHSAのようなタンパク質または他のポリマーに接合することができる。定着に対抗する哺乳類のワクチン接種のためのSCPの使用は、他のワクチン候補を上回る利点を提供する。単一タンパク質の接種による定着または感染の予防は、連鎖球菌性咽頭炎および膿痂疹のごく一般的な問題の発生を減らすだけでなく、リウマチ熱、急性糸球体腎炎、敗血症、中毒性ショックおよび壊死性筋膜炎といった続発症も排除するだろう。下記の実施例は本発明を例証するためのものであって制限するためのものではない。実施例1scpA49およびscpA6の挿入変異体と欠失変異体の作製並びに試験管内分析a菌株および培養条件。S.ピオゲネスCS101株は、血清型M49で血清乳白度陽性OF株である。CS159は、M遺伝子クラスターとscpAを通って広がる欠失を有する臨床分離株である。CS101株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体であるCS101Smは、ストレプトマイシン200μgmlを含むトリプトース血液寒天培地上で定常期培養物から連鎖球菌を平板培養することにより選択された。連鎖球菌CS210株とCS463株は、OF、クラスII、それぞれ血清型M2およびM11株の自然ストレプトマイシン耐性誘導体株である。連鎖球菌90131株とUAB200株は、A群連鎖球菌のOF、クラスI、それぞれ血清型M1とM6のヒト分離株である。CS101pGhost5は、未知の位置であるがただしscpAとemm遺伝子クラスターの外側においてpGhost5が染色体中に組み込まれているCS101株である。エシェリキアコリEscherichiacoliER1821株NewEnglandBiolabsIncBeverlyMAから入手を、自己不活化ベクタープラスミドpGhost5のための受容細胞として使用した。プラスミドpGhost5はAppligeneIncPleasantonCAから入手した。連鎖球菌は2ネオペプトンもしくは1酵母エキスが補足されたトッド-ヒューイットブロス中で、または5ヒツジ血液を含むトリプトース寒天平板上で増殖させた。プラスミドpGhost5を含有するE.コリER1821株は、エリスロマイシン300μgmlを含むLBブロス中で増殖させた。プラスミドpGhost5を含有する連鎖球菌は、1μgmlのエリスロマイシン含有1酵母エキスが補足されたトッド-ヒューイットブロスTHY中で増殖させた。SCPは、一般的にβ溶血連鎖球菌属からの連鎖球菌C5aペプチダーゼのことを言う。SCPA1,SCPA12,SCPA49およびSCPA6はそれぞれA群連鎖球菌M血清型1,1249および6株からの特異的ペプチダーゼである。scpAという語は、A群連鎖球菌からのSCPをコードする遺伝子のことを言う。scpA1scpA12scpA6およびscpA49は、それぞれSCPA1,SCPA12,SCPA49およびSCPA6ペプチダーゼをコードする遺伝子である。SCPBおよびscpBは、B群連鎖球菌からのペプチダーゼと遺伝子である。SCPA49配列番号1、SCPA12配列番号2、SCPA1配列番号23およびSCPB配列番号3のアミノ酸配列は図2に与えられる。bscpA49挿入変異体の作製。プラスミド挿入および遺伝子置換法を使って、明確なscpA49挿入変異体を作製した。挿入標的である内部scpA49BglIIBamHI断片を、熱感受性シャトルベクターpGhost5中に連結せしめてプラスミドpGscpA12を作製し、それをE.コリER1821中に形質転換せしめた図3。pGhost5ベクターは、39°Cで活性であるE.コリ複製開始点、温度感受性グラム陽性Gram複製開始点連鎖球菌中で30°Cで活性であり39°Cで不活性である、および選択用のエリスロマイシン耐性遺伝子を含有する。高温は、102~103の範囲の頻度での相同組換えによりA群連鎖球菌の染色体DNA中に該プラスミドを強制的に組み込ませる。組換えプラスミドDNApGscpA12をCS101受容細胞中にエレクトロポレーション移入せしめた。形質転換体を1μgmlエリスロマイシンを含むTHY-寒天平板上で30°Cにて選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpA49との間での組換えから生じた染色体組込み体を、39°Cにてエリスロマイシン耐性により選択した。2つの挿入変異体M14とM16を分析した。抗生物質を含まないTHY中での30°Cでの継代によりM14およびM16株のEmrS復帰変異体を得、最後にErm選択を使わずに37°Cで平板培養した。プラスミドを失ってしまったコロニーを単離して、変異体の表現型が無関係の自然変異ではなくてscpA49中へのプラスミドの挿入に起因することを確かめた。cscpA6挿入変異体の作製。上記項目に記載したのと同様にscpA6挿入変異体AK14を作製した。組換えプラスミドDNAであるpGscpA12は、scpA遺伝子の内部BglIIBamHI断片を含有する。このプラスミドをUAB200受容細胞中にエレクトロポレーション移入せしめ、そしてエリスロマイシンを含有するTHY寒天平板上で30°Cにて形質転換体を選択した。プラスミド挿入断片と染色体scpA6との間の組換えから生じたpGscpA12の染色体組込み体AK14株は、エリスロマイシンを含有する寒天培地上での39°Cでの増殖により選択した。scpA6中への挿入は、プローブとしてscpAを使ったサザンブロッティングと、該プラスミドに特異的なM13万能プライマー5GTAAAACGACGGCCAGT3配列番号6とGASの染色体scpAに特異的なscpAFor835プライマー5AAGGACGACACATTGCGTA3配列番号7を使ったPCRにより確かめた。dscpA中への明確な欠失の導入図3。scpA49中への挿入が正反対であるために下流遺伝子細菌のビルレンスに寄与する可能性もある未知の遺伝子の発現を低下させ得るという可能性を取り除くために、scpAの内部に明確な欠失を有する変異体株を作製した。まず第一に、を使った裏返しinsideoutPCR法によりscpAのBglIIHindIII断片中に限定欠失を作った。下線を引いたヌクレオチドは、それぞれ座標2398および2322を有するscpA配列に相当し、そしてボールド体のヌクレオチドはEcoRI認識部位に相当する。これらのプライマーは、scpA遺伝子中に枠内inframe欠失を製造するために選択された。これらのプライマーは反対方向でプラスミドDNAを複製し、欠失の境界を限定する。InnisMA他編、PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications。プラスミドpGscpA12DNAを鋳型として使った。増幅生成物をEcoRIで消化し、プラスミドpGhost5中に連結せしめた。得られたプラスミドpGΔscpA11は、scpAの内部に76bpの欠失を含んだ。この枠内欠失は、セリンプロテアーゼの推定触媒中心の一部を構成するセリンを含む、25アミノ酸を除去した。ChenCClearyPCompletenucleotidesequenceofthestreptococcalC5apeptidasegeneofStreptococcuspyogenesJBiolChem26531613167。欠失の箇所にEcoRV部位が作製された。この欠失部と重複するDNAを配列決定して、この欠失の境界を確かめた。欠失を含むプラスミドpGΔscpA11をE.コリER1821中に形質転換せしめた。ErmRについてコロニーを選択し、次いでEcoRIによって制限したミニプレププラスミドDNAを使って適当なscpA欠失についてスクリーニングした。正確な欠失境界線をDNA配列分析により確かめた。プラスミドpGΔscpA11を上述のCS101Sm株中にエレクトロポレーションにより導入し、次いで39°CでのErm上での増殖により組込み体を選択した。M49株CS101Smの染色体中へのプラスミドの組込みは高温選択を使った。PCRにより挿入位置を確かめた。エリスロマイシン選択を使わない低温でのCS101Smの増殖は、ランダム欠失現象によるかまたは挿入によって生じる重複したscpA配列間での組換えから起こる切除によりプラスミドを失ってしまったErmS復帰変異体の高頻度分離を引き起こした。2つの欠失変異体、MJ25およびMJ315が同定され、それらを更に研究した。プラスミドpGscpA11の組換え切除により後に残された染色体欠失を、PCR法とEcoRVで消化したDNAへのサザンハイブリダイゼーション法により明らかにした。eSCPに対する変異の試験管内効果。SCP抗原の発現およびペプチダーゼ活性に対する挿入と欠失の影響をウエスタンブロットとPMN付着アッセイにより評価した。連鎖球菌を100mlのTHY中で37°Cにて一晩インキュベートした。培養ペレットを5mlの冷02M酢酸ナトリウム中で2回洗浄し、次いで1mlのTE-ショ糖緩衝液20ショ糖10mMTris1mMEDTApH70および40μlのムタノリシン中に懸濁した。この混合物を37°Cで2時間回転させ、次いで4500rpmで5分間遠心分離した。上清はプロテアーゼ阻害剤として100mMフェニルメチルスルホニルフルオリドPMSFを含んだ。LaemmliUKCleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4Nature227680685に記載された通りに、電気泳動およびウエスタンブロット法を実施した。ウエスタンブロットおよびコロニーブロット上でSCPタンパク質を検出するために用いる一次抗血清は、精製済の組換えSCPタンパク質でのウサギの免疫処置によって調製した。結合は抗ウサギ抗体-アルカリホスファターゼ接合体により検出した。C5aペプチダーゼ活性はPMN付着アッセイを使って測定した。BoothSA他、DapsonesuppressesintegrinmediatedneutrophiladherencefunctionJInvestDermatol98135140。C5aSigmaStLouisMOを連鎖球菌抽出物または精製プロテアーゼと共にインキュベートした後、残余C5aはPMNを活性化してBSA被覆ウエルに付着させることができる。初めに、マイクロタイタープレートウエルをPBS中05BSAで被覆し、37°Cで1時間インキュベートした。フィコール-ハイパックFicollHypaqueSigmaStLouisMO中での遠心分離によりヒトPMNを単離した。40μlのそのままの連鎖球菌またはタンパク質抽出物を、1グルコースと01CaCl2を含むPBS340μl中で、20μlの5μMC5aと共に37°Cで45分間インキュベートした。BSA被覆ウエルをPBSで洗浄し、PMNを再懸濁させ、次いでウエルに残余C5aを添加した。この混合物を7CO2中で37°Cで45分間インキュベートした。最後に、ウエルを洗浄して非付着性PMNを除去した。付着性PMNをクリスタルバイオレットで染色し、ELISAリーダー中でOD570nmを読み取った。光学濃度は残余C5aの量に比例し、またはSCP活性の量に反比例する。親および変異体培養物からの細胞表面タンパク質のムタノリシン抽出物を、SCPA特異的血清を使ったウエスタンブロットにより分析した。変異体はSCPAを欠いていることが確かめられた。SCPA変異体AK14とMJ315の抽出物は抗SCPA血清と反応しなかった。野生型株CS101とUAB200からの抽出物には予想通りのサイズのSCPAタンパク質が観察された。変異体株AK14とMJ315がC5aペプチダーゼ活性を生産できないことは、rhC5aを分解するそれらの能力を比較することにより確認した。rhC5aへの分離PMNの暴露により、PMNがBSA被覆マイクロタイタープレートに付着するように誘導した。連鎖球菌SCPAまたは精製SCPAとのインユベーションはrhC5aを特異的に開裂させ、そしてPMNを活性化する能力を変更した。残余rhC5aに反応しそしてBSA被覆ウエルに結合したPMNを染色し、次いで分光光度測定した。親培養物UAB200およびCS101とrhC5aとのインキュベーションはrhC5aを破壊し、PMN付着をそれぞれ588と545だけ阻害した。対照的に、SCPA変異体AK14とMJ315はrhC5aを変更せず、BSA被覆ウエルへのPMNの付着も変更しなかった表1。この実験をウエスタンブロットにより確かめると、SCPA培養物がrhC5aを分解し得る別のプロテアーゼを欠いていることが証明された。scpA中の突然変異によりMタンパク質発現が影響を受けると予想しなかったけれども、SCPA変異体連鎖球菌がまだMタンパク質を発現しそして貧食に耐える能力を有するかどうかを評価するためにアッセイを行った。3時間のインキュベーションの間の新鮮なヒト血液中での連鎖球菌の増殖は、それらの表面上に抗貧食性Mタンパク質の存在を示す。RCLancefieldDifferentiationofGroupAStreptococciwithaCommonRAntigenintoThreeSerologicalTypeswithSpecialReferencetoBactericidalTestJExpMed106pp525685。予想通り、親の連鎖球菌UAB200とCS101は、それぞれ40倍と49倍増加した表1。MSCPA培養物であるAK14株とMJ315株は、それぞれ375倍と14倍増加した。このことは、scpA突然変異がMタンパク質発現とヒト全血中での貧食に対する耐性にほとんど影響を与えないことを確証した。両変異体株が幾分乏しい増殖を有することは再現性があり予想外のことであった。ヒト血漿中での変異体と親培養物の増殖速度は区別できなかった。SCPAの不活性化がC5aを循環血液中に蓄積可能にし、次いでそれがPMNを活性化したという可能性がある。活性化したPMNはより貧食性になり、M連鎖球菌をより殺傷することができる。表面タンパク質抽出物は、抗M49抗血清と抗M6抗血清を使ったウエスタンブロットにより分析するとM6およびM49抗原を含有する。この結果は、SCPA中の突然変異がMタンパク質発現を変更しないことを確証する。実施例2SCPは食細胞の漸増および皮下感染部位からの連鎖球菌のクリアランスを遅らせるSCPがC5aの不活性化を招くことを確かめるために、上記実施例1に記載した通りにscpA49の挿入変異体および欠失変異体を作製し、そして活性試験した。scpA49中に挿入または欠失を導入すると、変異体SCPはマイクロタイタープレートへのPMNのC5a活性化付着を破壊することができなかった。ビルレンスに対するscpA49変異の影響を、連鎖球菌が局在化されたままでありそして炎症細胞の流入を分析することができる動物モデルを使って試験した。SCPがごく初期に該微生物の浄化を遅らせる働きをするという仮定を検証するために、結合組織気嚢の接種後ちょうど4時間目にSCPおよびSCP連鎖球菌の量を比較した。更に、この感染から短期間後のリンパ節および脾臓への連鎖球菌の散在も評価した。CharlesRiverBreedingLaboratoryWilmingtonMAから入手したCD1非近交系雄マウス25gを全ての実験に使用した。結合組織気嚢は、25ゲージの注射針を使ってマウスの背中の皮膚の下に空気09mlとPBS中に希釈したA群連鎖球菌01mlを注入することにより作製した。ある実験では、陽性対照としてSCPCS101pGhost5を使った。別の実験では陽性対照としてCS101Sm株を使った。感染後4時間目に頸部脱臼によりマウスを安楽死させた。指示した場合、4つの鼠径部リンパ節、脾臓および気嚢を動物から切開し、PBS中でホモジナイズした。組織懸濁液を、1μgmlエリスロマイシンまたは200μgmlストレプトマイシンを含む血液寒天平板上で生存可能コロニー形成単位CFUについてアッセイした。予備実験において、気嚢をスライド上に固定し、ライト染料により染色し、顕微鏡検査した。この方法による顆粒球数は信頼できないけれども、固定化組織の中の残余SCPは野性型連鎖球菌よりも有意に少ないように見えた。この差を測るための試みとして追加の実験を行った。気嚢をPBS中で粉砕することにより気嚢の分散細胞集団を調製し、それらをナイロンモノフィラメントメッシュTETKOCoNewYorkに通した。300×gで5分間の遠心により細胞をペレットにし、それをFACS緩衝液フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶液、01NaN3、10BSA画分V中に5×106/mlの密度に再懸濁した。細胞10×106個を1μgのFITC抗マウスMac1で直接染色するかまたは1μgのビオチン接合抗マウスGr1に続いて蛍光もしくはFITCで標識した1μgのストレプトアビジンにより間接染色した。モノクローナル抗体Mac1とGr1はPharmingenIncCAから入手した。標識細胞を10パラホルムアルデヒド中で固定した。FACScan流動細胞計測器フローサイトメーターとConsort32ソフトウエアBectonDickinsonを使って蛍光プロフィールを作成した。マウスPMNを全血からフィコール-ハイパック密度勾配遠心により精製し、混成細胞集団中の限定されたPMNのための標準として使用した。特異的に標識された細胞の測定用に、各抗体マーカーについて平均蛍光を測定し、強く標識された細胞を映し出すためにゲートを設定した。対照は未染色の細胞、およびストレプトアビジン-FITCにのみ暴露された細胞を含んだ。2つの実験を実施した。第一はscpA49挿入変異体M16をそれのSCP親培養物であるCS101株と比較した。第二はscpA49欠失変異体MJ315を、それの親であるCS101Sm株と比較した表2。両実験とも、SCP連鎖球菌を接種したマウスからホモジナイズした気嚢は、野性型連鎖球菌を接種した気嚢よりも、4時間後の連鎖球菌の数が少なかった。第一の実験は2分の1への減少を示し、第二の実験は4分の1への減少を示した。その差は、不対Unpairedt検定を使った場合にそれぞれP<005およびP<0001で統計的に有意であった。野性型SCP連鎖球菌が8匹のマウスのうちの7匹および8匹のマウスのうちの6匹からの脾臓ホモジネートにおいて検出され;一方、SCP変異体は脾臓中にまれにしか検出されなかった。リンパ節ホモジネートの場合は全く逆であった。SCP連鎖球菌を接種した16匹のマウスのうち10匹からのリンパ節が生存可能な連鎖球菌を有していたのに対し、野性型連鎖球菌を感染させた16匹のマウスのうちのわずか4匹のリンパ節が生存可能菌を含んでいた。この差はフィッシャーの精密検定を使ってP<005において統計的に有意であると決定された。気嚢からの連鎖球菌のより迅速なクリアランスはPMNの強力な漸増に起因していた。気嚢中の全細胞集団数、Mac1陽性顆粒球の比率SpringerG他、Mac1macrophagedifferentiationantigenidentifiedbymonoclonalantibodyEurJImmunol9301306、およびGr1陽性PMNの比率BrummerE他、ImmunologicalactivationofpolymorphonuclearneutrophilsforfungalkillingstudieswithmurinecellsandblastomycesdermatitidisinvirtoJLeukoBio36505520を、単色FACS分析により比較した。ClarkJMAnewmethodforquantitationofcellmediatedimmunityinthemouseJReticuloendothelSoc25255267。簡単に言えば、FACS分析において、懸濁液中の個々の細胞を特異的な蛍光単一抗体で標識する。標識された細胞のアリコートをFACScan流動細胞計測器または蛍光標示式細胞分取器に注入し、それらの特有の蛍光に基づいて細胞数を計測する。SCP欠失変異体を感染させた気嚢は、SCP連鎖球菌を接種したものの2倍の数の炎症細胞を含んでいた図4。接種サイズを100倍にしてもこの差に変化はなかった。1×106個のSCP細胞MJ315株を感染させた気嚢は、SCP培養株を接種したものの3倍の数のGr1陽性細胞を含んでいた。SCP連鎖球菌を接種した気嚢では、細胞の約6がPMNであり21が別の種のMac1顆粒球PMNを含むであった。対比して、SCP連鎖球菌を接種した気嚢は卓越的にPMNを含んでいた。Gr1陽性細胞はMac1陽性細胞の数に等しいかまたはそれより多数であった。流動細胞計測器のゲートを高染色性顆粒球のみを測定するように設定した。いずれの抗体でも染色されなかった残りの70~80の細胞は多分、低染色性顆粒球、赤血球またはリンパ球のいずれかであるだろう。ライト染料で染色した気嚢調製物中に多数のリンパ球が顕微鏡下で観察された。脾臓ホモジネートから出現した連鎖球菌のSCPコロニーは、多くが莢膜に包まれており、水滴に似ていた。対照的に、リンパ節から生じた少数のSCPコロニーは、より接種材料に似ていた。それらは非粘液性コロニーと中程度に粘液性のコロニーの混合物であった。これらのデータは、MSCP莢膜封入連鎖球菌が感染後4時間以内に適応し、増殖しそして血流中に侵入することを示唆する。変異型連鎖球菌と野性型連鎖球菌の差別的往来traffickingの基本は、SCP菌に反応した食細胞の激しい流入のためであるかもしれない。マクロファージおよび/または皮膚樹状細胞がSCP連鎖球菌をより迅速に吸い込み、そしてそれらをリンパ節に運ぶのかもしれない。野性型に比較した変異型連鎖球菌の減少は意外な発見である。何故なら、SCP連鎖球菌はMであり、試験管内のヒト好中球による貧食に耐性であるからである。実施例3SCPはマウス鼻咽頭への定着に必要である野性型SCPおよびSCP連鎖球菌が鼻咽頭に定着する相対能力を評価するためにマウスの鼻腹腔内に接種した。ストレプトマイシン耐性M49株CS101および欠失変異体MJ315をこの実験に使用した。独特にマウス毒性であるが、動物体内での存続がもはやMタンパク質および/またはSCPに依らないかもしれない変異体の選択を避けるために、培養物をマウスに継代しなかった。20正常ウサギ血清を含むトッド-ヒューイットブロス中で増殖させ次いで10μlのPBS中に再懸濁したチャレンジ連鎖球菌株1×108~9×108CFUの16時間培養物を、25gの雌CD1CharlesRiverBreedingLaboratoriesIncWilmingtonMAまたはBALBcマウスSascoOmahaNEに鼻腔内投与した。培養物の希釈液を血液寒天平板上で平板培養することにより、生存菌数を計数した。接種後6~10日間に渡り、麻酔ウマウスから咽喉スワブを採取し、200μgmlのストレプトマイシンを含有する血液寒天平板上に画線した。37°Cで一晩インキュベートした後、平板上のβ溶血コロニーの数を計数した。全チャレンジ株は、正常細菌叢中で存続できるβ溶血菌と区別するためにストレプトマイシン耐性によりマーキングした。咽喉スワブをストレプトマイシン含有血液寒天上で培養した。1つのβ溶血コロニーの存在を陽性培養とみなした。非近交系マウスに2×108CFUの定常期連鎖球菌を鼻腔内に接種した。麻酔したマウスの鼻咽頭から8~10日間毎日スワブ標本をとり、スレプトマイシンを含む血液寒天上に画線した。SCPとSCPの差は第1日目までに明らかであったが、しかし統計的に有意な差は第3日および第4日目までは観察されなかった図5。第4日目までに、MSCP連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中9匹が陽性の咽喉培養物を生じたのに対して、MSCP連鎖球菌を感染させたマウスの18匹中2匹しか咽喉中に連鎖球菌を保持していなかった。18匹中4匹のマウスがSCP連鎖球菌感染後に死亡した。SCP連鎖球菌感染後には1匹も感染により死ななかった。血液寒天平板上のコロニーの数もSCP連鎖球菌の一層迅速なクリアランスと一致していた。例えば、第3日目に、7匹のマウスからの培養物が>100SCPCFUを含んだのに対し、SCP連鎖球菌を接種したマウスでは1匹だけが>100CFUを含んでいた。M49連鎖球菌は皮膚感染に頻繁に関連づけられるので、上記実験をM6株、すなわち咽喉感染と頻繁に関連づけられる血清型、を使って上記実験を繰り返した。M6株UAB200と実施例1に上述した方法を使って、挿入変異体AK14株を作製した。AK14株もまた、野性型M6培養物よりも迅速に鼻咽頭から浄化された図6。上記実験は、マウス鼻咽頭中でのA群連鎖球菌の存続がSCPに依存するということを確証する。上記実験に使用した全てのSCP変異体がMであり、すなわち新鮮なヒト血液による食作用に耐性であった。それでもなお、それらは鼻咽頭から浄化された。実施例4精製組換えSCPA49によるマウスの鼻腔内免疫処置は鼻腔内チャレンジ後の定着を防止するaThr63からHis1031までをコードする組換えワクチンΔSCPA49の作製図2および図7scpA49遺伝子の先端欠失形に相当するPCR断片を、CS101M49型A群連鎖球菌ΔSCPA49からクローニングした。この断片を、ヌクレオチド1033で始まる正プライマーとヌクレオチド3941で始まる逆プライマーを使ってPCRにより増幅させた番号付け法はChenCClearyPCompletenucleotidesequenceofthestreptococcalC5apeptidasegeneofStreptococcuspyogenesJBiolChem26531613167の方法に従った。該PCR断片をPharmaciaIncからのpGEX4T1高発現ベクター上のグルタチオントランスフェラーゼ遺伝子のトロンビン結合部位に連結せしめた。scpA断片を含むpJC6と命名したプラスミドをブダペスト条約の規定に基づいてATCCアメリカンタイプカルチャーコレクションRockvilleMDに寄託し、ATCC受託番号98225が付与された。scpA49の2908bp断片であるΔSCPA49を、BamHI認識配列を含むscpA49正プライマー5CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC3配列番号8とscpA逆プライマー5GAGTGGCCCTCCAATAGC3配列番号9を使ったPCRにより増幅せしめた。得られたPCR生成物から、SCPAタンパク質のシグナルペプチドと膜固定領域をコードする配列を削除した。PCR生成物をBamHIで消化し、そしてPharmaciaIncからのΔSCPA49融合タンパク質を、グルタチオン-セファロース4Bカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。1つのE.コリクローンからトランスフェラーゼ-SCP融合タンパク質を発現させ、グルタチオン-セファロース4bカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全ての方法が製造業者により記載されている。ハイブリッドタンパク質からトロンビン消化によりΔSCPA49を開裂せしめた。ベンズアミジン-セファロース6Bカラム上でのクロマトグラフィーにより溶出したSCPからトロンビンを除去した。トロンビンでの消化後、ベンズアミジン-セファロース6Bカラム上でのクロマトグラフィーによりトロンビンを除去した。発現方法と精製方法は製造業者により記載されている。アフィニティー精製されたタンパク質はSDSPAGEとウエスタンブロットにより純粋なΔSCPA49であることが確認された。このアフィニティー精製済みの先端欠失ΔSCPA49タンパク質は、PMN付着アッセイにより試験するとペプチダーゼ活性を欠いていた上記実施例1に記載。ウサギを使って精製ΔSCPA49に対して向けられた高度免疫抗血清を調製した。b免疫およびチャレンジプロトコル。10μlのPBS中20μgのアフィニティー精製済ΔSCPA49タンパク質を各外鼻孔に投与することにより、4週齢の非近交CD1雌マウスを免疫した。一日おきに3回マウスを免疫し、3回目の免疫の3週間後に再び追加免疫した。2週間の休止後、マウスを再び追加免疫した。DBessen他、InfluenceofIntranasalImmunizationwithSyntheticPeptidesCorrespondingtoConservedEpitopeofMProteinonMucosalColonizationbyGroupAStreptococciInfectImmun56pp26662672。対照マウスにはPBSのみを投与した。感染前に、ΔSCPA49タンパク質で免疫した全てのマウスがそれらの血清および唾液中に高力価のΔSCPA49抗原に対する抗体を有することがELISAにより測定された。A群連鎖球菌のCS101株20×108CFU、CS210株36×108CFU、CS463株78×108CFU、90131株34×108CFUおよびUAB200株96×108CFUを使って、最後のワクチン注射後7日目にマウスを鼻腔内的にチャレンジした。動物実験はNationalInstituteofHealthガイドラインに沿って実施した。c試料収集とELISA。免疫処置後に麻酔したマウスから血液試料と唾液試料を採取した。全ての血清を上述した通りにELISAによってSCPA49抗体の存在について試験した。SPOConnor他、TheHumanAntibodyResponsetoStreptococcalC5aPeptidesJInfectDis163109116頁1990。005M炭酸水素塩緩衝液pH96中500ngの精製タンパク質を添加することにより、精製済SCPA49タンパク質をマイクロタイターウエルに結合させた。4°Cで一晩インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、PBS中05BSAを使って1時間ブロックした。100μlの01ピロカルピン溶液の皮下注射によりマウスにおいて唾液分泌を刺激した。唾液試料を採取し、エッペンドルフ超遠心管中で14000rpmにて5分間回転させた。その上清をΔSCPA49タンパク質に対する分泌型IgAの存在についてELISAにより試験した。ELISA力価は、OD405≧01を有した各血清および唾液の最大希釈度を表す。dΔSCPA49に対する抗体応答の評価サブユニットΔSCPA49ワクチンの免疫原性を評価した。ウサギを精製ΔSCPA49により免疫した。ELISAにより測定するとそのウサギはΔSCPA49タンパク質に対する高レベルの抗体を産生した。精製ΔSCPA49免疫原は機能的活性を欠いているにもかかわらず、高度免疫ウサギ抗血清は試験管内で精製済の野性型SCPA49酵素のペプチダーゼ活性を中和することができた。更に、ΔSCPA49タンパク質に対する未希釈のウサギ抗血清は非相同の血清型に関連するC5aペプチダーゼ活性を中和することができた。無傷のM1,M6およびM12連鎖球菌に関連するC5aペプチダーゼ活性がこの抗血清によって阻害されたことは、ΔSCPA49タンパク質に対する抗体が血清型特異性を欠いているということの確証である。また、10匹の免疫処置マウスと10匹の対照マウスから血清試料と唾液試料を採取し、アジュバント無しで鼻腔内ルートによって投与した時のΔSCPA49タンパク質の免疫原性を評価した。精製ΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスは、PBSを投与した対照マウスに比べて高力価のΔSCPA49特異的IgGを血清中に産生した図9。ΔSCPA49に対して向けられた血清IgGの力価は、1:10240~1:20480であった。対比して、対照マウスのΔSCPA49特異的IgG力価は血清中に検出できなかった。精製ΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスは、対照マウスに比較してΔSCPA49特異的唾液sIgAの有意な増加も示した。免疫処置マウスの唾液中の特異的sIgA力価は1:16よりも大きかった。対比して、対照マウスの唾液中のΔSCPA49特異的sIgAは検出できなかった。それぞれ12560希釈した血清中および12希釈した唾液中のIgGおよびsIgAの相対濃度を図9に示す。これらの結果は、精製ΔSCPA49タンパク質が、鼻腔内投与するとマウスに特異的な全身性抗体応答および分泌型抗体応答を誘導する有効な免疫原であることを証明する。e感染マウスからの連鎖球菌の浄化に対するワクチンΔSCPA49の効果C5aペプチダーゼでの免疫処置が鼻咽頭からの連鎖球菌の浄化クリアランスを増強するかどうかを調べるために実験を行った。高レベルの抗SCPA抗体を含む高度免疫ウサギ血清およびヒト血清の両方が試験管内でSCPA活性を中和することができる。SPOConnor他、TheHumanAntibodyResponsetoStreptococcalC5aPeptidaseJInfectDis163109116。SCPAが口腔粘膜への定着を有意に促進するという事実は、精製ΔSCPA49によるマウスの免疫処置が連鎖球菌の鼻咽頭定着能力を低下できたことを示唆する。この可能性を調査するために、アフィニティー精製した遺伝子不活性化SCPAによりマウスを鼻腔内免疫処置した。先端切除タンパク質ΔSCPA49をアジュバントも担体も使わずに鼻腔内に投与した。野性型MSCPA連鎖球菌によるワクチン接種マウスの咽頭定着は、精製ΔSCPA49タンパク質の2種類の別製剤を使ってワクチン接種したマウスを使う3つの独立した実験において、PBSを投与したマウスとは有意に異なっていた表3と表4;図10。ΔSCPA49タンパク質で免疫処置した13匹のマウスのうちの1匹だけが、接種後10日目に連鎖球菌について培養陽性であった表4;図10。対比して、ワクチン接種しない対照マウスの30~58が6日間の間培養陽性のままであり、何匹かは感染後10日目にまだ陽性であった。血液寒天平板上のβ溶血性でストレプトマイシン耐性のコロニーの数も、ΔSCPA49ワクチン接種マウスと対照マウスとの間に有意差を示した。別の免疫処置マウスのグループは、非免疫処置対照よりも鼻咽頭から有意に迅速に血清型M49連鎖球菌を浄化した。最後に、ある血清型のSCPが別の血清型からの感染に対して動物を予防するかどうかを調べた。A群連鎖球菌の血清型は80種類以上存在する。有効なワクチンは複数の連鎖球菌血清型による感染を予防すべきである。OF血清型M2およびM11並びにOF血清型M1およびM6の連鎖球菌による定着コロニー形成に対する交差感染防御が観察された。血清型M49連鎖球菌からのΔSCPA49タンパク質に対して向けられたウサギ血清が数種類の異なる血清型に関連したペプチダーゼ活性を中和したという事実は、単一のサブユニットワクチンによる鼻腔内免疫処置がそれらの血清型による咽頭定着を低減または排除するかもしれないということを示唆した。この可能性を調査するために、上述のアフィニティー精製したΔSCPA49タンパク質の鼻腔内接種により20匹のマウスから成る4グループを免疫処置した。対照マウスにはPBSを投与した。連鎖球菌でチャレンジする前に、無作為に選んだ免疫処置マウスと対照マウスからの血清試料と唾液試料を抗SCPA抗体についてアッセイした。試験した全ての免疫処置マウスが強力な血清抗体応答と測定可能な唾液抗体応答を発生していた。4種の血清型の菌株によるΔSCPA49タンパク質で免疫処置したマウスの咽頭定着が全て、非免疫処置対照に比較して減少した。その差は接種後3日目および5日目に有意であった表5。血清型M2,M11およびM1株を接種した免疫処置マウスと対照マウスとの間に統計的に有意な差が観察された。しかしながら、OF血清型M2とM11はOF株のM1とM6よりも一層効率的に除去された。免疫処置マウスのM1連鎖球菌定着は、対照マウスに比較してかなり減少した。免疫処置マウスのわずか105が感染後5日目に培養陽性であった。対比して、対照マウスの37がこの株に関して培養陽性であった。免疫処置マウスはM6連鎖球菌をより迅速に除去したように見えるけれども、その差は統計的に有意でなかった。予備実験と同様に、血液寒天平板上のβ溶血連鎖球菌コロニーの数は対照動物から採取した試料よりもワクチン接種したマウスから採取した試料のほうが有意に少なかった。よって、ΔSCPA49タンパク質は別の連鎖球菌血清型に対して交差防御免疫を提供する有効なワクチンであった。実施例5SCPA49の部位特異的変異誘発A群連鎖球菌血清型は2つの主なグループOF株とOF株に分けることができる。後者がリウマチ熱や中毒性ショックに関係があり、一方でOF株は膿痂疹や急性糸球体腎炎の共通原因である。それらのグループのSCPAタンパク質は95~98同一であるが、それらに対する免疫応答は幾分異なる可能性がある。この考えは、M1OF株からとM49OF株から並行して特定の変異体SCPを作製する努力を促した。触媒活性に必要であるアミノ酸を、酵素を不活性化すると予想されるアミノ酸により置換した図1。pGEX4T1サブクローンから発現させたSCPA49のN末端およびC末端境界アミノ酸はそれぞれAsn32とHis1139であった図1と図8。SCPA49タンパク質のSer512SCPA49S512A、Asn295SCPA49N295AおよびAsp130SCPA49D130AをAlaにより置換し、そしてAsn295SCPA49N295RをArgにより置換したDeborahStafslienMSThesisUniversityofMinnesota。連鎖球菌CS101株からのscpA49遺伝子中に突然変異を導入するのに用いた方法は、部位特異的変異誘発のメガプライマー法であった。BarikSSitedirectedmutagenesisinvitromegaprimerPCRMethodsinMolecularBiology第57巻InVitroMutagenesisProtocolsHumanaPressIncTotowaNJ。プライマーscpFor9405CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC3配列番号10とscpmutrev18835TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC3配列番号11を使ってセリン変異を導入し、1450bp二本鎖PCR生成物を増幅せしめた。メガプライマーと呼ばれるこの第一PCR生成物を、QiagenQiaquickGelExtractionKitを使って精製し、次いで所望の変異を含む33kbscpA49遺伝子を増幅させる第二の非対称PCR反応に使用した。変性93°C、1分と伸長72°C、5分の5回目のサイクルを行った後、逆プライマーscpRev42635CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG3配列番号12を添加した。72°Cでの5サイクルの間に、逆プライマーを1mM濃度で添加した。94°Cで1分、58°Cで2分および72°Cで2~35分の25サイクルを使って増幅を完了させた。正プライマーを加えなかったこととメガプライマーを反応液100μlあたり4~6μgの濃度で添加したことを除き、反応体濃度は前の項目に記載したのと同じであった。この操作は変異体タンパク質SCPA49S512Aを提供した下記の表6参照。大部分同じやり方で、逆プライマーscpmutrev7175CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA3配列番号13とscpmutrev12145AGCTACTATCAGCACCAG3配列番号14を使ってアスパラギン酸およびアスパラギン変異体を作製し、それぞれ311bpおよび805bpメガプライマーを調製した。変異体タンパク質SCPA49D130Aを作製するにはプライマーscpmutrev717を使用し、そして変異体タンパク質SCPA49N295Aを作製するにはプライマーscpmutrev1214を使用した下記の表6参照。しかしながら、Qiaquick精製後、メガプライマーを01Uのマングビーンヌクレアーゼ4μgDNAあたりで処理し、30°Cで10分間インキュベートした。フェノール/クロロホルム抽出によりヌクレアーゼを除去し、エタノール沈澱により水性相中にメガプライマーを回収した。ペレットを80μlの無菌再蒸留水に再懸濁し、それの37μlを各100μl非対称PCR反応に使用した。次いで上述した通り、変異遺伝子をpGEX4T1中にクローニングした。S35標識dATPとSequenaseキットStratageneを使用するか、またはUniversityofMinnesotaMicrochemicalFacilityでの自動蛍光配列分析を使って、変異体を配列決定した。Eコリ発現ベクターpGEX4T1を使って変異体SCPAをGST融合タンパク質として過剰発現させた。この作業の前にGSTGeneFusionSystemHandbook中に与えられたプロトコルに従って組換えSCPAを精製した。SCPAタンパク質抗原は上述の通りアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。実施例6SCPA1変異体とSCPB変異体の作製次のようにしてS.ピオゲネスのM1血清型90226株から野生型scpA1遺伝子をPCRにより増幅せしめた。まず、完全遺伝子の断片のみが発現されるようにプライマーをデザインした。この断片は成熟タンパク質の出発部分に相当し、残基Asn32からAsp1038までの細胞壁固定ドメインの直前で終わる。正プライマーは、塩基番号940ChenCClearyPCompletenucleotidesequenceofthestreptococcalC5apeptidasegeneofStreptococcuspyogenesJBiolChem26531613167のものに対応する番号付け法のところにアニールする。反対の逆PCRプライマーは、DNA反復領域のすぐ上流の塩基番号3954のところにアニールする。該タンパク質のこの反復領域は、細胞壁を貫通し、次いで細胞壁のペプチドグリカンに結合する部分であると推定される。各プライマーのイタリック体で記載した領域は、クローニング工程を可能にするためにS.ピオゲネス配列に付加された追加配列である。正プライマーの下線領域はEcoRI制限部位を含み、逆プライマーの下線部分はBamHI部位を含む。逆プライマーは該遺伝子の枠内に翻訳を終結する終止コドンTAAも含む。塩基9403954に相当する得られたPCR生成物を、中間ベクターpCR21中にクローニングし、次いでE.コリTop10F細胞中に形質転換せしめた。適当な形質転換体より得られたプラスミドをEcoRIとBamHIで制限した。scpA1の断片を含有する3018塩基断片を標準手順に従ってゲル精製し、次いで同酵素により制限消化した発現ベクターpTrc99a中に連結した。この連結生成物を用いてE.コリDH5α細胞を形質転換し、所望のプラスミド構成物を含有する形質転換体を選択した。得られたプラスミドは、SDShineDalgarno配列とATG開始コドンの後方にscpA1のPCR断片を配置し、該PCR断片をアロラクトース類似体IPTGにより誘導可能であるtrcプロモーターの転写調節下に置く。野生型scpA1の部位特異的遺伝子変異体は、CLFisherGKPeiModificationofaPCRbasedsitedirectedmutagenesismethodBioTechniques23570574により記載された方法に従って作製した。プロテアーゼ活性に重要であるSCPA1中の適当なアミノ酸残基を、ズブチリシン様セリンプロテアーゼファミリーとの配列比較により推測した。SiezenRJ他、HomologymodelingandproteinengineeringstrategyofsubtilasesthefamilyofsubtilisinlikeserineproteinasesProteinEngineering4719737ChenCClearyPCompletenucleotidesequenceofthestreptococcalC5apeptidasegeneofStreptococcuspyogenesJBiolChem26531613167。このファミリー内で保存されている3残基は活性部位の形成に関与する。SCPA1では、それらはAsp130His193およびSer512である。それらのアミノ酸残基のうちの各1つを変更するため、PCR用に3セットの非重複オリゴヌクレオチドをデザインした。それらのオリゴヌクレオチドはDNAの向き合った鎖の上で互いから離れる方向に増幅させるようにデザインした。各セットで、一方のプライマーの5′末端が突然変異用に上記アミノ酸の1つをコードするコドンを含み、このコドンがアラニンをコードするように変更される。それらの3セットのプライマーを下記に列挙する。変異コドンがイタリック体で記される。D130A:正プライマー配列番号17GATからGCTへのコドン変化がアスパラギンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。逆プライマー配列番号185CACTGCAACAACAGTCCC3H193A:正プライマー配列番号19CACからGCCへのコドン変化がヒスチジンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。逆プライマー配列番号205TTGATCGACAGCGGTTTTACC3S512A正プライマー配列番号21ACTからGCTへのコドン変化がセリンからアラニンアミノ酸への変化に相当する。逆プライマー配列番号225TCCAGAAAGTTTGGCATACTTGTTGTTAGCC上記PCRプライマーセットを3つの別々の反応に使用した。鋳型DNAは野生型scpA1配列を含有するpLP605であった。次いでPCR生成物を自己連結せしめ、E.コリ株Top10F中に形質転換した。形質転換体を適当なセサイズと制限パターンについてスクリーニングした。S512A変異体の配列変更は、この突然変異を制限分析により直接同定することができるようにユニークSpeI制限部位を破壊する。全ての可能な変異体をDNA配列分析により確かめた。続いて、タンパク質の2領域130位と512位の間にあるユニークPstI部位を利用して、D130A変異をS512A変異と組み合わせて二重変異体を製造した。最終変更は、カナマイシン遺伝子を含有する予め変更されたpTRC99aベクターPharmaciaIncに変異型scpA1遺伝子を移すことにより、抗生物質選択をアンピシリンからカナマイシンへと変更することであった。SCPA1変異体について上述した方法を用いてSCPBタンパク質の変異体を作製した。野生型SCPB遺伝子はB群連鎖球菌78471IIa型からクローニングした。実施例7変異体タンパク質の分析各々の変異体構成物から発現させたタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。該タンパク質の予想サイズは121kDであるが、該酵素のカルボキシ末端に高プロリン細胞壁貫通領域があるために、SDS-PAGEの際に該タンパク質はわずかに遅く泳動される。従って、SDS-PAGEにより測定した時の見かけ分子量は130kDである。活性SCPは宿主に有害であり得るので、変異体タンパク質が酵素活性を欠くことは重要なことであった。変異体タンパク質の2つの性質を評価した。PMN付着アッセイにより測定した時の野生型タンパク質と変異体タンパク質の比活性を表7において比較する。この実験は、置換されたアミノ酸残基が酵素活性を90以上減少させることを示した。野生型酵素に対して向けられた抗体を結合する能力についても、変異体タンパク質を野生型タンパク質と比較した。競合ELISAは、可溶性抗原による固定化抗原への抗体結合の阻害を測定する。一定量の野生型抗原をマイクロタイタープレートのウエルに結合させた。一定量の抗体を可変量の可溶性競合抗原と共に同時に添加する。阻害率対抗原濃度曲線の傾きは、可溶性抗原の抗体への相対結合親和力を概算する。抗血清中の抗SCPAの正確な濃度を知らずに結合定数を算出することはできないが、幾つかのタンパク質の相対結合親和力を比較した図11。阻害率-濃度曲線の傾きが野生型タンパク質と変異体タンパク質とで同じであるので、アミノ酸置換が変異体タンパク質への抗体の結合能力を変更しなかったと結論づけられた。組換えSCPA1、SCPA49およびSCPBタンパク質も、抗SCP抗体に等しく良好に結合すると測定された図12。この実験では、プレート抗原がSCPA49であり、そして抗体がウサギ抗SCPA49であった。曲線の傾きにより表されるそれらの抗原への抗体の相対結合親和力は、非常に類似している。この結果は、M49OFおよびM1OFA群連鎖球菌から並びにB群連鎖球菌からのSCPAタンパク質が、抗体認識に関して等価であり、ワクチン製剤において互いに交換可能に使用できることを証明する。実施例8SCPA抗原の皮下SQ投与はマウスに防御を誘導する全ての予備防御実験は、アジュバントの非存在下でアフィニティー精製SCPAタンパク質を鼻腔内投与することにより実施した。歴史的に抗原の筋肉内またはSQ注射が好ましく、より受け入れられるワクチン投与方法である。従って、MPL/ミョウバン存在下でのSCPAのSQ注射が防御免疫応答を誘導するかどうか、そしてA群連鎖球菌のチャレンジ株がSCPAワクチン源のものと血清型で異なる場合にそのような応答が定着を減少させるかどうかを調べるために実験を行った。咽喉培養と鼻組織切片のサンプリングにより、口腔-鼻咽頭粘膜からの連鎖球菌の浄化能力を評価した。代表的な咽喉培養データを表8に与える。3種類の形態のSCPA抗原の各々のSQ注射により免疫したマウスは中程度の防御を誘導した。ΔSCPA49で免疫したマウスはOFM1株とOFM49株の両方に対して防御した。SCPA49S512AとSCPA1S512Aをその後の研究用に選択した。鼻腔内チャレンジ後の連鎖球菌の存続を更に定量的なアッセイにより評価した。この方法は、感染後の様々な時点でマウスグループを犠牲にし、鼻組織NTを切除し、次いでそれを生存可能連鎖球菌CFUについてアッセイすることを伴った。標準量のNTを緩衝液中でホモジナイズし、生存菌数により、CFU/mg組織の数を求めた。3グループのマウスをSCPA49S512A、SCPA1S512Aまたは破傷風トキソイドでSQ免疫した。全てのワクチンを上記と同様にMPL/ミョウバンと混合した。マウスに5μgタンパク質抗原を4回注射し、次いで最終注射から二週間後にチャレンジした。OFM49株CS101によるチャレンジから16時間後に鼻組織を収得した。CFU/mg組織の幾何平均を表9に示す。予想通り、鼻組織に関連する連鎖球菌の数は時間と共に減少し、その減少はSCPA抗原で免疫したマウスにおいて一層迅速で且つ完全であった。SCPAで免疫した全マウスグループが、対照マウスよりも少数の連鎖球菌を保持していた。この実験では、チャレンジ株CS101がOFM49でありそしてワクチンタンパク質源がOFM1株からのSCPA1S512Aであるので、SCPA1S512Aによる免疫が最も有効であり且つ交差防御応答を誘導した。これらの結果は、単一のSCPA抗原が非相同の血清型に対する防御を誘導できることを確証する。防御は細菌表面上のペプチダーゼ活性を中和する抗体により提供される。これは、連鎖球菌が粘膜組織上に付着した時点から数時間内に食細胞の流入を増加させる。食細胞による連鎖球菌の迅速な浄化は、その後の細菌の繁殖や存続を防止すると推測される。ELISAによりアッセイすると、マウスは一様に1:32000以上の血清IgG力価を有した。このことは、アジュバント存在下でのSCPA抗原のSQ注射が活発な抗体応答を誘導したことを示す。実施例9B群連鎖球菌からのC5aペプチダーゼはM12およびM49A群連鎖球菌からのものと配列がほとんど同じであるB群連鎖球菌C5aペプチダーゼSCPB遺伝子をクローニングし、配列決定し、そしてA群連鎖球菌M12およびM49血清型からのものと比較した。上記に記載の方法を使ってscpA12配列の一部分に相当するプライマーを用いたPCRによりscpB遺伝子全体を増幅させた。SCPB遺伝子は、126237ダルトンのMrを有する1150アミノ酸のタンパク質を特定する3450bpの転写解読枠ORFをコードする。SCPBのアミノ酸配列を図2に示す。M12およびM49A群連鎖球菌からのものに対するscpBヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の比較は、それぞれ98および97という高い類似性を示した。scpBは2つのC末端反復配列と重なった50bpの欠失を含み、scpA遺伝子に対比して幾つかの別のわずかな相違を有した。両配列の整列は、scpA12が実際はscpA49に対してよりもscpBの方に系統発生的に近いことを示した。血清型III,III/R,II,Ia/c,NT/c,NT/c/R1を表す30個の株は1コピーのscpBを担持している。発現ベクタープラスミドpGEX4T1ATCC受託番号98225を使って組換えSCPをE.コリ中で発現させると、親のB群連鎖球菌株78471型IIabから抽出された酵素と同一であることがわかった。ウエスタンブロット分析は、組換えSCPがB群連鎖球菌から以前に精製されたC5ase酵素と同じであることを示唆した。全ての刊行物、特許および特許出願書類は、個別に参考として本明細書中に組み込まれるかのように本明細書中に組み込まれる。本発明を様々な特定且つ好ましい態様および技術に関して記載してきた。しかしながら、本発明の範囲内において多数の変更および改良を行えると理解すべきである。"