"ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群PRRSワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、a配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及びこれらの任意の組合せ;baのホモログ;及びca又はbの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、PRRSワクチン組成物。前記ペプチド抗原が、配列番号9のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原が、配列番号10のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原が、配列番号11のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原が、配列番号12のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原が、1~5個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したTヘルパーエピトープをさらに有する、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記Tヘルパーエピトープが配列番号35である、請求項7に記載のPRRSワクチン。前記Tヘルパーエピトープが、ε-リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、請求項7に記載のPRRSワクチン。前記スペーサーが配列番号36である、請求項9に記載のPRRSワクチン。前記抗原ペプチドに結合されていないTヘルパーエピトープをさらに有し、該Tヘルパーエピトープが配列番号47~90からなる群から選択される、請求項1に記載のPRRSワクチン。前記ペプチド抗原の総量が約10μg~約1mgである、請求項1のいずれかに記載のPRRSワクチン。前記送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニドMontanideISA50V、ポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエート、及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1に記載のPRRSワクチン。請求項1に記載のワクチンを投与する工程を有する、PRRS感染に対して子ブタを防御する方法。aペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号31、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc配列番号80~90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSVThペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。aペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b配列番号42、配列番号44、配列番号45、配列番号46、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc配列番号80~90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSVThペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。a配列番号1及び配列番号2の混合物を固体支持体に付着させる工程、b前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、PRRS感染を診断する方法。抗PRRSV抗体の存在をテストするためのELISAイムノアッセイであって、a配列番号7及び配列番号8の混合物を固体支持体に付着させる工程、b前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、前記抗体を有するブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程を有する、上記ELISAイムノアッセイ。改変生ワクチンMLV及び不活化PRRSVウイルス溶解物ワクチンが市販されているにもかかわらず、PRRSV関連疾患の制御は、依然として問題をはらんでいる。1つの主要な問題は、PRRSVワクチンが、同種の攻撃に対しては有効であるが、異種の攻撃に対しては有効でないという点についての有効性である。また、MLVについての安全性の問題が本分野で報告されている。改変生ワクチンは、妊娠成熟雌ブタ、若雌ブタにおける使用に適さず、及びワクチン接種により精液中にワクチンウイルスの排出を引き起こす場合があるので雄ブタにおける使用に適さない。改変生ウイルスワクチンは、ワクチン接種動物中で存続できる。ワクチン未接種動物への感染、及びその後のワクチン-ウイルス誘導疾患が報告されている。なお、感染ブタとワクチン接種ブタとを識別でき、それによりPRRSV感染の追跡管理及び制御が容易になる、マーカーワクチンの開発が緊急に必要とされている。要約すると、防御抗体及び細胞性免疫反応を誘導可能な、異なる機能性B細胞エピトープ及びT細胞エピトープを有する免疫原性PRRSVペプチドを設計すること、ならびにブタにおけるPRRSV株の交差防御を可能にするこれらのデザイナーペプチドを有するワクチン製剤を設計することが、依然として緊急に必要とされている。これらの合理的に設計され且つ分子的に特徴付けられた免疫原性ペプチドの利用可能性と共に、感染ブタ由来の抗体によって認識され得る抗原性ペプチドを同定する必要性もあり、且つこれらのデザイナーペプチドを用いて、感染動物とワクチン接種動物とを血清学的に識別するための一組の診断テストしたがって、診断システムを開発し、PRRSV感染の有効な制御を可能にする必要性もある。最終的に、このようなペプチドベースのマーカーワクチンの低価格製造及び品質管理のための手段、ならびにPRRS疾患を効果的にモニタリング及び制御するための広い用途の診断システムを開発することが必要である。参考文献1GorbalenyaAetal2006NidoviralesevolvingthelargestRNAvirusgenomeVirusRes11717372LopezOJetal2007ProtectionagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectionthroughpassivetransferofPRRSVneutralizingantibodiesisdosedependentClinVaccineImmunol14269753LopezOJandOsorioFA2004RoleofneutralizingantibodiesinPRRSVprotectiveimmunityVetImmunolImmunopathol102155634MateuEDiazI2008ThechallengeofPRRSimmunologyVetJ1773453515BassaganyaRieraJetal2004ImpactofimmunizationswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusonlymphoproliferativerecallresponsesofCD8TcellsViralImmunol1725376BautistaEMandMolitorTW1997CellmediatedimmunitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinswineViralImmunol1083947LopezFuertesLetal1999AnalysisofcellularimmuneresponseinpigsrecoveredfromporcinerespiratoryandreproductivesyndromeinfectionVirusRes6433428VanheeMetal2011CharacterizationofantigenicregionsintheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbytheuseofpeptidespecificserumantibodiesVaccine29479448049WangYXetal2011IdentificationofimmunodominantTcellepitopesinmembraneproteinofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusVirusResearchdoi10101610DiazIetal2009InsilicopredictionandexvivoevaluationofpotentialTcellepitopesinglycoproteins4and5andnucleocapsidproteinofgenotypeIofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusVaccine275603561111WangCYArtificialThelpercellepitopesasimmunestimulatorsforsyntheticpeptideimmunogensincludingimmunogenicLHRHpeptidesUS602546812WangCYArtificialThelpercellepitopesasimmunestimulatorsforsyntheticpeptideimmunogensUS671330113WangCYFinstadConnieLWalfieldAlanMSiaCharlesSokollKennethKetalSiteSpecificUBIThAmyloidβVaccineforImmunotherapyofAlzheimersDiseaseVaccine2007253041305214WangCYWalfieldAlanMSitespecificpeptidevaccinesforimmunotherapyandimmunizationagainstchronicdiseasescancerinfectiousdiseasesandforveterinaryapplicationsVaccine2005232049205615HseuhPRKaoCLLeeCNChenLKHoMSSiaCFangXDLynnSetalandWangCYHighlySpecificSARSAntibodyTestforSerosurveillanceEmergInfectDiseases2004101558156216FinstadCLWangCYetalSyntheticluteinizinghormonereleasinghormonevaccineforeffectiveandrogendeprivationanditsapplicationtoprostatecancerimmunotherayVaccine2004221300131317WangCYetalSyntheticIgEpeptidevaccineforimmunotherapyforallergyVaccine2003211580159018WangCYetalSyntheticAIDSvaccinebytargetingHIVreceptorVaccine200221899719WangCYetalEffectiveSyntheticpeptidevaccineforfootandmouthdiseaseinswineVaccine2002202603261020WangCYetalSyntheticPeptidebasedVaccineandDiagnosticSystemforEffectiveControlofFMDBiologicals20012922122821FuerstTRNilesEGStudierFWandMossBEukaryotictransientexpressionsystembasedonrecombinantvacciniavirusthatsynthesizesbacteriophageT7RNApolymeraseProcNatlAcadSciUSA1986838122812622ChenCMLiuHTTuCFEffectsofPCV2infectioninatransgenicSPFpigfarminTaiwan13thAAAPAnimSciCongrSeptember22262008HanoiVietnamProceedingsp42023DasPBetalTheMinorEnvelopeGlycoproteinsGP2aandGP4ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusInteractwiththeReceptorCD1632010JVirol841731174024HarlowEandLaneDAntibodiesALaboratoryManualChapter14Immunoassayspp555612ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY1988発明の簡単な説明本開示は、ブタ生殖器呼吸器症候群PRRSに対するペプチドベースのマーカーワクチンならびにブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスPRRSVの予防、モニタリング及び制御のための一組の免疫診断テストに関する。構造的PRRSVプロテオーム全体にわたる抗原性領域に関する科学的情報を利用できるにもかかわらず、研究団体が数十年も努力しても、感染性因子に対する成功したペプチドベースのワクチンを全く開発できないために、大部分の病原体について合成ペプチドワクチンはこの先生産されそうもないという意見がある。本発明者は、第一世代の生物学的ワクチンから多くを学び、ここでは選択的なPRRSVのB細胞エピトープ及びT細胞エピトープを含む合理的設計アプローチにより、所望のウイルス株に対する合成ペプチドベースのPRRSVワクチンならびに疾患のモニタリング及び制御のためのコンパニオン診断テストの検証及び開発が可能なはずである。B細胞中和エピトープはほとんどが立体構造であり、それらのB細胞エピトープ関連ペプチド免疫原を設計する場合にはそれを考慮しなければならないと認識することが重要である。関連するB抗原性エピトープの同定及び設計には、標的分子の構造とその機能との間の関係を理解することが必要になる。免疫原設計に供する標的分子の構造及び機能の理解におけるこのような学問分野を、本発明者は機能的抗原学functionalantigenicと呼ぶ。また、免疫反応は複雑かつ多面的である。疑似種集団として存在する、急速に進化するRNAウイルスに対するワクチンは、宿主免疫系を回避するウイルス変異体が出現するリスクを最小限にするために、できる限り多くの異なる防御免疫メカニズムを刺激することを常に目標とすべきである。成功した合成ペプチドベースのワクチンは、適応免疫及び先天免疫を含む免疫系の適切な要素を刺激する成分を有するであろう。エピトープベースのペプチドワクチンの開発における別の主要な障害は、一部に、これらのエピトープを提示する短鎖ペプチドが非免疫原性であるという性質に起因している。また、病原体の遺伝的変異及び宿主の遺伝的変異性から生じる広範な交差防御のためのワクチンの普遍性が可能になるように、幅広いレパートリーのBエピトープ及びTエピトープを含むことが必要である。さまざまな疾患に対する合成ペプチドベースのワクチン及び診断テストの膨大な努力及び実験検証により、本発明者は、所望の免疫原性の増強に適したT細胞エピトープを補充した、インビボ及びインビトロの血清学的及び機能的研究のための抗体を誘発する天然標的分子上の抗原部位に擬態したペプチド免疫原の合理的な設計に重点を置いている。これにより、臨床的及び商業的応用のためのそれぞれの標的疾患における最適化抗原、免疫原、及びワクチン製剤につながっている11~20。本発明の種々の態様によるワクチン製剤は、PRRSVGP2、GP3、GP4、又はGP5タンパク質に由来するペプチドの混合物を含み;それぞれのペプチドは個々にB細胞PRRSV中和/レセプター結合エピトープを有し、該エピトープは個々に、各ペプチドの免疫原性を増強するために、人工Tヘルパーエピトープに結合し;ペプチドの混合物にPRRSVGP4、GP5、M及びヌクレオカプシドタンパク質に由来するTヘルパーエピトープを提示するペプチドの混合物を補充して、細胞性免疫を付与することができる。このようなウイルスペプチド組成物は、ワクチン製剤として許容可能な送達系に調製され、PRRSV負荷時にPRRSV抗体を持たないブタに感染からの交差防御を与えることができる。本発明の種々の態様による診断システムは一組の診断テストを含み、あるテストは、PRRSV感染動物から最適抗体認識のために、PRRSVORF7をコードする2つの重複する抗原ペプチドをELISAイムノアッセイ形式で提供し、且つその他のテストは、PRRSVペプチドワクチン免疫化動物から最適抗体認識のために、GP2、GP3、GP4及びGP5由来ワクチン標的ペプチドを、ELISAイムノアッセイ形式で提供する。これらの診断テストを組合せて、感染動物とワクチン接種動物との識別DIVA、ひいては疾患の効果的なモニタリング及び制御のための診断システムを構成する。PRRSV感染からブタを防御するこのようなワクチンの製造方法、及びDIVAのための一組の免疫診断テストの製造方法、ひいては疾患の効果的な制御を可能にする方法にも関する。本発明のペプチド又はペプチド組成物は、天然のウイルスとの交差反応性により、PRRSV負荷時に感染からPRRSV抗体を持たない子ブタを交差防御するためのマーカーワクチンの開発、及び感染動物とワクチン接種動物とを識別するための一組のペプチドベースのELISAの開発のために、標的種における膨大な血清学的検証のプロセスによって設計され、かつ最適化される。本開示はPRRSVワクチンに関し、詳細には、PRRSVGP2、GP3、GP4又はGP5タンパク質のBエピトープに由来するペプチド及びペプチド組成物を有するPRRSVワクチンに関し、各ペプチドは任意にTヘルパーエピトープと結合してもよく、PRRSVとの交差反応性を有する高力価の抗体を含めた液性免疫を免疫化宿主に誘導するように、ペプチドの免疫原性を増強してもよい。本ペプチド又はペプチド組成物は、細胞性免疫反応を開始するために、ワクチン製剤中にPRRSVGP4、GP5、M及びヌクレオカプシドタンパク質のT細胞エピトープを提示する追加のペプチドをさらに補充される。本発明の種々の態様が提供される。ある一組の態様として、感染動物由来のヌクレオカプシドNCタンパク質に対する抗体の検出用抗原として有効なペプチド及びペプチド組成物に関する。第2の一組の態様として、ワクチン接種動物由来のGP2、GP3、GP4及びGP5エピトープを標的とするマーカーワクチンに対する抗体の検出用に有効なペプチド及びペプチド組成物に関する。これらの診断テストはDIVAの診断システムを構成し、ひいては疾患の効果的な制御を構成する。PRRSVタンパク質のB細胞エピトープ及びT細胞エピトープの両方に由来する、ペプチド類、そのホモログ及びアナログに関する、他の一組の態様がある。このようなPRRSVペプチドは、優先的にではあるが任意に、それらの個々の免疫原性を増強するために人工コンビナトリアルTヘルパーエピトープに結合してもよい。また、他の一組の態様において、PRRSV感染に対してブタを防御するために、天然のPRRSVタンパク質抗原と交差反応性を示す抗体反応及び細胞性免疫反応の両方を一緒に誘発するように、PRRSVB細胞エピトープ及びT細胞エピトープ由来のペプチド免疫原に由来するペプチド及びペプチド組成物を有する、ワクチン製剤に関する。このような設計されたペプチドの各々は、産業上の利用のためにミリグラムからキログラムのスケールで化学合成することができ、かつ品質管理することができる。ワクチン製剤に通常含まれる送達ビヒクル及び他の成分もまた、本発明の種々の態様によって提供される。発明の詳細な説明ペプチド抗原は、免疫反応を検出することができ、あるペプチド抗原は、免疫反応を刺激することもできる。多くのペプチド抗原は、免疫反応の高感度かつ特異的な検出に用いられ得るが、ほとんどの場合、それら自体では免疫原として作用しない。ペプチド免疫原は、免疫反応の刺激及びそれらの検出に用いることができる、特殊な分類のペプチド抗原である。本発明のある態様によれば、PRRSVワクチン中のペプチド抗原は、防御免疫反応の発生を刺激するように共に作用するB細胞Bエピトープ及びTヘルパー細胞Thエピトープの両方を有するペプチド免疫原であり、PRRSV感染に対する免疫反応を検出することができる別の一組のペプチド抗原も存在する。B細胞エピトープの同定のある方法は、多様な長さ、典型的には、20~60残基又はこれ以上の長さ、のネステッドペプチドnestedpeptideであり且つ重複するペプチドの一組を利用する。これらのより長いペプチドは、面倒な一連の独立した固相ペプチド合成によって合成される。その後、得られたネステッドペプチドでありかつ重複するペプチドの一組を、抗体結合研究に用いることにより、非連続の立体構造B細胞エピトープを含む免疫優性決定基を最もうまく提示するペプチドを同定することができる。本発明の1つの態様は、2つの重複するPRRSVORF7がコードするヌクレオカプシドペプチドを提供し、その1方は70アミノ酸配列配列番号1、図2Aにも示すを有し、他方は73アミノ酸配列配列番号2、図2Bにも示すを有し、かつ各々が独自に、最適な抗体認識のためのB細胞エピトープのクラスターを有している。これらの抗原ペプチドは、経験的に同定され、PRRSV感染子ブタ由来の血清サンプル及びELISAイムノアッセイ形式を用いて最適化された。ペプチド抗原を含む抗体捕捉相に適合できる任意のイムノアッセイ形式例えば、ELISAを用いることにより、PRRSV感染ブタ由来の血液、血清、又は血漿サンプル中のPRRSVヌクレオカプシドタンパク質の特定のフラグメントに結合する抗体を検出し、かつ定量することができる。ある特定の態様において、完全長PRRSVヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸残基2~71に対応する、約70アミノ酸の最適化PRRSV抗原ペプチド配列番号1、及び完全長PRRSVヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸残基51~123に対応する、約73アミノ酸の別の最適化PRRSV抗原ペプチド配列番号2が同定された。これらの2つのペプチドを混合物中に等比で混合して、感染ブタにおけるELISAによるPRRSVに対する抗体の検出に最適な抗体捕捉相を構成した。これらの2つの高抗原性ペプチドは共に、免疫優性B細胞エピトープのクラスターを有することが見出され、PRRSV陽性血清パネルに対して最も顕著で一貫した抗原性を有した。PRRSVヌクレオカプシドペプチド例えば、配列番号1及び2を含む診断テストキットの製造及び使用は、本発明の種々の例示的態様の範囲内である。本発明のPRRSV抗原ペプチドの特定の態様は、さらに配列番号1及び2の免疫学的に機能的なホモログであると定義され、これらは、PRRSVの突然変異株及び変異株由来の対応する配列及び立体構造要素を有する。相同PRRSV抗原ペプチドは、起源となる変異体PRRSV北米株のヌクレオカプシドタンパク質の2~71位及び51~123位とほぼ相関するアミノ酸残基を有する。このようなホモログは、ClustalWJulieDThompsonTobyGibsonofEuropeanMolecularBiologyLaboratoryGermanyandDesmondHigginsofEuropeanBioinformaticsInstituteCambridgeUKAlgorithmicにより作成などの配列アラインメントプログラムによって容易に実証される。図3は、PRRSVMD001Taiwan/99Y/AF121131配列番号3、JXA1Beijing/06Y/EF112445配列番号4、NA/NJ-a/04Y/AY37282配列番号5、EU/Lena/08Y/EU909691配列番号6の多様な株から得た4つの抗原配列のClustalWによるアラインメントを示す。図3にアラインメントされたヌクレオカプシドホモログの起源となるPRRSV株は、欧州株のウイルスを含む。表1はまた、起源となるPRRSV株であるEU欧州株/08V204/Belgium/EU/GU737266を用いて、抗原ペプチド配列番号1及び配列番号2北米株/MD001/TW/AAC98536のホモログ配列番号7及び配列番号8を例示する。ある態様において、配列番号1に対するホモログ配列番号7は、EU株由来のPRRSVNCタンパク質のアミノ酸約2位~アミノ酸約72位のアミノ酸配列を有する。別の態様において、ホモログ配列番号8は、EU株由来のPRRSVNCタンパク質のアミノ酸約52位~アミノ酸約128位のアミノ酸配列を有する。これらの2つの相同ペプチドも同様に、混合物中に等比で混合して、感染ブタにおけるELISAによるPRRSV好ましくは欧州株に対する抗体の検出に最適な抗体捕捉相を構成できる。本発明のホモログはさらに、配列番号1及び配列番号2と少なくとも50の同一性を有すると定義される。ある態様において、変異株ホモログ配列番号7は、配列番号1と約50の同一性を有する。別の態様において、変異株ホモログ配列番号8は、配列番号2と約64の同一性を有する。感染動物の血清サンプル由来の抗体を検出するのに有用な、PRRSVNCタンパク質から同定される抗原ペプチドに加えて、中和及び/又はレセプター結合機能部位に対応する、PRRSVGP2、GP3、GP4及びGP5タンパク質上に存在する抗原領域がある。種々のペプチド免疫原は、標的ペプチドベースのELISAによってそれぞれの免疫原性を評価するために、そしてさらに重要なことには、本発明の態様による免疫蛍光アッセイIFAによって天然のPRRSVタンパク質に対する誘発抗体の交差反応性のために、これらのエピトープ領域の周辺で設計された。また、PRRSVGP4、GP5、M及びNCタンパク質上に存在する、十分に実証された免疫優性T細胞エピトープがある。これらのTヘルパー部位由来のペプチドは、ブタにおけるリンパ球増殖応答を引き起こし、動物における様々な細胞変性ウイルス感染に対する細胞性免疫反応に重要な役割を果たす、IFN-γを含むサイトカイン産生をもたらす。図4に示すような態様は、PRRSVJXA1受託番号AY2G2352の配列に基づくPRRSVORF2~ORF7がコードするGP2、GP3、GP4、GP5、M、及びNタンパク質における、本発明の選択されたB細胞エピトープ及びT細胞エピトープの分布及び位置を説明する。本発明の別の態様は、4つの最適化されかつ選択されたPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチドの配列、即ちGP5.3V21-E65配列番号9、GP2BV111-L136配列番号10、GP3BC57-C75配列番号11、及びGP4BC52-C69配列番号12を提供する。これらのB細胞エピトープクラスターは、中和特性及びレセプター結合特性を有する部位の周辺に位置する。本発明の他の態様は、これらの4つのPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログを提供する。表3は、起源となる株であるMD001、JXA1、NA及びEUを用いて、相同GP5配列番号13~15、GP2配列番号17~19、GP3配列番号21~23、及びGP4配列番号25~27由来のBエピトープクラスターペプチド配列のアラインメントを示す。B細胞エピトープクラスターペプチドの各々のコンセンサス配列配列番号16、配列番号20、配列番号24、配列番号28も示され、可変位置に割り当てられたアミノ酸は、それらの位置に最も頻繁に適用されるアミノ酸である。B細胞エピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、本来の抗原ペプチドと実質的に同じ免疫学的性質を保持する、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及びホモログの変異体を含む。例えば、配列番号9の機能的なアナログ又はホモログである変異体は、1つのアミノ酸位置における保存的置換;総電荷の変化;別の部分への共有結合;あるいは小さい付加、挿入、欠失もしくは保存的置換及び/又はそれらの任意の組合せを有することができる。したがって、PRRSVGP5.3BエピトープV21-E65抗原ペプチド例えば、配列番号9に結合する抗体は、そのPRRSVGP5.3Bエピトープ抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログにも実質的に類似の効力で結合することになるであろう。ある態様において、機能的なアナログは、配列番号9又はホモログに対して少なくとも40の同一性を有する。別の態様において、機能的なアナログは、配列番号11又はホモログに対して少なくとも56の同一性を有する。さらに別の態様において、機能的なアナログは、配列番号12又はホモログに対して少なくとも72の同一性を有する。さらに別の態様において、機能的なアナログは、配列番号10又はホモログに対して少なくとも80の同一性を有する。なお別の態様において、機能的なアナログは、配列番号12又はホモログに対して少なくとも94の同一性を有する。ある態様において、表3に示すように、PRRSVGP5.3BエピトープクラスターペプチドV21-E65の免疫学的に機能的なアナログは、保存的置換によるか、及び挿入又は欠失によって、改変されているPRRSVGP5.3Bエピトープクラスターペプチドのバージョンを包含する。この態様において、免疫学的に機能的なアナログは、配列番号9からか又は配列番号9のホモログから、保存的な置換によって改変することができる。保存的置換は、1つのアミノ酸残基が、類似の化学的性質を有する別のアミノ酸残基に置き換えられる場合の置換である。例えば、非極性疎水性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ;極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられ;正電荷塩基性アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ;負電荷酸性アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。別の態様において、表3及び表4に示すように、免疫学的に機能的なアナログは、N末端、C末端へのアミノ酸付加によって、及び/又はペプチドの中間部への挿入によって改変することができる。本発明の種々の態様において、付加は、ペプチドのN末端又はC末端への付加である。付加は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11アミノ酸残基の付加とすることができる配列番号9及び30。このような付加は、PRRSVタンパク質に存在せず、かつPRRSVBエピトープクラスターペプチドの免疫原性を変更しない、アミノ酸配列を構成してもよい。PRRSVBエピトープクラスターペプチドに存在しない付加として、小さい荷電配列例えば、リジンリジンリジン、分岐鎖構造の形成が可能なアミノ酸例えば、εNリジン又は環化構造の形成が可能なアミノ酸例えば、システインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある態様において、PRRSVに存在しないアミノ酸配列の付加は、5アミノ酸以下の付加である。アミノ酸の付加は、古典的又は非古典的なアミノ酸のいずれか、もしくはそれらの混合物とすることができる。別の特定の態様において、免疫学的に機能的なアナログは、ペプチドのN末端、C末端、及び/又は中間部に対するアミノ酸欠失によって改変することができる。種々の態様において、欠失は、ペプチドのN末端又はC末端に対する欠失である。欠失は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11アミノ酸残基の欠失とすることができる。表4に示すような特定の態様において、アミノ酸配列の欠失は、9アミノ酸以下の欠失である配列番号33及び34。別の態様において、表7に示すように、PRRSVBエピトープクラスターペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、電荷の変更によって改変されているPRRSVBエピトープクラスター抗原ペプチドを包含する。このような電荷の変更は、アミノ酸の置換、付加、もしくは欠失、又は荷電分子の共有結合の結果であってもよい。電荷の変更により、そのペプチドが、未改変のペプチドと比較してより塩基性に、より酸性に、又はより中性になるという結果を生じてもよい。ある特定の態様において、そのペプチドは、1~5個のリジン残基をN末端又はC末端に付加することによってより塩基性となる。より特定の態様において、そのペプチドは、3個のリジン残基をN末端に付加することによってより塩基性となる。限定されない例として、本発明のペプチドの免疫学的に機能的なアナログは、末端のアミノ酸に付加された1~約5個の追加のアミノ酸古典的及び非古典的を有することができる。例えば、電荷を変更するために、配列Lys-Lys-Lysを、このPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチドのアミノ末端に付加することができる。上記ペプチドは、Merrifield固相合成法及びそのプロセスに対する無数の利用可能な改良法などの標準的な手法を用いて容易に合成することができる。上記ペプチドは、組換えDNA技術を用いて作製することもできる。このように、PRRSVB細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及びPRRSVB細胞エピトープクラスター抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子、ならびにその補体complimentsは、本発明の種々の例示的な態様に包含される。PRRSVB細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及び免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子を含むベクター、特に発現ベクターもまた、本発明の種々の例示的な態様に包含される。それらのベクターを含有する宿主細胞も、本発明の種々の例示的な態様に包含される。本発明の種々の例示的な態様はまた、PRRSV抗原ペプチド及びPRRSVB細胞抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログを産生する方法も包含する。例えば、その方法は、PRRSV抗原ペプチド及び/又はPRRSV抗原ペプチドの免疫学的に機能的なアナログをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、そのPRRSVペプチド及び/又はPRRSVペプチドの免疫学的に機能的なアナログが発現されるような条件下でインキュベートする工程を有することができる。本発明のある態様により、固相合成によって産生されるペプチド組成物が提供される。この態様は、感染細胞の溶解物又は分泌物に由来する、管理されかつ十分に定義された免疫原を使用することができる。この態様の化学的プロセスによって産生される抗原の質は、管理されかつ定義されるので、結果として、抗原性、免疫原性及び収率の再現性を保証することができる。また、生体有害材料がペプチド抗原の製造に用いられないので、リスクを低下させ、費用のかかる生物学的封じ込めの必要性がなくなる。部位特異的免疫原は、高モル濃度の選択されたエピトープを提示するので、PRRSV抗原ペプチド組成物を用いたワクチンの安全性及び免疫有効性の両方が保証される。ある態様において、本発明のペプチドは合成される。定義されたPRRSV抗原合成ペプチドを用いることにより、子ブタにおける抗体検出及び診断のための抗原として用いられる場合、偽陽性の結果が最小限になる。公知のB細胞エピトープ及びThエピトープを有する定義された合成ペプチドを免疫原として用いることにより、ワクチンの免疫原性成分として用いられる場合、PRRSVに感染したか又は組換えウイルスに感染した宿主細胞由来の、ならびに組換えタンパク質発現系由来の、PRRSウイルス及び/又は組換えタンパク質と同時精製される可能性がある抗原性材料の存在によって引き起こされる、望ましくない非PRRSV特異的免疫反応が排除される。例えば、ブタ由来の血清は、宿主細胞に対する、又は組換えEscherichiacoli、酵母もしくはバキュロウイルスに対する抗体を有する可能性があり、それらは後に、生物学的に得られた抗原に基づく診断テストに用いられる抗原性材料と交差反応性となり、これらの外来性の免疫原を成分として含むワクチンによって生じるこのような免疫反応は、防御的ではない。対照的に、本発明のPRRSVペプチドワクチンを接種されたブタは、宿主細胞又は発現ベクター由来のタンパク質、例えば、生物学的に誘導されたPRRSV抗原と同時精製される組換えEscherichiacoli、酵母又はバキュロウイルス由来のタンパク質に対する不都合な抗体及び他の免疫反応がない、焦点を絞った免疫反応を生じるであろう。合成ペプチドのこの態様はまた、産生中に生じる不純物による干渉も最小限にする。長い合成の場合、カップリング効率の厳密な制御にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終結を含む、伸長サイクル中の事象に起因してペプチドアナログも生成され、そのため、標的とするペプチド合成物とともに複数のペプチドアナログが生成する。それにもかかわらず、このようなペプチドアナログは、免疫診断用の固相抗原としてか又はワクチン接種用の免疫原としてのいずれかで、免疫学的用途に用いられる場合、抗原性及び免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも適している。合成ペプチドの免疫学的用途における25年間の経験において、本発明者らは、意図した免疫学的活性の保持を可能にする構造的可変性の範囲が、低分子薬物による特定の薬物活性、又は生物学的に誘導される薬物と同時に生成される高分子に見られる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造的可変性の範囲よりもはるかに融通が利くものであることを見出した。これは、意図的に設計されたか、又は意図したペプチドと類似のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する欠失配列副産物の混合物として合成プロセスの誤りによって不可避的に生成されたかのいずれかのペプチドアナログが、所望のペプチドの精製された調製物と同程度に有効であることが多い理由である。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性及び有効性を保証するように、製造プロセス及び生成物評価プロセスの両方をモニタリングする識別力のあるQC手順が開発される限り、設計されたアナログ及び意図しないアナログ混合物は、有効である。本発明の他の態様において、内在性PRRSVThペプチド及びそれらのホモログ配列番号47~79をワクチン組成物中に含めることができる。Thペプチドが存在することにより、PRRSVペプチドワクチンの免疫原性を改善することができる。PRRSVBエピトープに由来する免疫原性ペプチド上述のホモログ及びアナログを包含するは、内在性PRRSVThエピトープと混合することができる。本発明の他の態様において、内在性PRRSVThペプチドはコンビナトリアル配列として提示されることができ、そこで、アミノ酸残基の組合せは、PRRSVThペプチドに対するホモログの配列に基づいて、フレームワーク内の特定の位置に表される。コンビナトリアルペプチドの集合体は、合成プロセス中、特定の位置に、1つの特定のアミノ酸の代わりに設計された保護アミノ酸の混合物を付加することによって、1つの合成プロセスで合成することができる。このようなコンビナトリアルPRRSVThペプチド集合体により、多様な遺伝的背景の動物に対する広範なTヘルパーエピトープ適用範囲が可能になる。PRRSVThペプチドの代表的なコンビナトリアル配列を、PRRSVThエピトープの各々について、表6の配列番号47~79に由来するように、表7の配列番号80~90に示す。ある態様において、JXA1配列に基づいて配列番号47、51、55、59、61、63、67、70、74、76と記載され表6にも示す、かつPRRSVBペプチド免疫原に結合していない、ORF4、ORF5、ORF6及びORF7由来の免疫優性PRRSVThエピトープのクラスターを有するThペプチドを用いてPRRSVBエピトープペプチド免疫原の免疫原性を補い、実施例5に記載するように、ペプチドベースのPRRSVワクチン製剤の免疫原性を増強することができる。Bエピトープペプチド免疫原に共有結合することなく、配列番号47、51、55、59、61、63、67、70、74、76を遊離ペプチドとして含むことにより、それらのワクチン製剤の免疫原性を改善することができる。実施例10に記載されるような別の態様において、Bエピトープペプチド免疫原に共有結合することなく、群2について配列番号47、51、55、59、61、63、67、70、74、76を、ならびに群1、群3、及び群4について配列番号80~90を遊離ペプチドとして含むことにより、それらのワクチン製剤の免疫原性を改善することができる。別の態様において、PRRSVペプチド上述のホモログ及びアナログを含むは、スペーサーを介して又はスペーサーを介さずに、Thエピトープを含むことが知られている配列を含むペプチドに共有結合することができる。この態様により、Thエピトープに共有結合していない同等の免疫原よりも増強された免疫原性を提供することができる。ある特定の態様において、Thエピトープを含むペプチドは、PRRSVペプチドのN末端配列番号38及び/又はC末端配列番号39に共有結合する。別の特定の態様において、スペーサーは、配列Lys-Lys-Lys-εNLys配列番号36、又は単一アミノ酸εNLysを有し、表5にも示すそれぞれ、配列番号43及び42。ある態様において、Thエピトープを含むペプチドは、PRRSVペプチドのアミノ末端に共有結合する。ある特定の態様において、Thエピトープを含む表5に示すようなペプチド配列番号40は、Lys-Lys-Lys-εNLysスペーサー配列番号36を介してアミノ末端に結合した人工コンビナトリアルThペプチド配列番号35表5に示すであり、配列番号40として示す。本発明の種々の態様は、PRRSVに対してブタを防御するためのワクチン組成物に関する。例示的な態様において、ワクチンは、免疫原性ペプチド抗原又はペプチド免疫原組成物及び許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する。種々の態様において、PRRSVワクチン組成物は、ペプチド抗原又はペプチド抗原組成物及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有し、そのペプチド抗原は、aPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチド抗原GP5.3V21-E65配列番号9、GP2BV111-L136配列番号10、GP3BC57-C75配列番号11及びGP4BC52-C69配列番号12のいずれか1つ;baのホモログ;ca又はbの抗原的にかつ免疫学的に機能的なアナログ;d少なくとも1つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加、及び/又はアミノ酸欠失を有する、a、b、又はc;ならびにea~dの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。PRRSVワクチンの態様において、ペプチド抗原の電荷は、1~5個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される。PRRSVクチンの別の態様において、抗原的にかつ免疫学的に機能的なホモログ又はアナログは、GP2、GP3、GP4及びGP5に由来する、PRRSVB細胞エピトープクラスターペプチド抗原GP5.3V21-E65配列番号9、GP2BV111-L136配列番号10、GP3BC57-C75配列番号11及びGP4BC52-C69配列番号12のいずれか1つに由来するアミノ酸配列の抗原と少なくとも50の同一性を有する。ある特定の態様において、ペプチド抗原は、配列番号9、10、11、12からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。PRRSVワクチンの別の態様において、ペプチド抗原は、該ペプチド抗原のN末端又はC末端に共有結合したTヘルパーエピトープをさらに有する。ある特定の態様において、Tヘルパーエピトープは、ペプチド抗原のアミノ末端に共有結合する。別の特定の態様において、Tヘルパーエピトープは、少なくとも1つのアミノ酸を有するスペーサーを介して、ペプチド抗原に共有結合する。ある特定の態様において、Tヘルパーエピトープは配列番号35である。さらに別の特定の態様において、スペーサーはLys-Lys-Lys-εNLys配列番号36である。さらに別の特定の態様において、スペーサーはεNLysである。ある特定の態様において、ペプチド抗原は、配列番号42、43、44、45又は46である。種々の例示的な態様において、任意の量の免疫原性ペプチド抗原を用いて、動物における免疫反応を誘発することができる。ある特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約0.1μg~約100mgである。別の特定の態様において、ペプチド抗原の量は、約1μg~約10mgである。さらに別の態様において、ペプチド抗原の量は、約10μg~約1mgである。PRRSVワクチン組成物の種々の態様において、この組成物は、配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、及び76の11個のPRRSVTヘルパーエピトープペプチドの等モル混合物をさらに有する。ある特定の態様において、配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、及び76の等モル混合物の量は、約0.1μg~約1mgである。より特定の態様において、配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、及び76の等モル混合物の量は、約1μg~約100μgである。種々の例示的な態様において、任意のタイプ又は任意の量の送達ビヒクル又はアジュバントを用いることができる。ある特定の態様において、送達ビヒクル及びアジュバントは、モンタニドMontanide商標ISA50V油中水型エマルションを生成するための、植物油及びオレイン酸マンニドmannideoleateからなる油性ワクチンアジュバント組成物、Tween登録商標80ポリソルベート80又はポリオキシエチレン20モノオレイン酸ソルビタンとしても公知、CpGオリゴヌクレオチド、及び/又はそれらの任意の組合せである。ある特定の態様において、PRRSVワクチン組成物は、配列番号33のペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有し、ペプチド抗原の量は約10μg~約1mgである本発明の別の態様は、PRRSV母性由来抗体MDA陽性であるか又は陽性でない子ブタをPRRSV感染に対して防御する方法に関し、この方法は、上述の例示的な態様のいずれかに包含されるワクチンを投与する工程を有する。本開示に従って調製した配列番号1及び配列番号2の2つのPRRSVNCペプチドの混合物を用いて、このペプチドをイムノアッセイの捕捉相に、例えばELISAテストキットの固相免疫吸着剤に、抗原的有効量で使用することにより、PRRSV抗体を検出することもできる。本発明のある態様によると、任意の適合性のイムノアッセイ形式を、対象のペプチドと共に用いることができる。このような形式は、当業者に周知であり、多くの標準的な免疫学マニュアル及びテキストに記載されている。例えばHarlowら、198824を参照のこと。これらには、他の周知のイムノアッセイ形式の中でも、酵素結合免疫吸着アッセイELISA、酵素イムノドットアッセイ、凝集アッセイ、抗体-ペプチド-抗体サンドイッチアッセイ、ペプチド-抗体-ペプチドサンドイッチアッセイが含まれる。ある態様において、イムノアッセイは、2つのPRRSVNC抗原ペプチド配列番号1及び配列番号2を含むペプチド組成物でコーティングされた固相を用いるELISAである。本発明のある態様によると、このペプチドにより、成熟雌ブタ及び若雌ブタ、成熟雄ブタ及び去勢ブタ、ならびに子ブタ由来の血清を、PRRSV感染についてスクリーニングELISAによってテストすることができ、ワクチン接種前の子ブタ由来の血清を、母体由来の抗PRRSV抗体のレベルについて評価することができ、かつ、PRRSV抗原ペプチドを用いたワクチンに対する、ワクチン接種を受けた子ブタにおける免疫反応のレベルを測定することができる。ある特定の態様において、ELISAイムノアッセイを用いて、ブタの血液、血清又は血漿サンプルを、抗PRRSV抗体の存在についてテストすることができ、このイムノアッセイは、i.2つのPRRSVNCペプチド配列番号1及び配列番号2の混合物を固体支持体に付着する工程、ii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びiii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する。別の特定の態様において、ELISAイムノアッセイを用いて、ブタの血液、血清又は血漿サンプルを、抗PRRSV抗体の存在についてテストすることができ、このアッセイは、i.2つのPRRSVNCペプチド配列番号7及び配列番号8の混合物を、欧州株配列に由来する配列番号1及び配列番号2のホモログとして、固体支持体に付着する工程、ii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、そのペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びiii.前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する。対象のELISAキットの例示使用において、テストすべきブタ血清サンプルを、サンプル希釈剤で希釈した後、1つ以上の上述のPRRSVペプチドと、ある期間、存在する場合には任意の抗体が、ペプチド感作固相に結合する条件下で接触させる。未結合の材料を除去した後例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することによって、二次複合体を、ブタ特異的IgGに対する標識抗体又は標識プロテインA、標識プロテインG、もしくは標識プロテインA/Gと接触させる。これらの抗体又はプロテインA、GもしくはA/Gは、この二次複合体に結合して三次複合体を形成し、これらの二次抗体又はプロテインAもしくはGもしくはA/Gがレポーター分子で標識されているので、その三次複合体は、検出手段に供されると検出される。レポーター分子は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、生物発光分子、化学発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどとすることができる。ELISAの場合、レポーター分子は、好ましくは酵素である。本発明の特定の態様として、以下が挙げられるが、これらに限定されない:1ペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバントを有する、ブタ生殖器呼吸器症候群PRRSワクチン組成物であって、該ペプチド抗原が、a配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及びこれらの任意の組合せ;baのホモログ;及びca又はbの任意の組合せ;からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、PRRSワクチン組成物。2ペプチド抗原が配列番号9のアミノ酸配列を有する、1に記載のPRRSワクチン。3ペプチド抗原が配列番号10のアミノ酸配列を有する、1に記載のPRRSワクチン。4ペプチド抗原が配列番号11のアミノ酸配列を有する、1に記載のPRRSワクチン。5ペプチド抗原が配列番号12のアミノ酸配列を有する、1に記載のPRRSワクチン。6ペプチド抗原が、1~5個のアミノ酸を付加するか又は欠失させることによって変更される、1に記載のPRRSワクチン。7ペプチド抗原のアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合したTヘルパーエピトープをさらに有する、1に記載のPRRSワクチン。8Tヘルパーエピトープが配列番号35である、7に記載のPRRSワクチン。9Tヘルパーエピトープが、ε-リジン残基を有するスペーサーを介してペプチド抗原に共有結合する、7に記載のPRRSワクチン。10スペーサーが配列番号36である、9に記載のPRRSワクチン。11抗原ペプチドに結合されていないTヘルパーエピトープをさらに有し、該Tヘルパーエピトープが配列番号47~90からなる群から選択される、1に記載のPRRSワクチン。12ペプチド抗原の総量が約10μg~約1mgである、1に記載のPRRSワクチン。13送達ビヒクル及びアジュバントが、モンタニドMontanideISA50V、ポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエート、及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、1に記載のPRRSワクチン。141に記載のワクチンを投与する工程を有する、PRRS感染に対して子ブタを防御する方法。15aペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b配列番号10、11、12、31、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc配列番号80~90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSVThペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。16aペプチド抗原及び獣医学的に許容可能な送達ビヒクル又はアジュバント、b配列番号42、44、45、46、及びそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド抗原、及びc配列番号80~90及びそれらの組合せからなる群から選択されるPRRSVThペプチド、を有する、PRRSワクチン組成物。17a配列番号1及び配列番号2の混合物を固体支持体に付着させる工程、b前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc前記固体支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、PRRS感染を診断する方法。18a配列番号7及び配列番号8の混合物を固体支持体に付着させる工程、b前記固体支持体に付着した前記ペプチドを、該ペプチドに抗体が結合するのを促す条件下で、抗体を含むブタの血液、血清又は血漿サンプルに曝露する工程、及びc前記支持体に付着した前記ペプチドに結合した抗体の存在を検出する工程、を有する、抗PRRSV抗体の存在をテストするためのELISAイムノアッセイ。以下の実施例は、本発明を説明するために役立つものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。PRRSVでコトランスフェクトされたHTK細胞を用いた免疫蛍光アッセイIFAによる標的PRRSVB細胞エピトープクラスターペプチド抗原と天然PRRSVタンパク質抗原との間の交差反応性についての免疫血清力価の評価のための血清学的アッセイPRRSVサブユニットタンパク質、GP3、GP4及びGP5、に対する抗体は、組換えワクシニアウイルスrVVT7T7ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルスとT7プロモーターの下流にPRRSVorf3、orf4及びorf5をそれぞれコードするプラスミドでコトランスフェクトされたHTK細胞を用いる免疫蛍光法によって検出することができる。この方法は、哺乳類細胞において、その本来のウイルス複製と共に高忠実度でこれらのPRRSVタンパク質の一過性の発現をもたらす。PRRSVGP3、GP4及びGP5が膜貫通ドメイン及び側鎖修飾からなるので、最良のPRRSVタンパク質構造は、デノボでしか生成できない。各々のPRRSVサブユニットタンパク質、GP2、GP3、GP4又はGP5、をデノボ合成し、コトランスフェクトされたHTK細胞を、PRRSVに対する特異的抗体の存在についての免疫アッセイにおける評価用免疫血清によって細胞内染色を行うための標的細胞として用いた。この免疫蛍光アッセイシステムにより、高い特異性及び感度で天然PRRSV抗原に対する抗体の検出に最良の条件が可能になる。図1Aに図示するメカニズムに従って、HTK細胞株細胞を、T7ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルスrVVT7に感染させ21、リポフェクトアミンlipofectamine商標InvitrogenによってPRRSV-orf3、orf4及びorf5プラスミドでコトランスフェクトした22。詳細には、T7ポリメラーゼプロモーターによって媒介される天然のPRRSVタンパク質の発現のためのpRRSVプラスミドの構築を、以下のとおり行った:完全長のpRRSV遺伝子台湾PRRSVMD001株受託番号AF035409由来を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅し、pCR2.1Topo登録商標プラスミドベクターInvitrogenにクローニングした。pRRSVプラスミドの発現能力を、PRRSV株MD001由来のorf3、orf4及びorf5に対する完全なヌクレオチド配列を示す配列決定によって確認した。HTK細胞を、96ウェルプレートにおいて集密度confuluency80になるまで増殖させ、rVVT7に感染させ22、次いで、リポフェクトアミン商標InvitrogenによってpRRSVorf3、orf4及びorf5プラスミドで個々にコトランスフェクトした。コトランスフェクションの24時間後、細胞を80アセトンで固定し、このプレートを免疫蛍光アッセイIFAによるPRRSVタンパク質に対する抗体の検出のために-80°Cで保存した。図1Aの図は、T7ポリメラーゼ組換えワクシニアウイルスT7/vacに感染させ21、リポフェクトアミン商標InvitrogenによってpCR-orf5プラスミドでコトランスフェクトされたHTK細胞株細胞を示す。組換えGP5タンパク質は、翻訳後に細胞質に輸送される22。抗GP5抗体は、本発明のある態様によれば、トランスフェクトされたHTK宿主細胞の細胞質に結合し、標識二次抗体の免疫蛍光法によって検出される。この方法により、原核生物T7プロモーターを介した完全長PRRSVGP5タンパク質のHTK細胞における一過性の真核生物発現によって、真正PRRSVGP5タンパク質に対する抗体が高い特異性で検出される。pCR-完全長PRRSVゲノムでの類似のトランスフェクションも、原核生物T7プロモーターを介した完全長PRRSVゲノムのHTK細胞における一過性の真核生物発現によるPRRSVGP2、GP3、GP4、M及びNタンパク質の高い特異性での検出に用いることができる。免疫蛍光アッセイIFAによるPRRSV抗体の力価測定初めに血清サンプルをPBSで10倍希釈し、次に2倍の段階希釈を行った。各テストランのために、PRRSV感染SPFブタ由来の陽性コントロール血清及び未感染SPFブタ由来の陰性コントロール血清の両方を含めて、pRRSVorf-7プラスミドによるPRRSVヌクレオカプシドタンパク質の発現を検証した。1:10よりも高い希釈度で細胞質に局在した蛍光シグナルを生じる血清サンプル図1Bに示すを、>10のIFA力価を有するとスコア化した;これらの力価から、PRRSVに感染した動物が示された。ワクチン接種の結果として標的ペプチド特異的抗体を含む、動物ワクチン由来の血清について、特異的標的タンパク質又は完全PRRSVゲノムに対するそれらの抗体の交差反応性を、対応する標的天然PRRSVタンパク質例えば、GP2、3、4又は5を用いた免疫蛍光アッセイIFAによって評価することができる。自然感染したブタから、又はPRRSVペプチドベースのワクチンを接種したブタから採取した血清サンプルのすべてのテストを、コード下で行った。PRRSVの中和/レセプター結合部位を提示するデザイナーペプチドの免疫原性評価のためのPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチド抗原ベースのELISA96ウェルプレートのウェルを、特記しない限り10mMNaHCO3緩衝液pH9.5中の特記しない限り2μg/mLでの個々の標的ペプチド100μLを用いて、37°Cで1時間、個々にコーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルを、3重量ゼラチンのPBS溶液250μLと共に37°Cで1時間インキュベートして、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングした後、0.05容量TWEEN登録商標20を含むPBSで3回洗浄し、乾燥させた。PRRSV抗体についてIFAで陽性のブタ血清及び陰性コントロール血清を、特記しない限り、20容量正常ヤギ血清、1重量ゼラチン及び0.05容量TWEEN登録商標20を含むPBSで1:20に希釈した。この希釈した検体100μLを各ウェルに添加し、37°Cで60分間反応させた。次に、ウェルを0.05容量TWEEN登録商標20のPBS溶液で6回洗浄して、未結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ブタIgGを標識トレーサーとして用いて、陽性ウェル中で形成された抗体/ペプチド抗原複合体に結合させた。0.05容量TWEEN登録商標20を含む1容量正常ヤギ血清のPBS溶液中の予め力価測定した最適希釈度のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタIgG100μLを各ウェルに添加して、37°Cでさらに30分間インキュベートした。0.05容量TWEEN登録商標20のPBS溶液でウェルを6回洗浄して未結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に0.04重量3’,3’,5’,5’-テトラメチルベンジジンTMB及び0.12容量過酸化水素を含む100μLの基質混合物とさらに15分間反応させた。この基質混合物を用いて、有色生成物を形成させることによりペルオキシダーゼ標識を検出した。1.0MH2SO4を100μL添加することにより反応を停止し、450nmでの吸光度A450を測定した。動物血清中のPRRSV抗体を検出する目的に従って、血清希釈を行った。すなわちa潜在的な自然感染を識別するために、1:20の希釈度を用い、A450測定値を記録し、カットオフ計算用の固有の内在性の陰性コントロールを用いた;又はbペプチドベースのPRRSVワクチン製剤を接種したブタの抗体価を測定するために、1:10~1:10,000の10倍段階希釈の血清をテストし、テストした血清の力価Log10として表されるをA450の線形回帰分析によって算出した。感染動物とワクチン接種動物を識別するための診断用途に最適なPRRSV抗原ペプチドの同定PRRSV分離体JXA1、LV、EU、NAの既に公開された配列由来、及び台湾株MD001由来のPRRSVのゲノム配列を用いて、オープンリーディングフレームからタンパク質配列を推定し、ORF2、3、4、5、6及び7がコードするタンパク質配列から得られたデータを用いて、PRRSV感染した動物由来の血清中の抗体を検出するためのB細胞エピトープクラスター抗原ペプチド、及びマーカーワクチン製剤を投与した動物において誘発される特異的抗体を検出するためにマーカーワクチン製剤に用いられる機能的中和/レセプター結合部位を提示する抗原ペプチドをデザインした。本発明者らは、生物情報学の情報及び古典的な免疫化実験を用いて、診断用途及びワクチン用途に最適なB及びT細胞エピトープクラスター化ペプチドを同定するためにスクリーニングされるペプチドの数を限定する戦略を用いた。感染動物とワクチン接種動物の識別のために緊急に必要とされるツールDIVAシステムと呼ばれるの開発は、マーカーワクチン設計プロセスを補完するものである。ブタにおいてPRRSV感染中に生成される大部分の抗体は、PRRSVORF7がコードするヌクレオカプシドタンパク質NCタンパク質これに対する主要な抗原決定基が同じ大陸由来の株間で比較的よく保存されているに対して特異的であるので、このNCタンパク質を、ウイルス特異的抗体の検出ならびに感染及び疾患の診断に適した候補として標的化した。抗体捕捉のために合成ペプチドベースの抗原を用いる利点としては、偽陽性を引き起こす、PRRSVとは無関係の細胞成分が存在しないことに起因する特異性の改善、及びエピトープクラスターペプチドの固有の性質に起因する感受性の改善が挙げられることがよく知られている。公知のPRRSV感染を有する動物由来の陽性血清を用いて、抗体検出に役立つ可能性のある強力かつ一貫した抗原性のための重複するPRRSVORF7がコードするNCペプチドをスクリーニングした。陰性血清は、正常なブタ及びPRRSV感染のないことが知られているSPFブタから採取した。北米MD001株のNCタンパク質のエピトープマッピングに関するデータを、図2に要約した。デザイナーペプチドを、2μg/mLにて1ウェル当たり0.1mLでプレートコーティングに用いた間接的ELISAを行った。MD001NCタンパク質由来の配列を徐々に長くした2つの系列a~eのペプチドを合成した。4171系列のペプチド図2Aに示すは、残基71で始まるC末端で合成し、4172系列のペプチド図2Bに示すは、残基123で始まるC末端で合成した。これらのペプチドを個々にプレートコーティングに用い、12個の確証されたPRRSV陰性血清のパネルと共に3つのプールされたPRRSV陽性血清で、各ペプチドに対する感受性及び特異性についてテストした。図2Aに示すように、ペプチド4171eのN末端に位置する配列PNNNGKQQKKK配列番号91を有する11merの抗原エピトープでテストしたこの4171系列由来のペプチドの中で、ペプチド4171e配列番号1が最も抗原性が高いことが分かった。図2Bに示すように、N末端に位置する配列EKPHFPLATEDDVRHHFT配列番号92を有する18merの抗原エピトープでテストしたこの4172系列由来のペプチドの中で、ペプチド4172e配列番号2が最も抗原性が高いことが分かった。18merの抗原エピトープEKPHFPLATEDDVRHHFT配列番号92は、ペプチド4171a~d内で提示した場合、抗原性はなかった。しかし、この18merのペプチドエピトープは、それ自体を完全長4171e分子配列番号1内で提示して、配列番号1上の11merの抗原エピトープPNNNGKQQKKKと組合せると、大きな立体構造エピトープを形成する。さらに、70mer及び73merの2つのペプチドそれぞれ、配列番号1及び2の予想外の免疫優性抗原性は、長い連続エピトープ及び非連続エピトープの列を提示する、NCタンパク質上の大きな露出面を提示する長鎖ペプチドと一致する。抗原ペプチド4171e配列番号1及び4172e配列番号2を2:1の混合比で、3μg/mLにて1ウェル当たり0.1mLでプレートコーティングに用い、これはPRRSV北米株に対する抗体の捕捉/検出のためのUBIPRRSVNCELISAの一部を成した。種々のPRRSV株MD001、JXA1、NA及びEU由来の相同NCタンパク質配列を、図3に示すようにアラインメントした。親MD001配列と比較して、起源となるEU配列にはアミノ酸残基の重大な置換、挿入及び欠失があるにもかかわらず、起源となる欧州株のPRRSVヌクレオカプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく表1に示すような置換ペプチドホモログ配列番号3及び配列番号4は、PRRSV欧州株に対する抗体の捕捉/検出のためのUBIPRRSVNCEUELISAにおいて抗原として同様に用いられる。IFAテストによって抗PRRSVNCタンパク質の反応性について予め特徴付けられた30個の血清のパネルを陽性血清パネルとして用いて、UBIPRRSVNCELISAの感受性及び特異性をさらに検証した。表2に示すように、UBIPRRSVNCELISAは、IFAによる検出限界が約1:16希釈であった場合、NCタンパク質についてIFAテストとだいたい同レベルの感受性を有する。UBIPRRSVNCELISAテストを補助的な血清学ツールとして用いて、他の実施例に記載されるように、野外サンプルを評価し、感染動物とワクチン接種動物を識別し、PRRSVマーカーペプチドベースのワクチンを評価した。PRRSVマーカーワクチンに用いる抗原ペプチドを同定するための血清学的検証用ペプチドの設計及び合成約10~約70アミノ酸長の配列を有するPRRSVGP2、GP3、GP4、GP5、M及びNCタンパク質由来のPRRSVB細胞及びT細胞の両方のエピトープクラスター部位を提示する、幅広いレパートリーのPRRSV抗原ペプチドを設計した。いくつかのペプチドについて、適切な部位でアミノ酸置換を行うことにより、対応する天然タンパク質との交差反応を最大にするように局所構造維持に制約を与える環状ペプチドの形成が可能になった。他の抗原ペプチドについて、それらの各々の免疫原性を高めるために、人工コンビナトリアルThペプチド例えば、UBITh3、配列番号15と結合させた。すべてのペプチドを、ペプチド合成の反復サイクル、ワクチン形成、動物免疫化、及び血清学的テストを含む、大きな労力を要しかつ時間的制約のある血清学的検証プロセスに供し、各診断及びワクチンのための本発明者らの最初の適用を受けた標的動物における、さらなるテストのための候補ペプチドを得た。免疫原性テストに用いられるすべてのペプチドを、Fmoc化学を用いて、AppliedBioSystemsPeptideSynthesizerModels430A431及び433を用いて合成した。N末端のFmoc保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を用いて、固相支持体上での独立した合成によって、各ペプチドを作製した。完成したペプチドを固体支持体から切り離し、90トリフルオロ酢酸によって側鎖保護基を除去した。合成ペプチド調製物を、正確な組成についてマトリックス支援レーザー脱離飛行時間型MALDTOF質量分析によって、且つ合成プロファイル及び濃度を含む内容について逆相HPLCによって、特徴付けした。長い合成の場合、カップリング効率の厳密な制御にもかかわらず、伸長サイクル中の事象アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終結を含むに起因してペプチドアナログも生成されたため、標的とするペプチドとともに複数のペプチドアナログが生成した。それにもかかわらず、このようなペプチドアナログは、免疫診断用の抗体捕捉抗原として、又はワクチン接種用の免疫原としてのいずれかで免疫学的用途に用いられる場合、抗原性及び免疫原性に寄与するものとしてペプチド調製物においてなおも適していた。これらのペプチドを使用して最終生成物の再現性及び有効性を保証するように、製造プロセス及び生成物評価プロセスの両方をモニタリングする識別力のあるQC手順が開発される限り、意図的に設計したか又は合成プロセスの間に副産物の混合物として生成したこのようなペプチドアナログは、典型的には、所望のペプチドの精製調製物と同程度に有効であることが多い。図4は、後のワクチン製剤用途に用いるために本発明者らの最初の調査及び検証を経た、PRRSV2~ORF7がコードするタンパク質GP2、GP3、GP4、GP5、M及びNCタンパク質上における選択されたB細胞エピトープ及びT細胞エピトープの分布/局在を示す。B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計目標は、中和抗体を誘導することができるか、又は標的細胞に結合するPRRSVレセプターに関連する、選択された機能部位を模倣する抗原ペプチドを作り出すことである。特異的なGP5B細胞エピトープクラスターペプチドを、単一のPRRSV株配列に基づくか、又はいくつかのPRRSV株配列に由来する場合は、広範なウイルス適用範囲のためのコンビナトリアル配列として、天然のPRRSVGP5タンパク質抗原に対するそれらの相対的な免疫原性及び交差反応性をテストするために、表4に示すようにレセプター結合/中和部位の周辺の4つのアミノ酸フレームGP5.1、5.2、5.3及び5.4配列番号9~14にわたって設計した。GP2BエピトープV111-L136、GP3BエピトープC57-C75及びGP4BエピトープC52-C69の呼称で、PRRSVJXA1配列に基づき構造タンパク質GP2~GP4由来の中和部位の周辺で設計された、さらなるB細胞クラスター抗原ペプチドを、表3に示す。GP2BV111-L136は直鎖ペプチド配列番号6として提示され、一方、GP3BエピトープC57-C75及びGP4BエピトープC52-C69は環状ペプチド配列番号7及び8として提示されることにより、立体構造維持のための局所的制約が可能になる。これらの抗原ペプチドはまた、これらのペプチド抗原の長さが短い性質に起因する免疫原性を増強するために、表5に示すようにGP5.1及びGP5.2フレームについてC末端で配列番号29及び30、又はN末端で配列番号39~46のいずれかで、人工コンビナトリアルThペプチド配列番号15に個々に結合した。これらのB細胞エピトープクラスターペプチド免疫原をワクチン製剤に組み込み、十分に設計されたプロトコルに従ってモルモット又はブタを免疫化し、広範な血清学的評価のために免疫血清を適時に採取した。これらの免疫血清を、それぞれの標的ペプチド抗原に対する抗体力価についてそれぞれの標的ペプチド抗原ベースのELISAでテストすることにより、免疫原性についてテストした。免疫蛍光アッセイIFAによるPRRSV天然タンパク質抗原に対する交差反応の検出は、実施例1に記述したように行った。これは、設計したペプチド免疫原が最終的なワクチン製剤での使用に適していることを評価するためのものである。ペプチド免疫原として認められたこれらのペプチド抗原について、表3に示すような起源となるPRRSV株例えば、MD001、JXA1、NA及びEU株由来の配列、又はコンセンサスcons配列、あるいはそれらに由来する、配列番号32、33及び34として表4に示すようなコンビナトリアル配列を有するペプチドホモログを、異なる株のPRRSVとの広範な交差反応性のために免疫化宿主において抗体を誘発できるペプチド免疫原としてさらに設計した。T細胞エピトープクラスターペプチド免疫原の設計は、はるかに簡単である。免疫化宿主における細胞性免疫反応の幅を広げるために、PRRSVで免疫化された後にウイルス負荷されたブタから得られた末梢血単核球PBMCの培養においてIFN-γ応答を誘導する能力に基づいて十分に特徴付けされた免疫優性T細胞エピトープを、ワクチン製剤に組み込むために選択した。GP4、GP5、M及びNCタンパク質由来の、PRRSVJXA1株に基づくT細胞エピトープクラスターペプチドの配列、ならびに種々のPRRSV株MD001、NA及びEUの相同PRRSVTヘルパーエピトープ配列のアラインメントを、配列番号47~79として表6に示す。これらのやや疎水性のペプチド抗原の溶解性を改善するために、それらに対する個々のTヘルパーペプチドのN末端に3つのリジン残基KKKを付加して、ペプチド免疫原として作用するようにした。全ての同定されたThペプチド免疫原配列番号47~79を、PRRSVB細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強するための補充T細胞エピトープ1として、かつそれら自体で細胞性免疫のためのPRRSVT細胞ペプチド免疫原として、ワクチン製剤中に等比で混合することによって、これらのT細胞クラスターペプチドのプールを作製した。T細胞エピトープ適用範囲を動物の多様な遺伝的背景にわたってさらに広げるために、特異的エピトープのコンビナトリアルペプチド4つの相同Tエピトープ配列に基づくを、各々のT細胞エピトープについて調製する。同様に、表7に示すように、3つのリジン残基KKKを、それぞれのコンビトリアルTエピトープクラスターペプチド免疫原配列番号80~90のN末端に付加した。これらのTエピトープクラスターコンビトリアルペプチド免疫原のプールプール2を、PRRSVB細胞クラスターペプチド免疫原の免疫原性をさらに増強するためのワクチン製剤中の補充として、かつそれら自体で細胞性免疫のためのPRRSVT細胞ペプチド免疫原として用いた。免疫原性及び天然PRRSVタンパク質との交差反応性を評価するための、GP5、GP2、GP3及びGP4タンパク質由来のPRRSVBエピトープクラスターペプチド抗原を含むワクチン製剤を用いたモルモット又はブタの免疫化外部ドメインは、細胞外空間細胞の外側の空間へと伸びる膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、標的細胞表面との接触を開始し、感染の間、細胞への付着及び細胞内への侵入の原因となる、ウイルスタンパク質の部分である。中和抗体はウイルスとその細胞レセプターとの相互作用を阻止するので、ウイルス侵入関連ドメインは、中和抗体の誘導にとって重要である。したがって、次世代の有効なPRRSVワクチンを開発する場合、PRRSVのウイルス侵入関連ドメインの機能性を評価することが重要である。マクロファージ特異的レクチンであるシアロアドヘシンCD163は、マクロファージ上の極めて重要なウイルスレセプターである。可溶型のシアロアドヘシンを用いて、PRRSVのGP5及びMの複合体のジスルフィド結合ヘテロダイマーが、シアロアドヘシンに対するリガンドであることを見出した。このリガンド-レセプター相互作用は、シアロアドヘシンのレクチン活性、及びGP5糖タンパク質上のシアル酸に依存する。したがって、PRRSVGP5タンパク質の外部ドメイン及びGP5の免疫原性に対するMの影響を調査して、ウイルスM/GP5と宿主細胞レセプターシアロアドヘシンとの間の相互作用を阻止する免疫を誘導する目的で、PRRSVマーカーワクチン製剤に用いるのに最適なGP5ペプチド免疫原を同定した。PRRSVGP5タンパク質の外部ドメインのレセプター結合/中和部位の周辺で45個を超えるペプチド抗原を設計し、免疫原性評価のために4つのアミノ酸配列フレームに分類した。第1のフレームは、PRRSV株MD001の配列に基づいて、GP5外部ドメインのC末端残基Eグルタミン酸で始まり、GP5タンパク質のシグナル配列中に5つの追加のアミノ酸残基を含んで、外部ドメインのN末端まで伸長することにより、GP5.1MD001A26-E65ペプチド抗原配列番号29として表4に示すような40merのペプチド抗原を作製した。この設計は、必要であれば、GP5ペプチド抗原の中心部のCys残基がMペプチドの外部ドメインとジスルフィド結合を形成することができる。第2のドメインは、GP5.1MD001A26-E65ペプチド抗原のシグナル配列中への別の5つのアミノ酸残基による、N末端での伸長で得られた、45merのペプチドGP5.2MD001V21-E65配列番号30であり、C24とC48の間の分子内ジスルフィド結合により、GP5の外部ドメインの局所立体構造の維持が可能になった。この設計により、Mタンパク質の非存在下で、GP5の外部ドメインの大部分に対する特異的抗体の誘導が可能になった。第3のフレームは、外部ドメインの11merのGP5HV2領域を除外したことを別として、第2フレームペプチド抗原GP5.2MD001V21-E65をモデルにして、34merのペプチド抗原GP5.3V21-D54配列番号9を得た。この設計により、GP5の外部ドメインの高度に保存された中心領域のB細胞認識が可能になる。第4のフレームGP5.4は、GP5タンパク質の外部ドメインの中央に位置するループ構造を対象とし、PRRSV株MD001配列に基づく25merの環状ペプチドGP5.4C24-C48になった。株間の変異に適応させるために、北米型のJXA1/MD001及びJXA1/NJ-aのPRRSV株配列に従って第3及び第4アミノ酸フレームのペプチド抗原をモデルにしたコンビナトリアルペプチドを、GP5.3JXA1/MD001V21-D54配列番号32、GP5.3JXA1/NJ-aV21-D54配列番号33及びGP5.4NJ-a/JXA1/MD001C24-C48配列番号34として設計した。GP5外部ドメインペプチド免疫原性に対するMタンパク質の外部ドメインの影響を評価するために、MD001配列に基づいて以下の配列:MGSSLDDRCHDSTAPQKVLLAFSITY配列番号93を有する26merの外部ドメインペプチドを、評価用に設計したM1-Y26。PRRSVの構造は、ウイルスRNAと結合したヌクレオカプシドタンパク質からなる。この核タンパク質は、脂質エンベロープに囲まれ、そのエンベロープ中に以下の6つの構造タンパク質が埋め込まれている:GP2、GP3、GP4、GP5ならびに非グリコシル化タンパク質M及びEORF2b。GP5及びMは、エンベロープ内で最も豊富なタンパク質であり、その他のエンベロープタンパク質の存在量はより少ない。GP5は、PRRSV防御免疫のための主要な標的であり続けてきたが、PRRSVの変異性、ならびにGP2及びGP3も臨床学的及びウイルス学的防御にいくらか関わっている一方、GP2、GP3及びGP4由来の抗原ペプチドに結合する実証されたポリクローナル抗体もPRRSVに対する中和活性を示すという最新の知見を考慮して、GP2、GP3及びGP4由来の選択された抗原ペプチドも、PRRSVワクチン製剤中に組み込むために設計し、スクリーニングし、同定した。具体的には、表3に示すような抗原ペプチドGP2BエピトープV111-L136配列番号10、GP3BエピトープC57-C75配列番号11、GP4BエピトープC52-C69配列番号12を、免疫原性及び交差反応性評価のために、PRRSVJXA1株配列に基づき設計した。種々のPRRSV株の相同GP5、GP2、GP4及びGP4由来のBエピトープ配列も、ペプチド抗原設計の参照のために例として表3にリスト化する。GP5、GP2、GP3、及びGP4由来のこれらのBエピトープクラスターペプチド抗原はまた、表5に示すように、GP5.1及びGP5.2フレームについてC末端配列番号37及び38又はN末端配列番号39~46でのいずれかで、人工コンビナトリアルThペプチド配列番号35に個々に結合し、それらの長さが短い性質を克服してこれらのペプチド抗原の免疫原性を増強させた。ワクチン製剤本発明のペプチドベースPRRSVワクチンの例示される使用において、アミノ末端又はカルボキシル末端でLys-Lys-Lys-εNLys配列番号36又はεNLysスペーサーを介して、人工コンビナトリアルTh配列UBITh登録商標3配列番号35などの外来性のThエピトープに結合するか又は結合しない、表3~7に配列番号9~90としてリスト化されるようなレセプター結合/中和部位又はTヘルパーエピトープクラスター部位を有する免疫原ペプチドとして含むワクチン製剤を、市販の油性ワクチン送達ビヒクルであるモンタニドMontanideISA50V2を用いて供給業者の推奨手順に基づいて、油中水型エマルションに製剤化した。オレイン酸マンニドmannideoleateの油性アジュバント組成物であるモンタニドMontanide登録商標ISA50V2Seppic、パリ、フランス及びブタワクチンに通常用いられるミネラルオイルを、等容量の水相ペプチドPBS溶液で乳化した。ペプチド免疫原を、特定のプロトコル例えば、エマルション中のペプチド比及び総ペプチド濃度に従って、約25~75μg/mLでそれぞれのエマルションに製剤化した。これらのエマルションベースのワクチン製剤を、他に特記しない限り、1部位当たり0.25mL~0.5mLでモルモットに、又は1部位当たり1mLで子ブタに筋肉注射した。デザイナーペプチドワクチン製剤でのモルモット及び子ブタの免疫化モルモットにおいて行った免疫原性研究について、成熟した無感作の雄及び雌DuncanHartleyモルモット体重300~350gを、1群当たり3匹で用いた。2回用量として0wpi及び3wpiに筋肉内IMに特定のワクチン製剤を投与して動物を免疫化した。これらのワクチン製剤は、免疫化の前に約30分間室温に放置し、約10~15秒間攪拌しなければならない。初回免疫化後0週目、3週目及び5週目wpiに、血清サンプル用に血液を採取した。ペプチド免疫原及びワクチン製剤の免疫原性評価のために、実施例1及び2に記載されるように、直接結合力価について標的ペプチドベースのELISAによって、ならびに交差反応性力価についてPRRSVによりコトランスフェクトされた細胞ベースのIFAによって、これらのサンプルをテストした。特定病原体不在SPF農場由来の約4週齢の子ブタを、免疫原性研究のために耳標を付け、研究プロトコルに従ってグループ化した子ブタ3~5頭/群。これらの群を、0週目及び4週目に筋肉内にワクチン製剤を投与して免疫化した。1つの研究において、以前にPRRSV感染があった通常の農場由来の子ブタを用いて、感染ブタと本発明のマーカーワクチン製剤をワクチン接種したブタとを区別するために、診断ELISAテストの組合せを用いることにより、抗PRRSV抗体の存在下でのデザイナーPRRSVペプチド抗原の別個の免疫原性を評価し、PRRSVマーカーワクチン製剤に対するこれらのブタの応答を測定した。初回免疫時、3~4週目の第1回追加免疫時、及び5~6週目の追加免疫から2週間後に血液サンプルを採取し、血清サンプルを調製し、実施例1及び2に詳述するように免疫原性及び交差反応性の評価のための複数の血清学的テストに供した。PRRSVGP5タンパク質外部ドメイン配列から設計したペプチド免疫原の最適化及びランク付け調製した多数のGP5外部ドメインペプチド免疫原の中から9個をエマルション製剤に製剤化して、初回及び追加免疫の免疫化スケジュール後のそれらの相対的な免疫原性を、図示及びランク付けした。表8から分かるように、PRRSVMD001配列に基づくペプチド免疫原4020Kc配列番号38は、標的ペプチドELISA>1log10及びIFA力価の両方に基づいて、ペプチド免疫原4020Kb配列番号37よりも免疫原性が高い。したがって、アミノ酸配列フレーム2GP5.2設計は、フレーム1GP5.1よりも優れている。ペプチド免疫原4020Kcを、実施例6に詳述するように、PRRSVMD001によるPRRSV負荷研究の大部分に用いた。表8に示すように、PRRSVMD001由来の配列を有するフレーム3GP5.3で設計されたペプチド免疫原4048Kb配列番号39は、ペプチド4020Kcとほぼ同じ免疫原性を有することが見出されたが、そのIFA力価は、ペプチド免疫原4020KcのIFA力価よりも高かった。ペプチド免疫原4048Kbと比較した場合に、ELISA及びIFAの両方によって実証されるような類似の免疫原性が、第3フレームGP5.3に基づいて設計された別のペプチド免疫原4050Kb配列番号40で見出された。したがって、フレーム3は、GP5B細胞エピトープクラスター抗原提示のためのより有利な設計フレームとみなされた。ウイルス株の適用範囲を広げるために、本発明者らは、アミノ酸配列フレーム3に基づいて、例えばペプチド免疫原4052Kb配列番号41及びペプチド4124Kb配列番号42のような、いくつかの関連するコンビナトリアルペプチド抗原の設計に進み、単一配列GP5ペプチド4048a配列番号9及び4050a配列番号31と比較した場合の抗体反応性の幅についてテストした。MD001及びJXA1由来のGP5.3フレーム配列との二重反応性が、ペプチド4052Kb配列番号41を用いた免疫化により得られた免疫血清について見出されたことから、MD001及びJXA1の両方の適用範囲の幅が実証された。GP5.3ペプチド抗原4124a配列番号30及び4124Kb配列番号42を、ペプチド免疫原のコンビナトリアル性をさらに拡大するために設計し、それらの各々の免疫原性について比較した。表8に示すように、ELISA及びIFAの両方によって示されるような免疫原性の著しい増強が、ペプチド抗原4124aと比較した場合にペプチド4124Kbで見出され、ペプチド抗原4124aに結合した場合の人工コンビナトリアルThペプチド配列番号35の免疫原性増強効果がわかった。GP5のループ構造を維持するようにN末端及びC末端の両方でアミノ酸を減らすことにより、ペプチド抗原4094a配列番号35及びそのより高い免疫原性型のペプチド抗原4094Kb配列番号43の設計を得た。両方のペプチド抗原が、このような配列トリミングの後に、低下した免疫原性を示したので、人工的に構築したループ構造C24-C48は、GP5外部ドメインの重大な意味を持つ部分を残しており、それにより増強される免疫原性は、ペプチド抗原4124a及び4124Kbの構造中にN末端及びC末端の両方から伸長することによって、最適に組み込まれることができる。すべての評価において、人工コンビナトリアルThペプチド配列番号35の、ペプチド抗原4020b及び4020cの場合に見られるようなC末端への付着結果として、4020Kb及び4020Kcが生じる、又は4124aのようなN末端への付着結果として、4124Kbが生じるはすべて、各々のペプチド抗原が、より優れたペプチド免疫原になることを促進した。ペプチド4094及び4124系列のペプチド抗原を、実施例7に記載されるようにPRRSVJXA1株によるPRRSVGP5ベースの負荷研究を追跡するために、エマルションワクチン製剤に調製した。ペプチド免疫原4124Kbは、エマルションの単回投与にもかかわらず、高病原性PRRSVJXA1株による感染からの無感作子ブタの完全な20頭/20頭=100防御の成功が実証された群5一方、ペプチド免疫原4094系列は、2回用量の免疫化の後に最適以下の防御4頭/5頭=80をもたらした。GP5Bエピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性へのPRRSV外部ドメインMペプチドの効果GP5及びMは、PRRSVエンベロープ内で最も豊富なタンパク質であり、これらの2つのタンパク質は、それらの外部ドメイン中にジスルフィド結合ヘテロダイマーを形成して、マクロファージの細胞表面上のシアロアドヘシンレセプターCD163に対するリガンドとして作用する。完全長M外部ドメインペプチド抗原26merの長さを調製し、1:1及び1:10の比で完全長GP5外部ドメインペプチド免疫原4020Kb又は4020Kcと混合して、GP5外部ドメインペプチド抗原4020Kb及び4020Kcの両方の免疫原性に対するこの外部ドメインMペプチドの影響を評価した。表9に示すように、26merの外部ドメインMペプチドは、GP5ペプチド免疫原4020Kb及び4020Kcと等比で混合した場合、驚くほどの免疫原性であることが見出され、GP5ペプチド免疫原4020Kb及び4020Kcに対するMの相対免疫原性は、ペプチドベースのELISAによって測定されるように、それぞれ約1000倍及び100倍にランク付けされた群1及び群2の比較;群3、群4及び群5の比較。GP5ペプチド免疫原4020Kcに対するIFA力価はまた、用量依存的に著しく抑制された群3、群4及び群5の比較。リガンド-レセプター相互作用は、マクロファージ上のシアロアドヘシンのレクチン活性及びGP5糖タンパク質上のシアル酸に依存するので、PRRSVエンベロープ中のこの主要タンパク質に結合するための抗体の誘発を可能にする、GP5の免疫原性を保存することが重要である。したがって、Mペプチドは、エンベロープ上でのGP5との共有結合が示唆され、リガンドとしてのGP5/M複合体の一部であるにもかかわらず、B細胞エピトープクラスターペプチド抗原ベースの構成成分における本発明者らの追跡PRRSVワクチン設計において除外された。PRRSVGP5B細胞エピトープクラスターペプチド抗原のIFA力価に対する様々な用量のPRRSVThプールの効果最適以下の免疫原性を有するGP5外部ドメインの中央ループ構造を提示するGP5ペプチド抗原4094aC24-C48を、子ブタにおける本研究に用いて、B細胞エピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性に対する様々な用量のPRRSVThペプチドの効果を調査した。PRRSVThエピトープクラスターペプチドの等比での混合物を、5、10、20~50で4094aペプチド抗原配列番号31にさらに補充した。B細胞エピトープクラスター抗原ペプチド及びT細胞エピトープクラスターペプチド抗原の両方を含むワクチン製剤を、30μg/mLの最適以下用量での初回及び追加免疫プロトコルを含む標準免疫化プロトコルによって子ブタに投与して、ペプチド抗原4094aの免疫原性に対するこのようなPRRSVThペプチドの効果をモニタリングした群1~群4。ELISAによって測定される免疫原性は、これらのモニタリングした群についてそれほど変化しなかったが、IFA力価により、天然PRRSVGP5タンパク質に対するこれらの子ブタにおいて誘発された抗ペプチド抗体の交差反応性の用量依存的な改善が実証された。比較のために、コンビナトリアルThエピトープを4094a配列番号31群5に共有結合させて含む、GP5B細胞エピトープクラスターペプチド免疫原4094Kb配列番号43が、ペプチド抗原4094a単独と比較して改善された免疫原性を有することも示した。これらの短いPRRSVThペプチド配列番号47~79は、免疫化宿主を刺激後にPRRSVに曝露すると再現応答recallresponseによってPRRSVに対する細胞性免疫を開始することが知られているが、B細胞エピトープクラスターペプチド抗原に共有結合しなかった。改善されたIFA力価によって示される抗体反応性の質の改善により、このようなT細胞性免疫反応の利点が示唆された。PRRSVへの曝露時にPRRSVに対するサイトカイン産生を含む広範な細胞性免疫を開始するために、これらの厳選されたPRRSVThペプチドを、すべての追跡負荷研究において、20重量/重量でPRRSVB細胞エピトープクラスターペプチド免疫原と共にワクチン製剤中に含めた。中和活性を有する抗原部位周辺の高い免疫原性を示すGP2、GP3及びGP4B細胞クラスターペプチドの同定及び設計GP2、GP3及びGP4タンパク質由来の抗原ペプチドに結合するポリクローナル抗体も、PRRSVに対する中和活性を示し、これらのPRRSVエンベロープの微量タンパク質も、PRRSVに対する臨床学的及びウイルス学的防御にいくらか関わっているという最新の知見を考慮して、表3に示すような特異的抗原ペプチドGP2BエピトープV111-L136配列番号6、GP3BエピトープC57-C75配列番号11、GP4BエピトープC52-C69配列番号12を、免疫原性及び交差反応性評価のために、PRRSVJXA1株配列に基づき設計し、候補ペプチド抗原として同定した。これらのBエピトープクラスターペプチド抗原を、そのN末端で人工コンビナトリアルThペプチド配列番号35に個々に結合し、モルモットにおける免疫原性評価のためのGP2、3、及び4B細胞エピトープクラスター抗原ペプチド配列番号44~46とした。人工コンビナトリアルTh配列に結合されているか又は結合されていない、中和活性を有する抗原部位の周辺で特異的に設計されたGP2、GP3及びGP4B細胞クラスターペプチドを個々に含むワクチン製剤を、それらの各々の免疫原性の評価のために、モルモットにおいてテストした。設計した多数のペプチド免疫原の中で、それらのN末端で人工コンビナトリアルThペプチドに結合した3つのペプチド配列番号44、45、及び46は、表11に示すように、30μg用量での単回投与でも、驚くほど高い免疫原性を示した。したがって、これらの高い免疫原性を示すペプチドは、PRRSVワクチンのための最終製剤に組み込むための傑出した候補である。モルモットにおける複合GP2、GP3、GP4及びGP5エピトープクラスターペプチド免疫原についての免疫原性評価PRRSVGP2、3、4及び5タンパク質由来のB細胞エピトープクラスターペプチド抗原の各々について設計を改良した後、初回刺激については総ペプチド濃度30μg/mLで、及び追跡追加免疫については3wpiに15μg/mLで、標準エマルションベースワクチン製剤中に等比で混合したこれらのペプチドの組合せを、他のペプチド抗原と混合したadmixed場合には個々のペプチド抗原の免疫原性についてテストし、且つ混合物中の1つ以上の抗原の免疫原性のいかなる意図されない抑制も評価及び回避するために、ペプチド抗原混合物の全体の免疫原性も評価した。この評価を行って、GP5/Mペプチド抗原混合物に対するMペプチドによる負の影響を回避した。表12に示すように、GP4Bエピトープクラスターペプチド抗原配列番号46を、GP3/4組合せ製剤としてGP3Bエピトープクラスターペプチド抗原配列番号45と、ならびに、GP3/4/5組合せ製剤としてGP3配列番号45及びGP5配列番号42と、又は、GP2/3/4組合せ製剤としてGP2配列番号44及びGP3配列番号45と混合した場合、標的ペプチドベースのELISAによって判断したGP4ペプチド抗原の免疫原性は、GP3標的ペプチドと混合した場合には強いままであったが、3種のペプチド抗原混合物中にある場合には、著しく弱まった。GP2及びGP3エピトープクラスターペプチド抗原の免疫原性は、GP4ペプチド抗原と比較して、単一のペプチド抗原と同じ免疫原性を維持した。したがって、GP2及びGP3エピトープクラスターペプチド抗原は、免疫反応適用範囲の幅を広げるために、任意のPRRSVペプチド抗原混合物にさらに確実に用いることができる。GP2、GP3及びGP4が、ウイルスエンベロープ上の微量成分であるという事実にかかわらず、対応する天然PRRSVタンパク質抗原との交差反応性を示す妥当なIFA力価が、GP5抗原ペプチドの非存在下でペプチド抗原混合物によって得られた例えば、群1、2及び4。PRRSVThエピトープクラスターペプチド抗原を補充したGP5由来のペプチドベースのPRRSVワクチンは、PRRSVMD001株による負荷から子ブタを防御したPRRSV感染からのブタの防御において、PRRSVGP5B細胞エピトープクラスターペプチド抗原の有効性を証明するために、3つの連続した免疫化及び負荷研究が台湾動物技術研究所ATITによって行われた。PRRSVGP5Bエピトープクラスターペプチド抗原によって生成されたワクチン製剤を客観的に評価するために、すべての製剤をコード化した。ブタコレラ、仮性狂犬病、萎縮性鼻炎、マイコプラズマハイオニューモニエ、口蹄疫、ブタ赤痢、疥癬、及びアクチノバチルスプルロニューモニアを含めた病原体がないことを保証するために、SPFブタを定期的にモニタリングした。PRRS1001S、1002S及び1003S研究のすべての群で、GP5Bエピトープクラスターペプチド免疫原4020Kc配列番号38及び4052Kb配列番号41を使用し、いくつかの製剤パラメータにわずかな変動があった。これらの製剤は、4020Kc抗原ペプチドとして群1及び2で、ならびに4052Kb抗原ペプチド由来ワクチン製剤として群3及び4で等価であるとみなされた。プールされた等比のPRRSVThエピトープペプチド混合物JXA1配列に基づく配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、76を10重量でそれぞれのワクチン製剤に補充して、細胞性免疫を付与することによって、PRRSVGP5ペプチド抗原の免疫原性をさらに増強した。トランスジェニックSPF農場を汚染しないために、これらの研究を2つの場所で行った。すなわち、免疫化の部分のみを、これらの免疫化/負荷研究への参加のために4週齢のSPFブタを提供したトランスジェニックSPF農場で行った。この農場はATITによって運営され、台湾北部のHsianShan、HsinChuの隔離された区域にある。4週間の初回及び追加免疫の免疫化プロトコルの完了後、これらのSPFブタを、負荷研究のために台湾南部にある十分に管理された別の農場に移動した。PRRSVの米国株は台湾に蔓延しているので、2つの米国株MD-001及びAMERVAC-PRRSを、これらの負荷研究に採用した。ウイルス負荷後、IFA及びウイルス血症テストのために、血清サンプルを採取した。最終的に、これらの動物を安楽死させ、肉眼検査及び病理学検査に供した。SPF子ブタは、1群当たり5頭で、研究設計に基づいてグループ化した。表13に示すように、血液サンプルを採取した。採取した全ての血清サンプルをPRRSV-ORF5IFAテストrVV-PRRSORF5発現法によるによってテストした。注射後の臨床的観察各々のワクチン投与の前及び後の全ての子ブタを、局所の反応源性及びアレルギー反応を含む反応及び全身性の呼吸困難、食欲、下痢、咳、CNS/SS、及びアレルギー反応を含む反応についての臨床的観察に供した。研究の間、局所反応源性に関連した腫脹が時折見出されたが、わずか3~4日間しか持続せず、それ以上の差は観察されずに正常な状態に戻った。研究対象の全ての動物について、全身性の有害反応は観察されなかった。ウイルス負荷後の臨床的観察全ての免疫化ブタは、ウイルス負荷を受けた後のモニタリングの期間中、PRRSに特有の臨床徴候を示さなかった。免疫化及び負荷後のIFA検出及び肺病変PRRSVに対する特異的抗体は、免疫化後に生成し、表14に示すように、4及び6wpi免疫化後の週数にIFAによって検出されたように、高力価に達した。表14に示すように、コントロール群の動物はいずれも、負荷ウイルスストックで表される場合にPRRSVGP5タンパク質の免疫原性が弱いという性質に大部分起因して、PRRSV負荷研究の後でもPRRSVGP5タンパク質に対する抗体を誘発しなかった。ワクチン接種群は、ウイルス負荷後2wpc負荷後の週数に、高いIFA力価を維持した。PRRSVGP5Bエピトープクラスターペプチド抗原ワクチン製剤群1及び2について4020KCならびに群3及び4について4052Kbで免疫化した20頭の子ブタのうち18頭は、1つの病変も検出されることなく、完全に防御された防御率90。群3及び4の子ブタのうち2頭には、軽微な病変が検出された。対照的に、図7A及び7Bに示すように、804頭/5頭のブタには、間質性肺炎の重度の病変が認められた。ATITのPRRSV研究室で行われた広範な負荷テストに基づいて、PRRSVGP5タンパク質のより高いIFA力価は、PRRSV負荷に対する完全防御とよく相関した。ウイルス血症検出PRRSVウイルス量検出のためにPR-PCR法を用いたところ、全てのワクチン接種ブタにおいて、検出可能なウイルス量は認められなかった。これは、肺における防御有効性の結果と一致している。これらの2つのウイルス株は、感染後に重篤な症状を引き起こさないが、20頭中18頭のワクチン接種ブタにおいて、ウイルス血症が認められず、かつ病理学的結果がまったく認められなかったことから、PRRSVGP5ベースのワクチン製剤によって付与される防御有効性の証明概念が実証された。PRRSVThエピトープクラスターペプチド抗原を補充したGP5由来のペプチドベースのPRRSVワクチンは、単回の免疫化スケジュールならびに初回及び追加免疫の免疫化スケジュールの両方の後で、高病原性PRRSVNVDC-JXA1株による負荷から子ブタを防御した中国PRRSVJXA1負荷モデルの背景:2006年、中国において、当初は知られていなかった、PRRSの症状を伴ういわゆる高熱病の未曾有の大規模流行があり、これは10を超える省自治都市又は自治区に蔓延して、2,000,000頭を超えるブタに発症し、約400,000頭の致死例を出した。典型的なPRRSとは異なり、多数の成熟雌ブタも高熱病に感染した。この非定型PRRSの大流行は、当初、神経症状例えば、震え、高熱40~42°C、紅斑性白化皮疹などを示すブタコレラ様疾患として同定された。免疫学的分析と共に行われた剖検により、複数の臓器が高病原性PRRSVに感染していることが明確に示され、重度の病理学的変化が観察された。EmergenceofFatalPRRSVVariantsUnparalleledOutbreaksofAtypicalPRRSinChinaandMolecularDissectionoftheUniqueHallmarkにおけるKegongTianら2007PLosOnedoi101371journalpone0000526による協力で、ブタ感染モデルが中国において確立され、12頭のSPFブタ1群当たり4頭の子ブタの負荷のために、異なる起源を有する3つの代表的なPRRSV分離体JXA1、HEB1、及びHUB2を用いて、分離PRRSVの高病原性を再現した。各群において、2頭の子ブタに静脈内注射し、両方とも6~8日以内に死亡したことから、テストしたPRRSV株の高い病原性が暗示された。同様に、各群の他の2頭の子ブタに鼻腔内接種すると、それらは3~6日以内に高熱病の顕著な徴候例えば、高熱、血斑、点状出血、震え、及びランピングlampingなどを示し、両方とも注射後10日目に死亡した。その後、ウイルス分離体を感染ブタからうまく回収し、PCR検出及びEMによって確認した。剖検を行って、免疫学的効果及び病理学的病変を評価した。ほぼ同じ病理学的変化肺、心臓、脳、腎臓、肝臓などにおいてが、高熱流行中に屠殺されたブタにおいて観察されたので、中国における高熱病の2006年の大流行は、ブタ集団における高病原性PRRAV感染によって引き起こされたことが確認された。PRRSV単離体の1つであるJXA1は現在、中華人民共和国PRCガイドラインの通り、子ブタにおけるPRRSVワクチンの防御有効性を検証するための標準化負荷研究における標準ウイルスとして用いられている。PRC政府ワクチン製品ガイドラインによる妥当なPRRAV負荷及びワクチンの有効性の定義4週齢の子ブタを、ペプチドベースのPRRSVワクチン製剤で1回又は2回、2週間の間隔でワクチン接種した一方、1群はワクチン未接種コントロールとして保持した。それらの全ての子ブタを、PRRSVNVDC-JXA1高抗原性ウイルス3mL10E5TCID50を含むを用いて耳の後ろに筋肉注射で負荷した。体温を21日間毎日観察した。この負荷研究は、5頭中5頭の動物が負荷時に発熱を伴う病気になり、かつ5頭中少なくとも2頭の動物が死亡する場合に、妥当とみなす。ワクチンが防御的であるとみなされるためには、免疫化したブタの5頭中少なくとも4頭が健康を維持していることが必要である。南京の動物衛生ワクチン社AnimalHealthVaccinecompanyと共同でUBIにより行われた負荷研究、PRC2011年概要報告:上述のようにPRCの農業部刊行のガイドラインに従って、合計35頭のブタを血清陰性についてスクリーニングし、そのうち30頭をこの負荷研究のために選択した。詳細な動物の選択、ランダム化、グループ化、免疫化及び負荷研究、温度観察及び記録、ならびに死亡数を以下に記載する。中国江蘇省無錫市の農場由来の28日齢の健康な子ブタを選択した。南京のワクチン効力/ウイルス負荷テストセンターに本拠地を置く動物衛生ワクチン社で治験を行った。PRRS抗体テストキットLSI社、フランス、ロット番号2-VERPRA-001,Exp.2012-01及びPRRS抗原テストキット:PRRSRT-PCRインビトロ診断キットNSP21594-1680変異体株を用いて、PRRSV不在の動物を選択した。PRRS病原性株NVCD-JXA1は、ストックの10倍希釈物を作製して負荷テストに用い、動物1頭当たり3mlで動物に投与した。農場由来の合計35頭の健康な子ブタを、スクリーニングのために選択し、30頭を本研究に登録した。選択された全ての子ブタは、血清中のPRRS抗原及び抗体について陰性との結果が出た。登録された全ての子ブタを、1群当たり5頭で、群1~6の6群に無作為に割り当てた。ブタの頸筋の脇にある耳の真後ろに位置する部位に、筋肉内注射を行った。免疫化投与量及び群を表15にリスト化する客観的になるためにコード下で行った。群1は、PRRSV内在性TヘルパーエピトープペプチドJXA1配列に基づく配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、76の等比のプールを20重量で補充した、PRRSVGP5ペプチドGP5Bエピトープクラスターペプチド抗原4094系列、配列番号43に基づくワクチンで免疫化した。群2~5については、PRRSVGP5ペプチドGP5Bエピトープクラスターペプチド抗原4124、配列番号42を免疫原として用いた。ワクチン製剤中の最終ペプチド濃度は、30μg/mLであった。この製剤はまた、PRRSV内在性TヘルパーエピトープペプチドJXA1配列に基づく配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、76が等比で混合されたプールを、群2、3、及び4についてそれぞれ10重量すなわち、27.5μgのB:2.5μgのTのプール、20重量すなわち、25μgのB:5μgのTのプール及び50重量すなわち、20μgのB:10μgのTのプールで、PRRSVBエピトープ免疫原配列番号42に補充して含んだ。群5の動物は、単回投与しか受けなかったことを除いて、群4と同じワクチン製剤を受けた。群6は、いずれのペプチドでの免疫化も受けなかった、陰性コントロール群であった。本研究に最初に登録された30頭全ての子ブタについての抗体スクリーニング結果を、表16に示す。免疫化前にRT-PCRによりPRRSV抗原についてテストしたブタ由来の全てのサンプルの結果から、30頭中30頭が陰性であることがわかった一方、テストキットの陽性コントロールは185塩基対の増幅バンドが認められたことから、このテストシステムの有効性を確証した。無作為化後の全ての動物番号を表17に示す。PRRSV抗体のOD値の結果を、初回免疫化後0日目及び28日目について表18に示す。PRRSVJXA1負荷後の体温及び死亡数を、表19に示される温度°Cで観察した。要約すると、表19に示すように、コントロール群群6の全ての子ブタが、ウイルス負荷後の最初の数日中に病気になり、表20に示すように、2頭が死亡した5頭中2頭=死亡率40。この負荷研究下でワクチン接種を受けなかったコントロール群の結果は、PRCの農業部によって制定された負荷研究の妥当性判断基準及びガイドラインに適合した。コントロール群と対照的に、群1の動物は、80の生存率5頭中4頭及びわずか20の死亡率で防御された。なお、群2~5の全ての動物20頭中20頭が防御され、したがって100の防御がもたらされた。1つの主要な研究としてGP5Bエピトープクラスターペプチド抗原ベースのワクチン製剤を受けた25頭全ての動物を合わせるとすなわち、群1~5、25頭中24頭の動物が、わずか4の死亡率で高病原性PRRSVウイルス株JXA1による負荷を生き残った。この結果は、負荷を受けて数日中に40のブタが死亡し、5頭全ての子ブタが病気になった後に100の死亡率をもたらしたコントロール群と比較すると、驚くべきことである。PRRSVに対する広く防御的な抗体を誘発するための多成分PRRSVペプチドワクチンPRRSVは、主要な糖タンパク質であるGP5と、3つの他の微量な糖タンパク質、すなわち、GP2a、GP3、及びGP4を、ビリオンエンベロープ上に含み、これらの全てが感染性ビリオンの生成に必要である。GP4とGP5タンパク質との間に強い相互作用が存在することが見出されたが、他の微量なエンベロープ糖タンパク質GP2及びGP3とGP5との間の弱い相互作用も検出されており、その結果、多タンパク質複合体の形成を生じる。全体として、GP4タンパク質は、糖タンパク質間の相互作用を媒介するために重要であり、感受性宿主細胞へのウイルス侵入のためにCD163との相互作用を媒介する原因となるGP5に加えて、GP2aと共に、ウイルス付着タンパク質としての役割を果たすという結論に達した。PRRSVの変異性が高いために、広く有効なPRRSVワクチンの開発には、複数のウイルス株の防御が必要である。PRRSVマーカーワクチン成分の基礎として、内在性PRRSVThペプチドプール1について、JXA1配列に基づく配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、76、及びプール2について、配列番号80~90のプールを補充した、既に防御有効性が実証された4つのGP5ベースのPRRSVワクチン製剤配列番号38のGP5Bエピトープペプチド抗原4020Kc、配列番号41のペプチド抗原4052Kb、配列番号43の4094Kb及び配列番号42の4124Kbを用い、多タンパク質レセプター複合体でポリクローナル抗体を誘発するために、このペプチド混合物中に、実証された機能的中和/レセプター結合部位を提示する抗原ペプチドを組み込むことにより、ウイルス適用範囲の広い強力な多成分PRRSVワクチンの開発を可能にすることが非常に望ましい。PRRSVに対する著しい中和特性を示すGP2、GP3、及びGP4抗原ペプチド結合抗体を用いて8、これらの選択領域の周辺でペプチド抗原を設計し、実施例5に示すように各々のタンパク質から最も強力なペプチド免疫原をスクリーニングした。これらのペプチド免疫原を、ウイルス株の広範な適用範囲を目的とする多成分PRRSVペプチドワクチンとして、様々なワクチン製剤に組み込んだ。精巧な分析ツールであるLC/MS/MSツール及び十分に管理されたGMPペプチド製造プロセスが利用できるので、地域利用例えば、北米対欧州のためにカスタマイズされた再現性のあるワクチン製剤を合理的に開発できる。PRRSV感染動物、ワクチン接種されたPRRSV不在動物、又はワクチン接種されたPRRSV感染動物を同定するためのUBIDIVAシステム及びエピトープベースのマーカーワクチンの適用実施例1に示すように、プレートコーティングのための混合物としてPRRSVヌクレオカプシドタンパク質由来の2つの抗原ペプチド4171e、配列番号1及び4172e、配列番号2を組合せた後、PRRSV感染動物を検出するためのトレーサーとしてタンパク質-HRPコンジュゲートを用いることにより、UBIPRRSVNCELISAテストキットを確立した。このテストを、効果的なPRRSVマーカーペプチドワクチンの免疫原性をモニタリングするためにカスタマイズされた標的ペプチドベースのELISAと併用して、感染動物とワクチン接種動物の識別のためのPRRSVDIVAシステムを形成することができる。図5に示すように、PRRSVワクチン免疫原性研究に入る前にPRRSV陰性であることが事前のスクリーニングにより分かっている、正常な子ブタn=109由来の血清は、UBIPRRSVNCELISAテストで高い特異性109-1/109=99を示した。この群の次に、天然PRRSVGP5タンパク質に対する交差反応性を有し、標的ペプチドベースのELISAによって示されるようにGP5に対する高力価の抗体を含むことが分かっているLog10力価>=3、PRRSVGP5マーカーワクチン製剤を受けたブタn=45由来の血清は、PRRSVNCELISAテストによって陰性とスコア化され、このテストの特異性がさらに実証された。中央に示される3つの血清群についてのELISA測定値は、感染動物由来の純種のIFA陽性血清のものである。これらのサンプルは、IFA力価と並行して増加するELSIAOD450nm測定値を示した。右端の血清は、PRRSV感染を有することが分かっている米国の農場から採取したサンプルn=100であった。UBIPRRSVNCELISAで>56の血清陽性率が見出され、この農場におけるPRRSV感染の高い有病率を示している。UBIPRRSVNCELISA及びUBIPRRSVBエピトープマーカーワクチン標的ペプチドベースのELISAを併用して、PRRSV感染を有することが分かっている台湾の農場においてPRRSVマーカーワクチン製剤の免疫原性をモニタリングしたところ、いくつかの洞察に満ちた情報が観察された。第一に、図6A及び6Bに示すように、PRRSVワクチン免疫原性研究に登録された全てのブタは、PRRSVNSELISAで、カットオフ値よりもずっと高いs/c比を示し、陽性であることが分かった。このような感染はグレーの背景で強調表示した図に示され、テストした全ての動物が感染していた。第二に、これらの子ブタには高レベルのPRRSVNC反応性抗体大部分は母性由来MDAが存在するにもかかわらず、全てのペプチドベースのPRRSVワクチン製剤が、それぞれの標的ペプチドベースのELISAによって検出されたように著しい免疫原性を実証した。図6A及び6Bに示すように、全ての動物を、初回免疫化後0週間、4週間及び6週間を通して受けたワクチン製剤中に含まれる成分ペプチド抗原に対するそのペプチド特異的抗体力価について、モニタリングした。その各々が初回ならびに0及び4週目の追加免疫スケジュールでの1回用量当たり、合計30μg/mLでこれらのペプチド抗原を含むワクチン製剤GP2GP3、GP3、GP3GP4、GP4、又はGP5ペプチド抗原の中で、独立した高い免疫原性は、ほとんど全てのPRRSVGP2及びGP3中和部位由来のペプチドワクチン製剤と関連し、GP5ペプチド単独ワクチン製剤と関連していることが見出され、GP4中和部位由来のペプチド抗原は、他のPRRSVGP3ペプチド抗原と組合せると、免疫原性が若干損なわれた。中和抗体を誘発するために、GP2、GP3、GP4及びGP5タンパク質由来の中和及びレセプター結合部位の周辺で設計されたPRRSVBエピトープクラスターペプチド免疫原を組み込み、細胞性免疫を促進するために内在性PRRSVTヘルパーペプチドの混合物を補充した、コンビナトリアルペプチドベースのPRRSVワクチンが、PRRSVMD001及びJXA1株共に北米型の株による負荷研究のために計画されている。SPF農場におけるPRRSV感染の根絶のためのUBIのPRRSVペプチドベースのマーカーワクチン及びその診断DIVAシステムの採用マーカーワクチン製剤に用いられるPRRSVBエピトープクラスターペプチド抗原は、PRRSVヌクレオカプシドタンパク質由来の抗原ペプチドを含まない一方、感染ブタは通常、この主要な構造タンパク質に対する早期抗体を発現しているので、感染動物とワクチン接種動物を識別するための診断システム、従って診断DIVAシステムに、PRRSVNCELISA及びPRRSVBエピトープマーカーワクチン標的ペプチドベースのELISAを組み込むことは論理的である。UBIのPRRSVペプチドベースのマーカーワクチンは、PRRSVタンパク質上の中和及びレセプター結合部位に対する高力価のIFA陽性交差反応性抗体を誘発することができる。このようなマーカーワクチン製剤は、MLV又はウイルス溶解物ベースのPRRSVワクチンよりも効果的に、PRRSV感染を予防することができる。なぜなら、これらのタンパク質の免疫原性が、現行の生物学的ワクチンフォーマットで提示される場合に非常に弱いという性質のせいである。UBIの診断DIVAシステムとそのPRRSVマーカーワクチンの併用は、PRRSV感染による長期的問題を克服するために、以下の戦略に基づいて台湾のSPF農場で実行される。このSPF農場は、全ての病原体に対する厳密なモニタリング記録を継続しており、PRRSV感染のみを有する。この農場は、その現在のPRRSV感染を、従来の生物学的ワクチンでは、重大なバイオセキュリティリスクを負うことなく排除できない。UBIのPRRSVペプチドベースのマーカーワクチンを用いると、ワクチンの化学的性質に起因するこのようないかなるバイオセキュリティリスクも示さない。PRRSV感染したSPF農場におけるPRRSV根絶のための戦略この農場は、少なくとも2年間、UBIのPRRSVペプチドベースのマーカーワクチンを用いたワクチン接種プログラムを継続する。農場内の全てのブタを、0週間、4週間及び8週間、免疫化スケジュールを用いてワクチン接種し、少なくとも6ヶ月間モニタリングする。NC及びマーカーワクチン標的ペプチドに対する血清抗体力価を、PRRSVウイルス血症レベルと共に、PRRSVNCELISA、IFA及び定量的PCRqPCRを含めたアッセイによってモニタリングする。ワクチン接種プログラム開始6ヶ月後、ワクチン接種を受けた母親から生まれた子ブタはワクチン接種を受けずに、これらの子ブタにおける感染率についてUBIPRRSVNCによって1~3ヶ月間モニタリングする。全ての子ブタがUBIPRRSVNCELISAでの陰性反応性を示せば、この農場は、PRRSV感染に対して制御下にあるとみなすことができる。この農場はその後、先にPRRSV感染していた全てのブタを退去させる。このような退去までは、農場内の全てのブタは、PRRSVペプチドベースのマーカーワクチンで継続的にワクチン接種する。この農場は、PRRSVに対するブタの免疫を増強するために、PRRSVペプチドベースのマーカーワクチンを用いて全てのブタのワクチン接種を継続する。新たに導入した子ブタ及び成熟雌ブタが、PRRSVNCELISAでの血清陰性反応性に基づきPRRSV不在であることが見出された場合、この農場はPRRSV不在であることを宣言することができ、従って、PRRSV根絶プログラムの成功を宣言することができる。モニタリングに用いる指標UBIのPRRSVNCELISA及びPRRSVマーカーワクチン標的ペプチドベースのELISA、したがってDIVAは、この農場の全ての動物由来の血清を、反応性一貫性についてモニタリングするのに用いることができる。PRRSVNCELISAから導き出される陽性率及び平均OD値は、ワクチン接種及びモニタリングの期間中記録される。PRRSVNCタンパク質に対する移行抗体を有する場合があるしたがって、PRRSVNCELISAで陽性を示す1ヶ月齢未満の子ブタは、時間と共に減少する。環境中に循環しているPRRSVが存在しない、すなわち、新たな感染がない場合、これらの子ブタもまたPRRSV不在になる。その農場は、PRRSV感染した成熟雌ブタを急いで退去させる。PRRSVマーカーペプチドワクチンで処置することにより、先に感染していた成熟雌ブタから環境へのPRRSVの放出についての残余リスクはさらに低下し、したがって、農場全体がPRRSV不在状態に到達することが可能になる。表21は、このようなテストのためのサンプルサイズ必要量を、1頭のPRRSV陽性ブタを検出する確率について、95の信頼度で設定する。DIVA及び多成分PRRSVペプチド免疫原ベースのワクチン製剤を用いたパイロットPRRSV排除研究DIVAによる血清学的手段によってモニタリングされる、パイロットPRRSV排除研究は、通常のPRRSV感染農場において、多成分PRRSVペプチド免疫原を含む油中水型ISA50エマルションベースのワクチン製剤を用いることによって行われ、このような多成分PRRSVペプチド免疫原ベースのワクチン製剤を受けた動物による、PRRSVNC抗体陰性化の潜在力を評価した。より具体的には、PRRSVNCELISAによって陽性と出た4週齢の合計15頭の子ブタを、本研究のために5つの実験群に分類した。これらの子ブタを、0週間、4週間、8週間、免疫化及び採血bleedingスケジュールに基づいて免疫化し、初回免疫化の日から13週間モニタリングした。GP5配列番号42、GP2配列番号44、GP3配列番号45及びGP4配列番号46由来のPRRSVBペプチド免疫原を、種々の組合せ例えば、群1及び2についてはGP5、GP2、GP3、及びGP4;群3についてはGP5、GP3及びGP4;群4についてはGP3及びGP4で、等比で、PRRSVBペプチド免疫原について1回用量当たり合計25μg/mLで混合した。これらの製剤には、群2についてはPRRSVThペプチド同じく等比で混合した、配列番号47、51、52、55、59、61、63、67、70、74、及び76を、群1、3及び4についてはPRRSVThコンビナトリアルペプチド配列番号80~90を、20重量すなわち、1回用量当たり5μg/mLでさらに補充した。PRRSV感染を特定するために、NCに対する血清抗体反応性をPRRSVNCELISAによってモニタリングする一方、種々のワクチン製剤によってもたらされる免疫原性について、PRRSVマーカーペプチドワクチンBエピトープ成分に対する血清抗体力価を、対応するPRRSVGP2、GP3、GP4及びGP5ペプチドベースのELISAによってモニタリングした。群5の動物は、PRRSVペプチドベースのワクチン製剤を受けず、陰性コントロール群としての役割を果たした。群1~4の全てのブタが、それぞれのマーカーワクチン標的PRRSVBGP2、GP3、GP4及びGP5ペプチドに対する抗体を発現したことが、それぞれのPRRSVペプチドベースのELISAによって検出され、特異的抗体力価は、初回免疫化から4週目の第2回免疫化の後に3Log10よりも高く、モニタリングされた13週間の間ずっと高いままであった。しかし、PRRSVNCタンパク質に対する抗体反応性は、表22に示すように、初回免疫化後およそ6~8週目で最大反応性まで増大した後、初回免疫化後10週目までにベースライン付近まで低下し、モニタリング期間中の初回免疫化後13週目でベースラインのままであった。対照的に、PRRSVペプチドベースの免疫原を含むワクチン製剤を受けていない、群5の動物由来の血清は全て、PRRSVNCタンパク質に対する高い反応性を維持した。PRRSVNCタンパク質に対する抗体は、感染ブタに存在することが知られているので、多成分PRRSVペプチド免疫原ベースのワクチン製剤でワクチン接種されたブタにおける、PRRSVNCに対するこのような陰性化の驚くべき知見により、これらの多成分PRRSVペプチドベースのワクチン製剤の有効性がさらに確証された。したがって、DIVAの適用及びこれらの多成分PRRSVペプチド免疫原ベースのワクチン製剤は、広い用途を有し、PRRSV感染のモニタリング、予防、排除及び根絶のための緊急の必要性を満たす。"