"多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、bさらに分化した細胞を生じさせるために、少なくとも1つの成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地において前記内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも1つの成長因子がFGF10、bFGF、及びFGF7からなる群から選択される上記ステップと、cニコチンアミド、GLP-1、及びエキセンディン4からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップとを含む上記方法。多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるためにアクチビンAを含む分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、b前記内胚葉細胞にpdx-1mRNAをトランスフェクトして、さらに分化した細胞を生じさせるステップと、cニコチンアミド、エキセンディン4、及びGLP-1からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップとを含む上記方法。多能性幹細胞から島前駆細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、b島前駆細胞を作製するために、少なくとも1つの成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地において前記内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも1つの成長因子がFGF10、bFGF、及びFGF7からなる群から選択される上記ステップとを含む上記方法。前記分化培地がアクチビンAを含む、請求項1又は3に記載の方法。前記分化培地が血清を含む、請求項4に記載の方法。前記分化培地が血清を欠く、請求項4に記載の方法。ステップbの前記培地がノギンをさらに含む、請求項6に記載の方法。前記分化培地が血清代替代用物を含む、請求項4に記載の方法。前記分化培地がWnt3をさらに含む、請求項2又は4に記載の方法。前記分化培地が血清を欠く、請求項9に記載の方法。前記多能性幹細胞を培養するステップが、多能性幹細胞のコラゲナーゼ脱離クラスターをゼラチンコーティング表面上で培養することにより実施される、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞を含む、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。多能性幹細胞がヒト誘導多能性iPP細胞を含む、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。ステップaからステップbの間に、前記少なくとも1つの成長因子及び前記cAMP誘導剤を含む培地において前記内胚葉細胞を培養するステップをさらに含み、前記培地がRAを欠く、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。前記cAMP誘導剤がフォルスコリンを含む、請求項1、3、又は14のいずれか一項に記載の方法。dステップcの後に、EpCAMに結合する作用物質と前記島細胞を接触させるステップと、e前記作用物質に結合する細胞を選択するステップとをさらに含む、請求項1に記載の方法。ステップcから前記接触させるステップの間に、前記島細胞を分散させて、分散した島細胞を生じさせるステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。前記選択するステップの後に、前記分散した島細胞を再凝集させるステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。前記再凝集させるステップが、カルシウムをキレート化する作用物質の存在下で実施される、請求項18に記載の方法。前記カルシウムをキレート化する作用物質が、EDTA、EGTA、BAPTA、シトレート、及びホスフェートからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。前記接触させるステップの後に、前記分散した島細胞をスキャフォールド上に播種するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。前記再凝集させるステップが、ステップa、b、又はcに用いられるものより少ないグルコースを含む培地において実施される、請求項18に記載の方法。前記培地のそれぞれのグルコース濃度が5mM~100mMの間である、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。島細胞を作製するステップが、胚様体の生成なしに実施される、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。島細胞がインスリンを合成する、請求項1又は2に記載の方法。前記島細胞がグルコース応答性である、請求項1に記載の方法。島細胞がグルカゴンをさらに合成する、請求項26に記載の方法。前記島細胞がソマトスタチンをさらに合成する、請求項25又は27に記載の方法。前記内胚葉細胞がSox17及びFoxA2の発現によって特徴づけられる、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。前記内胚葉細胞がOct4を発現しない、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。ステップbからステップcの間に、膵臓十二指腸ホメオボックス1pdx1、ニューロゲニン3ngn3、ペアードボックス遺伝子4pax4、ホメオボックスタンパク質Nkx-2.2nkx2.2、ホメオボックスタンパク質NK-6相同体Ankx6.1及びv-maf筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体AMAF-Aからなる群から選択される分化因子をコードするmRNAを前記さらに分化した細胞にトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。ステップaが約5日間実施される、請求項1、2、又は3のいずれか一項に記載の方法。ステップbが約5日間実施される、請求項1又は3に記載の方法。前記培養するステップが約2日間まで実施される、請求項10に記載の方法。請求項1又は2に記載の方法に従って作製される島細胞の集団。請求項3に記載の方法に従って作製される島前駆細胞の集団。遺伝子改変されていない、請求項35又は36に記載の細胞の集団。活性成分としての請求項35又は36に記載の細胞の集団及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。治療的有効量の請求項35又は36に記載の細胞の集団を対象に移植し、それにより糖尿病を処置するステップを含む、その必要がある対象において糖尿病を処置する方法。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、bさらに分化した細胞を生じさせるために、少なくとも1つの成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも1つの成長因子がFGF10、bFGF、及びFGF7からなる群から選択される上記ステップと、cニコチンアミド、GLP-1、及びエキセンディン4からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップとを含む上記方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるためにアクチビンAを含む分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、b内胚葉細胞にpdx-1mRNAをトランスフェクトして、さらに分化した細胞を生じさせるステップと、cニコチンアミド、エキセンディン4、及びGLP-1からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップとを含む上記方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島前駆細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、b島前駆細胞を作製するために、少なくとも1つの成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも1つの成長因子がFGF10、bFGF、及びFGF7からなる群から選択される上記ステップとを含む上記方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載された方法に従って作製される島細胞の集団が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載された方法に従って作製される島前駆細胞の集団が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分としての本明細書に記載された細胞の集団及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、治療的有効量の本明細書に記載された細胞の集団を対象に移植し、それにより糖尿病を処置するステップを含む、その必要がある対象において糖尿病を処置する方法が提供される。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地はアクチビンAを含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を欠く。本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップbの培地はノギンをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清代替代用物を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地はWnt3をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を欠く。本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞を培養するステップは、多能性幹細胞のコラゲナーゼ脱離クラスターをゼラチンコーティング表面上で培養することにより実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞はヒト誘導多能性iPP細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップaからステップbの間に、少なくとも1つの成長因子及びcAMP誘導剤を含む培地において内胚葉細胞を培養するステップをさらに含み、前記培地はRAを欠く。本発明のいくつかの実施形態によれば、cAMP誘導剤はフォルスコリンを含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、dステップcの後に、EpCAMに結合する作用物質と島細胞を接触させるステップと、e前記作用物質に結合する細胞を選択するステップとをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップcから接触させるステップの間に、島細胞を分散させて、分散した島細胞を生じさせるステップをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、選択するステップの後に、前記分散した島細胞を再凝集させるステップをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、再凝集させるステップは、カルシウムをキレート化する作用物質の存在下で実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、カルシウムをキレート化する作用物質は、EDTA、EGTA、BAPTA、シトレート、及びホスフェートからなる群から選択される。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、接触させるステップの後に、分散した島細胞をスキャフォールド上に播種するステップをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、再凝集させるステップは、ステップa、b、又はcに用いられるものより少ないグルコースを含む培地において実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、培地のそれぞれのグルコース濃度は5mM~100mMの間である。本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞を作製するステップは、胚様体の生成なしに実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はインスリンを合成する。本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はグルコース応答性である。本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はグルカゴンをさらに合成する。本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はソマトスタチンをさらに合成する。本発明のいくつかの実施形態によれば、内胚葉細胞はSox17及びFoxA2の発現によって特徴づけられる。本発明のいくつかの実施形態によれば、内胚葉細胞はOct4を発現しない。本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップbからステップcの間に、膵臓十二指腸ホメオボックス1pdx1、ニューロゲニン3ngn3、ペアードボックス遺伝子4pax4、ホメオボックスタンパク質Nkx-2.2nkx2.2、ホメオボックスタンパク質NK-6相同体Ankx6.1、及びv-maf筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体AmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologAMAF-Aからなる群から選択される分化因子をコードするmRNAをさらに分化した細胞にトランスフェクトするステップをさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップaは約5日間実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップbは約5日間実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、培養するステップは約2日間まで実施される。本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の集団は、遺伝子改変されていない。他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び/又は科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似した、又は等価の方法及び材料は、本発明の実施形態の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法及び/又は材料が下に記載されている。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法、及び例は、例証となるのみであり、必ずしも限定することを意図するものではない。本発明のいくつかの実施形態は、例としてのみ、添付の画像を参照して本明細書に記載されている。今、図面を詳細に具体的に参照しているが、示された事項は例とするものであり、且つ本発明の実施形態の例証的論議を目的とすることを強調しておく。この点において、図面に関して記載される説明によって、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。本発明は、そのいくつかの実施形態において、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞、及びそれを作製する方法に関する。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明に示された、又は実施例によって例示された詳細に必ずしも限定されるわけではないことを理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施若しくは実行することができる。I型糖尿病は、膵島インスリン産生β細胞の自己免疫性破壊によって引き起こされる。インスリン投与は、最適なインスリン投与量を調整することが難しいため、その疾患の長期的合併症を防止しない。損傷細胞の制御されたインスリン産生細胞での代替は、I型糖尿病についての究極の治療法と考えられる。膵臓移植術は成功しているが、ドナーの不足によって非常に限定される。有糸分裂後のβ細胞の強制的増殖に代わるものは、自然の自己増殖能力を有する幹細胞のインスリン産生細胞への分化の誘導である。様々なグループが、子宮内発生中に働く、正常な分化経路に基づいた異なる分化プロトコールを示唆している例えば、D’Amour、NatureBiotechnology2006;Jiang、Stemcells、2007;及びKroonNatureBiotechnology2008参照。しかしながら、現在まで、胚性幹細胞の定方向分化は、β細胞と比較して、少量のインスリンを産生するのみである細胞を生じている。糖尿病を処置するのに有効であろう細胞集団を作製する試みにおいて、本発明者らは、新規の分化プロトコールを考案し、図4~11、18、及び表4に示されているように、その作製された細胞が高レベルのインスリンとグルカゴンの両方を合成することを実証した。具体的には、本発明者らは、インスリンC-ペプチド及びグルカゴンについての二重染色によって、作製された島における細胞の約3分の1がグルカゴンを産生しα細胞表現型、3分の2がインスリンを産生するβ細胞表現型ことを示した図6A~E。それゆえに、その分化過程は、天然の膵臓ランゲルハンス島の構造を再現する。このように、本発明の一態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、a多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化するために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、bさらに分化した細胞を生じさせるために、少なくとも1つの成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも1つの成長因子がFGF10及びFGF7からなる群から選択される上記ステップと、cニコチンアミド、GLP-1、及びエキセンディン4からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップとを含む上記方法が提供される。本明細書に用いられる場合、句島細胞は、以下の島特異的ポリペプチドホルモンの少なくとも1つを合成する細胞を指す:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。したがって、本発明の方法により作製された島細胞は、インスリンを産生するβ細胞;2グルカゴンを産生するα細胞;3ソマトスタチンを産生するδ細胞又はD細胞;及び/又は膵臓ポリペプチドを産生するF細胞と解釈され得る。典型的には、本発明のこの態様の島細胞は、ホルモンを分泌顆粒の形で分泌小胞中に貯蔵する。本明細書の上記で述べられているように、本発明者らは、本発明の方法を用いて、島細胞集団を作製することができ、その各細胞型の相対量が、天然の島における相対量すなわち、3分の2のインスリン産生細胞及び3分の1のグルカゴン産生細胞を反映することを示している。本明細書に用いられる場合、句多能性幹細胞は、3つの胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉へ分化する能力がある細胞を指す。一実施形態によれば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び/又は誘導多能性幹細胞を含む。句胚性幹細胞は、全ての3つの胚性胚葉すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉の細胞へ分化する能力があり、又は未分化状態のままである胚性細胞を指す。句胚性幹細胞は、妊娠後に形成される胚性組織例えば、胚盤胞から胚の着床前すなわち、着床前胚盤胞に得られる細胞、着床後/原腸陥入前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞EBCWO2006/040763参照、及び妊娠中の任意の時、好ましくは妊娠10週前に、胎児の生殖組織から得られる胚性生殖EG細胞を含んでもよい。誘導多能性幹細胞iPS;胚様幹細胞は、多能性が賦与されているすなわち、3つの胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉へ分化する能力がある成体体細胞の脱分化により得られる細胞である。本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような細胞は、分化組織例えば、皮膚などの体細胞組織から得られ、細胞を胚性幹細胞の特性を獲得するように再プログラムする遺伝子操作により脱分化を起こしている。本発明のいくつかの実施形態によれば、誘導多能性幹細胞は、体性幹細胞においてOct-4、Sox2、Kfl4、及びc-Mycの発現を誘導することにより形成される。本発明の胚性幹細胞は、よく知られた細胞培養方法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトインビボ着床前胚から、又はインビトロ受精IVF胚から得られる。或いは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期へ増殖することができる。ヒトES細胞の単離について、透明帯が胚盤胞から除去され、内部細胞塊ICMは、免疫手術により単離され、その手術において、栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングにより無傷ICMから除去される。その後、ICMは、その増殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ内にプレーティングされる。9~15日後、ICM由来増殖物は、機械的解離か又は酵素分解かのいずれかによって凝集塊へ解離され、その後、その細胞は、新鮮な組織培養培地へ再びプレーティングされる。未分化形態を示すコロニーは、個々にマイクロピペットにより選択され、機械的に凝集塊へ解離され、再びプレーティングされる。その後、生じたES細胞は4~7日ごとに定期的に分割される。ヒトES細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Thomsonら、[米国特許第5,843,780号;Science282:1145、1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133、1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844、1995];Bongsoら、[HumReprod4:706、1989];及びGardnerら、[Fertil.Steril.69:84、1998]を参照されたい。市販の幹細胞もまた本発明のこの態様と共に用い得ることは認識されているであろう。ヒトES細胞は、NIHヒト胚性幹細胞登録簿www.escr.nih.govから購入することができる。市販の胚性幹細胞系の非限定的例は、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、及びTE32である。さらに、ES細胞は、マウスMills及びBradley、2001、ゴールデンハムスター[Doetschmanら、1988、DevBiol.127:224~7]、ラット[Iannacconeら、1994、DevBiol.163:288~92]、ウサギ[Gilesら、1993、MolReprodDev.36:130~8;GravesMoreadith、1993、MolReprodDev.1993、36:424~33]、いくつかの家畜動物種[Notarianniら、1991、JReprodFertilSuppl.43:255~60;Wheeler1994、ReprodFertilDev.6:563~8;Mitalipovaら、2001、Cloning.3:59~67]、及び非ヒト霊長類種アカゲザル及びマーモセット[Thomsonら、1995、ProcNatlAcadSciUSA.92:7844~8;Thomsonら、1996、BiolReprod.55:254~9]を含む他の種からも得ることができる。拡張胚盤胞細胞EBCは、原腸陥入前の段階において受精から少なくとも9日後の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、内部細胞塊を露出させるために透明帯は、[例えば、タイロードの酸性溶液によりSigmaAldrich、StLouis、MO、USA]消化される。その後、胚盤胞は、標準胚性幹細胞培養方法を用いてインビトロで受精後少なくとも9日間で、且つ最長14日間までの間すなわち、原腸陥入事象前、全胚として培養される。EG細胞は、当業者に知られた実験技術を用いて、妊娠約8~11週ヒト胎児の場合の胎児から得られる始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は、解離され、小さな塊へ切断され、それは、その後、機械的解離によって細胞へ脱凝集される。その後、EG細胞は、適切な培地を含む組織培養フラスコ内で成長させる。細胞は、EG細胞と一致した細胞形態が観察されるまで、典型的には7~30日後又は1~4継代後まで、毎日培地を交換して培養される。ヒトEG細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Shamblottら、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726、1998]及び米国特許第6,090,622号を参照されたい。誘導多能性幹細胞iPS胚様幹細胞は、体細胞の遺伝子操作により、例えば、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のOct-3/4、Sox2、c-Myc、及びKLF4などの転写因子でのレトロウイルス形質導入により、体細胞から作製することができる[YamanakaS、CellStemCell.2007、11:39~49;AoiTら、GenerationofPluripotentStemCellsfromAdultMouseLiverandStomachCells.Science.2008Feb14.印刷物より先の電子出版;IHPark、ZhaoR、WestJAら、Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors.Nature2008;451:141~146;KTakahashi、TanabeK、OhnukiMら、Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell2007;131:861~872]。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、又はレシピエント細胞が有糸分裂で停止している場合には接合体への核移植により作製することができる。未分化幹細胞は、当業者により胚又は成体起源の分化細胞とは明らかに区別することができる、特徴的な形態であることは認識されているであろう。典型的には、未分化幹細胞は、高い核/細胞質の比、顕著な核小体、及び細胞間結合が不明瞭であるコンパクトなコロニー形成を有する。未分化幹細胞の追加の特徴は、下文でさらに記載されている。現在実施されているES培養方法は、主に、幹細胞増殖に必要とされる因子を分泌し、同時にそれらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用に基づいている。フィーダー細胞を含まない系もまたES細胞培養に用いられており、そのような系は、フィーダー細胞層の代替として、血清、サイトカイン、及び成長因子を補充したマトリックスを利用する。フィーダー層に基づいた培養マウスフィーダー層-ES細胞を培養するための最も一般的な方法は、ES細胞の増殖及び多能性を支援する血清又は白血病抑制因子LIFを含有する組織培地を補充したフィーダー細胞層としてのマウス胚性線維芽細胞MEFに基づいている[ThomsonJA、Itskovitz-EldorJ、ShapiroSS、WaknitzMA、SwiergielJJ、MarshallVS、JonesJM.1998.Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282:1145~7;ReubinoffBE、PeraMF、FongC、TrounsonA、BongsoA.2000.Embryonicstemcelllinesfromhumanblastocysts:somaticdifferentiationinvitro.Nat.Biotechnol.18:399~404]。MEF細胞は、ウシ胎仔血清を補充した培地中の12~13日目のマウス胚に由来する。これらの条件下で、マウスES細胞は、多能性幹細胞として培養中、維持することができ、それらの表現型的及び機能的特性を保存する。しかしながら、マウスES細胞と違って、外から加えられたLIFの存在は、ヒトES細胞の分化を阻止しない。さらに、フィーダー細胞の使用は、生産コストを大幅に増加させ、ヒトES細胞培養のスケールアップを非現実的なものにさせている。加えて、フィーダー細胞は、それらが幹細胞より成長しないように代謝的に不活性化されており、それゆえ、ヒトES培養の分割ごとに新鮮なフィーダー細胞を有する必要がある。現在のところ、バルク培養で調製された胚性細胞からのフィーダー細胞成分の分離は効率的に達成することができないため、フィーダー細胞層で調製されるES培養は、ヒト治療に適していない。ES細胞はまた、塩基性線維芽細胞成長因子bFGFを補充した血清代替物を用いる無血清条件下、MEF上で培養することができる[AmitM、CarpenterMK、InokumaMS、ChiuCP、HarrisCP、WaknitzMA、Itskovitz-EldorJ、ThomsonJA.2000.Clonallyderivedhumanembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandproliferativepotentialforprolongedperiodsofculture.Dev.Biol.227:271~8]。これらの条件下において、ES細胞のクローニング効率は、ウシ胎仔血清下より4倍高い。加えて、血清代替物下での6ヶ月間の培養後、ES細胞は、全ての3つの胚性胚葉を含有する奇形腫を形成するそれらの能力によって示されているように、それらの多能性をなお維持している。この系は、より十分に定義された培養条件を用いるが、培養中のマウス細胞の存在は、ヒト培養物を病原体に曝し、そのことが、細胞に基づいた治療におけるそれら使用を制限している。フィーダー細胞層としてのヒト胚性線維芽細胞又は成体ファロピウス上皮細胞-ヒトES細胞は、ヒト胚性線維芽細胞、臍帯血線維芽細胞、又は成体ファロピウス上皮細胞を用いて成長させ、維持することができる。これらのヒトフィーダー細胞上で成長した場合、ヒトES細胞は正常な核型を表し、アルカリフォスファターゼ活性を示し、Oct-4、並びにSSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、及びGCTM-2を含む他の胚性細胞表面マーカーを発現し、インビボで奇形腫を形成し、全ての重要な形態学的特性を保持する[RichardsM、FongCY、ChanWK、WongPC、BongsoA.2002.Humanfeederssupportprolongedundifferentiatedgrowthofhumaninnercellmassesandembryonicstemcells.Nat.Biotechnol.20:933~6]。包皮フィーダー層-ヒトES細胞は、米国特許出願第10/368,045号に開示されているように、ヒト包皮フィーダー層上で培養することができる。包皮由来フィーダー細胞層は、ヒトES細胞を培養するのに適した完全に動物質を含まない環境からなる。加えて、包皮細胞は、それらの誘導から42継代もの間、培養中、維持することができ、ES細胞に比較的一定した環境を提供する。これらの条件下で、ヒトES細胞は、代わりのプロトコール例えば、MEFで成長した細胞とは機能的に区別できないことが見出された。分化後、ES細胞は、インビトロで、全ての3つの胚性胚葉に関連した遺伝子を発現し、インビボで、全ての3つの胚葉から生じた組織からなる奇形腫を形成した。加えて、ヒトファロピウス上皮細胞又はヒト胚性線維芽細胞と違って、包皮フィーダー層上で培養されたヒトES細胞は、少なくとも87継代の間、多能性且つ未分化状態で培養中維持された。フィーダーを含まない培養幹細胞は、培養培地の存在下で細胞外マトリックス例えば、Matrigel登録商標又はラミニンなどの固体表面上で成長させることができる。多能性幹細胞の増殖後、本発明は、多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるための分化培地中でのそれらの培養を企図する。本発明は、接着条件下細胞外マトリックス又はゼラチンコーティングプレートに付着している又は懸濁下非組織培養処理プレート内で多能性幹細胞を培養することを企図する。企図される細胞外マトリックスには、単独又は様々な組合せでの、MATRIGEL登録商標BectonDickenson、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などが挙げられるが、それらに限定されない。接着培養は、適切な成長培地と接触した細胞が存在し、基質へ接着した状態で生存可能な又は増殖することができる培養を指す。非接着培養は、細胞が、典型的には、適切な成長培地と懸濁状態にあり、基質に接着していない状態で生存可能な又は増殖することができる培養を指す。一実施形態によれば、多能性幹細胞はまず、それらが増殖した照射された線維芽細胞のその最初の表面から、例えばコラゲナーゼを用いることにより、脱離し、その後、分化のために異なる接着表面例えば、ゼラチンコーティング表面上に再びプレーティングされる。別の実施形態によれば、多能性幹細胞は、それらが増殖した照射線維芽細胞の同じ表面上で分化する。句内胚葉細胞は、その少なくとも50、より好ましくはその少なくとも70が、2つのマーカーSox17又はFoxA2の少なくとも1つを発現する、細胞の集団を指す。好ましい実施形態によれば、細胞の20未満、より好ましくは細胞の10未満は、多能性についてのマーカー、例えば、Oct4を発現する。Sox17、FoxA2、又はOct4の発現レベルを決定する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、RT-PCR、免疫組織化学法などが挙げられる。多能性幹細胞から内胚葉細胞を作製する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、NodalNM_018055;NP_060525.3及び小分子例えば、Borowiakら、CellStemCell、4巻、4号、348~358、3April2009参照の使用が挙げられる。或いは、内胚葉細胞は、胚様体を経由して作製されてもよい。具体的には、hES細胞を、FGFを含まない懸濁状態で培養して、胚様体を生じさせることができる。内胚葉細胞は、EBから選び出すことができ、例えば、Segev、Fischman、Ziskindら、Stemcells、2004;223:265~74を参照されたい。一実施形態によれば、内胚葉細胞への分化は、アクチビンAの存在下で実行される。アクチビンAの例示的な濃度範囲には、1~500ng/ml、より好ましくは1~250ng/ml、より好ましくは50~200ng/mlが挙げられ、例えば、100ng/mlなどである。本発明のこの態様の特定の実施形態によれば、多能性幹細胞は、アクチビンA及びWntリガンドを含む培地中での最初の培養例えば、約2日間、並びにアクチビンAを含むがWnt-3を欠く培地中でのその後の培養例えば、1日間により内胚葉細胞へ分化する。典型的には、第1の培養培地において、第2の培養培地と比較して、より低い濃度の血清が存在してもよい。第2の培養培地において血清濃度を増加させることは、細胞の生存時間を増加させ、又は代わりに、細胞の増殖を増強し得る。第1の培地の血清濃度は、約0~約10の範囲にあってもよい。或いは、第1の培地の血清濃度は、約0~約2の範囲にあってもよい。或いは、第1の培地の血清濃度は、約0~約1の範囲にあってもよい。或いは、第1の培地の血清濃度は、約0.5であってもよい。特定の実施形態によれば、第1の培養培地と第2の培養培地の両方が血清を欠く。典型的には、血清の代わりに、代替物が加えられる。そのような代替物は、少なくとも0.1の濃度、例えば、少なくとも0.2、少なくとも1、少なくとも1.5、又は少なくとも2の濃度などの様々な濃度で供給されてもよい。血清代替物は、いろいろな所から、例えばInvitrogenknock-outserumreplacement商標及びSigma-Aldrichから、入手できる。血清に代わって用いることができる追加の作用物質はアルブミン、例えば、ヒト組換えアルブミンである。本発明者らは、血清が上記の培地から除去された場合、より後の段階でのノギンの添加が、細胞中に産生されるインスリンの量に相乗効果を生じることを示している。典型的には、本明細書の下文でさらに記載されているように、ノギンは、成長因子、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸と共にすなわち、プロトコールの段階bで加えられる。Wntリガンドの選択を最適化して、分化過程の効率を向上させることができる。Wntリガンドは、Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a、及びWnt-7aからなる群から選択されてもよい。一実施形態において、WntリガンドはWnt-1である。代わりの実施形態において、WntリガンドはWnt-3aである。分化過程が実行され得る、企図される培養培地には、例えば、Dulbeccoの改変Eagle培地DMEM、Gibco11965-092;KnockoutDulbeccoの改変Eagle培地KODMEM、Gibco10829-018;HamのF12/50DMEM基本培地、CMRL-1066が挙げられる。好ましくは、培養培地は、医療グレードの純度である。典型的には、培養培地は、約5mM~100mMの間、より好ましくは約10mM~50mMの間、より好ましくは約15mM~50mMの間、例えば、17mMのグルコース濃度を有する。本発明者らは、内胚葉細胞を膵臓系統すなわち、膵臓前駆細胞へ分化させるために一緒に用いることができる3つの作用物質の新規のカクテルを発見している。句膵臓前駆細胞は、膵臓細胞へ完全には分化していないが、膵臓細胞の少なくとも1つの型、例えば、インスリンを産生するβ細胞;グルカゴンを産生するα細胞;ソマトスタチンを産生するδ細胞又はD細胞;及び/又は膵臓ポリペプチドを産生するF細胞への分化にコミットした細胞の集団を指す。典型的には、膵臓前駆細胞は、膵臓系統に特徴的な表現型マーカー例えば、GLUT2、PDX-1Ηnf3β、PC1/3、β2、Nkx2.2、及びPC2のいくつかを発現する。典型的には、それらは、脱分化又は再プログラムされない限り、インビトロで単独で培養された場合、他の胚性胚葉の子孫を産生しない。多分化能膵臓前駆細胞である個々の細胞が存在する可能性があるが、集団内の細胞のそれぞれが1つより多い型の子孫を形成する能力を有することを意味するものではないことは認識されているであろう。したがって、多能性細胞の内胚葉細胞への分化後、細胞は、その後、線維芽細胞成長因子例えば、FGF10、FGF7、又はbFGF、cAMP誘導剤、及びレチノイン酸RAを含む培地中、分化する。本明細書の上記で述べられているように、内胚葉細胞の生成のための最初の培養が血清の非存在下で実施される場合、FGF、cAMP誘導剤、及びRAを含む分化培地はまたノギンを含んでもよい。線維芽細胞成長因子の企図される濃度範囲は、50pg/ml~50μg/mlの間例えば、50ng/mlである。本明細書に用いられる場合、用語cAMP誘導剤は、フォルスコリン若しくはNPAR--プロピルノルアポモルフィン、PKAのD2受容体アゴニストであり、cAMPを増加させるにより直接的にか、又はイソブチル-メチルキサンチンIBMXによって、若しくはcAMP特異的Ro20-1724、ロリプラム、若しくはエタゾレートなどのIBMX様活性を有する化合物によってホスホジエステラーゼを阻害することにより間接的にかのいずれかで、cAMP活性を誘導する化合物を指すが、より好ましくは、単独又は組み合わせて用いられる、イソブチル-メチルキサンチンIBMX又はフォルスコリンを含む群から選択される。フォルスコリンについての企図される濃度範囲は、1~100μMの間例えば、10μMである。レチノイン酸は、1nM~1mMの間例えば、1~10μMの濃度で用いられてもよい。ノギンの企図される濃度範囲は、50~500ng/mlの間例えば、100ng/mlである。ノギンはいくつかの供給源、例えば、Preprotechから市販されている。典型的には、上記のカクテルを含む分化過程は、約2~10日間例えば、5日間実施される。典型的には、添加される場合のノギンは、この培養するステップの全期間例えば、5日間、加えられる。上記のカクテルの存在下での分化の前に、内胚葉細胞は、さらなる分化のために、レチノイン酸を含まずFGF及びcAMP誘導剤を含む培地において前条件付けされてもよい。この前条件付けは、1~5日間の間例えば2日間、実施されてもよい。本プロトコールの最終分化ステップは、ニコチンアミド及び/又はエキセンディン4を含む培地中での成熟を含む。この成熟ステップは、30~60日間、続いてもよい。ニコチンアミドの企図される濃度範囲は、1~100mMの間例えば、10mMである。エキセンディン-4の企図される濃度範囲は、1~100ng/mlの間である。本発明者らは、インスリン産生細胞の濃縮が、EpCAMを発現する細胞について選択することによって実施され得ることを見出している。典型的には、選択するステップは、この細胞表面タンパク質を特異的に認識する能力がある抗体を用いて実施されるが、本発明は、ポリヌクレオチド又は小分子などの追加の作用物質を企図する。濃縮するステップは、蛍光活性化セルソーターFACSを用いることなどによる公知の細胞ソーティング手順を用いて実施されてもよい。本明細書に用いられる場合、用語フローサイトメトリーは、試料中の材料例えば、特定のマーカーを含む腎細胞の割合が、例えば、標識抗体をその材料に結合することによりその材料を標識し、その材料を含有する流体の流れを光線の中に通過させ、その試料から放射された光を一連のフィルター及び鏡により構成波長へと分離し、その光を検出することにより決定される、アッセイを指す。多数のフローサイトメーターが市販されており、例えば、BectonDickinsonFACScanandFACScaliburBDBiosciences、MountainView、CAが挙げられる。FACS分析に用いられ得る抗体は、SchlossmanS、BoumellLら、[LeucocyteTypingV.NewYork:OxfordUniversityPress;1995]に教示されており、いろいろな所で市販されている。EpCAM抗体が磁気部分に直接的か、又は同族結合分子を通して間接的かのいずれかで付着している場合、不均一な細胞集団は、磁気活性化細胞分離によりEpCAMについて濃縮されてもよい。EpCAM抗体が親和性部分に付着している場合、不均一な細胞集団は、同族結合分子での親和性精製によりEpCAM細胞について濃縮することができる。したがって、例えば、EpCAM抗体がビオチンに付着している場合には、不均一な細胞集団は、ストレプトアビジンのビーズ又はカラムでの精製によりEpCAMを除去することができる。その後、EpCAM細胞は回収することができる。例えば、EpCAM抗体が抗体又は抗体のFcに付着している場合には、不均一な細胞集団は、プロテインAのビーズ又はカラムでの精製によりEpCAMを除去することができる。その後、EpCAM細胞は回収することができる。本発明のこの態様の分化細胞が典型的には接着性クラスターとして成長するため、細胞ソーティングの前に、不均一な細胞集団は、好ましくは、分散剤を用いて分散されるべきであることは認識されているであろう。分散剤の例には、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、アキュターゼaccutase、及びトリプシンが挙げられるが、それらに限定されない。代わりに、又は追加として、研和もまた、細胞の分散を増加させるために実施されてもよい。EpCAM細胞の濃縮後、細胞は、典型的には、その再凝集を可能にする条件下で、少なくともさらに2日間、好ましくは8日間以内例えば、2~6日間培養される。典型的には、細胞は、例えば、EDTA、EGTA、BAPTA、シトレート、及びホスフェートが挙げられるカルシウムをキレート化する作用物質の存在下で再凝集される。特定の実施形態によれば、再凝集は、低いグルコース濃度すなわち、最初の分化段階のグルコース濃度より低いで実施される。本発明者らによって企図される濃縮相中のグルコースの例示的な範囲には、1~10mM、より好ましくは2~8mM、例えば、5.5mMが挙げられる。再凝集が起こるために、細胞は、培養皿例えば、低接着性結合プレート上で培養されてもよいし、又は固体支持体すなわち、本明細書の下文でさらに記載されているようなスキャフォールド上に播種されてもよい。本発明により企図される典型的なスキャフォールドには、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、デンプン、ポリアミノ酸、ポリプロピレンフマレート、ゼラチン、アルギネート、ペクチン、フィブリン、酸化セルロース、キチン、キトサン、トロポエラスチン、ヒアルロン酸、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、及びポリビニルアルコールから製作されているものが挙げられる。一実施形態によれば、スキャフォールドは、生体適合性ポリマーから製作されている。句生体適合性ポリマーは、生物体の細胞、組織、又は体液と接触した場合、免疫学的反応及び/又は拒絶反応などの有害作用を誘導しない任意のポリマー合成又は天然を指す。生体適合性ポリマーはまた生分解性ポリマーであり得ることは認識されているであろう。句生分解性ポリマーは、プロテアーゼなどによる生理的環境において分解するすなわち、破壊することができる合成又は天然のポリマーを指す。生分解性は、分解基質すなわち、生物学的材料、又はそのポリマーの一部であるその部分の入手可能性、生分解作用の材料例えば、微生物、酵素、タンパク質の存在、並びに酸素好気性生物体、微生物、又はその部分について、二酸化炭素嫌気性生物体、微生物、又はその部分について、及び/又は他の栄養素の入手可能性に依存する。生分解性ポリマーの例には、コラーゲン例えば、コラーゲンI又はIV、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸PLA、ポリグリコール酸PGA、ポリカプロラクトンPCL、ポリラクチド-コ-グリコリドPLGA、ポリジオキサノンPDO、トリメチレンカーボネートTMC、ポリエチレングリコールPEG、コラーゲン、PEG-DMA、アルギネート、キトサンコポリマー、又はそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。例示的な実施形態によれば、スキャフォールドは多孔性アルギネートスポンジを含む。本発明者らはまた、分化過程のステップcの前又はそれと同時であるが、分化過程のステップbの後又はそれと同時に、分化因子をコードするmRNAでの内胚葉細胞のトランスフェクションが、島細胞を作製するために有用であり得ることを見出している。トランスフェクションは、分化の特定の段階における細胞で培養物を濃縮するのに役立つ可能性がある。したがって、例えば、本発明は、以下のmRNA作用物質のうちの1つでのトランスフェクションを企図する:膵臓十二指腸ホメオボックス1Pdx1、ニューロゲニン3Ngn3、ペアードボックス遺伝子4Pax4、ホメオボックスタンパク質Nkx-2.2Nkx2.2、ホメオボックスタンパク質NK-6相同体ANkx6.1及びv-maf筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体AMAF-A。Pdx1mRNA又はニューロゲニン3Ngn3mRNAは、レチノイン酸を培養するステップと共に、レチノイン酸処理の前に、又はレチノイン酸処理を回避して成熟ステップの直前に、トランスフェクトされてもよい。Pdx1mRNAがNgn3mRNAと共にトランスフェクトされてもよいことは認識されているであろう。好ましくは、ペアードボックス遺伝子4Pax4mRNAトランスフェクションは、レチノイン酸培養後1日以内に実施される。好ましくは、ホメオボックスタンパク質Nkx-2.2Nkx2.2、ホメオボックスタンパク質Nkx-6.1相同体ANkx6.1mRNAトランスフェクションは、レチノイン酸処理の終了後30日以内に実施される。MAF-AmRNAトランスフェクションは、レチノイン酸培養段階後1週間で実施されてもよい。本発明者らは、Pdx-1mRNAトランスフェクションが、プロトコールのレチノイン酸培養ステップbの代わりに用いられ得ることを見出しているが、それは、より後の段階でもすなわち、プロトコールのステップbの後に、例えば、成熟過程が開始されてから数日後、例えば、分化の30日目に、実施され得ることは認識されているであろう。mRNAのトランスフェクションのための方法は、市販されている方法を含め、当技術分野において知られており、それらには、エレクトロポレーションAmaxaNucleofector-IIAmaxaBiosystems、Cologne、Germany、ECM830BTXHarvardInstruments、Boston、Mass.、又はGenePulserIIBioRad、Denver、Colo.、MultiporatorEppendort、HamburgGermany、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介型トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介型トランスフェクション、又は遺伝子銃などの微粒子銃の粒子送達システムが挙げられるが、それらに限定されない例えば、Nishikawaら、HumGeneTher.、128:861~702001参照。インビトロでmRNAを合成する方法は、当技術分野において知られている。好ましい実施形態において、mRNAは、リボソーム結合、翻訳開始、及び細胞内でのmRNAの安定性を決定する、5’末端でのキャップと3’ポリAテールの両方を有する。ポリA/Tのひと続きのDNA鋳型への組込みの通常の方法は分子クローニングである。転写DNA鋳型のポリA/Tセグメントは、100TテールなどのポリTテールサイズは50~5000Tであり得るを含有するリバースプライマーを用いることによりPCR中に、又は非限定的に、DNAライゲーション若しくはインビトロ組換えを含む任意の他の方法によりPCR後に、作製することができる。ポリAテールはまた、RNAに安定性を与え、それらの分解を低減する。一般的に、ポリAテールの長さは、転写されたRNAの安定性と正に相関する。一実施形態において、ポリAテールは、100個から5000個の間のアデノシンである。RNAのポリAテールは、大腸菌E.coliポリAポリメラーゼE-PAPなどのポリAポリメラーゼを用いてインビトロ転写後にさらに伸長させることができる。さらに、異なる化学基の3’末端への付着は、mRNA安定性を増加させることができる。そのような付着は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含有することができる。例えば、ATP類似体は、ポリAポリメラーゼを用いてポリAテールへ組み入れることができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに増加させることができる。適切なATP類似体は、カルジオリピン及び8-アザアデノシンを含むが、それらに限定されない。5’キャップもまた、RNA分子に安定性を与える。好ましい実施形態において、5’キャップは、例えば、m7G5’ppp5’G、m7G5’ppp5’A、G5’ppp5’G、又はG5’ppp5’Aキャップ類似体であってもよく、それらは全て市販されている。5’キャップはまた、アンチリバースキャップ類似体anti-reverse-cap-analogARCAStepinskiら、RNA、7:1468~952001又は任意の他の適切な類似体であり得る。RNAはまた、配列内リボソーム進入部位IRES配列を含有してもよい。IRES配列は、mRNAへのキャップ非依存性リボソーム結合を惹起し、且つ翻訳開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列、又は人工的に設計された配列であってもよい。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存能を促進する因子を含有することができる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含むことができる。膵内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者によく知られており、膵内分泌系統に特徴的な追加のマーカーの同定が継続中である。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、膵内分泌系統に特徴的な性質を獲得していることを確認するために用いることができる。膵内分泌系統特異的マーカーには、例えば、Ngn-3、NeuroD、及びIslet-1などの1つ又は複数の転写因子の発現が挙げられる。β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者によく知られており、β細胞系統に特徴的な追加のマーカーの同定が継続中である。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β細胞系統に特徴的な性質を獲得していることを確認するために用いることができる。β細胞系統特異的特性には、例えば、とりわけ、Pdx1膵臓十二指腸ホメオボックス遺伝子1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、Hnf-6、Hnf-3β、及びMafAなどの1つ又は複数の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定として当技術分野において十分確立されている。例えば、EdlundNatureReviewsGenetics3:524~6322002を参照されたい。分化の効率は、膵内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現するタンパク質マーカーを特異的に認識する作用物質抗体などに、処理された細胞集団を曝すことによって決定されてもよい。或いは、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現するタンパク質マーカーを特異的に認識する作用物質抗体などに、処理された細胞集団を曝すことによって決定されてもよい。培養細胞又は単離細胞においてタンパク質マーカー及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当技術分野において標準である。これらには、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら編、2001supplement参照、及び切片化材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティングなどのイムノアッセイ、並びに無傷細胞においてアクセス可能であるマーカーについて、フローサイトメトリー分析FACS例えば、Harlow及びLane、UsingAntibodies:ALaboratoryManual、NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress1998参照が挙げられる。分化及び成熟後、最終生成物は、例えば、島形態を有する領域を選択且つ採取するために顕微鏡に連結されたコンピュータ制御のロボットアームを用いることにより、又は代わりに、FACSを用いて、特定のマーカーについて選択することにより、膵島細胞について濃縮することができる。この手順は、多能性ES細胞の混入のリスク、及びインビボでの細胞の移入後の奇形腫のリスクを回避する。本発明者らは、本発明の島細胞がグルコース応答性であることを企図し、それは、作製されたインスリン発現細胞が、グルコース輸送体膜貫通タンパク質Glut-2グルコース依存性インスリン分泌に必須のタンパク質の1つもまた発現することが示されたからである図7D。その細胞のグルコース応答性は、図23Aでさらに実証された。本発明のこの態様によれば、句グルコース応答性は、本発明の分化細胞の、グルコースに応答してインスリンを分泌する能力を指す。好ましくは、成体島β細胞は、16mMグルコースに応答して、0mMグルコースにおいてそれらが分泌する量の少なくとも2倍のインスリン量を分泌する。本発明の成体島β細胞集団はさらに、治療剤などの医薬品、テロメラーゼ遺伝子、免疫媒介性拒絶反応を低下させる作用物質、又はマーカー遺伝子を発現するように改変例えば、遺伝子改変されてもよい。代謝拮抗剤例えば、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素阻害剤、及びペプチド模倣薬などの治療剤が本発明において一般的に有用であり得ることが企図される。免疫媒介性拒絶反応を低下させ得る遺伝子の例はウテログロビン遺伝子である。ウテログロビンは、免疫寛容を与え、且つ炎症反応を防ぐ、妊娠中に発現するタンパク質である。本発明の成体島β細胞を遺伝子改変する方法は、上文に記載されている。本発明の島細胞はインスリンを発現するため、それらは、糖尿病などのインスリン欠乏に関連している疾患を処置するために用いられてもよい。天然の島におけるレベルと類似したインスリンレベルをまだ発現しない膵内分泌系統にコミットした細胞もまた、それらがPdx1、Nkx6.1、及びMAF-Aを共発現するならば、移入に用いられてもよい未成熟島細胞ことは認識されているであろう。これらの細胞は、それらが正しいインビボ環境にある場合、成熟するように、すなわち、高レベルのインスリンを発現するように、刺激され得る。したがって、本発明の別の態様によれば、治療的有効量の本発明の島細胞を対象に移植し、それにより糖尿病を処置するステップを含む、対象において糖尿病を処置する方法が提供される。本明細書に用いられる場合、糖尿病は、生物体において、インスリンの生合成若しくは産生における欠陥によるインスリンの絶対的欠乏1型糖尿病か、又はインスリン抵抗性、すなわち、インスリン作用の障害の存在下でのインスリンの相対的欠乏2型糖尿病かのいずれかに起因する疾患を指す。このように、糖尿病患者は、絶対的又は相対的インスリン欠乏を有し、症状及び徴候の中でも、血糖濃度の上昇、尿中グルコースの存在、及び多尿を示す。句処置することは、疾患、障害、若しくは状態の発生を阻害若しくは阻止すること、及び/又は疾患、障害、若しくは状態を患っている、若しくはそれと診断された個体において、疾患、障害、若しくは状態の低減、寛解、若しくは退行を引き起こすことを指す。当業者は、疾患、障害、又は状態の発生を評価するために用いることができる様々な方法及びアッセイ、並びに同様に、疾患、障害、又は状態の低減、寛解、又は退行を評価するために用いることができる様々な方法及びアッセイを知っているであろう。本明細書に用いられる場合、移植することは、任意の適切な経路を用いて、本発明の島細胞を供給することを指す。典型的には、β細胞治療は、肝臓の門脈へのカテーテルを用いる注入により実施されるが、他の投与方法例えば、皮下、又は腹腔内、又は脂肪組織内が構想される。本発明の島細胞は、自己供給源、半自己供給源、又は同種異系供給源に由来し得る。非自己細胞は、身体へ投与された場合、免疫反応を誘導する可能性が高いため、非自己細胞の拒絶反応の可能性を低下させるためにいくつかのアプローチが開発されている。これらは、レシピエント免疫系を抑制するか、又は移植術前に非自己細胞を免疫隔離半透膜内にカプセル化することのいずれかを含む。カプセル化技術は、一般的に、小球状媒体を利用するマイクロカプセル化、及びより大きいフラットシートの中空繊維膜を利用するマクロカプセル化として分類されるUludag,H.ら、Technologyofmammaliancellencapsulation.AdvDrugDelivRev.2000;42:29~64。マイクロカプセルを調製する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、LuMZら、Cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpolyallylamine.BiotechnolBioeng.2000、70:479~83、ChangTM及びPrakashS.Proceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms.MolBiotechnol.2001、17:249~60、並びにLuMZら、Anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepolyallylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate.JMicroencapsul.2000、17:245~51によって開示されたものが挙げられる。例えば、マイクロカプセルは、2-ヒドロキシエチルメチルアクリレートHEMA、メタクリル酸MAA、及びメチルメタクリレートMMAのターポリマーシェルと修飾コラーゲンを複合体化することにより調製され、その結果として、厚さ2~5μmのカプセルが生じる。そのようなマイクロカプセルは、負に帯電した滑面を与え、且つ血漿タンパク質吸収を最小限にするために、追加の2~5μmのターポリマーシェルでさらにカプセル化することができるChia,S.M.ら、Multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulationBiomaterials.200223:849~56。他のマイクロカプセルは、海洋性多糖であるアルギネートSambanis,A.Encapsulatedisletsindiabetestreatment.DiabetesThechnol.Ther.2003、5:665~8、又はその誘導体に基づいている。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウムの存在下における、アルギン酸ナトリウムとセルロース硫酸ナトリウムとのポリアニオンの間の、ポリメチレン-コ-グアニジンハイドロクロライドのポリカチオンでの多価電解質複合体形成によって調製することができる。より小さいカプセルが用いられる場合、細胞カプセル化が向上することは認識されているであろう。したがって、カプセルサイズを1mmから400μmへ低下させた場合、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散性、及びインビトロでの活性が向上したCanapleL.ら、Improvingcellencapsulationthroughsizecontrol.JBiomaterSciPolymEd.2002;13:783~96。さらに、小さくも7nmほどに十分制御されたポアサイズ、目的に合った表面化学的性質、及び正確な微細構造を有するナノ多孔性生物的カプセルが、細胞についての微小環境をうまく免疫隔離することが見出されたWilliamsD.Smallisbeautiful:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices.MedDeviceTechnol.1999、10:6~9;Desai,T.A.Microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation.ExpertOpinBiolTher.2002、2:633~46。免疫抑制剤の例には、メトトレキセート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンA、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジンスルファサラゾピリン、金塩、D-ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブREMICADE登録商標、エタネルセプト、TNFαブロッカー、炎症性サイトカインを標的にする生物学的作用物質、及び非ステロイド性抗炎症薬NSAIDが挙げられるが、それらに限定されない。NSAIDの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Cox-2阻害剤、及びトラマドールが挙げられるが、それらに限定されない。適切な場合、患者は、移植された細胞の生存及び機能を促進する医薬品又は生物活性物質でさらに処置することができる。これらの作用物質には、例えば、とりわけ、インスリン、アクチビンA、TGF-β1、2、及び3、骨形成タンパク質BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12、及び-13を含むTGFβファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子-1、及び-2、血小板由来成長因子-AA、及び-BB、多血小板血漿、インスリン様成長因子IGF-I、II、増殖分化因子GDF-5、-6、-7、-8、-10、-11、-15、血管内皮細胞由来成長因子VEGF、肝細胞成長因子HGF、プレイオトロフィン、エンドセリン、上皮成長因子EGF、β-セルリンを挙げることができる。他の薬学的化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド-IGLP-1及びII、GLP-1及び2ミメティボディmimetibody、エキセンディン-4、レチノイン酸、副甲状腺ホルモンを挙げることができる。インドラクタムV、又はPMA、又は例えば、米国特許出願公開第2004/0209901号及び米国特許出願公開第2004/0132729号に開示された化合物などのMAPK阻害剤。本発明の細胞は、それ自体で、又は適切な担体若しくは賦形剤と混合されている薬学的組成物として、ヒト対象に移植されてもよい。本明細書に用いられる場合、薬学的組成物は、本明細書に記載された細胞集団の1つ又は複数の、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学的成分との調製物を指す。薬学的組成物の目的は、化合物の生物体への投与を促進することである。以下、交換可能に用いられ得る、句生理学的に許容される担体及び薬学的に許容される担体は、生物体に有意な刺激作用を引き起こさず、且つ投与された化合物の生物学的活性及び性質を抑止しない担体又は希釈剤を指す。補助剤は、これらの句の下に含まれる。本明細書において、用語賦形剤は、活性成分の投与をさらに促進する、薬学的組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例は、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々な型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の薬学的組成物は、当技術分野においてよく知られた工程によって、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥工程を用いて製造されてもよい。したがって、本発明に従って用いられる薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性成分の加工を促進する賦形剤及び助剤を含む1つ又は複数の生理学的に許容される担体を用いる通常の様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。注射用として、薬学的組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合した緩衝液中に製剤化されてもよい。本発明の関連において用いられるのに適した薬学的組成物には、活性成分が、意図された目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物が挙げられる。より具体的には、治療的有効量とは、処置されている対象の障害例えば、糖尿病の症状を防ぎ、軽減し、若しくは改善し、又はその対象の生存を延ばすのに有効な活性成分インスリン産生細胞の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供された詳細な開示を鑑みれば、十分当業者の能力の範囲内である。本発明の方法に用いられる任意の調製物について、治療的有効量又は有効用量は、所望の濃度又は力価を達成するように動物モデル例えば、STZ糖尿病マウスから推定することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。本明細書に記載された活性成分の毒性及び治療効力は、実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。これらの動物研究から得られたデータは、ヒトに用いる用量の範囲を策定するのに用いることができる。用量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存して変わり得る。的確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる例えば、Finglら、1975、ThePharmacologicalBasisofTherapeutics1章1ページを参照。投薬量及び間隔は、正常血糖を誘導するのに十分な細胞数を供給するように個々に調整され得る最小有効濃度、MEC。MECは、調製物ごとに異なるが、インビトロデータから推定することができる。MECを達成するのに必要な用量は、個々の特性及び投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿中濃度を決定するために用いることができる。投与される組成物の量は、当然のことながら、処置されている対象、苦痛の重症度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。本発明の組成物は、必要に応じて、FDA認可キットなどの、活性成分を含有する1つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック又はディスペンサー装置内で提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔又はプラスチック箔を含んでもよい。パック又はディスペンサー装置は、投与についての使用説明書を添付されてもよい。パック又はディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関によって規定された形で容器に付された注記を盛り込んでもよく、その注記は、組成物の形又はヒト若しくは獣医学的投与の行政機関による認可を反映している。そのような注記は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局によって認可されたラベル付け、又は認可された製品挿入物であってもよい。適合性薬学的担体内に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記でさらに詳述されているのと同様に、調製され、適切な容器に入れられ、指示された状態の処置についてラベルを貼られてもよい。本発明はまた、細胞を3次元支持体へ組み入れることを企図する。細胞は、患者への移入前にインビトロのこの支持体上で維持することができる。或いは、細胞を含有する支持体は、追加のインビトロ培養なしに患者に直接移入することができる。支持体は、任意で、移植細胞の生存及び機能を促進する少なくとも1つの医薬品と共に組み入れることができる。本発明の目的のために用いるのに適した支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア、及びリザーバが挙げられる。特に、生物組織を再構築又は再生するために、及び組織成長を誘導するための走化性物質を送達するためにインビトロ及びインビボで用いられている、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形をとる合成及び天然材料が、本発明の方法の実施に用いるのに適している。例えば、米国特許第5,770,417号、米国特許第6,022,743号、米国特許第5,567,612号、米国特許第5,759,830号、米国特許第6,626,950号、米国特許第6,534,084号、米国特許第6,306,424号、米国特許第6,365,149号、米国特許第6,599,323号、米国特許第6,656,488号、米国特許出願公開第2004/0062753A1号、米国特許第4,557,264号、及び米国特許第6,333,029号に開示された材料を参照されたい。医薬品と共に組み入れられる支持体を形成するために、医薬品は、支持体を形成する前にポリマー溶液と混合することができる。或いは、医薬品は、製作された支持体上へ、好ましくは薬学的担体の存在下で、コーティングすることができる。その医薬品は、液体、微粉化固体、又は任意の他の適切な物理的形として存在してもよい。或いは、医薬品の放出速度を変化させるために支持体に賦形剤が加えられてもよい。代わりの実施形態において、支持体は、例えば、米国特許第6,509,369号に開示された化合物などの抗炎症化合物である少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられる。支持体は、例えば、米国特許第6,793,945号に開示された化合物などの抗アポトーシス性化合物である少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。支持体はまた、例えば、米国特許第6,331,298号に開示された化合物などの線維症の阻害剤である少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。支持体はまた、例えば、米国特許出願公開第2004/0220393号及び米国特許出願公開第2004/0209901号に開示された化合物などの血管新生を増強する能力がある少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。支持体はまた、例えば、米国特許出願公開第2004/0171623号に開示された化合物などの免疫抑制化合物である少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。支持体はまた、例えば、とりわけ、TGF-β1、2、及び3、骨形成タンパク質BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12、及び-13を含むTGF-βファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子-1、及び-2、血小板由来成長因子-AA、及び-BB、多血小板血漿、インスリン成長因子IGF-I、II、増殖分化因子GDF-5、-6、-8、-10、-15、血管内皮細胞由来成長因子VEGF、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの成長因子である少なくとも1つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。他の薬学的化合物には、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子1-α、グルカゴン様ペプチド-IGLP-1及びII、GLP-1及びGLP-2ミメティボディ、エキセンディン-4、ノーダルnodal、ノギン、NGF、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン-C、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、ディフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインを含有する生物学的ペプチド、例えば、米国特許出願公開第2004/0209901号及び米国特許出願公開第2004/0132729号に開示された化合物などのMAPK阻害剤を挙げることができる。本発明の細胞のスキャフォールドへの組入れは、細胞のスキャフォールド上への単純な沈着によって達成することができる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールド中へ侵入することができるJ.Pediatr.Surg.231Pt2:3~91988。細胞播種の効率を増強するためにいくつかの他のアプローチが開発されている。例えば、軟骨細胞のポリグリコール酸スキャフォールド上への播種にスピナーフラスコが用いられているBiotechnol.Prog.142:193~2021998。細胞を播種するための別のアプローチは、播種された細胞に最小限のストレスをもたらし、播種効率を増強する遠心分離の使用である。例えば、Yangらは、遠心分離細胞固定化CCIと呼ばれる細胞播種方法を開発したJ.Biomed.Mater.Res.553:379~862001。本発明の追加の目的、利点、及び新規の特徴は、以下の実施例の検討によって、当業者に明らかになるであろうし、その実施例は、限定することを意図するものではない。加えて、上文で描写されているような、及び下の特許請求の範囲のセクションにおいて主張されているような本発明の様々な実施形態及び態様のそれぞれは、以下の実施例に実験的確証を見出す。本明細書に用いられる場合、用語約は±10を指す。用語含むcomprises、含むことcomprising、含むincludes、含むことincluding、有するhaving、及びそれらの同根語は、含むが、それらに限定されないことを意味する。用語からなるconsistingofは、含み、且つそれらに限定されることを意味する。用語本質的に~からなるconsistingessentiallyofは、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、ステップ、及び/又は部分を含んでもよいが、追加の成分、ステップ、及び/又は部分が、主張された組成物、方法、又は構造の基本的且つ新規の特性を物質的に変化させない場合のみであることを意味する。本出願を通して、本発明の様々な実施形態が、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は、単に便利さ及び簡潔さのためだけであり、本発明の範囲への確固たる限定として解釈されるべきではないことは理解されているはずである。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分的な範囲、加えて、その範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、1から6までなどの範囲の記載は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの部分的な範囲、加えて、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、3、4、5、及び6を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。数値範囲が本明細書で示されている場合は常に、その示された範囲内の任意の挙げられた数字分数又は整数を含むことが意図される。第1の表示数から第2の表示数の間の範囲であること/範囲である、及び第1の表示数から第2の表示数までの範囲であること/範囲であるという句は、本明細書で交換可能に用いられ、第1及び第2の表示数、並びにその間の全ての分数及び整数を含むことが意図される。本明細書に用いられる場合、用語方法は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術、及び手順を指し、それらには、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的、及び医学的分野の実務者に知られているか、又はその実務者によって公知の様式、手段、技術、及び手順から容易に開発されるかのいずれかの様式、手段、技術、及び手順が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に用いられる場合、用語処置することは、状態の進行を抑止すること、実質的に阻害すること、遅らせること、若しくは逆転させること、状態の臨床症状若しくは審美的症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床症状若しくは審美的症状の出現を実質的に防ぐことを含む。明確にするために別々の実施形態の文脈において記載されている、本発明の特定の特徴もまた、組み合わせて、単一の実施形態において提供されてもよいことは認識されている。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記載されている、本発明の様々な特徴もまた、別々に、又は任意の適切な部分的組合せで、又は適するならば、本発明の任意の他の記載された実施形態において、提供されてもよい。様々な実施形態の文脈において記載された特定の特徴は、それらの要素なしでも実施形態が無効にならない限り、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきではない。上文で描写されているような、及び下の特許請求の範囲のセクションにおいて主張されているような本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例に実験的確証を見出す。今、以下の実施例に言及し、その実施例は、上の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的形式で示す。一般的に、本明細書に用いられる命名法及び本発明に利用される実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組換えDNA技術を含む。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、MolecularCloning:AlaboratoryManualSambrookら、1989;CurrentProtocolsinMolecularBiologyI~III巻Ausubel,R.M.編1994;Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileyandSons、Baltimore、Maryland1989;Perbal、APracticalGuidetoMolecularCloning、JohnWileySons、NewYork1988;Watsonら、RecombinantDNA、ScientificAmericanBooks、NewYork;Birrenら編GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries、1~4巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、NewYork1998を参照;方法は米国特許第4,666,828号;第4,683,202号;第4,801,531号;第5,192,659号、及び第5,272,057号;CellBiology:ALaboratoryHandbook、I~III巻Cellis,J.E.編1994;CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechniqueFreshney、Wiley-Liss、N.Y.1994、第3版;CurrentProtocolsinImmunologyI~III巻ColiganJ.E.編1994;Stitesら編、BasicandClinicalImmunology第8版、AppletonLange、Norwalk、CT1994;Mishell及びShiigi編、SelectedMethodsinCellularImmunology、W.H.FreemanandCo.、NewYork1980に示されている;利用可能なイムノアッセイは特許及び科学的文献に広く記載されており、例えば、米国特許第3,791,932号;第3,839,153号;第3,850,752号;第3,850,578号;第3,853,987号;第3,867,517号;第3,879,262号;第3,901,654号;第3,935,074号;第3,984,533号;第3,996,345号;第4,034,074号;第4,098,876号;第4,879,219号;第5,011,771号、及び第5,281,521号;OligonucleotideSynthesisGait,M.J.編1984;NucleicAcidHybridizationHames,B.D.及びHigginsS.J.編1985;TranscriptionandTranslationHames,B.D.及びHigginsS.J.編1984;AnimalCellCultureFreshney,R.I.編1986;ImmobilizedCellsandEnzymesIRLPress、1986;APracticalGuidetoMolecularCloningPerbal,B.、1984、及びMethodsinEnzymology1~317巻、AcademicPress;PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplicationsAcademicPress、SanDiego、CA1990;Marshakら、StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManualCSHLPress1996を参照されたいそれらの全ては、あたかも本明細書に完全に示されているように、参照により組み入れられている。他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供されている。それらにおける手順は、当技術分野においてよく知られていると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み入れられている。例1胚体内胚葉へのhES細胞の分化の手順:5日間のアクチビンAでの処理は、胚体内胚葉のマーカーを有する75の細胞を生じる材料及び方法ヒトES細胞の成長:γ線照射されたヒト包皮又は臍帯血線維芽細胞HEF、ウェルあたり2~3×105個の細胞を、0.1ブタゼラチン細胞培養試験済みでコーティングされたcostar6×ウェル組織培養プレートCorningのウェル上に播種した。ゼラチンを、水に、100ml再蒸留水あたり0.1gの濃度で溶解し、オートクレーブした。線維芽細胞を、DMEM/F12、10ウシ胎仔血清FCS、InVitrogen、グルタミン2mM、及びペニシリンストレプトマイシンPSBiologicalIndustriesBetHaEmek中、37°Cのインキュベータにおいて2時間~一晩、放置した。凍結後、又はコラゲナーゼIVWorthington又はInVitrogenでの解離直後のヒトES細胞を、HEF上に、ウェルあたり約450~500個のES細胞クラスターの濃度で播種した。hES細胞を、成長培地DMEM/F12BiologicalLaboratoriesBetHaEmek、Israel;20ノックアウト血清代替物KOSR、Invitrogen;グルタミン2mMglut、BiologicalindustriesBethaEmek;β-メルカプトエタノールβΜΕtOΗ、Invitrogen100μΜ;非必須アミノ酸1×NEEA、Invitrogen;ピルビン酸Na1mMNaPyr、Invitrogen、及び8ng/mlの組換えhbFGFPreprotech中で培養した。この培地は、毎日交換され、抗生物質を含有しなかった。細胞を、3~5日間、成長させておいた。各コロニーは、直径600~900μmまで成長し、平均3,300個の未分化hES細胞を含有した合計約2×108個の細胞。ES細胞を継代するために、グルタミン2mMを含むDMEM/F12中1.2mg/mlのコラゲナーゼIVのウェルあたり0.8mlの添加前に、培地を除去した。細胞をコラゲナーゼと共に、25~40分間、放置し、HEFに影響を及ぼさずに、hESCクラスターの脱離を引き起こした。細胞クラスターを、900rpm5~6分間の遠心分離によってコラゲナーゼから2回、洗浄した。そのペレットを300μlの培地中に再懸濁し、必要1mmより大きい直径ならば、クラスターのサイズを約3~400μmまで、150μlに設定された200μlの自動ピペットでの上げ下げピペッティングによって低下させた。コラゲナーゼでの処理を、同時には3つより多いプレートに実施しなかった。胚体内胚葉への分化:ステップIA:1日目、コラゲナーゼによって脱離した4日間Corning6×ウェルプレート上で成長したヒトES細胞コロニーの3つのウェルを15mlのチューブに収集し、コロニーを、分化培地ADMEM/F12、2KOSR、2mMグルタミン、1×NEAA、100μΜβΜEtΟΗ、1mMピルビン酸Na、及びペニシリンとストレプトマイシンPS中、低速遠心分離によって2回、洗浄した。全てのhESクラスターを収集し、且つ洗浄した後、クラスターを、1.5ml/ウェルの分化培地A1すなわち、100ng/ml組換えヒトアクチビンAPreprotech及び25ng/ml組換えWnt3RD、2ノックアウト血清代替物、並びに2mg/mlウシ血清アルブミンBSA、細胞培養試験済みSIGMAを含む分化培地A中に懸濁した。450~500個のコロニー/ウェルを、1日前に0.1ブタゼラチンSigmaでコーティングされているCostar6×ウェルプレート中に播種した。或いは、約3000個のコロニーを、10cm直径のプレート上に播種した。プレートを、培地交換なしに2日間、インキュベータ37°C、5CO2内に放置した。ステップIB:3日目、培地を、100ng/mlアクチビンA及び2mg/mlBSAを含有する分化培地A2DMEM/F12、2KOSR、2mMglut、1×NEAA、100μΜβΜΕtΟΗ、1mMNaPyr、及び2ウシ胎仔血清FCSに交換した。この段階において、クラスターはまだ浮遊しており、多数の単細胞が目に見えた。クラスターがウェルの底縁に落下するようにプレートを傾け、1.2mlの培地A2で完全なものにされる300μlの培地中にクラスターを残して、古い培地を除去した。数個のクラスターを含有する収集された培養培地を、900rpmで5分間、遠心分離した。ペレットを、1.5ml培地A2中に再懸濁し、ウェルの1つに加えた。4日目、たいていのクラスターがプレートに接着し、3日目と同様に、培養培地を、100ng/mlアクチビンA及び2mg/mlBSAを含有する分化培地A3DMEM/F12、2mMグルタミン、1×NEAA、100μΜβΜΕtΟΗ、1mMNaPyr、ただし、0.2FCSを含むに交換した。細胞を、培地A3中に2日間、放置した。胚体内胚葉に特異的なマーカーの発現の間接的免疫蛍光による分析:細胞を固定しCa2とMg2を含まないPBS中4パラホルムアルデヒド、20分間、PBSで3回、洗浄し、PBS中10ウマ血清でブロッキングした。一次抗体Abとの反応を、1BSAを含む、又は含まない10ウマ血清中で実施した。二次抗体蛍光タグ、Alexa488若しくはAlexa566MolecularProbes/Invitrogen又はCy3とコンジュゲートしたロバ抗マウス;ロバ抗ウサギ;ロバ又はウサギ抗ヤギ/ロバ抗ウサギDyLight488Jacksonlaboratoriesのいずれか。CCDカメラで写真を撮り、画像処理プログラムで処理した。マウスモノクローナル抗Sox17AbRD10μg/mlを0.1TritonX100と共に用いた。ウサギポリクローナル抗FoxA2ab40874Abcamを、0.1TritonX100と共に1/1000の希釈で用いた。結果上記プロトコールを用いて、5日間のアクチビンA処理の終わりに、細胞の約75がSox17及び/又はFoxA2を発現することが見出され図1A~F、細胞が胚体内胚葉段階にあることを示した。低倍率において、FoxA2図1A又はSox17図1Dの染色は、大きな領域が陽性であることを示すが、より高い倍率は核染色を示している図1B、E。核の約75がFoxA2及び/又はSox17を発現すると計算された。RNA抽出、続いて特異的プライマーでのRT-PCRにより、これらのマーカーの強い発現が確認された。抗Oct4抗体での免疫染色により、細胞のたった5が、この時点で抗Oct4陽性であることが示された図示せず。アクチビンAでの5日間の処理の終わりに、6ウェルプレートのウェルあたり播種された最初の300~500個のES細胞コロニーのうち約200個の接着性クラスターを観察することができ、好収量の胚体内胚葉クラスターを示している。例2ステップIA及びIB由来の細胞のFGF10、フォルスコリン、及びレチノイン酸での処理が、高パーセンテージのPdx1陽性細胞を生じる材料及び方法胚体内胚葉クラスターのPdx1陽性細胞への分化:ステップIIA。6日目、細胞をDMEM/F12、2mMグルタミン、1×PSで洗浄し、培地を分化培地B1DMEM/F12、2mMglutamaxInvitrogen、2mg/mlBSA、1B27supplementInVitrogen、50ng/mlヒト組換えFGF10Preprotech、及び10μΜフォルスコリンコレウスフォルスコリcoleusforskohlii由来F-6886SIGMAに交換した。細胞を同じ培地中、2日間、放置した。ステップIIB。8日目、培地を分化培地B2、すなわち、2μMの新鮮なATRAオールトランスレチノイン酸を添加した培地B1に、5日間、交換した。培地を2日ごとに交換した。ステップIII。13日目、培地を、DMEM/F12、グルタミン2mM、PS、1×ITSsupplementInvitrogen、2mg/mlBSA、5μg/mlウシフィブロネクチンBiologicalIndustriesBetHa’emek、ニコチンアミド10mMSIGMA、及びエキセンディン-4、5~50ng/mlに交換した。培地を2日ごとに交換した。C-ペプチド染色が陽性である細胞は、分化の19日目頃に出現し始めるが、C-ペプチドについての強い免疫染色は、23日目に出現し、陽性の島様構造は、50日目まで形成し続け、少なくとも70日間、持続する。細胞が15~20日間より多く分化した場合、それらをさらに、トリプシン処理し、再びプレーティングすることができる。第2のプレーティングにおいて、島様構造は、再プレーティングから20~30日後、出現する。免疫蛍光による分析:例1のように実施した。Triton0.1を含むPBS中5BSAでブロッキング1:100でのヤギポリクローナル抗ヒトPdx1/IPF1RD抗体を2時間、用いた。マウスモノクローナルAb抗Nkx6.1DevelopmentStudyHybridomaBankDSHBもまた用いたデータ図示せず。結果分化プロトコールの14日目、すなわち、レチノイン酸処理の終了から2日後において、培養細胞の約50がPdx1を発現する。図2A~Eは、いくつかの領域において、ほとんど全ての細胞がPdx1陽性であることを示している。Sox17発現と比較してPdx1陽性細胞のより低い全体的パーセンテージは、分化が細胞クラスター内で起こるという事実による。図2B~Eは、Pdx1染色がDAPI染色と共存することを示し2B、及びPdx1染色が核であることを示している。図2F~Iは、21日間の分化後、Pdx1で共染色されている細胞のドメインにおいてインスリンの誘導があることを示している。分化の25日目から、単層は裂け、上皮蕾すなわち、高い細胞密度の領域は単層から盛り上がる。図3A~Dは、32日後、上皮蕾は、典型的にはPdx1陽性であることを示している。最後の20日間、培養物をニコチンアミド及びエキセンディン-45ng/mlで処理した場合、単層及び蕾は、Pdx1陽性であった図3A~B。プレートをニコチンアミドでのみ処理した場合、単層は、エキセンディン-4を用いた場合よりPdx1陽性が少なかった図3C~D。細胞を数えることにより、5~50ng/mlの濃度におけるエキセンディン-4添加が、Pdx1陽性細胞のパーセンテージにプラスの効果を生じることが確認されたデータ図示せず。Pdx1のパーセンテージにおけるさらなる増加が、7日目において培養物をトリプシン処理し、解離した細胞を、新しいゼラチンコーティングプレート上に再プレーティングすることにより、達成された図4A~C。大部分がPdx1陽性細胞を有する島は、これらの条件下で頻繁に観察された。例3インスリン産生細胞及びグルカゴン産生細胞を有する島の形成材料及び方法例1及び2と同様に得られた培養物を、例2のステップIIIに詳述されているようなITS培地中、さらに培養し、希釈1:200におけるC-ペプチドに対するポリクローナルウサギ抗体Acris又はモノクローナル抗体MAB1975、Abcamを用いて一晩、染色した。グルカゴン産生細胞を検出するために、培養物をまた、1:200の濃度におけるグルカゴンに対するヤギポリクローナル抗体SantaCruzN-17を用いて一晩、染色した。グルコース輸送体Glut2を、1:200の濃度で用いられたマウスモノクローナル抗Glut-2抗体RDsystemsで検出した。二次抗体は、1:200で2時間の、DyLight549又は488JacksonLaboratoriesとコンジュゲートしたロバ抗ウサギ、ロバ抗ヤギ、又はロバ抗マウスであった。結果細胞質における特異的C-ペプチド染色は、分化過程の37日目に明瞭に観察された図5A~D。そのようなC-ペプチド染色は、20~25日目からすでに見ることができる。図5A~Dに描かれた実験において、エキセンディン-450ng/mlを、13日目から29日目まで与え、その後、培養物をITS培地例2のステップIII中に存続させた。37日目、多数の島様ドメインが、細胞質においてC-ペプチドについての強い染色を示し、それらの多くはまたPdx1陽性であった図5A~D。エキセンディン-4はまた、連続的に、且つさらに、より低い濃度5ng/mlで投与することができる。これらの条件下で、37日目における島様構造は、よりコンパクトで、且つより良く構造化されているように見える図6A~E。インスリンC-ペプチド及びグルカゴンについての二重染色は、そのような島における細胞の約3分の1がグルカゴンを産生しα細胞表現型、3分の2がインスリンを産生するβ細胞表現型ことを示している図6A~E。したがって、分化過程は、天然の膵臓ランゲルハンス島の構造を再生している。C-ペプチド陽性細胞の島様ドメインは、分化の56~60日目において発生し続けている図7及び8。C-ペプチド陽性細胞は、グルコース依存性インスリン分泌に必須のタンパク質の1つである、グルコース輸送体膜貫通タンパク質Glut-2が陽性であった図7D。Glut-2は膜タンパク質であり、より大きな倍率により、細胞の周辺におけるGlut-2染色が示されている図7F。分化の56日目に、細胞は、C-ペプチドとPdx1の両方で共染色された図7G。60日目において、C-ペプチド陽性島様構造は、より凝縮した。これは、50ng/mlにおけるエキセンディン-4に関して特に明らかである図8A~F。C-ペプチド/グルカゴン陽性領域の数を数えることにより、5ng/mlエキセンディン-4を有する試料と比較して、50ng/mlを有する培養物においてそのような領域が3倍多いことが示された図示せず。しかしながら、低濃度のエキセンディン-45ng/mlが、少しのエキセンディン-4も含まない対照条件と比較して、60日間の分化後、C-ペプチドが陽性である細胞の総量を増加させるのに十分であることが見出された図9A~B。インスリンmRNA濃度を半定量的RT-PCRを用いて調べた場合、インスリンmRNAは36日間の培養後にすなわち、ニコチンアミド及びBSAを含むITS培地中での培養中に高いが、FoxA2mRNA及びPdx1mRNAがより早い時点で存在することが見出された図10。例4hES細胞分化の経過中に外から加えられたPdx1mRNAの効果材料及び方法ヒトPdx1cDNAを、最初のプラスミドpcDNA3Pdx1から、それぞれ、EcoRI部位及びMsc1部位を含有するリバースプライマー及びフォワードプライマーを用いるPCRによって増幅した。PCR断片を、プラスミドPTMA-GFPにおいてクローン化し、そのプラスミドから、Msc1及びEcoR1を用いてGFP配列を切除した。cDNAの5’UTRは、コンセンサスリボソーム侵入部位を含み、3’UTRにおいて、cDNAの後にポリTテールが続く。プラスミドPTMAPdx1を、ポリTテールの3’においてSal1で直線化し、mRNAを、キットmMessagemMachineT7Appliedbiosystems/Ambionで、転写及び5’キャッピングした。デオキシリボヌクレアーゼI処理後、RNAを、RNAeasyカラムInvitrogen上で回収した。RNA完全性を、アガロースゲル電気泳動により、並びにオリゴdTプライマー、及びIRES領域を網羅するプライマー、加えてPdx1特異的プライマーを用いるRT-PCRにより、モニターした。6ウェルプレート中で成長したヒトES細胞派生物に、培地B1中の1日後段階IIA、7日目、3日間連続で、RNAをトランスフェクトした。トランスフェクションは、4μgのインビトロ転写及びキャッピングされたmRNA、並びに2μlのLipofectamine2000InVitrogenを補充した、抗生物質を含まない1mlの分化培地B1中であった。最後のトランスフェクションから24時間後、分化の12日目、及びより後、分化の32日目に、分析を行った。結果図11A~Kに示されているように、最後のトランスフェクションから1日後、RAでの処理なしで分化の12日目、Pdx1は、たいていのコロニーにおいて広く発現している図11A~K。対照的に、細胞をRAで処理せず、且つそれらに対照をトランスフェクトした場合、Pdx1陽性領域はまれであり、各領域に細胞がほとんど存在していない図12A~D。トランスフェクションから12日後、細胞を分析した場合、Pdx1mRNAをトランスフェクトされた細胞の大きなドメインがPdx1陽性として示された図11F~K。Pdx-1陽性領域内において、C-ペプチド陽性細胞のいくつかのドメインがあった図11H及びK。対照的に、RAで処理されず、対照をトランスフェクトされた細胞は、C-ペプチド陽性細胞の領域に対応するPdx1陽性細胞のドメインを示さず、これらのトランスフェクトされていない細胞においてPdx1シグナルは非常に弱い。図11L~Qにより、予想された通り、Pdx1染色が核であり、C-ペプチド染色が細胞質であり、共染色が、C-ペプチド細胞の大部分がPdx1陽性であることを示すことが、示されている。図13Aは、外から加えられたPdx1mRNAが、C-ペプチド染色によって測定されるようなインスリン産生細胞になるPdx1陽性細胞のパーセントを著しく増加させることを示している。図13Bは、Pdx1mRNAトランスフェクションが、Pdx-1陽性細胞のうちのC-ペプチド陽性細胞の比率だけでなく、全細胞DAPI染色のうちのC-ペプチド陽性細胞の比率も増加させることを示している。図14A~Hは、Pdx1mRNAトランスフェクション後、2つの型のPdx1陽性細胞を同定し得ることを示している。大きい陽性Pdx1の核を有する細胞は、C-ペプチド抗体によって非常に弱く染色され、それはおそらく、前駆体を表している図14A~D。他の領域において、Pdx1染色は、C-ペプチドについて強く共染色された、限定された小さく且つコンパクトな核である。これらの細胞は、おそらく、より成熟したインスリン産生細胞を表している。トランスフェクションから21日後に細胞に存在するPdx1タンパク質は、おそらく、内因性遺伝子の活性化から生じている。DNAプラスミドを用いる代わりにmRNAをそれらにトランスフェクトすることによって、長期間にわたって胚性幹細胞派生物の運命に影響を及ぼすことが可能であることをこれは実証している。例5ヒトES細胞の分化及びEpCAM集団の単離材料及び方法ヒトES細胞の成長:例1に記載された通り。ヒトES細胞の最初の分化:例1に記載されているように3ステップのプロトコールを用いて、細胞を最初に胚体内胚葉へ分化させた。これらのステップのそれぞれの必須の特徴は、図15ステップ1~3に記載されている。さらなる分化を、例2のステップIIA、IIB、及びIIIに記載されているように行った。これらのステップのそれぞれの必須の特徴は、図15ステップ4~6に記載されている。ヒトES細胞のさらなる分化-図15のステップ7及び8:ステップ7:20日目、例2のステップIIIに用いられた培地を、グルコース濃度を5.5mMに調整するように改変した本明細書ではDM7と呼ぶ。磁気細胞ソーティングMACStechnology、MiltenyiBiotecによるEpCAM細胞の単離について、10cm直径のプレートをPBS-/-Caなし、Mgなしで洗浄した。その後、細胞を、37°C、10分間のAccutaseStempro、2.5ml/10cmプレートでの処理及び上げ下げのピペッティングにより、解離させた。細胞をDM7中に収集し、アリコートをNucleoCounterNewBrunswickにおいて数えた。細胞を、1,500rpm350xgで5分間、遠心分離し、MACS緩衝液0.5BSA、2mMEDTAを含むPBS-/-中に、5千万個の細胞に対して0.3mlを用いて再懸濁した。抗EpCAM抗体にコンジュゲートした磁気ビーズMiltenyiBiotec-CD326多能性幹細胞マイクロビーズを加えた5千万個の細胞に対して0.1mlのビーズ。4°Cで30分後、細胞を、50mlのMACS緩衝液中で1回、洗浄し、遠心分離し、最後に、0.5mlMACS緩衝液中に再懸濁した最高で108個の細胞。細胞懸濁液を、あらかじめMACS緩衝液で洗浄されたMACSカラムにアプライし、MACS分離器の磁場に置き、フロースルー細胞画分を収集した。3mlの4回の洗浄後、カラムを分離器から取り外し、保持された細胞画分を収集した。4°Cで5分間の350xgでの遠心分離後、ペレットを3mlのDM7又はPBS中に再懸濁した。上記の手順を改変して、細胞を、Accutaseでの解離後、DM8、すなわち、10μMROCKInhibitorSigmaY0503及び1μg/mlラミニンヒト、胎盤由来、Sigma6274を補充したDM7中に収集した。デオキシリボヌクレアーゼSigmaD4527、20μg/mlでの処理を加えて、EpCAM-MACS分画前に細胞解離を完了した。ステップ8:上記のようにEpCAM細胞を単離した後、細胞を、350xgで5分間、遠心分離し、1mlのDM7又はDM8培地あたり106個の細胞において再懸濁し、最後に、UltraLowBindingプレートCorning、cc-3471に播種した。再播種された培養物を、インキュベータ37°C、5CO2へ2~6日間、戻した。顕微鏡観察により、細胞のクラスターへの再凝集の可視化が可能になった図16。再凝集期間の終わりに、プレートを緩やかな渦運動に供し、細胞凝集物を、両眼顕微鏡下で吸引し、分析のためにアリコートに分けた。事前ソート培養物のアリコート、及びEpCAM-MACS分離画分のアリコートステップ7から、加えて再凝集したクラスターのアリコートステップ8を分析した。Nucleocounterを用いて、細胞の数を数えた。350xgで5分間の遠心分離後、細胞ペレットをM-PER哺乳類タンパク質抽出試薬、Pierce中に、典型的には、2百万個の細胞に対して0.1mlのM-PERを用いて、溶解し、ヒトインスリンC-ペプチドの含有量を、ELISAキットMercodia、Upsalh、Sweden、超高感度c-ペプチドキット最小検出5pM又はMercodiac-ペプチドELISA最小検出90pMを用いて測定した。M-PER中の試料をキット緩衝液中に3倍又はそれ以上、希釈し、20μlの1/3希釈液をアッセイした。結果は、Bradfordアッセイにより測定された場合1mgの総タンパク質あたり、及びNucleoCounterにおいて数えられた百万個の細胞あたりで表された。他の細胞ペレットを、RNA抽出のために、百万個の細胞あたり0.7mlの緩衝液RLTRNAeasy、Qiagen中に懸濁した。ヒトインスリンmRNAを、参照としてTATA結合タンパク質TBP遺伝子を用いるRT-qPCRTaq-Man、AppliedBiosystems、StepOneにより定量化した。同じように、細胞をラバーポリスマンで掻爬した後、タンパク質及びRNAを全プレートから抽出した。結果図17は、全培養物のインスリンC-ペプチド含有量が、14日後から始まって増加し、23日目頃にプラトーに達したことを示している。EpCAM陽性細胞におけるc-ペプチド含有量のピークは、分化の23日目頃であった。この時点で、培養物を、フルオレセインコンジュゲート化抗EpCAM抗体図18A及びフィコエリトリンコンジュゲート化抗C-ペプチド抗体図18Bで免疫染色した。インスリンC-ペプチドを発現する細胞クラスターと重複して、多数のEpCAM陽性EpCAM構造が見られた図18C、3C。これらのEpCAM細胞クラスターはまた、グルカゴン陽性細胞図18Dの赤色を含有した。下記の表1は、保持されたEpCAM画分におけるインスリンC-ペプチド含有細胞の濃縮の程度、及びフロースルーEpCAM-画分における同時的欠乏を示している。EpCAM画分は、一貫して、回収された総インスリンC-ペプチドの約70を含有し表1、そのことは、インスリンを発現する細胞の大部分がEpCAM陽性であったことを示している。解離した培養物全体においてFACS分析により決定された場合、EpCAM細胞のパーセンテージは、2~10の範囲であり、EpCAM-MACS上に保持された画分において回収された細胞の割合が、類似した範囲であった表1。FACS分析によって分析された場合、フロースルーにおけるEpCAM陽性細胞のパーセントは、保持された画分における約50に対して、通常、0.2~0.4であった。EpCAM画分におけるインスリン産生細胞の濃縮を、qPCRによるインスリンmRNA含有量の測定によって確認した。表1の実験2において、23日目、ヒトインスリンmRNAの参照TBPmRNAに対する比率は、EpCAM画分における2.23に対して培養物全体において0.59であった。対照的に、EpCAMマイナス画分において、インスリンのTBPに対する比率は0.0127であり、それは、インスリンmRNAを発現する細胞の99.4より多くがEpCAM画分中であったことの確認を可能にしている。下記の表2に示されているように、EpCAM細胞の再凝集後、インスリンC-ペプチドの含有量は、解離したEpCAM細胞においてより高かった。これは、インスリン産生細胞の優先的な再凝集による可能性が最も高い。EpCAM-MACS後、保持された画分EpCAMは不均一な集団であり、それは、FACS分析により、平均して、保持された細胞の約50のみが、高度にEpCAM陽性であることを示したからである。再凝集後、細胞の約20~30が、図16A~Cに示されているもののような20~100ミクロンのクラスター内に見出された。したがって、再凝集は選択的であり、再凝集したクラスター内のC-ペプチドのより高い含有量が、インスリン産生細胞が再凝集ステップ中に濃縮されることを示している。培養物全体と比較して、EpCAM-MACS及び再凝集手順の組合せは、その手順が17~20日目に行われた場合、インスリンC-ペプチド含有量ng/mgタンパク質に関して20倍を超える濃縮を生じた表2、実験1及び2。精製は、より後の時点で減少する傾向にあった表2、実験3、24日目。特に、カルシウム依存性細胞-細胞相互作用がEDTAの添加によって阻害された場合、C-ペプチド含有量のさらなる増加があった表2、実験3、及び例6参照。例6ヒトインスリンmRNA及びC-ペプチドを発現するhES細胞由来EpCAM細胞の選択的再凝集による精製EpCAM-MACSソーティング及びEpCAM細胞画分の再凝集の組合せによって生じたインスリン産生細胞の精製を、インスリンmRNAの定量的測定によってさらに評価した。材料及び方法hES細胞の膵臓系統への分化:例5及び図15のステップ1~8に詳述されているように、hES細胞培養物を分化させ、異なるステップで抽出されたRNAをRT-qPCRに供した。下記の表3は、インスリンmRNAの参照遺伝子TBPTATA結合タンパク質に対する比率を示している。インスリンmRNAのレベルは、事前ソートされた細胞集団と比較して、再凝集されたクラスターにおいて約20倍増加した。再凝集ステップ中にEDTAが加えられた場合、濃縮は増加した。表3はまた、再凝集ステップの終了と一致した日において、並行培養物から抽出されたEpCAM細胞が、再凝集したクラスターより低いインスリンmRNAを有したことを示しており、濃縮が、培養のより長い時間のせいではなかったことを示している。再凝集したクラスター内の細胞数を、Accutaseでの再解離後にNucleocounterにおいて決定した例5参照。百万個の生細胞あたりのC-ペプチド含有量は、インスリンmRNAのレベルと類似した濃縮を示している表3。例7β細胞、α細胞、及びδ細胞を含有する島様構造へのEpCAM単細胞の再凝集材料及び方法ヒトES細胞を、図15ステップ1~7に概略を示されているような分化プロトコールに供した。したがって、分化の20日目、培養物をAccutase処理によって解離させ、図15のステップ7と同様にEpCAM細胞をEpCAM-MACSによって精製した。例1のステップ8と同様にEpCAM単細胞の懸濁液を、4日間、再凝集させた。再凝集したクラスターをPFA中に固定し、洗浄し、30スクロースと平衡化し、最後に、光学的切断温度コンパウンドopticalcuttingtemperaturecompoundOCTに包埋した。蛍光免疫染色を、12mm厚さの凍結切片上で行った。スライスを、C-ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンについて染色し、加えてDAPIで染色した。結果図19は、精製されたクラスターが島様形態を有し、異なる島特異的ホルモンを産生する細胞を含有したことを示している。大部分の細胞は、インスリンC-ペプチドについて染色されるが図19B、19D、その細胞のかなりの割合は、グルカゴンについて染色され図19A、少数の細胞がソマトスタチンについて染色された図19C。接着培養において、20日目、EpCAM染色領域図18参照がグルカゴン染色細胞を含有すること、及びEpCAM-MACS後の解離したEpCAM細胞もまたグルカゴンについて染色された解離細胞を含有することが示されたため、再凝集中、グルカゴン産生α細胞、加えてソマトスタチン産生δ細胞と共に、インスリン産生β細胞が自発的に集合して島様構造を形成していると結論づけることができる。EDTAの存在下での選択的再凝集は、インスリンmRNA及びC-ペプチド含有量のより高い濃縮を生じる例6参照。包埋、スライス、及び染色後、1mMEDTAの存在下で得られた島様構造図20Bは、EDTAの非存在下において図20Aよりも小さく、そのサイズ範囲は50~100ミクロンである図20B。EDTAの非存在下において、DAPIによる核染色により、より大きい細胞のクラスターがあることが示され、細胞凝集が、EDTAの存在下においてより、不均一であることを示唆している図20A、20B。EpCAMについての染色により、EDTAなしで再凝集したクラスター内の多くのEpCAM陰性細胞が示されるが図20A、C、EDTAを用いて得られたクラスター内にそのような細胞はほとんどなかった図20B、D。EpCAMによって媒介される細胞-細胞相互作用はカルシウム非依存性であるため、EDTAの存在下において、再凝集は多くのEpCAM陰性細胞を排除し、その結果として、より選択的な再凝集、及び本物の島細胞のより良い精製を生じる可能性が高い。図15と同様に分化させたhES細胞由来クラスターの解離、続いて、EpCAM-MACSソーティング、及びカルシウム非依存性細胞-細胞相互作用に有利に働く条件下での保持された細胞の再凝集が、高度に精製された膵島様構造光学顕微鏡法下で均一な収集物として見える図21を得るための効果的な方法である。例8血清代替物血清の代わり及びノギンレチノイン酸処理中での分化、続いてEpCam精製及び再凝集:インスリンmRNA及びC-ペプチド含有量の相乗的増加。分化手順のステップ2及び3図15におけるウシ胎仔血清FCSの添加は、hES細胞コロニーのゼラチンコーティングプレートへの付着を促進するのに有用であるが、アクチビンA処理の効力を阻害する。実際、これらのステップでのFCSの省略は、分化の終了時点においてインスリンmRNA及びC-ペプチドのレベルの増加を生じたが、培養物の生存率は低下した図示せず。FCSの代わりの血清代替物の使用は、細胞生存率及びインスリン収量の増加を可能にした。材料及び方法ヒトES細胞を、図22に示されたスキームに従って分化させた。例5に詳述された手順において2つの改変がなされた。したがって、ステップ2及び3において、ウシ胎仔血清を、同じ濃度すなわち、ステップ2における2、ステップ3における0.2での血清代替物KOSR、Invitrogenに置き換えた。加えて、ステップ5において、ノギンPreprotechを100ng/mlで加えた。EpCAM-MACS分画を、例5と同様に行った。その後、解離したEpCAM細胞を、EDTAの存在下で再凝集させたステップ8、例6参照。その後、その凝集物を、50xgで5分間の遠心分離によって収集し、その遠心分離は、再凝集していない単細胞からの分離を可能にする。アルギネートゲルにおけるEpCam陽性細胞の再凝集:EpCam陽性細胞を、アルギネートゲルAlgimatrix3DInvitrogenの細孔の内側に再凝集させた。多孔性Algimatrixゲルは、10固定緩衝液の存在下で形成される。19日目、EpCAM細胞を、0.5mlの培地中24ウェルプレートのウェルあたり2×106個の細胞で、5.5mMグルコースを含む培地DM8に播種し、100xgで4分間、遠心分離した。グルコース応答性の試験:194日目、培地を、ペニシリンストレプトマイシン、glutamax、0.2BSABiologicalIndustries、BetHaEmekIsrael、及び2.8mMグルコースを含むRPMI1640BiologicalIndustries、betHaEmekIsraelに交換した。この培地中、細胞を1時間インキュベートし、その後、培地を除去し、同じ組成の培地を2時間、適用した。この時点の後、3連のウェルを、5.5mMグルコース、27mMグルコース、又は30mMKClと共に27mMグルコースを含む同じ培地中でインキュベートした。2時間のインキュベーション後の上清を、培地中に放出されたインスリン濃度についてELISAによって試験した。結果両方の改変が適用された場合、各変化単独と比較して、C-ペプチド及びインスリンmRNAのレベルの相乗的増加が観察された表4及び5。ステップ2~3におけるKOSRとステップ5におけるノギンの組み合わせた使用により、C-ペプチドとインスリンmRNAの両方について最も高い値が生じたそれぞれ、表4及び5。20~23日目での培養物全体におけるEpCAM細胞のパーセンテージのFACSによる分析により、KOSR及びノギンを用いる改変プロトコールが用いられた場合、標準プロトコールと比較して、約2分の1の低下が示された。インスリン収量の向上は、多くの非関連細胞を排除する、EpCAM-MACSステップでの膵臓内分泌細胞のより優れた選択選択的再凝集によって完成される選択に関係している可能性が高い。機能性β細胞は、血中グルコースレベルの増加に応答してインスリンを分泌する。本細胞は、培地中のグルコース濃度の増加に応答してインスリンを放出する図23。インスリン放出が、グルコース濃度を2.8mMから27mMへ増加させることによって2.5倍増加し、一方、それは、グルコースを5.5mMへ増加させることによって50だけ増加することを、図23に見ることができる図23A。EDTAでの処理によってAlgimatrixゲルから単離された凝集物の形態が図23Bに示されている。凝集物の大部分は、50~100mMの直径の範囲にあり、ほんの少数だけが200mM以上の直径である。注目すべきことには、アルギネートバイオスキャフォールドにおけるインスリンC-ペプチドの含有量ng/mgタンパク質は、EpCAM細胞が超低結合性プレート内に懸濁状態で再凝集した並行培養物において観察されたものと同じであった。例9ストレプトゾトシンstz誘導化糖尿病scid-bgマウスにおけるヒトES細胞の治療効果の評価材料及び方法研究開始時点で7~8週齢のSCID-bg雄マウスを、180mg/kgの用量レベルで、6ml/kgの体積用量での細胞毒STZの単回の腹腔内IP注射に供した。>250mg/1日目の血中グルコースレベルを示した動物だけを、図15に概略を示されているような分化プロトコールに従って処理された3×106個のヒトES細胞の移入に供した。単回の移入を、左腎臓被膜の下に向けて行った。対照マウス群に偽注射した。空腹時ではない血中グルコースレベルを、STZ注射前に1回、移入前に1回、その後、研究の終わりまで週に2回、決定した。Glucometerを用いて、それぞれの日のほぼ同じ時間に測定を行った。血液試料を、尾静脈から採取した。グルコース負荷試験GTTを、2g/kgの用量レベルでの50デキストロースのIP注射又は経口胃管栄養法PO投与により、約16時間の絶食後、実施した。血中グルコースレベルを、以下の時点で、Glucometerを用いて尾静脈を介して全マウスにおいて決定した:デキストロース投与前、デキストロース投与から10分後、30分後、45分後、60分後、90分後、及び120分後。血液試料を、GTT試験後すなわち、デキストロース投与から約3時間後、収集した。血液試料を、尾静脈から、又は後眼窩静脈洞出血により得た。グルコースレベルについて毎週収集された全血試料合計2試料を、20~25μl/試料を超えない体積に限定し、GTT及びC-ペプチド測定について、全血液循環体積の10を超えない体積に限定した。IPGTT後のC-ペプチド測定値を、デキストロース投与から90分後、収集した。最後のIPGTTから1週間後、動物を安楽死させ、腎摘出術を施した。腎臓を切除し、パラフィンブロックに包埋し、又は後の組織学的分析のために凍結した。本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載されているが、多くの代案、改変、及びバリエーションが当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、添付された特許請求の範囲の精神及び幅広い範囲内に入るそのような代案、改変、及びバリエーションを全て包含することが意図される。本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的且つ個々に示されて、参照により本明細書に組み入れられている場合と同じ程度で、本明細書に参照により全体として組み入れられている。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は同定は、そのような参考文献が、本発明の先行技術として有効であるという承認として解釈されるべきではない。セクション見出しが用いられる範囲で、それらは、必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。"