体液由来の検体において、hsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする、横紋筋肉腫の検出方法。体液由来の検体において、hsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種の発現量が健常者より有意に亢進していることを検出の基準とする請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。少なくともhsamiR206の発現を評価することを特徴とする、請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。リアルタイムPCR法により検出する、請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。体液が血液であり、体液由来の検体が血漿又は血清である請求項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。本発明は、診断の困難な横紋筋肉腫を容易に検出する方法を提供することを目的とする。本発明者らは、小児腫瘍患者の体液由来検体において、筋に特異的に発現するmiRNA群であるhsamiR1133a133b206を定量し、横紋筋肉腫の非侵襲的な診断が可能かについて検討を行った。その結果、これらのmiRNAにより横紋筋肉腫が検出できることを見出した。本発明は、以下の横紋筋肉腫の検出方法を提供するものである。項1.体液由来の検体において、hsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする、横紋筋肉腫の検出方法。項2.体液由来の検体において、hsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種の発現量が健常者より有意に亢進していることを検出の基準とする項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。項3.hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206からなる群から選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現を評価することを特徴とする項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。項4.少なくともhsamiR206の発現を評価することを特徴とする、項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。項5.リアルタイムPCR法により検出する、項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。項6.体液が血液であり、体液由来の検体が血漿又は血清である項1に記載の横紋筋肉腫の検出方法。横紋筋肉腫は診断が難しい腫瘍の1つであるが、本発明によれば、従来無理と思われていた体液由来の検体を用い、横紋筋肉腫を検出することができるようになった。横紋筋肉腫は、化学療法、放射線療法の前に腫瘍を完全に切除することが予後の改善に重要であり、術前に暫定診断を行い初回に完全切除を目標とした手術方針を決定できることが重要である。本発明により横紋筋肉腫の診断がより正確かつ迅速にできるようになり、横紋筋肉腫の治療成績の向上が期待できる。本発明で検出の対象とするhsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206の配列を以下に示す。また、発現が高く、組織間での発現にばらつきが少ないためにinternalcontrolとして使用可能なhsamiR16の配列を合わせて表1に示す。hsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206は、図3に示すように、横紋筋肉腫細胞株の培養上清に多量に放出されており、腫瘍由来のmiRNAが腫瘍細胞内から遊離して存在する。人体内においても、腫瘍由来の遊離のmiRNAが体液中に存在することにより、横紋筋肉腫の検出、診断に利用できるものと考えられる。本明細書において、体液としては、血液、胸水、腹水、髄液、尿などが挙げられる。血液は横紋筋肉腫の発生部位もしくは転移部位によらず有効であるが、発生部位もしくは転移部位が泌尿器である場合には尿が、中枢神経系などの場合には髄液が、腹腔内などの場合には腹水が、胸腔内の場合には胸水が各々有効である。体液として血液を使用する場合、血液由来サンプルを18000g10分の遠心処理を行い、その上清を用いて、白血球、赤血球の混入を防止することが必要である。本発明で使用するmiRNAは、20年前の20°C保存血清検体からも検出可能であり、血清中で本発明に使用するのに十分な安定性を有している。例えば、血清を4°Cで30日間保存すると絶対量として16分の1から8分の1程度になるが、hsamiR133bとhsamiR16の比には大きな変化を認めなかった。miRNAの検出、定量は、miRNAを含むサンプルを逆転写してcDNAを得て、これを定量的リアルタイムPCRなどの適当な方法により実施することができる。cDNAは、例えばTaqManMicroRNARTkit、TaqManMicroRNAassaysのMaturemicroRNA特異的RTprimerなどを用いて、逆転写反応を行うことにより調製できる。また、定量的リアルタイムPCRは、TaqManMicroRNAassaysのTaqmanprimerとprobe、TaqManUniversalPCRMasterMixを用いて実施することができる。横紋筋肉腫の検出に関しては、p<005で有意に筋特異的miRNAの発現が、横紋筋肉腫群において増加する。測定対象のmiRNAとしては、hsamiR206が感度、特異度ともに最も高く、有用と考えられる。hsamiR133ahsamiR133b、hsamiR206については、腫瘍と血清のmicroRNA量の相関が認められた。本発明の横紋筋肉腫の検出に関し、筋特異的miRNAhsamiR1hsamiR133ahsamiR133b及びhsamiR206とhsamiR16の比筋特異的miRNAhsamiR16は、横紋筋肉腫の診断時の体液、特に血清のバイオマーカーとして期待される。本発明の検出方法によれば、横紋筋肉腫を他の小児の腫瘍である神経芽腫、ユーイング肉腫、悪性横紋筋様腫瘍と区別して検出可能である。従来これらの腫瘍との鑑別は困難であり、本発明は、横紋筋肉腫の特異的な検出に極めて有効な手段を提供する。本発明の筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の治療後に発現量が低下するので、治療の有効性の指標にもなる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。実施例11.方法細胞株、腫瘍検体、血清京都府立医科大学小児科で保有している16細胞株横紋筋肉腫7、神経芽腫4、ユーイング肉腫3、悪性横紋筋様腫瘍2、21腫瘍検体横紋筋肉腫7、未分化肉腫4、ウイルムス腫瘍2、神経芽腫2、ユーイング肉腫1、悪性横紋筋様腫瘍1、副腎がん1、網膜芽腫1、胞巣状軟部肉腫1、骨肉腫1、48血清検体横紋筋肉腫8、神経芽腫3、ウイルムス腫瘍2、ユーイング肉腫2、肝芽腫2、網膜芽腫2、骨肉腫2、未分化肉腫2、悪性横紋筋様腫瘍1、胞巣型軟部肉腫1、副腎がん1、膵芽腫1、奇形腫1、急性リンパ芽球性白血病1、ランゲルハンス細胞組織球症1、神経膠腫1、健常人ボランティア17、15体液検体横紋筋肉腫2髄液1、胸水1、神経芽腫3髄液1、胸水1、腹水1、髄芽腫3髄液3、上衣腫1髄液1、網膜芽腫1髄液1、悪性横紋筋様腫瘍1髄液1、ウイルムス腫瘍1髄液1、胚細胞腫瘍1腹水1、乳び胸1胸水1、自己免疫疾患1髄液1を用いて検討を行った。RNAの抽出miRNAを含むtotalRNAはmirVanaPARISkitAmbionを用いて抽出した。細胞株培養液の上清、血清については、細胞成分を除去するため、15000rpm、10分間の遠心処理をさらに加え、その上清を用いた。逆転写反応TaqmanMicroRNARTkitAppliedBiosystemsTaqmanMicroRNAassaysAppliedBiosystemsのmaturemiRNA特異的逆転写反応用プライマーを用いて逆転写反応を行った。定量的リアルタイムPCR逆転写したcDNA溶液、TamanMicroRNAassyasのプライマーとプローブを用いて、定量的リアルタイムPCRを行った。体液以外の検体では、組織間で発現のばらつきが少なく、高発現しているhsamiR16を内在コントロールとし、筋特異的miRNAの発現をnormalizeして、ΔΔCt法を用いて定量した。体液検体では、hsamiR16の発現が一定しなかったため、コピー数が既知である合成miRNAを用いて検量線を作成し、絶対定量を用いて定量した。血清1μl当たりのhsamiR206コピー数を算出し比較した。筋特異的miRNAhsamiR1133a133b206、およびhsamiR16の配列を表1に示す。統計解析血清におけるmiRNAの発現は、MannWhitneyのU検定を用いて比較した。腫瘍と血清のmiRNAの発現の相関はSpearmanの順位相関係数を用いて検討した。いずれの検定も両側検定で行い、p005を有意差ありとした。統計解析血清におけるmiRNAの発現は、MannWhitneyのU検定を用いて比較した。腫瘍と血清のmiRNAの発現の相関はSpearmanの順位相関係数を用いて検討した。いずれの検定も両側検定で行い、p005を有意差ありとした。2.結果細胞株における筋特異的miRNAの発現細胞株における検討では、横紋筋肉腫細胞株n7では、神経芽腫n4、ユーイング肉腫n3、悪性横紋筋様腫瘍n2細胞株に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた図1。臨床腫瘍検体における筋特異的miRNAの発現臨床腫瘍検体における検討では、横紋筋肉腫腫瘍検体n7で他の小児がん腫瘍検体n14に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた図2。細胞株培養液上清における筋特異的miRNAの発現細胞株培養液上清における検討では、横紋筋肉腫細胞株の培養液上清n7で、神経芽腫n4、ユーイング肉腫n3、悪性横紋筋様腫瘍n2細胞株の培養液上清に比べて筋特異的miRNAの発現が増加していた図3。血清における筋特異的miRNAの発現血清における検討では、横紋筋肉腫の患児血清n8において、他の小児がん患児血清n23、健常人ボランティア血清n17に比べて、筋特異的miRNAの発現が統計学的に有意差をもって増加していた図47。ROC曲線を用いて、cutoff値を設定し感度、特異度を算出したところ、hsamiR206が最も高い感度、特異度を示し、感度100、特異度913であった図7。また、腫瘍と血清の両方の検体が得られたものについて、miRNAの発現の相関について検討したところ、hsamiR1ではp00793と統計学的に有意ではないものの相関する傾向がみられ、hsamiR133a133b206では、有意な相関を認めた表2。また、治療前後のペア血清が得られた3症例について、治療による筋特異的miRNAの発現の変化についても検討を行っており、治療後には、いずれもcutoff値を下回っており、発現は健常人ボランティアと同程度にまで低下した図8。血清中の筋特異的miRNAは、横紋筋肉腫の病勢を反映して増減し、治療奏功時には低下し、再発時や増悪時には上昇した図10。体液における筋特異的miRNAの発現血清以外の体液である髄液、胸水においても、横紋筋肉腫患者n2では、筋特異的miRNAの発現が、非横紋筋肉腫患者n13と比較して高値であった図11。癌性髄膜炎を発症した横紋筋肉腫患者の髄液においても、その病勢を反映して増減し、治療奏功時には低下し、再発時や増悪時には上昇した図12。3.考察横紋筋肉腫の細胞株、臨床腫瘍検体において、いずれも筋特異的miRNAの発現は増加しており、横紋筋肉腫が未分化な筋細胞に由来する腫瘍であることと矛盾しない結果であった。また、細胞成分を除去した細胞株培養液上清からも筋特異的miRNAは検出可能であり、横紋筋肉腫において、発現が最も増加していた。これは、細胞外にも筋特異的miRNAが遊離していることを示唆しており、臨床腫瘍検体の結果と合わせると、横紋筋肉腫患児血清中にも筋特異的miRNAが多量に存在していると考えられた。血清での検討では、いずれの筋特異的miRNAの発現も横紋筋肉腫患児血清において有意に増加しており、横紋筋肉腫の術前診断に有用であると考えられた。なかでも、hsamiR206は感度100、特異度913とバイオマーカーとして最も有用であると考えられた。さらに、臨床腫瘍検体と血清のmiRNAの発現量は相関を認め、また、治療後には、横紋筋肉腫患児血清において筋特異的miRNAの発現は健常人ボランティアと同レベルまで低下しており、これらの結果は血清で検出されるmiRNAは腫瘍由来であることを示唆している。血清以外の体液においても横紋筋肉腫患者において、筋特異的miRNAの発現は高く、病勢に応じて発現の変化を認めた。横紋筋肉腫は、小児で最も多い軟部肉腫であるにもかかわらず、現在、血液検査で測定できる腫瘍マーカーは存在せず、その術前診断は困難である。一方、本腫瘍では初回手術後の残存腫瘍の存在は予後不良因子であるため、初回手術前に横紋筋肉腫の暫定診断がなされていれば、全摘を目標とした手術を計画することができる。このため、横紋筋肉腫の術前診断につながる非侵襲的なバイオマーカーの存在は重要である。今回検討した筋特異的miRNAは、高い感度、特異度をもって、横紋筋肉腫の術前診断を可能にし、予後の改善に寄与しうる新規バイオマーカーであると考えられる。