eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、以下のa~dのいずれかのオリゴヌクレオチドのセットを含む、プライマーセット:aそれぞれ配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなる4つのオリゴヌクレオチドのセット;baの4つのオリゴヌクレオチドのそれぞれの相補鎖である4つのオリゴヌクレオチドのセット;ca又はbに記載の4つオリゴヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドのセット;及びda~cのいずれかのオリゴヌクレオチドのセットに含まれるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーセットとして機能するオリゴヌクレオチドのセット。さらに、e~hのいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプライマーセット:e配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;feのオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;及びge又はfに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及びhe~gのいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド。前記食中毒原因大腸菌が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、及び視が毒素産生性大腸菌STECからなる群より選択されるいずれかの大腸菌である、請求項1または2に記載のプライマーセット。請求項1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを含む、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出用キット。eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法であって、試料中の核酸を抽出する工程と、LAMP法により、GenBankのAccessionNo.AF530557の642位から877位に含まれる領域を検出する工程と、を含む方法。前記LAMP法において請求項1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを使用する、請求項5に記載の方法。本発明は、食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出する方法及び当該方法に使用されるプライマーセット並びにキット等を提供することを目的とする。本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を特異的に検出するのに必要なeae遺伝子上の領域を特定し、当該領域をLAMP法により増幅できるプライマーを設計し、これを合成して実際に当該領域を特異的に増幅できることを確認して本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、1eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、以下のa~dのいずれかのオリゴヌクレオチドのセットを含む、プライマーセット:aそれぞれ配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなる4つのオリゴヌクレオチドのセット;baの4つのオリゴヌクレオチドのそれぞれの相補鎖である4つのオリゴヌクレオチドのセット;ca又はbに記載の4つオリゴヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドのセット;及びda~cのいずれかのオリゴヌクレオチドのセットに含まれるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーセットとして機能するオリゴヌクレオチドのセット;2さらに、e~hのいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、上記1に記載のプライマーセット:e配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;feのオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;及びge又はfに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及びhe~gのいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド;3前記食中毒原因大腸菌が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、及び視が毒素産生性大腸菌STECからなる群より選択されるいずれかの大腸菌である、上記1または2に記載のプライマーセット;4上記1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを含む、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出用キット;5eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法であって、試料中の核酸を抽出する工程と、LAMP法により、GenBankのAccessionNo.AF530557の642位から877位に含まれる領域を検出する工程と、を含む方法;及び6前記LAMP法において上記1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを使用する、上記5に記載の方法に関する。本発明によれば、LAMP法を利用して、インチミンをコードするeae遺伝子を有する大腸菌を特異的に、即ち他の大腸菌や他の属の腸内細菌と区別して、簡便且つ迅速に検出することができる。本発明は、各種食品検体、環境検体、臨床検体などにおける食中毒原因大腸菌による汚染の検出に有用である。本発明に係るプライマーセットは、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのセットである。本発明者は、国際的な遺伝子データベースGenBank、EMBL及びDDBJを使用して、eae遺伝子の塩基配列をすべて収集し、1塩基でも異なるものは別の配列として整理したところ、全部で83通りの配列を得た。このeae遺伝子の塩基配列は、例えばGenBankのデータベースなどから入手可能であり、AF530555、AF530557、AJ579305などの登録番号を有している。これらを比較して、配列が互いに100保存されている領域と95以上保存されている領域を特定した。これらの領域のうち、約250塩基長の領域で、且つその5分の4以上が100保存されており、残りの5分の1が95以上保存されている領域を特定した。このような領域は複数箇所特定できたが、それらから特異的な配列を特定し、LAMPプライマーを設計した。本発明者は、eae遺伝子の塩基配列に基づいて、インチミンをコードする領域例えば登録番号AF530557の642~877番目等を標的としてプライマーの設計を行った。プライマーの設計にあたっては上記塩基配列を標的に、各領域のTm値が約58~65°Cになる部分を選択し、またF2~B2領域間が120bp程度になるようにした。LAMPプライマーの設計の上でポイントとなるこれら幾つかの条件を満たす領域を絞り込みeae遺伝子検出用プライマーを設定した。設計したプライマー33種類を合成し、実際に種々の大腸菌株を用いてLAMP法による増幅を行ったところ、配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなるプライマーのセットを用いると、インチミンを有する大腸菌からは必ず増幅酸物が得られ、インチミンを有しない大腸菌及び他の腸内細菌は増幅酸物が得られないことを確認した。本発明のプライマーセットの第一の態様は、下表に示されるプライマーを含む。このプライマーセットは、GenBank登録番号AF530557において642位~877位の領域を標的として設計されたものである。このプライマーセットが増幅する領域は、GenBankなどで入手可能な他の細菌種の塩基配列と比較し相同性を示さない部分であることが確認された。本発明のプライマーセットは、上述した第一の態様における各オリゴヌクレオチドの相補鎖を含むものであってもよい。例えば、配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列と相補的な配列からなる4つのオリゴヌクレオチドを含むセットも、GenBank登録番号AF530557において642位~877位の領域を特異的に検出することができる。また、本発明のプライマーセットは、上述した第一の態様における各オリゴヌクレオチドと、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、5DenhardtsSolution01FicollPharmacia社、01ポリビニルピロリドン、01ウシ血清アルブミンを含むと、05SDSと、100μgmlサケ精子DNAを含む6×SSC溶液1×SSCは015MNaCl、15mMクエン酸ナトリウム中において65°Cで洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度イオン強度、温度等によって制御することができ、ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、相同性が十分に高いDNAのみがハイブリダイズする。従って、かかる条件下で、上記第一の態様における各オリゴヌクレオチドと、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドは、第一の態様におけるプライマーセットと同様に、LAMP法のプライマーとして機能する。当業者であれば、温度や塩濃度を調整することによって、ストリンジェントな条件を適宜選択することができる。また、本発明のプライマーセットは、上述した第一の態様における各オリゴヌクレオチドの少なくとも1つにおいて、1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、LAMP法用プライマーセットとして機能するオリゴヌクレオチドのセットであってもよい。1から数個とは、例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個から選択することができ、欠失、付加又は置換される部位は、オリゴヌクレオチドの5末端又は3末端でもよいし、末端以外の部分であってもよい。各プライマーに、例えば、制限酵素部位を導入してもよい。制限酵素部位を導入すると、LAMP法の反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に1つのバンドとして検出することができる。本明細書においてeae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌は、その程度を問わず食中毒を引き起こす大腸菌であってeae遺伝子を有するものであれば特に限定されないが、例えば、O157、O26、O111、O103、O145、MN157JournalofVeterinaryMedicalSciences62115111552000、A29、B31などが挙げられる。上記第一の態様のプライマーセットは、さらに、以下のi~ivのいずれかを含んでいてもよい。i配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;iiiのオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;iiii又はiiに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及びivi~iiiのいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド。配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、LAMP法において、ループプライマーであるLBプライマーとして機能する。ループプライマーとは、LAMP法において、ダンベル構造の5末端側のループの1本鎖部分B1領域とB2領域の間、またはF1領域とF2領域の間に相補的な配列を有するプライマーである。LAMP法は、FIP、BIP、F3、B3の4つのプライマーで実施することができるが、ループプライマーを用いることにより、DNA合成の起点を増やして増幅効率を上昇させることが可能である。かかるLBプライマーの相補鎖であるオリゴヌクレオチドii、オリゴヌクレオチドi又はiiとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドiii、i~iiiのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドivも、LBプライマーとして機能する。本発明のプライマーセットは、さらに、ループプライマーであるLFプライマーを含んでいてもよい。キット本明細書において、食中毒原因大腸菌の検出用キットは、本発明に係るプライマーセットを含み、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出に適している。かかるキットは、例えば、プライマーセットのほか、反応溶液、鎖置換型DNAポリメラーゼ、蒸留水、陽性コントロール、陰性コンロトール、取扱説明書等を含んでいてもよい。さらに、試料から核酸を抽出するための試薬や器具、各種反応用チューブ、チップ等を備えていてもよい。また、食品中の腸管出血性大腸菌を培養して測定する場合には、増菌用培地を備えていてもよい。かかるキットを用いれば、例えば、反応チューブに試料を添加して、LAMP用のリアルタイム濁度測定装置にセットすることにより、増幅及び増幅産物の検出を効率よく行うことができる。検出方法本明細書において、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法は、試料中の核酸を抽出する工程と、LAMP法により、eae遺伝子のうち、GenBank登録番号AF530557における642位~877位に含まれる領域を検出する工程と、を含む。試料は、例えば、食肉、野菜、果物、乳製品、魚介類等の各種食品検体、土壌、河川湖沼の水等の環境検体、ヒト、ウシ、ウマ等の動物由来の組織、糞便等の検体とすることができる。これらの試料から核酸を抽出する工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができるが、例えば、DNAをアルカリ熱抽出する方法で行うことができる。この場合、例えば、試料をアルカリ溶液中で加熱し、遠心処理を行った後、上清をLAMP法に使用する。LAMP法に供する前に核酸の濃縮を行ってもよい。核酸の抽出は、LysozymeやProteinaseKなどによって菌体を処理してから加熱する方法で行ってもよい。さらに、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心処理によりさらなる精製を行ってもよい。また、核酸抽出に先立って、増菌培養、菌の濃縮、分離等を行ってもよい。具体的には寒天培地上で増菌培養し、形成されたコロニーからDNAを抽出する。菌の濃縮、分離は、ろ過、遠心分離などを用いた公知の方法に従って行うことができる。LAMP法により、GenBank登録番号AF530557における642位~877位に含まれる領域で示される領域を検出する工程は、上記上清と、プライマーセット、鎖置換型DNAポリメラーゼ、基質dNTPs、反応バッファーを混合し、反応させることによって行うことができる。核酸がRNAの場合は、さらに逆転写酵素を加えることにより、反応をonepotで行うことができる。GenBank登録番号AF530557における642位~877位に含まれる領域とは、642位~877位の領域のみならず、この間に含まれる任意の領域を意味するが、例えば、642位~877位のうち連続した180塩基以上の領域や、連続した200塩基以上の領域等を選択することができる。反応は、例えば、65°Cで60分とすることができ、その後、温度を上げるなどの方法により酵素を失活させる。65°C、60分の反応を行うことにより、109~1010倍に核酸を増幅することが可能である。LAMP反応試薬は、例えば、栄研化学社から市販されているLoopampDNA増幅試薬キット但し、プライマーセットを除くを使用してもよい。この場合、反応液の例は次のとおりである。2倍濃度反応用緩衝液:40mMTrisHCl、20mMKCl、20mM2SO4、16mMMgSO4、02Tween20、16MBetaine;各終濃度28mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP;DNAポリメラーゼ:BstDNAPolymerase8unitsμl;本発明の各プライマー終濃度:FIPおよびBIP各40μM、F3およびB3各5μM、LB20μM。LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を45μl、2倍濃度反応用緩衝液を125μl、FIP、BIP、F3、B3、LBの各プライマーを1μl加え、DNAポリメラーゼ1μl、検体液鋳型DNA2μlを加え、全量25μlとする。あるいは、市販のDNAポリメラーゼ例えば、NewEnglandBioLab社のBstDNApolymeraseLargefragmentを使用し、これに添付されている反応用緩衝液10倍濃度を用いてもよい。この場合、反応液の例は次のとおりである。10倍濃度反応用緩衝液:200mMTrisHCl、100mMKCl、100mM2SO4、2mMMgSO4、1TritonX100;50mMMgSO4;各終濃度25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP例えばニッポンジーン社製dNTPsMixture;5MBetaine例えばSigma社製;DNAポリメラーゼ:BstDNApolymeraseLargefragment8unitsμl;本発明の各プライマー終濃度:FIPおよびBIP各40μM、F3およびB3各5μM、LB20μM。この場合、LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を21μl、10倍濃度反応用緩衝液を25μl、MgSO4を30μl、Betaineを80μl、dNTPsMixtureを14μl、FIP、BIP、F3、B3、LBの各プライマーを1μl加え、DNAポリメラーゼ1μl、検体液鋳型DNA2μlを加え、全量25μlとする。試料中に標的配列があれば、即ち、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌が含まれていれば、増幅反応の副産物として、ピロリン酸マグネシウムにより白濁を生じる。従って、反応液の濁度の上昇を確認することにより、試料中にeae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌が含まれていたかどうかを確認することができる。濁度の上昇は、目視により確認してもよいし、専用の濁度測定装置を使用して測定してもよい。必要に応じて、アガロースゲル電気泳動法などを利用してDNA断片の有無を検出してもよい。陽性コントロール及び/又は陰性コントロールを使用し、コントロールの濁度の変化と、試料の濁度の変化とを比較することにより、反応が適切に進行したかどうかを確認し、検査の精度を上げることができる。上記検出方法には、本発明のプライマーセットを用いてもよい。本発明のプライマーセットによれば、eae遺伝子を特異的に検出し、食中毒原因大腸菌の有無を精度よく確認することができる。本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。1プライマーの設計EHEC、STEC、及びEPECのeae遺伝子と他の大腸菌の塩基配列とを比較し、eae遺伝子に特異的なLAMPプライマーを設計した。設計したプライマーセットにおけるプライマーの配列は以下のとおりである。プライマーは、HPLCで精製したものを用いた。各プライマーセットについてのF2、F1c、B1c、B2、F3、B3の各部位positionを下表に示す。positionはGenBankのAccessionNo530557に対応する塩基の位置で表されている。バリエーションのある他の配列ともマッチさせるため、AF530557とは完全にマッチしていない部分を含むプライマーも含まれている。2LAMP反応LAMP反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、LAMP反応試薬は栄研化学社製のLoopampDNA増幅試薬キットを用い、栄研化学社のDNA増幅試薬キットLMP204の添付説明書に従って実験を行った。2倍濃度反応用緩衝液:40mMTrisHClpH88、20mMKCl、20mMNH42SO4、16mMMgSO4、02Tween20、16MBetaine。各終濃度28mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。DNAポリメラーゼ:BstDNAPolymerase8unitsμl。プライマー終濃度:FIP、BIP各40μM、F3、B3各5μM、LB各20μM。LAMP反応液は、滅菌蒸留水を45μl、2倍濃度反応用緩衝液を125μl、FIP、BIP、F3、B3、LBの各プライマーを1μl加え、DNAポリメラーゼ1μl、検体液鋳型DNA2μlを加え、全量25μlの反応液を調製した。検体液鋳型DNAの調整は以下のとおりに行った。まず、LuriaBertani寒天培地Trypton10gYeastextract5gNaCl5gAgar15gを蒸留水1リットルに溶解し滅菌したものをシャーレに流し込んで作製した平板培地で37°C1夜培養した大腸菌を白金耳で掻き取り、500μlのsalineEDTA溶液015MNaCl01MSodiumEDTApH80に懸濁し、25μlの20SDS溶液を加えて、60°Cで10分加温し溶菌させた。これに500μlのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを加えて激しく攪拌し、タンパク質を変性させた。これを8000rpm10分遠心し、上清を回収した。このPCI添加攪拌遠心を少なくとも3回繰り返し、得られた上清に99エタノールを25倍量加えて、混和した。エタノールによって沈殿したDNAの沈渣を残して、上清を捨てた。この沈渣を70エタノールで少なくとも3回濯ぎ、最後に99エタノールの濯ぎを行って、上清をできる限り除いた。得られた沈渣を、100μlの蒸留水に溶解して、検体原液とした。これを蒸留水で希釈したものを検体液鋳型DNAとした。大腸菌としては、eae遺伝子を保有するEHEC11株O157A、O157B、871、MN157、42、11、172、541、A29、B31及び145を用い、コントロールとして、eae遺伝子を保有しないSTECを7株91、134、sampleE、181、FU1、MC1、KR1、IW1、34105を用いた。これらの菌株は、いずれも本発明者の研究室で保存されている株であり、O157A、O157Bいずれも本発明者の研究室で使用している名前、A29及びB31は、実際に食中毒の原因となった株である。871、42、11、172、541、145は、健康な牛の糞便から単離し、stx遺伝子とeae遺伝子を保有することを確認している。また、コントロールで用いた株のうち、91、134、181は、健康な牛の糞便から単離し、stx遺伝子を保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。sampleE及び34105は、食肉の検査で牛肉表面から分離された株であり、stx遺伝子を保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。FU1、MC1、KR1、IW1は、浮腫病と呼ばれる豚の大腸菌症を発症した豚から分離された株であり、浮腫病の株に特異的なシガ毒素遺伝子stxeを保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。LAMP反応は、株式会社富士通システムソリューションズが販売するリアルタイム濁度測定装置Realoop30を用いて行った。65°Cの等温反応を60分間行い、その後80°C、2分間の酵素失活処理を行った。濁度測定装置は、LAMP反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをeae遺伝子について陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性-とした。3結果プライマーセット32及び25を用いた結果を図1-5、及び以下の表に示した。図1~3及び5の各レーンは以下のとおりである。図4の各レーンは以下のとおりである。図1~4は、ネガティブコントロールで非特異的反応が生じないことを確認するために上述の検体原液を100倍に希釈した高濃度の検体液を用いた結果である。プライマーセット32は、LBを加えない場合図1も加えた場合も図3上段及び図4、eae遺伝子を保有するEHECのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察され、eae遺伝子を保有しないSTECでは白濁を生じなかった。プライマーセット25は、eae遺伝子を保有しないSTECでは白濁を生じなかったが、eae遺伝子を保有するSTECについて白濁が明瞭でないものが存在した図2。特にLBを加えた場合に白濁が十分に生じない傾向が見られた図3下段。なお、他のプライマーセットは、偽陽性、偽陰性が多く見られ、eae遺伝子を特異的に検出するのに適していなかった。図5は、プライマーセット32について、上述の検体原液を10000倍に希釈した検体液を用いた結果である。プライマーセット32を用いれば、濃度の薄いDNAサンプルを用いた場合でも、eae遺伝子を保有する株について明瞭に白濁を生じることが確認できた。確認のため、EHEC、STEC及びEPECのeae遺伝子検出法の一つであるPCR法JournalofClinicalMicrobiology2004Vol42No2645651による検出を行った。結果を下表に示す。PCR法による検出の結果は、LAMP法による結果と完全に一致した。このことは、本発明による検査が正しい結果を与えることを示している。上表に示されるように、本発明に係るプライマーセットを使用してLAMP法を実施することにより、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を特異的に、1時間以内に確認することができた。