"酵素イムノアッセイによりヒト由来の生物学的流体における自然自己抗体を定量的に測定する方法であって;物理的収着用固相を抗原で処理し、被験生物学的試料を添加し、コンジュゲート含有溶液で前記固相を処理し、前記固相と液相とを分離し、前記固相に添加した発色剤溶液の吸光度を分光光度分析することを含み;前記物理的収着用固相としてストレプトアビジンでコーティングされている物理的収着用固相を用いること;予めビオチン化されている抗原と、前記物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするためのブロッキング剤としての標準的な手順に従ってビオチン化されたタンパク質で前記物理的収着用固相を処理すること;酵素で標識されており、且つヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの1種若しくは全てと反応するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を前記コンジュゲート含有溶液として用いること;前記物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に前記自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで前記被験生物学的流体を予め希釈し、次いで、前記被験生物学的流体を加熱処理すること;各生物学的流体の被験試料に対して、ビオチン化抗原が固定化されていない対照物理的収着用固相を用いること;及び抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用してプロットした検量線を用いて前記自然自己抗体の数を求めることを特徴とする方法。加熱処理を行う前に、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで希釈した被験生物学的流体を鉄含有酸化剤で更に処理する請求項1に記載のヒト由来の生物学的流体における自然自己抗体を定量的に測定する方法。本発明の目的は、EIA法を用いてヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定するための技術的に簡便で、感受性が高く、且つ特異的な方法を開発することにある。上記課題は、酵素イムノアッセイを用いてヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定する方法であって、物理的収着用固相を抗原で処理し、被験生物学的試料を添加し、コンジュゲート含有溶液で前記固相を処理し、前記固相と液相とを分離させ、発色剤溶液の吸光反応を分光光度分析することを含む方法により解決される。本発明によれば、ストレプトアビジンでコーティングされている物理的収着用固相を物理的収着用固相として用いることができる。予めビオチン化されている抗原と、前記物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするためのブロッキング剤としての標準的な手順に従ってビオチン化されたタンパク質を用いて前記物理的収着用固相を処理する。コンジュゲート含有溶液として、ヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの1種若しくは全ての種類と反応するモノクローナル又はポリクローナルな酵素標識抗体を用いる。更に、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで前記被験生物学的流体を予め希釈し、次いで、加熱処理する。各生物学的流体の被験試料に対して、ビオチン化抗原が固定化されていない対応する対照物理的収着用固相を用いる即ち、固相のストレプトアビジンと結合する各生物学的流体の被験試料に対して、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と同様のビオチン化対照タンパク質を用いることにより、自然自己抗体に対して特異的な分光学的シグナル及び非特異的な分光学的シグナルを測定することを可能にする。そして、抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に対して正規化された検量線を用いて自然自己抗体の数を求める。更に、加熱処理を行う前に、物理的収着用固相の非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質と、加熱処理中に自然自己抗体が分解するのを防ぐ基質とを含有するバッファーで希釈した被験生物学的流体を、鉄含有酸化剤で更に処理する。抗原を直接固定化すると抗原のエピトープの立体構造の変化及び分解が生じるので、EIA法の感受性が低下するが、本発明の方法では、ストレプトアビジンでコーティングした物理的収着用固相とビオチン化された被験試料を用いることにより、固定化されている抗原の全てのエピトープが自然自己抗体に結合可能な状態で保たれるので、感受性が高い。更に、ヒト免疫グロブリンのアイソタイプのうちの1種又は全ての種類と反応する酵素標識抗体を適用することにより、自然自己抗体の特定のアイソタイプ又は全てのアイソタイプの濃度を測定することが可能になるので、本発明の方法は適用範囲が広い。物理的収着用固相における非特異的結合部位をブロックするために用いられるタンパク質を含有するバッファーで被験試料を予め希釈することにより、被験試料中の抗体とタンパク質が固定化されている固相との非特異的結合の可能性を最小化できる。これも、本発明の方法の特異性及び感受性を高める。鉄含有酸化剤の添加及び被験試料の加熱処理により、自然自己抗体と抗原及び抗イディオタイプ抗体との複合体を破壊したり、様々なデマスキング作用により抗体パラトープによる抗原エピトープの利用可能性を確保したりすることが可能になる。被験試料をバッファーで予め希釈することにより、加熱処理中に自然自己抗体が分解されるのを防ぐことができ、自然自己抗体の総濃度即ち、遊離型及び抗原結合型の自然自己抗体、又はパラトープがブロックされている自然抗体の総濃度を測定することが可能になるので、擬陽性の結果が生じる可能性を低減し、且つ本発明の方法の感受性、効率、及び機能を高めることができる。各生物学的流体の被験試料について、固定化されている場合、ビオチン化ブロッキングタンパク質を備える個々の対照物理的収着用固相を用いると、自然自己抗体に対して特異的及び非特異的な分光学的シグナルを推定することが可能になるので、これも擬陽性が生じる可能性を低減し、且つ本発明の方法の感受性を高める。更に、本発明の本質的な特徴を組み合わせることにより、自然自己抗体の濃度の定量的測定の可能性を広げ、且つ本発明の課題を解決する技術的手段の範囲を広げることができる。ヒト由来の生物学的流体中の自然自己抗体濃度を定量的に測定するための本発明の方法は、以下の通り実施される。標準的なウェルプレートの物理的収着用固相ウェルをストレプトアビジン又はそのアナログ例えば、アビジン等でコーティングし、前記物理的収着用固相をブロッキング剤でブロッキングし、自然自己抗体の濃度を求めるために必要なビオチン化されている被験試料と共に、又は非特異的結合の対照であるビオチン化されているブロッキングタンパク質例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ゼラチン等対照ウェルと共にインキュベートする。最小量のビオチン例えば、D-ビオチニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル抗原のビオチンに対するモル比1:2で抗原をビオチン化して、エピトープの破壊を最小限に抑える。加熱処理中に自然自己抗体が分解されるのを防ぐためにタンパク質例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ゼラチン等、保存剤例えば、チメロサール等、界面活性物質例えば、Triton-X100等を含有するブロッキングバッファー溶液で50倍~200,000倍に希釈することにより、アッセイ用生物学的流体例えば、血清、血漿等を調製し、得られた生物学的流体溶液を50°C~80°Cの温度で加熱処理する。加熱処理前に、被験生物学的流体を鉄含有酸化剤例えば、塩化鉄III[FeCl3]で更に処理することを推奨する。次いで、加熱処理した被験生物学的流体溶液を、検量線をプロットするために用いた特異的抗体と同じウェルに入れる。検量線のプロットには、既知の濃度の抗原に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用する。形成される免疫複合体抗原-自然抗体を検出するために、特定の若しくは全てのヒト免疫グロブリンの軽鎖に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体例えば、ヤギポリクローナル抗体、ヒツジポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体等と酵素例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等とのコンジュゲートを用いる。酵素例えば、アルカリホスファターゼ等により分解される際に基質から分離される発色剤の量に依存して色が変化する発色剤溶液の吸光反応を用いて自然自己抗体の濃度を求める。前記基質は、特定の波長で色の特徴を分光学的に測定することができる可溶性生成物を生成する。実施例1ヒトのガンマインターフェロンIFN-γに対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定することで本発明の方法を実施しながら技術的な効果が得られる可能性を確認するために、インターフェロン療法を受けていない20人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、前記ドナーの血清は、ヒトのIFN-γに対する自己抗体は含有していないが、前記ドナーの血清中にはヒトのIFN-γに対する自然自己抗体は存在している。Greinerbio-oneGmbH製のストレプトアビジンでコーティングされている96ウェルプレートカタログ番号655990のウェルの一部に、eBiosciences製の組換え型ヒトガンマインターフェロンヒトIFN-γ、カタログ番号34-8319-85100μLを接種し、前記ウェルの他の部分被験試料に対する対照ウェルに、SigmaAldrich製のウシ血清アルブミンカタログ番号A-3803を接種した。これらは両方共、湿度100にて100μL/ウェルの割合でU-CyTechBioscienceCompanyの標準的な手順標準操作手順番号UCT-127に従ってビオチン化した標識の原理は、安定なアミド結合を形成することにより、タンパク質の遊離アミノ基をD-ビオチニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルNHS-ビオチンと反応させ抗原のビオチンに対するモル比1:2反応は、穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートしている間に生じる;次いで、ビオチン化されたタンパク質をリン酸バッファー溶液で透析して、未反応のNHS-ビオチンを除去するというものである。血清試料を20倍に希釈し即ち、1のTriton-X100及び0.002のチメロサールを含有するリン酸バッファー1,900μLで血清100μLを希釈し、75°Cで20分間インキュベートした。次いで、インキュベートした溶液を更に5倍に希釈し即ち、1のウシ血清アルブミンBSA、1のTriton-X100、及び0.002のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水400μLでインキュベートした溶液100μLを希釈し、プレートのウェルに接種するために用いた1ウェル当たり100μL。検量線をプロットするために、16単位/mL~0.5単位/mLの濃度の標準抗体溶液を調製したヒトIFN-γに対するマウスモノクローナル抗体、クローンMD-2。本明細書では、100pg/mLのマウスモノクローナル抗体を1単位/mLと定義した。調製した標準抗体、ネガティブコントロールとして用いた溶液1のBSA、1のTriton-X100、及び0.002のチメロサールを含有するリン酸バッファー、及び被験試料溶液を、表1に示す通りプレートのウェルに接種し、37°Cで2時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートから流体を除去し、標準洗浄溶液0.05のTwin-20及び0.01のチメロサールを含有するリン酸バッファーでプレートをすすいだ。表1は、プレートのウェルと接種した試料とのチャートを示す。次いで、全てのプレートのウェルに、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているヒトのIgA、IgM、IgGに対するヤギ抗体の混合物SigmaAldrich;カタログ番号A-3313又はアルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのIgGに対するヤギ抗体SigmaAldrich;カタログ番号A-3562を100μLずつ接種した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのIgGに対するヤギ抗体は、検量線をプロットするために用いるヒトIFN-γに対するモノクローナル抗体MD-2の濃度を測定するために使用するものである。次いで、前記プレートを37°Cで1時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートのウェルから流体を除去し、標準洗浄溶液0.05のTwin-20及び0.01のチメロサールを含有するリン酸バッファーでプレートを5回すすいだ。コンジュゲート含有溶液のインキュベートが終了する15分間前に、基質バッファー1錠とSigmaCompany製の基質パラニトロフェニルホスフェートカタログ番号N-27701錠とを蒸留水20mLに溶解させることにより発色剤溶液を調製した。調製した発色剤溶液100μLを各プレートのウェルに接種し、前記プレートを37°Cで30分間インキュベートした。インキュベート後、全てのプレートのウェルにMerckKgaA製の停止溶液3Nの水酸化ナトリウムカタログ番号1.06495を接種し、標準的な光度計を用いて405nmの波長における吸光度を測定した。得られた測定結果を用いて、IFN-γに対する自然自己抗体の濃度を計算した。この目的のために、標準抗体の光学密度ODの真の値、及び被験試料の真の値を以下の通り求めた:1.ネガティブコントロールの平均ODウェル1G、1H、2G、2HのODの算術平均値を計算した。2.標準抗体の平均ODそれぞれの標準P1~P6のウェルにおけるODの算術平均値を計算した。3.標準抗体のODの平均値とネガティブコントロールのODの平均値との差として、標準抗体のODの真の値を計算した。計算結果を表2に示す。4.得られた標準抗体の真のOD値を用いて、検量線をプロットした図1を参照されたい。グラフ中、縦軸y軸は、OD値であり、横軸x軸はIFN-γに対する抗体の濃度である。プロットした検量線は、以下の等式:y=-0.0052x20.177x0.0172により表すことができる。5.ビオチン化IFN-γが固定化されているプレートのウェル表1の列3、5、7、9、11、及びビオチン化BSAが固定化されているプレートのウェル表1の列4、6、8、10、12における被験試料の平均OD値を計算した。例えば、被験試料S1の場合、それぞれウェルA3、B3、及びA4、B4について平均OD値を計算した。6.ビオチン化IFN-γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均OD値と、ビオチン化BSAが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均OD値との差として、被験試料の真のOD値を計算した。例えば、被験試料S1の場合、プレートのウェルA3、B3で測定された平均OD値から、プレートのウェルA4、B4で測定された平均OD値を減じた。7.検量線図1を用いて、被験試料におけるヒトIFN-γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた即ち、100を乗じた。8.結果を表3に示す。実施例2ヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度が増加している感染性単核症の患者20人から血清試料を採取した。被験試料を1,000倍に希釈し、ヒト血清アルブミンをブロッキング剤として使用し、56°Cでインキュベートを行ったことを除いて、ヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度を求めるための工程は全て実施例1に記載した手順と同様であった。検量線を図2に示し、得られた結果を表4に示す。実施例3ヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度を定量的に測定するための本発明の方法を実施したときに技術的な効果が得られる可能性を検証するために、加熱処理を行う前に、被験生物学的流体を鉄含有酸化剤で更に処理した。インターフェロン療法を受けていない20人の健常ドナーから血清試料を採取した。したがって、血清中にヒトのIFN-γに対する自己抗体は存在しないが、ヒトのIFN-γに対する自然自己抗体は存在している。Greinerbio-oneGmbH製のストレプトアビジンでコーティングされている96ウェルプレートカタログ番号655990のウェルの一部に、eBiosciences製の組換え型ヒトIFN-γカタログ番号34-8319-85100μLを接種し、前記ウェルの他の部分被験試料に対する対照ウェルに、SigmaAldrich製のウシ血清アルブミンカタログ番号A-3803を接種した。これらは両方共、湿度100にて100μL/ウェルの割合でU-CyTechBioscienceCompanyの標準的な手順標準操作手順番号UCT-127に従ってビオチン化した標識の原理は、安定なアミド結合を形成することにより、タンパク質の遊離アミノ基をD-ビオチニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルNHS-ビオチンと反応させ反応は、穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートしている間に生じる;次いで、ビオチン化されたタンパク質をリン酸バッファー溶液で透析して、未反応のNHS-ビオチンを除去するというものである。血清試料を10倍に希釈し即ち、1のTriton-X100及び0.002のチメロサールを含有するリン酸バッファー90μLで血清10μLを希釈し、2mMのFeCl3で処理し、56°Cで40分間インキュベートした。次いで、インキュベートした溶液を更に5倍に希釈し即ち、1のウシ血清アルブミンBSA、1のTriton-X100、及び0.002のチメロサールを含有するリン酸バッファー400μLでインキュベートした溶液100μLを希釈し、プレートのウェルに接種するために用いた1ウェル当たり100μL。検量線をプロットするために、16単位/mL~0.5単位/mLの濃度の標準抗体溶液を調製したヒトIFN-γに対するマウスモノクローナル抗体、クローンMD-2。本明細書では、100pg/mLのマウスモノクローナル抗体を1単位/mLと定義した。調製した標準抗体、ネガティブコントロールとして用いた溶液1のBSA、1のTriton-X100、及び0.002のチメロサールを含有するリン酸バッファー、及び被験試料溶液を、表5に示す通りプレートのウェルに接種し、37°Cで2時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートから流体を除去し、標準洗浄溶液0.05のTwin-20及び0.01のチメロサールを含有するリン酸バッファーでプレートを5回すすいだ。表5は、プレートのウェルと接種した試料とのチャートを示す。次いで、全てのプレートのウェルに、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているヒトのIgA、IgM、IgGに対するヤギ抗体の混合物SigmaAldrich;カタログ番号A-3313又はアルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのIgGに対するヤギ抗体SigmaAldrich;カタログ番号A-3562を100μLずつ接種した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているマウスのIgGに対するヤギ抗体は、検量線をプロットするために用いるヒトIFN-γに対するモノクローナル抗体MD-2の濃度を測定するために使用するものである。次いで、前記プレートを37°Cで1時間インキュベートした。インキュベート後、デカンテーションによりプレートのウェルから流体を除去し、標準洗浄溶液0.05のTwin-20及び0.01のチメロサールを含有するリン酸バッファーでプレートを5回すすいだ。コンジュゲート含有溶液のインキュベートが終了する15分間前に、基質バッファー1錠とSigmaCompany製の基質パラニトロフェニルホスフェートカタログ番号N-27701錠とを蒸留水20mLに溶解させることにより発色剤溶液を調製した。調製した発色剤溶液100μLを各プレートのウェルに接種し、前記プレートを37°Cで30分間インキュベートした。インキュベート後、全てのプレートのウェルにMerckKgaA製の停止溶液3Nの水酸化ナトリウムカタログ番号1.06495を接種し、標準的な光度計を用いて405nmの波長における吸光度を測定した。得られた測定結果を用いて、IFN-γに対する自然自己抗体の濃度を計算した。この目的のために、標準抗体の光学密度ODの真の値、及び被験試料のODの真の値を以下の通り求めた:1.ネガティブコントロールの平均ODウェル1G、1H、2G、2HのODの算術平均値を計算した。2.標準抗体の平均ODそれぞれの標準P1~P6のウェルにおけるODの算術平均値を計算した。3.標準抗体のODの平均値とネガティブコントロールのODの平均値との差として、標準抗体のODの真の値を計算した。計算結果を表6に示す。4.得られた標準抗体の真のOD値を用いて、検量線をプロットした図3を参照されたい。グラフ中、縦軸y軸は、OD値であり、横軸x軸はIFN-γに対する抗体の濃度である。プロットした検量線は、以下の等式:y=-0.0049x20.1807x0.0184により表すことができる。5.ビオチン化IFN-γが固定化されているプレートのウェル表5の列3、5、7、9、11、及びビオチン化BSAが固定化されているプレートのウェル表5の列4、6、8、10、12における被験試料の平均OD値を計算した。例えば、被験試料S1の場合、それぞれウェルA3、B3、及びA4、B4について平均OD値を計算した。6.ビオチン化IFN-γが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均OD値と、ビオチン化BSAが固定化されているプレートのウェルにおいて測定された被験試料の平均OD値との差として、被験試料の真のOD値を計算した。例えば、被験試料S1の場合、プレートのウェルA3、B3で測定された平均OD値から、プレートのウェルA4、B4で測定された平均OD値を減じた。7.検量線図3を用いて、被験試料におけるヒトIFN-γに対する希釈自然自己抗体の濃度を求めた。被験試料におけるヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度の真の値を得るために、得られた結果に試料の希釈係数を乗じた即ち、100を乗じた。8.結果を表7に示す。したがって、ヒトのIFN-γに対する自然自己抗体を含有する血清に本発明を適用した実施例により、本発明の特徴を組み合わせて実施した際のヒトIFN-γに対する自然自己抗体の濃度の定量的測定の効率及び信頼性が証明された。また、実施例3の通り、被験生物学的流体を更に処理すると本発明の方法の効率が高まる。"