"配列番号1CHOP-2の1-309位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1においてL132に相当する位置での置換を含み、該置換がチャネルの極性を増加するものである、光誘起イオンチャネル。L132の置換を除いて、配列番号1CHOP-2の1-309位置に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくはからなる、該置換がチャネルの極性を増加するものである、請求項1に記載の光誘起イオンチャネル。置換が、L132C、L132S、L132E、L132DおよびL132Tから選択され、好ましくは置換がL132Cである、請求項1または2に記載の光誘起イオンチャネル。a光感受性が、海馬ニューロンにおいて野生型CHOP-2と比較して5倍より多く、好ましくは10倍より多く、より好ましくは20倍より多く、例えば30倍より多く、さらにより好ましくは40倍より多く、例えば50倍より多く、もっとも好ましくは60倍より多く、または70倍より多く増加する;かつ/またはbHEK293細胞でのFura-2-イメージングによって測定される、カルシウム伝導度が、野生型CHOP-2と比較して少なくとも2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍増加される;かつ/またはc海馬ニューロンにおいて全細胞電気生理学的記録により測定した野生型CHOP-2と比較して、少なくとも1.5倍、より好ましくは2倍、またはさらにより好ましくは2.5倍増加した刺激頻度を示す、前記請求項のいずれかに記載の光誘起イオンチャネル。さらに、少なくとも1個の以下のアミノ酸残基:配列番号1の位置253に対応する位置のアスパラギン酸;配列番号1の位置257に対応する位置のリジン;配列番号1の位置260に対応する位置のトリプトファン;配列番号1の位置123に対応する位置のグルタミン酸;配列番号1の位置134に対応する位置のヒスチジンまたはアルギニン、好ましくはアルギニン;配列番号1の位置128に対応する位置のトレオニン、セリン、またはアラニン;および/または配列番号の位置156に対応する位置のアラニン、を含む、前記請求項のいずれかに記載の光誘起イオンチャネル。共通モチーフ、LIDxxxKxxWF,Yを含む、前記請求項のいずれかに記載の光誘起イオンチャネル。請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシンであって、レチナール誘導体は3,4-デヒドロレチナール、13-エチルレチナール、9-dm-レチナール、3-ヒドロキシレチナール、4-ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール;3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,4,6,8,10ペンタエナール;3,7ジメチル-デカ-2,4,6,8-テトラエナール;3,7-ジメチル-オクタ-2,4,6-トリエナール;および6-7回転阻止レチナール、8-9回転阻止レチナール、および10-11回転阻止レチナールからなる群から選択される、チャネルロドプシン。請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体。請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列または請求項8に記載の核酸構成体を含む発現ベクターであって、好ましくは該ベクターは遺伝子治療、特にウイルス媒介性の遺伝子導入に好適である、発現ベクター。請求項7に記載のチャネルロドプシン、請求項8に記載の核酸構成体または請求項9に記載の発現ベクターを含む、細胞。哺乳動物細胞または昆虫細胞、または酵母細胞、好ましくはサッカロマイセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベまたはピチアパストリスからの酵母細胞である、請求項10に記載の細胞。哺乳動物細胞が、a光受容細胞、網膜桿状体細胞、網膜錐体細胞、網膜神経節細胞、双極ニューロン、神経節細胞、偽単極ニューロン、多極ニューロン、ピラミッド状ニューロン、プルキンエ細胞、または、顆粒細胞;またはbメラノーマ細胞、COS細胞;BHK細胞;HEK293細胞;CHO細胞;骨髄腫細胞;またはMDCK細胞、である、請求項11に記載の細胞薬剤としての使用のための、請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項7に記載のチャネルロドプシン、または請求項8に記載の核酸構成体、または請求項9に記載の発現ベクター、または請求項10に記載の細胞。遺伝子治療における使用のための、請求項10に記載の発現ベクター。失明または視力減少の治療における使用のための、請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項7に記載のチャネルロドプシン、または請求項8に記載の核酸構成体、または請求項9に記載の発現ベクター、または請求項10に記載の細胞。がん細胞、好ましくは黒色腫のがん細胞の切除における使用のための、配列番号1の位置128に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを有し、かつ/または配列番号1の位置156に相当する位置にアラニンを有する、請求項5に記載の光誘起イオンチャネル。請求項1~6のいずれか1項に記載の光誘起イオンチャネル、または請求項7に記載のチャネルロドプシン、または請求項10に記載の細胞の、高スループットのスクリーニングにおける使用。細胞内膜表面の電位はCaによって強く影響されることが知られているので、亜膜性のsubmembraneous細胞内Caレベルの修飾は膜の脱分極およびニューロンにおける電位依存性Naチャネルの活性化をもたらすであろう。したがって、発明者は、ニューロンの光感受性がCa流入で内膜表面の電位を上げることによって間接的に増加できると仮定した。驚くべきことに、発明者は強化されたCa透過性をもつ、以下でCatChすなわち、カルシウム転位チャネルロドプシンとして表される、ChR2変異体を見出した。CatChは、WTChR2と比べて、海馬ニューロンにおいて発現するとき、4倍高いCa透過性、70倍高い光感受性、およびより速い応答動態を有する。強化された光感受性およびより早い動態は、内膜表面電位を上昇させ、Ca活性化大コンダクタンスカリウムBKチャネルを活性化させる、比較的高い光駆動性のCa流入に起因することが示される。[Ca]iの増加は、内側面の電位を上げ、電位依存性Naチャネルの活性化を容易にし、かつ間接的に光感受性を増加させる。光刺激に続く再分極はCa依存BK-チャネル活性化により著しく加速される。CatChはニューロンの刺激光感受性を増加させるように光駆動性チャネルを設計できる新しい原則を例示する。活性化のために低い光強度を必要とする一方で、正確で速い活動電位の引き金となることなどの特性は臨床応用における光駆動性チャネルの使用のための道を開く。従って、第一の態様において、本発明は配列番号1CHOP-2の1-309位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1においてL132に相当する位置での変異を含む、光誘起イオンチャネルに関する。類似の第二の態様において、本発明はまた、第一の態様による光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシンに関する。さらに、第三の態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体を提供する。さらに他の態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネルをコードする核酸または第三の態様による核酸構成体を含む、発現ベクターを提供する。さらに、第二の態様によるチャネルロドプシン、第三の態様による核酸構成体、または第四の態様による発現ベクターを含む細胞が提供される。また、本発明は、第一の態様による光誘起イオンチャネル、第二の態様によるチャネルロドプシン、本発明による核酸構成体または発現ベクター、本発明による細胞の、薬剤としての使用に関する。特に、遺伝子療法における本発明による発現ベクターの使用が熟慮される。より具体的に、失明または視力減少の治療における本発明による光誘起イオンチャネル、チャネルロドプシン、核酸構成体、発現ベクターまたは細胞の使用が熟慮される。さらに他の態様において、本発明はさらに配列番号1の位置128に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを有し、かつ/または配列番号1の位置156に相当する位置にアラニンを有する、第一の態様による光誘起イオンチャネルのがん細胞の切除における使用を提供する。最終的な態様において、本発明は第一の態様による光誘起イオンチャネル、または第二の態様によるチャネルロドプシンまたは本発明による細胞の、高スループットのスクリーニングにおける使用に関する。好ましい実施形態の詳細な説明第一の態様において、本発明は配列番号1CHOP-2の1-309位置に示されるアミノ酸配列、より好ましくは配列番号1の1-315位置に示されるアミノ酸配列、さらには配列番号1の1-737位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1においてL132に相当する位置での変異を含む、光誘起イオンチャネルに関する。野生型CHOP2は以下のアミノ酸配列を有する:MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVNKGTGKYASRESFLVMRDKMKEKGIDVRASLDNSKEVEQEQAARAAMMMMNGNGMGMGMGMNGMNGMGGMNGMAGGAKPGLELTPQLQPGRVILAVPDISMVDFFREQFAQLSVTYELVPALGADNTLALVTQAQNLGGVDFVLIHPEFLRDRSSTSILSRLRGAGQRVAAFGWAQLGPMRDLIESANLDGWLEGPSFGQGILPAHIVALVAKMQQMRKMQQMQQIGMMTGGMNGMGGGMGGGMNGMGGGNGMNNMGNGMGGGMGNGMGGNGMNGMGGGNGMNNMGGNGMAGNGMGGGMGGNGMGGSMNGMSSGVVANVTPSAAGGMGGMMNGGMAAPQSPGMNGGRLGTNPLFNAAPSPLSSQLGAEAGMGSMGGMGGMSGMGGMGGMGGMGGAGAATTQAAGGNAEAEMLQNLMNEINRLKRELGE配列番号:1本発明の光誘起イオンチャネルは少なくとも5個の膜貫通ヘリックスをもつ、光感受性ポリエンと結合できる膜タンパク質である。6または7個の膜貫通ヘリックスをもつ膜貫通タンパク質が好ましい。しかしながら、7個以上、例えば8、9または10のヘリックスをもつ膜貫通タンパク質もまた、本発明に含まれる。その上、本発明は膜貫通部分に加えて、C-末端配列が、膜に包まれた内腔の内側、例えば細胞の細胞質またはリポソームの内側、まで拡張でき、または膜外表面上にも配置できるところの、C-および/またはN-末端配列を含む膜貫通タンパク質も含む。同様のことが、任意に存在する、同様に内腔内部および膜の外表面上にも配置できるN-末端配列にも適用される。C-および/またはN-末端配列の長さは原則としてどんな制限も受けないが、しかしながら、膜に埋め込まれていない1から1000アミノ酸、好ましくは1から500、特に好ましくは5から50のアミノ酸をもつ、C-末端配列をもつ光誘起イオンチャネルが好ましい。C-末端配列の長さから独立して、膜に埋め込まれないN-端末に位置する配列は、好ましくは1から500のアミノ酸、特に好ましくは5から50のアミノ酸を含む。膜貫通ヘリックスの概念は当業者によく知られている。これらは一般にαらせん状の、原則として20から25のアミノ酸を含む、立体構造である。しかしながら、天然の膜、例えば細胞または原形質膜、または合成膜の場合がある、膜の性質によって、膜貫通領域も、より短いか、または、より長い場合がある。例えば、人工膜の膜貫通領域は30アミノ酸まで含むことができるが、他方で数個のみのアミノ酸、例えば12から16個を含むこともできる。好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、配列番号1の1-309位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも75の同一性、より好ましくは少なくとも80の同一性、さらにより好ましくは少なくとも85の同一性、例えば少なくとも90の同一性、最も好ましくは少なくとも95の同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、配列番号1の1-315位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の同一性、好ましくは少なくとも75の同一性、より好ましくは少なくとも80の同一性、さらにより好ましくは少なくとも85の同一性、例えば少なくとも90の同一性、最も好ましくは少なくとも95の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一般に、アミノ酸配列と、配置された配列との間の配列同一性が少なくともxであれば、アミノ酸配列は上記の配列番号1または他のアミノ酸配列と少なくともxの同一性を有する。そのような配置は、例えば公衆に利用可能な、NCBIホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgiで提供されるBLASTプログラムのような、コンピュータ相同性プログラムを、ここで提供される初期の設定で用いることにより実施できる。一組の核酸配列の配列同一性割合を計算するさらなる方法は当業者に既知である。そのような、配列番号1の1-309または1-315位置に示されるアミノ酸配列と少なくとも70の同一性を有するアミノ酸配列を含む光誘起イオンチャネルの例は、コナミドリムシC.reinhardtiigi:15811379からのCHOP1、ボルボックスVolvoxcarteriからのCHOP2gi:167650748およびCHOP1gi:167650744、またはCHOP2またはCHOP1の他のいかなるオルソログまたは対立遺伝子多型である。さらにより好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、L132の変異を除いて、配列番号1CHOP-2の1-309位置に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくはからなる。他のさらにより好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは、L132の変異を除いて、配列番号1CHOP-2の1-315位置に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくはからなる。配列番号1のL132位置、またはL132に対応する位置での変異は、置換、追加および/または欠失であり得る。しかしながら、好ましくは変異は置換、より好ましくはL132C、L132S、L132E、L132DおよびL132Tから選択され、最も好ましくは置換はL132Cである。実験データがL132Cに関するものしかないとしても、置換L132S、L132E、L132DおよびL132Tは、全ての置換がチャネルの極性を増加させるので、効用の特性を示すであろうことが予期される。加えて、光誘起イオンチャネルはさらに準保存的置換を含む。保存的置換は、それらの側鎖および化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、無極性脂肪族側鎖、無極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小さい側鎖、大きい側鎖、等である。典型的な準保存的および保存的置換は以下の通りである。さらに、当業者は立体的に要求された位置のグリシンを置換すべきでないこと、およびアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造を有するタンパク質の一部にプロリンを挿入すべきでないことを理解するであろう。他の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルは共通モチーフconsensusmotif、LIDxxxKxxWF,Yを含む。この共通配列はレチナール結合アミノ酸リジンを囲むモチーフである。高い時間精度を維持する一方で、自然に起こる光強度でCatChを活性化させる可能性は、特に遺伝子治療での視力回復への努力のための、また他の生物医学的応用のための、優れた候補となる。その減少した光要求のために、CatChスパイクは474nmのスペクトル最大から離れた、例えば、緑色光532nm、図4d参照による励起によっても発生できる。作用スペクトル外側の隣接域での作業は、その減少した光要求のために可能となり、組織透過を容易にする。従って、好ましい本発明の変異光誘起イオンチャネルの光感受性は、海馬ニューロンにおいてWTCHOP-2と比較して5倍より多く、好ましくは10倍より多く、より好ましくは20倍より多く、例えば30倍より多く、さらにより好ましくは40倍より多く、例えば50倍より多く、もっとも好ましくは60倍より多く、または70倍より多く増加する。さらに、本発明の変異光誘起イオンチャネルは、海馬ニューロンにおいて全細胞電気生理学的記録whole-cellelectrophysiologicalrecordingにより測定したWTCHOP-2と比較して、少なくとも1.5倍、より好ましくは2倍、またはさらにより好ましくは2.5倍増加した刺激頻度を示す。実施例に示されているように、WT-Chop2は、20Hzでのシグナル伝達はすでに不正確であるところの、約10Hzから約20Hzまでの海馬ニューロンにおける刺激頻度を示す。さらに、当業者は、内因性のスパイク頻度もまた細胞の型に依存することを認めるであろう。例えば、聴細胞は、500Hzまでの内因性スパイク頻度を有する。さらに、実験はinvitroで、すなわち周囲温度で行われた。しかしながら、当業者は、動態もまた温度依存であるため、刺激頻度が哺乳動物などの温血動物でさらに高くなると予想するであろう。したがって、細胞型と温度に依存して、本発明の変異光誘起イオンチャネルが、全細胞電気生理学的記録により測定したWTCHOP-2と比較して、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍、例えば少なくとも20倍、または少なくとも30倍、またはより好ましくは少なくとも40倍、少なくとも50倍、例えば少なくとも60倍、または少なくとも70倍、さらにより好ましくは少なくとも80倍、少なくとも90倍、または少なくとも100倍、最も好ましくは少なくとも125倍、例えば少なくとも150倍、または少なくとも175倍、およびさらに最も好ましくは少なくとも200倍増加した刺激頻度を示し得ることが予想される。海馬ニューロンからの海馬培養神経細胞および電気生理学的記録は以下の実施例に例示される。簡潔に、海馬は出生後P1Sprague-DawleyラットJacksonLaboratoryから取り出され、パパイン20Uml-1で37°Cにて20分間処理される。海馬は10の牛胎児血清が補われたDMEMInvitrogen/Gibco、高グルコースで洗浄され、少量のこの溶液中で粉砕される。~7万5000個の細胞が、24ウェルプレート中のポリ-D-リジン/ラミニンでコートされたカバーガラス上に播種plateされる。3時間後に、プレート培地platingmediumは、培地2B-27補足剤、2mMGlutamax-I、および100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含むNeurobasalAに置き換えられた。変異体ChR2L132C-YFPおよびChR2WT-YFPは、播種の5~10日後にリポフェクタミン2000試薬Invitrogenを使用してトランスフェクトされる。あるいは、2~5×109GC/mlのウイルスAAV2/7-CAG-ChR2L132C-2A-EGFP-WPRE-bGHが播種の4~9日後に各々のウェルに加えられ得る。アデノ随伴ウイルスベクター構成体の代表的な構造は、以下の実施例で詳細に説明される。発現は、形質導入後5日間で目に見えるようになる。いかなる実験においても、全トランスレチナールは培地または記録培地recordingmediumに全く添加されない。海馬培養神経細胞の全細胞記録のために、5~10Ωの抵抗をもつパッチピペットが、129mMグルコン酸カリウム、10mMKCl、4mMMgATPおよび0.3mMNa3GTPで満たされ、pH7.2に滴定される。タイロード溶液は細胞外溶液として用いられる125mMNaCl、2mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgCl2、30mMグルコースおよび25mMHEPES、pH7.4に滴定。名目上はCa無しの細胞外溶液は、0mMCaおよび3mMMgを有することを除いて、この同じ溶液を含む。記録は、興奮性シナプス伝達遮断剤、1,2,3,4-テトラヒドロ-6-ニトロ-2,3-ジオキソ-ベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミドNBQX,10μM,SigmaおよびD--2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸AP-5,50μM,Sigmaの存在下で行われた。電圧固定記録のため、1μMのテトロドトキシンが細胞外溶液に添加される。BKチャネル活性を阻害するため、1mMTEAが加えられる。記録は、蛍光ランプを備える倒立ZeissAxiovert25顕微鏡上で行われる。成功したタンパク質の発現はEGFPまたはYFPによってもたらされる蛍光によって立証される。ニューロンのアクセス抵抗は、15~40MΩであり、実験全体にわたって、安定性のために監視される。電気生理学的信号は、Axopatch200A増幅器AxonInstruments,UnionCity,CAを使用することで増幅され、10kHzでフィルターにかけられ、AxonDigidata160050Hzでデジタル化され、かつpClamp9ソフトウェアAxonInstrumentsを用いて入手および分析される。光電流は、ダイオード励起固体レーザーPuschOptoTechGmbH;λ1=473nm,P1=100mW,λ2=532nm,P2=50mWからの様々な波長の光パルスまたはエキシマー励起色素レーザーCoumarin2,λ=450nmからの10ns閃光により誘起される。特定の光強度は、細胞から~500μmの距離にて、400μm直径の石英光ファイバーSTE-F100/400-Y-VIS/NIR;Laser2000,Wessling,Germanyの末端での強度である。ChR2L132C-YFPおよびChR2L132C-2A-EGFPを発現するニューロンから測定された電流は同じである。加えて、他の好ましい実施形態において、本発明の変異光誘起イオンチャネルの、HEK293細胞でのFura-2-イメージングによって測定される、カルシウム伝導度は、WTCHOP-2と比較して少なくとも2倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも4倍増加される。カルシウム伝導度Fura-2AM5mM、Invitrogen室温にて30分から1時間ロードされる。ローディングの後に、細胞はCaなしの140mMNaCl溶液140mMNaCl、7mMEGTA、2mMMgCl2、および10mMHEPES中で回収される。黄色蛍光タンパク質は、そのYFP-蛍光からの各々の細胞発現レベルを見積もるため、460/40nmのフィルターVisitronSystems、Puchheim、Germanyを使用する光に500ms曝すことにより励起される。15分間の暗闇の後、光駆動チャネルが青色光460/40nmで10秒間刺激される。Fura-2は、340nm340/20および380nm380/20、およびCCDカメラ全てのフィルターはVisitronSystems,Puchheim,Germanyで検出される放射光540/80nmで励起される。上記に示すように、変異光誘起イオンチャネルは、追加でさらなる変異、好ましくは置換を含み得る。一の好ましい実施形態において、光誘起イオンチャネルはさらに、少なくとも1個の以下のアミノ酸残基:配列番号1の位置253に対応する位置のアスパラギン酸;配列番号1の位置257に対応する位置のリジン;配列番号1の位置260に対応する位置のトリプトファン;配列番号1の位置123に対応する位置のグルタミン酸;配列番号1の位置134に対応する位置のヒスチジンまたはアルギニン、好ましくはアルギニン;配列番号1の位置128に対応する位置のトレオニン、セリン、またはアラニン;および/または配列番号の位置156に対応する位置のアラニン、を含み得る。従って、変異光誘起イオンチャネルは、配列番号1に対応する、示された位置におけるアミノ酸残基の以下の組み合わせの1個:Cys132Asp253;Cys132Lys257;Cys132Trp260;Cys132Glu123;Cys132His134;Cys132Arg134;Cys132Thr128;Cys132Ser128;Cys132Ala128;Cys132Ala156;Cys132Asp253Lys257;Cys132Asp253Trp260;Cys132Asp253Glu123;Cys132Asp253His134;Cys132Asp253Arg134;Cys132Asp253Thr128;Cys132Asp253Ser128;Cys132Asp253Ala128;Cys132Asp253Ala156;Cys132Lys257Trp260;Cys132Lys257Glu123;Cys132Lys257His134;Cys132Lys257Arg134;Cys132Lys257Thr128;Cys132Lys257Ser128;Cys132Lys257Ala128;Cys132Lys257Ala156;Cys132Trp260Glu123;Cys132Trp260His134;Cys132Trp260Arg134;Cys132Trp260Thr128;Cys132Trp260Ser128;Cys132Trp260Ala128;Cys132Trp260Ala156;Cys132Glu123His134;Cys132Glu123His134;Cys132Glu123Arg134;Cys132Glu123Thr128;Cys132Glu123Ser128;Cys132Glu123Ala128;Cys132Glu123Ala156;Cys132His134Thr128;Cys132His134Ser128;Cys132His134Ala128;Cys132His134Ala156;Cys132Arg134Thr128;Cys132Arg134Ser128;Cys132Arg134Ala128;Cys132Arg134Ala156;Cys132Thr128Ala156;Cys132Ser128Ala156;Cys132Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260;Cys132Asp253Lys257Glu123;Cys132Asp253Lys257His134;Cys132Asp253Lys257Arg134;Cys132Asp253Lys257Thr128;Cys132Asp253Lys257Ser128;Cys132Asp253Lys257Ala128;Cys132Asp253Lys257Ala156;Cys132Lys157Trp260Glu123;Cys132Lys157Trp260His134;Cys132Lys157Trp260Arg134;Cys132Lys157Trp260Thr128;Cys132Lys157Trp260Ser128;Cys132Lys157Trp260Ala128;Cys132Lys157Trp260Ala156;Cys132Trp260Glu123His134;Cys132Trp260Glu123Arg134;Cys132Trp260Glu123Thr128;Cys132Trp260Glu123Ser128;Cys132Trp260Glu123Ala128;Cys132Trp260Glu123Ala156;Cys132Glu123His134Thr128;Cys132Glu123His134Ser128;Cys132Glu123His134Ala128;Cys132Glu123His134Ala156;Cys132Glu123Arg134Thr128;Cys132Glu123Arg134Ser128;Cys132Glu123Arg134Ala128;Cys132Glu123Arg134Ala156;Cys132His134Thr128Ala156;Cys132His134Ser128Ala156;Cys132His134Ala128Ala156;Cys132Arg134Thr128Ala156;Cys132Arg134Ser128Ala156;Cys132Arg134Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123;Cys132Asp253Lys257Trp260His134;Cys132Asp253Lys257Trp260Arg134;Cys132Asp253Lys257Trp260Thr128;Cys132Asp253Lys257Trp260Ser128;Cys132Asp253Lys257Trp260Ala128;Cys132Asp253Lys257Trp260Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123His134;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134;Cys132Lys257Trp260Glu123Thr128;Cys132Lys257Trp260Glu123Ser128;Cys132Lys257Trp260Glu123Ala128;Cys132Lys257Trp260Glu123Ala156;Cys132Trp260Glu123His134Thr128;Cys132Trp260Glu123His134Ser128;Cys132Trp260Glu123His134Ala128;Cys132Trp260Glu123His134Ala156;Cys132Trp260Glu123Arg134Thr128;Cys132Trp260Glu123Arg134Ser128;Cys132Trp260Glu123Arg134Ala128;Cys132Trp260Glu123Arg134Ala156;Cys132Glu123Arg134Thr128Ala156;Cys132Glu123Arg134Ser128Ala156;Cys132Glu123Arg134Ala128Ala156;Cys132Glu123His134Thr128Ala156;Cys132Glu123His134Ser128Ala156;Cys132Glu123His134Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Thr128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Ser128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Ala128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Thr128;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Ser128;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Ala128;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Thr128;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Ser128;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Ala128;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Ala156;Cys132Trp260Glu123Arg134Thr128Ala156;Cys132Trp260Glu123Arg134Ser128Ala156;Cys132Trp260Glu123Arg134Ala128Ala156;Cys132Trp260Glu123His134Thr128Ala156;Cys132Trp260Glu123His134Ser128Ala156;Cys132Trp260Glu123His134Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Thr128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Ser128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Ala128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Thr128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Ser128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Ala128;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Thr128Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Ser128Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123His134Ala128Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Thr128Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Ser128Ala156;Cys132Lys257Trp260Glu123Arg134Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Thr128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Ser128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123His134Ala128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Thr128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Ser128Ala156;Cys132Asp253Lys257Trp260Glu123Arg134Ala128Ala156、を含み得る。しかしながら、上記のリストにおいてCys132はまた、Ser132、Glu132、Asp132またはThr132のいずれかに置換され得る。一般に、光誘起イオンチャネルの機能に必要なレチナール、またはレチナール誘導体は、細胞により生産され、該イオンチャネルでトランスフェクトされる。その配座によって、レチナールは、全トランスレチナール、11-シスレチナール、13-シスレチナール、または9-シスレチナールであり得る。しかしながら、本発明の変異光誘起イオンチャネルが小胞、リポソーム、または他の人工の細胞膜に組み込まれ得ることもまた、予期される。従って、第二の態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネル、およびレチナールまたはレチナール誘導体を含む、チャネルロドプシンを提供する。好ましくは、レチナール誘導体は3,4-デヒドロレチナール、13-エチルレチナール、9-dm-レチナール、3-ヒドロキシレチナール、4-ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール;3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,4,6,8,10ペンタエナール;3,7ジメチル-デカ-2,4,6,8-テトラエナール;3,7-ジメチル-オクタ-2,4,6-トリエナール;および6-7回転阻止rotation-blockedレチナール、8-9回転阻止レチナール、および10-11回転阻止レチナールからなる群から選択される。加えて、第一の態様の好ましい実施形態は、第二の態様の好ましい実施形態に対応する。第三の態様において、本発明はまた、第一の態様の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列を含む、核酸構成体に関する。最適の発現を確実にするために、コーディングDNAもまた、例えば、適切な調節配列および/または標的配列の付加、および/または、コーディングDNA配列の、選択された宿主の好ましいコドン使用頻度との照合により、変更できる。標的配列は、シナプス、ポストシナプス部位、軸索小丘、または小胞体などの、細胞内の特定の部位または区画compartmentに光誘起イオンチャネルを標的化する、C-末端伸張をコードし得る。核酸は、本発明のタンパク質の配列の発現を提供するために更なる要素、例えば、プロモーター、転写開始および停止信号、翻訳開始および停止信号、およびポリアデニル化信号、に結合され得る。プロモーターは誘導型または構成的、一般的または細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的プロモーターの例は両極細胞に特有のmGlu6-プロモーターである。プロモーター、ベクター、および他の要素の選択当業者のレベルでの設計事項である。そのような多くの要素が、文献に記載され、商業的供給者を通して入手可能である。従って、第四の態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネルをコードする核酸配列または第三の態様の核酸構成体を含む、発現ベクターを提供する。好ましい実施形態において、ベクターは遺伝子治療に好適であり、特に、ウイルス媒介性の遺伝子導入に好適である。ウイルス媒介性の遺伝子導入に好適なる用語は、本明細書では、該ベクターがウイルスにパックされ、その結果、対象の部位または細胞に送達できることを意味する。遺伝子治療に好適なウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、それらが認識し、感染させることができる細胞に遺伝子をどれくらいよく転移させるか、そして、それらが細胞のDNAを永久にまたは一時的に改変するかどうかの点で異なる。しかしながら、遺伝子治療は裸のDNA、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用などの非ウイルス性の方法もまた包含する。上記の通り、得られる核酸配列は細胞、例えば担体としてのウイルスの使用により、または例えば、リポフェクタミン、フージーンなどの化学トランスフェクタント、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿およびDNAの直接拡散を含むトランスフェクションにより細胞に導入され得る。細胞をトランスフェクトする方法は実施例に詳述され、それぞれの受容細胞に適合され得る。DNAでのトランスフェクションは、染色体外の形態で存在する、トランスフェクトされたDNAがゲノム、または不安定な一時的な細胞または細胞株に組み込まれると、安定な細胞または細胞株をもたらす。その上、安定な細胞株は、エピソーム複製プラスミドを使用することにより、安定した細胞株を入手でき、それは、染色体外プラスミドの遺伝的形質が細胞ゲノムに組み込まれる制御要素により制御されることを意味する。一般に、適切なベクターまたはプラスミドの選択は、対象となる宿主細胞による。従って、第五の態様において、本発明は第二の態様のチャネルロドプシン、第三の態様の核酸構成体または第四の態様の発現ベクターを含む細胞に関する。以下で説明されるように、本発明の変異光誘起イオンチャネルの一つの適用は、人間または動物などの盲目の対象の治療である。生まれつきの視細胞がもはや機能しない、多くの疾患があるが、すべての神経接合部は、作動し続けることができる。今日、網膜上に人工セラミック光電セルの薄いフィルムを移植する試みが様々な研究センターで行われている。これらの光電セルは、二次的に網膜のいまだ無傷の細胞を脱分極し、その結果、神経インパルス人工眼の引き金となることを意図する。これらの神経節細胞、アマクリン細胞または両極細胞における本発明の光制御イオンチャネルの意図的な発現は、非常により的確な解決策であり、より大きい三次元的な視覚解像度を可能にするであろう。変異光誘起イオンチャネルの、天然において対応するチャネルが発現しない細胞の膜への組込みは単純に、例えば、組み換えDNA技術の既知の手順を用いて、このイオンチャネルをコードするDNAがまず適切な発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはウイルスに組み込まれ、標的細胞はその後これにより形質転換され、タンパク質がこの宿主で発現されるということを達成できる。次に、細胞は適当な方法、例えばレチナールで、タンパク質およびレチナール間のシッフ塩基結合を可能にするために処理される。好ましい実施形態において、これはサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharo-mycesPombeまたはピチアパストリスPichiapastorisなどの種種の酵母において、細菌ロドプシン、および/またはウシロドプシンなどのロドプシンで既に成功裏に実施されているように、起こる。また、発現は哺乳動物細胞系または昆虫細胞系でも生じ得る。それゆえ、好ましい実施形態において、細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞である。発現は、好ましくはメラノーマ細胞例えば、BLM細胞株、COS細胞アフリカミドリザル腎臓CV1細胞感染により生成されるまたはHEK細胞ヒト胎児腎臓細胞例えばHEK293細胞、またはBHK細胞ベビーハムスター腎細胞における一時的発現としてのエピソーマルベクターで、またはCHO細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞、骨髄腫細胞またはMDCK細胞Madine-Darbyイヌ腎臓細胞またはバキュロウイルスに感染したSf9昆虫細胞における、ゲノムへの組込による安定な発現形態においてのいずれかで生じる。従って、より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞はCOS細胞;BHK細胞;HEK293細胞;CHO細胞;またはMDCK細胞である。視力回復の文脈における、最も好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は光受容細胞;網膜桿状体細胞;網膜錐体細胞;網膜神経節細胞;双極ニューロン;神経節細胞;偽単極ニューロン;多極ニューロン;ピラミッド状ニューロン;プルキンエ細胞;または、顆粒細胞である。ニューロンは、他の細胞との接続に特化された、電気的および、化学的シグナル伝達がシナプスを通して起こるところの、化学的シグナル伝達により情報を処理および伝達する電気的興奮細胞である。感覚器官の細胞に作用する、接触、音、光および多数の他の刺激に反応する感覚ニューロン、脳および脊椎から信号を受信し、筋収縮を引き起こし、腺に作用する運動ニューロン、脳または脊椎の同じ領域内の他のニューロンにニューロンを接続する介在ニューロンなどの、多数の特化された型のニューロンが存在する。一般に、ニューロンは体細胞、樹状突起、および軸索を有する。樹状突起は、細胞体から生じ、しばしば何百ミクロンも広がっていて、複数回分岐している、フィラメントである。軸索は、軸索小丘と呼ばれる部位の細胞体から生じる特別な細胞フィラメントである。ニューロンの細胞体は頻繁に複数の樹状突起をもたらすが、軸索がその終点までに数百回分岐し得るけれども、決して1つ以上の軸索をもたらさない。主要なシナプスにて、シグナルは1個のニューロンの軸索から他の樹状突起に送られる。しかしながら、これらの法則には多数の例外:樹状突起を欠くニューロン、軸索を全く有さないニューロン、軸索を別の軸索へ、または樹状突起を別の樹状突起に接続するシナプスなど、がある。さらにほとんどのニューロンは、解剖学的に単極または偽単極樹状突起および軸索は同じ過程から現れる、双極体細胞の反対端の軸索および単独の樹状突起、多極2個以上の樹状突起を有し、さらにi錐体細胞、プルキンエ細胞および前角細胞などの、長突起の軸索突起long-projectingaxonalprocessをもつゴルジIニューロン、およびii軸索突起が局所的に突出するゴルジIIニューロン、例えば顆粒細胞、としてさらに分類し得るとして特徴付けられる。光受容細胞は、光伝達能を有する網膜で見つけられた特化されたニューロンである。2種の古典的な光受容体は、それぞれが視覚系により使用される情報に寄与する、桿体視細胞および錐体視細胞である。網膜神経節細胞は、目の網膜の内表面の近くに位置する一種のニューロンである。これらの細胞は、視蓋前域中脳、視床下部の視交差上核、および外側膝状体視床に突出させる、樹状突起および長い軸索を有する。わずかな比率は、視覚にほとんど貢献しないか全く貢献しないが、それ自体は感光性である。それらの軸索は、網膜視床下部路を形成し、日周期および瞳孔対光反射、瞳孔のリサイズに貢献する。それらは光受容体から、2個の介在ニューロン型:両極細胞およびアマクリン細胞、を経て視覚情報を受け取る。アマクリン細胞は網膜における介在ニューロンであり、網膜神経節細胞への入力の70に関与する。網膜神経節への他の30の入力に関与する両極細胞はアマクリン細胞によって調節される。網膜の一部として、両極細胞は光受容体桿体細胞と錐体細胞と神経節細胞の間に存在する。それらは、光受容体から神経節細胞まで信号を伝えるために直接または間接的に働く。細胞は単離されおよび遺伝学的に改変され、維持され、適切な温度およびガス混合典型的には、37°C、5CO2で、任意に、当業者に既知および実施例における特定の細胞株または細胞型のために例示された、細胞培養器内で、培養され得る。培養条件は各々の細胞型により変化し得、特定の細胞型のための条件の変化は異なった表現型をもたらすことができる。温度とガス混合は別として、細胞培養系における最も一般的な変化の要素は増殖培地である。増殖培地のためのレシピは、pH、グルコース濃度、増殖因子、および特に他の栄養成分の存在において変化できる。増殖培地は、商業的に利用可能であるか、またはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関ATCCから入手可能な組成に従って、調製できる。補足培地に使用される増殖因子はしばしば子牛血清などの動物血液由来である。追加で、抗生物質が増殖培地に加えられ得る。一般的な操作の中で、培養細胞上で実施されるものは、培地変更および細胞通過である。CatCh適用のための追加の電位場がある。Caは重要な細胞内調節因子であるため、CatChは、細胞の、状態と活動を調節する、微調整されたCaの恒常性への光の介入を可能にする。基礎研究では、CatChは、閉じ込められたCa26に代わる手段としてCa依存開口分泌例えば、シナプスの伝達物質放出を光学的に制御する、カルシウム活性化キナーゼおよびホスファターゼを経て下流の細胞内プロセスを光学的に活性化する、またはゴルジ装置または小胞体などの細胞内区画にCatChを標的とすることによってアポトーシスを引き起こすために使用され得る。したがって、本発明の更なる態様は、第一の態様の光誘起イオンチャネルまたは第二の態様のチャネルロドプシン、または第三の態様の核酸構成体または本発明の細胞の薬物としての使用である。特に、本発明の発現ベクターは遺伝子治療で使用され得る。より具体的には、第一の態様の光誘起イオンチャネル、第二の態様のチャネルロドプシン、第三の態様の核酸構成体、または本発明の細胞は、盲目または減少した視力の治療で使用され得る。しかしながら、300Hzまでのその早いスパイク開始の動作のため、聴力回復または難聴の治療における光誘起イオンチャネルの使用もまた熟慮される。さらに、第一の態様の変異光誘起イオンチャネルは、恒久的な光誘起カルシウム流入を引き起こし、順に細胞死を引き起こす、追加の置換SFOの、または遅い変異体と呼ばれる、表1参照を含み得る。従って、癌細胞の除去における、配列番号1の位置128に相当する位置にスレオニン、セリンまたはアラニンを、および/または配列番号1の位置156に相当する位置にアラニンを追加的に有する本発明の光誘起イオンチャネルの使用が熟慮される。例えば、本発明の発現ベクターは癌細胞への癌細胞表面マーカーを経てウイルス媒介性の遺伝子導入で標的化できるであろう。さらに、具体的にはレトロウイルスが好ましくは癌細胞などの急速に分裂する細胞に組み込まれることに注意すべきである。結果として、本発明の光誘起イオンチャネルは、支配的に発現され、癌細胞の細胞膜に組み込まれる。光による刺激の際に、これらのイオンチャネルは、結果として癌細胞の死に通じる、恒久的なカルシウム流入を開いて、引き起こすであろう。そのような使用は、黒色腫の癌細胞のように光に自然に露出される癌細胞の除去に特に有利である。したがって、好ましい実施形態において、癌は黒色腫の癌である。最終的な態様において、本発明は第一の態様の光誘起イオンチャネル、または第二の態様のチャネルロドプシン、または本発明の細胞の、高スループットのスクリーニングでの使用に関する。高スループットのスクリーニングHTSは、特に創薬に使用され、かつ生物学および化学の分野に関連している科学実験のための方法である。HTSは、研究者が、しばしば現代のロボット工学、データ処理、制御ソフトウェア、液体の処理方法装置、および高感度検出器の組み合わせを通して、何百万もの生化学、遺伝子、または、薬理学の試験を短時間に行うことを許容する。この工程により、特定の生体分子経路を調節する活性剤;特に本発明の光誘起イオンチャネル、Ca誘導カリウムチャネルまたはBKチャネルなどのイオンチャネルを改変する物質、を急速に同定し得る。例えば、宿主細胞の中でCa誘導カリウムチャネルおよび光誘起イオンチャネルを共発現し得る。光による刺激の際に、光誘起チャネルは開かれ、細胞内Ca濃度が増加し、その結果、カリウムチャンネルを活性化するであろう。それ故、RH421N4-スルフォブチル-4-44ジペンチルアミノフェニルブタジエニルピリジニウム、内塩などの電位感受性色素によって監視され得る、膜電位における変化を受けるであろう。その結果、そのようなHTSは以下の段階を含み得る;iCa誘導カリウムチャネルおよび本発明の光誘起イオンチャネルを発現する細胞に、Ca誘導チャネルに対する候補剤を接触させる、ii光誘起チャンネルを誘起するために光刺激を適用する;iii膜電位混合シグナルの変更の決定、およびiv段階iiiで決定したシグナルと、段階iiに供された本発明の光誘起イオンチャネルのみを発現する細胞で決定されたシグナル単一シグナルの比較。膜電位の変化の減少は、Ca誘導カリウムチャンネルの有望なモジュレータを暗示するであろう。そのようなアプローチが、Ca誘導チャネルのみを発現する細胞で実施された直接測定と比較して遙かに改良された、約5:1のシグナルノイズ比を得ることが示されるであろう。改良されたシグナルノイズ比のため、特に光誘起イオンチャネルを使用することによって、前述の方法は特にHTSに適当であり得る。本質において、HTSは、比較的短い時間で、特定の標的に対する多数の物質の効果について多量の実験データを集めるためのアプローチを使用する。スクリーニングは、この文脈においては、ただ一つの目標通常、科学的仮説を試験するのために、すべてのデータが続いて適用され得る、より大きい実験である。HTSに関して、本発明の細胞は、マルチウェルプレート、例えば96ウェルプレートのような組織プレートに播種され得る。その後、プレート中の細胞は標的イオンチャネルと相互作用するために十分な時間、試験物質と接触される。試験物質は、プレートにわたって、ウェルからウェルで異なり得る。培養時間が過ぎた後に、測定は、プレートのすべてのウェルにわたって、手動または機械によって行われ、任意に試験物質で接触されていない細胞の測定値と比較される。研究者が、自動化されたルーチンでまだ実行されていなかった効果を探して、パッチクランプを使用するとき、手動測定が必要であり得る。そうでなければ、特化された自動分析装置はウェル上で多数の実験特定の頻度または高スループットパッチクランプ測定の光の分析などを実行できる。この場合、装置は単一のウェルから得られた値へ各数をマッピングして、各々の実験の結果を、例えば数値の格子として、出力する。この最初のアッセイの結果によって、研究者は、同じスクリーニングの中で新しいアッセイプレートへ活性すなわち、細胞内環状ヌクレオチドレベルを変更するとして特定されたものと同様の物質を使用することによって、追跡アッセイを実行でき、次に詳しいデータを集めるために実験を再実行して、化学剤の構造を最適化して、細胞への剤の効果を改良できる。自動化はHTSの有用性において重要な要素である。特化されたロボットは、最終分析を経た創作から、しばしば単一のアッセイプレートの寿命を超える過程の多くの原因となる。HTSロボットは通常、多くのプレートを同時に調製、分析でき、さらにデータ収集の過程を促進する。本発明のHTSに好適な装置の例は、FluorometricImagingPlateReaderFLIPRTM;MolecularDevices、FLEXstation登録商標MolecularDevices、VoltageIonProbeReaderVIPR,AuroraBiosciences、Attofluor登録商標RatioVision登録商標ATTOを含む。以下で、本発明は本発明の範囲を限定する意図でない図と実施例によって説明される。CatChの構築および生物物理学的特徴以前のアプローチと対照的に、発明者の目的は、その変異が陽イオン透過性を改変するWTChR2内の残基、を特定することであった。発明者は、3番目の膜貫通ドメインに、このドメイン内のいくつかの変異している残基が光サイクルを改変し、チャネルを駆動するgatingものとして、着目した図15-7、12。Arg115からThr139までの各々の残基は、個別にシステインに置き換えられ、アフリカツメガエル卵母細胞中で機能的な変化をスクリーニングされた。分光法CatChは以前説明される5、13ように、ピチアパストリス内で発現され、精製された。閃光光分解Flash-photolysis研究が実施され、吸収変化が、エキシマー励起染料レーザーexcimerpumpeddyelaser450nm、2-3mJ13からの10nsのレーザー閃光の励起後に測定された。L132CCatCh変異は電流出力の振幅および波形に優位な改変を示す。HEK293細胞培養および分子生物学C末端切断型のChR2L132C-YFPベクター:pcDNA3--chop2-309L132C-EYFPは、HEK293細胞にトランスフェクトされ、常にG418選択下0.6mg/ml;PAAGermany,Colbe,Germanyで保持された。野生型WTChR2のために、C末端切断型のChR2-YFPベクター:pcDNA4TO-chop2-309-EYFPがHEK293-Trex細胞Invitrogenに安定してトランスフェクトされ、以前に記載されたように13、培養され、誘導された。定常関係stationaryrelationのピークは、測定の24時間前にヒトコドン最適化pcDNA3.1--ChR2-YFP構成体WT、H134RまたはL132Cで一時的にトランスフェクトされたHEK293細胞Effectene、QIAGENから決定された。HEK293細胞における電気生理学的記録2-4MΩの抵抗をもつパッチピペットは、水平なDMZユニバーサルプーラーシリアルNo.5318904120B、Zeitz-Instruments,Augsburg,Germany上で薄肉のホウケイ酸ガラスGB150-8P,ScienceProducts,Hofheim,Germanyから作成された。光電流は全細胞パッチクランプ法で記録され、400μmの光ファイバーに焦点を合わせられたダイオード励起固体レーザーPuschOptoTechGmbH,BadenBaden,Germany;λ=473nmからの光パルスで活性化された。光パルスは速いコンピュータ制御シャッターUniblitzLS6ZM2,VincentAssociatesによって適用された。与えられたすべての光強度が、光導体の端で測定される。異なる陽イオンでの透過率の見積りを得るために、我々は、光電流-電圧関係を測定し、逆転電位を測定した。細胞内液は、140mMNaCl、7mMEGTA、2mMMgCl2および10mMTrispH=9を含み、細胞外液は140mMNaCl、2mMMgCl2および10mMTrispH=9を含んだ。陽イオン透過率のために、外部の140mMNaClは、140mMKCl、90mMCaCl2または90mMMgCl2でそれぞれ交換された。プロトン透過性は、pHが9から7.4または6に減少したときに、電流-電圧関係の逆転電位のシフトによって測定された。透過率比は、Na、K、HおよびCaのための条件を含む、ゴールドマン-ホジキン-カッツGHKの式により計算された。HEK293細胞において、トランスフェクションの24時間後に、CatChの青色光励起定常電流は、WTChR2と比較して~2.5倍高い振幅を有したCatCh:25.0±8.8pA/pF;WT:10.1±4.1pA/pF;平均±標準偏差、n=6、-60mV図2a。また、定常状態-ピーク電流比もまた、WTの0.37±0.18から、CatChの0.71±0.16まで増加した図2b。反復性の青色光刺激の間、CatChピーク電流は消失した。回復が黄色光で早期に誘導されなかったときに、それは暗闇の中で数分以内に回復した。対照的に、同じ条件下でのWTChR2ピーク電流の完全な回復は20秒かかった13。CatChの活性化および非活性化時定数τon=590±3μs,τoff=15±2ms,n=9,pH7.4,-60mV,平均±標準偏差は、WTChR2と比べてわずかに長かったτon=214±2μs,τoff=10±1ms,n=9,pH7.4,-60mV;平均±標準偏差;図.2a,b,図.5下段,表1。次に、発明者は、チャネル特性の記載された効果を光サイクルにおけるスペクトル変化と比較した。精製CatChの閃光光分解実験は、WTChR2スペクトル13からのわずかな逸脱だけを明らかにした図5を参照。1.脱プロトン化シッフ塩基を示す、初期P390中間体はわずかに検出可能である。2.チャネルの開口状態を示す、P520中間体は、電気生理学的に測定されたτoff値に相当する9msのわずかに延長された生存時間を示す。同様の開口生存期間値は、変化していない単位コンダクタンスにて倍増した活性を示す2、14、変異体H134Rで得られた。したがって、CatChの場合でも、開口状態の減速された動態は、単位コンダクタンスが変化していないところの、HEK293細胞で測定された2.5倍の増加する定常電流に関与できた。これは、以前に説明されるように14、定常雑音解析stationarynoiseanalysisを使用して、CatChの単独チャネルコンダクタンスを測定することによって、確認された。雑音解析実験が、以前に記載された14とおりにHEK293細胞上で実施され、室温23°Cで実施された。ピペット液は1mMグアニジン-HCl、199mMNMG-ClN-メチルグルカミン、10mMEGTA、2mMMgCl2および20mMHepespH7.4を含み、浴溶液は200mMグアニジン-HCl、2mMMgCl2、2mMCaCl2、および20mMHepespH7.4を含んだ。青色光刺激への電流応答は、飽和光条件saturatinglightcondition下および再度の、-60mVでの電流応答が最大電流の半分であるところの光条件I0.5;2kHzlow-passBesselfilter;サンプリングレート:100kHz;細胞直径:15μm下での電圧ステッププロトコルvoltagestepprotocolの適用下で記録された。-60mVの保持電位での持続的な照射2分の間の定常I0.5の記録は、単独チャネルコンダクタンスを見積もるのに使用された2kHzlow-passBesselfilter;サンプリングレート20kHz。照射無しコントロール、3個の記録および有り光刺激開始の30秒後、2個の記録の交互の記録は、集められ、フーリエ変換され、単独チャネルコンダクタンスがローレンツ関数での近似から見積もられた詳細は14参照。より低い光強度は、光駆動性チャネルの開口と閉鎖の最大限度の変動を得るために選ばれた。WTChR2およびH134R雑音解析実験に沿って、グアニジンは導電イオンとして使用された。チャネルの力学的特性は透過性陽イオンと独立であることに注意14。異なるパワースペクトルの評価は、150fSと推定された室温でのWTChR2単独チャネルコンダクタンス14と同様の、室温23°Cで200mMグアニジンのための140±5fSn=6、-60mVの単独チャネルコンダクタンスγをもたらした。雑音解析によって測定されたCatChの開口確率は、H134Rp0~0.6との比較において変わりがなかった。それ故、増加した開口チャネルの存続期間は2.5の要素による光電流観測された増加を容易に占めることができるが、CatChコピーのわずかに高められた発現は除くことができない。アフリカツメガエル卵母細胞調製および分子生物学細胞外に露出したシステイン残基のないC末端切断型のChR2変異体残基1-315C34AおよびC36A変異を含むは、ベクターpTLN27にサブクローニングされた。単一のシステイン変異は、QuickChangeSite-DirectedMutagenesisStratageneによって導入されて、配列決定により確認された。mRNAは、SP6mMessagemMachineキットAmbion,Austin,TXを使用して調製された。30ngのWTChR2/CatChmRNAを含む、50nlcRNAが各々のアフリカツメガエル卵母細胞に注入された。部分的な卵巣摘出後のコラゲナーゼ処理で卵母細胞を得た。cRNA注入後に、卵母細胞は、全トランスレチナール1μM、エタノール中の1mMストックより中で培養され、1mg/mlゲンタマイシンを含むORIバッファー90mMNaCl、2mMKCl、2mMCaCl2および5mMMops、pH7.4中で、18°Cにて2~4日間保持された。アフリカツメガエル卵母細胞上の2電極電圧固定法光電流は、75-Wキセノンアーク灯および450±25nmの帯域フィルターで活性化され、その光は~1018光子s-1cm-2の出力の1mm光導体と結合された。作用スペクトルは、各波長あたり~1.4×1017光子s-1cm-2のファイバー出力を達成するために、中性密度フィルターと組み合わせて狭帯域幅フィルター398-645nm;±10nm;K-seriesBalzerを使用することで記録された。作用スペクトルの生成のため、CaCC電流を抑制するためにORI溶液中のCaをBaに置き換えた。各波長における電流振幅は、等しい光子露出を表すために正規化された。分光法で決定された規定スペクトルgroundspectrumは、その後平均データポイントに合わせられた。カルシウム依存性塩素チャネルCaCCの活性化を抑制するために、速いCa2キレート剤1,2-ビス2-アミノフェノキシエタン-N,N,N’,N’-テトラ酢酸BAPTAの20mM溶液の50nlが、各卵母細胞に注入された卵母細胞において、~1mMの最終濃度。アフリカツメガエル卵母細胞において波長が変化しているCatChの励起は、474nmの最大の励起波長でのWTChR2スペクトルとほとんど同じ、ほとんど同じ動作スペクトルであることが明らかになった図6。細胞外Caおよび負の保持電位の存在下で、CatCh電流は、カルシウム依存性塩素チャネルCaCCのものと類似の重畳外向電流superimposedoutwardcurrent15、16に起因する照射の間、劇的な振幅の増加を示した図2c。WTChR2を発現する卵母細胞においてもまた、CaCC電流が観察されたが、それらはCatChによって誘導されたものより著しく小さかった図2c。WTChR2、およびCatCh、の両方について、80mMの細胞外Caにて、速いCaキレート剤BAPTA、1,2-ビス2-アミノフェノキシエタン-N,N,N’,N’-テトラ酢酸の細胞への注入は、残余のCa電流が残る一方1で、CaCC電流をなくした図2c。CatChのためのBAPTA注射の前後での光電流のより大きい違いは、捕獲活性化catchactivationに続く増加するCa流動の仮説をサポートする。増加した、CatChのカルシウム透過率CatChイオン透過率の見積りを得るために、異なる陽イオンのための光電流電圧関係および逆転電位が、HEK293細胞において測定された。これらの実験は、ナトリウム、カリウム、およびマグネシウムのための透過率がWTChR21に匹敵していることを明らかにした図2d。WTChR2pH/pNa=2.5106と比較して、CatChpH/pNa=4106のプロトン透過性はわずかに増加した。Ca透過率pCa/pNaは、細胞外液の140mMNaを90mMCaに置き換えたときの逆転電位シフトにより測定された。CatChの相対的なCa-透過率が、-30.7±2.7mVWTChR2、平均±標準偏差、n=5から-21.6±3.8mVCatCh、平均±標準偏差、n=5;図2eへの逆転電位二イオン電位bi-ionicpotentialのシフトからもわかるように、WTChR2における0.15から0.24まで増加した。CatChの増加するCa透過率をさらに定量化するために、我々は、CatChを発現しているHEK293細胞のFura-2カルシウムイメージングを実施し、340/380の測定比率をWTChR2発現細胞で測定された比率と比較した。HEK293細胞でのFura2イメージングFura-2AM5mM;Invitrogenは室温で30分から1時間ロードされた。ローディングの後に、細胞はCaなしの140mMNaCl溶液140mMNaCl、7mMEGTA、2mMMgCl2、および10mMHEPESで回収された。黄色蛍光タンパク質はそのYFP-蛍光から各細胞の発現レベルを見積もるために、460/40nmのフィルターVisitronSystems、Puchheim、Germanyを用いる光に500ms露出することにより励起された。溶液はその後、90mMCaCl2、7mMEGTA、2mMMgCl2および10mMHEPESから成る細胞外Ca溶液に置き換えられた。暗闇において15分後、光駆動性チャネルは10秒間、青色光460/40nmで刺激された。Fura-2は、340nm340/20および380nm380/20、およびCCDカメラ全てのフィルターはVisitronSystems、Puchheim、Germanyで検出された放射光540/80nmで、励起された。カルシウム取込みの要素としての異なったタンパク質の発現レベルを除去するために、測定された340/380比が、各個別の細胞のYFP-蛍光値で正規化された。図2fは、飽和90mMCa溶液における10秒間の青色光470nmの光刺激の際に、CatCh発現細胞のCa増加が、WT発現細胞より約4倍大きいことを示す。海馬ニューロンへの適用ニューロンへの適用のためのCatChの適合性を試験するため、構成体は培養された海馬錐体細胞の中で発現された。海馬ニューロン培養物海馬は出生後P1Sprague-DawleyラットJacksonLaboratoryから取り出され、パパイン20Uml-1で37°Cにて20分間処理された。海馬は10の牛胎児血清が補われたDMEMInvitrogen/Gibco、高グルコースで洗浄され、少量のこの溶液中で粉砕された。~7万5000個の細胞が、24ウェルプレート中のポリ-D-リジン/ラミニンでコートされたカバーガラス上に播種plateされた。3時間後に、プレート培地platingmediumは、培養培地2B-27補足剤、2mMGlutamax-I、および100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含むNeurobasalAに置き換えられた。ChR2L132C-YFPおよびChR2WT-YFPは、播種の5~10日後にリポフェクタミン2000試薬Invitrogenを使用してトランスフェクトされた。あるいは、2~5×109GC/mlのウイルスAAV2/7-CAG-ChR2L132C-2A-EGFP-WPRE-bGHが播種の4~9日後に各々のウェルに加えられた。発現は、形質導入後5日間で目に見えるようになった。培養物の生存期間~5週間について、神経毒症状は全く見られなかった。ここで記載されるいかなる実験においても、全トランスレチナールは培地または記録培地recordingmediumに全く添加されなかった。アデノ随伴ウイルスベクター構成体サイトメガロウィルス初期エンハンサー/ニワトリβアクチンCAGプロモーターは、PCR増幅され、pAAV2-CAG-EGFPを入手するために、pAAV2-Rho-EGFPAlbertoAuricchioからの親切な贈り物28に挿入された。pAAV2-CAG-EGFPウイルス発現プラスミドはさらに、ウッドチャック転写後調節要素WPREおよび牛成長ホルモンBGHポリアデニル化配列を含んだ。ChR2L132C-2A-EGFPVolkerBusskampoからの親切な贈り物-2A自己切断型ペプチド/CHYSEL29はアダプターPCRによって構築され、Clontechのinfusionkitを使用して、EGFPの置換により、pAAV2-CAG-EGFPにサブクローニングされた。ウイルスベクターpAAV2-CAG-ChR2L132C-2A-EGFP-WPRE-bGHはパッケージ化され血清型7、親和性はペンシルバニア大学のGeneTherapyProgramで2.26×1011ゲノムコピー/mlの最終的な感染性ウイルス測定濃度で精製した。海馬ニューロンからの電気生理学的記録海馬培養神経細胞の全細胞記録のために、5~10Ωの抵抗をもつパッチピペットが、129mMグルコン酸カリウム、10mMKCl、4mMMgATPおよび0.3mMNa3GTPで満たされ、pH7.2に滴定された。タイロード溶液は細胞外溶液として用いられた125mMNaCl、2mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgCl2、30mMグルコースおよび25mMHEPES、pH7.4に滴定。名目上はCa無しの細胞外溶液は、0mMCaおよび3mMMgを有することを除いて、この同じ溶液を含んだ。記録は、興奮性シナプス伝達遮断剤、1,2,3,4-テトラヒドロ-6-ニトロ-2,3-ジオキソ-ベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミドNBQX,10μM,SigmaおよびD--2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸AP-5,50μM,Sigmaの存在下で行われた。電圧固定記録のため、1μMのテトロドトキシンが細胞外溶液に添加された。BKチャネル活性を阻害するため、1mMTEAが加えられた。記録は、蛍光ランプを備える倒立ZeissAxiovert25顕微鏡上で行われた。成功したタンパク質の発現はEGFPまたはYFPによってもたらされる蛍光によって立証された。ニューロンのアクセス抵抗は、15~40MΩであり、実験全体にわたって、安定性のために監視された。電気生理学的信号は、Axopatch200A増幅器AxonInstruments,UnionCity,CAを使用することで増幅され、10kHzでフィルターにかけられ、AxonDigidata160050Hzでデジタル化され、かつpClamp9ソフトウェアAxonInstrumentsを用いて入手および分析された。光電流は、ダイオード励起固体レーザーPuschOptoTechGmbH;λ1=473nm,P1=100mW,λ2=532nm,P2=50mWからの様々な波長の光パルスまたはエキシマー励起色素レーザーCoumarin2,λ=450nmからの10ns閃光により誘起された。特定の光強度は、図の注釈および文書に示され、細胞から~500μmの距離にて、400μm直径の石英光ファイバーSTE-F100/400-Y-VIS/NIR;Laser2000,Wessling,Germanyの末端での強度である。ChR2L132C-YFPおよびChR2L132C-2A-EGFPを発現するニューロンから測定された電流は同じである。共焦点イメージングイメージングについて、海馬ニューロンがあるカバーガラスは、2スクロースを含むPBSバッファー中の4パラホルムアルデヒド中で10分間、4°Cにて固定された。細胞は続いて、ウサギα-GFPIgGInvitrogen、A11122中で1.5時間培養され、その後AlexaFlour488ロバ-α-ウサギIgGInvitrogen、A21206中で45分間培養された。取り付けられたカバーガラスの免疫蛍光はZeissLSM510共焦点顕微鏡Zeiss、Plan-Neofluar40×/0.75上で撮影された。CatCh変異体が数週間で、神経毒症状の兆候なしに海馬培養で確実に発現され図3a、HEK293細胞のように、全細胞の記録において高い定常状態-ピーク比および473nmの青色光への反応において、WTの164±39pA-60mV、n=6、平均±標準偏差と比較して、644±31pA-60mV、n=6、平均±標準偏差の約4倍増加した電流振幅を示した図3b。電流固定モードにおいて、典型的にWTを活性化するために用いられる人工的な高い光強度1018~1019光子s-1cm-2は、CatCh発現錐体細胞を脱分極性遮断に追い込んだ図4a。信頼できるスパイクトレーンを誘導するために、光強度は2ログ単位51016~21017光子s-1cm-2によって錐体光受容体駆動明所視の本来の範囲内の光強度に減少させた図4b17。図4cは錐体細胞の光強度に依存する発火率のための代表的な同調曲線を示す。平均した最大発火率は、8.2×1016±2.5×1016光子s-1cm-2平均±標準偏差、n=5の状態である。CatCh発現ニューロンのより高い光効率は、図4dにおいて緑色光532nmで例示されるように、最大感度から離れた波長での活性化を容易にする。これは、より深く貫通する緑色光での、より効果的な組織動員の点で利益を与え得る。我々は増加したCa透過率に、CatCh発現ニューロンの劇的に高められた光感受性を割当て、その結果、細胞質膜表面上の表面電位を一時的に増加させる10、11、18、19表面電位のCa効果の説明について、図7を参照。光励起の間、CatChは局所的な細胞内表面Ca濃度を一時的に増やすことにより、膜結合した速いCa供給源として機能し、その結果、負の表面電荷を中和する図7。このことは、内側面電位のより正の値へのシフトを引き起こし、その結果膜を脱分極することが知られている図711、18。その帰結は、電圧駆動性Naチャネルが、より負の膜電位で活性化することである18。短い光パルスまたは定常光を消した後に、Caが細胞質内で急速マイクロ秒に平衡化し、急速な回復および即座の活動電位の消失につながる。それ故、CatChに関して、WTChR2と比べて、より少ない光電流およびそれに続くより少ない光がスパイク開始に必要である。CatChにおける光パルスからスパイクまでの待ち時間は、同様の光強度2.8×1018光子s-1cm-2時に、WTChR2~10msの待ち時間3よりもより小さいジッターで、より速かった~5-6ms;図4e。発明者はCatChの、高頻度の光刺激で単一の活動電位を誘導するその性能についてさらに試験した。1ms長の青色の473nmの光パルス2.8×1019光子s-1cm-2のトレーンは、100信頼できるスパイクトレーンを50Hzの周波数まで動作させたn=8;図4f-ほとんどの錐体細胞は直流注入があっても50Hzを超えたウェルに続かない。WTは他方では、確実にスパイクを誘導するために少なくとも2ms光パルスを必要とし、これは20Hzの周波数までしか行われない12。我々は、CatChの短い活性化時間をさらに推し進め、各々のCatChタンパク質で単一の反転だけを誘導するのに十分な短いパルス長である、10Hzの周波数までの10nsの青色光パルス1.1×1025光子s-1cm-2まで、単一の活動電位を誘起した図4b。しかしながら、速い刺激頻度もまた、各スパイクの後に細胞の速い再分極を必要とする。WTと比較して減速されたCatChのτoffにもかかわらず、各活動電位のミリセカンド後以内に元来の静止電位に細胞を強力に再分極するための十分なCa活性化大コンダクタンスカリウムチャネルBKチャネル20を活性化させるために、CatCh活性化の間に~4倍増加したCa流入Fura-2測定、図2fを参照が現れる。速い再分極がBKチャネルを介してもたらされたことを立証するため、我々は100μMのカリウムチャネル阻害薬テトラエチルアンモニウムTEAを細胞外液へ加え、不完全な膜の再分極およびWTChR2のパルス刺激プロトコルで典型的に見られるプラトー電位の生成を観測した3図4h。まとめると、WT-発現細胞と比べて、CatCh発現ニューロンは、より速いスパイク開始、より速い再分極、および増加した光感受性を示す比較について、表1参照。外部のCaが不在で、3mMMgが存在する、表面電位にそれほど著しくない効果を有し11、18図7、WTChR2またはCatChを通して行われない対照実験は、上記の解釈を支持する:1光パルスからスパイクへの待ち時間はWTChR2値で増加した図4e、2Caの存在下で観察される速いスパイク再分極の代わりに、WTChR2実験で見られるようなものと同様の長引いている人為的な脱分極が観察された図4i、左、3Ca不在において、同等の光強度は、その他の点で等しい実験条件下で~10mV減少した脱分極をもたらした、4CatChの持続的な開口時間から期待される多重スパイクは、Ca不在において再発する図4i、右。したがって、発明者は、高いCa透過性をもつチャネルロドプシン、CatChは増加する光感受性および速い動態を組み合わせ、その結果、WTChR2および発表された遅いおよび速い変異体より優れることを示した異なるChR2変異体の特性の比較について、表1参照。考察一見したところでは、CatCh、WTChR2のL132C変異体、WTChR2と比較してむしろ平凡な結果を示している:1開口状態の存続期間の2倍の増加、2光サイクル動態における、P520中間体の減速された減衰、3変化しない単独のチャネルコンダクタンス、および4わずかに赤にシフトした吸収極大4nm。2.5倍に増加した光電流は、発現レベルの増加と全く関連のないパラメータで容易に説明できる。しかしながら、もう一度見てみると、アフリカツメガエル卵母細胞を発現するCatChから得られた電圧固定法データのさらなる精査は、逆転電位の測定およびHEK293細胞上のカルシウムイメージング実験でその後確認された、上昇したCa透過性を与えた。図1におけるモデルから判断すると、Ca透過性の増加は、光駆動プロトンポンプ細菌ロドプシンのL94A変異体について示されるように図1と比較21、より柔軟な構造の構成およびその結果としての空洞の形成により容易にされ得る。この空洞は、C128から1らせん回転分だけ離れた、保存された膜貫通ヘリックス3TM3の一部として疎水性パッチ中に位置するであろう。C128TM3およびD156TM4の間の相互作用の操作は、ChR2の反応サイクルを劇的に減速し5、6、その効果は細菌ロドプシン変異体L93A22、23、すなわちL94の隣接残基でも観察された。ChR2では、TM3およびTM4の相互作用は、イオン孔への明反応のトランスデューサーとしての構造要素24を指す、開閉gatingおよび選択性の両方に影響するように見える。より小さい、より親水性のシステインの挿入は螺旋状のセグメントの柔軟性を高め、Caのアクセスを容易にし得る。海馬錐体細胞に送達されたとき、CatChはWTChR2と比較して、~70倍増加した光感受性を示した。通常、そのような増加した光効力は、強く持続された開口チャネル存続期間を伴う2、6、13。CatChではそれが当てはまらない。観察された光感受性はこれまでの他のチャネルロドプシンから観察されたものと著しく異なる。以下で説明されるように、神経細胞の興奮性への副次的効果はCatChを通したCa流入によって誘導される。WTと比較してより遅い閉鎖動態を有するにもかかわらず、CatChは高頻度の光刺激の間、増加したスパイク信頼性および正確性を示し、追加のスパイクを抑えて、20Hzを超える刺激頻度にてWT発現細胞で典型的に観察される人為的なプラトー電位3、7、12を排除する。室温で照射された1msの光パルスは、CatCh発現錐体細胞で最大50Hzそれらの自然なスパイクの自然の限界;図4fまでの信頼できるスパイクトレーンを誘導した。皮質パルブアルブミン介在ニューロンなどの細胞をより速くスパイクする高頻度のCatCh介在スパイク誘導は、試験されるべきものとして残る12。チャネルロドプシン動態が~2.3のQ10で温度依存である14ので、発明者は光感受性をゆるめることなしの37°Cでのinvivo実験について、3.2倍加速したCatChを予想するであろう。これはCatCh介在スパイク刺激を少なくとも300Hzまで許容するであろう。より速い動態および高い時間精度と組み合わせられた増加した光感受性は、我々に各々のCatCh分子でシングルターンオーバーを活性化し、続いて単一のスパイクとなる。10nsのように短い光パルスでCatChを活性化することを許容した。興奮細胞における観察は、照射の間、増加したニューロンへのCa流入により最も良く説明される。透過性の増大による駆動力へのCaの寄与を無視できることに注意。しかしながら、我々は、CatChを、CatChチャネルが開いている限り、細胞膜の細胞質側表面にCaを一時的に送達する、光駆動性膜結合Ca源膜結合収容CamembraneboundcagedCaであるとみなすことができる。これは内膜表面上で負の帯電を一時型に中和し、その結果、膜の脱分極と同等である11、膜電位の増加が起こる図7。予想されるように、細胞外Caを非透過性Mgに置き換えたとき、観察されたCaの活動電位への効果が消失され、WTChR2の表現型が回復した。このことは、観察されたCaの効果が、細胞外Caの流入によるものであり、小胞体のような細胞小器官における電位発現を通した[Ca]iの上昇によって引き起こされるものではないことを証明する。表面電位を経る速い初期の脱分極は、光パルスからピークへの待ち時間を、WTChR2発現細胞3の~10msから、CatCh発現細胞の~5msまで半減させる。WTChR2と比較して、ピーク定常電流比はCatChで非常に低下する表1参照。したがって、CatChの持続している照射の間、細胞の脱分極レベルはほとんど静止したままで残る。持続的な照射の間の連続したCa流入は、カルシウム活性化非選択的陽イオンチャネルを活性化し得、それはさらに、定常的な脱分極レベルの維持を支持する。他方では、成功した高頻度のパルス刺激のための必須条件は、各々の活動電位に続く細胞の速い再分極である。WTと比較してわずかに増加したCatChの開口状態の存続期間は、その最大限度の刺激頻度を制限するはずである。しかしながら、増加したCa透過性は、カルシウム活性化大コンダクタンスカリウムチャネルBKチャネルの強力な活性化により、この制限を打ち消す。これは各々の活動電位の後、数ミリ秒以内でニューロンの静止膜電位を回復する。この理論は、パルス刺激プロトコルの長さの間、ニューロンの持続性の脱分極をもたらす、開口チャネル阻害薬TEAでのBKチャネルの阻害により確認された。既に利用可能な光遺伝学的方法optogenetictoolとの比較において、CatChは遅い変異体13またはSFO6と類似する、増加した光感受性を、しかしその増加したCa透過性による、より加速された応答動態および神経細胞の興奮性の結果と共に有する。これは、高い光感受性は速い動態のコストで確定される必要があり、速いチャネルロドプシン7、12に関して逆もまた同様であるところの、利用可能なChR2変異体より優れたCatChを作る概観に関して、表1を参照。光遺伝学的アプリケーションに関して、我々は、特異反応が究極的にはニューロンとCatCh発現レベルの本質的な生物物理的性質によって制御されるように、刺激の長さや強度などのそれぞれの実験的な準備における最適の光パルスパラメータを有効にするのが重要であることを注意する。参考文献のリストWO03/0849941.Nagel,G.etal.Channelrhodopsin-2,adirectlylight-gatedcation-selectivemembranechannel.ProcNatlAcadSciUSA100,13940-139452003.2.Nagel,G.etal.Lightactivationofchannelrhodopsin-2inexcitablecellsofCaenorhabditiseleganstriggersrapidbehavioralresponses.CurrBiol15,2279-22842005.3.Boyden,E.,Zhang,F.,Bamberg,E.,Nagel,G.Deisseroth,K.Millisecond-timescale,geneticallytargetedopticalcontrolofneuralactivity.NatNeurosci8,1263-12682005.4.Zhang,F.etal.Multimodalfastopticalinterrogationofneuralcircuitry.Nature446,633-6392007.5.Bamann,C.,Gueta,R.,Kleinlogel,S.,Nagel,G.Bamberg,E.Structuralguidanceofthephotocycleofchannelrhodopsin-2byaninterhelicalhydrogenbond.Biochemistry49,267-2782010.6.Berndt,A.,Yizhar,O.,Gunaydin,L.,Hegemann,P.Deisseroth,K.Bi-stableneuralstateswitches.NatNeurosci12,229-2342009.7.Lin,J.,Lin,M.,Steinbach,P.Tsien,R.Characterizationofengineeredchannelrhodopsinvariantswithimprovedpropertiesandkinetics.BiophysJ96,1803-18142009.8.Lagali,P.etal.Light-activatedchannelstargetedtoONbipolarcellsrestorevisualfunctioninretinaldegenerationNatNeurosci11,667-6752008.9.Bi,A.etal.Ectopicexpressionofamicrobial-typerhodopsinrestoresvisualresponsesinmicewithphotoreceptordegeneration.Neuron50,23-332006.10.Frankenhauser,B.Hodgkin,A.Theactionofcalciumontheelectricalpropertiesofsquidaxons.JPhysiolLond137,218-2441957.11.Hille,B.649-662SinauerAssociates,SunderlandMassachusettsUSA,2001.12.Gunaydin,L.etal.Ultrafastoptogeneticcontrol.NatNeurosci13,387-3922010.13.Bamann,C.,Kirsch,T.,Nagel,G.Bamberg,E.Spectralcharacteristicsofthephotocycleofchannelrhodopsin-2anditsimplicationforchannelfunction.JMolBiol375,686-6942008.14.Feldbauer,K.etal.Channelrhodopsin-2isaleakyprotonpump.ProcNatlAcadSciUSA2009.15.Caldwell,J.etal.Increasesinintracellularcalciumtriggeredbychannelrhodopsin-2potentiatetheresponseofmetabotropicglutamatereceptormGluR7.JBiolChemistry283,24300243072008.16.Weber,W.-M.IoncurrentsinXenopuslaevisoocytes:stateoftheart.BiochimBiophysActa1421,213-2331999.17.Thyagarajan,S.etal.Visualfunctioninmicewithphotoreceptordegenerationandtransgenicexpressionofchannelrhodopsin2inganglioncells.JNeurosci30,8745-87582010.18.Hille,B.,Woodhull,B.Shapiro,B.Negativesurfacechargenearsodiumchannelsofnerve:divalentions,monovalentions,andpH.PhilosTransRSocLondBBiolSci270,301-3181975.19.Muller,R.Finkelstein,A.Theeffectofsurfacechargeonthevoltage-dependentconductanceinducedinthinlipidmembranesbymonazomycin.JGeneralPhysiol60,285-3061972.20.Faber,E.Sah,P.Calcium-activateedpotassium-channels:multiplecontributionstoneuronalfunction.Neuroscientist9,181-1942003.21.Joh,N.,Oberai,A.,Yang,D.,Whitelegge,J.Bowie,J.Similarenergeticcontributionsofpackinginthecoreofmembraneandwater-solubleproteins.JAmChemSoc131,10846-108472009.22.Subramaniam,S.,Faruqi,A.,Oesterhelt,D.Henderson,R.Electrondiffractionstudiesoflight-inducedconformationalchangesintheLeu-93→Alabacteriorhodopsinmutant.ProcNatAcadSciUSA941767-17721997.23.Subramaniam,S.,Greenhalgh,D.,Rath,P.,Rothschild,K.Khorana,H.Replacementofleucine-93byalanineorthreonineslowsdownthedecayoftheNandOintermediatesinthephotocycleofbacteriorhodopsin:implicationsforprotonuptakeand13-cis-retinalall-trans-retinalreisomerization.ProcNatlAcadSciUSA88,6873-68771991.24.Nack,M.etal.TheDCgateinChannelrhodopsin-2:crucialhydrogenbondinginteractionbetweenC128andD156.PhotochemicalPhotobiologicalSciences9,194-1982010.25.Busskamp,V.etal.Geneticreactivationofconephotoreceptorsrestoresvisualresponsesinretinitispigmentosa..Science329,413-4172010.26.Ellis-Davies,G.C.R.Neurobiologywithcagedcalcium.ChemRev108,1603-16132008.27.Lorenz,C.,Pusch,M.Jentsch,T.HeteromultimericClCchloridechannelswithnovelproperties.ProcNatlAcadSciUSA92,13362-133661996.28.Allocca,M.etal.Noveladeno-associatedvirusserotypesefficientlytransducemurinephotoreceptors.JVirology81,1137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