"シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法であって、前記方法は:発現ベクターへ、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を連結する工程;発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程;及び組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み;前記組み換え型毒素タンパク質は、CRM197、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、及び緑膿菌外毒素Aから選択され、又は前記組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、及び緑膿菌外毒素Aから選択され、又は前記組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、及びクロストリジウムディフィシレ毒素Bから選択される、ことを特徴とする方法。前記組換え型タンパク質は、1リットル当たり0.2グラム乃至1リットル当たり約12グラムの可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量にて生成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。1リットル当たり約0.2グラム乃至1リットル当たり約12グラムである可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量は、約0.2g/L、約0.3g/L、約0.4g/L、約0.5g/L、約0.6g/L、約0.7g/L、約0.8g/L、約0.9g/L、約1g/L、約1.5g/L、約2g/L、約2.5g/L、約3g/L、約3.5g/L、約4g/L、約4.5g/L、約5g/L、約5.5g/L、約6g/L、約6.5g/L、約7g/L、約7.5g/L、約8g/L、約8.5g/L、約9g/L、約9.5g/L、約10g/L、約10.5g/L、約11g/L、約12g/L、約0.2g/L乃至約0.5g/L、約0.2g/L乃至約1g/L、約0.2乃至約2g/L、約0.3g/L乃至約0.6g/L、約0.3g/L乃至約1g/L、約0.3乃至約2g/L、約0.4乃至約0.7g/L、約0.4乃至約1g/L、約0.4乃至約2g/L、約0.4乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約1g/L、約0.5g/L乃至約2g/L、約0.5g/L乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約4g/L、約0.5g/L乃至約5g/L、約0.5g/L乃至約6g/L、約0.5g/L乃至約7g/L、約0.5g/L乃至約8g/L、約0.5g/L乃至約9g/L、約0.5g/L乃至約10g/L、約0.5g/L乃至約11g/L、約0.5g/L乃至約12g/L、約1g/L乃至約2g/L、約1g/L乃至約3g/L、約1g/L乃至約4g/L、約1g/L乃至約5g/L、約1g/L乃至約6g/L、約1g/L乃至約7g/L、約1g/L乃至約8g/L、約1g/L乃至約9g/L、約1g/L乃至約10g/L、約1g/L乃至約11g/L、約1g/L乃至約12g/L、約2g/L乃至約3g/L、約2g/L乃至約4g/L、約2g/L乃至約5g/L、約2g/L乃至約6g/L、約2g/L乃至約7g/L、約2g/L乃至約8g/L、約2g/L乃至約9g/L、約2g/L乃至約10g/L、約2g/L乃至約11g/L、約2g/L乃至約12g/L、約3g/L乃至約4g/L、約3g/L乃至約5g/L、約3g/L乃至約6g/L、約3g/L乃至約7g/L、約3g/L乃至約8g/L、約3g/L乃至約9g/L、約3g/L乃至約10g/L、約3g/L乃至約11g/L、約3g/L乃至約12g/L、約4g/L乃至約5g/L、約4g/L乃至約6g/L、約4g/L乃至約7g/L、約4g/L乃至約8g/L、約4g/L乃至約9g/L、約4g/L乃至約10g/L、約4g/L乃至約11g/L、約4g/L乃至約12g/L、約5g/L乃至約6g/L、約5g/L乃至約7g/L、約5g/L乃至約8g/L、約5g/L乃至約9g/L、約5g/L乃至約10g/L、約5g/L乃至約11g/L、約5g/L乃至約12g/L、約6g/L乃至約7g/L、約6g/L乃至約8g/L、約6g/L乃至約9g/L、約6g/L乃至約10g/L、約6g/L乃至約11g/L、約6g/L乃至約12g/L、約7g/L乃至約8g/L、約7g/L乃至約9g/L、約7g/L乃至約10g/L、約7g/L乃至約11g/L、約7g/L乃至約12g/L、約8g/L乃至約9g/L、約8g/L乃至約10g/L、約8g/L乃至約11g/L、約8g/L乃至約12g/L、約9g/L乃至約10g/L、約9g/L乃至約11g/L、約9g/L乃至約12g/L、約10g/L乃至約11g/L、約10g/L乃至約12g/L、又は約11g/L乃至約12g/Lであることを特徴とする、請求項2に記載の方法。前記毒素タンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列が、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合されることを特徴とする、請求項1乃至3の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞は、少なくとも1つのプロテアーゼの発現を欠き、又は前記宿主細胞は、少なくとも1つのフォールディングモジュレータ、又はその組み合わせを過剰発現させることを特徴とする、請求項1乃至4の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、前記宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が、Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V、又はPbpである分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至6の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、宿主細胞が、セラリシン、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、AprA、又はそれらの任意の組み合わせの発現を欠き、又は宿主細胞が、DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現し、及び更に、前記組み換え型毒素タンパク質がAzu、Pbp、又は自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至6の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞がDsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞がセラリシンの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞がHslU及びHslVの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、前記宿主細胞が野生型であり、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbp又はAzuに融合されることを特徴とする、請求項1乃至4の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がCRM197であり、前記組み換え型毒素タンパク質が、分泌リーダーAzu、Pbp、IbpS31A、CupA2、又はPbpA20Vに融合されることを特徴とする、請求項1乃至8の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がコレラ毒素Bであり、前記宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠き、又はHslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、DegP2S219Aを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞が、Lon、la、及びAprAの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーPbpA20Vに融合され、又はHslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、DegP2S219Aを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーDsbAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は14の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が、百日咳毒素S1E129AR9Kであり、宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠き、GrpE、DnaK、及びDnaJを過剰発現し、HtpXの発現を欠き、RXF01590の発現を欠き、又はppiBRXF05345の発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がその自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は16の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞が、Lon、la及びAprAの発現を欠き、又は前記宿主細胞が、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠き、又は前記宿主細胞がdsbABCDを過剰発現し、又は前記宿主細胞がGrpE、DnaK、及びDnaJを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が、分泌リーダーTolB、DsbA、DsbC、PbpA20V、NikA、又はCupA2に融合されることを特徴とする、請求項1乃至5又は18の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞がLon、la、及びAprAの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーDsbAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5、18、又は20の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素Cであり、前記宿主細胞がGrpE、DnaK、及びDnaJの発現を欠くことを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーNikAに融合されることを特徴とする、請求項1乃至5、18、20、又は22の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質がクロストリジウムディフィシレ毒素Bであり、前記宿主細胞がHtpXの発現を欠き、DegP1の発現を欠き、HslU、HslV、Prc1及びPrc2の発現を欠き、Lon、la、及びDegP2の発現を欠き、又は;前記宿主細胞が、Lon、Prc1、DegP2、AprAの発現を欠き、DegP2S219Aを過剰発現することを特徴とする、請求項1乃至5の何れか1つに記載の方法。活性アッセイにおける前記組み換え型毒素タンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、生成された水溶性毒素タンパク質の約40乃至約100が活性であると決定されることを特徴とする、請求項1乃至24の何れか1つに記載の方法。前記活性アッセイが、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。前記発現ベクターが、タンパク質コード配列に効果的に連結されたlac誘導体プロモータを含み、前記培養が、約0.02乃至約1.0mMの濃度でIPTGを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度が、約40乃至約200の吸光度単位AUの光電密度であり、培養のpHが約6乃至約7.5であり、成長温度が約20乃至約35°Cであることを特徴とする、請求項1乃至26の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞が、緑膿菌細胞であることを特徴とする、請求項1乃至27の何れか1つに記載の方法。前記宿主細胞がシュードモナスフルオレッセンスであることを特徴とする、請求項1乃至28の何れか1つに記載の方法。前記ヌクレオチド配列がシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項1乃至29の何れか1つに記載の方法。前記ヌクレオチド配列がシュードモナス宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項28に記載の方法。前記ヌクレオチド配列がシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項29に記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が百日咳毒素であり、前記百日咳毒素が野生型又はS1E129AR9Kであることを特徴とする、請求項1乃至4又は25乃至32の何れか1つに記載の方法。前記組み換え型毒素タンパク質が緑膿菌外毒素Aであり、前記緑膿菌外毒素Aが野生型、CRM66、又はrEPAであることを特徴とする、請求項1乃至4又は25乃至32の何れか1つに記載の方法。前記発現ベクターが分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項4乃至34の何れか1つに記載の方法。前記発現ベクターが、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1乃至35の何れか1つに記載の方法。本発明は、シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法に関し、該方法は:発現ベクターへ、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を連結する工程;発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程;及び組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み;ここで、組み換え型毒素タンパク質は、CRM197、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、又は緑膿菌外毒素Aである。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、又は緑膿菌外毒素Aである。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素B、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、又はクロストリジウムディフィシレ毒素Bである。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、CRM197、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントC、又はクロストリジウムディフィシレ毒素Bである。特定の実施形態において、組換え型タンパク質は、1リットル当たり約0.2グラム乃至1リットル当たり約12グラムの可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量にて生成される。特異的な実施形態において、可溶性の及び/又は活性な毒素タンパク質の収量は、約0.2g/L、約0.3g/L、l約0.4g/L、約0.5g/L、約0.6g/L、約0.7g/L、約0.8g/L、約0.9g/L、約1g/L、約1.5g/L、約2g/L、約2.5g/L、約3g/L、約3.5g/L、約4g/L、約4.5g/L、約5g/L、約5.5g/L、約6g/L、約6.5g/L、約7g/L、約7.5g/L、約8g/L、約8.5g/L、約9g/L、約9.5g/L、約10g/L、約10.5g/L、約11g/L、約12g/L、約0.2g/L乃至約0.5g/L、約0.2g/L乃至約1g/L、約0.2g/L乃至約2g/L、約0.3g/L乃至約0.6g/L、約0.3g/L乃至約1g/L、約0.3乃至約2g/L、約0.4乃至約0.7g/L、約0.4乃至約1g/L、約0.4乃至約2g/L、約0.4乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約1g/L、約0.5g/L乃至約2g/L、約0.5g/L乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約4g/L、約0.5g/L乃至約5g/L、約0.5g/L乃至約6g/L、約0.5g/L乃至約7g/L、約0.5g/L乃至約8g/L、約0.5g/L乃至約9g/L、約0.5g/L乃至約10g/L、約0.5g/L乃至約11g/L、約0.5g/L乃至約12g/L、約1g/L乃至約2g/L、約1g/L乃至約3g/L、約1g/L乃至約4g/L、約1g/L乃至約5g/L、約1g/L乃至約6g/L、約1g/L乃至約7g/L、約1g/L乃至約8g/L、約1g/L乃至約9g/L、約1g/L乃至約10g/L、約1g/L乃至約11g/L、約1g/L乃至約12g/L、約2g/L乃至約3g/L、約2g/L乃至約4g/L、約2g/L乃至約5g/L、約2g/L乃至約6g/L、約2g/L乃至約7g/L、約2g/L乃至約8g/L、約2g/L乃至約9g/L、約2g/L乃至約10g/L、約2g/L乃至約11g/L、約2g/L乃至約12g/L、約3g/L乃至約4g/L、約3g/L乃至約5g/L、約3g/L乃至約6g/L、約3g/L乃至約7g/L、約3g/L乃至約8g/L、約3g/L乃至約9g/L、約3g/L乃至約10g/L、約3g/L乃至約11g/L、約3g/L乃至約12g/L、約4g/L乃至約5g/L、約4g/L乃至約6g/L、約4g/L乃至約7g/L、約4g/L乃至約8g/L、約4g/L乃至約9g/L、約4g/L乃至約10g/L、約4g/L乃至約11g/L、約4g/L乃至約12g/L、約5g/L乃至約6g/L、約5g/L乃至約7g/L、約5g/L乃至約8g/L、約5g/L乃至約9g/L、約5g/L乃至約10g/L、約5g/L乃至約11g/L、約5g/L乃至約12g/L、約6g/L乃至約7g/L、約6g/L乃至約8g/L、約6g/L乃至約9g/L、約6g/L乃至約10g/L、約6g/L乃至約11g/L、約6g/L乃至約12g/L、約7g/L乃至約8g/L、約7g/L乃至約9g/L、約7g/L乃至約10g/L、約7g/L乃至約11g/L、約7g/L乃至約12g/L、約8g/L乃至約9g/L、約8g/L乃至約10g/L、約8g/L乃至約11g/L、約8g/L乃至約12g/L、約9g/L乃至約10g/L、約9g/L乃至約11g/L、約9g/L乃至約12g/L、約10g/L乃至約11g/L、約10g/L乃至約12g/L、又は約11g/L乃至約12g/Lである。実施形態において、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合される。実施形態において、宿主細胞は、少なくとも1つのプロテアーゼの発現を欠き、又は宿主細胞は、少なくとも1つのフォールディングモジュレータfoldingmodulator、又はその組み合わせを過剰発現させる。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V、又はPbpである分泌物リーダーに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、宿主細胞は、HslU及びHslV、又はPrc1、又はDegP1、又はDegP2、又はAprAの発現を欠く。特異的な実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、宿主細胞は、セラリシンSerralysin、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、又はAprAの発現を欠き、又は宿主細胞は、DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現させる。実施形態において、宿主細胞は、DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現させ、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーAzuに融合される。実施形態において、宿主細胞はセラリシンの発現を欠き、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーPbp又はAzuに融合される。実施形態において、宿主細胞はHslUとHslVの発現を欠き、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーPbp又はAzuに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、宿主細胞は野生型であり、ここで、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーPbp又はAzuに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はCRM197であり、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーAzu、Pbp、IbpS31A、CupA2、又はPbpA20Vに融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はコレラ毒素Bであり、宿主細胞は、Lon、La、及びAprAの発現を欠き、又は宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠く。関連する実施形態において、宿主細胞は、Lon、La、及びAprAの発現を欠き、ここで、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーPbpA20Vに融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、百日咳毒素S1E129AR9Kであり、宿主細胞は、Lon、La、及びAprA;GrpE、DnaK、及びDnaJ;HtpX;RXF01590;又はppiBRXF05345の発現を欠いている。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、その自然の分泌リーダーに融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Cであり、宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、及びAprAの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーDsbC、PbpA20V、又はCupA2に融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Cであり、宿主細胞は、Lon、La、及びAprAの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーDsbAに融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Cであり、宿主細胞は、GrpE、DnaK、及びDnaJの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーNikAに融合される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はクロストリジウムディフィシレ毒素Bであり、宿主細胞は、HtpX;DegP1;HslU、HslV、Prc1、及びPrc2;又はLon及びDegP2の発現を欠き、又は宿主細胞は、Lon、Prc1、DegP2、AprAの発現を欠き、DegP2S219Aを過剰発現する。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質の活性は、活性アッセイにおいて測定され、ここで、生成された水溶性毒素タンパク質の約40乃至約100は、活性であると決定される。関連する実施形態において、活性アッセイは、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイである。本発明の実施形態において、発現ベクターは、タンパク質コード配列に効果的に連結されたlac誘導体プロモータを含み、ここで、培養は、約0.02乃至約1.0mMの濃度でIPTGを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度は、約40乃至約200の吸光度単位AUの光学密度であり、培養のpHは、約6乃至約7.5であり、及び成長温度は約20乃至約35°Cである。実施形態において、宿主細胞は緑膿菌細胞である。関連する実施形態において、宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。本発明の実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化された。関連する実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナス宿主細胞における発現のために最適化された。他の関連する実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における発現のために最適化された。実施形態において、百日咳毒素は野生型又はS1E129AR9Kである。実施形態において、緑膿菌外毒素Aは野生型、CRM66、又はrEPAである。本発明の実施形態において、発現ベクターは、分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。実施形態において、発現ベクターは、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って生成された組み換え型毒素タンパク質を提供する。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、CRM197、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素B、百日咳毒素、破傷風毒素のフラグメントC、クロストリジウムディフィシレ毒素B、又は緑膿菌外毒素Aである。実施形態において、外毒素Aは野生型、CRM66、又はrEPAである。特定の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、毒素の高収率を生成する又は高品質の毒素を生成するものとして本明細書で確認された、シュードモナスフルオレッセンスの菌株で生成される。特定の実施形態において、組み換え型の毒素タンパク質は、毒素タンパク質の最も高い収量をもたらすものとして、本明細書に記載のシュードモナスフルオレッセンスの菌株において生成される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、毒素の発酵生成に使用されたものとして、本明細書に記載の菌株において生成される。引用による組み込みこの明細書で言及されるすべての公報、特許、及び特許出願は、個々の公報、特許、又は特許出願が、それぞれ、明確且つ個々に引用によって組み込まれると示されるように、同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。毒素ADPリボシル化毒素ADPリボシル化毒素ADPRTは、ニコチンアミドとNADのN-リボースの間のN-グリコシル結合の切断を促進し、標的タンパク質にADPリボース部分を移動する。ADPRTはそれぞれの標的に基づいて4つのファミリーに分類される。I型ADPRTはヘテロマーのGTP結合タンパク質を標的とする。それらは、コレラ毒素CTX、百日咳毒素PTX及び大腸菌易熱性毒素LTを含む。II型ADPRTジフテリア毒素及びシュードモナス菌外毒素Aは伸長因子2EF2を修正する。III型ADPRTボツリヌス菌C3細胞外酵素は、小さなGTP結合タンパク質をADPリボシル化する。IV型ADPRTADP-リボシル化アクチン。これらのアクチンに特異的なADPRTは、クロストリジウムボツリヌス菌C2毒素、ウェルシュ菌ι-毒素、クロストリジウムディフィシレ毒素引用により本明細書に組み込まれた、Popoff,etal.,1988,Actin-specificADP-ribosyltransferaseproducedbyaClostridiumdifficilestrain,InfectionandImmunity569:2299-2306に記載される、TcdAとTcdBとは異なる毒素、C.spiroforme毒素、及びセレウス菌の成長力のある殺虫のタンパク質VIPを含む、二成分の毒素のファミリーを含む。各々の型のADPRTからの様々な酵素の成分の構造は、NADによって又はNAD無しで決定され、例えば、引用により本明細書に組み込まれた、Tsuge,etal.,2008,StructuralbasisofactinrecognitionandarginineADP-ribosylationbyClostridiumperfringens-toxin,PNAS10521:7399-7404により考察される。典型的なアクチン特異的ADPRTは2つの類似したドメインを所有する:触媒能力に不可欠であるCドメイン;及び結合及び転位サブユニットとの相互作用に重要であるNドメイン。対照的に、サルモネラ菌及びIII型ADPRTC3からのSpvBは、ADPリボース転移酵素ドメインを1つだけ有し、N末端アダプタードメインを欠く。すべてのIV型ADPRTにおいて、2つの重要なグルタミン酸残留物を含むEXEモチーフは、触媒中心に存在する。EXEモチーフの前のグルタメートは、ADPリボース転移酵素に重要な残留物であると思われ、それはアクチン中のArg-177から脱プロトン化させられる。後のグルタミン酸は、N-リボース上でO’2を有する水素結合を形成し、オキソカルベニウム陽イオンを安定させると思われる。ADPRTは、全てが引用によって本明細書に組み込まれる、Barthetal.,2004,BinaryBacterialToxins:Biochemistry,Biology,andApplicationofCommonClostridiumandBacillusProteins,MicrobiologyandMolecularBiologyReviews683:373-402;Mueller-Dieckmann,etal.,StructureofmouseADP-ribosylhydrolase3mARH3,ActaCrystF64:156-162;Kulich,etal.,1995,ExpressionofRecombinantExoenzymeSofPseudomonasaeruginosa,InfectionandImmunity631:1-8;Sakurai,etal.,2009,ClostridiumperfringensIota-Toxin:StructureandFunction,Toxins1:208-228;及びSchirmer,etal.,2002,TheADP-ribosylatingMosquitocidalToxinfromBacillussphaericus,TheJournalofBiologicalChemistry27714:11941-11948によって更に記載される。本発明の実施形態において、ADPRTを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、ADPRTのグループは、CTXCTA及び/又はCTB、PTX、DTCRM197及び/又はWT、及びシュードモナス菌外毒素Aから成る。実施形態において、ADPRTのグループは、CTXCTA及び/又はCTB、PTX、及びシュードモナス菌外毒素Aから成る。他の実施形態において、I型ADPRTを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、I型ADPRTのグループはCTXCTA及び/又はCTB、及びPTXから成る。他の実施形態において、II型ADPRTを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、II型ADPRTのグループは、DTCRM197及び/又はWT、及びシュードモナス菌外毒素Aから成る。他の実施形態において、IV型ADPRTを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、IV型ADPRTはTcdBである。CRM197及びDT交差反応性物質197CRM197は、ミスセンス突然変異を有するDT遺伝子から生成されたジフテリア毒素DT変異体である。DTはADPリボシル化毒素である;CRM197は、DTのADPリボース転移酵素ADPRT活性を欠き、したがって無毒である。CRM197のための遺伝子は、単独ベース置換を有し、残留物52にてグリシンの代わりにグルタミン酸の取り込みをもたらす。例えば、全てが引用によって本明細書に組み込まれる、Bishai,etal.,1987,High-LevelExpressionofaProteolyticallySensitiveDiphtheriatoxinFragmentinEscherichiacoli,J.Bact.16911:5140-51、Giannini,etal.,1984,TheAmino-AcidSequenceofTwoNon-ToxicMutantsofDiphtheriatoxin:CRM45andCRM197,NucleicAcidsResearch1210:4063-9、及びGenBankAcc.No.1007216Aを参照。CRM197タンパク質は、当該技術分野において既知の方法によって、又はジフテリア菌又は他の微生物における発現によって低レベルで調製され得る。自然発生の、又は野生型の、ジフテリア毒素は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を含む様々な公共のソースから利用可能な毒素産生菌から得られ得る。ジフテリア菌においてCRM197タンパク質を生成するためのプラスミドシステムは、例えば、その全体において引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,614、382号、PlasmidforProductionofCRMProteinandDiphtheriatoxinに記載される。ヌクレオチド配列は、コリネバクテリオファージβによって運ばれたジフテリア毒素のための野生型構造遺伝子の既知のDTヌクレオチド配列に基づき、組換DNA技術例えば、Sambrooketal,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989に記載の技術を使用して、及び部位特異的変異誘発によっても調製され得る。例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、Greenfield,etal.,1993NucleotideSequenceoftheStructuralGeneforDiphtheriatoxinCarriedbyCorynebacteriophage18,ProcNatAcadSci80:6953-7を参照。本明細書の他の部分に記載されるように、ヌクレオチド配列は最適化され得る。本発明の実施形態において、CRM197又はDTは、実施例1における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、実施例1に記載の発現ベクタープラスミドの何れかと組み合わせて生成される。実施形態において、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型のCRM197又はDTタンパク質に融合される、表8及び表3に記載の分泌物リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、CRM197又はDTタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約0.5g/L乃至少なくとも約12g/Lの収量で、CRM197又はDTを生成するために使用される。コレラ毒素コレラ菌によって産出されたコレラ毒素CTXはまた、ADPリボシル化毒素である。コレラ毒素CTXは、6つのサブユニットタンパク質から構成されたオリゴマーの複合体である:コレラ毒素AサブユニットCTAの単一のコピー、及びコレラ毒素BサブユニットCTBの5つのコピー。各々12kDaの重量を有する5つのBサブユニットは五員環を形成する。Aサブユニットは、A1部分、CTA1、Gタンパク質をADP-リボシル化する球状の酵素、及びA2鎖、CTA2を有し、それは、Bサブユニット環の中央のポアにきっちり位置する拡張したα螺旋体を形成する。この環は、宿主細胞表面上のGM1ガングリオシド受容体に結合し、全複合体の内部移行をもたらす。一旦内部移行されると、CTA1鎖はジスルフィド架橋の減少によって放出される。その後、CTA1は活性化され、アデニル酸シクラーゼのADPリボシル化を触媒する。アデニル酸シクラーゼ活性において結果として生じる増加は、環状AMP合成を増加させ、それは大量の液体及び電解質流出を引き起こし、下痢をもたらす。CTXのBサブユニットは、比較的無害であるが、GM1ガングリオシド受容体に結合するその能力を保持する。それ故、CTBは、化学的に又は遺伝学的に結合した異種抗原の粘膜の取り込みの促進における使用を見出す。粘膜及び全身性の免疫を誘発することが実証されており、食用のワクチン生成で使用される候補である。その結合優先bindingpreferenceのため、CTBはまた、神経細胞のトレーサーとしての使用を見出す。その構造の特徴と同様にCTBの使用も、例えば、その全てが引用により本明細書に組み込まれる、Nozoye,etal.,2009,ProductionofAscarissuumAs14ProteinandItsFusionProteinwithCholeraToxinBSubunitinRiceSeeds,Parasitology995-1000;Harakuni,etal.,2005,HeteropentamericCholeraToxinBSubunitChimericMoleculesGeneticallyFusedtoaVaccineAntigenInduceSystemicandMucosalImmuneResponses:aPotentialNewStrategytoTargetRecombinantVaccineAntigenstoMucosalImmuneSystems,InfectionandImmunity739:5654-5665;Price,etal.,2005,IntranasalAdministrationofRecombinantNeisseriagonorrhoeaeTransferrinBindingProteinsAandBConjugatedtotheCholeraToxinBSubunitInducesSystemicandVaginalAntibodiesinMice,InfectionandImmunity737:3945-3953;及びSun,etal.,1999,IntranasalAdministrationofaSchistosomamansoniGlutathioneS-Transferase-CholeraToxoidConjugateVaccineEvokesAntiparasiticandAntipathologicalImmunityinMice,J.Immunol.163:1045-1052に記載される。本発明の実施形態において、CTB又はCTXは、例1において本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、例3に記載の発現ベクターの何れかと組み合わせて生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型CTB又はCTXタンパク質に融合される表8及び表3に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、CTB又はCTXタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約0.2g/L乃至少なくとも約5g/Lの収量でCTB又はCTXを生成するために使用される。百日咳毒素百日咳毒素は、百日咳菌によって生成された菌体外毒素と病原性の因子、疾患百日咳を引き起こすヒト気道の病原菌である。百日咳ホロトキシンは、AB5構造とのマルチサブユニットの複合体である。酵素学的に活性なAサブユニットS1は、哺乳動物細胞において幾つかのヘテロ三量体のGタンパク質主としてGiタンパク質のアルファサブユニットを修正するADPリボース転移酵素であり、BオリゴマーS2、S3、S4の2つのコピー、及びS5は、細胞上の複合糖質受容体を結合する。S1は、細胞エントリーの後にタンパク分解性に処理される。引用により本明細書に組み込まれる、Carbonetti,etal.,2005,ProteolyticCleavageofPertussisToxinS1SubunitisNotEssentialforItsActivityinMammalianCells,BMCMicrobiology5:7は、S1の処理が哺乳動物細胞におけるその細胞毒性活性に不可欠ではないと報告した。百日咳毒素の無毒な変異体はワクチンにおいて使用するために調査された。本発明の方法を使用して生成された百日咳毒素タンパク質は、百日咳から保護するためのワクチンにおける使用のために熟考される。百日咳毒素はまた、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、Roberts,etal.,1995,AMutantPertussisToxinMoleculeThatLacksADP-RibosyltransferaseActivity,PT-9K/129G,IsanEffectiveMucosalAdjuvantforIntranasallyDeliveredProteins,InfectionandImmunity636:2100-2108に記載されるように、ワクチンアジュバントとして試験された。更に、百日咳毒素はまた、研究目的、例えば、Gタンパク質シグナル経路例えば、引用により本明細書に組み込まれるMcCoy,etal.,2010,PAR1andPAR2coupletooverlappinganddistinctsetsofGproteinsandlinkedsignalingpathwaystodifferentiallyregulatecellphysiology,MolecularPharmacologyFastForwardMOL62018に関する研究のために、及び自己免疫性疾患、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎EAE、実験的自己免疫性精巣炎、実験的自己免疫性のブドウ膜炎などの誘発を高めるアジュバントとして役立つ引用により本明細書に組み込まれるSu,etal.,2001,PertussisToxinInhibitsInductionofTissue-SpecificAutoimmineDiseasebyDisruptingGProtein-CoupledSignals,JImmunol167:250-256.。毒素の5つのサブユニットは、図3に示される、百日咳トキソイドオペロンから発現される。特定の変異体を含む百日咳毒素タンパク質の発現及び構造は、全てその全体において引用により組み込まれる、Burnette,etal.,1992,PropertiesofPertussisToxinBOligomerAssembledInVitrofromRecombinantPolypeptidesProducedbyEscherichiacoli,InfectionandImmunity606:2252-2256;米国特許第5,085,862号Geneticdetoxificationofpertussistoxin;及びKaslow,etal.,1987,Structure-ActivityAnalysisoftheActivationofPertussisToxin,Biochemistry261:123-7によるものと同様、上記で引用された報告に記載される。本明細書で使用されるような百日咳毒素又はPTXは、百日咳毒素突然変異体S1R9KE129A又は野生型のタンパク質を指す。野生型の百日咳毒素及び百日咳毒素突然変異体S1R9KE129Aは、例えば、全てその全体において引用により組み込まれる、Roberts,etal.,1995上記で引用;米国特許第7,427,404号及び米国特許第7,666,436号、両方の表題PertussisToxinMutants,BordetellaStrainsCapableofProducingSuchMutantsandTheirUseintheDevelopmentofAntipertussisVaccines;米国特許第5,935,580号、RecombinantMutantsforInducingSpecificImmuneResponses;米国特許第7,169,399号、Non-ToxicDoubleMutantFormsofPertussisToxinasAdjuvants;米国特許第5,785,971号及び米国特許第5,427,788号、両方の表題PertussisToxinandUseinVaccines;及び米国特許第5,773,600号、DNAEncodingPertussisToxinMuteinsに記載される。本発明の実施形態において、百日咳毒素突然変異体S1E129A又は野生型の百日咳毒素は、実施例1、5及び7において本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して生成される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型PTXタンパク質に融合される表8及び表3に記載される分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。実施形態において、配列をコード化するサブユニットの何れか又は全ては、本明細書に別記されるように、選択されるシュードモナス菌宿主における発現のために最適化される。特定の実施形態において、サブユニットは、例えば、当該技術分野において周知の方法に従って個々の配列をサブクローン化することにより、2以上の構築物から発現される。特定の実施形態において、PTXタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約0.2g/L乃至少なくとも約5g/Lの収量でPTX又はPTXの個々のサブユニットを生成するために使用される。破傷風毒素のフラグメントC破傷風菌によって産出された破傷風毒素は、150kDaの分子量を有する神経毒である。それは2つの部分から構成される:100kDaの重鎖又はB鎖及び50kDaの軽鎖又はA鎖。鎖は、ジスルフィド結合によって連結される。B鎖は、神経細胞の細胞膜上のジシアロガングリオシドGD2及びGD1bに結合する。A鎖、亜鉛エンドペプチダーゼは、小胞に関連する膜タンパク質VAMPを攻撃する。A鎖の作用は、影響を受けた神経細胞が、タンパク質シナプトブレビンの分解により抑制性神経伝達物質GABAγ-アミノ酪酸及びグリシンを放出するのを止める。この結果は、最も小さな刺激からの筋肉における危険な活動過剰、即ち、感覚の刺激による運動反射の阻害ができないことである。これは、テタニー性攣縮と称される、アゴニスト及びアンタゴニスト筋肉組織の一般化された収縮を引き起こす。破傷風毒素のフラグメントCTetC又はTTCは、破傷風毒素のプロテアーゼ開裂例えばパパインによるによって、又はフラグメントの組み換え型の発現を通じて発生した50kDのポリペプチドである。それは、C末端での451のアミノ酸に相当するアミノ酸位置865-1315。フラグメントCの組み換え型の発現は、例えば、その全体において全て引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,443,966号、ExpressionofTetanusToxinFragmentC、WO/2005/000346、CarrierProteinsforVaccines、第6,010,871号、ModificationofPeptideandProteinに開示される。フラグメントCは、無毒であり、マウスとモルモットにおける防御免疫応答を刺激できることが示された。米国特許第5,443,966号は、破傷風毒素の配列及び大腸菌におけるフラグメントCの生成を記載する。酵母における組み換え型のTTCの発現は、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,571,694号、ExpressionofTetanusToxinFragmentCinYeastに記載された。それが高い特異性と親和性により神経細胞に結合するため、TTCは、神経細胞の薬物送達、又は研究目的のために標的とする分子としての使用を見出す。そのような使用は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、TetanustoxinCfragmentconjugatednanoparticlesfortargeteddrugdeliverytoneurons,Biomaterials2834:5176-5184に記載される。TTCタンパク質はまた、例えばWO/2005/000346に記載されるように、ワクチン担体タンパク質として潜在的に有用であり、クロストリジウムテタニ感染から保護するためのワクチンにおいて使用するために調査された。本発明の実施形態において、TTCは、実施例1における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、実施例8に記載の発現ベクターの何れかと組み合わせて生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型TTCのタンパク質に融合する表8及び表3に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を有する。特定の実施形態において、TTCのタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。実施形態において、本発明の方法は、約0.5g/L乃至少なくとも約12g/Lの収量でTTCを生成するために使用される。クロストリジウムディフィシル毒素Bクロストリジウムディフィシル毒素BTcdBは、クロストリジウムディフィシルによって生成された病原性因子であり、それは院内での下痢及び偽膜性大腸炎を引き起こす。TcdB、及び第2の大きなクロストリジウム毒素、TcdAは、偽膜性大腸炎の進行に関係する。TcdB約270kDのグルコシル化毒素は、酵素、転位及び受容体結合のドメインに分けることができる。TcdBの第1の546アミノ酸は、酵素の領域を含み、それは、推定上の転位及び受容体結合ドメインに続く。酵素活性は、このフラグメントのアミノ又はカルボキシ末端欠失が活性を減少するように、アミノ末端546の残留物を必要とすると報告された。酵素領域内で、トリプトファン102は、UDP-グルコース結合に不可欠であると示された。LCT内で保存されたDXDモチーフは、LCTグルコシルトランスフェラーゼ活性に不可欠である。TcdB及びTcsL酵素ドメインのキメラの分析に関係する研究は、残留物364乃至516が基質特異性を付与することを示唆する。TcdBの構造及びその発現並びにクロストリジウムディフィシレ感染のための保護ワクチンとしての潜在的な使用は、例えば、その全体において全て引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,226,597号、MutantsofClostridiumDifficileToxinBandMethodsofUse;Jank,etal.,2008,Structureandmodeofactionofclostridialglucosylatingtoxins:theABCDmodel,TrendsinMicrobiology165:222-229;Sullivan,etal.,1982,PurificationandCharacterizationofToxinsAandBofClostridiumdifficile,InfectionandImmunity353:1032-1040;及びYang,etal.,2008,ExpressionofrecombinantClostridiumdifficiletoxinAandBinBacillusmegaterium,BMCMicrobiology8:192にて考察される。本発明の実施形態において、TcdBは、実施例1、5及び7における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型TcdBタンパク質に結合される表8及び表3に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、TcdBタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約0.5g/L乃至少なくとも約10g/Lの収量でTcdBを生成するために使用される。緑膿菌外毒素A緑膿菌外毒素AETA又はPEは、II型ADPRTである。それは、触媒ドメインを哺乳動物細胞へと移動させることができ、細胞の伸長因子2のADPリボシル化によってタンパク質合成を阻害することができる、分泌された細菌毒素のファミリーの1つのメンバーである。タンパク質はモノマーとして存在し、613のアミノ酸66Kdの単一のポリペプチド鎖から成る。3.0-A分割resolutionに決定される、外毒素AのX線結晶構造は、主として逆平行ベータ構造からなり、分子のおよそ半分;α-ヘリックスからなる中間のドメイン;及び分子のおよそ3分の1を含むカルボキシル末端ドメインを含む、アミノ末端ドメインを示す。カルボキシル末端ドメインは、毒素のADPリボース転移酵素である。他の2つのドメインは、細胞受容体結合及び膜転位に恐らく関係する。毒素は細胞表面上の特異的な受容体を介して細胞に結合し、その後、毒素受容体複合体は細胞へ内部移行される。最終的に、ETAは、それが酵素学的にタンパク質合成を阻害するサイトゾルに伝送される。細胞の中毒が、酸性の小胞におけるpHを上げる、NH4などの弱塩基によって予防されるため、伝送プロセスは、酸性の区画から生じると考えられる。酸性の状態への暴露に際して、PEの疎水性のドメインは細胞膜へ入り、酵素のドメインが拡張した形態でサイトゾルを通過するチャネルの形成をもたらす。毒性を減少させたPEと突然変異体の活性は、例えば、その全体において両方が引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,892,827号、RecombinantPseudomonasExotoxins:ConstructionofanActiveImmunotoxinwithLowSideEffects、及びLukac,etal.,1988,ToxoidofPseudomonasaeruginosaExotoxinAGeneratedbyDeletionofanActive-SiteResidue,InfectionandImmunity5612:3095-3098に記載される。ワクチン共役としての外毒素A突然変異体rEPAの使用は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Fattom,etal.,1993,LaboratoryandClinicalEvaluationofConjugateVaccinesComposedofStaphylococcusaureusType5andType8CapsularPolysaccharidesBoundtoPseudomonasaeruginosaRecombinantExoproteinA,InfectionandImmunity613:1023-1032;Qian,etal.,2007,ConjugatingrecombinantproteinstoPseudomonasaeruginosaExoProteinA:astrategyforenhancingimmunogenicityofmalariavaccinecandidates,Vaccine2520:3923-3933;及びin,etal.,2001.TheEfficacyofaSalmonellaTyphiViConjugateVaccineinTwo-To-Five-Year-OldChildren,NEnglJMed34417:1263-1269に記載される。本明細書で使用されるような緑膿菌外毒素Aは、緑膿菌外毒素A突然変異体CRM66、欠失rEPAdeletionrEPA、又は野生型のタンパク質を指す。本発明の実施形態において、外毒素Aは、実施例1、5及び7における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、及び組み換え型外毒素Aタンパク質に融合される表8及び表3に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を有する発現ベクターを使用して生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、ETAタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約0.5g/L乃至少なくとも約12g/Lの収量で外毒素Aを生成するために使用される。本発明の方法を使用して生成された典型的な毒素タンパク質は、表1に記録される。この表は限定していないことが理解される。本発明の実施形態において、本発明の方法を使用する生成のための、本明細書に記載の毒素の核酸配列の何れかは、選択されたシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化することができる。本明細書に別記されるように、所定の配列の最適化に対する複数の選択肢がある。記載されるような選択肢の何れかは、本発明の方法を使用して生成された毒素の配列の最適化における使用のために熟慮される。本明細書で提供される最適化された配列は、本発明の方法に役立つ最適化された配列の限定しない例である。コドンの最適化異種の発現系において、最適化工程は、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善し得る。タンパク質発現は、転写、mRNAの処理、及び翻訳の安定性及びその開始に影響を与えるものを含む、多数の因子によって管理される。ポリヌクレオチド最適化工程は、研究者が発現構築物を効率的に設計するのを援助するための工程と同様、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善するための工程を含み得る。最適化のストラテジーは、例えば、翻訳開始領域の修正、mRNAの構造要素の変化、及び異なるコドンバイアスの使用を含み得る。細菌の宿主における異種のタンパク質の発現を改善するための、核酸配列を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主菌株における発現に関するコドンの最適化は、例えば、その全体において引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第2007/0292918号CodonOptimizationMethodに記載される。最適化は、このように異種遺伝子の多くの配列特徴の何れかに対処できる。特異的な例として、レアコドンに誘発された翻訳の停止は、減少された異種のタンパク質発現をもたらすことができる。レアコドンに誘発された翻訳の停止は、宿主生物においてめったに使用されない対象のポリヌクレオチドにおけるコドンの存在を含み、このことは、利用可能なtRNAプールにおけるそれらの欠乏により、タンパク質翻訳に負の影響を及ぼし得る。宿主生物における最適な翻訳を改善する1つの方法は、合成のポリヌクレオチド配列から取り除かれているレア宿主コドンをもたらし得るコドン最適化を行なう工程を含む。代替の翻訳の開始はまた、減少された異種のタンパク質発現をもたらすことができる。代替の翻訳の開始は、リボソーム結合部位RBSとして機能することができるモチーフを不注意に含む、合成のポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部の部位から切り詰められたタンパク質の翻訳の開始をもたらし得る。精製中に取り除くのが難しくなり得る、切り詰められたタンパク質を生成する可能性を減少させる1つの方法は、最適化されたポリヌクレオチド配列から推定上の内部のRBS配列を除去する工程を含む。繰り返して誘発されたポリメラーゼスリップslippageは、減少された異種のタンパク質発現をもたらし得る。繰り返して誘発されたポリメラーゼの滑りslippageは、フレームシフト突然変異をもたらし得るDNAポリメラーゼのスリップ又はスタッタリングstutteringを引き起こすと示された、ヌクレオチド配列の繰り返しに関係する。そのような繰り返しはまた、RNAポリメラーゼのスリッページを引き起こし得る。高いGC含量バイアスを有する生物体において、G又はCヌクレオチドの繰り返しからなる、より高い程度の繰り返しがあり得る。それ故、RNAポリメラーゼスリッページを誘発する可能性を減少させる1つの方法は、G又はCのヌクレオチドの拡張した繰り返しを変える工程を含む。干渉する二次構造はまた、減少された異種のタンパク質発現をもたらし得る。二次構造は、RBS配列又は開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の縮小に関連づけられた。ステムループ構造はまた、転写の停止及び減弱に関係し得る。最適化されたポリヌクレオチド配列は、改善された転写及び翻訳を許容するため、ヌクレオチド配列のRBS及び遺伝子のコード領域に最小の二次構造を含み得る。異種のタンパク質発現に影響を与え得る別の特徴は、制限部位の存在である。宿主発現ベクターへの転写単位のその後のサブクローニングにより妨害することができる制限部位を取り除くことによって、ポリヌクレオチド配列は最適化され得る。例えば、最適化プロセスは、宿主によって異種性に発現される所望のアミノ酸配列を同定することにより始まり得る。アミノ酸配列から、候補のポリヌクレオチド又はDNA配列が設計され得る。合成DNA配列の設計中に、コドン利用の頻度は、宿主発現生物体のコドン利用と比較することができ、レア宿主コドンは合成の配列から取り除かれ得る。更に、合成の候補DNA配列は、望ましくない酵素制限部位を取り除き、かつ任意の所望シグナル配列、リンカー、又は翻訳されていない領域を加える、又はそれらを取り除くために修正され得る。合成DNA配列は、G/Cの繰り返し及びステムループ構造などの翻訳プロセスにより妨害し得る、二次構造の存在に関して分析され得る。候補DNA配列が合成される前に、最適化された配列設計は、配列が所望のアミノ酸配列を正確にコード化することを確認するために調べられ得る。最終的に、候補DNA配列は、当該技術分野で既知のものなどの、DNA合成技術を使用して合成され得る。本発明の別の実施形態において、シュードモナスフルオレッセンスなどの宿主生物体における一般的なコドン利用は、異種のポリヌクレオチド配列の発現を最適化するために利用され得る。宿主発現系における特定のアミノ酸に好ましいように、めったに考慮されないコドンの割合及び分布が評価され得る。5及び10の使用の値は、カットオフ値として、レアコドンの測定に使用され得る。例えば、表2に記録されたコドンは、シュードモナスフルオレッセンスMB214ゲノムにおいて5未満の計算された発生を有し、シュードモナスフルオレッセンス宿主において発現した、最適化された遺伝子において一般に回避されるであろう。本発明は、使用されているシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化された任意の配列を含む、生成された毒素のための任意のコード配列の使用を熟考する。使用のために熟考された配列は、限定されないが、以下のものを除去するための最適化を含み、所望されるように任意の程度に最適化され得る:シュードモナス菌宿主細胞において5未満で生じるコドン、シュードモナス菌宿主細胞において10未満で生じるコドン、レアコドンに誘発された翻訳の停止、推定上の内部RBS配列、G又はCヌクレオチドの拡張した繰り返し、干渉する二次構造、制限部位、又はそれらの組み合わせ。更に、本発明の方法を実行するのに役立つ任意の分泌リーダーのアミノ酸配列は、任意の適切な核酸配列によってコード化され得る。発現系本発明の方法に役立つ宿主細胞と同様に、シュードモナス菌宿主細胞において、有用な調節配列例えば、プロモータ、分泌リーダー、及びリボソーム結合部位を含む異種のタンパク質を発現する方法は、例えば、その全体において引用により全てが本明細書に組み込まれる、米国特許公報第2008/0269070号及び米国特許出願番号第12/610,207号、両方の表題MethodforRapidlyScreeningMicrobialHoststoIdentifyCertainStrainswithImprovedYieldand/orQualityintheExpressionofHeterologousProteins、米国特許公報第2006/0040352号、ExpressionofMammalianProteinsinPseudomonasFluorescens、及び米国特許公報第2006/0110747号、ProcessforImprovedProteinExpressionbyStrainEngineeringに記載される。これら公報はまた、フォールディングモジュレータを過剰発現するために設計され、又は異種のタンパク質発現を増加させるために、欠失を含むプロテアーゼ変異が導入された、本発明の方法を実行するのに役立つ細菌の宿主菌株を記載する。リーダー配列リーダーは、その全体において全てが引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第2008/0193974号及び第2010/0048864号、両方の表題BacterialLeaderSequencesforIncreasedExpression、及び米国特許出願公報第2006/0008877号、ExpressionsystemswithSec-secretion、同様に米国特許出願公報第2008/0269070号及び米国特許出願第12/610,207号に詳しく記載される。実施形態において、分泌リーダーをコード化する配列は、毒素タンパク質をコード化する配列に融合される。実施形態において、分泌リーダーはペリプラズムの分泌リーダーである。実施形態において、分泌リーダーは自然の分泌リーダーである。本発明の方法に役立つ分泌リーダーは、表3に開示されたものに限定されないことが理解される。実施形態において、分泌リーダーは、Azu、IbpS31A、CupA2、又はPbpA20Vである。他の実施形態において、分泌リーダーは、Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V、又はPbpである。自然のCRM197は、開裂される分泌リーダーを介してジフテリア菌から細胞外空間へ輸送され、GADDのアミノ末端配列配列番号:21を残す。CRM197の自然のアミノ末端、その後シュードモナスフルオレッセンスにおける発現を保存し、及びジスルフィド結合形成を確実にするために、タンパク質は細胞周辺腔に標的とされる。プロモータ本発明に従って使用されるプロモータは、構成的なプロモータ又は調節されたプロモータであり得る。有用な調節されたプロモータの一般の例は、lacプロモータすなわち、lacZプロモータ、特にDeBoerによる米国特許第4,551,433号に記載のtac及びtrcプロモータ、更にPtac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、及びT7lacプロモータ由来のファミリーのものを含む。1つの実施形態において、プロモータは宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモータは大腸菌生物体に由来する。誘導可能なプロモータ配列は、本発明の方法に従って毒素の発現を調節するために使用され得る。実施形態において、本発明の方法に役立つ誘導可能なプロモータは、lacプロモータすなわち、lacZプロモータ、特にDeBoerによる米国特許第4,551,433号に記載のtac及びtrcプロモータ、更にPtac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5、及びT7lacプロモータ由来のファミリーのものを含む。1つの実施形態において、プロモータは宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモータは大腸菌生物体に由来する。本発明に従った発現系に役立つ非lac型プロモータの一般の例は、例えば表4に記録されたものを含む。例えば、J.Sanchez-RomeroV.DeLorenzo1999ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnologyA.DemainJ.Davies,eds.pp.460-74ASMPress,Washington,D.C.;H.Schweizer2001CurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445;及びR.SlaterR.Williams2000MolecularBiologyandBiotechnologyJ.WalkerR.Rapley,eds.pp.125-54TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UKを参照。選択された細菌の宿主細胞に固有のプロモータのヌクレオチド配列を有するプロモータも、標的ポリペプチド、例えば、シュードモナスアントラニラート又はベンゾアートオペロンのプロモーターPant,Pbenをコード化する、トランスジーンの発現を制御するために使用され得る。1以上のプロモータが別のものに共有結合的に付着される、直列型のプロモータはまた、それが同じ又は異なる配列、例えば、Pant-Pbenの直列型プロモータプロモータ間混合interpromoterhybrid、プラーク-プラークの直列型プロモータにあっても、又はそれが同じ或いは異なる生物体に由来するとしても、使用され得る。調節されたプロモータは、プロモータがその一部分である遺伝子の転写を制御するために、プロモータ調節タンパク質を利用する。調節されたプロモータが本明細書に使用される場合、相当するプロモータ調節タンパク質はまた、本発明に従った発現系の一部であろう。プロモータ調節タンパク質の例は次のものを含む:活性化タンパク質、例えば、大腸菌カタボライト活性化タンパク質、MalTタンパク質;AraCファミリー転写活性化因子;リプレッサータンパク質、例えば、大腸菌LacIタンパク質;及び二元機能調節タンパク質dual-functionregulatoryprotein、例えば、大腸菌NagCタンパク質。多くの調節されたプロモータ/プロモータ調節タンパク質の対は、当該技術分野では既知である。1つの実施形態において、標的タンパク質のための発現構築物及び対象の異種のタンパク質は、同じ調節要素に制御される。プロモータ調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、プロモータに制御される遺伝子の少なくとも1つのDNA転写制御領域に、タンパク質が放出又は結合することを可能にするように、調節タンパク質と可逆的に又は不可逆的に付随する化合物と相互に作用し、それにより遺伝子の転写を開始する際にトランスクリプターゼ酵素の作用を許容又は遮断する。エフェクター化合物は、誘発因子又はコリプレッサーとして分類され、これら化合物は、自然のエフェクター化合物及び無償性誘導物質化合物を含む。多くの規制されたプロモータ/プロモータ調節タンパク質/エフェクター化合物の三つ組は、当該技術分野では既知である。エフェクター化合物は細胞培養又は発酵の全体にわたって使用され得るが、調整されたプロモータが使用される好ましい実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量又は密度の増加の後、適切なエフェクター化合物は、対象のタンパク質又はポリペプチドをコード化する所望の遺伝子の発現を直接又は間接的にもたらす培養に加えられる。lacファミリープロモータが利用される実施形態において、lacI遺伝子はまたシステムの中に存在し得る。通常構成的に発現した遺伝子であるlacI遺伝子は、lacファミリープロモータのlacオペレーターに結合する、Lacレプレッサータンパク質LacIタンパク質LacrepressorproteinLacIproteinをコード化する。したがって、lacファミリープロモータが利用される場合、lacI遺伝子も含まれ、発現系において発現され得る。シュードモナスに役立つプロモータシステムは、文献、例えば、米国特許出願公報第2008/0269070号に記載され、また上記で引用される。他の調節要素実施形態において、可溶性タンパク質は、生成中に、細胞の細胞質又はペリプラズムのいずれかに存在する。タンパク質を標的とするのに役立つ分泌リーダーは、本明細書に別記され、及び米国特許出願公報第2008/0193974号、米国特許出願公報第2006/0008877号、及び米国特許出願第12/610,207号に記載される。他の要素は、限定されないが、転写エンハンサー配列、翻訳のエンハンサー配列、他のプロモータ、活性化因子、翻訳の開始及び停止の信号、転写ターミネーター、シストロンの調節剤cistronicregulators、多シストロン性の調節剤polycistronicregulators、発現されたポリペプチドの識別、分離、精製、及び/又は隔離を促進する、ヌクレオチド配列タグ及びタグポリペプチドコード配列などのタグ配列を含む。実施形態において、発現ベクターは、分泌シグナルのためのコード配列、又は対象のタンパク質又はポリペプチドのためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。1つの実施形態において、このタグ配列は、タンパク質の精製を許容する。タグ配列は、ヘキサ-ヒスチジンアフィニティータグなどの、アフィニティータグであり得る配列番号:46。別の実施形態において、アフィニティータグはグルタチオン-S-転移酵素分子であり得る。タグはまた、YFP又はGFPなど蛍光の分子、又はそのような蛍光タンパク質のアナログであり得る。タグはまた、抗体分子の一部、又は精製に役立つ既知の結合パートナーのための既知の抗原又はリガンドであり得る。本発明の方法を実行するのに役立つ発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、操作しやすくそれに結合した以下の調節要素を含み得る:プロモータ、リボソーム結合部位RBS、転写ターミネーター、及び翻訳の開始及び停止の信号。有用なRBSは、例えば、米国特許出願公報第2008/0269070号及び米国特許出願第12/610,207号に従って、発現系における宿主細胞として有用な種の何れかから得られ得る。多くの特異的な及び様々なコンセンサスRBSは既知であり、例えば、それらは、D.Frishmanetal.,Gene2342:257-658Jul.1999;及びB.E.Suzeketal.,Bioinformatics1712:1123-30December2001に記載され、引用される。加えて、自然又は合成のRBSが使用され得、例えば、それらは、EP0207459syntheticRBSs;O.Ikehataetal.,Eur.J.Biochem.1813:563-701989nativeRBSsequenceofAAGGAAGに記載される。方法、ベクター、及び翻訳並びに転写の要素の更なる例、及び本発明に役立つ他の要素は、当該技術分野において衆知であり、例えば、引用により本明細書に組み込まれる多くの他の公報と同様に、引用により全てが本明細書に組み込まれる、Gilroyによる米国特許第5,055,294号及びGilroyetal.による米国特許第5,128,130号;Rammleretal.による米国特許第5,252,479号;Barnesetal.による米国特許第4,695,455号及び第4,861,595号;Grayetal.による米国特許第5,252,479号;及びWilcoxによる米国特許第5,169,760号に記載される。宿主菌株シュードモナスを含む細菌の宿主、及び密接に関連した細菌の生物体は、本発明の方法の実行における使用のために熟慮される。特定の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。宿主細胞はまた、大腸菌細胞であり得る。本発明の方法を実行するのに役立つ宿主細胞及び構築物は、当該技術分野では既知であり、文献、例えば、その全体において引用により全てが本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第2009/0325230号、ProteinExpressionSystemsに記載されていた試薬と方法を使用して同定され得る又は作られ得る。この公報は、ヌクレイン酸構築物を、染色体のlacI遺伝子挿入を含む栄養要求性のシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞に導入することによる、組み換え型ポリペプチドの生成を記載する。ヌクレイン酸構築物は、宿主細胞におけるヌクレイン酸の発現を方向付けることができるプロモータに操作しやすく結合された、組み換え型ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、また、栄養要求性の選択マーカーをコード化するヌクレオチド配列を含む。栄養要求性の選択マーカーは、原栄養性を栄養要求性の宿主細胞に回復させるポリペプチドである。実施形態において、細胞は、プロリン、ウラシル又はそれらの組み合わせのために栄養要求性である。実施形態において、宿主細胞はMB101ATCCデポジットPTA-7841に由来する。その全体において両方とも引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第2009/0325230号、ProteinExpressionSystems、及びSchneider,etal.,2005,AuxotrophicmarkerspyrFandproCcanreplaceantibioticmarkersonproteinproductionplasmidsinhigh-cell-densityPseudomonasfluorescensfermentation,Biotechnol.Progress212:343-8は、菌株MB101におけるpyrF遺伝子を消すことにより構築されたウラシルのための、生成宿主菌株の栄養要求性を記載する。原栄養性prototropyを回復するためにpyrF欠失を補足することができるプラスミドを発生させるため、pyrF遺伝子は、菌株MB214ATCCデポジットPTA-7840からクローン化された。特定の実施形態において、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における二重pyrF-proC二重栄養要求性dualpyrF-proCdualauxotrophicの選択マーカーシステムが使用される。記載されるようなPyrF生成宿主菌株productionhoststrainは、本発明の方法を実行するのに役立つものとして本明細書に記載のものを含む、他の所望のゲノムの変化を導入するためのバックグラウンドとして使用され得る。実施形態において、宿主細胞はプセウドモナス目である。宿主細胞がプセウドモナス目である場合、それは、シュードモナス属を含むシュードモナス科のメンバーであり得る。γプロテオバクテリアの宿主は、大腸菌種のメンバー及びシュードモナスフルオレッセンス種のメンバーを含む。他のシュードモナス生物体も役立ち得る。シュードモナス及び密接に関連した種は、Gram-NegativeAerobicRodsandCoccibyR.E.BuchananandN.E.Gibbonseds.,Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology,pp.217-2898thed.,1974TheWilliamsWilkinsCo.,Baltimore,Md.,USAhereinafterBergey1974に記載の科及び/又は属に属するプロテオバクテリアのグループを含む、グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ1を含む。表5は、生物体のこれらの科及び属を提示する。シュードモナス菌及び密接に関連する細菌は一般に、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1Gram-ProteobacteriaSubgroup1又はグラム陰性好気性の桿菌及び球菌Gram-NegativeAerobicRodsandCocciに定義されるグループの一部であるBuchananandGibbonseds.1974Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology,pp.217-289。シュードモナス宿主菌株は、例えば、上記で引用される文献、米国特許出願公報第2006/0040352号に記載される。グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ1はまた、分類において使用される基準に従ったこの見出しheadingにおいて分類されるプロテオバクテリアを含む。見出しはまた、アシドボラクスAcidovorax属、ブレバンディモナスBrevundimonas、バークホルデリア、ヒドロゲノファガHydrogenophaga、オセアニモナスOceanimonas、ラルストニア、及びステノトロホモナス、ザントモナス属以前にザントモナス種と呼ばれていたに属する生物体を再編成することにより作られたスフィンゴモナス属及びそれに由来するブラストモナスBlastomonas属、Bergey1974に定義されるような酢酸菌属に属する生物体を再編成することにより作られたアシドモナスAcidomonas属などの、このセクションにおいて以前に分類されたが、もはやそうではないグループを含む。加えて、宿主は、シュードモナス属からの細胞、すなわちそれぞれアルテロモナスハロプランクティスAlteromonashaloplanktis、アルテロモナスニグリファシエンスAlteromonasnigrifaciens及びアルテロモナスプトレファシエンスAlteromonasputrefaciensとして再分類された、シュードモナスエナリアenaliaATCC14393、シュードモナスニグリファシエンスnigrifaciensiATCC19375及びシュードモナスプトレファシエンスATCC8071を含み得る。同様に、例えば、シュードモナスアシドボランスATCC15668及びシュードモナステストステロニATCC11996は、その後コマモナスアシドボランス及びコマモナステストステローニとしてそれぞれ再分類され;また、シュードモナスニグリファシエンスPseudomonasnigrifaciensATCC19375及びシュードモナスピスキキダPseudomonaspiscicidaATCC15057は、それぞれシュードアルテロモナスニグリファシエンスPseudoalteromonasnigrifaciens及びシュードアルテロモナスピスキキダPseudoalteromonaspiscicidaとして再分類された。グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1はまた、以下の科のいずれかに属すると分類されるプロテオバクテリアを含む:シュードモナス科、アゾトバクター科現在はしばしば、シュードモナス科のアゾトバクター群という同義語で呼ばれる、リゾビウム科及びメチロモナス科現在はしばしばメチロコッカスという同義語で呼ばれる。従って、本明細書に記載のそれらの属に加えて、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ1内の他の場合には本明細書に記載されている、更なるプロテオバクテリア属は、以下のものを含む:1アゾリゾフィルスAzorhizophilus属のアゾトバクター群細菌;2セルビブリオ、オリゲラOligella及びテレディニバクターTeredinibacter属のシュードモナス科細菌;3ケラトバクターChelatobacter、エンシファーEnsifer、リベリバクターLiberibacterカンジダリベリバクターCandidatusLiberibacterとも呼ばれる、及びシノリゾビウムSinorhizobium属のリゾビウム科細菌;及び4メチロバクターMethylobacter、メチロカルダムMethylocaldum、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロサルシナMethylosarcina及びメチロスフェラMethylosphaera属のメチロコッカス科細菌。宿主細胞はグラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16から選択され得る。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ16は、以下のシュードモナス種ATCC又は典型的な株の他の寄託番号を括弧内に示すのプロテオバクテリアのグループとして定義される:シュードモナスアビエタニフィラabietaniphilaATCC700689;シュードモナスエルジノーサaeruginosaATCC10145;シュードモナスアルカリゲネスalcaligenesATCC14909;シュードモナスアンギリセプチカanguillisepticaATCC33660;シュードモナスシトロネロリスcitronellolisATCC13674;シュードモナスフラベセンスflavescensATCC51555;シュードモナスメンドシナmendocinaATCC25411;シュードモナスニトロレデュセンスnitroreducensATCC33634;シュードモナスオレオボランスATCC8062;シュードモナスシュードアルカリゲネスpseudoalcaligenesATCC17440;シュードモナスレジノボランスresinovoransATCC14235;シュードモナスストラミネアstramineaATCC33636;シュードモナスアガリシagariciATCC25941;シュードモナスアルカリフィラalcaliphila;シュードモナスアルギノボラalginovora;シュードモナスアンデルソニイandersonii;シュードモナスアスプレニイaspleniiATCC23835;シュードモナスアゼライカazelaicaATCC27162;シュードモナスベイジェリンキイbeyerinckiiATCC19372;シュードモナスボレアリスborealis;シュードモナスボレオポリスboreopolisATCC33662;シュードモナスブラシカセラムbrassicacearum;シュードモナスブタノボラbutanovoraATCC43655;シュードモナスセルロサcellulosaATCC55703;シュードモナスアウランチアカaurantiacaATCC33663;シュードモナスクロロラフィスchlororaphisATCC9446、ATCC13985、ATCC17418、ATCC17461;シュードモナスフラジfragiATCC4973;シュードモナスルンデンシスlundensisATCC49968;シュードモナスタエトロレンスtaetrolensATCC4683;シュードモナスシシコーラcissicolaATCC33616;シュードモナスコロナファシエンスcoronafaciens;シュードモナスジテルペニフィラditerpeniphila;シュードモナスエロンガータelongataATCC10144;シュードモナスフレクテンスflectensATCC12775;シュードモナスアゾトフォルマンスazotoformans;シュードモナスブレンネリbrenneri;シュードモナスセドレラcedrella;シュードモナスコルガータcorrugataATCC29736;シュードモナスエクストレモリエンタリスextremorientali;シュードモナスフルオレッセンスATCC35858;シュードモナスゲサルディイgessardii;シュードモナスリバネンシスlibanensis;シュードモナスマンデリイmandeliiATCC700871;シュードモナスマージナリスmarginalisATCC10844;シュードモナスミグラエmigulae;シュードモナスムシドレンスmucidolensATCC4685;シュードモナスオリエンタリスorientalis;シュードモナスローデシアエrhodesiae;シュードモナスシンクサンタsynxanthaATCC9890;シュードモナストラアシイtolaasiiATCC33618;シュードモナスベロニイveroniiATCC700474;シュードモナスフレデリクスベルゲンシスfrederiksbergensis;シュードモナスゲニクラタgeniculataATCC19374;シュードモナスギンゲリgingeri;シュードモナスシュードモナスグラミニスgraminis;シュードモナスグリモンティgrimontii;シュードモナスハロデニトリフィカンスhalodenitrificans;シュードモナスハロフィラhalophila;シュードモナスヒビシコラhibiscicolaATCC19867;シュードモナスヒュッチエンシスhuttiensisATCC14670;シュードモナスヒドロゲノボラhydrogenovora;シュードモナスジェッセニイjesseniiATCC700870;シュードモナスキロネンシスkilonensis;シュードモナスランセオラタlanceolataATCC14669;シュードモナスリニlini;シュードモナスマルギナタmarginataATCC25417;シュードモナスメフィチカmephiticaATCC33665;シュードモナスデニトリフィカンスdenitrificansATCC19244;シュードモナスペルツシノゲナpertucinogenaATCC190;シュードモナスピクトラムpictorumATCC23328;シュードモナスサイクロフィラpsychrophila;シュードモナスフィルバfilvaATCC31418;シュードモナスモンテイリイmonteiliiATCC700476;シュードモナスモッセリイmosselii;シュードモナスオリジハビタンスoryzihabitansATCC43272;シュードモナスプレコグロシシダplecoglossicidaATCC700383;シュードモナスプチダputidaATCC12633;シュードモナスレアクタンスreactans;シュードモナススピノサspinosaATCC14606;シュードモナスバレアリカbalearica;シュードモナスルテオラluteolaATCC43273;シュードモナススタッツェリstutzeriATCC17588;シュードモナスアミグダリamygdaliATCC33614;シュードモナスアベラナエavellanaeATCC700331;シュードモナスカリカパパヤエcaricapapayaeATCC33615;シュードモナスシコリーcichoriiATCC10857;シュードモナスフィクセレクタエficuserectaeATCC35104;シュードモナスフソコバギナエfuscovaginae;シュードモナスメリアエmeliaeATCC33050;シュードモナスシリンゲsyringaeATCC19310;シュードモナスビリジフラバviridiflavaATCC13223;シュードモナスサーモカルボキシドボランスthermocarboxydovoransATCC35961;シュードモナスサーモトレランスthermotolerans;シュードモナスチベルバレンシスthivervalensis;シュードモナスバンコウベレンシスvancouverensisATCC700688;シュードモナスウィスコンシネンシスwisconsinensis;及びシュードモナスキアメンシスxiamenensis。1つの実施形態において、宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。宿主細胞はまた、グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17から選択され得る。グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ17は、例えば、以下のシュードモナス種に属するものを含む蛍光性シュードモナス菌として当該技術分野で既知のプロテオバクテリアのグループとして定義される:シュードモナスアゾトフォルマンスazotoformans;シュードモナスブレンネリbrenneri;シュードモナスセドレラcedrella;シュードモナスコルガータcorrugata;シュードモナスエクストレモリエンタリスextremorientalis;シュードモナスフルオレッセンスfluorescens;シュードモナスゲサルディイgessardii;シュードモナスリバネンシスlibanensis;シュードモナスマンデリイmandelii;シュードモナスマージナリスmarginalis;シュードモナスミグラエmigulae;シュードモナスムシドレンスmucidolens;シュードモナスオリエンタリスorientalis;シュードモナスローデシアエrhodesiae;シュードモナスシンクサンタsynxantha;シュードモナストラアシイtolaasii;及びシュードモナスベロニイveronii。実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は、HslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2、AprA、又はそれらの組み合わせの発現を欠く。実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼHslU、HslV、Prc1、DegP1、DegP2及びAprAを欠き、DegP2S219Aを過剰発現する。そのような菌株の一例は、宿主菌株2のように本明細書に開示される。これらプロテアーゼは、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許出願公報第2006/0110747号に記載される。AprA、細胞外のセラリシンserralysin型メタロプロテアーゼメタロプロテイナーゼは、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Maunsell,etal.,2006,ComplexregulationofAprAmetalloproteaseinPseudomonasfluorescensM114:evidencefortheinvolvementofiron,theECFsigmafactor,PbrAandpseudobactinM114siderophore,Microbiology152Pt1:29-42に、及び米国特許出願公報第2008/0193974号及び第2010/0048864号に記載される。他の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は、DsbA、DsbB、DsbC、及びDsbDを過剰発現する。DsbA、B、C及びDは、ジスルフィド結合イソメラーゼであり、例えば、米国特許出願公報第2008/0269070号及び米国特許出願第12/610,207号に記載される。他の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は野生型であり、すなわち、プロテアーゼ発現の不足が全く無く、任意のフォールディングモジュレータを過剰発現しない。プロテアーゼの発現を欠く宿主細胞は、野生型の宿主に関するそのプロテアーゼの正常な活性又は発現レベルの減少をもたらす、任意の修正を有し得る。例えば、ミスセンス変異又はナンセンス変異は、活性ではないタンパク質の発現に通じ得、遺伝子欠失はタンパク質発現を全くもたらすことができない。遺伝子のアップストリームの制御領域の変化は、タンパク質発現の減少をもたらす、又は全くタンパク質発現をもたらすことができない。他の遺伝子欠乏は、タンパク質の翻訳に影響を与え得る。プロテアーゼの処理に必要とされるタンパク質の活性が不完全な場合、プロテアーゼの発現はまた、不完全となり得る。本発明の方法に役立つ、プロテアーゼ及びフォールディングモジュレータの例は、表6及び7にそれぞれ示される。RXF番号は読取枠を指す。例えば、米国特許出願公報第2008/0269070号及び米国特許出願第12/610,207号を参照。特定のプロテアーゼは、プロテアーゼ及びシャペロン様の活性の両方を有し得る。これらプロテアーゼが、タンパク質収量及び/又は品質に対し負に影響を及ぼすとき、プロテアーゼを欠失させるのに役立ち、プロテアーゼのシャペロン活性がタンパク質収量及び/又は品質に対し陽性に影響を及ぼし得るとき、それらが過剰発現され得る。これらプロテアーゼは、以下のものを含むが、これらに限定されない:Hsp100Clp/HslファミリーメンバーRXF04587.1clpA、RXF08347.1、RXF04654.2clpX、RXF04663.1、RXF01957.2hslU、RXF01961.2hslV;ペプチジル-プロリルシス-トランスイソメラーゼファミリーメンバーRXF05345.2ppiB;メタロペプチダーゼM20ファミリーメンバーRXF04892.1アミヒドロラーゼ;メタロペプチダーゼM24ファミリーメンバーRXF04693.1メチオニンアミノペプチダーゼ及びRXF03364.1メチオニンアミノペプチダーゼ;及びセリンペプチダーゼS26シグナルペプチターゼIファミリーメンバーRXF01181.1シグナルペプチターゼ。高スループットスクリーン幾つかの実施形態において、高スループットスクリーンは、可溶性の組み換え型毒素タンパク質を発現するための最適条件を決定するために行われ得る。スクリーンにおいて変えられる条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景例えば、異なるプロテアーゼの欠失、発現構築物におけるプロモータのタイプ、組換え型タンパク質をコード化する配列に融合される分泌リーダー、成長温度、誘導可能なプロモータが使用される際の誘発時のOD、lacZプロモータが使用される時の誘発に使用されたIPTGの濃度、タンパク質誘発の持続時間、培養への誘発剤の追加後の成長温度、培養の撹拌の割合、プラスミド維持のための選択法、血管における培養の量、及び細胞を溶解する方法を含む。幾つかの実施形態において、宿主菌株のライブラリあるいはアレイが提供され、ここで、ライブラリにおける各菌株又は宿主細胞の個体群は、宿主細胞における1つ以上の標的遺伝子の発現を調節するために遺伝子組み換えが行われた。最適な宿主菌株又は最適な発現系は、アレイにおける表現型で異なる宿主細胞の他の個体群と比較される、対象の発現されたタンパク質の量、品質、及び/又は位置に基づいて、同定され得る又は選択され得る。したがって、最適な宿主菌株は、所望の明細書に従って対象のポリペプチドを生成する菌株である。所望の明細書が生成されているポリペプチドに依存して変わる一方で、明細書は、タンパク質の品質及び/又は量、例えば、タンパク質が隔離される又は分泌されるかどうか、及びどれくらいの量で、タンパク質が適切に又は望ましいように修飾されるprocessed及び/又は折り畳まれるかどうかを含む。実施形態において、改善された又は望ましい品質は、分泌リーダーの高忠実度開裂及び低レベルの分解での毒素タンパク質の生成であり得る。実施形態において、最適な宿主菌株又は最適な発現系は、可溶性の異種のタンパク質の量又は含量amountorquantity、復元可能な異種のタンパク質の量又は含量、適切に処理された異種のタンパク質の量又は含量、適切に折り重ねられた異種のタンパク質の量又は含量、活性の異種のタンパク質の量又は含量、及び/又は特定の絶対レベル又は一定の指示菌株、すなわち、比較に使用された菌株によって生成されたものに関連する特定のレベルの異種のタンパク質の量又は含量によって特徴づけられる、収量を生成する。異種のタンパク質の発現における改善された収量及び/又は品質により菌株を同定するために微生物の宿主をスクリーンする方法は、例えば、米国特許出願公報第20080269070号に記載される。発酵様式本発明による発現系は、任意の発酵様式fermentationformatにおいて培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地及び無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地又は無機塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、スクロース、又はグリセロールなどの炭素源からなる。無機塩培地の例は、例えば、M9培地、シュードモナス培地ATCC179、及びDavis-Mingioli培地BDDavisESMingioli1950J.Bact.60:17-28を参照を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム、及び鉄、銅、マンガン及び亜鉛の塩化カルシウム、ホウ酸塩及び硫酸塩などの微量金属の中から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸又は酵母抽出物など有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、気体のアンモニアの中から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコース又はグリセロールを含むであろう。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン又は他の成分で補われ得、もっとも、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。培地は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第2006/0040352号に記載され、それは、上に引用され、引用により組み込まれる。本発明の方法において有用な培養手順及び無機塩培地の詳細は、Riesenberg,Detal.,1991,HighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrate,J.Biotechnol.201:17-27によって記載される。実施形態において、生成はバイオリアクター培養において達成され得る。培養は、例えば無機塩培地を含む2リットルまでのバイオリアクターにおいて成長し、アンモニアの追加により32°C及びpH6.5に維持され得る。溶解された酸素は、発酵槽へ散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持され得る。過剰なレベルを維持するため、グリセロールは発光の間中培養に送達され得る。実施形態において、これら条件は、標的培養細胞濁度density、例えば、575nmA575での光学濁度が達するまで、すなわち標的タンパク質生成を開始するためにIPTGが加えられる時点で、維持される。誘発時の細胞密度、IPTGの濃度、pH及び温度は、発現のための最適条件を決定するために各々変えられ得ることが理解される。実施形態において、誘発時の細胞密度は、A575の40から200までの吸光度単位AUで変えられ得る。IPTG濃度は、0.02から1.0mMまでの範囲、6から7.5までのpH、及び20から35°C°までの温度において変えられ得る。16-24時間後、各々のバイオリアクターからの培養は、遠心分離、及び80°Cで冷凍された細胞ペレットによって採取され得る。その後、サンプルは、例えば、生成物形成のためのSDS-CGEによって分析され得る。発酵は任意の規模で行なわれ得る。本発明による発現系は、任意の規模での組換え型タンパク質発現に役立つ。したがって、例えば、マイクロリットル規模、ミリリットル規模、センチリットル規模、及びデシリットル規模の発酵容量が使用され得、1リットルの規模及びそれより大きな発酵容量が使用され得る。実施形態において、発酵容量は約1リットル、又はそれ以上である。実施形態において、発酵容量は、約1リットル乃至約100リットルである。実施形態において、発酵容量は、約1リットル、約2リットル、約3リットル、約4リットル、約5リットル、約6リットル、約7リットル、約8リットル、約9リットル、又は約10リットルである。実施形態において、発酵容量は、約1リットル乃至約5リットル、約1リットル乃至約10リットル、約1リットル乃至約25リットル、約1リットル乃至約50リットル、約1リットル乃至約75リットル、約10リットル乃至約25リットル、約25リットル乃至約50リットル、又は約50リットル乃至約100リットルである。他の実施形態において、発酵容量は、5リットル又はそれ以上、10リットル又はそれ以上、15リットル又はそれ以上、20リットル又はそれ以上、25リットル又はそれ以上、50リットル又はそれ以上、75リットル又はそれ以上、100リットル又はそれ以上、200リットル又はそれ以上、500リットル又はそれ以上、1,000リットル又はそれ以上、2,000リットル又はそれ以上、5,000リットル又はそれ以上、10,000リットル又はそれ以上、又は50,000リットル又はそれ以上である。細菌増殖条件提供される本発明の方法に役立つ増殖条件は、約4°C乃至約42°Cの温度、及び約5.7乃至約8.8のpHを含み得る。lacZプロモータを有する発現構築物が使用されるとき、発現は、約0.01mM乃至約1.0mMの終末濃度で培養にIPTGを加えることにより誘発され得る。培養のpHは、当業者には既知のpHバッファ及び方法を使用して維持され得る。培養中のpHの制御はまた、アンモニア水を使用して達成され得る。実施形態において、培養のpHは、約5.7乃至約8.8である。特定の実施形態において、pHは、約5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、又は8.8である。他の実施形態において、pHは、約5.7乃至5.9、5.8乃至6.0、5.9乃至6.1、6.0乃至6.2、6.1乃至6.3、6.2乃至6.5、6.4乃至6.7、6.5乃至6.8、6.6乃至6.9、6.7乃至7.0、6.8乃至7.1、6.9乃至7.2、7.0乃至7.3、7.1乃至7.4、7.2乃至7.5、7.3乃至7.6、7.4乃至7.7、7.5乃至7.8、7.6乃至7.9、7.7乃至8.0、7.8乃至8.1、7.9乃至8.2、8.0乃至8.3、8.1乃至8.4、8.2乃至8.5、8.3乃至8.6、8.4乃至8.7、又は8.5乃至8.8である。また他の実施形態において、pHは、約5.7乃至6.0、5.8乃至6.1、5.9乃至6.2、6.0乃至6.3、6.1乃至6.4、又は6.2乃至6.5である。特定の実施形態において、pHは、約5.7乃至約6.25である。実施形態において、成長温度は約4°C乃至約42°Cに維持される。特定の実施形態において、成長温度は、約4°C、約5°C、約6°C、約7°C、約8°C、約9°C、約10°C、約11°C、約12°C、約13°C、約14°C、約15°C、約16°C、約17°C、約18°C、約19°C、約20°C、約21°C、約22°C、約23°C、約24°C、約25°C、約26°C、約27°C、約28°C、約29°C、約30°C、約31°C、約32°C、約33°C、約34°C、約35°C、約36°C、約37°C、約38°C、約39°C、約40°C、約41°C、又は約42°Cである。他の実施形態において、成長温度は、約25°C乃至約27°C、約25°C乃至約28°C、約25°C乃至約29°C、約25°C乃至約30°C、約25°C乃至約31°C、約25°C乃至約32°C、約25°C乃至約33°C、約26°C乃至約28°C、約26°C乃至約29°C、約26°C乃至約30°C、約26°C乃至約31°C、約26°C乃至約32°C、約27°C乃至約29°C、約27°C乃至約30°C、約27°C乃至約31°C、約27°C乃至約32°C、約26°C乃至約33°C、約28°C乃至約30°C、約28°C乃至約31°C、約28°C乃至約32°C、約29°C乃至約31°C、約29°C乃至約32°C、約29°C乃至約33°C、約30°C乃至約32°C、約30°C乃至約33°C、約31°C乃至約33°C、約31°C乃至約32°C、約30°C乃至約33°C、又は約32°C乃至約33°Cに維持される。他の実施形態において、温度は培養中に変化する。1つの実施形態において、構築物、例えばIPTGから発現を誘発する薬剤が培養に加えられる前に、温度は約30°Cに維持される。誘発薬剤を加えた後に、温度は約25°Cに下げられる。誘発本明細書に別記されるように、誘導可能なプロモータは、組み換え型毒素タンパク質、例えばlacプロモータの発現を制御するため発現構築物において使用され得る。lacプロモータ誘導体又はファミリーメンバー、例えばtacプロモータの場合、エフェクター化合物は、IPTGのような無償性誘導物質イソプロピルチオガラクトシドとも呼ばれる、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドなどの、誘発因子である。実施形態において、lacプロモータ誘導体が使用され、細胞密度が約80乃至約160のOD575によって同定されたレベルに達したとき、組換え型タンパク質発現は、約0.01mM乃至約1.0mMの終末濃度にIPTGを加えることによって誘発される。実施形態において、組換え型タンパク質のための培養誘発の時間でのOD575は、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180であり得る。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約100、約100乃至約120、約120乃至約140、約140乃至約160である。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約120、約100乃至約140、又は約120乃至約160である。他の実施形態において、OD575は、約80乃至約140、又は約100乃至160である。細胞密度は、他の方法によって測定され得、他の単位、例えば1つの単位体積当たりの細胞において発現され得る。例えば、シュードモナスフルオレッセンス培養の約80乃至約160のOD575は、mL当たりおよそ8×1010乃至約1.6×1011のコロニー形成単位又は35乃至70g/lの乾燥菌体重量に等しい。実施形態において、培養誘発の時間での細胞密度は、細胞密度又は測定の単位を決定するために使用される方法にかかわらず、OD575での吸光度によって本明細書に特定されるような細胞密度に等しい。当業者の1人は、任意の細胞培養のために適切な転換を行う方法を知っているだろう。実施形態において、培養の最終のIPTG濃度は、約0.01mM、約0.02mM、約0.03mM、約0.04mM、約0.05mM、約0.06mM、約0.07mM、約0.08mM、約0.09mM、約0.1mM、約0.2mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.5mM、約0.6mM、約0.7mM、約0.8mM、約0.9mM、又は約1mMである。他の実施形態において、培養の最終のIPTG濃度は、約0.08mM乃至約0.1mM、約.1mM乃至約0.2mM、約.2mM乃至約0.3mM、約.3mM乃至約0.4mM、に対する約.2mM乃至約0.4mM、約0.08乃至約0.2mM、又は約0.1乃至1mMである。非lacプロモータが使用される実施形態において、本明細書及び文献に記載されるように、他の誘発因子又はエフェクターが使用され得る。1つの実施形態において、プロモータは、構成的なプロモータである。薬剤を加えて誘発した後、培養は、期間、例えば約24時間、組換え型タンパク質が発現される時間の間、成長し得る。誘発剤を加えた後、培養は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約13時間、約14時間、約15時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、約24時間、約36時間、又は約48時間成長し得る。誘発剤が培養に加えられた後、培養は、約1乃至48時間、約1乃至24時間、約10乃至24時間、約15乃至24時間、又は約20乃至24時間成長し得る。細胞培養は、遠心分離、及び後の溶解手順のため適切なバッファ又は溶液において再懸濁される培養ペレットによって濃縮され得る。実施形態において、細胞は、高圧機械細胞分裂のための装置市販で利用可能であり、例えば、MicrofluidicsMicrofluidizer、ConstantCellDisruptor、Niro-Soavihomogenizer、APV-Gaulinhomogenizerを使用して分裂される。組換え型タンパク質を発現する細胞は、例えば音波処理を使用して、分裂され得る。細胞を溶解するための当該技術分野で既知の任意の適切な方法は、可溶性画分を放出するために使用され得る。例えば、実施形態において、細胞膜溶解酵素及びEDTAなどの、化学物質及び/又は酵素の溶解試薬が使用され得る。凍結された培養又は以前に保管された培養の使用はまた、本発明の方法において熟慮される。培養は溶解前にOD標準化することができる。例えば、細胞は、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、又は約20のOD600に標準化され得る。遠心分離は、任意の適切な技術及び方法を使用して実行され得る。不溶性画分から可溶性画分を分離する目的のための細胞培養又は溶解産物の遠心分離は、当該技術分野において周知である。例えば、溶解された細胞は、20分間の20,800×gで4°Cで遠心分離され、及び上清は、手動又は自動化液体処理を使用して除去される。ペレット不溶性画分は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水PBS、pH7.4において再懸濁される。再懸濁は、例えば、オーバーヘッドミキサー、磁気撹拌棒、ロッキングシェーカーに接続された羽根車などの装置を使用して実行され得る。可溶性画分、すなわち、溶解産物の遠心分離後に得られた可溶性の上清、及び不溶性画分、すなわち、溶解産物の遠心分離後に得られたペレットは、培養を溶解し、遠心分離することにより結果として生じる。これらの2つの画分はまた、それぞれ、第1の可溶性画分及び第1の不溶性画分と称され得る。生成物の評価多数のアッセイ方法は、タンパク質を特徴づけるための当該技術分野において既知である。組み換え型毒素タンパク質の収量又は品質を特徴づけるための任意の適切な方法の使用は、本明細書で熟慮される。タンパク質の収量本明細書に記載のような任意の精製画分におけるタンパク質の収量は、当業者に既知の方法、例えば、毛細管のゲル電気泳動法CGE及びウェスタンブロット解析によって決定され得る。本明細書に記載され、当該技術分野で既知の活性アッセイはまた、タンパク質の収量に関する情報を提供し得る。実施形態において、これらの方法又は当該技術分野で既知の他の方法は、タンパク質の適切な処理、例えば、適切な分泌リーダー開裂を評価するために使用される。タンパク質の収量の有用な測定は、例えば、培養量あたりの組換え型タンパク質の量例えば、タンパク質のグラム又はミリグラム/培養のリットル、細胞溶解後に得られる不溶性のペレットにおいて測定された組換え型タンパク質のパーセント又は画分例えば、抽出上清における組み換え型のタンパク質の量/不溶性の画分におけるタンパク質、活性タンパク質のパーセント又は画分例えば、活性タンパク質の量/アッセイに使用されるタンパク質の量、合計の細胞タンパク質tcpのパーセント又は画分、タンパク質/細胞の量、及び乾燥したバイオマスのパーセント又は比率を含む。実施形態において、本明細書に記載のようなタンパク質の収量の測定は、得られる可溶性のタンパク質の量又は活性タンパク質の量、又はその両方に基づく。収量が培養量に関して発現される実施形態において、培養細胞密度は、特に異なる培養間の収量が比較されているとき、考慮され得る。実施形態において、本発明の方法は、1リットル当たり約0.2グラムから1リットル当たり約12グラムまでの、可溶性の及び/又は活性な及び/又は適切に処理された例えば、適切に分泌リーダーを開裂した組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の収量を得るために使用され得る。実施形態において、収量は、1リットル当たり約0.5グラムから1リットル当たり約12グラムまでである。特定の実施形態において、組換え型タンパク質又はサブユニットタンパク質の収量は、約0.2g/L、約0.3g/L、約0.4g/L、約0.5g/L、約0.6g/L、約0.7g/L、約0.8g/L、約0.9g/L、約1g/L、約1.5g/L、約2g/L、約2.5g/L、約3g/L、約3.5g/L、約4g/L、約4.5g/L、約5g/L、約5.5g/L、約6g/L、約6.5g/L、約7g/L、約7.5g/L、約8g/L、約8.5g/L、約9g/L、約9.5g/L、約10g/L、約10.5g/L、約11g/L、約12g/L、約0.2g/L乃至約0.5g/L、約0.2乃至約1g/L、約0.2g/L乃至約2g/L、約0.3g/L乃至約0.6g/L、約0.3g/L乃至約1g/L、約0.3乃至約2g/L、約0.4乃至約0.7g/L、約0.4乃至約1g/L、約0.4乃至約2g/L、約0.4乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約1g/L、約0.5g/L乃至約1g/L、約0.5g/L乃至約2g/L、約0.5g/L乃至約3g/L、約0.5g/L乃至約4g/L、約0.5g/L乃至約5g/L、約0.5g/L乃至約6g/L、約0.5g/L乃至約7g/L、約0.5g/L乃至約8g/L、約0.5g/L乃至約9g/L、約0.5g/L乃至約10g/L、約0.5g/L乃至約11g/L、約0.5g/L乃至約12g/L、約1g/L乃至約2g/L、約1g/L乃至約3g/L、約1g/L乃至約4g/L、約1g/L乃至約5g/L、約1g/L乃至約6g/L、約1g/L乃至約7g/L、約1g/L乃至約8g/L、約1g/L乃至約9g/L、約1g/L乃至約10g/L、約1g/L乃至約11g/L、約1g/L乃至約12g/L、約2g/L乃至約3g/L、約2g/L乃至約4g/L、約2g/L乃至約5g/L、約2g/L乃至約6g/L、約2g/L乃至約7g/L、約2g/L乃至約8g/L、約2g/L乃至約9g/L、約2g/L乃至約10g/L、約2g/L乃至約11g/L、約2g/L乃至約12g/L、約3g/L乃至約4g/L、約3g/L乃至約5g/L、約3g/L乃至約6g/L、約3g/L乃至約7g/L、約3g/L乃至約8g/L、約3g/L乃至約9g/L、約3g/L乃至約10g/L、約3g/L乃至約11g/L、約3g/L乃至約12g/L、約4g/L乃至約5g/L、約4g/L乃至約6g/L、約4g/L乃至約7g/L、約4g/L乃至約8g/L、約4g/L乃至約9g/L、約4g/L乃至約10g/L、約4g/L乃至約11g/L、約4g/L乃至約12g/L、約5g/L乃至約6g/L、約5g/L乃至約7g/L、約5g/L乃至約8g/L、約5g/L乃至約9g/L、約5g/L乃至約10g/L、約5g/L乃至約11g/L、約5g/L乃至約12g/L、約6g/L乃至約7g/L、約6g/L乃至約8g/L、約6g/L乃至約9g/L、約6g/L乃至約10g/L、約6g/L乃至約11g/L、約6g/L乃至約12g/L、約7g/L乃至約8g/L、約7g/L乃至約9g/L、約7g/L乃至約10g/L、約7g/L乃至約11g/L、約7g/L乃至約12g/L、約8g/L乃至約9g/L、約8g/L乃至約10g/L、約8g/L乃至約11g/L、約8g/L乃至約12g/L、約9g/L乃至約10g/L、約9g/L乃至約11g/L、約9g/L乃至約12g/L、約10g/L乃至約11g/L、約10g/L乃至約12g/L、又は約11g/L乃至約12g/Lである。実施形態において、生成された組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約1乃至75である。特定の実施形態において、生成された毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約1、約2、約3、約4、約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約1乃至約5、約1乃至約10、約1乃至約20、約1乃至約30、約1乃至約40、約1乃至約50、約1乃至約60、約1乃至約75、約2乃至約5、約2乃至約10、約2乃至約20、約2乃至約30、約2乃至約40、約2乃至約50、約2乃至約60、約2乃至約75、約3乃至約5、約3乃至約10、約3乃至約20、約3乃至約30、約3乃至約40、約3乃至約50、約3乃至約60、約3乃至約75、約4乃至約10、約4乃至約20、約4乃至約30、約4乃至約40、約4乃至約50、約4乃至約60、約4乃至約75、約5乃至約10、約5乃至約20、約5乃至約30、乃至約5~約40、乃至約5乃至約50、約5乃至約60、約5乃至約75、約10乃至約20、約10乃至約30、約10乃至約40、約10乃至約50、約10乃至約60、約10乃至約75、約20乃至約30、約20乃至約40、約20乃至約50、約20乃至約60、約20乃至約75、約30乃至約40、約30乃至約50、約30乃至約60、約30乃至約75、約40乃至約50、約40乃至約60、約40乃至約75、約50乃至約60、約50乃至約75、約60乃至約75、又は約70乃至約75である。特定の実施形態において、複数のタンパク質は同じ宿主細胞から生成される。例えば、実施形態において、百日咳毒素の全部で5つのサブユニットは、単一の培養で成長した同じ宿主細胞から作られる。そのような実施形態において、観察された濃度、の合計の細胞タンパク質又は活性は、個々の毒素サブユニットに関する、又は共に得られたすべてのサブユニットに関するものである。すなわち、実施形態において、本発明の方法は、1リットル当たり約1グラムから1リットル当たり約12グラムの、百日咳毒素タンパク質のS1、S2、S3、S4、又はS5サブユニットの収量を得るために使用される。実施形態において、生成されたS1、S2、S3、S4、又はS5サブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の1乃至75である。あるいは、本発明の方法は、1リットル当たり約1グラムから1リットル当たり約12グラムの、S1、S2、S3、S4、及びS5サブユニットタンパク質の収量を得るために使用される。実施形態において、生成されたS1、S2、S3、S4、及びS5サブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の1乃至75である。特定の実施形態において、得られた各サブユニットの量は、1リットル当たりのグラム又はの合計の細胞タンパク質において、ほぼ同じである。タンパク質の溶解度及び活性は、品質に関連するが、異なる手段によって一般に決定される。タンパク質の溶解度、特に疎水性タンパク質は、典型的にはタンパク質の折り畳み構造に関係がある;不溶性は、疎水性アミノ酸残留物が折り重ねられたタンパク質の外側に不適当に位置付けられることを示す。方法、例えば下記のものを使用して評価されたタンパク質活性は、適切なタンパク質立体配座の別の指標である。本明細書に使用されるように、可溶性の、活性な、又はその両方又は可溶性の及び/又は活性なは、当業者に既知の及び本明細書に記載の方法により、可溶性、活性、又は可溶性及び活性の両方であると決定されるタンパク質を指す。与えられたタンパク質の活性は、結合活性、例えば、受容体、特異抗体、又は別の既知の基質に結合することにより、又は関連する場合の酵素活性によって表わされるものを含む。活性レベルは、例えば、標準又は対照サンプルの、又は引用として使用される任意のサンプルの活性と比較されるときのように、絶対項又は相対語において記載され得る。毒素を評価するための活性アッセイは、当該技術分野で既知であり、文献に記載される。活性アッセイは、免疫学又は抗体結合アッセイ、例えば、ウェスタンブロット解析及びELISA、同様に受容体結合アッセイを含み、例えば、CRM197はジフテリア毒素受容体proHB-EGF結合アッセイによって評価され得る。これらのアッセイに役立つ抗体は、市販で入手可能である。活性アッセイはまた酵素活性アッセイを含む。野生型のDTは、当該技術分野で既知の、緑膿菌外毒素Aに関して本明細書に別記された方法を使用して、免疫学的に、及びADPリボシル化活性によってアッセイされ得る。例えば、CTBのウェスタンブロット解析は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,140,082号、ExpressionofGeneProductsfromGeneticallyManipulatedStrainsofBordetellaに記載されるように実行され得る。この特許は、ボルデテラにおけるCTBの発現を記載する。培養上清からのタンパク質は、SDS-PAGEによって分解され、又はCTB五量体をモノマーの形態に変換するために分解される前に沸騰された。タンパク質は、ナイロン細胞膜上に伝送され、ヤギ抗コレラゲノイドIgG抗体抗CTB、ListBiologicalsGAC-01Cにより調べた。検出は、発掘作業化学発光digchemiluminescenceBoehringerMannheimを使用して、アルカリフォスファターゼにより結合されたロバ抗ヤギIgGにより行なわれた。CTAとCTBの両方を含むコレラ毒素標準Sigmaは、比較に使用された。PTXのウェスタンブロット解析は、例えば、実施例において本明細書に記載されるように、市販の抗体を使用して実行され得る。モノクローナル抗体は、例えば、Abcam,Cambridge,MAから利用可能である。破傷風毒素Cフラグメントは、ウェスタンブロット解析、又は引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,443,966号、ExpressionoftetanustoxinfragmentCに記載されるようなELISAによって評価され得る。抗体は、複数の商業的供給源、例えば、Abcam,Cambridge,MAから利用可能である。TcdB活性は、当該技術分野に記載されているような、ウェスタンブロット又は他の検出分析によって評価され得る。酵素活性は、例えば、当該技術分野、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,226,597号に記載のグリコシヒドロラーゼ/グリコシル化アッセイ方法を使用して、分析され得る。具体的には、グルコシル化反応は、50mMのn-2ヒドロキシエチルピペラジン-n’-2-エタンスルホン酸、100mMのKCl、1mMのMnCl2、1mMのMgCl2、100μg/mlのBSA、0.2mMのGDP、40μMの[14C]UDP-グルコース303Ci/mol;ICNPharmaceuticals、100μMのUDP-グルコース及び3pmolのTcdB又は10pmolの各々の融合タンパク質を含む反応混合において実行され得る。アッセイは、37°Cで一晩インキュベートすることを許容され、切断されたグルコースは、AG1-X2陰イオン交換レジンを使用して分離し、液体シンチレーション計数器で数えられる。緑膿菌外毒素Aの活性は、免疫学の方法、例えばウェスタンブロット解析を使用して評価され得る。ETAがADPリボシル化毒素であるため、それは、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,892,827号に記載されるような、ADPリボシル化活性のためにアッセイされ得る。具体的には、ラビット網状赤血球調製又は伸長因子2EF-2により濃縮されたコムギ麦芽抽出物は、EF-2の源として使用される。アッセイ500μlの全容積は、約10pmoleのEF-2、37pmoleの14C-NAD0.06μCi、0.25乃至1.25μgのETA及びバッファ40mMのDTT、1mMのEDTA、及び50mMのトリス、pH8.1を含む。活性は、30分でEF-2に伝送されたNADのpmolesとして測定される。PEの既知の濃度の標準曲線は確立され、大腸菌からの抽出液におけるPEの活性を測定するために使用される。37°Cで30分のインキュベーション後、0.5mlの12のTCAは、各々のアッセイ混合物に加えられる。その後、アッセイ混合物は15分間氷浴に配置され、その後、10分間、3,000xg、4°Cで遠心分離を行った。ペレットは、1mlの6のTCAで洗浄され、上述のように遠心分離される。その後、ペレットはADPリボシル化活性の指数として、液体シンチレーション計数器において14C放射活性のために測定される。それ故、活性の測定は、例えば、抗体又は受容体の結合能力、基質の結合能力カラム材料に関する、又は酵素活性を表し得る。実施形態において、活性は、アッセイされる総量と比較して、抽出した上清における活性組み換え型毒素タンパク質によって表わされる。これは、アッセイにおいて使用される組み換え型毒素タンパク質の総量に関連するアッセイによって活性であると決定された、組み換え型毒素タンパク質の量に基づく。他の実施形態において、活性は、標準の、例えば自然のタンパク質と比較して、タンパク質の活性レベルによって表わされる。これは、標準サンプルにおける活性タンパク質の量に関連する、上清抽出液サンプルにおける、活性組み換え型毒素タンパク質の量に基づくここで、各々のサンプルから同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用される。実施形態において、毒素タンパク質又はサブユニットの約40乃至約100は、活性であると決定される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はタンパク質サブユニットの約40、約50、約60、約70、約80、約90、又は約100は、活性であると測定される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットの約40乃至約50、約50乃至約60、約60乃至約70、約70乃至約80、約80乃至約90、約90乃至約100、約50乃至約100、約60乃至約100、約70乃至約100、約80乃至約100、約40乃至約90、約40乃至約95、約50乃至約90、約50乃至約95、約50乃至約100、約60乃至約90、約60乃至約95、約60乃至約100、約70乃至約90、約70乃至約95、約70乃至約100、又は約70乃至約100は、活性であると決定される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はタンパク質サブユニットの約75乃至約100は、活性であると決定される。実施形態において、組み換え型の毒素タンパク質又はサブユニットの約75乃至約80、約75乃至約85、約75乃至約90、約75乃至約95、約80乃至約85、約80乃至約90、約80乃至約95、約80乃至約100、約85乃至約90、約85乃至約95、約85乃至約100、約90乃至約95、約90乃至約100、又は約95乃至約100は、活性であると決定される。誘発されたタンパク質の同一性を確認する手段も、当該技術分野で既知である。例えば、タンパク質は、MALDI-TOF質量分光法、N-末端配列分析、又はペプチドマッピングを使用する、ペプチド質量フィンガープリントによって分析され得る。本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され及び記載されてきた一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換が現在、当業者に生じるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。実施例1:組み換え型CRM197タンパク質の高スループット発現CRM197発現菌株を構築し、菌株において生成された可溶性のCRM197タンパク質の量を毛細管のゲル電気泳動法SDS-CGEを使用して分析した。結果として生じるデータに基づき、菌株を大規模な発現に使用するために選択した。CRM197発現菌株の構築及び成長CRM197コード配列を、CRM197アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:1は、発現された合成の最適化されたCRM197遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:2は、発現された合成の最適化されたCRM197遺伝子のDNA配列を示す。表8に示されるような、10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーに融合される、最適化されたCRM197配列を運ぶプラスミドを構築した。CRM197コード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために融合した。組み換え型CRM197コード配列に融合された10の分泌リーダー融合を含む構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表9に記録された4つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、微量金属及び5のグリセロールを有するHTP増殖培地で再懸濁し、その後、400μlのM9塩、1のグルコース培地、及び微量元素を有する96穴ディーププレート96-welldeepwellplateに伝送した。96-ウェルプレートを、48時間振ることにより、30°Cでインキュベートした。10μlの各々の40の種培養を、各々のウェルが微量元素及び5のグリセロールにより補足された500μlのHTP培地を含む三重の96穴ディーププレートに伝送し、24時間、以前のようにインキュベートした。イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGを、0.3mMの終末濃度で各々のウェルに加え、標的タンパク質の発現を誘発した。マンニトールSigma,M1902を、1の終末濃度で各々のウェルに加え、フォールディングモジュレータ過剰発現菌株におけるフォールディングモジュレータの発現を誘発し、温度を25°Cに下げた。誘発の24時間後に、400μlの量のPBSを使用して、細胞をOD600=15にまで標準化した。サンプルを、可溶性及び不溶性の画分を生成する音波処理及び遠心分離によって後で処理するために冷凍した。サンプル調製及びSDS-CGE分析可溶性及び不溶性の細胞の画分を、標準化された培養の音波処理によって、その後遠心分離によって調製した。冷凍されて標準化された培養液400μLを溶かし、3.5分間超音波で処理した。溶解産物を、20分間20,800×g4°Cで遠心分離し、上清を、手動又は自動化液体処理を使用して取り除いた可溶性画分。ペレット不溶性の画分を冷凍し、その後、4°Cで20分間20,080xgで再び遠心分離して、残りの上清を取り除いた。その後、ペレットを、400μLの1Xリン酸緩衝食塩水PBS、pH7.4において再懸濁した。SDS-CGE分析のための可溶性及び不溶性のサンプルの更なる希釈を、1Xリン酸緩衝食塩水PBS、pH7.4において行なった。可溶性及び不溶性のサンプルを、ジチオトレイトールDTTの存在下で、SDS毛細管ゲル電気泳動法CGECaliperLifeSciences,ProteinExpressLabChipKit,Part760301のために調製した。各々の菌株からの可溶性画分の減少するSDS-CGE分析の結果を示す、代表的なゲル様の画像を図1に示す。表10は、構築されたCRM197発現菌株の各々に関して、3つの複製の平均の可溶性CRM197の収量及び標準偏差を示す。各々の菌株のためスクリーンされた宿主菌株及び分泌リーダーも示す。分泌リーダー及び宿主菌株の両方は、CRM197発現への著しい影響を示した。発現は、0.5mLの規模で、検知可能でない収量から1.2g/L以上までの範囲に及び、最も高い発現レベルは、宿主菌株2バックグラウンドにおいて観察された。PS538-776において観察された収量は1263mg/Lであり、PS538-772におけるものは1241mg/Lであり、両方とも340mg/Lの平均収量を大幅に上回った。高い収量及び低い収量を、使用されるリーダーに依存する同じ宿主において観察し、及び高い収量及び低い収量を、異なる宿主菌株において同じリーダーを使用して観察した。PS538-772、PS538-773、PS538-776、PS538-778、PS538-782を、大規模な発酵における評価のため選択した。実施例2:組み換え型CRM197タンパク質の大規模発現組み換え型CRM197タンパク質を、2リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株PS538-772、PS538-776、及びPS538-782において生成した。培養は、本明細書に、及び例えばRiesenberg,D.,etal.,1991によっても記載されるような無機塩培地を含む、2リットルの発酵槽において成長し、アンモニアの追加により32°C及びpH6.5に維持された。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の撹拌及び流量の増加によって過剰に維持した。過剰レベルに維持するため、グリセロールを発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの状態を、誘発のための標的培養細胞濁度575nmA575での光学濁度が達するまで、すなわちCRM197生成を開始するためにIPTGが加えられる時点で、維持する。誘発の細胞密度を、A575の40から200までの吸光度単位AUで変えることができる。IPTG濃度を0.02から0.4mMまでの範囲で変えることができる。pH6から7.5、温度20乃至35°C。16-24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、及び細胞ペレットを80°Cで冷凍した。サンプルを、生成物形成用のSDS-CGEによって分析した。複数の発酵条件を、1乃至2g/LのSDS-CGEによって決定されるようなトップCRM197発現をもたらすと評価した図18及び19を参照。誘発されたタンパク質の同一性を、ジフテリア毒素特異抗体を使用するウェスタンブロット解析によって確認した図20。実施例3:組み換え型のコレラ毒素Bタンパク質の高スループット発現コレラ毒素B発現菌株の構築及び成長コレラ毒素Bコード配列を、コレラ毒素Bアミノ酸配列をコード化するため、シュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:22は、発現された合成のコレラ毒素B遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:23は、発現された合成の最適化されたコレラ毒素B遺伝子のDNA配列を示す。CRM197と共に使用される、同じ10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化されたコレラ毒素B配列を運ぶプラスミド表8に示されるを構築した。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。組み換え型コレラ毒素Bタンパク質に融合される10の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表9に記録された4つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現のために上述されるような、96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルのために上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。各々の菌株からの可溶性画分の減少するSDS-CGE分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図2に示す。表11は、構築されたコレラ毒素B発現菌株の各々に関する3つの複製の平均の可溶性コレラ毒素Bの収量及び標準偏差を示す。分泌リーダー及び宿主菌株の両方は、コレラ毒素B発現への著しい影響を示した。発現は、0.5mLの規模で、検知可能でない収量から0.2g/L以上までの範囲に及び、最も高い発現レベルは、hslUVprc1degP1degP2aprA欠失/DegP2S219A過剰発現宿主バックグラウンドにおいて観察された。リーダー6CupA2及び8PbpA20Vに融合されるコレラ毒素Bの発現は、全て4つの菌株において一貫して高いように思われる。実施例4:組み換え型コレラ毒素Bタンパク質の大規模発現組み換え型コレラ毒素Bタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株PS538-088及びPS538-091において生成した。選択された菌株を、本明細書に、及び例えばRiesenberg,D.,etal.,1991にも記載されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽で成長させ、アンモニアを付えることにより、32°C及びpH6.5に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度575nmA575での光学濁度が達するまで、すなわち標的タンパク質生成を開始するためにIPTGが加えられた時点で、維持した。CTB生成を開始するためにIPTGを加えた。16-24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを-80°Cで冷凍した。複数の発酵条件を、0.6乃至1.0g/LのSDS-CGEによって決定されるような、トップCTB発現をもたらすと評価した。最上級のtopperforming発酵培養を、pH6.5乃至7.2及び32°Cで、0.2mMのIPTGを有するおよそ80乃至160のODにて誘発した。可溶性のCTB濃度を、SDS-CGEによって測定した図14及び表12を参照。誘発されたタンパク質の同一性を、MALDI-TOF質量分光法を使用するペプチド質量フィンガープリントによって確認した。実施例5:組み換え型百日咳毒素タンパク質の高スループット発現百日咳トキソイドS1E129AR9K発現菌株の構築及び成長S1変異E129A及びR9Kにより、サブユニットS1、S2、S3、S4、及びS5をコード化する百日咳トキソイドオペロンの配列を、組み換え型百日咳毒素の発現に使用した。図3は、オペロンのマップを示す。図4は、翻訳を伴う、オペロンのDNA配列を示す配列番号:24。図5は、S1、S2、S3、S4、及びS5の個々のアミノ酸配列を示す。構築物を、表13に示される、8つのシュードモナスフルオレッセンス宿主において発現した。宿主細胞をp538-081により電気穿孔し、CRM197高スループット発現のために上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルのために上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。発現された百日咳毒素のウェスタンブロット解析上述された8つの培養からの可溶性画分を、百日咳トキソイド発現を評価するためにウェスタンブロットによって分析した。20マイクロリットルの可溶性画分2倍希釈され、減少され、及び減少されなかったを、1XBio_RadMESランニングバッファー中のBio-Rad12Bis-TrisGel上で実行した。減少されたウェスタン分析のため、1XのXT還元剤を加えた。タンパク質を、20のメタノールを有する1XNuPAGE転移バッファNuPAGETransferBufferInvitrogen,NP0006-1を使用して、60分間100Vで、SDS-PAGEから0.2μmのニトロセルロース膜Biorad,1620232上に伝送した。細胞膜を、PBSPierce,37528におけるBlocker商標の1のカゼインにおいて、室温で1時間遮断した。検出のため、希釈剤を捨て、百日咳菌毒素S4及びS1に対する各々のモノクローナル抗体の1:1000希釈の組み合わせを含んで、多くの物を加えたAbcam,catab37686and37547。ブロットを4°Cで一晩振ることによりインキュベートした。ブロットを、5分間各々PBS-Tweenにより3回洗浄し、その後、1時間室温で、ヤギ由来の抗マウスIgGペルオキシダーゼの1:5,000の希釈Sigma,CatA4416を含む、より多くの希釈剤においてインキュベートした。ImmunopureMetalEnhancedDABsubstratePierce,34065を使用する発色現象の前に、ブロットを、5分間各々PBS-TweenSigma,P3563により3回洗浄した。複数のサブユニットを、減少する及び減少しない条件下で、抗S1及び抗S4抗体によって検出した図6。観察された、発現されたトキソイドの減少した及び減少しないサンプルの横縞模様は、Sekura,etal.J.BiologicalChemistry258:14647,1983によって報告されるような、菌株165から精製された百日咳毒素に関して観察されたものと一致した。実施例6:組み換え型百日咳毒素タンパク質の大規模発現組み換え型百日咳毒素タンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株PS538-321、PS538-324、PS538-325、PS538-326、及びPS538-328において生成する。CTB大規模発現について上述されるように、選択された菌株を2リットルの発酵槽で成長させ、IPTGにより誘発し、サンプルを分析のために調製した。サンプルを、生成物形成のため、SDS-CGEによって分析し、それらの活性をウェスタンブロットによって分析した。実施例7:組み換え型野生型百日咳トキソイドの高スループット発現百日咳トキソイド発現菌株の構築及び成長S1を有する、サブユニットS1、S2、S3、S4、及びS5をコード化する野生型の百日咳毒素オペロンの配列を、組み換え型百日咳トキソイドの発現に使用する。図13は、翻訳を伴う、野生型のオペロンのDNA配列を示す配列番号:35。構築物を、表14に示されるシュードモナスフルオレッセンス宿主において発現する。過剰発現プラスミドを有していない、記録される各菌株を、a記載通りに過剰発現プラスミドを有さない;bGrpEDnaKJ過剰発現プラスミドを含んで、及びcDsbABCD過剰発現プラスミドを含んで試験する。宿主細胞をPTXWT発現プラスミドにより電気穿孔し、PTXS1R9KE129A高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、SDS-CGEによって、また上述されるようにも調製し、分析する。高小胞化菌株hyper-vesiculatingstrainとしても知られる、過分泌の菌株は、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、WO2010/008764、PseudomonasFluorescensStrainsforProductionofExtracellularRecombinantProteinに記載される。実施例8:組み換え型破傷風毒素フラグメントCタンパク質の高スループット発現破傷風毒素C発現菌株の構築及び成長破傷風毒素Cコード配列を、破傷風毒素Cアミノ酸配列順序をコード化するためにシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:30は、発現された合成の破傷風毒素C遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、及び配列番号:31は、発現されたた合成の最適化された破傷風毒素C遺伝子のDNA配列を示す。CRM197表8に示されると共に使用される、同じ10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化された破傷風毒素C配列を運ぶプラスミドを構築した。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。組み換え型破傷風毒素Cタンパク質に融合する10の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表9に記録された4つの宿主を、各々のリーダーにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。各々の菌株からの可溶性画分の減少するSDS-CGE分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図7に示す。表15は、構築された破傷風毒素C-発現菌株の各々に関する3つの複製の平均の可溶性破傷風毒素Cの収量及び標準偏差を示す。破傷風毒素Cフラグメントは、試験されたほとんどの菌株において十分に発現されるように思われ、最も高い収量は、hslUVprc1degP1degP2aprA欠失/DegP2S219A過剰発現発現宿主overexpressionexpressionhostにおいて600mg/Lにまで及ぶ。菌株PS538-529、PS538-538、PS538-544、PS538-546、PS538-547、PS538-548、PS538-558、PS538-565及びPS538-568を、更なる評価のため選択した。実施例9:組み換え型破傷風毒素フラグメントCタンパク質の大規模発現組み換え型破傷風毒素Cタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株PS538-529、PS538-538、PS538-544、PS538-546、PS538-547、PS538-548、PS538-558、PS538-565及びPS538-568において生成した。選択された菌株を、CRM197について上述されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽において成長させた。複数の発酵条件を、SDS-CGEによって決定されるような6乃至10g/Lの菌株PS538-529、PS538-546、及びPS538-547からのトップ可溶性TTCの発現をもたらすと評価した図11A及び表16を参照。最上級の発酵培養を、pH7.2及び32°Cで、0.2mMのIPTGを有するおよそ160のODにて誘発した。誘発されたタンパク質の同一性を、MALDI-TOF質量分光法及びウェスタンブロットを使用する、ペプチド質量フィンガープリントによって確認した。質量分光法とウェスタンブロット解析は、PS538-529、PS538-546及びPS538-547それぞれDsbA、PbpA20V及びDsbCの分泌リーダーが、これらの発現条件下で100の発現されたタンパク質から処理されないことを示した。しかしながら、TolBリーダーを、分泌されたタンパク質から正確に開裂されるものと同定した示されないデータ。分泌リーダーの高忠実度開裂及び低レベルの分解によりTTCの生成を可能にした菌株を同定するため、上記で概説された条件を使用して、TolB-TTC発現菌株PS538-538、PS538-548、PS538-558及びPS538-568を、2Lの発酵規模でスクリーンした。菌株PS538-538、PS538-548及びPS538-558を、ウェスタンブロット解析によって材料の類似の品質及び収量を生成するために観察した図11B。実施例10:組み換え型クロストリジウムディフィシレBタンパク質の高スループット発現TcdB発現菌株の構築及び成長TcdBコード配列を、TcdBアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号:32は、発現された合成のTcdB遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号:33は、発現された合成の最適化されたTcdB遺伝子のDNA配列を示す。最適化されたTcdB配列を運ぶプラスミドを、表17に記録された遺伝子型を有する、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。宿主細胞を、細胞質の発現プラスミドp538-211により電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。試験された24の菌株の各々からの可溶性画分の減少するSDS-CGE分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図8に示す。表18は、構築されたTcdB発現菌株の各々に関する3つの複製の平均の可溶性TcdBの収量及び標準偏差を示す。菌株PS538-654、PS538-659、PS538-669、PS538-671、及びPS538-674を、更なる評価のため選択した。実施例11:組み換え型クロストリジウムディフィシレ毒素Bタンパク質の大規模発現組み換え型クロストリジウムディフィシレ毒素Bタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株PS538-654、PS538-659、PS538-669、PS538-671、及びPS538-674において生成した。選択された菌株を2リットルの発酵槽で成長させ、IPTGにより誘発し、CTB大規模発現について上述されるように、サンプルを分析して調製した。複数の発酵条件を、およそ2g/lのSDS-CGEによって決定されるようなトップクロストリジウムディフィシレB毒素発現をもたらすと評価した。最上級の発酵培養を、pH6.5及び32°Cで、0.08mMのIPTGを有するおよそ160のODにて誘発した。可溶性のクロストリジウムディフィシレB毒素濃度をSDS-CGEによって決定した図12及び表19を参照。誘発されたタンパク質の同一性をウェスタンブロットによって確認した。実施例12:組み換え型外毒素Aタンパク質の高スループット発現緑膿菌外毒素A発現菌株の構築及び成長緑膿菌外毒素A突然変異体rEPAコード配列を、rEPAアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。図13は、発現した合成のrEPA遺伝子のアミノ酸及びDNA配列を示す。CRM197表8に示されると共に使用される同じ10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合される、図13に示されるような、いずれかの欠失変異株rEPAをコード化する最適化された配列を運ぶプラスミドを構築した。分泌リーダーコード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。rEPAタンパク質に融合される10の分泌リーダーを発現する構築物を、表20に記録された、8つのシュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。最も高い収量は、可溶性のrEPAの4.7乃至6.7g/lの範囲に及ぶ。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析した。最も高い収量は、可溶性の外毒素Aタンパク質の1.6乃至2.2g/lの範囲に及んだ。表21は、更なる試験のため選択された発現菌株の各々に関する可溶性のrEPAの収量を示す。実施例13:組み換え型緑膿菌外毒素Aタンパク質の大規模発現組み換え型緑膿菌外毒素Aタンパク質rEPAを、2リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株PS538-1633、PS538-1640及びPS538-1670において生成した。培養を、本明細書に、また例えばRiesenberg,D.,etal.,1991に記載されるような無機塩培地を含む2リットルの発酵槽において成長させ、アンモニアを追加することにより32°C及びpH6.5に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達する。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度575nmA575での光学濁度が達するまで、すなわちrEPA生成を開始するためにIPTGが加えられた時点で、維持した。誘発時の細胞密度は、A575の40から200までの吸光度単位AUで変えることができる。IPTG濃度を、0.02乃至0.4mMの範囲で変えることができる。pH6乃至7.5及び温度20乃至35°C。16-24時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを-80°Cで冷凍した。サンプルを生成物形成用のSDS-CGEによって分析した。複数の発酵条件を、32g/LまでのSDS-CGEによって決定されるようなトップrEPA発現をもたらすと評価した図15及び16。誘発されたタンパク質の同一性を、緑膿菌外毒素Aに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析によって確認した図17。得た収量を表22に示す。実施例14:組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質の高スループット発現野生型ジフテリア毒素発現菌株の構築及び成長ジフテリア毒素コード配列を、野生型ジフテリア毒素アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。配列番号:36は、発現された合成のジフテリア毒素遺伝子のアミノ酸配列を示し、配列番号:37は、発現された合成の最適化されたジフテリア毒素遺伝子のDNA配列を示す。CRM197表8に示されると共に使用される10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合される、ジフテリア毒素をコード化する最適化された配列を運ぶプラスミドを構築する。分泌リーダーコード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。組み換え型ジフテリア毒素タンパク質に融合する10の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験する。表9に記録された4つの宿主を、各々のリーダーにより試験する。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析する。実施例15:組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質の大規模発現組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株において生成する。選択された菌株を、2リットルの発酵槽において成長させ、IPTGにより誘発し、CRM197大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをSDS-CGEによって分析する。実施例16:組み換え型コレラホロトキシンタンパク質の高スループット発現CTX発現菌株の構築及び成長CTXコード配列を、CTXアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。コード配列は、図14に示されるCTX遺伝子のアミノ酸及びDNA配列に基づく。CRM197表8に示されると共に使用される10のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化されたCTX配列を運ぶプラスミドを構築する。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。組み換え型CTXタンパク質に融合する10の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験する。表9に記録された4つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験する。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、CRM197高スループット発現について上述されるような96-ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、CRM197高スループット発現サンプルについて上述されるようなSDS-CGEによって調製し、分析する。実施例17:組み換え型コレラホロトキシンタンパク質の大規模発現組み換え型コレラホロトキシンタンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスPfenex発現技術PfenexExpressionTechnology商標菌株において生成する。選択された菌株を、2リットルの発酵槽において成長させ、IPTGにより誘発し、CRM197大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをSDS-CGEによって分析する。"