"ヌクレアーゼおよび操作されたジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質であって、操作されたジンクフィンガードメインが、配列番号28~30および75~90のいずれかにより指定される標的部位に結合する融合タンパク質。ヌクレアーゼが、切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む請求項1に記載の融合タンパク質。ヌクレアーゼが、タイプIIS制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む請求項1または2に記載の融合タンパク質。切断ドメインまたは切断ハーフドメインが、天然または操作されている請求項3に記載の融合タンパク質。請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。細胞が胚細胞である請求項6に記載の細胞。請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項5に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。細胞中の1つまたは複数のRosa遺伝子を切断する方法であって、1つまたは複数のRosa遺伝子が切断されるように、1つまたは複数の請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質または1つまたは複数の請求項5に記載のポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップを含む方法。外因性のポリヌクレオチド配列を細胞のゲノム中に導入する方法であって、1つまたは複数の請求項9に記載のRosa遺伝子を切断するステップ;および細胞を外因性のポリヌクレオチド配列と接触させるステップを含み;1つまたは複数の遺伝子の切断が、外因性のポリヌクレオチド配列のゲノム中への相同組換えによる組込みを刺激する方法。外因性のポリヌクレオチド配列が、物理的にゲノム中に挿入される請求項10に記載の方法。外因性のポリヌクレオチド配列が、核酸複製プロセスを介してゲノム中に組み込まれる請求項11に記載の方法。外因性のポリヌクレオチド配列が、非相同依存性標的組込みを介してゲノム中に組み込まれる請求項11に記載の方法。細胞のゲノム中のRosa遺伝子配列を改変する方法であって、1つまたは複数の請求項9に記載のRosa遺伝子を切断するステップを含み、i第1のZFNが第1の切断部位を切断し、第2のZFNが第2の切断部位を切断し;iiRosa遺伝子配列が、第1切断部位と第2切断部位の間に位置し;iii第1と第2切断部位の切断により非相同末端結合または相同指向修復により遺伝子配列の改変が生ずる、方法。改変が欠失を含む請求項14に記載の方法。改変が外因性の配列の挿入を含む請求項15に記載の方法。遺伝子導入動物を生成する方法であって、請求項14~16のいずれか1項に記載の胚細胞中のRosa遺伝子配列を改変するステップ;および動物中で胚を発生させるステップ、を含む方法。改変が、指定された位置での1つまたは複数のランダム変異を含む請求項17に記載の方法。改変が、ヒト化遺伝子の挿入を含む請求項17に記載の方法。ヒト化遺伝子が、薬剤代謝に関係している請求項19に記載の方法。動物が性的成熟動物であり、改変遺伝子配列が、性的成熟動物の少なくとも一部の配偶子中に存在する請求項17~20のいずれか1項に記載の方法。対象の少なくとも1つのRosa遺伝子座中に1つまたは複数の遺伝性変異対立遺伝子を作る方法であって、請求項17~21のいずれか1項に記載の遺伝子導入動物を生成するステップ、ここで胚を性的成熟に育てる;およびその性的成熟動物に子孫を作らせるステップ、ここで少なくとも一部の子孫がその変異対立遺伝子を含む、方法。請求項1~4のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項5に記載のポリヌクレオチドを含むキット。1つまたは複数の外因性の配列、使用説明書、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される追加の成分をさらに含む請求項23に記載のキット。詳細な説明本明細書では、例えば、マウス、ラットまたはウサギ等の小哺乳動物で例えば、遺伝子の切断;例えば、切断に続いて外因性配列の挿入物理的挿入または相同指向修復を介した複製による挿入および/または切断に続いて非相同末端結合NHEJによる遺伝子の変化;1つまたは複数の遺伝子の部分的または完全な不活性化;内在性遺伝子の改変発現を作るためのランダム変異を有する対立遺伝子の生成;等および生殖系列中に運び込まれたゲノムの変化、におけるゲノム編集のための組成物と方法が記載されている。また、標的動物例えば、小哺乳動物細胞中の例えば、1つまたは複数の遺伝子を編集する変えるために、これらの組成物試薬を製造し使用する方法が開示されている。従って、本明細書記載の方法および組成物は、標的遺伝子変化例えば、ノックインおよび/または1つまたは複数の遺伝子のノックアウト部分的または完全のための、および/または任意の標的対立遺伝子配列のランダム変異のための非常に効率的な方法を提供し、従って、ヒト疾患の動物モデルの生成を可能とする。本明細書記載の組成物および方法は、労働集約的な選択および/または選別の必要もなく、最小限のオフターゲット効果で、動物の内在性遺伝子座の迅速、完全、および永続的な標的破壊を提供する。動物全身遺伝子ノックアウトは、また、ZFNmRNAまたはZFN発現カセットを注入することにより、1回のステップで容易に生成することができる。一般事項方法の実施、ならびに本明細書で開示の組成物の調製と使用には、別段の指示がなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を採用している。これらの技術は文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrooketal.MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL、Secondedition、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1989andThirdedition、2001;Ausubeletal.、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY、JohnWileySons、NewYork、1987andperiodicupdates;theseriesMETHODSINENZYMOLOGY、AcademicPress、SanDiego;Wolffe、CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION、Thirdedition、AcademicPress、SanDiego、1998;METHODSINENZYMOLOGY、Vol.304、ChromatinP.M.WassarmanandA.P.Wolffe、eds.、AcademicPress、SanDiego、1999;andMETHODSINMOLECULARBIOLOGY、Vol.119、ChromatinProtocolsP.B.Becker、ed.HumanaPress、Totowa、1999、を参照。定義用語の核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドは、同義に使用され、直鎖または環状構造、および単鎖または二重鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のためには、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものと解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの類似体、ならびに塩基、糖および/またはリン酸塩成分が改変されているヌクレオチド例えば、ホスホロチオエートバックボーンの既知の類似体を包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対を形成する。用語のポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。また、この用語は、1つまたは複数のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用できる。結合は、高分子間の例えば、タンパク質と核酸間の配列特異的、非共有結合相互作用を指す。相互作用全体として配列特異的である限りは、必ずしも全ての結合相互作用の成分が、配列特異的である必要はない例えば、DNAバックボーン中のリン酸塩残基と接触。このような相互作用は、通常、106M1以下の解離定数Kdを特徴とする。親和性は、結合の強さを指し、結合親和性の増加は、Kdの低下に対応する。結合タンパク質は、非共有結合で別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子DNA結合タンパク質、RNA分子RNA結合タンパク質および/またはタンパク質分子タンパク質結合タンパク質に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合は、それは、自身に結合することができホモダイマー、ホモトリマー、等を形成、および/または異なるタンパク質または異なる複数タンパク質の1つまたは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、2つ以上のタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、DNA結合、RNA結合およびタンパク質結合活性を持つ。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質または結合ドメインは、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインで、配列特異的方式で1つまたは複数のジンクフィンガーを介してDNAに結合する。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位により安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列領域である。用語のジンクフィンガーDNA結合タンパク質は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略される。ジンクフィンガー結合ドメインは、操作されて所定のヌクレオチド配列に結合することができる。フィンガータンパク質を操作する方法の非制限的例は、設計と選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然にはないタンパク質で、その設計/組成は、主として合理的な基準から得られる。合理的な設計基準には、置換ルール、および既存ZFP設計および結合データのデータベース蓄積情報の情報処理用コンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第6,140,081号;同6,453,242号;および同6,534,261号、を参照;また、国際公開第98/53058号;同98/53059号;同98/53060号;同02/016536号および同03/016496号、を参照。選択されたジンクフィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質で、その産生は、主に経験的プロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用捕捉またはハイブリッド選択、からの結果である。例えば、米国特許第5,789,538号;同5,925,523号;同6,007,988号;同6,013,453号;同6,200,759号;国際公開95/19431号;同96/06166号;同98/53057号;同98/54311号;同00/27878;同01/60970号;同01/88197号および同02/099084号、を参照。用語の配列は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、DNAまたはRNAであってもよく;直鎖、環状または分岐であってもよく、さらに、単鎖または二重鎖であってもよい。用語のドナー配列は、ゲノム中に挿入されたヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、2~10,000ヌクレオチドの長さまたはその間の、またはそれを超える任意の整数値であってよく、好ましくは、約100~1,000ヌクレオチドの長さまたはその間の任意の整数、より好ましくは、約200~500ヌクレオチドの長さである。相同、非同一配列は、第2の配列とある程度の配列同一性を分け合うが、その配列は第2の配列とは同じではない第1の配列を指す。例えば、変異遺伝子の野性型配列を含むポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列に相同かつ非同一である。ある特定の実施形態では、2つの配列間の相同性の程度は、正常細胞機序を利用して、それらの間の相同組換えを許容するのに充分である。2つの相同非同一配列は、任意の長さでよく、その非相同性の程度は、単一ヌクレオチドの小ささ例えば、標的相同組換えによるゲノム点変異の補正のためにまたは10キロベース以上の大きさ例えば、染色体の所定の異所性部位で遺伝子の挿入のためにであってもよい。相同非同一配列を含む2つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、20~10,000のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチドすなわち、ドナーポリヌクレオチドを使用可能である。核酸およびアミノ酸配列同一性を測定する技術は、当技術分野で既知である。通常、このような技術には、遺伝子のためのmRNAのヌクレオチド配列の決定および/またはそれによりコードされたアミノ酸配列の決定、およびこれらの配列と第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列との比較が含まれる。ゲノム配列もまた、この方式で決定および比較可能である。一般的に、同一性は、それぞれ、ヌクレオチド-対-ヌクレオチドまたはアミノ酸-対-アミノ酸の2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確な対応を指す。2つ以上の配列ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、それらのパーセント同一性を測定することにより比較できる。2つの配列のパーセント同一性は、核酸でもまたはアミノ酸配列でも、2つの整列させた配列の間の正確な一致の数をより短い方の配列の長さで割って、100倍したものである。あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定な2本鎖の形成を許容する条件下で、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、続いて、単鎖特異的ヌクレアーゼで消化させ、さらに消化断片のサイズ測定により、決定できる。配列が決まった長さの分子に対し、上記の方法を使って測定して、少なくとも約70~75、好ましくは、80~82、より好ましくは、85~90、さらにより好ましくは、92、さらにより好ましくは、95、および最も好ましくは、98の配列同一性を示す場合は、2つの核酸、または2つのポリペプチド配列は、実質的に相互に相同である。本明細書で使われる実質的に相同は、また、特定のDNAまたはポリペプチド配列に対し完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるDNA配列は、例えば、その特定のシステムに対し定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の技能範囲内である。例えば、Sambrooketal.、前出;NucleicAcidHybridization:APracticalApproach、editorsB.D.HamesandS.J.Higgins、1985Oxford;Washington、DC;IRLPress、を参照。2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように測定できる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーションイベント効率と強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野でよく知られたハイブリダイゼーションアッセイ例えば、サザンDNAブロット、ノーザンRNAブロット、溶液ハイブリダイゼーション、等、Sambrook、etal.、MolecularCloning:ALaboratoryManual、SecondEdition、1989ColdSpringHarbor、N.Y.を参照を使って評価できる。このようなアッセイは、様々な程度の選択性を使って、例えば、低から高まで厳密性が変わる条件を使って、実行できる。低厳密性の条件を採用する場合は、非特異的結合の非存在を、部分的な程度の配列同一性にも欠ける第2のプローブ例えば、標的分子に対し約30未満の配列同一性を有するプローブを使って評価でき、非特異的結合イベントが無い場合は、第2のプローブは、標的にハイブリダイズしないであろう。ハイブリダイゼーションに基づいた検出システムを利用する場合は、核酸プローブは、参照核酸配列に相補的なものが選ばれ、次に、適切な条件の選択により、プローブと参照配列が選択的に相互にハイブリダイズ、または結合して、二本鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照配列に選択的にハイブリダイズ可能な核酸分子は、通常、選択核酸プローブの配列に少なくとも約70配列同一性を有する少なくとも約10~14ヌクレオチド長さの標的核酸配列の検出を可能とする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常、選択核酸プローブの配列と約90~95を超える配列同一性を有する少なくとも約10~14ヌクレオチド長さの標的核酸配列の検出を可能とする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合、プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で既知の方法で決定できる例えば、NucleicAcidHybridization:APracticalApproach、editorsB.D.HamesandS.J.Higgins、1985Oxford;Washington、DC;IRLPress、を参照。ハイブリダイゼーションの条件は当業者にはよく知られている。ハイブリダイゼーションの厳密性は、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高い厳密性は、ミスマッチハイブリッドに対するより低い許容性と相関する。ハイブリダイゼーションの厳密性に影響する因子は当業者にはよく知られ、限定されないが、温度、pH、イオン強度、および、例えば、フォルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶剤の濃度が含まれる。当業者には知られているように、ハイブリダイゼーション厳密性は、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によってより高くなる。ハイブリダイゼーションの厳密性条件に関して、多くの等価な条件を採用して、例えば、以下の因子を変えることにより、特定の厳密性を確立できることは当技術分野でよく知られている:長さおよび配列の性質、種々の配列の塩基組成、塩の濃度ならびに他のハイブリダイゼーション溶液成分、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤例えば、デキストラン硫酸塩、およびポリエチレングリコールの存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、ならびに、洗浄条件を変えること。特定のセットのハイブリダイゼーション条件は、以下の当技術分野の標準的な方法により選択される例えば、Sambrook、etal.、MolecularCloning:ALaboratoryManual、SecondEdition、1989ColdSpringHarbor、N.Y.、を参照。組換えは、2つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換プロセスを指す。本開示の目的としては、相同組換えHRは、例えば、相同指向修復機序を介して細胞中の二重鎖切断の修復の間に起こる特殊な形のこのような交換を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー分子を標的分子すなわち、二重鎖切断を受けた分子のテンプレート修復に使用し、非交差遺伝子変換またはショートトラクト遺伝子変換として様々な呼び方で知られているが、理由は、このことが、遺伝子情報をドナーから標的に移すことになるためである。いかなる特定の理論にも拘泥する意図はないが、このような移入は、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修復、および/または合成依存的ストランドアニーリングドナーが標的の一部となるであろう遺伝情報を再合成するために使用される、および/または関連プロセス、を伴う可能性がある。このような特殊なHRは、ドナーポリヌクレオチドの一部または全部の配列が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような標的分子の配列の変化を生ずることが多い。本開示の方法では、本明細書記載の1つまたは複数の標的ヌクレアーゼが標的配列例えば、細胞クロマチン中の所定の部位で二重鎖切断を作り、切断領域中のヌクレオチド配列に相同性を有するドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入できる。二重鎖切断の存在により、ドナー配列の組込みの促進が認められる。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよく、または、代わりに、ドナーポリヌクレオチドが相同組換えを介した切断修復のテンプレートとして使用され、ドナーの細胞クロマチン中への組込みのように、ヌクレオチド配列の全部または一部の導入が生ずる。従って、細胞クロマチン中の第1の配列は、変えることができ、また、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換できる。従って、用語の置換するreplaceまたは置換replacementの使用は、1つのヌクレオチド配列の別のものでの置換を表すと理解できすなわち、情報上の配列の置換、必ずしも、1つのポリヌクレオチドの別のものでの物理的または化学的置換を必要としない。本明細書記載のいずれかの方法では、細胞内の追加の標的部位の追加の二重鎖切断に対し、追加のジンクフィンガータンパク質対を使用することができる。細胞クロマチン中の対象領域中の標的組換えおよび/または置換および/または配列変化の方法に関するある特定の実施形態では、染色体の配列が外因性のドナーヌクレオチド配列を使った相同組換えにより変化される。このような相同組換えは、切断領域に対する配列相同性が存在する場合は、細胞クロマチン中の二重鎖切断の存在により刺激される。本明細書記載のいずれかの方法では、第1のヌクレオチド配列ドナー配列は、対象領域中のゲノム配列に相同な同一ではない配列を含む可能性が有り、それにより、相同組換えを刺激して、非同一配列を対象領域に挿入できる。従って、ある特定の実施形態では、対象領域中の配列に相同な一部のドナー配列は、約80~99またはその間の任意の整数の置換されるゲノム配列に対する配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、100を超える近接塩基対の中でただ1つのヌクレオチドのみがドナーとゲノム配列間で異なる場合は、ドナーおよびゲノム配列間の相同性は、99を超える。ある特定の場合、ドナー配列の非相同部分は、対象領域中に存在しない配列を含むことができ、それにより、新規配列が対象領域に導入される。これらの例では、非相同配列には、通常、50~1,000塩基対またはその間の任意の整数値または1,000超の任意の数の塩基対の配列が隣接しており、これら隣接配列は、対象領域の配列に対し相同または同一である。他の実施形態では、ドナー配列は、第1の配列に非相同であり、非相同組換え機序によりゲノム中に挿入される。本明細書記載のいずれかの方法を使って、対象遺伝子の発現を妨害するドナー配列の標的組込みにより、部分的にまたは完全に細胞中の1つまたは複数の標的配列の不活化をおこなうことができる。部分的または完全不活化遺伝子を有する細胞株もまた提供される。さらに、本明細書記載の標的組込み方法は、また、1つまたは複数の外因性の配列を組み込むのにも使用可能である。外因性の核酸配列は、例えば、1つまたは複数の遺伝子もしくは相補DNA分子、または任意のタイプのコードもしくは非コード配列、ならびに1つまたは複数の調節領域例えば、プロモーターを含んでもよい。さらに、外因性の核酸配列が、1つまたは複数のRNA分子例えば、低分子ヘアピン型RNAsshRNA、抑制性RNARNAi、マイクロRNAmiRNA、等を産生してもよい。切断は、DNA分子の共有結合バックボーンの切断を指す。切断は、種々の方法で開始でき、限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学加水分解が含まれる。単鎖切断および二重鎖切断の両方が可能であり、二重鎖切断は、2つ異なる単鎖切断イベントの結果として発生し得る。DNA切断により、平滑末端または付着末端が生成され得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的二重鎖DNA切断のために使用される。切断ハーフドメインは、第2のポリペプチド同一または異なると共に、切断活性好ましくは二重鎖切断活性を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語の第1と第2切断ハーフドメイン;および-切断ハーフドメインおよび右と左切断ハーフドメインは、同義に使用され、二量体化する一対の切断ハーフドメインを指す。操作切断ハーフドメインは、別の切断ハーフドメイン例えば、別の操作切断ハーフドメインと強制的ヘテロダイマーを形成するように改変されている切断ハーフドメインである。また、米国特許公開第2005/0064474号;同第2007/0218528号および同第2008/0131962号、を参照。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。クロマチンは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、1次DNA、およびタンパク質を含み、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含む。大部分の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形で存在し、ヌクレオソームのコアは、2つの各ヒストンH2A、H2B、H3およびH4を含む八量体と会合した約150塩基対のDNAを含み;さらに、生物体に応じて可変長さのリンカーDNAがヌクレオソームコアの間に広がる。ヒストンH1の分子は、通常、リンカーDNAと会合している。本開示の目的としては、用語のクロマチンは、原核生物および真核生物両方のあらゆるタイプの細胞核タンパク質を包含することを意味している。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。染色体は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その核型を特徴とし、細胞のゲノムを含む全ての染色体の収集である。細胞のゲノムは、1つまたは複数の染色体を含むことができる。エピソームは、複製する核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。標的部位または標的配列は、結合のための充分な条件が存在すれば、結合分子が結合する核酸の一部を決める核酸配列である。例えば、配列5’-GAATTC-3’は、EcoRI制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。外因性の分子は、通常は細胞中に存在しない分子であるが、1つまたは複数の遺伝的、生化学的または他の方法により細胞中に導入可能である。細胞中で通常の存在は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉胚発生の間のみに存在する分子は、成人筋細胞に対しては外因性の分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、非熱ショック細胞に対しては、外因性の分子である。外因性分子には、例えば、機能バージョンの動作異常内在性分子または動作異常バージョンの正常機能内在性分子を含んでもよい。外因性分子は、また、別の種、例えば、動物のゲノム中に導入されたヒト配列、で通常見出される分子であってもよい。外因性の分子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスにより生成される小分子、または高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子のいずれかの改変誘導体、または1つまたは複数の上記分子を含むいずれかの複合体であってもよい。核酸は、DNAおよびRNAを含み、単鎖でも二重鎖でもよく;直鎖、分岐または環状でもよく;さらに任意の長さでよい。核酸には、二重鎖を形成できるもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第5,176,996号および同5,422,251号、を参照。タンパク質には、限定されないが、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが含まれる。外因性分子は、内在性分子、例えば、外因性のタンパク質または核酸と同じタイプの分子であってもよい。例えば、外因性の核酸は、細胞中に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミドまたはエピソーム、または通常は細胞中に存在しない染色体を含んでもよい。外因性分子の細胞中への導入方法は、当業者には既知であり、限定されないが、脂質媒介導入すなわち、中性および陽イオン脂質を含むリポソーム、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介導入およびウイルスベクター媒介導入、が含まれる。対照的に、内在性分子は、特定の発生段階で特定の環境条件下、通常特定の細胞中に存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他のオルガネラのゲノム、または天然エピソーム核酸を含んでもよい。追加の内在性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。融合分子は、2つ以上サブユニット分子が、好ましくは共有結合で、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子でも、または異なる化学タイプの分子であってもよい。第1のタイプの融合分子の例には、限定されないが、融合タンパク質例えば、ZFPDNA結合ドメインと切断ドメインの融合体および融合核酸例えば、前に記載の融合タンパク質をコードする核酸が含まれる。第2のタイプの融合分子の例には、限定されないが、三量体形成核酸とポリペプチド間の融合体、および小溝結合剤と核酸の間の融合体が含まれる。細胞中の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達により行わせることができ、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結反応は、また、細胞中のタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達方法は、本開示の別のところで示している。本開示の目的のための遺伝子には、遺伝子産物をコードするDNA領域下記を参照、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全DNA領域が含まれるが、このような調節配列がコードおよび/または複写配列に隣接して存在するか否にかかわらない。従って、遺伝子には、限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソームエントリー部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター配列、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座調節領域、が含まれる。遺伝子発現は、遺伝子中に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAまたはいずれかの他のタイプのRNAであっても、またはmRNAの翻訳により産生されたタンパク質であってもよい。遺伝子産物には、また、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集、等のプロセスにより改変されているRNA、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化により改変されたタンパク質、が含まれる。遺伝子発現の調節は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれる。ゲノム編集例えば、切断、変化、不活性化、ランダム変異は、発現を調節するために使用可能である。遺伝子不活性化は、本明細書記載のZFPを含まない細胞と比較して、遺伝子発現の何らかの減少を指す。従って、遺伝子不活性化は、部分的でも完全でもありうる。対象領域は、例えば、遺伝子または遺伝子内または隣接した非コード配列、等の細胞クロマチンのいずれかの領域であり、この領域中で外因性の分子に結合するのが望ましい。結合は、標的DNA切断および/または標的組換えの目的のためであってもよい。対象領域は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム例えば、ミトコンドリア、葉緑体、または、例えば、感染ウイルスゲノム中に存在してもよい。対象領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等の転写非コード領域内、またはコード領域の上流または下流の非転写領域内であってもよい。対象領域は、単一ヌクレオチド対程度の小ささでも、または2,000ヌクレオチド対もの長さでも、または任意の整数値のヌクレオチド対でもよい。用語の作動可能連結operativelinkageおよび作動可能に連結されたoperativelylinkedまたは作動可能に連結されたoperablylinkedは、2つ以上の要素配列要素、等の近位に関連して同義に使用され、この場合、要素が、両方の要素が正常に機能し、少なくとも1つの要素が、少なくとも1つの他の要素に対して行使する機能を媒介することができることを可能とするように配列されている。実例として、1つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応じて、転写調節配列がコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーター等の転写調節配列は、作動可能なようにコード配列に連結される。転写調節配列は、通常、コード配列とシスに作動可能なように連結されるが、すぐ隣である必要はない。例えば、エンハンサーは、作動可能なようにコード配列に連結されている転写調節配列であるが、それらは隣接していない。融合ポリペプチドに関する用語の作動可能に連結されたは、各要素が、連結されていない場合に行うのと同じ機能を、連結時に他の要素に対し実行するという事実を指す。例えば、ZFPDNA結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチド中で、ZFPDNA結合ドメイン部分が、その標的部位および/またはその結合部位に結合でき、一方、切断ドメインは、標的部位の近傍でDNAを切断することができる場合は、ZFPDNA結合ドメインおよび切断ドメインが作動可能に連結されている。タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の機能的断片は、その配列は、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、それでも完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子に比べ、より多い、より少ない、または同じ数の残基を持つことができ、および/または1つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能例えば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。同様に、タンパク質機能を測定する方法も、よく知られている。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動の移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって測定できる。DNA切断は、ゲル電気泳動法によりアッセイできる。Ausubeletal.、前出、を参照。タンパク質の別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは、遺伝的および生化学的の両方の相補性により測定できる。例えば、Fieldsetal.1989Nature340:245-246;米国特許第5,585,245号および国際公開第98/44350号、を参照。ジンクフィンガーヌクレアーゼ本明細書では、1つまたは複数のRosa遺伝子のゲノム編集例えば、切断、変化、不活性化および/またはランダム変異に使用できるジンクフィンガーヌクレアーゼZFNが記載されている。ZFNは、ジンクフィンガータンパク質ZFPおよびヌクレアーゼ切断ドメイン例えば、切断ハーフドメインを含む。A.ジンクフィンガータンパク質ジンクフィンガー結合ドメインは、選択配列に結合するように操作できる。例えば、Beerlietal.2002NatureBiotechnol.20:135-141;Paboetal.2001Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalanetal.2001NatureBiotechnol.19:656-660;Segaletal.2001Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Chooetal.2000Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416、を参照。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然ジンクフィンガータンパク質に比べて新規結合特異性を持つことができる。操作方法には、限定されないが、合理的な設計および種々のタイプの選択が含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列および個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、この場合、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列と結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、共有米国特許第6,453,242号および同6,534,261号、を参照。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む代表的選択方法が、米国特許第5,789,538号;同5,925,523号;同6,007,988号;同6,013,453号;同6,410,248号;同6,140,466号;同6,200,759号;および同6,242,568号;ならびに国際公開第98/37186号;同98/53057号;同00/27878号;同01/88197号および英国特許第2,338,237号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性の増強に関し、例えば、共有特許国際公開第02/077227号に記載されている。標的部位、ZFPの選択および融合タンパク質および前記をコードするポリヌクレオチドの設計と構築方法の選択は、当業者には既知であり、米国特許公開第20050064474号および20060188987号に詳細に記載されている。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらおよび他の参考に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび/またはマルチフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、例えば、5以上のアミノ酸長のリンカー例えば、TGEKP配列番号1、TGGQRP配列番号2、TGQKP配列番号3、および/またはTGSQKP配列番号4等の任意の適切なリンカー配列を使って一緒に連結できる。また、6以上のアミノ酸長の代表的リンカー配列に関しては、米国特許第6,479,626号;同6,903,185号;および同7,153,949号、を参照。本明細書記載のタンパク質は、それぞれのタンパク質ジンクフィンガーの間にいずれかの適切なリンカーの組み合わせを挿入することができる。後で記載するように、ある特定の実施形態では、4つ、5つ、または6つのフィンガー結合ドメインが、切断ハーフドメイン、例えば、FokI等のタイプIIs制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合される。1つまたは複数のこのようなジンクフィンガー/ヌクレアーゼハーフドメイン融合体対が、例えば、米国特許公開20050064474号で開示のように、標的切断に使用される。標的切断に関して、結合部位の近端は、5以上のヌクレオチド対により分離することが可能であり、各融合タンパク質は、DNA標的の逆ストランドに結合できる。オールペアワイズコンビネーション1Allpairwisecombination1が、Rosa遺伝子の標的切断のために使用可能である。本開示に従って、ZFNは、動物のゲノム中の任意の配列を標的にすることができる。一部の実施形態では、DNA結合ドメインは、植物病原体ザントモナス由来のTALエフェクターからの操作されたドメインであるBochetal、2009Science326:1509-1512およびMoscouandBogdanove、2009Science326:1501、を参照。B.切断ドメインZFNは、また、ヌクレアーゼ切断ドメイン、切断ハーフドメインを含む。本明細書に開示の融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが得られる代表的エンドヌクレアーゼには、限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。例えば、2002-2003カタログ、NewEnglandBiolabs、Beverly、MA;およびBelfortetal.1997NucleicAcidsRes.25:3379-3388、を参照。DNAを切断するさらなる酵素が知られている例えば、S1ヌクレアーゼ;マングビーンヌクレアーゼ;膵臓DNアーゼI;小球菌ヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;また、Linnetal.eds.Nucleases、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1993、を参照。1つまたは複数のこれらの酵素またはその機能性断片が、切断ドメインおよび切断ハーフドメインのソースとして使用できる。同様に、切断ハーフドメインは、上記で説明したように、任意のヌクレアーゼまたはその一部から得ることができる。これは、切断活性のためには二量体化が必要である。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合は、2つの融合タンパク質が切断に必要である。あるいは、2つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が、使用可能である。2つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼまたはその機能性断片から得ることができ、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼまたはその機能性断片から得ることができる。さらに、2つの融合タンパク質に対する標的部位は、2つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位との結合が、切断ハーフドメインを相互に空間定位に置き、切断ハーフドメインに、例えば、二量体化による機能的切断ドメインを形成させるように、相互に配置されるのが好ましい。従って、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、5~8ヌクレオチドまたは15~18ヌクレオチドだけ分離されている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、2つの標的部位間に介在できる例えば、2~50ヌクレオチド対またはそれを超える。一般的に、切断部位は、標的部位の間に位置する。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素は、多くの種に存在し、DNAに対する配列特異的結合認識部位でが可能で、また結合部位またはその近傍でDNAを切断可能である。ある特定の制限酵素例えば、タイプIISは、認識部位から離れた部位でDNAを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、タイプIIS酵素FokIは、1つの鎖の認識部位から9ヌクレオチドの位置、および、もう一方の鎖の認識部位から13ヌクレオチドの位置でのDNA二重鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号;同5,436,150号および同5,487,994号;ならびにLietal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Lietal.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kimetal.1994aProc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kimetal.1994bJ.Biol.Chem.269:31,978-31,982、を参照のこと。従って、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも1つのタイプIIS制限酵素由来の切断ドメインまたは切断ハーフドメインおよび1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメイン操作されていても、そうでなくてもよいを含む。切断ドメインが結合ドメインから分離可能な代表的タイプIIS制限酵素は、FokIである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である。Bitinaiteetal.1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。従って、本開示の目的のためには、開示された融合タンパク質で使用されるFokI酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。従って、ジンクフィンガーFokI融合体を使った標的二重鎖切断および/または細胞配列の標的置換のためには、それぞれFokI切断ハーフドメインを含む2つの融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび2つのFokI切断ハーフドメインを含む単一ポリペプチド分子を使うこともできる。ジンクフィンガーFokI融合体を使った標的切断および標的配列変化のためのパラメーターは、本開示の別のところで提供される。切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体を作り例えば、二量体化、機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれの部分であってもよい。代表的タイプIIS制限酵素は、国際公開第07/014275号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。追加の制限酵素は、また、分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらも、本開示で意図されている。例えば、Robertsetal.2003NucleicAcidsRes.31:418-420、を参照。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、1つまたは複数の操作された切断ハーフドメインまた、二量体化ドメイン変異体とも呼ばれるを含み、これは、例えば、米国特許公開第20050064474号;同20060188987号および同20080131962号に記載されているように、ホモ二量体化を最小限にするか、または防ぐ。これらの開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。FokIの位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、および538のアミノ酸残基は、全て、FokI切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。強制的ヘテロダイマーを形成する代表的FokIの操作された切断ハーフドメインには、第1の切断ハーフドメインが、FokIの490および538の位置のアミノ酸残基に変異を含み、第2の切断ハーフドメインが486および499の位置のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。従って、一実施形態では、490の位置の変異がGluEをLysKで置換し;538の位置の変異がIsoIをLysKで置換し;486の位置の変異がGlnQをGluEで置換し;さらに499の位置の変異がIsoIをLysKで置換する。具体的には、本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、1つの切断ハーフドメインで位置490E→Kおよび538I→Kを変異させてE490K:I538Kと命名されている操作された切断ハーフドメインを産生し、また、別の切断ハーフドメインで位置486Q→Eおよび499I→Lを変異させてQ486E:I499Lと命名されている操作された切断ハーフドメインを産生することにより調製された。本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小化または停止された強制的ヘテロダイマー変異体である。例えば、国際公開第07/139898号の実施例1を参照。ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置486、499および496に変異野性型FokIに対して番号付け、例えば、位置486の野性型GlnQ残基をGluE残基で置換する変異、位置499の野性型IsoI残基をLeuL残基で置換する変異、および位置496の野性型AsnN残基をAspDまたはGluE残基それぞれ、ELDおよびELEドメインとも呼ばれるで置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置490、538および537野性型FokIに対して番号付けに変異、例えば、位置490の野性型GluE残基をLysK残基で置換する変異、位置538の野性型IsoI残基をLysK残基で置換する変異、および位置537の野性型HisH残基をLysK残基またはArgR残基で置換する変異それぞれ、KKKおよびKKRドメインとも呼ばれるを含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、位置490および537野性型FokIに対して番号付けに変異、例えば、位置490の野性型GluE残基をLysK残基で置換する変異、および位置537の野性型HisH残基をLysK残基またはArgR残基で置換する変異それぞれ、KIKおよびKIRドメインとも呼ばれるを含む。米国特許出願第12/931,660号を参照。本明細書記載の操作された切断ハーフドメインは、任意の適切な方法、例えば、米国特許公開第20050064474号に記載のように、野性型切断ハーフドメインFokIの部位特異的変異誘発を使って調製可能である。C.追加の標的切断方法任意のRosa遺伝子中に標的部位を有するいずれかのヌクレアーゼは、本明細書で開示の方法に使用可能である。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、その内の一部は、統計的原則に基づくと、ヒト大のゲノム中に1回は存在する可能性がある。Rosa遺伝子中に標的部位を有するこのようなヌクレアーゼのいずれかは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、またはそれに追加して、標的切断の目的で使用可能である。代表的ホーミングエンドヌクレアーゼには、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevIIおよびI-TevIII、が含まれる。それらの認識配列は既知である。また、米国特許第5、420、032号;同6、833、252号;Belfortetal.1997NucleicAcidsRes.25:3379-3388;Dujonetal.1989Gene82:115-118;Perleretal.1994NucleicAcidsRes.22、1125-1127;Jasin1996TrendsGenet.12:224-228;Gimbleetal.1996J.Mol.Biol.263:163-180;Argastetal.1998J.Mol.Biol.280:345-353およびtheNewEnglandBiolabsカタログ、も参照のこと。大抵のホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性は、認識部位の点では絶対的ではないが、部位は、哺乳類サイズのゲノム当たりの単一切断イベントを、単一コピーの認識部位を含む細胞中でホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより得ることができる充分な長さである。また、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は、操作することにより、非天然標的部位に結合できることも報告されている。例えば、Chevalieretal.2002Molec.Cell10:895-905;Epinatetal.2003NucleicAcidsRes.31:2952-2962;Ashworthetal.2006Nature441:656-659;Paquesetal.2007CurrentGeneTherapy7:49-66、を参照。送達本明細書記載のZFNは、例えば、ZFNmRNAの注入等のいずれかの適切な手段により標的細胞に送達可能である。Hammerschmidtetal.1999MethodsCellBiol.59:87-115、を参照のこと。ジンクフィンガー含有タンパク質の送達方法は、例えば、米国特許第6,453,242号;同6,503,717号;同6,534,261号;同6,599,692号;同6,607,882号;同6,689,558号;同6,824,978号;同6,933,113号;同6,979,539号;同7,013,219号;および同7,163,824号に記載されており、これら全ての本開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書記載のZFNは、また、1つまたは複数のZFNをコードする配列を含むベクターを使って送達可能である。任意のベクター系が使用可能で、限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター;ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、等が含まれる。また、米国特許第6,534,261号;同6,607,882号;同6,824,978号;同6,933,113号;同6,979,539号;同7,013,219号;および同7,163,824号を参照のこと。これらは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれかが、1つまたは複数のZFNコード化配列を含むことができるのは明らかであろう。従って、1つまたは複数の対のZFNが細胞中に導入される場合、ZFNは、同じベクターで運ばれても、または異なるベクターで運ばれてもよい。複数のベクターが使用される場合は、それぞれのベクターは、1つまたは複数のZFNをコードする配列を含んでもよい。従来のウイルスおよび非ウイルス系遺伝子移入方法は、操作されたZFPをコードする核酸を細胞中に導入するのに使用可能である。このような方法は、また、ZFPをコードする核酸を細胞にインビトロで投与するためにも使うことができる。ある特定の実施形態では、ZFPをコードする核酸が、インビボまたはエクスビボでの使用のために投与される。非ウイルスベクター送達システムには、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ウイルス粒子、およびDNAの試薬増強取込が含まれる。例えば、Sonitron2000systemRich-Marを使ったソノポレーションは、また、核酸の送達に使用可能である。ウイルスベクター送達システムには、DNAおよびRNAウイルスが含まれ、これは、細胞に送達後、エピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有する。追加の代表的核酸送達システムには、AmaxaBiosystemsCologne、Germany、Maxcyte、Inc.Rockville、Maryland、BTXMolecularDeliverySystemsHolliston、MAおよびCopernicusTherapeuticsInc、例えば、米国特許第6008336号参照により提供されるものが含まれる。リポフェクションについては、例えば、米国特許第5,049,386号,同4,946,787号;および同4,897,355号に記載されている。またリポフェクション試薬は、市販されている例えば、Transfectam商標およびLipofectin商標。ポリヌクレオチドの効率的受容体認識リポフェクションに適切な陽イオン性および中性脂質には、Felgner、国際公開第91/17424号、同91/16024号のものが含まれる。送達は、細胞エクスビボで投与に対しても、または標的組織インビボで投与に対して行ってもよい。標的リポソーム、例えば、免疫脂質immunolipid複合体を含む脂質:核酸複合体の調製は、当業者にはよく知られている例えば、Crystal、Science270:404-4101995;Blaeseetal.、CancerGeneTher.2:291-2971995;Behretal.、BioconjugateChem.5:382-3891994;Remyetal.、BioconjugateChem.5:647-6541994;Gaoetal.、GeneTherapy2:710-7221995;Ahmadetal.、CancerRes.52:4817-48201992;米国特許第4,186,183号、同4,217,344号、同4,235,871号、同4,261,975号、同4,485,054号、同4,501,728号、同4,774,085号、同4,837,028号、および同4,946,787号を参照。追加の送達方法には、EnGeneICdeliveryvehicleEDVに送達する核酸のパッケージングの使用が含まれる。これらのEDVは、1つの抗体のアームが標的組織に対する特異性を有し、もう一方がEDVに対し特異性を有する二重特異性抗体を使って、特異的に標的組織に送達される。抗体は、EDVを標的細胞表面に運び、次に、EDVがエンドサイトーシスにより細胞中に取り込まれる。細胞中に入るとすぐに、含有物が放出されるMacDiarmidetal2009NatureBiotechnologyvol277p.643、を参照。上記したように、開示された方法と組成物はあらゆるタイプの細胞に使用可能である。動物細胞の子孫、変異体および誘導体にも使用できる。応用開示された方法と組成物は、いずれのRosa遺伝子または複数遺伝子のゲノム編集にも使用可能である。ある特定の応用では、この方法と組成物は、ゲノムRosa配列の不活化に使用できる。他の応用では、この方法と組成物は、未編集遺伝子またはヒト化遺伝子の組込みに比較して、異なる発現を有する新規対立遺伝子型の遺伝子の生成を含む、ランダム変異の生成を可能とし、これが、次に、動物モデルの生成を可能とする。他の応用では、この方法と組成物は、遺伝子の決められた位置でのランダム変異を生成するため使用でき、これにより、新規対立遺伝子型のそれらの遺伝子を有する動物の同定または選択が可能となる。他の応用では、この方法と組成物は、外因性のドナー配列の任意のゲノムの選択領域、例えば、マウスまたはラットRosa遺伝子中への標的組込みを可能とする。調節配列例えば、プロモーターを、標的の手法で対象部位に組み込むことができる。組込みは、例えば、宿主細胞のゲノム中への物理的挿入および、核酸複製プロセスを介したドナー配列の宿主細胞ゲノム中への複写による組込みの両方が意図される。ドナー配列は、また、核酸、例えば、shRNA、miRNA等を含んでもよい。これらの小分子核酸ドナーは、ゲノム内の対象遺伝子に与えるそれらの効果を調査するために使用できる。追加の対象ドナー配列は、疾患モデルに関連するタンパク質をコードするヒト遺伝子であってもよい。このような遺伝子の非制限的例には、ヒト因子VIIIおよびヒト因子IXが含まれる。従って、これらの遺伝子のRosa遺伝子座中への挿入が、研究者がこれらタンパク質をより詳細にインビボで調査することを可能とする。動物遺伝子のゲノム編集例えば、不活性化、組込みおよび/または標的またはランダム変異は、例えば、単一切断イベント、切断に続く非相同末端結合、切断に続く相同指向修復機序、切断に続くドナー配列の物理的組込み、2つの部位の切断に続く2つの切断部位間の配列削除のための結合、ミスセンスまたは非センスコドンのコード領域中への標的組換え、遺伝子または調節領域を破壊するための無関係の配列すなわち、詰め物stuffer配列の遺伝子またはその調節領域中への標的組換え、または転写物のミススプライシングを起こすためのスプライス受容体配列のイントロン中への標的組換え、により達成可能である。米国特許公開第20030232410号;同20050208489号;同20050026157号;同20050064474号;同20060188987号;同20060063231号;および国際公開第07/014275号、を参照のこと。これらの開示は、参照によってその全体が組み込まれる。Rosa遺伝子のZFN媒介ゲノム編集に関しては、種々の応用がある。本明細書記載の方法と組成物は、ヒト疾患モデルの生成を可能とする。例えば、p53遺伝子の編集により、癌調査および癌治療試験のための動物モデルを提供する癌ラットの生成が可能となる。実施例1:ラットゲノムのrRosa26核酸領域への標的組込み用制限断片長多型RFLPドナー核酸の構築また、NotIおよびPmeIRFLP部位のラットゲノムのrRosa26領域への標的組込み用にプラスミドも構築した。プラスミドの設計および構築については、上記した。rRosa26相同性領域の増幅に使用したPCRプライマー対を表1に示す。ラットRosa26の表示した標的部位を標的としたジンクフィンガー設計を表2と3に示す。ZFP認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドを大文字、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ラットC6細胞は、GFP対照またはZFNの各8対を形質移入された。形質移入の一日後、その細胞DNAを調製した。ZFN切断を、例えば、米国特許公開第20080015164号;同20080131962号および同20080159996号に記載のように、それぞれのプライマーで増幅した産物を使って、Surveyor商標ヌクレアーゼでアッセイした。結果を図1に示す。矢印で示している切断は、ZFN対を含む試料でのみ認められ、GFP特異的ZFNを形質移入した細胞を有する対照試料では認められなかった。実施例2:マウスRosa26遺伝子座特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼマウスRosa26の表示標的部位を標的にしたジンクフィンガー設計を表4と5に示す。ZFP認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドを大文字、非接触ヌクレオチドを小文字で示す。ZFN対18473/18477および18473/25096に対し上述のようにCel-I分析を行い、認められたパーセントNHEJは、次の通りであった:ZFN対18477/18473では26.5NHEJ、およびZFN対18473/25096では35.70NHEJ。実施例3:ドナーポリヌクレオチドのマウスゲノムのRosa26遺伝子座への標的組込み次のオリゴヌクレオチドを使って作ったPCR産物のクローニングによりRosaドナーを構築した:527bp左アームに対しては、PCR用に使用したオリゴヌクレオチドは、5’-ggctcgagtgagtcatcagacttctaagatcagg-3’配列番号31;413bp左アームドナーに対しては、逆方向プライマー5’-ctgaattcgaatgggcgggagtcttctgggca-3’配列番号33と組み合わせた5’-ggctcgagttttgataaggctgcagaag-3’配列番号32であった。640bp右アームに対しては、PCR用に使用したオリゴヌクレオチドは、5’-ccaagcttggaggtaggtggggtgagg-3’配列番号34;200bpアームに対しては、5’-ccaagcttagtcgctctgagttgttatc-3’配列番号35;100bpアームに対しては、逆方向プライマー5’-cattcgaattcagaaagactggagttgcagatc-3’配列番号37と組み合わせた5’-ccaagctttctgggagttctctgctgcc-3’配列番号36であった。個別アームアンプリコンを、融合PCRにより連結し、クローニングして種々の相同性のアームを有するドナーを産生した。Amaxa-ShuttleNeuro2a高効率プロトコルを使って、Neuro2a細胞200、000を、2μgのSF溶液中の表示したドナーと一緒に、各400ngのSBS18473および18477で同時形質移入した。形質移入の72時間後、ゲノムDNAを採取し、100ngを使って、5’-cccagctacagcctcgattt-3’、5’-cacaaatggcgtgttttggt-3’および試料当たり5μCiの32P-dATPと32P-dCTPの両方を用いて、アニール温度68°C72°Cで2分追加、28サイクルでPCRを行った。G-50カラム精製の後、各50μL反応物の内10μLを、EcoRIを使い37°Cで2時間消化し、10ポリアクリルアミドゲルに供した。図2に示すように、ドナーヌクレオチドが表示した頻度でRosa遺伝子座中に挿入された。本明細書で取り上げた全特許、特許出願および出版物は、本明細書により、参照によってその全体が組み込まれる。明確な理解を目的として、説明と例を用いて幾分詳細に開示を提供してきたが、本開示の精神や範囲から逸脱することなく、種々の変更と改変を行い得ることは当業者には明らかであろう。従って、前出の記載と例は、限定するものと解釈されるべきではない。"