"iRNAウイルス由来の決定された異種のウイルスエンベロープタンパク質単数又はウイルスエンベロープタンパク質複数で偽型化され、並びにiiそのゲノム中に、哺乳動物宿主を感染し得るプラスモディウム属Plasmodium寄生虫の前赤血球ステージ抗原のエピトープ単数又は複数を有する少なくとも1つのポリペプチド単数又は複数をコードする少なくとも1つの組み換えポリヌクレオチドを含み、ここで前記エピトープ単数又は複数は、T-エピトープ単数又は複数及び任意でB-エピトープ単数又は複数を含む、レンチウイルスベクター粒子。複製能力の無いHIVに基づくベクター粒子である、請求項1に記載のレンチウイルスベクター粒子。少なくとも1つの組み換えポリヌクレオチドが、ヒトに感染するプラスモディウム属寄生虫のサーカムスポロゾイトタンパク質CSPからの抗原のポリペプチド単数又は複数をコードする、又はスポロゾイト表面タンパク質2TRAP/SSP2、肝臓ステージ抗原LSA、LSA3、Pfエクスポーティッドタンパク質1PfExp1、Pf抗原2スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原SALSA、スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチSTARPからなる群から選択される抗原のポリペプチドをコードする、核酸配列を含む、請求項1に記載のレンチウイルスベクター粒子。そのゲノム中に、メロゾイト表面タンパク質1MSP2、特にメロゾイト表面タンパク質1MSP-1、メロゾイト表面タンパク質2MSP-2、メロゾイト表面タンパク質3MSP-3、メロゾイト表面タンパク質4MSP-4、メロゾイト表面タンパク質6MSP-6、MSP3-GLURP融合タンパク質、リング-感染赤血球表面抗原RESA、桿小体関連タンパク質1RAP-1、頂端膜抗原1AMA-1、赤血球結合抗原EBA-175、赤血球膜結合巨大タンパク質又は抗原332Ag332、dnaK型分子シャペロン、グルタミン酸リッチタンパク質GLURP;MSP3-GLURP融合タンパク質、赤血球膜タンパク質1EMP-1、セリンリピート抗原SERA、クラスター化したアスパラギンリッチタンパク質CARP、サーカムスポロゾイトタンパク質関連抗原前駆体CRA、細胞接着結合無性タンパク質CLAG、酸塩基リピート抗原ABRA又は101kDaマラリア抗原、桿小体抗原タンパク質RAP-2、Knob結合ヒスチジンリッチタンパク質KHRP、桿小体抗原タンパク質RAP、システインプロテアーゼ、仮定的なタンパク質PFE1325w、保護抗原MAg-1、フルクトース2リン酸アルドラーゼ、リボソームリンタンパク質P0、P型ATPase、グルコース制御タンパク質GRP78、アスパラギン及びアスパラギン酸リッチタンパク質AARP1、散在リピート抗原又はPFE0070wの群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び/又は有性ステージ及びスポロゾイト表面抗原、抗原Pfg27/25、抗原QF122、11-1ポリペプチド、生殖母体特異的表面タンパク質Pfs230、オーキネート表面タンパク質P25、キチナーゼ、多剤耐性タンパク質MRPの群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。組み換えポリヌクレオチド単数又は複数が、哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド配列を有し、任意でHIVに基づくゲノムの配列が、哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド配列を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。組み換えポリヌクレオチドが、少なくとも一つのCSP抗原のポリペプチドをコードし、ここで前記ポリペプチドが前記CSPのGPI-アンカーリングモチーフを欠損している、請求項1~5のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。統合能力の欠損しているベクター粒子、又は統合能力を有するベクター粒子のいずれかから選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。Indiana株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、NewJersey株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Cocal株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Isfahan株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Chandipura株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Pyri株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、又はSVCV株のVSV-Gタンパク質単数又は複数の群から選択される水疱性口内炎ウイルスVSVのウイルス膜貫通型糖化Gエンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化される、請求項1~7のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。iパッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にHIV-1のシス作用配列を含み、更に、機能性のレンチウイルス、特にHIV-1のDNAflapエレメントを含み、任意で、統合に必要なシス作用配列を含むベクタープラスミド、ここで前記ベクタープラスミドは更に、ii制御発現配列、特にプロモーターの制御下で、プラスモディウム属寄生虫のcs遺伝子の切断された、哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列のポリヌクレオチドを含む;VSV-Gエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数をコードするポリヌクレオチドを含むVSV-Gエンベロープ発現プラスミド、ここで前記ポリヌクレオチドは、制御発現配列の制御下にある;及びキャプシド形成プラスミドがレンチウイルス、特にHIV-1の、統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なgag-polコーディング配列、又は統合が欠損したベクター粒子の産生に好適な改変されたgag-polコーディング配列のいずれかを含み、ここで前記gag-pol配列がDNAflapエレメントとして同一のレンチウイルスサブファミリー由来であり、前記gag-pol若しくは改変されたgag-pol配列が制御発現配列の制御下にある、キャプシド形成プラスミド;を用いた、哺乳動物細胞の共トランスフェクションから回収された生成物である、請求項1~8のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。iパッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にHIV-1のシス作用配列を含み、更に、機能性のレンチウイルス、特にHIV-1のDNAflapエレメントを含み、任意で、統合に必要なシス作用配列を含むベクタープラスミド、ここで前記ベクタープラスミドは更に、ii制御発現配列、特にプロモーターの制御下で、プラスモディウム属寄生虫のcs遺伝子の切断された、哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列のポリヌクレオチドを含む;VSV-Gエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数をコードするポリヌクレオチドを含むVSV-Gエンベロープ発現プラスミド、ここで前記ポリヌクレオチドは、制御発現配列、特に誘導可能プロモーターを含む制御発現配列の制御下にある;及びキャプシド形成プラスミドが、レンチウイルス、特にHIV-1の統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なgag-polコーディング配列、又は統合の欠損したベクター粒子の産生に好適な改変されたgag-polコーディング配列のいずれかを含み、ここで前記gag-pol配列がDNAflapエレメントとして同一のレンチウイルスサブファミリー由来であり、前記レンチウイルスのgag-pol若しくは改変されたgag-pol配列が制御発現配列の制御下にある、キャプシド形成プラスミド;を用いた、安定的な細胞株から回収された生成物である、請求項1~9のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。レンチウイルスベクター粒子のベクターゲノムが、機能性のレンチウイルス遺伝子を欠損しているレンチウイルスに基づく配列、特にHIV-1に基づく配列を含み、パッケージング、逆転写、及び転写に必要なシス作用配列を含み、更に、機能性のレンチウイルス、特にHIV-1のDNAflapエレメントを含み、ここで前記ベクターゲノムが、前記シス作用配列において、少なくとも一つが以下:aレンチウイルスゲノムからの3’LTR配列が、切断され、U3領域のエンハンサーを欠損している;bレンチウイルスゲノムからの3’LTR配列が、切断され、U3領域を欠損している、又はU3領域において部分的に欠失している;cLTR5’のU3領域が、非レンチウイルスU3領域により、又はtat独立第一転写を促すのに好適なプロモーターにより置き換えられるのように改変されたポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項1~10のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。i第一の決定された異種のウイルスエンベロープタンパク質単数又はウイルスエンベロープタンパク質複数で偽型化される、請求項1~11のいずれか一項に定義のレンチウイルスベクター粒子;iiiにおいてレンチウイルスベクター粒子と別に提供される場合、前記第一の異種のウイルスエンベロープ単数又は複数と異なる、第二の決定された異種のウイルスエンベロープタンパク質単数又はウイルスエンベロープタンパク質複数で偽型化される、請求項1~11のいずれか一項に定義のレンチウイルスベクター粒子;ここで、前記第一及び第二のウイルスエンベロープタンパク質単数又は複数は、互いに血清中和せず、哺乳動物細胞のインビボ形質導入に好適である、を含む、哺乳動物宿主に分離して投与するための化合物の組み合わせ。前記第一及び第二のウイルスエンベロープタンパク質が以下:それぞれIndiana株のVSV-G及びNewJersey株のVSV-G、若しくはその逆、又は前記第一及び第二のエンベロープタンパク質の1つ又は双方が、天然のIndiana株のVSV-G若しくは/及び及びNewJersey株のVSV-Gの改変型、又は前記第一及び第二のエンベロープタンパク質の少なくとも一つが、キメラのVSV-Gタンパク質であって、ここで以下のドメイン:輸送決定因子YTDIE、細胞質尾部、膜貫通ドメイン、又は細胞質ドメインの少なくとも一つが、Indiana株由来である、又は第一のウイルスエンベロープタンパク質が、Indiana株のVSV-G若しくはNewJersey株のVSV-Gのいずれかであり、第二のウイルスエンベロープタンパク質が、Cocal株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Isfahan株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Chandipura株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Pyri株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、及びSVCV株のVSV-Gタンパク質単数又は複数の群から選択される、である、請求項12に記載の化合物の組み合わせ。レンチウイルス粒子が、iCSP抗原のポリペプチド、又はGPIアンカーリングモチーフを欠損したCSP抗原のポリペプチド、及びiiスポロゾイト表面タンパク質2TRAP/SSP2、肝臓ステージ抗原LSA、Pfエクスポーティッドタンパク質1PfExp1、Pf抗原2の群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも一つの更なるポリペプチドを含む、異なるポリペプチドをコードし、ここで、前記抗原の異なるポリペプチドが、同一のレンチウイルス粒子又は異なるレンチウイルス粒子から発現される、請求項9又は10に記載の、分離して提供される化合物の組み合わせ。レンチウイルス粒子が、メロゾイト表面タンパク質1MSP-1、メロゾイト表面タンパク質2MSP-2、頂端膜抗原1AMA-1、セリンリピート抗原SERA、GLURP抗原、Pf155/RESAリング-感染赤血球表面抗原、又は桿小体関連タンパク質1RAP-1若しくは桿小体関連タンパク質2RAP-2の群において選択されるポリペプチドをコードする、請求項1~14のいずれか一項に記載の、分離して提供される、化合物の組み合わせ。哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、請求項1~15のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に使用のための好適な投与ビヒクルで製剤化され、ここで前記使用は、宿主の細胞性免疫応答をプライムするために有効量のレンチウイルス粒子を投与すること、及び宿主の細胞性免疫応答をブーストするために有効量のレンチウイルス粒子を後で投与すること、及び任意でブーストについての前記投与ステップを繰り返すことを含む免疫付与パターンを含み、ここでプライム又はブートするステップのそれぞれにおいて投与されるレンチウイルス粒子は、互いに血清中和をしない異なる偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化され、ここで前記プライム又はブーストするステップは、少なくとも6週間、特に少なくとも8週間の時間空けられる、請求項1~16のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。分離して提供される用量の前記レンチウイルス粒子を含む投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主における、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のために用いられ、ここで、細胞性免疫応答をプライムすることを目的とする用量は、中程度の用量であり、細胞性免疫応答をブーストすることを目的とする用量は、プライムするのための用量より多い、請求項1~17のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。分離して提供される用量の前記レンチウイルス粒子を含む投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主においてマラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫に用いられ、ここで、統合能力のあるベクター粒子が用いられる場合、細胞性免疫応答をプライム及びブートすることを目的とする用量は、107~109のレンチウイルス粒子を含み、並びに統合能力のないベクター粒子が用いられる場合、細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、108~1010のレンチウイルス粒子を含む、請求項1~18のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。宿主において、少なくとも1つの以下の効果:Iマラリア寄生虫感染、特にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparum、プラスモディウムマラリアエPlasmodiummalariae、プラスモディウムビバックスPlasmodiumvivax、プラスモディウムノウレシPlasmodiumknowlesi、又はプラスモディウムオバールPlasmodiumovaleに対する無菌保護を誘発すること;IIマラリア寄生虫の細胞外形態を阻害すること;IIIマラリア寄生虫による肝細胞感染を予防すること、又は感染の肝臓ステージ増幅の阻害;IVマラリア寄生虫抗原単数又は複数に対する特異的T細胞免疫応答、特にCD8T細胞応答及び/又は特異的CD4T細胞応答を誘発すること;V寄生虫抗原単数又は複数に対するB細胞応答を誘発すること;VIマラリア寄生虫による感染の影響を減少又は緩和するために寄生虫血症を制御すること;VII寄生虫による感染又は寄生虫により誘導される病理に対する保護細胞性免疫を誘発すること;VIIIメモリーT細胞免疫応答を誘発すること;IXマラリア寄生虫による感染の間、CD4及びCD8T細胞応答の早期の及び高い回復を誘発すること;Xプラスモディウム属感染に関して肝臓内のメモリーリンパ球を刺激することによる早期の強力なCTCD8T応答を誘発すること;XIマラリア寄生虫が免疫応答を回避することを防ぐこと、従って、マラリア寄生虫による感染の長期の制御を可能にすること;を得るため好適である、投与用量及び投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主における、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に用いられる、請求項1~19のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための免疫原性組成物の製造のための、請求項1~20のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせの使用。アジュバント化合物、及び/又は免疫付与化合物、及び適切な送達ビヒクルと関連して、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に用いられる、請求項1~21のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせ。本発明の特定の実施形態では、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージのコードされたポリペプチドは、B-エピトープ単数又は複数を更に含む。本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、能力のある即ち、統合能力のある、又は欠損した即ち、統合能力のない粒子のいずれかを発現するように設計される。表現マラリア寄生虫及びプラスモディウム属寄生虫は、本願において互換的に用いられる。それらは、特にスポロゾイト、特に接種後に血流中に存在するスポロゾイト、又は肝細胞において発達するスポロゾイト、特に肝細胞において産生されるメロゾイトを含むメロゾイトを含む前赤血球ステージの形態、及びサイクルの赤血球ステージの形態、例えば、サイクルの赤血球細胞に含まれるメロゾイトを含む、哺乳動物、特にヒト宿主においてサイクルの様々なステージに関連する寄生虫の全ての形態を指す。寄生虫のこれらの形態は、当該技術分野においてよく知られており、同定されている様々な特異的抗原により特徴付けられ、感染のステージを参照することにより指定され得る。表現T-エピトープ及びB-エピトープは、T細胞により促される適応免疫応答、及びB細胞により促される免疫応答のそれぞれに関与する抗原決定基を意味する。特に、前記T-エピトープ及びそれぞれのB-エピトープは、好適な条件下で宿主に送達される場合、T細胞、それぞれのB細胞免疫応答を誘発する。本発明において定義されるレンチウイルスベクター粒子又はレンチウイルスベクター、若しくはレンチウイルスに基づくベクター粒子は、特定のレンチウイルス、特にHIV、特にHIV-1と異なるウイルスに由来するエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数を有するベクター粒子からなる、偽型化されたレンチウイルスベクターであり、それはレンチウイルスベクター粒子のベクターゲノムを提供する。従って、前記エンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数は、粒子のベクターゲノムに関して、異種のエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数である。以下の頁では、エンベロープタンパク質単数又は複数はまた、本発明を実行するのに好適な任意の種類のエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数を含むことを言及する。本願において、特定の実施形態では、レンチウイルスベクターレンチウイルスに基づくベクターは、HIVに基づくベクター、及び特にHIV-1に基づくベクターを含むことを言及する。本発明によるレンチウイルスベクターは、置換のベクターであり、それは、生物学的に活性なレンチウイルスタンパク質の発現を防ぐために、特にHIVの場合、機能性ENV、GAG、及びPOLタンパク質、並びに任意でレンチウイルス、特にHIVの更なる機能性及び/又はアクセサリー及び/又は制御タンパク質の前記輸送ベクターによる発現を防ぐために、レンチウイルスタンパク質をコードする元のレンチウイルスの配列が、ベクターのゲノムにおいて本質的に欠失している、又は存在する場合に改変され、特に変異誘発され、特に切断されていることを意味する。ベクター粒子のベクターゲノムは、マラリア寄生虫のポリペプチド単数又は複数をコードする対象のポリヌクレオチド又は導入遺伝子を含む組み換えベクターである。ベクターゲノムのレンチウイルスに基づく配列及びポリヌクレオチド/導入遺伝子は、プラスミドベクターにより産み出され、従って、配列ベクターとしても称されるトランスファーベクターを生じる。従って、これらの発現は、本願において互換的に用いられる。本明細書で定義されるベクターゲノムは、従って、その発現のための適切な制御配列の制御下に置かれるいわゆる組み換えポリヌクレオチドとは別に、前記ゲノムの非コーディング領域であり、DNA又はRNA合成及びプロセッシングのための認識シグナルを提供するために必要な元のレンチウイルスゲノムの配列ミニウイルスゲノムを含む。これらの配列は、パッケージング、逆転写及び転写のために、その上本発明の特定の目的のために必要であるシス作用配列であり、それらは、細胞における核内輸送、及び従って前記細胞における導入遺伝子輸送効率を助ける機能性配列を含み、そのエレメントは、DNAFlapエレメントとして記載され、レンチウイルスゲノム配列、又はいくつかのレトロエレメント、例えば酵母のそれに存在するいわゆるセントラルcPPT-CTSヌクレオチドドメインを含む、又はからなる。本発明のレンチウイルスベクターを調製するために用いられるベクターゲノムの構造及び組成は、当該技術分野において記載される原理、及びZennouetal,2000;FiratH.etal,2002;VandenDriesscheT.etalに最初に開示された斯かるレンチウイルスベクターの実施例に基づく。この種類の構築物は、本明細書に言及されるように、CNCMInstitutPasteur,Franceにおいて寄託されている。この点において、参照はまた、特許出願である、国際公開第99/55892号、国際公開第01/27300号、及び国際公開第01/27304号における、寄託された生物材料を含む開示に対してなされる。本発明の特定の実施形態によれば、ベクターゲノムは、2つの長い末端反復LTR間の全てのウイルスタンパク質コーディング配列が、マラリア寄生虫のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドで置き換えられた置換ベクターでもよく、ここでDNA-Flapエレメントは、本明細書に記載される要求されるシス作用配列に最挿入される。ベクターゲノムの組成に関する更なる特徴は、粒子の調製に関して開示される。本発明のレンチウイルスベクター粒子は、そのゲノム中に、本明細書に開示されるような、前赤血球ステージ抗原のエピトープ単数又は複数を含む少なくとも1つのポリペプチドをコードする1超の組み換えポリヌクレオチドを含んでもよい。特に、前記ベクターゲノムは、ゲノム上に連続、又は分離しており、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージの同一若しくは異なる抗原のいずれかの異なるポリペプチド、又はマラリア寄生虫の異なる形態の異なる抗原の異なるポリペプチド、特に、寄生虫の前赤血球ステージの及び赤血球ステージの抗原をコードする、二つのポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、二つの組み換えポリヌクレオチドを含み、それらのそれぞれは、異なるポリペプチド、及び同一のステージの異なる抗原由来の各ポリペプチドをコードする。表現抗原のエピトープ単数又は複数を有するポリペプチドは、本発明によれば、プラスモディウム属寄生虫の天然の抗原、それらの変異誘発型、及び特に斯かる天然の抗原のフラグメント、及び特に、斯かる天然の抗原の切断型でもよいポリペプチドを意図する。ポリペプチドは、1又はいくつかのエピトープ単数又は複数を提供するのに十分なアミノ酸配列を有し、従って、立体配座のBエピトープについて、少なくとも約4アミノ酸残基長、特に約4~約8アミノ酸残基長、又は連続的なTエピトープについて、少なくとも約9アミノ酸残基、特に約9~約19アミノ酸残基を有する。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子の組み換えポリヌクレオチドは、前記ドメインが、宿主における免疫応答の誘発に対して有用でない、又は有害である場合、マラリア寄生虫の抗原の切断型、特に完全長の即ち、天然の抗原の機能性ドメインの欠失をもたらすフラグメントをコードする。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、プラスモディウム属寄生虫、特にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparum、又はプラスモディウムマラリアエPlasmodiummalariae、プラスモディウムビバックスPlasmodiumvivax、プラスモディウムオバールPlasmodiumovale、又はプラスモディウムノウレシPlasmodiumknowlesiのサーカムスポロゾイトタンパク質からの抗原のポリペプチド単数又は複数をコードする少なくとも1つの組み換えポリヌクレオチドを含む。それは、特にCSPの切断型、及び特に、CSPのGPIアンカーリングモチーフを欠失しているポリペプチドである。本発明の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、場合によりCSPの抗原のポリペプチドに加えて、それらのゲノム中に、スポロゾイト表面タンパク質2TRAP/SSP2、肝臓ステージ抗原LSA、特にLSA3、Pfエクスポーティッドタンパク質1PfExp1/Py肝細胞赤血球タンパク質PyHEP17、並びにPf抗原2ここで、Pfは、プラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparumを表し、Pyは、プラスモディウムヨエリPlamsodiumyoeliiを表す、スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原SALSA、スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチSTARP、又は他の前赤血球抗原の群から選択される抗原のポリペプチド単数又は複数をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。本発明の特定の実施形態では、マラリア寄生虫の抗原のポリペプチドは、CSPタンパク質のフラグメントであり、それは、ベクターゲノムにより、前赤血球ステージからの抗原又は赤血球ステージの抗原のいずれかである、マラリア寄生虫の別の抗原のポリペプチドと共発現される。本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る赤血球ステージの抗原は、メロゾイト表面タンパク質1MSP2、特にメロゾイト表面タンパク質1MSP-1、メロゾイト表面タンパク質2MSP-2、メロゾイト表面タンパク質3MSP-3、メロゾイト表面タンパク質4MSP-4、メロゾイト表面タンパク質6MSP-6、リング-感染赤血球表面抗原RESA、桿小体関連タンパク質1RAP-1、頂端膜抗原1AMA-1、赤血球結合抗原EBA-175、赤血球膜結合巨大タンパク質又は抗原332Ag332、dnaK型分子シャペロン、グルタミン酸リッチタンパク質GLURP、特にMSP3-GLURP融合タンパク質国際公開第2004/043488号;ref28、赤血球膜タンパク質1EMP-1、セリンリピート抗原SERA、クラスター化したアスパラギンリッチタンパク質CARP、サーカムスポロゾイトタンパク質関連抗原前駆体CRA、細胞接着結合無性タンパク質CLAG、酸塩基リピート抗原ABRA又は101kDaマラリア抗原、桿小体抗原タンパク質RAP-2、Knob結合ヒスチジンリッチタンパク質KHRP、桿小体抗原タンパク質RAP、システインプロテアーゼ、仮定的なタンパク質PFE1325w、保護抗原MAg-1、フルクトース2リン酸アルドラーゼ、リボソームリンタンパク質P0、P型ATPase、グルコース制御タンパク質GRP78、アスパラギン及びアスパラギン酸リッチタンパク質AARP1、散在リピート抗原又はPFE0070wである。本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る有性ステージの抗原は、有性ステージ及びスポロゾイト表面抗原、抗原Pfg27/25、抗原QF122、11-1ポリペプチド、生殖母体特異的表面タンパク質Pfs230、オーキネート表面タンパク質P25、キチナーゼ、多剤耐性タンパク質MRPである。これらの抗原は、P.ファルシパルムP.Falciparumを参照することにより開示され、他のプラスモディウム属種において同等のものを有し得る。それらは、VaughanK.etal18に報告される。VaughanKらは、特に、本発明のベクターに用いられる組み換えポリヌクレオチド単数又は複数を調製するために、基礎として当業者により用いられ得る前記抗原のエピトープを開示する。プラスモディウム属寄生虫の前述の抗原は、先行技術に開示され。入手可能なデータベースであるそれらの配列を通して含まれる。サーカムスポロゾイトタンパク質CSPは、本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製のための好ましい抗原の一つである。それは、保護抗体の標的として、従来認識されていたスポロゾイトコートタンパク質を構成する。抗CS抗体を誘発するその能力とは別に、この抗原は、特にCD8T細胞エピトープ及びCD4T細胞エピトープを含む、T-エピトープを更に含む。特定のCSP抗原は、これらの配列の一致について、配列番号20、23、26、27、28、29、30、31、又は配列番号32として、それらのアミノ酸配列を通じて開示される。P.ビバックスP.vivaxの配列は、AY674050.1としてGenBankに与えられる。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、実施例に例証されるようにプラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiの、又は有利にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparumのCSP-抗原の少なくとも1つのポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを有し、例えば、プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoelii中のGPI-アンカーリングモチーフを欠失している前記CSP-抗原のフラグメントに対応するポリペプチドは、配列番号21の配列を有するCSPDGPIである。前記GPIモチーフは、プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiのCSP抗原の天然のアミノ酸配列中のC-末端部分の最後の12アミノ酸残基に対応する。P.ファルシパルムP.FalciparumにおけるCSPタンパク質の前記フラグメントの同等物は、図及び配列に開示され天然のタンパク質について配列番号23、GPIモチーフの欠失した配列について配列番号24、N末端の切断された配列について配列番号25、マラリアに対する保護免疫応答、及び無菌保護さえ誘発するポリペプチドの能力の、好適なネズミモデルにおける証拠を提供するために用いられる。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子のポリヌクレオチド単数又は複数は、哺乳動物コドン最適化COヌクレオチド配列を有し、任意で前記粒子のゲノムのレンチウイルス配列は、哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド配列を有する。特に、哺乳動物、特にヒト細胞において、発現について最適化された場合、コドン最適化ヌクレオチド配列は、斯かる哺乳動物又はヒト細胞において粒子の高い収率の産生を可能にすることが、観察されている。産生細胞は、実施例に例証される。従って、本発明のレンチウイルスベクター粒子が哺乳動物、特にヒト宿主に投与される場合、粒子の高い量は、強力な免疫応答の誘発を助ける前記宿主において産生される。本発明の特定の実施形態では、本明細書で開示されるレンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、上記で開示されるような寄生虫のサイクルの血液ステージの抗原、及び/又は有性ステージの抗原のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを更に含む。ポリペプチドは、天然の抗原、又はそれらの修飾型、特に、T細胞エピトープ単数又は複数若しくはB-細胞エピトープ単数又は複数、又は双方を含む、又はからなるフラグメントである。本発明のレンチウイルスベクター粒子の投与の結果として表現されるポリペプチドの例は、本明細書の下記で開示されるベクタープラスミド又は配列ベクターによりコードされるポリペプチドである。本発明はまた、2010年4月20日にCNCMParis,Franceにおいて寄託され、以下の特徴及び登録番号を有するこれらのベクタープラスミドに特に関する。これらのプラスミドは、本願の図及び配列に記載される。それらが含む導入遺伝子の配列は、P.ヨエリP.yoelii由来である。前記導入遺伝子は、P.ファルシパルムP.Falciparum由来の適切な配列により、有利に置き換えられてもよい。本発明はまた、プラスモディウム属抗原のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが、それらの機能性免疫原性変異体をコードするために改変され、又は別のプラスモディウム属株、特にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparumからの最適化されたポリヌクレオチドコドンに対応することにより置換される、又はCMVプロモーターを本明細書に記載のプロモーターの一つにより置換するために改変される場合、これらのプラスミドの変異体に関する。寄託されるプラスミドでは、プラスモディウムヨエリPalsmodiumyoelii抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、最適化されたコドンである。本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、異種のウイルスエンベロープタンパク質、又はレンチウイルス粒子のゲノムのレンチウイルス配列を提供するレンチウイルスではない、RNAウイルスに由来するエンベロープのウイルスポリタンパク質で偽型化される。レンチウイルスベクター粒子の調製のためのエンベロープタンパク質を分類する例として、本発明は、例えば、Indiana株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、NewJersey株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Cocal株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Isfahan株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Chandipura株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、Pyri株のVSV-Gタンパク質単数又は複数、又はSVCV株のVSV-Gタンパク質単数又は複数の群から選択される水疱性口内炎ウイルスVSVのウイルス膜貫通型糖化いわゆるGタンパク質エンベロープタンパク質単数又は複数に関する。水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質VSV-Gは、野生型粒子の表面コートとして機能する膜貫通型タンパク質である。それはまた、操作されたレンチウイルスベクターに好適なコートタンパク質である。現在、9つのウイルス種は、VSVジェンダーgenderに最終的に分類され、19のラブドウイルスは、暫定的にこのジェンダーに分類され、全ては交差中和の様々な程度を示す。配列決定される場合、タンパク質G遺伝子は、配列相同性を示す。VSV-Gタンパク質は、N末端エクトドメイン、膜貫通領域、及びC末端細胞質尾部を提示する。それは、トランスゴルジネットワーク小胞体及びゴルジ装置を介して細胞表面に輸送される。水疱性口内炎IndianaウイルスVSIV及び水疱性口内炎NewJerseyウイルスVSNJVは、本発明のレンチウイルスベクターを偽型化するため、又はレンチウイルスベクターを偽型化するための組み換えエンベロープタンパク質単数又は複数を設計するための好ましい株である。それらのVSV-Gタンパク質は、GenBankに開示され、いくつかの株が存在している。VSV-GNewJersey株について、参照は、登録番号V01214を有する配列に対して特になされる。Indiana株のVSV-Gについて、参照は、株JO2428に対応して、Genbankにおいて、登録番号AAA48370.1を有する配列に対してなされる。あるいは、VSVの中でも、チャンディプラウイルスCHPV、球菌ウイルスCOCV、ペリネウイルスPERV、ピリウイルスPIRYV、SVCV、又はイスファハンウイルスは、エンベロープタンパク質の偽型化を設計するための、及び特に免疫付与のブーストするステップに用いられる粒子を調製するための優れた候補となり得、従って、本発明のベクター粒子がプライムブースト接種法に用いられる場合、第二のエンベロープタンパク質単数又は複数、若しくは第三のエンベロープタンパク質単数又は複数、又は更なるエンベロープタンパク質単数又は複数を提供する。従って用いられる場合、球菌ウイルスエンベロープタンパク質単数又は複数は、プライムブースト接種法の後期又は最後の投与に好ましい。しかしながら、チャンディプラウイルスCHPV及びピリウイルスPIRYVは、異なるエンベロープで調製される粒子で得られるベクター力価を比較する場合、それらの受容体についてのそれらの低い親和性の結果として、低い融合性を有するエンベロープタンパクを提供し得る。それ故、第一のアプローチでは、これらのエンベロープは、効率的な形質導入能力を有する粒子を調製するためのエンベロープの選択から排除されてもよい。本明細書で言及されるVSV-Gタンパク質のアミノ酸配列及びコーディング配列は、特許出願、国際公開第2009/019612号に開示される。これらのアミノ酸配列の特定の例はまた、配列番号77、79、82、84、86、88、90として本願に提供される。VSV-Gエンコーディング配列を含むプラスミドは、前記出願、国際公開第2009/019612号に開示され、それは参照により援用される。プラスミドは、CNCMParis,Franceに寄託されている。前記エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号76、78、81、83、85、87、89として本願に提供される。本発明の特定の実施形態では、前記第一及び第二、及びもしあるのであれば、前記第三、又は更なるウイルスエンベロープタンパク質単数又は複数は、融合及び/又はエンドサイトーシスにより、抗原提示細胞、及び特に肝臓樹状細胞を含む樹状細胞により摂取され得る。特定の実施形態では、摂取の効率は、偽型化のためのVSVのエンベロープを選択するための特徴として用いられてもよい。この点において、形質導入の相対的な力価DCの力価/他の形質導入された細胞、例えば293T細胞の力価は、試験として考えられてもよく、DCと融合する相対的に優れた能力を有するエンベロープは好ましい。形質導入の相対的な力価は、実施例に例証される。抗原提示細胞APC、特に樹状細胞DCは、適宜免疫組成物として用いられる、偽型化されたレンチウイルスベクターの適切な標的細胞である。VSVエンベロープタンパク質単数又は複数VSV-Gをコードするポリヌクレオチドはまた、脾細胞、特に抗原提示細胞APC又は樹状細胞DC、又は肝臓樹状細胞、肝細胞若しくは非実質細胞を含む肝臓細胞を標的とする。特定のウイルスにおいて表面タンパク質としてしばしば指名されるエンベロープタンパク質単数又は複数は、異なる生物、特にRNAウイルス株に由来すると称され、前記タンパク質単数又は複数において、決定されたRNAウイルスにおいて発現される対応するタンパク質単数又は複数の本質的な特徴は、維持されることを意味する。前記の本質的な特徴は、タンパク質の構造又は機能に関連し、それは前記ベクターを偽型化するために、ベクター粒子の表面において、得られるタンパク質単数又は複数が発現されることを可能にするものである。エンベロープタンパク質は、従って、ベクター粒子上に存在する場合、宿主の標的細胞において認識され、内在化され得る。特定の実施形態では、化合物のキットの偽型化されたレンチウイルスベクターの設計における使用に好適なタンパク質単数又は複数又は糖タンパク質単数又は複数は、多量体のタンパク質として用いられる例えば三量体であるVSV-Gタンパク質。エンベロープタンパク質単数又は複数は、前記タンパク質単数又は複数についてのコーディング配列を含むポリヌクレオチドから発現され、そのポリヌクレオチドは、本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製に用いられるプラスミド設計されたエンベロープ発現プラスミド、又は偽型化envプラスミドに挿入される。エンベロープタンパク質単数又は複数をコードするポリヌクレオチドは、コーディング配列の転写及び/又は発現のための制御配列任意で、転写後制御エレメントPRE、特にポリヌクレオチド、例えばウッドチャック肝炎ウイルスのエレメント、即ちInvitrogenから得られるWPRE配列を含むの制御下にある。従って、インビボで哺乳動物細胞、特にヒト細胞における使用に好適な内在的プロモーター、及び前記プロモーターの制御下でエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む、核酸構築物は提供される。この構築物を含むプラスミドは、粒子の調製に好適な細胞のトランスフェクション又は形質導入に用いられる。プロモーターは、特に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導可能なプロモーターとしてそれらの特性について選択されてもよい。好適なプロモーターの例は、以下の遺伝子:EF1α、ヒトPGK、PPIプレプロインスリン、チオデキストリン、HLADR不変鎖P33、HLADRアルファ鎖、フェリチンL鎖又はフェリチンH鎖、キモシンベータ4、キモシンベータ10、システインリボソームタンパク質L41、CMVie又はキメラプロモーター、例えばJonesS.etal19に開示されるGAGCMV早期エンハンサー/チキンβアクチンのプロモーターを含む。これらのプロモーターはまた、キャプシド形成プラスミド由来のgag-polタンパク質の発現に関与する制御発現配列に用いられてもよい。あるいは、エンベロープ発現プラスミドが好適なパッケージング細胞株における発現、特に、連続的に発現されるウイルス粒子としての安定的な発現を対象とする場合、エンベロープタンパク質単数又は複数を発現するための内在的プロモーターは、有利に、誘導可能プロモーター、例えばCockrellA.S.etal.20に開示されるものである。斯かるプロモーターの例として、参照は、テトラサイクリン及びエクジソン誘導可能プロモーターに対してなされる。パッケージング細胞株は、STARパッケージング細胞株ref20、21又はSODkパッケージング細胞株、例えばSODk1及びSODk3を含むSODk0由来細胞株ref20、22、23、24でもよい。レンチウイルスベクター粒子を偽型化するために要求されるエンベロープタンパク質単数又は複数の発現のために用いられるヌクレオチド配列は、代替的に改変されてもよく、従って、参照として用いられる天然のエンベロープタンパク質単数又は複数をコードする核酸に関する変異体を提供する。改変は、ベクター粒子の調製のための細胞、及び/又は宿主の形質導入された細胞において、コドン頻度を改良するために実行されるコドン最適化。それは、天然のタンパク質単数又は複数と異なるタンパク質、特に改良された偽型化能力、産生のレベルにおいて改良された能力、又は化合物のキットに用いられるエンベロープタンパク質単数又は複数との交差反応性タンパク質としても称される血清中和の予防に関して改良された能力を有するものを発現するために改変されてもよい。エンベロープタンパク質単数又は複数をコードするポリヌクレオチドの斯かる改変、又は天然のエンベロープの変異体を生成するためのエンベロープタンパク質単数又は複数の改変は、おそらく、偽ウイルスに関連してエンベロープタンパク質単数又は複数の密度を改良することにより、細胞宿主におけるそれらの産生のレベル、又はベクター粒子を偽型化するそれらの能力に影響を与え、特に改良し得る。前記改変は、前記タンパク質単数又は複数のアミノ酸配列における変異、例えば、1若しくはいくつかのヌクレオチド若しくはヌクレオチドフラグメントの付加、欠失又は置換に由来し得る、又は翻訳後修飾、特に前記エンベロープタンパク質単数又は複数の糖化状態に関連し得る。本発明のレンチウイルスベクターを偽型化するために用いられるエンベロープタンパク質単数又は複数は、実際には、特に糖タンパク質である。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質VSV-Gを用いてウイルスベクターを偽型化することが、異なる種からの広い範囲の細胞種類の形質導入を可能にすることは、既に示されている。このVSV-G糖タンパク質は、その広い向性に加えて、ベクター偽型化に用いられる場合、興味深い安定性を有する。それ故、VSV-Gは、他の偽型の効率を評価するための標準として用いられているCroninJ.etal,2005。本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、以下:iパッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にHIV-1のシス作用配列を含み、更に機能性のレンチウイルス、特にHIV-1由来のDNAflapエレメント、及びii制御発現配列の制御下で、本明細書に開示されるマラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、任意で統合のための配列を含む、ベクタープラスミド;RNAウイルス由来の偽型化エンベロープをコードする発現プラスミド、ここで前記発現プラスミドは、偽型化のためのエンベロープタンパク質単数又はタンパク質複数をコードするポリヌクレオチドを含み、前記エンベロープ偽型化タンパク質は、有利にVSV由来であり、特にVSV-G若しくはそれらの変異体由来である;及びレンチウイルス、特にHIV-1の、統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なgag-polパッケージング配列、又は統合欠損ベクター粒子の産生に好適な改変されたgag-polパッケージング配列のいずれかを含む、キャプシド形成プラスミド、を用いた、哺乳動物細胞の共トランスフェクションから回収される生成物である。本発明はまた、従って、上述のレンチウイルスベクター粒子に関し、それは、以下:iパッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にHIV-1のシス作用配列を含み、機能性のレンチウイルス、特にHIV-1のDNAflapエレメントを更に含み、任意で統合に必要なシス作用配列を含むベクタープラスミド、ここで前記ベクタープラスミドは更に、ii制御発現配列、特にプロモーターの制御下で、プラスモディウム属寄生虫のcs遺伝子の切断された、哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列のポリヌクレオチドを含む;VSV-Gエンベロープタンパク質単数又はエンベロープタンパク質複数をコードするポリヌクレオチドを含むVSV-Gエンベロープ発現プラスミド、ここで前記ポリヌクレオチドは、制御発現配列、特に誘導可能プロモーターを含む制御発現配列の制御下にある;及びキャプシド形成プラスミドがレンチウイルス、特にHIV-1の統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なgag-polコーディング配列、又は統合欠損ベクター粒子の産生に好適な改変されたgag-polコーディング配列のいずれかを含み、前記gag-pol配列がDNAflapエレメントとして同一のレンチウイルスサブファミリー由来であり、前記レンチウイルスgag-pol若しくは改変されたgag-pol配列が制御発現配列の制御下にある、キャプシド形成プラスミド;を用いた安定的な細胞株から回収された生成物である。本発明のベクター粒子を発現する安定的な細胞株は、特に、プラスミドの形質導入により得られる。ポリヌクレオチドは、本願に開示される任意の実施形態によるマラリア抗原の少なくとも1つのポリペプチドをコードする。特に、それは、プラスモディウム属寄生虫、特にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparumのcs遺伝子の切断された哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列であるポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マラリア寄生虫の異なる抗原の別のポリペプチドをコードし、それは、様々な実施形態に開示されるように前記寄生虫の異なる抗原に起源する及び/又は由来する2又はそれ以上のポリペプチドをコードする。従って、ベクタープラスミドは、様々なポリペプチドの発現のためのいくつかの発現カセットを含んでもよく、又は様々なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがウイルス起源のIRES内部リボソーム侵入部位配列により分離されている、ビシストロン若しくはマルチシストロンの発現カセットを含んでもよく、それは融合タンパク質単数又は複数をコードしてもよい。ベクターゲノムに含まれ、導入遺伝子として、又は発現カセットにおいてマラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御する、内在プロモーターは、以下の遺伝子:EF1α、ヒトPGK、PPIプレプロインスリン、チオデキストリン、HLADR不変鎖P33、HLADRアルファ鎖、フェリチンL鎖又はフェリチンH鎖、キモシンベータ4、キモシンベータ10、又はシステインリボソームタンパク質L41、CMVie又はキメラプロモーター、例えばJonesS.etal19に開示されるGAGCMV早期エンハンサー/チキンβアクチンのプロモーターから選択されてもよい。上述の内在プロモーターの中のプロモーターは、エンベロープタンパク質単数又は複数及びパッケージングgag-pol由来タンパク質の発現について選択されてもよい。あるいは、ベクター粒子は、従ってベクター粒子を連続的に分泌し得る安定的なパッケージング細胞株において、本明細書で開示されるプラスミドの共トランスフェクションから産生され得る。エンベロープタンパク質単数又は複数の発現に関与する制御発現配列に用いられるプロモーターは、有利な誘導可能プロモーターである。以下の特定の実施形態は、ヒトレンチウイルスに基づく、及び特にHIVウイルスに基づくレンチウイルスベクター粒子を調製する場合に、実行されてもよい。本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子のゲノムは、ヒトレンチウイルス、特にHIVレンチウイルスに由来する。特に、偽型化されたレンチウイルスベクターは、HIVに基づくベクター、例えばHIV-1、又はHIV-2に基づくベクターであり、特にHIV-1M、例えばBRU又はLAI単離物に由来する。あるいは、ベクターゲノムのために必要な配列を提供するレンチウイルスベクターは、レンチウイルス、例えば、ヒト細胞をトランスフェクトし得るEIAV、CAEV、VISNA、FIV、BIV、SIV、HIV-2、HIV-Oに由来してもよい。上述のように、それが最終的に含む組み換えポリヌクレオチドと別に考慮される場合、ベクターゲノムは、元のレンチウイルスゲノム中の2つの長い末端反復LTR間の核酸が、導入遺伝子の宿主中の細胞の核に効率的に送達するためにするために含む、DNA若しくはRNA合成及びプロセッシングのためのシス作用配列に限定されている、又は生物学的に機能的なGAGポリタンパク質、並びに場合によりPOL及びENVタンパク質を含むレンチウイルス構造タンパク質の発現を可能にする必須の核酸部分について、少なくとも欠失若しくは変異誘発されている、代替ベクターである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、生物学的に機能的なGAG、並びに有利に、生物学的に機能的なPOL及びENVタンパク質の発現について欠損している。従って、ベクターゲノムは、これらのタンパク質をコードする配列を欠損している。特定の実施形態では、レンチウイルスの5’LTR及び3’LTR配列は、ベクターゲノムに用いられるが、少なくとも3’-LTRは、例えばエンハンサーについて、欠失、若しくは部分的に欠失し得る少なくともU3領域において、元のレンチウイルスの3’LTRに関して改変される。5’LTRはまた、特に、例えばTat-独立プロモーターがU3内部のプロモーターと置換され得る場合、そのプロモーター領域において、改変されてもよい。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、HIV-1レンチウイルスベクターのためのVif-、Vpr、Vpu-及びNef-アクセサリー遺伝子について、1又はいくつかのコーディング配列を含む。あるいは、これらの配列は、互いに独立して欠失し得、又は非機能的であり得る。レンチウイルスベクター粒子のベクターゲノムは、挿入されるシス-作用フラグメントとして、DNAflapエレメントに存在する、又は斯かるDNAflapエレメントを含む、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、DNAflapは、マラリア抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に挿入され、必ずではないが、有利に、ベクターゲノムのほぼ中央の位置に位置する。本発明に好適なDNAflapは、レトロウイルス、特にレンチウイルス、特にヒトレンチウイルス、特にHIV-1レトロウイルス、又はレトロウイルス様有機体、例えばレトロトランスポゾンから得られてもよい。それは、代替的に、CAEVヤギ関節炎脳炎ウイルスウイルス、EIAVウマ伝染性貧血ウイルスウイルス、VISNAウイルス、SIVサル免疫不全ウイルスウイルス、又はFIVネコ免疫不全ウイルスウイルスから得られてもよい。DNAflapは、合成的に化学合成、又は上述の適切な起源からのDNAflapを提供するDNAの増幅により、例えばポリメラーゼ連鎖反応PCRにより調製されてもよい。より好ましい実施形態では、DNAflapは、HIVレトロウイルス、例えば2つの種類の任意の単離物を含むHIV-1又はHIV-2ウイルスから得られる。DNAflapZennouV.etal.ref27,2000,Cellvol101,173-185に、又は国際公開第99/55892号、及び国際公開第01/27304号に定義されるは、それが特にHIV逆転写の間に通常合成される3重鎖DNA構造を生じる場合、いくつかのレンチウイルス、特にHIVのゲノムの中央にあり、HIVゲノム核内輸送のシス決定因子として作用する構造である。DNAflapは、逆転写の間、セントラルポリプリントラクトcPPT及びセントラル末端配列CTSにより、シスで制御される中央鎖置き換えイベントを可能にする。レンチウイルス由来ベクターに挿入される場合、逆転写の間、DNAflapを産生することを可能にするポリヌクレオチドは、遺伝子輸送効率を刺激し、野生型レベルまで核内輸送レベルを補うZennouetal.,Cell,2000。DNAflapの配列は、先行技術、特に上述の特許出願に開示されている。これらの配列はまた、配列番号69~配列番号75として開示される。それらは、好ましくは前記ベクターゲノムの中央近くの位置において、ベクターゲノム中に、任意で更なるフランキング配列と共に、好ましくは、フラグメントとして挿入される。或いは、それらは、本発明のポリヌクレオチド単数又は複数の発現を制御するプロモーターからすぐ上流に挿入されてもよい。ベクターゲノムに挿入された、DNAflapを含む前記フラグメントは、その起源及び調製に依存して、約80~約200bpの配列を有してもよい。特定の実施形態によれば、DNAflapは、約90~約140ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。HIV-1では、DNAflapは、安定的な99ヌクレオチド長のプラス鎖オーバーラップである。本発明のレンチウイルスベクターのゲノムベクターに用いられる場合、それは、特にそれがPCRフラグメントとして調製される場合、長い配列として挿入されてもよい。DNAflapを提供する構造を含む特定の適切なポリヌクレオチドは、HIV-1DNAのcPPT及びCTS領域を含む178塩基対のポリメラーゼ連鎖反応PCRフラグメントであるZennouetal2000。このPCRフラグメントは、ヌクレオチド4793~4971の配列に対応するフラグメントとして、HIV-1LAIの伝染性のDNAクローン、特にHIV1のpLAI3に特に由来してもよい。適切な場合、制限酵素認識部位は、クローニングのために、得られるフラグメントの一方又は双方の末端に付加される。例えば、NarI制限酵素認識部位は、PCR反応を行なうために用いられるプライマーの5’末端に付加されてもよい。それ故、本発明に用いられるDNAflapは、元のレンチウイルスゲノムのpol遺伝子の必要でない5’及び3’部分から欠失され、異なる起源の配列と再結合される。ゲノムベクターに用いられるDNAflap、並びにGAG及びPOLポリタンパク質をコードするキャプシド形成プラスミドのポリヌクレオチドは、同一のレンチウイルスサブファミリー、又は同一のレトロウイルス様有機物由来であるべきであることは、特定されている。好ましくは、ゲノムベクターの他のシス作用配列はまた、DNAflapを提供するもののように、同一のレンチウイルス、又は同一のレトロウイルス様有機物由来である。ベクターゲノムは、組み換えポリヌクレオチドをクローニングするための1又はいくつかの独自の制限酵素認識部位単数又は複数を更に含む。好ましい実施形態では、前記ベクターゲノムにおいて、レンチウイルスベクターゲノムの3’LTR配列は、少なくともアクチベータ-エンハンサー及び或いはU3領域のプロモーターを欠損している。別の特定の実施形態では、3’LTR領域は、U3領域を欠損しているデルタU3。この点において、参照は、国際公開第01/27300号及び国際公開第01/27304号における記載に対してなされる。特定の実施形態では、前記ベクターゲノムにおいて、LTR5’のU3領域は、tat-独立第一転写を実行するために好適な非レンチウイルスU3、又はプロモーターにより置き換えられる。斯かる場合、ベクターは、tatトランスアクチベーターから独立している。ベクターゲノムはまた、プサイΨパッケージングシグナルを含む。パッケージングシグナルは、gagORFのN末端フラグメントに由来する。特定の実施形態では、その配列は、可能性のあるgagペプチドの転写/翻訳と、導入遺伝子のそれとの任意の干渉を防ぐために、フレームシフト変異単数又は複数により改変され得る。ベクターゲノムはまた、任意で、スプライスドナー部位SD、スプライスアクセプター部位SA、及び/又はRev応答エレメントRREの中で選択されるエレメントを含んでもよい。特定の実施形態によれば、ベクタープラスミド又は付加されたゲノムベクターは、遺伝子組み換え発現カセットのための、以下のシス作用配列を含む:1.逆転写に要求されるLTR配列長い末端反復、該配列は、転写のために要求され、ウイルスDNA統合のための配列を任意で含む。3’LTRは、二つの主な理由:第一に、DNAがゲノムに統合されてすぐの、宿主遺伝子のトランス活性化を避けるため、及び第二に、逆転写retrotranscription後、ウイルスのシス配列の自己不活性化を可能にするために、遺伝子輸送のために必要な機能を撹乱させることなく、少なくとも自己不活性化するSINベクターを提供するために、プロモーターについて、U3領域において欠失している。任意で、ゲノムの転写を促す5’-LTRからのtat-依存U3配列は、非内因性プロモーター配列により置き換えられる。従って、標的細胞において、内在プロモーターからの配列のみが転写される導入遺伝子。2.ウイルスRNAキャプシド形成のために必要なΨ領域。3.Revタンパク質の結合後に、核から細胞質ゾルまでのウイルスのRNAメッセンジャーの輸送を可能にする、RRE配列REV応答エレメント。4.核内への輸送を容易にするDNAflapエレメントcPPT/CTS、通常Polに含まれる5.任意で、転写後エレメント、例えばmRNAの安定性を最適化するためにまた付加されるWPREシス作用配列ウッドチャック肝炎B型ウイルス応答後エレメント、マトリックス又はスキャホールド付着領域SAR及びMAR配列、例えば免疫グロブリン-カッパ遺伝子の配列ParkF.etalMolTher2001;4:164-173。本発明のレンチウイルスベクターは、非複製的であり複製能力が無い、即ちベクター及びレンチウイルスベクターゲノムは、複製能力を有するレンチウイルスに関する懸念事項を緩和するために好適であると見なされ、特に投与後、感染した宿主細胞から出芽する新規の粒子を形成し得ない。これは、レンチウイルスゲノムにおけるgag、pol若しくはenv遺伝子の不在、又は機能性遺伝子としてのそれらの不在の結果として、よく知られている方法において達成され得る。gag及びpol遺伝子は、従って、トランスにおいてのみ提供される。これはまた、粒子形成に必要な、他のウイルスコーディング配列単数又は複数及び/又はシス作用遺伝子エレメントを欠失させることにより達成され得る。機能性のfunctionalとは、正確に転写される、及び/又は正確に発現される遺伝子を意味する。従って、この実施形態では、本発明のレンチウイルスベクターゲノムに存在する場合、gag、pol又はenvの配列は、個別に、転写されない、又は不完全に転写される、のいずれかである。表現不完全に転写されるとは、転写産物であるgag、gag-pro若しくはgag-pro-pol、これらの一つ又はこれらのいくつかが転写されない、改変を意味する。レンチウイルス複製に関与する他の配列はまた、この状態を達成するために、ベクターゲノムにおいて変異誘発されてもよい。レンチウイルスベクターの複製の不在は、レンチウイルスゲノムの複製から際立つべきである。実際、前述のように、レンチウイルスゲノムは、ベクター粒子の複製を必ずしも確実にすることなく、レンチウイルスベクターゲノムの複製を確実にする、複製の起源を含んでもよい。レンチウイルスベクターを得るために、本発明によれば、ベクタープラスミドとしてベクターゲノムは、粒子又は偽粒子においてキャプシド形成されるべきである。従って、エンベロープタンパク質を除いて、レンチウイルスタンパク質は、gag遺伝子、及びpolレンチウイルス遺伝子又は統合能力の無いpol遺伝子のどちらかを有し、並びにHIV-1レンチウイルスベクターのためのVif-、Vpr、Vpu及びNef-アクセサリー遺伝子のためのいくつか若しくは全てのコーディング配列を好ましくは欠損している、少なくとも1つのキャプシド形成プラスミドに頼るベクターゲノムと共に、産生システム、特に産生細胞において、ベクターゲノムに対してトランスで提供されるべきである。レンチウイルスベクター粒子を偽型化するために選択されるエンベロープ偽型化タンパク質単数又は複数をコードするポリヌクレオチドを有する更なるプラスミドは、用いられる。好ましい実施形態では、パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子合成に必須のレンチウイルスタンパク質のみをコードする。プラスミド中のその存在が安全性の懸念を生じ得るアクセサリー遺伝子は、適宜除かれる。従って、パッケージングのためにトランスで運ばれるウイルスタンパク質は、それぞれHIV-1に由来するものについて例証される:1.マトリックスMA、見かけの分子量p17、キャプシドCA、p24及びヌクレオキャプシドNC、p6の結合のためのGAGタンパク質。2.酵素:インテグラーゼ、プロテアーゼ、及び逆転写酵素をコードするPOL。3.TAT及びREV制御タンパク質、ここでTATは、LTR媒介転写の開始に必要であり;5’LTRのU3領域がtat-独立転写に促されるプロモーターと置換される場合、TAT発現は除かれてもよい。REVは改変されてもよく、例えばドメインの認識がベクターゲノム中のRRE配列を置き換える得る、組み換えタンパク質に適宜用いられてもよく、又はそのRBDRNA結合ドメインを通してはRRE配列と結合し得るフラグメントとして用いられてもよい。ウイルス粒子におけるパッケージングプラスミドに含まれる遺伝子から産生されるmRNAの任意のパッケージングを避けるために、Ψ領域は、パッケージングプラスミドから取り除かれる。異種のプロモーターは、組み換え問題を避けるためにプラスミドに挿入され、ポリA尾部は、タンパク質をコードする配列から3’に付加される。適切なプロモーターは、上記に開示されている。エンベローププラスミドは、本明細書で開示される内在プロモーターの制御下で、本明細書で開示される偽型化のためのエンベロープタンパク質単数又は複数をコードする。本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製のための任意の、又は全ての記載されるプラスミドは、タンパク質をコードする部分において最適化されたコドンCOでもよい。本発明のコドン最適化は、好ましくは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において、プラスミドに含まれるコーディング配列の翻訳を改良するために行なわれる。本発明によれば、コドン最適化は、直接的に、又は間接的にベクター粒子の調製を改良するのに、又はそれらが投与される宿主の細胞によるそれらの取り込みを改良するのに、又は宿主の形質導入された細胞のゲノムにおけるマラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド導入遺伝子の輸送の効率を改良するのに、特に好適である。コドンを最適化するための方法は、当該技術分野においてよく知られており、コドン最適化は、その旨の使用可能なプログラムを用いるために特に行なわれる。コドン最適化は、実施例で例証される本発明の、記載されるpTRIP又はpThVプラスミドに含まれるコーディング配列について例証される。本発明の特定の実施形態では、偽型化されたレンチウイルスベクターはまた、あるいは、統合能力がない。斯かる場合では、ベクターゲノム、及び従ってそれを含む組み換えポリヌクレオチドは、形質導入された細胞又はそれが投与された宿主の細胞のゲノムに統合されない。本発明は、レンチウイルスベクターの使用に関し、ここで、発現されたインテグラーゼタンパク質が欠損しており、それは更に、免疫原性組成物において、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージ抗原のエピトープ単数又は複数を有する少なくとも1つのポリペプチドを特にコードするポリヌクレオチドを含む。統合能力がないとは、好ましくはレンチウイルス起源のインテグラーゼが宿主細胞のゲノムへのレンチウイルスゲノムの統合の能力を欠損している、即ち、そのインテグラーゼ活性を特に改変するために変異誘発されたインテグラーゼタンパク質であることを意味する。統合能力のないレンチウイルスベクターは、統合能力が欠損したインテグラーゼをコードする変異誘発されたpol遺伝子をもたらす、インテグラーゼをコードするpol遺伝子を改変することにより得られ、ここで、前記変異誘発されたpol遺伝子は、キャプシド形成プラスミドに含まれる。斯かる統合能力のないレンチウイルスベクターは、特許出願国際公開第2006/010834号に記載されている。従って、タンパク質のインテグラーゼ能力は、改変される一方で、GAG、PRO及びPOLタンパク質のキャプシド形成プラスミドからの正確な発現、及び/又はキャプシド及び従ってベクター粒子の形成、並びに統合ステップに先立つ又は続く他のウイルスサイクルの他のステップ、例えば逆転写、核内への輸送は、無傷である。インテグラーゼは、可能であるべき統合が、対応する野生型のインテグラーゼを含むレンチウイルスベクターと比較した場合、統合ステップが1/1000未満、好ましくは1/10000未満で行なわれる方法において改変される場合、欠損している。本発明の特定の実施形態では、欠損しているインテグラーゼは、クラス1の変異、好ましくはアミノ酸置換1-アミノ酸置換又は欠損しているインテグラーゼの発現の必要条件を充足する短い欠失に由来する。変異は、pol遺伝子内で行なわれる。これらのベクターは、統合ステップのDNA切断及び連結反応を特異的に阻害する酵素の触媒ドメインにおいて変異D64Vを有する欠損しているインテグラーゼを有してもよい。D64V変異は、偽型化されたHIV-1の統合を、野生型の最大1/10,000まで減少させるが、効率的な導入遺伝子発現を可能にする非分割細胞を形質導入するそれらの能力を維持する。HIV-1のインテグラーゼのインテグラーゼ能力に影響を与えるのに適するpol遺伝子における他の変異は、以下:H12N,H12C,H16C,H16V,S81R,D41A,K42A,H51A,Q53C,D55V,D64E,D64V,E69A,K71A,E85A,E87A,D116N,D116I,D116A,N120G,N120I,N120E,E152G,E152A,D-35-E,K156E,K156A,E157A,K159E,K159A,K160A,R166A,D167A,E170A,H171A,K173A,K186Q,K186T,K188T,E198A,R199C,R199T,R199A,D202A,K211A,Q214L,Q216L,Q221L,W235F,W235E,K236S,K236A,K246A,G247W,D253A,R262A,R263A及びK264Hである。特定の実施形態では、pol遺伝子における変異は、タンパク質の触媒部位である、以下の位置D64、D116若しくはE152のいずれか、又はこれらの位置のいくつかにおいて、行なわれる。これらの位置における任意の置換は、好適であり、上述のものを含む。別の提案された置換は、アミノ酸残基RRK位置262~264のアミノ酸残基AAHによる置き換えである。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターが統合能力を有していない場合、レンチウイルスゲノムは、レンチウイルスゲノムが発現される必要がある場合、その配列が細胞の性質に依存する、複製起源oriを更に含む。前記複製起源は、真核生物由来、好ましくは哺乳動物由来、最も好ましくはヒト由来でもよい。それは、あるいは、ウイルス由来、特にDNA環状エピソームウイルス、例えばSV40又はRPS由来でもよい。本発明のレンチウイルスベクターのレンチウイルスゲノムに挿入される複製起源を有することは、本発明の有利な実施形態である。実際、レンチウイルスゲノムが欠損したインテグラーゼのために細胞宿主ゲノムに統合されない場合、レンチウイルスゲノムは、頻繁な細胞分裂を経る細胞において消失し;これは、特に免疫細胞、例えばB又はT細胞にあてはまる。複製起源の存在は、少なくとも1つのレンチウイルスゲノムが細胞分裂後でさえ各細胞に存在し、従って、免疫応答の効率性を最大化する。本発明の前記レンチウイルスベクターのレンチウイルスベクターゲノムは、特に、番号I-2330の下で、1999年10月11日にCNCMParis,Franceに寄託されたHIV-1プラスミドpTRIPΔU3.CMV-GFP国際公開第01/27300号にも記載されるに由来してもよい。pTRIPΔU3.CMV-eGFPの配列は、配列番号35として提供され、図11に記載される。ベクターゲノムがこれらの特定のプラスミドに由来する場合、本願において開示される組み換えポリヌクレオチドの配列は、GFPコーディングフラグメントに加えて、又は置き換えて、それらに挿入される、GFPコーディング配列はまた、異なるマーカーに置換されてもよい。CMVプロモーターはまた、別のプロモーター、特に、導入遺伝子の発現に特に関連して開示されるプロモーターの一つに置換されてもよい。特定の寄託されたpTRIPベクターに含まれるWPRE配列はまた、任意で欠失していてもよい。ベクター粒子は、前記プラスミド、又は他のプロセスにより、適切な細胞例えば哺乳動物細胞又はヒト細胞、例えば293T細胞に例証されるヒト胚腎臓細胞のトランスフェクション後、産生され得る。レンチウイルス粒子の発現に用いられる細胞では、それらのコーディングポリヌクレオチドを安定的に発現させるための、又はそれらのコーディングポリヌクレオチドを一時的に若しくは半安定的に発現させるための、全て又はいくつかのプラスミドが用いられてもよい。産生される粒子の濃度は、細胞上清のP24HIV-1のキャプシドタンパク質含量を測定することにより、決定され得る。本発明のレンチウイルスベクターは、宿主に投与されると、それで偽型化されたエンベロープタンパク質に依存して、宿主の細胞、場合により特異的な細胞に感染する。感染は、逆転写retrotranscriptionが行なわれる場合、宿主細胞の細胞質へのレンチウイルスベクターゲノムの放出を導く。DNAflapを介した3重鎖形態下で、マラリア寄生虫の抗原単数又は複数のポリペプチド単数又は複数をコードするポリヌクレオチド単数又は複数が、細胞性機構を介して発現される場合、レンチウイルスベクターゲノムは、核内に輸送される。非分裂細胞例えばDCが形質導入される場合、発現は安定的であってもよい。分裂細胞、例えばB細胞が形質導入される場合、発現は、核酸希釈及び細胞分裂のために、レンチウイルスゲノムの複製起源の不在において一時的である。発現は、細胞分裂後、娘細胞へのレンチウイルスベクターゲノムの適切な拡散を確かにする複製起源を提供することにより、より長くしてもよい。安定性及び/又は発現はまた、ベクターゲノムにおけるMARマトリックス結合領域又はSARスキャホールド結合領域エレメントの挿入により増加してもよい。実際、これらのSAR又はMAR領域は、ATリッチ配列であり、細胞染色体,のマトリックスにレンチウイルスゲノムをアンカーし得、従って、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を制御し、特に導入遺伝子の遺伝子発現を刺激し、クロマチン接近可能性を向上させる。レンチウイルスゲノムが非統合性である場合、それは、宿主細胞ゲノムに統合しない。それにも関わらず、導入遺伝子によりコードされる少なくとも1つのポリペプチドは、十分に発現され、十分にプロセスされ、MHC分子と結合し、最終的に細胞表面に向かう。マラリア寄生虫の抗原単数又は複数のポリペプチド単数又は複数をコードするポリヌクレオチド単数又は複数の性質に依存して、MHC分子と結合する少なくとも1つのポリペプチドエピトープは、体液性又は細胞性免疫応答を引き起こす。他に指定のない限り、又は技術的に関連のない限り、任意のウイルスの特性、特にそれらのエンベロープタンパク質単数又は複数若しくは組み換えポリヌクレオチドに関するレンチウイルス粒子の構造又は使用の実施形態又は実施例に関する本願に開示される特性は、任意の可能性のある組み合わせにより、組み合わされてもよい。本発明は、哺乳動物宿主への分離した投与のための、化合物の組み合わせに更に関し、それは、少なくとも以下:i第一の決定された異種の、ウイルスエンベロープ偽型化タンパク質単数又はウイルスエンベロープ偽型化タンパク質複数で偽型化された本発明のレンチウイルスベクター粒子;iiiにおけるレンチウイルスベクター粒子とは別に提供される、前記第一の異種のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質単数又は複数とは異なる、第二の決定された異種のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質単数又はウイルスエンベロープ偽型化タンパク質複数で偽型化された本発明のレンチウイルスベクター粒子;ここで、前記第一及び第二のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質単数又は複数は、互いに血清中和せず、哺乳動物細胞、特にヒト細胞のインビボ形質導入に好適である;を含む。表現化合物の組み合わせ或いは化合物のキットは、活性成分のキット又は組み合わせを構成するレンチウイルスベクター粒子が、前記キット又は組み合わせにおいて分離した化合物として提供され、宿主への分離した投与、特に時間内の分離した投与が意図されることを意味する。従って、本発明は、それらを必要とする宿主において、第一の投与ステップが、免疫、特に細胞性免疫応答を誘発し、後の投与ステップ単数又は複数が、細胞性免疫応答を誘導する免疫応答をブーストする、プライムブースト投与を行なうことを可能にする。投与の各ステップについて、ベクター粒子の偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数は、他のステップ単数又は複数において用いられるものと異なる。従って、本発明のキット又は組み合わせの分離した化合物は、少なくともそれらの偽型化するエンベロープタンパク質における違いのために、異なる粒子を有する。キットの化合物は、従って、それを必要とする宿主、特に哺乳動物宿主、特にヒト宿主に時間内に分離して提供される。従って、前記レンチウイルスベクターは、分離したッケージで提供され得、それの分離した使用のために、共通のパッケージで提供される。それ故、パッケージに含まれ、使用のための指示を含む注意は、異なる偽型化エンベロープタンパク質単数又は偽型化エンベロープタンパク質複数で偽型化される前記レンチウイルスベクター粒子が、時間内で分離した投与のために、特に宿主における免疫応答をプライムし、続いてブーストするためであることを指してもよい。本発明に従って、化合物の組み合わせでは、第一の決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質単数又はウイルス偽型化エンベロープタンパク質複数で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子、及び第二の決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質単数又はウイルス偽型化エンベロープタンパク質複数で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子は、提供される。従って、前記第一及び第二の異種のウイルスエンベロープタンパク質単数又は複数は異なり、特に異なるウイルス株に由来する。従って、本発明の化合物のキットの分離された化合物に含まれるレンチウイルスベクター粒子は、少なくともベクター粒子を偽型化するために用いられる特定の偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数のために、互いに異なっている。本発明の特定の実施形態では、化合物の組み合わせは、第三の、又は更なる種類のレンチウイルスベクター粒子を含み、ここで、第三のレンチウイルスベクターの偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数は、前記第一及び第二の偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数と異なり、特に、異なるウイルス株に由来する。異なる偽型化エンベロープを有する粒子が、首尾よく投与される場合、前記エンベロープに関して、以下の順序:Indiana;NewJersey;Isfahan;SVCV/Cocalでの投与が好ましい。Cocalで偽型化されたレンチウイルスベクターは、いくつかの他のエンベロープを血清中和するので、それは、ワクチン接種クロノロジーchronologyにおいて、Cocalエンベロープが粒子の調製に用いられる場合、投与計画において、最後の一つとして、それらで偽型化された粒子を投与することが好ましい。それらの偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数とは別に、本発明のレンチウイルスベクターは、同一でもよく、特に同一のベクターゲノムを有してもよい。あるいは、それらが、同一の組み換えの決定されたポリヌクレオチド導入遺伝子とも称される、特に同一の組み換えポリヌクレオチドを有する場合、それらのベクターゲノムは異なってもよい。本発明の別の実施形態では、レンチウイルスベクターのベクターゲノムは、少なくとも1つの前記の異なるポリヌクレオチドが、共通の抗原決定基単数又は複数又は共通のエピトープ単数又は複数を有するポリペプチド単数又は複数をコードする場合、少なくとも1つの異なる組み換えポリヌクレオチドを有することにより異なる。それ故、異なるポリヌクレオチドは、互いに、同一の若しくは変異体のポリペプチドをコードする変異体でもよく、異なるポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここで、少なくとも1つの分離している化合物では、ベクターは、異なるウイルス、特にVSVの異なる種の異なる属の、異なるエンベロープタンパク質単数又は複数由来の結合したドメイン又はフラグメントを含む、組み換え偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化される。本発明の特定の実施形態では、少なくとも1つの第一、第二の、及びもしあれば第三の、又は更なる偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数は、Indiana株のVSV-Gの輸送決定因子を含む組み換えエンベロープタンパク質単数又は複数である。Indiana株のVSV-Gの輸送決定因子は、エンベロープのオープンリーディングフレームの細胞質フラグメントによりコードされるポリペプチドである。Indiana株のVSV-Gの輸送決定因子は、細胞質尾部におけるアミノ酸配列YTDIEを含む、又は有するポリペプチドであるNishimuaN.etal.2002。前記組み換えエンベロープタンパク質単数又は複数は、疎水性膜貫通ドメインにより区切られたVSV-Gの細胞内部分であるIndiana株のVSV-Gの細胞質尾部を含んでもよい。化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここでそれらの1又は2又はそれ以上は、indianaVSVの細胞質ドメイン、及び異なるVSV血清型の株のエクトドメインを含む組み換えエンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化される。化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここでそれらの一方又は双方は、indianaVSVの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにNew-JerseyVSVのエクトドメインを含む、組み換えエンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化される。適切な他の改変は、変異、特に点変異を含み、それは偽型化を改良する。VSV-Gタンパク質についての斯かる変異は、1若しくはいくつかのアミノ酸残基を置換すること、又は欠失することにより、膜貫通ドメインにおいて行なわれてもよい。適切な変異の他の例は、FredericksenB.L.etal1995又はNishimuraN.etal2003に開示される。宿主に投与される場合、これらのVSV-Gタンパク質で偽型化されるレンチウイルスベクターの形質導入効率を向上させるために、VSV-Gの糖化状態を改変することは、特に有力である。VSVの様々な株からのVSV-Gタンパク質は、図に開示され、それらの配列はまた、データベース、特にGenBankに由来し得る。特に、Indiana及びNew-Jersey株のVSV-Gタンパク質は、New-JerseyVSV-GについてGenBankAF170624、又はIndiana株についてGenBankM11048として開示される配列に対して、参照により得られ得る。VSVのNew-Jersey及びIndiana株の糖タンパク質を考慮して、2個のアスパラギン残基N180及びN336における糖化が、レンチウイルスベクターの効率的な偽型化を助けることが提案されている。この特定の特性は、本発明のレンチウイルスベクターの調製に適用されてもよい。VSV-G由来のエンベロープタンパク質をコードする以下の構築物は、本発明のレンチウイルスベクター粒子の組み合わせの調製に使用のための構築物の特定の例であり、国際公開第2009/019612号に開示される。配列番号76に示される、最適化されたコドンであるVSV-GIndiana遺伝子。特定のキャプシド形成プラスミドは、番号I-3842の下で、2007年10月10日にCNCMParis,Franceに寄託されたpThV-VSV.GIND-COであり、プラスミド構築物の代替型では、番号CNCMI-4056の下で、2008年7月31日に寄託されており、VSV-GIndianaNew-Jerseyからのエンベロープで偽型化された粒子の調製に使用のために好適である。他の構築物は、特に、プロモーターを本願において列挙されたものの中のプロモーターで置換することによる、この特定のプラスミド由来でもよい。最適化されたVSV-GNew-Jersey遺伝子コドンは、配列番号78に開示される。特定のキャプシド形成プラスミドは、特定のキャプシド形成プラスミドは、番号I-3843の下で、2007年10月10日にCNCMParis,Franceに寄託されたpThV-VSV.GNJ-COであり、プラスミド構築物の代替型では、番号CNCMI-4058の下で、2008年7月31日に寄託されており、VSV-GIndianaNew-Jerseyからのエンベロープで偽型化された粒子の調製に使用のために好適である。他の構築物は、特に、プロモーターを本願において列挙されたものの中のプロモーターで置換することによる、この特定のプラスミド由来でもよい。コドン最適化配列を有する、本発明を実行するために好適な他のエンベロープ遺伝子は、国際公開第2009/019612号に例証され、特にVSV-GChandipura遺伝子及びその発現産物、VSV-GCocal遺伝子及びその発現産物、VSV-GPiry遺伝子及びその発現産物、VSV-GIsfahan遺伝子及びその発現産物、VSV-GSpringviremiacarpウイルス遺伝子及びその発現産物を含む。VSV-GCocalについてのエンベロープ遺伝子を含む特定のキャプシド形成プラスミドは、番号CNCMI-4055の下で、2008年7月31日にCNCMParis,Franceに寄託されているpThV-VSV.GCOCAL-COである。VSV-GIsfahanについてのエンベロープ遺伝子を含む別の特定のキャプシド形成プラスミドは、番号CNCMI-4057の下で、2008年7月31日にCNCMParis,Franceに寄託されているpThV-VSV.GISFA-COである。VSV-GSpringviremiacarpウイルスについてのエンベロープ遺伝子を含む別の特定のキャプシド形成プラスミドは、番号CNCMI-4059の下で、2008年7月31日にCNCMParis,Franceに寄託されているpThV-VSV.GSVCV-COである。これらの構築物は、特許出願国際公開第2009/019612号に開示される。融合エンベロープタンパク質、特に異なるウイルスのVSV-Gタンパク質のいくつかの異なるフラグメントを含む融合タンパク、及び斯かるタンパク質をコードする核酸構築物は、代替の実施形態として用いられ、また国際公開第2009/019612号に開示される。特定の融合エンベロープは、本明細書で提供される配列に示されるように、New-Jerseyエンベロープタンパク質のエクトドメインとIndianaエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン間の融合である。本発明を実行するために好適な別の融合エンベロープタンパク質は、VSV-GChandipura、VSV-GCocal、VSV-GPyri、VSV-GIsfahan又はVSV-GSVCV、並びにVSV-GIndianaの膜貫通及び細胞質ドメインの中から選択される一つのVSV-Gタンパク質のエクトドメインを含む。前記融合タンパク質をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化核酸である。融合タンパク質をコードする核酸はまた、配列番号77、79、81、83、85、87、89として記載される。本発明の特定の実施形態では、化合物の組み合わせは提供され、ここで分離した化合物のレンチウイルス粒子は、iCSP抗原のポリペプチド、又はiiGPI-アンカーリングモチーフを欠損したCSP抗原CSPデルタGPI、若しくはN-末端の切断されたCSPタンパク質ポリペプチドCSPNTer又はまたCSPデルタSPのをコードする。特定の実施形態では、これらの化合物又はそれらのいくつかは、本明細書に開示される群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも1つの更なるポリペプチドをコードし、ここで前記抗原の異なるポリペプチドは、同一のレンチウイルス粒子又は異なるレンチウイルス粒子のいずれかから発現される。本発明の別の特定の実施形態では、これらの化合物又はそれらのいくつかは、本明細書に開示される群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも1つの更なるポリペプチドをコードする。本発明は特に、、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防免疫付与のために、本明細書で定義されるレンチウイルスベクター粒子、又は化合物の組み合わせに関する。従って、レンチウイルスベクター粒子、それを含む組成物、又は本発明の化合物の組み合わせは、それらを必要とする宿主、特に哺乳動物、特にヒト宿主に投与される場合、ナイーブリンパ球の活性化、エフェクターT細胞応答の生成、並びにマラリア寄生虫の抗原単数又は複数に対する免疫記憶抗原-特異的T細胞応答の生成を含む免疫応答を誘発する。免疫応答は、斯かる寄生虫が宿主にスポロゾイトとして接種される場合にマラリア寄生虫による感染を防ぎ得る、又はスポロゾイトの形態においてマラリア寄生虫の接種に起因する病理状態の発症若しくは進行を防ぎ得る、又は前記寄生虫の更なる形態、例えばメロゾイト形態の発生の結果の発症若しくは進行を防ぎ得る。従って、レンチウイルスベクター粒子又は本発明の化合物の組み合わせは、寄生虫の接種により、又はマラリア寄生虫のサイクルの赤血球外、即ち肝臓ステージの誘導により引き起こされる病理の発症の予防、制御、又は阻害に好適であり、有利な実施形態では、前記寄生虫の赤血球サイクルの発症及び進行を予防、緩和、又は阻害することに適している。有利なことに、投与のプライムブースト接種法に用いられる本発明のレンチウイルスベクター粒子は、保護免疫の発達を可能にし、特にマラリア寄生虫に誘導される病理に対して無菌保護を可能にすることが、観察されている。斯かる無菌保護は、もし前でない場合ifnotbefore、寄生虫のサイクルにおいて、肝臓感染のステージにおける感染の結果を制御することに起因し得る。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子の組成物は調製され、ここで、前記レンチウイルスベクター粒子は、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対して、予防的免疫付与に使用のための好適な投与ビヒクルと共に製剤化される。生理学的に許容されるビヒクルは、免疫付与組成物の投与経路に関して選択されてもよい。好ましい実施形態では、投与は、筋肉内に、又は子供に対して鼻腔内に行なわれてもよい。従って、化合物の組み合わせは、分離して提供されるレンチウイルスベクター粒子の組成物を含み、ここで化合物の組み合わせ又はキットのそれぞれの分離した組成物は、決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質単数又はタンパク質複数で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子を含み、前記偽型化エンベロープタンパク質は、化合物の組み合わせ又はキットの別の組成物のレンチウイルスベクター粒子の偽型化エンベロープタンパク質を血清中和するために、交差反応しない。従って、斯かる組成物又は前記組成物の化合物の組み合わせは、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対して、予防的免疫付与のために用いられ、前記使用は、宿主の細胞性免疫応答をプライムするための有効量のレンチウイルス粒子を投与すること、及び宿主の細胞性免疫応答をブーストするための有効量のレンチウイルス粒子を後で投与すること、及び任意でブーストの前記投与ステップを一回又は何回か繰り返すことを含む免疫付与パターンを含み、ここでプライム又はブーストするステップのそれぞれにおいて投与されるレンチウイルス粒子は、互いに交差中和をしない異なる偽型化エンベロープタンパク質単数又は複数で偽型化され、前記プライム又はブーストするステップは、少なくとも6週間、特に少なくとも8週間の時間が空けられる。マウスモデルが本発明のレンチウイルスベクター粒子を用いるプライムブースト接種法に従って処置される実施例では、斯かる投与計画に従って免疫付与され、最後の免疫付与ステップの6ヶ月後にチャレンジされたマウスは、ワクチン接種されたマウスの著しい割合について40超、未だ無菌保護を示すことが、発明者らにより示されており、それは本発明のレンチウイルスベクター粒子が宿主において長続きする無菌保護を誘発し、それ故、特にヒト宿主において、免疫付与のための好適な化合物を構成することを例証する。特定の実施形態では、本発明は、前記レンチウイルス粒子の、分離して提供される用量を含む投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、本明細書で定義されるレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせに関し、ここで、細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、中程度の用量であり、細胞性免疫応答をブースすることを目的とする用量は、プライムするのための用量より多い。従って、投与パターンにおいて用いられる細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、統合性ベクターが用いられる場合、107TU~109TUのウイルス粒子を含み、子供について意図される用量は、107TUの範囲であり、成人について、109TUの範囲である。プライム及びブーストすることを目的とする用量は、統合能力を有さないベクターが用いられる場合、108~1010のレンチウイルス粒子を含む。レンチウイルスベクター粒子又は本発明の化合物の組み合わせは、特定の実施形態では、宿主において、以下の効果:ヒト宿主において、特にプラスモディウムファルシパルムPlasmodiumfalciparum、プラスモディウムマラリアエPlasmodiummalariae、プラスモディウムビバックスPlasmodiumvivax、プラスモディウムノウレシPlasmodiumknowlesi又はプラスモディウムオバールPlasmodiumovaleによるマラリア寄生虫感染に対する、無菌保護を誘発すること;マラリア寄生虫の細胞外形態を阻害すること;マラリア寄生虫による肝細胞感染を予防すること、又は感染の肝臓ステージ増幅の阻害;マラリア寄生虫抗原単数又は複数に対する特異的T細胞免疫応答、特にCD8T細胞応答及び/又は特異的CD4T細胞応答を誘発すること;寄生虫抗原単数又は複数に対するB細胞応答を誘発すること;マラリア寄生虫による感染の影響を減少又は緩和するために寄生虫血症を制御すること;寄生虫による感染又は寄生虫により誘導される病理に対する保護細胞性免疫を誘発すること;メモリーT細胞免疫応答を誘発すること;マラリア寄生虫による感染の間、CD4及びCD8T細胞応答の早期の及び高い回復を誘発すること;プラスモディウム属感染に関して肝臓内のメモリーリンパ球を刺激することによる早期の強力なCTCD8T応答を誘発すること;マラリア寄生虫が免疫応答から回避することを防ぐこと、従って、マラリア寄生虫による感染の長期の制御を可能にすること;の少なくとも1つを得るために好適である用量、及び投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主に、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のために、特に用いられる。上記の目的とする効果の中でも、細胞性免疫応答T細胞免疫応答、特にCD8媒介細胞性免疫応答又はCD4媒介細胞性免疫応答、即ちCD8又はCD4受容体、好ましくは細胞傷害性Tリンパ球CTL及びメモリーT細胞応答を含む、活性化された細胞により媒介される免疫応答は、本発明のレンチウイルス粒子の免疫付与計画が定義される場合、有利に目的とされる。免疫応答はまた、体液性応答、即ちレンチウイルスベクターの前記の少なくとも1つのポリペプチドに対して産生される、前記レンチウイルスベクター粒子により誘発される抗体を含む。特定の実施形態では、前記体液性応答は、保護体液性応答である。保護体液性応答は、主に、それらの抗原、例えばIgGに対して高い親和性を有する成熟した抗体をもたらす。特定の態様では、保護体液性応答は、T細胞依存性である。特定の実施形態では、保護体液性応答は、中和抗体の産生を誘導する。本発明の特定の実施形態では、本発明のレンチウイルスベクターは、欠損したインテグラーゼを有する形態において用いられる場合でさえ、早期の免疫応答を誘発し得る。表現早期の免疫応答は、組成物の投与後約1週間以内に与えられる保護免疫応答寄生虫又は寄生虫に誘導される病理に対する保護を意味する。別の特定の有利な実施形態では、本発明のレンチウイルス粒子により与えられる免疫応答は、長続きする免疫応答であり、即ち、前記免疫応答は、メモリー細胞応答、及び特にセントラルメモリー細胞応答を含み;特定の実施形態では、それは、少なくとも数ヶ月間もなお検出され得実施例において、マウスについて例証されるように、保護は粒子の投与後少なくとも6ヶ月後もなお得られる、それは、保護が、投与後数年に亘りヒト宿主において続き得ると考えることが可能である。免疫応答が体液性応答を含む場合、長続きする応答は、任意の好適な方法、例えばELISA。免疫蛍光法IFA、フォーカス減少中和試験focusreductionneutralizationtestsFRNT、免疫沈降法、又はウエスタンブロット法による、特異的な抗体の検出により示され得る。特定の実施形態では、前記免疫応答、体液性又は細胞性のいずれかの早期の免疫応答、及び/又は長続きする免疫応答は、本発明の組成物の1回の投与後、非統合性遺伝子輸送ベクターを用いて誘発される。本発明はまた、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、免疫原性組成物の製造のための、本明細書で与えられる定義に従った、レンチウイルスベクター粒子の使用又は化合物の組み合わせの使用に関する。本発明はまた、本開示に従って、免疫応答を誘発するための本発明のレンチウイルスベクターを投与するステップを含み、及び前記応答をブーストするための1回又は何回か投与ステップを任意で繰り返す、哺乳動物宿主、特にヒト宿主に免疫付与を提供する方法に関する。本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせは、適切な送達ビヒクルとともに、哺乳動物、特にヒト宿主への投与に好適なアジュバント化合物、及び/又は免疫刺激化合物と関連して用いられてもよい。上記で引用されている組成物は、様々な経路:皮下s.c.、皮内i.d.、筋肉内i.m.、又は静脈内i.v.注射、経口投与、及び粘膜投与、特に鼻内注入、又は吸入を介して宿主に注入され得る。投与される量投与量は、治療される対照に依存し、患者の状態、個人の免疫系の状態、投与の経路、宿主のサイズを考慮することを含む。HIV-1レンチウイルスベクターについてのベクター粒子の同等のp24抗原の含量に関して表される好適な投与量範囲は、決定され得る。本発明の他の実施例及び特徴は、実施例及び図を読む場合、明らかであり、それは、本願において、与えられる定義と個別に組み合わせられ得る特徴を有するレンチウイルスベクター粒子の調製及び適用を例証する。レンチウイルスベクターが代替の戦略を象徴し得るかどうか評価するために、プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiTRIP.NICSのサーカムスポロゾイトCSタンパク質の切断された形態をコードする非統合性レンチウイルスベクターは、設計され、マラリアに関する動物マウスモデルにおいて評価された。CSタンパク質は、スポロゾイトの表面に亘り均一に分布しており、感染された肝臓細胞においてまた検出される45。従って、CSタンパク質に対する体液性免疫応答の誘導は、肝細胞伝染力を減少させる一方で、この抗原に対する細胞性免疫応答は、寄生虫感染した肝細胞を死滅させる。この概念は、CSタンパク質が、照射を受けたスポロゾイト免疫付与モデルにおける保護免疫の主な標的であることを例証した的確な研究により、近年支持されている6。更に、臨床試験においてこれまで試験されてきた全てのワクチン候補の中でも、CSタンパク質に基づくワクチンRTS,Sのみは、風土病の国々において、著しいマラリアの発生率、及び重症のマラリアの症例を減少することを示している78。CSタンパク質に対する最適な免疫応答を誘発するために、我々は、3つの戦略:1形質導入された細胞における抗原発現のレベルを増加させること、ここで我々は、ベクターバックボーンbackoneに、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、CSタンパク質の哺乳動物コドン最適化配列を挿入し、我々は、mRNA安定性の向上、及び細胞質への輸送のために、ウッドチャック転写後制御エレメント配列を導入遺伝子の下流に付加した。;2GPIアンカーリングモチーフの欠失が、CSタンパク質の免疫原性を向上することを示しているので、我々は、cs遺伝子の3’末端に位置するGPIアンカーリング配列を欠失させた9;3特異的な免疫応答を減少させること、及び特に、スポロゾイトチャレンジによる感染からマウスを保護すること、ここでマウスはLV-に基づくブースターを受けた、を組み合わせた。最初の免疫付与後に誘導された中和する抗-エンベロープ抗体の存在を回避するために、ブースト免疫付与に用いられるレンチウイルス粒子は、非交差反応血清型からVSV-Gエンベロープで偽型化されたプライムについてVSV-GIndiana、第一及び第二のブーストについて、それぞれVSV-GNewJersey及びCocal。第一の一連の実験では、マウスは、中容量のTRIP.NICSでプライムされ、8週間後に高容量のTRIP.NICSでブーストされた図1a。このプライムブースト接種法により誘導された保護を評価するために、BALB/cマウスは、80.103スポロゾイトのプラスモディウムヨエリPlasmodiumyoelii17XNLgfp株蚊中に存在する寄生虫の侵襲形態でチャレンジされた。チャレンジは、免疫付与計画の完了の4週間後に行なわれた。チャレンジの40時間後、肝臓ステージ発達の阻害のレベルは、マウスの肝臓中のプラスモディウム属の18SrRNAを定量することにより決定された。この目的のために、肝臓で抽出されたRNAは、EXPRESSOne-StepSYBR登録商標GreenER登録商標キットinvitrogen及びプラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiの18SrRNAの増幅のための特異的なプライマーを用いたプラスモディウム属の18SrRNA配列のリアルタイムPCR増幅に用いられた。図1bに示されるように、寄生虫の肝臓ステージ発達の阻害は、全ての免疫付与されたマウスについて完全であり、即ち寄生虫18SrRNAは、定量RT-PCRにより検出することはできなかった。並列実験では、保護はまた、免疫付与されたマウスの血液塗抹標本を検査することにより評価され、それは、赤血球ステージの発症について、500プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiスポロゾイトでチャレンジされた。末梢血塗抹標本は、免疫付与されたマウスが寄生虫血症を発症するかどうか、即ち、保護が発達し損なうかどうかを決定するために、チャレンジ後3~14日、毎日得られ、ギムザ染色され、顕微鏡により検査された。図1cに示されるように、完全な保護は、免疫付与されたマウスの60で生じた。第二の一連の実験では、我々は、Indiana及びNewJersey血清型に対する抗体と交差反応をしない、VSV-GCocalエンベロープで偽型化されたTRIP.NICSの第三の注射を加えた。最後のブーストから1ヶ月後、免疫付与されたマウスは、500スポロゾイトで静脈内にチャレンジされた図2a。予防能力は、ギムザ染色された血液塗抹標本により、注射後3日目から21日目まで、1日おきに血液ステージ寄生虫血症をモニタリングすることにより、評価された。5日後、全てのナイーブマウスは、明らかな血液ステージ寄生虫血症を示した。これに反して、62,5の免疫付与されたマウスは、無菌免疫を示した続く21日に亘る、寄生虫血症の不在により定義される図2b。更に、ナイーブマウスと比較して、寄生虫血症を発症している免疫付与されたマウスは、赤血球侵入の経過において、著しい遅延を示した図2c。チャレンジの10日後、部分的に保護された免疫付与されたマウスは、ナイーブマウスと比較して寄生虫血症のレベルにおいて2倍の減少を示し、この場合において、ワクチンが、部分的ではあるが、寄生虫の免疫制御を提供することを例証した図2d。肝脾腫大症は、マラリアの顕著な特徴である。我々は、その後、チャレンジの3週間後に屠殺されたマウスの臓器の定量分析を行なった。寄生虫に感染しているナイーブマウスは、大規模な脾腫を示した図3。更に、脾臓及び肝臓は、赤血球ヘモグロビンの消化の間、寄生虫により製造されるヘモゾインの蓄積に起因する暗い色素沈着を示した。これに対して、無菌免疫応答を備えたワクチン接種されたマウスの8匹中5匹の能力は、通常のサイズ及び色素沈着を示した肝臓及び脾臓の保存と一致した。免疫付与されたマウスの1/3が無菌保護を示さなかった理由を理解するために、我々は、チャレンジの3週間後に屠殺されたワクチン接種された動物においてCSタンパク質特異的免疫応答を評価した。チャレンジされたナイーブマウスは、T細胞を産生する検出可能なCSタンパク質特異的IFN-μを示さなかったデータは示されない。これに対して、ワクチン接種された群において、完全に保護されたマウスは、ワクチン接種されたが部分的に保護されたマウスと比較して、5~8倍高いCSP特異的T細胞応答を示し、免疫制御についてT細胞応答の強度の決定的な重要性を強調する図4。重要なことには、我々はまた、最後の免疫付与から6ヶ月において、チャレンジ実験を実行した。この場合、40超のワクチン接種されたマウスは、チャレンジ後、検出可能な寄生虫血症を未だ発症しておらず、我々のワクチン戦略により与えられる長続きする無菌保護を例証する図5。総合すると、これらのデータは、非統合性レンチウイルスベクターに基づくプライムブースト接種法が、感染体、例えばプラスモディウム属をチャレンジすることに対する高い程度の保護を与え得ることを例証した。これらの結果に基づいて、我々は、現在、複数ステージのワクチン手法を開発している。この戦略の原理は、肝臓ステージにおいて発現され、T細胞応答により標的化される抗原、及び血液ステージにおいて発現され、抗体反応により標的化される抗原に対する、複数の免疫応答を誘導することによる我々のワクチン手法により与えられる保護効率を改良することである。この目的のために、我々は、二つの前赤血球ステージ抗原CSタンパク質及び肝細胞赤血球タンパク質17kDa-HEP17、及び一つの赤血球ステージ抗原メロゾイト表面タンパク質1の42-kDaフラグメント-MSP-142を選択している。Hep17に特異的な細胞傷害性T細胞応答は、スポロゾイトチャレンジに対して部分的に保護的であり、MSP-142に特異的な抗体反応が血液ステージ寄生虫での致死的チャレンジに対してマウスを保護し得ることを示しているので、これらの抗原は選択された1011。Hep17又はMSP-142についてコードするレンチウイルスベクターは、材料及び方法の部分に詳述されるように構築された。Hep17を発現するレンチウイルス粒子の単回注射の免疫原性を評価するために、マウスの群n=5/群は、100ng3.2x107TU又は600ng1.9x108TUのTRIP.NIHep17で免疫付与され、特異的な免疫応答は、Elispotにより評価された。図6に示されるように、前述の9-mer及び15-merを用いて刺激後、比較的弱いCD8及びCD4応答は、免疫付与されたマウスの脾臓において検出され得る12。我々はまた、TRIP.IHep17レンチウイルス粒子の免疫原性を試験した。マウスの群n=5は、1x107TRIP.IHep17粒子を用いて筋肉内に免疫付与された。Hep-17特異的IFNgElispot反応は、免疫付与されたマウスからの脾細胞に関して、11日後に評価された。図7に示されるように、最も強い反応は、CD4T細胞エピトープKL14及びEK15、及び一つのCD8T細胞エピトープLA9に対して検出された。我々はまた、TRIP.ICS粒子とともにTRIP.IHep17粒子の共免疫付与後、得られたT細胞応答を評価した。マウスは、二つの注射:左の腿四頭筋に1x107TRIP.IHep17粒子の一つの注射、及び右の腿四頭筋に1x107TRIP.ICS粒子の一つの注射を受けた。平行して、マウスの群は、TRIP.ICS粒子単独1x107TU筋肉内、又はTRIP.IHep17粒子単独1x107TU筋肉内で免疫付与された。11日目において、免疫付与されたマウスの一部は、Elispot実験のために屠殺された。TRIP.CS粒子単独、又はTRIP.ICS及びTRIP.IHep17粒子で免疫付与されたマウスのCS特異的IFNgT細胞の頻度間で大きな違いは存在しなかった図8A。免疫付与されたマウスにおける細胞傷害性T細胞応答を評価するために、我々は、インビボ細胞傷害性アッセイ材料及び方法に記載に従ってを実行した。11日目において、TRIP.ICS粒子単独、又はTRIP.ICS及びHep17粒子で共免疫付与されたマウスの群は、CSペプチドを用いてパルスされた標的T細胞を用いて静脈注射によりチャレンジされた。期待されるよう、TRIP.ICS粒子で免疫付与されたマウスは、標的細胞を効率的に溶解し、我々は、TRIP.ICS粒子単独で免疫付与されたマウスの群と、TRIP.ICS及びTRIP.IHep17粒子の双方を受けたマウスの群間で著しい違いは検出されなかった図8B。総合すると、これらの結果は、TRIP.ICS粒子で共投与されたTRIP.IHep17粒子が、TRIP.ICS粒子により誘発されるCS特異的T細胞応答と著しく干渉しないことを例証した。我々はまた、TRIP.IHep17単独で免疫付与された、又はTRIP.ICS粒子で共投与されたマウスにおけるHep17-特異的IFNgT細胞の頻度を評価した。5つの9-merペプチドに対する刺激に応答する特異的T細胞の頻度CD8T細胞エピトープは、2つの群で同様であり、これらは、KL14エピトープCD4T細胞エピトープを用いた刺激後に測定された。際だって、CD4T細胞エピトープEK15に対して検出される応答は、TRIP.IHep17単独で免疫付与されたマウスにおいてよりも、共免疫付与されたマウスにおいて、2倍高かった図8C。図8Dに示されるように、Hep17ペプチド-パルス標的に対するT細胞の細胞傷害能力はまた、TRIP.IHep17及びTRIP.ICS粒子で共免疫付与されたマウスにおいて著しく減少した。集合的に、これらのデータは、CS-特異的免疫応答がHep17に特異的な細胞傷害性T細胞応答を増幅することを例証する。我々は、次に、レンチウイルスベクターの、血液ステージマラリア抗原メロゾイト表面タンパク質-1MSP1に対するB細胞応答を開始する能力を評価した。マウスn=5は、N末端において、カルレチクリンの分泌シグナルと融合した、プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiTRIP.IMSP142からのMSP1の42-kDa領域をコードする、様々な用量の統合性レンチウイルスベクターTRIP.IMSP142を用いて免疫付与された。免疫付与の3週間後、免疫付与されたマウスの各群から回収されたプール血清は、抗原の保護的C末端の19-kDa領域MSP-1191314に対する合計の抗-MSP1抗体の存在について試験された。9Aに示されるように、1x106TUと同じ程度の用量で免疫付与されたマウスは、抗-MSP-119抗体の検出可能なレベルを示し、1x107TUのこのベクターを用いた免疫付与は、2x103に達っする平均力価を有する抗-MSP-119Igの強力な分泌を誘導した。レンチウイルスベクター免疫付与により与えられる抗-MSP1応答が、第二の免疫付与により増幅され得るかどうかを知るために、VSV-GIndianaエンベロープで偽型化された100ngのTRIP.IMSP142粒子で免疫付与されたマウスは、3ヶ月後、VSV-GCocalエンベロープで偽型化された1000ngのTRIP.NIMSP142粒子でブーストされた図9B。最後の免疫付与の3週間後、抗-MSP-119抗体のレベルは、プライムブーストされたマウスにおいて、4x105の平均値に達した一方で、単にプライムされたマウスの血漿における力価は、2x104であった。結論として、統合性レンチウイルスベクターを有する免疫付与は、寄生虫による赤血球細胞の感染に対して保護的であることを示す、強力な抗-MSP-119Igを誘導し得る。材料及び方法動物及び寄生虫Balb/cOlaHsd6週齢、雌性は、HarlanLaboratoriesGannat,Franceから購入された。全ての動物実験は、AnimalCareatthePasteurInstituteのガイドラインに従って実行された。感染実験は、プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoelii17XNL株野生型、又は生きている蚊中でオーシスト及びスポロゾイトの検出を可能にするために、緑色蛍光タンパク質を発現する、遺伝的改変体を用いて行なわれた。プラスモディウムヨエリPlasmodiumyoeliiは、ステフェンスハマダラカAnophelesstephensi及びBalb/cマウスにおいて、代替のサイクルの推移cyclicpassagesにより、維持された。蚊は、標準的な手順を用いて、PasteurInstituteのCenterforProductionandInfectionofAnophelesCEPIAにおいて飼育された。プラスミドベクター構築PyCSタンパク質アミノ酸1-367;GenBank登録番号M58295の全長についてコードする遺伝子の哺乳動物コドン最適化形態は、Geneartにより合成された。GPIアンカーリングモチーフの欠失が、CSタンパク質の免疫原性を向上させることが示されているので、我々は、最後の11個のアミノ酸をコードする配列の欠失したcs遺伝子のコドン最適化形態を構築した。この配列は、以下のオリゴヌクレオチドSigma-Proligo:フォワード5’GGTACCGGATCCGCCACCATGAAGAAATGCACC-3’下線はBamHI部位;リバース5’-AGCTCGAGTCATCACAGGCTGTTGGACACGATGTTGAAGATGC-3’下線はXhoI部位を用いて、コドン最適化cs遺伝子のフラグメントのPCR増幅により得られた。得られた増幅産物は、pCR2.1-TOPOプラスミドInvitrogen及び配列pCR2.1-TOPOCSと称されるプラスミドにクローンされた。pTRIPCSベクタープラスミドは、BamHI/XhoI消化されたpTRIPCMV-GFP-WPREからのGFP配列を、pCR2.1-TOPOCSのBamHI/xhoI消化後得られる切断されたコドン最適化CS配列と置き換えることにより生成された。pTRIPHep17について、kozak配列を含み、5’にBamH1部位、及び3’にXhoI部位を有する、PyHep17遺伝子GenBank登録番号U43539の哺乳動物コドン最適化配列Geneartは、BamH1/XhoI消化されたpTRIPCMV-WPREにクローンされた。MSP1構築物について、合成の哺乳動物コドン最適化配列Geneartは:PyMSP142GenBank登録番号JO4668のコドン最適化配列に融合されたカルレチクリンMLLSVPLLLGLLGLAVAの分泌シグナルについてコードする配列を含むために設計された。BamH1/XhoIで消化される全体配列は、BamH1/XhoIで消化されるpTRIPCMV-WPREにクローンされた。pTRIPベクターの配列は:配列番号34、37、40、43、45及び47としてそれぞれ指定される。レンチウイルスベクター産生ベクター粒子は、前述のように15、ベクタープラスミドpTRIPCS、VSV-Gエンベロープ発現プラスミドpHCMV-G、及び統合が欠損しているベクターインテグラーゼの触媒ドメインにおけるD64V置換が、統合ステップのDNA切断及び連結反応を妨げるの生産のための、pD64Vキャプシド形成GAGPOLプラスミドを用いて、293T細胞の一時的リン酸カルシウム共トランスフェクションにより、生産された。濃縮されたベクター粒子のp24抗原含有量の定量は、市販のHIV-1p24酵素結合免疫吸着測定法ELISAキットPerkinElmerLifeSciencesを用いて行なわれた。TRIP.I及びTRIP.NI粒子のベクター力価は、アフィジコリンSIGMAで処理されたHeLa細胞を形質導入すること、及び前述のように15定量PCRを行なうことにより、測定された。統合性及び非統合性レンチウイルスベクターの力価は、増殖を停止した細胞において測定されたp24含量、及び定量PCRに従って、同様であった。マウス免疫付与及びチャレンジ6週齢のBALB/cマウスは、0.1mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に希釈された、VSV-GIndianaエンベロープで偽型化された100ngのTRIP.NICSベクター粒子で腹腔内にi.p.免疫付与された。8週間後、マウスは、VSV-GNewJerseyエンベロープで偽型化された1500ngのTRIP.NICSベクター粒子で腹腔内にブーストされた。免疫付与された、及び対照のマウスのチャレンジは、最後の免疫付与から4週間又はそれ以上後の、静脈内に80,000のスポロゾイトの注射からなった。チャレンジの結果は、後に詳述する定量的なリアルタイムRT-PCR法を用いることにより、マウスの肝臓における寄生虫負担を測定することにより、決定された。我々はまた、マウスの対照及び免疫付与された群において、3日目からチャレンジ後14日まで、毎日得られるギムザ染色された薄い血液塗布標本の顕微鏡検査により、500スポロゾイトの静脈内接種後、マウスが寄生虫血症を発症したかどうか測定した。簡潔に言うと、チャレンジされたマウスからの血液の小液滴は、顕微鏡スライド上に置かれた。液滴は、第二のスライドを用いて塗りつけられ、空気乾燥され、30秒間100メタノール中で固定された。固定されたスライドは、水Volvicで希釈された10ギムザReactfsRALの新鮮な溶液中で30分間染色され、水でリンスされ、空気中で乾燥された。スライドは、x100油浸対物レンズで観察された。リアルタイムRT-PCRによるP.ヨエリP.yoeliiの定量チャレンジされたマウスの肝臓における寄生虫負荷の定量は、幾つかの修正ととともに、前述のように16行なわれた。チャレンジの40時間後、肝臓は回収され、RNAはRNeasyミニキットQiagenを用いて抽出された。2μgのRNAは、寄生虫特異的18SrRNAの定量に用いられた。リアルタイムRT-PCRの反応は、EXPRESSOne-StepSYBR登録商標GreenER商標キットinvitrogen、及びP.ヨエリP.yoeliiの18SrRNAの増幅に特異的なプライマーを用いて行なわれた。プライマーSigma-Proligoの配列は:5’-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG-3’フォワードプライマー、及び5’-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3’リバースプライマーである。実験は、LightCycler商標装置Rochediagnosticsを用いて行なわれた。寄生虫RNAコピーの量は、寄生虫の18ScDNAPCR増幅フラグメントを含むプラスミド構築物pCR2.1-TOPOプラスミド-Invitrogenの段階希釈により調製される内部標準曲線上への閾蛍光値の外挿法により評価された。ElispotアッセイニトロセルロースマイクロプレートMAHAS4510,Milliporeは、捕捉抗体MouseIFNgElispotpair,BDPharmingenでコートされ、10FCSが添加されたRPMI1640Glutamax、抗体、Hepes、非必須アミノ酸、b-メルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムからなる完全培地でブロックされた。ベクター免疫付与マウスからの脾細胞は、0.125x106細胞/ウェルで3重にプレートに添加された。CS特異的CD8T細胞応答の定量のために、脾細胞は、2μg/mlのペプチドPolyPeptideLaboratoriesFrance、SYVPSAEQIPyCS280288又はIYNRNIVNRLPyCS5867とインキュベートされた。CS特異的CD4T細胞応答を評価するために、脾細胞は、2μg/mlのペプチドSYVPSAEQILEFVKQIPyCS280295とインキュベートされた。20時間後、スポットは、ビオチンコンジュゲート化抗体MouseIFNgElispotpair,BDPharmingen、続いてストレプトアビジン-APRoche、及びBCIP/NB基質溶液Promegaを用いて明らかにされた。スポットは、Bioreader2000Biosys,Karben,Germanyを用いて計測され、結果は、100万個の脾細胞あたりのIFNγスポット形成細胞sfcとして表わされた。同一のプロトコールは、Hep17特異的T細胞応答の定量に適用された。Elispot及びインビボ細胞傷害性アッセイにおいて刺激のために用いられるペプチドは、表1に要約される。インビボ細胞傷害性アッセイ標的細胞調製のために、ナイーブマウスからの脾細胞は、様々な濃度高濃度、5μM;低濃度、1μMのCFSEカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル、VybrantCFDA-SE細胞追跡キット,MolecularProbesで標識された。高濃度のCFSEで標識された脾細胞は、5μg/mlにおいてペプチドの組み合わせでパルスされた。低用量のCFSEで染色された対照集団は、ペプチドを含まない培地中でインキュベートされた。各マウスは、眼窩後静脈を通して、各画分から等量の細胞を含む混合物の107CFSE-標識細胞を接種された。15~18時間後、脾臓からの単一細胞の懸濁液は、フローサイトメトリーBectonDickinson,CellQuestsoftwareにより分析された。ペプチド-パルスされた細胞の消失は、免疫付与されたマウスに対するナイーブマウスにおける、パルスされた集団HighCFSE蛍光強度と未パルスの集団低濃度CFSE蛍光強度の比を比較することにより決定された。特異的な死亡のパーセンテージは、以下の計算:1-CFSE低濃度ナイーブ/CFSE高濃度ナイーブ/CFSE低濃度免疫付与/CFSE高濃度免疫付与100に従って確立された。組み換えMSP119タンパク質P.ヨエリP.yoeliiYMMSP119aa1649-1757は、pTRIPMSP142からのフォワードプライマー5’-CGTGGATCCATGGACGGCATGGATCTGCTG-3’及びリバースプライマー5’-GATGAATTCGGAGCTGCTGCTGCAGAACACG-3’を用いてPCRにより増幅され、グルタチオンS-トランスフェラーゼGST-融合タンパク質発現ベクターpGEX-2TAmershamBiosciences,Bucks,UKにクローンされた。大腸菌EscherichiacoliBL21starInvitrogenは、pGEX-2TMSP119で形質転換され、増殖及び誘導は、製造者の指示pGEXベクター、GST遺伝子融合システム、Amershamに従って行なわれた。BL21においてタンパク質の発現の誘導後、細胞は回収され、BugBuster試薬Novagenを用いて溶解された。組み換えタンパク質は、製造者の指示に従って、GST結合タンパク質精製キットNovagenを用いて、GST結合レジンクロマトグラフィーにより精製された。血清抗体反応の測定血清は、酵素結合免疫吸着測定法ELISAによるMSP119特異的抗体の評価のために、最後の免疫付与の3週間後に回収された。組み換えGST-MSP119融合タンパク質又はGST対照は、PBS中2μg/mlにおいて、4°Cで96ウェルNunc-ImmunoMaxisorpプレートFischerScientific,Wohlen,Germanyに一晩吸着させた。PBS中0.05Tween20で3回の洗浄後、ウェルは、室温で1時間、10のウシ胎児血清FBSを含む100μlのPBSの添加により、ブロックされた。プレートは、PBS中0.05Tween20で3回洗浄され、100μlの血清の10倍段階希釈液が、ウェルに添加された。室温で2時間のインキュベーション後、ウェルは洗浄され、PBS10FBSに1/4000に希釈された100μlのペルオキシダーゼヤギ抗-マウス免疫グロブリンHLJacksonImmunoResearchは、各ウェルに添加された。室温で1時間のインキュベーション後、ウェルは洗浄され、100μlのテトラメチルベンジジン基質試薬BDPharmingenは、各ウェルに添加された。プレートは、室温で30分間インキュベートされ、100μlの1NH2SO4は、反応を停止するために添加された。プレートは、450nmにおいて、光学密度について測定された。終点endpoint力価は、2倍の非免疫付与マウスからの血清の光学密度を誘発する、最後の希釈の逆数として計算された。参考文献1NussenzweigRSetalProtectiveimmunityproducedbytheinjectionofxirradiatedsporozoitesofplasmodiumbergheiNature2161601622GwadzRWetalPreliminarystudiesonvaccinationofrhesusmonkeyswithirradiatedsporozoitesofPlasmodiumknowlesiandcharacterizationofsurfaceantigensoftheseparasitesBullWorldHealthOrgan57Suppl11651733ClydeDFetalImmunizationofmanagainstsporoziteinducedfalciparummalariaAmJMedSci2661691774KappeSHBuscagliaCANussenzweigVPlasmodiumsporozoitemolecularcellbiologyAnnuRevCellDevBiol2029595SinghAPetalPlasmodiumcircumsporozoiteproteinpromotesthedevelopmentoftheliverstagesoftheparasiteCell1314925046KumarKAetalThecircumsporozoiteproteinisanimmunodominantprotectiveantigeninirradiatedsporozoitesNature4449379407AbdullaSetalSafetyandimmunogenicityofRTSSAS02DmalariavaccineininfantsNEnglJMed359253325448BejonPetalEfficacyofRTSSAS01Evaccineagainstmalariainchildren5to17monthsofageNEnglJMed359252125329BrunaRomeroORochaCDTsujiMGazzinelliRTEnhancedprotectiveimmunityagainstmalariabyvaccinationwitharecombinantadenovirusencodingthecircumsporozoiteproteinofPlasmodiumlackingtheGPIanchoringmotifVaccine223575358410DoolanDLetalIdentificationandcharacterizationoftheprotectivehepatocyteerythrocyteprotein17kDageneofPlasmodiumyoeliihomologofPlasmodiumfalciparumexportedprotein1JBiolChem271178611786811DraperSJetalEffectiveinductionofhightiterantibodiesbyviralvectorvaccinesNatMed1481982112DobanoCDoolanDLIdentificationofminimalCD8andCD4TcellepitopesinthePlasmodiumyoeliihepatocyteerythrocyteprotein17kDaMolImmunol443037304813HirunpetcharatCetalCompleteprotectiveimmunityinducedinmicebyimmunizationwiththe19kilodaltoncarboxylterminalfragmentofthemerozoitesurfaceprotein1ofPlasmodiumyoeliiexpressedinSaccharomycescerevisiaecorrelationofprotectionwithantigenspecificantibodytiterbutnotwitheffectorCD4TcellsJImmunol1593400341114AhlborgNetalProtectiveimmuneresponsestothe42kilodaltonregionofPlasmodiumyoeliimerozoitesurfaceprotein1areinducedbytheCterminal19kDaregionbutnotbytheadjacent33kDaregionInfectImmun7082082515CoutantFFrenkielMPDespresPCharneauPProtectiveantiviralimmunityconferredbyanonintegrativelentiviralvectorbasedvaccinePLoSONE3e397316BrunaRomeroOetalDetectionofmalarialiverstagesinmiceinfectedthroughthebiteofasingleAnophelesmosquitousingahighlysensitiverealtimePCRIntJParasitol311499150217DaneshvarCetalLaboratoryFeaturesofHumanPlasmodiumknowlesiInfectionClinicalInfectiousDiseases4985286018VaughanKetalMetaanalysisofimmuneepitopedataforallPlasmodiaoverviewandapplicationsformalarialimmunobiologyandvaccinerelatedissuesParasiteImmunology200931789719JonesStephanieetalLentiviralvectordesignforoptimalTcellreceptorgeneexpressioninthetransductionofperipheralbloodlymphocytesandtumorinfiltratinglymphocyteHumanGeneTherapy2063064020CockrellASetalGenedeliverybylentivirusvectorsMolBiotehnol3618420421IkediaYetalContinuoushightiterHIV1vectorproductionNatureBiotechnology2156957222CockrellASetalAtranslentiviralpackagingcelllineforhightiterconditionalselfinactivatingHIV1vectorsMolecularTherapy1427628423XuKetalGenerationofastablecelllineproducinghightiterselfinactivatinglentiviralvectors24KafriTetalApackagingcelllineforlentivirusvectorsJournalofvirolog7357658425ZenouVetalHIVgenomenuclearimportismediatedbyacentralDNAflapCell10117318526FiratHetalTheJournalofGeneMedicine4384527VandenDriessheTetalLentiviralvectorscontainingtheHumanImmunodeficiencyVirustype1centralpolypurinetractcanefficientlytransducenondividinghepatocytesandantigenpresentingcellsinvivoBlood2002Aug11008132228MeralEetalVACCINEvol27Issue4916November2009pages6862686829CroninJetalAlteringtheTropismofLentiviralvectorsthroughPseudotypingCurrGeneTher2005August538739830FredericksenBLetalJVirol1995691435144331NishimuraNetalPNAS20029967556760"