"脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞。前記小胞は、機能化脂質を含む、請求項1に記載の多層状脂質小胞。前記小胞は、ホスホコリンを含む、請求項1又は2に記載の多層状脂質小胞。前記小胞は、ホスホグリセロールを含む、請求項1、2又は3に記載の多層状脂質小胞。前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項2、3又は4に記載の多層状脂質小胞。前記小胞は、作用物質を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項6に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、抗原である、請求項6に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、アジュバントである、請求項6に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、タンパク質である、請求項6に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、前記小胞内に封入されている、請求項6に記載の多層状脂質小胞。前記作用物質は、前記脂質二重層間に封入されている、請求項6又は11に記載の多層状脂質小胞。前記小胞は、ポリエチレングリコールPEGと結合している、請求項1~12のいずれか1項に記載の多層状脂質小胞。前記小胞は、DOPC、DOPG及びマレイミド機能化脂質を含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の多層状脂質小胞。前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項14に記載の多層状脂質小胞。請求項1~15のいずれか1項に記載の前記多層状脂質小胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。請求項1~15のいずれか1項に記載の前記多層状脂質小胞及び凍結乾燥に適した賦活剤を含む組成物。前記凍結乾燥に適した賦活剤は、ショ糖を含む、請求項17に記載の前記多層状脂質小胞を含む組成物。機能化脂質を含むリポソームを二価陽イオンに接触させて融合リポソームを形成することと、前記融合リポソームを架橋剤に接触させて、脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成することと、を含む方法。前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項19に記載の方法。前記リポソームは、ホスホコリンを含む、請求項19又は20に記載の方法。前記リポソームは、ホスホグリセロールを含む、請求項19、20又は21に記載の方法。前記リポソームは、マレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含む、請求項19に記載の方法。前記機能化脂質は、機能化ホスホエタノールアミンである、請求項19~23のいずれか1項に記載の方法。前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項23に記載の方法。前記架橋剤は、ジチオール架橋剤である、請求項19~25のいずれか1項に記載の方法。前記架橋剤は、ジチオトレイトールDTTである、請求項19~25のいずれか1項に記載の方法。脂質二重層間に架橋を有する前記多層状脂質小胞の表面に結合したポリエチレングリコールPEGをさらに含む、請求項19~27のいずれか1項に記載の方法。前記二価陽イオンは、Ca2である、請求項19~28のいずれか1項に記載の方法。前記二価陽イオンは、Mg2である、請求項19~29のいずれか1項に記載の方法。前記接触することは、水性緩衝液中で実行される、請求項19~30のいずれか1項に記載の方法。前記リポソームは、作用物質を含む、請求項19~31のいずれか1項に記載の方法。前記作用物質は、予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項32に記載の方法。前記リポソームは、40:10:50のモル比のDOPC、DOPG及びマレイミド機能化脂質を使用して調製される、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質とのモル比は、1:2である、請求項8のいずれか1項に記載の方法。脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法。架橋した脂質二重層を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を対象に投与すること、を含む方法。前記多層状脂質小胞は、生分解性脂質を含む、請求項37に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、リン脂質を含む、請求項37又は38に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、ホスホコリン、ホスホグリセロール、及び/又はホスホエタノールアミンを含む、請求項37、38又は39に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、機能化脂質を含む、請求項37~40のいずれか1項に記載の方法。前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項41に記載の方法。前記マレイミド機能化脂質は、マレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項42に記載の方法。前記作用物質は、予防薬である、請求項37~43のいずれか1項に記載の方法。前記作用物質は、治療薬である、請求項37~43のいずれか1項に記載の方法。前記作用物質は、抗原である、請求項37~45のいずれか1項に記載の方法。前記作用物質は、アジュバントである、請求項37~45のいずれか1項に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、複数の作用物質を含む、請求項37~45のいずれか1項に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、2つの作用物質を含む、請求項37~45のいずれか1項に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、抗原及びアジュバントを含む、請求項49に記載の方法。前記多層状脂質小胞は、その外表面上でPEGと結合する、請求項37~50のいずれか1項に記載の方法。架橋した脂質二重層を有し、作用物質含む多層状脂質小胞を、invitroで細胞に接触させることを含む方法。本発明は、装填容量が向上し、高レベルの疎水性作用物質と疎水性作用物質との両方を同時に封入する能力があり、放出プロファイルが延長された新規性及び進歩性を有する薬物送達システムを提供する。これらの送達システムの幾つかの態様は、架橋した脂質二重層を有する多層状脂質小胞本明細書では二層間架橋多層状小胞またはICMVと呼ぶを含む。実施例で示すように、本発明の小胞は予想外の向上した封入効率例えば幾つかの場合では、単純なリポソームより100倍効率的であるを示し、封入された又は他の方法で閉じ込められた作用物質を、血清存在下でゆっくりと持続性のある動態によって放出することができ、invivoでの持続性の送達媒体として非常に望ましいものである。また、本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明の小胞は水性環境内で合成することができ、それにより、様々な先行技術の方法において一般的な、有機溶媒及び/又は酸性環境の使用を含む過酷な条件が回避される。その結果、これらの合成方法は、このような先行技術の方法を使用すると通常は構造的及び/又は機能的に損なわれるようなものを含め、様々な作用物質によってより適切なものになる。したがって、その結果得られる小胞は有機溶媒を含まず、専ら生分解性脂質などの脂質と、当該脂質内に封入された又は当該脂質を通って封入される任意の作用物質とで構成することができる。本発明は部分的に、本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明の上記及びその他の驚くべき予想外の特徴に基づく。したがって本発明は、これらの安定化した小胞、これらの小胞を含む組成物、これらの小胞の作成方法、及びその使用方法を提供する。したがって1つの態様では、本発明は脂質の二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞、又は脂質の二重層間に架橋を有する複数又は集団の多層状脂質小胞を提供する。複数とは1~103、1~104、1~105、1~106、1~107、1~108、又は1~109とすることができるが、これらに限定されない。小胞の様々な態様について以下で説明するが、これらの態様は他に明記しない限り、複数又は集団の小胞に等しく当てはまることを理解されたい。本発明の小胞は、単なる外部又は最外二重層の又は二重層表面の成分間の架橋ではなく、内部隣接又は並置二重層の成分間の結合を含む。幾つかの実施形態では、小胞は機能化した脂質を含む。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。機能化脂質はホスホエタノールアミンとすることができるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は機能化され、好ましくは直接機能化された脂質二重層成分を含む。幾つかの実施形態では、小胞はホスホコリンを含み、これはDOPCなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞はホスホグリセロールを含み、これはDOPGなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞はDOPC、DOPG及び機能化脂質を含み、これは機能化ホスホエタノールアミンなどであるが、これに限定されない。機能化脂質はマレイミド含有とすることができる。幾つかの実施形態では、小胞はDOPC、DOPG、及びマレイミド機能化脂質を含む。機能化脂質は、MPBなどであるが、これに限定されないマレイミド機能化ホスホエタノールアミンとすることができる。幾つかの実施形態では、DOPC:DOPG:機能化脂質のモル比は40:10:50である。幾つかの実施形態では、小胞はDOPC及びMPBを含むことができる。幾つかの実施形態では、小胞はDOPC、DOTAP及びMPBを含むことができる。幾つかの実施形態では、DOPC:DOTAP:機能化脂質のモル比は40:10:50である。幾つかの実施形態では、機能化脂質は少なくとも25の分子パーセンテージで存在する。幾つかの実施形態では、小胞は1つ又は複数の作用物質を含むある作用物質を含む。本明細書では、1つ又は複数の作用物質は相互に異なる1つ又は複数の作用物質を意味する。幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬、治療薬、又は診断薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は抗原である。幾つかの実施形態では作用物質は全タンパク質抗原を含むタンパク質抗原である。幾つかの実施形態では、作用物質はアジュバントである。アジュバントはTLR4、TLR7、TLR8及びTLR9アゴニストなどのTLRアゴニストとすることができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は抗原と、TLR4及びTLR7アゴニストなどの少なくとも2つのアジュバントとを含む。幾つかの実施形態では、作用物質はタンパク質である。幾つかの実施形態では、小胞は脂質又は粒子1mg当たり300μgを超える作用物質、又は脂質又は粒子1mg当たり400μgを超える作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞は脂質又は粒子1mg当たり300~400μgの作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞は脂質又は粒子1mg当たり325μgの作用物質、又は脂質又は粒子1mg当たり407μgの作用物質を含む。関連する実施形態では、作用物質はタンパク質抗原とすることができる。幾つかの実施形態では、作用物質は小胞内に封入される。幾つかの実施形態では、作用物質は小胞の核内に存在する。幾つかの実施形態では、作用物質は脂質二重層間に存在する。幾つかの実施形態では、小胞は核内にある作用物質を、脂質二重層間に別の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、核内の作用物質はタンパク質抗原などの抗原とすることができ、脂質二重層間の作用物質はMPLAなどであるが、これに限定されないアジュバントとすることができる。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、2つのアジュバントが内部脂質二重層間にある。2つのアジュバントは、幾つかの実施形態ではMPLA及びR-848である。幾つかの実施形態では、小胞は核内にある作用物質を、外部二重層内に別の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、核内の作用物質はタンパク質抗原などの抗原とすることができ、外部二重層内の作用物質はMPLAなどであるが、これに限定されないアジュバントとすることができる。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、2つのアジュバントが外部二重層内にある。幾つかの実施形態では、ある抗原が核内にあり、1つ又は複数のアジュバントが内部二重層間、及び/又は外部二重層表面上にある。2つのアジュバントは、幾つかの実施形態ではMPLA及びR-848である。幾つかの実施形態では、小胞はポリエチレングリコールPEGと結合する。幾つかの実施形態では、小胞はPEGと表面結合することができる。別の態様では、本発明は上記の多層状脂質小胞又は小胞集団のいずれか、及び製薬上許容可能なキャリアを含む。別の態様では、本発明は上記の多層状脂質小胞又は小胞集団のいずれか、及び凍結乾燥に適した賦形剤を含む。幾つかの実施形態では、凍結乾燥に適した賦形剤はショ糖を含む。小胞は単独型として使用することもできるし、本明細書で説明する作用物質のいずれかを含む他の作用物質と組み合わせることもできる。幾つかの実施形態では、小胞は細胞と一緒に投与されず、例えば対象に投与する前に、細胞に結合させる又は他の方法での物理的付着させることもない。しかし、小胞は体内の特定の細胞又は部位を標的とするために標的リガンドと結合することができる。別の態様では、本発明は融合リポソームを形成するために機能化脂質を含むリポソームを多価例えば二価陽イオンと接触させることと、脂質二重層間に架橋を有する、上記の小胞のいずれかを含む多層状脂質小胞を形成するために、融合リポソームを架橋剤と接触させることとを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、機能化脂質は機能化ホスホエタノールアミンである。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである。幾つかの実施形態では、リポソームはホスホコリンを含み、これはDOPCなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、リポソームはホスホグリセロールを含み、これはDOPGなどであるが、これに限定されない。幾つかの実施形態では、リポソームはマレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含む。幾つかの実施形態では、リポソームはDOPCなどであるが、DOPG及びマレイミド機能化脂質MPBなどを40:10:50のモル比で含む。幾つかの実施形態では、リポソームはDOPC及びMPBなどのマレイミド機能化脂質を含む。幾つかの実施形態では、リポソームはDOPC、DOTAP及びマレイミド機能化脂質MPBなどを任意選択で40:10:50のモル比で含む。幾つかの実施形態では、リンカーは膜透過性リンカーである。幾つかの実施形態では、架橋剤はジチオール架橋剤である。幾つかの実施形態では、架橋剤はジチオトレイトールDTTである。幾つかの実施形態では、ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質のモル比は1:2である。幾つかの実施形態では、この方法は、ポリエチレングリコールPEGを、脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞の表面と結合させることをさらに含む。幾つかの実施形態では、多価陽イオンは二価陽イオンであり、これはCa2又はMg2などであるが、これらに限定されない。これらは単独で、又は組み合わせて使用することができる。幾つかの実施形態では、接触は水性緩衝液内で生じる。幾つかの実施形態では、リポソームは作用物質を含む。幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬、治療薬、又は診断薬である。別の態様では、本発明は脂質二重層間に架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質などの機能化脂質二層成分を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を対象に投与することを含む方法を提供する。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、架橋脂質二重層を有する上記の多層状脂質小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかとすることができる。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞は生分解性脂質を含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はリン脂質を含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はホスホコリン、ホスホグリセロール、及び/又はホスホエタノールアミンを含む。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞は機能化脂質を含む。幾つかの実施形態では、機能化脂質はマレイミド機能化脂質である。幾つかの実施形態では、マレイミド機能化脂質はマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである。幾つかの実施形態では、作用物質は予防薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は治療薬である。幾つかの実施形態では、作用物質は抗原である。幾つかの実施形態では、作用物質はアジュバントである。幾つかの実施形態では、小胞は2つ以上の作用物質を含む。幾つかの実施形態では、小胞はある抗原及びあるアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、小胞はある抗原及び2つのアジュバントを含む。幾つかの実施形態では、小胞はあるタンパク質抗原及びあるTLR4アゴニスト及びあるTLR7アゴニストを含む。幾つかの実施形態では、タンパク質抗原などの抗原が小胞の核内に存在し、1つ又は複数のアジュバントが小胞の内部二重層間に存在する。幾つかの実施形態では、多層状脂質小胞はその外面上でPEGと結合する。幾つかの実施形態では、対象は癌を発症しているか、又はその危険がある。幾つかの実施形態では、対象は感染症を発症しているか、又はその危険がある。幾つかの実施形態では、アレルギー又は喘息を発症しているか、又はその危険がある、又は喘息発作を経験しているか、又はそれを経験する危険がある。幾つかの実施形態では、有効量は対象内の免疫応答を刺激する量である。免疫応答は体液性応答、又は細胞性応答であってもよい、又は体液性応答と細胞性応答の組合せであってもよい。細胞性応答はCD8T細胞の刺激を含むことがある。別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、抗原を含む多層状脂質小胞を投与することにより、それを要する対象の免疫応答を刺激することを含む方法を提供し、抗原の有効量が対象に投与される。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、上記のこのような小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかでよい。小胞は、1つ又は複数のアジュバントをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、小胞はその核にタンパク質抗原などの抗原を、その脂質二重層間にアジュバントを含む。タンパク質抗原は全タンパク質抗原でよい。アジュバントは、MPLAなどのTLR4アゴニスト及びR-848などのTLR7アゴニストでよいが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、小胞は脂質1mg当たり300~400μgの抗原を含む。幾つかの実施形態では、小胞は1回のみ投与されるすなわち、初回抗原投与量で十分である。幾つかの実施形態では、小胞は複数回例えば初回抗原投与量及び追加抗原投与量投与される。幾つかの実施形態では、抗原は細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、又はマイコバクテリア抗原である。幾つかの実施形態では、抗原は癌抗原である。幾つかの実施形態では、免疫応答は相乗的免疫応答である。別の態様では、本発明は架橋脂質二重層を有し、作用物質を含む多層状脂質小胞を細胞、又は細胞集団にinvitroで接触させることを含む方法を提供する。細胞又は細胞集団は、樹状細胞又は他の抗原提示細胞とすることができる。架橋脂質二重層を有する多層状脂質小胞は、架橋脂質二重層を有する上記の多層状脂質小胞のいずれか、又は本明細書で説明するもののいずれかとすることができる。上記の概念と、以下でさらに詳細に検討する追加の概念との組合せはすべてこのような概念が相互に矛盾しない限り、本明細書で開示する本発明の主題の一部であると想定されることを認識されたい。特に、本開示の最後にある特許請求の範囲の主題の組合せはすべて、本明細書で開示する本発明の主題の一部であると想定される。本明細書で明示的に採用され、参照により組み込まれた開示のいずれかにも現れることがある用語は、本明細書で開示する特定の概念と最も矛盾しない意味に合致することも認識されたい。本発明は、特に作用物質の送達に使用するために、安定化多層状脂質小胞を提供する。組み換えタンパク質に基づく先行技術のワクチンは、生ワクチン例えばウイルス性ベクターに伴う毒性及び抗ウイルス免疫を回避したが、その免疫原生は不十分であり、特にCD8T細胞CD8T応答に対して不十分である。サブユニットワクチンを強化するために、合成粒子保有抗原及びアジュバント分子が開発されているが、概してこれらの材料は、前臨床動物モードで生ワクチンに匹敵するCD8T応答を誘発していない。これらの先行技術の組成物及び方法と対照的に、本発明は、多層状小胞内で隣接する脂質二重層の頭部を架橋することによって形成される二重層間架橋多層状小胞ICMVなどの安定化多層状小胞を提供する。これらの小胞は細胞外条件で、特に小胞核内にタンパク質抗原を、小胞壁内に脂質系免疫促進分子を安定して取り込むが、エンドリソソームリパーゼの存在下で急速放出を呈した。抗原を単独で、又はアジュバントの存在下で送達するために使用する場合、本発明の小胞は極めて強力なワクチン例えば全タンパク質ワクチンを形成し、最強のワクチンベクターに匹敵する内因性T細胞及び抗体応答を誘導する。小胞は、その脂質二重層を内部結合例えば架橋することによって安定化する。これらの小胞の安定化した性質により、単純なリポソーム又は脂質でコーティングしたナノ粒子又は微粒子と比較して、大量の作用物質を取り込み、このような作用物質をさらに長期間にわたって保持することができる。特に血清の存在下では、その徐放性動態により、緩慢で一定の徐放が望ましく、細胞外環境では遅い放出が望ましいが、細胞内では即放性が望ましい作用物質のinvivo送達に有用となる。本発明は、このような小胞を、本明細書でさらに詳細に説明するような予防薬、治療薬、及び/又は診断薬などの多数かつ様々な作用物質とともに使用することを想定している。したがって、本発明は上述した小胞を含む組成物、その合成方法、及びその使用方法を提供する。安定化多層状脂質小胞MLV本発明は、隣接する又は並置した脂質二重層を相互に結合することによって安定化したMLVを提供する。本明細書では、多層状小胞は、2つ以上の同心状に配置構成された脂質二重層で構成されたシェルを有するナノ又はマイクロスフェアである。本明細書では、隣接又は並置脂質二重層又は脂質二重層表面は、相互に非常に近接しているが、それ以外は別個であり、通常は物理的に分離している二重層又は表面を意味する。この用語は通常、単一の二重層における2つの単層の関係を意味しない。本明細書では、結合は、任意の物理化学的手段によって相互に安定して接着した2つの実体を意味する。共有結合又は非共有結合を含め、当業者に知られている任意の結合を使用することができるが、共有結合が好ましい。本明細書で説明する幾つかの重要な実施形態では、MLVの隣接又は並置脂質二重層間の共有結合は、脂質二重層の架橋剤及び機能化成分を使用することによって達成される。しかし、本発明は、共有結合などの結合が他の方法で実行できることを想定している。一例として、本発明は、相補的反応性基が隣接する二重層表面の成分上にあり、架橋剤がなくても、二重層表面間の結合が、これらの基を相互に反応させることによって実行される方法を想定している。適切な相補的反応性基が当技術分野で知られており、本明細書で説明されている。小胞の内部は通常は水性環境であり、予防薬、治療薬又は診断薬などの作用物質を含むことができるが、これらに限定されない。場合によっては、小胞は固体ポリマー核例えば合成ポリマー核などの固体核を含まない。代わりに以上で検討したように、関係する作用物質を含む流体核を有することがある。核は、場合によっては重合してヒドロゲル核になるモノマを含むことができる。小胞は、本明細書ではナノ粒子又は微粒子などの粒子と呼ぶこともできるが、このようなナノ粒子又は微粒子は、本発明の安定化MLV及び二重層間架橋多層状脂質小胞ICMVの属性を有することを理解されたい。小胞は、図1A、図1B及び図2Aに示すように、その核にボイド容量を有することができる、及び/又はその核内に、及び/又は隣接又は並置脂質二重層間に1つ又は複数の作用物質を含むことができる。作用物質は通常、合成プロセス中に脂質溶液に含まれ、この方法で合成中に小胞に例えば封入によって取り込まれる。小胞が形成されるにつれ、親油性分子も脂質二重層内に直接取り込むことができる、又は小胞形成中に、親油性尾部を脂質二重層に固定することができる。小胞は、有機溶媒などの刺激性溶媒がない状態で生成することができ、その結果、有機溶媒などに影響されやすい作用物質などの多種多様な作用物質を封入可能にすることができる。小胞中の作用物質の量は変化可能であり、作用物質の性質によって解明することができる。実施例で実際に示すように、脂質1mg当たり300~400μgのタンパク質作用物質を本発明の小胞に取り込むことができる。幾つかの実施形態では、小胞は脂質1mg当たり約100μgの作用物質、又は約150μgの作用物質、又は約200μgの作用物質、又は約250μgの作用物質、又は約300μgの作用物質、又は約325μgの作用物質、又は約350μgの作用物質、又は約375μgの作用物質、又は約400μgの作用物質、又は約410μgの作用物質を含むことができる。幾つかの実施形態では、作用物質はタンパク質抗原などのタンパク質とすることができる。本発明の小胞は、貯留プロファイルで特徴付けることもできる。幾つかの実施形態では、小胞は、血清含有媒体例えば10血清内に配置し、37°Cに維持すると、1週間当たり約25の速度で作用物質を放出する。幾つかの実施形態では、小胞は、これらの条件で第一週には作用物質の約25を、約30日後には最大約90を放出する。幾つかの実施形態では、小胞は、4°CでPBSなどの緩衝剤中に30日保管されている場合、作用物質の少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、又は少なくとも95を維持している。各小胞内の脂質二重層の数は変化することがあり、通常は少なくとも2個から約50個、又は少なくとも2個から約25個、又は少なくとも2個から約15個、又は少なくとも2個から約10個、又は少なくとも2個から約5個である。小胞の直径は変化することがある。場合によっては、小胞の直径は約100から約500nmの範囲であり、約125から約300nm、約150から約300nm、約175から約275nmの範囲を含む。場合によっては、直径は約150から約250nmの範囲である。実施例で説明するように調製されるICMVの直径プロファイルが、図2B及び図3Aに示されている。小胞のいかなる調製時にも、小胞の直径、脂質二重層の数、装填される作用物質などに関して小胞間に不均質性があることが理解される。このような分布が実施例に示されている。本明細書では、本発明の小胞はリポソームとも呼ぶことができる例えば安定化多層状リポソーム、又は以下で検討するように二重層間架橋多層状リポソーム。したがって、小胞という用語を使用する場合、それは小胞の発生源又は起源を示唆するものではない。本発明の小胞は、以下でさらに詳細に検討するように、合成小胞であるすなわち、invitroで生成される。小胞は、隔離培養することができる、すなわち、それが合成される環境から全体が、又は一部が物理的に分離される。一例として、作用物質すなわち、そのカーゴ又はペイロードを含む小胞は、作用物質がない小胞すなわち、空の小胞から全部を、又は一部を分離することができ、それ故に隔離培養小胞と呼ぶことができる。分離は、重量又は質量、密度浮遊密度を含む、サイズ、色など例えば小胞のカーゴがエネルギ放射によって検出可能な場合に基づいて実行することができる。実施例で説明するように、遠心分離を使用して、脂質組成が同一で架橋二重層を有さない単純なリポソーム又はMLVから本発明の小胞を分離することができる。ペレットである本発明の小胞をこれらの他の粒子タイプから分離するには、約14,000gで約4分間の遠心分離で十分である。二重層間架橋多層状脂質小胞本発明の安定化MLVの一例は、二重層間架橋多層状脂質小胞ICMVである。上述した安定化MLVと同様に、ICMVは本明細書で説明するように相互に結合して同心状に配置構成された2つ以上の脂質二重層で構成されたシェルを有するナノ又はマイクロスフェアである。ICMVなどの安定化多層状小胞内にある脂質二重層の数は、約2~30と変化することができるが、2~15の範囲がさらに一般的である。したがって様々な実施形態では、層の数は2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はそれ以上とすることができる。ICMVの1つの例示的合成に由来する二重層の頻度分布が、図2Cに示してある。二重層は通常、細胞膜と同様の方法で配置構成された親水性頭部及び疎水性尾部を有する資質で構成されるすなわち、親水性頭部が通常は水性環境に曝露し、疎水性尾部が二重層に埋め込まれる。ICMVはその脂質二重層間の架橋によって安定化し、したがって二重層間架橋MLVと呼ばれる。本明細書では、これは小胞のシェル内の少なくとも2つの脂質層が相互に架橋される、という意味である。架橋二重層は通常、相互に並置又は隣接する二重層である。シェル内の脂質二重層の大部分又は全部は、シェル内でそれと並置した脂質二重層に架橋することができる。脂質二重層の間には1つ又は複数の架橋があってよい。通常、脂質二重層間には無数の架橋がある。このような架橋の配置構成及び位置決めはランダムであるか、非ランダムとすることができる。架橋の程度したがってその結果となる小胞の安定性は、小胞の作成に使用される機能化脂質又は他の脂質二重層の成分の割合、及び架橋条件例えば架橋剤による小胞培養の時間によって解明される。他の要素及びパラメータがすべて等しければ、小胞内の機能化脂質又は他の脂質二重層の成分の割合が高いほど、形成される架橋が多くなることが理解される。同様に、条件が架橋にとって好ましいほど、達成される架橋の程度が大きくなる。合成方法例示的合成方法は以下の通りである。すなわち、脂質及び任意選択で他の二重層の成分を化合して、同質の混合物を形成する。これは、脂質を乾燥させて脂質被膜を形成する乾燥ステップにより実行することができる。次に、脂質を水性溶媒と化合させる例えば再水和する。水性溶媒は、約7のpHなど、約6から約8の範囲のpHを有することができる。小胞の融合に融和性がある緩衝剤を、通常は低濃度の塩とともに使用する。実施例で使用する溶媒は、pH7.0の10mMのビス-トリスプロパンBTPである。緩衝剤の性質は、表1Aに示すように培養の長さに影響を与えることができる。例えば、それ以外がすべて等しければ、PBSなどの緩衝剤は、BTPなどの緩衝剤と比較して長い培養時間を必要とすることがある。緩衝剤がPBSである場合は、培養時間は約6~24時間、又は8~16時間、又は10~12時間とすることができる。緩衝剤がBTPである場合は、培養時間は1~4時間、又は1~2時間など、これより短くすることができる。したがって、十分な培養時間も使用すれば、様々な水性緩衝液を使用することができる。このステップは、小胞に取り込まれる作用物質の存在も含むことがある。その結果のリポソームは、次に多層状小胞に融合させるために、1つ又は複数の二価陽イオンで培養される。適切な二価陽イオンはMg2、Ca2、Ba2、又はSr2を含む。多価又はポリマー陽イオンも小胞融合に使用することができる。小胞融合は、陽イオン小胞を二価以上の陰イオンと混合することによっても達成することができ、その一例が、陽イオンリポソームとDNAオリゴヌクレオチド又はDNAプラズマとの融合である。これは、音波処理、渦形成などの攪拌により実行することができる。ある作用物質の存在下でリポソームを作成する場合、MLVはその核内に、又は同心状に配置構成された脂質二重層の間に、その作用物質を含むことになる。本発明は、様々な作用物質を保有するリポソームを融合して、このような作用物質を含むMLVを形成することを想定する。その結果であるMLVは、次に架橋剤で、好ましくは膜浸透性架橋剤で培養される。本明細書で述べるように、架橋剤の性質は、相互に結合されている反応基の性質に応じて変化する。実施例で実際に示すように、DTT又は1,4-ジ-[3’-2’-ピリジルチオ-プロピオンアミド]ブタンなどのジチオール含有架橋剤を使用して、マレイミド機能化脂質又は他の機能化脂質二重層の成分で構成されたMLVを架橋するか、図12に示すように、ジアジド架橋剤を使用し、クリックケミストリによりアルキン頭部を架橋することができる。これらの様々な培養はすべて、約6から約8、又は約6.5から約7.5の範囲、又は約7のpHの水性条件で実行する。架橋ステップは、室温例えば20~25°Cで、又は例えば最高37°C、又はそれ以上などの高温で実行することができる。その結果の架橋小胞は、次に例えば遠心分離又は他のペレット化手段によって収集し、洗浄して、チオール-PEGで培養することによってその最外面又は外面をPEG化することができる例えば本明細書では、小胞を表面PEG化した、又はPEGに表面結合したと言うことができる。PEGは任意のサイズにすることができ、それは0.1~10kDa、0.5~5kDa、又は1~3kDaを含むが、これらに限定されない。実施例では、チオールで機能化した2kDaのPEGを使用する。培養期間は約10分から2時間の範囲とすることができるが、温度、濃度などの他の条件に応じて、これより短い、又は長くてもよい。PEG化ステップは室温例えば20~25°Cで、又は例えば最高37°C、又はそれ以上などの高温で実行することができる。実施例の例示的合成方法では、30分の培養期間を使用する。次に小胞を例えば遠心分離又は他のペレット化手段によって収集し、水又は他の水性緩衝液で洗浄することができる。小胞は、PBSなどであるが、これに限定されない緩衝溶液に入れて4°Cで保存するか、適切な凍結保存剤に入れて凍結乾燥し、次に-20°Cで保存することができる。適切な凍結保存剤は、ショ糖を含むもの例えば1~5のショ糖、及び好ましくは約3のショ糖溶液を含む。架橋は、1つの二重層中の反応基を隣接する二重層中の相補的反応基と結合することによって達成することもできる。例えば、スクシンイミジルエステル機能化脂質Aの頭部及び第一アミン含有B頭部を含有する融合小胞は、隣接する二重層のA脂質とB脂質を現場で反応させることによって、架橋することができる。当業者によく知られている様々な他の相補的機能化脂質を、同様の方法で使用することができる。機能化脂質又は脂質二重層の他の機能化成分と架橋剤とのモル比は、条件に応じて変更することができる。場合によっては、約1から約5の範囲にすることができる。幾つかの実施形態では、2というモル比で十分であるすなわち、機能化脂質又は成分と架橋剤とのモル比が2:1である。実施例では、2:1のモル比のマレイミド機能化脂質とDTTを使用して、小胞の脂質二重層を架橋する合成方法について説明する。培養時間は1時間から24時間、2~18時間、2~12時間、又は2~6時間の範囲とすることができる。場合によっては、これは約2時間とすることができる。別の場合では、一晩例えば約12時間とすることができる。小胞中の機能化脂質の分子は、1から100、又は場合によっては約10から約60、又は場合によっては約25から約55の範囲とすることができる。場合によっては、小胞中の機能化脂質の分子は通常、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらに好ましくは少なくとも20、及びさらに好ましくは少なくとも25である。表1A及び表1Bは、機能化脂質がない状態では小胞が形成されないことを示す。逆に、非機能化脂質が分子として約0から99存在することができる。さらに典型的には、非機能化脂質は分子として約40~75又は40から60存在することができる。1つの重要な実施形態では、小胞はDOPC、DOPG及びマレイミド機能化DSPEを使用して合成される。これらの脂質の相互の比率は変更することができる。表1A及び表1Bは、DOPC:DOPG:マレイミド機能化脂質の比率の変更が小胞の収量に及ぼす影響を示す。DOPCの分子は1~50の範囲とすることができ、DOPGの分子は1~50の範囲とすることができ、マレイミド機能化脂質の分子は1~80の範囲とすることができる。本発明の幾つかの実施形態は、40:10:50というDOPC:DOPG:マレイミド機能化脂質の比率を有する小胞を提供する。幾つかの実施形態は、60:15:25というDOPC:DOPG:マレイミド機能化脂質の比率を有する小胞を提供する。幾つかの実施形態は、DOPG及びマレイミド機能化脂質で構成された小胞を提供する。脂質小胞は1つ又は複数の脂質で構成される。集合的に球形の二重層すなわち、小胞を形成する限り、脂質のタイプ、数及び比率は変更することができる。脂質は、自然発生する発生源から隔離培養することができる、又は自然発生する発生源とは別に合成することができる。脂質の少なくとも1つ又は幾つかは、両親媒性脂質であり、これは親水性部分と疎水性部分通常は親水性頭部と疎水性尾部を有すると定義される。疎水性部分は通常、疎水相例えば二重層内を指向し、疎水性部分は通常、水性相例えば二重層の外側、及び場合によっては隣接する並置二重層の表面間を指向する。親水性部分は炭水化物、燐酸塩、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシ及び他の同様の基のような極性基又は荷電基を含むことができる。疎水性部分は無極基を含むことができ、これは長鎖飽和及び非飽和脂肪族炭水化物基、及び1つ又は複数の芳香族、脂環又は複素基で置換された基を含むが、これらに限定されない。両親媒性化合物の例はリン脂質及びスフィンゴ脂質を含むが、これらに限定されない。通常、脂質はリン脂質である。リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンなどを含むが、これらに限定されない。コレステロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなどの他の脂質膜成分を使用できることを理解されたい。脂質は、陰イオン及び中性リン脂質などの陰イオン及び中性双性及び極性を含む脂質でよい。中性脂質は、選択されたpHにて無電荷又は中性双性形で存在する。生理学的pHにて、このような脂質は例えばジレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールを含む。双性脂質の例はジオレイルホスファチジルコリンDOPC、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、及びジオレオイルホスファチジルセリンDOPSを含むが、これらに限定されない。陰イオン脂質は、生理学的pHで負に荷電された脂質である。これらの脂質はホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロールPOPG、及び中性脂質に結合した他の陰イオン変更基を含むが、これらに限定されない。陰イオン及び中性脂質は、本明細書では集合的に非陽イオン脂質と呼ぶ。このような脂質はリンを含むことができるが、これらに限定されない。非陽イオン脂質の例はレシチン、リソレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンDPPE、ジミリストイルホスホエタノールアミンDMPE、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミンDSPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンPOPEパルミトイルオレオイルホスファチジルコリンPOPC、卵ホスファチジルコリンEPC、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジパルミトイルホスファチジルコリンDPPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールDPPG、パルミトイルオレイオールホスファチジルグリセロールPOPG、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンPOPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジルエタノールアミンSOPE、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、燐酸ジセチル、及びコレステロールを含む。追加の非亜燐酸含有脂質はステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン-硫酸ラウリル、アルキル-硫酸アリルポリエチルオキシル酸化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウムなど、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドを含む。場合によっては、リソホスファチジルコリン及びリソホスファチジルエタノールなどの脂質を使用することができる。非陽イオン脂質はPEG2000、PEG5000、及びリン脂質又はセラミドと結合するポリエチレングリコールPEG-Cerと呼ぶなどのポリエチレングリコール系ポリマーも含む。場合によっては、蛍光体などの検出可能なラベルで変更した形体などの、変更形の脂質を使用することができる。場合によっては、脂質は信号例えば蛍光信号を放射する脂質類似体である。その例は、1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-ヨウ化テトラメチルインドトリカルボシアニンDiR及び1,1’-ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドジカルボシアニンDiDを含むが、これらに限定されない。脂質は、封入された作用物質をinvivo及び/又はinvitroで放出できるために、生分解性であることが好ましい。生分解性脂質は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンジオレオイル-ホスホコリン、DOPC、陰イオン1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-1’-rac-グリセロールジオレオイル-ホスホグリセロール、DOPG、及び1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンジステアロイル-ホスホエタノールアミン、DSPEを含むが、これらに限定されない。コレステロールなどの非脂質膜成分も取り込むことができる。機能化脂質又は二重層成分脂質二重層の少なくとも1つの成分は、機能化しなければならない又は反応性でなければならない。本明細書では、機能化成分は、多層状小胞の隣接する二重層の架橋に使用することができる反応基を含む成分である。二重層成分は、反応基を含むように変更することができる。小胞の合成に使用される脂質の1つ又は複数は、機能化脂質とすることができる。本明細書では、機能化脂質は、多層状小胞の隣接する二重層の架橋に使用することができる反応基を有する脂質である。幾つかの実施形態では、反応基は、このような機能化脂質の間従って小胞内の脂質二重層の間に架橋を形成するために架橋剤又は他の部分と反応する基である。反応基は、架橋剤との接触、及び隣接する並置二重層内にある別の脂質との架橋を可能にする脂質上のいずれかの位置に位置特定することができる。幾つかの実施形態では、これは例えばリン脂質などの脂質の頭部にある。反応基の一例はマレイミド基である。マレイミド基は、ジチオールトレイトールDTTなどであるが、これに限定されないジチオール架橋剤の存在下で相互に架橋することができる。機能化脂質の一例は、本明細書でMPBと呼ぶ1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[4-p-マレイミドフェニルブチルアミドである。実施例では、本発明の小胞の合成にこの機能化脂質を使用することを実際に示す。機能化脂質の別の例は1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミドポリエチレングリコール2000]マレイミド-PEG2k-PEとも呼ばれるである。機能化脂質の別の例はジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートDOPE-malである。本発明は、他の機能化脂質、他の機能化脂質二重層成分、他の反応基、及び他の架橋剤の使用も想定していることを理解されたい。マレイミド基以外に、反応基の他の例は他のチオール反応基、第一及び第二アミンなどのアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アルキン基礎、アジド基、カルボニル、ハロアセチル例えばヨードアセチル基、イミドエステル基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルフヒドリル基、ピリジルジスルフィド基などを含むが、これらに限定されない。機能化及び非機能化脂質はAvantiPolarLipidsアラバマ州Alabasterなどの幾つかの販売元から入手可能である。本発明は、多重層小胞内の隣接する二重層を相互に結合する様々な方法を想定していることを理解されたい。場合によっては、隣接する二重層の結合を実行するために架橋剤を使用する。しかし、本発明はこれらに限定されない。一例として、小胞はクリックケミストリを使用して形成することができる。例示的合成方法は、以下のようなアルキン変性脂質及びアルキン-アジド化学現象を使用する。アルキン変性脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPE、744mg、1mmolなどの脂質を5mLのCDCl3中でプロピオル酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル167mg、1mmol及びEt3N202mg、2mmolと混合することによって作成された。反応はNMRでモニタした。反応は、室温で3時間後に終了した。有機溶液を5mLの5のNa2CO3、1のHCl及び鹸水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させて、蒸発させた後、アルキン変性DOPEを計量した。1:1のDOPCとアルキン-DOPEを有する1.26μmolの脂質被膜を準備し、水和化させて、音波処理し、上述したように10mMのMg2と融合するように誘導した。アルキン機能か脂質を有するMLVを、2.5mMのCuSO4、銅線、及び1.5mMの1,14-ジアジド-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカンで24時間、室温で培養した。遠心分離で3回洗浄した後、粒子収量を測定した。架橋剤架橋剤は、相互に結合している脂質二重層内の反応基の性質に応じて、同質二官能価値架橋剤又は異質二官能価架橋剤とすることができる。本明細書では架橋剤と架橋作用物質という用語は区別なく使用される。同質二官能価架橋剤は2つの同一の反応基を有する。異種二官能価架橋剤は2つの異なる反応基を有する。1つの場合、隣接する二重層は、同じ官能化脂質又は他の二重層成分及び架橋剤同質二官能価架橋剤を使用して、相互に架橋される。別の場合では、隣接する二重層は、異なる機能化脂質又は他の二重層成分及び架橋剤異質二官能価架橋剤を使用して、相互に架橋される。様々な市販の架橋剤が以下の基のうち1つ又は複数に対して反応性である。すなわち、マレイミド基、第一アミン基、第二アミン基、メルカプト基、カルボキシル基、カルボニル基、及び炭化水素である。アミン特異的な架橋剤の例には、ビススルホスクシンイミドスベリン酸、ビス[2-スクシンイミドオキシカルボニルオキシエチル]スルホン、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、アジピン酸ジメチル2HCl、ジメチルピメルイミド酸2HCl、ジメチルスベルイミド酸2HCl、及びエチレングリコールビス-[スクシンイミジル-[スクシネート]]がある。スルフィドリル基に対して反応性の架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン、1,4-ジ-[3’-2’-ピリジルジチオ-プロピオンアミド]ブタン、1-[p-アジドサリチルアミド]-4-[ヨードアセトアミド]ブタン、及びN-[4-p-アジドサリチルアミドブチル]-3’-[2’-ピリジルジチオ]プロピオンアミドを含む。炭水化物と優先的に反応する架橋剤は、アジドベンゾイルヒドラジンを含む。カルボキシル基と優先的に反応する架橋剤は4-[p-アジドサリチルアミド]ブチルアミンを含む。マレイミド反応基を架橋するために、ジチオールトレイトールDTT、1,4-ジ-[3’-2’-ピリジルジチオ-プロピオンアミド]ブタンDPDPBなどのジチオール架橋剤、及び場合によってはPEG-SH2などのチオール含有ポリマーを使用することができる。DTTの構造は下式の通りである。DPDPBの構造は下式の通りである。アルキンに反応する架橋剤は1,14-ジアジド-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカンなどのジアジド、及びクリックケミストリと適合性の他の基を含む。アミン及びスルフィドリルと反応する異質二官能価架橋剤はN-スクシンイミジル-3-[2-ピリジルジチオ]プロピオン酸、スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノ安息香酸、スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル6-[3-[2-ピリジルジチオ]プロピオンアミド]ヘキサン酸、及びスルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボン酸を含む。カルボキシル基及びアミン基と反応する異質二官能価架橋剤は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]-塩酸カルボジイミドを含む。炭化水素及びスルフィドリルと反応する異質二官能価架橋剤は、4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボキシヒドラジド2HCl、4-4-N-マレイミドフェニル-酪酸ヒドラジド2HCl、及び3-[2-ピリジルジチオ]プロピオニルヒドラジドを含む。他の架橋剤にはビス-β-4-アジドサリチルアミドエチル]ジスルフィド及びグルタルアルデヒドがある。架橋剤は、MLVの1つ又は複数の二重層を通って拡散し、隣接する様々な層を架橋できるように、膜透過性又は脂質可溶性であることも好ましい。任意の弱い極性/無荷電の二官能価又は異質二官能価低分子化合物を、効果的な膜透過性架橋剤とすることができ、このような分子がマレイミド、スクシンイミジルエステル、アジド、チオールなどであるが、これらに限定されない反応基を含む場合は、特にそうである。膜透過性架橋剤の例には、DTT及び1,4-ジ-[3’-2’-ピリジルジチオ-プロピオンアミド]ブタンDPDPBが含まれるが、これらに限定されない。PEG化ICMVはさらに変性させることができる。実施例で説明するように、ICMVはその表面でプロピレングリコールPEGと結合することができる。STEALTHリポソームなどの様々な作用物質の半減期を延長するために、臨床でPEG化が使用される。PEG化は、安定化MLVの表面上の機能化脂質を相補的な機能化PEGと反応させることによって遂行することができる。脂質は、ICMV合成の前にはPEGと結合しないことが好ましく、むしろPEGは合成後にICMVの外面と結合する、又は挿入後プロセスによって粒子の外膜層にPEG-脂質結合が導入される。ICMVのPEG化に使用される反応基は、二重層の架橋に使用されるものと同じでよく、その場合は、追加の機能化脂質又は他の機能化成分が不必要である。一例として、ICMVがマレイミド機能化脂質を含む場合、機能化PEGはチオール-PEGとすることができる。あるいは、小胞の安定化に使用される反応基は、PEGを外面と結合させる反応基と異なってよい。小胞の脂質二重層内にある機能化脂質又は成分の反応基の性質に応じて、他の変性タイプのPEGを使用できることが、当業者には認識される。適切な反応基には、第一アミン及び第二アミンなどのアミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アジド基、カルボニル、マレイミド基、ハロアセチル例えばヨードアセチル基、イミドエステル基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、及びピリジルジスルフィド基が含まれるが、これらに限定されない。表2は、合成直後及び7日後にPBS中でPEG化がICMVの直径に及ぼす影響を示す。合成直後、PEG化されたICMVは非PEG化ICMVよりわずかに大きい直径を有する例えば1つの実験では、PEG化したICMVは272±39nmに対して、非PEG化では234±45nmであった。特に例えば動的光散乱によりサイズ及び表面電荷、例えば層状性検定により外面上の脂質の画分、例えばFACSにより自身内又は自身を通して取り込まれる作用物質の量などを解明するために、結果となる安定化小胞で様々な試験を実行することができる。小胞で実行できる他の検査には、共焦点顕微鏡検査及び低温トンネル電子顕微鏡検査TEMが含まれる。下表は、安定化小胞で実施した様々な試験の結果を提供する。作用物質本発明は本発明のICMVなどの安定化脂質小胞を使用して、invivo又はinvitroで領域、組織又は細胞に作用物質を、場合によっては徐放などで送達することを想定している。本明細書では、作用物質とは予防又は治療上の利益を含むが、これらに限定されない利益を対照に提供するために使用することができる、又はinvivoで診断及び/又は検出例えば撮像に使用することができる、又はinvitroの用途に使用される任意の原子又は分子又は化合物である。いかなる作用物質も、組成物例えばICMVなどの安定化MLV、及びその医薬品組成物などの組成物、及び本発明の方法を使用して送達することができるが、ただしこれは本明細書で提供されるICMVなどの安定化MLVの中その全体に封入するか、他の方法でそれで輸送できる場合に限る。例えば、作用物質はこれらの小胞の合成に、及び任意選択で保存プロセスに耐えられなければならない。小胞は、例えば凍結乾燥形で、好ましくはショ糖系賦形剤を使用して合成し、保存することができる。作用物質は、合成中に小胞に組み込まれた場合、このような保存手順及び保存時間中に安定していなければならない。作用物質はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、低分子化合物例えば有機又は無機の化学物質薬物、ウイルス様粒子、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、炭化水素、及びその類似体、誘導体、混合物、融合体、化合物又は結合体とすることができるが、これらに限定されない。作用物質は、代謝され、したがってinvivoでその活性及び/又は安定形態へと変換するプロドラッグとすることができる。作用物質は天然に産出するか、天然以外で産出するものでよい。天然に産出する作用物質は、小胞が投与される先の対象によって合成することができるものを含む。天然以外で産出するのは、産出元が植物、動物、微生物、又は他の生物のいずれでも、普通は天然に存在しないものである。作用物質の1つのクラスは、単鎖又は多連鎖タンパク質及びペプチドなどのペプチド系作用物質である。その例には抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、酵素、補助因子、受容体、リガンド、転写因子及び他の制御因子、以下で検討するような幾つかの抗原、サイトカイン、ケモカインなどが含まれる。これらのペプチド系作用物質は天然に産出することも、しないこともあるが、例えば遺伝子工学による細胞を使用することにより、対象内で合成することができる。本発明の小胞を使用して送達することができる作用物質の別のクラスには、ペプチド系ではない作用物質が含まれる。その例には、天然産ではない化合物、又は哺乳類及び特にヒトの細胞によって天然に合成されない化合物が含まれる。治療又は診断目的で現在使用されている様々な作用物質は、本発明により送達することができ、それには撮像剤、免疫賦活剤及び免疫阻害剤などの免疫調節剤、抗原、アジュバント、サイトカイン、ケムトカイン、抗ガン剤、抗感染症剤、核酸、抗体又はそのフラグメント、サイトカイン抗体融合タンパク質などの融合タンパク質、Fc-融合タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。撮像剤。本明細書では、撮像剤とは、直接又は間接的に信号を発し、それによりinvivoで検出を可能にする作用物質である。造影剤及び放射性作用物質などの撮像剤は、核医学スキャン及び磁気共鳴映像MRIなどの医用撮像技術を使用して検出することができる。磁気共鳴映像MRI用の撮像剤にはGdDOTA、酸化鉄又は金のナノ粒子が含まれ、核医学用撮像剤には201T1、ガンマ放出放射性核種99mTcが含まれ、陽電子放射断層撮影PET用の撮像剤には陽電子放射同位体、18F-フッ化デオキシグルコース18FDG、18F-フッ素、銅-64、ガドアミド、及び203Pb及び11InなどのPbIIの放射性同位体が含まれ、invivo蛍光撮像用撮像剤は蛍光染料又は染料結合なの粒子などである。他の実施形態では、送達される作用物質が撮像剤と結合、融合、混合、又は化合する。免疫刺激剤。本明細書では、免疫刺激剤とは単独であろうと、別の作用物質との組合せであろうと、投与される先の対象の免疫応答を刺激する先在する免疫応答の強化を含む作用物質である。その例には、抗原、アジュバント例えばイミキモド及びレジキモドなどのTLRリガンド、イミダゾキノリン、非メチル化CpGジヌクレオチドを含む核酸、モノホスホリル脂質AMPLA又は他のリポ多糖類誘導体、一本鎖又は二本鎖RNA、フラゲリン、ムラミルジペプチド、インターロイキンを含むサイトカイン例えばIL-2、IL-7、IL-15又はこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト/変異形、IL-12、IFN-ガンマ、IFN-アルファ、GM-CSF、FLT3-リガンドなど、免疫賦活抗体例えば抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3、又はこれらの分子の一本鎖/抗体フラグメントなどが含まれる。抗原。抗原は癌抗原、自己又は自己免疫抗原、微生物抗原、アレルゲン、又は環境抗原とすることができるが、これらに限定されない。抗原はペプチド、脂質、又は自然界の炭化水素とすることができるが、これらに限定されない。癌抗原。癌抗原は癌細胞によって優先的に発現するすなわち、癌細胞以外よりも癌細胞内に高レベルで発現する抗原であり、場合によっては癌細胞によってのみ発現する。癌抗原は、癌細胞内又は癌細胞の表面上に発現することがある。抗原はMART-1/メラン-A、gp100、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質ADAbp、FAP、サイクロフィリンb、結腸直腸関連抗原CRC-C017-1A/GA733、癌胎児抗原CEA、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前立腺特異抗原PSA、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前立腺特異膜抗原PSMA、T細胞受容体/CD3-ゼータ鎖、及びCD20とすることができる。癌抗原はMAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2MAGE-B2、MAGE-Xp3MAGE-B3、MAGE-Xp4MAGE-B4、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5からなる群から選択することができる。癌抗原はGAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9からなる群から選択することができる。癌抗原はBAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUC族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-フェトプロテイン、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、γ-カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺腫様多発結腸ポリープタンパク質APC、フォドリン、コネクシン37、Ig-イディオタイプ、p15、gp75、GM2ガングリオシド、GD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のSmad族、1mp-1、P1A、EBV-コード化核抗原EBNA-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2HOM-MEL-40、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1及びCT-7、CD20、及びc-erbB-2からなる群から選択することができる。微生物抗原。微生物抗原は、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫及びマイコバクテリア種などであるが、これらに限定されない微生物種に由来する抗原である。したがって、微生物抗原には細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及びマイコバクテリア抗原を含まれる。細菌、ウイルス、真菌、寄生虫及びマイコバクテリア種の例が本明細書に提供されている。微生物抗原は、微生物種の一部であるか、微生物全体であることがある。アレルゲン。アレルゲンは対象内にアレルギー又は喘息反応を誘発することがある作用物質である。アレルゲンには花粉、昆虫の毒液、動物のふけ粉、菌類胞子及び薬物例えばペニシリンが含まれるが、これらに限定されない。自然の動物及び植物アレルゲンの例には、以下の属に特異的なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、イヌ属イエイヌ、ヒョウダニ属例えばコナヒョウダニ、ネコ属イエネコ、ブタクサ属Ambrosiaartemiisfolia、ドクムギ属例えばホソムギ又はイタリアンライグラス、スギ属スギ、アルテルナリア属葉上生息菌、ハンノキ、アルヌス属Alnusgultinoasa、カバノキ属Betulaverrucosa、カシ属Quercusalba、オリーブ属Oleaauropa、ヨモギ属Artemisiavulgaris、オオバコ属例えばPlantagolanceolata、ヒカゲミズ属例えばParietariaofficinalis又はParietariajudaica、チャバネゴキブリ属例えばチャバネゴキブリ、ミツバチ属例えばApismultiflorum、イトスギ属例えばCupressussempervirens、Cupressusarizonica及びCupressusmacrocarpa、ビャクシン属例えばJuniperussabinoides、エンビツビャクシン、トショウ及びJuniperusashei、Thuya例えばThuyaorientalis、ヒノキ属例えばヒノキ、ゴキブリ属例えばワモンゴキブリ、カモジグサ属例えばシバムギ、ライムギ属例えばライムギ、コムギ属例えばコムギ、カモガヤ属例えばオーチャードグラス、ウシノケグサ属例えばFestucaelatior、イチゴツナギ属例えばケンタッキーブルーグラス又はPoacompressa、カラスムギ例えばエンバク、シラゲガヤ属例えばHolcuslanatus、Anthoxanthum例えばハルガヤ、カラスムギ例えばArrhenatherumelatius、ヌカボ属例えばAgrostisalba、アワガエリ属例えばオオアワガエリ、クサヨシ属例えばリードカナリーグラス、スズメノヒエ属例えばバヒアグラス、モロコシ属例えばSorghumhalepensis、及びスズメノチャヒキ属例えばBromusinurmisである。アジュバント。アジュバントは明礬例えば水酸化アンモニウム、燐酸アンモニウム、QS21などのキラヤ木の樹皮から精製したサポニンHPLC分別で21番目のピークに溶出する糖脂質;AntigenicsInc、マサチューセッツ州ウスター、ポリ[ジカルボキシラトフェノキシ]ホスファゼンPCPPポリマー、米国ウイルス研究所、Flt3リガンド、リーシュマニア延長因子精製したリーシュマニアタンパク質、CorixaCorporation、ワシントン州シアトル、ISCOMS混合サポニン、脂質を含有し、抗原を保持することができるポアがあるウイルスサイズの粒子を形成する免疫賦活性錯体、CSL、オーストラリア、メルボルン、Pam3Cys、SB-AS4明礬及びMPLを含有するSmithKlineBeechamのアジュバントシステム4、SBB、ベルギー、CRL1005などのミセルを形成する非イオン性ブロック共重合体ポリオキシエチレンの鎖が隣接する疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を含む及びMontanideIMS例えばIMS1312、可溶性免疫賦活剤と化合した水性ナノ粒子、Seppicとすることができるが、これらに限定されない。アジュバントはTLRリガンドとすることができる。TLR3を通して作用するアジュバントは二重鎖RNAを含むが、これらに限定されない。TLR4を通して作用するアジュバントには、モノホスホリル脂質Aなどのリポ多糖類、トポテカン、テニポシド、ミトキサントロン、DNAアルキル化剤例えばシスプラチン、メクロレタミン、シクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン、DNA鎖切断誘発剤例えばブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、微小管阻害剤例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、代謝拮抗薬例えばシタラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、5-フルオロウラシル、フロクシウリジン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、又はエピポドフィロトキシンが含まれる。抗ガン剤の例にはアシビシン、アクラルビシン、塩酸アコラゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビセレシン、硫酸ブレオマイシン、ボルテゾミブベルケイド、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメール、カルボプラチンプラチナを含む製剤、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチンプラチナを含む製剤、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デクソールマプラチン、デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセルタキソテール、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロールニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エルロチニブタルセバ、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクシウリジン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、フォストリエシン、ゲフィチニブイレッサ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、メシル酸イマチニブ、インタフェロンアルファ-2a、インタフェロンアルファ-2b、インタフェロンアルファ-n1、インタフェロンアルファ-n3、インタフェロンベータ-Ia、インタフェロンガンマ-Ib、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レナリドマイドレブリミド、レビミド、レトロゾール、リュープロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン、メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、ミトマイシン、ミトスパー、ミトタン、ミトキサントロン、マイコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタクセル、ペメトレキセドアリムタ、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペントモン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピリトレキシムイソチオネート、ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポリフィマー、ポリフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、シトグルシド、スパルホサート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、タムスロシン、タキソール、タキソテール、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロミドテモダール、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、サリドマイドサロミド及びその誘導体、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラバザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ビングリシナート、ビンレウロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンが含まれるが、これらに限定されない。抗ガン剤は酵素阻害剤でよいが、これはチロシンキナーゼ阻害剤、CDK阻害剤、MAPキナーゼ阻害剤、又はEGFR阻害剤を含むが、これらに限定されない。チロシンキナーゼ阻害剤はゲニステイン4’,5,7-トリヒドロキシイソフラボン、チルホスチン253,4,5-トリヒドロキシフェニル、メチレン]-プロパンジニトリル、ハービマイシンA、ダイゼイン4’,7-ジヒドロキシイソフラボン、AG-126、t-1-3’-カルボキシ-4’-ヒドロキシフェニル-2-2,5-ジヒドロキシ-フェニルエタン、又はHDBA2-ヒドロキシ5-2,5-ジヒドロキシベンジルアミノ-2-ヒドロキシ安息香酸とすることができるが、これらに限定されない。CDK阻害剤はp21、p27、p57、p15、p16、p18、又はp19でよいが、これらに限定されない。MPAキナーゼ阻害剤はKY12420C23H24O8、CNI-1493、PD98059、又は4-4-フルオロフェニル-2-4-メチルスルフィニルフェニル-5-4-ピリジル1H-イミダゾールでよいが、これらに限定されない。EGFR阻害剤はエルロチニブタルセバ、ゲフィチニブ、WHI-P97キナゾリン誘導体、LFM-A12レフルノミド代謝産物類似体、ABX-EGF、ラパチニブ、カネルチニブ、ZD-6474ZACTIMA、AEE788、及びAG1458でよいが、これらに限定されない。抗ガン剤はVEGF阻害剤とすることができ、これはベバシズマブアバスチン、ラニビズマブルセンティス、ペガプタニブマクジェン、ソラフェニブ、スニチニブスーテントバタラニブ、ZD-6474ZACTIMA、アネコルタブRETAANE、乳酸スクアラミン、及びセマフォリンを含むが、これらに限定されない。抗ガン剤は抗体又は抗体フラグメントとすることができ、これはベバシズマブアバスチン、トラスツズマブハーセプチン、アレムツズマブキャンパス、B細胞慢性リンパ球白血病に対して指示される、ゲムツズマブマイロターグ、hP676、抗CD33、急性骨髄性白血病などの白血病に対して指示される、リツキシマブリツキサン、トシツモマブベキサール、抗CD20、B細胞悪性疾患に対して指示される、MDX-210HER-2/neu癌遺伝子タンパク質生成物と免疫グロブリンGタイプIFc受容体IgGとの両方に同時に結合する二重特異性抗体FcガンマRI、オレゴボマブOVAREX、卵巣癌に対して指示される、エドレコロマブPANOREX、ダクリズマブゼナパックス、パリビズマブシナジス、RSV感染などの呼吸性状態に対して指示される、イブリツモマブチウキセタンゼバリン、非ホジキンリンパ腫に対して指示される、セツキシマブアービタックス、MDX-447、MDX-22、MDX-220抗TAG-72、IOR-C5、IOR-T6抗CD1、IOREGF/R3、セロゴバブONCOSCINTOV103、エプラツズマブLYMPHOCIDE、ペムツモマブTHERAGYN、及びグリオマブH脳腫瘍、メラノーマに対して指示されるを含むが、これらに限定されない。血球分化剤。この作用物質は、造血始原細胞の1つ又は複数の系統への分化を刺激する作用物質とすることができる。その例にはIL-3、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、Wnt5A、Wnt11Aなどが含まれるが、これらに限定されない。血球自己再生剤。この作用物質は、増血始原細胞の自己複製を刺激する作用物質とすることができる。その例にはKitリガンド、GSK3-ベータ阻害剤、Wnt5AならびにSLF、ノッチ1活性剤、Lnk阻害剤、プロスタグランジンE2PGE2及びPGE2を含むPGE2経路を刺激する作用物質、PGI2、リノール酸、13s-HODE、LY171883、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ONO-259、Cay1039、16,16-ジメチルPEG2のPGE受容体アゴニスト、19R-ヒドロキシPGE2、16,16-ジメチルPGE2p-p-アセトアミドベンズアミドフェニルエステル、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE2,9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE2、9-デオキシ-9-メチレンPGE2、ブタプロスト、スルプロストン、PGE2セリノールアミド、PEG2メチルエステル、16-フェニルテトラノルPGE2、15S-15-メチルPGE2、15R-15-メチルPGE2、BIO、8-ブロモ-cAMP、フォルスコリン、バプタAM、フェンジリン、ニカルジピン、ニフェジピン、ピモジド、ストロファンチジン、ラナトシド、L-Arg、ニトロプルシドナトリウム、バナジン酸ナトリウム、ブラジキニン、メベベリン、フルドロキシコルチド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、1,5-ペンタメチレンテトラゾール、4-アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、12-メトキシドデセノン酸、N-ホルミル-Met-Leu-Phe、ガラミン、IAA94、クロロトリアニセン、及びその誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。抗感染症剤。この作用物質は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗真菌剤、及び抗マイコバクテリア剤を含むが、これらに限定されない抗感染症剤とすることができる。抗菌剤はβ-ラクタム抗生物質、ペニシリン天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、セファロスポリン第一世代、第二世代、及び第三世代セファロスポリン、他のβ-ラクタムイミペネム、モノバクタムなど、β-ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシド及びスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、スルホンアミド及びトリメトプリム、又はキノリンとすることができるが、これらに限定されない。他の抗菌剤にはアセダプソン、アセトスルフォンナトリウム、アラメシン、アレキシジン、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アミサイクリン、アミフロキサシン、メシル酸アミフロキサシン、アミカシン、硫酸アミカシン、アミノサリチル酸、アミノサリチル酸ナトリウム、アモキシシリン、アンホマイシン、アンピシリン、アンピシリンナトリウム、アパルシリンナトリウム、アプラマイシン、アスパルトシン、硫酸アストロマイシン、アビラマイシン、アボパルシン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズロシリンナトリウム、塩酸バカンピシリン、バシトラシン、バシトラシンメチレンジサリチレート、バシトラシン亜鉛、バンベルマイシン、ベンソイルパスカルシウム、ベリスロマイシン、硫酸ベタマイシン、ビアペネム、ビニラマイシン、塩酸ビフェネミン、ビスピリチオンマグスルフェックス、ブチカシン、硫酸ブチロシン、硫酸カプレオマイシン、カルバドックス、カルベニシリン二ナトリウム、カルベニシリンインダニルナトリウム、カルベニシリンフェニルナトリウム、カルベニシリンカリウム、カルモナムナトリウム、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファマンドールナフテート、セファマンドールナトリウム、セファパロール、セファトリジン、セファザフルナトリウム、セファゾリン、セファゾリンナトリウム、セフブペラゾン、セフジニル、セフェピム、塩酸セフェピム、セフェテコール、セフィキシム、塩酸セフメノキシム、セフメタゾール、セフメタゾールナトリウム、セフォニシド一ナトリウム、セフォニシドナトリウム、セホペラゾンナトリウム、セフォラニド、セフォタキシムナトリウム、セフォテタン、セフォテタン二ナトリウム、塩酸セフォチアム、セフォキシチン、セフォキシチンナトリウム、セフピミゾール、セフピミゾールナトリウム、セフピラミド、セフピラミドナトリウム、硫酸セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジンナトリウム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシムナトリウム、セフトリアキソンナトリウム、セフロキシム、セフロキシムアキセチル、セフロキシムピボキセチル、セフロキシムナトリウム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、塩酸セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、塩酸セトサイクリン、セトフェニコール、クロラムフェニコール、パルミチン酸クロラムフェニコール、パントテン酸クロラムフェニコール錯体、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、クロロヘキシジンホスファニラート、クロロキシレノール、重硫酸クロロテトラサイクリン、塩酸クロロテトラサイクリン、シノキサシン、シプロフロキサシン、塩酸シプロフロキサシン、シロレマイシン、クラリスロマイシン、塩酸クリナフロキサシン、クリンダマイシン、塩酸クリンダマイシン、塩酸クリンダマイシンパルミテート、燐酸クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリンベンザチンクロキサシリンナトリウム、クロキシキン、コリスチンメタナトリウム、硫酸コリスチン、クーママイシン、クーママイシンナトリウム、シクラシリン、シクロセリン、ダルホプリスチン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメサイクリン、デノフンギン、ジアベリジン、ジクロキサシリン、ジクロキサシリンナトリウム、硫酸ジヒドロストレプトマイシン、ジピリチオン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、ドキシサイクリンカルシウム、ドキシサイクリンフォスファテックス、ドキシサイクリン塩酸塩、ドロキサシンナトリウム、エノキサシン、エピシリン、塩酸エピテトラサイクリン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシンエチルコハク酸、エリスロマイシングルセプト酸、エリスロマイシンラクトビオン酸、エリスロマイシンプロピオン酸、エリスロマイシンステアリン酸、塩酸エタンブトール、エチオナミド、フレロキサシン、フロキサシリン、フルダラニン、フルメキン、ホスホマイシン、ホスホマイシントロメタミン、フモキシシリン、塩化フラゾリウム、酒石酸フラゾリウム、フシジン酸ナトリウム、フシジン酸、硫酸ゲンタマイシン、グロキシモナム、グラミシジン、ハロプロジン、ヘタシリン、ヘタシリンカリウム、ヘキセジン、イバフロキサシン、イミペネム、イソコナゾール、イセパマイシン、イソニアジド、ジョサマイシン、硫酸カナマイシン、キタサマイシン、レボフラルタドン、レボプロピルシリンカリウム、レキシスロマイシン、リンコマイシン、塩酸リンコマイシン、ロメフロキサシン、塩酸ロメフロキサシン、メシル酸ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マフェニド、メクロサイクリン、スルホサリチル酸メクロサイクリン、リン酸メガロマイシンカリウム、メキドックス、メロペネム、メタサイクリン、塩酸メタサイクリン、メテナミン、ヒブル酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メチシリンナトリウム、メチオプリム、塩酸メトロニダゾール、リン酸メトロニダゾール、メズロシリン、メズロシリンナトリウム、ミノサイクリン、塩酸ミノサイクリン、塩酸ミリンカーマイシン、モネンシン、モネンシンナトリウム、ナフシリンナトリウム、ナリジクス酸ナトリウム、ナリジクス酸、ナタマイシン、ネブラマイシン、パルミチン酸ネオマイシン、硫酸ネオマイシン、ウンデシレン酸ネオマイシン、硫酸ネチルマイシン、ノイトラマイシン、ニフラデン、ニフルアルデゾン、ニフラテル、ニフラトロン、ニフルダジル、ニフルイミド、ニフルピリノール、ニフルキナゾール、ニフルチアゾール、ニトロサイクリン、ニトロフラントイン、ニトロミド、ノルフロキサシン、ノボビオシンナトリウム、オフロキサシン、オルメトプリム、オキサシリンナトリウム、オキシモナム、オキシモナムナトリウム、オキソリニン酸、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリンカルシウム、塩酸オキシテトラサイクリン、パルジマイシン、パラクロロフェノール、パウロマイシン、ペフロキサシン、メシル酸ペフロキサシン、ペナメシリン、ペニシリンGベンザチン、ペニシリンGカリウム、ペニシリンGプロカイン、ペニシリンGナトリウム、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVハイドラバミン、ペニシリンVカリウム、ペンチジドンナトリウム、アミノサリチル酸フェニル、ピペラシリンナトリウム、ピルベニシリンナトリウム、ピリジシリンナトリウム、塩酸ピルリマイシン、塩酸ピバンピシリン、パモ酸ピバンピシリン、ピバンピシリンプロベナート、硫酸ポリミキシンB、ポルフィロマイシン、プロピカシン、プラジナミド、亜鉛ピリチオン、酢酸キンデカミン、キヌプリスチン、ラセフェニコール、ラモプラニン、ラニマイシン、レロマイシン、レプロマイシン、リファブチン、リファメタン、リファメキシル、リファミド、リファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロリテトラサイクリン、硝酸ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、酪酸ロサラマイシン、プロピオン酸ロサラマイシン、燐酸ロサラマイシンナトリウム、ステアリン酸ロサラマイシン、ロソクサシン、ロキサルソン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、サンフェトリネムナトリウム、サルモキシシリン、サルピシリン、スコパフンギン、シソマイシン、硫酸シソマイシン、スパルフロキサシン、塩酸スペクチノマイシン、スピラマイシン、塩酸スタリマイシン、ステフィマイシン、硫酸ストレプトマイシン、ストレプトニコジド、スルファベンズ、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファセタミドナトリウム、スルファシチン、スルファジアジン、スルファジアジンナトリウム、スルファドキシンスルファレン、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファモノメトキシン、スルファモキソール、スルファニル酸亜鉛、スルファニトラン、スルファサラジン、スルファソミゾール、スルファチアゾール、スルファザメト、スルフィソキサゾール、スルフィソキサゾールアセチル、スルフィソキサゾールジオールアミン、スルフォミキシン、スロペネム、スルタミシリン、スンシリンナトリウム、塩酸タランピシリン、テイコプラニン、塩酸テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、塩酸テトラサイクリン、リン酸テトラサイクリン錯体、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チフェンシリンカリウム、チカルシリンクレシルナトリウム、チカルシリン二ナトリウム、チカルシリン一ナトリウム、チクラトン、塩化チオドニウム、トブラマイシン、硫酸トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、硫酸トリメトプリム、トリスルファピリミジン、トロレアンドマイシン、硫化トロスペクトマイシン、チロスリシン、バンコマイシン、塩酸バンコマイシン、バージニアマイシン、又はゾルバマイシンであるが、これらに限定されない。抗マイコバクテリア剤にはミアンビトール塩酸エタンブトール、ダプソン4,4’-ジアミノジフェニルスルホン、ぺーサ顆粒アミノサリチル酸素顆粒、プリフチンリファペンチン、ピラジナミド、イソニアジド、リファビン、リファンピン、リファジンIV、リファマートリファンピン及びイソニアジド、リファタールリファンピン、イソニアジド、及びピラジンアミド、硫酸ストレプトマイシン又はトレカトル-SCエチオナミドがあるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤にはアマンチジン及びリマンタジン、リビバリン、アシクロビル、ビダラビン、トリフルオロチミジン、ガンシクロビル、ジドブジン、レチノビル、及びインタフェロンがあるが、これらに限定されない。抗ウイルス剤にはさらにアセマンナン、アシクロビル、アシクロビルナトリウム、アデホビル、アロブジン、アルビルセプトスドトックス、塩酸アマンタジン、アラノチン、アリルドン、メシル酸アテビルジン、アブリジン、シドホビル、シパムフィリン、塩酸シタラビン、メシル酸デラビルジン、デシスコロビル、ジダノシン、ジソキサリル、エドクスジン、エンビラデン、エンビロキシム、ファムシクロビル、塩酸ファモチン、フィアシタビン、フィアルウリジン、ホサリラート、フォスカーネットナトリウム、ホスホネットナトリウム、ガンシクロビル、ガンシクロビルナトリウム、イドクスウリジン、ケトキサール、ラミブジン、ロブカビル、塩酸メモチン、メチサゾン、ネビラピン、ペンシクロビル、ピロダビル、リバビリン、塩酸リマンタジン、メシル酸サキナビル、塩酸ソマンタジン、ソリブジン、スタトロン、スタブジン、塩酸チロロン、トリフルリジン、塩酸バラシクロビル、ビダラビン、燐酸ビダラビン、燐酸ビダラビンナトリウム、ビロキシム、ザルシタビン、ジドブジン、ジンビロキシム又はインテグラーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。抗真菌剤にはイミダゾール及びトリアゾール、ポリエンマクロリド抗生物質、グリセオフルビン、アンフォテリシンB、及びフルシトシンがあるが、これらに限定されない。抗寄生虫剤には重金属、抗マラリアキノリン、葉酸拮抗剤、ニトロイミダゾール、ベンズイミダゾール、アバーメクチン、プラキシカンテル、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、フェノール類例えばビチオノール、ニコロサミド、合成アルカロイド例えばデヒドロエメチン、ピペラジン例えばジエチルカルバマジン、アセトアニリド例えばジロキサニドフロナート、ハロゲン化キノリン例えばヨードキノールジヨードヒドロキシキン、ニトロフラン例えばニフルチモックス、ジアミジン例えばペンタミジン、テトラヒドロピリミジン例えばパモ酸ピランテル、又は硫酸化ナフチルアミン例えばスラミンが含まれる。他の抗感染症剤には塩酸ジフロキサシン、ラウリル臭化イソキノリン、モキサラクタム二ナトリウム、オルニダゾール、ペンチソミシン、塩酸サラフロキサシン、HIV及び他のレトロウイルスのプロテアーゼ阻害剤、HIV及び他のレトロウイルスのインテグラーゼ阻害剤、セファクロールセクロル、アシクロビルゾビラックス、ノルフロキサシン、Noroxin、セフォキシチンメホキシン、セフロキシムアキセチルセフチン、シプロフロキサシンシプロ、塩酸アミナクリン、塩化ベンゼトニウム、ビチオノレートナトリウム、ブロムクロレノン、過酸化尿素、塩化セタルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩酸クロルヘキシジン、クリオキノール、臭化ドミフェン、フェンチクロール、塩化フルダゾニウム、塩基性フクシン、フラゾリドン、ゲンチアナ紫、ハルキノール、ヘキサクロロフェン、過酸化水素、イクタモール、イミデシルヨウ素、ヨウ素、イソプロピルアルコール、酢酸マフェナイド、メラレインナトリウム、塩化メルクフェノール、塩化水銀IIアミド、塩化メチルベンゼトニウム、ニトロフラゾン、ニトロメルソール、塩酸オクテニジン、オキシクロロセン、オキシクロロセンナトリウム、樟脳処理したパラクロロフェノール、過マンガン酸カリウム、ポビドンヨード、塩化セパゾニウム、硝酸銀、スルファジアジン銀、シムクロセン、チメルホネートナトリウム、チメロサール、又はトロクロセンカリウムがあるが、これらに限定されない。核酸剤。本発明により対象に送達することができる核酸には天然又は天然以外で産出するDNAcDNA、ゲノムDNA、核DNA、ミトコンドリアDNAなど、RNAmRNA、rRNA、tRNAなどオリゴヌクレオチド、三重らせん体形成分子、US6194388号免疫賦活CpG核酸に関するその教示は、参照により本明細書に組み込むものとするに記載されているような免疫賦活核酸、遺伝子発現の調節に使用される小型干渉性RNAsiRNA又はマイクロRNAmiRNA、遺伝子発現の調節に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、遺伝子又は遺伝子フラグメント、制御配列、及びその類似体、誘導体、及び組合せが含まれる。これらの核酸は、例えば標的組織及び/又は細胞への結合及び/又は摂取を促進するために、巧妙に投与するか、錯化して別の実体にすることができる。抗炎症剤。抗炎症剤は、炎症を軽減又は解消する作用物質である。それにはアルクロフェナック、二プロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド、アルファアミラーゼ、アムシナファル、アムシナフィド、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリロース、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、クロピラック、プロピオン酸クロチカソン、酢酸コルメタソン、コルトドキソン、デフラザコルト、デソニド、デソキシメタソン、二プロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、二酢酸ジフロラゾン、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサル、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ、エノリカムナトリウム、エピリゾール、エトドラック、エトフェナマート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドサル、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカソン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタソール、酢酸ハロプレドン、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、酢酸イソフルプレドン、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロルノキシカム、ロテプレドノールエタボナート、メクロフェノキセートナトリウム、メクロフェナム酸、二ブチル酸メクロリゾン、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、メチルプレドニゾロンスェプタナート、モルニフルマート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラリニン、多硫酸ペントサンナトリウム、グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム、ピルフェニドン、ピロキシカム、桂皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナザート、プリフェロン、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、酢酸プロキサゾール、リメキソロン、ロマザリット、サルコレックス、サルナセジン、サルサレート、サリチル酸、塩化サンギナリウム、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダック、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナック、ピバル酸チオコルトール、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、糖質コルチコイド、ゾメピラックナトリウムが含まれる。1つの好ましい抗炎症剤はアスピリンである。他の作用物質。作用物質にはアドレナリン作用薬、副腎皮質ステロイド、副腎皮質抑制剤、嫌酒薬、アルドステロン拮抗薬、アンモニア解毒薬、アミノ酸、筋萎縮性側索硬化症作用薬、アナボリックステロイド、興奮薬、鎮痛薬、アンドロゲン、麻酔薬、食欲抑制薬、食欲抑制薬、下垂体前葉活性剤、下垂体前葉抑制剤、駆虫薬、ニキビ止め薬、抗アドレナリン作用薬、抗アレルギー薬、抗アメーバ薬、抗アンドロゲン物質、抗貧血剤、抗狭心症薬、抗不安薬、抗関節炎薬、β-アドレナリンアゴニスト、メチルキサンチン、マスト細胞安定剤、抗コリン作用薬、糖質コルチコイドなどの副腎皮質ステロイドなどの抗喘息薬、抗アテローム硬化症剤、抗胆石症剤、胆石形成防止剤、抗コリン作用薬、抗凝血剤、抗コクシジウム薬、抗痙攣薬、抗鬱剤、抗糖尿病剤、止瀉薬、抗利尿薬、抗運動障害剤、制吐剤、抗てんかん薬、抗エストロゲン剤、抗線維素溶解薬、抗緑内障薬、抗出血剤、抗ヒスタミン薬、抗高脂血症剤、抗高リポタンパク血症剤、抗高血圧薬、抗低血圧薬、抗感染薬、抗炎症剤、抗角質化剤、抗偏頭痛薬、抗有糸分裂薬、抗真菌薬、制嘔吐剤、抗好中球減少症剤、抗強迫観念剤、抗酸化剤、抗パーキンソン病薬、抗蠕動剤、肺胞嚢防止剤、抗前立腺肥大剤、抗原虫薬、止痒剤、抗疥癬剤、抗精神病薬、抗リウマチ薬、抗住血吸虫薬、抗脂漏薬、抗分泌薬、鎮痙薬、抗血栓薬、鎮咳薬、抗潰瘍薬、抗尿結石剤、食欲抑制剤、血糖値調整剤、骨吸収阻害剤、気管支拡張薬、炭酸脱水酵素阻害薬、心抑制薬、心臓保護薬、強心剤、心血管剤、脳虚血剤、胆汁分泌促進薬、コリン作動薬、コリン作動アゴニスト、コリンエステラーゼ不活性剤、抗コクシジウム剤、認知補助剤、認知改善薬、結膜炎薬、造影剤、鎮静剤、診断補助剤、利尿剤、ドーパミン作動薬、外部奇生生物撲滅薬、吐剤、酵素阻害剤、エストロゲン、エストロゲン受容体アゴニスト、線維素溶解薬、蛍光剤、酸素遊離基スカベンジャ、胃酸抑制剤、胃腸運動作用因子、老人病薬、糖質コルチコイド、性腺刺激成分、発毛刺激剤、止血剤、植物活性剤、ヒスタミンH2受容体拮抗薬、ホルモン、低コレステロール血症、低血糖症、抗高脂血症薬、低血圧、HMGCoA還元酵素阻害剤、不能症治療補助剤、炎症性腸疾患薬、角質溶解薬、LHRHアゴニスト、肝臓病薬、黄体融解素、記憶補助剤、精神状態昂進剤、ミネラル、気分調節薬、粘液溶解薬、粘膜保護剤、多発性硬化症薬、散瞳薬、鼻粘膜充血除去薬、神経弛緩薬、神経筋遮断薬、神経保護薬、NMDA拮抗薬、非ホルモンステロール誘導体、栄養素、子宮収縮薬、パジェット病薬、プラスミノゲン活性化因子、血小板活性化因子拮抗薬、血小板凝集阻害剤、脳卒中後及び頭部外傷後の作用物質、プロゲスチン、プロスタグランジン、前立腺肥大阻害剤、プロシロトロピン、向精神剤、放射性作用物質、弛緩薬、鼻炎薬、殺疥癬虫薬、硬化剤、鎮痛剤、催眠鎮静薬、選択的アデノシンAl拮抗薬、金属イオン封鎖剤、セロトニン拮抗薬、セロトニン阻害剤、セロトニン受容体拮抗薬、ステロイド、興奮薬、抑制剤、甲状腺ホルモン、抗甲状腺薬、甲状腺擬態、精神安定剤、不安定狭心症薬、尿酸排泄薬、血管収縮薬、血管拡張剤、傷薬、創傷治癒薬、又はキサンチン酸化酵素阻害薬があるが、これらに限定されない。対象本発明は、本明細書で想定されるような作用物質の送達による恩恵を受けそうな事実上いかなる対象のタイプにも実践することができる。本発明の幾つかの実施形態では、ヒト対象が好ましい対象である。対象には家のペット例えばイヌ、ネコ、ウサギ、フェレットなど、家畜又は農場の動物例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ及び他の家禽類、サラブレッドなどのウマ、研究室の動物例えばマウス、ラット、ラビットなどのような動物も含まれる。対象には魚及び他の水生種も含まれる。作用物質が投与される対象は正常な対象でもよい。あるいは、1つ又は複数の特定の作用物質の送達により診断できる、又はその恩恵を受けることができる症状がある、又はその症状が発生する危険があるものとすることができる。このような症状には癌例えば固形腫瘍癌又は白血病などの非固形癌、感染症体内の特定の領域又は組織に局在する感染症など、自己免疫異常、アレルギー又はアレルギー症状、喘息、移植の拒否反応などが含まれる。本発明に包含される様々な症状を診断する試験は当技術分野で知られており、普通の医師も精通している。これらの研究室の試験には顕微鏡分析、培養依存の試験培養菌など、及び核酸検出試験が含まれるが、これらに限定されない。それには湿式マウント、染色で向上させた顕微鏡検査、免疫顕微鏡検査例えばFISH、ハイブリダイゼーション顕微鏡検査、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニングテストなどが含まれる。医師は通常、以上で列挙した研究室の試験を実行する以外に、完全な病歴も受け取り、完全な理学的検査を実行する。癌を有する対象とは、検出可能な癌細胞を有する対象である。癌発生の危険がある対象とは、癌を発生する蓋然性が通常より高い対象である。これらの対象には、例えば癌発生の可能性が高くなることに関係すると実証されている遺伝的異常を有する対象、癌の家族性素因を有する対象、タバコ、アスベスト、又は他の化学的毒素など癌を引き起こす作用物質すなわち、発癌物質に曝露した対象、及び以前に癌の治療を受け、見かけの寛解状態にある対象が含まれる。感染を有する対象とは、熱、寒気、筋肉痛、羞明、咽頭炎、急性リンパ節炎、脾腫、消化管の不調、白血球増加又は白血球減少を含むが、これらに限定されない症状を呈する対象、及び/又は体内で感染症の病原体又は副産物を検出することができる対象である。感染症発生の危険がある対象とは、感染症の病原体に曝露する危険がある対象である。このような対象には、このような病原体が存在することが知られている区域、及びこのような感染症が一般的である区域に居住する対象が含まれる。これらの対象には、注射針を共有する、無防備な性交渉をする、感染した対象サンプルに日常的に接触する例えば医師などの危険性が高い行為に関わる対象、腹部手術を含むがこれらに限定されない手術を受けた人なども含まれる。対象は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染又はマイコバクテリア感染などの感染を有する、又はその発生の危険があることがある。これらの実施形態では、小胞は抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、又は抗マイコバクテリア剤などの抗菌剤を含むことができ、細胞キャリア例えばT細胞は、感染に対する免疫応答の刺激、又は場合によっては感染の治療に有用な別の作用物質を生成するために、遺伝子工学で処理することができる。癌本発明は、例えば固形腫瘍癌などの癌を有する、又はそれを発生する危険がある対象に対して、本発明の小胞を使用して作用物質を投与することを想定している。作用物質は、化学療法剤、抗体系治療剤、ホルモン系治療剤、酵素阻害剤などの抗ガン剤とすることができる、及び/又は抗原例えば癌抗原及び/又はアジュバントなどの免疫賦活剤とすることができる、及び/又は診断薬例えば造影剤、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかとすることができる。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び/又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。癌は単純癌、肉腫又は黒色腫となることがある。単純癌には基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、中枢神経癌、大腸直腸癌、腎臓又は腎細胞癌、喉頭癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌NSCLC;腺癌、巨燕麦細胞癌、及び扁平上皮癌など、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌基底細胞癌及び扁平上皮癌など、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、直腸癌、呼吸器の癌、及び泌尿系の癌が含まれるが、これらに限定されない。肉腫は、稀な間葉性新生物で骨骨肉腫及び軟組織線維肉腫に生じる。肉腫には脂肪肉腫粘液性脂肪肉腫及び多態性脂肪肉腫など、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍悪性シュワン細胞腫、神経線維肉腫、又は神経原性肉腫とも呼ばれる、ユーイング腫ユーイング骨肉腫、骨格外すなわち、骨以外のユーイング肉腫、及び原始神経外胚葉腫瘍など、滑膜肉腫、血管肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、類腱腫進行性線維腫症とも呼ばれる、隆起性皮膚線維肉腫DFSP、悪性線維性組織球腫MFH、血管外皮細胞腫、悪性間葉組織腫瘍、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、癒着性小細胞腫瘍、消化管間質腫瘍GISTGI間質肉腫としても知られる、及び軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。黒色腫は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍である。黒色腫の例には悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、及び末端性ほくろ性黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。癌は固形腫瘍リンパ腫となることがある。その例にはホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びB細胞リンパ腫が含まれる。癌には骨癌、脳腫瘍、乳癌、結腸大腸癌、結合組織癌消化系の癌、子宮内膜癌、食道癌、目の癌、頭部及び首の癌、胃ガン、上皮内新生物、黒色腫神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、網膜芽腫、又は横紋筋肉腫があるが、これらに限定されない。感染症本発明は、例えば細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、又はマイコバクテリア感染症を有する、又はそれを発生する危険がある対象に対して、本発明の小胞を使用して作用物質を投与することを想定している。作用物質には抗感染薬抗菌剤、抗ウイルス剤、抗近々剤、抗寄生虫剤、及び抗マイコバクテリア剤など、抗原例えば最近抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及びマイコバクテリア抗原などの微生物抗原などの免疫賦活剤、及び/又はアジュバント、診断薬例えば造影剤、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び/又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。細菌感染症には大腸菌感染症、ブドウ球菌感染症、連鎖菌感染症、緑膿菌感染症、クロストリジウム‐ディフィシレ感染症、レジオネラ感染症、肺炎球菌感染症、ヘモフィルス感染症、クレブシエラ感染症、エンテロバクタ感染症、シトロバクタ感染症、ナイセリア感染症、赤痢菌感染症、サルモネラ菌感染症、リステリア感染症、パスツレラ感染症、連鎖桿菌感染症、スピリルム感染症、トレポネーマ感染症、放射菌感染症、ボレリア感染症、コリネバクテリウム感染症、ノカルジア感染症、ガードネレラ感染症、カンピロバクタ感染症、スピロヘータ感染症、プロテウス感染症、バクテリオイド感染症、ピロリ菌感染、又は炭疽菌感染があるが、これらに限定されない。マイコバクテリア感染症には、それぞれ結核菌及び癩菌を原因とする結核又はハンセン病があるが、これらに限定されない。ウイルス感染症には単純疱疹ウイルス1型感染症、単純疱疹ウイルス2型感染症、サイトメガロウイルス感染症、A型肝炎ウイルス感染症、B型肝炎ウイルス感染症、C型肝炎ウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、EBウイルス感染症、ロタウイルス感染症、アデノウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、インフルエンザA型ウイルス感染症、H1N1ブタインフルエンザ感染症、RSウイルス感染症、水痘‐帯状疱疹ウイルス感染症、天然痘感染症、サル痘ウイルス感染症、SARS感染症、又はトリインフルエンザ感染症があるが、これらに限定されない。真菌感染症にはカンジダ症、白癬、ヒストプラズマ症、分芽菌症、パラコクシジオイドミコーシス、クリプトコッカス、アスペルギルス症、色素酵母菌症、菌腫感染症、偽アレシェリアシス、又は癜風感染症があるが、これらに限定されない。寄生虫感染症にはアメーバ症、トリパノソーマ‐クルージ感染症、肝蛭症、リーシュマニア症、プラズマ原虫感染症、糸状虫症、肺吸虫症、トリパノソーマ‐ブルーセイ感染症、ニューモシスティス感染症、膣トリコモナス感染症、条虫感染症、模様条虫感染症、エキノコックス感染症、住血吸虫感染症、神経嚢虫、アメリカ鉤虫感染症、又はヒト鞭虫があるが、これらに限定されない。アレルギー及び喘息本発明は、アレルギー又は喘息を有する、又はそれを発生する危険がある対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質にはアレルゲン、Th1応答を刺激する作用物質などの免疫賦活剤、Th2応答を阻害する作用物質などの面積阻害剤又は免疫抑制剤、抗炎症剤、ロイコトリエン拮抗薬、IL-4突然変異タンパク質、可溶性IL-4受容体、抗IL-4抗体、IL-4拮抗剤、抗IL-5抗体、可溶性IL-13受容体-Fc融合タンパク質、抗IL-9抗体、CCR3拮抗剤、CCR5拮抗剤、VLA-4阻害剤、及び他のIgEの下方制御因子、例えば制限なしで抗IgE、IL-12及びIFN-ガンマなどのTh1サイトカインなどのサイトカイン、プレドニゾロンなどのコルチコステロイドを含むステロイドがあるが、これらに限定されない、及び/又は診断薬例えば造影剤、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び/又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。アレルギーはアレルゲンに対する獲得過敏症である。アレルギー症状には湿疹、アレルギー性鼻炎又は鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹発疹、及び食物アレルギー、及び他のアトピ症状が含まれるが、これらに限定されない。アレルギーは通常、無害のアレルゲンに対してIgE抗体が発生することによって引き起こされる。喘息は気管系の障害であり、炎症、気道狭窄、及び吸入剤に対する気道の反応増大を特徴とする。喘息はアトピ又はアレルギー症状を伴うことが多いが、これに限らない。自己免疫疾患本発明は、自己免疫疾患又は異常を有する、又はそれを発生する危険がある対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質にはTh1応答を阻害するものを含む免疫阻害剤又は免疫抑制剤、Th2応答を刺激する免疫賦活剤、IL-4、IL-5及びIL-10などのサイトカイン、後援商材がある、及び/又は診断薬例えば造影剤、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び/又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。自己免疫疾患とは、対象自身の抗体が宿主組織に反応するか、免疫エフェクタT細胞が内因性の自己ペプチドに対して自己反応し、組織の破壊を引き起こすという疾患の種類である。したがって、免疫応答は自己抗原と呼ばれる対象自身の抗原に対して展開される。自己免疫疾患は通常、Th1バイアスがあると見なされる。その結果、Th2免疫応答又はTh2様サイトカインの導入が遊離になることがある。自己免疫疾患にはリウマチ様動脈炎、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスSLE、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症MG、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡例えば尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体での硬皮症、混合性結合組織病、多発筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎例えば半月形糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インシュリン抵抗性、及び自己免疫性真性糖尿病があるが、これらに限定されない。移植療法本発明は、細胞又は器官を移植した対象に作用物質を投与することを想定している。作用物質には免疫阻害剤又は免疫抑制剤、抗炎症剤がある、及び/又は診断薬例えば造影剤、又は本明細書で説明する他の作用物質のいずれかがある。本発明は本発明の小胞が、これらの対象に単独で、又は組み合わせて送達するこれらの作用物質の量を増加させる、及び/又は安定した徐放プロファイルにより、これらの作用物質に対する対象の曝露を延長可能にすることができると想定している。本明細書で提供する組成物及び方法は、移植療法後に免疫応答を調製するために使用することもできる。移植の成功は、身体の免疫系による移植組織の拒絶によって制限されることが多い。その結果、被移植者は通常、移植組織が生き延びられるために長期間にわたって免疫抑制される。本発明は、移植の拒絶を最小化するために移植部位に免疫調節剤、特に免疫阻害剤を投与することを想定している。したがって、本発明は移植を予定した対象、移植を受けている対象、又は移植した対象への投与を想定している。上記のリストは包括的ではなく、例示である。当業者には、本発明の方法を使用した予防及び治療に適した各症状タイプの他の例が明らかになる。有効な量、療法、製剤作用物質は安定化したMLVの形態で有効量を投与される。有効量とは、医学的に望ましい結果を提供するのに十分な作用物質の用量である。有効量は、所望のアウトカム、治療又は予防する特定の状態、治療中の対象の年齢及び身体的状態、症状の重症度、治療期間、併用療法のがある場合はその性質、特定の投与経路などの要因に応じて、医師の知識及び専門技術内で変化する。通常は、最大容量、すなわち、健全な医学的判断により安全な最高用量を使用することが好ましい。例えば対象が腫瘍を有している場合、有効量は、例えば腫瘍の撮像によって解明されるような腫瘍の体積又は負荷を減少させる量とすることができる。有効量は、血液又は他の体液又は組織中の癌細胞の存在及び/又は頻度によって評価することもできる。腫瘍が組織又は器官の正常な機能に影響を及ぼす場合は、組織又は器官の正常な機能を測定することによって、有効量を評価することができる。場合によっては、有効量とは1つ又は複数、好ましくは全部の症状を軽減又は解消するのに必要な量である。例えば、アレルギーを有する、又は喘息の発作を経験している対象では、作用物質の有効量は、アレルギー又は喘息発作に伴う症状を軽減又は解消する量とすることができる。これにはくしゃみ、蕁麻疹、鼻閉、及び呼吸困難が含まれることがある。同様に、感染症を有する対象では、作用物質の有効量は、感染症に伴う症状を軽減又は解消する量とすることができる。それには発熱及び倦怠感が含まれることがある。作用物質が診断薬である場合、有効量は、身体の関係領域又は細胞の視覚化を可能にする量とすることができる。作用物質が抗原である場合、有効量は抗原に対する免疫応答を引き起こし、抗原の由来となる病原体に対して好ましくは短期間の、さらに好ましくは長期間の保護を提供する量とすることができる。場合によっては、本発明は作用物質を1回投与することを想定し、場合によっては、本発明は作用物質を複数回投与することを想定することが理解される。一例として、抗原を初回投与量及び追加投与量で投与することができるが、場合によっては、本発明は追加投与量が必要ない十分な抗原を、及び任意選択でアジュバントを送達する。本発明は製薬組成物を提供する。製薬組成物は、好ましくは薬学的に許容可能なキャリアに入れた本発明の小胞、及び好ましくは作用物質を含む無菌組成物である。薬学的に許容可能なキャリアという用語は、ヒト及び本発明が想定する他の対象への投与に適した1つ又は複数の融和性の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を意味する。キャリアという用語は、投与を容易にするために小胞及び好ましくは作用物質と化合することができる天然又は合成の有機又は無機成分を指す。製薬組成物の成分は、所望の薬学的効率を実質的に損なうような相互作用を排除する方法で混合される。適切な緩衝剤には、酢酸と塩1~2W/V、クエン酸と塩1~3W/V、ホウ酸と塩0.5~2.5W/V、及び燐酸と塩0.8~2W/Vが含まれる。適切な保存剤には塩化ベンザルコニウム0.003~0.03W/V、クロロブタノール0.3~0.9W/V、及びパラオキシ安息香酸エステル類0.01~0.25W/Vが含まれる。本明細書で他に言明していない限り、様々な投与経路が使用可能である。選択される特定のモードが、選択される特定の活性作用物質、治療される特定の症状、及び治療効力のために必要な容量によって決定されることは言うまでもない。概して、提供される方法は、医学的に許容可能な任意の投与モード、すなわち、臨床的に許容不能な副作用を引き起こさずに、有効レベルの所望の応答を生成する任意のモードを使用して実践することができる。1つの投与モードは非経口経路である。非経口という用語には、皮下注射、静脈注射、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射又は輸注技術が含まれる。他の投与モードには口腔、粘膜、直腸、膣、舌下、鼻腔内、気管内、吸入、眼球、経皮などが含まれる。経口投与の場合、化合物は、当技術分野でよく知られている薬学的に許容可能なキャリアに小胞を組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。このようなキャリアにより、治療すべき対象が経口摂取するために錠剤、丸薬、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、被膜、懸濁液などとして製剤化することができる。適切な賦活剤には、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール又はソルビトールを含む糖などの充填剤と、例えばコーンスターチ、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び/又はポリビニルピロリドンPVPなどのセルロース調製とがある。任意選択で、経口製剤は、内部の酸性状態を中和するために塩水又は緩衝剤中で製剤化するか、キャリアが全くない状態で投与することもできる。経口で使用可能な医薬製剤には、ゼラチンで作成されたプッシュフィット式カプセル、さらにゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作成した密封ソフトカプセルが含まれる。プッシュフィット式カプセルには、水溶液、緩衝溶液、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に浮遊させた小胞を含めることができる。また、安定剤を添加することができる。経口投与するための製剤化はすべて、このような投与に適した用量でなければならない。口腔内投与の場合、組成物は従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態をとることができる。吸入による投与の場合、組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切な気体などの適切な噴射剤を使用することにより、加圧したパック又はネブライザからエアロゾル噴霧提示の形態で送達できるので都合がよい。加圧したエアロゾルの場合、用量単位は、計量した量を送達するために弁を設けることによって決定することができる。本発明の組成物を全身に送達することが望ましい場合、例えば大量瞬時投与又は連続注輸などの注入により非経口投与するように製剤化することができる。注入するための製剤化は単位用量の形態で、例えばアンプル又は複数用量の容器に入れて提示することができる。非経口の医薬製剤には、処方成分の水溶液が含まれる。注入用水性懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を上げる物質が含まれる。あるいは、小胞の懸濁液は、油性懸濁液として調製することができる。適切な脂肪親和性溶媒又は小胞には、ごま油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。あるいは小胞は、使用前に例えば発熱性物質がない無菌の水などの適切な小胞と一緒の構成にするために、粉末形態又は凍結乾燥形態とすることができる。小胞は、座剤又は滞留性浣腸剤のように、例えばココアバター又は他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含有するなど、直腸又は膣の組成で製剤化することもできる。invitroの使用本発明は、細胞成長因子などを含むが、これらに限定されない1つ又は複数の作用物質の安定的な発生源を必要とする、又はそれを有する方が都合がよくなる細胞培養又は組織工学などのinvitroの用途もさらに想定している。キット本発明は、本発明の小胞を含むキットをさらに想定している。小胞は、1つ又は複数の関係する作用物質を含むことができる。キットには、小胞に取り込まれる1つ又は複数の関係する作用物質をさらに含めることができる。キットには小胞の使用指示などの書類も含めることができる。小胞は好ましくはショ糖を含有した賦活剤とともに、緩衝剤に入れて、又は凍結乾燥形態で提供することができる。本発明は、本発明の小胞を合成するために必要な様々な物質、試薬及び触媒を含むキットも想定している。このようなキットには、例えば本明細書で説明するような脂質、機能化脂質などの脂質二重層の機能化成分、膜透過性架橋剤などの1つ又は複数の架橋剤、二価陽イオンなどの多価陽イオンなどを含めることができる。これらのキットには、小胞を合成する指示などの書類も含めることができる。キットには関係する作用物質も含めることができる。本発明について、以下の実施例でさらに例証するが、これは決してさらなる限定とは解釈されない。本出願を通して引用される全参照先参照文献、発行済み特許、公開特許出願、及び共願特許出願を含むの内容はすべて、参照により明示的に本明細書に組み込むものとする。実施例実施例1先行技術の方法の限界に対応するために、多層状小胞MLV内の隣接する脂質層の頭部を接続する架橋を形成することによって安定化させた脂質粒子の合成を構想した。二価陽イオンはリポソームの融合を誘発してMLVにすることが知られている。Duzgunes他のJMembraneBiol198159115125を参照されたい。マレイミドで機能化した脂質例えばMPBを小胞に導入し、ヂチオール架橋剤を使用してMPBの層を架橋することによって、このプロセスを変更した例えば図1Aに示す合成略図。その結果となる二層間架橋の多層状脂質小胞ICMVはタンパク質の封入効率が大幅に向上したこと単純なリポソームに対して100倍、図5、粒子の質量当たりのタンパク質装填量が大幅に向上したこと単純なリポソームに対して20倍、図5、及び低速の徐放動態図6で、血清の存在下にて取り込んだカーゴの持続的貯留が大幅に向上したことなど、魅力的な特徴を呈した。合成は、全体が脆弱なタンパク質カーゴの取り込みに親和的な水性緩衝液中で実行され、生分解性脂質のみで構成される粒子を生成する。この新種の粒子を生物医学的に応用するための試験台として、抗原及びアジュバントの送達小胞としてのICMVを検査した。特に、モデル抗原としてオバルブミンOVAを使用し、ワクチン用途のためにinvivoでトール様受容体アゴニストTLRaの同時送達を検査した。材料及び方法脂質40:10:50のモル比のDOPC:DOPG:マレイミド機能化脂質を乾燥して脂質被膜を形成し、カーゴ分子の存在下でpH7.0の10mMのビス-トリスプロパンBTP中で1時間再水和した。図1Aに示すように、その結果のリポソームを音波処理し、Mg2及びCa2などの二価陽イオンを添加することによって融合するように誘導した。その結果のMLVをDTTマレイミド:DTTの比率2:1で培養し、マレイミド機能化脂質の並置する層を結合させて、架橋ICMVを形成した。その結果の構造を遠心分離して洗浄し、次に2kDaのPEG-チオールで培養してPEG化した。最終生成物を遠心分離し、脱イオン水で3回洗浄した。粒子のサイズ及び表面の電荷は、90粒子サイズの分析器BrookhavenInstrumentsを使用して動的光散乱法DLSにて割り出した。粒子サイズは、共焦点顕微鏡検査及び低温TEMで分析した。粒子の外面に露出した脂質の画分を定量化するために、上述したような層状性検定を実施したGirard他のBiophysicaljournal200487419429を参照。封入化を研究するために、alexafluor500で変性したオバルブミンOVAを使用して、PEG化リポソーム、Bershteyn他のSoftMatter2008417871791にて上述されているような脂質コーティングしたPLGA粒子、及びICMVに封入された量を測定した。幾つかの検定では、アレキサフルオル、555で変性したCIV-Gag及びFLT-3リガンドを使用した。これらの粒子からのOVAの放出は、100kDaのMW分画で透析膜内で実施した。invitro樹状細胞DC活性化研究のために、それぞれモノホスホリル脂質AMPLA及びR-848、TLR4及びTLR7アゴニストと組み合わせたOVAを封入したICMVで、骨髄由来又は脾臓のDCを培養した。細胞を染色し、フローサイトメトリで分析して、DC活性化及び粒子内部移行の程度を検査した。培地は、ELISARDSystemsによりIL12p70の発現を分析した。ワクチンキャリアとしてのICMVのinvivo機能を分析するために、C57BI/6マウスの群の脇腹に大量瞬時投与で、又はICMV中でTLRアゴニストがある状態、又はない状態で送達される70μgのOVAを皮下注射して免疫処置し、21日後に追加処理した。免疫処置により誘発されたOVA特異的T細胞及びインタフェロンガンマ生成T細胞の頻度を、末梢血単核細胞のフローサイトメトリ分析により解明した。抗OVAタイタを、免疫処置したマウスからの血清のELISA分析により解明した。動物は、米国国立衛生研究所、州、及び地方のガイドラインに従って世話をした。結果及び検討MLVの従来の形成プロトコルを変更して、安定したICMVを合成した図1A。最初に、タンパク質又は薬物カーゴ溶液の存在下で音波処理し、脂質被膜を再水和することによって、最大50molのMPBを含有するリポソームを形成した。その結果となるリポソームに二価陽イオンを添加して、その融合を誘発し、以上で報告したようにMLVを形成した。Duzgunes他のJMembraneBiol198159115125を参照。次に膜透過性試薬としてDTTを投入し、MLV内で並置する脂質膜のマレイミド頭部間に共有架橋を形成した図1B。表1A及び表1Bに示すように、40を超える有意の収量で安定したICMVを形成するために、二価陽イオンとDTTの両方が必要であった。Mg2又はDTTのみで形成したMLVでは、10K×gで遠心分離した脂質粒子が有意な量で生成されなかった。20mMの塩化ナトリウムが存在すると、粒子の形成を妨害した。何故なら、一価陽イオンは、二価陽イオンが媒介する小胞の融合を阻止することが知られているからであるDuzgunes他のJMembraneBiol198159115125を参照。有意な収量の粒子を達成するには、少なくとも25mol以上のMPBが必要であったので、その後は40:10:50のモル比のDOPC:DOPG:MPBの脂質組成物で作業することにした。その結果のICMVは250±40nmの典型的な平均直径を有し、多分散性指数は約0.08であった図3A。粒子の低温EM画像により、単一の脂質二重層よりも厚い高電子密度バンクで構成された多層状構造であることが判明し、このことは脂質膜をまたいで結合した脂質の多層であることを示唆した図3B。粒子の外面に表示された脂質の画分を、層状性検定で測定した。音波処理したリポソームは外面に37±2.3の脂質を有する一方、その値はMg2及びDTTでリポソームを変性した後に形成したICMV中で19±1.0へと低下し、そのことは、それが多層状構造であることを示唆した。表面に表示されたMPBをPET-チオール2kDaのMWと反応させることによって、ICMVをPEG化した。PEG化はICMVの直径を272±40nmへと増大させ、PBS中で7日間保存された粒子は、元のサイズを維持していた表2及び表示のない幾つかのデータ。ICMVは、賦形剤として3ショ糖を添加した状態で、凍結乾燥に適合した。何故なら、凍結乾燥後に緩衝溶液中に再浮遊した粒子は、全体的な形態及びサイズの特徴を維持していたからである表2。リポソーム及びPLGA粒子は、タンパク質を送達する小胞に広く使用されてきたので、これらの小胞に封入されたタンパク質をICMVと比較した。図5に示すように、ICMVは、従来のPEG化したステルスリポソーム及び脂質でコーティングしたPLGA粒子と比較して優れたOVA封入効率それぞれ108倍及び4倍の増加を呈した。同様に粒子総質量当たりの封入OVAの量は、ICMV中でそれぞれ21倍及び10倍増加した。次に、合成の過程でICMVに封入された様々なタンパク質の量を検査した図4A。SIV-gag、FLT-3リガンド、及び封入OVAの量は、音波処理したリポソームから、Mg2が媒介した融合により形成されたMLV、Mg2及びDTTによって形成されたICMVへと漸進的に増加する。特に、最初に装填されたOVAの70を超える量が、脂質1mg当たり407.5±18.7μgのOVAで、ICMVに封入された。OVAをモデルタンパク質と使用して、これらの小胞から放出されるカーゴを比較した図6。OVAはICMVからは低速で連続的に放出され、血清を含む媒質中のリポソーム及びMLVからはバースト放出された。モデルワクチン抗原としてOVAを使用して、ワクチン送達のプラットフォームとしてのICMVを検査した。ICMVにOVA及びトール様受容体アゴニスト、MPLATLR4リガンド及び/又はレジキモドTLR7/8リガンドを装填した。invitroでOVAを装填したICMVで培養した樹状細胞DCは粒子を貪食した。OVA装填ICMVのみではinvitroでDCが活性化しなかったが、TLRアゴニストTLRaを担持する粒子は共刺激分子例えばCD40、CD80、CD86、及びMHCIIの上方制御、及びinvitroでのDCによるIL-12p70の分泌を刺激し、TLR4及びTLR7アゴニストの両方を担持する粒子がDCの相乗活性化を促進した図8。ワクチン接種のためにOVAとの組合せでTLRaを同時送達する粒子の効力をinvivoで試験するために、OVA装填ICMVでC57B1/6マウスに免疫処置し、同等の用量の可溶性OVAと比較した。興味深いことに、OVAの大量瞬時投与と比較して、OVA装填ICMVは抗原特異的CD8T細胞の膨張を17倍増大させ、追加投与後に全CD8T細胞中で約7に到達した図10。これらのOVA装填粒子は、機能が匹敵するインタフェロンガンマIFN-ガンマを生成するOVA特異的T細胞の最高頻度も誘発する。しかし、OVAに対する抗体応答は、最大タイタのためにTLRaの存在を必要とし、OVAを装填してTLR4及びTLR7アゴニストと同時封入したICMVは、同じ用量の可溶性OVA/TLRaと比較して10倍高い抗OVA抗体のタイタを誘発したことは注目に値する図10B。臨床関連の病原体からの抗原に対してICMVが誘発することができる免疫応答の理解の手始めとして、感染因子からの抗原での免疫処置を試験した。抗原が封入され、その二重層内にMPLAも取り込まれた様々な用量のICMVを使用して、マウスを免疫処置した。初期及び追加療法の後、34日目から血清中で検出すると、抗原に対して強力な抗体タイタが生成され、可溶性抗原及びMPLAによって送達された同等用量によって誘発された抗体タイタははるかに弱かったデータは表示せず。これらの結果は、ICMVが免疫処置のための抗原送達の効果的な小胞であることを示唆している。本研究では、魅力的な特徴を呈する新規の多層状脂質粒子を開発した。すなわち、有機溶媒を使用せずに、ICMV中のタンパク質封入が大幅に向上する。これらの粒子は、コロイドの安定性を呈し、脂質系粒子は十分に生分解性である。ワクチン送達のプラットフォームとしてのICMVの融通性が実証された。これらの研究は、ICMVが様々なinvivoの薬剤送達用途に広く有用であるに違いないことを示唆している。実施例2以下の実施例は、実施例1で説明した実験及び結果の幾つかをさらに包括的に説明し、報告する。現在認可されているワクチンアジュバント例えば水酸化アルミニウム及び水中油型乳剤MF59は、細胞免疫を刺激説に、主に体液性免疫応答を誘発することによって免疫を促進する12。HIV、マラリア、及びC型肝炎などの細胞内病原体又は癌に対するワクチンには、強力なCD8T細胞CD8T応答が必要になることがあるので、協奏的体液及び細胞免疫応答を促進する技術に対する関心が高い34。そのために、複製組み換えウイルスなどの工学した生ワクチンベクターが開発されており5-7、これはネズミのモデルで機能性抗原特異的CD8T細胞の堅調な抗体応答及び大膨張を誘発することができる。しかし、生ベクター及び抗ベクター免疫に対する安全性の懸念が、生ベクターワクチンの設計を複雑化することがある7。既存のベクター特異的免疫応答は、臨床検査で生ベクター系ワクチンの免疫原生を低下させており8、初期免疫処置後に生ベクターに対する免疫応答が上昇するので、同じベクターを使用した追加免疫処置に問題を生じることがある7。対照的に、規定された抗原を送達する非生体の合成ワクチンは、抗ベクター免疫性を回避するために合理的に設計することができる9。このようなサブユニットワクチンは、標的病原体の構造に通常存在し、選択された1つ又は幾つかの組み換え型タンパク質又は多糖類から構成される。しかし、サブユニットワクチンは、交差提示クラスIのMHC分子上で未処理のCD8T細胞に対して提示するための免疫細胞による細胞外抗原の摂取及び処理の効率が低いので、誘発されるCD8T応答が少ない、又はない10。交差提示を促進するために、タンパク質抗原を装填した合成粒子及び規定された免疫促進分子を使用し1117、還元主義者の方法で、病原体により感染中に免疫系に提供されるキューを模倣した。リポソームは、毒性及び免疫原生が低く、臨床用で安全性の実績があり、調製が容易で、商業規模での製造しやすさが実証されているので1819、この用途には特に魅力的な材料である。単層、多層、又は重合小胞の形態の脂質小胞が、ワクチン送達材料として試験されており、多少の成功を収めている1923。脂質小胞中に取り込まれた抗原がinvivoで交差提示され192425、リポソームタンパク質ワクチンが小動物のモデルで保護T細胞媒介の抗菌性及び抗腫瘍性免疫応答を誘発することが示されている232627。しかし、HIV及び癌などの疾患では、ウイルス/腫瘍を抑制するために体液性免疫と協調した極めて強力なT細胞性応答が必要であると現在考えられており、したがってさらに強力なT細胞ワクチンが未だに探求されている34。ワクチン送達における脂質小胞の効力に影響する潜在的要因は、血清成分の存在下で安定性が限定される。高温で処理するか、予備成形した小胞膜を通した拡散によって装填することができるリポソームカーゴの場合、特にコレステロール及び/又はPEG化と組み合わせた場合、高Tm脂質を使用することによって小胞の安定性を向上させることができる28。単層及び多層小胞は、二重層の表面で反応性頭部を重合するか29、リン脂質アシル尾部の反応基を重合するか2029、膜の疎水性内部に吸着した疎水性モノマを重合すること30によっても安定化されている。これらの各アプローチに共通しているのは、二重層の面で成分を重合するという概念である。しかし、ワクチン抗原に適合する穏やかな状態で実行することができる重合の化学作用を発見することは難問である20。ここで、新種の脂質薬物キャリアについて説明する。すなわち、小胞壁内で密に積み重ねられた隣接二重層の並置面にわたって脂質頭部を結合する短い共有架橋で、多層状小胞を安定化させることによって形成される二層間架橋多層状小胞ICMVである。ICMVは高レベルのタンパク質を封入して、確実に保持し、同じ脂質組成の単純なリポソーム又は多層状小胞MLVと比較すると、血清に30日間曝露した場合、非常に低速で取り込んでいたカーゴを放出した。しかし、これらの小胞は、細胞内の区画内に通常高レベルで見られるリポソームの存在下で急速に劣化した31。この新規の小胞構造を使用し、高レベルのモデルタンパク質抗原オバルブミン、OVA及び脂質様免疫刺激リガンドモノホスホリル脂質A、MPLAを同時に取り込んで、マウスで免疫処置研究を実施し、ICMVは強健な抗体タイタを、単純なリポソームの約1000倍、及び同一の脂質組成のMLVの約10倍多く誘発することを発見した。ベクター未経験の個体に投与される単回投与にのみ有効であることが多い生ベクターとは異なり7、これらの合成小胞は、繰り返し投与した後に体液性及びCD8T細胞性応答の着実な増加を引き起こし、抗原特異性T細胞は、初回及び2回の追加免疫処置の後、血中の総CD8T細胞のほぼ30というピークまで膨張した。したがってこれらの新しい材料は、体液性免疫及び細胞免疫の両方を生成するために安全かつ非常に効果的であるサブユニットワクチンへの扉を開く。材料及び方法ICMVの合成。クロロホルム中の1.26μモルの脂質典型的な脂質組成:DOPC1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン:DOPG1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-1’-rac-グリセロールl:MPB1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[4-p-マレイミドフェニルブチルアミド=4:1:5モル比、全脂質はAvantiPolarLipidsアラバマ州アラバスタによるをガラスのバイアルに計量分配し、真空中で有機溶媒を一晩蒸発させ、乾燥した脂質薄膜を調製した。脂質被膜は、カーゴタンパク質とともにpH7.0で10mMのビス-トリスプロパンBTP内で1時間、10分毎に厳密に渦形成して再水和し、次に氷上にて30分間隔で5分間、6ワットと3ワットの交互の電力サイクルで音波処理したMisonixMicrosonXLプローブチップ超音波処理器、Farmingdale、ニューヨーク。この第一ステップで形成されたリポソームは、最終濃度が10mMのMg2及びCa2などの二価陽イオンを添加することによって融合を誘導した。その結果のMLVを、1.5mMのDTTマレイミド:DTTのモル比が2:1で1時間、37°Cで培養し、マレイミド機能化脂質の対抗する二重層を結合させて架橋ICMVを形成し、その結果の小胞を14,000×gで4分間遠心分離し、脱イオン水で2回洗浄して回収した。PEG化のために粒子を、マレイミド基に対してPEG-SHが1.5倍余計にある2kDaのPEG-チオールLaysanBio、アラバマ州Arabで1時間、37°Cで培養した。その結果の粒子を遠心分離し、脱イオン水で3回洗浄した。最終生成物は、PBS中で4°Cで保存するか、凍結防止剤として3のショ糖が存在する状態で凍結乾燥し、-20°Cで保存した。幾つかの検定では、Optima超遠心分離機BeckmanCoulterを使用して6時間、115kgで超遠心分離して架橋する前に、単純なリポソーム又はMg融合MLVを収穫した。invitroのタンパク質装填及び薬物放出。封入研究では、取り込んだタンパク質の量を直接的に蛍光定量するために、オバルブミンOVA、Worthington、ニュージャージー州レークウッド、SIV-gagAdvancedBioscienceLaboratories、メリーランド州ケンジントン、及びFLT-3LPeprotech、ニュージャージー州ロッキーヒルをアレキサフルオル555Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッドでラベリングした。OVAも、上述したようにDRV及びPLGAナノ粒子に封入した4344。幾つかの実験では、ICMVに無関連の抗原コントロール49WalterReedArmyInstituteofResearchのDrAnjaliYadavaにより提供として組み換え型の三日熱タンパク質VMPを装填した。1mgのOVAを1.5mMのTCEPで1時間、室温で培養し、その後に1.5mMのエチルマレイミドPierce、イリノイ州ロックフォードで1時間、37°Cで培養することによって、キャップ構造のチオールOVAを調製した。チオール保護の程度は、エルマン検定50で評価して>95であった。アレキサフルオル555でラベリングしたOVAの脂質小胞からの放出は、100kDaのMW分画の透析膜を使用して、37°Cの10ウシ胎児血清を補給したRPMI媒質中で定量化した。蛍光を定量化するために、一定間隔で放出媒質を取り出し、薬物放出のモニタを継続するために等量の新鮮な媒質と交換した。時間経過の最後に残った残留OVAは、1のTritonX100処理した小胞の脂質抽出で解明し、蛍光分光法で放出したタンパク質を測定した。500nm/mlのホスホリパーゼASigma、ミズーリ州セントルイスを補給したハンクス緩衝塩水で、OVA放出検定も実施した。封入されたカーゴ分子の安定性を検査するために、ICMVに封入された単クローンラットのIgGを、1のTritonX100処理で回収し、銀染色した非還元状態でSDS-PAGEにより分析したPierce。ICMVでのワクチン接種研究。C57BI/6マウスの群JacksonLaboratoriesの尾に指示された用量のTLRアゴニストMPLAがある、又はないOVAを皮下注射して免疫処置した。免疫処置によって誘発されたOVA特異的CD8T細胞及びその表現型の頻度は、生/死細胞を区別するためのDAPI、抗CD8アルファ、抗CD44、抗CD62L、及びSIINFEKL/H-2KbペプチドMHC四量体BectonDickinsonで染色した後、選択された時点でPBMCのフローサイメトリ分析によって解明した。感作されたCD8T細胞の機能性を評価するために、PBMCを1μMのOVAペプチドSIINFEKL及びGolgiPlugBectonDickinsonで6時間、生体外刺激し、固定して、透過化処理し、抗IFNガンマ及びCD8アルファで染色して、フローサイメトリで分析した。450nmのOD値が0.5である血清の希釈剤と定義された抗OVAのIgGタイタを、免疫処置したマウスからの血清のELISA分析で解明した。動物は、米国国立衛生研究所、州、及び地方のガイドラインに従って世話をした。統計分析。統計分析はJmp51SASInstituteInc、ノースカロライナ州ケアリで実施した。データセットは、分散の一方向又は双方向分析ANOVAを使用し、その後に多重比較のためにTukeyのHSD試験で分析した。0.05未満のp値は、統計的に有意と見なされた。値はすべて平均値±標準誤差で報告されている。結果予備成形されたMLV内の隣接する並置二重層の機能化脂質頭部の間に共有架橋を導入して、ICMVを形成した図2A。典型的な分析では、DOPC、陰イオンDOPG、及び陰イオンマレイミド頭部脂質MPBを4:1:5のモル比で含有する乾燥リン脂質被膜を水和して音波処理し、単純リポソームを形成したステップi。二価陽イオン例えばMg2をリポソームに添加して、以前に報告32されているように小胞の融合及びMLVの形成を誘導したステップii。MLV中で隣接する二重層間に架橋を導入するために、次にジチオールトレイトールDTTを小胞懸濁液に添加して、膜透過性架橋剤として作用し、小胞の層間に形成された陽イオン塩橋によって近接した並置膜のマレイミド頭部間に共有結合を形成したステップiii。PEG化は、脂質小胞の血清安定性及び血液循環半減期を上げるために周知の方略である18。したがって最終ステップとして、小胞を洗浄し、粒子の外面に露出した残留マレイミド基にチオール末端PEGでキャップをしたステップiv。粒子の直径/多分散性は、これらの粒子を内部移行できる細胞タイプを決定し33、小胞壁を含む二重層の数は、小胞の安定性、及び血清の存在下でカーゴを保持/徐放する能力に影響すると予想される。これらの特性を評価し、ICMVの形成プロセスをよりよく理解するために、合成の各ステップで生成物を特徴付けた。音波処理ステップiによって形成された初期のリポソームは、約190nmの流体力学的径を有し、サイズは、Mg2が媒介した小胞融合ステップii、及びその後の二重層のDTTステープリングステップiiiの後、約240nmまで増加した表2。その結果のICMVは、一般的な脂質小胞又はポリマーナノ粒子の薬剤1221と比較して単一モードで比較的狭いサイズ分布を示し、架橋ステップ中に動的光散乱法DLS又は低温電子顕微鏡検査法で粒子のバルク凝集の証拠はなかった図2A、図2B及び表2。チオール末端PEGをDTTで処理した小胞に添加すると、MLVの表面上に残っていた検出可能なマレイミド基が反応停止し、粒子の径を大幅に変化させずに、ICMVの約2molの表面露出脂質上にPEG鎖を導入した表2及び表示のないデータ。4°Cで、又はPBS中で37°Cで保存したPEG化ICMVは、7日間安定したままであり、賦活剤として添加された3ショ糖での凍結乾燥に適していたが34、このことは、長期保存状態への適合性を協調した表2及び表示のないデータ。最初のリポソーム、Mg2融合MLV、及び最終的なICMVを低温電子顕微鏡検査で撮像すると図2A、DTTで架橋すると、密に積み重なって、約4~5nmの高電子密度条痕として解像された二重層から構成される厚い多層状壁を有する小胞の形成につながることが判明した。粒子当たりの二重層の中央値は4.4四分位数間範囲[IQR]3.3~6.9であり、粒子半径中央値と脂質壁の厚さとの比率は3.8IQR、2.4~6.8であった図2C、図2D。興味深いことに、ICMVの大部分は同心状の二重層から構成される小胞壁を有していたが、不完全な脂質外層の形態で表面欠陥があるICMVのわずかな例も見られたデータは表示せず。陽イオンで媒介した融合及びDTT架橋の後に電子顕微鏡での撮像で観察された小胞の層状性増大と矛盾せず、小胞の外面に露出した脂質の画分は、バルク染料反応停止層状性検定35で測定し、合成のステップii及びiiiで減少した表2。DTT処理後にマレイミド脂質間が架橋された化学的証拠は、ICMVの薄層クロマトグラフィ及びMALDI-TOF測定で判明したデータは表示せず。重要なことは、粒子サイズと個々の層状性分布が両方とも単モードであり、粒子の機能的特性例えばタンパク質の放出を歪曲するような汚染性の単層小胞は3未満で、大きい凝集はなかったことである。ICMVは、単核細胞及び樹状細胞によって貪食されるに違いないサイズ36、及び従来の単層又は多層状リポソームと比較してタンパク質の取り込みを安定化させる架橋多層状壁構造を有している。安定した小胞を形成するために必要な条件の分析により、ICMV形成のメカニズムに対する見通しが得られた。二層間架橋の後、ICMVは14,000×gで4分間の遠心分離低速条件で収集することができたが、同等の脂質成分の単純リポソーム又はMLVは、ペレット化のために超遠心分離が必要であった。架橋した小胞の収量の代理測定として低速遠心分離によって収集した粒子の質量を使用すると、ICMVの形成には二価陽イオンで媒介した融合Mg2又はCa2の図2Aのステップii及びDTT処理ステップiiiの両方が必要であることが判明した表1A、表1B。Mg2又はDTTのみで処理した先駆物質小胞は、マレイミド基に対して分子が10倍余分でも、有意な収量の粒子を生成しなかった表1A、表1B。また、ICMVの形成には少なくとも25molのMPBが必要であり表1A、表1B、ICMVの有意な収量のために必要な高レベルの反応性頭部は、二層内同じ二重層の頭部間の架橋形成と二層間架橋形成との競合を反映することがある。DTTは、使用した条件では、別の膜透過性ジチオールであるDPDPBで置換することができたが、2kDaのPEG-ジチオールでは置換できなかった。ICMVは、DOPC及びMPB脂質のみを使用して、又はDOPGの代わりに陽イオンDOTAPを使用して形成することもできたデータは表示せず。ICMVを形成する代替方法として、マレイミド-ジチオールの架橋を生体直交型クリックケミストリに交換することができ、小胞形成のためにアルキン末端脂質を、架橋のためにジアジドを採用した3738図12及び表示のないデータ。したがって、安定化した小胞を形成するための二層間架橋は、他の脂質/架橋剤のケミストリにも適合可能な一般的方略である。高い合成安定性及びコロイドの安定性に基づき、タンパク質/ワクチン送達小胞として、さらなる試験のために4:1:5のモル比のDOPC:DOPG:MPBの脂質組成を有するPEG化したICMVに焦点を絞ることにした。タンパク質送達のためのICMVの安定性を試験するために、幾つかの球状タンパク質、すなわち、SIV-gag、HIVワクチン抗体、FLT-3L、治療用サイトカイン、及びモデルワクチン抗原であるオバルブミンOVAの取り込みを検査した。タンパク質封入は、合成のステップiのタンパク質溶液で、乾燥した脂質を再水和することによって達成された図2A。封入タンパク質の量は、ICMV調製の各ステップで増加し図4A、このことはステップiiとステップiiiの両方で小胞融合として生じる追加のタンパク質取り込みを反映していることがある。ICMVへのタンパク質取り込みは、カーゴタンパク質上のチオールがマレイミド機能化脂質小胞と結合することによって媒介されなかった。何故なら、タンパク質上の全チオール基をブロックするためにTCEPで事前還元され、エチル-マレイミドで処理されたOVAが、変性していないタンパク質と同様のレベルでICMVに封入されているからであるキャップをしたチオールOVA対未変性OVAでは76.1±6.3対83.3±8.4;p=0.17。モデルタンパク質カーゴ中の二硫化物結合は、小胞形成プロセス中にDTT架橋剤によって減少せず、ICMVの封入はタンパク質凝集を引き起こさないことも確認されたデータは表示せず。ICMVによって達成されたタンパク質装填の効率及び品質を、薬物送達小胞の最も一般的なタイプのうち2つと直接比較するために3941、リポソーム、PLGAナノ粒子、及びICMV内のOVAの封入を比較した。すなわち、ホスホコリン、PEG脂質、及びコレステロールで構成された安定した脂質組成のモデルを使用して42、リポソームの最も効率的な水性取り込みアプローチの1つとしてDRVを形成し43、二重乳化溶媒蒸発プロセスを使用してOVAを装填したPLGA粒子を調製した44。ICMVは、DRV又はPLGAと比較して、優れた封入効率約75を停止それぞれ2倍及び4倍の増加;図4B、粒子の総質量当たりの封入OVAの量粒子1mg当たり約325μgのOVAは、DRV又はPLGA粒子と比較して、ICMVはそれぞれ1.8倍及び9倍の増加であった図4C。したがって、ICMVは様々な球状タンパク質を封入するのに効果的であり、少なくともモデル抗原OVAの場合、ICMVを装填したタンパク質は一般的な代替タンパク質キャリアより効率的であるように見えた。次に、血清の存在下でタンパク質貯留が増加する間に、二層間架橋によって脂質小胞の生分解性の保持が可能になったかを解明した。脂質組成がすべて同じであるPEG化リポソーム、Mg2融合MLV、又はICMVにOVAを装填し、10のウシ胎児血清を含有する媒体中で37°Cにてタンパク質放出の動態を定量化した。単層状リポソームは、取り込んだOVAの全ペイロードを約2日以内に素早く放出したが、多層状Mg2融合MLVは、同じ期間に取り込んだカーゴの約50を放出した図4D。しかし、ICMVは大幅に向上したタンパク質の貯留を示し、1週間でカーゴのわずか約25しか放出せず、30日後には約90であった図4D。注目に値するのは、ICMVが、コレステロールを含むことによって安定化した単層リポソームより、タンパク質の放出も非常に遅かったことである図4D。架橋小胞は、PBS中で4°Cにて30日間保存された場合、取り込んだタンパク質の約95も貯留していた図4E。細胞内区画をモデル化した状態でも、ICMVからのタンパク質放出を検査し、還元又は酸性条件で37°Cにて1日間培養された小胞は、取り込んだOVAの>95を保持していたが、ホスホリパーゼAでの培養では、OVAの>90が放出され、小胞が急速に劣化した図4E。したがって、ICMVは血清の存在下で従来のリポソーム製剤よりも高い安定性を呈したが、細胞内リポソーム内区画の中に存在する構造の存在下で急速に分解し31、細胞による内部移行後にカーゴの細胞内放出を引き起こすメカニズムを提供した。細胞による内部移行の前に、invivoで投与すると小胞内で多少のタンパク質分解が生じ得るが、このような分解プロセスが最小であるべきワクチン送達での免疫処置から最初の数日で45、抗原の重大な摂取及び処理が生じる。ICMVの独特の構造は、封入されたタンパク質抗原を細胞外環境に効率的に貯留するが、エンドソーム内/リソソーム内では急速に放出し、ワクチン応答を向上させることになるとの仮説をたてた。ワクチンICMVを生成するために、モデル抗原OVAを搬送する小胞OVA-ICMVを調製し、これらの小胞を分子アジュバントモノホスホリル脂質AMPLAと混合した。MPLAは、樹状細胞、B細胞、及び先天性免疫細胞によって発現し、ワクチン応答を増幅させる可能性があるトール様受容体TLR4のFDA認可のアゴニストである146。抗原を装填してMPLAと混合したICMVは、MPLAがないICMVを適用した樹状細胞DCと比較して、invitroで脾臓及び骨髄DC上の共刺激分子の上方制御を促進した図7A及び表示のないデータ。ICMVを適用したDCはOVAから誘導されたペプチドを交差提示し、その効率は、MHCクラスIH-2Kb分子で錯化したSIINFEKLペプチドOVA257-264を認識する25-D1.16mAbでDCを染色することによって解明した状態で、添加MPLAがある、又はない可溶性OVAを適用したものと比較して非常に向上しているp<0.001、無関係の抗原[三日熱タンパク質、VMP]を装填した可溶性OVA又はICMVと比較、図7B。OVA-ICMVMPLAで培養した脾臓DCは、カルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステルCFSE希釈検定で評価して、invitroでOVA特異的な未処理のOT-1CD8T細胞の堅調な増殖を引き起こした。対照的に、DCに同等の用量の可溶性OVA及びMPLA、空のICMV、又はVMP-ICMVを適用した場合は、弱いT細胞性応答が検出され、これはICMVによって誘発されたT細胞性応答の特異性を示す図7C。これらの結果は、MPLAを添加すると、ICMV又は可溶性OVAによる同等のDC活性が可能になるが、粒子状抗原の送達で予想されるように、ICMVは抗原の交差提示の増大を引き起こすことを示唆する。小胞構造がinvivoの免疫応答に対する小胞構造の影響を解明するために、C57B1/6マウスに、PEG化した単層リポソーム、MLV、又はICMVの形態で等価用量のOVA、MPLA、及び脂質それぞれ10μg、0.1μg、及び142μgをワクチン接種した。免疫処置の7日後に、フローサイメトリで末梢血単核細胞PBMC中のOVAペプチド-MHC四量体抗原特異的CD8T細胞の頻度を分析することによって、内因性CD8T細胞性応答の強度を評価し、可溶性OVA<リポソーム<Mg2融合MLV<ICMVの順序でT細胞性応答が増大する傾向があることが判明した図9A。免疫処置後3週間で、Mg2融合MLVは、可溶性OVA又は単層リポソームと比較して、動物の血清中に約100倍多いOVA特異的IgGタイタを誘発した。しかし、ICMVの免疫処置により生じた体液性応答は非常に強力になり、可溶性OVAp<0.01及び非架橋MLVの免疫処置p<0.05よりもそれぞれ約100倍及び約10倍強力である図9B。したがって、ICMVの安定化した構造は、T細胞性応答と抗体応答の両方を促進した。他の製剤と比較して、ICMVによる免疫処置に対するT細胞及び抗体応答の強化は、抗原提示細胞APCへの抗原送達の改善、DCの活性化増強、invitroで見られる抗原交差提示の増強、又はこれらの要因の組合せに帰すことができた。これらの可能性を区別するために、可溶性、リポソーム、又はICMV製剤としてMPLAと混合した蛍光体結合OVAでマウスを免疫処置し、OVAを内在化した流入領域鼠径リンパ節細胞を2日目に評価した。ICMVによって送達されるOVAは、流入領域リンパ節dLN中のDC、マクロファージ、及び形質球様細胞CD11cB220DCの合計中に容易に検出されたが、可溶性及びリポソーム製剤は、背景上に蛍光をほとんど示さなかったp<0.01、図9C、図9D。ラベリングしていないOVAでこの分析を繰り返すと、OVA-ICMVをMPLAとともに投与した場合、可溶性又はリポソームOVAMPLAと比較して、dLN内のDC中で共刺激マーカ及びMHC-IIの発現にマイナな増強を引き起こすことが判明した図9E及び表示のないデータ。しかし、OVAペプチド提示を検出するために25-D1.16抗体を使用すると、ICMV免疫処置後にdLN内のDC上にOVAペプチド-MHC錯体が容易に検出されたが、可溶性OVA又はリポソームOVAを注入しても、25-D1.16と自己ペプチドMHC錯体とで予想される背景交差反応性47よりも強力な染色はなかった図9F。全体として、これらの結果は、ICMVの架橋多層状構造内に取り込まれた抗原の貯留が改善されると、APCへの抗原送達が向上し、その後に交差提示が向上することを示唆する。ICMVの多層状構造により、水性核内のタンパク質抗原ばかりでなく小胞壁内の親油性分子も封鎖する機会が与えられる。したがって、ICMVの壁全体にMPLAを埋め込むと、小胞内の抗原とともにMPLAの貯留を改良することにより、invivoの免疫応答に影響するか否かを試験した。TLRアゴニストは、合成の第一ステップでMPLAを他の脂質と同時溶解することによりint-MPLAICMV、小胞層全体に組み込まれており、挿入後のアプローチext-MPLAICMVにより、小胞表面のみに組み込まれた同量のMPLAを担持するICMVとこれらの小胞を比較した図11A及び表示のないデータ。マウスは、ICMV中の、又は可溶性形態のOVA10μg及びMPLA0.1μg又は1.0μgを皮下注射して免疫処置し、21日目及び35日目に同じ製剤で追加処置した。図11Bに示すように、低用量のMPLAを使用して免疫処置すると、2回の追加処置後でも可溶性OVAに対する抗体応答はほとんど検出不可能であったが、intMPLAとextMPLAは両方とも56日目には強力な抗OVA血清IgGタイタを誘発した。可溶性OVAに対するIgG応答は、10倍多いMPLAを使用して獲得することができたが、1.0μgのMPLAを使用したint-MPLAICMVは、可溶性タンパク質より高いタイタを誘発した56日目に3倍。他方で、これらの免疫処置研究を通して、ICMVの脂質成分に対する有意なレベルの抗体は観察されなかった。ICMVの多重層にMPLAを埋め込むと、ワクチン接種に対するCD8T細胞性応答にさらに顕著な影響を与えた。0.1μgのMPLAと混合した可溶性OVAが誘発する抗原特異的T細胞の膨張は、PBMCの四量体染色によって評価して、ほとんど検出不可能であった。ext-MplaICMV送達は、d41による四量体T細胞集団の2.5倍の増加につながった図11C、p<0.05。10倍多くのMPLAを添加すると、可溶性OVAの免疫処置は、追加処置後にext-MPLAICMVと同等のT細胞性応答に最終的に到達することができた。対照的に、int-MPLAICMVで免疫処置すると、劇的に強化されたCD8T細胞性応答を誘発し、これは追加処置ごとに膨張し続け、41日目にはCD8T細胞集団中の四量体T細胞が28のピークに到達したext-MPLAICMVの5倍p<0.05、及び可溶性OVAMPLAの14倍p<0.01、図11C。注目に値するのは、病原体及び腫瘍に対する長期間の保護を提供することが知られている中枢記憶T細胞の表現型48である四量体CD44CD62L細胞の頻度を、int-MPLAICMVが全体的に有意に上昇させたことであるp<0.01、図11D。intMPLAICMVによって誘発された抗原特異的T細胞は、最終追加処理後に1カ月後でも生き残り、CD8T細胞中に四量体T細胞が約11あったそれぞれext-MPLAICMV及び可溶性OVAMPLAの3倍及び8倍、両方ともp<0.05、図11C。これらの免疫処置によって膨張したT細胞の機能性を試験するために、49日目に生体外で再評価した後、CD8T細胞が末梢血からインタフェロンγIFN-γを生成する能力を評価した。int-MPLAICMVで免疫処置したマウスは、extMPLAICMV又は可溶性OVAの免疫処置を受けたマウスよりもIFN-γコンピテントT細胞のレベルがはるかに高かったp<0.05、図11E。出願人の知る限りでは、抗原特異的T細胞の膨張程度、記憶細胞の残存、及びIFN-γ機能性に関して、これはタンパク質ワクチンに関してこれまで報告された最強の内因性T細胞性応答の1つであり、組み換え型ウイルスなどの強力な生ベクターに匹敵する56。注目に値するのは、これが均質な追加処置、同じ粒子製剤で繰り返した免疫処置、病原体による送達ベクター自身に対して生じる免疫応答により多くの生ベクターでは使用することができない方略により達成されることである。これらの研究は、架橋した多層状脂質小胞に基づくミクロン以下の粒子試薬の新しいクラスの合成を実証し、これは生物医学的用途にとって幾つかの魅力的な形体を組み合わせており、粒子の合成はタンパク質カーゴを有機溶媒に曝露させる必要がなく、粒子の脂質基剤によって代謝性副産物へと本質的に生分解性になり、リン脂質シェルによって親油性及び親水性カーゴ両方の分子捕捉が可能になり、タンパク質は粒子の質量当たり非常に高レベルで封入され、粒子からのタンパク質放出は非常に長期間にわたって持続させることができる。これらの結果は、ICMVが生体高分子の送達に、及び特にワクチン適用にとって非常に効果的な媒体になり得ることを示唆する。合成粒子ワクチンを使用して、このような強力な複合T細胞及び抗体応答を達成できる能力により、感染症及び癌の状況でワクチン接種の新しい可能性をもたらすことができた。<参照文献>1GuyBTheperfectmixrecentprogressinadjuvantresearchNatRevMicrobiol55055172PerrieYMohammedARKirbyDJMcNeilSEBramwellVWVaccineadjuvantsystemsenhancingtheefficacyofsubunitproteinantigensIntJPharm3642722803ReedSGBertholetSColerRNFriedeMNewhorizonsinadjuvantsforvaccinedevelopmentTrendsImmunol3023324WalkerBDBurtonDRTowardanAIDSvaccineScience3207607645HaglundKetalRobustrecallandlongtermmemoryTcellresponsesinducedbyprimeboostregimenswithheterologousliveviralvectorsexpressinghumanimmunodeficiencyvirustype1GagandEnvproteinsJVirol76750675176FlatzLetalDevelopmentofreplicationdefectivelymphocyticchoriomeningitisvirusvectorsfortheinductionofpotentCD8TcellimmunityNatMed163393457BraveALjungbergKWahrenBLiuMAVaccinedeliverymethodsusingviralvectorsMolPharm418328PriddyFHetalSafetyandimmunogenicityofareplicationincompetentadenovirustype5HIV1cladeBgagpolnefvaccineinhealthyadultsClinInfectDis46176917819HubbellJAThomasSNSwartzMAMaterialsengineeringforimmunomodulationNature46244946010HeathWRCarboneFRCrosspresentationinviralimmunityandselftoleranceNatRevImmunol112613411KwonYJJamesEShastriNFrechetJMInvivotargetingofdendriticcellsforactivationofcellularimmunityusingvaccinecarriersbasedonpHresponsivemicroparticlesProcNatlAcadSciUSA102182641826812HamdySetalEnhancedantigenspecificprimaryCD4andCD8responsesbycodeliveryofovalbuminandtolllikereceptorligandmonophosphoryllipidAinpolynanoparticlesJBiomedMaterResA8165266213HeitASchmitzFHaasTBuschDHWagnerHAntigencoencapsulatedwithadjuvantsefficientlydriveprotectiveTcellimmunityEurJImmunol372063207414SchlosserEetalTLRligandsandantigenneedtobecoencapsulatedintothesamebiodegradablemicrosphereforthegenerationofpotentcytotoxicTlymphocyteresponsesVaccine261626163715HeffernanMJKasturiSPYangSCPulendranBMurthyNThestimulationofCD8TcellsbydendriticcellspulsedwithpolyketalmicroparticlescontainingionpairedproteinantigenandpolypolyBiomaterials3091091816DementoSLetalInflammasomeactivatingnanoparticlesasmodularsystemsforoptimizingvaccineefficacyVaccine273013302117ReddySTetalExploitinglymphatictransportandcomplementactivationinnanoparticlevaccinesNatBiotechnol251159116418TorchilinVPRecentadvanceswithliposomesaspharmaceuticalcarriersNatRevDrugDiscov414516019GregoriadisGGurselIGurselMMcCormackBLiposomesasimmunologicaladjuvantsandvaccinecarriersJournalofControlledRelease41495620JeongJMChungYCHwangJHEnhancedadjuvanticpropertyofpolymerizedliposomeascomparedtoaphospholipidliposomeJBiotechnol9425526321VangalaAetalComparisonofvesiclebasedantigendeliverysystemsfordeliveryofhepatitisBsurfaceantigenJControlRelease11910211022SteersNJPeachmanKKMcClainSAlvingCRRaoMLiposomeencapsulatedHIV1Gagp24containinglipidAinduceseffectorCD4TcellsmemoryCD8TcellsandproinflammatorycytokinesVaccine276939694923BhowmickSMazumdarTSinhaRAliNComparisonofliposomebasedantigendeliverysystemsforprotectionagainstLeishmaniadonovaniJControlRelease14119920724ReddyRZhouFNairSHuangLRouseBTInvivocytotoxicTlymphocyteinductionwithsolubleproteinsadministeredinliposomesJImmunol1481585158925CollinsDSFindlayKHardingCVProcessingofexogenousliposomeencapsulatedantigensinvivogeneratesclassIMHCrestrictedTcellresponsesJImmunol1483336334126WakitaDetalAnindispensableroleoftype1IFNsforinducingCTLmediatedcompleteeradicationofestablishedtumortissuebyCpGliposomecoencapsulatedwithmodeltumorantigenIntImmunol1842543427PopescuMCetalAnovelproteoliposomalvaccineelicitspotentantitumorimmunityinmiceBlood1095407541028AllenTMMumbengegwiDRCharroisGJAntiCD19targetedliposomaldoxorubicinimprovesthetherapeuticefficacyinmurineBcelllymphomaandamelioratesthetoxicityofliposomeswithvaryingdrugreleaseratesClinCancerRes113567357329CashionMPLongTEBiomimeticDesignandPerformanceofPolymerizableLipidsAccountsofChemicalResearch421016102530HotzJMeierWVesicletemplatedpolymerhollowspheresLangmuir141031103631MahadevanSTappelALLysosomallipasesofratliverandkidneyJBiolChem2432849285432PapahadjopoulosDNirSDuzgunesNMolecularmechanismsofcalciuminducedmembranefusionJBioenergBiomembr2215717933ZaunerWFarrowNAHainesAMInvitrouptakeofpolystyrenemicrosphereseffectofparticlesizecelllineandcelldensityJControlRelease71395134MohammedARBramwellVWCoombesAGPerrieYLyophilisationandsterilisationofliposomalvaccinestoproducestableandsterileproductsMethods40303835GirardPetalAnewmethodforthereconstitutionofmembraneproteinsintogiantunilamellarvesiclesBiophysJ8741942936LutsiakMERobinsonDRCoesterCKwonGSSamuelJAnalysisofpolynanosphereuptakebyhumandendriticcellsandmacrophagesinvitroPharmRes191480148737HuisgenRCycloadditionsdefinitionclassificationandcharacterizationAngewandteChemieInternationalEdition732138WangQetalBioconjugationbycoppercatalyzedazidealkyne32cycloadditionJAmChemSoc1253192319339AllenTMCullisPRDrugdeliverysystemsenteringthemainstreamScience3031818182240MundargiRCBabuVRRangaswamyVPatelPAminabhaviTMNanomicrotechnologiesfordeliveringmacromoleculartherapeuticsusingpolyanditsderivativesJControlRelease12519320941VasirJKLabhasetwarVBiodegradablenanoparticlesforcytosolicdeliveryoftherapeuticsAdvDrugDelivRev5971872842GabizonAetalProlongedcirculationtimeandenhancedaccumulationinmalignantexudatesofdoxorubicinencapsulatedinpolyethyleneglycolcoatedliposomesCancerRes5498799243KirbyCGregoriadisGDehydrationrehydrationvesiclesasimplemethodforhighyielddrugentrapmentinliposomesBioTechnology297998444BershteynAetalPolymersupportedlipidshellsonionsandflowersSoftMatter41787179145McKeeASMunksMWMarrackPHowdoadjuvantsworkImportantconsiderationsfornewgenerationadjuvantsImmunity2768769046MataHaroVetalThevaccineadjuvantmonophosphoryllipidAasaTRIFbiasedagonistofTLR4Science3161628163247PorgadorAYewdellJWDengYBenninkJRGermainRNLocalizationquantitationandinsitudetectionofspecificpeptideMHCclassIcomplexesusingamonoclonalantibodyImmunity671572648SallustoFGeginatJLanzavecchiaACentralmemoryandeffectormemoryTcellsubsetsfunctiongenerationandmaintenanceAnnuRevImmunol2274576349YadavaAetalAnovelchimericPlasmodiumvivaxcircumsporozoiteproteininducesbiologicallyfunctionalantibodiesthatrecognizebothVK210andVK247sporozoitesInfectImmun751177118550EllmanGLTissuesulfhydrylgroupsArchBiochemBiophys827077同等物本明細書では本発明の幾つかの実施形態について説明し、図示してきたが、本明細書で説明した機能を実行する、及び/又は結果及び/又は1つ又は複数の利点を獲得するために、当業者には様々な他の手段及び/又は構造が容易に構想され、このような変形及び/又は解像はそれぞれ、本明細書で説明する本発明の実施形態の範囲に入るものとする。さらに一般的には、本明細書で述べたすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成は例示の意味であり、実際のパラメータ、寸法、材料及び/又は構成は、本発明の教示が使用される特定の1つ又は複数の用途に依存することが、当業者には容易に認識される。当業者には、日常の実験の範囲内で、本明細書で述べた特定の本発明の実施形態に対して多くの同等物が認識されるか、それを確認することができる。したがって、上記の実施形態は例示としてのみ提示されており、特許請求の範囲及びその同等物の範囲内で、本発明の実施形態は特に説明及び特許請求の範囲にあるもの以外で実践できることを理解されたい。本開示にある本発明の実施形態は、本明細書で述べた個々の各形体、システム、物品、材料、キット及び/又は方法を指向する。また、2つ以上のこのような形体、システム、物品、材料、キット及び/又は方法の任意の組合せは、このような形体、システム、物品、材料、キット及び/又は方法が相互に矛盾しない限り、本開示にある本発明の範囲に含まれる。本明細書で定義し、使用したすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれた文書の定義、及び/又は定義された用語の通常の意味を規制すると理解されたい。本明細書で開示されたすべての参照文献、特許及び特許出願は、それぞれの言及先である主題が参照により組み込むものとし、それは場合によっては文書全体を包含することがある。本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞のあるは、明らかに矛盾して示されていない限り、少なくとも1つの意味であると理解されたい。本明細書及び特許請求の範囲で使用する及び/又はという語句は、このように結合される要素、すなわち、幾つかのケースでは接続的に提示され、他のケースでは離接的に提示される要素のいずれか又は両方という意味であることを理解されたい。及び/又はとともに列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の1つ又は複数であると想定されたい。他の要素は、及び/又はという語句によって特に識別された要素以外に、特に識別されたこれらの要素に関係あるか、無関係であるかに関わらず、任意選択で提示することができる。したがって、非制限的な例として、A及び/又はBと言う場合、含むなどの開放型の言語と結合して使用されると、1つの実施形態ではAのみ任意選択でB以外の要素を含む、別の実施形態ではBのみ任意選択でA以外の要素を含む、さらに別の実施形態ではAとBの両方任意選択で他の要素を含むなどを指すことができる。本明細書及び特許請求の範囲で使用する又はは、以上で定義したような及び/又はと同じ意味を有すると理解されたい。例えば、リスト中の項目を分離する場合、又は又は及び/又はは包括的であると解釈されたい。すなわち、幾つかの要素又は要素のリストのうち少なくとも1つを含むが、複数も、さらに任意選択でリストにない追加の品目も含む。対照的に、のうち1つのみで又はのまさに1つでなどの明瞭に指示される用語のみ、又は特許請求の範囲で使用された場合にからなるは、幾つかの要素又は要素のリストのうちまさに1つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用する又はという用語は、いずれか、のうち1つ、の1つのみ、又はのまさに1つなどの排他性の用語で提示される場合、排他的代替物すなわち、一方又は他方であるが、両方ではないを示すと解釈されたい。基本的に~からなるは、特許請求の範囲で使用する場合、特許法の分野で使用されている通常の意味を有するものとする。本明細書及び特許請求の範囲で使用され、1つ又は複数の要素のリストに関して少なくとも1つという語句は、要素のリストにある任意の1つ又は複数の要素から選択された少なくとも1つを意味するが、リスト内に特に列挙された各要素の少なくとも1つを必ずしも含まず、要素のリストにある要素の任意の組合せを排除しないことを理解されたい。この定義により、少なくとも1つという語句が言及する要素のリストで特に識別された要素以外に、特に識別されたこれらの要素に関係しても、無関係でも、要素を任意選択で提示可能にすることができる。したがって非限定的な例として、A及びBのうち少なくとも1つ又は同等にA又はBのうち少なくとも1つ、又は同等にA及び/又はBのうち少なくとも1つは、1つの実施形態では少なくとも1つ、任意選択でBがない状態で複数、Aなど及び任意選択でB以外の要素などを、別の実施形態では少なくとも1つ、任意選択でAがない状態で複数、B及び任意選択でA以外の要素などを、さらに別の実施形態では少なくとも1つ、任意選択で複数、A、及び少なくとも1つ、任意選択で複数、Bなど及び任意選択で他の要素など等々を指すことができる。矛盾することが明示されていない限り、特許請求の範囲にあり複数のステップ又は行為を含む方法のいずれでも、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が言及されている順序に必ずしも限定されないことを理解されたい。特許請求の範囲、さらに上記の明細書でも、含む、担持する、有する、含有する、伴う、保持する、構成されるなどの前後を接続する語句は、開放型である、すなわち、含むが限定されないという意味であることを理解されたい。からなる及び基本的に~からなるという前後を接続する語句のみが、米国特許商標庁の特許審査手続便覧MPEPのセクション2111.03で規定されているように、それぞれ閉鎖型又は半閉鎖型の前後を接続する語句である。"