共有結合により少なくとも1つの疎水性側鎖基にコンジュゲートされる組換えタンパク質であって、前記疎水性側鎖基が、シアル酸を介して前記タンパク質に連結される組換えタンパク質。凝血因子である、請求項1に記載のタンパク質。FVII分子である、請求項2に記載の凝血因子。FVIII分子である、請求項2に記載の凝血因子。FVIX分子である、請求項2に記載の凝血因子。抗体の抗原結合断片である、請求項1に記載の組換えタンパク質。疎水性側鎖基が、脂肪酸および脂肪族二塩基酸からなる群のうちの1または複数から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。vWF結合能を低下させた、請求項4に記載のFVIII分子。疎水性側鎖基が、シアル酸を介して、共有結合によりOグリカンにコンジュゲートされ、前記Oグリカンが、末端欠失型Bドメインに位置し、因子FIIIの活性化が、前記疎水性側鎖基の除去を結果としてもたらす、請求項4および請求項8のいずれか一項に記載のFVIII分子。少なくとも1つの親水性ポリマーとさらにコンジュゲートされる、請求項4、および8から9のいずれか一項に記載のFVIII分子。シアリルトランスフェラーゼ触媒反応を介する、疎水性側鎖基の組換えタンパク質への結合を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の分子を作製する方法。薬物としての、請求項1から10のいずれか一項に記載の分子の使用。炎症性疾患を治療するための、請求項6に記載の抗体の抗原結合断片の使用。血友病を治療するための、請求項1から5、および7から10のいずれか一項に記載の分子の使用。請求項1から10のいずれか一項に記載の分子を含む医薬組成物。循環における半減期を著明に延長した凝血因子の開発、および医薬用タンパク質一般の開発には、多様な方法が用いられている。これらの方法の多くは、例えば、PEGなどの親水性ポリマーとのコンジュゲーションに関する。その一方で、疎水性側鎖基は、invivoにおいて完全に分解しうるという事実のために、このような鎖とのコンジュゲーションが、魅力的な手法を構成している。他方で、1または複数の明確に規定された疎水性部分とのタンパク質のコンジュゲーションは、例えば、FVIIIなどの凝血因子を含めた、比較的大型のタンパク質の半減期を延長するための魅力的な手法を、これまでのところは構成していない。実際、このような疎水性部分のタンパク質へのコンジュゲーションは、1FVIIIなどの大型のタンパク質が安定的であるのは、有機溶媒を欠いた水性緩衝液中に限られること2このような水性緩衝液中では、脂肪酸などの親油性部分が不溶性であること3比較的小型の親油性部分の結合が、例えば、FVIIIなど、はるかに大型のタンパク質の寿命を何らかの形で著明に延長する結果をもたらすことは疑わしいこと4親油性部分は、通常親水性であるタンパク質表面に結合すると、凝集またはエネルギー的には好ましいが破壊的なアンフォールディングのために、それらの安定性を撹乱しうることおよび5タンパク質の、その天然の結合パートナーとの相互作用も、同様の形で撹乱され、生物学的活性の低下をもたらしうることのために、現実的な手法であるとは考えられないであろう。本発明は、シアル酸を介して、共有結合により少なくとも1つの疎水性側鎖基にコンジュゲートされる、例えば、抗体の抗原結合断片、FVII、FVIII、およびFIXなどの組換えタンパク質分子に関する。本発明はさらに、このようなコンジュゲートを生成させる方法、ならびにこのようなコンジュゲートの使用にも関する。このようなコンジュゲートは、循環における半減期が改変され、比較的均質の構造を有することが好ましい。コンジュゲートはさらに、生物学的活性を保持し、有機溶剤を用いずに生成させることが好ましい。しかし、微量の有機溶媒の使用を含む、このような分子を作製する方法を用いることも可能である。定義タンパク質本発明の範囲内のタンパク質およびペプチドは、治療的処置に適するタンパク質ペプチドであることが好ましい。このようなタンパク質には、血清タンパク質、例えば、血液凝固因子、ヘモグロビン、免疫グロブリン、抗体、Fab断片など、抗体の抗原結合断片、インターロイキン、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、ガンマインターフェロン、例えば、DR3、TNF1R、TNF2R、CD27、およびCD30など、TNF受容体ファミリーのメンバー、顆粒球コロニー刺激因子を含めたコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、およびホスホリパーゼ活性化タンパク質などのサイトカインが含まれるがこれらに限定されない。他のタンパク質には、インスリン、GLP1、GLP2、レクチンおよびリシンなどの植物タンパク質、腫瘍壊死因子および類縁の対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体およびインターロイキン受容体の可溶性形態、ヒト増殖ホルモン、TGFaまたはTGFpなどの組織増殖因子、上皮増殖因子などの増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素細胞刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクチベーターなどが含まれる。対象の免疫グロブリンには、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、およびこれらの断片が含まれる。本発明によるタンパク質は、天然タンパク質と構造的に類似する可能性があり、天然タンパク質のC末端およびN末端の一方または両方に1または複数のアミノ酸を付加することにより、天然アミノ酸配列内の1または多数の異なる部位において1または複数のアミノ酸を置換することにより、天然タンパク質の一方の端部もしくは両方の端部において、またはアミノ酸配列の1もしくは複数の部位において、1または複数のアミノ酸を欠失させることにより、あるいは天然アミノ酸配列内の1または複数の部位に1または複数のアミノ酸を挿入することにより、天然タンパク質から誘導することができる。本明細書で用いられる抗体、モノクローナル抗体、およびmAbという用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子およびそれらの断片を指すことを意図する。全長抗体とは、ジスルフィド結合により相互に連結されている、2本の重鎖および2本の軽鎖である、4本のポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域と、重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の3つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域と、軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、CLという1つのドメインを含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域と称するより保存的な領域を散在させる、相補性決定領域と称する、超可変性領域へとさらに細分することができる。各VH鎖およびVL鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される、3つずつのCDRおよび4つずつのFRから構成される。全長抗体は通常、二価抗体である、すなわち、両方のアームにより抗原に結合する能力を有する。これに対し、本発明による一価抗体は、抗原に特異的な結合部位をただ1つだけ含む。Fab領域FabドメインFab断片は、抗体が結合する特異的標的を規定する可変区画を含有する。Fab断片は、本発明による一特異性抗体一価抗体の例である。本発明によるコンジュゲートFab断片は、翻訳後修飾されていないFab断片と比較して、循環における半減期が著明に延長されていることが多い。したがって、抗体のFab断片および他の抗原結合断片は、免疫系の調節に特に有用であり、したがって、例えば、癌、および、例えば、自己免疫疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性心筋炎、川崎病、冠動脈疾患、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、全身性硬化症、乾癬性関節炎、骨関節炎、アトピー性皮膚炎、尋常性白斑、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、自己免疫性腎炎、グッドパスチャー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、アレルギー、喘息、および他の自己免疫疾患を含めたなどの免疫関連障害の治療に特に有用である。本発明による一価抗体の例には、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片である、Fab断片例えば、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された、それらのうちの1つだけがその抗原に特異的である、2つのFab断片を含む二価断片VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片VHドメインからなるdAb断片、Nature341544~546頁単離相補性決定領域ならびにその抗原に対して一価である二重特異性抗体が含まれる。凝血因子凝血因子は、二次血栓の形成に関与する。凝血因子には、vWF、因子I、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、および因子XIIIが含まれる。本発明による凝血因子変異体は、凝血因子活性を有する、すなわち、該分子の活性は、天然の凝血因子活性の少なくとも25であり、天然の凝血因子活性の好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも75、および最も好ましくは少なくとも90である。因子VIIとは、肝臓で主に生成する糖タンパク質である。成熟タンパク質は、406アミノ酸残基からなり、相同性により規定される4つのドメインから構成される。N末端のGlaドメインに、2つの上皮増殖因子様ドメイン、およびC末端のセリンプロテアーゼドメインが後続する。FVIIは、単鎖分子として、血漿中を循環する。活性化FVIIへと活性化すると、該分子は、残基Arg152と残基Ile153との間で切断され、ジスルフィド結合により一体に保持される2本鎖タンパク質が結果としてもたらされる。軽鎖が、GlaドメインおよびEGF様ドメインを含有するのに対し、重鎖は、プロテアーゼドメインである。FVIIaは、生物学的に活性となるのに、その細胞表面共因子である組織因子への結合を必要とする。因子VIIは、血漿に由来する場合もあり、よく知られた生成法および精製法を用いて、組換えにより生成させる場合もある。グリコシル化、ガンマカルボキシル化、および他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択される宿主細胞およびその増殖条件に応じて変化しうる。因子VIIポリペプチドという用語は、因子VIIのザイモゲンならびに因子VIIの活性化形態を指す場合がある。本明細書では、因子VIIポリペプチドという用語が、野生型の因子VIIa分子のほか、FVII変異体、FVII誘導体、およびFVIIコンジュゲートを指す。このような変異体、誘導体、およびコンジュゲートは、野生型のヒト因子VIIaと比べて、実質的に同じであるか、または改善された生物学的活性を示しうる。本発明によるFVIIFVII変異体は、配列番号1の配列を有する因子FVIIを含み、親タンパク質のうちの1もしくは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸により置換されており、かつまたは親タンパク質のうちの1もしくは複数のアミノ酸が、欠失しており、かつまたは1もしくは複数のアミノ酸が、タンパク質に挿入されており、かつまたは1もしくは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。FVII変異体は、野生型の因子VIIaと比べて、実質的に同じであるか、または改善された生物学的活性を示し、親ペプチドのうちの1または複数のアミノ酸が、アルキル化、グリコシル化、PEG化、アシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、またはアミド形成などにより、遺伝子的に、かつまたは化学的に、かつまたは酵素的に修飾されている、FVIIポリペプチドをさらに含む。配列番号1野生型のヒト凝血因子VIIANAFLγγLRPGSLγRγCKγγQCSFγγARγIFKDAγRTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRRPGVLLRAPFPγガンマカルボキシル化Glu残基を表わす。以下の通りに、FVIIaコンジュゲート活性を決定することができる阻害剤の混合物によりプロトロンビンおよびFXを処理して、微量の活性酵素を中和する。FV、プロトロンビン、TF経路阻害剤、および抗トロンビン抗体を、CaCl2と混合し、4°Cで一晩にわたり保存する。健常ボランティア被験者に由来する末梢血を、クエン酸中に入れる。MKjalke、ThrombHeamostasis78、1202~1208頁、1997において説明される通りに、密度勾配遠心分離およびゲル濾過により血小板を単離し、37°Cで15分間にわたり、50ugmlのトロンビン受容体アゴニストペプチドと共にインキュベーションすることにより活性化する。血小板懸濁液のアリコートをTruCount試験管へと移し、製造元により説明される通り、FACScanフローサイトメーター上で、蛍光ビーズを基準物質として用いることにより、血小板密度を決定する。約100000個ulの最終血小板密度を用いる。因子Vを、タンパク質Ca2混合物に添加する。次いで、FVIIaコンジュゲートを添加した後、血小板を添加して、200ulの最終容量を得る。150mMのNaCl、1mgmlのBSA、1mMのEDTA、および50uMのPefablocXaを含有する、pH74の20mMHepes中に05mMのChromozymTH90ulに、10ulずつのアリコートを、時間間隔を置いて移す。20分後に、50の酢酸100ulを添加することにより、基質の加水分解を停止させ、405nmにおける吸光度を測定する。トロンビン検量線から、トロンビン濃度を計算する。FVIIa活性を特徴づけるためのさらなるアッセイは、WO07031559またはPerson、PNAS98、13583~13588頁、2001および本明細書で引用される参考文献において見出すことができる。因子VIII分子FVIII因子VIIIとは、肝細胞が主に生成させる、大型の複合体糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含めた2351アミノ酸からなり、相同性により規定される複数の異なるドメインを含有する。3つのAドメイン、単独のBドメイン、および2つのCドメインが存在する。ドメインの順序は、NH2A1A2BA3C1C2COOHと列挙することができる。FVIIIは、BA3間境界で分離される2本の鎖として、血漿中を循環する。該鎖は、二価金属イオン結合により連結される。A1A2B鎖を重鎖と称するのに対し、A3C1C2を軽鎖と称する。invivoにおいて、内因性の因子VIII分子は、多様なサイズのBドメインを伴う分子プールとして循環する。invivoにおいておそらく生じることは、段階的なBドメインの酵素的除去であり、この結果、多様なサイズのBドメインを伴う分子のプールがもたらされる。Bドメインの最後の部分が除去される、740位における切断は、トロンビンの活性化と連関して生じると一般に考えられている。しかし、例えば、740位における切断部位が損なわれた因子VIIIの変異体が、活性でありうることも除外できない。本明細書で用いられる因子VIIIまたはFVIIIとは、内因性凝血経路のメンバーであり、血液凝固に不可欠である、ヒト血漿糖タンパク質を指す。天然FVIIIは、配列番号2に示される、全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号2のアミノ酸741~1648にわたる。配列番号2:ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本発明による因子VIII分子は、配列番号2の残基1670~1684のvWF結合領域内には1または複数の変化もまた存在しうるが、残りのドメインは、配列番号2のアミノ酸番号1~740および1649~2332に示される配列に緊密に対応する、Bドメイン末端欠失型因子FVIII分子でありうる。本発明による好ましいBドメインリンカーを、配列番号4に示す。本発明によるFVIII分子は、配列番号2に示される配列と若干異なりうるが、これは、例えば、vWF結合能を低減する目的で、突然変異を導入しうる事実のために、残りのドメインが、配列番号2に示されるアミノ酸配列とは若干、例えば、約1、2、または3など、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸以上異なりうることを意味する。さらに、例えば、LRP、各種の受容体、他の凝血因子、細胞表面など、他の各種の構成要素、グリコシル化部位の導入およびまたは除去などにより、因子VIIIの結合能を修飾するために、分子内の他の位置にアミノ酸修飾を導入することが妥当である。本発明による因子VIII分子は、因子VIII活性を有するが、これは、凝血カスケード内で、FVIIIと機能的に類似するかまたは同等の形で機能し、活性化血小板においてFIXaと相互作用することによりFXaの形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力を意味する。活性化は、invitroにおいて、例えば、血栓解析、内因性トロンビンポテンシャル解析など、当技術分野でよく知られる技法により評価することができる。本発明による因子VIII分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、および100であるか、または100をさらに超えるFVIII活性を有する。内因性の全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌される前に、前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失FVIIIは、2つの異なる戦略により生成させることができる。Bドメインのない重鎖および軽鎖を2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成するか、またはBドメイン欠失FVIIIを、単鎖前駆体ポリペプチド鎖として合成し、これを、全長FVIII前駆体と同じ形で重鎖および軽鎖へと切断する。Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖部分と軽鎖部分とが通常、リンカーにより隔てられている。Bドメイン欠失FVIII内に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカー配列は、FVIIIのBドメインに由来することが好ましい。少なくとも、リンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644~1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIが活性化するとリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖内に配置される。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビンの活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に影響を与える可能性は低い。Bドメインの欠失は、FVIIIを生成させるのに有利である。にも関わらず、生成能を低下させることなく、Bドメインの一部をリンカー内に組み入れることもできる。生成能に対するBドメインの負の影響が、Bドメインの特定のサイズまたは配列に帰せられたことはない。末端欠失型Bドメインは、複数のOグリコシル化部位を含有しうる。しかし、好ましい実施形態によれば、該分子が、末端欠失型Bドメイン内に含むO結合オリゴ糖は、1つ、代替的に、2つ、3つ、または4つだけである。好ましい実施形態によれば、末端欠失型Bドメインが含む潜在的なOグリコシル化部位は1つだけであり、1または複数の疎水性部分が、好ましくはリンカーを介して、共有結合によりこのOグリコシル化部位にコンジュゲートされる。因子VIII分子はまた、多数のN結合オリゴ糖も含有し、これらのうちの各々は、疎水性側鎖基を結合させるためのアンカーとして潜在的に用いることができる。野生型のFVIII分子におけるBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による分子における末端欠失型Bドメインの長さは、例えば、約12~500アミノ酸、約12~400アミノ酸、12~300アミノ酸、12~200アミノ酸、15~100アミノ酸、15~75アミノ酸、15~50アミノ酸、15~45アミノ酸、20~45アミノ酸、20~40アミノ酸、または20~30アミノ酸など、例えば、約10アミノ酸~約700アミノ酸など、約10~約800アミノ酸で変化しうる。末端欠失型Bドメインは、重鎖およびもしくは軽鎖の断片、ならびにまたは野生型FVIII分子内には見出されない、人工的に導入された配列の断片を含みうる。本明細書では、Bドメイン末端欠失およびBドメイン欠失という用語を互換的に用いることができる。フォンウィレブランド因子vWFは、血漿中に存在する大型の単量体多量体糖タンパク質であり、内皮、巨核細胞、および内皮下結合組織において構成的に生成する。その主要な機能は、他のタンパク質、特に、因子VIIIへの結合であり、創傷部位への血小板の接着において重要である。因子VIIIは、vWFに結合するが、循環中では不活性である。因子VIIIは、vWFに結合しないと、急速に分解されるか、または除去される。したがって、FVIIIにおけるvWF結合能の低減または除去は、これまでのところ、循環における半減期が延長された因子FVIIIの変異体を得るのにまったく望ましくない手法であると考えられてきた。本明細書では、vWFへの結合能の低減という用語が、vWFへの結合能を、少なくとも50、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも90、および最も好ましくは100低下させた、因子VIIIの変異体を包含することを意図する。vWFに対するFVIIIの結合は、ELISA様のアッセイにより測定することもでき、表面プラズモン共鳴を用いる固定化vWFへの直接的な結合として測定することもできる。EP0319315において開示されている通り、vWFへの結合の原因となる因子VIII内の領域は、残基1670~1684にわたる領域である。この領域に関わる、因子VIIIの点突然変異体およびまたは欠失突然変異体は、vWFに対する結合能を変化させると予測される。本発明により特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異Y1680F、Y1680R、Y1680N、およびE1682T、およびY1680Cのうちの1または複数を含む変異体が含まれる。理論により拘束されることなく述べると、疎水性側鎖基を、vWF結合能が正常である因子VIII分子に結合させるのではなく、このような側鎖基を、vWF結合能を低下させた因子VIII分子に結合させることが有利でありうる理由は、大型の因子VIIIvWF複合体においては、該側鎖基のサイズが、比較的小さくなることであると予測される。比較的大きな側鎖基は、遊離因子VIIIの除去を遮断するのにより効果的に機能すると仮定される。因子IX因子IXaは、テナーゼ複合体の一部として、凝血における適正なトロンビンの形成を支援するのに必要とされる因子Xaの大半を生成させることにより、止血における重要な役割を果たす、トリプシン様のセリンプロテアーゼである。因子IXは、因子VII、プロトロンビン、因子X、およびプロテインCと構造的に類似する、ビタミンK依存性の凝血因子である。循環するザイモゲン形態は、N末端のγカルボキシグルタミン酸に富むドメイン、2つのEGFドメイン、およびC末端のトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、4つの異なるドメインへと分けられる、415アミノ酸からなる。FIXの活性化は、35アミノ酸の断片である、いわゆる活性化ペプチドを放出する、Arg145Ala146およびArg180Val181における限定的なタンパク質分解により生じる。活性化ペプチドは、高度にグリコシル化され、2つのN結合グリカン、および最大4つのO結合グリカンを含有する。本明細書で用いられる因子IXまたはFIXとは、内因性の凝血経路のメンバーであり、血液凝固に不可欠である、ヒト因子IX糖タンパク質を指す。因子IXには、個体によっては存在および発生する場合もある、天然のFIXの対立遺伝子変異体が含まれる。因子IXは、血漿に由来する場合もあり、よく知られた作製法および精製法を用いて、組換えにより生成させる場合もある。グリコシル化、ガンマカルボキシル化、および他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択される宿主細胞およびその増殖条件に応じて変化しうる。別段に指定または指示しない限り、因子IXとは、その任意の断片、類似体、および誘導体を含め、凝血におけるその通常の役割において機能的な任意のヒト因子IXタンパク質分子を意味する。野生型FIXの1つの例は、配列番号3に示される、全長ヒトFIX分子である。本明細書で用いられる類似体、もしくは類似体、または変異体とは、配列番号3の配列を有する因子FIXを名指すことを意図し、親タンパク質のうちの1もしくは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸により置換されており、かつまたは親タンパク質のうちの1もしくは複数のアミノ酸が、欠失しており、かつまたは1もしくは複数のアミノ酸が、タンパク質に挿入されており、かつまたは1もしくは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。このような付加は、親タンパク質のN末端またはC末端の一方で生じる場合もあり、これらの両方で生じる場合もある。この定義における類似体または類似体は、その活性化形態におけるFIX活性をなおも有する。一実施形態では、変異体が、配列番号3の配列と少なくとも90同一である。さらなる実施形態では、変異体が、配列番号3の配列と少なくとも95同一である。本明細書で用いられる、特定の位置に対する任意の言及は、配列番号3における対応する位置を指す。別段に指定しない限り、因子IXのドメインには、以下のアミノ酸残基残基Tyr1~残基Lys43の領域であるGlaドメイン残基Gln44~残基Leu84の領域であるEGF1残基Asp85~残基Arg145の領域であるEGF2残基Ala146~残基Arg180の領域である活性化ペプチドおよび残基Val181~残基Thr414の領域であるプロテアーゼドメインが含まれる。軽鎖が、Glaドメイン、EGF1、およびEGF2を包含する領域を指すのに対し、重鎖は、プロテアーゼドメインを指す。配列番号3野生型のヒト凝血因子IXYNSGKLγγFVQGNLγRγCMγγKCSFγγARγVFγNTγRTTγFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTγガンマカルボキシル化Gluが存在することを表わす。完全なガンマカルボキシル化FIXでは、最初の12のGlu残基が、ガンマカルボキシル化されるが、観察されるガンマカルボキシル化がより低度な変異体も存在する。FIXの148位には、AlaまたはThrのいずれでもありうる二型性が存在することに注意されたい、PNAS、822847頁を参照されたい。N9GPおよびBeneFIXにはAlaが存在するのに対し、BiogenIdec製のFIXFcは、Thrを保有する。したがって、本発明によるFIX分子も、148位においてAla残基を有する場合もあり、Thr残基を有する場合もある。FIXコンジュゲートの活性の決定は、例えば、Biggs、Oxford、BlackwellScientific、614頁において説明されている、一段階活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイなど、当技術分野で説明されている方法を用いて実施することができる。略述すると、本明細書で説明される因子IX分子の生物学的活性をアッセイするには、等量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、当技術分野でよく知られる滅菌瀉血法を用いて血友病B患者から単離した、因子IXを欠損する血漿、もしくは因子IXを免疫枯渇させた血漿、基準物質としての正常なプール血漿、または試料、および25mMのカルシウムを伴うアッセイを実施することができる。このアッセイでは、1単位の活性を、正常なプール血漿1ミリリットル中に存在する量として定義する。代替的には、活性を、WHOヒトFIX基準物質に対して較正した、正常ヒト血漿プールに対して測定することもできる。さらに、例えば、ProctorおよびRapaportにおいて説明される通りに、因子IXが、因子IXを欠損する患者に由来する血漿の血栓形成時間を、正常まで短縮する能力に基づく、生物学的活性についてのアッセイも実施することができる。融合タンパク質融合タンパク質キメラタンパク質とは、元は個別のタンパク質をコードする、2つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う単一のポリペプチドが結果としてもたらされる。例えば、本発明による凝血因子分子などの治療用タンパク質を、別のポリペプチド、例えば、Fc受容体など、例えば、抗体結合ポリペプチドへと融合することができる。本発明によるタンパク質はまた、Fcドメイン、好ましくは、エフェクター機能を結果として低下させる突然変異、およびまたは新生児型Fc受容体に対するアフィニティーを結果として増大させる突然変異を含むFcドメインへと融合させることもできる。例えば、因子VIIIなどの凝血因子と比較すると、抗体は、半減期が極めて長い。したがって、凝血因子によるFc受容体融合タンパク質と、循環する抗体との間で、共有結合を介さない複合体を形成させることにより、例えば、因子VII、因子VIII、および因子IXなどの凝血因子の半減期を著明に延長することが可能となりうる。循環における半減期の改変本発明によるタンパク質は、野生型のタンパク質分子と比較して、循環における半減期が改変され、循環における半減期が延長されることが好ましい。循環における半減期は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、好ましくは少なくとも20、好ましくは少なくとも25、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも35、好ましくは少なくとも40、好ましくは少なくとも45、好ましくは少なくとも50、好ましくは少なくとも55、好ましくは少なくとも60、好ましくは少なくとも65、好ましくは少なくとも70、好ましくは少なくとも75、好ましくは少なくとも80、好ましくは少なくとも85、好ましくは少なくとも90、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも125、より好ましくは少なくとも150、より好ましくは少なくとも175、より好ましくは少なくとも200、および最も好ましくは少なくとも250または300延長されることが好ましい。このような分子は、循環における半減期が、少なくとも400、500、600、またはさらに700延長されることがなおより好ましい。疎水性側鎖疎水性側鎖基本発明によるタンパク質は、側鎖基とコンジュゲートされる。これに関して、側鎖基とは、性質の大半が疎水性であり、天然では該タンパク質分子の一部ではない側鎖基として理解すべきである。タンパク質にコンジュゲートされると、このような疎水性側鎖基は、コンジュゲートされないタンパク質と比較して、該タンパク質のinvivoの循環における半減期を延長しうる。本明細書では、これらの疎水性側鎖基をアルブミン結合剤と称する場合があり、これには、脂肪酸の誘導体が含まれうる。これらの基は、invitroまたはinvivoにおいて、アルブミンに対する親和性を有する場合もあり、アルブミンに対する親和性を有さない場合もある。タンパク質またはペプチドに対するアルブミン結合剤の結合は、前記タンパク質またはペプチドの血漿における半減期を延長する可能性があることが示されている。アルブミンは、高度に疎水性の分子に結合することが可能であるため、典型的なアルブミン結合剤のクラスは、脂肪酸に由来する。したがって、本発明の文脈では、12部分を有する化合物が、潜在的なアルブミン結合剤である。このような結合剤が、タンパク質またはペプチドに結合し、前記タンパク質またはペプチドの血漿における半減期を結果として延長するならば、該アルブミン結合剤は、アルブミンに結合することにより、かつまたは他の機構により、血漿における半減期の全体的な延長に寄与しうる。一実施形態では、アルブミン結合剤タンパク質コンジュゲートが、単一のアルブミン結合剤が該タンパク質に結合している分子である。他の実施形態では、2つ、3つ、4つ、5つ以上など、複数のアルブミン結合剤がタンパク質に結合している。アルブミン結合部分は、アルブミンへの結合に特に関与性であり、これにより、血流における循環の延長に特に関与性である部分を含む場合があり、したがって、半減期延長部分と称することができる。半減期延長部分は、ペプチドへの結合点として用いられる部分の反対側の端部に存在するか、またはこの近傍に存在することが好ましい。アルブミン結合部分の残りの部分、すなわち、半減期延長部分と、ペプチドへの結合点として用いられる部分との間の部分は、リンカー部分、リンカー、スペーサーなどと称することができる。しかし、リンカーの存在は任意選択であり、したがって、アルブミン結合部分は、半減期延長部分と同一でありうる。特定の実施形態では、アルブミン結合部分およびまたは半減期延長部分が、親油性であり、かつまたは生理学的pHで負に帯電する。好ましい実施形態では、アルブミン結合部分およびまたは半減期延長部分が、場合によってはリンカーを介して、アミド結合により、シアル酸残基またはシアル酸誘導体のアミノ基に共有結合する。本発明の高度に好ましい実施形態によれば、例えば、シアリルトランスフェラーゼの使用を伴う方法など、酵素的方法を用いて、アルブミン結合剤を、糖タンパク質に結合する。本発明の目的では、アルブミン結合部分、半減期延長部分、およびリンカーという用語が、これらの分子の非反応形態ならびに反応形態を包含する。一方の形態または他方の形態のいずれが意味されているかどうかは、その用語が用いられる文脈から明らかである。脂肪酸という用語は、4~28個の炭素原子を有する、脂肪族モノカルボン酸を指し、炭素原子が非分枝性およびまたは偶数個であることが好ましく、飽和脂肪酸の場合もあり、非飽和脂肪酸の場合もある。脂肪族二塩基酸という用語は、上記で定義される脂肪酸を指すが、オメガ位にさらなるカルボン酸基を伴う。したがって、脂肪族二塩基酸とは、ジカルボン酸である。命名法は当技術分野における通常の通りであり、例えば、COOHならびにHOOCがカルボキシを指し、C6H4がフェニレンを指し、COならびにOCがカルボニルを指し、C6H5Oがフェノキシを指す。好ましい実施形態では、本発明のアルブミン結合部分が、リンカー、およびシアル酸残基、またはシアル酸誘導体を介して、ペプチドまたはタンパク質に連結された、脂肪アシル基nCO式中、n1、2、3、40、またはオメガカルボキシ脂肪アシル基nCO式中、n1、2、3、40を含む。好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、2~80個のC原子、好ましくは5~70個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、4~60個のヘテロ原子、好ましくは2~40個のヘテロ原子、より好ましくは3~30個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子の特に好ましい例は、N原子、O原子、およびS原子である。H原子およびC原子は、ヘテロ原子ではない。別の実施形態では、リンカーが、少なくとも1つのOEG分子、およびもしくは少なくとも1つのグルタミン酸残基、またはそうではなくて対応するラジカル2O2OCH2COを名指すものであるを含む。好ましい一実施形態では、リンカー部分が、アミド結合によりシアル酸残基に連結される、ジカルボキシアミド部分を含む。好ましい例では、ジカルボキシアミド残基が、2~30個のC原子、好ましくは4~20個のC原子、より好ましくは4~10個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、ジカルボキシアミド残基が、0~10個のヘテロ原子、好ましくは0~5個のヘテロ原子を有する。別の好ましい例では、リンカー部分が、その遠位カルボキシル基を介して、アミド結合によりシアル酸残基に連結された、アミノ基および遠位カルボキシル基の両方を含有する基を含む。好ましい一実施形態では、この基が、OEG基である。アミノ酸であるグルタミン酸は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマカルボキシ基は、シアル酸残基もしくはシアル酸誘導体のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は、OEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに用いられることが好ましい。Gluのアミノ基は、半減期延長部分のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合はOEG分子のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGluのガンマカルボキシ基とのアミド結合を形成する。このようなGluの組入れを、場合によって簡単に、ガンマGluと称する。したがって、本発明による個別のタンパク質は、親水性および疎水性両方の側鎖基を含みうる。したがって、本発明によるタンパク質を、疎水性側鎖基のほか、性質が必ずしも疎水性ではない1または複数の側鎖基、例えば、親水性基、ポリペプチドなどとコンジュゲートすることもさらに可能である。広範な態様では、本発明が、a1もしくは複数のN結合グリカン、およびまたはb1もしくは複数のO結合グリカンを含むタンパク質に対する安定的なコンジュゲートに関し、この場合、疎水性側鎖基が、場合によって、親水性スペーサー、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを介して、前記タンパク質における前記1または複数のグリカンに連結される。グリカンは、天然の場合もあり、本発明によるタンパク質へと遺伝子操作される場合もある。一実施形態では、側鎖が、そのN結合グリカンのうちの1または複数を介して、タンパク質へと連結される。別の実施形態では、側鎖が、そのO結合グリカンのうちの1または複数を介して、タンパク質へと連結される。さらなる実施形態では、側鎖が、そのN結合グリカンおよびそのO結合グリカンの両方を介して、タンパク質へと連結される。好ましい実施形態では、タンパク質が、凝血因子である。本発明の一実施形態では、親水スペーサーが、LogP0である。親水性スペーサーの可溶性は、そのlogP値により記載することができる。分配係数としてもまた知られるlogPはと、平衡にある2つの不混和性溶媒の混合物の2つの相における化合物の濃度比の対数である。溶媒のうちの1つが水であるのに対し、第2の溶媒は、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、およびプロピレングリコールジペラルゴネートから選択されることが典型的である。これらの異なる溶媒中で測定されるlogP値は、主に、水素結合の効果のために、差違を示す。オクタノールが、水素結合を与えかつ受け取るのに対し、シクロヘキサンは不活性である。クロロホルムが水素結合を与えうるのに対し、PGDPは水素結合を受け取りうるのみである。本発明の別の実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネートにおけるLogPが、05未満である。さらなる実施形態では、親水性スペーサーの、オクタン1オール、クロロホルム、シクロヘキサン、またはプロピレングリコールジペラルゴネートにおけるlogPが、1未満である。代替的に、公表されているアルゴリズム、ANewSubstituentConstantPiDerivedfromPartitionCoefficientsCALipinskiら、AdvancedDrugDeliveryReviews、23、3~25頁、ExperimentalandComputationalApproachestoEstimateSolubilityandPermeabilityinDrugDiscoveryandDevelopmentSettingsならびにIMoriguchi、SHirono、INakagome、HHirano、ChemPharmBull42、976~978頁、ComparisonofReliabilityoflogPValuesforDrugsCalculatedbySeveralMethodsを用いて、アルブミン結合剤部分または親水性スペーサー部分のmLogPおよびまたはcLogPとして、LogP値を計算することもできる。さらなる実施形態では、リンカーを介して、タンパク質を1つのアルブミン結合残基へと連結する。別の実施形態では、タンパク質の各種のグリカンを、1または2以上のリンカーを介して、1または2以上のアルブミン結合残基へと連結する。これらのアルブミン結合残基は、同一の場合もあり、同一でない場合もある。また、これらのリンカーが同一の場合もあり、同一でない場合もある。したがって、一例では、1または2以上のアルブミン結合残基が、1つのリンカーを介して、タンパク質の1種類のグリカンに連結され、加えて、1または2以上のアルブミン結合残基が、リンカーを介して、タンパク質の別の種類のグリカンへと連結される。代替的に、アルブミン結合残基は、例えば、天然のシステイン残基もしくは組換えにより導入されたシステイン残基、一方もしくは両方のN末端、一方もしくは両方のC末端、グルタミン残基、またはリシン残基など、タンパク質の他の部位に加えて、1または複数種のグリカンを介しても連結される。このようなグリカンの好ましい例は、二分枝型複合体であるNグリカンおよびコア1型Oグリカンである。別の実施形態では、天然タンパク質より多くのグリカンを含有するように、タンパク質を組換え操作している。これらのグリカンは、本発明のアルブミン結合残基による修飾に適する。さらなる実施形態では、タンパク質が、疎水性側鎖基に加えて、1または複数の修飾を有する。したがって、タンパク質を、例えば、PEG、ポリシアル酸、ヒドロアルキルデンプン、デキストラン、デンドリマーなどであるがこれらに限定されない、1または複数の親水性ポリマーに連結することができる。一実施形態では、親水性ポリマーを、タンパク質のグリカンのうちの1つに連結する一方で、疎水性側鎖基を、タンパク質の別のグリカンに連結する。特定の実施形態では、親水性ポリマーが、FVIII分子のOグリカンに連結されるPEGであるのに対し、疎水性側鎖は、前記FVIII分子のNグリカンに連結される。別の特定の実施形態では、親水性ポリマーが、FVIII分子のNグリカンに連結されるPEGであるのに対し、疎水性側鎖は、前記FVIII分子のOグリカンに連結される。さらなる態様では、本発明が、タンパク質コンジュゲートに関し、該コンジュゲートは、式zアシアロタンパク質式中、アシアロタンパク質は、末端のシアル酸が、グリカンから除去されているタンパク質を表わし、zは、値が1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の整数である。B2は、構造式中、R1、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、B2をB1または水素と連結する結合であり、は、アシアロ凝血因子への連結を指す。したがって、で終わる結合は、結合だけ、すなわち、開かれた結合を表わすを伴うグリシルシアル酸を表わす。B1は、リンカーを表わす。Wは、AとB1とを連結する化学基であり、Aは、アルブミン結合疎水性側鎖基ならびにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、およびプロドラッグを表わす。好ましい実施形態では、Aが、アルキレン鎖n式中、n8~26であり、場合によって、アリール置換基、およびカルボン酸、スルホン酸、スルフェン酸、スルフィン酸、ホスホン酸、またはホスフィン酸、アシルスルホンアミド、テトラゾール、ヒドロキシオキサゾールなどのカルボン酸等価体など、負に帯電した基に連結されるなどの疎水性基を含む。さらなる実施形態では、Aが、構造式中、は、Wを介するB1への結合を示し、したがって、で終わる結合は、結合だけ、すなわち、開かれた結合を表わす。R7は、水素、COOH、テトラゾリル、またはCNHS2R7a、である。nは、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、および25から選択され、R7aは、C1~6アルキル、フェニル、またはC1~6アルキルフェニルから選択され、は、基Aの残りの部分に対する結合を示す。さらなる実施形態では、R7が、COOHである。別の実施形態では、nが、14、16、および18から選択される。さらなる実施形態では、R7が、COOHであり、nが、14、16、および18から選択されるを有するを有する。さらなる実施形態では、Aが、以下のリストならびにCH3n基式中、n8~26である式中、は、Wを介するB1への結合を示し、したがって、で終わる結合は、結合だけ、すなわち、開かれた結合を表わすから選択される。さらなる実施形態では、Wが、CONH、式中、q0~10およびr0または1である、式中、p1~20である、式中、t0~10であるであり、場合によって、窒素原子を介してB1の構造的要素を相互連結するか、またはB2のアミンに連結される。さらなる実施形態では、B1が、以下のリスト式中、は、B2およびWへの結合を示すから選択される。特定の実施形態では、R1、R1、R3、R4、R5、およびR6が水素であり、R2が、B1に連結される。さらなる特定の実施形態では、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6が水素であり、R1が、B1に連結される。さらなる実施形態ではタンパク質コンジュゲートが、以下のリスト式中、タンパク質分子1つ当たり、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの側鎖を結合させるから選択される。特定の実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、タンパク質のNグリカンに結合させる。別の実施形態では、側鎖を、Oグリカンに結合させる。別の実施形態では、側鎖を、FVIIIのOグリカンに結合させることに加えて、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIIのNグリカンに結合させる。さらなる実施形態では、40kDaのPEGを、FVIIIのOグリカンに結合させることに加えて、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIIのNグリカンに結合させる。さらなる実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FVIIaのNグリカンのうちの1または2以上に結合させる一方で、別のグリカンをPEGで修飾する。別の実施形態では、1つ、2つ、3つ、または4つの側鎖を、FIXのNグリカンのうちの1または2に結合させる一方で、別のグリカンまたは同じグリカンをPEGで修飾する。糖タンパク質糖タンパク質という用語は、骨格アミノ酸配列のうちの1または複数のアミノ酸残基に結合した、1または複数のオリゴ糖を含有する、ペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを包含することを意図する。グリカンは、N結合グリカンでもO結合グリカンでもよい。グリカンは、天然の場合もあり、本発明によるタンパク質へと遺伝子操作される場合もある。N結合オリゴ糖およびO結合オリゴ糖本明細書で用いられるグリカンまたは互換的なオリゴ糖鎖とは、共有結合により単一のアミノ酸残基に連結される、全オリゴ糖構造を指す。グリカンは通常、N結合グリカンまたはO結合グリカンである、例えば、グリカンは、アスパラギン残基に連結されるか、またはセリン残基もしくはトレオニン残基に連結される。N結合オリゴ糖鎖は、例えば、二分岐型、三分岐型、または四分岐型など、多分岐型である可能性があり、Man3GlcNAcGlcNAcのコア構造を含有することが極めて多い。NグリカンおよびOグリカンはいずれも、タンパク質を生成させる細胞を介して、タンパク質に結合する。細胞内のNグリコシル化機構は、新たに生成するタンパク質が、リボソームから小胞体へと移出されるときに、アミノ酸鎖内のNグリコシル化コンセンサスモチーフを認識およびグリコシル化する。insituのヒトにおいて生成する場合、一部の糖タンパク質は、末端シアル酸残基またはキャッピングシアル酸残基を伴うグリカン構造を有する、すなわち、各分岐の末端の糖は、α2→3連結またはα2→6連結を介してガラクトースへと連結される、Nアセチルノイラミン酸である。他の糖タンパク質は、他の糖残基によりグリカン端がキャッピングされている。しかし、他の状況下で生成すると、糖タンパク質は、例えば、シアル酸残基を欠くNグリコリルノイラミン酸残基を含有するガラクトースの代わりに、末端Nアセチルガラクトサミン残基を含有するなど、それらの分岐のうちの1または複数において異なる末端構造を有するオリゴ糖鎖を含有しうる。N結合オリゴ糖およびまたはO結合オリゴ糖のパターンは、限定なしに、高速液体クロマトグラフィーキャピラリー電気泳動核磁気共鳴高速原子衝突、エレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離などのイオン化法を用いる質量分析ガスクロマトグラフィーおよびアニオン交換HPLC、サイズ除外クロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動、ゲル等電点電気泳動、またはキャピラリー等電点電気泳動を伴う、エクソグリコシダーゼによる処理を含めた、当技術分野において知られる任意の方法を用いて決定することができる。例えば、Weberら、AnalBiochem225135頁Klausenら、JChromatog718195頁Morrisら、MassSpectrometryofBiologicalMaterials、McEwenら編、MarcelDekker、137~167頁Conboyら、BiolMassSpectrom21397頁、1992Hellerqvist、MethEnzymol193554頁Suttonら、AnalBiohcem31834頁Harveyら、OrganicMassSpectrometry29752頁を参照されたい。したがって、末端シアル酸または互換的な末端ノイラミン酸とは、グリカンまたはオリゴ糖鎖内の末端糖残基として連結されたシアル酸残基を包含することを意図する、すなわち、各分岐の末端の糖は、α2→3連結またはα2→6連結を介してガラクトースへと連結されたNアセチルノイラミン酸である。ガラクトースまたはその誘導体という用語は、天然のDガラクトースなどのガラクトース残基、またはNアセチルガラクトサミン残基など、その誘導体を意味する。末端ガラクトースまたはその誘導体という用語は、グリカンまたはオリゴ糖鎖内の末端糖残基として連結された、ガラクトースまたはその誘導体を意味し、例えば、各分岐の末端糖が、ガラクトースまたはNアセチルガラクトサミンである。アシアロ糖タンパク質という用語は、1または複数の末端シアル酸残基が、例えば、シアリダーゼによる処理を介して、または基底をなすガラクトースもしくはNアセチルガラクトサミンの層から、少なくとも1つのガラクトース残基またはNアセチルガラクトサミン残基を露出させる化学的処理を介して除去された糖タンパク質を包含することを意図する。一般に、NXSTモチーフを得るように、アミノ酸の突然変異を導入することにより、N結合グリカンを導入することができる。本発明のタンパク質分子は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN結合グリカンを含有する。N結合グリカンの構造は、高マンノース形態または複合体形態である。高マンノースグリカンは、グリカンの非還元性端部に、末端マンノース残基を含有する。複合体のNグリカンは、非還元性端部に、シアル酸、ガラクトース、またはNアセチルグルコサミンを含有する。同様に、Oグリカンは、アミノ酸鎖内の特定のOグリコシル化部位へと結合させるが、Oグリコシル化を誘発するモチーフは、Nグリコシル化シグナルよりはるかに異質性であり、アミノ酸配列内のOグリコシル化部位を予測する能力は、いまだ不十分である。したがって、人工的なOグリコシル化部位の構築は、ある不確実性を随伴する。本発明のコンジュゲートでは、N結合グリカンまたはO結合グリカン内のシアル酸に側鎖を連結する。疎水性側鎖基の連結基をタンパク質へと連結する化学的方法は、部位選択的なものもあるが、非選択的となる傾向にある。しかし、大半の方法で一般的なのは、洗浄剤または有機溶媒など、有害な添加剤を添加しない限り、水性緩衝液中では、疎水性基を含有する試薬を用いることができないという事実である。水性環境におけるそれらの不溶性のために、疎水性基をタンパク質に連結することは元来困難である一方で、タンパク質が可溶性であるのは、水性環境内に限られる。酵素的手法の使用に随伴する利点は多い。本発明による好ましい酵素的方法に従えば、疎水性側鎖基シアリルCMP基質を、化学的に調製することができる。シアリルトランスフェラーゼ酵素を用いて、この基質を、アシアロタンパク質に存在するグリカンへと酵素的に転移させることができる。本発明の発明者らは、この酵素的手法が、驚くべきことに、有機溶媒を添加せずに実施しうることを発見した。例えば、生物学的活性の喪失、環境上の懸念、有機溶媒の完全な除去を確認するためのさらなるステップの実施など、有機溶媒の使用に随伴する欠点は多い。FVIIIタンパク質の操作では、緩衝液にグリセロール、例えば、5~30のグリセロール、好ましくは10~20のグリセロールを添加することが有利でありうる。グリセロールが存在すると、例えば、凍結融解工程において因子VIII分子が安定化すると考えられ、また、因子VIIIによる凝集物の形成も阻止することができる。グリセロールは高度に親水性であり、それ自体、有機溶媒とは考えられない。さらに、その性質が高度に親水性であるために、グリセロールは、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、Nメチルピロリジン、ジメチルスルホキシドなど、他の有機溶媒について観察される、タンパク質の安定性に対する負の影響を免れている。したがって、酵素的コンジュゲーションにおいて存在させるグリセロールは、コンジュゲーション工程が完了した後も除去する必要がない。シアリルトランスフェラーゼシアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、新たに生成するオリゴ糖へと転移させる酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖ヌクレオチドのドナー基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、糖脂質、または糖タンパク質のN結合グリカンもしくはO結合グリカンにおける末端のガラクトースに付加する。それらが作用するアクセプター基質、およびそれらが形成する糖連結の種類に基づき、約20の異なるシアリルトランスフェラーゼを識別することができる。連結は、シアル酸の2位と、ガラクトースの3位または6位との間で形成されることが典型的である。本発明による好ましいシアリルトランスフェラーゼは、EC2499クラスの酵素に属する。非限定的な例は、ST3GALI、およびST3GalIII、およびST6GalNAcIである。したがって、例えば、特定のグリコシル化パターンにより特定のシアリルトランスフェラーゼを選択することにより、かつまたは特定のグリコシルパターンによりタンパク質を操作することにより、本発明によるコンジュゲートタンパク質の構造を操作することが可能である。アクセプター基質アクセプターまたはアクセプター基質という用語は、シアリルトランスフェラーゼを介する反応におけるグリコシド結合により、ドナー基質に連結される求核基質を指す。アクセプターは、単糖もしくはオリゴ糖、またはこれらの誘導体である。アクセプターの反応性部分は、このような単糖もしくはオリゴ糖または誘導体内に含有されるヒドロキシル基である。シアリルトランスフェラーゼを介する反応における反応性ヒドロキシル基は、末端ガラクトースまたは非末端ガラクトースにおけるヒドロキシル基であることが典型的である。反応性ヒドロキシル基は、末端ガラクトースにおける3ヒドロキシル基または6ヒドロキシル基であることが典型的である。反応性ヒドロキシル基の別の種類は、末端シアル酸の8ヒドロキシル基である。ドナー基質ドナーまたはドナー基質という用語は、シアリルトランスフェラーゼを介する反応におけるグリコシド結合により、アクセプター基質に連結される求電子基質を指す。ドナー基質は、ルロワール型の糖ヌクレオチドの場合もあり、ルロワール型以外の糖ヌクレオチドの場合もある。本発明の好ましい糖ヌクレオチドは、置換基が、シアル酸のNアセチル基に連結された、シアル酸シチジン一リン酸である。組換えタンパク質を生成させる宿主細胞は、該分子が、フォールディングおよび翻訳後修飾、例えば、グリコシル化および硫酸化において適正にプロセシングされることを確保するため、哺乳動物起源であることが好ましい。本発明を実施する場合、細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましくは、限定なしに、CHO細胞系、ベビーハムスター腎細胞系、およびHEK293細胞系を含め、確立された哺乳動物細胞系である。現在のところ好ましい細胞は、HEK293細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、および骨髄腫細胞であり、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。医薬組成物本明細書では、医薬組成物が、例えば、RTU滅菌水性組成物、または、例えば、水中もしくは水性緩衝液中で再構成しうる乾燥滅菌組成物など、非経口投与に適する、本発明によるタンパク質分子を含む組成物を包含することを意味することが好ましい。本発明による組成物は、各種の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤などを含みうる。このような組成物中のさらなる成分には、保湿剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調整剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質、および双性イオンが含まれうる。このようなさらなる成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を与えるべきでないことは当然である。非経口投与は、シリンジ、場合によって、ペン型シリンジによる皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して実施することができる。代替的に、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻腔内スプレーまたは肺内スプレーの形態でタンパク質を投与するための溶液または懸濁液でありうる組成物である。なおさらなる選択肢として、医薬組成物はまた、例えば、注射針なしの注射による、もしくはパッチ、場合によって、イオントフォレーシスパッチによる経皮投与、または経粘膜投与、例えば、口腔内投与にも適合させうる。本明細書で用いられる治療という用語は、それを必要とする任意のヒト対象または他の動物対象に対する医学的治療を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを示す一時的または決定的な診断を施した治療者による身体検診を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態に従い、個体により異なりうる。したがって、前記治療は、予防的治療の場合もあり、緩和的治療の場合もあり、対症的治療の場合もあり、かつまたは治癒的治療の場合もある。したがって、第1の態様によれば、本発明が、共有結合により少なくとも1つの疎水性側鎖基にコンジュゲートされる組換えタンパク質であって、前記疎水性側鎖基が、シアル酸を介して前記タンパク質に連結される組換えタンパク質に関する。疎水性側鎖基は、場合によって、リンカーを介してタンパク質にコンジュゲートされる。一実施形態では、タンパク質が、例えば、FVII、FVIII、またはFIXなどの凝血因子である。別の実施形態では、タンパク質が、抗体の抗原結合断片である。本発明による好ましい実施形態では、疎水性側鎖基が、脂肪酸および脂肪族二塩基酸からなる群のうちの1または複数から選択される。別の好ましい実施形態では、疎水性側鎖基が、シアル酸を介して因子VIIIに連結される。さらに別の好ましい実施形態では、因子VIII分子が、少なくとも1つのグリカンを含み、前記少なくとも1つのグリカンが、シアル酸に連結され、前記シアル酸が、疎水性側鎖基に連結される。本発明による特に興味深い実施形態では、因子VIII分子のvWF結合能が調整されており、好ましくは低減されている。さらに別の興味深い実施形態では、因子VIII分子が、好ましくは、Bドメインリンカーが、配列番号4に示される配列を有する、Bドメイン末端欠失型変異体である。特に好ましい実施形態によれば、疎水性側鎖基が、共有結合により、因子VIII分子の末端欠失型Bドメイン内に位置するOグリカンにコンジュゲートされ、因子VIIIが活性化する結果として、疎水性側鎖基が除去される。別の実施形態では、Bドメイン内のOグリカンを、例えば、PEG、HES、もしくはPSAなどの親水性ポリマー、または、例えば、アルブミンなどのペプチドとコンジュゲートする。配列番号4に示されるBドメインと類似するBドメイン内のO結合グリカンを、親水性ポリマーへとコンジュゲートする場合は、1または複数の疎水性側鎖基を、N結合グリカンにコンジュゲートすることが好ましく、この逆もまた成り立つ。親水性ポリマーはまた、化学的方法または酵素的方法を用いても、N結合グリカンおよびまたはO結合グリカンにおけるシアル酸を介して、FVIIIへとコンジュゲートすることができる。親水性ポリマーはまた、当技術分野において知られる他の方法を用いても、該分子へとコンジュゲートすることができる。本発明によるさらに別の興味深い実施形態では、因子VIIIポリペプチドを、例えば、Fcドメイン、または抗体結合タンパク質など、別のポリペプチドに融合する。別の態様は、本発明による分子を作製する方法であって、疎水性側鎖基の組換え因子VIII分子への結合を含む方法に関する。好ましい実施形態では、疎水性側鎖基を、シアリルトランスフェラーゼ触媒反応を介して結合させる。特に好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼを、ST3GalIおよびST3GalIIIからなる群から選択する。さらに別の実施形態では、シアリルトランスフェラーゼが、ST6GalNAcIである。特に、本発明は、このような方法により得られるか、または得ることが可能な分子にさらに関する。酵素的方法は、このような反応の有効性をそれほど減殺することなく、微量を添加することも可能でありうるが、好ましくは有機溶媒の添加を用いない。第3の態様は、血友病、炎症性疾患、または癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、本発明による分子を投与するステップを含む方法に関する。本発明の第4の態様は、本発明による方法を介して得ることができるか、または得られるタンパク質に関する。第5の態様は、血友病、炎症性疾患、および癌を治療するための、本発明による分子の使用に関する。最後の態様は、本発明による分子を含む医薬組成物に関する。略号CVカラム容量FLD蛍光検出MQMilliQ水mz質量対電荷比MS質量分析HPLC高速液体クロマトグラフィーRP逆相LCMS液体クロマトグラフィー質量分析NMR核磁気共鳴分光法rtまたはRT室温BoctertブチルオキシカルボニルOfButertブチルエステルfButertブチルCMPシチジン一リン酸DCMジクロロメタン、CH2Cl2、塩化メチレンDICジイソプロピルカルボジイミドDIPEANNジイソプロピルエチルアミンDMFNNジメチルホルムアミドDMSOジメチルスルホキシドFmoc9Hフルオレン9イルメトキシカルボニルLysOH6アミノ2アミノヘキサン酸Thxtrans4アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸GSCグリシルシアル酸CMPエステルMBPマンノース結合タンパク質NANNアセチルノイラミン酸NMPNメチルピロリジン2オンOEGエトキシエトキシ酢酸TFAトリフルオロ酢酸THFテトラヒドロフランTIPSトリイソプロピルシランUM4メチルウンベリフェリルLacラクトシルまたはラクトースHC重鎖LC軽鎖SC単鎖PSCポリエチレングリコールシアル酸CMPエステルwt野生型アミノ酸の略号は、IUPACの慣用法に従う。緩衝液の略号は、StollVSおよびBlanchardJS、MethodsofEnzymology、182、1990、AcademicPress、24~38頁に従う。全体的手順HPLCAgilentZorbaxシリカカラムまたはVydacC18シリカカラムを用いるAgilent1100システムにおいて、RPHPLC解析を実施した。検出は、214nmおよび280nmにおけるUVにより行った。標準的な水01TFAの緩衝液およびアセトニトリルTFAの緩衝液による適切な勾配を用いて、溶出を実施した。解析システムと類似の勾配、および2cmもしくは5cmのC18カラムを用いる、Watersシステム、またはGilsonシステムにおいて、調製的RPHPLCを実施した。場合によっては、10mMNH4HCO3、10の10mMNH4HCO3を伴う90のアセトニトリルを、それぞれ、A緩衝液およびB緩衝液として用いる、中性システムも使用した。LCMS2つのPerkinElmerSeries200Microポンプ、PerkinElmerSeries200オートサンプラー、AppliedBiosystems785AUV検出器を装備した、PESciexAPI150質量分析器において、LCMS解析を実施した。HPLCシステムの場合と同じ緩衝液を用いて、室温、15ml分、30mm×50mmで5μmのWatersXterraC18シリカカラムを溶出させた。5のB緩衝液でカラムを平衡化し、5のB緩衝液で10分間にわたり、次いで、7分間で5~90にわたるB緩衝液の直線勾配で溶出させた。検出は、214nmにおけるUV検出、および全イオン流により行った。カラム溶出物の画分を、PESciexAPI100質量分析器のイオンスプレーインターフェースへと導入した。試行中2秒ごとに、100~800amuの質量範囲を走査した。タンパク質の精製AktaExplorerクロマトグラフィーシステム、およびGEHealthCare製のカラムにおいて、タンパク質のクロマトグラフィーを実施した。GEHealthcareinstructionleaflet71700600ATに従い、6モノデオキシ6モノアミノベータシクロデキストリンを、NHSHitrapカラムへと固定化することにより調製したカラムを用いて、シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーを実施した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、pH73、10のグリセロールを出発緩衝液として用い、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、pH73、10のグリセロール、20mMのヒドロキシプロピルシクロデキストリンを溶出緩衝液として用いて、クロマトグラフィーを実施した。SDSPAGENuPAGE7トリスアセテートゲルを用いて、SDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を実施した。ゲルは、クーマシー染色または銀染色し、必要な場合はまた、MMKurfurst、AnalBiochem200244~248頁、1992により説明される通りに、ヨウ化バリウムでPEGについて染色した。LDS処理の前に、場合によって、FVIII試料およびFVIIIコンジュゲート試料を、トロンビンで処理した。トロンビンとのインキュベーションを、37°Cで10分間にわたり実施した。次いで、標準的なSDSPAGE手順に従い、試料を処理した。これらの解析では、トロンビンに対応するバンドが、ゲルの低分子量範囲に現れた。タンパク質濃度の決定減衰係数を146とするUV測定により、FVIIIおよびFVIIIコンジュゲートの濃度を決定した。代替的に、必要な場合は、HPLC法も用いた。粒子サイズを5mm、流速を200mL分とする、GraceVydac214TP5215C4カラムを40°Cで用いるAgilent1100システムにおいて、解析を実施した。溶媒は、MilliQ水中に007のトリフルオロ酢酸、およびアセトニトリル中に01のTFAであった。60分間で40~55にわたる溶媒Bの直線勾配により、因子VIIIタンパク質を溶出させた。個々の試料のタンパク質濃度は、HPLCクロマトグラムにおける面積を積分し、因子VIIIの基準物質と比較することにより決定した。基準物質における因子VIII濃度は、110°Cの6NHCl中で24時間にわたる加水分解後におけるアミノ酸解析により決定した。本質的に、製造元により説明される通りに、蛍光標識を用いて、HP1100HPLCにおいて試料を解析した。実験で用いるGSC出発物質GSCは、解析的HPLC検出GSC反応時間05分間により、純度74で、AlbanyMolecularResearchIncから購入した。組換えBドメイン末端欠失型Oグリコシル化因子VIIIの生成細胞系および培養工程因子VIIIのcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、Bドメイン欠失因子VIII、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1~740を含む因子VIII重鎖、および全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1649~2332を含む因子VIII軽鎖、16、349頁を参照されたいをコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸741~750および1638~1648による配列を含む21アミノ酸のリンカーにより連結した。チャイニーズハムスター卵巣細胞に、このプラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。工程の第1のステップは、作業用の細胞バンクバイアルに由来する細胞バイアルを、化学的に規定された、動物成分非含有増殖培地へと接種することである。まず融解後、細胞を、T型フラスコ内でインキュベートする。融解の1または2日後、細胞をシェーカーフラスコへと移し、細胞密度を02~30×106個mlに維持するために、培養物容量を系列希釈により拡張する。次のステップは、シェーカーフラスコ中の培地を、種培養用バイオリアクターへと移すことである。ここで培養物容量をさらに拡張してから、最終的に生成用バイオリアクターへと移す。化学的に規定された、同じ、動物成分非含有培地を、すべての接種物拡張ステップに用いる。生成用バイオリアクターへと移した後で、培地に、生成物濃度を増大させる成分を補充する。生成用バイオリアクターでは、サイクル時間を3日間とする反復バッチ工程で細胞を培養する。回収時には、培養物容量の80~90を、回収タンクへと移す。次いで、初期細胞密度を得るために、残りの培養液を、新鮮な培地で希釈し、次いで、新規の増殖期を開始する。遠心分離および濾過により回収バッチを洗浄し、保持タンクへと移してから、精製工程を開始する。保持タンク内の細胞を含まない回収物に緩衝液を添加し、pHを安定化させる。生成試行が終了するまでに、細胞バンクの生成を終了させるために、細胞を回収して凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、滅菌性、およびウイルス汚染について検査する。精製細胞培養培地から、Bドメイン欠失因子VIIIを単離するために、CaptoMMCカラムにおける濃縮ステップ、ELISAおよびクロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、ならびに最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を使用した11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、002のTween80、pH75中で平衡化したCaptoMMCによるカラムへと、流速15ml分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、15MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH75により、流速1ml分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、因子VIII活性についてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。因子VIIIに対するモノクローナル抗体を発生させた。エピトープマッピングにより、この抗体F25は、アミノ酸残基725~740の重鎖最C末端配列を認識することが判明した。本質的に、製造元により説明される通りに、ゲル1ml当たり24mgの密度で、F25抗体を、NHS活性化セファロース4FFに連結した。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、pH73で10倍に希釈し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73で平衡化したF25Sepharoseカラムへと、流速05ml分で適用した。UVシグナルが一定となるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、UVシグナルが一定となるまで、再度、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、065MのNaCl、pH73で洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、50のエチレングリコール、pH73により、流速1ml分で、因子VIIIを溶出させた。1mlの画分を回収し、因子VIII活性についてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約25mlのプール容量を得た。イオン交換ステップのために、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73および緩衝液B20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、1MのNaCl、pH73を調製した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分で、MacroPrep25QSupportによるカラムを平衡化した。前出の工程によるプールを、緩衝液Aで10倍に希釈し、流速2ml分でカラムへと送入した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分でカラムを洗浄し、流速2ml分で120mlの15緩衝液B~70緩衝液Bにわたる直線勾配により、因子VIIIを溶出させた。2mlの画分を回収し、因子VIII活性についてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約36mlのプール容量を得た。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、150mMのNaCl、pH73で平衡化した調製グレードのSuperdex200カラムへと1ml分で適用し、溶出させた。3mlの画分を回収し、因子VIII活性についてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約57mlのプール容量を得た。因子VIIIを含有するプールを、80°Cで保存した。発色活性およびELISAの測定により判定される通り、上記の4ステップの精製手順を用いることにより、約15の全収量が得られた。実施例1で得られた、組換えN8因子VIII分子は、Bドメインに1つのO結合グリカンを存在させている、16、349頁を参照されたい。したがって、このOグリカンに疎水性側鎖基を特異的に結合させることにより、均一の構造を有する分子の生成が可能となる。さらに、該分子が活性化すると、Bドメインおよび疎水性側鎖基は除去され、したがって、活性化した分子は、活性化した内因性の因子VIIIと類似の構造を有する。C16脂肪族二塩基酸γGluNHSエステルをGSCへと連結して、シアリルトランスフェラーゼの基質1を得るGSCを、トリス緩衝液およびアセトニトリル50μlの混合物中に溶解させた。2層系を得た。C16脂肪族二塩基酸であるγGluNHSエステルを、THF中に溶解させ、次いで、トリス緩衝液を添加して、清明な溶液を得た。この溶液を、GSC溶液へと添加した。清明な溶液を得た。約4時間の反応時間後、真空中で試料を濃縮して、有機溶媒のバルクを除去し、次いで、20°Cで凍結させた。HPLCおよびLCMSにより、生成物を同定した。中性緩衝液系およびC4Jupiter10×250cmカラムを用いるRPHPLCによる精製。流速5ml分勾配2分のB緩衝液。生成物1を含有する後期溶出画分を回収した。該画分を濃縮して乾燥させた。C4カラムにおいて比較的良好に保持されたにもかかわらず、生成物は、完全な水溶性を示し、10mMのNH4HC03中で再溶解した。溶液中の生成物の濃度は、GSCを基準物質として用いる、272nmにおけるUV測定により、41μMと決定された。収量42mg。LCMSにより、生成物の内容を確認した。生成物溶液は、20°Cで保存した。上記のプロトコールを用いて、疎水性側鎖基を保有する、シアリルトランスフェラーゼ基質を調製した。基質1は、水性緩衝液中で、完全に可溶性であることが分かった。アルブミン結合剤であるNHSエステル2の調製CEMLibertyマイクロウェーブペプチド合成器における合成には、RinkAmide樹脂を用いた。以下のアミノ酸をその順序で用いる、標準的なFmoc化学反応プロトコールを用いた。1FmocLysOH6ml中に112g2FmocOEGOH12ml中に139g3FmocGluOtBu6ml中に077g4FmocThxOH6ml中に068g5C16二酸モノtブチルエステル6ml中に062gすべての連結は、7等量のDICを添加することにより実施した。これらの連結の後、Liberty合成器から樹脂を除去し、洗浄し、水気を切り、5mlのヘキサフルオロイソプロパノールで10分間にわたり処理した。次いで、樹脂をDCMで洗浄し、水気を切った。次いで、ヘキサフルオロイソプロパノールによる処理、およびDCMによる洗浄を反復した。スベリン酸ビスNHSエステルを、NMP中に溶解させ、DIPEAを添加した。この溶液を、水気を切った樹脂に添加し、一晩にわたり反応させた。連結後、樹脂をNMPで洗浄し、次いで、DCMで洗浄し、水気を切った。水気を切った樹脂に、9412525のTFATIPSメルカプトエタノールH2O混合物を添加し、周囲温度で2時間にわたり、樹脂を振とうした。樹脂を75mlの氷冷ジエチルエーテル中にゆっくりと入れて水気を切り、その結果として生成物を沈殿させた。室温で05時間にわたりさらに振とうし、遠心分離することにより、固体としての生成物を得、これを、ジエチルエーテルで2回にわたり洗浄し、真空中で乾燥させた。粗生成物を、HPLC用のA緩衝液およびB緩衝液の混合物中に溶解させ、調製用RPHPLCにより精製した。HPLCおよびLCMSにより、生成物の内容および純度を確認した。上記のプロトコールを用いて、高度に複合体化したアルブミン結合側鎖を、NHSエステルとして調製した。この化合物を、実施例4におけるGSCと反応させるように準備する。NHSエステルをGSCへと連結して、基質3を得る実施例3のNHSエステル2を、THF中に溶解させ、トリス緩衝液を添加した。GSCを秤量し、NHSエステル溶液へと添加し、室温で30分間にわたり反応させた。実施例2で概観した通りに、反応混合物を、MQ水により4mlまで希釈し、RPHPLCにより精製した。勾配10→50のB緩衝液。LCMSにより関与性の画分を同定し、凍結乾燥させた。ここでもまた、生成物は、優れた水溶性を示した。収量77mg。LCMSにより、生成物を同定した。上記のプロトコールを用いて、複合体のアルブミン結合疎水性側鎖を保有するシアリルトランスフェラーゼ基質を調製した。基質3は、水性緩衝液中で完全に可溶性であることが分かった。基質1の蛍光標識ラクトースへの連結反応に用いられる試薬緩衝液HEPES100mM、pH75酵素CalBiochem製のラット組換えα23シアリルトランスフェラーゼ。該酵素を、緩衝液中で希釈し、10kDaのMilliporeBiomax限外濾過デバイスにより約10倍に濃縮した100μlを2台のデバイスの各々に分注し、室温、12000Gで26分間にわたり遠心分離した。最終容量を、約8~10μlずつとし、濃度を、1700mUmlとした。反応には、125mU、75μlを用いた。アクセプターLacUM。トリス50mM、pH741mMCaCl2中に05mgmlの溶液。各反応では、容量25μlを用いた。ドナーである基質1各反応では、125ナノモル、3μlを用いた。対照ドナーCMPNAN14mg、すなわち、41mMのHEPES540μl、pH75中に22マイクロモル。各反応では、125ナノモル、すなわち、3μlを用いた。2つの反応を、エッペンドルフ試験管内で実施し、その後、RPHPLCを行った。以下のHPLC法カラムC18、21×50mm緩衝液A純水、B純粋なMeCN流速02ml分カラム温度40°C。検出UV214nmおよび254nm蛍光検出励起波長315nm、発光波長375nmを用いた。蛍光検出トレースを追跡することにより、反応を定量化した。反応1アクセプタードナー酵素。20時間後に、反応は、生成物への81の転換に到達した。生成物は、LCMSにより確認した。反応2アクセプター対照ドナー酵素。20時間後に、反応は、生成物への97の転換に到達した。酵素を伴わない対照反応は、20時間後においても、生成物の形成をもたらさなかった。この反応を用いて、基質1が、アクセプターとしての蛍光標識ラクトースとの、シアリルトランスフェラーゼ触媒連結反応におけるドナーとして反応する能力を検証した。すべての反応は、水性緩衝液中で実施した。C18脂肪族二塩基酸γGluOEGOEGNHSエステルをGSCに連結して、シアリルトランスフェラーゼ基質4を得る171カルボキシ322エトキシエチルカルバモイルメトキシエトキシエチルカルバモイルプロピルカルバモイルヘプタデカン酸を、THFおよびpH75の100mMHEPES緩衝液による混合物中で溶解させた。THFおよびpH75の100mMHEPES緩衝液による混合物中のGSC溶液を添加した。反応混合物を、1時間にわたりインキュベートした。HPLCは、GSC出発物質の完全な転換を示した。調製的HPLC010で均一濃度次いで、40分間にわたり、603010へと直線的に変化させる基質4反応時間36分間における複数回の試行により、反応混合物を精製した。解析的HPLCにより、画分を解析した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥させて、重炭酸アンモニウムを除去した。凍結乾燥粉末を水中に溶解させ、それに、Dowex59WX2短型カラム中を流過させることにより、アンモニウム対イオンを、ナトリウムカチオンと交換した。水性溶出物を今一度凍結乾燥させて、合計278mgの基質4を得た。LCMSAP13000反応時間398分、mz1345。1HNMRδ122ppm140172186207575677702723755768795848。基質3の蛍光標識ラクトースへの連結アクセプターLacUM。トリス緩衝液50mM、pH741mMCaCl2中に05mgmlの溶液。各反応では、容量25μlを用いた。酵素ラットMBPST3GalIII、106Umg09mgml。各反応では、26μlを用いた。ドナーである基質3イミダゾール緩衝液中に25μgμl各反応では、10μlを用いた。対照ドナー41mMHEPES緩衝液中に14mgのCMPNAN反応1アクセプタードナー酵素反応2アクセプター対照ドナー酵素反応3アクセプタードナー3つの反応を、エッペンドルフ試験管内で実施し、アクセプタードナー酵素を混合し、37°Cでインキュベートした。反応は、以下のHPLC法カラムC18、21×50mm緩衝液A水中に01のTFA、BMeCN中に01のTFA流速02ml分カラム温度40°Cダイオードアレイ検出器214nmおよび254nm蛍光検出励起波長315nm、発光波長375nmを用いるHPLCによりモニタリングした。結果反応12時間後にほぼ完全に生成物へと転換した。反応21時間後にほぼ完全に生成物へと転換した。反応3反応は生じなかった。生成物は、LCMSにより同定した。この反応を用いて、基質3が、アクセプターとしての蛍光標識ラクトースとの、シアリルトランスフェラーゼ触媒連結反応におけるドナーとして反応する能力を検証した。すべての反応は、水性緩衝液中で実施した。ST3GalIIIを用いて、基質1を、野生型Bドメイン欠失FVIIIのNグリカンへと連結する野生型Bドメイン欠失FVIII150μlの緩衝液中に03mgシアリダーゼノイラミニダーゼアガロース上に60μlN5254株ゲル1ml当たり06~18U基質14μl、41mM10mMNH4HC03中に16ナノモルST3GalIII300μl。実施例7で用いたのと同じバッチ。遠心分離用のミニ濾過デバイス内で、シアリダーゼを洗浄した水により2回、次いで、緩衝液により3回にわたる。最後に、該デバイスの水気を切った。FVIIIを添加し、混合した。15分間おきに、反応物をピペットで混合した。3時間にわたる反応の後、混合物を濾過し、試料を採取して、SDSPAGE解析にかけた。濾過物の半分を用いて、さらなる反応を行った。10kDaMilliporeBiomax限外濾過デバイスを用いて、ST3GalIIIを、約30μlへと濃縮した。基質1およびST3GalIIIを、濾過物へと添加した。混合物を、32°Cでインキュベートした。1時間後および23時間後に試料を採取し、SDSPAGEにかけた。試料のSDSPAGE解析100μlのFVIII緩衝液により、1μlの試料を希釈した。各試料から25μlずつを2連で採取し、トロンビンによる前処理を伴う解析、またはトロンビンによる前処理を伴わない解析にかけた。SilverQuestにより、ゲルを染色した。レーン2野生型Bドメイン欠失FVIII2つの強いバンドが、重鎖および軽鎖に対応し、強度の低いバンドが単鎖に対応する。3シアリダーゼを伴う3時間後における反応混合物レーン1と同一。4および5基質1およびST3GalIIIを伴う1時間後と23時間後における反応混合物レーン2と同一であるが、ST3GalIIIに対応するさらなるバンドを伴う。7野生型Bドメイン欠失FVIII軽鎖、A1ドメイン、およびA2ドメインに対応する一連のバンド。8シアリダーゼを伴う3時間後における反応混合物レーン7と同一。9および10基質1およびST3GalIIIを伴う1時間後と23時間後における反応混合物。レーン7および8と酷似するが、脂肪酸部分による基質1の修飾に対応して、A1バンドおよびA3C1C2バンドが、高分子量側へとわずかにシフトしていたことが注目される。SDSPAGE解析は、C16ガンマGluシアル酸の1~4基が、野生型Bドメイン欠失FVIIIのアシアロNグリカンに結合する証拠をもたらした。この例は、基質1が、FVIIIに連結されうることを示す。高度に疎水性の脂肪酸含有基質が、水に遊離して可溶性であり、緩衝液中の操作も容易であることは、驚くべきことである。基質1とST3GalIIIとによる反応を介する、Nグリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII化合物5の調製アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIII、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロース中に56ナノモルを、ST3GalIIIおよび基質1で処理した。反応物を、32°Cで22時間にわたりインキュベートした。試料を採取して、SDSPAGE解析にかけた。次いで、CMPNAN溶液中に31マイクロモルを添加し、32°Cで1時間にわたりインキュベートした。反応混合物を、約18mlの緩衝液により19mlまで希釈した。そのときの塩濃度は、約28mMであった。溶液を、10mlの緩衝液で平衡化したAIECスピンカラムへと投入した。次いで、カラムを、12倍濃度の緩衝液10ml、22倍濃度の緩衝液10ml、32倍濃度の緩衝液10mlで洗浄した。最後に、FVIIIコンジュゲートを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73、1MのNaClで溶出させた。コンジュゲートを1ml中に回収した。回収したコンジュゲートを、Superdex2001030GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースで溶出させた。溶出物は、約04カラム容量に1つのピーク、および約060カラム容量に別のピークを含有した。最初のピークは、SDSPAGEにより、ST3GalIII酵素として同定された。第2のピークは、35ml中に226μgとして単離されたコンジュゲートを含有した。トロンビンによりあらかじめ切断させた状態で、非還元SDSPAGEにより生成物を特徴づけたが、これによれば、修飾グリカンを含有するA1およびA3C1C2に対応するバンドが、高分子量側へとわずかにシフトした。この例では、基質1がFVIIIのNグリカンに連結され、クロマトグラフィーステップにより、コンジュゲートが単離された。連結は、容易に実施された。基質3とST3GalIIIとによる反応を介する、Nグリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII化合物6の調製アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIII、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロース中に56ナノモルを、ST3GalIIIおよび基質3で処理した。反応物を、32°Cで215時間にわたりインキュベートした。試料を採取して、SDSPAGE解析にかけた。次いで、CMPNAN溶液中に31マイクロモルを添加し、32°Cで1時間にわたりインキュベートした。反応混合物を、約18mlの緩衝液で19mlまで希釈した。そのときの塩濃度は、約28mMであった。次いで、実施例9で概観した通りに、生成物を、AIECスピンカラムにより精製した。コンジュゲートを1ml中に回収した。回収したコンジュゲートを、Superdex20010300GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースで溶出させた。溶出物は、約043カラム容量に1つのピーク、および約058カラム容量に別のピークを含有した。最初のピークは、SDSPAGEにより、ST3GalIII酵素として同定された。第2のピークは、25ml中に273μgとして単離されたコンジュゲートを含有した。トロンビンによりあらかじめ切断させた状態で、非還元SDSPAGEにより生成物を特徴づけたが、これによれば、修飾グリカンを含有するA1およびA3C1C2に対応するバンドが、高分子量側へと明確にシフトした。この例では、基質3がFVIIIのNグリカンに連結され、クロマトグラフィーステップにより、コンジュゲートが単離された。基質3とST3GalIとによる反応を介する、Oグリカン修飾野生型Bドメイン欠失FVIII化合物7の調製緩衝液中の野生型Bドメイン欠失FVIIIを、シアリダーゼ、12μl、043mgml、130UmlChristensenおよびEgebjerg、BiotechnolApplBiochem、41、225~231頁を参照されたい、HISST3GalIおよび基質3と混合した。混合物を32°Cで25時間にわたりインキュベートし、その後、シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより、コンジュゲートFVIIIを単離した。この物質を、固定化シクロデキストリンカラムへと投入し、18mlの出発緩衝液で洗浄した。100の溶出緩衝液までの段階として溶出を実施したところ、25ml中に730μgとして、生成物が溶出された。次いで、生成物を、CMPNANおよびMBPSBDST3GalIIIにより、32°Cで1時間にわたり処理し、凍結させた。融解後、実施例9で概観した通りに、生成物を、AIECスピンカラムにより精製し、5倍濃度の緩衝液350μlで最終的な溶出を実施し、700ul中に586μgのコンジュゲートを得た。得られたコンジュゲートを、Superdex2001030GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースで溶出させた。溶出物は、058カラム容量に1つの主要なピークを含有し、これを回収したところ、25ml中に348μgのコンジュゲートを含有した。非還元SDSPAGEにより生成物を特徴づけたが、これにより、修飾グリカンを含有するHCに対応するバンドが、高分子量側へとわずかにシフトしたことが示される。また、野生型Bドメイン欠失FVIIIをスパイクした解析的シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィー、およびこれをスパイクしない解析的シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより、該コンジュゲートは、シクロデキストリンに結合するが、野生型Bドメイン欠失FVIIIは、シクロデキストリンに結合しないことが分かった。OグリカンをPEG化しNグリカンを疎水性側鎖基により修飾した野生型Bドメイン欠失FVIII化合物8の調製WO2009108806A1において説明される通りに、野生型Bドメイン欠失FVIIIを、シアリダーゼ、ST3GalI、および40kDaのPSCを用いるPEG化反応にかけた。反応の完了後、生成物を、Superdex2001030GLゲル濾過カラムに適用し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73、25mMのNaClで溶出させた。PEG化FVIIIを含有する生成物は、038~054カラム容量における、部分的に分離した2つのピークとして溶出した。実施例9で概観した通りに、このプールを、AIECスピンカラムにより精製し、3倍濃度の緩衝液300μl、により最終的な溶出を実施し、PEG化FVIIIを600μl中240μgとした。次に、生成物を、MBPSBDST3GalIIIおよび基質3で処理した。反応混合物を32°Cで20時間にわたりインキュベートし、その後、CMPNANを添加し、32°Cで1時間にわたり反応させた。次いで、反応混合物を、80°Cで凍結させた。融解させた試料を、25mlの緩衝液で希釈し、実施例9で概観した通りに、AIECスピンカラム上で精製した。3倍濃度の緩衝液250μlにより最終的な溶出を実施した。プールを、Superdex2001030GLゲル濾過カラムに適用し、ヒスチジン、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースで溶出させた。溶出物は、非PEG化FVIIIを含有する058カラム容量における1つのピーク、および約043カラム容量付近における2つの非分離ピークを含有した。早期におけるこれらの2つのピークの溶出が、おそらくST3GalIIIであるのに対し、後期における溶出ピークは所望の化合物を含有した。低量のST3GalIIIと共に所望の化合物を含有する画分を回収したところ、非還元SDSPAGEは、HCが高分子量側へとシフトすることを示したが、これは、PEGのOグリカンへの結合と符合した。トロンビンによりあらかじめ切断させた状態での非還元SDSPAGEは、修飾グリカンを含有する、A1およびA3C1C2に対応するバンドが、高分子量側へとシフトすることを示したが、これは、基質3のNグリカンへの結合と符合した。アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIIIアシアロ野生型Bドメイン欠失FVIIIは、2つの経路を介して、野生型Bドメイン欠失FVIIIをシアリダーゼで処理することにより得た。第1の経路は、シアリルトランスフェラーゼを介して、FVIIIのOグリカンまたはNグリカンに修飾基を連結する直前または連結するのと同時に、野生型Bドメイン欠失FVIIIをシアリダーゼで処理することを包含した。これは、実施例8、11、および12で説明されている。代替的に、アシアロ野生型Bドメイン欠失FVIIIは、以下の方式でも得られた。WO2009108806A1において説明される通りに、野生型Bドメイン欠失FVIIIを、シアリダーゼ、ST3GalI、および40kDaのPSCを用いるPEG化反応にかけた。反応の完了後、AIECにより、アシアロFVIIIを、PEG化FVIIIから分離した。最後に、MonoQAIECカラムを用いて、アシアロFVIIIを緩衝液交換した。82mlの緩衝液中でAIECから単離された合計374mgのアシアロFVIIIを、MQ水で希釈して、12mScmの導電性を得、緩衝液、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースで平衡化したカラムへと投入した。緩衝液、CaCl2、Tween80、NaCl、スクロースの勾配を用いて、生成物を溶出させた。約500mMのNaClで生成物を溶出させた。基質4のアシアロトランスフェリンへの酵素的連結。Nグリカン修飾トランスフェリンの調製基質4を、20HPCDを含有する100μlのイミダゾール緩衝液中で溶解させた。200μlのイミダゾール緩衝液中のアシアロトランスフェリン溶液を添加した後、20μlのHepes緩衝液のグリセロール、pH70中のMBPSBDST3GalIII酵素を添加した。混合物に、さらなるイミダゾール緩衝液を添加して、全反応物容量を400μlとし、次いで、室温で2時間にわたりインキュベートした。LCMSDTOFにより、反応混合物を解析し、300~2000Daで測定したスペクトルに、デコンボリューションアルゴリズムを適用した。ピーク強度に基づき生成物の分布非反応アシアロトランスフェリンモノ誘導体化アシアロトランスフェリン二重誘導体化アシアロトランスフェリンを計算した。この例は、基質4の疎水性側鎖基が、ポリペプチドのアシアログリカンへと転移したことを検証するために、形成された生成物の質量を示す解析データを、後に得ることが可能であることを示す。疎水性側鎖基とコンジュゲートされたFVIIIのアルブミン結合GEHealthcareinstructionleaflet71700600ATに従い、HiTrapNHSカラムを用いて、セファロースHSAカラムを調製した。置換は、10マイクロモルmlであった。SigmaによるHSAを用いた。1mlの緩衝液中に1mgの量を、連結に用いた。上述の指示書冊子において説明されるプロトコールにより、連結効率を、71と決定した。以下の条件で、カラムを用いた流速05ml分平衡化緩衝液A緩衝液20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、pH73、10のグリセロール溶出緩衝液B緩衝液A緩衝液中に20mMのヒドロキシプロピルシクロデキストリン温度22°C検出蛍光検出励起波長315nm、発光波長375nm0~20から、60を経て、100へと段階を踏む、B緩衝液の段階的勾配を用いた。3つの試料を、次の方式1ブランク試料ピークではなく、ヒドロキシルプロピルシクロデキストリンの段階的勾配に対応する、強度が低く幅の広いシグナルを示すこと2野生型Bドメイン欠失FVIII試料保持時間25分において、カラムの空容量に対応するピークを示すので、このタンパク質は、カラムに対するアフィニティーを有さないこと3実施例10の化合物6と同様に調製されたアルブミン結合剤とのFVIIIコンジュゲートの粗反応混合物試料20のB緩衝液における溶出に対応する、保持時間75分のピークに加えて、保持時間25分において、カラムの空容量に対応するピークを示す。したがって、該タンパク質の画分は、カラムに結合した。この画分を単離したところ、化合物6に対応する、疎水性側鎖により修飾されたFVIIIであることが判明した。これは、SDSPAGE解析における、軽鎖および重鎖に対応するバンドのシフトを観察することにより決定したことにより調べた。類似の実験では、試料2または3のタンパク質のうちのいずれも、固定化タンパク質を含有しないカラムには結合しないことが判明した。この例は、実験の条件下では、野生型Bドメイン欠失FVIIIが、HSAに結合しないのに対し、化合物6に対応する、疎水性側鎖で修飾したFVIII誘導体は、HSAに結合することを示す。疎水性側鎖とコンジュゲートされたFVIIIの、invitroにおける活性の特徴づけ以下の通りに、CoatestSP試薬を用いるFVIII比色アッセイにおいて、FVIII誘導体5~8のFVIII活性を評価したCoatestアッセイ緩衝液中で、FVIII試料およびFVIII基準物質を希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレートに二連で添加した。CoatestSPキットによる因子IXa因子X試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を、513で混合し、このうちの75μlを、ウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後、50μlの因子Xa基質S2765トロンビン阻害剤I2581ミックスを添加し、反応物を室温で10分間にわたりインキュベートしてから、pH3の1Mクエン酸25μlを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー上で、415nmにおける吸光度を測定した。陰性対照による値を、すべての試料から減じ、FVIII濃度と対比してプロットした吸光度値の線形回帰により、検量線を作成した。試料の活性を、HPLCにより決定されるタンパク質濃度で除することにより、比活性を計算した。一段階血栓アッセイにおいて測定されたFVIIIC以下の通り、一段階FVIII血栓アッセイにより、FVIII誘導体5~8のFVIIICをさらに評価した。HBSBSA緩衝液中で、FVIII誘導体試料およびFVIII基準物質を、約10Umlまで希釈した後、VWFを含有するFVIII欠損血漿中で10倍に希釈した。その後、試料を、HBSBSA緩衝液中で希釈した。単一因子プログラムを用いて、ACL300R測定器またはACL5000測定器上で、APTT血栓形成時間を測定した。VWFを伴うFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、SynthASilInstrumentationLaboratoryをaPTT試薬として用いた。血栓測定器では、希釈した試料または基準物質を、37°Cで、FVIII欠損血漿およびaPTT試薬と混合した。塩化カルシウムを添加し、血栓形成までの時間を、濁度により決定した。FVIII基準物質の希釈液による血栓形成時間の検量線に基づき、試料中のFVIIICを計算した。Table2におけるデータは、FVIII誘導体5~8に対する血栓アッセイにより測定されたFVIIICの比活性が、良好~極めて良好であったことを裏付ける。疎水性側鎖とコンジュゲートされたFVIIIの薬物動態的特徴づけrFVIII変異体の薬物動態を、FVIII欠損マウスマウスまたはvWF欠損マウスにおいて評価した。vWFKOマウスのFVIIICが13で正常であったのに対し、FVIIIKOマウスは、FVIIICが検出可能でなかった。体重約25グラムで16~28週齢の範囲の雄および雌の混合集団を用いた。マウスには、尾静脈に単回の静脈内rFVIII注射を施した。投与の64時間後までの時点において、コーティングなしのガラス細管を用いて、眼窩静脈叢から血液を採取した。各マウスから3回ずつ試料を採取し、各時点において2~4例ずつの試料を採取した。クエン酸ナトリウムにより、血液を速やかに安定化させ、4倍濃度のFVIIICoatestSP緩衝液中で希釈してから、4000×gで5分間にわたる遠心分離にかけた。希釈した血液から得た血漿を、ドライアイス上で凍結させ、80°Cで保存した。実施例16で説明した通り、比色アッセイにおいて、FVIIICを決定した。WinNonlinProversion41ソフトウェアを用いる、ノンコンパートメント法により、薬物動態解析を実施した。Table3は、薬物動態パラメータ半減期、クリアランス、および平均滞留時間についての推定値を示す。データは、FVIIIが疎水性側鎖とコンジュゲートされると、クリアランスが減少し、半減期および平均滞留時間が延長されることを示す。Nグリカンを疎水性側鎖で修飾したFVIIaの調製以下の試薬を用いた。アシアロFVIIaGlyGly緩衝液、pH6中500μl、13ナノモルを用いた。基質12mgml30μlまたは32ナノモルを用いた。MBPSBPST3GalIII12Uml100μlを用いた。アシアロFVIIaとは、シアリダーゼで前処理され、精製された、組換えFVIIaを指した。アシアロFVIIaを融解させ、基質1およびST3GalIIIを添加した。混合物を、32°Cでインキュベートした。110分後、試料を、シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより分離した。クロマトグラムは、2つのピークを含有した。SDSPAGEを用いて、FVIIa重鎖およびFVIIa軽鎖の分子量の増大により示される通り、最初の溶出ピークは、非修飾アシアロFVIIaに対応し、最後の溶出ピークは、アルブミン結合剤で修飾したアシアロFVIIaに対応した。この例は、FVIIaの、そのNグリカンにおける、基質3の疎水性側鎖による修飾が可能であることを示す。Nグリカンを疎水性側鎖で修飾したFIXの調製以下の試薬を用いたFIX10mMのヒスチジン、3mMのCaCl2、50mMのNaClによる緩衝液、pH6中。緩衝液により、100μlを1mlまで希釈した。100μlを用いた。基質12mgml75μlを用いた。MBPSBPST3GalIII12Uml25μlを用いた。シアリダーゼノイラミニダーゼアガロース上に50μlPierceスピンカラムを用いて、シアリダーゼをスピンダウンし、500μlの水で2回にわたり洗浄し、次いで、緩衝液により3回にわたり洗浄した。洗浄したシアリダーゼをスピンダウンし、これを、融解させたFIXに添加した。反応物を、室温で一晩にわたり静かに振とうし、次いで、Pierceスピンカラムを用いて濾過した。アシアロFIXを含有する、結果として得られる濾過物に、基質1およびST3GalIIIを施し、32°Cで46時間にわたりインキュベートした。反応混合物の試料を、シクロデキストリンアフィニティークロマトグラフィーにより分離した。クロマトグラムは、2つのピークを含有した。SDSPAGEを用いて、FVIIa重鎖およびFVIIa軽鎖の分子量の増大により示される通り、最初の溶出ピークは、非修飾アシアロFVIXに対応し、最後の溶出ピークは、アルブミン結合剤で修飾したアシアロFIXに対応した。ゲルはまた、FIXが自己活性化することにより生成する少量のFIXaの存在も示した。この例は、FIXの、そのNグリカンにおける、基質3の疎水性側鎖による修飾が可能であることを示す。