"被験対象の心臓血管疾患を治療するための方法であって、リンゴ果皮抽出物を有効量投与して前記被験対象の心臓血管疾患を治療することを含むことを特徴とする方法。請求項1に記載の方法において、前記リンゴ果皮抽出物が、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物QAEであることを特徴とする方法。請求項1または2に記載の方法において、低密度リポタンパク質LDLの酸化が、前記被験対象において阻害されることを特徴とする方法。請求項1~3のいずれか一項に記載の方法において、コレステロール値が、前記被験対象において低下することを特徴とする方法。請求項4に記載の方法において、血液コレステロール値が、前記被験対象において低下することを特徴とする方法。請求項1~5のいずれか一項に記載の方法において、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、または高脂血症が、前記被験対象において治療されることを特徴とする方法。被験対象の心臓血管の健康を維持するための方法であって、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物QAEを有効量投与することを含む方法。ケルセチンに富んだリンゴ抽出物QAEを含むことを特徴とする医薬組成物または栄養補助食品組成物。被験対象の心臓血管疾患の治療、低密度リポタンパク質酸化の阻害、コレステロール値の低減、または心臓血管の健康の維持のための、請求項8に記載の医薬組成物または栄養補助食品組成物。請求項8または9に記載の組成物において、前記組成物が、機能性食品、健康補助食品、または食物製品もしくは飲料製品であることを特徴とする方法。請求項1~7のいずれか1項に記載の方法において、二次治療薬の投与をさらに含むことを特徴とする方法。請求項11に記載の方法において、前記二次治療薬が、コレステロール低下剤、抗酸化剤、アセチルサリチル酸、および/または心臓血管疾患の治療のための別の薬剤であることを特徴とする方法。請求項12に記載の方法において、前記二次治療薬が、スタチン、ビタミンC、および/またはビタミンEであることを特徴とする方法。請求項11~13のいずれか一項に記載の方法において、前記二次薬および前記リンゴ果皮抽出物が、同時に投与されることを特徴とする方法。請求項11~13のいずれか一項に記載の方法において、前記二次薬および前記リンゴ果皮抽出物が、連続的に投与されることを特徴とする方法。被験対象の心臓血管疾患を治療するための、具体的には、コレステロール値を低下させ、かつ/または低密度リポタンパク質LDLの酸化を阻害するためのリンゴ果皮抽出物が本明細書に提供される。ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物またはトリテルペンに富んだリンゴ抽出物TAEならびにこの抽出物を含有する健康補助食品および/または食物製品および飲料製品を含む医薬組成物および栄養補助食品組成物もまた提供される。血中総コレステロール、特にLDL値の上昇およびLDL酸化は、心臓血管疾患にとって第一の危険因子と長い間考えられてきた。有害または望ましくない副作用を引き起こすことなく、血中コレステロール値を維持または制御するための天然の健康製品に大いなる関心が持たれている。リンゴは西洋の食事で最も広く摂取される果物であり、いくつかの植物性生理活性物質を含有することが知られている。例えば、フラボノイドおよびトリテルペンは、リンゴ果皮の主要な植物性化学物質の1つである図1に示す。果皮中のポリフェノール含量は、果肉中よりも約2~6倍高くBoyerandLiu,Nutr.J.,2004,3:5、したがって、果皮抽出物には果肉抽出物よりも高い抗酸化活性があるTsaoetal.,J.Agric.FoodChem.,2005,53:4989-4995。いくつかのポリフェノールの中では、フラバノールカテキンおよびオリゴマープロシアニジン、ヒドロキシ桂皮酸、ジヒドロカルコン、フロボノールflovonol、およびアントシアニンが、赤リンゴ果皮に見出される主要な化合物であるWojdyloetal.,J.Agric.FoodChem.,2008,56:6520-6530。トリテルペンは、最も豊富にあるウルソール酸とともにCefarellietal.,J.Agric.FoodChem.,2006,54:803-809、リンゴ果皮中の別の主成分であるHeandLiu,J.Agric.FoodChem.,2008,56:9905-9910。リンゴ果皮からの生理活性物質に富んだ2種の抽出物が、NovaScotiaAgriculturalCollegeのTree-FruitBio-products研究室で調製された。ここで、抽出物の一方はケルセチンに富んだ抽出物QAEであり、他方はトリテルペンに富んだ抽出物TAEであった。これらの抽出物は、invitroでLDL酸化阻害を阻害する能力、およびinvivoで高コレステロール血症および酸化ストレスのマーカーに影響を与える能力について検討された。これら抽出物の抗酸化効果が最初にinvitroで試験され、次いで、食餌で誘導した高コレステロール血症のハムスターモデルにおけるコレステロールの代謝およびホメオスタシスに対するQAEおよびTAEの効果が検討された。両方の抽出物のinvivoでの抗酸化能も酸化ストレスのマーカーとして測定された。我々は、invitroでのヒトLDLの酸化およびinvivoでの動物モデルにおけるコレステロール代謝に対する、2種のリンゴ抽出物、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物QAEおよびトリテルペンに富んだリンゴ抽出物TAEの効果を本明細書に報告する。2種のリンゴ抽出物は、invitroにおけるCu2誘導およびペルオキシルラジカル誘導のLDL酸化を、それぞれ0.5~5mgL-1および50~200mgL-1の濃度で効果的に阻害した。我々は、その抗酸化特性に加えて、QAEがハムスターモデルにおける血中コレステロールを低下させることができることを示す。したがって、被験対象のLDL酸化を阻害するための方法であって、被験対象にQAEまたはTAEを投与してLDL酸化を阻害することを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、QAEおよび/またはTAEを含むリンゴ果皮抽出物が投与される。別の実施形態では、LDLのフリーラジカル酸化が阻害される。さらに別の実施形態では、Cu2誘導および/またはペルオキシルラジカル誘導LDL酸化が阻害される。別の態様では、被験対象の血清および/または肝臓コレステロール値が低下する。その必要のある被験対象の血中コレステロールを低下させるための方法であって、被験対象にQAEおよび/またはTAEを投与することを含む方法が本明細書にさらに提供される。一実施形態では、QAEが被験対象に投与される。別の態様では、コレステロール代謝を調節するための方法であって、被験対象にQAEおよび/またはTAEを投与することを含む方法が提供される。一態様では、被験対象の血清および/またはコレステロール値を低下させる。本発明は、アテローム斑の減少および/または総血清コレステロール、トリグリセリド、血清LDLコレステロール、および/または血清HDLコレステロール値の低減のための組成物および方法にさらに関する。さらなる態様では、被験対象の心臓血管疾患を治療するための方法であって、被験対象にQAEおよび/またはTAEを投与することを含む方法が本明細書に提供される。一実施形態では、心臓血管疾患は、被験対象におけるLDL酸化の阻害、血清および/または肝臓のコレステロール値の低減、および/またはコレステロール代謝の調節によって治療または予防することができる。心臓血管疾患とは、心臓、血液、およびリンパ管を含む循環系の一群の疾患を指す。心臓血管疾患は世界的に一番の死因である。最も一般的な心臓血管疾患は冠性心疾患および脳卒中である。本発明の方法によって予防または治療することができる心臓血管疾患の非限定例としては、冠性心疾患心筋に供給する血管の疾患、脳血管疾患脳に供給する血管の疾患、末梢動脈疾患腕および脚に供給する血管の疾患、リウマチ性心疾患連鎖球菌に起因するリウマチ熱による心筋および心臓弁の損傷、先天性心疾患誕生時に存在する心臓構造の奇形、深部静脈血栓症および肺塞栓症心臓および肺に移動および移入し得る下肢静脈中の血餅、高脂血症過剰なLDLなどの血中脂質量、高血圧、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、心不全、心リズム欠陥、動脈硬化症、心臓発作、および脳卒中が挙げられる。心臓発作および脳卒中は、通常急性イベントであり、血液が心臓または脳に流れることを妨げる閉塞物によって主に引き起こされる。これに対する最も一般的な理由は、心臓または脳に供給する血管の内壁上の脂肪沈着物の蓄積である。脳卒中もまた、脳血管または血栓からの出血によって引き起こされ得る。多くの様々な種類のリンゴが、これらに限定されないが、アンブロシアAmbrosia、アーカンソーブラックArkansasblack、ブラエバーンBraeburn、コートランドCortland、エンパイアーEmpire、フジFuji、ジョナソンJonathon、ゴールデンデリシャスGoldendelicious、グラニースミスGrannysmith、ガラGala、グラベンシュタインGravenstein、ハニークリスプHoneycrisp、イダレッドIdared、マッキントシュMcintosh、ニュートンピピンNewtownpippin、ノーザンスパイNorthernspy、ピンクレディーPinklady、レッドデリシャスReddelicious、ロームビューティーRomebeauty、ルセットRusset、スノーSnow、スパルタンSpartan、およびワインサップWinesapを含めて知られている。本明細書に記載のQAEおよびTAE抽出物は、所望の任意のリンゴ種から調製することができると考えられる。当業者は、共通の一般知識を使用し、入手可能性、栄養素含量、コスト、皮むきの容易さ等のいくつかの要素に応じて、本発明の抽出物を調製するのに適したリンゴを選ぶことになる。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ケルセチン-3-O-ルチノシドおよび/またはウルソール酸など、リンゴ果皮抽出物の1つまたは複数の成分を含むことができる。別の態様では、本明細書に記載のQAEおよび/またはTAE抽出物を含む新規組成物が本明細書に提供される。例えば、経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが所定量の抽出物を含有するカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤などの個別の単位として、または水中油型液状エマルジョン、油中水型液状エマルジョンとして、もしくは水溶液内のサプリメントとして提供することができる。口腔への局所投与に適した製剤には、抽出物を含むロゼンジ剤、ゼラチンおよび/またはグリセリンまたはスクロースおよびアカシアの中に抽出物を含むトローチ剤が含まれる。本明細書に言及の抽出物に加えて、本発明の組成物は、当該組成物のタイプに関して当技術分野で従来からある他の添加物を含むことができることを理解されたい。例えば、経口投与に適した製剤は、甘味料、増粘剤、および香味料などのさらなる添加物を含むことができる。さらに、製剤は、水性または非水性の希釈剤中の有効成分の懸濁液、溶液、およびエマルジョン、シロップ、顆粒、または粉末の形態とすることもできる。このような組成物は薬学のいずれの方法によっても調製することができるが、すべての方法は、有効成分または抽出物を、担体として必要な1つまたは複数の成分と合わせるステップを含む。一般に、組成物は、有効成分例えば抽出物を液体担体もしくは微粉固体担体またはその両方と均一にかつ細かく混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の形態に成形することにより調製される。例えば、錠剤は、場合によっては1つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形することにより調製することができる。圧縮錠剤は、粉末または果粒などの流動性形態の有効成分を、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合して、適切なマシン中で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、湿潤した粉末状化合物と不活性な液体希釈剤との混合物を、適切なマシン中で成形することにより作製することができる。例えば、一実施形態では、各錠剤は、抽出物を約2.5mg~約500mg含有することができ、各サッシェ剤またはカプセル剤は、抽出物を約2.5~約500mg含有することができる。別の実施形態では、心臓血管疾患の治療、LDL酸化の阻害、またはコレステロール値の低減のための適切な投薬量範囲は、例えば、1日に、kg体重当たり化合物約0.01mg~約100mg、好ましくはkg当たり約0.1mg~約10mgである。予防量および/または治療量は経験的に決定することができ、治療されている被験対象に応じて、例えば被験対象の症状、体重などに応じて変動することになる。同様に、適切な投薬製剤および薬剤の投与方法は、当業者が容易に決定することができる。例えば、1日投薬量は、ある期間を通して1回、2回、またはそれ以上の回数で投与するのに適した形態で、1つ、2つ、またはそれ以上の用量に分割することができる。本発明の抽出物、組成物、および方法は、他の適切な組成物および治療と併用することができると考えられる。したがって、本発明の組成物および方法では、本発明の抽出物は、単独でまたは外科手術、ホルモン療法、および/または他の治療薬と併用して投与することができる。他剤との併用投与には、同時投与第1および第2の薬剤の同時投与および連続投与第1の薬剤に続いて第2の薬剤を投与、または第2の薬剤に続いて第1の薬剤を投与が含まれる。本明細書に記載の方法の範囲内で使用される薬剤の併用は、治療対象の症状または疾患に対して、相加的または相乗的治療効果を発揮することができる。本明細書に記載の方法の範囲内で使用される薬剤の併用はまた、単独で、すなわち他剤と併用することなく投与される場合に起こる、これらの薬剤の少なくとも1つと関連した有害作用を低減することができる。例えば、一方の薬剤の副作用の毒性が他方により減弱される場合、それによって、より高い投薬量、患者のコンプライアンスの改善、または治療アウトカムの改善が可能になる。医師は、より低い投薬量を使用し、したがって有害な副作用を最小限に抑えながら、それまでに認識されていた薬物の臨床的有益性を達成することができる。さらに、同時に投与され、異なる標的に作用する2種の薬剤は、相乗的に作用して、疾患進行または症候を緩和または寛解させることができる。例えば、心臓血管疾患の治療、LDL酸化の阻害、および/またはコレステロール値の低減のための多くの薬剤が知られており、また使用されている。本発明の組成物および方法と併用して使用することが考えられる治療薬の非限定例としては、スタチン、胆汁酸吸収阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、フィブラート系薬剤、低コレステロール血症薬、高コレステロール血症薬、プロブコール、N,N’-ジフェニレンジアミン、ブチルヒドロキシアニソールBHA、およびブチルヒドロキシトルエンBHTなどの抗酸化剤が挙げられるZipesetal.Eds.,2005,Braunwald’sHeartDisease,ElsevierSaunders,Philadelphia。他の例としては、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、β-アドレナリン遮断薬、アセチルサリチル酸ASA、カルシウム拮抗薬、ニトログリセリン、血栓溶解薬、およびPlavix登録商標が挙げられる。最も一般的なコレステロール低下薬は、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンなどのスタチンである。コレステロールを低下させる別の種類の薬物は、コレセベラム、コレスチラミン、およびコレスチポールなどの樹脂剤である。フェノフィブレートおよびジェムフィブロジルなどのフィブラート系薬剤およびニコチン酸ナイアシンもまた、コレステロールを低下させるために使用される。したがって、本発明の抽出物、組成物、および方法は、心臓血管疾患の予防または治療、LDL酸化の阻害、および/またはコレステロール値の低減の作用が知られている他の医薬品または生理活性物質と同時にまたは連続して投与することができる。一実施形態では、その必要のある被験対象の心臓血管疾患の治療、LDL酸化の阻害、および/またはコレステロール値の低減の方法であって、本発明の抽出物または組成物を含む第1の薬剤の有効量および第2の薬剤を投与することを含む方法が本明細書に提供される。第2の薬剤は、例えば、スタチンなどのコレステロール低下薬、プロブコール、ビタミンC、もしくはビタミンEなどの抗酸化剤、ASA、または当技術分野で知られている他の治療薬とすることができる。特定の実施形態では、第1および第2の薬剤は、同じ組成物または製剤に一緒にまとめられる。一実施形態では、その必要のある被験対象のコレステロール値を低下させるための方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、その必要のある被験対象のLDL酸化を阻害する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。さらに別の実施形態では、その必要のある被験対象の高脂血症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。さらにさらなる実施形態では、その必要のある被験対象の動脈硬化症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。別の実施形態では、その必要のある被験対象のアテローム性動脈硬化症を治療する方法であって、本発明の抽出物または組成物を治療有効量投与することを含む方法が本明細書に提供される。不健康な食事、運動不足、ストレス、および喫煙などの行動危険因子が、大部分の心臓血管疾患の原因である。したがって、現代の生活様式によるこの望ましくない結果を、有効な天然成分を用いて打破することができれば、さらに好都合であろう。例えば、食物製品または飲料製品に組み込むことができる天然成分が提供できれば、そのような製品は日常的に摂取されるので、好都合となろう。あるいは、このような有効な天然成分を、健康補助食品に組み込むことも可能であろう。したがって、本発明は、健康の改善または心臓血管疾患の治療用の栄養補助食品、健康補助食品、および/または食物製品もしくは飲料製品を製造するための、本発明の抽出物および組成物の使用にさらに関する。本明細書で使用する用語栄養補助食品は、栄養用途および医薬用途の両分野における有用性を示す。したがって、新規の栄養補助食品抽出物および組成物は、食品および飲料へのサプリメントとしての使用、ならびにカプセル剤もしくは錠剤などの固体製剤、または溶液もしくは懸濁液などの液体製剤とすることができる医薬製剤または医薬品としての使用を見出すことができる。前述から明らかなように、栄養補助食品組成物という用語はまた、組成物および場合によっては炭水化物を含有する本抽出物を含む食品および飲料ならびに前述の有効な抽出物を含むサプリメント組成物、例えば健康補助食品を含む。本明細書で使用する用語健康補助食品は、食餌の補充を意図する健康補助成分を含有し、口から摂取される製品を示す。これらの製品中の健康補助成分としては、ビタミン、ミネラル、薬草または他の植物成分、アミノ酸、ならびに酵素、器官組織、腺、および代謝産物などの物質を挙げることができる。健康補助食品はまた、抽出物であっても濃縮物であってもよく、錠剤、カプセル、軟ゲル、ゲルキャップ、液体、または粉末など多くの形態で与えることができる。健康補助食品はまた、バーなどの他の形態とすることもできるが、その場合、健康補助食品のラベル上の情報は、従来の食品としてまたはミールもしくは食餌の唯一のアイテムとしてその製品を表示することは一般にない。マルチビタミンおよびミネラルサプリメントを本発明の栄養補助食品組成物に加えると、一部の食餌には欠けている必須栄養素を適当量得ることができる。マルチビタミンおよびミネラルサプリメントはまた、生活様式パターンおよびよくある不適切な食餌パターンによる栄養素の消失および欠乏に対する疾患予防および防止のために有用となり得る。さらに、αトコフェロールビタミンEおよびアスコルビン酸ビタミンCなどの抗酸化剤によるオキシダントストレス制御は、心臓血管疾患の治療において有用となり得る。したがって、上記有効物質に加えてマルチビタミンサプリメントを摂取すると、十分バランスのとれた栄養を維持することができる。さらに、マグネシウムMg2、カルシウムCa2、および/またはカリウムKなどのミネラルと本抽出物および組成物との組合せは、健康の改善および心臓血管疾患を含む疾患の治療に使用することができる。本発明のさらなる実施形態では、心臓血管の健康の維持を支援するのに適し、本発明の抽出物および組成物を含む、食物製品もしくは飲料製品またはその中に組み込むことができる成分が提供される。一実施形態では、許容可能な安定性および/または感覚受容特性、例えばまったくないかまたは許容可能なレベルの苦味などの良好な味を有する、食物製品もしくは飲料製品またはその中に組み込むことができる成分が提供される。別の実施形態では、心臓血管疾患の予防を援助しかつ/または心臓血管の健康の維持を支援するなど、健康有益性を与える成分を高濃度含む食物製品または飲料製品が提供される。したがって、一実施形態では、心臓血管の健康維持のための機能性食物製品を製造するための、本抽出物およびその組成物の使用が提供される。本発明の抽出物および組成物のさらなる利点は、それらを食物製品または飲料製品に好都合に組み込んで、その安定性および/または感覚受容特性に許容できないほどの影響を与えることなく、機能性食物製品を製造することができることである。本発明の健康有益性薬healthbenefitagentは、健康有益性を与える、すなわち、健康面にプラスの効果を有する物質であるか、または、摂取された場合に、心臓血管の健康維持となる健康面の健全性を維持する助けとなる物質である。健康有益性とは、健康面にプラスの効果を有するか、または健康面の健全性を維持する助けとなることを意味する。本発明の機能性食物製品は、本発明の抽出物および組成物が成分として有効量使用され、その結果、食物製品の消費者に顕著な健康有益性が得られる、ヒト摂取に適した食物製品または飲料製品として定義される。本発明の栄養補助食品はいずれの食品タイプでもよい。これらは、食物製品に加えて、香料、糖、果物、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等の一般的な食品成分を適正量で含むことができる。したがって、一実施形態では、本発明の抽出物および組成物は、心臓血管疾患を改善するために添加物として健康食品に使用することができる。QAEまたはTAE抽出物は、単独で、または食品に適した従来の手順および含量によって他の食品もしくは食品成分と組み合わせて、食品添加物として使用することができる。所望の用途予防、健康管理、または治療に応じて、有効な成分の組合せを、共通の一般知識および技術的に認められた方法を使用して当業者が決定するような比で調整することができる。したがって、本発明の抽出物および組成物は、これらに限定されないが、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー、スナック、クッキー、ピザ、パスタ、麺、ガム、乳製品アイスクリーム、ミルクセーキ、ヨーグルト、またはミルクなど、スープ、飲料、茶、アルコール、および複合ビタミン剤を含む任意の種類の食品に実際上添加することができる。本発明の健康食品または飲料組成物は、従来の食品および飲料の場合のように、種々の甘味料または天然炭水化物をさらに含むことができる。好ましくは、天然炭水化物としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、マルトースおよびスクロースなどの二糖類、デキストリンおよびシクロデキストリンなどの多糖類、ならびにキシリトール、ソルビトール、およびエリトリトールなどの糖アルコール類を挙げることができる。甘味料としては、タウマチンおよびステビオシドなどの天然物質、ならびにサッカリンおよびアスパルテームなどの合成物質を挙げることができる。さらに、本発明の抽出物および組成物は、種々の栄養素、ビタミン、電解質、香味料、または着色剤、ならびにペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、保護コロイド、粘性促進剤、pH制御剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、または炭酸飲料のための炭酸化剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、天然果汁、果汁飲料、および野菜飲料を製造するための新鮮果肉を含むことができる。上述の成分は、独立してまたは組合せて使用することができる。本発明の目的のために、次の用語が下記に定義される。特許請求の範囲および/または本明細書において用語含むcomprisingと併せて使用される場合、単語aまたはanの使用は、1つのを意味することもあるが、1つまたは複数の、少なくとも1つの、1つまたは1より多くのという意味と一致することもある。同様に、単語別のanotherは少なくとも二番目またはそれより多くを意味することがある。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単語含むcomprisingならびにcompriseおよびcomprisesなどのcomprisingの任意の形態、有するhavingならびにhaveおよびhasなどのhavingの任意の形態、含むincludingならびにincludeおよびincludesなどのincludingの任意の形態、または含有するcontainingならびにcontainおよびcontainsなどのcontainingの任意の形態は、包含的すなわちオープンエンド形式であり、追加の列挙していない要素または工程ステップを除外しない。用語阻害は、化学的または生化学的作用の実質的な緩慢化、妨害、抑制、防止、遅延、および/または阻止を意味するように意図される。用語阻害剤は、化学的作用を実質的に緩慢化、妨害、抑制、防止、遅延、および/または阻止する化合物、薬物、または試剤を意味するように意図される。用語治療または治療するは、被験対象における疾患状態の改善または被験対象における疾患もしくは病状に付随した症候の改善など、所望の薬理的および/または生理的な効果を得ることを意味するように意図される。この効果は、疾患またはそれに付随した症候を完全にまたは部分的に防止する点で予防的であることも、かつ/または疾患および/またはその疾患に起因する病態生理学的な影響を部分的にまたは完全に緩解させる点で治療的であることもある。本明細書で使用される場合、治療は、哺乳動物の疾患のいずれの治療も包含し、以下のこと、すなわち、a疾患に罹患する可能性が大きいがまだそれに罹患していると診断されていない個体にその疾患または症状が発症することを予防すること心臓血管疾患を予防することなど、b疾患を阻害すること例えば、その進行を阻止すること、またはc疾患を緩和すること例えば、その疾患に付随した症候を軽減することを含む。用語治療上有効は、疾患もしくは病状に付随した症候を実質的に改善するか、または基礎疾患もしくは病状を改善、寛解、もしくは軽減するのに十分な薬剤量を意味するように意図される。例えば、心臓血管疾患の治療では、疾患のいずれの症候であっても軽減、予防、遅延、抑制、または阻止する薬剤であれば、治療上有効であろう。治療有効量の化合物により、疾患の発症を遅延、防止、もしくは予防するように、または疾患の症候を寛解するように、または疾患の期間を変更するように、その疾患を治療することができる。invivoまたはinvitroの任意の特定用途の具体的な有効量は、使用する具体的な薬剤の活性、年齢、体重、健康状態、性別、および/または個体の食餌、投与時間、投与ルート、排泄速度、薬物併用、および治療している特定疾患の重症度を含む種々の要因に依存することになる。例えば、有効量は、invivoまたはinvitroにおいてLDL酸化の阻害またはコレステロールの低減を達成するのに必要な本発明の抽出物または組成物の量とすることができる。本明細書で使用される場合、用語被験対象はヒトを含めた哺乳動物を含む。本明細書で使用される場合、用語担体は、リン酸緩衝生理食塩水、水、生理食塩水、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべての溶媒を含む。治療上または薬学的に有効な物質に対するこのような媒体および試剤の使用は、当技術分野で周知である。二次的な有効成分も組成物に組み込むことができる。本発明の医薬組成物は、薬学的にまたは治療上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って、製剤化することができる。製剤は、当業者に周知であり、容易に入手可能ないくつもの情報源に記載されている。例えば、Remington’sPharmaceuticalScienceMartinEW1995EastonPa.,MackPublishingCompany,19thed.は、本発明に関して使用することができる製剤を記載している。本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されるであろうが、これらの実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。他に定義されていない限り、または他に文脈上明確に指示されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価ないかなる方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができると理解されたい。材料および方法I.invitroアッセイ植物原料。QAEは、ジョナサン×ゴールデンデリシャスから生まれたリンゴ品種ジョナゴールドの果皮から抽出した。TAEは、ジョナサン×ウェージナーから生まれた品種であるイダレッドリンゴの果皮から抽出した。リンゴ果皮は、商用パイ製造業者、AppleValleyFoodsInc.,Kentville,NovaScotia,Canadain2006から集めた。皮をむいた直後に、リンゴ果皮粉末を、RupasingheらRupasingheetal.,J.Agric.FoodChem.,2010,58:1233-1239に記載のように、果皮から調製した。化学薬品。ヒト血漿から単離したLDL150mMNaCl、0.01EDTA、pH7.4中は、EMDChemicalsInc.Gibbstown,NJ,USAから購入した。Peroxoquant商標定量的過酸化物アッセイキットの脂質コンパティブルフォーミュレーションは、PierceBiotechnologyInc.Rockford,IL,USAから購入した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法SDS-PAGEに必要な試薬は、Bio-RadlaboratoriesMississauga,ON,Canadaから購入した。シアニジン-3-O-ガラクトシドおよびエピカテキンは、Indofinechemicalcompany,Inc.Hillsborough,NJ,USAから購入した。オレアノール酸およびコロリン酸は、ChromaDexCorporateIrvine,CA,USAから購入した。BHT、テトラ-ブチルヒドロキノンTBHQ、2,2’-アゾビス2-アミジノプロパンジヒドロクロリドAAPH、硫酸銅、2-チオバルビツール酸TBA、およびトリクロロ酢酸TCAは、Sigma-AldrichCanadaLtd.Oakville,ON,Canadaから購入した。96穴マイクロプレートは、FisherScientificOttawa,ON,Canadaから購入した。他のすべての化学薬品および試薬は、最高級純度のものを上述の供給業者から購入した。invivoケルセチン代謝産物は、PaulA.Kroon博士、プロジェクトリーダーPolyphenolsandHealth、InstituteofFoodResearch,NorwichResearchPark,NorwichNR47UAUKからの贈与であった。QAEおよびTAEの調製。Rupasingheetal.,J.Agric.FoodChem.,2010,58:1233-1239により記載のASE2の調製に準じて、QAEを調製した。QAEの原液は、95エタノールで調製し、-20°Cに保存した。アッセイを開始する前に、濃度に応じて、95エタノール中のQAEの必要量を、各ホウケイ酸チューブ13×10mm中、窒素下で乾燥した。この抽出物は水溶性であるので、酸化誘導の前に、乾燥抽出物をリン酸緩衝生理食塩水PBSおよびLDL混合物で再構成した。TAEは、下記のように調製した。リンゴ果皮粉末200gを、酢酸エチルEtOAc2Lによる還流下で、2時間加熱した。減圧および常温下で溶媒を除去した後に、緑色を帯びた固形残渣がフラスコに残留した。灰白色の固形抽出物が得られるまで繰り返して、残査をn-ヘキサンを用いて徹底的に洗浄し、遠心分離6000rpm、15分間し、着色色素から分離した。最終的に、抽出物をN2下で30分間乾燥し、真空オーブン中に33°Cで一晩保持して、溶媒のいかなる痕跡も除去した。ウルソール酸およびオレアノール酸の最高合計含有量を評価するための種々の方法を比較するために、それぞれの手順に対して、リンゴ果皮20gをEtOAc200mLで抽出した。比較した方法は、還流下での2時間加熱、マイクロ波補助還流下での30分間加熱、30分間超音波処理、および室温での24時間振盪であった。各抽出の終了時に、トリテルペノイドを含有するEtOAcのアリコートを濾過し、LC-MS/MS分析のために-20°Cに保存した。TAEの原液は、100ジメチルホルムアミドDMFで調製した。濃度に応じて、DMF中のTAEの必要量を、PBSおよびLDL反応混合物に別々に加えた。予備試験から、LDL反応混合物中の10DMFは、LDL酸化に対して顕著な効果を少しも示さないことがわかった。2種の抽出物における成分化合物のLC-MS/MS分析。Rupasingheetal.,J.Agric.FoodChem.,2010,58:1233-1239により記載のように、QAE中の主要なフェノール化合物の組成を決定した。抽出物の成分化合物およびinvivoのケルセチン代謝産物の調製。QAEの7種の主要成分化合物、すなわち、クロロゲン酸、フロリジン、エピカテキン、シアニジン-3-O-ガラクトシド、ケルセチン、ケルセチン-3-O-ガラクチシドgalactiside、およびケルセチン-3-O-グルコシドを3濃度、0.05、5、および50mgL-1で使用した。これらの化合物をジメチルスルホキシドDMSOに溶解した。LDL酸化生成物の濃度応答性阻害を検討するために、ケルセチンおよびケルセチン-3-Oガラクトシドを、それらの活性に基づいて使用した。3種のinvivoケルセチン代謝産物、すなわち、ケルセチン-3’-スルフェート、ケルセチン-3-グルクロン酸、およびイソラムネチン-3-グルクロン酸を100メタノールに溶解し、0.05、5、および50mgL-1濃度を試験のために使用した。濃度応答性LDL酸化を検討するために、活性に基づいて、ケルセチン代謝産物を1つ選択した。TAEの2種の主要成分の純粋化合物であるウルソール酸およびコロリン酸ならびにウルソール酸の異性体であるオレアノール酸を使用して、濃度応答性LDL酸化阻害を検討した。オレアノール酸は、天然に最も豊富な異性体であり、ウルソール酸から分離することが困難であるため、選択した。化合物をDMFに溶解して、必要な濃度に応じて希釈し調製した。QAEを使用して実施するアッセイのために、反応混合物容量の10を誘導溶液から構成し、容量の残部90をPBSおよびLDL反応混合物から構成した。TAEを使用して実施するアッセイのために、反応混合物容量の10をTAE/DMF溶液から構成し、残部80をPBSおよびLDL反応混合物から構成した。成分化合物およびケルセチンのinvivo代謝産物を使用して実施するアッセイのために、反応混合物の10をメタノール、DMSO、またはDMFのいずれかで構成し、別の10を誘導システムから構成し、容量の残部をPBSおよびLDL溶液から構成した。LDLの調製。固有の抗酸化物質を除去するために、購入したLDLを、Fisherbrandセルロース透析チューブタイプT3膜、ThermoFisherScientificInc.,Ottawa,ON,Canadaを使用して、0.138MNaClおよび0.0027MKCl25°CでpH7.4を含有するPBSに対して、4°Cで24時間透析した。緩衝液は6時間ごとに交換した。透析したLDLは直ちに使用したか、または窒素下暗所で-80°Cにて保存し、2~3週以内に使用した。透析したLDLのタンパク質含量は、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ローリー法Lowryetal.,J.Biol.Chem.,1951,193:165-275により測定した。LDL酸化誘導。2つの酸化誘導法、すなわち、硫酸銅および2,2’-アゾビス2-メチルプロピオンアミジンジヒドロクロリドAAPHを使用した。両方の誘導システムに対して、100μg/mLの最終LDLタンパク質濃度を使用した。最終濃度10μΜのCu2の存在下および最終濃度5mMのAAPHの存在下でそれぞれ、37°Cで4時間、暗所にてLDLを酸化した。実験単位は、ブランク、陽性対照誘導はするが、抗酸化剤処理はしない、陰性対照誘導も処理もしない、および種々の濃度のQAEまたはTAEのいずれかからそれぞれなり、Cu2またはAAPHのいずれかにより誘導した。酸化は、1mMエチレンジアミン四酢酸EDTA溶液と1mMブチルヒドロキシトルエンBHT溶液との1:1混合物を添加して終結させた。QAEの7種の主要成分化合物であるクロロゲン酸、フロリジン、エピカテキン、シアニジン-3-O-ガラクトシド、ケルセチン、ケルセチン-3-O-ガラクトシド、およびケルセチン-3-O-グルコシド、ならびに3種のinvivoケルセチン代謝産物を、50、5、および0.05mgL-1の3濃度で試験して、LDL酸化阻害レベルを検討した。最も有効な純粋化合物およびケルセチン代謝産物を選択した後、濃度応答性LDL酸化阻害を検討した。TAEの2種の主要成分およびウルソール酸の異性体であるオレアノール酸もまた使用して、濃度応答性を検討した。このセクションの前半に説明したように、それと同じ濃度のCu2およびAAPHを使用し、EDTAとBHTとの1:1混合物により酸化を終結させた。チオバルビツール酸反応性物質TBARSアッセイの測定。TBARSは、Xuetal.,J.FoodSci.,2007,72:S522-S527の方法に少し改変を加えて測定した。LDL酸化を終結させた後、TBA試薬0.2MNaOH中の0.67チオバルビツール酸TBA試薬および20トリクロロ酢酸TCAを、反応混合物に添加し、徹底的に混合した。この混合物を95°Cで30分間インキュベートして、ピンク色のクロモゲンを発色させた。室温に冷却した後、チューブを1500gで15分間遠心分離し、FLUOstarOPTIMAプレートリーダーBMGLabtechInc.Canadaを使用して蛍光を測定した。使用した励起波長および発光波長は、それぞれ532nmおよび590nmであった。TBARS活性は、陽性対照と比較してLDL酸化のパーセント阻害式1として表現された。式中、Fは蛍光である。パーセント阻害=100F陽性対照-F試料/F陽性対照1このようにして、一次および二次酸化生成物形成の測定は、パーセントLDL酸化阻害として表現した。式1はまた、次のように書くこともできる。すなわち、阻害=100Ave対照-A試料/Ave対照、式中、Aは吸光度であり、ve対照は誘導システム、基質を含むが、処理なしの対照である。脂質ヒドロペルオキシドの測定第一鉄キシレノールオレンジアッセイ。ヒドロペルオキシドの形成を、Peroxoquant商標定量的過酸化物アッセイキットの脂質コンパティブルフォーミュレーションにより測定した。LDL酸化をCu2またはAAPHにより誘導し、37°Cで4時間、暗所にてインキュベートした。ヒドロペルオキシドを、製造業者の説明書に従って測定した。FLUOstarOPTIMAプレートリーダーBMGLabtech,Durham,NC,USAを使用して、595nmの吸光度を測定した。ヒドロペルオキシドの活性は、陽性対照と比較してLDLのパーセント阻害式1として表現した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSPAGE。SDS-PAGEについては、10SDSと共に5ゲルを使用した。LDLタンパク質16μgを、異なる4濃度のQAEおよびTAEと共に、個別にインキュベートし、10μΜCu2または15mMAAPHのいずれかを使用して、37°Cで4時間、酸化を誘導した最終反応容量は50μLであった。テトラ-ブチルヒドロキノンTBHQ、5mgL-1を参照として使用した。EDTA/BHT溶液を用いてLDL試料の酸化を終結させた後、試料をLaemmli商標試料緩衝液2-メルカプトエタノール50μLをLaemmli商標試料緩衝液950μLと混合したを用いて1:1で希釈し、100°Cで5分間加熱してタンパク質を変性させた。その後、各試料20μLを、ウェルに別々にロードし、ゲルを190Vで約45分間泳動させた。泳動完了後、ゲルをバイオセーフクーマシーブルー染色剤で染色し、記録した。統計分析。測定はすべて三つ組で行い、平均±標準誤差SEMとして表現した。実験はすべて、別々の日に2回実施して再現性をチェックした。一元配置分散分析を、一般線形モデルSASV8,Cary,NC,USAを使用して、実施したすべての実験について個別に実施した。応答変数として、パーセント阻害を使用した。正規性および定数分散の仮定を、Anderson-Darling検定を使用しかつ残差対適合を調べて検定した。独立性は無作為化によって達成した。TAE処理におけるCu2誘導二次生成物についての正規性を得るために、濃度を平方根に変換した。この特定のデータセットについては、その結果を逆変換してから表示した。p≦0.05で有意差があった場合に、多重平均比較をTukey’shonestlysignificantdifference検定により実施した。II.ハムスターモデルのinvivo研究化学薬品および装置。生理活性物質に富んだ2種のリンゴ抽出物を除く、ハムスター用の食餌材料はすべて、DyetsInc.Bethlehem,PA,USAから購入した。血清脂質プロフィールは、商用キットBiovisionInc.,California,USAを使用して分析し、肝臓脂質は、WakoChemicalsInc.Richmond,VA,USAのキットを用いて分析した。血清および肝臓の抗酸化状態の検討に必要な化学薬品および試薬は、Sigma-AldrichCanadaLtd.Oakville,Ontario,Canadaから購入した。動物および食餌。実験は、InstituteofNutrisciencesandHealth,NationalResearchCouncilofCanada,Charlottetown,PrinceEdwardIslandPEIで実施した。倫理的承認は、AnimalCareandUseCommitteeACUCatUniversityofPrinceEdwardIslandUPEI,Charlottetown,PEI,CanadaandNovaScotiaAgriculturalCollegeNSAC,Truro,NovaScotia,Canadaから得た。実験は、CanadianCouncilforAnimalCareのガイドラインに準拠して行った。体重100~120gの雄性ゴールデンシリアンハムスター60匹を、CharlesRiverLaboratoriesInc.Quebec,Canadaから購入し、ケージに別々に収容し、12時間の明/暗サイクルのもとに置いた。2週間の順応期間の間、通常のげっ歯類用固形飼料を動物に給餌し、食餌および水を自由に摂取させた。その後、ハムスターの体重を測定して、それぞれ15匹の動物群にランダムに割り当てた後、食餌療法試験を開始した。ハムスターに30日間実験食を給餌した。正常対照NCとして、ΑIN93-Gフォーミュレーションに準拠したカゼイン-コーンスターチ-スクロースをベースとした食餌を動物に給餌した。アテローム生成対照ACの食餌については、0.15のコレステロールをNC食餌に添加した。実験処置群には、50mg/kg体重/日の用量でQAEまたはTAEのいずれかを添加したAC食餌を給餌した。試験食は毎週調製して、-20°Cに保存した。アテローム生成試験食の基本組成を下表1に示す。正常対照に対しては、コレステロールを添加しなかった。生理活性物質に富んだ2種の食餌については、必要量の生理活性物質を、上述の食餌に個別に添加した。生理活性物質に富んだリンゴ果皮抽出物の調製。invivo研究に使用したリンゴ果皮抽出物は、invitro研究に使用したものと同じ抽出物とした。抽出物は上記のように調製した。血液試料および組織試料の収集および保存。Jiaetal,Atherosclerosis,2008,201:101-107による報告の手順に従って、食物摂取量を毎日記録し、動物の体重を毎週測定した。動物の行動を毎日観察して記録した。屠殺の72時間前に、0.5mLに溶解した[13C]コレステロール0.18mgを頚静脈を介して動物に注射した。外科手術の後、動物の回復を観察し、それぞれのケージに戻した。30日目の屠殺の2時間前に、酸化重水素0.5mLを腹腔内注射により動物に投与した。イソフルラン吸入薬により動物を麻酔して、血液を血清チューブに収集し、室温で2時間凝固させた後、氷上に置いた。血清を遠心分離により分離して、-80°Cに保存した。肝臓、腎臓、脳、および腸を解剖し、PBSですすいで洗浄して、秤量し、液体窒素中で瞬間冷凍して、分析まで-80°Cに保存した。血清脂質および肝臓脂質の分析。血清のTCおよびTGは、酵素キットを使用して直接測定した。HDLの測定のために、非HDLを沈殿緩衝液により血清から沈殿させた。この沈殿をPBSに溶解し、非HDL分画を定量した。これらの測定すべてについて、製造業者の説明書に従った。肝臓脂質は、前述Jiaetal.,Atherosclerosis,2008,201:101-107のように抽出した。手短に言えば、肝臓0.5gを秤量し、メタノール15mLが入った50mLのガラスチューブに移した。チューブを55°Cで15分間振盪した。次いで、ヘキサン:クロロホルム4:1、v:v24mLを水2mLと共に加えた。この試料を15分間振盪した後、チューブを遠心分離し、その上清を集めた。この抽出工程をさらに2回繰り返し、上清を一緒にプールして窒素ガス下で乾燥した。乾燥した脂質をイソプロピルアルコールに再溶解し、脂質プロフィールの分析のために使用した。肝臓の総コレステロールTC、トリグリセリドTG、および遊離コレステロールFCは、酵素キットを使用して直接測定し、コレステロールエステルCEは、総コレステロールTC=FCCEから遊離コレステロールを減算して評価した。血清および肝臓の抗酸化状態の測定。血清抗酸化剤活性は、Rupasingheetal,FoodChem,2008,107:1217-1224により記載のFerricReducingAntioxidantPowerFRAPアッセイにより測定した。手短に言えば、300mmolL-1の酢酸緩衝液pH3.6、10mmolL-1のTPTZ溶液、および20mmolL-1の塩化第二鉄溶液を、10:1:1の比で混合して、FRAPワーキングアッセイ試薬WRを調製した。FRAP-WRはアッセイ直前に調製し、TPTZ溶液は分析を行う当日に調製した。1mMのTrolox標準原液は、Trolox25mgをメタノール100mLに溶解して調製し、必要になるまで-80°Cに保存した。この原液を適宜メタノール中に希釈して、検量線を作成するために100~1000μΜの種々の濃度のTroloxを調製した。分析前に、FRAP-WRおよび試料を37°Cに加温した。分析のために、ブランク、標準、または試料20μlを、96穴透明ポリスチレンプレート中で、FRAP-WR180μlと反応させた。FLUOstarOPTIMAプレートリーダーを、BMGLabtechsoftwareBMGLabtechInc.Canadaを使用してプログラムし、FRAP-WRの注入および3秒間の振盪の6分後に、595nmの吸光度を読み取るようにした。血清のFRAP値は、Trolox当量μΜとして表現した。血清中の二次酸化生成物の形成は、Balakumaretal.,PharmacologicalResearch,2008,58:356-363によるチオバルビツール酸反応性物質TBARSアッセイにより測定した。手短に言えば、20トリクロロ酢酸TCA250μLを、血清50μLおよびTBA試薬250μLに加え、100°Cで30分間インキュベートした。放冷した後、試料を1000×gで20分間遠心分離し、その上清をFLUOstarOptimaプレートリーダーBMGLabtechInc.Canadaにより535nmでTBARSについて分析した。1~100μmolL-1μΜ濃度の1,1,3,3-テトラメトキシプロパンTEPを使用して、標準曲線を作成し、血清のTBARS濃度をTEP当量μMとして評価した。肝臓TBARSは、Beraetal.,InternationaljournalofAyurvedaresearch,2010,1:18-24、およびRosaetal.,Experimentalgastroenterology,2010,47:72-78により記載の方法を少し改変して測定した。手短に言えば、肝臓試料0.5gを秤量して、氷冷PBS5mLと共にホモジナイズし、その内容物を13000×gで15分間遠心分離した。上清250μLをTCA500μLと混合し、攪拌した。次いで、TBA試薬500μLを添加して撹拌し、ウォーターバス中で100°Cにて30分間インキュベートした。肝臓試料は二つ組で分析し、血清TBARS分析と同様に吸収を読み取った。1~25μΜのTEP標準を検量線に使用し、肝臓のTBARS濃度をnmolg-1肝臓組織として表現した。統計分析。データはすべて平均±標準偏差として表現し、各処置群は15匹の動物で構成した。正規性および定数分散の仮定を、Anderson-Darling検定を使用しかつ残差対適合を調べて検定した。独立性は無作為化によって達成した。各分析について、Minitab15MinitabInc.,PA,USA統計ソフトウェアにより、一般線形モデルを使用する一元配置分散分析を実施した。p≦0.05で処置群間に有意差があった場合には、SASV8Cary,NC,USAを使用して、最小二乗平均検定PDIFFによる多重平均比較を実施した。実施例1QAEおよびTAEの組成LC-MS/MSにより測定されたQAEの総ポリフェノール含量は、56.5mg/gであった表2A。これまでの研究と一致して、QAE中の主要な化合物群は、フラボノール、フラバン-3-オール、アントシアニン、ジヒドロカルコン、およびフェノール酸であったRupasingheetal.,J.Agric.FoodChem.,2010,58:1233-1239;HuberandRupasinghe,J.FoodSci.,2009,4:C693-C699。LC-MS/MSにより測定された、TAE中の総トリテルペン含量は、526mg/g抽出物乾燥重量52.6であった表2B。存在した主要な5環性トリテルペンは、ウルソール酸およびコロリン酸であり、濃度はそれぞれ377.30および149.07mg/g乾燥重量であった。実施例2invitroにおける、QAEおよびTAEによる一次および二次LDL酸化生成物の阻害QAEを、Cu2およびAAPHのそれぞれの存在下で、LDL反応混合物と共にインキュベートし、LDL酸化のQAEによる防止レベルをinvitroで測定した。その結果から、LDLでは、AAPH誘導酸化よりもCu2誘導酸化がQAEにより良好に防止されることがわかった図2、表3。AAPH誘導一次酸化生成物のQAEによる最大防止は約55であった。Cu2誘導一次酸化生成物の場合は、85を超える防止が0.5~10mgL-1の間の濃度でQAEについて観察された。Cu2誘導二次酸化生成物の最大終結点は、1mgL-1においてであったが、0.5~10mgL-1の間に有意差はなかったp>0.05。両方の誘導システムにおいて、一次酸化に関し、濃度が10~25mgL1を超えた場合に、QAEは酸化促進剤になった。二次酸化生成物のパーセント阻害も、同様の濃度応答性挙動を示した。一次酸化について上記に示されたように、両誘導システムにより誘導される二次酸化生成物に対する酸化促進効果が10mgL-1を超える濃度でQAEについて観察することができた。Halliwell,Free.Rad.Biol.Med,1995,8:125-126による報告のように、抗酸化化合物は、その最適濃度範囲より低い濃度でも、またはそれより高い濃度でも有効ではない。抗酸化化合物は、低濃度では、十分な防止を与えることができず、一方高濃度では、酸化促進剤として作用する。この現象は、LDLが種々の濃度のQAEとインキュベートされる場合に、明確に観察された。QAEはいくつかのポリフェノール化合物から構成されているので、個々の化合物の抗酸化活性およびそれらの相乗効果が、QAEの抗酸化活性全体の原因となっている可能性がある。図2からわかるように、LDL酸化がCu2により誘導される場合、0.5~5mgL-1のQAE濃度で、脂質の一次および二次酸化生成物の85超が阻害された。25mgL-1を超える濃度では、LDLはもはや保護されず、酸化促進効果が示された。AAPH誘導の下では、QAEは、一次酸化生成物を十分に防止しなかった。しかしながら、5~10mgL-1の濃度で完全酸化阻害が示された図2および3。QAEに比較して、TAEは、いくつかの予備試験を実施した後データ提示せず、はるかに高い濃度がLDL酸化の阻害に必要であった。TAE活性の検討における無視できない制限として、その疎水的性質があった。LDL懸濁液は完全に水性であったので、適合性のある溶媒系を見出すことは困難を伴った。エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、およびDMFなどの少数の溶媒系を検討した後、DMFが最も適合性のある溶媒であることが見出された。この溶媒では、TAEは完全に可溶性であり、かつLDL粒子は破壊されなかった。10DMFでは、最高濃度のTAE500mgL-1でも100の溶解性が示され、SDSPAGEで観察されるように、LDL粒子の分解も示さなれなかった。Cu2誘導二次酸化生成物について、50~200mgL-1の濃度範囲で、85を超えるLDL酸化阻害が観察された図4;表3。200mgL-1を超える濃度で、TAEは、Halliwell,Free.Rad.Biol.Med,1995,8:125-126により説明された抗酸化的挙動に続き、TBARS生成を増加させる酸化促進効果を示した。QAEと同様に、TAEは、Cu2誘導LDL酸化と比較して、AAPH誘導LDL酸化を十分に防止しないことが観察された表3。一般に、抗酸化剤濃度がその最適値より大きい場合、抗酸化剤は酸化可能な基質に対して損傷効果を及ぼすことがあるHalliwell,Free.Rad.Biol.Med,1995,8:125-126。これにより、基質の酸化をさらに進行させる酸化促進効果が生じる。興味深いことに、Cu2およびAAPH誘導一次LDL酸化生成物の両方について、最高濃度500mgL-1でもTAEの酸化促進効果はないことが観察された。これにより、一次酸化生成物阻害において、この抽出物の酸化促進濃度が500mgL-1より大きいことが示され得る。AAPH誘導一次生成物および二次酸化生成物に関してTAEが与える防止レベルは、QAEよりも相当低いものであった。しかしながら、Cu2誘導酸化生成物は、顕著に阻害された図4および5。85を超える防止は、150mgL-1より高濃度で得られた。500mgL-1のTAEでも、ヒドロペルオキシド生成に対する酸化促進効果がないことは注目に値する。実施例3invitroにおける、QAEの成分化合物およびinvivoケルセチン代謝産物による二次LDL酸化生成物の阻害QAEの主要成分化合物および3種のinvivoケルセチン代謝産物によるTBARS生成阻害の結果を表4に示す。予備試験では、50、5、および0.05mgL-1の3濃度を各化合物について使用し、50mgL-1が、最高レベルの酸化阻害データを提示せずを与える最も有効な濃度であった。QAEの成分化合物は、AAPHおよびCu2誘導LDL酸化を異なるレベルで防止し、クロロゲン酸、ケルセチン、およびケルセチン誘導体は、両誘導システムに対して良好に85超作用した表4。フロロジンPhlorodzin、エピカテキン、およびシアニジン-3-O-ガラクトシドは、Cu2誘導酸化については有望な結果を示したが、AAPH誘導酸化についてはそうではなかった。全体として、QAEの成分化合物はすべて、Cu2誘導LDL酸化を完全に阻害した。Tsaoおよび共同研究者Tsaoetal.,J.Agric.FoodChem.,2005,53:4989-4995は、ケルセチングリコシドは中程度の抗酸化活性を有するが、フラバン-3-オールおよびプロシアニジンは、リンゴ果皮および果肉中の全抗酸化活性に対して最大の寄与をしていると報告したが、本研究は異なる結果を示した。一部の研究では、抗酸化活性に対するフロリジンの寄与は少ないとの報告がありTsaoetal.,J.Agric.FoodChem.,2005,53:4989-4995;LuandFoo,FoodChem,2000,68:81-85、これは、本研究のAAPH誘導LDL酸化においては確認されたが、Cu2誘導酸化においては確認されなかった。多くのフラボノイドのサブクラスの中では、リンゴ果皮から単離されたケルセチン誘導体およびフラバン-3-オールが、高いペルオキシルラジカルスカベンジング活性を示したHeandLiu,J.Agric.FoodChem.,2008,56:9905-9910;LuandFoo,FoodChem,2000,68:81-85。この発見は、ペルオキシルラジカル誘導LDL酸化が、エピカテキンおよびケルセチン誘導体により70超阻害された本研究の結果により確認された。全体として、QAEの成分化合物はすべて、50mgL-1で、LDL酸化を50を超えて効果的に阻害した。ケルセチン代謝産物による防止は、50mgL-1において、他のケルセチン誘導体よりも弱いものであった。これらの結果表4から、ケルセチン-3-グルクロン酸が、LDL酸化を最も良好に防止することが示されたので、LDL酸化に対するその濃度応答関係について試験した。比較のために、ケルセチンおよびケルセチン-3-O-ガラクトシドも同じ濃度で使用した。ケルセチンは、1mgL-1を超える濃度で、Cu2誘導LDL酸化を80超防止し、5mgL-1を超える濃度で、AAPH誘導LDL酸化を80超防止した表5。5mgL-1を超えるケルセチン-3-O-ガラクトシド濃度により、両誘導システムについて、85を超えるLDL酸化阻害が得られた表5。AAPH誘導LDL酸化に対するケルセチン-3-グルクロン酸による防止は、1mgL-1を超える濃度では、Cu2誘導LDL酸化表5に比較して、かなり弱いものであった。Houおよび共同研究者によればHouetal.,Chem.Phys.Lipids,2004,129:209-19、ケルセチングリコシドは、Cu2およびAAPH誘導LDL酸化に対する有効な抗酸化剤であるが、親アグリコンほど有効ではなかった。本研究の結果はこの発見と一致しなかった。AAPH誘導LDL酸化阻害では、アグリコンよりもグリコシドが優れていたが、Cu2誘導酸化阻害では、これら3種のケルセチン化合物の間で有意差がなかった。ケルセチンは、フリーラジカルスカベンジャーおよび遷移金属イオンのラジカルキレーターとして認識されているKamadaetal.,FreeRad.Res.,2005,39:185-194。ケルセチンは、吸収および代謝変換の後でも、血漿脂質のCu2誘導過酸化に対する抗酸化活性を有することが示されているdaSilvaetal.,FEBSLett.,1998,430:405-408。ケルセチン投与により、invivoで脂質過酸化が防止されることも報告されている。大動脈に蓄積されるケルセチン-3-グリコシドでは、ケルセチン-3-グリコシドと共に高コレステロールの食餌を給餌されたウサギにおいて、TBARSおよびコレステロールエステルヒドロペルオキシドが顕著に低いことが示されたKamadaetal.,FreeRad.Res.,2005,39:185-194。ケルセチン化合物は、腸細胞および肝臓の両方において、メチル化、グルクロノ結合、およびスルホ結合誘導体に代謝されるPerez-Vizcainoetal.,FreeRad.Res.,2006,40:1054-1065。B環のカテコール構造、およびB環のO-ジヒドロキシル基以外の位置での結合が、他の2種のinvivo代謝産物と比較して優れた抗酸化活性を示す原因であると考えられるYamamotoetal.,Arch.Biochem.Biophys.,1999,372:347-354;Lokeetal.,J.Agric.FoodChem.,2008,56:3609-3615。本研究の発見は、Lokeおよび共同研究者により報告された結果を確認するLokeetal.,J.Agric.FoodChem.,2008,56:3609-3615。彼らの報告によると、LDLがホルボール-12-ミリステート-13-アセテート活性化好中球とインキュベートされた場合、invivo代謝産物は、親分子と比較して顕著に低い阻害活性を示すLokeetal,J.Agric.FoodChem.,2008,56:3609-3615。さらに、彼らの発見が示すところでは、ケルセチン-3-O-グルクロニドは、3’-0-メチル-ケルセチン、3’-O-メチルケルセチン-3-O-グルクロニド、およびケルセチン-3’-O-スルフェートよりも、脂質過酸化を減少させるのに極めて有効であるLokeetal.,J.Agric.FoodChem.,2008,56:3609-3615。実施例4invitroにおける、TAE成分化合物による二次LDL酸化生成物の阻害TAEの2種の主要成分化合物は、ウルソール酸およびコロリン酸であり、このうち前者の方が豊富であった。オレアノール酸がウルソール酸の最も豊富な異性体であり、かつLC-MS/MSによりこれらを互いに識別することが困難なため、両異性体について濃度応答性LDL酸化阻害を検討した。Cu2誘導LDL酸化を、オレアノール酸でもコロリン酸でもなく、ウルソール酸がある程度防止できることは注目に値する表6。3種の化合物はすべて、Cu2誘導LDL酸化よりもAAPH誘導LDL酸化を良好に防止する。ケルセチン化合物と比較すると、このLDL酸化の防止は相当弱いものであった。AAPH誘導LDL酸化のより大きな防止は、300mgL-1濃度のウルソール酸により得られた表6。TAEはCu2誘導LDL酸化を効果的に阻害したが、その成分化合物の反応は逆であった。最大のLDL酸化阻害がウルソール酸により得られたにもかかわらず、その構造異性体であるオレアノール酸は有効ではなかった。オレアノール酸は、10~100mgL-1で、AAPH誘導LDL酸化を約30防止し、ウルソール酸は、100mgL-1を超える濃度で、40を超える防止を与えた。まとめると、これら2種の異性体は、10~500mgL-1の幅広い濃度範囲で相乗的に有効であった。Andrikopoulosおよび共同研究者Andrikopoulosetal.,Phytother.Res.,2003,17:501-507は、ウルソール酸およびオレアノール酸は、LDL酸化に対して同等レベルの防止を与えると述べているが、これは本発見と一致しない。彼らはさらに、2種の化合物の構造的相違が生物活性に影響を及ぼさないことに注目した。コロリン酸は、ウルソール酸およびオレアノール酸と比較して、中間の有効性を示したが、Cu2誘導LDL酸化の防止をまったく示さなかった。AAPH誘導LDL酸化阻害に対するコロリン酸の有効濃度は、200mgL-1超であり、この濃度で40を超える阻害が得られた表6。トリテルペノイド化合物は、非低下または非銅キレート化合物であるAndrikopoulosetal.,J.Med.Foods,2002,5:1-7。ある研究では、ウルソール酸、ウバオール、およびオレアノール酸10~20μΜを含む種々のトリテルペノイド化合物である、オリーブオイル中の微量成分が、平均として表現すると、40を超えるLDL酸化防止を示したAndrikopoulosetal.,J.Med.Foods,2002,5:1-7。別の研究では、ウルソール酸が抗酸化活性をまったく示さず、またLDLにおいて、α-トコフェロールに対する保護をまったく与えないことが確認されたZhangetal.,J.Nutr.Biochem.,2001,12:144-152。本研究の結果から、TAEに存在する3種の化合物はすべて、Cu2誘導LDL酸化に対する阻害効果が弱かったので、トリテルペン化合物は金属イオンキレーターとして作用しないことが明らかとなった。Alloucheらによる研究Alloucheetal.,FoodChem.Toxicol.,2010,doi:10.1016/j.fct.2010.07.022は、オレアノール酸について、抗酸化特性も抗トロンビン特性も発見されなかった本研究の発見を補足するものであった。対象とする3種のトリテルペンの構造を検討すると、コロリン酸の構造には、C-2位およびC-3位の2つの隣接した水酸基がある。したがって、コロリン酸は、プロトンを供与し、より良好な抗酸化活性を示す点から、LDL酸化を良好に防止することができると予測される。コロリン酸と同様の構造を有する別の5環性トリテルペンであるマスリン酸は抗酸化効果を示したWangetal.,Punicagranatum.Fitoterapia,2006,77,534-537。これら2種のトリテルペン分子の主な相違は、C-19位およびC-20位にある。実施例5invitroにおける、2種の抽出物によるLDLタンパク質分解の阻害陰性および陽性対照と比較して、LDLのアポリポタンパク質の分解レベルを検出するために、SDSPAGEを実施した図3および5。陰性対照レーン2は、酸化による分解が最小レベルであるアポリポタンパク質からなっていた。2つの対照と比較すると、4つの異なるQAE濃度による処理によって、種々のレベルの酸化的LDL分解が起こることがわかる図3。陰性対照と比較すると、両誘導システムの下で、高濃度のQAEでは、低濃度よりもLDLタンパク質分解が少ないことが示された。TAEは、AAPH誘導/ペルオキシルラジカル媒介による分解からLDLを保護する能力が弱いことが明確にわかる図5。Cu2媒介LDL分解では、陰性および陽性対照と比較すると、様々な程度の保護が観察され得る。陰性および陽性対照と比較すると、高濃度のTAEほど、使用した参照5mgL-1のTBHQよりもLDL酸化を良好に防止した。要約すると、ケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物QAE、トリテルペンに富んだリンゴ果皮抽出物TAE、それらの成分化合物、および3種の選択されたinvivoケルセチン代謝産物について、invitro低密度リポタンパク質LDL酸化を阻害する能力を検討した。QAEは、0.5~10mgL-1で85を超える酸化阻害を示しp<0.05、25mgL-1以上の濃度では、酸化促進効果が顕著であった。ケルセチン、ケルセチン-3-O-ガラクトシド、およびケルセチン-3-グルクロン酸は、5~50mgL-1で有効であり80を超える阻害、p<0.05、酸化促進効果はまったく示さなかった。TAEは、150~500mgL-1で、Cu2誘導脂質ヒドロペルオキシド生成を85超阻害し、酸化促進効果は観察されなかった。約50のCu2誘導LDLTBARSが、50~200mgL-1で阻害されたp<0.05。TAE成分化合物の中では、コロリン酸およびオレアノール酸と比較して、ウルソール酸がペルオキシル-ラジカル誘導LDL酸化を阻害するのに有効であった。全体として、2種の抽出物は、invitro酸化から効果的にLDLを保護した。これらの発見から、QAEに富んだ抽出物、TAEに富んだ抽出物、およびそれらの組成物は、LDL酸化の阻害、血漿および/または肝臓のコレステロール値の低減、および/または被験対象の心臓血管疾患の治療のために使用することができることが示唆される。実施例6ハムスターモデルにおける食物摂取量および体重に対する2種の抽出物の効果食餌で誘導された高コレステロール血症の動物が、一般に、ヒトコレステロール代謝の研究のために使用される。ハムスターは、食餌で誘導されたアテローム性動脈硬化の影響を研究するのに好適な動物モデルと考えられるWangetal.,Lipids,2003,38:165-170。ハムスターにおける血漿リポタンパク質に対する食餌性コレステロールの影響が、ヒトにおけるものと類似することが示されている。健常ヒトに食餌性コレステロールを曝露すると、血漿総コレステロールTC、低密度リポタンパク質コレステロールLDL、および高密度リポタンパク質コレステロールHDLが増加することが示され、同様の変化が食餌性コレステロールに曝露された健常ハムスターでも観察されたZhangetal.,Mol.Nutr.FoodRes.,2009,53:921-930。我々は、ハムスターモデルを使用して、invivoにおけるコレステロール代謝の調節に対するリンゴ抽出物およびリンゴ果皮生理活性物質の効果を研究した。処置群のそれぞれに処置用食餌を割り当てる前は、動物の平均体重は112.73±0.13gであった。実験食餌を導入し、28日間継続した後で、動物の体重は、処置群の間で有意に変化しなかったp>0.05。動物の食餌摂取量は、各週とも処置群の間で有意差はなかったp>0.05表7。4つの処置群の平均体重は132.07±1.26gであった表8。体重gについて、各週とも処置群の間で有意差はなかったp>0.05。これらの結果から、食餌処置によって、試験期間の間に動物の食餌摂取量または体重増加量が影響を受けなかったことがわかる。実施例7血清および肝臓の脂質レベルに対する2種の抽出物の効果ハムスターの血清脂質プロフィールを表9に示す。QAE食餌は、AC食餌に比較して、血清非HDLコレステロール値を低下させたp<0.05。血液のTC、TG、およびHDLコレステロールの濃度に、QAE、AC、およびNC群の間で差があった。非HDLコレステロール値は、NCおよびQAEを給餌されたハムスターの間では、有意差がなかったp=0.005。驚くべきことに、TAE食餌群がAC群に比べて有意に高いTGおよびTC値を示すことを我々は見出したp<0.05。HDL-C値および非HDL-C値では、TAE食餌群およびAC食餌群の間で有意差はなかったp>0.05。肝臓脂質プロフィールについては、肝臓TGに関し、処置群のいずれの間にも有意差はなかったp=0.994表10。TCについては、ACと2種の生理活性物質に富んだ食餌との間では有意差がなかったが、前述の3群はすべて、NC群とは有意差があったp<0.0001。FC値は、QAE食餌については、NCと有意差がなかったが、TAE食餌はAC食餌と差があったp=0.0125。実施例8血清および肝臓の抗酸化状態血清FRAPおよびTBARS値について、処置群のいずれの間にも有意差はなかったp>0.05。しかしながら、TAE食餌を給餌されたハムスターでは、他の3群に比較して、肝臓のTBARSMDA値が上昇したので、肝臓TBARS値には有意差があった表11。要約すると、本研究は、invivoコレステロール代謝に対する2種のリンゴ抽出物の影響を検討するために実施した。60匹の雄性ゴールデンシリアンハムスターを、ケージに別々に収容した。2週間の順応期間の後に、ハムスターを4群に分け、正常対照NCとしてはAIN-93G純粋食、アテローム生成対照ACとしては0.15コレステロールを添加した普通食、ケルセチンに富んだリンゴ抽出物QAE50mg/kg体重/日を補充したアテローム生成食餌、およびトリテルペンに富んだリンゴ抽出物TAE50mg/kg体重/日を補充したアテローム生成食餌をそれぞれ4週間給餌した。QAE食餌は、ACに比較して、血清TCおよび非高密度リポタンパク質コレステロール非HDL値を低下させたp<0.05。対照的に、TAE食餌は、AC食餌に比較して、血清TC値を増加させたp<0.05。2種のリンゴ果皮抽出物は、血清トリグリセリドおよびHDL値、ならびに血清チオバルビツール酸反応性物質TBARSおよびferricreducingantioxidantpowerなどのinvivo酸化ストレスバイオマーカーに影響を与えなかった。QAEもTAEも、肝臓TBARS、TC、遊離コレステロール、およびトリグリセリドに影響を与えなかった。結論として、QAEは、その抗酸化特性に加えて血中コレステロールを低下させることができ、TAEもまたコレステロール代謝に効果がある。全体として、我々は、QAEおよびケルセチン誘導体がLDL酸化に対する強力な抗酸化活性を有することを明確に実証した。QAE食餌は、AC群に比較して、血清TCを12.6、非HDL-Cを30.7効果的に低下させた。HDL-C値は、NC群と比較して36.8増加した。種々のinvivoモデルで、コレステロール代謝に対する新鮮リンゴ、凍結乾燥リンゴ、およびリンゴ抽出物の効果を試験する研究が多数行われてきた。0.3コレステロールを給餌されたラットに15凍結乾燥リンゴを導入すると、0.3コレステロールのみを給餌された対照動物に比べ、血漿コレステロール値は9.3低下するが、TG値は有意差がないことが示されたAprikianetal.,FoodChem.,2001,75:445-452。このリンゴ食餌は、凍結乾燥リンゴ全体からなっているため、繊維を5~10および糖を11~12含有していた。したがって、低コレステロール血症に効果があることが知られているペクチンならびにフルクトースおよび糖の効果がこの結果に寄与した可能性がある。対照的に、本研究で使用されたQAE処理食餌は、抽出されたリンゴポリフェノールから主としてなっており、繊維および糖を含有せず、主要成分化合物はケルセチン誘導体であった。さらに、我々は、血清脂質プロフィールの変量が、QAE処置動物よりもTAE処置動物において高いことを見出した。血清TGおよびTCについては、TAE処置動物の値はAC群より一層高かった。本発明の特定の実施形態が実施例に記載されているが、本発明の変更および改変を当業者が想到することは明らかである。本発明の実施形態は、実施例により限定されることを意図するものではない。当業者が想到するこのような変更および改変は、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内にあることを特に理解されたい。例えば、一実施形態の一部として説明または記載された形態を、別の実施形態で使用して、さらなる実施形態を得ることができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲内に入るような変更および変形ならびにその等価物を包含することを意図するものである。本明細書で引用されたすべての文書および文献は、それらの内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。"