配列番号1の第11~第42アミノ酸の、uPAの増殖因子様ドメインを含む第1のポリペプチド、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体および配列番号2の第5~第39アミノ酸の、VNのソマトメジンBドメインを含む第2のポリペプチド、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体からなる群より選択される2つのポリペプチドを含み、2つのポリペプチドが分子足場により互いに連結される、ダイマー分子。前記第1のポリペプチドが、配列番号2の第5~第39アミノ酸の、SMBドメイン、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含みおよび前記第2のポリペプチドが、配列番号1の第11~第42アミノ酸の、GFDドメイン、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含む、請求項1に記載のダイマー分子。前記GFDドメインが配列番号1の第8~第48アミノ酸から本質的になる、請求項1または2に記載のダイマー分子。前記GFDドメインが配列番号1の第1~第48アミノ酸からなる、請求項1から3のいずれか一項に記載のダイマー分子。前記SMBドメインが配列番号2の第1~第41アミノ酸からなる、請求項1から4のいずれか一項に記載のダイマー分子。第1および第2のポリペプチドが、cN末端SMBドメインGFDドメインC末端の順序の配列を含む、およびdそのC末端を介して分子足場に連結される、請求項2から5のいずれか一項に記載のダイマー分子。前記SMBドメインおよびGFDドメインが第1のリンカーペプチドにより連結される、請求項2から6のいずれか一項に記載のダイマー分子。前記第1のリンカーペプチドが配列番号3の配列から本質的になる、請求項7に記載のダイマー分子。第1および第2のポリペプチドのそれぞれが第2のリンカーペプチドにより分子足場に連結される、請求項1から8のいずれか一項に記載のダイマー分子。リンカーペプチドが配列番号4の配列から本質的になる、請求項9に記載のダイマー分子。分子足場が免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、化学的リンカーまたはペプチドリンカーである、請求項1から10のいずれか一項に記載のダイマー分子。Fcの重鎖定常領域のそれぞれが、本質的に配列番号5の配列を有する、請求項11に記載のダイマー分子。配列番号6の配列の第1のモノマーおよび配列番号7の配列の第2のモノマーから本質的になる、請求項12に記載のダイマー分子。第1および第2のモノマーが配列番号8の配列を有する、請求項12に記載のダイマー分子。医学的使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。癌の治療としての使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。治療剤にコンジュゲートされる、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。前記治療剤が放射性核種または毒素である、請求項17に記載のダイマー分子。診断方法における使用のための、請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子。uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断における使用のための、請求項19に記載のダイマー分子。治療上有効量の請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子のそれを必要とする対象への投与を含む、癌の治療方法。請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子および好適な賦形剤または添加剤を含む医薬組成物。別の治療剤をさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。前記治療剤が放射性核種または毒素である、請求項23に記載の医薬組成物。請求項1から14のいずれか一項に記載のダイマー分子を含む、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断のためのキット。本発明は、新しい型のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体の阻害剤の概念、構築および検証に関する。生成される阻害剤分子は、共通の足場上で非常に近い位置にある、細胞外プロテアーゼであるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の受容体結合ドメインと細胞外マトリックスタンパク質であるビトロネクチンの受容体結合ドメインとを含有する二価uPARリガンドである。uPARへのそのような阻害剤の結合は、uPAとVNの両方の結合部位が同時に、および効率的に占有され、かくして、受容体のタンパク質分解活性およびシグナル活性の両活性を遮断する複合体をもたらす。本発明の阻害剤分子は、物理的および機能的uPARVN相互作用およびuPARuPA相互作用の強力なアンタゴニストである。それは受容体へのVN結合を刺激することなく、uPAR中のuPA結合ポケットを標的化する点で非常に有利である。実際、uPARのuPA結合ポケットに結合する、全てではないとしても、多くの公知の薬剤が、uPARVN相互作用のアゴニストであり、従ってシグナリングを誘導する。対照的に、本発明の分子uPARlockは、シグナリングを遮断する。さらに、uPARlock分子の使用については、種特異性の障壁がない。uPAuPAR相互作用に対する薬剤の評価における主な問題は、それらが広範囲の種特異性を示し、異種移植モデルにおいて化合物を確実に試験することを困難にするということである。uPARlockの特異性は、エフェクタードメインの種の起源を変化させることにより、容易に設定することができる。本発明のアンタゴニスト分子は、Fcタグに起因する長いinvivo半減期などの優れた薬剤特性を示す。さらに、それはヒト配列から構成され、かくして、それは非免疫原性である。uPARlock分子は、遮断剤として機能するように設計されたものである。uPARへのその高い親和性および特異性ならびにFc部分の存在によって、例えば、放射性核種、毒素などの好適なエフェクター分子とのコンジュゲーションにより、uPAR標的化診断およびまたは療法のために前記分子を好適に用いることができる。かくして、本発明のアンタゴニスト分子は、多用途の臨床適用を有する。従って、本発明の目的は、配列番号1の第11~第42アミノ酸のu、PAの増殖因子様ドメインを含む第1のポリペプチド、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体および配列番号2の第5~第39アミノ酸の、VNのソマトメジンBドメインを含む第2のポリペプチド、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する対応する領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体からなる群より選択される2つのポリペプチドを含むダイマー分子であって、2つのポリペプチドが分子足場により互いに連結される、前記分子である。好ましくは、上記のダイマー分子中、第1のポリペプチドは、配列番号2の第5~第39アミノ酸のSMBドメイン、もしくはVNオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含みおよび第2のポリペプチドは、配列番号1の第11~第42アミノ酸のGFDドメイン、もしくはuPAオーソロガス遺伝子に由来する同じ領域によりコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体もしくは類似体をさらに含む。本発明のダイマー分子は、当業界で公知の任意の手段により取得し得る。誘導体は、より長いか、またはより短い配列を有するポリペプチドであってよく、すなわち、酵素に対して耐性であるように改変されたものなどであってよい。本発明のダイマー分子中、GFDドメインは、好ましくは、配列番号1の第8~第48アミノ酸から本質的になり、より好ましくは、それは配列番号1の第1~第48アミノ酸からなる。本発明のダイマー分子中、SMBドメインは、好ましくは、配列番号2の第1~第41アミノ酸からなる。好ましい実施形態において、第1および第2のポリペプチドは、aN末端SMBドメインGFDドメインC末端の順序の配列を含む、およびbそのC末端を介して分子足場に連結される。より好ましくは、SMBドメインおよびGFDドメインは、第1のリンカーペプチドにより連結される。前記第1のリンカーペプチドは、好ましくは、配列番号3の配列から本質的になる。本発明のダイマー分子中、第1および第2のポリペプチドはそれぞれ、好ましくは、第2のリンカーペプチドを用いて分子足場に連結される。前記リンカーペプチドは、好ましくは、配列番号4の配列から本質的になる。本発明のダイマー分子の分子足場は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、化学的リンカーまたはペプチドリンカーである。本発明の実施形態において、Fcの重鎖定常領域はそれぞれ、本質的に、配列PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLXaaCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKATPPVLDSDGSFFLXaaSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK、を有する。好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子は、配列番号6の配列の第1のモノマー、および配列番号7の配列の第2のモノマーから本質的になる。別の好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子の第1および第2のモノマーは、配列番号8の配列を有する。本発明の別の目的は、医学的使用のため、好ましくは、癌の治療としての使用のための上記ダイマー分子である。好ましい実施形態において、本発明のダイマー分子は、治療剤にコンジュゲートされ、その治療剤は、好ましくは放射性核種または毒素である。本発明のさらなる目的は、診断方法における使用のため、好ましくは、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断における使用のための上記ダイマー分子である。本発明の他の目的は、治療上有効量の本発明のダイマー分子のそれを必要とする対象への投与を含む癌の治療方法であって、医薬組成物が本発明のダイマー分子と、好適な賦形剤または添加剤とを含む、前記方法である。前記医薬組成物はさらに、別の治療剤、好ましくは放射性核種または毒素を含んでもよい。本発明の別の目的は、本発明のダイマー分子を含む、uPARにより媒介される病理または腫瘍の診断のためのキットである。ここで、本発明を以下の図面を参照しながら非限定例によって説明する。実験手順uPA、VNおよびuPARのアミノ酸配列斜体で示すシグナルペプチド、太字で示す成熟タンパク質および太字下線付きで示すuPAR結合増殖因子様ドメインを含むヒトuPAのアミノ酸配列斜体で示すシグナルペプチド、太字で示す成熟タンパク質および太字下線付きで示すuPAR結合ソマトメジンBドメインを含むヒトVNのアミノ酸配列斜体で示すシグナルペプチド、下線付きの斜体で示す、Gly283に結合した糖脂質膜アンカーの付加の際の合成中に除去されるC末端ペプチド、および太字で示す成熟タンパク質を含むヒトuPARのアミノ酸配列発現ベクターの構築Fcタグ付SMBおよびGFDのための発現ベクターは、pFRTTOFcプラスミドに基づくものであるが、いくつかの改変を導入して、様々なコード領域のシャッフリングを容易にし、ならびにタンパク質収率を改善し、特異的プロテアーゼ切断による組換えタンパク質からのFcタグの除去を可能にした。第1に、Fcコード領域の下流のベクター配列中に位置するXhoI制限部位を、dXudXdオリゴを用いる部位特異的突然変異誘発によって破壊した。第2に、PreFPreRオリゴをアニーリングさせることにより作製したPreScissionプロテアーゼの切断配列をコードするリンカーを、シグナルペプチドFc連結部に位置するXhoI部位に挿入した。組換えタンパク質の収率を増加させることがわかった構築物のFc領域中に存在するイントロンを除去するために、ベクターをCHO細胞中にトランスフェクトし、RNAを抽出し、逆転写し、cDNAをhVNukpnFcNrオリゴを用いて増幅した。PCR産物をKpnINotIで消化し、これを用いて親ベクターの対応する断片を置換し、pFRTTOFcを作製した。一過的タンパク質発現のために、FcカセットをpEGFPN1ベクターのKpnINotIに導入し、pN1Fcを作製した。Knobおよびhole突然変異を、FcKnobFFcKnobRおよびFcHoleFFcHoleRオリゴ対を用いる部位特異的突然変異誘発によりFc領域中に導入して、それぞれベクターpN1FcKおよびpN1FcHを得た。VNのシグナルペプチドおよびSMBドメインをコードする配列を、hVNukpnSMBRV2オリゴを用いてVNcDNAを増幅することにより作製し、pN1FcKおよびpN1FcH中のKpnIXhoI部位にクローニングした。uPAのシグナルペプチドおよびGFDドメインをコードする配列を、ATFkpnFGFDRVオリゴを用いるヒトuPAcDNAの増幅により作製し、SMBについて記載されたようにクローニングした。このクローニング戦略は、GSGLELEVLFQGPIEリンカーによりヒトIgG1のヒンジおよびFc領域に接続されたGFDまたはSMBから構成される成熟融合タンパク質をもたらす。Fcタグ付uPARのための発現ベクターを、オリゴURfSKuPARXdオリゴを用いるヒトuPARcDNAの増幅により作製し、生成物をpFRTTOFc中のKpnIXhoI部位にクローニングした。マウス免疫グロブリン重鎖定常領域でタグ付けしたuPARのための発現ベクターを、pEGFPN1中でおよびIgG1cDNAを集合させることにより作製した。得られる成熟キメラタンパク質は、ヒトuPAR残基1~277、LEVLFQPLEAGAGリンカーおよびマウス免疫グロブリン重鎖の第216~第441アミノ酸から構成されるに従って番号付けられる。全てのコード領域の予想される配列を配列決定により確認した。オリゴヌクレオチド配列dXu5gtaaatgagcggccgcgtcgagtctagaggg3dXd5ccctctagactcgacgcggccgctcattta3PreF5tcgagctggaagttctgttccaggggccca3PreR5agctacccggggaccttgtcttgaaggtcg3hVNukpn5cggggtaccatggcacccctgaga3FcNr5ttgcggccgctcatttacccggagacag3FcKnobF5aaccaggtcagcctgtactgcctggtcaaaggc3FcKnobR5gcctttgaccaggcagtacaggctgacctggtt3FcHoleF5ggctccttcttcctcaccagcaagctcaccgtg3FcHoleR5cacggtgagcttgctggtgaggaagaaggagcc3ATFkpnF5gcggtacccgccaccatgagagccctgctggcgcgc3GFDRV5gcctcgagtcctgatccttttgacttatctatttcaca3SMBRV25gcctcgagtcctgatccgggcttgcactcagccgt3URfSK5gcgtcgacggtacccgccaccatgggtcacccgccgctgctg3uPARXd5agcctcgagcccactgcggtactggacatc3UpreR2D5gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccac3mFcU5gcctcgaggcaggagcaggacccagggattgtggttgtaa3mFcD5gcgcggccgctcatttaccaggagagtg3uPARlockの組成上記のように構築されたuPARlockの組成は、分子、特に、2つのポリペプチドGFDFcKおよびSMBFcHから構成されるジスルフィド結合したヘテロダイマーであり、以下のアミノ酸組成を有する。以下のものから構成される太字ヒトuPA、斜体人工リンカー領域ならびに太字の斜体Knob置換を含有するヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常領域。より短い、および長いuPAの小片も機能し得る。第11~第42アミノ酸を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0であってよい。この研究ではKnob置換を用いて、発現の間に形成されるヘテロダイマーの量を増加させるが、ヘテロダイマーの阻害品質に対する効果を有さないと予測される。以下のものから構成される太字ヒトVN、斜体人工リンカー領域ならびに太字の斜体Hole置換を含有するヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常領域。より短い、および長いVNの小片も機能し得る。第5~第39アミノ酸を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0であってよい。この研究ではHole置換を用いて、発現の間に形成されるヘテロダイマーの量を増加させるが、ヘテロダイマーの阻害品質に対する効果を有さないと予測される。組換えタンパク質の発現および精製Phoenix細胞を、予め温めた無血清DMEMで1回洗浄し、8mlのOptiMEMを添加した。uPARlockについて、培養物を、Fugeneトランスフェクション試薬を製造業者の説明書に従って用いて、pN1GFDFcKおよびpN1SMBFcHの混合物でトランスフェクトした。対照タンパク質GFDGFDおよびSMBSMBを、それぞれpN1GFDhFcKpN1GFDhFcHおよびpN1SMBhFcKpN1SMBhFcHを同時トランスフェクトすることにより発現させた。トランスフェクトされた培養物を6~8日間静置した後、上清を回収し、濾過した。タンパク質をプロテインAセファロース上で精製し、01MGlycinepH28、05MNaClを用いて溶出し、PBSに対して大規模に透析した。invitro結合アッセイ96穴イムノプレートを、4°CONでコーティングバッファーに希釈したprouPAまたはVNで被覆した。プレートを、洗浄バッファーを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、RTで1~2時間、ブロッキングバッファーを含有するPBSを用いて非特異的結合部位を遮断した。PBSTで洗浄した後、希釈バッファー中で調製された試験しようとするアゴニストおよびアンタゴニストの存在下または非存在下で、ウェルをuPARmFcと共にインキュベートした。RTで1~2時間、結合を起こさせ、プレートを洗浄バッファーで3回洗浄した。ビオチン化ヤギ抗マウスFc抗体およびEu3標識ストレプトアビジンとの連続的インキュベーションにより、結合したuPARmFcを検出した。DELFIAプロトコルを用いるEnvisionXciteプレートリーダーを用いる解離増強時間分解蛍光測定により、結合したEu3を定量した。細胞系293uPAR、293uPART54Aおよび293モック細胞系を、以前に詳細に記載されたように、野生型ヒトuPARcDNA、Thr54Ala置換を含むuPARcDNAを含有するpcDNA5FRTTO発現ベクターまたは空の発現ベクターを用いるHEK293FlpInTREx細胞の安定なトランスフェクションにより作製した。接着アッセイ細胞をEプレートのウェル中に播種し、リアルタイム細胞分析装置を用いて規則的な間隔で細胞接着をモニターした。RTCAシステムは、組織培養96穴Eプレートの底部で一体化された互いに入り込んだ微小電極間の電気インピーダンスを測定するものである。電極頂部の細胞の存在は、電極溶液境界面での局所イオン環境に影響し、電極インピーダンスの増加をもたらす。細胞接着が強くなるほど、電極インピーダンスが増加する。移動アッセイCO2および温度を制御するためのインキュベーションチャンバを備えたOlympusIX80倒立顕微鏡を用いて、37°C、5CO2で経時的生細胞画像化を実施した。細胞を、1x105細胞ウェルの集密度で12穴プレート中に塗布した。経時的画像化は血清を含有する増殖培地中で実施した。10x対物レンズを通して細胞を観察し、5hにわたって5分毎に写真を撮影した。獲得システムは、デジタルカメラおよびSystemControlSoftwareOlympusScanRを含む。明るさコントラスト、スムージングおよび画像の鮮明さの調整を、ImageJ142qを用いて行い、常に全画像に適用した。細胞の移動速度を、プラグインマニュアルトラッキングを用いるImageJ142qを用いて定量した。この実験では、無作為に選択された細胞を追跡し、実験を通じたその平均移動速度を算出した。SMBGFDmFcおよびGFDSMBmFcのクローニングマウスIgG定常領域でタグ付けした組換えタンパク質のための発現ベクターを、pFRTTOFcのヒトFc領域をuPARmFc発現ベクターから取ったマウスFc領域とで置換することにより作製した。GFDSMBキメラを作製するために、ヒトuPAcDNAをATFkpnFGLINKRオリゴを用いて増幅し、ヒトVNcDNAをSLINKFSMBRV2オリゴを用いて増幅した。2つのPCR産物を精製し、ATFkpnFSMBRV2オリゴを用いて同時増幅した。SMBGFDキメラを作製するために、ヒトVNcDNAをhVnUkpnSLINKRオリゴを用いて増幅し、ヒトuPAcDNAをGLINKFGFDRVオリゴを用いて増幅した。2つのPCR産物を精製し、VnUkpnGFDRVオリゴを用いて同時増幅した。GFDSMBおよびSMBGFDキメラを、pFRTTOmFc中のKpn1Xho1にクローニングして、GFDSMBmFcおよびSMBGFDmFcをコードする発現ベクターを作製した。ヒトFcでタグ付けしたSMBGFDキメラをコードする発現ベクターを、SMBGFDキメラをpFRTTOFc中のKpn1Xho1にクローニングすることにより作製した。組換えタンパク質の発現および精製pFRTTOGFDSMBmFc、pFRTTOSMBGFDmFcおよびpFRTTOSMBGFDFc発現ベクターを、CHOFlpIn細胞中にトランスフェクトし、以前に記載のように、無血清条件下で組換えタンパク質を発現させた。標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより、馴化培地から組換えキメラを精製し、PBSに対して大規模に透析した。オリゴヌクレオチド配列SLINKF5tcaggcggaggtggctctggcggtggcggacaagagtcatgcaagggc3、GLINKR5agagccacctccgcctgaaccgcctccaccggtttttgacttatctat3、SLINKR5agagccacctccgcctgaaccgcctccaccgggcttgcactcagccgt3、GLINKF5tcaggcggaggtggctctggcggtggcggaccatcgaactgtgactgt3。異種移植実験6週齢のオスのBalbCnunuマウスを、CharlesRiverから取得した。接種前に、血清含有培地中で増殖しているPC3細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、トリプシン処理により収穫し、1200rpmで7分間沈降させた。細胞を、20Matrigelを含む200μlのPBS中に再懸濁した。動物をAvertinの腹腔内注射により麻酔し、10x106個の細胞を、26ゲージの針を用いて麻酔したマウスの右脇腹に皮下接種した。異種移植の5日後、動物を、ビヒクル、非免疫マウスIgG1でipで週に2回処理する2つの対照群と、動物をuPARlockV2で処理する実験群とに動物を無作為化した。動物を、腫瘍の発生および増殖について7週間にわたって週に2回モニターした。腫瘍体積を、式腫瘍体積短い方の直径2x長い方の直径2に従って決定した。明白な腫瘍を生じなかった2匹のマウスを分析から排除した。PBSおよびIgG処理動物において腫瘍成長の有意差はなく、これらのマウスに由来するデータを、uPARlockV2実験群との比較のためにプールした。結果を平均±SEとして分析し、実験データの比較を、対応のない両側等分散t検定により分析した。GFDSMBmFc、SMBGFDmFcおよびSMBGFDhFcの比較上記構築物の組成は、分子、特に、2つのポリペプチドGFDSMBmFcまたはSMBGFDmFcまたはSMBGFDhFcから構成されるジスルフィド結合したホモダイマーであり、以下のアミノ酸組成を有する。GFDSMBmFcは、ヒトuPAの残基1~49、GGGGSGGGGSGGGGリンカー、ヒトVNの残基2~41、GSGLEAGAGリンカーおよびマウス免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域から構成される。SMBGFDmFcは、ヒトVNの残基1~41、GGGGSGGGGSGGGGリンカー、ヒトuPAの残基8~48、GSGLEAGAGリンカーおよびマウス免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域から構成される。GFDSMBhFcは、ヒトVNの残基1~41、GGGGSGGGGSGGGGリンカー、ヒトuPAの残基8~48、GSGLELEVLFQGPIEリンカーおよびヒト免疫グロブリンに由来する重鎖定常領域から構成される。より短い、および長いVNの小片も機能し得る。第5~第39アミノ酸を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。異なる長さおよび配列のリンカー領域が同等に、またはより良好に機能し得る。最少の長さは0である。より短い、および長いuPAの小片も機能し得る。第11~第42アミノ酸を含む配列は、最少の機能的配列を表してもよい。免疫組織化学分析免疫組織化学分析のために、原発腫瘍を切り出し、4パラホルムアルデヒド中で固定し、最適切断温度樹脂中に埋込んだ。組織ブロックを8μmで切片化し、免疫染色のために正に荷電したガラススライド上に載せた。Ki67染色のために、切片を4°Cで1分間、アセトンと共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、RTで1h、予備インキュベーションバッファー中でブロッキングした。スライドを4°Cで一晩、Ki67抗体と共にインキュベートした後、PBSで洗浄した。検出のために、抗ウサギCy3およびDAPIを用いた。スライドをVectamountAQを用いてマウントした。アポトーシス細胞の検出のために、切片を室温で1分間、80エタノールと共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄した後、RTで1h、予備インキュベーションバッファー中でブロッキングした。一次抗体のインキュベーションを4°Cで一晩行った後、PBSで洗浄した。Ki67染色されたスライドに関して検出を行った。細胞増殖およびアポトーシスの定量のために、動物あたり合計24個の切片を、それぞれ10倍の倍率で分析した。データを、視野あたりの陽性細胞の平均数として示す。腫瘍画像化実験のために、uPARlockV2およびマウスIgGを、製造業者の説明書に従ってAlexa488染料で標識した。PC3腫瘍を担持するマウスに、腹腔内経路により50μgの標識タンパク質を注入し、24時間後に腫瘍を収穫した。腫瘍組織を、免疫組織化学分析について記載されたように加工した。結果uPARlockの原理uPAの増殖因子様ドメインおよびVNのソマトメジンBドメインは、無傷分子のuPAR結合決定因子の全部を含有するが、細胞外タンパク質分解および細胞シグナリングにおけるその生物活性を欠く。その結果、これらのドメインは、それぞれuPARuPAおよびuPARVN相互作用の特異的競合的アンタゴニストである。uPARのuPAとVNの両方により媒介される生物活性の完全な阻害には、受容体上の両結合部位の占有が必要であり、これは図1Aに例示される通り、単離されたGFDおよびSMBドメインを用いて達成することができる。阻害には2つの連続的な1番目の分子間結合反応が必要であり、どのリガンドが受容体に最初に結合するかに応じて2つの経路に従い得る。この手法によるinvivoでのuPAR阻害の有効性は、異なる相互作用の親和性および従って、invivoで達成および維持することができるGFDおよびSMBの濃度に応じて制限される。GFDおよびSMBドメインはむしろ小さいため、それらは循環から迅速に消失する可能性が非常に高い。SMBドメインは受容体に対するGFDの親和性よりも約1000倍弱いuPARに対する親和性を有するため、このドメインの結合はこの手法の有効性を制限する可能性が特に高い。uPAR機能を遮断するためのGFDおよびSMBを用いる有効性を有意に改善するために、著者は、共通の足場への結合による2つのドメイン間の強制的近接性が、単離されたドメインと比較して大きく改善された阻害特性を有する化合物をもたらし得るとの仮説を立てた。uPARlockにおいては、GFDおよびSMBドメインは共通の足場上に位置するため、阻害にとって必須である第2の結合反応はここでゼロオーダーの分子内再配置である。この第2の結合反応は分子内結合反応よりも数桁規模でより効率的であると予想されるため、uPARlockの阻害活性は、初期の結合およびいかによく足場が設計されるかによってのみ制限される。その結果、uPARlockはGFDよりも強力なuPAアンタゴニストであり、SMBよりも非常に強力なVNアンタゴニストである。GFDSMB足場は、図1Cに示されるものと異なる方法で作製することができる。GFDおよびSMBドメインを免疫グロブリン重鎖定常領域に結合させ、共有ヘテロダイマーを単離することができる。また、所望のGFDSMB足場をロイシンジッパーのようなダイマーを形成するペプチド配列を用いて作製することもできる。最後に、GFDおよびSMBドメインを、好適なリンカーを含有する単一のポリペプチドとして発現させることができる。一例として、本研究では、免疫グロブリン足場を用いた。より長いか、またはより短い小片のGFDおよびSMBも同様に機能し得る。さらに、GFDおよびSMBはオルトログ遺伝子から誘導することができる。GFDおよびSMBを足場に接続するリンカーの長さおよび配列を変化させることにより、活性をさらに改善することができる。uPAR結合を改善するSMBおよびGFD中の突然変異を導入することもできる。ロイシンジッパーおよび単一ペプチド足場手法も好適である。uPARlockはGFDおよびSMBドメインに基づくものである必要は必ずしもない。これらの構成要素の一方または両方を、他のuPAR結合ドメインまたはuPA結合部位およびもしくはVN結合部位と同一であるか、またはそれと重複する部位でuPARに結合するペプチドと置換することができる。uPARlockの構築uPAR、uPAのアミノ末端断片およびVNのソマトメジンBドメインの間の三元複合体の結晶構造の精査は、uPAおよびVNのペプチド骨格がいくつかの位置で近くに位置することを示している。特に、uPA中のLys48とVN中のPro41は約19Å離れているに過ぎない。これらの位置のuPAおよびVNのペプチド骨格極性はほぼ平行であり、受容体から外側に向かっており、膜固定位置から遠い。かくして、uPAの残基1~48およびVNの残基1~41をそのC末端を介して共通の足場に接続することにより、uPARへの両ドメインの同時的および構成的結合を助けるキメラが生成されると予測される。共通の足場上にGFDおよびSMBを連結するために、著者は、近くに位置する2つのN末端を有するこれらの形態の安定なダイマーとしてヒトIgGの定常領域を選択する。GFDについては、著者はヒトuPAの第1~第48アミノ酸、PreScissionプロテアーゼ切断部位を含有する短いリンカー領域およびヒトIgG1免疫グロブリン重鎖のヒンジおよび定常領域Fcから構成される成熟ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築した。対応するSMBFcポリペプチドは、ヒトVNの第1~第41アミノ酸および同一のリンカーおよびFc領域を有する。Fcタグ付GFDおよびSMBの間のヘテロダイマー化を助けるために、著者は、以前に記載されたように、Fc領域を改変してknobまたはhole置換を担持させた。キメラタンパク質GFDFcKおよびSMBFcHの哺乳動物細胞中での同時発現は、GFDFcKSMBFcHヘテロダイマーの顕著な産生ならびに2および2ホモダイマーならびにGFDFcKおよびSMBFcHモノマーの少量の産生をもたらす。uPARlockはuPARに特異的に結合するuPARlockの受容体結合活性を確認するために、固定された可溶性uPARを、等量のGFDFcKおよびSMBFcH発現ベクターと共に同時トランスフェクトしたPhoenix細胞の馴化培地の連続希釈液と共にインキュベートした。洗浄後、結合したuPARlockを、ビオチン化抗ヒトFc抗体およびEu標識ストレプトアビジンとの連続的インキュベーションを用いて検出した。図3Aに示されるように、uPARlockでトランスフェクトされた細胞の馴化培地は、特異的および用量依存的なuPAR結合活性を実際に含む。uPARlockの精製uPARlockをより良好に特徴付けるために、標準的なプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによりトランスフェクト細胞の馴化培地からタンパク質を精製した。SDSPAGEにより分析した場合、非還元的条件下ではuPARlockはアミノ酸組成から予測される分子量と良好に一致する約75kDaの見かけの分子量を有する。還元的条件下では、SMBFcHおよびGFDFcKモノマーを表す2つの主要なペプチドが観察される。しかしながら、これらの間には分子量の小さな違いがあるため、ヘテロダイマー化の効率を確実に見積もることは不可能である。uPARlockはuPAuPAR相互作用の競合的アンタゴニストであるuPARuPAのアンタゴニストとしてのuPARlockの活性を試験するために、著者は、マウスFcでタグ付けした精製されたuPARを固定されたuPAに結合させる結合アッセイを用いた。このアッセイでは、uPARmFcは飽和可能な様式で、高い親和性でuPAに結合する。uPARlockのアンタゴニスト特性を決定するために、著者は、増加する濃度のuPARlockまたはuPAと混合した固定濃度のuPARmFcを用いる同じアッセイを用いた。このアッセイでは、uPARlockおよびuPAは、非常に類似した用量応答で固定されたuPAへのuPARmFcの結合を阻害し、uPARlockが実際にuPARuPA相互作用の効率的な競合的アンタゴニストであることを実証している。uPARlockはuPARVN相互作用の強力なアンタゴニストであるuPARVN相互作用のアンタゴニストとしてのuPARlockの活性を試験するために、著者は、uPARmFcをuPAの存在下で固定されたVNに結合させる結合アッセイを用いた。このアッセイでは、uPARmFcはuPA依存的様式で高い親和性で固定されたVNに結合する。uPARlockの活性を試験するために、著者は、固定濃度のuPARmFcおよび比較のために増加する濃度のuPARlockまたはuPAと混合した過剰のuPAを用いる実験を行った。このアッセイでは、uPARlockは、固定されたVNへのuPARの結合の非常に強力な阻害剤である。これは、VNへのuPARの結合にとって必要とされるuPAとは全く対照的であり、過剰に存在する場合でも相互作用を顕著に阻害することができない。これらの実験は、uPARlockがinvivoでuPARVN相互作用の強力なアンタゴニストであることを示している。uPARlockはVNへのuPARにより媒介される細胞接着の強力な機能的阻害剤である生細胞中でのuPARシグナリングの阻害におけるuPARlockの活性を評価するために、著者は、リアルタイム細胞分析装置を用いるインピーダンス測定によってVNで被覆されたウェルへの細胞接着を定量した。これらの実験では、著者は、uPAの非存在下では非常に低いVN結合活性を示し、uPAの存在下では完全な活性を示す、条件的uPAR突然変異体を発現する293細胞を用いた。293モックおよび293uPART54A細胞をVN上に播種した場合、それらは1~15時間後にプラトーに達する細胞指数の時間依存的増加により示される通り、基質に弱く接着した。uPAのその後の添加により、細胞指数の劇的な増加によりここで証明される通り、293uPART54A細胞の接着の迅速で強力な増加が誘導される。対照細胞へのuPAの添加は、これらの細胞がuPARを発現せず、細胞指数の顕著な変化も一貫して誘導しないため、細胞接着を促進しない。293uPART54A細胞をuPARlockの存在下で播種した場合、細胞接着の初期段階は未処理の細胞、またはモックトランスフェクト細胞のものと類似しており、uPARlockが基本的なインテグリンに媒介される細胞接着に影響しないことを示している。重要なことは、uPARlockを用いる処理が、uPAの添加により誘導される293uPART54A細胞指数の増加をほぼ完全に無効化するということである。これらのデータは、uPARlockがVNに対するuPAに誘導される、uPARに媒介される細胞接着の強力で特異的な阻害剤であることを示している。GFDとSMBとの間の強制的近接性はuPAuPAR相互作用の拮抗におけるuPARlockの活性に寄与するuPARlockの構築の背後にある原理は、共通の足場への結合によるGFDおよびSMBドメインの間で生成される強制的近接性がその強力なアンタゴニスト活性にとって必須であると予測するものである。この予測に実験的に取り組むために、著者は、図6Aに示されるように同一の足場を有するが、2つのGFDドメインまたは2つのSMBドメインのいずれかを担持するuPARlockの変異体を構築した。これらのタンパク質のSDSPAGEゲルを図6Bに示す。組換えSMBSMBおよびGFDGFDタンパク質、ならびにこれらの11混合物の結合を、固定されたuPARへの結合に関してuPARlockと比較した。GFDGFDとSMBSMBの11混合物は、この試料がuPARlockと同量の組成のGFD、SMBおよび足場ドメインを有するが、GFDとSMBが別の足場上に位置するため、特に良好な対照である。SMBSMBを除いて、全てのタンパク質調製物がuPARへの用量依存的結合を示し、uPARlockの結合が最も強かった。これは、それが相互作用を誘導するGFDとuPARとの高親和性相互作用であるという予測と一致する。GFDGFDSMBSMB混合物がuPARlockと比較してあまりよく結合しないという事実は、uPARlock上のSMBドメインがuPARとのその相互作用を安定化するという仮定を支持する。また、同じタンパク質調製物を、固定されたuPAへのuPARmFcの結合の競合におけるその活性についても試験した。非常に類似した結果が得られた。このアッセイでは、GFDGFD調製物はuPARlockよりも活性が高く、等しい濃度のuPARlockおよびGFDGFDでは、後者のタンパク質は2倍の数の高親和性uPAR結合ドメインを含むという事実と一致する。GFDとSMBとの強制的近接性はuPARに媒介される細胞接着に対するuPARlockの機能的アンタゴニスト活性にとって必須であるVNに対するuPARに媒介される細胞接着に対するuPARlockの阻害活性に関するGFDとSMBとの密接な近接性の重要性を決定するために、著者は固定されたVNに対する293uPARおよび293uPART54A細胞の接着プロセスにおけるインピーダンスの変化を測定した。293uPAR細胞においては、uPARlockは、未処理の細胞と比較してVNに対する基本的な細胞接着を減少させ、uPAに対する応答を無効化する。同じ細胞において、SMBSMBは本質的には活性を示さないが、GFDGFDおよびGFDGFDSMBSMBはアゴニスト活性を示す。293uPART54A細胞においては、uPARlockはアゴニスト活性を有さず、uPAにより誘導される細胞接着を完全に遮断する。これらの細胞において、GFDGFDキメラおよびGFDGFDSMBSMB混合物のアゴニスト効果はさらにより顕著であり、SMBSMBキメラは不活性である。これらのデータは、uPARlock中のGFDおよびSMBドメインの密接な近接性が、VNへの細胞接着におけるuPARシグナリングに対する分子の阻害活性の原因であり、それにとって必要であることを明確に示している。GFDとSMBとの強制的近接性はuPARに媒介される細胞移動に対するuPARlockの機能的アンタゴニスト活性にとって必須である細胞接着の下流の、293細胞におけるuPARの発現も、血清被覆表面上での無作為な細胞移動を刺激する。一貫して、著者は、uPARlockが293uPAR細胞の基本的移動を非常に有意に阻害することを見出した。このuPARlock活性には、SMBとGFDドメインとの強制的近接性が必要である。uPARlockV2単一のポリペプチド中にSMBとGFDドメインを含有するuPARlockの変異体を作製することができ、これはいくつかの利点を有する可能性がある。第1に、これらの製造は、単一のポリペプチドのみを発現させる必要があるため、あまり複雑ではない。第2に、ヘテロダイマー化を要するuPARlock調製物中に低レベルで存在するSMBFcおよびGFDFcのような望ましくない、非阻害的な、およびまたはアゴニスト変異体の形成を防止する単一のポリペプチド鎖中に存在する場合、SMBおよびGFDドメインの数は常に等しい。この目的を考慮して、本発明者らはSMBおよびGFDドメインが単一のポリペプチド鎖中に遺伝子操作し、C末端マウスFcタグでタグ付けしたキメラを構築した。2つの変異体が作製された。第1は、N末端SMBドメイン、リンカー、GFDドメインおよびC末端マウス免疫グロブリン定常領域から構成される。第2は、同様の構成を有するが、SMBおよびGFDドメインの相対位置が逆転している。これらの分子の構造を例示する略図を図9Aに示す。これらのホモダイマータンパク質をCHO細胞中で発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。GFDSMBmFcおよびSMBGFDmFcの機能的阻害活性を決定するために、本発明者らは、VNに対するuPARに媒介される細胞接着の阻害におけるその効力を測定した。図9Bから明らかな通り、SMBGFDmFcキメラは、VNに対するuPARを発現する293細胞の接着の迅速な用量および時間依存的減少を誘導した。SMBGFDmFc、GFDSMBmFcおよびuPARlockによる1時間の処理における用量応答曲線を図9Cに示し、これはSMBGFDmFcキメラがuPARlockまたはGFDSMBmFcキメラよりも約3倍強力であることを示している。これらの試薬はヒトでの使用のために作製されたものであるため、本発明者らは、SMBGFDキメラをヒトFcタグを有するように再クローニングし、この化合物をuPARlockV2と呼んだ。これらのデータは、同じポリペプチド鎖中に位置するSMBおよびGFDドメインを有する機能的uPARlock変異体を作製することができること、およびエフェクタードメインのこの再編成でも、より強力な阻害剤をももたらし得ることを示している。さらに、これらの実験は、uPARlockのようなキメラを作製する場合に、大きい柔軟度が可能になることを実証する。図9Bおよび9Cに示される実験から明らかな通り、uPARlock変異体によるVNへの293uPAR細胞の接着の最大阻害は、約60の最大阻害で不完全である。この残存する細胞接着は、VNに対するインテグリンに媒介される細胞接着により引き起こされる可能性があり、これはuPARlockによっては阻害することができない。この可能性に直接取り組むために、本発明者らは、VN被覆と、uPAR結合において完全に活性であるが、VNの45RGD47配列中の単一のアミノ酸置換に起因してインテグリン結合が欠損している組換えタンパク質VNFcRADとを置換する接着実験を繰り返した。図10Bに認められるように、uPARlockV2は293uPAR細胞接着をほぼ完全に阻害するが、最も高い試験濃度でのuPARlock事象については、残存する接着が依然として観察される。また、uPARlockV2のIC50は、uPARlockのものよりも優れている。総合すると、これらのデータは、uPARlockV2がuPARlockよりも優れていることを示す。概念の証明uPARlockおよびuPARlockV2によるuPAR機能の阻害は、受容体へのSMBおよびGFDドメインの両方の同時結合を必要とすると予測され、これは図7においてuPARlockについて主に実証された。この点をより的確で包括的な方法で証明するために、本発明者らは、uPARとの相互作用を遮断することが知られるSMBドメイン中に単一のアミノ酸置換を含有するuPARlockおよびuPARlockV2の変異体を作製した。これらの変異体、uPARlockD22AおよびuPARlockV2D22Aのドメイン構造を図10Aに例示し、これはSMBドメイン中の単一のAsp22Ala置換について以外はuPARlockおよびuPARlockV2のものと同一である。細胞接着アッセイにおいて生物活性についてアッセイした場合、uPARlockD22AおよびuPARlockV2D22Aは両方とも、阻害活性を示さず、実際、用量依存的アゴニスト活性を示す。総合すると、これらのデータは、単一の足場上の機能的GFDおよびSMBドメインの存在が、uPAR機能のuPARlock様阻害剤に対する基礎的要件であることを示している。uPARlockV2はinvivoで腫瘍成長を阻害するinvivoでのuPARlockの潜在的な抗腫瘍活性を決定するために、本発明者らは、前立腺癌異種移植モデルを用いる試験を行った。このモデルにおいては、100万個のPC3細胞を、皮下経路を介してオスのBalbCnunuマウスの右脇腹に接種した。異種移植された動物を、腹腔内注射によりuPARlockV2で週2回処理し、腫瘍の体積をキャリブレーションによりモニターした。図11に示される通り、uPARlockV2で処理した動物は、対照動物と比較して有意に減少した腫瘍体積を示した。処理した動物は、腫瘍体積の約50の減少を示し、これは抗uPAR阻害抗体ATN658を用いて他者により観察されたものよりも良好である。uPARlockで処理された動物のPC3腫瘍における細胞増殖の低下およびアポトーシスの増強uPARlockで処理された動物におけるPC3腫瘍成長の低下の生物学的理由を精査するために、本発明者らは、異種移植の8週間後に動物から採取した腫瘍切片の免疫組織化学分析を行った。腫瘍細胞増殖を評価するために、本発明者らは、増殖細胞抗原Ki67について染色し、アポトーシスを評価するために、本発明者らは、活性化されたカスパーゼ3について染色した。図12Aに示される通り、uPARlockV2で処理されたマウスから採取した腫瘍は、切断されたカスパーゼ3の反応性により証明されるようにアポトーシスを受ける細胞数の強力な増加を示し、Ki67陽性性により示されるように増殖細胞数の顕著な減少を示す。これらのデータの定量を図12Bに示す。同じ結果はuPARlockについても得られた。総合すると、これらのデータは、uPARlockが、アポトーシスを促進し、細胞増殖を低下させることにより腫瘍成長を抑制することを示唆している。uPARlockを用いる腫瘍画像化および薬剤送達癌の増殖を低下させるその直接的活性に加えて、uPARlockを画像化腫瘍のために、およびまたは薬剤送達ビヒクルとして潜在的に用いることもできる。この可能性に直接取り組むために、本発明者らは、マウスにPC3細胞を異種移植し、薬剤の介入なしに8週間、一次腫瘍を増殖させた。次いで、本発明者らは、腹腔内経路により50マイクログラムのAlexa488標識uPARlockV2またはAlexa488標識マウスIgGを腫瘍担持動物に注射した。標識タンパク質の注射の24時間後、腫瘍を切除し、固定し、包埋し、切片化し、腫瘍組織中の緑色蛍光シグナルの存在について顕微鏡により観察した。図13に示されるように、標識されたuPARlockを注射したマウスに由来する腫瘍は、顕著な蛍光の領域を示したが、標識されたIgGを受ける動物においては同様の蛍光は観察されなかった。同じ結果が、uPARlockについても得られた。これらの領域の細胞の性質は不明であるが、データは、uPARlockが蛍光染料を腫瘍組織に標的化することができることを明確に示し、これはuPARlockを腫瘍画像化のため、およびまたは薬剤送達ビヒクルとして潜在的に用いることができることを示している。[参考文献]