"霊長類の間葉幹細胞のクローン集団を作製する方法であって、以下の工程、1.約5から約100ngmlのbFGFを含む無血清半固形培地に間葉先駆体を含む、霊長類の不均質な単一細胞懸濁物を培養して、独立コロニーが形成する工程、及び2.約5から約100ngmlのbFGFを含む無血清液体培地において、前記独立コロニーの1つを培養して、MSCの実質的に純粋なクローン集団を得る工程、を含むことを特徴とする方法。前記不均質懸濁物が、以下の工程、万能性霊長類細胞を骨髄支質細胞と一緒に分化支援培地で2から5日間、分化細胞が形成されるまで共同培養する工程、及び前記分化細胞を懸濁させる工程、を含む方法で得られる、請求項1に記載の方法。万能性細胞が、胚性幹細胞ESC及び誘導万能性幹iPS細胞から成る群から選択される、請求項2に記載の方法。万能性細胞のinvitro分化によって誘導されない細胞を不均質懸濁物から枯渇させる工程を更に含む、請求項2に記載の方法。枯渇工程が、以下の工程、枯渇させるべき細胞上のエピトープに特異的な常磁性モノクローナル抗体に、枯渇させるべき細胞を非共有結合により結合させる工程、及び磁石を用いて抗体結合細胞を分離する工程、を含む、請求項4に記載の方法。骨髄支質細胞が、マウスOP9細胞である、請求項2に記載の方法。不均質懸濁物が、以下の工程、胚様体を単一細胞に分離させる工程及び前記単一細胞を懸濁する工程、を含む方法で入手される、請求項1に記載の方法。単一細胞懸濁物を10から20日間培養する、請求項1に記載の方法。半固形培地が、約20から約100ngmlのbFGFを含む、請求項1に記載の方法。半固形培地が、約5ngmlのbFGFを含む、請求項1に記載の方法。半固形培地が、約1のメチルセルロースを含む、請求項1に記載の方法。半固形培地が、約10から約20ngmlのPDGFBBを含む、請求項1に記載の方法。単一細胞懸濁物の細胞が、MIXL1及びTを発現する、請求項1に記載の方法。霊長類細胞が、ヒト起源である、請求項1に記載の方法。MSCが、細胞外マトリックスタンパク質の存在下で培養される、請求項1に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質が、マトリゲル登録商標、コラーゲン、ゼラチン又はフィブロネクチンから成る群から選択される、請求項15に記載の方法。間葉コロニーが、FOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2を発現する、請求項1に記載の方法。間葉コロニーが、CD44、CD56、CD140a、CD146及びCD105を発現するが、CD31、CD43、CD45及びVEカドヘリンを発現しない、請求項1に記載の方法。無血清半固形培地で培養中に形成されたコロニーの少なくとも1つの間葉の特徴を観察し、それによって懸濁物中の間葉先駆体の同定を確認する工程を含む、請求項1に記載の方法。少なくとも1つの間葉の特徴が、機能的特徴、形態学的特徴及び表現型の特徴から成る群から選択される、請求項19に記載の方法。機能的特徴が、1間葉細胞の増殖を促進する因子例えばPDGFBB、EGF及びTGFアルファによる増殖刺激及び中胚葉分化に必要な因子例えばVEGF、TGFベータ及びアクチビンAによる増殖抑制;及び2骨形成性、軟骨形成性又は脂肪形成性細胞系列への分化から成る群から選択される、請求項20に記載の方法。形態学的特徴が、1直径が100-500μmの、密に詰まった丸い形状の細胞凝集物;2密集した外側細胞層及び不規則な内部構造の欠如から成る群から選択される、請求項20に記載の方法。表現型の特徴が、1CD44、CD56、CD105、CD146及びCD140aを発現するが、CD31、CD43、CD45及びVEカドヘリンを発現しないこと;2FOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2の発現;及び3ビメンチン、アルファ平滑筋アクチン及びデスミンの発現から成る群から選択される、請求項20に記載の方法。更に、コロニーを計測して、不均質懸濁物中の間葉先駆体の数を概算する工程を含む、請求項19に記載の方法。少なくともCD44、CD56、CD73、CD146、CD140a及びCD105について陽性であるが、CD31、CD43、CD45及びVEカドヘリンについては陰性である、クローン由来間葉幹細胞の実質的に純粋な株を含む、細胞集団。集団が、少なくとも99の間葉幹細胞を含む、請求項25に記載の細胞集団。霊長類のアペリンレセプター陽性側板中胚葉細胞の集団を作製する方法であって、以下の工程、霊長類の万能性幹細胞を分化支援培養液中で培養して、アペリンレセプターを発現する工程、及びアペリンレセプター陽性側板中胚葉細胞を単離する工程、を含むことを特徴とする前記方法。霊長類の万能性幹細胞が、骨髄支質細胞と約2から約5日間共同培養される、請求項27に記載の方法。約1から約5のアペリンレセプター陽性細胞が、血管芽細胞及びメサンギウム芽細胞の潜在能力を有する、請求項27に記載の方法。特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似するか又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、本明細書では好ましい方法及び材料を述べる。遺伝子の発現の欠如又は細胞上にあるマーカーが存在しないということは、本出願時に当業界で公知の方法を用いてそのような遺伝子又はマーカーの発現を検出できないことを指すことは当業者には一般的に理解されている。より感度の高い方法ならばそのような遺伝子又はマーカーの低レベルの発現を検出できる可能性があることは排除し得ない。実施態様及び本発明の特許請求の範囲の記載において、下記の用語が下記に示す定義にしたがって用いられる。本明細書で用いられるように、約は指摘濃度の5内を意味する。本明細書で用いられるように、クローンは、細胞の凝集物からではなく単一細胞から培養した細胞の集団を意味する。クローン集団の細胞は、細胞表面マーカー及び形態に関して実質的に均一なパターンを提示し、遺伝的に実質的に同一である。本明細書で用いられるように、胚様体又はEBは、万能性細胞例えばESC又はiPS細胞に由来する細胞の凝集物であり、この場合、細胞凝集は、ハンギングドロップ、非組織培養処理プレート又はスピンナーフラスコすなわち低粘着条件へのプレート、及び典型的なコロニー増殖を形成するために細胞の表面粘着を妨げる任意の方法によって開始できる。EBは細胞の丸い集合物として出現し、3つ胚葉すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉全てに由来する細胞タイプを含む。EBを作製する方法は当業者には周知である。以下を参照されたい:ItskovitzEldorJetalDifferentiationofhumanembryonicstemcellsintoembryoidbodiescompromisingthethreeembryonicgermlayersMolMed688952000;OdoricoJetalStemCells191932042001;及び米国特許6602711号前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる。本明細書で用いられるように、無血清は、培養も培養液も血清又は血漿を含まないが、精製もしくは合成された血清成分又は血漿成分例えばFGFは、下記に記載するように再現性のある量で培養に提供することができる。本明細書で用いられるように、実質的に純粋な集団は、少なくとも99の所望の細胞タイプを含む誘導細胞の集団を意味する。細胞の精製は当業者に公知の任意の手段によって達成できる。例えば実質的に純粋な細胞集団は、本明細書に記載するようにより純度の低い集団から細胞の増殖によって又は選別によって得ることができる。本明細書で用いられるように、万能性細胞は、3つの胚葉の全てに分化して身体の任意の細胞タイプになることができる細胞の集団を意味する。万能性細胞は多様な細胞表面マーカーを発現し、未分化細胞の細胞形態学的特徴を有し、免疫障害動物例えばSCIDマウスに導入したとき奇形腫を形成することができる。奇形腫は典型的には3つの胚葉全てに特徴的な細胞又は組織を含む。本明細書で用いられるように、多能性細胞は万能性細胞よりも分化が進んでいるが、永久的に特定の細胞タイプに拘束されているわけではない。万能性細胞はしたがって多能性細胞よりも高い潜在能力を有する。本明細書で用いられるように、誘導万能性幹細胞又はiPS細胞は、万能性へと再プログラミングされた分化した体細胞である。前記細胞は、それらの対応する分化した体細胞の起源と遺伝的に実質的に同一であり、より高い潜在能力を有する細胞例えばES細胞と類似する特徴を提示する。以下を参照されたい:YuJetalInducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcellsScience318191719202007前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。本明細書で用いられるように、間葉幹細胞MSCは、骨格細胞系列すなわち骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪細胞に分化することができる細胞である。上記に特記したように、固有のMSCマーカーは未だ同定されていない。したがって、当業者に周知の形態学的及び機能的基準を用いてこれらの細胞を同定する。以下を参照されたい:HorwitzetalsupraDominicietal上掲書;TrivediPHemattiPDerivationandimmunologicalcharacterizationofmesenchymalstromalcellsfromhumanembryonicstemcellsExpHematolJan52008Epubaheadofprint;TrivediPHemattiPSimultaneousgenerationofCD34primitivehematopoieticcellsandCD56mesenchymalstemcellsfromhumanembryonicstemcellscoculturedwithmurineOP9stromalcellsExpHematol351461542007;米国特許出願の米国公開公報No20060008902前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる。本明細書に記載した方法によって作製されたMSCは表現型の基準にしたがって特徴付けることができる。MSCは、球形から卵形の核を有する特徴的な単核の卵形、星形又は紡錘形の形状によって認識することができる。伸長した卵形の核は、典型的にははっきりとした核小体並びに異質染色質及び真正染色質の混合物を有する。これらの細胞はほとんど細胞質をもたないが、核から伸長するように見える多くの細い突起を有する。MSCは典型的には以下のマーカー、CD106VCAM、CD73、CD146、CD166ALCAM、CD29、CD44及びアルカリ性ホスファターゼの1つ、2つ、3つ又は4つ以上について染色されるが、造血系列の細胞マーカー例えばCD14又はCD45及び内皮系列の細胞マーカー例えばCD31及びVEカドヘリンについては陰性であると考えられている。MSCはまたマーカーとしてSTRO1を発現することができる。本明細書で用いられるように、メサンギウム芽細胞はMSCとともに内皮細胞の先駆細胞である。本明細書で用いられるように、間葉コロニーはメサンギウム芽細胞を起源とする間葉細胞を含むコロニーである。本明細書で用いられるように、血管芽細胞は血管細胞とともに内皮細胞の前駆体である。本明細書で用いられるように、芽細胞コロニーは血管芽細胞を起源とするもっぱら造血細胞を含むコロニーである。本明細書で用いられるように、中内胚葉mesendodermは中胚葉及び内胚葉を生じる組織である。本明細書で用いられるように、中胚葉は、POU4F1、SOX1及びPAX6神経冠、LAMA3、KRT14及びKRT10表面外胚葉、CGA及びPLAC1栄養外胚葉、FOXA、FOXA2、APOA1、TMPRSS2、TTR1及びAFP内胚葉、並びにSOX2及びDPPA2未分化hESCよりもはるかに高レベルでKDR及びPDGFRaを発現する細胞サブセットである。本明細書で用いられるように、側板中胚葉は、少なくともFOXF1及びHAND1を発現するが、MEOX1及びTCF15沿軸中胚葉、PAX2及びPAX8中間中胚葉の発現を欠き、更に少なくとも内皮系及び造血系に分化する能力を有する中胚葉のサブセットである。マトリゲル、ラミニン、コラーゲン特にコラーゲンI型、フィブロネクチン及びグリコサミノグリカンはいずれも、細胞外マトリックスとして単独で又は多様な組合せで適切であり得る。本発明は、以下の非限定的な実施例を熟考するとき更に完全に理解されるであろう。無血清条件下で万能性幹細胞からMSCを作製するhESCH1;WiCellMadisonWIは、無血清培養液例えば、20のノックアウトKnockoutTM血清代替物、2mMのLグルタミン、1x100μM非必須アミノ酸、100μMの2メルカプトエタノール及び4ngmlのbFGFいずれもGibcoInvitrogenCarlsbadCAを補充したDMEMF12培養液中で、放射線照射マウス胎児線維芽細胞上で維持された。以下を参照されたい:AmitMetalClonallyderivedhumanembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandproliferativepotentialforprolongedperiodsofcultureDevBiol2272712782000前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。マウスOP9骨髄支質細胞DrToruNakanoより寄贈、更にATCCカタログCRL2749からも入手可能は、20ウシ胎児血清FCS;HyClone,LoganUTを含むアルファMEM培養液GibcoInvitrogen中でゼラチン被覆皿での4日間の継代培養によって維持された。hESCは、以前に記載されたように、マウスOP9骨髄支質細胞との共同培養によって分化が誘導されたVodyanikMetalHumanembryonicstemcellderivedCD34cellsefficientproductioninthecoculturewithOP9stromalcellsandanalysisoflymphohematopoieticpotentialBlood1056176262005前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。簡単に記せば、hESCの小さな凝集物を、10FCS及び100μMのMTGSigmaStLouisMOを補充したアルファMEM中のOP9細胞に加えた。培養の次の日1日目培養液を交換し、下記に示す日に培養を採集した。hESCH1のOP9支質細胞との共同培養から2日目に、原条集団中内胚葉GSC、EOMES、MIXL1及びTBRACHYURY及び初期中胚葉EVX1、LHX1及びTBX6のための転写因子のピーク発現がニムブレゲンNimbleGenMadisonWIマイクロアレイで検出された。共同培養から3-5日目に、培養は、間葉先駆細胞を内胚葉及び中胚葉に特徴的な遺伝子を発現する細胞とともに含んでいた。中胚葉に特徴的な遺伝子の中では、側板中胚葉に特徴的な遺伝子のみ例えばFOXF1、HAND1、NKX25及びGATA2が一貫して発現された。対照的に、中軸中胚葉、沿軸中胚葉MEOX1、TCF15又は中間中胚葉PAX2、PAX8に特徴的な遺伝子は一貫しては発現されなかった。したがって、3-5日間OP9細胞と共同培養したhESCは、側板胚体外中胚葉に特徴的な遺伝子を発現する細胞を生じた。hESCH1OP9共同培養から3-5日目に、細胞はまた最大の細胞分裂によって特徴づけられ、更に上皮系-間葉転換EMT、SNAI1、SNAI2及び細胞の数量拡大HOXB2、HOXB3に必要な遺伝子の発現を維持した。hESCH1OP9共同培養から5-7日目に、特異的な中胚葉系列及び内胚葉系列への分化が観察され、このとき発達中の内胚葉系AFP及びSERPINA1、間葉SOX9、RUNX2及びPPARG2及び血管内皮系CDH5及びGATA1細胞のマーカーが検出された。筋肉誘導因子MYOD1、MYF5及びMYF6、神経外胚葉SOX1、PAX6及びNEFL又は栄養外胚葉CGB及びPLACのマーカーはいずれも7日間の共同培養を通じて発現されず、OP9細胞は、中内胚葉経路へ方向付けられhESC分化のために有効な誘導環境を提供することを示した。hESCH1OP9共同培養から2日目に、37°Cで15分間のコラゲナーゼIVGibcoInvitrogenDMEMF12培養液で1mgml及び37°Cで10分間の005トリプシン‐05mMEDTAGibcoInvitrogenによる連続的酵素処理によって、単一細胞懸濁物を共同培養から採集した。細胞をPBS‐5FBSで3回洗浄し、70μm及び30μm細胞ろ過器BDLabwareBedfordMAでろ過し、抗マウスCD29PEAbDSerotecRaleighNC及び抗PE常磁性モノクローナル抗体MiltenyiBiotecAuburnCAで標識した。細胞懸濁物は磁石活性化細胞分類MACSにより以下のように精製した:細胞懸濁物をMidiMACS分離ユニットMiltenyiBiotechと結合させたLD磁気カラムに通し、OP9枯渇hESC誘導細胞の陰性分画を得た。純度はパン抗ヒトTRA185モノクローナル抗体RDSystemsMinneapolisMNを用いて立証した、精製した単一細胞懸濁物を、10-20ngmlPDGFBBPeproTechの存在下又は非存在下で半固形無血清培地に05-2x104細胞mlの濃度でプレートした。前記培地は、5-100ngmlbFGFPeproTechRockyHillNJ及び1メチルセルロースStemCellTechnologiesVancouverCanadaを補充したステムラインStemLineTM無血清培地SigmaStLouisMOで構成されていた。PDGFBBは間葉細胞の増殖を改善したが、コロニー形成については必須ではなかった。或いは、単一細胞懸濁物は以下を含む半固形コロニー形成無血清培地にプレートされた:40ESCultM3120メチルセルロース、25無血清エクスパンション培地SFEMStemCellTechnologies、25内皮無血清培地ESFMInvotrogen、10BIT9500StemCellTechnologies、グルタマックスGlutaMAX、1:100に稀釈、エクスサイトExCyteMillipore、1:1000に稀釈、100μMモノチオグリセロールMTG、50μgmlアスコルビン酸及び20ngmlのbFGF。10-20日培養した後、胚様体EBと類似する大きくてコンパクトな間葉コロニーが形成された。これらの間葉コロニーは7日目に検出されたが、10-20日の培養が活発に増殖するコロニーを提示するために必要であった。未分化のhESC又は共同培養から1日目もしくは6日目に採集した細胞は、同じ条件下で培養したときこれらの間葉コロニーを形成しなかった。間葉コロニー類胚様体に似るは以下のいくつかの特徴によりEBとは区別された:1bFGFを補充した無血清条件下での形成及び増殖、並びに間葉細胞の増殖を促進する因子例えばPDGFBB、EGF及びTGFαにより刺激されるが、間葉コロニーで中胚葉分化に必要な因子例えばVEGF、TGFβ及びアクチビンAによって抑制されること;2間葉コロニーでは長期間培養後でさえも、EBに特徴的な密集した外側細胞層及び不規則な空洞化構造を欠くこと;3間葉コロニーを構成する細胞では形態学的な均質性が提示されること;及び4コンパクトな回転楕円体に更に発達する密に詰まった構造物コアの樹立によるコロニー形成。単一細胞懸濁物が半固形培地へのプレート時に凝集物を形成しなかったことを示すために、前記培養方法で得られた間葉コロニーのクローン性が、レトロウイルスによりレポーター遺伝子例えば強化緑色蛍光タンパク質EGFP又はヒストン2BmOrange蛍光タンパク質で目印を付けた細胞から樹立したキメラhESC株を用いて試験し確認された。レポーター遺伝子生成物の発現によってクローン性が示された。キメラhESC株は以下の2つのレンチウイルス構築物から作製された:1伸長因子1アルファEF1アルファプロモーターから構成的に発現されるEGFPタンパク質、及び2EF1アルファプロモーターから構成的に発現されるH2BBmOrangeタンパク質。両構築物を293FT細胞にパッケージし、レンチウイルスによりH1hESCを形質導入して、緑色のEGFPタンパク質又はオレンジ色のH2BBmOrangeタンパク質のどちらかを発現する安定なH1hESC株を作製した。記載の方法により誘導した間葉コロニーは単一コロニーは単色緑色又はオレンジ色のどちらかであり、したがってMSCはクローン起源すなわち単一細胞であることを示している。更にまた、予想表現型解析によって間葉コロニー形成細胞CFC頻度とKDRVEGFR2発現との間の正の相関性が示された。ただしもっとも初期の血管形成性前駆体のKDRhighCD34集団は間葉CFCを欠いていた。間葉コロニー内の細胞の解析によって、CD90、CD140a及びCD166の高発現、CD44、CD56及びCD105の低発現、並びにCD24、CD31、CD43、CD45、CD144VEカドヘリンの発現欠如及びSSEA4の発現欠如によって規定される初期間葉細胞の均質集団であることが示された。更にまた、間葉コロニーはビメンチン、アルファ平滑筋及びデスミンを発現した。更にまた、間葉コロニーはMSC系列に特異的な遺伝子、例えばFOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2を発現した。コラーゲン又はフィブロネクチンを被覆した96ウェルプレートのウェルに個々の間葉コロニーを移した。前記ウェルには、02mlウェルのステムライン無血清培地5-100ngmlbFGFを補充又は50のステムラインII無血清HSCエクスパンション培地HSFEMSigma及び50ESFMグルタマックス1:100に稀釈、エクスサイト1:2000に稀釈、100μMTG及び10ngmlのbFGFを補充から成る無血清エクスパンション培地で予め満たされていた。3-4日間培養した後、個々のウェルの粘着細胞をトリプシン処理によって採集し、5-100ngmlbFGF補充ステムライン無血清培地又は無血清エクスパンション培地MSFEM50のステムラインII商標無血清HSCエクスパンション培地HSFEMSigma、50ESFM、グルタマックス1100稀釈、エクスサイト12000稀釈、100μMTG及び5-100ngmlのbFGFを含む中でコラーゲン又はフィブロネクチン被覆皿にて数量を拡大させた。多数回の継代のためにMSCの数量を拡大させた。個々のコロニーをコラーゲン又はフィブロネクチン被覆プレートにプレートしたとき、線維芽細胞に類似する細胞が即座に粘着し激しく増殖するのが観察された。その後の継代では、最初の10継代の間は細胞は激しく増殖したが、10-15継代で増殖速度は低下し、15-20継代では徐々に老化が観察された。単一MBCFCに由来する培養は観察期間中に合計1022の細胞を蓄積させた。各コロニーは単一細胞を起源とすると考えられるので、前記の数は単一hESC由来間葉前駆体の数量拡大潜在能力と一致する。個々のコロニーから樹立された細胞株はbFGF補充無血清培地で10-15継代の間高い分裂速度で維持された。全ての細胞株は、CD44、CD56、CD73、CD105、CD146及びCD140aPDGFRAの発現及び血管内皮系マーカーすなわちCD31、CD43、CD45及びVEカドヘリンの欠如を特徴とする間葉表現型を示した。間葉分化潜在能力を出現させる条件下で試験したとき、前記細胞株は骨形成性、軟骨形成性及び脂肪形成性分化能力を示した。興味深いことに、これらの細胞は骨髄MSCに類似しているが、骨髄MSCよりも良好に数量を拡大し分裂する。これらの数量拡大間葉細胞は軟骨形成性細胞系列、骨形成性細胞系列及び脂肪形成性細胞系列に分化することができた。しかしながらこれらの細胞は、OP9細胞とともに培養したとき、又は血管内皮増殖因子VEGF、bFGF、SCF、TPO、IL3、IL6とともに無血清培養で培養したとき造血細胞又は内皮細胞を生じることはできず、これらの間葉細胞の限定分化潜在能力を示した。間葉コロニーはまた種々の誘導万能性幹細胞iPS、例えばレンチウイルスベクターを用いて再プログラミングされたiPS1、iPS46及びiPS1YuetalScience318191719202007、又はトランスジーンを含まないiPS5437T及びiPS11997TYuetalScience3247978012009から作製された。トランスジーンを含むiPS細胞に由来する間葉コロニーは不規則でより構造の粗い形態を示す。トランスジーンを含まないiPSCは典型的な回転楕円体の間葉コロニーを生じた。メサンギウム芽細胞のinvitro作製と性状決定造血系、内皮系及び間葉幹細胞の潜在能力を有する中胚葉系列の細胞を生じることができる中胚葉系先駆細胞集団を単離し性状を決定するために、実施例1に記載したようにH1hES細胞をOP9細胞と共同培養した。2から3日間共同培養した後で、原条集団中内胚葉の代表的遺伝子MIXL1、T、EOMESが発現されたとき、抗マウスCD29抗体を用いてOP9細胞を枯渇させたhESC誘導細胞を、20ngmlのbFGFPeproTechRockyHillNJを含む半固形無血清培地実質的に実施例1に記載したとおりにプレートした。プレートしたH1由来TRA185細胞1000個当たりのコロニー形成細胞CFC数を計算した。半固形培地で2-3日経過した後で、細胞は密に詰まった構造コアを形成した。OP9細胞との2日間の共同培養で分化したhESCに由来するコアは更に回転楕円体の間葉コロニーへと増殖した。OP9細胞との3日間の共同培養で分化したhESCに由来するコアは更に、造血系及び内皮系潜在能力を有する分散した芽細胞コロニーへと増殖した。bFGFはhESCに由来する両方のコロニーの形成のために必要かつ十分である。bFGFは間葉コロニー及び芽細胞コロニーの両方の形成を支援した。対照的に、bFGFの非存在下では、VEGFもPDGFBB図1A、SCF、IGF1又はHGFデータは示されていないも、単独であっても組み合わされてあっても、どちらのコロニーの形成も支援しなかった。一方、PDGFBB10ngmlは単独ではコロニー形成を支援しなかったが、bFGFと組み合わせたPDGFBBは間葉コロニーの収量及びサイズをbFGF単独と比較して顕著に増加させた図1A。VEGF20ngmlは単独ではコロニー形成を支援しなかったが、bFGF培養に前記を添加したとき芽細胞コロニーの数はわずかに増加したが、ただし間葉コロニーの形成は抑制された図1A。各コロニータイプを生じた細胞は、全hESC由来細胞の約2-3を構成した図1B。間葉コロニー内の細胞が血液血管系列の細胞を生じることができるか否かを決定するために、個々の間葉コロニーを5-7日目にメチルセルロースから採取して、10FBS並びにサイトカインSCF50ngml、TPO50ngml、IL310ngml及びIL620ngmを含むアルファMEM培養液中でOP9細胞上にプレートした。4日間培養した後で細胞を採集し、フローサイトメトリーで解析するか、又はウサギ抗ヒトCD144VEカドヘリン;1μg、eBioscienceSanDiegoCAをマウス抗ヒトCD4305μgml、BDBioscienceもしくはマウス抗ヒトカルポニン05μgml、ThermoFisherScientific一次抗体と組み合わせて用い、続いて交差吸収した二次ロバ抗マウスIgGDyLight594及びロバ抗ウサギIgGDyLight488抗体両抗体ともに2μgml、JacksonImmunoResearchLaboratoriesIncWestGrovePAでinsitu染色した。間葉コロニーは、内皮系及び間葉細胞を生じる前駆体、すなわちメサンギウム芽細胞起源であった。実施例1で説明したように、粘着培養で間葉コロニーから数量拡大されたMSCは、OP9細胞と培養したとき造血細胞又は内皮細胞を生じなかった。対照的に、半固形培地中で5-7日目のコロニー形成培養から単離した間葉コロニーの約70が、OP9細胞と培養したときCD31CD144内皮細胞を生じた図1D及びE、上段パネル。したがって、間葉コロニーは、内皮系列及び間葉列の共通の前駆体、すなわちメサンギウム芽細胞起源であった。対照的に、芽細胞コロニーはCD31CD43造血細胞を含み、内皮細胞を生じることができた図1D及びE、下段パネル。間葉コロニーの内皮系潜在能力は、コロニー形成アッセイの媒体への骨形態発生タンパク質4BMP4の添加により顕著に強化できたBMP4非添加でCD31CD43細胞が32±24に対して5ngmlのBMP4で116±05。実質的に側板胚体外中胚葉細胞に富む細胞集団の作製及び単離OP9共同培養で分化させたH1hESCの遺伝的プロファイリングは、外胚葉栄養外胚葉、神経外胚葉又は表面外胚葉が検出不能であることにより中胚葉及び内胚葉系列への選択的拘束を明らかにした図2。原条遺伝子MIXL1、T及びEOMESの同期発現が検出されたとき、細胞は培養2日目までに中内胚葉に拘束された。以降の培養で、中胚葉及び内胚葉特異的遺伝子が、更に最終的には二次性内胚葉及び中胚葉特異的遺伝子が発現された。中胚葉遺伝子のうちで、側板胚体外中胚葉サブセットに特徴的なものFOXF1、HAND1、NKX25、GATA2が一貫して発現されたが、中軸中胚葉CHRD、SHH、沿軸中胚葉MEOX1、TCF15又は中間中胚葉PAX2、PAX8サブセットの遺伝子の発現は一貫しなかった。アペリンレセプターAPLNRの発現は強く誘導され、分化の2-3日目に中胚葉の拘束と同時にアップレギュレートされた。APLNR発現及び前記を発現する細胞の特徴を決定するために、アペリンレセプター特異的モノクローナル抗体RDSystemsをCD30、KDR、PDGFRA、T及びFOXA2に対する抗体と組み合わせてOP9共同培養で分化させたhESCを染色した。未分化hESC及びOP9共同培養から1日目のhESC由来細胞はAPLNR陰性であった図3A、Day1パネル。APLNRの発現は、OP9細胞と2-3日間共同培養した細胞で強くアップレギュレートされた図3A、Day2及びDay3.2日目には、15-20の細胞がAPLNRで、3日目までに、60-70の細胞がAPLNRであった。このアップレギュレーションは中胚葉拘束と同時に生じ、このことは中胚葉マーカー、例えばKDRVEGFR2、T及びPDGFRAのアップレギュレーションによって立証された図3A、Day2及びDay3。APLNR細胞数は日が経過するにつれ徐々に減少した図3B。逆にhESCマーカー例えばCD30は連続してダウンレギュレートした。PDGFRAは共同培養2日目では低レベルでのみ発現されたが、APLNRは共同培養から2日目に早くも高濃度で発現され、APLNR陰性細胞からAPLNR陽性細胞の分離を可能にする。H1OP9細胞の共同培養から2、25及び3日目に、APLNR及びAPLNR細胞を磁気による分類によって分離し、マイクロアレイ解析で遺伝子発現を解析した。MIXL1、T及びEOMES原条細胞中内胚葉の指標であるはいずれもAPLNR細胞で発現されたが、神経冠神経外胚葉と密接に関連する転写物POU4F1、SOX1、SOX2、SOX3、SOX10は検出できなかった図4A及び4B。予想されたように、APLNR細胞ではTCF21中胚葉特異的転写物が豊富であったが、全内胚葉FOXA2、APOA1、限定内胚葉FOXA1、TMPRSS2及び内臓内胚葉TTR、AFPは、APLNR細胞で見出された図1A及びC。興味深いことに、APLNR細胞は、側板胚体外中胚葉に典型的なFOXF1、IRX3、BMP4、WNT5A、NKX25、HAND1及びHAND2を発現したが、胚の沿軸筋原性中胚葉MEOX1、TCF15、PAX3、PAX7及び中間中胚葉PAX2、PAX8のマーカーは発現しなかった。このデータは、APLNR細胞は、中内胚葉への発達を運命づけられた細胞の全集団ではなく、中胚葉、おそらくは側板胚体外中胚葉を連想させるその亜集団の代表であることを示している図3C及び図4。更に中胚葉の実体を確認するために、T初期中胚葉のマーカー及びFOXA2内胚葉のマーカーの発現についてAPLNR細胞を解析した、図3Aに示すように、APLNR細胞はTであり、4日目に収束するまでT発現を維持する。対照的に、FOXA2細胞培養の全細胞の5未満を含んでいたはAPLNRを発現しなかった。したがって、APLNR細胞は培養2-3日目ではTFOXA2中胚葉系前駆体である。APLNR細胞は中胚葉系前駆体であるという見解を更に支持するために、H1OP9共同培養に中胚葉形成阻害物質SB4315425μgml又はDKK1150μgmlを補充した。APLNR細胞は、中胚葉形成阻害物質を加えた培養では検出できず図3B、APLNR細胞は中胚葉系であることが確認された。更にまた、間葉コロニー及び芽細胞コロニー形成潜在能力は完全にAPLNR細胞集団内でのみ見出され図3D、メサンギウム形成性間葉コロニー及び血管形成性芽細胞コロニーの両方がAPLNR中胚葉系前駆体によって形成されることが更に確認された。APLNR側板胚体外中胚葉細胞の単離による無血清条件下でのhESC由来メサンギウム芽細胞の濃縮間葉コロニーの起源を認定し、メサンギウム芽細胞に富む細胞集団を得るために、万能性幹細胞をOP9と2-3日間共同培養し、中胚葉形成を誘導した。マウス特異的CD29抗体によりOP9細胞を枯渇させた後で、APLNR及びAPLNR細胞を磁気分類により単離した。bFGF存在下の半固形培地でのコロニー形成アッセイによって、メサンギウム芽細胞及び血管芽細胞の潜在能力は完全にAPLNR分画内に限られることが示された図3D。APLNR分画内の約1から5の細胞がメサンギウム芽細胞活性を有していた。本発明を現在もっとも実践的で好ましい実施態様であると考えられるものと関連して述べてきた。しかしながら、本発明は例示的手段として提供されてきたのであって、開示の実施態様に限定することは意図されていない。したがって、本発明が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲内の全ての改変及び代替的取り合わせを包含しようとするものであることは当業者には理解されよう。"