選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法であって:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第1の宿主細胞環境において、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、前記選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第2の宿主細胞環境において前記プラスミドを培養するステップを含む、方法。c前記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを細胞培養物中で維持するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。d前記選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを前記第2の宿主細胞環境から単離するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、部位特異的な組換えを起こすために必要な補助配列に機能的に関連している、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、異なる細胞内にある、上述の請求項のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境が、PepA、ArgR、およびArcAをコードする遺伝子のうちの1つ以上に不活性化変異を含む、請求項5に記載の方法。前記第2の宿主細胞環境が、活性バージョンのPepA遺伝子およびArgR遺伝子またはArcA遺伝子を含む、請求項5または6に記載の方法。前記第2の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼを含む、請求項5に記載の方法。前記部位特異的リコンビナーゼが、内因性部位特異的リコンビナーゼである、請求項7に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、同じ宿主細胞内に形成される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、一時的に分離される、請求項9に記載の方法。前記第2の宿主細胞環境が、誘導性部位特異的リコンビナーゼを含む、請求項9または10に記載の方法。前記第2の宿主細胞環境が、細胞の温度の変更、細胞の容量オスモル濃度の変更、細胞内のインデューサーのレベルの変更、または前記プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する細胞内の化学種のレベルの変更によって形成される、請求項9~12のいずれか1項に記載の方法。前記部位特異的リコンビナーゼが、Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX、およびCodVから選択される、請求項8、9、12、または13のいずれか1項に記載の方法。前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、トランスポザーゼ標的部位である、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、Ecdif、cer、psi、pif、mwr、Bsdif、loxP、FRT、およびRSから選択される、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。前記選択可能なマーカー遺伝子が、抗生物質耐性遺伝子である、上述の請求項のいずれか1項に記載の方法。前記選択可能なマーカー遺伝子が、前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境に必須であるが、それらには存在しない代謝産物の産生を可能にする、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境が、グラム陰性細菌細胞である、上述の請求項のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、およびビブリオ属から独立して選択される、請求項19に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境が、グラム陽性細菌細胞である、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、およびミコバクテリウム属から独立して選択される、請求項21に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境が古細菌である、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境が酵母細胞である、請求項23に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、ハンゼヌラ属、ピキア属、サッカロミセス属、およびシゾサッカロミセス属から独立して選択される、請求項24に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および/または前記第2の宿主細胞環境が、プラスミドを複製することができる非真菌真核生物である、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。前記第1の宿主細胞環境および前記第2の宿主細胞環境が、クラミドモナスChlamydomomas属、タマホコリカビ属、およびエントアメーバ属から独立して選択される、請求項26に記載の方法。前記プラスミドが、1つ以上の目的の遺伝子をコードする、上述の請求項のいずれか1項に記載の方法。上述の請求項のいずれか1項に記載の方法に従って作製されるプラスミド。選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む、非改変宿主細胞。残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を有しかつ選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む、宿主細胞。誘導性部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む、請求項31に記載の宿主細胞。前記誘導性部位特異的リコンビナーゼが、前記宿主細胞の染色体に存在する、請求項32に記載の宿主細胞。請求項30に記載の非改変宿主細胞または請求項31~33のいずれか1項に記載の宿主細胞および薬学的に許容され得る担体を含む、組成物。請求項30に記載の非改変宿主細胞、請求項31~33のいずれか1項に記載の宿主細胞、または請求項34に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、前記患者を予防接種または処置する方法。患者の予防接種または患者の疾患の処置に使用するための、請求項30に記載の非改変宿主細胞、請求項31~33のいずれか1項に記載の宿主細胞、または請求項34に記載の組成物。患者を予防接種するまたは患者の疾患を処置するための薬剤の製造に使用するための、請求項30に記載の非改変宿主細胞、請求項31~33のいずれか1項に記載の宿主細胞、または請求項34に記載の組成物。部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞であって、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAのうちの1つ以上をコードする染色体遺伝子のうちの1つ以上に不活性化変異をさらに含む、宿主細胞。キットであって:i部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む第1の宿主細胞環境であって、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない、第1の宿主細胞環境;およびii前記選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、前記部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第2の宿主細胞環境を含むか、またはこれらからなる、キット。これら両方の選択可能マーカー遺伝子を含まない発現系の不都合な点は、微生物細胞の染色体を遺伝子改変する必要があることである。これは、多くの種で技術的に困難であり、遺伝子操作を容易に行うことができる種であっても、多くの時間と労力を要する。したがって、選択可能なマーカー遺伝子を含まず、かつ宿主細胞の遺伝子改変を必要としないプラスミド選択系を開発する必要がある。発明の説明本発明者らは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを産生する系を開発した。この系の開発では、本発明者らは、驚くべきことに、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを、プラスミド維持系を用いずに宿主細胞に維持できることを見出した。当業者は、プラスミド維持系の非存在下ではプラスミドが宿主細胞から消失すると予期していたため、この知見は予想外である。この驚くべき知見は、選択可能なマーカー遺伝子の切除後の細胞にかかる代謝負荷の大幅な減少によるものである可能性が高い。したがって、第1の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第1の宿主細胞環境において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得る第2の宿主細胞環境においてプラスミドを培養し、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。宿主細胞環境用語宿主細胞環境は、宿主細胞自体および宿主細胞環境の条件を包含する。したがって、宿主細胞環境は、プラスミドが第1の宿主細胞から第2の宿主細胞に移動すると、または宿主細胞の条件が変更されると変化する。後者の場合は、第1の宿主細胞環境と第2の宿主細胞環境が、一時的に分離される。宿主細胞の条件は、一般に、細胞が培養される条件を変更することによって変更される。変更できる条件は、限定するものではないが、容量オスモル濃度、温度、インデューサーの存在または非存在、細胞の成長段階、およびDNAの二次構造または超らせん性を変更する化学種chemicalsの存在を含む。したがって、第2の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない第1の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得る第2の宿主細胞においてプラスミドを培養し、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。第3の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする容量オスモル濃度の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞の容量オスモル濃度を変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。第4の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする温度の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞の温度を変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。第5の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにするインデューサーの存在しない宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように宿主細胞にインデューサーを添加して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。第6の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:aプラスミドのDNAの二次構造または超らせん性を変更して、細胞が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こし得ないようにする化学種が存在する宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るように細胞中の化学種のレベルを変更して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。第7の態様では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを作製する方法に関し、この方法は:a部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用して、細胞が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こし得ないようにすることができる部位特異的リコンビナーゼが存在しない第1の宿主細胞において、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを培養するステップ;およびb続いて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼが存在する第2の宿主細胞においてプラスミドを培養して、選択可能なマーカー遺伝子を切除するステップを含む。一実施形態では、宿主細胞環境は、上記の1つ以上の変更によって変更することができる。部位特異的リコンビナーゼ一実施形態では、本発明の方法は、第2の宿主細胞環境において選択可能なマーカー遺伝子を切除することができる内因性部位特異的リコンビナーゼを利用する。これは、宿主細胞を遺伝子改変する必要をなくすため有利であり、この方法が、より単純かつより効率的になる。用語内因性は、部位特異的リコンビナーゼが第2の宿主細胞環境と同じ細胞型を起源とする意味で使用される。一般に、部位特異的リコンビナーゼは、第2の宿主細胞環境を起源とする、すなわち第2の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼを発現できる遺伝子を含めるために遺伝子操作されていない。当業者には、本発明の方法においてプラスミドに作用する内因性部位特異的リコンビナーゼの性質が、このプラスミド内に存在する部位特異的リコンビナーゼ標的部位の性質に依存することは明らかであろう。内因性部位特異的リコンビナーゼの利用は、トランス型の外来性リコンビナーゼの導入を必要としないため、従来技術よりも有利である。これは、リコンビナーゼを発現させるために宿主細胞環境を変更する必要がないため、方法を単純にし、方法を迅速、割安、かつより効率的にする。さらなる実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼは、XerC、XerD、CodV、RipX、Cre、Int、Xis、P22、Flp、およびR1の1つ以上を含むことができる。一実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼは、Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX、およびCodVから選択することができる。別の実施形態では、内因性部位特異的リコンビナーゼはトランスポザーゼであることができる。好ましくは、部位特異的リコンビナーゼは、XerCおよびXerDである。より好ましくは、XerCおよびXerD部位特異的リコンビナーゼは内因性である。原核生物中のXer組換え系は、複製後の正確な染色体分離を保障し、かつRecAによって生成される染色体二量体を単量体に戻すために必須であり、複製された染色体の分離を可能にする。Xerリコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼファミリーのメンバーであり、グラム陰性菌、例えば、大腸菌中のXerCおよびXerDBlakelyら、Cell、1993、75:351-361、およびBacillussubtilisおよび他のグラム陽性菌中のCodVおよびRipXSciochettiら、1999、J.Bacteriol.、181:6053-6062によって代表される。Xerリコンビナーゼは、difとして知られている染色体の28塩基対標的配列に作用するLeslieおよびSherratt、1995、EMBOJ.、14:1561-1570;Sciochettiら、2001、J.Bacteriol.、183:1058-1068。タンパク質FtsKは、大腸菌におけるXer組換えに必要でありRecchiaら、1999、EMBOJ.、18:5724-5734、そしてFtsK相同体は、細菌で広く保存されているが、古細菌では見られないRecchiaおよびSherratt、1999、Mol.Microbiol.、34:1146-1148。内因性Xerリコンビネーション系は、線状DNA分子の宿主細胞染色体への組み込み後に抗生物質耐性遺伝子を染色体から切除する技術Xer-ciseに以前から使用されていたBloorおよびCranenburgh、2006、Appl.Environ.Microbiol.、72:2520-2525。内因性Xer組換え系は、プラスミド二量体を分離するようにも機能する。組換えを容易にするために、プラスミド二量体は、difに機能的に等価な部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む。これらの部位は、cerおよびpsiである。cerは、大腸菌プラスミドColE1で見られSummersおよびSherratt、1984、Cell、36:1097-151103、psiは、SalmonellaプラスミドpSC101で見られるCornetら、1994、J.Bacteriol.、176:3188-3195。プラスミド二量体が形成されると、Xer組換え系は、cerおよびpsi部位でDNA組換えを行うことによって二量体を2つの単量体に戻すように機能する。しかしながら、染色体dif部位とは異なり、XerCおよびXerDは、~180bpの補助配列accessorysequenceも存在する場合には、プラスミド標的部位のみに作用するHayesおよびSherratt、1997。cerのこれらの補助配列は、タンパク質PepAアミノペプチダーゼAおよびArgRアルギニン生合成経路リプレッサーの結合部位であり、psiの補助配列は、タンパク質PepAおよびArcAの結合部位であるCollomsら、1998、MolMicrobiol.、28:521-530。この構成は、Xer組換えがプラスミドに対して方向性を有するようにするために必要である、すなわち二量体化によって自然に形成される直接反復二量体分離部位にのみ機能する。前述のXer-cise系は、補助配列の要件から、プラスミド二量体を分離するためにプラスミドに直接適用することができない。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼは、誘導性であるか、または恒常的に発現され得る。一部の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは誘導性である。特に、本発明の方法が、同じ宿主細胞内に存在する第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境を利用する場合、部位特異的リコンビナーゼは、好ましくは誘導性である。この実施形態の範囲内では、リコンビナーゼの発現は、容量オスモル濃度、温度、インデューサーの存在または非存在、細胞の成長段階、およびDNAの二次構造または超らせん性を変更する化学種の存在の1つ以上を変更することによって誘発することができる。リコンビナーゼの導入上記の本発明の好ましい実施形態は、プラスミドが維持される第2の宿主細胞環境の遺伝子改変を必要としない。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼ、例えば、Xerリコンビナーゼ系が、第2の宿主細胞環境で自然に存在しない場合、本発明の方法は、適切な部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼをコードする遺伝子を宿主細胞環境に導入することによって行うことができる。このアプローチは、部位特異的リコンビナーゼが第2の宿主細胞環境に存在する場合にも使用することができるが、第2の宿主細胞環境には自然に存在しない代替の部位特異的リコンビナーゼが望ましい。この実施形態では、代替の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を、第2の宿主細胞環境に導入することができる。部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、染色体外要素に導入するか、または宿主細胞染色体に組み込むことができる。宿主細胞環境に導入するのに適したリコンビナーゼの例には、限定されるものではないが、バクテリオファージP1由来のCreDaleおよびOw、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、88:10558-10562、バクテリオファージλ由来のIntおよびXisZubkoら、2000、NatureBiotechnol.、18:442-445、およびP22Wulffら、1993、Mol.Microbiol.、9:261-271、FlpDatsenkoおよびWanner、2000、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、97:6640-6645、ならびに酵母由来のRSugitaら、2000、PlantJ.、22:461-469が含まれる。トランス型で発現されるトランスポザーゼもまた、内部分離部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を切除するために使用することができSanchisら、1997、Appl.Environ.Microbiol.、63:779-784、従ってリコンビナーゼと同じ要領で宿主細胞環境に導入することができる。プラスミドの選択可能なマーカー遺伝子は、宿主細胞環境に導入されるリコンビナーゼ系の部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接される。本発明の方法は、内因性部位特異的リコンビナーゼ系が使用される場合、上記のように機能する。部位特異的リコンビナーゼ標的部位本発明の方法に使用されるプラスミド内に存在する選択可能なマーカー遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位によって隣接される。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、部位特異的リコンビナーゼが案内される染色体またはプラスミドのDNA配列の一部である。部位特異的リコンビナーゼ標的部位が直列に存在する場合は、これらの部位特異的リコンビナーゼ標的部位に、1つ以上の部位特異的リコンビナーゼが作用して、これらの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間に位置するDNAの部分を切除することができる。本発明の範囲内では、用語、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、トランスポザーゼ標的部位も含む。上記説明されたように、Xerリコンビナーゼ系は、原核生物では内因性であり、チロシンリコンビナーゼXerCおよびXerDを利用して染色体二量体およびプラスミド二量体の両方を分離する。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、XerCおよび/またはXerDに結合することができる。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、任意のXerCおよび/またはXerD結合部位とすることができる。例示的な部位は、宿主細胞染色体およびプラスミドから同定することができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、プラスミドおよび染色体から自然発生するプラスミド二量体分離部位を結合することによって形成することができる。このようなハイブリッド部位の例として、配列が以下の表1に示されている、pif部位としても知られているdif-psiハイブリッド部位Cornetら、1994、J.Bacteriol.、176:3188-3195が挙げられる。pif部位は、psiとは1つのヌクレオチドのみが異なっているが、プラスミドおよび染色体におけるXer組換えを促進することができる。本発明のプロセスに使用されるさらなるハイブリッド部位は、ハイブリッド配列を作製し、これらのハイブリッド配列がプラスミド二量体分離部位として機能できるかを、単純な組換え試験、例えば、Barreら、2000GenesDev.、14:2976-2988に記載されている試験を用いて決定することによって開発することができる。染色体またはプラスミドの局所超らせん性は、Xer組換えにおける重要な因子であると考えられるため、浸透圧条件または周囲のDNA配列が、染色体上でのみ正常に機能する部位、例えば、difを介してプラスミドにおけるXer組換えを促進することができる状況が存在し得る。したがって、一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、dif部位とすることができる。さらなる実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、以下の表1に列記されている部位すなわち、配列番号:1~9のいずれか1つ、または配列番号:17、20、または23のいずれか1つに類似させることができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号:1~9、17、20、または23のいずれかを含む、またはこのいずれかからなる場合は、配列番号:1~9、17、20、または23の1つに類似していると見なされる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号:1~9、17、20、または23のいずれか1つに対して50以上の配列同一性を有する場合、配列番号:1~9、17、20、または23の1つに類似していると見なされる。あるいは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、配列番号:1~9、17、20、または23の1つに対して60、70、80、85、90、95、99、または100の配列同一性を有することができる。これは、配列番号:1~9、17、20、または23のいずれか1つに対して1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、または15のヌクレオチド置換を有する配列に等しいと考えることができる。配列番号:1~9、17、20、または23のいずれか1つの15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、または34のヌクレオチドの断片を含む配列も、本発明の範囲内に含まれる。上記の断片または変異配列は、XerCおよび/またはXerDに結合することができる。当業者には、プラスミドに含まれる部位特異的リコンビナーゼ標的部位の性質が、本発明の方法を実施する第1および第2の宿主細胞環境では内因性である部位特異的リコンビナーゼに依存することは明らかであろう。本発明の方法は、トランス型の外来性リコンビナーゼの導入を必要としないため、従来技術のプロセスに勝る利点を提供する。したがって、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、第2の細胞環境で内因性部位特異的リコンビナーゼによって作用され得なければならない。しかしながら、これは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位もまた、プロセスが行われる細胞に対して内因性でなければならないという意味ではない。例えば、ある種の部位特異的リコンビナーゼが、他の種の部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用できるという証拠が存在するNeilsonら、1999、Mol.Microbiol.、31:915-926。加えて、部位特異的リコンビナーゼは、異なっている部位、例えば、大腸菌dif部位およびpsi-difハイブリッドpif部位を分離することを示したCornetら、1994、J.Bacteriol.、176:3188-3195。真核生物はまた、2つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間のDNAを切除するように作用する天然の部位特異的リコンビナーゼも含む。例えば、酵母2ミクロンプラスミドのFlpリコンビナーゼは、FRT部位間のDNA組換えによりプラスミドの領域を反転させるように作用する。したがって、一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、FRT部位とすることができる。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的配列は、互いに同じとすることができる。別の実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的配列は、互いに異なり得る。上記のように、補助配列は、プラスミドに存在する部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の部位特異的組換えを誘導する必要がある。したがって、一実施形態では、1つ以上の部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、1つ以上のアクセサリータンパク質accessoryproteinの結合部位に機能的に関連することができる。アクセサリータンパク質の結合部位は、一般に補助部位と呼ばれる。一実施形態では、補助配列は、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAの1つ以上の結合部位とすることができる。特定の実施形態では、補助配列は、PepAの結合部位およびArgRまたはArcAのいずれかの結合部位を含むことができる。一実施形態では、補助配列は、以下に示されている配列に類似させることができ、これらの配列では、ArgR/ArcA結合部位の下に点線が引かれ、XerCD結合部位の下に1本の破線が引かれている。PepAは、ArgR/ArcA結合部位の周りの補助配列に結合するが、正確な位置は、特定されていない。補助部位は、配列番号:17、20、または23のいずれか1つを含む、またはこのいずれか1つからなる場合は、以下に列記されている部位の1つに類似していると見なされる。補助部位は、配列番号:17、20、または23のいずれか1つに対して50以上の配列同一性を有する場合は、以下に列記されている部位の1つに類似していると見なされる。あるいは、補助部位は、配列番号:17、20、または23のいずれか1つに対して60、70、80、85、90、95、99、または100の配列同一性を有することができる。これは、配列番号:17、30、または23のいずれか1つに対して1つ、2つ、3つ、または4つのヌクレオチド置換を有する配列と同等と考えることができる。配列番号:17、20、または23のいずれか1つの8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17のヌクレオチドの断片を含む配列も、本発明の範囲内に含まれる。上記の断片または変異配列は、PepA、ArgR、またはArcAに結合することが可能である。pSC101配列番号:15のpsi部位および補助配列ColEI配列番号:18のcer部位および補助配列pJHCMW1配列番号:21のmwr部位および補助配列選択可能なマーカー遺伝子選択可能なマーカー遺伝子は、核酸分子の存在を検出するために使用することができる任意の遺伝子とすることができる。一般に、抗生物質耐性遺伝子が、特定の核酸分子を含む細胞を識別するために当分野で使用される。したがって、一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質を含む培地中での培養によるプラスミドを含む細胞の識別を可能にする抗生物質耐性遺伝子である。抗生物質耐性遺伝子は、当分野で知られており、これらの遺伝子のいずれも使用することができる。使用できる抗生物質耐性遺伝子の例として、限定されるものではないが、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、およびゼオシンに耐性を伝達する遺伝子を挙げることができる。本発明に従って使用することができる他の抗生物質耐性遺伝子は、Neu、1992、Science、2571064-1073に記載されている。代替の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、宿主細胞環境に必須であるが宿主細胞環境に存在しない代謝産物の産生を可能にする。一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、細胞が宿主培養される培地で見られないアミノ酸のアミノ酸生合成経路に関与し得る。別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、ジアミノピメリン酸合成に関与するチミジル酸シンターゼ遺伝子thyAまたはasd遺伝子とすることができる。選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子が存在しないプラスミドである。第1の宿主細胞環境第1の宿主細胞環境は、選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。したがって、選択可能なマーカー遺伝子がプラスミド内に維持され、プラスミドを含む細胞を、選択可能なマーカー遺伝子の発現に基づいて選択することができる。一実施形態では、細胞は、プラスミドの50未満が部位特異的に組換えられる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。別の実施形態では、プラスミドの40、30、20、15、10、5、3、2、1、0.5、0.1未満、または0が部位特異的に組換えられる場合は、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。変異一実施形態では、第1の宿主細胞環境は、プラスミドの部位特異的組換えに関与する1つ以上のタンパク質をコードする遺伝子における変異を含み得る。部位特異的リコンビナーゼ、例えば、XerCまたはXerDをコードする遺伝子に変異が存在しないのが好ましい。これは、これらのタンパク質が染色体分離を必要とし、かつこれらのタンパク質の機能型が存在しないと染色体分離が起きず、第1の宿主細胞環境が存続できないためである。一実施形態では、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAのうちの1つ以上をコードする染色体遺伝子は、変異していることがある。上記のように、PepAおよびArgRは、cer部位でのプラスミドの部位特異的組換えに必要である一方、PepAおよびArcAは、psi部位での部位特異的組換えに必要である。したがって、これらのアクセサリータンパク質をコードする遺伝子のうちの1つ以上における変異は、第1の宿主細胞環境で部位特異的組換えが起こるのを防止する。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、第1の宿主細胞環境に存在する場合はプラスミドによって維持され、選択圧を使用して、プラスミドを含む細胞を選択することができる。PepA、ArgR、またはArcAタンパク質の1つ以上をコードする遺伝子の変異は、不活性化変異であり得る。このような変異は、これらのアクセサリータンパク質の1つ以上をコードする1つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換によって起こり得る。別の実施形態では、変異が、1つ以上のアクセサリータンパク質の発現が防止される第1の宿主細胞環境に存在することがある。このような変異は、アクセサリータンパク質の発現に関与するタンパク質をコードする遺伝子中であり得る。あるいは、アクセサリータンパク質のmRNAの翻訳を防止するリプレッサーまたはアンチセンス配列を、過剰発現させることができる。好ましい実施形態では、PepA遺伝子の変異は、cerまたはpsi部位のいずれかにおける組換えを細胞が起こすことができないようにするため、第1の宿主細胞環境は、この変異を含む。第1の宿主細胞環境として使用されるアクセサリータンパク質の変異は、DS957、DS941pepA、DS941arcA2、DS941arcA::Tn52.3Collomsら、1998、Mol.Microbiol.、283:521-530、ECK4253、およびECK3226Babaら、2006、Mol.SystemsBiology2006doi:10.1038/msb4100050から選択される変異大腸菌株とすることができる。容量オスモル濃度別の実施形態では、第1の宿主細胞環境は、この第1の宿主細胞環境の容量オスモル濃度が組換えが起きることを許容しないため、部位特異的組換え部位間の組換えを起こすことができない。この実施形態の範囲内では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、肺炎桿菌プラスミドpJHCMW1のmwr部位とすることができる。この部位は、cerに関連し、PepAおよびArgRに結合する補助配列に隣接しているPhamら、2002、J.Bacteriol.、184:1607-1616。この浸透圧調節配列は、高い塩濃度の下では効率的なXer組換えを可能にしないが、塩濃度がLブロス中0.5NaCl未満の場合は、結果として生じるDNA超らせん性の変化により、Xer組換えが可能となるTriguerosら、2009、NucleicAcidsRes.、37:3580-3587。したがって、この実施形態では、第1の宿主細胞環境は、209mmol/kg0.5NaCl以上の容量オスモル濃度を有することができる。第1の宿主細胞環境の容量オスモル濃度は、0.5、0.4、0.3、0.2、または0.1NaClの濃度範囲が非組換えプラスミドの十分な部分を持続させることができるため、この濃度のNaClを含む培地中で第1の宿主細胞環境を培養することによって集団中の全てのプラスミドの完全な組換えに必要なレベルよりも高いレベルに維持することができる。理想的には、第1の宿主細胞環境の濃度は、0.5よりも高い。宿主細胞が移される第2の環境は、0.1未満のNaCl、理想的には0のNaClを有する。温度別の実施形態では、第1の宿主細胞環境は、この第1の宿主細胞環境の温度が、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低いため、部位特異的組換え部位間の組換えを起こすことができない。インデューサー別の実施形態では、第1の宿主細胞環境は、この第1の宿主細胞環境中にインデューサーが存在しないため、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。このようなインデューサーは、組み換えを起こすのに必要であり得る。プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する化学種部位特異的リコンビナーゼ標的部位間に組換えが起こるようにするために、プラスミドは、リコンビナーゼおよびアクセサリータンパク質がそれぞれ、部位特異的リコンビナーゼ標的部位および補助配列にアクセスするために正しい二次構造および超らせん性を有していなければならない。したがって、一実施形態では、第1の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはアクセサリータンパク質がプラスミドの関連部位へのアクセスを許容しないプラスミドの二次構造または超らせん性を形成する化学種の存在のために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。このような化学種、例えば、臭化エチジウムは、DNAを挿入することができる。部位特異的リコンビナーゼの非存在さらなる実施形態では、第1の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼの非存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない。第2の宿主細胞環境第2の宿主細胞環境は、選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、この選択可能なマーカー遺伝子に隣接した部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えによってプラスミドから切除される。一実施形態では、細胞は、細胞の1超が、プラスミドの部位特異的組換えを行うことができる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。他の実施形態では、細胞は、プラスミドの2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5、99.9超、または100が、部位特異的に組換えられる場合は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。活性なPepA、ArgA、およびArcA第1の宿主細胞環境が、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、およびArcAをコードする遺伝子のうちの1つ以上に不活性化変異を含む実施形態では、第2の宿主細胞環境は、活性バージョンのPepA、ArgR、およびArcAの1つ以上を含み得る。好ましくは、第2の宿主細胞環境は、組換えがcerまたはpsi部位で起こり得るように活性バージョンのPepAとArgRおよびArcAの少なくとも一方を含む。一実施形態では、第2の宿主細胞環境は、第1の宿主細胞環境で不活性化される活性バージョンのアクセサリータンパク質のいずれかを含み得る。容量オスモル濃度第1の宿主細胞環境が、組換えが起こるのに必要な容量オスモル濃度よりも低い容量オスモル濃度に維持される実施形態では、第2の宿主細胞環境を、組換えを行うのに必要な容量オスモル濃度よりも高い容量オスモル濃度を呈するようにすることによって、組換えを起こし得るようにすることができる。この実施形態は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位が、肺炎桿菌プラスミドpJHCMW1のmwr部位に類似している場合に起こり得る。この実施形態では、第2の宿主細胞環境は、0.5未満の塩の濃度による容量オスモル濃度を有することができる。一実施形態では、第1の宿主細胞環境の容量オスモル濃度は、0.55、0.6、0.7、0.8、0.9、1超、またはそれ以上の塩の濃度に依存し得る。当業者には、容量オスモル濃度を、第1の宿主細胞環境と第2の宿主細胞環境との間で様々な方法で変更できることは明らかであろう。一実施形態では、第1の宿主細胞環境を第2の宿主細胞環境に変換するために、この第1の宿主細胞環境を、塩を含まない培地で希釈することによって、容量オスモル濃度を変更することができる。あるいは、塩を含む第1の培地の細胞を遠心分離して細胞ペレットを作製し、塩を含む上清を除去し、そして細胞を塩を含まない培地中に再懸濁する。温度第1の宿主細胞環境が、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低い温度に維持される実施形態では、第2の宿主細胞環境を、組換えを起こすのに必要な温度よりも高いまたは低い温度を呈するようにすることによって、組換えを起こし得るようにすることができる。当業者には、この温度を、第1の宿主細胞環境と第2の宿主細胞環境との間で様々な方法で変更できることは明らかであろう。一実施形態では、この温度は、宿主細胞が培養される温度を変更することによって変更することができる。インデューサー第1の宿主細胞環境が、この第1の宿主細胞環境にインデューサーが存在しないために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第2の宿主細胞環境を、インデューサーの添加によって組換えを起こし得るようにすることができる。当業者には、インデューサーを様々な方法で細胞に添加することができることは明らかであろう。一実施形態では、インデューサーの添加は、第1の宿主細胞環境から第2の宿主細胞環境に変換するために、宿主細胞が培養されている培地にインデューサーを添加することによって行うことができる。プラスミドの二次構造または超らせん性を変更する化学種部位特異的リコンビナーゼおよび/またはアクセサリータンパク質のプラスミドの関連部位へのアクセスを許容しないプラスミドの二次構造または超らせん性を形成する化学種の存在のために、第1の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第2の宿主細胞環境を、この化学種の除去によって組換えを起こし得るようにすることができる。当業者には、化学種を、様々な方法で細胞から除去できることは明らかであろう。化学種を含む第1の培地の細胞を遠心分離して細胞ペレットを作製し、この化学種を含む上清を除去し、そして細胞を化学種を含まない培地に再懸濁する。部位特異的リコンビナーゼの存在第1の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼが存在しないために、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない実施形態では、第2の宿主細胞環境は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼの存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位に作用することができる部位特異的リコンビナーゼを、第2の宿主細胞環境内に存在する別のプラスミドがコードすることができる、あるいは、第2の宿主細胞環境が別個の宿主細胞である場合は、部位特異的リコンビナーゼを、第2の宿主細胞の染色体に組み込むことができる。宿主細胞環境の選択一実施形態では、第2の宿主細胞は、腸内細菌科のメンバー例えば、エシェリキア属、赤痢菌属、またはサルモネラ属とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境は、pepAまたはargR/arcA変異を含む大腸菌株とすることができる。これにより、第1の宿主細胞環境内に存在するXerCおよびXerDタンパク質が、第1の宿主細胞環境内で部位特異的リコンビナーゼ標的部位の組み換えを行うことができない。この実施形態はまた、第2の宿主細胞環境における組換えに必要なXerリコンビナーゼ標的部位およびアクセサリータンパク質標的部位が第1の宿主細胞環境に存在する場合にも起こり得る。しかしながら、第1の宿主細胞環境が、第2の宿主細胞環境から十分に進化的に異なり、そのXer組換え系が、第1の宿主細胞環境のプラスミドの部位特異的リコンビナーゼ認識部位に作用しない場合は、第1の宿主細胞環境は、pepAまたはargR/arcA変異を有する必要がない。別の実施形態では、第1の宿主細胞環境は、原核細胞であり、プラスミドは、FRT部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含むことができる。原核細胞が、FRT部位を組み換えるために必要なFlpリコンビナーゼを含まないため、部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、第1の宿主細胞環境では組み換えられず、1つ以上のアクセサリータンパク質をコードする遺伝子の変異が、第1の宿主細胞環境において一切必要ない。この実施形態では、第2の宿主細胞環境は、FRT部位間の組換えを第2の宿主細胞環境で起こして選択可能なマーカー遺伝子を切除できるように、FRT部位間の部位特異的な組換えを起こすことができる真核生物、例えば、酵母細胞とするべきである。宿主細胞の形質転換第1の宿主細胞環境が、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドで形質転換されることを理解されたい。第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境が、異なる細胞で形成される実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを第1の宿主細胞環境から除去し、第2の宿主細胞環境に形質転換する。宿主細胞の形質転換の方法は、当分野で周知であり、例えば、SambrookMolecularCloning;ALaboratoryManual、第2版、1989に記載されている。部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを第1の宿主細胞環境から分離する方法もまた、当分野で周知であり、例えば、SambrookMolecularCloning;ALaboratoryManual、第2版、1989に記載されている。好ましい実施形態では、形質転換は、エレクトロポレーションによって行うことができる。第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境が、異なる細胞で形成される実施形態では、プラスミドの各宿主細胞環境への形質転換の方法は、同じでも良いし、異なっていても良い。細胞培養第1のステップにおいて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得ないようにする条件下で、第1の宿主細胞環境で培養する。このステップの範囲内において、プラスミドを含む細胞のみが維持されるように、細胞を選択圧の存在下で培養することができる。第2のステップにおいて、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを、選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えが起こり得るようにする条件下で、第2の宿主細胞環境で培養する。細胞培養の適切な条件は、当分野で公知である。一実施形態では、細胞培養条件は、成長に必要な全ての栄養を提供するブロス培地または寒天プレートにおける25~42°C、理想的には30~37°Cの温度を含み得る。最も一般的な条件は、LB寒天またはLBブロスにおける37°Cであろう。当業者には、選択可能なマーカー遺伝子が瞬時に切除されないことは明らかであろう。したがって、第2の宿主細胞環境は、プラスミドを含む細胞のみが当初は維持されるように、当初は選択圧の存在を含み得る。一実施形態では、本方法は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを細胞培養中に維持するステップをさらに含むことができる。このステップは、選択可能なマーカー遺伝子の切除後に行うことができる。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法に従って作製された選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドを、プラスミド維持系の非存在下で第2の宿主細胞環境で維持できることを見出した。当業者は、プラスミド維持系が存在しないとプラスミドが消失すると予期していたため、これは驚くべきことである。本発明の方法に従って作製された選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子の発現の非存在下での代謝負荷の減少により維持されると考えられる。さらなる実施形態では、本方法は、選択可能なマーカー遺伝子遺伝子を含まないプラスミドを第1および/または第2の宿主細胞環境から分離するステップをさらに含むことができる。プラスミド分離の方法は、当分野で周知であり、限定されるものではないが、BirnboimおよびDoly、1979、NucleicAcidsRes.、7:1513-1523に基づいた方法に従ったアルカリ溶解法による遠心分離および精製を含む。DNAは、第2の宿主細胞環境からの抽出後に分析することができる。宿主細胞型第1および第2の宿主細胞環境は、任意の細胞型から形成することができる。第1および第2の宿主細胞環境は、同じ細胞型でも良いし、異なる細胞型でも良い。第1および第2の宿主細胞環境が同じ細胞型である場合、これらは、異なる菌株であっても良い。第1および第2の宿主細胞環境が、同じ細胞で形成される実施形態では、第1および第2の宿主細胞環境は、同じ細胞型となる。一実施形態では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、原核細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、細菌細胞とすることができる。一実施形態では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、グラム陰性細菌細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、およびビブリオ属から独立して選択することができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、大腸菌およびSalmonellaentericaSerovarsTyphiおよびTyphimuriumを含むから独立して選択することができる。別の実施形態では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、グラム陽性細菌細胞とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカスLactococcus属、およびミコバクテリウム属から独立して選択することができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、BacillussubtilisまたはMycobacteriumbovis例えば、BCG株から独立して選択することができる。別の実施形態では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、古細菌とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、酵母とすることができる。さらに、この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、ハンゼヌラHansenula属、ピキアPichia属、サッカロミセス属、およびシゾサッカロミセスSchizosaccharomyces属から独立して選択することができる。別の実施形態では、第1の宿主細胞環境および/または第2の宿主細胞環境は、プラスミドを複製することができる非真菌真核生物とすることができる。この実施形態の範囲内では、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境は、クラミドモナスChlamydomomas属、タマホコリカビDictyostelium属、およびエントアメーバ属から独立して選択することができる。細胞が原核細胞である場合は、細胞は、RecA細胞またはRecA-細胞とすることができる。本発明の範囲内では、提案された宿主細胞型のいずれも、弱毒化または非弱毒化宿主細胞とすることができる。第1の宿主細胞環境と第2の宿主細胞環境の全ての組み合わせが、本発明の範囲内で企図されることを理解されたい。目的の遺伝子一実施形態では、本発明の方法に使用されるプラスミドは、目的の遺伝子を含む。目的の遺伝子は、組換え的に作製するのが望ましい、または治療に使用することができる任意の核酸またはタンパク質をコードすることができる。さらなる実施形態では、目的の遺伝子は、治療または予防に有用なタンパク質とすることができる。別の実施形態では、この遺伝子は、ワクチンとして使用するのに適した遺伝子とすることができる。1ステップ法一般に、本発明の方法は、第1の宿主細胞環境および第2の宿主細胞環境を用いて上記のように行われる。しかしながら、代替の実施形態では、プラスミドは、合成または化学的に連結して、第2の宿主細胞環境に直接形質転換することができる。この方法は、第1の宿主細胞環境の必要性をなくすであろう。したがって、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる単一宿主細胞環境を利用する方法も包含する。この代替の方法は、プラスミドが、プラスミド維持系の非存在下で、選択可能なマーカー遺伝子の切除後の第2の宿主細胞環境内に維持される驚くべき利点を維持する。プラスミド一実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって作製される選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドも包含する。このプラスミドは、第2の宿主細胞環境から単離し、かつ/または精製することができる。別の実施形態では、本発明はまた、本発明の方法によって作製された選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む第2の宿主細胞環境も含む。別の実施形態では、本発明は、本発明の方法に従って作製されたプラスミドおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物を含む。プラスミドを含む宿主細胞一実施形態では、本発明はまた、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む宿主細胞も包含する。このような宿主細胞は、プラスミド維持系を欠いていると言うこともできる。一実施形態では、宿主細胞内のプラスミドは、残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含む。残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、当初から存在する、2つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組み換え後にプラスミドに残った部位特異的リコンビナーゼ標的部位である。したがって、一実施形態では、宿主細胞内のプラスミドは、1つの部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含むことができる。これにより、本発明の方法によって作製されたプラスミドを含む宿主細胞と、残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位を含まない、代替の方法によって作製されたプラスミドを含む宿主細胞とを区別することができる。必要に応じて、宿主細胞は、上記説明したようにプラスミド維持系、例えば、ORTオペレーター-リプレッサータイトレーションまたはoriSELECTを含むことができる。一実施形態では、宿主細胞は、誘導性部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むことができる。この誘導性部位特異的リコンビナーゼは、宿主細胞の染色体に存在することができる。一実施形態では、宿主細胞は、非改変宿主細胞とすることができる。プラスミド維持系を含まない非改変宿主細胞は、プラスミド維持系を含まない宿主細胞がプラスミドを維持するとは以前は予想していなかったため、本発明に従った方法によってのみ作製することができる。宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の細胞型とすることができる。例えば、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞例えば、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、アグロバクテリウム属、シュードモナス属、またはビブリオ属の、グラム陽性細菌細胞例えば、バチルス属、ストレプトミセス属、リステリア属、乳酸杆菌属、ラクトコッカス属、またはミコバクテリウム属の、古細菌、酵母例えば、ハンゼヌラ属、ピキア属、サッカロミセス属、またはシゾサッカロミセス属の、またはプラスミドを複製できる非真菌真核生物例えば、クラミドモナスChlamydomomas属、タマホコリカビ属、またはエントアメーバ属のとすることができる。宿主細胞内のプラスミドに含まれる残存部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、Ecdif、cer、psi、pif、mwr、Bsdif、loxP、FRT、およびRSを含む、本発明の方法に関連して説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。このような宿主細胞は、後述するように治療用またはワクチンとして有利に使用することができる。別の実施形態では、本発明は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む非改変宿主細胞および薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物を含む。プラスミドおよび宿主細胞の用途本発明の範囲内では、本発明の方法に従って作製されたプラスミド、およびプラスミド維持系が存在しないプラスミドを含む宿主細胞は、多数の用途を有し得る。第1に、本発明の方法に従って作製されたプラスミド、およびプラスミド維持系が存在しないプラスミドを含む宿主細胞は、療法に使用することができる。この療法は、治療または予防とすることができる。治療用またはワクチンとしての組換えタンパク質の生産一実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞すなわち第2の宿主細胞環境を、栄養ブロスフラスコまたは発酵槽で増殖させて、タンパク質治療用またはタンパク質ワクチンとして使用するために後に回収される組換えタンパク質を生産する。治療用DNAおよびDNAワクチンの生産別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞すなわち第2の宿主細胞環境を、栄養ブロスフラスコまたは発酵槽で増殖させて、DNA治療用またはDNAワクチンとして使用するために後に回収されるDNA配列を生産することができる。DNA治療用またはDNAワクチンは、一般にプラスミドの形態をとるが、次のプラスミドのプロセシングを受けた線状DNA分子の形態をとることもできる。このようなプロセシングは、制限エンドヌクレアーゼの使用を含み得る。生きた細菌ベクターを用いた組換えタンパク質およびDNAの動物への送達別の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞すなわち第2の宿主細胞環境を、処置を必要とする動物に直接投与することができる。この実施形態の範囲内では、この細胞環境を、弱毒化しても良いし、弱毒化しなくても良い。この実施形態では、細胞は、治療効果または免疫効果が得られるように、その内容物を患者に放出することができる。例えば、弱毒化サルモネラ菌を使用して、組換え抗原を発現するプラスミドを消化管内面の粘膜免疫系に経口送達することができるLeckenbyら、2009、Microb.Pathog.、46:201-206。あるいは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む第2の宿主細胞環境は、例えば、細胞が、アグロバクテリウム属のメンバーである場合は、プラスミドDNAを植物に直接送達して遺伝子改変を可能にするために使用することができるEbinumaら、2001、PlantCellRep.、20:383-392。選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミド、または上記説明されたプラスミドを含む細胞を、当分野で公知の任意の方法によって患者に投与することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、経口投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与、粘膜内投与、静脈内投与、腹膜内投与、または経鼻投与を含む。本発明の範囲内では、処置される患者は、処置を必要とする任意の動物とすることができる。これは、ヒト、魚、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ラクダ、ブタ、ヒツジ、ラット、マウス、およびウマを含む。別の実施形態では、本発明は、患者を予防接種または処置する方法を含み、この方法は、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを、薬学的に許容され得る量、患者に投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、患者の予防接種または患者の疾患の処置に使用するための、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを含む。さらなる実施形態では、本発明は、患者を予防接種するまたは患者の疾患を処置するための薬剤の製造に使用するための、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドを含む形質転換細胞または本発明の方法に従って作製されるプラスミドを含む。キットおよびキットに使用される宿主細胞一実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを包含する。このキットは:i部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む第1の宿主細胞環境であって、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができない、第1の宿主細胞環境;およびii選択可能なマーカー遺伝子が切除されるように、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる第2の宿主細胞環境を含み得る、またはこれらからなり得る。一実施形態では、キット内の第1および第2の宿主細胞環境は、別個の細胞内に存在することができる、すなわちキットは、第1の宿主細胞および第2の宿主細胞を含む。キット内に存在する宿主細胞は、任意の細胞型とすることができる。特に、宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の細胞型に由来することができる。第1の宿主は、プラスミドの部位特異的組換えに関与する1つ以上のタンパク質をコードする遺伝子における変異を含むことができる。好ましくは、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAのうちの1つ以上をコードする染色体遺伝子は、第1の宿主細胞で変異され得る。第2の宿主細胞は、内因性XerC/XerDおよび/または活性バージョンの1つ以上のアクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAの存在により、部位特異的リコンビナーゼ標的部位間の組換えを起こすことができる。部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、本発明の方法に関連して説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。キットは、取扱説明書も含み得る。本発明はまた、本発明のキットまたは方法におけるこの第1の宿主細胞環境として使用するのに適した宿主細胞も提供する。特に、本発明は、部位特異的リコンビナーゼ標的部位に隣接した選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドを含む宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、アクセサリータンパク質PepA、ArgR、またはArcAのうちの1つ以上をコードする染色体遺伝子のうちの1つ以上に不活性化変異をさらに含む。本発明のこの態様に従った宿主細胞は、任意の細胞型に由来することができる。特に、宿主細胞は、本発明の方法に関連して上記説明されたどの細胞型に由来しても良い。上記説明されたおよびキットの宿主細胞内のプラスミドに含まれる部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の部位特異的リコンビナーゼ標的部位とすることができる。これらの宿主細胞のプラスミドの選択可能なマーカー遺伝子は、本発明の方法に関連して上記説明された任意の選択可能なマーカー遺伝子とすることができる。ここで、本発明を、実施例によってより詳細に説明する。実施例で説明される系に対する変更が可能であることを理解されたい。実施例1真核生物発現プラスミドpORTl-CMVをpORT1から構築したCranenburghら、2001、NucleicAcidsRes.、29:e26。発現ベクターpcDNA3.1Invitrogen、Carlsbad、CAをNruIおよびPvuIIで切断して、PCMVおよびbGHpAを含む領域を切除した。この断片を、HincIIおよびEcll36IIで切断されたpORT1に連結してpORT1-CMVを作製した。クロラムフェニコール耐性遺伝子catを、プライマー5’ACYCおよび3’ACYCを用いてpACYC184NewEnglandBiolabs、Hitchin、U.K.由来のPCR産物によって増幅し;次いで、これをAvrIIで切断し、アルカリホスファターゼphosphatiseを用いて脱リン酸化し、次いでFseIで切断した。pSC101DSMZ、Braunschweig、Germanyのpsi遺伝子座をコードする2つのPCR産物を、プライマー対5AvrTPSIと3AvrPSIおよび5FsePSIと3fSIにより作製し;これらをそれぞれ、AvrIIおよびFseIを用いて切断した。pORTl-CMVプラスミドをAvrIIおよびFseIを用いて切断し、脱リン酸化した。3断片連結を用いて、pORT1-CMV、pACYC184、およびAvrII切断psiPCR産物を組み合わせて、pORTcatPSIと呼ばれる中間プラスミドを作製した。次いで、このプラスミドをFseIで切断し、脱リン酸化し、FseI切断psiPCR産物を連結して、ベクターpORT3-CMV直接反復方向におけるpsi部位およびpORT4-CMV逆反復方向におけるpsi部位を作製した。菌株DHlpORT3a-CMVおよびDHlpORT4-CMVを凍結ストックから固形成長培地に接種し、インキュベートして単一コロニーを得た。各菌株の単一コロニーを使用して、LBブロス培養物に接種した。次いで、0日目と呼ばれるこれらの培養物を24時間インキュベートした。600nmでの光学密度を測定し、1日目培養物に、測定された光学密度で接種し、1日目培養物を、24時間インキュベートした。細胞世代の総数が40を超えるまで、この手順を繰り返した。正規化サンプルを毎日採取し、後の分析のために凍結した。プラスミドDNAを、ミニプレップによって凍結サンプルから抽出し、アガロースゲル電気泳動法によって調べた。pORT3-CMVにおける部位特異的リコンビナーゼ標的部位は、正しい相対方向直接反復にあるため、非改変大腸菌DH1細胞におけるXer組換えにより、抗生物質耐性遺伝子を含まないプラスミドpORT3a-CMVを作製する。このプラスミドを、反復培養の期間4日間にわたって安定に維持する。pORT4-CMVプラスミドは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位が正しくない相対方向逆反復にある点のみがpORT3-CMVと異なっている。pORT4-CMVが、非改変大腸菌DH1の同じ菌株に形質転換されると、Xer組換えが起こり得ないため、抗生物質耐性遺伝子が維持される。抗生物質耐性遺伝子による代謝負荷により、反復培養のわずか2日後にpORT4-CMVが細胞から消失した。これは、選択可能なマーカー遺伝子を含まないプラスミドが、活性なプラスミド維持系を含むように改変されていない細菌細胞内で維持されることを実証している。実施例2低コピー数の発現ベクターpSC2cを構築するために、プライマーTetlaccat1およびTetlaccat2を使用してpORT3-CMVのpsi隣接cat遺伝子カセットを増幅し、その上流にlacオペレーターを導入した。このPCR産物をpCR2.1にクローニングして、pCRcatpsiを作製した。pSC101の複製起点を、プライマーa101およびas101を用いてPCRによって増幅し、pCR2.1-TOPOにクローニングし、pCR101を作製した。psi隣接cat遺伝子カセットを含むpCRcatpsiのBspHI断片を、pCR101のBspHI断片に連結してp101catを作製した。pagCプロモーターを、プライマーNdepag1およびBsppag1を用いてサルモネラ菌ゲノムDNAからPCRによって作製した。このPCR産物をpCR2.1にクローニングしてpCRpag1を作製した。PCRプライマーNotpag1およびNotpag2を用いて、pCRpag1からpagCプロモーターを増幅した。NotI処置PCR産物をNotI切断p101catにクローニングしてpSC2cを作製した。大腸菌pepA変異株を、必要なクローニング操作に使用した。pSC2cプラスミドを、SalmonellaentericaserovarTyphimuriumSL3261に形質転換し、この形質転換体を、クロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上で最初に選択した。単一コロニーを分離し、抗生物質の非存在下、LBブロス中で一晩培養した。Xer組換えにより、cat遺伝子が欠失してpSC2が形成され、SL3261pSC2のクロラムフェニコール感受性コロニーを同定した。プラスミドの維持を評価するために、SL3261pSC2の単一コロニーをLBブロスに接種し、24時間インキュベートした図5Bにおける1日目。600nmでの光学密度を測定し、第2のLBブロス培養を、決定された光学密度で開始した。細胞世代の総数が40を超えるまで、この手順を4日間にわたって繰り返した。正規化細胞サンプルを毎日採取し、プラスミドDNAを抽出した。これらを、NdeI消化により線状にし、アガロースゲル電気泳動法にかけた。大腸菌pepA変異株DS957から調製したプラスミドDNAを参照として使用した図5BにおけるpSC2c。このプラスミドは、4日間の反復培養にわたって安定に維持されたため、本発明が、サルモネラ菌内の低コピー数プラスミドにも適用可能であることを示唆している。参考文献