下記ステップ1から3を少なくとも含むオリゴ糖の製造方法;ステップ1:β-フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、第1の糖基質及び第2の糖基質を接触させるステップ、ステップ2:前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ-フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、第1の糖基質及び第2の糖基質からオリゴ糖を生成するステップ、ステップ3:オリゴ糖を精製するステップ。第1の糖基質、第2の糖基質及びオリゴ糖が、下記AからDのいずれかの組み合わせである、請求項1に記載のオリゴ糖の製造方法;A第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:N-アセチルDグルコサミン、オリゴ糖:N-アセチルスクロサミン、B第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:N-アセチルDガラクトサミン、オリゴ糖:βDフルクトフラノシルαNアセチルDガラクトサミニド、C第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:スクロース、フルクトース、オリゴ糖:フラクトオリゴ糖、フルクトースオリゴ糖D第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:ラクトース、オリゴ糖:ラクトスクロース。コウジ菌菌糸固定化担体が、下記ステップにより製造されるものである、請求項1又は2に記載の製造方法;a担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、b前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、cコウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップ。担体が珪藻土又はパーライト粒から選択される、請求項3に記載の製造方法。下記ステップにより製造されるコウジ菌菌糸固定化担体;a担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、b前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、cコウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップ。担体が珪藻土又はパーライト粒から選択される、請求項5に記載のコウジ菌菌糸固定化担体。本発明は、簡便、効率的、安全かつ低コストのオリゴ糖の製造方法を提供することを課題とする。本発明は下記のオリゴ糖の製造方法を提供する。1下記ステップ1から3を少なくとも含むオリゴ糖の製造方法;ステップ1:β-フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、第1の糖基質及び第2の糖基質を接触させるステップ、ステップ2:前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ-フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、第1の糖基質及び第2の糖基質からオリゴ糖を生成するステップ、ステップ3:オリゴ糖を精製するステップ。2第1の糖基質、第2の糖基質及びオリゴ糖が、下記AからDのいずれかの組み合わせである、上記1に記載のオリゴ糖の製造方法;A:第一の糖基質:スクロース、第二の糖基質:NアセチルDグルコサミン以下、GlcNAcと表記することがある、オリゴ糖:N-アセチルスクロサミン、B:第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:N-アセチルDガラクトサミン以下、GalNAcと表記することがある、オリゴ糖:βDフルクトフラノシルαNアセチルDガラクトサミニド、C:第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:スクロース、フルクトース、オリゴ糖:フラクトオリゴ糖、フルクトースオリゴ糖D:第1の糖基質:スクロース、第2の糖基質:ラクトース、オリゴ糖:ラクトスクロース。3コウジ菌菌糸固定化担体が、下記ステップにより製造されるものである、上記1又は2に記載の製造方法;a:担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、b:前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、c:コウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップ。4担体が珪藻土以下、セライトと表記することがある又は発泡性真珠岩粒以下、パーライト粒と表記することがあるから選択される、上記3に記載の製造方法。5下記ステップにより製造されるコウジ菌菌糸固定化担体;a:担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、b:前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、c:コウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップ。6担体が珪藻土又は発泡性真珠岩粒から選択される上記5に記載のコウジ菌菌糸固定化担体。本発明は、β-フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸を全細胞触媒として利用することにより、煩雑な酵素抽出を経ることなく、効率的、簡便かつ低コストでオリゴ糖を製造することができる。特にNアセチルスクロサミンは従来簡易製造法が確立されていなかったことから、本発明の意義は大きい。また、コウジ菌は食品製造にも用いられている日本における一般的な菌類であることから、製造したオリゴ糖の安全性は極めて高い。さらに、本発明は酵素を含む菌糸を利用することから、酵素を結果物のオリゴ糖を含む反応混合物から容易に取り除くことができるという利点もある。本発明のオリゴ糖の製造方法は、下記ステップ1から3を少なくとも含むことを特徴とする。ステップ1:β-フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、第1の糖基質及び第2の糖基質を接触させるステップ。ステップ2:前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ-フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、第1の糖基質及び第2の糖基質からオリゴ糖を生成するステップ。ステップ3:オリゴ糖を精製するステップ。以下、各ステップについて説明する。1ステップ1ステップ1は、β-フルクトフラノシダーゼを保持するコウジ菌菌糸固定化担体に、第1の糖基質及び第2の糖基質を接触させるステップである。ステップ1におけるコウジ菌としては、所望のオリゴ糖の生成を触媒するβ-フルクトフラノシダーゼを産生するものである限り特に限定されないが、代表的にはAspergillusoryzaeに属するコウジ菌を用いることができる。Aspergillusoryzaeに属するコウジ菌としては、例えばNBRC100959AspergillusoryzaeCohnvarbrunneusMurakami、NBRC100537AspergillusoryzaeCohn、NBRC4079AspergillusoryzaeCohn、NBRC4290AspergillusoryzaeCohn、NBRC5238AspergillusoryzaeCohn、NBRC5239AspergillusoryzaeCohnvarbrunneusMurakami、NBRC5240AspergillusoryzaeCohn、NBRC8871AspergillusoryzaeCohn、NBRC30102AspergillusoryzaeCohnvarbrunneusMurakami及びNBRC30103AspergillusoryzaeCohnvarbrunneusMurakamiが例示され、これらはいずれも独製品評価技術基盤機構のバイオテクノロジーセンターより一般に入手することができる。第1の糖基質、第2の糖基質は、所望のオリゴ糖を得るために用いる基質を意味し、例えば所望のオリゴ糖がN-アセチルスクロサミンの場合、第1の糖基質としてスクロース、第2の糖基質としてGlcNAcを用いることができる。この場合の酵素反応の略図を、実施例1を例として図1に示す。所望のオリゴ糖がβDフルクトフラノシルαNアセチルDガラクトサミニドである場合、第1の糖基質としてスクロース、第2の糖基質としてGalNAcを用いることができる。所望のオリゴ糖がフラクトオリゴ糖の場合、第1の糖基質としてスクロース、第2の糖基質としてスクロース及びフルクトースを用いることができ、1-ケストース、ニストース、フラクトシルニストース及びフルクトースのみからなるフルクトースオリゴ糖フルクトビオース、フルクトトリオース、フルクトテトラオースを生成できる。なお、第2の糖基質はβ-フルクトフラノシダーゼによる加水分解により結果的に得られる化合物であってもよい。例えば、第2の糖基質としてフルクトースを用いる場合、反応溶液中に添加する化合物としてはスクロースを採用し、β-フルクトフラノシダーゼによる加水分解により生じるフルクトースを第2の糖基質としてコウジ菌菌糸固定化担体に接触させることもできる。所望のオリゴ糖がラクトスクロースの場合、第1の糖基質としてスクロース、第2の糖基質としてラクトースを用いることができる。しかし、これらはあくまでも例示であり、コウジ菌由来のβ-フルクトフラノシダーゼによって触媒される基質とオリゴ糖の組み合わせであれば、当業者が適宜選択の上、本発明に適用することができる。なお、第1の糖基質及び第2の糖基質との用語は、フルクトースを転移させる側の糖基質とフルクトースを受取り結合する側の糖基質を便宜上区別するために用いられるに過ぎず、第1の糖基質及び第2の糖基質のいずれにあたるかは、例えばそれぞれの糖基質を添加する順序、量比等によって決定されるものではない。コウジ菌菌糸固定化担体の製造方法は特に限定されないが、例えば下記ステップにより製造することができる。a:担体を含む培地中でコウジ菌を培養するステップ、b:前記培養後の培地からコウジ菌菌糸固定化担体を分取するステップ、c:コウジ菌菌糸固定化担体を乾燥するステップ。担体としては、表面に凹凸がある多孔性物質でありコウジ菌菌糸を反応しやすい状態に保持することができるものであれば特に限定されないが、例えば珪藻土やパーライト粒を好ましく用いることができる。具体的方法としては、例えば珪藻土を担体として用いる場合、コウジ菌胞子の懸濁液を珪藻土含有培養液に加え、菌糸を適温にて増殖させ、コウジ菌糸と珪藻土から成る顆粒コウジ菌菌糸固定化珪藻土を得、培養液をろ過してコウジ菌菌糸固定化珪藻土を分取し、アセトン処理等に例示される脱水処理、乾燥処理を行い、コウジ菌菌糸固定化担体を製造することができる。より詳細には後述する実施例を参照されたい。実施例により、調製されたコウジ菌菌糸固定化担体が、顆粒状の形態を有し、乾燥菌糸と珪藻土の分散により顆粒中に多くの空間を形成することが確認された。また、βフルクトフラノシダーゼが乾燥コウジ菌菌糸の細胞壁に存在することも確認され、この状態が菌糸のβフルクトフラノシダーゼが反応混合物の中の基質と接触するのに好都合であることを確認した。一方、例えばパーライト粒を担体として用いる場合、コウジ菌胞子の懸濁液をパーライト粒を含む培養液に加え、菌糸を適温にて増殖させ、表面に菌糸が生えたパーライト粒を得、培養液をろ過してコウジ菌菌糸固定化パーライト粒を分取し、アセトン処理等に例示される脱水処理、乾燥処理を行い、コウジ菌菌糸固定化担体を製造することができる。より詳細には後述する実施例を参照されたい。実施例により、調製されたコウジ菌菌糸固定化担体が、コウジ菌菌糸がパーライト粒を幾重にも囲んで多くの空間を形成していることが確認され、この状態が菌糸のβフルクトフラノシダーゼが反応混合物の中の基質と接触するのに好都合であることを確認した。コウジ菌菌糸固定化担体に糖基質を接触させる方法は特に限定されないが、例えばバッチ法、カラムリアクター法が例示される。詳しくは後述の実施例を参照されたい。連続生産によるオリゴ糖の大量生産を行う観点ではカラムリアクター法が特に望ましく、この場合、担体としては例えばパーライト粒等、物理的に強固なものを用いることが望ましい。2ステップ2ステップ2は、前記接触後のコウジ菌菌糸固定化担体において、菌糸に保持されたβ-フルクトフラノシダーゼによる糖転移反応を行い、第1の糖基質及び第2の糖基質からオリゴ糖を生成するステップである。第1の糖基質及び第2の糖基質のモル比は特に限定されないが、例えば第1の糖基質としてスクロースを、第2の糖基質としてGlcNAcを用いてN-アセチルスクロサミンを生成する場合、スクロース対GlcNAcのモル比が、1:1から1:5の範囲が好ましく、1:2から1:4の範囲がより好ましく、1:3が最も好ましい。βDフルクトフラノシルαNアセチルDガラクトサミニド及びラクトスクロースの生成についても同様である。フラクトオリゴ糖の生成については、重量/容量で10から50の範囲が好ましく、30がより好ましい。酵素反応は、例えばクエン酸ナトリウム緩衝液pH55に例示される緩衝液を酵素反応溶液として適宜選択し、当該酵素反応溶液中に糖基質及びコウジ菌菌糸固定化担体を、適当な条件下で共存させることにより行うことができる。基質溶液中に添加するコウジ菌菌糸固定化担体の量は、反応時間の都合によって当業者が適宜調節することができる。酵素反応の条件は特に限定されないが、例えば25°Cから30°Cで穏やかな震とうさせる等、当業者が適宜選択することができる。3ステップ3ステップ3は、オリゴ糖を精製するステップである。精製とは、ステップ2により生成したオリゴ糖をコウジ菌菌糸固定化担体を含む混合物から分離する操作を意味する。オリゴ糖の精製は、例えば反応混合物の濾過によるコウジ菌菌糸固定化担体の除去とそれにより得られた上清からのカラムクロマトグラフィーによる分離等、当業者が適宜選択する方法により行うことができ、精製の程度は特に限定されない。以下、本発明を実施例により詳述するが、本発明の範囲はこれにより限定されるものではない。コウジ菌NBRC100959株菌糸固定化珪藻土を用いたNアセチルスクロサミンの製造方法:1材料GlcNAcはシグマアルドリッチからを購入した。スクロース、Dグルコース、Dフルクトース、1ケストース、ニストース及びセライト535は、和光純薬株式会社から入手した。他のすべての化学物質は分析グレードのものを使用した。糸状菌細胞壁溶解酵素Yatalaseはタカラバイオから購入した。アスペルギルス属株は、独製品評価技術基盤機構のバイオテクノロジーセンターから入手した。2Aoryzae菌糸固定化担体の調製コウジ菌胞子AoryzaeNBRC100959の懸濁液500μLを、重量/容量にして2のスクロース、05のペプトン、02のNaNO3、01のK2HPO4、005のMgSO47H2O、005のKCl、0001のFeSO47H2O及び40gのセライト535を含む100mLの培地に加えた。菌糸は28°Cで72時間震とうして増殖させた。得られたAoryzae菌糸とセライト535から成る含水小粒は、No5A濾紙を用いた吸引濾過で回収し、100mlの冷アセトンに再懸濁し、30分間氷上に静置した。これらの操作は二度繰り返した。脱水した小粒を濾紙を用いた吸引濾過で回収した後、室温で吸引器を用いて緩やかな減圧下で乾燥し、乾燥AoryzaeNBRC100959菌糸及びセライト535から成る顆粒を入手した。顆粒の電子顕微鏡的観察は、卓上顕微鏡TM1000を用いて行った。これらの操作で菌は死滅したが、菌糸の細胞壁中に存在するβ-フルクトフラノシダーゼの活性は保たれた。顆粒中の乾燥菌糸の含有量は206であった。3オリゴ糖の生産及び精製20mMクエン酸ナトリウム緩衝液100mL中のスクロースとGlcNAcの混合物に、700mgの乾燥AoryzaeNBRC100959菌糸を含む上記の顆粒を加えた。混合物は30°Cで穏やかな震とう条件下でインキュベートした。酵素反応中、特定の間隔で、薄層クロマトグラフ法及び高圧液体クロマトグラフィーによって、オリゴ糖生産の進捗状況をモニターした。TLCプレートSilicaGel60N、230400meshEメルク、ダルムシュタット、ドイツは、831容量/容量のnBuOHPyridineH2Oを移動相溶剤として用いて二度展開した。プレートの上の化合物は、重量/容量にして24のH3nH2O、5のH2SO4及び15のH3PO4を含む水溶液をスプレーし、加熱することで可視化した。HPLC分析は、COSMOSILSugarDカラムにより、移動相溶媒として7723容量/容量のCH3CNH2Oを用いて行った検出器;RI71示差屈折率計昭和電工社、ポンプ;LC10ASポンプ島津製作所。8時間のインキュベーションの後、No5A濾紙を用いて顆粒を取り除き、反応生成物を含む上清を得た。得られた溶液は、活性炭カラムに供し、酵素反応産物は5容量/容量のエタノール水溶液で溶出した。酵素反応産物を含む画分を回収した後、エバポレーターを用いて濃縮した。次に、オリゴ糖はUltraPackNH40Cカラム山善、大阪、日本サイズ直径5cm×高さ30cm、溶剤;52容量/容量の2PrOHH2Oを用いたカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。オリゴ糖を含む画分を回収し、エバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥を行なうことで白色粉末を得た。4オリゴ糖の構造同定と特性評価酵素反応産物を、1H及び13CNMR及び質量分析によって評価した。試料の1H及び13CNMRスペクトルをVXR400分光計を用い25°CにおいてD2O中で記録した。各シグナルの化学シフトはトリメチルシランからのダウンフィールドシフトで表した。質量スペクトルは、陽イオンダイレクトESI条件下でZQ4000LCMS装置を用いて記録した。比旋光性は、P1030偏光計を用い、20°CにおいてH2O中で測定した。融点は、MP21キャピラリー装置で測定した。5βフルクトフラノシダーゼの部分精製とオリゴ糖生産性の確認259gの乾燥AoryzaeNBRC100959菌糸を含む上記の顆粒を、06M2SO4及び250mgYatalaseを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液300mLに懸濁し、30°Cで穏やかな震とう条件下でインキュベートした。3時間の震とう後、セライト及び菌糸残渣をNo5A濾紙を用いて懸濁液から取り除き、得られた上清をDismic25CSシリンジフィルターユニットを用いてさらに濾過し、20mMクエン酸ナトリウム緩衝液に対して透析した。得られた溶液中のタンパク質は、硫安塩析3090飽和によって分画し、生じた沈殿は遠心によって回収した。βフルクトフラノシダーゼを含む沈殿物は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透析した。得られた粗酵素溶液は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡化したTOYOPEARLSuperQ650M樹脂カラムに供した。酵素は同緩衝液中0から025MNaClの直線勾配により溶出した図3。本カラムクロマトグラフィーによって得られた2種類のβフルクトフラノシダーゼの画分以下、最初に溶出された酵素画分をF1、2番目に溶出された酵素画分をF2とするは、それぞれ回収後にAmiconUltra1510K遠心限外濾過装置により濃縮し、粗酵素溶液として用いた。100μLのF1粗酵素溶液とF2粗酵素溶液を、それぞれスクロースとGlcNAcのを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液1mLに添加し、生成する糖転移反応生成物をTLCにより確認したTLCの展開及び発色条件は上記と同様。6βフルクトフラノシダーゼ活性の測定糖転移に関わるβフルクトフラノシダーゼも、低濃度1以下のスクロース溶液中では加水分解活性を示す。そこで、βフルクトフラノシダーゼの加水分解活性は、基質として低濃度のスクロースを用いることで測定し、スクロースから放出された還元糖の量を測定することによってモニターした。酵素溶液を50μLの04重量/容量スクロースを含む100mMクエン酸ナトリウム緩衝液に加え、混合物は30°Cでインキュベーションした。インキュベーション後、酵素反応は95°Cで5分間加熱することで停止させた。反応混合物の中の還元糖の量はソモギネルソン法で決定した。1酵素活性単位1ユニットは、アッセイ条件下において1分間当り1μmolのDグルコースと同等な還元糖を遊離するのに必要な酵素の量とした。結果及び考察:1Aoryzae固定化担体の調製AoryzaeNBRC100959のβフルクトフラノシダーゼが、液体培養の後に得られた菌糸から真菌細胞壁溶解酵素Yatalase処理によって遊離した。これらの事実は、βフルクトフラノシダーゼがAoryzae菌糸の細胞壁に存在することを示す。そこで、高濃度基質糖中における本酵素の糖転移作用を利用してDフルクトースとGlcNAcから成るオリゴ糖をスクロースとGlcNAcから合成するために、活性型のβフルクトフラノシダーゼを含む乾燥Aoryzae菌糸を全細胞触媒として使用した。効率的に酵素反応を実行するのに適当な菌糸の状態を調べたところ、AoryzaeNBRC100959菌糸とセライト535の混合物のアセトン処理と乾燥によって得られる顆粒が、高い糖転移活性を示すことがわかった。電子顕微鏡的観察から、乾燥菌糸とセライトの分散によって、顆粒中に多くの空間が形成されたことを確認した。この状態が、菌糸中のβフルクトフラノシダーゼが反応混合物中の基質と接触するのに好都合であると考える。2オリゴ糖の生産、同定及び特性評価10重量/容量のスクロースと194重量/容量GlcNAcを含む20mMNaクエン酸塩緩衝液100mL中に、乾燥AoryzaeNBRC100959株菌糸を含む上記顆粒を加え、オリゴ糖合成を行った。反応混合物のTLC分析図5では、スクロースが減少するのに従って、スクロース加水分解物とスクロース間の糖転移産物以外に、未知の産物が確認された。この未知の産物を反応混合物から2種類のカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、その構造をMSとNMR分光学を用いて特定した。化合物aのESIMSにおいて、分子イオンMHは384mzの値を示した。この結果は、化合物aがDフルクトースとGlcNAcからなる二糖類であることを示している。化合物aの1H及び13CNMRデータは図6Aに示す。GlcNAcのグリコシド結合の位置はHMBCNMR実験で検出した。GlcNAcのアノマー水素が、GlcNAcの3位と5位の炭素C3、C5及びDフルクトースの2位の炭素と共にクロスピークを示した。また、GlcNAcのアノマー水素と2位の炭素に結合する水素の間の結合定数は、40Hzであった図6A。これらの結果から、化合物aを、βDフルクトフラノシルαNアセチルDグルコサミニドと特定することができた。図7に示されているように、この二糖類は主要な糖転移産物であり、8時間の反応後のスクロースからの単離収率は221であった。得られたNアセチルスクロサミンの比旋光度と融点は、それぞれ807oと6266°Cであった。本二糖類については、少なくとも8gが2mlの水に溶けて高い粘性を示す無色のシロップを生成した。AoryzaeNBRC100959の乾燥菌糸にはF1とF2の2種類のβフルクトフラノシダーゼが存在しており図3、F1の酵素がスクロースとGlcNAcから糖転移反応によりNアセチルスクロサミンを生産することが明らかとなった図4。株の異なるコウジ菌菌糸固定化珪藻土を用いたNアセチルスクロサミンの製造アスペルギルス属の他の株NBRC100537、NBRC4079、NBRC4290、NBRC5238、NBRC5239、NBRC5240、NBRC8871、NBRC30102及びNBRC30103を用い、実施例1と同様の方法によりNアセチルスクロサミンを調整した。乾燥菌糸及びセライト535からなる顆粒中の各アスペルギルス属株の乾燥菌糸の含有量は以下の通りだった;NBRC100537;190、NBRC4079;190、NBRC4290;244NBRC5238;175、NBRC5239;189、NBRC5240;199、NBRC8871;773、NBRC30102;312、及びNBRC30103;250。8時間の反応後のスクロースとGlcNAcからのNアセチルスクロサミンの単離収率を、実施例1の場合を100とした相対的割合として図8に示す。この結果、いずれの株もNBRC100959株と同等あるいはそれ以上にNアセチルスクロサミンを生産できることが分かった。コウジ菌菌糸固定化パーライト粒を用いたNアセチルスクロサミンの製造NBRC100959株方法:1材料GlcNAcはシグマアルドリッチからを購入した。スクロース、Dグルコース、Dフルクトース、1ケストース及びニストースは、和光純薬株式会社から入手した。粒状直径2~5mmのパーライトは、広田商店から入手した。他のすべての化学物質は分析グレードのものを使用した。TLCプレートはメルクダルムシュタット、ドイツから購入した。アスペルギルス属株は、独製品評価技術基盤機構のバイオテクノロジーセンターから入手した。2Aoryzae菌糸固定化担体の調製Aoryzae菌糸の培養には、重量/容量にして2のスクロース、05のペプトン、02のNaNO3、01のK2HPO4、005のMgSO47H2O、005のKCl及び0001のFeSO47H2Oを含む液体培地を使用した。Aoryzae菌糸をパーライト粒に固定化するために次の2つの方法を行った。方法1:固相培養1gのパーライト粒中に39mLの上記培地を染込ませた後、AoryzaeNBRC100959の胞子懸濁液01mLを均一に加え、3日間28°Cで静置した。静置後、表面にAoryzae菌糸が繁殖したパーライト粒は、No5A濾紙を用いた吸引濾過で回収した。次に、これを30分間冷アセトン50mLに浸し、濾紙を用いて吸引濾過で回収した。この操作は二度繰り返した。得られた脱水Aoryzae菌糸が付着したビーズは、室温で吸引器を用いて減圧乾燥した。乾燥菌糸固定化パーライト中の乾燥菌糸の含有量は、20であった。乾燥Aoryzae菌糸が固定されたパーライト粒の電子顕微鏡的観察は、卓上顕微鏡TM1000を用いて行った。方法2:液体培養AoryzaeNBRC100959の胞子懸濁液01mLを1gのパーライト粒を含む99mLの上記培地に加え、80回転/分の震とう条件下、混合物を3日間28°Cでインキュベーションした。インキュベーションの後、表面にAoryzae菌糸が繁殖したパーライト粒は、No5A濾紙を用いた吸引濾過で回収した。次に、これを30分間冷アセトン50mLに浸し、濾紙を用いて吸引濾過で回収した。この操作は二度繰り返した。得られた脱水Aoryzae菌糸が付着したビーズは、室温で吸引器を用いて減圧乾燥した。乾燥菌糸固定化パーライト中の乾燥菌糸の含有量は、20であった。乾燥Aoryzae菌糸が固定されたパーライト粒の電子顕微鏡的観察は、卓上顕微鏡TM1000を用いて行った。3Nアセチルスクロサミンの生産及び精製バッチ方式スクロースとGlcNAcを含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液10mLに、100mgの乾燥AoryzaeNBRC100959株菌糸が付着したパーライト粒を加え、混合物を30°Cで穏やかな震とう下でインキュベーションした。Nアセチルスクロサミンは反応液から2種類のカラムクロマトグラフィーで精製した。まず、反応液を活性炭カラムサイズ直径25cm×高さ20cm、溶剤H2Oに供した。次に、Nアセチルスクロサミンを10のEtOH水溶液でカラムから溶出した。本オリゴ糖を含む画分を回収しエバポレーターで濃縮した後、UltraPackNH40Cカラム山善、大阪、日本サイズ直径20cm×高さ30cm、溶剤2PrOHH2O52を用いたクロマトグラフィーによってNアセチルスクロサミンを精製した。Nアセチルスクロサミンを含む画分を回収し、エバポレーターで濃縮した後、試料を凍結乾燥した。4Nアセチルスクロサミンの分析TLCとHPLCによってNアセチルスクロサミン生産をモニターした。TLCプレートは、移動相溶剤として831のnBuOHPyridineH2Oを用い二度展開した。プレートの上の化合物は、重量/容量にして24のH3nH2O、5のH2SO4及び15のH3PO4を含む水溶液をスプレーし、加熱することで可視化した。HPLC分析は、COSMOSILSugarDカラムにより、移動相溶媒として7723容量/容量のCH3CNH2Oを用いて行った検出器;RI71示差屈折率計昭和電工社、ポンプ;LC10ASポンプ島津製作所。1HNMRにより得られたNアセチルスクロサミンの構造を確認した。試料の1HNMRスペクトルは、VXR400分光計を用いて25°CにおいてD2O中で記録した。各シグナルの化学シフトはトリメチルシランからのダウンフィールドシフトで表した。5βフルクトフラノシダーゼの部分的な精製500mgの乾燥AoryzaeNBRC100959株の菌糸が固定化されたパーライト粒を、06Mの2SO4と50mgのYatalaseを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液中に懸濁した。懸濁液は30°Cで穏やかな震とう下でインキュベーションした。3時間の震とう後、残った菌糸固定化パーライト粒を、No5A濾紙を用いた吸引濾過で取り除き、得られた上清のタンパク質を、硫安塩析3090飽和によって分画し、生じた沈殿は遠心によって回収した。βフルクトフラノシダーゼを含む沈殿物は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して透析した。得られた粗酵素溶液は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡化したTOYOPEARLSuperQ650M樹脂カラムに供した。酵素は同緩衝液中0から03MNaClの直線勾配により溶出した。βフルクトフラノシダーゼの加水分解活性は、基質として低濃度のスクロースを用いることで測定し、スクロースから放出された還元糖の量を測定することによってモニターした。酵素溶液を50μLの04重量/容量スクロースを含む100mMクエン酸ナトリウム緩衝液に加え、混合物は30°Cでインキュベーションした。インキュベーション後、酵素反応は95°Cで5分間加熱することで停止させた。反応混合物の中の還元糖の量はソモギネルソン法で決定した。1酵素活性単位1ユニットは、アッセイ条件下において1分間当り1μmolのDグルコースと同等な還元糖を遊離するのに必要な酵素の量とした。結果及び考察:1Aoryzae菌糸固定化担体の調製乾燥Aoryzae菌糸だけを詰めたカラムに高濃度のスクロースとGlcNAcを含む溶液を通すことによって、Nアセチルスクロサミンを生産しようとした。しかし、目詰まりによりカラムに連続的に溶液を通すのは困難であった。この問題を解決するために、Aoryzae菌糸が固定化された粒状担体をカラムに詰めることにした。Aoryzae菌糸を固定化するためにパーライト粒を選んだ。パーライト粒は多孔性であり表面に多くの凹凸を有するので、菌糸は容易に付着すると考えた。AoryzaeNBRC100595を用い、固相培養及び液体培養の2つの方法で菌糸固定化パーライト粒の生産を行った。両方の培養方法で、NBRC100959株の菌糸はパーライト粒に付着しその表面で良好に生育した。液体培養では、菌糸は液体培地中で成長したが図9C1、固相培養においては主に空気中で成長した。菌糸はアセトン処理と乾燥処理で死滅したが、細胞壁のβフルクトフラノシダーゼの活性は保たれた。それぞれの乾燥菌糸サンプルの電子顕微鏡的観察により、NBRC100595株の乾燥菌糸が重なり合ってパーライト粒を幾重にも囲んでいることを確認した。方法1で調製したビーズ中の乾燥菌糸の含有量は約17、方法2で調製したものは約20であった。2バッチ方式によるNアセチルスクロサミン生産の確認Nアセチルスクロサミンの生産性を、10のスクロースと194のGlcNAcを含む緩衝液に、乾燥AoryzaeNBRC100595菌糸固定化パーライト粒を加えたバッチ方式で調べた。固相培養によって調製した菌糸固定化パーライト粒を添加した反応混合物のTLCとHPLCによる分析では、スクロース加水分解物が主要な反応生成物として観測された。他方、液体培養で調製した菌糸固定化パーライト粒を用いた場合、Nアセチルスクロサミンと思われる化合物の生産が確認された図10B1。この化合物の1HNMRシグナルは、Nアセチルスクロサミンのもの図7Aと完全に一致した。これらの事実から、液体培養で作られたAoryzaeNBRC100959菌糸固定化パーライト粒が、スクロースとGlcNAcからNアセチルスクロサミンを生産できることを確認した。図10B2に示すHPLC分析データは、1ケストースやニストースなどのフラクトオリゴ糖も生成したが、Nアセチルスクロサミンが主要な糖転移反応産物であることを示す。異なる培養方法で調製された2種類のAoryzae菌糸固定化パーライト粒の間に、そのような違いが生じた原因を調べるために、それぞれのパーライト粒の乾燥Aoryzae菌糸に含まれるβフルクトフラノシダーゼついて調べた。前述のように、我々は、AoryzaeNBRC100959の乾燥菌糸にはF1とF2の2種類のβフルクトフラノシダーゼが存在しており図3、F1の酵素がスクロースとGlcNAcから糖転移反応によりNアセチルスクロサミンを生産することが明らかにした図4。固相培養によって育てられた菌糸はF2を主なβフルクトフラノシダーゼとして有し図11A、液体培養で育てられた菌糸ではF1の含有量がF2より多かった。この結果から、カラムリアクターを用いたNアセチルスクロサミンの生産に、液体培養法で作成した乾燥Aoryzae菌糸固定化パーライト粒を以降の実験に用いることにした。アスペルギルス属の他の株NBRC100537、NBRC4079、NBRC4290、NBRC5238、NBRC5240、NBRC8871、NBRC30102、NBRC30103を用い、実施例3の方法2の液体培養と同様の方法によりNアセチルスクロサミンを調整した。ビーズ中の各アスペルギルス属株の乾燥菌糸の含有量は以下の通りだった;NBRC100537;219、NBRC4079;167、NBRC4290;194、NBRC5238;167、NBRC5239;219、NBRC5240;237、NBRC8871;306、NBRC30102;231、NBRC30103;194。16時間の反応後のスクロースからのNアセチルスクロサミンの単離収率を、実施例3の方法2の場合を100とした相対的割合として図12に示す。この結果、いずれの株もNBRC100959株と同等あるいはそれ以上にNアセチルスクロサミンを生産できることが分かった。カラムリアクターを用いたNアセチルスクロサミンの連続生産AoryzaeNBRC4290菌糸固定化パーライト粒を詰めたカラム直径2cm×高さ20cmに10のスクロースと194を含む20mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH55を約100mL/日の流速で流し、カラムリアクターによるNアセチルスクロサミンの連続生産を行なった。図14Aにカラムリアクター装置の図を示す。反応液中のNアセチルスクロサミンはHPLCにて定量した。その結果、上記の小カラムでもNアセチルスクロサミンの生産量は約25~40g/日となり、少なくとも30日以上の安定した連続生産が可能であった図14B。このことは、本システムを用いることによりNアセチルスクロサミンの大量生産が可能であることを示す。バッチ方式によるコウジ菌菌糸固定化パーライト粒を用いたフラクトオリゴ糖の生産NBRC100959株フラクトオリゴ糖の生産性を、30のスクロースを含む緩衝液に、液体培養法によって調製した乾燥AoryzaeNBRC100595菌糸固定化パーライト粒を加えたバッチ方式で調べた。TLCの結果から、1ケストースおよびニストースの生産が確認された図15A。また、HLC分析の結果図15Bから、1ケストースは主要な糖転移反応生成物であることが分かった。これらの事実から、液体培養で作られたAoryzaeNBRC100959菌糸固定化パーライト粒が、高濃度スクロース溶液中で1ケストースを主とするフラクトオリゴ糖を生産できることを確認した。