"シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法であって、aCHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する細胞培養培地を回収する工程と、b前記細胞培養培地を、i少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー及び/又は混合モードクロマトグラフィー工程と、ii少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該細胞培養培地から精製する工程と、を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法。前記シアリルトランスフェラーゼがST6GalNAcIである、請求項1に記載の方法。前記ST6GalNAcIが、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及びニワトリのST6GalNAcIからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。前記ST6GalNAcIがニワトリのST6GalNAcIである、請求項3に記載の方法。前記ST6GalNAcIのポリペプチドが、配列番号4又は配列番号6によるアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の方法。前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドがシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。EPOシグナル配列及びシアリルトランスフェラーゼポリペプチド配列をコードする発現カセットを、CHO細胞において前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させるのに使用する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。工程aを、所定の細胞密度に達した後、37°C±1°Cから32°C±1°Cへのインキュベーション温度変化を適用することにより行う、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。工程bが、i2回のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は1回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び1回の混合モードクロマトグラフィー工程と、ii1回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程と、iii1回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。工程bを以下の順番で行う、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法:i.陰イオン交換クロマトグラフィー;ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、官能基として第四級アンモニウムを保有する樹脂を用いて行う、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、溶離液として7.0~8.0の範囲のpHでNaCl/Tris-HClバッファーを用いて行う、請求項11に記載の方法。前記第1のアフィニティークロマトグラフィーを、色素アフィニティークロマトグラフィーを用いて行う、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記第1のアフィニティークロマトグラフィーを、BlueSepharoseFastFlow樹脂を用いて行う、請求項13に記載の方法。前記BlueSepharoseによるアフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として7.0~8.0の範囲のpHで塩酸L-アルギニン/リン酸カリウムバッファーを用いて行う、請求項14に記載の方法。前記混合モードクロマトグラフィーを、ヒドロキシアパタイト樹脂を用いて行う、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。前記ヒドロキシアパタイトによるアフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として6.3~7.3の範囲のpHでNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて行う、請求項16に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーをスルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂によって行う、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーを、SP-SepharoseHighPerformance樹脂を用いて行う、請求項18に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーを、溶離液として6.0~7.0の範囲のpHでNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて行う、請求項19に記載の方法。工程bを以下の順番で行う、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法:i.Q-SepharoseFastFlow樹脂を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー;ii.BlueSepharoseFastFlow樹脂を用いる第1のアフィニティークロマトグラフィー;iii.ヒドロキシアパタイト樹脂を用いる混合モードクロマトグラフィー;iv.SP-SepharoseHighPerformance樹脂を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー。請求項1~21のいずれか一項に記載の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。少なくとも98の純度である、請求項22に記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。ST6GalNAcIである、請求項22又は23に記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチド。治療用ポリペプチドのグリコシル化又は糖ペグ化のための請求項22~24のいずれか一項に記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの使用。前記治療用ポリペプチドがヒトG-CSFである、請求項25に記載の使用。したがって、薬学的規模のプロセス及び反応に、特に糖ペプチド治療薬の作製に好適な活性及び純度を有する組換えシアリルトランスフェラーゼを作製する効率的な方法が依然として必要とされている。そのため、本発明の根底にある課題は、組換えシアリルトランスフェラーゼを作製するためにかかる方法を提供することである。この課題は、一態様においては、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法であって、aCHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現させ、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収する工程と、b前記細胞培養培地を、i少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー及び/又は1回の混合モードクロマトグラフィー工程と、ii少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は1回の陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを該培養培地から精製する工程と、を含む、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを作製する方法を提供することによって本発明に従って解決される。1つの実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び/又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。好ましくは、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。好ましい実施の形態において、前記シアリルトランスフェラーゼはST6GalNAcIである。典型的には、前記ST6GalNAcIは、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及びニワトリのST6GalNAcIからなる群から選択される。好ましい実施の形態において、前記ST6GalNAcIはニワトリのST6GalNAcIである。最も好ましくは、前記ST6GalNAcIのポリペプチドは、配列番号4又は配列番号6によるアミノ酸配列を含む。本発明の実施の形態によれば、EPOシグナル配列及びシアリルトランスフェラーゼポリペプチド配列をコードする発現カセットを、CHO細胞において前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用する。好ましくは、作製方法の工程aを、無血清フェドバッチ培養を使用することにより、及び/又は所定の細胞密度に達した後、37°C±1°Cから32°C±1°Cへのインキュベーション温度変化を行うことにより行う。さらに、本発明は、工程cが、2回のアフィニティークロマトグラフィープロセス、又は1回のアフィニティークロマトグラフィープロセス及び1回の混合モードクロマトグラフィープロセスと、1回の陰イオン交換クロマトグラフィープロセスと、1回の陽イオン交換クロマトグラフィープロセスとを含む、方法を含む。最も好ましい実施の形態において、工程cを以下の順番で行う:i.陰イオン交換クロマトグラフィー;ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基としてジエチルアミノエチル基DEAE、第四級アミノエチル基QAE、第四級アンモニウム基Q、ジメチルアミノエチル基DMAE及び/又はトリメチルアミノエチル基TMAEを含有する陰イオン交換樹脂又は陰イオン交換膜によって行う。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として7.0~8.0の範囲のpHでNaCl/Tris-HClバッファーを用いて市販のQ-SepharoseFastFlow樹脂によって行う。概して、アフィニティークロマトグラフィーは、Ni-NTA樹脂、Talon樹脂、色素クロマトグラフィー樹脂、抗体親和性樹脂、レクチン親和性樹脂及び/又はペプチド-リガンド親和性樹脂によって行う。好ましい実施形態では、第1のアフィニティークロマトグラフィーを、好ましくは溶離液として7.0~8.0の範囲のpHで塩酸L-アルギニン/リン酸カリウムバッファーを用いて市販のBlueSepharoseFF樹脂によって行い、混合モードクロマトグラフィーを、好ましくは溶離液として7.0~8.0の範囲のpHでNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて市販のヒドロキシアパタイト樹脂によって行う。典型的には、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂又は同様の特性を有する樹脂によって行う。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーは、より好ましくは溶離液として6.0~7.0の範囲のpHでNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて市販のSP-SepharoseHighPerformance樹脂によって行う。別の態様では、本発明は、本発明による方法のいずれか1つによって作製された、少なくとも98の純度、好ましくは少なくとも99の純度、最も好ましくは99を超える純度のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。好ましい実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはST6GalNAcIである。更なる態様では、本発明は、治療用タンパク質のグリコシル化のための、例えばヒトサイトカインのグリコシル化のための、特にヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFのグリコシル化のための本発明による方法のいずれか1つによって作製されたST6GalNacIポリペプチドの使用を含む。本発明は、活性及び純度が高い改良されたシアリルトランスフェラーゼを作製及び精製する方法を提供する。この目的は、CHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現すること、発現されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含有する細胞培養培地を回収すること、並びに培養培地を、i少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー及び/又は1回の混合モードクロマトグラフィープロセスと、ii少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー及び/又は1回の陽イオン交換クロマトグラフィープロセスとに供することにより、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを培養培地から精製することにより達成される。より具体的には、本発明は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を以下の順番で行う方法に関する:i.陰イオン交換クロマトグラフィー;ii.第1のアフィニティークロマトグラフィー;iii.第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー;iv.陽イオン交換クロマトグラフィー。他に特に規定がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を本明細書に記載している。A.シアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び発現カセット一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び/又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシグナルペプチドを更に含むことができる。好ましい実施形態では、EPOシグナル配列及びシアリルトランスフェラーゼポリペプチド配列をコードする発現カセットを、CHO細胞においてシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用する。ポリペプチド代替的にはタンパク質と称されるは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合によって結合しているポリマーを指す。加えて、ポリペプチドには、非天然アミノ酸、例えばP-アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも含まれる。遺伝子によってコードされないアミノ酸も本発明に使用することができる。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療部分、生体分子等を含むように修飾されているアミノ酸も本発明に使用することができる。本発明に使用されるアミノ酸は全て、D-異性体又はL-異性体のいずれであってもよい。通常L-異性体が好ましい。さらに、他のペプチド模倣体も本発明に有用である。本明細書で使用される場合、ペプチドはグリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドには、ペプチドを発現する系により不完全にグリコシル化されているペプチドも含まれる。概評に関しては、SpatolaAFinChemistryandbiochemistryofaminoacidspeptidesandproteinsBWeinsteinedsMarcelDekkerNewYorkp267を参照されたい。ポリペプチドという用語には、一般的にタンパク質又はペプチドと称される分子が含まれる。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、α-2,3シアリルトランスフェラーゼST3Gal3KitagawaandPaulson1994JBiolChem26913941401、α-N-アセチルガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼIST6GalNAcI非特許文献8、及びβ1,3GalNAc-α2,3-シアリルトランスフェラーゼST3GalIGillespieetal1992JBiolChem2672100410を含むがそれらに限定されない、当業者によって既知の任意のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであり得る。切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、天然のシアリルトランスフェラーゼよりも少ないアミノ酸残基を有するが、酵素活性を保持するシアリルトランスフェラーゼを指す。酵素が活性を保持していれば、いずれの数のアミノ酸残基が欠失してもよい。幾つかの実施形態では、ドメイン又はドメインの一部が欠失していてもよい。本発明の好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含む。活性ドメイン又は触媒ドメインは、酵素により行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメイン又はその部分配列を指す。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、ドナーからアクセプター糖へとシアル酸残基を移動するのに十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒ドメインは、酵素全体、その部分配列を含み得るか、又は天然の酵素若しくはその部分配列には付着しない更なるアミノ酸配列を含み得る。触媒領域の例としては、配列番号2による全長配列の232位のアミノ酸残基から566位のアミノ酸残基を含む、ニワトリST6GalNacIの触媒ドメインであるが、それに限定されない。ニワトリST6GalNacIの触媒ドメインを配列番号4に示す。好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼはST6GalNAcIである。典型的には、ST6GalNAcIは、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス及びニワトリのST6GalNAcIからなる群から選択される非特許文献8、非特許文献9、特許文献8。最も好ましい実施形態では、ST6GalNAcIは、配列番号1のヌクレオチド配列によりコードされるニワトリST6GalNAcIである。好ましくは、ST6GalNAcIポリペプチドは、配列番号3又は配列番号5によるヌクレオチド配列によりコードされ、それぞれ配列番号4又は配列番号6によるアミノ酸配列を有する。B.発現系本発明によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをCHO細胞又は当業者に既知の同等の細胞株で発現する。可溶性シアリルトランスフェラーゼの発現のために各遺伝物質を宿主細胞に導入するのに使用される特定の手法は特に重要ではない。当業者により理解されるように、プロモーターの選択、並びに本発明のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを発現するのに使用される宿主細胞に遺伝物質を導入するための方法及び戦略が当該技術分野で既知である。これらには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、及びクローニングしたゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の既知の方法のいずれかの使用が含まれる。用いられる特定の遺伝子工学的手法は、全長又は遺伝子修飾型又は切断型のシアリルトランスフェラーゼを発現することが可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入することができさえすれば十分である。ベクターは単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するのに使用することができる物質の組成物である。様々な種類のベクターが当該技術分野で既知であり、これには直鎖核酸、イオン性化合物又は両親媒性化合物に関連する核酸、プラスミド及びウイルスが含まれるが、それらに限定されない。このため、ベクターという用語には、自己複製するプラスミド又は遺伝子修飾したウイルスが含まれる。この用語は、例えばポリリシン化合物、リポソームのような核酸の細胞への移動を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物を含むように解釈されるものとする。好適なベクターは、例えばCMVプロモーターを伴う、pSV40ベクター、pEF-1-αベクター、pSV2ベクター、pT-Rexベクター、pSecTag2ベクター、pBudCE4.1ベクター、又はpCDNA/HisMaxベクターを含む。本発明の好ましい実施形態では、異種遺伝子の高レベルの発現のために設計されているpMOZ-G8ベクターをシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの発現に使用する。中でも好適な選択マーカーは、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン及びジヒドロ葉酸レダクターゼDHFRである。C.CHO細胞培養本発明の実施形態によれば、作製方法の工程aを、無血清フェドバッチ培養を使用することにより、及び5×105生存細胞数/mL以上、好ましくは1.5×106生存細胞数/mL以上の所定の細胞密度に達した後、37°C±1°Cから32°C±1°Cへのインキュベーション温度変化を用いることにより行う。本発明者らは、この温度変化が細胞の生存率を増大させ、それにより細胞を培養物中でより長期間維持することができることを見出している。これにより、より高い生産収率がもたらされる。例えば、温度変化を用いないと、細胞は5日間しか培養することができず、約24mg/lという生産収率が得られる。これに対して、温度変化を適用する場合、細胞を9日間培養することができ、68mg/lという生産収率が得られる。シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを、ST6GalNAc1を過剰発現するように改変されたCHO由来の細胞株を用いて無血清フェドバッチ培養において作製する。発酵プロセスのための接種材料を、マスターセルバンクMCBの1つのバイアルからTフラスコ又はスピナーフラスコを用いて成長させ、その後シードバイオリアクターで培養する。それから接種材料を生産用バイオリアクターに移し、そこで細胞密度が作製に適したレベルに達するまで更に細胞の増殖を行う。温度変化は規定の細胞密度で開始し、グルコースレベルをグルコース溶液の供給により規定の範囲内に維持する。培養の終了時に、培養物を回収する。培養物中の細胞及び残屑を深層ろ過により回収物から取り除く。回収物をタンパク質精製を開始するまで2°C~8°Cで保管する。図1は本発明の好ましい実施形態の様々な細胞培養工程及び回収工程を示している。D.シアリルトランスフェラーゼの精製本発明の更なる態様によれば、培養培地からのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの精製を、培養培地を少なくとも1回のアフィニティークロマトグラフィー工程及び/又は混合モードクロマトグラフィー工程と、少なくとも1回の陰イオン交換クロマトグラフィー工程及び/又は陽イオン交換クロマトグラフィー工程とに供することにより行う。好ましい実施形態では、精製は以下の順番で達成される:i.酵素を含有する溶液を濃縮し、DNA、宿主細胞タンパク質HCP及び発酵培地化合物等の夾雑物の最初の低減をもたらす陰イオン交換クロマトグラフィー、ii.シアリルトランスフェラーゼ酵素を濃縮し、宿主細胞タンパク質を枯渇させる中間精製工程として用いられる第1のアフィニティークロマトグラフィー、iii.宿主細胞タンパク質レベルを効果的に低減させるのに用いられる第2のアフィニティークロマトグラフィー又は混合モードクロマトグラフィー、及びiv.あらゆる残存する宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物を取り除くのに用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー。図2は本発明の好ましい実施形態の様々な精製工程を示している。I.陰イオン交換クロマトグラフィー工程本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陰イオン交換クロマトグラフィーAEC工程が含まれる。AECは、サンプル中のタンパク質と樹脂上に固定化された電荷との間の電荷間相互作用によるものである。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の結合イオンが負電荷であり、樹脂上に固定化された官能基は正電荷である。一般的に用いられる陰イオン交換樹脂は、Q樹脂、第四級アミン及びDEAEジエチルアミノエタン樹脂である。しかしながら概して、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、あらゆる一般的な市販の陰イオン交換樹脂又は陰イオン交換膜によって行うことができる。陰イオン交換樹脂をプレパックドカラムの形態で使用することができる。代替的に、カラムを自ら調製することができる。通常のカラム以外のカラムには容積及び形状に関して特別な制限はない。当業者であれば、使用する陰イオン交換樹脂の量が、捕捉工程においてカラムに適用される細胞培養液又は任意の他の液体、例えば先行するクロマトグラフィー工程の溶出液の総タンパク質含有量に応じて変わることを認識している。本発明で使用することができる典型的な強陰イオン交換樹脂は、第四級アミノエチルQAE部分、第四級アンモニウムQ部分、及びトリメチルアンモニウムエチルTMAE基等の官能基を含む。第四級アミノエチルQAE部分を有する樹脂としては、例えばToyopearlQAETosohBioscienceGermanyから入手可能、SelectacelQAEセルロースの第四級アミノエチル誘導体、PolysciencesIncPennsylvaniaUSAから入手可能等が挙げられる。第四級アンモニウムQ部分を有する樹脂としては、例えばQSepharoseXL、QSepharoseFF、QSepharoseHP、ResourceQGEHealthcareGermanyから入手可能、MacroPrepHighQBioRadCaliforniaUSA、ToyopearlSuperQTosohBioscienceGermanyから入手可能、及びUNOsphereQBioRadCaliforniaUSAから入手可能が挙げられる。トリメチルアンモニウムエチルTMAE基を有する樹脂としては、例えばFractogelEMDTMAEMerckGermanyから入手可能が挙げられる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、-NCH33官能基を有する強陰イオン交換樹脂、又は同様の特性を有する樹脂を用いて行われる強陰イオン交換クロマトグラフィーであるのが好ましい。本発明で使用することができる強陰イオン交換樹脂の好ましい例は、UNOsphereQ、QSepharoseHP、QSepharoseFF、及び第四級アンモニウムQ部分を有する他の樹脂として当該技術分野で知られる第四級アンモニウム強陰イオン交換樹脂である。本発明の最も好ましい実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーを市販のQ-SepharoseFastFlow樹脂によって行う。陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を、弱アルカリ性のpHを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばホウ酸バッファー、トリエタノールアミン/イミノ二酢酸、Tris、酢酸アンモニウム、トリシン、ビシン、TES、HEPES、TAPSが挙げられる。Trisバッファーの使用が好ましく、バッファーは、7.6のpHで20mMのTrisを含有するのがより好ましい。陰イオン交換樹脂を平衡バッファーで1回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。陰イオン交換樹脂からの溶出は通常、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加により移動相の導電率を増大することにより達成される。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として7.0~8.0の範囲のpHでNaCl/Tris-HClバッファーを用いて行う。より好ましくは、溶出バッファーは、7.6のpHで800mMのNaCl及び20mMのTris/HClを含有する。II.第1のアフィニティークロマトグラフィー工程本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、アフィニティークロマトグラフィー工程好ましくは色素アフィニティークロマトグラフィーであるが含まれる。好ましい実施の形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを精製する方法は、単一のアフィニティークロマトグラフィー工程を含み、単一のアフィニティークロマトグラフィー工程が色素アフィニティークロマトグラフィー工程であるのがより好ましい。色素アフィニティークロマトグラフィーは、サンプルのタンパク質上の結合部位に対する固定化色素の高い親和性に基づくものである。色素アフィニティークロマトグラフィーの工程は、固定化リガンドとして当業者に既知の色素化合物、すなわちCibacronBlueF3G-Aを有する樹脂を用いて行う。固定化という用語は、当業者によって十分に理解されるものであり、リガンドが樹脂と化学的に連結するという意味でリガンドを誘導体化することを意味する。特に好ましい樹脂は、BlueSepharoseFFAmershamBiosciencesIncから入手可能である。本方法は同様の特性を有する代替的な樹脂により行うことができることが理解される。代替的な樹脂の例としては、ToyopearlAF-blue-HC-650MTosohBioscience、ToyopearlSuperButyl550、ToyopearlPhenyl650、BlueCellthruBigBeadSterogene、SwellGelBluePierce、Cibachromeblue3GA-agarose100Sigma、Affi-GelBlueBioRad、Econo-PacblueカートリッジBioRad、BluesepharoseHPAmersham、CibacronBlue3GASigma、BlueSepharose6FFGEHealthcare、ProSepPBMillipore、MethylSepharose、及びCDPSepharoseCalbiochemが挙げられる。色素アフィニティークロマトグラフィーの工程を、弱アルカリ性のpHを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばMES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、BES、MOPS、TES、HEPESが挙げられる。好ましくは、平衡バッファーは、リン酸カリウムバッファー及びNaClを含む。より好ましくは、平衡バッファーは、25mMのリン酸カリウムバッファーpH7.5及び50mMのNaClを含む。親和性樹脂を平衡バッファーで1回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。より好ましい実施形態では、色素アフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として7.0~8.0の範囲のpHで塩酸L-アルギニン/リン酸カリウムバッファーを用いて行う。最も好ましくは、タンパク質を7.5のpHで500mMの塩酸L-アルギニン及び25mMのリン酸カリウムを含有するバッファーによって溶出させる。III.第2のアフィニティークロマトグラフィー工程又は混合モードクロマトグラフィー本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスは、先の第II章に記載された第2のアフィニティークロマトグラフィー工程、又は混合モードクロマトグラフィー、好ましくはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリクス及びリガンドの両方を形成する不溶性の水酸化リン酸カルシウムCa10PO46OH2を利用する混合モードクロマトグラフィーである。官能基は、正に帯電したカルシウムイオン対C部位及び負に帯電したリン酸基の集団P部位からなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質との間の相互作用は複雑かつ多重モードである。相互作用の方法の1つでは、タンパク質上の正に帯電したアミノ基が負に帯電したP部位と結び付き、タンパク質上の負に帯電したカルボキシル基がC部位との配位錯体形成により相互作用するShepardJofChromatography8919398。結晶性ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーに用いられた最初のタイプのヒドロキシアパタイトであった。セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおける更なる改良型である。セラミックヒドロキシアパタイトは、ナノ結晶が凝集し、粒子となり、高温で融解して、クロマトグラフィー用途に好適な安定したセラミックミクロスフェアを生じる形態のヒドロキシアパタイトを指す。セラミックヒドロキシアパタイトの市販例としては、CHTタイプI及びCHTタイプIIが挙げられるが、それらに限定されない。セラミックヒドロキシアパタイトは、耐久性が高く、タンパク質結合能が良好であり、結晶性ヒドロキシアパタイトよりも高い流速及び圧力で使用することができるVolaetalBioTechniques14650655。ヒドロキシアパタイトはタンパク質、核酸及び抗体のクロマトグラフィーによる分離に用いられている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーでは、通常カラムを平衡状態にし、サンプルを低濃度のリン酸バッファー中で適用した後、吸着したタンパク質をリン酸バッファーの濃度勾配で溶出させるGiovanniniBiotechnologyandBioengineering73522529。任意のヒドロキシアパタイト樹脂を用いて、本発明による方法の混合モードクロマトグラフィー工程を行うことができる。好ましい実施形態では、混合モードクロマトグラフィー工程は、タイプI又はタイプIIのヒドロキシアパタイト樹脂等のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂で行う。ヒドロキシアパタイト樹脂は、20μm、40μm又は80μmのような任意のサイズの粒子を有し得る。非常に好ましい実施形態では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂は40μmのサイズを有する粒子を含む。特に好適なヒドロキシアパタイト樹脂は、CHTセラミックヒドロキシアパタイトタイプI40μmという商品名で市販されているカラムである。平衡バッファーは6.3~7.3のpHでリン酸カリウムバッファーを含むのが好ましく、平衡バッファーはpH6.8で5mMのリン酸カリウムバッファーを含むのがより好ましい。ヒドロキシアパタイト樹脂を平衡バッファーで1回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。本発明のより好ましい実施形態では、ヒドロキシアパタイトアフィニティークロマトグラフィーを、溶離液として6.3~7.3の範囲のpHでNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて行う。最も好ましくは、溶出バッファーは、6.8のpHで5mMのリン酸カリウムバッファー及び1MのNaClを含有する。IV.陽イオン交換クロマトグラフィー工程本発明の実施形態によれば、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド精製プロセスには、陽イオン交換クロマトグラフィーCEC工程が含まれる。CECは、サンプル中のタンパク質と樹脂上に固定化された電荷との間の電荷間相互作用によるものである。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の結合イオンが正電荷であり、固定化された官能基は負電荷である。一般的に用いられる陽イオン交換樹脂は、S樹脂、硫酸塩誘導体、及びCMカルボキシメチル樹脂、カルボキシル化誘導イオンである。しかしながら概して、陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、あらゆる一般的な市販の陽イオン交換樹脂又は陽イオン交換膜によって行うことができる。陽イオン交換樹脂を、官能基、例えばスルホン酸が固定されている充填済みのカラム又は膜の形態で使用することができる。代替的に、カラムを自ら調製することができる。通常のカラム以外のカラムには容積及び形状に関して特別な制限はない。当業者であれば、使用する陽イオン交換樹脂の量が、細胞培養液又は任意の他の液体、例えば先行するクロマトグラフィー工程の溶出液の総タンパク質含有量に応じて変わることを認識している。様々なタイプの陽イオン交換材料は、Bio-Rex商標例えばタイプ70、Chelex商標例えばタイプ100、Macro-Prep商標例えばタイプCM、HighS、25S、AG商標例えばタイプ50W、MP全てBioRadLaboratoriesから入手可能;WCX2Ciphergenから入手可能、Dowex商標MAC-3DowChemicalcompanyから入手可能、MustangC及びMustangSPallCorporationから入手可能、CelluloseCM例えばタイプ23、52、hyper-D、partisphereWhatmanplc.から入手可能、Amberlite商標IRC例えばタイプ76、747、748、Amberlite商標GT73、Toyopearl商標例えばタイプSP、CM、650M全てTosohBioscienceGmbHから入手可能、CM1500及びCM3000BioChromLabsから入手可能、SP-Sepharose商標、CM-Sepharose商標GEHealthcareから入手可能、Porous樹脂PerSeptiveBiosystemsから入手可能、AsahipakES例えばタイプ502C、CXpakP、IECCM例えばタイプ825、2825、5025、LG、IECSP例えばタイプ420N、825、IECQA例えばタイプLG、825ShokoAmericaIncから入手可能、50W陽イオン交換樹脂EichromTechnologiesIncから入手可能のように様々な商品名で、多くの供給業者から入手可能である。好ましくは、陽イオン交換材料は、Macro-Prep商標HighS若しくは25S、MacroCapSP、Toyopearl商標SP650M、SourceS、SPSepharose、又はPOLYCATA等の強陽イオン交換材料である。本発明の好ましい実施形態では、陽イオン交換工程は、スルホプロピル陽イオン交換材料を含有する樹脂又は同様の特性を有する樹脂によって行う。本発明の最も好ましい実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、市販のSP-SepharoseHighPerformance樹脂によって行う。陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を、弱酸性のpHを有する平衡バッファーを用いて行うのが好ましい。好適なバッファーとしては、例えばマレイン酸、マロン酸、クエン酸、乳酸、ギ酸、ブタン二酸、酢酸、リン酸、HEPES及びBICINEが挙げられる。リン酸バッファーの使用が好ましく、平衡バッファーは、6.0のpHで25mMのリン酸カリウムバッファーを含有するのがより好ましい。陽イオン交換樹脂を平衡バッファーで1回又は複数回洗浄し、フロースルー画分を廃棄する。陽イオン交換樹脂からの溶出は通常、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加により移動相の導電率を増大することにより達成される。好ましくは、陽イオン交換クロマトグラフィーは、溶離液として6.0~7.0の範囲のpHを有するNaCl/リン酸カリウムバッファーを用いて行う。より好ましくは、溶出バッファーは、6.0のpHで250mMのNaCl及び25mMのリン酸カリウムを含有する。V.更なる精製工程さらに、本方法はろ過工程を含むことができる。ろ過プロセスは、当業者によって既知であり、あらゆる一般的な方法を使用することができる。本方法は、本方法の様々な工程で1つ又は複数の限外ろ過プロセスを含むことができる。本方法は、例えば最終的なウイルス除去のためにナノろ過を含むことができる。限外ろ過は静水圧によって液体が半透膜に押し付けられる形態の膜ろ過である。高分子量の懸濁固体及び溶質が保持される一方で、水及び低分子量の溶質が膜を通過する。限外ろ過は、巨大分子の溶液、特にタンパク質溶液を精製及び濃縮するのに一般的に用いられる分離方法である。限外ろ過はナノろ過に類似しているが、保持される分子のサイズが異なる。本発明の構成では、10kDaの分子量カットオフが好ましい10kDaUF。UF膜を希釈及び再濃縮の反復又は継続により、溶液から塩及び他の微細種を取り除く透析ろ過にも使用することができる。好ましくは、精製プロセスは1回又は複数回の限外/透析ろ過工程を含む。これらのろ過工程は、クロマトグラフィー工程の前に、その間に、及び/又はその後に行うことができる。好ましくは、1回の透析ろ過工程をクロマトグラフィー工程の間に、例えば混合モードクロマトグラフィー工程と陽イオン交換クロマトグラフィー工程との間に行い、1回の限外ろ過/透析ろ過工程をクロマトグラフィー工程の後に行う。これらのろ過工程は、市販のろ過デバイス、例えばGEHealthcare又はSartoriusから入手可能なろ過デバイスを用いて行うことができる。限外ろ過は、Sartoriusが提供するSartoconカセット及びSartoconSliceカセットを用いて行うのが好ましい。E.作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチド別の態様では、本発明は、本発明による方法のいずれか1つにより作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼシグナルドメインの全て若しくは一部、シアリルトランスフェラーゼ膜貫通ドメインの全て若しくは一部、及び/又はシアリルトランスフェラーゼステムドメインの全て若しくは一部を欠いている切断型シアリルトランスフェラーゼポリペプチドである。本発明の好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドはシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインのみを含み、上記ポリペプチドは可溶性である。最も好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは、ST6GalNAcI、好ましくはニワトリ由来のST6GalNAcIであり、最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼは配列番号4又は配列番号6によるタンパク質である。本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドには、従来技術のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを上回る幾つかの利点がある。本発明の新規の改良された作製方法により、活性が高く、医薬品グレードまで精製され、また大規模生産に適したシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが提供される。純粋なpureという用語は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、ポリペプチドを調製するのに用いられる混合物中に通常該材料とともに存在する構成要素、例えばDNA又は宿主細胞タンパク質を実質的に又は本質的に含まないことを指す。典型的には、本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも98の純度、好ましくは少なくとも99の純度である。純度は任意の当該技術分野で認識される分析方法例えば銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、HPLC、RP-HPLC、ELISA又は同様の手段により決定される。活性型activeという用語は本発明の方法により作製されるシアリルトランスフェラーゼポリペプチドの比活性を指し、その活性はシアル酸部分をドナー分子からアクセプター分子へと移動させるシアリルトランスフェラーゼの触媒活性を意味する。ST6GalNAcIの触媒活性は、α2,6連結によりシアル酸部分をCMP-シアル酸から糖タンパク質のアミノ酸スレオニン/セリンとO連結したN-アセチルガラクトサミンGalNAc残基に移動させることを指す。比活性は活性単位で表すことができる。本明細書で使用される場合、1活性単位は、所与のアクセプター基質、温度及びpH値で1分当たり1μmolの生成物の形成を触媒するものである。本発明では、ST6GalNAcIの比活性は、5U/mg~10U/mg、好ましくは6U/mg~9U/mg、最も好ましくは7U/mg~8U/mgの範囲である。シアリルトランスフェラーゼ活性は既知の方法により決定することができる。かかる方法としては、蛍光アッセイ、RP-HPLCベースのアッセイ及び放射性アプローチが挙げられるSpiegeletal1992JChromatogr573237、Grossetal1990AnalBiochem18612734、非特許文献9。F.シアリルトランスフェラーゼの使用更なる態様では、本発明は治療用タンパク質のグリコシル化のための、特にヒトG-CSF、エリスロポエチン、IFN、hGH、FSH、インスリン又は抗体の糖PEG化のための本発明による方法により作製されたST6GalNacIの使用を含む。グリコシルトランスフェラーゼST6GalNAcIは、治療用タンパク質のグリコシル化に必須の成分である。加えて、ST6GalNAcIは、治療的に重要な糖ペプチド及びオリゴ糖治療薬の研究及び開発に重要な成分である。本発明の修飾されたST6GalNAcIシアリルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシル化ペプチドのinvivo及びinvitroでの調製に、並びに本発明の修飾されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素により移動することができる特定のグリコシル残基を含有するオリゴ糖の作製に有用である。修飾型のST6GalNAcIポリペプチドは、その全長ポリペプチド対応物に匹敵する、場合によってはそれを超える生体活性を保有することができる。グリコシル化という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の方法により調製されるシアリルトランスフェラーゼによる被修飾糖種と、ポリペプチド、例えばエリスロポエチンペプチドのアミノ酸残基又はグリコシル残基との酵素によって媒介される共役を指す。グリコシル化の下位種Subgeneraは、複合糖質化glycoconjugation、及び被修飾糖の修飾基がポリエチレングリコール、そのアルキル誘導体例えばm-PEG又は反応性誘導体例えばH2N-PEG、HOOC-PEGである糖PEG化である。治療用タンパク質は、本明細書で使用される場合、疾患若しくは機能不全を治療するために、又は被験体の健康状態を改善するために被験体に投与されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質又は糖ペプチドを指す。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。更に好ましい実施形態では、治療用タンパク質はヒトタンパク質である。更なる実施形態では、治療用タンパク質はCHO細胞で作製される1つ又は複数のグリコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化されるか、又はそうでなければ修飾される。G-CSF顆粒球コロニー刺激因子は、造血前駆細胞の増殖及び分化、並びに成熟好中球の活性化を刺激する造血成長因子である。G-CSFはinvitro及びinvivoで好中球増殖を支持することが可能である。ヒト型のG-CSFは1986年に日本及び米国のグループによってクローニングされた例えばNagataetal1986Nature319415418を参照されたい。天然のヒト糖タンパク質は2つの形態で存在し、1つは174個のアミノ酸を有し、もう1つは177個のアミノ酸を有する。より豊富でかつ活性が高い174アミノ酸型が組換えDNA技術による医薬品の開発に使用されている。以下の実施例は、切断型のニワトリST6GalNAcIポリペプチドの作製及び精製を表し、本発明の方法を更に説明するために与えられているにすぎない。本発明の範囲が以下の実施例のみで構成されるものであるとは解釈されない。1.発現カセットの構築発現カセットは、介在配列の8つのアミノ酸がN末端に付着した、アミノ酸K232でN末端切断したニワトリグリコシルトランスフェラーゼα-N-アセチル-ノイラミニル-2,3-β-ガラクトシル-1,3-N-アセチルガラクトサミニドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼIからなるST6GalNAcIポリペプチドの発現のために作製した。発現に用いられる全アミノ酸配列を配列番号6に示す。翻訳開始シグナルを付加するため、及び発現率を増大するため、切断型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸をヒトゲノムのエリスロポエチンEPOの発現カセットに導入し、EPOのコード配列を置き換えた。ST6GalNAcI転写ユニットは全体として、以下の要素を含有するように設計された:EPOシグナル配列ヒトエリスロポエチンエキソン14つのアミノ酸をコードする、イントロン1、及びエキソン2の一部27個のアミノ酸:MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGをコードするからなる;ST6GalNAcI及び介在配列のヌクレオチド配列配列番号5;ヒトエリスロポエチンの3’-UTR、285bp;5’-NotI部位を有する45bpのリンカー3’-MunI部位はSV40配列の不可欠部分である。配列番号6で提示されるアミノ酸配列に基づき、成熟ST6GalNAcIのヌクレオチド配列を、CHO細胞でのコドン使用頻度に合わせて最適化した。しかしながら、ゲノムEPO配列から誘導されるヌクレオチドは、天然ヒトエリスロポエチン配列に適合しておらず、また対応していなかった。得られる発現カセットはEcST6と略される。EcST6のヌクレオチド配列はシークエンシングにより確認された配列番号7。配列一致度は100であった。2.発現ベクターの構築合成EcST6画分をNotI/MnuI画分として発現ベクターpMOZ-G8にクローニングした。このベクターは、アンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ発現ユニットと、原核生物要素としてpBR322複製起点と、SV40初期遺伝子プロモーターにより誘導される真核生物選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼDHFRと、対応するSV403’-UTRとを含有するpSV2骨格に基づくものである。元のマウスDHFR選択マーカーをCHODHFR遺伝子との部分融合により修飾し、選択剤メトトレキサートMTXに対する10分の1の親和性を示す組換えハイブリッドDHFRDHFRecを得た。DHFRec選択マーカーをトランスフェクトした細胞をより大量のMTXによって選択し、初めにCHOSICHODHFR前駆細胞株に存在する内因性DHFRをブロックし、プラスミド由来のDHFRecを保有する遺伝子操作した細胞のみを濃縮することができる。遺伝子発現は強いmCMVプロモーターの制御下にある。mCMVプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトMCS及びウサギβ-グロビンイントロン、並びにcDNA転写産物の有効な発現を可能にする3’-UTRがある。カセットのベクターpMOZ-G8への挿入をPCRで確かめた。大腸菌細胞を発現プラスミドpMO7-G8EcST6によって形質転換した。様々な形質転換体のコロニースクリーニングを行い、プラスミドDNAを選択クローンから調製した。pMO7-G8EcST6の同一性を確認するために、全ヌクレオチド配列をDNAシークエンシングで確かめた。3.CHO細胞株分泌型のニワトリST6Gal-NAcIの発現のために、チャイニーズハムスター卵巣細胞株を使用した。ST6GalNAcIの作製に用いられる親細胞株は、無血清及び無タンパク質の培地での成長に適しているジヒドロ葉酸レダクターゼdhfr活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHOdhfr-であるCHOSI4の誘導体である。宿主細胞株CHOSI4の概要:CHOSI4宿主細胞株をCHOdhfr-から誘導したATCC番号CRL-9096;DSMZBraunschweigGermanyによるACC126。CHOSI4宿主細胞株は、MAM-PF2培地中の長期培養による無血清及び無タンパク質の既知組成培地中の成長に適していた。CHOSI4の形態は円形である。培養物は単一細胞懸濁液として成長させる。CHOSI4は血清、タンパク質、ペプチド又は加水分解物を含有しない、無動物成分の既知組成MAM-PF培地での成長に適している。また、細胞株を他の市販の無血清培地中で培養することができる。CHOSI4を1週間当たり1:50の総分割比で継代培養する。細胞を初めに1:20で分割し、新たなフラスコに入れ、4日後に初期容量の3/2の新鮮な培地を得る。CHOSI4は、1日当たり1を超える比成長速度D>1×d-1及び撹拌培養系においてバッチモードで2×106細胞数/mL、及びフェドバッチモードで1×107細胞数/mLという細胞密度を示す。付着因子又はウシ胎仔血清を細胞培養培地に添加することにより、細胞形態が変化し、上皮層へとCHOSI4細胞が逆戻りする。4.細胞の培養及び回収Tフラスコ及びスピナーフラスコ内での細胞の解凍及び接種材料の増殖MCBの単一バイアルを液体窒素の気相中での保管から取り出し、37±1°Cの温浴で加温した。細胞を遠心分離により予め加温した新鮮な培養培地の入ったTフラスコ内に回収した。更なる接種材料の増殖は、スピナーフラスコ内での希釈工程及び継代培養工程により、培養培地の容量をバイオリアクター内でのシードとして用いるのに適切な最終容量まで増大することで達成された。シードバイオリアクター内での細胞増殖スピナーフラスコ内での細胞の増殖後、接種材料をシードバイオリアクターに移し、新鮮な培地を用いて、容量を10Lの最終実施容量まで増大させた。生産用バイオリアクターでの接種に適切な細胞数が達成されるまで、細胞を3日間シードバイオリアクター内で培養した。生産用バイオリアクター内での培養シードバイオリアクター内での成長後、シードバイオリアクターの内容物を無菌状態で生産用バイオリアクターに移し、移した培養物を新鮮な培養培地を用いて最終実施容量まで増殖させた。1.5×106生存細胞数/mL以上の所定の細胞密度に達した後、37°C±1°Cから32°C±1°Cへとインキュベーション温度を下げた。グルコースレベルは4g/L~8g/Lの濃度のグルコース溶液を供給することにより、規定の範囲内に維持した。発酵プロセスは生産用バイオリアクター内での培養開始の14日~17日後に終了させた。回収及び保管発酵の終了後、滅菌使い捨てバッグでの回収物の深層ろ過により、生産用バイオリアクターの細胞懸濁液から細胞及び残屑を取り除いた。使い捨て深層フィルターを回収物のろ過に用いた。回収物を更なる下流の処理まで2°C~8°Cで保管した。5.精製精製-実施例1ST6GalNAcIの精製プロセスは、陰イオン交換カラムを用いる捕捉クロマトグラフィー工程から開始した。続く精製工程には、アフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、限外ろ過/透析ろ過、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び15nmのPlanova商標膜に通す最後のナノろ過が含まれていた。クロマトグラフィー工程は勾配クロマトグラフィー系を用いて行い、自動で実行した。UV吸収、導電率、pH、流速及び背圧をクロマトグラフィー工程ごとに好適なソフトウェアにより記録した。用いられるカラムのタイプ及び樹脂を表1に示す。第1のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィーQ-SepharoseFFQ-SepharoseFastFlow樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第1のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でST6GalNAcIを捕捉し、容量を低減した。ST6GalNAcIを、20mMのTrisHClpH7.6中での800mMのNaClの塩添加工程を適用することにより溶出した。溶出液をUV吸収プロファイルに基づき回収した。クロマトグラフィー条件は表2にまとめる。第2のカラム:アフィニティークロマトグラフィーBlueSepharose6FFBlueSepharose6FFは、色素CibacronBlue商標と共有結合的に連結するアガロース樹脂であり、Q-Sepharose溶出液に含有される夾雑物の存在下でST6GalNAcIと優先的に結合させるのに使用した。ST6GalNAcIを25mMのリン酸カリウムバッファーpH7.5中の500mMの塩酸L-アルギニンによって溶出した。溶出液をUV吸収プロファイルに基づき回収した。クロマトグラフィー条件を表3にまとめる。第3のカラム:混合モードクロマトグラフィーヒドロキシアパタイトヒドロキシアパタイト樹脂での混合モードクロマトグラフィーを、中間工程として使用して、HCP及びDNAのレベルを更に低減した。ST6GalNAcIを5mMのリン酸ナトリウムバッファーpH6.8中の1.0MのNaClによって溶出した。溶出液をUV吸収プロファイルに基づき回収した。クロマトグラフィー条件を表4にまとめる。限外ろ過/透析ろ過ヒドロキシアパタイト溶出液を、30kDaの分子量カットオフMWCOでSartoconスライスモジュールを用いて透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、最終的にバッファーを25mMのリン酸カリウムバッファーpH6.0に交換した。第4のカラム:陽イオン交換クロマトグラフィーSPSepharose陽イオン交換クロマトグラフィーを最終精製polishing工程として用い、残りの残存するHCPを可能な限り全て除去した。特定条件下で、適用されるST6GalNAcIを25mMのリン酸カリウムバッファーpH6.0中の250mMのNaClによって溶出した。クロマトグラフィー条件を表5にまとめる。限外ろ過/透析ろ過及び配合SP-Sepharose溶出液を30kDaのMWCOでSartoconスライスモジュールによって透析ろ過した。接線流ろ過を実施し、生成物を脱塩及び濃縮して、バッファーを50mMのBisTrispH6.5、100mMのNaCl、5ソルビトールに交換した。透析ろ過の完了後、Tween80を最終濃度が0.003になるまで添加した。精製-実施例2第1のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィーQSepharoseFFこのプロセス工程を陰イオン交換クロマトグラフィーによる、清澄化したclarified滅菌ろ過済みのバイオリアクター回収物からのcST6の捕捉に用いる。バイオリアクターからの1000mLの上清をバッファーA20mMのTrispH7.6で1:3に希釈して、omni25/150QSepharoseFFカラムに充填した。cST6を線形NaCl勾配0-1M、20CVにより溶出した。第2のカラム:アフィニティークロマトグラフィーCDPアフィニティーマトリクスこのアフィニティークロマトグラフィープロセス工程は、cST6純度を増大するのに重要な中間工程である。QSepharose捕捉工程からの画分9~画分11のプールをバッファーA10mMのMESpH6.8、25グリセロールで1:3に希釈して、XK10/55CDPアフィニティーカラムに充填した。CDPカラムの過充填を避けるために、充填物を2つの同一のCDP操作に適用した。cST6を線形NaCl勾配0-1M、10CVにより溶出した。第3のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィーMonoQSepharoseこの陰イオン交換クロマトグラフィーを最終精製工程として用いた。CDP中間工程からのcST6画分のプールをバッファーA20mMのTrispH7.6で1:10に希釈し、MonoQHR10/10カラムに充填した。cST6を線形NaCl勾配0-0.6M、5CVにより溶出した。精製-実施例3第1のカラム:陰イオン交換クロマトグラフィーQ-SepharoseFFQ-SepharoseFastFlow樹脂による陰イオン交換クロマトグラフィーを第1のクロマトグラフィー工程として使用し、回収物中でST6GalNAcIを捕捉し、容量を低減した。フェドバッチ培養バイオリアクターからの300mLの清澄化した滅菌ろ過済みの上清を精製した。クロマトグラフィー条件を表6にまとめる。第2のカラム:中間アフィニティークロマトグラフィーBlueSepharoseFFこのアフィニティークロマトグラフィープロセス工程はcST6純度を増大するのに重要な中間工程である。捕捉クロマトグラフィー工程の溶出液29mLを希釈し、BlueSepharoseクロマトグラフィー工程により精製した。クロマトグラフィー条件を表7にまとめる。第3のカラム:精製アフィニティークロマトグラフィーProsepPBProSep-PB媒体は孔径を制御したガラスビーズに固定化された合成m-アミノフェニルリガンドで構成されている。このアフィニティークロマトグラフィーを最終精製工程として用いた。15mLの中間溶出液をこのクロマトグラフィー工程で精製した。クロマトグラフィー条件を表8にまとめる。6.生成物のST6GalNAcI純度、比活性及び収率実施例1実施例1に従って精製したST6GalNAcIの純度を、3つのバッチにおいてクマシー染色したSDS-PAGE図3を参照されたい、RP-HPLC、ELISA及び閾値アッセイにより測定した。ST6GalNAcIの比活性をRP-HPLCにより測定した。純度及び比活性は表9に示したとおりであった。精製したST6GalNacIの生産収率は65mg/L~75mg/Lの範囲であった。比較研究を行い、CHO細胞におけるST6GalNAcIの発現と、昆虫細胞におけるST6GalNAcIの発現とを比較した。昆虫細胞由来のST6GalNAcIは2.5U/mgという比活性を示し、CHO由来のST6GalNAcIは7.8U/mgというより高い比活性を示した。実施例2実施例2による精製したcST6画分をプールし、クマシー染色したSDS-PAGEにより純度を分析した図4を参照されたい。3つの異なるクローンC1、C2及びC3から得られたcST6サンプルプールを、希釈せずに充填し、1:5に希釈して充填し、1:10に希釈して充填した。表10はサンプルの調製及び充填を示す。図4に示されるように、希釈していないプールは20kDa未満の微量の夾雑を示す。1:10に希釈したプールのシグナルは、希釈していないサンプルでの不純物のシグナルよりも強かった。これにより、純度は90を超えると推測することができる。実施例3実施例3に従って精製したST6GalNAcIの純度を、3つのバッチにおいてクマシー染色したSDS-PAGE、RP-HPLC、ELISA及び閾値アッセイにより測定した。ST6GalNAcIの比活性をRP-HPLCにより測定した。"