"高分子電解質骨格に結合した1つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含み、刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる、刺激応答性ポリマー。高分子電解質骨格が少なくとも2つのモノマー単位を含む、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。高分子電解質骨格が少なくとも3つのモノマー単位を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。高分子電解質骨格中の各モノマー単位が電荷を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。モノマー単位の少なくとも50が電荷を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。対象生体分子が治療用ポリペプチドである、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。対象生体分子が治療用ポリペプチドと一緒にサンプル中に存在している不純物である、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。不純物が宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、DNA、RNA、ウイルス、脂質、全細胞及び細胞破片からなる群から選択される、請求項7に記載の刺激応答性ポリマー。刺激が多価イオンである、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。多価イオンがリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項9に記載の刺激応答性ポリマー。治療用ポリペプチドが抗体である、請求項7に記載の刺激応答性ポリマー。抗体がモノクローナル抗体である、請求項11に記載の刺激応答性ポリマー。ポリアリルアミン、ベンジル基で修飾させたポリアリルアミン、ポリビニルアミン及びベンジル基で修飾させたポリビニルアミンからなる群から選択される刺激応答性ポリマーであって、刺激がリン酸塩またはクエン酸塩である、前記ポリマー。サンプル中の1つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、a標的分子及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;bサンプルを請求項1に記載の刺激応答性ポリマーと接触させてポリマーと1つ以上の不純物の複合体を形成するステップ;及びcサンプルに刺激を加えて溶液から複合体を沈殿させるステップ;を含み、これにより1つ以上の不純物から標的分子を分離する、前記方法。1つ以上の濾過ステップを更に含む、請求項14に記載の方法。1つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む、請求項14に記載の方法。刺激が多価イオンである、請求項14に記載の方法。多価イオンがリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項17に記載の方法。高分子電解質骨格が少なくとも2つのモノマー単位を含み、前記単位の少なくとも50が電荷を含む、請求項14に記載の方法。高分子電解質骨格が少なくとも3つのモノマー単位を含み、前記単位の少なくとも50が電荷を含む、請求項14に記載の方法。以下の構造:式中、R1及びR2は骨格の一部を形成する荷電基であり;R3は骨格中の荷電基に結合している疎水基であり;nはポリマー中のモノマー単位の数であり、nは2以上であるを含み、炭素含有高分子電解質骨格を含む、刺激応答性ポリマー。以下の構造:式中、R1、R2及びR3は骨格の一部を形成する荷電基であり;R4は骨格中の荷電基に結合している疎水基であり;R5はR1、R2またはR3中に存在する電荷と反対の電荷を有する基であり;nはポリマー中のモノマー単位の数であり、nは2以上であるを含み、炭素含有高分子電解質骨格を含む、刺激応答性ポリマー。請求項1に記載の刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、刺激応答性ポリマーを用いてサンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、a抗体及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;bポリマーが1つ以上の不純物と結合するのに適した第1組の条件下において、サンプルを請求項1に記載のポリマーと接触させ、それによりポリマーと1つ以上の不純物の第1複合体を形成し、前記第1組の条件が、ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのpHまたは塩濃度を調節することを含むステップ;c第2組の条件下でサンプルから第1複合体を沈殿させるステップ;dサンプルを多価イオンを含む刺激と接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第2複合体を形成するステップ;e第2複合体を沈殿させるステップ;を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する、前記方法。抗体がモノクローナル抗体である、請求項23に記載の方法。1つ以上の不純物が宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、ウイルス、抗体凝集物及び細胞培養添加物からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。サンプルが供給材料を含む、請求項23に記載の方法。サンプルが抗体が分泌される細胞培養培地を含む、請求項23に記載の方法。1つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む、請求項23に記載の方法。1つ以上の濾過ステップを更に含む、請求項23に記載の方法。高分子電解質骨格がポリアミン骨格を含む、請求項1に記載のポリマー。疎水基がフェニル基である、請求項1に記載のポリマー。以下の構造式中、R1、R2は骨格の一部を形成するアミンであり;R3はアミン基の20~75上に存在する疎水性修飾基であり、フェニル基またはその誘導体から構成され;nはポリマー中のモノマー単位の数であり、nは2以上であるを含み、炭素含有高分子電解質骨格を含む、サンプルから対象生体分子を精製するために有用な刺激応答性ポリマー。以下の式:式中、R1、R2及びR3は骨格の一部を形成するアミン基であり;R4はR1、R2またはR3基の5~75に結合しているフェニル基であり;R5はR1、R2及びR3基の5~50を修飾するカチオン交換基であり;nはポリマー中のモノマー単位の数であり、nは2以上であるを含み、炭素含有高分子電解質骨格を含む、1つ以上の不純物から標的分子を分離するための刺激応答性ポリマー。刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、刺激応答性ポリマーを用いてサンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、a抗体及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;bポリマーが1つ以上の不純物と結合するのに適した第1組の条件下において、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させ、それによりポリマーと1つ以上の不純物の第1複合体を形成し、前記第1組の条件が、ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのpHまたは塩濃度を調節することを含むステップ;c第1組の条件下でサンプルから第1複合体を凝集させるステップ;d凝集させた固体を除去するステップ;eサンプルを多価イオンと接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第2複合体を形成するステップ;及びf第2複合体を沈殿させるステップ;を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離させる、前記方法。サンプル中の1つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、a標的分子及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;b多価イオン応答性ポリマーの添加前、添加中または添加後に多価イオンを添加してサンプルを多価イオン応答性ポリマーと接触させて、ポリマーと1つ以上の不純物の複合体を形成するステップ;c溶液から複合体を沈殿させるステップ;を含み、それにより1つ以上の不純物から標的分子を分離させる、前記方法。多価イオン刺激がリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項35に記載の方法。刺激応答性ポリマーがコポリマーである、請求項35に記載の方法。ステップcの後に、多価イオンで修飾させた膜または樹脂を使用することを含む、残留量のポリマーを除去するステップを更に含む、請求項35に記載の方法。多価イオンがリン酸塩である、請求項38に記載の方法。本発明は、少なくとも部分的に、1つ以上の疎水基で修飾させた高分子電解質骨格を含む新規で改善された刺激応答性ポリマーを提供し、刺激を加えることによりポリマー溶解度を変化させ得る。本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマー及び前記ポリマーの使用方法は、例えばタンパク質を含めた所望の標的分子を精製するため及び不純物例えば、宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、脂質、エンドトキシン、細胞培養添加物、細胞及び細胞破片のような望ましくない実在物を除去するための改善されたpH範囲を与える点で従来技術に記載されているものよりもより効率的である。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されているポリマーは、低濃度の単一多価塩に対して応答性であり、これにより既存の塩応答性ポリマーに比して改善されたスケーラビリティー及び低い導電性が得られる。各種実施形態では、本発明に従うポリマーは、細胞培養培地から全細胞、細胞破片及び他の可溶性不純物を効果的に除去し得る。ポリマーは、当該タンパク質及び1つ以上の不純物を含有しているタンパク質混合物から不純物をも効果的に除去できる。更に、本明細書中に記載されている各種ポリマーは、サンプル中の標的分子及び当該タンパク質/産物を効果的に捕捉することができ、これによりこれらをサンプル中に存在している1つ以上の不純物から分離し、標的分子の純度を向上させることができる。広範囲の条件を用いて標的分子例えば、治療用タンパク質を精製するための本明細書中に記載されているポリマーの使用方法も本発明に包含される。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、所望の標的分子例えば、治療用タンパク質または望ましい産物、或いは所望しない実在物例えば、宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、脂質、エンドトキシン、細胞培養添加物、全細胞及び細胞破片を含めた1つ以上の不純物のいずれかに結合し、沈殿させるために使用され得ると考えられる。通常、所望の標的分子または所望しない実在物であれ、本発明に従うポリマーにより結合される分子を対象生体分子と称する。本明細書中に記載されている、使用する特定の刺激応答性ポリマーの選択は、ポリマーを何と結合させるかによって決定される。例えば、そのpIよりも高いpHで正味負電荷を持っている対象生体分子例えば、全細胞、細胞破片、DNA、エンドトキシン及びタンパク質の場合には、カチオン性であるすなわち、正に荷電している高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーを使用することが望ましい。一方、そのpIよりも低いpHで正味正電荷を持っている対象生体分子例えば、タンパク質の場合には、アニオン性であるすなわち、負に荷電している高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーを使用することが望ましい。正電荷は、精製プロセス中に使用する条件下でポリマーに固有であり得、または正電荷は、刺激応答性ポリマーを帯電させるpHの変化に応じて生じ得る。生体分子の全回収に影響を与える重要なパラメーターは、高分子電解質骨格中の疎水性修飾基の別の非修飾荷電基に対する比である。例えば、疎水基が上昇すると、非特異的相互作用による生体分子のロスが生ずる。従って、所与の生体分子の場合、生体分子回収を最大とするために荷電基の疎水基に対する特定比が使用され得る。加えて、疎水基の高いはポリマー溶解度及び高分子電解質骨格上の荷電基の有効性を限定し得る。更に、高分子電解質ポリアリルアミンの骨格中の荷電アミン基をベンジルクロリドで修飾すると、第2級アミンが生じ、この基は広範囲のpH条件下で帯電される。しかしながら、ベンジル修飾は電荷-電荷相互作用に影響を及ぼし得るアミン基に立体的かさ高さを付加する。加えて、高分子電解質骨格中の荷電基を疎水基で修飾すると、荷電基の数を減少させ得る。例えば、ポリアリルアミンのアミン基をベンジルクロリドで修飾すると、荷電基でないアミド結合が形成され、これにより骨格中の荷電基の数が減少する。従って、荷電基の数の減少は、ポリマーの溶解度及びポリマーの電荷-電荷相互作用を介して結合する能力にも影響を及ぼし得る。本発明に従うあるポリマーは、カチオン性、他はアニオン性であるが、カチオン性であり、1つ以上の疎水基及で修飾させた高分子電解質骨格及びアニオン性基を含むハイブリッドポリマーも合成され得る。前記ハイブリッドポリマーの場合、カチオン性高分子電解質上の非修飾基は、複合体形成塩に対して応答性であり、骨格上のアニオン性修飾基は、正味正電荷を持つ対象生体分子に結合し得る。従って、高分子電解質骨格内の非修飾カチオン基のアニオン性疎水基に対する比は、ポリマーが対象生体分子と複合体を形成し、捕捉するために必要な溶解度及び刺激を決定するために重要である。例えば、高分子電解質骨格中の非修飾カチオン基が余りに少ないと、刺激に対する応答が制限されるかまたはなくなり得る。一方、アニオン基が余りに少ないと、対象生体分子を捕捉する能力が制限され得る。疎水基による高分子電解質骨格の修飾の必要レベル、並びに使用される刺激のタイプ及び量は、ポリマーを用いて精製しようとする対象生体分子及び使用する条件、並びにポリマー骨格の固有の溶解度及び分子量に基づいて決定され得る。例えば、使用する刺激例えば、多価塩の量を最小とするためには、高分子電解質骨格に結合させる疎水基をより多くすることが望ましい。或いは、多価イオン刺激の量を多くすると、疎水性修飾の程度または必要な疎水性修飾が低下する。幾つかの場合には、例えば多価イオン刺激が非常に高濃度であるならば、疎水性修飾の必要性を完全に排除することができる。或いは、ポリマー分子量を高くすると、高分子電解質骨格の固有溶解度が低下し、高分子電解質骨格疎水性修飾を低下5以下またはゼロにすることができる。しかしながら、疎水性修飾を排除すると、高いポリマー添加量でより低い分子量またはより可溶性のポリマー骨格の場合残留ポリマー量が増加する恐れがある。各種実施形態では、高分子電解質骨格上の疎水性修飾の程度は、1~85または5~0の範囲である。従って、刺激応答性ポリマーにより結合させようとする対象生体分子に応じて、疎水性修飾のは、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80または85である。幾つかの実施形態では、複合体形成塩を刺激として使用する。各種実施形態では、複合体形成塩の濃度は、2mM~500mMまたは25mM~100mMの範囲である。複合体形成塩の例には、多価イオン例えば、クエン酸塩、リン酸塩、硫酸塩及びEDTA及びイオン会合塩例えば、過塩素酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム塩、ドデシルベンゼン硫酸塩、FeII-4-クロロ-2-ニトロフェノールアニオン、テトラフェニルホウ酸ナトリウム塩及びヘキサニトロジフェノールアミンが含まれるが、これらに限定されない例えば、ANALYTICALSCIENCES,DECEMBER1987,VOL.3,p.479を参照されたい。通常、当業者は、当業界で公知の、本明細書中に記載されているポリマーに対して刺激として使用され得る各種複合体形成塩を熟知している。沈殿を誘発するために必要な複合体形成塩の量は、複数の因子、例えばpH、ポリマー濃度及びサンプル中の対象生体分子の濃度に依存する。例えば、ポリアリルアミンのような幾つかの高分子電解質はpHアミンプロトン化のレベルによって変化する電荷密度を有している。pHが上昇すると、電荷密度のレベルが低下するため、沈殿を誘発するために必要な刺激の程度は、pHがより低い場合や電荷密度状態がより高い場合とは異なる。通常、本発明に従う刺激応答性ポリマーは標的分子を含有している供給材料または標的分子を含有しているサンプルに固体または液体形態で添加され得る。最終ポリマー濃度は通常0.01~2である。本明細書中に記載されている幾つかの方法では、ポリマー及び対象生体分子の混合物を形成した後、刺激、例えば複合体形成塩例えば、多価アニオンを加える。刺激の量は、ポリマー濃度に依存し得る。例えば、2のポリマー濃度はポリマー沈殿を誘発させるのに必要な刺激をより多く必要とする。刺激応答によりポリマーを完全に沈殿させるためには、刺激を正しい量または僅かに過剰の量適用することが重要である。これは、過剰添加により問題となる残留ポリマーが発生するポリマー凝集と対照的である。本発明は各種精製スキームにおいて使用され得る。刺激応答性ポリマーはプロセスの任意のステップにおいて有用であり得るが、プロセスの始めに標的分子の清澄化または捕捉中に使用することが好ましい。1つの刺激応答性ポリマーまたはポリマー混合物を1つ以上のステップで添加し、その後1つ以上の刺激を用いて沈殿させることができる。ポリマーが対象生体分子すなわち、1つ以上の不純物または所望の標的分子と会合させる前、その間またはその後に刺激を加えてもよい。また、通常固体形態である沈殿を除去する前、その間またはその後に刺激を加えてもよい。沈殿はその後、同時、並行または一連の分離スキームにおいて当業界で公知の1つ以上の技術及び/または本明細書中に記載されている技術、例えば濾過、沈降、遠心または他の固体/液体分離方法、或いは方法の組合せを用いて除去され得る。刺激応答性ポリマーの添加は、幾つかの方法でなし得る。刺激応答性ポリマーを添加する前に細胞培養培地は所望の条件に調節し得、例えばpH及び/または導電性を調節例えば、低下し得る。次いで、刺激応答性ポリマーを細胞培養培地に添加し、混合し得る。刺激応答性ポリマーは、液体または固体フォーマットで添加され得る。ポリマー含有溶液それ自体は、まさに細胞培養培地のpHを所望の条件に調節するように調製され得る。例えば、刺激応答性ポリマーを濃酢酸溶液中に溶解させ得る。この酢酸溶液の濃度は、刺激応答性ポリマーの添加時に必要なpH調節を与え、これにより所望のポリマー濃度及び溶液pHが生ずるように容量、発酵溶液条件及びタンパク質濃度に基づいて変更し得る。溶液が曇り始め、沈殿を形成し始めるように、刺激応答性ポリマーは、タイプ及び固体に応じて自然な凝集が起こる濃度で、典型的には0.01~0.1wtポリマーまたは0.01~0.5wtポリマーの範囲で添加され得る。或いは、刺激応答性ポリマーは、自然な凝集は起こらないが、ポリマー-生体分子会合が起こる濃度で、例えば典型的には0.5~2wtポリマーの範囲で添加され得、溶液は元の溶液よりも透明であるか、やや曇っているかまたはより濁っていてもよい。また、刺激応答性ポリマーを自然凝集及びポリマー-生体分子会合の両方が起こる濃度で添加してもよい。例えば凝集プロセスの場合などのポリマーの過剰添加に関連する諸問題を緩和することから、精製スキームにおいて刺激を使用することがより望ましいが、本明細書中に記載されているポリマーを凝集剤として使用することも考えられる。例示的精製スキームでは、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、発酵が完了した後に細胞培養物に添加され、ポリマーは所望の標的分子でない対象生体分子に結合するように調製される。この方法では、刺激応答性ポリマーを第1組の条件下で、例えば対象生体分子を結合するポリマーの添加前、添加中または添加後に調節され得る条件下で、細胞培養物に添加する。刺激応答性ポリマーを第1組の条件下で添加した後、刺激を第2組の条件下で添加し、これにより対象生体分子例えば、細胞、細胞破片、宿主細胞タンパク質、DNA、エンドトキシン及びウイルスのような1つ以上の不純物を含む沈殿が生ずる。その後固体沈殿を遠心及び/または濾過により除去すると清澄化した細胞培養液が生ずる。その後、生じた清澄化した細胞培養液を所望の標的分子に結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかけ得る。その後、標的分子は捕捉ステップから溶離され得る。従って、幾つかの場合には、清澄化ステップで1つ以上の不純物を除去することができる本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いることにより、追加ステップの数を減少、削除または変更し得る。幾つかの実施形態では、刺激応答性ポリマーが標的分子ではない対象生体分子に結合する条件下で刺激応答性ポリマーを細胞培養物に添加する。刺激応答性ポリマーを所望の溶液条件下で十分混合した後、対象生体分子を含む凝集物を形成する。対象生体分子を含有する固体を一次清澄化により除去する。生じた細胞培養液を収集し、刺激を加えて残留ポリマーを沈殿させる。その後、沈殿した残留ポリマーを二次清澄化により除去する。生じた清澄化した細胞培養溶液を標的分子に結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかける。一次清澄化後の精製ステップで刺激を加えることにより残留ポリマーを除去することもできる。また、任意のステップで残留ポリマーを除去するために刺激を加えても、プロセスを通して1つ以上の刺激を複数回加えてもよい。別の精製スキームでは、刺激応答性ポリマーを、発酵が完了した後の細胞培養液にポリマーが標的分子を結合しないように、ポリマーが1つ以上の不純物に結合するのに適した条件下で添加する。刺激応答性ポリマーを所望の溶液条件下で十分に混合した後、1つ以上の不純物と固体沈殿を形成する刺激を加える。固体沈殿を遠心及び/または濾過により除去する。生じた清澄化した細胞培養溶液を、刺激応答性ポリマーを結合させることができるフィルター中を通過させる。当業者は、刺激応答性ポリマーを結合させることができるフィルターを容易に選択/同定することができる。例えば、ポリマーにより結合させようとする対象生体分子と類似の特性を有しているフィルターを用意し得る。或いは、対象生体分子と同一の電荷を有する荷電基及び刺激応答性ポリマーの電荷と反対の電荷を有するフィルターを使用してもよい。ポリマーを溶液から除去するために、膜、充填床またはフィルターも使用し得る。例えば、ポリアミン刺激応答性ポリマーを除去するために、スルホン酸基を含有するアニオン性膜を使用し得る。また、ポリマーを沈殿させるために使用される刺激に、類似の結合特性を有するフィルターも使用され得る。刺激が多価アニオンであるならば、多価アニオンを含有している表面を有するフィルターを用意すると、溶液からポリマーを除去することができる。例えば、ポリビニルリン酸塩で修飾させた膜は、リン酸塩イオンがポリアミンと複合体を形成し、それにより、沈殿を誘発させる殆ど同一の方法でポリアミンに結合し得る。また、ポリビニルリン酸塩で修飾させたビーズ例えば、ポリメタクリレートを使用してもよい。幾つかの実施形態では、刺激応答性ポリマーを除去することができるフィルターを用いて溶液を濾過した後、生じた溶液を標的生体分子を結合させるためにクロマトグラフィー媒体を用いる捕捉ステップにかける。クロマトグラフィー媒体、デプスフィルター、または刺激応答性ポリマーを結合することができる他の多孔性材料を用いてポリマーを除去することができる。また、単一のステップまたは2つ以上の複数ステップでポリマーを吸着手段を用いて除去することもできる。更に、混合物にポリマーを添加した後の任意のステップで、ポリマーを吸着手段を用いて除去することができる。本発明は、本明細書中に記載されている精製スキームの多くの改変において使用し得ると考えられる。刺激応答性ポリマーは、清澄化及び捕捉ステップの両方を置換または強化するために使用され得る。例えば、1つ以上の不純物に結合するが、標的分子に結合しない第1のポリマー、標的分子に結合する第2のポリマーという2つの別々の刺激応答性ポリマーを使用し得る。これらの2つのポリマーは、別々のステップまたは単一ステップで適用され得る。同様に、標的分子に結合し得る官能基及び1つ以上の不純物に結合し得る高分子電解質骨格を有する単一ポリマーを使用し得る。単一ポリマーは、単一ステップまたは複数のステップで標的分子及び1つ以上の不純物に結合できる。幾つかの異なる沈殿/刺激添加または洗浄ステップ後、標的分子のポリマーからの溶離をその後行ってもよい。捕捉ステップ後のウイルス不活化または他のステップより生ずる懸濁状固体または不純物を清澄化するために、刺激応答性ポリマーを捕捉ステップ後に添加し、使用してもよい。研磨ステップに代えて、または研磨ステップを強化するために、刺激応答性ポリマーを使用してもよい。幾つかの実施形態では、ウイルス不活化ステップすなわち、溶液を低pH、界面活性剤または熱に曝すを含める。溶液条件を調節し、サンプルを一連の研磨ステップすなわち、1つ以上のイオン交換、疎水性相互作用、混合モード及びその他にかけてもよい。次いで、溶液をウイルス濾過及び限外濾過、またはダイアフィルトレーションを含めた一連の濾過ステップにかけてもよい。本発明の開示内容がより容易に理解され得るように、幾つかの用語をまず定義する。追加の定義は詳細説明を通して記載する。I.定義本明細書中で互換可能に使用されている用語刺激は、本発明に従う刺激応答性ポリマーによる応答をもたらす環境における物理的または化学的変化を指すことを意味する。従って、本発明は、刺激に対して応答性であり、刺激によりポリマーの溶解度の変化をもたらす新規ポリマーを提供する。本明細書中に記載されている1つ以上のポリマーが応答性である刺激の例には、例えば温度の変化、導電性の変化及び/またはpHの変化が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、刺激は、サンプルへの複合体化剤または複合体形成塩の添加を含む。各種実施形態では、刺激は、通常、サンプルにポリマーを添加した後に加える。しかしながら、サンプルへのポリマーの添加中またはその前に刺激を加えてもよい。本明細書中で使用されている用語ポリマーは、2つ以上のモノマー単位の共有結合により形成される分子を指す。モノマー単位は合成のものであっても、天然のものであってもよい。反復単位により形成されるポリマーは、線状でも、分枝状でもよい。ポリマーの例には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン及びコポリマー例えば、ポリスチレン-コ-ポリピリジン、ポリアクリル酸-コ-メチルメタクリレート、プルロニック、PF68等が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従う幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリ高分子電解質骨格を含む。本明細書には、本発明に従う方法において使用され得る刺激に対して応答性であるコポリマーも記載されている。通常、ポリマーの場合モノマー単位は、同一タイプのものであるが、コポリマーは、通常、異なるタイプのモノマー単位を有すると理解される。本明細書中で使用されている用語刺激応答性ポリマーは、刺激を加えた後物理的及び/または化学的特性の変化を示すポリマーまたはコポリマーである。典型的な刺激応答は、ポリマーの溶解度の変化である。例えば、ポリマーポリN-イソプロピルアクリルアミドは、約35°Cを下回る温度で水に可溶性であるが、約35°Cの温度で水に不溶性となる。特定実施形態では、刺激応答性ポリマーは、多価イオン刺激例えば、リン酸塩刺激に対して応答性であるポリアリルアミンまたはポリビニルアミンポリマーである。本明細書中で使用されている用語高分子電解質骨格は、2つ以上のモノマー単位を含む炭素含有ポリマーを指し、単位の少なくとも50、単位の少なくとも55、単位の少なくとも60、単位の少なくとも65、単位の少なくとも70、単位の少なくとも75、単位の少なくとも80、単位の少なくとも85、単位の少なくとも90、または単位の少なくとも95が荷電官能基を含有している。換言すると、モノマー単位の少なくとも50は、単位の一部を形成する荷電基を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている高分子電解質骨格は、少なくとも2つ以上のモノマー単位を含有し、前記単位の各々が荷電官能基を含有している。モノマー単位の各々が荷電官能基を含有しているポリマーの高分子電解質骨格の場合、このポリマーは連続高分子電解質と称して言及され得る。高分子電解質の例には、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、キトサン及びポリビニルリン酸が含まれるが、これらに限定されない。モノマー単位とは異なる1つ以上の実在物が高分子電解質骨格に結合していてもよいとも考えられる。本明細書中で使用されている用語疎水基は、水に対する親和性がないかまたは殆どない非極性の実在物または化学基を指す。疎水基の例には、フェニル基、第3級ブチル基、環状炭化水素、多環式脂肪族炭化水素、多環式芳香族炭化水素、及び短鎖炭化水素例えば、ヘキシル及びオクチル基が含まれるが、これらに限定されない。特定実施形態では、疎水基はフェニル基である。疎水基は、非炭化水素であっても、ヘテロ原子例えば、窒素、酸素、硫黄、リン等を含有していてもよい。本発明に従う各種実施形態では、骨格中の荷電基に結合している1つ以上の疎水基を有する高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーが提供される。理論に拘束されることを望むものではないが、高分子電解質骨格に結合している疎水基の数はポリマー溶解度を変化させて、ポリマーの刺激応答性を改善するために重要であると理解される。しかしながら、刺激なしでポリマーを水不溶性とする疎水基の数を有することが望ましいことがある。疎水基で修飾させた高分子電解質骨格中の荷電基のは、通常、ポリマーの疎水性修飾と称される。従って、各種実施形態では、疎水性修飾が重要であり、1~85または5~5の範囲である。従って、疎水性修飾は少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、または少なくとも85であり得る。本明細書中で使用されている用語疎水性修飾は、通常、高分子電解質ポリマー骨格中の全高分子電解質モノマー単位のとしての疎水基修飾させた高分子電解質荷電基に対する非修飾高分子電解質荷電基の比を指す。幾つかの実施形態では、高分子電解質骨格に結合している疎水基は、更に骨格中の荷電基とは区別される実在物である疎水基に結合している荷電基を有している。本明細書中で使用されている用語アルキルは、通常、直鎖または分枝状炭化水素鎖を指す。直鎖または分枝鎖炭化水素鎖は、例えばアルカン、アルケン及びアルキンを含めた置換または未置換の非環式炭素含有化合物を指す。アルキル基の例には、低級アルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチルまたはイソヘキシル;高級アルキル、例えばn-ヘプチル、n-オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル等;低級アルキレン、例えばエチレン、プロピレン、プロピリン、ブチレン、ブタジエン、ペンテン、n-ヘキセンまたはイソヘキセン;並びに高級アルキレン、例えばn-ヘプテン、n-オクテン、イソオクテン、ノネン、デセン等が含まれる。当業者は、本発明に包含される多数の直鎖すなわち、線状及び分枝状アルキル基を熟知している。加えて、上記アルキル基は、1個以上の水素原子が官能基で置換されている各種置換基をも含有し得る。官能基の例には、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸基等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語アルケニルは、炭素-炭素結合の少なくとも1つが炭素-炭素二重結合である直鎖または分枝状炭化水素鎖を指す。本明細書中で使用されている用語アルアルキルは、末端が少なくとも1個のアリール基で置換されているアルキル基を指す。本明細書中で使用されている用語アルアルケニルは、末端が少なくとも1個のアリール基で置換されているアルケニル基を指す。本明細書中で使用されている用語アリールは、多くの場合、少なくとも6個のnπ電子を含む共役二重結合系を有する炭化水素環を指す。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アニシル、トルイル及びキシレニルが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語フルオロカーボンは、1個以上の水素原子がフッ素基で置換されている直鎖または分枝状炭素鎖を指す。直鎖または分枝鎖フルオロカーボン鎖は、通常例えばアルカン、アルケン及びアルキンを含めた置換または未置換の非環式炭素含有化合物を指す。アルキル基の例には、低級アルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチルまたはイソヘキシル;高級アルキル、例えばn-ヘプチル、n-オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル等;低級アルキレン、例えばエチレン、プロピレン、プロピリン、ブチレン、ブタジエン、ペンテン、n-ヘキセンまたはイソヘキセン;並びに高級アルキレン、例えばn-ヘプテン、n-オクテン、イソオクテン、ノネン、デセン等が含まれる。通常、当業者は、本発明の範囲内である多数の直鎖すなわち、線状及び分枝状アルキル基を熟知している。加えて、アルキル基は1個以上の水素または1個以上のフッ素原子が官能基で置換されている各種置換基をも含有し得る。官能基の例には、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸基等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語官能基は、本明細書中に記載されているポリマーに追加の官能性を付与する基である。換言すると、官能基は疎水基とは異なり、高分子電解質骨格、例えば骨格中の荷電基に結合している基である。例えば、幾つかの実施形態では、官能基はポリマーの結合特性を変化させるためのリガンド、例えばカルボン酸、スルホン酸、スルフェート、第1級アミン、第4級アミン及びジエチルアミノ基であり得る。官能基は特性を変化させたり、またはポリマーに対して追加の所望特性を与え得、例えば刺激応答を変化させたり、ポリマーを第2の刺激に対して応答性とし得る。刺激応答挙動を変化させるための官能基の例には、カルボン酸基pH応答性、ピリジン基pH応答性及びN-イソプロピルアクリルアミド基温度応答が、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語リガンドは、通常、別の実在物に対する特異的結合能力を与える実在物を指す。リガンドの例には、イオン交換基、生物親和性または生物特異的基、疎水基、チオフィリック相互作用基、キレートまたはキレート化基、所謂標的化合物とのπ-π相互作用を有する基、水素結合基及び親水性基が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語凝集は、1つ以上の懸濁状の不溶性または可溶性不純物を除去するための凝集剤例えば、本明細書中に記載されているポリマーの溶液への添加を指す。ポリマーは、典型的な固体-液体分離方法により溶液から除去され得る不溶性凝集物を自然に形成し得る濃度で溶液に添加されなければならない。本明細書中で使用されている用語組成物、溶液またはサンプルは、本明細書中に記載されている1つ以上の刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとする標的分子または所望産物と1つ以上の望ましくない実在物または不純物の混合物を指す。幾つかの実施形態では、サンプルは標的分子または所望産物が分泌される供給材料または細胞培養培地を含む。幾つかの実施形態では、サンプルは1つ以上の不純物例えば、宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、脂質、細胞培養添加物、細胞または細胞破片と一緒に標的分子例えば、治療用タンパク質または抗体を含む。幾つかの実施形態では、サンプルは細胞培養培地に分泌される当該標的分子を含む。幾つかの実施形態では、標的分子を本明細書中に記載されている1つ以上の刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとするサンプルを、該サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させる前に部分的に精製する。部分的精製は、例えばサンプルを1つ以上の精製ステップ、例えば1つ以上の非アフィニティークロマトグラフィーステップにかけることにより達成され得る。標的分子は、1つ以上の不純物を沈殿させるかまたは標的分子を沈殿させることにより1つ以上の望ましくない実在物または不純物から分離され得る。幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、第1組の条件下でそれ自体標的分子または産物例えば、標的タンパク質またはポリペプチドである対象生体分子に結合し、第2組の条件下で、例えばサンプルに刺激を加えて標的分子を沈殿させる。他の実施形態では、対象生体分子は標的分子以外の分子である。換言すると、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーにより結合される対象生体分子は、サンプル中の標的分子と結合させたくない分子であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーは、刺激を加えると1つ以上の宿主細胞タンパク質、DNA、全細胞、細胞破片、ウイルス、エンドトキシン及び/または細胞培養添加物に結合し、沈殿させると考えられる。従って、標的分子例えば、標的タンパク質またはポリペプチドは、本明細書中に記載されているポリマーを用いて所望の標的分子を沈殿させるかまたは所望の標的分子を含有しているサンプル中に存在しているかもしれない1つ以上の望ましくない実在物例えば、1つ以上の不純物を沈殿させることにより精製され得る。本明細書中で使用されている用語沈殿させる、沈殿するまたは沈殿は、結合例えば、対象生体分子との複合体の形態または非結合ポリマーの水性及び/または可溶性状態から非水性及び/または不溶性状態への変化を指す。本明細書中で使用されている用語対象生体分子は、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーにより結合し、沈殿する分子を指す。例えば、対象生体分子は所望の標的分子、例えば当該の所望産物またはポリペプチド例えば、抗体であり得、または所望の標的分子を含有しているサンプルから除去されなければならない望ましくない実在物であり得る。望ましくない実在物には、例えば宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、タンパク質凝集物、細胞培養添加物、ウイルス、エンドトキシン、全細胞及び細胞破片から選択される1つ以上の不純物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で互換可能に使用されている用語標的分子、標的生体分子、所望の標的分子及び所望の標的生体分子は、通常、当該ポリペプチドまたは産物を含有しているサンプル中に存在しているかもしれない1つ以上の望ましくない実在物例えば、1つ以上の不純物から精製または分離したい当該ポリペプチドまたは産物を指す。本明細書中で互換可能に使用されている用語当該タンパク質、標的ポリペプチド、当該ポリペプチド及び標的タンパク質は通常、治療用タンパク質またはポリペプチドを指し、これらには本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとする抗体が含まれるが、これに限定されない。本明細書中で互換可能に使用されている用語ポリペプチドまたはタンパク質は、通常、約10個以上のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、タンパク質またはポリペプチドと一緒にサンプル中に存在している1つ以上の望ましくない実在物からタンパク質またはポリペプチドを分離するために使用される。幾つかの実施形態では、1つ以上の実在物は、精製しようするタンパク質またはポリペプチドと一緒にサンプル中に存在しているかもしれない1つ以上の不純物である。先に検討したように、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、サンプルに刺激を加えると当該タンパク質またはポリペプチドに特異的に結合し、沈殿させる。他の実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、サンプルに刺激を加えると当該タンパク質またはポリペプチド以外の実在物、例えば宿主細胞タンパク質、DNA、ウイルス、全細胞、細胞破片及び細胞培養添加物に結合し、沈殿させる。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて精製しようとするタンパク質またはポリペプチドは哺乳動物タンパク質、例えば治療用タンパク質または治療において使用され得るタンパク質である。タンパク質の例には、例えばレニン;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α-1-アンチトリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子、例えば因子VIIIC、因子IX、組織因子及びフォンウィルブラント因子;抗凝血因子、例えばタンパク質C;心房性ナトリウム利尿ペプチド因子;肺サーファクタント;プラスミノーゲンアクチベーター、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織タイププラスミノーゲンアクチベーターt-PA;ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子-α及び-β;エンケファリナーゼ;ランテス正常T細胞の発現および分泌の活性制御物質;ヒトマクロファージ炎症性タンパク質MIP-1-α;血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン;ミュラー管抑制因子;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;微生物タンパク質、例えばβ-ラクタマーゼ;Dnアーゼ;IgE;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原CTLA、例えばCTLA-4;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子VEGF;ホルモンまたは成長因子に対する受容体;タンパク質AまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3、-4、-5または-6NT-3、NT-4、NT-5またはNT-6、或いは神経成長因子、例えばNGF-β;血小板由来増殖因子PDGF;線維芽細胞増殖因子、例えばα-FGF及びβ-FGF;上皮増殖因子EGF;トランスフォーミング成長因子TGF、例えばTGF-α及びTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ4またはTGF-β5を含めたTGF-β;インスリン様成長因子I及びIIIGF-I及びIGF-Π;des1-3-IGF-I脳IGF-I、インスリン様成長因子結合タンパク質IGFBP;CDタンパク質、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34及びCD40;エリスロポエチン;骨形成誘導因子;イムノトキシン;骨形態形成タンパク質BMP;インターフェロン、例えばインターフェロン-α、-β及び-γ;コロニー刺激因子CSF、例えばM-CSF、GM-CSF及びG-CSF;インターロイキンIL、例えばIL-1~IL-10;スーパーオキシドジムスターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス抗原、例えばAIDSエンベロープの一部;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えばHER2、HER3またはHER4受容体;上にリストしたポリペプチドの断片及び/または変異体が含まれるが、これらに限定されない。更に、幾つかの実施形態では、本発明に従うスマートポリマーを用いて精製されるタンパク質またはポリペプチドは、抗体、その機能性断片または変異体である。幾つかの実施形態では、当該タンパク質は免疫グロブリンのFc領域を含有する組換えタンパク質である。本明細書中で互換可能に使用されている用語免疫グロブリン、Igまたは抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有している2本の重鎖及び2本の軽鎖から構成される基本的4ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化されている。本明細書中で互換可能に使用されている用語一本鎖免疫グロブリンまたは一本鎖抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有している重鎖及び軽鎖から構成される2ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ペプチドリンカーにより安定化されている。用語ドメインは、例えばβプリーツシート及び/または鎖間ジスルフィド結合により安定化されているペプチドループを含む例えば、3~4ペプチドループを含む重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、更に本明細書中で、定常ドメインの場合には各種クラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対欠乏に基づいて、また可変ドメインの場合には各種クラスメンバーのドメイン内の大きな変動に基づいて、定常または可変と称されている。抗体またはポリペプチドドメインはしばしば当業界で抗体またはポリペプチド領域と互換可能に称されている。抗体軽鎖の定常ドメインは軽鎖定常領域、軽鎖定常ドメイン、CL領域またはCLドメインと互換可能に称されている。抗体重鎖の定常ドメインは重鎖定常領域、重鎖定常ドメイン、CH領域またはCHドメインと互換可能に称されている。抗体軽鎖の可変ドメインは軽鎖可変領域、軽鎖可変ドメイン、VL領域またはVLドメインと互換可能に称されている。抗体重鎖の可変ドメインは重鎖可変領域、重鎖可変ドメイン、VH領域またはVHドメインと互換可能に称されている。免疫グロブリンまたは抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、モノマーまたはポリマー形態で存在し得る。例えば、IgM抗体はペンタマー形態で存在し、及び/またはIgA抗体は、モノマー、ダイマーまたはマルチマー形態で存在する。リガンド特異的結合ドメインを保持しているかまたはリガンド特異的結合ドメインを含むように修飾されている限り、免疫グロブリンまたは抗体には多重特異性抗体例えば、二重特異性抗体及び抗体断片も含まれ得る。用語断片は、インタクト、すなわち完全抗体、または抗体鎖より少数のアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片はインタクト、すなわち完全抗体、または抗体鎖を化学的または酵素的に処理することにより得ることができる。断片は組換え手段によっても得ることができる。組換え産生したとき、断片は、単独で、または融合タンパク質と呼ばれる大きなタンパク質の一部として発現され得る。断片の例には、Fab、Fab’、Fab’2、Fc及び/またはFv断片が含まれる。融合タンパク質の例には、Fc融合タンパク質が含まれる。通常、免疫グロブリンまたは抗体は、当該抗原に向いている。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、抗体を疾患または障害を患っている哺乳動物に対して投与するとその哺乳動物において治療効果が生じ得る。しかしながら、非ポリペプチド例えば、腫瘍関連糖脂質抗原;米国特許No.5,091,178を参照されたいに対する抗体も考えられる。抗原がポリペプチドの場合には、膜貫通分子例えば、受容体またはリガンド例えば、増殖因子であり得る。本明細書中で使用されている用語モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、微量で存在するかもしれない考えられる天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一抗原部位に向いている。更に、典型的には、各種決定基エピトープに対して異なる抗体を含んでいる一般的なポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に向いている。修飾語モノクローナルは、抗体の特性を抗体の実質的な均質な集団から得られるものとして示すが、特別の方法により抗体を産生しなければならないとは見なされない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体は、Kohlerら,Nature,256:4951975が最初に記載したハイブリドーマ方法により作成され得、または組換えDNA方法例えば、米国特許No.4,816,567を参照されたいにより作成され得る。モノクローナル抗体は、例えばClacksonら,Nature,352:624-6281991及びMarksら,J.Mol.Biol.,222:581-5971991に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。モノクローナル抗体は、更に、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖及び/または軽鎖の一部が特定種に由来するか或いは特定抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りが別の種に由来するか或いは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体免疫グロブリン、並びに前記抗体の断片が含まれる米国特許No.4,816,567;及びMorrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-68551984。本明細書中で使用されているとき、用語超可変領域は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補性決定領域またはCDR由来のアミノ酸残基すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基24-34LI、50-56L2及び89-97L3、及び重鎖可変ドメイン中の残基31-35HI、50-65H2及び95-102H3;Kabatら,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991、及び/または超可変ループ由来のアミノ酸残基すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基26-32L1、50-52L2及び91-96L3、及び重鎖可変ドメイン中の残基26-32H1、53-55H2及び96-101H3;ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.,196:901-9171987を含む。フレームワークまたはFR残基は、本明細書中に定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。非ヒト例えば、マウス抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、家兔または非ヒト霊長類のような非ヒト種ドナー抗体由来の超可変領域残基で置換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域FR残基が対応する非ヒト残基で置換されている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体またはドナー抗体中に存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾により抗体性能が更に純化される。通常、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、FR領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域Fc、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域Fcの少なくとも一部をも含む。更なる詳細については、Jonesら,Nature,321:522-5251986;Riechmannら,Nature,332:323-3291988;及びPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-5961992を参照されたい。幾つかの実施形態では、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて分離または精製される抗体は、治療用抗体である。治療用抗体の例には、例えばトラスツズマブHERCEPTIN商標;Genentech,Inc.,Carterら1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289;米国特許No.5,725,856;抗CD20抗体、例えばキメラ抗CD20C2B8;米国特許No.5,736,137;リツキシマブRITUXAN商標、オクレリズマブ、2H7抗体のキメラまたはヒト化変異体米国特許No.5,721,108;WO04/056312またはトシツモマブBEXXAR商標;抗IL-8StJohnら1993,Chest,103:932及びWO95/23865;ヒト化及び/またはアフィニティー成熟した抗VEGF抗体例えば、ヒト化抗VEGF抗体huA4.6.1ベバシズマブAVASTIN商標,Genentech,Inc.;Kimら1992,GrowthFactors,7:53-64;WO96/30046;WO98/45331を含めた抗VEGF抗体;抗PSCA抗体WO01/40309;S2C6及びそのヒト化変異体を含めた抗CD40抗体WO00/75348;抗CD11a米国特許No.5,622,700;WO98/23761;Steppeら1991,TransplantIntl.,4:3-7;Hourmantら1994,Transplantation,58:377-380;抗IgEPrestaら1993,J.Immunol.,151:2623-2632;WO95/19181;抗CD18米国特許No.5,622,700;WO97/26912;E25、E26及びE27を含めた抗IgE米国特許No.5,714,338;米国特許No.5,091,313;WO93/04173;米国特許No.5,714,338;抗Apo-2受容体抗体WO98/51793;cA2REMICADE商標、CDP571及びMAK-195を含めた抗TNF-α抗体米国特許No.5,672,347;Lorenzら1996,J.Immunol.,1564:1646-1653;Dhainautら1995,Crit.CareMed.,239:1461-1469;抗組織因子TFEP0420937B1;抗ヒトα4β7インテグリンWO98/06248;抗EGFRキメラ化またはヒト化225抗体WO96/40210;抗CD3抗体、例えばOKT3米国特許No.4,515,893;抗CD25または抗tac抗体、例えばCHI-621SIMULECT商標及びZENAPAX商標米国特許No.5,693,762;抗CD4抗体、例えばcM-7412抗体Choyら1996,ArthritisRheum.,391:52-56;抗CD52抗体、例えばCAMPATH-1HRiechmannら1988,Nature,332:323-337;抗Fc受容体抗体、例えばFcγRIに対するM22抗体Grazianoら1995,J.Immunol.,15510:4996-5002;抗癌胎児性抗原CEA抗体、例えばhMN-14Sharkeyら1995,CancerRes.,5523Suppl:5935s-5945s;huBrE-3、hu-Mc3及びCHL6を含めた乳房上皮細胞に対する抗体Cerianiら1995,CancerRes.,5523:5852s-5856s;及びRichmanら1995,CancerRes.,5523Supp:5916s-5920s;結腸癌細胞に結合する抗体、例えばC242Littonら1996,Eur.J.Immunol.,261:1-9;抗CD38抗体、例えばAT13/5Ellisら1995,J.Immunol.,1552:925-937;抗CD33抗体、例えばHuM195Jurcieら1995,CancerRes.,5523Suppl:5908s-5910s、及びCMA-676またはCDP771;抗CD22抗体、例えばLL2またはリンホシドJuweidら1995,CancerRes.,5523Suppl:5899s-5907s;抗EpCAM抗体、例えば17-1APANOREX商標;抗GpIIb/IIIa抗体、例えばアブシキマブまたはc7E3FabREOPRO商標;抗RSV抗体、例えばMEDI-493SYNAGIS商標;抗CMV抗体、例えばPROTOVIR商標;抗HIV抗体、例えばPRO542;抗肝炎抗体、例えば抗HepB抗体OSTAVIR商標;抗CA125抗体OvaRex;抗イディオタイプGD3エピトープ抗体BEC2;抗αvβ3抗体VITAXIN商標;抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばch-G250;ING-1;抗ヒト17-1A抗体3622W94;抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体A33;GD3ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体R24;抗ヒト扁平上皮癌SF-25;並びに抗ヒト白血球抗原HLA抗体、例えばSmartID10及び抗HLADR抗体OncolymLym-1が含まれる。本明細書中で互換可能に使用されている用語汚染物質、不純物及び破片は、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて1つ以上の異物または不適切な物質から分離しようとする当該タンパク質またはポリペプチド例えば、抗体を含有しているサンプル中に存在するかもしれない生物学的マクロ分子例えば、DNA、RNA、1つ以上の宿主細胞タンパク質HCPまたはCHOP、エンドトキシン、ウイルス、脂質及び1つ以上の添加物を含めた異物または不適切な物質を指す。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、当該タンパク質またはポリペプチド及び1つ以上の不純物を含有しているサンプルから当該タンパク質またはポリペプチドに結合し、沈殿させる。他の実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、1つ以上の不純物に結合し、沈殿させ、これにより1つ以上の不純物から当該ポリペプチドまたはタンパク質を分離する。本明細書中で互換可能に使用されている用語チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質及びCHOPは、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞培養物由来の宿主細胞タンパク質HCPの混合物を指す。HCPまたはCHOPは通常、細胞培養培地またはライゼート例えば、当該タンパク質またはポリペプチド例えば、CHOP細胞中で発現する抗体またはイムノアドヘシンを含有している収集した細胞培養液中に不純物として存在している。通常、当該タンパク質を含む混合物中に存在するCHOPの量は当該タンパク質の純度の目安を与える。典型的には、タンパク質混合物中のCHOPの量は混合物中の当該タンパク質の量に対して百万分率で表示される。宿主細胞が別の哺乳動物細胞型、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞の場合、HCPは宿主細胞のライゼート中に存在する標的タンパク質以外のタンパク質を指すと理解されたい。本明細書中で使用されている用語細胞培養添加物は、細胞培養または発酵プロセスを促進または改善するために細胞培養プロセスに添加される分子例えば、非タンパク質添加物を指す。本発明に従う幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーは、1つ以上の細胞培養添加物に結合し、沈殿させる。細胞培養添加物の例には、消泡剤、抗生物質、染料及び栄養素が含まれる。本明細書中で互換可能に使用されている用語百万分率またはppmは、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて精製した所望の標的分子例えば、標的タンパク質または抗体の純度の目安を指す。従って、この目安は、精製プロセス後に存在する標的分子の量を評価するかまたは所望しない実在物の量を評価するために使用され得る。幾つかの実施形態では、単位ppmは、ミリグラム/ミリリッター単位での当該タンパク質のナノグラム/ミリリッター単位での溶液中の不純物例えば、HCPまたはCHOPすなわち、CHOPppm=CHOPng/ml/当該タンパク質mg/mlの量を指す。タンパク質が例えば、凍結乾燥により乾燥されている場合には、ppmはCHOPng/当該タンパク質mgを指す。用語単離する、精製する及び分離するは、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて標的分子及び1つ以上の不純物を含有している組成物またはサンプルから標的分子例えば、当該ポリペプチドまたはタンパク質を精製する状況で本明細書中で互換可能に使用されている。幾つかの実施形態では、サンプル中の標的分子の純度は、本明細書中に記載されているように刺激応答性ポリマーを用いることによりサンプルから1つ以上の不純物を完全にまたは部分的に除去することにより上昇する。別の実施形態では、サンプル中の標的分子の純度はサンプル中の1つ以上の不純物から標的分子を沈殿除去することにより上昇する。幾つかの実施形態では、精製プロセスは、更に1つ以上のクロマトグラフィーステップを使用する。典型的には、これらのステップは、本発明に従う刺激応答性ポリマーを用いて1つ以上の所望しない実在物から標的分子を分離した後所要により実施され得る。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載されている刺激応答性ポリマーを用いて当該ポリペプチドまたはタンパク質を単離、分離または精製するための精製ステップは、均質なまたは純粋な組成物またはサンプルを生ずる全精製プロセスの一部であり得る。この用語は、当該タンパク質を含んでいる組成物中に100ppm未満のHCP、或いは90ppm未満、80ppm未満、70ppm未満、60ppm未満、50ppm未満、40ppm未満、30ppm未満、20ppm未満、10ppm未満、5ppm未満または3ppm未満しかHCPを含んでいない組成物またはサンプルを指すために使用される。本明細書中で使用されている用語清澄化ステップは、通常、生体分子の精製における1つ以上の初期ステップを指す。清澄化ステップは、通常、例えば遠心及びデブス濾過、沈殿、凝集及び沈降の1つまたはその各種組合せを含めた1つ以上のステップを用いる細胞及び/または細胞破片の除去を含む。清澄化ステップは通常、1つ以上の望ましくない実在物の除去を含み、典型的には所望の標的分子の捕捉を含むステップの前に実施される。清澄化の別の重要な態様は、後に精製プロセスにおいて無菌フィルターを汚す恐れがあるサンプル中の可溶性及び不溶性成分を除去し、これにより全精製プロセスをより経済的とすることである。幾つかの実施形態では、本明細書中の実施例に記載されているより低い濁度/不純物及び下流フィルターのより多い処理量により立証されるように、本発明は、各種精製スキームにおいて一般に使用されている慣用の清澄化ステップ以上の改善を提供する。本明細書中で使用されている用語クロマトグラフィーは、当該アナライト例えば、標的分子を混合物中に存在する他の分子から分離する任意の種類の技術を指す。通常、当該アナライトは、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定媒体を介して移動する速度、または結合及び溶離プロセスの差の結果として他の分子から分離される。用語クロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー媒体は本明細書中で互換可能に使用されており、当該アナライト例えば、標的分子を混合物中に存在している他の分子から分離する任意の種類の相例えば、固体相を指す。通常、当該アナライトは、混合物の個々の分子が移動相の影響下で固定固体相を介して移動する速度、または結合及び溶離プロセスの差の結果として他の分子から分離される。各種タイプのクロマトグラフィー媒体の例には、例えばカチオン交換樹脂、アフィニティー樹脂、アニオン交換樹脂、アニオン交換膜、疎水性相互作用樹脂及びイオン交換モノリスが含まれる。本明細書中で使用されている用語捕捉ステップは、通常、標的分子を刺激応答性ポリマーまたはクロマトグラフィー樹脂と結合させて、標的分子及びポリマーまたは樹脂の沈殿を含有する固体相を生じさせるために使用される方法を指す。典型的には、標的分子はその後標的分子を固体相から除去して標的分子を1つ以上の不純物から分離させる溶離ステップを用いて回収される。各種実施形態では、捕捉ステップはクロマトグラフィー媒体例えば、樹脂、膜またはモノリスまたはポリマー刺激応答性ポリマー、高分子電解質、または標的分子を結合するポリマーを用いて実施され得る。本明細書中で使用されている用語塩は、酸及び塩基の相互作用により形成される化合物を指す。本明細書中に記載されている方法において使用される各種バッファー中で使用され得る各種塩には、酢酸塩例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸塩例えば、クエン酸ナトリウム塩、塩化物例えば、塩化ナトリウム、硫酸塩例えば、硫酸ナトリウムまたはカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で互換可能に使用されている用語多価塩または多価イオンは、2つ以上の電荷または電荷含有基を含有している化合物を指す。幾つかの実施形態では、多価塩は刺激として使用され、その結果塩刺激に対して応答性のポリマーの溶解度が変化し、通常、ポリマーが溶液から沈殿する。使用され得る多価塩の例には、例えばリン酸塩及び硫酸塩が含まれる。例えばクエン酸塩のような使用され得る対イオンも本発明に包含される。本明細書中に記載されている刺激として使用するとき、多価塩は刺激応答性ポリマーと共に対象生体分子を含有しているサンプルに対して独立型試薬として添加され得る。或いは、塩を基質、例えば膜に付着させてもよい。特定実施形態では、膜を多価塩含有ポリマーコーティングであるポリビニルリン酸塩で修飾させる。本明細書中に記載されているように刺激として使用される多価イオンは他の刺激例えば、温度及びpHに比べてタンパク質構造及び安定性を余り害さないと考えられる。幾つかの実施形態では、多価塩は1つ以上の実在物と相互作用して、会合種または複合体を形成することができる。従って、前記塩は複合体形成塩とも称され得る。複合体形成塩及びそれより生ずる複合体の非限定例は、多価カチオン例えば、Cu2及びCa2及びエチレンジアミンテトラ酢酸塩中に存在するカルボン酸基とのその複合体;多価アニオン例えば、リン酸塩PO43-及びクエン酸塩及びポリアリルアミン中に存在する第1級アミンとのその複合体;並びにイオン会合性塩例えば、過塩素酸塩、ドデシル硫酸塩及びドデシルベンゼンスルホン酸塩及びポリアリルアミン中に存在する第1級アミンとのその複合体である。イオン会合性塩は、一価カチオンまたはアニオンのかさ高の電荷分散塩である。幾つかの実施形態では、イオン会合性塩は刺激として使用され、その結果塩刺激に対して応答性のポリマーの溶解度が変化して、ポリマーが溶液から沈殿する。使用され得イオン会合性塩の例には、例えば過塩素酸塩、ドデシル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、テトラフェニルホウ酸塩及びヘキサニトロジフェノールアミンが含まれる。本明細書中で使用されている用語溶媒は、通常、1つ以上の他の物質を溶解または分散させて、溶液を得ることができる液体物質を指す。溶媒には水性及び有機溶媒が含まれ、有用な有機溶媒には、非極性溶媒、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール及び2,2-チオジグリコールが含まれる。本明細書中で互換可能に使用されている用語ポリペプチドのpIまたは等電点は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と釣り合うpHを指す。pIは、ポリペプチドの結合炭水化物のアミノ酸残基またはシアル酸残基の正味電荷から計算され得、または等電点電気泳動により測定され得る。限定的と解釈されるべきでない以下の実施例により本発明を更に説明する。本明細書を通して引用されているすべての文献、特許及び公開特許出願の内容及び図面は、参照により本明細書に組み込まれる。[実施例1]清澄化されていない非発現細胞培養液CCFの作成代表的実験において、非発現チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株由来の細胞を10LのバイオリアクターNewBrunswickScientificにおいて10×106細胞/mLの密度まで増殖させ、64生存度で収集した。IgGを1.3g/Lの濃度までスパイクした。宿主細胞タンパク質HCPのレベルは、ELISACygnusCM015を用いて8300ng/mlであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のpHは7.2であった。[実施例2]疎水基で修飾させた高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーの合成代表的実験において、疎水基で修飾させたポリアリルアミンBzMPAA骨格を含む刺激応答性ポリマーを合成した。疎水基で修飾させたカチオン性高分子電解質骨格を含むポリマーを40wt線状ポリアリルアミンNITTOBO,150kD10.3g、水酸化リチウム2g及び50水/メタノール20mlの混合物を用いて合成し、十分に混合されるまで攪拌した。ベンジルクロリド2.1mlをメタノール15ml中に含む溶液をポリマー溶液に添加した。生じた混合物を60°Cで14時間加熱した。溶媒との熱力学的非相容性の結果として、ベンジル修飾ポリアリルアミンは反応期間の終わりに沈殿した。沈殿をアセトン30mLで洗浄し、1M酢酸400mL中に再溶解した。ポリマーをpH7の50mMリン酸ナトリウムで沈殿させることにより更に精製した。図1は、ポリアリルアミン高分子電解質ポリマーの疎水基、すなわちベンジルクロリドとの反応の概略を示す。[実施例3]ベンジル修飾ポリアリルアミンBzMPAAの溶液の製造室温で16時間連続攪拌しながら実施例2からのポリマー10gを1M酢酸90g中に溶解させることにより10BzMPAA溶液を製造した。生じた粘性溶液はわずかに曇っていた。[実施例4]非発現細胞培養液CCFの清澄化における異なる濃度のベンジル修飾ポリアリルアミンBzMPAAの使用実施例1からの清澄化されていない細胞培養液CCFの5mLサンプルに0.2g,0.3g,0.4g及び0.5gの量の実施例3からのBzMPAAを添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5~5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2Mトリス塩基を用いてpH7に調節した。ポリマー-標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム0.043gを添加した。分散状の固体懸濁液形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集した。各サンプルからの上清を0.2umDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表1に詳記する。[実施例5]BzMPAAを用いる非発現CCFの清澄化における異なるpH値の使用実施例1からの清澄化されていない細胞培養液5mLを含有している4つのサンプルに実施例3からのBzMPAA各0.4gを添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5~5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2Mトリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー-標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム0.043gを添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集した。次いで、各サンプルからの上清を0.2umDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表1に詳記する。この表にはスパイクした非発現CHOCCFのBzMPAA精製が記載されている。[実施例6]CCFの清澄化におけるBzMPAAの使用により生ずる純度レベルについてのアッセイ実施例4及び実施例5からのサンプルをアフィニティープロティンA分析用HPLCアッセイを用いてIgG回収についてアッセイした。或いは、溶液中のIgGのレベルを分析用プロティンAカラムを用いて測定した。具体的には、PorosA/20プロティンAカラムAppliedBiosystemsをPBSで平衡化し、0.1MリシンpH2で溶離し、6MグアニジンHClで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルIgGSeracareを用いてIgG標準曲線を作成した。サンプルを注入し、IgG濃度を標準曲線から求めた。実施例4及び実施例5からのサンプルを市販の酵素結合免疫吸着アッセイELISAキットCygnusTechnologiesInc.,ノースカロライナ州サウスポート,CygnusCM015を用いて宿主細胞タンパク質HCPについてアッセイした。実施例4及び実施例5からのサンプルを標準ピコグリーンアッセイ及び標準としてのニシン精液DNAを用いてDNAについてもアッセイした。[実施例7]清澄化されていない細胞培養液CCFの作成発現チャイニーズハムスター卵巣CHO-DG44細胞株由来の細胞を10LのバイオリアクターNewBrunswickScientificにおいて10×106細胞/mlの密度まで増殖させ、30生存度で収集した。モノクローナル抗体MAb価は0.8g/Lであると測定された。宿主細胞タンパク質HCPのレベルはELISAアッセイCygnus3GELISAを用いて200,000ng/mlであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のpHはpH6.9であった。[実施例8]20ベンジル修飾ポリアリルアミンBzMPAAの合成ポリアリルアミンPAANittobo,150kD;40wt./wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド1.38g,1.25mLを一度に添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60°Cに加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液40mL中で攪拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO43.48gを撹拌しながら添加し、溶液のpHを約6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例9]40ベンジル修飾ポリアリルアミンBzMPAAの合成ポリアリルアミンPAANittobo,150kD;40wt/wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド2.30g,2.09mLを添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60°Cに加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液40mL中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO43.48gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例10]60ベンジル修飾ポリアリルアミンBzMPAAの合成ポリアリルアミンPAANITTOBO,150kD;40wt/wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド3.23g,2.94mLを添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60°Cに加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液40mL中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO43.48gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例11]ジフェニル修飾ポリアリルアミンDPhMPAAの合成例示的実験において、高分子電解質ポリマー骨格のポリアリルアミンをジフェニル基で修飾させた。簡単に説明すると、ポリアリルアミンPAANittobo,150kD;40wt/wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、クロロジフェニルメタン3.68g,3.23mLを添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60°Cに加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、1M水性AcOH溶液40mL中で撹拌した。ジフェニルクロロメタンの加水分解により生じた残りの白色固体を濾別した。次いで、溶液をH2Oで400mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO43.48gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例12]6ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミンDClBzMPAAの合成別の実験において、ポリアリルアミンPAANITTOBO,150kD;40wt/wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、3,4-ジクロロベンジルクロリド1.71g,1.21mLを添加し、混合物を室温で一晩17時間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O100mlで希釈した後、pHをリン酸で中性pH7.0に調節した。沈殿したポリマーを濾別し、H2Oで洗浄し、真空オーブン中60°Cで一晩乾燥した。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例13]10ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミンDClBzMPAAの合成別の代表的実験において、10ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミンPAANITTOBO,150kD;40wt/wt.5gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム1.68g1.2当量/モノマーを50/50H2O/1,2-ジメトキシエタンDME40mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、3,4-ジクロロベンジルクロリド0.57g,0.40mLを添加し、室温で数分間攪拌した後、60°Cに一晩21時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60~70°Cで除去した後、残りの溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液20mL中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO41.74gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例14]33クロロベンジル修飾ポリアリルアミンDClBzMPAAの合成別の代表的実験において、33クロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミンPAANITTOBO,150kD;40wt/wt.5gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーを50/50H2O/1,2-ジメトキシエタンDME40mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4-クロロベンジルクロリド1.48gを添加し、室温で数分間攪拌した後、60°Cに一晩21時間加熱した。翌日、DMEを真空下60~70°Cで蒸発させ、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液20mL中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO41.74gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例15]13フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンDClBzMPAAの合成別の実験において、13フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミンPAANittobo,150kD;40wt/wt.4.7gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーを50/50H2O/1,2-ジメトキシエタンDME40mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4-フェニルベンジルクロリド1gを添加し、混合物を55°Cで一晩20時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60~70°Cで除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液40mL中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO41.74gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7.0に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例16]27フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンDClBzMPAAの合成別の実験において、27フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミンPAANittobo,150kD;40wt/wt.2.8gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム3.34g1.2当量/モノマーを50/50H2O/1,2-ジメトキシエタンDME40mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4-フェニルベンジルクロリド1gを添加し、混合物を55°Cで一晩20時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60~70°Cで除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、1M水性AcOH溶液32mL中で撹拌し、完全に溶解するまで一晩撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO41.74gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7.0に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50~60°Cで一晩乾燥した。[実施例17]異なるポリマー濃度でのCCFの清澄化例示的実験において、実施例8~16に上記されている刺激応答性ポリマーをCCFの清澄化について評価した。CCFの作成は実施例7に上記されている。清澄化されていない細胞培養液の5mLサンプルに0.2g,0.3g,0.4g及び0.5gの量の実施例8~16からのポリマー溶液を添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5~5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2Mトリス塩基を用いてpH7に調節した。ポリマー-標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩0.043gを添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に詳記する。[実施例18]異なるpHでのポリマーを用いるCCFの清澄化別の実験において、実施例7に記載されている清澄化されていない細胞培養液5mLを含有している4つのサンプルに実施例8~16からのポリマー溶液各0.4gを添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5~5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2Mトリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー-標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩0.043gを添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に記載する。[実施例19]異なるレベルの多価イオン刺激に対して応答性のポリマーを用いるCCFの清澄化別の実験において、実施例8~15に記載されているポリマーを異なる量の多価イオン刺激を用いてCCFの清澄化について評価した。具体的には、実施例7に記載されている清澄化されていない細胞培養液5mLを含有している4つのサンプルに実施例8~15からのポリマー溶液各0.4gを添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5~5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2Mトリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー-標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液に0.031~0.043g50~70mMの最終リン酸塩濃度の範囲のリン酸水素二カリウム塩を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に記載する。[実施例20]慣用されている凝集剤を用いるCCFの清澄化別の実験において、比較データを得る試みにおいて慣用されている凝集剤のキトサンをCCFの清澄化のために使用した。ポリマー溶液2wtはRiske,F.ら;JournalofBiotechnology,1282007,813-823に記載されている手順に従って作成した。ポリマー溶液を量及びpH条件を変えて実施例7からのCCFに添加した。このポリマーの場合刺激は使用しなかった。生じた精製を表2に記載する。[実施例21]CCFを刺激応答性ポリマーを用いて沈殿させた後の純度レベルの評価代表的実験において、実施例8~16に記載されているポリマーをアフィニティープロティンA分析用HPLCアッセイを用いてIgG回収についてアッセイした。或いは、溶液中のIgGレベルを分析用プロティンAカラムを用いて調べた。PorosA/20プロティンAカラムAppliedBiosystemsをPBSで平衡化し、0.1MリシンpH2で溶離し、6MグアニジンHClで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルIgGSeracareを用いてIgG標準曲線を作成した。サンプルを注入し、IgG濃度を標準曲線から求めた。実施例8~16からのサンプルを市販の酵素結合免疫吸着アッセイELISAキットCygnusTechnologiesInc.,ノースカロライナ州サウスポート,CygnusCM015を用いて宿主細胞タンパク質HCPについてアッセイした。実施例8~16からのサンプルを標準ピコグリーンアッセイ及び標準としてのニシン精液DNAを用いてDNAについてもアッセイした。細胞及び細胞破片の減少を評価するために、4000rpmで1分間遠心した後濁度を調べた。[実施例22]ベンジル修飾ポリエチレンイミンBzMPEIの合成別の実験において、ベンジル修飾ポリエチレンイミン刺激応答性ポリマーを次のように合成した。PEIAldrich,750kD;50wt./wt.10gを100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム1.2当量/モノマー~3.34gをH2O25mL中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加する。次いで、ベンジルクロリド2.30g,2.09mLを添加し、室温で数分間攪拌した後、60°Cで一晩17時間加熱する。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去する。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M水性AcOH溶液20mL中で撹拌する。次いで、溶液をH2Oで400mL1ポリマー溶液の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウムK2HPO43.48gを撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させる。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50~60°Cで一晩乾燥する。[実施例23]ベンジル修飾ポリビニルアミンBzMPVAの合成代表実施例において、ベンジル修飾ポリビニルアミンを次のように合成した。ポリビニルアミンPVA塩酸塩MW=83,500,AirProductsandChemicalsInc.32gをガラス容器に秤量して入れた。H2O200mLを添加し、50NaOH26gを添加し、十分混合されるまで撹拌する。ベンジルクロリド23.5gを添加し、70°Cで16時間混合する。反応が進行するにつれて、固体白色塊が上清から分離する。固体を沈降させ、デカントにより上清を捨てる。固体を3酢酸350mL中に一晩溶解する。H2O360mLを添加し、溶液が均質になるまで16時間混合する。全容量を脱イオンDIH2Oで3.2Lにすることにより1w/v溶液まで希釈する。ポリマーの沈殿を開始するためにリン酸ナトリウムを50mMの濃度まで添加する。pH6.8に達するまで1MNaOHを添加して、追加的にポリマーを沈殿させる。乾燥ケーキを濾過し、上清を捨てる。固体を70°Cで一晩乾燥する。5w/v溶液を製造するために均質溶液が生ずるまで3酢酸中に溶解する。[実施例24]刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較それぞれ0.2wt及び0.4の最終ポリマー濃度とするように水性溶液にポリアリルアミンPAA,Nittobo,150kD;40wt./wt.及び実施例10からのポリマーBz-MPAAを添加した。リン酸水素カリウム塩を刺激として使用し、PAA及び実施例10のポリマー溶液に異なる量で添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表3に示す。[実施例25]刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較それぞれ0.2重量及び0.4重量の最終ポリマー濃度とするように水性溶液に非修飾ポリマーポリアリルアミンPAA,Nittobo,150kD;40wt/wt.、ポリエチレンイミンPEI,Aldrich,750kD;50wt/wt.、ポリビニルアミンポリビニルアミンPVA塩酸塩,MW=83,500,AirProductsandChemicalsInc.、並びに実施例10からの修飾ポリマーBz-MPAA、実施例22からの修飾ポリマーBzMPEI及び実施例23からの修飾ポリマーBzMPVAを添加した。リン酸水素カリウム150mMを刺激として使用し、0.4ポリマー溶液の各々に添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表4に示す。[実施例26]ヘキサン酸及びtert-ブチル修飾ポリアリルアミンHC-t-BuMPAAの合成40wt線状ポリマーポリアリルアミン150kDa,NITTOBO10ml及び水酸化ナトリウム1M30mlを含む溶液中に6-ブロモヘキサン酸3.49gを溶解した。混合物をT=50°Cで18時間反応させ、生成物を水和ゲルとして沈殿させた。沈殿を100mg/ml水酸化リチウム溶液中に溶解し、tert-ブチルグリシジルエーテル2.5mlを含有するメタノール10mlと混合した。次いで、混合物をT=50°Cで18時間反応させた。ポリマー溶液を3.5kda分子量カットオフ透析チューブを用いて脱イオンDI水に対する示量透析3日間により精製した。ポリマー溶液の最終濃度は7.2wtであった。合成反応の概略を図2に示す。[実施例27]トリス緩衝液中に溶解したときのヘキサン酸及びtert-ブチル修飾ポリアリルアミンHC-t-BuMPAAの多価刺激に対する塩化ナトリウムの影響0、0.15または0.5M塩化ナトリウムを含有する25mMリン酸ナトリウム10mlに実施例26からのHC-t-BuMPAA600μlを添加した。溶液の最終pHは11.6であった。溶液を3M酢酸を用いて滴定し、各添加後に溶液の濁度を記録した。図3に示すように、リン酸ナトリウムに加えて塩化ナトリウムを添加することにより、相転移が生ずるpH応答性の変化が観察された。[実施例28]異なるポリマー濃度でのポリマーHC-t-BuMPAAを用いるCCFの清澄化代表的実験において、清澄化されていないCCFを本発明に従うポリマーを用いて次のように清澄化した。25mMリン酸ナトリウムを含有している実施例1からの清澄化されていない細胞培養液5mlに実施例26からのHC-t-BuMPAA178、356または534μlを添加し、3M酢酸25μlを用いてpH8.7に調節した。ポリマーを添加した後、溶液の最終pHを3M酢酸を用いて7.2に調節すると、ポリマー-細胞複合体が沈殿した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を更に5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心4000rpmで1分間により収集し、上清を0.2μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。使用したポリマーの濃度に関係なく、プロセスによりMabが100回収された。[実施例29]モノマーからのポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーの合成第1級アミンを含有する反復単位を含む刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。脱イオン水165g及びN-ビニルホルムアミドNVFSIGMA-ALDRICH,9822.5gを250mlの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びN2ディップスティックを備えた。N2をパージしながら溶液を0.5時間攪拌した後、連続的にパージしながら更に0.5時間かけて45°Cに加熱した。2,2’-アゾビス2-アミドプロパン二塩酸塩ABAPAldrich0.288gを脱イオン水10mlに添加することにより開始剤溶液を製造し、溶解した。250mlの丸底フラスコに開始剤溶液をN2雰囲気下で添加した。窒素下激しく攪拌しながら、溶液を55°Cに1時間加熱した後、65°Cで2時間加熱し、更に75°Cで1時間加熱した。粘性の均質溶液が得られ、室温まで冷却した。粘度をブルックフィールド粘度DV-IIPro粘度計設定100RPM,45トルク,スピンドル34により測定した。生じた溶液の粘度は278~350センチポイズcPであった。溶液を500mlのフラスコに移し、H2O330mlで希釈し、50NaOH40gを攪拌しながら添加した。溶液を85°Cで8時間加熱した。加水分解したポリマーに2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加し、リン酸塩イオンを添加したときの溶液からの白色固体の沈殿を観察することにより、小サンプルのリン酸塩刺激に対する感受性を試験した。pHが約2に達するまで加水分解したポリマー溶液に25HClを1滴ずつ添加した。溶液を一晩激しく攪拌し、均質な黄色溶液を得た。この溶液に攪拌しながら4モルNaOH100mlをイソプロピルアルコール500mlと一緒に添加した。2モルリン酸ナトリウム100mlを添加することによりポリマーを単離し、固体を真空濾過し、脱イオン水で洗浄した。固体ポリマーを真空オーブン中65°Cで一晩乾燥した。部分的に乾燥したポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕し、更に真空オーブン中65°C24時間乾燥した。最後に、40.7gの乾燥粉末を回収し、1モル酢酸中に5w/wの最終濃度まで溶解した。ポリビニルアミン合成プロセスの概略を図4に示す。[実施例30]一連の疎水性修飾させたポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーの合成実施例29から合成したPVAを用いて、3つの別々の疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。実施例29からの5PVA溶液100mlを3つの500mlのガラスジャーの各々に入れ、ジャー1、2及び3のラベルを付けた。3つのジャーの各々に、4モルNaOH100gを攪拌しながら添加した。次いで、各ジャーに1-プロパノール50gを補助溶媒として添加し、溶液を攪拌した後、ジャー1、2及び3にそれぞれ0.74g、1.47g及び2.94gのベンジルクロリドを添加した。3つのジャーを60°Cで16時間加熱した。反応溶液の容量を脱イオン水で500mlとし、25HClを用いてpHを8に調節し、2モルリン酸ナトリウム100gを添加することにより、生じたポリマーの各々を個々の反応溶液から単離した。リン酸塩イオンを添加したら、固体沈殿を真空濾過により収集した。各反応からの固体を個別に脱イオン水で洗浄し、1モル酢酸300ml中に溶解した。個々の溶液をpH7.4に調節し、2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加してポリマーを沈殿し、生じた固体を濾過し、固体を水及びイソプロピルアルコールで順次洗浄した後、真空オーブン中65°Cで2日間乾燥することにより、ポリマーを更に精製した。乾燥ポリマーの各サンプルを液体窒素を用いて凍結し、微粉末に粉砕した。回収した乾燥ポリマーの塊はジャー1、2及び3のそれぞれにつき1.44、2.12及び2.47gであった。個々のポリマーの各々を1モル酢酸中に溶解して2溶液とした。[実施例31]ポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーを製造するための超高分子量ポリN-ビニルアセトアミドの加水分解によるアミンの脱保護別の例示的実験例では、超高分子量刺激応答性ポリマーを次のように製造した。超高分子量ポリマーは通常、1000KDa以上の分子量を有するポリマーを指す。第1級アミンを含有する反復単位から構成される刺激応答性ポリマーを次のように製造した。2Lのガラスジャーにおいて、4,060kDaの平均分子量を有するポリN-ビニルアセトアミド線状ホモポリマーPOLYSCIENCES,INC.40gを16時間激しく撹拌しながら脱イオン水0.8L中に溶解した。この溶液に濃HCl140gを連続撹拌しながら1時間かけて添加した。ジャーに軽く蓋を被せ、溶液を混合するために断続的に回転させながら溶液を99°Cに5日間加熱した。5日間加熱した後、溶液を室温まで冷却し、全容量を脱イオン水で4リッターに調節した。溶液を激しく攪拌しながら8モルNaOHを用いてpH7に調節した。更なる沈殿が観察されないまで、加水分解された生成物を2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加して沈殿させた。白色沈殿を脱イオン水で洗浄し、余分の水を除去するためにプレスした。回収したポリマーを真空オーブン中65°Cで2日間乾燥させた。乾燥させたポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕した。回収した乾燥した塊は42.5gであった。乾燥粉末を1モル酢酸及び0.08HCl中に溶解させることにより2溶液を製造した。生じた溶液をリン酸塩またはクエン酸塩刺激に対する応答について出発物質ポリN-ビニルアセトアミド線状ホモポリマーの2溶液と比較した。これは、出発物質及び生じた加水分解ポリマーの50mlサンプルに2モルリン酸ナトリウムまたは0.2モルクエン酸ナトリウム塩を1滴ずつ添加することにより実施した。生じた加水分解ポリマーはリン酸塩またはクエン酸塩イオンの添加により白色塊に沈殿したのに対して、出発物質の溶液はリン酸塩またはクエン酸塩イオンを1滴ずつ添加しても沈殿を有しなかった。これにより、出発物質は刺激例えば、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価アニオンに対して非応答性であるが、本実施例に記載されているように合成した超高分子量ポリマーは刺激例えば、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価アニオンに対して応答性であることを示している。図5は、ポリアミンポリマーを脱保護して、刺激応答性ポリビニルアミンPVAを形成するための方法を示す。[実施例32]脱保護したポリN-ビニルアセトアミドを主成分とする疎水性修飾ポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーの合成実施例31からの脱保護した4,060kDaポリN-ビニルアセトアミド線状ホモポリマーから得たPVAを用いて、超高分子量の疎水性修飾した刺激応答性ポリマーを次のように製造した。脱保護した4,060kDaポリN-ビニルアセトアミドの2溶液100gをガラスジャーに入れた。このガラスジャーにpHを約13に調節するために4モルNaOH100gを添加した。次いで、ジャーに1-プロパノール20gを補助溶媒として添加した。最後に、ベンジルクロリド0.58gを添加し、ジャーに蓋をかぶせた。反応物を激しく撹拌しながら60°Cで3時間加熱した。3時間後、反応混合物を室温まで冷却し、生成物をアセトンで沈殿させた後、収集した。生じた固体を脱イオン水、イソプロピルアルコールで順次洗浄し、真空オーブン中65°Cで2日間乾燥した。乾燥した固体を微粉末まで粉砕し、収集したポリマーの最終乾燥した塊は1.44gであった。乾燥粉末を1モル酢酸及び0.08HCl中に溶解させることにより2溶液を製造した。0.5ポリマー溶液の5mLサンプルに2モルリン酸ナトリウムまたは0.2モルクエン酸ナトリウム塩を1滴ずつ添加することにより生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると白色沈殿が観察された。これにより、ポリマーが多価アニオン刺激に対して応答性であったことが示される。図6は本実施例に記載されている合成方法の概略を示す。[実施例33]刺激応答性ビニルアミン/ビニルブチルエーテルコポリマーVA-コ-VBEの合成別の実験では、モノマー単位の1つが疎水基を含んでいる刺激応答性コポリマーを製造した。第1級アミン及びブチルエーテルを含有している反復単位から構成される刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。オクタン90g、Span-85SIGMA2.5g、N-ビニルホルムアミドNVFALDRICH,9816g、N-ブチルビニルエーテルSIGMA5g及び脱イオン水30gを250mlの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びN2ディップスティックを備えた。溶液を攪拌し、温度が55°Cに上昇するのでN2を1時間パージした。脱イオン水10ml中に2,2’-アゾビス2-アミジノプロパン二塩酸塩ABAPALDRICH0.10gを添加することにより開始剤溶液を製造し、溶解した。開始剤溶液を窒素をパージした雰囲気下で反応溶液を収容している250mlの丸底フラスコに充填した。激しく攪拌し且つ連続的に窒素をパージしながら、溶液を55°Cに1時間加熱し、次いで60°Cで1時間加熱し、次いで70°Cで1時間加熱した後、80°Cで1時間加熱した。こうすると、底に粘性ゲル層を有する2相溶液が生じた。上層をデカントし、捨てた。下層に脱イオン水200mlを添加し、激しく攪拌しながら50NaOH20gを添加した。溶液を80°Cで6時間加熱した。6時間後、溶液を熱から外し、室温まで冷却した。容量を脱イオン水を用いて2Lまで増加させた。2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することにより生成物を単離すると、大きな白い沈殿が生じた。上清をデカントすることにより沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水で洗浄した。単離したポリマーを脱イオン水500ml、酢酸10g及び濃HCl2g中に溶解した。0.5ポリマー溶液の5mLサンプルに2モルリン酸ナトリウムまたは0.2モルクエン酸ナトリウム塩を1滴ずつ添加することにより、生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると、白色沈殿が観察された。これにより、ポリマーが多価アニオン刺激に対して応答性であったことが示される。図7は本実施例に記載されている反応の概略を示す。本実施例は、疎水性モノマーと共重合したアミンまたは荷電官能基を含有するコポリマーが多価イオン刺激に対して応答性であることを示している。[実施例34]逆乳化重合によるNVFモノマーからの超高分子量ポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーの合成第1級アミンを含有する反復単位から構成される刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。オクタン90g、Span-85SIGMA2.5g、N-ビニルホルムアミドNVFALDRICH,9816g及び脱イオン水30gを250mlの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びN2ディップスティックを備えた。溶液を攪拌し、温度が55°Cに上昇したのでN2を1時間パージした。脱イオン水20ml中に2,2’-アゾビス2-アミジノプロパン二塩酸塩ABAPALDRICH0.20gを添加し、溶解することにより開始剤溶液を製造した。開始剤溶液を窒素をパージした雰囲気下で反応溶液を収容している250mlの丸底フラスコに充填した。激しく撹拌し且つ窒素を連続パージしながら、溶液を60°Cに2時間加熱した後、75°Cに1時間加熱した。底に粘性ゲル層を有する2相溶液が生じた。上層をデカントし、捨てた。下層に脱イオン水500mlを添加し、激しく攪拌しながら50NaOH48gを添加した。溶液を80°Cに16時間加熱した。16時間後、溶液を熱から外し、室温まで冷却した。容量を脱イオン水を用いて1Lまで増加させた。2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することにより生成物を単離すると、大きな白い沈殿が生じた。上清をデカントすることにより沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水で洗浄し、イソプロピルアルコール中に2時間浸漬し、最後に脱イオン水で再び洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中65°Cで3日間乾燥した。乾燥させたポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕し、更に1日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は21.5gであった。乾燥粉末を1モル酢酸及び0.08HCl中に溶解することにより2溶液を製造した。1ポリマー溶液の50mLサンプルに2モルリン酸ナトリウムまたは0.2モルクエン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することにより、生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると、白色沈殿が観察された。[実施例35]高分子量の疎水性修飾ポリビニルアミンPVA刺激応答性ポリマーの合成BASFから入手したLupamin9095線状ポリビニルアミン,平均MW=340kDa,20固体,pH7~9の溶液を用いて、疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。Lupamin9095約60gのポリビニルアミン300gを2Lのガラスジャーに添加した。次いで、NaOHペレット40g及び脱イオン水500mlを溶解し、ジャーに添加した。この後、1,2-ジメトキシエタンSIGMA500mlを補助溶媒として添加し、均質になるまで溶液を激しく攪拌した。次いで、反応ジャーにベンジルクロリドACROSORGANICS,9917.66gを攪拌しながら添加した。溶液を磁気撹拌しながら60°Cに16時間加熱した。次いで、溶液を室温まで冷却し、5Lのビーカーに移した。次いで、脱イオン水1500mlを攪拌しながら添加した。氷酢酸を用いてpHを5に調節した。2モルリン酸ナトリウム250mlをゆっくり添加することにより生成物が沈殿し、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を攪拌しながら1モル酢酸2L中に溶解した。全容量を脱イオン水で10Lとし、50NaOHを1滴ずつ添加することによりpHを7に調節した。2モルリン酸ナトリウム600gを添加して生成物を沈殿させた。固体を真空濾過により単離し、脱イオン水で洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中65°Cで3日間乾燥した。乾燥ポリマーを液体窒素で凍結し、微粉末まで粉砕し、更に1日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は46gであった。小サンプルを1モルCD3COOD/D2O酸中に溶解し、1H-NMRスペクトルを得た。このスペクトルを図8に示す。1H-NMRピークを積分し、ベンジル修飾の量は18であると判明した。[実施例36]疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性ポリマーの200g規模の合成本明細書中に記載されている例示的実験で、本明細書中に記載されているポリマーが大規模で製造され得ることが立証された。ポリアリルアミンの溶液PAA,NITTOBO,150kD;40wt/wt.を用いて、疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。ポリアリルアミンPAA,NITTOBO,150kD;40wt./wt.500g約200gのポリアリルアミンを4Lのガラスジャーに添加した。次いで、NaOHペレット80g及び脱イオン水1000mlを溶解し、ジャーに添加した。この後、1,2-ジメトキシエタンSIGMA1000mlを補助溶媒として添加し、均質になるまで溶液を激しく攪拌した。次いで、反応ジャーにベンジルクロリドACROSORGANICS,99114gを添加した。溶液を磁気撹拌しながら60°Cで16時間加熱した。次いで、溶液を室温まで冷却し、10Lのビーカーに移した。次いで、脱イオン水1000mlを攪拌しながら添加し、粘性の固体塊を溶液から沈殿させた。2モルリン酸ナトリウム200mlをゆっくり添加することにより生成物を更に沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を攪拌しながら1モル酢酸3L中に溶解した。全容量を脱イオン水で10Lとし、50NaOHを1滴ずつ添加することによりpHを7に調節した。2モルリン酸ナトリウム800gを添加して生成物を沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。ポリマーを以下の方法により更に精製した。固体を撹拌しながら1モル酢酸3L中に溶解した。全容量を脱イオン水で10Lとし、50NaOHを1滴ずつ添加することによりpHを7に調節した。2モルリン酸ナトリウム800gを添加して生成物を沈殿させ、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中65°Cで3日間乾燥した。乾燥したポリマーを液体窒素で凍結し、微粉末まで粉砕し、更に1日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は250gであった。小サンプルを1モルCD3COOD/D2O酸中に溶解し、図9に示す。1H-NMRスペクトルを得た。1H-NMRピークを積分し、ベンジル修飾の量は33であると判明した。[実施例37]CHO細胞培養物における刺激応答性ポリマー対カチオン性高分子電解質の添加量増加に対する凝集性能及び上清品質の測定本明細書中に記載されている例示的実験では、本発明に従う刺激応答性ポリマーを幾つかの所望の特性について公知のポリマー、すなわちキトサンと比較した。CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。中間分子量キトサンMMWキトサンSigma-Aldrichの2w/wの溶液の溶液を1モル酢酸中で製造した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの2w/w溶液を実施例36に従って製造した。CHO細胞培養物10mlを15mlのコニカルチューブ中に分配した。LMWキトサン及び33-BnPAA毎に、CHO細胞培養物を収容している各コニカルチューブに0.0、0.1、0.2、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.14、0.18、0.22及び0.4w/vの添加量のポリマーを添加した。33-BnPAAを収容しているコニカルチューブの場合のみ、pHを7.2に調節し、150mMリン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。下表5及び図10に代表的実験の結果を要約し、非刺激応答性ポリマー例えば、キトサンは効率的凝集のために添加量を最適化することが必要であるが、本発明に従う刺激応答性ポリマーは添加量最適化を必要としないようであることを明示している。換言すると、キトサンのような非刺激応答性ポリマーの場合、効率的凝集のために最適添加量のポリマーを一旦添加し、最適添加量を超えると濁度が増加し、これは望ましくない。一方、本明細書中に記載されているような刺激応答性ポリマーの場合、刺激応答性ポリマーは添加量の増加に関係なく有効な凝集剤/沈殿剤であり続ける。[実施例38]CHO細胞培養物における多価アニオン刺激の存在下対刺激なしでの刺激応答性ポリマーの添加量の増加を伴う凝集性能及び上清品質の測定CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの2w/w溶液を実施例36に従って製造した。33-BnPAAポリマーの場合、CHO細胞培養物を収容している各コニカルチューブに0.0、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.14、0.18、0.22及び0.4w/vの添加量の個々のポリマーを3通りに1つはリン酸塩、1つはクエン酸塩、1つは刺激なし添加した。pHを7.2に調節し、150mMリン酸ナトリウムまたは150mMクエン酸ナトリウム塩の刺激を加え、または刺激を加えなかった。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表6及び図11に示す。表6及び図11に代表的実験の結果を要約し、刺激応答性ポリマー例えば、実施例36に記載されているは、刺激なしでポリマー添加量を最適化することにより、非刺激応答性凝集剤実施例37におけるキトサンデータと同様にとして作用し得ることを明示している。しかしながら、リン酸塩またはクエン酸塩のような多価イオン刺激を加えると、刺激応答性ポリマーは、ポリマー添加量を増加させても遠心分離液濁度が影響されないので添加量最適化を必要としない。[実施例39]CHO細胞培養物における非修飾刺激応答性ポリマーの添加量の増加に伴う凝集性能及び上清品質の測定別の実験において、CHO細胞培養物中の非修飾刺激応答性ポリマーでの凝集能力及び上清品質を本明細書中に記載されているように測定した。CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。ポリアリルアミンPAA,NITTOBO,150kD;40wt./wt.を1モル酢酸中に溶解させることにより非修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性ポリマーの2w/w溶液を製造した。CHO細胞培養物10mlを15mlのコニカルチューブに分配する。CHO細胞培養物を収容している各コニカルチューブに0.0、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.14、0.18、0.22及び0.4w/wの添加量のポリマーを添加した。pHを7.2に調節し、150mMリン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表7に示す。[実施例40]CHO細胞培養物における刺激応答性ポリマーの凝集性能、沈降時間及び上清品質の測定CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの10w/w溶液を実施例36と同様に製造した。CHO細胞培養物50mlを100mlのガラスメスシリンダーに2通りで入れた。シリンダーの1つには、刺激応答性ポリマーを0.5の添加量で添加し、2モルトリス塩基を1滴ずつ添加してpHを7に調節し、2モルリン酸ナトリウム溶液を添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMに調節し、溶液を2分間撹拌した。刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集し、粒子サイズを大きくするために、リン酸ナトリウム及びpH調節を実施した。リン酸ナトリウムを添加し、pHを調節した後、大きな凝集粒子が刺激応答性ポリマーで処理した供給材料で観察された。他のメスシリンダーを2分間攪拌し、何も添加しなかった。いずれのシリンダーも1時間放置した。1時間後、上清を吸引し、濁度を記録した。スマートポリマーを有するシリンダー中の固相は明確な沈降前線を有し、不明確な沈降前線を与える未処理シリンダー中の固相に比してより速く沈降する鋭い固体から液相への転移ことが観察された。上記実験の1つの結果を表8に要約する。未処理シリンダーの場合、沈降前線が大きく散在しており、不明確であったために、沈降前線に関する測定は大まかな推定であった。[実施例41]異なる分子量を有するポリアミンを用いる清澄化性能の比較異なる分子量を有する一連のポリマーを入手し、修飾し、細胞培養物を凝集、沈殿及び精製するために使用した。分子量が15kD、85kD、150kD、350kD、600~950kD及び2000~4000kDの第1級アミン反復単位を有するポリマーを以下の方法により入手し及び/または修飾した。15kDポリアリルアミンポリマーはNITTOBOから入手し、実施例36と同様の方法を用いてベンジル化したベンジル基を共有結合し、精製した。85kDベンジル化ポリビニルアミンポリマーは実施例23により製造した。150kDベンジル化ポリアリルアミンは実施例36に従って製造した。350kDベンジル化ポリビニルアミンポリマーは実施例35により製造した。950kDポリビニルアミンポリマー骨格は、ポリミンVZBASFを2当量の塩基を用いて80°Cで8時間加水分解することにより製造した。非修飾2000~4000kDPVAは実施例31に従って製造した。ベンジル化2000~4000kDポリマーは実施例32に従って製造した。ポリマーは、約12×106細胞/mLのCHODG44細胞培養物を凝集、沈殿及び精製するために使用し、<50の細胞生存度で収集した。凝集は0.2及び0.4w/wのポリマー添加量で実施した。50mMリン酸ナトリウムの溶液刺激及び2モルトリス塩基を用いる7へのpH調節を適用した。フロックサイズについての観察を記録し、を小さいフロック、を非常に大きな凝集物として示した。と示されたバイアルは、凝集物の懸濁液よりもむしろ完全ゾーン分離であった。鋭い固体液体界面を持つ大きな凝集物/粒子はより速く沈降することも注目される。結果を表9に示す。この表には、異なる分子量のポリアミンを用いた凝集の結果が明示されている。[実施例42]異なる疎水性修飾のポリアミンを用いる清澄化性能の比較CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。実施例31、32、33及び35に記載されているポリマーのサンプルを実施例38に記載されている細胞培養物に添加した。ただし、ポリマー添加量は表10に記載されているように0.1wt~0.6wtであった。初期細胞培養濁度は~900NTUであり、ポリマー処理なしの遠心分離液の濁度は212NTUであった。pHを7.2に調節し、50mMリン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表10に示す。この表には、異なるポリマー添加量での各種疎水性修飾の性能が明示されている。表10は、疎水基の種類及び/またはポリマー分子量を変化させることにより、刺激に対する応答及び生じる遠心分離液濁度を変化させ得ることを明示している。[実施例43]刺激応答性ポリマーを用いて得た低い濁度の下流濾過に対する影響刺激応答性ポリマーのその後の遠心及びデプス濾過ステップに対する影響を評価するために、次の手順を実施した。PTG1抗体を発現するDG44チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株を10LのバイオリアクターNEWBRUNSWICKSCIENTIFICにおいて約15×106細胞/mLの密度まで増殖させ、<50生存度で収集した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの10w/w溶液を実施例36と同様に製造する。DG44CHO細胞培養物の1画分を0.2の刺激応答性ポリマー33-BnPAAで処理し、DG44CHO細胞培養物の別の画分は処理しない。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMとし、2モルトリス塩基を1滴ずつ添加することによりpHを7.2に調節する。リン酸ナトリウム及びpH調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集させ、粒度を大きくするために実施する。リン酸ナトリウム添加及びpH調節の後に、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きなフロック状粒子が観察される。両画分を3000RPMで5分間遠心し、上清をデカントし、濁度を測定した。33-BnPAAポリマーで処理した供給材料についての遠心分離液濁度は10NTUであると測定され、未処理供給材料についての遠心分離液濁度は60NTUであると測定された。各供給材料に対するデプスフィルター処理量を以下の方法により測定した。供給材料毎に、23cm2の表面積を有するX0HCMillistak登録商標Pod使い捨てデプスフィルターMILLIPOREを使用した。デプスフィルターにはぜん動ポンプ及びインライン圧力センサーを備えた。フィルターに説明書に従って脱イオン水を流し、供給材料を100LMHで圧送し、濾液をプールした。33-BnPAAポリマーで処理した供給材料についてのプールした濁度は6NTUであり、未処理供給材料の濾液についてのプールした濁度は9NTUであった。33-BnPAAポリマーで処理した供給材料に対するフィルター処理量は10psiで1304L/m2であり、この時点で供給限界のために実験を停止した。未処理供給材料に対するフィルター処理量は20psiで206L/m2であり、この時点で圧力限界のために実験を停止した。[実施例44]モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のアフィニティー樹脂を用いる捕捉刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、モデル供給材料を作成し、次の手順を実施する。CHO細胞培養物を実施例1に同様の方法を用いて作成する。初期供給材料HCPレベルは~210,000ppmであった。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの10w/w溶液を実施例36と同様に製造する。CHO細胞培養物の1つの画分を0.1の刺激応答性ポリマー33-BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の別の画分を0.4の刺激応答性ポリマー33-BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の第3の画分は処理しない。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMとし、2モルトリス塩基を1滴ずつ添加することによりpHを7.2に調節する。リン酸ナトリウム及びpH調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集させ、粒度を大きくするために実施する。リン酸ナトリウム添加及びpH調節の後に、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きなフロック状粒子が観察される。細胞培養物の各画分を実験室規模のバケット遠心分離機を用いて3000RPMで5分間遠心する。各遠心分離液の濁度を記録し、表11に報告する。遠心分離液を0.2μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過する。濾液プールを、プロティンAアフィニティークロマトグラフィーProSepUltraPlus登録商標、結合-溶離カチオン交換クロマトグラフィーProResS登録商標、及び通過モードでの膜吸着材アニオン交換クロマトグラフィーChromaSorb登録商標から構成される3ステップクロマトグラフィーに基づく精製により精製した。精製は表12の方法に従ってクロマトグラフィーワークステーションで実施した。ステップ毎のプールを、宿主細胞タンパク質CHOPについてはELISAにより、浸出したプロティンALProAについてはELISAにより、残留DNAについてはPicoGreen登録商標アッセイにより、濁度、凝集タンパク質AGGについてはサイズ排除HPLCにより、タンパク質濃度についてはUV吸収により分析した。[実施例45]モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のカチオン交換樹脂を用いる捕捉刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、次の手順を実施した。PTG1抗体を発現するDG44チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株を10LのバイオリアクターNewBrunswickScientificにおいて約15×106細胞/mLの密度まで増殖させ、~142000ppmのHCPレベルで<50生存度で収集した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性33-BnPAAポリマーの10w/w溶液を実施例36と同様に製造した。CHO細胞培養物の1つの画分を0.1の刺激応答性ポリマー33-BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の別の画分を0.4の刺激応答性ポリマー33-BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の第3画分は処理しなかった。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して2モルリン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMとし、2モルトリス塩基を1滴ずつ添加することによりpHを7.2に調節した。リン酸ナトリウム及びpH調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集し、粒度を大きくするために実施した。リン酸ナトリウム添加及びpH調節後、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きな凝集粒子が観察された。細胞培養物の各画分を実験室規模のバケット遠心分離機において3000RPMで5分間遠心する。各遠心分離液の濁度を記録し、表13に報告する。遠心分離液を0.2/μmDurapore登録商標フィルターを介して濾過した。濾液プールを、結合-溶離カチオン交換クロマトグラフィーProResS登録商標、及び通過モードでの膜吸着材アニオン交換クロマトグラフィーChromaSorb登録商標から構成される2ステップクロマトグラフィーに基づく精製により精製した。精製は表12の方法に従ってクロマトグラフィーワークステーションで実施した。ステップ毎のプールを、宿主細胞タンパク質CHOPについてはELISAにより、浸出したプロティンALProAについてはELISAにより、残留DNAについてはPicoGreen登録商標アッセイにより、濁度、凝集タンパク質AGGについてはサイズ排除HPLCにより、タンパク質濃度についてはUV吸収により分析した。[実施例46]リン酸2-ヒドロキシエチルメタクリレートPAHEMAで修飾させたポリエチレン膜表面別の実験において、膜を多価イオン刺激を取り込むように修飾した。この膜は残留刺激応答性ポリマーを除去するために使用され得るPAHEMAの16水性混合物を、PAHEMAAldrich695890,75PAHEMA及び25BisHEMPA16g、イルガキュア29590.2g及び水93.8gを用いて製造した。ポリエチレン膜0.65um,UPDPMILLIPOREを予めメタノールで湿らし、水と交換し、PAHEMA調製物で処理した。サンプルをUV光に曝し、メタノール及び水で洗浄し、乾燥した。この表面修飾により膜に付加された重量は4.4であった。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー正に荷電した染料で染色すると、1.43のシアン光学密度の深青色が生じた。[実施例47]リン酸2-ヒドロキシエチルメタクリレートPAHEMAで修飾させた親水性ポリエチレン膜表面PAHEMAの16水性混合物を、PAHEMAAldrich695890,75PAHEMA及び25BisHEMPA16g、イルガキュア29590.2g及び水93.8gを用いて製造した。親水性膜0.65um,MPLCMILLIPOREを直接PAHEMA溶液と接触させた。上記のようにUV光に曝し、洗浄すると、膜に7.6が付加された。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー正に荷電した染料で染色すると、1.45のシアン光学密度の深青色が生じた。[実施例48]リン酸ヒドロキシエチルメタクリレートPAHEMAで修飾させた親水性ポリメタクリレート樹脂別の実験では、樹脂を刺激を含むように修飾した。この修飾された樹脂はその後残留ポリマーを除去するために使用され得る。アリルグリシジルエーテルAGE60ml、4MNaOH110g、硫酸ナトリウム12gの組成を有する溶液を製造する。この溶液にToyoPearl65C媒体60mlを添加し、混合物を回転式ハイブリダイサー中に50°Cで16時間置く。媒体を標準手順により分離し、洗浄する。PAHEMA1.0g、過硫酸アンモニウム0.06g、水9.0gのPAHEMAグラフト化溶液を製造する。この溶液にAGE修飾させたToyoPearl媒体5mlを添加する。混合物をハイブリダイザー中に80°Cで16時間置く。標準手順により分離し、洗浄すると、PAHEMA修飾樹脂が得られる。この生成物を正に荷電した染料であるメチレンブルーの0.01水溶液で処理すると、暗青色で染色される。[実施例49]リン酸2-ヒドロキシエチルメタクリレートPAHEMAで修飾させた親水性ポリエチレン膜表面との刺激応答性ポリマーの結合PAHEMA修飾MPLC膜実施例47を使用して、以下の実験手順を用いてそれぞれ100、10及び1ppmPAAを含有している3つの溶液からポリアリルアミンPAAポリマーを捕捉した。膜ディスク20mm直径を15ccセルホルダーにおいて加工した。PAA溶液を1.5cc/秒で加工した。膜をPBS緩衝液100mLを用いてセルホルダーの内外を洗浄した。加工した膜をPonceauSで染色した。PonceauSは、正に荷電している表面に強く吸着する負に荷電している染料である。PAAがPAHEMA修飾膜に吸着されると、表面は負電荷から正電荷に変化した。この変化は、加工溶液をPonceauSで染色することにより容易に観察される。PonceauSでの染色度の良好な目安はマクベス濃度計を用いて測定されるマゼンタ光学密度である。膜の上流側及び下流側の両方のすなわち、PAAを充填した各種加工膜についてのマゼンタ光学密度の値を表14に示す。1ppmの場合で見られるように、PAAのすべてが膜の上流側で捕捉される。15mLの加工溶液の場合、これは4.8μgのPAA/cm2-膜表面に相当する。従って、本実施例の結果に基づいて、本明細書中に記載されている修飾した膜及び樹脂は残留ポリマーのレベルを低下させるために、または残留ポリマーを完全に除去するために使用され得ると結論づけることができる。明細書は、参照により本明細書に組み入れる本明細書中に引用されている文献の教示内容に照らして最も十分に理解される。明細書中の実施形態は本発明の実施形態の説明を与え、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識している。すべての刊行物及び特許文献が全文参照により組み入れられる。参照により組み入れられる材料が本明細書を否定したり矛盾している限り、本明細書は上記材料に取って代わる。本明細書中の文献の引用は、これらの文献が本発明に対する先行技術であるという容認ではない。別段の指示がない限り、特許請求の範囲を含めた明細書中で使用されている成分、細胞培養物、処理条件等の量を表すすべての数字はいずれも用語約により修飾されると理解されるべきである。従って、反対の指示がない限り、数値パラメーターはおおよそであり、本発明により得るべく求めている所望特性に応じて異なり得る。別段の指示がない限り、一連の要素の前の用語少なくともは一連の中のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者は、本明細書中に記載されている発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識しており、またルーチンの実験を用いるだけで確認することができる。これらの均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されると意図される。当業者には自明のように、本発明の多くの修飾及び改変がその趣旨及び範囲を逸脱することなく加え得る。本明細書中に記載されている具体的実施形態は単なる例として提示されており、決して限定することを意味しない。明細書及び実施例は例としてのみ見なされ、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲により示されていると意図される。"