"標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質であって、ここで該標的部位は、表3または表4に特定されるようなヌクレオチド配列を有する、ジンクフィンガータンパク質。ジンクフィンガーのC2H2クラスの少なくとも1つのフィンガーを含む、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質。前記標的部位が、表3または表4の列におけるヌクレオチド配列の1つであって、そして該ジンクフィンガーの少なくとも1つにおいて、位置-1~6が、該列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項2に記載のジンクフィンガータンパク質。3つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表3の列に特定されるような、第1、第2、および第3の7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項3に記載のジンクフィンガータンパク質。請求項4に記載のジンクフィンガータンパク質であって、ここで該セグメントが、表3に列挙される該ジンクフィンガータンパク質の1つについて特定されるアミノ酸配列を有し、ここで、該ジンクフィンガータンパク質は、以下:BVO13A、EP10A、GATA82Z7678、HBV3、HP384A、HUM17A、HUM19A、MTS5A、MX1E、PDF5A、RAT24A、SAN16A、USX3A、VEGF1、VEGF13、VEGF1A、VEGF1B、VEGF1C、VEGF1D、VG10A、VG1B、VG4A、VG8A、VOP28A-2、VOP30A-4、VOP32A-6、VOP32B-7、VOP35A-10、ZEN-7A1、VOP29A-3、VOP32C、VOP32D、VOP32E、VOP32F、VOP32G、VOP32H、VOP32IおよびVOP32Jからなる群より選択される、ジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーの少なくとも1つにおける位置-1~6が、表4に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項2に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項2に記載のジンクフィンガータンパク質。請求項7に記載のジンクフィンガータンパク質であって、ここで前記セグメントが、表4に列挙されるような、BVO10A-9A、BVO12A-11BおよびBVO14B-13Aからなる群より選択されるジンクフィンガータンパク質について特定されるアミノ酸配列を有する、ジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質。前記融合タンパク質が、複数個の調節ドメインを含む、請求項9に記載のジンクフィンガータンパク質。前記調節ドメインが、活性化ドメインである、請求項9に記載のジンクフィンガータンパク質。前記活性化ドメインが、aVP16、bp65、ならびにcaおよびbの機能的フラグメントからなる群より選択される、請求項11に記載のジンクフィンガータンパク質。前記調節ドメインが、抑制ドメインである、請求項9に記載のジンクフィンガータンパク質。前記抑制ドメインが、aKRAB、bメチル結合性ドメインタンパク質2B、cv-ErbA抑制ドメイン、ならびにda、bおよびcの機能的フラグメントからなる群より選択される、請求項13に記載のジンクフィンガータンパク質。表3または表4に特定されるようなヌクレオチド配列を有する標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質であって、該標的部位を含むVEGF遺伝子を含むゲノムを有する動物に導入される場合、この結合によって、該ジンクフィンガータンパク質は血管新生を調節し得る、ジンクフィンガータンパク質。ジンクフィンガーのC2H2クラスの少なくとも3つのフィンガーを含む、請求項15に記載のジンクフィンガータンパク質。前記標的部位が、表3または表4の列におけるヌクレオチド配列の1つであって、そして前記ジンクフィンガーの少なくとも1つにおいて、位置-1~6が、該列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項16に記載のジンクフィンガータンパク質。前記3つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表3の列に特定されるような、第1、第2、および第3の7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項17に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーの少なくとも1つにおける位置-1~6が、表4に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項16に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項19に記載のジンクフィンガータンパク質。ポリペプチドをコードする核酸であって、ここで該ポリペプチドが、請求項1に記載のジンクフィンガーを含む、核酸。ポリペプチドをコードする核酸であって、ここで該ポリペプチドが、請求項4に記載のジンクフィンガータンパク質を含む、核酸。ポリペプチドをコードする核酸であって、ここで該ポリペプチドが、請求項7に記載のジンクフィンガータンパク質を含む、核酸。ポリペプチドをコードする核酸であって、ここで該ポリペプチドが、請求項9に記載のジンクフィンガータンパク質を含む、核酸。VEGF遺伝子の発現を調節するための方法であって、該方法は、ジンクフィンガータンパク質と、細胞内の核酸の標的部位とを接触させる工程を包含し、ここで該標的部位が、表3または表4に特定されるようなヌクレオチド配列を有し、そして該ジンクフィンガータンパク質の該標的部位への結合が、該細胞でのVEGF遺伝子の発現を調節する、方法。VEGF遺伝子の複数個のスプライス改変体の発現が調節される、請求項25に記載の方法。複数個の標的部位が、複数個のジンクフィンガータンパク質に接触され、そして、各ジンクフィンガータンパク質が別個の標的部位に結合する、請求項25に記載の方法。前記複数個のジンクフィンガータンパク質のそれぞれが、融合タンパク質である、請求項27に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質のそれぞれが、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項28に記載の方法。それぞれのジンクフィンガータンパク質が、異なる調節ドメインと融合している、請求項29に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、ジンクフィンガーのC2H2クラスの少なくとも3つのフィンガーを含む、請求項25に記載の方法。前記3つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表3の列に特定されるような、第1、第2、および第3の7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項31に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項31に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項25に記載の方法。前記方法がさらに、前記ジンクフィンガータンパク質を送達ビヒクルと組み合わせて投与する工程を包含する、請求項34に記載の方法。前記方法がさらに、前記ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を前記細胞内に投与する工程を包含する、請求項34に記載の方法。前記投与する工程が、前記核酸を裸の形態で前記細胞内に送達する工程を包含する、請求項36に記載の方法。前記核酸が、発現ベクター内に含まれ、そしてプロモーターに作動可能に連結し、そして投与する工程が、該ベクターを前記細胞内に送達する工程を包含する、請求項36に記載の方法。前記発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項38に記載の方法。前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、およびAAV発現ベクターからなる群より選択される、請求項39に記載の方法。前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項38に記載の方法。前記調節ドメインが、活性化ドメインを含み、そして前記標的部位への前記ジンクフィンガータンパク質の結合が、前記細胞内での前記VEGF遺伝子の転写を活性化する、請求項34に記載の方法。前記細胞が、細胞の集団である、請求項42に記載の方法。VEGF転写の活性化が、前記細胞の集団での血管形成を活性化する、請求項43に記載の方法。前記細胞の集団が、細胞培養物である、請求項44に記載の方法。前記細胞の集団が、哺乳動物被験体に存在する、請求項44に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガータンパク質核酸が、疾患または損傷を処置するに有効な量で投与される、請求項36に記載の方法。前記疾患または損傷が、アテローム硬化症、虚血、および関節炎からなる群より選択される、請求項47に記載の方法。前記被験体が、創傷を有し、そして投与される前記量が該創傷を処置するに効果的である、請求項47に記載の方法。前記被験体が、潰瘍を有し、そして投与される前記量が該潰瘍を処置するに効果的である、請求項47に記載の方法。VEGF転写の活性化が、前記細胞の集団でのリンパ球生成を活性化する、請求項42に記載の方法。VEGF転写の活性化が、前記細胞の集団での骨髄発生を活性化する、請求項42に記載の方法。前記活性化ドメインが、aVP16、bp65、ならびにcaおよびbの機能的フラグメントからなる群より選択される、請求項42に記載の方法。前記調節ドメインが、抑制ドメインであって、そして前記標的部位への前記ジンクフィンガータンパク質の結合が、前記細胞内での前記VEGF遺伝子の転写を抑制する、請求項34に記載の方法。前記細胞が、細胞の集団である、請求項54に記載の方法。VEGF転写の抑制が、前記細胞の集団での血管形成を抑制する、請求項55に記載の方法。前記細胞の集団が、細胞培養物である、請求項55に記載の方法。前記細胞の集団が、哺乳動物被験体に存在する、請求項55に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガータンパク質核酸が、疾患または損傷を処置するに有効な量で投与される、請求項58に記載の方法。前記疾患が、腫瘍である、請求項59に記載の方法。前記抑制ドメインが、aKRAB、bメチル結合性ドメインタンパク質2B、cv-ErbA抑制ドメイン、ならびにda、bおよびcの機能的フラグメントからなる群より選択される、請求項54に記載の方法。前記標的部位が、単一の型のVEGF遺伝子中に位置し、そして前記ジンクフィンガータンパク質の該標的部位への結合が、前記細胞中の単一のVEGF遺伝子の発現を調節する、請求項25に記載の方法。前記標的部位が、複数個の異なる型のVEGF遺伝子中に位置し、そして前記ジンクフィンガータンパク質の該標的部位への結合が、複数個のVEGF遺伝子の発現を調節する、請求項25に記載の方法。請求項63に記載の方法であって、ここで前記標的部位が、以下:EP10A、GATA82Z678、HBV3、HP384A、HUM17A、MTS5A、PDF5A、USX3A、VEGF1、VEGF13、VEGF1A、VG10A、VG1B、VG4A、VG8A、VOP28A-2、VOP30A-4、およびZEN-7A1からなる群より選択されるタンパク質によって結合されるヌクレオチド配列を含む、方法。前記標的部位が、VOP28A-2によって認識されるヌクレオチド配列である、請求項64に記載の方法。前記標的部位が、VOP30A-4によって認識されるヌクレオチド配列である、請求項64に記載の方法。血管新生を調節するための方法であって、該方法は、VEGF遺伝子内に標的部位を含むゲノムを有する動物にジンクフィンガータンパク質を導入する工程を包含し、これによって、該ジンクフィンガータンパク質が該標的部位に結合し、そしてそれによって、該動物での血管新生を調節する、方法。前記血管新生の調節が、新規血管形成の阻害を含む、請求項67に記載の方法。前記血管新生の調節が、新規血管形成の刺激を含む、請求項67に記載の方法。前記血管が、高透過性でない、請求項69に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、表3または表4に特定される標的部位に結合する、請求項67に記載の方法。3つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表3の列に特定されるような、第1、第2、および第3の7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項71に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項71に記載の方法。前記標的部位が、複数個のVEGF遺伝子中に存在し、これによって、前記ジンクフィンガータンパク質は、該複数個の遺伝子中の該標的部位に結合し、この結合によって該複数個のVEGF遺伝子の発現を調節する、請求項67に記載の方法。前記導入する工程が、前記動物内に複数個のジンクフィンガータンパク質を導入する工程を包含し、それぞれのジンクフィンガータンパク質が同じ遺伝子中の異なる標的部位に結合する、請求項67に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質のそれぞれが、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項75に記載の方法。それぞれのジンクフィンガータンパク質が、異なる調節ドメインと融合している、請求項76に記載の方法。虚血の処置の方法であって、該方法は、虚血を有する動物内に、表3または表4に特定された標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質を投与する工程を包含し、ここで該ジンクフィンガータンパク質は、虚血を処置するに有効な量で投与される、方法。前記動物が、前記標的部位と、該標的部位に結合する前記ジンクフィンガータンパク質とを含むVEGF遺伝子を含むゲノムを有する、請求項78に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、ジンクフィンガーのC2H2クラスの少なくとも3つのフィンガーを含む、請求項79に記載の方法。前記3つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表3の列に特定されるような、第1、第2、および第3の7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項80に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質は、6つのジンクフィンガーを含み、そして該6つのジンクフィンガーのそれぞれにおける位置-1~6が、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項80に記載の方法。VEGF遺伝子の発現の調節因子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下:a試験細胞を、ジンクフィンガータンパク質と試験薬剤とに接触させる工程であって、ここで該ジンクフィンガータンパク質は、標的部位に結合する少なくとも1つのジンクフィンガーを含み、該標的部位は、表3または表4で特定されるようなヌクレオチド配列を有する、工程;b前記試験細胞におけるVEGF遺伝子の発現レベルをベースラインレベルと比較する工程であって、該ベースラインレベルに対する該試験細胞での発現レベルにおける統計学的に有意な差異は、該試験薬剤が、VEGF遺伝子発現の潜在的な調節物質であることを示す、工程を包含する、方法。前記ジンクフィンガーが、活性化ドメインを含む融合タンパク質であり、そして前記試験細胞における、前記ベースラインレベルに対して低レベルの発現は、前記試験薬剤が前記VEGF遺伝子の抑制物質であることを示す、請求項83に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、抑制ドメインを含む融合タンパク質であり、そして前記試験細胞における、前記ベースラインレベルに対して増加した発現レベルは、前記試験薬剤が前記VEGF遺伝子の活性化剤であることを示す、請求項83に記載の方法。薬学的組成物であって、該組成物は、調節配列に作動可能に結合した請求項14に記載の核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含み、ここで、該調節配列が細胞での該核酸の発現を可能にする、薬学的組成物。前記核酸が、発現ベクター中に含まれる、請求項86に記載の薬学的組成物。前記発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項87に記載の薬学的組成物。前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、およびAAV発現ベクターからなる群より選択される、請求項88に記載の薬学的組成物。請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。複数個のジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質であって、ここで該複数個のジンクフィンガーの少なくとも1つが、表3または表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、ジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質が、3つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質であって、前記少なくとも1つのジンクフィンガーが、表3の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項91に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガーの少なくとも2つが、表3の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項92に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガーの3つ全てが、表3の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項93に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガータンパク質が、6つのフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質であって、前記少なくとも1つのジンクフィンガーが、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項91に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガーの少なくとも3つが、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項95に記載のジンクフィンガータンパク質。前記ジンクフィンガーの6つ全てが、表4の列に特定されるような7つの連続するアミノ酸のセグメントによって占められる、請求項96に記載のジンクフィンガータンパク質。創傷を処置するための方法であって、該方法は、VEGF遺伝子内に標的部位を含むゲノムを有する動物内にジンクフィンガータンパク質を導入する工程を包含し、これによって、該ジンクフィンガータンパク質は、該標的部位に結合し、このような結合は創傷の治癒を促進する、方法。要旨種々のジンクフィンガータンパク質ZFPおよびそのようなタンパク質を使用する方法は、遺伝子発現の調節における使用のために提供される。特定のZFPは、遺伝子内の、特異的標的配列に結合し、それによって新脈管形成を調節するように設計される。ZFPは、融合タンパク質の一部として、調節ドメインに融合され得る。ZFPとの融合について、活性化ドメインまたはリプレッサードメインのいずれかを選択することによって、遺伝子発現の活性化または抑制のいずれかをし得る。従って、ZFPに融合する調節ドメインの適切な選択によって、遺伝子の発現、そして従って、そのような遺伝子に関連する種々の生理学的プロセスを選択的に調節し得る。従って、例えば、新脈管形成を用いて、新脈管形成に影響を及ぼす遺伝子内の標的配列に結合するZFPにアクチベーションドメインを結合することによって、新脈管形成に関連する特定の有益な局面例えば、虚血の緩和を強化し得る。対照的に、新脈管形成が有害なプロセス例えば、血液供給の腫瘍への送達に関連する場合、リプレッサーに融合するZFPを使用することによって、新脈管形成を減少し得る。それゆえ、新脈管形成に関与する遺伝子へのこの型のZFPの結合は、有意に新脈管形成を減少する。提供されるZFPは、1つ以上のジンクフィンガーを含み、表3または表4の列に示されるようなアミノ酸配列を有する、少なくとも1つのフィンガーを有する。これらのZFPとしては、種々のVEGF遺伝子内の特定の配列に結合するZFPが挙げられる。そのような結合は、新脈管形成を調節するために、そして、虚血および適切な血流に依存する種々の他の障害を処置するために使用され得る。表3および表4は、異なるVEGF遺伝子内の特定の標的部位に結合するZFPの大きな集合のアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド標的部位は、これらの表の列2に示される。従って、本明細書中で開示される特定のZFPは、表3および表4に特定されるヌクレオチド配列を有する標的部位を認識する。これらのZFPのいくつかは、1~6個のフィンガーを含み他のZFPは、より多くのフィンガーを有し得るが、そしてこれらのフィンガーは、表3および表4の列に示されるアミノ酸によって占められる。これらのアミノ酸は、ジンクフィンガーの位置-1から6を占有し得る。本明細書中に提供される特定のZFPは、代表的に9ヌクレオチドを有する標的部位を認識する。一般的に、そのような標的部位は、多重フィンガータンパク質のそれぞれのジンクフィンガー成分によって結合される、3つの標的サブサイトを含む。そのような標的部位の例は、表3に列挙される。認識に関与するジンクフィンガー成分の一部のアミノ酸配列は、列4、6および8に示される。3つのジンクフィンガーを有するいくつかのタンパク質について、これらのフィンガーは、表3に示される7つ連続するアミノ酸の第1、第2および第3のセグメントによって占有される。本明細書中に開示される他のZFPは、代表的に18ヌクレオチドを含む標的配列に結合する。これらの標的配列は、6つのフィンガーを含むZFPによって認識され得る。そのようなZFPの例は、表4に列挙される。それゆえ、特定の本発明のZFPは、表4に示される6フィンガーのZFPを含み、各々のフィンガーの位置-1~6が、表4の列に明記される7つ連続するアミノ酸のセグメントによって、占有される。上に示されるように、本明細書中で提供されるZFPのいくつかは、新脈管形成を調節するための方法において有用である。いくつかの方法において、新脈管形成の調節は、新規血管形成の阻害を含む。いくつかの方法において、新脈管形成の調節は、新規血管形成の刺激を含む。そのような方法のいくつかにおいて、血管は、非浸透性または非過浸透性である。従って、表3または表4に明記されるようなヌクレオチド配列を有する標的部位に結合するZFPもまた提供される。このZFPが、標的部位を含むVEGF遺伝子を含むゲノムを有する動物に導入される場合、それによって新規血管形成が調節される。ZFPの前記の型のいずれかは、しばしば調節ドメインを含む融合タンパク質の一部である。この調節ドメインは、アクチベーターまたはリプレッサーであり得る。同様に、本明細書中で提供されるような新脈管形成を調節するための特定の方法は、表3または表4に明記されるような標的部位に結合するZFPを標的部位を含むVEGF遺伝子を含むゲノムを有する動物へ導入する工程を包含する。ZFPの標的部位に対する結合は、動物において新規血管形成の調節を生じる。関連する方法は、細胞内で、核酸の標的部位をジンクフィンガータンパク質と接触させる工程を包含し、ここで、この標的部位は、表3または表4に明記されるようなヌクレオチド配列を有し、標的部位へのジンクフィンガータンパク質の結合は、細胞内のVEGF遺伝子の発現を調節する。本明細書中に提供されるZFPは、血管の形成の調節に関連する多くの異なる疾患を処置するために使用され得る。従って、特定の方法は、虚血を処置するために設計される。これらの方法のいくつかは、表3または表4に明記されるような標的部位に結合するZFPを、虚血を有する動物に投与する工程を包含し、ここでZFPは、虚血を処置するための有効量で投与される。ZFPはまた、例えば、創傷の処置、種々の外科的適用ならびにリンパの内皮細胞の増殖および骨髄造血の活性化の増進において使用され得る。他のZFPは、血管形成の抑制による、所望されていないプロセスを防止する際の使用を見出す。従って、例えば、ZFPは、糖尿病性網膜症、乾癬、関節症および腫瘍増殖の処置において使用され得る。特定のZFPを選択することによって、生理学的プロセス例えば、新脈管形成が調節され得、そして処置を調整し得る範囲を、調整し得る。任意の所定の遺伝子における複数の標的部位が、本明細書中に提供されるZFPによって作用され得、そして、単一のZFPが、複数の遺伝子中に位置する標的部位に結合し得るので、これが達成され得る。従って、いくつかの方法において、複数のZFPが投与される。次いで、これらのZFPは、同じ遺伝子内に位置する異なる標的部位に結合し得る。そのようなZFPは、いくつかの例において、相乗的な効果を有し得る。特定の方法において、複数の融合タンパク質は、異なる調節配列を含む。これとは対照的に、本明細書中に提供されるいくつかのZFPを使用して、単一のZFPの投与は、複数の遺伝子の遺伝子発現を調節し得る。なぜなら、各々の遺伝子は、標的配列を含むからである。本明細書中で開示されるZFPをコードするヌクレオチドもまた、本明細書中で提供される。さらに、核酸および/またはZFPを含む薬学的組成物もまた提供される。例えば、特定の組成物は、調節配列に作動可能に連結された本明細書中に記載されるZFPの1つをコードする核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含み、ここで、この調節配列が、細胞中のこの核酸の発現を可能にする。タンパク質ベースの組成物は、本明細書中で開示されるZFPおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。詳細な説明I.定義分子生物学、生化学、細胞培養、組換えDNA、および関連分野における従来技術の実施は、当業者に周知であり、そして例えば、以下の参考文献中で議論される:Sambrookら、MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1989;Ausubelら、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY、JohnWileySons、NewYork、1987および定期的最新版;METHODSINENZYMOLOGYシリーズ、AcademicPress、SanDiego;およびMETHODSINMOLECULARBIOLOGY、119巻、ChromatinProtocolsP.B.Becker編HumanaPress、Totowa、1999、これらの全ては、それらの全体において参考として援用される。用語ジンクフィンガータンパク質またはZFPとは、亜鉛によって安定化されるDNA結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のDNA結合ドメインは、代表的にフィンガーといわれる。ZFPは、少なくとも1つのフィンガー、代表的に、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれより多いフィンガーを有する。それぞれのフィンガーは、2~4個のDNAの塩基対、代表的には、3個または4個のDNAの塩基対に対して結合する。ZFPは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に対して結合する。各フィンガーは、代表的に、約30アミノ酸の、亜鉛キレート化DNA結合サブドメインを含有する。これらのタンパク質の1つのクラスC2H2クラスを特徴付ける例示的なモチーフは、-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-5-Hisここで、Xは任意のアミノ酸である配列番号208である。ジンクフィンガータンパク質のさらなるクラスが公知であり、そして本方法の実施において、ならびに本明細書中に開示される組成物の製造および使用において有用である例えば、Rhodesら1993ScientificAmerican268:56-65を参照のこと。研究は、このクラスの1個のジンクフィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基と共に、亜鉛に配位される2つの不変のヒスチジン残基を含むαへリックスから構成されることを示してきた例えば、BergおよびShi、Science271:1081-10851996を参照のこと。標的部位は、ZFPによって認識される核酸配列である。単一の標的部位は、代表的に、約4~約10個の塩基対を有する。代表的に、2フィンガーのZFPは、4~7個の塩基対標的部位を認識し、3フィンガーのZFPは、6~10個の塩基対標的部位を認識し、6フィンガーのZFPは、2つの隣接する9~10個の塩基対標的部位を認識する。標的サブサイトまたはサブサイトは、交差鎖cross-strand相互作用を除く、単一のジンクフィンガーによって結合されるDNA標的部位の一部分である。従って、交差鎖相互作用の存在しない場合、サブサイトは一般的に3ヌクレオチド長である。交差鎖相互作用を生じる場合においてすなわち、D-ableサブサイト、共有に係るWO00/42219を参照のこと、サブサイトは4ヌクレオチド長であり、そして別の3ヌクレオチドサブサイトもしくは4ヌクレオチドサブサイトと重複する。Kdとは、結合分子に対する解離定数、すなわち、所定のアッセイ系例えば、米国特許第5,789,538号を参照のことを使用して測定されるような、所定の条件下すなわち、[標的]Kdの場合で、その標的に対する化合物の最大半減の結合を与えるすなわち、半数の化合物分子がその標的に結合される化合物例えば、ジンクフィンガータンパク質の濃度をいう。Kdを測定するために使用されるアッセイ系は、ZFPの実際のKdの最も正確な測定を得るように選択されるべきである。ZFPの実際のKdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系が使用され得る。1つの実施形態において、ZFPに対するKdは、電気泳動度シフトアッセイEMSAを使用して測定される。ZFPの純度または活性についての補正がされない場合は、Kdの算出は、所定のZFPの真のKdの過大評価を生じ得る。好ましくは、遺伝子の転写を調節するために使用されるZFPのKdは、約100nM未満、より好ましくは約75nM未満、より好ましくは約50nM未満、最も好ましくは25nM未満である。用語VEGF遺伝子とは、一般的に、上記に記載されるような遺伝子のVEGFファミリーのいずれかのメンバー、またはネイティブなVEGFヌクレオチド配列を有するVEGFファミリー由来の遺伝子のコレクション、ならびに起源もしくは調製の様式に関わらず、改変体および改変された形態をいう。これらのVEGF遺伝子は、任意の供給源由来であり得る。代表的に、VEGF遺伝子とは、哺乳動物、特にヒト中のVEGF遺伝子をいう。ネイティブなヌクレオチド配列を有するVEGF遺伝子は、天然から入手されるVEGF遺伝子すなわち、天然に存在するVEGF遺伝子と同一なヌクレオチド配列を有する遺伝子である。さらに詳細には、この用語は、以下を含む:VEGF-Aイソ型VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-A189、およびVEGF-206を含む;VEGF-Bイソ型VEGF-B167、およびVEGF-B186を含む;VEGF-C;VEGF-D;VEGF-E背景の節で記載されるようなオルフウイルス株由来の種々のVEGF様タンパク質;VEGF-H;VEGF-R;VEGF-X;VEGF-138;およびPlGFPlGF-1およびPlGF-2の両方。この用語はまた、特定のイソ型の改変体を含む。例えば、この用語は、イソ型VEGF-145だけでなく、VEGF-145-I、VEGF-145-II、およびVEGF-145-IIIも含む。この用語はまた、対立遺伝子の改変体、選択的エキソンスプライシングから生じる他のイソ型、ネイティブな配列に機能的に等価である形態、およびネイティブなVEGF遺伝子に実質的に同一である核酸を包含する。より詳細には、この用語は、以下のVEGF遺伝子を包含する。VEGFVEGF-Aは、多くの研究者によって記載されてきた例えば、Leungら1989Science246:1306-1309;Keckら1989Science246:1309-1312;およびConnら1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2628-2632これらの各々はその全体において本明細書中に援用されるを参照のこと。VEGF-A189イソ型は米国特許第5,240,848号に、VEGF-A121イソ型は、米国特許第5,194,596号および同第5,219,739号に;そしてVEGF-A165イソ型は、米国特許第5,332,671号に開示され、これらの各々は、その全体が参考として援用される。VEGF-Bは、PCT公開WO96/26736、米国特許第5,840,693号、米国特許第5,607,918号、および米国特許第5,928,939号に記載され、これらの各々は、その全体が本明細書中に援用される。PCT公開WO96/27007およびWO00/09148、ならびにOlofssonら1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:2576-2581これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用されるもまた参照のこと。VEGF-Cは、Joukovら、1996EMBOJ.15:290-298、およびLeeら1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1988-1992、ならびに米国特許第5,935,820号;および米国特許第6,130,071号これらの各々は、その全体が本明細書中に援用されるに開示される。米国特許第5,776,755号および同第5,932,540号、ならびにPCT公開WO95/24473;WO96/39515;WO97/05250;WO97/09427;WO97/17442;WO98/33917;およびWO99/46364これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用されるもまた参照のこと。他の形態は、EP0476983B1;米国特許第5,994,300号および同第6,040,157号;ならびにPCT公開WO00/45835これらの各々は、その全体が参考として援用されるにおいて議論される。VEGF-Dは、PCT公開WO98/07832、WO98/24811;およびWO99/33485に記載される。VEGF-Dはさらに、Achenら1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:548-553に記載され、上記の各々は、その全体が本明細書中に援用される。EP0935001A1これは、その全体が本明細書中に援用されるもまた参照のこと。この用語はまた、本明細書中で集合的にVEGF-Eとして言及される、背景の節において記載される種々のウイルス性の形態を含む。このようなウイルス性VEGF様遺伝子は、OVNZ2、ORFV2-VEGF、OV-VEGF2およびVEGF-ENZ2Aとして文献中に多様に言及される、オルフウイルス株NZ2から単離された遺伝子を含む例えば、Lyttle,D.J.ら1994J.Virology68:84-92;およびPCT公開WO00/25805を参照のこと。株NZ7中で同定された遺伝子NZ7、OV-VEGF7、VEGF-EおよびVEGF-ENZ7と呼ばれるもまた含まれる。この遺伝子は、Lyttle,D.J.ら1994J.Virology68:84-92;およびOgawa,S.ら1998J.Biol.Chem.273:31273-31282中で議論される。PCT公開WO00/25805に開示されるNZ10もまた含まれる。オルフウイルス株D1701由来の遺伝子もまた含まれる例えば、Meyerら1999EMBOJ.18:363-74これは、その全体が本明細書中に参考として援用される。パラポックスウイルスpara-poxvirus由来の別のウイルス性VEGF様タンパク質は、PCT公開WO99/50290に開示されている。この用語はさらに、VEGF-Eとしても言及されている、哺乳動物のVEGF様タンパク質を含む例えば、WO99/4767を参照のこと。この用語はまた、PCT公開WO00/44903その全体が参考として援用されるで議論される、PDGF/VEGF様増殖因子H、または単にVEGF-Hと呼ばれる遺伝子を含む。VEGF-R例えば、その全体が参考として援用される、PCT公開WO99/37671を参照のことおよびVEGF-X例えば、その全体が本明細書中に参考として援用されるPCT公開WO00/37641を参照のこともまた含まれ、同時に、最近同定されたVEGF-138遺伝子も含まれる。胎盤増殖因子PlGFの種々のイソ型PlGF1およびPlGF2、もさらにこの用語に含まれる。この遺伝子およびこの遺伝子がコードするタンパク質を、単離および特徴付けるための方法は、Maglioneら1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9267-9271これは、その全体が本明細書中に参考として援用されるに記載される。Birkenhager,R.1996Biochem.J.316:703-707;Kao,Y.1997Biochem.Biophys.Res.Commun.235:493-498;Kao,Y.1996J.Biol.Chem.271:3154-3162;およびKlauss,M.1996J.Biol.Chem.271:17629-17634これらの各々は、その全体が参考として援用されるもまた参照のこと。上記に記載されるように、用語VEGF遺伝子は、ネイティブな配列のVEGF遺伝子に実質的に同一である核酸を含む。2つ以上の核酸またはポリペプチドに関連して、用語同一または同一性パーセントとは、例えば以下に記載されるような配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような、または目視検査によって測定されるような、最大の一致に対して比較および整列された場合の、同一である2つ以上の配列もしくは部分配列subsequenceをいうか、または同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する2以上の配列または部分配列をいう。2つ以上の核酸またはポリペプチドに関連して、句実質的に同一とは、例えば以下に記載されるような配列比較アルゴリズムを使用して測定されるような、または目視検査によって測定されるような、最大の一致に対して比較および整列された場合の、少なくとも75、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、95以上またはこれらの間任意の整数値のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する2つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約10残基長、好ましくは約20残基長、より好ましくは約40~60残基長またはそれらの間の任意の整数値の残基長である配列の領域にわたって、好ましくは60~80残基より長い領域にわたって、より好ましくは少なくとも約90~100残基にわたって存在し、そして最も好ましくは、これらの配列は、比較される配列の全長例えば、ヌクレオチド配列のコード領域のようなにわたって実質的に同一である。配列比較について、代表的に、ある配列が、参照配列として機能し、これに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピュータに入力され、部分配列の座標が指定され、そして必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、この配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。比較のために最適な配列のアライメントは、例えば、SmithWaterman、Adv.Appl.Math.2:4821981の局所的相同性アルゴリズム、NeedlemanWunsch、J.Mol.Biol.48:4431970の相同性アライメントアルゴリズム、PearsonLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:24441988の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、または目視検査一般的に、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel,F.M.ら編JohnWileySons,Inc.,NewYork1987-1999補遺461999年4月のような補遺を含むを参照のことによって実施され得る。配列の比較を実施するためのこれらのプログラムの使用は、代表的に、それぞれのプログラムについて特定のデフォルトのパラメータを使用して実施される。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-4101990に記載されるBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、NationalCenterforBiotechnologyInformationを通じて一般に入手可能である。このアルゴリズムは、第1に、問い合わせquery配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高いスコアの配列対HSPを同定することを含み、この短いワードは、そのデータベース配列中の同一の長さのワードと整列した場合、いくらかの正の値の閾値スコアTに一致するかまたは満たすかのいずれかである。これは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれるAltschulら、前出。これらの初期隣接ワードヒットは、検索を開始して、これらを含むより長いHSPを見出すためのシードとして機能を果たす。次いで、これらのワードヒットは、累積アライメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方の方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータM一致する残基対に対する報酬rewardスコア;常に0より大およびパラメータNミスマッチ残基に対するペナルティースコア;常に0より小を用いて算出される。アミノ酸配列に関しては、スコアリング行列を使用して累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下の場合に停止される:累積アライメントスコアが、その最大到達値から量Xだけ低下する場合;1つ以上の負のスコアリング残基アライメントの累積に起因して、累積スコアが0以下になる場合;またはいずれかの配列の末端に到達される場合。配列類似性を決定するために、BLASTプログラムのデフォルトのパラメータが適切である。BLASTNプログラムヌクレオチド配列に対しては、ワード長W11、期待値E10、M=5、N=4をデフォルトとして、そして両方の鎖の比較を利用する。アミノ酸配列に対して、BLASTPプログラムは、ワード長W3、期待値E10をデフォルトとして、そしてBLOSUM62スコアリング行列を利用する。TBLATNプログラムヌクレオチド配列に対してタンパク質配列を使用するは、ワード長W3、期待値E10をデフォルトとして、そしてBLOSUM62スコアリング行列を利用するHenikoffHenikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:109151989を参照のこと。配列同一性パーセントを算出することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する例えば、KarlinAltschul、Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-57871993を参照のこと。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定は、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する、最小和確率smallestsumprobabilityPNである。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、そして最も好ましくは約0.001未満である場合、核酸は、参照配列に対して類似するとみなされる。2つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。実質的にハイブリダイズするとは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、そしてこれは、最小のミスマッチを含み、このミスマッチは、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを減少させることによって調節され、標的ポリヌクレオチド配列の所望される検出を達成し得る。句特異的にハイブリダイズするとは、その配列が、例えば、総細胞性DNAまたはRNAの複雑な混合物に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ、分子が結合するか、二重鎖になるかまたはハイブリダイズすることをいう。2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。特定のポリヌクレオチド配列の保存的に改変された改変体とは、同一もしくは実質的に同一なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをいうか、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重に起因して、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGの全ては、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがあるコドンによって特定されている全ての位置で、このコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなしに、これらの記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸の改変体はサイレント改変体であり、このサイレント改変体は、保存的に改変された改変体の一種である。ポリペプチドをコードする、本明細書中に記載される全てのポリヌクレオチド配列はまた、他で言及される場合を除いて、全て可能性のあるサイレント改変体を記載する。当業者は、核酸中のそれぞれのコドン通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGを除いてが、標準的な技術によって改変されて、機能的に同一の分子を産生し得ることを理解する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント改変体は、記載される配列のそれぞれにおいて暗に示されている。ポリペプチドは、代表的に、例えば、2つのペプチドが保存的な置換によってのみ異なる場合、第2のポリペプチドに実質的に同一である。タンパク質を記載する場合、保存的置換とは、タンパク質の活性を実質的に変更しない、タンパク質のアミノ酸組成における変化をいう。従って、特定のアミノ酸配列の保存的に改変された改変体とは、タンパク質活性について重要でないアミノ酸のアミノ酸置換をいうが、または重要なアミノ酸の置換であっても、実質的に活性を変更しないような、類似の特性例えば、酸性、塩基性、正の荷電性または負の荷電性、極性または非極性などを有する他のアミノ酸でのアミノ酸の置換をいう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的な置換の表は、当業者に周知である。例えば、Creighton1984Proteins、W.H.FreemanandCompanyを参照のこと。さらに、コードされる配列中の単一のアミノ酸もしくは小さな割合のアミノ酸を、変更、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加もまた、保存的に改変された改変体である。用語VEGFタンパク質とは、VEGF遺伝子によってコードされるタンパク質をいい、そしてそのようなタンパク質の機能的等価物を含む。タンパク質、ポリペプチドもしくは核酸の機能的フラグメントまたは機能的等価物は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一の機能をなお保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的フラグメントは、対応するネイティブな分子より、多いか、少ないかもしくは同じ数の残基を有し得るか、そして/または、1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置換を含み得る。核酸の機能例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力、調節分子に対する結合を決定するための方法は、当該分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのDNA結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定され得る。Ausubelら、前出を参照のこと。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝的および生化学的両方の相補性によって決定され得る。例えば、Fieldsら1989Nature340:245-246;米国特許第5,585,245号およびPCTWO98/44350を参照のこと。用語核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドは、交換可能に使用され、そして一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをいう。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基部分、糖部分および/またはリン酸部分において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対形成特異性すなわち、Aのアナログは、Tと塩基対形成するを有する。従って、用語ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベース中に入力され得、そして機能的ゲノミックスおよび相同性検索のようなバイオインフォマティックスの適用のために使用され得る。この用語はさらに、合成的である、天然に存在する、および天然に存在しない、参照核酸と同様な結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは結合を含む核酸を包含する。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸PNAが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中において、ヌクレオチド配列は、慣用的な5’-3’方向で示される。染色質は、細胞性ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞性染色質は、核酸主に、DNAおよびタンパク質ヒストンおよび非ヒストン染色体性タンパク質を含むを含む。真核生物の細胞性染色質の大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、それぞれ2つのヒストンH2A、H2B、H3およびH4を含む8量体に結合した約150塩基対のDNA;およびヌクレオソームコアの間に伸長するリンカーDNA生物に依存して変動する長さのDNAを含む。ヒストンH1の分子は、一般的に、リンカーDNAに結合されている。本開示の目的のために、用語染色質は、原核生物および真核生物の両方の全ての型の細胞性核タンパク質を包含することを意味する。細胞性染色質は、染色体性およびエピソーム性の両方の染色質を含む。染色体は、細胞のゲノムの全てまたは一部分を含有する染色質複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その核型によって特徴付けられ、核型は、細胞のゲノムを含む全ての染色体のコレクションである。細胞のゲノムは、1つ以上の染色体を含有し得る。エピソームは、細胞の染色体性核型の部分ではない核酸を含有する、複製する核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよび特定のウイルスのゲノムが挙げられる。外因性分子は、細胞中に通常存在せず、1つ以上の遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。細胞中の正常な存在は、その細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に対しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能するバージョン、または通常に機能する内因性分子の機能不全のバージョンを含み得る。外因性分子は、数ある中で、コンビナトリアル化学のプロセスによって生成されるような低分子、もしくはタンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、ポリサッカリドのような高分子、上記分子の任意に改変された誘導体、または1つ以上の上記分子を含有する任意の複合体であり得る。DNAおよびRNAを含む核酸は、一本鎖または二本鎖であり得;直鎖状、分枝状または環状であり得;そして任意の長さの核酸であり得る。核酸には、二重鎖を形成し得る核酸、および三重鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第5,176,996号および同第5,422,251号を参照のこと。タンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:DNA結合タンパク質、転写因子、染色質再構築因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼ。外因性分子は、それが、内因性分子と異なる配列を有する場合、内因性分子と同一の型の分子例えば、タンパク質または核酸すなわち、外因性遺伝子であり得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、そしてこれらとしては、脂質媒介移入すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバートメント、リン酸カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン媒介移入およびウイルス性ベクター媒介移入が挙げられるが、これらに限定されない。対照的に、内因性分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で、特定の細胞中に通常存在する分子である。句転写開始部位に隣接するとは、転写開始部位の上流または下流のいずれかに約50塩基以内である標的部位をいう。転写開始部位の上流とは、転写開始部位から約50塩基越えて5’側すなわち、遺伝子の非転写領域内である標的部位をいう。転写開始部位の下流とは、転写開始部位から約50塩基越えて3’側である標的部位をいう。融合分子は、2つ以上のサブユニット分子が、連結されている代表的には、共有結合的に分子である。これらのサブユニット分子は、同一の化学的な分子の型であり得るか、または異なる化学的な型の分子であり得る。第1の型の融合分子の例としては、融合ポリペプチド例えば、ZFPDNA結合ドメインと転写活性ドメインとの間の融合および融合核酸例えば、上記記載の融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されない。第2の型の融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合体、および小溝結合因子minorgroovebinderと核酸との間の融合体が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物以下を参照のことをコードするDNA領域、および遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域そのような調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接するか否かに拘らずを含む。従って、遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入entry部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリクス結合部位および遺伝子座制御領域。遺伝子発現は、遺伝子中に含まれる情報の遺伝子産物への転換をいう。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAまたはRNAの任意の他の型、またはmRNAの翻訳によって生成されたタンパク質であり得る。遺伝子産物としてはまた、プロセス例えば、キャップ化、ポリアデニル化、メチル化、および編集によって改変されたRNA、および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質が挙げられる。遺伝子活性化は、遺伝子産物の生成の増加を生じる、任意のプロセスをいう。遺伝子産物は、RNAmRNA、rRNA、tRNAおよび構造RNAを含むが、これらに限定されないか、またはタンパク質のいずれかであり得る。従って、遺伝子活性化は、遺伝子の転写および/またはmRNAの翻訳を増大する、それらのプロセスを含む。転写を増大する遺伝子活性化プロセスの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:転写開始複合体の形成を促進するプロセス、転写開始速度を増大するプロセス、転写伸長速度を増大するプロセス、転写のプロセッシビティーprocessivityを増大するプロセス、および転写抑制を軽減するプロセス例えば、転写リプレッサーの結合のブロッキングによって。遺伝子活性化は、例えば、抑制の阻害、ならびに現在のレベルを超えるための発現の刺激から成り得る。翻訳を増大する遺伝子活性化プロセスの例としては、翻訳開始を増大するプロセス、翻訳伸長を増大するプロセスおよびmRNAの安定性を増大するプロセスが挙げられる。一般に、遺伝子活性化は、遺伝子産物の生成における任意の検出可能な増加を含み、ある場合には約2倍、他の場合には約2倍~約5倍またはその間の任意の整数、また他の場合には約5倍と約10倍との間またはその間の任意の整数、なお他の場合には約10倍と約20倍との間またはその間の任意の整数、時々約20倍と約50倍との間またはその間の任意の整数、他の場合には約50倍と約100との間またはその間の任意の整数、およびなお別の場合には100倍以上の間の、遺伝子産物の生成の増加である。遺伝子抑制および遺伝子発現の阻害は、遺伝子産物の生成の減少を生じる任意のプロセスをいう。遺伝子産物は、RNAmRNA、rRNA、tRNAおよび構造RNAが挙げられるが、これらに限定されないか、またはタンパク質のいずれかであり得る。従って、遺伝子抑制は、遺伝子の転写および/またはmRNAの翻訳を低下させるそれらのプロセスを含む。転写を低下させる遺伝子抑制プロセスの例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない:転写開始複合体の形成を阻害するプロセス、転写開始速度を減少させるプロセス、転写伸長速度を減少するプロセス、転写のプロセッシビティーを減少させるプロセスおよび転写活性化をアンタゴナイズするプロセス例えば、転写アクチベーターの結合をブロッキングすることによって。遺伝子抑制は、例えば、活性化の阻止、ならびに現在のレベルを下回る、発現の阻害から成り得る。翻訳を減少させる遺伝子抑制プロセスの例としては、翻訳開始を減少させるプロセス、翻訳伸長を減少させるプロセス、およびmRNA安定性を減少させるプロセスが挙げられる。転写の抑制は、遺伝子の転写の可逆的不活性化および不可逆的不活性化の両方を含む。一般に、遺伝子抑制は、遺伝子産物の生成における任意の検出可能な減少を含み、ある場合には約2倍、他の場合には約2倍~約5倍またはその間の任意の整数、またさらに他の場合には約5倍と約10倍との間またはその間の任意の整数、なお他の場合には約10倍と約20倍との間またはその間の任意の整数、時々約20倍と約50倍との間またはその間の任意の整数、他の場合には約50倍と約100との間またはその間の任意の整数、ならびになお他の場合には100倍以上の、遺伝子産物の生成の減損である。なお他の場合において、遺伝子抑制は、遺伝子発現の完全な抑制を生じ、その結果、1つの遺伝子産物も検出できない。調節は、活性またはプロセスのレベルまたは規模の変化をいう。この変化は、増加または減少のいずれかであり得る。例えば、遺伝子発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制の両方を含む。調節は、標的遺伝子の発現によって間接的または直接的に影響される任意のパラメーターを決定することによって、アッセイされ得る。このようなパラメーターとしては、例えば、以下が挙げられる:RNAレベルまたはタンパク質レベルの変化、タンパク質活性の変化、生成物レベルの変化、下流遺伝子発現の変化、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ、CAT、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質例えば、MistiliおよびSpector、NatureBiotechnology15:961~9641997を参照のこと転写の変化;シグナル伝達、リン酸化および脱リン酸化、レセプター-リガンド相互作用、二次メッセンジャー濃縮物例えば、cGMP、cAMP、IP3およびCa2、細胞増殖ならびに新血管形成の変化。これらのアッセイは、インビトロ、インビボおよびエキソビボであり得る。このような機能的効果は、例えば、以下のような当業者に公知である任意の手段によって、測定され得る:RNAレベルまたはタンパク質レベルの測定、RNA安定性の測定、下流遺伝子発現またはレポーター遺伝子発現の同定例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカー、リガンド結合アッセイを介する;細胞内二次メッセンジャー例えば、cGMPおよびイノシトール三リン酸IP3の変化;細胞内カルシウムレベルの変化;サイトカイン放出など。調節ドメインまたは機能的ドメインは、DNA結合ドメインすなわち、ZFPにテザー化された場合、転写調節活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。典型的に、調節ドメインは、転写調節をもたらすために例えば、融合分子を形成するために、ZFPに共有結合または非共有結合される。調節ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインであり得る。活性化ドメインとしては、核因子κ-BのVP16、VP64およびp65サブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。抑制ドメインとしては、KRAB、MBD2Bおよびv-ErbAが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる調節ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる:転写因子および補因子例えば、MAD、ERD、SID、初期増殖応答因子1および核ホルモンレセプター、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなど。アクチベーターおよびリプレッサーは、コアクチベーターおよびコリプレッサーを含む例えば、Utleyら、Nature394:498~5021998を参照のこと。あるいは、ZFPは、調節ドメインなしで単独で作用して転写調節をもたらし得る。用語作動可能に連結されたまたは作動的に連結されたは、2つ以上の成分例えば、配列エレメントの近位に関して使用され、これらの成分が配列され、その結果、両方の成分は、正常に機能し、そして、これらの成分の少なくとも1つ1つが機能他の成分の少なくとも1つに対して機能するを媒介し得る可能性を与える。例として、転写調節配列例えば、プロモーターが、1つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コーディング配列の転写レベルを制御する場合、この転写調節配列は、コーディング配列に作動的に連結される。作動的に連結された転写調節配列は、一般に、コーディング配列とcisで連結するが、そのコーディング配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは連続していないとしても、このエンハンサーは、そのコーディング配列に作動的に連結される転写調節配列を構成し得る。融合ポリペプチドに関して、用語作動可能に連結されたまたは作動的に連結されたは、成分の各々が、そのように連結されていない場合のように、他の成分との結合において同じ機能を行う事実をいう。例えば、ZFPDNA結合ドメインが転写活性化ドメインまたは、その機能的フラグメントに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいてZFPDNA結合ドメイン部分がその標的部位および/またはその結合部位に結合し得る一方、転写活性化ドメインその機能的フラグメントが転写を活性化し得る場合、ZFPDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインまたはその機能的フラグメントは、作動的に結合される。用語組換えは、細胞に関して使用される場合、その細胞が、外因性の核酸を複製するか、または外因性の核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞のネイティブ非組換え形態内では見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、細胞のネイティブ形態において見出される遺伝子を含み、ここで、この遺伝子は改変され、そして人為的手段によってこの細胞内へ再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を取出すことなしに改変された細胞に対して内因的である核酸を有する細胞を、含む;このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連した技術によって得られる改変が挙げられる。組換え発現カセット発現カセットまたは発現構築物は、組換え的に、または合成的に生成された核酸構築物であり、この核酸構築物は、このような配列に適合する宿主において、制御エレメントに作動的に連結された構造遺伝子の発現に影響し得る制御エレメントを有する。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、必要に応じて、転写終結シグナルを含む。典型的に、組換え発現カセットは、転写される少なくとも1つの核酸例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸およびプロモーターを含む。発現に影響を与える点で必要であるかまたは有用であるさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように、使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞から発現されたタンパク質の分泌を指向するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含む。遺伝子の発現に影響する転写終結シグナル、エンハンサーおよび他の核酸配列もまた、発現カセット中に含まれる。プロモーターは、転写を指向する核酸制御配列アレイとして定義される。本明細書中で使用する場合、プロモーターは、典型的に、転写開始部位に近位の必要な核酸配列例えば、特定のRNAポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメント、CCAATボックス、SP-1部位などを含む。本明細書中で使用する場合、プロモーターはまた、必要に応じて、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらのエレメントは、転写開始部位から数千塩基対の場所に位置し得る。プロモーターは、しばしば、DNA結合分子例えば、ポリペプチド例えば、核レセプター、Gal4、lacレセプターなどによるトランス活性化に応答するエレメントを有する。構成的プロモーターは、大部分の環境条件下および発生的条件下において活性であるプロモーターである。誘導性プロモーターは、特定の環境条件下および発生的条件下において活性であるプロモーターである。弱weakプロモーターとは、EisenbergおよびMcKnight、Mol.Cell.Biol.5:1940~19471985中に記載されるように、野生型の単純ヘルペスウイルスHSVチミジンキナーゼtkプロモーターまたは変異型HSVtkプロモーターとほぼ同様の活性を有するプロモーターをいう。発現ベクターは、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にし、そして、必要に応じて宿主細胞において発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え的にまたは合成的に生成される核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、もしくは核酸フラグメント、またはウイルス由来もしくは非ウイルス由来の一部であり得る。典型的に、発現ベクターは、発現カセットを含み、この発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された転写される核酸を含む。用語発現ベクターはまた、プロモーターに作動可能に連結された裸のDNAを含む。宿主細胞は、発現ベクターまたは核酸を含む細胞を意味し、これらのいずれかは、必要に応じて、ZFPまたはZFP融合タンパク質をコードする。宿主細胞は、典型的に、発現ベクターの複製または発現を補助する。宿主細胞は、原核細胞例えば、E.coliもしくは真核細胞酵母細胞、真菌細胞、原生生物細胞、高等植物細胞、昆虫または両生類細胞、または哺乳動物細胞CHO、HeLa、293、COS-1など例えば、培養細胞インビトロ、移植片および初代培養物インビトロおよびエキソビボ、およびインビボの細胞であり得る。ある物体に適用する場合、用語天然に存在するとは、この物体が、ヒトによって人為的に生成されたものを除いて、天然中に見出され得ることを意味する。用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸ならびに然に存在するアミノ酸ポリマーのアナログまたは模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用する。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の添加によって、改変され得る。用語ポリペプチドペプチドおよびタンパク質は、糖タンパク質ならびに糖タンパク質を含む。ポリペプチド配列は、従来のN末端からC末端の方向に、本明細書中で表示される。部分配列またはセグメントは、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸例えば、ポリペプチドのより長い配列の一部をそれぞれ含むヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をいう。用語虚血は、特定の領域例えば、組織または器官への不適切な血液供給に通常は閉塞に起因する局部的貧血の状態を広くいう。虚血は、血流の閉塞に関する種々の疾患例えば、冠状動脈疾患および末梢血管疾患peripheralvasculardiseaseに関連し得る。新脈管形成は、新しい血管が発達するプロセスを広くいう。このプロセスは、既知の血管由来の毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組織浸潤に関する。新脈管形成は、正常な生理学的プロセス例えば、小胞増殖、胚発達および創傷治癒において、および病態プロセス例えば、腫瘍増殖および腫瘍転移において重要である。用語調節は、生理学的プロセスの範囲、持続期間、レベルまたは特性における変化をいう。例えば、新脈管形成の調節は、新しい血管の形成の増加または新しい血管形成の減少を含み得る。新脈管形成の調節はまた、非浸透性血管または非高浸透性血管の形成の刺激をいい得る。新脈管形成のための種々のアッセイが、以下に記載される。本明細書中で使用する場合、用語処理することおよび処理は、症状の重篤度および/または頻度の減少、症状および/または根本的原因の排除、症状および/またはそれらの根本的原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または治療をいう。薬学的組成物の有効量または、治療有効量は、所望の効果を提供するための因子の十分な量であるが非毒性的な量を意味する。この用語は、被験体を処理するのに十分な量をいう。従って、用語治療量は、疾患または全く所望されない任意の他の症状の進行を予防すること、妨げること、遅延すること、または覆すことによって、疾患の状態または症状を治療するのに十分な量をいう。用語予防有効量は、まだ疾患を有していない被験体に与えられた量をいい、従って、予防有効量は、疾患の発症を予防、防御または遅延するのに有効的な量である。創傷は、任意の組織の外傷を広くいう。創傷は、外傷例えば、暴力、事故または手術によって引き起こされたから生じ得る。創傷は、下にある組織に対する損傷を有する上皮層例えば、皮膚の裂傷または断裂を含み得る。II.概要種々の方法が、新脈管形成を調節するためおよび虚血を処理するために、本明細書中で提供される。ある場合には、このような方法は、細胞または細胞集団例えば、生物体においてと、1つ以上のVEGF遺伝子中の特定の配列に結合する1つ以上のジンクフィンガータンパク質ZFPを接触させることに関する。特定の方法において、あるZFPは投与され、そして、異なるVEGF遺伝子中の標的部位例えば、VEGF-A、VEGF-BおよびVEGF-C中の標的部位に結合し得る。他の方法は、特定の遺伝子内の複数の標的部位に結合する複数の異なるZFPを投与することに関する。従って、特定の核酸セグメント標的部位を特異的に認識および結合し、それによって、1つ以上のVEGF遺伝子の発現を調節するように操作された種々のジンクフィンガータンパク質もまた本明細書中で提供される。1つの実施形態において、ZFPは、VEGF遺伝子の転写を活性化または抑制するようなキメラ転写因子を作製するために、調節ドメインに連結される。このようなZFPを用いて、特定のVEGF遺伝子の発現が増強される;他の特定のZFPを用いて、発現が抑制され得る。一般に、ZFPが結合する標的部位は、VEGF遺伝子の発現の活性化または抑制を生じる部位である。標的部位は、転写開始部位ヌクレオチド0として定義されるの近傍、上流および/または下流であり得る。上記で示したように、本ZFPのいくつかは、単一のVEGF遺伝子の発現を調節する。他のZFPは、複数のVEGF遺伝子の発現を調節する。従って、利用される特定のZFP単数および複数に依存して、ある者は、1つ以上のVEGF遺伝子が発現されるレベルを調整する。さらに、複数のZFPまたはZFP融合分子明瞭な標的部位を有するは、単一のVEGF遺伝子を調節するために使用され得る。標的部位に結合し、そしてVEGF遺伝子の発現VEGF遺伝子の多様な機能も一緒にに影響するようなZFPの能力の効果によって、本明細書中で提供されるZFPは、多種多様な適用において使用され得る。一般に、ZFPは、増殖の活性化または抑制のいずれかによって、種々の内皮細胞の増殖を調節するために使用され得る。特定の適用において、ZFPが使用され得、VEGF遺伝子の発現を活性化し、インビトロおよびインビボの両方で、細胞集団中で有利な新脈管形成を誘発する。このような活性化は、例えば、虚血状態の処理において新しい血管および毛細血管の形成を促進するために、利用され得る。例えば、ZFPは、種々の動脈閉塞または静脈閉塞のいずれかを有する個人例えば、関節硬化症を有する個人における副行循環の発育を刺激するために使用され得る。ZFPはまた、リンパ球生成リンパ管の形成および骨髄造血骨髄の組織エレメントおよび/または骨髄由来の血球の型の形成を促進するために使用され得、そして、創傷中の血管および組織の再生のために使用され得る。他の方法は、新脈管形成の抑制に関する。従って、VFGF遺伝子の発現を抑制するために本明細書中で提供される特定のZFPを利用する能力は、他の場合において有用であり得る。例えば、ZFPは内皮の増殖が所望されない場合例えば、腫瘍に対するさらなる血管の形成をブロックする際、病理学例えば、糖尿病網膜症および関節炎に関連する病理学的新脈管形成における微小血管系の増殖を防止する際に、このような増殖を防ぐために投与され得る。ZFPはまた、治療的適用以外の適用において使用され得る。例えば、ZFPは、VEGF遺伝子発現の活性化または抑制のいずれかに対抗し得る因子をスクリーニングするために使用し得る。ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列もまた、本明細書中で記載される。さらに、スクリーニング法を介して同定された因子ZFPをコードする核酸および/またはZFP自身は、種々の障害例えば、まさに記載された障害を処理するための薬学的組成物中で利用され得る。III.遺伝子発現を調節するためのジンクフィンガータンパク質A.一般本明細書中で開示されるジンクフィンガータンパク質ZFPは、配列特異的様式でDNAに結合し得るタンパク質である。前に示したように、これらのZFPは、種々の適用新脈管形成の調節を含むにおいて、および虚血の処理において使用し得る。これらのタンパク質の1クラスC2H2クラスを特徴付ける例示的なモチーフは、-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-5-HisXは任意のアミノ酸配列番号208である。いくつかの構造研究は、フィンガードメインが2つの不変ヒスチジン残基を含むαヘリックス、および亜鉛を介して配位されるβターン中の2つの不変システイン残基を含むことを実証した。しかし、本明細書中で提供されるZFPは、この特定のクラスには限定されない。ジンクフィンガータンパク質のさらなるクラスが公知であり、そして、本明細書中で開示される方法および組成物において使用もされ得る例えば、Rhodesら1993ScientificAmerican268:56~65を参照のこと。特定のZFPにおいて、単一のフィンガードメインは、約30アミノ酸長である。ジンクフィンガードメインは、DNA認識にのみならず、RNA結合およびタンパク質-タンパク質結合にも関連する。Zif268マウスの転写因子由来の3つのフィンガードメインのX線結晶構造は、同系のDNA配列を用いた複合体において解析され、そして、各フィンガーが周期的な回転によって次へ重ね合わせられ得るということを示した。この構造は、各フィンガーが3塩基対の間隔にわたりDNAと独立して相互作用することを示唆し、この相互作用は、各認識ヘリックス上の1位、2位、3位および6位での側鎖を用いて、それらの各DNA三重サブサイトと接触する。Zif268のアミノ末端は、このアミノ末端が最も接触するDNA鎖の3’末端に位置される。いくつかのジンクフィンガーは、標的セグメントの4番目の塩基に結合し得る。ジンクフィンガータンパク質が最も接触する鎖が標的鎖と指定される場合、いくつかのジンクフィンガータンパク質は標的鎖中の3つの塩基トリプレットthreebasetriplet、および非標的鎖上の4番目の塩基に結合する。4番目の塩基は、3つの塩基のサブサイトのすぐ3’の塩基に対して相補的である。B.例示的なZFPVEGF遺伝子を含む核酸上の特定の標的部位に結合するZFPが、本明細書中に開示される。従って、ZFPが本明細書中で提供される標的部位に結合する場合、このZFPは、アミノ酸組成物が変化している種々の異なる成分のフィンガーを含み得る。いくつかのVEGF遺伝子における標的部位の位置が表2中に与えられ、そして、この標的部位の部分配列が以下の表3および表4中これらの2つの表の各々における標的と表示された2列目中に記載される。特定のVEGF遺伝子についての転写開始部位は、まだ正確に確立されていない。従って、以下のVEGF遺伝子について表2中に列挙された位置は、この転写開始部位が以下:のような特定のGenBank登録について示された位置であるということを想定する。上記で示したように、標的部位は、転写開始部位ヌクレオチド0として定義されるの上流または下流に位置し得る。標的部位のいくつかは9個のヌクレオチドを含む表3を参照のこと一方、他の部位は、18個のヌクレオチドを含む表4を参照のこと。これらの標的部位の1つの特徴は、ZFPまたはZFPおよび1つ以上の調節ドメインを含む融合タンパク質の標的部位への結合は、1つ以上のVEGF遺伝子の発現レベルに影響し得るということである。上記で定義したように、本明細書中で提供されるZFPによって調節され得るVEGF遺伝子としては以下が含まれるが、これらに限定されない:VEGF-Aイソ型であるVEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-A189およびVEGF-A206を含む、VEGFBイソ型であるVEGF-B167およびVEGF-B186を含む、VEGFC、VEGFD、ウイルスVEGF様タンパク質ウイルスVEGF-Eおよび哺乳動物VEGF-E、VEGF-H、VEGF-R、VEGF-X、VEGF-138およびP1GFP1GF-1およびP1GF-2を含む。標的部位は、転写開始部位に隣接して位置し得るか、または転写開始部位よりも有意に上流もしくは下流に位置し得る。いくつかの標的部位は単一のVEGF遺伝子内に位置し得、その結果、ZFPの標的への結合は、単一のVEGF遺伝子の発現に影響する。他の標的部位は複数のVEGF遺伝子内に位置し、その結果、単一のZFPの結合は、複数の遺伝子の発現を調節し得る。さらなる他の場合、各々が同一遺伝子中の標的を認識する複数のZFPが、使用され得る。標的部位に結合するZFPは、典型的に、少なくとも1つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー例えば、2,3,4,5,6以上のフィンガーを含み得る。通常、ZFPは少なくとも3つのフィンガーを含み得る。特定のZFPは6つのフィンガーを含み得る。3つのフィンガーを含むZFPは、典型的に9または10ヌクレオチドを含む標的部位を認識する;6つのフィンガーを有するZFPは、18~20ヌクレオチドを含む標的部位を認識し得る。ZFPはまた、1つ以上の調節ドメインこのドメインは、転写の活性化ドメインまたは抑制ドメインであり得るを含む融合タンパク質であり得る。表3および表4は、多くの異なるZFPのアミノ酸配列、およびそのZFPが結合する対応する標的部位を示す。表3は、9ヌクレオチドを含む標的部位に結合するZFPを列挙する。この表中の1番目の列は、ZFPの内部基準名を列挙する。列2は、3つのフィンガーのジンクフィンガータンパク質によって結合される9塩基の標的部位5’から3’の方向で記載される標的部位を含む。標的部位に関して対応する配列番号が、列3に記載される。認識に関与する3つのジンクフィンガー成分の部分のアミノ酸配列は、列4、列6および列8に列挙され、そして、これらに対応する配列番号が、各々、列5、列7および列9に各々列挙される。ジンクフィンガーの番号付けの規定は、以下で定義される。列10は、いくつかのZFP/標的部位複合体の解離定数を列挙する。このような定数を決定するための方法は、以下に記載される。クロス鎖の相互作用を除外することで、各フィンガーは、対応する標的配列の範囲内でトリプレットの塩基標的サブサイトに結合する。第1のフィンガーは標的の3’末端から第1のトリプレット開始部位に結合し、第2のフィンガーは、第2のトリプレットに結合し、そして、第3のフィンガーは標的配列の第3のトリプレットすなわち最も5’側に結合する。従って、例えば、ZFPBVO13AのRSDHLARフィンガー配列番号30表3の1番目の列は5’GGG3’に結合し、DRSNLTRフィンガー配列番号36は5’GAC3’に結合し、そして、RSDALTQフィンガー配列番号88は5’ATG3’に結合する。表4は、VEGF遺伝子を標的とする6つのフィンガーZFPの情報を提供する。表4は、表3と類似の型式であり、列1はZFPの内部標準名を示す。しかし、表3とは対照的に、表4の列2は、6つのフィンガータンパク質によって認識される18塩基の標的部位を示しここで、標的はまた5’から3’の方向に列挙される、対応する配列番号を列3に列挙する。認識に関与する6つのジンクフィンガー成分の部分のアミノ酸配列は、列4、列6、列8、列10、列12および列14中に列挙され、関連する配列番号が列5、列7、列9、列11、列13および列15に各々記載される。この型のZFPでは、第1のフィンガーは標的部位の3’末端から第1トリプレット開始部位に結合し、第2のフィンガーは、第2のトリプレットに結合し、第3のフィンガーは第3のトリプレットに結合し、第4のフィンガーは第4のトリプレットに結合し、第5のフィンガーは第5のトリプレットに結合し、そして、第6のフィンガーは標的配列の第6のトリプレットすなわち最も5’側に結合するこの場合もクロス鎖の相互作用を除外する。ここで、BVO10A-9Aと名付けられたZFPについて、第1のフィンガーQSSDLRR配列番号120は5’GCT3’に結合し、第2のフィンガーRSDHLTR配列番号123は5’GGG3’に結合し、第3のフィンガーDRSALAR配列番号126は5’GTC3’に結合し、第4のフィンガーRSDHLAR配列番号129は5’GGG3’に結合し、第5のフィンガーRSDNLAR配列番号132は5’GAG3’に結合し、そして、第6のフィンガーRSDALTR配列番号135は5’GTG3’に結合する。従って、本明細書中で提供されるZFPについてのいくつかの標的部位、およびこのようなZFPの特定の例が、表3および4に開示される。潜在的な標的部位について試験されたVEGF遺伝子のセグメントまたは領域は、表1に示される。表1に列挙される数は、標的部位を同定するために試験された種々のVEGF遺伝子についての転写開始部位に関する開始塩基および終止塩基kbpをいう。負の数は、転写開始部位の上流のkbpをいい、そして正の数は、転写開始部位の下流のkbpをいい、ここで、転写開始部位は、ヌクレオチド0として定義される。標的部位について試験されたVEGF配列としては、VEGF-AGenBankアクセス番号AF095785を参照のこと、VEGF-BGenBankアクセス番号U80601、-0.4kbから0.32kbを参照のこと、VEGF-CGenBankアクセス番号AF020393を参照のことおよびVEGF-D遺伝子HSU69570およびHSY12864を参照のことについての配列、ならびにP1GFGenBankアクセス番号AC015837を参照のことおよびウイルスのVEGF-E遺伝子GenBankアクセス番号AF106020およびMeyer,M.ら1999EMBOJ.18:363-74;GenBankアクセス番号S67520およびLyttle,D.J.ら1994J.Virol.68:84-92;およびGenBankアクセス番号AF091434を参照のことについての配列が挙げられる。これらの各遺伝子についての配列を提供する参考文献は、前に列挙される。従って、例えば、表1を参考とすると、標的部位について試験されるVEGF-A遺伝子のヌクレオチド配列は、転写開始部位の2.3kb上流から転写開始部位の1.1kb下流に広がる。種々のVEGF遺伝子における特定のZFPについての標的部位の位置は、表2に要約される。この表における1欄目は、ZFPについての内部基準名であり、そして表3および4の1欄目中の同じ名前に対応する。種々のVEGF遺伝子配列における標的部位の5’末端の位置は、残りの欄に列挙される。さらに、負の数は、転写開始部位ヌクレオチド0として定義されるの上流のヌクレオチドの数をいい、その一方で、正の数は、転写開始部位の下流のヌクレオチドの数を示す。故に、VEGFAヌクレオチド配列においてBVO13A表2の1列目と命名されたZFPについての標的部位5’末端は、VEGFAについての主な転写開始部位の851塩基下流に位置されるヌクレオチドで始まる。特定の標的部位が、複数のVEGF遺伝子中に現れる。例えば、VEGFAヌクレオチド配列においてVG4Aと命名されたZFPについての標的部位5’末端は、VEGFAについての転写開始部位の1083塩基上流に位置されるヌクレオチドで始まる。同じ標的部位5’末端はまた、VEGFBについての転写開始部位の上流のヌクレオチド31およびVEGFCについての転写開始部位の252塩基上流のヌクレオチドで始まる。特定のZFPは、単一のVEGF遺伝子において1つを超える標的部位を有し;例えば、EP10Aは、VEGFA遺伝子において2つの標的部位を有する表2を参照のこと。結果として、前出で示されるように、本明細書中に記載される特定のZFPは、単一のVEGF遺伝子の活性を調節することによって脈管形成を調節するために利用され得、その一方で、他のZFPは、複数の遺伝子の発現を制御するために利用され得る。例えば、VG8AといわれるZFPは、表2に列挙される各VEGF遺伝子について結合部位を有し、従って、種々のVEGF遺伝子の発現を制御するために同時に利用され得る。本明細書中で提供される種々のZFPの賢明な選択および/またはそれらの組合せによって、VEGF遺伝子が調節されるように調整され得る。IV.ZFPの特徴ジンクフィンガータンパク質は、ジンクフィンガー成分から形成される。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、1~37のフィンガーを有し得、通常2、3、4、5または6のフィンガーを有する。ジンクフィンガータンパク質は、標的遺伝子内で比較的小さい部分配列を表す標的部位時折、標的セグメントといわれるを認識し、そして結合する。ジンクフィンガータンパク質の各成分フィンガーは、標的部位内のサブサイトに結合し得る。このサブサイトは、同じ鎖時折、標的鎖といわれる上にある3つの連続する塩基のトリプレット全てを含む。このサブサイトはまた、標的鎖上の3つの連続する塩基のすぐ3’側の塩基の相補体である反対の鎖上の第4番目の塩基を含んでもよいし、含まなくてもよい。多くのジンクフィンガータンパク質において、ジンクフィンガーは、同じジンクフィンガータンパク質における他のフィンガーに実質的に独立のトリプレットのサブサイトに結合する。従って、複数のフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質の結合特異性は、通常ほとんどその成分フィンガーの特異性の凝集体である。例えば、ジンクフィンガータンパク質が、トリプレットXXX、YYYおよびZZZに独立して結合する、第1、第2および第3のフィンガーから形成される場合、このジンクフィンガータンパク質の結合特異性は、3’XXXYYYZZZ5’である。N末端からC末端へのジンクフィンガータンパク質におけるフィンガーの相対順序は、標的における3’から5’方向へのトリプレットの相対順序を決定する。例えば、ジンクフィンガータンパク質が、N末端からC末端の、それぞれ5’GAC3’、5’GTA3’および5’GGC3’のトリプレットに独立して結合する、第1、第2および第3のフィンガーを含む場合、ジンクフィンガータンパク質は、標的セグメント3’CAGATGCGG5’配列番号209に結合する。ジンクフィンガータンパク質が、別の順序例えば、第2のフィンガー、第1のフィンガー、第3のフィンガーにおいてフィンガーを含む場合、ジンクフィンガータンパク質は、異なる順列のトリプレット、例として3’ATGCAGCGG5’配列番号210を含む標的セグメントに結合する。BergShi、Science271、1081~10861996を参照のこと。いくつかの場合において、その成分フィンガーの凝集体としてのジンクフィンガータンパク質の結合特性の評価は、同じタンパク質における複数のフィンガー結合のコンテキスト依存の相互作用によって影響され得る。2つ以上のジンクフィンガータンパク質は、ジンクフィンガータンパク質成分の凝集体である標的特異性を有するように結合し得る例えば、KimPabo、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95、2812~28171998を参照のこと。例えば、XXX、YYYおよびZZZにそれぞれ結合する第1、第2および第3の成分フィンガーを有する第1のジンクフィンガータンパク質は、AAA、BBBおよびCCCへの結合特性を有する第1、第2および第3の成分フィンガーを有する第2のジンクフィンガータンパク質に結合され得る。従って、結合した第1および第2のタンパク質の結合特性は、3’XXXYYYZZZAAABBBCCC5’であり、ここで、下線は、短い介在性領域を示す典型的には、0~5塩基の任意の型。この局面において、標的部位は、介在セグメントによって分離される2つの標的セグメントを含むとみなされ得る。結合は、任意の以下のペプチドリンカーを用いて達成され得る。TGEKP:配列番号211Liuら、1997、前出;G4Sn配列番号212Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:1156~11601996;GGRRGGGS;配列番号213LRQRDGERP;配列番号214LRQKDGGGSERP;配列番号215LRQKDG3S2ERP配列番号216。あるいは、可撓性のリンカーは、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングし得るコンピュータプログラムを用いてか、またはファージディスプレイ方法によって合理的に設計され得る。さらなるバリエーションにおいて、非共有結合は、2つのジンクフィンガータンパク質と、この2つのジンクフィンガータンパク質のヘテロ二量体形成を促進するドメインとを融合することによって達成され得る。例えば、1つのジンクフィンガータンパク質は、fosと融合され得、そして他のジンクフィンガータンパク質はjunと融合され得るBarbasら、WO95/119431を参照のこと。2つのジンクフィンガータンパク質の結合は、哺乳動物のゲノム内に特有の結合特異性を与えるために有利である。典型的な哺乳動物の2倍体ゲノムは、3×109bpからなる。4つのヌクレオチドA、C、G、およびTが、ランダムに分布されていると仮定すると、与えられた9bpの配列は、約23,000回存在する。従って、絶対的な特異性を有する9bpの標的を認識するZFPは、ゲノム内の約23,000の部位に結合する潜在性を有する。18bpの配列は、3.4×1010bpに1回存在するか、またはその複雑性が、哺乳動物のゲノムの10倍であるランダムDNA配列中に約1回存在する。ジンクフィンガータンパク質の成分フィンガーは、代表的に約30のアミノ酸を含み、そして1つの実施形態において、以下のモチーフN-Cを有する:Cys-X2-4-Cys-X.X.X.X.X.X.X.X.X.X.X.X.-His-X3-5-His-11234567単一のβターンにおける2つの不変のヒスチジン残基および2つの不変のシステイン残基は、亜鉛原子を介して配位されている例えば、BergShi、Science271、1081-10851996を参照のこと。上記のモチーフは、ジンクフィンガーに与える結合特異性の領域についての分野における標準である番号付けの慣習を示す。第1の不変のHis残基の左側N末端側にあるアミノ酸は、6番と指定され、そして左にあるさらに他のアミノ酸は、逐次減少した番号を割当られる。αヘリックスは、残基1で始まり、そして第2の保存されたヒスチジンに続く残基へと伸長する。それ故、ヘリックスの全体は、可変性の長さ11残基と13残基との間である。V.ZFPの設計本明細書中で提供されるZFPは、VEGF遺伝子における選択された標的部位を認識するように設計される例えば、表3、4および6に示されるように。ZFPを設計または選択するプロセスは、代表的にフレームワーク残基の供給源として天然のZFPを用いて開始する。設計または選択のプロセスは、所望される結合特性を与えるために非保存位置すなわち、-1~6の位置を定義するために役立つ。1つの適切なZFPは、マウス転写因子Zif268のDNA結合ドメインである。このタンパク質のDNA結合ドメインは、アミノ酸配列:YACPVESCDRRFSRSDELTRHIRIHTGQKPF1配列番号217FQCRICMRNFSRSDHLTTHIRTHTGEKPF2配列番号218FACDICGRKFARSDERKRHTKIHLRQKF3配列番号219を有し、そして標的5’GCGTGGGCG3’配列番号220に結合する。フレームワーク残基の供給源としての別の適切な天然のジンクフィンガータンパク質は、Sp-1である。ジンクフィンガータンパク質の構築のために用いられるSp-1配列は、Sp-1転写因子におけるアミノ酸531~624に対応する。この配列は、94アミノ酸の長さである。Sp-1のアミノ酸配列は、以下のようである:配列番号221Sp-1は、標的部位5’GGGGCGGGG3’配列番号222に結合する。Sp-1の代替の形態、Sp-1コンセンサス配列は、以下のアミノ酸配列を有する:配列番号223小文字は、ShiBerg,ChemistryandBiology1,83-89.1995からのリーダー配列である。Sp-1コンセンサス配列に対する必要に応じた結合配列は、5’GGGGCGGGG3’配列番号222である。他の適切なZFPが、以下に記載される。いくつかのジンクフィンガータンパク質の合理的な設計を助ける多くの置換の法則がある。例えば、ZFPDNA結合ドメインは、共有に係るWO00/42219;WO00/41566;および1999年11月19日に出願された米国特許出願番号09/444,241;2000年3月23日に出願された米国特許出願番号09/535,088;ならびに米国特許第5,789,538号;同第6,007,408号;同第6,013,453号;同第6,140,081号;同第6,140,466号;ならびにPCT公開番号WO95/19431、WO98/54311、WO00/23464およびWO/27878に記載されるような特定の標的部位を認識するために設計および/または選択され得る。1つの実施形態において、ジンクフィンガーDNA結合ドメインについての標的部位は、共有に係るWO00/42219に開示される部位選択の法則に従って同定される。1つの好ましい実施形態において、ZFPは、共有に係る2000年11月20日に出願された米国特許出願番号09/716,637、表題IterativeOptimizationintheDesignofBindingProteinsに記載されるように選択される。WO96/06166;DesjarlaisBerg,PNAS90,2256-22601993;ChooKlug,PNAS91,11163-111671994;DesjarlaisBerg,PNAS89,7345-73491992;Jamiesonら、Biochemistry33:5689-56951994;およびChooら、WO98/53057,WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060もまた参照のこと。これらの法則の多くは、遍在する転写因子、Sp-1DesjarlaisおよびBerg,1992;1993の3つのフィンガードメインの部位特異的変異誘発によって支持される。これらの法則の1つは、DNAトリプレットにおける5’Gが、認識ヘリックスの6位にアルギニンを取込んでいるジンクフィンガーによって結合され得ることである。別の置換の法則は、サブサイトの中間におけるGが、ジンクフィンガーの3位にヒスチジン残基を含むことによって認識され得ることである。さらなる置換の法則は、アスパラギンが、トリプレットの中間におけるAを認識するように取込まれ得、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンまたはスレオニンが、トリプレットの中間におけるCを認識するように取込まれ得、そして小さい側鎖を有するアミノ酸例えば、アラニンが、トリプレットの中間におけるTを認識するように組み込まれ得ることである。さらなる置換の法則は、トリプレットサブサイトの3’塩基が、以下のアミノ酸を認識ヘリックスの-1位に取込むことによって認識され得ることである:Gを認識するようにアルギニンを、Aを認識するようにグルタミンを、Cを認識するようにグルタミン酸またはアスパラギン酸を、およびTを認識するようにスレオニンを。これらの置換法則は、ジンクフィンガータンパク質の設計において有用であるが、これらは、全ての可能な標的部位に配慮しない。さらに、法則の根底にある仮定、すなわちジンクフィンガーにおける特定のアミノ酸が、サブサイトにおける特定の塩基に結合する原因であることは、概算にすぎない。フィンガーにおける近位のアミノ酸の間のコンテキスト依存の相互作用または単一塩基への複数のアミノ酸の結合もしくはその逆は、置換の法則の存在によって予想される結合特異性のバリエーションを生じ得る。従って、特定の実施形態において、予め決定された特異性のZFPDNA結合ドメインは、共有に係る2000年11月20日に出願された、表題IterativeOptimizationintheDesignofBindingProteinsの米国出願番号09/716,637に記載される方法に従って、得られる。当該分野において公知の任意の適切な方法が、ZFPをコードする核酸を設計および構築するために使用され得る例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ/合理的設計、親和性選択、PCR、cDNAまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的な構築など例えば、米国特許第5,786,538号;Wuら、PNAS92:344-3481995;Jamiesonら、Biochemistry33:5689-56951994;RebarPabo,Science263:671-6731994;ChooKlug,PNAS91:11163-111671994;ChooKlug,PNAS91:11168-111721994;DesjarlaisBerg,PNAS90:2256-22601993;DesjarlaisBerg,PNAS89:7345-73491992;Pomerantzら、Science267:93-961995;Pomerantzら、PNAS92:9752-97561995;およびLiuら、PNAS94:5525-55301997;GriesmanPabo,Science275:657-6611997;DesjarlaisBerg,PNAS91:11-99-111031994を参照のこと。特定の好ましい実施形態において、DNA結合ドメイン例えば、ZFPDNA結合ドメインの結合特異性は、問題の配列例えば、細胞のクロマチン中において接近可能な領域を同定することによって決定される。接近可能な領域は、共有に係る2000年8月28日に出願されたDatabasesofAccessibleRegionSequences;MethodsofPreparationandUseThereofと表された米国特許出願番号60/228,556に記載されるように決定され得、この開示は、本明細書中で参考として援用される。実施例1もまた参照のこと。次いで、DNA結合ドメインが、接近可能な領域内の標的部位に結合するために本明細書中に記載されるように設計および/または選択される。VI.ジンクフィンガータンパク質の生成A.合成およびクローニングZFPポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードするZFP核酸は、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を用いて作製され得る。一般的方法を開示する基本のテキストとしては、Sambrookら、MolecularCloning,ALaboratoryManual第2版、1989;Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual1990;およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、編1994が挙げられる。さらに、約100塩基よりも少ない核酸は、任意の種々の商業的供給源例えば、TheMidlandCertifiedReagentCompanymcrcoligos.com、TheGreatAmericanGeneCompanyhttp://www.genco.com、ExpressGenInc.www.expressgen.com、OperonTechnologiesInc.Alameda,CAからカスタムオーダーされ得る。同様に、ペプチドは、任意の種々の供給源例えば、PeptidoGenicpkimccnet.com、HTIBio-products,inc.http://www.htibio.com、BMABiomedicalsLtdU.K.Bio.Synthesis,Inc.からカスタムオーダーされ得る。オリゴヌクレオチドは、VanDevanterら、NucleicAcidsRes.12:6159-61681984に記載されるように自動化合成機を用いて、最初にBeaucageCaruthers,TetrahedronLetts.22:1859-18621981に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル方法に従って、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、または逆相HPLCのいずれかによる。クローン化された遺伝子の配列および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallaceら、Gene16:21-261981の二本鎖鋳型の配列決定のためのチェーンターミネーション法を用いたクローニング後、確認され得る。2つの代替の方法が、代表的に、新しく設計されたDNA結合ペプチドを発現するために必要とされるコード配列を作製するために使用される。1つのプロトコルは、6つの重複するオリゴヌクレオチドを利用するPCRベースのアセンブリ手段である。3つのオリゴヌクレオチドが、認識ヘリックスの間のDNA結合ドメインの部分をコードするユニバーサル配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的に、全てのジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の3つの特異的なオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックス上の1位、2位、3位および6位に主にある置換基を含み、これは、それぞれの異なるDNA結合ドメインに特異的である。PCR合成は、2工程において実行される。第1に、二本鎖のDNAの鋳型が、低温のアニーリング工程を用いて4サイクルのPCR反応で6つのオリゴヌクレオチド3つは、ユニバーサル、3つは特異的を結合することによって作製され、これによって、オリゴヌクレオチドをアニーリングしてDNA骨格scaffoldを形成する。骨格中のギャップは、高忠実度の耐熱性ポリメラーゼによって埋められ、TaqポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼの組合せもまた充分である。構築の第2期において、ジンクフィンガーテンプレートは、シャトルベクターまたは直接発現ベクターにクローン化するためにいずれかの末端に制限部位を組込むように設計された外部プライマーによって増幅される。新しく設計されたDNA結合タンパク質をクローニングする代替の方法は、所望されるZFPの特定の領域をコードする相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程に依存する。この特定の適用は、オリゴヌクレオチドが、最後のライゲーション工程の前にリン酸化されることを必要とする。これは、通常アニーリング反応を設定する前に実行される。簡潔には、タンパク質の定常領域をコードするユニバーサルオリゴヌクレオチド上記のオリゴ1、2および3が、その相補的オリゴヌクレオチドとアニーリングされる。さらに、フィンガー認識ヘリックスをコードする特異的オリゴヌクレオチドは、そのそれぞれの相補的オリゴヌクレオチドとアニールされる。これらの相補的オリゴは、上記のプロトコルにおいてポリメラーゼによって予め埋められた領域を埋めるように設計される。オリゴ1および6に相補的なオリゴヌクレオチドは、以下の工程において選択されたベクターへのクローニングに使用される制限部位に特異的なオーバーハング配列を残すように設計される。第2のアセンブリプロトコルは、以下の局面において、最初のプロトコルと異なる:新しく設計されたZFPをコードする骨格は、合成DNAから完全に構成され、これによって、ポリメラーゼ埋め込み工程をはぶき、さらにフラクメントを、増幅を必要としないベクター中にクローン化する。最後に、配列特異的オーバーハングを残す設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化のために必要である。あるいは、ZFP認識ヘリックスに対する変化は、従来の部位特異的変異誘発方法を用いて作製され得る。両方のアセンブリ方法は、新しく設計されたZFPをコードする生じた断片が、ベクター中にライゲーションされることを必要とする。最終的に、ZFPコード配列は、発現ベクター中にクローン化される。通常利用される発現ベクターとしては、改変されたpMAL-c2細菌発現ベクターNewEnglandBioLabs,Beverly,MAまたは真核生物発現ベクター、pcDNAPromega、Madison、WIが挙げられるが、これらに限定されない。最終構築物は、配列分析によって確認される。当業者に公知のタンパク質精製の任意の適切な方法が、ZFPを精製するために使用され得るAusubel、前出、Sambrook、前出を参照のこと。さらに、任意の適切な宿主例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞などが、発現のために使用され得る。細菌株JM109中のマルトース結合タンパク質に融合されたジンクフィンガータンパク質MBP-ZFPの発現は、アミロースカラムNewEnglandBioLabs,Beverly,MAを介して直接精製され得る。ジンクフィンガーキメラタンパク質の高い発現レベルは、IPTGを用いた誘導によって得られうる。なぜならば、pMal-c2発現プラスミドにおけるMBP-ZFP融合が、tacプロモーターNewEnglandBioLabs,Beverly,MAの制御下であるからである。MBP-ZFP融合プラスミドを含む細菌を、10μMZnCl2、0.02グルコースおよび50μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地に接種し、37°Cで振とうする。対数増殖期中期に、IPTGを0.3mM添加し、そして培地を振とうする。3時間後、細菌を遠心分離によって収集し、超音波によってか、またはフレンチ圧力細胞またはリゾチームの使用を介して分解し、そして不溶性の材料を、遠心分離によって除いた。MBP-ZFPタンパク質を、アミロース結合樹脂上に捕獲し、20mMTris-HClpH7.5、200mMNaCl、5mMDTTおよび50μMZnCl2を含む緩衝液を用いて強く洗浄し、次いで、本質的に同じ緩衝液中のマルトースで溶出する精製は、NewEnglandBioLabsからの標準的なプロトコルに基づく。精製されたタンパク質を、定量し、そして生化学的分析のために保存する。精製されたタンパク質の分解定数例えば、Kdは、代表的に、電気移動度シフトアッセイEMSABuratowskiChodosh、inCurrentProtocolsinMolecularBiologypp.12.2.1-12.2.7Ausubel編、1996を介して特徴づけされる。親和性は、標識された二本鎖オリゴヌクレオチド標的の固定された量に対して精製されたタンパク質を滴定することによって測定される。この標的は、代表的に、天然の配列において見出された3bpに近接する天然の結合部位配列を含み、さらに一定の近接する配列を含む。天然の結合部位は、代表的に、3つのフィンガータンパク質について9bpであり、そして6つのフィンガーZFPについて2×9bp介入塩基である。アニーリングされたオリゴヌクレオチド標的は、T4ファージポリヌクレオチドキナーゼを用いた標的の効果的な標識化を可能にする1塩基の5’オーバーハングを所有する。このアッセイのために、標的を1nM以下の濃度実際の濃度を、予測される分解定数よりも少なくとも10倍低く保つにて添加し、精製したZFPを、種々の濃度で添加し、そして反応を、少なくとも45分間平衡まで放置する。さらに、反応混合物はまた、10mMTrispH7.5、100mMKCl、1mMMgCl2、0.1mMZnCl2、5mMDTT、10グリセロール、0.02BSAを含む。平衡化された反応物を、Tris/グリシン緩衝液中で45分間予備泳動した10ポリアクリルアミドゲル上にロードし、次いで、結合した標識標的および結合していない標識標的を、150Vでの電気泳動によって解析する。あるいは、4のポリアクリルアミド濃縮ゲルを含む10~20勾配Tris-HClゲルが使用され得る。乾燥されたゲルを、オートラジオグラフィーまたはホスホ画像化によって可視化し、そして見かけ上のKdを、最大の半分の結合を生じるタンパク質濃度を計算することによって測定する。このアッセイはまた、タンパク質調製における活性画分の測定を含み得る。活性画分は、化学量論的なゲルシフトによって測定され、ここで、タンパク質は、高濃度の標的DNAに対して滴定される。滴定は、標的の100、50および25で実行される通常は、マイクロモル濃度レベルで。B.ファージディスプレイファージディスプレイの技術は、所望される標的特異性を有するジンクフィンガータンパク質を生成する非常に経験的な方法を提供する例えば、Rebar,米国特許第5,789,538号;Chooら、WO96/06166;Barbasら、WO95/19431およびWO98/543111;Jamiesonら、前出。この方法は、合理的な設計と組み合わせてか、または代替として使用され得る。この方法は、変異誘発されたジンクフィンガータンパク質の多様なライブラリーの生成、続いて、親和性選択方法を用いて所望されるDNA結合特性を有するタンパク質の単離を含む。この方法の使用のために、実験者は、代表的に以下のように進める。第一に、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子を、変異誘発して、結合特異性および/または親和性について重要な領域に多様性を導入する。代表的な適用において、これは、-1位、2位、3位、および6位での単一のフィンガー、およびいくつかの場合、付属の位置例えば、1位、5位、8位、および10位でのランダム化を介して達成される。次に、変異誘発させた遺伝子を、コートタンパク質pIIIをコードする線維状ファージの遺伝子IIIとの融合物としてファージベクターまたはファージミドベクター中にクローン化する。ジンクフィンガータンパク質は、膜輸出シグナルペプチドをコードする遺伝子IIIのセグメントとpIIIの残りとの間に挿入され、その結果、ジンクフィンガータンパク質は、pIIIとアミノ末端融合物または成熟したプロセシングされたタンパク質として発現される。ファージミドベクターを使用する場合、変異誘発されたジンクフィンガー遺伝子はまた、pIIIをファージ粒子中にアセンブリするために必要とされるC末端領域を最小限コードする短縮型バージョンの遺伝子IIIと融合され得る。生じたベクターライブラリーは、E.coliに形質転換され、そしてコートタンパク質pIIIとの融合物としてその表面上に種々のジンクフィンガータンパク質を発現する線維状ファージを生産するために使用される。ファージミドベクターが使用される場合、この工程は、ヘルパーファージを用いた重感染を必要とする。次いで、このファージライブラリーを、標的のDNA部位とインキュベートし、そして親和性選択方法を用いて、大量のファージから高い親和性で標的と結合するファージを単離する。代表的に、DNA標的を、固体支持上に固定化し、次いで、最も強固に結合しているファージの他は全て除去するに充分な条件下で洗浄する。洗浄後、支持体上に残っている任意のファージを、ジンクフィンガーとDNAの結合を分解する条件下で、溶出を介して回収する。回収したファージを、新たにE.coliを感染するために使用し、次いで、これを増幅し、そして新しいバッチのファージ粒子を生産するために使用する。次いで、選択および増幅を、強固な結合物についてファージプールを富化するために必要なだけ何度も繰り返し、その結果、これらは、配列決定および/または配列決定方法を用いて同定され得る。この方法は、pIII融合物のために例示されているが、類似の原理が、pVIII融合物としてZFP改変体をスクリーニングするために使用され得る。特定の実施形態において、特定のジンクフィンガータンパク質によって結合された配列を、タンパク質とランダム化二本鎖オリゴヌクレオチド配列のプールとの間の結合反応例えば、Kdの測定のための条件、前出を参照のことを行なうことによって測定する。結合反応は、電気泳動移動度シフトアッセイEMSAによって分析され、ここで、タンパク質-DNA複合体は、ゲル中で移動が遅れ、そして結合していない核酸から分離され得る。フィンガーに結合しているオリゴヌクレオチドは、ゲルから精製され、そして例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって、増幅される。次いで、この選択すなわち、結合反応およびEMSA分析を、選択されたオリゴヌクレオチド配列を用いて、所望されるだけ何度も繰り返す。この方法において、特定のアミノ酸配列を有するジンクフィンガータンパク質の結合特異性が、測定される。C.調節ドメインジンクフィンガータンパク質は、しばしば、融合タンパク質として外因性ドメインまたはその機能性フラグメントとともに発現される。ZFPに加えられるための通常のドメインとしては、例えば、転写因子ドメインアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、サイレンサー、発癌遺伝子例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosのファミリーメンバーなど;DNA修復酵素ならびにこれらの関連因子および修飾因子;DNA再構成酵素ならびにこれらの関連因子および修飾因子;クロマチン関連タンパク質およびこれらの修飾因子例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ;そしてDNA改変酵素例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびにこれらの関連因子および修飾因子が挙げられる。ZFPが標的遺伝子の発現を抑制するのに使用される場合、ZFPとの融合に好ましいドメインは、ヒトKOX-1タンパク質由来のKRAB抑制ドメインである。。活性化を達成するための好ましいドメインとしては、HSVVP16活性化ドメイン例えば、Hagmannら、J.Virol.71、5952-59621997を参照のこと核ホルモンレセプター例えば、Torchiaら、Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-3831998を参照のこと;核因子κBのp65サブユニットBitkoBarik、J.Virol.72:5610-56181998およびDoyleHunt、Neuroreport8:2937-29421997;Liuら、CancerGeneTher.5:3-281998、または、VP64のような人工的なキメラ機能性ドメインSeifpalら、EMBOJ.11、4961-49681992が挙げられる。VEGF遺伝子中の新規の配列とアクセス可能領域例えば、DNaseI過敏性部位との同一性は、新脈管形成の調節を促進する融合分子の設計を可能にする。従って、特定の実施形態において、本明細書中に開示される組成物および方法は、VEGF遺伝子の1つ以上の調節領域を特異的に標的化するDNA結合ドメインと機能性例えば、抑制または活性化ドメインとの間の融合物またはこのような融合物をコードするポリヌクレオチドを含む。このように、抑制ドメインまたは活性化ドメインは、DNA結合ドメインによって結合されるVEGF遺伝子中の配列の近くに置かれる。次いで、機能性ドメインの転写調節機能は、VEGF調節配列に作用し得る。さらなる実施形態において、TargetedModificationofChromatinStructure,と表題された共同所有の米国特許出願に記載されるような、標的化されたクロマチンのリモデリングは、DNA結合分子の結合にアクセス可能な細胞内クロマチンにおける1つ以上の部位を産生するのに使用され得る。融合分子は、当業者に周知であるクローニング法および生物化学的な結合方法によって構成される。融合分子は、DNA結合ドメインおよび機能性ドメイン例えば、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインを含む。融合分子はまた、必要に応じて核局在化シグナル例えば、SV40媒体T抗原由来のシグナルおよびエピトープタグ例えば、FLAGおよび赤血球凝集素を含む。融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、翻訳レーディングフレームが、この融合物の成分の間で保存されるように設計される。一方における機能性ドメインまたはこれらの機能性フラグメントのポリペプチド成分と他方における非タンパク質DNA結合ドメイン例えば、抗生物質、インターカレーターintercalator、副溝バインダー、核酸との間の融合物は、当業者に公知の生物化学的結合方法によって構成される。例えば、PierceChemicalCompanyRockford、ILのカタログを参照のこと。副溝バインダーとポリペプチドとの間の融合物を作製する方法および組成物が、記載されている。Mappら2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3930-3935。本明細書中に開示される融合分子は、VEGF遺伝子の標的部位に結合するDNA結合ドメインを含む。特定の実施形態において、この標的部位は、細胞内クロマチンのアクセス可能な領域に存在する。アクセス可能な領域は、例えば、共同所有された米国特許出願番号第60/228,556号に記載されるように決定され得る。この標的部位が、細胞内クロマチンのアクセス可能な領域に存在しない場合、1つ以上のアクセス可能な領域が、発明の名称TargetedModificationofChromatinStructure.の共有にかかる米国特許出願に記載されるように作製され得る。さらなる実施形態において、融合分子のDNA結合ドメインは、その標的部位がアクセス可能な領域にあるか否かにかかわらず、細胞内クロマチンに結合し得る。例えば、このようなDNA結合ドメインは、リンカーDNAおよび/またはヌクレオソームのDNAに結合し得る。この型の先駆的なpioneerDNA結合ドメインの例は、特定のステロイドレセプターおよび肝細胞核因子3HNF3に見出される。Cordingleyら1987Cell48:261-270;Pinaら1990Cell60:719-731;およびCirilloら1998EMBOJ.17:244-254。このような適用のために、融合分子は、当業者に公知のように、薬学的に受容可能なキャリアとともに典型的に処方される。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第17版、1985;および共同所有のWO00/42219を参照のこと。融合分子の機能性成分/ドメインは、融合分子が、一旦そのDNA結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響し得る種々の異なる成分のいずれかから選択され得る。従って、この機能性成分としては、アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー、およびサイレンサーのような種々の転写因子ドメインが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、遺伝子の発現を抑制するのに使用されるべきDNA結合ドメイン例えば、ZFPと融合する例示的な機能性ドメインは、ヒトKOX-1タンパク質由来のKRAB抑制ドメインである。例えば、Thiesenら、NewBiologist2、363-3741990;Margolinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA91、4509-45131994;Pengueら、Nucl.AcidsRes.22:2908-29141994;Witzgallら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA91、4514-45181994を参照のこと。別の適切な抑制ドメインは、メチル結合ドメインタンパク質2BMBD-2BであるMBDタンパク質の説明のために、Hendrichら1999MammGenome10:906-912をまた参照のこと。別の有用な抑制ドメインは、v-ErbAタンパク質に関連するドメインである。例えば、Dammら1989Nature339:593-597;Evans1989Int.J.CancerSuppl.4:26-28;Painら1990NewBiol.2:284-294;Sapら1989Nature340:242-244;Zenkeら1988Cell52:107-119;およびZenkeら1990Cell61:1035-1049を参照のこと。活性化を達成するための適切なドメインとしては、HSVVP16活性化ドメイン例えば、Hagmannら、J.Virol.71、5952-59621997を参照のこと核ホルモンレセプター例えば、Torchiaら、Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-3831998;核因子κBのp65サブユニットBitkoBarik、J.Virol.72:5610-56181998およびDoyleHunt、Neuroreport8:2937-29421997;Liuら、CancerGeneTher.5:3-281998、あるいは、VP64のような人工的なキメラ機能性ドメインSeifpalら、EMBOJ.11、4961-49681992が挙げられる。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、VP16、VP64、p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2AおよびERF-2が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Robyrら2000Mol.Endocrinol.14:329-347;Collingwoodら1999J.Mol.Endocrinol.23:255-275;Leoら2000Gene245:1-11;Manteuffel-Cymborowska1999ActaBiochim.Pol.46:77-89;McKennaら1999J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12;Malikら2000TrendsBiochem.Sci.25:277-283;およびLemonら1999Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504を参照のこと。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、ARF-6、ARF-7、およびARF-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、およびTRAB1が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ogawaら2000Gene245:21-29;Okanamiら1996GenesCells1:87-99;Goffら1991GenesDev.5:298-309;Choら1999PlantMol.Biol.40:419-429;Ulmasonら1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849;Sprenger-Hausselsら2000PlantJ.22:1-8;Gongら1999PlantMol.Biol.41:33-44;およびHoboら1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、KRAB、SID、MBD2、MBD3、DNMTファミリーのメンバー例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、Rb、およびMeCP2が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Birdら1999Cell99:451-454;Tylerら1999Cell99:443-446;Knoepflerら1999Cell99:447-450;およびRobertsonら2000NatureGenet.25:338-342を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ROM2およびAtHD2Aが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Chernら1996PlantCell8:305-321;およびWuら2000PlantJ.22:19-27を参照のこと。さらなる機能性ドメインは、例えば、共同所有されるWO00/41566に記載される。D.発現ベクター選択したZFPをコードする核酸は、複製および/または発現例えば、Kdの決定のための原核生物細胞または真核生物細胞に形質転換するための中間ベクターに典型的にクローニングされる。中間ベクターは、ZFP、またはタンパク質の生成物をコードする核酸の貯蔵または操作のための典型的な原核生物ベクター例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ZFPをコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、あるいは原生動物細胞に投与するための発現ベクターに典型的にクローニングされる。クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、ZFPは、直接転写のためのプロモーターを含む発現ベクターに典型的にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野において周知であり、例えば、Sambrookら、MolecularCloning、ALaboratoryManual第2版、1989;Kriegler、GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual1990;およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら編、1994に記載される。ZFPを発現するための細菌発現系は、例えば、E.coli、Bacillussp.およびSalmonellaPalvaら、Gene22:229-2351983に関して入手可能である。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞についての真核生物発現系は、当該分野において周知であり、また、市販されている。ZFP核酸の直接発現に使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。例えば、強い構成性プロモーターは、ZFPの発現および精製に典型的に使用される。対照的に、ZFPが遺伝子調節のためにインビボに投与される場合、構成性プロモーターか、誘導性プロモーターのいずれかが使用され、ZFPの特定の使用に依存する。さらに、ZFPの投与のための好ましいプロモーターは、類似の活性を有するHSVTKまたはプロモーターのような弱いプロモーターであり得る。このプロモーターは、典型的には、トランス活性化に応答性のエレメントをまた、含み得る例えば、低酸素応答エレメント、Gal4応答エレメント、lac抑制応答エレメント、およびtet調節系およびRU-486系のような低分子制御系例えば、GossenBujard、PNAS89:55471992;Oliginoら、GeneTher.5:491-4961998;Wangら、GeneTher.4:432-4411997;Neeringら、Blood88:1147-11551996;およびRendahlら、Nat.Biotechnol.16:757-7611998を参照のこと。プロモーターに加え、発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要な全てのさらなるエレメントを含む転写単位または発現カセットを典型的に含む。従って、典型的な発現カセットは、例えば、ZFPをコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーター、および例えば、転写物の有効なポリアデニル化、転写終止部位、リポソーム結合部位、または翻訳終止部位に必要とされるシグナルを含む。カセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および外因性スプライシングイントロンシグナルが挙げられ得る。細胞内に遺伝子情報を輸送するのに使用される特定の発現ベクターは、ZEPの意図される使用に関して選択される。標準の細菌性発現ベクターとしては、pBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dのようなプラスミド、ならびにGSTおよびLacZのような市販の融合発現系が挙げられる。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質MBPである。このような融合タンパク質は、ZFPの精製に使用される。エピトープタグはまた、発現をモニタリングするため、ならびに細胞性局在および亜細胞性局在をモニタリングするための好都合な単離方法を提供するための組換えタンパク質に添加され得る例えば、c-mycまたはFLAG。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば、真核生物発現ベクター例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン-バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、pMSG、pAV009/A、pMTO10/A、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、ならびにSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの配向下で、タンパク質を発現し得る任意の他のベクターが挙げられる。いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸還元酵素のような安定にトランスフェクトされた細胞株を選択するためのマーカーを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下のZFPコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するような高収率の発現系はまた、適切である。発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしてはまた、E.coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌を選択し得る抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え体配列の挿入を可能にするためのプラスミドの本質的ではない領域における独特な制限部位が挙げられる。標準的なトランスフェクション方法は、大量のタンパク質を発現する、細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を産生するのに使用され、次いで、これらの細胞株は、標準的な技術を使用して精製される例えば、Colleyら、J.Biol.Chem.264:17619-176221989;GuidetoProteinPurification、inMethodsinEnzymology、vol.182Deutscher編、1990を参照のこと。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術例えば、Morrison、J.Bact.132:349-3511977;Clark-CurtissおよびCurtiss、MethodsinEnzymology101:347-362Wuら編、1983を参照のことに従って実施される。外来性のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の周知の手順が、使用され得る。これらの手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気泳動、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクターエピソーム型および組み込み型の両方、ならびにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来性ゲノム物質を宿主細胞に導入する他の周知の方法のいずれか例えば、Sambrookら、前出を参照のことの使用が挙げられる。特定の遺伝子操作の手順を使用して、少なくとも一つの遺伝子を、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞中に首尾よく導入し得ることのみが、必要である。VII.アッセイ一旦ZFPが直上の手順に従って設計および調製されると、この設計されたZFPの活性の最初の評価が行われる。次いで、目的の遺伝子の発現を調節する能力を示すZFPタンパク質は、ZFPが設計された特定の用途に基づくより特定の活性についてさらにアッセイされ得る。従って、例えば、本明細書中で提供されるZFPは、VEGF発現を調節するそれらの能力について最初にアッセイされ得る。次いで、新脈管形成を調節するためにおよび/または虚血を処置するためのZFPの能力のより特定なアッセイが、典型的になされる。これらのより特定なアッセイの説明は、IX章の下方に示される。特定のZFPの活性は、例えば、免疫学的アッセイ例えば、ELISAおよび抗体を用いる免疫組織化学アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ例えば、RNase保護研究、Northern研究、インサイチュハイブリダイゼーション研究、オリゴヌクレオチドアレイ研究、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイなどを使用して、例えば、タンパク質レベルまたはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖;転写活性化またはレポーター遺伝子の抑制;セカンドメッセンジャーレベル例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca2;サイトカイン生成レベルおよびホルモン生成レベル;ならびに新脈管形成を測定することによる、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して評価され得る。ZFPは、典型的には、培養細胞例えば、293細胞、CHO細胞、VERO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などを使用してインビトロでの活性について最初に試験される。好ましくは、ヒト細胞が使用される。ZFPは、しばしば、レポーター遺伝子を有する一過性の発現系を使用して、最初に試験され、次いで、標的内因性遺伝子の調節は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞および動物にて試験される。このZFPは、細胞内で組換え的に発現され得るか、動物に移植された細胞内で組換え的に発現され得るか、またトランスジェニック動物において組換え的に発現され得、そして以下に記載の送達ビヒクルを使用して動物または細胞にタンパク質として投与され得る。細胞は、不死化され得るか溶液中であり得るか、動物に注入され得るか、またはトランスジェニック動物もしくは非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載のインビトロアッセイまたはインビボアッセイのうちの1つを使用して試験される。サンプルまたはアッセイは、ZFPで処理され、そして調節の程度を調べるために未処理のコントロールサンプルと比較される。上記のように、内因性遺伝子発現の調節のために、ZFPは、200nM以下のKd、より好ましくは、100nM以下、より好ましくは50nM、最も好ましくは、25nM以下のKdを典型的に有する。ZFPの効果は、上記の任意のパラメータを試験することによって測定され得る。任意の適切な遺伝子発現、表現型、または生理学的な変化が、ZFPの影響を評価するのに使用され得る。機能的な結果が、インタクトな細胞または動物を使用して決定される場合、腫瘍の増殖、創傷治癒、新生血管形成、ホルモン放出、公知の遺伝子マーカーおよび特徴づけされていない遺伝子マーカーの両方に対する転写変化例えば、ノーザンブロット研究またはオリゴヌクレオチドアレイ研究、細胞増殖またはpH変化のような細胞代謝における変化、ならびにcGMPのような細胞内セカンドメッセンジャーにおける変化のような種々の効果がまた、測定され得る。内因性遺伝子発現のZFP調節のための好ましいアッセイは、インビトロで実施され得る。1つの好ましいインビトロアッセイ様式において、培養細胞における内因性遺伝子発現のZFP調節は、ELISAアッセイを使用して、タンパク質産物を試験することによって測定される。この試験サンプルは、別の遺伝子を標的化する、ZFPコード配列を欠くベクターまたは関連しないZFPをコードするベクターで処理されるコントロール細胞と比較される。別の実施形態において、内因性遺伝子発現のZFP調節は、標的遺伝子mRNA発現のレベルを測定することによって、インビトロで決定される。遺伝子発現のレベルは、増幅例えば、PCR、LCR、またはハイブリダイゼーションアッセイ例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロッティングならびにRNase保護を使用して測定される。定量的なRT-PCR技術の使用すなわち、TaqManアッセイと呼ばれるはまた、転写物のレベルを定量化するのに使用され得る。タンパク質またはmRNAのレベルは、本明細書中に記載されるように、直接的にまたは間接的に標識される検出剤例えば、蛍光標識される核酸または放射活性標識される核酸、放射活性標識される抗体または酵素学的に標識される抗体などを使用して検出される。このような方法はまた、Gelfandに対する米国特許第5,210,015号、Livakらに対する米国特許第5,538,848号およびHaalandに対する米国特許第5,863,736号、およびHeid、C.A.ら、GenomeResearch、6:986-9941996;Gibson、U.E.M、ら、GenomeResearch6:995-10011996;Holland、P.M.、ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280、1991;およびLivak、K.J.ら、PCRMethodsandApplications357-3621995これらの各々は、その全体が参考として援用されるに記載される。あるいは、レポーター遺伝子系は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、CAT、またはβ-galのようなレポーター遺伝子に作動可能に結合されたVEGF遺伝子プロモーターを使用して誘導され得る。このレポーター構築物は、典型的には、培養細胞内に同時トランスフェクトされる。選択したZFPでの処理後、レポーター遺伝子転写、翻訳、または活性の量が、当業者に公知の標準的な技術に従って測定される。内因性遺伝子発現のZFP調節をモニタリングするために有用な好ましいアッセイ様式の別の例は、インビボで実施される。このアッセイは、新生血管形成を介して、腫瘍支持体に含まれるVEGFのような遺伝子を試験するために特に有用である。このアッセイにおいて、選択したZFPを発現する培養腫瘍細胞は、無胸腺症マウス、照射マウス、またはSCIDマウスのような免疫欠損マウスに皮下注射される。適切な期間好ましくは4~8週間後、腫瘍の増殖は、例えば、容積もしくはその2つの最大直径によって測定され、コントロールと比較される。腫瘍が、統計学的に有意な減少例えば、StudentT試験を使用してを示すことは、増殖が阻害されていることを指す。あるいは、腫瘍新生血管形成の程度がまた、測定され得る。内皮細胞特異的抗体を使用する免疫アッセイが、腫瘍の新生血管形成および腫瘍中の血管の数を染色するのに使用される。腫瘍が、血管の数に例えば、StudentTテストを使用して統計学的に有意な減少を示すということは、新生血管形成が阻害されているということである。トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物はまた、インビボでのVEGF遺伝子発現の調節を試験するのに使用される。トランスジェニック動物は、典型的には、選択したZFPを発現する。あるいは、選択したZFPを一過性に発現する動物、またはZFPが送達ビヒクルにて投与される動物が、使用され得る。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるアッセイのいずれか1つを使用して試験される。VIII.薬学的組成物本明細書中に提供されるZFP、およびより典型的には、これらをコードする核酸は、必要に応じて、薬学的組成物として薬学的に受容可能なキャリアとともに処方され得る。A.核酸ベースの組成物従来のウイルスベースの遺伝子および非ウイルスベースの遺伝子の移入方法は、哺乳動細胞または標的組織に本発明のZFPをコードする核酸を導入するために使用され得る。このような方法は、インビトロで、ZFPをコードする核酸を細胞へ投与するのに使用され得る。いくつかの例において、ZFPをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療の使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達ビヒクルと複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、DNAウイルスおよびRNAウイルスが挙げられ、これらは、細胞への送達後、エピソーム性ゲノムか組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手段の総説については、Anderson、Science256:808-8131992;NabelFelgner、TIBTECH11:211-2171993;MitaniCaskey、TIBTECH11:162-1661993;Dillon、TIBTECH11:167-1751993;Miller、Nature357:455-4601992;VanBrunt、Biotechnology610:1149-11541988;Vigne、RestorativeNeurologyandNeuroscience8:35-361995;KremerPerricaudet、BritishMedicalBulletin511:31-441995;Haddadaら、inCurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyDoerflerandBoehm編1995;およびYuら、GeneTherapy1:13-261994を参照のこと。本明細書中に提供されるZFPをコードする核酸の非ウイルス性送達の方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンもしくはリピド:核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および薬剤で増強させたDNAの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、同第4,946,787;および同第4,897,355号に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販されている例えば、TransfectamTMおよびLipofectinTM。ポリヌクレオチドの有効なレセプター認識リポフェクションに適切なカチオン性リピドおよび中性リピドとしては、Felgner、WO91/17424、WO91/16024のリピドが挙げられる。送達は、細胞エキソビボ投与または標的組織インビボ投与へなされ得る。免疫リピド複合体のような標的化されたリポソームを含むリピド:核酸複合体の調製は、当業者に周知である例えば、Crystal、Science270:404-4101995;Blaeseら、CancerGeneTher.2:291-2971995;Behrら、BioconjugateChem.5:382-3891994;Remyら、BioconjugateChem.5:647-6541994;Gaoら、GeneTherapy2:710-7221995;Ahmadら、CancerRes.52:4817-48201992;米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、および同第4,946,787号を参照のこと。操作されたZFPをコードする核酸の送達のためのRNAウイルスベース系またはDNAウイルスベース系の使用は、体内における特定の細胞に対するウイルスの標的化、および核へのウイルスペイロードの輸送のための高度に進化された工程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接的に投与され得るインビボか、またはインビトロで細胞を処理するために使用され得、そして改変された細胞は、患者に投与されるエキソビボ。ZFPの送達のための従来のウイルスベースの系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられ得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および標的組織への遺伝子移入の最も有効で用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、しばしば、挿入される導入遺伝子の長期間の発現をもたらす。さらに、高い形質転換効率は、多くの異なる細胞型および標的組織において観察される。レトロウイルスの親和性は、外来のエンベロープタンパク質を取りこみ、標的細胞の潜在的な標的集合を拡張することによって変化され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質転換または感染し得、典型的に高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、6~10kbまでの外来配列をパッケージングする能力を有するcis作用性長末端反復から構成される。この最小のcis作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いで、これらは永久的な導入遺伝子発現を提供するために標的細胞中に治療遺伝子を組み込むために使用される。広範に使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウスの白血病ウイルスMuLV、テナガザル様白血病ウイルスGaLV、サル免疫不全ウイルスSIV、ヒト免疫不全ウイルスHIV、およびこれらの組合せに基づくベクターが挙げられる例えば、Buchscherら、J.Virol.66:2731-27391992;Johannら、J.Virol.66:1635-16401992;Sommerfeltら、Virol.176:58-591990;Wilsonら、J.Virol.63:2374-23781989;Millerら、J.Virol.65:2220-22241991;PCT/US94/05700を参照のこと。ZFPの一過性の発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系が、典型的に使用される。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質転換効率であり得、細胞分裂を必要としない。このようなベクターによって、高い力価および発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純な系において、大量に生産され得る。アデノ随伴ウイルスAAVベクターはまた、標的核酸を用いてに細胞を形質転換するために例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生産、ならびにインビボおよびエキソビボの遺伝子治療手段のために使用され得る例えば、Westら、Virology160:38-471987;米国特許第4,797,368号;WO93/24641;Kotin、HumanGeneTherapy5:793-8011994;Muzyczka、J.Clin.Invest.94:13511994を参照のこと。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschinら、Mol.Cell.Biol.5:3251-32601985;Tratschin、ら、Mol.Cell.Biol.4:2072-20811984;HermonatMuzyczka、PNAS81:6466-64701984;およびSamulskiら、J.Virol63:03822-38281989を含む、多くの公開物に記載される。特に、少なくとも6つのウイルスベクターアプローチは、断然もっとも頻繁に使用される系であるレトロウイルスベクターとともに、臨床試験において遺伝子移入のために現在利用可能である。全てのそれらのウイルスベクターは、形質導入試薬を生成するためのヘルパー細胞株へ挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含む、アプローチを利用する。例であるpLASNおよびMFG-Sは、臨床試験に使用されるレトロウイルスベクターであるDunbarら、Blood85:3048-3051995;Kohnら、Nat.Med.1:1017-1021995;Malechら、PNAS94:2212133-121381997。PA317/pLASNは、遺伝子治療試験において使用される第1の治療的ベクターであったBlaeseら、Science270:475-4801995。50以上の形質導入効率が、MFG-Sパッケージベクターについて確認されたEllemら、ImmunolImmunother.441:10-201997;Dranoffら、Hum.GeneTher.1:111-21997。組換えアデノ随伴ウイルスベクターrAAVは、欠損および非病原性パルボウイルスのアデノ随伴ウイルス2型に基づいた別の代替の遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子の発現カセットに隣接するAAVの145bpの逆方向末端反復配列のみを保持する、プラスミドから誘導される。形質導入細胞のゲノムへの組み込みに起因する有効な遺伝子移入および適切な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴であるWagnerら、Lancet351:91171702-31998、Kearnsら、GeneTher.9:748-551996。複製-欠損組換えアデノウイルスベクターAdは、高い力価で生産され得、そして多数の異なる細胞型に容易に感染するので、結腸癌の遺伝子治療のために主に使用される。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、AdE1a、E1bおよびE3遺伝子を置換し;引き続いて複製欠損ベクターを、トランスで欠落した遺伝子機能を供給するヒト293細胞に伝播するように操作される。Adベクターは、インビボで非分裂細胞、分化細胞例えば肝臓、腎臓および筋肉系組織中に見出させるそれらを含む多数の組織型に形質導入し得る。通常のAdベクターは、大きな保持能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の例は、筋内注射での抗腫瘍性の免疫のためのポリヌクレオチド治療を含むStermanら、Hum.GeneTher.7:1083-91998。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、以下に挙げられる:Roseneckerら、Infection24:15-101996;Stermanら、Hum.GeneTher.9:71083-10891998;Welshら、Hum.GeneTher.2:205-181995;Alvarezら、Hum.GeneTher.5:597-6131997;Topfら、GeneTher.5:507-5131998;Stermanら、Hum.GeneTher.7:1083-10891998。パッケージ細胞は、宿主細胞を感染し得るウイルス粒子の形成のために使用される。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージする293細胞、そしてレトロウイルスをパッケージするψ2細胞またはPA317細胞を含む。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、ウイルス粒子中へ核酸ベクターをパッケージする産生細胞株によってたいてい生成される。ベクターは、代表的にパッケージおよび引き続く宿主への組み込みに必要な最小のウイルス配列、発現されるべきタンパク質のための発現カセットによって置換される他のウイルス配列、を含む。不足するウイルス機能は、パッケージ細胞株によって、トランスにおいて供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは、典型的にパッケージすること、そして宿主ゲノムへの組み込みに必要とされる、AAVゲノムからのITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子すなわちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠く、ヘルパープラスミドを含む細胞株中にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染される。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如に起因して、有意な量でパッケージされない。アデノウイルスとのコンタミネーションは、例えば、アデノウイルスはAAVよりも敏感であるので、例えば、熱治療によって減少し得る。多くの遺伝子治療用途において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織型に対する高度な特異性で送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、ウイルスの外側の表面上のウイルス性コートタンパク質との融合タンパク質としてのリガンドを発現することによって、与えられる細胞型に対する特異性を有するように、典型的に改変される。リガンドは、目的の細胞型上に存在すると公知のレセプターに対する親和性を有するように選択される。例えば、Hanら、PNAS92:9747-97511995は、モロニーマウス白血病ウイルスは、gp70に融合されるヒトヒレグリンを発現するように改変され得、そして組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染する、ことを報告した。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現する標的細胞の他の対にまで拡張され得る。例えば、糸状ファージは、実質的に任意に選ばれる細胞レセプターに対する特異的結合親和性を有する、抗体フラグメント例えば、FABまたはFvを表示するように操作され得る。上記の記述は、主にウイルスベクターに適用するにもかかわらず、同じ原理が、非ウイルスベクターにも適用され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みに有利であると考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与典型的に全身投与例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入、または以下に記載されるような局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで、細胞に送達され得、例えば、細胞が個々の患者例えば、リンパ球、骨髄吸引、組織バイオプシーまたは万能なドナー造血幹細胞から外植され、通常、ベクターを取り込んだ細胞についての選択後に、続いて患者の細胞へ再移植される。診断、研究または遺伝子治療例えば、トランスフェクトした細胞の宿主生物体への再注入を介してのためのエキソビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。ある実例において、細胞は、被験体生物体から単離され、ZFP核酸遺伝子またはcDNAでトランスフェクションされ、そして被験体生物体例えば、患者へ再注入し戻される。エキソビボでのトランスフェクトに適した種々の細胞型は、当業者に周知である例えば、患者からの細胞の単離方法および培養方法の考察については、Freshneyら、CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique第3編1994、およびそこで引用した参考文献を参照のこと。1つの実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためにエキソビボの手順で使用される。幹細胞を使用することの利点は、幹細胞が、インビトロで他の細胞型に分化し得るか、または哺乳動物例えば、その細胞のドナーへ導入され得るここで、幹細胞は骨髄内に移植されることである。サイトカイン例えば、GM-CSF、IFN-γおよびTNF-αを用いて、臨床的に重要な免疫細胞型へインビトロでCD34細胞を分化するための方法は、公知であるInabaら、J.Exp.Med.176:1693-17021992を参照のこと。幹細胞は、公知の方法を用いて、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、不必要な細胞例えば、CD4およびCD8T細胞、CD45panB細胞、GR-1顆粒球ならびにIad分化した抗原提示細胞に結合する抗体と共に骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離されるInabaら、J.Exp.Med.176:1693-17021992を参照のこと。治療的ZFP核酸を含むベクター例えば、レトロウイルス、アデノイルス、リポソームなどはまた、インビボで細胞の形質導入のために、生物体に直接投与され得る。あるいは、裸のDNAが、投与され得る。投与は、血液または組織細胞と分子を最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによって達成される。このような核酸を投与するために適した方法は、利用可能であり、そして当業者に周知であり、そして1つより多くの経路が、特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路が、別の経路より即効性および効果的な反応をしばしば提供し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、一部、投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、以下に記載されるような、薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第17編、1989を参照のこと。B.タンパク質組成物ポリペプチド化合物例えば、本発明のZFPの投与における重要な因子は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核のような細胞内区画の膜を横切る能力を有する、ことを確実にすることである。細胞膜は、小さい、非イオン性親油性化合物に対して自由に浸透でき、そして極性化合物、高分子および治療的薬剤または診断的薬剤に対して本来浸透できない脂質-タンパク質の二重層で構成される。しかし、細胞膜を横切ってZFPのようなポリペプチドをトランスロケーションする能力を有する、タンパク質および他の化合物例えば、リポソームは、記載されている。例えば、膜トランスロケーションポリペプチドは、膜トランスロケーションキャリアとして作用する能力を有する、両親媒性アミノ酸部分配列または疎水性アミノ酸部分配列を有する。1つの実施形態において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を通過してトランスロケーションする能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最も短く内部移行できるペプチド、アンテナペディアは、タンパク質の第3ヘリックスアミノ酸位置43~58で見出された例えば、Prochiantz、CurrentOpinioninNeurobiology6:629-6341996を参照のこと。別の部分配列であるシグナルペプチドのh疎水性ドメインは、類似の細胞膜トランスロケーション特性を有することを見出された例えば、Linら、J.Biol.Chem.270:14255-142581995を参照のこと。細胞へのZFPの取り込みを促進するための、ZFPに結合し得るペプチド配列の例としては、限定しないが、以下が挙げられる:HIVのtatタンパク質の11アミノ酸ペプチド;p16タンパク質の84~103アミノ酸に対応する20残基のペプチド配列Fahraeusら、CurrentBiology6:841996を参照のこと;アンテナペディアの60アミノ酸長のホメオドメインの、第3ヘリックスDerossiら、J.Biol.Chem.269:104441994;カポージ線維芽細胞増殖因子K-FGFh領域のようなシグナルペプチドのh領域Linら、前出;またはHSV由来のVP22トランスロケーションドメインElliotおよびO’Hare、Cell88:223-2331997。増強した細胞の取り込みを提供する他の適切な化学成分はまた、ZFPに化学的に結合し得る。毒素分子はまた、細胞膜を通過してポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、このような分子は、少なくとも2つの部分で構成される2成分毒素と呼ばれる:トランスロケーションドメインもしくはポリペプチドまたは結合ドメインもしくはポリペプチドおよび分離した毒素ドメインもしくはポリペプチド。典型的に、トランスロケーションドメインまたはポリペプチドは、細胞レセプターに結合し、そして次いで毒素は、細胞内へ輸送される。ウェルチ菌微小毒素、ジフテリア毒素DT、シュードモナス体外毒素APE、百日咳毒素PT、炭疽菌毒素および百日咳アデニレートシクラーゼCYAを含むいくつかの細菌毒素は、内部またはアミノ酸末端融合物として、細胞サイトゾルへペプチドを送達することの試みにおいて使用されているAroraら、J.Biol.Chem.、268:3334-33411993;Perelleら、Infect.Immun.、61:5147-51561993;Stenmarkら、J.CellBiol.113:1025-10321991;Donnellyら、PNAS90:3530-35341993;Carbonettiら、Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.95:2951995;Seboら、Infect.Immun.63:3851-38571995;Klimpelら、PNASU.S.A.89:10277-102811992;およびNovakら、J.Biol.Chem.267:17186-171931992。このような部分配列は、細胞膜を通過してZFPをトランスロケーションするために使用される。ZFPは、都合よくこのような配列に融合し得るか、またはこのような配列で誘導体化され得る。典型的に、トランスロケーション配列は、融合タンパク質の一部として提供される。任意に、リンカーは、ZFPおよびトランスロケーション配列に連結するために使用され得る。任意の適切なリンカーは、例えば、ペプチドリンカーが使用され得る。ZFPはまた、リポソームおよびリポソーム誘導体例えば、免疫リポソームを介して、動物細胞好ましくは哺乳動物細胞へ導入され得る。用語リポソームは、1つ以上の集中的に要求される脂質二重層から構成される、水相をカプセル化する小胞をいう。水相は、代表的に細胞に送達されるべき化合物すなわち、ZFPを含む。リポソームは、原形質膜と融合し、それによってサイトゾル内へ薬物を放出する。あるいは、リポソームは、輸送小胞において細胞によって食菌されるかまたは取り込まれる。エンドソームまたはファゴソーム内で、一旦、リポソームは、輸送小胞の膜と分解するか、または融合するかのいずれかをし、そしてその内容物を放出する。リポソームを介する薬物送達の現法において、リポソームは、最終的に浸透し、そして標的組織または標的細胞にカプセル化した化合物この場合、ZFPを放出する。全身または組織特異性送達のために、これは、例えば、受動的様式において、達成され得、ここでリポソーム二重層は、体内での様々な薬剤の動きを通して、長い間で分解する。あるいは、活性薬物放出は、リポソーム小胞において、浸透性の変化を誘導するための薬剤を使用することを含む。リポソーム膜は、環境が、リポソーム膜の近辺で酸性になる場合、不安定化するように、構築され得る例えば、PNAS84:78511987;Biochemistry28:9081989を参照のこと。例えば、リポソームが標的細胞によってエンドサイトーシスされる場合、リポソームが不安定になり、そしてそれらの内容物を放出する。この不安定化は、フソジェネシスfusogenesisと呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEは、多くのフソジェネシス系の基礎である。このようなリポソームは、代表的にZFPおよび脂質成分例えば、予め決定された細胞表面のレセプターまたはリガンド例えば、抗原に結合する抗体のようなレセプター認識分子を任意に含む、中性および/または陽イオン性脂質を含む。リポソームを調製するための種々の方法は、以下に記載されるように利用可能である:例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:4671980、米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、同第4,946,787号、PCT公開番号WO91/17424、DeamerおよびBangham、Biochim.Biophys.Acta443:629-6341976;Fraleyら、PNAS76:3348-33521979;Hopeら、Biochim.Biophys.Acta812:55-651985;Mayerら、Biochim.Biophys.Acta858:161-1681986;Williamsら、PNAS85:242-2461988;LiposomesOstro編、1983、Chapter1;Hopeら、Chem.Phys.Lip.40:891986;Gregoriadis、LiposomeTechnology1984およびLasic、Liposomes:fromPhysicstoApplications1993。適切な方法は、例えば、超音波処理、押出し、高圧/均質化、微流動化、界面活性剤透析法、小さいリポソーム小胞のカルシウム誘導融合およびエーテル融合方法これらの全ては当業者に周知であるを含む。いくつかの例において、リポソームは、特定の細胞型、組織などに対して特異的である標的化部分を用いて標的化される。種々の標的化部分例えば、リガンド、レセプターおよびモノクローナル抗体を用いてリポソームを標的とすることは、以前に記載されている例えば、米国特許第4,957,773号および同第4,603,044号を参照のこと。リポソームに標的化剤を結合するための標準的な方法が、使用され得る。これらの方法は、標的剤の結合のために活性化され得るか、または親油性化合物に誘導体化され得る例えば、脂質誘導体化ブレオマイシンを、リポソームの脂質成分例えば、ホスファチジルエタノールアミンへの取り込みを一般的に含む。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインAを取り込むリポソームを用いて構築され得るRenneisenら、J.Biol.Chem.、265:16337-163421990およびLeonettiら、PNAS87:2448-24511990を参照のこと。C.投薬量ZFPの治療用途のために、患者に投与される用量は、患者において長い時間、十分な有利な治療的応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、利用される特定のZFPの効力およびKd、標的細胞の核の容積、および患者の状態、ならびに処置されるべき患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物またはベクターの投与に付随するいずれかの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。疾患の処置または予防において、投与されるべきZFPの有効な量を決定することにおいて、医師が、ZFPまたはZFPをコードする核酸の循環する血漿レベル、潜在的ZFP毒性、疾患の進行、および抗ZFP抗体の生産を評価する。投与は、単一または分割した用量を介して達成され得る。D.組成および投与の様式1.一般ZFPおよびZFPをコードする核酸は、遺伝子発現の調節のためにおよび下記のような治療的用途または予防的用途のために、患者に直接投与され得る。一般的に、そして本明細書中の考察を考慮して、動物または患者へZFP導入することをいう句は、ZFPまたはZFP融合タンパク質が、導入されることおよび/またはZFPまたはZFP融合タンパク質をコードする核酸が、動物において発現され得る形態で導入されることを意味し得る。例えば、次の章において最も詳細に記載されるように、ZFPおよび/または核酸は、新脈管形成を調節するためおよび虚血処置において使用され得る。治療的有効量の投与は、ZFPを処置されるべき組織と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによって達成される。ZFPは、好ましくは薬学的受容可能なキャリアと共に、任意の適切な様式で投与される。このような調節因子を投与する適した方法は、利用可能であり、そして当業者に周知であり、そして1つより多くの経路が、特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路が、別の経路より即効性および効果的な反応をしばしば提供し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、一部、投与される特定の組成物によっておよび組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第17編1985を参照のこと。ZFP単独または他の適切な成分と組み合わせては、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物中すなわち、これらは、噴霧され得るに作られ得る。エアロゾル処方物は、加圧受容可能な噴霧剤例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに配置され得る。非経口投与例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路によってに適した処方物は、抗酸化物を含み得る、水性および非水性の、等張性の滅菌した注入液、緩衝液、静菌剤、および処方物を意図したレシピエントの血液との等張性にする溶質、懸濁液を含み得る水性および非水性の滅菌した懸濁液、溶解剤、濃化剤、安定剤および防腐剤を含む。開示された方法の実行において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、または髄腔内によって投与され得る。化合物の処方は、単一用量unit-doseまたは多用量multi-dose用の密封容器例えば、アンプルおよびバイアル中に存在し得る。注入溶液および注入懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒、および以前に記載された種類の錠剤から調製され得る。2.例示的な新脈管形成送達の選択種々の送達選択は、新脈管形成、従って、例えば虚血状態の処置を調節するための、本明細書中で提供される薬学的組成物の送達のために利用可能である。特定の用途に依存して、組成物は、被験体の特定の場所または組織を標的化され得る。例えば、ある方法において、虚血のような様々な障害を処置するために、心臓の特定の領域へ組成物を送達する。対照的に、他の処置は、一般的な方法において、特定の領域への送達を標的化することを探究することもなく、組成物を投与することを含む。多くのアプローチが、特定の領域への薬剤の送達を局在化するために利用され得る。特定のこれらの方法は、体の管腔または組織への送達を含む例えば、米国特許第5,941,868号;同第6,067,988号;同第6,050,986号;および同第5,997,509;およびPCT公開WO00/25850;WO00/04928;99/59666;および99/38559を参照のこと。送達はまた、心筋内注射または心筋内投与によって達成され得る。このようなアプローチの例としては、以下に開示されるものが挙げられる:米国特許第6,086,582号;同第6,045,565号;同第6,056,969号;および同第5,997,525号;およびPCT公開WO00/16848;WO00/18462;WO00/24452;WO99/49773およびWO99/49926。局所的な送達のための他の選択は、心膜内の注射例えば、米国特許第5,931,810号;同第5,968,010号;および同第5,972,013号を参照のことおよび血管周囲送達を含む。様々な経心筋再脈管transmyocardialrevascularTMRのチャネル送達アプローチも同様に利用され得る。多くのこれらの方法は、血管再生を行うためにレーザーを利用する。このようなアプローチの考察は、例えば、以下に示される:米国特許第5,925,012号;同第5,976,164号;同第5,993,443号;および同第5,999,678号。他の選択は、動脈内送達および/または冠内送達例えば、冠状動脈注射例えば、WO99/29251を参照のこと、および血管内投与例えば、米国特許第6,001,350号;同第6,066,123号;および同第6,048,332;およびPCT公開WO99/31982;WO99/33500;およびWO00/15285を参照のことを含む。従って、例えば、心筋へ直接、本明細書に記載されるように、組成物を注射し得る。新脈管形成を調節するための組成物を送達するためのさらなる選択は、静脈内投与または皮下投与、心臓チャンバーアクセス例えば、米国特許第5,924,424号を参照のことおよび組織工学米国特許第5,944,754号を用いての、全身投与を含む。当業者によって公知のほかの送達方法としては、以下に開示される方法が挙げられる:米国特許第5,698,531号;同第5,893,839号;同第5,797,870号;同第5,693,622号;同第5,674,722号;同第5,328,470号;および同第5,707,969。IX.用途A.一般本明細書に開示される標的部位に結合するZFPおよびそれらをコードする核酸は、広範な種々の用途特に、内皮細胞増殖の調節を含む用途において利用され得る。このような方法は、一般的に、本明細書中に開示される標的部位のうちの1つに対する結合特異性を有するZPFと、細胞または細胞集団内の核酸の標的部位とを接触させる工程を包含する。例えば、細胞培養物を用いたインビトロでの方法またはインビボでの方法が、行なわれ得る。調節が1つ以上のVEGF遺伝子の活性化を含むような特定の方法が、行なわれる。このような方法は、さらなる内皮細胞の生成が、所望される場合例えば、動脈妨害または血管妨害のいくつかの型を軽減するための新脈管形成を促進するか、またはリンパ球生成または骨髄造血を活性化する場合に有用である。他の方法は、このような抑制が、例えば、腫瘍の領域内でのさらなる血管発達を阻害するような有益な効果を提供する場合、内皮細胞増殖を抑制するために行なわれ得る。ZFPはまた、非治療的用途例えば、VEGF遺伝子の発現を活性化または抑制する因子を同定するかまたは標的配列を含む標的核酸を検出する、スクリーニング方法のために使用され得る。B.治療的用途1.新脈管形成の調節本明細書中で提供されるZFPおよびそれらをコードする核酸例えば、前に記載される薬学的組成物は、得られるVEGFタンパク質が、細胞培養物すなわち、インビトロ用途においておよびインビボの両方で、内皮細胞増殖を活性化する際の増殖因子として作用し得るように、VEGF遺伝子の発現の活性化のために利用され得る。このような活性化は、新しい血管および毛細血管が形成される有用な新脈管形成を促進し得る;活性化はまた、体細胞増殖ならびに脈管の発達および分化を促進し得る。それゆえ、新脈管形成を促進するための特定の方法は、動物へZFPを導入する工程を包含する。新脈管形成を調節する遺伝子への活性化ドメインを保有するZFPの結合は、新脈管形成のプロセスを増強し得る。特定の方法は、VEGF遺伝子中の標的部位に結合するための本明細書中に記載されるようなZFPの使用を含む。ZFPに融合した活性化ドメインは、1つ以上のVEGF遺伝子の発現を活性化する。ZFPおよび核酸はまた、骨修復、創傷治療を促進することならびに胃潰瘍および/または十二指腸潰瘍の治癒を促進することにおいて有用であり得る。ZFPおよび核酸はまた、黄体および子宮内膜の発達、妊娠の開始および/または維持において有用な活性化を促進するために利用され得る。関連する方法において、ZFPおよび核酸の投与はまた、胚形成の補助での有用性を見出す。内皮細胞増殖および新脈管形成を評価するための種々のアッセイが、公知である。例えば、内皮細胞増殖アッセイは、FerraraおよびHenzel1989Nature380:439-443;Gospodarowiczら1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:7311-7315;およびClaffeyら1995Biochim.Biophys.Acta.1246:1-9によって議論される。新脈管形成を促進するためのZFPおよび/または核酸の能力は、Leungら1989Science246:1306-1309よって議論されるように、例えば、ヒヨコの絨毛尿膜中で評価され得る。別の選択は、Rastinejadら、1989Cell56:345-355よって議論されるように、ラットの角膜を用いたアッセイを行うことである。他のアッセイは、米国特許第5,840,693号に開示される。さらに、実施例4および図9に開示される組織切片の顕微鏡検査は、新脈管形成のためのアッセイとして使用され得る。それぞれのこれらの方法は、インビボでの新脈管形成の容認されたアッセイであり、そしてその結果はまた、他の系から推定され得る。ZFPおよび/またはそれらをコードする核酸の投与はまた、血管新生の開始または伸張が所望される用途において利用され得る。このような用途の例としては、組織移植または臓器移植後の治療を含む。多くの用途は、虚血状態およびアテローム性動脈硬化症から生じるような種々の型の血流妨害を軽減することを含む。例えば、特定の用途は、組織梗塞または動脈狭窄症例えば、冠状動脈性心臓病で起こるにおいて、副行循環を樹立することを含む。副行循環のシミュレーションはまた、深在静脈血栓症、心筋梗塞、虚血肢体ischaemiclimbおよび/または産後の脈管問題の処置において有用である。多くのアッセイが、虚血を処置するためのZFPの能力を評価するために利用され得る。例えば、虚血を研究するための様々な様式が、公知である。これらは、限定しないが、実験的に誘発したラットの後肢の虚血例えば、Takeshita,S.ら、Circulation199898:1261-63;およびTakeshita,S.ら1994Circulation905;partII:228-234を参照のこと、部分的に虚血性の後肢のラビットモデル例えば、Hopkins,S.ら、J.Vasc.Surg.199827:886-894を参照のこと、および慢性的なブタの心筋虚血モデル例えば、Harada,K.ら、Am.J.Physiol.1996270:886-94;およびHariawala,M.ら、1996、J.Surg.Res.63:77-82を参照のことを含む。別のアッセイは、後肢虚血のウサギモデルを含む例えば、Takeshita,S.ら、1994、Circulation905;partII:228-234を参照のこと。新生血管形成はまた、骨折部位での新しい血管の形成を含む治癒プロセスとして、骨折修復において重要である。従って、ZFPおよび核酸はまた、骨折の処置において使用され得る。投与の効果を測定するためのアッセイは、公知である。例えば、アテローム性動脈硬化症についてアッセイするため方法は、PCT公開WO00/25805に考察される。創傷処置は、本明細書中に記載されるZEP、核酸および化合物の投与が有用である別の一般的な適用の型である。ZFPおよび核酸は、潰瘍、褥瘡および静脈性の潰瘍venousulcerならびに火傷のような重要な創傷の処置のために使用され得る。このような潰瘍の例は、糖尿病患者において見られる。ZFP融合物の使用が、創傷治癒を促進する例が、実施例4および図9に提供される。本明細書中において提供されるZFPおよび核酸はまた、多様な外科的な適用において、利用され得る。例えば、別の使用法は、植皮が施される火傷部位または外傷部位の準備のために用いられる。同様に、この組成物は、血管移植手術における内皮細胞の形成を促進するために使用され得る。このような手術においては、組成物は、手術の前または間に移植部位に導入され得る。ZFPおよび核酸は、形成外科において、利用され得、特に火傷領域または別の損傷領域の再形成のために使用され得る。この組成物が利用され得る、別の外科的な状況は、バルーン血管形成術に続く、創傷治癒の手術後においてである。なぜならこのような手術は、内皮細胞の除去または損傷を伴うからである。このような場合の処置は、ZFPまたは核酸を非経口的なキャリアと組み合わせて含む組成物を使用し得る。ZFPおよびそれらをコードする核酸もまた、一般的な手術ならびに切断部および裂傷の処置および修復においても使用法が見出されている。このような適用において、ZFPまたは核酸は、創傷が感染することを阻止するために使用される。局所的な創傷治癒において使用される場合、ZFPまたは核酸は、ある場合に、処置される部位に直接的に、溶液、スプレー、クリーム、ゲル、軟膏または乾燥散剤の一部として局所的に投与され得る。徐放組成物はまた、特定の型の創傷を処置する際に有用であり得る。種々の組成物の有用性を評価するために利用され得る創傷治癒アッセイは、例えば、Schillingら1959Surgery46:702-710;およびHuntら1967Surgery114:302-307よって考察される。別の創傷治癒アッセイは、実施例4に開示される。本明細書中で提供されるZFPおよび核酸はまた、リンパ内皮細胞およびリンパ管の成長促進に利用され得る。さらに、この組成物は、リンパ管形成を刺激するために利用され得る。従って、例えば、この組成物は、リンパ管の再成長または透過性を促進するために投与され得る。この組成物は、臓器移植した患者の処置ならびに手術および癌の処置にしばしば伴う腋窩リンパ管の損失の緩和において有用であり得る。他の関連する適用として、リンパ管の閉塞例えば、象皮病およびリンパ管腫lymphangiomasが挙げられる。骨髄造血の活性化はまた、特定の本発明のZFPおよび核酸によりなされ得る。例えば、この組成物は、好中球の顆粒球の成長を促進するために使用され得る。このような処置は、例えば、顆粒球減少のような疾患に罹患している患者を処置するために有用であり得る。好中球の顆粒球の産生は、確立した微視的な方法および巨視的な方法によってモニターされ得る。これまでの実験は、マウスにおける単一のマウスVEGF164アイソフォームisoformをコードするcDNAの導入が、透過性の血管の形成を導き、この血管は自然出血性であったことを示したPettersson、A.ら、2000、Lab.Invest.80:99-115。略述すると、マウスVEGF164をコードするアデノウイルスベクターが、マウスの耳の皮下に注射された。VEGF164は、このマウスの耳のモデルにおいて出血および脈管内色素の血管外遊出を誘導することが示された。マウスのVEGF164をコードするアデノウイスルを用いて同様に処置されたマウスの耳を比較する場合、ZFPが誘導する新生脈管構造は、自発的には出血せず、そしてEvansBluedye注入に対しても浸透性ではなかった実施例6を参照のこと。2.VEGF遺伝子発現の抑制本明細書中で提供される組成物はまた、種々の治療適用においてVEGF遺伝子の発現を抑制するために利用され得る。1つの共通の適用は、治療上の理由のために破壊されることが望まれる、特定の細胞または組織に対して新脈管形成を減らすかまたは阻害することである。しばしば、このような方法は、腫瘍増殖または転移のような、病理学的な過程に関連する脈管形成事象を妨げるための組成物の投与に関する。他の病理学的なプロセスは、増加した新脈管形成、特に微小血管系の増殖に関連し、糖尿病性網膜症、乾癬および種々の関節障害が挙げられる。従って、特定の本発明の組成物は、これらのプロセスを処置するために利用され得る。C.非治療適用ZFPおよびそれらをコードする核酸はまた、種々の非治療適用においても利用され得る。このような適用の1つとして、新脈管形成を調節できる新たな因子を同定するためのスクリーニングを含む。特に、ZFPは、VEGF遺伝子の発現のような、遺伝子発現を調節し得る因子の同定のために使用され得る。このような方法は、一般的に、細胞または細胞集団と、表2~3に列挙される標的部位の1つに結合するZFPとを接触させて、1つ以上のVEGFの発現を活性化するかまたは抑制する工程を含む。細胞はまた、試験因子とも接触させられる。次いで、VEGF遺伝子の発現レベルが、決定されそして発現のベースラインレベルと比較される。試験細胞中のVEGF遺伝子の発現レベルのベースラインレベルとの統計学的に有意な差は、試験因子がVEGF遺伝子発現の潜在的なモジュレーターであることを示す。例えば、ZFPが、VEGF遺伝子の発現を活性化する場合、および試験細胞における発現レベルがベースラインレベルより低い場合、証拠は、試験因子がVEGF遺伝子発現のリプレッサーであることを示す。一方、ZFPがVEGF遺伝子の発現を抑制する場合、試験因子は、ZFPによって引き起こされる抑制を軽減し得る潜在的な活性化因子についてスクリーニングされ得る。この方法は、核酸がアッセイにおいて利用される細胞中に発現のための必須調節配列を含む場合、ZFPをコードする核酸を導入することにより変動され得る。このような方法は、ZFPと相互作用し潜在的にその結合を増強するかまたは減少させ、および/または遺伝子上のほかの場所に結合でき、それによって、相乗効果または拮抗効果のどちらかを提供する因子を同定するために使用され得る。発現のベースラインレベルとは、一般に、実験値または決定された値と比較される値または値の範囲をいう。代表的には、ベースライン値は、試験される細胞または個体を用い並行して同一の条件下で個別に処置されるコントロール細胞または個体について決定された値である。ベースライン値はまた、コントロール細胞または個体の集団について確立された統計的な値例えば、平均値meanまたは平均値averageであり得る。いま記載されたような細胞のアッセイにおいて、しばしば試験細胞は、ZFPと接触されるかまたはZFPを発現するが、コントロール細胞は接触も発現もしない。相違が、実験誤差のレベルよりも大きい場合、相違は、一般的に統計的に有意であると考えられる。観測された相違の偶発する可能性p値が、いくつかの所定のレベルより小さい場合、このような相違はまた、統計的に有意である。従って、統計学的に有意な相違は、0.005未満であり、好ましくは0.01未満であり、最も好ましくは0.001未満であるp値をいい得る。他の適用において、ZFPは、サンプル中の標的核酸の配列特異的な検出のための診断法において使用され、本明細書中に提供される標的部位の1つを含む。例として、ZFPは、標的部位を含むmRNAもしくはcDNAの複合体混合物における特定のmRNA種または特定のcDNAの存在を検出するために使用され得る。従って、ZFPは、サンプル中のVEGF遺伝子のコピー数を定量するために使用され得る。診断用アッセイの実施のための適切な形式は、ドメインに連結されたZFPを使用し、このドメインに連結されたZFPは、ELISAプレート上へのZFPの固定化を可能にする。固定されたZFPは、結合が起こり得る条件下で、標的核酸を含有することが疑われるサンプルに接触される。代表的には、サンプル中の核酸は、標識される例えば、PCR増幅の過程において。あるいは、標識されていないプローブは、第2の標識されたプローブを用いて検出され得る。洗浄の後、標識が結合した核酸が、検出される。以下の実施例は、開示された方法および組成物の特定の局面を単により詳細に説明するために提供され、そしていかなる方法においても、限定するものと解釈されるべきではない。実施例1設計されたジンクフィンガー融合タンパク質のパネルを用いるヒトVEGF遺伝子の調節I.導入遺伝子調節の研究における主要な問題点は、細胞が内因性の染色体遺伝子の特異的な活性化を達成する機構に関する。この問題への取り組みにおいて、合理的に設計された転写機構の構成要素は、本発明者らの遺伝子調節についての理解を試験するための強力な手段を提供し得るChattejeeら1995Nature374:820-822;Kimら1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3616-3620;Klagesら1995Nature374、822-823。特に、人工的な転写因子所定の遺伝子座の範囲内の新規な配列に標的化されそして実験者が選択する機能ドメインを有するは、全ての規定された構成要素を使用する所定の活性化プロセスのいずれかの完全な概括の展望を提供するので、特に有用であることを証明し得る。人工的な転写因子はまた、医学および生物工学のような領域において実用的な利益を提供し得る。新規の、所望のDNA配列の特異的な認識を達成するために現われてきた、選択されたDNA結合モチーフは、ジンクフィンガーである。これらのジンクフィンガーとしては、はじめに記載されたCys2-His2ジンクフィンガー、ならびに、例えば、Cys4ジンクフィンガーなどのような、さらなる型のジンクフィンガーが挙げられる。例えば、Rhodesら1993ScientificAmerican268:56-65を参照のこと。過去十年の間、選択および設計の研究は、このモチーフの適合性を実証し、そして事実上どんなDNA配列に対しても特異的に結合し得るジンクフィンガータンパク質ZFPを設計するための簡便で、強力な戦略を作り出してきた。例えば、Chooら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11,163-11,167;Chooら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11,168-11,172;Chooら1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:646正誤表として出版された;Desjarlaisら1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7345-7349;Desjarlaisら1992Proteins12:101-104;Desjarlaisら1992Proteins13,272;Desjarlaisら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2256-2260;Greismanら1997Science275:657-661;Jamiesonら1994Biochemistry33:5689-5695;Jamiesonら1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:12,834-12,839;Liuら1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5525-5530;Rebarら1994Science263:671-673;Rebarら1996Meth.Enzymol.267:129-149;Segalら1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:2758-2763を参照のこと。より最近、新規の、DNA配列特異性が操作されたZFPが、内因性の染色体遺伝子を調節するための人工転写因子として使用され始めた。例えば、Bartsevichら2000Mol.Pharmacol.58:1-10;Beerliら2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:1495-1500;Zhangら2000J.Biol.Chem.275:33,850-33,860を参照のこと。さらに、共有されるPCTWO00/41566も参照のこと。この研究の目的は、血管内皮増殖因子AVEGF-Aに対する内因性遺伝子を活性化する、ZFPのパネルを同定することであった。VEGF-Aは、胚形成の間および創傷治癒のような成人におけるプロセスの両方において、新しい血管増殖の重要な誘導因子として一般に認識されている内皮細胞特異的マイトジェンである最近の総説として、Flammeら1997Mech.Dev.63:51-60;Ferrara1999J.Mol.Med.77:527-543;Yancopoulosら2000Nature407:242-248を参照のこと。脈管形成および新脈管形成の両方におけるVEGF-Aの中心的役割は、VEGF-Aの発現レベルが巧妙に正確な調節機構によって制御されることを明らかに必要とする。マウスにおける研究は、VEGF-Aを、その単一機能不全haploinsufficiencyが胚の致死率を誘発する恐らく唯一の例である遺伝子として強調してきたFerraraら1996Nature380:439-442;Carmelietら1996Nature380:435-439。さらに、いくつかの他の研究は、適切なVEGF-Aの機能にはVEGF-A遺伝子により産生される3つの主要なスプライス改変体の適切な相対レベルでの発現を必要とすることを示唆したCarmelietら、1996前出;Carmelietら1999NatureMed.5:495-502;Grunsteinら2000Mol.Cell.Biol.20:7282-7291。状態および転写因子の多様性は、VEGF-Aの発現の誘導に関与してきた。Chuaら1998FreeRadic.Biol.Med.25:891-897;Cohenら1996J.Biol.Chem.271:736-741;Damertら1997Biochem.J.327:419-423;Diazら2000J.Biol.Chem.275:642-650;Ladouxら1994Biochem.Biophys.Res.Commun.204:794-798;Ryutoら1996J.Biol.Chem.271:28,220-28,228;Salimathら2000Oncogene19:3470-3746、この中で恐らく最もよく特徴付けられるのは、HIF-1により仲介される低酸素応答であるLevyら1995J.Biol.Chem.270:13,333-13,340;Liuら1995Circ.Res.77:638-643;Forsytheら1996Mol.Cell.Biol.16:4604-4613;Kimuraら2000aBlood95:189-197。その高度に調節された性質に一致して、VEGF-A調節不全は、種々の病理状態腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、ならびに虚血性の心臓および四肢疾患において役割を果たす。その結果として、VEGF-Aは、設計された人工的な転写因子を使用する親pro-および抗anti-脈管形成遺伝子治療の両方についての魅力的な標的を提供するようである。この実施例において、発明者らは、操作されたCys2-His2ZFP、および血管内皮増殖因子AVEGF-Aの遺伝子を含有する内因性染色体遺伝子座の活性化を成し遂げるための染色体構造についての知識を活用してきた。DNAseI過敏症マッピング分析は、VEGF-A遺伝子座の接近可能な領域の同定のために使用された。この分析は、VEGF-Aにおいて別個の4つのDNAseI接触可能領域を同定し、このうち3つは活性化研究のために使用されたHEK293細胞に存在した。次いで、3つのHEK293特異的DNAseI接近可能領域の各々の範囲内の9塩基対配列を認識するために、8つの新規のZFPを、設計し、それらのDNA結合特性の特徴付けを行った。設計された各ZFPは、10nM未満の見かけのKdで意図されたそれらの標的に結合した。次いで、これらのジンクフィンガーを、VP16転写活性化ドメインに連結しSadowskiら1988Nature335:563-564、そして内因性VEGF-A遺伝子および約3kbのVEGF-Aプロモーターを含む一過性にトランスフェクトされたネイティブレポーター構築物の両方について転写を活性化するそれらの能力を試験した。この結果は、設計されたZFP-VP16融合物の各々が、内因性VEGF-A遺伝子座およびネイティブレポーター構築物の両方を活性化することを示す。設計されたZFPはまた、NFκBのp65サブユニットに由来する活性化ドメインと連結されRubenら1991Science251:1490-1493;誤記訂正はScience1991254:11に記載される、そして、内因性VEGF-A単独でおよびVP16連結型ZFPとの任意の組合せの両方について転写を活性化する能力について試験した。このストラテジーは、VEGF-Aの発現を活性化する、7つの9塩基対部位に標的化された、8つの異なるZFPを産生した。特定のZFPに対して、VP16またはp65のどちらかに由来の活性化ドメインとの連結は、標的化される染色体部位に依存して、異なるレベルの活性化を提供する。さらに、VP16-およびp65-連結型ZFP別個の染色体部位に標的化されるの特定の組合せが、同時トランスフェクトcotransfectedされる場合、観察されるVEGF-Aの活性化は、個々のZFPの活性化レベルに対する相和より高い。最後に、これらの操作された転写因子により達成される活性化のレベルが、低酸素応答の間に獲得されるVEGF-Aレベルを上回り、そしてこの活性化により産生されるVEGF-Aスプライス改変体の相対比が、これらの細胞において通常観察される値に非常に近づくことを開示した。II.実験手順細胞株および細胞培養。これらの研究に使用された不朽化細胞株HEK293、Hep3BおよびH9c22-1を、AmericanTypeCultureCollectionから得、そしてヒト初代骨格筋細胞を、Cloneticsから得た。各株を、本質的に提供者が推奨するように維持した。ラット初代心臓筋細胞を、115U/mlII型コラゲナーゼおよび0.08パンクレアチンの溶液を用いる分離により出生後1日目のWistar-HanラットCharleRiverの心臓から回収。次いで、これらを、不連続なPercoll勾配を用いて精製し、15の血清を含有する平板培養培地に再懸濁し、次いで、ゼラチンコートプレート上で24時間平板プレート培養した。次いで、細胞を、DNaseIマッピング研究への使用に先立って、無血清培地中に24時間~48時間維持した。VEGF-A遺伝子座におけるDNaseIが接近可能なクロマチン領域のマッピング。DNaseI消化を、1.5分間22°Cで行い、そしてDNaseIの濃度を、図1の説明文中に示されるように使用したのを除いて、核を、基本的にZhangら上述に記載されるように単離し、そしてDNaseIWorthingtonを用いて処理した。次いで、ゲノムDNAの単離、制限酵素消化、およびサザンブロッド分析を、酵素およびプローブが、図1についての説明文中に示されるようであったことを除いて、基本的にZhangら上述によって記載されるように行った。細胞のクロマチン中の接近可能な領域の同定に関するさらなる開示については、共有に係る米国特許出願番号60/200,590および60/228,556もまた参照のこと。ZFPをコードするポリヌクレオチドの構築;ジンクフィンガータンパク質の合成、精製および結合分析。VEGF-Aに標的化されるZFPをコードする遺伝子を、上記のように構築し、クローン化しそして精製した。例えば、Zhangら上述;WO00/41566;およびWO00/42219を参照のこと。略述すると、各3つフィンガータンパク質three-fingerproteinのα-ヘリックス領域およびβ-シート領域をコードするオリゴヌクレオチドを、PCRを使用して構築し図2Aおよび図2B、そして結果として生じるZFP遺伝子の各々を、マルトース結合タンパク質をコードするDNAとの融合物として、pMal-c2プラスミドNewEnglandBiolabs、Beverly、MA中にクローン化した。次いで、マルトース結合タンパク質-ZFP融合物を、発現させ、そしてアミロースレジンNewEnglandBiolabs、Beverly、MAを使用してアフィニティー精製した。結合研究を、結合反応は、10pMの標識された標的部位を含み、そして、緩衝液の組成は以下:17mMTris、170mMKCl、1.7mMMgCl2、3.5mMDTT、0.01~0.033mMZnCl2、15グリセロール、300μg/mlウシ血清アルブミン、0.03IGEPALであったことを除いて基本的に記載されるようにZhangら、上述;WO00/41566;およびWO00/42219行った。さらに、これらの研究のためのZFP濃度を、ZFP調製物の結合が本質的に化学量論的である条件を使用し、ZFP調製物の各々のDNA結合活性を測定することにより直接的に決定したZFPおよび標的部位の濃度は100nMより高い。この改変されたプロトコルを使用して、SP1ジンクフィンガータンパク質は、その標的部位に対し、以前の研究において決定された親和性Zhangら、上述より、有意に高い親和性を示し、そしてこれらの研究における活性に基づくZFPの濃度の評価の使用および新しい結合緩衝液の両方が、見かけのKdの相違に寄与するようである。ジンクフィンガー融合タンパク質の構築。VEGF-A標的化ジンクフィンガーを、以前に記載されたようにZhangら、上述;WO00/41566;およびWO00/42219、SP1骨格に構築し、そしてpcDNA3哺乳動物発現ベクターInvitrogen、Carlsbad、CAの中にクローン化した。CMVプロモーターを、哺乳動物細胞において全てのZFPを発現させるために使用した。全てのZFP構築物は、SV40ラージT抗原largeTantigen由来のN末端核局在化シグナルPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val、配列番号224;ジンクフィンガーDNA-結合ドメイン、活性化ドメイン、およびFLAGペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、配列番号225を含んだ。ZFP-VP16融合物は、単純ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン由来のアミノ酸413~490を含んだSadowskiら、上述;Zhangら、上述;WO00/41566;およびWO00/42219。ZFP-p65融合体は、活性化ドメインとしてヒトNF-κB転写因子p65サブユニットアミノ酸288~548を有したRubenら、上述。ヒトVEGF-Aレポーター活性化のためのZFP融合物の活性についてのアッセイ。ヒトVEGF-Aプロモーター活性におけるZFPの効果を、ヒトVEGF-Aプロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター構築物を使用することにより測定した。ヒトVEGF-Aルシフェラーゼレポーター構築物pGLPVFHを、3318塩基対のヒトVEGF-Aプロモーターを含むゲノムDNAフラグメントおよびその隣の配列転写開始位置に関してnt-2279~1039をpGL3ベクターのPromega、Madison、WIKpnI部位とNcoI部位との間の多重multipleクローニング部位へ挿入することによって作製した。VEGF-A遺伝子の翻訳開始コドンATGを、この構成物のルシフェラーゼ遺伝子に直接融合した。ヒト胚腎臓細胞HEK293を、DMEMDulbecco改変Eagle培地中で増殖し、10のウシ胎仔血清を補い、5CO2インキュベーター中37°Cで培養した。細胞を、トランスフェクションの1日前に、1ウェルあたり160,000細胞の密度で24ウェルプレート中にプレートした。レポーター構築物およびZFP-VP16融合プラスミドを、LipofectAMINE試薬GibcoLifeTechnologies、Rockville、MDによってこれらの細胞に同時トランスフェクトし、ここで製造業者の推奨に従って1.5μlのLipofectAMINE試薬、260ngのVEGF-Aレポーター構築物、30ngのZFP-VP16をコードするプラスミドDNA、および10ngのコントロールpRL-CMVプラスミドPromega、Madison、WIを使用した。トランスフェクションの16時間後に培地を取り去り、そして新鮮な培地に交換した。トランスフェクションの40時間後に、培地を除去し、そして細胞を、回収し、そして製造業者のプロトコルに従って、Dual-luciferaseAssaySystemPromega、Madison、WIを使用してルシフェラーゼレポーター活性をアッセイした。一過性transientトランスフェクションによるヒト細胞中の内因性VEGF-A遺伝子上のZFP融合物の活性についてのアッセイ。ヒト胚腎臓細胞HEK293を、DMEMDulbecco改変Eagle培地中で増殖し、10のウシ胎仔血清を補い、5CO2インキュベーター中37°Cで培養した。細胞を、1ウェルあたり160,000細胞の密度で24ウェルプレート中にプレートした。一日後、ZFP-VP16融合物をコードするプラスミドを、LipofectAMINE試薬GibcoLifeTechnologies、Rockville、MDを用いて細胞中にトランスフェクトし、ここで、1ウェルあたり1.5μlのLipofectAMINE試薬および0.3μgのZFPプラスミドDNAを、製造業者の推奨に従って使用した。細胞を、50のコンフルエンスまたは90のコンフルエンス、あるいはその間のいずれかの整数の割合でトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後に培地を除去し、そして新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクションの40時間後、培養培地および細胞を回収し、そしてVEGF-Aの発現についてアッセイした。培養培地中のVEGF-Aタンパク質内容物を、ヒトVEGFELISAキットRDSystems、Minneapolis、MNを用い、製造業者のプロトコルに従ってアッセイした。ZFPタンパク質発現のウエスタン分析のために、細胞を、LaemmliSampleLoadingBufferを用いて溶解し、そして溶解物を、10のポリアクリルアミドゲル電気泳動BioRad、Hercules、CAによって分析し、その後、設計されたZFPのFLAGエピトープタグを認識する抗FLAG抗体Sigma、St.Louis、MOを使用するウェスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロッドを、前に記載したようにZhangら、前述ECLAmershamPhamaciaBiotech、Piscataway、NJを用いて可視化した。VEGFmRNAレベルの定量的RT-PCR分析のために、細胞を、溶解し、そして製造業者の説明書Qiagen、Valencia、CAに従い、インカラムDNase処理を用いるRNeasyTotalRNA単離キットを使用して全RNAを調製した。25ngのRNAを、前に記載したようにZhangら、上述、ABI7700SDS機PerkinElmerAppliedBiosystems、FosterCity、CAにおいてTaqman化学を使用するリアルタイム定量RT-PCR分析において使用した。略述すると、MultiscribeReverseTranscriptasePEBioSystems、FosterCity,CAを使用して、逆転写を、48°Cで30分間行った。95°Cでの10分の変性に続き、AmpliGoldDNAポリメラーゼを使用するPCR増幅を、95°Cで15秒間および60°Cで1分間の40サイクル行った。この結果を、SDSバージョン1.6.3ソフトウェアPEBioSystems、FosterCity、CAを使用して分析した。Taqman分析に使用したプライマーおよびプローブを、表5に列挙する。これらのプライマーおよびプローブは、ヒトVEGF-A遺伝子の全て公知のスプライス改変体であると認識するが、スプライス改変体の間は、識別しない。VEGFmRNAのRNAブロット分析HEK293細胞を、150mmの培養皿で増殖し、そしてpcDNA3ベクターコントロールまたはZFPをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトし、ここで製造業者の推奨に従って、LipofectAMINE試薬GibcoLifeTechnologies、Rockville、MDを使用した。細胞および馴化培地を、トランスフェクションの40時間後に回収した。全てのRNAを、Trizol試薬GibcoLifeTechnologies、Rockville、MDを使用して細胞から抽出し、その後RNeasy全RNA単離中型調製midi-prepシステムQiagen、Valencia、CAを使用した。RNAブロットのための、全てのRNAサンプル30μgを、1.2のホルムアルデヒドアガロースゲルに分離し、そしてNytranSuperChargemembraneSchleicherSchuell、Keene、NH上にブロットした。膜を、68°CのUltrahybTMハイブリダイゼーション緩衝液Ambion、Austin、TX中で、32P-標識したヒトVEGF-A165アンチセンスリボプローブとハイブリダイズした。68°Cの0.1×SSC、0.1SDSを用いた洗浄の後、膜を、フィルムに曝した。同一の膜を、0.1SDS中で煮沸することにより剥がし、ヒトβ-アクチンアンチセンスリボプローブを用いて再ハイブリダイズした。VEGF-AmRNAのスプライス改変体の分析VEGF-AmRNAの多数のスプライス改変体を検出するために、全RNAサンプル0.5μgを、TitanTM単一チューブone-tubeRT-PCRsystemRocheMolecularBiochemicals、Indianapolis、INを使用する、20サイクルのRT-PCR反応に供した。使用したプライマーは、以下:5’-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATT-3’配列番号:235、および5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3’配列番号:236であった。PCR産物を、3Nusieve3:1アガロースゲルFMC、Rockland、MEに再溶解し、NytranSuperChargemembraneSchleicherSchuell、Keene、NH上にブロットし、そして32P-標識されたヒトVEGF-A165アンチセンスリボプローブを使用するサザンハイブリダイゼーションによって分析した。VEGF-189、VEGF-165およびVEGF-120についての、予期されるPCR産物のサイズは、それぞれ、630塩基対、576塩基対、および444塩基対であった。III.結果VEGF-Aと会合した接近可能なクロマチンの構成的細胞特異的領域-クロマチンマッピング研究は、腫瘍株および始原細胞を含むヒトおよびラットからの種々の細胞型を包含した。この調査の範囲、および細胞型の選択は、種々のプロ-血管形成遺伝子療法およびアンチ-血管形成遺伝子療法のための候補ZFPを開発する目的によって動機付けられた。初期の目的は、VEGF-Aプロモーター中の任意の構成的接近可能クロマチン領域、および医療的に関係ある標的組織およびモデル生物に特異的な領域を同定することであった。従って、DNAse超感受性分析を、多くの異なる始原細胞および細胞株からのクロマチンに関して実施した。この分析の結果は、VEGA-A遺伝子中またはその近傍に4つの別個の超感受性領域の存在を示す。これらのうち2つは、VEGF-Aプロモーターのほぼ塩基-550および1を中心にし、試験されたすべての細胞型において変動せずに観察された。図1は、ヒト図1Aおよびラット図1Bの両方におけるこれら領域を同定する代表的な実験結果を示す。両方の領域は、高解像度で見たときダブレットとして見えた図1Aおよび1C。1にあるオープン領域の発見は、幾分予期されていた。なぜなら、超感受性領域は、しばしば、転写開始部位の近傍に観察されているからであり例えば、Grossら1988Ann.Rev.Biochem.57:159-197を参照のこと、そしてこの領域は、SP1およびAP-2の標的を含む、VEGF-A活性化に重要であることが示されているいくつかの保存された調節エレメントをさらに含むからである。Milaniniら1998J.Biol.Chem.273:18、165-18、172。-550領域中の接近可能なクロマチンの観察ヒトおよびラット両方のクロマチン中は、幾分より驚くべき結果であった、なぜなら、VEGF-Aプロモーターのこの領域にこれまでマップされた調節エレメントはないからである。しかし、VEGF-Aプロモーターのこの領域が、ヒト、マウスおよびラット間で高い程度の配列保存を示した図1F、灰色トレースことは注目され、保存が、調節エレメントのサイズの配列ブロックに関して評価されるとき、より明確になり図1F、黒色トレース、しかもこの領域のDNAseI超感受性および1領域のDNAaseI超感受性もまた、ラットとヒト間で保存されている。実際、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動するSV40基礎プロモーターに融合した、この領域を含むDNAフラグメントを含む構築物の分析は、この領域がシスに作用する調節機能を媒介することを示す。この-550領域が本来DANseI消化により感受性であったという可能性は、DNAseIによるこの領域の増加した切断を示さなかった、精製された裸のDNAを用いたコントロールマッピング研究を実施することにより排除された。-550および1に見出された構成的超感受性領域に加え、試験された細胞型の1つのサブセットのみに見られた、他の2つの接近可能なクロマチンのストレッチが同定された。これら領域の1つは、VEGF-Aの低酸素症応答エレメントHREの中心にある約300bpを包含し、そしてヒト始原骨格筋細胞中図1CおよびHep3B細胞株中で観察された。対照的に、この部位は、HEK293細胞中では明瞭に観察されなかった図1C。この低酸素症応答エレメントは、VEGF-Aプロモーター中の増加した配列保存の領域を包含し図1F、そしてHIFに対する結合部位を含む低酸素によるVEGF-Aの誘導に必要であるいくつかの保存された調節エレメントを含むことが示されている。Ikedaら1995J.Biol.Chem.270:19、761-19、766;Liuら1995上述;Grantら2000Biochemistry39:8187-8192。最後に、HEK293細胞図1D、始原骨格筋細胞、およびラット始原心筋細胞図1Bにおいて、転写開始部位の約500bp下流に、超感受性領域が観察された。興味深いことに、この領域は、推定のSP1調節エレメントを含み、そして代替の転写開始部位に隣接している図1F。Akiriら1998Oncogene17:227-236。この領域はまた、レポーター遺伝子の発現をシスに活性化する能力を示した。要約すれば、本発明者らは、VEGF-Aの転写開始部位に対し、約-550、1、および500bpに中心のある、HEK293細胞中のDNAseに接近可能な3つの領域を同定した。VEGF-Aのオープンクロマチン領域を標的にするZFPの設計および生化学的特徴付け。上記の超感受性領域の各々内に含まれる配列に結合するZFPを設計した。ジンクフィンガーDNA認識の設計および選択研究は、特徴付けられたトリプレット特異性をもつ、フィンガーの多様なコレクションを生じた。例えば、Elrod-Ericksonら1998Structure6:451-464および上述の参考文献を参照のこと。集合的に、これらのフィンガーは、特定の条件下で、所望の結合性質をもつマルチフィンガータンパク質を得るために混合され、かつ適合され得るトリプレット結合モジュールのディレクトリを提供する。このアプローチを用い、293細胞中で観察された-550、1および500オープンクロマチン領域内の部位に標的される一連のZFPを設計し図2D、そしてこれらのZFPをコードする遺伝子をアセンブルした。超感受性領域の外側の部位に標的される2つのコントロールZFPをコードする遺伝子もまたアセンブルした。これらZFPの設計は、表3、4および6に示される。これらのZFPは、VEGF-Aの転写開始部位に対するそれらの標的位置に従って命名された。従って、VZ-475およびVZ590の標的配列中の最初の塩基は、VEGF-A遺伝子の主要な転写開始部位の475塩基対上流および590ヌクレオチド下流にある。これらのZFPの1つは、この領域内に2つの標的部位をもち、そしてこの事実を反映するために複合名を与えたVZ42/530。複数のZFPが所定の配列に標的される場合、これは、交互のZFP設計間を区別するために各名前の終わりに小文字の接尾辞の使用により示されている。従前に記載の方法を用い例えば、同時所有のWO00/41566およびWO00/42219、およびZhangら、前述を参照のこと、ZFP設計をコードする遺伝子をアセンブルし、そしてコードされたタンパク質の各々を組換え形態で発現した図2A-2C。次いで、各々のZFPのDNA結合親和性を、ゲルシフトアッセイを用いて特徴付けた。設計されたZFPのすべては、ナノモル範囲であったそれらの意図されたDNA標的に対する見かけのKdsを示した。比較のために、これらの条件下SP1は、そのDNA標的に対し、0.25nMの見かけのKdを示した。これらの研究は、各々の設計されたZFPが高親和性でその標的部位を認識することを示した。ZFPによるヒトVEGF-A遺伝子プロモーターの活性化。設計されたZFPの各々を、VP16転写因子の最小活性化ドメインに融合し、そしてVEGF-Aプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を活性化するその能力について試験した。融合構築物はまた、N末端核局在化配列およびC末端FLAGエピトープタグを含んだ。レポータープラスミドは、ヒトVEGF-Aプロモーターの制御下ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むように構築した。このレポータープラスミドを用い細胞中に一時的に同時トランスフェクトするとき、設計されたZFP-VP16融合物のすべては、これレポーターを活性化し得た図3A。活性化の範囲は、3~15倍の間で変動した。この活性化はZFP依存性であった;GreenFluorescentProtein-VP16融合物は、レポーターを活性化し得なかったからである。図12をまた参照のこと。これらの結果は、設計されたZFPのすべてが染色体外DNAテンプレート上で活性であったことを示す。ZFPを用いる内因性ヒトVEGF-A遺伝子の転写活性化。これらのZFP-VP16融合物が、内因性染色体遺伝子座からのVEGF-A遺伝子転写の調節においてまた活性であったか否かを試験するために、これら設計されたZFP-VP16融合物を、HEK293細胞中に一時的にトランスフェクトし、そして内因性VEGF-A遺伝子発現に対するそれらの影響を分析した。ヒト胎児腎臓細胞HEK293は、任意のZFP構築物の不在下で、相対的に低いレベルのVEGF-Aを産生した。図3Cに示されるように、上記のように設計されたZFP-VP16融合物の発現は、ELISAにより測定したとき、培養培地中への高められたレベルのVEGF-Aの分泌を生じた。活性化の範囲は、2~15倍の範囲で変動し、ZFPVZ434bが最も活性であった。ZFPにより誘導されるこの増加したVEGF-Aタンパク質の産生は、定量的PCRにより測定したとき、VEGF-AmRNAのレベルにおける2~10倍増加と相関した図3D。種々のZFP-VP16融合物は、変動する能力でヒトVEGF-AmRNA転写を活性化し、ZFPVP434bが最も活性であった。異なるZFP融合物が、タンパク質レベルのウェスタンブロッティングにより図3E、およびmRNA発現に対するTaqmanにより図3F測定したとき、同様のレベルまで発現されたことが見出された。図10および13さらなるZFP構築物により誘導されるVEGFタンパク質レベルおよび図11VEGFmRNAレベルの対応する分析もまた参照のこと。VEGF-A遺伝子の接近可能な領域に標的されるZFPの挙動を、非接近可能な領域に標的されるZFPのそれと比較した。これらの研究からの代表的データを図4に示す。試験された4つのすべてのZFPがほぼ等しいレベルまで染色体外レポーター構築物を活性化したが、内因性VEGF-A遺伝子に対する活性に関し、明瞭な食い違いが観察された。接近可能な領域に標的されたZFPは、VEGF-Aを4~5の係数で活性化し、その一方、接近可能な領域の外側の部位に標的されるZFPは、VEGF-A発現レベルにおける認知し得る増加を示さなかった。従って、特定の場合には、設計されるZFPを、細胞クロマチンの設計可能な領域に存在する結合部位に標的することが有利であり得る。異なる活性化ドメインと融合したZFPによるヒトVEGF-A遺伝子の活性化。ヒト細胞におけるより高いレベルのZFPによるVEGF-A活性化を達成するために、他の活性化ドメインの性能を試験し、そしてVP16により達成されるそれと比較した。いくつかの設計されたZFPを用いて試験したとき、NF-κBのp65サブユニットからの活性化ドメインの使用がより高いレベルの活性化を提供したことが見出された図5。この実験では、いくつかのZFP-p65融合物、例えば、ZFPVZ434bは、たとえZFP-p65融合タンパク質およびZFP-VP16融合タンパク質が同様のレベルまで細胞中で発現および蓄積されたとしても図5B、ZFP-VP16融合物により誘導されるそれよりも3~4倍高いレベルのVEGF-Aタンパク質を誘導した図5C。このZFP-p65融合物により誘導されたより高いレベルのVEGF-Aタンパク質産生は、Taqman分析により測定したとき、より高いレベルのVEGF-AmRNA転写と一致した図5D。興味深いことに、VZ-8のような、いくつかのZFPについて、p65融合物は、VP16融合物のそれと同様の活性を示した。従って、VP16とp65は、異なる標的部位に依存する活性化機構をもつようである。ヒトVEGF-A遺伝子の活性化におけるZFP間の相乗作用。VFGF遺伝子プロモーターの多様な領域を標的にし、そして異なる活性化ドメインに融合したZFPを活性化するセットの利用可能性は、ZFPの異なる活性化ドメインとの組み合わせが、VEGF遺伝子転写の相乗的制御を達成し得るか否かを調査する機会を提供した。この可能性を試験するために、種々のZFP-VP16およびZFP-p65融合物を、ヒトHEK293細胞中に同時トランスフェクトし、そしてVEGFレベルを、ELISAおよびTaqmanにより測定した。図6に示されるように、ZFPsVZ434b-VP16およびVZ-573a-p65は、293細胞におけるVEGF産生を、それぞれ8倍および6倍活性化した。しかし、これら2つの融合物を、1:1の比で細胞中に同時トランスフェクトしたとき、VEGF遺伝子活性化のレベル30倍は、個々の各々のZFPにより誘導されるレベルと比較して、付加的より多かった。ZFPVZ434b-p65とVZ-573a-VP16との間の同様の相乗作用もまた観察された。ZFPによるVEGF誘導の低酸素症により誘導されたVEGF-Aのレベルとの比較。生理学的に相当するプロセスによるVFGFの活性化に関し、ZFP融合物によるVEGF-A発現の活性化の大きさを評価するために、ZFP融合物により誘導されるVEGFレベルを、低酸素症により誘導されるそれと比較した。試験された多くのZFP融合物について例えば、ZFPVZ434b、ZFPは、低酸素症により誘導されるそれより高いレベルまでVEGF-A発現を活性化し得た。図7に示されるように、低酸素条件下で増殖したHEK293細胞は、通常酸素条件で増殖した細胞図7Bにおけるより5倍高い定常状態VEGF-AmRNAレベルを有し、そしてVEGF-Aタンパク質は、培養培地中でほぼ400pg/mlまで蓄積した10倍増加、図7A。p65活性化ドメインに融合したZFPVZ434bは、ほぼ4000pg/mlまでの培養培地中のVEGFタンパク質の蓄積図7A,およびVEGFmRNAレベルにおける20倍の増加図7Bにより証明されるように、低酸素により誘導されるそれより、5~10倍大きいレベルまでVEGF遺伝子の発現を誘導した。この観察はまた、RNAブロット分析により確認された図7C。単一のZFPを用いる複数VEGFスプライス改変体の活性化。ヒトVEGF-AmRNAのいくつかのスプライス改変体が報告されており、各々は特異的なエキソン付加を含む。Ferrara1999上述。主要なVEGFmRNAスプライス改変体は、VEGF206をほとんど発現せず、胎児肝臓でのみ検出されているが、121、165、および189および206アミノ酸をもつポリペプチドを産生する。設計されるZFPは、天然の染色体プロモーターからの遺伝子転写を活性化したので上述を参照のこと、それらは、異なるVEGF-A転写物のすべてを、それらの相対的性質を保存しながら、等しく活性化することが予期される。この考えを確認するために、同じプロモーターからの複数の転写物を活性化するZFPVZ434bの能力を分析した。スプライス改変体を区別するために、RT-PCRを、異なるスプライシングの領域に隣接するプライマーを、各スプライス改変体について別個のPCR産物が産生されるように用いて実施した。次いでPCR産物を、VEGF165プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションにより分析した。3つのスプライス改変体VEGF-A-189、VEGF-A-165、およびVEGF-A-121を293細胞中で検出し、VEGF-A-165が優先的形態であった。図7Dに示されるように、VP16またはp65融合物のいずれかとして、単一ZFP、VZ434bの導入は、すべてのスプライス改変体のレベルにおける比例した増加をもたらした。IV.討論この実施例は、そのプロモーター内の多様な標的部位から内因性ヒトVEGF-A遺伝子を活性化し得るZFPのパネルの成功した設計を示す。この実験的アプローチは、VEGF-A遺伝子座のクロマチン構造に関する情報を取り込んだ。なぜなら、特定の状況では、クロマチン構造に関する情報が、ZFP設計原理と組み合わせて用いることができ、内因性遺伝子を特異的に調節し得る人工的転写因子を同定するための効率的手段を提供するからである。本明細書に開示されたいくつかの設計されたZFPは、潜在的なアクチベーターであり、低酸素症による誘導の間に観察されるVEGF-Aレベルを超えるVEGF-Aレベルを生じる。開示された方法および/または開示された組成物の実施には、機構の理解は必要ではないが、DNAseI接近可能な領域に標的される設計されたZFP融合物は、これら領域におそらく結合する天然の転写因子と相乗的に作用し得ることが可能である。本明細書に開示される人工的転写因子のパネルは、VEGF-A遺伝子の多様な部位に標的され、内因性遺伝子座における転写活性化の構造的決定因子を評価するための特有なツールを提供し、そしていくつかの結果は、クロマチン構造の可能な転写効果を反映する。例えば、ZFPのパネルの異なるメンバーは、染色体外プロモーターレポーター構築物と比較して、内因性VEGF-A遺伝子座の異なるパターンの活性化を示す図3Bと3Cを比較のこと。さらに、VP16を実施させるp65活性化ドメインの能力は、位置依存的様式で変動し、VEGF-A遺伝子座内のZFP標的の位置に依存し、相対的活性化レベルは、3の係数を超えて変動し、VEGF-A遺伝子座内のZFP標的の位置に依存する図5C。これらの効果は、おそらくは他の調節タンパク質の結合とカップルする、クロマチンにより課せられる構造的文脈から生じる内因性遺伝子座を活性化するために、設計された転写因子の能力に関する制限を反映し得る。それらはまた、異なる活性化ドメインが最適性能のために別個の調節および立体的要求を有するという考えを再強調する。内因性遺伝子座に標的される因子のパネルを生成する能力はまた、種々の適用において実際の利点を提供する。標的遺伝子座のアップまたはダウン調節の影響を研究することで、例えば、遺伝子機能に関する結論は、所望の効果が多くの異なる調節因子を用いて繰り返し観察される場合、最も強力である。さらに、潜在的な医療使用には、複数のZFP候補の利用可能性は、最小の副作用で最適な利益を生じる先導化合物を得るより大きな可能性を提供する。これらタンパク質の使用のさらなる可能性は、転写調節の研究においてにある。例えば、同じ遺伝子座中の任意の部位に複数の活性化ドメインを標的にする能力は、相乗作用の研究において明瞭な適用を有している。この点について、同時トランスフェクトされたVP16活性化およびp65活性化ドメインを保持するZFPにより媒介される、VEGF発現に対するより大きい付加的効果が、本明細書に開示されている。適切に標的される機能的ドメインのより大きな組み合わせを用いることにより、設計されたZFPは、完全に規定された成分を用いる活性化プロセスの全体的な再構築の見込みを提供し得る。本明細書に開示された研究のさらなる観察は、NF-κBp65サブユニットRubenら、上述と融合したZFPが、単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質の78アミノ酸活性化サブドメインSadowskiら、上述と同様、またはそれより良好に内因性VEGF遺伝子を活性化することである。VP16およびNF-κBp65の両方は、強力な酸性活性化ドメインであり、かつ特定の機能的特徴を共有しているが;例えば、ARC/DRIP複合体の召集およびプロモーターDNA上の予備開始複合体の促進されたアセンブリNaarら1999Nature398:828-832;Rachezら1999Nature398:824-828;それらのトランス活性化機構における差異が報告されている。例えば、p300のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性が、NF-κBによる活性化に必要であるがVP16による活性化にはそれほど必須ではないことが示されている。Krausら1999Mol.Cell.Biol.19:8123-8135;Liら2000Mol.Cell.Biol.20:2031-2042。p300の局所的利用可能性または内因性VEGF遺伝子座内のその他の同時アクチベーターが観察された差異を説明し得る可能性がある。最後に、本明細書に開示される設計されたZFPは、生理学的条件下例えば、低酸素症で観察されたそれらに類似する比率で、VEGF-Aの各主要スプライス改変体を上方調節する。これは、最近の研究が適正なイソ形態バランスがVEGF-A機能に重要であることを示唆しているので重要である。Carmelietら1996上述;Carmelietら1999上述;Grunsteinら2000上述。特に、VEGF-Aの165、189および206アミノ酸イソ形態は、増加してより強力なヘパリン結合ドメインを有し、これは、VEGFレセプターに対する提示、および細胞外マトリックスへの結合に関与している。ヘパリン結合能力は、VEGF-A能力の重要な決定因子であり、異なるイソ形態について異なる生物学的活性を生じる。現在、大部分のVEGF-A遺伝子療法試行は、ちょうど一つのVEGF-Aスプライス改変体cDNAまたはタンパク質イソ形態の適用を含む。Isnerら1996Lancet348:370-374;Esakofら1999Hum.GeneTher.10:2307-2314;Rosengartら1990aAnn.Surg.230:466-470、討論470-472;Rosengartら1999bCirculation100:468-474;Hendelら2000Circulation101:118-121。理想的な遺伝子療法剤は、種々の異なるVEGF-Aイソ形態の天然比率を賦活し得るべきであることが示唆される。従って、本明細書に開示される設計されたZFPを用いるVEGF-Aの活性化は、この点に関して利点を提供し、プロ血管形成遺伝子療法剤の重要な成分を提供する。実施例2内因性マウスVEGF遺伝子の活性化マウスVEGF遺伝子の配列GenBank受託番号U41383を、ZFP標的部位についてサーチし、そして、VG10A/8Aと称するZFPを、転写開始部位の下流の56と73ヌクレオチドとの間の部位に結合するように設計した。この標的部位の配列は、5’-TGAGCGGCGGCAGCGGAG配列番号237である。この標的部位に結合するよう設計された6フィンガーZFPは、認識ヘリックス中に以下のアミノ酸配列をもつN末端からC末端方向に進行して:RSDNLAR配列番号35;RSDELQR配列番号159;QSGSLTR配列番号57;RSDELTR配列番号122;RSDELSR配列番号238およびQSGHLTK配列番号239。この6フィンガー結合ドメインを、実施例1に記載の方法に従って、VP16活性化ドメインに融合した。このZFP融合物をコードするプラスミドを、マウスVEGFプロモーターの制御下のレポーター遺伝子とともにマウス細胞中に同時トランスフェクトし、そしてレポーター遺伝子活性の29倍活性化を観察した。このZFP構築物をまた、マウス骨格筋中に注入し、内因性VEGF遺伝子の活性化について試験した。プラスミドDNAの1mg/ml溶液の100マイクロリットルを、生きたマウスの四頭筋中の2つの異なる部位中に注入した。対側性四頭は、実験注入を受ける筋肉に類似の筋肉中の部位に、ZFPコード配列を欠くプラスミドの2つのコントロール注入を受けた。注入針は、注入の同様の深さを確実にするためにマークを付け、そして注入の部位にIndiaInkでマークを付けた。注入の3日後、同一サイズの組織サンプルを、マークを付けた注入部位からパンチパイオプシーにより回収した。この組織サンプルからタンパク質を抽出し、そしてゲル電気泳動により分離した。このゲルをブロットし、そしてこのブロットを抗マウスVEGF抗体RDSystems、Minneapolis、MNを用いてプローブした。結果を図8に示す。これらの結果は、VEGFの産生が、ZFP-VP16融合物をコードするプラスミドを注入したマウス筋肉で増加し、しかもVEGF発現の増加が、注入それ自身に単に起因しないことを示す。実施例3内因性ラットVEGF遺伝子の活性化ラットVEGF遺伝子中の部位に標的されたZFPを用い、実施例2に記載したのと同様の実験をラットに対して実施した。このZFPのいくつかは、ヒトVEGF-A遺伝子中のZFP標的部位に相同であり、そしてヒトVEGF-A遺伝子を活性化することが示された実施例1、前述を参照のこと。これら標的部位およびこれらZFPの認識ヘリックスの配列は、表7中に提供される。ZFP-VP16融合物を、実施例2に記載のマウス注入と同様に、ラット骨格筋血に注入した。抗ラットVEGF抗体RDSystems、Minneapolis、MNを用いるイムノブロッティングによる分析は、すべてのZFP融合物がラットVEGF産生を活性化し、そしてBVO12A-11A、BVO14A-13B、およびVOP32Bが5~10倍の間でVEGF発現の顕著な増加を誘導したことを示した。実施例4VEGF標的化ZFP融合物を用いる、マウスにおける創傷治癒および血管形成の刺激この実施例では、パンチバイオプシー創傷をマウスの両方の四頭筋中に作製した。CMVプロモーターの転写制御下のVG10A/8AZFP-VP16融合物をコードするプラスミドを実施例2、上述で用いたように、創傷の1つの周縁中に注入し、そしてZFP結合ドメインをコードする配列を欠くコントロールプラスミドを、対側の創傷中に注入した。3日後、組織を切除し、そしてヘモシアニンエオシン染色した薄い切片を顕微鏡で調べた。結果を図9に示す。図9Bは、低倍率画像を示し、そこでは、内成長する組織の縁が、創傷を覆う血栓の下に見られる頂部左の血栓、内成長する組織の縁が矢印頭により示される。対照的に、図9Aに示されるコントロール注入組織では血栓の下に内成長する組織は見られない。図9Dおよび9Fは、高倍率画像を示し、これは、図9Cおよび9Eに示されるコントロール注入組織に比較して、多数の毛細血管断面および赤血球細胞により証明されるように、ZFP注入組織中の増加した血管形成を示す。この実験の結果は、標的されたZFP融合物によるVEGF遺伝子の活性化が、より速い創傷治癒および増加した血管形成に至ることを示す。実施例5単一のZFP融合タンパク質を用いる複数ヒトVEGF遺伝子の調節この実施例では、単一ZFP融合物が複数のヒトVEGF遺伝子を調節する能力を試験した。表2に示されるように、VOP28AZFPおよびVOP30AZFPは、VEGF-AおよびVEGF-C両遺伝子中に標的部位をもつ。VOP28Aは、VEGF-A遺伝子中-573に、およびVEGF-C遺伝子中61に標的部位をもち;その一方、VOP30Aは、VEGF-A中42および530に、そしてVEGF-C中-481に1つの標的部位をもつ。HEK293細胞を、実施例1、上述に記載の方法に従って、VOP28A-VP16融合物またはVOP30A-VP16融合物のいずれかをコードするプラスミドでトランスフェクトした。同時トランスフェクションの40時間後、VEGF-AmRNAを、表5に示すプライマーおよびプローブを用い、実施例1に記載のように、TaqMan登録商標により定量した。VEGF-CmRNAは、表8に開示されるプライマーとプローブを用い、実施例1に開示された方法に従って、同じRNAサンプル中で定量した。図14に示される結果は、VOP28AおよびVOP30A融合タンパク質の各々が、VEGF-AmRNAおよびVEGF-CmRNAの両方の産生を活性化することを示す。コントロールとして、HEK293細胞を、VOP32B-VP16融合物をコードするプラスミドでトランスフェクトした。VOP32Bは、VEGF-A遺伝子中、434に標的部位をもつが、VEGF-C遺伝子中に標的部位はもたない。これら細胞では、VEGF-CmRNAレベルに変化はないが、VEGF-A転写の強い活性化が観察された図14。これらの結果は、複数のVEGF遺伝子が、単一のZFPにより調節され得、血管形成のより効率的な調節に至ることを示す。実施例6VEGF-標的ZFP融合物を用いるマウス中のVEGFのインビボ誘導、ならびに血管形成および創傷治癒の刺激I.緒言この一連の実験は、適切に設計されたZFP融合タンパク質の、インビボにおけるVEGFの発現を活性化する能力をさらに示すため、およびこのようなタンパク質の、ヒトにおける対応するプロセスのモデルとして用いられるマウスモデル系中の血管形成および創傷治癒を刺激する能力を示すために設計された。操作されたZFPおよび染色体構造の知見を、種々の異なる型の調査に用いて、VEGFAの選択的な活性化を達成した。実施例1のように、DNAseI超高感度マッピング分析による標的の同定の後、VEGFを刺激する特定のZFPを設計した。これらの最初の実験は、NIH3T3細胞およびC127I細胞の両方における3つの異なるDNAse-Iの利用可能領域の同定を導いた。ZFPを、各々の細胞型において同定した利用可能領域内の9bpまたは18bpの標的部位のいずれかに結合するように設計した。これらの設計されたZFPの各々は、0.6nM未満の見かけのKdで、意図する標的に緊密に結合し、かつ天然に存在する転写因子SP1よりも緊密に結合することが示された。次いで、1つの設計されたZFPおよびVP16転写活性化ドメインの1つを含む融合タンパク質Sadowskiら、1998Nature335:563-564を、それらがC127I細胞中の内因性VEGF-A遺伝子の発現を活性化する能力について、転写およびタンパク質レベルの両方で試験した。以下により十分に記載されるように、その結果は、設計されたZFPが、内因性のVEGF-A位置を活性化し得、そしてそのように作用して、新脈管形成、上皮再形成、および創傷治癒のプロセスを促進することを実証する。II.実験手順A.VEGFを調節するジンクフィンガータンパク質の設計マウスVEGF-A位置におけるDNAse-I利用可能な染色体領域のマッピングC127I細胞およびNIH3T3細胞を、AmericanTypeCultureCollectionから得、そして実質的に供給者によって推されるように、維持した。核を単離して、そしてDNAseIWorthington消化が22°Cで1.5分にわたり、用いるDNAseIの濃度が図15Aの凡例に示されるようなものであることを除いて、本質的に記述されるようにZhangら、2000J.Biol.Chem.275:33、850-33、860;およびLiuら、2001J.Biol.Chem.276:11,323-11,334、DNAseIで処理した。次いでゲノムDNAの単離、制限酵素消化、およびサザンブロット分析を、酵素およびプローブが、図15Aに示されるようなものであることを除いて、実質的に記載されるようにZhangら、前出;およびLiuら、2001、前出実施した。ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子の合成3フィンガーZFPmVZ426およびmVZ509をコードする遺伝子のアセンブリは、記載されているLiuら、2001、前出[その研究において、これらの設計は、各々VZ434およびVZ42/530として示された。]。簡単には、各々の3フィンガータンパク質のα-ヘリックス領域およびβ-シート領域をコードするオリゴを、PCRを用いて構築し、そして各々の得られたZFP遺伝子を、マルトース結合タンパク質をコードするDNAとの融合物としてpMal-c2プラスミドNewEnglandBiolabsへとクローニングした。6フィンガータンパク質mVZ57をコードする遺伝子を構築するために、以下の2つの工程の戦略を用いた。第1に、VZ57のフィンガー1~3および4~6に対応する3フィンガータンパク質をコードする遺伝子を構築し、そして上記のようにクローニングし、構築物pMal-c21~3およびpMAl-c24~6を産生した。次に、これらの2つの遺伝子を、可撓性ペプチドリンカーをコードする短いDNAスペーサーを介して結合させた。これを以下のように達成した:iプライマー5’CCCAGATCTGGTGATGGCAAGAAGAAGCAGCACCATCTGCCACATCCAG配列番号241および5’CCCAAGCTTAGGATCCACCCTTCTTGTTCTGGTGGGT配列番号242を用いた4~6ZFP遺伝子のPCR;iiBglIIおよびHindIIIを用いた、得られたフラグメントの消化プライマー中の下線部位;ならびにiiiBamHIおよびHindIII部位へのpMal-c21~3のライゲーション。得られたタンパク質VZ57は、可撓性ペプチドによって、以下のようなフィンガー3の第2のジンク配位ヒスチジンとフィンガー4の第1のジンク配位システインとの間のアミノ酸配列:HQNKKGGSGDGKKKQHIC配列番号243と結合された1~3および4~6の3フィンガーモジュールからなる。結合の研究結合の研究を、緩衝液を以下の最終組成物に改変したことを除いて、実質的に記載されるようにLiuら、2001J.Biol.Chem.276:11,323~11,334実施した:10mMのTris、100mMのKCl、1mMのMgCl2、10mMのDTT、0.01mMのZnCl2、10のグリセロール、200μg/mlのウシ血清アルブミン、0.02のIGEPAL。これらの条件下で、SP1コントロールとして用いた、転写因子を含む天然に存在するジンクフィンガーは、以前の研究Liuら、2001、前出で決定された親和性よりも有意に高い親和性を示し、そして本発明者らの精製した結合緩衝液の使用が、見かけのKdの差異に寄与したようである。これらの研究に関するZFP濃度を、各々のZFP調製物のDNA結合活性を、結合が実質的に化学量論的な条件すなわち、ZFPおよび標的部位の濃度がKdの50倍よりも高いを用いて測定することによって直接的に決定した。レトロウイルスベクターの構築本明細書に記載されるレトロウイルスベクターは、pLXSN内的シミアンウイルスSV40のプロモーターの制御下のネオマイシン耐性遺伝子を含む、Moloneyマウス白血病ウイルスベースのベクター由来である。EcoRI制限部位およびXhoI制限部位を用いて、このジンクフィンガーの発現カセットを、pLXSN中のLTRのすぐ下流に配置した。簡単には、全てのZFP構築物は、SV40ラージT抗原由来のN末端核局在化シグナルPro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val配列番号224、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、アミノ酸413~アミノ酸490までの単純疱疹ウイルスVP16活性化ドメイン、およびFLAGペプチドAsp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys配列番号225を含んだ。このLXSNベクターを、293AMPHOPAKTM細胞株において産生した。このLXSNベクターは、0.5~1.0×106G418耐性コロニー形成単位の範囲のタイターを有した。ウイルスを含む上清をトランスフェクションの48時間後に収集し、0.45mmのポアサイズのフィルターでろ過し、そして標的細胞の形質導入のために新しいものを用いるか、分割し、そして-80°Cで保存した。レトロウイルス形質導入AMPHO-PAKTM293細胞株をClontechから入手し、製造者の推奨に従い、増殖させた。C127I細胞を、AmericanTypeCultureCollectionATCCから入手し、そして10のウシ胎児血清を補充したDulbeccoの改変Eagle培地DMEN中で増殖させた。この細胞を、6ウェルのプレート中で、2×104細胞/ウェルの密度でプレートし、次いで24時間後に、8μg/mlのポリブレンの存在下で、2.0mlのウイルス含有上清に曝露し、そして37°Cのインキュベーターでインキュベートした。このウイルスを24時間後に取り出し、そして新しい培地を添加した。この細胞を、2日後に分離し、そしてG418含有培地を添加した。G418耐性細胞集団を14日後に確立し、そしてELISAによって、VEGF発現について試験した。この細胞を、5×105細胞/ウェルの密度でプレートし、24時間で再形成させ、そして培地を、24時間後にELISAのために収集した。B.アデノウイルス構築および実験構築ジンクフィンガータンパク質ZFPcDNAをコードする組換えE1A/E1B欠失アデノウイルスベクターを、Ad-EasyシステムT.-C.Heら、1998Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:2509-2514を用いて産生した。簡単には、VEGFを調節するZFPをコードするcDNAをpAd-Track-CMVシャトルベクターへとサブクローニングした。このベクターは、2つの別のCMVプロモーターを含み、一方は、挿入されたcDNAの発現を指向し、そして他方は、形質導入マーカーの緑色蛍光タンパク質GFPの発現を指向する。このシャトルベクターにおいて、緑色蛍光タンパク質およびcDNA発現カセットの両方は、ゲノムアデノウイルス-5配列によって隣接し、ゲノムアデノウイルス-5DNAでの組換えを可能とするT.-C.Heら、1998前出。より詳細には、pcDNAMVG前出の実施例2に記載されるような、ジンクフィンガー結合ドメインVG10A/8Aをコードするプラスミドならびに3フィンガー構築物pCVVOP30AおよびpCVVOP32B由来の、ZFPをコードする挿入物を、EcoRI/HindIIIを用いて制限消化によって切断し、そしてシャトルプラスミドpAdTrack-CMV中にサブクローニングし、PmeIを用いて線状化した。各々の構築物を、アデノウイルス-5ゲノムベクターpAd-Easy-1と共に、エレクトトロコンピーテントelectrocompetentなBJ5183E.coli細菌へと同時エレクトロポレーションした。VEGFを調節するZFPをコードしかつ必須のアデノウイルスE1A/E1B遺伝子領域について欠失するアデノウイルス-5ゲノムDNAクローンを、E.coliにおいて、ZFPをコードするpAd-Track-CMVシャトルベクターとpAd-Easy-1との間の組換えによって得た。制限マッピングによって、カナマイシン耐性コロニーを、組換え株についてスクリーニングし、そして適切な制限パターンを有するクローンを、リポフェクタミン試薬を用いてヒト胚腎臓293細胞HEK293へとトランスフェクトした。HEK293は、E1A/E1B遺伝子を含み、そしてこれらの必須タンパク質を、トランスフェクト株中に提供して、複製欠損E1A/E1B欠損アデノウイルス組換え株の産生および増殖を可能とする。これらの組換え株は、E1A/E1B遺伝子機能の欠失に起因して正常な哺乳動物細胞中で増殖しない。アデノウイルスストックを、記載されるように、293細胞中で拡大し、CsCl超遠心によって精製し、カラム精製またはリン酸緩衝化生理食塩水に対する透析によって脱塩し、HEK293単層上で滴定した例えば、Giordanoら、1996Nat.Med.2:534-9;およびGiordanoら1997Circulation96:400-3を参照のこと。アデノウイルスストックを、-80で、20グリセロール中で保存した。インビトロ試験上記のアデノウイルスベクターが形質導入後にVEGF-Aを調節するZFPの発現を指向し得たことを検証するために、ラット大動脈平滑筋培養細胞SMCにおける研究を実施した。上記のように、これらの研究に用いられるZFP構築物は、FLAGエピトープおよびVP-16活性化ドメインの両方を含む。従って、ZFP構築物のアデノウイルス媒介発現を、FLAGエピトープおよびVP-16活性化ドメインに指向される抗体を用いて、SMCにおいて発現されるタンパク質のウェスタンブロット分析によって評価した。簡単には、SMCを、サブコンフルエンスになるまで培養物中で増殖させ、そしてZFPまたは緑色蛍光タンパク質GFPコントロールのいずれかをコードするアデノウイルスベクターを用いて形質導入した。形質導入を、約5の感染多重度で実施した。形質導入の48時間後に、この細胞を、スクラップし、そしてタンパク質溶解物を、FLAGエピトープFisherScientificまたはVP-16のいずれかに対して特異的な抗体を用いるウェスタンブロット分析のために得た。C.VEGF-ZFPによる骨格筋および心筋におけるVEGF-A遺伝子の誘導プラスミド注射研究多数の異なるVEGF-A調節ZFPが内因性VEGF-A遺伝子の発現を誘導する能力を、ラット骨格筋において、インビボで試験した。最初の研究を、VEGF-Aを調節するZFP融合タンパク質またはDNA結合ドメインの非存在の同じペプチド配列を有するコントロールタンパク質のいずれかをコードするプラスミドDNA発現ベクターを用いて実施した。遺伝子発現がCMVプロモーターによって指向される市販のプラスミドpCDNA-3;Clonetechを、ZFPをコードするプラスミドを構築するための骨格として用いた。VEGF-Aを調節するZFPをコードする50μgの精製したプラスミドDNAを、50μlのリン酸緩衝化生理食塩水PBS中に希釈し、そして1ccシリンジ中に吸引した。Sprague-Dawleyラットの後足の内転筋を覆う皮膚において微小な切開を作製し、そしてプラスミドDNAを、30ゲージの針を介して、筋肉中に直接注射した。この部位に、プラスミドDNA送達の点で、少量の墨を注射することによって印を付けた。50μgのコントロールプラスミドを、同じ方法を用いて、反対側の後足の内転筋中に注射した。プラスミド送達の3日後または6日後に、このラットを、屠殺し、そしてプラスミド注射部位から骨格筋を、直径1cmの細切採取法を用いて、回収した。この筋組織を、氷冷PBS中ですすぎ、そして液体窒素中で急速に冷凍し、次のウェスタンブロッティングによるVEGF-Aタンパク質発現分析に用いた。ZFPに指向されるVEGF-Aタンパク質発現を、類似のアプローチを用いて、心筋においても評価した。簡単には、麻酔し、そして通気したCD-1マウスにおいて、心臓を、左外側の開胸によって曝した。VEGF-ZFPまたはコントロールペプチドのいずれかをコードする50μgのプラスミドDNAを、心尖中に、50μl容量で注射した。注射を、注射部位の漂白によって記録した。この胸部を閉じ、そしてこの動物の回復を可能とした。注射の3日後、この動物を屠殺し、そして心臓を取り出した。その尖を、はさみ、氷冷PBSですすぎ、液体窒素中で急速に冷凍し、そして、次のウェスタンブロッティングによるVEGF-Aタンパク質発現分析に用いたこれらの実験に関するデータは示さず。類似の技術は、ラットに用いられ得る。アデノウイルス注射研究プラスミドDNA注射研究に用いられる方法論に類似する方法論を用いて、VEGF-ZFPをコードするアデノウイルスベクターまたはコントロール緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスベクターを、CD-1マウスの後足の内転筋中に注射した。50μl容量のPBS中の約5×108pfuのVEGF-ZFPをコードするアデノウイルスを、1ccのシリンジおよび30ゲージの針を用いて、上記のように、内転筋中に注射した。反対の後足の内転筋に、緑色蛍光タンパク質をコードするコントロールアデノウイルスを注射した。アデノウイルス注射の3日後または6日後に、この骨格筋の注射部位を、VEGF-Aタンパク質発現のウェスタンブロット分析のために、上記のように回収した。マウスVEGF-A調節ドメインおよびラットVEGF-A調節ドメインVOP30A、VOP32B、BVO12の両方におけるDNA配列に結合するように設計されたVEGF-ZFPについて、インビボでの試験も、ラット後足の内転筋中で、実施した。注射の容量を、100μlに増加させたが、これらの研究を、実質的に上記のように実施した。関連する実験も、同じ容量でプラスミドを用いて実施した。D.マウス耳の新脈管形成アッセイ設計されたVEGF-ZFPがインビボで新脈管形成を誘導する能力を試験するために、VEGFを調節するZFPまたはコントロール緑色蛍光タンパク質のいずれかをコードするアデノウイルスベクターの注射後に、マウスの耳における新脈管形成を、評価した例えば、Pettersson,A.ら、2000LaboratoryInvestigation80:99-115を参照のこと。簡単には、1ccのシリンジおよび30ゲージの針を用いて、約25μl容量のPBS中の、VEGF-ZFPをコードする約3×108pfuのアデノウイルスを、マウスの耳に皮下注射した。その反対側の耳に、等量のコントロール緑色蛍光タンパク質アデノウイルスを、同様に注射した。注射の3日後および6日後に、この耳を、可視的に検査し、そしてデジタル写真を、同じ設定を用いて、同じ距離で得た。この動物を、屠殺し、この耳を回収し、そして新脈管形成の組織免疫学的分析のためにOTC中に新しいまま冷凍した。脈管計数マウスの耳における新脈管形成/血管形成を、内皮細胞に特異的である抗レクチン抗体VectorLaboratories、Burlingame、CAを用いて、新鮮なまま凍結した組織の切片で評価した例えば、Christie、K.N.およびThomson,C.1989J.Histochem.Cytochem.37:130、3-1304を参照のこと。簡単には、冷凍された切片を、アセトンで固定し、PBSですすぎ、そして抗レクチン抗体と共に2時間にわたりインキュベートした。3回の一連の洗浄工程の後、この切片を、アルカリホスファターゼに連結する2次抗体と共に2時間インキュベートし、そしてそのスライドを、市販のアルカリホスファターゼ染色キットVectaInc.を用いて展開した。脈管数を、切片の同一性に対して盲目的な観察によって抗レクチン免疫染色の顕微鏡分析に基づき、決定した。1つの切片あたり、別々の5つの40×顕微鏡の領域を評価し、領域あたりのレクチン染色された脈管の数を平均した。E.創傷治癒インビボの機能的生物学的アッセイにおいて、VEGF-Aを調節するZFPが新脈管形成を増加させる能力を評価するために、本発明者らは、皮膚創傷治癒の十分に確立されたモデルを用いた例えば、Swift,M.E.ら、1999LabInvest.79:1479-87を参照のこと。両側の背中に十分再現可能な皮膚創傷を、CD-1マウスにおいて、5mmの細切採取法を用いる5mmの円の皮膚の切開によって作製した。これらの創傷の治癒は、肉芽組織の産生、ケラチノサイトの内方増殖による上皮再形成、および新脈管形成応答を含む。創傷形成のとき、20μl容量のPBS中の約5×108pfuのVEGF-ZFPをコードするアデノウイルスを、局所的な適用によって、この創傷部位に送達した。その反対側の創傷部位を、緑色蛍光タンパク質をコードするコントロールのアデノウイルスを用いて処理した。5日目に、この創傷部位全体を切開し、そして慎重に二等分し、ホルマリンで固定し、そしてパラフィンブロック中に包理した。複数の連続する切片を得、そして、組織学的分析および組織免疫学的分析のために用いた。創傷の上皮再形成を、ヘマトキシリンで分析し、そしてエオシン染色した切片を、4×および40×の対物レンズの光学顕微鏡下で評価した。顕微鏡写真の画像を、SPOTCCDカメラを用いて得、そして分析するために、AdobePhotoshopへとインポートimportした。以下の上皮再形成の2つのパラメータを、評価した:a創傷の端部からケラチノサイト内方増殖の先端までの間の距離、およびb創傷の反対端部からケラチノサイト増殖の先端の間の距離。全ての測定を、定量的に、コンピューターキャリパを用いて行い、そして全ての切片を、その処理に盲目的な観察によって、評価した。創傷脈管数を、上記の上皮細胞に特異的な抗レクチン抗体を用いた、創傷切片の免疫染色によって決定した。1つの切片あたり5つの別々の顕微鏡の領域100×の倍率からの脈管数を計数し、そして1つの切片あたりの結果を平均した。F.ウェスタンブロット分析アデノウイルスZFPまたはコントロールアデノウイルス緑色蛍光タンパク質GFP注射の3日後に、ZFP誘導化VEGF発現のウェスタンブロット分析のために、動物を安楽死により殺した。注射部位周辺の骨格筋を、慎重に取り出し、Tris-HCl50mMpH8.0、NaCl150mM、SDS0.1、NP-401、NaDesoxycholate0.5、およびプロテイナーゼインヒビターを含む溶解緩衝液中で4°Cでホモジナイズした。10分間の遠心分離4°Cで10,000gの後、このタンパク質含有上清画分を、収集し、各々のサンプルの小部分を用いて、タンパク質濃度BioRadを決定し、そしてサンプルを、50mMのDTTを含む2倍の充填緩衝液を用いて希釈し1:1、そして5分間煮沸して変成させた。等量の総タンパク質を含むサンプルを充填し、そして12のSDS-PAGEゲルTris-グリシン、Novexを介する電気泳動により分離した。ゲル中のタンパク質を、ニトロセルロース膜に移し、そしてその膜を、マウスモノクローナル抗-VEGF抗体RDIに曝露して、VEGF発現のレベルを確認し、ウサギポリクローナル抗-VP16抗体Clonetechに曝露して、ZFP-VP16融合タンパク質の発現を確認し、そして内部標準としてマウスモノクローナル抗筋肉特異的アクチン抗体NCLに曝露した。TBSTでの複数回の洗浄の後、このブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合体化2次抗体と共に室温で、1時間インキュベートし、続いてTBST洗浄をし、そしてHRP検出のための増加した化学蛍光基質Pierceを用いて展開した。III.結果A.マウスVEGF-A位置におけるDNaseI利用可能領域のマッピングZFP転写調節因子を設計するための戦略は、目的の位置の中の利用可能な領域の優先的な標的化を含む。そのような領域これは、DNaseI高感受性部位のマッピングを介して容易に同定されるGrossら、1988Ann.Rev.Biochem.57:159-197は、一般的に、周辺のDNAの伸長部よりも高分子に対してより利用可能であり、そしてこれらの領域は、しばしば、関連する遺伝子の天然の転写調節因子に対する結合部位を含む。設計したZFPを用いるそのような領域の優先的な標的化は、より効果的な調節およびより高い応答の潜在性の両方を生じる傾向にあるLiuら、2001J.Biol.Chem.276:11,323-11,334。従って、本発明者らは,マウスVEGF-A位置においてDNaseI利用可能領域をマッピングした。NIH3T3細胞株およびC127I細胞株の両方において、本発明者らは、増加されたDNaseI利用可能性の3つの領域が塩基-550、1、および400転写開始位置に対する相対的な数字にほとんど集中したことを観察した図15Aおよび図15B。この-550領域および1領域は、各々、約200塩基対にわたるようであるが、一方で400領域は、幾分か広くそして約300塩基対を包含する図15Aおよび図15B。本発明者らはまた、マウスTM3細胞株ならびにヒトおよびマウス由来の種々の細胞型Liuら、2001、前出における、DNaseI利用可能性の類似のパターンも観察したデータを示さず。B.マウスVEGF-Aのクロマチン領域を明らかにするため標的化されたZFPの設計および生化学的特徴付け本発明者らは、次に、1利用可能領域および400利用可能領域内の標的部位を選択し、そしてこれらの配列を高い親和性で認識するジンクフィンガータンパク質を設計した図15C。これを、公知のトリプレット基準物のフィンガーと一緒に連結することによって達成し、所望の配列特異性を有する3フィンガーZFPまたは6フィンガーZFPのいずれかを産生した。本発明者らのZFPの設計を、図15Cに示し、このZFPを、マウスVEGF-Aの転写開始位置に関連するこれらの標的位置に従い示す。これら2つの設計mVZ426およびmVZ509は、3つのフィンガーを含み、そしてヒトおよびマウスにおいて保存される9塩基対の配列を標的化する。本発明者らの第3のZFP、mVZ57は、6つのフィンガーを含み、そしてマウスにおいて存在するヒトには存在しない18塩基対の配列を標的化する。本発明者らのZFPについての遺伝子を構築し実験手順を参照のこと、そして各々のタンパク質を発現させ、そして実質的に記載されるようにLiuら、2001、前出;およびZhangら、前出精製した。次いで、本発明者らは、ゲルシフトアッセイを用いて、各々のZFPのDNA結合親和性を、特徴付けた。これらの研究のための手順は、改変結合緩衝液を用いたことを除き、実質的に以前に記載されている手順Liuら、2001、前出;およびZhangら、前出と同一であった。本発明者らは、本発明者らが設計したZFPが、高い親和性0.031nMのKdでで標的に結合することを見出した図15D。比較のために、SP1本発明者らの設計物に対する親のZFPは、これらの条件下で、そのDNA標的について0.053nMの見かけのKdを示した。C.ZFPによるマウスVEGF-A位置の活性化C127I細胞株が、本発明者らの設計したZFPによって媒介される活性化を測定する際の発現に対して、VEGF-A発現の相対的に低いバックグラウンドを示すので、本発明者らは、VEGF-A活性化の最初の研究のために、C127I細胞株を使用することを選択した。これらの研究のために、各々のZFPを、VP16活性化ドメイン、核局在化配列、およびFLAGタグの融合物として、pLXSNMoloneyマウス白血病ウイルスに基づくベクターへとクローニングした。次いで、C127I細胞を、このベクターに曝露し、そして形質導入した細胞集団を、G418を用いて選択した。図16Bに示されるように、本発明者らのZFP-VP16融合物の発現は、VEGF-AmRNAの分析によって決定されるように、VEGF-A位置の活性化を生じ、VEGF-Aメッセージの相対的レベルは、緑色蛍光タンパク質に融合されたVP16活性化ドメインを発現するコントロール構築物と比較して、VZ426-VP16を4.6倍まで増加させた。本発明者らはまた、ELIZAによって測定される、この培地に分泌されるVEGF-Aタンパク質のレベルにおいて、類似の増加を観察した図16C。D.VEGF結合ZFPによる骨格筋および心筋におけるVEGF-A遺伝子の誘導VEGF-Aを調節するZFPのアデノウイルス媒介発現のインビトロでの特徴づけVEGF-A調節ZFPをコードする組換えアデノウイルス構築物をインビボで試験する前に、このZFPの発現を、ウェスタンブロット分析によって検証した。大動脈平滑筋細胞SMCを、VEGF-Aを調節するZFPまたは緑色蛍光タンパク質GFPのいずれかをコードするアデノウイルスを用いて形質導入した。形質導入の48時間後、これらの細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そしてタンパク質溶解物を調製した。抗VP16抗体または抗FLAGエピトープ抗体のいずれかを用いるウェスタンブロット分析は、アデノ-VEGF-ZFP形質導入細胞におけるZFP構築物の発現を明らかにしたが、アデノ-緑色蛍光タンパク質GFP形質導入細胞におけるZFP構築物の発現は示さなかった図17A。VEGF-Aを調節するジンクフィンガータンパク質VOP30Aをコードする組換えアデノウイルスの注射後のVEGF-Aタンパク質発現VP16活性化ドメインに融合されたVOP30AZFP結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする、50μl容量のリン酸緩衝化生理食塩水中の約5×108pfuのアデノウイルスアデノ-VOP30Aを、CD-1マウスの後足内転筋へと注射した。その反対側の後足の内転筋に、コントロールとして、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスアデノ-GFPを注射した。この注射の3日後に、注射部位を包含する筋肉を収集し、これを用いて、VEGFタンパク質発現のウェスタンブロット分析のためのタンパク質溶解物を調製した。図17Bに例示されるように、アデノウイルス媒介VOP30A遺伝子発現は、VEGF-Aタンパク質発現の著しい増加によって実証される、インビボでのVEGF-A遺伝子の著しい誘導を生じた。抗VP16抗体を用いるウェスタンブロッティングにより、注射された筋肉におけるVOP30A構築物の発現を検証した。アデノ-MVGの注射後のマウスにおけるVEGF-Aタンパク質発現の誘導アデノ-MVGまたはコントロールとしてのアデノ-GFP緑色蛍光タンパク質の骨格筋注射を、直前に示すように達成した。注射の3日後に、VEGF-Aタンパク質発現を、ウェスタンブロットによって評価した。VEGF-Aタンパク質発現の誘導を、図17Cに示されるように観察した。骨格筋タンパク質溶解物の等量の負荷を、アクチンの免疫染色によって検証した。VEGF-Aを調節するジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドの骨格筋注射の後のラットにおけるVEGF-Aタンパク質発現Sprague-Dawleyラットの後足内転筋中に、ZFPをコードするプラスミドVOP30A、VOP32B、BVO12A、BVO14AまたはコントロールプラスミドZFP結合ドメインを欠失するを注射する試験を実施した。全てのプラスミドにおいて、タンパク質発現は、CMVプロモーターによって指向された。遺伝子注射の3日後に、その注射部位を摘出した。図17Dに示されるような、生じたタンパク質溶解物のウェスタンブロット分析の結果は、4種類の全ての構築物によるVEGF-Aタンパク質の誘導を示す。E.新脈管形成の誘導VEGFを調節するジンクフィンガータンパク質をコードする組換えアデノウイルスの皮下注射は、マウスの耳において新脈管形成を誘導するVEGF-Aを調節するジンクフィンガータンバク質がインビボで新脈管形成を誘導する能力を評価するために、本発明者らは、マウスの耳中に、VEGFを調節するZFPをコードする組換えアデノウイルスを皮下注射した。25μl容量中の約5×108pfuを、CD-1マウスの耳中に、皮下注射した。その反対側の耳に、同じ様式で、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするコントロールのアデノウイルスを注射した。3日後および6日後に、この動物を可視化し、そして耳のデジタル写真を撮影した。図18A~Dに示されるように、VEGF-Aを調節するZFPをコードする遺伝子VOP30AまたはVOP32Bのアデノウイルス媒介送達は、増大した耳の新脈形成を生じた。これらの結果は、図18Eに示されるように、形式的脈管数と関連した。増加した脈管形成を、VEGF-Aを調節するジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子のアデノウイルス媒介送達後の脈管数によって検証するちょうど記載された耳の新脈管形成アッセイにおけるVEGF-Aを調節するZFPをコードする遺伝子のアデノウイルス媒介送達の効果をさらに特徴付けるために、免疫組織化学によって容易にされる脈管計数を、コンロトールおよびVEGF-ZFPVOP30AまたはVOP32B処理されたマウスの耳からの切片で実施した。脈管計数を、処理群に対して盲目的な観察によって実施し、そして40倍の倍率で、切片あたり5つの別々の領域を計数することによって測定し、そしてその値を平均した3日目に、1群あたりn=5;6日目に1群あたりn=4。図18Eに示されるように、このアプローチを用いて実施されたアッセイはまた、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルス灰色四角と比較して、ZFPをコードするアデノウイルス黒色四角を注射した耳について脈管形成の有意な増加を見出した。ZFP構築物による内因性VEGF-A遺伝子の活性化から生じる新脈管構造は、過浸透性ではない。さらなる耳新脈管形成の研究は、以前に記載されたアプローチThurston,G.ら、2000、NatureMedicine6:460-463の改変を使用した。簡単に言えば、ZFPを活性化するVEGF-AまたはマウスVEGF164のいずれかをコードするアデノウイルスベクターを、CD-1マウスの耳に皮下注射した15μl容積中に108pfu。反対側の耳に、GFPをコードするアデノウイルスを注射した。デジタル写真を3日後または6日後に得た。エバンスブルー色素200μlの4溶液を尾静脈に注射し、3時間後に、耳での分布を評価し、写真を撮った。次いで、マウスを屠殺し、耳をOTC中に包埋し、液体窒素冷却イソペンタン中で凍らせた。5μmの切片を冷アセトン:メタノールで固定し、モノクローナル抗PECAM抗体で免疫染色し、そして以前に記載されるように、管の計数を得たGiordano,F.J.ら、2001、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:5780-5785。VEGFは、強力な血管透過性因子であり、マウス耳モデルにおいて、出血および脈管内の色素の血管外遊出を誘導することが示されたPettersson,A.ら、2000、Lab.Invest.80:99-115。興味深いことに、マウスVEGF164をコードするアデノウイルスで同様に処置された耳と比較する場合、ZFP誘導性の新脈管構造は、自発的には出血性でなく、そして、エバンスブルー色素注入に対して浸透性ではなかった図22を参照のこと。他の実験において、アンギオポイエチンangiopoietin1より成熟した非漏出性新脈管構造の増殖を促進する能力が以前に示された増殖因子の発現は、VEGF-ZFP処置細胞において誘導されなかった。図22に示されるように、VEGF-A発現のZFP誘導性発現から生じる新脈管構造は、マウスVEGF164cDNA発現によって生じ、新脈管構造のように過浸透性ではない。F.加速された創傷治癒皮膚創傷治癒は、ZFPを調節するVEGF-Aによって加速される。両側の皮膚創傷を、パンチ生検鉗子を使用して5mmの円形の皮膚を切除することによって、CD-1マウスの背中に生成した。創傷時に、VEGF-A調節ジンクフィンガータンパク質MVGをコードするアデノウイルスを傷に局所的に適用した。対側性の創傷を、緑色蛍光タンパク質をコードするコントロールアデノウイルスの局所的適用によって処置した。VEGF-A調節ZFPを用いる処置が、創傷後5日に記録された、再上皮形成の度合いをどのように増加するかということの例が、図19Aおよび図19Bに示される。矢印は、創傷へのケラチノサイトの内殖のリーディングエッジを示す。明らかなように、そして、図19Cのグラフに示されるように、ケラチノサイトの内殖のエッジ間の距離は、VEGF-ZFP処置によって減少する;従って、再上皮形成は増強され、全ての測定を、取り込まれたデジタル画像およびコンピューターカリパープログラムを使用して実行した。グラフに示される値は、相対的単位である。創傷再上皮形成は、VEGF-A調節ZFPを用いた処置によって増強される図20Aおよび図20Bに示されるように、創傷へのケラチノサイトのリーディングエッジの内殖は、VEGF-A調節ZFPMVGをコードする組換えアデノウイルスの局所的適用によって増強される。図20Aおよび図20Bの左下の矢頭は、創傷エッジをマークし、各々の図の上の矢印は、創傷後5日でのケラチノサイトの内殖の範囲をマークする。この分析は、図19Aおよび図19Bに示されるケラチノサイト内殖錐体間の距離の定量に対して相補的である。VEGF-A調節ジンクフィンガータンパク質をコードする組換えアデノウイルスの局所的適用による、皮膚創傷の処置によって、新脈管形成および増加した血管分布が生じる。皮膚創傷を、VEGF-A調節ZFPMVGをコードするアデノウイルスまたは緑色蛍光タンパク質GFPをコードするコントロールアデノウイルスのいずれかを用いて、ちょうど記載されるように処置した。創傷を固定し、薄片化し、そして内皮細胞特異的レクチンに対する抗体を用いて免疫染色した。図21Aおよび図21Bに示されるように、コントロール創傷図21Bに比べて、VEGF-ZFP処置創傷図21Aにおける増加した血管分布が存在する。管計数を、デジタル的に取り込まれた画像上で実行し、そして1切片当たり1群あたりn=6の5つの高倍率視野の平均を示す。このアプローチを使用した結果図21Cを参照のことは、免疫染色の結果と一致する。IV.議論この実施例に記載される実験の結果は、本明細書中に記載されるアプローチを使用する、VEGF-A遺伝子のプロモーター領域内の標的部位へ強固に結合し得るZFPを、設計する能力を例示する。特定のZFPは、意図される標的部位に、次いで、天然に存在する転写因子SP1に、より強固に結合することが見出された。これらのZFPがインビトロで機能する能力は、ZFPをコードする構築物でC127I細胞をトランスフェクトし、そして、転写しおよび発現されたタンパク質レベルの両方で、VEGF-Aの増加した発現を実証することによって、示された。新脈管形成および創傷治癒についての、いくつかの異なる受け入れられるモデル系を使用し、これらの調査からの結果はまた、ZFPが、新脈管形成の調節するために使用され得、従って、血流および血液送達と関連する広範な種々の状態に影響を与えることを示す。より具体的には、前述の結果は、インビボで1つ以上のVEGF遺伝子の発現を調節し、それによって管形成を調節する適切な結合能力を有するZFPをコードするプラスミドまたはウイルス構築物を導入することによって、新脈管形成を調節し得ることを示す。この一般的なアプローチの有用性の例として、この実施例で実施される特定のモデル研究の結果は、導入されたZFPが、創傷再上皮形成および創傷治癒を有意に加速し得ることを示す。そのような有用性は、受け入れられるモデル系を使用し、そして確立された組織学的方法および免疫組織学的方法によって示された。これらの結果を考慮して、この実施例において例示されるアプローチは、新脈管形成の調節に基づく他の処置適用において使用され得ることが期待される。ZFPを使用した、適切な活性化ドメインまたはリプレッサードメインのいずれかの賢明な選択によって、処置される状態の性質に依存して、新脈管形成を選択的に増加または減少し得る。調査のこの特定のセットが、ZFPを細胞に導入するためにウイルス構築物またはプラスミド構築物を使用して実施される場合、上に記載されるような他の送達方法もまた、使用され得る。本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のためだけのものであり、それを考慮した種々の改変または変化は当業者に提案され、本願の精神および範囲ならびに添付された特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考としてそのように援用されるように、特異的にそして個々に示されるように、全ての目的について同じ範囲まで、その全体が参考として、本明細書によって援用される。"