"生体高分子複合体の集合、均質性、および/または熱力学的安定性を決定する方法であって、以下の工程:-緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の1種類以上の生体高分子の複合体を提供すること;-前記の試料の温度を、前記の試料の蛍光を熱平衡後に測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性の状態を反映する;-以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を計算すること:a温度の関数としての該試料の見かけの2状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を2状態から6状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、例えばアンフォールディング状態を遷移曲線を得るためのレーベンバーグマーカートアルゴリズムおよびΧ2最小化に基づいて決定して前記の曲線を完全な2状態曲線に対して比較することにより、同定すること;b2状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること;c融解温度Tmおよび/またはアンフォールディングのエンタルピーΔHを計算すること;を含む、前記方法。請求項1に記載の方法であって、前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を計算する工程が、曲線の最初の部分における強い負の傾きに基づいて破棄されるべき曲線を同定することを含む、前記方法。請求項1または2に記載の方法であって、温度の関数としての蛍光の曲線が、遷移曲線を得るために正規化され、ここで該曲線の最も低い極小が0に設定され、該曲線の最も高い極大が1000に設定され、これらの2個のデータの点により記述される範囲の外にある実験値が前記の曲線の計算から除外される、前記方法。請求項1~3のいずれか1項に記載の方法であって、実験的pH値が、適切な波長の蛍光を温度の関数として示す曲線に関して、緩衝系のΔpKA/T値を用いて、アンフォールディング遷移の変曲点において決定される、前記方法。ΔHがアンフォールディング遷移の傾きに基づいて計算される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。請求項1~5の方法のいずれか1つに従って同定された試料の集合、均質性および/または熱力学的安定性を少なくとも2個以上の別個の試料に関して比較し、最も安定化する条件が存在する条件を同定する工程を含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の安定化条件を決定する方法。曲線が、予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類される、請求項6に記載の方法。請求項7に記載の方法であって、予め決められたパラメーターが以下の順序:実験データに対するR2、完全な2状態モデルに対するR2、2状態モデルに関するアンフォールディングのΔH、2状態モデルに関するTm、最高に当てはめられたモデルのΔH、最高に当てはめられたモデルのTm、ならびに遷移曲線の最も低い極小および最も高い極大の下の面積;で選択される、前記方法。高い光散乱強度を有する曲線が予め破棄される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記の複合体の不安定化条件を同定する使用のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。リガンド結合のスクリーニングにおける使用のための、複合体形成を安定化、不安定化または阻害する化合物のスクリーニングのための、別の生物と対比してある生物から単離された複合体に対するリガンドの特異性を決定するための、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。前記の複合体のさらなる分析および処理を可能にする緩衝条件を同定するための、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。曲線が示差走査蛍光定量法DSFに基づく、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。計算がソフトウェアにより達成される、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。請求項1~14の少なくとも1項に記載の方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な媒体上に存在するコンピュータープログラム。コンピュータープログラムであって、それがコンピューター上で作動しているか、またはコンピューター上に読み込まれる際に、コンピューターに請求項1~14のいずれか1項に記載の方法を実施させる、前記コンピュータープログラム。請求項15または16に記載のコンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム記憶媒体。請求項1~14の少なくとも1項に記載の方法を実施するためのプログラム命令を含有する、コンピューターで読み取り可能な記憶媒体を含む装置。示差走査蛍光定量法のための装置ならびに請求項1~14の少なくとも1項に記載の方法を実施するための請求項15または16のいずれか1項に記載のソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を示差走査蛍光定量法に基づいて決定するためのシステム。DSFの単純性および少ない試料必要量は、前記の方法を高分子複合体の安定性を決定するために特に有用なものにするであろう。しかし、タンパク質-タンパク質複合体が分析された最近のKopecらの開示を除き、それぞれの個々のドメイン/サブユニットが独立してアンフォールディングして多相アンフォールディング曲線をもたらすであろうことに基づいて、前記の方法は多ドメインタンパク質および分子機械に関して有用であるとは考えられてこなかった。そのような曲線は複合体の安定性に関する情報を含有せず、個々の構成要素の安定性に関する情報のみを含有するであろう。従って、生体高分子複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性の決定を可能にする方法およびシステムに関する進行中の必要性が存在する。前記の方法は前記の高分子複合体に関する安定化条件を同定するために特に有用であり、従って前記の複合体のさらなる機能分析を可能にするはずである。本発明は、生体高分子複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を決定する新規方法を提供することを目的としている。高分子複合体の見かけの融解温度を計算することは、安定化条件を分析するためおよび前記の安定化条件を最適化するために十分ではないことが認識されてきた。対照的に、温度の関数としてのその試料の見かけの2状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を好ましくは2状態~6状態モデルの範囲の多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることによって、同定することにより、既存の方法を向上させることが必要とされている。例えばレーベンバーグマーカートアルゴリズムによりそのアンフォールディングモデルの物理的パラメーターに従って当てはめを実施し、遷移アンフォールディング曲線を得る。次いで、最高に当てはまる曲線をさらなる処理のために用いて、そのデータの最高に当てはまるモデルに対する差が無視できるほどに小さい場合のみ2状態モデルを仮定する。従って、第1観点において、以下の工程を含む、生体高分子複合体の集合、均質性、および/または熱力学的安定性を決定する方法が提供される:-緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の1種類以上の生体高分子の複合体を提供すること;-前記の試料の温度を、熱平衡後に前記の試料の蛍光を測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を蛍光曲線として決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性の状態を反映する;-以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を計算すること:a温度の関数としてのその試料の見かけの2状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を2状態から6状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、例えばアンフォールディング状態を遷移曲線を得るためのレーベンバーグマーカートアルゴリズムおよびΧ2最小化に基づいて決定して前記の曲線を完全な2状態曲線に対して比較することにより、同定すること;b2状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること;c融解温度Tmおよび/またはアンフォールディングのエンタルピーΔHを計算すること。加えて、本発明は、上記で記述した方法に従う試料の集合、均質性および/または熱力学的安定性を少なくとも2個以上の別個の試料に関して比較し、最も安定化する条件が存在する条件を同定する工程を含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の安定化条件を決定する方法を提供する。さらに、本発明に従う方法は、リガンド結合に関するスクリーニング、複合体形成を不安定化もしくは阻害する、もしくは複合体形成を安定化もしくは促進する化合物に関するスクリーニング、または別の生物と対比してある生物ら単離された複合体に対するリガンドの特異性を決定するためのスクリーニングを可能にする。別の観点において、本発明は、本発明に従う方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な形態上に存在するコンピュータープログラムを提供する。さらに、DSFのための装置および本発明に従う方法を実施するための本発明に従うソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性をDSFに基づいて決定するためのシステムが提供される。本発明は、第1観点において、以下の工程を含む、生体高分子複合体の集合、均質性、および/または熱力学的安定性を決定する方法に関する:-緩衝系および蛍光色素を含有する試料中の1種類以上の生体高分子の複合体を提供すること;-前記の試料の温度を、前記の試料の蛍光を測定するのに適した速度で段階的に上昇させ、それにより温度の関数としての適切な波長における蛍光を蛍光曲線として決定すること、それにより前記の蛍光は前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性の状態を反映する;-以下の工程に基づいて前記の複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を計算すること:a温度の関数としてのその試料の見かけの2状態アンフォールディング蛍光曲線を、前記の曲線を2状態から6状態モデルまでの多状態アンフォールディングモデルに従って当てはめることにより、例えばアンフォールディング状態を遷移曲線を得るためのレーベンバーグマーカートアルゴリズムおよびΧ2最小化に基づいて決定して前記の曲線を完全な2状態曲線に対して比較することにより、同定すること;b2状態モデル中の変曲点において前記の遷移曲線の傾きを計算すること;c融解温度Tmおよび/またはアンフォールディングのエンタルピーΔHを計算すること。本明細書で用いられる際、用語Χ2最小化はレーベンバーグマーカートアルゴリズムの一部であるNumericalRecipes、第3版、第15章、p799。さらに、用語アンフォールディング遷移の変曲点は、その複合体の融点として定義されている。本明細書で用いられる際、用語R2は、モデルの実験曲線に対する当てはめの質を指す。R2が0.999未満である場合、その曲線は好ましくは破棄される。R2が可能な限り1に近いことが好ましい。蛍光色素はソルバトクロミック色素solvatochromaticdyeであることが好ましい。ソルバトクロミック色素は、その蛍光放射が極性溶媒中で消光され、前記の色素が疎水性溶媒環境に移された際に強く蛍光を放射する色素である。すなわち、温度を上げることにより徐々にアンフォールディングを引き起こす場合、その生体高分子複合体の疎水性残基の溶媒曝露が起こり、同時に疎水性溶媒環境の存在の増大によりそのソルバトクロミック色素の蛍光放射シグナルが増大する。当業者は適切な蛍光色素をよく知っている。すなわち、thermofluor分析における使用に適した蛍光色素は周知であり、以下の色素が含まれる:syproオレンジ、チオイノシン、およびN-エテノアデノシン、ホルマイシン、ダンシル誘導体、フルオレセイン誘導体、6-プロピオニル-2-ジメチルアミノ-ナフタレン6-propionyl-2-dimethylamino-napthalenePRODAN、2-アニリノナフタレン2-anilinonapthalene、およびN-アリールアミノ-ナフタレンスルホネート誘導体、例えば1-アニリノナフタレン-8-スルホネート1,8-ANS、2-アニリノナフタレン-6-スルホネート2,6-ANS、2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N,N-ジメチル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-フェニル-2-アミノナフタレン、N-シクロヘキシル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-フェニル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-フェニル-N-メチル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-o-トルイル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-m-トルイル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、N-p-トルイル-2-アミノナフタレン-6-スルホネート、2-p-トルイジニル-ナフタレン-6-スルホン酸2,6-TNS、4-ジシアノビニルジュロリジンDCVJ、6-ドデカノイル-2-ジメチルアミノナフタレンLAURDAN、6-ヘキサデカノイル-2-2-トリメチルアンモニウムエチルメチルアミノナフタレンクロリドPATMAN、ナイルレッド、N-フェニル-1-ナフチルアミン、1,1-ジシアノ-2-[6-ジメチルアミノナフタレン-2-イル]プロペンDDNP、4,4’-ジアニリノ-1,1-ビナフチル-5,5-ジスルホン酸ビ-ANS、およびDAPOXYL誘導体MolecularProbes、オレゴン州ユージーン。1態様において、その色素はMolecularProbesInc.から入手可能なSyproオレンジである。1態様において、その蛍光は530nmの波長において測定される。放射された光を測定するための適切な機器には、適切な波長の光を放射および測定する設備を備えたあらゆる第2世代のリアルタイムPCRシステム、例えばAppliedBiosystemsから入手可能な7900HT高速リアルタイムPCRシステムおよびBioradから入手可能なCFX96リアルタイムPCR機械が含まれる。典型的な運転に関する温度は、例えば384ウェルブロックに基づいて約0.02°C/秒の温度勾配を用いておおよそ20°Cから100°Cまでであろうが、所望であれば40から100°Cまでであってよい。7900HTシステムの場合、最小ランプramp速度は、例えば384ウェルブロックに基づいて0.02°C/秒1パワーであってよい。この系の最大ランプ速度は、例えば384ウェルブロックに基づいて2°C/秒100パワーであってよい。従って、最適な温度ランプ範囲は約0.02~約2°C/秒である。1態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、94、96、100、150、200、250、300、350またはより大きい数、例えば384または1024個のタンパク質試料が同時に分析される。その機器は、そのプロセスをさらに自動化し、ヒトの介入なしで処理することができる試料の数を増大させるためのロボット設備との組み合わせで用いることができる。好ましくは、その方法はDSF示差走査蛍光定量法に基づく。DSFは高スループットスクリーニング技法として用いることができ、それは解釈する必要があるかなりの量のデータを生成し、データ分析の自動化を可能にする。データセットまたは曲線は、間違ったシグナルのためにふるい分けされることが好ましい。これらの間違ったシグナルまたは測定結果には、気泡、ピペットエラー、色素の結晶化または高分子複合体の一部の凝集物等による間違った結果が含まれる。加えて、その方法にはデータの正規化のためのバックグラウンドの減算が含まれることが好ましい。この点において、別の好ましい態様において、温度の関数としての蛍光の曲線は遷移曲線を得るために正規化され、ここでその曲線の最も低い極小が0に設定され、その曲線の最も高い極大が1000に設定され、これらの2個のデータの点により記述される範囲の外にある実験値は前記の曲線の計算から除外される。蛍光における増大がその高分子複合体のアンフォールディングに相当することは十分に確証されている。従って、次の工程は、温度の関数としてのその試料の蛍光曲線を2、3、4、5、および6状態を含む多状態アンフォールディングモデルに当てはめることを必要とする。安定化条件下で、見かけの2状態アンフォールディング蛍光曲線が得られる。これらの当てはめられた曲線は遷移曲線とも呼ばれる。例えば、その当てはめはレーベンバーグマーカートアルゴリズムおよびΧ2最小化を用いることにより実施される。さらに、完全な2状態曲線に対する類似度が、2状態に対するR2の決定に基づいて測定されることが好ましい。さらに、好ましい態様において、その方法には2状態モデルにおける変曲点におけるその遷移曲線の傾きを計算することが含まれ、加えて、または代わりに、温度Tmおよび/またはアンフォールディングのエンタルピーΔHが計算されることが好ましい。当業者は、それぞれのパラメーターを計算するための適切な手段および方法をよく知っている。さらに、さらなる好ましい態様において、その方法には、適切な波長の蛍光を温度の関数として示す曲線に関して、緩衝系のΔpKA/T値を用いて、アンフォールディング遷移の変曲点において実験的なpH値を決定する工程が含まれる。ΔHは、アンフォールディング遷移の傾きの非線形当てはめに基づいて計算されることが特に好ましい。この場合、ΔHは全てのアンフォールディングおよび解離エンタルピーの加重平均を記述する。さらなる分析のため、本発明の方法は、本発明の方法に従って同定されるような試料の集合、均質性および/または熱力学的安定性を少なくとも2個以上の別個の試料に関して比較し、最高の安定化条件が存在する場合にその条件を同定する工程を含む、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の安定化条件を決定することを含む。最高の安定化条件を同定するための曲線は、予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類されることが好ましい。すなわち、本発明に従う方法は、生体高分子複合体に関する最高の安定化条件を同定することを可能にする。従って、この方法は前記の複合体のための、特にこれらの複合体の単離および技術分析のための、安定化緩衝条件を決定するために特に有用である。好ましい態様において、その複合体はタンパク質、核酸、糖類、および/または脂質を含む。例えば、タンパク質/タンパク質複合体を、集合、均質性および熱力学的安定性に関して調べることができる。さらに、本発明者らはタンパク質-核酸複合体をうまく分析した。別の好ましい態様において、その曲線は予め決められたパラメーターに関してヒューリスティックに分類される。特に、その予め決められたパラメーターを以下の順序で選択することが好ましい:実験データに当てはめられた多相アンフォールディングモデルの結果、結果の完全な2相モデルへの当てはめ、2相モデルに関するアンフォールディングのΔH、2相モデルに関するTm、最高に当てはめられたモデルのΔH、最高に当てはめられたモデルのTmならびに遷移曲線の最も低い極小および最も高い極大の下の囲まれた面積。従って、高スループット法を用いることにより、生体高分子複合体の安定化および不安定化条件を容易且つ好都合に決定することが可能である。その方法は異なるアプローチのために用いることができる。例えば、本発明に従う方法を用いることにより、リガンド結合をスクリーニングすることが可能である。すなわち、蛍光曲線を観察および比較することにより、リガンドの前記の複合体への結合を同定することが可能である。さらに、その方法は複合体形成を不安定化または阻害する化合物に関するスクリーニングを可能にする。一方で、本発明に従う方法は複合体形成を安定化または促進する化合物に関するスクリーニングを可能にする。さらに、本発明は異なる生物にわたる複合体へのリガンド結合の特異性を同定することを可能にする。これは、例えばある生物において効果を示すが別の生物において前記の効果を示さないはずである、例えば病原体に対して効果を有するが宿主に対しては効果を有しない、抗生物質または他の化合物の開発の分野において特に興味深い可能性がある。本発明に従う方法の別の利点は、それが高スループットスクリーニングに適しており、該高スループットスクリーニングは少量の試料しか要求しない、という事実である。驚くべきことに、様々な構成要素からなる、例えば少なくとも2個、3個、4個、またはさらに多くの異なる構成要素からなる生体高分子複合体を、示差走査蛍光定量技術を適用することにより分析することができることが決定されている。従って、これらの生体高分子複合体が関与する、新規の有効成分、例えば新規の治療剤、に関するスクリーニング法における使用のために、これらの生体高分子複合体を提供することが可能である。別の観点において、本発明は、本発明に従う方法を実施するためのプログラムコードを有する、コンピューターで読み取り可能な媒体上に存在するコンピュータープログラムを提供する。さらに、本発明は、それがコンピューター上に乗っているかriding、またはコンピューター上で読み込まれた際にコンピューターに本発明に従う方法を実施させるコンピュータープログラムを提供する。加えて、本発明は、本発明に従うコンピュータープログラムを含むコンピュータープログラム記憶媒体を提供する。別の態様は、本発明に従う方法を実施するためのプログラム命令を含有するコンピューターで読み取り可能な記憶媒体を含む装置に関する。最後に、本発明は、ポリペプチド複合体のような生体高分子複合体の集合、均質性および/または熱力学的安定性を示差走査蛍光定量法に基づいて決定するためのシステムならびに本発明に従う方法を実施するための本発明に従うソフトウェアまたはコンピュータープログラムを含むデータ処理ユニットを提供する。理論に束縛されるわけではないが、thermofluorアッセイは用いられる色素の環境依存性の蛍光に基づいており、例えば適切な蛍光色素の代表的なものとしてのSYPROオレンジは極性環境では低い量子収率を示すが、それは疎水性の周囲環境において超蛍光性hyperfluorescentになる。そのアッセイの間、タンパク質は、上昇した温度においてアンフォールディングして疎水性の小区画patchesを露出し、それが蛍光における増大をもたらす。さらに温度が上昇すると、これに続いて前に露出した疎水性の小区画を隠す急速な凝集が起こり、結果としてより低い蛍光シグナルがもたらされる。今までは、得られたDSF曲線は、蛍光の増大の間の変曲点を決定するために、曲線の単純なボルツマンモデルへの非線形回帰により解釈された。これはそのタンパク質の融点を決定し、単鎖タンパク質の安定化に関する読み出し情報readoutとして用いられたNiesenFHetal222122221。しかし、タンパク質複合体に関しては、融点の読み出し情報のみでは十分ではない。これは、複雑な多ドメインタンパク質に関してそのタンパク質の個々の部分が独立して融解し、多数のTmをもたらし得ることを確認している国際公開第2010/109204号においても認識されている。記述された挙動を仮定すると、その色素の3種類の異なる種をあらゆる時点において溶液中で見付けることができる:F0の最大蛍光を有する遊離の色素、FNの最大シグナルを有する未変性状態のタンパク質に結合した色素全ての未変性タンパク質は未変性且つ色素が結合していることを意味する、およびFUに対応するアンフォールディングしたタンパク質に結合した色素。全ての時点において、測定された蛍光シグナルはそれらの3種類の種により放射されるシグナル部分の合計により記述することができる:ここで、fN、fUはそれぞれアンフォールディングした、および折り畳まれたタンパク質状態の割合である。色素はタンパク質よりも大過剰であるため、F0は実験の過程の間に変化せず、ベースライン実験を実施することにより、実験において単純に減算することができる。従って、F0は以下では無視することができる。平衡定数K=fU/fNにより記述される単純な2状態モデルを仮定すると、これは結果として次の式をもたらす:実施される実験は温度依存性であり、従って全ての方程式のパラメーターも同様である。ファントホッフ等温線を用いるKに関して、これは次の式をもたらす:アンフォールディングエントロピーが測定範囲において温度に依存しないと仮定すると、これはクラーク-ファーシュト方程式Biochemistry3243224329のわずかな変形をもたらし、ここでΔHはアンフォールディングエンタルピーを記述し、Tmは未変性およびアンフォールディング状態の割合が等しい融解温度を記述する。FNTはスクリーンの最初の蛍光を記述し、ほとんどの場合に関して線形であると近似することができる。溶液中の界面活性剤、気泡または凝集物、ならびに複合体の未変性の立体構造中の露出した疎水性小区画は、線形挙動の逸脱をもたらし得る。それらの場合では、異なる近似が必要とされる。界面活性剤により導入される最初の高いシグナルは、その界面活性剤の臨界ミセル濃度の温度依存性に非常によく似ており、従って二次多項式と類似の方法で補正される。気泡または凝集物は結果として増大した光散乱をもたらす。これらの作用の補正はそのモデルにいくつかの未知のパラメーターを導入するであろう。これらの効果を示す曲線は、単純にここから先はfromhereon無視される。FUTは凝集挙動を記述する。実験の過程の間温度は上昇するため、凝集速度も段階的に変化する。これは得られたデータによるその曲線のこの領域の正確な記述を不可能にする。従って、単一の指数関数としての凝集の過程が唯一近似されている。上記のことを考慮すると、式5に到達するであろう:ここでの意味のあるパラメーターは、アンフォールディングエンタルピーに関する尺度であるタンパク質の融解温度TmおよびアンフォールディングエンタルピーΔHmであり、ここで安定化条件に関して高いTmならびに高いΔHmを見つけることができる。タンパク質の安定性の正確な記述として、自由アンフォールディングエンタルピーΔGU-Nを構造分析に関して望まれる温度に外挿する必要がある。アンフォールディングプロセスの間の熱容量における変化ΔCpが既知である場合、これはMatouschekAetalProteinEngineering710891095により行うことができる:タンパク質-タンパク質複合体に関しては、前に用いられたようなより多くの色素状態を仮定しなければならない。複合体の場合では、全ての色素は、全ての個々の折り畳まれた中間体ならびに全てのアンフォールディングされた構成要素に結合していることができる。等式1は次の式に変化する:原理的に、複合体の3種類の異なる挙動をここで仮定することができる。第1に、その複合体は温度上昇により非常に急速に脱集合し、その構成要素は独立してアンフォールディングする。これは個々のアンフォールディング曲線の合計およびおそらく多相遷移につながるであろう。第2に、その複合体はゆっくりと脱集合し、一方でいくつかの既に解離した構成要素は既にアンフォールディングしている可能性がある。これは、おそらく多相の脱集合と重ね合わせられた記述された多相挙動につながるであろう。最も極端な場合には、複合体全体の脱集合ならびにその構成要素のアンフォールディングが完全に協同的な意味で同時に起こる。これは2相遷移をもたらす。協同性がない場合、個々の構成要素は互いに独立してアンフォールディングすると考えられ、それは等式3に類似して次のように単純に記述することができ:ここでΔHm,iは、1つの構成要素に関するアンフォールディングおよび解離エンタルピーの和を記述する。一般に全ての曲線は、その複合体の脱集合平衡の、個々の構成要素のアンフォールディングへの重ね合わせにより記述することができなければならず、それは次の式により与えられる:極端な場合において、等式8および9におけるn=1は、等式4の類似形をもたらす。これは、その複合体のアンフォールディングおよび脱集合の全体的な協同性を意味し、それは複合体に安定性を提供する力の物理的性質が単一のドメインの安定な折り畳みを提供する力の物理的性質と等しいため、実現可能である。従って、理想的な状況下では、複合体の脱会合およびその構成要素のアンフォールディングは協奏的に起こると仮定することができる。従って、等式4はこの仮定の記述に適したものになり、ここではΔHが全てのアンフォールディングおよび解離エンタルピーの加重平均を記述している点が異なっている。結果として、nは協同性に関する尺度として用いることができ、従ってその分析に関する重要なパラメーターである。上記のことから、タンパク質複合体に関する熱的シフトthermalshiftの単純な分析では不十分であることは明らかである。最初の2つの記述された場合では、見かけのTmは、いくつかの重ね合わせられたアンフォールディング曲線の結果として得られる加重平均でしかなく、複合体の安定性に関する情報は与えない。しかし、これは見かけのΔH値においても、従ってその曲線の峻度steepnessにおいても見ることができる。従って、ΔHを測定することはTmの情報量の推定のための価値ある手段である。従って、Tmのシフトは、曲線の峻度が増大するか、または一定である場合にのみ意味がある。100kDa~5MDaに至るまでの大きさの範囲の30種類の複合体が今までに分析された下記参照。全ての場合において、複合体は、高度に濃縮された緩衝物質およびアンフォールディング曲線の連続的な測定のための色素と混合された。結果として得られた曲線を全ての記述されたモデルに当てはめ、さらに分析した。さらに、等しい条件におけるその複合体の陰性染色TEM画像を得た。多相曲線または高いnを有する等式8もしくは9にのみ当てはまる曲線を結果としてもたらす緩衝条件は、結果として大部分がEMにより見られるような凝集または崩壊した試料をもたらした。図1はそのような条件の例を示す。対照的に、低いn、高いΔHおよび高いTmを有する曲線は電子顕微鏡画像において完全な粒子の単分散分布を示した図1、3番目の列を参照。完全なアンフォールディング協同性は大きな不均質な複合体に関しては非常にありそうもなく思われるが、本発明者らは今までに試験した全ての複合体に関して2状態アンフォールディング挙動を示す適切な条件を見付けた。完全な協同性に関して、脱集合はその複合体の協同的集合と逆の様式で一致する。その理論のさらなる検証のため、複合体をGraFix方法論NatMethods55355で処理し、ここでその複合体を、その複合体の過酷な構造変化を導入することなく、または構造的完全性を損なうことなく、グルタルアルデヒドでわずかに固定する。この方法はまた、複合体の安定性を増大させ、ならびに単分散複合体をもたらすことが分かった。本発明者らの理論に関する対照として、本発明者らはGraFix処理された試料に対してDSF実験を行い、本発明者らの方法で分析した。全ての場合において、GraFix処理された試料は、大部分は増大したTmを有する見かけの2状態曲線を示すがΔHは一定のままであることが分かった。これは、GraFixによるわずかな化学固定は少数の架橋を導入するのみであり、従って集合した状態および脱集合した状態の間のエントロピーの差を低下させる一方で、エンタルピー的寄与の大部分は変化しないままである、という仮定とよく一致している。データ分析-方法の特徴DSFは高スループットスクリーニング技法として用いることができ、それは解釈する必要があるかなりの量のデータを生成する。従って、DSF曲線のデータ分析および解釈を最大限可能な程度まで自動化することが望ましい。最小限の使用者との対話処理しか必要としない非常に速いデータ処理を可能にする、上記で導入された理論的背景に基づくスタンドアローンのソフトウェアツールの形態での本発明に従う方法が開発されている。そのソフトウェアは2個の入力ファイルを必要とする。1つのファイルは、リアルタイムPCR装置から得られたDSFデータを含有する。第2の入力は、生データ中のそれぞれのDSF曲線に関する緩衝条件を指定するシンプルテキストファイルである。そのデータの初期の処理には、自動化された機能、例えばバックグラウンドの減算、データの正規化、気泡の検出およびピペット操作のエラーの補正ならびに関連のないデータセットの自動的な識別が含まれる。そのデータ分析は、レーベンバーグマーカートアルゴリズムJournaloftheSocietyforIndustrialandAppliedMathematics11431441をχ2測定と共に用いる全ての入力データセットに関する2~6状態に関する本発明に従う方法による高速曲線当てはめにより行われる。条件のふるい分けおよび階層的分類。安定化条件を記述するDSF曲線を効率的に見付けるため、ふるい分けおよび階層的分類アプローチを適用することができる。今まで、Thermofluorに基づくアッセイはデータ評価に関して排他的にTm値に頼ってきた。これは、ΔHがヘスの法則に従って全ての条件に関してほとんど等しくなければならないため、完全な2状態アンフォールディング挙動を示す試料に関しては合理的なアプローチである。しかし、タンパク質複合体に関しては、多くのDSF曲線がこの2状態モデルと似ているが、それらの蛍光における増大は峻度がより小さい可能性がある。より小さいΔH、従って異なるエンタルピー的寄与の平均値のみを意味する。Tm値のみを考慮すると、浅い曲線は、そのTm値が無意味なより高い値へとシフトすると考えられるため、誤解させる結果をもたらすであろう。浅い曲線の形状は、溶液中の複合体の異なる種に帰することができるいくつかのアンフォールディング曲線の重ね合わせの結果である。従って、それは増大した試料の不均質性を示すものである。そのような誤った解釈を避けるため、DSF曲線は曲線の峻度に従って予め分類され、それは見かけのΔHにより記述される。まとめると、最も安定化する条件に相当するDSF曲線に関する完全に自動化された検索のために、現在、データの準備およびふるい分けの3つの工程ならびに階層的分類および動的閾値処理の別の3つの工程を有するアルゴリズムが用いられている。ふるい分けの工程:1全ての曲線に関してバックグラウンドを減算し、それらを0~1000の範囲に正規化する。その曲線の最も小さい極小を0に、最も高い極大を1000にそれぞれ設定する。この区間の間の全ての値を0~1000の範囲内で正規化する;この区間の範囲外の全ての値を破棄する。2気泡を含有する試料の曲線は、その曲線の最初のデータの点から最も低い極小までの区間における蛍光値の曲線の平均勾配により識別される。強い負の傾きを有する全てのDSF曲線を破棄する。3それぞれの曲線を2状態から6状態までのそれぞれのモデルに当てはめ、R2測定に関して最高に当てはまるものを検出する。最高に当てはまるもののR2が0.999未満である場合、この曲線は破棄される。本発明に従う好ましい分類および閾値処理工程:当てはめの質を定量化するため、R2測定が用いられる。ここで、R2は1から残差平方和SSerrを総平方和SStotで割った商を引いたものである。およびであり、ここでであり、yiはデータセットの値であり、fiは当てはめられたモデルからの対応する値である。閾値処理のためのパラメーターは百分率の値として与えることができ、適用の順序は例えば次のように設定することができる:1全ての残っている曲線を2状態モデルに対するそれらのR2値により分類し、それらの曲線の最高の50切り上げを次の工程に進める。2ここで、残っている曲線をそれらのΔH値により分類し、再度最高の50切り上げのみを次のレベルに進める。3この最後の工程において、その曲線をそれらのTm値により分類し、最高の50切り上げのみが最も安定化する条件を有するその試料の曲線に相当する。アルゴリズムの結果:その標本に関する最も安定化する条件に相当する3個までの曲線がこのアルゴリズムの後に残っているであろう。記述された順位付けシステムは電子顕微鏡法により評価されている。最高の順位を付けられた曲線は、常に結果としてEM格子上の完全な粒子の単分散分布をもたらした。これは、その試料を、結果として得られる安定化緩衝液中でGraFix方法論にさらに供する場合に特に当てはまるKastneretal、上記参照。追加の特徴本発明に従う方法は、ピペット操作のエラー、粗悪な試料または他の理由、試料が気泡、色素の結晶もしくはタンパク質凝集物を含有していること、による、thermofluor技法におけるほとんどの一般的な問題に関して追加で補正することができる。これらの全てが、光散乱を、従って高い最初のシグナルをもたらす。そのソフトウェアはそれらの曲線を検出し、さらなる分析においてそれらを無視することができる。類似の効果が、ミセル形成により界面活性剤中で見出される。それらの場合において、そのソフトウェアは二次多項式の減算によりそれらの曲線を補正するであろう。さらに、本発明に従う方法は、温度に誘導されるpHシフトに関して補正することができる。緩衝物質のpKA値は温度により非常に大きく変動し得るため、これに関して補正しなければならない。その曲線に関するモデル結果パラメーターは、融点に関して正確に決定される。このことは、それらがその融点におけるそのpHにおける安定性を記述することを意味する。複合体の安定性の依存性において、pHの違いは重要であり、結果として新規の所望の緩衝液のpHの誤解をもたらし得る。これはその物質の供給業者により提供されるΔpKA/T値を用いた融点への直線外挿により補正される。それの曲線の形状への影響は、ΔGN-UおよびpHの間の依存性TanfordCinProteinChemistryJJTECBAnfinsenandMRFredericedspp195ならびにpHおよびTの間の依存性は線形であるため、単一指数関数として当てはめられたFUTにより既に補正されている。さらに、全ての既に確立されたthermofluorの変形を、ここで大きなタンパク質の集合体に適用することができる。これには酵素学的結合アッセイならびに医薬スクリーニングが含まれる。実験手順thermofluorアッセイスクリーニングは96ウェルプレートmultiplate96、白色、低プロファイル、Biozyme中で20μl反応で実施した。それぞれのウェルは、10×SyproORANGEInvitrogen、ドイツを補った0.1~1μMの複合体および適切なスクリーニングプレートの2μLを含有していた。緩衝物質およびpHに関するスクリーニングはpHatscreenJenaBioscience、ドイツを用いて、添加剤に関してはAdditiveScreenHTHamptonResearch、米国を用いて実施した。全てのプレートはタンパク質を含まない、ならびにスクリーニング物質を含まない対照ウェルを含有していた。測定はCFX96RealTimeunitBioRAD、米国中で30°C~95°Cの温度範囲で1°Cのステップ幅で実施した。それぞれの温度において反応を30秒間平衡化させておいた。最後に、HEXチャンネルから得られたシグナルを分析した。電子顕微鏡法精製した複合体に適切なスクリーニング物質を補い、10分間保温し、カスタムメイドの炭素薄膜上に吸着させた。CM200FEG電子顕微鏡FEI、オランダにおいて160kVで画像を得た。4k×4kCCDカメラTemCam-F415;TVIPS、ドイツをピクセルの2倍ビニングbinningおよび86,000倍の倍率で用いた。本発明に従う方法を検証するため、蛍光色素SyproOrangeInvitrogenの存在下でpHATBufferscreenの様々な緩衝条件下で、500kDaの天然分子量を有するホモ10量体性複合体であるセレノシステインシンターゼSelAのアンフォールディング遷移を記録した。そのアンフォールディング遷移は本発明に従う方法に基づいて分析した。さらに、それぞれの条件下での試料の分散度を電子顕微鏡法EMにより決定した。明確に多相性のアンフォールディング遷移が記録された緩衝条件下で、陰性染色EMにおける大きな凝集物が観察された図1、左の列。部分的に3状態の遷移が記録された際、部分的な凝集を示すEM画像中央のパネルが得られた。対照的に、見かけ上2状態のアンフォールディング遷移をもたらした条件は、EMにより単一粒子の単分散領域fieldを示した右のパネル。従って、本発明に従う方法により決定されるような単一熱アンフォールディング遷移を実際に複合体に関して得ることができ、それは高分子複合体の単分散および安定性を示している。これらの発見は、高分子複合体が上記で概説したような安定化条件下で実際に見かけ上2状態の様式でアンフォールディングすることを予測する、理論上の熱力学的考察とよく一致している。安定化条件下でのこの驚くべき複合体の挙動は、本発明に従う方法との組み合わせでのThermofluor法を、例えば国際公開第2010/109204号における以前の記載とは対照的に、高分子複合体の安定性を最適化するための有用な道具にする。本発明に従う方法の有効性に関する次の原理証明において、熱アンフォールディングが単一ドメインタンパク質に関して記述されているのと類似して分子機械を安定化する小さい分子を見付けるのに適しているかどうかが決定された。これに関して、GroEL/GroESそれぞれホモ14量体の800kDaおよびホモ7量体の70kDaシャペロニン系が分析されている。シャペロニン系の2つの重要な特性は文献において十分に記述されている。まず、GroELは二重の7量体性環構造を形成し、それは疎水性残基を1つの面上に露出し、そこに未変性でない基質タンパク質が結合することができる。次に、アデニン-ヌクレオチドのGroELへの結合が立体構造変化を誘導し、それは前に露出した疎水性残基を埋め込ませ、それはGroELの二重の環の1つの面にGroESが結合するのに不可欠である。従って、等モルのGroEL/GroESの本発明に従う測定は、溶媒に曝露した疎水性残基のために高い初期蛍光を生じるはずであり、それは温度ランピングrampingの際に徐々に低下する。dATPまたはATPのどちらかの存在下では、この高い初期強度は存在せず、単一の見かけの2状態のアンフォールディング遷移が観察され、これはGroEL/GroES複合体の形成を示している図2参照。従って、本発明に従う方法は分子機械の小分子安定化剤を決定するのに適している。次に、細胞分子機械の別の豊富なクラスである核酸-タンパク質複合体を研究した。それは、生化学および構造生物学の両方により数十年間広範囲にわたって研究されてきたリボソームを用いて開始した。様々な源からのリボソームの精製に関していくつかの十分に確立されたプロトコルが存在し、それは構造生物学を実施することができる安定な粒子をもたらす。従って、本発明者らは標準的なプロトコルに従ってHeLa細胞から80Sリボソームを精製し、それらに対して本発明に従う方法を実施した。HeLaの80Sリボソームは80個より多くのタンパク質および4個のRNAからなる。驚くべきことに、本発明に従う方法を用いて、80Sリボソームのほとんど2状態のアンフォールディング挙動が得られた。これらの単一遷移が完全な粒子に対応しているかどうかを検証するため、本発明者らはそれらに対して勾配遠心分離およびそれに続くSDS-PAGEを行った。HeLaのリボソームに関して予想されるようなおおよその80Sのスベドベルグ定数を有する単分散的に沈降する粒子の種が見付かった。次いで精製した80Sリボソームを50mMEDTAで処理し、それに対して本発明に従う方法を実施した。これらの条件下では、80Sリボソームを安定化する二価のMgイオンが滴定して除かれtitratedaway、リボソームの40Sおよび60Sサブユニットの混合物が形成されることが記述されている。これは密度勾配分析により検証することができ、本発明に従って多相遷移がもたらされた図3。要約すると、本発明に従う方法は核酸-タンパク質複合体の安定性を決定および最適化するのにも適している。最後に、本発明の方法が高分子複合体の安定性の最適化に適していることの十分な証明を提供したので、構造生物学に関して不十分にしか特性付けされていない分子機械を分析した。この目的のため、ビオンファラリアグラブラタBiomaphalariaglabrataのヘモグロビンBGHbを選択した。BGHbは、13個の異なるシステインを含まないグロビンドメイン、それに加えてサブユニットの二量体化のための3個のシステインを有する小さいN末端の非グロビンのプラグドメインからなる。これらのサブユニットは3×2ジスルフィド結合したサブユニットの四次構造を形成することが報告されており、それは約1.4MDaの総質量を形成する。BGHbを以前に記述されたように陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、凝集状態をEMにより決定した図4。電子顕微鏡写真は、様々な程度の解離した粒子および凝集物を有する多分散試料を明らかにした。次いでBGHbに対して本発明に従う方法を実施した。BGHbがアルカリ性から酸性pH値までのイミダゾール緩衝液中で徐々に安定化することが観察された。実際、8.2のpHからpH5.8までにおいて、BGHbの熱安定性は45ケルビン高められた。注目すべきことに、そのpHATscreenにおける任意の他の緩衝系中ではBGHbに関する熱アンフォールディング遷移は一切観察されておらず、これは強い不安定化を示唆している。従って、BGHbをpH5.8におけるイミダゾール中に再緩衝し、その凝集状態をEMにより再評価した図4。これらの条件において、いくらかの量の解離したサブユニットを有するBGHbの明確に識別可能な単一粒子が見付かった。pH5.8におけるイミダゾール中のBGHbに対してさらにGraFix処理を行った際、粒子の単分散領域を有するEM顕微鏡写真が得られ図4、それは明らかに構造生物学に適用することができる。特に、この全手順は24時間以内に成し遂げることができた。従って、本発明に従う方法は、好ましくはGraFixとの組み合わせで、構造決定プロジェクトの方向を絶望的から非常に有望に転換する能力を有する。図5および6において、本発明に従う方法が、それぞれ流れ図で、および典型的な曲線として、詳細に示されている。それぞれのプローブの温度にわたる蛍光の生データは、それぞれのプローブに関するそれぞれのデータ情報と組み合わせられる。次いで、6より多くの関連する極大を有するデータセットならびに参照試料またはプローブを除外する図6の第1および第2の列も参照。続いて、緩衝液の参照値を平均し、データセットから減算する。加えて、そのデータセットを示されたように正規化する図6の第3の列も参照。加えて、気泡または結晶化のために異常な構造を示すデータセットを除外する図6の第4の列も参照。残りのデータセットを本発明に従って2~6状態に関するモデルに当てはめることにより、分析を継続する。従って、様々なパラメーターがそれぞれの当てはめに関して、特にそれぞれの2状態モデルに関して、計算される図6の第5または最後の列も参照。さらに、最高に当てはまるモデルに関する様々なパラメーターを抽出する。様々なパラメーターを計算した後、そのデータセットを概説したようにその様々なパラメーターを考慮して分類する。最後に、残っている曲線を、例えばその曲線を重ねることにより比較して最高の安定化条件を同定する。"