"ビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、前記患者のユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比較して低いかどうかを決定するステップを含み、前記基準レベルと比べて低下していないユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性は、前記患者がビグリカン療法に応答する可能性が高いことを示す、方法。ビグリカン療法の効果をモニタリングする方法であって、ビグリカン療法を受容している患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、膜会合ユートロフィンの増大したレベルは、前記ビグリカン療法が有効であることを示す、方法。前記ビグリカン療法が、配列番号9と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ビグリカン療法が、配列番号9のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ビグリカン療法が、配列番号10と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ビグリカン療法が、配列番号10のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ビグリカン療法が、配列番号11と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ビグリカン療法が、配列番号11のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を含む、請求項1または2に記載の方法。ビグリカンポリペプチドの患者の用量を調整する方法であって、第1の用量のビグリカンポリペプチドを患者に投与するステップと、前記患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップと、膜会合ユートロフィンの前記量を所定の標的レベルと比較するステップと、前記ビグリカンポリペプチドの前記用量を、前記測定されたレベルと前記標的レベルとの間の差違に応じて調整するステップとを含む、方法。ビグリカンポリペプチドの活性を測定する方法であって、前記ビグリカンポリペプチドを、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、ビグリカンポリペプチドを施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの増大した量は、ビグリカン活性の指標となる、方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項9または10に記載の方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項9または10に記載の方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項9または10に記載の方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項9または10に記載の方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項9または10に記載の方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項9または10に記載の方法。ビグリカン関連状態の治療剤を同定する方法であって、被験化合物を、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、前記被験化合物を施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、前記被験細胞における膜会合ユートロフィンの量の増大により、前記化合物がビグリカン関連状態の治療剤であることが示される、方法。前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項17に記載の方法。前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性mytonicジストロフィーである、請求項18に記載の方法。前記被験細胞が筋細胞である、請求項17に記載の方法。ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90同一である、請求項21に記載の組成物。前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその断片と少なくとも90同一である、請求項21に記載の組成物。ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を含む治療用組成物。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90同一である、請求項24に記載の治療用組成物。前記抗炎症薬が、ロフェコキシブRofecoxibmまたはセレコキシブである、請求項24に記載の治療用組成物。筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE-031、AMG-745、またはMYO-029である、請求項24に記載の治療用組成物。ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN-195である、請求項24に記載の治療用組成物。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMTC1100である、請求項24に記載の治療用組成物。nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項24に記載の治療用組成物。筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、請求項24に記載の治療用組成物。筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE-031またはAMG-745である、請求項24に記載の治療用組成物。線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項24に記載の治療用組成物。エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI-4658、PRO51、またはPRO44である、請求項24に記載の治療用組成物。ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者にビグリカンポリペプチドを含む有効量の組成物およびユートロフィンポリペプチドを共時投与するステップを含む、方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90同一である、請求項35に記載の方法。前記ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその断片と少なくとも90同一である、請求項35に記載の方法。ビグリカン関連状態を処置する方法であって、ビグリカン関連状態の処置を必要とする患者に有効量のiビグリカンポリペプチドを含む組成物、ならびにii抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を共時投与するステップを含む、方法。前記ビグリカンポリペプチドが、配列番号9またはその断片と少なくとも90同一である、請求項38に記載の方法。前記抗炎症薬が、ロフェコキシブまたはセレコキシブである、請求項38に記載の方法。筋肉量を増大させる前記薬剤が、ACE-031、AMG-745、またはMYO-029である、請求項38に記載の方法。ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる前記薬剤が、BMN-195である、請求項38に記載の方法。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる前記薬剤が、SMTC1100である、請求項38に記載の方法。nNOS系の活性を増大させる前記薬剤が、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートである、請求項38に記載の方法。筋細胞膜の修復を促進する前記薬剤が、ジスフェリン、MG53、またはCav3である、請求項38に記載の方法。筋再生を増大させる前記薬剤が、ACE-031またはAMG-745である、請求項38に記載の方法。線維化を低下させる前記薬剤が、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬である、請求項38に記載の方法。エクソンスキッピングを促進する前記薬剤が、AVI-4658、PRO51、またはPRO44である、請求項38に記載の方法。ビグリカン関連状態を処置する方法であって、0.1mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを、ビグリカン関連状態の処置を必要とするヒト患者に1~4週間ごとに投与するステップを含む、方法。前記ビグリカン関連状態が、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である、請求項49に記載の方法。前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーである、請求項50に記載の方法。ビグリカンポリペプチドの前記量が、0.1~1.5mg/kgである、請求項49に記載の方法。ジストログリカンおよびDAPCは、筋肉ならびに他の組織の多様な過程において極めて重要な役割を果たすことが明らかである。ジストログリカンおよび/またはDAPCの機能を調節するための診断剤および治療剤ならびに方法を開発することが必要である。特定の態様では、本開示は、ビグリカン療法に対する患者の応答を予測する方法であって、患者のユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比較して低いかどうかを決定するステップを含み、ユートロフィンタンパク質のレベルまたは活性が基準レベルと比べて低くなければ、患者がビグリカン療法に応答する可能性が高いことが示される方法を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカン療法の効果をモニタリングする方法であって、ビグリカン療法を受容している患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップを含み、膜会合ユートロフィンレベルが高ければ、ビグリカン療法が有効であることが示される方法を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドの患者の用量を調整する方法であって、第1の用量のビグリカンポリペプチドを患者に投与するステップと、患者における膜会合ユートロフィンの量を測定するステップと、膜会合ユートロフィンの量を所定の標的レベルと比較するステップと、ビグリカンポリペプチドの用量を、測定されたレベルと標的レベルとの間の差違に応じて調整するステップとを含む方法を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドの活性を測定する方法であって、ビグリカンポリペプチドを、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、ビグリカンポリペプチドを施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、被験細胞における膜会合ユートロフィンの増大した量は、ビグリカン活性の指標となる方法を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態の治療剤を同定する方法であって、被験化合物を、ユートロフィンを発現する被験細胞に投与するステップと、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量を、被験化合物を施されなかった対照細胞における膜会合ユートロフィンの量と比較するステップとを含み、被験細胞における膜会合ユートロフィンの量の増大により、化合物がビグリカン関連状態の治療剤であることが示される方法を提供する。ビグリカン関連状態は、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態でありうる。筋ジストロフィーは、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性mytonicジストロフィーでありうる。被験細胞は、筋細胞でありうる。特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む治療用組成物を提供する。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその断片と少なくとも90同一である、請求項21に記載の組成物。特定の態様では、本開示は、ビグリカンポリペプチド、ならびに抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を含む治療用組成物を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、それを必要とする患者にビグリカンポリペプチドおよびユートロフィンポリペプチドを含む有効量の組成物を共時投与するステップを含む方法を提供する。特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のiビグリカンポリペプチドを含む組成物、ならびにii抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤のうちの1または複数を共時投与するステップを含む方法を提供する。抗炎症薬は、例えば、ロフェコキシブRofecoxibmまたはセレコキシブでありうる。筋肉量を増大させる薬剤は、例えば、ACE-031、AMG-745、またはMYO-029でありうる。ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤は、例えば、BMN-195でありうる。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤は、例えば、SMTC1100でありうる。nNOS系の活性を増大させる薬剤は、例えば、タダラフィル、バルデナフィル、またはシルデナフィルシトレートでありうる。筋細胞膜の修復を促進する薬剤は、例えば、ジスフェリン、MG53、またはCav3でありうる。筋再生を増大させる薬剤は、例えば、ACE-031またはAMG-745でありうる。線維化を低下させる薬剤は、例えば、線維化促進因子アンタゴニストまたは抗線維化薬でありうる。エクソンスキッピングを促進する薬剤は、例えば、AVI-4658、PRO51、またはPRO44でありうる。特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、0.5mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを、それを必要とするヒト患者に1~4週間ごとに投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドを1~2週間ごと、2~3週間ごと、または3~4週間ごとに投与する。一部の実施形態では、1mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、5mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、10mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、20mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、50mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。一部の実施形態では、100mg/kg/200mg/kgのビグリカンポリペプチドを投与する。特定の態様では、本開示は、ビグリカン関連状態を処置する方法であって、0.1mg/kg~100mg/kgのビグリカンポリペプチドを、それを必要とするヒト患者に1~4週間ごとに投与するステップを含む方法を提供する。例えば、ビグリカンの量は、0.1mg/kg~1.5mg/kgでありうる。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドを1~2週間ごと、2~3週間ごと、または3~4週間ごとに投与する。一部の実施形態では、ビグリカン関連状態は、筋ジストロフィー、神経筋疾患、神経疾患、または神経筋接合部またはシナプスの異常を特徴とする状態である。筋ジストロフィーは、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または筋強直性ジストロフィーでありうる。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号9と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号10と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号11と少なくとも90同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列を含む。本開示は、前出の態様および実施形態のうちのいずれかの全ての組合せのほか、発明を実施するための形態および実施例で示される実施形態のうちのいずれかによる組合せも想定する。I.概観本開示は、機能不全性のDAPCと関連する疾患もしくは状態、細胞構造の不安定、神経筋接合部もしくはシナプスにおける欠陥、またはVI型コラーゲン欠損を処置および/または防止するための、ビグリカンを含有する組成物および方法を提供する。このような疾患には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、他のミオパシー、神経筋障害、および神経障害が含まれるがこれらに限定されない。本開示の特定の態様は、ビグリカン治療剤がユートロフィンの細胞膜への適正な局在化を促進し、ユートロフィンが欠如するとビグリカン治療剤の有効性が低減することの新規の発見に基づく。結果として、本開示は、特に、ユートロフィンのレベル、局在化、または機能をアッセイすることにより、ビグリカン療法が成功する可能性が高いかどうかを決定する方法を提供する。さらに、DAPCおよびジストログリカンの広範な組織分布を考慮すると、ビグリカンは、細胞膜を介するシグナル伝達を制御し、かつ/または筋細胞以外の細胞の細胞膜の完全性を維持するのに役割を果たす可能性が高い。例えば、ジストログリカンまたは他のDAPCの構成要素は、脳、腎臓、および心臓において豊富である。したがって、本開示は、より一般に、ビグリカンを含有する組成物およびビグリカンポリペプチドが相互作用する膜タンパク質複合体、例えば、DAPCまたはMuSK受容体の異常と関連する疾患または障害を予測する方法を提供する。ジストログリカンは、微生物例えば、ラッサ熱ウイルスおよび脈絡髄膜炎熱ウイルスが細胞に侵入するのに用いられる受容体であることが知られているので、本明細書で記載されるビグリカンを含有する治療剤および予測法は、このような微生物による感染との関連で用いることができる。特殊な作用機構に限定されることを望まずに述べると、ビグリカン治療剤は、微生物のジストログリカンへの結合を妨害または阻害しうる。ヒトビグリカン例えば、Fischerら、J.Biol.Chem.、264巻:4571頁1996年では骨の低分子プロテオグリカンとされる;GenBank受託番号:J04599;配列番号9およびシビレエイの発電器官から単離されたDAG-125のいずれも、DAPCの構成要素と相互作用することが示されている。2つのタンパク質の間の配列相同性および類似の生物学的活性本明細書でさらに記載されるに基づき、ヒトビグリカン配列番号9は、シビレエイDAG-125のヒトオーソログでありうると考えられる。代替的に、シビレエイDAG-125のヒトオーソログは、ヒトビグリカンと高度に関連するタンパク質でもありうる。明確さのために述べると、本明細書で用いられるビグリカンという用語は、ヒトビグリカン配列番号9およびシビレエイDAG-125のほか、それらの相同体も包含することを意図する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーDMDとは、少年のうちの約1:3,500が罹患する遺伝疾患であり、彼らの大半は、20歳代半ばまでに死亡する1。DMDは、ジストロフィンにおける変異であって、ジストロフィン会合タンパク質複合体DAPCと称する、筋細胞表面における構造分子およびシグナル伝達分子の集合体の構築および機能の不完全を結果としてもたらす変異により引き起こされる2~4。現在のところ、DMDの主要な病態を標的とする処置は見られない。DMDの1つの魅力的な治療法は、ジストロフィンの相同体であるユートロフィンの上方制御を介する筋細胞膜の安定化である。トランスジェニック体でユートロフィンを過剰発現させると、ジストロフィン欠損mdxマウスにおけるジストロフィー性病態がレスキューされ、これにおける機能が回復される5~7。成熟筋では、ユートロフィンの発現が、神経筋および筋腱間接合部に制約される。しかし、発生しつつある筋肉および再生しつつある筋肉では、ユートロフィンが、筋線維全体にわたり発現する8~10。これらの観察は、発生しつつある筋肉におけるユートロフィンの発現を正常に制御する経路を集結させれば、発症しつつあるDMDを処置するための生産的な手法でありうる可能性を提起する。細胞外マトリックスタンパク質であるビグリカンは、発生しつつある筋肉において重要な役割を果たす。ヒトおよびマウスのいずれでも、ビグリカンは、未成熟筋および再生しつつある筋肉において最も高度に発現する11、12。ビグリカンは、DAPCの構成要素であり、DAPCにおいて、ビグリカンは、α-ジストログリカン13ならびにα-サルコグリカンおよびγ-サルコグリカン14に結合する。ビグリカンは、特に、未成熟筋における、サルコグリカンのほか、ジストロブレビン、シントロフィン、およびnNOSの発現を制御する。最後に、ビグリカンは、適時の筋再生に重要である11。局所送達された組換えヒトビグリカンrhBGNは、bgn-/o筋の細胞外マトリックスへと組み込まれ、そこで少なくとも2週間にわたり存続し、複数のDAPCの構成要素の発現をレスキューする15。これらの結果は、rhBGNが、ジストロフィンを欠く筋肉の機能を増強することを示唆する。本明細書において、本発明者らは、未成熟ビグリカンヌルbgn-/oマウスにおいてユートロフィンが下方制御され、培養筋管においてrhBGNが膜会合ユートロフィンを上方制御することを示す。rhBGNは、ジストロフィン欠損mdxマウスへと全身送達することができ、そこでrhBGNが筋鞘におけるユートロフィンおよび他のDAPCの構成要素を上方制御し、筋病態を改善し、機能を向上させることが重要である。複数系列の証拠は、ビグリカンがユートロフィンを細胞膜へと動員することにより作用することを示す。したがって、rhBGNは、DMDの治療剤として用いることができる。II.定義便宜のため、明細書、実施例、および付属の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書で用いられるGAGとは、本明細書では二糖単位の反復からなる非分枝状の多糖長鎖であるムコ多糖と互換的に用いられるグリコサミングリカンを指す。2つの糖のうちの1つは、常にアミノ糖N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミンである。グリコサミングリカンは、プロテオグリカン分子を形成するコアタンパク質のセリン残基と共有結合的に連結される。糖タンパク質という用語は、ポリペプチド鎖へと共有結合的に接合された1または複数の炭水化物基を含有するタンパク質を指す。典型的に、糖タンパク質は、重量で1~60の、組成が可変的な多数の比較的短鎖で分枝状のオリゴ糖鎖の形態にある炭水化物を含有する。糖タンパク質とは対照的に、プロテオグリカンは、はるかに高分子であり最大数百万ドルトン、多くの非分枝状のグリコサミングリカン長鎖の形態にある、重量で90~95の炭水化物を含有する。ビグリカンという用語は、ヒトビグリカンまたはシビレエイDAG-125の少なくとも1つの生物学的活性を有するポリペプチドを指す。好ましいビグリカンには、シビレエイDAG-125配列番号1~3のうちの少なくとも1つを含む、ヒトビグリカン配列番号9のほか、これらの相同体および断片が含まれる。好ましい相同体は、少なくとも約70の同一性、少なくとも約75の同一性、少なくとも約80の同一性、少なくとも約85の同一性、少なくとも約90の同一性、少なくとも約95の同一性、およびなおより好ましくは、少なくとも約98または99の同一性を有するタンパク質またはペプチドである。なおより好ましい相同体は、ヒトビグリカンまたはシビレエイDAG-125と特定の百分率の相同性または同一性を有し、これらの分子の少なくとも1つの生物学的活性を有する相同体である。ビグリカンという用語は、全長ビグリカンに限定されず、また、ビグリカンの少なくとも1つの活性を有する断片部分も包含する。本明細書で用いられるビグリカンという用語は、GAG側鎖を伴うポリペプチドの形態およびGAG側鎖を伴わないポリペプチドの形態の両方を指す。野生型のヒトビグリカンという用語は、Fischerら、J.Biol.Chem.、264巻:4571頁1989年において記載されているタンパク質であって、GenBank受託番号:J04599および配列番号9に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。野生型のヒトビグリカンタンパク質をコードするcDNA配列は、配列番号7および配列番号8としてのそのオープンリーディングフレームに示されている。ビグリカン関連ポリペプチドという用語は、ビグリカンの少なくとも1つの活性を有する特定のポリペプチドを指し、この用語は、野生型ビグリカンを包含しない。野生型ビグリカンおよびビグリカン関連ポリペプチドのいずれも、ビグリカン治療剤という用語の中に包摂される。ビグリカンコアという用語は、GAG鎖を包含しないビグリカンを指す。本明細書で記載される、ビグリカン関連治療剤という用語は、ビグリカン様のポリペプチドであって、このポリペプチドが、グリコサミングリカンGAG側鎖を欠くすなわち、これが野生型のグリカン化部位を欠くためにように、野生型のビグリカンタンパク質例えば、シビレエイDAG-125または哺乳動物ビグリカン、好ましくはヒトビグリカンの2つのグリカン化されたセリン残基に対応する2つのアミノ酸残基が欠失しているか、または別のアミノ酸好ましくは、グリシンまたはアラニンなどのアルキル側鎖を伴うアミノ酸により置換されているポリペプチドを指す。加えて、ビグリカン関連治療剤は、野生型ビグリカンの特徴および生物学的活性のうちの1または複数を有する。例えば、ビグリカン関連治療剤は、以下の特徴のうちの1または複数を有しうる:約35~約55kDaの分子量;配列番号1~6のうちの1もしくは複数、または配列番号9、10、もしくは11のうちの残基38~365と少なくとも80、85、90、95、または99同一なアミノ酸配列;および対応する定義の下に上記で列挙したビグリカンの生物学的活性のうちの1または複数。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第WO2011/146480号では、多数のビグリカン関連治療剤が記載されている。ビグリカン関連治療剤とは、ビグリカン治療剤の1つの種類である。ビグリカン治療剤という用語は、本明細書で記載され、野生型ビグリカンの少なくとも1つの生物学的活性を有するビグリカンポリペプチドの部分もさらに包含する。ビグリカン治療剤という用語はまた、ペプチド模倣剤もしくはその誘導体、またはビグリカン様のポリペプチドをコードする核酸も包含する。ビグリカンの生物学的活性とは、細胞膜の完全性を維持する能力;細胞膜におけるDAPCを安定化させる能力;DAPCの1または複数の構成要素に結合する能力;例えば、α-ジストログリカンへの結合野生型のヒトビグリカンなど、特定のビグリカンの場合、α-サルコグリカンまたはγ-サルコグリカンなど、サルコグリカン構成要素への結合;MuSKへの結合;VI型コラーゲンへの結合;シナプス後の分化を刺激することなどにより神経筋接合部の形成を刺激すること;AChRの凝集、例えば、アグリンに誘導されるAChRの凝集の強化;DAPCの構成要素、例えば、サルコグリカンのリン酸化;MuSKのリン酸化を刺激すること、またはアグリンに誘導されるMuSKのリン酸化を強化すること;ユートロフィンレベルを上昇させること;およびユートロフィンの細胞膜への局在化を促進することのうちの1または複数を指すことを意図する。特定の実施形態では、ビグリカンが、MuSK、α-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、およびVI型コラーゲンに結合するが、α-ジストログリカンには結合しない。ビグリカン核酸という用語は、ビグリカンタンパク質をコードする核酸、例えば、配列番号9を有するタンパク質をコードする核酸を指す。本明細書では、異常なabnormalという用語が、異常なaberrantと互換的に用いられ、野生型の分子もしくは活性または正常な分子もしくは活性と異なる分子または活性を指す。DAPCという用語は、ジストロフィン、α-ジストログリカンおよびβ-ジストログリカン、ならびにサルコグリカンによる膜貫通複合体を含む膜複合体であるジストロフィン会合タンパク質複合体を指す。サルコグリカンは、α-サルコグリカン、β-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、δ-サルコグリカン、およびε-サルコグリカンを包含する異なる形態で存在する。特定のサルコグリカンは、特定の組織に特異的である、例えば、α-サルコグリカンおよびδ-サルコグリカンは骨格筋特異的である。ジストロフィン会合タンパク質には、α-ジストログリカン、ジストロブレビン、サルコスパン、およびシントロフィンなどのタンパク質または糖タンパク質が含まれる。AChRという用語は、アセチルコリン受容体を指す。SLRPという用語は、ロイシンリッチリピートによる低分子のプロテオグリカンを指す。本明細書で筋特異的キナーゼと互換的に用いられるMuSKという用語は、正常筋および除神経筋のほか、心臓、脾臓、卵巣、または網膜を含めた他の組織においてを発現するタンパク質チロシンキナーゼを指すValenzuela,D.ら、1995年、Neuron、15巻:573~584頁を参照されたい。チロシンキナーゼは、代替的に除神経筋キナーゼに代わり、Dmkとも称している。したがって、MuSKおよびDmkという用語は、互換的に用いることができる。このタンパク質は、チロシンキナーゼのTrkファミリーと関連すると考えられ、さらに米国特許第5,814,478号において記載されている。本明細書で用いられるMuSK活性化分子という用語は、分化した筋細胞の文脈でMuSK受容体のリン酸化を誘導することが可能な分子を指す。1つのこのような活性化分子は、アグリンである。ポリペプチドに適用される実質的な同一性という用語は、2つのペプチド配列が、デフォルトのギャップの重みを用いるGAPプログラムまたはBESTFITプログラムなどにより最適に配列決定された場合、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセント以上の配列同一性例えば、99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり;脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり;アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり;硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。筋芽細胞とは、他の筋芽細胞と融合することにより、最終的に骨格筋線維へと発生する筋管をもたらす細胞である。この用語は、場合によって、骨格筋線維の直前の前駆体として認識可能な全ての細胞について用いられる。代替的には、この用語は融合が可能な有糸分裂後細胞に取り置いて、他の細胞を推定筋芽細胞と称する。筋原線維とは、太いフィラメントおよび細いフィラメントの規則的配列からなり、収縮装置を構成する、横紋筋の長い円筒形の細胞小器官である。筋管とは、一部の末梢に位置する、筋原線維を含有する長型の多核細胞3つ以上の核である。筋管は、invivoまたはinvitroにおいて、筋芽細胞の融合により形成され、最終的に、末梢に位置する核を有し、それらの細胞質の大半が筋原線維で満たされている成熟筋線維へと発生する。ユートロフィンジストロフィン会合タンパク質とは、成体筋の神経筋接合部近傍に局在化するジストロフィンの常染色体相同体395kDのサイズであるが、ジストロフィンの非存在下においてすなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ユートロフィンはまた、筋鞘の細胞質面上にも配置される。ユートロフィンのヒトmRNA配列を配列番号12として示し、ヒトユートロフィンのポリペプチド配列を配列番号13として示す。配列番号12および13は、GenBank受託番号:X69086.1の下に見出すことができる。本明細書で用いられるトランスフェクションという用語は、核酸を介する遺伝子移入による、核酸、例えば、発現ベクターのレシピエント細胞への導入を意味する。本明細書では、形質導入という用語を、核酸によるトランスフェクションが、ウイルスによる核酸の送達を介する場合に一般に用いる。本明細書で用いられる形質転換とは、細胞による外因性DNAまたは外因性RNAの取込みの結果として細胞の遺伝子型が変わる過程を指し、例えば、形質転換された細胞は、ポリペプチドの組換え形態を発現させるか、または導入された遺伝子に由来するアンチセンスの発現の場合、組換えタンパク質の自然発生形態の発現を破壊する。本明細書で用いられるトランス遺伝子という用語は、細胞へと導入された核酸配列を指す。トランス遺伝子を導入した細胞に由来する娘細胞もまた、トランス遺伝子を含有するというそれが欠失していない限り。トランス遺伝子は、例えば、部分的または全体的に異種のポリペプチド、すなわち、トランスジェニック動物もしくはそれが導入される細胞に対して外来であるか、またはトランスジェニック動物もしくはそれが導入される細胞の内因性遺伝子と相同であるが、それが挿入される例えば、天然遺伝子の場所と異なる場所に挿入される細胞のゲノムを変化させるような形で、動物のゲノムへと挿入するようにデザインされるかまたは挿入されるポリペプチドをコードしうる。代替的に、トランス遺伝子はまた、エピソーム内にも存在しうる。トランス遺伝子には、1または複数の転写制御配列および選択されたコード配列を最適に発現させるのに必要でありうる他の任意の核酸例えば、イントロンが含まれうる。本明細書で用いられるベクターという用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの1つの種類は、エピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。適切なベクターは、自己複製および/またはそれらが連結された核酸の発現が可能なベクターである。本明細書では、それらを作動的に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能なベクターを、発現ベクターと称する。一般に、組換えDNA法において有用な発現ベクターは、それらのベクター形態では染色体に結合しない環状二本鎖のDNAループを一般に指す、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドが、最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、別段に指定しない限り、本明細書では、ベクターが、プラスミドを意味する。しかし、本開示はまた、同等な機能を果たす他の形態の発現ベクターであって、本明細書に後続する当技術分野において公知となるベクターも提供する。本明細書で用いられる~に由来するという語句は、所与の配列から選択されるペプチド配列またはヌクレオチド配列を示す。名付けられた配列に由来するペプチド配列またはヌクレオチド配列は、親配列と比べて少数の修飾を含有することが可能であり、大半の場合、親配列に存在するアミノ酸残基またはアミノ酸塩基対のうちの約15未満であり、好ましくは約10未満であり、多くの場合は約5未満の欠失、置換、または挿入を表す。DNAの場合、2つのDNA分子が、互いと選択的にハイブリダイズすることが可能であれば、1つのDNA分子はまた、別のDNA分子に由来するとも考えられる。キメラ、融合、および複合という用語は、天然では、天然以外のように直接的に共有結合的に連結されているのが見出されないという意味で互いに異種の、少なくとも2つの構成要素部分を含有するタンパク質、ペプチドドメイン、もしくはヌクレオチド配列、または分子を示すのに用いられる。より具体的に述べると、これらの構成要素部分は、天然の同じ連続ポリペプチドまたは遺伝子には見出されず、少なくともキメラタンパク質または複合ドメインに存在する同じ順序もしくは配向性で、または同じ間隔では見出されない。このような物質は、少なくとも2つの異なるタンパク質もしくは遺伝子に由来するか、または同じタンパク質もしくは遺伝子の少なくとも2つの隣接しない部分に由来する構成要素を含有する。複合タンパク質、およびそれらをコードするDNA配列は、それらが、天然では、天然以外のように直接的に共有結合的に併せて連結されているのが見出されない少なくとも2つの構成部分を含有するという意味で組換えである。調節するという用語は、阻害することまたは刺激することを指す。シナプス後膜の活性化という用語は、神経筋接合部における、一般に、神経細胞から筋細胞へのシグナル伝達による刺激を指す。活性化は通常、神経筋接合部の細胞膜におけるAChRの凝集の刺激および/またはMuSKのリン酸化を包含する。活性化は、シナプス後分化の誘導を結果としてもたらす。対象に関する処置することという用語は、対象の疾患または障害の少なくとも1つの症状を改善することを指す。処置することとは、疾患または状態を治癒させることの場合もあり、それを改善することの場合もあるが、その少なくとも特定の症状を軽減することでありうる。III.治療用ビグリカンポリペプチド本明細書で開示される方法および組成物では、野生型のビグリカン治療剤を用いる場合もあり、変異体のビグリカン治療剤を用いる場合もある。このような治療剤は、例えば、形質細胞膜の完全性を維持するのに用いることができ、特に、ジストロフィン会合タンパク質複合体DAPCを安定化させるビグリカン治療剤は、これらの膜において用い、これにより膜の崩壊を防止することができる。ビグリカン治療剤はまた、シナプス後膜の分化を刺激することなどにより、神経筋接合部の形成も刺激し、より一般に、ビグリカン治療剤は、シナプス形成を刺激する。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、野生型ビグリカンポリペプチドまたはその断片である。例えば、このポリペプチドは、配列番号9の配列またはその活性部分を含みうる。一部の実施形態では、このポリペプチドが、配列番号9を含む。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、グリコサミングリカンGAG側鎖を含まない。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸38~365と少なくとも80、90、95、98、または99同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号9のアミノ酸38~365と同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、厳密な条件下で配列番号8とハイブリダイズする核酸によりコードされる。他の特定の実施形態では、ビグリカンポリペプチドがグリコサミングリカンGAG側鎖を含まないように、ビグリカンポリペプチドが、2つのセリン残基例えば、配列番号9の残基42および47におけるにおいて少なくとも2つのアミノ酸残基の置換を含む変異体のビグリカンポリペプチドなどのビグリカンポリペプチドである。例えば、変異体のビグリカンポリペプチドは、配列番号10のアミノ酸配列またはその断片を含みうる。配列番号10とは、コンセンサス配列であって、残基42および47が、各々独立に非存在の場合もあり、セリンまたはトレオニンを除く任意のアミノ酸の場合もあるコンセンサス配列である。特定の実施形態では、配列番号10の残基42および47のいずれもが存在する。特定の実施形態では、変異体のビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列またはその断片を含む。配列番号11は、配列番号9と類似するが、変異S42AおよびS47Aを包含する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号9と少なくとも80、90、95、98、もしくは99同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、2つのセリン残基が、配列番号9の残基42および47に対応する位置にある。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号11のアミノ酸配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、配列番号9における1または複数のLRRを含む。ビグリカン治療剤は、1または複数の有用な生物学的活性を有しうる。好ましい実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、ユートロフィンの細胞膜との会合を増大させる。好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、ユートロフィンのタンパク質レベルを上方制御する。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤が、ユートロフィンのmRNAレベルを上方制御しない。特定の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、細胞における筋特異的キナーゼMuSKを活性化させる。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、アグリンに誘導されるMuSKのリン酸化を強化する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、MuSKに結合する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、α-サルコグリカンおよび/またはγ-サルコグリカンに結合する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、サルコグリカンのリン酸化を誘導する。一部の実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドが、アグリンに誘導されるアセチルコリン受容体AChRのクラスター化を強化する。対象のビグリカンポリペプチドは、任意の適切な技法を用いて生成させることができる。当技術分野では、多数のこのような技法が周知である。例えば、ビグリカンをコードするDNA配列の修飾は、部位指向的変異誘発を使用して1または複数のヌクレオチドを変化させることにより達成することができる。刊行物Carterら、1986年、BiochemJ.、237巻1号:1~7頁;Sambrookら、1989年、MolecularCloning:ALaboratoryManual、2版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NYにより例示される通り、当技術分野では一般に、部位特異的変異誘発法が周知である。察知される通り、この技法では典型的に、一本鎖形態および二本鎖形態のいずれにおいて存在するファージミドベクターも使用する。代替的に、変異体は、PCR商標を用いることにより生成させることもできる。部位指向的変異誘発において有用である典型的なベクターには、M13ファージMessingら、1981年またはpUC119などのベクターが含まれる。これらのベクターは、市販品が容易に入手可能であり、それらの使用は一般に当業者に周知である。当技術分野では代替的に、二本鎖プラスミドまたはファージミドなどを使用する部位指向的変異誘発法も周知であり、これらもまた用いることができる。特定の実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、DAPCの1または複数の構成要素に結合する。好ましい実施形態では、ビグリカンポリペプチドが、適正なユートロフィンの細胞膜への局在化を促進する。ビグリカン治療剤はまた、α-サルコグリカンなど、サルコグリカンの構成要素に結合することも好ましい。なおより好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、例えば、α-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、およびδ-サルコグリカンから選択されるサルコグリカン複合体の構成要素に結合する。ビグリカンポリペプチドが結合するサルコグリカンの構成要素は、α-サルコグリカンであることが好ましい。一般に、治療用ビグリカンペプチドは、DAPCの1または複数の構成要素に接触し、例えば、これにより、複合体を安定化させ、筋ジストロフィーにおいて見られる異常など、DAPC複合体の異常から結果として生じる細胞膜の不安定化を軽減する。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤は、MuSK、α-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、およびVI型コラーゲンに結合するが、α-ジストログリカンには結合しない。ビグリカンがα-ジストログリカンに結合することが可能でない実施形態においてもなお、ビグリカンがα-ジストログリカンに間接的に影響を及ぼしうる機構がやはり存在する。以下の機構は、非結合理論と考えるべきである:1ビグリカンはVI型コラーゲンに結合し、アルファ-DGの他のリガンドを動員することが可能である;この機構は、筋肉または筋肉以外の組織において生じうること、2ビグリカンは、MuSKに結合し、したがって、間接的にα-ジストログリカンを動員しうること、および3ビグリカンは二量体化することが公知であるので、α-ジストログリカンに結合することが可能でない変異体のビグリカンは、内因性のビグリカンであるプロテオグリカンとヘテロ二量体化し、したがって、α-ジストログリカンを動員しうること。他の実施形態では、ビグリカン治療剤が、受容体チロシンキナーゼであるMuSKに結合する。このような化合物は、MuSKおよび/またはサルコグリカン複合体の構成要素、例えば、α-サルコグリカンに結合しうる。好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、MuSKを活性化させ、α-サルコグリカンおよび/またはγ-サルコグリカンのリン酸化を誘導する。対象のビグリカン治療剤は、上記で列挙した分子のうちの1または複数に特異的に結合する、すなわち、対象のビグリカン治療剤は、有意にまたは検出可能なレベルで他の分子に結合して、細胞において望ましくない効果を生成させないことが好ましい。ビグリカン治療剤は、上記で列挙した分子のうちの1または複数に、10-6M以下の解離定数で、およびなおより好ましくは10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、または10-13M以下の解離定数で結合することが好ましい。解離定数は、当技術分野で周知の方法により決定することができる。当技術分野では、ビグリカン治療剤のDAPCの構成要素またはMuSKへの結合レベルを決定するか、または、例えば、これらの分子に結合する化合物のライブラリーのメンバーを同定するための結合アッセイが公知であり、また、本明細書でもさらに記載される。また、このようなアッセイにおいて用いられるDAPCの構成要素またはMuSKを調製する方法も公知である。このような構成要素は、組織から単離することもでき、それらがタンパク質である場合は、組換えまたは合成により調製することもできる。それらのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、GenBankまたは刊行物から入手可能である。他の好ましい実施形態では、ビグリカン治療剤が、DAPCの1または複数の構成要素および/またはMuSKに結合しうることに加えて、または、その代わりに、1または複数のビグリカンの生物学的活性を示す。例えば、ビグリカン治療剤は、AChRの凝集を誘導すること、および/またはアグリンに誘導されるチロシンによるMuSKのリン酸化を刺激することを含め、神経筋接合部の形成、特に、シナプス後膜の分化を刺激しうる。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、低濃度における強化および高レベルにおける脱強化を伴う二相的な形でのアグリンに誘導されるAChRのクラスター化を強化する。場合によって、ビグリカン治療剤は、高濃度においてアグリンに誘導されるAChRのクラスター化を阻害しない。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、invivoにおいて筋損傷を軽減する。ビグリカン治療剤は、タンパク質またはその誘導体の場合もあり、ペプチド模倣剤またはその誘導体の場合もあり、核酸例えば、変異体のビグリカンポリペプチドをコードする核酸の場合もある。ペプチド模倣剤は、例えば、ビグリカンbiglyanの構造に基づいて調製することができる。一般に、ビグリカン治療剤は、要請される特徴、例えば、α-サルコグリカンおよび/またはDAPCの他の構成要素への結合を示す。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤が、以下のアミノ酸配列:IQAIEFEDL配列番号1;LGLGFNEIR配列番号2;およびTSYHGISLFNNPVNYWDVL配列番号3、またはこれらのアミノ酸配列が得られたシビレエイタンパク質の哺乳動物オーソログに由来するアミノ酸配列など、これらに関連するアミノ酸配列のうちの1または複数を含む。ビグリカン治療剤は、これらの配列の3つ全てまたはこれらに関連する配列を含有することが好ましい。例えば、ビグリカン治療剤は、ヒトビグリカンの一部である以下のアミノ酸配列:IQAIELEDL配列番号4;LGLGHNQIR配列番号5;およびAYYNGISLFNNPVPYWEVQ配列番号6のうちの1または複数を含みうる。シビレエイDAG-125を包含する組成物、およびシビレエイDAG-125を用いる方法は本開示の範囲内にあるが、好ましい組成物および方法は、本明細書ではシビレエイDAG-125のオーソログと称する、脊椎動物を含めた哺乳動物によるシビレエイDAG-125の相同体に関する組成物および方法である。シビレエイDAG-125の好ましいオーソログは、ヒトオーソログ、齧歯動物オーソログ、マウスオーソログ、イヌオーソログ、ネコオーソログ、ヒツジオーソログ、およびウシオーソログである。DAG-125の哺乳動物によるオーソログが、ビグリカンである。シビレエイDAG-125の哺乳動物による他のオーソログは、配列番号1~3のうちの1または複数をコードするヌクレオチド配列を含有するプローブを伴うスクリーニングライブラリーを介して単離することができる。シビレエイDAG-125の哺乳動物によるオーソログをクローニングするための他の多数の方法も利用可能である。例えば、シビレエイDAG-125に対する抗体を生成させ、哺乳動物による発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。クローニングされるタンパク質の、シビレエイDAG-125の哺乳動物によるオーソログとしての同定は、シビレエイDAG-125を使用する実施例において記載されているアッセイと同じ生物学的アッセイを実施することにより、確立することができる。したがって、本明細書で提示されるポリペプチドはまた、それぞれ、それらがヒアルロナンと相互作用する能力のため、またはそれらのグリコサミングリカンの種類のために、また非凝集型または低分子のデルマタン硫酸プロテオグリカンとも称する、低分子のロイシンに富むプロテオグリカンSLRPファミリーのメンバーでもありうる。SLRPは、それらのタンパク質およびゲノムの組織化に基づき、3つのクラスへと組織化される。全てのSLRPは、いずれかの側で低分子のシステインクラスターが隣接する、ロイシンリッチリピートLRRを含有する中央ドメインにより特徴づけられる。SLRPは、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Iozzoら1998年、Ann.Rev.Biochem.、67巻:609頁において記載されている。SLRPタンパク質のコアは、約35~45kDの範囲にあり、最もN末端において1つまたは2つのGAG鎖を接合させている。SLRPタンパク質コアの一般的構造は、ジスルフィド結合したシステインを保存したドメインで挟まれる、6~10のロイシンリッチリピートLRRによるタンデム配列からなる。グリコシル化の程度およびGAG鎖の数に応じて、天然の分子量は、約100~250kDの範囲にわたる。それらの配列の相同性に基づき、Iozzo、前出は、SLRPが、1ビグリカンおよびデコリン;2フィブロモジュリン、ルミカン、ケラトカン、PREPLP、およびオステオアドヘリン;ならびに3エピフィカンおよびオステオグリシンからなる3つのクラスへと群分けされることを提起している。SLRPタンパク質コアの最も説得的な特色は、LRRである。このような反復配列SLRPにおいて24アミノ酸ずつは、多種多様な細胞内文脈、膜貫通文脈、および細胞外文脈におけるタンパク質間相互作用を媒介するKobeおよびDeisenhofer1994年、TrendsBiochem.Sci.、19巻:415~21頁。例えば、trkBにおけるニューロトロフィン結合部位は、LRRであるWindischら1995年、Biochemistry、34巻:11256~63頁。反復配列は、α螺旋に続き、アンチパラレルに配列されたベータシートの一般的構造を有すると考えられるが、SLRPではこの順序が可逆化されうることを、配列解析は示唆しているHockingら1998年、MatrixBiol.、17巻:1~19頁。各反復配列の保存された残基がそれらの二次的な構造を決定する一方、介在するアミノ酸がリガンド結合の特異性を決定する可能性が高い。本明細書の方法および組成物において用いるのに適するSLRPには、ビグリカンおよびデコリンなど、クラスISLRPの変異体が含まれる。α-ジストログリカンに結合することが示された例えば、米国特許第6,864,236号を参照されたい、シビレエイプロテオグリカンであるDAG-125の部分的なアミノ酸配列は、ヒトビグリカンに対して強い相同性を示す:合計37アミノ酸長の配列中で78の同一性が見出された。齧歯動物、ブタ、およびヒトに由来するビグリカンは、>95同一である。ヒトに由来するデコリンとビグリカンとは、55だけ同一である。このような相同性は、デコリンおよびビグリカンが、共有される機能および固有の機能の両方を有することと符合する。したがって、シビレエイDAG-125は、ヒトビグリカンのアミノ酸配列により酷似するアミノ酸配列を有するが、ビグリカンとデコリンとの構造および機能の類似性に基づき、デコリンおよびその誘導体も本明細書の方法を実施するのに用いることができる。多様な種に由来するビグリカンおよびデコリンの遺伝子およびタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、GenBankなどで公表されている。例えば、ヒトビグリカンは、GenBank受託番号:J04599Fisherら1989年、J.Biol.Chem.、264巻:4571頁において記載されている、骨の低分子プロテオグリカンIビグリカンをコードするヒトhPGI;配列番号7~9、およびGenBank受託番号:M65154の下に見出すことができ;ウシビグリカンは、GenBank受託番号:L07953の下に見出すことができ;ラットビグリカンは、GenBank受託番号:U17834の下に見出すことができ、マウスビグリカンは、GenBank受託番号:L20276およびX53928の下に見出すことができ;ヒツジビグリカンは、GenBank受託番号:AF034842の下に見出すことができ;ヒトデコリンは、GenBank受託番号:M14219において見出すことができ;ウサギデコリンは、GenBank受託番号:I47020において見出すことができ;ニワトリデコリンは、GenBank受託番号:P28675において見出すことができ;ウマデコリンは、GenBank受託番号:AF038において見出すことができ;ウシデコリンは、GenBank受託番号:P21793において見出すことができ;ヒツジデコリンは、GenBank受託番号:AF125041において見出すことができ;ラットデコリンは、GenBank受託番号:Q01129において見出すことができる。ビグリカンおよびデコリンならびに他のSLRPの配列は、GenBankで見出すことができる。デコリンおよびビグリカンはそれぞれ、1つおよび2つのグリコサミングリカンGAG鎖を有する。それらの組成物は組織特異的であり、多数のレベルで制御することができるHockingら1998年、MatrixBiol、17巻:1~19頁。例えば、皮膚および軟骨に由来するビグリカンのGAGが主にデルマタン硫酸であるのに対し、骨において合成されるビグリカンは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ヘパラン硫酸側鎖は、報告されていない。タンパク質コアおよび細胞型の両方が、これらのSLRPの異なるグリコシル化に寄与する。特定の具体的な実施形態では、ビグリカン治療剤が、融合タンパク質を包含する。例えば、ビグリカンポリペプチドまたはその断片は、免疫グロブリン部分と融合させることができる。代替的に、融合タンパク質は、プロテオグリカンの2つ以上の部分の間の組合せ、例えば、デコリン分子の部分へと融合させたビグリカン分子の部分でもありうる。特定の具体的な実施形態では、ビグリカン治療剤が、ビグリカンの部分および断片を包含する。部分は、少なくとも5、10、15、または20アミノ酸長であることが典型的である。好ましい部分は、DAPCの構成要素との相互作用など、生物学的活性を及ぼすのに十分である。部分は、タンパク質の1または複数の特定のドメインを含む場合もあり、これらからなる場合もある。ビグリカンおよびデコリンのドメインは、2つのシステインに富む領域成熟ビグリカンのN末端およびC末端の40~50アミノ酸に組み入れられるおよびロイシンリッチリピートLRRを包含する。LRR領域とは、反復配列を含有し、アミノ酸81~314から本質的になるビグリカンの領域を指す。本明細書では、各個別の反復配列をLRRと称する。LRRは、タンパク質間相互作用を媒介すると考えられ、したがって、DAPCおよびシナプス後膜を安定化させるのに十分でありうる。少なくとも、ビグリカンがMuSKに結合するという観察に基づくなら、LRRは、ビグリカンのMuSKとの相互作用を媒介することに関与し、MuSKのリン酸化を媒介することに関与しうると考えられる。具体的な実施形態では、本開示は、サルコグリカンへの結合が可能なビグリカンの部分からなるビグリカン治療剤を提供する。ヒトビグリカンのα-サルコグリカン結合ドメインは、成熟ビグリカンタンパク質のN末端ドメイン、すなわち、アミノ酸38~80に位置し、より具体的に述べると、配列番号9のアミノ酸38~58に位置することが示されている。また、C末端のシステインに富むドメインがγ-サルコグリカンとの相互作用を媒介することも示されている。したがって、ビグリカン治療剤は、N末端またはC末端のシステインに富むドメイン、すなわち、配列番号9のアミノ酸38~80および315~368からなるビグリカンの部分断片を包含しうる。本明細書ではまた、特定のビグリカンドメインの組合せも開示される。例えば、ビグリカンの断片は、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、または200のアミノ酸からなりうる。ビグリカン治療剤の短鎖部分をミニビグリカン治療剤と称する。野生型のヒトビグリカンは、368アミノ酸配列番号9からなり、そのうちのアミノ酸1~19は、シグナルペプチドGenBank受託番号:NP_001702;およびFisherら、前出を構成する。したがって、シグナルペプチドを伴わない野生型のヒトビグリカンは、配列番号9のアミノ酸20~368からなる。成熟ビグリカンタンパク質は、配列番号9のアミノ酸38~368からなるが、アミノ酸1~37はプレプロペプチドなので、プロセシングにおいて切断される。アミノ酸38~80は、N末端のシステインに富む領域に対応する。ロイシンリッチリピート領域に対応するアミノ酸81~314の近傍は、約24または23アミノ酸の10回の反復配列を含有する。ヒトビグリカンをコードするcDNAにおけるオープンリーディングフレームは、配列番号7のヌクレオチド121~1227に対応し、配列番号8として表される。ビグリカンの成熟形態をコードするヌクレオチド配列は、配列番号7のヌクレオチド232~1227である。ビグリカン治療剤は、ビグリカンコアの成熟形態と関連しうる、すなわち、ビグリカンコアの2つのグリカン化されたセリンが欠失しているか、または本明細書で記載される他のアミノ酸で置換されているという条件で、シグナルペプチドが脱落している場合もあり、シグナルペプチドを伴う全長ビグリカンの場合もある。当技術分野では、化合物が野生型ビグリカンタンパク質の生物学的活性を有するかどうかを決定する方法が公知である。野生型ビグリカンタンパク質の生物学的活性とは、ユートロフィンの細胞膜への局在化を促進する能力;細胞膜の完全性を維持する能力;細胞膜におけるDAPCを安定化させる能力;DAPCの1または複数の構成要素に結合する能力;例えば、α-ジストログリカンに結合する能力、α-サルコグリカンなど、サルコグリカンの構成要素に結合する能力;α-サルコグリカンのリン酸化;MuSKへの結合;シナプス後の分化を刺激することなどにより神経筋接合部の形成を刺激する、VI型コラーゲンへの結合;AChR凝集の刺激する;MuSKのリン酸化の刺激およびアグリン誘導性MuSKのリン酸化の強化のうちの1または複数を指すことを意図する。このような方法は、上記の活性のうちの1または複数を有する化合物を同定するための、化合物のスクリーニングライブラリーにさらに適応させることができる。細胞膜の破断、例えば、漏洩膜の存在は、例えば、Tinsleyら1996年、Nature、384巻:349頁;およびStraubら1997年、J.CellBiol.、139巻:375頁において記載されている通りに、クレアチンキナーゼの放出またはEvansブルー色素の吸収を測定するアッセイにより決定することができる。ビグリカン治療剤はまた、多様な動物モデル、特に、ジストロフィン陰性であるmdxマウス例えば、米国特許第7,612,038号を参照されたいにおいても調べることができる。好ましいビグリカン治療剤は、SLRP、例えば、ビグリカン、またはそのオーソログのヌクレオチド配列と少なくとも約70、好ましくは少なくとも約80、なおより好ましくは少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、またはなおより好ましくは少なくとも約99同一なヌクレオチド配列またはその部分によりコードされる。本明細書で開示される好ましい核酸は、ビグリカンコアの2つのグリカン化されたセリンが欠失しているか、または本明細書で記載される他のアミノ酸で置換されているという条件で、SLRP、例えば、ビグリカン例えば、ヒトビグリカンをコードする配列番号7または8もしくはDAG-125またはそのオーソログ、その断片のヌクレオチド配列と少なくとも約70、好ましくは少なくとも約80、なおより好ましくは少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、およびなおより好ましくは少なくとも約99同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を包含する。一実施形態では、この核酸が、配列番号1~3または配列番号4~6もしくは9のうちの1または複数を含有するポリペプチドをコードする。本開示の別の態様は、厳密な条件下でビグリカン治療剤、例えば、配列番号1~6もしくは9のうちの1もしくは複数またはこれらの相補体を有するポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性の条件、例えば、約45°Cで6.0倍濃度の塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCの後、50°Cで2.0倍濃度のSSCによる洗浄は、当業者に公知であるか、またはCurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons、N.Y.1989年、6.3.1~6.3.6において見出すことができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、50°Cで約2.0倍濃度のSSCによる低度な厳密性乃至50°Cで約0.2倍濃度のSSCによる高度な厳密性から選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、室温である約22°Cの低度な厳密性の条件から、約65°Cの高度な厳密性の条件へと上昇させることができる。温度および塩の両方を変化させることもでき、温度または塩濃度を一定に保ちながら、他の変数を変えることもできる。好ましい実施形態では、ビグリカンポリペプチドをコードする核酸が、中程度に厳密な条件下で、例えば、約2.0倍濃度のSSCおよび約40°Cで、配列番号1~6のうちの1つもしくはその相補体をコードする核酸、またはSLRPをコードする核酸に結合する。特に好ましい実施形態では、本開示による核酸は、高度な厳密性の条件下で、配列番号7もしくは8またはその相補体を有する核酸など、配列番号1~6または9のうちの1つをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズする。当技術分野では、本明細書で開示されるポリペプチドおよび核酸を調製する多様な方法が周知である。例えば、ポリペプチドまたは核酸を組織から単離することもでき、化合物を組換えまたは合成により生成させることもできる。組織から単離されたタンパク質は、好ましくは少なくとも約70、好ましくは少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、および最も好ましくは、少なくとも約99の純度である。したがって、好ましいポリペプチドは、そこからポリペプチドを抽出した物質のうちの約1未満、および、なおより好ましくは約0.1未満を含有する。治療用ビグリカンポリペプチドはまた、組換えにより生成させることもできる。典型的には、タンパク質をコードする遺伝子をプラスミドまたはベクターへと挿入し、次いで、結果として得られる構築物を適切な細胞へとトランスフェクトし、次いで、ここで、タンパク質を発現させ、最終的にここからタンパク質を精製する。ビグリカンを生成させ、これを精製する方法は、MercadoらBiglycanregulatestheexpressionandsarcolemmallocalizationofdystrobrevin,syntrophin,andnNOS、FasebJ.、2006年において論じられている。ビグリカンポリペプチドはまた、実施例12の方法により精製することもできる。一部の実施形態では、実施例12の方法を、さらなる精製ステップと組み合わせる。これらのステップでは、例えば、イオン交換樹脂を使用する。したがって、本開示はさらに、開示されるタンパク質を生成させる方法にも関する。例えば、対象のタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、タンパク質を発現させるのに適切な条件下で培養することができる。タンパク質は、分泌シグナル配列を組み入れることにより分泌させることができ、タンパク質を含有する細胞と培地との混合物から単離することができる。代替的に、タンパク質を細胞質内に保持し、細胞を採取し、溶解させ、タンパク質を単離することもできる。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および典型的に細胞副産物を包含する。当技術分野では、細胞の培養に適する培地が周知である。タンパク質は、細胞培養培地から単離することもでき、宿主細胞から単離することもでき、これらのいずれから単離することもできる。当技術分野では、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびタンパク質の特定のエピトープに特異的な抗体によるイムノアフィニティー精製を含めた、タンパク質を精製する技法が公知である。したがって、治療用ビグリカンポリペプチドのコード配列は、微生物細胞過程または真核細胞過程を介してタンパク質の組換え形態を生成させるのに用いることができる。ポリヌクレオチド配列を発現ベクターなどの遺伝子構築物へとライゲーションし、真核生物酵母、鳥類、昆虫、または哺乳動物または原核生物細菌細胞である宿主へと形質転換またはトランスフェクトすることは、標準的な手順である。組換えタンパク質を生成させるための発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、本融合タンパク質を発現させるのに適するベクターには、以下の種類のプラスミド:pBR322に由来するプラスミド、pEMBLに由来するプラスミド、pEXに由来するプラスミド、pBTacに由来するプラスミド、およびE.coliなどの原核細胞において発現させるためのpUCに由来するプラスミドが含まれる。酵母において組換えタンパク質を発現させるための多数のベクターが存在する。例えば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、遺伝子構築物をS.cerevisiaeへと導入するときに有用なクローニング媒体および発現媒体である例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Broachら1983年、ExperimentalManipulationofGeneExpression、M.Inouye編、AcademicPress、83頁を参照されたい。これらのベクターは、pBR322oriの存在によりE.coliで複製することができ、酵母2ミクロンプラスミドの複製決定因子により、S.cerevisiaeで複製することができる。加えて、アンピシリンなどの薬物耐性マーカーも用いることができる。タンパク質は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞バキュロウイルス系でも生成させることができ、原核細胞でも生成させることができる。ビグリカン治療剤を生成させるのに用いうる細胞は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化またはスルホン化を触媒する酵素のレベルおよび/または活性を上昇させるようにさらに改変することもできる。例えば、細胞を、スルホトランスフェラーゼ、例えば、コンドロイチンスルホトランスフェラーゼ、例えば、コンドロイチン-6-スルホトランスフェラーゼC6ST;Fukutaら1995年、J.Biol.Chem.、270巻:18575頁、またはNastukら1998年、J.Neuroscience、18巻:7167頁において記載されている神経系に関与するスルホトランスフェラーゼNSISTをコードする発現構築物で形質転換または共トランスフェクトすることができる。好ましい実施形態では、ビグリカンまたはユートロフィンなど、本明細書で記載される組換えタンパク質を、共免疫沈降研究および結合研究を容易とする、エピトープタグしたタンパク質として生成させる。例えば、本明細書で記載されるタンパク質は、牛痘ウイルス/T7バクテリオファージ発現系を用いて、真核細胞により生成させることができる。ビグリカンポリペプチド、例えば、成熟ビグリカンタンパク質をコードする組換え牛痘ウイルスであるvBGN4は、T7ファージプロモーターの制御下でポリヒスチジン融合タンパク質として発現させることができ、例えば、Hockingら1996年、JBiolChem、271巻:19571~7頁において記載されている通り、HT-1080細胞およびUMR106細胞により発現させることができる。不死化細胞系、例えば、ビグリカン陰性細胞系などの筋細胞系は、Jatら、PNAS1991年、88巻:5096~100頁;Nobleら1992年、BrainPathology、2巻:39~46頁において記載されている通りに得ることができる。一実施形態では、H-2Kb/tsA58トランスジェニックマウスを用いる。このマウスは、インターフェロン誘導性プロモーターこのマウスは、CharlesRiverで入手可能であるの制御下にある熱不安定性の不死化遺伝子SV40ラージT抗原のtsA58変異体を保有するヘテロ接合体である。この遺伝子を含有する細胞を培養すると、それらは、33°C、インターフェロンの存在下で無際限に増殖する。しかし、温度を39°Cへと上げこの温度では、tsA58抗原が非機能的となる、インターフェロンを除去すると、細胞は分裂を停止する。この方法は、星状細胞、破骨細胞、小柱網、および結腸上皮細胞を含めた多種多様な細胞型を成長させるのに用いられているChambersら1993年、PNAS、90巻:5578~82頁;Grovesら1993年、Dev.Biol.、159巻:87~104頁;Whiteheadら1993年、PNAS、90巻:587~91頁;Nobleら1995年、TransgenicRes.、4巻:215~25頁;Tammら1999年、Invest.Ophtamol.Vis.Sci.、40巻:1392~403頁。この技法は、筋細胞系を生成させるのに十分に適する。例えば、1つの研究だけで、65例の個別の筋細胞系が、新生仔~4週齢の範囲の動物から派生しているMorganら1994年、Dev.Biol.、162巻、486~98頁。これらの細胞系は、最大80世代にわたり維持された。注目すべきは、これらの細胞系が、培養物中で非許容条件へとシフトさせた場合に限り筋管を形成したのではなく、また、宿主マウスへと植え込んだ場合にも筋肉を形成したことである。H-2Kb/tsA58トランスジェニック法はまた、D.Glassらによっても用いられてMuSK-/-筋細胞系を生成させたSugiyamaら1997年、J.CellBiol.、139巻:181~91頁。条件付きの不死化細胞系を生成させるために、特定の変異を有するマウス、例えば、ビグリカンまたはMuSKが欠損するマウスを、ヘテロ接合体のH-2Kb/tsA58トランスジェニックマウスと交配させることができる。完全な活性に要請される遺伝子のコピーは1つだけなので、この交配は、単純である。次いで、新生仔動物に由来する筋細胞を播種し、許容条件下で33°Cで、インターフェロンを伴う成長させることができる。次いで、増殖する細胞をクローニングし、各系列に由来する試料を非許容温度へと移し、それらが筋管を形成する能力について調べることができる。野生型;デコリン-/-;ビグリカン-/o;およびデコリン-/-ビグリカン-/oの細胞系は、この技法を用いて得ることが可能な細胞系の例である。ビグリカン治療剤で対象を処置する特定の方法は、本明細書で記載されるタンパク質の対象への投与を含む。しかし、タンパク質はまた、対象おいて遺伝子治療法を介して生成させることもできる。したがって、例えば、ベクターが筋細胞に侵入し、そこで発現することが可能であるように、対象の筋内に、治療用ビグリカンタンパク質をコードするベクターの注射を施すことができる例えば、対象が筋ジストロフィーを有する場合。代替的に、ベクターはウイルスベクターであることも可能であり、これがウイルスカプシドと共に施されるとウイルスは細胞、例えば、筋細胞に感染し、これによりベクターを送達する。当技術分野では、遺伝子治療のための方法およびベクターが周知である。例示的な方法を以下に示す。好ましい哺乳動物用発現ベクターは、細菌におけるベクターの伝搬を容易にするための原核細胞の配列、および真核細胞内で発現する1または複数の真核細胞の転写単位の両方を含有する。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo、およびpHygに由来するベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適する哺乳動物用発現ベクターの例である。これらのベクターの一部を、原核細胞および真核細胞のいずれにおいても、複製および薬物耐性による選択を容易にする、pBR322などの細菌プラスミドに由来する配列により改変する。代替的に、ウシパピローマウイルスBPV-1またはエプスタイン-バーウイルスpHEBo、pREPに由来するベクター、およびp205など、ウイルスの派生体も、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現に用いることができる。他のウイルスレトロウイルスを含めた発現系の例は、以下の遺伝子治療用送達系についての記載において見出すことができる。当技術分野では、プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される多様な方法が周知である。原核細胞および真核細胞の両方ならびに遺伝子組換え手順に適する他の発現系については、MolecularCloning:ALaboratoryManual、2版、Sambrook、Fritsch、およびManiatis編ColdSpringHarborLaboratoryPress、1989年、16および17章を参照されたい。場合によっては、バキュロウイルス発現系を用いることにより組換え融合タンパク質を発現させることも所望でありうる。このようなバキュロウイルス発現系の例には、pVLに由来するベクターpVL1392、pVL1393、およびpVL941など、pAcUWに由来するベクターpAcUW1など、およびpBlueBacに由来するベクターpBlueBacIIIを含有するβ-galなどが含まれる。さらに他の実施形態では、対象遺伝子を、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルス1を含めたウイルスベクター、または組換え細菌プラスミドもしくは真核生物プラスミドへと挿入することにより、対象の発現構築物を派生させることができる。下記でより詳細に記載する通り、対象の発現構築物についてのこのような実施形態は、invivoおよびexvivoにおける多様な遺伝子治療プロトコールにおける使用がとりわけ想定される。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般に、invivoにおいて外因性遺伝子を特にヒトへと導入するのに最適な組換え遺伝子送達系であると理解される。これらのベクターは、遺伝子の細胞への効率的な送達をもたらし、導入された核酸は、宿主の染色体DNAに安定的に組み込まれる。レトロウイルスを用いるための主要な要件は、特に、細胞集団における野生型ウイルス拡大の可能性に関するそれらの使用の安全性を確保することである。複製欠損のレトロウイルスだけを生成させる特化した細胞系パッケージング細胞と称するの開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大させており、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とする遺伝子導入における使用について十分に特徴づけられている総説については、Miller,A.D.1990年、Blood、76巻:271頁を参照されたい。したがって、レトロウイルスのコード配列の一部gag、pol、envを、ビグリカンタンパク質をコードする核酸で置換して、レトロウイルスを複製欠損とした組換えレトロウイルスを構築することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスをビリオンへとパッケージングし、これを、標準的技法により、ヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞に感染させるのに用いることができる。組換えレトロウイルスを生成させ、invitroまたはinvivoにおいて、このようなウイルスを細胞に感染させるためのプロトコールは、CurrentProtocolsinMolecularBiology、Ausubel,F.M.ら編、GreenePublishingAssociates1989年、9.10~9.14節、および他の標準的な実験室用マニュアルにおいて見出すことができる。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知のpLJ、pZIP、pWE、およびpEMが含まれる。同種指向性のレトロウイルス系および両種指向性のレトロウイルス系のいずれを調製するのにも適するパッケージングウイルス系列の例には、CRIP、Cre、Ψ2、およびAmが含まれる。レトロウイルスは、invitroおよび/またはinvivoにおいて、多様な遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含めた多くの異なる細胞型へと導入するのに用いられてきた例えばEglitisら1985年、Science、230巻:1395~1398頁;DanosおよびMulligan1988年、PNASUSA、85巻:6460~6464頁;Wilsonら1988年、PNASUSA、85巻:3014~3018頁;Armentanoら1990年、PNASUSA、87巻:6141~6145頁;Huberら1991年、PNASUSA、88巻:8039~8043頁;Ferryら1991年、PNASUSA、88巻:8377~8381頁;Chowdhuryら1991年、Science、254巻:1802~1805頁;vanBeusechemら1992年、PNASUSA、89巻:7640~7644頁;Kayら1992年、HumanGeneTherapy、3巻:641~647頁;Daiら1992年、PNASUSA、89巻:10892~10895頁;Hwuら1993年、J.Immunol.、150巻:4104~4115頁;米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願第WO89/07136号;PCT出願第WO89/02468号;PCT出願第WO89/05345号;ならびにPCT出願第WO92/07573号を参照されたい。さらに、ウイルス粒子表面におけるウイルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウイルスの感染スペクトルを制限し、結果として、レトロウイルスベースのベクターの感染スペクトルを制限することが可能なことが示されている例えば、PCT公開第WO93/25234号、同第WO94/06920号、および同第WO94/11524号を参照されたい。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルを修飾するための戦略には、細胞表面抗原に特異的な抗体の、ウイルスのenvタンパク質への連結Rouxら1989年、PNASUSA、86巻:9079~9083頁;Julanら1992年、J.GenVirol、73巻:3251~3255頁;およびGoudら1983年、Virology、163巻:251~254頁;細胞表面リガンドの、ウイルスのenvタンパク質への連結Nedaら1991年、J.Biol.Chem.、266巻:14143~14146頁が含まれる。連結は、タンパク質または他の分子種例えば、envタンパク質をアシアロ糖タンパク質へと転換するラクトースによる化学的架橋形成の形態でありうるほか、融合タンパク質例えば、単鎖抗体/env融合タンパク質を生成させることを介する場合もある。この技法は、感染を特定の組織型に制限するかまたは他の形で方向付けるのに有用であるが、また、同種指向性ベクターを両種指向性ベクターへと転換するのにも用いることができる。別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルスに由来するベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムは、対象の遺伝子産物はコードするが、通常の溶解性ウイルスの生活環におけるその複製能力の点では不活化されるように操作することができる例えば、Berknerら1988年、BioTechniques、6巻:616頁;Rosenfeldら1991年、Science、252巻:431~434頁;およびRosenfeldら1992年、Cell、68巻:143~155頁を参照されたい。アデノウイルス株のAd型5dl324またはアデノウイルスの他の株例えば、Ad2、Ad3、Ad7などに由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。特定の状況において、組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染することが可能でなく、気道上皮Rosenfeldら1992年、前出、内皮細胞Lemarchandら1992年、PNASUSA、89巻:6482~6486頁、肝細胞HerzおよびGerard1993年、PNASUSA、90巻:2812~2816頁、および筋細胞Quantinら1992年、PNASUSA、89巻:2581~2584頁を含めた、多種多様な細胞型に感染させるのに用いうるという点で有利でありうる。さらに、これらのウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮に適し、上記の通り、感染性のスペクトルに影響を及ぼすように改変することができる。加えて、導入されるアデノウイルスDNAおよびそこに含有される外来のDNAは、宿主細胞のゲノムへは組み込まれず、エピソームにとどまり、これにより、導入されたDNA例えば、レトロウイルスDNAが宿主ゲノムに組み込まれる状況において、挿入による変異誘発の結果として生じうる潜在的な問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの外来のDNAに対する保有用量は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい最大で8キロ塩基Berknerら、前出;Haj-AhmandおよびGraham1986年、J.Virol.、57巻:267頁。現在用いられており、したがって、本明細書で記載される方法において用いるのにも好適な、最も複製欠損性が大きなアデノウイルスベクターは、ウイルスのE1遺伝子およびE3遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルスの遺伝子物質のうちの80も保持している例えば、Jonesら1979年、Cell、16巻:683頁;Berknerら、前出;およびGrahamら、MethodsinMolecularBiology、E.J.Murray編Humana、Clifton、NJ、1991年、7巻、109~127頁を参照されたい。挿入されるキメラ遺伝子の発現は、例えば、E1Aプロモーター、主要後期プロモーターMLP、および関連するリーダー配列、ウイルスのE3プロモーター、または外因的に付加されたプロモーター配列の制御下でありうる。本明細書で開示される遺伝子を送達するのに有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルスAAVである。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを要請する、自然発生の欠損ウイルスである総説については、Muzyczkaら、Curr.TopicsinMicro.andImmunol.1992年、158巻:97~129頁を参照されたい。アデノ随伴ウイルスはまた、そのDNAを非分裂細胞へと組み込むことが可能であり、高頻度の安定的な組込みを呈示しうる少数のウイルスのうちの1つでもある例えば、Flotteら1992年、Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.、7巻:349~356頁;Samulskiら1989年、J.Virol.、63巻:3822~3828頁;およびMcLaughlinら1989年、J.Virol.、62巻:1963~1973頁を参照されたい。300塩基対を含有するに過ぎないAAVのベクターは、パッケージングおよび組込みが可能である。外因性DNAのための空間は、約4.5kbに制限される。Tratschinら1985年、Mol.Cell.Biol.、5巻:3251~3260頁において記載されているAAVベクターなどのAAVベクターは、DNAを細胞へと導入するのに用いることができる。AAVベクターを用いて、多様な核酸が、異なる細胞型へと導入されている例えばHermonatら1984年、PNASUSA、81巻:6466~6470頁;Tratschinら1985年、Mol.Cell.Biol.、4巻:2072~2081頁;Wondisfordら1988年、Mol.Endocrinol.、2巻:32~39頁;Tratschinら1984年、J.Virol.、51巻:611~619頁;およびFlotteら1993年、J.Biol.Chem.、268巻:3781~3790頁を参照されたい。遺伝子治療において適用されうる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス、および複数のRNAウイルスに由来している。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼組織の細胞において組換え遺伝子を存続させるための固有の戦略をもたらしうるPeposeら1994年、InvestOphthalmolVisSci、35巻:2662~2666頁。動物の組織において治療用ビグリカンタンパク質を発現させるには、上記で例示した導入法などのウイルス導入法に加えてまた、非ウイルス的方法も使用されうる。大半の非ウイルス的遺伝子導入法は、哺乳動物細胞により用いられる、高分子の取込みおよび細胞内輸送のための通常の機構に依拠する。特定の実施形態では、非ウイルス遺伝子送達系が、標的とされた細胞が遺伝子を取り込むためのエンドサイトーシス経路に依拠する。この種類の例示的な遺伝子送達系には、リポソーム誘導系、ポリリシンコンジュゲート、および人工のウイルスエンベロープが含まれる。代表的な実施形態では、対象のタンパク質をコードする遺伝子を、それらの表面に正の電荷を保有し、場合によって標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けされたリポソーム例えば、リポフェクチンに封入することができるMizunoら1992年、NoShinkeiGeka、20巻:547~551頁;PCT公開第WO91/06309号;日本特許出願第1047381号;および欧州特許公開第EP-A-43075号。例えば、筋細胞、神経細胞、または心細胞に対するリポフェクションは、特異的な組織会合抗原に対するモノクローナル抗体でタグ付けされたリポソームを用いて実行することができるMizunoら1992年、Neurol.Med.Chir.、32巻:873~876頁。さらに別の例示的な実施形態では、遺伝子送達系が、ポリリシンなどの遺伝子結合剤により架橋される抗体または細胞表面リガンドを含む例えば、PCT公開第WO93/04701号、同第WO92/22635号、同第WO92/20316号、同第WO92/19749号、および同第WO92/06180号を参照されたい。例えば、ポリカチオン、例えば、ポリリシンへとコンジュゲートした抗体を含む可溶性のポリヌクレオチド担体を用いて、invivoにおいて特殊な細胞にトランスフェクトするのに、対象遺伝子構築物のうちのいずれかを用いることができる米国特許第5,166,320号を参照されたい。また、エンドソーム構造からの遺伝子の逸出を増強する薬剤を用いて、エンドサイトーシスを介する対象の核酸構築物の有効な送達を改善しうることも察知されるであろう。例えば、全アデノウイルスまたはインフルエンザHA遺伝子産物の融合性ペプチドを、DNAを含有するエンドソームの効率的な崩壊を誘導する送達系の一部として用いることができるMulliganら1993年、Science260~926頁;Wagnerら1992年、PNASUSA、89巻:7934頁;およびChristianoら1993年、PNASUSA、90巻:2122頁。例えば、米国特許第5,679,647号およびCarsonらによる関連の特許、WO90/11092、ならびにFelgnerら1990年、Science、247巻:1465頁において記載されている通りに、ビグリカンポリペプチドをコードする核酸はまた、ネイキッドDNAとしても対象に投与することができる。臨床状況では、遺伝子送達系を、多数の方法のうちのいずれかにより患者へと導入することができる。例えば、遺伝子送達系による医薬調製物は、例えば、静脈内注射を介して全身に導入することができ、標的細胞への構築物の特異的な形質導入は、主に、遺伝子送達媒体、遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型または組織型の発現、またはこれらの組合せによりもたらされるトランスフェクションの特異性から生じる。他の実施形態では、動物への導入が極めて局在化されているので、組換え遺伝子の初回送達はいっそう制限される。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルを介して米国特許第5,328,470号を参照されたい導入することもでき、定位注射を介して例えば、Chenら1994年、PNASUSA、91巻:3054~3057頁導入することもできる。治療用ビグリカンペプチドをコードする遺伝子は、構成的プロモーターの制御下に置くこともでき、誘導的プロモーターの制御下に置くこともできる。当技術分野では、これらが周知である。IV.ユートロフィンタンパク質およびユートロフィン転写物ユートロフィンとは、発生しつつある筋肉において高レベルで発現するジストロフィンの相同体である。ユートロフィンは、成体筋の神経筋接合部近傍に局在化するが、ジストロフィンの非存在下においてすなわち、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ユートロフィンはまた、筋鞘の細胞質面上にも配置される。トランスジェニック体でユートロフィンを過剰発現させると、ジストロフィン欠損mdxマウスにおけるジストロフィー性病態がレスキューされ、これにおける機能が回復される5~7。成熟筋では、ユートロフィンの発現が、神経筋および筋腱間接合部に制約される。しかし、発生しつつある筋肉および再生しつつある筋肉では、ユートロフィンが、筋線維全体にわたり発現する8~10。ヒトユートロフィンは、C末端のシステインに富む領域が高度に保存された、3433アミノ酸のタンパク質である。ユートロフィンは、WWドメイン、EFハンド、およびZZドメインを含有するHniaKら、ZZdomainofdystrophinandutrophin:topologyandmappingofabeta-dystroglycaninteractionsite、BiochemJ.、2007年2月1日;401巻3号:667~77頁。WWドメインは、2つの保存されたトリプトファン残基を含有するタンパク質間相互作用ドメインである。ZZドメインは、予測される亜鉛フィンガーモチーフを含む。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドがヒトユートロフィンである。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13またはその活性断片を含む。一部の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、配列番号13に対して少なくとも80、90、95、97、99の同一性を有する配列またはその活性断片を含む。特定の実施形態では、ユートロフィンポリペプチドが、無傷のZZドメイン、および無傷のEFハンドドメイン、および/または無傷のWWドメインを有する。ユートロフィンのヒトmRNA配列を配列番号12として示し、ヒトユートロフィンのポリペプチド配列を配列番号13として示す。配列番号12および13はまた、GenBank受託番号:X69086.12008年10月7日の下にも見出すことができる。ヒトユートロフィンの配列はまた、受託番号:CAA488292008年10月7日の下にも見出すことができる。ヒトユートロフィンをコードするゲノムDNA配列はまた、公表されているデータベース、例えば、EntrezGeneの第6染色体の位置6q24遺伝子座タグ:RP11-352E13.1においても入手可能である。当業者は、モデル生物のユートロフィン配列を容易に決定することができる。公表されているデータベースでは、複数のモデル生物のユートロフィン配列が入手可能である。例えば、Musmusculusのユートロフィン配列は、受託番号:NP_035812の下に入手可能である。当業者は、本明細書における開示を最新技術と組み合わせて用いて、患者がユートロフィンを欠損しているかどうかを決定することができる。まず、ユートロフィンのmRNAレベルまたはタンパク質レベルを決定することができる。例えば、ユートロフィンのmRNAレベルは、定量的逆転写酵素PCR、マイクロアレイ、ドットブロット、またはサザンブロットにより測定することができる。本明細書では、ユートロフィンのmRNA配列を配列番号12として提示するが、当業者は、この配列に対するプライマーまたはプローブを容易にデザインすることができる。加えて、ユートロフィンのタンパク質レベルも、ウェスタンブロット、ELISA、またはタンパク質マイクロアレイを介して測定することができる。ユートロフィン抗体は、例えば、MercadoMLら2006年、Biglycanregulatestheexpressionandsarcolemmallocalizationofdystrobrevin,syntrophin,andnNOS、FASEBにおいて記載されている通りに入手可能である。他のユートロフィン抗体も作製することができ、当技術分野では、抗体を作製する多数の技法が公知である。ユートロフィンのmRNAレベルおよびタンパク質レベルを決定する方法については、実施例4で論じる。加えて、患者におけるユートロフィン遺伝子のDNA配列を決定して、変異を同定することもできる。例えば、サンガーによる配列決定法、ダイターミネーター法、大規模並列処理特徴配列決定法、454パイロシークエンシング、IlluminaSolexa配列決定法、およびSOLiD配列決定法などの多様なハイスループット配列決定法を用いることができる。また、例えば、公知のユートロフィンのSNP、欠失、または挿入を含有するプローブを用いて、ハイブリダイゼーション法を介してDNA配列をアッセイすることもできる。また、公知のユートロフィンのSNP、欠失、または挿入で終止するプライマーを用いるプライマー伸長法も用いることができる。一部の実施形態では、ユートロフィンの欠損についてのアッセイが、患者がユートロフィン遺伝子座において既に公知の特異的な損傷を有するかどうかをアッセイするステップを包含する。ユートロフィン遺伝子座における例示的な遺伝子損傷は、TabetACらMolecularcharacterizationofadenovo6q24.2q25.3duplicationinterruptingUTRNinapatientwitharthrogryposis、AmJMedGenetA.、2010年7月;152A巻7号:1781~8頁において開示されている。ユートロフィンの機能性についての複数のアッセイが公知である。例えば、ユートロフィンを、ジストログリカンへの結合についてアッセイすることができる。別のユートロフィンについての機能的アッセイは、シントロフィンタンパク質を介する、ユートロフィンのNav1.5との会合について検討するAlbesaMら、RegulationofthecardiacsodiumchannelNav1.5byutrophinindystrophin-deficientmice、CardiovascRes.、2010年11月3日、[印字版に先行するEpub版]。加えて、ユートロフィンは、細胞極性制御キナーゼであるPAR-1bへの結合についてもアッセイすることができるYamashitaKら、The8thand9thtandemspectrin-likerepeatsofutrophincooperativelyformafunctionalunittointeractwithpolarity-regulatingkinasePAR-1b、BiochemBiophysResCommun.、2010年1月1日;391巻1号:812~7頁。VI.処置法本開示は、筋障害、神経筋障害、神経障害、およびVI型コラーゲン関連障害を含めた障害を処置するための治療法および予防法を提供する。治療法は、疾患または障害の少なくとも1つの症状を消失させるかまたは少なくとも軽減し、好ましくは疾患または障害を治癒させることを意図する。予防法には、疾患または障害の出現を防止することを意図する方法、すなわち、疾患または障害の出現に対して効力を及ぼすことを意図する方法が含まれる。野生型ビグリカンは、α-ジストログリカンおよびサルコグリカンsarocoglycansに結合し、これにより、DAPCの多様な構成要素の間のリンクとして機能することが示された。さらに、ビグリカンレベルは、ジストロフィンを欠くマウス筋ジストロフィーのモデルであるmdxマウスの筋細胞において高いことも見出された。筋細胞におけるジストロフィンの非存在は、細胞膜を不安定化させることが公知であるので、ジストロフィン陰性の筋細胞におけるビグリカンの上方制御は、ジストロフィンの非存在に対する補償機構でありうる。したがって、特定の実施形態では、本開示は、細胞膜の不安定性または組織化、特に、細胞膜におけるDAPCの異常から結果として生じる不安定性と関連する疾患または障害を防止および処置する方法を提供する。DAPCは筋細胞膜において見出されるので、本明細書の方法を用いて処置しうる疾患には、筋ジストロフィーおよび筋萎縮などの筋疾患が含まれる。この点で、筋ジストロフィーを処置し、潜在的に治癒させる1つの有望な方途は、ユートロフィンの発現の制御に基づく内因性補償機構の活性化である。ユートロフィンは、多数の構造的特性および機能的特性をジストロフィンと共有するジストロフィンの相同体である。しかし、正常な筋肉およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋肉のいずれにおいても、ユートロフィンは、筋膜のある画分:神経筋接合部および筋腱間接合部だけで発現する。膜のバルクは、ユートロフィンを有さない。しかし、動物モデルでは、ジストロフィンを欠く筋肉においてユートロフィンの発現を強制すると、筋膜におけるDAPCの回復およびジストロフィー性表現型のレスキューがもたらされることが示されている。ユートロフィン遺伝子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において正常であることが多いので、筋肉においてその発現を活性化し、かつ/または筋膜をその標的とする方法であれば、DAPCを膜へと戻し、したがって、筋細胞の健康を促進することに用いられうるであろう。逆に、ユートロフィンの発現が完全に破壊された患者では、ビグリカン療法が有効であるとは期待されない。しかし、活性ユートロフィンのレベルが異常に低い患者でも、ビグリカン療法は、ユートロフィンレベルを増大させ、かつ/またはその局在化を正常化することにより、有効でありうる。さらに、一部の実施形態では、患者のユートロフィンレベルが低いことを示す試験により、この患者をビグリカン治療剤とユートロフィン治療剤との組合せで処置すべきことも示されている。それらのうちの多くが本発明者らによりなされた観察から生じる複数系列の証拠は、低分子のロイシンリッチリピートによるプロテオグリカンであるビグリカンであれば、ユートロフィンの発現および局在化を制御する方法において用いうることを示す。タンパク質であるアグリンは、ユートロフィン発現の上方制御を引き起こし、それを、細胞表面における特定のドメインに局在化するように方向付けうることが裏付けられている。アグリンのシグナル伝達受容体は、受容体チロシンキナーゼであるMuSKである。アグリンはまた、培養された筋管におけるα-サルコグリカンおよびγ-サルコグリカンのチロシンのリン酸化も誘導しうることが観察されている。ビグリカンはまた、α-サルコグリカンおよびγ-サルコグリカンのチロシンのリン酸化を制御しうることも観察された。さらに、受容体チロシンキナーゼであるMuSKは、これらのタンパク質の、このビグリカンに誘導されるチロシンのリン酸化にも要請される。さらに、ビグリカンは、MuSKにも結合しうる。これらの観察は、ビグリカンが、直接的に作用して、筋細胞表面におけるユートロフィンを含めたDAPCを組織化しうることを示す。したがって、本出願は、ユートロフィンを上方制御し、ユートロフィンの局在化を正常化し、MuSKを活性化し、かつ/またはサルコグリカンのリン酸化を誘導するビグリカン治療剤によるこれらの障害の処置を提供する。例示だけを目的として述べると、ビグリカン治療剤例えば、ポリペプチド、ペプチド、またはペプチド模倣剤は、筋ジストロフィー、筋萎縮、または他の状態を伴う患者へと送達して、内因性のユートロフィン遺伝子の発現を上方制御し、かつ/またはユートロフィンの筋膜への局在化を促進することができる。このような実施形態では、治療用ビグリカンポリペプチドを、ポリペプチドの形態またはそれ自体で送達することもでき、例えば、ヒト化抗体配列または類似する担体実体へと融合させた融合タンパク質の一部として送達することもできる。治療用ビグリカンポリペプチドは、プラスミドDNA、ウイルスベクター、または治療用ビグリカンポリペプチドをコードする核酸配列を患者へと導入する他のモダリティーを含めた核酸ベースの方法を介して送達することができる。ビグリカン治療剤の送達は、ユートロフィンの発現の増大および筋細胞表面への局在化の制御を方向付け、同時に、ジストロフィン会合タンパク質複合体の残余部分を回復させることにより、筋線維を内部から癒すのに用いられうる。さらに、DAPCはまた他の細胞型においても見出されるので、本開示はまた、任意のDAPCの異常と関連する疾患を処置する方法も提供する。例えば、DAPCは脳に存在し、加えて、アグリンがアルツハイマー病を伴う患者の老人斑において見出されているので、本明細書で記載される方法により、神経疾患もまた処置または防止することができる。さらに、本明細書で記載される方法により神経障害を処置または防止しうるという適応は、筋ジストロフィーを伴う患者はまた、末梢神経系および中枢神経系の障害を患うことも多いという観察に基づく。したがって、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者のうちの約3分の1は、精神障害、特に、精神遅滞を有する。したがって、ジストロフィンは、神経系において役割を果たすと考えられ、よって、DAPCも、神経系において役割を果たすと考えられる。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを伴う患者はまた、横隔膜問題も有することから、横隔膜におけるジストロフィンの役割が示され、おそらくはDAPCの役割も示される。したがって、本明細書で記載される組成物および方法はまた、横隔膜の異常と関連する障害においても適用される。本出願は、ビグリカンに対する患者の応答を予測する方法であって、患者がいくつかの疾患のうちの1または複数を有する方法を開示する。このような疾患には、ビグリカンが異常である疾患だけでなく、より一般に、ビグリカンにより改善しうるかまたは治癒させうる欠陥と関連する任意の疾患または状態も含まれる。特に、ビグリカン治療剤が少なくとも部分的に、欠損した構成要素から結果として生じる欠陥を治癒させうるという条件で、疾患は、DAPCの任意の構成要素またはこれと会合した構成要素における欠陥または異常であって、これにより、例えば、細胞膜の不安定を結果としてもたらす欠陥または異常を特徴としうる。特に、疾患には、ビグリカン治療剤の存在によりより安定とされうるDAPCの不安定と関連する任意の疾患が含まれる。さらに、ビグリカンは、神経筋接合部の形成、特に、アグリンに誘導されるシナプス後膜の分化に対する刺激を媒介することで公知の受容体であるMuSKに結合し、これをリン酸化して、アグリンに誘導されるAChRの凝集を強化し、ビグリカン陰性マウスの筋管におけるアグリンに誘導されるAChRの凝集の欠損を、筋管へのその付加を介して是正することが示されたので、本開示はまた、神経筋障害など、神経筋接合部の疾患または障害に関する方法も提供する。例えば、これらの疾患は、本明細書で開示されるビグリカンによる組合せ治療剤のうちの1つで処置することができる。加えて、ユートロフィンについてのアッセイを用いて、患者が、神経筋障害など、神経筋接合部の疾患または障害のためのビグリカン療法に応答するかどうかを決定することもできる。A.例示的な疾患および障害本明細書の組成物および方法は、多種多様なビグリカン関連障害に用いることができる。特に、本明細書の方法を用いて、ビグリカン療法に対する患者の応答を予測することができるが、この場合、患者は、ビグリカン療法で処置可能な任意の適切な疾患を有する。本明細書では、筋ジストロフィーおよび運動ニューロン病を含めた、このような疾患の多数の例が提示される。特定の細胞型の細胞膜の不安定化または不適正な組織化を特徴とする疾患または障害には、神経系病変を伴わない筋力低下および筋萎縮を特徴とする遺伝子変性ミオパシーの群である、筋ジストロフィーMDが含まれる。3つの主要な種類は、偽肥大性デュシェンヌ型、ベッカー型MD、肢帯型MD、および顔面肩甲上腕型MDである。例えば、筋ジストロフィーおよび筋萎縮は、筋細胞膜の破断を特徴とする、すなわち、筋ジストロフィーおよび筋萎縮は、DAPCの構成要素、すなわち、ジストロフィンにおける変異から結果として生じると考えられる漏洩膜を特徴とする。また、サルコグリカンの変異も、筋ジストロフィーおよび漏洩膜を結果としてもたらすことが公知である。したがって、本開示は、ジストロフィンおよび/もしくはサルコグリカン、またはDAPCの他の構成要素における変異と関連する疾患、特に、筋ジストロフィーとの関連で、ビグリカン治療剤に対する患者の応答を予測する方法を提供する。本開示はまた、本明細書の組合せ治療剤を用いて、ジストロフィンおよび/もしくはサルコグリカン、またはDAPCの他の構成要素における変異と関連する疾患、特に、筋ジストロフィーを処置する方法も提供する。ジストロフィンの異常は、軽度のベッカー型筋ジストロフィーBMDおよび重度のデュシェンヌ型筋ジストロフィーDMDのいずれの一因ともなる。BMDでは、ジストロフィンは作られるが、サイズおよび/または量が異常である。患者は、軽度~中程度の筋力低下を示す。DMDでは、タンパク質が作られず、患者は13歳までに車椅子が欠かせなくなり、通常20歳までに死亡する。別の種類のジストロフィーには、臨床的発症が早期である極めて障害惹起的な筋疾患であり、重度の新生児性低血圧症の最も高頻度の原因でもある、先天性筋ジストロフィーCMDが含まれる。その症状は、出生時または生後最初の数カ月間において感知され、運動マイルストーンの遅れ、重度で早期の拘縮、および関節変形と関連することが多い筋緊張の低下からなる。疾患の早期段階で血清クレアチンキナーゼが正常値の30倍まで上昇し、次いで、急速に低下する。筋生検の組織学的変化は、筋線維のサイズにおける大きなばらつき、少数の壊死性線維および再生しつつある線維、筋内膜コラーゲン組織の顕著な増大、および特定の微細構造的特色の消失からなる。CMDの診断は、臨床的描像および筋生検の形態的変化に基づくが、他の筋障害が類似の臨床病態的特色を呈示しうるので、これを確実に下すことはできない。CMDとして分類される疾患群内では、多様な形態が個別化されている。2つの一般的な形態は、西欧型および日本型であり、後者は、重度の精神障害と関連し、通常福山型先天性筋ジストロフィーFCMDと称する。近年、先天性筋ジストロフィーCMDの1つの形態が、ラミニンアルファ2鎖遺伝子の変異により引き起こされるものとして特徴づけられている。ラミニンは、DAPCと会合するタンパク質である。したがって、本開示はまた、通常DAPCと会合する分子の異常と関連する疾患に対するビグリカン療法の効果を予測する方法も提供する。本開示はまた、本明細書の組合せ治療剤を用いて、通常DAPCと会合する分子の異常と関連する疾患を処置する方法も提供する。他の筋ジストロフィーには、臨床的および遺伝子的に異質な障害のクラスを表す肢帯型筋ジストロフィーLGMDが含まれる。これらのジストロフィーは、常染色体優性形質または常染色体劣性形質として受け継がれる。常染色体優性形態であるLGMD1Aが、5q31-q33へとマップされるSpeer,M.C.ら、Am.J.Hum.Genet.、50巻:1211頁、1992年;Yamaoka,L.Y.ら、Neuromusc.Disord.、4巻:471頁、1994年一方、常染色体劣性形態に関与する6つの遺伝子は、15q15.1LGMD2ABeckmann,J.S.ら、C.R.Acad.Sci.Paris、312巻:141頁、1991年、2p16-p13LGMD2BBashir,R.ら、Hum.Mol.Genet.、3巻:455頁、1994年、13q12LGMD2CBenOthmane,K.ら、NatureGenet.、2巻:315頁、1992年;Azibi,K.ら、Hum.Mol.Genet.、2巻:1423頁、1993年、17q12-q21.33LGMD2DRoberds,S.L.ら、Cell、78巻:625頁、1994年;McNally,E.M.ら、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.、91巻:9690頁、1994年、4q12LG1MD2ELim,L.E.ら、Nat.Genet.、11巻:257頁、1994年;Bonnemann,C.G.ら、Nat.Genet.、11巻:266頁、1995年へとマップされ、最も近年に5q33-q34LGMD2FPassos-Bueno,M.R.ら、Hum.Mol.Genet.、5巻:815頁、1996年へとマップされた。LGMD2C、2D、および2Eを伴う患者は、ガンマ-サルコグリカン、アルファ-サルコグリカン、およびベータ-サルコグリカンのそれぞれをコードする遺伝子の変異から結果として生じるサルコグリカン複合体の構成要素が欠損する。LGMD2Aの一因となる遺伝子は、筋特異的なカルパインとして同定されているが、LGMD1A、2B、および2Fの一因となる遺伝子は、なおも未知である。さらに他の種類の筋ジストロフィーには、遠位部における筋力低下の緩徐な進行を特徴とする、成体後期に発症する常染色体優性ミオパシーである、ウェランダー遠位型ミオパシーWDMが含まれる。この障害は、遠位部における遺伝性ミオパシーのモデル疾患と考えられている。この疾患は、染色体2p13と連関している。別の筋ジストロフィーは、近年クローニングされた、遺伝子記号をDYSFとする遺伝子であるジスフェリンの変異により引き起こされる遠位型筋ジストロフィーである、三好型ミオパシーであるWeilerら1999年、HumMolGenet、8巻:871~7頁。さらに他のジストロフィーには、遺伝性遠位型ミオパシー、良性先天性筋緊張低下症、中心核病、ネマリンミオパシー、および筋細管中心核ミオパシーが含まれる。ビグリカン治療剤を用いて処置または防止しうる他の疾患には、ビグリカン治療剤により処置すると萎縮が停止するかまたは緩徐化されるという条件で、組織の萎縮、例えば、筋ジストロフィーから結果として生じる筋萎縮以外の筋萎縮を特徴とする疾患が含まれる。さらに、本開示はまた、組織の萎縮、例えば、筋萎縮を可逆化する方法も提供する。これは、萎縮した組織にビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤を含む組成物、またはこれらの治療剤を個別に含む別個の組成物を施すことなど、例えば、患者をビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤により処置することにより、達成することができる。筋萎縮は、神経外傷に起因する脱神経筋によるその神経との接触の喪失;変性性神経障害、代謝性神経障害、もしくは炎症性神経障害例えば、ギラン-バレ症候群、末梢神経障害、または環境における毒素もしくは薬物により引き起こされる神経への損傷damageから結果として生じる場合がある。別の実施形態では、筋萎縮が、運動ニューロン障害に起因する脱神経から結果として生じる。このような運動ニューロン障害には、筋萎縮性側索硬化症ALSまたはルーゲーリック病;小児性脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症、ならびに多巣性伝導ブロックを伴う自己免疫性運動神経障害を含めた成人性運動ニューロン疾患が含まれるがこれらに限定されない。別の実施形態では、筋萎縮が、長期にわたる不使用から結果として生じる。このような廃用性萎縮は、脳卒中、脊髄損傷injuryに起因するまひ;外傷骨折、捻挫、または脱臼などに起因する骨格の固定または病臥の長期化が含まれるがこれらに限定されない状態から生じうる。さらに別の実施形態では、筋萎縮が、がんおよび他の慢性疾病による悪液質、空腹、または横紋筋融解症が含まれるがこれらに限定されない代謝性ストレスまたは栄養不全、甲状腺障害および糖尿病などであるがこれらに限定されない内分泌障害から結果として生じる。筋組織の萎縮および壊死は、罹患組織の線維化を随伴することが多いので、萎縮または壊死の可逆化または阻害はまた、線維化の阻害または可逆化も結果としてもたらしうる。加えて、ビグリカン治療剤は、後天性中毒性または炎症性ミオパシーを処置するのに有用でありうる。炎症性筋疾患の帰結として生じるミオパシーには、多発性筋炎および皮膚筋炎が含まれるがこれらに限定されない。中毒性ミオパシーは、アミオダロンadiodarone、クロロキン、クロフィブラート、コルヒチン、ドキソルビシン、エタノール、ヒドロキシクロロキン、有機リン酸エステル、ペルヘキシリンperihexiline、およびビンクリスチンが含まれるがこれらに限定されない薬剤に起因しうる。神経筋ジストロフィーには、筋強直性ジストロフィーが含まれる。筋強直性ジストロフィーDM;またはスタイナート病とは、常染色体優性の神経筋疾患であり、成人が罹患する筋ジストロフィーの最も一般的な形態である。DMの臨床的描像は十分に確立されているが、例外的に可変的であるHarper,P.S.、MyotonicDystrophy、2版、W.B.SaundersCo.、London、1989年。一般には、筋強直、進行性の筋力低下、および筋損耗を伴う筋疾患であると考えられているが、DMは、他の多様な系における異常を特徴とする。DM患者は、心伝導障害、平滑筋病変、睡眠過剰、白内障、グルコース反応の異常、ならびに、男性では、早期の脱毛および精巣萎縮を患うことが多いHarper,P.S.、MyotonicDystrophy、2版、W.B.SaundersCo.、London、1989年。場合によっては診断するのが困難な最も軽微な形態は、中高年において見られ、筋病変をほとんどまたは全く伴わない白内障を特徴とする。筋強直および筋力低下を示す古典的な形態は、成年早期および青年期に発症する頻度が最も高い。先天的に生じる最も重度の形態は、全般的な筋形成不全、精神遅滞、および新生児死亡率の高さと関連する。この疾患および罹患する遺伝子は、米国特許第5,955,265号においてさらに記載されている。別の神経筋疾患は、脊髄性筋萎縮症SMAであり、小児ではデュシェンヌ型筋ジストロフィーに次いで2番目に最も一般的な神経筋疾患である。SMAとは、乳幼児が主に罹患する消耗性神経筋障害を指す。この障害は、脊髄の後角細胞としてもまた公知である下位運動ニューロンの変性により引き起こされる。正常な下位運動ニューロンは、筋肉を刺激して収縮させる。神経変性は、刺激を低減し、これにより、筋組織を萎縮させる例えば、米国特許第5,882,868号を参照されたい。上記の筋ジストロフィーおよびミオパシーは、骨格筋の障害である。しかし、本開示はまた、平滑筋の障害、例えば、肥大型心筋症、拡張型心筋症、および拘束型心筋症を含めた心筋症にも関する。少なくとも特定の平滑筋、例えば、心筋は、サルコグリカンに富む。サルコグリカンにおける変異は、心筋レベルにおける筋鞘の不安定性を結果としてもたらしうる例えば、Melacini1999年、MuscleNerve、22巻:473頁を参照されたい。例えば、サルコグリカンを変異させた動物モデルは、心筋クレアチンキナーゼの上昇を示す。特に、デルタ-サルコグリカンSgcdヌルマウスは、心筋および骨格筋における組織学的顕徴としての巣状の壊死領域を伴う心筋症を発症することが示されている。動物はまた、骨格および心膜におけるサルコグリカン-サルコスパンSG-SSPN複合体の非存在も示した。血管平滑筋におけるSG-SSPN複合体の喪失は、冠血管系の異常と関連した。したがって、血管平滑筋におけるSG-SSPN複合体の崩壊は、血管機能を攪乱し、これにより心筋症が誘発され、筋ジストロフィーが悪化するCoral-Vazquezら1999年、Cell、98巻:465頁。デルタ-サルコグリカン陰性マウスと同様に、γ-サルコグリカンを欠くマウスは、幼年で顕著なジストロフィー性の筋変化を示したHackら1998年、JCellBiol、142巻:1279頁。これらのマウスは、20週齢までに心筋症を発症し、若年で死亡した。さらに、γ-サルコグリカンを欠く骨格筋では、アポトーシス性の筋核が豊富であったことから、プログラム細胞死が筋線維変性に寄与することが示唆される。Evansブルー色素による生体染色は、γ-サルコグリカンを欠く筋肉が、ジストロフィン欠損筋において見られる膜の分断と同様な膜の分断を発症することを明らかにした。また、γ-サルコグリカンが失われると、α-サルコグリカンおよびε-サルコグリカンは部分的に保持されるが、ベータ-サルコグリカンおよびデルタ-サルコグリカンは二次的に低減することも示されたことから、β-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、およびδ-サルコグリカンが1つの単位として機能することが示される。細胞膜複合体の他の構成要素が機能的であるからには、ビグリカン治療剤の存在により複合体は安定化されうるであろう。動物モデルに加えて、ヒトにおける特定の心筋症が、ジストロフィン、ジストログリカン、またはサルコグリカンにおける変異と連関している。例えば、ジストロフィンは、X結合型拡張型心筋症の一因となる遺伝子として同定されているTowbinJ.A.1998年、CurrOpinCellBiol、10巻:131頁、およびこの文献における参考文献。この場合、ジストロフィン遺伝子は、臨床的に明らかな骨格筋ミオパシーを伴わない心筋症を結果としてもたらす5’側変異を含有したBiesら1997年、JMolCellCardiol、29巻:3175頁。さらに、心筋症はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィージストロフィンの変異と関連する、または肢帯型筋ジストロフィーなど、他の種類の筋ジストロフィーを有する対象おいても見出された。例えば、拡張型心筋症は、常染色体優性の1症例、および進行した常染色体劣性患者または散発性患者の3例このうちの2例は、α-サルコグリカンが欠損することが見出されたにおいて存在した。これらの患者3例のうちの2例および他の3例は、ジストロフィン異常症に特徴的であることが公知なECGの異常を示した。アルファサルコグリカンの非存在と拡張型心筋症の存在との間の強い関連が見出された。常染色体優性の6例では、房室AV伝導障害が認められ、年齢と共に、かつ、筋力低下の同時的存在下において重症度が増大した。これらの患者のうちの特定例では、ペースメーカーの植え込みが必要であったvanderKooi1998年、Heart、79巻:73頁を参照されたい。ビグリカン治療剤はまた、心筋症、例えば、ウイルスに由来する拡張型心筋症、例えば、エンテロウイルス感染、例えば、B3型コクサッキーウイルス感染から結果として生じる拡張型心筋症を処置または防止するのにも用いることができる。精製されたコクサッキーウイルスのプロテアーゼ2Aは、invitroの培養された筋細胞に対するコクサッキーウイルスの感染時においても、感染したマウス心臓においてもジストロフィンを切断し、ジストロフィン機能の障害をもたらすことが示されているBadorffら1999年、NatMed、5巻:320頁。ジストロフィンの切断は、ジストロフィンと会合した糖タンパク質であるα-サルコグリカンおよびβ-ジストログリカンの破壊を結果としてもたらす。したがって、心筋症は、ビグリカン治療剤を、例えば、ジストロフィンまたはこれと会合したタンパク質を破壊することにより心筋症を引き起こすウイルスに感染した対象への投与を介して、防止または可逆化しうるであろう。ビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤の組合せを投与すれば、罹患した心細胞の細胞膜を再安定化させるかまたは再組織化しうるであろう。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤を用いて神経筋障害である重症筋無力症を処置することができる。したがって、ビグリカン治療剤はまた、心筋症などの平滑筋障害を防止または処置し、心平滑筋組織の萎縮および/または壊死を停止させるのにも用いることができる。この処置はまた、筋細胞の生存を促進するのにも用いることができる。したがって、本明細書の方法を用いて、平滑筋障害および心筋障害との関連でビグリカン療法に対する患者の応答を予測することができる。ビグリカン治療剤で処置しうる神経障害には、多発性筋炎および神経原性障害が含まれる。処置しうる別の神経疾患は、アルツハイマー病である。本明細書の方法で処置しうる他の疾患には、プロテオグリカンが異常なレベルで存在するか、または正常な対象における活性と比べて異常な活性を有する疾患が含まれる。例えば、疾患または障害は、例えば、細胞膜の不安定を結果としてもたらす、ビグリカンレベルの低下により引き起こされうるであろう。代替的に、疾患または障害は、例えば、MuSKの過剰刺激またはAChRの過剰凝集下記を参照されたいを結果としてもたらす、ビグリカンのレベルまたは活性の異常な上昇からも結果として生じうるであろう。本明細書の方法で処置しうるかまたはビグリカン応答性について評価しうるさらに他の疾患または障害には、プロテオグリカンと別の分子DAPC分子またはMuSK分子以外の分子、例えば、C1qなどの補体因子との相互作用の異常と関連する疾患または障害が含まれる。例えば、C1qは、ビグリカンと相互作用することが示されているHockingら1996年、J.Biol.Chem.、271巻:19571頁。また、C1qの細胞表面への結合が、食作用の増強およびスーパーオキシドの生成の刺激を含めた多数の生物学的活性を媒介することも公知である。したがって、ビグリカンはC1qに結合するので、ビグリカン治療剤を用いて、C1qの、細胞表面におけるその受容体への結合を阻害して、このような生物学的活性のうちの1または複数を阻害することができる。加えて、C1qまたは他の補体構成要素と細胞表面との相互作用を阻害するビグリカン治療剤はまた、補体を介する細胞およびこのような細胞を含有する組織の壊死を阻害するのにも用いることができる。さらに、本出願は、微生物、例えば、ウイルスによる細胞の感染を防止または阻害する方法も提供する。例えば、ジストログリカンは、それを介して特定の微生物が真核細胞に侵入する受容体であることが示されているScience1998年、282巻:2079頁。したがって、対象に、微生物が結合するジストログリカン分子上の部位を直接的または間接的に結合不能とする化合物を投与することにより、微生物の細胞への侵入を阻害することができる。この方法を用いて、例えば、ラッサ熱ウイルスの感染およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスLCMVの感染のほか、オリベロスウイルスおよび茂原ウイルスを含めた他のアレナウイルスによる感染を防止または阻害することができる。可溶性のα-ジストログリカンは、LCMV感染およびLFV感染の両方から防護することが示されたScience1998年、282巻:2079頁。したがって、本明細書で開示されるビグリカンによる組合せ治療剤を用いて、ビグリカンに関連する感染性疾患を処置することができる。疾患を処置するのに最も適切なビグリカン治療剤を選択するには、例えば、筋ジストロフィーを有する、例えば、患者から確立された細胞培養物に加えて、多様な動物モデルを用いることもできる。特に、DAPCの構成要素の変異または非存在と関連する筋ジストロフィーまたは心筋症を防止または処置するのに用いられる治療剤を同定するには、これらのタンパク質の変異形を有するか、これらのタンパク質をコードする遺伝子にヌル変異を有するマウスを用いることができる。例えば、デルタ-サルコグリカンなどのサルコグリカンが破壊されたマウスを用いることができる。このようなマウスは、例えば、Coral-Vazquezら1999年、Cell、98巻:465頁において記載されている。代替的に、ジストロフィンが欠損するマウスmdxマウス、またはα-サルコグリカンもしくはγ-サルコグリカンが欠損するマウスも用いることができる。このようなマウスは、本明細書および文献において記載されている。さらなるマウスは、当技術分野で公知の方法により作製することができる。治療剤を同定するための例示的な実施形態では、異なる治療剤をδ-サルコグリカンヌルマウスに投与し、心機能を研究することにより、治療剤の効果を評価する。この目的で用いうる別の動物モデルは、ゲノムの欠失のためにδ-サルコグリカンを発現しない心筋症性ハムスターである。このラットは、常染色体劣性心筋症の動物モデルであり、Sakamotoら、FEBSLett1999年、44巻:124頁においてさらに記載されている。米国特許第7,759,314号で論じられている通り、ビグリカン治療剤はまた、VI型コラーゲン障害を処置するのにも用いることができる。米国特許第7,759,314号では、ビグリカンヌルマウスが、免疫蛍光法により決定されるVI型コラーゲンレベルの顕著な低減を呈示することが示された。実施例11で示す通り、VI型コラーゲンを欠損するマウスへのビグリカンの投与は、筋肉におけるVI型コラーゲンレベルの上昇を結果としてもたらした。したがって、本明細書で記載されるビグリカンによる組合せ治療剤はまた、VI型コラーゲンレベルを増大させ、これにより、VI型コラーゲン障害を処置するのにも用いることができる。さらに、本明細書の方法を用いて、VI型コラーゲン障害のためのビグリカン療法に対する患者の応答を予測することもできる。一般に、VI型コラーゲン障害とは、対象がもたらすVI型コラーゲンのレベルまたは活性が、ゼロではないが低い障害である。一部の実施形態では、この障害は、VI型コラーゲン活性を低減するが、完全には消失させない変異を特徴とする。一部の実施形態では、障害が、VI型コラーゲンの安定性の低減を特徴とする。特定の実施形態では、障害が、VI型コラーゲンタンパク質のゼロではないが低いレベルを特徴とする。例えば、ヘテロ接合性の変異例えば、ハプロ不全は、VI型コラーゲンレベルの低下を結果としてもたらし得る。ビグリカン治療剤の投与は、VI型コラーゲンのレベルを増大させ、これにより、VI型コラーゲン障害を処置すると期待される。したがって、本明細書で開示される方法により処置されうる特殊なVI型コラーゲン障害には、以下が含まれる。ベスレムミオパシーは、少なくとも部分的には、VI型コラーゲン遺伝子における変異により引き起こされる。一部の実施形態では、ベスレムミオパシーが、ハプロ不全により引き起こされるPepeGら、COL6A1genomicdeletionsinBethlemmyopathyandUllrichmusculardystrophy、AnnNeurol.、2006年1月;59巻1号:190~5頁;Bakerら、MolecularconsequencesofdominantBethlemmyopathycollagenVImutations、AnnNeurol.、2007年10月;62巻4号:390~405頁。VI型コラーゲンの機能はまた、ウールリッヒ型先天性筋ジストロフィーにおいても損なわれる。ベスレムミオパシーと同様に、UCMD患者は、VI型コラーゲンの野生型コピーを有しうるJimenez-Mallebreraら、AcomparativeanalysisofcollagenVIproductioninmuscle,skinandfibroblastsfrom14UllrichcongenitalmusculardystrophypatientswithdominantandrecessiveCOL6Amutations、NeuromusculDisord.、2006年10月;16巻9~10号:571~82頁。特定の実施形態では、本明細書で記載されるビグリカン治療剤を投与することにより、VI型コラーゲン関連障害を処置することができる。VI.治療用組成物の有効用量および投与対象に、薬学的有効量のビグリカンまたはビグリカン関連治療剤を、ユートロフィン治療剤などの第2の治療剤と共時投与することにより、対象おける上記の疾患または障害を処置または改善することができる。本明細書で用いられる共時投与とは、両方の薬剤が、処置される組織において同時に有効量で存在するように、2つの薬剤を患者に投与する治療レジメンを指す。2つの薬剤は、同時に投与する例えば、同じ組成物による場合もあり、別個の組成物による場合もあることもでき、別個の時点に投与するいずれの順序による場合もあることもでき、なおまた、異なる投与方式を介して投与することもできる。例えば、ビグリカン治療剤の投与は、第2の治療剤例えば、ユートロフィン治療剤の投与に、数分間~数日間の範囲の間隔で先行する場合もあり、後続する場合もある。特定のこのような実施形態では、ビグリカン治療剤と第2の治療剤ユートロフィン治療剤などとを、互いから約1分間、約5分間、約10分間、約30分間、約60分間、約2時間、約4時間、約6時間、8時間、約10時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、もしくは約48時間、またはこれを超える時間以内に投与することができる。ビグリカンは、投与2週間後のマウス筋組織においても検出しうるため実施例3を参照されたい、一部の実施形態では、ビグリカンを、第2の治療剤の少なくとも2週間前に投与し、第2の治療剤を投与するときもなお有効レベルで存在させることができる。一部の実施形態では、ビグリカン治療剤の投与と第2の治療剤の投与とを、互いから約1分間、約5分間、約30分間、なおまたは約60分間以内に行う。特定の実施形態では、ある場合には、ビグリカン治療剤の投与と第2の治療剤の投与とが互いから約60分間以内である一方、他の場合には、ビグリカン治療剤の投与と第2の治療剤の投与とが互いから数日間以内であるように、ビグリカン治療剤と第2の治療剤ユートロフィン治療剤などとを、異なる投与レジメン例えば、ビグリカン治療剤は、例えば、1~4週間ごとに1回だけ投与する一方、第2の治療剤は毎日投与する;代替的に、ビグリカン治療剤は毎日1回投与しうる一方、第2の治療剤は3週間ごとに1回だけ投与しうるにより投与することができる。疾患が、高レベルまたは高度な活性のビグリカンにより引き起こされるのか、低レベルまたは低度な活性のビグリカンにより引き起こされるのかに応じて、疾患を有する対象に、アゴニストのビグリカン治療剤またはアンタゴニストのビグリカン治療剤を投与する。当業者は、本明細書の疾患のうちのいずれかを処置するのにどの治療剤を投与すべきかを予測しうるであろうが、試験を実施して、投与するのに適切な治療剤を決定することもできる。このような試験では、例えば、疾患の動物モデルを用いることができる。代替的に、疾患が、例えば、ビグリカンまたはユートロフィンにおける変異に起因する場合には、invitro試験に取り組み、変異の影響を決定することもできる。これにより、この種の変異を有する対象には、どの種の治療剤を投与すべきかを決定することが可能となる。ビグリカン治療剤を対象へと投与する別の方式は、対象の治療用ビグリカンタンパク質を発現および分泌する細胞を調製し、この細胞をマトリックスへと挿入し、このマトリックスを対象の所望の場所へと投与することを介する。したがって、本開示に従い操作される細胞はまた、例えば、宿主生物または患者へと植え込む前に、治療用タンパク質を生成させるために、従来の生体適合性の材料および方法を用いてカプセル化することもできる。例えば、Hguyenら、TissueImplantSystemsandMethodsforSustainingviableHighCellDensitieswithinaHost、米国特許第5,314,471号BaxterInternational,Inc.;UludagおよびSefton、1993年、JBiomed.Mater.Res.、27巻10号:1213~24頁HepG2細胞/ヒドロキシエチルメタクリレート-メチルメタクリレート膜;Changら、1993年、HumGeneTher、4巻4号:433~40頁hGH/免疫保護的で選択透過性のアルギン酸マイクロカプセルを発現するマウスLtk細胞;Reddyら、1993年、JInfectDis、168巻4号:1082~3頁アルギン酸;TaiおよびSun、1993年、FASEBJ、7巻11号:1061~9頁hGH/アルギン酸-ポリ-L-リシン-アルギン酸膜を発現するマウス線維芽細胞;Aoら、1995年、TransplanataionProc.、27巻6号:3349、3350頁アルギン酸;Rajotteら、1995年、TransplantationProc.、27巻6号:3389頁アルギン酸;Lakeyら、1995年、TransplantationProc.、27巻6号:3266頁アルギン酸;Korbuttら、1995年、TransplantationProc.、27巻6号:3212頁アルギン酸;Dorianら、米国特許第5,429,821号アルギン酸;Emerichら、1993年、ExpNeurol、122巻1号:37~47頁ポリマーでカプセル化されたPC12細胞;Sagenら、1993年、JNeurosci、13巻6号:2415~23頁半透過性ポリマー膜によりカプセル化され、ラット脊髄のくも膜下腔へと植え込まれた、ウシクロム親和性細胞;Aebischerら、1994年、ExpNeurol、126巻2号:151~8頁ポリマーでカプセル化され、サルへと植え込まれた、ラットPC12細胞;また、Aebischer、WO92/19595も参照されたい;Savelkoulら、1994年、JImmunolMethods、170巻2号:185~96頁カプセル化され、抗体を生成させる、ハイブリドーマ;カプセル化され、多様なサイトカインを発現するトランスフェクト細胞系;Winnら、1994年、PNASUSA、91巻6号:2324~8頁ポリマー製免疫隔離デバイスによりカプセル化されてラットへと植え込まれ、ヒト神経増殖因子を発現する操作されたBHK細胞;Emerichら、1994年、ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry、18巻5号:935~46頁ポリマーでカプセル化され、ラットへと植え込まれた、PC12細胞;Kordowerら、1994年、PNASUSA、91巻23号:10898~902頁ポリマーでカプセル化されてサルへと植え込まれ、hNGFを発現する操作されたBHK細胞およびButlerら、WO95/04521カプセル化されたデバイスを参照されたい。次いで、細胞を、カプセル化形態で、動物宿主へと導入することができ、好ましくは哺乳動物へと導入することができ、より好ましくはそれを必要とするヒト対象と導入することができる。カプセル化物質が半透過性であり、カプセル化された細胞が生成させる分泌タンパク質の宿主への放出を可能とすることが好ましい。多くの実施形態では、半透過性のカプセル化が、カプセル化された細胞を、カプセル化された細胞が導入される宿主生物から免疫隔離する。これらの実施形態では、カプセル化された細胞が、1または複数の治療用タンパク質を、宿主種から発現する場合もあり、かつ/またはウイルスタンパク質もしくは宿主種以外の種に由来するタンパク質から発現する場合もある。代替的に、ビグリカン治療剤は、治療用ビグリカンタンパク質をコードする核酸である。したがって、それを必要とする対象には、特殊な組織、例えば、ジストロフィー性組織を特異的に標的としうる対象のタンパク質をコードする、ある用量のウイルスベクターを施すことができる。ベクターは、ネイキッド形態で投与することもでき、ウイルス粒子として投与することもできる本明細書でさらに記載される。この目的で、invivoにおいて標的の組織および細胞を修飾するために多様な技法が開発されている。トランスフェクション、および、場合によっては、ウイルスの宿主への組込みを可能とする上記のウイルスベクターなど、多数のウイルスベクターが開発されている。例えば、Dubenskyら1984年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻、7529~7533頁;Kanedaら1989年、Science、243巻、375~378頁;Hiebertら1989年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻、3594~3598頁;Hatzogluら1990年、J.Biol.Chem.、265巻、17285~17293頁およびFerryら1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、8377~8381頁を参照されたい。ベクターは、注射、例えば、静脈内注射もしくは筋内注射を介して投与することもでき、吸入を介して投与することもでき、他の非経口方式を介して投与することもできる。また、リポソームを伴う複合体、または注射、カテーテル、もしくは遺伝子銃を介するDNAの投与など、ウイルス以外の送達法も用いることができる。さらに別の実施形態では、細胞を対象から得、exvivoにおいて改変し、同じ対象または異なる対象へと導入する。治療剤化合物のさらなる投与方法を以下に示す。特定の実施形態では、ビグリカン治療剤を、マウスにおいて有効であった2、5、および10mg/kgの用量実施例13および14を参照されたいと同等な用量まで投与した。動物用量をヒト用量へと転換するための1つの尺度は、体表面積に基づくが、これは、インターネット上のfda.gov/ohrms/dockets/98fr/02d-0492-gdl0001-vol1.pdfにおけるGuidanceforIndustryReviewers:EstimatingtheSafeStartingDoseinClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteersにおいて記載されている。この刊行物は、マウス用量を12.3で除してヒト用量に到達することを推奨している。この変換係数を用いると、2、5、および10mg/kgのマウス用量に対応するヒト用量は、0.16mg/kg、0.41mg/kg、および0.81mg/kgである。したがって、一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドの投与用量が、0.16~0.81mg/kgである。一部の実施形態では、ビグリカンポリペプチドの用量が、0.1~1.5mg/kg、0.1~1.2mg/kg、0.1~1.0mg/kg、0.1~0.5mg/kg、0.2~1.0mg/kg、または0.5~1.5mg/kgである。好ましい実施形態では、用量が、0.1~1.2mg/kgである。これらの用量は、例えば、1~4週間ごとに、1~2週間ごとに、2~3週間ごとに、または3~4週間ごとに投与することができる。A.毒性実施例8は、rhBRNがマウスに及ぼす毒性が低いことを示す。また、実施例8のアッセイを用いて、他のビグリカン治療剤の毒性を決定することもできる。ビグリカン治療剤の毒性および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学手順、例えば、LD50モデル生物集団のうちの50に対して致死的な用量およびED50集団のうちの50において治療的に有効な用量を決定するための手順により判定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を呈示する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈示する化合物も用いうるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を軽減するためには、罹患組織部位をこのような化合物の標的とする送達系をデザインするように注意を払うべきである。細胞培養物によるアッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて用いられる用量の範囲を処方するのに用いることができる。特に、AChRの凝集を強化するために治療剤を投与する場合は、刺激が所望される場合は刺激を、阻害が所望される場合は阻害を結果としてもたらす用量を確立することが望ましい。次いで、医学的試験において試験を継続することができる。このような化合物の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないED50を包含する循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。本明細書の方法で用いられる任意の化合物の場合、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方して、細胞培養物中で決定されるIC50すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度を包含する循環血漿濃度の範囲を達成することができる。このような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。B.医薬組成物本開示に従い用いられる医薬組成物は、生理学的に許容される1または複数の担体または賦形剤を用いる従来の方式で調合することができる。したがって、治療剤およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、例えば、注射、吸入、もしくは送気を介する口腔または鼻腔を介する投与、または、経口投与、口腔内投与、非経口投与、もしくは直腸内投与のために調合することができる。このような療法では、ビグリカンによる組合せ治療剤を、全身投与および局所投与または局部化投与を含めた多様な投与負荷のために調合することができる。技法および処方は、一般にRemmington’sPharmaceuticalSciences、MeadePublishingCo.、Easton、PAにおいて見出すことができる。全身投与の場合、筋内注射、静脈内注射、腹腔内注射、および皮下注射を含めた注射を用いることができる。注射用には、ビグリカン治療剤を、例えば、ハンクス液またはリンゲル液など、生理学的に適合性の緩衝液中の溶液に調合することができる。加えて、化合物を固体形態で調合し、使用の直前に再溶解または懸濁させることもできる。また、凍結乾燥形態も含まれる。経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤例えば、トウモロコシアルファデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース;充填剤例えば、ラクトース、結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム;潤滑剤例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、またはシリカ;崩壊剤例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム;または保湿剤例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど、薬学的に許容される賦形剤と共に、従来の手段により調製される錠剤またはカプセルの形態を取りうる。錠剤は、コーティングすることができる。当技術分野では、錠剤をコーティングする方法が周知である。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることもでき、使用前に水または他の適する媒体で構成するための乾燥製品として存在させることもできる。このような液体調製物は、懸濁化剤例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または可食性水素化脂肪;乳化剤例えば、レシチンまたはアカシアゴム;非水性媒体例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または画分化された植物油;および防腐剤例えば、安息香酸メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸など、薬学的に許容される添加剤と共に、従来の手段により調製することができる。調製物はまた、必要に応じ、緩衝塩、芳香剤、着色剤、および甘味剤も含有しうる。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出をもたらすのに適した形で調合することができる。口腔内投与では、組成物は、従来の方式で処方される錠剤またはトローチの形態を取ることができる。吸入を介する投与では、ビグリカン治療剤を、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用を伴う加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレーの提示の形態で送達するのが簡便である。加圧型エアゾールの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを施すことにより決定することができる。吸入器または注入器において用いられる、化合物の粉末ミックスおよびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを調合することができる。化合物は、注射を介する、例えば、ボーラス注射または連続注入を介する非経口投与のために調合することができる。注射用の処方物は、防腐剤を添加した単位剤形、例えば、アンプルまたは複数回投与用の容器により提示することができる。組成物は、油性媒体中または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ることが可能であり、懸濁剤、安定化剤、および/または分散剤などの調合剤を含有しうる。代替的に、有効成分は、使用前に適切な媒体、例えば、滅菌の発熱物質非含有水で構成するための粉末形態でありうる。化合物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなど、従来の坐剤ベースを含有する坐剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物に調合することもできる。既に記載した処方物に加えて、化合物はまた、デポ剤調製物として調合することもできる。このような長期作用型処方物は、植え込み例えば、皮下への植え込みまたは筋内への植え込みにより投与することもでき、筋内注射により投与することもできる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料と共に例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして調合することもでき、イオン交換樹脂と共に調合することもでき、可溶性の低い誘導体、例えば、可溶性の低い塩として調合することもできる。全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段を介しても可能である。経粘膜投与用または経皮投与用の処方物では、透過する障壁に適切な浸透剤を用いる。当技術分野では、このような浸透剤、例えば、経粘膜投与では胆汁塩およびフシジン酸誘導体が一般に公知である。加えて、洗浄剤を用いて、透過を容易にすることもできる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーを介する場合もあり、坐剤を用いる場合もある。局所投与では、当技術分野で一般に公知である通り、ビグリカン治療剤を、軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームへと調合する。洗浄液を局所的に用いて、損傷または炎症を処置し、治癒を加速化させることもできる。臨床状況では、本明細書で記載されるビグリカンおよび/またはユートロフィンをコードする治療剤遺伝子の遺伝子送達系を、当技術分野ではそれらの各々がよく知られた多数の方法のうちのいずれかを介して患者へと導入することができる。例えば、遺伝子送達系による医薬調製物は、例えば、静脈内注射を介して全身に導入することができ、標的細胞への構築物の特異的な形質導入は、主に、遺伝子送達媒体、受容体遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型もしくは組織型の発現、またはこれらの組合せによりもたらされるトランスフェクションの特異性から生じる。他の実施形態では、組換え遺伝子の初回送達の制約が大きく、動物への導入は極めて局部化される。例えば、遺伝子送達媒体は、カテーテルを介して米国特許第5,328,470号を参照されたい導入することもでき、定位注射を介して例えば、Chenら1994年、PNAS、91巻:3054~3057頁導入することもできる。遺伝子治療用構築物内のビグリカンタンパク質をコードする遺伝子は、電気穿孔により、例えば、Devら1994年、CancerTreatRev、20巻:105~115頁により記載される技法を用いて送達することができる。DNAを筋細胞へと送達する方式には、米国特許第5,858,351号において記載されているベクターなど、組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いる方式が含まれる。代替的に、遺伝子は、Wolffら1990年、Science、247巻:1465~1468頁;Acsadiら1991年、Nature、352巻:815~818頁;BarrおよびLeiden1991年、Science、254巻:1507~1509頁により記載されるプラスミドDNAなどのプラスミドDNAの直接注射によっても筋肉へと送達されている。しかし、この投与方式の結果としてもたらされる発現レベルは一般に、持続的ではあるが一般に低い。低くはあるが持続的な発現レベルは、本明細書の方法を実施するのに有効であると予測される。遺伝子治療用構築物または遺伝子治療用ポリペプチドによる医薬調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子送達系またはポリペプチドから本質的になる場合もあり、遺伝子送達媒体または遺伝子送達化合物が組み込まれた徐放マトリックスを含む場合もある。代替的に、完全な遺伝子送達系を、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で生成させうる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を生成させる1または複数の細胞も含みうる。所望の場合、組成物は、有効成分を含有する1または複数の単位剤形を含有しうるパックまたは分注デバイスにより提示することもできる。例えば、パックは、ブリスターパックなど、金属製またはプラスチック製の箔を含みうる。パックまたは分注デバイスは、投与のための指示書を伴いうる。VII.ビグリカンによる組合せ治療剤のさらなる例示的な使用ビグリカン治療剤はまた、ユートロフィンeutrophinポリペプチドなど、第2の治療剤と組み合わせた、細胞または組織培養物例えば、成長しつつある器官系に対する栄養補助物質としても用いることができる。任意の細胞型がこれらの栄養補助物質から利益を得る可能性がある。培養物へと添加される化合物の量は、小スケールの実験において、例えば、細胞または器官を、量を増大させる特定のビグリカンと共にインキュベートすることにより決定することができる。好ましい細胞には、真核細胞、例えば、筋細胞または神経細胞が含まれる。他の好ましい組織には、萎縮性組織が含まれる。したがって、このような組織を、invitroにおいて、有効量のビグリカン治療剤およびユートロフィン治療剤などの第2の治療剤と共にインキュベートして、組織の萎縮を可逆化することができる。一実施形態では、萎縮性組織を対象から得、この組織を、exvivoにおいて、組織の萎縮を可逆化するのに十分な量のビグリカン治療剤およびユートロフィンなどの第2の治療剤と共に、組織の萎縮を可逆化するのに十分な時間にわたり培養し、次いで、この組織を、同じ対象または異なる対象に再投与することができる。代替的に、ビグリカン治療剤および第2の治療剤を、invitroにおいて、筋ジストロフィー、またはビグリカン治療剤で処置しうる他の疾患を有する対象から得られる細胞または組織の培養物に添加して、invitroにおけるそれらの成長または生存を向上させることもできる。筋ジストロフィーまたは他の疾患を有する対象に由来する脳細胞または筋細胞などの細胞を維持する可能性は、例えば、疾患を処置する治療剤を開発するのに有用である。VIII.組合せ治療剤特定の実施形態では、ビグリカンを第2の治療剤と組み合わせる。一部の実施形態では、第2の治療剤がユートロフィンポリペプチドである。一部の実施形態では、治療剤が、抗炎症薬、筋肉量を増大させる薬剤、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる薬剤、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる薬剤、nNOS系の活性を増大させる薬剤、筋細胞膜の修復を促進する薬剤、筋再生を増大させる薬剤、線維化を低下させる薬剤、およびジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進するアンチセンス剤である。ビグリカン治療剤は、任意の適切な抗炎症薬と組み合わせることができる。例示的な抗炎症剤には、ロフェコキシブVioxxおよびセレコキシブCelebrexが含まれる。他の抗炎症剤および抗炎症剤のクラスには、副腎皮質ステロイドコルチゾール、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、6U-メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、およびデキサメタゾン、非ステロイド剤、およびプロドラッグサリチル酸誘導体、すなわち、アスピリン;パラアミノフェノール誘導体、すなわち、アセトアミノフェン;インドールおよびインデン酢酸インドメタシン、スリンダクト、およびエトダルク、ヘテロアリール酢酸トルメチン、ジクロフェナク、およびケトロラク、アリールプロピオン酸イブプロフェンおよび誘導体、アントラニル酸メフェナム酸およびメクロフェナム酸、エノール酸ピロキシカム、テノキシカム、フェニルブタゾン、およびオキシフェンタトラゾン、ナブメトン、および金化合物オーラノフィン、金チオグルコース、金チオリンゴ酸ナトリウムが含まれる。ビグリカン治療剤は、筋肉量を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。薬剤は、例えば、MYO-29Pfizerまたはその類似体もしくは相同体など、ミオスタチンを阻害する抗体でありうる。筋肉量を増大させる他の例示的な薬剤には、ACE-031Acceleron、AMG-745Amgen、およびこれらの類似体、ならびにミオスタチンおよび関連のTGFβファミリーメンバーを中和する他の薬剤が含まれる。ビグリカン治療剤は、ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ユートロフィンのmRNAレベルを増大させる例示的な薬剤には、また、BMN-195BioMarinとも称するSMTC1100SummitCorp.、およびユートロフィンをコードする外因性核酸が含まれる。ビグリカン治療剤は、ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ユートロフィンのタンパク質レベルを増大させる例示的な薬剤には、SMTC1100また、BMN-195とも呼ばれる、L-アルギニン、およびモルシドミンが含まれる。ビグリカン治療剤は、nNOS系の活性を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。nNOS系の活性を増大させる例示的な薬剤には、タダラフィルCialis、バルデナフィルLevitra、シルデナフィルシトレートViagra、およびL-アルギニンが含まれる。ビグリカン治療剤は、筋細胞膜の修復を促進する任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。筋細胞膜の修復を促進する例示的な薬剤には、組換えジスフェリンBansalDら、Dysferlinandtheplasmamembranerepairinmusculardystrophy、TrendsCellBiol.、2004年4月;14巻4号:206~13頁、組換えMG53WangXら、Cardioprotectionofischemia/reperfusioninjurybycholesterol-dependentMG53-mediatedmembranerepair、CircRes.、2010年7月9日;107巻1号:76~83頁;Epub、2010年5月13日、または組換えCav3CaiCら、MG53nucleatesassemblyofcellmembranerepairmachinery、NatCellBiol.、2009年1月;11巻1号:56~64;Epub、2008年11月30日が含まれる。ビグリカン治療剤は、筋再生を増大させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。筋再生を増大させる例示的な薬剤には、ACE-031AcceleronおよびAMG-745Amgenが含まれる。ビグリカン治療剤は、線維化を低下させる任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。当業者には、線維化関連の障害のための多様な処置が公知である。処置には、抗炎症剤、コルチコステロイド、ペニシラミン、およびコルヒチンが含まれる。例えば、Beers,MHおよびBerkow,R編、TheMerckManual、7版、MerckResearchLaboratories、1999年を参照されたい。一部の実施形態では、抗線維化療法には、線維化促進因子アンタゴニストおよび/または抗線維化剤の投与が含まれる。このようにして、抗線維化療法は、例えば、阻害性抗体を用いて、線維芽細胞、線維芽細胞前駆体、筋線維芽細胞前駆体、および/または造血系単球前駆体分化、ならびに線維性組織の形成および維持を標的としうる。限定せずに述べると、本発明の療法の一部としてのアンタゴニストにより標的とされうる線維化促進因子には、β型形質転換増殖因子TGF-β1~5を含めたTGF-β、VEGF、EGF、RANTES、インターロイキンファミリーのメンバー例えば、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、およびIL-13、アルファ型腫瘍壊死因子TNF-α、血小板由来増殖因子PDGF、塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、1型単球走化性タンパク質MCP-1、マクロファージ炎症性タンパク質例えば、MIP-1α、MIP-2、結合組織増殖因子CTGF、エンドセリン1、アンジオテンシンII、レニン、レプチン、ケモカイン例えば、CCL2、CCL12、CXCL12、CXCR4、CCR3、CCR5、CCR7、SLC/CCL21、および線維性組織の形成、成長、または維持を促進するかまたはこれらと関連することが公知である他の因子が含まれる。特定の実施形態では、抗線維化療法が、線維化促進因子のうちの1または複数を指向する抗体を包含しうる。他の選択される実施形態では、可溶性受容体が、標的のリガンドについて、その対応する天然の細胞受容体と競合するように、抗線維化療法は、線維化促進因子および/またはサイトカインのうちの1または複数の受容体の可溶性形態を包含しうる。特定の実施形態では、抗線維化療法が、線維化促進因子および/またはサイトカインのうちの1または複数との関連でアンチセンスの少なくとも1つの配列を含有する、1または複数のオリゴリボヌクレオチドを包含しうる。特定の実施形態では、線維化促進因子アンタゴニストを、IL-12、IL-10、IFN-γ、またはBMP-7OP-1など、抗線維化効果を有することが公知のサイトカインで置換することもでき、これらで増強することもできる。例えば、IFN-γ1bActimmune登録商標;ヒトインターフェロンは、140アミノ酸の単鎖ポリペプチドである。IFN-γ1bは、E.coliにおいて組換えにより作製され、非グリコシル化されるRinderknechtら1984年、J.Biol.Chem.、259巻:6790~6797頁。一部の実施形態では、抗線維化薬が、HT-100HaloTherapeuticsなど、ハロフジノン類似体である。ビグリカン治療剤は、ジストロフィン転写物におけるエクソンスキッピングを促進する任意の適切な薬剤と組み合わせることができる。ジストロフィンにおけるエクソンスキッピングを促進する例示的な薬剤には、AVI-4658AVIPharmaceuticals、PRO51およびPRO44ProsensaandGSKが含まれる。HeemskerkHら、Developmentofantisense-mediatedexonskippingasatreatmentforduchennemusculardystrophy、AnnNYAcadSci.、2009年9月;1175巻:71~9頁ではまた、エクソンスキッピングを媒介するアンチセンス治療剤も記載されている。本発明は、いかなる形であれ限定的なものとしてみなされるべきではない以下の実施例によりさらに例示される。本出願全体で引用される全ての参考文献論文の参考文献、交付された特許、公開された特許出願を含めたの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。別段に示さない限り、本発明の実施は、当技術分野内にある、細胞生物学、細胞培養法、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA法、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、MolecularCloningALaboratoryManual、2版、Sambrook、Fritsch、およびManiatis編ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989年;DNACloning、IおよびII巻D.N.Glover編、1985年;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait編、1984年;Mullisら、米国特許第4,683,195号;NucleicAcidHybridizationB.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984年;TranscriptionAndTranslationB.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984年;CultureOfAnimalCellsR.I.Freshney、AlanR.Liss,Inc.、1987年;ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress、1986年;B.Perbal、APracticalGuideToMolecularCloning1984年;thetreatise,MethodsInEnzymologyAcademicPress,Inc.、N.Y.;GeneTransferVectorsForMammalianCellsJ.H.MillerおよびM.P.Calos編、1987年、ColdSpringHarborLaboratory;MethodsInEnzymology、154および155巻Wuら編、ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyMayerおよびWalker編、AcademicPress、London、1987年;HandbookOfExperimentalImmunology、I~IV巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986年;ManipulatingtheMouseEmbryo、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.、1986年を参照されたい。実施例1内因性のビグリカンは未成熟筋におけるユートロフィンの発現を制御する生後14日目P14、ユートロフィンは、シナプス周囲の筋鞘において高度に発現する図1A9。ビグリカンの存在下および非存在下におけるユートロフィンの発現レベルを比較するために、本発明者らは、bgn-/oマウスおよび年齢を適合させたコンジェニック対照に由来する筋切片を免疫染色した。全ての場合において、変異体の切片およびWT切片を、同じスライドガラスガラス上にマウントし、併せて染色し、同時に画像化した材料および方法。図1Aは、bgn-/o筋内のシナプス周囲の筋鞘では、ユートロフィンの発現が低下するのに対し、筋鞘におけるジストロフィンの発現は変化しなかったことを示す。各遺伝子型に由来する3匹ずつの動物の各々に由来する50の筋鞘節を定量化したところ、ユートロフィンレベルが約28低下することが示された図1B;bgn-/o:0.72±0.03、WT:1.0±0.04、対応のないスチューデントのt検定、P<0.0001。これに対して、筋鞘におけるジストロフィンの発現には有意差が見られなかった図1C;bgn-/o:1.01±0.03、WT:1.00±0.03、対応のないスチューデントのt検定、P=0.76。とりわけ、ユートロフィン転写物の量は、P14におけるbgn-/o筋と比較したWTにおいて識別不能であった以下の本文および図1D。これらの結果は、筋鞘におけるユートロフィンタンパク質の発現が、ビグリカンの非存在下では選択的に低下することを示す。実施例2rhBGNによる処置は培養筋細胞における膜会合ユートロフィンを上方制御する次に、本発明者らは、ユートロフィンの筋鞘との会合の制御におけるビグリカンの役割についてより正確に詳述するために、細胞培養系に目を転じた。本発明者らは、1nMのrhBGNでbgn-/o筋管を刺激し、ウェスタンブロット法を介して膜画分中のユートロフィンレベルおよびγ-サルコグリカンレベルを評価した。図2Aに示される通り、rhBGNによる処置は、これらの膜画分中のユートロフィンタンパク質およびγ-サルコグリカンタンパク質を上方制御する。他方、rhBGNによる処置の後、ユートロフィン転写物のレベルは低減された非処置:1±0.10;rhBGNによる処置:0.7±0.06;対応のないスチューデントのt検定、P=0.02;各々において3連ずつのフラスコによるn=6の別個の実験。したがって、膜におけるユートロフィンタンパク質の発現の上方制御は、その転写物レベルの上昇とは関連しない。上記の結果は、ビグリカンは、翻訳の増大、安定性の増大、および/またはユートロフィンの膜へのターゲティングを伴う機構を介してユートロフィンタンパク質を制御しうることを示唆する。これらの可能性を識別するため、本発明者らは、対照培養物中およびビグリカンで処置した培養物中のユートロフィンの総タンパク質レベルを評価した。図2に示される通り、ユートロフィンの総タンパク質レベルは、処置された筋管および処置されなかった筋管において識別不能である。膜結合画分が増大する条件下では、ユートロフィンの総細胞タンパク質の変化を検出できないことから、ビグリカンによりユートロフィンの膜との会合が制御されることが示される。実施例3rhBGNの全身送達ユートロフィンの膜への動員におけるビグリカンの役割は、内因性のビグリカンおよび筋内送達されたrhBGNのいずれも、invivoにおいてDAPCタンパク質を制御しうる15ことを示す前出の結果と併せてまとめると、rhBGNがDMDの治療剤でありうることを示唆する。この実験は、rhBGNが全身送達されうることを示す。捕捉ELISAは、rhBGNが、腹腔内送達の30および60分後における循環中で容易に検出されることを示した図7A。内因性のビグリカンを発現する組織において組換えタンパク質を検出するために13、本発明者らは、動物にAlexa-555へとコンジュゲートしたrhBGNを腹腔内注射した。図7Bに示される通り、注射の48時間後、このrhBGNは、筋細胞外マトリックスにおいて容易に検出される。これらの観察は、循環する組換えタンパク質が筋へと分配され、そこで、ECMと安定的に会合することを示す。この結果は、bgn-/oマウスにおける単回筋内注射後少なくとも2週間にわたり、筋内送達されたrhBGNが筋内で安定であるという本発明者らのかつての知見15と合致する。この知見はまた、mdxマウスにおける単回注射の2週間後に観察されるrhBGNの有効性とも符合する以下で論じる。まとめると、これらの知見は、rhBGNは全身送達することが可能であり、長期間にわたり筋肉に局在化しうることを示す。実施例4rhBGNはmdxマウスにおいてユートロフィンおよび他のDAPCの構成要素を上方制御する次に、本発明者らは、rhBGNがmdxマウスにおいてユートロフィンを上方制御しうるかどうかを問うた。rhBGNの単回腹腔内投与を約P18のmdxマウスへと送達し、2週間後に筋鞘におけるユートロフィンレベルを評価した。再生しつつある筋肉線維ではユートロフィンの発現が一過性に増大し16、シナプス領域およびシナプス周囲領域で濃縮されることが知られている8、17ため、本発明者らは、本発明者らの解析を、再生していない末梢有核筋線維のシナプス外域へと制約した。図3AおよびBに示される通り、rhBGNによる処置は、mdxマウスの大腿四頭筋の筋鞘におけるユートロフィンの発現を、>2.5倍に増大させた媒体による処置:1.0±0.05、rhBGNによる処置:2.5±0.08、対応のないスチューデントのt検定、P<0.0001、各群から2匹ずつの動物に由来する筋鞘節のn=200。筋鞘におけるユートロフィンレベルはまた、前脛骨筋においても有意に上昇した媒体:1.0±0.1、rhBGN:1.7±0.1、対応のないスチューデントのt検定;各群から3匹ずつの動物に由来する筋鞘節のn=300。また、γ-サルコグリカン、β2-シントロフィン、およびnNOSのレベルも、rhBGNの単回投与後の筋鞘において増大した図4。本発明者らは、α-シントロフィンレベルの変化を観察しなかった。γ-サルコグリカンおよびnNOSの増大は、細胞培養物における本発明者らの観察であって、rhBGNによる処置が、膜におけるこれらのタンパク質レベルを増大させた観察と合致する図215。さらに、bgn-/oマウスでは、これらのタンパク質のほか、β2シントロフィンも制御異常である14、15。膜画分についてのウェスタンブロット法により、rhBGNによる処置は、mdxマウスにおけるユートロフィンおよびγ-サルコグリカンのいずれのレベルを増大させることの証拠がさらにもたらされた図3CおよびD。まとめると、これらの結果は、rhBGNによる処置は、ユートロフィンタンパク質およびDAPCタンパク質の発現を筋鞘に回復させることを示す。rhBGNで処置したmdxにおけるユートロフィン転写物のレベルは変化しなかった図3C。この知見は、本発明者らのbgn-/o筋によるinvivoの結果および細胞培養の結果図1および2と合致し、rhBGNが、mdxマウスにおける転写後レベルのユートロフィンを制御することを示す。最後に、これらの結果は、rhBGNの効果が、6~13週間にわたる処置による複数回投与後にも観察しうることを示す図3DおよびE。まとめると、これらの免疫組織学的結果および生化学的結果は、全身送達されたrhBGNが、ジストロフィー性マウスの膜におけるユートロフィンおよび他のDAPCタンパク質を上方制御しうることを示す。実施例5rhBGNはmdxマウスにおけるジストロフィー性病態を軽減するrhBGNがmdxマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗するかどうかを決定するために、本発明者らはまず、約P18のmdxマウスにrhBGNまたは媒体単独の単回腹腔内投与を行い、2または3週間後に筋肉を組織学的に評価した。図5A上パネルは、媒体を注射したマウスに由来する横隔膜の切片が、高比率の中心核線維CNFならびに壊死/再生巣および単核細胞浸潤領域を含めた特徴的なジストロフィー性病態を提示することを示す18。驚くべきことに、rhBGNによる処置の結果、rhBGNで処置したマウスに由来する筋肉において観察されるCNF比率が、約50低減された媒体を注射した動物およびrhBGNを注射した動物のそれぞれについて17.7±2.8および9.6±1.7;対応のないスチューデントのt検定、P=0.028、媒体を注射した動物のn=13およびrhBGNを注射した動物のn=11;図5B。本発明者らはまた、1、2、または10mg/kgのrhBGNを施されたマウスにおいて、筋損傷のマーカーである血清クレアチンキナーゼCKレベルも評価した。他の研究者らにより報告されている通り18、ベースラインのCKレベルには実験間でかなりのばらつきが認められた。本発明者らは、これらの動物において、CKレベルの低下への傾向を観察したが、データは統計学的有意性に到達しなかった図9。まとめると、これらの知見は、rhBGNによる処置が、mdxマウスにおけるジストロフィー性病態を軽減することを示す。実施例6rhBGNの有効性はユートロフィン依存的である本発明者らは次に、rhBGNがmdxマウスにおけるジストロフィー性病態に対抗する能力が、ユートロフィンに依存するかどうかを問うた。ユートロフィンがmdxマウスにおけるrhBGNの作用に必要であるならば、ユートロフィンおよびジストロフィンの両方についてのマウス変異体の病態は、rhBGNの投与により影響されないであろう。図10は、rhBGNまたは媒体を単回注射した後のmdx:utrn-/-マウスにおいて再生した筋線維の組織学的特徴および数が、識別不能であったことを示す。したがって、少なくとも一部のユートロフィンは、rhBGNの高度な治療的有効性に必要である。実施例7rhBGNによる処置はmdxマウスにおける筋機能を向上させるDMDの有効な処置は、筋機能を向上させる。DMDにおける筋線維病態、機能不全、および死亡の主要な原因のうちの1つは、収縮誘導性損傷に対する感受性の増大である。このような筋損傷は、exvivoにおいて、複数回の逐次的な遠心性伸展収縮ECCの各回の後にもたらされる力を測定することにより評価することができる19、20。これらのexvivoのmdx筋では、損傷に対する感受性が、一連のECC後における力の低下の増大により証拠立てられる。本発明者らは、mdxマウスに、15週齢まで3週間間隔P14に始まるでrhBGNまたは媒体を注射し、既に記載される通りに筋肉生理を測定した21、22。各回の連続ECCの後における力の低下量の低減により示される通り、rhBGNによる処置により、筋機能の測定値についての成績が改善された図6CおよびD。この改善は頑健であり、2回目のECC以降統計学的に有意であった図6C。本発明者らは、発生した比力specificforceの量を含め、筋機能の他のパラメータの変化は観察しなかった表1。このような生理学的改善のプロファイル比力の変化を伴わない損傷に対する抵抗性の増大は、AAVによるマイクロジストロフィンR4~R23の送達23またはヘレグリンによる処置24で観察されるプロファイルと類似する。したがって、rhBGNによる処置は、mdxマウスにおける筋機能を向上させる。実施例8rhBGNはmdxマウスにおいて十分に忍容される本発明者らは、処置の3カ月後でもなお、mdxマウスにおけるrhBGN投与の有害な効果を観察していない。器官重量は、長年および広範にわたり受容されている薬理学的毒性の尺度である25、26。図11Aに示される通り、肝臓、腎臓、肺、または脾臓の重量に有意差は認められなかった。心臓の重量は8減少した。動物の全体重は、媒体を投与した動物とrhBGNを投与した動物とで同等であった。また、筋重量も、rhBGNで処置した動物において17大きいヒラメ筋を例外として変化しなかった。さらに、腎機能不全または肝機能不全の徴候も観察されなかった:1~10mg/kgの範囲の単回投与時には、血清クレアチニン、血中尿素窒素BUN、アスパラギン酸トランスアミナーゼAST、またはビリルビンのレベルの有意な変化は認められなかった図11B。実施例9実施例1~8の材料および方法ビグリカン既に記載される通りに、非グリカン化組換えヒトビグリカンrhBGNを、哺乳動物細胞において生成させ、精製した15。この形態は、GAG側鎖を欠く。Alexa555タンパク質標識キットInvitrogenCorporationを用いて、この蛍光剤をrhBGNへとコンジュゲートした。動物および注射全てのプロトコールは、BrownUniversityのInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeによる同意および承認の下で実行した。単回注射では、P16~19のマウスに20mMのトリス25μL、0.5MのNaCl、0.2のCHAPS中に100μgのrhBGN、または媒体20mMのトリス、0.5MのNaCl、0.2のCHAPSの腹腔内注射を施した。複数回注射されるマウスには、100μgのrhBGNまたは媒体のさらなる腹腔内注射を3週間間隔で施した。最終回の注射の13~25日後にマウスを捕獲した。追跡研究のため、成体mdxマウスにAlexa555で標識したrhBGNの腹腔内注射を施し、48時間後に横隔膜を摘出した。組織学的特徴および免疫組織化学的特徴既に記載される通りに15凍結切片を調製および染色した。bgn-/o解析では、P14コンジェニックのbgn-/o切片およびWT切片を同じスライドガラスにマウントし、同時に免疫染色し、同じセッションで同一の曝露を用いて、冷却したCCDカメラにより画像化した。注射されたマウス媒体およびrhBGNに由来する比較のための全ての切片もまた、併せてマウントし、染色し、画像化した。切片は、NikonMelville、NYEclipseE800顕微鏡およびScanalyticsIPLabスペクトルソフトウェアまたはNISElementsNikonにより収集される画像を用いて観察した。ユートロフィンおよびジストロフィンの免疫反応の強度は、Metamorph画像解析ソフトウェアUniversalImagingまたはImageJソフトウェアNationalInstitutesofHealthを用いて定量化した。本発明者らはまた、間質腔における構造であって、一部の実験においてユートロフィンの増大を示す血管でありうる構造も観察した図3。これらの構造は、本発明者らの測定値には組み入れなかった。筋鞘節の平均averageピクセル強度を測定し、これらから平均meanのバックグラウンド各状態に由来する筋鞘以外の領域を測定することにより決定するを減じた。平均averageバックグラウンドレベルは、状態間で識別不能であった。mdxマウスにおける解析は、各状態2匹ずつのマウスに由来する大腿四頭筋および各状態3匹ずつのマウスに由来するTAにおいて実施した。CNFの百分率を記録するため、HE染色した切片内の壊死/再生巣を別として、全ての断面化された筋線維を、20倍の対物レンズ下でカウントした筋切片1個当たり270~1,913本の線維。定量的RT-PCRおよびウェスタンブロット解析ユートロフィン転写物のレベルは、SYBR-GreenInvitrogenを用いて測定した。培養法、溶解物の調製、および膜画分、ならびにウェスタンブロットによる解析は、以下で詳述される標準的な手順を介する。筋肉生理前述の通り、mdxマウスに、rhBGN動物1匹当たり25μgずつまたは媒体を、P14に始めて3週間ごとに腹腔内注射し、3.5カ月齢のとき、exvivoにおいてEDL筋の生理学的特性を解析した21、22。筋長は、最大の単収縮応答を達成するように調整し、この長さLoを測定した。最大上刺激を700ミリ秒とし、総伸展を10回の平均Loとし、伸展速度を0.5Lo/秒とする標準的なECCプロトコールによる各強縮について、遠心性収縮力の減少を計算した。上記の通りにEDL切片を得、画像を収集した。断面積は、ImageJソフトウェアNationalInstitutesofHealthを用いて測定した。ウェスタンブロット解析細胞膜調製物のために、ビグリカンヌル筋管をPBS中で洗浄し、組織培養フラスコから掻爬し、解剖緩衝液0.3Mのスクロース、pH7.4の35mMトリス、10mMのEDTA、10mMのEGTA、およびプロテアーゼ阻害剤混合物;RocheAppliedScience中でホモジナイズした。試料を、4°C、7,000×gで5分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を、4°C、38,000×gで60分間にわたり遠心分離することにより、膜を回収した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質濃度アッセイPierceにより決定した。ビグリカンヌル筋管から全タンパク質を抽出するために、細胞をPBS中で洗浄し、RIPA溶解緩衝液SantaCruzBiotechnology中で25分間にわたり可溶化し、溶解物を10,000×gで遠心分離し、上清を回収した。大腿四頭筋および大腿二頭筋に由来する膜画分は、既に記載される通りにMercadoMLら2006年、Biglycanregulatestheexpressionandsarcolemmallocalizationofdystrobrevin,syntrophin,andnNOS、FASEBJ調製した。細胞画分または筋画分は、SDS/PAGEにより分離し、タンパク質をニトロセルロース膜へと導入した。全タンパク質染色SYPRORuby;Invitrogenは、StormImagerAmershamBioscienceにより画像化した。ブロットを一次抗体と共にインキュベートした後、ヤギ抗マウスIgGをHRPAmershamへとコンジュゲートした。シグナルは、StormImagerを用いるECLplusAmershamにより検出した。定量的RT-PCR注射されたmdx動物に由来するビグリカンヌル筋不死化細胞系および大腿四頭筋からのRNAの抽出は、TRIzol法Invitrogenを用いて実施した。SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemKitInvitrogenを用いて、精製されたRNAを、cDNAへと転換した。qPCR反応は、ABIPRISM7300リアルタイムサーモサイクラーにおいてSYBR-Green法Invitrogenを用いて実施した。プライマーは、DSGeneプライマーデザインソフトウェアAccelrysを用いてデザインした。正規化のためにATPシンターゼを用いた。データ解析は、検量線法BiggarWDら2004年、DeflazacortinDuchennemusculardystrophy:Acomparisonoftwodifferentprotocols、NeuromusculDisord、14巻:476~482頁を用いて実施した。用いたプライマーは、以下の通りであった:ATPSアーゼのフォワードプライマー:5’-TGGGAAAATCGGACTCTTTG-3’配列番号14;ATPSアーゼのリバースプライマー:5’-AGTAACCACCATGGGCTTTG配列番号15;ユートロフィンのフォワードプライマー:5’-TCCCAAGACCCATTCAACCC配列番号16;ユートロフィンのリバースプライマー:TGGATAGTCAGTGTTTGGTTCC配列番号17gi110431377;3’UTR:塩基10383~12382の間。動物C3Hバックグラウンドにおけるコンジェニックのビグリカンヌルマウスを、前述の通りMercadoら、2006年に発生させ、JacksonLaboratory製のWTC3Hと比較した。C57BL/10ScSn-mdx/Jマウスは、JacksonLaboratoryから購入し、mdx:utrn-/-マウスは、記載されているMannCJら2001年、Antisense-inducedexonskippingandsynthesisofdystrophininthemdxmouse、ProcNatlAcadSciUSA、98巻:42~47頁通りに飼育した。抗体以下の一次抗体を用いた:抗ユートロフィンモノクローナル抗体VectorLabs、ウサギ抗ユートロフィン抗体S.Froehner、UniversityofWashington、Seattle,WAにより恵与される、Q:2ウサギ抗ジストロフィン抗体Abcam、抗γ-サルコグリカンモノクローナル抗体Vector、ウサギ抗ラミニン抗体Sigma、ウサギ抗β2-シントロフィン抗体vanDeutekomJCら2007年、LocaldystrophinrestorationwithantisenseoligonucleotidePRO051、NEnglJMed、357巻:2677~2686頁、およびウサギ抗nNOS抗体Invitrogen。抗ビグリカンモノクローナル抗体2A5Mercadoら、2006年、およびウサギ抗ビグリカン抗体BoweMA、MendisDB、FallonJR2000年、Thesmallleucine-richrepeatproteoglycanbiglycanbindstoalpha-dystroglycanandisupregulatedindystrophicmuscle、JCellBiol、148巻:801~810頁の特異性は、ウェスタンブロットMercadoら、2006年、Boweら、2000年、RafiiMSら2006年、Biglycanbindstoalpha-andgamma-sarcoglycanandregulatestheirexpressionduringdevelopment、JCellPhysiol、209巻:439~447頁、およびELISA実施例3により確立し、これらの試薬をビグリカンヌル試料において調べたところ、反応性は観察されなかった。以下の二次抗体を用いた:Alexa488ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa555ヤギ抗ウサギIgGInvitrogen、HRPヤギ抗マウスIgG、およびHRPヤギ抗ウサギIgG。細胞培養物不死化ビグリカンヌル細胞は、既に記載されている通りにMercadoら、2006年成長させた。細胞を4~5日間にわたり分化させ、次いで、分化培地中に1nMのrhBGNで8時間にわたり処置した。血清化学反応心穿刺によりrhBGNを注射したマウスおよび媒体を注射したマウスから血液を回収し、3,300RPMで10分間にわたりスピンして血清を分離した。血清クレアチンキナーゼ、BUN、クレアチニン、AST、および総ビリルビンの解析は、UniversityofCalifornia-DavisComparativePathologyLaboratoryにより実施された。血清におけるrhBGNの検出成体C57/B6マウスに、10mg/kgのrhBGNを腹腔内注射し、注射の30分間、1時間、および24時間後に心穿刺により血液を回収した条件1つ当たりのマウスのn=3~4。対照実験は、同等なレベルのrhBGNが血漿中に存在する注射の1時間後に0.12μg/mL;n=2ことを示した。結合部位が2つのELISAでは、プレートをマウス抗ビグリカン抗体でコーティングし、ブロッキングし、血清試料または基準物質ビグリカン希釈液と共にインキュベートした後、ウサギ抗ビグリカン抗体およびヤギ抗ウサギHRP抗体と共にインキュベートした。アッセイの感度は、約5ng/mLであった。実施例10異なるビグリカン形態の調製および特徴づけビグリカンは、プロテオグリカンPG形態および非グリカン化NG形態のいずれとしても発現する細胞外マトリックスタンパク質である。ビグリカンbiglyvanのプロテオグリカン形態は、セリン5またはセリン10番号付けは、成熟ポリペプチドの配列に基づくにおいて付加されうる1つまたは2つのグリコサミングリカン側鎖を含有する。本発明者らは、組換えDNA法を用いて、ビグリカンの変異体形態であって、GAG付加部位でありうる2つのセリンをアラニンへと変異させた変異体形態を創出した。この変異体を、S5A-S10A、またはSAと称する。本発明者らはまた、野生型構築物も作製した。全ての構築物は6-HISタグ付けされ、ヒトビグリカン配列に基づいた。接頭辞であるHisを用いて、このタグの存在を示す。本発明者らは、3つのビグリカン形態PG、NG、S5A-S10Aを生成させ、解析した。全てのビグリカン形態は、HEK293細胞により作製し、ニッケルクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとの組合せにより精製した。図13および14に示される通り、これらの調製物は、>90の純度であった。具体的に、図13は、SDS-PAGEにより解析した後、クーマシー染色を施した、ビグリカンの非グリカン化NG形態およびプロテオグリカン形態PGを示す。図14は、AgilentBioanalyzer2100Protein80チップアッセイにより解析した、ビグリカンのNG形態およびPG形態についての解析を示す。ビグリカンのNG形態では、見かけの質量が55.9kdであり、純度は92.6であった。ビグリカンのNG形態とPG形態との混合物では、見かけの質量が58.9kdであり、純度は74であった。ビグリカンのPG形態では、見かけの質量が60kdであり、純度は決定されなかった。また、図15および16で示す通り、S5A-S10A調製物の純度も>90であった。具体的に、図15は、SDS-PAGEにより解析した後、クーマシー染色を施したS5A-S10Aビグリカンについての解析を示す。図16は、AgilentBioanalyzer2100によるS5A-S10Aビグリカンについての最後の解析を示す。見かけの質量は46.3kdであり、純度は93.2であった。ウェスタンブロットデータは、S5A-S10Aが、SDSゲル上において、NGより速く泳動することを示し、これは、S5および/またはS10におけるO結合型グリコシル化の存在と符合する図17。図17は、組換え非グリカン化NGビグリカンおよびS5A-S10A変異体のビグリカンについてのウェスタンブロット解析を示す。試料は、SDSPAGE上で泳動させ、ニトロセルロース膜へと移し、ビグリカン抗体でプローブした。ser-alとは、GAG付加部位の両方に対する二重変異体S5A-S10Aである。アミノ酸位置は、成熟タンパク質のものである。S5A-S10A変異体の泳動は、野生型の非グリカン化体より速かったことに注意されたい。これらのデータは、非グリカン化体におけるセリンの一方または両方が修飾されていることを示す。図15におけるNG試料の相対的泳動は、この図を作成するのに用いられたゲル系のために、図13および14における相対的泳動と比較して異なることに注意されたい。NG試料の全ては、同じ系で分離すると同じ泳動を示す。ガスクロマトグラフィーによるNGおよびS5A-S10Aの総炭水化物についてのグリコシル解析は、それらの間には大きな差違が見られることを明らかにした表2。とりわけ、S5A-S10Aのグリコシル化の全体は、NGにおけるグリコシル化の57であった。NGにおいてはイズロン酸またはグルクロン酸が検出されなかったことから、NG調製物中にはGAGが存在しなかったことが示される。比較のために述べると、イズロン酸およびグルクロン酸のいずれも、高度にPGプロテオグリカンに富む以下の表2を参照されたい。GC-MSによりグリコシル組成物を決定する方法表2を、以下の通りに実行した。単糖組成物の解析に割り当てられた試料非透析試料についての情報に基づき、約125μgとされるを、ねじ式栓のついた試験管に入れ、内部基準物質としての10μgイノシトールを添加し、凍結乾燥させた。次いで、100°Cで2時間にわたる、メタノール中に3MのHClを伴うメタノリシスの後に、メタノール中のピリジンおよび酢酸無水和物による再N-アセチル化アミノ糖を検出するためを介して、乾燥させた試料からメチルグリコシドを調製した。前出のメタノリシスステップおよび再N-アセチル化ステップを2回にわたり反復した。次いで、試料を、Tri-Sil試薬ThermoScientificにより80°Cで0.5時間にわたりペル-O-トリメチルシリル化TMSした。これらの手順を、既にMerkleおよびPoppe1994年、MethodsEnzymol.、230巻:1~15頁;Yorkら1985年、MethodsEnzymol.、118巻:3~40頁において記載されている通りに実行した。SupelcoEC-1溶融シリカキャピラリーカラム30m×内径0.25mmを装備し、HewlettPackard5970MSDへとインターフェースされた、HewlettPackardSeriesII5890ガスクロマトグラフにより、TMSメチルグリコシドについての解析を実施した。ビグリカンの異なる形態を、レクチンブロット法によりさらに特徴づけた図23。組換えビグリカンbilgycan試料であるNG非グリカン化体、PGプロテオグリカン、SA変異体、および対照のBSA、カルボキシペプチダーゼYa、トランスフェリンb、およびアシアロフェツインdをPonceauSにより染色した。フェツインcは、おそらくこの糖タンパク質が高度にグリコシル化およびシアリル化しているため、PonceauSではほとんど染色されなかった。PGは、MAAおよびDSAで染色された。SAは、GNAおよびMAAでわずかに染色され、SNAおよびDSAで強く染色された。これらの結果は、NGタンパク質およびSAタンパク質におけるグリカンが、末端のマンノース、GalまたはGalNAcおよびGalβ1~4GlcNAcまたは末端GlcNAcへと2~6および2~3連結されたシアル酸を有するのに対し、PGタンパク質のグリカンは、GalおよびGalβ1~4GlcNAcまたは末端のGlcNAc構造へと2~3連結されたシアル酸を含有することを示す。DIGグリカン差別化キットRocheを用いてレクチンブロット法を実行した。略述すると、試料および対照をニトロセルロース膜へとブロットした1μgの試料、陽性対照、および陰性対照。膜をブロッキング溶液中に浸漬したキットにより供給される後、TBS中1μg/mlのジゴキシゲニンで標識したレクチンと共にインキュベートした。750mUのアルカリホスファターゼとコンジュゲートした二次抗体としてのヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体および発色試薬としてのニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェートを用いて結合活性を画像化した。カルボキシペプチダーゼYa:GNA陽性、トランスフェリンb:SNA陽性、フェツインc:MAA陽性、およびアシアロフェツインd:PNAおよびDSA陽性を陽性対照として用いた。ウシ血清アルブミンBSAを陰性対照として用いた。PonceauS染色を、膜におけるタンパク質を検出するために用いた。加えて、異なるビグリカン形態におけるN結合型グリコシル化の位置を決定した図24。SAタンパク質には、2つの潜在的なN-グリコシル化部位が認められ、Asn248およびAsn288が、N-グリコシル化のN-X-S/Tコンセンサス配列内に見出される。SA変異体のビグリカンをトリプシンで消化し、グリコシル化したアスパラギン残基をアスパラギン酸残基へと転換するH218O中のPNGアーゼFで、糖ペプチドを脱グリコシル化した。グリコシル化したペプチドは、対応するグリコシル化されていないペプチドと比較して質量3Daの増大を示す。親質量リストモニタリング法およびTurboSequestアルゴリズムを用いるデータベース検索を伴うLC-MS/MSを介して、SAのグリコシル化部位であるAsn248およびAsn288はグリコシル化していることが示された。SAに由来するN結合型グリコシル化部位のペプチドについての概要を図24に示す。これらの結果は、SAの2つの潜在的なN結合型グリコシル化部位が完全にグリコシル化していることを示す。SAにおけるアミノ酸の番号付けが、NGのアミノ酸の番号付けと異なることは注意に値する。しかし、N-グリコシル化部位を含めたペプチド配列は、2つの試料間で同一であり、NG試料の番号付けは、UniProtデータベースにおいて見出される番号付けと符合する。N結合型グリコシル化の解析を実施するために、50マイクログラムのSAビグリカンを、55°C、25mMのDTTで1時間にわたり還元し、暗所内、90mMのヨードアセトアミドで45分間にわたりカルボキシアミドメチル化した。乾燥させた透析試料を50mMの重炭酸アンモニウムNH4HCO3中で再懸濁させ、25°C、2.5μgのトリプシンで20時間にわたり消化した。100°Cで5分間にわたりトリプシンを脱活性化させた後、次いで、試料を、36μLの18O水H218Oおよび1MのNH4HCO32μL中に2μgのPNGアーゼFで脱グリコシル化した。標識したペプチドを200μLの移動相A水中に0.1のギ酸と共に再懸濁させ、次いで、試料を、高圧窒素ボンベ装置内、1,000psi約5uLの負荷で10分間にわたり、C18リバースプライマー相樹脂10.5cm;Waters、Milford、MAによりセルフパッキングさせて、ナノスプレーテイパードキャピラリーカラム/エミッター360×75×15μm、PicoFrit、NewObjective、Woburn、MAへとロードし、次いで、流速約500nL/分で160分間にわたり移動相Bを増大させる直線勾配を介して、質量分析器へと直接分離した。ナノスプレーによるイオン供給源を装備したLTQOrbitrapDiscoverer質量分析器ThermoScientificにより、LC-MS/MS解析を実施した。TurboSequestアルゴリズムProteomeDiscoverer1.1、ThermoScientificを用いて、結果として得られるデータを、組換えSA配列に照らして検索した。SEQUESTパラメータは、前駆体イオン質量の公差30.0ppmおよびモノアイソトピック質量によるフラグメントイオンの公差0.8Daを許容するように設定した。トリプシンペプチドには、最大2つの逸失した内部切断部位が許容され、57.02146Da、15.9949Da、および2.98826Daを差別化する修飾が、システインのアルキル化、メチオニンの酸化、およびアスパラギン酸の18O標識のそれぞれに許容された。NG試料では、第1のステップを除く上記の手順の全てに従った。40マイクログラムのNGを、55°C、25mMのDTTで1時間にわたり還元し、暗所内、90mMのヨードアセトアミドで45分間にわたりカルボキシアミドメチル化した。乾燥させた透析試料を50mMの重炭酸アンモニウムNH4HCO3中で再懸濁させ、25°C、2μgのトリプシンで20時間にわたり消化した。100°Cで5分間にわたりトリプシンを脱活性化させた後、次いで、試料を、36μLの18O水H218Oおよび1MのNH4HCO32μL中に2μgのPNGアーゼFで脱グリコシル化した。まとめると、これらのデータは、ビグリカンの非グリカン化形態およびSA変異体形態は、一部の炭水化物部分を含有するが、これらは、ビグリカンのプロテオグリカン形態とは異なることを示す。NGとS5A-S10Aとについての生体活性の比較は、異なる活性を示した。S5A-S10Aが、二相的な応答強化および脱強化を示すのに対し、NGは、三相的な応答強化、脱強化、および阻害を示す図18。図18上パネルは、細胞培養物によるバイオアッセイにおけるNGおよびS5A-S10Aビグリカンの生体活性を示す。初代培養のニワトリ筋管を、1Uの精製アグリンおよび多様な濃度のNGまたはS5A-S10Aビグリカンで処置した。次いで、記載されている通りにNastukら、1991年、PMID、1660286、3連の培養物中の筋管節1つ当たりのAChRクラスターの数をカウントした。アグリン単独により誘導されるAChRクラスター化のレベルを水平の点線で示す。S5A-S10Aは、低濃度≦0.05μg/mlでは強化を示し、高濃度の全てでは脱強化を示すことに注意されたい。これに対して、NGビグリカンは、≦0.05μg/mlでは強化を示すが、次いで、高濃度では脱強化および阻害を明示する。SAおよびNGと比較して、PGは、AChRのクラスター化に対して著しく異なる効果を示す下パネルを参照されたい。本発明者らは、S5A-S10Aが、invivoにおいて活性であることを見出した。S5A-S10Aのmdxマウスへの全身注射は、血清クレアチンキナーゼレベルの測定により評価される筋細胞の損傷を軽減した図19。図19は、S5A-S10Aビグリカンが、mdxマウスにおける筋損傷を軽減することを示す。P18のmdxマウスに、毎週1回2週間にわたり媒体またはS5A-S10Aビグリカンを腹腔内注射し、血清クレアチンキナーゼsCKレベルを測定した。ビグリカンを注射した動物では、sCKレベルが2分の1未満に低減されたP<0.01;n=4。図20は、S5A-S10ArhBGNの機能的有効性を示す。mdxマウスに、10mg/kgのSA-rhBGNを、表示される間隔で3カ月間にわたり腹腔内注射した。単離筋について遠心性収縮を測定した。筋長は、最大の単収縮応答を達成するように調整し、この長さLoを測定した。最大上刺激を700ミリ秒とし、総伸展を10回の平均Loとし、伸展速度を0.5Lo/秒とする標準的なECCプロトコールによる各強縮について、遠心性収縮力の減少を計算した。筋機能の向上における用量頻度反応関係は、図20に明らかである。図21は、invivoにおけるSA-rhBGNの筋線維に対する効果を示す図である。P18のmdxマウスに表示用量のSA-rhBGNを腹腔内注射し、ヒラメ筋について中心局在核を伴う筋線維の百分率を決定した。2週間後に横隔膜筋についても同じ測定を実施した。既に記載される通りにMercadoら、FasebJ.2006年、凍結切片を調製および染色した。切片は、NikonMelville、NYEclipseE800顕微鏡およびScanalyticsIPLabスペクトルソフトウェアFairfax、VAまたはNISElementsNikonにより収集される画像を用いて観察した。中心局在核の百分率を記録するため、HE染色した切片内の壊死/再生巣を別として、全ての断面化された筋線維を、20倍の対物レンズ下でカウントした。実施例11ビグリカンの投与はVI型コラーゲンレベルが欠損するマウスにおけるVI型コラーゲンレベルを増大させる野生型VI型コラーゲンを伴うビグリカンヌルマウスでは、VI型コラーゲンレベルが低減される。組換えビグリカンがinvivoのこの系におけるVI型コラーゲンレベルを回復させる有効性を調べるため、レスキュー法を用いた。組換えビグリカンをビグリカンヌルマウスの筋内へと注射し、VI型コラーゲンの発現を評価した。精製された組換え非グリカン化ビグリカンまたはプロテオグリカンを、5週齢のビグリカンヌル動物合計6匹の動物の右側大腿四頭筋へと注射した。動物内比較を可能とするため、媒体単独を左側大腿四頭筋へと注射した。各例では、溶液中に1.0の墨汁を包含させることにより、注射部位を画像化した。図22aは、注射された組換えビグリカンであるプロテオグリカンが、筋周膜および筋外膜の注射部位に適切に局在化することを示す。注射されたビグリカンは、ビグリカンヌル筋におけるVI型コラーゲンの発現に対して顕著な効果を及ぼした。注射の4日後までに、本発明者らは、ビグリカンによる染色領域と緊密に共局在化するVI型コラーゲン発現の増大を観察した図22b。媒体を注射した筋肉では、VI型コラーゲンの上方制御が観察されなかったデータは示さない。また、VI型コラーゲンの発現は、非グリカン化ビグリカンポリペプチドによっても上方制御されたデータは示さない。まとめると、これらの結果は、ビグリカンポリペプチドをinvivoにおいて筋肉へと送達することができ、そこで、間質および筋細胞表面におけるVI型コラーゲンの発現レベルを増強しうることを示す。さらに、このレスキューは、ビグリカンの非グリカン化形態でも達成することができ、ビグリカンのプロテオグリカン形態でも達成することができる。実施例12S5A-S10ArhBGNの精製タグ付けされていないS5A-S10ArhBGNを、以下のスキームにより精製した。第1に、変異体のビグリカンの凍結アリコートを、4°Cで融解させた。完全に融解させたら、これらの試料を遠心分離して、任意の粒子状物質を除去した。次いで、0.45μmのシリンジフィルターを用いて上清を濾過した。次いで、濾過された試料を、脱イオン化水で1:3に希釈した。変異体のビグリカンを、1mL/分で、1mLのHiTrapQFFGELifeSciencesアニオン交換カラムへと適用した。まず、カラムを、QFFA緩衝液pH8.5の20mMトリス;50mMのNaCl中で平衡化した。結合しなかった試料は、QFFAを用いてカラムから洗い流し、試料の適用および洗浄時に4mLの画分を回収した。変異体のビグリカンは、2つの段階勾配40カラム容量にわたる0~50のB;5カラム容量にわたる50~100のB;QFFB緩衝液は、pH8.5の20mMトリス;1MのNaClからなるのうちの第1の部分に溶出した。1mLの画分を回収し、SDS-PAGE解析およびクーマシー染色のためにサンプリングした。変異体のビグリカンを含有する画分を、次の精製ステップのためにプールした。図25は、アニオン交換による精製ステップのために得られた溶出プロファイルおよびクーマシー染色を示す。アニオン交換からプールされた画分を、1Mのクエン酸ナトリウムと1:1で混合し、最終クエン酸ナトリウム濃度を500mMとした。タンパク質を、1mL/分で、1mLのHiTrapButylSFFGELifeSciencesHIC疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムへと適用した。まず、カラムを、HICA緩衝液pH8.5の20mMトリス;200mMのNaCl;500mMのクエン酸ナトリウム中で平衡化した。結合しなかった試料は、HICAを用いてカラムから洗い流し、試料の適用および洗浄時に4mLの画分を回収した。変異体のビグリカンは、20カラム容量にわたる100~0のBにわたり溶出させたHICB緩衝液は、pH8.5の20mMトリス;200mMのNaClからなる。0.75mLの画分を回収し、SDS-PAGE解析ならびに銀染色およびクーマシー染色の両方ためにサンプリングした。図26は、HICによる精製ステップのために得られた溶出プロファイルおよびクーマシー染色を示す。実施例13タグ付けされていないマウスビグリカンはマウスによる急性研究におけるジストロフィーマーカーを低減するタグ付けされていないT2ビグリカンのマウス形態およびヒト形態を生成させて調べた。図27に示される通り、T2ビグリカンによる処置は、全身注射された合計2週間にわたり毎週1回mdxマウスにおけるsCKレベルおよび中心核レベルの有意な低減を結果としてもたらした。2、5、および10mg/kgの用量で、sCKレベルの有意な低減P<0.05;1群当たりの動物のn=5~7;ダネットの事後多重比較検定による1元配置ANOVA解析が認められた。10mg/kgで、sCKレベルは4.5分の1に低減された。処置された動物ではまた、中心核の百分率も低減された。10mg/kgの用量で、横隔膜CNの百分率は、54低減されたp=0.04;スチューデントのt検定;1群当たりの動物のn=5~7。また、2および5mg/kgの用量で、有効性への傾向p≒0.06も観察された。図28で示す通り、2mg/kgのT2rMuBGNは、大腿四頭筋に由来する膜画分中のユートロフィンのタンパク質レベルを1.5倍に上昇させたP<0.05;群1つ当たりの筋肉のn=4~5。このアッセイにおいて、本発明者らは、ビグリカンを全身注射された2週間にわたり毎週1回マウスに由来する大腿四頭筋からKClで洗浄した膜を調製した。Storm画像化システムを用いるウェスタンブロットにより、ユートロフィンレベルを定量化した。これらの実験は、タグがビグリカンの治療的有効性に必要でないことを確認する。実施例14タグ付けされていないマウスビグリカンはマウスによる長期研究におけるジストロフィー性病態を軽減するT2ビグリカンは、ECCにより判定される筋機能を向上させた。図29で示す通り、2mg/kgのT2-rMuBGNによりmdxマウスを処置した12週間にわたり毎週1回結果、遠心性収縮による損傷に対する抵抗性が、媒体を注射した対照と比較して63向上したp=0.007;1群当たりの動物のn=3~4。実施例15細胞培養物によるバイオアッセイにおいて用いられるヒトビグリカンの用量反応曲線タグ付けされていないT2ビグリカンの用量範囲を、細胞培養物によるバイオアッセイによりアッセイした。図30で示す通り、T2ビグリカンは、アグリンに誘導されるAChRのクラスター化活性を、濃度範囲:0.008~0.256μg/ml約0.2~7nMで30倍超強化する。0.512μg/ml14nMの高用量では、反応が、ほぼベースラインに戻る。本発明者らは、タグ付けされたrHuBGN、タグ付けされたT2rHuBGNおよびタグ付けされていないT2rHuBGN、ならびにT2rMuBGNを含め、本発明者らが調べたGAG側鎖を欠く全ての組換えビグリカンによる類似する用量反応プロファイルを観察した。タグ付けされていないT2ビグリカンは、マウスモデルにおいて、Uの逆数による同様の用量反応曲線を示す。図27~29は、20mg/kgの用量より低用量2および10mg/kgで高い有効性を示す。2および10mg/kgの用量は、3つの短期アッセイ2週間にわたる処置全てsCK、CN、ユートロフィンのほか、長期12週間にわたる処置のECC測定においても有効性を示した図27~29。しかし、sCKアッセイおよびCNアッセイのいずれにおいても、20mg/kgの用量では、ベースラインへの復帰がみられた。ユートロフィン反応およびECCでも同様の傾向が観察された。興味深いことに、これらの後者2つの例では、2mg/kgの用量が、10mg/kgの用量に勝った。T2/NGビグリカンについてのinvivoにおける用量反応プロファイルと細胞培養物による用量反応プロファイルとの一致は、この反応が、ビグリカンの固有な薬理学的特性に起因することを示唆する。このような薬理学的特徴に対する1つの蓋然的な説明は、T2/NGビグリカンに対する高アフィニティーの結合部位および低アフィニティーの結合部位の存在である。また、二相的な応答が二量体としてのビグリカンの作用を反映する可能性もあるScottら、JBC、2006年。用量反応曲線は、二量体がその1または複数のリガンドを架橋することが可能な好ましい濃度を反映しうるであろう。さらにまとめると、実施例13~15は、ヒトビグリカンおよびマウスビグリカンのいずれもが、マウスモデルにおいて生理学的に関与性の効果を生成させることを例示する。これらの実験は、ビグリカンが、一部のアミノ酸配列の変化にかかわらず、その治療活性を保持することを示す。同等物当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するか、または確認しうるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包摂されることを意図する。"