ヒトfrizzled受容体のFriドメインを含む単離されたポリペプチドであって、Friドメインが、野生型Friドメインと比較して生物学的結合部位において1つまたは複数の置換を含む、前記単離されたポリペプチド。frizzled受容体の野生型Friドメインを含むポリペプチドと比較して、Wntに対する低い結合親和性を有する、請求項1記載のポリペプチド。WntがWnt3Aである、請求項2記載のポリペプチド。野生型Friドメインが、SEQIDNO117~126からなる群より選択される配列を有するポリペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。野生型Friドメインが、SEQIDNO28、32、36、40、44、48、52、56、60、および64からなる群より選択される配列を有するポリペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。表16より選択されるくぼみの残基の部位における置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。1つまたは複数の置換が、表17より選択される部位における1つまたは複数の置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。1つまたは複数の置換が、野生型FZDFriドメイン配列の対応する部位にあるアミノ酸よりも疎水性が低いアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。Fc領域をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。ヒトFZD受容体がFZD4、FZD5、またはFZD8である、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。ヒトFZD受容体がFZD8である、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。1つまたは複数の置換が、F72、L75、I78、またはL121における置換を含む、請求項11記載のポリペプチド。1つまたは複数の置換がL75における置換を含む、請求項12記載のポリペプチド。1つまたは複数の置換がF72Y、L75S、I78S、またはL121Sを含む、請求項12または13記載のポリペプチド。Wntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性について化合物をスクリーニングする方法であって、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチドである第1のポリペプチドに対する化合物の結合親和性を決定する工程野生型Friドメインを含む第2のポリペプチドに対する該化合物の結合親和性を決定する工程および第1のポリペプチドに対する該化合物の結合親和性と、第2のポリペプチドに対する該化合物の結合親和性とを比較する工程であって、該化合物が、第1のポリペプチドに対するよりも第2のポリペプチドに対して高い親和性を有する場合に、該化合物が、可能性のあるWntシグナル伝達阻害剤として同定される、工程を含む前記方法。SEQIDNO98~111およびSEQIDNO113~116からなる群より選択される配列と少なくとも約80同一の配列を含む、単離されたポリペプチド。SEQIDNO98~112からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリペプチド。SEQIDNO112を含む、請求項17記載のポリペプチド。SEQIDNO108を含む、請求項18記載のポリペプチド。SEQIDNO98~112からなる群より選択される環状ペプチドから本質的になる、請求項17記載のポリペプチド。環状ペプチドSEQIDNO108から本質的になる、請求項20記載のポリペプチド。SEQIDNO113~116からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリペプチド。SEQIDNO113~116からなる群より選択される配列から本質的になる、請求項22記載のポリペプチド。約100アミノ酸未満の長さである、請求項16~19および22のいずれか一項記載のポリペプチド。約5~約20アミノ酸の長さである、請求項24記載のポリペプチド。改変ポリペプチドである、請求項16~25のいずれか一項記載のポリペプチド。標識されている、請求項26記載のポリペプチド。Wntシグナル伝達阻害剤である、請求項16~27のいずれか一項記載のポリペプチド。請求項16~28のいずれか一項記載のポリペプチドを含む、剤。Wntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性について化合物をスクリーニングする方法であって、化合物が、ヒトFZD受容体との結合について、請求項16~28のいずれか一項記載のポリペプチドと競合することができるかどうかを決定する工程であって、該化合物が結合についてポリペプチドと競合する能力は、該化合物がWntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性を有することを示す、工程を含む、前記方法。Wntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性について化合物をスクリーニングする方法であって、化合物が、請求項16~28のいずれか一項記載のポリペプチドを、ヒトFZD受容体のBBSから移動させることができるかどうかを決定する工程であって、該化合物がポリペプチドを移動させる能力は、該化合物がWntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性を有することを示す、工程を含む、前記方法。ヒトFZD受容体がFZD8である、請求項30または31記載の方法。ヒトFZD受容体が可溶型である、請求項30~32のいずれか一項記載の方法。請求項15および30~33のいずれか一項記載の方法によって同定された、剤。ヒトFZD受容体に結合する単離された剤であって、ヒトFZD受容体の野生型Friドメインを含むポリペプチドに対する結合親和性と比較して請求項1~14のいずれか一項記載のポリペプチドに対して低い結合親和性を有する、前記単離された剤。ヒトFZD受容体との結合について請求項16~28のいずれか一項記載のポリペプチドと競合する、単離された剤。ヒトFZD受容体がFZD8である、請求項35~36のいずれか一項記載の剤。ポリペプチドを含む、請求項34~37のいずれか一項記載の剤。抗体を含む、請求項38記載の剤。抗体ではない、請求項38記載の剤。ポリペプチドが約100アミノ酸未満の長さである、請求項38記載の剤。ポリペプチドが約5~約20アミノ酸の長さである、請求項41記載の剤。ポリペプチドが改変ポリペプチドである、請求項38~42のいずれか一項記載の剤。脂質を含む、請求項34~37のいずれか一項記載の剤。約2000ダルトン未満の分子量を有する、請求項34~44のいずれか一項記載の剤。WntとヒトFZD受容体との結合を阻害する、請求項34~45のいずれか一項記載の剤。WntがWnt3aである、請求項46記載の剤。古典的Wntシグナル伝達を阻害する、請求項34~47のいずれか一項記載の剤。請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤を含む、薬学的組成物。細胞と、請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤の有効量とを接触させる工程を含む、細胞におけるWntシグナル伝達を阻害する方法。Wntシグナル伝達が古典的Wntシグナル伝達である、請求項50記載の方法。細胞と、請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤の有効量とを接触させる工程を含む、細胞の分化を誘導する方法。細胞が腫瘍細胞である、請求項50~52のいずれか一項記載の方法。腫瘍と、請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤の有効量とを接触させる工程を含む、腫瘍の成長を阻害する方法。請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤の有効量を対象に投与する工程を含む、Wntシグナル伝達活性化に関連する疾患を治療する方法。疾患が癌である、請求項55記載の方法。疾患が多発性嚢胞腎である、請求項55記載の方法。ヒトFZD受容体のBBSに結合する剤の有効量を対象に投与する工程を含む、多発性嚢胞腎を治療する方法。剤が18R5である、請求項58記載の方法。腫瘍と、請求項16~29および34~48のいずれか一項記載のポリペプチドまたは剤の有効量とを接触させる工程を含む、腫瘍の腫瘍形成能を低下させる方法。発明の詳細な説明本発明は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に結合する、ポリペプチド、例えば、抗体を含むが、これに限定されない、新規の剤を提供する。関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチド、FZD結合剤を含む組成物、およびFZD結合剤を作製する方法も提供される。新規のFZD結合剤を使用する方法、例えば、腫瘍成長を阻害する方法およびまたは癌を治療する方法がさらに提供される。本発明は、FZDに結合する抗癌剤に適した標的である、ヒトfrizzled受容体における領域を同定したことに一部、基づいている。2種類の抗FZD抗体18R8および18R5はFZD7に特異的に結合するが、FZD1、FZD2、FZD5、およびFZD8と交差反応することも見出された。18R8抗体を用いたインビトロ実験から、この抗体はWntシグナル伝達を阻害し、WntリガンドとFZD8との結合を阻害できることも分かった。18R5抗体はまた、細胞をベースとするアッセイでもWntシグナル伝達を阻害できることが証明された。18R5抗体によるインビボ実験から、この抗体は腫瘍の成長または再発を阻害できることも証明された。本発明者らはまた、抗FZD抗体18R5が腫瘍の癌幹細胞頻度を低下させ、分化を誘導し、ならびにまたは腫瘍細胞の腫瘍形成能を低下できることも示した。これらの活性のある18R8および18R5抗体を用いたエピトープマッピング実験から、両抗体とも、FZD8における配列GLEVHQの少なくとも一部および配列YGFAの少なくとも一部に結合することが分かった。これらの2種類の抗体の証明された生物学的活性を考慮して、マウスFrizzled8の結晶構造を分析し、以前は特定の機能が認められていなかった、これらの配列を含むfrizzledタンパク質の細胞外領域は、FZD生物機能およびWntシグナル伝達において重要な機能上の役割を果たしていることが初めて同定された。ヒトfrizzled受容体のこの領域は生物学的結合部位と名付けられ、抗癌治療に適した標的である。さらに、第3の抗体である44R24がヒトFZD5およびFZD8に特異的に結合することが見出された。この抗体もまた、細胞をベースとするアッセイにおいてWntシグナル伝達を阻害することができ、インビボで抗腫瘍効力が可能なことが示された。抗FZD抗体18R8および18R5を用いた治療と同様に、44R24で腫瘍を治療すると、腫瘍に高レベルの分化マーカーが生じた。エピトープマッピングからもまた、抗FZD抗体44R24のエピトープが抗FZD抗体18R8および18R5のエピトープと重複することが分かった。より具体的には、44R24は、BBS内の領域YGFAの少なくとも一部に結合することが示された。I定義本発明の理解を容易にするために、多くの用語および句を以下で定義する。抗体という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組み合わせなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位によって認識しかつ特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられる抗体という用語は、抗体が所望の生物活性を示す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片2、およびFv断片など、単鎖Fv変異体、少なくとも二つの無傷の抗体から生成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む任意の他の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリンIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラスのいずれかであり得る。IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体は、裸であっても、または毒素、放射性同位体などの他の分子に結合していてもよい。抗体断片という用語は、無傷の抗体の一部を指し、かつ無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab、F2、およびFv断片、直鎖状抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これに限定されない。モノクローナル抗体とは、単一の抗原決定基、すなわちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する、均一な抗体集団を指す。これは、異なる抗原決定基を対象とした異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的である。モノクローナル抗体という用語は、無傷でありかつ完全長であるモノクローナル抗体、ならびに抗体断片2、Fvなど、単鎖変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を包含する。さらに、モノクローナル抗体とは、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、およびトランスジェニック動物による手法を含むが、これに限定されない多様な手法によって作製される抗体を指す。ヒト化抗体という用語は、最小の非ヒト配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である非ヒト抗体の形を指す。典型的には、ヒト化抗体とは、相補性決定領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種のCDR由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、Fvフレームワーク領域中およびまたは置き換えられた非ヒト残基の中の別の残基の置換によってさらに改変して、抗体の特異性、親和性、およびまたは能力を改良および最適化することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応する全てまたは実質的に全てのCDR領域を含む、少なくとも1つ、典型的には2つまたは3つの可変ドメインの実質的に全てを含む。しかし一方で、全てまたは実質的に全てのFR領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメインの少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことができる。米国特許第5225539号に、ヒト化抗体を作製するために用いられる方法の例が述べられている。ヒト抗体という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製された、ヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、無傷もしくは完全長の抗体、その断片、ならびにまたは、例えば、マウスの軽鎖およびヒトの重鎖ポリペプチドを含む抗体などの、少なくとも1つのヒト重鎖およびもしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。キメラ抗体という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する1つの哺乳動物種由来の抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、別の種において免疫応答を誘発することを回避するために、別の種に由来する抗体中の配列と相同である。エピトープまたは抗原決定基という用語は、本明細書において同義に用いられ、かつ、特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸、およびタンパク質の三次元的折り畳みによって近接して並べられた非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されているエピトープは、タンパク質が変性した場合にも典型的には維持されるが、三次元的折り畳みによって形成されたエピトープは、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは、独特の空間配置中に典型的には少なくとも3アミノ酸、より通常は少なくとも5または8~10アミノ酸を含む。抗体がエピトープまたはタンパク質に特異的に結合するということは、抗体がエピトープまたはタンパク質に対し、無関係のタンパク質を含む別の物質よりも高い頻度で、素早く、長い持続時間で、高い親和性で、または前記のいくつかの組み合わせで反応または結合することを意味する。ある態様において特異的に結合するとは、抗体が、例えば、約01mMまたはそれ以下のKDであるが、より通常は、約1μM未満のKDでタンパク質に結合することを意味する。ある態様では、特異的に結合するとは、抗体が、ある時には、少なくとも約01μMまたはそれ以下のKDで、またある時には、少なくとも約001μMまたはそれ以下のKDでタンパク質に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性のために、特異的結合は、複数の種にある、ある特定のタンパク質、例えば、frizzled受容体を認識する抗体を含み得る。同様に、異なるFZD受容体間の、これらの受容体のポリペプチド配列のある特定の領域における相同性のために、特異的結合は、複数の種類のfrizzled受容体を認識する抗体を含み得る。第1の標的に特異的に結合する抗体または結合部分は第2の標的に特異的に結合してもよく、特異的に結合しなくてもよいことが理解される。従って、特異的結合は、必ずしも、排他的な結合、すなわち、1種類の標的のみとの結合を必要としない。従って、抗体は、ある態様では、複数の種類の標的に特異的に結合する。ある態様では、複数の種類の標的は、抗体の同じ抗原結合部位に結合してもよい。例えば、抗体は、場合によっては、2つ同一の抗原結合部位を含んでもよく、これらの抗原結合部位はそれぞれ、2種類またはそれ以上のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある特定の他の態様において、抗体は二重特異性でもよく、特異性の異なる少なくとも2種類の抗原結合部位を含んでもよい。非限定的な例として、二重特異性抗体は、あるfrizzled受容体、例えば、ヒトFZD5のエピトープを認識する1つの抗原結合部位を含んでもよく、さらに、第2のfrizzled受容体、例えば、ヒトFZD8の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位を含んでもよい。必ずしもそうとは限らないが、一般的に、結合についての言及は特異的結合を意味する。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然では見られない形をしたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、天然で見られる形ではない程度まで精製されたものが含まれる。ある態様では、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。本明細書で使用する実質的に純粋なは、純度が少なくとも50の、より好ましくは純度が少なくとも90の、より好ましくは純度が少なくとも95の、より好ましくは純度が少なくとも98の、より好ましくは純度が少なくとも99の材料を指す。癌および癌性という用語は、無秩序な細胞増殖を特徴とする細胞集団を含む哺乳動物における生理的状態を指す、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これに限定されない。このような癌のより詳細な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。腫瘍および新生物とは、過度の細胞成長または増殖に起因する、前癌病変を含む良性病変または悪性病変の任意の組織塊を指す。癌幹細胞、腫瘍幹細胞、または固形腫瘍幹細胞という用語は、本明細書で同義に用いられ、かつ、高い増殖能を有し;非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下した1つまたは複数の種類の分化した後代細胞を産生することができ;かつ自己複製または自己維持のための対称細胞分裂を行うことができる、固形腫瘍由来の細胞集団を指す。癌幹細胞、腫瘍幹細胞、または固形腫瘍幹細胞のこれらの特性によって、これらの癌幹細胞は、易感染性のマウスに累代移植されると、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比較して触診可能な腫瘍を形成できる。癌幹細胞は、分化に対して無秩序な様式で自己複製を起こし、変異が生じるにつれて経時変化することができる異常細胞型を含む腫瘍を形成する。癌細胞、腫瘍細胞という用語、およびその文法上の等価物は、腫瘍細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性幹細胞の両方を含む、腫瘍または前癌病変に由来する細胞の全集団を指す。本明細書で使用する腫瘍細胞という用語は、再生および分化する能力が無い腫瘍細胞のみを指している場合に、腫瘍細胞と癌幹細胞を区別するために非腫瘍形成性のという用語で修飾される。腫瘍形成性のという用語は、自己複製の特性、および固形腫瘍幹細胞が腫瘍を形成するのを可能にする他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖を含む、固形腫瘍幹細胞の機能的特徴を指す。自己複製および他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖のこれらの特性によって、癌幹細胞は、易感染性マウスに累代移植されると、非腫瘍形成性腫瘍細胞と比較して触診可能な腫瘍を形成できる。非腫瘍形成性腫瘍細胞は累代移植されても、腫瘍を形成することができない。非腫瘍形成性腫瘍細胞は、固形腫瘍から腫瘍細胞を得た後に易感染性マウスに一次移植されると腫瘍を形成することがあるが、累代移植では腫瘍を生じないことが観察されている。対象という用語は、特定の治療のレシピエントとなるべき、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含むが、これに限定されない任意の動物を指す。典型的には、ヒト対象に関して、本明細書では対象および患者という用語が同義に用いられる。薬学的に許容される塩とは、薬学的に許容され、かつ親化合物の望ましい薬理活性を有する化合物の塩を指す。薬学的に許容される賦形剤、担体、または補助剤とは、本開示の抗体の少なくとも1つと共に対象に投与することができ、かつこの抗体の薬理活性を破壊せず、かつ治療量の化合物を送達するのに十分な用量で投与されたときに無毒である、賦形剤、担体、または補助剤を指す。薬学的に許容されるビヒクルとは、本開示の抗体の少なくとも1つと共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体を指す。治療的有効量という用語は、対象または哺乳動物の疾患または障害を治療するのに有効な、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の薬物の量を指す。癌の場合には、薬物の治療的有効量は、癌細胞の数を減少させること;腫瘍の大きさを縮小すること;例えば、軟組織および骨への癌の拡大を含む、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害または停止させること;腫瘍転移を阻害および停止させること;腫瘍成長を阻害および停止させること;癌に関連した1つまたは複数の症状をある程度軽減させること;罹患率と死亡率を低下させること;生活の質を改善すること;腫瘍の腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能力を低下させること;腫瘍内にある癌幹細胞の数もしくは頻度を低下させること;非腫瘍形成性状態に腫瘍形成性細胞を分化させること、あるいは、このような効果の組み合わせが可能である。薬物が既存の癌細胞の増殖を防止しかつまたはこれを死滅させるという点で、薬物を、細胞増殖抑制性およびまたは細胞傷害性であると言うことができる。例えば、治療するもしくは治療もしくは治療するためにまたは寛解するもしくは寛解するためにという用語は、1診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒する、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を減速させる、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を和らげる、およびまたは診断された病理学的状態もしくは障害の進行を止める治療的処置と、2標的とされた病理学的状態もしくは障害の発症を阻止およびまたは遅らせる予防的処置または防止的処置の両方を指す。従って、治療を必要とする者には、既に障害がある者;障害になりやすい者;および障害を予防しようとする者が含まれる。ある態様では、対象は、癌細胞の数が減少していること、もしくは癌細胞が完全に存在しないこと;腫瘍の大きさが縮小していること;軟組織および骨への癌の拡大を含む、末梢器官への癌細胞浸潤が阻害されていること、もしくは末梢器官への癌細胞浸潤が無いこと;腫瘍転移が阻害されていること、もしくは腫瘍転移が無いこと;腫瘍成長が阻害されていること、もしくは腫瘍成長が無いこと;特定の癌に関連する1つもしくは複数の症状が軽減していること;罹患率および死亡率が低下していること;生活の質が改善していること;腫瘍の腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能力が低下していること;腫瘍内にある癌幹細胞の数もしくは頻度が低下していること;非腫瘍形成性状態に腫瘍形成性細胞が分化していること;または効果のいくつかの組み合わせの1つまたは複数を示すのであれば、本発明の方法に従って癌が首尾良く治療されている。本明細書において同義に用いられるポリヌクレオチドまたは核酸は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、およびまたはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質でもよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含んでもよい。ヌクレオチド構造への修飾が存在するのであれば、ポリマーが組み立てられる前に付与されてもよく、ポリマーが組み立てられた後に付与されてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分と結合することによってさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば、キャップ、類似体による1つまたは複数の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷結合および荷電結合による修飾、ペンダント部分、例えば、タンパク質を含む修飾、インターカレーターによる修飾、キレート剤を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾結合による修飾、ならびに非修飾型のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換してもよく、標準的な保護基によって保護してもよく、さらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を調製するために活性化してもよく、固体支持体と結合してもよい。5末端OHおよび3末端OHをリン酸化してもよく、アミンまたは1~20個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換してもよい。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、2Oメチル、2Oアリル、2フルオロ、または2アジドリボース、炭素環式糖類似体、αアノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドを含む、当技術分野において一般に知られている、リボース糖またはデオキシリボース糖の類似型を含有してもよい。1つまたは複数のホスホジエステル結合を、別の結合基で置換することができる。これらの別の結合基には、リン酸基が、PS、PS、NR2、PR、POR、COまたはCH2で置換される態様が含まれるが、これに限定されない。式中、それぞれのRまたはRは独立して、H、またはエーテル結合を含有してもよい置換もしくは非置換アルキル、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、あるいはアラルドイルである。ポリヌクレオチド内の結合は全て同一である必要はない。前記の説明は、RNAおよびDNAを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域とも知られる3つの相補性決定領域でつながれた4つのフレームワーク領域からなる。各鎖内のCDRはFRによって近くにまとめられ、他の鎖からのCDRは抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRの決定には少なくとも2種類の技法異種間配列可変性に基づくアプローチ;および抗原抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチJMolecBiol273927948がある。さらに、CDRを決定するために、時として、これらの2つのアプローチの組み合わせが当技術分野において用いられる。ベクターという用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができる、好ましくは、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したDNAまたはRNA発現ベクター、リポソームにカプセル化されたDNAまたはRNA発現ベクター、およびある特定の真核細胞、例えば、プロデューサー細胞が含まれるが、これに限定されない。ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において同義に用いられる。ポリマーは直鎖または分岐鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、あるいは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの他の任意の操作もしくは修飾によって改変されたアミノ酸ポリマーを含む。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。本発明のポリペプチドは、ある態様では抗体をベースとするので、単鎖または結合した鎖として生じでもよいことが理解される。2種類またはそれ以上の核酸またはポリペプチドの文脈において、同一のまたはパーセント同一性という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を全く考慮することなく、最大一致を得るように比較およびアラインメントされた時に、同じであるか、または特定のパーセントの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において公知である。配列アラインメントアルゴリズムのこのような非限定的な一例は、Karlinetal1993ProcNatlAcadSci9058735877において改良され、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれた、Karlinetal1990ProcNatlAcadSci8722642268に記載のアルゴリズムである。ある態様では、GappedBLASTを、Altschuletal1997NucleicAcidsRes2533893402に記載のように使用することができる。BLAST2、WUBLAST2、ALIGN、ALIGN2、またはMegalignは、配列をアラインメントするために使用することができる公的利用可能なさらなるソフトウェアプログラムである。ある態様では、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアのGAPプログラムを用いて、および1、2、3、4、5、または6のレングスウェイトを用いて決定される。ある特定の他の態様では、NeedlemanandWunsch444453のアルゴリズムを組み込んでいる、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる。または、ある態様では、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、MyersandMillerのアルゴリズムを用いて決定される。例えば、パーセント同一性は、ALIGNプログラムを使用し、PAM120と、残基表、ギャップレングスペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによって最大限アラインメントするための適切なパラメータは当業者によって決定することができる。ある態様では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが用いられる。ある態様では、第2の配列アミノ酸に対する第1のアミノ酸配列のXのパーセント同一性は、100xで計算される。式中、Yは、第1の配列および第2の配列のアラインメントにおいて同一マッチとスコアされたアミノ酸残基の数であり、Zは、第2の配列における残基の総数である。第1の配列の長さが第2の配列より長ければ、第2の配列に対する第1の配列のパーセント同一性は、第1の配列に対する第2の配列のパーセント同一性より長くなるだろう。非限定的な例として、特定のポリヌクレオチドが参照配列に対してある特定のパーセント配列同一性を有するかどうかは、ある態様では、Bestfitプログラムを用いて決定することができる。Bestfitは、2つの配列間の最良の相同性セグメントを見つけるために、SmithandWatermanAdvancesinAppliedMathematics2482489の局所相同性アルゴリズムを用いる。特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と95同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用する場合、参照ヌクレオチド配列の完全長にわたって同一性パーセントが計算され、参照配列におけるヌクレオチド総数の5までの相同性ギャップが許されるように、パラメータが設定される。ある態様では、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一である。実質的に同一であるとは、2つの核酸またはポリペプチドが最大限一致するように比較および整列された時に、配列比較アルゴリズムまたは目視検査を用いて測定された場合に、少なくとも70、少なくとも75、好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、ある態様では少なくとも95、96、97、98、99のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約10、好ましくは約20、より好ましくは約40~60残基、またはその間の任意の整数値の配列の領域にわたって、好ましくは、60~80残基より長い領域にわたって、より好ましくは少なくとも約90~100残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、比較されている配列、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域の完全長にわたって実質的に同一である。保存的アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換である。塩基性側鎖、酸性側鎖、無電荷極性側鎖、非極性側鎖、β分枝側鎖、および芳香族側鎖を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換するのが保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体と、抗原、すなわち、ポリペプチドまたは抗体が結合する1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体との結合を阻止しない。抗原結合を妨げない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当技術分野において周知であるKobayashietalProteinEng12879884およびBurksetalProcNatlAcadSciUSA94412417を参照されたい。本開示および特許請求の範囲において用いられる単数形1つの、1つの、およびそのは、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数形を含む。本明細書においてを含むという言葉で態様が説明された場合はいつでも、からなるおよびまたはから本質的になるで説明される他の類似する態様も提供されることが理解される。例えば、本明細書においてAおよびまたはBという句で用いられるようなおよびまたはという用語は、AおよびB、AまたはB、A、ならびにBを含むことが意図される。同様に、例えば、A、B、およびまたはCという句で用いられるようなおよびまたはという用語は、以下の態様のそれぞれを含むことが意図される:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A;B;ならびにC。高ストリンジェンシー条件とは、洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば、50°Cで、0015M塩化ナトリウム00015Mクエン酸ナトリウム01ドデシル硫酸ナトリウムを使用すること;ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、50ホルムアミド01ウシ血清アルブミン01Ficoll01ポリビニルピロリドン50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH65750mM塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを42°Cで使用すること;または50ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム、01ピロリン酸ナトリウム、5×デンハート溶液、超音波処理済みサケ精子DNA、01SDS、および10硫酸デキストランを42°Cで使用し、42°Cで02×SSC中で洗浄し、55°Cで50ホルムアミド中で洗浄し、その後、EDTAを含む01×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55°Cで行うことによって特定されてもよい。IIFZD結合剤本発明は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する剤を提供する。これらの剤は、本明細書においてFZD結合剤と呼ばれる。ある態様では、前記剤は、2種類の、3種類の、4種類の、5種類の、6種類の、7種類の、8種類の、9種類の、または10種類のfrizzled受容体に特異的に結合する。これらの剤に結合するヒトfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択されてもよい。ある態様では、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびまたはFZD8を含む。ある態様では、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体はFZD7を含む。ある態様では、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体はFZD5およびまたはFZD8を含む。ある態様では、前記の剤は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する。FZD1~10の完全長アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は当技術分野において公知であり、本明細書においてもとして提供される。ある態様では、本明細書に記載の抗体または他のポリペプチドもしくは剤は、FZD7に特異的に結合する。ある態様では、前記の抗体、ポリペプチド、または剤は、さらに、1種類または複数の種類のさらなるヒトfrizzled受容体に特異的に結合してもよく、1種類または複数の種類のさらなるヒトfrizzled受容体と交差反応してもよい。ある態様では、本明細書に記載の抗体または他のポリペプチドもしくは剤は、FZD5に特異的に結合する。ある態様では、前記の抗体、ポリペプチド、または剤は、さらに、1種類または複数の種類のさらなるヒトfrizzled受容体に特異的に結合してもよく、1種類または複数の種類のさらなるヒトfrizzled受容体と交差反応してもよい。ある態様では、前記剤は、2種類またはそれ以上のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、2種類またはそれ以上のヒトfrizzled受容体は、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。ある態様では、2種類またはそれ以上のfrizzled受容体はFZD1を含み、第2のfrizzled受容体は、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。ある態様では、2種類またはそれ以上のfrizzled受容体はFZD2を含み、第2のfrizzled受容体は、FZD1、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。ある態様では、2種類またはそれ以上のfrizzled受容体はFZD5を含み、第2のfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。ある態様では、2種類またはそれ以上のfrizzled受容体はFZD5およびFZD8を含む。ある態様では、2種類またはそれ以上のfrizzled受容体はFZD7を含み、第2のfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD5、およびFZD8からなる群より選択される。ある態様では、前記剤は、3種類またはそれ以上の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、3種類またはそれ以上の種類のヒトfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される3種類またはそれ以上のfrizzled受容体を含む。ある態様では、前記剤は、さらに、1種類または複数の種類のさらなるヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、前記剤または抗体は、これらが結合する1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体における細胞外ドメインに特異的に結合する。ヒトfrizzled受容体のそれぞれの細胞外ドメインの配列は当技術分野において公知であり、としても提供される。ある態様では、前記剤または抗体は、これらが結合する、ヒトfrizzled受容体におけるFriドメインとも知られるに特異的に結合する。それぞれのヒトfrizzled受容体のFriドメインの配列は当技術分野において公知であり、としても提供される。ある態様では、本明細書に記載のFZDに結合する抗体またはポリペプチドの個々の抗原結合部位は、1種類、2種類、3種類、4種類、もしくは5種類ヒトfrizzled受容体に結合することができる。ある態様では、FZDに結合する抗体またはポリペプチドの個々の抗原結合部位は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1種類、2種類、3種類、4種類、または5種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合することができる。ある態様では、抗体またはポリペプチドの個々の結合部位は、少なくともFZD5およびFZD8に特異的に結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、または約10nMもしくはそれ以下の解離定数で、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に結合する。例えば、ある態様では、複数の種類のFZDに結合する、本明細書に記載のFZDに結合する剤または抗体は、約100nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、または約10nMもしくはそれ以下のKDでFZDに結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約40nMまたはそれ以下の解離定数で、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種類または複数の種類ののFZDのそれぞれに結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約10nMまたはそれ以下の解離定数で、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種類または複数の種類のFZDのそれぞれに結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約10nMまたはそれ以下の解離定数で、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちのFZDのそれぞれに結合する。ある態様では、特定のFZDに対する前記剤または抗体の解離定数は、FZD細胞外ドメインまたはFriドメインがBiacoreチップ上に固定化されているFZDFc融合タンパク質を用いて求められた解離定数である。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約1nM~約10nMの解離定数で、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のFZDの1種類または複数の種類のそれぞれに結合する。または、FZDに結合する剤または抗体は、約1nM~約10nMの解離定数で、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8の2種類以上に結合する。ある特定のさらなる態様において、FZDに結合する剤または抗体は、約1nM~約10nMの解離定数でFZD5およびFZD8の両方それぞれに結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、少なくとも約3nMの解離定数でFZD8に結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約3nM~30nMの解離定数でFZD8に結合する。ある特定の他の態様において、FZD8結合の解離定数は約3nM~10nMでもよい。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、約1μMもしくはそれ以下、約100nMもしくはそれ以下、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、約10nMもしくはそれ以下、または約1nMもしくはそれ以下のEC50で、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に結合する。例えば、ある態様では、複数の種類のFZDに結合する、本明細書に記載のFZDに結合する剤または抗体は、これらのFZDに対して、約40nMもしくはそれ以下、約20nMもしくはそれ以下、または約10nMもしくはそれ以下のEC50を有する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種類または複数の種類のFZDに対して、約20nMまたはそれ以下のEC50を有する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8のうちの1種類または複数の種類のFZDに対して、約10nMまたはそれ以下のEC50を有する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、FZD5およびまたはFZD8の結合に関して、約40nMもしくはそれ以下または20nMもしくはそれ以下のEC50を有する。ある態様では、FZDに結合する剤は、SEQIDNO10を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO12もしくはSEQIDNO14を含む軽鎖可変領域を含む抗体のエピトープと同じエピトープに結合するか、またはSEQIDNO10を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO12もしくはSEQIDNO14を含む軽鎖可変領域を含む抗体のエピトープと重複するエピトープに結合する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、SEQIDNO11の配列を含む重鎖およびSEQIDNO13もしくはSEQIDNO15の配列を含む軽鎖を含む抗体のエピトープと同じエピトープに結合するか、またはSEQIDNO11の配列を含む重鎖およびSEQIDNO13もしくはSEQIDNO15の配列を含む軽鎖を含む抗体のエピトープと重複するエピトープに結合する。ある態様では、FZD結合剤は、SEQIDNO85を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO86を含む軽鎖可変領域を含む抗体のエピトープと同じエピトープに結合するか、またはSEQIDNO85を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO86を含む軽鎖可変領域を含む抗体のエピトープと重複するエピトープに結合する。ある態様では、FZD結合剤は、競合的結合アッセイにおいて、ヒトfrizzled受容体との特異的結合について抗体と競合する。ここで、抗体は、SEQIDNO10を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO12またはSEQIDNO14を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様では、FZD結合剤は、ヒトfrizzled受容体との特異的結合について、SEQIDNO11の配列を含む重鎖およびSEQIDNO13またはSEQIDNO15の配列を含む軽鎖を含む抗体と競合する。ある態様では、ヒトfrizzled受容体との特異的結合について剤が競合する抗体は、18R5IgG抗体である。ある特定の他の態様において、抗体は18R8IgG抗体である。ある態様では、FZD結合剤は、競合的結合アッセイにおいて、ヒトfrizzled受容体との特異的結合について抗体と競合する。ここで、抗体は、SEQIDNO85を含む重鎖可変領域およびSEQIDNO86を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様では、FZD結合剤は、FZDにおけるWntの結合と直接競合するか、またはFZDにおけるWntの結合を直接阻害する。ある態様では、FZDに結合する剤または抗体は、本発明者らが生物学的結合部位と名付けたヒトfrizzled受容体の領域の少なくとも一部に結合する。ヒトFZD8において、BBSは、以下からなる:アミノ酸72、74~75、78、92、121~122、および129~132からなる立体構造エピトープ;配列GLEVHQからなるFZD8の領域;ならびに配列YGFAからなるFZD8の領域。FZD1~7、FZD9、およびFZD10上にあるBBSの対応する残基は、以下の表1および図8において特定している。ある態様では、リガンドとFZDとの結合をブロックする剤は、リガンドとBBSとの結合を阻害する。ある態様では、BBSの少なくとも一部に結合する剤はまた、ヒトfrizzled受容体上の他の1つまたは複数の領域に結合してもよいことが理解される。言い換えると、ある態様では、FZDに結合する剤または抗体が結合するエピトープは、BBSと重複するが、BBSの中に完全に含まれない、FZD受容体の細胞外ドメイン内の領域である。ある特定の他の態様において、FZDに結合する剤または抗体が結合するエピトープは、BBSの中に完全に含まれる。表1FZD受容体の生物学的結合部位理論に拘束されるものではないが、BBSは、可能性のあるリガンド結合部位、例えば、Wnt結合部位を含むと考えられている。FZD8上で、この可能性のあるリガンド結合部位は、アミノ酸72、74~75、78、92、121~122、および129~132によって形成される立体構造エピトープを含む。FZD1~7、FZD9、およびFZD10上の可能性のあるリガンド結合部位の対応する残基を、図8の配列アラインメントにおいて示した。ある態様では、リガンドとBBSとの結合をブロックする剤は、リガンドと、この立体構造エピトープの結合を阻害する。ある態様では、このリガンド結合部位の少なくとも一部に結合する剤はまた、ヒトfrizzled受容体上の他の領域に結合してもよいことが理解される。ある特定の他の態様において、剤は、立体構造エピトープ外の、どのFZD部分にも結合しない。ある態様では、前記剤は、ヒトfrizzled受容体がFZD8である場合に、ヒトfrizzled受容体における配列の少なくとも一部に結合する、またはヒトfrizzled受容体がFZD1~7、FZD9、もしくはFZD10である場合に、対応する配列の少なくとも一部に結合する。FZD上のこの領域は、図8および図9において特定しているBBSの上端を構成する。様々なfrizzled受容体におけるFZD8のエピトープに対応する配列は以下の表2において特定し、図8のアラインメントからも明らかである。ある態様では、前記剤は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される、ヒトfrizzled受容体に特異的に結合し、剤は、ヒトfrizzled受容体におけるの少なくとも一部に結合する。ある態様では、剤は、ヒトfrizzled受容体FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびまたはFZD8における配列AGLEVHQFの少なくとも一部に特異的に結合する。ある態様では、前記剤は、FZD8の配列AGLEVHQFに対応する、FZD3、FZD4、FZD6、FZD9、およびまたはFZD10における配列の少なくとも一部に結合する。ある態様では、前記剤は、ヒトfrizzled受容体FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびまたはFZD8における配列GLEVHQの少なくとも一部に特異的に結合する。この配列は、図9に示したBBSの上端である。ある態様では、前記剤は、FZD8の配列GLEVHQに対応する、FZD3、FZD4、FZD6、FZD9、およびまたはFZD10の配列の少なくとも一部に結合する。以下の表2の2番目および3番目の縦列において、FZD8の配列GLEVHQに対応する配列に下線を付し、この配列は図8の配列アラインメントから明らかである。ある態様では、FZD8のSEQIDNO67もしくは68の少なくとも一部に結合する、または別のFZDの対応するエピトープに結合する剤は、リガンドとFZDとの結合を阻害する。ある態様では、前記の示された領域に結合する剤はまた、ヒトfrizzled受容体上の他のさらなる領域にも結合してよい。表2ヒトfrizzled受容体上の対応する領域FZD8のaa66~71GLEVHQに対応する配列に下線を付している。FZD8のaa125~128YGFAに対応する配列に下線を付している。ある態様では、FZD結合剤は、ヒトfrizzled受容体がFZD8である場合に、BBSの下端を構成する配列QYGFAからなる領域の少なくとも一部に結合する、またはヒトfrizzled受容体がFZD1~7、FZD9、もしくはFZD10である場合に、対応する配列からなる領域の少なくとも一部に結合する。様々なfrizzled受容体における領域QYGFAに対応する配列は、図8および上の表2において特定している。ある態様では、FZD結合剤は、ヒトfrizzled受容体がFZD8である場合に、BBSの下端である配列YGFAからなる領域の少なくとも一部に結合する、またはヒトfrizzled受容体がFZD1~7、FZD9、もしくはFZD10である場合に、対応する配列からなる領域の少なくとも一部に結合する。様々なfrizzled受容体における領域YGFAに対応する配列は、図8において特定し、かつ上の表2の4番目の縦列において下線を付している。ある態様では、FZD8のSEQIDNO66もしくはSEQIDNO74の少なくとも一部、または別のFZDのその対応する配列に結合する剤は、リガンドとFZDとの結合を阻害する。ある態様では、この領域に結合する剤はまた、ヒトfrizzled受容体上の他の場所の1つまたは複数のアミノ酸残基に結合してもよい。ある態様では、FZD結合剤は、BBSの上端を形成する領域の少なくとも一部、ならびにBBSの下端を形成する領域の少なくとも一部に結合する。ある態様では、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびもしくはFZD8における、FZD8における、FZD8におけるAGLEVHQF、ならびにまたはFZD8におけるGLEVHQ、ならびにあるいは異なるヒトfrizzled受容体におけるこれらの配列のいずれかに対応する配列の少なくとも一部に結合するFZD結合剤はさらに、FZD8におけるQYGFAもしくはFZD8におけるYGFA、およびまたはFZD1~7、FZD9、もしくはFZD10におけるこれらの配列の1つに対応する配列の少なくとも一部に結合する。ある態様では、FZD結合剤は、FZD8における配列GLEVHQの少なくとも一部に結合し、FZD8における配列YGFAの少なくとも一部に結合する。ある態様では、FZD結合剤は、FZD8の配列GLEVHQに対応する、FZD1~7、FZD9、またはFZD10の領域の少なくとも一部に結合し、FZD8の配列YGFAに対応する、FZD1~7、FZD9、またはFZD10の領域の少なくとも一部に結合する。ある態様では、示された配列に結合するFZD結合剤はまた、これらが結合する、ヒトfrizzled受容体における他の場所の1つまたは複数の配列にも結合する。言い換えると、ある態様では、FZDに結合する剤または抗体が結合するエピトープは、前記の配列と一部しか重複しないFZD細胞外ドメイン内の領域である。ある特定の他の態様において、FZD結合剤が結合するエピトープ全体が前記の配列の中に完全に含まれる。ある態様では、FZD結合剤は、ヒトFZD受容体のBBSのくぼみに結合する。例えば、以下の実施例にある表16に列挙したくぼみの残基を参照されたい。ある態様では、FZD8のL75は剤の結合に必要である。ある態様では、BBSのくぼみの中に結合するFZD結合剤の分子量は約2000ダルトン未満または約1000ダルトン未満でもよい。FZD結合剤は、ポリペプチド、脂質、アプタマー、低分子、または他の化合物でもよい。ある態様では、FZD結合剤は、約100以下のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。ある態様では、前記ポリペプチドは約20未満のアミノ酸を含む。ポリペプチドは改変されてもよく、改変されなくてもよい。ある態様では、前記剤は、SEQIDNO98~111および113~116からなる群より選択される配列と少なくとも約80の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む。ある態様では、前記剤はSEQIDNO112を含む。場合によっては、前記剤はSEQIDNO108を含んでもよい。ある態様では、前記剤はポリペプチドである。ある態様では、前記剤またはポリペプチドは抗体である。ある態様では、前記抗体はIgG1抗体またはIgG2抗体である。ある態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。ある態様では、前記抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある態様では、前記抗体は抗体断片である。本発明の抗体または他の剤は、当技術分野において公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイには、例えば、BIAcore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技法を用いた、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これに限定されない。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である。例えば、抗体とヒトfrizzled受容体との特異的結合は、ELISAを用いて求めることができる。ELISAアッセイは、抗原を調製する工程、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする工程、検出可能な化合物、例えば、酵素基質が結合した、FZDに結合する抗体または他のFZD結合剤を、ウェルに添加する工程、ある期間にわたってインキュベートする工程、および抗原の存在を検出する工程を含む。ある態様では、FZDに結合する抗体または剤には、検出可能な化合物が結合していないが、その代わりに、FZDに結合する抗体または剤を認識する第2の結合抗体がウェルに添加される。ある態様では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、FZDに結合する抗体または剤をウェルにコーティングし、コーティングされたウェルに抗原を添加した後に、検出可能な化合物が結合した第2の抗体を添加してもよい。当業者であれば、検出されるシグナルを増強するために改変することができるパラメータ、ならびに当技術分野において公知のELISAの他のバリエーションについてよく知っているであろう。ヒトfrizzled受容体に対する抗体または他の剤の結合親和性および抗体抗原相互作用のオフレートは、競合的結合アッセイによって求めることができる。競合的結合アッセイの一例は、漸増量の非標識抗原の存在下で、標識された抗原またはその断片もしくはバリアントと関心対象の抗体とをインキュベーションした後に、標識された抗原に結合した抗体を検出する工程を含む、ラジオイムノアッセイである。frizzled受容体に対する抗体の親和性および結合のオフレートは、スキャッチャードプロット分析によってデータから求めることができる。ある態様では、BIAcore動態解析を用いて、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に結合する抗体または剤の結合のオンレートおよびオフレートを求める。BIAcore動態解析は、チップ表面上にFZD抗原が固定化されたチップからの抗体の結合および解離を解析する工程を含む。ある態様では、前記剤は、前記剤が結合する、少なくとも1種類のヒトfrizzled受容体のアンタゴニストである。ある態様では、前記剤は、結合されるヒトfrizzled受容体の1つまたは複数の活性の少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約90、または約100を阻害する。ある態様では、FZD結合剤は、リガンドと少なくとも1種類のヒトfrizzled受容体との結合を阻害する。ある態様では、FZD結合剤は、リガンドと、ヒトfrizzled受容体の生物学的結合部位との結合を阻害する。ある態様では、リガンドはヒトWntタンパク質である。19種類のヒトWntタンパク質WNT1、WNT2、WNT2B13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、およびWNT16が同定されている。ある態様では、前記剤は、WNT3AとFZD8との結合を阻害する。ある態様では、FZD結合剤によって得られる、特定のリガンドと特定のヒトfrizzledタンパク質との結合の阻害は、少なくとも約10、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約90、または少なくとも約95である。ある態様では、リガンド、例えば、WntとFZDとの結合を阻害する剤はWntシグナル伝達をさらに阻害する。ある態様では、FZD結合剤はWntシグナル伝達を阻害する。Wntシグナル伝達を阻害するFZD結合剤は、ある態様では、1種類または複数の種類のWntによるシグナル伝達を阻害することができるが、必ずしも全種類のWntによるシグナル伝達を阻害しないことが理解される。ある特定の他の態様において、全種類のWntによるシグナル伝達が阻害されてもよい。ある態様では、WNT1、WNT2、WNT2B13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、およびWNT16からなる群より選択される1種類または複数の種類のWntによるシグナル伝達が阻害される。ある態様では、阻害されるWntシグナル伝達は、WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b、およびまたはWNT10Bによるシグナル伝達である。ある態様では、前記剤は、WNT1、WNT3A、WNT7b、およびWNT10Bによるシグナル伝達を阻害する。特定の態様において、前記剤は、WNT3Aによるシグナル伝達を阻害する。ある態様では、FZD結合剤により得られる、Wntによるシグナル伝達の阻害は、少なくとも約10、少なくとも約25、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約90、または少なくとも約95の、Wntによるシグナル伝達レベルの低下である。ある態様では、阻害されるWntシグナル伝達は標準的Wntシグナル伝達である。FZD結合剤がWntシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイが当技術分野において公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCFLucレポーターベクターを用いた、細胞をベースとするルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、インビトロで、標準的Wntシグナル伝達レベルを測定することができる。1種類または複数の種類のWntとFZD結合剤の存在下でのWntシグナル伝達レベルを、FZD結合剤が存在しない状態でのシグナル伝達レベルと比較する。このようなルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、標準的Wntシグナル伝達の阻害を評価するための非限定的な具体例を、下記の実施例3および実施例11に示した。TCFlucレポーターアッセイに加えて、標準的Wntシグナル伝達に対するFZD結合剤の作用は、βカテニンにより調節される遺伝子、例えば、cmyc、サイクリンD1、およびまたはフィブロネクチンの発現レベルに対する前記剤の作用を測定することによってインビトロまたはインビボで測定することができる。ある態様では、Wntシグナル伝達に対する剤の作用はまた、Dishevelled1、Dishevelled2、Dishevelled3、LRP5、LRP6、およびまたはβカテニンのリン酸化状態に対する前記剤の作用を測定することによって評価することもできる。なおさらなる態様において、Wntシグナル伝達に対するFZD結合剤の作用は、Wntシグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルに及ぼすFZD結合剤の影響を評価することによって決定される。ある態様では、FZD結合剤は、以下の作用の1つまたは複数を有する:腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍内の癌幹細胞頻度の低下による腫瘍の腫瘍形成能の低下、腫瘍成長の阻害、生存の増大、腫瘍細胞の細胞死の誘発、非腫瘍形成性状態への腫瘍形成性細胞の分化、または腫瘍細胞の転移の阻止。ある態様では、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体または他の剤は、結合している毒素、化学療法剤、放射性同位体、または他のこのような剤を介して細胞死を誘発する。例えば、ある態様では、ヒトfrizzled抗体に対する抗体に、タンパク質内部移行により、FZDを発現する腫瘍細胞において活性化される毒素が結合している。ある特定の他の態様において、前記剤または抗体には、毒素、化学療法剤、または放射性同位体が結合していない。ある態様では、FZD結合剤は腫瘍成長を阻害することができる。ある態様では、FZD結合剤は、インビボで腫瘍成長を阻害することができる。ある態様では、FZD結合剤は、腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある態様では、前記剤または抗体は、動物モデル、例えば、マウス異種移植片モデルにおいて、癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある態様では、腫瘍内の癌幹細胞の数または頻度は、少なくとも約12、約13、約15、約110、約150、約1100、または約11000に低下する。ある態様では、癌幹細胞の数または頻度の低下は、動物モデルを用いた限界希釈アッセイによって求められる。抗FZD抗体の効力を試験するために用いられる限界希釈アッセイの一例を、下記の実施例8に示した。腫瘍内の癌幹細胞の数または頻度の低下を求める限界希釈アッセイの使用に関するさらなる例およびガイダンスは、例えば、国際公開公報第2008042236号、米国特許出願公開第20080064049号、および米国特許出願公開第20080178305号において見られる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、ヒトfrizzled受容体に対する抗体は、抗体依存性細胞傷害を介して、FZDタンパク質を発現する細胞の細胞死を媒介する。ADCCは、抗体のFc部分を認識するエフェクター細胞による細胞溶解を伴う。例えば、多くのリンパ球、単球、組織マクロファージ、顆粒球、および好酸球がFc受容体を有し、細胞溶解を媒介することができる。ある態様では、1種類または複数の種類のFZDに対する抗体は、補体依存性細胞傷害を活性化することによって、FZDタンパク質を発現する細胞の細胞死を誘発する。CDCは、血清補体と抗体のFc部分とが結合し、その後に、補体タンパク質カスケードが活性化して、細胞膜が傷つけられ、最終的に、細胞死が起こることを伴う。抗体の生物学的活性は、かなりの程度まで、抗体分子の定常ドメインまたはFc領域によって決まることが知られている。異なるクラスおよびサブクラスの抗体はこの点で異なり、同じサブクラスであるが異なる種に由来する抗体も同様である。ヒト抗体のうち、IgMは、補体に結合する抗体の中で最も効率的なクラスであり、これにIgG1、IgG3、およびIgG2が続くのに対して、IgG4は、補体カスケードを全く活性化しないように見える。本発明によって、望ましい生物学的活性を有する、これらのクラスの抗体が調製された。1種類または複数の種類のFZDに対する特定の抗体が、補体活性化およびまたはADCCによって標的細胞の溶解を媒介する能力をアッセイすることができる。関心対象の細胞をインビトロで増殖および標識する。抗体を、抗原抗体複合体によって活性化することができる血清補体または免疫細胞と組み合わせて、細胞培養物に添加する。例えば、溶解細胞からの標識の放出によって、標的細胞の細胞溶解素が検出される。実際には、抗体は、補体およびまたは免疫細胞の供給源として患者自身の血清を用いてスクリーニングすることができる。次いで、インビトロ試験において補体を活性化することができる抗体またはADCCを媒介することができる抗体を、その患者の治療に使用することができる。本発明は、1つのCDRにつき4個までの保存的アミノ酸置換がある、18R5およびまたは18R8のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、およびまたは6つを含む、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を含むが、これに限定されない、ポリペプチドを提供する。従って、本発明は、18R5およびまたは18R8のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、およびまたは6つを含む、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を含むが、これに限定されない、ポリペプチドを提供する。ある態様では、ポリペプチドは、18R8の重鎖CDR3およびまたは18R5もしくは18R8の軽鎖CDR3を含む。ある態様では、重鎖CDRは重鎖可変領域内に含まれる、およびまたは軽鎖CDRは軽鎖可変領域内に含まれる。例えば、本発明は、ヒトfrizzled受容体に特異的に結合するポリペプチドを提供する。ここで、前記ポリペプチドは、、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR2;およびあるいは、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む。ある態様では、前記ポリペプチドは、、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO4もしくはSEQIDNO7のバリアントを含む、軽鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO5またはSEQIDNO8のバリアントを含む、軽鎖CDR2;およびあるいは、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO6またはSEQIDNO9のバリアントを含む、軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。従って、本発明は、を含む重鎖CDR1、を含む重鎖CDR2、およびまたはを含む重鎖CDR3を含む、ポリペプチドまたは抗体を提供する。ある態様では、軽鎖CDRは、抗体重鎖の可変領域内に含まれる。ある態様では、重鎖CDRの1つまたは複数を含むポリペプチドまたは抗体は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、CDRは、1個、2個、3個、または4個の保存的アミノ酸置換で改変されている。ある態様では、重鎖CDRはそれぞれ、1~2個以下の保存的アミノ酸置換で改変されている。本発明はまた、ヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を提供する。ここで、抗体は、、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR2;および、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む。ある態様では、前記抗体は、、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO4もしくはSEQIDNO7のバリアントを含む、軽鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO5もしくはSEQIDNO8のバリアントを含む、軽鎖CDR2;および、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO6もしくはSEQIDNO9のバリアントを含む、軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。一部の別の態様において、前記抗体は、代わりに、を含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2;およびを含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある態様では、前記抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびまたはFZD8に特異的に結合する。ある態様では、前記抗体は、FZD5およびFZD8を含む、2種類またはそれ以上のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。さらに、本発明は、ヒトfrizzled受容体に特異的に結合するポリペプチドを提供する。ここで、前記ポリペプチドは、、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO4もしくはSEQIDNO7のバリアントを含む、軽鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO5もしくはSEQIDNO8のバリアントを含む、軽鎖CDR2;およびあるいは、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含むSEQIDNO6もしくはSEQIDNO9のバリアントを含む、軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。配列、または4個までの保存的アミノ酸置換を有するSEQIDNO71の配列を含む、軽鎖CDR1、配列KNRPSG、または4個までの保存的アミノ酸置換を有するSEQIDNO72の配列を含む、軽鎖CDR2、およびあるいは配列SASL、または4個までの保存的アミノ酸置換を有するSEQIDNO73の配列を含む、軽鎖CDR3を含むポリペプチドまたは抗体も提供される。本発明はまた、を含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびまたはを含む軽鎖CDR3を含むポリペプチドまたは抗体を提供する。ある態様では、前記ポリペプチドまたは抗体は、を含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。ある特定の他の態様において、前記ポリペプチドまたは抗体は、を含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。ある態様では、軽鎖CDRは、抗体軽鎖の可変領域内に含まれる。ある態様では、ポリペプチドまたは抗体は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、1つまたは複数の軽鎖CDRを含むポリペプチドまたは抗体は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある態様では、CDRは、1個、2個、3個、または4個の保存的改変によって改変されている。ある態様では、軽鎖CDRはそれぞれ、1~2個以下の保存的アミノ酸置換で改変されている。ある態様では、前記抗体は、を含む重鎖CDR1、を含む重鎖CDR2、およびNFIKYVFANを含む重鎖CDR3;ならびにまたはを含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。ある態様では、前記抗体は、を含む重鎖CDR1、を含む重鎖CDR2、およびを含む重鎖CDR3;ならびにを含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。ある態様では、前記抗体は、を含む重鎖CDR1、を含む重鎖CDR2、およびを含む重鎖CDR3、ならびにを含む軽鎖CDR1、を含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。ある態様では、CDRは、1個、2個、3個、または4個の保存的アミノ酸置換によって改変されている。ある態様では、CDRはそれぞれ、1~2個以下の保存的アミノ酸置換で改変されている。さらに、本発明は、CDR1つにつき4個までの保存的アミノ酸置換を有する、抗FZD抗体44R24のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、およびまたは6つを含む、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を含むが、これに限定されない、ポリペプチドを提供する。従って、本発明は、44R24のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、およびまたは6つを含む、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を含むが、これに限定されない、ポリペプチドを提供する。ある態様では、前記ポリペプチドは、44R24の重鎖CDR3およびまたは44R24の軽鎖CDR3を含む。ある態様では、重鎖CDRは重鎖可変領域内に含まれる、およびまたは軽鎖CDRは軽鎖可変領域内に含まれる。本発明はまた、ヒトFZD5およびまたはFZD8に特異的に結合するポリペプチドを提供する。ここで、抗体は、、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR1;、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR2;およびSIVFDY、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、重鎖CDR3;ならびにあるいは、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、軽鎖CDR1;SG、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、軽鎖CDR2;およびGSWDTRPYPKY、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含むそのバリアントを含む、軽鎖CDR3を含む。ある態様では、前記抗体は、を含む重鎖CDR1、を含む重鎖CDR2、およびSIVFDYを含む重鎖CDR3;ならびにまたはを含む軽鎖CDR1、SGを含む軽鎖CDR2、およびを含む軽鎖CDR3を含む。本明細書に記載の個々の軽鎖または重鎖の1つを含むポリペプチド、ならびに軽鎖および重鎖の両方を含むポリペプチドも提供される。SEQIDNO10と少なくとも約80の配列同一性を有するポリペプチド;およびまたはSEQIDNO12もしくはSEQIDNO14と少なくとも約80の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドも提供される。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO10、12、または14と少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約97、または少なくとも約99の配列同一性を有するポリペプチドを含む。従って、ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO10と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチド、およびまたはSEQIDNO12もしくは14と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO10のアミノ酸配列を有するポリペプチド;およびまたはSEQIDNO12もしくはSEQIDNO14のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO11のアミノ酸配列を有するポリペプチド;およびまたはSEQIDNO13もしくはSEQIDNO15のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある態様では、前記ポリペプチドは抗体であり、およびまたは前記ポリペプチドは、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。例えば、本発明は、SEQIDNO10のアミノ酸配列を有するポリペプチド;およびSEQIDNO14のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体を提供する。ある態様においてSEQIDNO10を含むポリペプチドは重鎖可変領域である。ある態様では、SEQIDNO12または14を含むポリペプチドは、軽鎖可変領域である。ある態様では、SEQIDNO10、12、または14とある程度の配列同一性パーセントを有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換の点でのみSEQIDNO10、12、または14と異なる。ある態様では、前記ポリペプチドまたは抗体は、SEQIDNO10およびSEQIDNO12;SEQIDNO10およびSEQIDNO14;SEQIDNO11およびSEQIDNO13;またはSEQIDNO11およびSEQIDNO15を含む。さらに、本発明は、FZD5およびまたはFZD8に特異的に結合し、SEQIDNO85と少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約97、もしくは少なくとも約99の同一性を有するポリペプチド;およびまたはSEQIDNO86と少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約97、もしくは少なくとも約99の同一性を有するポリペプチドを含む、抗体または他のポリペプチドを提供する。ある特定の他の態様において、前記ポリペプチドまたは抗体は、SEQIDNO85およびまたはSEQIDNO86を含む。ある態様では、FZD結合剤は、18R8、18R5、18R4605、18R4805、および44R24IgG抗体からなる群より選択される抗FZD抗体を含むか、または該抗FZD抗体から本質的になるか、または該抗FZD抗体からなる。ある態様では、FZD結合剤は、米国特許出願公開第20070116701号において報告された44M1、44M2、44M13、44M15、44M17、44M18、18M4、18M6、18M17、18M18、54M1、54M2、54M3、54M4、54M5、54M6、または54M7抗体ではない。米国特許出願公開第20070116701号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、FZD結合剤は、FZD5に結合する抗体であるが、44M13ではない。ある態様では、FZD結合剤は、18R8IgG2抗体の重鎖および軽鎖を含む。ある態様では、FZD結合剤は、18R8IgG2抗体である。18R8IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、ブダペスト条約の規定に基づいて、2008年9月29日に、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVAUSAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA9540が割り当てられた。ある態様では、FZD結合剤は、18R5IgG2抗体の重鎖および軽鎖を含む。ある態様では、FZD結合剤は、18R5IgG2抗体である。18R5IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、ブダペスト条約の規定に基づいて、2008年9月29日にATCCに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA9541が割り当てられた。ある態様では、FZD結合剤は、2009年8月26日にATCCに寄託され、寄託指定番号PTA10307、PTA10309、またはPTA10311が割り当てられたプラスミドによってコードされるIgG抗体である。ある態様では、FZD結合剤は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびまたはFZD8との特異的結合について、ATCC寄託指定番号PTA9540、PTA9541、PTA10307、またはPTA10309を有するプラスミドによってコードされる抗体と競合する剤である。ある特定の他の態様において、FZD結合剤は、FZD5およびまたはFZD8との特異的結合について、ATCC寄託指定番号PTA10311を有するプラスミドによってコードされる抗体と競合する剤である。ある態様では、FZD結合剤の、マウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期は、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間である。ある態様では、FZD結合剤は、マウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期が少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のIgG抗体である。ポリペプチドおよび抗体などの剤の半減期を延ばす方法は当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を延ばす公知の方法には、pH60での抗体と新生児型Fc受容体とのpH依存性結合を高める、Fc領域への変異の導入が含まれる。Fc領域を欠く抗体断片の循環半減期を延ばす公知の方法には、ペグ化のような技法が含まれる。ポリクローナル抗体は、任意の公知の方法によって調製することができる。ポリクローナル抗体は、関連抗原を複数回、皮下注射または腹腔内注射することによって、動物を免疫することによって産生され、任意で、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミンが結合され、滅菌食塩水で希釈され、安定したエマルジョンを形成するためにアジュバントと組み合わせられる。次いで、ポリクローナル抗体は、このように免疫した動物の血液、腹水などから回収される。集めた血液を凝固させ、血清をデカントし、遠心分離によって遠心分離し、抗体価についてアッセイする。ポリクローナル抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む当技術分野において標準的な方法に従って血清または腹水から精製することができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、KohlerandMilsteinNature256495によって記載されたハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を上述のように免疫して、免疫に用いた抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発させる。リンパ球はまたインビトロで免疫することもできる。免疫化に続いてリンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適当なミエローマ細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させ、それらを次に、融合していないリンパ球およびミエローマ細胞から分離して、選択することができる。次いで、免疫沈降、免疫ブロッティング、またはインビトロ結合アッセイ、酵素結合免疫測定法によって決定される。選択された抗原に対して特異的に作られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法を用いるインビトロの培養で、またはインビボで動物中の腹水腫瘍として増殖することができる。次いで、ポリクローナル抗体について上述したように、モノクローナル抗体を培地または腹水から精製することができる。または、モノクローナル抗体はまた、米国特許第4816567号に記載されているように組換えDNA法を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRTPCRによって単離し、それらの配列を、従来の手順を用いて決定する。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクター中へクローニングし、それを、トランスフェクションされていなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、またはミエローマ細胞にトランスフェクションすると、宿主細胞はモノクローナル抗体を産生する。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種のCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから、記載されたように単離することができる。さらに、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換えDNA技術を用いた多くの異なるやり方で、代わりの抗体を作製するように改変することができる。ある態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、1キメラ抗体を作製するために、例えば、ヒト抗体の領域で、または2融合抗体を作製するために、非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。ある態様では、モノクローナル抗体の望ましい抗体断片を作製するために、定常領域は切断または除去される。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。ある態様では、ヒトfrizzled受容体に対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。ある態様では、このような抗体は、ヒト対象に投与された時の抗原性およびHAMA応答を低減するために治療に用いられる。ヒト化抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて作製することができる。ある特定の他の態様において、ヒトfrizzled受容体に対する抗体は、ヒト抗体である。ある特定の態様において、剤は、モノクローナル抗体などの抗体であり、これはマウス抗体ではない。当技術分野で公知の様々な技法を用いて、ヒト抗体を直接、調製することができる。インビトロで免疫し、標的抗原に対して作られた抗体を産生する免疫個体から単離した不死化ヒトBリンパ球を作製することができるBoemeretal1991JImmunol1478695および米国特許第5750373号を参照されたい。また、例えば、Vaughanetal1996NatBiotech14309314Sheetsetal1998ProcNatlAcadSci9561576162HoogenboomandWinter1991JMolBiol227381およびMarksetal1991JMolBiol222581に記載のように、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから、ヒト抗体を選択することができる。抗体ファージライブラリーの作製および使用のための技法はまた、米国特許第5969108号、同第6172197号、同第5885793号、同第6521404号同第6544731号同第6555313号同第6582915号同第6593081号同第6300064号同第6653068号同第6706484号および同第7264963号ならびにRotheetal2007JMolBiodoi101016jjmb200712018にも記載されている。親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略が当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体を作製するのに使用することができる。ヒト化抗体はまた、免疫されると、内因性免疫グロブリンを産生せずに、ヒト抗体の全レパートリーを産生することができる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作ることもできる。このアプローチは、米国特許第5545807号同第5545806号同第5569825号同第5625126号同第5633425号および同第5661016号に記載されている。本発明はまた、ヒトfrizzled受容体を特異的に認識する二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、少なくとも2種類のエピトープを特異的に認識および結合することができる抗体である。異なるエピトープが同じ分子の中にあってもよく、例えば、抗体が、ヒトfrizzled受容体と、例えば、1白血球上のエフェクター分子、例えば、T細胞受容体もしくはFc受容体、または2下記で詳述する細胞傷害剤の両方を特異的に認識し、結合することができるように異なる分子上にあってもよい。ある態様では、二重特異性抗体は、少なくとも1種類のヒトfrizzled受容体と、VEGF、Notchリガンド、例えば、delta様リガンド、もしくはjagged、または、Notch1、Notch2、Notch3、およびNotch4からなる群より選択される少なくとも1種類のNotch受容体のいずれかに特異的に結合する。二重特異性抗体は無傷の抗体または抗体断片でもよい。例示的な二重特異性抗体は2種類の異なるエピトープに結合することができ、このうちの少なくとも1つは本発明のポリペプチドに由来する。または、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームを、白血球上のトリガー分子、例えば、T細胞受容体分子、または細胞防御機構を、特定の抗原を発現する細胞に焦点を合わせるために、IgGのFc受容体に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体はまた、細胞傷害剤を、特定の抗原を発現する細胞に誘導するのに使用することができる。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害剤または放射性核種、キレート剤、例えば、EOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETAに結合するアームを有する。二重特異性抗体を作製するための技法は当技術分野において一般的なものである。二価を超える抗体も意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。従って、ある態様では、ヒトfrizzled受容体に対する抗体は多重特異性である。または、ある特定の他の態様において、本発明のFZD結合剤は二重特異性抗体ではない。ある態様では、抗体の抗原結合部位はそれぞれ、他の抗原結合部位と同一である。ある態様では、個々の抗原結合部位は、2種類以上のfrizzled受容体の間で相同である領域に結合する。ある態様では、抗原結合部位は、2種類以上のfrizzled受容体の間で相同である、BBSに存在する領域に結合する。ある態様では、本明細書に記載の抗体は単一特異性でもよい。例えば、ある態様では、抗体が含有する1つまたは複数の抗原結合部位はそれぞれ、1種類または複数の種類の同じヒトFZD受容体に結合することができる。ある態様では、本明細書に記載の単一特異性抗体の抗原結合部位は、1種類、2種類、3種類、4種類、もしくは5種類ヒトfrizzled受容体に結合することができる。ある態様では、例えば、腫瘍浸透性を増大させるための抗体断片が提供される。抗体断片の作製のための様々な技術が公知である。従来から、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質消化によって得られる。ある態様では、抗体断片は組換えによって作製される。Fab、Fv、およびscFv抗体断片は全て大腸菌内または他の宿主細胞内で発現させ、分泌させることができ、従って、これらの断片の大量産生が可能である。このような抗体断片を、上に議論した抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5641870号に記載されているように直鎖状抗体であってもよく、単一特異性もしくは二重特異性であってよい。抗体断片を作製するための他の技術は当業者には明白であろう。本発明によれば、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的な単鎖抗体の作製に技術を合わせることができる。さらに、Fab発現ライブラリーの構築に方法を合わせて、FZD受容体、またはその誘導体、断片、類似体、もしくはホモログに対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ有効な同定を可能にすることができる。抗体断片は、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF2断片;F2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFab断片;抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるFab断片、ならびにFv断片を含むが、これに限定されない当技術分野の技術によって作製することができる。さらに、特に、抗体断片の場合には、その血清半減期を延ばすように抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片中の適当な領域の変異による、抗体断片中へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、あるいは、ペプチドタグにエピトープを組み入れて、次いで、それを抗体断片のいずれかの端にまたは中間に融合することにより行うことができる。ヘテロ結合抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、共有結合した2つの抗体からなる。例えば、免疫細胞が望ましくない細胞を標的とするために、このような抗体が提案されている。この抗体は、架橋剤を必要とする方法を含む、合成タンパク質化学で公知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成させて、免疫毒素を構築することができる。この目的に適している試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル4メルカプトブチルイミダートが含まれる。本発明の目的のためには、改変抗体が、抗体とヒトFZD受容体のポリペプチドとの会合を提供する任意の型の可変領域を含むことができると認識されるはずである。この点で、可変領域は、液性応答の開始および所望の腫瘍に関連する抗原に対する免疫グロブリンの生成を誘起することができる、任意の型の哺乳動物を含んでもよく、これに由来するものであってよい。従って、改変抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、またはオオカミに由来してもよい。ある態様では、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域の両方がヒトである。他の態様では、結合特性を改善する、または分子の免疫原性を減少させるように、適合性を有する抗体の可変領域を操作する、または特異的に調整することができる。この点に関して、移入アミノ酸配列を含めることにより、本発明において有用な可変領域をヒト化、または他の方法で変えることができる。ある態様では、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインを、1つまたは複数のCDRの少なくとも一部の置き換えによって、必要な場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列変更によって改変する。CDRは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラス、さらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、CDRが、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すためには、CDRの全てを、供与側の可変領域からの完全なCDRで置き換えることは必要でない場合がある。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことのみが必要な場合がある。米国特許第5585089号、第5693761号および第5693762号で述べられた説明を考慮すれば、日常的な実験作業を行って、または試行錯誤によって、免疫原性が減少した機能的な抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内のことであろう。可変領域への変化にもかかわらず、当業者であれば、本発明の改変抗体は、天然のまたは変化していない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して、望ましい生化学的特徴が得られるように、例えば、腫瘍局在化が増大または血清半減期が減少するように、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部が欠失されている、または他の方法で変えられている抗体を含むことを理解するだろう。ある態様では、改変抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。本発明と適合する定常領域への改変は、1つまたは複数のドメイン内の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。すなわち、本明細書において開示された改変抗体は、3つの重鎖定常ドメインおよびまたは軽鎖定常ドメインの1つまたは複数の変化または改変を含んでもよい。ある態様では、1つまたは複数のドメインが部分的または完全に欠失している改変された定常領域が意図される。ある態様では、改変抗体は、CH2ドメイン全体が除去されている、ドメイン欠失構築物またはバリアントを含む。ある態様では、除かれた定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域によって付与される、ある程度の分子可撓性をもたらす短いアミノ酸スペーサーで置換される。これらの構成に加えて、定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と抗体が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化はまた炎症応答を刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体はFc領域を介して細胞に結合し、抗体Fc領域上のFc受容体部位は細胞上のFc受容体に結合する。IgG、IgE、IgA、およびIgMを含む、異なるクラスの抗体に特異的な多くのFc受容体がある。抗体と、細胞表面上のFc受容体が結合すると、貪食および抗体コーティング粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む、多くの重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。ある態様では、FZDに結合する抗体はエフェクター機能の変化をもたらし、次に、これは、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、定常領域ドメインが欠失または不活性化すると、改変された循環抗体のFc受容体結合が低下し、それによって、腫瘍局在化が増大し得る。他の場合では、本発明と一致する、定常領域の改変は補体結合を緩和し、従って、血清半減期を短くし、結合している細胞毒の非特異的結合を弱めるかもしれない。ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を無くすように、定常領域のさらに他の改変を使用することができる。ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分が無くなると、抗原特異性または抗体可撓性が増大することにより局在化が増大する。同様に、本発明による定常領域の改変は、当業者の十分に範囲内で、周知の生化学的または分子的な操作法を用いて容易に行うことができる。ある態様では、抗体であるFZD結合剤は、1つまたは複数のエフェクター機能を有さない。例えば、ある態様では、抗体は、抗体依存性細胞傷害活性を有さず、およびまたは補体依存性細胞傷害活性を有さない。ある態様では、抗体は、Fc受容体およびまたは補体因子に結合しない。ある態様では、抗体はエフェクター機能を有さない。ある態様では、改変抗体は、CH3ドメインをそれぞれの改変抗体のヒンジ領域へ直接融合するように操作できることに留意されたい。他の構築物では、ヒンジ領域と改変されたCH2およびまたはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーを設けることが望ましい場合がある。例えば、CH2ドメインが欠失され、残りのCH3ドメインがヒンジ領域に5~20個のアミノ酸スペーサーを用いて連結された、適合性を有する構築物を発現することができる。このようなスペーサーを付加することにより、例えば、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、またはヒンジ領域の可撓性を保つことができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性を有することが判明しており、構築物に対する望ましくない免疫応答を誘発する場合があることに留意すべきである。従って、ある態様では、構築物に付加されるどのスペーサーも、比較的、免疫原性が無く、または改変抗体の望ましい生化学特質が維持されるようにスペーサー全体が除かれさえする。定常領域ドメイン全体の欠失の他に、部分的欠失または少数のもしくは単一のアミノ酸の置換によっても、本発明の抗体を提供することができることが認識されよう。例えば、CH2ドメインの選択された区域の単一のアミノ酸の変異が、Fc結合を大幅に減少させ、それによって腫瘍の局在化を増大させるのに十分である可能性がある。同様に、1つまたは複数の定常領域ドメインの、調節しようとするエフェクター機能を制御する部分を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておく一方で、抗体の選択された特性を改善する可能性がある。さらに、上に示唆されるように、開示された抗体の定常領域は、結果として生じる構築物のプロファイルを向上させる、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変抗体の構成および免疫原プロファイルを実質的に維持する一方で、保存された結合部位によって提供される活性を妨害することが可能な場合がある。ある態様は、エフェクター機能の増加もしくは減少などの望ましい特性を増強するように、またはより多くの細胞毒素もしくは炭水化物接着をもたらすように、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含んでもよい。このような態様では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。本発明は、本明細書において示された、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはその抗体断片と実質的に相同のバリアントおよび等価物をさらに含む。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含有してもよい。例えば、保存的置換は、アミノ酸の、同じ一般クラス内の別のアミノ酸による置換、例えば、ある酸性アミノ酸の、別の酸性アミノ酸による置換、ある塩基性アミノ酸の、別の塩基性アミノ酸による置換、またはある中性アミノ酸の、別の中性アミノ酸による置換を指す。保存的アミノ酸置換によって意図されるものは当技術分野において周知である。本発明はまた、抗体が細胞傷害剤に結合している免疫結合体に関する。細胞傷害剤には、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素、放射性同位体などが含まれる。このような免疫結合体の作製において有用な化学療法剤には、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤が含まれる。使用することができる酵素活性を有する毒素およびその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。放射性結合抗体を作製するために、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reを含む、様々な放射性核種を利用することができる。抗体と細胞傷害剤の結合体は、Nスクシンイミジル3プロピオネート、イミノチオラン、イミドエステルの二官能基誘導体、活性エステル、アルデヒド、ビスアジド化合物ヘキサンジアミン、ビスジアゾニウム誘導体エチレンジアミン、ジイソシアネート、およびビス活性フッ素化合物などの様々な二官能基性タンパク質カップリング剤を用いて作製する。抗体と1つまたは複数の小分子毒素、およびCC1065、ならびにこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体との結合体も用いることができる。結合抗体は2種類の共有結合した抗体からなる。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、このような抗体が提案されている。前記の抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製できることが意図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル4メルカプトブチルイミダートが含まれる。有用な量を得る方法に関係なく、本発明の抗体は、多くの結合型または非結合型のいずれか1つで使用することができる。または、本発明の抗体は、非結合型または裸の型で使用することができる。ある態様では、抗体は、悪性細胞を排除するために、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を含む対象の天然の防御機構を利用するために非結合型で用いられる。ある態様では、抗体は、多くの周知のキレート剤または直接標識のいずれか1つを用いて、放射性同位体、例えば、90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、および188Reに結合することができる。他の態様において、開示された組成物は、薬物、プロドラッグ、または生物学的応答調節物質、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびリンホカイン、例えば、インターフェロンとカップリングした抗体を含んでもよい。本発明のさらに他の態様は、特定の生体毒素、例えば、リシンまたはジフテリア毒素と結合した抗体の使用を含む。さらに他の態様では、改変抗体は、他の免疫学的に活性なリガンドと複合体化してもよい。ここで、結果として生じる分子は、腫瘍性細胞およびエフェクター細胞、例えば、T細胞に結合する。使用するために、結合型改変抗体または非結合型改変抗体のどれを選択するかは、癌のタイプおよび病期、補助的治療の使用、ならびに患者の状態によって決まる。当業者であれば、本明細書の開示を考慮して、このような選択を容易に行うことができることが理解されるだろう。本発明のポリペプチドは、ヒトFZD受容体に対する抗体またはその断片を含む、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドでもよい。タンパク質の構造または機能に影響を及ぼすことなく、本発明の一部のアミノ酸配列を変えることができることが当技術分野において理解されるだろう。従って、本発明は、ヒトFZD受容体タンパク質に対する抗体もしくはその断片の実質的な活性を示す、またはヒトFZD受容体タンパク質に対する抗体もしくはその断片の領域を含む、ポリペプチドのバリエーションさらに含む。このような変異体には、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換が含まれる。前記のポリペプチドおよび類似体は、通常、タンパク質の部分にはない、さらなる化学的部分を含有するようにさらに改変することができる。これらの誘導体化部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。これらの部分はまた、タンパク質の望ましい副作用などを低減する、または無くすこともできる。これらの部分の概説は、REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES20thedMackPublishingCoEastonPAに見られる。本明細書に記載の単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって作製することができる。このような方法は、直接的なタンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築と、適切な形質転換宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。ある態様では、DNA配列は、組換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能類似体を得るために、部位特異的変異誘発によって変異誘発することができる。例えば、ZoelleretalProcNatlAcadSciUSA8156625066および米国特許第4588585号を参照されたい。ある態様では、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築される。このようなオリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を用いて、関心対象の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的に組み立てるための5オーバーハングまたは3オーバーハングを含有する。組み立てられたら、関心対象の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結する。適切に組み立てられたことは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列に機能的に連結しなければならない。ある態様では、ヒトfrizzled受容体に対する抗体またはその断片をコードするDNAを増幅および発現するために、組換え発現ベクターが用いられる。組換え発現ベクターは、抗FZD抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNAに由来するDNA断片が、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに機能的に連結されている、複製可能なDNA構築物である。転写単位は、一般的に、下記に詳述するような、遺伝子発現を調節する役割を有する遺伝因子またはエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列の集合を含む。このような調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含むことがある。通常、複製起点によって付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、これらの機能が互いに関連しているときに、機能的に連結されている。例えば、シグナルペプチドのDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。または、組換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される場合、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は、任意で、最終産物を得るために発現組換えタンパク質から後で切断されてもよい。発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択によって決まる。多種多様な発現宿主ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。FZDに結合するポリペプチドもしくは抗体の発現に適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または杆菌が含まれる。高等真核細胞には、下記に記載の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も使用することができる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と使用するのに適した適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Pouwelsetalに記載されている。この関連する開示は参照により本明細書に組み入れられる。抗体産生を含む、タンパク質を産生する方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第20080187954号、米国特許第6413746号および同第6660501号、ならびに国際公開公報第04009823号に見られる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物培養系または昆虫細胞培養系も有利に用いられる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ完全に機能するので実施可能である。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、Gluzmanに記載のサル腎臓細胞のCOS7株、ならびに、例えば、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣、HeLa、およびBHK細胞株を含む、適切なベクターを発現することができる他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5または3隣接非転写配列、ならびに5または3非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、LuckowandSummersBioTechnology647に概説されている。形質転換宿主により産生されたタンパク質は、任意の適切な方法に従って精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィーカラムクロマトグラフィー、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法が含まれる。適切なアフィニティカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオンSトランスフェラーゼをタンパク質に取り付けることができる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶学のような技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。例えば、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMilliporePellicon限外濾過ユニットを用いて、組換えタンパク質を培地に分泌する系からの上清を濃縮することができる。濃縮工程後に、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。または、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル基を有するマトリックスまたは基質を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般に用いられる他のタイプでもよい。または、陽イオン交換工程を使用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。最後に、FZD結合剤をさらに精製するために、疎水性RPHPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた、1つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー工程を使用することができる。均一な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全てを様々な組み合わせで使用することができる。細菌培養において産生された組換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離することができる。最後の精製工程には高速液体クロマトグラフィーを使用することができる。組換えタンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来法によって破壊することができる。抗体および他のタンパク質の精製のための当技術分野における公知の方法には、例えば、米国特許出願公開第20080312425号、同第20080177048号、および同第20090187005号に記載の方法が含まれる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、FZD結合剤は、抗体ではないポリペプチドである。高親和性で、タンパク質標的に結合する非抗体ポリペプチドを同定および作製するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、SkerraCurrOpinBiotechnol18295304、HosseetalProteinScience151427、GilletalCurrOpinBiotechnol17653658、NygrenFEBSJ275266876、およびSkerraFEBSJ275267783を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、FZDに結合するポリペプチドを同定産生するために、ファージディスプレイ技術が用いられてきた。ある態様では、ポリペプチドは、プロテインA、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。ある態様では、ポリペプチドは天然または非天然に改変されている。非限定的な例として、ポリペプチドは標識されてもよい。ある態様では、ポリペプチドはグリコシル化される、ペグ化される、リン酸化される、またはアセチル化される、アミド化される。ある態様では、改変はポリペプチドの安定性を高める、およびまたはインビボ半減期を延ばす。ある態様では、ポリペプチドは環状である。ある特定のさらなる態様において、ポリペプチドは1つまたは複数のNメチルアミノ酸を含む。ある態様では、FZD結合剤は、SEQIDNO98~112からなる群より選択される配列、もしくはSEQIDNO98~111からなる群より選択される配列と少なくとも約80のアミノ酸配列同一性を有する配列を含むポリペプチドである。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO98~111からなる群より選択される配列と少なくとも約85、少なくとも約88、または少なくとも約90のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO98~112からなる群より選択される環状ペプチドを含むか、該環状ペプチドから本質的になるか、または該環状ペプチドからなる。ある態様では、前記配列はSEQIDNO108である。ある特定の他の態様において、前記配列はSEQIDNO112である。ある特定の他の態様において、FZD結合剤は、SEQIDNO113~116からなる群より選択される配列と少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約88、もしくは少なくとも約90のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。ある特定の他の態様において、FZD結合剤は、SEQIDNO113~116からなる群より選択される配列を含むか、該配列から本質的になるか、もしくは該配列からなるポリペプチドである。ある態様では、FZD結合ポリペプチドの長さは約500アミノ酸未満、長さは約200アミノ酸未満、長さは約100アミノ酸未満、長さは約50アミノ酸未満、長さは約20アミノ酸アミノ酸未満、または長さは約15アミノ酸未満でもよい。このようなポリペプチドの長さは少なくとも約3、少なくとも約5、または少なくとも約7アミノ酸でもよい。従って、ある態様では、前記ポリペプチドの長さは約5~約20アミノ酸でもよい。ある態様では、前記ポリペプチドの長さは約7~約15アミノ酸である。いくつかの態様では、前記剤は非タンパク質分子である。ある態様では、前記剤は低分子である。非タンパク質FZD結合剤の同定において有用なコンビナトリアルケミストリーライブラリーおよび技法は当業者に公知である。例えば、KennedyetalJCombChem10345354、DolleetalJCombChem9855902、およびBhattacharyyaCurrMedChem81383404を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある特定のさらなる態様において、前記剤は、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、またはプロテオグリカンである。ある態様では、前記剤は脂質を含む。例えば、場合によっては、前記剤は脂肪酸またはその誘導体を含んでもよい。ある態様では、脂肪酸は、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、αリノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、またはドコサヘキサエン酸である。BBSのくぼみは疎水性であるので、1種類または複数の種類の脂質を含む剤は、くぼみを標的とするのに特に適している。ある態様では、前記剤は核酸アプタマーである。アプタマーは、他の分子に結合する能力に基づいて選択されたポリヌクレオチド分子である。いくつかの態様では、アプタマーはDNAポリヌクレオチドを含む。ある特定の他の態様において、アプタマーはRNAポリヌクレオチドを含む。ある態様では、アプタマーは、1つまたは複数の修飾核酸残基を含む。核酸アプタマーを作製する方法およびタンパク質との結合について核酸アプタマーをスクリーニングする方法は当技術分野において周知である。例えば、米国特許第5270163号、米国特許第5683867号、米国特許第5763595号、米国特許第6344321号、米国特許第7368236号、米国特許第5582981号、米国特許第5756291号、米国特許第5840867号、米国特許第7312325号、米国特許第7329742号、国際公開公報第02077262号、国際公開公報第03070984号、米国特許出願公開第20050239134号、米国特許出願公開第20050124565号、および米国特許出願公開第20080227735号を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある態様では、前記剤の分子量は少なくとも約100ダルトンである。ある態様では、前記剤の分子量は少なくとも約1000ダルトンである。ある態様では、前記剤の分子量は約2000ダルトン未満または約1000ダルトン未満である。さらに、本発明は、Wntシグナル伝達の阻害における効力、抗腫瘍効力、およびまたは癌幹細胞に対する効力について剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法には、剤に曝露されたことのある第1の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルと、剤に曝露されたことのない第2の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルとを比較する工程を含む方法が含まれるが、これに限定されない。ある態様では、これらの方法は、第1の固形腫瘍を剤に曝露するが、第2の固形腫瘍を剤に曝露しない工程;第1の固形腫瘍および第2の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルを評価する工程;ならびに第1の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルと、第2の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルとを比較する工程を含む。ある態様では、前記剤は、標準的Wntシグナル伝達経路の阻害剤であり、およびまたは1種類または複数の種類のヒトWntタンパク質と1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体との結合を阻害する。ある態様では、前記剤は、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する抗体である。ある態様では、第2の固形腫瘍と比較して、第1の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルが増加していることにより、固形腫瘍幹細胞に対する抗力が示される。ある特定の他の態様において、第2の固形腫瘍と比較して、第1の固形腫瘍における1種類もしくは複数の種類の分化マーカーのレベルが低下していることにより、固形腫瘍幹細胞に対する効力が示される。ある態様では、固形腫瘍は膵臓腫瘍である。ある態様では、固形腫瘍は膵臓腫瘍であり、1種類もしくは複数の種類の分化マーカーは、1種類または複数の種類のムチンおよびまたはクロモグラニンAを含んでもよい。ある特定の別の態様において、固形腫瘍は結腸腫瘍である。ある態様では、固形腫瘍は結腸腫瘍であり、1種類もしくは複数の種類の分化マーカーはサイトケラチン7を含む。膵臓および結腸ならびに他の腫瘍タイプの他の潜在的な分化マーカーが当業者に公知である。スクリーニング方法において潜在的な分化マーカーが有用なことは、当業者であれば、望ましい腫瘍タイプを、本明細書において開示された抗FZD抗体、例えば、18R5およびまたは44R24の1つまたは複数で治療し、次いで、治療された腫瘍によるマーカー発現の変化を、対照と比較して評価することによって容易に評価することができる。このような方法の非限定的な例は、例えば、以下の特定の実施例において見られる。さらなるスクリーニングアッセイに有用な試薬には、変異FZD誘導体、例えば、生物学的結合部位において1つまたは複数のアミノ酸置換がなされているfrizzled受容体Friドメインを含むポリペプチドが含まれる。ある態様では、Wntに対する変異ポリペプチドの結合親和性は、そのWntに対するfrizzled受容体の野生型Friドメインを含むポリペプチドの結合親和性と比較して低い。ある態様では、野生型Friドメインは、最小Friドメイン配列、例えば、SEQIDNO117~126からなる群より選択される配列を含む。または、野生型Friドメインは、SEQIDNO28、32、36、40、44、48、52、56、60、および64からなる群より選択されるFZDFriドメイン配列を有するポリペプチドを含む。ある態様では、アミノ酸置換の1つまたは複数は、表16およびまたは表17より選択されるくぼみの残基の部位においてなされてもよい。ある態様では、Friドメインは、FZD4、FZD5、またはFZD8Friドメインである。ある態様では、Friドメインは、F72、L75、I78、またはL121において1つまたは複数の置換を含むFZD8Friドメインである。ある態様では、FZD8FriドメインはL75変異を含む。BBSのくぼみに存在するアミノ酸置換は、例えば、野生型FZD配列の同じ部位に存在するアミノ酸残基よりも疎水性が低いアミノ酸残基でもよい。または、1つまたは複数の置換は、BBSの上部オーバーハングおよびまたは下部オーバーハングにおいてなされてもよい。ある態様では、変異FZDポリペプチドは可溶性である。ある態様では、変異FZDポリペプチドは可溶性FZD受容体であり、ヒトFc領域などのFc領域を含んでもよい。ある態様では、本発明は、FZD8とWntとの結合を妨げる1つまたは複数の置換がBBSにおいてなされているFZD8Friドメインを含むポリペプチドを提供する。例えば、1つまたは複数の置換はBBSのくぼみにおいてなされている。ある態様では、1つまたは複数の置換は、F72、L75、I78、およびまたはL121においてなされている。可能性のある置換の非限定的な例には、F72Y、L75S、I78S、またはL121Sが含まれる。ある態様では、L75において置換がなされている。FZD受容体のBBSに結合する剤、Wntシグナル伝達を阻害する剤、およびまたは抗癌剤などの治療剤として使用することができる剤をスクリーニングするためのアッセイには、BBSにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換がなされている変異FZDポリペプチドと比較して野生型FZDFriドメイン配列と優先的に結合するかどうかについて化合物がスクリーニングされるアッセイが含まれる。例えば、本発明は、Wntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性について化合物をスクリーニングする方法を提供する。1つの態様において、前記方法は、生物学的結合部位の中に1つまたは複数の置換を含むfrizzled受容体Friドメインを含む第1のポリペプチドに対する化合物の結合親和性を決定する工程を含む。前記方法は、第1のポリペプチドのヒトFrizzled受容体Friドメインの野生型配列を含む第2のポリペプチドに対する化合物の結合親和性を決定する工程、次いで、第1のポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性と第2のポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性とを比較する工程を含む。前記化合物が、第1のポリペプチドに対するよりも第2のポリペプチドに対して高い親和性を有する場合に、前記化合物は、可能性のあるWntシグナル伝達阻害剤として同定される。ある態様では、前記のアッセイまたは本明細書に記載の他のアッセイにおけるFZD受容体はヒトFZD受容体である。ヒトFZD受容体は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10でもよい。同様に、上述のアッセイまたは本明細書の他の場所に記載の他のアッセイのある態様では、Wntタンパク質はヒトWntタンパク質である。例えば、ある態様では、Wntタンパク質は、ヒトWnt3aまたは本明細書の他の場所に記載の別のヒトWntタンパク質である。本発明は、スクリーニングアッセイにおいて有用な、さらなるポリペプチドをさらに提供する。例えば、本発明は、SEQIDNO98~112からなる群より選択される配列を含むポリペプチドを提供する。ある態様では、前記ポリペプチドは、SEQIDNO98~112からなる群より選択される環状ペプチドを含むか、該環状ペプチドから本質的になるか、または該環状ペプチドからなる。本発明はまた、SEQIDNO113~116からなる群より選択される配列を含むか、該配列から本質的になるか、または該配列からなる単離されたポリペプチドを提供する。ある態様では、配列はSEQIDNO108である。ある態様では、配列はSEQIDNO112である。ある特定の他の態様において、配列はSEQIDNO113である。競合的結合アッセイおよびまたは置換アッセイにおいて用いられるポリペプチドは場合によっては標識または改変される。一般的に、このようなアッセイにおいて、本明細書に記載の任意のFZD結合剤を使用することができる。ある特定の他の態様において、競合的結合アッセイにおいて用いられるFZD結合ポリペプチドは抗体18R5である。前段落または本明細書の他の場所に記載のFZD結合ポリペプチドの使用を伴うスクリーニング方法も提供される。1つの態様において、Wntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性について化合物をスクリーニングする方法は、化合物が、ヒトFZD受容体との結合について、FZD結合ポリペプチドと競合することができるかどうかを決定する工程を含む。このような方法において、化合物が結合についてポリペプチドと競合する能力は、前記化合物がWntシグナル伝達阻害剤としての可能性のある活性を有することを示す。ある態様では、FZD受容体はFZD8である。ある態様では、スクリーニングアッセイにおいて実際に用いられるヒトFZD受容体分子は可溶型である。ある態様では、FZD結合剤を同定するために、本明細書に記載のスクリーニングアッセイおよびまたは他のアッセイが用いられている。例えば、前記剤は、SEQIDNO98~116の1つを含むポリペプチドを用いた競合的結合アッセイまたは置換アッセイによって同定されていてもよい。または、前記剤は、例えば、野生型FZDと比較して、BBSの中に1つまたは複数の置換を含むFZDとの結合が低いことによって同定されていてもよい。IIIポリヌクレオチドある態様では、本発明は、ヒトFZD受容体に特異的に結合するポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ヒトfrizzled受容体に対する抗体をコードする、またはこのような抗体の断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはRNAの形をとってもよく、DNAの形をとってもよい。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み、二本鎖または一本鎖でもよく、一本鎖はコード鎖または非コード鎖でもよい。ある態様では、ポリヌクレオチドは単離されている。ある態様では、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。本発明は、SEQIDNO10、12、14からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明は、SEQIDNO85~86からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。SEQIDNO11、13、または15を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。SEQIDNO98~111およびSEQIDNO113~116からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある態様では、前記ポリヌクレオチドは、SEQIDNO108をコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は、SEQIDNO17、19、および21からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドを提供する。または、ある態様では、ポリヌクレオチドは、SEQIDNO87~90、92、および94~95からなる群より選択される配列を含んでもよい。SEQIDNO18、20、または22を含むポリヌクレオチド配列も提供される。SEQIDNO17、19、もしくは21の配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびまたはSEQIDNO10、12、または14の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドも提供される。SEQIDNO87~90、92、および94~95からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびにまたはSEQIDNO85または86の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある態様では、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションである。ある態様では、前記ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチドと同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟型ポリペプチドを形成するために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有する場合がある。前記ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質とさらなる5アミノ酸残基であるプロタンパク質もコードする。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、不活性型のタンパク質である。プロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。ある態様において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合、マーカー配列は、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでもよい。または、哺乳動物宿主が用いられる場合、マーカー配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素タグでもよい。さらに、本発明は、例えば、断片、類似体、および誘導体をコードする、前記ポリヌクレオチドのバリアントに関する。ある態様では、本発明は、本明細書に記載のヒトFZD受容体に対する抗体またはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも80同一の、少なくとも85同一の、少なくとも90同一の、少なくとも95同一の、ある態様では、少なくとも96、97、98、または99同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドあたり点変異を5個までポリヌクレオチド配列が含むことができる以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5まで欠失する、または別のヌクレオチドで置換することができる。または、参照配列の総ヌクレオチドの5まで多くのヌクレオチドを参照配列に挿入することができる。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置または末端位置間の任意の場所で行われてもよく、参照配列の中のヌクレオチドの間に個々に、あるいは参照配列内の1つもしくは複数の近接するグループの中に分散してもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方の変化を含有してもよい。ある態様において、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質および活性を変えない変化を含有する。ある態様では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝暗号の縮重によるサイレントな置換により作製される。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由で、例えば、ある特定の宿主に合わせたコドン発現を最適化するように作製することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供される。IV使用方法および薬学的組成物本発明のFZD結合剤は、治療方法、例えば、癌の治療を含むが、これに限定されない様々な用途において有用である。ある態様では、前記剤は、Wntシグナル伝達の阻害の阻害、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍量の低下、およびまたは腫瘍の腫瘍形成能の低下に有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの方法でもよい。ある態様では、FZDに結合する剤またはポリペプチドまたは抗体は、これらが結合する1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体のアンタゴニストである。ある態様では、FZD結合剤またはアンタゴニストは、Wntシグナル伝達活性化に関連する疾患の治療において用いられる。ある態様では、方法は、FZD結合剤の有効量を対象に投与する工程を含む。ある態様では、疾患は癌または多発性嚢胞腎である。特定の態様において、疾患は、Wntシグナル伝達依存性の疾患である。特定の態様において、Wntシグナル伝達は、標準的Wntシグナル伝達である。ある態様では、FZD結合剤またはアンタゴニストは、幹細胞およびまたは前駆細胞のレベルの増加を特徴とする障害の治療において用いられる。ある態様では、FZD結合剤またはアンタゴニストを用いて治療される疾患は、癌である。ある態様では、癌は、Wnt依存性腫瘍を特徴とする。ある態様では、癌は、FZD結合剤が結合する1種類または複数の種類のfrizzled受容体を発現する腫瘍を特徴とする。ある態様では、癌は、Wnt遺伝子シグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子を発現する腫瘍を特徴とする。ある態様では、FZD結合剤またはアンタゴニストを用いて治療される疾患は、癌ではない。例えば、疾患は、代謝障害、例えば、肥満または糖尿病177180でもよい。または、疾患は、骨障害、例えば、骨粗鬆症、変形性関節症、または慢性関節リウマチ5506DayetalBoneJointSurgAm2008Feb90Suppl11924でもよい。疾患はまた、腎臓障害、例えば、多発性嚢胞腎10048BenzingetalJAmSocNephrol2007May18138998でもよい。または、黄斑変性および家族性滲出性硝子体網膜症を含むが、これに限定されない眼障害を治療することができる。心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、弁障害、および心肥大を含む心血管障害も治療することができる2339KobayashietalNatCellBiol2009Jan114655vanGijnetalCardiovascRes2002Jul551624ChristmanetalAmJPhysiolHeartCircPhysiol2008Jun294H286470MalekaretalHypertension2010Apr5593945。ある態様では、疾患は、肺障害、例えば、特発性肺動脈高血圧または肺線維症e2142である。ある態様では、FZD結合剤を用いて治療される疾患は、肝臓疾患、例えば、肝硬変または肝線維症であるG3949。従って、本発明は、多発性嚢胞腎を治療する方法であって、それを必要とする対象に、FZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。ある態様では、FZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体は、ヒトFZD受容体のBBSに結合する。ある態様では、FZD結合ポリペプチドは、SEQIDNO98~111およびSEQIDNO113~116からなる群より選択される配列と少なくとも80の同一性を有する配列を含む。ある特定の他の態様において、前記ポリペプチドはSEQIDNO112の配列を含む。なおさらなる態様において、FZD結合剤は18R5である。本発明は、FZD結合剤の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法を提供する。ある態様では、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、肝臓癌、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、胃腸癌、黒色腫、子宮頚癌、膀胱癌、グリア芽細胞腫、および頭頚部癌からなる群より選択される癌である。ある態様では、癌は膵臓癌である。ある態様では、癌は結腸直腸癌である。ある態様では、対象はヒトである。さらに、本発明は、本明細書に記載の抗体または他の剤を用いて、腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。ある態様では、腫瘍成長を阻害するための方法は、インビトロで腫瘍または腫瘍細胞とFZD結合剤の有効量とを接触させる工程を含む。例えば、腫瘍成長を阻害するために、標的のFZDを発現する不死化細胞株または癌細胞株が、抗体または他の剤を添加した培地中で培養される。ある態様では、腫瘍細胞が、患者試料、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料から単離され、腫瘍成長を阻害するために、FZD結合剤を添加した培地中で培養される。ある態様では、腫瘍成長を阻害する方法は、インビボで腫瘍または腫瘍細胞とFZD結合剤の有効量とを接触させる工程を含む。ある態様では、腫瘍または腫瘍細胞とFZD結合剤との接触は動物モデルにおいて行われる。例えば、腫瘍成長を阻害するために、FZD結合剤は、易感染性マウスにおいて成長させた、1種類または複数の種類のFZDを発現する異種移植片に投与されてもよい。ある態様では、癌幹細胞は、患者試料、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料から単離され、易感染性マウスに注射され、次いで、腫瘍成長を阻害するために、このマウスにFZD結合剤が投与される。ある態様では、腫瘍成長を阻止するために、FZD結合剤は、腫瘍形成性細胞を動物に導入すると同時に、または腫瘍形成性細胞を動物に導入した直後に投与される。ある態様では、腫瘍形成性細胞が特定のサイズに成長した後に、FZD結合剤は治療剤として投与される。ある態様では、腫瘍成長を阻害する方法は、FZD結合剤の治療的有効量を対象に投与する工程を含む。ある態様では、対象はヒトである。ある態様では、対象は腫瘍を有するか、腫瘍が除去されている。ある態様では、腫瘍は、Wntシグナル伝達が活性化している腫瘍である。ある態様では、活性化しているWntシグナル伝達は、標準的Wntシグナル伝達である。ある態様では、腫瘍はWnt依存性腫瘍である。例えば、ある態様では、腫瘍は、アキシン過剰発現に対して感受性がある。ある態様では、腫瘍は、大腸腺腫症腫瘍抑制遺伝子の不活化変異も、βカテニン遺伝子の活性化変異も含まない。ある態様では、腫瘍は、Wnt遺伝子シグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子を発現する。ある態様では、治療されている対象の癌は、このような腫瘍を含む。ある態様では、腫瘍は、FZDに結合する剤または抗体が結合する1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体を発現する。ある態様では、腫瘍はヒトfrizzled受容体を過剰発現する。ある態様では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頚腫瘍、膀胱腫瘍、グリア芽細胞腫、および頭頚部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある態様では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。ある態様では、腫瘍は膵臓腫瘍である。本発明はまた、細胞とFZD結合剤の有効量とを接触させる工程を含む、細胞におけるWntシグナル伝達を阻害する方法を提供する。ある態様では、前記細胞は腫瘍細胞である。ある態様では、前記方法は、細胞と剤とを接触させる工程が、剤の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、インビボ方法である。一部の別の態様において、前記方法は、インビトロ方法またはエクスビボ方法である。ある態様では、阻害されるWntシグナル伝達は、標準的Wntシグナル伝達である。ある態様では、Wntシグナル伝達は、WNT1、WNT2、WNT3、WNT3A、WNT7a、WNT7b、およびまたはWNT10Bによるシグナル伝達である。ある態様では、Wntシグナル伝達は、WNT1、WNT3A、WNT7b、およびまたはWNT10Bによるシグナル伝達である。さらに、本発明は、腫瘍とFZD結合剤の有効量とを接触させる工程またはFZD結合剤の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍の腫瘍形成能を低下させる方法を提供する。ある態様では、腫瘍は癌幹細胞を含む。ある態様では、腫瘍における癌幹細胞頻度は剤投与によって低下する。従って、本発明はまた、腫瘍と、FZD結合剤の有効量とを接触させる工程を含む、腫瘍における癌幹細胞頻度を少なくする方法も提供する。さらに、本発明は、腫瘍形成性細胞とFZD結合剤とを接触させる工程を含む、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性細胞に分化させる方法を提供する。ある態様では、腫瘍形成性細胞は膵臓腫瘍細胞である。ある特定の他の態様において、腫瘍形成性細胞は結腸腫瘍細胞である。腫瘍細胞を含むが、これに限定されない細胞の分化を誘導するために、本明細書に記載のFZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体を使用することも提供される。例えば、細胞と、本明細書に記載のFZD結合剤の有効量とを接触させる工程を含む、細胞の分化を誘導する方法が想定される。FZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、対象における腫瘍の細胞の分化を誘導する方法も提供される。ある態様では、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある特定の他の態様において、腫瘍は結腸腫瘍である。さらに、対象における、Wntシグナル伝達活性化に関連する、ならびにまたは幹細胞およびもしくは前駆細胞のレベルの増加を特徴とする疾患または障害を治療する方法が提供される。ある態様では、前記治療方法は、FZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体の治療的有効量を対象に投与する工程を含む。ある態様では、Wntシグナル伝達は、標準的Wntシグナル伝達である。さらに、本発明は、固形腫瘍の間質と、FZDに結合する剤、ポリペプチド、または抗体の有効量とを接触させる工程を含む、固形腫瘍の間質における筋線維芽細胞活性化を低下させる方法を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載のFZD結合剤の1種類または複数の種類を含む、薬学的組成物を提供する。ある態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの薬学的組成物は、ヒト患者における腫瘍成長の阻害および癌の治療において有用である。ある態様では、本発明の精製された抗体または剤と薬学的に許容されるビヒクルを組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が調製される。適切な薬学的に許容されるビヒクルには、無毒の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液;塩、例えば、塩化ナトリウム;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤;低分子量ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体;および非イオン界面活性剤、例えば、TWEENまたはポリエチレングリコールが含まれるが、これに限定されない。ある態様では、薬学的組成物は凍結される。ある特定の他の態様において、薬学的組成物は凍結乾燥される。本発明は、本明細書に記載の抗体、例えば、18R5の製剤を提供する。前記製剤は、以下の成分30~50mMヒスチジン、70~110mM塩化ナトリウム、60~100mMスクロース、およびまたは001~004ポリソルベート20の1つもしくは複数を含み、pHは55~59である。ある態様では、前記製剤は、40mMヒスチジン、86mM塩化ナトリウム、82mMスクロース、および002ポリソルベート20、pH57を含む。従って、1つの態様において、18R5製剤は、5~20mgmL18R5、40mMヒスチジン、86mM塩化ナトリウム、82mMスクロース、および002ポリソルベート20、pH57を含む。別の態様において、18R5製剤は、5~20mgmL18R5、56mMヒスチジン、86mM塩化ナトリウム、82mMスクロース、および002ポリソルベート20、pH57を含む。ある態様では、製剤中の18R5濃度は10mgmLである。ある態様では、薬学的組成物は凍結される。本発明の薬学的組成物は、局所治療または全身治療のための多様な手法で投与することができる。投与は、局所投与、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤、および散剤;肺投与;経口投与;または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射もしくは注入を含む、非経口投与;あるいは頭蓋内投与でもよい。治療製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、経口投与、非経口投与、もしくは直腸投与のための、または吸入による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解した溶液もしくは懸濁液、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均一混合物を含む固体の予備処方組成物を形成するために、従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴム、および他の希釈剤が含まれる。次いで、固体予備処方組成物を、上述の型の単位剤形へ細分する。持効性の長所を与える剤形を提供するために、新規組成物の錠剤やピルなどをコーティングするか、他の方法で調合することができる。例えば、錠剤またはピルは、外部成分によって覆われた内部組成物を含むことができる。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分にそのまま胃を通過させるかまたはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、二つの成分を分離することができる。このような腸溶層またはコーティングには様々な材料を用いることができる。このような材料は、多くのポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。抗体をマイクロカプセル中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合法によって、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリマイクロカプセルが、コロイド状薬物送達システム中に、またはRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy20thEdMackPublishingに記載されているマクロエマルジョン中にそれぞれ調製される。ある態様では、薬学的製剤には、リポソームと複合体化された本発明の抗体または他の剤が含まれる。循環時間が延長したリポソームが米国特許第5013556号に開示されている。いくつかのリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成することができる。規定の孔径のフィルターに通してリポソームを押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームが得られる。さらに、徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例には、抗体を含む、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品の形をしている。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ポリまたはポリなどのヒドロゲル、ポリラクチド、Lグルタミン酸と7エチルLグルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRONDEPOTなどの分解性乳酸グリコール酸コポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、およびポリD3ヒドロキシ酪酸が含まれる。ある態様では、FZD結合剤を投与する工程に加えて、前記の方法または治療は、第2の抗癌剤を投与する工程をさらに含む。FZD結合剤および第2の抗癌剤を含む薬学的組成物も提供される。ある態様では、FZD結合剤と第2の抗癌剤との組み合わせの投与は、癌幹細胞の頻度に対する相乗効果などの相乗効果を有する。FZD結合剤と第2の抗癌剤の組み合わせを、任意の順番で、または同時に投与できることが理解されるだろう。選択された態様において、FZD結合剤は、第2の抗癌剤による治療を以前に受けたことがある患者に投与される。ある特定の他の態様において、FZD結合剤および第2の抗癌剤は、実質的に同時にまたは時を同じくして投与される。例えば、対象は、第2の抗癌剤による治療コースを受けると同時に、FZD結合剤が与えられる。ある態様では、FZD結合剤には、第2の抗癌剤による治療の1年以内に投与される。ある特定の他の態様において、FZD結合剤は、第2の抗癌剤による任意の治療の10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内、または2ヶ月以内に投与される。ある特定の他の態様において、FZD結合剤は、第2の抗癌剤による任意の治療の4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内に投与される。ある態様では、FZD結合剤は、第2の抗癌剤による任意の治療の5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に投与される。さらに、数時間または数分のうちに、2種類の剤または治療を対象に投与できることが理解されるだろう。抗癌剤の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤、ビスおよびトリ核白金錯体、ならびにカルボプラチン、アントラサイクリン、抗生物質葉酸、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、実施化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある態様では、第2の抗癌剤は、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。FZD結合剤と組み合わせて投与することができる抗癌剤には、化学療法剤が含まれる。従って、ある態様では、前記の方法または治療は、本発明の抗体または剤と、化学療法剤または複数の種類の化学療法剤のカクテルとの併用投与を伴う。抗体による治療は、化学療法の投与の前に、化学療法の投与と同時に、または化学療法の投与の後に行われてもよい。本発明により意図される化学療法には、当技術分野において公知であり、市販されている化学物質または薬物、例えば、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、5フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、およびカルボプラチンが含まれる。併用投与は、1種類の薬学的製剤に入れた、または別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、どちらの順番でもよいが、活性剤の全てがその生物学的活性を同時に発揮できるように、一般的にある期間内で行われる、連続投与を含んでもよい。このような化学療法剤の調製および投与計画は、製造業者の説明書に従って、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。このような化学療法の調製および投与計画はまた、ChemotherapyServiceEdMCPerryWilliamsWilkinsBaltimoreMdに記載されている。本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド;アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6ジアゾ5オキソLノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5フルオロウラシル;葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5FU;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フロリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート;デフォファミン;デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリニック酸;2エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;シゾフラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;222トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポプロマン;ガシトシン;アラビノシド;シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル;クロランブシル;ゲムシタビン;6チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド;イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロン酸;CPT11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン;レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン;および前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれるが、これに限定されない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4イミダゾール、4ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェンを含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。ある態様では、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤には、ドキソルビシンHCL、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCL、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCL、テニポシド、およびイリノテカンが含まれるが、これに限定されない。ある態様では、第2の抗癌剤はイリノテカンである。ある態様では、治療される腫瘍は、結腸直腸腫瘍であり、第2の抗癌剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカンである。ある態様では、化学療法剤は、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に似ているが、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば、細胞分裂を妨害するのに十分に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5アザシチジン、6メルカプトプリン、アザチオプリン、6チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これに限定されない。ある態様では、第2の抗癌剤は、ゲムシタビンである。ある態様では、治療される腫瘍は、膵臓腫瘍であり、第2の抗癌剤は、代謝拮抗物質である。ある態様では、化学療法剤は、チューブリンに結合する剤を含むが、これに限定されない、有糸分裂阻害剤である。非限定的な例として、前記剤はタキサンを含む。ある態様では、前記剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。ある態様では、前記剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、DHAパクリタキセル、またはPGパクリタキセルである。ある特定の他の態様において、有糸分裂阻害剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。いくつかの態様では、有糸分裂阻害剤は、Eg5キネシンの阻害剤または有糸分裂キナーゼ、例えば、AuroraAもしくはPlk1の阻害剤である。ある態様では、FZD結合剤またはポリペプチドまたは抗体と組み合わせて投与される化学療法剤が有糸分裂阻害剤を含む場合、治療されている癌または腫瘍は、乳癌または乳房腫瘍である。ある態様では、前記治療は、本発明の抗体と放射線療法の併用投与を伴う。抗体による治療は、放射線療法の投与の前に、放射線療法の投与と同時に、または放射線療法の投与の後に行ってもよい。当業者により決定されるように、このような放射線療法の任意の投与計画を使用することができる。いくつかの態様では、第2の抗癌剤は抗体を含む。従って、治療は、本発明の抗体と、EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、Notch、およびまたはVEGFに結合する抗体を含むが、これに限定されない、さらなる腫瘍関連抗原に対する他の抗体との併用投与を伴ってもよい。例示的な抗DLL4抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20080187532号に記載されている。ある態様では、第2の抗癌剤は、血管新生阻害剤である抗体である。さらなる抗DLL4抗体は、例えば、国際公開公報第2008091222号および国際公開公報第20080793326号、および米国特許出願公開第20080014196号、同第20080175847号、同第20080181899号、および同第20080107648号に記載されている。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。例示的な抗Notch抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20080131434号に記載されている。ある態様では、第2の抗癌剤は、血管新生阻害剤である抗体である。ある態様では、第2の抗癌剤は、Notchシグナル伝達阻害剤である。ある態様では、第2の抗癌剤は、アバスチン、ハーセプチン、ベクチビックス、またはエルビタックスである。併用投与は、1種類の薬学的製剤に入れた、または別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、どちらの順番でもよいが、活性剤の全てがその生物学的活性を同時に発揮できるように、一般的にある期間内で行われる連続投与を含んでもよい。さらに、治療は、1種類または複数の種類のサイトカインの投与を含んでもよく、癌細胞の外科的除去、または治療を行っている医師により必要とみなされた他の任意の療法により達成されてもよい。疾患の治療のために、本発明の抗体または剤の適切な投与量は、治療されている疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、抗体または剤が治療目的または予防目的で投与されているかどうか、以前の療法、患者の病歴などによって、全て、治療を行っている医師の自由裁量で決まる。抗体または剤は、一回で投与されてもよく、数日~数ヶ月間続く一連の治療にわたって投与されてもよく、治癒するまで、または疾患状態が緩和するまで投与されてもよい。最適な投与計画は、患者の身体における薬物蓄積を測定することによって計算することができ、個々の抗体または剤の相対効力に応じて変化する。投与を行っている医師は、最適な投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。ある態様では、投与量は001μg~100mgkg体重であり、1日に、1週間に、1ヶ月に、または1年に1回またはそれ以上与えることができる。ある態様では、抗体または他のFZD結合剤は、2週間に1回または3週間に1回与えられる。ある態様では、抗体または他のFZD結合剤の投与量は、約01mg~約20mgkg体重である。治療を行っている医師は、測定された滞留時間および体液または組織中の薬物濃度に基づいて、投薬のための反復率を評価することができる。VWnt遺伝子シグネチャーおよびその使用さらに、本発明は、腫瘍におけるWntシグナル伝達活性を示す遺伝子シグネチャーであるWnt遺伝子シグネチャーを提供する。Wnt遺伝子シグネチャーは、腫瘍、患者、およびまたは療法の選択において使用することができる。Wnt遺伝子シグネチャーは、Wntシグナル伝達が活性化されていない腫瘍と比較した、Wntシグナル伝達が活性化されている腫瘍における一組の遺伝子のディファレンシャルな発現を含む。ある態様では、Wntシグナル伝達は、標準的Wntシグナル伝達である。Wnt遺伝子シグネチャーは、Wntシグナル伝達の阻害剤による治療に応答する可能性が高い腫瘍およびまたは患者の同定に有用である。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーは、以下の表3に列挙した、1種類または複数の種類の遺伝子を含む。プローブセットIDの番号は、GeneChipヒトゲノムU13320アレイのプローブセットIDの番号である。Wntシグナル伝達が活性化している腫瘍において、Wnt遺伝子シグネチャーを構成する表3の遺伝子の発現レベルは、Wntシグナル伝達が活性化していない腫瘍と比較して上昇している。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーは、以下の表3に列挙した2種類またはそれ以上の遺伝子を含む。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーは、以下の表3に列挙した遺伝子の3つもしくはそれ以上、4つもしくはそれ以上、5つもしくはそれ以上、6つもしくはそれ以上、7つもしくはそれ以上、8つもしくはそれ以上、9つもしくはそれ以上、10もしくはそれ以上、11もしくはそれ以上、12もしくはそれ以上、13もしくはそれ以上、14もしくはそれ以上、15もしくはそれ以上、16もしくはそれ以上、17もしくはそれ以上、18もしくはそれ以上、または19もしくはそれ以上を含む。ある態様では、表3の1種類またはそれ以上の種類の遺伝子の発現レベルについて評価される腫瘍は、結腸直腸腫瘍である。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーは、アキシン2およびまたはFOXQ1を含む。ある態様では、腫瘍は結腸直腸腫瘍であり、Wnt遺伝子シグネチャーは、アキシン2、LGR5、およびまたはFOXQ1を含む。表3例示的なWnt遺伝子シグネチャー遺伝子Wnt経路阻害剤による治療に適した患者を選択するために、または特定の療法の効力を評価するために、Wnt遺伝子シグネチャーを使用する方法も提供される。ある態様では、Wntシグナル伝達阻害剤は、FZD結合剤、例えば、アンタゴニストFZD抗体である。例えば、患者は、患者にある腫瘍または患者から取り除かれた腫瘍がWnt遺伝子シグネチャーを示すかどうかを決定することによって、FZD結合剤による治療に適していると同定することができる。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーを検出する工程は、腫瘍における、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルを評価する行程を含む。Wnt遺伝子シグネチャーを構成する、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルが腫瘍において上昇していれば、患者は、FZD結合剤、例えば、Wntシグナル伝達を阻害する抗FZD抗体による治療に適していると同定される。特定の患者に適した療法を選択するためにWnt遺伝子シグネチャーを使用する方法も同様に提供される。本発明は、腫瘍における、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルを得る工程、1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルに基づいて、FZD結合剤による治療を開始するまたは継続するために患者を選択する工程、およびFZD結合剤を患者に投与する工程を含む、腫瘍を有する患者または腫瘍が除去された患者において癌を治療する方法を提供する。ある態様では、前記方法は、腫瘍における1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルを測定する工程を含む。ある態様では、1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルは対照または参照レベルと比較される。Wntシグナル伝達阻害剤による治療に応答し得る腫瘍を同定する方法も提供される。ある態様では、Wntシグナル伝達阻害剤は、FZD結合剤である。ある態様では、前記方法は、Wnt遺伝子シグネチャーについて腫瘍を試験する工程を含む。ある態様では、前記方法は、腫瘍における、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルを評価する工程を含む。Wnt遺伝子シグネチャーを示すと同定された腫瘍に対して薬物候補をスクリーニングする方法も提供される。ある態様では、薬物候補は、Wntシグナル伝達阻害剤である。このような薬物候補は、好ましくは、Wntシグナル伝達が活性化している腫瘍、およびまたはWntシグナル伝達に依存する腫瘍に対する効力について試験される。本発明はまた、腫瘍における、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルを評価する工程、1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルに基づいて、薬物候補による試験のために腫瘍を選択する工程、および腫瘍に対する薬物候補の効果を試験する工程を含む、薬物候補をスクリーニングする方法を提供する。さらに、ある態様では、Wntシグナル伝達が活性化している腫瘍の治療の効力を評価するために、Wnt遺伝子シグネチャーに対する薬物の効果を確認および使用すことができる。ある態様では、これは、患者の治療をモニタリングする方法を提供する。一部の別の態様において、これは、薬物候補の効力を評価する方法を提供する。ある態様では、表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現レベルの減少は治療の効力を示す。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子のレベルを評価する工程は、1種類または複数の種類の遺伝子のポリヌクレオチドの発現レベルを決定する工程を含む。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーを検出する工程は、シグネチャーを構成する1種類または複数の種類の遺伝子のポリヌクレオチドのmRNA発現を検出する工程を含む。ある態様では、mRNA発現の検出はノーザンブロットを介するものである。ある態様では、mRNA発現の検出は、癌幹細胞シグネチャーを構成するポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーセットを用いた、RTPCR、リアルタイムPCR、または定量PCRを介するものである。ある態様では、mRNAの検出は、試料を、癌幹細胞遺伝子シグネチャーを構成するポリヌクレオチドに相補的な核酸プローブに曝露する工程を含む。ある態様では、試料のmRNAは、検出前にcDNAに変換される。ある態様では、mRNAの検出は、Wnt遺伝子シグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを介するものである。ある態様では、Wnt遺伝子シグネチャーの1種類または複数の種類の遺伝子のレベルを評価する工程は、1種類または複数の種類の遺伝子によってコードされるポリペプチドを検出する工程を含む。ある態様では、1種類または複数の種類の遺伝子のポリペプチド発現産物のレベルの評価は、試料を、ポリペプチドに特異的な抗体に曝露する工程、および抗体とポリペプチドとの結合を、例えば、定量免疫蛍光またはELISAによって検出する工程を含む。他の検出手段も当業者に公知である。例えば、米国特許第6057105号を参照されたい。ストリンジェントな条件下で、表3の1種類または複数の種類の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイも提供される。アレイを含むキットも提供される。表3の1種類または複数の種類の遺伝子の発現産物に結合する抗体を含むキットも提供される。VIFzd結合剤を含むキット本発明は、本明細書に記載の抗体または他の剤を含み、本明細書に記載の方法を実施するのに使用することができるキットを提供する。ある態様では、キットは、1つまたは複数の容器に入れられた、1種類または複数の種類のヒトfrizzled受容体に対する少なくとも1種類の精製された抗体を含む。ある態様では、キットは、全ての対照を含む、検出アッセイを行うのに必要およびまたは十分な成分の全て、アッセイを行うための説明書、ならびに分析および結果の表示に必要な任意のソフトウェアを含む。当業者であれば、本発明の開示された抗体または剤を、当技術分野において周知の確立されたキット形式の1つに容易に組み込むことができることを容易に認めるだろう。さらに、FZD結合剤、ならびに第2の抗癌剤を含むキットが提供される。ある態様では、第2の抗癌剤は、化学療法剤である。ある態様では、第2の抗癌剤は、血管新生阻害剤である。ある態様では、第2の抗癌剤は、Notchシグナル伝達阻害剤である。FZD結合剤、および上の表3にある1種類または複数の種類の遺伝子の発現を評価するための試薬を含むキットも提供される。本開示の態様を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに明確にすることができる。実施例は、本開示のある特定の抗体の調製および本開示の抗体を用いるための方法を詳述する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料と方法の両方に多くの変更を加えることができることは当業者には明白であろう。本明細書に記載の実施例および態様は例示にすぎず、これらを考慮して、様々な変更および修正が当業者に示唆され、本願の精神および範囲の中に含まれることが理解される。実施例1抗FZD抗体の同定作製1種類または複数の種類のヒトFrizzled受容体を特異的に認識するヒト抗体は、ファージディスプレイを用いて単離することができる。例えば、ヒト抗体可変ドメインを含有する合成抗体ライブラリーを、ヒトFZD7受容体の細胞外ドメインの特異的かつ高親和性の認識についてパンニングすることができる。望ましい特徴を有する特異的なFabが同定されたら、CHO細胞においてヒト抗体を発現させるために、Fabのヒト可変領域を、ヒトIgG2重鎖および軽鎖を含有するIg発現ベクターにクローニングする。ファージディスプレイを用いて、FZD7の細胞外ドメインに結合する特異的Fabである18R8を同定した。ヒトFabファージライブラリーからの2x1013個のFabディスプレイファージ粒子を、受動免疫された組換えFZD7ECDFcタンパク質とインキュベートした。非特異的ファージを洗い流し、次いで、DTTによって特異的ファージを溶出させた。溶出したアウトプットを用いてTG1F細菌に感染させ、ヘルパーファージによってレスキューした。次いで、IPTGによってFabディスプレイを誘導した。このレスキューした1回目のアウトプットは、さらなる選択回のための出発点として役立った。選択は3回目まで続け、次いで、アウトプットをELISAにおいて、組換えFZD7ECDFcタンパク質に対する特異的Fabについてスクリーニングした。ヒトFZD7に特異的に結合するFabを同定した。同定されたFabの可変領域の配列を得た。部位特異的変異誘発によって、親配列からN結合型グリコシル化部位を除去した。重鎖CDR1にあるN結合型グリコシル化部位AsnをHisに変えた。この変異は、哺乳動物系における発現間のグリコシル化を阻止するために行った。結果として生じたFabを18R8と名付けた。18R8の重鎖および軽鎖CDR配列を以下の表4に示す。18R8のVH配列およびVL配列を、それぞれ、SEQIDNO10およびSEQIDNO12に示す。表418R8および18R5ヒト抗体のCDRN結合型グリコシル化部位を除去するための部位特異的変化に下線を付している。抗FZDFab18R5は、18R8FabのVHCH1鎖と、18R8が同定された最初のFabファージライブラリーに由来する様々なVLCL鎖を結合することによって作製した。18R5は、固定化された組換えFZD7ECDFcタンパク質による3回のパニング後にライブラリーから単離された。18R5のCDRの配列を上の表4に示す。18R5抗体のVLは、SEQIDNO14に示した配列を有する。18R5抗体の重鎖CDRおよびVHは、18R8抗体のものと同一である。CHO細胞において発現させるために、18R8および18R5Fabのヒト可変領域を、ヒトIgG2重鎖および軽鎖を含有するIg発現ベクターにクローニングした。18R8IgG抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれSEQIDNO11およびSEQIDNO13に示す。各鎖のアミノ酸配列のN末端にあるシグナル配列は、分泌の際に切断される。18R8IgG抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、それぞれ、SEQIDNO18およびSEQIDNO20に示す。18R5IgG抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、SEQIDNO11およびSEQIDNO15に示す。18R5IgG抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、それぞれ、SEQIDNO18およびSEQIDNO22に示す。プロテインA精製を用いて抗体を精製した。18R8および18R5抗体のKDを、BiacoreLifescienceからのBiacore2000システムを用いて求めた。具体的には、精製された抗Fzd7抗体を、HBSPで、100~078nMまで連続2倍希釈した。CM5Biacoreチップ上に固定化された組換えFzdFcタンパク質に対して、それぞれの希釈液を試験した。結合速度および解離速度を測定し、Biaevaluationソフトウェアプログラムを用いてKD値を求めた。表518R8および18R5IgG抗体の親和性別の抗FZD抗体である18R0512も調製した。実施例2抗FZD抗体のFACS分析によって、複数の種類の細胞表面ヒトFZDとの結合が証明される細胞表面発現FZDタンパク質に結合する抗体の能力を、フローサイトメトリー分析を用いて決定した。選択されたFZDタンパク質の強い細胞表面発現を可能にするために、標準的な組換えDNA技術を用いて、FZDをコードするポリヌクレオチドの上流にCMVプロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドを作製した。10種類のヒトfrizzledタンパク質それぞれについて、類似の発現プラスミドを作製した。FZD発現ベクターの別バージョンも調製した。ここでは、標準的な組換え技術によって、成熟FZDタンパク質のN末端に融合したN末端シグナル配列FLAGエピトープタグをコードするポリヌクレオチドも作製した。さらに、N末端シグナル配列FLAGエピトープに融合した、FZDのCRDドメインまたはFZDタンパク質のN末端細胞外ドメイン全体からなるキメラタンパク質、ならびにヒトCD4タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするC末端部に融合した、FZDのCRDドメインまたはFZDタンパク質のN末端細胞外ドメイン全体からなるキメラタンパク質をコードする発現プラスミドを設計した。フローサイトメトリーによってFZDに対する抗体結合を測定するために、FZD発現ベクターおよびトランスフェクションマーカーGFPをHEK293細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの24~48時間後に、細胞を懸濁液中に集め、抗FZD抗体またはバックグラウンド抗体結合を検出するために対照IgGと氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、一次抗体を、蛍光発色団が結合しているFcドメイン特異的二次抗体で検出した。次いで、標識細胞をフローサイトメトリーによって分析して、FZDタンパク質の細胞表面発現を特異的に認識する抗FZD抗体を同定した。モノクローナル抗体18R5および18R8は、トランスフェクト細胞上のFZDを認識した。図1および図2に示したように、18R8および18R5は両方とも、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8を含む複数の種類のFZDに結合する。18R8および18R5がそれぞれのFZDタンパク質に結合する相対能力を調べるために、結合反応中の抗体量を変える滴定分析を行った。この分析によって、それぞれのFZD受容体に対する18R5の結合能力は、18R8より大きいことが証明された。実施例318R8および18R5によるWntシグナル伝達の阻害Wntシグナル伝達経路の活性化をブロックする抗FZDIgG抗体18R8および18R5の能力を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてインビトロで決定した。STF293細胞を、抗生物質および10FCSを添加したDMEM中で培養した。STF293細胞は、標準的Wntシグナル伝達レベルを測定するために、7コピーのTCF結合部位がホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーターの上流に連結している8xTCFLucレポーターベクター、およびトランスフェクション効率の内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼレポーターが安定に組み込まれている293細胞である。細胞を培養プレートに添加した。試験しようとするFZD抗体を添加した。次いで、細胞を、Wnt3aを安定発現するL細胞から調製されたWnt3A調整培地、またはWnt3Aを過剰発現しないL細胞からの対照調整培地の存在下または非存在下でインキュベートした。一晩インキュベーション後に、デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて、ルシフェラーゼレベルを測定した。ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して規準化した。このように、Wnt誘導性経路活性化を阻害する18R8および18R5抗体の能力を決定した。STF293細胞を異なる濃度の18R8または18R5IgG抗体で処理し、Wnt3A調整培地を添加した。デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて、18時間後に細胞をアッセイした。結果を図3に示す。抗FZD抗体18R5を用いて、Wnt3a経路のTCFシグナル伝達の大きな阻害が観察された。さらなる実験において、異なるWntリガンドによるシグナル伝達に拮抗する18R8抗体の能力を決定した。Fugene6によって48時間、Wnt1、Wnt2、Wnt2b2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9b、およびWnt10bをHEK293細胞にトランスフェクトした。Wnt3A調整培地を、活性化の陽性対照として使用した。STF293細胞を、抗生物質および10FCSを添加したDMEM中で培養し、20μgml18R8抗体で処理したか、抗体で処理しなかった。次いで、Wnt過剰発現HEK293細胞を添加した。処理して18時間後に、デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いてルシフェラーゼレベルを測定した。結果を図4に示す。抗FZD抗体18R8は、Wnt3Aに加えて、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt7A、Wnt7B、およびWnt10Bの阻害を含む、様々なWntのシグナル伝達を阻害することが示された。類似実験において、異なるWntリガンドによるシグナル伝達を阻害する18R5抗体の能力を決定した。結果を図67に示す。18R5は、細胞ベースレポーターアッセイにおいて活性がある各Wntファミリーに応答したβカテニンシグナル伝達を阻害することが見出された。実施例418R8はFZDとWntとの結合をブロックする18R8が、FZDとWntとの結合をブロックする能力を評価するために、132μgμlの可溶性のFriドメイン含有FZD8Fc2μlを、Wnt3Aのみまたは18R8IgG抗体の存在下でWnt3Aに結合するように培地に添加した。混合物を単独で、またはプロテインAセファロースビーズの存在下で、4°Cで2時間インキュベートした。インキュベーション後に、各試料中のプロテインAビーズを回転によって取り出し、8xTCFルシフェラーゼ活性を誘導する能力について上清をアッセイした。標準的Wntシグナル伝達レベルを測定するために、8xTCFを安定発現し、抗生物質および10FCSを添加したDMEM中で培養したSTF293細胞に、上清を添加した。STF293細胞を処理して18時間後に、デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて、ルシフェラーゼレベルを測定した。図5に示したように、Wnt3AプロテインAによって、ルシフェラーゼ単位により測定されたように、レポーター遺伝子の強力な活性化が誘導される。Fzd8fcが添加されると、Wnt3AFzd8とFc融合タンパク質とプロテインAセファロースビーズとの複合体が誘導される。プロテインAWnt3AFzd8複合体が遠心分離によって除去されると、結果として生じる上清は、もはやレポーター遺伝子を活性化することができない。18R8が添加されると、恐らく、この抗体がFzd8のWnt3A相互作用ドメイン上でブロックすることによって、この複合体は破壊される。自身のFc部分を介してプロテインAと容易に相互作用することができるプロテインAFzd8fc複合体は、18R8と共に除去されるが、レポーター活性は容易に観察することができるので、このことは、複合体化しなかったWnt3Aの濃度が十分にあったことを示唆している。プロテインAによって18R8が除去されなくてもWnt3A活性化の回復を示さないので、18R8はSTF293細胞上に存在する内因性Fzd上でも機能する。図5のデータは、インキュベーション反応に18R8IgG抗体が存在することによって、FZD8Fcのみで観察された活性と比較して、上清中のWnt3A活性が保持されたことを示す。これらの結果から、18R8は、Wnt3Aに結合するFZD8の能力をブロックし、抗体と、18R8により認識されるエピトープとが結合することによって、WntFZD相互作用をブロックできることが分かる。同様に、Fzdと相互作用するWntの能力を18R5が直接ブロックするかどうかを決定するために、さらなる結合研究を行った。結果を図68に示す。示したように、Wnt3A、FZD5Fc、および18R5を共インキュベートし、次いで、プロテインAIPによって18R5およびFZD5Fcを除去した。次いで、8xTCFルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて上清のWNT活性をアッセイした。18R5はWnt3AとFzd5Fcの結合をブロックした。このことから、18R5がWntシグナル伝達を阻害する機構には、Wnt結合の直接阻害が関与していることが示唆される。実施例518R8および18R5のエピトープマッピング18R8IgG抗体により認識されるFZDエピトープを同定するために、エピトープマッピングを行った。細胞表面発現FZDのフローサイトメトリー分析を用いて、抗体結合を測定した。FZD8のFriドメインのN末端に融合し、次に、CD4タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合した、N末端シグナル配列FLAGエピトープタグをコードするポリヌクレオチドの上流にCMVプロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドベクターを、標準的な組換え技術によって作製した。この発現構築物は、細胞表面上でのFZD8Friドメインの発現、ならびに発現をモニタリングするためのFLAGエピトープタグの発現を可能にする。次いで、部位特異的変異誘発を用いて、FZDの細胞外ドメイン内の選択されたアミノ酸を改変した。FZDをコードする発現ベクターおよびトランスフェクションマーカーGFPをコードする発現ベクターをHEK293細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を懸濁液に入れて集め、バックグラウンド抗体結合を検出するために抗FZD抗体または対照IgGと氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光発色団が結合している抗抗体二次抗体を用いて、一次抗体を検出した。次いで、抗FZD抗体と細胞表面FZDとの結合を測定するために、フローサイトメトリーによって標識細胞を分析した。このように、抗FZD抗体の結合に重要なFZD細胞外ドメイン内の特定のアミノ酸を同定した。FZD8のアミノ酸残基82~83をPDからSQに変異させた時に、18R8によるFZD8の結合は大きな影響を受けなかった。同様に、アミノ酸109Sが109Qに変化した時に、結合への影響ははっきりと観察されなかった。他方で、FZD8の残基70~71がHQからAEに変化した時に、18R8による細胞上のFZD8の結合は明らかに減少した。アミノ酸66~67がGLからAAに変異した時に、またはアミノ酸68~69がEVからQLに変異した時に、またはアミノ酸126~127がFGからNVに変異した時に、18R8抗体と細胞上のFZD8との結合は同じように失われた。FZDの細胞外ドメインのある特定のアミノ酸が置換された時に、FZDへの結合が失われたことから、抗体の特定の認識部位が明らかになった。このように、抗体18R8は、FZD8のアミノ酸66~71GLEVHQおよびヒトFZD8のアミノ酸124~128GFを含むエピトープに結合することが決定された。このエピトープ領域は、FZD8が結合するヒトfrizzled受容体全体にわたってよく保存されており、FZD8が結合しないヒトfrizzled受容体では高度に保存されていない。18R5IgGおよび18R8IgGと、細胞上の野生型FZD8および変異FZD8との結合を比較したFACS実験も行った。これらの実験から、18R8抗体および18R5抗体はFZD8上の類似のエピトープに結合することが証明された。実施例6生物学的結合部位の同定Wntシグナル伝達を阻害する抗体が発見され、これらの抗体が結合するFZDタンパク質内のエピトープが発見されたことで、今や、FZDタンパク質構造のどの領域がWntシグナル伝達に重要であるか分析できるようになった。これを調べるために、マウスFzd8のFriドメインの結晶構造を調べた。本発明者らは、18R8および18R5の結合エピトープが、特定の機能上の役割が以前に認められていなかったFZD構造の領域内にあることを同定した。さらに、このエピトープは、くぼみによって分けられた、Fzdの2つの別々の表面エレメントを含有していた。10種類のヒトfrizzled受容体を比較した時に、このくぼみの下部に並んでいるアミノ酸の同一性が著しく保存されていることも発見された。18R8および18R5が結合する、このくぼみならびに上端および下端を含む領域は、FZDの生物学的結合部位と名付けられた。以前に報告されたマウスFZD8結晶構造の分析86902001およびソフトウェアプログラムPymolを用いて行った分析に基づく、FzdFriドメインの構造の画像を図9に示す。白丸で示した生物学的結合部位を含むFzdタンパク質領域を有するFZDFriドメインの表面図を、左上の画像に示す。BBSの上端、下端、およびくぼみと名付けた領域にはそれぞれ、パネルの下部にある別々の画像に、暗い表面の色で強調している。図9の右上の画像は、10種類のヒトFzdファミリーメンバーのうちの9種類または10種類において保存されている残基を暗い表面で強調している。実施例7インビボでの18R5による腫瘍成長の阻害18R5によるWnt依存性腫瘍成長の阻止5~7週齢の雌NODSCIDマウスの右上の乳房脂肪パッドに、50000個のマウス乳房腫瘍ウイルスWNT1腫瘍由来細胞を注射した。トランスジェニックWnt1マウスは、過形成、浸潤性腺管癌、および遠隔転移を含む乳房腫瘍形成の別々の段階を示し、従って、この乳癌マウスモデルは、腫瘍の形成および成長におけるWntの役割を分析するための有用なツールであるCell3199109。これらのマウスからの腫瘍を解離し、腫瘍増殖のために、これらの解離した腫瘍細胞を使用した。腫瘍細胞を乳房脂肪パッドに移植したマウスを週2回モニタリングした。腫瘍が触知可能になったら、腫瘍を週2回測定し、式12を用いて、腫瘍量を求めた。式中、a=長さ、b=幅である。データは平均および平均±SEMで表した。群平均は、スチューデント両側独立t検定を用いて比較した。<005の確率値で有意差があると解釈した。19日目に、平均腫瘍量が44mm3のマウスを無作為に2つの群に分けた。1群は10匹の動物からなった。動物に、対照抗体または18R5IgG抗体のいずれかを注射した。抗体の投与は、腹膜内空洞に週2回、注射することによって行った。対照抗体を用いて治療された腫瘍と比較して、抗体18R5による治療によって腫瘍成長は完全に消失した。18R5とイリノテカンの併用治療による0MPC28異種移植片の腫瘍成長の低下別の態様において、OMPC28結腸腫瘍の異種移植片の成長を弱めることができるかどうか、抗FZD抗体を分析した。解離したヒトOMPC28細胞を、6~8週齢の雄NODSCIDマウスに皮下注射した。腫瘍成長を毎週モニタリングし、腫瘍が触知可能になったら腫瘍測定を開始した。24日目に、平均腫瘍量が129mm3のマウスを無作為に4つの群に分けた。1群は10匹の動物からなった。動物に、対照抗体、または18R5IgG抗体、またはイリノテカン、または18R5とイリノテカンの組み合わせを注射した。抗体およびイリノテカンの投与は、腹膜内空洞に週2回、注射することによって行った。腫瘍を週2回測定し、式12を用いて、腫瘍量を求めた。式中、a=長さ、b=幅である。データは平均および平均±SEMで表した。群平均は、スチューデント両側独立t検定を用いて比較した。<005の確率値で有意差があると解釈した。図11に示したように、18R5で治療すると、腫瘍成長が40低下した。さらに、18R5およびイリノテカンにより治療すると、イリノテカンのみによる治療と比較して腫瘍成長が53低下した。従って、18R5は、OMPC28結腸腫瘍モデルにおいて、単一の剤として、ならびにイリノテカンと組み合わせて、抗腫瘍成長活性を証明した。18R5とゲムシタビンの併用治療によるOMPPn4異種移植片の腫瘍成長の低下別の態様では、OMPPn4膵臓腫瘍の異種移植片の成長を弱めることができるかどうか、抗FZD抗体を分析した。NODSCIDマウスはHarlanから購入し、研究の前に数日間、順応させた。インビボ癌幹細胞由来膵臓異種移植片モデルの確立および特徴付けは以前に述べられた。効力研究のために、OMPPn4ヒト膵臓腫瘍細胞を単一細胞懸濁液に解離し、FACS緩衝液の11混合物ならびにMatrigelに再懸濁し、50000個の細胞100μLを含有する25ゲージ針を用いて、6~7週齢の雄NODSCIDマウスの右側腹部領域に皮下移植した。腫瘍成長を毎週モニタリングし、腫瘍が触知可能になったら腫瘍測定を開始した。36日目に、平均腫瘍量が約120mm3に達し、腫瘍を有する動物を無作為に分けた。2日後に治療を開始した。動物に、対照抗体、18R5IgG抗体、ゲムシタビン、または18R5IgG抗体とゲムシタビンの組み合わせを注射した。抗体およびまたはゲムシタビンの投与は、腹膜内空洞に週1回、注射することによって行った。電子キャリパを用いて、腫瘍成長を測定した。腫瘍を週1回測定し、式12を用いて、腫瘍量を求めた。式中、a=長さ、b=幅である。動物の体重が15超減少していれば、動物の体重を毎日測定し、動物の体重が20減少していれば、安楽死させた。データは平均および平均±SEMで表した。群間の平均値の差は、ノンパラメトリックt検定によって解析した。多重比較では、一元配置ANOVA検定と事後t検定比較を使用した。p<005の差であれば有意差があるとみなした。統計解析用のソフトウェアは、GraphPadPrism4によるものであった。研究の終わりに、CO2チャンバーを使用し、その後に頸部脱臼によって、マウスを安楽死させた。RNAおよび組織学分析のために腫瘍を集めた。残りの腫瘍を、癌幹細胞頻度を分析するための単一細胞懸濁液に処理するために冷medium199に移した。OMPPn4異種移植片研究の結果を図12に示す。単独療法としての18R5抗体による治療は、この実験において腫瘍成長の大幅な低下をもたらさなかった。しかしながら、18R5およびゲムシタビンにより治療すると、腫瘍成長は、ゲムシタビンによる治療を超えて42低下した。従って、18R5は、OMPPn4膵臓腫瘍モデルにおいて、認可された標準治療化学療法剤であるゲムシタビンと組み合わせて相乗的な抗腫瘍成長活性を証明した。18R5とパクリタキセルの併用治療によるPE13乳房腫瘍成長の低下10000個のPE13ヒト乳房腫瘍細胞をNODSCIDマウスに移植し、約120mm3の平均体積に達するまで、22日間成長させた。次いで、動物を無作為に、それぞれ10匹の動物からなる4つの群に分け、対照抗体、抗FZD18R5、パクリタキセル、または18R5パクリタキセルを投与した。図37は、対照抗体、抗FZD18R5、パクリタキセル、または18R5パクリタキセルが投与されたマウスの平均腫瘍量を示す。抗体は、10mgkg、IP、週2回、投与した。パクリタキセルは、10mgkg、IP、週1回、投与した。図37に示した日に、腫瘍を測定した。図38は、18R5パクリタキセル群の個々の動物の腫瘍成長を示す。18R5パクリタキセル治療は、抗腫瘍活性および確立した乳房腫瘍の退縮をもたらすことが示された。実施例8癌幹細胞頻度に対する効果を決定するためのアッセイ固形腫瘍癌幹細胞に対するFZDに結合する剤または抗体の効果、および癌幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成能に対するFZDに結合する剤または抗体の効果を評価するために、限界希釈アッセイを使用することができる。このアッセイは、FZDに結合する抗体または他の剤を用いて治療された動物からの腫瘍内の癌幹細胞頻度を決定するために、およびこの頻度と、対照動物からの腫瘍の癌幹細胞頻度とを比較するために使用することができる。OMPC28腫瘍内の癌幹細胞に対する18R5とイリノテカンの併用治療の効果前記のOMPC28異種移植片研究からの対照および治療された腫瘍を、研究の終わりに採取した。腫瘍を処理し、単細胞に解離した。次いで、腫瘍細胞を、ビオチン化マウス抗体と氷上で30分間インキュベートした後に、磁石の力を借りてマウス細胞を取り出すために、ストレプトアビジン標識磁気ビーズを添加した。LDAのために、懸濁液中のヒト細胞を採取し、計数し、適切な細胞用量を含むFACS緩衝液をMatrigelと11混合物で混合し、NODSCIDマウスに皮下注射した。腫瘍を4ヶ月まで成長させる。望ましい時点で、抗FZD抗体で治療された腫瘍細胞を注射した全ての群において、検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセントを求め、対照において検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセントと比較する。例えば、125個の対照治療腫瘍細胞を注射し、検出可能な腫瘍を有するマウスの数を求め、125個のFZD抗体治療腫瘍細胞を注射し、検出可能な腫瘍を有するマウスの数と比較する。次いで、LCalcソフトウェアを用いて、癌幹細胞頻度を計算する。簡単に述べると、ポアソン統計に基づくと、37の動物が腫瘍を発症しなければ、既知数の注射細胞の中に、ちょうど1個の癌幹細胞が存在する。細胞表面マーカーの分析のために、単一腫瘍細胞懸濁液を、蛍光色素が直接結合している抗ESAおよび抗CD44抗体を用いて染色した。死細胞は、バイアビリティダイDAPIを用いて排除した。フローサイトメトリーは、FACSAriaを用いて行った。側方散乱光および前方散乱光プロファイルを用いて、細胞凝集塊を排除した。対照抗体を用いて治療された腫瘍の分析から、腫瘍集団全体の64がESAおよびCD44を両方とも高レベルで発現することが明らかになった。図39に示したように、二重陽性集団は、イリノテカンのみによる処理の影響を大きく受けなかったが、18R5または18R5とイリノテカンの組み合わせによる治療によって二重陽性集団は減少した。OMPPn4腫瘍内の癌幹細胞に対する18R5とゲムシタビンの併用治療の効果前記のOMPPn4異種移植片研究からの対照および治療された腫瘍を、41日間の治療の終わりに採取した。腫瘍を処理し、単一細胞に解離した。次いで、腫瘍細胞を、ビオチン化マウス抗体と氷上で30分間インキュベートし、その後に、マウス細胞を取り出すためにストレプトアビジン標識磁気ビーズを添加した。懸濁液中に残っているヒト細胞を集め、計数し、適切な細胞用量まで希釈し、11FACS緩衝液およびMatrigelの混合物中で混合し、NODSCIDマウスに皮下注射した。図40に示したように、75日間、腫瘍を成長させた。図40の各点は、個々のマウスの腫瘍量を示す。抗FZD抗体で治療された腫瘍細胞を注射した全ての群において、検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセントを求め、対照において検出可能な腫瘍を有するマウスのパーセントと比較した。例えば、810個の対照治療腫瘍細胞を注射し、検出可能な腫瘍を有するマウスの数を求め、810個のFZD抗体治療腫瘍細胞を注射し、検出可能な腫瘍を有するマウスの数と比較した。次いで、LCalcソフトウェアを用いて、癌幹細胞頻度を計算するために、腫瘍成長頻度を使用する。各治療群の計算した癌幹細胞頻度を図41に示す。18R5のみによる治療および18R5とゲムシタビンとを組み合わせた治療によって癌幹細胞頻度が低下したが、ゲムシタビンのみによる治療は効果がなかった。実施例9FZD抗体の作製抗原の作製抗体作製のための抗原として、ヒトFZD受容体の細胞外ドメインまたはFriドメインの組換えポリペプチド断片を作製する。標準的な組換えDNA技術を用いて、望ましいヒトfrizzled受容体のこれらのドメインのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを単離する。これらのポリヌクレオチドのN末端にヒトFcタグまたはヒスチジンタグをインフレームで連結し、昆虫細胞におけるバキュロウイルスを介した発現用のトランスファープラスミドベクターにクローニングする。標準的なトランスフェクション、感染、および細胞培養プロトコールを用いて、対応するFZDポリペプチドを発現する組換え昆虫細胞を作製する。プロテインAおよびNiキレートアフィニティクロマトグラフィーを用いて、昆虫細胞調整培地から抗原タンパク質を精製する。精製された抗原タンパク質をPBSに対して透析し、約1mgmlまで濃縮し、免疫のために調製中に滅菌濾過する。免疫化標準的な技法を用いて、マウスを、精製されたFZD抗原タンパク質で免疫する。初回免疫の約70日後に、ELISAおよびFACS分析を用いて、マウス一匹一匹からの血液を抗原認識についてスクリーニングする。最後の抗原追加免疫のために、最も高い抗体価を有する2匹の動物を選択する。この後に、ハイブリドーマ作製のために脾臓細胞を単離する。ハイブリドーマ細胞を、1細胞ウェルで、96ウェルプレートにプレーティングし、各ウェルからの上清を、抗原タンパク質に対するELISAおよびFACS分析によってスクリーニングする。最も高い抗体価を有する、いくつかのハイブリドーマを選択し、静置フラスコ培養にしてスケールアップする。プロテインAまたはタンパク質Gアガロースクロマトグラフィーを用いて、ハイブリドーマ上清から抗体を精製する。精製されたモノクローナル抗体をFACSによって再試験し、IgG抗体およびIgM抗体を選択するためにアイソタイプを決定する。エピトープマッピングシステインリッチドメインを含むFZD細胞外ドメインの特定の領域を認識する抗体を同定するために、エピトープマッピングを行う。細胞外FZDドメインの断片をコードするポリヌクレオチドの上流にCMVプロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドベクターを、標準的な組換えDNA技術を用いて作製する。次いで、組換えタンパク質を、一過的トランスフェクションによって哺乳動物培養細胞において発現させる。トランスフェクションの24時間~48時間後に、細胞を採取し、FZD抗原で免疫したマウスからの抗体を用いて、ウェスタンブロッティングのために、細胞溶解産物タンパク質をSDSPAGEアクリルアミドゲル上で分離する。ELISAによって、FZDのリガンド結合ドメインを認識する抗体を、Wntタンパク質との競合的結合についてさらに分析することができる。FZDに対する抗体が認識する細胞外ドメイン内の特異的エピトープを同定するために、SPOTシステムを使用する。1個のアミノ酸が重複し、FZD細胞外ドメイン全体をカバーする一連の10残基の直鎖ペプチドを合成し、SPOT合成法によってセルロース膜に共有結合させる。膜を、ブロッキング緩衝液と室温で8時間プレインキュベートし、抗体と4°Cで一晩ハイブリダイズさせる。次いで、膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合した二次抗体とインキュベートし、再洗浄し、3アミノ9エチルカルバゾールを含有するシグナル発色溶液を用いて視覚化する。このように、抗体により認識される特異的エピトープを決定する。FACS分析天然の細胞表面FZDタンパク質を認識するハイブリドーマクローンにより産生されたモノクローナル抗体を選択するために、FACs分析を使用する。HEK293細胞に、対応するFZDの完全長cDNAクローンをコードする発現ベクターのみをトランスフェクトする、またはGFPを発現するベクターをコトランスフェクトする。Flagエピトープタグをアミノ末端に導入することができ、これにより、細胞表面上でのタグ化FZD受容体の発現を確認することができる。トランスフェクションの24~48時間後に、細胞を懸濁液に入れて集め、抗FZD抗体、FLAG抗体、免疫血清、またはバックグラウンド抗体結合を検出するための対照IgGと氷上でインキュベートする。細胞を洗浄し、蛍光発色団が結合している抗マウス二次抗体を用いて、一次抗体を検出する。次いで、対応するFZD受容体の細胞表面発現を特異的に認識する抗FZD抗体を同定するために、標識細胞をFACSで分別する。望ましいヒトfrizzled受容体を認識する抗体が同定される。キメラ抗体FZD受容体を特異的に認識するモノクローナル抗体が同定された後に、げっ歯類抗体が治療剤として用いられる時のヒト抗マウス抗体免疫応答を克服するために、これらの抗体を改変する。選択されたモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、RTPCRによってハイブリドーマ細胞から単離し、それぞれ、哺乳動物発現ベクターに入れて、ヒトIgG1重鎖およびκ軽鎖定常領域とインフレームで連結する。または、同じプラスミド上にヒトIgG1重鎖およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含有するヒトIg発現ベクター、例えば、TCAE53が用いられる。次いで、キメラ抗体作製のために、キメラ重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣細胞にコトランスフェクトする。ELISAおよびFACSによって、キメラ抗体の免疫反応性および親和性を親マウス抗体と比較する。ヒト化抗体キメラ抗体治療剤は今なお頻繁に抗原性があるために、ヒト抗キメラ抗体免疫応答が生じるので、FZD受容体に対するキメラ抗体をさらにヒト化することができる。ヒト化抗体を作製するために、3つの短い超可変配列、すなわち相補性決定領域、ならびにまたは前記の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインのCDR領域を正しく配置するのに必要なフレームワーク領域からの要素を潜在的に含む、抗体の特異性決定モチーフの鍵となる側面を、組換えDNA技術を用いて操作して、それぞれ、ヒト重鎖抗体遺伝子および軽鎖抗体遺伝子の生殖系列DNA配列に入れ、次いで、CHO細胞において発現させるために哺乳動物発現ベクターにクローニングする。ELISAおよびFACSによって、ヒト化抗体の免疫反応性および親和性を親キメラ抗体と比較する。さらに、ヒト化抗体の特異性、親和性などを最適化するために、可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を使用することができる。ヒト抗体ある態様では、ファージディスプレイ技術を用いて、FZD受容体の細胞外ドメインを特異的に認識するヒト抗体を単離する。単鎖Fvまたはfabドメインとしてディスプレイされたヒト抗体可変ドメインを含有するファージディスプレイ抗体ライブラリーを、前記のFZD受容体抗原の特異的かつ高親和性の認識についてスクリーニングする。次いで、CHO細胞においてヒト抗体を発現させるために、同定された可変ドメイン抗体配列を、ヒトIgG1重鎖およびκ軽鎖を含有するIg発現ベクターに再編成する。実施例10特異的エピトープを認識する抗体の作製ハイブリドーマからのモノクローナル抗体ある態様では、FZD受容体の機能的エピトープを認識する抗体は、マウスを、FZD受容体抗原の1つまたは複数で免疫することによって作製される。標準的な技法を用いて、マウスを精製FZD抗原タンパク質で免疫する。ある態様では、別個のFZD受容体抗原でマウスを連続して免疫する。初回免疫の約70日後に、個々のマウスからの血液をスクリーニングする。最後の抗原追加免疫のために、FZD抗原に対して高い抗体価を有する動物を選択し、この後に、ハイブリドーマを作製するために、脾臓細胞を単離する。ハイブリドーマ細胞を、96ウェルプレート中、1ウェルあたり1個の細胞でプレーティングし、各ウェルからの上清を、ELISAおよびフローサイトメトリー分析によってスクリーニングする。生物学的結合部位の中にあるエピトープまたは生物学的結合部位と重複するエピトープを含む、特異的エピトープを認識するモノクローナル抗体を同定するために、抗体が望ましいFZDに結合するかどうか、望ましい特異的エピトープの中に特定のアミノ酸置換を有するFZDに結合しないかどうか、ハイブリドーマ上清をスクリーニングする。ヒト抗体FZD受容体の望ましいエピトープを認識する抗体を同定するために、ファージディスプレイライブラリーを使用することができる。例えば、選択されたFZDのFriドメインを組換えタンパク質として発現させ、10μgmLで、適切な表面上にコーティングする。次いで、ヒトファージライブラリーを、2回またはそれ以上の濃縮によってパンニングする。任意で、別個のFZDタンパク質を用いて、後の回のパニングを行うことができる。任意で、それぞれの回のパニングは、内のエピトープを含む望ましい標的エピトープ領域内に特定のアミノ酸置換を含有するデコイ可溶性FZDタンパク質の存在下で行ってもよい。次いで、ELISAまたはフローサイトメトリー分析によって、望ましいFZDタンパク質に結合する能力について、パニング選択からのアウトプットの個々のクローンをスクリーニングする。望ましいエピトープとの結合は、望ましい標的エピトープの中に特定のアミノ酸置換を含有するFZDタンパク質と結合しないことによって評価する。次いで、抗原結合ドメインをコードする遺伝子をファージから回収し、適切な宿主細胞株において発現させるために、抗原結合ドメインと定常領域を接続することによって完全なヒト抗体分子を構築するのに使用する。本明細書の他の場所に記載のように、腫瘍細胞増殖を阻止する能力について、抗体を同定および試験する。実施例11FZD受容体に対する抗体を評価するためのさらなるインビトロアッセイ本実施例は、細胞増殖、経路活性化、および細胞傷害性に対する、FZD受容体に対して作製した抗体の活性を試験するための代表的なインビトロアッセイについて述べる。増殖アッセイTaqman分析を用いて、様々な癌細胞株によるFZD受容体の発現を定量する。FZD受容体を発現すると同定された細胞株を、96ウェル組織培養マイクロプレートに入れて、104細胞ウェルの密度でプレーティングし、24時間、増殖させる。その後に、細胞を、2FCSを含む新鮮なDMEMに入れて、さらに12時間、培養する。この時点で、10μmolLBrdUの存在下で、抗FZD抗体または対照抗体を培地に添加する。BrdU標識後に、培地を除去し、細胞をエタノールで室温で30分間固定し、ペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗BrdU抗体と90分間反応させる。基質を、テトラメチルベンジジンを含有する溶液に入れて発色させ、1molLH2SO425μlによって15分後に止める。自動ELISAプレートリーダーと450nmフィルターを用いて、呈色反応を測定する。全ての実験を3回繰り返して行う。対照抗体と比較して、細胞増殖を阻害する抗FZD抗体の能力を決定する。経路活性化アッセイある態様では、Wntシグナル伝達経路の活性化をブロックする、FZD受容体に対する抗体の能力をインビトロで決定する。例えば、抗生物質および10FCSを添加したDMEM中で培養したHEK293細胞に対して、1Wntシグナル伝達経路を活性化するために、Wnt7BおよびFZD10発現ベクター2標準的Wntシグナル伝達レベルを測定するために、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に3コピーまたは8コピーのTCF結合ドメインを含有する、TCFLuc野生型または変異型レポーターベクターならびに3トランスフェクション効率の内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼレポーターをコトランスフェクトする。次いで、抗FZD10および対照抗体を細胞培地に添加する。トランスフェクションの48時間後に、デュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて、ルシフェラーゼレベルを測定する。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して基準化する。3回の独立した実験を3回繰り返して行う。このように、Wnt経路活性化を阻害するFZD抗体の能力を決定する。補体依存性細胞傷害アッセイある態様では、FZD受容体を発現する癌細胞株、または易感染性マウスにおいて異種移植片として継代された、患者試料から単離した癌幹細胞を用いて、FZD受容体に対する抗体によって媒介される補体依存性細胞傷害を測定する。抗生物質および5FBSを添加したRPMI1640培地200μlに、細胞を106細胞mlで懸濁する。次いで、懸濁した細胞を、FZD受容体に対する抗体または対照抗体を含む血清または熱失活血清200μlと混合する。これを3回繰り返して行う。細胞混合物を、5CO2中で、37°Cで1~4時間インキュベートする。次いで、処理した細胞を集め、培地で希釈したFITC標識アネキシンV100μlに再懸濁し、室温で10分間インキュベートする。HBSSで希釈したヨウ化プロピジウム溶液100マイクロリットルを添加し、室温で5分間インキュベートする。細胞を集め、培地に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析する。FITC染色細胞のフローサイトメトリーによって、総細胞数が得られる。熱失活血清および対照抗体と比較した、血清およびFZDに対する抗体の存在下での細胞死を測定するために、総細胞に対するパーセントとしての死細胞によるヨウ化プロピジウム取り込みが用いられる。このように、補体依存性細胞傷害を媒介する抗FZD抗体の能力を決定する。抗体依存性細胞傷害アッセイFZD受容体を発現する癌細胞株、または易感染性マウスにおける異種移植片として継代された、患者試料から単離した癌幹細胞を用いて、FZD受容体に対する抗体によって媒介される抗体依存性細胞傷害を測定した。細胞を、抗生物質および5FBSを添加したフェノールレッドを含まないRPMI1640培地200μlに、106細胞mlで懸濁した。エフェクター細胞として使用するために、FicollPaque密度勾配遠心分離法によって、末梢血単核球をヘパリン添加末梢血から単離する。次いで、標的細胞とPBMCエフェクター細胞を、251、101、および51のET比で、96ウェルプレートに入れて、少なくとも1種類のFZD受容体抗体または対照抗体の存在下で混合する。対照は、抗体の存在下での、標的細胞のみおよびエフェクター細胞のみのインキュベーションを含む。細胞混合物を、5CO2中で、37°Cで1~6時間インキュベートする。次いで、細胞溶解の際に放出される安定サイトゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼの放出を、比色アッセイによって測定する。標準的な96ウェルプレートリーダーを用いて490nmでの吸光度データを集め、バックグラウンドを補正する。特異的細胞傷害性のパーセントを、以下の式に従って計算する:細胞傷害性=100×。このように、抗体依存性細胞傷害を媒介する、FZD受容体に対する抗体の能力を決定する。実施例12インビボでの抗FZD受容体抗体を用いた腫瘍成長の阻止本実施例は、異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻止するための抗FZD受容体抗体の使用について述べる。ある態様では、マウスにおいて異種移植片として継代された、患者試料からの腫瘍細胞を、実験動物に再継代するために調製する。腫瘍組織を無菌条件下で取り出し、小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。具体的には、胸水細胞または結果として生じる腫瘍断片を、超高純度のコラゲナーゼIIIを含む培地と混合し、15~20分ごとに10mLピペットで上下にピペッティングしながら、37°Cで3~4時間インキュベートする。消化された細胞を、45μMナイロンメッシュに通して濾過し、RPMI20FBSで洗浄し、HBSSで2回洗浄する。次いで、腫瘍成長を誘発するために、解離した腫瘍細胞を、NODSCIDマウスの乳房脂肪パッドに皮下注射する。ある態様では、最初に、解離した腫瘍細胞を、細胞表面マーカーに基づいて腫瘍形成性細胞および非腫瘍形成性細胞に分別した後に、実験動物に注射する。具体的には、前記のように解離した腫瘍細胞を、2熱失活仔ウシ血清を含有するHepes緩衝生理食塩溶液で2回洗浄し、100μlにつき106個の細胞で再懸濁する。抗体を添加し、細胞を氷上で20分間インキュベートした後に、HBSS2HICSで2回洗浄する。抗体には、抗ESA、抗CD44、抗CD24、および細胞系マーカーである抗CD2、抗CD3、抗CDlO、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64、および抗CD140bが含まれる。これらのマーカーを発現する細胞のポジティブセレクションまたはネガティブセレクションを行うために、抗体を蛍光色素に直接結合させる。マウス細胞は、H2Kd細胞を選択することによって排除し、死細胞は、バイアビリティダイ7AADを使用することによって排除する。フローサイトメトリーは、FACSVantageによって行う。側方散乱光および前方散乱光プロファイルを用いて、細胞凝集塊を排除する。次いで、腫瘍成長を誘発するために、単離されたESA、CD44、CD24low、Lin腫瘍形成性細胞をNODSCIDマウスに皮下注射する。一例として、腫瘍細胞の増殖を弱めることができるかどうか抗FZD抗体を分析する。解離した腫瘍細胞を、6~8週齢NODSCIDマウスの側腹部領域に皮下注射する。腫瘍細胞注射の2日後に、動物に、10mgkgの抗FZD抗体を、週に2回、腹腔内注射する。成長が検出されるまで、腫瘍成長を毎週モニタリングする。この後に、腫瘍成長を、計8週間、週2回、測定する。このように、PBS注射対照と比較して腫瘍成長を大幅に弱める、FZD結合抗体を同定する。実施例13抗FZD受容体抗体を用いた腫瘍のインビボ治療本実施例は、異種移植片モデルにおいて癌を治療するための抗FZD受容体抗体の使用について述べる。ある態様では、マウスにおいて異種移植片として継代された、患者試料からの腫瘍細胞を、実験動物に再継代するために調製する。腫瘍組織を取り出し、小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。次いで、腫瘍成長を誘発するために、解離した腫瘍細胞を、乳房腫瘍の場合はNODSCIDマウスの乳房脂肪パッドに、または非乳房腫瘍の場合はNODSCIDマウスの側腹部に皮下注射する。または、ESA、CD44、CD24low、Lin腫瘍形成腫瘍細胞を前記のように単離し、注射する。腫瘍細胞注射後に、動物の腫瘍成長をモニタリングする。腫瘍の平均サイズが約150~200mmに達したら、抗体治療を開始する。各動物の腹腔内に、100μgのFZD受容体抗体または対照抗体を、計6週間、1週間に2~5回、与える。腫瘍の大きさを6週間、週2回、評価する。このように、対照抗体と比較して、腫瘍成長をさらに阻止する、または腫瘍の大きさを縮小するFZD受容体抗体の能力を決定する。抗体治療のエンドポイントで、さらなる分析のために腫瘍を採取する。ある態様では、腫瘍への抗体浸透および腫瘍応答を評価するために、腫瘍の一部を免疫蛍光によって分析する。抗FZD受容体で治療されたマウスおよび対照抗体で治療されたマウスから採取された各腫瘍の一部を液体窒素に入れて新鮮凍結し、OCTに入れて包埋し、10μm切片としてクリオスタットで切断してガラススライドに載せる。ある態様では、各腫瘍の一部をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、10μm切片としてミクロトームで切断してガラススライドに載せる。切片を後固定し、腫瘍生検材料に存在する抗FZD受容体または対照抗体を検出するために、注射された抗体を特異的に認識する発色団標識抗体とインキュベートする。さらに、異なる腫瘍および腫瘍に補充される細胞タイプを検出する抗体、例えば、血管内皮細胞を検出する、抗VEカドヘリンまたは抗PECAM1抗体、血管平滑筋細胞を検出する、抗平滑筋αアクチン抗体、増殖細胞を検出する、抗Ki67抗体、死にかけている細胞を検出する、TUNELアッセイ、Wntシグナル伝達を検出する、抗βカテニン抗体、およびNotchシグナル伝達を検出する、抗細胞内ドメインNotch断片抗体を用いて、例えば、血管新生、腫瘍成長、および腫瘍形態に対する抗体治療の効果を評価することができる。ある態様では、腫瘍細胞遺伝子発現に対する抗FZD受容体抗体治療の効果も評価する。FZD抗体で治療されたマウスおよび対照抗体で治療されたマウスから採取された各腫瘍の一部から、総RNAを抽出し、定量RTPCRに使用する。FZD受容体、例えば、Wnt1およびβカテニンを含む、Wntシグナル伝達経路の成分、ならびに以前に同定されたさらなる癌幹細胞マーカーの発現レベルを、内部対照であるハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較して分析する。このように、FZD受容体抗体治療の際の腫瘍細胞遺伝子発現の変化を決定する。さらに、腫瘍内の癌幹細胞頻度に対する抗FZD受容体抗体治療の効果を評価する。FZDで治療したマウスからの腫瘍試料と、対照抗体で治療したマウスからの腫瘍試料を小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。次いで、前記で詳述したように、腫瘍形成癌幹細胞が存在するかどうか、ESA、CD44、CD24low、Lin表面細胞マーカー発現に基づいて、解離した腫瘍細胞をFACS分析によって分析する。次いで、抗FZD抗体治療後に、ESA、CD44、CD24low、Lin発現に基づいて単離した細胞の腫瘍形成能を評価することができる。FZD抗体で治療したマウスから単離したESA、CD44、CD24low、Lin癌幹細胞と、対照抗体で治療したマウスから単離したESA、CD44、CD24low、Lin癌幹細胞を、NODSCIDマウスの乳房脂肪パッドに再度、皮下注射した。次いで、一貫した腫瘍形成に必要な注射細胞の数に基づいて、癌幹細胞の腫瘍形成能を決定する。実施例14Wnt遺伝子シグネチャーの同定ヒト結腸腫瘍においてWntシグナル伝達経路活性化に特異的な発現を示す一群の遺伝子を同定する実験を行った。アキシン過剰発現による腫瘍成長の抑止アキシンは、標準的Wnt経路の重要な制御因子である。アキシンは、βカテニン分解を誘発する多タンパク質複合体の一部であり、従って、この経路はWntの非存在下では働かない。この作用はWntによって逆転する。Wntは破壊複合体からアキシンを取り除き、これにより、βカテニンが移動し、特定の標的遺伝子がTCFを介して活性化される。外因性アキシンの過剰発現およびドミナントネガティブ切断型TCFの発現は、Wntシグナル伝達経路をブロックするための、はっきり特徴づけられた手段である。本発明者らは、レンチウイルスを介したアキシン過剰発現によって、UMPE13およびUMT3乳房腫瘍の成長、ならびにNODSCIDマウスにおけるOMPC11およびOMPC17結腸腫瘍の成長が完全に消失したことを示した。UMT3腫瘍細胞におけるDNTCF4の安定発現にも同じ効果があった。まとめると、これらのデータから、細胞内Wnt遮断は、異なる腫瘍タイプの発症にマイナス効果を及ぼし得ることが証明された。このことは、Wnt経路が、乳癌および結腸癌の治療のための関連する標的であることを裏付けている。Wntシグナル伝達経路は、多くの腫瘍タイプにおいて構成的に活性化されている。ほとんどの結腸腫瘍において、この活性化は、APCの切断変異またはβカテニンの活性化変異によるものである。このような変異は、他の組織については報告されていない。他の組織では、Wntシグナル伝達経路は、別のセットの変異またはオートクライン機構により活性化されている可能性がある。Wntシグナル伝達経路が依然としてオートクライン刺激に応答する腫瘍では、細胞外手段、例えば、抗体または他の可溶性タンパク質阻害剤を用いた経路の遮断が実行可能であり、腫瘍発症に影響を及ぼすはずである。このようなWnt依存性腫瘍の同定は、抗Wnt剤の開発、および診療所での標的となる腫瘍タイプの特定に役立つだろう。免疫組織化学的データから、ほとんどのOMPC11腫瘍細胞は高レベルの細胞質核βカテニンを発現することが分かった。このことは、この腫瘍タイプにおいて、Wntシグナル伝達経路が構成的に活性化されていることを示唆している。これは、ウエスタンブロットによって、OMPC11において高レベルのβカテニンが検出されたことによって確かめられた。Wnt経路活性化とアキシン過剰発現に対する感受性の組み合わせから、OMPC11は、WntおよびWnt遮断に応答した遺伝子発現の調節を研究するための、ならびにWnt遺伝子シグネチャーを得るための良い腫瘍となっている。アキシン過剰発現に応答したディファレンシャルな遺伝子発現のマイクロアレイ分析アキシンを用いてOMPC11結腸腫瘍細胞を処理した時のディファレンシャルな遺伝子発現を、マイクロアレイ分析によって決定した。結腸腫瘍細胞の供給源として、NODSCIDマウスから新鮮に取り出したヒト結腸OMPC11腫瘍を使用した。構成的アキシンIRESGFP発現カセットおよび対照IRESGFP発現カセットを送達するために、2種類のレンチウイルスベクターを作製した。これらを、それぞれ、L0M91およびLOM92と名付けた。OMPC11腫瘍を単一細胞懸濁液になるように処理し、マウス系列細胞から取り出した。linを持たない細胞に、感染多重度25で、L0M91または92レンチウイルスベクターを感染させ、3~4日間、培養で維持し、GFP発現について分別した。分別した細胞の各試料から総RNAを抽出した。RNAを、GeneChipヒトゲノムU13320マイクロアレイで分析した。実験を2回繰り返した。Wnt経路によって調節される基本セットの遺伝子を含有する遺伝子シグネチャーは、アキシン処理後に異なって発現し、正常試料および悪性結腸腫瘍試料のパネル全体にわたってアキシン2の発現との相関関係も示した遺伝子を分析することによって作製した。アキシンマイクロアレイ実験から、アキシン過剰発現に応答してダウンレギュレーションを示した遺伝子を同定した。この選択のカットオフは、t検定p値01未満で、対照試料と比較して、アキシン1過剰発現試料において50またはそれ以上ダウンレギュレーションしたことであった。アキシン1は公知のWnt経路阻害剤であるので、アキシン1過剰発現によってダウンレギュレーションした遺伝子は、直接的または間接的なWnt経路標的である。次いで、一組の結腸腸他の消化器組織の悪性腫瘍試料の中で、アキシン2と高い相関関係を示した遺伝子を同定することによって、この選択をさらに精巧にした。アキシン2は公知のWnt標的であるので、アキシン2と類似の発現パターンを示す遺伝子もWnt標的である可能性が高い。この分析により、Wnt経路活性についての遺伝子シグネチャーが得られた。このシグネチャーの中の遺伝子の発現レベルを用いると、個々の腫瘍試料または異なる腫瘍タイプが、Wnt経路シグナル伝達の変化の証拠を示すかどうか評価することができる。表6結腸腫瘍に由来するWnt遺伝子シグネチャーのリスト実施例15抗FZD受容体抗体を用いたヒト癌の治療本実施例は、FZD受容体発現が検出されている癌幹細胞およびもしくは腫瘍細胞、ならびにまたはWntシグナル伝達の阻害に応答することを示すWnt遺伝子シグネチャーを有する腫瘍細胞を含む腫瘍を標的とするために、FZD受容体に対する抗体を用いて癌を治療するための方法について述べる。最初に、腫瘍生検材料から、癌幹細胞マーカーもしくはFZD受容体の存在、またはWnt遺伝子シグネチャー中の1種類もしくは複数の種類の遺伝子の発現を決定することができる。癌と診断された患者からの生検材料から腫瘍細胞を無菌条件下で取り出す。ある態様では、組織生検材料を液体窒素に入れて新鮮凍結し、OCTに入れて包埋し、10μm切片としてクリオスタットで切断してガラススライドに載せる。ある態様では、組織生検材料をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、10μm切片としてミクロトームで切断してガラススライドに載せる。FZDタンパク質発現を検出するために、切片を、FZD受容体に対する抗体とインキュベートする。または、実施例14に記載のWnt遺伝子シグネチャー中の1種類または複数の種類の遺伝子が存在するかどうか、切片を分析することができる。癌幹細胞の存在も決定することができる。組織生検試料を小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、単一細胞懸濁液を得るために、細胞を酵素消化および機械的破壊に供する。次いで、癌幹細胞を検出するために、解離した腫瘍細胞を抗ESA抗体、抗CD44抗体、抗CD24抗体、抗Lin抗体、および抗FZD抗体とインキュベートし、ESA、CD44、CD24low、Lin、FZD腫瘍幹細胞の存在を、前記で詳述したようにフローサイトメトリーによって決定する。FZD受容体およびまたはWnt遺伝子シグネチャー中の1種類もしくは複数の種類の遺伝子を発現すると診断された腫瘍を有する癌患者を、抗FZD受容体抗体を用いて治療する。ある態様では、前記のように作製した、ヒト化モノクローナル抗FZD受容体抗体またはヒトモノクローナル抗FZD受容体抗体を精製し、注射用の適切な薬学的なビヒクルを用いて処方する。ある態様では、患者は、FZD抗体を用いて、少なくとも10週間にわたって1ヶ月に少なくとも1回、治療する。ある態様では、患者は、FZD抗体を用いて、少なくとも約14週間にわたって1ヶ月に少なくとも1回、治療する。それぞれの抗体投与は薬学的に有効な用量でなければならない。ある態様では、約2~約100mgmlの抗FZD抗体が投与される。ある態様では、約5~約40mgmlの抗FZD抗体が投与される。抗体は、標準的な放射線療法レジメンまたは1つもしくは複数の化学療法剤、例えば、オキサリプラチン、フルオロウラシル、ロイコボリン、またはストレプトゾシンを用いた化学療法レジメンの前に、これらと同時に、あるいはこれらの後に投与することができる。このような治療によって抗腫瘍応答が生じたかどうかを決定するために、患者は、例えば、腫瘍退縮、新たな腫瘍の発生率の低下、腫瘍抗原発現の低下、癌幹細胞数の減少、または疾患予後を評価する他の手段に基づいてモニタリングされる。実施例1618R5およびゲムシタビンによる治療後の膵臓腫瘍細胞の分化定量PCRによる、治療された膵臓腫瘍細胞の遺伝子発現分析前記のように、対照Ab、18R5IgG抗体、ゲムシタビン、またはゲムシタビンと18R5IgG抗体の組み合わせを用いて治療したPN4異種移植片腫瘍を、クロモグラニンA発現について、定量PCR分析によって分析した。CHGAは、乳房、結腸、肺および膵臓の腫瘍を含む様々な腫瘍の神経内分泌分化マーカーであることは周知であり、膵臓腫瘍におけるCHGAの高発現が生存の改善と関連することが見出されている。総RNAを、PN4異種移植片研究の各群の5個の腫瘍から調製し、ワンステップ逆転写PCRによって、AppliedBiosystemsTaqmanの目録にあるプローブを使用し、標準的なプロトコールに従って評価した。CHGAの分析に使用したプローブプライマーセットには、FAM色素標識プローブおよび以下のプライマーが含まれた。GusBを内部対照として使用した。簡単に述べると、RTは48°Cで30分間、初回変性は95°Cで10分間、その後に、95°Cで15秒の変性と60°Cで1分の伸長の40サイクルを行った。増幅蛍光プローブの取り込みをリアルタイムで観察した。島β細胞マーカーであるCHGAは、ゲムシタビンおよび18R5を用いて治療されたマウスからの試料でのみ大幅に上昇した。対照Ab、18R5、およびゲムシタビンのみの群からの腫瘍は類似のCHGARNAレベルを発現したのに対して、組み合わせ群からの腫瘍のCHGA発現は明らかに増加していた。18R5およびゲムシタビンの両方を用いて治療された腫瘍における2回の実験において、CHGAレベルは10倍および7倍に上昇した。代表的な実験の結果を図42に示す。免疫組織化学による、治療された膵臓腫瘍細胞の遺伝子発現分析治療された腫瘍から調製された組織切片上での免疫組織化学によって、タンパク質レベルで高いCHGA発現も観察された。対照Abで治療された腫瘍は、腫瘍全体に点在している細胞からなる小さなサブセットの強い染色を示した。18R5のみまたはゲムシタビンのみを用いて治療した腫瘍は、対照とほぼ同じレベルのCHGAを発現した。対照的に、18R5とゲムシタビンの組み合わせを用いて治療した腫瘍は、CHGA陽性細胞数の増加を示した。これは、QPCRによって検出されたRNA発現の増加と一致する。アルシアンブルーおよびki67に対する抗体による染色内分泌細胞、分泌細胞、または腺管細胞の別の特徴はムチン産生であり、これらの細胞はアルシアンブルー染色によって検出することができる。腫瘍を採取および処理している間に、18R5で治療された腫瘍の粘液が、対照で治療された腫瘍より非常に多いことが観察された。従って、対照抗体、ゲムシタビンのみ、18R5のみ、または18R5ゲムシタビンを用いて治療されたマウスからのPN4腫瘍切片を、アルシアンブルーで染色した。18R5のみの群および18R5ゲムシタビンの群の両方で、18R5で治療した腫瘍は、対照およびゲムシタビンのみの群と比較して、アルシアンブルー染色が明らかに増加した。粘液性細胞の増加は、別の膵臓腫瘍株PN13でも、18R5または対照抗体を用いた治療後に認められた。この実験では、PN13腫瘍を有するマウスを前記のように治療した。粘液性細胞を明らかにするために、腫瘍切片をアルシアンブルーで染色し、増殖している細胞を明らかにするために、免疫組織化学により、ki67に対する抗体でも染色した。結果から、18R5治療によって、アルシアンブルー陽性粘液性細胞の数が大幅に増加したことが分かる。さらに、18R5治療によって、ki67陽性細胞頻度が低下した。興味深いことに、粘液性細胞と、ki67陽性細胞とは一致しなかった。このことは、粘液性細胞が増殖細胞でないことを示唆している。これにより、18R5治療は、非増殖子孫への腫瘍細胞の分化を促進するという証拠が得られた。要約すると、CHGA発現の増大、アルシアンブルー染色により証明されたムチン産生の増大、およびki67に対する抗体を用いた染色により証明された非増殖子孫の生成は、18R5治療によるWntFZDシグナル伝達の阻害によって、非増殖性分化細胞に特有の特徴を有する複数の異なる細胞タイプへの膵臓腫瘍細胞の分化が促進されるモデルと一致する。実施例1718R5を単独でおよびまたは他の抗癌剤と組み合わせて用いた、さらなるインビボ効力研究OMPLU24異種移植片の腫瘍成長に対する効果インビボでのOMPLU24ヒト肺腫瘍の成長の阻害における、抗FZD抗体18R5のみの効力およびタキソールと組み合わせた効力を評価した。50000個のOMPLU24ヒト肺腫瘍細胞を、NODSCIDマウスの皮下に注射した。腫瘍の平均体積が143mm3に達するまで、腫瘍を27日間、成長させた。動物を無作為に4つの群に分け、対照抗体、抗FZD18R5、タキソールまたは18R5とタキソールの組み合わせを用いて治療した。図44に示した日に腫瘍を測定した。抗体は、10mgkg腹腔内、週1回で投与した。タキソールは、15mgkg、IP、週1回で投与した。結果を図44に示す。抗FZD治療は腫瘍成長を弱めることが観察され、併用治療は、タキソールのみと比較して高い抗腫瘍活性を示した。OMPLU33異種移植片の腫瘍成長に対する効果インビボでのOMPLU33ヒト肺腫瘍の成長の阻害における、抗FZD抗体18R5のみの効力およびアバスチンと組み合わせた効力も試験した。10000個のOMPLU33ヒト肺腫瘍細胞を、NODSCIDマウスに皮下注射した。腫瘍の平均体積が124mm3に達するまで、腫瘍を30日間、成長させた。動物を無作為に4つの群に分け、対照抗体、アバスチン、抗FZD18R5、または18R5とアバスチンの組み合わせを用いて治療した。図45に示した日に腫瘍を測定した。抗体は10mgkgIP、週2回で投与した。結果を図45に示す。抗FZD治療は、腫瘍成長を弱めることが観察され、併用治療は、アバスチンのみと比較して高い抗腫瘍活性を示した。T3異種移植片の腫瘍成長に対する効果インビボでのT3ヒトHER2陽性乳房腫瘍の成長の阻害における、抗FZD抗体18R5のみの効力およびハーセプチンと組み合わせた効力も評価した。50000個のT3ヒト乳房腫瘍細胞を、NODSCIDマウスに皮下注射した。腫瘍の平均体積が125mm3に達するまで、腫瘍を32日間、成長させた。動物を無作為に4つの群に分け、対照抗体、抗FZD18R5、ハーセプチン、または185とハーセプチンの組み合わせを用いて治療した。図46に示した日に腫瘍を測定した。抗体は10mgkgIP、週2回で投与した。結果を図46に示す。18R5とハーセプチンによる併用治療は、ハーセプチンのみと比較して高い抗腫瘍活性を示した。実施例18抗FZD抗体配列抗FZD抗体の重鎖CDRおよび軽鎖CDRを、それぞれ、以下の表7および表8に示す。抗FZD抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにそのコード配列を、以下の表9に特定する。表9に列挙したVHおよびVLのアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列を、図13~15または以下の表10および表11に示す。抗FZD抗体の重鎖または軽鎖をコードする配列を、図14~15または以下の表12に示す。表7抗FZDヒト抗体の重鎖CDR表8抗FZDヒト抗体の軽鎖CDR表9抗FZDヒト抗体のVHおよびVL表10さらなる抗FZDVHおよびVLアミノ酸配列表11抗FZD抗体のVHおよびVLをコードするさらなるヌクレオチド配列表12抗FZDIgG抗体の重鎖または軽鎖をコードするさらなるヌクレオチド配列抗FZDIgG抗体18R4605、18R4805、および44R24をコードする大腸菌から単離されたプラスミドは、ブダペスト条約の規定に基づいて、2009年8月26日に、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVAUSAに寄託した。実施例19抗FZD抗体の結合プロファイルFACS分析を用いて、抗FZDモノクローナル抗体のFZD1、2、5、7および8結合プロファイルを特徴付けた。完全長FZD1、2、5、7または8を発現するプラスミドDNAと、トランスフェクションマーカーとして使用したレポーター遺伝子GFPを発現する別のプラスミドとをHEK293細胞にコトランスフェクトした。Fugene6を、製造業者の指示に従って、トランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクト細胞を、24~48時間、37°Cおよび5CO2でインキュベートした。次いで、抗FZDmAbを、最終体積50μlで、20μgmlの濃度から希釈し、計8回、連続4倍希釈した。それぞれのFZDGFP293一過的トランスフェクタントプールを懸濁液に入れて収集し、100000個のトランスフェクト細胞を、試験しようとする希釈した抗FZDmAbと氷上で30~60分間インキュベートした。細胞を洗浄し、結合した抗Fzd抗体を、蛍光発色団が結合している二次抗ヒト抗体で検出した。次いで、標識細胞を検出し、FACSにより計数した。得られたFACSデータは、平均蛍光強度単位で表した。GraphPadPrismソフトウェアを用いて、データをグラフ化および解析した。用量反応曲線を確立するために、MFIをAb濃度の関数としてプロットした。曲線にフィットさせ、EC50を計算するために、非線形回帰を数値に当てはめた。mAb18R5および44R24の結合プロファイルを決定および比較した。18R5および44R24のそれぞれとFzd1、2、5、7および8との結合を示す用量反応曲線を図47に示す。2種類のmAbについて計算したEC50を表13に示す。44R24は、Fzd5およびFzd8に高い親和性で結合した。S字形の用量反応曲線は、他の3種類のFzd受容体について確立することができなかった。このことから、44R24はFzd1、2および7に結合しないことが示唆される。18R5については、Fzd1、2、5および7の高親和性結合が確かめられた。表13mAb18R5および44R24のEC50実施例20細胞をベースとするアッセイにおける抗FZDmAbの抗Wnt活性の評価STF293細胞におけるWntシグナル伝達を阻害する18R5および44R24の能力を決定し、比較した。STF細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が最小プロモーターの上流にある複数コピーのTCF結合部位によって調節されるSuperTopFlashレポーターカセットを安定にトランスフェクトされたヒト胎児由来腎臓細胞293細胞である。Wnt3aに応答して、低い基底Luc発現を30~60倍に誘導することができる。これにより、抗FzdAbの阻害活性を評価するための広いウィンドウが得られる。mAbを評価するために、STF293細胞をDMEM10FBS中で増殖させた。1日目に、96ウェルOpticalBottomWhiteプレートに、1ウェルにつき10000個の細胞をプレーティングした。細胞を、37°Cおよび5CO2で一晩インキュベートした。2日目に、試験しようとするAbを、培地を用いて、40μgμlの最終濃度まで希釈した。5倍段階希釈を7回行った。STF293細胞培地を、Ab希釈液50μl、Wnt3a安定L細胞からのWnt3a調整培地25μl、およびDMEM10FBS25μlを含有する混合物と交換した。それぞれのAbについて、試験した最終濃度は、20μgml、4μgml、08μgml、016μgml、003μgml、0006μgml、00013μgml、00003μgmlであった。それぞれのAb濃度を3回繰り返して試験した。ヒト抗ハプテンAbであるLZ1を陰性対照Abとして使用した。親L細胞からの非Wnt3a調整培地を、陰性対照誘導物質として使用した。プレートをインキュベーターに戻した。3日目に、PromegaSteadyGloキットを用いて、製造業者の仕様書に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は光子秒で表した。GraphPadPrismソフトウェアを用いて、データをグラフ化および解析した。用量反応曲線を確立するために、ルシフェラーゼ活性をAb濃度の関数としてプロットした。曲線にフィットさせ、IC50を計算するために、非線形回帰を数値に当てはめた。同様に、STF細胞においてWntシグナル伝達を阻害する44R24および18R5の能力を前記のように決定し、比較した。結果を図48および表14に示す。44R24活性は、より高いAb濃度でしか検出されなかった。このことは、アッセイにおけるこの抗体の低い活性を反映している。44R24のIC50は、18R5の13分の1になると算出された。表1418R5および44R24によるST293細胞におけるWntシグナル伝達の阻害のIC50A549細胞においてWntシグナル伝達を阻害する18R5および44R24の能力も決定した。A549細胞は、Wntシグナル伝達の内因活性を変換するアキシン2遺伝子が高発現しているヒト肺癌腫細胞である。アキシン2は、Wntの転写をアップレギュレートし、最終的に、フィードバックループ機構を介してWntシグナル伝達をダウンレギュレートすることによって、この経路の活性化に応答する、周知のWnt標的遺伝子である。この系は、qPCRによって、アキシン2mRNAレベルに対する抗FzdAbの影響を試験するのに使用した。12ウェルプレートに、1ウェルにつき30000個のA549細胞を播種し、DMEM10FBS中で3日間増殖させた。様々な濃度の抗体を24時間添加し、細胞から総RNAを抽出した。非結合抗体であるLZ1を、陰性対照として最高濃度のみで使用した。30000個のA549細胞を12ウェルプレートに播種し、DMEM10FBS中で3日間増殖させた。様々な濃度の抗FZD抗体18R5または44R24を添加し、非結合抗体であるLZ1を、陰性対照として最高濃度のみで使用した。処理の24時間後にRNAを作製し、次いで、DNアーゼを用いて処理した。アキシン2は、Wntシグナル伝達における強力な標的遺伝子であることが知られている。AppliedBiosystems7900HT機器を用いてTaqman相対発現アッセイを行うことによって、その発現レベルを調べた。1点につき50ngのRNAを使用し、これを三通り行った。内因性対照にはGUSBプローブを使用した。全ての結果は、LZ1対照試料中のアキシン2レベルに対して基準化した。18R5および44R24による、アキシン2遺伝子発現の基底値の阻害を示した用量反応曲線、ならびにこれらの抗体のEC50計算値を図49に示す。18R5および44R24は、同等の効率で、LZ1対照と比較してアキシン2基底値を阻害した。実施例21膵臓異種移植片モデルにおける抗FZDmAbの抗腫瘍活性の評価OMPPN13膵臓腫瘍:マウスにおいて2回継代された凍結OMPPN13腫瘍細胞を、Oncomed腫瘍バンクから入手した。細胞を融解し、融解直後にNODSCIDマウスの左側腹部に皮下注射した。動物1匹につき約25000個の生細胞を注射した。マウスの腫瘍成長を毎週、モニタリングした。腫瘍が発症した後に、腫瘍の大きさをキャリパで週1回、測定した。200~300mm3の腫瘍を有するマウスを、それぞれ5匹の動物を含む治療群に送った。各群の腫瘍の大きさの平均は同等であった。無作為化の翌日に、Ab治療を開始した。LZ1を陰性対照Abとして使用した。12日間にわたって、腹膜内注射を介して、10mgkgのAbを3回投与した。最後の注射の24時間後に、マウスを安楽死させた。腫瘍、十二指腸、および肝臓を採取した。パラフィン包埋および切片のために腫瘍組織をホルマリンで固定した。ムチン産生細胞の出現をモニタリングするために、免疫組織化学によってMuc16検出を行った。ムチンは、膵臓における分化細胞のサブタイプに特異的であり、従って、腫瘍モデルにおける分化マーカーとして用いられる。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を脱パラフィンした。最初に、キシレンで2回、各5分間、連続処理することによって、スライドを脱パラフィンした。次いで、1002回、各3分、901回、1分、801回、1分、および701回、1分、エタノール水溶液のシリーズに浸漬することによって、組織を脱水した。1分間、蒸留水を流して組織を洗浄した。ムチン16抗体を、FFPE組織切片におけるムチン16発現細胞のIHC検出に使用した。オートクレーブ内で10mMクエン酸緩衝液pH60を用いて、熱により誘導される抗原賦活化を行った。次いで、スライドを室温に保ち、タンパク質の抗原性をゆっくりと回復させた。組織切片を、3過酸化水素水溶液でブロックし、洗浄し、次いで、正常ウマ血清ブロッキング溶液、10NHS、1BSA、01ゼラチン、01Tx100、005NaN3を用いて、室温で1時間、再度ブロックした。次いで、切片を、DaVinciGreen希釈剤pH73で1200に希釈したMuc16一次抗体で、室温で1時間、染色した後に、01tritonX100を含有するリン酸緩衝食塩水を用いて3回洗浄した。次いで、ImmPress抗マウスIgGHRP結合体を3滴落として、切片を室温で30分間、染色した後に、01tritonX100を含有するリン酸緩衝食塩水を用いて3回洗浄した。スライドをペトリ皿に入れ、VectorNovaRedキットを用いて1~2分間、発色させた。蒸留水を添加することで、反応を止めた。スライドに蒸留水を流して徹底的にリンスした。次いで、組織切片をヘマトキシリンを用いて1分間、対比染色し、洗浄し、次いで、ブルーイング溶液を用いて30秒間、中和した。スライドを一晩乾燥させ、VectaMountを用いて封入した。対照Ab、18R5、または44R24を用いて治療された腫瘍の代表的な視野を図50に示す。LZ1は低強度の染色と関連しているが、18R5を用いて治療された腫瘍では、Muc16抗体による、さらに高いレベルの染色が検出された。これは、18R5によって、腫瘍細胞がムチン産生細胞系列に分化するように誘導されたことを示唆している。44R24で治療された腫瘍におけるMuc16染色のレベルは、18R5で治療された腫瘍より強くなかったが、それでもなお、この実験においてLZ1で治療された腫瘍よりわずかに強いように見えた。qPCRを用いてWnt標的遺伝子発現を分析するために、腫瘍、十二指腸、および肝臓からも総RNAを抽出した。組織を採取した時に、RNAlaterにすぐに移した。FibrousTissueミニキットのQIAGENRNeasyを用いて、製造業者の説明書に従って、RNAを抽出した。ABIワンステップRTPCRプロトコールおよび試薬を用いて、50ngの総RNAを遺伝子発現分析に供した。GusB遺伝子発現を内因性対照として使用した。それぞれの試料について三通り準備した。それぞれの治療群の5つ全ての腫瘍を分析した。実験を行うためにABI7900TaqMan機器を使用した。ABISDS221ソフトウェアを用いて、データを解析し、DeltaCt値を計算し、これを相対量に変換した。それぞれの治療群について、5つ全ての腫瘍の三通りの値を平均した。次いで、対照抗体と比較して、阻害倍率を計算した。結果を表15に示す。Wnt標的遺伝子に対する抗FZDAbの影響にはばらつきがあった。18R5は、腫瘍および肝臓において23xおよび8xの阻害を誘導したのに対して、十二指腸では影響を受けなかった。44R24によって誘導された変化は、より小さかった。表1518R5で治療した組織および44R24で治療した組織におけるWnt標的遺伝子のqPCR遺伝子発現分析ND実施せず。別々の実験をイタリック体で示す。OMPPN4膵臓腫瘍:OMPPN4膵臓腫瘍の異種移植片モデルにおける腫瘍間質に及ぼす18R5の影響も調べた。治療により発現レベルが変化したマイクロアレイによって、いくつかの遺伝子を同定した。これらのうち、平滑筋アクチンタンパク質をコードするACTA2は特に興味の対象である。SMAは、腫瘍間質の活性化と関連することが示されている。従って、そのダウンレギュレーションは、腫瘍形成表現型が弱まった徴候とみなすことができる。前記の実施例7に記載のように、OMPPN4腫瘍を有するNODSCIDマウスを、対照Ab、18R5、ゲムシタビン、または18R5とゲムシタビンの組み合わせを用いて、6週間、週1回、治療した。10mgkgの濃度の抗体を投与した。この実験から腫瘍を採取した後に、腫瘍のWnt標的遺伝子発現をRNAレベルおよびタンパク質レベルで、それぞれ、マイクロアレイおよびIHCを用いて分析した。総RNAを腫瘍から抽出し、増幅し、マイクロアレイ分析に供した。OvationRNAAmplificationSystemV2を用いて、総RNAを増幅した。結果として生じた増幅アンチセンスsscDNAを断片化し、Affymetrixチップに使用するためにFLOvationcDNABiotinModuleV2を用いてビオチン化した。これらの実験では、AffymetrixHGU133plus2またはMG43020オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した。ハイブリダイゼーション後、遺伝子チップを洗浄し、染色し、製造業者の説明書に従ってスキャンした。cDNAおよび断片化cDNAの量は、アレイハイブリダイゼーションの前に分光光度計およびBioanalyzerによって評価した。スキャンされたチップ生データを、GCOSソフトウェアパッケージを用いて定量および調整し、チップ欠陥および異常値を検出するために、Affymetrixが推奨するGeneChipQualityControlの包括的な評価に供した。チップ欠陥および異常値は後のデータ分析から除外した。アレイバックグラウンドの調整およびシグナル強度の基準化は、オープンソースBioconductorソフトウェアのGCRMAアルゴリズムを用いて行った。2つの群または時点で異なって発現した遺伝子を、ベイズのt検定で同定した。ベイズのt検定は、発現レベルが似ているプローブセットの観察された分散から得られた群内分散の、スチューデントt検定とベイズ法による評価を組み合わせている50919。ヒト腫瘍遺伝子チップ分析のために、試料をヒトチップおよびマウスチップの両方でアッセイして、ヒト腫瘍全体およびマウス間質に対する治療効果を独立して評価した。種特異的でないAffymetrixプローブセットは分析から省いた。平滑筋アクチンα免疫蛍光のための調製において、OCTを用いて腫瘍組織を凍結した。4ミクロン切片を入手し、80°Cで凍結して保管した。SMAa染色のために、組織を、20°Cの冷アセトンを用いて15分間固定し、次いで、乾燥させ、室温にし、次いで、疎水性PAPペンを用いて印を付けた。次いで、リン酸緩衝食塩水を用いてスライドを洗浄した。正常ウマ血清RTUを用いて、組織を室温で2時間ブロックした。110000倍に希釈したFITC結合平滑筋アクチンα抗体を用いて、一次抗体染色を1時間行った。01tritonX100を含有するPBSを用いて、切片を3回洗浄した。次いで、スライドを風乾し、次いで、DAPIを含有するハードセット封入剤を用いて封入した。図51Aは、マイクロアレイによって検出されたACTA2遺伝子発現レベルを示す。抗FZD抗体18R5を用いて治療された腫瘍は、ACTA2発現レベルの低下を示した。図51Bは、対照mAbおよび18R5で治療されたOMPPN4腫瘍での平滑筋アクチンα免疫蛍光の結果を示す。SMAa量の低下は、18R5で治療された腫瘍において検出された。ACTA2の発現およびSMAの量は、18R5に応答して腫瘍間質において劇的に減少した。このことは、Wnt遮断が、この腫瘍区画に影響を及ぼし、十分に確立した腫瘍形成マーカーを減少させることによって、影響を及ぼしたことを示唆している。これらの結果は、筋線維芽細胞活性化の低下が18R5の抗腫瘍作用機構の1つであり得ることを示唆している。実施例22Muc16陽性OMPPN13細胞の腫瘍形成能力の評価前記のように、膵臓腫瘍において18R5治療によって、ムチン発現の増大を含む遺伝子発現および細胞表現型変化が誘導された。特に、治療されたPN13腫瘍において行われたIHCから、Muc16陽性細胞の数の増加が明らかになった。治療された腫瘍におけるMuc16遺伝子発現レベルも対照腫瘍より高かった。18R5により誘導されたMuc16陽性細胞が、分化した腫瘍細胞亜集団を代表するという仮説を試験するために、18R5により誘導されたMuc16陽性細胞の腫瘍形成能を評価した。実施例21に記載のプロトコールに従って、OMPPN13を有するマウスを18R5で治療した。Ab治療開始の12日後にマウスを安楽死させた。腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液を得るために、組織を消化するコラゲナーゼIIIを用いて処理した。マウス間質細胞を、ビオチン化抗H2Kd抗体およびビオチン化抗CD45抗体を用いて染色した。次いで、細胞を、ストレプトアビジンが結合している磁気ビーズとインキュベートし、Dynal磁石を用いて枯渇させた。結果として生じた、linを持たない腫瘍細胞を、PE結合二次Abで検出される抗Muc16mAbを用いて染色した。DIVAソフトウェアにより動作するARIAFACS機器を用いて、Muc16陽性細胞およびMuc16陰性細胞を分別した。図52Aを参照されたい。腫瘍形成能を比較するために、細胞を、NODSCIDマウスの左側腹部に再度、皮下注射した。それぞれの細胞タイプを10匹のマウスに注射した。それぞれのマウスに75個の細胞を与えた。Muc16細胞およびMuc16細胞を注射して生じた腫瘍の代表的な写真を図52Bに示す。マウスに注射した後のMuc16腫瘍およびMuc16腫瘍の成長曲線を図52Cに示す。Muc16細胞を注射した後に腫瘍は成長しなかったのに対して、Muc16細胞を注射した10匹のマウスのうち7匹が腫瘍を発症した。データから、18R5により誘導されたMuc16細胞は非腫瘍形成性であることが示唆され、このことは、18R5抗腫瘍活性の根底をなす機構としての分化の誘導を裏付けている。実施例23抗FZD抗体を用いた、さらなるインビボ研究18R5mAbを用いたPE13乳房腫瘍再発研究:PE13乳房腫瘍細胞をNodScidマウスに注射し、腫瘍が約100mm3に達するまで成長させた。動物を無作為に2つの群に分け、タキソール対照抗体、または同じ用量のタキソール抗FZD18R5を投与した。抗体は20mgkg週1回投与した。タキソール治療は70日目に止め、抗体治療を続けた。結果を図53に示す。18R5は、腫瘍退縮率を高め、タキソール治療を止めた後に腫瘍再発を遅らせることが観察された。18R5mAbを用いた、PE13乳房腫瘍の限界希釈アッセイ研究:PE13乳房腫瘍を有する動物を、対照抗体、18R5、タキソール、またはタキソールと18R5の組み合わせを用いて治療した。タキソールは15mgkg週2回で投与し、抗体は20mgkg週1回投与した。腫瘍を採取し、ヒト腫瘍細胞をlin枯渇によって精製した。50個、150個、または500個の腫瘍細胞を新たなマウスコホートに注射した。結果を図54に示す。腫瘍成長頻度を59日後にモニタリングし、CSC頻度を計算するのに使用した。18R5mAbを用いた、PN4膵臓腫瘍の再発研究:PN4膵臓腫瘍細胞をNodScidマウスに注射し、腫瘍が約250mm3に達するまで成長させた。腫瘍が退縮するまで、動物にゲムシタビンを5週間与えた。動物を無作為に2つの群に分け、対照抗体または抗FZD18R5を投与した。抗体は10mgkg週1回で投与した。結果を図55に示す。18R5は、ゲムシタビン治療後に腫瘍再発を遅らせることが観察された。44R24mAbを用いた、PN4膵臓腫瘍の成長研究:PN4膵臓腫瘍をNodScidマウスに注射した。腫瘍が約150mm3の体積に達するまで成長させた。動物を無作為に4つの群に分け、対照抗体、抗FZD5844R24、ゲムシタビン、または44R24とゲムシタビンの組み合わせを与えた。ゲムシタビンは15mgkg週1回で投与し、抗体は20mgkg週2回で投与した。結果を図56に示す。44R24は、ゲムシタビンのみと比較して、ゲムシタビンと組み合わせて腫瘍成長を弱めることが観察された。実施例24抗FZD抗体44R24のエピトープマッピング抗FZD抗体44R24のエピトープマッピングは、抗体18R8および18R5について実施例5において前述したのと同様に行った。18R8の結合を破壊することが以前に示された一連のFZD8アミノ酸バリアントを用いたフローサイトメトリーによって、44R24が18R8と類似のエピトープに結合する能力を評価した。FZD8のアミノ酸126~127は、コトランスフェクトされた細胞集団内での染色低下により示されたように、44R24の結合に必要であることが見出された。FACS実験の結果を図57に示す。これらの結果から、44R24は、18R8エピトープと重複し、共有のアミノ酸126~127を含むエピトープに結合することが分かる。実施例25抗FZD抗体18R5、18R8、および44R24を用いたC28結腸腫瘍の成長研究C28腫瘍細胞をNodScidマウスに皮下注射した。腫瘍の平均体積が126mm3に達するまで、腫瘍を成長させた。腫瘍を有する動物を無作為に4つの群に分け、対照Ab、18R8、44R24、または18R5を用いて治療した。抗体を15mgkg、週2回で腹腔内投与した。腫瘍量を示した。抗体44R24および18R5による治療によって、対照群と比較して成長が減少したのに対して、18R8は影響を及ぼさなかった。図58に示した実験における動物の治療後に、腫瘍を採取し、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、5ミクロン切片に切断した。腫瘍切片を、結腸細胞分化マーカーであるサイトケラチン7発現について、免疫組織化学によって分析した。サイトケラチン7発現は、44R24または18R5による治療後に高くなることが見られた。実施例2618R5の作製および精製当業者に公知の標準的な方法を用いて、18R5抗体を発現するCHO由来組換え細胞株を作製した。抗体の作製および精製のために、フェドバッチバイオリアクター細胞培養プロセスを用いて細胞株を培養し、無血清合成培地中で増殖させた。この細胞培養プロセスは約10~15日間行われ、接種して約5日後に37°Cから34°Cへの温度変更を含んだ。18R5抗体を多段階精製スキームで精製した。最初に、バイオリアクターから回収された細胞培養液を、MabSelectSuReを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。樹脂1リットル当たり25~30グラムのタンパク質でHCCFをMabSelectSuReカラムにアプライし、その後にカラムを3回洗浄した。100mMグリシンHClを用いて、結合している18R5抗体をカラムから溶出した。ウイルス不活性化のために、18R5含有溶出液を室温で1時間、低pHに保ち、その後に、1MBisTris緩衝液を用いてpHを約65に調節した。次いで、溶出液を02ミクロンフィルターで濾過し、次の精製工程まで2~8°Cで保管した。2番目に、18R5含有溶出液を、CaptoQ樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。18R5抗体はCaptoQカラムを通過し、収集されたのに対して、不純物はカラムに結合し、18R5プールから除去された。18R5抗体を含有するフロースループールを02ミクロンフィルターで濾過し、次の精製工程まで保管した。3番目に、18R5含有フロースループールを、充填CHTI型カラムにおいてセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供した。18R5抗体および残留不純物はCHTカラムに結合された。カラムを、5~10ポリエチレングリコールを含有する低塩緩衝液で2回洗浄した。18R5抗体を、5~10PEGを含有する高塩緩衝液を用いてカラムから溶出し、収集した。タンジェンシャルフロー限外濾過およびダイアフィルトレーションを用いて、高塩溶出緩衝液を、ヒスチジン、NaCl、およびスクロースを含む緩衝液と交換した。精製18R5抗体を02ミクロンフィルターで濾過し、将来使用するために2~8°Cで保管した。実施例27OMP18R5結合部位内の残基はWnt結合に影響を及ぼす前述のように、18R5抗体は、非連続エピトープを介した相互作用によってFrizzled受容体に結合する。18R5結合領域内にあるFZD受容体表面は、FZDの結晶構造においてはっきりと目に見えるくぼみを含む。各ヒトFZD受容体のBBSのくぼみの中にあるアミノ酸残基を表16に示す。このくぼみの底部に沿って並んでいる残基はFZDファミリーメンバー間で特に高い保存を示し、機能に重要であることが示唆される。18R5とFZDが結合すると、WntとFZDの相互作用がブロックされる。このことから、この領域はWntシグナル伝達に機能的に関係することが証明される。FZD8のこの結合領域内にある残基の重要性をさらに探索するために、くぼみに沿って並んでいる選ばれた残基を別の残基に変異させた。次いで、これらの置換を含有するFZD受容体がWnt3Aに結合する能力を評価した。それぞれの置換によって、WntがFZD受容体に結合する能力は大幅に低下した。このことから、Wnt相互作用の媒介において、このFZD受容体領域は重要であることが確かめられた。表16FZD受容体の生物学的結合部位のくぼみにあるアミノ酸残基表1710種類のヒトFZD受容体における変異体の類似残基のアミノ酸位置実施例28FZDのWnt結合領域に結合する低分子ペプチドの同定FZDに結合する低分子ペプチドを同定するために、本発明者らはペプチドライブラリーをスクリーニングした。URSA法を使用し、プロテインAビーズに結合した組換えFZD8Fcを用いてライブラリーをスクリーニングした。3回増菌した後に、個々のクローンがFZDに結合するかどうか試験した。図61に示したように、FZDに結合するが、無関係の対照タンパク質には結合しないペプチドを同定した。このことは、これらのペプチドがFZDと特異的に相互作用することを証明している。代表的な陽性クローンを矢印で強調している。FZD結合ペプチドの配列を決定した。12マーペプチドライブラリーに由来する直鎖ペプチド、およびシステイン残基が隣接する7個のランダムアミノ酸からなるライブラリーに由来する環状ペプチドを単離した。図62に示したように、環状ペプチドは、類似構造をとることを示唆する似ているが異なる配列を示し、明らかなコンセンサス配列を示した。これらのFZD結合ペプチドの全てがBBSを介してFZDと相互作用するかどうか調べるために、本発明者らは、前記の実施例27に記載の実験において示されたアミノ酸置換を含むFZDとペプチドが相互作用して、Wnt結合に影響を及ぼす能力を調べた。図63に示したように、Wnt結合領域内でFZDと特異的に相互作用するFZD結合ペプチドを同定した。アミノ酸置換がくぼみ領域内に導入された時に、いくつかのペプチドとFZDとの結合は大幅に低下したか、無くなった。このことから、この領域と相互作用する低分子を同定できることが証明された。実施例29FrizzledのWnt結合領域に結合する低分子によるWntシグナル伝達の阻害FZD細胞外ドメインに結合し、BBS領域と相互作用するペプチドがWntシグナル伝達に影響を及ぼすことができるかどうか調べるために、Wntレポーターアッセイを行った。クローン2および24の配列を含有する2種類のペプチドを化学合成した。Wntレポーターアッセイでは、古典的Wntシグナル伝達を活性化する外因性Wntタンパク質によって誘導される8xTCFルシフェラーゼレポーターが用いられた。図64に示したように、FZDタンパク質に結合する小さなペプチドは、Wnt3Aに応答するHEK293細胞の能力を阻害することができた。実施例30FZDBBSWnt結合領域に結合する非ペプチド低分子の同定FZD受容体のWnt結合領域に結合する低分子を同定することができる多くの手法がある。1つのアプローチでは、BBSの中に、より具体的には、FZDのくぼみ領域に結合するペプチドを利用して、低分子化合物ライブラリーを迅速かつ高処理量にスクリーニングすることができる。1つの非限定的な例として、ペプチドを便利なレポーターで標識することができる。次いで、標識ペプチドをFZDタンパク質に結合することができる。次いで、ペプチドFZD複合体を、低分子ライブラリーに由来する試験化合物と相互作用させ、低分子がFZD受容体からペプチドを移動させる能力、または低分子がFZDタンパク質との結合についてペプチドと競合する能力を測定することができる。このように、FZDタンパク質の望ましい結合領域内に特異的に結合する低分子を同定することができる。実施例3118R5による多発性嚢胞腎の治療18R5が多発性嚢胞腎を治療する能力はマウスPKDモデルにおいて証明することができる。ヒトPKDにおいて観察される基礎となる変異を反映し、ヒト疾患に非常に似た病態を示す数種類のマウスPKDモデルがある。これらのモデルのいくつかには、ポリシスチン1をコードするPKD1遺伝子またはポリシスチン2をコードするPKD2遺伝子の発現レベルの変化が関与している。これらの遺伝子は、多発性嚢胞腎のほぼ全てのヒト症例において変異している。このようなモデルの1つを用いると、18R5を15mgkg週2回の用量でIP注射で投与することによって、PKD1またはPKD2の発現が変化したマウスが治療される。1ヶ月の治療後に、18R5で治療されなかった対照マウスと比較して腎機能の改善を観察することができる。この機能改善は、腎臓嚢胞のサイズの縮小および数の減少、組織切片のki67IHC染色によって測定可能な腎臓上皮細胞の増殖の低下、ならびに血中尿素濃度の低下によって測定される腎機能の改善によって現われる。関連する参考文献には、HappeetalHumMolGenet2009Jul1518253242KimetalJAmSocNephrol2009Dec20255669、およびKurbegovicetalHumMolGenet2010Apr119117489が含まれる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。実施例32モノクローナル抗体18R5のさらなる精製スキーム当業者に公知の標準的な方法を用いて、18R5抗体を発現するCHO由来組換え細胞株を作製した。抗体の作製および精製のために、フェドバッチバイオリアクター細胞培養プロセスを用いて細胞株を培養し、無血清合成培地中で増殖させた。この細胞培養プロセスは約10~15日間行われ、接種して約5日後に37°Cから34°Cへの温度変更を含んだ。18R5抗体を多段階精製スキームで精製した。最初に、バイオリアクターから回収された細胞培養液を、MabSelectSuReを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。樹脂1リットル当たり25~30グラムのタンパク質でHCCFをMabSelectSuReカラムにアプライし、その後にカラムを3回洗浄した。100mMグリシンHClを用いて、結合している18R5抗体をカラムから溶出した。ウイルス不活性化のために、18R5含有溶出液を室温で1時間、低pHに保ち、その後に、05~1MBisTris緩衝液を用いてpHを約675~685に調節した。次いで、溶出液を02ミクロンフィルターで濾過し、次の精製工程まで2~8°Cで保管した。2番目に、18R5含有溶出液を、CaptoQ樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。18R5抗体はCaptoQカラムを通過し、収集されたのに対して、凝集物などの不純物はカラムに結合し、18R5プールから除去された。18R5抗体を含有するフロースループールを02ミクロンフィルターで濾過し、次の精製工程まで保管した。3番目に、18R5含有フロースループールを、充填CHTI型カラムにおいてセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供した。18R5抗体および凝集物などの残留不純物はCHTカラムに結合された。カラムを、0~10ポリエチレングリコールを含有する低塩緩衝液で2回洗浄した。18R5抗体を、10~13PEGを含有する高塩緩衝液を用いてカラムから溶出し、収集した。タンジェンシャルフロー限外濾過およびダイアフィルトレーションを用いて、高塩溶出緩衝液を、ヒスチジンおよびNaClを含む緩衝液と交換した。ダイアフィルトレーション後、18R5含有溶液を、ヒスチジン、NaCl、スクロース、およびポリソルベート20を含む賦形剤緩衝液で希釈した。精製18R5抗体を02ミクロンフィルターで濾過し、将来使用するために2~8°Cで保管または65°C以下で凍結した。本明細書において引用された、全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、およびアクセッション番号データベース配列は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号データベース配列が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、米国特許出願公開第20100104574号として公開された2009年9月28日出願の米国特許出願第12568534号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。