aDNA切断剤を、該DNA切断剤が細胞内のゲノムDNAを切断するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階;ならびにb該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階;ならびにc該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階を含む、染色体DNAを分析するための方法。段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む、請求項1記載の方法。段階aが、前記細胞内で異種発現カセットから前記DNA切断剤を発現させ、それにより該DNA切断剤を該細胞に導入することを含む、請求項1記載の方法。検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、請求項1記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、請求項1記載の方法。増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、請求項5記載の方法。検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、請求項1記載の方法。ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項7記載の方法。ヌクレオチド配列の決定が、1前記ヌクレオチド配列の決定、および2配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、請求項7記載の方法。検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項1記載の方法。前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、請求項10記載の方法。前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、請求項11記載の方法。検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、請求項1記載の方法。前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、請求項1記載の方法。検出する段階が、前記インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、請求項1記載の方法。濃縮する段階が、前記DNAをサイズ選択することを含む、請求項1記載の方法。前記DNAが10~500bpの断片について濃縮される、請求項16記載の方法。前記DNAが500bp超の断片について濃縮される、請求項16記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、請求項1記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、請求項1記載の方法。aDNA修飾剤を、該DNA修飾剤が細胞内のゲノムDNAを修飾するような条件下で、該ゲノムDNAを有する該細胞に導入する段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該剤によって異なる程度で修飾され、それにより、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される、段階;ならびに続いてb該細胞内の、または該細胞から単離された該ゲノムDNAをDNA切断剤と接触させる段階であって、該ゲノムDNAの異なる領域が該DNA切断剤によって異なる程度で切断され、それにより、切断されたDNA領域およびインタクトなDNA領域が生成される、段階;ならびにc該DNAを、インタクトなDNAまたは切断されたDNAのいずれかについて濃縮する段階であって、それにより、濃縮されたDNAが生成される、段階;ならびにd該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーもしくは切断されたコピーの存在、非存在もしくは量を検出するか、または該濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域もしくは切断されたDNA領域のクローニング、単離もしくはヌクレオチド配列の決定を行う段階を含む、染色体DNAを分析するための方法。段階aの後に、修飾されたDNAに特異的に結合する親和性物質と前記DNAを接触させることにより、修飾されたDNA領域または修飾されていないDNA領域について該DNAを濃縮する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。前記修飾がDNAメチル化である、請求項22記載の方法。前記親和性物質が、メチル化されたDNAに特異的に結合する抗体またはタンパク質である、請求項21記載の方法。濃縮する段階が段階aと段階cの間に行われる、請求項21記載の方法。濃縮する段階が段階cと段階dの間に行われる、請求項21記載の方法。前記修飾剤がDNAメチルトランスフェラーゼである、請求項21記載の方法。前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のアデノシンをメチル化する、請求項27記載の方法。前記DNA切断剤がアデノシンメチル化感受性制限酵素である、請求項28記載の方法。前記アデノシンメチル化感受性制限酵素が、DpnI、DpnII、MboIおよびSau3AIからなる群より選択される、請求項29記載の方法。前記DNAメチルトランスフェラーゼがDNA中のシトシンをメチル化する、請求項27記載の方法。前記DNA切断剤がシトシンメチル化感受性制限酵素である、請求項31記載の方法。前記シトシンメチル化感受性制限酵素が、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstUI、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、McrBC、MspI、NaeI、NarI、NoI、PmlI、PstI、PvI、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraIからなる群より選択される、請求項32記載の方法。段階aの前または段階aと同時に、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含む、請求項21記載の方法。段階aが、前記細胞内で異種発現カセットから前記DNA切断剤およびまたはDNA修飾剤を発現させ、それにより該DNA切断剤およびまたはDNA修飾剤を該細胞に導入することを含む、請求項21記載の方法。検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーの量を検出することを含む、請求項21記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域を増幅する段階を含む、請求項21記載の方法。増幅する段階がリアルタイムPCRを含む、請求項37記載の方法。検出する段階が、前記少なくとも1つのDNA領域の切断されたコピーの量を検出することを含む、請求項21記載の方法。検出する段階が、前記濃縮されたDNAにおける少なくとも1つのインタクトなDNA領域または切断されたDNA領域のヌクレオチド配列の決定を行うことを含む、請求項21記載の方法。ヌクレオチド配列の決定が、DNAポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることを含む、請求項40記載の方法。ヌクレオチド配列の決定が、1ヌクレオチド配列の決定、および2配列決定されたヌクレオチドが修飾されているかどうかの決定を同時に行うことを含む、請求項40記載の方法。検出する段階が、前記濃縮されたDNAを複数の核酸プローブとハイブリダイズさせること、および該濃縮されたDNAと該核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項21記載の方法。前記核酸プローブが固体支持体と連結されている、請求項43記載の方法。前記固体支持体が、マイクロアレイおよびビーズからなる群より選択される、請求項44記載の方法。前記DNA切断剤が、DNアーゼおよび制限酵素より選択される、請求項21記載の方法。検出する段階が、インタクトなDNAまたは切断されたDNAを、固体支持体と連結された核酸とハイブリダイズさせることを含む、請求項21記載の方法。濃縮する段階が、前記DNAをサイズ選択することを含む、請求項21記載の方法。前記DNAが10~500bpの断片について濃縮される、請求項48記載の方法。前記DNAが500bp超の断片について濃縮される、請求項48記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、該DNA領域のコピーの総数と比較される、請求項21記載の方法。前記少なくとも1つのDNA領域のインタクトなコピーまたは切断されたコピーの量が、第2の細胞内の該少なくとも1つのDNA領域のすべてのコピー、インタクトなコピーまたは切断されたコピーの量と比較される、請求項21記載の方法。詳細な説明I.序論本発明は、DNA切断剤またはDNA修飾剤に対するクロマチン中のDNAのアクセス可能性に基づきゲノムDNAに切断部位を導入することを伴う方法を提供する。DNA修飾剤が用いられる場合には、それに続いて修飾感受性のDNA切断剤を用いて切断部位を導入する。いずれの場合にも、切断後、DNAを今度は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて例えば、サイズ選択または他の手段により濃縮し、その後、分析することができる。切断されたDNAまたは切断されていないDNAは、異なるクロマチン構造、それ故に、DNA切断剤に対する異なるアクセス可能性を有するクロマチンに由来したDNAに相当する。いくつかの態様において、本発明は、インタクトなクロマチンにおける例えば、インタクトな核におけるゲノムDNAを切断することによってクロマチン構造の分析を可能にし、その際にクロマチンの構造がクロマチンDNAの差次的な切断を、クロマチン構造に依存してもたらす。したがって、クロマチンにおけるDNA切断剤のアクセス可能性に基づき、異なるDNA領域が、より頻繁にまたはそれほど頻繁にではなく切断され、相対的に異なるサイズの断片を生ずるものと考えられる。切断されたDNAを今度は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて例えば、サイズ選択または他の手段により濃縮し、その後、分析することができる。相対的により大きなまたは小さなDNA断片を選択することにより、DNA切断剤に対して、それぞれ、相対的にアクセス不能またはアクセス可能であったDNAを選択および濃縮し、それにより、DNAに対する剤のアクセス可能性によって規定されるある種のクラスのクロマチン構造のDNAについて濃縮することができる。濃縮されたら、少なくとも1つのDNA領域を検出し、クローニングし、配列決定し、定量し、またはそれ以外の方法で分析することができる。本方法は特定のクラスのヌクレオチド配列を濃縮するので、本方法は、ゲノム規模でのクロマチン分析に、すなわち、異なる細胞においてまたは異なる刺激に応答してゲノムの全体で起こるクロマチン変化の多様さをモニタリングするために特に有用である。DNA配列は特定のサイズについて濃縮されているので、このDNAを、例えば、ポリメラーゼの反応速度の分析を伴う方法、ならびにヌクレオチド配列およびヌクレオチドのメチル化状態の同時検出を可能にする方法を含む、次世代配列決定において好都合に用いることができる。実に、次世代配列決定法の速度および費用低減は、本明細書に記載されている方法を次世代配列決定法で用いて、試料中のすべてまたは典型的なコピー数の配列を決定することにより試料中の配列のコピー数を絶対的にまたは相対的に定量できるようなものである。さらに、DNAをコピーするDNA増幅または他のプロセスなしでの濃縮は、必要ならDNAにおけるメチル化または他の検出可能なDNA修飾の同時検出を可能にする。あるいは、一部のDNA領域は修飾を含有するが、他のDNA領域は含有しないような、または少なくとも、一部のDNA領域が他のDNA領域よりも相対的に多くの修飾を有するようなクロマチン構造依存的な様式で、インタクトなクロマチンのDNAにDNA修飾を導入することができる。この場合、特定のDNA領域における修飾の相対存在度は、少なくとも部分的にクロマチン構造と相関関係にあると考えられ、したがって、導入される修飾の相対数は、修飾剤に対するクロマチン中の当該DNA領域の相対的なアクセス可能性と相関関係にある。修飾されたDNA領域を、その後、修飾選択的な様式でDNAを切断するDNA切断剤により切断することができ、例えば、該剤は修飾を有するDNAのみを切断し、または該剤は修飾を欠いているDNAのみを切断する。これらの態様において、クロマチン特異的な様式でDNA修飾が既に挿入されているので、DNA切断剤は当該DNAを単離されたDNAとして、すなわち、必ずしもそうとは限らないが、天然のクロマチン構造の一部として切断することができる。得られたDNA断片のサイズ選択により、選択される相対サイズに依存して、および用いられるDNA切断剤に依存してクロマチン中の相対的にアクセス可能なまたはアクセス不能なDNA領域が選択されるものと考えられる。DNA切断剤のみとの関連で上記に論じられているように、濃縮されたクラスのヌクレオチド配列を検出し、クローニングし、配列決定し、定量し、またはそれ以外の方法で分析することができる。少なくとも1つのDNA領域をこのように分析することができ、いくつかの態様において、本方法はゲノム規模でのクロマチン分析のために用いられる。DNA配列は特定のサイズについて濃縮されているので、このDNAを、例えば、ポリメラーゼの反応速度の分析を伴う方法、ならびにヌクレオチド配列およびヌクレオチドのメチル化状態の同時検出を可能にする方法を含む、次世代配列決定において好都合に用いることができる。繰り返すが、必要なら、メチル化または他のDNA修飾を、配列決定で、または配列決定の一部として同時に検出することができる。いくつかの態様において、DNA切断剤またはDNA修飾剤が導入される核は細胞内にあり、DNA切断剤またはDNA修飾剤は細胞に導入される。あるいは、DNA切断剤またはDNA修飾剤は、細胞の核に直接導入される。例えば、核は単離された核であることができ、DNA切断剤またはDNA修飾剤を、単離された核に導入することができる。本発明の方法は、細胞の細胞膜を透過処理するかまたは破壊する段階を含むことができ、それにより、細胞中および核DNAへのDNA切断剤またはDNA修飾剤の導入が向上される。細胞膜の透過処理または破壊は、DNA切断剤またはDNA修飾剤を細胞に導入する前に行われてもよく、あるいは細胞膜の透過処理または破壊は、DNA切断剤またはDNA修飾剤の導入と同時に行われてもよい。いくつかの態様において、透過処理剤の除去後に、任意で緩衝液の交換とともに、DNA切断剤またはDNA修飾剤を、透過処理を行った細胞と接触させる。または、いくつかの態様において、1つまたは複数の中間段階を省いて例えば、緩衝液の交換、細胞の洗浄などを省いて、DNA切断剤またはDNA修飾剤をゲノムDNAと接触させる。上述した通り、この後者のアプローチは、手間のかかる作業および必要な時間の量を減らすために好都合であり得、さらに、アッセイにおける誤りやコンタミネーションをもたらす可能性のある原因も減らす。用いるDNA切断剤またはDNA修飾剤の量、ならびにDNA切断剤またはDNA修飾剤との反応時間は、用いる剤に依存すると考えられる。当業者は、用いる剤に応じて条件をどのように調整すべきかを認識しているであろう。一般に、DNAの切断段階または修飾段階の条件は、完全な消化が達成されないように調整する。したがって、例えば、いくつかの態様において、修飾段階の条件は、陽性対照‐すなわち、修飾がアクセス可能であって、生じる対照‐が、100未満ではあるが高いレベル、例えば、80~95、80~99、85~95、90~98などで生じるように設定される。III細胞の透過処理および破壊本明細書に記載されている方法は、少なくともDNA切断剤およびまたはDNA修飾剤と、クロマチン構造を保持しているゲノムDNAとを接触させる段階を伴う。これは、例えば、該剤と、インタクトなおよび任意で透過処理されていてもよい核内のゲノムDNAとを接触させることによって達成することができる。いくつかの態様において、核内DNAはインタクトな細胞内にある。あるいは、核は単離された核であってもよく、すなわち、細胞の残部から単離されていてもよい。細胞膜は、当技術分野において公知の任意の方法で透過処理すること、または破壊することができる。本明細書で説明しているように、本方法は、DNAの単離の前にゲノムDNAを接触させることを伴い、それ故に、細胞膜の透過処理または破壊の方法は、ヌクレオソームまたはクロマチンの構造が破壊されるように細胞のゲノムDNAの構造を破壊することはないと考えられる。いくつかの態様においては、細胞膜を、細胞膜を透過性にするかまたは破壊する剤と接触させる。リゾ脂質は、細胞膜を透過性にする例示的なクラスの剤である。例示的なリゾ脂質には、リゾホスファチジルコリン当技術分野においてリゾレシチンとしても公知であるまたはモノパルミトイルホスファチジルコリンが非限定的に含まれる。種々のリゾ脂質が、例えば、WO/2003/052095号にも記載されている。非イオン性界面活性剤は、細胞膜を破壊する例示的なクラスの剤である。例示的な非イオン性界面活性剤には、NP40、Tween20およびTritonX100が非限定的に含まれる。本発明の1つの局面は、透過処理剤とDNA切断剤またはDNA修飾剤との同時送達である。したがって、いくつかの態様においては、両方の剤を含む緩衝液を細胞と接触させる。緩衝液は、細胞クロマチンの構造を維持させながら両方の剤の活性を維持させるのに適合しているべきである。または、エレクトロポレーションまたは微粒子銃法を、DNA修飾剤が細胞内に導入され、従ってゲノムDNAと接触しうるように、細胞膜を透過処理するために用いることもできる。多岐にわたるエレクトロポレーション法が周知であり、本明細書に記載されたDNA修飾剤の送達用に適合させることができる。例示的なエレクトロポレーション法には、WO/2000/062855号に記載されたものが非限定的に含まれる。微粒子銃法には、米国特許第5179022号に記載されたものが非限定的に含まれる。II.一般的方法種々の真核生物細胞を本発明に用いることができる。いくつかの態様において、細胞は、ヒトの、または非ヒトの哺乳動物細胞を非限定的に含む動物細胞である。非ヒト哺乳動物細胞には、霊長動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞およびウシ細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、細胞は植物細胞または非限定的に酵母を含む真菌細胞である。細胞は、例えば、培養初代細胞、不死化培養細胞であってもよく、または生検試料もしくは組織試料に由来し、任意で培養した上でアッセイする前に分裂するように刺激したものでもよい。培養細胞は、透過処理および/またはDNA修飾の段階の前および/または最中に、浮遊していてもよく、または付着していてもよい。細胞が動物組織、生検試料などに由来してもよい。例えば、細胞は腫瘍生検試料に由来しうる。本方法は、あるDNA領域に対するアクセス可能性を、その同じ領域からの転写と関連づけることを含みうる。いくつかの態様においては、アクセス可能性と遺伝子発現との間の相関関係を決定するために実験を行い、その後に特定のDNA領域に対するDNA切断剤またはDNA修飾剤のアクセス可能性を用いて、そのDNA領域からの転写を予測することができる。いくつかの態様においては、DNA領域からの転写、およびDNA切断剤またはDNA修飾剤に対するその領域のアクセス可能性を、両方とも決定する。転写を測定するための多岐にわたる方法が公知であり、それにはノーザンブロット法、RTPCR、およびRTqPCRが非限定的に含まれる。いくつかの態様においては、ある領域のDNAメチル化状態を、DNA切断剤またはDNA修飾剤に対するDNA領域のアクセス可能性と関連づけることができる。いくつかの態様においては、アクセス可能性とその領域におけるDNAメチル化との相関関係を決定するために実験を行い、その後に特定のDNA領域に対するDNA切断剤またはDNA修飾剤のアクセス可能性を利用して、そのDNA領域からのDNAメチル化を予測することができる。いくつかの態様においては、DNA領域のメチル化、およびDNA修飾剤に対するその領域のアクセス可能性を、両方とも決定する。DNAメチル化を測定するための多岐にわたる方法が公知であり、それには、バイサルファイトの使用例えば、配列決定において、および/またはメチル化感受性制限酵素との組み合わせで例えば、EadsetalNucleicAcidsResearch288E322002を参照および高分解能融解アッセイHRM例えば、WodjaczetalNucleicAcidsResearch356e412007を参照が非限定的に含まれる。DNAの修飾およびまたは切断ならびに切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に、細胞のゲノム中の第1のDNA領域と第2のDNA領域との間の量または他の物理的特徴の比較がなされ得る。代替的に、または加えて、2つの異なる細胞における第1のDNA領域の量または他の物理的特徴を比較することもできる。例えば、2つの細胞は、罹患しているおよび健常な細胞または組織、異なる細胞型、異なる発生段階幹細胞または始原細胞を非限定的に含むなどであってよい。このようにして、本発明の方法を用いることにより、細胞間のクロマチン構造の違いを検出すること、および/または1つの細胞内の2つもしくはそれ以上のDNA領域例えば、遺伝子間の相対的なクロマチン構造を決定することができる。加えて、同じ細胞または異なる細胞における特定の領域のクロマチン構造に対する薬物刺激、化学刺激または環境的刺激の影響を決定することもできる。IV.DNA切断剤A.制限酵素いくつかの態様において、DNA切断剤は制限酵素である。したがって、これらの態様において、ゲノムDNAに導入される切断部位は、配列特異的な一本鎖例えば、ニックまたは二本鎖切断事象である。多岐にわたる制限酵素が公知であり、本発明に用いることができる。あらゆる種類の制限酵素を用いることができる。I型酵素はDNAを、それらの認識配列から離れたところでランダムに切断する。II型酵素はDNAを、それらの認識配列の付近または内部の所定の位置で切断する。いくつかのII型酵素はDNAを、それらの認識配列の内部で切断する。IIS型酵素は、それらの認識配列の外側のうち片側を切断する。より正確にはIV型と呼ばれる第3の主な種類のII型酵素は、それらの認識配列の外側を切断する。例えば、連続配列を認識するもの例えば、AcuI:CTGAAGは、片側のみを切断する;不連続配列を認識するもの例えば、BcgI:CGANNNNNNTGCは両側を切断し、その認識配列を含む小さな断片を遊離させる。III型はそれらの認識配列の外側を切断し、切断を遂行するためには、そのような配列が反対向きで2つ同一のDNA分子内に必要である。本発明の方法は、あらゆる種類の制限酵素または他のDNA切断酵素と用いるために適合させることができる。いくつかの態様において、酵素は、認識配列の比較的付近例えば、5、10または20塩基対以内を切断する。そのような酵素は、切断を達成するためにアクセス可能でなければならないDNAの範囲が認識配列それ自体よりも長く、それ故に緻密なクロマチン構造内にないDNAをより広範な範囲で含みうるため、クロマチン構造をアッセイする上で特に有用な可能性がある。認識配列の外側を切断する例示的な酵素には、例えば、IIS型酵素、III型酵素およびIV型酵素が含まれる。IIS型制限酵素には、MnlI、FokIおよびAlwIが非限定的に含まれる。いくつかの態様においては、複数例えば、2つ、3つ、4つなどの制限酵素を用いる。酵素の組み合わせは、すべてが1つの型由来である酵素の組み合わせを含んでもよく、または異なる型の混合物であってもよい。本明細書に記載した通りに、インタクトなまたは切断されたDNAを、その後に別々に検出して定量し、DNA領域のインタクトなおよび/または切断されたコピーの数を決定する。いくつかの態様においては、透過処理剤または膜破壊剤を、制限酵素の前に添加する。いくつかの態様においては、制限酵素と透過処理剤または破壊剤とを同時に添加する例えば、適切な緩衝液中に、またはそれとともに。仮に両方の剤を最初に同時に細胞と接触させない場合でも、透過処理は持続的過程であるため、透過処理とDNA切断剤への接触とを同時に行うことを依然として達成することができる。したがって、例えば、透過処理剤の添加のすぐ後に透過処理が実質的に完了する前にDNA切断剤を添加することは、透過処理および細胞をDNA切断剤と接触させることを同時に行うことと見なすことができる。同時にとは、透過処理剤の添加と切断剤の添加との間に中間的な操作緩衝液の交換、遠心処理などを非限定的に含むを行わないことを意味する。いくつかの態様においては、05リゾレシチンw/v、50mMNaCl、10mMTrisHClpH74、10mMMgCl2、1mMDTT、100ug/mlBSAおよび0~500単位/mlのMnlIまたは他の制限酵素を用いる。いくつかの態様においては、025リゾレシチンw/v、50mMNaCl、10mMTrisHClpH74、10mMMgCl2、1mMDTT、100ug/mlBSAおよび0~500単位/mlのMnlIまたは他の制限酵素を用いる。いくつかの態様においては、075リゾレシチンw/v、50mMNaCl、10mMTrisHClpH74、10mMMgCl2、1mMDTT、100ug/mlBSAおよび0~500単位/mlのMnlIまたは他の制限酵素を用いる。いくつかの態様においては、1リゾレシチンw/v、50mMNaCl、10mMTrisHClpH74、10mMMgCl2、1mMDTT、100ug/mlBSAおよび0~800単位/mlのMnlIまたは他の制限酵素を用いる。透過処理および消化の後に、任意で同時に溶解/停止用緩衝液および/または温度上昇を加えることにより、消化を任意で停止させて、細胞を溶解する。例示的な溶解/停止用緩衝液には、反応を停止させて細胞を溶解するのに十分なキレート剤および界面活性剤が含まれうる。例えば、いくつかの態様において、溶解/停止用緩衝液は、100mMTrisHClpH8、100mMNaCl、100mMEDTA、5SDSw/vおよび3mg/mlのプロテイナーゼKを含む。いくつかの態様において、溶解/停止用緩衝液は、100mMTrisHClpH8、100mMNaCl、100mMEDTA、1SDSw/vおよび3mg/mlのプロテイナーゼKを含む。いくつかの態様において、溶解/停止用緩衝液は、200mMTrisHClpH8、100mMNaCl、500mMEDTA、5SDSw/vおよび5mg/mlのプロテイナーゼKを含む。B.DNアーゼいくつかの態様においては、DNAに配列非特異的な様式で切れ目またはニックを入れる酵素をDNA修飾剤として用いる。したがって、いくつかの態様において、DNA切断剤は配列非特異的エンドヌクレアーゼ本明細書ではDNアーゼとも称するである。あらゆる配列非特異的エンドヌクレアーゼ例えば、DNアーゼI、II、III、IV、V、VI、VIIのいずれかを、本発明に従って用いることができる。例えば、DNアーゼIを非限定的に含む、あらゆるDNアーゼを用いることができる。用いるDNアーゼには、天然に存在するDNアーゼ、さらには改変DNアーゼが含まれうる。改変DNアーゼの一例はTURBODNアーゼAmbionであり、これは活性亢進および塩耐性を可能にする突然変異を含む。例示的なDNアーゼには、ウシ膵臓DNアーゼI例えば、NewEnglandBiolabsから入手可能が非限定的に含まれる。あるいは、二本鎖DNアーゼdsDNアーゼを用いることができる。dsDNアーゼの例としては、例えば、NilsenetalPLoSONE54el02952010を参照のこと。DNアーゼ処理後、当該DNAの精製、および切断されたDNAまたは切断されていないDNAについての濃縮例えば、サイズ選択または濃縮を行うことができ、続いて、当該DNAの検出およびまたは定量を行うことができる。任意で、DNA領域のインタクトなおよび/または切断されたコピーの数を、本明細書に記載した通りに決定することができる。いくつかの態様においては、透過処理剤または膜破壊剤を、DNアーゼの前に添加する。いくつかの態様においては、DNアーゼと透過処理剤または破壊剤とを同時に添加する例えば、適切な緩衝液とともに。いくつかの態様において、透過処理/消化用緩衝液は、025リゾレシチンw/v、10mMTrisHClpH74、25mMMgCl2、05mMCaCl2および0~200単位/mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理/消化用緩衝液は、05リゾレシチンw/v、10mMTrisHClpH74、25mMMgCl2、05mMCaCl2および0~200単位/mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理/消化用緩衝液は、075リゾレシチンw/v、10mMTrisHClpH74、25mMMgCl2、05mMCaCl2および0~500単位/mlのDNアーゼIを含む。いくつかの態様において、透過処理/消化用緩衝液は、025リゾレシチンw/v、10mMTrisHClpH74、25mMMgCl2、05mMCaCl2および0~500単位/mlのDNアーゼIを含む。透過処理および溶解は、例えば、制限酵素に関して上述した通りに停止させることができる。他の箇所で考察しているように、DNアーゼまたは他の一般的なDNA切断剤の使用を、一方が標的であり、もう一方が、試験条件のいずれにおいても概ね常にアクセス可能であるかまたは概ね常にアクセス不能であるDNA領域である、少なくとも2つの異なるDNA領域間の切断の程度をモニターすることによって向上させることができる。そのような遺伝子の例は本明細書中の他の箇所で考察されており、公知であるかまたは同定することができる。例えば、ハウスキーピング遺伝子を範囲に含むDNA領域は概ね常にアクセス可能である。続いて、対照と比較した残りの標的の相対量を用いて、標的DNA領域での相対的なクロマチン構造を決定することができる。CDNA切断剤の使用上記のように、DNA切断剤を核内のインタクトなクロマチンと接触させることができる。あるいは、DNA切断剤は、クロマチンをDNA修飾剤と接触させた後に用いることもできる。後者の場合、DNA切断剤をクロマチンと接触させる必要はないが、代わりに、より典型的には、DNA修飾剤との接触後に細胞核から精製された精製DNAとDNA切断剤を接触させる。用いられるDNA切断剤の種類は、どの切断剤がクロマチンと接触されるかに依るものと考えられる。クロマチンDNAがDNA切断剤と接触される状況では、任意のDNA切断剤を、通常、所望のように用いることができる。しかしながら、クロマチンDNAがDNA修飾剤と接触される態様では、その後に用いられるDNA切断剤は、DNAにおける修飾の有無に依存してDNAを選択的に切断する剤であろう。したがって、例えば、修飾がシトシンメチル化である場合、DNA切断剤は、シトシンメチル化の有無に依存してDNAを選択的に切断するであろう。修飾がアデノシンメチル化である場合、DNA切断剤は、アデノシンメチル化の有無に依存してDNAを選択的に切断するであろう。いくつかの態様において、DNA修飾剤の後に、修飾を有するDNAを選択的に切断するDNA切断剤でDNA任意で精製されていてもよいDNAを切断することが行われる。あるいは、いくつかの態様において、DNA修飾剤の後に、修飾を欠いているDNAを選択的に切断するDNA切断剤でDNA任意で精製されていてもよいDNAを切断することが行われる。いくつかの態様において、DNA修飾は、DNAメチル化例えば、アデノシンメチル化例えば、6メチルアデノシン、シトシンメチル化例えば、5メチルシトシン、もしくはこの修飾を導入かつ認識するために酵素を利用できる場合、4メチルシトシン、または他のヌクレオチドメチル化である。これらの態様においては、メチル化感受性制限酵素または他のメチル化感受性の剤を用いて、DNAをメチル化依存的な様式でまたはメチル化感受性の様式で切断することができる。例示的なメチル化感受性制限酵素すなわち、メチル化が存在しないならDNAを切断する酵素としては、例えば、シトシンメチル化感受性制限酵素およびアデノシンメチル化感受性制限酵素が挙げられる。例示的なメチル化感受性制限酵素すなわち、メチル化が存在しないならDNAを切断する酵素としては、例えば、シトシンメチル化感受性制限酵素例えば、AatII、AciI、AclI、AgeI、AluI、AscI、AseI、AsiSI、BbeI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsrFI、BssHII、BssKI、BstBI、BstNI、BstUI、ClaI、EaeI、EagI、FauI、FseI、HhaI、HinP1I、HinCII、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MboI、MluI、MapA1I、MspI、NaeI、NarI、NoI、PmlI、PstI、PvI、RsrII、SacII、SapI、Sau3AI、SflI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TscI、XmaIおよびZraIならびにアデノシンメチル化感受性制限酵素例えば、DpnIIが挙げられる。例示的なメチル化依存性制限酵素すなわち、メチル化が存在するならDNAを切断する酵素としては、例えば、シトシンメチル化依存性制限酵素例えば、McrBC、GlaIおよびBlsIならびにアデノシンメチル化依存性制限酵素例えば、DpnIが挙げられる。IVDNA修飾剤本発明のいくつかの態様において、DNA修飾剤はクロマチンDNAに対する共有結合修飾を生成させる。aメチルトランスフェラーゼいくつかの態様において、本発明のDNA修飾剤はメチルトランスフェラーゼである。種々のメチルトランスフェラーゼが当技術分野において公知であり、本発明に用いることができる。いくつかの態様において、用いるメチルトランスフェラーゼはDNA中のアデノシンに対してメチル部分を付加する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、DAMメチルトランスフェラーゼが非限定的に含まれる。アデノシンは真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化アデノシンの存在は、DAMメチルトランスフェラーゼまたは類似の活性を有する他のメチルトランスフェラーゼがDNA領域にアクセス可能であったことを指し示している。アデノシンのメチル化は、例えば、認識配列がメチル化アデノシンを含む制限酵素を用いて検出することができる。そのような酵素の一例には、DpnIが非限定的に含まれる。続いて、当該DNAを、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することができ、所望の場合は、本明細書に記載した通りに例えば、インタクトなDNAは増幅されるが切断されたDNAはそうでないように、またはLMPCRを用いて、切断されたDNAは増幅するがインタクトなDNAは増幅しないように定量することができる。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、非限定的にGC配列を含むシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、MCviPIが非限定的に含まれる。例えば、XuetalNucAcidsRes2617396139661998を参照のこと。GC配列は真核生物細胞ではメチル化されないため、特定のDNA領域におけるメチル化GC配列の存在は、DNA修飾剤すなわち、GC配列中のシトシンをメチル化するメチルトランスフェラーゼがDNA領域にアクセス可能であったことを指し示している。メチル化GC配列は、任意のさまざまな手法を用いて同定することができる。他の箇所で述べたように、いくつかの態様において、ヌクレオチドのヌクレオチド配列とメチル化状態とを、例えば鋳型依存的なポリメラーゼの反応速度をモニタリングすることにより、同時に決定することができる。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、CGCpGとしても知られる配列中のシトシンをメチル化する。そのようなメチルトランスフェラーゼの例には、MSssIが非限定的に含まれる。そのようなメチルトランスフェラーゼの使用は一般に、典型的にはメチル化されないDNA領域に対する使用に限定される。これは、CG配列が真核生物細胞では内因性にメチル化され、それ故に、メチル化が稀であるようなDNA領域を除き、CG配列が内因性メチルトランスフェラーゼではなく修飾剤によってメチル化されると想定することは一般に不可能であるためである。GC配列の場合と同様に、CG配列のメチル化は、得られるDNAをシトシンメチル化に感受性または依存性の制限酵素によって切断することと、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することとを含む方法によって検出することができる。b.化学物質いくつかの態様において、DNA修飾剤はDNA修飾性化学物質である。大部分のDNA修飾性化学物質はクロマチンと比較して相対的に小さいため、融合パートナーを伴わないDNA修飾性化学物質の使用は、異なるDNA領域のアクセス可能性の程度に仮に違いがあるにしてもわずかであると考えられることから、状況によっては有効でない。このため、いくつかの態様において、DNA修飾剤は、DNA修飾性化学物質と連結された立体障害を有する分子を含む。立体障害を有する分子は、クロマチン構造に応じてDNA修飾剤のアクセス可能性に違いをもたらす任意のタンパク質または他の分子でありうる。これは例えば、結果を、本明細書に記載したDNアーゼまたは制限酵素を用いた結果と比較することによって検討することができる。いくつかの態様において、立体障害を有する分子は、少なくとも5、7、10または15kDのサイズであると考えられる。おそらく当業者は、立体障害を備える分子としてポリペプチドを用いることが好都合であると判断するであろう。DNA修飾剤がDNAを修飾する能力を著しく妨害することのない任意のポリペプチドを用いることができる。いくつかの態様において、ポリペプチドは、以下でさらに詳細に考察している二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインである。本発明のDNA修飾性化学物質は、立体障害を有する分子と直接連結させること、またはリンカーを介して連結させることができる。種々のホモおよびヘテロ二官能性リンカーが公知であり、この目的に用いることができる。例示的なDNA修飾性化学物質には、ヒドラジンおよび、例えば、MathisonetalToxicologyandAppliedPharmacology127191981994に記載されているようなその誘導体および硫酸ジメチルが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、ヒドラジンはDNA中のグアノシンにメチル基を導入するか、他の様式でDNAを損傷させる。いくつかの態様において、硫酸ジメチルはグアニンをメチル化するか、または、グアニン中に存在するイミダゾール環を開裂させることにより、DNA中のグアニンの塩基特異的切断をもたらす。DNA修飾性化学物質による修飾の検出は、生じたDNA修飾の種類に依存すると考えられる。いくつかの態様において、硫酸ジメチルまたはヒドラジンによる修飾を検出するために、DNAをピペリジンにより高温90°Cで処理する。DNAはDNA修飾部位で切断を受け、DNAは無傷または無傷でない領域について濃縮され、本明細書に記載したヌクレアーゼ切断を検出するのと同じ様式で当該切断を検出することができる。V.DNA切断剤またはDNA修飾剤を改良するためのDNA結合ドメインいくつかの態様においては、本発明のDNA修飾剤または切断剤を、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメイン例えば、DNA結合ドメインと融合させるかまたは他の様式で連結させる。DNA修飾剤または切断剤がポリペプチドである場合には、二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを、例えば、DNA修飾剤または切断剤とのタンパク質融合物として、組換えDNA技術を介して合成することができる。二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインは、二本鎖核酸と配列非依存的な様式で結合するタンパク質またはタンパク質の定まった領域であり、すなわち結合は、特定の配列に対する全体的な選好性を示さない。いくつかの態様において、二本鎖核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸に対して一本鎖核酸よりも10倍またはそれ以上高い親和性を示す。二本鎖核酸結合タンパク質は、本発明のいくつかの態様において耐熱性である。そのようなタンパク質の例には、古細菌小型塩基性DNA結合タンパク質Sac7dおよびSso7d例えば、CholietalBiochimicaetBiophysicaActa9501932031988;BaumannetalStructuralBiol18088191994;およびGaoetalNatureStrucBiol57827861998を参照、古細菌HMf様タンパク質例えば、StanchetalJMolecBiol2551872031996;SandmanetalGene1502072081994を参照、およびPCNA相同体例えば、CannetalJBacteriology181659165991999;ShamooandSteitzCell991551661999;DeFeliceetalJMolecBiol29147571999;およびZhangetalBiochemistry3410703107121995を参照が非限定的に含まれる。DNA結合ドメインに関するそのほかの情報については、欧州特許第1283875B1も参照のこと。Sso7dおよびSac7dSso7dおよびSac7dは、それぞれ超好熱性古細菌スルホロブスソルファタリカスSulfolobussolfataricusおよびSアシドカルダリウスSacidocaldariusに由来する小型約7000kdMWの塩基性染色体タンパク質である。これらのタンパク質はリジンに富み、高い耐熱性、酸安定性および化学安定性を有する。それらはDNAと配列非依存的な様式で結合し、結合すると、DNAのTMをいくつかの条件下では最大40°C上昇させるMcAfeeetalBiochemistry3410063100771995。これらのタンパク質およびそれらの相同体は、典型的には、高温でゲノムDNAを安定化させることに関与すると考えられている。HMF様タンパク質HMfファミリーの古細菌ヒストンは、DNAと直接相互作用すると考えられている真核生物H4ヒストンとアミノ酸配列および構造の両方の点で相同性がある。HMfファミリータンパク質は溶液中で安定な二量体を形成し、いくつかのHMf相同体が耐熱性種例えば、メタノテルムスフェルビダスMethanothermusfervidusおよびパイロコッカス属GB3a菌株から同定されている。HMfファミリータンパク質は、TaqDNAポリメラーゼまたは固有の処理能力が低い任意のDNA修飾酵素と結合させると、その酵素がDNA基質に沿ってスライドする能力を強化し、それ故にその処理能力を高める。例えば、二量体HMfファミリータンパク質を、TaqDNAポリメラーゼのN末端に、例えば化学修飾を介して共有結合で連結させ、それによりそのポリメラーゼの処理能力を改善することができる。当業者は、当技術分野において公知であるその他の二本鎖配列非特異的な核酸結合ドメインを認知していると考えられ、それらを本明細書に記載したように用いることもできる。VI.クロマチンDNAの修飾または切断段階後のDNAの単離上記のように、いくつかの態様においては、クロマチンについてのDNA修飾/切断段階の後に、利用可能な任意の方法に従ってゲノムDNAを細胞から単離する。その後の濃縮および定量段階のために許容しうる純度のDNAがもたらされる限り、本質的にあらゆるDNA精製手順を用いることができる。例えば、標準的な細胞溶解試薬を、細胞を溶解するために用いることができる。任意でプロテアーゼプロテイナーゼKを非限定的に含むを用いることができる。DNAは、当技術分野において公知である通りに混合物から単離することができる。いくつかの態様においては、フェノール/クロロホルム抽出を用い、DNAをその後に例えば、エタノールにより沈殿させて、精製する。いくつかの態様においては、必要に応じて例えば、RNアーゼにより、またはDNA精製カラムによりRNAを除去または分解する。DNA精製の後、DNAを、切断されたDNAまたは切断されていないDNAについて濃縮することができる。これは、例えば、DNAサイズ選択によって達成することができる。これは、例えば、クロマチンにおけるDNA切断剤または修飾剤に対してアクセス可能な領域を含むDNAを濃縮するのに有用である。該剤に対してアクセス可能な領域は、以下のように特徴付けられるものと考えられる:クロマチンに接触されるDNA切断剤に関しては、より短い断片もしくは断片なし;またはクロマチンに接触される修飾剤と修飾依存性DNA切断剤との組み合わせに関しては、より短い断片もしくは断片なし;またはクロマチンに接触される修飾剤と修飾感受性のDNA切断剤との組み合わせに関しては、より長い断片。同様に、クロマチンにおける該剤または修飾剤に対してアクセス可能ではない領域は、以下のように特徴付けられるものと考えられる:クロマチンに接触されるDNA切断剤に関しては、より長い断片もしくはインタクトな領域;またはクロマチンに接触される修飾剤と修飾感受性のDNA切断剤との組み合わせに関しては、より長い断片もしくはインタクトな領域;またはクロマチンに接触される修飾剤と修飾依存性DNA切断剤との組み合わせに関しては、より短い断片もしくは断片なし。断片の濃縮は、例えば、特定の剤のアクセス可能性例えば、クロマチン構造について濃縮される核酸の集団の生成において有用である。この集団を今度は、そのような核酸が濃縮されているライブラリーのために用いることができ、またはそのような核酸が濃縮されているライブラリーを生成するために用いることができる。ライブラリーは、例えば、当技術分野において公知のようにファージ、ウイルス、プラスミドまたは他の構築体として維持することができる。特定のクロマチン構造に対する断片濃縮例えば、断片のサイズ選択によるの利点は、任意により少ない介入段階でまたはさらなる介入段階なしで、ヌクレオチド配列の決定を可能にすることである。濃縮された集団における断片のすべてのまたは代表の選択物を配列決定することによって、容易に、集団においてどの配列が濃縮されているかを評価し、それにより、必要ならゲノム規模での分析をもたらすことができる。標準的なSangerダイデオキシ法または他のヌクレオチド配列決定法を使用できるが、濃縮された断片の配列決定は高速大量処理の配列決定、例えば、HiSeq商標、MiSeq商標またはGenomeAnalyzer配列決定それぞれIlluminaより利用可能、SOLiD商標またはIonTorrent商標配列決定それぞれLifeTechnologiesより利用可能および454商標配列決定RocheDiagnosticsよりのような次世代配列決定法が用いられる場合、特に有効でありうる。例えば、高速大量処理の配列決定において、複数の鋳型および複数のプライマーを用いた並行配列決定反応により、ゲノムまたはゲノムの大部分の迅速な配列決定が可能になる。例えば、WO03004690、WO03054142、WO2004069849、WO2004070005、WO2004070007、WO2005003375、WO0006770、WO0027521、WO0058507、WO0123610、WO0157248、WO0157249、WO02061127、WO03016565、WO03048387、WO2004018497、WO2004018493、WO2004050915、WO2004076692、WO2005021786、WO2005047301、WO2005065814、WO2005068656、WO2005068089、WO2005078130、およびSeoetalProcNatlAcadSciUSA200410154885493を参照されたい。さらに、DNAポリメラーゼの反応速度を鋳型依存的な様式でモニターするヌクレオチド配列の決定はまた、サイズ選択法で特に有用である。これは、配列決定を用いて、ヌクレオチドおよびメチル化または他の検出可能な修飾状態を同時に評価する場合においてはさらに有益である。そのような場合、DNAを増幅またはコピーすることができずそれによってはメチル化が除去されよう、それ故に、濃縮によって、同じアッセイ法のなかでメチル化または他の修飾を評価しながら、ある特定のクラス濃縮されたクラスのクロマチンの配列を分析し、かつ任意で定量することが可能になる。ヌクレオチド配列およびヌクレオチド修飾状態の決定はまた、例えば、DNA修飾剤がクロマチンと接触されており、それにより、アクセス可能なクロマチン構造およびアクセス不能なクロマチン構造に対応する、それぞれ、修飾されたDNA領域および修飾されていないDNA領域が生成される場合においても有用である。いくつかの態様において、濃縮されたDNA断片は単一分子リアルタイムSMRT配列決定により配列決定される。SMRT配列決定は、単一のDNAポリメラーゼ分子がリアルタイムで認識され、その間に、それらが鋳型核酸鎖と相補的な蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを触媒することによる方法である。SMRT配列決定の方法は、当技術分野において公知であり、FlusbergetalNatureMethods74614652010によって最初に記載されており、これはすべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。簡潔に言えば、SMRT配列決定では、ヌクレオチドの取り込みが蛍光のパルスとして検出され、その色によりそのヌクレオチドが特定される。パルスは、ポリメラーゼがDNA鋳型中の次の塩基へ移行する前に、ヌクレオチドの末端に連結されている蛍光体がポリメラーゼによって切断される場合に止まる。蛍光パルスは発光スペクトルにより、ならびにパルスの持続時間パルス幅および連続パルス間の間隔パルス間隔時間またはIPDにより特徴付けられる。パルス幅は、ヌクレオチド結合後、蛍光体放出までのすべての動的段階と相関関係にあり、IPDは、ヌクレオチド結合およびポリメラーゼ移行の反応速度と相関関係にある。このように、SMRT配列決定において蛍光パルスを測定することにより、DNAポリメラーゼの反応速度をモニターすることができる。蛍光標識された各ヌクレオチドすなわち、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンに特徴的な蛍光パルスの差異を測定することに加えて、非メチル化塩基と対比してメチル化塩基の差異を測定することもできる。例えば、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のIPDをその非メチル化対応物と比べて変化させる例えば、非メチル化アデノシンと比べてメチル化アデノシン。さらに、メチル化塩基の存在は、メチル化塩基のパルス幅をその非メチル化対応物と比べて変化させ例えば、非メチル化シトシンと比べてメチル化シトシン、さらに、異なる修飾は、異なるパルス幅を有する例えば、5ヒドロキシメチルシトシンは5メチルシトシンよりも顕著な変化範囲を有する。このように、各種の非修飾塩基および修飾塩基は、ある状況下でのIPDおよびパルス幅のその組み合わせに基づき、固有のサインを有する。SMRT配列決定の感度は、溶液条件、ポリメラーゼ変異、およびヌクレオチドの動態サインを活用するアルゴリズム法の最適化、ならびに隣接したメチルシトシン塩基を分解するのを補助するデコンボリューション法によってさらに向上することができる。あるいは、サイズ選択を行って、1つまたは複数の特定のDNA領域の検出を補助することができる。関心対象のDNA領域が公知である場合、サイズ分画またはサイズ選択を用いて、配列の分解が存在するかどうかを検出することができる例えば、DNA断片が無傷か、相対的に長いか、または断片化されているか、および相対的に短いかどうかを検出することにより。例えば、いくつかの態様において、DNAは、ゲノムDNAにおける関心対象のDNA領域を含む部分についてまたはゲノムDNAにおける関心対象のDNA領域を含む部分について濃縮されたライブラリーから単離され、任意の公知の方法によるサイズ分離に供される。核酸サイズ分離技術の例としては、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動例えば、QuertermousCurrProtocMolBiolChapter5Unit54May2001、スクロース勾配例えば、WeisandQuertermousCurrProtocMolBiolChapter5Unit53May2001、またはカラムに基づくゲル電気泳動が挙げられるが、これらに限定されることはない。選択されるDNA断片のサイズは、用いられる特定の剤および望まれる目標に依って異なるであろう。いくつかの態様において、より小さな断片が選択されよう。例えば、いくつかの態様において、DNAは10~500塩基対、10~1000塩基対、または他の範囲の断片について選択される。いくつかの態様において、より大きな断片が選択されよう。例えば、いくつかの態様において、DNAは、100、500もしくは1000塩基対、または500から1000もしくは2000もしくは3000塩基対を含むが、これらに限定されない、他のサイズよりも長い断片について選択される。あるいは、中間的な断片、すなわち、最も大きくもまたはより小さくもない断片を選択することができる。いくつかの態様においては、インタクトな、修飾された、または修飾されていない任意で上記のように濃縮されたDNAを単離して、ライブラリーへとクローニングする。場合によっては、1つまたは複数の特定のインタクトな、修飾された、または修飾されていない配列を単離および/またはクローニングする。または、インタクトな、修飾された、または修飾されていないDNA領域を有する試料を用いて、そのような領域に関して濃縮されたライブラリーを調製する。DNA切断剤との接触後にインタクトなDNAは、その剤に対して、よりアクセス可能性が低かったDNAを表す。同様に、DNA修飾剤との接触後に修飾されていないDNAは、よりアクセス可能性の低いDNAを表す。その反対に、修飾されたDNAは、修飾剤に対して、よりアクセス可能性が高かったDNAを表す。上記の態様のいくつかにおいては、クローニングの前に、インタクトなDNAを切断されたDNAから精製し例えば、分離し、かつ/または修飾されたDNAを修飾されていないDNAから精製し、それにより、1つのクラスのDNAに関してのクローニングプールを濃縮する。修飾された/修飾されていないDNAに関する濃縮は、修飾の性質に応じて異なると考えられる。いくつかの態様においては、修飾されたまたは修飾されていないDNAと特異的に結合する親和性物質を用いて、修飾されたDNAを修飾されていないDNAから分離する。いくつかの態様においては、サブトラクティブライブラリーを作製する。例えば、本発明の方法においてインタクトな、修飾された、または修飾されていない罹患細胞DNA領域に関して濃縮されたライブラリーを作製し、その後に健常細胞由来の対応するライブラリーを用いてサブトラクションして、それにより、両方とも無傷であるか、修飾されているか、または修飾されておらず、かつ特定の疾患に対して特異的である、差次的なDNA配列ライブラリーを作製することができる。癌細胞を非限定的に含む、任意の罹患細胞を用いることができる。代替的なサブトラクティブ戦略を、例えば、異なる細胞型、細胞時期、薬物治療などの間で用いることもできる。VIIDNAの物理的特徴の検出細胞とDNA修飾剤またはDNA切断剤との接触、それに続く切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に、DNAの任意のさまざまな物理的特徴を検出することができる。物理的特徴には、DNAメチル化、融解温度、GC含有量、ヌクレオチド配列、およびポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力が含まれるが、これらに限定されることはない。そのような特徴を検出するための種々の方法が公知であり、用いることができる。いくつかの態様において、DNA修飾切断の段階の後に、決定される物理的特徴は、DNAフットプリンティング例えば、DNAの特定の領域に対する1つまたは複数の特定のタンパク質の能力を決定することを含まない。例えば、1つの非限定的な態様において、例えばqPCRを用いるインタクトなDNAの定量は、DNAフットプリンティングを含まない。いくつかの態様において、1つまたは複数のDNA配列のヌクレオチド配列が決定される。配列決定は、標準的なダイデオキシヌクレオチドに基づく配列決定を用いて、または高速大量処理もしくは次世代の配列決定SMRT配列決定を含むが、これに限定されないを用いて行うことができる。あるいは、種々の濃縮画分におけるゲノムDNA領域の特定は、ポリヌクレオチドプローブが固体支持体例えばチップと連結されている態様を含むが、これに限定されない、ハイブリダイゼーションによって検出することができる。いくつかの態様において、物理的特徴はDNAメチル化である。例えば、相対的にアクセス可能なDNAがDNA切断剤によって切断されれば、残りのインタクトなDNAアクセス可能性がより低いDNAに相当するについて単離および濃縮し、続いてメチル化状態に関して分析することができる。非常にさまざまなDNAメチル化検出方法が公知である。いくつかの態様においては、DNA修飾剤または切断剤との接触後に、DNAをバイサルファイトと接触させ、それにより、DNA中のメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する。続いて、特定のDNA領域のメチル化を、本明細書で考察したものを含む、任意のさまざまなメチル化検出方法によって決定することができる。いくつかの態様において、高分解能融解アッセイHRMを用いて、バイサルファイト変換後のメチル化状態を検出する。この方法では、バイサルファイト変換後にDNA領域を増幅し、その結果得られたアンプリコンの融解温度を決定する。融解温度はシトシンがバイサルファイトによって変換されたか否かおよびその後に増幅反応においてTとしてコピーされたか否かに応じて異なると考えられるため、アンプリコンの融解温度をメチル化含有量と相関させることができる。VIII.標的DNA領域DNA領域は、ゲノムDNA内部の関心対象の標的配列である。細胞のゲノムDNA中の任意のDNA配列を、本明細書に記載した通りに、DNA修飾剤または切断剤のアクセス可能性に関して評価することができる。例えば、複数の異なる細胞型において、処理していない細胞と薬物刺激、化学刺激もしくは環境的刺激に曝露された細胞との間で、または正常組織と罹患組織との間で異なるアクセス可能性を呈する、関心対象のDNA領域を同定するために、DNA領域をスクリーニングする。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法は、アクセス可能性の変化が疾患またはその欠如のマーカーとして作用するDNA領域を同定するために用いられる。例示的な疾患には、癌が非限定的に含まれる。癌でない細胞と比較して癌細胞において変化したDNAメチル化および/またはクロマチン構造を有する数多くの遺伝子が記載されており、したがって、本明細書に記載の方法によって、例えば癌の予後予測および診断について分析することができる。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞iPS細胞および胚性幹細胞を非限定的に含む幹細胞の多能性が、クロマチンのアクセス可能性を利用して評価される。いくつかの態様において、DNA領域は、特定の細胞の罹患状態または発生状態に応じて、アクセス可能性に差異を伴うことが判明している。これらの態様において、本発明の方法は、診断ツールまたは予後予測ツールとして用いることができる。本発明の方法を用いて診断または予後予測がひとたび確定されれば、その診断または予後予測を考慮して、治療レジメンを設定すること、または既存の治療レジメンを変更することができる。例えば、本発明の方法に従った癌細胞の検出は、癌細胞が検出された個体に対する化学療法薬および/または放射線の投与につながりうる。種々のDNA領域を、研究目的で、および/または試薬が予想通りに機能することを確認するための対照DNA領域として、検出することができる。例えば、いくつかの態様においては、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能であるDNA領域をアッセイする。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陽性対照として有用である。そのようなDNA領域は、例えば、構成的であるかまたはほぼ構成的である遺伝子の内部または近傍に見いだすことができる。そのような遺伝子には、一般にハウスキーピング遺伝子と呼ばれるもの、すなわち、基本的な生物機能を維持するためにその発現が必要とされる遺伝子が含まれる。そのような遺伝子の例には、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼGAPDHおよびβアクチンACTBが非限定的に含まれる。DNA領域には、任意でプロモーターの少なくとも一部分を含む、そのような遺伝子の全体または一部分が含まれうる。いくつかの態様において、DNA領域は、ある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるDNAの少なくとも一部分を含む。そのようなDNA領域は、例えば、アクセス可能性に関する陰性対照として有用である。この文脈におけるアクセス不能なとは、そのコピーが、DNA領域のコピーの20前後を上回らない割合でしか修飾されないDNA領域のことを指す。そのような遺伝子配列の例には、異質染色質性として一般に認識されているものが含まれ、極めて特定の細胞型のみで発現される例えば、組織特異的または臓器特異的な様式で発現される遺伝子が含まれる。特定の細胞型を除いて一般にアクセス不能である例示的な遺伝子には、ヘモグロビンβ鎖HBB、免疫グロブリン軽鎖κIGK、およびロドプシンRHOが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、DNA領域は、細胞の罹患状態に応じて異なるアクセス可能性を有するか、またはさもなければ細胞の型または生育環境に応じてさまざまなアクセス可能性を有する、遺伝子配列である。例えば、ある種の遺伝子は、癌でない細胞では一般にアクセス不能であるが、癌細胞ではアクセス可能である。さまざまなアクセス可能性を有する遺伝子には、例えば、グルタチオンsトランスフェラーゼπGSTP1が含まれる。いくつかの態様において、本発明のDNA領域は、以下の遺伝子の1つまたは複数からの遺伝子配列例えば、プロモーター配列から選択される:1型カドヘリン1Eカドヘリン、シトクロムP4501A1CYP1A1、Ras関連ドメインファミリー1ARASSF1A、p15、p16、細胞死関連プロテインキナーゼ1DAPK、腺腫性結腸ポリポーシスAPC、メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼMGMT、乳癌1遺伝子BRCA1およびhMLH。いくつかの態様において、DNA領域は、例えば、異なる細胞型の間、異なる条件の間、正常細胞と罹患細胞との間などで異なるアクセス可能性を有する領域を同定するために、ランダムに選択される。IX標的遺伝子座のコピーの定量DNA修飾を定量するための方法は、ゲノムDNAに導入されるDNA修飾の種類に依存すると考えられる。いくつかの態様において、濃縮されたDNA例えば、アクセス可能なまたはアクセス不能なDNAに相当する、サイズ選択された核酸断片を、上記の配列決定技術を用いて検出および定量することができる。例えば、試料中のすべての配列または典型的なコピー数の配列を配列決定し、それにより、濃縮されたクラスのヌクレオチドの量および配列情報を提供することができる。いくつかの態様において、上記と同様に、配列決定によってメチル化を同時に決定することができる。いくつかの態様において、濃縮されたDNAは、1つまたは複数の核酸とハイブリダイズされる。いくつかの態様において、当該核酸は、固体支持体例えば、マイクロアレイまたはビーズと連結されている。これらの態様は、複数の濃縮された配列を同時にマイクロアレイとハイブリダイズさせることができ、続いてハイブリダイゼーションを検出および定量することができるので、ゲノム規模での分析に特に有用である。例えば、Nimblegen商標SequenceCapturetechnologyを参照されたい。本明細書に記載されている態様のいくつかにおいて、核酸アダプターが濃縮DNAにライゲートされるかまたは別の方法で連結され、それにより、濃縮DNAの好都合な増幅およびまたは配列決定を可能にする。いくつかの態様において、二本鎖DNA切断事象例えば、制限酵素もしくはDNアーゼによって導入されるような、または、メチルトランスフェラーゼ処理後もしくは本明細書に記載されたDNA修飾性化学物質による修飾後に、例えばメチル化感受性もしくはメチル化依存性制限酵素によって続いて導入されるような修飾を、関心対象のDNA領域を含むアンプリコンを生成するように設計された増幅反応を用いて好都合に検出することができる。配列特異的制限酵素を用いた場合のような定まった部位での切断事象の場合には、潜在的な切断部位にまたがるアンプリコンが生成されるようにプライマーを設計する。インタクトなDNAのみが増幅されると考えられる。全DNAの量も判明しているならば、切断されたDNAの量を、全DNAとインタクトなDNAとの間の差として計算することができる。DNAの総量は、当技術分野において公知である任意のDNA定量法に従って決定することができる。いくつかの態様において、全DNAの量は、修飾とは無関係にDNAを増幅するプライマーのセットを設計することにより、好都合に決定することができる。これは例えば、同じ遺伝子領域内または別のDNA領域内にある、潜在的な切断部位をまたがないプライマーを設計することによって達成することができる。DNアーゼIなどの配列非特異的ヌクレアーゼを用いる場合のような不定部位での切断事象の場合には、アクセス不能な参照遺伝子の使用を内部対照として組み入れるべきである。以下により詳細に考察するように、定量的増幅例えばリアルタイムPCRを含む方法は、DNA領域のインタクトなコピーの量の決定を可能にし、さまざまな対照とともに用いる場合、細胞におけるコピーの総数と比較してインタクトなDNAの相対量を決定するために用いることができる。従って、DNA領域の修飾もしくは切断されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数例えば、コピーの総数に対して相対的、または第2のDNA領域の修飾されたコピーまたは修飾されていないコピーの数に対して相対的を、算出することができる。本発明のいくつかの態様において、DNA領域の修飾されたコピーの数は、切断されたDNAまたは切断されていないDNAの濃縮の後に直接決定される。例えば、特定の付着末端または平滑末端の存在時にのみ起こると考えられる特定のライゲーション事象を検出することなどにより、制限酵素切断を検出して定量することができる。例えば、制限酵素によって生成される付着末端に対して相補的な付着末端を含む核酸アダプターを、切断されたゲノムDNAとライゲートさせることができる。続いて、例えば、定量的増幅方法によりライゲーション事象の数を検出して定量することができる。いくつかの態様においては、ライゲーション媒介PCRLMPCRを用いて、DNA領域の切断されたコピーの数を定量する。LMPCRの方法は当技術分野において公知であり、PfeiferetalScience2468108131989において最初に記載されている。LMPCRは、必要に応じて、定量的結果のためにリアルタイムで行うことができる。定量的増幅方法例えば、定量的PCRまたは定量的線形増幅は、核酸テンプレートを増幅し、増幅されたDNAの量を直接的または間接的に例えば、Ct値を決定して決定し、続いて増幅サイクル数に基づいて最初のテンプレートの量を算出することを伴う。反応を用いたDNA遺伝子座の増幅は周知である米国特許第4683195号および第4683202号;PCRPROTOCOLSAGUIDETOMETHODSANDAPPLICATIONSInnisetaleds1990を参照。典型的には、PCRを用いてDNAテンプレートを増幅する。しかし、代替的な増幅方法も記載されており、それらの代替的な方法がそれらの方法が切断されたDNAを増幅するよりも高い程度でインタクトなDNAを増幅する限り、それを用いることもできる。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第6180349号;第6033854号;および第5972602号、さらには例えば、GibsonetalGenomeResearch699510011996;DeGravesetalBiotechniques3411061011252003;DeimanBetalMolBiotechnol202163792002に記載されている。増幅はリアルタイムでモニターすることができる。いくつかの態様において、定量的増幅は、増幅例えば、PCR反応のサイクルにおけるテンプレートのコピーを表すシグナル例えば、プローブの蛍光のモニタリングに基づく。PCRの初期サイクルでは、形成されるアンプリコンの量が、アッセイから測定可能であるシグナル出力を支持しないため、非常に弱いシグナルしか観察されない。初期サイクルの後には、形成されるアンプリコンの量が増加するため、シグナル強度は測定可能なレベルまで増大し、PCRが非対数期に入る後期のサイクルではプラトーに達する。シグナル強度対サイクル数のプロットを通じて、測定可能なシグナルがPCR反応から得られる特定のサイクルを推定し、それを用いてPCRの開始前の標的の量を逆算することができる。この方法によって決定される特定のサイクル数は、典型的には、サイクル閾値Ctと呼ばれる。例示的な方法は、例えば、HeidetalGenomeMethods6986941996に、加水分解プローブに関連して記載されている。増幅産物の検出のための1つの方法は、53エキソヌクレアーゼ加水分解PCRアッセイTaqMan商標アッセイとも呼ばれるである米国特許第5210015号および第5487972号;HollandetalPNASUSA88727672801991;LeeetalNucleicAcidsRes21376137661993。このアッセイは、増幅反応の間に、二重標識された蛍光発生プローブTaqMan商標プローブのハイブリダイゼーションおよび切断によって特定のPCR産物の蓄積を検出する。蛍光発生プローブは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。PCRの間に、このプローブは、増幅されるセグメントとそれがハイブリダイズした場合に、しかもその場合にのみ、DNAポリメラーゼの5エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。プローブの切断は、レポーター色素の蛍光強度の増加を生じさせる。エネルギー転移の使用に依拠して増幅産物を検出する別の方法は、TyagiandKramerNatureBiotech143033091996に記載されたビーコンプローブ法であり、これは米国特許第5119801号および第5312728号の主題でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端5末端または3末端かのいずれかにはドナー蛍光体があり、もう一方の末端にはアクセプター部分がある。TyagiとKramerの方法の場合には、このアクセプター部分はクエンチャーであり、すなわち、アクセプターはドナーによって放出されたエネルギーを吸収するが、その後に自ら蛍光を発することはない。したがって、ビーコンがオープン構造である場合はドナー蛍光体の蛍光を検出しうるが、ビーコンがヘアピン閉鎖構造である場合はドナー蛍光体の蛍光は消光する。PCRに用いる場合、PCR産物の一方の鎖とハイブリダイズする分子ビーコンプローブはオープン構造であり、蛍光が検出されるが、ハイブリダイズしないままのものは蛍光を発しないと考えられるTyagiandKramerNatureBiotechnol143033061996。その結果、蛍光の量はPCR産物の量が増加するにつれて増加し、それ故にPCRの進行の尺度として用いることができる。当業者は、その他の定量的増幅法も利用可能であることを認識しているであろう。核酸の定量的増幅を行うためのさまざまな他の手法も公知である。例えば、いくつかの方法は、オリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズした場合に蛍光の変化が生じるように構築されている1つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドを用いる。例えば、そのような1つの方法は、2つのオリゴプローブをアンプリコンとアニーリングさせる、蛍光共鳴エネルギー転移FRETを利用する二重蛍光体アプローチ、例えば、LightCycler商標ハイブリダイゼーションプローブである。オリゴヌクレオチドは、効率的なエネルギー転移に適合する距離で隔てられた蛍光体と頭尾方向でハイブリダイズするように設計される。核酸と結合するかまたは伸長産物に組み入れられた場合にシグナルを発するように構築された標識オリゴヌクレオチドの他の例には、以下が含まれる:Scorpions商標プローブ例えば、WhitcombeetalNatureBiotechnology178048071999および米国特許第6326145号、Sunrise商標またはAmplifluor商標プローブ例えば、NazarenkoetalNucAcidsRes25251625211997および米国特許第6117635号、および、クエンチャーがなくてもシグナル低下をもたらす二次構造を形成し、かつ標的とハイブリダイズした場合に増大したシグナルを発するプローブ例えば、Luxprobes商標。他の態様においては、二本鎖DNA中に挿入された時にシグナルを生じるインターカレート剤を用いうる。例示的な剤には、SYBRGREEN商標、SYBRGOLD商標およびEVAGREEN商標が含まれる。これらの剤はテンプレート特異的ではないため、シグナルはテンプレート特異的増幅に基づいて生成されると想定される。テンプレート配列の融解点は一般に、例えばプライマーダイマーなどよりもはるかに高いと考えられるため、このことはテンプレートの関数としてシグナルをモニターすることによって確認することができる。いくつかの態様において、DNA領域の量は、試料中のヌクレオチド配列のコピーを決定し、続いて試料中の同じ配列を有するコピーの相対数または絶対数を決定することによって決定される。本発明の方法による切断もしくは修飾されたまたは切断もしくは修飾されていないDNA領域の定量は、いくつかの態様において、DNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの、その同じ領域のコピーの総数と比較した相対量例えば、比またはパーセンテージなどの標準化された値を決定することによって、さらに改良することができる。いくつかの態様において、1つのDNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量を、第2のまたはそれ以上のDNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの数と比較する。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合には、各DNA領域の切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量を、まず、DNA領域のコピーの総数に対して標準化する。または、同じ試料から得られる場合には、いくつかの態様において、各DNA領域のコピーの総数はおおよそ同じであると仮定し、そのため2つまたはそれ以上のDNA領域の間で比較する場合に、各値をコピーの総数に対してまず標準化することなしに、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの相対量例えば、比またはパーセンテージを各DNA領域間で決定することもできる。いくつかの態様においては、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の量または相対量例えば、全DNAとの対比を、対照値と比較する。対照値は、例えば、特定のDNA領域に対するアクセス可能性が特定の値を上回るかそれ未満であるかを知りたい場合に、好都合に用いることができる。例えば、特定のDNA領域が正常細胞では典型的にはアクセス可能であるが罹患細胞ではアクセス不能であるまたはその反対の状況では、切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数を、単に、例えば、20超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、80超またはそれ未満が修飾されているかまたは修飾されていない、などの対照値と比較してもよい。または、対照値が、対照DNA領域に関する過去データまたは予想されるデータであってもよい。これらの場合には、対照DNA領域の実際の量または相対量を任意で数回決定し、その結果得られたデータを用いて、関心対象のDNA領域に関して決定された切断もしくは修飾されたコピーまたは修飾もしくは切断されていないコピーの実際の数または相対数と比較することのできる対照値を作成することができる。本明細書に記載された方法のための計算は、コンピュータベースの計算およびツールを含みうる。これらのツールは、従来設計の汎用コンピュータシステム本明細書ではホストコンピュータと称するによって実行可能なコンピュータプログラムの形態で提供されることが好都合である。ホストコンピュータは数多くのさまざまなハードウェア構成部分を用いて構成されてよく、さまざまな寸法および方式で製造することができる例えば、デスクトップPC、ラップトップ、タブレットPC、ハンディ型コンピュータ、サーバー、ワークステーション、大型汎用コンピュータ。モニター、キーボード、ディスクドライブ、CDおよび/またはDVDドライブなどの標準的な構成部品が含まれてもよい。ホストコンピュータをネットワークに結びつける場合、接続は任意の適した伝達媒体例えば、有線媒体、光媒体および/または無線媒体ならびに任意の適した通信プロトコル例えば、TCPIPを介して提供されうる;ホストコンピュータが適したネットワーク用ハードウェア例えば、モデム、イーサネットカード、WiFiカードを含んでもよい。ホストコンピュータは、UNIX、Linux、MicrosoftWindows、MacOSまたは任意の他のオペレーティングシステムを含む、さまざまなオペレーティングシステムの任意のものを実行してよい。本発明の実行局面に関するコンピュータコードは、PERL、C、C、Java、JavaScript、VBScript、AWK、または、ホストコンピュータ上で実行されうるか、もしくはホストコンピュータ上で実行されるようにコンパイルされうる、任意の他のスクリプト言語またはプログラム言語を含むさまざまな言語で記述されうる。また、コードを、アセンブリ言語またはマシン言語のような低水準言語で記述するかまたは分散させてもよい。ホストコンピュータシステムは、ユーザーがツールの動作を制御するインターフェースを好都合に提供する。本明細書に記載された例において、ソフトウェアツールはスクリプト例えば、PERLを用いるとして実行され、その遂行はユーザーにより、LinuxまたはUNIXなどのオペレーティングシステムの標準的なコマンドラインインターフェースから開始される。当業者は、コマンドをオペレーティングシステムに対して適宜適合させうることを認識しているであろう。他の態様において、ユーザーがポインティングデバイスを用いて動作を制御することを可能にするグラフィカルユーザーインターフェースが提供されてもよい。したがって、本発明は、いかなる特定のユーザーインターフェースにも限定されない。本発明のさまざまな特徴を組み入れたスクリプトまたはプログラムを、記憶および/または伝達のために、さまざまなコンピュータ可読媒体上に符号化して記録してもよい。適した媒体の例には、磁気ディスクまたはテープ、コンパクトディスクCDまたはDVDデジタル多目的ディスクなどの光学記憶媒体、フラッシュメモリー、ならびにインターネットを含む種々のプロトコルに準拠する有線、光および/または無線ネットワークを介した伝達用に適合化されたキャリア信号が含まれる。Xキット本発明はまた、本発明のアクセス可能性およびサイズ選択または他の濃縮のアッセイを行うためのキットも提供する。キットは、書面による使用説明書、または電子的な使用説明書例えば、CDROMまたはDVD上を任意で含んでもよい。本発明のキットは、例えば、DNA修飾剤およびまたはDNA切断剤、ならびに核酸サイズ選択ができる装置サイズ排除カラム、ゲルろ過、またはサイズによって核酸を分類する他のカラムを含むが、これらに限定されないを含んでもよい。キットは、任意で細胞透過処理剤およびまたは細胞破壊剤を含んでもよい。DNA修飾剤には、例えば、メチルトランスフェラーゼまたはDNA修飾性化学物質を含む、本明細書中に詳細に記載されたものが含まれうる。DNA切断剤には、例えば、制限酵素、DNアーゼ、またはDNA切断性化学物質が含まれうる。本発明のキットは、透過処理剤およびDNA修飾剤ならびにまたはDNA切断剤を、同じバイアル容器内およびそれ故に同じ緩衝液中に含んでもよい。あるいは、透過処理剤ならびにDNA修飾剤およびまたはDNA切断剤が別々のバイアル容器内にあってもよい。本発明のキットはまた、1つまたは複数の対照細胞およびまたは核酸も含みうる。例示的な対照核酸には、例えば、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能である例えば、ハウスキーピング遺伝子配列またはそのプロモーターか、またはある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるかのいずれかである遺伝子配列を含むものが含まれる。いくつかの態様において、本キットは、そのような遺伝子配列を増幅するためのプライマーの1つまたは複数のセットを遺伝子配列または細胞がキットに実際に含まれるか否かにかかわらず含む。例えば、いくつかの態様において、本キットは、DNA修飾剤、DNA切断剤、ならびに細胞透過処理剤およびまたは細胞破壊剤、ならびに対照DNA領域を増幅するための1つまたは複数のプライマーセット本明細書に記載される対照遺伝子を含むが、これに限定されることはない、ならびに任意で、第2のDNA領域例えば標的DNA領域を増幅するための1つまたは複数のプライマーセットを含む。いくつかの態様において、本発明のキットは、以下のもののうち1つまたは複数を含む:iメチルトランスフェラーゼもしくは他のDNA修飾剤;ならびにまたはiiDNA切断剤ならびにiii細胞膜の透過処理剤もしくは破壊剤;iv修飾剤によるさらなる修飾を防止することのできる停止用溶液;v核酸の抽出およびもしくは精製のための材料例えば、ゲノムDNAの精製およびもしくは停止用溶液の成分のような非DNA成分の除去のためのスピンカラム;viDNAの配列決定のための試薬例えば、単分子リアルタイム配列決定試薬もしくはナノポア配列決定試薬もしくはDNAを定量的に増幅する例えば、qPCRための試薬;ならびにvii核酸サイズ選択のできる機器例えば、サイズ排除カラムもしくはゲルろ過カラムのための1つもしくは複数の試薬。以下の実施例は、特許請求する本発明を限定するためではなく、それを例示するために提供される。実施例1:全ゲノムDNAを未処理の透過処理細胞から単離し、透過処理細胞をヌクレアーゼDNアーゼI、20分、37°Cで処理した。次に、当該細胞由来のDNAを単離し、3アガロースゲル上で分画した。Qiagenゲル抽出DNA精製キットを用いて標準的な手順により、100~400bpのサイズ範囲内のDNAをゲルから抽出した。サイズ選択したDNAの一部分をAgilentBioanalyzerで分析した。DNAの大部分はサイズが100~500bpであり、サイズ選択プロトコルが予想通りにうまくいったことが実証された。分画されたDNAからいくつかの遺伝子配列を増幅させて、その相対存在度を決定した。既知の異なるアクセス可能性を有する遺伝子を用いて、この方法を検証した。下記表は、サイズ選択したDNA試料中の遺伝子プロモーターを分析するリアルタイムPCRの結果をまとめたものである。上記表中のDNAレベルは、その量が、100に設定したGAPDHプロモーターDNAの存在度と相対的であるように標準化した。このデータから、アクセス可能な遺伝子プロモーターに対応するDNAが、アクセス不能な遺伝子プロモーターに対応するDNAの量と比べて高度に濃縮されていることが示唆される。また、Hela細胞における部分的にアクセス可能な遺伝子プロモーターに対応するDNAがアクセス不能な遺伝子プロモーターDNAと比べて、サイズ選択した試料において濃縮されている。このデータは予想されたものであり、アクセス可能なクロマチンに対応するDNAが、サイズ選択されたDNA試料において高度に濃縮されていることを示している。サイズ選択したHelaDNA試料の次世代配列決定の結果をまた、UCSCゲノムブラウザで調べた。このデータを、他の技術DigitalDNaseおよびDNaseSeqレーンによりゲノム規模でアクセス可能なクロマチン領域をマッピングしている公的に入手可能なデータと比較した。サイズ選択したDNAに対するピークは、他の技術によるピークとよく相関しており、よく特徴付けられた他の現行の技術と同様に、サイズ選択したDNAによる方法によっても、アクセス可能なクロマチン領域がマッピングされることが実証された。実施例2理論実験例propheticexample:DNA修飾剤による修飾に対するクロマチン領域のアクセス可能性を、4種の細胞株でさまざまなアクセス可能性レベルの4種の遺伝子について調べる。DAMメチルトランスフェラーゼは、GATCモチーフの6位でアデニンをメチル化する細菌酵素である。透過処理した細胞をDAMメチルトランスフェラーゼによりインサイチューで処理して、アクセス可能なクロマチンを修飾する;対照細胞は透過処理用緩衝液のみで処理する。DNAを精製し、DAM修飾されていないGATCモチーフのみを消化するメチル化感受性制限酵素DpnIIで消化する;対照反応では緩衝液のみで処理する。4種の遺伝子、すなわちロドプシンRHO、β2ミクログロブリンB2M、P14およびHカドヘリンCDH13におけるDNA修飾を、4種の細胞株:HeLa、PC3、LNCaPおよびHCT15を用いて分析する。DpnIIで切断されたDNAをサイズ選択段階に供し例えば、サイズ排除スピンカラムに適用し、それにより、少なくとも所定のDNA断片を選択するそれにより、混合物から、アクセス可能な配列に相当する、より小さな、切断された断片を除去する。このDNAをその後、配列決定例えば、SMRT配列決定に供し、それにより、統計的に関係がある数の断片を配列決定して、サイズ選択された試料中にどの断片が存在するかを決定する。選択したゲノム領域のDpnII消化を、当技術分野において公知の定量的PCRqPCR法を用いても評価する。B2M、RHO、p14およびCDH13プロモーターに特異的なプライマーを用いてDNA試料を増幅させる。増幅領域のそれぞれに、1箇所のDAM修飾部位GATCが存在していた。B2Mプロモーターの分析B2Mは、すべての細胞株において構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子である。すべての細胞株において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料と比べてB2M配列をほとんどまたは全く含まない。これは、DAMがB2Mプロモーターを修飾し、それをDpnII消化から保護することを示しており、B2Mプロモーターがすべての細胞株においてアクセス可能であることを示唆している。RHOプロモーターの分析RHOは、分析されるすべての細胞株において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能なクロマチン立体配置の中にある。すべての細胞株において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料とおおよそ同じ量の、RHO配列を有する断片を含む。これは、RHOプロモーターがDpnII消化から保護されることを示しており、RHOプロモーターの位置がアクセス不能なクロマチン内にあることと一致している。p14プロモーターの分析p14はHCT15細胞において発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。p14はHela、PC3およびLNCaP細胞において発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。HCT15細胞株において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料とおおよそ同じ量の、p14配列を有する断片を含む。しかしながら、Hela、PC3およびLNCaP細胞において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料と比べてp14配列をほとんどまたは全く含まない。CDH13プロモーターの分析CDH13はHela細胞において高度に発現されており、そのプロモーターはアクセス可能である。CH13はPC3、LNCaPおよびHCT15細胞において十分に発現されておらず、そのプロモーターはアクセス不能である。HCT15細胞株において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料と比べてCDH13配列をほとんどまたは全く含まない。しかしながら、Hela、PC3およびLNCaP細胞において、DAMDpnII試料は、無DAMDpnII試料とおおよそ同じ量の、CDH13配列を有する断片を含む。本明細書に記載された例および態様が例示のみを目的としていること、ならびにそれらを考慮してさまざまな改変および変更が当業者には想起されると考えられ、それらが本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることは、理解されるであろう。本明細書中に引用された刊行物、特許および特許出願はすべて、それらの全体が、あらゆる目的で参照により組み入れられる。