"配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第631~725位の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第1のプローブ及び第2のプローブからなり、前記第1のプローブは第1の蛍光物質で標識されており、前記第2のプローブは前記第1の蛍光物質と蛍光共鳴エネルギー移動FRETを起こす第2の蛍光物質で標識されている、18SrRNA検出用FRETプローブ。前記第1のプローブは、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第669~687位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であり、前記第2のプローブは、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第645~664位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体である、請求項1に記載の18SrRNA検出用FRETプローブ。前記第1のプローブは、配列番号2に記載の塩基配列からなる2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチドであり、前記第2のプローブは、配列番号3に記載の塩基配列からなる2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチドである、請求項1又は2に記載の18SrRNA検出用FRETプローブ。しかしながら、非特許文献2の方法では、2本鎖核酸と1本鎖核酸とを染め分けることが可能であるものの、18SrRNAを選択的に検出することは不可能である。また、18SrRNAの検出を目的とした場合、細胞内に数十万分子以上存在することから、非特許文献4のQFRETプローブによる信号の増幅は必要ない。また、非特許文献4の方法では、連続的な信号の増幅により定量性が低下する場合がある。そこで、本発明は、18SrRNAを高感度で定量的に検出することが可能なFRETプローブを提供することを目的とする。本発明は、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第631~725位番目の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第1のプローブ及び第2のプローブからなり、第1のプローブは第1の蛍光物質で標識されており、第2のプローブは前記第1の蛍光物質とFRETを起こす第2の蛍光物質で標識されている、18SrRNA検出用FRETプローブを提供する。上記本発明のFRETプローブによれば、18SrRNAを高感度で定量的に検出することができる。上記第1のプローブは、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第669~687位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であり、上記第2のプローブは、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第645~664位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であることがより好ましい。さらに、上記第1のプローブは、配列番号2に記載の塩基配列からなる2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチドであり、上記第2のプローブは、配列番号3に記載の塩基配列からなる2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチドであることが更に好ましい。このようなプローブは、18SrRNAを高感度で定量的に検出する性能が更に高い。本発明により、18SrRNAを高感度で定量的に検出することが可能なFRETプローブが提供される。プローブの設計本実施形態の18SrRNA検出用FRETプローブは、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第631~725位の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第1のプローブ及び第2のプローブからなり、第1のプローブは第1の蛍光物質で標識されており、第2のプローブは前記第1の蛍光物質と蛍光共鳴エネルギー移動FRETを起こす第2の蛍光物質で標識されている。上記第1のプローブ及び第2のプローブのうち、隣接して標的核酸にハイブリダイズした状態で、標的配列の相補鎖配列で5’側に位置する方を5’側プローブと呼び、他方を3’側プローブと呼ぶ。本明細書において、隣接とは、5’側プローブの3’末端塩基と3’側プローブの5’末端塩基との間が、0~8塩基、好ましくは0~4塩基離れて隣り合うことをいう。5’側プローブの3’末端及び3’側プローブの5’末端を、それぞれFRETを起こす組み合わせの蛍光物質で標識する。FRETを起こす蛍光物質の組み合わせのうち、エネルギーを与える方の物質をドナー蛍光物質と呼び、エネルギーを受けとる方の分子をアクセプター蛍光物質と呼ぶ。5’側プローブと3’側プローブのいずれにドナー蛍光物質を標識してもよい。以下、ドナー蛍光物質で標識した方のプローブをドナープローブと呼び、アクセプター蛍光物質で標識した方のプローブをアクセプタープローブと呼ぶ場合がある。本実施形態のFRETプローブを設計する場合、配列番号1に記載の塩基配列からなる核酸の第631~725位の領域に隣接してハイブリダイズ可能なようにドナープローブとアクセプタープローブを設計する。ドナープローブとアクセプタープローブの融解温度Tm値は、ほぼ一致することが好ましい。これは、ドナープローブとアクセプタープローブをほぼ同じ確率で標的配列に結合させるためである。ドナープローブとアクセプタープローブのTm値は、36°C以上であることが好ましい。これは生細胞が生息可能な温度域で標的核酸とプローブがハイブリダイズしなければならないためである。また、ドナープローブとアクセプタープローブの長さは、それぞれ15~25塩基であることが好ましく、16~22塩基であることがより好ましい。FRETプローブは、蛍光物質に隣接してグアニンG塩基が存在しないことが好ましい。これは、蛍光物質の近傍に核酸塩基特にグアニンが存在すると蛍光物質が消光する場合があるためである。また、ドナープローブ同士、アクセプタープローブ同士、又はドナープローブ及びアクセプタープローブが相補的に結合しにくい配列であることが好ましい。これは、相補的な配列が存在すると、プローブのみで互いにハイブリダイズしてしまう場合があるためである。その結果、標的核酸に依存せずFRETを起こしたり、プローブが定量的に標的核酸にハイブリダイズできなくなる等の問題が生じる場合がある。経験的に、4塩基以上連続して相補的な配列を持たないような配列を選択するとよい。プローブ単独又はプローブ間で相補的に結合しにくい配列であるか否かは、実際にプローブを合成し、溶液中における蛍光測定により確認することができる。プローブの合成上記のようにして設計したFRETプローブの塩基配列に基づいて、実際にFRETプローブを合成する。プローブは核酸又は核酸誘導体により構成される。より具体的には、DNAやRNA等の核酸、ペプチド核酸PNA、LockedNucleicAcidLNA、ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド等の核酸誘導体、及び、部分的にこれらの核酸や核酸誘導体が混合したものが挙げられる。また、UウラシルがTチミンに置き換えられていてもよい。FRETプローブがRNAである場合、RNaseによる分解を抑制するために、2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチドとすることが好ましい。蛍光物質5’側プローブ及び3’側プローブの一方をドナー蛍光物質で修飾し、他方をアクセプター蛍光物質で修飾する。ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間の距離は、5’側プローブ及び3’側プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で4塩基であることが好ましい。この距離がFRETを起こすのに適しているためである。一実施形態において、プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で、5’側プローブの3’末端と、3’側プローブの5’末端の間の距離が4塩基となるようにプローブを設計し、5’側プローブの3’末端と、3’側プローブの5’末端を蛍光物質で修飾する。別の実施形態において、蛍光物質で修飾するのはプローブの末端ではなく、より内側の塩基である。このような場合であっても、プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間の距離が4塩基であれば、効率よくFRETを起こすことができる。ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の組み合わせとしては、例えば、表1に示すものが使用できる。18SrRNAの検出一実施形態において、インビトロで18SrRNAを検出し、定量することができる。サンプルとしては、対象から抽出した全RNA等を使用できる。例えば、1μMのドナープローブおよびアクセプタープローブを溶解した緩衝液中に全RNAを混合する。プローブを標的核酸にハイブリダイズさせるためには、例えば150mMNaCl-15mMSodiumCitratepH7.0SSC溶液中、温度37°C等の条件下で20分間放置するとよい。続いて、蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計等の装置を用いて、FRETの蛍光を検出する。より具体的には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を照射し、アクセプター蛍光物質の蛍光を測定する。例えば、ドナー蛍光物質にAlexaFluor488インビトロジェン社を用い、アクセプター蛍光物質にAlexaFluor647インビトロジェン社を用いた場合、ドナー蛍光物質の励起波長は488nmであり、アクセプター蛍光物質の蛍光波長は630nmである。別の実施形態において、生きた又は固定した細胞内で18SrRNAを検出し、定量することができる。生きた細胞へのプローブの導入には、後述するストレプトリジンOSLOを使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の方法が使用できる。固定した細胞を対象として18SrRNAを検出する場合には、細胞へのプローブの導入には、界面活性剤を用いる等の方法が使用できる。細胞内にプローブを導入する方法は条件が異なってくるので一概に同じ条件を設定できないが、ハイブリダイゼーションに限れば数分でハイブリダイズする。続いて、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター等を用いて、FRETの蛍光を検出することができる。以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。FRETプローブの設計及び合成ヒト18SrRNA遺伝子配列番号1、Genbankアクセッション番号K03432.1及びヒト28SRNA遺伝子配列番号4、Genbankアクセッション番号NR_003287の塩基配列を使用し、特開2007-37465号公報に記載された方法にしたがって、18SrRNA及び28SRNA検出用FRETプローブを設計した。具体的には、18SrRNA及び28SRNAのそれぞれの塩基配列について、次の操作を行った。まず、長さnの塩基配列のi番目1≦i≦nの塩基のSS-count値Siを算出した。SS-count値とは、RNAの高次構造予測の指標の一つである。SS-count値は、RNAの各塩基における相補鎖を形成しない場合の数を表し、この数値が高い塩基ほど、高次構造の中で熱的に不安定で1本鎖となっている確率が高い。SS-count値は、Zuckerらによって開発されたRNAの2次構造を予測するプログラムである、mfoldZukerM.Mfoldwebserverfornucleicacidfoldingandhybridizationprediction.NucleicAcidsRes.2003Jul1;3113:3406-15.を使用して算出することができる。Lは一組のFRETプローブがハイブリダイズする標的部位全体の長さである。ここではドナープローブ20塩基、アクセプタープローブ20塩基、ドナー色素-アクセプター色素間の至適間隔4塩基の合計L=44塩基とした。続いて、18S及び28SrRNAの各塩基配列の塩基番号をiとし、1≦i≦n-L1である全てのiについて、i番目の塩基からiL-1番目の塩基までのSS-count値Siの平均値Miを算出した。図1aは、18SrRNAの塩基配列について、横軸に塩基番号、縦軸にMiをプロットしたグラフである。図1bは、28SrRNAの塩基配列について、図1aと同様にして作成したグラフである。図1a及びbにおいて、塩基配列上のMiの値が大きい領域は、1本鎖となっている確率が高いため、FRETプローブがハイブリダイズする標的領域として適していると考えられる。図1a及びb中、FRETプローブの標的領域として選択した領域を太線で示した。図1a及びbに示したFRETプローブの標的領域から、ドナープローブ及びアクセプタープローブの塩基配列を選択した。FRETプローブとしては、Miの値が大きいだけでなく、上述した理由から、次の条件を満たす配列を選択した。1ドナープローブとアクセプタープローブの融解温度Tm値がほぼ一致すること。2蛍光物質標識に隣接してグアニンG塩基が存在しないこと。3ドナープローブ同士、アクセプタープローブ同士、又はドナープローブ及びアクセプタープローブが相補的に結合しにくい配列であること。以上の方法により、18SrRNA用FRETプローブセットとして次の塩基配列を設計した。5’-GAUCCAACUACGAGCUUUU-3’18S_DnrR、配列番号25’-UGCAGCAACUUUAAUAUACG-3’18S_AccR、配列番号3設計した塩基配列に基づき、FRETプローブを合成した。合成は株式会社日本バイオサービスに依頼した。プローブの合成には、2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチド2’OMeを用いた。プローブの合成に用いるアミダイト試薬としては、いずれもGlenresearch社製の2’-OMe-A-CE-Phosphoamidite型番10-3100-90、2’-OMe-C-CE-Phosphoamidite型番10-3110-90、2’-OMe-G-CE-Phosphoamidite型番10-3121-90、2’-OMe-U-CE-Phosphoamidite型番10-3130-90を用いた。また、プローブ18S_DnrRの3’末端を蛍光物質AlexaFluor488インビトロジェン社で修飾した。また、プローブ18S_AccRの5’末端を蛍光物質AlexaFluor647インビトロジェン社で修飾した。より具体的には、プローブの3’末端は、プローブ合成後に蛍光物質と結合させることにより、蛍光物質で修飾した。また、プローブの5’末端は、蛍光物質修飾済みのアミダイド試薬を使用してプローブを合成することによって蛍光物質で修飾した。上記のプローブ18S_DnrRは、配列番号1に示す18SrRNAの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号1の塩基配列の第687~669位にハイブリダイズする。同様に、プローブ18S_AccRは、配列番号1の塩基配列の第664~645位にハイブリダイズする。この結果、第669位に位置するドナー蛍光色素と第664位に位置するアクセプター蛍光色素が4塩基離れて隣接することになり、効率的にFRETを起こすことが可能となる。28SrRNA用FRETプローブセットとして次の塩基配列を設計した。5’-ACUUCGGCCUUCAAAGUU-3’28S_DnrR、配列番号55’-UUUGAAUAUUUGCUACUACC-3’28S_AccR、配列番号6設計した塩基配列に基づき、FRETプローブを合成した。プローブの合成には2’OMeを用いた。また、プローブ28S_DnrRの3’末端を蛍光物質AlexaFluor488ライフテクノロジーズジャパン株式会社で修飾した。また、プローブ28S_AccRの5’末端を蛍光物質AlexaFluor647ライフテクノロジーズジャパン株式会社で修飾した。上記のプローブ28S_DnrRは、配列番号4に示す28SrRNAの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号4の塩基配列の第2398~2381位にハイブリダイズする。同様に、プローブ28S_AccRは、配列番号4の塩基配列の第2376~2357位にハイブリダイズする。この結果、第2381位に位置するドナー蛍光色素と第2376位に位置するアクセプター蛍光色素が4塩基離れて隣接することになり、効率的にFRETを起こすことが可能となる。合成した18S及び28SrRNA用FRETプローブをそれぞれ水に溶解し、100nMの溶液を調製した。実験例1細胞内のrRNAのFRETによる検出慢性骨髄性白血病細胞株K562を実験に用いた。細胞内へのFRETプローブの導入には、ストレプトリジンOSLOにより膜穿孔を行い、血清培地により再封入する方法を用いた例えば、特開2007-37463号公報を参照。具体的には、まず、培養したK562細胞を常法により回収して、血球計数板で細胞密度を測定し、1×106個/mlの細胞密度となるように調整した。次に、濃度調整したK562細胞1mlを遠心チューブに移し、遠心して上澄みを除去した後、等容量のリン酸緩衝液PBSで懸濁して洗浄し、再び遠心して上澄みを捨てた。続いて、100nMのドナープローブ及びアクセプタープローブを4μlずつ添加し、0.1mg/ml濃度のSLOシグマアルドリッチ社の0.01ウシ血清アルブミン溶液を加えて全量を40μlに調整し、ピペッティングにより懸濁した。続いて37°Cで5分間インキュベートした。次に、37°Cに加温した血清入りの培地1mlを加えて37°Cで30分間放置し、SLOを失活させ、細胞膜を再封入した。血清入りの培地としては、具体的には10FBSウシ胎児血清、シグマアルドリッチ社-RPMI1640シグマアルドリッチ社を用いた。続いて、遠心して細胞を回収後、PBSに懸濁してフローサイトメトリーで測定した。フローサイトメーターとしては、FACSAria商品名、日本BDバイオサイエンス社を使用した。図2a及びbに、フローサイトメトリーによる測定結果を示す。図2aはFRETプローブで18SrRNAを検出した結果を示し、bは、28SrRNAを検出した結果を示す。グラフの横軸は、アクセプター蛍光物質の励起波長波長633nmで励起した結果発生したアクセプター蛍光物質の蛍光波長695nmを検出した値以下AAという場合がある。であり、すなわち、各細胞内に存在するアクセプタープローブの量を示す。グラフの縦軸は、ドナー蛍光物質の励起波長波長488nmで励起した結果発生したアクセプター蛍光物質の蛍光波長695nmを検出した値すなわちFRETによる蛍光、以下DAという場合があるを、ドナー蛍光物質の励起波長波長488nmで励起した結果発生したドナー蛍光物質の蛍光波長525nmを検出した値以下DDという場合があるで割った値DA/DDであり、FRETを蛍光強度比で示すことにより蛍光強度変化をより明確に示したものである。図2の結果から明らかなように、18SrRNA及び28SrRNAのいずれを検出した場合においてもFRETが観察され、各rRNAが検出されたことが示された。また、18SrRNAの検出に使用したFRETプローブは、DA/DDの比が大きく、非常に感度が高いことが明らかとなった。実験例2細胞内のrRNAのFRETによる検出プローブの組み合わせを変更し、正しくFRETを検出できているか否かについて検討した。図3a~dは、プローブの組み合わせを変更した点以外は実験例1と同様にして細胞内のrRNAをFRETにより検出した結果を示すグラフである。図3aは18SrRNA検出用ドナープローブ18S_DnrR及びアクセプタープローブ18S_AccRを組み合わせた結果であり、bは28SrRNA検出用ドナープローブ28S_DnrR及びアクセプタープローブ28S_AccRを組み合わせた結果であり、cは18SrRNA検出用ドナープローブ18S_DnrR及び28SrRNA検出用アクセプタープローブ28S_AccRを組み合わせた結果であり、dは28SrRNA検出用ドナープローブ28S_DnrR及び18SrRNA検出用アクセプタープローブ18S_AccRを組み合わせた結果である。図3の結果から明らかなように、正しいプローブの組み合わせの場合にFRETによる蛍光強度比の変化が観察された。このことから、各FRETプローブが標的分子に特異的に結合して蛍光を発していると考えられた。実験例3熱ショックによるrRNAの増加細胞を数時間、40°C程度の高温環境に晒すと、細胞の保護を目的とした一群のタンパク質が合成される。これらのタンパク質は熱ショックタンパク質と呼ばれ、温度変化に対する発現が迅速であり、かつ大量に合成されることが知られている。タンパク質合成が盛んであれば、その合成の場となるリボソームも必要となり、従ってrRNAの合成が盛んになることが推定される。そこで熱ショック42°C、2時間の有無により増加する細胞内のrRNAの定量的な測定を行った。K562細胞を106個/mlの濃度に調整し、137°Cで2時間インキュベーション、237°Cで1時間インキュベーション後に42°Cで1時間インキュベーション、及び342°Cで2時間インキュベーションした後に、実験例1と同様にしてFRETプローブを用いて細胞内のrRNAを検出した。また、細胞の蛍光顕微鏡観察及びRT-PCRも行った。図4に測定結果をまとめた。左側3列は18SrRNAの測定結果を示し、右側3列は28SrRNAの測定結果を示す。最上行は横軸にAAを、縦軸にDA/DDを示したフローサイトメトリー測定の結果である。第2行は、横軸にDA/DDを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。第3行は、培養細胞のDAの蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。最下段は、各熱処理を施した細胞のrRNAをRT-PCRにより増幅後、アガロース電気泳動した結果を示す写真であり、各レーンの数字はPCRのサイクル数を示す。cDNAの調製には、Cells-to-cDNA商品名、Ambion社製を使用した。cDNA溶液は、2倍ずつ段階希釈して6~8系列の希釈溶液を調製して鋳型とし、同時にPCR反応を行った。PCR反応は、94°Cで2分熱変性した後、94°C30秒、53°C30秒及び72°C30秒を26サイクル行い、最後に72°Cで5分の反応条件で行った。PCR産物を電気泳動して増幅断片のバンドを確認し、希釈系列の倍数とサイクル数からrRNA量を見積もった。PCRに使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。18SrRNA増幅用プライマー5’-TCGAGGCCCTGTAATTGGAA-3’18S_Fwd、配列番号75’-TTGCGCCGGTCCAAGAATTT-3’18S_Rev、配列番号828SrRNA増幅用プライマー5’-GCGCATGAATGGATGAACGA-3’28S_Fwd、配列番号95’-AAGCGAGCTTTTGCCCTTCT-3’28S_Rev、配列番号1042°Cで2時間のインキュベーションにより、多くのrRNAが転写されたことが示された。これは、熱ショック関連タンパク質が盛んに合成され、タンパク質合成の場であるリボソームが必要となり、その要請に応じて多くのrRNAが転写された結果であると考えられる。フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡観察及びRT-PCRの結果は、いずれもFRETによる蛍光強度変化とrRNA量の間に相関関係があることを示した。実験例4抗がん剤によるrRNA合成阻害実験癌細胞は細胞増殖が盛んなことから、タンパク質の合成も盛んである。タンパク質合成の場であるリボソームは精密にタンパク質の合成を制御しているため、リボソームの要求をサポートする為にrRNAの転写も盛んである。抗がん剤の一つである5FU5-フルオロウラシルはrDNAからrRNAを転写する酵素であるRNAポリメラーゼIの酵素活性を選択的に阻害することでrRNAの合成を阻害する薬剤として一般的に用いられている例えば、WilkinsonDS,TistyTD.AndHanasRJ.TheInhibitionofRibosomalRNASynthesisandMaturationonNovikoffHepatomaCellsby5-Fluorouridine.CancerRes.,1975Nov;35,3014-3020.を参照。総説であれば、LongleyDB,HarkinDP,JhonstonPG.5-fluorouracil:mechanismsofactionandclinicalstrategies.NatRevCancer.2003May;35:330-8.を参照。。図5は、5FUとFUDRフルオロデオキシウリジンの作用機序を示す図である。5FUは代謝を受けてFUTPフルオロウリジン三リン酸になり、RNAの中に入り込んでRNA合成を阻害する。また、5FUは代謝を受けてFdUMPフルオロデオキシウリジン一リン酸になり、チミジル酸シンターゼTSを阻害してDNA合成を阻害する。したがって、5FUはRNA合成及びDNA合成の双方を阻害する。これに対し、FUDRはDNA合成を阻害するのみで、RNA合成には影響しない。白血病細胞株HL601×106個に各濃度の5FUを添加して、37°Cで2時間インキュベーションした後、実験例1と同様にして、FRETプローブ18S_DnrR及び18S_AccRを用いて細胞内の18SrRNAを検出した。図6は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。最左列から順に、0、0.0625、0.125、0.25及び1mMの5FUを添加した結果を示す。また、最上行は横軸にAAを、縦軸にDA/DDを示した測定の結果である。第2行は、横軸にDA/DDを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。また、グラフ中の数値は全細胞のDA/DDの値の平均値である。第3行は、横軸にDDを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。図6から明らかなように、5FUの添加量が増加するにしたがってDA/DDの値が低下していくことが確認された。すなわち、5FUの添加量が増加するにしたがって18SrRNAの合成が抑制された。この結果は、第2行及び第3行のヒストグラムからも明らかである。第2行のヒストグラムでは、5FUの濃度が上昇するにしたがってヒストグラムの肩右上部分が消失し、DA/DDの値の平均値も低下した。また、第3行のヒストグラムでは、5FUを添加しない場合には蛍光強度の異なる細胞集団が2つ存在ピークが2つしていたものが、5FUの添加により蛍光強度の低い細胞集団が消失して、蛍光強度の高い細胞集団に移行する過程が観察された。この現象は蛍光がFRETに由来するものであるかを蛍光顕微鏡で確認するために行われるアクセプターブリーチング操作に類似していると考えられる。つまり、rRNAが十分に存在する状況では、FRETに関与するドナープローブの蛍光強度は低いが、5FUによってRNAの合成が阻害された細胞では、rRNAの量が減少するためにFRETが解消される。その結果、細胞内に導入されたドナープローブのうち、FRETが成立しないドナープローブの割合が増加し、細胞から発せられる蛍光の強度はドナープローブのみを導入した場合の蛍光強度に近づく。蛍光顕微鏡観察では、FRETを起こしているプローブにおいて、アクセプタープローブが存在しない場合のドナープローブの蛍光強度を測定するには、アクセプター蛍光物質を退色させて、ドナー蛍光物質の蛍光を測定するがアクセプターブリーチング操作、フローサイトメトリーでそのようなことはできないので、実際はFRETを起こしている細胞の有無を総和として観察していると考えられる。このように、HL60細胞を用いた細胞内FRETによるrRNAの蛍光検出では、5FUの添加によりRNA合成が阻害された結実、RNA量が低下し、rRNAに由来するFRETの蛍光が低下した。実験例5抗がん剤によるrRNA合成阻害実験5FUの代わりにFUDRを用いた点以外は実験例4と同様の実験を行った。上述したように、FUDRはDNA合成を阻害するのみで、RNA合成には影響しない。HL60細胞1×106個に各濃度のFUDRを添加して、37°Cで2時間インキュベーションした後、実験例1と同様にして、FRETプローブ18S_DnrR及び18S_AccRを用いて細胞内の18SrRNAを検出した。図7は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。最左列から順に、0、0.0625、0.125、0.25及び1mMのFUDRを添加した結果を示す。グラフは、横軸にAAを、縦軸にDA/DDを示した測定の結果である。図7の結果から明らかなように、HL60細胞にFUDRを添加しても、18SrRNAの量は変化しなかった。これは、FUDRがDNA合成を阻害するのみで、RNA合成には影響しないことによると考えられた。実験例6抗がん剤によるrRNA合成阻害実験抗がん剤によって実際にRNAの合成が阻害されることを、別の染色法により確認した。染色には、SYTO-RNASelect商品名、インビトロジェン社を使用した。具体的には、まず、HL60細胞2×106個に、各濃度の5FU又はFUDRを添加し、血清を除いた培地中で37°Cで2時間インキュベーションした。続いて、培地に対して1/10000量のSYTO-RNASelectを添加して30分インキュベートした。続いて、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりSYTO-RNASelectに由来する蛍光を測定した。図8a及びbは、実験結果を示すグラフである。図8aは5FUを添加した結果であり、bはFUDRを添加した結果である。横軸は添加した5FU又はFUDRの濃度を示し、縦軸はSYTO-RNASelectに由来する蛍光の蛍光強度の平均値を示す。RNA合成を阻害する5FUの添加量が増加するにしたがって、RNAの蛍光強度が低下することが示された。ここで、SYTO-RNASelectは、rRNAを特異的に染色することはできないが、一般的な細胞に含まれる全RNAの9割をrRNAが占めることから、SYTO-RNASelectの蛍光は、rRNAの量を反映していると考えられる。一方、RNA合成を阻害しないFUDRを添加しても、RNAの蛍光強度には有意な変化は観察されなかった。この結果は、実験例4の結果が正しいことを支持するものであると考えられる。実験例718SrRNA検出用FRETプローブの検討上記の検討により、18S_DnrR及び18S_AccRからなる18SrRNA検出用FRETプローブは、18SrRNAの検出感度が非常に高いことが示された。そこで、上記プローブと標的部位を変更した18SrRNA検出用FRETプローブを設計、合成し、反応性を検討した。図9は、横軸に18SrRNAの塩基番号、縦軸にSS-count値Siの平均値をプロットしたグラフである。グラフ中bと表示した領域は、18S_DnrR及び18S_AccRからなる18SrRNA検出用FRETプローブの標的領域を示す。ここでは、bの領域に隣接する、a及びcの領域を標的領域とする18SrRNA検出用FRETプローブを設計、合成した。図9のaの領域を標的領域とする18SrRNA検出用FRETプローブの塩基配列は次の通りであった。5’-AUUACCGCGGCUGCUGGCA-3’18S_refA_DnrR、配列番号115’-ACUUGCCCUCCAAUGGAUCC-3’18S_refA_AccR、配列番号12プローブの合成には、2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチド2’OMeを用いた。プローブ18S_refA_DnrRの3’末端を蛍光物質AlexaFluor488インビトロジェン社で修飾した。また、プローブ18S_refA_AccRの5’末端を蛍光物質AlexaFluor647インビトロジェン社で修飾した。図9のcの領域を標的領域とする18SrRNA検出用FRETプローブの塩基配列は次の通りであった。5’-AUCGAGGGGGCGCCGAGA-3’18S_refB_DnrR、配列番号135’-AGGGGCGGGGACGGGCG-3’18S_refB_AccR、配列番号14プローブの合成には、2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチド2’OMeを用いた。プローブ18S_refB_DnrRの3’末端を蛍光物質AlexaFluor488インビトロジェン社で修飾した。また、プローブ18S_refB_AccRの5’末端を蛍光物質AlexaFluor647インビトロジェン社で修飾した。上記のプローブ18S_refA_DnrRは、配列番号1に示す18SrRNAの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号1の塩基配列の第770~752位にハイブリダイズする。同様に、プローブ18S_refA_AccRは、配列番号1の塩基配列の第747~728位にハイブリダイズする。この結果、第752位に位置するドナー蛍光色素と第747位に位置するアクセプター蛍光色素が4塩基離れて隣接することになり、効率的にFRETを起こすことが可能となる。同様に、上記のプローブ18S_refB_DnrRは、配列番号1の塩基配列の第904~887位にハイブリダイズする。また、プローブ18S_refB_AccRは、配列番号1の塩基配列の第882~866位にハイブリダイズする。この結果、第887位に位置するドナー蛍光色素と第882位に位置するアクセプター蛍光色素が4塩基離れて隣接することになり、効率的にFRETを起こすことが可能となる。図10a~cは、HL60細胞を用いて、実験例1と同様にして細胞内の18SrRNAをFRETにより検出した結果を示すグラフである。図10aは、プローブとして18S_refA_DnrR及び18S_refA_AccRを使用した結果であり、bは、プローブとして18S_DnrR及び18S_AccRを使用した結果であり、cは、プローブとして18S_refB_DnrR及び18S_refB_AccRを使用した結果である。図10の結果から明らかなように、18S_DnrR及び18S_AccRからなる18SrRNA検出用FRETプローブは、他のプローブと比較して、格段に18SrRNAの検出感度が高いことが示された。"