aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体を含む、薬学的組成物。前記ペプチドが10~50個のアミノ酸を含む、請求項1記載の薬学的組成物。aの抗体がモノクローナル抗体である、請求項1または2のいずれか記載の薬学的組成物。aの抗体がSEQIDNO37の重鎖可変ドメインおよびSEQIDNO36の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1~3のいずれか一項記載の薬学的組成物。aの抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1~3のいずれか一項記載の薬学的組成物。aの抗体がSEQIDNO39の重鎖可変ドメインおよびSEQIDNO38の軽鎖可変ドメインを含む、請求項5記載の薬学的組成物。前記ペプチドが、以下からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項記載の薬学的組成物。aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体であって、産生後に回収された、複合体。前記ペプチドが10~50個のアミノ酸を含む、請求項8記載の複合体。aの抗体がモノクローナル抗体である、請求項8~9のいずれか記載の複合体。aの抗体がSEQIDNO1の重鎖可変ドメインおよびSEQIDNO2の軽鎖可変ドメインを含む、請求項8~10のいずれか一項記載の複合体。aの抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項8~10のいずれか一項記載の複合体。aの抗体がSEQIDNO3の重鎖可変ドメインおよびSEQIDNO4の軽鎖可変ドメインを含む、請求項12記載の複合体。前記ペプチドが、以下からなる群より選択されることを特徴とする、請求項8~13のいずれか一項記載の複合体。代謝疾患の治療のための、請求項1~7のいずれか一項記載の薬学的組成物。癌の治療のための、請求項1~7のいずれか一項記載の薬学的組成物。炎症性疾患の治療のための、請求項1~7のいずれか一項記載の薬学的組成物。発明の詳細な説明本発明の1つの局面は、以下aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体を含む、薬学的組成物である。本発明の別の局面は、以下aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体である。1つの態様において、ペプチドは10~50個のアミノ酸を含む。12個以上のアミノ酸を有するペプチドには典型的に二次構造がある。従って、1つの態様において、ペプチドは12~40個のアミノ酸を含む。1つの態様において、ペプチドは12~30個のアミノ酸を含む。ジゴキシゲニンまたはジゴキシゲニンまたはDIGという用語は本明細書において同義に用いられ、331214トリヒドロキシ1013ジメチル1234567891112151617テトラデカヒドロシクロペンタaフェナントレン17イル2Hフラン5オンを指す。ジゴキシゲニンは、植物ジギタリス、ジギタリスオリエンタリス、およびジギタリスラナタの花および葉にしか見出されないステロイドであるp847。抗ジゴキシゲニン抗体およびジゴキシゲニンに結合する抗体という用語は、aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体、およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体が形成されるように十分な親和性を有し、ペプチドの半減期を延ばす治療剤として有用な、ジゴキシゲニンに結合することができる抗体を指す。治療用ペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンという用語は、ペプチドと共有結合しているジゴキシゲニンを指す。典型的に、ジゴキシゲニンは、その3ヒドロキシ基を介したペプチドとの結合体である。活性化ジゴキシゲニン3カルボキシメチル誘導体は、このような結合体化ジゴキシゲニンペプチドの出発物質としてよく用いられる。1つの態様において、ジゴキシゲニンは、リンカーを介してペプチドと結合体化される。前記リンカーは、aメチレンカルボキシメチル基、b1~10個のアミノ酸、およびまたはc構造式NH2nOxCH2CH2COOHを有する1つもしくは複数の化合物を含んでもよい。式中、nは2または3であり、xは1~10、好ましくは、1~7である式NHnOxCH2CH2Cのリンカーが生じるこのような化合物の一例は、例えば、12アミノ4710トリオキサドデカン酸であるリンカーまたはTEGスペーサーが生じる。実施例5を参照されたい。1つの態様において、リンカーはマレイミド基をさらに含む。このようなリンカーを介してペプチドに結合体化したジゴキシゲニンの例は下記の実施例5に記載される。リンカーは、好ましくは、電荷を含有する、またはおよび水素結合を形成することができるので、安定化作用および可溶化作用を有する。さらに、リンカーは、抗ジゴキシゲニン抗体とジゴキシゲニン結合体化ペプチドとの結合を立体的に容易にすることができる。1つの態様において、リンカーは、ペプチドのアミノ酸の側鎖に配置される側鎖と結合体化されている。1つの態様において、リンカーは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。ペプチド上にあるリンカーの位置は、典型的には、ペプチドの生物学的活性が影響を受けない領域において選択される。従って、リンカーの結合位置は、ペプチドがどういったものか、および生物学的活性を担う関連構造要素によって決まる。ジゴキシゲニンが取り付けられたペプチドの生物学的活性はインビトロアッセイにおいて試験することができる。本明細書で使用するペプチドという用語はアミノ酸重合体を指す。本明細書で使用する、これらの用語は、対応する天然アミノ酸の人工化学類似体である1つまたは複数のアミノ酸残基を含むアミノ酸重合体に適用される。これらの用語はまた天然アミノ酸重合体にも適用される。アミノ酸はL型でもよく、D型でもよい。ペプチドは、ペプチド内の2つの非隣接アミノ酸間に分子内結合、例えば、バックボーンとバックボーン、側鎖とバックボーン、および側鎖と側鎖との環化を有する環式でもよい。環式ペプチドは、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、米国特許第6013625号を参照されたい。典型的な生物学的に活性なペプチドは、例えば、BellmannSickertKetalTrendsPharmSci31434441に記載されている。全てのペプチド配列は、αN末端アミノ酸残基が左側にあり、αC末端アミノ酸残基が右側にある一般に認められている規則に従って書かれる。本明細書で使用するN末端という用語はペプチド中のアミノ酸の遊離αアミノ基を指し、C末端という用語はペプチド中のアミノ酸の遊離aカルボン酸末端を指す。N末端に基があるペプチドは、N末端アミノ酸残基のαアミノ窒素に基があるペプチドを指す。N末端に基があるアミノ酸は、αアミノ窒素に基があるアミノ酸を指す。D接頭語、例えば、DAlaもしくはNMeDIleで特に明記してあるものを除いて、または小文字、例えば、a、i、lで書かれているものを除いて、本明細書および添付の特許請求の範囲中に記載のペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のα炭素の立体化学は、天然配置、すなわちL配置である。ペプチドのN末端にある、ある特定のアシル置換基中のキラル中心の立体化学を特定するために、カーンインゴルドプレローグRおよびS名称が用いられる。RSという名称は、2種類のエナンチオマー型のラセミ混合物を示すことが意図される。この命名法は、CahnRSetalAngewChemIntEdEngl5385415に記載の命名法に従う。一般的に、本明細書で使用するアミノ酸という用語は、天然、非天然のアミノ酸およびこれらの誘導体を指す。このようなアミノ酸の例には、Aad、Abu、Ach、Acp、Acpc、Aib、Aic、11Aic、、Ala、アリルグリシン、アロイソロイシン、Arg、Asn、Asu、Asp、Bip、BnHP4ヒドロキシプロリン、Cha、Cit、シクロヘキシルグリシン、シクロペンチルアラニン、βシクロプロピルアラニン、Cys、Dab、Dap、p、33ジフェニルアラニン、ジnプロピルグリシン、2フリルアラニン、Gln、Glu、Gly、His、ホモシクロヘキシルアラニン、ホモシトルリン、ホモシクロロイシン、ホモロイシン、ホモアルギニン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、Ile、Leu、Lys、Lys、Nal、Nal、Met、4MeOApcシクロヘキサン1カルボン酸、ノルロイシン、Nva、オマチン、4Pal、Phe、345F3Phe、23456F5Phe、Pqa3キナゾリン酢酸、Pro、ピリジルアラニン、キノリルアラニン、Ser、サルコシン、トリアゾリルアラニン、チエニルアラニン、Thr、Tic、Tic、Tle、Trp、Tyr、Tyr、Valが含まれるが、これに限定されない。本発明の1つの態様において、アミノ酸は前記のリストからなる群より選択される。本発明の説明において便利なように、天然アミノ酸の略語を以下に列挙する:AspDアスパラギン酸AlaAアラニンArgRアルギニンAsnNアスパラギンGlyGグリシンGluEグルタミン酸GlnQグルタミンHisHヒスチジンIleIイソロイシンLeuLロイシンLysKリジンMetMメチオニンPheFフェニルアラニンProPプロリンSerSセリンThrTスレオニンTrpWトリプトファンTyrYチロシンCysCシステインおよびValVバリン。典型的なアミノ酸誘導体化の一部の非限定的な略語リストを以下に示す:AcアセチルBoc9フルオレニルメトキシカルボニルDdeFmoc9フルオレニルメトキシカルボニルMtr4メトキシ236トリメチルベンゼンスルホニルPbf22467ペンタメチルジヒドロベンゾフラン5スルホニルTrtトリチル、tButertブチルTEG4710トリオキサドデカン酸リンカー。1つの態様において、ペプチドは、例えば、WO2007065808に記載の神経ペプチド2受容体アゴニストである。1つの態様において、ペプチドは、からなる群より選択される。1つの態様において、ペプチドは、である。1つの態様において、ペプチドは、である。1つの態様において、ペプチドは、以下からなる群より選択される。1つの態様において、ペプチドは、以下からなる群より選択されるペプチドと実質的に相同である。1つの態様において、ペプチドは、以下からなる群より選択される。実質的に相同とは、アミノ酸残基の少なくとも約85から入手可能なBLASTプログラムを用いて配列を比較することによって特定することができる。1つの態様において、ペプチドはインビトロアッセイにおいて生物学的活性を示す点で特徴付けられる。1つの態様において、生物学的活性は抗増殖性、抗炎症性、抗癌性、抗ウイルス性であるか、代謝疾患に関連する。1つの態様において、複合体は、非天然アミノ酸を含有する点で特徴付けられる。1つの態様において、複合体は、ペプチドを生物において産生できない点で特徴付けられる。本明細書において抗体という用語は、単一特異性抗体の場合、最も広い意味で用いられ、望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含むが、これに限定されない様々な抗体構造を含む。抗体断片は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab、FabSH、F2ダイアボディ直鎖抗体単鎖抗体分子が含まれる。本明細書で使用するジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体という用語は、ジゴキシゲニンまたはその誘導体、例えば、ジゴキシン、ジギトキシンにのみ特異的に結合し、さらなる抗原、例えば、タンパク質抗原、例えば、HER2またはIGF1Rに特異的に結合しない抗体を指す。本明細書で使用するジゴキシゲニンに結合する二重特異性抗体という用語は、ジゴキシゲニンまたはその誘導体、例えば、ジゴキシン、ジギトキシンに特異的に結合し、さらなる抗原、例えば、タンパク質抗原、例えば、HER2またはIGF1Rにも特異的に結合する抗体を指す。本明細書における目的では、アクセプターヒトフレームワークは、下記で定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメインフレームワークまたは重鎖可変ドメインフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、アミノ酸配列変化を含んでもよい。ある態様において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。ある態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。キメラ抗体という用語は、重鎖およびまたは軽鎖の一部が、ある特定の供給源または種に由来するが、重鎖およびまたは軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。抗体のクラスは、抗体重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5種類の主要なクラスIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられることがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。本明細書で使用する、aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体という用語は、抗体抗原相互作用に基づいて、抗体およびジゴキシゲニンによって形成された非共有結合複合体を指す。薬剤、例えば、薬学的製剤の有効量は、望ましい治療効果または予防結果を実現するために、必要な投与および期間において有効な量を指す。本明細書においてFc領域という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にわたる。しかしながら、Fc領域のC末端リジンは存在してもよく、存在しなくてもよい。本明細書において他で特定しない限り、Fc領域または定常領域にあるアミノ酸残基の番号は、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest5thedPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMDに記載のようにEUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。フレームワークまたはFRは、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメインFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、HVR配列およびFR配列は、一般的に、VHにおいて以下の配列FR1H1FR2H2FR3H3FR4に現れる。完全長抗体、インタクトな抗体、および全抗体という用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書において規定されたFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために本明細書において同義に用いられる。宿主細胞、宿主細胞株、および宿主細胞培養物という用語は同義に用いられ、外因性核酸が導入されている細胞を、このような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞は形質転換体および形質転換細胞を含み、形質転換体および形質転換細胞は継代数を考慮することなく、初代形質転換細胞および初代形質転換細胞に由来する子孫を含む。子孫は核酸内容の点で親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義から、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。ヒトコンセンサスフレームワークは、ヒト免疫グロブリンVLフレームワーク配列またはVHフレームワーク配列の選ばれたものにおいて最もよく現れるアミノ酸残基であるフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンVL配列またはVH配列の選ばれたものは可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に、配列のサブグループは、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterestfifthedNIHPublication913242BethesdaMDVols13に記載のようなサブグループである。1つの態様において、VLの場合、サブグループは、Kabatetal前記に記載のようなサブグループκIである。1つの態様において、VHの場合、サブグループは、Kabatetal前記に記載のようなサブグループIIIである。ヒト化抗体は、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基およびヒトFRに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインのうち実質的に全てを含み、ここで、HVRの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のHVRに対応し、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のFRに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。ヒト化型の抗体、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化されている抗体を指す。本明細書で使用する超可変領域またはHVRという用語は、配列が高頻度で変化する、およびまたは構造が規定されたループを形成する抗体可変ドメイン領域の1つ1つを指す。一般的に、天然4鎖抗体は6つのHVRを含む。3つがVHにあり、3つがVLにある。HVRは、一般的に、超可変ループおよびまたは相補性決定領域に由来するアミノ酸残基を含む。後者は配列変化が最も大きい、およびまたは抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26~32、50~52、91~96、26~32、53~55、および96~101901917にある。例示的なCDRは、アミノ酸残基L1の24~34、L2の50~56、L3の89~97、H1の31~35B、H2の50~65、およびH3の95~102にある。VHにあるCDR1を除いて、CDRは、一般的に、超可変ループに由来するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原に接触する残基である特異性決定残基すなわちSDRも含む。SDRは、短縮型CDR、すなわちaCDRと呼ばれるCDR領域の中に含まれる。例示的なaCDRは、アミノ酸残基L1の31~34、L2の50~55、L3の89~96、H1の31~35B、H2の50~58、およびH3の95~102にある16191633を参照されたい。特に定めのない限り、HVR残基および可変ドメインにある他の残基の番号は、本明細書においてKabatetal前記に従って付けられる。本明細書で使用するモノクローナル抗体という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は同一であり、およびまたは可能のある変種抗体、例えば、天然変異を含有する変種抗体またはモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる変種抗体を除いて同じエピトープに結合する。このような変種は一般的に微量に存在する。典型的に、異なる決定基に対して作られた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は抗原にある1つの決定基に対して作られている。従って、モノクローナルという修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られたという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈すべきでない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用した方法を含むが、これに限定されない様々な技法によって作ることができる。このような方法およびモノクローナル抗体を作るための他の例示的な方法は本明細書に記載されている。参照ポリペプチド配列に関するパーセントアミノ酸配列同一性は、配列をアライメントし、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮に入れずに最大パーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中アミノ酸残基のパーセントと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的としたアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内である様々なやり方で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST2、ALIGN、またはMegalignソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大アラインメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列アラインメントに適したパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、配列比較コンピュータプログラムALIGN2を用いて、アミノ酸配列同一性値が作成される。ALIGN2配列比較コンピュータプログラムはGenentechIncによって書かれ、ソースコードはユーザー文書と共に米国著作権庁WashingtonDC20559に提出されており、米国著作権番号TXU510087で登録されている。ALIGN2プログラムは、GenentechIncSouthSanFranciscoCaliforniaから公的に利用可能であるか、ソースコードからコンパイルされてもよい。ALIGN2プログラムは、デジタルUNIXV40Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはALIGN2プログラムによって設定され、変更はない。アミノ酸配列比較のためにALIGN2が用いられる場合、ある特定のアミノ酸配列Bに対する、ある特定のアミノ酸配列Bとの、またはある特定のアミノ酸配列Bと比較した、ある特定のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性は、以下100X分数XYのように計算することができる。式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN2によって、そのプログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一マッチとスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAのアミノ酸配列同一性はAに対するBのアミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるだろう。特に定めのない限り、本明細書において用いられる全てのアミノ酸配列同一性の値は、ALIGN2コンピュータプログラムを使用した直前の段落に記載のように得られる。薬学的製剤という用語は、調製物であって、調製物の中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形をとり、製剤が投与される対象に対して容認できないほど毒性のある追加成分を含有しない調製物を指す。薬学的に許容される担体は、活性成分以外の、対象に無毒な、薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する、治療または治療するは、治療されている個体の自然過程を変えることを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の間に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的な病理学的結果または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の寛解または軽減、および軽快または予後の改善が含まれるが、これに限定されない。ある態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延するために、または疾患の進行を遅くするために用いられる。可変領域または可変ドメインという用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは一般的に類似した構造を有し、それぞれのドメインは、4つの保存フレームワーク領域および3つの超可変領域を含むを参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、1つのVHドメインまたはVLドメインだけで十分な場合がある。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを用いて、それぞれ、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして、抗原に結合する抗体を単離することができる880887ClacksonTetalNature352624628を参照されたい。本明細書で使用するベクターという用語は、連結している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターならびにベクターが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、機能的に連結された核酸を発現させることができる。このようなベクターは本明細書において発現ベクターと呼ばれる。組成物および方法1つの局面において、本発明は、一部、aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体ならびにその薬学的組成物に基づく。ある特定の態様において、ジゴキシゲニンに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、癌、代謝疾患、または炎症疾患、またはウイルス性疾患の診断または治療に有用である。単一特異性抗ジゴキシゲニン抗体および5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化したジゴキシゲニンの例示的な複合体1つの局面において、本発明は、一部、aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体に基づく。抗体親和性本明細書で使用する結合またはに結合するもしくは特異的に結合する抗体という用語は同義に用いられ、インビトロアッセイ、好ましくは、精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイにおける抗体と腫瘍抗原エピトープとの結合を指す。結合親和性は、ka、kD、およびKDという用語によって定義される。結合する、または特異的に結合するとは、108M以下、好ましくは、108M~1013Mの結合親和性を意味する。従って、本発明によるジゴキシゲニンに結合する抗体は、108moll以下、好ましくは、108M~1013Mの結合親和性でジゴキシゲニンに特異的に結合する。抗ジゴキシゲニン抗体強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体は、例えば、HunterMMetalJImmunol12911651172に記載のように作製することができる。このような抗体の一例は、高親和性で強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに結合するモノクローナル抗体2610である2173921747BurksEAetalPNAS94412417。免疫化用の免疫原を調製するために、例えば、ジゴキシンまたはジゴキシゲニンをヒト血清アルブミンと結合体化してもよい。また、KLHと結合体化されたジゴキシゲニンまたはジゴキシン3CMOオキシムがよく用いられる。また、ジゴキシゲニンそれ自体も使用することができる。ジゴキシゲニン免疫原を調製する他の方法は、例えば、US4469797に記載されている。結果として生じた抗体は、多くの場合、強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに結合する。ジゴキシゲニンに結合する典型的な抗体には、モノクローナル抗体2610、モノクローナル抗体21H8モノクローナル抗体1A21、モノクローナル抗体が含まれる。キメラ抗体およびヒト化抗体ある特定の態様において、本明細書において提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号およびMorrisonSLetalProcNatlAcadSciUSA8168516855に記載されている。1つの態様において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域、およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変えられているクラススイッチ抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。ある特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を弱めるためにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR、が非ヒト抗体に由来し、FRがヒト抗体配列に由来する1つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。ある態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体に由来する対応する残基で置換される。ヒト化抗体およびヒト化抗体を作る方法は、例えば、AlmagroJCandFranssonJFrontBiosci1316191633において概説され、例えば、RiechmannLetalNature332332327QueenCetalProcNatlAcadSciUSA861002910033米国特許第5821337号、同第7527791号、同第6982321号、および同第7087409号KashmiriSVetalMethods362534グラフティングについて説明しているPadlanEAMolImmunol28489498について説明しているDallAcquaWFetalMethods364360ならびにOsbournetalMethods366168およびKlimkaAetalBrJCancer83252260について説明しているにおいてさらに説明される。ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域には、ベストフィット法を用いて選択されたフレームワーク領域22962308を参照されたい軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域42854289およびPrestaLGetalJImmunol15126232632を参照されたいヒト成熟フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域16191633を参照されたいならびにスクリーニングFRライブラリーに由来するフレームワーク領域1067810684およびRosokMJetalJBiolChem2712261122618を参照されたいが含まれるが、これに限定されない。ヒト抗体ある特定の態様において、本明細書において提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、vanDijkMAandvandeWinkelJGCurrOpinChemBiol5368374およびLonbergNCurrOpinImmunol20450459において概説されている。ヒト抗体は、抗原曝露に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わった、または染色体外に存在する、もしくは動物の染色体に無作為に組み込まれたヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、一般的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座は不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、LonbergNNatBiotech2311171125を参照されたい。例えば、XENOMOUSE技術について説明している米国特許第6075181号および同第6150584号HUMAB技術について説明している米国特許第5770429号KMMOUSE技術について説明している米国特許第7041870号ならびにVELOCIMOUSE技術について説明している米国特許出願公開第20070061900号も参照されたい。例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、このような動物によって作製されたインタクトな抗体に由来するヒト可変領域をさらに改変することができる。ヒト抗体はまた、ハイブリドーマをベースとした方法によって作ることもできる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマおよびマウスヒトヘテロミエローマ細胞株が説明されている30013005BrodeuretalMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplicationsMarcelDekkerIncNewYorkpp5163およびBoernerPetalJImmunol1478695を参照されたい。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して作製されたヒト抗体もLiJetalProcNatlAcadSciUSA10335573562に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第7189826号およびNiJXiandaiMianyixue26265268に記載の方法が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術もまたVollmersHPandBrandleinSHistologyandHistopathology20927937、およびVollmersHPandBrandleinSMethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology27185191に記載されている。ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変ドメイン配列を単離することによって作製することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列は望ましいヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法を下記で説明する。ライブラリー由来抗体本発明の抗体は、望ましい活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、このようなライブラリーを、望ましい結合特性を有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が当技術分野において公知である。このような方法は、例えば、HoogenboomHRetalMethodsinMolecularBiology178137において概説され、例えば、McCaffertyJetalNature348552554ClacksonTetalNature352624628MarksJDetalJMolBiol222581597MarksJDandBradburyAMethodsinMolecularBiology248161176SidhuSSetalJMolBiol338299310LeeCVetalJMolBiol34010731093FellouseFAProcNatlAcadSciUSA1011246712472およびLeeCVetalJImmunolMethods284119132においてさらに説明されている。ある特定のファージディスプレイ法において、VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーはポリメラーゼ連鎖反応によって別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組換えられる。次いで、WinterGetalAnnRevImmunol12433455に記載のように、これらを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Fv断片またはFab断片として抗体断片をディスプレイする。ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫された供給源に由来するライブラリーから、免疫原に対する高親和性抗体が得られる。または、GriffithsADetalEMBOJ12725734に記載のように、免疫化することなく広範囲の非自己抗原に対する抗体、同様に自己抗原に対する抗体の単一の供給源を得るために、ナイーブレパートリーをクローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーはまた、HoogenboomHRandWinterGJMolBiol227381388に記載のように、再編成されていないV遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有するPCRプライマーを用いて高度可変CDR3領域をコードし、インビトロで再編成を行うことによって合成により作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて説明している特許公報には、例えば米国特許第5750373号、ならびに米国特許出願公開第20050079574号、同第20050119455号、同第20050266000号、同第20070117126号、同第20070160598号、同第20070237764、同第20070292936号、および同第20090002360号が含まれる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。抗体変種ある特定の態様において、本明細書において提供された抗体のアミノ酸配列変種が意図される。例えば、抗体の結合親和性およびまたは他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、およびまたは抗体のアミノ酸配列への挿入、およびまたは抗体のアミノ酸配列中の残基の置換が含まれる。最終構築物が望ましい特徴、例えば、抗原結合を有するのであれば、最終構築物に到達するために、欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせることができる。置換変種、挿入変種、および欠失変種ある特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が提供される。置換変異誘発用の関心対象の部位にはHVRおよびFRが含まれる。保存的置換を保存的置換という見出しを付けた以下の表に示した。さらに多くの実質的な変化を例示的な置換という見出しを付けた表1に示した。さらに、アミノ酸側鎖クラスに関して下記に記載した。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を、望ましい活性、例えば、抗原結合の保持改善、免疫原性の低下、またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングすることができる。表アミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる。疎水性ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile中性親水性Cys、Ser、Thr、Asn、Gln酸性Asp、Glu塩基性His、Lys、Arg鎖の方向に影響を及ぼす残基Gly、Pro芳香族Trp、Tyr、Phe非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。あるタイプの置換変種は、親抗体の1つまたは複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる研究のために選択される、結果として生じた変種は、親抗体に対して、ある特定の生物学的特性の改変を有する、およびまたは親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換変種は親和性成熟抗体である。親和性成熟抗体は、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟法、例えば、本明細書に記載のファージディスプレイに基づく親和性成熟法を用いて都合よく作製することができる。簡単に述べると、1つまたは複数のHVR残基が変異され、変種抗体はファージ上にディスプレイされ、ある特定の生物学的活性について選択される。抗体親和性を改善するために、変化がHVRにおいてなされてもよい。このような変化は、HVRホットスポット、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異するコドンによってコードされる残基においてなされてもよく179196を参照されたい、およびまたはSDRにおいてなされてもよい。結果として生じた変種VHまたは変種VLは結合親和性について試験される。二次ライブラリーからの構築および再選択による親和性成熟は、例えば、HoogenboomHRetalMethodsinMolecularBiology178137において記載されている。親和性成熟のある態様において、任意の様々な方法によって成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作り出される。次いで、望ましい親和性を有する任意の抗体変種を特定するために、ライブラリーは選択される。多様性を導入する別の方法は、HVR特異的なアプローチを伴う。このアプローチでは、いくつかのHVR残基がランダム化される。抗原結合に関与するHVR残基を、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて特異的に特定することができる。特に、CDRH3およびCDRL3が標的化されることが多い。ある特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、このような変化によって抗体が抗原に結合する能力が実質的に低下しない限り、1つまたは複数のHVRの中にあってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下しない保存的変化がHVRにおいてなされてもよい。このような変化はHVRホットスポットまたはSDRの外側にあってもよい。前記で提供される変種VH配列およびVL配列のある特定の態様において、それぞれのHVRは変化しないか、または1個以下、2個以下、もしくは3個以下のアミノ酸置換を含有する。変異誘発のために標的化することができる、抗体の残基または領域を特定するための有用な方法は、CunninghamBCandWellsJAScience24410811085に記載のようにアラニンスキャニング変異誘発と呼ばれる。この方法において、残基または標的残基グループが特定され、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうか確かめるために、中性アミノ酸または負電荷アミノ酸によって置換される。最初の置換に対して機能感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入されることがある。または、もしくはさらに、抗体と抗原との接触点を特定するために、抗原抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接する残基は置換候補として標的化または除去されることがある。変種は、望ましい特性を含有するかどうか確かめるためにスクリーニングされることがある。アミノ酸配列挿入には、長さが1残基から100個以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶアミノ末端融合およびまたはカルボキシル末端融合、ならびに1個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変種には、抗体のN末端もしくはC末端と酵素との融合または抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドとの融合が含まれる。組換え方法および組成物抗体は、例えば、米国特許第4816567号に記載のように、組換え方法および組成物を用いて産生することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗ジゴキシゲニン抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列およびまたはVHを含むアミノ酸配列をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクターが提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような1つの態様において、宿主細胞は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターで形質転換されている。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはリンパ系細胞である。1つの態様において、抗ジゴキシゲニン抗体を作る方法であって、抗体の発現に適した条件下で、前記で提供されたような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程、および任意で、宿主細胞から抗体を回収する工程を含む、方法が提供される。抗ジゴキシゲニンを組換え産生するために、抗体をコードする核酸、例えば、前記の核酸が単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよびまたは発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。このような核酸は、従来手順を用いて容易に単離および配列決定することができる。抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない時には、抗体を細菌において産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5648237号、同第5789199号、および同第5840523号を参照されたい245254も参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分にある細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。原核生物に加えて糸状菌または酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターに適したクローニング宿主または発現宿主であり、グリコシル化経路がヒト化されており、その結果、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体が産生される菌類および酵母株を含む14091414およびLiHetalNatBiotech24210215を参照されたい。グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができる、特に、ヨトウガ細胞をトランスフェクトするために使用することができる、非常に多くのバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5959177号、同第6040498号、同第6420548号、同第7125978号、および同第6417429号技術について説明しているを参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株ヒト胚腎臓株5974に記載の293細胞ベビーハムスター腎臓細胞マウスセルトリ細胞243252に記載のTM4細胞サル腎臓細胞アフリカミドリザル腎臓細胞ヒト子宮頸癌細胞イヌ腎臓細胞肝臓細胞ヒト肺細胞ヒト肝臓細胞マウス乳癌例えば、MatherJPetalAnnalsNYAcadSci3834468に記載のTRI細胞MRC5細胞およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFRCHO細胞42164220を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞ならびにミエローマ細胞株、例えば、Y0、NS0、およびSp20が含まれる。抗体産生に適した、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、YazakiPJandWuAMMethodsinMolecularBiology248255268を参照されたい。アッセイ本明細書において提供された抗ジゴキシゲニン抗体は、当技術分野において公知の様々なアッセイによって、その物理的特性化学的特性およびまたは生物学的活性について特定、スクリーニング、または特徴付けることができる。薬学的製剤本明細書に記載のように、aジゴキシゲニンに結合する単一特異性抗体およびb5~60個のアミノ酸からなるペプチドと結合体化しているジゴキシゲニンの複合体の薬学的製剤は、望ましい程度の純度を有するこのような抗体を1種類または複数種の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形で調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される投与量および濃度においてレシピエントに無毒であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質防腐剤低分子量ポリペプチドタンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンアミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジングルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物キレート剤、例えば、EDTA糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール塩形成対イオン、例えば、ナトリウム金属錯体ならびにまたは非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールを含むが、これに限定されない。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ヒト可溶性PH20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、rHuPH20BaxterInternationalIncが含まれる。rHuPH20を含む、ある特定の例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開第20050260186号および同第20060104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPは1種類または複数種のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。例示的な凍結乾燥抗体製剤は米国特許第6267958号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第6171586号およびWO2006044908に記載の製剤が含まれる。後者の製剤にはヒスチジン酢酸緩衝液が含まれる。本明細書の製剤はまた、必要に応じて、治療されている特定の適応症に合わせて複数種の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補活性を有する活性成分を含有してもよい。このような活性成分は、所期の目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。活性成分は、例えば、コアセルベーション法によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルの中に、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ゼラチンマイクロカプセルおよびポリマイクロカプセルの中に、コロイド薬物送達系の中に、またはマクロエマルジョンの中に封入されてもよい。このような技法は、RemingtonsPharmaceuticalSciences16theditionOsolAに開示される。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。このマトリックスは、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。インビボ投与に用いられる製剤は一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜での濾過によって容易に達成することができる。本発明の1つの局面は、代謝疾患を治療するための本発明による薬学的組成物である。別の局面は、癌を治療するための本発明による薬学的組成物である。別の局面は、炎症性疾患を治療するための本発明による薬学的組成物である。本発明のさらなる局面は、代謝疾患を治療するための本発明による複合体である。別の局面は、癌を治療するための本発明による複合体である。別の局面は、炎症性疾患を治療するための本発明による複合体である。本発明の1つのさらなる局面は、代謝疾患を治療するための医用薬剤を製造するための本発明による複合体である。別の局面は、癌を治療するための医用薬剤を製造するための本発明による複合体である。別の局面は、炎症性疾患を治療するための医用薬剤を製造するための本発明による複合体である。本発明の別の局面は、代謝疾患、癌、または炎症性疾患の治療を必要とする患者に有効量の本発明による複合体を投与することによって、代謝疾患、癌、または炎症性疾患に罹患している患者を治療する方法である。製造物品本発明の別の局面において、前記の障害の治療、予防、およびまたは診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および容器に貼られている、または容器に関連するラベルまたは添付文書を備える。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バックなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、単独の組成物、または状態の治療、予防、およびもしくは診断に有効な別の組成物と組み合わされる組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい。組成物中の少なくとも1種類の活性薬剤は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、えり抜きの状態を治療するのに用いられることを示す。さらに、製造物品は、本発明の抗体を含む組成物が中に入れられている第1の容器およびさらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む組成物が中に入れられている第2の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造物品は、ある特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに備えてもよい。または、もしくはさらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、静菌性注射用水、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む第2の容器をさらに備えてもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。配列表抗腫瘍作用を有するペプチド抗DIG抗体SEQIDNO36マウス1911の軽鎖可変ドメインVLSEQIDNO37マウス1911の重鎖可変ドメインVHSEQIDNO38ヒト化1911の軽鎖可変ドメインVLSEQIDNO39ヒト化1911の重鎖可変ドメインVH前述の発明は、理解しやすくするために例示および例としていくらか詳しく説明されたが、説明および例は本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。本明細書において引用された全ての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。以下は、本発明の方法および組成物の例である。前記で提供された一般的な説明があれば、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。実験手順実施例1マウスハイブリドーマクローン1911に由来するマウスIgG1κのVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴付け実施例2mu1911のVHドメインおよびVLドメインのヒト化実施例3組換えヒト化抗体および二重特異性誘導体の組成、発現および精製実施例4組換えヒト化抗体、断片、および融合タンパク質とジゴキシゲニン化化合物との結合実施例5ジゴキシゲニン化化合物の作製実施例6ジゴキシゲニン化化合物とIgGとの規定された複合体の作製実施例7ジゴキシゲニン化ペプチドおよび抗体との複合体は機能を保持する実施例8抗体と複合体を形成したジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドは細胞培養実験においてペグ化PYY由来ペプチドより優れた効力を有する実施例9ジゴキシゲニン化Cy5またはジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドとIgGとの複合体の血清安定性および血清中レベル実施例10ジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドとIgGとの複合体のインビボ活性表表1マウス野生型DIGIgGおよび組換え誘導体と異なるジゴキシゲニン化抗原との結合親和性表2非改変ヒト由来ペプチドおよびジゴキシゲニン化ヒト由来ペプチドの細胞傷害抗力表3非改変フルオロフォアCy5およびジゴキシゲニン化フルオロフォアCy5および複合体を形成したフルオロフォアCy5の蛍光表4cAMPアッセイにおけるPYY誘導体のインビトロでの生物活性表5複合体を形成しなかったDigフルオロフォアおよびDigペプチドならびに抗体と複合体を形成したDigフルオロフォアおよびDigペプチドのPKパラメータ実施例1a抗Dig抗体強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体は、例えば、HunterMMetalJImmunol12911651172に記載のように作製することができる。このような抗体の一例はモノクローナル抗体2610である。2610抗体は、高い親和性で強心配糖体ジゴキシン、ジギトキシン、およびジゴキシゲニンに結合する2173921747BurksEAetalPNAS94412417。これらの方法を適用し、免疫化のためにヒト血清アルブミンと結合体化されたジゴキシンを用いて、本発明者らは、モノクローナルマウス抗体ハイブリドーマクローン1911を作製した。実施例1bマウスハイブリドーマクローン1911に由来するマウスIgG1κのVHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAの単離および特徴付け組換え抗体、抗体断片、および融合タンパク質を設計、作製、最適化、および特徴付けするための必要条件は、タンパク質およびの配列情報が入手できることである。従って、ハイブリドーマクローン1911から、マウス抗体のVHドメインおよびVLドメインについて、この情報を入手した。後で実施することが必要な実験工程は、を産生する1911ハイブリドーマ細胞からのRNAの単離、このRNAからcDNAへの変換、次いで、VHを有するPCR断片およびVLを有するPCR断片への変換、ならびに大腸菌における増殖のためのプラスミドベクターへのこれらのPCR断片の組込み、ならびにこれらのDNA配列の決定であった。本明細書に記載の実験工程のさらなる詳細はPCTEP2010004051に記載されている。1911ハイブリドーマ細胞からのRNA調製RneasyKitを適用して、5x10e6個の抗体発現ハイブリドーマ細胞からRNAを調製した。簡単に述べると、沈殿した細胞をPBSで1回洗浄し、沈殿させ、その後に、溶解のために500μlのRLTPufferに再懸濁した。Qiashredderに通すことによって細胞を完全に溶解し、次いで、製造業者のマニュアルに記載のように、マトリックスにより媒介される精製手順に供した。最後の洗浄工程後に、50ulのRNaseフリー水に溶解してカラムからRNAを回収した。120に希釈した試料のA260およびA280を定量することによって、回収されたRNAの濃度を求めた。ホルムアミドアガロースゲルでの変性RNAゲル電気泳動によって、単離されたRNA試料の完全性を分析した。これらのRNAゲル電気泳動の例は、インタクトな18sリボソームRNAおよび28sリボソームRNAを表す別個のバンドを示した。これらのバンドが損なわれていないことからRNA調製物の質は良好なことが示された。1911ハイブリドーマから単離されたRNAを分注して凍結し、80Cで保管した。RACEPCRによる1911VHをコードするDNA断片および1911VHをコードするDNA断片の作製標準的な5RLMRACEプロトコールのための記載の反応を用いてFirstChoiceKit試薬キットを適用することによって、1911RNA調製物から後のPCR反応用のcDNAを調製した。PCR反応にはPwoDNAポリメラーゼを使用した。このために、10μgの1911RNAまたは対照RNAを適用し、記載のように5RACEアダプターを組み込むように処理した。本発明者らはアウターPCR反応を適用する必要はなく、インナーPCRに直接進んだ。これは、5RACEInnerPrimterおよびCκ特異的プライマーまたはCH1特異的プライマーからなるプライマーペアを組み合わせることを伴った。VL領域を増幅するcκ用のプライマー配列は、であった。VH領域を増幅するCH1用のプライマー配列は、であった。これらのプライマー組み合わせの場合、60°Cのアニーリング温度が適しており、PCRを実施するために55~65Cの温度が適用されている。抗体VH領域を含有するDNA断片またはVL領域を含有するDNA断片の成功した特異的増幅は、1911RNAから得られた600bp~800bpの別個のDNA断片の出現によって反映される。これらのDNA断片は、ハイブリドーマ1911のVHコード配列およびVLコード配列を含有する。プラスミドへの1911VHコードDNA断片および1911VHコードDNA断片のクローニングならびにこれらのDNA配列およびタンパク質配列の決定VHコードPCR断片およびVLコードPCR断片を、標準的な分子生物学的技法によるアガロースゲル抽出およびその後の精製によって単離した。製造業者の説明書に正確に従ってpCRbluntIItopoキットを適用することによって、Pwoによって作製された精製PCR断片をベクターpCRbluntIItopoに挿入した。Topo連結反応物を形質転換によって大腸菌Topo10oneshotコンピテント細胞に導入した。この後、VL含有インサートまたはVH含有インサートを有するベクターを含有する大腸菌クローンをLBカナマイシン寒天プレート上のコロニーとして特定した。その後に、これらのコロニーからプラスミドを調製し、EcoRIによる制限消化によってベクター中の望ましいインサートの存在を確認した。ベクターバックボーンは、インサートの両側に隣接するEcoRI制限認識部位を含有するので、インサートを有するプラスミドは、約800bpまたは600bpのEcoRiから放出可能なインサートを有することによって規定された。VHおよびVLの複数クローンに対する自動DNA配列決定によって1911VLおよびVHのDNA配列および推定タンパク質配列を決定した。クローン1911のVLのアミノ酸配列をSEQIDNO36に示し、クローン1911のVH配列をSEQIDNO37に示した。実施例2mu1911のVHドメインおよびVLドメインのヒト化抗体配列のヒト化の目的は、マウス由来の最初の抗体の全機能を保持しているが、ヒト免疫系によって外来として認識される配列も構造も有さない分子を作製することである。この課題に対処することができる様々な手順が利用可能であり、公表されている16191633HwangWYKandFooteJMethods36310。抗体の可変領域の機能は二次および三次構造によって決まるが、構造の形成はVHおよびVLの一次配列に基づく。このために、ヒト化の大きな課題は、タンパク質一次配列をいくつかの位置で変える必要があるのにもかかわらず、構造によって規定される機能を保持することである。従って、抗体の機能的に重要な領域の構造に関する知識はヒト化を助けるのに極めて重要である。ヒト化mu1911由来変種を作製するために、本発明者らは、以下の実験ウェットラボ手順ならびにインシリコ手順を組み合わせた。本発明者らは、mu1911の抗原結合部位のインシリコ予測から開始して、高度のヒト類似性ならびに全機能を保持する高い可能性を有するインシリコhu変種を予測することができた。最後に、本発明者らは、本発明者らのインシリコモデルを検証し、本発明者らのインシリコモデルに改良を加えるために、抗原を伴うおよび伴わない抗体の構造を実験により決定した。本明細書に記載の設計パラメータおよび実験工程のさらなる詳細はPCTEP2010004051に記載されている。mu1911の抗原結合部位のインシリコモデリングmu1911Fv領域の本発明者らのインシリコ構造モデルの基盤は、実験により決定されたVHmRNA配列およびVLmRNA配列から推定されたタンパク質配列である。これらの配列によってコードされるタンパク質の構造モデルは、マウス抗体のFvドメインのホモロジーモデリングとエネルギー最小化によってインシリコにより作製された。このために、ホモロジーモデリング用に適用するCDR配列およびフレームワーク配列を、PDBを介して相同性について別々に検索した。それぞれのCDRおよびフレームワークについて、さらに多くのホモログ構造が重ね合わせられた。その後に、軽鎖および重鎖の異なる部分からモデルを組み立てた後に、複合体の最小化を行った。本発明者らのホモロジーモデリング手順から得られたmu1911Fv領域の構造モデルから、推定された構造のかなり独特な特徴の1つは、VHVL境界面の中の深いところまで及んでいるように見える、よく目につく空洞であることが分かった。この狭い空洞が形成するための主要な決定要因はVHの長いCDR3ループである。空洞の内部には、1個のメチオニン、2個のセリン、2個のプロリン、数個のチロシンが並んでいる。この抗体によって認識される抗原ジゴキシゲニンは、ハプテンのように深い空洞の中に入って結合する。抗原の存在下でのマウス抗DigFv領域の結合領域の結晶化およびX線構造決定抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化VH配列およびVL配列をさらに最適化するために、本発明者らは親抗体の構造を実験により決定した。このために、周知の最新方法を適用した、精製IgGのプロテアーゼ消化によってFab断片を作製した。プロテインAクロマトグラフィーによって、残存しているFc断片からFab断片を分離し、その後に、サイズ排除クロマトグラフィーに供して、タンパク質断片を除去した。結晶化のために、20mMHisHCl、140mMNaCl、pH60に溶解した精製FabおよびCy5標識ジゴキシゲニンをジゴキシゲニン化蛍光色素Cy5と複合体形成した。結晶準備の前に、タンパク質溶液を濃縮した。複合体形成のために、DIGCy5を20mMHisHCl、140mMNaCl、pH60に溶解し、51の最終モル比まで濃縮タンパク質溶液に添加した。DIGCy5と複合体を形成したマウスFabの結晶は、タンパク質溶液1μlと、602メチル13プロパンジオール01M酢酸ナトリウムpH465mMCaCl2を含有するリザーバー溶液1μlを混合した後に、25°Cで懸垂滴蒸気拡散法を用いて得られた。結晶をさらに凍結保護する必要なく、液体窒素結晶で急速冷凍した。DIGCy5と複合体を形成したマウスFabの回折データを、2009年9月11日にX06SAにおいて収集した。データは、XDS916924を用いて統合およびスケール変更した。複合体の結晶は、ab13801Å、c123696、αβγ90°で空間群P42212に属し、28Åの分解能まで解析された。PDBID3cfd2a6d2a6jを有する構造に基づく検索モデルを作製することによって12321235SethiDKetalImmunity24429438、プログラムBALBES125132を参照されたいを用いた分子置換によって構造を解析した。非対称単位の中に合計2個のFab分子を配置することができた。初期モデルを完了し、プログラムCOOT21262132を用いた手作業のモデル構築およびプログラムPHENIX419435を用いた精密化によって精密化した。初回の精密化の後に、DIGCy5のDIG部分の差電子密度が現われた。DIGモデルはPDBID1lkeから入手し385396、DIGの精密化パラメータはオンラインツールPRODRG13551363によって作成した。最後の精密化工程のために電子密度の中にDIGモデルを配置した。図はプログラムPYMOLを用いて作成した。実験による構造決定の結果はPCTEP2010004051に詳述されている。構造から、得られた結晶型は、非対称単位の中に2つの独立したDIGCy5抗DIGFab複合体を含有し、両複合体の原子モデルを構築できることが明らかになった。DIGCy5のDIG部分は非対称単位の中の両Fab分子において秩序立っているが、非対称単位の一方の分子に、他方の分子より密接に結合しているように見える。DIGは、L鎖およびH鎖の境界面にあり、CDR中央に位置するポケットの中に結合する。DIGの原子O32はポケットの底部に向いており、Cy5とのリンカーは外側にあり、溶媒の中に向いている。DIGに加えて、Cy5とのリンカーの最初のC原子について、はっきりした2FoFc電子密度が見える。リンカーの可動性のために、リンカーの残部もCy5も電子密度地図には目に見えない。この障害から、リンカーはタンパク質に取り付けられておらず、抗体によるDIGの認識に影響を及ぼすことなく、異なる性質およびサイズの分子、例えば、色素、siRNA、およびその他をDIGに取り付けるのに十分な長さがあることが分かる。興味深いことに、結合ポケットは、DIGのような疎水性分子について予想されるように完全に疎水性でなく、いくらかの正電荷ポテンシャルを含んでいる。結合ポケットは、重鎖の4つのチロシン残基、ならびにA33、W47、P61、P99、およびM112によって裏打ちされている。軽鎖からは、残基Q89、S91、L94、P96、およびF98がポケット形成に関与している。軽鎖の可能性のある水素結合パートナーN35およびY36がポケットの底部を形成するが、DIGに到達しない。DIG結合には直接的な水素結合が1つしか関与せず、DIGのO32と軽鎖のQ89との間で形成する。もう2つの水素結合は直接的でないが、水分子によって媒介される。O12は、重鎖のY109のカルボニル酸素およびS35の側鎖と相互作用している。4番目の水素結合は、O14とS91のバックボーンカルボニル酸素との間で形成するが、これも水分子によって媒介される。非対称単位の両分子にある水素結合の数および長さの比較から、2番目の複合体において、DIGはポケットに完全に入ることができないことが分かる。一方の分子では、DIG部分はポケットの中にかなり深く入り込み、4つの水素結合を形成する。2番目のDIGはゆるく結合しており、他方の分子ほど深くポケットに入らず、他方の分子より弱い水素結合を3つしか形成しない。全機能を保持しているmu1911ヒト化変種の規定28Åの分解能で結合領域を実験により決定した結果から、リガンドとその抗体との結合様式を特徴付けることができる。この結果から、構造は、本発明者らが一次配列のインシリコ分析によって予測した構造モデルにおおむね似ていることがさらに裏付けられた。親抗体の可変領域のインシリコモデル構造ならびに実験により決定された現実の構造を入手できることが、組換えジゴキシゲニン結合モジュールの詳細なモデリングおよびタンパク質操作を介したさらなる改善のための必要条件である。望ましいヒト化VHドメインおよびヒト化VLドメインに相当するアミノ酸配列が、CDRグラフティングならびに結合特異性および親和性を調節するさらなる変異の導入に基づく手順を適用することによって規定された。この手順の基礎となる基本原理は、ヒト生殖系列の中での、マウス配列と異なる各アミノ酸のスコア値の帰属である。このスコアは、抗原認識能力または複合体安定性に及ぼすアミノ酸電荷の推定上の影響によって規定される。低いスコアおよび相対的な高い使用頻度に基づいてヒト生殖系列が選択される。結果として生じるヒト化分子にt細胞エピトープがごくわずかしか無いように、または全く無いようにするために、このヒト化手順にはTEPITOPE分析が含まれる。最初に、この手順によって規定されたヒト配列は、スコアが高すぎる場合、マウス配列と交換する必要がある場合がある。これは、CDRまたはCDR配列の周囲領域におけるアミノ酸変化に最も頻繁に必要とされる。場合によっては、安定性および機能性を保持するために、マウス残基への逆突然変異がCDRだけでなくフレームワークの中でも必要とされる。本発明者らが選択した、結果として生じたhu変種は、ヒトフレームワークVH311およびVL139の組み合わせに基づいており、ヒトと高度の類似性を有する。VLの場合、ヒトVK139のフレームワークおよびIGKJ40102生殖系列のヒトj要素において逆突然変異を組込む必要はなかった。これは、高いヒト特徴および比較的少ない数のTEPITOPEアラートにつながった。VH変種は、ヒトVH323生殖系列およびヒトJIGHJ6012に由来する。変種JはヒトVH311生殖系列において構築された。さらに、本発明者らのスコアリング法を用いて、本発明者らは、ヒト特徴を高め、TEPITOPEアラートの数を減らすためにCDRの中に1つのヒトアミノ酸を導入することができた。ヒト化VHのアミノ酸配列をSEQIDNO38に示し、ヒト化VLのアミノ酸配列をSEQIDNO39に示した。親和性が増大したジゴキシゲニン結合モジュールの作製抗ジゴキシゲニン抗体のヒト化VH配列およびヒト化VL配列のさらなる最適化を適用して、ジゴキシゲニンに対する親和性がさらに高いモジュールを作製した。実験により決定された予測構造ならびにインシリコで計算された予測構造に基づいて、本発明者らは、変化すると親和性に影響し得る3つの位置を特定した。これらは、VHドメインのSer49、Ile57、およびAla60に位置した。アミノ酸VHSer49とAlaを交換、VHIle57とAlaを交換、およびVHAla60とProを交換することによって、それぞれの抗体誘導体が作製された。この配列からなる結合実体を発現させ、標準的なプロテインAおよびサイズ排除技術を用いて精製することができた。結果として生じた分子は完全に機能し、ヒト化親分子と比較してジゴキシゲニンに対する改善した親和性を示した。これは表面プラズモン共鳴実験によって証明された。これらの実験の結果から、VH49変異、VH57変異、およびVH60変異を導入することによってジゴキシゲニンに対する親和性が約10倍改善したと判明した。この後に、Dig結合可変領域の実験により決定された構造を検査することによって、これらの位置の関係が確かめられた。実施例3組換えヒト化抗体の組成、発現、および精製キメラIgGもしくはヒト化IgGを形成するために、または他の抗体配列を有する二重特異性融合タンパク質を作製するために、マウスモジュールおよびヒト化モジュールをヒト抗体定常領域と組み合わせた。Digに結合するヒト化IgGの作製には、このような分子のアミノ配列およびヌクレオチド配列を設計および規定すること、これらの分子を、トランスフェクトされた哺乳動物培養細胞において発現させること、ならびにこれらの分子を、トランスフェクトされた細胞の上清から精製することが必要であった。概念実証研究用のモデル系として用いられたように、Digならびに他の標的に結合する二重特異性誘導体も作製した。例えば、ここで、ペプチドまたはフルオロフォアの規定された複合体形成を以下の実施例において証明することができた。本明細書に記載の実験工程のさらなる詳細はPCTEP2010004051に記載されている。IgGならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体のアミノ配列およびヌクレオチド配列の設計および規定マウスmu1911Fv領域の結合特異性を有するヒト化IgGを作製するために、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VH配列とIgG1のCH1CH2CH3のN末端をインフレームで融合した。同様に、本発明者らは、前記で規定されたヒト化VL配列とCκのN末端をインフレームで融合した。結果として生じたhuIgGH鎖およびL鎖のアミノ酸配列はPCTEP2010004051に記載されている。ヒト化ジゴキシゲニン結合IgGの模式図を図1に示した。huの結合特異性ならびに受容体型チロシンキナーゼHer2またはIGF1Rに対する特異性を含む二重特異性抗体誘導体を作製するために、本発明者らは、ヒト化したVH配列およびVL配列によって規定される単鎖Fvモジュールと、以前に述べられた抗体のH鎖のC末端またはIGF1R抗体のH鎖のC末端をインフレームで融合した。以前に述べられているVH44VL100ジスルフィド結合を導入することによって、適用されたscFvモジュールをさらに安定化した12391245。Her2またはIGF1Rならびにジゴキシゲニンに結合する、結果として生じた二重特異性抗体誘導体のアミノ酸配列はPCTEP2010004051に記載されている。IgG、ならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体の発現FreeStyle293発現系を用いて製造業者の説明書に従って、ヒト胚腎臓293F細胞の一過的トランスフェクションによって、IgGおよび二重特異性抗体誘導体を発現させた。このために、対応する二重特異性抗体の軽鎖および重鎖を、原核生物選択マーカーおよび真核生物選択マーカーを有する発現ベクターの中に構築した。これらのプラスミドを大腸菌において増幅し、精製し、その後に、一過的トランスフェクションに適用した。細胞を取り扱うために、CurrentProtocolsinCellBiologyBonifacinoJSDassoMHarfordJBLippincottSchwartzJandYamadaKMJohnWileySonsIncに記載のように標準的な細胞培養法を使用した。懸濁FreeStyle293F細胞をFreeStyle293Expression培地に入れて37°C8CO2で培養し、トランスフェクションの日に細胞を1~2x106生細胞mlの密度で新鮮培地に播種した。250mlの最終トランスフェクション体積のために333μlの293fectinならびに250μgの11モル比の重鎖プラスミドDNAおよび軽鎖プラスミドDNAを用いて、DNA293fectin複合体をOptiMEMI培地に溶解して調製した。トランスフェクションの7日後に、IgGまたは二重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、14000gで30分の遠心分離および滅菌フィルターに通す濾過によって清澄化した。精製まで上清を20°Cで保管した。細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を求めるために、アフィニティHPLCクロマトグラフィーを適用した。このために、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養上清を、200mMKH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH74に溶解してAppliedBiosystemsPorosA20カラムにアプライし、UltiMate3000HPLCシステムによって200mMNaCl、100mMクエン酸、pH25を用いてマトリックスから溶出させた。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。精製された標準IgG1抗体は標準として役立った。IgGならびにジゴキシゲニンおよびHer2またはIGF1Rに結合する二重特異性抗体誘導体の精製発現プラスミドのトランスフェクションの7日後に、HEK293細胞上清を収集した。この中に含まれる組換え抗体を上清からプロテインASepharoseを用いたアフィニティクロマトグラフィーおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって二段階で精製した。簡単に述べると、単一特異性抗体を含有する清澄化培養上清および二重特異性抗体を含有する清澄化培養上清を、PBS緩衝液で平衡化したHiTrapProteinAHPカラムにアプライした。結合しなかったタンパク質を平衡化緩衝液によって洗い流した。二重特異性抗体を01Mクエン酸緩衝液、pH28によって溶出させ、タンパク質含有画分を01ml1MTris、pH85によって中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、AmiconUltra遠心フィルター装置によって3mlの体積まで濃縮し、20mMヒスチジン、140mMNaCl、pH60で平衡化したSuperdex200HiLoad120ml1660ゲル濾過カラムにロードした。精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、PaceetalProteinScience1995424111423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度とバックグラウンド補正として320nmでのODを測定することによって求めた。単量体抗体画分をプールし、瞬間冷凍し、80°Cで保管した。後のタンパク質分析および特徴付けのために、試料の一部を用意した。DIGHu2抗体構築物および二重特異性DIG構築物の均一性を、還元剤の存在下および非存在下のSDSPAGEならびにクーマシーブリリアントブルー染色によって確認した。NuPAGEPreCastゲルシステムを製造業者の説明書に従って使用した。還元条件下で、IgGに関連するポリペプチド鎖は、SDSPAGEの際に、計算分子量と類似する見かけの分子サイズを示した。全ての構築物の発現レベルはプロテインAによって分析された。平均タンパク質収率は、このような非最適化一過的発現実験において6~35mg精製タンパク質L細胞培養上清であった。本明細書に記載の発現工程および精製工程のさらなる詳細はPCTEP2010004051に記載されている。実施例4組換えヒト化抗体、断片、および融合タンパク質とジゴキシゲニン化化合物との結合以下で述べる分析は、ヒト化手順によって完全な結合活性を保持している誘導体が生じたかどうか評価するために行った。このために、BiacoreT100またはBiacore3000機器を用いて表面プラズモン共鳴技術によって、組換え誘導体の結合特性を分析した。このシステムは分子相互作用研究用に十分に確立している。これは、リガンド分析物結合を連続リアルタイムモニタリングし、従って、様々なアッセイ設定において会合速度定数、解離速度定数、および平衡定数を求めることができる。SPR技術は、金でコーティングされたバイオセンサーチップ表面近くの屈折率を測定することに基づく。屈折率の変化から、固定化されたリガンドと、溶解状態で注入された分析物の相互作用によって引き起こされる表面の質量変化が分かる。分子が、表面にある固定化リガンドに結合すれば質量が増大し、解離すれば質量が減少する。結合研究を行うために、捕捉用の抗ヒトIgG抗体を、アミンカップリング化学を用いてCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。フローセルを、01MNヒドロキシスクシンイミドおよび01M3プロピルNエチルカルボジイミドの11混合物によって5μlminの流速で活性化した。特に断りのない限り、10μgmlの抗ヒトIgG抗体を酢酸ナトリウム、pH50に溶解して注入した。これによって、約12000RUの表面密度が得られた。参照対照フローセルを同様に処理したが、捕捉用抗体の代わりにビヒクル緩衝液のみで処理した。1MエタノールアミンHClpH85を注入することによって表面をブロックした。ヒト化タンパク質変種の結合と、最初のハイブリドーマ1911に由来するマウスIgGの結合を比較するために、抗ヒトIgG抗体について前記で述べられたのと同様に、捕捉用抗マウスIgG抗体をCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。組換え誘導体の機能を評価するために、ヒト化IgG、huジスルフィド安定化scFvを有する融合タンパク質を含む組換えhuモジュールの結合を、ジゴキシゲニン化抗原を用いてアッセイした。結果として生じた結合親和性を、組換えヒト化モジュールが得られたマウス野生型DIGIgGの結合と比較した。ハイブリドーマ由来マウス1911とヒト化IgGとの比較抗マウスIgG抗体を、前記と同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。2μgmlの抗ヒトIgG抗体を注入し、これによって約600RUの表面密度が得られた。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、085H3PO4を60秒間、5μlminで注入し、次いで、5mMNaOHを60秒間、5μlminで注入することによって、再生を行った。分析しようとする試料をHBSPで希釈し、5μlminの流速で注入した。接触時間は1~5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIGBP4については03125nM、0625nM、125nM、25nM、5nM、および10nMであった。接触時間は3分であり、解離時間は30μlminの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25°Cで行った。マウス1911の場合、それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシンHClpH15の再生溶液を30μlminの流速で60秒間注入した。ヒト化IgGの場合、085H3PO4を60秒間5μlminで注入し、次いで、5mMNaOHを60秒間5μlminで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル秒の割合で検出した。これらの分析の結果を表1に示した。これから、組換えヒト化は、マウス親抗体と同じ機能および高親和性でジゴキシゲニン化化合物に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化抗体のKdは抗体の機能がそのヒト化変種において保持されたと結論付けた。ハイブリドーマ由来マウス1911と組換えヒト化単鎖Fv融合タンパク質との比較抗マウスIgG抗体および抗ヒトIgG抗体を、前記と同様にCM5バイオセンサーチップ表面に固定化した。分析しようとする試料をHBSPで希釈し、5μlminの流速で注入した。接触時間は1~5nMの濃度の抗体の場合、3分であった。結合親和性を測定するために、様々なジゴキシゲニン化抗原を漸増濃度にして注入した。漸増濃度は、DIGBP4については03125nM、0625nM、125nM、25nM、5nM、および10nMであり、DIGsiRNAについては0018~120nMであった。接触時間は3分であり、解離時間は30μlminの流速で各分子について5分であった。全ての相互作用を25°Cで行った。それぞれの結合サイクルの後に共有結合していないタンパク質を除去するために、10mMグリシンHClpH15の再生溶液を30μlminの流速で60秒間注入した。RNAseがリガンドとして用いられる時には、085H3PO4を60秒間、5μlminで注入し、次いで、5mMNaOHを60秒間、5μlminで注入することによって、再生を行った。シグナルは1シグナル秒の割合で検出した。これらの分析の結果を表1に示した。これから、適用された二重特異性融合タンパク質に存在する組換えヒト化scFvモジュールは、マウス親抗体と同じ機能および高親和性で、ジゴキシゲニン化したタンパク質および核酸に結合することが分かる。ジゴキシゲニン化タンパク質に対するマウス抗体のKdは33pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは68pMであった。同様に、ジゴキシゲニン化核酸に対するマウス抗体のKdは269pMであることが判明し、ヒト化単鎖FvのKdは35nMであった。従って、本発明者らは、野生型抗体の機能が、二重特異性融合タンパク質に存在する組換えヒト化scFvモジュールにおいても保持されると結論付けた。表1マウス野生型DIGIgGおよび組換え誘導体と異なるジゴキシゲニン化抗原との結合親和性モノジゴキシゲニン化タンパク質DIGミオグロビンとの結合におけるヒト化IgG、IGF1RDIG、およびマウスM1911の結合親和性を比較した、さらなるSPR研究を行った。DIGMyoに対するヒト化IgGおよびジスルフィド安定化scFv誘導体の結合親和性は同等であったが、マウスM1911の親和性の方が明らかに優れていた。DIGBP4に対するヒト化IgGの親和性およびジスルフィド安定化scFvの親和性が高いことは、DIGBP4に対する結合のアビディティ効果によるものである可能性が高い。なぜなら、タンパク質DIGBP4はその表面に複数のDIG分子を有するからである。実施例5ジゴキシゲニン化化合物の作製ジゴキシゲニン結合抗体と複合体形成するための化合物を作製するために、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンを化合物にカップリングし、化合物がその機能を保持するように、このカップリングが行われるのを確実なものにすることが必要である。これらの機能を評価するために本発明者ら例として調製した化合物には、ジゴキシゲニン化フルオロフォアおよび一組のジゴキシゲニン化ペプチド誘導体が含まれる。カップリング手順および試薬を図2Aに模式的に示した。DigCy5およびジゴキシゲニン化PYYペプチド誘導体の組成を、それぞれ、図2Bおよび図2Cに示した。この技術を評価するために本発明者らが例として使用したペプチドは、メリチン、FALLLv1、FALLv2、およびFam5bである。後ろの3つのペプチドは、ヒト由来の生理活性ペプチドのスクリーニングにおいて特定された。これらのペプチドは、アミノ末端システインを付加することによってジゴキシゲニンにカップリングすることができる。これらのペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別のペプチド誘導体は、非天然アミノ酸を含有するPYY誘導体である。この文章中、このPYYペプチド誘導体はmoPYYと呼ばれる。このペプチドmoPYYの配列は以下の通りである。このペプチドは、位置2にあるリジンのεアミノ基を介してジゴキシゲニンにカップリングすることができる。この技術を評価するために例として使用することができる他のPYY誘導体ペプチド誘導体を以下に列挙した。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別の化合物は蛍光化合物Cy5である。この化合物の組成を図2Bに示した。NHSエステル化学を介して、この化合物をジゴキシゲニンにカップリングすることができる。ジゴキシゲニン結合体化用のアミノ末端システインを有するペプチドの作製確立したプロトコールに従って、Fmoc化学を用いる自動化AppliedBiosystemsABI433Aペプチド合成機において、ペプチド合成を行った。反復サイクルにおいて、対応するFmocアミノ酸を連続してカップリングすることによって、ペプチド配列を組み立てた。カップリング工程ごとに、樹脂を、Nメチルピロリドンに溶解した20ピペリジンで処理することによって、N末端Fmoc基を除去した。カップリングは、DMFに溶解したHBTUHOBtおよびDIPEAによって活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて行った。カップリング工程ごとに、NMPに溶解したAc2O、DIPEA、およびHOBtの混合物で処理することによって、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程の間に、樹脂をNメチルピロリドンおよびDMFによって大規模に洗浄した。立体障害アミノ酸を自動化二重カップリングに組込んだ。このために、カップリングサイクルの間にキャッピング工程なく、樹脂を1mmolの活性化基本要素によって2回処理した。標的配列が完了したら、標準的なアミノ酸カップリング条件を用いて、Fmoc12アミノ4710トリオキサドデカン酸をFAM5BおよびINF7ペプチドとカップリングした。その後に、全てのペプチド配列のアミノ末端にFmocCysOHを取り付けた。最後のFmoc脱保護の後に、ペプチド樹脂をフィルターフリットに入れ、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシランの混合物によって25時間処理した。切断溶液を濾過し、冷ジイソプロピルエーテルを添加してペプチドを沈殿させて、無色の固体を得た。無色の固体をジイソプロピルエーテルによってくりかえし洗浄した。粗生成物を酢酸水混合物に再溶解し、凍結乾燥し、その後に、01TFAを含有するアセトニトリル水勾配を用いた調製用逆相HPLCによって精製した。アミノ末端システインを有するペプチドとジゴキシゲニンとのカップリング対応するシステイン改変ペプチドを01MKPO4緩衝液に溶解した溶液に、100μLのDMFに溶解した等モル量のジゴキシゲニン3カルボキシメチルエチルアミドマレイミドを添加した。反応混合物を周囲温度で2~20時間、穏やかに混合し、濾過し、標的化合物を、01TFAを含有するアセトニトリル水勾配を用いた調製用逆相HPLCによって単離した。凍結乾燥の後に、ジゴキシゲニンペプチド結合体を無色の固体として得た。ペプチドメリチンの分子量は294964であり、結果として生じたペプチドDig結合体の分子量は352033である。ペプチドFaLLv1の分子量は471059であり、結果として生じたペプチドDig結合体の分子量は538443である。ペプチドFALLv2の分子量は479176であり、結果として生じたペプチドDig結合体の分子量は546559である。ペプチドFam5bの分子量は363437であり、結果として生じたペプチドDig結合体の分子量は541047である。ペプチドINF7の分子量は289625であり、結果として生じたペプチドDig結合体の分子量は346694である。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、H2Oに溶解した結合体を分注して20°Cで保管した。図7Aは、ペプチドジゴキシゲニン複合体の組成を模式的に示す。ジゴキシゲニン化型PYYペプチド誘導体の作製PYYペプチド誘導体は、樹脂に結合したペプチド配列AcIKPqaRHYLNWVTRQMeArgYTentaGelRAM樹脂の自動固相合成によって得られた。確立したプロトコールに従って、Fmoc化学を用いる自動化AppliedBiosystemsABI433Aペプチド合成機において、ペプチド合成を行った。TentaGelRAM樹脂を用いて、対応するFmocアミノ酸を連続カップリングすることによって、ペプチド配列を反復サイクルにおいて組み立てた。カップリング工程ごとに、Nメチルピロリドンに溶解した20ピペリジンで樹脂を処理することによって、N末端Fmoc基を除去した。カップリングは、DMFに溶解したHBTUHOBtおよびDIPEAによって活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて行った。位置2、3、および14それぞれにおいて、アミノ酸誘導体FmocLysOH、FmocPqaOH、およびFmocNMeArgOHを合成配列に組み込んだ。カップリング工程ごとに、NMPに溶解したAc2O、DIPEA、およびHOBtの混合物で処理することによって、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程の間に、樹脂をNメチルピロリドンおよびDMFによって大規模に洗浄した。立体障害アミノ酸を自動化二重カップリングに組込んだ。このために、カップリングサイクルの間にキャッピング工程なく、樹脂を1mmolの活性化基本要素によって2回処理した。標的配列が完了した後、さらなる操作のために樹脂をフリット固相反応器に移した。ivDde基を除去するために、ペプチド樹脂PqaRHYLNWVTRQMeArgYTentaGelRAM樹脂をDMFで30分間、膨張させ、その後に、DMFに溶解した2ヒドラジン水和物溶液で2時間、処理した。洗浄後、樹脂をイソプロパノールおよびDMFによって大規模に洗浄し、DMFに溶解したFmoc12アミノ4710トリオキサドデカン酸、HATU、HOAt、および2Mジイソプロピルエチルアミンの溶液を添加し、混合物を16時間、振盪した。樹脂をDMFで洗浄し、Fmoc基を、DMFに溶解した混合物40ピリジンで切断した。その後に、樹脂をフィルターフリットに入れ、トリフルオロ酢酸、水、およびトリイソプロピルシランの混合物で25時間、処理した。切断溶液を濾過し、冷ジイソプロピルエーテルを添加することによってペプチドを沈殿させて、無色の固体を得た。無色の固体をジイソプロピルエーテルでくりかえし洗浄した。粗生成物を酢酸水混合物に再溶解し、凍結乾燥して、無色の固体として表題化合物を得た。これを、さらに精製することなく、後の操作のために使用した。ペプチド誘導体の分析特徴付けのために、本発明者らは以下の条件を適用し、以下のデータを受け取った分析HPLCtR98分ジゴキシゲニン化ペプチド誘導体DIGmoPYYの調製ペプチドを水に溶解した溶液に、NMPに溶解したジゴキシゲニン3カルボキシメチルNヒドロキシスクシンイミドを添加した。トリエチルアミンを添加し、混合物を室温で2時間、回転させた。その後に、NMPに溶解したさらなるジゴキシゲニン3カルボキシメチルNヒドロキシスクシンイミド、およびトリエチルアミンを添加し、溶液を15時間、回転させた。粗生成物を、01TFAを含有するアセトニトリル水勾配を用いた調製用逆相HPLCによって精製して、無色の固体としてDigPYYペプチドを得た。ペプチド誘導体の分析特徴付けのために、本発明者らは以下の条件を適用し、以下のデータを受け取った分析HPLCtR113分。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、ジゴキシゲニン化ペプチドを凍結乾燥物として4°Cで保管した。図2CはDIGmoPYYの構造を示す。ジゴキシゲニン化Cy5の作製ジゴキシゲニン化Cy5を作製するために、モノバックエチレンジアミンを用いて、DIGカルボキシメチルNHSエステルを変換した。その後に、Bocを除去し、遊離したアミンをCy5NHSエステルと反応させた。DIGCy5を精製するために、RP18カラムを用いたHPLCを行った。溶出剤Aは、01TFAを含有するH2Oであり、溶出剤Bは、01TFAを含有するアセトニトリルであった。60分にわたって行った溶出の間に、溶出剤Bの濃度を0から100に上げた。Cy5の分子量は79199Daである。結果として生じたCy5Dig結合体の分子量は116755Daである。抗体との複合体形成の時点まで、本発明者らは、PBSに溶解した結合体を分注して20°Cで保管した。図2BはCy5ジゴキシゲニン結合体の構造を示す。実施例6ジゴキシゲニン化ペプチドまたはフルオロフォアとIgGとの規定された複合体の作製ジゴキシゲニン化ペプチドとジゴキシゲニン結合抗体および抗体誘導体との複合体は、優れた生物物理学的特性および改善したPKパラメータをペプチドに付与し得る。さらに、万一、二重特異性抗体が例示的な概念実証複合体として適用された場合には、このような複合体は、二重特異性抗体変種によって認識される抗原をディスプレイする細胞にペプチドを標的化することができる。これらの複合体は、その2つの高親和性Dig結合部位において2つのジゴキシゲニン化ペプチドを結合させる1つのヒト化IgGからなる。このような複合体の組成を図3に示した。ジゴキシゲニン化されているのにもかかわらず、ならびに抗体と複合体を形成しているのにもかかわらず、ペプチドが優れた生物学的活性を保持していることが望ましい。複合体を形成したジゴキシゲニン化ペプチドの存在下で、二重特異性抗体誘導体の細胞表面標的結合部位が、その結合特異性および親和性を保持していることも望ましい。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した一組のペプチドは、メリチン、FALLLv1、FALLv2、およびFam5bである。後ろの3つのペプチドは、ヒト由来の生理活性ペプチドのスクリーニングにおいて特定された。メリチンおよび3つのヒト由来ペプチドの生物学的活性は、ヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害作用を確かめることによってインビトロで評価することができる。さらに、この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別のペプチドはペプチドチロシンチロシンまたは膵臓ペプチドYYショートPYY類似体である。位置2にあるリジンを介してジゴキシゲニン化されていれば、以下の文章においてDIGmoPYYと呼ばれる。この化合物を図2Cに図示した。ペプチドmoPYYおよびその誘導体はNPY受容体ファミリーのY2受容体に結合し、それによってNPY受容体ファミリーのY2受容体を調節する。PYYは、食事に反応して回腸および結腸の中の神経内分泌細胞によって分泌される。PYYは胃運動低下を阻害し、消化効率および栄養分吸収効率を増大させ、おそらくY2受容体によって媒介される食欲を低下させることが示されている。PYYは食物摂取のバランスを取ることによってエネルギーホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしているので、このペプチドはII型糖尿病または肥満の治療に有用な可能性がある。moPYYはインビトロで高度かつ特異的な活性があるが、他の多くの治療用ペプチドと同様に生物内で安定性が限定され、血清半減期が短いという欠点を有する。これらの問題に対処するアプローチの1つは部位特異的ペグ化であったが、PEGは多くの場合においてペプチドの到達および活性を妨げることが知られている。従って、抗体Digペプチド複合体の作製はペグ化の代替として役立つかもしれない。このような複合体を作製するために、適切なリンカーを介してジゴキシゲニンをペプチドとカップリングし、これによって、ペプチドが抗体表面上に露出し、従って、その活性の保持を可能にすることおよび治療用ペプチドの生物学的活性が保持されている、IgGとジゴキシゲニン化ペプチドの複合体を作製することが必要である。この技術を評価するために本発明者らが例として使用した別の化合物はDigCy5である。この分子は蛍光特性を有し、従って、その活性はインビトロならびにインビボで蛍光画像化によって確かめることができる。ジゴキシゲニン化ペプチドメリチン、FALLv1、およびFALLv2と組換え二重特異性抗体との複合体形成抗体とジゴキシゲニン化化合物との複合体を作製するために、ジゴキシゲニン化ペプチドとジゴキシゲニン結合抗体誘導体との複合体を作製および特徴付ける必要がある。これらの複合体は、規定された様式で形成されるものとする。これらの複合体が化合物またはペプチドの活性を保持することを確実なものにする。組換え二重特異性抗体および二重特異性抗体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は前述されている。ジゴキシゲニン化ペプチドとおよび二重特異性抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、ペプチドDig結合体をH2Oに1mgmlの最終濃度まで溶解した。二重特異性抗体を、20mMヒスチジン、140mMNaCl、pH60緩衝液に溶解して1mgmlの濃度にした。ペプチドおよび二重特異性抗体を上下にピペッティングすることによって21モル比まで混合し、RTで15分間インキュベートした。次いで、複合体をさらに改変することなくインビトロアッセイにおいて使用した。これらのアッセイのための複合体の希釈は、OptiMEM1に溶解して行った。結果として生じた複合体は、抗体誘導体1つにつき2つのDigペプチドを有する単量体IgG様分子と規定された。これらの二重特異性ペプチド複合体の規定された組成はサイズ排除クロマトグラフィーおよび装填競合実験によって確かめられた。図3は、このような規定された抗体複合体の模式図を示す。メリチン、FALL、またはFam5Bとジゴキシゲニン結合実体とのカップリングのさらなる詳細はPCTEP2010004051に記載されている。ジゴキシゲニン化Cy5とIgGおよび抗体誘導体との複合体形成ヒト化IgGおよびマウスIgGまたは二重特異性抗体誘導体をカップリング反応のタンパク質成分として使用した。これらの分子の組成および精製は前述されている。ジゴキシゲニン化Cy5とジゴキシゲニン結合抗体との複合体を作製するために、本発明者らは、Cy5Dig結合体をPBSに05mgmlの最終濃度まで溶解した。抗体または抗体誘導体を、20mMヒスチジンおよび140mMNaClからなる緩衝液、pH6に溶解して1mgmlの濃度で使用した。ジゴキシゲニン化Cy5および抗体を21のモル比まで混合した。この手順の結果として、規定された組成の複合体の均一な調製物が生じた。図4は、2つのジゴキシゲニン結合部位を含有する二重特異性抗体誘導体がDigCy5と様々な化学量論比でインキュベートされた装填実験の結果を例示的に示す。抗体の装填は、サイズ排除カラムによって抗体関連フルオロフォアの蛍光を測定することによって確かめることができる。これらの実験の結果から、装填は、抗体がジゴキシゲニン結合部位を含有する場合にのみ生じ、Dig結合特異性のない抗体はDigCy5に結合しないことが証明された。さらに、21のDigCy5IgG比に達するまで、二価Dig結合抗体誘導体について装填シグナルの増大が観察された。その後、装填に関連する蛍光シグナルはプラトーに達する。これは、1つの二価抗DigIgGが2分子のDigCy5を結合することを証明している。結合複合体は、この期間内で、かつ分析サイズ排除手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。ジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドとハイブリドーマ由来マウスIgGおよびヒト化組換えIgGとの複合体形成ジゴキシゲニン化ペプチドとマウスハイブリドーマ由来IgGとの複合体を作製するために、muを12mlの水に溶解し、20mMHis、140mMNaClpH60に対して透析して、11mlの緩衝液中に300mgを得た。DIGmoPYYを1時間以内に285mgの4つの部分に分けて添加し、室温でもう1時間インキュベートした。複合体形成反応が完了した後に、ペプチドIgG複合体を、20mMヒスチジン、140mMNaCl、pH60に溶解して、Superdex2002660GLカラムを介したサイズ排除クロマトグラフィーによって流速25mlminで精製した。溶出された複合体を4ml画分中に収集し、プールし、02μmフィルターで滅菌して、143mgmlの濃度のIgGペプチド複合体234mgを得た。同様に、ヒト化IgGのペプチド複合体を作製するために、huIgGの濃度を20mMHis、140mMNaCl、pH60に溶解して106mgmlにした。057mg197x107mol303eqのジゴキシゲニン化ペプチドDIGmoPYYを凍結乾燥物としてIgG溶液に添加した。ペプチドおよび抗体を室温で15時間インキュベートした。過剰なペプチドを、20mMヒスチジン、140mMNaCl、pH60に溶解して、Superose610300GLカラムを介したサイズ排除クロマトグラフィーによって05mlminの流速で除去した。溶出された複合体を05ml画分中に収集し、プールし、02μmフィルターで滅菌して、186mgmlの濃度のIgGペプチド複合体47mgを得た。結果として生じたペプチドIgG複合体は単量体IgG様分子として規定された。図5は、DIGmoPYYペプチドとヒト化IgGおよびマウスIgGとの複合体のサイズ排除プロファイルを示す。結果として生じた複合体は、1つの抗体誘導体につき2つのDigPYY誘導体を有する単量体IgG様分子として規定された。これらのペプチド複合体の規定された組成はサイズ排除クロマトグラフィーによって確かめられた。サイズ排除クロマトグラフィーはまたタンパク質凝集物が存在しないことも示した。規定された組成のこれらの二重特異性ペプチド複合体は、SECMALS分析、図6によってさらに確かめられた。SECMALS分析のために、100~500μgのそれぞれの試料を、025~05mlminの流速で、移動相として1xPBSpH74を用いてSuperdex20010300GLサイズ排除カラムに適用した。光散乱を、WyattminiDawnTREOSQELS検出器を用いて検出し、屈折率を、WyattOptilabrEX検出器を用いて測定した。結果として生じたデータを、ソフトウェアASTRAを用いて分析した。SECMALLS分析の結果から、複合体の質量、半径、およびサイズに関する情報が得られる。次いで、これらのデータを、対応する無装填抗体のデータと比較した。これらの実験の結果から、DIGmoPYYをDig結合抗体に曝露すると、1つの二価IgGにつき2つのDIGmoPYY誘導体を含有する複合体が生じることが証明された。従って、DIGmoPYYは、規定された部位において、かつ規定された化学量論でDig結合抗体と複合体を形成することができる。結合複合体は、この期間内で、かつ分析SECMALLS手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。表面プラズモン共鳴研究を適用することによる複合体の特徴付けから、複合体形成反応によって、規定された、かつ完全に装填した分子が生じたというさらなる証拠が得られた。ジゴキシゲニン結合抗体を、シグナル増大をもたらすSPRチップに結合することができる。その後に、DIGmoPYYを添加すると、全ての結合部位が完全に占有されるまでシグナルはさらに増大する。これらの状態で、さらに多くのDIGmoPYYを添加しても、シグナルはこれ以上増大しない。このことから、装填反応は特異的であり、シグナルはDigペプチドの非特異的な付着性によって引き起こされないことが分かる。さらに、Digペプチドが抗体から分離するという証拠がないので、抗体の装填は極めて安定している。これらの実験の結果から、DIGmoPYYをDig結合抗体に曝露すると、規定されたサイズの分子の良好に規定された組成物が生じることが証明される。従って、DIGmoPYYは、規定された部位において、かつ規定された化学量論でDig結合抗体と複合体を形成することができる。結果として生じた組成物は、SECにおいて良好に規定され、かつ均一であるように見える。結合複合体は、この期間内で、かつSECまたはSPR手順に関連する実験条件下で解離しないのでかなり安定している。実施例7ジゴキシゲニン化ペプチドおよび抗体との複合体は機能を保持する抗体と生理活性化合物との複合体形成を目的とした全ての技術のために対処する必要のある非常に重要な話題の1つは、化合物の機能が保持されていなければならないということである。本発明者らが説明する抗体技術は、生理活性ペプチドに対して2つの調節工程を有する。第1の工程では、本発明者らは、ジゴキシゲニンを生理活性ペプチドに共有結合する。第2の工程では、このジゴキシゲニン化ペプチドと、大きなタンパク質である抗体誘導体との複合体を形成させる。ペプチドの活性を保持するために、両工程のために改変ペプチドの活性を確実なものとすることが重要である。すなわち、活性アッセイは、ジゴキシゲニン化後にペプチドの機能が保持されている、およびジゴキシゲニン化ペプチドとマウスまたはヒト化との複合体形成後に機能が保持されていることを示す必要がある。非改変細胞傷害性ペプチドおよびジゴキシゲニン化細胞傷害性ペプチドならびに抗体と複合体を形成した細胞傷害性ペプチドの生物学的活性の比較ジゴキシゲニンによるペプチドメリチン、FALLv1、およびFALLv2の付加または変化によってペプチドの生物学的活性が変わるかどうか評価するために、本発明者らはインビトロアッセイを行った。これらのペプチドが細胞傷害性であるので、これらの生物学的活性は死細胞数をモニタリングすることによって容易に分析することができる。この数を測定するために、CytoToxGloアッセイを使用した。表2は、メリチン、Fallv1、およびFallv2ペプチド、ならびにこれらのDIG改変変種の生物学的活性を評価するために実施された、これらのCytoToxGloアッセイの結果を示す。これらのアッセイのために、H322M細胞を96ウェルプレートの中に15000細胞ウェルの密度で播種した。細胞を、10FCS、Naピロベート、Lグルタミン、およびNEAAミックスを含むRPMIに入れ、37°C、5CO2、および85湿度で24時間インキュベートした。次いで、ペプチドおよびそのDIG改変変種を示された濃度で細胞に添加した。細胞をさらに48時間インキュベートした。この期間の後に、細胞を、CytoToxGloアッセイ試薬を用いて製造業者の説明書に従って処理した。手短に述べると、このアッセイは、試薬中の蛍光発生ペプチドを切断する培地中のプロテアーゼの存在によって死細胞を検出する。従って、このアッセイの蛍光は死細胞を表している。次いで、96ウェルプレートを、InfiniteF200ルミネッセンスリーダーにおいて分析した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ペプチドは、非改変ペプチドと比較した時に、その生物学的活性を保持していることが分かる。CytoToxGloアッセイのIC50値は、非改変ペプチドについては328μM、ジゴキシゲニン化ペプチドメリチンについては398μMであった。Fallv1およびFallv2の活性は、ジゴキシゲニンと結合体化された時に同様に保持された。従って、ジゴキシゲニン化は生物学的活性を妨げなかった。本発明者らは、メリチン、FALLv1、およびFALLv2ペプチドのジゴキシゲニン化がこれらの生物学的活性を妨げないと結論づけた。ハプテンとの共有結合だけでなく、ペプチドと大きな抗体分子との複合体形成もペプチドの生物学的活性に影響を及ぼすことがある。IgG由来分子は大きなタンパク質であるので、このような分子がペプチドの到達を立体的に妨げる可能性があり、従って、生物学的活性を妨げる可能性があることは経験的に排除することができない。この話題に対処するために、本発明者らは、細胞傷害性ペプチドFALLv1およびFam5bに対するペプチド抗体複合体のインビトロ活性を分析した。再度、本発明者らは、これらのペプチドには腫瘍細胞株に対する細胞傷害性があるという事実を利用し、従って、前記のように細胞傷害アッセイおよび生存アッセイにおいてペプチドの機能を試験した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ペプチドは、ジゴキシゲニン結合抗体誘導体と複合体を形成した時にその生物学的活性を保持することが分かった。さらに、本発明者らは、このようなペプチドを腫瘍細胞に標的化するために二重特異性抗体を利用した時に、非標的化細胞と比較して、標的化細胞に対してペプチドによって媒介される高い細胞傷害性を示すことができた。表2非改変ヒト由来ペプチドおよびジゴキシゲニン化ヒト由来ペプチドの細胞傷害抗力非改変Cy5およびジゴキシゲニン化Cy5の蛍光活性Cy5のジゴキシゲニン化によってCy5の蛍光特性が変わるかどうか評価するために、本発明者らはCy5の励起スペクトルおよび発光スペクトルを比較し、これを、新たに作製されたDigCy5のスペクトルおよび二重特異性抗体との複合体内にあるDigCy5と比較した。表3は、これらの分析の結果をまとめたものである。Cy5とジゴキシゲニンとの結合体化ならびにDigCy5と抗体との複合体形成によってCy5の蛍光特性は妨げられない。表3非改変フルオロフォアCy5およびジゴキシゲニン化フルオロフォアCy5および複合体を形成したフルオロフォアCy5の蛍光非改変PYY由来ペプチドおよびジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドならびにIgGとの複合体の生物学的活性の比較PYY由来ペプチドの望ましい機能は、そのコグネイト受容体NPY2に結合し、そのコグネイト受容体NPY2のシグナル伝達を妨害することである。NPY2受容体を介したシグナル伝達は代謝プロセスに関与する、およびまたは代謝プロセスを調節する。ペプチドmoPYYをジゴキシゲニンで改変してDIGmoPYYを作製することによって、この活性が影響を受けるかどうか評価するために、本発明者らは、NPY2受容体を発現するHEK293細胞において、フォルスコリン刺激によるcAMP蓄積をDIGmoPYYが阻害する能力を評価した。同時に、本発明者らは、ジゴキシゲニン化に使用した位置と同じ位置においてPEGで誘導体化されたmoPYYペプチドの活性を評価した。図7は、PYY、そのY2受容体特異的改変類似体moPYY、そのDig改変変種DIGmoPYY、ペグ化変種PEGmoPYY、および抗体と複合体を形成したDig変種の生物学的活性を評価するために実施されたcAMPアッセイの結果を示す。cAMPアゴニストアッセイのために、以下の材料384ウェルプレートTropixcAMPScreenKitcAMPELISASystemフォルスコリン細胞HEK293hNPY2R増殖培地ダルベッコ改変イーグル培地10胎仔ウシ血清、熱失活1ペニシリンストレプトマイシン500μgmLG418およびプレーティング培地DMEMF12woフェノールレッド10FBS、熱失活1ペニシリンストレプトマイシン500μgmLG418を使用した。アッセイを行うために、初日に培地を捨て、単層細胞をフラスコ1個あたり10mLのPBSで洗浄した。PBSと共にデカントした後に、5mLのVERSENEを用いて、細胞を除去した。フラスコを軽くたたき、細胞懸濁液をプールした。それぞれのフラスコを10mLプレーティング培地でリンスし、1000rpmで5分間、遠心分離した。懸濁液をプールし、カウントした。懸濁液を、HEK293hNPY2Rの場合、20105細胞mLの密度でプレーティング培地に再懸濁した。50マイクロリットルの細胞を、Multidropディスペンサーを用いて384ウェルプレートに移した。プレートを37°Cで一晩インキュベートした。2日目に、細胞を75~85コンフルエンスになっているかどうかチェックした。培地および試薬を室温にした。希釈液を調製する前に、ジメチルスルホキシドに溶解した刺激用化合物の原液を32°Cになるまで5~10分間、温めた。希釈液は、05mM3イソブチル1メチルキサンチンおよび05mgmLBSAを含むDMEMF12に溶解して調製した。刺激用培地に溶解した最終DMSO濃度は11であり、フォルスコリン濃度は5μMであった。細胞プレートをペーパータオルの上でそっと逆さにして、細胞培地を取り出した。ウェル1つにつき50μLの刺激用培地を入れた。プレートを室温で30分間インキュベートし、毒性について細胞を顕微鏡下でチェックした。30分間の処理後に、刺激用培地を捨て、50μLウェルのアッセイ溶解緩衝液を添加した。プレートを37°Cで45分間インキュベートした。20μLの溶解産物を、刺激用プレートから、Tropixキットのプレコーティング済み抗体プレートに移した。10μLのAP結合体および20μLの抗cAMP抗体を添加した。1時間振盪しながら、プレートを室温でインキュベートした。次いで、プレートを、洗浄1回につきウェル1つあたり70μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した。プレートをたたいて乾燥させた。30μLウェルのCSPDSaphireIIRTU基質エンハンサー溶液を添加し、RTで45分間インキュベートした。1ウェルにつき1秒間のシグナルをルミノメーターにおいて測定した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ペプチド誘導体DIGmoPYYはmoPYYの活性の大部分を保持していることが分かる。cAMPアッセイのIC50値は、非改変ペプチドについては0012nM、改変類似体moPYYについては012nM、ジゴキシゲニン化ペプチドDIGmoPYYについては042nMであった。従って、ジゴキシゲニン化は生物学的活性に対してわずかな影響しか及ぼさなかった。大きなIgGとの複合体形成はDigペプチドの活性に対してある程度の影響を及ぼしたが、Digペプチドは有意な活性を依然として保持した。cAMPアッセイのIC50値は、ペプチド抗体複合体については24nMであった。他のPYY誘導体もまた、cAMPアッセイにおいて証明された時にインビトロで生物活性を示し、抗Digペプチド複合体に有用なペプチドである。インビトロ結果であるEC50をまとめたものを以下の表に示した。表4cAMPアッセイにおけるPYY誘導体のインビトロでの生物活性実施例8ジゴキシゲニン化抗体と複合体を形成したmoPYYペプチドは細胞培養実験においてペグ化moPYYペプチドより優れた効力を有する。PEGとペプチドとの共有結合によってペプチドの機能は妨げられることが多く、従って、ペプチドの活性は低下する。例えば、取り付けられるペプチドより長いことが多いPEG鎖はペプチドに巻き付き、それによって、極めて重要な領域の到達を防ぐ可能性がある。ハプテンとの共有結合だけでなく、ペプチドと大きな抗体分子との複合体形成も生物学的活性に影響を及ぼす可能性がある。IgGがPEG鎖のようにペプチドに巻き付き、それによって、極めて重要な領域の到達を防ぐことができるのはまずないように思われる。しかしながら、IgGは大きなタンパク質であるので、このような分子がペプチドの到達を立体的に妨げ、従って、生物学的活性を妨げる可能性があることは経験的に排除することができない。この話題に対処するために、本発明者らは、PYY由来ペプチドを対象にして、ペプチドとそのコグネイト受容体との相互作用を扱うcAMPアッセイにおいて、ペプチドIgG複合体のインビトロ活性とPEGペプチドのインビトロ活性を比較した。これらのアッセイの結果から、ジゴキシゲニン化ペプチドはそのペグ化対応物より優れた活性を保持していることが分かる。cAMPアッセイのIC50値は、ジゴキシゲニン化ペプチドDIGmoPYYについては042nMであった。対照的に、PEGmoPYYと同じ位置においてペグ化を行うと、抗力が大幅に低下した分子が生じた。このことから、PYY類似体ペプチドのジゴキシゲニン化は、同じ位置にあるペグ化と比較してPYY類似体ペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさないことが分かる。さらに、Digペプチド対PEGペプチドの効力の改善は、抗体と複合体を形成した時にも依然として見られる。cAMPアッセイのIC50値は、ペプチド抗体複合体については24nMであったのに対して、ペグ化ペプチドについては10nMであった。従って、インビトロでのDigペプチド抗体複合体の生物学的活性はインビトロでのPEGペプチドと比較して4倍優れていた。実施例9ジゴキシゲニン化Cy5またはジゴキシゲニン化moPYYペプチドとIgGとの複合体の血清安定性および血清中レベル本発明者らのペプチド改変技術の目的は、ペプチドの治療適用性を改善することである。ペプチドを治療に適用する主なボトルネックは、現在、インビボでの限定された安定性ならびにまたは短い血清半減期および速いクリアランスである。抗体とハプテン標識ペプチドとの複合体形成がこれらの問題を克服し得るかどうか評価するために、本発明者らは、インビボでの抗体とフルオロフォアまたはペプチドの複合体のPKパラメータを求め、これらと非改変化合物のPKと比較した。このために、本発明者らは、ジゴキシゲニン結合IgGにジゴキシゲニン化フルオロフォアDigCy5またはジゴキシゲニン化DigPYYペプチド誘導体を装填する複合体を形成しなかった化合物および複合体を形成した化合物を動物に適用する、ならびにこれらの動物において化合物の血清中濃度を経時的に分析する必要があった。DigCy5およびDIGmoPYYとの複合体の調製DigCy5複合体を作製するために、8861nmolの凍結乾燥DIGCy5を4つの部分に分けて、ゆっくりと振盪しながら、20mMヒスチジン140mMNaClpH60に溶解した4464nmol抗DIG抗体にRTで1時間以内に添加した。最後の部分を添加した後に、試料を計2時間インキュベートした。DIGPYY複合体の場合、6917nmolの凍結乾燥DIGPYYを、20mMヒスチジン140mMNaClpH60中の364nmolの抗DIG抗体に添加し、DIGCy5複合体と同様に処理した。試料を、移動相として20mMヒスチジン140mMNaClpH60を用いてSuperdex200HiLoad1660prepgradeサイズ排除カラムに適用した。複合体を含有する画分をプールし、遠心濾過装置を用いて194mgmlおよび199mgmlまで濃縮した。DIGCy5含有試料のタンパク質濃度を、式x希釈率εによって求めた。CFは、0008と求められた補正率A280nmA649nmである。抗体へのDIGCy5のローディングは、式x希釈率を用いて12モルDIGCy5モル抗体と計算された。DIGPYY複合体のローディングはSECMALLSによって求められ、結果として11のDIGPYY抗体比となった。全ての試料を、無菌条件下でPVDF注射器フィルターを用いて濾過した。静脈内適用後、様々な時点で、インビボでの複合体を形成したDigCy5および複合体を形成しなかったDigCy5の血清中濃度の決定抗体と低分子蛍光基質との複合体形成のPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン140mMNaClpH60に溶解した321nmolのDIGCy5または対応する抗体複合体化化合物を、それぞれの物質について2匹の雌マウスに適用した。マウスの体重は、抗体複合体の場合、24g、25g、複合体を形成しなかったDIGCy5の場合、24gおよび25gであった。以下の時点マウス1については008時間、2時間、および24時間、マウス2については008時間、4時間、24時間の後に、約01mlの血液試料を収集した。RTで1時間後に、遠心分離によって少なくとも40μlの血清試料を入手した。血清試料を80°Cで保管した。所定の時点での血清中の化合物の量を求めるために、本発明者らはDigCy5の蛍光特性を利用した。血清試料中のCy5関連蛍光を、CaryEclipse蛍光分光光度計を用いて120μl石英キュベット中で室温で測定した。励起波長は649nmであり、発光を670nmで測定した。適切な発光強度範囲に達するように、血清試料を1xPBSで希釈した。それぞれの試料と同じように1xPBSで希釈した未処置マウス血清をブランクプローブとして使用した。図8および表4は、注射5分後の血清中レベルに対して基準化されたCy5媒介蛍光の相対レベルとして表された、これらの分析の結果を示す。さらに小さな分子量の化合物について予想されたように、複合体を形成しなかったDigCy5は血清から急速になくなる。注射2時間後、適用され、かつ血清中に5分後に検出可能な蛍光の5未満しか検出できなかった。さらに後の時点である注射4時間後および24時間後では、Cy5媒介シグナルは検出できなかった。このことから、化合物は循環から急速に除去されたことが分かる。複合体を形成しなかった化合物とは対照的に、抗体と複合体を形成した化合物は高レベルかつ後の時点で検出可能であった。注射2時間後、依然として、適用された蛍光の約70が血清中に検出可能であった。後の時点でも有意なCy5媒介蛍光レベルが検出可能であり、4時間で5分値の約60が検出可能であり、注射24時間後で約40が検出可能であった。このことから、抗体複合体形成は低分子化合物の血清半減期を有意に延ばすことが分かる。表5複合体を形成しなかったDigフルオロフォアおよびDigペプチドならびに抗体と複合体を形成したDigフルオロフォアおよびDigペプチドのPKパラメータ静脈内適用後、様々な時点での、インビボでの複合体を形成したDigペプチドおよび複合体を形成しなかったDigペプチドの血清中濃度の決定抗体とジゴキシゲニン化ペプチドとの複合体形成のPKパラメータに及ぼす影響を分析するために、20mMヒスチジン140mMNaClpH60に溶解した321nmolのペプチドDIGmoPYYまたは対応する抗体複合体化ペプチドを、それぞれの物質について2匹の雌マウスに適用した。マウスの体重は、DIGmoPYYの場合、23gおよび25g、DIGmoPYYの場合、28gおよび26gであった。以下の時点マウス1については008時間、2時間、および24時間、マウス2については008時間、4時間、24時間の後に、約01mlの血液試料を収集した。RTで1時間後に、遠心分離によって少なくとも40μlの血清試料を入手した。血清試料を80°Cで保管した。所定の時点での血清中のジゴキシゲニン化ペプチドの量の測定はDigCy5より難しいことが判明した。この理由は、本発明者らには血清試料中のペプチドを検出する直接的な手段が無かったことにあった。従って、本発明者らは、血清中のジゴキシゲニン化ペプチドを検出するウエスタンブロット関連アッセイを考案した。第1の工程では、血清試料を還元SDSPAGEによって分離した。このための試料調製は高濃度のSDSおよび還元剤に血清を曝露することを含んだので、DigペプチドをIgGから放出することができる。抗体複合体からのペプチドの放出を媒介し、SDSPAGEによっつてペプチドを分離するために、2μlのそれぞれの血清試料を18μlの20mMヒスチジン140mMNaClpH60で希釈し、67μlの4xLDS試料緩衝液および3μlの10x試料還元剤と95°Cで5分間、混合した。対照として、同じ系統の未処置マウスの血清2μlを使用した。試料を4~12BisTrisゲルに適用し、ランニング緩衝液として1xMESを用いて200V120mAで20分間、移動させた。その後に、分離したタンパク質およびペプチドを、XCellSureLockMiniCellシステムを用いてPVDF膜に25V130mAで40分間ブロットした。膜を、1xPBS1Tween20に溶解した1スキムミルクでRTで1時間ブロックした。その後に、ジゴキシゲニン化ペプチドを、抗ジゴキシゲニン抗体を用いて膜上で検出した。このために、1スキムミルクPBST10mlに溶解した13μgmlの濃度の抗ジゴキシゲニン抗体MAKM1911IgGを膜にRTで2時間、適用した。膜を1xPBSTで3x5分間、洗浄した。LumiLightPLUSウェスタンブロッティングキットのPODにカップリングさせた抗マウスIgGFab断片を、1スキムミルクPBST10mlで125に希釈してRTで1時間、適用した。膜を1xPBSTで3x5分間、洗浄した。検出は、4mlのLumiLightウェスタンブロッティング基質中で膜をRTで5分間インキュベートすることによって行った。化学ルミネセンスをLumiImagerF1によって検出した。曝露時間は20分であった。本発明者らの分析の結果を図9および表4に示した。血清中のタンパク質濃度が高く、Digペプチドのサイズがかなり小さかったために、ウエスタンブロット由来シグナルの正確な定量は保証されない。さらに、ウエスタンブロットから派生した技法は定量データではなく定性データを提供する。それにもかかわらず、これらの技術上の制約にもかかわらず、本発明者らは、様々な時点でマウス血清中のDigペプチドの存在を証明することができた。抗体と複合体を形成したペプチドが与えられたマウスは最も早い時点で強いシグナルを示した。ブロット上での対照ペプチドのサイズおよび場所により示されたように、これらのシグナルは、はっきりとペプチドのものとみなすことができた。これらの血清試料中で、高質量のさらなるシグナルも目に見えた。これらは血清中に存在するペプチドであり、本発明者らのアッセイにおける異常な電気泳動挙動を示しているのかもしれない。抗体と複合体を形成したペプチドで処置されたマウスの血清中に、ペプチド関連シグナルは初期の時点で最も強く、時が経つにつれて減少した。それにもかかわらず、全ての時点および投与して24時間後でさえも、良好なシグナルによりペプチドは依然として検出可能であった。対照的に、複合体を形成しなかったペプチドが与えられたマウスでは、放出された小さなペプチドのものとみなすことができるシグナルは、最も早い時点でもほとんど検出することができなかった。図9Bは、正常な露出条件下ではブロット上に遊離ペプチドがほとんど目に見えないことを示す。ブロットのコントラスト強調および長い露出時間は、投与5分後に、いくらかのペプチドの存在を証明することができるが、微量にしか証明することができない。もっと後の時点では、規定されたペプチドのバンドはコントラストを強調しても検出することができない。さらに、複合体を形成しなかったペプチドが与えられたマウスにおいて、さらに高質量のさらなるシグナルもかなり弱かった。これらの実験から、本発明者らは、複合体を形成しなかったペプチドのマウス血清中の半減期は非常に短いと結論づけた。対照的に、同じペプチドであるが、抗体と複合体を形成した形のペプチドが与えられたマウスは、かなり長期間にわたって血清中にこれらのペプチドの存在を示す。注射して24時間後でさえも、これらのマウスの血清中にペプチドをはっきりと特定することができる。従って、抗体複合体形成は低分子蛍光化合物の薬物動態を改善するだけでなく、ジゴキシゲニン化ペプチドの薬物動態も改善する。実施例10ジゴキシゲニン化PYY由来ペプチドとIgGとの複合体のインビボ活性説明されたペプチド改変技術の目的はペプチドの治療適用性を改善することである。ペプチドを治療に適用する主なボトルネックは、現在、インビボでの限定された安定性ならびにまたは短い血清半減期および速いクリアランスである。短い血清半減期および速いクリアランスは、その結果として、治療用ペプチドの治療抗力を限定することが多い。抗体とハプテン標識ペプチドが複合体形成すると、ペプチドを含む低分子化合物の血清半減期が延びるので、本発明者らは、このことが、複合体を形成しなかったペプチドと比較して、抗体と複合体を形成したペプチドの治療効力の改善につながる可能性があると考えた。この話題に対処するために、本発明者らは、ペプチド抗体複合体のインビボ生物学的活性を確かめ、これらと、複合体を形成しなかったペプチドのインビボ生物学的活性を比較した。これらの実験における食物摂取に及ぼすNPY2受容体アゴニストの影響を確かめるために、本発明者らは、DIOモデルにおいて、複合体を形成しなかったPYY由来ペプチドおよび抗体と複合体を形成したペプチドを動物に適用した。Jacksonlaboratoriesから入手した成獣雄C57B16マウスに対して実験を行った。肥満を誘導するために、マウスを、20週間にわたって高脂肪飼料の上に置いた。食事性肥満マウスを体重および24時間食物摂取によって選別し、一匹一匹、22°C、逆12時間明周期12時間暗周期で標準的なケージに入れ、これらの条件に少なくとも6日間、順応させた後に、実験を開始した。試験全体を通じて飼料および水を自由に与えた。暗周期の開始時にAbPYY3~37融合タンパク質およびビヒクル対照を注射し、食物摂取を、投与後96時間まで様々な時間間隔で測定した。複合体を形成しなかったペプチドmoPYYを1105μMolkgの濃度で適用した。抗体と複合体を形成したDIGmoPYYを062μMolkgの濃度で適用した。従って、抗体と複合体を形成したペプチドの注射モル濃度は、複合体を形成しなかったペプチドの注射モル濃度の117未満であった。ペプチドチロシンチロシンまたは膵臓ペプチドYYショートPYY類似体moPYYはNPY受容体ファミリーのY2受容体に結合し、それによって、NPY受容体ファミリーのY2受容体を調節する。PYYは、食事に反応して回腸および結腸の中の神経内分泌細胞によって分泌される。これは胃運動低下を阻害し、消化効率および栄養分吸収効率を増大させ、おそらくY2受容体によって媒介される食欲を低下させることが示されている。PYYは食物摂取のバランスを取ることによってエネルギーホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしているので、このペプチドおよびその誘導体、例えば、moPYYまたはPEGmoPYYまたはDIGmoPYYはII型糖尿病または肥満の治療に有用な可能性がある。このペプチドは、おそらくY2受容体によって媒介される食欲を低下させることが示されているので、そのインビボ活性は、DIOモデルにおける食物摂取を確かめることによって評価することができる。それによって、ペプチドによって媒介される活性は食物摂取の減少に反映される。食物摂取の減少は治療効力を示し、食物摂取の変化または摂取の増加があっても低い効力または不活性に対応しない。これらの試験の結果を図10および図11に示した。図10および図11では、非処置動物の食物摂取の差違を、複合体を形成しなかったペプチドで処置したマウスおよび抗体と複合体を形成したペプチドが与えられたマウスと比較した。示されたデータから、複合体を形成しなかったペプチドを適用しても、この動物モデルにおける食物摂取はほとんど影響を受けないことが証明された。対照的に、抗体と複合体を形成したペプチドを適用すると、処置動物の食物摂取は数時間から数日の期間にわたって著しく低下した。このことから、抗体と治療用ペプチドとの安定した複合体形成は治療用ペプチドの治療効力を著しく改善できることが証明された。