"適切なPCR条件下において、BRAF遺伝子の突然変異位置の上下流200個以内のヌクレオチドと結合する、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマー。前記プライマーが、上流プライマーおよび下流プライマーからなる、請求項1に記載のプライマー。適切なPCR条件下において、BRAF遺伝子の突然変異位置の塩基配列と特異的に結合する、蛍光定量PCRのプローブ。前記プローブの5’末端に蛍光発光物質が結合され、3’末端に蛍光消光物質が結合される、請求項3に記載のプローブ。検出しようとするBRAF遺伝子の野生型配列を含む、プラスミド。前記プラスミドに含まれるBRAF遺伝子の野生型配列が配列番号13である、請求項5に記載のプラスミド。検出しようとするBRAF遺伝子の突然変異型配列を含む、プラスミド。前記プラスミドに含まれるBRAF遺伝子の突然変異型配列が配列番号14である、請求項7に記載のプラスミド。以下から選択される試薬、すなわち請求項1または2に記載のプライマー、請求項3または4に記載のプローブと、請求項5および/または7に記載のプラスミドを含む、BRAF遺伝子突然変異の定量検出キット。プライマーおよびプローブの比率が2:1~10:1であり、順方向および逆方向プライマーの比率が1:3~3:1である、請求項9に記載のキット。本発明が解決しようとする問題は、BRAF遺伝子突然変異の定量検出キットを提供することである。BRAF遺伝子の600位のアミノ酸コドンであるGTG塩基が、GAG塩基に突然変異した状態を定量的に検出する。上述の問題を解決するために、本発明はTaq酵素、10×Taq緩衝液、MgCl2、dNTPミックス、BRAF遺伝子の突然変異部位の配列を特異的に増幅することができるPCRプライマーと、野生型および突然変異型の配列を特異的に識別することができるプローブを含む定量検出キット、ならびに以下に示す検出方法を提供する。1BRAF遺伝子の600位のコドンの突然変異部位付近に、それぞれ上下流プライマーを設計し、各突然変異部位の突然変異状態に基づき、特異的なプローブを設計する。このプローブは、BRAFの特定部位の野生型または検出しようとする突然変異型の配列と特異的に結合することができ、それにより、この部位に検出しようとする遺伝子の突然変異が生じているかどうかを確定する。2検出されるBRAF突然変異の比率を正確に定量するために、本発明は標準品を設計する。3被験検体および標準品に対し、蛍光定量PCRを行って検出する。4標準品の検出結果から、定量に用いる標準曲線が得られ、標準曲線から、被験検体の核酸のBRAF遺伝子突然変異が、BRAF遺伝子全体に占める比率を算出する。前記ステップ1の前に、被験検体中の核酸の抽出、精製、および濃度の測定が行われることをさらに含む。蛍光定量PCRは、適切なPCR条件下において、使用したプローブと、BRAF遺伝子の突然変異位置の塩基配列との特異的な結合を検出する。前記プローブは、好ましくは5’末端に蛍光発光物質が結合され、3’末端に蛍光消光物質が結合される。前述した蛍光発光物質はFAM、TET、HEX、ROXから選択され、前述した蛍光消光物質はBHQ、TAMARAから選択される。好ましくは、前記蛍光発光物質はFAMであり、前述した蛍光消光物質はBHQである。前記プローブの配列は、好ましくは配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12である。前記標準品は、少なくともプラスミド、ゲノムDNAまたは化学的に合成された配列のうちの1種を含む。好ましくは、前記標準品は、野生型プラスミドおよび/または突然変異型プラスミドを含み、このうち野生型プラスミドはBRAF遺伝子の野生型配列を含み、突然変異型プラスミドはBRAF遺伝子の突然変異型配列を含む。さらに好ましくは、前記標準品は野生型プラスミドおよび/または突然変異型プラスミドからなる。前記被験検体には、新鮮組織、パラフィン包埋組織、細胞株、血液、胸膜滲出液、腹膜滲出液、唾液、消化液、尿、糞便が含まれる。前記プライマーは、上流プライマーおよび下流プライマーからなる。前記プライマーは、好ましくは配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6である。前述したBRAF遺伝子突然変異の定量検出キットは、以下から選択される試薬、すなわち上述したようなプライマー、プローブおよび標準品を含む。前記キットは、好ましくはさらにTaq酵素、10×Taq緩衝液、MgCl2、dNTPミックスを含む。好ましいプライマーおよびプローブの比率は2:1~10:1であり、好ましい順方向および逆方向プライマーの比率は1:3~3:1である。標準品は、上述したプラスミドが一定の比率に応じて混合されたものが含まれ、野生型プラスミドおよび突然変異型プラスミドの含量の比率は、それぞれ0~100である。以下の実施例は、関連するいかなる実施も当業者に提供し、さらに本発明の完全な開示および記載に使用される。なおかつこれらの例は、出願人が考える発明の範囲を制限するものではなく、下文の実験もまた、実施されたすべての実験を指すものではなく、ただ実施することができる実験であるのみである。実施例において、具体的条件を明記していない実験方法は、通常、通例の条件、例えば分子クローニング実験マニュアル第3版SambrookJ.に基づくか、またはメーカー推奨の条件に基づく。ヒトの新鮮腫瘍組織、パラフィン包埋組織、末梢血、胸水、ヒト細胞系ゲノムDNAの抽出我々が検査を行ったヒト癌細胞系には、非小細胞肺癌NSCLCA549、H460、H838およびH1703、乳癌MCF-7、BT474およびHuL100、悪性中皮腫細胞系H513、H2052、H290、MS-1およびH28、甲状腺癌KAT10、結腸癌細胞系SW480、S1-M1-80、頭頸部癌細胞系U87、子宮頸癌Hela、肉腫細胞系Mes-SA、Saos-2およびA204が含まれる。検査を行ったヒトの新鮮腫瘍組織、末梢血、パラフィン包埋組織には、NSCLC、中皮腫、結腸癌、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、甲状腺癌、悪性癌および卵巣癌が含まれる。標本のDNA抽出Qiagen社、Promega社、Roche社のDNA抽出キットを使用して検体のゲノムDNAを抽出することができ、Gene社のNanodropND1000型核酸微量測定器を使用し、抽出したDNAの濃度および純度を測定したOD260/OD280は約1.8、OD260/OD230は2.0より大きい。以下に、Promega社のDNA抽出キットを例とし、検体DNAの抽出手順を紹介する。1.新鮮組織のDNA抽出1はさみで大豆ほどの大きさに組織を切り取り、乳鉢に入れた。組織をせん断し、液体窒素を加えてすりつぶし、粉末にした。2あらかじめ冷却したライシス溶液600μlを乳鉢に入れ、1mlのピペットチップで6回ピペッティングを行い、できるだけ組織粉末およびライシス溶液を混合させた。混合物を1.5mlEPチューブに移し、転倒混和を6回行って混合した後、65°Cで20分間水浴に入れた。3RNaseを3μl加え、転倒混和を6回行って混合し、37°Cで20分間水浴に入れた。4室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を200μl加え、転倒混和を6回行って混合した。氷上に5分間放置した後、13,000×g、室温で4分間遠心分離を行った。5事前に600μlのイソプロパノール室温を入れた新しいEPチューブに上清を移し、6回穏やかに混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。6上清を捨て、沈殿に70エタノール室温を600μl加え、転倒混和を6回行って混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。7エタノールを除去し、15分間空気乾燥させた。8沈殿に40μlのDNA溶解液を加え、65°Cで1時間または4°Cオーバーナイトでインキュベートした。2.パラフィン包埋組織のDNA抽出11mgまたは1mgより小さい組織を1.5mlの遠心分離チューブに入れた。2新鮮なインキュベーション緩衝液/プロテイナーゼK溶液100μlを調製して加えた。検体の種類に基づき、56°C、オーバーナイトでインキュベートした。3インキュベートした検体チューブを取り出し、2倍体積量のライシス緩衝液を加えた。4樹脂が完全に懸濁するまで、ボルテックスミキサーで10秒間樹脂を撹拌し、完全に懸濁した樹脂を7μl加えた。ボルテックスミキサーで3秒間撹拌後、室温で5分間インキュベートした。5ボルテックスミキサーで2秒間撹拌し、チューブをMagneSphere登録商標磁気分離スタンドに置いた。すぐに磁気分離を行った。6チューブの壁の樹脂には触れないように、すべての溶液を注意深く除去した。7ライシス緩衝液を100μl加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、ボルテックスミキサーで2秒間撹拌した。8チューブを磁気分離スタンドに戻し、全てのライシス溶液を除去した。9調製した1×洗浄液を100μl加え、磁気分離スタンドからチューブを取り外し、ボルテックスミキサーで2秒間撹拌した。10チューブを磁気分離スタンドに戻し、全ての洗浄液を除去した。11ステップ9および10を2回繰り返し、全部で3回洗浄を行い、最後の1回の洗浄を確実に行った後、全ての液体を除去した。12蓋を開けてチューブを磁気分離スタンドに置き、空気中で5分間乾燥させた。13溶出液を25μl加えた。14チューブの蓋を閉め、ボルテックスミキサーで2秒間撹拌した。65°Cで5分間インキュベートした。15インキュベートしたチューブを取り出し、ボルテックスミキサーで2秒間撹拌した。すぐに磁気分離スタンドに置いた。16DNA溶液を選択した容器に注意深く移した。3.全血のDNA抽出1抗凝固全血を300μl採取し、細胞ライシス溶液を900μl加え、1mlのピペットチップでピペッティングを6回行って混合し、できる限り全血および細胞ライシス溶液を混合させた。室温に10分間放置し、その間に1mlピペットチップでピペッティングを3回行って混合した。213,000×g、室温で20秒間遠心分離を行った後、上清を捨て、激しく振盪した。あらかじめ冷却したライシス溶液を300μl加え、沈殿が完全に溶解するまで1mlのピペットチップでピペッティングを行い混合した。3RNaseを1.5μl加え、転倒混和を6回行って混合し、37°Cで20分間水浴に入れた。4室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を100μl加え、転倒混和を6回行って混合した。氷上で5分間放置した後、13,000×g、室温で4分間遠心分離を行った。5事前に300μlのイソプロパノール室温を入れた新しいEPチューブに上清を移し、6回穏やかに混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。6上清を捨て、沈殿に70エタノール室温を1ml加え、転倒混和を6回行って混合し、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。7エタノールを除去し、15分間乾燥させた。8沈殿にDNA溶解液を40μl加え、65°Cで1時間または4°Cオーバーナイトでインキュベートした。4.胸水のDNA抽出1胸水5mlを採取し、2000rpm、室温で10分間遠心分離を行った。上清を回収し、細胞ライシス溶液を1ml加え、転倒混和を6回行って混合し、室温に10分間放置した。213,000×g、室温で20秒間遠心分離を行った後、上清を捨て、激しく振盪し、あらかじめ冷却したライシス溶液を1ml加え、沈殿が完全に溶解するまで混合した。3RNaseを3μl加え、転倒混和を6回行って混合し、37°Cで20分間水浴に入れた。4室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を200μl加え、転倒混和を6回行って混合した。氷上で5分間放置した後、13,000×g、室温で4分間遠心分離を行った。5事前にイソプロパノール室温を5ml入れた新しいEPチューブに上清を移し、6回穏やかに混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。6上清を捨て、沈殿に70エタノール室温を1ml加え、転倒混和を6回行って混合し、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。7エタノールを除去し、15分間空気乾燥させた。8沈殿にDNA溶解液を40μl加え、65°C1時間または4°Cオーバーナイトでインキュベートした。5.細胞系のDNA抽出1少なくとも約1×106個の細胞を採取し、1.5mlのEPチューブに移して、13,000×g、室温で遠心分離を10秒間行った。接着細胞の場合、細胞を採取する前にパンクレアチンで消化する必要がある。2上清を捨て、PBSを200μl加えて細胞を洗浄し、13,000×g、室温で遠心分離を10秒間行った後、上清を捨て、沈殿が混濁するまで激しく振盪した。3あらかじめ冷却したライシス溶液を600μl加え、細胞の塊が肉眼で見えなくなるまで、1mlのピペットチップでピペッティングを行って混合した。4RNaseを3μl加え、転倒混和を6回行って混合し、37°Cで20分間水浴に入れた。5室温まで冷却し、タンパク質沈殿剤を200μl加え、転倒混和を6回行って混合した。氷上で5分間放置した後、13,000×g、室温で4分間遠心分離を行った。6事前に600μlのイソプロパノール室温を入れた新しいEPチューブに上清を移し、6回穏やかに混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。7上清を捨て、沈殿に70エタノール室温を600μl加え、転倒混和を6回行って混合した後、13,000×g、室温で1分間遠心分離を行った。8エタノールを除去し、15分間空気乾燥させた。9沈殿にDNA溶解液を40μl加え、65°C1時間または4°Cオーバーナイトでインキュベートした。突然変異型および野生型の検出配列を含むプラスミド標準品の準備1.野生型プラスミドの構築図1、図21.1ベクターの準備TAクローニングベクターpMD18-Tは、TAKARA社から購入した。1.2インサートの準備PCR法を使用してインサートを調製した。PCRのテンプレートはステップ1で抽出した検体のゲノムDNAであり、反応系および増幅条件は下表のとおりである表1、表2、表3。表1:PCR反応系50μl表2:PCRプライマー表3:PCR増幅条件1.3QIAgenゲル回収キットを使用して目的断片を回収した後、TAクローニングにより、それをpMD18-TベクターTAKARA社より購入に挿入した。1.4新しく構築したプラスミドは、大腸菌DH5α株で大量に増幅させ、抽出、精製することにより得られた具体的な方法は《分子クローニング実験マニュアル》第3版、96~99、103頁を参照。1.5BamHIおよびHindIIIを利用して、ダブルダイジェストを行って確認した。1.6制限酵素消化の結果、陽性を呈した菌種のシーケンシングを行い、シーケンシングを正確に行った後、野生型の配列を含む標準品とした図3。2.突然変異型プラスミドの構築:突然変異部位の突然変異プライマーを設計し、DPNI法を利用して突然変異型配列を含む標準品が得られた。2.1必要な突然変異配列に基づき、突然変異部位の突然変異プライマーを設計した表4。表4:突然変異プライマー2.25ngの野生型プラスミドをテンプレートとし、突然変異プライマーおよびPfu酵素を使用して目的部位を突然変異させた。増幅系および条件は、表1、表4、表3に示す通りである。BRAF遺伝子コドン600のGTG→GAG突然変異配列を含むプラスミドの調製過程において、増幅系にBRAF-1-F配列番号7およびBRAF-1-R配列番号8プライマーを添加する必要がある。2.3DPNI酵素を使用してステップ2.2で得られた産物を処理し、37°Cで1時間インキュベートした後、産物を回収した。大腸菌DH5α株で大量に増幅させ、抽出、精製を行った。2.4BamHIおよびHindIIIを利用して、ダブルダイジェストを行い確認した。2.5制限酵素消化の結果、陽性を呈した菌種のシークエンシングを行い、シークエンシングを正確に行った後、突然変異型配列を含む標準品とした図4。甲状腺癌および大腸癌検体を例とした、ヒト細胞系、ヒトの新鮮腫瘍組織、末梢血、パラフィン包埋組織のゲノムDNAにおけるBRAF突然変異の検出1.蛍光定量PCR反応のテンプレートは、実施例1で抽出した甲状腺癌および大腸癌検体のゲノムDNAと、実施例2で調製した標準品であり、再蒸留水をネガティブコントロールとした。標準曲線を作成するため、標準品を1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlに2倍希釈した。2.反応系および反応条件は表2、表5、表6、表7であり、このうち標識プローブの蛍光発光物質はFAM、TET、HEX、ROXから選択し、蛍光消光物質はBHQ、TAMARAから選択した。表5:蛍光定量PCR反応系20μl/チューブBRAF遺伝子コドン600の突然変異状態の検出には、2つの系を構築する必要があるが、プローブが異なる以外、系に用いるその他の試薬は同じである。BRAF遺伝子コドン600の野生型遺伝子を検出する場合、系にBRAF-W-1配列番号9またはBRAF-W-2配列番号10プローブを添加する必要があり、BRAF遺伝子コドン600のGTG→GAG突然変異型遺伝子を検出する場合、系にBRAF-M-1配列番号11またはBRAF-M-2配列番号12プローブを添加する必要がある。表6:プローブ表7:増幅条件3.標準曲線の作成手順3の標準品から得られたCT値の結果に基づき、標準曲線を作成した。図5はプラスミド標準品の増幅曲線であり、図中、上昇した5本の曲線は、左から右に順次それぞれ0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μlに2倍希釈したプラスミド標準品の増幅曲線を表す。横軸はサイクル数を示し、縦軸は蛍光検出値を示す。ここから、さらに計算に用いる標準曲線を作成することができる図6。図6中、横軸はテンプレートのコピー数の対数値であり、縦軸はCT値である。このうちテンプレートのコピー数=質量/分子量×6.02×1023である。本実験において、プラスミドはpMD18-Tベクターおよびインサートからなり、インサートの塩基長は基本的に一致し、違っていても最大でわずか20数塩基の長さであり、PMD18-Tベクター2692bpの長さに相対して、影響は大きくないため、野生型および突然変異型プラスミドの標準品のコピー数の比≒質量の比である。4.標本BRAF遺伝子の特定の突然変異型の比率を計算する標準曲線に基づき、検体のCT値から反応した野生型および突然変異型のゲノムDNAのコピー数を求め、それにより突然変異型BRAFのDNAおよびBRAFのDNAの総量この部位の野生型にあらゆる突然変異型を加えたものの割合が得られる。図7に示すように、ある肺癌パラフィン包埋組織検体から検出された、BRAFコドン600の野生型のCT値は16.20であり図7A、GTG→GAG突然変異型は24.95であった図7B。それぞれ対応する標準曲線の公式図6から各々のコピー数を求めることができ、ここから突然変異型および野生型の含量の比が1:50であることがわかり、組織中の約2のBRAF遺伝子に、コドン600のGTG→GAG突然変異が生じていることが推測された。5.検出結果本実施例は、80例の甲状腺癌および大腸癌の組織、全血と、細胞系の標本に対してBRAF遺伝子突然変異の検出を行い、全部で8例に突然変異が生じていることが検出された。突然変異率、すなわちその検体中の突然変異遺伝子および非突然変異遺伝子の比率を表8に示す。表8:BRAF突然変異率"