"糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む、糖タンパク質の検出方法。前記糖鎖が複合型糖鎖又はO結合型糖鎖である、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、トランスフェリン、γ-グルタミルトランスペプチターゼγ-GTP、IgG、IgA、IgM、α1-酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、hCGヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、CEA癌胎児性抗原、及びPSA前立腺特異抗原からなる群から選ばれる一種である、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、担体に固定化されている、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項4に記載の糖タンパク質の検出方法。前記検出用レクチンは、標識されている、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。さらに、前記検出しようとする糖残基の全糖鎖又は糖タンパク質に対する付加率又は欠損率を求めることを含む、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キット。前記疾患が、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症、及び糖尿病からなる群から選らばれる少なくとも一種である、請求項8に記載の糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キット。糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の研究用試薬又は研究用キット。前記疾患が、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症又は糖尿病である、請求項10に記載の糖鎖変化と関連する疾患の研究用試薬又は研究用キット。レクチンは、シアル酸、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。今まで、特定の糖残基に親和性を有する植物や動物由来のレクチンが数多く発見されている。レクチンを用いた酵素免疫測定法レクチンELISAは、LectinsandGlycobiologyGabius,H.J.著、UPSTATEBOOKS刊行、Macedon,NY,U.S.A.、特開平10-311832、特開平08-285853、特開07-325083等に記載される公知の糖鎖分析手法である。レクチンELISAは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる、という長所を有する。しかし、従来のレクチンELISAは、本明細書の比較例が示すように、糖タンパク質の糖鎖構造の微量の変化を検出するには不十分である。現状のレクチンELISAで糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断することは困難である。そこで、本発明は、糖タンパク質の糖鎖構造の微量の変化を精度高く検出できる糖タンパク質の検出方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖鎖の糖残基に親和性を有する検出用レクチンと、その糖残基の近傍に位置する糖残基に親和性を有する競合用レクチンとが混在する系で糖残基を測定することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む、糖タンパク質の検出方法を提供する。本明細書において、糖タンパク質は、糖鎖を有するタンパク質を意味し、そして糖鎖を有するその断片は、糖鎖を有するペプチド、及び糖鎖自体を含む意味で使用する。糖タンパク質の糖鎖をその糖残基を認識するレクチン1種類で検出することは公知である。しかし、本発明のように、競合用レクチンと検出用レクチンとを混在させた系で糖残基を検出することは新規である。前記糖鎖は、特に複合型糖鎖又はO結合型糖鎖である。前記糖タンパク質は、例えばハプトグロビン、トランスフェリン、γ-グルタミルトランスペプチターゼγ-GTP、IgG、IgA、IgM、α1-酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、hCGヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、CEA癌胎児性抗原、及びPSA前立腺特異抗原からなる群から選ばれる一種である。前記糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、担体に固定化されていてもよい。前記糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。前記検出用レクチンは、標識されていることが好ましい。上記検出方法は、さらに、前記検出しようとする糖残基の全糖鎖に対する付加率又は欠損率を求めることを含むことが好ましい。本発明は、また、糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キットを提供する。前記疾患は、例えばアルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症、及び糖尿病からなる群から選らばれる少なくとも一種である。本発明は、また、糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の研究用試薬又は研究用キットを提供する。前記疾患は、例えばアルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症又は糖尿病である。本発明の糖タンパク質の検出方法によれば、糖残基量の微量の変化を検出することができ、従来のレクチンELISAと比べて分析精度が向上する。特に、糖鎖付加率の高い糖タンパク質の糖鎖の微量の変化が判別可能となる。これは、糖タンパク質から糖残基が欠損又は付加することによって異常や疾患が誘起される場合に疾患や異常の早期発見につながる。本発明によって微量の糖鎖変化が解析可能になるので、本発明が疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも大いに期待される。以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の検出方法は、糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片以下、単に糖タンパク質等ということがある、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む。本発明の検出対象となる糖鎖には、N結合型糖鎖及びO結合型糖鎖が含まれる。N結合型糖鎖には、下記式:式中、Manはマンノース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Fucはフコースを意味するで示されるコア構造に、シアル酸、ガラクトース及びN-アセチルグルコサミンで構成される側鎖N-アセチルラクトサミン構造、ポリN-アセチルラクトサミン構造が1~6本付加した複合型糖鎖、前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖、並びに複合型と高マンノース型とが混成した混成型糖鎖が含まれる。本発明は、特に複合型糖鎖の検出に向いている。複合型糖鎖を有する糖タンパク質の例を以下に示す。下記式:式中、Manはマンノース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Galはガラクトース、Neu5AcはN―アセチルノイラミン酸を意味するを有するトランスフェリンヒト。下記式:式中、Manはマンノース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Galはガラクトース、Neu5AcはN―アセチルノイラミン酸を意味するを有するハプトグロビンヒト。下記式:式中、Manはマンノース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Galはガラクトース、Fucはフコースを意味するを有するIgGヒト。本発明は、O結合型糖鎖の検出にも向いている。O結合型糖鎖を有する糖タンパク質の例を以下に示す。下記式:式中、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン、Galはガラクトース、Fucはフコース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを意味するを有するムチンブタ。下記式:式中、GalNAcはN-アセチルガラクトサミン、Galはガラクトース、Fucはフコース、Neu5AcはN―アセチルノイラミン酸、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを意味するを有するムチンウシ。本発明の検出対象となる糖残基には、シアル酸、ガラクトース、マンノース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、フコース等が含まれる。これらの糖残基は、健常者が通常有する糖鎖構造に対して付加するものであっても、又は欠損するものでもあってもよい。糖タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。そのような例には、ハプトグロビン、トランスフェリン、γ-グルタミルトランスペプチターゼγ-GTP、IgG、IgA、IgM、α1-酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、hCGヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン、CEA癌胎児性抗原、PSA前立腺特異抗原等が挙げられる。糖タンパク質の出所は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。本発明の検出方法に供する試料は、糖タンパク質以外に、その断片であっても糖鎖を有する限り、使用可能である。そのような断片には、糖ペプチドや糖鎖自体が挙げられる。その場合、糖タンパク質を、予め糖ペプチドや糖鎖の状態に加工してから使用する。前記糖タンパク質等は、必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。前記糖タンパク質等の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。前記糖タンパク質等は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。さらに、抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるFab、Fab’、Fab’2等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。上記の抗体等が検出用レクチンや競合用レクチンと反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、N-グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のFc部をペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素により限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。上記抗体の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体例えば抗トランスフェリン抗体の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。抗体の結合した担体に糖タンパク質等の溶液を添加することにより、糖タンパク質を抗原-抗体反応で結合させる。本発明で使用する検出用レクチンとは、糖タンパク質の糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有するレクチンを意味する。競合用レクチンとは、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有するレクチン、又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有するレクチンを意味する。競合用レクチンは、糖鎖変化と関連する疾患等に応じて決まる。例えば、特発性正常圧水頭症患者から採取したトランスフェリンに結合する糖鎖は、シアル酸とガラクトースの2個の糖残基の欠損によって、N-アセチルグルコサミン残基が露出している。検出用及び競合用レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常100mM以下、好ましくは10mM以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示す。赤血球凝集反応阻害試験法は、特許4514163フコースα1→6特異的レクチンに記載されている方法で行うことができる。特許4514163を参照のためにここに編入する。シアル酸に親和性を有するレクチンの例として、ニホンニワトコレクチンSSA、セイヨウニワトコレクチンSNA、イヌエンジュレクチンMAM、ヤナギマツタケレクチンACG、キカラスウリレクチンTJA-I、ムジナタケレクチンPVL、コムギ胚芽レクチンWGA等が挙げられる。好ましくは、ニホンニワトコレクチンSSA、セイヨウニワトコレクチンSNA、及びキカラスウリレクチンTJA-Iである。ガラクトースに親和性を有するレクチンの例としては、デイゴマメレクチンECA、ニガウリレクチンMCL、ムラサキモクワンジュレクチンBPL、ヒママメレクチンRCA120、ピーナッツレクチンPNAが挙げられる。好ましくは、デイゴマメレクチンECA、ニガウリレクチンMCL、及びムラサキモクワンジュレクチンBPLである。マンノースに親和性を有するレクチンの例としては、レンズマメレクチンLCA、コンカナバリンAConA、及びエンドウマメレクチンPSAが挙げられる。N-アセチルグルコサミンに親和性を有するレクチンの例としては、バンデリアマメレクチン-IIGSL-II、ムジナタケレクチンPVL、及びコムギ胚芽レクチンWGAが挙げられる。好ましくは、バンデリアマメレクチン-IIGSL-IIである。フコースと親和性を有するレクチンとして、ハリエニシダレクチンUEA-1、ミヤコグサレクチンLTA、レンズマメレクチンLCA、エンドウマメレクチンPSA、ヒイロチャワンタケレクチンAAL、ラッパスイセンレクチンNPA、ソラマメレクチンVFA、麹菌レクチンAOL、及びツチスギタケレクチンPTLが挙げられる。シアル酸欠損を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにシアル酸と親和性を有するレクチン、競合用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチンが好ましい。シアル酸付加を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチン、競合用レクチンにシアル酸と親和性を有するレクチンが好ましい。また、ガラクトース欠損を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチン、競合用レクチンにN-アセチルグルコサミンと親和性を有するレクチンが好ましい。検出用レクチンは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。標識手段の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRP、アルカリホスファターゼALP、β-D-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネートFITC、テトラメチルローダミンBイソチオシアネートTRITC、ローダミン、CyDye等の蛍光化合物、125I、3H、14C等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラッテクス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。セイヨウワサビペルオキシダーゼHRPの基質としては3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジンTMB、2,2’-アジノジ-[3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸]2アンモニウム塩-H2O2、5-アミノサリチル酸-H2O2、又はo-フェニレンジアミンOPD-H2O2、アルカリフォスターゼの基質としてはp-ニトロフェニルホスフェートPNPP又は4-メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ-D-ガラクトシダーゼの基質としてはo-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシドを挙げることができる。標識手段は、常法により検出用レクチンへ結合することができる。特に、標識をアビジン又はストレプトアビジン-ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。固定化された糖タンパク質、検出用レクチン及び競合用レクチンを反応させるために、検出用レクチン及び競合用レクチンを混在させた系に糖タンパク質を曝す。糖タンパク質と検出用レクチン又は競合用レクチンとの反応順序に特に限定はない。すなわち、同時に反応させても、任意の順序で反応させてもよい。好ましくは、固定化された糖タンパク質と競合用レクチンとを反応させた後、検出用レクチンを反応させる。上記反応の後、検出用レクチンを検出することにより、糖タンパク質の糖鎖量を測定する。検出用レクチンの検出方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。検出方法の例としては、レクチンELISA、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。表面プラズモン共鳴法は、担体に固定化した糖タンパク質量、及び、糖タンパク質に結合した検出レクチン量を多段階法で同時に測定できるので利便である。標識した検出レクチンの標識物量吸光度等等で表わした糖鎖量は、標準試料のものと対比することによって、その変化を察知することができる。例えば、検体の糖タンパク質濃度を一定値に調整すると、検出レクチンの測定結果は糖タンパク質に付加した特定の糖鎖量の変化を反映することになる。糖タンパク質の糖鎖量を健常者と患者との間で比較することにより、糖鎖変化に関連する疾患を従来よりも高い精度で診断できる。糖残基量の変化率糖付加や糖欠損の度合いを定量化することは、糖鎖変化と関連する疾患の診断、治療及び予防、研究等に大いに役立つ。糖の付加率を求めるには、予め、糖鎖末端の全位置に目的とする糖残基が付加した参照試料例えば、健常者の糖タンパク質や市販又は合成した試薬の全糖残基量を本発明の検出方法で測定する。糖残基量を、標識した検出レクチンの標識物量吸光度等で表わす。次いで、未知試料の糖残基量を本発明の検出方法で測定する。未知試料で測定された糖残基量を全糖残基量で除した値が糖付加率となる。糖付加率を1から減じたものが糖欠損率となる。糖鎖量の変化率は、測定試料の糖タンパク質量に対する糖鎖量の比で表してもよい。まず、糖タンパク質の量を吸光度、酵素結合免疫吸着法、ブラッドフォード法、ローリー法等で求めておく。糖付加率又は糖欠損率の導出に検量線を使用することは、測定作業の効率化の点で有利である。予め、目的糖残基量が既知で、糖残基量の異なる複数の標準試料を、本発明の検出方法で測定し、目的糖残基量と検出レクチンの標識物量吸光度等との関係を求め、検量線を作成しておく。目的糖残基量が未知の試料の標識物量吸光度等を本発明の検出方法で求め、標識物量を前記検量線に当てはめる。本発明は、また、糖タンパク質及び/又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも1個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キット、あるいは、研究用試薬又は研究用キットを提供する。上記診断薬又は診断薬キットあるいは研究用試薬又は研究用キットには、適宜、標識用化合物、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、標準タンパク質、緩衝液、溶解剤、洗浄剤、反応停止剤、プレート等の診断薬キットに使われるに公知のものを含む。糖鎖変化と関連する疾患は、特に限定されない。例えば、シアル酸残基の関与が指摘される疾患の例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、IgA腎症、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、心筋梗塞、繊維症、膵炎、糖尿病、糖タンパク質糖鎖転移不全症等がある。ガラクトース残基の関与が指摘される疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌等がある。N-アセチルグルコサミン残基の関与が指摘される疾患の例としては、特発性正常圧水頭症、肝癌等がある。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例1~3、比較例1~3シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別1実施例1~3では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチン及び競合用レクチン表2に示すガラクトース結合レクチンが混在する系で検出した。比較例1では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみが存在する系で検出した。比較例2~3では、検出用レクチン及び非競合用レクチン表2に示すマンノース結合レクチンが混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。1.レクチンの準備ビオチン標識ニホンニワトコレクチンBiotin-SSA、レンズマメレクチンLCA、デイゴマメレクチンECA及びコンカナバリンAConAは株J-オイルミルズ製を使用し、キカラスウリレクチン-ITJA-Iを生化学バイオビジネス社より、そしてニガウリレクチンMCLをシグマ社より購入した。セイヨウニワトコレクチンSNAを、BroekaertWF,et.al.,BiochemJ.1984、221、163-9に記載の精製方法に従って得た。ムラサキモクワンジュレクチンBPLを、YamamotoK,,et.al.,FEBSLett.1991、281、258-62に記載の精製方法に従って得た。上記SNA及びTJA-Iのビオチニル化を、Gabius,H.J.LectinsandGlycobiologyISBN:0387562117/0-387-56211-7P.142に記載の方法に従って行った。ビオチン標識したSNA及びTJA-Iを、それぞれBiotin-SNA及びBiotin-TJA-Iと略す。2.シアル酸率の異なるトランスフェリンの調製ヒト由来トランスフェリンシグマ社製を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0で2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridiumperfringens由来のノイラミニダーゼ和光純薬社製を5mU/mgトランスフェリンになるように添加した。溶液を37°Cの水浴で保温し、時間0分、1分、2分、5分、15分又は18時間後に一部をサンプリングした後、100°Cで1分間加熱して酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに100°Cで1分間加熱し、ノイラミニダーゼ未処理とした。上記で得たトランスフェリン溶液をそれぞれ等電点電気泳動PhastSystem:GEヘルスケアジャパン社製をかけて、シアル酸数の異なるトランスフェリンに分離した。分離したトランスフェリンをタンパク染色後、デンシトメーターアトー社製で染色強度を測定した。ノイラミニダーゼ未処理のトランスフェリンのシアル酸量を100として、染色強度から算出されたシアル酸量をトランスフェリンのシアル酸率とした。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表1に示す。上記シアル酸率の異なるトランスフェリンを、使用時まで冷凍保存した。3.レクチンELISAシアル酸率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度5μg/mlにて添加した溶液50μlを、マイクロタイタープレートヌンク社製のウエルに添加した。マイクロタイタープレートを37°Cで2時間、放置した後、250μlのリン酸緩衝化生理食塩水PBSで1回、洗浄した。BSA牛血清アルブミン、シグマ社製2gをリン酸緩衝化生理食塩水PBS198mlに溶解して得た1BSA溶液以下、1BSA-PBSと略すを150μl添加して、37°Cで2時間おくことによりブロッキングを行った。Tween20ナカライテスク社製1gをPBS2000mlに添加した溶液以下、PBS-Tween20と略す250μlでウエルを3回洗浄後、前記ガラクトース結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度1mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加して、室温で1時間放置した。前記検出用レクチンを濃度12.5μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間放置した。ウエルを250μlのPBS-Tween20で3回洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンベクター社製を濃度1μg/mlにて含有する1BSA-PBSを50μl添加して、室温で1時間放置した。ウエルを250μlのPBS-Tween20で3回洗浄後、TMB試薬KPL社製50μlを添加した。室温で5分放置後、1Mリン酸を50μl添加して反応を停止した。マイクロプレートリーダー製品名:POWERSCAN登録商標HT、DSファーマバイオメディカル社製で波長450nmの吸光度で測定した。検出用レクチンとしてのBiotin-SNAに競合用レクチンとしてのECA実施例1、MCL実施例2又はBPL実施例3が混在する系において、シアル酸率の異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度の変化を図1に示す。また、競合用レクチンが非混在比較例1の系の吸光度の変化も図1に示す。図1において、検出用レクチンのみが存在する比較例1では、トランスフェリンのシアル酸率が低い場合は、シアル酸率に依存して吸光度が増大する。しかし、シアル酸率が73以上となると、吸光度はほぼ一定となる。すなわち、競合用レクチンが非混在の系では、シアル酸率が73以上のトランスフェリンのシアル酸率の違いを区別できない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例1~3では、シアル酸率73以上であっても、シアル酸率に依存して吸光度が増加している。検出用レクチンと競合するレクチンが存在する実施例1~3では、シアル酸率が高いトランスフェリンのシアル酸率の違いを容易に区別できる。シアル酸率が91及び73のトランスフェリンの吸光度比OD91/OD73を、測定3回の平均値と標準偏差で表2に示す。さらに、それぞれの検出用レクチンにおいて、比較例1との有意差検定t検定の結果を示す。表中、はp<0.01を意味し、そしてはp<0.05を意味する。表2で、比較例1~3の吸光度比は1に近い。一方、実施例1~3の吸光度比は、1よりも有意に増大している。このことから、検出用レクチンに競合するレクチンを混在させた実施例のみで、トランスフェリンのシアル酸率の変化、特に高いシアル酸率での差を判別しやすくなることが実証された。実施例4、比較例4シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別2シアル酸率の異なるトランスフェリンを、抗体を介して固相化する以外は、実施例1と同様の手順で、トランスフェリンを競合用レクチン及び検出用レクチンが混在する系で反応させた。比較例4では、競合用レクチンが非混在の系で反応させた。以下に、具体的な手順を示す。1.レクチンELISA抗ヒトトランスフェリン抗体LNM社製を0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度5μg/mlにて溶かした溶液を50μl、マイクロタイタープレートヌンク社製のウエルに添加し、4°Cで一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。固相化マイクロタイタープレートのウエルを、250μlのPBS-Tween20で3回、洗浄した。シアル酸率の異なるトランスフェリンを濃度4μg/mlにて含有する1BSA-PBSを50μl添加し、室温で1時間保温した。ウエルを250μlのPBS-Tween20で3回、洗浄後、ECAを濃度1mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加し、室温で1時間保温した。更に、Biotin-SSAを濃度12.5μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間反応させた。HRP反応と発色を実施例1と同様に行った。検出用レクチンに競合用レクチンとしてのECAが混在する系において、シアル酸率が73及び91のトランスフェリンをそれぞれ検出したときの吸光度を図2に示す。また、競合用レクチンが非混在の系比較例4の吸光度も図2に示す。吸光度の有意差検定を行った。は、P<0.01を意味する。図2に示すとおり、競合用レクチンが非混在で反応させた比較例4では、シアル酸率91と73のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンに競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例4では、吸光度に有意差が見られたp<0.01。本発明によれば、トランスフェリンを、抗体を介して固相化した場合でも、高シアル酸率のトランスフェリン同士を判別できることが判明した。実施例5~7、比較例5~7シアル酸率の異なる糖鎖を有するハプトグロビンの判別実施例5~7では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるハプトグロビンを、検出用レクチン及び競合用レクチン表4に示すガラクトース結合レクチンが混在する系で検出した。比較例5では、前記ハプトグロビンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例6~7では、検出用レクチン及び非競合用レクチン表4に示すマンノース結合レクチンが混在する系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。1.シアル酸率の異なるハプトグロビンの調製ヒト由来ハプトグロビンBIODESIGN社製を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に2mg/mlになるように溶解した後、ここにArthrobacterureafaciens由来のノイラミニダーゼナカライテスク社製を0.5mU/mgハプトグロビンになるように添加した。溶液を37°Cの水浴で保温し、時間0分又は30分にサンプリングした後、10倍量の20mM炭酸ナトリウム溶液を加えて酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに10倍量の20mM炭酸ナトリウム溶液を加えてノイラミニダーゼ未処理とした。上記で得たハプトグロビンの単糖組成分析を、ABEE糖組成分析キットプラスS株J-オイルミルズ製を用いて行った。ノイラミニダーゼ未処理のハプトグロビンのシアル酸量を100として、ノイラミニダーゼ処理のハプトグロビンのシアル酸率として算出した。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表3に示す。上記シアル酸率の異なるハプトグロビンを使用時まで冷凍保存した。2.レクチンELISAシアル酸率の異なるハプトグロビンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレートヌンク社製に添加し、4°Cで一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。250μlのPBS-Tween20でウエルを3回洗浄後、前記ガラクトース結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度1mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加し、室温で1時間放置した。前記検出用レクチンを濃度12.5μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間放置した。HRP反応と発色を実施例1と同様に行った。検出用レクチンとしてのBiotin-SSAに競合用レクチンとしてのECA実施例5、MCL実施例6又はBPL実施例7が混在する系において、シアル酸率の異なるハプトグロビンを検出したときの吸光度を図3に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系比較例5の吸光度も図3に示す。シアル酸率100と85のハプトグロビンの吸光度の有意差検定を行った。は、P<0.01を意味する。図3において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の比較例5では、シアル酸率100と85のハプトグロビンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチンECA、MCL又はBPLを混在させた実施例5~7では、吸光度に有意差が見られたP<0.01。以上のことから、本発明は、トランスフェリンだけでなく、ハプトグロビンのシアル酸量の判別にも応用できることが実証された。シアル酸付加率100と85のハプトグロビンの吸光度比OD100/OD85を、測定3回の平均値と標準偏差で表4に示す。さらに、比較例5に対する有意差検定t検定の結果を示す。表中、はp<0.01を意味し、そしてはp<0.05を意味する。表4で、比較例5~7の吸光度比は1に近い。一方、実施例5~7の吸光度比は、1よりも有意に増大している。このことから、ハプトグロビンは、トランスフェリンと同様に、検出用レクチンに競合するレクチンを混在させた実施例のみで、ハプトグロビンのシアル酸率の変化、特に高いシアル酸率での差を判別しやすくなることが実証された。実施例8、比較例8~9ガラクトース率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別マイクロタイタープレートに固相化したガラクトース率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンに競合用レクチン表6に示すN-アセチルグルコサミン結合レクチンが混在する系で検出した。比較例8では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例9では、検出用レクチン及び非競合用レクチン表6に示すマンノース結合レクチンが混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。1.試薬の準備ビオチン標識デイゴマメレクチンBiotin-ECAは株J-オイルミルズ製を使用した。バンデリアマメレクチン-IIGSL-IIをDelmotteFM,et.al.,EurJBiochem.1980、112、219-23に記載の精製方法に従って得た。2.ガラクトース率の異なるトランスフェリンの調製ヒト由来トランスフェリンシグマ社製を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridiumperfringens由来ノイラミニダーゼ和光純薬社製を10mU/mgトランスフェリンになるように添加した。この溶液を37°Cで一晩保温した。次に、連鎖球菌由来β-ガラクトシダーゼ生化学バイオビジネス社製を0.5mU/mgトランスフェリンになるように添加した。溶液を37°Cの水浴で保温し、1分又は8分後に一部をサンプリングした後、等量の20mM炭酸ナトリウム溶液を添加して酵素反応を停止した。β-ガラクトシダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに等量の20mM炭酸ナトリウム溶液を添加してβ-ガラクトシダーゼ未処理とした。ガラクトース率の異なるトランスフェリンの単糖組成分析を、ABEE糖組成分析キットプラスS株J-オイルミルズ製を用いて行った。β-ガラクトシダーゼ未処理のトランスフェリンのガラクトース量を100として、β-ガラクトシダーゼ処理のトランスフェリンのガラクトース率を算出した。β-ガラクトシダーゼ処理時間とガラクトース率との関係を表5に示す。上記ガラクトース率の異なるトランスフェリンを使用時まで冷凍保存した。3.レクチンELISAガラクトース率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレートヌンク社製に添加し、4°Cで一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。250μlのPBS-Tween20でウエルを3回洗浄後、前記N-アセチルグルコサミン結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度1mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加し、室温で1時間放置した。Biotin-ECAを濃度5μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間保温した。HRP反応と発色を実施例1と同様に行った。検出用レクチンとしてのBiotin-ECAに競合用レクチンとしてのGSL-IIが混在する系において、ガラクトース率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を図4に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系比較例8の吸光度も図4に示す。ガラクトース率が82と75のトランスフェリンの吸光度の有意差検定を行った。は、P<0.01を意味する。図4において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系である比較例8では、ガラクトース率が82と75のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するN-アセチルグルコサミン結合レクチンGSL-IIを混在させた実施例8では、吸光度に有意差が見られたP<0.01。以上のことから、本発明は、トランスフェリンのシアル酸だけでなく、ガラクトース量の判別にも応用できることが実証された。ガラクトース率が82と75のトランスフェリンの吸光度比OD82/OD75を、3回の平均値と標準偏差で表6に示す。さらに、比較例8との有意差検定t検定の結果を示す。表中、はp<0.01を意味する。表6で、比較例8~9の吸光度比は1に近い。一方、実施例8の吸光度比は1よりも有意に増大している。このことから、トランスフェリンのガラクトース率の判別は、シアル酸率と同様に、検出用レクチンと競合するレクチンを混在させることで容易になることが実証された。実施例9、比較例10シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別3マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンとしてのガラクトース結合レクチンに競合用レクチンとしてのシアル酸結合レクチンが混在する系で検出した。比較例10では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。具体的な手順を以下に示す。1.試薬の準備ニホンニワトコレクチンSSAは株J-オイルミルズ製を使用した。2.シアル酸率の異なるトランスフェリンの調製ヒト由来トランスフェリンシグマ社製を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0で2mg/mlになるように溶解した後、ここにArthrobacterureafaciens由来のノイラミニダーゼナカライテスク社製を5mU/mgトランスフェリンになるように添加した。溶液を37°Cの水浴で3時間又は20時間で一部をサンプリングした後、10倍量の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5を加え、酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに10倍量の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5を加えノイラミニダーゼ未処理とした。シアル酸率の異なるトランスフェリンの単糖組成分析を、ABEE糖組成分析キットプラスS株J-オイルミルズ製を用いて行った。ノイラミニダーゼ未処理のトランスフェリンのシアル酸量を100として、ノイラミニダーゼ処理のトランスフェリンのシアル酸率を算出した。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表7に示す。上記シアル酸率の異なるトランスフェリンを使用時まで冷凍保存した。3.レクチンELISAシアル酸率の異なるトランスフェリンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度5μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレートヌンク社製に添加し、37°Cで2時間、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。250μlのPBS-Tween20でウエルを3回洗浄後、前記ニホンニワトコレクチンSSAを濃度0.13mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加し、室温で1時間放置した。Biotin-ECAを濃度3μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間保温した。HRP反応と発色を実施例1と同様に行った。検出用レクチンとしてのBiotin-ECAに競合用レクチンとしてのSSAが混在する系において、シアル酸率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を図5に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系比較例10の吸光度も図5に示す。シアル酸率が0と7のトランスフェリンの吸光度の有意差検定を行った。は、P<0.01を意味する。図5において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系である比較例10では、シアル酸率が0と7のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンに競合用レクチンでのニホンニワトコレクチンSSAを混在させた実施例9では、吸光度に有意差が見られたP<0.01。本発明の方法によりシアル酸率が0と7のトランスフェリンを区別できることは、本発明がシアル酸の微量な欠損だけでなく、微量な増加の判別にも応用できることを証明する。実施例10、比較例11シアル酸率の異なる糖鎖を有するムチンの判別実施例10では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるムチンを、検出用レクチンシアル酸結合レクチンに競合用レクチンガラクトース結合レクチンが混在する系で検出した。比較例11では、前記ムチンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。1.シアル酸率の異なるムチンの調製ムチンブタ胃由来シグマ社製を、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0に2mg/mlになるように溶解した後、ここにClostridiumperfringens由来ノイラミニダーゼ和光純薬社製を0.1mU/mgムチンになるように添加した。溶液を37°Cで17時間保温した。ノイラミニダーゼ未添加の試料も同様の処理を行い、これをノイラミニダーゼ未処理とした。上記で得たムチンのグリコシド結合型シアル酸を、生化学実験講座4糖質の化学下巻P.382に記載の方法に従って定量した。ノイラミニダーゼ未処理のムチンのシアル酸量を100として、ノイラミニダーゼ処理のムチンのシアル酸率を算出した。ノイラミニダーゼ処理とシアル酸率との関係を表8に示す。2.レクチンELISAシアル酸率の異なるムチンを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.5に濃度10μg/mlにて添加した溶液を50μl、マイクロタイタープレートヌンク社製に添加し、37°Cで2時間固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例1と同様に行った。250μlのPBS-Tween20でウエルを3回洗浄後、BPLを濃度0.25mg/mlにて含有する1BSA-PBSを40μl添加し、室温で1時間放置した。更に、Biotin-SSAを濃度12.5μg/mlにて含有する1BSA-PBSを10μl添加し、室温で1時間反応させた。HRP反応と発色を実施例1と同様に行った。検出用レクチンとしてのBiotin-SSAに競合用レクチンとしてのBPL実施例10が混在する系において、シアル酸率の異なるムチンを検出したときの吸光度を図6に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系比較例11の吸光度も図6に示す。シアル酸率100と81のムチンの吸光度の有意差検定を行った。は、P<0.01を意味する。図6において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の比較例11では、シアル酸率100と81のムチンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチンBPLを混在させた実施例10では、吸光度に有意差が見られたP<0.01。以上のことから、本発明は、N結合型糖鎖だけでなく、O結合型糖鎖のシアル酸量の判別にも応用できることが実証された。"