"修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及び前記熱安定性ルシフェラーゼのN末端部分に前記熱安定性ルシフェラーゼのC末端部分を連結するリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは親の円順列熱安定性ルシフェラーゼに関連して修飾され、前記リンカーは細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含み、ここで前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、i前記標的分子の存在下での前記親の円順列熱安定性ルシフェラーゼ、又はii前記標的分子の不在下での前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも1つに関し、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する、ポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2の位置507に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。前記位置507でのアミノ酸がIである、請求項2記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2の位置503に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項1~3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記位置503でのアミノ酸がGである、請求項4記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2の位置471に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項1~5のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記位置471でのアミノ酸がTである、請求項6記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2の位置193に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項1~7のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記位置193でのアミノ酸がPである、請求項8記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2のI471T、S503G、T507I及びS193Pに対応するアミノ酸置換を含む、請求項1~9のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2のI471T、S503G及びT507Iに対応するアミノ酸置換を含む、請求項1~10のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2のS503G、T507I及びS193Pに対応するアミノ酸置換を含む、請求項1~11のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2のT507Iに対応するアミノ酸置換を含む、請求項1~12のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2の位置5、17、21、23、26、39、44、51、81、101、103、110、114、115、119、123、126、128、133、137、186、191、192、193、196、208、211、214、226、228、230、233、264、273、275、286、287、294、295、297、302、303、304、306、308、309、313、324、329、331、343、348、353、364、374、385、389、409、420、426、427、428、431、449、456、460、461、465、466、468、471、473、482、484、485、489、493、494、497、503、507、509、510、513、516、517、521、522、523、526、530、533、536、537、542又は543、又はそれらの組合せに対応する少なくとも1つのアミノ酸の置換を含む、請求項1~13のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼの残基2-12、残基32-53、残基70-88、残基102-126、残基139-165、残基183-203、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495又は残基535-546に対応する領域で円順列される、請求項1~14のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記バイオセンサーが、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含む、請求項1~15のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記バイオセンサーがプロテアーゼ認識部位を含む、請求項1~16のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記プロテアーゼ認識部位が、カスパーゼ3認識部位、カスパーゼ8認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、前立腺血清抗原認識部位、SARSウィルスプロテアーゼ認識部位、TEVプロテアーゼ認識部位、グランザイムB認識部位、MMP認識部位及びライノウィルスプロテアーゼ認識部位から成る群から選択される、請求項17記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、ルキオラクルキアタLuciolacruciata、ルキオララテラリスLuciolalateralis、ピロコエリアミヤコpyrocoeliamiyako、ラムピリスノクチルカLampyrisnoctiluca、フォツリスペンシルバニカPhoturispennsylvanica、フェンゴデスspPhengodessp、ルキオラミングレリカLuciolamingrelica及びフォチナスピラリスphotinuspyralisから成る群から選択された種からの野生型ルシフェラーゼから変性される、請求項1~18のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼである、請求項1~19のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号2に対して少なくとも95のアミノ酸同一性を有する、請求項20記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号4に対して少なくとも90のアミノ酸同一性を有する、請求項20記載のポリヌクレオチド。前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号4に対して少なくとも95のアミノ酸同一性を有する、請求項20記載のポリヌクレオチド。前記リンカーが前記センサー領域DEVDを含む、請求項1~23のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。前記リンカーが、SSDEVDGSSG、SSGSDEVDGSLSSG、SDEVDGSL又はDEVDGである、請求項1~24のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。配列番号6のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。前記ポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に結合される、請求項27記載のポリヌクレオチド。請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチド、又は請求項27又は28記載のベクターを含む細胞。請求項29記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチドによりコードされる修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で請求項29記載の細胞を増殖することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で請求項27又は28記載のベクターを細胞中に導入することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチド又は請求項27又は28記載のベクターを含むキット。細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、a前記細胞と、請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチド又は請求項27又は28記載のベクター及び修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ;そしてb前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼと相互反応できる、方法。細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、a前記細胞と、請求項31記載の修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ;そしてb前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと相互反応できる、方法。サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、a標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ;そしてb前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はinvitro転写/翻訳混合物である、請求項37記載の方法。前記標的分子がプロテアーゼである、請求項35~38のいずれか1項記載の方法。前記プロテアーゼが、カスパーゼ3、カスパーゼ8、TEVプロテアーゼ又はMMP-2である、請求項39記載の方法。前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、請求項35~40のいずれか1項記載の方法。ルミネッセンスがinvivoイメージングにより検出される、請求項35~41のいずれか1項記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、請求項37~42のいずれか1項記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、請求項43記載の方法。細胞中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、a標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と細胞とを接触させ;そしてb前記細胞中のルミネセンスを検出することを含む方法。前記標的分子がプロテアーゼである、請求項45記載の方法。前記プロテアーゼが、カスパーゼ3、カスパーゼ8、TEVプロテアーゼ又はMMP-2である、請求項46記載の方法。前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、請求項45~47のいずれか1項記載の方法。動物中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、a前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記動物とを接触させ;そしてb前記動物中のルミネッセンスを検出することを含む方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、請求項49記載の方法。前記細胞が、前記動物中に注入されるか又は移植される、請求項50記載の方法。前記ルシフェラーゼのための基質が前記動物中に注入される、請求項49~51のいずれか1項記載の方法。前記動物がマウスである、請求項49~52のいずれか1項記載の方法。前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、請求項49~53のいずれか1項記載の方法。ルミネッセンスがイメージングにより検出される、請求項49~54のいずれか1項記載の方法。サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、a前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体上の固定し;b前記標的分子を含むサンプルを、前記固定されたバイオセンサーに添加し;c前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質を添加し、そしてdルミネッセンスを検出することを含む方法。前記固体支持体が、粒子、樹脂、カラム、ウェルボトム、プレート又はスライドである、請求項56記載の方法。前記標的分子がプロテアーゼである、請求項56又は57記載の方法。前記プロテアーゼが、カスパーゼ3、カスパーゼ8、TEVプロテアーゼ又はMMP-2である、請求項58記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、請求項56~59のいずれか1項記載の方法。前記標的分子が精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、請求項56~60のいずれか1項記載の方法。サンプル中のアポトーシスの検出方法であって、aアポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ;そしてb前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はinvitro転写/翻訳混合物である、請求項62記載の方法。前記標的分子がプロテアーゼである、請求項62又は63記載の方法。前記プロテアーゼが、カスパーゼ3又はカスパーゼ8である、請求項64記載の方法。前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、請求項62~65のいずれか1項記載の方法。ルミネッセンスがinvivoイメージングにより検出される、請求項62~66のいずれか1項記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、請求項62~67のいずれか1項記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、請求項68記載の方法。前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、請求項1~26のいずれか1項記載のポリヌクレオチドによりコードされる、請求項37~69のいずれか1項記載の方法。本発明のいずれかの態様を詳細に説明する前、本発明は次の記載に示されるか又は次の図面に示される成分の構成及び配置の詳細へのその適用において制限されるものではないことが理解されるべきである。本発明は他の態様のものであり得、そして実施され得るか又は種々の態様で実施され得る。本発明の方法の次の記載においては、工程段階は、特にことわらない限り、室温約22°C及び大気圧下で実施される。本明細書に引用されるいずれかの数範囲は、下限値~上限値のすべての値を含むことが特に理解される。例えば、濃度範囲又は有益な効果範囲が1~50として言及される場合、値、例えば2-40、10-30又は1-3、等が本明細書において明確に列挙されることが意図される。同様に、配列同一性範囲が例えば60<100以下として与えられる場合、65、75、90、等が本明細書において明確に列挙されることが意図される。それらは特に意図される唯一の例であり、そして最低値-最高値のすべての可能性ある数値は、本出願に明確に言及されると思われる。用語熱安定性ルシフェラーゼthermostableluciferascとは、対応する野生型ルシフェラーゼに比較して、所定の温度例えば、22°Cで増強された安定性を有するルシフェラーゼを言及する。本明細書に開示される典型的な態様に関しては、用語TLは、Ppe2の熱安定性変異体を言及するために使用され、ここでPpe2はフォツリスペンシルバニカPhoturispennsylvanicaからのルシフェラーゼである。しかしながら、当業者は、いずれの熱安定性ルシフェラーゼでも使用され得、ここでTLが言及されることを認識している。例えば、フォチナスピラリスPhotinuspyralisからのルシフェラーゼ、並びにルキオラクルキアタLuciolacruciata、ルキオララテラリスLuciolalateralis、ピロコエリアミヤコpyrocoeliamiyako、ラムピリスノクチルカLampyrisnoctiluca、フォツリスペンシルバニカPhoturispennsylvanica、フェンゴデスspPhengodessp、ルキオラミングレリカLuciolamingrelica及びフォチナスピラリスphotinuspyralisからのルシフェラーゼが使用され得るYeetalBiochimicaetBiophysicaActa13393952を参照のこと。用語CPとは、円順列を言及する。例えば、TL-CPとは、フォツリスペンシルバニカからのPpe2ルシフェラーゼの円順列熱安定性変異体を言及する。用語DEVD:DDとは、リンカー、すなわちDEVDカスパーゼ3/7認識部位及び3種のアミノ酸、すなわちDEVDカスパーゼ認識部位のC末端側上に存在するGSLを含む円順列ルシフェラーゼのN末端を連結するアミノ酸配列を言及する。用語バイオセンサーbiosensorとは、標的分子と相互反応できるセンサー領域を含むアミノ酸配列を言及する。標的分子がセンサー領域と相互反応する場合、システムの分子性質が表される。用語カスパーゼ-3/7バイオセンサーCaspase-3/7BioSensor及びCBSとはカスパーゼ-3/7認識部位、すなわち修飾されたTLフラグメント間の結合でカスパーゼ-3/7認識部位DEVDを有する、円順列フォツリスペンシルバニカからのPpe2ルシフェラーゼの熱安全性変異体を含むバイオセンサーを言及する。例えば、TL-CP358-DEVD:DDとは、配列番号2に比較して、位置358での円順列CBSを言及し、そして円順列熱安定性ルシフェラーゼのN-及びC末端を連結するDEVD:DDリンカーを含む。用語CBS変異体とは、CBSに比較して、1又は2以上のアミノ酸置換を有するCBSを言及する。置換された残基を同定するために本出願を通して使用されるアミノ酸番号付けは、フォツリスペンシルバニカからの野生型Ppe2ルシフェラーゼのポリペプチド配列、すなわち配列番号2、又はフォツリス2ペンシルバニカポリペプチド配列からのPep2ルシフェラーゼの熱安定性変異体、すなわち配列番号4における位置に比較して特定される。さらに、配列番号4で示される他の変異体が使用され得る。用語標的分子targetmoleculeとは、バイオセンサーと相互反応する興味ある分子、例えばプロテアーゼ、キナーゼ、G-タンパク質結合受容体、cAMPcGMP酵素補因子、イオン例えば、カルシウムイオン;pHセンサーとして使用するための水素イオン、抗体、ペプチド、又はシステムの分子性質のバイオセンサーによる表示を引起す糖を言及する。複数の核酸又はポリペプチド配列に関しての用語同一性identityとは、同じであるか、又はいずれかの数の配列比較アルゴリズムを用いて、又は手動的アライメント及び目視検査により測定されるように、比較窓又は企画された領域にわたっての最大の一致について比較され、そして一列に整列される場合、同じである特定の百分率のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する複数の配列又は副配列を言及する。比較するための配列の一列整列方法は、当業界おいて良く知られている。用語細胞cell、細胞系cellline及び宿主細胞hostcellとは、本明細書において使用される場合、交換可能的に使用され、そしてすべてのそのような名称は、それらの名称の子孫又は可能性ある子孫を包含する。用語形質転換された細胞とは、本発明の核酸分子を導入されている細胞又は導入されている先祖を言及する。任意には、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質又はポリペプチドを生成できる安定してトランスファクトされた細胞系を創造するために、適切な細胞系中に導入され得る。ベクター、細胞及びそのような細胞系を構成するための方法は、当業者において良く知られている。用語形質転換体transformants又は形質転換された細胞transformedcellsは、トランスファーの数とは関係なく、最初に形質転換された細胞に由来する一次形質転換された細胞を包含する。すべての子孫は、意図した又は偶然のトランスファーのために、DNA含有率において正確には同一でない。それにもかかわらず、元の形質転換された細胞についてスクリーンされるのと同じ官能性を有する突然変異子孫は、形質転換体の定義に包含される。用語非相同heterologus核酸配列又はタンパク質は、本明細書において使用される場合、参照配列に比較して、異なった源を有するか、又は外来性種に起因する配列を言及し、又は同じ種からである場合、それは元の形から実質的に修飾され得る。用語相同性homologyとは、複数配列間の相補性の程度を言及する。部分的相同性又は完全な相同性すなわち、同一性が存在し得る。用語核酸分子nucleicacidmolecule、ポリヌクレオチドpolynucleotide又は核酸配列nucleicacidsequenceとは、本明細書において使用される場合、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生成のために必要なコード配列を含む核酸、DNA又はRNAを言及する。コードされるポリペプチドは、完全な長さのポリペプチド、そのフラグメント完全な長以下、又は完全な長さのポリペプチド又はそのフラグメントのいずれかと別のポリペプチドとの融合体融合ポリペプチドを生成するであり得る。タンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列を意味し、又は言い換えれば、その核酸配列は遺伝子生成物をコードする。コード領域はcDNA、ゲノムDNA又はRNA形に存在することができる。DNA形で存在する場合、オリゴヌクレオチドは、一本鎖すなわち、センス鎖又は二本鎖であり得る。適切な制御要素、例えばエンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル、等が、必要なら、一次RNA転写体の転写及び又は正しいプロセッシングの適切な開始を可能にするために、遺伝子のコード領域に接近して配置され得る。他の制御又は調節要素は、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル、及びエンハンサー要素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。親parentalとは、本明細書において使用される場合、本発明のさらなる操作により変異体を生成するために使用される開始アミノ酸又はヌクレオチド配列を言及する。例えば、野生型フォツリスペンシルバニカPpe2ルシフェラーゼ配列番号2、フォツリスペンシルバニカからのPp2ルシフェラーゼの熱安定性変異体、例えば配列番号4、又はフォツリスペンシルバニカからのPp2ルシフェラーゼの円順列熱安定性変異体、例えば配列番号6が、本発明に記載される変異体を生成するために出発配列として使用され得る。さらに、配列番号4又は6で示されるそれら以外の他の変異体が親配列として使用され得る。ペプチドpeptide、タンパク質protein及びポリペプチドpolypeptideとは、長さ又は後-翻訳修飾例えば、グリコシル化又はリン酸化にかかわらず、アミノ酸のいずれかの鎖を意味する。本発明の核酸分子はまた、天然に存在するタンパク質又はそのポリペプチドフラグメントの変異体をコードすることができ、それは、誘導される天然に存在する生来の又は野生型タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60、70、80、85、90、95又は99同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、甲虫類ルシフェラーゼは、配列番号2に対して少なくとも60、70、80、85、90、95又は99のアミノ酸同一性を有し;ホタルルシフェラーゼは配列番号2又は4の1つに対して少なくとも60、70、80、85、90、95又は99のアミノ酸配列同一性を有し;又は前記ルシフェラーゼは配列番号6、8、10、12、14、18、20、22、58、60、62、64、66、68、70、72又は74に基づかれる。純粋pureとは、本明細書において使用される場合、目的の種が存在する有力な種でありすなわち、モル基準に基づいて、それは組成物におけるいずれかの他の個々の種よりも一層、富んでいる、そして1つの態様によれば、実質的に精製された画分が組成物であり、ここで目的種は、存在するすべての高分子種の少なくとも50モル基準に基づいてを含む。一般的に、実質的に純粋なsubstantiallypure組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の約80以上、1つの態様によれば、約85、約90、約95又は約99以上を含む。1つの態様によれば、目的種は実質的に均質に精製され組成物中の汚染種は従来の検出方法により検出される、ここで前記組成物は単一の高分子種から実質的に成る。核酸は異なったタイプの突然変異を含むことが知られている。置換substitutionとは、親配列からの1又は2以上の塩基位置でのヌクレオチドの配列の変更を言及する。突然変異はまた、1又は2以上の塩基の挿入又は欠失を言及し、その結果、核酸配列は親配列例えば、野生型とは異なるか、又は交換終止コドンを有する。用語応答性responsivityとは、標的分子とバイオセンサーとの相互反応による、ルミネセンスの変更、例えば高められた又は低められたルミネッセンスを言及する。サンプルsampleとは、本明細書において使用される場合、細胞、動物、細胞溶解物、又はinvitro転写翻訳混合物を言及することができる。用語ベクターvectorとは、DNAのフラグメントが挿入されるか又はクローン化され得、そしてDNAセグメントを細胞中にトランスファーするために使用され得、そして細胞中で複製できる核酸分子を言及する。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウィルス、コスミド及び同様のものに由来することができる。用語野生型wildtypeとは、本明細書において使用される場合、天然に存在する源から単離された遺伝子又は遺伝子生成物の特徴を有する遺伝子又は遺伝子生成物を言及する。前記遺伝子又は遺伝子生成物は、天然に存在するか又は合成性であり得る。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察され、そして従って、遺伝子の野生型として任意に示される遺伝子である。対照的に、用語変異体mutant又は変種variantとは、野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、配列及び又は機能性質における修飾すなわち、変更された特性を示す遺伝子又は遺伝子生成物を言及する。天然に存在する及び合成変異体は単離され、そしてそれらが、野生型遺伝子又は遺伝子生成物に比較される場合、変更された特性を有する事実により同定され得る。ルミネッセンスとは、適切な条件下で、例えば適切な基質、例えばルシフェリンの存在下でルシフェラーゼポリペプチドの光出力を言及する。光出力は、ルシフェリン基質の添加に基づいて開始するルミネセンス反応に基づいての光出力の即時又はほぼ即時の測定時々、T=0ルミネセンス又はフラッシュflashとして言及されるとして測定され得る。種々の態様によるルミネッセンス反応が、例えば原核又は真核発現システムンにおける細胞からの溶解物含有溶液において実施される。他の態様によれば、発現はinvitroシステムにおいて発生し、又はルシフェラーゼタンパク質は細胞外培地中に分泌され、後者の場合、溶解物を製造する必要はない。他の態様によれば、ルシフェラーゼは全細胞において又はinvivoで、例えば動物において発現される。いくつかの態様によれば、反応は、適切な材料、例えばルシフェリンを、ルシフェラーゼタンパク質を含む反応チャンバー例えば、多ウェルプレート、例えば96ウェルプレートのウェル中に注入することにより開始される。反応チャンバーは、例えばルミノメーター又は光電子増倍管を用いて、光出力を測定できる読み取り装置に配置され得る。ルシフェラーゼが全細胞又は動物において発現される場合、反応は、ルシフェラーゼ基質、例えばルシフェリンの投与により開始される。全細胞に関して、この投与は細胞培地中へのルシフェラーゼ基質の添加を包含することができる。動物に関しては、ルシフェラーゼ基質の添加は、注入又は経口投与、例えば動物飼料又は水中への基質の含有を包含することができる。光出力又はルミネッセンスはまた、秒、分、時、等の期間、例えば同じ反応チャンバー、細胞又は動物において時間にわたって測定され得る。光出力又はルミネッセンスは、時間にわたっての平均、シグナルの崩壊の半減期、一定時間にわたってのシグナルの合計、又はピーク出力として報告され得る。ルミネッセンスはまた、イメージング、例えばinvivoイメージングを通して検出され得る。増強された応答は、TL-CPバイオセンサーが標的分子と相互反応する前及び後、示差活性を含む。TL-CPバイオセンサーの基本活性は、バイオセンサーが標的分子と相互反応する前、アッセイ時間0での活性として定義される。誘発された活性は、TL-CPバイオセンサーが標的分子と相互反応された後、ある経過した時間tでの活性として定義される。活性の応答又は倍増は誘発された活性:基本活性の比率である。増強されたルミネッセンスは、比較して得られる測定値の適切な比較により決定されるような高められた光出力を包含する。本明細書に開示されるように、TL-CPバイオセンサー配列への1又は2以上の適切なアミノ酸置換が、増強されたルミネッセンスを示すTL-CPバイオセンサーポリペプチドを生成する。親の熱安定性ルシフェラーゼヌクレオチド分子からのヌクレオチド配列の変化は、アミノ酸置換を導くことにより、及び/又はタンパク質発現を増強することにより、増強されたルミネッセンスに寄与することができる。増強されたシグナル安定性は、時間経過下でのシグナルの崩壊の半減期により測定されるように、ルシフェラーゼからのシグナルがいかに長くルミネッセンスを発光し続けるかの上昇性を包含する。増強されたタンパク質安定性は、高められた熱安定性例えば、高められた濃度での安定性及び化学安定性例えば、変性剤、例えば界面活性剤、例えばTritonX100の存在下での安定性を包含する。ルシフェラーゼバイオセンサーはこれまで記載されている。例えば、米国特許公開第2005/0153310号この開示は参照により本明細書に組み込まれるを参照のこと。センサー領域は円順列ルシフェラーゼ中にクローン化され、その結果、ルシフェラーゼバイオセンサーが標的分子と相互反応する場合、増強された又は高められたルミネッセンスが、標的分子と接触しなかったルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、生成される。他方では、センサー領域は円順列ルシフェラーゼ中にクローン化され、その結果、ルシフェラーゼセンサーが標的分子と相互反応する場合、標的分子と接触しなかったルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、低められたルミネッセンスが生成されるか、又はまったく生成されない。センサー領域は、プロテアーゼの活性、環状ヌクレオチド、例えばcAMP及びcGMPの結合、カルシウムの存在又は濃度、他のイオン又は抗体、1又は2以上のG-タンパク質カップリング受容体リガンドの存在又は濃度、pHの変化、ホスファターゼ又はキナーゼ又は他の酵素の活性、興味ある分子、例えばペプチドの結合タンパク質、又は当業者に知られている糖を検出するために有用である。1つの態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、特定の宿主における発現のために最適化される。本明細書において使用される場合、最適化とは、コドン最適化、及び真核細胞における、コーザック及び又は1又は2以上のイントロンの導入を包含する。従って、核酸分子は、30、35、40又は45以上、例えば50、55、60又はそれ以上のコドンで修飾されていないルシフェラーゼをコードする野生型核酸のコドン組成とは異なるコドン組成を有することができる。本発現の1つの態様によれば、異なるコドンは、哺乳類においてより頻繁に使用されるそれらのコドンであり、そして別の態様によれば、異なるコドンは植物においてより頻繁に使用されるそれらのコドンである。特定タイプの哺乳類、例えばヒトは、別のタイプの哺乳類とは異なった組の好ましいコドンを有することができる。同様に、特定タイプの植物は、別のタイプの植物とは異なった組の好ましいコドンを有することができる。本発明の1つの態様によれば、異なるコドンの大部分は、それらの最適化された配列がルシフェラーゼのためのシグナルの強度を高めるので、所望する宿主細胞における好ましいコドンである。哺乳類例えば、ヒト及び植物のための好ましいコドンは、公知である例えば、WadaetalNAR182367MurrayetalNAR17477;国際公開第02/16944号。1つの態様によれば、対応する野生型ルシフェラーゼは、甲虫類種、例えばルキオラクルキアタ、ルキオララテラリス、ピロコエリアミヤコ、ラムピリスノクチルカ、フォツリスペンシルバニカ、フェンゴデスsp、ルキオラミングレリカ及びフォチナスピラリスからであるYeetalBiochimicaetBiophysicaActa13393952を参照のこと。1つの態様によれば、TL-CPバイオセンサーは、TL間の結合で、アミノ酸DEVDを含むカスパーゼ-3認識部位を含む。カスパーゼ-3との相互反応に基づいて、TL-CPバイオセンサーは、その認識部位で分裂し、2つのTLフラグメントによる、より好ましく、高活性のコンホメーションの形成を可能にする。他の態様によれば、TL-CPバイオセンサーは、他のプロテアーゼのための認識部位、例えばカスパーゼ-8認識部位TEVプロテアーゼ認識部位又はMMP-2認識部位を含む。修飾されたTL-CPバイオセンサーのアミノ酸配列は、対応する修飾されていないTL-CPバイオセンサー親、例えばルシフェラーゼ配列における1又は2以上の置換を有する変異体ルシフェラーゼのアミノ酸配列とは異なる。1つの態様によれば、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼ親ルシフェラーゼのアミノ酸配列に比較して、円順列されており、ここで前記順列は1つの部位残基で、又は修飾に対して耐性である領域に存在する。1つの態様によれば、TL-CPバイオセンサーは、1又は2以上の別個単離された異種アミノ酸配列を有し、それらの少なくとも1つは標的分子と直接的に又は間接的に相互反応し、そして得られるTL-CPバイオセンサーが、標的物との相互反応の前及び又は後、生物ルミネッセンス活性を有する限り、例えば生物ルミネッセンス活性が、標的分子との相互反応の後、変更される限り、例えば光強度、色彩又は運動プロフィールの変更が存在する限り、修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのN-及び又はC末端を包含する、1つの部位で又は修飾に対して耐性の領域に1又は2以上のアミノ酸の欠失を任意には包含することができる。1つの態様によれば、本発明のTL-CPは、対応する熱安定性ルシフェラーゼ、例えば修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのアミノ酸配列に比較して、円順列アミノ酸を含み、円順列熱安定性ルシフェラーゼにおいて新規のN-及びC末端をもたらし、その少なくとも1つは修飾に対して耐性であり、そして標的分子と直接的に又は間接的に相互反応するアミノ酸配列を含むセンサー領域を導入することにより官能性を有するように構築される部位で又は領域に存在する。別の態様によれば、円順列熱安定性ルシフェラーゼは、他の修飾、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのN-又はC末端内への挿入及び又はその末端内の欠失、例えば対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのN-及びC末端で又は近くでの、例えば対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのN末端の残基1~約10又は約30、又はその間のいずれかの数に対応する残基、及び又は対応する修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼのC末端の最後の残基、ほぼ最後の残基30、例えば最後の残基15、又は残基1~30の間のいずれかの数に対応する残基の別の挿入及び/又は欠失を包含するが、但しそれらだけには限定されない。1つの態様によれば、熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、例えば配列番号2又は4の残基、例えば残基7、37、47、75、83、107、121、144、160、174、188、198、205、225、233、242、255、268、308、316、358、377、403、435、490又は540で、又は残基2-12残基32-53、例えば残基32-43又は残基42-52残基70-88、例えば残基70-80又は残基78-88残基102-126、例えば残基102-112又は残基116-126残基139-165残基183-203残基220-247、例えば残基228-238残基262-273残基303-313残基353-408残基485-495又は残基535-546に対応する領域において、円順列され得る。残基番号付けは、修飾されていない生来のホタルルシフェラーゼ配合の番号付けに基づかれる。対応する位置は、例えば配列アライメントプログラムを用いて、ルシフェラーゼ配列を一列整列することにより同定され得る。修飾に対して耐性のルシフェラーゼ中の残基又は領域がルシフェラーゼを円順列のための又は挿入のための部位として使用され得る。1つの態様によれば、本発明は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及びリンカーを含むバイオセンサーをコードするポリヌクレオチドを提供する。1つの態様によれば、熱安定性ルシフェラーゼは、改良された性質、例えば熱安定性配列番号3及び4を付与するアミノ酸置換を含むフォツリスペンシルバニカルシフェラーゼPpe2配列番号1及び2のバージョンに基づかれる。リンカーは、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのC末端部分を、修飾された熱安定性ルシフェラーゼのN末端部分に結合させる。リンカーは、細胞において標的分子と相互反応できるセンサー領域を有する。修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、修飾されていない熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、標的物とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する。1つの態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、細胞における標的分子との相互反応の後、増強された応答を有する。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、位置5、17、21、23、26、39、44、51、81、101、103、110、114、115、119、123、126、128、133、137、186、191、192、193、196、208、211、214、226、228、230、233、264、273、275、286、287、294、295、297、302、303、304、306、308、309、313、324、329、331、343、348、353、364、374、385、389、409、420、426、427、428、431、449、456、460、461、465、466、468、471、473、482、484、485、489、493、494、497、503、507、509、510、513、516、517、521、522、523、526、530、533、536、537、542又は543、又はそれらの組合せに対応する少なくとも1つのアミノ酸の置換を含む。1つの態様によれば、TL-CPは熱安定性ルシフェラーゼのN-及びC末端を連結するセンサー領域を含むリンカーを有し、ここで前記センサー領域は、標的分子、例えばプロテアーゼ又はキナーゼと直接的に相互反応する、アミノ酸配列、例えばプロテアーゼ認識部位又はキナーゼ部位を含む。1つの態様によれば、標的分子と相互反応するアミノ酸配列は、少なくとも1つのリンカーを端に有し、例えばペプチドリンカーを端に有し、このリンカーは同じであっても又は異なっていても良く、これは任意には、標的分子との相互反応に基づいて、ルミネッセンス及び又は応答を改良する。1つの態様によれば、標的分子と相互反応するアミノ酸配列は、N末端で少なくとも1つのリンカーを端に有し、このリンカーは標的分子との相互反応に基づいて、ルミネッセンス及び又は応答を改良する。1つの態様によれば、リンカー次の配列の少なくとも1つを有する:GSSGGSGGSGGG、GSSSDSDSSAGS、GSNDSSGGSEGG、GSNGGFDSSEGG、GSIRWSGLSGGD、GSRGGSVYSEGG、GSSEGSSDFGGD、GSIVVSCSSEGG、GSNWDSGCSREG、GSNWDSGCSREC、GSSGCTGDAGGS、GSNWDSGCSRQC、GSS/NS/D/GD/S/GS/FD/GS/GSA/EGS/G、GSI/R/SR/G/EW/GSG/V/SL/Y/DS/FG/EGD/G、GSI/N/SV/W/GV/D/CS/TC/GS/C/DS/AE/R/GG/EG/S、GSI/SV/G/AV/GS/CG/DG/D/SS/AG/EG/EG/N、GSI/N/SV/W/G/AV/D/C/GS/T/CC/GS/C/DS/AE/R/GG/EG/S、GSIAGCGDAGEG、GSNWDSGCSRE、GSIAGCGDAGEG、GSNWDSGCSREG、NWDSGCSREG、又はIAGCGDAGEG。/の印は、/の前又は後のアミノ酸がその位置で使用され得ることを示唆する。本発明のバイオセンサーに使用されるリンカーはアミノ酸配列であり、バイオセンサーにおけるその存在はそのバイオセンサーの活性を実質的に低めず、例えばリンカーを欠く対応するバイオセンサーに比較して、10倍以上、例えば4倍以下又は2倍以下、活性を低めず、そして/又は本発明のバイオセンサーに使用されるリンカーの存在は、リンカーを欠く対応するバイオセンサー、又はリンカーGSSGGSGGSGGG配列番号23を有する対応するバイオセンサーに比較して、又は対応する両バイオセンサーに比較して、その標的物との相互反応に対するルミネッセンス又は応答を高める。1つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、本発明のN末端側のセンサー領域に位置し、そして標的分子、例えば検出される分子と直接的に又は間接的に相互反応することができる。1つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、本発明のバイオセンサーのC末端側のペプチド配列に位置する。1つの態様によれば、本発明のペプチドリンカーは、検出される標的分子と直接的に又は間接的に相互反応することができる、N末端及びC末端側のペプチド配列に位置する。1つの態様によれば、標的分子の不在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、対応する親修飾されていないの円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性以下であり、例えば修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネッセンス活性は、対応する親修飾されていないの円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの約0.001、0.01、0.1、1、10、20、50、70又はそれ以上但し、100以下であり、ここで修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が任意には、検出される。別の態様によれば、標的物の不在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、親修飾されていないの円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性と実質的に同じであるか又はそれ以上であり、例えば本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのルミネッセンス活性は、親修飾されていないの円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性の約1.5倍、例えば少なくとも2、3又は5倍、又はそれ以上である。標的分子の存在下で、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は検出可能的に変更される。例えば、標的分子の存在下での修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性の検出できる変更は、標的物の不在下での修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性に比較して、少なくとも0.001、0.01、0.1、1、10又は100、及び2倍、4倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍又はそれ以上までの変更である。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに存在するが、しかし親修飾されていないの円順列ルシフェラーゼバイオセンサーには存在しないセンサー領域と相互反応する標的分子の物理的近接性は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性を変更し、例えば低め、排除するか又は高める。1つの態様によれば、標的物の存在下での本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネセンスシグナルは、標的分子の存在下での対応する親修飾されていないの円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのルミネッセンスシグナルに比較して、高められる。本発明は、円順列バイオセンサーを包含し、このルシフェラーゼ配列は、オリジナル野生型のN-又はC末端、又は両端での残基の欠失、例えばN末端での1~3又はそれ以上の残基及びC末端での1~6又はそれ以上の残基の欠失、及び標的分子と相互反応するか、又は後-翻訳修飾センサーにより影響されるセンサー領域を含むことができる。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのルシフェラーゼ配列は、修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのアミノ酸配列と同じであるか、又は実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチド又はペプチドとは、アミノ酸配列が大部分同じであるが、しかし完全に同じではなく、そしてそれが関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。一般的に、2種のアミノ酸配列は、それらが少なくとも80同一であり、例えば少なくとも85、90、95、99又はそれ以上の同一性を有する場合、実質的に同じであるか又は実質的に相同である。1つの態様によれば、修飾は、ヒドロラーゼ、例えばプロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ例えば、コレステロールエステラーゼ、ホスファターゼ例えば、アルカリホスファターゼ及び同様のもの但し、それらだけには限定されないのための認識部位の導入であり得る。例えば、ヒドロラーゼは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない:ペプチド結合に作用する酵素ペプチドヒドロラーゼ、例えばアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジル-ペプチダーゼ、トリペプチジル-ペプチダーゼ、ペプチジル-ジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ及び未知の触媒機構のエンドペプチダーゼ。例えば、本発明の修飾された熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、次のものを含むことができる:エンテロキナーゼ切断部位、カスパーゼ切断部位、コロナウィルスプロテアーゼ部位、キナーゼ部位、HIV-1プロテアーゼ部位、HCVプロテアーゼ部位、SARSウィルスプロテアーゼ部位、グランザイムB部位、ライノウィルスプロテアーゼ部位、例えばライノウィルス3Cプロテアーゼ部位、プロホルモンコンバーターゼ部位、インターロイキン-16-転換酵素部位、CMVアセンブリング部位、リーシュマンジュン部位、B.アントラシスBanthracis致死因子、ポツリヌス菌神経毒L鎖プロテアーゼ部位、アミロイド前駆体タンパク質のためのβ-セクレターゼ部位VKM-DAEF;配列番号56、前立腺特異的抗原配列、トロンビン部位、レニン及びアンジオテンシン-転換酵素部位、カテプシンD部位、マトリックスメタロプロテイナーゼ部位、uPA部位、プラスミン部位、カチオンのための結合部位、例えばカルシウム結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、マルトース結合ドメイン又はビオチン結合ドメイン。別の態様によれば、本発明の修飾された熱安定性カブト虫ルシフェラーゼは、リガンド、例えば抗体又は金属、例えばカルシウムにより認識される配列を含むことができる。本発明はまた、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現し、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸分子を含む発現カセットを含み、そして又は宿主細胞において本発明の核酸分子を発現できるベクター例えば、プラスミド、ウィルス又は欠陥性ウィルス粒子を含む安定細胞系も包含する。1つの態様によれば、発現カセットは、プロモーター、例えば核酸分子に操作可能的に結合される構成又は調節可能プロモーターを含む。1つの態様によれば、宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞、例えば植物又は脊椎動物細胞、例えば哺乳類細胞、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、羊又は齧歯動物例えば、ウサギ、ラット、フェレット又はマウス細胞、及び核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞、又は本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを含むキットもまた提供される。例えば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクターは、サンプル、例えば細胞、細胞溶解物、invitro転写/翻訳混合物、又は上清液と共に混合され、そしてサンプル中の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、任意には、1又は2以上の時点で、又は標的物を有さないか又は異なった量の標的物を有する対照サンプルに比較して、検出されるか又は決定される。時間の経過につれて、及び又は対照、例えば特定量の標的分子を有する細胞に比較して、サンプル中のルミネッセンス活性の変化は、サンプル中の標的分子の存在又は量、又は実験条件に関連する標的分子の量の変化を示唆する。1つの態様によれば、細胞は、プロモーター、例えば調節又は構成プロモーター、及び環状ヌクレオチドと相互反応するセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含むベクターと接触される。1つの態様によれば、トランスフェクトされた細胞は、プロモーターが修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘発する条件下で培養され、そしてルミネッセンスの存在又は量が測定される。別の態様によれば、標的分子と相互反応するセンサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー、及び標的分子を有すると思われるサンプルが混合され、そしてルミネッセンスの量が決定される。本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞又は動物、例えばマウスにおける種々の条件及び/又は法的分子を測定するか検出するための機能的レポーターとして使用され得ない用途に使用され得る。例えば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするベクター、又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、細胞、動物、細胞溶解物、invitro転写/翻訳混合物、又は上清液に導入され、そして修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が、例えば1又は2以上の時点で、及び対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、検出されるか又は決定される。時間の経過と共に、及び/又は対照、例えばその対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、細胞、動物、細胞溶解物、invitro転写/翻訳混合物、又は上清液におけるルミネッセンス活性の変化は、プロテアーゼの存在を示す。例えば、本発明は、重症急性呼吸器症候群に関連するウィルスの検出方法を包含する。前記法方法は、生物学的、例えば生理学的組織又は流体サンプルと、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触することを包含する。バイオセンサナーは、ウィルスのプロテアーゼのためのアミノ酸認識配列を含む。サンプルの存在下で修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性が変更されるかどうかが検出され、又は決定され、それにより、サンプルがウィルスを含むかどうかを示唆する。1つの観点によれば、本開示は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基とサンプルとを接触させ、そしてルミネッセンスを測定することを含む、サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法を提供する。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、標的分子のためのセンサー領域を含む。そのセンサー領域は、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含むことができるが、但しそれらだけには限定されない。態様によれば、前記方法は、プロテアーゼ、抗体、金属、イオン、環状ヌクレオチド又はヌクレオチドである標的分子の存在又は活性を検出できる。態様によれば、プロテアーゼは、カスパーゼ3、カスパーゼ8、TEVプロテアーゼ又はMMP-2であり得る。態様によれば、サンプルは、細胞、動物、細胞溶解物、又はinvitro転写/翻訳混合物であり得る。対応によれば、前記方法はさらに、標的分子の活性を変更できる例えば、下げるか、排除するか又は高めることができる試験化合物を添加することを含む。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのための基質は、ルシフェリン又はルシフェリン誘導体であり得る。本発明はまた、興味ある分子の存在の検出方法も提供する。例えば、細胞が、プロモーター、例えば調節プロモーター、及び興味ある分子と相互反応する挿入/センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列を含むベクターと接触される。1つの態様によれば、トランスフェクトされた細胞は、プロモーターが修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの一過性発現を誘発する条件下で培養され、そして修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。別の態様によれば、動物、例えばマウスが、プロモーター、例えば調節プロモーター、及び興味ある分子と相互反応する挿入/センサー領域を含む、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする核酸配列を含むベクター、又は本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現するトランスフェクトされた細胞により接触される。次に、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、分子、すなわち興味ある分子と相互反応するアミノ酸配列を含み、又は他方では、その対応する修飾されていない円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに比較して、敏感である。興味ある分子との変更された相互反応又はその相互反応に比較しての一定の条件下での変更された活性又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性を有する突然変異誘発された修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする1又は2以上の突然変異誘発されたポリヌクレオチドが選択される。別の態様によれば、本発明は、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンセンサーと分子のライブラリーとを接触させ、そして1又は2以上の分子が修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーにおけるセンサー領域と相互反応するかどうかを検出するか又は決定することを包含する方法を提供する。本発明はまた、サンプルに存在する標的分子又は興味ある分子の量を調節できる剤試験剤のスクリーニング方法も提供する。調節modulationとは、生物活性又はプロセスの機能的特性例えば、酵素活性を増強するか又は阻害する能力を言及する。そのような増強又は阻害は、特定現象の発生、例えばシグナルトランスダクション経路の活性化に依存することができる。モジュレーターmodulatorとは、剤天然に存在するか又は天然に存在しない、例えば生物高分子例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド又はオリジナル分子、小分子、生物材料、例えば細菌、植物、菌類又は動物特に、哺乳類細胞又は組織から製造された抽出物、又はいずれか他の剤を言及する。モジュレーターは、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイへの包含により、生物学的工程の阻害剤又は活性化因子例えば、作動薬、部分的作動薬又は拮抗薬直接的に又は間接的にとしての有能な活性について評価される。モジュレーターの活性は、知られているか、未知であるか、又は一部知られている。そのようなモジュレーターは、本発明の方法を用いて、スクリーンされ得る。用語試験剤又は試験化合物とは、推定モジュレーターとして本発明の1又は2以上のスクリーニング方法により試験される剤又は化合物を言及する。通常、種々の予定された濃度、例えば、0.01μM、1.0μM、1.0μM及び10.0μMがスクリーニングのために使用される。対照は、試験剤の不在下でのシグナルの測定、標的物を調節することが知られている剤又は化合物への比較、又は試験剤又は化合物との接触の前、間及び/又は後、サンプル例えば、細胞、組織又は器官への比較を包含することができる。1つの態様によれば、前記方法は、プロテアーゼ活性を調節する剤又は化合物についてスクリーニングすることを包含する。例えば、1つの態様によれば、アポトーシスを調節できる剤又は化合物の同定方法が提供される。カスパーゼファミリーのプロテアーゼは、アポトーシスと関連している。従って、前記方法は、カスパーゼファミリーのプロテアーゼと、カスパーゼ活性を調節すると思われる剤又は化合物、及びアスパーゼにより分裂できる分裂部位を有する修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触させることを包含する。修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの活性は、試験剤又は化合物との接触の前及び後、サンプルにおいて検出される。剤との接触の後、活性の上昇はアポトーシスを阻害する剤又は化合物を暗示し、そして下降はアポトーシスを活性化する剤を暗示する。従って、本発明は、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーに存在する認識配列の分裂を調節する剤又は化合物を同定し、そしてその活性を検出するのに有用なスクリーニングシステムを提供する。これはプロテアーゼ活性モジュレーターについての急速なスクリーニングを可能にする。本明細書に記載されるスクリーニングシステムの使用は、プロテアーゼ、例えばカスパーゼファミリーのプロテアーゼを調節する例えば、阻害するか又は活性化する剤又は化合物を同定するための敏感で且つ急速な手段を提供する。特に、本発明は、センサー領域が興味ある酵素のための切断部位であるアミノ酸配列を含む、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを企画する。従って、興味ある分子がプロテアーゼである場合、挿入体はプロテアーゼのための切断認識配列を含むペプチドを含む。プロテアーゼのための切断認識配列は、タンパク質分解切断の間、プロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。従って、本発明は、サンプルと、プロテアーゼのためのセンサー領域を含む本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーとを接触させ、そしてルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、サンプル中のプロテアーゼの量を決定する方法を提供する。本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、特に、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞又は動物の内部のプロテアーゼの活性をモニターするために使用され得る。本発明のアッセイは、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを切断するプロテアーゼの活性を変更する剤又は化合物を同定するための薬剤をスクリーニングするために使用され得る。1つの態様によれば、アッセイはプロテアーゼをinvitroで含むサンプルに対して実施される。既知量のプロテアーゼを含むサンプルが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び試験剤と共に混合される。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量が上記のようにして決定される。試験剤の存在下でのプロテアーゼモル当たりの活性の量が、試験剤の不在下でのプロテアーゼモル当たりの活性と比較される。差異は、試験剤がプロテアーゼの活性を変更することを示唆する。他方では、その変更は、プロテアーゼ活性の上昇であり得、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の低下、又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の上昇又は維持に対応するプロテアーゼ活性の低下をもたらす。1つの態様によれば、プロテアーゼ活性を変更する剤の能力が決定される。このアッセイにおいては、細胞がプロテアーゼ活性を調節すると思われる剤又は化合物により条件付けされるか又は接触させられる。培養物中の細胞が溶解され、そしてプロテアーゼ活性が測定される。例えば、既知又は未知量のプロテアーゼを含む溶解された細胞サンプルが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと共に混合される。次に、サンプル中のプロテアーゼ活性の量は、対照、又は処理されていないサンプル及び処理された溶解細胞サンプルにおける修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の程度を決定することにより、上記のようにして決定される。活性又は阻害は、サンプル中のμg又はmgタンパク質当たりに基づいて計算され得る。従って、プロテアーゼ活性の調節は、プロテアーゼ活性の上昇を包含し、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の低下又は修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性の上昇又は維持に対応するプロテアーゼ活性の低下をもたらす。典型的には、差異は、標準測定値に対して測定され、絶対量のプロテアーゼ活性が得られる。プロテアーゼの活性又は発現を阻止するか又は妨げる試験剤が、未処理の対照に比較して、処理された細胞における高められた修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性により検出され得る。別の態様によれば、invivoでプロテアーゼ活性を変更する剤又は化合物の能力が決定される。invivoアッセイにおいては、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードする発現ベクターにより過渡的に又は安定してトランスフェクトされた細胞が異なった量の試験剤又は試験化合物に暴露され、そして細胞中のルシフェラーゼ活性に対する試験剤又は試験化合物の効果が決定され得る。典型的には、その差異は、標準測定値に対して測定され、絶対量のプロテアーゼ活性が得られる。プロテアーゼの活性又は発現を阻害するか又は妨げる試験剤は、未処理の対照に比較して、処理された細胞における高められた修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー活性により検出され得る。別の態様によれば、動物におけるプロテアーゼ活性を変更する剤又は化合物の能力が決定される。完全な動物アッセイにおいては、動物、例えばマウスが、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンターを発現する細胞により注入され、そしてその動物が異なった量の試験剤又は試験化合物に暴露される。態様によれば、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が動物に移植され得る。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質が動物中に注入される。次に、動物におけるルシフェラーゼ活性に対する試験剤又は試験化合物効果が決定され得る。本開示はまた、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体、例えば粒子、樹脂、カラム、固体表面例えば、プレート、スライド又はウェル底に固定する方法も提供する。次に、固定されたバイオセンサーは、興味ある分子の存在又は活性を検出するために使用され得る。態様によれば、精製された形での又は細胞溶解物、例えばE.コリ細胞溶解物において発現される、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、固体支持体、例えば樹脂又は固体表面上に固定され、そして興味ある分子が検出される。興味ある分子は、精製された形の分子であり得るか、又は細胞溶解物においても発現され得る。次に修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの検出できる活性が決定される。1つの観点によれば、本開示は、サンプルと、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ、そしてサンプル中のルミネッセンスを検出することを含む、サンプル中のアポトーシスを検出する方法を提供する。態様によれば、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーは、アポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む。本発明のアッセイへの使用のための材料及び組成物は、理想的には、キットの調製のために適合される。そのようなキットは、1又は2以上の容器手段、例えばバイアル、管及び同様のものを含むキャリヤー手段を含み、ここで容器手段の個々は、方法に使用されるべき別々の要素の1つを含む。容器の1つは、本発明の修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー又はポリヌクレオチド例えば、ベクターの形でのを含む。第2容器は、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーのための基質を含む。本発明は、次の非制限実施例により、さらに記載されるであろう。実施例I:細胞に高められた応答性を有する修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの生成カスパーゼ3BioSensorは、カスパーゼ-3認識部位を有する、アミノ酸358で円順列されたCP、熱安定性フォツリスペンシルバニカルシフェラーゼTLであり、すなわち、TLフラグメント間の結合で、アミノ酸DEVDを含むカスパーゼ-3認識部位を含む。開始鋳型として使用される特定のCBSは、TL-CP358-DEVD:DDと呼ばれる。このCBSのアミノ酸配列は、MTL残基358-544SDEVDGSLTL残基4-354V配列番号6として表される。CPTLにおけるアミノ酸位置は、非CPTL配列のそれらのアミノ酸に相関する付随する付録に提供される。カスパーゼ-3による処理に基づいて、CBSは認識部位で切断され、2種のTLフラグメントにより、より好ましく、高い活性のコンホメーションの形成が可能にされる。CBSの有用性は、カスパーゼ-3による切断の前及び後での示差活性である。CBSの基本活性は、カスパーゼ-3が認識部位で切断する時間の前、アッセイ時間0として定義される。誘発された活性は、CBSがカスパーゼ-3により切断された後の時間tでの活性として定義される。活性に関する応答又は倍増は、基本活性に対する誘発された活性の比率である。TL-CP358-DEVD:DDでの置換を、誤差傾向の変異誘発性PCR-基礎システムGeneMorphIIStratageneDaughertyPNASUSA972029を用いて、その製造業者の説明書に従って生成し、誘発に対する増強された応答性を有するCBS変異体を開発した。得られるライブラリーを、E.コリにおいて発現し、そして組換えカスパーゼ-3による前処理を伴って及びそれを伴わないで、ルシフェラーゼ活性についてスクリーンしたデータは示されていない。最良のシグナル及び応答特性を有するCBS変異体を、TNF-α-関連のアポプトーシス誘発リガンドTRAIL処理に対する応答を測定する動力学アッセイにより、HEK293細胞において評価したWileySRetalImmunity3673NilesALetalMethMolBiol414137。TRAILは、死受容体の活性化を通してアポトーシスを誘発し、活性カスパーゼ-8を形成し、これはカスパーゼ-3を生成するためにプロカスパーゼ3を活性化する。活性カスパーゼ-3の出現は、CBS変異体が切断され、そして活性化されるにつれて、ルミネッセンスの上昇により付随される。手短には、96-ウェルプレートのウェル当たり15,000個の細胞でプレートされたHEK293細胞を、TL-CP358-DEVD:DDにアミノ酸置換を有する種々のCBS変異体をコードするプラスミドDNAにより、TransITLTIを用いて過渡的にトランスフェクトした。同じプラスミドはまた、トランスフェクトション制御として作用するウミシイタケRenillaルシフェラーゼの構成的発現のための遺伝子を担持した。細胞を37°Cで2時間、2mMのルシフェリンにより前処理した。細胞を、1μg/mlのTRAILにより処理し、そして37°Cで10時間アッセイした。ルミネッセンスを経過時間にわたって連続的にモニターしたルミノメーター:VarioskanFlash1秒の積分時間刻み。複製ウェルにおける細胞を、TRAIL添加の時間で、すなわち時間0で溶解し、そしてウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。次に、すべてのバイオセンサーデータを、ウミシイタケルシフェラーゼルミネッセンスDualGloAssaySystemPromegaCorporationを用いて、トランスフェクション効率のために標準化した。典型的なCBS変異体は、表1に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。表1は、TRAIL処理に対する改良された応答を示す、クローン名称により識別される、TL-CP358-DEVD:DDの変異体を列挙する。表1に列挙される改良性は、親のTL-CP358-DEVD:DDCBSに対して標準化される。基礎BASALとは、TRAIL添加での、すなわち時間0での標準化されたバイオセンサールミネッセンスを表し、誘発されたものINDUCEDとは、TRAIL添加のおよそ10時間後での標準化されたバイオセンサールミネッセンスを表し、そして応答RESPONSEとは、発光量比率、すなわち基礎活性に対する誘発された活性の比率を表す。当業界において知られている標準配列決定技法を用いて、個々のクローンにおけるアミノ酸置換を同定した表1を参照のこと。アミノ酸位置は、親TL、例えば変異体=TL358の位置2でのProに基づかれ;従って、DEVDのN末端側の残基はTL残基358-544Glyを表し;DEVDのC末端側の残基は4Lys-354Glyを表す例については、図1を参照のこと。個々のアミノ酸配列置換は、TL-CP358-DEVD:DD配列を有さない親TLにおけるアミノ酸位置に対応する位置により示され、それにより、数字上の位置に続く最初の文字は親TLにおけるその対応するアミノ酸を表す。アミノ酸が別のアミノ酸により置換される場合、2番目の文字はアミノ酸置換を表す。アミノ酸が終止コドンにより置換される場合、置換はSTOPにより示される。表1:対応するTL-CP358-DEVD:DDに対するCBS変異体の応答の改良倍率foldimprovementの要約実施例II熱安定性ルシフェラーゼカスパーゼ-3バイオセンサーにおける突然変異の特定組合せの評価追加のCBS変異体を、オリゴ-基準の特定部位の突然変異誘発キットQuikChange488を用いて、その製造業者の説明書に従って生成した。最も改良された応答を有する、実施例Iからのそれらの変異体、特にクローン12:B-10、01:A-05、04:C-03、01:E-11、16:D-12、01:D-02及び07:B-02に同定されるアミノ酸置換を組合し、そして実施例IにおけるようにしてHEK293細胞において評価した。追加のCBS変異体を生成するために使用されるアミノ酸置換は、配列番号2に対応する、193SP、297SI、329RQ、471IT、503SG、507TI、523KI533VA及び536QRであった。典型的なCBS変異体は、表2に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。表2は、クローン新規番号NEW、アミノ酸置換を示す、カラムにおいてXにより示されるクローンに見出されるアミノ酸置換193SP、297SI、329RQ、471IT、503SG、507TI、523KI533VA及び536QR、対応する出発TL-CP358-DEVD:DDに対する基礎、誘発されたもの、及び応答の改良性を包含する。表2.対応するTL-CP358-DEVD:DDに対する特定アミノ酸置換の組合せを有するCBS変異体の応答の改良性の要約試験される置換の組合せの多くは、親TL-CP358-DEVD:DDバイオセンサー又は表1に開示される変異体に比較して、高められた応答を示した。4種のCBS変異体、すなわち01:A-05、FC7:24、FC7:43及びFC7:49が特に興味あるものである図1及び表3を参照のこと。図1は、親TL-CP358-DEVD:DD配列におけるそれらの変異体中に組み込まれる、4種のアミノ酸置換I471T、S503G、T507I及びS193Pの位置、及び円順列部位のために修正された位置を示すまた、表3も参照のこと。図1の上部図は、一次アミノ酸配列の連続番号付けに基づいての置換の位置を表す。図1の下部図は、親TL-CP358-DEVD:DDに基づいてのコドン名称を示す。ヌクレオチド変化は次の通りである:471ata>aca503agt>ggt507aca>ata193tcg>ccg。表3.クローン011-05、FC7:24、FC7:43及びFC7:43に見出されるアミノ酸置換の要約改良されたCBS変異体01A-05、FC7:24、FC7:43及びFC7:49それぞれ、1A5、24、43、及び49における肝細胞中のTRAILに対する応答を、10時間にわたって、図2A-B及び3A-Bにおける親TL-CP358-DEVD:DDTL-CPと比較した。変異体01:A-05は、TL-CP358-DEVD:DDに比較して、それぞれ2及び10時間のTRAIL処理の後、2倍及び約4.8倍高い応答を有した図2A及び2B。2時間後、変異体FC7:24及びFC7:49は、TL-CP358-DEVD:DD及び変異体43よりも約2倍高い応答を有した図3A及び3B。10時間後、変異体FC7:24及びFC7:49はTL-CP358-DEVD:DDよりも約3.2-3.7倍高い応答を有し図3A及び3B、そして変異体FC7:43は約2.2倍高い応答を有した。それらのデータは、CBSバイオセンサーがそれらの4種のアミノ酸置換471T、S503G、T507I及びS193Pのうち1又は2以上の置換を組み込むことにより、改良された応答を有するよう生成される得ることを示す。実施例III異なったリンカー配列、例えばSSDEVDGSSG、SSGSDEVDGSLSSG、SDEVDGSL配列番号54又はDEVDGを有する追加のCBS変異体を生成した。CBS変異体を、実施例IにおけるようにしてHEK293細胞において評価した。典型的なCBS変異体は、図4に列挙されるそれらの変異体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、すべてのバイオセンターデータを、実施例Iにおけるようにして、ウミシイタケルシフェラーゼルミネッセンスを用いて、トランスフェクション効率のために標準化した。図4は、それが含むリンカー配列リンカーによるクローンを識別し、そしてTRAIL添加、すなわち時間0基礎t=0で、TRAIL添加後、およそ10時間で誘発されたもの10時間、RLUにおけるルミネッセンス、及び発光量比率、すなわち基礎活性に対する誘発されたもの活性の比率応答10時間を示す。2種の実験間の共通するリンカーは、番号2である。数の差異は実験間の典型的な変動である。リンカー3は、TL-CP358-DEVD:DDとして言及されるクローンに見出される同じリンカーである。実施例IV:カスパーゼ-8を検出するためへの熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーの評価本発明の熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞中のカスパーゼ-8活性を検出するために使用され得るかどうかを評価するために、カスパーゼ-8切断部位、LETDG配列番号15を含むバイオセンサーを生成した。2種の異なったバイオセンサーTL-CP358-カスパーゼ-8及びTL-CP233-カスパーゼ-8を使用した。対照として、ホタルフォチナスピラリス:PpyルシフェラーゼバイオセンサーFFCP234カスパーゼ8、FF-CP359-カスパーゼ8及びTL-CP358-DEVDを使用した。表4は、前記バイオセンサーの詳細な配列を提供する。表4すべてのバイオセンサーを、HeLa細胞中にトランスフェクトした。細胞を、96-ウェル組織培養プレート中に10,000/ウェルでプレートした。バイオセンサーDNAを、表4に記載のようにして、細胞中へのトランスフェクションのために調製した。30の10μl反応を、個々のバイオセンサーについて設定した。TransITLTIトランスフェクションマスター混合物を、1650μlのDMEMと49.5μlのLTIとを混合することにより調製した。このマスター混合物を室温で15時間インキュベータした。次に、300μlのマスター混合物を個々のバイオセンサーDNAに添加し30の反応のために十分な;0.1μg/反応、そして室温で、さらに15分間インキュベートした表5。10μlのバイオセンサーDNA-トランスフェクションマスター混合物溶液を、適切なウェル中の細胞に添加した。次に、細胞を37°C、5CO2下で一晩インキュベートした。表5一晩のインキュベーションの後、培地を細胞から除去し、そして2mMのルシフェラーゼEFPromegaからログ番号E6551を含むCO2非依存性培地により置換した。細胞を、Varioskanルミノメーターにおいて2時間、ルシフェリンEFにより予備平衡化し、そして20分ごとにバイオルミネッセンス読み取りを行った。インキュベーションに続き、細胞を、CO2非依存性培地10ウシ胎児血清FBS中、1μg/mlのTRAILにより、又は化合物を含まない対照培地10FBSのみにより誘発した。細胞を再び500分間、Varioskanルミノメーターにおいて37°Cでインキュベートし、そして20分ごとにバイオルミネッセンスを読取った。図5-8は、TL-CP233-カスパーゼ8及びTL-CP358-カスパーゼ8で、バイオセンサーがTRAILによるカスパーゼ8活性化を検出できることを示す。図5及び7は、37°Cでの時間経過にわたってのTRAILによるカスパーゼ8活性化の運動プロフィールを識別する。図6及び8は、経過時間にわたってのTRAILによるカスパーゼ8活性化の反応倍率を識別する。活性化の発光量比率を、所定の時点で、TRAILを有さないサンプルのシグナルによりTRAILを有するサンプルのシグナルを割算することにより計算した。図7及び8は、TL-CP358-DEVDにより測定されるようなTrailによるカスパーゼ3誘発、及びカスパーゼ8誘発を示す。実施例V:TEVプロテアーゼ熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーの活性化本発明の熱安定性変異ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞中のTEVプロテアーゼ活性を検出できるかどうかを評価するために、TEVプロテアーゼ切断部位GSS-ENLYFQS-SSG配列番号78を含む、TL-CP233バイオセンサー、すなわちTL-CP233-TEVを生成した。TL-CP233-TEVは、M/TL残基233-544GSS-ENLYFQS-SSGTL残基4-233/Vとして表され得るアミノ酸配列を有する。対照として、ホタルフォチナスピラリス;PpyルシフェラーゼバイオセンサーFF-CP235-TEV、FF-CP269-TEV及びFF-CP359-TEVを使用した。すべてのトランスフェクションのために、CMVプロモーターから連続的に発現されるTEVプロテアーゼGenbank受託番号BFB754をトランスフェクトした。この構造体は、トランスフェクション効率対照としての使用のためにウミシイタケルシフェラーゼを同時発現する。バイオセンサー及びTEVプロテアーゼ構造体の個々を、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞にトランスフェクトした。細胞を、96-ウェル組織培養プレート中に、15,000個の細胞ウェルでプレートした。トランスフェクション溶液を、表6に従って調製した。個々のセンサーを、TEVプロテアーゼ又はキャリヤーベクターpF9a-nullのいずれかと共に同時トランスフェクトした。表6細胞を、37°C、5CO2下で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を培地及び5mMのルシフェリンEFにより2時間、平衡化した。次に、バイオルミネッセンスをVarioskanルミノメーターにより37°Cで測定した。結果を、トランスフェクション効率のために対照のウミシイタケに対して評価した。TEV認識配列FF-CP233-リードスルー;FF-CP233-RTを有さないバイオセンサーを、TEVプロテアーゼにより活性化せず、そして他のバイオセンサーをTEVプロテアーゼにより活性化した図9。実施例VI:グリオーマ細胞におけるアポトーシスの分子イメージング本発明の熱安定性変異バイオセンサーが細胞における細胞死を検出するために使用され得ることを示すために、熱安定性カスパーゼ3バイオセンサー、TL-CP233-カスパーゼ3、TL-CP358-カスパーゼ3、及び熱安定性変異カスパーゼ3バイオセンサー1A5、24、43及び49を、グリオーマ細胞系D54-MGにおいて安定して発現し、細胞を、TRAILにより処理し、そしてバイオルミネッセンス測定し、カスパーゼ3活性を検出した。熱安定性バイオセンサーを安定して発現する細胞を誘導するために、D54-MG細胞をバイオセンサーによりトランスフェクトした。バイオセンサーを、PCR増幅により、ネオマイシン耐性遺伝子Invitrogenを含むpEFベクター中にサブクローン化し、そしてSalI及びEcoRI制限部位で多重クローニング部位中に挿入した。トランスフェクションを、3μlのFugene6トランスフェクション試薬Roche及び1μgのプラスミドDNAを用いて、6-ウェル組織培養皿において実施した。細胞を、10FBSGibco、PenStrepグルタミン及び200μgmLゲネシチンを含むRPMI培地Gibcoに、48時間、配置した。単一のクローンを、当業界において周知である標準技法を用いて、トランスフェクションのおよそ10日後、選択した。手短には、培地を細胞から除き、そして細胞を軽くPBSにより洗浄した。丸形フィルター紙をトリプシンに浸し、そして単一のコロニー上に配置した。結合された細胞を含むフィルター紙を除き、そして24-ウェル組織培養皿中に配置した。それぞれ個々の細胞を、ルシフェラーゼ抗体Promega;カタログ番号G7451及びバイオルミネッセンスPBSにおいて再構成された100μg/mlのD-ルシフェリンを培地に直接、添加し、そして検出したを用いて、ウェスターンブロットにより、レポーター発現のための選択の約2-3週後、試験した。類似するバイオルミネッセンス活性最高の発光量比率及びレポーター発現ウェスターンブロットにより決定されるを有するクローンを、細胞死の検出への使用のために選択した。細胞死を検出するために、安定D54-MG細胞を、96-ウェルアッセイプレート中に、10,000個の細胞/ウェルで接種し、そして37°C、5CO2下で24時間インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、細胞を、200ng/mlのD-ルシフェリンPromegaにより処理した。生存細胞バイオルミネッセンスを、2、4及び6時間で映像化した。光子数を、EnvisionルミノメーターPerkinElmerを用いて、前-及び後-TRAIL処理の異なった時点で数えた。レポーター発現及びTRAIL-誘発されたアポトーシスをさらに、ルシフェラーゼ及びカスパーゼ-3に対して、ウェスターンブロットにより検出した。図10は、TRAILによる処理に基づいて、種々の熱安全生/バイオセンサーを安定して発現するD54-MG細胞は、バイオルミネッセンス活性において100-200倍の誘発をもたらしたことを示す。異なったバージョンの熱安定性バイオセンサーを発現するD54-MG細胞を、処理しないか、又は200ng/mlのTRAILにより処理し、そして示される時点で映像化し;光子数/秒を示される時点で記録した図10A。処理されていないか又は200ng/mlのTRAILにより処理された、異なったバージョンの熱安定性バイオセンサーを発現するD54-MG細胞の発光量比率を、基線時間0時に対して値光子/秒を標準化することにより計算した。図10B。異なったバイオセンサーバージョンにより達成されるフォールドチェンジfoldchangesの他に、基線、2、4及び6時間の後処理での平均光子数/秒が図10Cに示される。図10Dは、ルシフェラーゼ及びカスパーゼ-3に対する、レポーター発現及びTRAIL誘発されたアポトーシスの検出をウェルターンブロットにより示す。実施例VII:熱安定性変異バイオセンサーの使用invivoでの細胞死を検出するためへの熱安定性変異バイオセンサーの使用を示すために、TL-CP233-カスパーゼ3、TL-CP358-カスパーゼ3、1A5、43又は49のいずれかを安定して発現するD54-MG細胞を、ヌードマウス中に移植した。脇腹に異種移植されたマウスモデルを確立するために、上記に列挙されるバイオセンサー実施例VIに記載されるようなの1つを安定して発現する2×106個のD54-MG細胞をヌードマウスに皮下移植した。8mg/kgのTRAILによる処理を、腫瘍が電子デシタルカルパス測定によりされる場合、腫瘍が約100mm3に達した場合に、開始した。invivoバイオルミネッセンス検出のために、マウスに、2イソフルラン/空気混合物を用いて麻酔をし、そして単一用量150mg/kgのD-ルシフェリンを腹腔内注入した。光子数/秒を、IVISイメージングシステムCaliperLifeSciencesを用いて、TRAIL処理の前、及び処理の6時間後図11A、得た。発光量比率図11Bを、マウス当たり、全処理値に対して後処理値を標準化することにより計算した。データは、本発明の熱安定性変異バイオセンサーが、TRAIL処理に基づいて100倍のバイオルミネッセンス活性化が異種移植マウスモデルに見出される場合、非常に敏感であることを示す。D54-MGレポーター異種移植されたヌードマウスを、8mg/kgのTRAILにより処理した。光子数/秒を前-及び後-処理から得た図11。発光量比率を、マウス当たり、前処理値に対する後処理値を標準化することにより計算した図11B。図11Cは、異なったバイオセンサーバージョンにより達成されるフォールドチェンジの他に、基線での及び処理後6時間での平均光子数/秒を示す表を示す。実施例VIII:胸骨転移での細胞死のイメージング動物における細胞死を検出するためへの熱安定性カスパーゼ-3バイオセンサーの使用を示すために、TL-CP233-カスパーゼ-3バイオセンサーグリオーマ細胞についての実施例VIに記載されるようにして誘導されたを安定して発現する100,000個のMDA-MB231/1833細胞1833;乳癌細胞系を、ヌードマウスの頸骨中に移植した。腫瘍増殖に続いて、MRIを取り、そしてTRAIL処理を、腫瘍が5-15mm3に達した場合に開始した。invivoバイオルミネッセンス検出のために、マウスを2イソフルラン/空気混合物を用いて麻酔し、そして単一用量150mg/kgのD-ルシフェリンを腹腔内注入した。光子数/秒が、TRAIL処理の前及び処理後6時間で、又は図12A-Dに示されるように、IVISイメージングシステムCaliperLifeSciencesを用いて得られた。発光量比率図11Bを、マウス当たり前処理値に対して後処理地を標準化することにより計算した。図12Aにおいては、TL-CP233-カスパーゼ-3を安定して発現する頸骨内移植されたMDA-MB231/1833を、TRAIL200ng/mlにより処理し、そして1時間ごとに連続して10分間、映像化した。発光量比率を、前処理値に対してデータを標準化することにより計算した。図12Bにおいては、Z因子を、あらゆる時点で、Zhangetalに記載のようにして計算し、そして0.82の平均Z因子が高生産性スクリーニングのためのアッセイ適合性を満たした。図2Cにおいては、代表的なイメージが、MDA-MB231/1833細胞を安定して発現する頸骨内移植されたTL-CP233-カスパーゼ-3から示される時点で、光子/秒により取られた。図12Dにおいては、TRAILにより処理された、異種移植された試験動物の発光量比率が示された。このデータは、マウスモデルにおいて細胞死を力学的に且つ時間経過にわたってイメージングするための熱安定性バイオセンサーの有用性を強調する。実施例IX:高生産性スクリーニングでの熱安定性カスパーゼバイオセンサーの有用性高生産性スクリーニングHTSへの熱安定性バイオセンサーの有用性を示すために、実施例VIIIからのTL-CP233-カスパーゼ-3を安定して発現するMDA-MB2311833細胞を用いて、NIHClinicalCollectionBiofocusandTimTecKinaseInhibitorlibrariesにおける化合物をスクリーンした。TL-CP233-カスパーゼ-3MDA-MB2311833細胞を、96-ウェルプレートに、10,000個の細胞/ウェルで接種した。接種の48時間後、培地を、1GloSensorcAMP試薬を含むCO2非依存性培地に変え、そして10μMの最終濃度で化合物と共に0~23時間インキュベートした。NIHClinicalCollectionにおける合計483の化合物及びTimTecCollectionからの80のキナーゼインヒビターを試験した。培地及び化合物ライブラリーの添加を、TitertekMultidropMicroplateDispensorを用いて実施した。相対的ルミネッセンスを、未処理のウェルに対して化合物処理されたウェルの値を標準化することにより計算した図13A及び13C。図13Aは、NIHClinicalCollectionBiofocusLibraryにおける化合物からの化合物処理最大に基づく相対的ルミネッセンスを示す。図13Cは、TimTecKinaseInhibitorLibraryにおける化合物からの化合物処理最大に基づく相対的ルミネッセンスを示す。4以上に達する最大値は有意であると見なされる。ヒートマップを、BioinformaticsToolboxofMatlabSoftwareを用いて生成し、そして時間経過にわたってのバイオセンサーの活性化の相互関係を示す図13B及び13D。Z-因子は、実施例VIIIに記載のようにして計算された。熱安定性バイオセンサーの反復されたイメージング能力のために、種々の薬物に応答してのアポプトーシスの力学が映像化され得る。これは、化学療法抵抗性の1833の乳癌細胞系において興味ある死誘発性化合物の同定を可能にした。実施例X:MMP-2センサーの精製マトリックスメタロプロテイナーゼMMPは、細胞外マトリックスの主要タンパク質成分の分解に関与する亜鉛酵素の相同グループである。5種の主要MMPがヒトに同定されており、そして結合組織転換及び破壊に関与している。それらは、マトリックス部分を占めるタイプI,II及びIIIコラーゲンを加水分解する線維芽細胞型及び好中球型隙間性コラーゲンを包含する。線維芽細胞コラゲナーゼはまた、生来型VII及びXコラーゲンも加水分解する。MMPは時々、線維芽細胞型及び好中球型コラーゲンがそれぞれMMP-1及びMMP8として示される数字コードにより言及される。72-kDaのゼラチナーゼMMP-2が増殖する線維芽細胞及び腫瘍細胞により生成され、ところが明確な92-kDaのゼラチナーゼMMP-9が好中球、マクロファージ及び一定の形質転換された細胞により生成される。本明細書に使用されるMMP-2センサー配列番号69及び70は、1A5変異体バックボーン及びヒトMMP-2認識部位PLGMWSR配列番号72を含む。さらに、MMP-2センサーは、次の2種の精製標識を含む:TEVプロテアーゼ部位によりセンサー領域から分離されるセンサーのN末端上のGST標識精製されたMMP-2センサーからのGST標識の除去のための及びセンサーのC末端上の5xHQ標識。MMP-2センサーの精製を、His及びGST精製を用いて、次の通りに実施した。1.MMP-2センサーを含むE.コリKRX細胞Promegaの培養物2~5mlを、37°Cで振盪しながら、LB/アンピシリンにおいて増殖した。2.個々の培養物を、0.05ラムノース及び0.05グルコースを有する1LのLBにより1:100に希釈した。3.25°Cで18-20時間インキュベートした。4.細胞を5000gで5分間の遠心分離により収穫し1Lを2-500mlのアリコートに分ける、細胞ペーストの重量を計測し、そして-20°Cで一晩、置いた。5.2つの細胞ペーストの1つを、30mlの溶解緩衝液8.5mLgの細胞ペースト50mMのNaH2P04、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール及びNaOHによりpH8.0にするにより再懸濁した。1mg/mlのリソザイムを添加し、そしてその再懸濁液を、時折転倒しながら、氷上で30分間インキュベートした。6.溶解溶液を、パワー6.0で2分間5秒の始動、5秒の停止、音波処理した。100μlのサンプルを、合計サンプルとして保存した。7.溶解溶液を、16,000gで20分間、回転した。100μlのサンプルを、可溶性サンプルとして保存した。8.6mlの溶解物当たり1mlの50Ni-NTA樹脂Oiagen;溶解緩衝により予備洗浄された合計5mlを添加し、そして4°Cで1時間、混合した。9.サンプルをテーブルトップ遠心分離機上で700rpmで2分間、回転した。100μmlのサンプルを、フロースルーflowthroughサンプルとして保存し、そして上清液を捨てた。10.樹脂を40mlの溶解緩衝液により洗浄し、4°Cで5分間、混合し、テーブルトップ遠心分離機上で700rpmで2分間、回転し、そして上清液を捨てた。11.次に、樹脂を40mlの洗浄緩衝液20mMのイミダゾールを含む溶解緩衝液により洗浄し、テーブルトップ遠心分離機上で700rpmで2分間、回転し、そして上清液を捨てた。12.10mlの洗浄緩衝液を添加し、そして混合し、そして上清液を空のカラムに添加した。13.カラムを50mlの洗浄緩衝液により洗浄し、そして100μlの樹脂を除き、そして保存した。14.センサーを、10mlの溶出緩衝液250mMのイミダゾールを含む溶解緩衝液によりカラムから溶出し、そして0.5mlの画分を集め、そしてBradfordアッセイを用いて、直接的にアッセイした。15.100μlの樹脂を除き、そして保存し、溶出画分を組合し、そしてその組合された画分を10mlの溶解緩衝液により希釈した。16.組合された画分を、GST結合/洗浄緩衝液1×PBSにおいて透析した。17.透析されたタンパク質を、GST結合/洗浄緩衝液により予備洗浄された5mlのグルタチオン-セファロース樹脂スラリーGEカタログ番号17-0756-01に添加し、そして4°Cで1時間インキュベートした。18.樹脂混合物をテーブルトップ遠心分離機上で700rpmで2分間、回転し、その100μlをフロースルーとして保存し、そして上清液を捨てた。19.樹脂を空のカラムに添加し、50mlのGST結合/洗浄緩衝液により洗浄し、そしてその100μlを除いた。20.タンパク質を溶出緩衝液10mMの還元されたグルタチオンを含む1×PBS緩衝液により溶出した。0.5mlの画分集め、そしてBradfordアッセイを用いて、直接的にアッセイした。100μlの樹脂を除き、そして保存した。21.保存された画分合計、可溶性、フロースルーhis、溶出の前のHis樹脂、溶出後のHis樹脂、透析後のサンプル、フロースル-GST、溶出の前のGST樹脂、溶出のGST樹脂、及びGST画分を、SDS-PAGEゲル上で分析した図14。22.GST画分を組合し、そして貯蔵緩衝液50mMのHEPESpH7.5、150mMのNaCl、1mMのDTT、50グリセロールにより透析した。精製されたMMP-2センサーがMMP-2を検出できることを示すために、精製されたMMP-2センサー1.3mg/mlを、図15に記載のようにして、緩衝液50mMのTris-HClpH7.5、150mMのNaCl、10mMのCaCl2及び0.05Brij35により希釈した。活性化されたMMP-210ng/μl;Anaspecを、図15に記載のようにして、希釈されたMMp-2センサーン添加した。最終反応混合物の合計体積は50μlであった。この混合物を37°Cで1時間インキュベートした。BrightGloアッセイ試薬を、その製造業者の説明書に従って調製し、そしてその50μlを前記混合物に添加した。ルミネッセンスを、GloMaxMultiplusルミノメーター上ですぐに読取った。図15は、対照MMP-2センサーからのバックグラウンドに対する倍増を表す。その結果は、本発明のMMP-2センサーが、0.75ngほどの少ないタンパク質を検出するために使用され得る。精製されたMMP-2センサーの感受性をさらに示すために、蛍光発生性SensoLyte520MMP-2アッセイをまた使用し、MMp-2タンパク質を検出した。アッセイを、その製造業者の説明書に従って実施した。蛍光を、Ex490nm/Em520nmでTecan蛍光計上で検出した。図16A-Bは、Sensolyteアッセイを用いての1.5ngのMMP-2タンパク質の検出を報告する。実施例XI:CBSの無細胞発現本発明のプロテアーゼバイオセンサーが無細胞環境下で外因性クロロテアーゼにより効果的且つ効率的に切断され得ることを示すために、CBS変異体1A4を小麦胚芽抽出物において発現し、そしてカスパーゼ-3を検出するために使用した。CBS変異体1A5を、ベクターpFN19KHaloTag中にクローン化し、CBS-HaloTag融合タンパク質配列番号71及び72を生成した。20μl8μgのCBS-HTベクターを、30μlのTnT登録商標SP6高-収率小麦胚芽発現システムPromegaカタログ番号L3261に添加し、そして25°Cで90分間インキュベートした。CBS-HTカスパーゼ-3切断反応に関しては、1体積の発現反応を等体積のカスパーゼ-3含有E.コリ溶解物又はC3溶解緩衝液0.8×FastBreak、10mMのDTT、0.1CHAPS、0.8mg/mlのリソザイム、3U/μlのRQ1DNアーゼPromegaカタログ番号M610Aのいずれかと共にインキュベートし、そして室温で60分間インキュベートした。カスパーゼ-3含有E.コリ溶解物を、組換えカスパーゼ-3を過剰発現するKRX細胞から調製した。手短には、KRX細胞を、pTS1k:カスパーゼ-3T/Sにより形質転換した。開始培養物50ml、LBブイヨンを、単一コロニーから接種し、そして振盪しながら275rpm、37°Cで17-22時間、増殖した。開始培養物を新鮮な培地により希釈し1:50、そして増殖を、さらに3時間、続けた。次に、インキュベーション温度を25°Cに下げ、そして15分後、カスパーゼ-3の発現を、ラムノースの添加により開始した0.2の最終濃度。2時間後、細胞を遠心分離により集め、50mlのC3溶解緩衝液に再懸濁し、そして周囲温度すなわち、22-24°Cで10分間インキュベートした。溶解物を、遠心分離20,000xg、4°Cで20分により透明にし、そしてカスパーゼ-3源として使用した。カスパーゼ-3によるCBS-HTの切断を次の異なった手段により検出した:SDS-PAGE分析及びルミネッセンス検出。SDS-PAGE分析に関しては、切断反応サンプルを、まず蛍光マーカーCA-TAMクロロアルカン-TAMRAリガンドPromegaカタログ番号G825Aにより標識した。20μlのサンプルを、20μlのCA-TAM緩衝液1×PBS、0.05IGEPALにより1:100に希釈されるに添加し、そして室温で30分間インキュベートした。このサンプルに、40μlのSDS-PAGE充填緩衝液、1SDS、25.2グリセロール、1.5mMノブロモフェノールブルー、100mMのDTTを添加した。得られる溶液を65°Cで30分間インキュベートした。その10μlを、SDS-PAGEゲル上に負荷した。対照として、0.60、0.15及び0.03mg/mlのHT:GSTHaloTagGSTにより検出した。ルミネッセンスによる検出のために、40μlの切断反応サンプルを、60μlの緩衝液50mMのHEPESpH7.5及び100μlのBright-Gloアッセイ試薬に添加した。ルミネッセンスを、前記のようにして検出した表7。表7実施例XII:CBSの固定化無細胞環境下で発現される本発明のプロテアーゼバイオセンサーがら、固体支持体上に固定される場合、活性を維持すること示すために、小麦胚芽抽出物において発現されるCBS-HT融合体実施例XIを、固体支持体樹脂及びプレートに固定し、そしてそれを用いて、カスパーゼ-3を検出した。樹脂への固定化図18Aに関しては、Haldink樹脂25スラリー、Promegaカタログ番号G1912をまず、HTPB緩衝液50mMのHEPES、150mMのNaCl、1mMのDTT及び0.5mMのEDTAにより平衡化した。1体積のスラリーからの樹脂を遠心分離機1000xgで5分により集め、そして貯蔵緩衝液を除いた。樹脂ペレットを2体積のHTPBに再懸濁し、そして混合した。この工程を合計3回のHTPB洗浄のために反復した。実施例XI無細胞発現反応からのCBS-HT融合体100μlを、25μlの洗浄された樹脂HTPB中、50スラリーと共に混合し、そして4°Cで混合しながら、一晩インキュベートした。インキュベーションを周囲温度で2時間、続けた。インキュベーションの後、樹脂を洗浄し、未結合CBSを除いた。樹脂を50μlアリコートにわけ、そして個々のアリコートをHTPBにより3度、洗浄した。最終樹脂ペレットを、50μlのHTPBに再懸濁した。CBSカスパーゼ-3切断反応に関しては、20μlの洗浄された樹脂を、20μlのカスパーゼ-3含有E.コリ溶解物又はC3溶解緩衝液実施例XIにおけるようなのいずれかと共に混合し、そして周囲温度で30分インキュベートした。60μlのHEPESpH7.5を前記サンプルに添加し、続いて100μlのBrightGloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを前記のようにして検出した表8及び図19。表8プレートへの固定化図18Bに関しては、CBS-HT融合タンパク質を固定化するためのHalotag登録商標リガンドを含むマイクロタイタープレートを調製した。手短には、アミン-PEG200-ClアルカンHaloTag等力商標リガンド0.25mMの最終濃度を含む重炭酸塩緩衝液pH8.5100μl;pbi3961及びメトキシ-PEG-NH20.75mMの最終濃度を、NHSマイクロタイタープレートのウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートした。次に、ウェルを、0.05Tween-20を含むPBSにより3度、洗浄した。洗浄の後、50mMのエタノールアミンを添加し、そしてプレートを周囲温度で30分間インキュベートし、そして0.05Tween-20を含むPBSにより再び3度、洗浄した。次にプレートを、個々のウェルにおいて、0.05Tween-20を含むPBSと共に4°Cで貯蔵した。アッセイに関しては、ウェルを200μlのHPTBにより3度、洗浄した。50μlのCBS-HT無細胞発現反応物実施例XIをウェルに添加し、そして4°Cで一晩インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートを200μlのPBSI0.05IGEPALを含む1×PBSにより3度、洗浄した。100μlのカスパーゼ-3を含むE.コリ溶解物又はC3溶解緩衝液上記に記載されるを添加し、そしてプレートを混合しながら、室温で60分間インキュベートした。次に、ウェルを100μlのPBSIにより洗浄した。100μlのHEPESpH7.5及び100μlのBrightGloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前記のようにして検出した表9。表9実施例XIII:EコリにおけるCBS発現本発明のプロテアーゼバイオセンサーがEコリにおいて発現され、そして機能することができることを示すために、CBS変異体1A5をE.コリにおいて発現し、そしてそれを用いて、カスパーゼ-3を検出した。CBS変異体1A5を、HaloTag登録商標CBSのC末端例及び5xHQ標識CBSのN末端側を含む細菌発現ベクター中にクローン化した。この融合タンパク質を、次の通りにしてE.コリにおいて発現した:E.コリKRXベクターにより形質転換した。開始培養物50ml、LBブイヨンを、単一コロニーから接種し、そして振盪275rpmしながら、37°Cで17-22時間、増殖した。開始培養物を、誘発培地500mL、0.05グルコース及び0.02ラムノースを含むLBブイヨン中に希釈し1:50、そして増殖を、振盪275rpmしながら、25°Cで、さらに17-22時間続けた。培養物を2つの250mlアリコートに分け、そして細胞を遠心分離4°Cで20分間、5,000xgにより集めた。1つの細胞ペレットを、溶解緩衝液25mL、50mMのHEPES、0.2XFastBreak、2mMのDTT、0.05CHAPS、50mMのアルギニン、50mMのグルタミン酸、0.2mg/mLのリソザイム、lOU/mLのRQ1DNアーゼ及びプロテアーゼインヒビターに再懸濁し、そして氷上で30分間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを音波処理したMisonixSonicator3000、合計4分、5秒の開始、5秒の休止、パワー設定5。粗溶解物を、遠心分離4°Cで20分間、20,000xgにより透明にし、そして上清液透明な溶解物をCBS源として使用した。カスパーゼ-3切断反応に関しては、20μlの透明な溶解物を、カスパーゼ-3を発現するE.コリ溶解物実施例XII20μlと共に混合し、そして室温で30分間インキュベートした。60μlのHEPESpH7.5を添加し、続いて100μlのBrightGloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを上記のようにして検出した図20。実施例XIV:E.コリからのCBSの精製E.コリからの本発明の機能プロテアーゼバイオセンサーを精製する能力を示すために、実施例XIIIにおいて発現されるCBSを、HisLinkPromegaカタログ番号V8821カラムクロマトグラフィーを用いて、その製造業者の説明書に従って精製した。手短には、25mlの透明にされた溶解物をNaClにより0.5Mにし最終濃度、そして結合緩衝液100mMのHEPESpH7.5、10mMのイミダゾール、500mMのNaClにより平衡化された、固定されたHisLink樹脂2mlに適用した。樹脂を、12mlの結合緩衝液、続いて溶出緩衝液100mのHEPESpH7.5、100mMのイミダゾールにより洗浄した。1.75mlの画分を集めた。SDSPAGEゲル分析に関しては、サンプルをCA-TAMにより標識し、そして前記のようにして分析した図21A。カスパーゼ-3切断反応に関しては、20μlの個々のサンプルを、20μlのカスパーゼ-3を発現するE.コリ溶解物実施例XIIと共に混合し、そして室温で30分間インキュベートした。60μlのHEPESpH7.5を添加し、続いて100μlのBright-Gloアッセイ試薬を添加した。ルミネッセンスを、上記のようにして検出した表10及び図21B。表10実施例XV:E.コリ発現されたCBSの固定化E.コリに発現されるプロテアーゼバイオセンサーが、プロテアーゼを検出する能力を維持しながら、固体支持体に固定され得ることを示すために、精製されたHQ:CBS:HTを、HaloLink樹脂及びHaloLinkプレート上に固定し、そしてカスパーゼ-3による活性化についてアッセイした。HaloLink樹脂上への固定化のために、100μlの精製されたHQ:CBS:HTを、30μlの固定されたHaloLink樹脂前記のようにHTPBにより予備平衡化されたに添加し、そして周囲温度で2時間インキュベートした。樹脂を、300μlのHTPBにより3度、洗浄し、そして最終樹脂ペレットを、300μlのHTPBに再懸濁した。50μlの洗浄された樹脂を、カスパーゼ-3を含むE.コリ溶解物20μl又はC3溶解緩衝液50μlに添加し、そして終止温度で30分間インキュベートした。100μlのBrightGloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前述のようにして検出した表11及び図22。HaloLinkプレート上への固定化のために、100μlの精製されたHQ:CBS:HTを、固定されたHaloTag登録商標リガンドを含むマイクロタイタープレートに添加した実施例XII。プレートを、混合しながら、室温で2時間インキュベートした。次に、プレートを、1×PBSI0.05IGEPALを含む1×PBSにより3度、洗浄し、そしてカスパーゼ-3を含むE.コリ溶解物前述のようにして調製された100μlと共に室温で30分間インキュベートした。100μlのBright-Gloアッセイ試薬を添加し、そしてルミネッセンスを前述のようにして検出した表11及び図22。表11すべての出版物、特許及び特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書においては、本発明はその一定の態様に関して記載されており、そして多くの詳細が例示目的のために示されて来たが、本発明は追加の態様に影響されやすく、そして本明細書における一定の詳細が、本発明の基本的原理から逸脱することなく、相当に変更され得ることは、当業者に明らかであろう。従って、本発明は、中でも、標的分子に対する増強された応答を有する、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを提供する。本発明の種々の特徴及び利点が次のクレームン示される。"