"明細書に記載の発明。新脈管形成疾患の現在の処置は、不適切である。連続性の新脈管形成を防止する薬剤例えば、薬物TNP-470、モノクローナル抗体、アンチセンス核酸およびタンパク質アンギオスタチンangiostatinおよびエンドスタチンendostatinが、現在試験されている。Battegay、J.Mol.Med.、73、333-3461995;Hanahanら、Cell、86、353-3641996;Folkman、N.Engl.J.Med.、333,1757-17631995を参照のこと。抗新脈管形成タンパク質を用いた予備的な結果は有望だが、新規な抗新脈管形成治療の開発のために、新脈管形成に関与するリガンドおよびレセプターをコードする遺伝子を、同定する必要が依然存在する。発明の要旨本発明者らは、VEGF165R遺伝子配列番号1をコードするcDNAを単離し、そしてそのレセプターのアミノ酸配列配列番号2を推定した。本発明者らは、この新規なVEGFレセプターが、Flt-1またはKDR/Flk-1に構造的に関係なく、そして内皮細胞だけでなく、非内皮細胞驚くことに腫瘍細胞を含むによっても、発現されるということを発見した。したがって、本発明は以下を提供する。1VEGF165に特異的に結合し、そしてVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させる、単離された可溶性ニューロピリン。2前記ニューロピリンが、ニューロピリン-1またはニューロピリン-2である、項目1に記載の可溶性ニューロピリン。3前記ニューロピリンが、ニューロピリン-1であり、そして配列番号2のアミノ酸配列か、またはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントを包含する、項目2に記載の可溶性ニューロピリン。4前記ニューロピリンが、ニューロピリン-2であり、そして配列番号4のアミノ酸配列か、またはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントを包含する、項目2に記載の可溶性ニューロピリン。5前記ニューロピリンが、ニューロピリン-1であり、そして配列番号6のアミノ酸配列を包含する、項目2に記載の可溶性ニューロピリン。6前記ニューロピリンが、ニューロピリン-2であり、そして配列番号8のアミノ酸配列を包含する、項目2に記載の可溶性ニューロピリン。7配列番号2のアミノ酸227~587か、あるいはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、単離された可溶性ニューロピリン-1。8配列番号4のアミノ酸277~594か、あるいはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、単離された可溶性ニューロピリン-2。9項目1~8に記載の可溶性ニューロピリンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。10VEGF165に特異的に結合し、そしてVEGF媒介HUVEC増殖を減少させる、可溶性ニューロピリンをコードする単離されたポリヌクレオチド。11前記ニューロピリンが、ニューロピリン-1またはニューロピリン-2である、項目10に記載の単離されたポリヌクレオチド。12前記ニューロピリンが、配列番号2のアミノ酸配列227~587か、あるいはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、項目11に記載の単離されたポリヌクレオチド。13前記ニューロピリンが、配列番号4のアミノ酸配列277~594か、あるいはVEGF165媒介HUVEC増殖を減少させるそのフラグメントまたは相同体を包含する、項目12に記載の単離されたポリヌクレオチド。14前記ニューロピリンが、ニューロピリン-1であり、そして配列番号6のアミノ酸配列を包含する、項目11に記載の単離されたポリヌクレオチド。15前記ニューロピリンが、ニューロピリン-2であり、そして配列番号8のアミノ酸配列を包含する、項目11に記載の単離されたポリヌクレオチド。16配列番号5または配列番号7のヌクレオチド配列を有する、項目10に記載の単離されたポリヌクレオチド。17項目10~16に記載のポリヌクレオチドを含有する、ベクター。18項目17に記載のベクターを含有する、宿主細胞。19前記キャリアが、皮膚への局所的な適用に対して受容可能である、項目9に記載の薬学的組成物。20前記キャリアが、眼への適用に対して受容可能である、請求項9に記載の薬学的組成物。21前記組成物が、VEGFに関連する疾患または障害を有する被験体を処置する方法に使用するものである、項目9に記載の薬学的組成物。22前記VEGFに関連する疾患または障害が、転移、不適切な新脈管形成、慢性炎症、糖尿病性網膜症、および関節炎からなる群より選択される、項目21に記載の薬学的組成物。23前記疾患または障害が、固形腫瘍である、項目21に記載の薬学的組成物。24前記組成物が、ニューロピリンを発現する腫瘍を処置する方法において使用するためのものである、項目9に記載の薬学的組成物。25VEGFに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目10に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。26VEGFに関連する疾患または障害を処置するための医薬の調製における、項目1~8に記載の単離された可溶性ニューロピリンの使用。VEGF165Rの機能の確認において、本発明者らはさらに、このレセプターが、ニューロン細胞誘導の細胞表面媒介物として同定されたことを発見し、そしてニューロピリン-1neuropilin-1と呼んだKolodkinら、Cell90:753-7621997。本発明者らは、このレセプターをVEGF165R/NP-1またはNP-1という。VEGF165R/NP-1cDNAの発現クローニングに加え、本発明者らは、その推定アミノ酸配列が、VEGF165R/NP-1のアミノ酸配列と47の相同性であり、そして最近クローン化されたラットニューロピリン-2NP-2Kolodkinら、Cell90、753-7621997と90を超えて相同である、別のヒトcDNAクローンを単離した。本発明者らの結果は、これらのニューロピリンが内皮細胞および腫瘍細胞乳房、前立腺、および黒色腫を含むの両方により発現されることを示す図18。本発明者らは、KDRおよびVEGF165R/NP-1の両方を発現する内皮細胞が、KDRのみを発現する内皮細胞と比べた場合、VEGF121でなく、VEGF165に対して増大された走化性で反応することを示した。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、VEGF165R/NP-1は、内皮細胞において、KDRに対するコレセプターco-receptorとして細胞の運動性を媒介するために機能すると考えている。本発明者らはまた、Boydenチャンバー運動性アッセイにおいて、VEGF165が、用量応答様式で、231乳癌細胞の運動性を刺激することを示した図15A。VEGF121は、これらの細胞の運動性に対する効果を有さなかった図15B。231細胞のような腫瘍細胞は、VEGFレセプター、KDRまたはFlt-1を発現しないため、理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、腫瘍細胞が、VEGF165R/NP-1を介してVEGF165に対して直接的に応答性であると考えている。本発明者らはまた、Dunningラット前立腺癌細胞の2つの改変体、AT2.1細胞低運動性および低転移能のものである、およびAT3.1細胞高運動性および高転移性であるを解析した。架橋およびノーザンブロット解析により、AT3.1細胞が、VEGF165に結合可能な、大量のVEGF165R/NP-1を発現し、対して、AT2.1細胞が、VEGF165R/NP-1を発現しないことを示す図18。腫瘍切片の免疫染色により、AT3.1におけるVEGF165R/NP-1の発現は確認されたが、AT2.1腫瘍においては確認されなかった。さらに、免疫染色により、皮下AT3.1およびPC3腫瘍において、VEGF165R/NP-1を発現する腫瘍細胞が、腫瘍/真皮の境界の侵襲前部で優先的に見出されることが示された。さらに、VEGF165R/NP-1を過剰発現するAT2.1細胞の安定なクローンは、Boydenチャンバーアッセイにおいて運動性を増強した。これらの結果は、ニューロピリンの発現が、新脈管形成および運動性転移性癌細胞に関連し、したがって、抗新脈管形成および抗癌治療に対する重要な標的であることを示す。本発明者らは、現在、C末端領域で切断されて可溶性ニューロピリンsNP外部ドメインを産生する、いくつかのニューロピリンのアイソフォームを同定し、そしてクローン化した図19。ノーザンブロット解析により、いくつかの細胞株および組織が、選択的スプライシングにより明らかに生成された7kbのニューロピリン-1NP-1および7kbのニューロピリン-2NP-2に加えて、類似の転写物を発現することが明らかにされた後に、これらのアイソフォームはクローン化された。インタクトなニューロピリンは、補体成分に相同なaドメイン、凝固因子に相同なbドメイン、MAMに相同なcドメイン、膜貫通ドメイン、および短い40アミノ酸の細胞質ドメインを有するKawakamiAら、1995J.Neurobiol.29:1-17図19。ニューロピリン-1のアイソフォームがクローン化され、それは、bドメインのすぐ後でC末端が切断されていた。転写の間に、5’スプライス供与体部位の読み過ごしが存在し、そのため、終結に続いてイントロン部分が発現され、その結果、cドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、bドメインに続く、イントロンの3アミノ酸で置換された。さらに、ニューロピリン-2のアイソフォームがクローン化され、その中では、C末端部分のbドメイン、cドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが、そのイントロンの8アミノ酸で置換されていた。切断されたニューロピリン-1のcDNAは、COS細胞内で発現され、そして馴化培地中のタンパク質を特異的な抗ニューロピリン-1抗体を使用したウエスタンブロットにより解析した図20。切断されたニューロピリン-1cDNAのトランスフェクトにより産生されたベクターコントロールのトランスフェクトでは産生されない90kDaのタンパク質は、馴化培地中に見出されたが、溶解産物中では見出されなかった。従って、ニューロピリン-1アイソフォームは、ニューロピリン-1の可溶性形態sNP1である。本発明者らはまた、膜近傍ドメインのある部位での切断により、a、b、およびcドメインを含む、操作し切断した可溶化ニューロピリン-1外部ドメインレセプターsNP1abcと名付けたを発現させた。sNPは、VEGF165またはエキソン7配列番号を含むVEGFの任意の形態に結合し得、従って、ニューロピリンとだけでなく、同様にKDR/Flk-1およびFlk-1とのVEGFの相互作用を阻害するために有用である。さらに、sNPはまた、インタクトなニューロピリンレセプターとの二量体化により細胞内で発現される場合、ドミナントネガティブレセプターとして作用し得る。本発明者らの結果は、sNP1タンパク質調製物が、PAE/NP1に対合する125I-VEGF165結合の、およびVEGF媒介性HUVEC増殖の優れたインヒビターであることを示した図21。従って、sNPまたはsNPをコードする核酸例えば、DNAまたはRNAは、VEGFおよびNPの機能のインヒビターとして有用であり、VEGFに関連する疾患,障害、または状態の処置に使用され得る。sNPはまた、単独で使用され得るか、または例えば、VEGFを直接的に拮抗するもの例えば、抗VEGF抗体、可溶性VEGFレセプター細胞外ドメインまたはVEGFレセプターに拮抗するもの例えば、抗KDR抗体、KDRキナーゼインヒビター、ドミナントネガティブなVEGFレセプターを含む他の抗VEGF戦略との組合せで使用され得るPrestaLGら、CancerRes.57:4593-45991997、KendallRLら、1996Biochem.Biophys.Res.Commun.226:324-328、GoldmanCKら、1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:8795-8800、StrawnLMら、1996CancerRes.56:3540-3545、ZhuZら、1998CancerRes.58:3209-3214、WitteLら、1998CancerMetastasisRev.17:155-161。VEGFに関連する疾患、障害、または状態としては、網膜新生血管形成、血管腫、固形腫瘍増殖、白血病、転移、乾癬、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、子宮内膜病、黄斑変性muculardegenerationおよび未熟児網膜症ROPが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、選択された組織中の天然に存在する可溶性ニューロピリンの発現についてののスクリーニング方法に関する。発現は、RNAレベルイントロン配列に対応する特異的プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションで解析され得るか、またはタンパク質レベル低分子量のウエスタンブロット検出で解析され得る。次いで、インタクトで、かつ切断されたニューロピリンアイソフォームの相対的分布が決定され得る。これらの技術は、細胞、組織、および尿のような生物学的液体中のsNPの分布を解析するために使用され得る。sNP1およびsNP2の両方は、インタクトなニューロピリンにおいて存在しないC末端のイントロン配列を含む。sNP1は、そのcDNAにおいて、3個のC末端イントロンアミノ酸GIKおよび28個のイントロンbpを有する。sNP2は、そのcDNAにおいて、8個のC末端イントロンアミノ酸VGCSWRPLおよび146個のイントロンbpを有する。従って、sNP特異的プローブは、インサイチュハイブリダイゼーションのために、そして、インタクトなニューロピリンのバックグラウンドにおける、腫瘍および正常組織中のsNPの分布について分析するために調製され得る。本発明の他の局面は、以下に開示される。発明の詳細な説明本発明は、可溶性のニューロピリンタンパク質sNPをコードするcDNAに関し、このcDNAはニューロピリンNPを産生する細胞から単離、またはNPをコードするDNAから組換え操作される。NP-1およびNP-2は、任意のニューロピリンまたはVEGFレセプターVEGFR以外の好ましいNPであり、これらの構成要素は、上記のVEGF165R/NP-1およびNP-2のどちらとも少なくとも約85の相同性を有する。より好ましくは、このような構成要素は少なくとも90の相同性を有する。さらにより好ましくは、各構成要素は少なくとも95の相同性を有する。相同性は当該分野に周知の手段で測定される。例えば、相同性は、相同性を比較するために使用される任意の標準的なアルゴリズムにより決定され得る。これらは、NIHwww.ncbi.nlm.nkh.gov/BLAST/newblast.htmlを参照のことから入手可能なBLAST2.0例えば、BLAST2.0.4およびi2.0.5Altschul,S.F.ら、NucleicAcidsRes.25:3389~34021997およびDNASISHitachiSoftwareEngineeringAmerica,Ltd.を含むが、これらに限定されない。これらのプログラムは、好ましくは、相同性比較のための標準的な初期設定のような自動設定に設定されるべきである。NIHにより説明されるように、ギャップのある結果は、ギャップのない結果よりもより生物学的な意義を有する傾向にある。容易な参照のために、この開示は一般に、VEGF165R/NP-1およびNP-2および/またはそれらの相同物について述べているが、全ての教示は上述した相同物に適用可能である。本発明はさらに、単離および精製したsNPタンパク質に関する。本明細書で使用されるsNPは、エキソン7配列番号15を含む、血管内皮細胞増殖因子に特異的に結合し得るタンパク質例えばVEGF165をいい、例えばSokerら、J.Biol.Chem.272,31582~315881997に記載のようにVEGF165を使用するヒト臍静脈内皮細胞HUVEC増殖アッセイによって決定されるような、VEGFアンタゴニスト活性を有する。好ましくは、このsNPは、HUVEC増殖を少なくとも25減少し、より好ましくは50減少し、さらにより好ましくは75減少し、最も好ましくは95減少する。sNPのVEGFアンタゴニスト活性はまた、標識化したVEGF165のVEGF165Rへの結合の阻害Sokerら、J.Biol.Chem.271,5761~57671996に開示される、または標識化したVEGF165のPAE/NP細胞への結合の阻害実施例に記載されるによって決定され得る。好ましくは、部分は、結合を少なくとも25、より好ましくは50、最も好ましくは75、阻害する。用語単離されたは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド例えば、DNAが、その本来の環境から取り出されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系中の共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドもしくはDNAまたはポリぺプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および/またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリぺプチドは組成物の一部であり得、そしてなお、このようなベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないように単離され得る。完全長のNP-1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号1および2として配列表に記載される。完全長のNP-2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号3および4として配列表に開示される。ヒトVEGF165R/NP-1またはNP-2をコードするDNA、および組換えヒトVEGF165R/NP-1またはNP-2は、実施例に記載される方法に従って産生され得る。NP-1またはNP-2を産生する哺乳動物細胞株は、MDA-MB-231細胞ATCCHTB-26、PC3前立腺癌腫細胞およびヒト臍静脈内皮細胞HUVECATCCCRL1730を含むが、これらに限定されない。他の細胞および細胞株もまた、sNPを単離するための使用に適切であり得る。適切な細胞の選択は、細胞表面上または細胞抽出液もしくは馴化培地中のsNP結合活性に対するスクリーニング、あるいはPCRまたはハイブリダイゼーションによる遺伝子発現に対するスクリーニングによって実施され得る。可溶性のレセプター活性を検出する方法は、当該分野で周知であるDuan,D-S.R.ら、1991J.Biol.Chem.、266、413~418頁。ヒトHUVEC細胞AmericanTypeCultureCollection、ATCCCRL1730Hoshi,H.およびMcKeehan,W.L.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、198481、6413~6417頁のような完全長のNPを産生する細胞は、ATCCの推奨培養条件に従って増殖させられる。インタクトなNPならびに細胞外領域sNP-1およびsNP-2を図8に示す。インタクトなレセプターは、相補成分に相同なaドメイン、凝固因子に相同なbドメイン、MAMに相同なcドメイン、膜貫通ドメインTM、および40アミノ酸の短い細胞質ドメインcytoを有する。本発明の対象であるこのレセプターの2つの阻害形態もまた図8に示し、そして配列番号6および8として配列表に記載し、そしてこれらはcドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの全てを欠く。本発明の好ましいsNPはさらにaドメインを欠く。ニューロピリン-1配列番号2のドメインは以下の通りである:a1アミノ酸22~146、a2アミノ酸147~273、b1アミノ酸275~430、b2アミノ酸431~587、cアミノ酸646~809、TMアミノ酸857~884、cytoアミノ酸885~923。ニューロピリン-2配列番号4のドメインは以下の通りである:a1アミノ酸24~148、a2アミノ酸149~275、b1アミノ酸277~433、b2アミノ酸434~594、cアミノ酸642~800、TMアミノ酸865~893、cytoアミノ酸894~931。任意の種々の手順が、sNPcDNAを分子クローン化するために使用され得る。これらの方法としては、適切な発現ベクター系におけるsNP含有cDNAライブラリーの構築の後の、sNP遺伝子の直接的な機能的発現が挙げられるが、これに限定されない。別の方法は、sNPの推定アミノ酸配列から設計した標識化したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクター内に構築されたsNP含有cDNAライブラリーをスクリーニングすることである。1つの方法は、完全長のNPタンパク質の少なくとも一部分をコードする、部分的なcDNAを用いて、バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクター内に構築されたsNP含有cDNAライブラリーをスクリーニングする工程からなる。この部分的なcDNAを、完全長のNPをコードするDNAの公知の配列からのオリゴヌクレオチドプライマーの設計を介して、sNPDNAフラグメントの特異的なPCR増幅によって得る。他の型のライブラリー、ならびに他の細胞または細胞型から構築されたライブラリーが、sNPをコードするDNAの単離に有用であり得ることは、当業者に容易に明らかである。さらに、適切なcDNAライブラリーは、sNP活性を有する細胞または細胞株から調製され得る。sNPcDNAを単離するためのcDNAライブラリーの調製に使用する細胞または細胞株の選択は、まず、本明細書に記載される方法を使用して、分泌されたsNP活性を測定することによって行われ得る。cDNAライブラリーの調製は、当該分野に周知の標準的な技術により実施され得る。周知のcDNAライブラリー構築技術は例えば、MolecularCloning,ALaboratoryManual第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis、ColdSpringHarbor、N.Y.1989に見出され得る。sNPをコードするDNAはまた、適切なゲノムDNAライブラリーから単離され得ることもまた、当業者に容易に明らかである。ゲノムDNAライブラリーの構築は、当該分野に周知の標準的な技術により実施され得る。周知のゲノムDNAライブラリー構築技術は、Sambrookら前出に見出し得る。sNP分子を得る別の手段は、NPの部分的または完全なアミノ酸配列例えば、NP-1またはNP-2をコードするDNAからそれらを組換え操作することである。組換えDNA技術を使用して、有糸分裂誘発を刺激せずに、エキソン7を含むVEGFに結合し得るNPの少なくとも一部分をコードするDNA分子が構築される。Sambrookら前出に見出されるような標準的な組換えDNA技術が使用される。本発明の好ましい方法の1つを使用して、sNPをコードするcDNAクローンは、ポリメラーゼ連鎖反応PCRに基づく技術、およびcDNAライブラリースクリーニングを利用する2段階アプローチtwo-stageapproachにおいて単離される。第1のステージにおいては、公知の完全長のNPからの細胞外ドメイン配列情報に由来するDNAオリゴヌクレオチドを使用して、sNP特異的DNAフラグメントの増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第2のステージにおいては、これらのフラグメントを、HUVEC細胞ATCCCRL1730に由来する市販のλgt10cDNAライブラリーClontechから完全なsNPcDNAを単離するためのプローブとして使用するためにクローン化する。別の方法を使用して、sNPをコードするDNAを、NPをコードするDNA配列から構築する。説明のために、NP-1をコードするDNAを利用する。レセプターDNA配列を使用して、レセプターの細胞外ドメイン、すなわちVEGF結合ドメインのみをコードするDNA分子を構築する。制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、レセプターDNA内に同定され、そして細胞外コード部分を切り出すために直接的に利用され得る。さらに、上述したようなPCR技術を利用して、所望のDNA部分を産生し得る。当該分野において標準的な他の技術を利用して、上述した技術に類似する様式においてsNP分子を産生し得ることは当業者に容易に明らかである。このような技術は、例えば、Sambrookら前出に見出される。好ましい方法において、sNPcDNAは、aドメインのN末端内のHisドメインでタグ化され、そしてpcDNA3.1哺乳動物発現プラスミドにサブクローン化される。各プラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、G418耐性クローンを単離する。馴化培地を回収し、そしてConAセファロースカラムに供し、洗浄し、そしてConA結合タンパク質を溶出する。この溶出物をニッケルカラムに供し、洗浄し、そしてNi結合sNPタンパク質を溶出する。精製したsNPを、125I-VEGF165のPAE/NP細胞への結合ならびにHUVECの増殖および運動性のVEGF165刺激を阻害する能力についてアッセイする。より小さなフラグメントはPCRにより産生される。本発明者らの結果は、VEGFはニューロピリンのbドメインに結合し、そしてaおよびcドメインを必要としないことを示す。図19を参照のこと。NおよびC末端のますますより大きなセグメントを欠くbドメインのより小さな部分が、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRにより調製され得る。次いで、増幅したcDNAは発現ベクターに連結され、COS細胞内で発現され、そして馴化培地を、図21AでsNPについて示されるようにして125I-VEGF165のPAE/NP1細胞への結合を阻害する能力について試験される。膜貫通領域を含む、さらなる短縮形態のNPが構築され得る。膜貫通の保持は、標的細胞表面での阻害分子の配向を容易にし得る。膜貫通領域含有分子の構築は、当該分野に公知の標準的な技術本明細書に記載されるような簡便な制限エンドヌクレアーゼ切断部位またはPCR技術の利用を含むがこれに限定されないにより行われる。上述した方法により得られたクローン化sNPcDNAは、適切なプロモーターおよび適切な他の転写調節エレメントを含む発現ベクターへの分子クローニングによって組換え発現しされ得、そして原核生物または真核生物の宿主細胞に移行され、組換えsNPを産生し得る。このような操作のための技術は、Sambrookら前出に十分に記載され、そして当該分野で周知である。発現ベクターは、適切な宿主内での遺伝子のクローン化コピーの転写、およびそれらのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として本明細書に定義される。このようなベクターは、種々の宿主例えば、細菌、藍藻、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞において真核生物遺伝子を発現するために使用され得る。特異的に設計したベクターは、宿主間例えば、細菌細胞-酵母細胞、または細菌細胞-動物細胞、あるいは細菌細胞-昆虫細胞でのDNAシャトルを許容する。適切に構築した発現ベクターは以下を含むべきである:宿主細胞内での自律的な複製のための複製起点、選択可能マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高いコピー数に対する潜在能力、および活性プロモーター。プロモーターは、RNAポリメラーゼをDNAに結合させ、そしてRNA合成を開始させるように指向されるDNA配列として定義される。強力なプロモーターは、mRNAを高頻度に開始させるプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミドまたはウィルスが含まれ得るが、これらに限定されない。種々の哺乳動物発現ベクターが、哺乳動物細胞において組換えsNPを発現するために使用され得る。組換えsVEGF-Rの発現に適し得る、市販の哺乳動物発現ベクターとしては、pMC1neoStratagene、pXT1Stratagene、pSG5Stratagene、EBO-pSV2-neoATCC37593pBPV-I8-2ATCC37110、pdBPV-MMTneo342-12ATCC37224、pRSVgptATCC37199、pRSVneoATCC37198、pSV2-dhfrATCC37146、pUCTagATCC37460、およびgZD35ATCC37565が挙げられるが、これらに限定されない。sNPをコードするDNAはまた、組換え宿主細胞内での発現のために、発現ベクター内にクローン化され得る。組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞ヒト、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類起源の細胞株を含むが、これらに限定されない、および昆虫細胞ショウジョウバエ、ガ、カ、およびアワヨトウの幼虫に由来する細胞株を含むが、これらに限定されないを含むが、これらに限定されない。適切であり得、かつ市販の哺乳動物種に由来する細胞株としては、CV-1ATCCCCL70、COS-1ATCCCRL1650、COS-7ATCCCRL1651、CHO-K1ATCCCCL61、3T3ATCCCCL92、NIH/3T3ATCCCRL1658、HeLaATCCCCL2、C127IATCCCRL1616、BS-C-1ATCCCCL26、およびMRC-5ATCCCCL171が挙げられるが、これらに限定されない。適切であり得、かつ市販の昆虫細胞株としては、3M-SATCCCRL8851、ガATCCCCL80、カATCCCCL194、および195;ATCCCRL1660および1591、およびアワヨトウの幼虫Sf9,ATCCCRL1711が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、多数の技術形質転換、トランスフェクション、リポソームまたはプロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されないのうちの任意の1つにより、宿主細胞に導入され得る。発現ベクターを含む細胞はクローン的に増殖され、そして個々に分析されて、その細胞がsNPタンパク質を産生するかどうかを決定する。sNP発現宿主細胞クローンの同定は、いくつかの手段抗sNP抗体を用いた免疫学的反応性、放射標識されたVEGFへの結合、および宿主細胞分泌sNP活性の存在を含むが、これらに限定されないによって実施され得る。組換え宿主細胞におけるsNPの発現の後、sNPタンパク質は、有糸分裂誘発を刺激せずにVEGFに結合し得る活性型のsNPを提供するために回収され得る。いくつかのsNP精製手順が使用に適している。sNPは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、VEGF165リガンドアフィニティークロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの種々の組み合わせ、または個々の適用によって、細胞溶解物および細胞抽出液から、または馴化培養培地から精製され得る。さらに、組換えsNPは、全長sNP、またはsNPのポリペプチドフラグメントに対して特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて作製された免疫親和性カラムを使用することによって他の細胞タンパク質から分離され得る。好ましくは、sNPは、DNA構築物を含むsNPをCOS細胞一過性のトランスフェクションおよびCHO細胞安定なトランスフェクタントにトランスフェクトすることによって精製され得る。この使用される構築物は、例えば、Hisタグおよびmycタグの両方でニューロピリンneuropilinのN末端の近くVEGF結合に必要とされないドメインにおけるで二重タグ化され得る。レクチンカラムクロマトグラフィーは、sNP精製の第1の工程として有用である。この精製における第2の工程は、Hisタグ化タンパク質を、必要な場合、抗myc抗体を結合するニッケルカラムを使用することである。本発明者らは、細胞に対するVEGF結合を阻害する際に、タグ化sNPが完全に活性であることを示した図21A。非タグ化sNPを精製するための、レクチンとVEGF親和性クロマトグラフィーとの組み合わせは、インタクトなニューロピリン-1の精製についての実施例において示されるように十分である。次いで、精製sNPタンパク質は、VEGF媒介性内皮細胞例えば、HUVEC遊走および増殖ならびにラットの大動脈環インビトロ血管新生からの内皮細胞の遊走における効果について試験され得る。sNPタンパク質はまた、ニワトリCAM、およびマウス角膜モデルにおけるVEGF媒介性血管新生の阻害についてインビボで試験され得る。sNPと相互作用するはずのないFGF-2は、コントロールとして使用され得る。精製sNPタンパク質およびこのタンパク質をコードするDNAはまた、マウスモデル特に、ヌードマウスへの皮下または正常位に増殖したPC3腫瘍で試験され、血管新生、腫瘍増殖および転移の阻害を探し得る。本発明のインヒビターは、血管新生および腫瘍細胞移動性を含むVEGF媒介性活性の阻害に対して使用され得る。このインヒビターは、局所または静脈内のいずれかに使用され得る。局所適用については、この処方物は、約10ng~約1mg/cm2/dayの速度で直接的に適用される。静脈内適用については、このインヒビターは、体重の約1mg~約10mg/kg/dayの速度で使用される。内部使用については、この処方物は、移植された遅放性ポリマー材料からかまたは遅放性ポンプからかあるいは反復注入のいずれかで、処置されるべき領域に直接的に放出され得る。いずれかの場合における放出速度は、約100ng~約100mg/day/cm3である。非局所的な適用については、このインヒビターは、標準的な薬学的実務に従って、薬学的組成物中において薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤例えば、リン酸緩衝液、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液などとの組み合わせで投与される。局所適用については、種々の薬学的処方物が、本発明の活性化合物の投与のために有用である。このような処方物は、以下を含むがこれらに限定されない:疎水性ワセリンまたはポリエチレングリコール軟膏剤のような軟膏剤;キサンタンxanthanガムのようなガムを含み得るペースト剤;アルコール性溶液または水性溶液のような溶液;水酸化アルミニウムまたはアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル;ヒトまたは動物アルブミンのようなアルブミン;ヒトまたは動物コラーゲンのようなコラーゲン;アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロース例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース;Pluronic.RTM.F-127により例示されるPluronic.RTM.Polyolのようなポリオキサマー;tetronic1508のようなtetronics;ならびにアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸。本発明のsNPは、血管新生を負に調節する治療的に有効量の別の分子と組み合わされ得、この分子は、TNP-470、血小板因子4、トロンボスポンジン-1、メタロプロテアーゼの組織インヒビターTIMP1およびTIMP2、プロラクチン16-Kdフラグメント、アンジオスタチンプラスミノゲンの38-Kdフラグメント、エンドスタチン、bFGF可溶性レセプター、トランスフォーミング増殖因子β、インターフェロンα、可溶性KDRおよびFLT-1レセプター、ならびに胎盤プロリフェリンproliferin関連タンパク質であり得るがこれらに限定されない。本発明のsNPはまた、化学療法剤と組み合わされ得る。本発明のsNPをコードするDNAは、遺伝子治療の型で使用され、そして当業者に公知の任意の方法によって宿主に送達され、VEGFに関連する障害を処置し得る。本発明の好ましい実施態様は、さらなる腫瘍増殖および最終的な転移を予防するために固形腫瘍の血管新生を阻害する方法に関する。この目標のために、遺伝子移入が近づき得る任意の固形腫瘍または腫瘍を囲む領域が、開示された治療適用の標的である。sNPをコードし、組換えウイルス性または非ウイルス性に基づく遺伝子移入系の中に収容されるDNAは、当該分野で公知である任意の多数の手順によりこの腫瘍の近傍内の標的細胞に指向され得る。この手順は、以下を含むがこれらに限定されないa腫瘍内部の部位およびこの腫瘍の周囲の部位に有効量のDNAを投与することと組み合わされる外科的手順可能な場合、腫瘍の一部または全体の最初の除去を含む;bこの腫瘍の部位中または近接部位への直接的な遺伝子移入ビヒクルの注入;ならびに、c当該分野で公知である技術を使用する遺伝子移入ベクターおよび/または遺伝子産物の局在化送達または全身的な送達。VEGFまたはニューロピリン発現細胞を含む任意の固形腫瘍は、処置のための潜在的な標的である。例えば、決して限定としては列挙しないが、遺伝子治療適用に特に脆弱な固形腫瘍は、以下である;a神経膠芽細胞、星状細胞腫、神経芽腫、髄膜細胞腫、上衣細胞腫を含むが必ずしもこれらに限定されない中枢神経系の新生物;b本来の位置での癌髄様癌、管状腺癌、浸潤浸潤する癌および粘液性癌腫を含むがその部位の癌に限定されない前立腺、精巣、子宮、頸、卵巣乳房のような組織でのホルモン依存性癌;c皮膚および眼の黒色腫を含むがこれらに限定されない黒色腫;d扁平上皮癌、紡錘体癌、小細胞癌、腺癌および大細胞癌を少なくとも含む肺の癌;ならびにe少なくとも大腸の腺癌を含む、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、および肛門領域のような胃腸管系の癌。sNPをコードするDNAフラグメントは、ウイルス性または非ウイルス性に基づく方法によって、全身的にまたは哺乳動物宿主の固形腫瘍の近傍における標的細胞に対してかのいずれかで送達され得る。本発明に利用され得るウイルスベクター系は、以下を含むがこれらに限定されない;aアデノウイルスベクター;bレトロウイルスベクター;cアデノ随伴ウイルスベクター;d単純疱疹ウイルスベクター;eSV40ベクター;fポリオーマウイルスベクター;gパピローマウイルスベクター;hピコナウイルスベクター;およびiワクシニアウイルスベクター。本発明のsNPをコードするDNAを含む組換えウイルスまたはベクターは、好ましくは、固形腫瘍および/またはこの固形腫瘍に近接する静止状態の組織例えば、脂肪組織または筋組織への直接注入によりこの宿主に投与される。もちろん、腫瘍細胞を標的とされる脂肪組織または筋組織の領域にトランスフェクトすることは、有用である。これらの周囲の細胞におけるsNPの一過性発現は、これらのタンパク質の局所的な細胞外増加を生じ、そしてVEGFとの結合を促進し、これによりこのレセプターへのVEGFの結合を阻害する。また適切である非ウイルス性ベクターは、例えば、リポソーム媒介性またはリガンド/ポリ-L-リジン結合体例えば、アシアロ糖蛋白媒介性送達系のようなDNA脂質複合体を含む例えば、Felgnerら、1994、J.Biol.Chem.269:2550~2561;Derossiら、1995、Restor.Neurol.Neuros.8:7~10;およびAbcallahら、1995、Biol.Cell85:1~7を参照のこと。裸のDNAの直接注入もまた、使用され得る。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の1つ以上の成分で充填された1つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じて、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関による規定される形態での通知は、このような容器に付随し得、この通知は、ヒト投与についての製造機関、使用機関、または販売機関による認可を示す。以上または以下の引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。本発明はさらに、以下の実施例を例証する。これらの例示は、本発明の理解を目的に提供され、その限定として解釈されない。実施例1実験手順材料トランスフェクションのための細胞培養培地、リポフェクチンおよびリポフェクタミン試薬をLifeTechnologiesから購入した。ヒト組換えVEGF165およびVEGF121は、以前に記載されるようにヒトVEGF165またはVEGF121のいずれかをコードする組換えバキュロウイルスベクターを用いて感染されたSf-21昆虫細胞において産生されたCohenら、GrowthFactors、7、131~1381992;Cohenら、J.Biol.Chem.、270、11322~113261995。GSTVEGFエキソン78融合タンパク質をE.coliにおいて調製し、そして以前に記載されるように精製したSokerら、J.Biol.Chem.、271、5761~57671996。ヘパリン、ハイグロマイシンBおよびプロテアーゼインヒビターをSigmaSt.Louis、MOから購入した。125I-ナトリウム、32P-dCTP、およびGeneScreen-Plusハイブリダイゼーション転移膜をDuPontNENBoston、MAから購入した。ジスクシンイミジルスベリン酸DSSおよびIODO-BEADSをPierceChemicalCo.Rockford、ILから購入した。ConAセファロースをPharmaciaLKBBiotechnologyInc.Piscataway、NJから購入した。RNAzol-BをTEL-TESTInc.Friendswood、TXから購入した。銀染色キットおよびTrans-BlotPVDF膜をBio-RadLaboratoriesHercules、CAから購入した。複数組織ノザンブロット膜をClontechPaloAlto、CAから購入した。ポリATractmRNA単離キットをPromegaMadison、WIから購入した。RediPrimeDNA標識キットおよび分子量マーカーをAmershamArlingtonHeights、ILから購入した。プラスミド:pcDNA3.1をInvitrogenCarlsbad、CAから購入し、そしてCMVプロモーターを含み、かつハイグロマイシンBホスホリラーゼをコードするpCPhygroは、Dr.UrbanDeutschMaxPlankInstitute、BadNauheim、Germanyによって親切に提供された。制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼをNewEnglandBiolabs,Inc.Beverly、MAから購入した。NT-B2写真用エマルジョンおよびX線フィルムをEastmanKodakCompanyRochesterNYから購入した。細胞培養ヒト臍帯静脈ECHUVECをAmericanTypeCultureCollectionATCCRockville、MDから入手し、そして20ウシ胎児血清FCSならびにグルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン混合物GPSを含むM-199培地中でのゼラチンコートディッシュ上で増殖した。塩基性FGF2ng/mlを1日おきに培養培地に添加した。親ブタ大動脈内皮PAE細胞およびKDRを発現するPAE細胞PAE/KDRWaltenbergerら、J.Biol.Chem.269、26988~269951994は、Dr.LenaClaesson-Welshにより親切に提供され、そして10FCSおよびGPSを含むF12培地で増殖した。MDA-MB-231細胞およびMDA-MB-453細胞を、ATCCから入手し、そして10FCSおよびGPSを含むDMEMで増殖した。ヒト黒色腫細胞株である、RU-mel、EP-melおよびWK-melは、Dr.RandolfByerBostonUniversityMedicalSchool、Boston、MAから親切に提供され、そして2FCS、8ウシ血清およびGPSを含むDMEMで増殖した。ヒト転移性前立腺癌であるLNCaP細胞および前立腺癌であるPC3細胞は、Dr.MichaelFreemanChildren’sHospital、Boston、MAから親切に提供され、そして5FCSおよびGPSを含むRPMI1640で増殖した。精製およびタンパク質配列決定150cmディッシュで増殖された約5×108MDA-MB-231細胞を5mMEDTAを含むPBSで洗浄し、掻き取り、そして500gで5分間遠心分離した。この細胞ペレットを150mlの20mMHEPES、pH8.0、0.5TritonX-100ならびに1mMAEBSF、5μg/mlロイペプチンおよび5μg/mlアプロチニンを含むプロテアーゼインヒビターを用いて氷上で30分間溶解し、そしてこの溶解物を30,000×gで30分間遠心分離した。MnCl2およびCaCl2を、各々1mMの最終濃度を得るように上清に添加した。この溶解物を、ConAセファロースカラム7mlに吸収し、そして結合タンパク質を、15mlの20mMHEPES、pH8.0、0.2MNaCl、0.1TritonX-100および1Mメチル-α-D-マンノピラノシドを用いて0.2ml/minで溶出した。この溶出物を30分間隔で二度さらに繰り返した。このConAカラム溶出物をプールし、そして以前に記載されるように調製された、約150μgのVEGF165を含む0.5mlのVEGF165-セファロースビーズとともに4°Cで12時間インキュベートしたWilchekおよびMiron、Biochem.Int.4、629~635.1982。このVEGF165-セファロースビーズを、50mlの20mMHEPES、pH8.0、0.2MNaClおよび0.1TritonX-100、次いで25mlの20mMHEPES、pH8.0を用いて洗浄した。このビーズをSDS-PAGE緩衝液中で煮沸し、結合タンパク質を6SDS-PAGEによって分離した。セミドライ電気ブロッターHoefferScientificを使用して、タンパク質をTransBlotPVDF膜に転移し、そしてこのPVDF膜を40メタノール中の0.1クマシーブリリアントブルーで染色した。130~140kDaダブレットにおける2つの顕著なタンパク質を別々に切り出し、HarvardMicrochemistry施設Cambrige、MAのDr.WilliamLaneにより提供されるサービスとしてAppliedBiosystemsmodel477A微量配列決定機を使用してN末端の配列決定をした。発現クローニングおよびDNA配列決定相補的DNAcDNAを5μgの231mRNAから合成した。二本鎖cDNAをEcoRIアダプターに連結し、そして5~20酢酸カリウム勾配でサイズ分画した。2kbよりも大きいDNAフラグメントを真核生物発現プラスミドpcDNA3.1に連結した。このプラスミドライブラリーをE.coliにトランスフェクトし、約1×107の個々のクローンの一次ライブラリーを生じた。形質転換された細菌の一部を240プールに分割し、これら各々は、約3×103の個々のクローンを表す。各プールから調製されたDNAを使用し、製造業者の指示に従いリポフェクチン試薬を使用して12ウェルディッシュ中に播種されたCOS-7細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後に、この細胞を1μg/mlヘパリンの存在下で125I-VEGF16510ng/mlとともに氷上で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS中の4パラホルムアルデヒドを用いて固定した。個々の細胞に結合する125I-VEGF165は、記載されるように、単層を写真用エマルジョン、NT-B2とともに重層し、そして2日後にこのエマルジョンを現像することによって検出されたGearingら、1989。7つの陽性DNAプールを同定し、この陽性プールのうちの1つからのDNAを使用し、E.coliを形質転換した。このE.coliを50の別々のプールにさらに分割し、各プールが約100クローンを表す、50のLBアンピシリンディッシュ上に播種した。これらのプールから作製されたDNAをCOS-7細胞にトランスフェクトし、上記のように125I-VEGF165結合についてスクリーニングした。20の陽性プールをこの工程で検出し、そしてそれらの対応するDNAを使用し、E.coliを形質転換した。各プールを別々のLBアンピシリンディッシュ上に播種し、DNAを96の個々のコロニーから調製し、そして上記のようにトランスフェクトされたCOS-7細胞に対する125I-VEGF165結合について96ウェル二次元格子においてスクリーニングした。7つの単独のクローンをこの工程の陽性として同定した。この7つの陽性プラスミドクローンを増幅し、そしてそれらのDNAを制限酵素消化によって分析した。6つのクローンは、消化の同一消化パターンを示し、そして1つは異なっていた。各々の群からの1つのクローンを自動化DNA配列決定に供した。ノザン分析製造業者の指示に従いRNAzolを使用して、培養中の細胞から総RNAを調製した。20μgRNAのサンプルを1ホルムアルデヒド-アガロースゲルで分離し、そしてGeneScreen-Plus膜に転写した。この膜を、ORF中のヌクレオチド63~454に対応する、ヒトVEGF165R/NP-1cDNAの32P標識フラグメントを用いて63°Cで18時間ハイブリダイズした。この膜を洗浄し、そしてX線フィルムに18時間曝露した。市販の複数のヒト成人組織のmRNAブロットClonetech、2μg/レーンを、同様の様式で、ヒトNP-1についてプローブした。この複数組織ブロットを0.5SDSの存在下で煮沸により剥がし、そしてこのORFのヌクレオチド2841~3251に対応するKDRcDNAの32P標識フラグメントを用いて再プローブしたTermanら、Oncogene6、1677~16831991。PAE細胞のトランスフェクション親PAE細胞およびKDRを発現するPAE細胞PAE/KDRWaltenbergerら、1994を、LenaClaesson-Welsh博士から入手した。ヒトNP-1cDNAを、XhoIおよびXbaI制限酵素を用いて消化し、そしてpCPhygroの対応する部位にサブクローニングし、pCPhyg-NP-1を産生した。PAEおよびPAE/KDR細胞を、6cmディッシュで増殖し、製造業者の指示に従いリポフェクタミンを使用して5μgのpCPhyg-NP-1をトランスフェクトした。細胞をさらに48時間増殖させ、そしてこの培地を、200μg/mlのハイグロマイシンBを含む新鮮な培地と交換した。2週間後、単離されたコロニー5~10×103細胞/コロニーを48ウェルディッシュの別々のウェルに移し、そして200μg/mlハイグロマイシンBの存在下で増殖した。VEGF165R/NP-1PAE/NP-1を発現するか、またはVEGF165R/NP-1およびKDRを共発現するPAE/KDR/NP-1安定なPAE細胞クローンを、125I-VEGF165の結合および架橋によってVEGF165レセプター発現についてスクリーニングした。一過性のトランスフェクションについては、PAE/KDR細胞を、上記のようにVEGF165R/NP-1を用いてトランスフェクトし、そして3日後に125I-VEGF165架橋分析を実行した。VEGFの放射ヨウ素化、結合および架橋実験IODO-BEADSを使用するVEGF165およびVEGF121の放射ヨウ素化を、以前に記載されるように実行したSokerら、J.Biol.Chem.272、31582~315881997。この比活性は、40,000~100,000cpm/ngタンパク質で変動した。125I-VEGF165および125I-VEGF121を使用する結合および架橋実験を、以前に記載されるように実行したGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.267、6093~60981992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。VEGF結合は、γカウンターで細胞に関連する放射活性を測定することによって定量されたBeckman、Gamma5500。カウントは3ウェルの平均を表す。全ての実験を少なくとも3回繰り返し、そして同様の結果を得た。結合実験の結果を、LIGANDプログラムMunsonおよびRodbard、1980を使用するスキャッチャードの方法によって分析した。125I-VEGF165および125I-VEGF121の架橋複合体を、6SDS/PAGEによって分離し、そしてこのゲルをX線フィルムに曝露した。その後、X線フィルムを、IS-1000デジタル画像処理システムAlphaInnotechCorporationを使用することによって走査した。VEGF165Rの精製231細胞の細胞表面レセプターに対する125I-VEGF165の架橋は、165~175kDa標識複合体の形成を生じるSokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。これらの細胞は、約1~2×105VEGF165結合部位/細胞を有する。VEGF165とは対照的に、VEGF121は、231細胞に結合せず、そしてリガンド-レセプター複合体を形成しないSokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。231細胞中の相対的に高いVEGF165Rの数および全く検出可能なKDRまたはFlt-1mRNAが欠乏すること示さずは、これらの細胞がVEGF165R精製のために有用な供給源であることを示唆する。予備的な特徴付けは、VEGF165Rが糖タンパク質であることを示した。従って、約5×108細胞から調整された231細胞溶解物がConAセファロースカラムに吸収された。ConAカラムから溶出される結合タンパク質を、VEGF165セファロースとともにインキュベートし、そしてこのVEGF165親和性精製タンパク質をSDS-PAGEおよび銀染色により分析した図9、レーン2。約130~135kDaの分子量である顕著なダブレットが、検出された。このサイズは、約130~135kDaのサイズであるレセプターに結合した40~45kDaのVEGF165の165~175kDa複合体の形成と一致する図9、レーン1。この2つのバンドを別々に切り出し、そしてN末端アミノ酸配列決定を実行した図1、右。上側および下側のバンドの両方は、同様なN末端アミノ酸配列を有しており、この配列は、マウスKawasakiら、J.Neurobiol.29,1~171995およびヒトニューロピリン-1NP-1HeおよびTessier-Lavigne、Cell90739~7511997のN末端領域における推定アミノ酸配列に対して高度な配列相同性を示した。231細胞由来mRNAからのVEGF165Rの発現クローニングこの精製に伴って、VEGF165Rを発現クローニングによってクローン化したAruffoおよびSeed、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84、8573~85771987a;AruffoおよびSeed、EMBOJ.、6、3313~33161987b;Gearingら、EMBOJ.8、3667~36761989。発現クローニングについて、231細胞mRNAを使用し、真核細胞発現プラスミド中に約107クローンのcDNAライブラリーを調製した。このプラスミドライブラリーで形質転換されたE.coliをプールに分割した。各々のプールから調製されるDNAを別々のウェルのCOS-7細胞にトランスフェクトし、そして個々の細胞を、写真用エマルジョンで重層された単層のオートラジオグラフィによって検出されるように、125I-VEGF165に結合する能力についてスクリーニングした図2A。サブプーリングおよびスクリーニングの3ラウンドの後に、7つの単一陽性cDNAクローンを得た。図2Bは、これらの単一の陽性クローンのうちの1つクローンA2を用いてトランスフェクトされたCOS-7細胞に対する125I-VEGF165の結合を示す。制限酵素分析は、7つの陽性単一クローンのうちの6つが同一の制限消化パターンを有するが、1つのクローンが異なる示さずパターンを有することを示した。これらの同様のcDNAクローンのうちの1つ、クローンA2図3の配列決定は、それがヒト発現配列タグデータバンクdbEST由来の配列と同一であることを示した。この配列はまた、マウスニューロピリン、NP-1Kawakamiら、J.Neurobiol29、1~171995の配列に対して高い割合の相同性を示した。本発明者らが、ヒトVEGF165Rをクローン化した後に、2つのグループがセマフォリンsemaphorinIIIのラットおよびヒトレセプターのクローニングを報告し、そしてそれらがNP-1であると同定したHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739~7511997;Kolodkinら、Cell90、753~7621997。この231細胞由来VEGF165RcDNA配列は、ヒトNP-1配列HeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739~7511997と実際は同一である例外についての図説明文3を参照のこと。きわめて、発現クローニングによって得られる推定アミノ酸配列図3は、N末端配列決定によって決定された、NP-1としてのVEGF165Rの同定を確認し図1、従って、本発明者らは、このVEGFレセプターをVEGF165R/NP-1と命名した。ヒトVEGF165R/NP-1のcDNA配列は、推定シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを表す2つの疎水性領域を有する923アミノ酸のオープンリーディングフレームORFを予測する図3。全体的に、この配列は、細胞表面レセプターの構造と一致する外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを予測する。図1に示されるように、タンパク質精製を介して得られたこのN末端配列は、21アミノ酸推定疎水性シグナルペプチドドメインの下流であり、従って、このシグナルペプチドドメインが切断され、そして除去されることを直接的に示す。40アミノ酸の短い細胞質の尾部は、231細胞の部分的なトリプシン消化により放出される可溶性VEGF165R/NP-1がインタクトなVEGF165R/NP-1と同じサイズであることを実証する結果と一致する示さず。異なる制限酵素プロフィールを有した発現クローニングにより得られた1つのクローンの配列分析は、VEGF165R/NP-1に対して約47の相同性を有する931アミノ酸のオープンリーディングフレームを予測した図4。このヒトcDNAは、ラットニューロピリン-2NP-2と93の配列相同性を有し、そして最近クローン化されたヒトNP-2と同一であるChenら、Neuron、19、547~5591997。成人の細胞株および組織におけるVEGF165R/NP-1の発現NP-1遺伝子発現の報告は、今のところ発達している胚の神経系に限定されているTakagiら、Dev.Biol.122、90~1001987;Kawakamiら、J.Neurobiol.29、1~171995;Takagiら、Dev.Biol.170、207~2221995。しかし、細胞表面VEGF165R/NP-1は、ECのような非ニューロン性成人細胞型および種々の腫瘍由来細胞と関連するSokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。ノザンブロット分析は、125I-VEGF165架橋された細胞がまた、VEGF165R/NP-1mRNAを合成するか否かを決定するために実行された図5。VEGF165R/NP-1mRNAレベルは、231細胞およびPC3細胞で最も高かった。VEGF165R/NP-1mRNAは、HUVEC細胞、LNCaP細胞、EP-mel細胞およびRU-mel細胞においてより少ない程度で検出された。MDA-MB-453細胞およびWK-mel細胞中の発現は、あるとしてもほとんど存在しなかった。このVEGF165R/NP-1遺伝子発現パターンは、HUVEC細胞、231細胞、PC3細胞、LNCaP細胞、EP-mel細胞およびRU-mel細胞が、細胞表面VEGF165R/NP-1に125I-VEGF165を結合させるが、MDA-MB-453細胞およびWK-mel細胞がそうではないこと示す、本発明者らの以前の結果と一致したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。VEGF165R/NP-1遺伝子発現はまた、種々の成人組織において、KDR遺伝子発現と比較するノザンブロットによって分析された図6。VEGF165R/NP-1mRNAレベルは成人の心臓および胎盤において比較的高く、そして肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において比較的中程度であった。比較的低いレベルのVEGF165R/NP-1mRNAは、成人の脳において検出された。興味深いことに、マウスおよびニワトリ脳におけるNP-1遺伝子発現の以前の分析は、この遺伝子が胚発生の間に主に発現され、そして出生後に大きく減少することを示唆したKawakamiら、J.Neurobiol.29、1~171995;Takagiら、Dev.Biol.170、207~2221995。KDRmRNAの組織分布は、心臓で高度に発現しないという例外を伴うがVEGF165R/NP-1のmRNAの組織分布と同様であった。これらの結果は、VEGF165R/NP-1が、心臓および胎盤のように血管新生が生じる組織を含む、成人の非ニューロン組織において広く発現されることを示す。VEGF165R/NP-1に対するVEGF165結合の特徴付けVEGF165R/NP-1の結合性質を特徴付けるために、ブタ大動脈内皮PAE細胞は、VEGF165R/NP-1のcDNAを用いてトランスフェクトされた。このPAE細胞は、これらの発現研究のために選択された。なぜならば、PAE細胞は、KDRも、Flt-1もWaltenbergerら、J.Biol.Chem.269、26988~269951994、VEGF165Rのいずれも発現していないからである。VEGF165R/NP-1PAE/NP-1を合成する安定な細胞株を確立し、そして125I-VEGF165結合実験を実行した図7。PAE/NP-1細胞に対する125I-VEGF165結合は、用量依存性の様式で増加し、そして約30ng/mlで飽和に達した。このことは、VEGF165R/NP-1が特異的VEGF165レセプターであることを実証する図7A。VEGF165結合のスキャッチャード分析は、約3.2×1010MのKdを有する1つのクラスのVEGF165結合部位、および1細胞当たり約3×105の125I-VEGF165結合部位を明らかにした図7B。同様のKd値が、いくつかの独立して生成したPAE/NP-1クローンについて得られたが、このレセプター数はクローン毎に変動した示さず。PAE/NP-1細胞株に対する3×1010MのKdは、HUVEC細胞および231細胞によって天然に発現されるVEGF165R/NP-1に対して得られる2~2.8×1010MのKd値と一致するGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.267、6093~60981992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。PAE/NP-1細胞に対する125I-VEGF165結合は、1μg/mlヘパリンによって増強され示さず、このことは、ヘパリンが、HUVEC細胞および231細胞上のVEGF165R/NP-1に対する125I-VEGF165結合を増強することを示す以前の研究と一致したGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.267、6093~60981992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。VEGF165R/NP-1を発現している細胞に対するVEGFのアイソフォーム特異的結合VEGF165VEGF121ではないは、HUVEC細胞および231細胞上のVEGF165R/NP-1に結合するGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.271、5519~55231992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761~57671996。VEGF165R/NP-1を用いてトランスフェクトされた細胞が、同一の結合特異性を有するか否かを確認するために、PAE/NP-1細胞を、125I-VEGF165または125I-VEGF121とともにインキュベートし、その後、架橋した図8。125I-VEGF165は親PAE細胞に結合しなかったが図8、レーン3、VEGF165R/NP-1を介してPAE/NP-1細胞に結合した図8、レーン4。VEGF165R/NP-1を用いて形成された放射標識複合体は、HUVEC細胞図8、レーン1およびPC3細胞図8、レーン2において形成された複合体と同様のサイズであった。一方、125I-VEGF121は、親PAE細胞図8、レーン7またはPAE/NP-1細胞図8、レーン8のいずれに対しても結合しなかった。これらの結果は、内因性VEGF165R/NP-1を発現している細胞例えば、HUVEC細胞、231細胞およびPC3細胞で生じるVEGFアイソフォーム特異的結合を実証し、これらの結果が、VEGF165R/NP-1cDNAを用いてトランスフェクトされる細胞で複製され得、そしてVEGF165RおよびNP-1が同一であるという知見を支持し得る。VEGF165R/NP-1およびKDRの同時発現が、KDRへのVEGF165の結合を変化させるVEGF165R/NP-1の発現が、VEGF165とKDRとの相互作用に何らかの影響を有するかどうかを決定するために、以前にKDRcDNAでトランスフェクトして安定なPAE/KDR細胞のクローンを産生したPAE細胞Waltenbergerら、J.Biol.Chem.269、26988-269951994を、VEGF165R/NP-1cDNAとトランスフェクトし、そして両方のレセプターPAE/KDR/NP-1を発現する安定なクローンを得た。これらの細胞は、125I-VEGF165をKDR図8、レーン6、上部の複合体およびVEGF165R/NP-1図8、レーン6、下部複合体へ結合し、HUVEC図8、レーン1と類似した架橋特性を産生した。一方、PAE/KDR/NP-1細胞は、VEGF121のVEGF165R/NP-1と結合する能力がないことと一致し、125I-VEGF121に結合して、KDRとの複合体のみを形成する図8、レーン9および10。細胞中でKDRおよびVEGF165R/NP-1図8、レーン6が同時発現していることが明らかとなり、240kDaの125I-VEGF165-KDR複合体形成の程度は、親のPAE/KDR細胞と比較して増強された図8、レーン5。これらの結果は再現性があり、そして異なるクローンでの240kDaの125I-VEGF165-KDRの複合体形成の程度は、VEGF165R/NP-1の発現レベルと正の相関関係があったデータ示さず。しかし、これらの異なるKDR結合の結果は、おそらくトランスフェクション後のクローンの選択に起因するということを決定的には除外することはできなかった。それゆえ、親のPAE/KDR細胞を、VEGF165R/NP-1cDNAとトランスフェクトし、そして125I-VEGF165を、個々のクローンの間のKDR発現の何らかの多様性を除くために、3日後に細胞に対して結合および架橋させた図9。KDRを含む標識された240kDaの複合体が、親のPAE/KDR細胞で形成され図9、レーン1、そしてPAE/KDR細胞中に発現ベクターと共にトランスフェクトした図9、レーン2。しかし、125I-VEGF165を、VEGF165R/NP-1を過渡的に発現しているPAE/KDR細胞と架橋した場合、親のPAE/KDR細胞図9、レーン1および発現ベクターとトランスフェクトしたPAE/KDR細胞図9、レーン2と比較して、約4倍大きいより強烈に標識された240kDaの複合体が観察された図9、レーン3。これらの結果は、同じ細胞内におけるKDRおよびVEGF165R/NP-1遺伝子の同時発現が、VEGF165のKDRへの結合能力を増強することを示唆する。GST-VEGFエキソン78融合タンパク質は、VEGF165のVEGF165R/NP-1およびKDRへの結合を阻害する本発明者らは、125I-VEGF165が、そのエキソン7にコードされたドメインを介してVEGF165R/NP-1に結合することを示したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。さらに、VEGFエキソン78にコードされたペプチドを含むGST融合タンパク質GST-Ex78は、231細胞およびHUVECに関連したVEGF165R/NP-1への125I-VEGF165の結合を完全に阻害するSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996;Sokerら、J.Biol.Chem.272、31582-315881997。PAE/NP-1細胞を添加した場合、融合タンパク質は、VEGF165R/NP-1への結合を完全に阻害した図10、レーン1と比較したレーン2。一方、125I-VEGF165のKDRへの結合は、全く阻害されなかった図10、レーン3と比較したレーン4。従って、これらの結果は、GST-Ex78が、VEGF165R/NP-1とは直接結合するが、KDRとは結合しないことを実証する。GST-Ex78の効果は異なっているが、細胞内においてVEGF165R/NP-1およびKDRPAE/KDR/NP-1の両方を同時発現する。図8および9の結果と一致して、PAE/KDR/NP-1細胞中の125I-VEGF165のKDRとの結合の程度図10、レーン5は、親のPAE/KDR細胞よりも大きかった図10、レーン3。興味深いことに、PAE/KDR/NP-1細胞において、GST-Ex78は、期待したように125I-VEGF165のVEGF165R/NP-1への結合を完全に阻害するだけでなく、予期しなかったKDRへの結合もまた実質的に阻害した図10、レーン5と比較したレーン6。GST-Ex78の存在下において、これらの細胞内での125I-VEGF165のKDRへの結合は、VEGF165R/NP-1を発現していない親のPAE/KDR細胞において見られたレベルに対して減少した図10、レーン3および4と比較したレーン6。融合タンパク質は、KDRに直接結合しないので、これらの結果は、125I-VEGF165のVEGF165R/NP-1への直接的な結合を阻害することが、125I-VEGF165のKDRへの間接的な結合を阻害することを示唆する。図8、9および10の結果を組み合わせると、VEGF165とVEGF165R/NP-1との相互作用が、KDRとVEGFの相互作用を増強することを示唆する。ニューロピリン-1neuropilin-1は、アイソフォーム-特異的VEGF165レセプターである最近、本発明者らは、VEGF165と結合するがVEGF121とは結合せず、従って本発明者らがVEGF165Rと名づけた新規な130~135kDaのVEGF細胞表面レセプターを記載したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。本発明者らは、現在そのクローニングしたcDNAを発現するVEGF165Rを精製し、そしてこれがヒトニューロピリン-1NP-1と同一であることを示したHeおよびTessier-Lavigne、Cell90739-7511997。VEGF165Rが、NP-1と同一であることの証拠およびNP-1が、VEGF165のレセプターとして機能することの証拠は、以下のようである:iヒトMDA-MB-231231細胞からのVEGF165Rタンパク質の精製は、VEGF親和性を用い、SDS-PAGEおよび銀染色法により130~140kDaの二重線を得た。両方のタンパク質のN末端配列決定から、マウスNP-1との高い相同性が実証された、18のアミノ酸の同じN末端配列が得られたKawakamiら、J.Neurobiol.29、1~171995;ii本発明者らは、ヒト231細胞からVEGF165Rを精製した後、ヒトNP-1のクローニングを報告しHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997、そしてヒトVEGF165RのN末端配列が、ヒトNP-1のN末端領域の配列と同一であることを見出した;iii231細胞cDNAライブラリーを用いた発現クローニングによりいくつかのcDNAクローンを単離し、そしてそれらの配列は、ヒトNP-1cDNA配列と同一であったHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997。精製および発現クローニングの組み合わせは、発現クローニングのみを用いた以前の研究よりも、NP-1タンパク質のN末端の明白な同定を可能にする利点を有するHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kolodkinら、Cell90、753-7621997;ivNP-1遺伝子発現のノザンブロット分析は、以前の125I-VEGF165架橋実験と一致したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。VEGF165がVEGF165Rに結合した細胞は、比較的多量のNP-1mRNAを合成したが、一方、たとえあるにしても非常に少量のVEGF165結合を示す細胞は、たとえあるにしても大してNP-1mRNAを合成しなかった;vNP-1がPAE細胞において発現された場合、親細胞ではないがトランスフェクトされた細胞が、VEGF121とは結合できないが、VEGF165と結合し得、このことは、前述のHUVECおよび231細胞が示した、アイソフォームの結合特性と一致したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。さらに、NP-1を発現するPAEとの125I-VEGF165結合のKdは、約3×1010Mであり、以前の231細胞およびHUVECの結合Kd値である2~2.8×1010Mと一致したSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996;およびviVEGF165のNP-1ポスト-トランスフェクションを発現する細胞との結合は、このリガンドのHUVECおよび231細胞への結合であるので、ヘパリンの存在下においてより効果的であったGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.267、6093-60981992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。これらの結果を合わせると、VEGF165RがNP-1と同一であるということだけでなくアイソフォーム特異的な方法によって、VEGF165を結合する機能的レセプターであるということを示す。従って、本発明者らは、このVEGFレセプターをVEGF165R/NP-1と命名した。VEGF165R/NP-1cDNAの発現クローニングに加えて、別のヒトcDNAクローンを、単離した。これから予測されるアミノ酸配列は、VEGF165R/NP-1のアミノ酸配列と47相同性であり、そして最近クローニングされた、ラットニューロピリン-2NP-2と90を超えて相同であったKolodkinら、Cell90、753-7621997。NP-2は、コラプシン/セマフォリンファミリーのメンバーを選択的に結合するChenら、Neuron19、547-5591997。NP-1が、VEGF165のレセプターとして働くという発見は、NP-1は、以前胚の発達中に神経系とのみ関連すると示されておりKawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995;Takagiら、Dev.Biol.170、207-2221995、そしてごく最近、コラプシン/セマファリンファミリーのメンバーのレセプターとして働くことが発見されたHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kolodkinら、Cell90、753-7621992ために驚きであった。NP-1は、初めXenopusの視覚系の発達において同定された、130~140kDaの膜貫通糖タンパク質であるTakagiら、Dev.Biol.122、90-1001987;Takagiら、Neuron7、295-3071991。神経系におけるNP-1の発現は、発達中および特にアクソンが神経網を活発に形成している場合、それらの発達段階に関連して、空間的および時間的に高く制御されるFujisawaら、Dev.Neurosci.17、343-3491995;Kawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995;Takagiら、Dev.Biol.170、207-2221995。NP-1タンパク質は、ニューロンのアクソンとは関連があるが、小孔とは関連がないKawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995。機能的には、ニューロピリンは、インビトロにおいて視覚神経繊維の神経突起成長の促進を示しHirataら、Neurosci.Res.17、159-1691993、そして細胞の接着性の促進を示したTagakiら、Dev.Biol.170、207-2221995。標的化されたNP-1の破壊によって、末梢神経系の遠心性繊維の軌道に重篤な異常を生じるKitsukawaら、Neuron19、995-10051997。これらの研究にもとづいて、NP-1が、アクソンの成長およびガイダンスにおいて神経細胞認識分子の役割を果たしていることが示唆されたKawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995;HeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kitsukawaら、Neuron19、995-10051997;Kolodkinら、Cell90、753-7621997。本発明者らの結果は、最初、Xenopus、ニワトリ、およびマウスにおいて発現しているNP-1が、発達および初期の出生後段階を制限していることを示した初期の研究Fujisawaら、Dev.Neurosci.17、343-3491995;Kawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995;Takagiら、Dev.Biol.170、207-2221995とは逆に、VEGF165R/NP-1がまた、成体組織においても発現していることを示した。例えば、マウスにおいてNP-1は、発達中の神経系で9日目に背根神経節において発現され始め、15日目に中断されるKawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995。本発明者らのヒト成体組織のノーザンブロット分析が、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓において、VEGF165R/NP-1mRNA転写産物の相対的に高レベルを実証した。興味深いことに、マウス神経系の発現の研究と一致して、成人の脳において非常に少ない相対的な発現がみられるKawakamiら、J.Neurobiol.29、1-171995。VEGF165R/NP-1はまた、ECおよび種々の腫瘍由来の細胞を含む培養された多くの非神経細胞株において発現される。これらの細胞におけるVEGF165R/NP-1の考えられる機能は、以下に考察される脈管形成を媒介している可能性がある。さらに、NP-1は、ラットE14脊髄および背根神経節DRG組織から得られたcDNAライブラリーの発現クローニングによりコラプシン/セマフォリンファミリーのレセプターとして同定されたHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kolodkinら、Cell90、753-7621997。コラプシン/セマフォリンコラプシン-D-1/セマIII/セムDは、反発的な成長円錐およびアクソンガイダンスにおいて機能する膜貫通および分泌糖タンパク質の大きなファミリーを含むKolodkinら、Cell75、1389-13991993。DRG細胞のセマIIIの反発的な効果は、抗NP-1抗体によりブロックされたHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kolodkinら、Cell90、753-7621997。NP-1に結合しているセマIIIのKdは0.15~3.25×1010MでありHeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kolodkinら、Cell90、753-7621997、これは約3×1010Mである、VEGF165R/NP-1に結合するVEGF165の値と類似している。これらの結果は、明らかに異なる生物学的活性を有する2つの構造的に異なるリガンド、一方のEC移動および増殖のVEGF誘導刺激、および他方の神経細胞のセマIII誘導相反化学斥力が、同じレセプターに結合し、類似した親和力を有することを示す。興味深い疑問は、2つのリガンドがVEGF165R/NP-1の同じ部位に結合するか、または異なった部位に結合するかである。VEGF165R/NP-1は、その外部ドメインに5つの別々のドメインを有し、そしてそれは、NP-1のタンパク質モジュールのこの多様性は、NP-1のための複数の結合リガンドの可能性と一致することが示唆されてきたTakagiら、Neuron7、295-3071991;Feinerら、Neuron19539-5451997;HeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997。予備的な分析は、セマIIIとVEGF165R/NP-1に結合するVEGFの原因であるVEGFエキソン7との間の配列相同性で全く大きな値を示さなかったSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。しかし、それらは、2つのリガンド間においていくつかの3次元構造が類似し得る。神経および血管の両方が、分岐および方向性移動を示すので、VEGF165が、いくらかの神経ガイダンス活性を示すのかどうか、およびセマIIIが、いくらかのEC成長因子活性を有するのかどうかという疑問がまた生じる。これらの可能性は、いまだ調べられていなかった。しかし、VEGFは、最適なEC成長因子活性のために2つのレセプター、KDRおよびNP-1を必要とし得Sokerら、J.Biol.Chem.272、31582-315881997、そしてセマIIIは、NP-1およびまだ決定されていない最適な化学斥力活性のための高親和性レセプターを必要とし得Feinerら、Neuron19、539-5451997;HeおよびTessier-Lavigne、Cell90、739-7511997;Kitsukawaら、Neuron19、995-10051997、その結果、NP-1単独での存在は、これらのリガンドの新規な生物学的活性を示すために十分ではあり得ない。さらなる研究は、神経発生を制御するメカニズムと脈管形成を制御するメカニズムとの間にいくらかの関係があるのかどうかについて決定する。脈管形成におけるVEGF165R/NP-1の役割VEGF165R/NP-1は、VEGF165のKDRへの結合を制御し、マウスでのKDRノックアウト実験によって確かめられた脈管形成の重要なレギュレーターであるRTKとの高い親和性を示すShalabyら、Nature376、62-661995。KDRのVEGF165に対する親和性は、VEGF165R/NP-1に対する親和性よりも約50倍高いGitay-Gorenら、J.Biol.Chem.287、6003-60961992;Waltenbergerら、J.Biol.Chem.269、26988-269951994。VEGF165R/NP-1およびKDRが、同時発現する場合、125I-VEGF165のKDRへの結合は、KDR単独を発現する細胞発現と比較して約4倍まで増強される。結合の増強は、VEGF165R/NP-1およびKDRを同時発現する安定したクローンPAE/KDR/NP-1細胞においてそしてまた、過渡的にVEGF165R/NP-1クローンの選択が起こらないcDNAとトランスフェクトしたPAE/KDR細胞において実証され得る。逆に、PAE/KDR/NP-1細胞における125I-VEGF165のVEGF165R/NP-1への結合が、VEGFエキソン78GST-Ex78を含むGST融合タンパク質によって、完全に阻害される場合、KDRへの結合は、実質的に阻害され、KDR単独を発現する細胞において観察されるレベルに低下する。融合タンパク質は、VEGF165R/NP-1に直接結合するが、KDRには直接結合することができないSokerら、J.Biol.Chem.272、31582-315881997。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、VEGF165は、エキソン7にコードされたドメインを介してVEGF165R/NP-1に結合し、そしてVEGF165は、エキソン4にコードされたドメインを介してKDRとの結合を促進すると考えている図11。その比較的高いレセプター/細胞数約0.2~2×105を有するVEGF165R/NP-1Gitay-Gorenら、J.Biol.Chem.287、6003-60961992;Sokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996は、細胞表面上のVEGF165を濃縮する役割を果たし、それゆえ、KDRとVEGF165のより強い接近を提供するようである。あるいは、VEGF165R/NP-1との結合により、VEGF165は、KDRとの結合を増強する構造変化をうける。最終的な結果は、KDRシグナル伝達の上昇、およびVEGF活性の増加であった。本発明者らは、KDRとの結合の増強を実証し得るが、現在までのところ、本発明者らは、PAE/KDR細胞と比較した、PAE/KDR/NP-1細胞に対するVEGFの分裂促進性の増強は実証し得なかった。理由の1つは、これらの細胞株が、HUVECが行なう場合のように、VEGFに応答して容易に増殖しないことであるWaltenbergerら、J.Biol.Chem.269、26988-269951994。それにもかかわらず、本発明者らは、KDRおよびVEGF165R/NP-1の両方に結合するVEGF165が、KDRにのみ結合するVEGF121よりも、HUVECのよりよい分裂促進因子であることを見出したKeytら、J.Biol.Chem.271、5638-56461996b;Sokerら、J.Biol.Chem.272、31582-315881997。さらに、GST-Ex78によるHUVECにおいてのVEGF165のVEGF165R/NP-1への結合阻害は、KDRへの結合を阻害し、そしてまた、VEGF165により誘導されたHUVEC増殖を阻害し、VEGF121により誘導されたレベルよりも低くするSokerら、J.Biol.Chem.272、31582-315881997。これらの結果を組み合わせると、VEGF165の媒介におけるVEGF165R/NP-1の役割が示唆されるが、VEGF121の分裂促進因子活性における役割は示唆しない。二重レセプターが、成長因子の結合および活性を制御するという概念は、以前TGF-β、bFGFおよびNGFにおいて実証されているLopez-Casillasら、Cell67、785-7951991;Yayonら、Cell64、841-8481991;Barbacid、Curr.Opin.CellBiol.7、148-1551995。VEGF165R/NP-1と脈管形成との間の別の関連は、NP-1が、トランスジェニックマウスで局所的に過剰発現したという研究から明らかになるKitsuskawaら、Develop.121、4309-43181995。NP-1の過剰発現は、子宮内において、胎齢15.5日以前に胚の致死およびマウスの死を引き起こし、そしてそのうち最も良く生き残ったものは、NP-1が、低レベルで発現していた。NP-1を過剰発現するマウスは、血管、心臓、および手足のような数の限られた非神経組織において形態学的な異常を示した。NP-1は、ECおよびECの周囲の間葉細胞の両方において発現した。胚は、正常な対応物と比較して、過剰なそして異常な毛細血管および血管を有し、そしていくらかの場合において拡張した血管も同様に有していた。いくつかのキメラマウスが、主に頭部や首に出血を示した。これらの結果は、VEGF165R/NP-1の局所的な過剰発現が、VEGF165の不適切な活性を引き起こし、その結果、脈管形成の増強および/または異常を媒介する可能性と一致する。NP-1と脈管形成との間の関連についての証拠の別の一部は、NP-1遺伝子の破壊を標的化されたマウスにおいて胚が、末梢神経系の重篤な異常を有したが、子宮内で10.5から12.5胎齢で死亡したのは、ほとんどがおそらく心臓血管系における異常のためであるということを示す最近の報告に起因するKitsukawaら、Neuron19、995-10051997。VEGF165R/NP-1は、腫瘍由来細胞と関連している本発明者らが今までに検出した最も高い程度のVEGF165R/NP-1発現は、HUVECにおいて生じるよりもさらに、231乳癌細胞およびPC3前立腺癌細胞のような腫瘍由来細胞において生じた。この腫瘍細胞は、大量なレベルのVEGF165R/NP-1mRNAおよび約200,000のVEGF165レセプター/細胞を発現するSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。一方、これらの腫瘍細胞は、KDRまたはFlt-1を発現せず、その結果、VEGF165R/NP-1は、これらの細胞と関連する唯一のVEGFレセプターである。それゆえ、この腫瘍細胞は、VEGF165R/NP-1が、KDRのバックグラウンドの欠如におけるVEGF165の機能的なレセプターかどうかを試験するために有用である。現在までのところ、本発明者らは、VEGF165R/NP-1が、レセプターチロシンのリン酸化により測定された腫瘍由来細胞におけるVEGF165シグナルを媒介することを示し得ない。それにもかかわらず、VEGF165は、生存、分化または、運動性の増加のようなまだ活性を決定していないが、腫瘍細胞でいくらかの誘導による効果を有し得る。最近の報告で、神経膠腫細胞が、VEGF165に結合するが、VEGF121には十分に結合しない190kDaのタンパク質を発現することを実証したOmuraら、J.Biol.Chem.272、23317-233221997。チロシンリン酸化の刺激のないことは、このレセプターへのVEGF165の結合において実証され得る。190kDaのアイソフォーム特異的レセプターが、VEGF165R/NP-1と関連があるかどうかについては、まだ知られていない。VEGF165R/NP-1は、VEGF165のための保存機能および隔絶機能を有し得る。VEGF165が、腫瘍細胞により産生され、そしてエキソン7にコードされるドメインを介して細胞上のVEGF165R/NP-1に結合することが想定され得るSokerら、J.Biol.Chem.271、5761-57671996。次いで、蓄えられたVEGF165は、パラクリン様式で放出され腫瘍脈管形成を刺激し得る。あるいは、VEGF165R/NP-1は、VEGF165が、エキソン7にコードされたドメインを介した腫瘍細胞上のVEGF165R/NP-1に結合し、そしてまたをエキソン4にコードされたドメインを介して近傍のEC上のKDRに結合するジャクスタクリン効果を媒介し得るKeytら、J.Biol.Chem.271、5638-56461996b。そのようなメカニズムが、ECを誘引する腫瘍細胞のためにより効率的な方法を生じ得、それにより、腫瘍脈管形成を増強する。要約すると、本発明者らは、独立した精製および発現クローニング方法により、VEGFアイソフォーム特異的レセプターであるVEGF165Rが、神経系の胚発生において役割を果たすとして、そしてコラプシン/セマフォリンのレセプターであるとして以前に同定された細胞表面タンパク質である、NP-1と同一であることを実証した。さらに、VEGF165R/NP-1への結合は、VEGF165の、ECおよび腫瘍細胞上のKDRへの結合を増強する。実験の理論的根拠本発明者らは、腫瘍細胞ニューロピリン-1が、腫瘍細胞の運動性を媒介し、そしてそれにより転移することを発見した。ボイデンチャンバー運動性アッセイにおいて、VEGF16550ng/mlが、用量応答様式で最大で2倍の刺激で231乳癌細胞の運動性を刺激する図15A。一方、VEGF121は、これらの細胞の運動性に効果を有さなかった図15B。231細胞は、KDRまたはFlt-1を発現しないことから、これらの結果は、腫瘍細胞が、直接VEGF165と応答することを示唆し、そしてVEGF165が、ニューロピリン-1を介したシグナル腫瘍細胞であり得ることを示唆する。癌細胞の運動性を誘導するVEGF165を媒介するための可能性のある候補は、PI3-キナーゼPI3-KCarpenterら、1996Curr.Opin.CellBiol.8:153-158である。231細胞は、KDRまたはFlt-1を発現しないことから、これらの結果は、腫瘍細胞が直接VEGF165と応答することを示唆し、そしてVEGF165が、ニューロピリン-1を介したシグナル腫瘍細胞であり得ることを示唆する。他のタイプの証拠は、ニューロピリン-1発現が、腫瘍細胞の運動性と関連し得るということである。本発明者らは、低い運動性および低い潜在的転移性を有するAT2.1細胞、および高い運動性および転移性を有するAT3.1細胞という、ダンニングDunningラット前立腺癌細胞の2つの改変体について分析した。架橋分析およびノーザンブロット分析は、AT2.1細胞は、ニューロピリン-1を発現しないが、AT3.1細胞は、豊富にニューロピリン-1を発現し、VEGF165と結合し得ることを示す図16。腫瘍切片の免疫染色により、AT3.1におけるニューロピリン-1の発現を確かめたが、AT2.1腫瘍では、確認できなかった。さらに、免疫染色は、皮下のAT3.1およびPC3腫瘍において、ニューロピリン-1を発現する腫瘍細胞が、腫瘍/真皮の境界の前面に優先的に侵入するのが見出されることを示す。より直接的に、ニューロピリン-1の発現が、運動性の増強と関係しているのかどうかを決定するために、ニューロピリン-1をAT2.1細胞において過剰発現させた図17。ニューロピリン-1を過剰発現する3つの安定なAT2.1クローン細胞が、ボイデンチャンバーアッセイにおいて運動性を増強した。これらの結果は、AT2.1細胞におけるニューロピリン-1の過剰発現が、それらの運動性を増強することを示す。合わせて考えると、腫瘍細胞上でのニューロピリン-1の発現が、運動性、転移性の表現型に関係しているようである。実施例2NP-1およびsNP-2の構築ニューロピリン-1およびニューロピリン-2の可溶性形態をコードしているcDNAを、PC3細胞mRNAから合成したオリゴdT-プライマーcDNAライブラリーからクローニングした。可溶性ニューロピリン-1sNP-1のcDNAクローニングsNP-1のcDNAは、エキソンとエキソンの境の位置のアミノ酸641位の後のb2とcドメインとの間の全長のNP-1cDNAから逸脱する。sNP-1クローンの3’末端は、3つの新規なアミノ酸および翻訳終止コドンをコードする28bpのイントロン配列を有する。b1ドメイン中から設計された、オリゴヌクレオチドGAAGTATACGGTTGCAAGATA配列番号16を、sNP-1cDNAの3’末端をクローニングするために3’RACEcDNA末端の急速な増幅に用いた。sNP-1cDNAの全長を、sNP-1のオープンリーディングフレームORFの5’末端GCGTTCCTCTCGGATCCAGGC配列番号17および3’末端CAGGTATCAAATAAAATAC配列番号18のプライマーを用いてRT-PCRによりPC3ライブラリーから続いてクローニングした。sNP-1cDNAを、sNP-1の43位と44位との間のアミノ酸のa1ドメインのN末端におけるHisおよびc-mycドメインアミノ酸HHHHHHQQKLISQQNL配列番号23でタグ化した。完全にタグ化したsNP-1cDNAを、哺乳動物の発現プラスミドであるpcDNA3.1にサブクローニングした。sNP-1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号5および6として配列表に示す。可溶性ニューロピリン-2sNP-2cDNAクローニングsNP-2cDNAが、エキソンとエキソンの境の位置の、アミノ酸547位の後のb2ドメイン中のNP-2cDNAの全長から逸脱する。sNP-2クローンの3’末端が、8つの新規なアミノ酸および翻訳終止コドンをコードする146bpのイントロン配列を有する。b1ドメイン中から設計された、オリゴヌクレオチドGGCTGCCGGGTAACAGATGC配列番号20を、sNP-2cDNAの3’末端をクローニングするために3’RACEcDNA末端の急速な増幅に用いた。sNP-2cDNAの全長を、sNP-2のオープンリーディングフレームORFの5’末端ATGGATATGTTTCCTCTC配列番号21および3’末端GTTCTTGGAGGCCTCTGTAA配列番号22のプライマーを用いてRT-PCRによりPC3ライブラリーから続いてクローニングした。sNP-2cDNAを、sNP-2の31位と32位との間のアミノ酸のa1ドメインのN末端におけるHisおよびc-mycドメインアミノ酸HHHHHHQQKLISQQNL配列番号19でタグ化した。完全にタグ化されたsNP-2cDNAを、哺乳動物の発現プラスミドであるpcDNA3.1にサブクローニングした。sNP-2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号7および8として配列表に示す。実施例3可溶性NP-1の調製ドメインABおよびC1.BamHI部位100塩基目とXbaI部位4687塩基目との間のNP-1の配列を、pBluscriptIIKSStratagene、LaJolaCAのBamHI部位とXbaI部位との間にサブクローニングして、pBS-NP1を得た。2.PCRを、NP-1配列において以下のプライマーを用いて行なった:プライマー1正方向:NP-1の2200塩基目のNdeI部位太字および下線プライマー2逆方向:6ヒスチジンhis-tagおよびXbaI部位太字および下線を含むNP-1の2823塩基目の膜貫通膜ドメインの外PCRDNA産物およそ、600bpを、NdeIおよびXbaIを用いて消化し、そしてアガロースゲルから精製した。プラスミドpBS-NP1を、NdeIおよびXbaIを用いて消化し、そしてNP-1の細胞外部位を含む大きなフラグメントを、アガロースゲルから精製し、そしてベクターとして用いた。上述のPCR産物およびベクターのライゲーションを行ない、そして得られたプラスミドを、pBS-sNPhisと名づけた。3.プラスミドpBS-sNPhisを、BamHIおよびXbaIを用いて消化し、そしてNP-1の細胞外部分を含むフラグメントhis-tag含むを、pCPhygro上述の実施例およびSokerら、Cell92:7351998に記載のBamHIおよびXbaI部位にサブクローニングしてpCPhyg-sNPhisを得た。4.プラスミドpCPhyg-sNPhisを、CHO細胞にトランスフェクトし、そしてハイグロマイシン耐性クローンを選択し、そして可溶性NP-1の発現を試験した。可溶性NP-1を、ニッケルセファロースビーズを用いて培地より精製した。5.以下の手法により、クローンにおけるsNP-1の発現を試験した。培地を、24時間馴化し、そして馴化した培地を、24時間レクチンConAと共にインキュベートした。ConA結合原料をSDS-PAGEおよびニューロピリン-1のAドメインに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。本明細書中を通して引用される参考文献は、本明細書中に参考として援用される。本発明は、特定の実施態様についての参照とともに記載されている。しかし、この適用は、その添付の請求項の精神および範囲を逸脱せずに、当業者によってなされ得るそれらの変更および置換を包含することが意図される。配列表"