"少なくとも1個の免疫原をコードする導入遺伝子を送達し支配するための複製欠損アデノウイルスベクターであって、配列番号57または配列番号96に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスゲノムを含み、ここでE1、E2及びE4からなる群から選択される少なくとも1個の遺伝子が機能的に欠失するよう改変されている、前記複製欠損アデノウイルスベクター。アデノウイルスゲノムが、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の複製欠損アデノウイルスベクター。アデノウイルスゲノムが、配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の複製欠損アデノウイルスベクター。E1ヌクレオチド配列の機能的欠失により特徴付けられる、請求項1~3のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクター。E1a、E1b、E2a、E2b、E4、orfs1,2、3、4、5、6、6/7、pIX、IVa2、領域L1、L2、L3、L4、L5からなる群から選択される1以上のアデノウイルス領域を発現する、請求項1~3のいずれか一項に記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。a配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含むヘキソン遺伝子配列;及びb配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む繊維遺伝子配列を含む、単離された組換えアデノウイルスゲノム。その投与により増強された反応が誘発される、請求項1~4のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、前記複製欠損アデノウイルスベクターの十分量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における抗原特異的免疫反応を増強する方法において使用するための組成物。前記ベクターが、そのE1遺伝子を完全に欠失され、さらにそのE3遺伝子を任意選択的に欠失されている、請求項7に記載の組成物。前記免疫反応が、TAAに特異的な増強免疫反応である、請求項7に記載の組成物。前記増強された免疫反応が、抗原特異的CD8T細胞の産生を含む、請求項7または請求項9に記載の組成物。その投与により一次免疫反応が誘発される、請求項1~4のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、少なくともそのE1遺伝子の機能的欠損を含有する前記複製欠損アデノウイルスベクターの十分量を哺乳動物に投与することを含む、未処置哺乳動物において免疫反応を誘発する方法において使用するための、組成物。前記増強された反応又は一次免疫反応はそれぞれ、HIV、HBV、HCV、HPV、HSV1、HSV2、SARSCoV、Leishmaniamajorリーシュマニアメジャー、Plasmodiummalariae四日熱マラリア原虫、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV、CMV、Mycobacteriumtubercolosisマイコバクテリウムテュバキュローシスからなる群から選択される感染物質由来の抗原に特異的である、請求項7または請求項11に記載の組成物。前記免疫反応が、前記哺乳動物が寛容性を有するTAAに特異的な一次免疫反応である、請求項7に記載の組成物。感染物質由来の抗原に対して、免疫反応を誘導する方法において使用するための、請求項1~4に記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、ここで前記方法は、a抗原特異的免疫反応が望まれる感染物質抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のワクチン組成物を投与することによって、感染物質抗原に反応させるために宿主に初回刺激を行うステップと、b少なくともそのE1遺伝子が機能的に欠失され、該E1遺伝子が欠失した部位において、該初回刺激ステップで送達されるものと同じ感染物質抗原をコードするDNAの発現を支配することが可能であるプロモーターを含む配列を含有する、請求項4に記載のアデノウイルスベクターを含む第二のワクチン組成物を投与することによって、ステップaの免疫反応を増強するステップとを含み、該増強免疫組成物の投与が、防御的免疫を付与する効果を有する免疫反応を誘発する、前記組成物。前記感染物質由来の抗原が、HIV、HBV、HCV、HPV、HSV1、HSV2、SARSCoV、Leishmaniamajorリーシュマニアメジャー、Plasmodiummalariae四日熱マラリア原虫、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV、CMV及びMycobacteriumtubercolosisマイコバクテリウムテュバキュローシスからなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。前記第二のワクチン組成物が、HIV、HCV、HBV、HPV、HSV1、HSV2、SARSCoV、Leishmaniamajorリーシュマニアメジャー、Plasmodiummalariae四日熱マラリア原虫、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV、CMV及びMycobacteriumtubercolosisマイコバクテリウムテュバキュローシスからなる群から選択される感染物質由来の抗原をコードするDNAを含むアデノウイルスベクターを含む、請求項14に記載の組成物。前記免疫反応が、抗原特異的CD8T細胞の産生を含む、請求項14に記載の組成物。自己抗原に対する宿主寛容性を打破する方法において使用するための、請求項1~4に記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、ここで前記方法が、a抗原特異的免疫反応が望まれる自己抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のワクチン組成物を投与することによって、自己抗原に対して反応させるために宿主に初回刺激を行い、それによって、一次免疫反応を誘発するステップと、b少なくともそのE1遺伝子が機能的に欠失され、該E1遺伝子欠失の部位において、初回刺激ステップで送達される同じ自己抗原をコードするDNAの発現を支配することが可能であるプロモーターを含む配列を含有する、組換えアデノウイルスベクターを含む第二のワクチン組成物を投与することによって、ステップaの一次免疫反応を増強するステップとを含み、該増強免疫組成物の投与が、自己抗原に対する宿主の寛容性を打破する効果を有する免疫反応を誘発する、組成物。前記第二のワクチン組成物が、HER2NEU、CEA、HEPCAM、PSA、PSMA、テロメラーゼ、GP100、MELAN-A/MART-1、MUC-1、NY-ESO-1、サバイビン、ストロメリシン3、チロシナーゼ、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-CO-58、NY-BR-62、HKLP2、5T4及びVEGFR2からなる群から選択される、自己抗原をコードするDNAを含むアデノウイルスベクターを含む、請求項18に記載の組成物。前記免疫反応が、抗原特異的CD8T細胞の産生を含む、請求項18に記載の組成物。前記第一及び第二のワクチン組成物が両方とも、異なる血清型により特徴付けられるアデノウイルスベクターである、請求項19または20に記載の組成物。したがって、引き続き、操作しやすく、製薬スケールに持って行きやすく、長期保存でき、ヒトの補完的細胞株で高レベルで複製することができ、免疫原性が高く、ヒトアデノウイルスの共通血清型と交差反応する中和B細胞エピトープを欠いており、規制当局により広められている安全性RCA基準に合致し、ヒトでの使用に適切な初回刺激/追加免疫に使用できる、ヒト宿主での使用に適したアデノウイルスワクチン担体の開発が必要とされている。本発明は、チンパンジーアデノウイルス由来の組み換え複製欠損アデノウイルスベクター及びヒトE1発現細胞株においてチンパンジーアデノウイルスベクターを生成させるための方法に関する。本発明はまた、ヒトにおける使用に適切な臨床グレードのベクターストックを生成させるための方法及び、防御的及び/又は治療的免疫反応を誘発するために、開示するベクターをワクチン担体として使用するための手段を提供する。本発明はさらに、免疫原をコードする導入遺伝子を送達し、発現を支配するように設計されたワクチン組成物を調製するための、本発明の組み換えアデノウイルスを使用するための方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、感染物質由来の免疫原をコードする導入遺伝子を含有するワクチン投与のための、ワクチン担体としての、開示するベクターの使用をもくろむ。第二の実施形態において、本発明は、癌ワクチンを調製及び投与するための、開示するベクターの使用をもくろむ。特定の実施形態において、本発明は、TAAをコードする導入遺伝子を含有する癌ワクチンの調製及び投与をもくろむ。ある局面において、本発明は、本明細書中で、ChAd3配列番号1図5A-5K、ChAd6配列番号2図6A-6K、CV32配列番号3図7A-7K、CV33配列番号4図8A-8K及びCV23配列番号5図9A-9Jと呼ばれる、5種類のチンパンジーアデノウイルスChAdの完全ゲノム配列を開示する。ChAd3及びChAd6は、本明細書中で開示する方法に従い単離された新規アデノウイルスを表す。ChAd3及びChAd6のゲノムは、それぞれ37741及び36648塩基対の長さである。このChAd3ヘキソン遺伝子配列番号41は、配列番号1のヌクレオチドnt19086から21965停止コドンを除く。を含有し、ChAd3繊維遺伝子配列番号42は、配列番号1のnt32805から34487停止コドンを除く。を含有する。ChAd6ヘキソン遺伝子は、配列番号2のnt18266-21124配列番号43停止コドンを除く。を含有し、その繊維遺伝子配列番号44は、配列番号2のnt32218から33552停止コドンを除く。を含有する。全長ヘキソンペプチドの多配列アラインメントから推定される配列相同性に基づき、ChAd3は、ヒトサブグループCに分類され、ChAd6は、ヒトサブグループEに分類される。CV32、CV33及びCV23アデノウイルスのゲノムは、それぞれ、36,606、36,535及び32,020塩基対の長さである。CV32Pan6ATCCN.VR-592、CV33Pan7ATCCN.VR-593及びCV23Pan5EsoterixInc.,は、全て、ヒトAd4hAd4に関連することが分かっているサブグループEWigand,Rら、Intervirology1989,30:1-9。しかし、ヘキソン配列アラインメントに基づいて、CV32は、その後、hAd4よりも、ヒトサブグループDメンバーに密接に類似するものとして特徴付けられた。第二の局面において、本発明は、本明細書中で開示する方法に従い単離された21種類のさらなるチンパンジーアデノウイルスChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82の繊維及びヘキソン遺伝子に対するヌクレオチド配列を提供する。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19に対する繊維遺伝子ヌクレオチド配列は、それぞれ図10から図19に記載されており、本明細書中で、配列番号6から15配列番号6、ChAd20;配列番号7、ChAd4;配列番号8、ChAd5;配列番号9、ChAd7;配列番号10、ChAd9;配列番号11、ChAd10;配列番号12、ChAd11;配列番号13、ChAd16配列番号14、ChAd17及び配列番号15、ChAd19と呼ばれる。ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82に対する繊維遺伝子ヌクレオチド配列は、本明細書中で配列番号58、ChAd8、配列番号60、ChAd22、配列番号62、ChAd24、配列番号64、ChAd26、配列番号66、ChAd30、配列番号68、ChAd31、配列番号70、ChAd37、配列番号72、ChAd38、配列番号74、ChAd44、配列番号76、ChAd63及び配列番号78、ChAd82と呼び、配列リストに記載する。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19に対するヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列は、図21-30にそれぞれ記載され、本明細書中で、配列番号16から25:配列番号16、ChAd20;配列番号17、ChAd4;配列番号18、ChAd5;配列番号19、ChAd7;配列番号20、ChAd9;配列番号21、ChAd10;配列番号22、ChAd11;配列番号23、ChAd16;配列番号24、ChAd17及び配列番号25、ChAd19と呼ぶ。ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82に対するヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列は、本明細書中で、配列番号97、-ChAd8、配列番号99、ChAd22、配列番号101、ChAd24、配列番号103、ChAd26、配列番号105、ChAd30、配列番号107、ChAd31、配列番号109、ChAd37、配列番号111、ChAd38、配列番号113、ChAd44、配列番号115、ChAd63及び配列番号117、ChAd82と呼び、配列リストに記載する。第三の局面において、本発明は、本明細書中で開示する方法に従い単離された、21種類のさらなるチンパンジーアデノウイルスChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82の繊維及びヘキソンタンパク質に対するアミノ酸配列を提供する。本明細書中で開示され主張される繊維タンパク質は、配列番号83、ChAd3、配列番号84、ChAd6、配列番号48、ChAd20、配列番号49、ChAd4、配列番号50、ChAd5、配列番号51、ChAd7、配列番号52、ChAd9、配列番号53、ChAd10、配列番号54、ChAd11、配列番号55、ChAd16、配列番号56、ChAd17、配列番号57、ChAd19、配列番号59、ChAd8、配列番号61、ChAd22、配列番号63、ChAd24、配列番号65、ChAd26、配列番号67、ChAd30、配列番号69、ChAd31、配列番号71、ChAd37、配列番号73、ChAd38、配列番号75、ChAd44、配列番号77、ChAd63及び配列番号79、ChAd82と呼ばれる。図20Aから20Gは、本明細書中で開示され主張される繊維タンパク質のアミノ酸配列を、C1配列番号85、CV68配列番号86、Pan5CV23とも呼ばれる。配列番号80、Pan6CV32とも呼ばれる。配列番号81及びPan7CV33とも呼ばれる。配列番号82の繊維タンパク質のアミノ酸配列と比較するアラインメントを提供する。本明細書中で開示され主張されるヘキソンタンパク質は、配列番号122、ChAd3、配列番号123、ChAd6、配列番号87、ChAd20、配列番号88、ChAd4、配列番号89、ChAd5、配列番号90、ChAd7、配列番号91、ChAd9、配列番号92、ChAd10、配列番号93、ChAd11、配列番号94、ChAd16、配列番号95、ChAd17、配列番号96、ChAd19、配列番号98、ChAd8、配列番号100、ChAd22、配列番号102、ChAd24、配列番号104、ChAd26、配列番号106、ChAd30、配列番号108、ChAd31、配列番号110、ChAd37、配列番号112、ChAd38、配列番号114、ChAd44、配列番号116、ChAd63及び配列番号118、ChAd82と呼ばれる。図31Aから31Jは、本明細書中で開示され主張されるヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、C1配列番号124、CV68配列番号125、Pan5CV23とも呼ばれる。配列番号119、Pan6CV32とも呼ばれる。、配列番号120及びPan7CV33とも呼ばれる。配列番号121のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列との比較を与える。ヘキソンタンパク質の多配列アラインメントにより、熟練者は、ヒトアデノウイルス血清型の提案される分類に従う系統発生解析を行うことが可能となるRux,J.J.ら、2003J.Virol.77:9553-9566。代替的局面において、本発明はさらに、21種類のさらなるチンパンジーアデノウイルス分離株を提供する。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17及びChAd19を含有する試料を、BudapestTreatyのもと、オリジナル委託物として、EuropeanCollectionofCellCulturesECACC、PrtonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UnitedKingdomにより、2003年12月12日に委託した。この委託物に対して、次の受託番号が割り当てられた:03121201ChAd4、03121202ChAd5、03121203ChAd7、03121204ChAd9、03121205ChAd10、03121206ChAd11、03121207ChAd16、03121208ChAd17、03121209ChAd19及び03121210ChAd20。ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82を含有する試料を、BudapestTreatyのもと、オリジナル委託物として、ECACCPrtonDown,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UnitedKingdomにより、2005年1月12日に委託した。これらの委託物に対して、次の受託番号が割り当てられた:05011201ChAd8、05011202ChAd22、05011203ChAd24、05011204ChAd26、05011205ChAd30、05011206ChAd31、05011207ChAd37、05011208ChAd38、05011209ChAd44、05011210ChAd63及び05011211ChAd82。これらの委託物は、InternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsofthePurposesofPatentProcedureにおけるBudapestTreatyの条項に従い維持される。これらの委託物は、当業者に対する便宜としてのみ、なされたものであり、委託物が25U.S.C.§112のもとで要求されることの承認ではない。特許の付与において、37C.F.R.§1.808bにおいて規定される要件を除き、委託した物質の公共に対する利用可能性における制限は全て、変更不能に取り除かれる。さらなる局面において、本発明はまた、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染することができ、コードされる導入遺伝子産物の発現を支配することができる、複製欠損組み換えアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で示されるように、開示するベクターは、免疫反応が望まれる免疫原を含有する導入遺伝子の送達に対する使用のためのワクチン担体としての使用に適する。特定の実施形態において、本発明は、ヒトE1発現つまりパッケージング細胞株において高レベルで複製することができる、組み換え複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを提供する。ある実施形態において、本発明は、PER.C6TM細胞において複製できる組み換えアデノウイルスを提供する。一般に、本発明に包含される組み換えベクターは、ヒト集団において一般に直面させられるアデノウイルス血清型に対して既存の免疫を回避するワクチン担体を提供する。とりわけ、本発明の組み換えベクターは、本明細書中で、ヒトアデノウイルス由来ベクターの共通血清型と交差反応する中和Bエピトープを欠いていることが示される、ベクター骨格配列を含有する。本発明はさらに、アデノウイルス部分及びプラスミド部分を含み、該アデノウイルス部分が通常、aウイルス左端ITR及びパッケージングシグナル、pIX遺伝子の一部及びウイルスゲノム右端と;b遺伝子発現カセットと、を含む、群特異的シャトルベクターを提供する。この群特異的シャトルベクターは、同じ血清型サブグループつまり、サブグループA、B、C、D又はEに割り当てられ、本明細書中で開示されるヌクレオチド配列を操作するために、及び/又は、E1領域を欠くチンパンジーアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスプレプラスミドを生じる、同じサブグループに属する他のチンパンジーアデノウイルスをクローニングするために、使用することができるアデノウイルスの間で観察される、ヌクレオチド配列相同性を活用するように設計されている。本発明の他の局面には、アデノウイルスワクチンベクター及び/又はアデノウイルスプレプラスミドベクターを含有する宿主細胞が含まれ、該ベクターの生成方法には、アデノウイルスワクチンベクターを、アデノウイルスE1タンパク質を発現する宿主細胞に導入することと、得られたアデノウイルスワクチンベクターを回収することと、が含まれる。特定の実施形態において、本発明は、アデノウイルスE1発現ヒト細胞に、開示するアデノウイルスベクターの1つを導入することと、得られた組み換えアデノウイルスを回収することと、を含む、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを生成する方法を提供する。本発明の別の局面はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含有するワクチン組成物を提供する。組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する組成物は、単独で、又はその他のウイルス性もしくは非ウイルス性ベースのDNA/タンパク質ワクチンと組み合わせて、投与し得る。これらはまた、幅広い治療計画の一部として投与し得る。これらの組成物は、予防的又は治療的設定のいずれかで、哺乳動物宿主、好ましくはヒト宿主に投与することができる。本明細書中で示されるように、初回刺激追加免疫計画又は血清学的に区別されるAdベクターの複数回注射など、単独又は組合せ方式での開示するワクチン組成物の投与の結果、その導入遺伝子によりコードされる免疫原を特異的に認識することができる、哺乳動物における免疫反応が誘導される。本明細書中で開示され主張される方法の1つは、少なくとも、その野生型E1遺伝子の機能的欠失を含有し、少なくとも1個の標的抗原をコードするヌクレオチド配列の発現を支配することができるプロモーターを含む配列を担う、組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターの十分量を、哺乳動物未処置又は標的抗原に対して免疫活性となるように初回刺激されているもののいずれかに投与することを含み、本組み換えベクターの投与が抗原特異的免疫反応を誘発又は刺激する。ある実施形態において、本発明は、感染物質に対して免疫反応予防的又は治療的を誘導するように設計された方法を提供する例えば、ウイルス性もしくは細菌病原体又は哺乳動物寄生生物。第二の実施形態において、本発明は、TAAなどの、自己抗原に対する寛容性を打破する、哺乳動物において免疫反応を誘導するように設計された方法を提供する。本発明のこの局面は、癌ワクチンの調製及び投与のための、ワクチン担体としての、開示するベクターの使用をもくろむ。本発明のさらに他の実施形態及び長所は、次の本発明の詳細な説明から容易に明らかとなろう。ChAdの単離、クローニング、配列決定及び特性決定チンパンジーアデノウイルスの単離ウイルス輸送培地VTM;MicrotestM4-RMulti-MicrobeTransportMedium,RemelInc.において便検体を回収し、次にNIRCNewIberiaResearchCenter4401W.AdmiralDoyleDriveNewIberia,LA70560で-70°Cにて凍結又は直接凍結した。この検体を細胞培養物への接種のために処理するまで<-70°Cで凍結保存した。この検体を細胞培養物へ接種する際、この検体を解凍し、次に過剰の氷冷ウイルス輸送培地中でボルテックスした。前記検体を懸濁液へ入れて解離させた後、それらを1500から1800rpmで10分間遠心分離した。上清を0.8μmシリンジフィルター及び0.2μmシリンジフィルターを通じて連続して濾過し、次にこの濾過した材料を細胞培養物へ接種したシェルバイアルへ200から250μl、及び試験管培養物へ250から300μl。処理した各検体を293細胞もしくはA549細胞を播種した試験管培養物及びシェルバイアル培養物へと接種した。対照ポジティブ及びネガティブ培養物を、1セットの試料を接種する各場合に調製した。設定におけるシェルバイアルに全て接種したら、それらを室温にて60±10分間、2000rpm900xgで遠心分離した。培養物中の熱損傷を防止するため、ローターの回転が停止した直後に前記バイアルを遠心分離機から取り出した。遠心分離後、交差汚染を防止するため、各バイアルにおいて新鮮な滅菌済みパスツールピペットを使用して、接種材料を前記シェルバイアルから吸引した。各洗浄につき1.0mlの新鮮な培地を使用して、前記培養物を3回洗浄した。3回目の洗浄の後、新鮮な培地1.0mlを各バイアルへピペットを介して添加し、前記シェルバイアルを35から37°Cのインキュベーターの中で3日から4日間約96時間静置した。培養期間の終了時に、上清を前記培養物から吸引し、各洗浄に対して約1.0mlの緩衝液を使用して、免疫蛍光アッセイIFA緩衝液で各バイアルにおける細胞層を2回洗浄した。1.0mLの冷アセトンを各バイアルへ添加する2から8°Cで10分間ことにより、細胞を固定した。アセトン洗浄したスライドを、シェルバイアルカバースリップと関連付けた検体認識番号で標識した。このシェルバイアルカバースリップを、一次マウス抗アデノウイルス抗体[MAB8052、Chemicon]を使用してアデノウイルス感染細胞の蛍光標識用に処理した。蛍光顕微鏡を使用して、スライドを評価する。ウェル1から4にわたる免疫蛍光がカバーする範囲に留意して、10倍の対物レンズを使用して各調製物をスキャンした。40倍の対物レンズを使用して特異的免疫蛍光の有無を確認した。前記シェルバイアルについて記載したものと同じ手順で、試験管培養物に接種した例えば、ネガティブ対照を最初に処理し、次いで、臨床検体及びポジティブ対照。この接種材料を36から38°Cにて60分から120分間吸着させた。吸着時間後、この検体/対照を試験管から吸引し、新鮮な培地と交換した。接種から3日から4日後、及び、その後週に1回、この培養試験管から培地を吸引し、1.5mlの新鮮な培地と交換した。培養試験管をCPEについて、接種後少なくとも21日間、少なくとも1日おきに目で見て観察した。チンパンジー検体で接種した培養物を対照と比較し、CPEの程度を観察することによって評価した。14日後に、CPEを示さない培養物を新鮮な試験管培養物へ通し、21日後にCPEに対して陰性である培養試験管を陰性とみなした。3から4のCPEの培養試験管を10秒間ボルテックスした。細胞を試験管壁から、滅菌済みの1.0mL血清学用ピペットを使用して回収し、培養上清中で懸濁した。5mLのスナップキャップ試験管に検体認識番号及び日付を付した後、-70°Cで保存した。この細胞懸濁液500μlを、培養試験管からスナップキャップ試験管へ移し、アデノウイルスを検出するための間接免疫蛍光抗体技術シェルバイアルを染色するための手段と同等を使用して処理するまで、2°Cから8°Cで最長1日間保存した。チンパンジーアデノウイルス増幅ATCC又はEsoterixInc.,.Austin,Texasから購入した野生型チンパンジーアデノウイルスCV32、CV33、CV23及びCV68ATCC受託番号:CV32、VR-592;CV33、VR-593;及びオリジナルの分離株を、ヒトE1発現細胞株PER.C6TM又は293を使用することによって以下のように増殖させた。簡潔には、10ウシ胎児血清FBSGibcoBRL,LifeTechnologies、1ペニシリン-ストレプトマイシン、2mMグルタミン及び10mMMgCl2Per.C6TMを添加したダルベッコ改変イーグル培地DMEM;GibcoBRL,LifeTechnologies中で細胞を培養した。5ウマ血清GibcoBRL,LifeTechnologiesを添加したDMEM中でアデノウイルス感染を行った。細胞の100がウイルスにより誘導される細胞病理学的効果CPEを呈したら、感染した細胞及び培地を回収し、凍結融解を3回繰り返して細胞溶解させた。野生型チンパンジーアデノウイルスCVストックを全て、増幅の第一継代後に96穴プレートに播種した293細胞を感染させることによってクローニングした。ウイルスクローニングは、ウイルス増幅の第一継代で得られる細胞溶解液の希釈を制限することによって行った。5個の単離されたクローンを拾い、連続して増殖させた。増幅の3回から4回の連続した継代の後、5つの2層細胞ファクトリーNUNC上に播種した細胞において、アデノウイルスの大規模調製を行った1つの細胞ファクトリーにつき2億個の細胞。塩化セシウム密度勾配における超遠心段階を2回行い、細胞溶解液から、精製したウイルス粒子を得た。ウイルスゲノムDNAの配列決定1SDS-TEN中のプロテイナーゼK0.5mg/mlで55°Cで2時間消化することにより、精製ウイルス調製物3x1012ppから、ゲノムDNAを単離した。フェノール-クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿の後、このゲノムDNAを水中で再懸濁し、ゲノム配列決定に供した。全長のAdゲノム配列決定のため、精製ウイルスDNAを霧状にし、無作為にせん断された断片を得た。E.コリDNAポリメラーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼのKlenow断片を用いて、このDNA断片を平滑末端化にした。平滑末端断片を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、1から3kbの範囲の大きさの断片を精製し、pUC19ベクターのSmaI部位へとクローニングし、ショットガンライブラリを作製した。ライゲーションを使用してコンピテントXL1-BlueMRF’を形質転換した。X-gal及びIPTGを含有するLB寒天上での白色/青色スクリーニングにより陽性コロニーを同定した。プラスミドDNAの3個から4個の96穴ブロックをライブラリから単離し、pUC順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて配列決定した。配列決定の読み取りは全て、Phred-Phrapソフトウェアパッケージを使用して性質及びベクター配列についてスクリーニングした。このスクリーニングを通過した読み取りをコンティグに集めた。プライマーは、ギャップを閉鎖し、両端のDNA配列を決定するために、アデノウイルスDNAを直接配列決定するよう設計した。ChAd3配列番号1、ChAd6配列番号2、CV32配列番号3、CV33配列番号4、及びCV23配列番号5を含む選択されたウイルスについて完全なウイルスゲノム配列決定が行われた。表1は、ChAd3、ChAd6、Pan5CV23、Pan6CV32、Pan7CV33、C1及びC68アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列間の同一性の割合を要約するデータを提供する。アラインメントは、FASTAパッケージ第2版の一部としてのALIGNプログラムを使用して計算したWilliamR.Penson,UniversityofVirginia;MyersMiller,CABIOS1989,4:11-17。新規のアデノウイルス分離株例えば、ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82の特徴を調べるために、ヘキソン及び繊維遺伝子のヌクレオチド配列もプライマーウォーキングにより決定した。繊維遺伝子は、配列番号6から15配列番号6、ChAd20;配列番号7、ChAd4;配列番号8、ChAd5;配列番号9、ChAd7;配列番号10、ChAd9;配列番号11、ChAd10;配列番号12、ChAd11;配列番号13、ChAd16;配列番号14、ChAd17;配列番号15、ChAd19及び配列番号58、ChAd8、配列番号60、ChAd22、配列番号62、ChAd24、配列番号64、ChAd26、配列番号66、ChAd30、配列番号68、ChAd31、配列番号70、ChAd37、配列番号72、ChAd38、配列番号74、ChAd44、配列番号76、ChAd63及び配列番号78、ChAd82である。図20Aから20Gは本明細書中で開示され主張される前記ChAd分離株の繊維タンパク質のアミノ酸配列の比較を与える。ヘキソン遺伝子配列は、配列番号16から25配列番号16、ChAd20;配列番号17、ChAd4;配列番号18、ChAd5;配列番号19、ChAd7;配列番号20、ChAd9;配列番号21、ChAd10;配列番号22、ChAd11;配列番号23、ChAd16;配列番号24、ChAd17;配列番号25、ChAd19、配列番号97、ChAd8、配列番号99、ChAd22、配列番号101、ChAd24、配列番号103、ChAd26、配列番号105、ChAd30、配列番号107、ChAd31、配列番号109、ChAd37、配列番号111、ChAd38、配列番号113、ChAd44、配列番号115、ChAd63及び配列番号117、ChAd82である。図31Aから31Jは、本明細書に開示され主張されるChAd分離株のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の比較を与える。チンパンジーアデノウイルスの分類異なるチンパンジーアデノウイルス株の分類は、6個のサブグループへのヒトアデノウイルス血清型のすでに提唱されている分類Horowitz,MS1990Adenoviridaeandtheirreplication.VirologyB.N.Fields及びD.M.Knipe,編RavenPress,NewYorkpp.1679-1740に従い、AlignXプログラムInformax,Incを使用することによるアミノ酸及びヌクレオチド配列アラインメントにより得た。新たな分離株の最初の分類は、異なる制限エンドヌクレアーゼによるウイルスゲノムの制限パターンを観察すること及びヘキソン遺伝子の超可変領域7HVR7の配列分析により得られた。このために、HVR7に隣接する高度に保存された領域に関して2つのプライマー:TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA配列番号45及びGTGGAARGGCACGTAGCG配列番号46を設計した。精製ウイルスDNA又は未精製293細胞溶解液をテンプレートとして使用するPCRによりこのHVR7を増幅した後配列決定した。HVR7配列分析に基づいて、我々は、新たに単離されたウイルスを、ヒトAdウイルスについて提唱されるサブグループA~Fへ分類したHorowitz,MS1990Adenoviridaeandtheirreplication.VirologyB.N.FieldsandD.M.Knipe編ravenPress,NewYorkpp.1679-1740。図35に示される系統発生樹はヒト及びチンパンジーのアデノウイルスへキソンアミノ酸配列のアラインメントにより得られた。この結果は、AlignXプログラムInformax,Incを使用することによるヘキソンHVR7に限定したヌクレオチド配列アラインメントに基づく最初の分類と一致する。この系統樹は、PAUPSEARCHWisconsinPackageVersion10.3,AccelrysInc.を使用する全長のヘキソンペプチド配列の多配列アラインメントから推定し、TREEVIEWにより可視化を行い、操作した。WisconsinPackageにおいて実装されるPAUPSEARCHプログラムを使用してブートストラップ信頼分析を実行した。各アラインメントについて、検索基準としてHeuristicSearchを用い、最適性基準としてMaximumParsimonyを用いて、前記プログラムを1000個の複製物に関して実行し、報告する信頼値は、50多数決コンセンサス50majority-ruleconsensusから得た。ChAdシャトルベクター及び発現ベクターの構築及びレスキューベクター構築及びレスキューウイルスゲノムの左右両端由来のウイルスDNA配列を含有する適切なシャトルベクターを用いて、相同組み換えにより、ゲノムウイルスDNAを標準プラスミドベクターにクローニングした図2。下記でさらに詳しく述べるように、グループ特異的シャトルベクターを開発するために、同一血清型サブグループに分類されるウイルス間で観察される配列相同性を利用した。サブグループD及びEへ分類されるチンパンジーアデノウイルスのゲノムウイルスDNAは、両サブグループに属するウイルスをクローニングするための共通のシャトルベクターの構築が可能となるのに十分な相同性を生じた。サブグループD/Eシャトルベクターの構築ChAd6ウイルスゲノムを完全に配列決定し配列番号2、得られた情報を使用して、サブグループD及びEのチンパンジーアデノウイルスの相同組み換えによるクローニングを促進するためにシャトルベクターを構築した。本明細書でpARSChAd6-3と呼ばれるChAd6シャトルベクターの構築を図1に記載する。図32は、本明細書に記載されるクローニング実験で使用されるオリゴヌクレオチド配列配列番号26から40及び配列番号45から46のリストを提供する。簡潔に述べると、オリゴヌクレオチド、5’-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTC-3配列番号27及び5’-CGCTGGCACTCAAGAGTGGCCTC-3’配列番号28を使用して、PCRによりChAd6DNAの左端由来の457bpを増幅し、EcoRI及びSnaBIで消化し、EcoRI-SnaBIで切断しておいたpNEBAd35-2へクローニングし、pNEBChAd6-LIを得た。右のChAd6ITRbp36222からbp36648を、PCRにより、オリゴヌクレオチド5’-ATGAAGCTTGTTTAAACCCATCATCAATAATATACCT-3’配列番号29及び5’-ATCTAGACAGCGTCCATAGCTTACCG-3’配列番号30を用いて増幅し、制限酵素HindIII及びXbaIで消化し、HindIII-XbaIで切断しておいたpNEBChAd6LIへクローニングし、その結果、pNEBChAd6-RLIを得た。最後に、ChAd6ゲノムDNA配列のヌクレオチド3426から3813に対応するDNA断片を、オリゴヌクレオチド5’ATGCTACGTAGCGATCGCGTGAGTAGTGTTTGGGGGTGGGTGGG-3’配列番号31及び5’-TAGGCGCGCCGCTTCTCCTCGTTCAGGCTGGCG-3’配列番号32を用いて増幅し、SnaBI及びAscIで消化した後にSnaBI-AscIで消化しておいたpNEBChAd6-RLIにライゲーションし、その結果、pNEBChAd6-RLIdE1を得た。DH5aE.コリ株における組み換え及びプラスミド増幅効率を向上させるため、ChAd6の左右両方のITRを含有する1306bp断片及びpIX遺伝子断片を、pNEBChAd6-RLIdE1から、PmeI消化により切り出し、pMRKAd5SEAPからの、オリゴヌクレオチド5’-GATCTAGTTAGTTTAAACGAATTCGGATCTGCGACGCG-3’配列番号33及び5’TTCGATCATGTTTAAACGAAATTAAGAATTCGGATCC-3’配列番号34を使用するPCR増幅により得られた異なるプラスミドベクターへ移した。この最後のライゲーション段階により、ChAd6シャトルベクターpARSChAd6-3が生じた。サブグループCシャトルベクターの構築ChAd3ウイルスゲノムを完全に配列決定し配列番号1、得られた情報を使用して、サブグループCチンパンジーアデノウイルスの相同組み換えによるクローニングを促進するためにシャトルベクターを構築した。簡潔には、本明細書でpChAd3EGFPと呼ばれるサブグループCチンパンジーアデノウイルスをクローニングするのに使用されるシャトルベクターを以下のように構築した。pIXコード化領域を含有するChAd3DNA断片ヌクレオチド3542から4105を、オリゴヌクレオチド5’-TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG-3’配列番号35及び5’-TAGGCGCGCCCTTAAACGGCATTTGTGGGAG-3’配列番号36を使用するPCRにより増幅し、SgfI-AscIにより消化し、その後SgfI-AscIで消化したpARSCV32-3へとクローニングし、pARS-ChAd3Dを得た。ChAd3右端nt37320から37441を、オリゴヌクレオチド5’-CGTCTAGAAGACCCGAGTCTTACCAGT-3’配列番号37及び5’-CGGGATCCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATT-3’配列番号38を用いたPCRにより増幅し、XbaI及びBamHIで消化した後、XbaI及びBamHIで制限酵素処理したpARS-ChAd3Dへライゲーションし、pARS-ChAd3RDを得た。ChAd3ウイルスDNA左端nt1から460を、オリゴヌクレオチド5’-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTT-3’配列番号39及び5’-ATGACGCGATCGCTGATATCCTATAATAATAAAACGCAGACTTTG-3’配列番号40を用いたPCRにより増幅し、EcoRI及びSgfIで消化した後、EcoRI及びSgfIで切断したpARS-ChAd3RDへクローニングし、その結果、pARS-ChAd3RLDを得た。このウイルスDNAカセットはまた、酵素切断によってプラスミドDNAからウイルスDNAが放出されるよう、両ITRの端にある制限酵素部位PmeIを含有するように設計された。サブグループBシャトルベクターの構築サブグループBシャトルの構築は、サブグループC及びD/Eシャトルの構築についてすでに記載したストラテジーに従った。簡潔には、pARS-ChAd3RLDが左端、pIX領域、右端を、ChAd30の対応する断片と置換することによって改変した。さらに、ChAd30のE4領域を、ChAd30E4プロモーター調節の下でクローニングされるAd5E4orf6と置換した。このシャトルプラスミドを、pChAd30EGFPシャトルベクターと命名した。ΔE1チンパンジーアデノウイルスベクターの構築サブグループB:サブグループBのチンパンジーアデノウイルスベクターをE.コリ株BJ5183における相同組み換えにより構築した。BJ5183細胞に対して、BstEII及びBst1107Iで消化したpChAd30EGFPシャトルベクターと、ChAd8及びChAd30の精製ウイルスDNAとを用いて、同時形質変換した。pIX遺伝子、直線化したpChAd30EGFPシャトルの両端に存在する右ITRDNA配列及びウイルスゲノムDNAの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能になり、EGFP発現カセットにより置換されるE1領域が同時に欠失した。ヒトサイトメガロウイルスHCMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBghポリAに基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼSEAP、EGFP、HIVgag、HCVNS領域ChAd6シャトルベクターについて図3に記載されるようなもの。、並びにヒト及びアカゲザル由来のCEA及びHER2neuのような腫瘍関連抗原を発現させた。全ての発現カセットを相同組み換えによりChAd30ベクターへと挿入した。サブグループC:サブグループCのチンバンジーアデノウイルスベクターをE.コリ株BJ5183における相同組み換えにより構築した。BstEII及びBst1107Iで切断したpChAd3EGFPシャトルベクターと、ChAd3、ChAd11、ChAd19及びChAd20の精製ウイルスDNAと、を用いて、BJ5183細胞に対して同時形質変換を行った。pIX遺伝子、直線化したpChAd3EGFPシャトルの端に存在する右ITRDNA配列と、ウイルスゲノムDNAとの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能になり、EGFP発現カセットにより置換されるE1領域が同時に欠失した。ヒトサイトメガロウイルスHCMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBghポリAに基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼSEAP、EGFP、HIVgag、HCVNS領域ChAd6シャトルベクターに対して図3に記載されるようなもの。、並びにヒト及びアカゲザル由来のCEA及びHER2neuのような腫瘍関連抗原を発現させた。サブグループD及びE:サブグループD及びEのチンパンジーアデノウイルスに基づいたΔE1ベクターを構築するため、シャトルベクターpARSChAd6-3をAscIで消化し、E.コリ株BJ5183に、CV32、CV33、CV68、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd9、ChAd10及びChAd16の精製ウイルスDNAを用いて同時形質転換した。pIX遺伝子及び直線化したpChAd6-3の端に存在する右ITRDNA配列と、ウイルスゲノムDNAとの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能となり、E1領域が同時に欠失した。図2及び図4。ヒトサイトメガロウイルスHCMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルBghポリAに基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼSEAP、EGFP、HIVgag、HCVNS領域図3、並びにヒト及びアカゲザル由来のCEA及びHER2neuのような腫瘍関連抗原を発現させた。図4に記載されるようなΔE1アデノウイルスプレプラスミドへの相同組み換えによって転移されるpARSChAd6-3ベクターの1個のSnaBI部位へ全発現カセットを挿入した。ΔE1ベクターのレスキュー及び増幅6cmの細胞培養皿に播種された5x106個のPER.C6TM細胞を、エンドヌクレアーゼ消化によりプラスミド配列から放出されるクローン化されたウイルスベクター10μgでトランスフェクトションした。LipofectamineInvitrogenを使用してDNAトランスフェクションを行った。トランスフェクションした細胞及び培地を、トランスフェクションから5から10日後に回収し、凍結解凍により溶解した。次に、レスキューしたベクターを293細胞又はPER.C6TM細胞での連続継代により増幅した。総計1から2x109個の細胞において、5から10個の細胞ファクトリーNUNC,Inc.上に播種した細胞を感染させることによって大規模増幅を行った。塩化セシウム勾配上での2回の超遠心により、精製ベクター調製物を得て、10グリセロールを含有するPBSに対して透析し、分注して-70°Cにて保存した。中和実験本明細書で開示されるチンパンジーアデノウイルスに対する中和抗体のヒト血清における普及率を評価するため、中和アッセイを実行した。このアッセイにより、分泌型アルカリフォスファターゼSEAPに対する遺伝子を担うチンパンジーアデノウイルスがヒト293細胞に対して形質導入する能力に及ぼす血清プレインキュベーションの効果を評価した。中和タイターは、ウイルスのみのポジティブ対照において観察されるSEAP活性の50の低下を与える血清の希釈度として定義される。CV33-SEAP、CV32-SEAP及びChAd3-SEAPの2x106個から1.5x107個の自然粒子を完全培地100μlに希釈し、完全培地に希釈したヒト又はチンパンジー血清等量に添加した。各血清試料を様々な希釈率で試験した1/18希釈から開始して、1/4希釈を5回行い、14608まで。。試料を37°Cで1時間プレインキュベーションし、その後96穴プレートへ播種した293細胞1個のウェルあたり3x104個の細胞へ添加した。インキュベーションの1時間後に接種材料を除去し、細胞に新鮮培地を再供給し、24時間後、培地50μlを取り出し、SEAP活性を化学発光アッセイにより測定した。ウイルスのみのポジティブ対照において観察されるSEAP活性の50低下を与える血清の希釈度として、中和タイターを定義する。100検体のヒト血清のパネルをChAd中和活性について検査した。並行して同じパネルをAd5SEAPベクターに関して検査した。表2で与える結果は、チンパンジーアデノウイルス由来のベクターに対して向けられた、中和抗体のヒト血清における普及率が非常に低いことを示す。CV32ベクターにおいて200の閾値を超えるタイターを示すものは、4検体の血清のみであるのに対し、ChAd3SEAPベクターについては、8検体が200を超えるタイターを示した。一方、検査したチンパンジー血清のパネルは、抗チンパンジーAd免疫性の普及率が非常に高いことを示した。これらの知見から、予想したように、チンパンジーAdに基づくベクターがヒトにおいて中和される機会が非常に少ないことが確認された。それゆえこれらの知見は、Ad5などの共通のヒトAd血清型に基づいたウイルスベクターの投与を制限する、既存の抗ヒトAd免疫性の問題に対する理想的な解決を呈示する。ChAdベクター親和性Ad5ベクター及びChAdベクターを介した遺伝子導入の効率を、異なる組織由来のヒト初代細胞のパネルにおけるEGFP発現により評価した。ヒト軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン細胞、骨格筋細胞及びメラニン細胞を製造者の説明書に従って培養した。ヒト単球細胞、未成熟及び成熟樹状細胞DCを記載されているように得たRomani,N.ら、1996,J.Immunol.Methods,196,137.。形質導入された蛍光細胞をFACS分析により検出した。試験するヒト初代細胞のパネルには、心臓循環器疾患、関節リウマチ、組織工学骨、皮膚及び軟骨及びワクチン接種の分野におけるインビボ及びエクスビボでの遺伝子導入を利用した異なる治療ストラテジーに対する重要な標的細胞である細胞が含まれる。図38Aから図38Dで示す結果は、異なる細胞タイプの感染の差異に基づく効率により示されるように、CARに代わる受容体を、異なるチンパンジーアデノウイルスが認識できることが示唆される。マウス免疫付与実験方法及び材料免疫付与プロトコール及び脾臓細胞/PBMC調製免疫付与:緩衝液0.1mLで希釈した、選択したアデノウイルスを用いてマウスに免疫付与した。各ベクター用量を50μlずつ2つに分割し、マウスの両側の大腿四頭筋に注射した。脾臓細胞調製:マウスを注射3週間後に屠殺し、それらの脾臓を摘出し、R1010FCS、55mM2-メルカプトエタノール、1MHEPES緩衝液、2mML-グルタミン、RPMI培地1640中の1xペニシリン-ストレプトマイシン溶液10mLに移した。スチール製の網を介して脾臓を細分化し、R102mLでこの網を洗浄した後、脾臓細胞を50mLのファルコンチューブに移し、1200rpmで10分間室温rtにて遠心分離した。上清を除去し、ACK溶解緩衝液GibcoBRLFormulation79-0422DG3mLを添加した。細胞を5分間rtでインキュベーションした。1xPBS45mlを添加し、試験管を上述のように遠心分離した。R1030mLで洗浄した後、細胞をR105mL中で再懸濁し、70mナイロン細胞濾過器Falcon2350を介して濾過した。細胞10μLをTurk溶液Merck040417345990μLで希釈し、計数した。最終的に、細胞をR10中で、107個細胞/mLに希釈した。末梢血単核球PBMC調製:マウス血液試料150μLを2mLのエッペンドルフチューブへ50μLPBS/2EDTAとともに移した。1mLACK緩衝液を各チューブへ添加した。RTで5分間穏やかに混合し、インキュベーションした。試料を微量遠心器において1500rpmで5分間遠心分離した。上清を除去し、同じ免疫付与コホート由来の白血球ペレットを合わせた。ACK緩衝液インキュベーションを繰り返した後、PBMCのペレットを、R10培地1mLに再懸濁した。IFN-γELISPOTアッセイMilliporeMAIP45プレートを、PBSで2.5μg/mLに希釈した、100μl/ウェルの精製ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体Pharmingen、cat.551216でコーティングし、4°Cで一晩o/nインキュベーションした。プレートを滅菌済みPBSで2回洗浄し、CO2インキュベーターの中でR10200μl/ウェルとともに2時間インキュベーションすることにより、非特異的結合部位をブロックした。HIVgagを発現するAdベクターによる免疫付与実験において、9マーのペプチドAMQMLKETI、Balb/CマウスにおいてマッピングされるCD8HIVGAGエピトープ配列番号47をR10中で2μg/mLに希釈し、50μl/ウェルの量でウェルに添加した。HCV-NS発現ベクターを用いて行った免疫付与実験において、NS3ヘリカーゼドメインをカバーするペプチドのプールならびにヘリカーゼドメインに含まれるマッピングされたCD8エピトープを呈示する9マーのペプチドを使用した。ヒトCEA抗原を発現するChAdによる免疫化実験を、全アミノ酸配列をカバーする、重複する15マーペプチドのプールにより評価した。対照としてDMSO及びコンカナバリンAを使用した。細胞を各ウェルへ5x105及び2.5x105の量で添加した。CO2インキュベーターにおいて一晩インキュベーションした後、プレートを0.05Tween20/PBSで洗浄し、アッセイ緩衝液5FBS、0.005Tween20、PBSで1/250に希釈したビオチン化ラット抗マウスIFN-γモノクローナル抗体PharMingen、Cat.55441050μl/ウェルを添加した。プレートを4°Cで一晩インキュベーションし、上述のように洗浄した。ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼ複合体BD554065をアッセイ緩衝液で1/2500に希釈し、50μL/ウェルの量で室温にて2時間添加した。洗浄後、BCIP/NBT1ステップ溶液PiercE3404250μL/ウェルを添加してプレートを発色させた。ウェルを脱イオン水で洗浄することにより反応を停止させた。スポットをELISPOTリーダーにより自動計数した。マウスIFN-γ細胞内染色ICS脾臓細胞をR101mL中2x106個細胞に希釈し、2μg/mLの濃度の上述と同じ抗原で刺激した。対照として、DMSO及びブドウ球菌エンテロトキシンBSEBを使用した。CO2インキュベーター中で一晩インキュベーションした後、細胞をFACS緩衝液1FCS、0.01NaN3、PBSで洗浄し、精製した抗マウスCD16/CD32Fcブロッククローン2.4G2、Pharmingen、cat.553142を1/25に希釈し、100μL/試料の量で添加し、4°Cで15分間インキュベーションした。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液で1:50に希釈したAPC標識抗マウスCD3eクローン145-2C11、Pharmingen553066、PE標識抗マウスCD4クローンL3T4、BDPharmingen、cat.553142及びPerCP標識抗マウスCD8aクローン53-6.7、Pharmingen、cat.553036を100μL/試料の量で添加した。細胞をrtで30分間インキュベーションし、洗浄し、固定し、浸透させBectonDickinson、FACSPerm2、PermWash100μL/試料中で1:50に希釈したFITC標識抗マウスIFN-γPharmingen、cat.554411とともにRTにて30分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を1ホルムアルデヒド/PBS500μLに再懸濁し、CellQuestソフトウェアBectonDickinsonを用いて細胞内サイトカイン染色ICSをFACS-Caliburフローサイトメーターで分析した。ChAdベクターはマウスにおいて強いCMI反応を誘発する本明細書に開示されるChAdベクターが細胞性免疫反応CMIを誘発する能力を、HIVgag導入遺伝子を発現するベクターを使用してマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、5匹のBalb/Cマウスの群に、様々なベクターを、マウス1匹あたり105から1010vpの、10倍ずつ増加する用量で注射した。注射から3週間後に、脾臓細胞中のgag特異的CD8T細胞を定量することにより、免疫反応の強さを調べた。Balb/CマウスにおいてマッピングされるgagCD8T細胞エピトープを再現するペプチドによるインビトロ刺激後に、ELISPOTアッセイによって又はIFN-γ細胞内染色及びFACS分析によって、IFN-γ分泌CD8T細胞の数を調べた。表3で報告する5匹の免疫付与動物から得られた結果は、9マーのCD8gagエピトープ又はgagペプチドプールとのインキュベーション後の、脾臓細胞100万個あたりのスポット形成細胞数として示す。gagペプチドプールは、全gag配列を包含する10-aaまで重複する20-aaペプチドからなる。ポジティブの値を太字で示す。表3で与えるデータから、本明細書に開示され主張されるChAdベクターの投与により、hAd5によって誘発される反応に匹敵する強い細胞性免疫反応が誘発されることが示される。ポジティブの免疫付与結果免疫付与ブレイクポイントを生じる最低のベクター用量で観察することによって、発明者らは、106ppベクター用量でのブレイクポイントを有するもっとも有力なサブグループCのChAd3gagである、様々なベクターの効力を評価した。免疫付与ブレイクポイントによる評価を図33に示す。ChAd3ベクター及びCV33GAGベクターはGAG特異的CD8T細胞を特徴とするCMI反応を誘発する。HIVgag導入遺伝子を含むChAdベクターに反応して誘発されるCMI反応の特徴を調べるために、様々な用量のベクターで免疫付与した5匹のマウスのコホートからプールされた脾臓細胞を細胞内IFN-γ染色により分析した。表3及び表4に示されるデータは個別の実験において回収された。脾臓細胞をR101mLで2x106個細胞に希釈し、2μg/mLの濃度で上述と同じ抗原で刺激した。対照として、DMSO及びSEBブドウ球菌エンテロトキシンBを使用した。CO2インキュベーターで一晩インキュベーションした後、細胞をFACS緩衝液1FCS、0.01NaN3、PBSで洗浄し、精製抗マウスCD16/CD32Fcブロッククローン2.4G2、Pharmingen、cat.553142を1/25に希釈し、100μL/試料の量で添加し、4°Cで15分間インキュベーションした。細胞をFACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中で1:50希釈した、APC標識抗マウスCD3eクローン145-2C11、Pharmingen、cat.553066、PE標識抗マウスCD4クローンL3T4、BDPharmingen、cat.553142及びPerCP標識抗マウスCD8aクローン53-6.7、Pharmingen、cat.553036を100μL/試料の量で添加した。細胞を室温で30分間インキュベーションし、洗浄し、固定し、浸透させBectonDickson、FACSPerm2、PermWash100μl/試料で1:50に希釈したFITC標識抗マウスIFN-γPharmingen、cat.554411とともにRTで30分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を1ホルムアルデヒド/PBS500μLに再懸濁し、CellQuestソフトウェアBectonDickinsonを用いてFACS-Caliburフローサイトメーターで分析した。表4は、gag特異的CD8T細胞又はCD4T細胞のいずれかであるgag特異的CD3T細胞の割合を要約するデータを与える。ポジティブの結果を太字で示す。本明細書で与えるデータから、様々な血清型サブグループつまりサブグループC、D及びEへと分類されるウイルス由来のChAdベクターにより誘発される免疫反応の細胞特性が同様であり、gag特異的反応は全て、CD8T細胞を主に特徴とすることが示される。さらに、多量のベクターでgag特異的CD4反応が全ての免疫付与実験で明らかになることを留意すること。ICSアッセイにより、ChAd3ベクターが106個のベクター用量で抗gagCD8反応を刺激できることが確認された。ChAdベクターは、HCVNS特異的T細胞反応を誘発する。CV32-NSmutベクター及びCV33-NSmutベクターの効力をMRKAd6NSmutの効力に対して、C57/Black6において評価した。107から109vp/マウスの、10倍ずつ増加する量のベクターを動物に注射した。単回注射の3週間後に、NS3タンパク質のヘリカーゼドメインにおいてマッピングされるCD8T細胞エピトープを再現する9マーペプチドでT細胞を刺激して、IFN-γELISPOT及びIFN-γ細胞内染色により、CMIを分析した。表5で与えるデータは、NS39マーペプチド非存在下偽又は存在下におけるインキュベーション後の、100万個の脾臓細胞あたりのスポット形成細胞数を要約する。HCV-NSを発現するCV32ベクター及びCV33ベクターの両者は強いT細胞反応を刺激することが本データから示される。CV32ベクターに対する最初の陽性結果が109vp/用量を注射することにより得られたという観察に基づき、CV32DE1E3NSmutベクターの免疫付与効力は、ヒトサブグループCのAd6DE1E3NSmutベクターよりも、約1/100と、低いと思われる。MRKAd6NSmutを使用する並行した実験から、107vp/動物の用量が細胞性免疫性を刺激するのに十分であることが示された。それゆえ本結果から、gag発現ベクターによる実験表3参照においても観察されたヒトサブグループCベクターhAd5及びhAd6などに対して、CV32由来のベクターの免疫付与効力が低いことが確認される。抗Ad5既存免疫はChAd3gagにより誘発される抗GAGCMIを抑制しない。高い血清普及率のseroprevalentAd5に対する既存免疫性のChAd3免疫付与への影響を調べるために、1コホートにつきBalbCマウス5匹の4コホートに対して、大腿四頭筋にAd5野生型1回1010vpを第0週及び第2週の2回注射してプレ免疫付与した。対照として1コホート5匹の2コホートのマウスに緩衝液のみを同じ時点で注射した。次に、Ad5でプレ免疫付与したマウスのコホートに対して、Ad5gagベクター又はChAd3gagベクターのいずれか106vp又は107vp/マウスで免疫付与した。対照未処理のマウスのコホートを、Ad5gagベクター又はChAd3gagベクター106vp/マウスで免疫付与した。抗Ad5及びChAd3の中和免疫性を、Ad5ベクター及びChAd3SEAPベクターを使用して上述の中和アッセイにより第4週に評価した。BalbCマウスにおいてマッピングされるgagエピトープを含有するgag9マーペプチドで刺激した、精製脾臓細胞においてELISPOT分析により抗gag免疫性を評価した。図36で報告する結果から、抗Ad5免疫性がChAd3gagにより誘発される抗gagCMIを抑制しないのに対し、予測されるように、抗Ad5免疫性がAd5gag免疫付与を完全に遮断することが示された。ChAd3hCEA免疫化はヒトCEAを発現するトランスジェニックマウスにおいて強いCEA特異的免疫反応を誘発する。本明細書で開示し主張するChAdベクターが自己抗原に対して免疫反応を誘発し、それゆえにその寛容性を打破する能力も、ヒトCEAを発現するトランスジェニックマウスにおいて評価したClarke,Pら、CancerRes.1988587:1469-77.。8匹のマウスのコホートの大腿四頭筋にChAd3hCEA又はAd5hCEA1010vpを既に述べたように注射した。aa497から端aa703までのヒトCEAアミノ酸配列を包含する15マーペプチドのプールで刺激したPBMCに対して、CEAに対する免疫反応を75日目まで毎週モニタリングした。CEAペプチドプールインキュベーションに反応した、CD4-CD8T細胞分泌性インターフェロン-γを調べるICSによって、抗CEA免疫性を評価した。図37で報告する結果から、ChAd3hCEAベクター免疫付与が、同じ導入遺伝子を発現するAd5よりも、ヒトCEAに対するCD8T細胞反応をより持続するよう刺激することが示される。霊長類免疫付与実験方法及び材料免疫付与プロトコール本明細書に開示し主張するChAdベクターがアカゲザル本明細書でサルと呼ばれる。においてCMIを誘発する能力も評価した。サルを麻酔しケタミン/キシラジン、本ワクチンをツベルクリンシリンジBecton-Dickinsonを使用して両側の三角筋へ0.5mlずつ筋肉内に送達した。全ての場合において、このサルの体重は、3から10kgであり、各ワクチンの用量は緩衝液1ml中で投与した。免疫付与手法の間、何回か回収した血液試料から、血清及び末梢血単核球PBMCを調製した。動物の取り扱い及び処置は全て、theGuideforCareandUseofLaboratoryanimals,InstituteofLaboratoryanimalResources,NationalResearchCouncilに記載の原則に従い、theInstitutionalanimalCareandUseCommitteeにより承認される基準に従った。ELISPOTアッセイアカゲザルについてのIFN-γELISPOTアッセイを、いくつかの改変を行い、上述のプロトコールAllenら、2001J.Virol.752:738-749に従って実行した。gag特異的刺激について、10-aaの重複がある全HIV-1gag配列を包含する20-aaのペプチドからペプチドプールを調製したSynpepCorp.,Dublin,CA。HCVNS特異的刺激について、10-aaの重複があるNS3からNS5bの全HCV-NS配列を包含する15-aaペプチドから、6個のペプチドプールを調製した。HER2neu及びCEA特異的刺激を、10-aaの重複がある全タンパク質の配列を包含する15-aaのペプチドで実行した。2から4x105個の末梢血単核球PBMC50μlを各ウェルへ添加した。小さなサイズを80fLでカットオフして、細胞をBeckmanCoulterZ2粒子アナライザーを使用して計数した。培地50μl又はペプチドあたり8μg/mlのgagペプチドプールのいずれかをこのPBMCへ添加した。この試料を37°C、5CO2で20時間から24時間インキュベーションした。このように、スポットを発色させ、プレートを特注の画像化装置及びImageProプラットフォームSilverSpring,MDに基づいた自動計数サブルーチンを使用して処理した。計数を106個の細胞インプットに対して正規化した。細胞内サイトカイン染色ICS2x106PBMC/mL完全RPMI培地1mL17x100mmの丸底ポリプロピレンチューブSarstedt,Newton,NCに入れた。に、抗hCD28クローンL293、Becton-Dickinson及び抗hCD49dクローンL25、Becton-Dickinsonモノクローナル抗体を、終濃度1μg/mLとなるように添加した。gag特異的刺激については、ペプチドプール10μLペプチド1個につき0.4mg/mlを添加した。同様の条件をHCVNS特異的刺激について使用した。このチューブを37°Cで1時間インキュベーションした後、5mg/mLのブレフェルジンASigma20μlLを添加した。細胞を37°C、5CO2、90湿度で16時間インキュベーションした。冷PBS/2FBS4mLを各チューブへ添加し、細胞を1200rpmで10分間遠心分離してペレットを得た。細胞をPBS/2FBS中に再懸濁し、いくつかの蛍光標識mAbを使用して表面マーカーに対して染色した30分間、4°Cそのモノクローナル抗体は、チューブ1本あたり20μlの、抗hCD3-APC、クローンFN-18Biosource;20μl抗hCD8-PerCP、クローンSK1BectonDickinson,FranklinLakes,NJ;及び20μL抗hCD4-PE、クローンSK3BectonDickinsonであった。。この段階から、試料を暗所で取り扱った。細胞を洗浄し、750μL1xFACSPerm緩衝液BectonDickinson中で室温にて10分間インキュベーションした。この細胞をペレットにし、PBS/2FBS中に再懸濁し、FITC-抗hIFN-γ、クローンMD-1Biosource0.1μgを添加した。30分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、PBS中に再懸濁した。BectonDickinsonFACSCalibur機器の4色チャネル全部を使用して試料を分析した。本データを分析するため、下部側及び前方に散乱するリンパ球集団を最初にゲーティングした。サイトカイン陽性反応についての共通の蛍光のカットオフをCD4及びCD8の両集団について使用し、試料の偽反応及びgagペプチド反応チューブの両者に対して使用した。ChAdΔE1-gagベクターを使用する同種初回刺激-追加免疫法はサルにおけるgag特異的T細胞を誘発する。1コホート3匹の動物のコホートに以下のコンストラクトのいずれかを第0週及び第4週で筋肉内注射により与えた。すなわちCV32ΔE1-gag1010vp又はCV33ΔE1-gag1010vp又はMRKAd5ΔE1gag1010vp及び108vpであった。4週間隔で回収したPBMCを、ELISPOTアッセイにより分析した。Gagペプチドプール非存在下偽又は存在下でのインキュベーション後の、100万個のPBMCあたりのスポット形成細胞数を示す表6で与える結果から、非ヒト霊長類においてgag特異的T細胞の有意なレベルをCV32ΔE1-gag及びCV33ΔE1gagの両者が誘導できることが確認される。興味深いことに、単回投与第4週後、CV32ΔE1-gag反応は、108vp/投与のMRKAd5ΔE1-gagに匹敵し、1010vp/投与のMRKAd5-gagのそれより低かったことに留意すること。1010vp/投与のCV33ΔE1-gagは、1010vp/投与のMRKAd5-gagのそれに匹敵する反応を誘導する。この結果は2回目の投与後の第8週で確認された。ChAdベクターは、異種初回刺激-追加免疫法においてHCVNS特異的T細胞反応を誘発する。個別の実験において、2匹及び3匹のサルのグループに第0週、第4週で動物1匹につき108vp又は1010vpでMRKAd6NSoptmutベクターを用いて免疫付与を行った。この動物を第24週で、同じ用量の同じウイルスで追加免疫し、1010個vp/動物でCV33-NSmutにより第104週に再度追加免疫を行った。この結果は、HCVNSペプチドプールの非存在下偽又は存在下でのインキュベーション後の100万個のPBMCあたりのスポット形成細胞数を要約する表7及び表8に示す。IFN-γELISPOTにより評価されるように、T細胞免疫性は1010vpを注射した動物において最初の投与後第4週で表8、及び108vpで注射した動物において第8週2回目の投与後で表7ピークの反応を示した。この反応は第24週での注射により促進されなかった同種追加免疫のに対し、強い促進効果がCV33-NSmutによる注射の後に観察された異種追加免疫。チンパンジーAdベクターによる異種追加免疫の効率を第二の実験において評価した。3匹のサルのコホートに対して、第0週及び第4週に、MRKAd5gag1010vp/動物、MRKAd6NSmut1010vp/動物又は両ベクター各ベクターにつき1010vp/動物の組み合わせで免疫付与し、その後第24週で同じ抗原で追加免疫した同種追加免疫。同種追加免疫を同じ抗原で実行し、異種追加免疫をCV33gag、CV32NSmut又は前記2つのベクターの組み合わせで実行した。表9で与える結果は、HCVNSペプチドプール非存在下偽又は存在下でのインキュベーション後、100万個のPBMCあたりのスポット形成細胞数を要約する。同じコホートを、第51週に、CV33gag1010vp/動物、CV32NSmut1010vp/動物及び前記2つのベクターの組み合わせ各ベクターにつき1010vp/動物で再度追加免疫した。表9で与える結果はさらに、この反応がワクチンの初回用量の注射後第4週で観察されるピークを下回るため、同種追加免疫が効果的ではなかったことを示す。異種チンパンジーベクターによる免疫付与後第54週で、IFN-γELISPOTにより強い免疫促進効果が測定された。TAAを含むChAdベクターによるワクチン接種は寛容性を打破し、サルにおけるTAA特異的T細胞反応を誘発する。チンパンジーアデノウイルスベクターが自己抗原に対する寛容性を打破し、ヒトアデノウイルスベクターにより初回刺激された免疫反応を促進するためのチンパンジーベクターの有用性を証明するのに十分に免疫原性があるか否かを調べるために設定した実験を、1コホート4匹のサルのコホートにおいて実施した。腫瘍関連抗原CEAを含むAd5DE1RhCEA1011vpの3回の注射を第0週、第2週及び第4週に行って動物に免疫付与した後、第16週、第18週及び第20週に、CV33DE1RhCEA1011vpによるワクチン接種を行った。アカゲザルCEAペプチドを用いて、IFNγELISPOTにより、T細胞反応を測定した。アカゲザルCEAC及びDペプチドプール非存在下DMSO又は存在下のインキュベーション後の100万個のPBMCあたりのスポット形成細胞数を与える図34に報告される結果により、2つの異なるAd血清型によるワクチン接種に基づく免疫付与プロトコールが、非ヒト霊長類において、CEAに対してT細胞反応を持続させるに到ることが確認される。本発明はその特定の好ましい実施形態に関して詳細に記載されているが、改変及びバリエーションが、記載され、主張される本発明の精神及び範囲内であることは理解されよう。"