TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む、生存可能なグラム陰性細菌。リガンドがリピドAを含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。リガンドが6アシル脂質多糖を含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。リガンドが、哺乳動物における共刺激免疫応答分子の産生を活性化することができる、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。リガンドが、炎症のメディエーターを合成するようにマクロファージを誘導することができる、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。大腸菌である、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。K12、Br、W3110、MG1655、Br、BL21、O157h7、042、1011、1180、1357、1412、1520、182770、236275、3431、53638、83972、92978、98NK2、ABU83972、B、B088、B171、B185、B354、B646、B7A、C、c7122、CFT073、DH1、DH5α、E110019、E128010、E7468、E85171、EAEC042、EPECa11、EPECa12、EPECa14、ETEC、H10407、F11、F18、FVEC1302、FVEC1412、GEMEC1、HB101、HT115、KO11、LF82、LT41、LT62、LT68、MS1071、MS1197、MS1241、MS1457、MS792、MS851、NCTC86、Nissle1917、NTH19、NTH40、NU14、O103H2、O103HNM、O103K、O104H12、O108H25、O109H9、O111H、O111H19、O111H2、O111H21、O111NM、O115H、O115HMN、O115K、O119H6、O119UT、O124H40、O127aH6、O127H6、O128H2、O131H25、O136H、O139H28、O13H11、O142H6、O145H、O153H21、O153H7、O154H9、O15712、O157H、O157H12、O157H43、O157H45、O157H7EDL933、O157NM、O15NM、O177H11、O17K52H18、O180H、O1K1APEC、O26、O26H、O26H11、O26H11K60、O26NM、O41H、O45K1、O51H、O55H51、O55H6、O55H7、O5H、O6、O63H6、O63HNM、O6K15H31、O7K1、O8、O81、O84H、O86aH34、O86aH40、O90H8、O91H21、O9H4、O9H51、ONTH、ONTH25、OP50、OroughH12、OroughH19、OroughH34、OroughH37、OroughH9、OUTH12、OUTH45、OUTH6、OUTH7、OUTHNM、OUTNM、RN5871、RS218、55989EAEC、BBL21、BBL21DE3、SE11、SMS35SECEC、UTI89UPEC、TA004、TA155、TX1999、およびVir68からなる群より選択される大腸菌株である、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。シュードモナス属の株である、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。機能的なアラビノース5リン酸イソメラーゼKdsDおよびGutQの活性の低下をさらに含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。輸送体におけるサプレッサー変異をさらに含み、それによってリピドIVAを輸送する輸送体の能力が増大する、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。42°Cでの増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異をさらに含む、請求項10記載の生存可能なグラム陰性細菌。輸送体がMsbAである、請求項10記載の生存可能なグラム陰性細菌。輸送体が対立遺伝子MsbAP50S、MsbAP18S、MsbAT283A、MsbAR309S、またはMsbAD498Vの1つである、請求項12記載の生存可能なグラム陰性細菌。膜タンパク質YhjDに影響を及ぼすサプレッサー変異をさらに含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。膜タンパク質YhjDがYhjDR134Cである、請求項14記載の生存可能なグラム陰性細菌。42°Cでの増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異をさらに含む、請求項14記載の生存可能なグラム陰性細菌。KPM22、KPM22L1、KPM22L11、KPM22L13、KPM22L14、KPM22L15、KPM22L18、およびKPM22L20からなる群より選択される大腸菌K12菌株である、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子が実質的に欠失している、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317、KPM318、およびKPM320からなる群より選択される大腸菌K12菌株である、請求項18記載の生存可能なグラム陰性細菌。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌であって、少なくとも1つの改変を含む大腸菌K12菌株である、該生存可能なグラム陰性細菌。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌であって、少なくとも1つの改変を含む大腸菌K12菌株である、該生存可能なグラム陰性細菌。1つまたは複数の酵素が、LpxL、LpxM、PagP、LpxP、およびEptAからなる群より選択され、かつ実質的に不活性である、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptAの1つまたは複数の遺伝子の部分的な欠失または完全な欠失の部位に、部位特異的リコンビナーゼのスカー配列を含む、請求項22記載の生存可能なグラム陰性細菌。抗生物質に対する耐性を与える手段を含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。37°C超で約35分未満の対数期倍加時間を示す、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。37°C超で約40分未満の対数期倍加時間を示す、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。37°C超で約45分未満の対数期倍加時間を示す、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。DNA制限酵素またはDNAメチル化酵素をコードする遺伝子が変異または欠失している、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。recAまたはendAをコードする遺伝子が変異または欠失している、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。Fプラスミド、Fプラスミド、またはF線毛の産生をコードする遺伝子をさらに含む、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。42°Cで指数関数的に増殖することができる、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。エレクトロコンピテントである、請求項33記載の生存可能なグラム陰性細菌。約01M~09Mの塩濃度で生存し続ける、請求項1記載の生存可能なグラム陰性細菌。TLR4MD2のアゴニストであるリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌の外膜。リピドIVAをアシル化することができるOアシルトランスフェラーゼを欠く、生存可能なグラム陰性細菌。大腸菌種である、請求項37記載の生存可能なグラム陰性細菌。シュードモナス属の種である、請求項37記載の生存可能なグラム陰性細菌。Oアシルトランスフェラーゼが、LpxL、LpxM、LpxP、PagPからなる群より選択される、請求項37記載の生存可能なグラム陰性細菌。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、40°C超の温度で指数関数的に増殖することができるグラム陰性細菌を、選択する方法であって、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ約30°C~40°Cでの増殖を可能にするサプレッサー変異を有する菌株を、増殖させる段階該菌株を適切な栄養培地にプレーティングする段階および単一の細菌コロニーが現れるまで、プレーティングした菌株を42°Cでインキュベートする段階を含む、前記方法。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜とlpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される、オープンリーディングフレームの欠失を有する遺伝子を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼ酵素の標的となる部位に隣接している、該DNAカセットとを含む、生存可能なグラム陰性ドナー細菌。抗生物質がカナマイシン、ペニシリン、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、またはアンピシリンである、請求項1記載の生存可能なグラム陰性ドナー細菌。lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子を実質的に欠く細菌を構築する方法であって、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜とオープンリーディングフレームの欠失を有する改変された標的遺伝子である改変遺伝子を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼの適切な標的部位にさらに隣接している、該DNAカセットとを含む生存可能なグラム陰性細菌を得る段階細菌をP1vir形質導入に供する段階ならびに相同組換えによって、標的遺伝子を改変遺伝子で置き換える段階を含む、前記方法。改変遺伝子が、改変された抗生物質耐性遺伝子である、請求項44記載の方法。抗生物質耐性遺伝子に隣接する配列に対して作用できる部位特異的リコンビナーゼの一過性導入によって抗生物質耐性遺伝子を欠失させ、それにより耐性遺伝子を欠失させかつ部位特異的リコンビナーゼに特有のスカーを残す後続の段階をさらに含む、請求項45記載の方法。グラム陰性細菌が、KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317、KPM318、およびKPM320からなる群より選択される大腸菌K12菌株である、請求項44記載の方法。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルを作製する方法であって、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌を得る段階DNAベクターを増幅するように機能する該細菌にDNAベクターを導入する段階および増幅されたDNAを有する該細菌から、標準的なDNA単離プロトコルによってDNAサンプルを収集する段階を含む、前記方法。TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法であって、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌を得る段階機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を該細菌に導入する段階DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌を増殖させる段階DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階ならびに該細菌を収集して、関心対象のタンパク質を放出するように該細菌を処理する段階を含む、前記方法。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法であって、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌であって、遺伝子lolA、lolB、またはlppの少なくとも1つが変異または欠失しており、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、該細菌を得る段階機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子と選択マーカー遺伝子との両方を含むDNAベクター発現構築物を該細菌に導入する段階DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌を培地中で増殖させる段階DNAベクター発現構築物で形質転換された該細菌が関心対象のタンパク質を発現することを可能にするまたは誘導する段階ならびに培地中に関心対象のタンパク質を残すように、培地から該細菌を除去する段階を含む、前記方法。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない細菌のライブラリーであって、一連のタンパク質バリアントを発現し、哺乳動物細胞に基づくアッセイにおいて該タンパク質バリアントを活性についてスクリーニングするのに有用である、細菌ライブラリー。ライブラリーのメンバーがファージディスプレイにより作製される、請求項51記載のライブラリー。ライブラリーのメンバーが、ライブラリーのプロトタイプメンバーを発現するプラスミドベクターの変異誘発により作製される、請求項51記載のライブラリー。TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない外膜を有し、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである、生存可能なグラム陰性細菌を含むキット。好ましい態様の説明6つのアシル鎖が付着した2つのグルコサミン残基を含んだリポ多糖の成分であるリピドAは、Toll様受容体4のアゴニストとして機能する。TLR4MD2は、いくつかの免疫系細胞、例えばマクロファージ、単球、および樹状細胞に存在する。LPSリピドAを介したTLR4MD2の活性化は、共刺激免疫応答成分および分子の活性化につながり、最終的には内毒素性をもたらしうる。例えば、LPSがTLR4MD2に結合されるようになると、サイトカイン産生が活性化され、補体が活性化され、凝固が活性化されうる。サイトカインにはインターロイキンIL1、IL6、IL8、腫瘍壊死因子、および血小板活性化因子が含まれうる。そのようなサイトカインは炎症および敗血性ショックのメディエーターの産生を刺激しうる。補体C3aおよびC5aは、血管拡張に至るヒスタミン放出を引き起こし、およびまたは好中球走化性に影響を与えうる。血液凝固第XII因子は、血栓症、プラスミン活性化などをもたらすいくつかの応答を活性化しうる。グラム陰性細菌は、通常、その外膜の中に6アシルLPSの大部分を含む。本発明は、Toll様受容体4MD2のアゴニストとして作用する成分を実質的に欠く外膜を含む生存可能なグラム陰性細菌を特徴とする。その成分にはリピドA、6アシル脂質など、またはその組み合わせを含めることができる。通常のLPSとは対照的に、リピドIVA、または4アシルLPSはヒトTLR4MD2にあまり強固に結合せず、アゴニストとしてではなくTLR4MD2に対する穏やかなアンタゴニストとして作用する。いくつかの態様において、外膜において実質的に欠けているリガンドには、リピドIVA、またはリピドIVAの誘導体が含まれる。本明細書において用いられる場合、実質的に欠くという用語は、外膜が、ほぼゼロのアゴニストリガンドから、外膜20μgを単一のアッセイウェルに添加したときのHEKblueアッセイにおいて最大シグナルの約25を超える応答を誘導することのないアゴニストリガンドのレベルまでを有することを意味する。いくつかの態様において、本発明にしたがって使用されうるHEKBlueアッセイは、InvivoGen3950SorrentoValleyBlvdSuite100SanDiegoCA92121カタログ番号hkbhtlr4から得ることができ、このアッセイプロトコルは図92に提示されている。例えば、いくつかの態様において、Toll様受容体4のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜は、外膜がリガンドを全く持たないことを意味する。いくつかの態様において、外膜は、1ウェルあたり20μgまでの膜抽出物として試験したときのHEKblue細胞に基づくアッセイにおいて検出限界を下回るレベルで存在するTLR4MD2に対する少量のアゴニストを持ちうる。ヒト細胞株HEKblueはTLR4MD2シグナル伝達に極めて感受性であるように操作されており、このアッセイは、1ウェルあたりにLPS20pgしか存在しない場合でも非常に強いシグナルを与える。いくつかの態様において、非常に低いシグナルが1ウェルあたり外膜20μgのレベルでさえもみられる。本発明のグラム陰性細菌は大腸菌を含むが、これに限定されることはない。例えば、シュードモナス属の種のような遠縁のグラム陰性の種も、その外膜の成分としてTLR4MD2アゴニストを欠きながらも増殖するように操作することができる。いくつかの態様において、大腸菌株はK12、W3110、MG1655、Br、BL21、O157h7、042、1011、1180、1357、1412、1520、182770、236275、3431、53638、83972、92978、98NK2、ABU83972、B、B088、B171、B185、B354、B646、B7A、C、c7122、CFT073、DH1、DH5α、E110019、E128010、E7468、E85171、EAEC042、EPECa11、EPECa12、EPECa14、ETEC、H10407、F11、F18、FVEC1302、FVEC1412、GEMEC1、HB101、HT115、KO11、LF82、LT41、LT62、LT68、MS1071、MS1197、MS1241、MS1457、MS792、MS851、NCTC86、Nissle1917、NTH19、NTH40、NU14、O103H2、O103HNM、O103K、O104H12、O108H25、O109H9、0111H、O111H19、O111H2、O111H21、O111NM、O115H、O115HMN、O115K、O119H6、O119UT、O124H40、O127aH6、O127H6、O128H2、O131H25、O136H、O139H28、O13H11、O142H6、O145H、O153H21、O153H7、O154H9、O15712、O157H、O157H12、O157H43、O157H45、O157H7EDL933、O157NM、O15NM、O177H11、O17K52H18、O180H、O1K1APEC、O26、O26H、O26H11、O26H11K60、O26NM、O41H、O45K1、O51H、O55H51、O55H6、O55H7、O5H、O6、O63H6、O63HNM、O6K15H31、O7K1、O8、O81、O84H、O86aH34、O86aH40、O90H8、O91H21、O9H4、O9H51、ONTH、ONTH25、OP50、OroughH12、OroughH19、OroughH34、OroughH37、OroughH9、OUTH12、OUTH45、OUTH6、OUTH7、OUTHNM、OUTNM、RN5871、RS218、55989EAEC、BBL21、BBL21DE3、SE11、SMS35SECEC、UTI89UPEC、TA004、TA155、TX1999、またはVir68である。いくつかの態様において、本発明の生存可能なグラム陰性細菌は、機能的なDアラビノース5リン酸イソメラーゼKdsDおよびGutQの活性の低下を有する。機能的なAPIKdsDおよびGutQの活性の低下は、APIの実質的な不活性化、例えばAPIを実質的に不活性化するように機能する化学剤、APIを実質的に不活性化するように機能するドミナントネガティブタンパク質、APIに結合し、かつAPIを実質的に不活性化するように機能するその断片の抗体などの結果でありうる。いくつかの態様において、機能的なAPIKdsDおよびGutQの活性の低下は、APIをコードする遺伝子における部分的または実質的な欠失または変異の結果でありうる。細菌には大腸菌K12TCM15、BL21、BL21、W3110が含まれうる。サプレッサー変異本発明の生存可能なグラム陰性細菌は、膜中のいずれかのTLR4アゴニストを欠くにもかかわらず増殖を可能にするサプレッサー変異を含む。例えば、生存可能なグラム陰性細菌は、両方のAPI遺伝子を欠き、かつ外因性A5Pが供給されなければ生存できない、大腸菌K12TCM15に由来してもよい。生存可能なグラム陰性細菌は、両方のAPI遺伝子を欠くにもかかわらず細菌を生存可能にするサプレッサー変異を含みうる。サプレッサー変異は機能獲得型サプレッサー変異および機能喪失型サプレッサー変異を含みうる。いくつかの態様において、サプレッサー変異は、輸送体または膜タンパク質、例えば、msbAによってコードされる輸送体MsbAまたはyhjDによってコードされる膜タンパク質YhjDをコードする遺伝子における変異である。サプレッサー変異は輸送体または膜タンパク質に、リピドIVAを輸送する能力の増大をもたらすことができる。サプレッサー変異はアミノ酸置換、例えば、MsbAにおけるアミノ酸の位置番号18での、もしくは位置番号50での、もしくは位置番号283での、もしくは位置番号310での、もしくは位置番号448での変異、またはYhjDにおけるアミノ酸の位置番号134での変異を含みうる。いくつかの態様において、サプレッサー変異は輸送体の発現の上方制御をもたらし、リピドIVAを輸送する細菌の能力が増大する。サプレッサー変異は上記の例に限定されない。細菌には大腸菌K12KPM22、KPM22L1、KPM22L11が含まれうる。いくつかの態様において、細菌には大腸菌K12KPM22L13、KPM22L14、KPM22L15、KPM22L18、KPM22L20が含まれる。いくつかの態様においては、遠縁のグラム陰性細菌種において、そのネイティブのmsbA遺伝子を野生型の大腸菌msbA遺伝子それ自体で置き換えることができないとしても、大腸菌msbA遺伝子のサプレッサー対立遺伝子を用いることができる。非復帰変異性菌株野生型グラム陰性細菌では、OアシルトランスフェラーゼLpxLおよびLpxMはO結合脂質をKdo2リピドIVAに付加し、TLR4MD2のアゴニストとして機能する6アシル脂質を形成させる。Kdoの非存在下において、OアシルトランスフェラーゼLpxLおよびLpxMは、リピドIVAを基質として用いることができず、O結合脂質を付加しない。しかしながら、lpxLまたはlpxMにおける変異は、酵素の特異性を改変し、トランスフェラーゼがリピドIVAを基質として用いることを可能にし、それによって、TLR4MD2のアゴニストとして機能する6アシル脂質を作製することが可能である。あるいは、変異はlpxPまたはpagPのプロモーターまたはレギュレーターにおいて起こり、これらの通常は存在しないまたは非常に低い存在量のトランスフェラーゼの発現を活性化しうる。あるいは、変異はlpxLまたはlpxMのプロモーターまたはレギュレーターにおいて起こり、これがその過剰発現を活性化しうる。これらの状況を回避するのに役立つように、本発明の細菌は、以下の遺伝子lpxL、lpxM、pagP、およびlpxPの1つまたは複数における欠失をさらに含みうる。あるいは、いくつかの態様において、1つまたは複数の酵素が細菌において実質的に不活性化される。いくつかの態様において、リピドAホスホエタノールアミントランスフェラーゼをコードする遺伝子eptAが部分的にまたは実質的に欠失される。いくつかの態様において、細菌は大腸菌K12KPM279、KPM280、KPM288、KPM290、KPM296、KPM300、KPM303、KPM310、KPM312、KPM314、KPM316、KPM317もしくはKPM318、またはこれらの菌株のさらなる派生株である。実験用ツール本発明は同様に、記述の生存可能なグラム陰性細菌に由来する、実験用ツール、試薬、菌株などを特徴とする。例えば、いくつかの態様において、本発明の細菌は、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである。いくつかの態様において、細菌はエレクトロコンピテントである。いくつかの態様において、細菌は、抗生物質に対する耐性を与える手段を含む。いくつかの態様において、細菌は、細胞上にハイスループットスクリーニング用のタンパク質を発現するための手段を含む。いくつかの態様において、細菌は研究用およびまたは治療用およびまたは診断用の組換えタンパク質を発現するための手段を含む。細菌は、37°C超で増殖を可能にする少なくとも1つのさらなるサプレッサー変異を含むことができる。さらなるサプレッサー変異は、例えば、細菌の外膜を安定化することができ、または内膜から離れるような毒性前駆体の輸送を増強することができる。いくつかの態様において、細菌は、37°C超で、例えば約38°Cで、約39°Cで、約40°Cで、約41°Cで、約42°Cで指数関数的に増殖することができる。いくつかの態様において、細菌は、37°C超で約30分未満の対数期倍加時間を示す。あるいは、細菌は、37°C超で35分未満または40分未満または約45分未満の対数期倍加時間を示しうる。いくつかの態様において、細菌は、40°C超で約30分未満の対数期倍加時間を示す。いくつかの態様において、細菌は、42°Cで約30分未満の対数期倍加時間を示す。いくつかの態様において、細菌株は大腸菌K12KPM2966である。いくつかの態様において、さらなるサプレッサー変異は、さまざまな塩濃度で増殖する細菌の能力を改変することができる。いくつかの態様において、生存可能なグラム陰性細菌は約01M~09Mの塩濃度において生存可能である。ドナー菌株は新しいバリアント菌株を素早く構築する能力をもたらすことができる。ドナー菌株は上記の遺伝子改変の1つまたは複数、例えば、以下の遺伝子の1つにおける部分的または実質的な欠失を含むことができるlpxL、lpxM、lpxP、pagG、eptA、kdsD、gutQなど。各ドナー欠失構築物は、欠失されたDNA配列に取って代わる選択マーカー遺伝子カセットを有し、このカセットには部位特異的な欠失部位が、これらを後に用いて、対応するリコンビナーゼの菌株への一過的または一時的な導入時に、選択マーカー遺伝子カセットを欠失できるような配向および配列で隣接している。いくつかの態様において、細菌はさらに、Fプラスミドを含むか、Fプラスミドを含むか、またはF線毛の産生をコードする遺伝子を含む。いくつかの態様において、細菌は、バクテリオファージfd、バクテリオファージM13、またはfdもしくはM13に関連するバクテリオファージを増殖させることができる。いくつかの態様において、DNA制限酵素またはDNAメチル化酵素をコードする遺伝子が変異または欠失している。これによって未改変DNAまたはPCR増幅DNAの形質転換およびまたはクローニングの増強を可能にすることができる。いくつかの態様において、recAまたはendAをコードする遺伝子が変異している、部分的に欠失している、または実質的に欠失している。recAのそのような不活性化または欠失は、プラスミドによる形質転換後に単量体プラスミドDNAを主に産生する宿主をもたらす。endAの不活性化はそのような菌株に導入されたプラスミドの超らせんDNAの収量の増加をもたらす。本発明は同様に、TLR4MD2受容体のアゴニストであるリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌の外膜を特徴とする。本発明の細菌はドナー菌株として用いることができる。いくつかの態様において、ドナー菌株は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むことができる。いくつかの態様において、ドナー菌株は、オープンリーディングフレームの欠失を有する遺伝子を含むDNAカセットを含む。例えば、遺伝子は、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択することができる。DNAカセットは、抗生物質に対する耐性を与える手段およびまたはリコンビナーゼ成分をさらに含むことができる。本発明の細菌は、kdsD、gutQ、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子の1つまたは複数において特に、操作された遺伝子の欠失の部位にスカーDNA配列を保持することができる。スカーは部位特異的な組換えによる選択カセットの欠失によって作製される。リコンビナーゼは、FLP、Cre、IntXis、Hin、Ginなどからなる群より選択されるものでありうる。作製されたスカーは同一のリコンビナーゼによるその後の組換えに対して活性であってもよく、あるいは、スカーは同一のリコンビナーゼによるさらなる組換え事象に対して不活性であってもよい。選択カセットDNAの欠失により得られる菌株は、類似の選択カセットを用いるさらなる遺伝子欠失のその後の移入のためのレシピエントとして再び使用することができるものであり、したがって、単一の菌株において複数の遺伝子欠失の構築が容易となる。方法本発明は同様に、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠くグラム陰性細菌であって、40°C超の温度で指数関数的に増殖することができる該細菌を選択する方法を特徴とする。いくつかの態様において、この方法は、TLR4MD2受容体のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ約30°C~40°Cでの増殖を可能にするサプレッサー変異を有する細菌を、増殖させる段階を含む。この細菌を次に、適切な栄養培地にプレーティングし、42°Cでインキュベートすることができる。そのような条件の下で現れる単一のコロニーは、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠き、かつ42°Cで指数関数的に増殖することができる細菌に相当する。本発明は同様に、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびeptAからなる群より選択される遺伝子を実質的に欠く細菌を構築する方法を特徴とする。この方法は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜およびオープンリーディングフレームの欠失を有する改変された標的遺伝子である改変遺伝子を含むDNAカセットであって、抗生物質に対する耐性を与える手段をさらに含み、かつ部位特異的リコンビナーゼの適切な標的部位にさらに隣接している該DNAカセットを含む生存可能なグラム陰性細菌を得る段階を含む。この方法は、細菌をP1vir形質導入に供する段階、および標的遺伝子を、改変された耐性カセット遺伝子と相同組換えによって置き換える段階をさらに含む。その後に、部位特異的リコンビナーゼ酵素またはこの酵素をコードするDNAを細胞に導入すると、この酵素は、カセットに隣接している対応する認識部位に作用して組換えを触媒し、染色体にスカー配列のみを残す。あるいは、上記の遺伝子欠失カセットは、redgam相同組換え法を介し、PCR増幅された線状型のカセットを用いて、直接的に菌株の染色体に導入してもよい。上記のように、次いで耐性遺伝子をその後、部位特異的な組換え段階を用いて欠失させ、再度スカー配列を残す。P1vir形質導入、線形DNAを用いたredgam組換え、および部位特異的な組換えはすべて、当業者に周知の技術である。細菌、例えば大腸菌のようなグラム陰性細菌は、DNAを増幅させるためのまたは関心対象のタンパク質を発現させるための発現システムとしてよく用いられる。場合によっては、細菌から得られ収集されるDNAまたはタンパク質には、細菌の成分、例えばTLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドが混入していることがある。混入は、哺乳動物宿主細胞株の一過性のトランスフェクション、細胞に基づくスクリーニングアッセイにおいてレポーター株として働く培養哺乳動物細胞の処理などの、さらなる実験および手順に悪影響を及ぼしうる。本発明は同様に、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないDNAサンプルを作製する方法を特徴とする。この方法は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌を得る段階を含みうる。細菌は一般に、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである。DNAベクターは当業者に周知の標準的な方法を介して細菌に導入することができる。細菌はDNAベクターを増幅するように機能し、細菌を適切な培地中で増殖させることができる。増幅されたDNAサンプルは、当業者に周知の標準的なDNA単離プロトコルによって細菌から収集することができる。DNAの増幅に用いられる細菌は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠くので、DNAサンプルもリガンドを実質的に欠く。これらの細菌から単離されたDNAは、プラスミドによりコードされるタンパク質の発現のための哺乳動物細胞の一過性のトランスフェクションに特に有用である。プラスミド宿主として利用される通常の大腸菌に由来するLPSは、一過性のトランスフェクション手順からのタンパク質の産生性および収量に悪影響を与えうる。本発明は同様に、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まないタンパク質サンプルを作製する方法を特徴とする。この方法は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を含むグラム陰性細菌を得る段階、および当業者に周知の標準的なプロトコルによって細菌にDNAベクター発現構築物を導入する段階を含むことができる。DNAベクター発現構築物は、機能的プロモーターから発現される関心対象のタンパク質をコードする遺伝子も選択マーカー遺伝子もともに含む。いくつかの態様において、細菌は、遺伝子lolA、lolB、またはlppの少なくとも1つにおける変異またはその欠失を含む。DNAベクター発現構築物で形質転換された細菌を次いで、関心対象のタンパク質を細菌に発現させるように、増殖させることができる。いくつかの態様において、細菌は関心対象のタンパク質を発現するように誘導される。関心対象のタンパク質を次いで、標準的な方法により細菌から収集することができる。いくつかの態様において、細菌は培地から除去されて、関心対象のタンパク質を培地中に残す。タンパク質発現に用いられる細菌は、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを欠くので、タンパク質サンプルもリガンドを実質的に欠く。ライブラリーはさまざまなタンパク質バリアントをスクリーニングするのに極めて有用なツールである。本発明は同様に、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に含まない細菌のライブラリーを特徴とする。細菌ライブラリーは一連のタンパク質バリアントを発現することができる。いくつかの態様において、細菌ライブラリーは、哺乳動物細胞に基づくアッセイにおいてタンパク質バリアントを活性についてスクリーニングするために用いられるが、しかし、本発明は哺乳動物細胞に基づくアッセイに限定されない。ライブラリーのメンバーは、ファージディスプレイによって、ライブラリーのプロトタイプメンバーを発現するプラスミドベクターの変異誘発によって、または他の標準的な方法によって、作製することができる。さまざまな試薬、菌株などをキットの形態で提供することができる。例えば、キットは、TLR4MD2のアゴニストとして作用するリガンドを実質的に欠く外膜を有する生存可能なグラム陰性細菌であって、細胞外DNAを取り込むようにコンピテントである該細菌を含むことができる。以下に提供される例は、本発明をさらに明らかにするための例にすぎず、本発明の範囲を決して限定するものではない。実施例1増殖速度の決定以下の例では本発明によるさまざまな菌株の増殖速度の測定について記述する。本発明は以下の例に限定されない。菌株の増殖速度は指数関数的に増殖している培養物の600nmでの細胞密度をモニタリングすることによって決定することができる。新鮮な終夜培養物を、予め加温された培地中で50分の1に希釈し、対数増殖中期まで細菌の増殖を継続させることができる。培養物を次いで、予め加温された培地中でOD600約0005まで再度希釈し、世代時間の決定のために細胞を指数関数的に増殖させ続けることができる。培地はルリアベルターニ培地を含むことができ、10gLNaClをさらに含むことができる。図1に示されるように、KPM22L1、KPM22L11、KPM22L13、KPM22L18、およびKPM22L20を37°Cで増殖させた。KPM22L1、KPM22L11、およびKPM22L18はすべて、約36~44分の世代時間を有していた。図2に示されるように、大腸菌株KPM288および菌株KPM290を37°Cのルリアベルターニ培地中または37°Cの、15μMのDアラビノース5リン酸および10μMのDグルコース6リン酸を補充したLB培地中のいずれかで増殖させた。LB培地での世代時間は以下の通りであるものと計算されたKPM28845分、KPM29043分。A5PおよびG6Pを補充したLB培地での増殖の結果は次の通りであったKPM288は2~3世代後、指数関数的な増殖が止まった、KPM29046分。図3に示されるように、大腸菌株KPM303をLB培地、15μMA5Pおよび10μMG6Pを補充したLB培地、SuperBroth培地、または15μMA5Pおよび10μMG6Pを補充したSB培地中のいずれかで37°Cにて増殖させた。SB培地はLB培地と比べてKPM303の増殖速度を改善しなかった。しかしながら、A5PおよびG6Pを補充したLB培地中での増殖とは対照的に、KPM303は、A5PおよびG6Pを補充したSB中で培養された場合、2~3世代後も指数関数的な増殖をし続けた。図4に示されるように、大腸菌株KPM303、KPM312、およびKPM316をSB培地または15μMA5Pおよび10μMG6Pを補充したSB中のいずれかで37°Cにて増殖させた。SB培地での世代時間は以下の通りであったKPM30354分、KPM31250分、KPM31646分。A5PおよびG6Pを補充したSB培地での世代時間は以下の通りであったKPM30339分、KPM31242分、KPM31642分。図5に示されるように、大腸菌株KPM316を10mMMgSO4および2mMCaCl2を補充したSB培地または10mMMgSO4、2mMCaCl2、15μMA5P、および10μMG6Pを補充したSB培地中のいずれかで37°Cにて増殖させた。KPM316は、10mMMgSO4および2mMCaCl2を含むSB中で51分の世代時間を有した。KPM316は、10mMMgSO4、2mMCaCl2、15μMA5P、および10μMG6Pを含むSB中で46分の世代時間を有した。図6に示されるように、大腸菌株KPM316およびKPM318を、SB培地中または15μMA5P、および10μMG6Pを補充したSB培地中のいずれかで37°Cにて増殖させた。KPM316およびKPM318はこれらの培地中で39~44分の世代時間を示した。実施例2温度耐性菌株の作製以下の例では、KPM296の温度耐性派生株の作製について記述する。本発明は以下の例に限定されない。37°CでLB培地中にて増殖させたKPM296の新鮮な終夜培養物を、LB寒天プレートにプレーティングし、42°Cでインキュベートすることができる。42°Cでのインキュベーションを数日間、例えば4~5日間続けることができる。42°Cでコロニー形成能を有するクローンが現れうる。42°C耐性菌株は42°CのLB寒天プレート上での終夜増殖によって確認することができる。KPM2966はKPM296の42°C耐性派生株である。図7に示されるように、大腸菌株KPM2966およびKPM316を10mMMgSO4および2mMCaCl2を有するSB中、または10mMMgSO4、2mMCaCl2、15μMA5P、および10μMG6Pを有するSB中のいずれかで37°Cにて増殖させた。10mMMgSO4および2mMCaCl2を含むSB培地中でのKPM2966の増殖速度は48分であった。10mMMgSO4、2mMCaCl2、15μMA5P、および10μMG6Pを含むSB中では、KPM2966の増殖速度は42分であった。図8に示されるように、KPM296から42°Cでの並行選択より独立的に単離された一連の大腸菌株を42°CにてSB培地中で増殖させた。KPM2966を含めて、試験したほぼすべての分離株が42°Cでの指数関数的な増殖を、倍加時間のバラツキは広範でありながらも示す。親菌株KPM296は42°CにてLB培地中またはSB培地中で全く増殖することができなかった。本方法では、KPM316およびKPM318を用いることによっても、42°Cで増殖できる一連の独立した分離株を選択するのに成功した。実施例3菌株構築以下の例では上記の各種菌株の構築について記述する。本発明はこれらの例に限定されない。lpxL、lpxM、pagP、lpxP、およびまたはeptA遺伝子を標的化するカナマイシン耐性カセットを、ファージλRedリコンビナーゼ手順を用いドナー菌株において作製することができ、次いでP1vir形質導入によりKPM菌株へ移入することができる。カナマイシン耐性遺伝子の切り出しは、FLPリコンビナーゼの存在下で行うことができ、温度感受性ヘルパープラスミドpCP20を除去することができる。P1vir形質導入および他のそのような技術は当業者に公知である。例えば、ΔlpxLKmカセットをKPM22において作製し、菌株KPM279を得ることができる。KPM279をP1vir形質導入によるKPM22L1へのΔlpxLKmカセットの移入用のドナーとして用い、菌株KPM288を得ることができ、またはP1vir形質導入によるKPM22L11へのΔlpxLKmカセットの移入用のドナーとして用い、菌株KPM290を得ることができる。さらに、菌株KPM316は、それぞれ、標的化カセットのドナー菌株としてKPM280、BW30270ΔlpxPKm、およびBW30270ΔpagPKmを用いアシルトランスフェラーゼでの連続的欠失によって得ることができるKPM290KPM296KPM300KPM303KPM310KPM312KPM314KPM316。KPM318は、BW30270ΔeptAKmでのλRedリコンビナーゼ手順により作製されたΔeptAKmのP1vir形質導入によってKPM317をもたらし、これから次に、FLPリコンビナーゼの一過性発現によってKmカセットを取り除くことによりKPM316から得られた。各欠失に隣接するプライマーを用いたPCR増幅を使って、親BW30270由来の対照DNAに対して欠失を確認した。いずれの場合にも、親菌株は、KPM318において欠失された遺伝子に隣接するプライマーで、より大きなPCR産物を示す。実施例4他の試薬および方法以下の例では本発明によって使用できる他の試薬および方法について記述する。本発明はこれらの例に限定されない。内毒素の存在を標準的なアッセイによって検出することができる。例えば、HEKBlueLPSDetectionKitsを用いることができる。このアッセイにおいて、HEKBlue4細胞はLPSに対し極めて感受性であり、わずか03ngmLのLPSの濃度を検出するために用いることができる。このアッセイは製造元のプロトコルにしたがって行うことができる。全細胞および同様に細胞の外膜抽出物をHEKBlueLPSDetectionKitで試験した。対照の野生型細胞および外膜を親のBW30270から調製し、これらをKPM316およびKPM318由来の細胞および抽出物のサンプルとともに試験した。図10に示した結果から、HEKBlueLPSアッセイではわずか2pgのLPSに応答し、LPS内毒素に対し極めて感受性であることが実証される。KPM316またはKPM318から調製されたサンプルのいずれのシグナルも、アッセイに加えた外膜が20マイクログラムでさえ、本質的にバックグラウンドレベルであり、TLR4MD2シグナル伝達に対する効力が9桁小さかった。KPM316またはKPM318の全細胞も、4桁低いレベルで著しい応答を示したBW30270の全細胞とは対照的に、試験した最も高いレベルでも著しいシグナルを引き起こすことはできなかった。KPM316の外膜抽出物のESI質量スペクトルの分析から、リピドIVAおよびリピドIVAエタノールアミンに対して予測された顕著な質量が示された。KPM318外膜のESIMSから、エタノールアミントランスフェラーゼがこの菌株から欠失されていたので、予想通り、リピドIVAしか示されなかった。P1vir形質導入は、感染により溶菌相へ入る変異バクテリオファージP1virを介してドナー菌株からレシピエント菌株に遺伝子対立遺伝子を移動させるために用いられる標準的な方法である。P1はおよそ90kbのDNAをパッケージングすることができ、したがって、選択マーカーとともに一般的に用いられる。そのような実験を行うために、ドナー菌株を培養する。次いでP1virをドナー菌株培養物に加えることができ、培養物が完全に溶菌するまでモニタリングすることができる。次いで溶菌物を収集し、レシピエント細胞の培養物に加える。溶菌物とのレシピエント細胞のインキュベーションの後、選択マーカーを有するコロニーを選択するために選択培地にレシピエント細胞をプレーティングする。大腸菌K12菌株の完全な配列がBlattnerFRら145362およびRileyMら19Print2006において提供されている。KPM316菌株の作製は図12に概説されている。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす。以下が親菌株から欠失されたΔgutQ、ΔkdsD、ΔlpxL、ΔlpxM、ΔpagP、およびΔlpxP。KPM316配列を野生型菌株MG1655のそれと比較した。これらの変異の機能は未知である。KPM318菌株の作製は図14に概説されている。msbAの野生型対立遺伝子はmsbA52で置き換えられ、その際に965895位のCがTに置き換えられ、MsbAタンパク質において18番目のアミノ酸のプロリンの代わりにセリンをもたらす。以下が親菌株から欠失されたΔgutQ、ΔkdsD、ΔlpxL、ΔlpxM、ΔpagP、ΔlpxP、およびΔeptA。作製された菌株の例は表1に提供されている。KPM318およびBW30270菌株はIlluminaDNA配列決定装置を用いてScrippsCoreDNA配列決定施設で配列決定された。配列は40または60塩基の、両末端からの読み出しを用いて作製された。DNAサンプルを各菌株から調製し、末端タグ化ライブラリーを作製するために用いた。参照レーンのほか、1レーンごとに最大で6つのライブラリーを流した。他のレーンはさらに関連性のないDNAの読み出しのために用い、これをさらなる内部対照として役立てた。単一ヌクレオチド多型は参照ゲノム、つまりBlattnerのMG1655菌株との比較時にScripps分析プログラムによって100変異体であると規定されるすべての単一塩基変化をさす。欠失挿入多型は、この場合も先と同様にMG1655を参照として用い、Scripps分析プログラムによって規定されるすべての欠失または挿入をさす。読み出しの100で検出されたものだけが提供される。全遺伝子欠失は別個の配列アライメントによって独立的に確認された。KPM318配列を野生型菌株BW30270の配列と比較した。配列決定によりmsbAP18Sサプレッサー対立遺伝子が特定されたが、これはオリジナルのKPM菌株に存在することが以前に確立されていた。菌株の操作によって導入されたすべての既知の変化が100の頻度で存在することが分かった。これは操作されたすべての欠失および点変異にも当てはまった。より頑強な菌株を特定するために、KPM318の温度耐性派生株を単離した。37°CにてLB培地中で増殖させたKPM318の終夜培養物をLB寒天プレートにプレーティングし、42°Cでインキュベートした。42°Cで4~5日間のプレートの継続的インキュベーションの後にだけ、高温でのコロニー形成能を取り戻したいくつかのクローンが得られた。無作為に選択したクローンの42°C耐性表現型を42°C、LB寒天プレート上での終夜増殖によって確認した。KPM318の一連の独立的な、非クローン性42°C耐性派生株が特定された。計24個の温度耐性KPM318派生株のなかで、菌株KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823は、SB培地中、または15μMのDアラビノース5リン酸および10μMのDグルコース6リン酸を補充したSB培地中にて回復されたLPS生合成の条件下のいずれかで30°C、37°Cおよび42°Cの温度にて指数関数的に増殖することができる、最良の増殖特性を示した。それゆえ、これらの温度耐性菌株はある範囲の温度にわたって頑強な増殖特性を示す。KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823菌株は、ScrippsCoreDNA配列決定施設にてIlluminaDNA配列決定装置を用いて配列決定された。42°Cでの菌株の生存可能性の主な原因となりうる特異的な変異が特定された。菌株KPM3189およびKPM31810は、リボソームリサイクリング因子を変化させるfrrD61Y変異を発現する。KPM31819菌株は、伸長因子Pをコードするefpにおいてフレームシフト変異を有する。KPM31823菌株は、デオキシシチジンデアミナーゼ遺伝子をコードするdcdにおいてP146およびL147の欠失を有する。これらの変異の特異的機能は未知である。KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823菌株のLPSリピドIVA組成を分析した。培養物を、LB培地またはA5PG6Pを補充したLB培地中のいずれかにて静止期にまで42°Cで増殖させた。LPSリピドIVAを、A5PG6Pを有するLB培地中で増殖させた菌株の場合にはオリジナルのフェノールクロロホルム石油エーテル手順またはLBのみの培地で増殖させた菌株の場合には改変PCPプロトコルのいずれかを用いて各菌株の乾燥バイオマスから抽出した。次いで抽出物をESIFTICR質量分析に供した。LB培地中で増殖させたKPM31823菌株は42°CでリピドIVAを主に発現する。42°C耐性KPM318派生株を、A5PG6Pを補充したLB培地中で増殖させた場合には、大腸菌K12コアオリゴ糖の生合成が回復された。テトラアシル化前駆体リピドIVAと付着してはいたが、すべての菌株において異なるグリコフォームの類似混合物の発現が認められた。A5PG6Pを補充したLB培地中37°Cで増殖させた親菌株KPM318から単離されたLPSを、これらすべての実験の対照として用いた。KPM318によって発現された異なるグリコフォームのいくつかの分子量が割り当て可能であり、表2に示されている。総合すれば、KPM318の42°C耐性派生株の全LPSリピドIVA組成はK12コアに典型的な不均一のオリゴ糖組成に関していずれの特性も示さなかった。これらの菌株のすべての外膜調製物はリピドAを示さなかったそれらはリピドIVAを含むだけであった。LBSB培地またはA5PG6Pを補充したLBSB培地中のいずれかで増殖させた各種KPM菌株から単離されたLPSリピドIVAと細菌細胞の両方の生物学的活性を、HEKBlueLPS検出アッセイを用いて調べた。この検出アッセイ用の細菌細胞の調製のため、各菌株の終夜培養物1mlを遠心分離によって沈降し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄した。細菌細胞を殺処理するために、ペレットをその後、10×濃縮ペニシリンストレプトマイシンのDPBS溶液1mlに再懸濁した。混合物を室温で2時間インキュベートし、4°Cで終夜保存した。同時に、終夜培養物の連続希釈液を終夜培養物PenStrep殺処理細胞の細胞数の計算のために調製した。菌株のPenStrep懸濁液を10×濃縮PenStrepのDPBS溶液中で108cfumlに希釈し、懸濁液の連続希釈液を次に、10×濃縮PenStrepのDPBS溶液中で調製して107、106、105、104、103、102および101cfumlの細菌細胞懸濁液を得た。菌株BW30270、KPM316およびKPM318由来の細菌細胞懸濁液の連続希釈液を用いた典型的なHEKBlueLPS検出アッセイを図28に示す。対照菌株BW30270と比べて、LB培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来の細菌細胞懸濁液のLPS活性は皆無かそれに近い。A5PG6Pを補充した培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株の活性にはわずかな増加が認められる。KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPSリピドIVAサンプルの連続希釈液によって誘導されるNFκB活性化は皆無かそれに近い。LBのみの培地およびA5PG6Pを補充したLB培地中42°Cで増殖させた温度耐性菌株KPM3189から単離されたLPSリピドIVAの生物学的活性を、BW30270、KPM316およびKPM318由来のLPSリピドIVAサンプルがHEKBlue細胞においてNFκB活性化を誘導する能力と比較した。菌株BW30270をLB培地中37°Cで増殖させ、その一方で、菌株KPM316およびKPM318は、LB培地またはA5PG6Pを含有するLB培地中のいずれかで37°Cにて培養した。KPM3189の潜在的なアンタゴニスト活性を調べるために、KPM3189から単離された一定量のLPSリピドIVAを逓減量のBW30270由来LPSと混合した。LPM3189由来のLPSリピドIVAは、高濃度で存在する場合に、このアンタゴニストと競合するBW30270の能力によって実証される通りLPS活性の強力なアンタゴニストである。ヒトTNFαELISAを、LB培地またはA5PG6Pを含有するLB培地中のいずれかで37°Cにて増殖させたKPM316およびKPM318菌株から単離されたLPSリピドIVAで行った。大腸菌K235から単離されたSLPSを陽性対照として用いた。Biocollを用いて血液を分離した。単核細胞を単離し、Hanks中で2回およびVLERPMI中で1回洗浄した。MCSFを含むTeflonバッグ中で単球をインキュベートすることによって単球をマクロファージへ分化させた。マクロファージを7日後に収集した。細胞の数を決定した。マクロファージを平底96ウェルプレートの中に、VLERPMI100Uペニシリン100μgmlストレプトマイシン2mMLグルタミン4AB血清中1×105個の細胞ウェルで播種した。LPSリピドIVAサンプルをKPM316およびKPM318菌株から単離し、37°Cおよび5CO2にて30分間プレインキュベートした。SLPSK235をサンプルに4時間加えた。上清を除去し、4°Cで終夜保存した。ELISAを行ってTNFα活性を評価した。AB血清不含VLERPMI中でのLPSサンプルの連続希釈液を調製した。KPM318LPSLB、KPM316LPSLB、KPM318LPSLBAG、およびKPM316LPSLBAGを20mMHEPESpH70中にて1mgmlで調製した。次いで100ugmL~1ngmLの連続希釈液を調製した。プレートを、コーティング用緩衝液中で250分の1希釈した捕捉用抗体でコーティングした。プレートを終夜撹拌し、その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。プレートをアッセイ希釈液180μlウェルでブロッキングし、室温で1時間撹拌した。プレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した。サンプルをアッセイ希釈液中で希釈し、標準物質の連続希釈液を以下のように調製した。1212500pgml12250pgml12125pgml12625pgml123125pgml12156pgml1278pgml1239pgmlプレートを室温で2時間、標準物質、サンプルおよびブランクとともに撹拌した。プレートを洗浄用緩衝液で3回洗浄した。検知溶液および検出用抗体をプレートに1000分の1で加えた。酵素試薬を250分の1で加えた。プレートを室温で1時間撹拌し、その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。プレートを基質用緩衝液中のTMBとともに暗所中で撹拌した。ウェルが青くなるまで、最低限30分間プレートをインキュベートした。50μlウェルのH2SO4で反応を停止した。450nmで吸光度を測定した。陽性対照K235から単離されたLPSリピドIVAは、試験したすべての濃度でTNFα活性を強力に増加させた。KPM316およびKPM318菌株由来のLPSリピドIVAは、試験したすべての濃度でK235に由来するLPSによるTNFαの誘導を阻害することが可能であったそれゆえ、KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPSリピドIVAはLPS活性の強力なアンタゴニストである。4AB血清を含有する培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来のLPSリピドIVAは、マクロファージからのTNFαの放出を阻害することが可能であった。無血清培地中で増殖させたKPM316およびKPM318菌株由来のLPSリピドIVAは、マクロファージからのTNFαの放出を阻害することが可能であった。それゆえ、KPM316およびKPM318菌株から単離されたLPSリピドIVAはTNFα活性の強力な阻害剤である。LPSはヒト細胞においてTLR4受容体の活性化によりその炎症機能を及ぼすことが知られている。HEK293hTLR4MD233細胞およびHEK293hTLR42細胞からのIL8の放出を評価することにより、KPM316およびKPM318菌株由来のLPSリピドIVAの生物学的活性を評価した。hTLR4MD233細胞はLPS結合に応答して、シグナルを生ずるのに対し、HEK293hTLR42細胞はペプチドグリカンに応答し、LPSに応答しない。それゆえ、後者の細胞株を用いて、LPS特異性を評価することができる。K235菌株由来のSLPSをこれらのアッセイにおける陽性対照として用いた。HEK293hTLR4MD233細胞培地は、PenStrepGluおよび10FCSを補充したDMEMであった。ウェルの中に播種されたのは1ウェルあたりHEK293hTLR4MD233細胞50000個であった。細胞を24時間の間、LPSリピドIVAサンプルの存在下で刺激し、その後、ヒトIL8放出の測定を行った。KPM316およびKPM318菌株由来のLPSリピドIVAは、HEK293hTLR4MD233細胞からのIL8の放出を遮断することが可能であった。これらの菌株由来のLPSリピドIVA抽出物は、HEK293hTLR22細胞からのIL8の放出を促進することが可能であったことから、粗抽出物であった。TLR2は、サイトカインシグナル伝達を引き起こしうる別の細菌成分であるペプチドグリカンの受容体である。遊離ペプチドグリカンの存在量は、これが通常は微量成分であるため、LPSのレベルよりも典型的にはかなり低い。ここでは、これを使って、抽出物には、細胞の外膜周辺質に由来する材料が実際に含有されることを実証する。というのは、細胞の外膜周辺質は、ペプチドグリカンが位置する場所であるからである。TLR4MD2を過剰発現するHEK細胞はLPS結合に応答し、すなわち、IL8を放出したのに対し、ペプチドグリカンに応答するTLR2を過剰発現するHEK細胞はLPSに応答しない。それゆえ、この対照から、どちらの場合にも外膜抽出物由来の何かがアッセイに実際に加えられていたことが確実である。異種遺伝子を過剰発現するKPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823菌株の能力を評価した。標準的な増殖および誘導条件の下で大量に細胞質および周辺質MalEタンパク質バリアントを発現するこれらの菌株の能力を調べるためのモデルタンパク質としてMalELacZα融合タンパク質を用いた。BW30270、KPM318、KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823菌株を、それぞれ、細胞質MalELacZαおよび周辺質MalELacZαの発現のために、プラスミドpMALc2およびpMALp2でそれぞれ形質転換した。以下の菌株が得られた。BW30270pMALc2KPM318pMALc2KPM3189pMALc2KPM31810pMALc2KPM31819pMALc2KPM31823pMALc2BW30270pMALp2KPM318pMALp2KPM3189pMALp2KPM31810pMALp2KPM31819pMALp2KPM31823pMALp2の発現を誘導するために、培養物がOD600およそ06の対数増殖中期に達した時点でを終濃度04mMまで加えた。プラスミドpMALc2を保有する菌株の場合、細胞を誘導の前、誘導3時間後、および終夜誘導後に収集した。プラスミドpMALp2を有する菌株の場合、サンプルを非誘導細胞から、ならびに3時間、6時間、12時間、および24時間の誘導時間後に採取した。培地中にMalELacZαタンパク質を分泌する能力を、対照としてpMALc2菌株を用い、pMALp2プラスミドを保有する菌株についてさらに調べた。BugBuster試薬を製造元の推奨にしたがって用い、タンパク質抽出物を調製した。MalEに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析を行って、MalELacZα発現を検出した。MalELacZαの発現レベルはpMALc2菌株では誘導3時間後の時点で、ならびにpMALp2菌株では誘導3時間後および6時間後の時点で最も高かった。MalELacZαの発現は菌株KPM318、KPM3189およびKPM31810において一貫して最も高く、BW30270野生型対照とほぼ同一の発現レベルを示した。予想通り、クマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルでも免疫ブロットでも、プラスミドpMALc2を保有する菌株の培地中のMalELacZαは、タンパク質の細胞質発現のために検出されなかった。対照的に、pMALp2菌株の培地中のMalELacZαタンパク質の存在量は、IPTG誘導の時間の増加とともに明らかに増加した。これはすべてのKPM変異体に当てはまっただけでなく、BW30270野生型菌株にも当てはまった。培地中のMalELacZαの存在がKPM菌株での損なわれた外膜の結果としてのタンパク質の分泌の結果であるのか、または単に、本研究において用いられた実験条件下でのタンパク質の周辺質過剰発現による細胞溶菌の結果であるのかは不明である。MBPは大腸菌において高度に発現されることが公知である。KPM18温度耐性派生株は野生型の対照菌株BW30270に類似のタンパク質発現レベルを示した。これらの菌株は、細胞溶菌がなくてもタンパク質の回収を可能にする、野生型菌株よりも容易にMBPを分泌または漏出する。ヒトApoA1タンパク質を産生するKPM318およびその温度耐性派生株の能力を調べた。companyDNA20により大腸菌のコドン用法について最適化されたapoA1遺伝子が合成され、pJexpress404中のTn5プロモーターの制御下にクローニングされた。ApoA1の周辺質発現のため、その遺伝子を大腸菌の主要な外膜プロテインAに対するompAのリーダー配列に融合させた。さらに、apoA1遺伝子の細胞質型も周辺質型もともに、6×Hisタグコード配列にC末端融合させた。菌株を細胞質ApoA1および周辺質ApoA1の発現のために、それぞれ、pJexpress40451149およびpJexpress40451150で形質転換した。いくつかの試みにもかかわらず、菌株KPM31823はpJexpress40451149およびpJexpress40451150発現ベクターで形質転換することができなかった。以下の菌株が得られた。1BW30270pJexpress404511492KPM318pJexpress404511493KPM3189pJexpress404511494KPM31810pJexpress404511495KPM31819pJexpress404511496BW30270pJexpress404511507KPM318pJexpress404511508KPM3189pJexpress404511509KPM31810pJexpress4045115010KPM31819pJexpress40451150培養物を、100μgmlアンピシリンを含有するSB培地5ml中にて37°Cで終夜増殖させた。終夜培養物を、100μgmlアンピシリンを含有する予め加温されたSB培地40ml中で希釈した。培養物を37°Cで増殖させ、OD600およそ06まで250rpmで撹拌した。各菌株に対する細胞数を決定した。非誘導培養物を6000rpmで10分間遠心分離した。さらなる分析のために各pJexpress40451150培養上清のアリコット1mlを得た。1mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、80°Cで保存した。IPTGを培養物に加えた。細胞を37°Cでインキュベートし、250rpmで3時間撹拌した。各菌株に対する細胞数を評価した。3時間の誘導後、各培養物5mlを取り出した。1BW30270pJexpress40451149誘導2KPM318pJexpress40451149誘導3KPM31842C9pJexpress40451149誘導4KPM31842C10pJexpress40451149誘導5KPM31842C19pJexpress40451149誘導6BW30270pJexpress40451150誘導7KPM318pJexpress40451150誘導8KPM31842C9pJexpress40451150誘導9KPM31842C10pJexpress40451150誘導10KPM31842C19pJexpress40451150誘導誘導培養物を6000rpmで10分間遠心分離した。さらなる分析のために各pJexpress40451150培養上清のアリコット1mlを得た。1mlの培養上清および細胞ペレットを80°Cで保存した。誘導を37°Cおよび250rpmで継続した。各培養物に対する細胞数を誘導6時間後の菌株で決定した。各培養物のアリコット3mlを誘導6時間後に取り出した。1BW30270pJexpress40451149誘導2KPM318pJexpress40451149誘導3KPM31842C9pJexpress40451149誘導4KPM31842C10pJexpress40451149誘導5KPM31842C19pJexpress40451149誘導6BW30270pJexpress40451150誘導7KPM318pJexpress40451150誘導8KPM31842C9pJexpress40451150誘導9KPM31842C10pJexpress40451150誘導10KPM31842C19pJexpress40451150誘導誘導培養物を6000rpmで10分間遠心分離した。さらなる分析のために取り出したのは、各pJexpress40451150培養上清のアリコット1mlであった。1mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、80°Cで保存した。誘導を37°Cおよび250rpmで継続した。細胞数を誘導12時間後の各菌株について決定した。各培養物のアリコット2mlを12時間の誘導後に取り出した。1BW30270pJexpress40451149誘導2KPM318pJexpress40451149誘導3KPM31842C9pJexpress40451149誘導4KPM31842C10pJexpress40451149誘導5KPM31842C19pJexpress40451149誘導6BW30270pJexpress40451150誘導7KPM318pJexpress40451150誘導8KPM31842C9pJexpress40451150誘導9KPM31842C10pJexpress40451150誘導10KPM31842C19pJexpress40451150誘導誘導培養物を6000rpmで10分間遠心分離した。さらなる分析のために得たのは、各pJexpress40451150培養上清1mlであった。1mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、80°Cで保存した。誘導を37°Cおよび250rpmで継続した。各菌株に対する細胞数を誘導24時間後に決定した。24時間の誘導後に取り出したのは各培養物1mlであった。1BW30270pJexpress40451149誘導2KPM318pJexpress40451149誘導3KPM31842C9pJexpress40451149誘導4KPM31842C10pJexpress40451149誘導5KPM31842C19pJexpress40451149誘導6BW30270pJexpress40451150誘導7KPM318pJexpress40451150誘導8KPM31842C9pJexpress40451150誘導9KPM31842C10pJexpress40451150誘導10KPM31842C19pJexpress40451150誘導培養物を6000rpmで10分間誘導した。pJexpress40451150培養上清をさらなる分析のために得た。1mlの培養上清および細胞ペレットを凍結し、80°Cで保存した。非誘導細胞および誘導細胞を融解し、すべての細胞ペレットを1×BugBuster300μlに再懸濁した。サンプルに加えられたのは20mgmlのリゾチーム溶液3μlおよびベンゾナーゼ05μlであった。サンプルを振盪しながら室温で20分間インキュベートした。サンプルを20分間14000rpmで遠心分離した。1×BugBusterは以下を含有する。10×濃縮BugBuster1ml1MTrisHClpH75200μl2メルカプトEtOH35μlヒトApoA1タンパク質の細胞質型も周辺質型もともに、12SDSPAGEによって分析した場合に、大腸菌株BW30270、KPM318、KPM3189およびKPM31810において発現されていたが、KPM31819においては発現されていなかった。29kDaのバンドの見掛け上の相対分子量は、C末端ヒスチジンタグに融合されたタンパク質の算出質量に一致していた。著しくは、周辺質に発現されたApoA1は、29kDaおよび31kDaの見掛け上の相対分子量を有する2本のバンドとして移動し、後者は314kDaの非プロセッシングApoA1の算出質量と一致していた。ApoA1は大腸菌の細胞質に可溶性および不溶性タンパク質の混合物として発現されることがこれまでに明らかにされており、このことは、ApoA1の非プロセッシング型と推定されるものが、周辺質中のその最終目的地への輸送およびプロセッシングに到達できないタンパク質の不溶性画分を構成することを示唆している。しかしながら、本発明者らは、現在、より遅い移動性のバンドの出現がSDSPAGE前の2分間の95°Cでのサンプル調製の結果であるという可能性を排除することができない。いずれにせよ、これらの結果から、KPM菌株におけるApoA1の発現速度はBW30270におけるのと少なくとも同じくらい速く、少なくとも6時間の一定レベルを示したことが示唆される。MalELacZαで行われた実験とは対照的に、SDSPAGE分析のための培地の容量は、ポリアクリルアミドゲル上に負荷された培養上清の量が全く同一のOD600値に由来するようにpJexpress40451150保有細胞の光学密度に関して調整された。驚くべきことに、図50中の菌株KPM31810pJexpress40451150で十分にまた同じように示された通り、すべての温度耐性菌株の光学細胞密度は増加したが、生存細胞の数はIPTG誘導の全期間にわたって減少した。図51~53に示されるように、pJexpress40451150プラスミドを保有する菌株は、ApoA1を培地中に分泌することができなかった。弱いクマシー染色バンドはむしろ、細胞抽出物のタンパク質バンド形成パターンと似ており、したがって、細胞溶菌に由来する可能性が最も高かった。PentaHis抗体での免疫ブロットを用いることにより、本発明者らは、SDSPAGE分析のすべての所見を確証することができた。総合すれば、本発明者らのデータから、42°C耐性KPM318派生株KPM3189およびKPM31810はタンパク質発現に適した宿主であることが示唆される。細菌増殖、誘導およびサンプル調製のための条件の最適化は、関心対象のタンパク質の発現速度および収量をさらに改善するはずである。細胞のDNA形質転換能を評価した。エレクトロコンピテント細胞の調製のため、培養物を激しく振盪させながら37°Cで対数増殖中期まで増殖させた。細胞をその後、氷冷水で3回および氷冷10グリセロールで2回洗浄した。最後に、細胞沈殿物を少量の氷冷10グリセロールに再懸濁し、80°Cで保存するために50μlのアリコットを調製した。最初に、本発明者らは、pMALc2によるKPM318の形質転換に及ぼす、回復されたK12コアオリゴ糖生合成の影響を調べた。菌株BW30270を対照としてLB培地中で増殖させた一方で、KPM318を、LB培地およびA5PG6Pを含有するLB培地中で培養した。菌株BW30270、KPM318およびKPM318が、それぞれ、0621、0613および0519の光学密度に到達した時点で、エレクトロコンピテント細胞の調製のために細胞を収集した。形質転換のために全く同一の数のエレクトロコンピテント細胞を用いるために、本発明者らは、各菌株のコンピテント細胞1ミリリットルあたりのコロニー形成単位を決定した。KPM318およびKPM318のエレクトロコンピテント細胞を氷冷10グリセロールで73×108cfumlに希釈し、プラスミドpMALc225ngでそれぞれ形質転換した。形質転換混合物を連続的に希釈し、100μgmlのアンピシリンを含有するLB寒天プレートにプレーティングし、37°Cでインキュベートした。表14中の結果は、菌株BW30270、KPM318およびKPM318が同様の効率で形質転換されたことを実証する。このデータは、LBのみの培地中での増殖時に外膜においてリピドIVAを主に発現するKPM318が、回復されたコアオリゴ糖生合成の条件の下でBW30270またはKPM318よりも高い効率で形質転換されなかったことをさらに示している。各菌株について無作為に選択した4つの形質転換体からのプラスミドpMALc2を37°Cおよび200rpmにて、100μgmlのアンピシリンを含有するLB培地中で増殖させた5mlの終夜培養物から単離した。WizardPlusMiniprepsDNAPurificationSystemを用いてプラスミドを単離した。1μlのサンプルをその後、TBE緩衝液中08のアガロースゲル上で泳動した。電気泳動の結果から、プラスミドpMALc2の収量が大腸菌株BW30270pMALc2、KPM318pMALc2、およびKPM318pMALc2に対して明らかにほぼ同一であることが示唆された。次の段階として、42°C耐性KPM318派生株KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823をプラスミドpMALc2およびpMALp2でそれぞれ形質転換した。細胞をSB培地中37°Cで増殖させ、KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823が、それぞれ、0618、0596、0491および0702の光学密度に到達した時点でエレクトロコンピテント細胞の調製のために収集した。エレクトロコンピテント細胞をpMALc225ngおよびpMALp225ngでそれぞれ形質転換した。形質転換混合物の連続希釈液を次いで、100μgmlのアンピシリンを有するLB寒天プレートにプレーティングし、37°Cでインキュベートした。42°C耐性KPM318菌株の形質転換効率は表15にまとめられている。KPM3189、KPM31810およびKPM31819菌株は高い効率で形質転換されたが、プラスミドpMALc2およびpMALp2を取り込むKPM31823の能力は、ほんのわずかにすぎなかった。事実、後者の結果は、プラスミドpJexpress40451149およびpJexpress40451150でKPM31823を形質転換できないことと一致していた。WizardPlusMiniprepsDNAPurificationSystemを製造元の推奨にしたがって用い、KPM3189pMALc2、KPM3189pMALp2、KPM31810pMALc2、およびKPM31810pMALp2について無作為に選択した2つの形質転換体の5mlの終夜培養物からプラスミドpMALc2およびpMALp2を単離した。サンプルをTBE緩衝液中08のアガロースゲル上で泳動した。最後に、単離されたプラスミドの収量を、上記のタンパク質発現試験に後に用いたそれらの菌株について決定した。総合すれば、高い形質転換効率も、標準的なミニプレップ培養から得られたプラスミドDNAの許容される収量も、KPM3189およびKPM31810がプラスミドDNA産生菌株の開発に適した基礎菌株であることを示唆している。ファージディスプレイライブラリーに由来するタンパク質のスクリーニングの用に供されるKPM基礎菌株を開発するためには、菌株はM13ファージによる感染を可能とするためにFプラスミドを有しなくてはならない。本発明者らは、試験管接合プロトコルによりBW30270、KPM318、KPM3189、KPM31810、KPM31819、およびKPM31823にF121Tn10プラスミドを移入するためのドナー菌株として大腸菌JC19022を用いた。培養物を激しく振盪させながら培地5ml中にて37°Cで終夜増殖させた。JC19022には10μgmlのテトラサイクリンを含有するLB培地を用い、BW30270にはLB培地を用い、KPM318およびその温度耐性派生株にはA5PG6Pを補充したLB培地を用いた。終夜培養物の以下の希釈を、終夜増殖に用いたのと同じ培地を用いてセットアップした。ドナー25μl→5ml50μl→5ml100μl→5ml200μl→5mlレシピエント25μl→5ml50μl→5ml100μl→5ml200μl→5mlサンプルをおよそ2~3時間37°Cで激しく振盪した。懸濁液の光学密度を記録した。最適なOD600の範囲は008~02である利用できる選択肢があるなら01に最も近いOD600での希釈を用いなくてはならない。ドナー菌株の培地からテトラサイクリンを除去するために、培養物を遠心分離しなければならず、細胞ペレットをLB培地4mlに再懸濁しなければならない。移入のために比率11のドナーレシピエントを用いる。ドナー希釈液の希釈を決定し、これに500を乗じる。この値をレシピエントのOD600で除して、ドナー500μlに加えるμl単位でのレシピエントの量を得る。ドナー培養物を適切な量のレシピエント培養物とともにインキュベートする。接合培養物を撹拌なしで2時間37°Cでインキュベートする。培養物を次いで、さらに2時間37°Cでインキュベートし、220rpmで撹拌する。サンプルを激しくボルテックスして、接合対を破壊する。各接合に対してPBS中101、102、103、および104の希釈液を調製し、各々の非希釈および希釈接合培養物100μlを、1μgmlのチアミンおよび10μgmlのテトラサイクリンを含有するM9寒天プレートに加えた。培養物を37°Cでインキュベートした。潜在的な接合完了体を、1μgmlのチアミンおよび10μgmlのテトラサイクリンを含有するM9寒天プレート上に画線し、37°Cでインキュベートした。試験管接合実験により、すべてのレシピエント菌株に対していくつかの潜在的な接合完了体が得られた。潜在的な接合完了体のサブセットをその後、ΔlpxPノックアウト変異の存在についてPCRにより調べて、偽陽性クローンとテトラサイクリン耐性KPM菌株とを区別した。図65に示されるように、試験したすべてのテトラサイクリン耐性KPM318接合完了体はΔlpxPノックアウト変異を含有し、このことから、KPM菌株へのF121Tn10プラスミドの移入の成功が示唆された。lpxPPCRを用いることにより、本発明者らはまた、必要とされるΔlpxPノックアウト変異を含んだ、KPM3189、KPM31810、KPM31819およびKPM31823のいくつかの潜在的なF121Tn10接合完了体を特定することができた。KPM318およびその42°C耐性派生株におけるF121Tn10プラスミドの存在の証拠を提供するために、ならびに接合完了体がM13に感染しやすいことを示すために、各菌株について無作為に選択した接合完了体4つを感染させるために、M13KO7ヘルパーファージを用いた。M13KO7は、M13複製起点のなかにともに挿入された、P15A由来の複製起点およびTn903由来のカナマイシン耐性遺伝子を含むので、感染後のカナマイシン耐性クローンの発現はM13KO7に所与の菌株が感染しやすいことの表れである。10μgmlのテトラサイクリンを含有するLB培地中の大腸菌JC19022およびBW30270、ならびに10μgmlのテトラサイクリンおよびA5PG6Pを有するLB培地中のKPM318および42°C耐性KPM318派生株の終夜培養物をセットアップした。BW30270およびKPM318菌株を対照として、それぞれ、LB培地およびA5PG6Pを補充したLB培地中で増殖させた。培養物を37°Cで激しく撹拌した。以下の菌株および潜在的な接合完了体を増殖させた。1BW302702KPM3183JC190224BW3027015BW3027026BW3027037BW3027048KPM31849KPM318610KPM318711KPM318812KPM3189113KPM3189214KPM3189315KPM3189416KPM31810117KPM31810318KPM31810419KPM31810520KPM31819321KPM31819422KPM31819523KPM31819624KPM31823125KPM31823226KPM31823327KPM318235BW30270およびJC19022の終夜培養物をLB培地3ml中で増殖させ、KPM318および潜在的な接合完了体を、A5PG6Pを補充したLB培地3ml中で培養した。培養物を激しく振盪させながら37°Cで対数増殖初期まで増殖させた。懸濁液のOD600の決定のためにアリコット1mlを取り出した。M13KO7感染実験によりKPM318およびその温度耐性派生株のすべての潜在的な接合完了体に対するカナマイシン耐性コロニーが得られた。カナマイシン耐性コロニーの数は菌株によってかなり違ったが、この結果から、KPM菌株へのプラスミドF121Tn10の接合性移入が成功であった、および菌株はM13感染をうけやすくなったことが示唆される。これは温度耐性KPM318派生株におけるファージディスプレイライブラリーの作製のための根本的な基盤となるはずである。大腸菌XL1Blue由来のsupE44遺伝子をBW30270、KPM318およびその42°C耐性派生株に移入した。BW30270、KPM318およびその派生株におけるsupE44の選択を容易にするために、ヘルパープラスミドpMAK705Km耐性CATMUTを構築した。第一に、プラスミドpKD4のカナマイシン耐性遺伝子を、プライマー5BamHIKm耐性および3HindIIIKm耐性を用いて増幅し、その後、BamHIおよびHindIIIによるPCR産物の消化を行った。第二に、BamHIHindIII消化したPCR産物を温度感受性プラスミドpMAK705のBamHIHindIII部位にクローニングして、pMAK705Km耐性を得た。最後に、位置番号10のコドンACCを、ChangeITMutagenesisSystemによる部位特異的変異誘発法においてプライマーCATamberおよびCATwtreverseを用いTAGナンセンスコドンに置き換えた。cat遺伝子へのamberナンセンスコドンの導入を検証するため、大腸菌株TOP10およびXL1BlueをプラスミドpMAK705Km耐性CATMUTで形質転換した。得られた菌株TOP10pMAK705Km耐性CATMUTおよびXL1BluepMAK705Km耐性CATMUTをLB30μgmlカナマイシンプレートおよびLB30μgmlカナマイシン15μgmlクロラムフェニコールプレートの両方に画線した。glnVの野生型対立遺伝子を保有するTOP10pMAK705Km耐性CATMUTとは対照的に、XL1BluepMAK705Km耐性CATMUT菌株はLB30μgmlカナマイシン15μgmlクロラムフェニコールプレート上で増殖することができ、supE44によるナンセンス変異の抑制を示唆するものであった。実施例5KPM由来ΔendAΔrecA菌株の構築ΔrecAKm耐性菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352はそれぞれ、KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に対応するΔendA菌株に由来するものであった。本実施例において用いられる場合のΔは、欠失を意味する。ΔrecAKm耐性標的化カセットは、本質的には他のノックアウト変異の構築について記述したようにP1vir形質導入によってKPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に移入した。1ΔrecAKm耐性変異を保有する大腸菌株BW26547を、形質導入用のドナーとして用いた。菌株は大腸菌遺伝子貯蔵センターから得た。2ファージP1virを、30μgmlカナマイシンを有するLB培地中37°Cで増殖させたBW26547に対し繁殖させて、ΔrecAKm耐性形質導入溶菌液を得た。3形質導入のため、ΔendAレシピエント菌株KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347を、A5PG6Pを補充したLB培地中37°Cで増殖させた。4形質導入は標準的なプロトコルにしたがい、30μgmlカナマイシンを含有するLB寒天プレート上37°Cで潜在的な形質導入体を選択して行った。5recAとgutQの距離は約6kbにすぎず、したがって潜在的なカナマイシン耐性形質導入体をおよびKPM菌株において欠失されたgutQ遺伝子の両方の存在についてPCRにより試験した。6結果として、ΔrecAKm耐性およびオリジナルのΔgutQ変異を含有する菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352が得られた。7カナマイシン耐性遺伝子をpCP20による一過性の形質転換を用い除去して、菌株KPM353、KPM354、KPM355、KPM356、およびKPM357を得る。8上記のrecAプライマーはΔrecA最終菌株におけるKanR挿入断片の除去を特定するのに役立つ。実施例6大腸菌株の名称指定以下の特許の以下の開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWIPO出願番号2007084633。本明細書において引用される参考文献および刊行物は、これらの参考文献が本発明と一致する程度まで参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明のさまざまな修正は、本明細書において記述されるものに加えて、先述の記述から当業者に明らかであろう。そのような修正も添付の特許請求の範囲に入るように意図される。本出願において引用される各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明の好ましい態様が示され記述されてきたが、添付の特許請求の範囲を超えない修正を本発明に加えられることが当業者には容易に明らかであろう。それゆえ、本発明の範囲は当然ながら以下の特許請求の範囲によって限定されるのみである。