試料中の少なくとも1つの酵素の活性に関連する生物分子を検出するための方法であって、少なくとも1つの酵素を少なくとも1つの基質と、酵素が基質と反応することができる条件下で、混合する段階;生物分子を分配するための分配要素を提供する段階;および分配要素中の生物分子の蛍光を検出するための段階;を含み、検出される蛍光が試料中の酵素活性を示す、方法。分配要素が、ポリマ膜を含む、請求項1記載の方法。酵素が基質と反応することができる条件が、水性条件を含む、請求項1記載の方法。生物分子が基質であり、蛍光を検出する段階が、蛍光の量の変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。生物分子が、酵素基質反応の生成物である、請求項1記載の方法。酵素活性が、微生物と関連する、請求項1記載の方法。微生物が、生物汚染物質である、請求項6記載の方法。少なくとも1つの酵素が、βグルクロニダーゼおよびβガラクトシダーゼから選択される、請求項1記載の方法。微生物が大腸菌および総大腸菌群から選択される、請求項7記載の方法。少なくとも1つの基質が、ピレンβDグルクロニド、アントラセンβDグルクロニド、ピロメテンβDグルクロニド、ピレンβDガラクトピラノシド、およびアントラセンβDガラクトピラノシドから選択される、請求項1記載の方法。試料が、水、生物試料、食品および土壌から選択される、請求項1記載の方法。酵素および基質が、分配要素を含むカートリッジ中で混合される、請求項1記載の方法。分子の蛍光を検出するための光学プローブであって、光導波管;および光導波管の一端に配置された分配要素;を含み、分子が、選択的に分配要素中に分配され、分子の蛍光が導波管内に結合される、光学プローブ。蛍光分子が、酵素基質および酵素基質反応の生成物から選択される、請求項13記載の光学プローブ。分配要素が、ポリマ膜である、請求項13記載の光学プローブ。ポリマ膜が、ポリジメチルシロキサンを含む、請求項15記載の光学プローブ。光導波管が光ファイバである、請求項13記載の光学プローブ。分子の存在を検出するための装置であって、請求項13記載の光学プローブ;励起光源;および分子の蛍光を検出するための検出器;を備え、検出された蛍光が分子の存在を示す、装置。蛍光分子が、酵素基質および酵素基質反応の生成物から選択される、請求項18記載の装置。酵素が、微生物と関連する、請求項18記載の装置。酵素が、βグルクロニダーゼおよびβガラクトシダーゼから選択される、請求項18記載の装置。微生物が大腸菌および総大腸菌群から選択される、請求項20記載の装置。基質が、ピレンβDグルクロニド、アントラセンβDグルクロニド、ピロメテンβDグルクロニド、ピレンβDガラクトピラノシド、およびアントラセンβDガラクトピラノシドから選択される、請求項19記載の装置。試料中の少なくとも1つの酵素の活性と関連する生物分子を検出するためのシステムであって、試料および少なくとも1つの基質をインキュベートし、酵素を基質と反応させ、生物分子を生成させるための容器;生物分子を分配することができる分配要素;分配要素中に分配された生物分子に照射する励起光源;分配要素中に分配された生物分子の蛍光を検出する検出器;および制御ユニット;を備え、検出された蛍光は試料中の酵素の活性を示す、システム。制御ユニットは、システムの動作を制御する機能、蛍光検出に関連するデータを保存する機能、および蛍光検出に関連するデータを出力する機能から選択される少なくとも1つの機能を実施する、請求項24記載のシステム。容器が、試料および基質を含むための取り外し可能なカートリッジを備える、請求項24記載のシステム。分配要素が、取り外し可能なカートリッジ内に配置される、請求項26記載のシステム。蛍光検出に関連するデータを通信ネットワークに中継する通信ユニットをさらに備える、請求項24記載のシステム。酵素が、生物汚染物質と関連する、請求項24記載のシステム。試料が、水、生物試料、食品および土壌から選択される、請求項24記載のシステム。酵素が、βグルクロニダーゼおよびβガラクトシダーゼから選択される、請求項24記載のシステム。生物汚染物質が大腸菌および総大腸菌群から選択される、請求項29記載のシステム。少なくとも1つの基質が、ピレンβDグルクロニド、アントラセンβDグルクロニド、ピロメテンβDグルクロニド、ピレンβDガラクトピラノシド、およびアントラセンβDガラクトピラノシドから選択される、請求項24記載のシステム。システムの分配要素および光学部品を較正する、もしくは蛍光検出をモニタする、またはそれらの両方のための手段をさらに備える、請求項24記載のシステム。分配要素を較正するおよび蛍光検出をモニタする手段が、分配要素中に分配され、生物分子とは異なる波長で蛍光を発するフルオロフォアを含み、フルオロフォアの蛍光が検出器により検出され、制御ユニットが検出された蛍光を使用して、システムの分配要素および光学部品を較正し、またはシステムの蛍光検出をモニタする、請求項34記載のシステム。試料中の生物汚染物質を検出するためのキットであって、請求項18記載の装置;および生物汚染物質と関連する酵素に対する基質;を含み、試料中の生物汚染物質の存在または量を示す、キット。試料および基質をインキュベートするための容器をさらに含む、請求項36記載のキット。試料が、水、食品、生物試料および土壌から選択される、請求項36記載のキット。生物汚染物質が大腸菌および総大腸菌群から選択される少なくとも1つの微生物である、請求項36記載のキット。酵素が、βグルクロニダーゼおよびβガラクトシダーゼから選択される少なくとも1つの酵素である、請求項36記載のキット。少なくとも1つの基質が、ピレンβDグルクロニド、アントラセンβDグルクロニド、ピロメテンβDグルクロニド、ピレンβDガラクトピラノシド、およびアントラセンβDガラクトピラノシドから選択される、請求項36記載のキット。標的種を検出するための方法であって、標的種に特異的な抗体を試料と、抗体が標的種に結合することができる条件下で、混合する段階;蛍光分子を生成することにより結合抗体の定量が可能となる酵素を提供する段階;蛍光分子を分配させるための分配要素を提供する段階;および分配要素中の蛍光分子の蛍光を検出する段階;を含み、検出された蛍光が、試料中の酵素活性を示す、方法。抗体が酵素に結合される、請求項42記載の方法。酵素が、標的種に特異的な抗体に特異的な第2の抗体に結合され、複合体が、標的種に特異的な抗体および試料の組み合わせと混合される、請求項42記載の方法。蛍光が酵素基質反応の間中、連続して検出される、請求項42記載の方法。蛍光が、酵素基質反応中のある一定時間後に検出される、請求項42記載の方法。標的種が生物または化学汚染物質である、請求項42記載の方法。標的種が、細菌、原虫およびウイルスからなる群から選択される、請求項42記載の方法。発明の詳細な説明本発明の広範囲にわたる局面によれば、酵素活性に関連する生体分子の信頼性のある迅速検出のための方法および装置が提供される。本発明は、生物汚染物質、例えば微生物の酵素活性に関連する生体分子の検出に適用することができる。そのため、本発明の1つの実際の適用は、水および食品などの試料中の生物汚染物質の検出に関連し、この場合、汚染された水および食品の消費による汚染の蔓延および個人への感染を阻止するために、迅速な検出が重要である。本発明の別の実際の適用は、酵素レベルを決定するための、酵素免疫測定法などのアッセイ法における使用である。本明細書で使用されるように、生体分子という用語は、分子が自然で見出されるかどうかに関わらず、酵素反応の基質として機能することができる任意の分子、または酵素反応により生成させることができる任意の分子を表すことを意図する。むしろ、分子は生物学的であるとされる。効果的に、酵素に結合する、または酵素により代謝される、または酵素触媒反応により効果的に生成する、のいずれかであるからである。このように、合成基質およびその生成物は、この開示の目的では生物学的である。特に、本発明は、信頼性のある、迅速な酵素活性の検出を提供する。本発明によれば、標的酵素活性は、酵素に、フルオロフォアを含む基質を提供し、非常に低い生成物濃度の酵素基質反応蛍光生成物の蛍光を選択的に検出することにより、検出される。また、標的酵素活性は、酵素に、フルオロフォアを含む基質を提供し、基質の蛍光を選択的に検出することにより検出される。この速度は酵素基質反応が進むにつれ減少する。蛍光生成物または基質の選択的検出は、分配要素を有する光学プローブ、または単に分配要素を提供することにより達成される。この場合、生成物または基質は分配要素内に分配される。分配要素を有する光学プローブ、または分配要素は、分配要素に分配された生成物または基質の蛍光を検出するための適した光学ハードウエアに光学的に結合される。非常に低い生成物濃度での酵素基質相互作用の生成物または基質濃度のわずかな変化を検出することができると、迅速な検出が得られる。ほんの少量の生成物を生成させる、または少量の基質を除去するのに必要とされる時間は短いからである。そのため、微生物の存在が検出される態様では、検出に必要とされるのは、ほんの小数の微生物であり、このためインキュベーション時間は短くなる。本発明について主に酵素基質生成物の検出を参照して説明するが、本発明は基質の検出に同様に適用できることは理解されるであろう。本発明による酵素活性の検出は、標的酵素が活性である任意の培地中で実施することができる。この培地は対象分子、例えば酵素基質反応生成物の分配要素中への分配が可能なように十分流動性がある。適した培地は水性であり、流体または半固体であってもよい。一般に、本発明を使用して試料、例えば、水、食品、組織および体液などの生物試料、ならびに土壌中の標的酵素を検出する。いくつかの試料、例えば、一定の食品、生物および土壌試料の分析では、試料を適した培地と混合させる必要がある。本明細書で使用されるように、検出およびモニタリングは交換可能であり、オンオフに基づき、または連続して、酵素活性およびまたは微生物の存在を検出することを意味するものである。迅速検出のための酵素活性検出スキームを最適化するために、下記3つの基準を満たすべきである:1基質は高い速度定数で標的酵素と反応すべきである;2生成物は高蛍光性で、微量でも容易に検出される;3基質と生成物の間の蛍光の差は大きくなければならず、そのため溶液からの蛍光信号は酵素変換により変化する。これらの基準のため、従来の検出スキームの最適化にはかなりの制約がかかる。例えば、蛍光変化が必要なので、酵素による変換速度または生成物の検出限界の観点から所定の基質は最適でない場合もある。酵素に対しより良好な基質であり、または非常に蛍光性の生成物を有する蛍光発生性の候補は、基質自体が蛍光を発する場合、変換の検出を阻害し、適切でないかもしれない。本発明はそのような制約を克服する。フルオロフォアに対し報告されている最も低い検出限界の多くには、多環式芳香族炭化水素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、または有機金属化合物、例えばキレートランタニドが関係する。そのようなフルオロフォアは、従来の検出スキームでは、βグルクロニダーゼまたはβガラクトシダーゼ活性を検出するための基質において使用されていない。生成物に対しかなり異なる蛍光スペクトルまたは強度を有する対応する糖類との誘導体は知られていないからである。代わりに、現在使用されているフルオロフォアはほとんど全てのクマリン誘導体、例えばウンベリフェロンであり、これらはグルクロニドまたはガラクトシドとの複合体として許容される蛍光強度を有するが蛍光はずっと低い。対照的に、本発明は基質中でずっと広範囲のフルオロフォアを使用することができる。広範囲にわたる基質が報告されており、それらの多くが市販の検出用途で使用されている。溶液中の変換生成物の検出には、蛍光発生染料が好ましい。例えば、ウンベリフェロンおよびウンベリフェロン誘導体の複合体は、生成物と基質との間の蛍光の対比が良好であり、複合体のβgluまたはβgal酵素のいずれかとの反応に対する速度が迅速であるため、好ましい。他の基質、例えばジオキセタンもまた報告されている。溶解検出スキームでは色素生産性基質が使用されているが、膜またはゲル担持細胞検出において使用するのが好ましい傾向がある。例としてはインドリルおよびインドキシル複合体が挙げられる。本発明の1つの局面によれば、試料中の酵素活性に関連する生体分子を検出する方法が提供される。本明細書で使用されるように、生体分子という用語は、酵素基質または酵素基質反応の任意の生成物を意味するものとする。方法は、標的酵素または標的酵素と関連する生物汚染物質と基質とを混合する段階、混合物に励起光を照射する段階、および基質または酵素基質反応の任意の生成物のいずれかの蛍光を選択的に検出する段階を含む。好ましくは、酵素基質反応の蛍光生成物の蛍光が検出される。試料が実質的に液体または半固体でない場合、基質および試料は溶液中で混合することが好ましい。適した溶液としては、酵素活性を支持およびまたは促進することができる任意の溶液が挙げられる。細胞を使用する場合、適した溶液は、例えば、研究中の細胞の増殖を支持および促進するように選択される、適切な培地としてもよい。細胞およびほとんど酵素に対し、そのような溶液は水性である。酵素基質反応の生成物は、例えば、遊離蛍光分子とすることができ、その蛍光が検出される。本発明によれば、蛍光は、生成物と基質を区別する光学プローブにより検出され、そのため、生成物または基質の蛍光のみが検出される。特に、生成物または基質のいずれかの蛍光は、分配要素を単独で、または光学プローブと結合させて提供することにより検出される。分配要素により、生成物または基質のいずれかをその中に分配させることができる。蛍光を測定するための適した装置、例えば分光計またはフィルタ光度計に接続させると、分配要素光学プローブは、蛍光強度に伴い予測通りに変動する大きさを有し、生成物または基質濃度の関数である信号を発生させる。好ましい態様では、基質、生成物および分配要素の組み合わせが選択され、基質は検出されず、生成物が最低限の濃度で検出される。このように、生成物と基質の蛍光を区別することにより、上記第3の最適化基準が克服される。本発明は、任意の酵素活性の検出に適用することができ、ただし、そのような標的酵素に対する基質はフルオロフォアと結合することができること、標的酵素基質反応により蛍光生成物が生成すること、および蛍光生成物は本発明の分配要素光学プローブにより選択的に検出できることを条件とすることは認識されるであろう。化学結合を開裂させる酵素では、基質は酵素に結合する部分を含まなければならず、酵素が開裂する結合を介して蛍光生成物に結合される。他の酵素反応、例えば、生成物を形成させるための基質の化学変換のみが存在するいくつかのペルオキシダーゼ反応では、適した基質は、分配要素中に分配される生成物を提供するものである。本発明を使用して1を超える酵素の存在を検出することができ、これは、同時に1を超える微生物の種または株に対応するかもしれない。この場合、考慮中の各酵素に対し適した基質の使用が必要である。各異なる酵素基質反応の蛍光生成物が異なる波長で蛍光を発する場合、考慮中の各酵素の活性を検出することができる。また、各異なる酵素基質反応の蛍光生成物が同じ波長で蛍光を発する場合、少なくとも1つの酵素活性を検出することができる。好ましい態様では、本発明が関する酵素は、βグルクロニダーゼまたはβガラクトシダーゼである。そのような態様では、本発明は、水および食品などの試料中における、様々な株、ならびにストックNo413、EcoliB型および汚水分離ストックNosKS1およびKS2を含む大腸菌、および他の微生物、例えば、エンテロバクタークロアカ、シトロバクターフレウンデー、クブシエラニューモニア、シュードモナスアエルギノーザ、および総大腸菌群の存在を検出するための方法を提供する。βgluおよびβgalに対する適した基質は、それぞれ、グルクロニドまたはガラクトシド部分を有する任意の基質であり、ここで、グルクロニドという用語は、それらの任意の塩および遊離酸を含むものとする。適した基質の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない:ピレンβDグルクロニド;アントラセンβDグルクロニド;ピロメテンβDグルクロニド;ピレンβDガラクトピラノシド;およびアントラセンβDガラクトピラノシド。例えば、下記反応スキームで示されるように、βglu活性は、ピレンβDグルクロニドを用いて検出され、検出される生成物はヒドロキシピレンである:βglu活性をアントラセンβDグルクロニドで検出する場合、下記反応スキームで示されるように、検出される生成物はヒドロキシアントラセンである。βglu活性をピロロメテンβDグルクロニドで検出する場合、下記反応スキームで示されるように、検出される生成物はヒドロキシピロメテンである。βgal活性をピレンβDガラクトピラノシドで検出する場合、下記反応スキームで示されるように、検出される生成物はヒドロキシピレンである。実施例15~19は、多くのこれらの基質およびそれらの中間体のための合成を提供する。本発明の第2の局面によれば、蛍光分子を選択的に検出するための光学プローブが提供される。特に、光学プローブは分子のプローブ中への分配を提供し、この場合、検出された蛍光は、主にプローブ中に分配された分子の蛍光である。分子のそのような分配は、光学プローブの端に分配要素を配置することにより達成される。分配要素により、対象分子のみがその中に分配される。例えば、蛍光発生基質および蛍光酵素基質生成物を用いて酵素活性を検出するために、本発明は、基質または生成物分子のみが分配される分配要素を有する光学プローブを提供し、このため、基質または生成物のいずれかの蛍光が検出される。このように、光学プローブは基質および生成物のうちの1つのみからの蛍光を検出するので、基質および生成物の両方ともが蛍光性かどうかは重要ではない。基質の蛍光の消失速度、または生成物の蛍光の出現速度を測定することにより、酵素活性を測定することができる。好ましい態様では、生成物分子は分配要素に分配され、酵素活性は生成物の蛍光の出現速度を測定することにより決定される。上記のように、本発明による酵素活性の検出は、標的酵素が活性である任意の培地中で実施することができる。一般に、そのような培地は水性であり、流体であっても半固体であってもよい。図1に示される、1つの態様によれば、本発明の光学プローブ2は、一端に配置された分配要素3を有する光導波管、例えば光ファイバを備える。励起光源4および分光計6または光を検出するための他の適した装置を、カプラ7を介して光ファイバの反対端に結合させ、光が光源4から分配要素3まで進み、分配要素により受理された光は光学検出器6まで進むようにする。光源4の波長は対象の蛍光性標的分子の励起に適するように選択され、通常生体分子に対しては紫外線領域である。しかしながら、本発明は他の波長および標的分子に適用できる。適した光源の例は、発光ダイオード、レーザダイオード、およびレーザである。別の態様では、励起光源4はプローブと別々であり、そのためカプラ7は必要ない。標的分子に特異的な励起波長の選択およびまたは標的分子に特異的な発光波長のモニタリングにより、検出の特異性および選択性が改善される。図1の実施例では、プローブ2が、基質分子10および標的酵素12、または酵素を有する細胞12を含む試料溶液8中に浸漬される。細胞を使用する場合、膜18は任意に、細胞接着のために提供されていてもよい。基質分子10は標的酵素12により生成物分子14および蛍光性生成物分子16に変換される。分配要素3は基質分子または蛍光性生成物分子のいずれか、好ましくは後者をその中に分配させる。このように、生成物分子16は分配要素3中に分配され、そこで、光源4からの励起光が照射される。標的分子16から発光される蛍光は分光計6または他の適した装置により検出される。1つの態様によれば、光学プローブの分配要素は、光ファイバの一端に配置されたポリマ膜を含み、そのため、光ファイバのその端の光学開口が被覆される。図2Aは直径600μmの光ファイバ製のそのような光ファイバプローブの顕微鏡写真である。ポリマの物理特性を決定するポリマ材料の特性、例えば分子量および架橋度は、対象の蛍光性分子を選択的に分配させるように選択される。図2Bで示される好ましい態様では、光学プローブ100は光ファイバの一端に取り付けられた球状分配要素104を備える。光ファイバはコア102a、コーティング102bおよびジャケット102cを有する。光ファイバは、関連機器に容易に接続されるように、もう一方の端で適したコネクタ、例えば、SMAコネクタにより終端処理される。球状分配要素は、異なるポリマ調合物を用いて様々なサイズ、様々な剛性で調製することができる。一般に、約02mg~約03mgの球状分配要素を使用することができる。好ましくは、球状分配要素の直径は実質的には、使用した光ファイバの直径と一致する。発明者らは、600μmの光ファイバでは、実質的に等しい直径を有する球状分配要素を取り付けると、良好な性能が得られることを見出した。半球分配要素を光ファイバにとりつけることにより、性能をさらに改善させることができる。球の直径を損なうことなく、分配要素の体積を減少させるからである。図2Bに示されるように、例えば、ステンレス鋼製の剛性チューブ106を使用して、ファイバコア12aおよび球状ファイバジョイント108を保護することができる。ステンレス鋼はその強度および腐食耐性のため、剛性チューブ106のための好ましい材料である。球状ファイバジョイント108は分配要素104と実質的に同じ特性、例えば、屈折率を有するポリマ材料で作製され、球104を光ファイバおよび剛性チューブに取り付けるのに使用される。ポリマジョイントは剛性チューブの端を塞ぎ、液体が、チューブと、ファイバコーティングおよびジャケットの間に入らないようにする。そのような光ファイバプローブの作製方法を下記、実施例19において示す。例えば、上記pyrglu基質を用いた水溶液中のヒドロキシピレン生成物分子の検出に適した態様では、分配要素は、透明な疎水性ポリジメチルシロキサンエラストマーから構成される。ヒドロキシピレンは水溶液からPDMS中に分配され、一方、pyrglu基質はPDMS中に分配されない。このように、ヒドロキシピレンの蛍光は光学プローブにより検出される。PDMS膜中のヒドロキシピレンの出現速度は、試料溶液中の酵素濃度に対して直線性を有し、そのため、光学プローブからの信号対時間のモニタリングにより、酵素活性が測定される。異なる分子量および異なる架橋度を有する3つの適したPDMS材料の例はGERTV118、Sylguard186、およびSylguard184である。前駆体材料および硬化剤が提供されるポリマでは、前駆体材料の硬化剤に対する比率、硬化条件などの変数を変化させることができ、ポリマの物理特性が操作できる。他のポリマ、例えばGERTV118はすでに混合して供給され、空気に曝露されると重合する。分配要素に適した他の材料の例としては、ゾルゲル、樹脂、ゲル、複合物、吸着剤、PDMS以外のポリマ、ポリウレタン、ポリアクリレート、分子鋳型膜が挙げられるが、これらに限定されない。検出限界を最適化するためには、ファイバの光学開口における分配要素の体積を最大とするべきであり、一方応答時間を最小にするには、分配要素材料の断面を狭くすべきである。例えば、分配要素が膜である場合、要素の断面は約400μm~約800μm、好ましくは約500μm~約700μmとするべきであり、厚さは約800μm未満、好ましくは約600μm未満とするべきである。所定の標的分子を検出するために満足のいく性能を有する分配要素は、これらの特徴の間で妥協を示すであろう。ポリマ膜分配要素を円錐、球、または半球形状とすることにより性能をさらに増強させることができる。これにより、ポリマ膜中に分配されない標的分子の検出を阻害することによりプローブの選択性が増強され、試料からのバックグラウンド信号が制限される。検出時間を最小に抑えるための方策としては、例えば、増殖条件を最適化することにより細胞のインキュベーション時間を減少させること、分配要素光学プローブによる信号の発生に必要な細胞数を減少させることが挙げられる。後者は、生成物用の励起光源および検出器、細胞による生成物への基質変換速度、および生成物用の分配要素の1または複数の適合性を最適化することにより達成できる。本発明をそのように最適化すると、1つの細胞の検出時間が3~4倍、2~4時間に、改善される。蛍光性標的分子に関して詳細に説明してきたが、蛍光以外の光、例えば、バイオルミネセンスまたはケミルミネセンスを検出することにより、本発明を、酵素活性および微生物の存在の検出に適用することができるが、ただし、バイオルミネセンスまたはケミルミネセンス標的分子が光学プローブの分配要素中に分配できることを条件とする。本発明の1つの局面によれば、酵素活性を検出するための自動化システムが提供される。例えば、本発明による自動化システムを使用して、上記で詳細に記述したように、適した基質を使用すると、水、食品、または土壌試料中のグルクロニダーゼおよびまたはガラクトシダーゼ活性を検出し、大腸菌および総大腸菌群を検出することができる。自動化システムの1つの態様について、その概略図を図3Aおよび3Bに示す。システムは上記のような、分配要素を備えた光ファイバ2から作製される少なくとも1つの光学プローブ3、および関連光学部品、例えば適した光源4、分光計6または光を検出するための他の装置、光ファイバ束7、コネクタ8、カプラ5、など、試料入口および廃棄出口を備える容器26、適したハードウエア、ならびに光学プローブおよび試料インキュベータに接続され、例えば、試料インキュベータへの基質の添加および試料流速を制御するための制御ユニットコンピュータインタフェース22を備える。自動化システムはさらに、試料の温度、塩素濃度、pH、および濁度などの変数をモニタするための1または複数の追加のプローブ28を備えることができる。これらの変数は大腸菌および総大腸菌試験の時間および信号しきい値に影響することがあるからである。コンピュータインタフェース22はシステムの動作を制御し、対象となる酵素、このため微生物の有無に関連するデータを収集し、報告する。自動化システムのいくつかの用途では、例えば、水中の大腸菌およびまたは総大腸菌群の有無をモニタするために使用する場合、コンピュータインタフェースは、そのような微生物が検出された場合、水の流れを遮断するように構成することができる。図3Aに示されるように、システムは、光源からの励起光を光学プローブ分配要素に送達し、光学プローブから光検出装置、例えば分光計または電荷結合装置に蛍光を送達する光学パッケージを備える。1つの態様では、光学パッケージは二股ファイバ束である;すなわち、第1の光ファイバは第2および第3の光ファイバン端に一端で結合され;第2の光ファイバは光源と結合され、第3のファイバは光検出装置と結合される。3つのファイバの結合領域に、適合する屈折率流体が任意に提供されてもよく、散乱光が減少する。好ましくは、図3Aで示した部品は全て、光学プローブを除き、共通のシャシーまたはエンクロージャ内に備えられる。好ましい態様では、第1の光ファイバは600μmファイバ、ポリイミドコーティングおよびナイロンジャケットを備えた低OHファイバである。このファイバは、一端で適したコネクタ、例えばSMAアダプタにより終端処理され、光学プローブに接続される。第1のファイバの他端は第2および第3のファイバに結合される。第2および第3のファイバは第1のファイバと同じ直径であってもよいが、第2および第3のファイバのためにより小さな直径のファイバを使用すると、より良好な結合が得られる。特に、第2および第3のファイバ用に、400μmコア、ポリイミドコーティングおよびナイロンジャケットを備える低OHファイバを使用すると、600μmの第1のファイバに結合した場合に非常に良好な性能が得られる。励起光、例えば、UV光の第2ファイバの自由端内への結合は、ファイバの端と光源の間にレンズを配置することにより増強される。1つの態様では、レンズは球面レンズであり、例えば、MellesGriot、Ottawa、Ontario、Canadaから入手可能なサファイアボールレンズである。第3ファイバの自由端は光検出装置に結合される。光検出装置がCCDである態様では、第3ファイバの自由端は、光源の波長の光がCCDに到達するのを阻止するロングパス光学フィルタを介してCCD上の1または複数の画素と整合される。微生物の有無を調べるための水をモニタするための自動化システムは、一家族住宅、学校、病院、市営の建物など、および特に井戸を備えたそのような住居および施設、ならびに市の上水配給ネットワークに据え付けることができる。後者では、自動化システムは水源に、ポンピングステーションに、および配給ネットワーク内の様々な分岐点で取り付けられ、各自動化システムは適した通信ハードウエアソフトウエア24を用いて通信ネットワークに接続されることが予測される。そのような自動化システムは、汚染が許容されないレベルに到達した時、警告として、許容範囲と共に、様々な緊急レベル時に、および配給ネットワーク内で汚染が検出された場合、例えば、リアルタイム情報をオペレータに提供する。システムはまた、自動的に、影響を受けた分岐点で汚染された水の配給を遮断することもできるであろう。新規のまたは現存の水の配給システムへの据え付けを容易にするために、自動化システムは好ましくは、小型装置光源CCD分光計を用いてコンパクトな構造で提供される。1つの態様では、システムは、大腸菌および総大腸菌群を含む広範囲にわたる病原体に対する有無および細菌学的計数評価を送達することができる一体化された分配要素を備える試験カートリッジを使用する自動サンプラーユニットである。好ましくは、試験カートリッジは使い捨てカートリッジである。システムは上記原理に基づくが、光ファイバではなく、個々の試料が含有される一体分配要素を備えるカートリッジを使用する。分配要素は、光学プローブを用いて実施されるように、複数の試料と接触せず、このため、試料間での二次汚染の潜在的な原因が排除される。設計により、試験と試験の間に、光学プローブを洗浄する必要も排除される。好ましい態様では、システムは、連続光学経路完全性モニタリングおよび自己較正を提供する複数のフルオロフォアに基づく較正法を含む。システムは任意に、異なる病原体に対する複数の試験の実施を提供する。試験カートリッジは、特定の標的病原体、例えば大腸菌および総大腸菌群に対する細菌学的試験を実施するのに必要な要素を組み入れる。図3Cに示されるように、試験カートリッジ200は、自動化システムにおいて簡単な構造により容易に操作することができる滅菌内部含む密閉ケーシング202を備える。分配要素204、および粉末または液体形態の試験培地はハウジング202内に含まれる。上述ように、試験培地は1または複数のグルクロニドまたはガラクトシド基質材料を含み、各基質材料は標的フルオロフォアを含む。試験培地はまた、水性環境に溶解し較正および光学信号経路完全性のモニタリングのためのベースライン光学信号を提供する第2のフルオロフォア、ならびに標的生物の増殖を支持するための増殖培地を含む。試験培地は任意に、水試料から遊離塩素を除去するためのチオ硫酸ナトリウム;非標的微生物の増殖を阻害するための抗生物質;および標的病原体の存在下で反応し、試料中の標的病原体の存在を視覚的に確認できるように色の変化を生成する化合物を含んでもよい。図3Cに示されるように、ケーシング202のホールまたはポート206は、膜または隔膜により被覆され、この膜により、ケーシング内の滅菌野を保存するように、例えば、針を使用して隔膜を通して試料を注入することにより、試料をカートリッジ内に導入することができる。ケーシング202上には、整合または指標付マーク208も配置され、これらは自動的に感知することができ、自動化システムによるカートリッジの操作および配向が容易になり、カートリッジの識別が可能となり、サンプリングユニットを様々な標的病原体に対する様々な試験の型に適合させることができる。カートリッジには任意にさらに、その1または複数の内面にフィン、チャネルまたはボス210を備えることができ、カートリッジを回転または撹拌させる際に試料の混合が容易になる。図3Dでは、複数の試験カートリッジ200を保持するためのマガジン220が図示されており、カートリッジを端に向かって偏らせるためにスプリング222などが備えられる。図3Eは本発明の自動サンプラー装置の1つの態様の概略図である。装置は、試験チャンバ内に1または複数の試験カートリッジ200を保持するためのホルダ230を備える。試験カートリッジは、図3Dに示したようなマガジンから手動で、または自動的にホルダ内に装着されてもよい。マガジン内に装着された試験カートリッジは、たった1つの型の標的病原体のためのものであってもよく、または様々な標的生物のための試験カートリッジの混合が存在してもよい。例えば、試験カートリッジは大腸菌のみ、大腸菌と総大腸菌群の組み合わせ、および同様に、場合によっては他の標的病原体のためのものであってもよい。光電子工学試験整合センサ232と共に、試験カートリッジ上の指示器208により、装置は異なるカートリッジ間で識別することができる。ホルダ230はモータおよび駆動システム238を介して、カートリッジ200を保持、回転およびまたは撹拌させるための支持ローラ234、236を有する。装置はまた、水または他の試料をカートリッジ取り入れポート206を介して注入する試料注入器240を含んでもよい。また、カートリッジには、装置内に装着される前に、試料を注入してもよい。装置はまた、試料のインキュベーションのための加熱システム260を含んでもよく、その場合、例えば、加熱された空気がホルダ230を通って流される。装置は対象のフルオロフォアを検出するための光学部品を含む。光学部品は分配要素と共に、上記と同じ原理で機能し、光学経路は図3Eの点線により表される。このように、装置は、カートリッジ200の分配要素204を照射するための光源242、例えばUV光源、および分配要素中に分配された標的フルオロフォアの蛍光を検出するための光学検出器244、例えばCCDを含む。装置はまた、上記、較正フルオロフォアの照射および検出を行う光学部品を含んでもよく、これにより、較正およびまたは光学信号経路完全性のモニタリングのためのベースライン光学信号が提供される。そのような態様では、標的および較正フルオロフォアにより生成する蛍光は区別され、検出されなければならない。このように、例えば、分配要素から放射される蛍光を検出するための光学経路は、光学経路を2つのチャネルに分割するビームスプリッター250およびミラー252である。各チャネルは、対象のフルオロフォアの波長で光学フィルタ254、256を用いてフィルタ処理され、フィルタ処理された信号が検出される。装置は任意に、オペレータによる動作制御を可能とするコントロールパネル、データ収集処理表示装置、およびリモートコントロールインタフェースを含み、装置は監視制御およびモニタリング、データロギング、および診断システム、通常SCADAシステムと呼ばれる、とインタフェースされる。本発明の自動化水サンプラーユニットは、検出結果の信頼性を保証するいくつかの特徴を有する。例えば、上記のように、試験カートリッジは追加の蛍光分子を使用する。これにより、各試験カートリッジの分配要素およびシステムの光学部品の較正が提供でき、好都合である。較正フルオロフォアの別の好都合な機能は、試験を通して光学経路の連続完全性モニタリングを提供することである。光学経路の不具合により検出フルオロフォアのルミネセンスの検出ができなくなり、誤った否定的な結果が得られるからである。光学経路の完全性は、CCD系検出器を使用することにより保証される。ここで、CCDアレイ上の複数の画素を横切る照射により検出の冗長性が得られる。システムには任意に、下記のうちの1または複数が備えられてもよい:1肯定的な結果が得られるた場合の試料の再試験2有害水試料のバイオハザードの可能性を軽減するために、完了した水試験への塩素の注入3有害水試料の視覚的な確認を提供するための、基質への色指示薬の導入4試験カートリッジに埋め込んだ分配要素からの光学信号を収集するための自由空間光学感知技術の使用、または分配要素に摩擦により適合するインタフェースを提供するための研磨光ファイバセグメントの使用5試料の時間カスケーディングを提供する、または複数の標的病原体試験を提供する、のいずれかのため、複数の試験が平行して実施できる、試料注入器、加熱システム、および分配要素用の光学検出器からなる同じ装置内での複数の試験チャンバの含有下記は、試験サイクル中、本発明の自動化水サンプラーユニットにより実施される主な段階の例である:1試験サイクルは、コントロールパネルを使用して、またはSCADAインタフェースを介する遠隔起動コマンドにより作動される2試験チャンバは必要な温度まで予め加熱される3試験カートリッジはカートリッジマガジンから選択され、試験チャンバに装着される4試験カートリッジは、カートリッジを回転させカートリッジを整合させ、試験サイクル中に撹拌するローラ機構により係合される5整合試験ID指示器を用いて試験カートリッジを整合させ、隔膜を針注入器と整合させる6必要とされる体積の水試料を試験カートリッジに注入する。インライン流量計を使用して必要な試料体積を測定する7針注入器を、塩素またはアルコール溶液を用いて清浄にし、滅菌する8内部タイマーを作動させ、SCADA信号を試験型IDと試料開始時間と共に送る9試験カートリッジを連続して回転させ、確実に、基質を溶解させ、試験水試料と混合させる10水試料は、水溶性較正フルオロフォアを含む基質混合物を溶解する11光学経路を作動させ、較正フルオロフォアのベースライン示度に対しモニタする12試料の回転および撹拌を20時間までの試験時間の間維持する13試験時間全体を通して、較正フルオロフォアおよび標的フルオロフォアの両方の示度に対しモニタする14光学経路ステータス、病原体検出ステータス、および診断ステータスデータを、ロギングおよび報告のためにSCADAデータチャネルを介して定期的に送る15標的病原体の存在および推定数に対する警告を、聴覚および視覚的に、ユニットのフロントパネルに提供し、ロギング、報告、および運転動作のためにSCADAデータチャネルを介して送る16試験時間の終わりに、試料試験カートリッジを廃棄容器内に排出し、システムをリセットし別の試験を実施する本発明のさらに別の局面によれば、酵素活性を検出するためのキットが提供される。キットは、上記のように、光学プローブ、関連する光学部品および任意に、他の部品、例えばインキュベータを備え、好ましくはコンパクトで低コストであり、水や他の試料について大腸菌および総大腸菌群などの汚染微生物の存在に対し試験、モニタしたいと考える世帯主などの個人にとって、使用可能で手頃である。本発明のさらに別の局面では、酵素活性の測定が酵素結合免疫測定法と連結され、試料、例えば水中の様々な標的種、例えば化学および微生物汚染物質の検出が可能となる。酵素結合免疫吸着検定法が好ましい態様である。標的種の認識における特異性および選択性は、イムノアッセイ法において使用される抗体により与えられる。標的種の定量は酵素により生成する蛍光性種の検出により与えられる。標識は、分配要素を使用することにより上記のように検出される。本発明のアッセイ法は、任意の標準イムノアッセイ法において使用される任意の酵素、例えば、アルカリホスファターゼを使用することができる。APまたは他の酵素活性をモニタするために、蛍光性化合物に結合されたリン酸部分を有する基質を使用する。この場合、生成蛍光化合物は、光学プローブの分配要素に分配されるものである。イムノアッセイ法により検出することができる汚染物質のクラスとしては、ホルモン、エストロゲン化合物、殺虫薬、生物毒素、多核芳香族化合物、およびポリ塩化ビフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの局面のいくつかの態様では、EIAは競合的結合アッセイ法を含む。第1の態様では、酵素は化合物に結合され、複合体は、抗体への結合に対し、標的化合物と競合することができる。これにより抗体と錯化された一定量の複合体が得られ、この量は存在する標的化合物の量に逆比例する。較正または競合的結合プロットは、最初に未結合複合体から抗体錯体を単離し、一連の標準標的汚染物質濃度に対し酵素活性を測定することにより作成される。下記実施例20を参照のこと。競合的結合を使用する第2の態様では、第2の標識を化合物に結合させ、第2の標識化合物複合体が、抗体への結合に対し、標的化合物と競合することができるようにする。競合的結合段階後、第2の標識に結合する第2の抗体を添加し、第2の抗体は酵素に結合する。上記のように、抗体錯体は未結合複合体から分離され、錯化標識の量は元の試料中の標的化合物の量に逆比例する。本発明の別の態様では、EIAは標的化合物の検出のためにサンドイッチアッセイ法を含む。そのような態様は一般に、生物汚染物質の検出に好ましい。サンドイッチアッセイ法の例では、対象の標的に特異的な抗体が固体担体上に固定される。試料を担体表面上に導入する。標的を有する汚染物質が抗体に結合し、固定される。固定された汚染物質の数を決定するために、汚染物質を認識しそれらに結合する第2の抗体を添加する。第2の抗体は、非標識であってもよく、または前もって酵素に結合させることができる。第2の抗体が非標識である場合、酵素に結合する第3の抗体を添加し、第3の抗体は第2の抗体を認識し、それに結合する。いずれにせよ、この手順の結果は、元の試料中に存在する標的汚染物質の数に正比例する固定酵素の量である。選択した酵素により生成物、好ましくは蛍光生成物が生成し、これが本明細書で記述されるように検出される。周知の汚染物質レベルを含む一連の標準溶液に対し酵素活性を測定することにより検量線プロットを作成する。本発明のこの局面によれば、EIAを使用して、試料、例えば水、食品、生物試料および土壌中の生物汚染物質、クリプトスポリジウムアルブウム、およびシュードモナスアエリギノーザを検出することができる。好都合なことに、汚染物質自体の生物活性の測定では検出できない生物汚染物質の検出に使用することができる。イムノアッセイを都合よく使用することができる生物汚染物質のクラスとしては、細菌、原虫、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。各クラスの特定の例としては、細菌については、大腸菌0157H7、シュードモナスアエルギノーザ;原虫については、クリプトスポリジウムパルブウムおよびギアルジアランブリア;ならびにウイルスについては、ノーウォークおよびSARSウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特に、アッセイ法は試料中のギアルジアランブリア、クリプトスポリジウムアルブウムおよびシュードモナスアエリギノーザを検出するのに有益である。これらの生物はグルクロニダーゼまたはガラクトシダーゼを有しておらず、このため、上記これらの酵素に基づく検出スキームに適しているからである。本発明は酵素活性の測定に対し、現在の方法を超える明確な利点を有する。例えば、通常使用される方法は、基質が生成物に変換されると、光学特性が変化する基質生成物の組み合わせを使用する。いくつかの基質は入手可能であり、酵素変換でかなりの光学変化が起こるが、この変化に対する要件により使用できる基質がかなり制限される。βgluなどの酵素は、通常加水分解による化学結合の開裂を触媒するが、これは基質からの酸素結合置換基が除去され、ヒドロキシ基にとって代わられることを意味する。そのため、従来の基質は、エーテルからヒドロキシル形態への変換において、かなりの光学変化をうける化合物に限定される。いくつかの化合物、例えばヒドロキシクマリン化合物はそのような変化を受ける。多環式芳香族炭化水素を含む、より感度よく検出することができる多くの他の化合物は、そのような変換では、光学特性の有意の変化が起こらない。対照的に、本発明では、生成物は、光学プローブの分配要素への分配差に基づき基質から区別される。これは、化合物の化学特性の変化が必要とされる、すなわち、分配要素に分配されない形態から分配される形態への変化が必要とされるが、光学特性の変化は必要ないことを意味する。その結果、従来の方法では使用できない広範囲の化合物が、本発明による基質として使用することができる。例えば、PAHは生成物への変換前後の両方で蛍光を発する、適した基質である。βglu活性の検出に関係する上記態様では、pyrgluはPAHのグルクロニド形態であり、実質的には水溶性であり、PDMSのような疎水性膜中に分配されない。生成物HPはずっと極性が低く、PDMS中に容易に分配される。本発明は、さらに利点を提供する。蛍光励起および発光に対する全光学経路は、光学プローブ内部に含まれ、特に、分配要素内に含まれ、光は測定における溶液を貫通しなくてもよい。これは、酵素活性は、不透明なまたは高散乱培地で直接検出されてもよいことを意味する。プローブ分配要素は連続してモニタされる信号を提供し、これにより、酵素活性測定において必要とされる動力学の解析が容易になる。最後に、プローブ分配要素の感度は、分配要素中の化合物濃度の溶液中の濃度に対する比率として規定される、生成物に対する分配定数により部分的に決定される。Kfsが1より大きい場合、生成物は分配要素中に前濃縮される。Kfsに対する値が大きくなるほど、検出感度が高くなる。PAHに対しては、10000またはそれ以上の値が典型的である。引用した文献全ての内容は参照により本明細書に、全体として組み込まれる。本発明について下記の限定されない実施例によりさらに説明する。実施例1光学プローブ光学プローブを、1mの長さの一本の直径600μmのナイロンに被覆されたシリカファイバから作製した。ファイバの第1の端を他の機器との光学インタフェースのために準備し、分配要素をファイバの第2端に取り付けた。ファイバの第1端は4cmのクラッドを除去し、ファイバにセラミックブレードでスコアリングし、ねじって引っ張りファイバを破壊し平面を残すようにすることにより準備した。分配要素に対しては、透明な疎水性ポリジメチルシロキサンエラストマー膜をファイバの第2端に適用した。プローブを異なる分子量開始材料および異なる架橋度を有する3つのPDMS材料から作製した。GERTV118膜を、50mgのPDMS前駆体材料を300μlのジクロロメタンと混合し、その後、混合物が粘着性を示すまでDCMを蒸発させることにより作製した。18ゲージシリンジの先端を使用して、粘着性PDMSのビーズをファイバの露出した先端に適用し、ビーズを24時間室温で硬化させた。Sylguard186膜を、ベース材料および硬化剤を101の体積比で混合することにより作製した。この混合物を3倍の体積のジクロロメタンに溶解した。DCMを蒸発させ、この混合物を5時間室温で硬化させた。18ゲージシリンジの先端を使用して、混合したSylguard186のビーズをファイバの露出した先端に適用し、ビーズを48時間室温で硬化させた。この型のビーズの例を図2に示す。その後、ビーズを、小刀を用いて調整し、励起光経路に直接存在しないエラストマーを除去した。小刀を使用して円錐状の端も作製し、プローブ体積およびバックグラウンド散乱を減少させた。Sylguard184膜を、上記Sylguard186手順を繰り返すことにより作製したが、ずっと薄い膜を作製した。より厚い膜を得るために、調製したファイバを90°Cのオーブンで30分間垂直に配置した。Sylguard184をベース材料および硬化剤を101の体積比で混合することにより作製した。ファイバがまだ温かい間、選択を混合Sylguard184と接触させた。これにより、エラストマーがファイバ先端上で急激に硬化した。膜が適当な寸法のビーズに類似するまで、複数回、これを繰り返した。その後、ビーズを小刀を用いて調整し、励起光経路に直接存在しないエラストマーを除去した。実施例2光学プローブの実験的設置およびキャラクタリゼーション実験的設置を図4に示す。この設置では、励起および発光スペクトルの走査、時間の関数としての、固定波長での発光のモニタリング、およびセンサ時間応答曲線の作成が可能である。一定長の光ファイバ2から作製した光学プローブ3を、光学カプラ5および光ファイバ7を介して励起光源4および分光計6に接続した。光源4は、キセノンランプに結合されたコンピュータ制御の走査モノクロメータを含み、励起波長が選択された。分光計7は光電子増倍管検出器を備えた同様のモノクロメータを含み、より長い波長での発光をモニタした。上記手順を用いていくつかの光学プローブを調製した。光学プローブの初期キャラクタリゼーションを、生成物化合物、1ヒドロキシピレンを、プローブを含む溶液に直接添加することにより実施した。GERTV118を用いて作製したプローブの応答時間を図5に示す。このプローブでは30~40分で平衡が起こり、他のプローブは同様の応答時間を示した。平衡後、プローブにより検出した蛍光は図6に示されるように、HP濃度に対し直線性を有した。基質ピレンβDグルクロニドに対する同様のプロットでは勾配が0であり、基質は検出されないことが示された。実施例3酵素活性の検出酵素活性を検出するためのプローブの動作を、プローブを基質溶液に挿入し、安定化させ、その後に酵素を添加することにより証明した。初期遅延後、蛍光の増加が30分にわたり観察された。20分~30分の曲線の勾配を相対酵素活性の測定値として使用した。様々な基質レベルでの測定酵素活性をプロットすることにより、最適基質濃度は10μMであると決定した。この濃度をその後の実験で使用した。測定した酵素活性対添加した酵素量のプロットは直線であり、プローブにより酵素活性が定量でき、10ngmlもの少ない酵素レベルが検出できることが示された。実施例4大腸菌の光学プローブ検出大腸菌B細胞数を、光学密度および平板計数測定の組み合わせにより決定した。様々な初期細胞数を含む試料を、標準Luriaブロスおよび10μMの基質を添加したガラスバイアル内に入れ、インキュベーション時間を370±01°Cで維持した。試料に光学プローブを挿入し、時間の関数として蛍光信号をモニタすることにより、試料を一度に試験した。1~10時間後、1または複数の大腸菌細胞が試料中に最初に存在すれば、信号は急激に増加した。対照実験では24時間後、何の応答もなかった。プローブを試料中に挿入した時間と信号発現の間の時間は最初に添加した細胞数に反比例し、細胞増殖の動力的分析モデルと一致した。実施例5大腸菌増殖の動力学および大腸菌の定量獲得した信号対時間データは、細胞増殖に対する単純な動力学的モデルを用いて記述することができると仮定する。この場合、光学プローブは生成物濃度を報告し、この濃度は存在する細胞数の関数である。この仮定を用いると、光学プローブは、検出容器中で臨界数の細胞が発生すると正の信号を提供する。試料中の最初の細胞数をC0、検出に必要な数をCd、細胞数が2倍になる時間をt2、検出に必要な時間をtdと規定する。任意の時間の細胞数は下記のように書け:および検出時間では下記のようになる:これは下記のように変換でき:これは、下記のように配列し直される:ピレンβDグルクロニド基質を用いて、周知のC0を有する一連の実験を実施し、検出までの時間tdを決定した。In対tdのプロットは直線であり、勾配からInt2、および切片からInが得られた。得られたプロットの線形回帰から、倍加時間t2を計算すると、203分であり、検出のための細胞臨界数Cdを決定すると3×108であった。プロットの線形性により全体的な挙動に対するこのモデルが支持され、検出前の時点の細胞数を計算する。これを使用すると特別な曲線を得ることができ、例えば、C01細胞、および任意の特定の時間では、我々は存在する細胞数を推定することができる。未知の試料に対し特定の時間で検出が起こると、同じプロットを使用して、最初に存在した細胞数を決定することができ、そのため試料中の大腸菌の定量が可能である。これにより試料および参照実験に対し同じ倍加時間が仮定される。これらはより広い範囲の試料に対し決定することができる。この実験を繰り返し、3つの他の基質を用い、大腸菌および総大腸菌群の検出のために、Log対検出時間の較正プロットを作成した。図11Bは、アントラセンβDグルクロニド基質を用いた様々な初期細胞数での大腸菌検出時間を示す。これらの実験は、35°Cで撹拌した100mLの試料を用い、075mgの基質および大腸菌株25922を用いて、実施した。図11CはピレンβDガラクトピラノシド基質を用いた、様々な細胞数での総大腸菌群検出時間を示したものである。大腸菌は大腸菌クラスに入るので、試験生物として大腸菌B型を用いて検出を証明する。これらの実験は、37°Cで撹拌した10mL試料を用いて実施した。図11Dは、アントラセニルβDガラクトピラノシド基質を用いた、様々な細胞数での総大腸菌群検出時間を示したものである。大腸菌は大腸菌クラスに入るので、試験生物として大腸菌25922を用いて検出を証明する。これらの実験は、37°Cで撹拌した20mL試料を用いて実施した。実施例64つの大腸菌株の検出大腸菌Bをカナダ、オンタリオ州、キングストン所在のキングストンクイーンズ大学の研究グループから獲得した。株ATCC25922をアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。株KS1およびKS2をキングストン市から流れ出る下水処理プラントから単離した。野生型または天然株を表す。これらの株を上記分析にかけた;すなわち、各株は増殖して信号発現時間が得られるので、pyrglu基質を用い、プローブ信号対時間を追跡した。信号は最初に存在する細胞数に関連する。ATCC株およびキングストン下水株の1つに対する結果を図12Aおよび12Bにおいてプロットする。図12AおよびBからわかるように、全ての曲線の勾配は等価である。これらのプロットのy切片は、最初の試料中で1つの細胞を検出するのにかかる時間を予測する。勾配が同一であるが、y切片がわずかに異なるという事実は、増殖が始まる前の各株に対する遅延または蘇生時間の差を示すかもしれない。これにより、実際の試料に対する信号発現時間から引き出すことができる細胞数推定値には約1オーダーの大きさの範囲が存在する。実施例7アントラセングルクロニド基質アントラセンβDグルクロニド基質について、pyrglu基質と同じように試験した。antglu基質はピレン基質と実質的に同一に機能した。この基質の検出に対する励起および発光波長はわずかに長く、このため、小型分光計部品を使用する際にいくらかの改善が提供される。例えば、いくつかの構造において励起のために使用される紫外光発光ダイオードは、375nmで極大出力を有し、これはヒドロキシピレンを励起するための極大波長よりわずかに長いが、ヒドロキシアントラセンを励起するための極大波長により近い。実施例8ガラクトシダーゼ酵素に対するピレンガラクトピラノシド基質ガラクトシダーゼ活性の検出のための基質、ピレンガラクトピラノシドを合成し、大腸菌Bを用いて試験した。大腸菌に対するグルクロニダーゼ試験と類似する、ガラクトシダーゼ酵素試験を総大腸菌群細菌の指標として使用する。この基質からの生成物はグルクロニダーゼ生成物、すなわち、ヒドロキシピレンと同一であるので、本発明の方法および光学プローブはpyrglu基質を用いても機能するが、ただし、ガラクトシダーゼ酵素が発現することを条件とすることが予測された。何百万もの細胞および数千の細胞を含むと推定される試料に対する初期の結果はグルクロニダーゼ試験と実質的に等しい。実施例9大腸菌試験の比較カナダオンタリオ州キングストンまたはその付近の現地淡水源からの水試料を現地の認可研究所に送達し、標準メンブランフィルタ法を用いた大腸菌分析を実施した。基準研究所は、各~200mL試料から10mlの体積を分析用に取り出し、その後残りの試料を発明者らに届けた。各試料10mlを栄養ブロス濃縮物10mlと混合し、20mlの標準培地を得、これにpyrglu基質を添加した。試料を37°Cの浴に入れ、撹拌バーおよび光学プローブを追加した。蛍光をモニタし、各試料に対し検出時間を決定した。陰性試料は少なくとも20時間後、有意の蛍光信号を示さなかった。これらの試料の最初の組に対する結果を使用して、td応答を較正すると、図14に示す大腸菌曲線が得られた。この較正を使用してその後のtd結果を、各試料に対する単位体積あたりの細胞数に変換した。比較の結果から、とりわけ0~25CFU範囲では、本発明と標準研究所技術との間で良好な一致が示された。表1に、2つの方法の定性的な比較を示す。表1ではデータを有無のフォーマットとし、1細胞レベルでのサンプリング統計偏差が許容される。比較から、試料の陽性および陰性分類間で完全な一致が示される。この比較により、本発明が基準研究所技術よりも多くの利点を有し、性能に何の犠牲もないことが証明される。例えば、本発明は、より迅速で、必要とされる試料操作が少なく、視覚による計数、観察、またはヒトの介入がない光学検出が提供され、過剰増殖およびまたは不透明試料において使用することができ、広いダイナミックレンジを有し、そのため希釈が必要でない試験を提供する。表1有無モードでの大腸菌の検出に対する本発明および基準研究所技術の比較実施例10総大腸菌群の検出実施例9の試料のサブセットを、pyrgelを用いる総大腸菌群分析のために選択した。基準研究所はこれらに対し総大腸菌群決定を実施していないので、最確数定量法を用いたTC結果を提供する、市販の定量システム、IdexxLaboratoriesIncWestbrook、MEを使用する別個のTC試験も、試料について実施した。初期の結果を図13に示す;しかしながら、このデータの対数線形フィットに対する数値を確認するにはより多くのデータが必要であることに注意すべきである。そのため、この曲線が図14の大腸菌曲線と異なるかどうかについては結論づけることはできない。それらの2つの曲線は異なる汚染範囲をカバーしているからである。どちらの曲線も実際の試料を使用しており、存在する総大腸菌生物の実際の株にはランダムな変動があり、そのため、全体の性能は大腸菌試験と類似することが予測されることが強調されるべきである。。実施例112アントラセニルβDガラクトピラノシドの調製2アントラセニルβDガラクトピラノシド4を図15で示したスキームにより調製した。アセトブロモガラクトース1を用いた相間移動条件下での2ヒドロキシアントラセン2のグリコシル化により、Zemplen条件下で脱保護されて4となる複合体3が良好な収率で得られた。実施例121ピレニルβDガラクトピラノシドの調製1ピレニルβDガラクトピラノシド7を実施例11と同様の様式で、1ヒドロキシピレンおよびアセトブロモガラクトースから調製した。図17に示されるように、2ヒドロキシアントラセンおよび1ヒドロキシピレンのグリコシル化もまた、アグリコンをペンタアセチルガラクトース6と縮合させることにより実施してもよいが、複合体6の収率は高くない。実施例13アントラセンβDグルクロニドの調製アントラセンβDグルクロニドを、図18で示したスキームに従い調製した。2ヒドロキシアントラセンをトリメチルシリルエーテル10に変換しその溶解度を増大させた。トリメチルシリルエーテル10を三フッ化ホウ素エーテルの存在下、トリクロロアセトアミデート9に結合させた。乾燥メタノール中でのナトリウムメトキシドによる得られた複合体11の脱保護後、水を添加すると、ナトリウム塩12が溶液から結晶化した。この塩を、シクロヘキシルアンモニウムアセテートとの塩交換により、シクロヘキシルアンモニウム塩13に変換してもよい。イソブチリルトリクロロアセトアミデート14を使用して、図19のスキームに示されるように、複合体15を介してアントラセンのグルクロニドを調製してもよいが、収率は改善されない。実施例142アントラセニルβDガラクトピラノシド4の調製テトラOアセチル2アントラセニルβDガラクトピラノシド3の調製テトラOアセチル1ブロモ1デオキシガラクトース1、2ヒドロキシアントラセン2、硫酸水素テトラブチルアンモニウム、ジクロロメタンおよび15M水酸化ナトリウムの混合物を室温で一晩中、激しく撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水、satd塩類溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで希釈した。溶媒を蒸発させると、褐色のゴムが得られた。これを、シリカゲルクロマトグラフにかけ、溶離剤としてジクロロメタン、その後に391ジクロロメタン酢酸エチルを用いると、化合物3が金色泡沫として得られた。乾燥メタノールに溶解したテトラOアセチル2アントラセニルβDガラクトピラノシド3の溶液を室温で撹拌し、0052Mのナトリウムメトキシドを含むメタノールで処理した。20分後、白色沈澱が形成し始めた。一晩中撹拌した後、生成物を濾過し、少量のメタノールで洗浄し、その後、吸引して乾燥させると、クリーム状の白色固体、148mgが残った。実施例151ピレニルβDガラクトピラノシドの調製1ピレニルβDガラクトピラノシドを、実施例14で記述した様式と同様の様式で、調製した。Tlcは、単一のスポットRf014を示した。実施例16メチルトリOアセチル2アントラセニルβDグルクロニド11の調製2ヒドロキシアントラセントリメチルシリルエーテル10の調製乾燥ピリジンに溶解した2ヒドロキシアントラセンの溶液に、クロロトリメチルシランを添加した。直ちに沈澱が形成した。一晩中室温で撹拌した後、トルエンを添加し、混合物を濾過した。固体をさらにトルエンで洗浄し、濾液を合わせ、揮散させると、橙色の結晶固体が残った。残渣をトルエンに溶解し、再び濾過し、微量のピリジン塩酸塩を除去した。溶媒の蒸発により橙色の固体が得られ、これを高真空下で乾燥させると、定量的収率のトリメチルシリルエーテルが得られた。これを以下で、精製せずに使用した。25mLのナシ状フラスコに2ヒドロキシアントラセントリメチルシリルエーテル10およびイミデート9を入れ、窒素でフラッシュした。粉末状の、活性化した3オングストロームのモレキュラーシーブを反応フラスコに直ちに添加し、これに窒素を再びフラッシュし、氷中で冷却した。乾燥ジクロロメタンを添加し、混合物を30分間、氷冷しながら、撹拌した。三フッ化ホウ素エーテルを最後に添加すると、反応物は直ちに灰緑色に変わった。反応混合物を一晩中窒素下で撹拌し、徐々に室温まで温めた。メタノールを添加し、10分間撹拌することにより反応をクエンチした。固体を濾過して除去し、ジクロロメタンでよく洗浄した。濾液を合わせ、蒸発させると、褐色の泡沫が残り、これをジクロロメタンに溶解し、シリカゲルで処理し、再蒸発させた。残渣をジクロロメタン中で準備したシリカゲルカラムの上に添加し、この溶媒で溶離した。生成物を含む画分を合わせ、蒸発させると、くすんだ黄色の固体が残った。酢酸エチルからの結晶化により、オフホワイトの固体が得られた。実施例172アントラセニルβDグルクロン酸、ナトリウム塩12の調製メチルトリOセチル2アントラセニルβDグルクロニド11を乾燥メタノール中に懸濁させ、氷浴中で窒素下冷却した。これに、0678Mのナトリウムメトキシド溶液を添加した。混合物を一晩中撹拌し、徐々に室温まで温めた。生成物が溶液から沈澱するにつれ、固体が徐々に消費された。次の日、水を添加し、撹拌を室温で続けた。微細な沈殿物を濾過し、少量のメタノールで洗浄し、吸引して乾燥させると、生成物がオフホワイトの固体として得られた。実施例182アントラセニルβDグルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩13の調製ナトリウム塩12をメタノールおよび水に溶解し、加熱して沸騰させた。溶液を、パスツールピペットに含まれる組織プラグを通して濾過し、熱水を用いて洗浄した。熱濾液に酢酸シクロヘキシルアンモニウムを添加し、得られた溶液を冷却しながら撹拌した。氷中で冷却すると、シクロヘキシルアンモニウム塩が結晶化し、これを濾過して淡黄色固体として収集した。実施例19ポリマー球分配要素光学プローブの調製および評価この実施例は、シリコーンまたはポリジメチルシロキサン球分配要素光学プローブの調製および評価について記述する。PDMSは中性極性を有し、そのため疎水性である。この特性により、材料は水に浸漬されると、コンパクトな形状、すなわち球を形成する。この実施例で記述した分配要素のために使用されるPDMSは水よりもわずかに密度が高く、そのため、材料の球は水溶液の底に沈み、バイアルの底面に接着する。材料が硬化して剛性ポリマとなると、密度がわずかに増加する。我々は、懸濁中に硬化するのに十分長く球が浮かび続けるように、密度勾配を有する極性バッチ溶液を使用するスキームを開発した。バッチ溶液を下記のように調製した。酢酸ナトリウム三水和物14gおよび水4mLの溶液を、20mLのガラスバイアル中で完全に混合することにより調製した。その後、95エタノール4mLを同じバイアルに撹拌せずに徐々に添加した。酢酸ナトリウム層はPDMS材料および硬化シリコーンよりも極性および密度が高いが、アルコール層は前駆体材料よりもかなり極性であるが密度は低い。溶液中に浸漬させると、ポリマ材料の球は直ちに、2つの別個の層の間の混合層に向かって移動し、そこで懸濁されたままとなる。球は混合層では横方向に移動せず、そのため、PDMS材料を溶液に注入することにより単一のバイアル中で多くの球を作製することができる。バッチ溶液により、各球に対し同一の形状が確保されるが、球のサイズは注入したPDMS材料の量に依存する。前駆体シリコーンの粘度が高いため、正確な体積注入のために標準の実験用ピペットおよびシリンジを使用することができない。そのため、前駆体材料に溶媒を添加し、その粘度減少させる。ポリマの硬化段階中に、溶媒は単純に拡散し、または蒸発してしまう。ジクロロメタン、ヘキサンおよび他の有機物などの多くの溶媒を使用して、前駆体材料を溶解することができるが、これらの溶媒はエタノールまたは水中に完全に混和せず、そのため、シリコーンは、硬化すると、バッチ溶液の表面まで徐々に上がってくる。テトラヒドロフランは前駆体物質を溶解し、徐々にエタノール中に消散することができる溶媒であり、バッチ溶液の混合層中にシリコーン球が残り、生成収率は90~100である。再現性のある注入物に必要とされるTHFの量は、使用するシリコーンの型およびブランドにより変動する。約12mgの球質量では、DowCorningSylguard184シリコーンを用いる場合シリコーン前駆体1gにつきTHF045mLが必要であり、UnitedChemicalTechnologiesシリコーンを使用する場合シリコーン1gにつきTHF06mLが必要である。較正ピペットおよびシリンジを使用して、シリコーン溶媒をバッチ溶液に注入することができる。1~3mgの球を調製する場合、シリンジを用いるとより良好な再現性が得られる。シリンジを使用する場合、シリンジバレル上のゲージを都合よく使用して、バッチ溶液に注入するシリコーン溶媒溶液の体積を設定することができる。ポリマ溶媒をシリンジ中に入れるとすぐに、針をふき取り清浄にし、バッチ溶液のエタノール層中に挿入する。一滴のポリマ溶液が針から離れ、直ちにバッチ溶液の境界層に落下するまで、針プランジャを徐々に加圧する。針をエタノール層の他の位置まで移動させ、別の一滴を針から絞り出す。このように、かなりたくさんの球を20mLバイアル中で作製することができる。シリンジをバッチ溶液から注意深く取り除き、その後、バイアルにふたをかぶせ、室温で硬化時間が経過するまで静置する。バッチ溶液から固体ポリマ球を除去するために、球より細孔サイズが小さいプラスチックフィルタ漏斗を使用してバッチ溶液を濾過する。その後、保持した球を95エタノールで洗浄し、残留酢酸ナトリウムを除去し、乾燥させる。乾燥すると、ポリマ球を計量し、質量により分類する。ポリマ球分配要素光学プローブの性能上記のようにポリマ球分配要素を大量生産するために使用されるバッチプロセスにより、シリコーン球が一貫したサイズ、形態、および光学透明度を有することが確保され、これにより光学プローブの検出限界が改善される。その結果、平衡時間、一定の生成物溶液、例えばヒドロキシピレンまたはヒドロキシアントラセン中での信号生成、および球を用いて作製した光学プローブの較正が標準化される。上記のように、シリコーン球の調製には、様々なPDMS調合物を使用することができる。様々な調合物によりポリマの物理特性が変化する。例えば、DowCorningSylgard184では、高い架橋度およびヒュームドシリカなどのフィラー材料の添加により、非常に剛性のポリマが形成される。このポリマは、アルコール溶液中で、分解に耐え、膨潤を最小に抑えることができるので、溶液中での寿命が非常に長い。この調合物の欠点は、1mgの球が生成物溶液中で平衡に達するのに3時間必要となることである。UnitedChemicalTechnologiesシリコーンから作製した1mgの球は1時間で平衡に達する。この球は、ヒュームドシリカが不足し、架橋度が低いため、Sylguard184を用いて作製した球よりも剛性が低いが、膨潤および分解を受けやすい。架橋度は両方の調合物において制御することができ、表2に示すように、1~3時間の平衡時間を有するポリマが達成される。表2球を作製するための2つのブランドのPDMS材料の調合物実施例20光学プローブを用いた酵素イムノアッセイ法導入この実施例は、17βエストラジオールの検出のためのイムノアッセイ法における、上記のようなPDMS分配要素を備えた光学プローブの使用について記述する。標準イムノアッセイキットをこの目的のために使用した。AssayDesigns’sCorrelateEIA17βEstradiolキットは生物および環境試料におけるE2の定量のための競合イムノアッセイ法である。標準または従来のアッセイ法手順を以下、説明する。E2を含むかもしれない試料または標準溶液を、マイクロタイタプレートのマイクロウエル内に、アルカリホスファターゼ酵素標識に付着されたE2を含む第2溶液と共に入れる。E2に対するポリクローナル抗体をマイクロウエルに添加する。これは予め、antiE2を不可逆的にマイクロウエル表面に結合させる別の抗体で被覆されている。固定された抗体分子の数に対し、過剰のAPE2を添加する。E2およびAPE2の両方の競合的結合が起こり、APE2の固定量は、混合物中のE2の量と反比例する。結合時間後、残留試料および試薬を洗浄して除去すると、マイクロウエル中には固定されたAPE2およびE2抗体複合体のみが残る。基質溶液を添加し、酵素活性測定により、固定されたAPE2量を決定する。着色生成物を生成する基質とAPとの間の反応をモニタする。市販のキットは通常、基質としてpニトロフェニルホスフェートを、生成物としてpニトロフェノールを使用する。酵素活性を定量するために、生成した黄色を、連続してまたは一定インキュベーション時間後に405nmでの吸光度として測定する。モニタした信号は吸光度対時間曲線の勾配または一定時間モードで測定した吸光度の値である。信号はAPE2のみを含むブランクで最大であり、試料中のE2レベルの増加に伴い減少する。ブランク溶液の信号に対する任意の試料の信号は、APE2の相対結合の測定値であり、しばしば、結合した割合またはパーセンテージとして表される。標準溶液に対する結合割合対E2濃度のプロットはアッセイ法に対する検量線を提供し、これを使用して、未知の試料中の濃度が決定される。そのようなイムノアッセイ法において使用される検出機器は、通常ベンチトップマイクロタイタプレートリーダーである。これは精密で高価な機器であり、動作させるには幾人かの熟練者が必要であり、維持費が嵩む。また、マイクロプレート付属品を備えた従来の分光計を使用することができる。他のイムノアッセイ法はより大きな容器内で実施され、検出はベンチトップまたは携帯分光計で実施されるが、これらは、より多くの試料体積を使用し、1試料につきより多くの試薬を使用し、このため、より高いコストで動作する。携帯用またはフィールドバージョンは通常、精度および検出限界が低い。他の携帯用イムノアッセイは視覚的読み出しによるテストストリップを使用するが、これらは通常、定量的な結果を提供することができず、検出限界がよくない。ここで、酵素活性を検出するための光学プローブを使用した標準酵素イムノアッセイ法に対する別の検出スキームについて説明する。これは、上記競合的結合スキームおよび全ての他の酵素イムノアッセイスキーム、例えばサンドイッチアッセイ法、イムノプローブおよび免疫標識システムにおいて使用することができる。我々のアプローチでは、我々は生成物の検出のために、ポリマ分配要素を有する光学プローブを使用する。AP活性をモニタするために、蛍光化合物に結合させたリン酸部分を有する基質を使用する。この場合、生成蛍光化合物は、光学プローブにより検出されるものである。このアプローチを実証するために、我々は、1ピレンホスフェートを合成した。これは、APと反応すると、1ヒドロキシピレンおよびリン酸イオンを生成する。我々のアッセイ法では、光学プローブを、結合APおよびPP基質を含むマイクロウエル中に挿入する。PPおよびAPとの反応によりHOPが生成するので、HOPをプローブにより検出する。従来のアッセイ法のように、HOPは連続して、または終点モードで検出することができる。どちらの場合の信号も蛍光対時間曲線の勾配であり、従来のイムノアッセイ法に対し上述したアプローチと類似のアプローチを使用して、較正プロットが作成される。実験薬品および試薬AssayDesigns’sCorrelateEIA17βEstradiolキットをAssayDesignsIncから購入した。トリスヒドロキシメチルアミノメタンおよびMgCl26H2OをSigmaAldrichから入手した。MgCl210mMを有する01MTris緩衝液pH9を毎日新たに調製した。1ピレンホスフェートを我々の研究所で合成した。基質ストック497e4Mを、使用直前に、MgCl210mMを有するpH9の01MTrisHCl緩衝液中で調製した。2M硫酸を停止液として使用した。計装75ワットキセノンarcランプおよび光電子増倍検出器を備えた分光計を用いて蛍光測定を行った。励起および発光スリットを全ての測定のために5nm帯域通過に設定した。励起波長は345nmであり、発光波長は385nmであった。ポリマー分配要素を備えた光学プローブを、生成物の検出のために光学プローブ結合システムと共に使用した。手順製造者が推奨する手順に従い、イムノアッセイ法を実施した。反応を抗体でコートしたマイクロウエル中で実施した。全てのアッセイ法を室温で実施した。全ての試薬は、開封前に少なくとも30分間室温にした。100μlのアッセイ用緩衝液をBoマイクロウエルにピペットでとり、1~6の標準100μlを個々のウエルに添加した。その後、50μlの複合体および50μlの抗体を、終点モードイムノアッセイにおいて各ウエルに添加した。動力学モードイムノアッセイ法では、20μlの複合体および20μlの抗体を添加し、アッセイ法用緩衝液もまた各ウエルに添加し、60μlとした。プレートをプレートシーラーで被覆し、2時間、~500rpmで軌道撹拌しながらインキュベートした。インキュベーション後、プレートを300μlウエル洗浄溶液で4度洗浄した。未反応試薬を洗い流した後、250μlの緩衝PP溶液をウエルに添加した。連続イムノアッセイにおいて、光学プローブをPP溶液前、またはPP溶液と共に挿入した。終点イムノアッセイでは、室温で30分インキュベートした後、PP変換反応を2MH2SO450μlで停止させ、その後、光学プローブを溶液中に挿入した。どちらの場合も、信頼できる勾配が得られるまで、HOP取り込み曲線を記録した。各アッセイ後、5050エタノール水溶液または1MNaOH溶液で、HOPを光学プローブのポリマ分配要素から一掃した。結果および考察パラメータKMおよびVmaxの決定PPはこの酵素の基質として以前報告されていないので、AP活性の決定のためのミカエリスメンテン動力学的パラメータを決定した。基質濃度の関数としての基質変換速度を、1組の光学プローブ信号対時間曲線を作成することにより決定した。速度を基質濃度の関数としてプロットし、非線形曲線フィッティングにより動力学的パラメータVmax9×103molessおよびKM245×105Mが得られた。理想的には、約10×KMのアッセイ法の作用基質濃度をアッセイ法で使用し、感度および勾配再現性を最大とする。酵素活性のPP阻害は2×104Mレベルで示されるので、我々は、PPを使用する別のアッセイ法には、5×KMの信頼できる最大濃度を使用することを決めた。光学プローブを用いたイムノアッセイ法終点モードでpH9の緩衝液に溶解した125×104Mの基質溶液を用いてイムノアッセイ法を実施した。停止時間溶液に浸漬させた後の光学プローブ応答を得た。予測されるように、E2濃度がより大きな試料では、より低い結合E2AP量が得られ、このため光学プローブ応答がより低かった。相対応答を使用して結合E2APを計算した。結合対E2濃度のプロットは、本質的にアッセイ法のための検量線であり、図21に示す。同じイムノアッセイパラメータを動力学的モードで使用し、光学プローブ信号対時間のプロットを作成した。このデータは実施例19において記述されているように光学プローブを用いて獲得し、これを使用して図22に示した結合曲線を作成した。結論これらの結果から、酵素活性を検出するために光学プローブを使用するこの新規酵素イムノアッセイ法では、従来の酵素イムノアッセイ法に匹敵する結果が得られるが、高価な検出装置は必要ないことが示される。等価物当業者であれば、上記態様の変形物を認識し、またはルーチン実験により確認することができるであろう。そのような変形物は本発明の範囲内にあり、添付の請求の範囲内にある。参考文献