"癌を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒト由来の少なくとも一つの第1のサンプルから、PIK3CA遺伝子における少なくとも一つの突然変異または前記PIK3CA遺伝子によりコードされている少なくとも一つの変異型タンパク質を検出すること、ならびに前記少なくとも一つのサンプルが、少なくとも一つの変異型PI3Kタンパク質またはPIK3CA遺伝子における突然変異を有する場合には、前記ヒトに、有効量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、方法。前記PIK3CA遺伝子における突然変異が体細胞突然変異である、請求項1に記載の方法。前記PIK3CA遺伝子における突然変異が、3140A>G、1633G>A、1624G>A、3140A>T、1634A>C、1634A>G、1636C>A、および333G>Cから選択される、請求項1または2に記載の方法。前記PIK3CA遺伝子によりコードされているタンパク質における少なくとも一つの突然変異が、H1047L、H1047R、Q546K、E545A、M1043I、E545D、E545K、P539R、K111N、P449T、およびE542Kから選択されるものである、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも一つの突然変異が、H1047R、Q546K、E545A、M1043I、E545D、P539R、およびK111Nから選択されるものである、請求項4に記載の方法。前記癌が、乳癌、結腸癌、腎細胞癌、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、黒色腫、およびリンパ腫から選択されるものである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも一つの第1のサンプルが、腫瘍サンプルまたは腫瘍細胞である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記ヒトが、3コピー以上のHER2遺伝子を有する腫瘍を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記ヒトが、5コピー以上のHER2遺伝子を有する腫瘍を有する、請求項8に記載の方法。前記ヒトが、Her2および/もしくはそのフラグメント、ならびに/またはHer2をコードする遺伝子からのタンパク質を過剰発現する腫瘍を有する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記サンプルがKRAS遺伝子における突然変異を有さない、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記ヒト由来の少なくとも一つの第2のサンプルから、Rasタンパク質の突然変異の状態を決定することをさらに含んでなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記第1のサンプルと、第2のサンプルとが同じである、請求項12に記載の方法。前記第1のサンプルと、第2のサンプルとがどちらも腫瘍サンプルである、請求項12または13に記載の方法。前記第1のサンプルと、第2のサンプルとが血液に由来する、請求項12または13に記載の方法。前記第1のサンプルと、第2のサンプルとが異なる、請求項12に記載の方法。前記Rasタンパク質がKRASである、請求項12に記載の方法。前記Rasタンパク質における突然変異が、G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G12R、G13A、G13D、Q61K、Q61RE76G、E76K、E76Q、およびA146Tから選択されるものである、請求項12~17のいずれか一項に記載の方法。前記Rasタンパク質における突然変異が、G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G12R、およびG13Aから選択されるものである、請求項17に記載の方法。癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者由来の少なくとも一つの腫瘍細胞におけるHer2遺伝子の数および/または前記腫瘍細胞により発現されるHer2/neu受容体の量を検出すること、ならびに前記腫瘍細胞が3コピー以上のHer2遺伝子を有する場合には、および/または前記腫瘍細胞が非腫瘍細胞よりも多い量のHer2遺伝子産物を発現する場合には、治療上有効な量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、方法。前記腫瘍細胞が、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、黒色腫、およびリンパ腫から選択される、請求項18に記載の方法。癌を有するヒトを治療する方法であって、1前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、PIK3CA遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および2PIK3CAにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、方法。癌を有するヒトを治療する方法であって、1それを必要とするヒトに抗新生物薬を投与すること、2前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、PIK3CA遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および2PIK3CAにおける少なくとも一つの突然変異が検出される場合には、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、方法。PIK3CAにおける少なくとも一つの突然変異の検出と、医薬組成物としての2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩に対する、癌に罹患している前記ヒトの高い反応の可能性とを相関させることをさらに含んでなる、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。1前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、PIK3CA遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して、およびHer2遺伝子のコピー数に関して遺伝子型決定を行うこと、ならびに2PIK3CAにおける少なくとも一つの突然変異が検出され、かつ少なくとも3コピーのHer2遺伝子が検出された場合には、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、請求項24に記載の方法。1前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、KRasタンパク質における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、2前記Rasタンパク質における突然変異が検出されない場合には、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、請求項22または24に記載の方法。前記KRasタンパク質の少なくとも一つの突然変異が、G12S、G12V、G12D、G12A、G12C、G12R、およびG13Aから選択される、請求項26に記載の方法。少なくとも1用量の第2の抗新生物薬を投与することをさらに含んでなる、請求項22~27のいずれか一項に記載の方法。癌を有するヒトを治療する方法であって、1それを必要とするヒトに1用量の抗新生物薬を投与すること、2前記ヒト由来の少なくとも一つの腫瘍細胞に対し、PIK3CA遺伝子における少なくとも一つの突然変異に関して遺伝子型決定を行うこと、および3PIK3CAにおける少なくとも一つの突然変異が検出された場合には、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を医薬組成物として投与することを含んでなる、方法。前記ヒトが腫瘍細胞において少なくとも一つの変異型PI3Kタンパク質における少なくとも一つの突然変異、またはPIK3CA遺伝子における突然変異および/または少なくとも3コピー以上のHer2遺伝子を有する場合には、ヒトの治療に対する高い反応の可能性と、少なくとも一つの、少なくとも1用量の2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドまたは薬学的に許容可能な塩とを相関させる工程をさらに含んでなる、請求項1~29のいずれか一項に記載の方法。実験化合物Bの製造2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドa6-ブロモ-4-4-ピリダジニルキノリン6-ブロモ-4-ヨードキノリン17.43g、52.2mmol、4-トリブチルスタンニルピリダジン19.27g、52.2mmol、およびPdCl2dppf-CH2Cl22.132g、2.61mmolを1,4-ジオキサン200mLに溶かし、105°Cに加熱した。3時間後、パラジウム触媒を追加し、6時間加熱した。濃縮し、塩化メチレン/メタノールに溶かした。2MeOH/EtOAcからの5MeOH/EtOAcを用いてカラムクロマトグラフィーcombiflashにより精製し、粗標題化合物を得た。EtOAcで摩砕し、6-ブロモ-4-4-ピリダジニルキノリン5.8g、20.27mmol、収率38.8を得た。MSme28592879MHb2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド無水1,4-ジオキサン120ml中、6-ブロモ-4-4-ピリダジニルキノリン4.8g、16.78mmol、ビスピナコラト二ホウ素4.69g、18.45mmol、PdCl2dppf-CH2Cl2530mg、0.649mmolおよび酢酸カリウム3.29g、33.6mmolのスラリーを100°Cで3時間加熱した。出発臭化物が完全に消失したことをLCMSにより確認した。次に、この反応物をN-[5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジニル]-2,4-ジフルオロベンゼンスルホンアミド6.68g、17.61mmolおよび追加のPdCl2dppf-CH2Cl2550mg、0.673mmolで処理した後、110°Cで16時間加熱した。反応物を室温まで放冷し、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィーAnalogix;5MeOH/5CH2Cl2/90EtOACにより精製し、6.5g76の目的生成物を得た。MSme5059MH中間体:N-[5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジニル]-2,4-ジフルオロベンゼンスルホンアミドの製造a5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ニトロピリジンメタノール200mL中、5-ブロモ-2-クロロ-3-ニトロピリジン50g、211mmolの冷却0°C溶液に、10分かけて20ナトリウムメトキシド50mL、211mmol溶液を滴下した。この反応物すぐに不均質となったを周囲温度まで温め、16時間撹拌した。反応物を濾過し、沈殿を水200mLで希釈し、1時間撹拌した。固体を濾過し、水3×100mLで洗浄し、真空乾燥器40°Cで乾燥させ、5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ニトロピリジン36g、154mmol、収率73.4を淡黄色粉末として得た。元の濾液を真空濃縮し、水150mLで希釈した。飽和塩化アンモニウム25mLを加え、この混合物を1時間撹拌した。固体を濾過し、水で洗浄し、真空乾燥器40°Cで乾燥させ、第2生成物5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ニトロピリジン9g、38.6mmol、収率18.34を得た。総収率=90MSme23282347MHb5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジンアミン酢酸エチル1L中、5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ニトロピリジン45g、193mmolの溶液に塩化スズII二水和物174g、772mmolを加えた。この反応混合物を還流下で4時間加熱した。LC/MSは出発材料が一部残留していることを示したので、20molの塩化スズII二水和物を加え、還流下で加熱を続けた。2時間後、反応物を周囲温度まで放冷し、真空濃縮した。残渣を2N水酸化ナトリウムで処理し、この混合物を1時間撹拌した。次に、この混合物を塩化メチレン1Lとともにセライトで濾過し、塩化メチレン500mLで洗浄した。層を分離し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮して5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジンアミン23g、113mmol、収率58.7を得た。この生成物をそのまま次の反応に用いた。MSme20192039MHcN-[5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジニル]-2,4-ジフルオロベンゼンスルホンアミドピリジン200mL中、5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジンアミン20.3g、100mmolの冷却0°C溶液に塩化2,4-ジフルオロベンゼンスルホニル21.3g、100mmolを15分かけてゆっくり加えた反応物は不均質となった。氷浴を外し、反応物を周囲温度で16時間撹拌し、その時点で反応物を水500mLで希釈し、固体を濾別し、多量の水で洗浄した。沈殿を真空乾燥器にて50°Cで乾燥させ、N-[5-ブロモ-2-メチルオキシ-3-ピリジニル]-2,4-ジフルオロベンゼンスルホンアミド12g、31.6mmol、収率31.7を得た。MSme37903809MH生物学的データ:遺伝子型決定QiagenQiAmpDNA血液キットを用い、血液からDNAを抽出した。遺伝子型決定は、下記の技術:グラクソスミスクラインFlowcytometricplatformforhighthroughputsinglenucleotidepolymorphismanalysisBiotechniques3066166689により改変された一塩基鎖伸長アッセイであるIlluminaHuman1MDNA分析ビーズチッププラットフォームWholegenomegenotypingwiththesinglebaseextensionassayNatMethods33133を用いて行った。統計分析有効性PGx分析は、各多型に関して、エンドポイントとしてのインベスティゲーターレビューに基づくPFSおよび反応率RECISTを用いて行った。Cox回帰を用いて各SNPとPFSの遺伝的連関を調べた。遺伝子型による生存率のカプランマイヤープロットを作成した。下記の共変量、年齢、性別、人種、Motzerリスクスコア、ECOGパフォーマンスステータス、および過去の腎臓切除の状態のそれぞれをCoxモデリングにより、PFSとの連関について個々に調べた。p<0.05でPFSと有意に連関があった総ての共変量を遺伝子型に関するCoxモデルに含めた。RECIST反応は、部分反応者および完全反応者PRCR、安定疾患SD、および進行性疾患PDの3つのカテゴリーに分類した。反応状態が未知または評価不能である患者は本分析から除外した。反応と遺伝子型とで構成した3×3テーブルについてフィッシャーの正確確率検定を用い、連関の有意性を評価した。この予備的分析では、多重比較に対する補正は行わなかった。望ましくは独立したデータセットでの確認を要する名義的有意水準p<0.05を満たす多型を報告した。実施例1ホスホイノシチド3-キナーゼPI3Kシグナル伝達経路は、広域のヒト癌において活性化されている。癌細胞の成長および生存におけるPI3Kの生物学的役割ならびにヒト癌における活性化突然変異の頻度は十分に報告されている。この経路の活性化は、間接的には受容体チロシンキナーゼの体細胞異常によって、または直接的にはPIK3CAなどのPI3K遺伝子における突然変異によって起こる場合が多い。かなりの割合の腫瘍がこの経路の阻害から利益を得ていると考えられる。化合物Bは、2,4-ジフルオロ-N-{2-メチルオキシ-5-[4-4-ピリダジニル-6-キノリニル]-3-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドとも呼ばれ、野生型ホスホイノシチド3-キナーゼαPI3Kαおよびヒト癌において見られるp110αの一般的な活性化突然変異体の新規な経口投与用阻害剤である。化合物Bは、タンパク質キナーゼの大規模パネルで評価した際、PI3Kファミリー酵素に良好な選択性を示す。この化合物は最近、第I相臨床試験に入ったところである。invitro腫瘍モデルのコホートを用いて、臨床有効性を予測する試みが成果を上げたことから、腫瘍由来細胞株の拡張パネルは、全候補の有効性治験を再現することができ、それにより、どの組織構造および特定の腫瘍遺伝子型が治療から利益を得る可能性が最も高いかを特定することができる。この目的で、化合物Bを2つのヒト乳癌細胞株パネルで試験した。試験1.乳癌細胞株パネルA方法細胞株増殖アッセイこの試験には計15の乳癌細胞株を用いた。これらの細胞は、5または10ウシ胎児血清、2mMGlutaMAX商標および1mMピルビン酸ナトリウムを添加したRPMI-1640、または供給者AmericanTypeCultureCollectionManassasVAUSADevelopmentalTherapeuticsProgramNationalCancerInstituteBethesdaMDUSAGermanCollectionofMicroorganismsandCellCulturesBraunschweigGermanyEuropeanCollectionofCellCulturesPortonDownUKによって推奨されている培養培地で培養した。各株の細胞を384ウェルマイクロタイタープレートに2種類の細胞密度で播種した。低密度範囲は300~1800細胞/ウェルであり、高密度範囲は600~3600細胞/ウェルであった。播種密度はその阻害剤の非存在下での細胞株の増殖率により決定され、細胞株間で異なった。高播種密度は低播種密度の二倍であった。各細胞密度は3反復で播種した。各細胞株、各密度で合計30ウェルを漸増濃度の化合物Bで処理した。さらに、各密度で24ウェルのジメチルスルホキシドDMSO処理対照を設けた。播種後、細胞を37°C、5CO2で24時間インキュベートした。次に、化合物Bを10種の濃度で各細胞株に加えた。まず、化合物Bの投与溶液をDMSOにて、マスターストック濃度10mMで調製した。次に、この保存溶液の1:3連続希釈液を作成し、一定範囲の検量線用保存濃縮液:10.00mM、3.164mM、1.001mM、316.9μM、100.3μM、31.74μM、10.04μM、3.178μM、1.006μMおよび318.3nMとした。これらの化合物Bの検量線用保存濃縮液を、BiomekFXリキッドハンドラーを用い、播種済みの癌細胞株に分注し、最終処理濃度を保存濃縮液の0.1とした。化合物Bを含まない同容量のDMSOを、各播種密度の24の対照ウェルに0.1濃度で分注した。また、DMSO対照の添加直後に、各細胞株につき各播種密度で同様に細胞を播種した0時点プレートも準備した。72時間インキュベーション後、プレートの各ウェルに、細胞培養培地と同容量のCellTiter-GloCellTiter-GloLuminescentcellViabilityAssay、Promega、Madison、WIを加えた。内容物が混合されて細胞溶解と安定化が誘導された後、細胞の発光をSpactraMaxM5eMolecularDevices、Sunnyvale、CA、USAを用いて記録した。化合物B処理細胞の発光を、化合物Bの総ての濃度、各細胞密度、3反復の全ウェルについて、24のDMSO処理対照ウェルの平均値と比較した。マイクロソフトエクセルでXLfitモデル205にて強度パーセント値を用い、低播種密度および高播種密度のgIC50を計算した4パラメーターロジスティックフィット。具体的には、増加枠の中点gIC50は、化合物添加時T=0における細胞数とDMSOで処理した対照細胞の増殖の間の半分のところに位置する。gIC50値は、癌細胞の増殖阻害を測る尺度となる。各細胞株、各播種密度の曲線について、両データの質と曲線の当てはめの妥当性を手作業で調べた。最初のデータが不十分であった場合には、その曲線およびその後のgIC50を以降の分析から除外した。細胞株の播種物は、当てはめた曲線のr2値が<0.75であった場合に、不十分な質であるとみなした。最後に、データの質が許容されるものであれば、Ymin値0時点での細胞密度に対する最大増殖阻害と定義を、データが妥当な質であった場合の細胞傷害性の尺度として計算した。15総ての細胞株について、Affymetrix500KチップAffymetrixInc、Sunnyvale、CAを用い、HER2遺伝子のDNAコピー数データを採取した。まず、各株から、GenEluteMammalianGenomicDNAミニプレップキットSigma、St.Louis、MOを用いてDNAを抽出した。2つのアリコート各250ngを制限酵素NspまたはStyNewEnglandBiolabs、Boston、MAで消化した。次に、消化したDNAをアダプターと連結し、PlatinumPfxDNAポリメラーゼInvitrogenを用いてPCRにより増幅し、およそ250~2000bpの産物を得た。各酵素消化物について、100μLの4アリコートでPCRを行い、プールし、精製し、定量し、40μg/45μLに補正し、DNアーゼIで切断し、およそ25~200bpのサイズとした。次に、これらの癌細胞株の切断産物を標識し、変性させ、Affymetrix500Kチップにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションが完了したところで、Affymetrixfluidicsstationsを用いて各アッセイを洗浄および染色した。画像データはGeneChipScanner3000ExpressionAnalyisis、Inc、DurhamNCを用いて採取した。10種の非腫瘍形成性リンパ芽球性細胞株のパネルから同様にして採取したデータを用い、DNAコピー数を算出した。HER2遺伝子のDNAコピー数は、下記の手順を用いて算出した。1.総てのSNPチップ画像CELファイルを、AffymetrixGenotypeソフトウエアを用いて抽出し、読み取り、dChipソフトウエアパッケージを用いて補正した。総ての癌細胞株について、SNP強度スコアをリンパ芽球性参照パネルの個々の中央値強度スコアで割ることにより、SNP式のコピー数比率log2スケールを算出した。総てのサンプルについて中央値コピー数が2倍性であると仮定して、データを補正した。2.最後に、サーキュラーバイナリーセグメンテーションCBSによってコピー数の推論を行ってノイズ例えば、標的内のマスクされていない複合配列からのノイズを減らし、少なくとも2つの基礎SNPに基づいてゲノム全領域のコンセンサススコアを得た。3.このプラットフォームと核型データの事前の比較に基づくLog2比カットオフを用いて、HER2を、3~5コピー0.25~0.65、>5コピー>0.65のコピー数増、一染色体性-0.25~-0.75または同型接合性の欠如<-0.75を有するとして分類した。細胞株突然変異データPIK3CAおよびKRAS遺伝子の状態に関する突然変異データを収集した。データ源はtheCatologofSomaticMutationsinCancerdatabaseの一部として公開されている癌細胞株突然変異スクリーニングデータである。増殖アッセイで用いた細胞株の属性がCOSMICデータベースにおける属性と一致することを確認するため、感受性スクリーニングにおける細胞株とCOSMICにおける細胞株とで遺伝子型比較を行った。具体的には、これには、以下のことが含まれる。1.Affymetrix500KSNPチップAffymetrix、Inc.、Sunnyvale、CAおよびRLMMアルゴリズムを用い、各細胞株について遺伝子型を予測すること。2.各細胞株の遺伝子型が、COSMICにおいて突然変異プロフィールを有する各細胞株について予め予測されたものと一致するかどうか確認すること。遺伝子型の一致に基づき、各細胞株の突然変異の状態を割り付けること。結果化合物Bを15種のヒト乳房細胞株のパネルで試験した。細胞傷害性曲線を作成し、2種類の細胞密度を用い、総ての細胞についてgIC50を求めた表1。化合物BのgIC50は、この15細胞パネルで、0.1~227.0nMの範囲であった。全体の中央値gIC50は3.2nMであった。腫瘍細胞株の3/1520がgIC50>20nMを示し、7/1547がgIC50<3nMを示した。各個の細胞株の応答性の程度はgIC50の算出に基づいて評価し、この場合、値が低いほど、化合物Bによる処理に対する細胞の応答性が高い。KRASおよびPIK3CAの突然変異データは、化合物Bに対する応答性に関してスクリーニングした15細胞株の総てに利用可能であった。合計406/15の細胞株がPIK3CAの突然変異を有し、71/15がKRASの突然変異を有していた。両遺伝子に対して突然変異を有する細胞株は無かった。合計203/15がHER2遺伝子に5コピー以上のコピー数増加を有していた。これらのデータを表2に示す。DNA配列:ヒトPIK3CAの野生型遺伝子配列は当技術分野で公知であり、httpwwwncbinlmnihgovNCBI参照配列:NG_012113.1を含む種々のデータベースから入手することができる。また、VoliniaetalGenomics244727も参照。KRas:遺伝子配列もまた、httpwwwncbinlmnihgovNCBI参照配列:NG_007524.1から入手することができる。K-Ras、N-Ras、およびH-Rasの野生型タンパク質配列は当技術分野で公知であり、SwisProtデータベースUniProtKB/Swiss-ProtそれぞれUniProtKBNo.P01116K-ras;UniProtKBNo.P01111N-ras、およびP01112H-Rasを含む種々のデータベースから入手することができる。また、ShimizuetalProcNatlAcadSci80pp21122116BosMutationresearchReviewsinGeneticToxicology195およびFasanoetalMolCellBiol4pp16951705も参照。試験2.乳房細胞株パネルB化合物B処理の関数としての増殖阻害を、別のアッセイにおいて、正常上皮組織および癌細胞の両方から構成される51の乳房細胞株のパネルで分析した。薬物の調製:薬物は33mM特に断りのない限り保存液としてDMSOに溶かし、3回以内の実験を行うのに十分な溶液を含有するアリコートとして-20°Cで保存した凍結/解凍サイクルを制限するため。薬物プレートの調製:希釈薬物プレート:保存濃縮液から、DMSOを用いて8種の連続希釈液1:5を作製した。従って、合計9用量保存液と8種の連続希釈液を用量応答曲線に利用可能であった。検量線用薬物プレート:この希釈薬物プレートから、総ての用量にわたって、PBSまたは細胞株を用いたスクリーニングに使用される細胞培養培地のいずれかを用いて別の希釈液を作製した。一般に、処理の際は100μlの細胞培養に約5μlを加え、各用量を3ウェルで反復した。注:処理ウェルでの最終DMSO濃度は0.3以下である。また、ビヒクル対照として0.3DMSOで処理した3ウェルおよび場合によりPBSまたは培地DMSOまたは化合物の添加なしのいずれかで処理した細胞培養物3ウェルも設けた。スクリーニングプロトコール:-1日:96ウェルプレートに100μl容量で細胞を播種。注:播種する細胞数は、3日間の薬物処理後の増殖アッセイ時に対照ウェルがなお対数増殖期にあるように密集前調整。0日目:処理のためにプレートに薬物を添加。0時点プレートを、薬物を添加した時点でベースラインの読み取りを確保できるように、増殖アッセイの手順を施した。3日目:若干の改変を加え、増殖アッセイ例えば、PromegaによるCell-TitreGloアッセイの手順を施す。1倍CTG試薬製造者により提示されているようにPBSで2倍希釈することによるを調製する。プレート96ウェルから培地を除去し、1ウェル当たり50μlの1倍CTGを加える。このプレートを室温で10分間回転させ、BIO-TEKFLx800で読み取る。データの算出:LBNLは、NCINIHDTPHumanTumorCellLineScreenProcessにより設定されたプロトコールに従い、以下にまとめる。増殖阻害パーセンテージは次のように算出する。濃度がTi>/=Tzである場合、[Ti-Tz/C-Tz]×100濃度がTi<Tzである場合、[Ti-Tz/Tz]×100C:対照増殖ビヒクル対照増殖Tz:0時点での読み取り値Ti:9種の濃度水準の薬物の存在下での試験増殖gIC50:50増殖阻害は下式から算出する。[Ti-Tz/C-Tz]×100=50薬物インキュベーションの際の対照細胞の正味増殖に50の低下をもたらす薬物濃度。TGI:全増殖阻害は下式から算出する。Ti=Tz全増殖阻害をもたらす薬物濃度0時点のベースラインまで減少。LC50:細胞増殖の50正味低下は下式から算出する。[Ti-Tz/Tz]×100=-50最初0時点の細胞数に比べて薬物処理終了時の細胞数に50の減少をもたらす薬物の濃度処理後の細胞の正味減少を示す。活性のレベルが達成されれば、これらの3つの各パラメーターについて値を算出するが、効果が達成されないかまたは上回れば、そのパラメーターの値は、供試最大または最小濃度よりも高いまたは低いとして表現される。細胞株セットのサブセットはそれらの分子サブタイプに関して特徴付けられたものである。これらの細胞株を分類するためのこの手順は、NeveRMetal2006CancerCell1051527に記載されている。分類は遺伝子発現データに基づいて行った。化合物Bを51のヒト乳房細胞株のパネルで試験した。細胞傷害性曲線を作成し、総ての細胞について2種類の細胞密度を用いてgIC50を求めた表1。15細胞パネルに対しての化合物BのgIC50は1.1~398.1nMの範囲であった。全体のgIC50中央値は10.4nMであり、平均値は28.9nMであった。16/5131の腫瘍細胞株だけがgIC50>30nMを示し、7/5114はgIC50<3nMを示した。各個の細胞株の応答性の程度はgIC50の算出に基づいて評価し、この場合、値が低いほど、化合物Bによる処理に対する細胞の応答性が高い。PIK3CAの突然変異データは、化合物Bに対する応答性に関してスクリーニングされた33の細胞株に利用可能であった。合計279/33の細胞株がPIK3CAの突然変異を有していた。合計49細胞株をHER2の状態に関してスクリーニングした。これらのうち13/4927が、HER2が増幅されているとみなされた。これらのデータを表3に示す。本発明の好ましい実施形態が上記に説明されているが、本発明は本明細書に開示されているその通りの教示に限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲内に入る総ての改変に対する権利が保持されると理解するべきである。"