"培地中に、メチオニン、ロイシン、システイン、チロシン、及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法。培地中に、アミノ酸として少なくとも必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミンを含み、かつメチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、請求項1に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法。メチオニンを含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、請求項1又は2に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法。哺乳動物由来の多能性幹細胞が、ヒト又はマウス由来のES細胞又はiPS細胞である、請求項1~3のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法。請求項1~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記分化培地で、ES細胞又はiPS細胞を、少なくとも5時間培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法。請求項1~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記分化培地で、ES細胞又はiPS細胞を、少なくとも1日間培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法。前記分化培地でES細胞又はiPS細胞を培養することを、前記多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉の成形の直前又は形成が確認できる時期に行う、請求項5又は6に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法。請求項1~7のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記分化培地が、内胚葉分化培地である、多能性幹細胞を分化誘導する方法。多能性幹細胞を、必須アミノ酸スレオニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミン及び準必須アミノ酸システイン、チロシン及びアルギニンを含む分化誘導培地で培養した後、メチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法。哺乳動物由来の多能性幹細胞が、ヒト又はマウス由来のES細胞又はiPS細胞である、請求項9に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法哺乳動物由来の多能性幹細胞を内胚葉まで分化誘導させる、請求項9又は10に記載の方法。さらに、分化した内胚葉を、肝臓分化培地で培養することにより、多能性幹細胞を肝臓細胞まで分化させる、請求項11に記載の方法。さらに、分化した内胚葉を、膵臓分化培地で培養することにより、多能性幹細胞を膵臓細胞まで分化させる、請求項11に記載の方法。前記肝臓分化培地又は膵臓分化培地がプロリンを1.0mM以上10mM以下の濃度で添加した培地である、請求項12又は13に記載の方法。培地中に、メチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない、多能性幹細胞を分化誘導するための培地。培地中に、アミノ酸として少なくとも必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミンを含み、かつメチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない、請求項15に記載の多能性幹細胞を分化誘導するための分化誘導培地。多能性幹細胞が、ヒト又はマウス由来のES細胞又はiPS細胞である、請求項15又は16に記載の培地。前記分化誘導するための培地が、マウス又はヒト由来のES細胞又はiPS細胞を内胚葉に分化誘導するための内胚葉分化培地である、請求項15又は16に記載の培地。未分化の多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞を、インビトロで、特定の組織細胞に分化誘導する場合、癌化しやすいなどの指摘がある未分化細胞が残るという問題がある。さらに、ヒトES細胞やヒトiPS細胞では、細胞株毎の分化指向性が異なるため、未分化細胞が残りやすいという問題がある。本発明の目的は、簡便な手段で、多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞を、効率よく目的の細胞に分化誘導できる方法及び培地を提供することである。本発明のさらなる目的は、簡便な手段で、多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞を分化誘導する際に、未分化細胞を除去する又は分化誘導効率を上げることにより、未分化細胞の混入を防ぐことができる方法及び培地を提供することである。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、多能性幹細胞を分化誘導する際に、分化培地中から特定のアミノ酸を除くことにより、効率よく分化誘導できることを見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、1培地中に、必須アミノ酸であるメチオニン、ロイシン、及び準必須アミノ酸であるシステイン、チロシン、アルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法、2必須アミノ酸であるメチオニン又はロイシン或いはその両者を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、1に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、3メチオニンを含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、2に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、4準必須アミノ酸であるシステイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、1に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、5哺乳動物由来の多能性幹細胞が、ES細胞又はiPS細胞である、1~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、6哺乳動物が、ヒト又はマウスである、5に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、7哺乳動物由来の多能性幹細胞が、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞である、6に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、81~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記分化培地で、ES細胞又はiPS細胞を、少なくとも5時間、好ましくは1日間、さらに好ましくは2日間培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法、91~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記分化培地が、内胚葉分化培地である、多能性幹細胞を分化誘導する方法、101~4のいずれか一つに記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法であって、前記多能性幹細胞を、前もって、必須アミノ酸スレオニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミン及び準必須アミノ酸システイン、チロシン及びアルギニンを含む分化誘導培地で培養することを含む多能性幹細胞を分化誘導する方法、11哺乳動物由来の多能性幹細胞を内胚葉まで分化誘導させる、10に記載の方法、12さらに、分化した内胚葉を、肝臓分化培地で培養することにより、多能性幹細胞を肝臓細胞まで分化させる、11に記載の方法、13さらに、分化した内胚葉を、膵臓分化培地で培養することにより、多能性幹細胞を膵臓細胞まで分化させる、11に記載の方法、14前記肝臓分化培地又は膵臓分化培地が、プロリンを1mM以上10mM以下の濃度で添加した分化培地である、12又は13に記載の方法、15多能性幹細胞が、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞である、10~14のいずれか一つに記載の方法、16培地中に、必須アミノ酸であるメチオニン、ロイシン、及び準必須アミノ酸であるシステイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない、多能性幹細胞を分化誘導するための培地、17多能性幹細胞が、ヒト又はマウス由来のES細胞又はiPS細胞である、16に記載の培地、及び18前記分化誘導するための培地が、マウス又はヒト由来のES細胞又はiPS細胞を内胚葉に分化誘導するための内胚葉分化培地である、16に記載の培地、19培地中に、アミノ酸として、必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミンを含み、かつメチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない分化培地で、哺乳動物由来の多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を分化誘導する方法、20前記分化培地でES細胞又はiPS細胞を少なくとも5時間、好ましくは1日間、更に好ましくは2日間培養することを、前記多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉の成形の直前又は形成が確認できる時期に行う、前記8に記載の多能性幹細胞を分化誘導する方法、21培地中に、アミノ酸として少なくとも必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミンを含み、かつメチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない、前記16に記載の多能性幹細胞を分化誘導するための分化誘導培地、22多能性幹細胞を分化誘導するための、培地中に、メチオニン、ロイシンシステイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まない培地の使用、である。本発明の方法又は培地を用いることにより、多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞を、効率よく分化誘導でき、未分化細胞の混入を軽減又は除去できる。また、本発明の方法又は培地を用いることにより、分化誘導効率の向上が達成できる。本発明で用いる多能性幹細胞とは、自己複製能を有しインビトロにおいて培養することが可能で、かつ、個体を構成する細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞ES細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞GS細胞、体細胞由来の人工多能性幹細胞iPS細胞等をあげることができるが、本発明で特に好ましく用いられるのはiPS細胞又はES細胞であり、特に好ましくは、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞である。本発明で用いるES細胞は、哺乳類動物由来のES細胞であればよく、その種類や取得方法などは特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル又はヒト等をあげることができ、好ましくは、マウス又はヒトであり、さらに好ましくはヒトである。ES細胞は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に細胞株として樹立することができる。このように、ES細胞は、受精卵から取得することが多いが、受精卵以外、例えば、脂肪組織、胎盤、精巣細胞から取得することもでき、いずれのES細胞も本発明の対象である。また、iPS細胞人工多能性幹細胞とは、分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞例えば、線維芽細胞などへ分化多能性を付与する数種類の転写因子分化多能性因子遺伝子を導入することにより、ES細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞のことである。分化多能性因子としては、多くの因子が報告されており、特に限定しないが、例えば、Octファミリー例えば、Oct3/4、Soxファミリー例えば、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15及びSox17など、Klfファミリー例えば、Klf4、Klf2など、Mycファミリー例えば、c-Myc、N-Myc、L-Mycなど、Nanog、LIN28などを挙げることができる。iPS細胞の樹立方法については、多くの報告がなされており、それらを参考にすることができる例えば、Takahashiら,Cell2006,126:663-676;Okitaら,Nature2007,448:313-317;Wernigら,Nature2007,448:318-324;Maheraliら,CellStemCell2007,1:55-70;Parkら,Nature2007,451:141-146;Nakagawaら,NatBiotechnol2008,26:101-106;Wernigら,CellStemCell2008,10:10-12;Yuら,Science2007,318:1917-1920;Takahashiら,Cell2007,131:861-872;Stadtfeldら,Science2008322:945-949など。本発明で用いる未分化細胞とは、多分化能を有する細胞を意味し、また、文脈においては、多能性幹細胞、例えばES細胞やiPS細胞を分化誘導処理した後も、分化誘導が起こらず、引き続き多分化能を有している細胞を意味する。哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞MEF細胞を用い、白血病阻害因子、KSRノックアウト血清代替物、ウシ胎仔血清FBS、非必須アミノ酸、Lグルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、β-メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM培地を用いて維持することができる。iPS細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてMEF細胞を用いて、bFGF、KSRノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、Lグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β-メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEMF12培地を用いて維持することができる。本発明における多能性幹細胞、例えばES細胞又はiPS細胞の分化誘導は、フィーダー細胞を含む培養系、フィーダーフリーの培養系のいずれも含む。フィーダー細胞としては、例えば、mmcM15細胞をあげることができるが、これに限定されるものではない。また、フィーダーフリーの培養系としては、例えば、擬似基底膜sBMsynthesizedBasementMembranesubstratumをあげることができるが、これに限定されるものではない。本発明で言う多能性幹細胞の分化又は分化誘導とは、多能性幹細胞が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかに分化誘導されることを含む意味で用いられ、更にはまた、それらが、いずれかの生体を構成する臓器又は器官細胞へと分化することを含む意味でも用いられる。本発明の培養方法で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGjB培地、CMRL1066培地、GlasgowMEM培地、ImprovedMEM培地、IMDM培地、Medium199培地、EaglesMEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI1640培地、Fischer’s、およびこれらの混合培地等をあげることができるが、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。本発明の培養方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得るが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という観点からは、無血清培地が好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分例えば、増殖因子が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のKSRを適量例えば、1-20添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地、細胞由来の因子を添加した培地等をあげることができるが、これらに限定されない。本発明の培地はまた、血清代替物を含んでいても、また含んでいなくともよい。血清代替物は、例えば、アルブミン例えば、脂質リッチアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’-チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものが可能である。かかる血清代替物は、例えば、国際公開第93/30679号公報に記載の方法により調製することができるが、市販のものを利用することもできる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、上記KSRがあげられる。本発明の培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸例えば、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等、任意の成分を含有できる。ただし、本発明に従って、特定のアミノ酸を培地から除く場合は、この限りではない。本発明においては、多能性幹細胞、例えば、ES細胞やiPS細胞を分化する際に、特定のアミノ酸を培地より除くことにより、未分化細胞の減少や除去を行うことができ、その結果、分化誘導効率を向上させることができる。アミノ酸は、一般に、必須アミノ酸Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys,His及び非必須アミノ酸Gly、Ala、Ser、Cys、Gln、Asn、Asp、Tyr、Arg、Proに分けられる。しかし、非必須アミノ酸の内、Cys及びTyrはそれぞれ、前駆アミノ酸として必須アミノ酸であるMet及びPheが必要であるため、準必須アミノ酸と定義されている。また、Argは、未分化細胞胎児新生児においては、アルギニン合成酵素の活性が低いため、未分化細胞においては、準必須アミノ酸と定義できる。本発明及び本明細書においては、Cys、Tyr及びArgを準必須アミノ酸と呼ぶ。本発明でいうアミノ酸除去培地以下、δ除去したアミノ酸培地と表記する場合があるとは、未分化多能性幹細胞の減少又は分化誘導効率を上げることができる、特定のアミノ酸を含有しない分化培地を意味する。分化培地としては、特に限定されないが、例えば消化管、肝臓、膵臓等への分化を望む場合は、特定のアミノ酸を含有しない内胚葉分化培地が該当し、例えば体腔、血管、心臓等への分化を望む場合は、特定のアミノ酸を含有しない中胚葉分化培地、例えば表皮や神経への分化を望む場合は、特定のアミノ酸を含有しない外胚葉分化培地が該当する。その他、特定の器官細胞への分化誘導を行う培地、例えば、肝臓分化培地や膵臓分化培地も、特定のアミノ酸を含有せずかつ未分化多能性幹細胞の減少又は分化誘導効率を上げることができる限り、本発明で言うアミノ酸除去培地に該当する。本発明で言うアミノ酸除去培地は、特定のアミノ酸を含まない内胚葉分化培地、中胚葉分化培地、及び外胚葉分化培地を含むが、好ましくは、特定のアミノ酸を含有しない内胚葉分化培地である。本発明のアミノ酸除去培地において含まれない特定のアミノ酸とは、メチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンのいずれか一つ、又は、それらの2以上の組み合わせ、或いは、それらのすべての組合せであるアミノ酸群である。上記アミノ酸の少なくとも一つが含まれていない分化培地であれば、未分化多能性幹細胞の減少又は分化誘導効率を上げることができるが、特に好ましくは、少なくともメチオニンを含有しない分化培地である。言い換えれば、分化培地は一般に、アラニンを除くすべての必須アミノ酸、及び非必須アミノ酸を含有するが、本発明のアミノ酸除去培地は、必須アミノ酸であるメチオニン、ロイシン、及び準必須アミノ酸であるシステイン、チロシン、アルギニン、からなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含有しない分化培地である。本明細書においては、分化培地又は分化誘導培地は、互いに同じ意味を表すものであり、相互に交換して使用できる。培地中に、アミノ酸として少なくとも必須アミノ酸であるスレオニン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン及びヒスタミンを含み、かつメチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸を含まないとは、培地中に、少なくとも上記8種の必須アミン酸を含み、更にそれ以外の任意のアミノ酸を含むことができるが、メチオニン、ロイシン、システイン、チロシン及びアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも一つのアミノ酸又はそれらの2以上の組合せのアミノ酸群を培地中に含まないことを意味する。例えば、メチオニン以外の上記11種類のアミノ酸を含むがメチオニンを含まない培地、それに更に非必須アミノ酸を含む培地をあげることができる。本発明のアミノ酸除去培地におけるアミノ酸を含まないとは、特定のアミノ酸を、全く含まない場合に加えて微量に含有する場合を含む。微量に含有する場合とは、特定のアミノ酸を低濃度でしか含有しないために、分化において未分化多能性幹細胞の減少又は除去或いは分化誘導効率を上げることができる場合を含む。より具体的には、本発明のアミノ酸除去培地におけるアミノ酸を含まないとは、特定のアミノ酸のいずれかを分化培地中に、全く含まない場合の他、20μM以下、好ましくは10μM以下、さらに好ましくは1μM以下、最も好ましくは0.1μM以下含有することを意味する。本発明においては、多能性幹細胞を、本発明のアミノ酸除去培地において、少なくとも5時間、好ましくは少なくとも1日、更に好ましくは少なくとも2日培養する。また、本発明のアミノ酸除去培地で培養する期間は、好ましくは4日以下、特に好ましくは2日以下である。すべての培養期間、例えば、分化誘導初期の0~10日間のすべてにおいて、本発明のアミノ酸除去培地で多能性幹細胞を培養すると、細胞の成長が妨げられ細胞が成育できない。本発明においては、多能性幹細胞を必須アミノ酸及び準必須アミノ酸を含む分化培地で培養した後、本発明のアミノ酸除去培地で培養することが好ましい。多能性幹細胞の分化誘導において、本発明のアミノ酸除去培地中で多能性幹細胞を培養する時期は、特に制限はなく、未分化多能性幹細胞の減少又は除去或いは分化誘導効率を上げることができる限り、分化誘導の初期内胚葉、中胚葉又は外胚葉への分化の時期であっても又は後期内胚葉、中胚葉又は外胚葉から各種細胞への分化の時期であってよいが、好ましくは、内胚葉、中胚葉又は外胚葉への分化の時期であり、さらに好ましくは、多能性幹細胞を内胚葉、中胚葉又は外胚葉に分化させる培養期間の後半の時期、言い換えれば、内胚葉、中胚葉又は外胚葉の形成の直前又は形成が確認できる時期である。ヒトES細胞やヒトiPS細胞から肝臓細胞又は膵臓細胞への分化を例とした場合は、好ましくは、ES細胞/iPS細胞から内胚葉へと分化する分化誘導の初期の時期であり、さらに好ましくは内胚葉への分化誘導の終期、例えば、培養4日目から10日目までの間の数日間、例えば、培養4日目~6日目又は培養8日目~10日目までの時期であり、最も好ましくは培養8日目~10日目までの時期である。また、分化させた細胞を移植する場合は、移植直前において本発明のアミノ酸除去培地で培養することにより、移植細胞より、未分化多能性幹細胞を減少又は除去することが可能である。本発明における多能性幹細胞の肝臓細胞又は膵臓細胞への分化誘導においては、本発明のアミノ酸除去培地で多能性幹細胞を培養した後に、プロリンを添加した分化培地で培養することができ、それにより、さらに分化誘導効率の改善が期待できる。分化培地に添加するプロリンの量は、1.0mM以上100mM以下、好ましくは、1.0mM以上50mM以下、さらに好ましくは、1.0mM以上10mM以下である。以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。A材料と方法1ヒトES細胞の維持培養ヒトES細胞khES3BiochemBiophysResCommun200634592632は、中辻博士と末盛博士京都大学より分与されたものを、ヒトES細胞の使用に関する指針文部科学省発行に従って使用した。未分化ヒトES細胞は、20KSRノックアウト血清代替物;Invitrogen社、100μM非必須アミノ酸NEAA;GIBCO社、2mML-グルタミンナカライテスク社、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンナカライテスク社、100μMβ-メルカプトエタノールSigma社及び5ng/mlbFGFbovinefibroblastgrowthfactorを添加したKnockoutDulbecco’sModifiedEagle培地DMEM/F12Invitrogen社中にて、支持細胞であるマウス胎児線維芽細胞MEFのフィーダー層上で、37°C、5CO2条件下で培養した。ヒトES細胞の継代には、20KSRおよび1mMCaCl2を含むPBS内で、37°C、5分間、0.25トリプシンと0.1mg/mlコラゲナーゼIVで処理することによりヒトES細胞コロニーを支持細胞層から分離し、その後、培養液を加え、ピペットで優しく数回吸引することでES細胞塊を小片にした5~20細胞。継代は1:2の分割比で実施した。2ヒトiPS細胞の維持培養ヒトiPS細胞株201B7は、高橋博士TakahashiKetalCell131861722007より分与されたものを使用した。また、ヒトiPS細胞Toe細胞株JCRB1338は、梅澤明弘博士国立成育医療センター研究所らが独立行政法人医薬基盤研究所に寄託したものの分譲を受けて使用した。ただし、以下の実施例の記載において、特に断りのない限りは、用いたヒトiPS細胞は、201B7である。未分化のヒトiPS細胞も、ヒトES細胞と同様にして、維持培養を行った。3フィーダー細胞mmcM15細胞の調整mmcM15細胞mousemesonephrosは、登録番号ECACC95102517として、細胞バンクCAMRCenterforAppliedMicrobiologyResearchECACC,Salisbury,Wiltshireに登録されている。M15細胞は文献LarssonSHCharlieuJPMiyagawaKetalSubnuclearlocalizationofWT1insplicingortranscriptionfactordomainsisregulatedbyalternativesplicingCell81391401の記載に従って入手可能である。4免疫細胞化学検査免疫蛍光染色全マウント免疫組織化学検査を行う際、ES細胞又はiPS細胞をNuncTheranoxColerslips24ウェルタイプNunc社上に置いた。細胞を、4パラホルムアルデヒド中、室温で20分間固定し、0.1Tween含有リン酸緩衝生理食塩水PBS-Tで充分に洗浄した。1TritonX-100を含有するPBS中、室温で10分間浸透させ、ブロッキング溶液×5BlockingOne、ナカライタスク社で1時間インキュベートした後、ブロッキング溶液中の一次抗体を試料に添加し、4°Cで一夜インキュベートした。試料をPBS-Tで充分に洗浄し、PermaFluorAqueousMounting培地IMMUNON社でマウントした。共焦点画像をLeicaSpectralConfocalScanningSystem、TCS-SP2Leica社を用いて取得した。検出に用いた抗体は以下の通りである。ウサギ抗α-フェトプロテインAFP、Dako社、ヤギ抗アルブミンSigma社、ウサギ抗Pdx1Chemicon社、マウス抗Oct3/4SantaCruz社、ヤギ抗Sox17RD社。二次抗体はAlexa568標識ヤギ抗ウサギ抗体とロバ抗ヤギ抗体、及びAlexa488標識ヤギ抗マウス抗体とヤギ抗ウサギ抗体、ロバ抗ヤギ抗体MolecularProbes社を用いた。細胞はDAPIRoche社で対比染色した。また、Sox17およびOct3/4陽性細胞数については、ImageXpressモレキュラーデバイス社を用いて定量化した。5インドシアニングリーンテストインドシアニングリーンICG;第一三共株式会社を培地で希釈し、最終濃度を1mg/mlとした。ICGテスト溶液を、分化したiPS細胞に加え、37°C、5CO2下で30分間インキュベートした。その後、ICG含有培地を除去し、HBSSで3回洗浄した。ICG処理後24時間の間、ICGの細胞取り込みを、電子顕微鏡により観察した。6アルブミン分泌テスト培地を新鮮な培地に交換し、24時間もしくは48時間培養した後、培養上清を回収した。培養上清中へ分泌されたヒトアルブミンを、ELISAQuantitationkitBethylLaboratories社で測定した。7CYP活性測定チトクロームP450活性を確認するために、P450-Gro商標CYP3A4AssaywithLuciferin-IPAPromega社を用いた。分化誘導30日目に、適当な発光CYP基質を含む培地に交換した。製造者使用説明書に従って、細胞を、37°Cで3時間培養した後、培養上清を同量の検出試薬と混合した。8PAS染色過ヨウ素酸シッフ染色分化した細胞中でのグリコーゲン貯蔵の検出のために、PAS染色キット武藤化学株式会社を用いた。30日間培養した細胞を、3.3ホルマリン中で10分間固定した後、製造者使用説明書に従って染色を行った。9リアルタイムPCR分析RNeasymini-kitQiagen社を用いてES細胞からRNAを抽出した後、RNAをDNA分解酵素Qiagen社で処理した。RT反応を調べるため、MMLV逆転写酵素東洋紡株式会社とoligodTprimer東洋紡株式会社を用いて3μgのRNAを逆転写した。5倍に希釈したcDNARTプロダクトの1の1μlをPCR分析に使用した。定量RT-PCRを用いて、各アミノ酸培地の肝臓分化マーカーAFP、Albuminの発現を定量し、経時的に比較した。B実施例実施例1:ヒトES細胞及びヒトiPS細胞の内胚葉への分化材料と方法1に従って維持培養したヒトES細胞KhES3株及びヒトiPS細胞201B7を内胚葉に分化させた。ヒトES細胞/iPS細胞を播種する前日に、mmcM15細胞を5.0×104細胞/ウェルの細胞密度で、ゼラチンコート済の96ウェルプレートに事前に播種しておいたmmcM15プレート。ヒトES細胞/iPS細胞は、分化誘導に先立ち、ReproStem培地ReproCell社にRockinhibitorY27632;10μM、和光純薬工業株式会社及び5ng/mlbFGFを添加した培地中で1日培養した。分化誘導のため、ヒトES細胞/iPS細胞を、0.25トリプシン-EDTAInvitrogen社を用いて培養皿から剥離し、マイトマイシンC処理をしたmmcM15細胞プレートに、1x104細胞/ウェルの細胞濃度にて播種した。ES/iPS細胞は、播種の翌日、PBSで1回洗浄した後、分化培地に移した。内胚葉分化のための分化培地は、100ng/mlアクチビンRDSystems社、B27培地添加物Invitrogen社、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンナカライテスク社、2mML-グルタミンナカライテスク社、及び100μMβ-メルカプトエタノールSigma社を含んだPRMI1640培地Invitrogen社を用いた。培地は、一日おきに、新しい培地と交換した。ヒトES細胞/iPS細胞を、分化培地で10日間培養した。ヒトES細胞については、分化培地に移してから、培養6日目Day6、8日目Day8及び10日目Day10のそれぞれについて、抗Sox17抗体及びOct3/4抗体を用いた免疫蛍光染色を行った。また、ヒトiPS細胞については、培養4日目Day4、培養6日目Day6、8日目Day8及び10日目Day10について、Sox17及びOct3/4の免疫蛍光染色を行った。結果を図1に示す。免疫蛍光染色の結果、ヒトES細胞及びヒトiPS細胞ともに、培養10日目にはSox17赤色陽性の内胚葉細胞が確認できた。また、材料と方法9に従い、Sox17、Oct3/4のそれぞれの発現について、RT-PCRを行ったコントロールとして、GAPDHの発現を確認した。結果を図1に示す。RT-PCRの結果、培養10日目Day10のヒトES細胞では未分化細胞マーカーのOct3/4の発現が消失しているが、ヒトiPS細胞の場合は依然として発現が残っていた。このことから、ヒトiPS細胞株201B7はヒトES細胞株KhES3株と比べて、内胚葉への分化に対して抵抗性があることが示唆された。実施例2:ヒトES細胞及びヒトiPS細胞の肝臓への分化実施例1と同様にして、内胚葉分化培地で10日間培養した後、培地を肝臓分化培地に変更した。肝臓分化培地は、1μMデキサメタゾンSigma社、10μ/mlヒト組換えHGFPeprotech社、0.5DMSOSigma社、0.5mMニコチンアミドSigma社、0.2mMアスコルビン酸Sigma社、10KSR、2000mg/lグルコース、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンナカライテスク社、2mML-グルタミンナカライテスク社、及び100μMβ-メルカプトエタノールSigma社を含んだDMEM培地Invitrogen社を用いた。培地は、29日目まで、一日おきに新しい培地に交換した。材料と方法9に従い、未熟肝臓細胞マーカーであるAFP及び成熟肝臓細胞マーカーであるアルブミンのそれぞれの発現について、RT-PCRを行った。結果を図2に示す。黒色バーがヒトES細胞であり、白色バーがヒトiPS細胞である。その結果、AFPはすべての培養期間において、iPS細胞株の方がES細胞株よりも発現量が低かった。さらに、アルブミンに関しては、iPS細胞ではES細胞と比較して顕著な低発現を示した。これらの結果から、ヒトiPS細胞株201B7はヒトES細胞株KhES3株と比べて、内胚葉のみならず肝臓への分化に対しても抵抗性があることが示唆された。実施例3:ヒトiPS細胞を用いた、内胚葉への分化におけるアミノ酸の影響アミノ酸を1種類ずつ除去した内胚葉分化培地を用いてヒトiPS細胞を内胚葉に分化誘導した。内胚葉への分化誘導は、mmcM15細胞を用いた内胚葉分化誘導法を用いた非特許文献6参照。培地は、培養時期に応じて以下の培地を用いた。内胚葉分化培地として、培養開始Day0から培養6日目Day6又は8日目Day8までは、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンGIBCO社、2mML-グルタミンGIBCO社、100μMβ-メルカプトエタノールSigma社、非必須アミノ酸GIBCO社、100ng/mlアクチビンRDSystems社、及びB27培地添加物Invitrogen社を添加したPRMI1640培地Invitrogen社を用いた。内胚葉分化培地として、培養6日目Day6又は8日目Day8から培養10日Day10までは、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシン、2mML-グルタミン、100μMβ-メルカプトエタノール、100ng/mlアクチビン、及びB27培地添加物を添加したPRMI1640培地から1種類ずつアミノ酸を除去したアミノ酸除去培地又はアミノ酸を除去していない培地コントロール培地を用いた。具体的には、ゼラチンコートした96ウェルプレートに、支持細胞としてmmcM15細胞を播種した。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞を、mmcM15細胞上に1×104個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞を10μMY27632、5ng/mlbFGFを添加したES培地ReproStem、ReproCell社で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後にPBSで一回洗浄後に、内胚葉分化培地に培地を変更したDay0。培養6日目又は培養8日目まで内胚葉分化培地を1日おきに交換し、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。培養6日目又は培養8日目に、アミノ酸除去培地又はコントロール培地に培地を変更した。アミノ酸除去培地又はコントロール培地を用いて培養10日目までヒトiPS細胞を培養した。培養10日目に、ヒトiPS細胞の免疫蛍光染色を行い、内胚葉分化マーカーSox17と未分化マーカーOct3/4の陽性細胞の割合を定量解析した。DAPIで染色されたものに対するそれぞれの陽性細胞の割合を算出した。図3Aに、培養のスケジュールを示す。コントロール培地における、免疫蛍光染色の結果を図3Bに示す。また、内胚葉分化マーカーSox17と未分化マーカーOct3/4の陽性細胞の割合を定量解析した結果を図4に示す。各陽性細胞の割合を、各アミノ酸除去培地とコントロールとの間で比較した。X軸は除去したアミノ酸の種類、Y軸は陽性細胞率を示している。黒色バーはOct3/4陽性細胞、白色バーはSox17陽性細胞を示す。6日目~10日目の間のアミノ酸除去は、Oct3/4陽性細胞、Sox17陽性細胞の割合に影響した。各必須アミノ酸Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys,His及び準必須アミノ酸Cys、Tyr、Argの除去はOct3/4陽性細胞率を減少させた。Serを除くいずれのアミノ酸除去においてSOX17陽性細胞率は増加しなかった実施例4:ヒトiPS細胞の内胚葉への分化における、8日目~10日目の間のアミノ酸除去の影響実施例3と同様にして、ヒトiPS細胞を用いて、内胚葉分化における、8日目~10日目の間のアミノ酸除去の影響を確認した。ただし、mmcM15細胞を用いた内胚葉分化誘導法を用いて8日目Day0~Day8まで通常培地で培養した後、8日目~10日目Day8~Day10までアミノ酸除去培地又はコントロール培地に変更し、ヒトiPS細胞を培養した。10日目Day10に、ヒトiPS細胞の免疫蛍光染色を行い、Sox17陽性細胞とOct3/4陽性細胞の割合を定量した。各陽性細胞の割合を、各アミノ酸除去培地とコントロール培地との間で比較した。結果を、図5に示す。X軸は各除去アミノ酸、Y軸は陽性細胞率を示す。黒色バーはOct3/4陽性細胞、白色バーはSox17陽性細胞を示す。8日目~10日目の間のアミノ酸除去は、Oct3/4陽性細胞、Sox17陽性細胞の割合に影響した。非特許文献2において、マウスES細胞の生存に必須だと報告があったThrを除去した培地では、Oct3/4陽性細胞とともにSox17陽性細胞数も減少するため、選択培地としては不向きであった。各必須アミノ酸Thr、Met、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys,His及び準必須アミノ酸Cys、Tyr、Argの除去はOct3/4陽性細胞率を顕著に減少させた。Gly,Ser,Met,Cys,Gln,Leu又はArgの除去はSox17陽性細胞率を増加させた。Oct3/4の減少とSox17の増加の両方を示したのは、Met、Cys、Leu、Argを除去した培地ドッドバーであり、Sox17の変化なくOct3/4の減少を示したのがTyrを除去した培地ドッドバーであった。8日目Day8~10日目Day10の間、メチオニン除去培地δMet培地で培養して内胚葉へ分化させたヒトiPS細胞を免疫蛍光染色したものを図6に示す。コントロール培地を用いて培養したヒトiPS細胞には、Oct3/4陽性細胞が残存し、Sox17陽性細胞と混在している。一方、メチオニン除去培地を用いて培養したヒトiPS細胞にはOct3/4陽性細胞の残存を認めず、Sox17陽性細胞が均一に存在している。実施例5:ヒトiPS細胞の肝臓細胞への分化における、8日目~10日目の間のメチオニン除去の影響ヒトiPS細胞の内胚葉分化過程におけるメチオニン濃度変化のヒトiPS細胞の肝臓への分化に対する影響を調べるために、メチオニン除去培地及び任意の濃度のメチオニン含有培地で8日目Day8~10日目Day10まで処理した後、肝臓分化培地で培養した場合の、肝臓マーカーであるAFPの発現変化を調べた。8日目~10日目の期間のメチオニン添加濃度は、それぞれ1、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、200及び500μMとした。実施例4と同様にして、mmcM15細胞を用いて、8日目までヒトiPS細胞を内胚葉に分化誘導し、8日目Day8~10日目Day10まで、メチオニン除去培地及び任意の濃度のメチオニン含有培地に培地を変更し、37°C、5CO2下で10日目Day10まで培養した。10日目Day10に肝臓分化培地10KSR、2000mg/lD-グルコース、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシン、2mML-グルタミン、100μMβ-メルカプトエタノール、10μ/mlヒト組換えHGF、及び1μMデキサメタゾンを含んだMEME培地以下2000KSR-DMEM培地という。に培地を変更し、37°C、5CO2下で20日目Day20まで培養した。10日目Day10~20日目Day20の期間、培地を1日おきに交換した。20日目でDay20で、ヒトiPS細の免疫蛍光染色を行い、それぞれのメチオニン濃度毎にOct3/4陽性細胞およびAFP陽性細胞の割合を比較した。結果を図7に示す。図7Bの結果より、以下のことがわかった。メチオニン濃度に依存して、20日目におけるOct3/4陽性細胞の割合が増加していた。また、AFP陽性細胞の割合は50μM以上のメチオニン添加で減少していた。また、図7Cより、以下のことが確認された。メチオニン濃度に依存して、20日目Day20におけるOct3/4陽性細胞数が増加している。メチオニン濃度0μM~0.1μMではOct3/4陽性細胞の残存はわずかで、AFP陽性細胞が均一に存在している。メチオニン濃度1μM~20μMでは、Oct3/4陽性細胞数が軽度の増加を示すが、AFP陽性細胞数の減少を認めない。50μM以上のメチオニン添加ではOct3/4陽性細胞の顕著な増加とSox17陽性細胞の顕著な減少を認める。実施例6:ヒトiPS細胞の肝臓細胞への分化における、メチオニン除去の影響実施例4と同様にして、mmcM15細胞を用いて、8日目までヒトiPS細胞を内胚葉に分化誘導し、8日目~10日目までは、メチオニン除去培地δMet培地又はコントロール培地に培地を変更し、37°C、5CO2下で培養した。10日目Day10に肝臓分化培地2000KSR-DMEM培地に培地を変更し、37°C、5CO2下で30日目Day30まで培養した。10日目Day10~30日目Day30の期間、培地を1日おきに交換した。実施例6-120日間培養したヒトiPS細胞を、抗AFP抗体及び抗Oct3/4抗体を用いて、免疫蛍光染色を行った。結果を図8A示す。コントロール培地を用いて培養したヒトiPS細胞では、20日目Day20においてOct3/4陽性細胞の残存を認めたが、これに対して、δMet培地を用いて培養したヒトiPS細胞では、20日目にけるOct3/4陽性細胞の残存を認めなかった。実施例6-230日間培養したヒトiPS細胞を、抗AFP抗体及び抗アルブミン抗体を用いて、免疫蛍光染色を行った。結果を図8Bに示す。コントロール培地を用いて培養したヒトiPS細胞のものと同様にδMet培地を用いて培養したヒトiPS細胞においても、30日目Day30においてアルブミン陽性細胞が確認できた。実施例6-3材料と方法5に従い、30日目Day30における、インドシアニングリーンICGの取り込み-排泄試験を行った。結果を図8Cに示す。上段はコントロール培地で培養後、肝臓分化培地で培養したヒトiPS細胞Day30、下段はδMet培地で培養後、肝臓分化培地で培養したヒトiPS細胞Day30である。左欄は、ICG処理後0時間、右欄は、ICG処理後24時間である。コントロール培地で培養したヒトiPS細胞及びδMet培地で培養したヒトiPS細胞の両方で、ICGの取り込みと、24時間後の排泄を認めた。実施例6-4材料と方法6に従い、20日目Day20及び30日目Day30における、アルブミン分泌量の測定を行った。20日目及び30日目で、培地交換48時間後の培養液中のアルブミン量を測定し、2日間に分泌されるアルブミン量を定量したn=4。結果を図8Dに示す。δMet培地で培養したヒトiPS細胞では、コントロールに比較して顕著に高いアルブミン分泌活性を示した。実施例6-5材料と方法7に従い、30日目Day30におけるCYP3A4活性を調べた。結果を図8Eに示す。δMet培地で培養したヒトiPS細胞では、コントロール培地ctに比較して高いCYP3A4活性を示した。実施例6-6材料と方法8に従い、30日間Day30培養したヒトiPS細胞に対してPAS染色を行った。結果を図8Fに示す。δMet培地で培養したものは、PAS陽性細胞が存在し、一部は、二核細胞binuclearcellであった矢印。実施例7:ヒトiPS細胞の膵臓細胞への分化における、8日目~10日目の間のメチオニン除去の影響ヒトiPS細胞の内胚葉分化過程におけるメチオニン除去がヒトiPS細胞の膵臓への分化に対する影響を調べるために、コントロール培地又はメチオニン除去培地で8日目~10日目まで処理した後、膵臓分化培地で13日目まで培養し、機能性膵β細胞マーカーであるPdx1の発現を調べた。実施例4と同様にして、mmcM15細胞を用いて、8日目までヒトiPS細胞を内胚葉に分化誘導し、8日目~10日目まで、コントロール培地又はメチオニン除去培地に培地を変更し、37°C、5CO2下で10日目まで培養した。10日目に膵臓分化培地2000mg/lD-グルコース、50units/mlペニシリン及び50μg/mlストレプトマイシンGIBCO社、2mML-グルタミンGIBCO社、100μMβ-メルカプトエタノールSIGMA社、非必須アミノ酸GIBCO社、1μMレチノイン酸、50ng/mlFgf10Fibroblastgrowthfactor-10、0.25μMKAAD-シクロパミン、及びB27培地添加物を添加したDMEM培地に移した。10日目~13日目の間、毎日新しい培地と交換した。10日目Day10のヒトiPS細胞を、抗Oct3/4抗体及び抗Sox17抗体を用いて、13日目Day13のヒトiPS細胞を、抗Oct3/4抗体及び抗Pdx1抗体を用いて、免疫蛍光染色をした。結果を、図9A示す。また、材料と方法9に従い、Sox17、Oct3/4、Pdx1のそれぞれの発現について、RT-PCRを行ったコントロールとして、GAPDHの発現を確認した。結果を図9BDay10及び図9CDay13に示す。免疫蛍光染色の結果より、メチオニン除去群では、Oct3/4陽性細胞が顕著に減少していた。また、RT-PCT解析でも同様の結果が得られた。実施例8:フィーダーフリーの分化誘導系における、メチオニン除去の影響フィーダー細胞mmcM15細胞を用いないヒトiPS細胞の内胚葉分化過程におけるメチオニン除去がヒトiPS細胞の肝臓分化に及ぼす影響を調べた。具体的には、RPMI1640培地で40倍希釈したマトリゲルBDで一晩コートした96ウェルプレートを培養に用いた。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞を、マトリゲルコートプレートに1×105個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞を10μMY27632、5ng/mlbFGFを添加したES培地ReproStem、ReproCell社で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後にPBSで一回洗浄後に、内胚葉分化培地に培地を変更したDay0。培養8日目まで内胚葉分化培地を1日おきに交換し、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。培養8日目に、メチオニン除去培地δMet培地又はコントロール培地に培地を変更した。メチオニン除去培地又はコントロール培地を用いて培養10日目までヒトiPS細胞を培養した。培養10日目に、ヒトiPS細胞の免疫蛍光染色を行い、内胚葉分化マーカーSox17と未分化マーカーOct3/4の陽性細胞を解析した。培養10日目に肝臓分化培地2000KSR-DMEM培地に交換し、それ以降は1日おきに培地交換した。培養10日目Day10の細胞を、抗Sox17抗体及び抗Oct3/4抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。結果を図10Bに示す。M15細胞を用いた分化誘導方法と同様に、フィーダーフリーの培養系においても8日目~10日目までのメチオニン除去は未分化細胞の除去効果があることが確認された。また、培養18日目Day18の細胞を、Oct3/4、アルブミン、AFPのそれぞれの発現について、RT-PCRを行ったコントロールとして、GAPDHの発現を確認した。結果を図10Cに示す。メチオニン除去群において、未分化細胞マーカーのOct3/4の発現が顕著に減少している一方、肝臓マーカーであるアルブミンの発現が高くなっていることが確認された。また、17日目Day17、25日目Day25及び27日目Day27における、アルブミン分泌量の測定を行った。17,25および27日目で、培地交換24時間後の培養液中のアルブミン量を測定し、1日間に分泌されるアルブミン量を定量した。結果を図10Dに示す。メチオニン除去培地で培養したヒトiPS細胞黒色バーでは、コントロール白色バーに比較して顕著に高いアルブミン分泌活性を示した。実施例9:ヒトiPS細胞の肝臓分化におけるプロリン添加の影響実施例9-1肝臓分化におけるプロリン添加分化培地の影響を調べるために、プロリンを1mMの濃度に添加した肝臓分化培地を用いてヒトiPS細胞を肝臓前駆細胞に分化誘導した。ゼラチンコートした96ウェルプレートに支持細胞としてmmcM15細胞を播種した。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞をmmcM15細胞上に1×104個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞をY27632及びbFGFを添加したES培地で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後に内胚葉分化培地に培地を変更したDay0。実施例3と同様にして、培養開始日Day0~8日目Day8まで内胚葉分化培地を1日おきに交換し、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。8日目Day8にメチオニン除去培地又はコントロール培地に培地を変更した。メチオニン除去培地またはコントロール培地を用いて10日目Day10までヒトiPS細胞を培養した。10日目Day10に、肝臓分化培地2000KSR-DMEM培地、コントロール培地又はコントロール培地にさらにプロリン1mMを添加したPro含有2000KSR-DMEM培地に培地を変更し、37°C、5CO2下で19日目Day19まで培養した。10日目~19日目の期間、培地を1日おきに交換した。19日目Day19において、抗Oct3/4抗体及び抗AFP抗体を用いて、ヒトiPS細胞の免疫蛍光染色を行った。結果を図11に示す。メチオニン除去群では、コントロール群に比較して、AFP陽性細胞が均一に存在し、Oct3/4陽性細胞が減少していた。プロリン添加群では、コントロール群に比較してAFP陽性細胞が多く、Oct3/4陽性細胞が減少していた。メチオニン除去とプロリン添加を行った群ではAFP陽性細胞の増加とOct3/4陽性細胞の顕著な減少を認めた。実施例9-2プロリンの添加量を1mMから10mMに変えた他は、実施例9-1と同様にして実験を行った。プロリンを10mMした場合も、1mM添加の場合と、同様の結果が得られた。実施例10:ヒトES細胞を用いた、内胚葉への分化におけるアミノ酸の影響実施例1と同様にして、ヒトES細胞khES3を内胚葉へと分化させた。ただし、培養8日目~10日目は、ヒトiPS細胞の場合と同様に、メチオニンを除去したメチオニン除去培地で培養した。培養10日目Day10に、内胚葉未分化マーカーSox17と未分化マーカーOct3/4の遺伝子発現を、リアルタイムPCR法を用いて定量解析した。結果を図12に示す。培養8日目~10日目にメチオニン除去培地で培養することにより、未分化マーカーであるOct3/4の発現が顕著に減少して、内胚葉マーカーであるSox17の発現が顕著に増加していた。このことから、アミノ酸除去培地の効果は、ヒトES細胞にも有効であることが示された。実施例11:フィーダーフリー系でのヒトiPS細胞の分化における、4日目~6日目の間のメチオニン除去培地の効果実施例8と同様にして、フィーダー細胞を用いない系において、iPS細胞Toe細胞株を内胚葉へと分化させた。ただし、メチオニン除去培地での培養は、8日目~10日目及び4日目~6日目に行い、それぞれ10日目Day10及び6日目Day6における細胞を、抗Sox17抗体及び抗Oct3/4抗体を用いて、免疫蛍光染色を行った。結果を図13に示す。その結果、4日目~6日目までのメチオニン除去培地での培養においても、8日目~10日目と同様に、未分化細胞の除去効果があることが確認された。実施例12:ヒトiPS細胞の維持培養過程におけるメチオニン除去の影響ヒトiPS細胞の維持培養過程におけるメチオニン除去が、ヒトiPS細胞の生育に及ぼす影響を調べた。具体的には、RPMI1640培地で40倍希釈したマトリゲルBDで一晩コートした96ウェルプレートを培養に用いた。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞を、マトリゲルコートプレートに5×104個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞を10μMY27632、5ng/mlbFGFを添加したES培地CSTI-7細胞科学研究所で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後にPBSで一回洗浄後に、CSTI-7培地Complete、CSTI-7からメチオニンを除去した培地ΔMetおよびΔMetに様々な濃度のメチオニンを添加した培地ΔMetMetに変更したDay0。培養2日目まで、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。培養2日目に、ヒトiPS細胞の細胞数を、PrestBlueInvitrogenを用いて定量した。結果を図14に示す。図14Aは、培養2日後の各条件の明視野像を示している。メチオニン除去することにより、ヒトiPS細胞のコロニーは減少した。図4Bはメチオニン除去後の細胞数を定量化した結果である。メチオニンの除去により、未分化のiPS細胞の生育が妨げられていることが確認された。実施例13:メチオニン除去培地での処理時間の影響内胚葉分化におけるメチオニン除去培地の処理時間の影響を調べるために、分化8日目にメチオニン除去培地に培地交換し、5、24及び48時間後の細胞増殖及びアポトーシスについて評価した。具体的には、ゼラチンコートした96ウェルプレートに支持細胞としてmmcM15細胞を播種した。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞をmmcM15細胞上に1×104個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞をY27632及びbFGFを添加したES培地で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後に内胚葉分化培地に培地を変更したDay0。培養開始日Day0~8日目Day8まで内胚葉分化培地を1日おきに交換し、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。8日目Day8にメチオニン除去培地又はコントロール培地に培地を変更した。メチオニン除去培地またはコントロール培地を用いて10日目Day10までヒトiPS細胞を培養した。8日目の培地交換の5、24及び48時間後の細胞増殖をClick-iTEdU細胞増殖アッセイキットInvitrogen社を用いて評価し、アポトーシスをInSitu細胞死検出キットロシュ社を用いて評価した。さらに、メチオニン除去の期間について検討するために除去期間をD6-10、D7-10、D8-10、及びD9-10として、培養10日目のOct3/4およびSox17陽性細胞をカウントした。結果を図15及び図16に示す。図15Aは、Oct3/4およびSox17陽性細胞におけるEdU取り込みを抗体染色で評価した結果を示し、Bに定量結果をグラフで示した。メチオニン除去5時間後には、細胞増殖は著しく阻害され、その効果は、Oct3/4陽性細胞で顕著であった。Cは、Oct3/4およびSox17陽性細胞におけるアポトーシスをTunel染色で評価した結果を示し、Dに定量結果をグラフで示した。メチオニン除去5時間後には、Oct3/4陽性細胞において特異的にアポトーシスが誘導されている。また、メチオニン除去の期間について検討するために除去期間をD6-10、D7-10、D8-10、及びD9-10として、培養10日目のOct3/4およびSox17陽性細胞をカウントした。結果を図16に示す。培養6日目からの除去ではSox17陽性細胞の減少が確認された。実施例14:メチルドナー除去培地の影響内胚葉分化におけるメチオニンおよびメチルドナー除去培地の影響を調べるために、分化8日目に培地中よりメチオニンおよびメチルドナーを除去し、10日目まで培養しOct3/4及びSox17陽性細胞数を抗体染色で評価した。具体的には、ゼラチンコートした96ウェルプレートに支持細胞としてmmcM15細胞を播種した。ヒトiPS細胞は、播種24時間前からY2763210μMで処理し、0.25トリプシンを用いて剥離した。剥離したヒトiPS細胞をmmcM15細胞上に1×104個/ウェルの細胞濃度で播種した。播種したヒトiPS細胞をY27632及びbFGFを添加したES培地で37°C、5CO2下で24時間培養した。24時間後に内胚葉分化培地に培地を変更したDay0。培養開始日Day0~8日目Day8まで内胚葉分化培地を1日おきに交換し、37°C、5CO2下でヒトiPS細胞を培養した。8日目Day8に各種培地に培地を変更した。培地中からメチオニン葉酸ビタミンB12ベタインコリンを除去したものをメチルドナー除去培地とした。各種培地を用いて10日目Day10までヒトiPS細胞を培養し、Oct3/4およびSox17陽性細胞をカウントした。図17に示すように、メチオニンは生体内でビタミンB12VB12葉酸FolicAcidコリンベタインを利用して、S-アデノシルメチオニンSAMS-アデノシルホモシステインSAHホモシステインHcyから生合成される。また、メチオニンは代謝されてシステインCysになることが知られている。そこで、メチオニン除去培地△Met又はメチルドナー除去培地△MDに、Met,SAM,Hcy,SAH,Cysを添加して、メチオニン除去によるOct3/4陽性細胞の減少作用を阻害できるかを試した。結果を図18に示した。図中、△MDは、メチルドナーである、メチオニン、葉酸、ビタミンB12、ベタイン及びコリンを含まない培地を意味する。図18Aは、Oct3/4及びSox17陽性細胞の染色像を示し、図18Bに定量結果をグラフで示した。Bに示すように、Met,SAM,Hcy,SAH添加により、Oct3/4陽性細胞の減少効果は阻害され、Cys添加は影響がなかった。さらに、メチルドナー除去培地を用いてメチオニン生合成が行われない系で同様の検討を行ったところMet,SAMの添加は、Oct3/4陽性細胞の減少効果を阻害したが、Hcy,SAHの添加は影響がなかった。このことからメチオニン除去による未分化細胞の減少は、細胞中のSAMがなくなることに起因することが示唆された。上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。"