1カプシド改変を含むアデノウイルス血清型5核酸主鎖、2E1のRb結合定常領域2における24bp欠失および3E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k67Kの代わりに、CTLA4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。以下の領域左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む、請求項1または2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。領域が5から3方向に順次に配置される、請求項3に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。野生型領域がE1領域の上流に位置する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E1領域がウイルスパッケージングシグナルを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。aCTLAMAbをコードする核酸配列がウイルスE3プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E1領域の上流に、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターまたはE2Fプロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ウイルスの主鎖にCpG部位をさらに含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。CpG部位がE3領域にある、請求項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E4領域が野生型である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変が、Ad53キメリズム、インテグリン結合性領域の挿入およびまたは繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変がAd53キメリズムである、請求項12に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変がRGD4C改変である、請求項12に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。少なくとも1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ただ1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ベクターが、Rbp16経路における欠損を有する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ベクターが、テロメラーゼを発現する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。請求項1~18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む細胞。請求項1~18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。insitu癌ワクチンとして機能する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。被験者の癌を治療するための、請求項1~18のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクター。被験者の癌を治療する方法であって、請求項1~18または20のいずれか1つに記載のベクターまたは医薬組成物の被験者への投与を含む前記方法。癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病リンパ腫、神経腫、フォンヒッペルリンドウ病、ゾリンジャーエリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌、扁桃癌からなる群から選択される、請求項21~23に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。被験者がヒトまたは動物である、請求項21~24に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。投与が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射であるか、または経口投与である、請求項21~25のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物が、治療期間中に数回投与される、請求項21~26のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。以前の治療のベクターと比較して異なるカプシドの繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される、請求項21~27のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、被験者への同時放射線治療または同時化学療法または他の同時癌治療の投与をさらに含む、請求項21~28のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、被験者における、べラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬オートファジー誘導剤テモゾロマイド制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質シクロホスファミドおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される助剤の被験者への投与をさらに含む、請求項21~29のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む、請求項21~29のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。細胞内でCTLA4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を産生する方法であって、a請求項1~18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、b細胞内で前記ベクターのCTLA4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現させることを含む前記方法。被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、a請求項1~15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、b細胞内で前記ベクターのCTLA4に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を発現させ、c腫瘍溶解性プラットフォームを用いることによって抗CTLA4mAbの発現量を増加させ、d腫瘍溶解性プラットフォームを用いることによって抗CTLA4mAbの腫瘍対血漿比を増加させることを含む前記方法。細胞内で抗CTLA4mAbを産生するための、請求項1~18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。CTLA4に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための、請求項1~18のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。動物すべての動物プロトコルは、ExperimentalAnimalCommitteeoftheUniversityofHelsinkiandtheProvincialGovernmentofSouthernFinlandに審査され承認された。4~5週齢のNMRIヌードマウスはTaconic社から入手し、試験の前に少なくとも1週間隔離した。マウスの健康状態をしばしばモニターし、何らかの痛みまたは苦痛の徴候が明らかになり次第それらを殺した。細胞培養ヒト頭頸部扁平上皮癌低継代培養腫瘍細胞培養物UTSCC8を、10FCS、1非必須アミノ酸2mmolLグルタミン、100単位mLペニシリンおよび100単位mLストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。UTSCC細胞は、低継代培養で、一般的には継代培養15~30で用いた。ヒト形質転換胎児腎臓細胞株293、ヒト肺癌細胞株A549、ヒト卵巣癌細胞株SKOV3ip1およびヒト前立腺癌細胞株PC3MM2ならびにJurkatヒトTリンパ芽球性白血病細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。すべての細胞株は、推奨条件で維持した。ヒト試料健常者および、従来の治療には難治性の進行性転移腫瘍患者の末梢血単核細胞をインフォームドコンセントを得て入手した。統計解析両側スチューデントt検定を用い、005未満のP値を有意とみなした。アデノウイルスの構築IgG2型抗CTLA4mAbをコードするcDNA配列を含むキメラアデノウイルスを作成した。アデノウイルスE3Aの67Kgp19K欠失部位に抗CTLA4mAbのコード配列を導入して、複製コンピテントアデノウイルスAd53Δ24aCTLA4、Ad53hTERTΔ24aCTLA4、Ad53hTERTΔ24aCTLA4CpG、Ad53E2FΔ24aCTLA4およびAd53E2FΔ24aCTLA4CpGを作成し、あるいはCMVプロモーターによって駆動される欠失E1に導入して、複製欠損性アデノウイルスAd53aCTLA4を作成した。一般的なアデノウイルス調製技術を用いて腫瘍溶解性アデノウイルスを作成し増幅した。簡潔に言えば、導入遺伝子および他の部分を含むE1またはE3シャトルベクターのいずれかを最初に構築し、ヒト組換え酵素を特徴とする細菌細胞内でレスキュープラスミドと組み換えた。対照ウイルスAd5Luc1およびAd53Δ24を含むこれらのウイルスの主な特徴を図1に示す。Ad53Δ24aCTLA4を作成するために、プラスミドpTHSNaCTLA4を作成した。pTHSNaCTLA4は、67Kgp19Kが欠失したアデノウイルスゲノムのE3領域にIgG2型抗CTLA4mAbのH鎖およびL鎖を含む。H鎖およびL鎖の等モル濃度は、両鎖間の内部リボソーム侵入部位によって達成される。エシェリキアコリBJ5183細胞内で、FspI線状化pTHSNaCTLA4と、血清型3ノブおよびE1Aにおける24bp欠失を含むレスキュープラスミドであるSrfI線状化pAdEasy153Δ24との相同組換えによってpAdEasy153Δ24aCTLA4を作成した。Ad53Δ24aCTLA4のゲノムをPacI消化によって放出させ、次いでA549細胞にトランスフェクトした。このウイルスをA549細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的TCID50アッセイを行い、感染性粒子力価を測定した。Ad53hTERTΔ24aCTLA4、Ad53hTERTΔ24aCTLA4CpG、Ad53E2FΔ24aCTLA4およびAd53E2FΔ24aCTLA4CpGを作成するために、最初に抗CTLA増幅産物をpTHSNまたはpTHSNCpGにサブクローニングし、続いて、pAd53hTERTE1AまたはpAd53E2FE1Aと組換えた5396403。得られたプラスミドをPacIで線状化し、増幅およびレスキューのためにA549細胞にトランスフェクトした。このウイルスをA549細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的TCID50アッセイを行い、感染性粒子力価を測定した。クローニングのすべての段階をPCRおよび複数の制限酵素処理で確認した。シャトルプラスミドpTHSNaCTLA4を配列決定した。野生型E1の非存在をPCRにより確認した。最終ウイルスにおいて、配列決定およびPCRを用いてE1領域、導入遺伝子および繊維をチェックした。以前記載したように、野生型組換えのリスクを避けるために、トランスフェクションを含むウイルス産生のすべての段階をA549細胞で行った。aCTLA4は、感染後約8時間で開始される複製関連導入遺伝子発現を引き起こすE3プロモーターの制御下にある。E3は、67Kgp19Kの欠失を除けば無傷である。非複製型E1欠失対照ウイルスAd53aCTLA4を構築するために、抗CTLA4mAbcDNAの両鎖をpShuttleCMVに連結した。全アデノウイルスゲノムを含むpAdEasy153プラスミドとPmeI線状化pShuttleCMVaCTLA4との間の相同組換えを行って、pAdEasy153aCTLA4を構築した。Ad53aCTLA4のゲノムをPacIによって放出させ、293細胞にトランスフェクトした。このウイルスを293細胞で増殖させ、塩化セシウム勾配で精製した。ウイルス粒子濃度を260nmで測定し、293細胞で標準的プラークアッセイを行い、感染性粒子を測定した。構築されたアデノウイルスのinvitroでの発現および機能性構築されたアデノウイルスが抗CTLA4mAbを発現することを確認するために、ウェスタンブロット分析を用いた。構築されたAd53Δ24aCTLA4またはAd53aCTLA4を用い、1細胞当たり10ウイルス粒子でA549またはPC3MM2腫瘍細胞に感染させた。48時間後、ウイルス感染細胞の上清を002μmフィルターで濾過し、15μLを還元または天然条件下で75SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。この膜をヤギ抗ヒトIgGと共にインキュベートし、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された二次抗体と共にインキュベートした。増強化学発光によってシグナルの検出を行った。ウェスタンブロットにおいて、感染後48時間の上清において、Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4は、天然条件では、予想されたおおよそ150kDaの抗CTLA4mAbを発現し、変性条件では、おおよそ50kDaのH鎖およびおおよそ25kDaのL鎖を発現した。腫瘍溶解性ウイルスAd53Δ24aCTLA4または複製欠損Ad53aCTLA4による抗CTLA4mAb発現を比較するために、PC3MM2細胞を20000細胞ウェルで播種し、それぞれのウイルスを用いて1細胞当たり10VPで感染させた。感染後24時間、48時間および72時間で上清を採取し、ヒトIgGの量をELISAで分析した。Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4による機能性抗CTLA4mAbの発現の確認のために、刺激されたJurkat細胞のIL2産生増加を前述のように試験した。Jurkat細胞を、03μgmlのイオノマイシン、003μgmlのホルボールミリスチルアセタートおよび1μgmlの組換えヒトB7Fcキメラで刺激し、002μm濾過したウイルス感染したPC3MM2細胞の上清で処置した。Jurkat細胞の刺激後48時間で、製造業者の使用説明書に従って、BDCytometricBeadArratHumanSolubleProteinFlexSetによって増殖培地中のインターロイキン2レベルを分析した。1細胞当たり10ウイルス粒子を用い、48時間後に上清を採取した。マウス抗ヒトCTLA4mAb、ヨーロッパを陽性対照として用いた。FCAPArrayv102ソフトウェアを用いて分析した。図7に機能性アッセイの概略図を示す。抗CTLA4mAbは、細胞表面のCTLA4に結合して、組換えB7との免疫抑制相互作用を遮断する。この分析は、それぞれの同質遺伝子対照Ad53Δ24またはAd53Luc1による感染細胞と比較して、Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4に感染した細胞の上清にmAb抗CTLA4活性が観察されたことを示している。陽性対照として組換え抗CTLA4mAbを用いたが、これはJurkat細胞から採取した上清よりも強力であった。ウイルスによって発現された抗CTLA4mAbのCTLA4を介したシグナル伝達を遮断する能力をさらに確認するために、機能喪失アッセイを行った。機能喪失アッセイにおいて、Jurkat細胞を上記のように活性化したが、ただし、イオノマイシン、PMAおよび組換えB7に01μgmlの組換えヒトCTLA4Fcキメラを加えた。rCTLA4は増殖培地中の抗CTLA4mAbに結合し、細胞表面にCTLA4を放出させてrB7と相互作用し、T細胞活性化を抑制するが、これはIL2産生として観察される。それぞれの同質遺伝子である武装していない対照Ad53Δ24またはAd53Luc1と比較して、Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4に感染した細胞からの上清では、抗CTLA4mAb機能の喪失が観察された。さらにまた、Ad53Δ24aCTLA4腫瘍感染細胞の上清で、陽性対照よりもさらに高い、最も高い機能喪失が観察された。総合すれば、Ad53Δ24aCTLA4での癌細胞の感染は、ヒトCTLA4に対する機能性完全ヒトmAbの高発現をもたらし、これは、IL2によって測定されるT細胞活性の低下を引き起こすことをこのデータは示している。アデノウイルスE1およびE3領域における欠失、すなわち、それぞれ、E1のRb結合定常領域2における24bp欠失およびE3における67Kgp19K欠失を考慮に入れる場合、抗CTLA4発現カセットの挿入は、アデノウイルスパッケージングおよび機能性との適合性の提案された105閾値をほんの少し下回ったゲノムサイズの増加と等しい。ゲノムサイズの増加または抗CTLA4の発現がウイルス複製に影響するかどうかを試験するために、A549細胞をAd53Δ24aCTLA4、Ad53Δ24またはPBSに感染させ、上清および細胞から種々の時点でqPCRによってウイルスゲノムを測定した。ウイルス群間で有意差は見られず、無傷の複製が示唆された。腫瘍細胞株および低継代培養腫瘍外植片のCTLA4発現腫瘍細胞株のほぼ90がCTLA4を発現し、抗CTLA4mAbは直接抗腫瘍活性を有することができるということが報告されているため、用いたHNSCC低継代培養腫瘍外植片を含む腫瘍細胞株においてもそれが本当であるかどうかを調べた。表面CTLA4を分析するために、低継代培養腫瘍細胞培養物UTSCC8または腫瘍細胞株A549、SKOV3ip1およびPC3MM2において、間接免疫蛍光法を行った。簡潔に言えば、一次抗体としてマウス抗ヒトCTLA4mAb、ヨーロッパを用いて細胞ペレットを4°Cで30分間インキュベートし、次いで二次抗体としてAlexaFluor488ロバ抗マウスIgGを用いて4°Cでさらに30分間インキュベートした。LSRフローサイトメーター、ヨーロッパを用いて蛍光強度を測定した。少なくとも40000細胞試料が計数された。分析には、ClontechDiscoveryLabwareイムノサイトメトリーシステム、ヨーロッパおよびFlowJo761ソフトウェアを用いた。A549、SKOV3ip1およびPC3MM2腫瘍細胞株は、それぞれ995、966および966のCTLA4発現を示したが、UTSCC8低継代培養腫瘍外植片は903のCTLA4発現を示した。構築されたアデノウイルスのinvitroおよびinvivoでの腫瘍溶解能の評価種々の腫瘍細胞株およびHNSCC低継代培養腫瘍細胞培養物に対するAd53Δ24aCTLA4の腫瘍溶解性有効性を評価した。HNSCC低継代培養腫瘍細胞培養物または腫瘍細胞株PC3MM2、SKOV3ip1もしくはA549を96ウェルプレートに15×104または10×104細胞ウェルで播種した。翌日、2FCSを含むDMEMにウイルスを種々の濃度で希釈し、細胞を37°Cで1時間感染させ、洗浄し、5FCSを含むDMEM中でインキュベートした。製造業者のプロトコルに従って細胞生存率を測定した。結果を図3に示す。Ad53Δ24aCTLA4は、すべての細胞株において、陽性対照ウイルスAd53Δ24と同様な腫瘍溶解能を示した。また、腫瘍細胞はCTLA4を発現するため、複製欠損性Ad53aCTLA4は抗腫瘍活性を示した。Ad53Δ24aCTLA4の腫瘍溶解効果は、それぞれ、PC3MM2、SKOV3ip1、A549およびUTSCC8に対して、976、782、691および573の細胞致死を示した。Ad53Δ24aCTLA4と、E3に導入遺伝子を含まないそのカウンターパートは、分析した腫瘍細胞株のいずれにおいても、細胞傷害に統計的有意差を示さなかった。非複製型Ad53aCTLA4では、低ウイルス用量では細胞傷害は観察されなかった。しかしながら、最も高いAd53aCTLA4用量では細胞傷害が観察され、PC3MM2、SKOV3ip1、A549およびUTSCC8に対しては、それぞれ最大細胞致死率は962、743、491および5615であった。この結果は、癌細胞の表面に発現されたCTLAとの抗CTLA4の直接結合が細胞死を引き起こすという以前の証明と一致する。Ad53Δ24aCTLA4の抗腫瘍活性の評価ヒト前立腺癌異種植皮を有する免疫不全ヌードマウスにおいて、抗CTLA4モノクローナル抗体を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスでこのマウスを処置することによって、このアデノウイルスの腫瘍増殖抑制およびアポトーシスを評価した。5~6週齢雌NMRIヌードマウスの脇腹に5x106個のPC3MM2細胞を注射することによって、ヒト前立腺外植片異種植皮を定着させた。7日後、1x108VPを1日おきに3回、50μLの容量で腫瘍に注射し、対照腫瘍にはDMEMのみを注射した。腫瘍体積を算出するために、式を用いた。5日目に、抗CTLA4またはアポトーシスの発現に関して、免疫組織化学によって腫瘍低温切片を染色した。TissueTekOCTに封入した凍結腫瘍の4~5μmの低温切片を調製し、アセトン中20°Cで10分間固定した。一次抗体として、ヤギ抗ヒトIgGおよび活性カスパーゼ3に対するウサギモノクローナル抗体、1200希釈、室温、1時間、AB559565を用いた。さらにまた、製造業者の使用説明書に従って、LSAB2SystemHRPキットを用いて切片をインキュベートした。33’ジアミノベンジジンを用いて結合抗体を可視化した。最後に、ヘマトキシリンで切片を対比染色し、エタノールで脱水し、キシレンで清澄化し、カナダバルサムでシールした。OlympusDP50カラーカメラを備えたLeicaDMLB顕微鏡を用いて、40倍で典型的画像を記録した。7日目に、Ad53Δ24aCTLA4またはAd53aCTLA4で処置したマウスの腫瘍および血漿におけるヒトIgGレベルを測定した。Ad53Δ24aCTLA4で処置した腫瘍において、Ad53aCTLA4で処置した腫瘍と比較して、81倍高い抗CTLA4mAbが認められた。さらに、Ad53Δ24aCTLA4で処置した腫瘍において、同じ動物の血漿と比較して、433倍高い抗CTLA4mAbが認められた。平均血漿中濃度は3926μggであったが、これは、それぞれイピリムマブおよびトレメリムマブ450μgmLで処置されたヒトにおいて耐性と報告された濃度より低い。Ad53Δ24aCTLA4腫瘍において、mAb濃度は16977μggであった。従って、この濃度は血漿中よりもずっと高い。ヒト抗CTLA4mAbはマウスCTLA4に結合せず、異種植皮実験は、T細胞欠損ヌードマウスを必要とする。従って、このモデルは、腫瘍溶解性および前アポトーシス作用のみをアッセイする。それにもかかわらず、この侵襲性皮下前立腺癌異種植皮モデルにおいて、Ad53Δ24aCTLA4は、モックと比較して有意な抗腫瘍効果を示した。他の処置群は、モックと比較して有意な効果を示さなかった。Ad53Δ24aCTLA4とAd53Δ24の間に統計的有意差は認められなかったが、抗CTLA4mAb発現がこのウイルスの抗腫瘍有効性を低下させないというinvitroデータが追認された。CTLA4遮断Abは、アポトーシスを引き起こすことによって腫瘍細胞の直接致死を誘導することができることを考慮して、抗腫瘍効果が、ヒト抗CTLA4mAb産生およびそれに続くアポトーシスの増加と関連するかどうかを評価した。Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4で処置した腫瘍において、ヒトmAb染色が観察されたが、Ad53Δ24またはAd53Luc1では観察されなかった。ヒトmAbの発現は、アポトーシスの増加と関連していると推定される。従って、Ad53Δ24aCTLA4で処置した腫瘍は抗CTLA4mAbを発現し、アポトーシスの増加をもたらす。Ad53Δ24aCTLA4の腫瘍溶解性および前アポトーシス作用をさらに評価するために、ヒト肺癌異種植皮モデルを用いた。このモデルは、導入遺伝子の免疫調節機能を考慮に入れない。5~6週齢雌NMRIヌードマウスの脇腹に5x106個のA549細胞を注射してヒト肺癌腫瘍を定着させた。Ad53Δ24aCTLA4、組換え抗CTLA4タンパク質、非複製型対照ウイルスAd53lucIまたは腫瘍溶解性Ad53Δ24で腫瘍を処置して、PC3MM2腫瘍に関して前述のように測定した。腫瘍が平均直径15mmに達したとき、マウスを殺した。Ad53Δ24aCTLA4とAd53Δ24との間に統計的有意差は認められなかったが、これは、本発明のウイルスの複製依存性腫瘍溶解能が親ウイルスと類似していることを示唆している。抗CTLA4mAbを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスによる癌患者のT細胞の免疫調節前臨床所見をヒトに拡張するために、化学療法に難治性な進行した固形腫瘍を有する患者のPBMCを試験した。癌患者のPBMCを、腫瘍によって誘導される免疫抑制を真似するために、03μgmlのイオノマイシン、003μgmlのホルボールミリスチルアセタートおよび1μgmlの組換えヒトB7Fcキメラで刺激した。刺激後、002μm濾過したAd53Δ24aCTLA4、Ad53Δ24、Ad53aCTLA4またはAd53Luc1で感染したPC3MM2細胞の上清でPBMCを処置した。機能喪失アッセイにおいて、イオノマイシン、PMAおよび組換えB7に01μgmlの組換えヒトCTLA4Fcキメラを加えた。PBMCの刺激後24時間で、製造業者の使用説明書に従って、BDCytometricBeadArratHumanSolubleProteinFlexSetによって増殖培地中のインターロイキン2またはインターフェロンγレベルを分析した。1細胞当たり10ウイルス粒子を用い、48時間後に上清を採取した。マウス抗ヒトCTLA4mAb、ヨーロッパを陽性対照として用いた。FCAPArrayv102ソフトウェアを用いて分析した。全4名の患者試料において、IL2およびインターフェロンγによって測定されるように、抗CTLA4mAbを発現する腫瘍溶解性アデノウイルスからの上清は、T細胞活性を増強させることができた。この実験の理論的根拠は図7に示されている。興味深いことに、不死化したT細胞株であるJurkat細胞を用いた場合、組換えmAbはより有効であったが、患者試料を用いた場合、ウイルス上清は多くの場合より強力であった。同様なデータは機能喪失アッセイにおいて得られたが、理論的根拠は図7E~Fに示す。健常者からのPBMCに対する抗CTLA4mAbの効果実施例6に記載した実験を、健常者のPBMCを用いて同様に行った。癌患者と対照的に、Ad53Δ24aCTLA4感染細胞からの上清はIL2またはインターフェロンγの産生を増加させなかった。機能喪失アッセイにおいて、いずれも有意な変化が見られなかった。しかしながら、陽性対照組換えmAbがいずれの場合も有効であったため、これは用量効果であると想定された。このことは、機能喪失アッセイにおけるAd53Δ24aCTLA4に関してみられる有意でない傾向および、Ad53aCTLA4感染細胞からの上清によるいくつかのケースの有意な効果によって支持される。それにもかかわらず、癌患者において抗CTLA4mAbの効果がより著しかったが、これは、存在する進行癌によって、癌患者が高い程度の免疫抑制プロセスを継続しているせいであると推定された。抗CTLA4mAb発現の増加における複製コンピテントプラットフォームの有用性抗CTLA4mAbの発現の増加における複製コンピテントプラットフォームの有用性を複製欠損性ウイルスと比較して分析した。PC3MM2細胞を20000細胞ウェルで播種し、Ad53Δ24aCTLA4およびAd53aCTLA4を用い、それぞれ1細胞当たり10VPで感染させた。感染後24時間、48時間および72時間で上清を採取し、ヒトIgGの量をELISAで分析した。複製欠損Ad53aCTLA4と比較して、腫瘍溶解性ウイルスAd53Δ24aCTLA4を用いて3倍の増加が観察された。Ad53aCTLA4。腫瘍溶解性プラットフォームの有用性の1つは、高いレベルの導入遺伝子発現が得られることである。初期遺伝子の発現後、ウイルスゲノムは増幅し、10000コピーまでものウイルスDNAが製造される。これは、導入遺伝子が製造できるコピーよりもずっと多くのコピーをもたらす。増強した免疫応答を有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクター免疫応答をさらに増強するために、肺癌の異種植皮マウスモデルを用いて、ウイルス主鎖におけるToll様受容体9を刺激するCpG分子を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスを研究した。NMRIヌードマウスにA549細胞を移植し、1x108個のVPのCpGリッチ腫瘍溶解性アデノウイルスAd5Δ24CpG、Δ24欠失を含む腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルスCpGを含む組換えオリゴで処置した。前に述べたように、2日間隔で12日間腫瘍増殖を測定した。抗腫瘍免疫の媒介にCpGリッチウイルスAd5Δ24CpGが最も有効であった同じマウスから採取した脾細胞をUV不活化ウイルスで刺激し、A549細胞と11および101の比率で共培養した。72時間目にMTS細胞致死アッセイを行った。示された時点でまだ生きていたA549細胞の百分率を示す。図12Aに示しデータは、CpG改変ウイルスが抗原提示細胞を刺激することができ、これによって増強した抗腫瘍免疫応答が得られたことを示している。この応答は大変強力であったため、T細胞を欠くヌードマウスにおいてさえ、それを観察することができた。従って、免疫適格動物およびヒトにおいて、さらに良いデータが予想される。TLR9刺激の有用性は、aCTLA4による抑制シグナルの同時ダウンレギュレーションによって最も顕著になると考えられる。ウイルスによって産生される抗CTLA4の発現は、抗ウイルス免疫を増強することができ、それによってウイルス療法を妨げる恐れがある。このために、免疫適格マウスの脾細胞に対するマウス抗CTLA4とアデノウイルスの併用効果を評価した。PBS、Ad53Δ24単独、Ad53Δ24とマウスaCTLA4抗体の併用またはマウスaCTLA4抗体単独で免疫適格C57Bl6マウスを3回処置した。2週間後、脾臓を採取し、インターフェロンγELISPOTで脾細胞を分析した。UV不活化Ad53キメラウイルスまたはAd5ペプチド混合物によって刺激を行った。群間で有意差は認められなかった。これは、ウイルスによって引き起こされる免疫にマウス抗CTLA4抗体が影響しないことを示唆する。ヒト癌患者における抗CTLA4モノクローナル抗体を特徴とする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの安全性と有効性I患者進行性難治性固形腫瘍を有する患者をFinnishMedicinesAssociationに認可されたAdvancedTherapyAccessProgramに登録した。標準治療に難治性な進行した固形腫瘍を有する癌患者の中から患者を選択する。選択基準は、従来の治療には難治性の固形腫瘍、WHOパフォーマンススコア3以下および主要臓器機能の不全であった。除外基準は、臓器移植片、HIV、重篤な心血管疾患、代謝疾患、肺疾患または腫瘍溶解性ウイルス処置を妨げる他の症状、所見もしくは疾患であった。医薬品の臨床試験の実施に関する基準およびヘルシンキ宣言に基づいて文書でのインフォームドコンセントを得、処置を行った。処置は、必要に応じて、腫瘍内、静脈内または腹腔内に行う。IIaCTLA4mAbをコードするアデノウイルスベクターでの処置臨床用の腫瘍溶解性アデノウイルスを製造し、患者の処置を開始する。処置は腫瘍内注射で行う。処置の総数は、3週間ごとに3回である。ウイルス用量は、他の腫瘍溶解性ウイルスを用いた本発明者の以前のデータに基づいて選択する。しかしながら、必要に応じて、種々の投与スキームを用いることができる。例えば、連続処置の最初のラウンドに関しては、患者には、用量の一部、例えば用量の5分の4または5分の2を腫瘍内または腹腔内に投与し、用量の残りを静脈内に投与する。投与時に、適切な条件下で、滅菌生理食塩水にウイルスを希釈する。ウイルス投与後、すべての患者をその病院において終夜モニターし、続いてその後4週間を外来患者としてモニターする。各来院時にフィジカルアセスメントおよび病歴を記録し、臨床的に意味のある検査値を経過観察した。処置の副作用を記録し、有害事象共通用語規準v30に従ってスコアを付ける。多くの癌患者が疾患による症状を有するため、悪化していない場合は既存の症状はスコアしない。しかしながら、症状がより重篤になる場合、例えば処置前のグレード1が処置後にグレード2に変化する場合、それをグレード2とスコアする。腫瘍サイズは、造影CTスキャンで評価する。最大腫瘍径を得る。注入された病変および注入されない病変を含むすべての疾患に固形癌の治療効果判定基準基準を適用する。これらの基準は有効PR、不変SD、進行増悪PDである。PRに達しない明確な腫瘍の減少はやや有効とスコアする。ベースラインにおいて上昇しているとき、血清腫瘍マーカーもまた評価し、同じ百分率を用いる。経時的血液中ウイルスコピー数、抗ウイルス中和抗体の誘導、抗ウイルスおよび抗腫瘍T細胞の変化、他の免疫学的細胞型および抗腫瘍抗体の変化を含む免疫学的およびウイルス学的パラメータに関して患者の血清試料を分析する。さらに、有害事象を有害事象共通用語規準v30に従ってグレードをつけ、中和抗体力価を測定し、CTのためのRECIST基準またはポジトロン断層法CTのためのPERCIST基準に従って有効性を評価する。すべての患者は処置前に進行性の腫瘍を有していた。疾患のステージは様々である。