"増幅反応混合物中の標的核酸配列を濃縮するための方法であって、前記方法は、a.少なくとも以下の成分:参照配列を有し、および、前記参照配列に少なくとも50相同するとともに前記参照配列と同じプライマー対によって増幅可能でもある1以上の標的配列を有する疑いのもある核酸配列と、プライマー部位間の参照配列の鎖の1つの配列の少なくとも一部と完全に相補的な過剰な量の参照ブロック核酸配列、を含む増幅反応混合物を調整する工程と、b.変性された参照鎖と変性された標的鎖を形成するために、参照配列の溶解温度Tm以上である第1の変性温度に、前記標的配列を有する疑いのある反応混合物をさらす工程と、c.参照ブロック配列と相補的な参照鎖とのヘテロ二本鎖、および、参照ブロック配列と標的鎖とのヘテロ二本鎖の形成を可能にするように、反応混合物の温度を下げる工程と、d.参照ブロック配列と標的鎖との前記ヘテロ二本鎖の優先的な変性を可能にするのに十分であるが、参照ブロック配列と相補的な参照鎖とのヘテロ二本鎖を変性するのにはまだ不十分な臨界温度Tcに、前記反応混合物をさらす工程と、e.前記プライマー対を反応混合物中の遊離標的鎖と任意の遊離参照鎖にアニールすることができるように、反応混合物中の温度を下げる工程と、および、f.前記参照配列に対して前記標的配列を濃縮するために前記プライマー対を伸長する工程を含むことを特徴とする方法。参照ブロック配列上の3’-末端は伸長を阻害するためにブロックされることを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列鎖上の5’-末端は、TaqDNAポリメラーゼによる5’から3’のエキソヌクレオリシスを妨げるヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。工程aで提供される参照ブロック配列は一本鎖核酸参照ブロック配列であることを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列は、反応混合物が第1の変性温度にさらされる際に工程bで一本鎖参照ブロック配列を形成するために変性するニ本鎖核酸参照ブロック配列として工程aで提供されることを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列は、一本鎖DNA、RNA、ペプチド核酸、または、ロックト核酸の1つであることを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列は、一本鎖DNA、RNA、ペプチド核酸またはロックト核酸、あるいは、別の修飾ヌクレオチドの間のキメラであることを特徴とする請求項1に記載の方法。キメラ配列上のペプチド核酸またはロックト核酸の位置は、変異が存在しそうな位置にマッチするように選択され、それによって、参照ブロック配列と標的鎖とのヘテロ二本鎖を変性するために必要な温度と、参照ブロック配列と相補的な参照鎖とのヘテロ二本鎖を変性するために必要な温度の差を最大化することを特徴とする請求項7に記載の方法。参照ブロック配列は、そのプライマー結合部位間の参照配列の鎖の1つと完全に相補的であるか、または、プライマー結合部位のいずれかの末端で重複することを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列は参照配列と同じか、参照配列よりも短いことを特徴とする請求項1に記載の方法。冷却工程cは1分未満であることを特徴とする請求項1に記載の方法。参照ブロック配列は、25nMにほとんど等しい量で反応混合物中に存在することを特徴とする請求項1に記載の方法。二本鎖標的配列の溶解温度は、二本鎖参照配列の溶解温度よりも大きいか、該溶解温度と等しいことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記参照および標的配列は、PCRに反応混合物をさらし、その後、請求項1の濃縮方法に反応混合物の少なくとも一部をさらすことによって、まず増幅されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記標的配列はホモ接合変異を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記標的配列は、参照配列から差次的にメチル化され、反応混合物上で請求項1の方法を実施する前に、反応混合物は亜硫酸水素ナトリウムで処理されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記参照および標的配列は、少なくとも25の塩基対を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記方法は2サイクル以上繰り返されることを特徴とする請求項1に記載の方法。MALDI-TOF、HR-融解、ジデオキシ配列決定法、単一分子配列決定、ピロシーケンス、第二世代ハイスループット配列決定、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCR、および、定量的PCRからなる群から選択される1以上の方法を用いて、濃縮した標的配列で前記混合反応物を分析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記Tcは1秒-60秒で適用されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記反応混合物は核酸検出色素を含有することを特徴とする請求項1に記載の方法。前記方法はリアルタイムPCR装置で実行されることを特徴とする請求項14に記載の方法。前記方法は標識化されたプローブを用いるリアルタイム反応条件下で実行されることを特徴とする請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法を実行するためのプログラム命令を含む、コンピュータ読み取り可能な媒体。本発明の1つの目的は、fullCOLD-PCRの初期のサイクル中のヘテロ二本鎖形成の効率を改善することである。別の目的はfullCOLD-PCRのための全体的なサイクル時間を減少させることである。本発明はサンプル中の低含量対立遺伝子を濃縮するための方法を対象としており、fullCOLD-PCRの効率を改善し、かつ、サイクル時間を減らすために、反応混合物中の過剰な参照ブロック配列の使用を対象としている。本発明は、先に引用された特許出願EnrichmentofatargetSequenceと題された特許文献1現在では特許文献2GerassimosMakrigiorgosによる。本発明の譲受人に譲渡されているの図1と2に関して記載されたCOLD-PCR方法に対する修飾を含んでおり、該文献は引用によって本明細書に組み込まれている。より具体的には、本発明に従って、修飾されたfullCOLD-PCRプロトコルにつき、反応混合物を熱サイクルthermocyclingにさらす前に、操作された参照ブロック配列例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、反応混合物に過剰に加えられる。修飾されたfullCOLD-PCR方法は、核酸サンプルを含有する増幅反応混合物の調製を含む。核酸サンプルは、野生型の配列のような参照配列を有し、1つ以上の変異体配列のような1つ以上の標的配列を含有しているらしいとの疑いをかけられる。言及されたように、本発明の目的は、標的配列の濃度を濃縮することであり、したがって、ほとんどの状況では、標的配列が存在するとして低含量である場合、該方法が使用される。該方法は約1乃至10のヌクレオチド配列の変化を含む突然変異対立遺伝子を濃縮するのに特に適しているが、本発明に従う標的配列は参照配列に少なくとも50相同である。標的配列は、参照配列に使用されたものと同じ対のプライマーを含むPCRによって増幅可能である。言及されたように、本発明は、超過濃度レベルの反応混合物に参照ブロック配列の存在を含んでいる。参照ブロック配列は、少なくともそのプライマー部位間の参照配列の鎖の1つの少なくとも一部と相補的であるか、または、プライマー部位に部分的に重複する核酸配列である。反応混合物に加えられる参照ブロック配列は、一本鎖であるのが望ましいだが、最初の変性工程が変性した一本鎖の参照ブロック配列をもたらすため、ニ本鎖でもあり得る。fullCOLD-PCRプロトコルに従って、反応混合物は、参照配列とさらには標的配列の融解温度Tm以上ある第1の変性温度例えば95°Cにさらされ、結果として、参照配列と標的配列の変性鎖をもたらす。反応液は、例えば、70°Cまでハイブリダイゼーションを促進するために冷却される。冷却が配列を過剰な量の参照ブロック配列の存在下で起こるため、参照ブロック配列は、参照配列の相補鎖と、さらに標的配列の相補鎖とハイブリダイズする。例えば、一本鎖参照ブロック配列が工程の開始時に過剰に加えられると仮定すると、工程でのこの時点での反応混合物は、参照ブロック配列と相補的な参照例えば、野生型鎖のヘテロ二本鎖、および、参照ブロック配列と標的例えば変異体鎖のヘテロ二本鎖を含有している。この時点での反応混合物は、参照と標的の配列の変性マイナス鎖を含有する。修飾されたfullCOLD-PCRサイクル中に存在する形成されたヘテロ二本鎖は、上記の参照された特許出願に記載されたfullCOLD-PCRプロトコル中で形成された参照-標的ヘテロ二本鎖とは基本的に異なる。過剰な量の参照ブロック配列を加えると、従来のfullCOLD-PCRプロトコル例えば、約8分中よりも迅速なハイブリダイゼーション例えば、約30秒を促進する。本発明の好ましい実施形態では、冷却ハイブリダイゼーション工程は、継続時間が1分未満である。その後、反応混合物は、参照ブロック配列からの標的鎖の優先的な変性を可能にするのに十分な臨界温度例えば、Tc=84.5°Cにさらされる。臨界温度Tcは、反応混合物がTcインキュベートされる場合、参照ブロック鎖と相補参照鎖のニ本鎖がほとんど変性されないままであるが、参照ブロック鎖と標的鎖はほとんど変性されるように選択される。ほとんどという用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも60、好ましくは少なくとも90、または、さらに好ましくは少なくとも98を意味する。参照ブロック配列と標的鎖のニ本鎖の融解温度は、参照ブロック配列と相補配列の鎖のニ本鎖の溶解温度よりも常に低い。なぜなら、前者はミスマッチを含むが、後者はミスマッチを含まないためである。優先的な変性後、反応混合物の温度が下げられることによって、反応混合物中の遊離標的freetargetと参照の鎖にプライマー対をアニール化することが可能となる。再度、一本鎖参照ブロックオリゴヌクレオチドが工程の開始時に過剰に加えられると仮定すると、サイクルのこの時点で、理論上は、最初の変性工程と比較して標的配列の2つの遊離鎖と、わずか1つの遊離参照鎖がある。別の参照鎖は参照ブロック配列でハイブリダイズされ、したがって、増幅には利用不可能である。アニールされたプライマーは伸長され、結果として、標的配列の指数関数的な増幅をもたらす一方で、参照鎖は単に直線的に増幅されるだけである。従って、標的配列は、COLD-PCRサイクルのあいだ、サンプル中の参照配列に対して委徐々に濃縮される。方法は10乃至30以上のサイクルが繰り返される傾向がある。該方法は、標的増幅産物の濃縮をかなり増加させて、fullCOLD-PCRのためのサイクル時間を減らすことがわかった。それは、従来のfullCOLD-PCRプロトコルではヘテロ二本鎖を形成しなかったホモ接合変異を濃縮することもできる。参照ブロック配列の長さは、標的または参照の配列の長さと等しいか、または、標的または参照の配列の長さよりも小さいか、あるいは、大きくてもよい。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は、プライマーが参照配列にあまり結合しないように、配列の各側で、標的と参照の配列よりもいくつかの塩基分小さい。従って、参照ブロック配列は、標的配列を増幅するプライマーによって伸長することができない。この目的のために、随意に、参照ブロック配列の3’OHはDNAポリメラーゼ伸長に対してブロック可能である。同様に、随意に、参照ブロック配列の5’-末端は、TaqDNAポリメラーゼすなわち、ハイブリダイズされた参照ブロック配列の分解による5’から3’のエキソヌクレオリシスexonucleolysisが避けられるように、部分的に重複するヌクレオチド配列で設計されてもよい。言及されるように、参照配列は一本鎖またはニ本鎖である。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は一本鎖核酸である。しかしながら、参照ブロック配列は、一本鎖DNA、RNA、ペプチド核酸PNAまたはロックト核酸LNA、あるいは、別の修飾ヌクレオチドのあいだのキメラのような他の形状をとることができる。キメラ配列上のPNAまたはLNAの位置は、その位置での潜在的なミスマッチの効果を最大限にするように、変異が存在しそうな位置にマッチするために選択可能である。参照ブロック配列は、一本鎖PNAまたは一本鎖DNAであってもよい。本発明の他の実施形態と利点は、図面と以下の詳細な記載を再検討すると当業者に明白なことがある。本明細書で使用されているように、標的配列を濃縮するという用語は、標的配列の量を増加させて、サンプル中の対応する参照配列に対する標的配列の割合を増やすことを言う。例えば、参照配列に対する標的配列の割合がサンプル中で当初5乃至95である場合、標的配列は30の参照配列に対して70の標的配列の割合をもたらすように、増幅反応で優先的に増幅されてもよい。したがって、参照配列に対する標的配列の14倍の濃縮がある。本明細書に使用されるように、用語標的配列は、対応する参照配列ほど核酸サンプル中では見られない核酸を指す。標的配列は、サンプルにおいて、参照配列標的配列の総量の50未満を構成する。標的配列は突然変異対立遺伝子であってもよい。例えば、サンプル例えば、血液サンプルは多数の正常細胞とわずかな癌細胞を含有してもよい。正常細胞は突然変異でないまたは野生型の対立遺伝子を含有するが、少数の癌細胞は体細胞突然変異を含有している。この場合、変異体は標的配列であり、その一方で野生型の配列が参照配列である。本明細書で使用されているように、標的鎖は、標的配列の一つの核酸鎖singlenucleicacidstrandを指す。標的配列は対応する参照配列に少なくとも50相同でなければならないが、参照配列からの少なくとも1つのヌクレオチドで異ならなければならない。標的配列は、参照配列に使用されたものと同じ対のプライマーによるPCRを介して増幅可能である。本明細書で使用されているように、用語参照配列は、対応する標的配列よりも核酸サンプル中で見られる核酸を指す。参照配列は、サンプル中の全参照配列標的配列の50以上を構成する。好ましくは、参照配列は、標的配列よりも、RNAおよび/またはDNAレベル10X、15X、20X、25X、30X、35X、40X、45X、50X、60X、70X、80X、90X100X、150X、200X以上で発現される。本明細書で使用されているように、参照鎖は、参照配列の一つの核酸鎖を指す。本明細書で使用されているように、用語野生型は、母集団中の特定の遺伝子について最も一般的なポリヌクレオチド配列または対立遺伝子を指す。一般に、野生型対立遺伝子は正常細胞から得られる。本明細書で使用されているように、用語変異体は、核酸配列中のヌクレオチド変化すなわち、単一または複数ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を指す。変異を有するbear核酸は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列とは配列において異なる核酸配列突然変異対立遺伝子を有している。本発明は、体細胞突然変異と多型性に広く関連している。本発明の方法は、多くの配列変化でも有用であるが、約1乃至10のヌクレオチド配列変化を含有する突然変異対立遺伝子を選択的に濃縮する際に特に役立つ。突然変異対立遺伝子は、病変組織または細胞から典型的に得られ、疾患状態に関連している。本明細書に使用されるように、用語融解温度またはTmは、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度を指す。一般的に、Tmは、ニ本鎖核酸分子中のワトソンクリック塩基対の半分が破壊または解離しすなわち、溶解している、その一方で、ワトソンクリック塩基対のもう半分がニ本鎖立体構造中でインタクトなままである、温度として定義されてもよい。言いかえれば、Tmは、2つの相補的配列のヌクレオチドの50がアニールされニ本鎖、ヌクレオチドの50が変性される一本鎖温度として定義される。したがって、Tmは、二本鎖から一本鎖の核酸分子への移行時または、逆に、一本鎖から二本鎖の核酸分子への移行時の中間点を定義する。Tmは、多くの方法、例えば、Wetmur1991Wetmur,J.G.1991.DNAprobes:applicationsoftheprinciplesofnucleicacidhybridization.CritRevBiochemMolBiol26:227-259,のように最隣接計算anearest-neighborcalculation、および、インターネットで利用可能なOligo商標プライマー設計と計画を含むコマーシャル番組によって、推定することが可能である。あるいは、Tmは実際の実験を介して測定可能である。例えば、二本鎖DNA結合、または、臭化エチジウムまたはSYBR-Green分子プローブのような挿入色素は、核酸の実際なTmを測定するために、融解曲線アッセイで使用されることができる。核酸のTmを測定するための追加の方法は、当該技術では周知である。これらの方法のいくつかは、発明者の先行特許EnrichmentofatargetSequenceと題された特許文献1現在では特許文献2に列挙されており、この文献は引用によって本明細書に組み込まれる。本明細書で使用されているように、参照ブロック配列は、オリゴヌクレオチドなどの操作された一本鎖またはニ本鎖の核酸配列であり、好ましくは標的配列よりも短い長さを有する。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は、プライマーが参照配列にあまり結合しないように、配列の各側で、参照配列よりもいくつかの塩基分小さい。随意に、参照ブロック配列の3’OH末端は、DNAポリメラーゼ伸長に対してブロックされ、5-末端はTaqDNAポリメラーゼによる5’から3’のエキソヌクレオリシスを避けるために修飾される。参照ブロック配列は、反応混合物が一本鎖DNA、RNA、ペプチド核酸PNAまたはロックト核酸LNA、あるいは、別の修飾されたヌクレオチドの間のキメラのような臨界温度Tcにさらされる際に、参照配列にアニール化されたままの他の形状をとることもできる。本発明に関して使用されるように、用語臨界温度またはTcは、標的鎖と参照ブロック配列のニ本鎖を優先的に変性するために選択された温度を指す。反応混合物がTcでインキュベートされる際に、参照ブロック鎖と相補的な参照鎖からなるニ本鎖はほとんど変性しないままであるが、参照ブロック鎖と標的鎖からなるニ本鎖がほとんど変性されるように、臨界温度Tcは選択される。ほとんどという用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも60、好ましくは少なくとも90、または、さらに好ましくは少なくとも98を意味する。以下に提供される例において、中間のインキュベーション工程に選択された臨界温度Tcは、84.5°Cであるが、第1の変性温度は95°Cである。本明細書で使用されているように、プライマー対は、PCR反応の間に増幅生成物を形成するように標的と参照の配列の反対側の鎖とアニール化される2つのプライマーを指す。標的および参照配列は、プライマー結合を促進するために少なくとも25の塩基でなければならない。プライマー対は反応のTc未満のTmを有するように設計されている。本明細書で使用されているように、相同性は、2つのポリマー分子、例えば、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド間のサブユニット配列の類似を指す。パーセント配列同一性と配列類似性を測定するのにふさわしいアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらはAltschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-34021997とAltschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-4101990にそれぞれ記載されている。BLAST分析を行なうためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を介して公に利用可能である。核酸増幅一般的に、1つの実施形態では、本発明の方法で用いられる核酸サンプルは、標的と参照配列を有するゲノムDNAを含む。別の実施形態では、本発明の方法の核酸サンプルは、先に核酸増幅反応で増幅させた標的と参照の配列を含む。当業者は、核酸を増幅するのに利用可能な多くの方法があることを認識するであろう。恐らく、最も一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR;例えば、米国特許第4,683,195号と第4,683,202号だけでなく、Saikietal.,Science230:1350-13541985andGyllenstenetal.,PNASUSA85:7652-76561985を参照である。PCR方法の好ましい変更形態は、非対称PCR例えば、Maoetal.,Biotechniques274:674-6781999;Lehbeinetal.,Electrophoresis198-9:1381-13841998;Lazaroetal.,Mol.Cell.Probes65:357-3591992;および、米国特許第6,197,499号を参照。他の増幅方法は、限定されないが、鎖置換増幅SDAWalkeretal.,NucleicAcidsRes.207:1691-16961992と同様に、米国特許第5,744,311号、5,648,211号、および、5,631,147号を参照、ローリングサークル増幅RCAPCT公報WO97/19193を参照、核酸配列に基づく増幅NASBACompton,Nature350:91-921991と同様に、米国特許第5,409,818号と第5,554,527号を参照、転写増幅法TMAKwohetal.,PNASUSA86:1173-11771989と同様に、米国特許第5,399,491号を参照、自家持続配列複製法3SRGuatellietal.,PNASUSA87:1874-18791990を参照、および、リガーゼ連鎖反応LCA米国特許第5,427,930号と5,792,607号を参照を含む。その最も単純な形状では、PCRは、標的DNA中で反対側の鎖にハイブリダイズして関心領域に隣接する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特異的DNA配列の酵素合成のためのインビトロな方法である。鋳型変性、プライマーアニーリング、および、DNAポリメラーゼによってアニールされたプライマーの伸長に関与する一連の反復的な反応工程は、その終端がプライマーの5’末端によって定義される、特定のフラグメントの指数関数的な蓄積をもたらす。PCRはゲノムDNA中の他の配列に対する109の因子によって特異的DNA配列の選択的な濃縮をもたらすことができると報告されている。PCR方法はSaikietal.,1985,Science230:1350にも記載されている。PCRは、鋳型DNA標的と参照の配列少なくとも1fg;さらに好ましくは1-1000ngと少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー用いて行われる。典型的な反応混合物は以下のものを含んでいる:2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの適切な緩衝液、0.4μlの1.25μMdNTP、2.5ユニットのTaqDNAポリメラーゼStratagene、および、脱イオン水で総容積25μl。PCRはプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて行なわれる。PCRサイクルの各工程の長さと温度は、サイクルの数と同じように、ストリンジェンシー条件にしたがって有効に調節される。アニール温度とタイミングは、プライマーが鋳型とアニール化される効率と、許容されるミスマッチの程度の両方によって決定される。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化する能力は、十分、当業者の知識の範囲内である。30°Cと72°Cの間のアニール温度が使用される。鋳型分子の最初の変性は、4分間、92°C乃至99°Cの間で通常生じ、その後、変性15秒乃至1分間、94°C乃至99°C、アニーリング上に議論されるように測定された温度;1-2分、および、伸長1分間72°Cからなる20-40のサイクルが続く。最終の伸長工程は72°Cで4分間行なわれるのが一般的であり、その後、4°Cで限定されていない0-24時間工程が行われてもよい。PCRは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する核酸ポリメラーゼまたは酵素を利用する。一般に、酵素は、標的配列にアニールされたプライマーの3’-末端で合成を始め、鋳型に沿って5’-方向に続ける。既存のDNAポリメラーゼは、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、T7DNAポリメラーゼ、サーマスサーモフィラスTthDNAポリメラーゼ、バチルスステアロサーモフィルスDNAポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリスThermococcuslitoralisDNAポリメラーゼ、サーマスアクアティクスTaqDNAポリメラーゼ、および、パイロコッカスフリオサスPfuDNAポリメラーゼを含んでいる。用語核酸ポリメラーゼはRNAポリメラーゼを含有する。核酸鋳型がRNAである場合、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素のようなRNA依存性の重合活性を指す。本発明の濃縮手順は、サーモサイクラーのようなPCR装置で行われるか、または、より好ましくはリアルタイムPCR装置でリアルタイム反応条件下で行なわれる。リアルタイム反応条件は、さらに、生成時にPCR生成物を測定/検知するために、核酸検出剤例えば、色素またはプローブを用いる。サンプル本明細書で使用されているように、サンプルは、対象の核酸標的および参照の配列を含有しているかまたは含有すると推定される任意の物質、あるいは、対象の核酸を含有しているかまたは含有すると推定される核酸そのものを指す。用語サンプルは、このように核酸ゲノムDNA、cDNA、RNA、細胞、生物、組織、液体、または、物質のサンプルを含み、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌、気道、腸管、および、泌尿生殖器、唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロの細胞培養成分のサンプル、自然分離株飲料水、海水、固形物質など、微生物標本microbialspecimens、および、核酸トレーサー分子でマーキングされた物体または標本を含む。本発明の核酸配列はゲノムDNAから増幅することができる。ゲノムDNAは、以下の方法に応じて組織または細胞から分離することができる。あるいは、本発明の核酸配列は、当該技術で周知の方法によって血液から分離することができる。特定の組織から遺伝子の変異形態の検出を促進するために、組織は分離される。哺乳動物組織からゲノムDNAを分離するために、組織は液体窒素中で細分化されて凍結させる。凍結させた組織は、あらかじめ冷やしておいた乳鉢と乳棒で細かい粉末に砕かれ、消化緩衝液100mMNaCl、10mMTris-HCl、pH8.0、25mMEDTA、pH8.0、0.5w/vSDS、0.1mg/mlのプロテイナーゼK中で、組織100mgごとに1.2mlの消化緩衝液で、懸濁される。哺乳動物の組織培養細胞からゲノムDNAを分離するために、細胞は500xgで5分間、遠心分離によってペレット状にされpelleted、1-10mlの氷のように冷たいPBS中で再懸濁され、500xgで5分間再度ペレット状にされ、1容量の緩衝液中で再懸濁される。消化緩衝液中のサンプルは、50°Cで12-18時間振りながらインキュベートされ、その後、等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを用いて抽出される。相が遠心分離工程1700xg、10分間後に分解しない場合、別の容量の消化緩衝液プロテイナーゼKを含まないが加えられ、遠心分離工程が繰り返される。厚い白い材料が二相の界面で明白な場合、有機抽出工程が繰り返される。抽出後、上の水層は新しい管に移され、該管には、1/2の容量の7.5M酢酸アンモニウムと2容量の100エタノールが加えられる。核酸は、1700xgで2分間の遠心分離によってペレット状にさせられ、70エタノールで洗浄され、空気乾燥させられ、1mg/mlのTE緩衝液10mMTris-HCl、pH8.0、1のmMEDTA、pH8.0中で再懸濁される。残りのRNAは、0.1SDSと1μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼの存在下で37°Cで1時間サンプルをインキュベートすることによって、および、抽出とエタノール沈澱工程を繰り返すことによって、取り除かれる。本方法によるゲノムDNAの収量は、およそ2mgDNA/1g細胞または組織であると推定されるAusubelら。上記参照。この方法によって分離されたゲノムDNAは、本発明にしたがって使用することができる。標的DNAも全血から抽出されてもよい。例えば、血液は、血清を調製するための抗凝血剤を伴わないか、または、EDTA、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、あるいは、同様の抗凝血剤、最も好ましくは血漿の調製のためのEDTAを伴う、好ましくはシリコーン化されたガラスを含む採取チューブへと、標準的な方法によって採取されてもよい。好ましい方法は、必ずしも必要とされるとは限らないが、血漿または血清が全血から分画されるものである。血漿または血清は、遠心分離によって、好ましくは5-10分間、300~800xgの穏やかな遠心分離によって全血から分画されるか、または、他の標準分析法によって分画されてもよい。ヘパリンがPCRの邪魔になることがあるため、ヘパリン処置した血液の使用はヘパリナーゼによる事前処理を必要とすることがある。したがって、EDTAは血液標本の好ましい抗凝血剤である。採取したばかりの血漿または血清、あるいは、凍結させて保存してその後解凍した血漿または血清のいずれかは、本発明の方法で使用することができる。保存された血漿または血清は、-20°C乃至-70°Cで維持されなければならず、採取したばかりの血漿または血清は、使用するまで冷却されたままか氷の上で維持される。その後、DNAは当該技術で周知の方法によって抽出されてもよい。本発明の方法はメチル化が標的配列で生じたかどうかを検知するために使用することができる。メチル化検出法は、DNAのメチル化感受性処置のための化学的または酵素的な手法を含む。化学処理は、亜硫酸水素ナトリウムによるDNAのインキュベーションを含み、それはメチル化されていないシトシンを選択的にウラシルへと変換する。DNAはまず熱変性され、次に、5Mの亜硫酸水素塩pH5-7で処理される。あらかじめ存在するウラシルを取り除くゲノムDNAの事前処理は、亜硫酸水素塩による処置の前に使用される。この事前処理は、5mMヒドロキシルアミンpH7の存在下でのウラシルグリコシラーゼ処置からなる。標的配列のメチル化されたシトシンはウラシルに変換されるので、参照ブロック配列の存在下においてfullCOLD-PCRのハイブリダイゼーション冷却工程で参照ブロック配列を用いて二重になる際に、該シトシンはここでミスマッチを形成することになる。参照ブロック配列の不在下でのfullCOLD-PCR先行技術図1は、先に組み込まれた、EnrichmentofatargetSequenceと称された特許文献2で説明されるように、標的と参照の配列を含有している核酸サンプル中の標的配列を濃縮するための、fullCOLD-PCRとして知られている先行技術手順を示す。図1は、上記の組み込まれた特許出願で図1の再生である。標的と参照の配列は、ゲノムDNA、cDNA、ウィルスDNA、哺乳動物DNA、胎児DNA、または、細菌DNAを含む様々なソースから得ることができる。参照配列は一般に野生型対立遺伝子で、標的配列が突然変異対立遺伝子であるが、逆もまた真実であってもよい。突然変異対立遺伝子は1つ以上のどんなヌクレオチドの欠失、挿入または変質を含んでもよい。幾つかの実施形態では、突然変異対立遺伝子は体細胞突然変異である。他の実施形態では、標的配列はメチル化されたDNAであり、その一方で、参照配列はメチル化されていないDNAである。方法は、参照配列の融解温度Tm以上の第1の変性温度図1A、工程1に増幅反応混合物をさらす工程を含んでいる。核酸のTmは実験を通じて測定され、計算によって評価されてもよい。当業者は、本明細書に記載の核酸のTmを測定するための多数の周知な方法をよく知っている。PCR反応の変性温度を通常選択されるように、第1の変性温度は一般に選択され、標的と参照の配列を十分に変性するのを可能にするほどに十分高いものでなければならない例えば94°C。1つの実施形態では、第1の変性温度は参照配列のTm以上の約1°C乃至30°Cで、より好ましくは、参照配列のTmは、参照配列のTm以上の約5°C乃至20°Cである。次に、増幅反応混合物の温度は、標的配列と参照配列がハイブリダイズするのを可能にするほど低い図1A、工程2。このアニーリング工程は、標的-標的、参照-参照、および、標的-参照の配列のニ本鎖の形成をもたらすが、標的-参照の二本鎖を形成するために最適化されなければならない。方法で使用されるPCRプライマーは、該プライマーがこの中間温度で標的と参照の配列に結合するのを妨げる融解温度を有するように設計される。上に言及されるように、標的-参照ハイブリダイゼーションと冷却に係る比較的長い時間の要件は、少なくともいくつかの適用でfullCOLD-PCRの有効性を制限することがわかっている図1A、工程2。その後、標的参照ハイブリダイゼーションのニ本鎖は、反応混合物の温度をTcに増加させることによって優先的に変性される図1A、工程3。図1のTcまたは臨界温度は、参照配列のTm未満であるが、標的-参照のニ本鎖のTm以上になるように選択される。先に言及されたように、標的配列と参照配列がクロスハイブリダイズすると、二本鎖DNA配列に沿ったどの場所でも、1以上の単一ヌクレオチドのミスマッチのわずかな配列の差が、その配列の融解温度Tmの小さいが予測可能な変化を生じさせる非特許文献1;非特許文献2。ミスマッチの正確な配列の構成と位置に依存しているため、0.1-20°Cの範囲での融解温度の変化が起こり得る。Tcは、約1秒から5分間適用されるのか一般的であり図1A、工程3、好ましくは5秒から30秒適用される。必要に応じて、多くのサイクルについて、工程3と2の間で振動させることができる。標的-参照ハイブリダイゼーションのニ本鎖を優先的に変性させた後、反応混合物の温度は、1つ以上のプライマーが標的配列とアニールすることを可能にするように、下げられる図1A、工程4。アニールされたプライマーは、核酸ポリメラーゼによって伸長され図1A、工程5、それにより、サンプルに含有される核酸の母集団中の標的配列を濃縮する。方法の工程は、標的と参照の配列の十分な増幅を得るために、多数のサイクルで繰り返されるのが一般的である。1つの実施形態では、方法の工程は、5乃至40のサイクルが繰り返され、より好ましくは、10-30のサイクルが繰り返される。サイクルの最適な数は、当業者によって決定されることができる。好ましくは、本方法は、PCR装置で、より好ましくはSMARTCYCLERリアルタイムPCR装置カリフォルニア州サニーベールのCepheidやMx3005PリアルタイムPCR装置カリフォルニア州ラホーヤのStratageneのようなリアルタイム検出PCR装置で行われる。この実施形態では、反応混合物は、反応の増幅産物を定量化するか、および/または、モニタリングするために、核酸検出剤例えば、SYBRGreen色素またはLC-Green色素のような核酸検出色素、あるいは、蛍光染料に操作可能につながれたプローブを含んでもよい。ひとたび標的配列の濃縮が完全であれば、サンプルはさらに処理されてもよく、例えば、配列決定反応にさらされてもよい。濃縮した対立遺伝子は、以下のものを含む様々な手順によってさらに処理されてもよい:MALDI-TOF、HR-融解、ジデオキシ配列決定法、単一の分子配列決定、第二世代ハイスループット配列決定secondgenerationhighthroughputsequencing、ピロシーケンス、RFLP、デジタルPCR、および、定量的PCR図1Bを参照。診断アッセイと同様にこれらの処理技術のさらに具体的な記載は、EnrichmentofatargetSequenceと題された上記の特許文献2に含まれており、該文献は参照によって本明細書に組み込まれる。反応混合物中の過剰な参照ブロック配列によるfullCLDPCRサイクル図2は、本発明の修飾されたfullCOLD-PCR方法に従って標的配列の濃縮を説明する。初めに図2、工程1、核酸サンプルは、二本鎖の参照配列10例えば、野生型の配列を含有しており、二本鎖の標的配列12例えば変異体配列を含有している。増幅反応混合物は、サンプル、他のPCR成分、および、本発明に従って、25nMのような過剰な濃度レベルの参照ブロック配列14を含有している。図2では、描かれた参照ブロック配列14は、そのプライマー部位間の参照配列10の鎖10Aの1つと相補的な一本鎖核酸配列である。図2の工程1の反応混合物は、30秒間、例えば95°Cの第1の変性温度にさらされ、その結果、参照配列10A、10Bと、標的配列12A、12Bの変性鎖がもたらされる。その後、反応混合物はハイブリダイゼーションを促進するために冷却される例えば70°Cで、30秒間が、これは、正当該技術での通常の8分間の冷却からの劇的な減少である。冷却は過剰な量の参照ブロック配列14の存在下で起こるため、参照ブロック配列14は、参照配列の相補鎖10Aと標的配列の相補鎖12Aと優先的にハイブリダイズする。図2の工程2は、70°Cまでのハイブリダイゼーション冷却後の反応混合物の状態を説明する。参照ブロック配列14および相補的な参照鎖10Aのヘテロ二本鎖16と、参照ブロック配列14および相補的な標的鎖12Aのヘテロ二本鎖18に加えて、反応混合物は、参照と標的の配列の変性したマイナス鎖10Bおよび12Bをそれぞれ含有している。図2の工程3で、反応混合物は、臨界温度Tc例えば、84.5°Cにさらされる。この温度は、標的鎖12Aと参照ブロック配列14のヘテロ二本鎖18の優先的な変性を可能にするために選ばれる。臨界温度Tcは、反応混合物がTcでインキュベートされる際に、参照ブロック鎖14と相補的な参照鎖10Aのニ本鎖16がほとんど変性されないままであるように、選択される。参照ブロック配列14と標的鎖10Bのニ本鎖18の融解温度は、常に、参照ブロック配列14と相補的な参照鎖10Aのニ本鎖16の融解温度未満となる。なぜなら、参照ブロック配列14は参照鎖10Aの少なくとも一部と完全に相補的であるためであり、標的鎖12Aを含む少なくとも1つのミスマッチがある。図2の工程4を参照すると、優先的な変性の後、反応混合物の温度が例えば60°Cに下げられることで、プライマー対20A20Bは、反応混合物中の遊離標的鎖12A12Bと遊離参照鎖10Bとアニールすることが可能となる。参照番号20Aはフォワードプライマーを、参照番号20Bはリバースプライマーを指す。先に記載されたように、標的配列12は、参照配列10に使用されるものと同じ対のプライマー20A20Bを介して増幅可能である。図2の工程5は、第1の変性工程と比較した標的配列の2つの遊離鎖12A12Bと、およびたった1つの遊離参照鎖10Bを説明している。もう一方の参照鎖10Aは、参照ブロック配列14によってハイブリダイズされ、したがって、増幅には利用できない。その後、反応混合物の温度が例えば72°Cに上げられることによって、アニールされたプライマー20A20Bを伸長し、そうすることで参照配列10に対する反応混合物中の標的配列12の濃度を濃縮する。方法は5乃至30サイクル繰り返される傾向にある。図2で示される方法は、個々のプロトコルに関して最適化可能であり、最適化されなければならない。様々なPCRおよびリアルタイムPCR機器を操作するために、必要に応じて、このようなプロトコルをソフトウェアで具体化することができる。好ましい参照ブロック配列についての設計面での配慮上記のように、参照ブロック配列は多くの形態をとることができるが、好ましい形態は一本鎖の非伸長性のDNAである。より具体的には、好ましい参照ブロック配列は以下の特徴を有する:a長さが200bpまでの一本鎖DNAを含む;bプライマーが参照ブロック配列にアニールされる際に参照配列にあまり結合しないように、標的配列よりもいくつかの塩基分例えば、配列の各側で8-12の塩基分小さな長さを有し、および、参照ブロック配列そのものにもあまり結合しない;および、cDNAポリメラーゼ伸長にブロックされる3’-末端を含有している。そのような参照ブロック配列は、いくつかの方法の1つで合成することができる。まず、参照ブロック配列は、配列の3’-末端の修飾を可能にする標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いる直接合成によって作ることができる。3’-末端は、リン酸基、アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、または、3’乃至5’ポリメラーゼ伸長をブロックする他の部分を含有してもよい。あるいは、参照ブロック配列は、最終生成物として一本鎖DNAを生成するPCR反応の間に、ポリメラーゼ合成によって作ることができる。この場合、生成された一本鎖DNAは、参照ブロック配列に必要な完全な配列に相当する。ポリメラーゼ合成によって一本鎖DNAを合成する方法は、複数あり、当業者に周知である。例えば、非対称のPCRまたはLATEPCRは適切である。あるいは、一本鎖DNA参照ブロック配列は、固体の支持体上でニ本鎖PCR生成物を結合することによって合成可能である。これは、ビオチン化されるプライマー対のひとつを用いて、標準的なPCR反応を行なうことにより遂行される。PCRの後、PCR生成物は、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体例えば、電磁ビーズでインキュベートされ、ビーズに結合することが可能となる。その後、温度を2-3分間95°Cに上げることで、DNAを変性して、固定化されたPCR生成物からビオチン化されていないDNA鎖を溶液に放出する。相補的DNA鎖を含む磁気ビーズは、その後取り除かれ、溶液中に残っている一本鎖生成物は、参照ブロック配列として役立つ。一本鎖参照ブロック配列が使用される前に、3’-末端は好ましくはポリメラーゼ伸長にブロックされる。これは当業者に周知のいくつかの方法で遂行することができる。例えば、末端デオキシヌクレオチド転移酵素TdTによる反応は、一本鎖参照ブロック配列の末端に単一のジデオキシヌクレオチドddNTPを加えるために、溶液中のddNTPの存在下で用いることができる。ddNTPsは、ポリメラーゼ伸長をブロックする役目をする。あるいは、参照ブロック配列の3’-末端に相補的なオリゴヌクレオチド鋳型は、一時的なニ本鎖構造を提供するために使用することができる。その後、ポリメラーゼはハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの反対側の参照ブロック配列の3’-末端に、単一のddNTPを挿入するために使用することができる。ニ本鎖形態の参照ブロック配列を合成する別の方法では、従来のPCRが、まれな酵素制限部位を含有するプライマーを用いて行われることで、対象の配列の野生版を増幅する。PCR増幅の後、制限酵素は、PCR生成物の両末端を温浸し、オーバーハングを形成するために適用される。その後、これらのオーバーハングは、ジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ伸長にさらされ、それによって、さらなる伸長から両側の3’-末端をブロックする。その後、二本鎖の3’-末端ブロックPCR生成物は、ニ本鎖参照ブロック配列として役立つことができる。オリゴヌクレオチド合成により生成された参照ブロック配列の特異的な例2つの参照ブロック配列は合成された:p53エキソン8の部分に対応する、60bpRBS60および90bpRBS90参照ブロック配列。表1は、合成されたRBS60およびRBS90の参照ブロック配列について列挙される配列を含む。RBS60およびRBS90配列の両方は、IntegratedDNATechnologies,Incによる3’-ブロックリン酸基で合成された。同じエキソン8フラグメント中の変異を含む株化細胞は、方法を試験するために使用される表1の配列表を参照。図3は、修飾されたfullCOLD-PCR濃縮に関する、RBS60参照ブロック配列の使用を説明する概略図である。87bp増幅産物は、下線を引いたプライマーを用いて予備的に増幅される。相補的な参照ブロック配列RBS60は、図3の参照鎖のために設計される。図3から明白なように、RBS60はプライマーが結合するのを防ぎ、伸長を防ぐために3’リン酸基を含有している。RBS60のためのプロトコル:p53エキソン8からの167bp配列は、従来のPCRと、プライマーEx8-167F、および、Ex8-167R表1を用いて最初に増幅された。使用されたゲノムDNAは、野生型のDNA、または、3変異体DNA混合物を野生型のDNAに入れたもののいずれかであった。特定の変異を含有する使用された突然変異細胞株が、表1に列挙される。PCR生成物はその後500倍に希釈された。その後、25nMの参照ブロック配列RBS60と、167bpフラグメント内で入れ子にされたnested領域を増幅する200nMのプライマー87fおよび87rとの存在下で、修飾されたfull-COLD-PCR反応は実行された。Phusion商標ポリメラーゼNewEnglandBiolabsは増幅に用いられた。full-COLD-PCRプログラムは次のとおりだった:5サイクルの従来のPCR95°Cで30秒;60°Cで30秒;72°Cで1分;その後の25サイクルのfullCOLD-PCR95°Cで30秒;70°Cで30秒;その後Tc=84.5°Cで3秒、その後60°Cで30秒;72°Cで1分X25。あるいは、RBS60の不在下でのfullCOLD-PCRは、RBS60の存在下でfullCOLD-PCRについてまったく同じプログラムを適用することによって、しかしながら、反応混合物からRBS60を取り除くことによって、行なわれた。RBS60の存在下でのfullCOLD-PCRおよび、fullCOLD-PCRRBS60はないと、fastCOLD-PCRと規則的なPCRの後、生成物は長めのプライマー30T-p53-87F用いて配列決定された。RBSS90のためのプロトコル:RBS60について記載されたように、同じ手順がRBS90にも適用された。しかしながら、入れ子にされたfullCOLD-PCRのために設定されたプライマーは、p53-ex8-115Fおよびp53-ex8-115Rであり、RBS90に適用されたTcは、Tc=84.4°Cであった。結果:代表的な結果がRBS60について図4乃至7で、RBS90について図8で描かれる。図4乃至7において、RBS60の存在下の修飾したfullCOLD-PCRは、fullCOLD-PCRRBS60はない、FastCOLD-PCR、および、従来のPCRと比較される。図4は、修飾したfullCOLD-PCR25nMRBSによる濃縮は、変異が融解温度を上昇させる環境には左右されない3から37までの増加ことを説明している。図4のFastCOLD-PCRと従来のPCRを使用する場合、変異は検出できない。図5は、修飾したfullCOLD-PCR25nMRBSによる濃縮は、変異が融解温度に影響を与えない環境には左右されない3から47までの増加ことを同じように説明している。再び、図5のFastCOLD-PCRと従来のPCRを使用する場合、変異は検出できない。図6は、修飾したfullCOLD-PCR25nMRBSによる濃縮は、変異が融解温度を下げる環境には左右されない3から45までの増加ことを説明している。図6では、FastCOLD-PCRによる濃縮は、同様にすなわち、下がった融解温度によって左右されない。再び、図6では、従来のPCRを使用する場合、変異は検出できない。図7は、欠失を減らす温度の結果を説明する。修飾したfullCOLD-PCR25nMRBSによる濃縮は、FastCOLD-PCRによる濃縮と同じように堅調である3から45までの増加。再び、従来のPCRを使用する場合、変異は検出できない。図8は、RBS90を用いて処理されたサンプルからのHCC1008突然変異対立遺伝子の濃縮のSanger配列決定データを表示しており、90bp参照ブロック配列の存在下での修飾したfullCOLD-PCRによる濃縮が堅調である3から38までの増加を示している。RBS60を用いて処理されたサンプルからのHCC1008突然変異対立遺伝子の濃縮のSanger配列決定データを表示している図5の結果を、図8の結果と比較することで、本発明の方法が異なる期間の参照ブロック配列で堅調であることが確認される。ここまで研究してきたすべてのケースとすべての変異において、RBSの存在下の修飾したfullCOLD-PCRは、短い反応時間ですべてのタイプの変異Tmを上昇、維持、低下させる変異を濃縮し、かつ、Full-COLD-PCRRBSがないよりも濃縮が優れているという点で、最良の性能を有するように思われる。"