"実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む領域を含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、クロマトグラフィー媒体。前記官能性は陽イオン交換官能性である。請求項1に記載の媒体。前記官能性は陰イオン交換官能性である請求項1に記載の媒体。前記官能性はアクリル重合体の官能性である請求項1に記載の媒体。前記繊維の表面はペンダントスルホプロピル基で変性されたものである請求項1に記載の媒体。前記繊維の表面はペンダントトリメチルアンモニウム基で変性されたものである請求項1に記載の媒体。前記官能性は前記繊維にグラフトされた基によるものである請求項1に記載の媒体。前記繊維はほぼ15m2/gの表面積を有する請求項1に記載の媒体。実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する大表面積繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、大表面積繊維の不織布ベッド。実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、ほぐれた又は融着したカット繊維からなる充填ベッドを収容したハウジング。実質的な長軸部を形成する本体領域と、該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する繊維より構成され、前記繊維は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている、繊維媒体のベッドに、バイオ分子を含む試料を接触させることよりなる、バイオ分子を含む試料の精製方法。前記官能性は貫流形式で精製を可能にする請求項11に記載の精製方法。前記官能性は結合/溶離形式の精製を可能にする請求項11に記載の方法。前記イオン交換官能性は陽イオン交換官能性であり、前記精製はpH5~8で実施される請求項11に記載の方法。タンパク質混合物を用意し、長軸部を形成する本体領域と該本体領域から放射状に外方へ延びた複数の突起とを含む横断面を有する媒体の低密度ベッドであって、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから選択した一種のクロマトグラフィーを可能にする官能性を付与されている繊維媒体のベッドに、前記タンパク質混合物を接触させ、前記繊維媒体を洗浄して未結合の成分を除去し、前記繊維媒体を圧縮し、ついで前記圧縮された繊維媒体を洗浄して結合タンパク質を抽出する、タンパク質の精製方法。本明細書に記載の実施形態を利用して、従来技術の欠点に取り組んだ。該実施形態は、クロマトグラフィー媒体特にイオン交換クロマトグラフィー媒体のための吸着媒体に関する。開示されたクロマトグラフィー媒体は成形された繊維から製造される。本発明のある実施形態では、成形された繊維は繊維状構造又は畝状構造を有する。これ等の畝は通常の繊維に比して表面積を増大させる。したがって、繊維直径を減じるこれは、典型的にはベッドの透過率を減じ対応して流量を減じることなく、大表面積が得られる。本発明の実施例による高表面積の繊維の例は、翼付き繊維であり。米国ノースカロライナ州Raleigh所在のAllassoIndustriesIncから入手できる。Allasso社の翼付き繊維の断面走査電子顕微鏡SEM像を図1dに示す。これ等の繊維は約14m2/gの表面積を有する。本発明はまた、陽イオン又は陰イオン交換官能性を例えば高表面積繊維に付与するような、表面ペンダントSP官能基を追加する方法を開示する。このペンダント官能基はバイオ分子例えばモノクローナル抗体mAbのイオン交換クロマトグラフィー精製に対して有用である。本発明の実施形態は、高表面積の官能化繊維を含む媒体によるバイオ分子の単離、精製または分離の方法にも関する。これらの方法は貫流モードまたは結合/溶離モードで実施できる。例えば、モノクローナル抗体mAbの精製は、典型的には陽イオン交換クロマトグラフィーで実施されるものであり、抗体タンパク質の等電位点以下のpHで且つ控えめに抑制された溶液導電率で動作されると、抗体タンパク質はイオン交換リガンドを介してイオン的に支持体に結合し、他方未結合の汚染物ホスト細胞タンパク質、核酸等はクロマトグラフィーのベッドを自由に通過する。さらにこれらの汚染物は充填されたビーズベッドを適当なバッファー溶液でフラッシュすることにより除去することができ、しかる後に、ビーズ樹脂とタンパク質の間のイオン相互作用を十分に遮蔽する高い伝導率を有する適当な緩衝液により、結合されたmAb生成物を釈放することができる。対照的に、陰イオン交換クロマトグラフィーは、しばしばモノクローナル抗体の製造において下流側で使用されて、残留細胞培養物の汚染物をさらに除去するために使用され、この場合の動作は、mAbタンパク質がビーズ樹脂の陽イオン性表面に結合しないでクロマトグラフィーカラムを自由に通過するようなpHと導電性を有する溶液条件下で実施される。他方、正味の負電荷を有するタンパク質と核酸は効果的に陰イオン交換樹脂に結合して製品から除去される。ある実施形態に従うと、ここに記載した媒体は、ビーズベースのクロマトグラフィー媒体に比して高いベッド透過率例えば、500-900mDarcyと低い材料コストを有し、20~60mg/mLのIgG動的結合と、高い分離効率例えば理論段高さHETP<0.1cmと、50-160mg/gのIgG静電結合容量と、リガンド結合サイトへの吸着質の速い対流支配型の輸送とを有する。或る実施形態によると、固有の大表面積を有する押し出し成型繊維例えば熱可塑性繊維を使用して、長さ2-6mmに切断した繊維がランダム配向した充填ベッドとして構成するとき、高い流れ透過率液体と一様な流れ分布が可能となる。かかる繊維表面を官能化する化学的処理方法が提供され、吸着による相互作用に基づいたバイオ分子及び生物学的分離が可能になる。化学的処理方法はイオン性、親和性、疏水性等の相互作用、またはそれらの組み合わせの相互作用に基づく種々の表面化学的官能性をこの成型繊維に付与する。繊維の製造及び単純な表面化学処理の複合した技術より、バイオ製薬やワクチン製造において、経済的で容易に拡張可能な精製操作技術が提供できる。ある実施形態によると、速い処理速度を可能にする吸着分離材料が提供される。なぜなら、溶質を繊維表面へまたは繊維表面からのの質量輸送が、媒体を通る流体の対流により大きく制御されるからである。これは、拡散型の輸送が長い接触時間を要求しそれ故遅い処理速度であるビーズ型媒体に対して対照的である。ビーズ細孔の殺菌処理が制限される理由から従来のビーズ型の媒体を使用して能率的に分離できなかったウイルスのような大きい生物学的な種を捕捉または除去する能力が、本発明では提供される。以下に大表面積繊維表面の官能化及び遊離ラジカルグラフト重合法を説明する。例1ペンダントアリル基による大表面積繊維の表面変性ナイロン繊維表面のアリルグリシジルエーテルによる変性。ガラスボトルにアリルグリシジルエーテル28.9g、250mmol、硫酸ナトリウム6.0g、42mmol及び4Nの水酸化ナトリウム溶液60mLを入れた。この混合物に4gのほぐれたナイロン繊維供給者ロットIDを加えた。この濡れた固形物を50°Cで12時間加熱した。室温まで冷却後、固形物をブッフナー漏斗に移し、蒸留水400mLで洗浄し、次いでこの材料を30分間真空乾燥した。9.4gの湿った固形分を得た。この材料を直ちに次の工程で使用した。例2アリル変性し、ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能基を有する大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合アリル変性したナイロンAMPS/DMAM55/45のグラフト重合ガラスボトルに2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸AMPS、5.02g、24mmol、N,N-ジメチルアクリルアミドDMAM、1.96g、20mmol、過硫酸アンモニウム0.49g、2mmol及び水72.8mLを加えた。この混合物に9.4gのほぐれたナイロン繊維実施例1を加え、この濡れた固形物を80°Cで4時間加熱した。室温まで冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、蒸留水450mLとメタノール250mLで洗浄した。この材料をオーブン中70°Cで12時間乾燥した。4.0gの白色繊維固形分が得られた。例3得られた媒体の官能性能実施例2からのスルホプロピルで官能化した大表面積の繊維を、ポリクローナルヒトガンマイミュノグロブリンIgGの精製のため、陽イオン交換クロマトグラフィーで評価した。IgGに対する静的結合容量測定の結果は下記の表1に示す。この研究において、AllasoIndustriesから市販されている未官能化の翼付き繊維の試料ロット番号090602PA6Cの静的結合容量を、上記の例1及び例2に記載された紫外線照射重合法及び熱開始重合体グラフト法によりに製造されたスルホプロピル官能化繊維試料と比較した。熱開始遊離ラジカルグラフト法は、紫外線開始法による静的表面結合容量10~30mgIgG/g繊維試料や未官能化繊維のみの静的表面結合容量20mgIgG/g繊維試料よりも十分に高い静的表面結合容量50~80mgIgG/g繊維試料を有するSP官能化繊維媒体を提供した。また、1MのNaCl溶液によるIgG溶離試験をこれ等の試料に対して行った。これらの溶離条件下に、SP官能化繊維材料から50~70の結合IgGの回収が得られた。これ等の結果に基づき、SP官能化繊維媒体はバイオ分子クロマトグラフィーの用途における官能性能試験に対して十分な静的結合容量及び塩溶出特性を示すことが分かった。表1:静的結合容量の測定。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウム中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMApH5。洗浄バッファー:50mM酢酸ナトリウムpH5。溶離バッファ:50mMの酢酸ナトリウム中1Mの塩化ナトリウムpH5。例4約0.3gのほぐれたSP官能化Allasso翼付き繊維を内径6.6mmのIDOmnifitクロマトグラフィーカラムに充填した。ベッド体積は頂部溶剤分配ヘッダーの圧縮により2cmに調整してカラム容積を0.68mLにした。IgG動的結合容量の測定を次の手順で実施した。10CVカラム容積50mMのNaOAc緩衝液pH5平衡化60CV50mMのNaOAc緩衝液pH5中2mg/mLのIgGSeraCareIgGチャレンジ80CV50mMのNaOAc緩衝液pH5洗浄50CV50mMのNaOAc緩衝液pH5中1MのNaCl溶離20CV0.5MのNaOH洗浄60CV50mMのNaOAc緩衝液pH5洗浄図2はいくつかの実施形態に従った、例2に記載されたSPF1繊維に対する代表的なIgG破過曲線の例である。20~30mg/mLの範囲で鋭い破過曲線とIgG動的結合容量DBCが測定された表2。50mMのNaOAc緩衝液pH5中の1Mの塩化ナトリウムで溶離することにより、結合IgGの定量的な回収が達成された。表2:実施例2のSP官能化媒体SPF1の異なる線速度における1、5、10及び50の破過でのIgGのDBCの値図3は200~1500cm/hrの範囲の種々の線速度でのSPF1繊維媒体カラムに対する重畳したIgG破過曲線である。線流れ速度が増加しても破過曲線の形に差がない。図4は非常に高速1500cm/hrですら測定したIgG動的結合容量がわずかしか変動しないことを示す。この挙動はシステムがIgG分子のイオン性リガンド結合サイトへの対流による輸送に支配されることを示している。これに対して従来のビーズによるイオン交換クロマトグラフィー樹脂は速度が増すと動的結合容量が減少し、破過曲線がより拡散する。非常に高い速度では、ベッドの圧縮がビーズの一体性を損われ、その結果として流れの一様性が乏しくなり、クロマトグラフ性能が低下する。例5アクリルアミド共重合体被覆によるナイロン表面の変性AMPS/DMAMが55/45の溶液重合250mLの三口丸底フラスコに、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸AMPS、10.04g、48mmol、N,N-ジメチルアクリルアミドDMAM、3.92g、40mmol、過硫酸アンモニウム0.98g、4mmol及び水146mLを装入した。この溶液を80°Cに4時間加熱した。室温に冷却したのち、この重合体溶液を直ちに次に示す工程に使用した。ナイロン繊維表面のAMPS/DMAM重合体被覆Coatingによる変性ガラスボトルに19gの上記の工程で調製したAMPS/DMAM55/45共重合体溶液と、1gのほぐれたナイロン繊維AllassoIndustries.090602PA6Cを加えた。この濡れた固形物を80°Cで24時間加熱した。室温に冷却後、固形物をブッフナー漏斗に移し、蒸留水3×50mLとメタノール1×50mLで洗浄した。この材料を真空中で10分間乾燥した。この材料をオーブンに入れて40°Cで24時間乾燥した。0.9gの白色繊維状固形物が得られた。静的結合容量の測定IgGに対する静的結合容量の測定結果は表3に示す。この研究ではAllassoの未官能化の翼付き繊維試料の静的結合容量を、この例5の溶液重合体被覆法に従って調製したスルホプロピルSP官能化繊維の試料と比較した。この研究では溶液重合体被覆法では、SP官能化繊維媒体の方が、SP未官能化繊維媒体単独1mgのIgG/g繊維試料よりも高い静的結合容量30~40mgのIgG/g繊維試料を提供した。これ等の結果に基づき、SP官能化重合体繊維被覆はAMPS/DMAM共重合体の単なる被覆と熱アニールだけで設けることができる。表3:静的結合容量の測定。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウムpH5中の2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA。例6ペンダントアリル基による大表面積繊維の表面変性アリルグリシジルエーテルによるナイロン繊維表面の変性0.5Lのフラスコに、アリルグリシジルエーテル70.7g、620mmol、硫酸ナトリウム14.9g、105mmol及び4Nの水酸化ナトリウム溶液350mLを装入した。この混合物に10gのほぐれたナイロン繊維AllassoIndustries090602PA6Cを追加した。濡れた固形物を50°Cで12時間加熱した。室温に冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、蒸留水1.5Lとメタノール0.5Lで洗浄した。得られた材料を真空中で30分乾燥し、次いでオーブンに入れ50°Cで18時間乾燥した。8.8gの白色繊維固体が得られた。例7ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能基での、アリル変性大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合アリル変性ナイロンAMPS/DMAM55/45のグラフト重合ガラス容器に2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸AMPS、N,N-ジメチルアクリルアミドDMAM、過硫酸アンモニウム、及び水を、下の表4に記載した比率で装入した。ほぐれたアリルグリシジルエーテル変性ナイロン繊維実施例6を各混合物に加えた。この濡れた固形物を80°Cで4時間加熱した。室温に冷却後、濡れた固形物を各々ブッフナー漏斗に移し、蒸留水3×50mLとメタノール1×50mLで洗浄した。得られた材料はオーブン中、40°Cで12時間乾燥した。乾燥した表面変性繊維の試料はIgGチャレンジ溶液で静的結合容量を測定する用意が整う。静的結合容量の測定IgGに対する静的結合容量の測定結果も表4に示す。この研究では、Allassoからの官能化されていない翼付き繊維試料の静的結合容量が、熱開始重合体のグラフト工程により調製されたスルホプロピル官能化繊維の試料試料A~Gと比較された。この研究では、SP官能化繊維媒体のIgG静的結合容量はAMPS/DMAM重合体組成と反応溶液の濃度に影響されうる。例えば、試料EとGは、より高いAMPS濃度で調製された試料AとCと同様に、官能化しないナイロン繊維単独6mgIgG/g繊維よりも実質的に高いIgG静的結合容量を示す。表4:グラフト重合組成物とIgG静的結合容量測定データ。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウムpH5中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA媒体の官能性能例2で得たスルホプロピル官能化高表面積繊維の性能を次の例でモノクローナル抗体mAbの陽イオン交換クロマトグラフィーによる結合及び溶離精製で評価した。mAbは濃度6.7mg/mLでタンパク質Aカラムからの溶離物として用意した。例8モノクローナル抗体の結合及び溶離精製カラム充填例2で得た0.9gのスルホプロピル官能化した大表面積繊維を100gのイソプロパノール中で30分間かけてスラリー化した。400mLの脱イオン水を加え、スラリーを一晩撹拌した。この繊維スラリーを内径11mmのVantageカラムに移し、真空を用いて過剰の液をカラムから引いて人絹繊維の圧縮を促進した。スラリーをカラムに移送したのち、カラムの頂部ヘッダをセットし、ヘッダーで圧縮して、最終のカラム堆積2.76mLにした目標性能に向けてベッドを圧縮。2重量のアセトン溶液を用いてHETP理論弾高さ及びピーク非対称の測定を実行した。HETPは0.1cm未満であり、ピーク非対称性は2.0未満であった。陽イオン交換クロマトグラフフィーによるmAbの精製図5~6には、例2の陽イオン交換媒体を用いてmAbの結合/溶離精製するクロマトグラフィー法を実施する例が示されている。この例では、6.7mg/mLのmAb14.7mgのmAbを含有するタンパク質A溶離液0.79CV2.18mLが、カラムに適用され、100mMのMES緩衝液pH6中250mMのNaClで溶離される。mAbの溶離ピークは20個の0.5CV画分各画分=1.38mLで収集された。280nmでの各画分のUV吸収の測定によるmAb溶出画分の定量は13.8mg収率94の回収を示した。図7のタンパク質AのHPLCによる各溶離画分のIgG分析も行った。この分析もまた各溶離画分のIgG濃度を与える。この分析により、mAb溶離が主として画分第5~9に存在すること及びmAbの回収率が90であることを示した。図8にはチャイニーズハムスターの卵巣-各mAb溶離画分のホスト細胞タンパク質濃度CHO-HCPに対するELISAデータが記載されている。HCPは主として画分第5~9において濃度479ng/mLの平均濃度で溶離される。mAbチャレンジ溶液は6944ng/mLのHCP濃度を有し、HCPクリアランス対数減少値LRVは1.1と算出された。例9ペンダントアリル基を有する大表面積繊維の表面変性アリルグリシジルエーテルによるナイロン繊維の表面変性ガラスボトルにアリルグリシジルエーテル28.8g、252mmol硫酸ナトリウム6.0g、43mmol、及び4Nの水酸化ナトリウム溶液60mLを装入した。この混合物に4gのほぐれたナイロン繊維AllassoIndustries090602PA6Cを追加し、この濡れた固形物を50°Cで12時間加熱した。室温に冷却したのち、この固形物をブッフナー漏斗に移して蒸留水0.5Lで洗浄した。得られた材料を真空中で30分乾燥した。この湿った材料を直ちに次の工程で使用した。例10ペンダントトリメチルアンモニウム陽イオン交換官能性を有するアリル変性大表面積繊維の遊離ラジカルグラフト重合アリル変性ナイロンAPTAC100のグラフト重合カラスボトルに3-アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライドAPTAC、9.1g、44mmol、過硫酸アンモニウム0.64g、3mmol、水27mL、及び10gの濡れたアリルグリシジルエーテル変性した上記例9の繊維を装入した。この溶液を80°Cで4時間加熱した。室温に冷却したのち、この濡れた固形物をブッフナー漏斗に移して蒸留水100mLとメタノール30mLで洗浄した。得られた材料を真空中50°Cで120分乾燥した。材料をオーブンにおいて50°Cで12時間乾燥させた。6.1gの明黄色の繊維固形物を得た。乾燥しかつ表面変性した繊維試料はウシ血清アルブミンBSA試験溶液と静的結合容量の測定をうける用意ができた。例11静的結合容量の測定トリメチルアンモニウム官能化繊維の陰イオン交換への適用における性能を試験するために、BSA静的結合容量測定を実施した。その結果を下の表5に示す。この研究では、例10の熱開始重合体グラフト法により調製されたトリメチルアンモニウム官能化繊維試料の静的結合容量が記録された。例10からのトリメチルアンモニウム官能化繊維媒体のBSA静的結合容量は1~19mg/gである。表5:静的結合容量の測定。チャレンジ:25mMのTRIS緩衝液pH8中0.5gのウシ血清アルブミンBSA例12変性しないナイロン繊維のグラフト重合200mLの6個のガラスボトルに3-スルホプロピルメタクリレートのカリウム塩3-SPMA、水、ナイロン繊維AllassoIndustries製、及び1MのHNO3溶液下記の表に記載の量でを装入した。1Mの硝酸中0.4Mの硝酸二アンモニウムセリウムIVCANの溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を35°Cで18時間加熱した。室温に冷却後、各ボトルからの繊維固形物を0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL、1M水酸化ナトリウム溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL、及びアセトン1×50mLで洗浄した。ついでこの材料をオーブンにおいて40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形物の試料が得られた表6の回収及び重量付加データ参照。表6:セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データ。静的結合容量の測定IgGに対する静的結合容量の測定結果を次の表7に示す。SP-官能化触手繊維媒体は市販のバイオ分子クロマトグラフ用に使用されるビーズべースの陽イオン交換媒体に比肩できるIgG静的結合容量を示す。注1:0.33g/mLの繊維充填密度表7:静的結合容量の測定。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウムpH5中2g/LポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA動的結合容量の測定例12-6のSP官能化繊維媒体に対するIgG動的結合容量の測定結果を次の表8に示す。1.0gの媒体を11mm内径のVantageカラムに充填し、ベッド深さ2.9cm2.75mLのカラム容積、0.36g/mLの繊維充填密度になるまで圧縮した。動的結合容量の測定は、60~1200cm/hrの線速度範囲にわたり行った。これ等の速度は9~180秒の滞留時間に相当する。例12-6の繊維媒体は30~40mg/mLの範囲のIgG動的結合容量を示す。表8:SP触手官能化Allasso翼付繊維の陽イオン交換媒体の各種線速度における1510及び50破過でのIgGDBC値RTは滞留時間。チャレンジ:50mM酢酸塩溶液pH5中の20g/LポリクローナルヒトIgG。例13未変性ナイロン繊維のグラフト重合6個の200mLのボトルにグリシジルメタクリレートGMA、水、ナイロン繊維AllassoIndustries製及び1MのHNO3溶液下記の表に記載の量を装入した。1MのHNO3硝酸中の硝酸二アンモニウムセリウムIVCANの0.4M溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を35°Cで18時間加熱した。室温に冷却後、各ボトルからの繊維固形物を0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL及びアセトン1×50mLで洗浄した。ついでこの材料をオーブンにおいて40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形物の試料が得られた表9の回収及び重量追加データ参照。注1:1/3分離画分に基づく計算表9:セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データエポキシ官能化繊維のジエチルアミン官能化6個の250mLボトルに上例からの湿ったGMA官能化繊維の部分と、25重量のジエチルアミン水溶液を加えた下記の表に記載の量。これ等の混合物を室温で3時間撹拌した。続いて繊維固形分を脱イオン水3×50mLとエタノール1×50mLで洗浄した。これ等の材料をオーブンに入れて40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形物が得られた回収及び重量付加データについては表10参照。注1;初期の1.5gの繊維装入量の2/3の部分に基づいて算出表10:エポキシ官能化繊維のジエチルアミンによる変性に対する組成と回収データ静的結合容量の測定BSAに対する静的結合容量測定の結果を次の表11に示す。GMA触手のグラフト密度に依存して、ジエチルアミン官能化結合手を有する繊維媒体は広い範囲のBSA静的結合容量SBCを示すことができる。この系列では、例13-2Bと例13-3Bの組成は、商用のバイオ分子クロマトフィーの用途において、ビーズベースの陽イオン交換媒体に比肩できるBSAのSBC値を与えることが分かった。注1:0.33g/mLの繊維充填密度に基づく表11:静的結合容量の測定。チャレンジ:25mMトリス緩衝液pH8中2g/Lのウシ血清アルブミンBSA動的結合容量の測定例13-3Bのジメチルアミンで官能化した繊維媒体のBSA動的結合容量の測定結果を次の表12に示す。この媒体0.5gを内径11mmのVantageカラムに充填し、ベッド深さ1.5cmまで圧縮した1.42mLのカラム容積で0.35g/mLの繊維充填密度。動的結合容量の測定を線速度200cm/hrで行った。この速度は滞留時間27秒に相当する。例13-3Bの繊維媒体は10破過で30mg/mLのBSA動的結合容量を示した。表12:ジメチルアミン触手官能化されたAllasso翼付き繊維の陰イオン交換媒体での200cm/hrにおけるBSAの1、5、10及び50破過におけるDBC値動的結合容量値RTは滞留時間。チャレンジ:25mMTris緩衝液PH8中2g/Lのウシ血清アルブミンBSA。例14未変性ナイロン繊維のグラフト重合500mLのボトルにグリシジルメタクリレートGMA,1.70g、12mmolと水232.8mLを入れた。5gのAllassoナイロン繊維をこの溶液に加えた。1MのHNO3溶液7.22mL、7.2mmolを反応混合物に加え、次いで1MのHNO30.602mL,0.240mmol中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIVの溶液を加えた。この反応混合物を35°Cで1時間加熱した。室温まで冷却した後、固形分を脱イオン水3×100mLで洗浄した後、この濡れた材料12.21gを直ちに次工程で使用した。エポキシ官能化繊維のQ官能化4個の250mLのボトルに、上例からの濡れたGMA官能化繊維の部分とメタノール次の表13に記載の量で中50重量のトリメチルアミン水溶液を装入した。この混合物を室温で18時間撹拌した。ついで繊維固形物を0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸の溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液3×50mL、脱イオン水3×50mL、及びエタノール1×50mLで洗浄した。次いでこの材料をオーブンに入れ、40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形分の試料が得られた表13の回収及び重量追加データ参照。表13:トリメチルアミンによるエポキシ官能化繊維の変性のための組成及び回収データ静的結合容量の測定BSAに対する静的結合容量の測定の結果は下記の表14に示す。Q-官能化触手繊維媒体は30mg/mLのBSA静的結合容量を与えた。この系列においては、例14C及び14Dの組成が最高のBSASBC値を与える。これは商用バイオ分子クロマトグラフの用途で使用されているビーズベースの陰イオン交換媒体と同等である。注1:0.33g/mLの繊維充填密度表14:静的結合容量測定。チャレンジ:25mMのトリス緩衝液pH8中2g/Lのウシ血清アルブミンBSA。動的結合容量の測定例14Cにより調製したQ官能化繊維媒体に対するBSAの動的結合容量の測定の結果は下記の表15に示す。1.0gの同媒体を内径11mmのVantageカラムに入れ、ベッド深さ3.0cm2.85mLのカラム容積、0.35g/mL繊維充填密度に圧縮した。動的結合容量の測定は60~1200cm/hrの線速度範囲で行った。これ等の速度は9~180秒の滞留時間に相当する。例14Cの繊維媒体は30~40mg/mLの範囲のBSA動的結合容量を示している。表15:Q-触手官能化したAllasso翼付き陰イオン交換繊維媒体に対するBSAの動的結合容量DBCの、各種線速度破過1、5、10及び50に対する値RT=滞留時間。チャレンジ:25mMトリス緩衝液pH8中2g/Lのウシ血清アルブミンBSA。例15未変性ナイロン繊維のグラフト重合500mLのボトルにヒドロキシエチルメタクリレートHEMA1.69g、13mmolと水232.5mLを装入した。この溶液に5.00gのAllassoナイロン繊維を加えた。1MのHNO3溶液7.21mL、7.2mmolを反応混合物に加え、次いで1MのHNO3溶液0.601mL、0.240mmol中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIVの溶液を添加した。反応混合物を35°Cで1時間加熱した。室温に冷却後、固形分を0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸溶液3×100mL、脱イオン水3×100mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液3×100mL、脱イオン水3×100mL、及びエタノール1×100mLで洗浄した。得られた材料をオーブンに入れ40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形物5.58gが得られた。例16ポリHEMA官能化繊維の硫酸化アルゴン雰囲気と磁気撹拌子と3NのNaOHバッブラーを有する500mLの3口フラスコに、酢酸を加え、0°Cに冷却した。クロロスルホン酸5.0g、43mmolを加えた。上記の例からの2.5gのポリHEMA官能化繊維をこの反応混合物に添加し、室温まで放置して温め、1時間撹拌した。次いでこの繊維固形物に5mLの水と300mLの1M炭酸ナトリウム溶液の添加で中和した。固形の炭酸ナトリウムをこの反応混合物に分割して添加してpH>7にした。繊維固形物を1Mの炭酸ナトリウム溶液3×100mL、脱イオン水3×100mL、及びエタノール1×100mLで順次洗浄した。この材料をオーブンにて40°Cで12時間乾燥した。3.64gの白色のゴム状固体を得た。比較例1未変性EVOH繊維のグラフト重合4個の30mLのボトルに2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液AmPS-Na,50水溶液、水、及びEVOH繊維EngineeredFiberTechnologies,S030-0.5dx5mmを装入した。反応混合物を真空パージし、窒素で3回裏込めバックフィルした。1MのHNO3溶液と1MのHNO3溶液中硝酸アンモニウムセリウムIVCANの0.4M溶液を各ボトルに加えた下記の表16に記載した分量で。これらの反応ボトルに蓋をし、それらの混合物を40°Cで12時間加熱した。室温まで冷却したのち、各ボトルから繊維固形物を脱イオン水3×30mL、0.5Mの水酸化ナトリウム溶液中0.2Mのアスコルビン酸3×30mL、脱イオン水3×30mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液2×30mL、脱イオン水3×30mL、及びメタノール2×30mLで洗浄した。この材料をオーブンに入れて40°Cで8時間乾燥した。白色繊維固形物を得た表16の回収と収率のデータ参照表16:セリウムレドックスグラフト重合組成と回収のデータ比較例2未変性PVA繊維のグラフと重合4個の30mLのボトルに2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液AmPS-Na、50水溶液、水、及びPVA繊維EngineeredFiberTechnologies,VPB052×3mmを装入した。この反応混合物を真空パージし、窒素で3回裏込めバックフィルした。1MのHNO3溶液と1MのHNO3溶液中硝酸アンモニウムセリウムIVCANの0.4M溶液を各ボトルに加えた下記の表17に記載した分量。これらの反応ボトルに蓋をし、それらの混合物を40°Cで12時間加熱した。室温まで冷却したのち、各ボトルから繊維固形物を脱イオン水3×30mL、0.5Mの硫酸溶液中0.2Mのアスコルビン酸3×30mL、脱イオン水3×30mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液2×30mL、脱イオン水3×30mL、及びメタノール2×30mLで洗浄した。この材料をオーブンに入れて40°Cで8時間乾燥した。白色繊維固形物を得た表17の回収と収率のデータ参照表17:セリウムレドックスグラフト重合組成と回収のデータ静的結合容量の測定IgGに対する静的結合容量の測定結果を下の表18に示す。EVOH繊維ベースの母材に基づくSP官能化触手媒体比較例1は低いIgG静的結合容量を示すに過ぎない。PVC繊維ベースの母材に基づくSP官能化触手媒体比較例2はある組成比較例2-1に対してわずかに高いIgG静的結合容量を示すに過ぎない。すべての場合において、IgGSBC値は市販のバイオ分子クロマトグラフで使用される市販のビーズベースの陽イオン交換媒体よりもはるかに低い。これらの例は翼付き繊維媒体AllassoIndustries製が示す表面積増加の利点を示すのに役立っている。もしもPVA又はEVOHベースの母材に同様な表面積の増強が実行されれば、本書に記載したセリウムイオンレドックスグラフト法を使用して直接表面を官能化した後で高いIgG結合容量を得ることができるであろう。注:0.33g/mLの繊維充填密度に基づく表18:静的結合容量の測定。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウムpH5中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA。例16HPA/MBAm95/5によるナイロン繊維表面の変性機械撹拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた2000mLの三口フラスコに、ヒドロキシプロピルアクリレートHPA、13.7g、95mmol、N,N’-メチレンビスアクリルアミドMBAm、0.77g、5mmol、及び水710mLを装入した。この混合物に16.8gのほぐれたナイロン繊維AllassoIndustries090602PA6Cを加え、次いで過硫酸アンモニウム1.60g、7mmolを添加した。濡れた固形物を80°Cで4時間加熱した。室温に冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、熱水3×500mLとメタノール1×500mLで洗浄した。この材料を真空中で20分間乾燥した。この材料をオーブンに移し、40°Cで18時間乾燥した。17.6gの白色繊維が得られた。例17HPA/MBAm変性ナイロン繊維のグラフト重合4個の200mLのボトルにグリシジルメタクリレートGMA、水、HPA/MBAm変性ナイロン繊維例16及び1MのHNO3溶液下記の表19に記載の量を装入した。1MのHNO3中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIVCAN溶液を各ボトルに添加した。反応ボトルに蓋をし、これらの混合物を35°Cで12時間加熱した。室温に冷却したのち、各ボトルからの繊維固形物を脱イオン水3×150mL及びメタノール1×150mLで洗浄した。この材料をオーブン中で40°Cにて12時間乾燥した。白色の繊維質固形物のサンプルが得られた表19参照の回収及び重量付加データ参照。表19:セリウムレドックスグラフト重合組成と回収データ例18組み換えタンパク質A親和性リガンドrSPAによるナイロン繊維表面の変性250mLのボトルに1Mの重炭酸ナトリウム100mL、組み換えタンパク質A47.5mg/mL水溶液としてrSPARN091139、150mg及び水90mLを装入した。上記の例17-4からのGMAグラフト繊維350mgをこの反応混合物に加え、37°Cで2.5時間加熱した。室温への冷却後、固形分をブッフナー漏斗に移し、0.1Mの重炭酸ナトリウム3×100mLで洗浄した。濡れた繊維固形物を、0.2Mの重炭酸ナトリウム/0.5Mの塩化ナトリウム溶液中10重量のチオグリセロール溶液100mL中に懸濁した。この混合物を室温で一夜撹拌した。固形分をブッフナー漏斗に移し、0.1MのTRIZMA塩基溶液、0.15Mの塩化ナトリウム1×75mL、及び0.15Mの酢酸1×75mLによる洗浄サイクルを行った。TRIZMA塩基溶液と酢酸溶液による洗浄はさらに2回反復した。最後にこの繊維固形物を脱イオン水1×75mLと20エタノール1×75mLで洗浄した。この繊維固形物を20エタノール中に保存した。静的結合容量の測定例18に従って製造したタンパク質Aで官能化された繊維媒体に対するIgG静的結合容量の測定の結果を次の表20に示す。タンパク質Aで官能化された触手を有する繊維媒体は4mg/mL程度のIgG静的結合容量を有する。タンパク質Aのリガンド結合方法をさらに最適化すれば、バイオ分子アフィニティークロマトグラフの用途で低コストで且つ増大したIgG静的結合容量が提供されるであろう。注1:0.33g/mLの繊維充填密度に基づく表20:静的結合容量の測定チャレンジ:PBSpH7.4中2g/LのポリクローなるIgGSeraCareLifeScienceMilford,MA動的結合容量の測定例18のタンパク質A官能化繊維媒体に対するIgG動的結合容量の測定の結果は下記の表21に示す。0.35gの媒体を内径11mmのVantageカラムに充填し、ベッド深さ1.1cmまで圧縮した1.04mLのカラム容積、0.34g/mLの繊維充填密度。動的結合容量測定を60~800cm/hrの線速度範囲で行った。これらの速度は5~60秒の滞留時間に相当している。例18の繊維媒体は5g/mLの範囲のIgG動的結合容量を示している。タンパク質Aリガンド結合方法のさらなる最適化は低コストのバイオ分子親和クロマトグラフィーの応用に対して増大したIgG動的結合容量を提供するであろう。表21:種々の線速度RTは滞留時間における1、5、10及び50破過におけるタンパク質A官能化したAllasso翼付繊維の親和クロマトグラフ媒体に対するIgG動的結合容量の測定DBC動的結合容量。チャレンジ:リン酸塩緩衝塩水pH74中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA。例19HPA/MBAmで変性したナイロン繊維の貫流通式グラフト重合内径22mmのVantageクロマトグラフカラムに、例16からのHPA/MBAm変性ナイロン繊維100mLの脱イオン水中1.52gの繊維のスラリーを装入した。真空を用いて過分の液体をカラムを通して引いて人絹繊維の圧縮を容易にした。スラリーをカラムに移したのち、カラムに上部ヘッダを取り付けて最終の容積が4.54mLベッド深さ1.2cmになるようにヘッダを圧縮した。磁気攪拌棒、還流コンデンサ、温度調整器及び加熱マントルを有する250mLの3口フラスコに、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルフォン酸ナトリウム塩溶液AmPS-Na、50水溶液、23.0g、100mmolと水53.5mLを加えた。この単量体溶液をアルゴンで10分間撹散した。1MのHNO30.62mL、0.250mmol中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIV溶液と1MのHNO3溶液2.5mL、2.5mmolを反応混合物に加え、それを35°Cに加熱した。この単量体溶液をVantageカラムに3.5mL/分の流量で12時間ポンプ送りした。この単量体溶液の粘度は反応中増大することが分かった。これはカラムを流れる単量体溶液の流量をほぼ3時間後に実質的に減少する結果となった。室温に冷却後、Vantageカラムから繊維固形分を取り出し、0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸溶液3×150mL、脱イオン水3×150mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液3×150mL、脱イオン水3×150ML及びメタノール1×150mLで洗浄した。この材料をオーブンに入れ、40°Cで12時間乾燥した。1.52gの白色繊維固形物を得た。静的結合容量の測定IgGに対する静的結合容量の測定結果を下の表22に示す。貫流グラフト重合法により製造されたSP官能化触手繊維媒体は、市販のバイオ分子クロマトブラフ用ビーズベース陽イオン交換媒体と同等の静的IgG結合容量を示した。HPA/MBAm変性繊維前駆体例16はごくわずかなIgGに対する静的結合容量しか示さなかった。注1:0.33g/mLの繊維充填密度に基づく。表22:静的結合容量測定。チャレンジ:50mMの酢酸塩溶液中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA動的結合容量の測定例19のSP官能化繊維媒体に対するIgG動的結合容量の測定結果は下の表23に示す。0.64gの媒体を内径11mmのVantageカラムに装入し、ベッド深さ2.0cmの深さまで圧縮した1.90mLのカラム容積、0.32g/mLの繊維充填密度。動的結合容量の測定を線速度200cm/hrで行った。この速度は滞留時間36秒に相当する。例19の繊維媒体のIgG動的結合容量は40mg/mLであった。表23:種々の線速度RTは滞留時間、ndはデータなしにおける1、5、10及び50破過における、SP触手官能化Allasso翼付繊維陽イオン交換媒体に対するIgG動的結合容量の測定DBC動的結合容量値。チャレンジ:50mMの酢酸塩溶液pH5中2.0g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMA例20未変性ナイロン繊維のグラフト共重合4個の250mLボトルに、グリシジルメタクリレートGMA、3-アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド溶液APTAC、75wt水溶液、水、翼付きナイロン繊維、及び1MのHNO3量は表24参照を装入した。1MのHNO3中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIVCAN溶液を各ボトルに加えた。反応ボトルに蓋をし、この混合物を35°Cで3時間加熱した。室温まで冷却し、各ボトルからの繊維固形物をアセトン3×100mLで洗浄した。この濡れた材料をオーブンに入れて40°Cで12時間乾燥した。白色繊維固形物の試料が得られた表24の回収及び重量付加データ参照。表24:セリウムレドックスグラフト重合組成物と回収データ例21エポキシ官能化繊維のポリアリルアミン変性30mLのボトルに、上記例20-2のGMA/APTACグラフト繊維0.5g、水10mL、40ポリアリルアミンヒドロクロリド溶液1.25gの40wt溶液、及び1.0Mの水酸化ナトリウム10mLを装入した。この反応混合物を35°Cで18時間加熱した。室温に冷却後、固形分を脱イオン水3×50mL及びアセトン1×50mLで洗浄した。この濡れた材料をオーブンに入れ、40°Cで12時間乾燥した。0.48gの明るい黄色の繊維状固形物が得られた。例22スルホプロピル官能化繊維のポリアリルアミン変性磁気撹拌棒を備えた500mLのビーカーに例2のスルホプロピル官能化繊維1.0gとポリアリルアミン水溶液PAAMW=15kDa、20w/w、75mLを装入した。ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル750μL、Aldrich475696を加え、その混合物を室温で5分間ですばやく撹拌し、次いで250mLの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した3×250mL。この繊維を40°Cで一夜乾燥した。例22例23スルホプロピル官能化繊維のポリアリルアミン変性磁気撹拌棒を備えた500mLのビーカーに例2のスルホプロピル官能化繊維1.0gとポリアリルアミン水溶液PAAMW=15kDa、20w/w、75mLを装入した。ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル750μL、Aldrich475696を加え、その混合物を室温で10分間すばやく撹拌し、次いで250mLの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した3×250mL。この繊維を40°Cで一夜乾燥した。例23例24スルホプロピル官能化繊維のポリアリルアミン変性磁気撹拌棒を備えた500mLのビーカーに例23のポリアリルアミン官能化繊維1.0gとポリアリルアミンの水溶液PAAMW=15kDa、20w/w、75mLを装入した。ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル750μL、Aldrich475696を加え、その混合物を室温で10分間すばやく撹拌し、次いで250mLの水で急冷した。混合物をメジウムガラスフリットフィルタでろ過し、次いで水洗した3×250mL。この繊維を40°Cで一夜乾燥した。例24静的結合容量の測定ウシ血清アルブミンBSAに対する静的結合容量の測定結果を下の表25に示す。このポリアリルアミン官能化繊維媒体は20~60mg/mLの範囲のBSA静的結合容量を与えた。この系列では、例24からの組成はBSAに対する最高の静的結合容量SBCを与えたが、これは商用のバイオ分子クロマトグラフの応用に使用されているビーズに基づく陰イオン交換媒体と同等である。注1:0.33g/mLの繊維充填密度表25:静的結合容量の測定。チャレンジ:50mMのトリスバッファpH8中2g/Lのウシ血清アルブミンBSA動的結合容量の測定例24のポリアリルアミン官能化繊維媒体に対するBSA動的結合容量の測定結果を下の表26に示す。1.0gの繊維媒体を内径11mmのVantageカラムに充填し、ベッド深さ3.0cm2.85mLのカラム容積、0.35g/mLの繊維充填密度まで圧縮した。動的結合容量の測定を線速度200cm/hrで実施した。この速度は54秒の滞留時間に相当する。例24の繊維媒体は、10破過において50mg/mLのBSA動的結合容量を示した。表26:200cm/hrRTは滞留時間での1、5、10及び50破過における、ポリアリルアミン官能化Allasso翼付繊維の陰イオン交換媒体に対するBSA動的結合容量DBCの測定。チャレンジ:25mMTrispH8中0.5g/LのBSA例25HPA/MBAm95/5によるナイロン繊維表面の変性機械的攪拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた1000mLの3口丸底フラスコにヒドロキシプロピルアクリレートHPA、13.7g、95mmol、N,N’-メチレンビスアクリルアミドMBAm、0.77g、5mmol及び水710mLを装入した。この混合物に16.8gのほぐれたナイロン繊維AllasoIndustries090602PA6Cを加えた。過硫酸アンモニウム1.60g、7mmolを加えた。濡れた固形物を80°Cで4時間加熱した。室温に冷却したのち、固形物をブッフナー漏斗に移し、熱水で洗浄し3×500mL、ついでメタノール1×500mLで洗浄した。この材料を真空中で30分乾燥した。ついでオーブンに移し、40°Cで12時間乾燥した。17.3gの白色繊維を得た。例26HPA/MBAmで変性され、ペンダントスルホプロピル陽イオン交換官能性を有する高表面積繊維のセリウムイオンレドックスによるグラフト重合HPA/MBAm変性ナイロン繊維のグラフト重合機械的攪拌器、還流コンデンサ及び温度制御器を備えた200mLの3口丸底フラスコに、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム塩AMPS-Na、23.1g、100mmolと水76.3mLを装入した。この溶液に2.50gのHPA/MBAm変性ナイロン繊維例25を加えた。この反応混合物を真空中で掃気し、窒素ガスの3サイクル裏込め充填を行った。1MのHNO30.620mL、0.250mmol中0.4Mの硝酸アンモニウムセリウムIV溶液、及び1MのHNO3溶液2.46mL、2.46mmolをこの反応混合物に加えた。この反応混合物を35°Cで18時間加熱した。室温まで冷却した後、固形物を、0.5Mの硫酸中0.2Mのアスコルビン酸溶液3×150mL、脱イオン水3×150mL、1Mの水酸化ナトリウム溶液3×150mL、脱イオン水3×150mL、及びアセトン3×150mLで洗浄した。この材料をオーブンに入れて40°Cで12時間乾燥した。2.52gの白色繊維質固形物を得た。媒体の機能性能例26からのスルホプロピル官能化高表面積繊維を、陽イオン交換クロマトグラフ媒体で、ポリクローナルヒトガンマ免疫グロブリンIgGの精製に対して評価した。IgGに対する静的結合容量の測定結果を表27に示す。この研究では、AllassoロットID3kgバッチ-製造ロットIDなしからの未官能化翼付き繊維の試料の静的結合容量を、例26のセリウムイオンレドックス重合法により製造されたスルホプロピル触手官能化繊維の試料、及び例2の熱開始グラフト重合法の試料と比較した。セリウムイオンレドックス重合法は、熱開始重合体グラフト法50mgIgG/g繊維試料及び未官能化繊維のみ10mgIgG/g繊維試料と比較して、相当に高い静的結合容量150mgIgG/g繊維試料を有するスルホプロピルSP触手官能化繊維媒体を提供することが分かった。SP触手官能化繊維媒体は商用のバイオ分子クロマトグラフィーの用途で使用されるビーズベースの樹脂媒体に比肩できるIgG静的結合容量を示す。表27:静的結合容量測定。チャレンジ:50mMの酢酸ナトリウムpH5中2g/LのポリクローナルヒトIgGSeraCareLifeSciencesMilfordMAHETP理論段高さ値は、例26からの1.00gのSP-触手変性ナイロン繊維を内径11mmのVantageカラムに充填し、繊維ベッドを深さ3.0cmに圧縮したものカラム容積2.85mLにアセトン注入法を用いて測定した。HETPの許容値0.08cmとピーク非対称性1.8~2.0が見出された。これ等の結果に基づき、0.35g/mLのSP-触手変性繊維充填密度がクロマトグラフの評価において十分な一様流れ性能を与えると考えられる。同じカラムを使用して次の手順によりIgG動的結合容量の測定も行った。5CVカラム容積50mMのNaOAc緩衝液pH5平衡化60CV50mMのNaOAc緩衝液pH5中1.7mg/mLのIgGSeraCareIgGチャレンジ30CV50mMのNaOAcpH5洗浄15CV50mMのNaOAc緩衝液中1MのNaClpH5溶離10CV0.5MのNaOH洗浄10CV50mMのNaOAc緩衝液pH5洗浄図10は特定の実施形態に従ったSP-触手変性繊維に対する代表的なIgG破過曲線の例を示す。鋭い破過曲線と10IgG破過で40mg/mLのIgG動的結合容量がある表28。表28:種々の線速度での1、5、10、及び50破過RT=滞留時間におけるSP-触手変性繊維Allasso翼付き繊維陽イオン交換媒体に対するIgG動的結合容量図11は200~1200cm/hrの種々の線速度でのSP-触手繊維カラムに対する重畳したIgG破過曲線を示す。線速度が大きくなるにつれてIgG破過曲線の傾斜がわずかに減じる。本書に記載された実施形態に従った繊維媒体に対するIgG動的結合容量に対する速度の効果は、ビーズに基づく装置で典型的に観測される速度の効果よりははるかに小さい。図12において、最高速度1200cm/hr、9秒の滞留時間で測定されたIgG動的結合容量のわずかな減少が見られる。この挙動は、このシステムがIgG分子のイオン性リガンド結合サイトへの対流による輸送に大きく支配されることを示している。これに対して、従来のビーズに基づくイオン交換クロマトグラフィー樹脂は、速度の増加につれて動的結合容量がかなり減少し且つより大きい拡散破過曲線を示すであろう。非常な高速度ではベッドの圧縮がビーズの完全性を損ない、流れの一様性を損なってクロマトグラフ性能を減じる。例27貫流ホスト細胞タンパク質クリアランス例26に従って製造したスルホプロピル官能化繊維媒体を貫流精製ポリッシュモードでのHCP除去活性に対して評価した。0.3gのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径14.5mmのカラムに装入し、ベッド深さ0.6cm1.00mLの容積、0.30g/mLの繊維充填密度まで圧縮した。このカラムを単独に、及び商用の膜式吸着器ChromaSorb商標,MilliporeCorp,膜体積0.2mLと組み合わせて試験した。モノクローナル抗体を含んでいる細胞培地を清澄化し、次いでタンパク質Aカラムクロマトグラフィーを用いて分離し、溶液をpH5に調節した。次いでタンパク質Aの溶離pHをTRISでpH7に調節し、次いで0.2μの膜を通過させて濾過した。このカラムとChromasorb商標膜装置を緩衝溶液25mMのTris、pH7で平衡化した。このスルホプロピル官能化繊維媒体及びChromaSorb膜式吸着器MilliporeCorpの商品名を表29に記載したように独立に評価し、また直列で評価した。7.3g/Lのモノクローナル抗体たんぱく質AプロテインAの72mLの溶離物pH7を0.25mL/分で同装置に流通させた。6つの12mL分画を捕集した。8つの貫流分画と1つの保留試料をHCP-ELISAとタンパク質AHPLCにより分析して、HCPクリアランス及びモノクローナル抗体回収レベルをそれぞれ決定した。SP繊維0.38LRVはChromaSorb商品名膜吸着器1.42LRVほどにはHCPを除去しなかったが、pH7での2個の貫流型吸着器の直列接続配置はHCPクリアランス2.13LRVで独立したいずれかの吸着器よりも有効であった。これらの吸着媒体はこの用途に限定されない容量なので、これら2個の吸着器は別個の明確に異なるHCPの個体群を除去するであろうことを示唆している。HCPがより正の有効電荷を有する場合には、SP繊維はより低いpHでより多くのHCPを除去するのではないかと思われるが、しかし、SP繊維に対するモノクローナル抗体の親和性も増大して製品回収率を減じるであろう。注1:貫流画分容積の総和表29:モノクローナル抗体の貫流精製。3つの貫流洗練列の評価。SP-繊維例26頂部、ChromaSorb商品名中段、SP繊維例26/ChromaSorb商品名直列底部。5個の貫流と1つのプールした画分に対するモノクローナル抗体回収タンパク質AHPLC及びHCPクリアランスHCP-ELISA。チャレンジ:0.25mL/分の流量での7.3g/Lのモノクローナル抗体タンパク質A溶離液pH7。例28還流ホスト細胞タンパク質クリアランス例14で作製したQ-官能化繊維媒体例14Cを貫流精製モードでHCP除去活性に対する評価を行った。0.34gのQ-官能化繊維媒体を14.5mmの内径を有するカラムに充填し、ベッド深さ0.6cm1.00mLのカラム容積、0.34g/mLの繊維充填密度に圧縮した。モノクローナル抗体を含んだ細胞培養媒体を清澄し、次いでタンパク質Aカラムクロマトグラフィーを用いて単離し、pHを5に調整した。引き続いてタンパク質Aの溶離をTRIZMA塩基でpH8に調整し、次いで0.2μのろ過膜でろ過した。Q-官能化繊維媒体のカラムを緩衝溶液25mMのpH8のTrisで平衡化した。Q-官能化繊維媒体の評価からのデータを表30に示した。8.2g/Lのモノクローナル抗体タンパク質A溶離物pH8100mLを流量1.0mL/分でカラム装置に通した。10個の10mL画分を集めた。溶離緩衝液として25mMのTrispH8中1Mの塩化ナトリウム溶液で、結合HCPを溶離した。2個の10mL溶離画分も集めた。これら10個の貫流画分と2個の溶離画分をHCP-ELISAとタンパク質AHPLCで分析して、HCPクリアランスのレベルとモノクローナル抗体回収をそれぞれ決定した。Q-官能化繊維は貫流モードでのHCPクリアランスで有効であった。0.3のHCPホスト細胞タンパク質のLRV除去活対数減少値が高いmAbモノクローナル抗体回収率98で達成された。ここに開示した実施形態のQ官能化繊維媒体は、モノクローナル抗体の製造のための貫流ポリッシュ精製においてビーズベースの樹脂媒体及び膜吸着媒体の装置に代わる便利で低コストの代替物として使用できる。Q-官能化繊維媒体例14Cにより製造したQ-官能化繊維媒体に対して700mDaの高い透過性は膜吸着器を用いて達成できない流量でmAb供給流の高速処理を可能にしうる。注1:貫流及び溶離画分容積の会合表30:モノクローナル抗体供給物の貫流精製。充填ベッド形式のQ-官能化繊維媒体を用いる貫流ポリッシュ法による流れの評価1.0mLカラム容量、0.34g/mL充填密度。5つの貫流画分及び2つの溶離画分に対するモノクローナル抗体の回収タンパク質AHPLC及びHCPクリアランスHCP-ELISA。集めた画分データは算出値である。チャレンジ:流量1.0mL/分で8.2g/Lのモノクローナル抗体タンパク質A溶出液pH8滞留時間60秒。例29貫流モノクローナル抗体の会合クリアランス例26で製造したスルホプロピル繊維媒体によるモノクローナル抗体の総合除去活性を貫流ポリッシュモードで評価した。1.0gのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径11mmのVantageカラムに充填し、ベッド深さ3.0cmに圧縮したカラム容積2.85mL、繊維充填密度0.35g/mL。20g/Lのモノクローナル抗体を含有するタンパク質A溶離プールを、50mMの酢酸塩緩衝液pH5中0.5mMの塩化ナトリウムと50mMの酢酸塩緩衝液pH5で希釈し、pH5と導電率19mS/cmの6.9g/Lの溶液を得た。導電率19mS/cmは単量体モノクローナル抗体の結合を弱め、タンパク質Aの供給溶液中の総合したモノクローナル抗体の結合を有利にするために選択したスルホプロピル官能化繊維媒体のカラムは緩衝液pH5の50mMの酢酸塩で平衡化した。スルホプロピル官能化繊維媒体の評価データは表31と図9に示す。6.9g/Lのモノクローナル抗体タンパク質A溶出液pH5、19mS/cm285mLを3.2mL/分200cm/hrの流量でカラムに通過させた。33個の8.6mL3カラム容積画分を捕集した。結合した単量体及び会合モノクローナル抗体を、50mMの酢酸塩pH5中0.5Mの塩化ナトリウム溶液を溶離緩衝液バッファとして使用して溶離した。5個の8.6mL3カラム容積の溶離画分を捕集した。これ等33個の貫流画分と5個の溶離画分をサイズ排除クロマトグラフィーSECとタンパク質AHPLCで分析して会合クリアランスとモノクローナル抗体タンパク質の回収のレベルをそれぞれ決定した。スルホプロピル官能化繊維は、貫流モード動作で、単量体モノクローナル抗体種の存在下に、会合したモノクローナル抗体に結合する能力を示した。タンパク質AのHPLCデータからは、92という高いmAb回収率を見出した。SECデータの分析によると貫流画分2に単量体mAbの完全な破過が見られ、一方、会合mAbは貫流画分5まで初期供給濃度0.6100破過に適合しなかった。溶離画分35、36及び37のSEC分析は、mAb集団の会合した高分子量HMWの種に富み、単量体mAbが枯渇していることを示した。本書に示した実施形態によるスルホプロピル官能化繊維媒体は本実施例に記載した方法に従って会合クリアランスの手段として役立つ。スルホプロピル官能化繊維媒体の高度な透過性例26により調製したスルホプロピル官能化繊維媒体に対し520mDaは、模擬した動的ベッド動作に適する高い流量で高速かつ迅速サイクルのmAb供給流れを可能にする。注1:貫流及び溶離画分体積の総計表31:モノクローナル抗体の貫流総合クリアランス。スルホプロピル官能化繊維媒体の充填ベッド形式2.85mLのカラム容積、0.35g/mLの充填密度での貫流総合クリアランス法の評価。31個の貫流、3個の溶離画分に対するモノクローナル抗体回収タンパク質AHPLCと単量体、HMW会合SEC。プールした画分のデータは計算値。チャレンジ:3.2mL/分滞留時間54秒での6.9g/Lのモノクローナル抗体タンパク質Aの溶離pH5、19mS例32圧縮性ベッドへの直接捕捉例19のスルホプロピル官能化繊維媒体を、貫流モード動作で、未清澄化細胞培養液からの直接的なモノクローナル抗体の捕捉に対して評価した。0.49gのスルホプロピル官能化繊維媒体を内径14.5mmのカラムに充填し、ベッド深さ3.0cm5.0mLのカラム容積、0.10g/mLの繊維充填密度に圧縮した。スルホプロピル官能化繊維媒体のカラムを緩衝液50mMの酢酸塩緩衝液pH5で平衡化した。0.8g/Lのモノクローナル抗体を含む未清澄化チャイニーズハムスター卵細胞の培養液pH6.5、5.7mS/cmを用意した。0.8g/Lのモノクローナル抗体を含む100mLの未清澄化の細胞培養液を流量12.5mL/分460cm/hrでカラムに通した。9個の10mL2カラム容積の貫流画分を収集した。低密度繊維ベッドを50mMの酢酸塩緩衝液pH5で、繊維ベッドを繰り返して圧縮及び膨張することにより洗浄した。この圧縮及び膨張はカラムの流れ分配ヘッダーを調整することにより行った。13個の10mL2カラム容積の50mM酢酸塩緩衝液pH5洗浄画分を捕集した。結合したモノクローナル抗体を溶離緩衝液として50mMの酢酸塩溶液中pH51.0Mの塩化ナトリウム溶液を用いて溶離した。溶離工程は、モノクローナル抗体溶離物をさらに濃縮するために、圧縮ベッド方式ベッド深さ1.0cm、1.65mLのカラム容積、0.30g/mLの繊維充填密度で実施することが好ましい。3個の10mL2カラム容積溶離画分を捕集した。9個の貫流画分、13個の洗浄画分、及び3個の溶離画分をタンパク質AHPLCで分析して、モノクローナル抗体回収を測定した。スルホプロピル官能化繊維媒体の評価データを表32に示す。これらスルホプロピル官能化繊維は未清澄化チャイニーズハムスター卵細胞の培養培地の存在下に、モノクローナル抗体mAbへ結合する能力を有することを示した。タンパク質AHPLCのデータは、画分7によるmAb捕捉動作中にmAbの完全な破過が起きることを示している。50mM酢酸塩溶液pH5での洗浄段階は、洗浄画分6により未結合のmAbをカラムと装置から除去する。50mMの酢酸塩溶液pH5中1.0Mの塩化ナトリウムによる溶離は、結合したmAbをスルホプロピル官能化繊維媒体カラムから溶離する。当業者は種々のプロセスの変形によりモノクローナルIgG結合容量の十分な利得が実現できることを認識するであろう。それらには、細胞培養供給物導通性の減少、未清澄脂肪培養供給物の希釈、或いは本例のスルホプロピルに基づく陽イオン交換性リガンドの官能性に代わるタンパク質A親和リガンド構造の使用等が含まれる。当業者には例18のタンパク質A官能化繊維媒体又はその誘導体がこの直接捕捉に好ましいことが理解されよう。低充填密度の形式では、表面官能化繊維媒体は、未清澄化の供給流から直接のIgG捕捉が可能である。引き続くベッド圧縮は圧縮ベッド形式でのmAb溶離の濃縮を可能にする。この方法は、モノクローナル抗体のような治療用のバイオ薬剤の下流側の工程で、第1清澄化遠心工程及び第2清澄化深濾過工程を省略することができるであろう。注1:貫流、洗浄、及び溶離画分体積の総計表32:未清澄化細胞培地からのモノクローナル抗体の直接捕捉。直接mAb捕捉法の評価は、スルホプロピル官能化繊維媒体を充填したベッドの形式で行う容積:5.00mLカラム容積。充填密度:0.10g/mL。モノクローナル抗体濃度及び回収タンパク質AHPLC4個の貫流、4個の洗出し、及び3個の塩化ナトリウム溶出画分。チャレンジ:0.87g/Lのモノクローナル抗体を含む100mLの未清澄チャイニーズハムスター卵細胞液pH6.5、5.7mSで流量12.5mL/分滞留時間:24秒例33ウイルスの結合/溶離精製のための繊維媒体の可能性バクテリオファージφ6に対する静的結合容量と溶離回収測定の結果が表31に挙げてある。5個のプラスチック遠心管に例14CのQ-官能化触手繊維媒体と未官能化Allasso繊維試料を下表33に記載した量で装入した。各繊維試料と対照の管を5mLの25mMトリス緩衝液pH8、0.18mg/mLのHSAで10分間撹拌しながら平衡化した。これ等の管を室温で最高4000rpmの卓上型遠心分離器で10分間回転して繊維媒体をペレット化した。2.5mLの上澄みを取り除き、25mMのトリス緩衝液pH8、0.18mg/mLHSA中1.7×107pfu/mLのφ6溶液2.5mLを各管に加えた。これらの試料を室温で1時間撹拌した。その後、管を卓上遠心分離器で室温で4000rpmで15分間回転し繊維媒体をペレット化した。2.5mLの上澄みを除去し、これ等の試料をプラーク形成分析法により未結合φ6に対する分析を行った。管を2.5mLの25mMトリス緩衝液pH8、0.18mg/mLのHSAで遠心下で3回洗浄し、繊維媒体を各洗浄と2.5mLの上澄み除去の間にペレット化した。洗浄後に25mMのトリス緩衝液pH8,0.18mg/mLHSA中1.0Mの塩化ナトリウムの溶液2.5mLを各管に加えた5mLの全容積、最終NaCl濃度0.5M。これらの試料を室温で10分間撹拌した。その後、管を卓上遠心分離器中、室温で10分間4000rpmで回転し、繊維媒体をペレット化した。2.5mLの上澄みを除去し、これ等の溶離試料のプラーク形成分析法により溶離φ6を分析した。試料14CのQ-官能化触手繊維媒体は有意なバクテリオファージφ6の対数減少値LRV3.1を示し、溶離回収率が40を示した。この性能は商業的なウイルスクロマトグラフで使用されている膜ベースの陰イオン交換媒体と同等である。本発明のQ-官能化繊維媒体は予め充填される装置形式又は貫流ウイルスクリアランス又は結合/溶離ウイルス精製のためのクロマトグラフィーカラムに一体に組込むことができる。表33:静的結合容量測定。チャレンジ:0.18mg/mLのHSAでの25mMトリスpH8中2.5mLの1.7×107pfu/mLバクテリオファージφ6。溶出緩衝液:0.18mg/mLのHSAを有する25mMトリスpH8中0.5MのNaCl。"