"単一細胞ハプロタイピングの方法であって、a.単一細胞を選抜する工程と、b.前記単一細胞を溶解する工程と、c.前記単一細胞のDNAを増幅する工程と、d.増幅された前記単一細胞DNAの超並列ゲノムワイド遺伝的多型タイピング=ジェノタイピングを行う工程と、e.全ての遺伝的多型又はその一部を用いて該単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する工程と、f.近接する遺伝的多型の情報に基づいて、1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、を含む、単一細胞ハプロタイピングの方法。1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う、請求項1に記載の方法。或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項2に記載の方法。或る量の遺伝的多型閾値よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、該小さなハプロタイプブロックに対して隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項2又は3に記載の方法。遺伝的多型の量が或る特定の閾値T1よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値T1よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これら2つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。二重細胞ハプロタイピングの方法であって、a.2つの細胞を選抜する工程と、b.前記2つの細胞を溶解する工程と、c.各細胞について、単一細胞のDNAを増幅する工程と、d.各細胞について、増幅された該単一細胞DNAの超並列ゲノムワイド遺伝的多型タイピング=ジェノタイピングを行う工程と、e.2つの別個にジェノタイピングした該単一細胞間で一致する遺伝的多型コールからなる仮想遺伝子型を生成する工程と、f.前記仮想遺伝子型のハプロタイプを再構築する工程と、g.近接する遺伝的多型の情報に基づいて、1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当てを再配分する工程と、を含む、二重細胞ハプロタイピングの方法。1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分を、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって行う、請求項6に記載の二重細胞ハプロタイピングの方法。或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項7に記載の方法。或る量の遺伝的多型閾値よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、該小さなハプロタイプブロックに対して隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項7又は8に記載の方法。遺伝的多型の量が或る特定の閾値T1よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値T1よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの2つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法であって、或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを再配分することによって、該ハプロタイプブロックを処理することを含む、単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を改善する方法。或る量の遺伝的多型よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分に、前記量の遺伝的多型よりも大きいハプロタイプブロックの祖父母起源を利用する、請求項11に記載の方法。或る量の遺伝的多型閾値よりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当ての再配分を、該閾値よりも大きい、該小さなハプロタイプブロックに対して隣接する最初の左及び右のハプロタイプブロックの祖父母起源を利用することによって行う、請求項11又は12に記載の方法。遺伝的多型の量が或る特定の閾値T1よりも小さいハプロタイプブロックを、該閾値T1よりも大きい、該ハプロタイプブロックの左側又は右側の最初のハプロタイプブロックに、これらの2つのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ配分する、請求項11~13に記載の方法。1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当ての再配分が、画像処理法に基づく、請求項1に記載の単一細胞ハプロタイピングの方法及び請求項6に記載の二重細胞ハプロタイピングの方法。画像処理法が1Dメジアンフィルターの適用である、請求項15に記載の方法。遺伝的多型タイピングを単一ヌクレオチド多型タイピングSNPタイピングによって行う、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。遺伝的多型タイピングをDNAシークエンシングによって行う、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。単一細胞がヒト又は動物の割球である、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。定義遺伝子型=遺伝子座、染色体又はゲノムの任意の対立遺伝子構成ハプロタイプ=遺伝子座、染色体又はゲノムのシンテニー対立遺伝子の任意の配列単一細胞ハプロタイピング=単一細胞由来の遺伝子型からのシンテニー対立遺伝子の配列の任意の決定二重細胞ジェノタイピング=2つの別個にジェノタイピングされる単一細胞における一致する遺伝的多型コールの決定二重細胞ハプロタイピング=2つの別個にジェノタイピングされる単一細胞における一致する遺伝的多型コールからのシンテニー対立遺伝子の配列の任意の決定本発明の方法は、好ましくは、1.単一細胞を選抜する工程と、2.単一細胞を溶解する工程と、3.例えば多置換増幅MDA法を用いることによって単一細胞のDNAを増幅する工程と、4.増幅された単一細胞DNAの超並列遺伝的多型タイピング=ジェノタイピングを行う工程この工程では、超並列遺伝的多型タイピングを、例えば増幅単一細胞DNAをAffymetrixの高分解能SNPアレイにハイブリダイズし、続いてAffymetrixのGeneChipSNPプローブの強度を解釈するためのDynamicModelアルゴリズムDietal2005を使用することによって行うことができると、5.その後のハプロタイプ再構築のために、計算された単一細胞遺伝子型からヘテロ接合性遺伝的多型のみを選択する任意の工程と、6.2つの別個にジェノタイピングした単一細胞間で一致する遺伝的多型コールからなる仮想遺伝子型を生成する任意の工程と、7.単一細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する=単一細胞ハプロタイピング;任意の工程5を含むか又は含まず、任意の工程6を含まないか、又は仮想二重細胞の遺伝子型のハプロタイプを再構築する任意の工程6=二重細胞ハプロタイピングによる工程この工程では、ハプロタイピングは例えばMERLINソフトウェアを用いて行うことができると、8.設計した平滑化アルゴリズムを用いて生成した単一細胞及び/又は二重細胞の未処理のハプロタイプの解釈を簡略化する工程と、を含む第3項における本発明のフローチャートも参照されたい。種々の工程を下記でより詳細に説明する。A.単一細胞の溶解、DNA増幅及び精製工程1:単一細胞を、1.5μlのアルカリ溶解バッファーALB;200mMKOH及び50mMDTTを含有する200μl容PCRチューブに、75μmのストリッパーチップMidAtlanticDiagnostics,MountLaurel,USAを用いたマウス制御によるピペット操作によって移す。最後の洗浄滴から一定分量を陰性対照として採取する。工程2:サンプルを多置換増幅MDA反応の前に少なくとも30分間-20°Cで貯蔵し、更に65°Cで10分間インキュベートする。工程3:単一細胞SCDNAを、MDA法Spitsetal2006に従い、GenomiPhiV2GEHealthcare,Piscataway,NJを用いて増幅する。MDA産物を精製し、100μlの溶出バッファーHighPurePCRProductPurificationKit;Roche,Basel,Switzerlandに再懸濁する。全ての増幅産物を、分光光度計NanodropND-1000分光光度計;NanodropTechnologies,Rockland,DEを用いて定量する。2μg未満のDNAしか生じないSC増幅は、更に使用しないことが好ましい。代替案としては、任意の単一細胞の溶解、DNA増幅DOP-PCR、PEP-PCR、ライゲーション媒介PCR、alu-PCR、PicoPlex全ゲノム増幅等及びDNA精製の方法が挙げられる。B.単一細胞のゲノムワイド遺伝的多型タイピング及び二重細胞のジェノタイピング工程4:単一ヒト細胞のゲノムワイド遺伝的多型タイピング及びその後のハプロタイピングを可能にするために、AffymetrixのGeneChipHumanMapping250KNspIアレイを、250ngの単一細胞の増幅DNAを用い、メーカーの使用説明書に従って実行する。得られるSNPプローブの強度を、続いてSNP信頼性閾値を0.12に設定したDynamicModelアルゴリズムを用いて解釈するDietal2005。任意の工程5:単一細胞遺伝子型からのヘテロ接合性SNPのみを更に適用する。任意の工程6:2つの別個の単一細胞分析からの一致するSNPコールからなる仮想遺伝子型=二重細胞由来の遺伝子型を、例えばTinn-R2.2.0.2及びR2.8.0を用いて作成する。代替案としては、メーカーの使用説明書に変更を加えた又は変更を加えていない任意のゲノムワイドSNPタイピングプラットフォームAffymetrix製例えば、GeneChipHumanMapping250KStyIアレイ、GeneChipHumanMapping500Kアレイ、Genome-WideHumanSNPArray5.0、Genome-WideHumanSNPArray6.0、特注のアレイ等及びIllumina製例えば、HumanOmni1-Quad、Human1M-Duo、Human660W-Quad、HumanCytoSNP-12、特注のアレイ等のより低分解能及び高分解能のプラットフォームを含む、及びその後のジェノタイピングソフトウェアRLMM、BRLMM、Birdseed、GenomeStudioGenotypingModuleIllumina等が挙げられる。代替案としては、任意の超並列シークエンシング手法、及び単一細胞又は二重細胞のハプロタイピングのための任意のタイプの多型遺伝的変異の使用も挙げられる。C.単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング工程7:単一細胞又は二重細胞由来の遺伝子型のゲノムワイドハプロタイプ再構築を、MERLINアルゴリズムによって、最も可能性の高い遺伝子流動パターンというオプション最良のコマンドラインオプションを用いて行う非特許文献4。ped、map及びdatのファイルを、Tinn-R2.2.0.2及びR2.8.0又はMatlabを用いて生成する。MERLINの要件として、それぞれの遺伝的多型が独自の遺伝的距離を有していなくてはならない。deCODEマップKongetal2002から外挿される性平均のSNP遺伝的距離が使用され、これはNetAffx注釈ファイルのバージョンNA272008/11/25に挙げられている。代替案としては、任意のハプロタイピングソフトウェアStephensandDonnelly2003、非特許文献1、非特許文献8、並びに任意の性特異的/性平均の遺伝子地図deCODEマップKongetal2002、MarshfieldマップBromanetal1998、Affymetrix及びジョンズホプキンス大学のAravindaChakravarti博士のグループの未発表のデータによるSLM1マップ2022個のマイクロサテライトマーカー及び6205SNPについての遺伝子型に基づくものであった等の利用、又は所与の民族的背景における既知のハプロタイプ及びハプロタイプ頻度の利用Frazeretal2007が挙げられる。D.単一細胞及び二重細胞の未処理ハプロタイプの平滑化2倍体の単一細胞のゲノムワイドハプロタイピングは主に、ランダムな対立遺伝子ドロップアウトADO及び選択的増幅PAのような単一細胞DNA増幅のアーチファクト工程3、並びに遺伝的多型検出の誤ったアルゴリズム的解釈ADO及びPA現象に加えて、対立遺伝子ドロップインADIも観察される工程4によって導入される遺伝子型エラーのために妨げられている。ハプロタイピング工程7にとって最も問題となる遺伝的多型タイピングエラーは、メンデル不一致をもたらさないため、誤った対立遺伝子割当て及び誤った相同的組換え部位を導入するエラーである。したがって、対立遺伝子ドロップアウト及び選択的増幅に関する問題を、単一細胞由来のヘテロ接合性遺伝的多型のみを使用することによって回避することができる場合であっても、未処理の単一細胞ハプロタイプの解釈工程8を確実に解釈するためにアルゴリズム複数の場合もありが必要とされる。工程8:平滑化アルゴリズムは、ハプロタイプブロックの間違った対立遺伝子割当てを調整することによって、生成された単一細胞及び/又は二重細胞の未処理のハプロタイプの解釈を容易にする。ゲノムワイドスキャン及び下流分析において遺伝的多型を除外又は追加することの容易さ、ゲノムワイド遺伝的多型タイピングにおける実験室、ユーザー及びアルゴリズムによるバイアスの存在を考えると、下記に規定される閾値は絶対的なものではなく、使用される遺伝的多型タイピングのプラットフォーム/アルゴリズム、使用される遺伝的多型の注釈ファイル、実験室、ユーザー等に対して柔軟であり、修正可能であるものと考えるべきである。未処理の単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプの解釈を容易にし、遺伝的交差を未処理のハプロタイプからより正確に突き止めるために、3工程平滑化アルゴリズム図10を参照されたいを単一細胞及び二重細胞のハプロタイプに適用する。本発明の平滑化アルゴリズムによって、閾値1本発明の好ましい実施形態では、ハプロタイプブロックサイズについての閾値1は200SNPに設定されるよりも小さいハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを、閾値1よりも大きい隣接ハプロタイプブロックの祖父母配分に合わせて調整する。このアルゴリズム設計は、閾値1よりも大きい未処理のハプロタイプブロックの大半が正確な対立遺伝子に配分されるという発見に基づく。アルゴリズムの第1の工程では、ハプロタイプブロックサイズについてのユーザーが調節可能な閾値1を設定する図10の工程1を参照されたい。このように、このアルゴリズムは、閾値1よりも大きい2つの隣接ハプロタイプブロック間の潜在的な偽陽性の組換え部位を、それらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ取り除く。さらに、閾値1よりも小さく、染色体のp末端又はq末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源を、閾値1を下回るp末端又はq末端のハプロタイプブロックが一括して500SNPよりも小さい場合に、閾値1よりも大きい最初のハプロタイプブロックに合わせて調整する閾値1は同様にユーザーによって調節可能であり、任意に規定することができる。閾値1よりも大きく、異なる祖父母に割り当てられるハプロタイプブロック間の対立遺伝子割当てを精緻化するために図10の工程2及び工程3を参照されたい、閾値2及び閾値3本発明の好ましい実施形態では、ハプロタイプブロックサイズについての閾値2及び閾値3は、それぞれ50SNP及び200SNPに設定されるを、アルゴリズムの第2及び第3の工程それぞれにおいて、工程1後の平滑化したハプロタイプに対して適用する。単一細胞ハプロタイプの平滑化のためのアルゴリズムを、Tinn-R2.2.0.2及びR2.8.0において設計した。工程8の代替的な手法では、非線形平滑化アルゴリズムは、1つ又は複数の遺伝的多型及び/又は中間領域の対立遺伝子割当てを調整することによって、生成された単一細胞及び/又は二重細胞の未処理のハプロタイプの解釈、及び未処理のハプロタイプからの遺伝的交差の特定を容易にする。本発明の好ましい実施形態では、1DメジアンフィルターPratt1978を、この非線形平滑化アルゴリズムに適用する。メジアンフィルターはノイズを低減する画像処理法であるが、ノイズを除去しながらエッジを保持することができる。この非線形平滑化アルゴリズムでは、1Dメジアンフィルターは、スライディングウィンドウ遺伝的多型の数で表される、及び各々のウィンドウ内での対立遺伝子割当てバイナリフォーマットで表されるの調整を用いる。調整はウィンドウの中央値に応じて行われる。ウィンドウのサイズはユーザーによって規定される。本currentアルゴリズムの好ましい実施形態では、1番染色体について450SNPのウィンドウを使用した図12を参照されたい。次いで、非線形平滑化アルゴリズムは、各々の染色体における遺伝的多型の数に基づくウィンドウを適用する非線形平滑化アルゴリズムの好ましい実施形態では、染色体に特異的なウィンドウ=特定の染色体中の遺伝的多型の数/1番染色体における遺伝的多型の数×1番染色体についてのウィンドウサイズ。最後に、非線形平滑化アルゴリズムは、平滑化したハプロタイプブロックと未処理のハプロタイプブロックとを比較し、未処理のハプロタイプブロックにおける遺伝的多型の大部分が、平滑化したハプロタイプブロックと同じ対立遺伝子に配分されていることを確認する。これが当てはまらない場合には、未処理のハプロタイプを維持した。このアルゴリズムをMatlabにおいて設計した。さらに、付加的な規則を追加することができる。好ましい実施形態では、種々の手法によって計算し、平滑化した単一細胞ハプロタイプを、ハプロタイプ一致について統合し、解釈を更に簡略化する。本発明の好ましい実施形態では、単一細胞ハプロタイプを、信頼性の高い単一細胞の遺伝子型及びハプロタイプの解釈のために、既存の方法Vannesteetal2009によって決定される単一細胞DNAコピー数プロファイルとも統合する。さらに、ハプロタイプブロックサイズを利用する平滑化及び解釈の工程における付加的な規則例えば、ハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを、減数分裂交差干渉原理、異なる祖父母起源に配分される遺伝的多型の数の比率の算出、及びこの比率のみの対立遺伝子割当ての調整に基づいて調整又は保持するために、遺伝的多型ハプロタイプブロックサイズの閾値を規定することは、ユーザーによって規定される基準を満たすを、同様に上記に記載の方法に追加することができる。また、異なる民族的背景における既知のハプロタイプ及びハプロタイプ頻度を利用する付加的な工程を追加することができるFrazeretal2007。最後に、上記に記載の平滑化アルゴリズムに、相同的組換えの既知のホットスポットの情報を付け加えることができるFrazeretal2007。本発明の平滑化アルゴリズムは、単一ヌクレオチド多型SNPアレイ又は超並列DNAシークエンサーの結果に基づくハプロタイプの解釈を容易にするのに特に有用である。当業者であれば、任意のジェノタイピング方法を全ゲノム増幅単一細胞DNAに対して行い、続いて任意のハプロタイピング方法を行う場合の単一細胞ゲノム又は遺伝子座の信頼性の高いハプロタイプ推定にとっての上述の方法の実用的価値を理解するであろう。平滑化による単一細胞及び/又は二重細胞のハプロタイピングのための本願に記載される方法は、胚選択の目的、異なる対立遺伝子構成を有する細胞からなる不均一組織の遺伝学研究、又は法医学的研究のためにヒト及び動物の細胞に使用/適用することができる。実施例1:EBVで形質転換したヒトのリンパ芽球様細胞のハプロタイピング単一細胞のジェノタイピング4つの異なる個体にそれぞれ由来する、EBVで形質転換した4つのリンパ芽球様細胞株を用いて方法を確立した。これらの個体の複数の血球から単離したゲノムDNA、及び1つの細胞株当たり3つの単一細胞に由来するMDA-DNAを、Affymetrixの250KSNPアレイにハイブリダイズした。得られたSNPプローブの強度を、MDA、対立遺伝子ドロップアウトADO、又は選択的増幅PAを受けていない2倍体ゲノムにおけるSNPのタイピングについて最適化した3つの異なるアルゴリズムDynamicModelDietal2005、BRLMM及びBirdseedによって解釈した。MDA単一細胞DNAのSNPタイピング精度は、単一細胞遺伝子型と、対応する非増幅ゲノムDNAから得られる参照遺伝子型とをアラインメントすることによって決定した。種々のアルゴリズムが、単一細胞ホモ接合性SNPと参照SNPとの一致に対して軽微な影響を有していたが、ヘテロ接合性SNPの一致に対して重大な影響が見られた表1及び図6。DynamicModelアルゴリズムは、単一ヒト細胞におけるヘテロ接合性SNPのタイピングについて、BRLMMアルゴリズム及びBirdseedアルゴリズムの両方より優れている。DynamicModelアルゴリズムにおいて0.12というSNPタイピング信頼性閾値を用いることによって、単一細胞において平均して89.04±5.0SDのホモ接合性SNP及び91.24±6.0SDのヘテロ接合性SNPが、複数の細胞から単離されたゲノムDNAを用いて決定した対応する遺伝子型と適合した。さらに、DynamicModelアルゴリズムDietal2005、BRLMMアルゴリズム又はBirdseedアルゴリズムを用いてジェノタイピングすると、非増幅ゲノムDNAサンプルにおいてヘテロ接合性のSNPのうち、平均してそれぞれ29.38±11.30SD、12.41±4.81SD及び32.91±6.33SDが対応する単一細胞においてホモ接合性である。これらの不一致の一部は、対立遺伝子ドロップアウト、又は単一細胞のゲノムの特定の対立遺伝子の選択的増幅のような全ゲノム増幅のアーチファクトに起因し得るSpitsetal2006、非特許文献8。しかしながら、種々の統計的アルゴリズムが種々のコーリングエラーを導入することが明らかである。DynamicModelによって計算した単一細胞DNAフィンガープリントを、ハプロタイプ再構築について更に調査した。表1:単一細胞SNPタイピング精度についてのジェノタイピングアルゴリズムの比較一致a参照遺伝子型との単一細胞ホモ接合性SNPの一致b参照遺伝子型との単一細胞ヘテロ接合性SNPの一致cデータは平均±標準偏差で表す参照遺伝子型は、DynamicModelによってタイピングしたゲノムDNAサンプルである閾値0.12。単一細胞及び二重細胞のハプロタイピング単一細胞由来の遺伝子型からハプロタイプを再構築する可能性を調べるために、初めに3つの異なる家族に属する4人の個体について、母系遺伝常染色体及び性染色体の参照対立遺伝子の配列を決定した図11。この目的で、4人の個体、並びに彼らの親及び母方の祖父母のゲノムDNAを250KのSNPについてタイピングし、MERLINアルゴリズム非特許文献4を用いてハプロタイプを計算した。異なる個体それぞれの2つの組換え部位を、STRマーカー分析によって検証したデータは示さない。続いて、MERLIN家系図ファイルにおいて4人の個体の遺伝子型を単一細胞由来の遺伝子型と交換することによって単一細胞由来のハプロタイプを決定した。1個体当たり3つの単一リンパ芽球様細胞をフェージングした。得られた単一細胞由来のハプロタイプは、参照ハプロタイプ図1Aと比較した場合に、より小数の連続的なSNPからなる、はるかに多くのハプロタイプブロックを含有していた。これらの偽陽性の組換え部位の結果として、ハプロタイプ不一致における常染色体SNPの相対量は、計算された単一細胞ハプロタイプ図1E、図7ではおよそ17.72±5.0SDであるため、単一細胞由来のハプロタイプに基づいて祖父母相同染色体間で母系の遺伝的交差の正確な位置を識別することは困難である。単一細胞由来のハプロタイプと参照対立遺伝子配列との間の相違は、単一細胞MDA-DNAのジェノタイピングエラーによるものである。より信頼性の高い遺伝子型を導き出すために、同じ個体の2つの単一細胞遺伝子型で一致するSNPコールからなる仮想遺伝子型を作成するアルゴリズムを設計した。この二重細胞分析において、平均して96.32±2.88SDのホモ接合性SNP及び98.46±1.11SDのヘテロ接合性SNPが参照遺伝子型と適合した図6。これらの仮想遺伝子型を用いてハプロタイプを再構築することによって、ハプロタイプブロックの数、偽陽性の組換え部位、及び常染色体SNPのハプロタイプ不一致が大幅に減少し8.77±4.24SD図1B、図1E、図7、シンテニーな真の対立遺伝子配列を視覚的に区別することが可能になった。ハプロタイプの平滑化シンテニー対立遺伝子の単一細胞及び二重細胞由来の配列の分析を更に簡略化する手段を開発した。単一細胞の遺伝子型のフェージングは、参照ハプロタイプと適合しない多数の小さなハプロタイプブロックをしばしば生成する。これらの矛盾する対立遺伝子割当ての少なくとも一部を修正するアルゴリズムを生成する可能性を評価するために、参照ハプロタイプと比較してそれぞれ一致した、不一致の、及び相同的組換え部位にわたるハプロタイプブロックのサイズについてのヒストグラムを作成した図2A。これにより、参照との適合を有しないハプロタイプブロックの大部分が、連続的な200SNPよりも小さいことが明らかになった図2A~図2C。この観察結果に基づいて、小さなハプロタイプブロックの対立遺伝子割当てを隣接する大きなハプロタイプブロックの祖父母配分に合わせて再調整する、単一細胞ハプロタイプのための3工程平滑化アルゴリズムを設計した。アルゴリズムの第1のサイクルでは、ハプロタイプブロックサイズについてのユーザーが調節可能な閾値を200SNPに設定した。このように、このアルゴリズムは、200SNPよりも大きい2つの隣接ハプロタイプブロック間の潜在的な偽陽性の組換え部位を、それらのハプロタイプブロックが同じ祖父母に配分される場合にのみ取り除く。さらに、閾値よりも小さく、染色体のp末端又はq末端に位置するハプロタイプブロックの祖父母起源を、閾値を下回るp末端又はq末端のハプロタイプブロックが一括して500SNPよりも小さい場合に、少なくとも200SNPにわたる最初のハプロタイプブロックに合わせて調整する。200SNPよりも大きく、異なる祖父母に割り当てられるハプロタイプブロック間の対立遺伝子割当てを精緻化するために、50SNP及び200SNPという閾値を、アルゴリズムの第2及び第3の工程それぞれにおいて平滑化したハプロタイプに対して適用した。単一細胞遺伝子型及び二重細胞遺伝子型に由来するハプロタイプを、このアルゴリズムを用いて平滑化した。単一細胞遺伝子型に由来するシンテニー祖父母系対立遺伝子配列の平滑化は、2つの単一細胞遺伝子型間で一致するSNPコールに由来するハプロタイプと比較して、ハプロタイプ不一致におけるより少ないSNPをもたらした4.45±3.85SD図1C、図1E、図7。二重細胞由来のハプロタイプの平滑化は、最良の結果をもたらしたハプロタイプ不一致におけるSNP:1.86±2.13SD図1D~図1E、図7。平滑化した単一細胞及び二重細胞のハプロタイピングデータを用いて遺伝的交差マッピングの精度を決定するために、4人の個体において検出された175個の相同的組換え部位をアラインメントした。参照対立遺伝子配列との、これらのアラインメントした遺伝的交差の周囲の1000SNPについてのハプロタイプ一致頻度の計算図3Aから、平滑化した二重細胞由来のハプロタイプによって、平滑化した単一細胞由来のハプロタイプよりも正確に交差が突き止められることが示された。実際に、平滑化した単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプについて、90を超える正確なSNPハプロタイプ推測の頻度に達するには、それぞれ遺伝的交差に隣接するおよそ250SNP及び50SNPの距離を考慮する必要がある。正確な祖父母起源に配分される交差隣接SNPの頻度は、未処理の単一細胞又は二重細胞由来のハプロタイプよりも、平滑化したハプロタイプで高い図3A及び図3B。結論としては、このアルゴリズムは、単一細胞又は二重細胞の分析に基づいて、遺伝染色分体上で祖父母系染色体間の相同的組換え部位を突き止めることを更に容易にする。第2の非線形平滑化アルゴリズムを同様に開発した。このアルゴリズムは、1Dメジアンフィルターに基づく。一般に、メジアンフィルターはノイズを低減する画像処理法であるが、ノイズを除去しながらエッジを保持することができる。この非線形平滑化アルゴリズムでは、1Dメジアンフィルターは、スライディングウィンドウSNPの数で表される、及び各々のウィンドウ内での対立遺伝子割当てバイナリフォーマットで表されるの調整を用いる。調整は、ユーザーによってサイズが規定されるウィンドウの中央値に応じて行われる。本アルゴリズムの好ましい実施形態では、1番染色体について450SNPのウィンドウを使用した図12を参照されたい。各々の染色体におけるSNPマーカーの密度と、各々の染色体の未処理のハプロタイプ解釈に最適なウィンドウサイズとの間に相関が存在することが更に観察された。したがって、非線形平滑化アルゴリズムは、各々の染色体におけるSNPの数に基づくウィンドウを計算し、適用する染色体に特異的なウィンドウ=特定の染色体中のSNPの数/1番染色体におけるSNPの数×1番染色体についてのウィンドウサイズ。最後に、このアルゴリズムは、平滑化したハプロタイプブロックと未処理のハプロタイプブロックとを比較し、未処理のハプロタイプブロックにおけるSNPの大部分が、平滑化したハプロタイプブロックと同じ対立遺伝子に配分されていることを確認する。これが当てはまらない場合には、未処理のハプロタイプを維持した。非線形平滑化アルゴリズムは優れたハプロタイプ不一致率をもたらした1個体のEBV-リンパ芽球様細胞については3.40±2.05SD、及び別の個体のEBV-リンパ芽球様細胞については1.65±0.51SD。実施例2:ヒト割球のハプロタイピングリンパ芽球様細胞をハプロタイピングするこの単一細胞及び二重細胞の手法が、ヒト割球に対しても奏功するか否かを試験するために、同じ胚に由来する3つの単一の割球における父系遺伝常染色体上の祖父母系対立遺伝子配列を決定した。この男性胚は、夫婦が彼らの子供への22q11欠失の父系伝達を回避することを望むために、着床前遺伝子診断PGDに適用される介助生殖技術から得られたものである。2つの更なる割球に対するFISH分析から、この胚が22q11欠失を保有することが明らかとなったデータは示さない。3つの割球における父系遺伝染色体のハプロタイプを再構築することによって、このFISH結果を確認することができた。22q11欠失内に位置するSNPのプローブ強度クラスターグラフ分析によって、欠失は父親の祖母系対立遺伝子上に新たに起こったことが証明されたデータは示さない。3つの単一の割球のDynamicModelによる遺伝子型、及び2つの単一の割球において一致するSNPコールから得られる3つの対応する仮想遺伝子型のハプロタイプ再構築から、22q11遺伝子座がこれらの割球において祖母系ハプロタイプブロックに組み込まれていることが明らかになった図4A及び図4B。この分析は、既知の22q11欠失領域内のSNPを追加及び除外図4A及び図4Bすることによって行った。欠失内のSNPは正確にタイピングすることができないため、誤った組換え部位が検出され、これは、これらのSNPをハプロタイプ再構築から除外することによって回避された。計算したハプロタイプの平滑化の後、相同的組換え部位は、22番染色体のこの父系遺伝染色分体上に見られなかった図4C及び図4D。同様の結果が他の8つの常染色体についても得られたが、残りの遺伝常染色体は祖父母系染色体間での相同的組換えの部位を示した図5A~図5D。さらに、この胚の参照ハプロタイプを、3つの単一の割球において一致するSNPコールから計算した。単一の割球に由来するハプロタイプにおいておよそ20.3±3.4SDの常染色体SNPが、この参照対立遺伝子配列と一致していないことが分かった図8。2つずつのこれらの割球の遺伝子型の混合によって、常染色体SNPのハプロタイプ不一致率が7.54±1.90SDまで低下したが、単一細胞及び二重細胞由来のハプロタイプの平滑化は、それぞれ7.84±1.60SD及び6.08±1.20SDの不一致率をもたらした。複数の細胞から抽出した非増幅ゲノムDNAに由来する参照ハプロタイプはこの胚では欠けているが、これらの結果は単一のEBVで形質転換したリンパ芽球様細胞のハプロタイプ再構築と同程度である。異なる単一細胞遺伝子型から得られるハプロタイプへの非線形平滑化アルゴリズムの適用は、Merlinインプットフォーマット戦略1.未処理の単一細胞遺伝子型インプット、2.未処理の単一細胞遺伝子型に由来するヘテロ接合性SNPのみからなるインプット、及び3.仮想二重細胞遺伝子型インプットは、高いゲノムワイドハプロタイプの一致を更に実証し、父系相同染色体間の減数分裂性の組換え事象のゲノムワイド検出も可能にした図13。結論としては、本発明者らの結果は、ハプロタイプ平滑化と組み合わせた単一割球及び二重割球のハプロタイピングが、胚における遺伝子座の対立遺伝子特異的な遺伝を評価することを可能にするという原理を証明する。平滑化を用いた又は用いない、本願に記載される単一細胞及び/又は二重細胞のハプロタイピングのための方法は、胚選択の目的、異なる対立遺伝子構成を有する細胞からなる不均一組織の遺伝学研究、又は法医学的研究のためにヒト及び動物の細胞に使用/適用することができる。1AbecasisGRChernySSCooksonWOCardonLR2002MerlinrapidanalysisofdensegeneticmapsusingsparsegeneflowtreesNatGenet30971012AltshulerDDalyMJLanderES2008GeneticmappinginhumandiseaseScience3228818883BromanKWMurrayJCSheffieldVCWhiteRLWeberJL1998ComprehensivehumangeneticmapsindividualandsexspecificvariationinrecombinationAmJHumGenet638618694DiXMatsuzakiHWebsterTAHubbellELiuGDongSBartellDHuangJChilesRYangGetal2005Dynamicmodelbasedalgorithmsforscreeningandgenotypingover100KSNPsonoligonucleotidemicroarraysBioinformatics21195819635FrazerKABallingerDGCoxDRHindsDAStuveLLGibbsRABelmontJWBoudreauAHardenbolPLealSMetal2007Asecondgenerationhumanhaplotypemapofover31millionSNPsNature4498518616FrazerKAMurraySSSchorkNJTopolEJ2009HumangeneticvariationanditscontributiontocomplextraitsNatRevGenet102412517GaoGAllisonDBHoescheleI2009HaplotypingmethodsforpedigreesHumHered672482668GoddardMEandHayesBJ2009MappinggenesforcomplextraitsindomesticanimalsandtheiruseinbreedingprogrammesNatRevGenet103813919HandysideAHHartonGLMarianiBThornhillARAffaraNAShawMAGriffinDK2009KaryomappingaUniversalMethodforGenomeWideAnalysisofGeneticDiseasebasedonMappingCrossoversbetweenParentalHaplotypesJMedGenet4765165810IwamotoKBundoMUedaJNakanoYUkaiWHashimotoESaitoTKatoT2007DetectionofchromosomalstructuralalterationsinsinglecellsbySNParraysasystematicsurveyofamplificationbiasandoptimizedworkflowPLoSONE2e130611JohnsonDSGemelosGBanerJRyanACinniogluCBanjevicMRossRAlperMBarrettBFrederickJetal2010Preclinicalvalidationofamicroarraymethodforfullmolecularkaryotypingofblastomeresina24hprotocolHumReprod251066107512KongAGudbjartssonDFSainzJJonsdottirGMGudjonssonSARichardssonBSigurdardottirSBarnardJHallbeckBMassonGetal2002AhighresolutionrecombinationmapofthehumangenomeNatGenet3124124713MeuwissenTHHayesBJGoddardME2001PredictionoftotalgeneticvalueusinggenomewidedensemarkermapsGenetics1571819182914PrattWK1978DigitalImageProcessingInpp330333JohnWileySons15RenwickPJTrusslerJOstadSaffariEFassihiHBlackCBraudePOgilvieCMAbbsS2006ProofofprincipleandfirstcasesusingpreimplantationgenetichaplotypingaparadigmshiftforembryodiagnosisReprodBiomedOnline1311011916SpitsCLeCaignecCDeRyckeMVanHauteLVanSteirteghemALiebaersISermonK2006WholegenomemultipledisplacementamplificationfromsinglecellsNatProtoc11965197017StephensMandDonnellyP2003AcomparisonofbayesianmethodsforhaplotypereconstructionfrompopulationgenotypedataAmJHumGenet731162116918VannesteEVoetTLeCaignecCAmpeMKoningsPMelotteCDebrockSAmyereMVikkulaMSchuitFetal2009ChromosomeinstabilityiscommoninhumancleavagestageembryosNatMed15577583"