"少なくとも1つの治療剤および少なくとも1つの界面活性剤を含み、結晶性であることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が前記治療剤の結晶をコーティングすることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、棒状形状または円形であることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、z-平均直径が約100nm~1μmであることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が両親媒性ブロックコポリマーを含むことを特徴とするナノ粒子。請求項5に記載のナノ粒子において、前記両親媒性ブロックコポリマーが、ポリオキシエチレンの少なくとも1つのブロックおよびポリオキシプロピレンの少なくとも1つのブロックを含むことを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が、ポロキサマー188、ポロキサマー407、ポリビニルアルコールPVA、1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン-メチル-ポリエチレングリコールコンジュゲート-2000mPEG2000DSPE、ドデシル硫酸ナトリウムSDS、および1,2-ジオレオイロキシ-3-トリメチルアンモニウムプロパンDOTAPからなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が少なくとも1つのターゲティングリガンドに連結されていることを特徴とするナノ粒子。請求項8に記載のナノ粒子において、前記ターゲティングリガンドがマクロファージターゲティングリガンドであることを特徴とするナノ粒子。請求項9に記載のナノ粒子において、前記マクロファージターゲティングリガンドが葉酸であることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記治療剤が抗レトロウイルスであることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記治療剤が、アタザナビルATV、エファビレンツEFV、インジナビルIDV、およびリトナビルRTVからなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。請求項12に記載のナノ粒子において、前記治療剤が、EFV、IDV、およびRTVからなる群から選択されることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が荷電性であることを特徴とするナノ粒子。請求項14に記載のナノ粒子において、前記界面活性剤が負に荷電していることを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が少なくとも約95治療剤を含むことを特徴とするナノ粒子。請求項16に記載のナノ粒子において、前記ナノ粒子が少なくとも約99治療剤を含むことを特徴とするナノ粒子。請求項1に記載の少なくとも1つのナノ粒子および少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物。必要のある被験体において、HIV感染を治療または抑制する方法であって、前記方法が、前記治療剤が抗HIV化合物である、請求項18に記載の少なくとも1つの組成物を前記被験体に投与することを含む方法。請求項19に記載の方法において、少なくとも1つの追加の抗HIV化合物の投与をさらに含むことを特徴とする方法。請求項19に記載の方法において、前記ターゲティングリガンドがマクロファージターゲティングリガンドであることを特徴とする方法。請求項21に記載の方法において、前記マクロファージターゲティングリガンドが葉酸であることを特徴とする方法。請求項19に記載の方法において、前記ナノ粒子が約10mg/kg以下で投与されることを特徴とする方法。ヒト免疫不全ウイルス1型HIV-1感染に対する長期間抗レトロウイルス剤療法ARTは、代謝および細胞毒性の異常を誘導する一方、薬物動態および体内分布に制限を示す。また、ARTは複雑な投与スケジュールを通常必要とし、耐性ウイルスの出現および治療不成功をもたらす。本発明のナノ製剤化されたART組成物は、そのような制限を排除して、臨床成績の改善に影響を与える。本明細書では、クラスリン依存エンドシトーシスに続いて、ナノ粒子NPが初期エンドソームから再循環エンドソームへの経路に選別されて、リソソーム分解を回避することを実証した。粒子はインタクトのまま放出され、完全な抗レトロウイルス効果を保持した。これらの結果は、粒子の完全性および抗レトロウイルス活性の両方を維持する、抗レトロウイルスナノ製剤の細胞内輸送の可能な経路を提供し、ターゲティング薬物送達に対してこの手法が高い有用性を有することを実証する。実際に、NPの細胞内存在場所およびNPの除放性は、長期間抗レトロウイルス効果の基礎となる。さらに、データは、マクロファージなどの細胞が薬物トランスポーターとして機能し、かつ重要なことには、輸送において薬物積載粒子を分解も修飾もしないことを実証する。そのため、生物学的に活性な薬物は、それが目的とする標的部位に変化せずに送達される。本発明は、細胞に化合物を送達するためのナノ粒子を包含する。特定の実施形態では、ナノ粒子は被験体に抗レトロウイルス剤療法を送達するためのものである。本発明のナノ粒子は、少なくとも1つの目的化合物および少なくとも1つの界面活性剤を含む。ナノ粒子のこれらの成分は、他の任意選択の成分と共に、以下に記載される。I.治療剤本発明のナノ粒子は、細胞または被験体非ヒト動物を含むに、任意の薬剤または化合物、特に生物活性剤例えば治療剤または診断薬を送達するために使用することができる。本明細書で使用する用語生物活性剤には、薬物または植物保護剤の開発における潜在的なリードとしてスクリーニングされる化合物も含まれる。生物活性剤および治療剤としては、限定はされないが、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、核酸、合成薬および天然薬、ペプトイド、ポリエン、マクロサイルmacrocyles、グリコシド、テルペン、テルペノイド、脂肪族化合物および芳香族化合物、小分子、ならびにそれらの誘導体および塩が挙げられる。特定の実施形態では、治療剤は、合成薬および天然薬などの化学物質である。本発明の組成物および方法により、任意のタイプの化合物を細胞または被験体に送達することができるが、本発明の以下の説明は化合物を治療剤として例示する。本発明のナノ粒子は少なくとも1つの治療剤を含む。ナノ粒子は、一般に、治療剤の結晶性結晶特性がある固体ナノ粒子であり、典型的には、約99純度の治療剤を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、界面活性剤下記に記載溶液に、治療剤、特に治療剤の遊離塩基形態を加え、次いで、湿式粉砕または高圧ホモジナイゼーションによりナノ粒子を生成することにより合成される。治療剤および界面活性剤の溶液を撹拌した後、湿式粉砕または高圧ホモジナイゼーションを行ってもよい。特定の実施形態では、得られるナノ粒子は直径が最大1μmである。特定の実施形態では、ナノ粒子の直径は、約200nm~約500nmであり、具体的には約250~350nmである。特定の実施形態では、ナノ粒子は、不規則形状でも円形状でもなく、棒状、具体的には細長い棒状である。本発明のナノ粒子は、中性であっても荷電していてもよい。ナノ粒子は、正に荷電しても負に荷電してもよい。治療剤は、疎水性であっても、水不溶性化合物であっても、または水難溶性化合物であってもよい。例えば、治療剤は、pH範囲0~14、具体的にはpH4と10の間で、具体的には20°Cにて、約10mg/ml未満、1mg/ml未満、より具体的には約100μg/ml未満、およびより具体的には約25μg/ml未満の水溶性または水溶媒溶解性であってよい。特定の実施形態では、本発明のナノ粒子の治療剤は抗菌剤である。別の実施形態では、治療剤は抗ウイルス剤、より具体的には抗レトロウイルス剤である。抗レトロウイルス剤は、レンチウイルスに有効または特異的でありうる。レンチウイルスとしては、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルスHIV例えば、HIV-1、HIV-2、ウシ免疫不全ウイルスBIV、ネコ免疫不全ウイルスFIV、サル免疫不全ウイルスSIV、およびウマ伝染性貧血ウイルスEIAが挙げられる。特定の実施形態では、治療剤は抗HIV剤である。抗HIV化合物または抗HIV剤はHIVを阻害する化合物である。抗HIV剤の例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる。Iヌクレオシドアナログ系逆転写酵素阻害剤NRTI。NRTIは、HIV-1逆転写酵素の活性を阻害するヌクレオシドおよびヌクレオチドならびにそれらのアナログを指す。ヌクレオシドアナログ系逆転写酵素阻害剤の例としては、限定はされないが、アデフォビルピボキシルが挙げられる。II非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤NNRTI。NNRTIは、HIV逆転写酵素上の非基質結合部位に可逆的に結合し、それによって活性部位の形状を変化させるかまたはポリメラーゼ活性を阻止するアロステリック阻害剤である。NNRTIの例としては、限定はされないが、デラビルジンBHAP、U-90152;RESCRIPTOR登録商標、エファビレンツDMP-266、SUSTIVA登録商標、ネビラピンVIRAMUNE登録商標、PNU-142721、カプラビリンS-1153、AG-1549、エミビリン、-カラノリドANSC-675451およびB、エトラビリンTMC-125、リルピビリンTC278、Edurant商標、DAPYTMC120、BILR-355BS、PHI-236、およびPHI-443TMC-278が挙げられる。IIIプロテアーゼ阻害剤PI。プロテアーゼ阻害剤は、HIV-1プロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例としては、限定はされないが、ダルナビル、アンプレナビル141W94、AGENERASE登録商標、チプラニビルPNU-140690、APTIVUS登録商標、インジナビルMK-639;CRIXIVAN登録商標、サキナビルINVIRASE登録商標、FORTOVASE登録商標、ホスアンプレナビルLEXIVA登録商標、ロピナビルABT-378、リトナビルABT-538、NORVIR登録商標、アタザナビルREYATAZ登録商標、ネルフィナビルAG-1343、VIRACEPT登録商標、ラシナビルBMS-234475/CGP-61755、BMS-2322623、GW-640385XVX-385、AG-001859、およびSM-309515が挙げられる。IV融合阻害剤FI。融合阻害剤は、HIVエンベロープタンパク質に結合してウイルスが宿主細胞と融合するのに必要な構造変化を阻止することにより作用する、ペプチドなどの化合物である。融合阻害剤の例としては、限定はされないが、マラビロクSelzentry登録商標、Celsentri、エンフビルチドINN、FUZEON登録商標、T-20DP-178、FUZEON登録商標、およびT-1249が挙げられる。Vインテグラーゼ阻害剤。インテグラーゼ阻害剤は、宿主細胞のDNAにウイルスゲノムを挿入するウイルスの酵素であるインテグラーゼの作用を阻止するように設計された抗レトロウイルス薬のクラスである。融合阻害剤の例としては、限定はされないが、ラルテグラビル、エルビテグラビル、およびMK-2048が挙げられる。抗HIV化合物にはさらに、限定はされないが、ALVAC商標登録HIVvCP1521、AIDSVAX登録商標B/Egpl20、およびそれらの組合せなどのHIVワクチンが含まれる。抗HIV化合物にはさらに、HIV抗体例えば、gpl20またはgp41に対する抗体、具体的には広範な中和抗体が含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗HIV剤は、プロテアーゼ阻害剤であるNNRTIまたはNRTIである。特定の実施形態では、抗HIV剤は、インジナビル、リトナビル、アタザナビル、およびエファビレンツからなる群から選択される。具体的には、異なる作用機序を有する場合には、2種類以上の抗HIV剤を使用してもよい。特定の実施形態では、抗HIV療法は、高活性抗レトロウイルス剤療法HAARTである。II.界面活性剤上述したように、本発明のナノ粒子は少なくとも1つの界面活性剤を含む。界面活性剤は、湿潤剤、洗浄剤、分散剤、または乳化剤と通常呼ばれる物質を含む界面活性剤を指す。界面活性剤は通常両親媒性の有機化合物である。特定の実施形態では、界面活性物質は両親媒性ブロックコポリマーである。特定の実施形態では、ナノ粒子の少なくとも1つの界面活性剤は、両親媒性ブロックコポリマー、具体的には、ポリオキシプロピレンの少なくとも1つのブロックおよびポリオキシエチレンの少なくとも1つのブロックを含むコポリマーである。本発明の特定の実施形態では、界面活性剤は、ナノ粒子を合成するために上記に記載のように、ナノ粒子および/または界面活性剤の溶液中に約0.0001~約5の範囲の濃度で存在する。特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は、約0.1~約2の範囲にある。本発明の界面活性剤は、荷電していても中性であってもよい。特定の実施形態では、界面活性剤は、正または負に荷電しており、具体的には負に荷電している。特定の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレンの少なくとも1つのブロックおよびポリオキシプロピレンの少なくとも1つのブロックを含むコポリマーである。両親媒性ブロックコポリマーは、以下の式で示すブロックコポリマーにより例示される。式中、x、y、z、i、およびjは、約2~約800、具体的には約5~約200、より具体的には約5~約80の値を示し、式IVおよびVで示される各R1、R2ペアについては、一方は水素であり、他方はメチル基である。当業者は、x、y、およびzの値は、統計的平均を通常示し、xおよびzの値は、必ずではないが、同じであることが多いことを認識している。式I~IIIついては、実際は、Bブロック内のイソプロピレン基の配向がランダムになるという点で簡素化され過ぎている。このランダム配向は、式IVおよびVでは示されており、これらの式はより完全である。このようなポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン化合物は、SantonAm.PerfumerCosmet.1958724:54-58;SchmolkaLoc.cit.1967827:25-30、Schick,ed.Non-ionicSuifactants,Dekker,N.Y.,1967pp.300-371により記載されている。このような化合物のいくつかは、リポロキサマーlipoloxamers、Pluronics登録商標、ポロキサマー、およびシンペロニクスsynperonicsなどの総称商品名で市販されている。Pluronics登録商標に典型的なA-B-A式とは対照的なB-A-B式内のPluronic登録商標コポリマーは、多くの場合、逆のPluronics登録商標、Pluronic登録商標Rまたはメロキサポールmeroxapolと呼ばれる。一般に、ブロックコポリマーは、親水性のAと疎水性のBのブロックセグメントを有するものとして記載することができる。したがって、例えば、式A-B-Aのコポリマーは、別の親水性ブロックに結合した疎水性ブロックに結合した親水性ブロックからなるトリブロックコポリマーである。式IVのポリオキサミンpolyoxamineポリマーは、商品名Tetronic登録商標でBASFから入手可能である。式IVで表わされるポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックの順序を逆転して、TetronicR登録商標を創製することが可能であり、これは、BASFからも入手可能であるSchmolka,J.Am.Oil.Soc.197959:110を参照のこと。ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーはまた、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの反復単位のランダムな混合物を含む親水性ブロックを有するように設計することができる。ブロックの親水性を維持するために、エチレンオキシドを優勢にすることができる。同様に、疎水性ブロックは、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの反復単位の混合物であってもよい。このようなブロックコポリマーは、商品名Pluradot商標でBASFから入手可能である。第1セグメントを構成するポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック単位は、エチレンオキシドのみからなる必要はない。また、B-タイプセグメントがすべて、プロピレンオキシド単位のみからなる必要もない。代わりに、最も簡単な場合には、例えば、セグメントAにおけるモノマーの少なくとも1つを側鎖基で置換してもよい。いくつかのポロキサマーコポリマーは、下記の式を満たすように設計される。ポロキサマーの例としては、限定はされないが、Pluronic登録商標L31、L35、F38、L42、L43、L44、L61、L62、L63、L64、P65、F68、L72、P75、F77、L81、P84、P85、F87、F88、L92、F98、L101、P103、P104、P105、F108、L121、L122、L123、F127、10R5、10R8、12R3、17R1、17R2、17R4、17R8、22R4、25R1、25R2、25R4、25R5、25R8、31R1、31R2、および31R4が挙げられる。Pluronic登録商標ブロックコポリマーは、接頭文字に2桁または3桁の数字を続けて名付けられる。接頭文字L、P、またはFは、各ポリマーの物理的形態液体、ペースト、またはフレーク化可能な固体を指す。数字コードは、ブロックコポリマーの構造パラメーターを定義する。このコードの最後の桁は、EOブロックの重量含量を10重量パーセント単位で近似する例えば、その桁が8であれば80重量、その桁が1であれば10重量である。残りの上1桁または上2桁は、中心POブロックの分子量をコードする。コードを判読する場合は、対応する数字に300を乗じて、ダルトンDa単位でのおよその分子量を得るべきである。したがって、Pluronic命名法では、参考文献がない場合に、ブロックコポリマーの特性を評価するための便利なアプローチが得られる。例えば、コードF127は、固体で、3600Da12×300のPOブロックと70重量のEOとを有するブロック共重合体を定義する。各Pluronic登録商標ブロックコポリマーの正確な分子特性は製造業者から得ることができる。他の生体適合性両親媒性コポリマーには、GaucherらJ.ControlRel.2005109:169-188に記載のものが含まれる。他のポリマーの例としては、限定はされないが、ポリ2-オキサゾリン両親媒性ブロックコポリマー、ポリエチレングリコール-ポリ乳酸PEG-PLA、PEG-PLA-PEG、ポリエチレングリコールポリラクチド-co-グリコリドPEG-PLG、ポリエチレングリコール-ポリ乳酸-co-グリコール酸PEG-PLGA、ポリエチレングリコール-ポリカプロラクトンPEG-PCL、ポリエチレングリコール-ポリアスパルタートPEG-PAsp、ポリエチレングリコール-ポリグルタミン酸PEG-PGlu、ポリエチレングリコール-ポリアクリル酸PEG-PAA、ポリエチレングリコール-ポリメタクリル酸PEG-PMA、ポリエチレングリコール-ポリエチレンイミンPEG-PEI、ポリエチレングリコール-ポリL-リジンPEG-PLys、ポリエチレングリコール-ポリ2-Ν,Ν-ジメチルアミノメタクリル酸エチルPEG-PDMAEMA、およびポリエチレングリコール-キトサン誘導体が挙げられる。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー188、ポロキサマー407、ポリビニルアルコールPVA、1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン-メチル-ポリエチレングリコールコンジュゲート-2000mPEG2000DSPE、ドデシル硫酸ナトリウムSDS、および1,2-ジオレオイロキシ-3-トリメチルアンモニウムプロパンDOTAPからなる群から選択される少なくとも1つを含む。本発明の界面活性剤は、ターゲティングリガンドに連結されてもよい。ターゲティングリガンドは、特定の組織型または細胞型に特異的に結合する化合物である。特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは細胞表面マーカー/受容体に対するリガンドである。ターゲティングリガンドは、標的となる組織または細胞型に優先的または独占的に発現する細胞表面マーカー例えば、タンパク質または炭水化物に免疫学的に特異的な抗体またはその断片であってもよい。ターゲティングリガンドは、界面活性剤に直接連結されてもリンカーを介して連結されてもよい。一般に、リンカーは、界面活性剤に共有結合でリガンドを結合させる、共有結合を含む化学成分または一続きの原子である。リンカーは、リガンドおよび界面活性剤の合成的に可能な任意の位置に連結することができる。代表的なリンカーは、場合によっては置換された;飽和もしくは不飽和の;直鎖、分枝、もしくは環状アルキル基、または場合によっては置換されたアリール基を少なくとも1つ含むことができる。リンカーはまた、ポリペプチド例えば、約1~約10、具体的には約1~約5のアミノ酸であってもよい。リンカーは非分解性であってもよく、かつ生理的環境または条件下で実質的に切断されないか全く切断されない共有結合または任意の他の化学構造であってもよい。特定の実施形態では、ターゲティングリガンドは、マクロファージターゲティングリガンドである。マクロファージターゲティングリガンドとしては、限定はされないが、葉酸受容体リガンド例えば、葉酸folate葉酸folicacidならびに葉酸受容体抗体およびその断片例えば、Sudimacketal.2000Adv.DrugDel.Rev.,41:147-162を参照のこと、マンノース受容体リガンド例えば、マンノース、およびホルミルペプチド受容体FPRリガンド例えば、N-ホルミル-Met-Leu-PhefMLFが挙げられる。以下に実証されるように、マクロファージへのナノ粒子のターゲティングは、遊離薬物または非ターゲティングナノ粒子と比較して、中枢神経系ターゲティング例えば、脳ターゲティング、より優れた肝臓ターゲティング、排出率低下、毒性低下、半減期の延長を提供する。III.投与本発明は、本発明の少なくとも1つのナノ粒子時として本明細書ではナノARTとして言及されるおよび少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を包含する。上述のように、ナノ粒子は2つ以上の治療剤を含んでもよい。特定の実施形態では、組成物は、第1の治療剤を含む第1のナノ粒子と第2の治療剤を含む第2のナノ粒子とを含み、ここで、第1の治療剤と第2の治療剤は異なる。本発明の組成物は、他の治療剤例えば、他の抗HIV化合物をさらに含んでもよい。本発明はまた、微生物感染例えば、ウイルスまたは細菌、具体的にはレトロウイルスまたはレンチウイルスの感染、具体的にはHIV感染例えばHIV-1を予防、抑制、および/または治療するための方法を包含する。本発明の医薬組成物は、HIV感染を治療/阻止するために、動物、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトに投与することができる。本発明の医薬組成物はまた、少なくとも1つの他の抗微生物剤、具体的には少なくとも1つの他の抗HIV化合物/剤を含んでもよい。追加の抗HIV化合物はまた、本発明の抗HIVNPとは別の組成物で投与してもよい。これらの組成物は、同時に投与しても別に例えば、連続して投与してもよい。本発明の組成物の投与における投薬量範囲は、所望の作用例えば、HIV感染、その症状例えば、AIDS、ARC、またはそれに対する素因の治癒、緩和、治療、および/または予防をもたらすのに十分な範囲である。特定の実施形態では、本発明の組成物は、より低用量、例えば、約50mg/kg以下、約25mg/kg以下、または約10mg/kg以下で投与される。投薬量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど高くすべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、症状、性別、疾患の程度に応じて異なり、当業者によって決定されうる。投薬量は、何らかの禁忌counterindicationがある事象では、個々の医師によって調整されうる。本明細書に記載のナノ粒子は、一般に、医薬調製物として患者に投与することになる。本明細書で使用する用語患者は、ヒトまたは動物の被験体を指す。これらのナノ粒子は、医師の指導の下で治療上使用されうる。治療剤が本明細書で例示されるが、任意の生物活性剤、例えば診断薬またはイメージング剤を患者に投与することができる。本発明のナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容可能な任意の担体と共に、投与のために好都合に製剤化することができる。例えば、複合体は、水、緩衝食塩水、エタノール、ポリオール例えば、グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等、ジメチルスルホキシドDMSO、オイル、洗浄剤、懸濁化剤、またはそれらの適切な混合物などの許容される媒体と共に製剤化することができる。選ばれた媒体中のナノ粒子の濃度を変えることは可能であり、媒体は、医薬調製物の所望の投与ルートに基づいて選ぶことができる。いかなる従来の媒体または薬剤でも、投与されるナノ粒子と適合しない場合を除いて、医薬調製物中でそれを使用することが考えられる。特定の患者への投与に適した、本発明によるナノ粒子の用量および投与計画は、患者の年齢、性別、体重、全身健康状態、およびナノ粒子の投与目的である特定の症状およびその重症度を考慮して、医師により決定することができる。医師はまた、投与ルート、医薬担体、およびナノ粒子の生物活性を考慮に入れることができる。適切な医薬調製物の選択は、選ばれた投与方法にも依存することになる。例えば、本発明のナノ粒子は、直接注射または静脈内に投与することができる。この実例では、医薬調製物は、注射部位と適合する媒体中に分散したナノ粒子を含む。本発明のナノ粒子は任意の方法で投与することができる。例えば、本発明のナノ粒子は、限定はされないが、非経口的に、皮下に、経口的に、局所的に、肺に、直腸に、経膣的に、静脈内に、腹腔内に、髄腔内に、脳内に、硬膜外に、筋肉内に、皮内に、または頸動脈内に投与することができる。特定の実施形態では、ナノ粒子は静脈内にまたは腹腔内に投与される。注射用の医薬調製物は当技術分野で知られている。ナノ粒子を投与する方法として注射が選択された場合には、十分な量の分子または細胞がその標的細胞に到達して生物学的作用を発揮することを確認する工程を取らなければならない。経口投与のための投与剤形としては、限定はされないが、錠剤例えば、コーティングおよび非コーティング、噛み砕き可能、ゼラチンカプセル剤例えば、軟質または硬質、ロゼンジ剤、トローチ剤、溶液、乳剤、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、粉末/果粒例えば、再構成可能または分散性、ガム、および発泡錠が挙げられる。非経口投与のための投与剤形としては、限定はされないが、溶液、乳剤、懸濁液、分散液、および再構成用粉末/果粒が挙げられる。局所投与のための投与剤形としては、限定はされないが、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、塗布剤、パッチ、および経皮送達システムが挙げられる。薬学的に許容可能な担体との親和的な混合物中の有効成分として本発明のナノ粒子を含有する医薬組成物を、従来の医薬配合技術に従って調製することができる。担体は、投与、例えば静脈内、経口、直接注射、頭蓋内、硝子体内投与のために望ましい調製形態に応じて多種多様な形態を取ることができる。本発明の医薬調製物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬量単位形態で製剤化することができる。本明細書で使用する場合、投薬量単位形態は、治療を受けている患者に適した医薬調製物の物理的に別々の単位を指す。各投薬量は、選択された医薬担体と共同して所望の作用をもたらすように計算された有効成分量を含有すべきである。適切な投薬量単位を決定するための手順は、当業者には周知である。投薬量単位は患者の体重に基づいて、比例的に増加または減少させることができる。当技術分野で知られているように、特定の病的症状の緩和にとって適切な濃度を、投薬量濃度曲線を計算することにより決定することができる。本発明に従って、ナノ粒子の投与に適切な投薬量単位を、動物モデルにおける分子または細胞の毒性評価により決定することができる。医薬調製物中の種々の濃度のナノ粒子をマウスに投与することができ、その処置の結果として観察された有益な結果および副作用に基づいて、最小および最大の投薬量を決定することができる。適切な投薬量単位はまた、他の標準薬と組み合わせたナノ粒子治療の効果を評価することにより決定することができる。ナノ粒子の投薬量単位は、検出された効果に従って、個別にまたは各治療と組み合わせて決定することができる。ナノ粒子を含む医薬調製物は、病的症状が減少または緩和するまで、適切な間隔、例えば少なくとも1日2回以上で投与することができ、その後投与量を維持レベルに減少させることができる。特定の症例における適切な間隔は、患者の容態に通常依存することになる。本発明は、疾患/障害を治療する方法であって、本発明のナノ粒子および具体的には少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を包含する。本発明はまた、生体外療法を介して被験体を治療する方法を包含する。具体的には、本方法は、被験体から細胞を取り出こと、その細胞を本発明のナノ粒子にインビトロで曝露/接触させること、およびその細胞を被験体に戻すことを含む。特定の実施形態では、細胞はマクロファージを含む。疾患または障害を治療する他の方法を、本発明の方法と組み合わせることができ、本発明の組成物と同時投与することができる。本発明はまた、本発明のナノ粒子を細胞にインビトロで例えば培養で送達することを含む。ナノ粒子は少なくとも1つの担体で細胞に送達してもよい。IV.定義薬学的に許容可能なは、動物およびより具体的にはヒトにおける使用に対して、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されたもの、または米国薬局方もしくは他の一般に認められ薬局方に収載されたものを指す。担体は、例えば、本発明の活性薬剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、防腐剤例えば、チメロゾールThimersol、ベンジルアルコール、抗酸化剤例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、可溶化剤例えば、Tween80、ポリソルベート80、乳化剤、緩衝液例えば、TrisHCl、酢酸塩、リン酸塩、抗菌剤、増量剤例えば、ラクトース、マンニトール、賦形剤、補助剤、またはビヒクルを指す。薬学的に許容可能な担体は、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水およびオイルなどの無菌液体であってもよい。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセリンの水溶液は、具体的には注射液用担体として使用することができる。適切な医薬担体は、Remington’sPharmaceuticalSciencesbyE.W.MartinMackPublishingCo.,Easton,PA;Gennaro,A.R.,Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Lippincott,WilliamsandWilkins;Liberman,etal.,Eds.,PharmaceuticalDosageForms,MarcelDecker,NewYork,N.Y.;およびKibbe,etal.,Eds.,HandbookofPharmaceuticalExcipients,AmericanPharmaceuticalAssociation,Washingtonに記載されている。本明細書で使用する用語治療するは、患者症状例えば、1つまたは複数の徴候の改善、症状進行の遅延を含む、疾患に苦しむ患者に利益をもたらす任意のタイプの治療を指す。特定の実施形態では、レトロウイルス感染の治療は、少なくとも感染細胞数の抑制/減少をもたらす。化合物または医薬組成物の治療有効量は、特定の障害または疾患の徴候を予防、抑制、治療、または低減するのに有効な量を指す。本明細書における微生物感染例えば、HIV感染の治療は、微生物感染、その徴候、またはそれに対する素因を治癒、緩和、および/または予防することを指すことができる。本明細書で使用する用語治療剤は、症状、疾患、または障害を治療するかまたは症状、疾患または障害の徴候を低減するために使用することができる、限定はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、および抗体を含む化学物質または生体分子を指す。本明細書で使用する用語小分子は、比較的低分子量例えば、4,000未満、2,000未満、具体的には1kDa未満または800Da未満の物質または化合物を指す。典型的には、小分子は有機物であり、アミノ酸またはジペプチドである可能性はあるが、タンパク質でも、ポリペプチドでも、核酸でもない。本明細書で使用する用語抗菌剤は、細菌、真菌類、ウイルス、または原生動物などの微生物の成長を阻止または阻害する物質を示す。本明細書で使用する用語抗ウイルス剤は、ウイルスを破壊するかまたはウイルスの複製再生産を抑制する物質を指す。本明細書で使用する用語高活性抗レトロウイルス剤療法HAARTは、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、HIVプロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤などの療法を種々組み合わせたHIV療法を指す。本明細書で使用する用語両親媒性は、水および脂質/無極性環境の両方に溶解する能力を意味する。典型的には、両親媒性化合物は親水性部分と疎水性部分とを含む。疎水性は、無極性環境に対する選好を示す例えば、疎水性物質または部分は、水よりも炭化水素などの無極性溶媒に容易に溶解または湿潤する。本明細書で使用する用語親水性は、水に溶解する能力を意味する。本明細書で使用する用語ポリマーは、2つ以上の反復単位またはモノマーの化学的結合から形成される分子を示す。用語ブロックコポリマーは、最も単純には、各ポリマーセグメントが同種の2つ以上の隣接した単位を含む、少なくとも2つの異なるポリマーセグメントのコンジュゲートを指す。抗体または抗体分子は、特異抗原に結合する抗体およびその断片例えば、scFvを含む、任意の免疫グロブリンである。本明細書で使用する場合、抗体または抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の融合物を想定する。本明細書で使用する用語免疫学的に特異的なは、目的のタンパク質または化合物の1つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識および結合しないタンパク質/ポリペプチド、具体的には抗体を指す。以下の実施例は、本発明の実行方法を例示的に提供するもので、本発明の範囲を限定する意図はまったくない。実施例1組織の聖域、具体的には中枢神経系CNSのウイルス複製を減弱させる必要性が大いにあるRaoetal.2009ExpertOpin.DrugDeliv.,6:771-784;Varatharajanetal.2009Antivir.Res.,82:A99-A109。そのような目標を達成する1つの方法は、ナノ製剤化薬物送達手法の適用によってであるMallipeddietal.2010Int.J.Nanomed.,5:533-547;Wongetal.2010Adv.DrugDeliv.Rev.,62:503-517;Nowaceketal.2009Nanomed.,4:557-574;dasNevesetal.2010Adv.DrugDeliv.Rev.,62:458-477。実際、ナノ製剤化化合物は、二次的な細胞および組織の毒性を同時に低減しながら、抗レトロウイルス剤療法ARTの薬物動態および薬力学に良好な影響を与えるChirenjeetal.2010ExpertRev.Anti-Infect.Ther.,8:1177-1186;Destacheetal.2009BMCInfect.Dis.,9:198;Douetal.2006Blood108:2827-2835;Douetal.2009J.Immunol.,183:661-669;Mahajanetal.2010Curr.HIVRes.,8:396-404;Parikhetal.2009J.Virol.,83:10358-10365;Yangetal.2010Bioorg.Med.Chem.,18:117-123。さらに、ナノ製剤化薬物の細胞仲介輸送により、罹病器官、具体的には中枢神経系への薬物の送達が改善される見込みがあることが示されたDouetal.2009J.Immunol.,183:661-669。このシステムは、血液由来マクロファージがナノ製剤化物質を取り込み、細胞内コンパートメント内にそれらを貯蔵し、血管壁を横切って活動性疾患部位に薬物を送達する能力に基づいている。食作用、排除、抗原提示、および分泌機能に加えて、マクロファージは、ウイルスの潜伏場所、ウイルス輸送の担体、および進行中のHIV-1複製のリザーバーとしても機能するBenarochetal.2010Retrovirology7:29;Kurodaetal.2010J.Leukoc.Biol.,87:569-573;LeDouceetal.2010Retrovirology7:32;Persidskyetal.2003J.Leukoc.Biol.,74:691-701。薬物送達システムでは、HIV-1感染に対する抗レトロウイルス剤療法ART送達のために単球マクロファージを利用することができるDouetal.2009J.Immunol.,183:661-669;Douetal.2007Virology358:148-158;Nowaceketal.2010J.NeuroimmunePharmacol.,5:592-601;Nowaceketal.2009Nanomedicine4:903-917。ここで、ナノ製剤化薬物は、抗レトロウイルス薬結晶から構成され、インジナビルIDV、リトナビルRTV、アタザナビルATV、およびエファビレンツEFVを含む。個々の親薬物について、大型結晶を界面活性剤の存在下で湿式粉砕によりナノ粒子NPに細分化することができる。これらのミクロからナノ製剤化抗レトロウイルス薬は、ナノARTと呼ばれる。次いで、マクロファージを使用してナノARTを取り込み、長期間にわたりそれらを徐々に放出することができる。ナノ製剤化薬物の構造および組成は、安定性、細胞間相互作用、効果、および細胞毒性に重要な影響を及ぼすCaldorera-Mooreetal.2010ExpertOpin.DrugDeliv.,7:479-495;Doshietal.2010J.R.Soc.Interface7:S403-S410;Huangetal.2010Biomaterials31:438-448;Zolniketal.2010Endocrinology151:458-465。本明細書では、治療効果を目的とした、ナノARTの細胞ベースの送達のための単球由来マクロファージMDMプラットフォームの最適化を、製造、特性評価、および薬力学を改善することにより実施する。水難溶性薬物の結晶性ナノ粒子を製造するために以前使用されていたので、湿式粉砕を開発に使用した。これにより臨床的使用のためにスケールアップが可能になるTanakaetal.2009Chem.Pharm.Bull.Tokyo57:1050-1057;Huetal.2004DrugDev.Ind.Pharm.,30:233-245。材料および方法ナノARTの調製および特性評価リトナビルRTVShengdaPharmaceuticalCo.,Zhejiang,ChinaおよびエファビレンツEFVHeteroLabsLTD.,Hyderabad,Indiaは、遊離塩基形態で入手した。インジナビルIDV硫酸塩LongshemCo.,Shanghai,ChinaおよびアタザナビルATV硫酸塩GymaLaboratoriesofAmericaInc.,Westbury,NYの遊離塩基を、1NNaOH溶液を使用して作製した。本研究で使用した界面活性剤は以下のとおり:ポロキサマー-188P188;Sigma-Aldrich,SaintLouis,MOおよびポリビニルアルコールPVASigma-Aldrich,SaintLouis,MO、1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミン-メチル-ポリエチレングリコールコンジュゲート-2000mPEG2000DSPEGenzymePharmaceuticalsLLC,Cambridge,MA、ドデシル硫酸ナトリウムSDSBio-RadLaboratories,Hercules,CAおよび1,2-ジオレオイロキシ-3-トリメチルアンモニウムプロパンDOTAPAvantiPolarLipidsInc.,Alabaster,AL。各ナノ懸濁液の調製においては、界面活性剤を、以下の5つの組合せ重量/体積で10mMHEPES緩衝液pH7.8に懸濁した:10.5P188単独;20.5PVAおよび0.5SDS;30.5P188および0.5SDS;40.3P188および0.1mPEG2000DSPE;ならびに50.5P188、0.2mPEG2000DSPE、および0.1DOTAP。次いで、遊離塩基薬物ATV、EFV、IDV、またはRTV;0.6重量を、界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、均一分散になるまで、Ultra-turrax登録商標T-18ローター-ステータミキサーを使用して撹拌した。次いで、この混合物を、0.8mm粉砕媒体ジルコニウムセラミックビーズ50mLと共に、NETZSCHMicroSeriesWetMillNETZSCHPremierTechnologies,LLC,Exton,PAに移した。この試料を、所望の粒子サイズになるまで、600~4320rpmの範囲の速度で30分~1時間処理した。粒子サイズ、多分散性、および表面電荷については、ナノ懸濁液20μlを蒸留/脱イオン水で50倍に希釈し、MalvernZetasizerNanoSeriesNano-ZSMalvernInstrumentsInc.,Westborough,MAを使用して、動的光散乱により分析した。所望のサイズを得た後、試料を遠心分離し、得られたペレットを、浸透圧を調整するための9.25ショ糖と共にそれぞれの界面活性剤溶液に再懸濁した。最終薬物濃度は、高速液体クロマトグラフィーHPLCを使用して決定した。ヒト単球の単離および培養HIV-1および肝炎血清反応陰性ドナーから白血球除去により得られたヒト単球を、向流遠心分離により精製した。単球を、10熱失活プールヒト血清、1グルタミン、50μg/mlゲンタマイシン、10μg/mlシプロフロキサシン、および1000U/ml組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子と共に、1×106細胞/mlの濃度で37°C、DMEM中で培養したGendelmanetal.1988J.Exp.Med.,167:1428-1441。電子顕微鏡法細胞試料を、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中の3グルタルアルデヒドで固定し、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中の1四酸化オスミウムでさらに1時間固定した。次いで、試料を漸加的エタノール系列で脱水し、走査型電子顕微鏡用にEpon812ElectronMicroscopicSciences,FortWashington,PAに包埋した。透過型電子顕微鏡の場合は、薄片80nmを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、日立H7500-I透過型電子顕微鏡HitachiHighTechnologiesAmericaInc.,Schaumburg,IL下で観察した。ナノARTの取り込みおよび放出以前に公表された方法の修正版を使用して、ナノARTの取り込みおよび放出を研究したNowaceketal.2009Nanomedicine4:903-917。7日間の分化の後に、MDMを100μΜナノARTで処理した。ナノARTの取り込みは、8時間培地交換せずに評価した。付着したMDMをリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、掻き取ってPBS中に集めた。細胞を4°Cで10分間、950×gで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール200μl中で短時間超音波処理し、4°Cで10分間、20,000×gで遠心分離した。このメタノール抽出物を-80°Cで保存した。ナノARTの細胞保持および放出を研究するために、MDMを100μΜナノARTに8時間曝露し、PBSで3回洗浄し、新たなナノART不含培地を加えた。培地の半分を一日おきに交換しながら15日間MDMを培養した。ナノART処理後1、5、10、および15日目に、細胞取り込みのために、記載のようにMDMを収集した。以前に記載のようにNowaceketal.2010J.NeuroimmunePharmacol.,5:592-601HPLC分析まで、細胞抽出物および培地の両方を-80°Cで保存した。生細胞の顕微鏡検査Vybrant登録商標DiO細胞標識溶液InvitrogenCorp.,Carlsbad,CAを使用してMDMを染色し、緑色蛍光により生存MDMを同定した。NPは、界面活性剤コーティングに蛍光リン脂質を加えることにより、リサミンローダミンB1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩rDHPE;InvitrogenCorp.,Carlsbad,CAで標識した。rDHPE標識NPは赤色蛍光を示した。添加したトレーサの量に基づくと、標識リン脂質分子の数は、総コーティング物質のうちの極めて小さな割合を表し、リン脂質コーティングの厚さへの寄与は最小であった。これは、rDHPEリン脂質の存在下または非存在下で製剤化されたナノARTのサイズには顕著な差がないことがサイズ測定により示されて確認された。蛍光リン脂質と共に製剤化された薬物の取り込みおよび放出は、非標識粒子と比較して差が検出されなかった。掃引フィールド共焦点顕微鏡、488nm緑および568nm赤レーザ励起、および60倍対物レンズを備えたニコンTE2000-UNikonInstrumentsInc.,Melville,NYを使用して、30秒ごとに画像を取り込んだ。ナノARTの抗レトロウイルス活性MDMを100μΜナノARTで8時間処理し、洗浄して過剰な薬物を除去し、ナノART処理後10および15日目に、0.01感染性ウイルス粒子/細胞の感染多重度にてHIV-1ADAで感染させたGendelmanetal.1988J.Exp.Med.,167:1428-1441。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、10日間細胞を培養した。逆転写酵素RT活性Kalteretal.1991J.Immunol.,146:298-306によりアッセイされる子孫ウイルス粒子産生を測定するために10日目に培地試料を収集した。感染細胞によるHIV-1p24抗原の発現についての並行分析を、免疫染色により実施した。逆転写酵素活性培地試料10μlを、100mMTris-HClpH7.9、300mMKCl、10mMDTT、および0.1ノニルフェノキシルポリエトキシエタノール-40NP-40を含有する溶液10μlと混合した。この反応混合物を37°Cで15分間インキュベートした。この時点で、50mMTris-HClpH7.9、150mMKCl、5mMDTT、15mMMgCl2、0.05NP-40、10μg/mlポリA、0.250U/mlオリゴdT12-18、および10μCi/ml3HTTPを含有する溶液25μlを各ウェルに加え、37°Cで18時間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷10トリクロロ酢酸TCA50μlを各ウェルに加え、これらのウェルをグラスファイバーフィルター上に採取し、β-シンチレーション分光法により、フィルターについて3H-TTP取り込みを評価したKalteretal.1991J.Immunol.,146:298-306。免疫組織化学HIV-1感染後10日目に、4リン酸緩衝化パラホルムアルデヒドを用いて室温RTで15分間、細胞を固定した。固定細胞を、10BSAw/1TritonX-100PBS中を用いてRTで30分間ブロックし、HIV-1p24に対するマウスモノクローナル抗体1:100,Dako,Carpinteria,CAと共に3時間インキュベートした。DakoEnVision商標System-HRP標識ポリマー抗マウス二次抗体およびジアミノベンジジン染色を使用して、p24抗体の結合を検出したNowaceketal.2010J.NeuroimmunePharmacol.,5:592-601;Nowaceketal.2009Nanomedicine4:903-917。細胞核はヘマトキシリンで対比染色した。40倍対物レンズを備えたニコンTE300顕微鏡を使用して画像を取得した。細胞毒性細胞生存率に対するナノART処理の影響を判定するために、MDMを100μΜナノARTで8時間処理し、PBSで洗浄し、MTT3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドアッセイを使用して生存率を評価した。細胞生存率に対する影響は、使用した処理濃度ではいずれの製剤でも観察されなかった。ナノARTの効果8時間のMDM薬物取り込み、15日間のMDM薬物放出細胞および培地でのレベル、および15日間の抗レトロウイルス効果HIV感染MDM由来の上清におけるRT活性の曲線下面積AUCを決定した。取り込みおよび放出のスコアリングは、各親薬物/実験パラメーターについて最良のAUCの関数としての各製剤の10進重み付けdecade-weighted比として計算した。抗レトロウイルス活性のスコアリングは、各親薬物のRT活性AUCの逆数の10進重み付け比から決定した。AUCは、時間の関数として各薬物またはRT活性のレベルから決定した。各親薬物の中で、取り込み、細胞保持、または培地への放出に対して最大AUCが得られたナノ製剤を10とスコア化する一方、最小RT活性が得られた製剤を10とスコア化した。各親薬物群の中の残りの製剤は、AUC/AUCbest比に基づいて、10の最高スコアに比例するようにスコア化した。各薬物ナノ製剤の各パラメーターからのスコアは平均して、各製剤に対する平均最終スコアを得た。各親薬物群の上位第2四分位数内の平均最終スコアを有する製剤を試験の継続GOに指定し、一方、下位第2四分位数内の平均を有する製剤の評価を中止したNOGO。結果ナノARTの製造および特性評価21のナノART製剤は、リン脂質界面活性剤で薄層コーティングされた遊離塩基抗レトロウイルス薬のナノサイズ化された薬物結晶からなった。5つの異なる界面活性剤の組合せを、薬物当たり合計5つの製剤のために各薬物について使用した。細胞取り込みおよび放出ならびに抗レトロウイルス効果に対するサイズの効果を決定するために、より大型な粒子の追加のRTV製剤を、界面活性剤P188/mPEG2000DSPEを使用して作製した。すべての製剤を、コーティング、サイズ、電荷、および形状を含むそれらの物理的性質に基づいて特徴づけた。これらの製剤は、同様のサイズからなり、233nmIDV製剤M1005~423nmRTV製剤M2005の範囲にあって、平均サイズが309nmであった表1。粒子サイズ分布は、湿式粉砕方法により製造されたリポソームまたは他のナノ製剤化薬物製剤について知られているものと相違するものではなかったTakatsukaetal.2009Chem.Pharm.Bull.Tokyo57:1061-1067;VanEerdenbrughetal.2007Int.J.Pharm.,338:198-206。各製剤の粒子サイズの均一性を評価するために、各製剤の多分散性を測定した。多分散性指標PDIは、0.180RTV製剤M2004~0.301ATV製剤M3004の範囲にあり、これから、粒子の大部分は計算平均サイズに近いが、各製剤内でサイズに広がりがあることが示された。追加のRTV-Pl88/mPEG2000DSPE製剤M2006は、サイズが540nmあり、M2002265nmのサイズの約2倍であった。各製剤のゼータ電位も測定された。最も負に荷電した製剤は、界面活性剤としてP188およびSDSを含有するものM1004、M2004、M3004、およびM4004であった。DOTAPの追加は、製剤M1003、M2003、M3003、およびM4003に正電荷を付与した。残りの界面活性剤の組合せからは、負電荷の大きさが種々異なる製剤が得られた。粒子形態は薬物に応じて異なっていた;しかし、同じ薬物の製剤はすべて同様の形状であった図1。IDVおよびEFVの粒子は、縁が粗い多角形状であった。ATV製剤は、縁が滑らかな長い細い棒に類似しており、一方RTV製剤は、縁が滑らかな短い太い棒に類似していた。透過型電子顕微鏡により、ナノARTの細胞内取り込みが確認され、ナノARTの完全な構造が細胞内部で保持されることが実証された。ナノARTの取り込み物理的性質を特徴づけた後、これらの製剤についてインビトロPKおよびMDMによる細胞処理を試験した。MDMにおけるナノARTの取り込みでは、完全な取り込みの95超がほとんどのナノARTについて8時間までに起こることが示されたDouetal.2006Blood108:2827-2835;Douetal.2007Virology358:148-158;Nowaceketal.2010J.NeuroimmunePharmacol.,5:592-601;Nowaceketal.2009Nanomedicine4:903-917。したがって、取り込み実験はすべて8時間実施し、その時点で細胞内に含有された薬物量を最大と見なした。IDV製剤すべてについて、取り込み速度は同様であり、最大取り込みの85が4時間までに起こった図2A。8時間での細胞薬物レベルは、M1004およびM1002について、それぞれ10.7~16.7μg/106細胞の範囲であった。RTV製剤すべてについても、取り込み速度は同様であった図2B。4時間までに、最大取り込みの約80が起こった。8時間での細胞内RTVの最大レベルは、M2005およびM2004について、それぞれ18.2~27.0μg/106細胞の範囲であった。IDVおよびRTVとは対照的に、ATV製剤間では取り込み速度が異なっており、4時間での細胞レベルは、最大の65~90の範囲であった図2C。ナノARTの取り込みの最大量は、ATV製剤すべてについて8時間で起こった。ATVの最大細胞レベルは、製剤間で顕著に異なり、M3005およびM3001について、それぞれ8.6~37.1μg/106細胞の範囲であった。EFV製剤すべてについて、取り込み速度は同様であり、大多数の最大取り込みは1時間までに起こった図2D。EFV製剤の最大細胞レベルの範囲は狭く、M4003およびM4005について、それぞれ0.5~1.5μg/106細胞であった。薬物取り込みは、生細胞の共焦点イメージングを使用して、リアルタイムで視覚化した。これらの実験では、緑色で標識したMDMを、赤色で標識したM3001またはM3005で処理し、4時間にわたり30秒ごとに画像を取得した。得られたビデオは、薬物取り込みのHPLC測定を支持する。MDMは、細胞質中の赤色NPの数が示すように、M3005粒子よりもはるかに速い速度でかつ多量にM3001粒子を蓄積した。図3に、8時間インキュベーションにおける、MDM内の薬物濃度についてのAUCを図示する。ナノART製剤すべてについて、AUCμg/106細胞での測定薬物濃度の合計を評価した。これらの値は、図4における、ナノART製剤の取り込みについてのスコアリングに使用した。ナノARTの細胞保持および放出ナノARTを8時間負荷した後、MDMを薬物不含培地でさらに15日間培養して、ナノARTの細胞保持および培地への放出の両方を研究した。15日間にわたり一日おきに培地の半分を交換して、薬物の放出を促進した。IDV製剤すべてについて、細胞保持および細胞放出に関するプロフィールは同様であった図5。負荷後に細胞内に含有されたものの約90が最初の24時間以内に放出された;しかし、IDV製剤すべてについて、薬物レベルは低いものではあったが、15日を通して細胞内に検出可能であった表2。培地内のIDV濃度は、1日目から10日目まで安定して減少し続けた図5。M1001については、低いが検出可能な量の薬物が15日を通して培地中に見出された;しかし、他のIDV製剤すべてについては、IDVは15日目までには培地中に検出できなくなった。RTV製剤すべてについても、細胞保持および細胞放出に関するプロフィールは同様であった図5。IDVとは対照的に、負荷後に細胞内に含有されたRTVの20のみが、最初の24時間以内に放出され、RTV製剤すべてについて、15日目においても依然として細胞内に薬物を検出することができた表2。RTV製剤すべてについて、培地中のRTV濃度は1日目から15日目まで着実に低下し、15日目でも6μg/mlを超えるレベルがあった。IDVおよびRTVの製剤についてのように、ATV製剤すべてについて、細胞保持に関するプロフィールは同様であった図5;しかし、薬物の絶対量は8時間の負荷レベルに応じて異なっていた。負荷後の初期細胞レベルにかかわらず、最初の24時間以内に、ATV約4μg/106細胞がすべての製剤で放出された。しかし、薬物放出のこの初期バーストの後では、細胞は薬物を保持し、少量のみが時間経過と共に放出された。15日目の後でも、M3001およびM3004を負荷された細胞は、初期量の50を超える薬物を保持した表2。ナノART負荷細胞からのATVの放出による培地中の薬物濃度のプロフィールは、すべての製剤について、ほとんど同じであった図5。5日目まで、培地中のATV含量は、M3005以外のすべての製剤について、1.5μg/mlを超えており、15日目を通して0.25~1.1μg/mlの間に留まった。EFV製剤すべてについても、細胞保持および放出の両方に関するプロフィールおよび量は同様であった図5。IDV製剤について観察されたように、時間0で細胞内に存在したEFVの約90が最初の24時間以内に放出された;しかし、15日目においても依然として、EFV製剤すべてについて、細胞内に薬物を検出することができた表2。EFV製剤すべてについて、培地中のEFV濃度は1日目から15日目まで着実に低下し図5、15日目を通して低レベルの薬物が検出可能であった表2。抗レトロウイルス効果HIV複製の阻害におけるナノARTの有効性を判定するために、ART処理後1、5、10、および15日目にMDMをHIV-1ADAに曝露した。HIV暴露後、MDMを引き続き培養し、10日後にRT分析のために培地試料を収集した。IDV製剤はすべて、低いが同様の抗レトロウイルス効果を示した。ウイルス暴露をナノART処理後15日目に行った場合、HIV複製は約20低下した図6。これに対して、EFV製剤はすべて、細胞内に留まった薬物が比較的少量にもかかわらず、ナノART処理後15日目の曝露によるHIV感染をほぼ完全に防止した。RTVおよびATVの製剤では、HIV阻害が幅広く変動することが実証された。15日目のウイルス暴露において、阻害範囲は、RTV製剤それぞれM2002およびM2004について25~60、ATV製剤それぞれM3005およびM3001について20~80であった。興味深いことに、RT活性は、ATVおよびEFVの製剤については、細胞内に保持された薬物量と直接相関し、各薬物群に対する相関係数は0.92であった。HIV-1p24抗原の発現を使用して、RT活性およびHIV増殖を確認した。各種抗レトロウイルス薬について、取り込み、細胞保持、薬物放出、およびRT活性により判定された、最良および最悪性能の製剤を、比較を目的として試験した。これらの製剤は、M1004とM1002IDV、M2004とM2002RTV、M3001と3005ATV、ならびにM4005とM4003EFVであった。ナノARTを負荷したMDMを、ナノART処理後1、5、10、および15日目にHIV-1ADAに曝露し、次いで感染後10日目にp24抗原の存在について試験した。p24抗原発現の実験による評価により、ナノARTすべてについて、時間経過と共にHIV感染が漸増する茶色染色の増加により示されることが実証された。しかし、各薬物の最良性能の製剤、すなわち、M1004、M2004、M3001、およびM4005は、最悪性能の製剤、すなわち、M1002、M2002、M3005、およびM4003よりも高度にp24発現の増加を抑制した図7。特に興味深いことには、EFV製剤はすべて、15日目の暴露によるウイルス感染を抑制した。ナノART製剤すべてについて、p24の発現はRT活性のレベルを反映した。ナノARTのスコアリングシステムナノ製剤すべてについて、MDMへの取り込みおよびMDMからの放出、ならびにHIV-1感染細胞におけるそれらの抗レトロウイルス活性を評価した。各実験パラメーター内でナノ製剤を、各親薬物群の中で最良性能の製剤に基づいてスコア化しランク付けした図4。蓄積スコア合計および平均最終スコアに基づいて、データをランク付けした。Go判定は、上位2中央四分位数内にスコア化された製剤に与えられ、一方NoGo指定は、下位2中央四分位数にスコア化されたものに与えられた。しかし、nogoの指定は、それらの製剤を治療または他の目的に使用することができない、または使用すべきではないことを示すものでは決してなく、この指定は、他の製剤が本アッセイおよび結果に基づいてより好ましいことを単に示しているだけである。IDV製剤のM1002およびM1005は、最高の平均最終スコアを示し、したがってGo判定を与えられた。RTV製剤については、M2003およびM2005の共有平均スコア7.3は、中央値でもある;したがって、2つの製剤M2004およびM2006のみがGo指定を与えられた。ATV製剤については、M3001およびM3002がGoと指定された。7.5対5.1というスコアにおける明確な分離が、Go/NoGoATV製剤間に観察された。EFV製剤の1つであるM4005は、試験した各パラメーターで最高スコアを示し、最終平均アコアが10となった。EFV製剤について次に高い最終スコアM4002は、M4005のほぼ半分で5.1であった。平均最終スコアの差は、これら2つの製剤にとって実質的であるが、両方にGo判定が与えられた。4つの抗レトロウイルス薬について21のナノART製剤を製造して特性評価し、MDMのインビトロ試験システムでナノARTを評価するために試験した。薬物タイプ、界面活性剤コーティング、および形状が、粒子の取り込み、薬物放出、および抗レトロウイルス反応に対して本質的な影響を及ぼすことが実証されたが、一方マイナーな効果を及ぼすものは粒子電荷およびサイズであった。界面活性剤コーティングでは、薬物タイプの間で実質的な相違があった。IDV、RTV、およびEFVの場合、5つの製剤のうち4つは、同様の試験結果であった。界面活性剤の組合せPl88/mPEG2000DSPEは、ATVを例外として、試験したすべての薬物についてGO製剤と指定された。粒子形状は、ナノARTの性能に影響を及ぼした。IDVおよびEFVの粒子は、縁が不揃いの円形であり、細胞取り込みの減少を示した。これに対して、RTVおよびATVは、縁が滑らかで整然とした棒様形状であった。RTV棒は短く角が滑らかであるが、ATVは棒が長く縁が鋭利である。最も効果的な粒子取り込みは、ATV製剤のM3001で認められ、これにより棒が長い方がより迅速に取り込まれることが示唆された。これらの結果は、マクロファージの食細胞運動カイネティクスに対する粒子形状の影響を検討して、球状微粒子が短い棒形より緩除に取り込まれること、長い棒形が短い棒形より迅速に取り込まれることを見出した研究と一致しているHuangetal.2010Biomaterials31:438-448;Chithranietal.2006NanoLett.,6:662-668;Grattonetal.2008Proc.NatlAcad.Sci.,105:11613-11618。ナノARTの性能に影響を及ぼす最も重要な因子の1つは、親薬物の化学的性質であった。ATV製剤はすべて、PKは良好であるが抗レトロウイルス効果は比較的不良であることが実証された。さらに、EFVナノARTは、取り込みが低いにもかかわらず、最良の抗レトロウイルス効果を示した。興味深いことには、遊離塩基ATVの溶解性は、他の遊離塩基薬物の溶解性よりも300倍超大きくIDV:15μg/ml、EFV:9μg/ml、またはRTV:1~2μg/mlに対してATV:4~5mg/mlWishartetal.2008NucleicAcidsRes.,36:D901-D906;Wishartetal.2006NucleicAcidsRes.,34:D668-D672、ATVナノ製剤の取り込みおよび放出は、界面活性剤コーティングにより最も影響を受けるように見えた。ナノARTは最大99の純粋な薬物結晶からなりうるものであり、その結果として、特定の抗レトロウイルス薬が、他のものよりもMDM細胞を媒介とした送達に一層よく適合する可能性がある。単一薬物群内ですべてのナノART製剤の抗レトロウイルス活性を比較すると、効果の良好な予測因子として、細胞内に含有される薬物量が挙げられる。EFVおよびATVのナノART製剤の場合に、細胞内に含有された薬物量とHIV感染に対する防御度の間に強い相関0.92が証明された。含有した薬物が多い細胞ほど、周囲培地中に存在した薬物量にかかわらず、防御レベルが高いことが示された。5日目および15日目において、薬物製剤すべてについて、培地中に存在する薬物量は、種々のHIV株および宿主細胞型に関して報告された抗HIV活性のEC50レベルを超えていた1.7~25nM、EFV;35~200nM、RTV;5~29nMIDV;2~5nMATVRobinsonetal.2000Antimicrob.AgentsChemother.,44:2093-2099。さらに、すべての薬物について、5日目の培地レベルは、治療ヒト血漿レベルに等しかった1.8~4.1μg/ml、EFV;3.5~9.6μg/mlRTV;0.15~8.0μg/mlIDV、および0.3~2.2μg/ml、ATVShannonetal.,HaddadandWinchester’sClinicalManagementofPoisoningandDrugOverdose,4thed.SaundersElsevier,Philadelphia,PA,2007;vonHentigetal.2008J.Antimicrob.Chemother.,62:579-582。これらの結果をまとめると、ナノARTは、主として細胞内部で抗レトロウイルス作用を及ぼすことが示される。MDM内に含有されたナノART量は、HIV-1感染に対する防御度の重要な指標であるが、唯一の決定要素ではない。ナノART薬物の一部は、極めて少量で高度に効果的であったが、より多量に細胞内にあった他のものはそれより効果が少なかった。例えば、15日目において、ナノART処理細胞内のIDVレベルは検出できなかった;それでもHIV-1感染は約20減少した。これに対して、ナノART処理後に細胞内に含有されたEFV量はすべての製剤について極めて低かったが、細胞はHIV感染からほぼ完全に防御された。さらに、ATVナノART処理細胞は、EFVナノART処理細胞よりも1000倍超の薬物濃度であったが、それでもHIV感染の程度は様々であった。この現象に対する可能な説明は、すべてのナノARTが同一の様式で細胞内を移行し、様々な細胞内コンパートメントに貯留されうるとは限らないということである。これが真実ならば、細胞内でのナノART局在も、細胞に実際に入る薬物量と同様に重要になりうることが示唆される。例えば、ナノARTが、HIV複製が起こっている同じエンドソームコンパートメントに共存する場合、完全なウイルス複製の阻害は、少量の薬物のみで可能となりうる。一方、HIV複製が起こっているところとは別のコンパートメントに貯留されたナノARTは、多量に存在したとしても、効果が少ない可能性がある。ナノ物質の内部機構、細胞内移行、細胞内貯留が、それらの生物作用にとって重要であることが実証されてきたJiangetal.2008Nat.Nanotechnol.,3:145-150;Vallhovetal.2007NanoLett.,7:3576-3582;Slowingetal.2006J.Am.Chem.Soc,128:14792-14793。ここで、ナノARTの性能に比較的影響が少ない2つの因子は、サイズおよび電荷であった。他の研究では、ナノ粒子のサイズが機能に顕著に影響を及ぼしうることが示されているが、本研究では、粒子サイズのみに基づいた、ナノART性能の明らかな差は認められなかったJiangetal.2008Nat.Nanotechnol.,3:145-150;Vallhovetal.2007NanoLett.,7:3576-3582;Ferrari,M.2008Nat.Nanotechnol.,3:131-132。サイズ効果のこの欠如は、ナノARTのサイズが類似していることによる可能性がある。このサイズは、233nm~423nmの範囲にあり、全体的に100nmを超えて変動することはなかった。例外は、M2006とM2002との全般的な性能比較であった;両方は同じ界面活性剤の組合せでコーティングされたが、サイズは約2倍異なっていた。RTVナノART製剤の中で全般的に最悪の性能であったM2002は、性能が2番目のM2006の約半分のサイズであった。これは、より大きなナノART粒子がより小さなナノART粒子よりも性能がよい可能性があることを意味し、提案されたより大きなナノARTサイズが1μmに近いが、薬物放出の延長と共に、MDMにより一層効率的に取り込まれうるという他の発見と対応する。粒子電荷もまた、ナノARTの性能に対して、効果がより限定的であった。粒子の大部分が強い負電荷<-15.0mVであり、少数のものが比較的弱い電荷-15mV~0mVの間であり、少数のものが強い正電荷>20mVであった。強く荷電したNPは弱電荷または中性電荷のNPよりも取り込みが良好であることが示されてきたRoseretal.1998Eur.J.Pharm.Biopharm.,46:255-263。試験した各薬物について最良の性能を示したナノART製剤は強い負電荷を有していたが、弱い負電荷≦-8.2を有した製剤は、下位の2つにランク付けされた。正に荷電した粒子は、その群の真中にランク付けされる傾向があった。この結果は、荷電したナノARTが中性電荷のものよりも性能が良好であることを強く示唆する。伝統的なART薬物をナノARTに再パッケージし、トランスポーターとしてマクロファージを使用すると、以下のものを含む、HIV-1感染の治療に対していくつかの利点が得られる:i長時間の血漿薬物濃度;ii除放的かつ安定した薬物放出;iii活動的な感染部位への薬物送達のターゲティング;およびiv毒性の低減。インビトロおよびインビボの両方の研究において、ナノARTをマクロファージに負荷すると、抗レトロウイルス薬の体内分布および効果が大幅に改善されつつ、同時に細胞毒性が低減することが実証された。実際、結晶性抗レトロウイルスNPを使用するインビボ研究では、治療効果が示され、インビボ投与すると、これらのタイプのNPがマクロファージに取り込まれうることがわかった。実施例2結晶性抗レトロウイルスナノ粒子ナノARTは、事実上、薬物の投与間隔を延長し、投与薬物濃度を減少させ、ウイルスの潜伏場所への薬物到達を促進し、有害な副作用を低減し、感染個体への薬物アベイラビリティを改善する。後者は、服薬遵守が悪いか、経口薬物吸収が限定されているか、または必要とされる医薬を得る機会がほとんどない患者を対象とする。ナノARTの運搬に単球および単球由来マクロファージMDMを使用すると、製剤化されていない薬物と比較して、優れた安定性、低い毒性、および強力な抗レトロウイルス効果が示されるDouetal.2006Blood108:2827-2835;Douetal.2007Virology358:148-158;Nowaceketal.2009Nanomed.4:903-917。実際に、ナノART積載MDMは、サイトカインシグナル伝達に応答して生物学的障壁を横断し、感染組織に薬物を直接送達し、ウイルス複製を劇的に減少させることができるDouetal.2009J.Immunol.,183:661-669。動物試験では、インビトロの結果が支持され、臨床的に適切な薬物量が、単回投与後最大3ヶ月間血清および組織の両方に存在することが実証されたBaertetal.2009Eur.J.Pharm.Biopharm.,72:502-508;Van’tKloosteretal.2010Antimicrob.AgentsChemother.,54:2042-2050。ここで、最初の取り込み時点から最終放出までのナノARTの細胞内局在を研究した。迅速なクラスリン依存性内部移行に続いて、薬物粒子は再循環経路に選別され、そのため分解が回避される。MDMから薬物はインタクトのままで放出され、抗レトロウイルス効果に低下はなかった。興味深いことには、粒子移行経路は、HIVのエンドサイトーシス選別に対して観察されたものと対応する。HIVとナノARTとの間の細胞内エンドサイトーシス存在場所のこのような対応関係は、ウイルス複製の制限に関してさらなる利点を提供する。まとめると、これらの発見により、HIVに感染した人々に対する効率的かつ単純化された薬物レジメンのための治療オプションとしてマクロファージ媒介性薬物送達があることが示される。材料および方法抗体および試薬Rab11およびRab7に対するヤギ抗体Ab、ならびにRab8、Rab11、およびRabl4に対するヒトsiRNAは、SantaCruzBiotechnologyCA,USAから購入した。SilenceMagsiRNA送達試薬および磁気プレートは、OzBiosciencesMarseille,Franceから購入した。リソソーム膜タンパク質1LAMP1に対するウサギAbは、NovusBiologicalsCO,USAから購入した。初期エンドソーム抗原1EEA1、クラスリン、Rab8、およびRabl4に対するウサギAbは、CellSignalingTechnologiesMA,USAから購入した。食作用に対するpHrhodo-デキストランコンジュゲート、ローダミンファロイジン、ファロイジンAlexaFluor登録商標488および647、AlexaFluor登録商標594結合トランスフェリンTfn、抗ウサギAlexaFluor登録商標488、594、および647、抗マウスAlexaFluor登録商標488、594、および647、抗ヤギAlexaFluor登録商標488、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI含有ProLong登録商標Gold抗フェージング溶液はすべて、MolecularProbesOR,USAから購入した。Dynasoreおよびインドメタシンは、Sigma-AldrichMO,USAから購入した。RTV-NPの製造および特性評価リトナビルナノ粒子RTV-NPは、以前に記載のように上記およびNowaceketal.2009Nanomed.,4:903-917を参照のこと、AvestinC-5ホモジナイザーAvestin,Inc.,ON,Canadaを使用して、高圧ホモジナイゼーションにより調製した。薬物結晶をコーティングするために使用した界面活性剤は、ポロキサマー188P188;SpectrumChemicals,CA,USA、1,2-ジステアロイル-ホスファチジルエタノールアミンメチル-ポリエチレングリコール2000mPEG2000-DSPE、および1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDOTAPを含み、AvantiPolarLipids,IncAL,USAから購入した。ナノサイズ化された薬物結晶をコーティングするために、各界面活性剤は、P1880.5、mPEG2000-DSPE0.2、およびDOTAP0.1重量/容積から構成した。ナノ懸濁液は、緩衝液として10mMリン酸ナトリウムまたは10mMHEPESのいずれかを使用して、pH7.8の弱アルカリ性で製剤化した。浸透圧は、グリセリン2.25またはショ糖9.25で調整した。遊離塩基薬物に界面活性剤溶液を加え、約2[容積に対する重量の割合]の濃度にした。この溶液を、粒子サイズを低減するためにUltra-Turrax商標T-18IKA登録商標WorksInc.[NC,USA]ローター-ステータミキサーを使用して10分間混合した。この懸濁液を、約30パスの間、または所望の粒子サイズが得られるまで、20,000psiでホモジナイズした。サイズは、HORIBALA920光散乱測定機器HORIBAInstrumentsInc.,CA,USAを使用して測定した。多分散性およびゼータ電位の測定については、懸濁液0.1mlを10mMHEPESpH7.49.9mlに希釈し、MalvernZetasizerNanoSeriesMalvernInstrumentsInc.,MA,USAを使用して動的光散乱により分析した。各読み取りにつき少なくとも4回反復し、読み取りの変動は2未満であった。所望のサイズを得た後、試料を遠心分離し、得られたペレットを、浸透圧を調整するための9.25ショ糖を含有する界面活性剤溶液に再懸濁した。粒子サイズおよび形状は、下記に記載のように、走査型電子顕微鏡により特徴づけた。RTV-NPは、Vybrant商標1,1’ジオクタデシル-3,3,3’,3’-テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩DiO細胞標識溶液Ex:484nm;Em:501nmまたは3,3’-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩DiD;Ex:644nm;Em:665nm;Invitrogen[CA,USA]を使用して蛍光標識した。RTV-NP懸濁液1mlと色素5μlとを合わせて一晩混合することにより粒子を標識した。20,000×gで遠心分離後、過剰色素がすべて除去されるまで、5ヒト血清含有ダルベッコ改変イーグル培地DMEMで粒子を洗浄した少なくとも5回の洗浄。製剤の最終薬物含量は、高速液体クロマトグラフィーHPLCにより測定した。ヒト単球の単離および培養UniversityofNebraskaMedicalCenterの施設内倫理委員会InstitutionalReviewBoardにより承認を得た後、ヒト単球を、HIVおよび肝炎血清反応陰性ドナーから白血球を除去することにより取得し、向流遠心分離により精製した。Wright染色サイトスピンを調製し、細胞純度を抗CD68クローンKP-1による免疫標識によりアッセイした。単球は、10熱失活プールヒト血清、1グルタミン、50μg/mlゲンタマイシン、10μg/mlシプロフロキサシン、およびPfizerInc.MA,USAからの好意の贈与である1000U/ml組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子MCSFを添加したDMEM中で、加湿環境5CO2下37°Cにて、1×106細胞/mlの濃度で培養した。マクロファージへの分化を誘導するために、単球をMCSFの存在下で7日間培養した。RTV-NPの取り込みおよび放出単球由来マクロファージ1ウェル当たり2×106を100μΜRTV-NPと共に培養した。粒子の取り込みは、細胞収集を指定時間に行いながら、24時間培地交換せずに評価した。付着したMDMを、リン酸緩衝生理食塩水PBS1mlで3回洗浄した後、PBS1ml中に細胞を掻き取った。試料を4°Cで10分間、950×gで遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをメタノール200μl中で超音波処理し、4°Cで10分間、10,000×gで遠心分離した。このメタノール抽出物を、HPLC分析の実施まで、-80°Cで保存した。最初の12時間、RTV-NPに曝露した後、一日おきに培地の半分を交換してMDMからの薬物放出を2週間にわたり評価した。培地試料を対応細胞と共に保管し、HPLC分析が実行可能となるまで-80°Cで保存した。メタノール抽出細胞懸濁液を、4°Cで10分間、21,800×gで遠心分離した。培地試料を融解し、メタノールを添加して除タンパクした。試料を4°Cで10分間、21,800×gで遠心分離した;上清を減圧乾固し、100メタノール75μlに再懸濁した。処理した培地または細胞の三つ組み試料20μlを、C8ガードカートリッジを装着したYMCPackOctylC8カラムWatersInc.[MA,USA]を使用して、HPLCにより評価した。47アセトニトリル/5325mMKH2P04pH4.15からなる移動相を0.4ml/minで送出し、UV/Vis検出を212nmで行った。細胞および培地におけるRTVレベルを、メタノールで作製した遊離薬物0.025~100μg/mlの標準曲線と比較してピーク面積で決定した。免疫細胞化学および共焦点顕微鏡検査蛍光免疫染色のために、細胞をPBSで3回洗浄し、室温で30分間、4パラホルムアルデヒドPFAで固定した。細胞をブロッキング/透過化溶液0.1Triton、PBS中の5ウシ血清アルブミン[BSA]で処理し、50mMNH4C1で15分間クエンチした。細胞をPBS中の0.1Tritonで1回洗浄し、一次および二次Abと連続して室温でインキュベートした。複数のAbで染色したMDMの場合、免疫染色の前に、二次Abの非特異的交差結合について試験した。同じ宿主に由来するかまたは同じ宿主を認識する二次Abの使用は回避した。スライドをDAPI含有ProLongGold抗フェージング試薬で覆い、LSM510共焦点顕微鏡CarlZeissMicroimaging,Inc.,NY,USAで63倍オイルレンズを使用して画像化した。再循環コンパートメントのイメージングポリ-d-リジンコーティングのチャンバースライド中で増殖した単球由来マクロファージを、無血清DMEMと共に3時間インキュベートしてヒト血清を枯渇させた。細胞を、1μΜAlexa594-Tfnおよび100μΜDiO標識RTV-NPと4時間共インキュベートした。内部移行しなかった微粒子を、PBSで3回連続して洗浄することにより除去した。細胞を4PFAで固定し、LSM510共焦点顕微鏡CarlZeissMicroimaging,Inc.の63倍オイルレンズを使用して画像化した。酸性化コンパートメントの検出単球由来マクロファージを、デキストランビーズに結合したpHrhodo商標および100μΜDiO標識RTV-NPに37°Cで4時間曝露した。内部移行しなかった微粒子を、Hanks平衡塩類溶液pH7.4で3回洗浄して除去した後、4PFAによる固定およびイメージングを行った。様々なpHレベル3.0~8.5でのpHrhodo商標色素の蛍光強度を、M5開花FlorescenceマイクロプレートリーダーMolecularDevices[CA,USA]を使用して、あらかじめ測定した。RTV-NP取り込みの阻害単球由来マクロファージをPBSで3回洗浄し、無血清培地と共に30分間インキュベートした。次いで、細胞を、100μΜdynasore、100μΜインドメタシン、および両方の組合せに、無血清培地中で30分間曝露するか、または未処理のままにした。細胞を無血清培地で1回洗浄し、無血清培地で再構成した100μΜDiD標識RTV-NPを、新たな阻害剤と共に37°Cで3時間MDMに加えた。細胞をPBSで3回洗浄し、細胞リフターを使用して機械的に引き剥がした。細胞を4PFAで30分間固定し、フローサイトメトリーによりRTV-NPの取り込みを分析した。データは、CellQuestSoftwareBDBiosciences,CA,USAを使用して、FACSCalibur商標フローサイトメーター上で得た。薬物含量のHPLC分析については、反復実験を行った。電子顕微鏡検査試料を、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中の3グルタルアルデヒドで固定し、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4中の1四酸化オスミウムでさらに1時間固定した。試料を漸加的エタノール系列で脱水し、走査型電子顕微鏡用にEpon812ElectronMicroscopicSciences[PA,USA]に包埋した。薄片80nmを酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡HitachiH7500-I;HitachiHighTechnologiesAmericaInc.[IL,USA]下で観察した。エンドサイトーシスコンパートメントの濃縮RTV-NP結合コンパートメントの濃縮のために、RTV-NPを、0.01ブリリアントブルーR-250色素Thermo-FisherScientific,MA,USAを用いて室温で12時間標識した。過剰な色素を、PBSで5回の洗浄およびその後の20,000×gで10分間の5回の遠心分離によって除去した。次いで、100μΜRTV-NPを37°Cで12時間MDMに加えた。細胞をPBSで3回洗浄し、RTV-NPの取り込みを、ニコンEclipseTE300顕微鏡NikonInstruments,Inc.[NY,USA]上で明視野設定を使用して視覚化した。細胞をホモジナイゼーション緩衝液100mMショ糖、10mMイミダゾール溶液、pH7.4で引き剥がした後、ダンス型ホモジナイザー上で15ストローク行った。500×gで10分間遠心分離して細胞デブリおよび核を除去した。上清を60ショ糖、10mMイミダゾール溶液、pH7.4と等比で混合してショ糖濃度を30に調整した後、60、35、20、および10のショ糖勾配上に積層し、4°Cで1時間、100,000×gで遠心分離した。濃縮されたエンドサイトーシスコンパートメント青色を含有する10~20と35~60のショ糖バンドの間の界面を収集した。ペレットを、4°Cで30分間、100,000×gで遠心分離して収集し、PBSで3回洗浄してショ糖を除去した。次いで、下記に記載のように、ペレットをプロテオミクス分析のために処理した。エンドサイトーシスコンパートメントの免疫単離を、一部改変して以前の記載のように実施したBasyuketal.2003Dev.Cell5:161-174。MDM400×106細胞を100μΜRTV-NPで6時間処理した。細胞をPBSで3回洗浄して細胞外のRTV-NPを除去し、次いで、ホモジナイゼーション緩衝液10mMHEPES-KOH、pH7.2、250mMショ糖、1mMEDTA、および1mMMgOAc2中で掻き取った。次いで、ダンス型ホモジナイザーで15ストローク行って細胞を破壊した。4°Cで10分間、400×gで遠心分離して、核および破壊されていない細胞を除去した。EEA1、リソソーム結合LAMP1、およびRab11抗体に結合した4°Cで12時間、PBS中の10BSAにおいて結合プロテインA/G常磁性ビーズスラリー20μl;Milliporeを上清とインキュベートした。ビーズのみも細胞溶解物に曝露して結合特異性を試験した。4°Cで24時間インキュベートした後、EEA1、LAMP1、およびRab11のエンドサイトーシスコンパートメントを洗浄し、磁気分離機Invitrogen上に収集した。各コンパートメントのRTV-NP含量を、上記のようにHPLCにより測定した。プロテオミクス分析および質量分析エンドサイトーシスコンパートメントを、溶解緩衝液、pH8.5[30mMTrisCl、7M尿素、2Mチオ尿素、4w/v3-[3-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート、20mMジチオスレイトール、および1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルSigma]でピペッティングにより可溶化した。タンパク質を、製造業者の説明書に従って、2Dクリーンアップキットを使用して沈殿させ、2DQuantGEHealthcare[WI,USA]により定量した。試料をBis-Tris4-12および7Tris-グリシンゲルInvitrogen上で泳動させ、低分子量および高分子量のタンパク質を分離した。電気泳動後、10メタノール、7酢酸で1時間固定し、室温で24時間クーマシー染色を行った。バンドを手作業で切り取り、37°Cで16時間、ゲル内トリプシン消化を行った10ng/スポットのトリプシン[Promega,WI,USA]。μC18ZipTips登録商標Millipore,MA,USAを使用するペプチド抽出および精製を、Proprep商標ProteinDigestionおよびMassSpecPreparationSystemsGenomicSolutions,MI,USA上で実施した。抽出されたペプチドを、ミクロキャピラリーRPC18カラムNewObjectives,Inc.[MA,USA]上で分画し、ナノスプレー構成の液体クロマトグラフィーエレクトロスプレイイオン化タンデム型質量分析システムLTQ-Orbitrap質量分析計を備えたProteomeXSystem、Thermo-FisherScientificを使用して配列決定した。取得したスペクトルについて、SEQUESTサーチエンジンThermo-FisherScientificのBioWorks3.1SRソフトウェアを使用して、ヒトタンパク質のサブセットに限定したNCBI.fastaタンパク質データベースに対して検索した。TurboSEQUEST登録商標検索パラメーターは以下のように設定した:Dta生成閾値10000、Dta生成に対する前駆体質量許容値1.4、Dta検索、ペプチド許容値1.5、およびフラグメントイオン許容値1.00。電荷状態はautoに設定した。データベースnr.fastaを、ftp.ncbi.nih.govから取得し、インハウスでインデックス付きhuman.fasta.idxwを作製するために使用したキーワード:ホモサピエンス、ヒト、霊長類。2つ以上のユニークなペプチド配列p<0.05を有するタンパク質は、高度に信頼性があると見なした。siRNA処理およびウエスタンブロッティングsiRNAを磁気ビーズと組み合せて、製造業者の説明書の指示どおりに、MDMに形質移入し、次いで、タンパク質ノックダウンを最大にするために、さらに72時間培養した。タンパク質の除去は、ウエスタンブロッティングにより確認した。タンパク質試料は、Pierce660-nmタンパク質アッセイおよび曲線を標準化するための前希釈タンパク質アッセイBSAスタンダードThermoScientific[IL,USA]を使用して定量した。各タンパク質試料から、10~15μgを、NuPAGE登録商標Novex4-12Bis-TrisゲルInvitrogen上に負荷し電気泳動に付した;ゲルをポリフッ化ビニリデン膜Bio-RadLaboratories[CA,USA]に転写した。膜をPBS-T中の5粉乳/5BSAでブロックし、次いで、一次Abおよびその後に二次Abで探査した。タンパク質バンドを、SuperSignal登録商標WestPico化学発光基質Pierce[IL,USA]を使用して識別した。次いで、siRNAを形質移入したMDMを、100μΜRTV-NPで処理した後、細胞および対応培地試料を採取して、HPLCにより薬物分析を行った。マクロファージのRTV-NPの放出および遊離薬物への解離細胞に薬物を負荷した18時間後に、RTVNP負荷MDMから細胞培養培地を収集した。インタクトなRTV-NPを、ベックマンTL-100超遠心分離機Brea[CA,USA]上で、4°Cで1時間、100,000×gで遠心分離して、溶解した薬物から分離した。得られた上清およびNPペレットを、HPLCによる薬物定量のために処理した。RTVの抗レトロウイルス活性エタノール中に溶解した非製剤化状態最終濃度0.01、本来のRTVNP、または放出されたRTV-NPのいずれかのRTVを等量用いて、単球由来マクロファージを12時間処理し、次いで洗浄した。RTV-NP処理後1日目に、薬物処理したMDMに、0.01感染性ウイルス粒子/細胞の感染多重度でHIVADAを感染させたGendelmanetal.1988J.Exp.Med.,167:1428-1441。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、10日間細胞を培養した。逆転写酵素RT活性Kalteretal.1991J.Immunol.,146:3396-3404によりアッセイされる子孫ウイルス粒子産生を測定するために、感染後10日目に培地試料を収集した。感染細胞におけるHIVp24抗原の発現についての並行分析を、培地採取と同じ日に、p24マウスモノクローナルAbDako[CA,USA]を使用する免疫染色により実施した。RTアッセイ96ウェルプレートにおいて、培地試料10μlを、100mMTris-HClpH7.9、300mMKCl、10mMジチオスレイトール、0.1ノニルフェノキシルポリエトキシルエタノール40NP-40、および水を含有する溶液10μlと混合した。この反応混合物を37°Cで15分間インキュベートし、50mMTris-HClpH7.9、150mMKCl、5mMジチオスレイトール、15mMMgCl2、0.05NP-40、10μg/mlポリA、0.250U/mlオリゴdT12-18、および10μCi/mlトリチウム標識チミジン三リン酸を含有する溶液25μlを各ウェルに加えた;プレートを37°Cで18時間インキュベートした。インキュベーション後、冷10TCA50μlを各ウェルに加えた;これらのウェルをグラスファイバーフィルター上に採取し、β-シンチレーション分光法により、フィルターについてトリチウム標識チミジン三リン酸の取り込みをTopCountNXT商標PerkinElmerInc.[MA,USA]を使用して評価したKalteretal.1991J.Immunol.,146:3396-3404。HIV-1p24染色の免疫組織化学および定量HIV-1感染後合計10日目に、4リン酸緩衝化PFAを用いて室温で15分間、細胞を固定した。固定細胞を、1TritonX-100を含有するPBS中の10BSAを用いて室温で30分間ブロックし、HIV-1p24に対するマウスモノクローナル抗体1:100,Dakoと共に室温で3時間インキュベートした。DakoEnVision商標System-HRP標識ポリマー抗マウス二次Abおよびジアミノベンジジン染色を使用して、p24Abの結合を検出した。細胞核をヘマトキシリンで60秒間対比染色した。40倍対物レンズを備えたニコンTE300顕微鏡を使用して画像を取得した。免疫染色の定量は、Image-ProPlusv.4.0MediaCyberneticsInc.[MD,USA]を使用するデンシトメトリーにより実施した。p24の発現は、顕微鏡視野当たり全画像領域のパーセントとして陽性領域指標を決定することにより定量した。統計分析免疫染色の定量を、JACoPプラグインrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.htmlを利用して、ImageJソフトウェアで実施し、ピアソンの共局在係数を計算した。同じ光学設定で取得された3~5組の画像について比較した。グラフおよび統計分析は、ExcelおよびPrismソフトウェアGraphPadSoftware,Inc.[CA,USA]使用して作製した。取り込みおよび放出試験の薬物レベルの有意差は、二元配置分散分析およびそれに続くボンフェローニの多重比較検定により判定した。siRNA実験におけるRT活性、p24密度、および薬物含量の有意差は、一元配置分散分析およびそれに続くダネットの多重比較検定より判定した。他のすべてのデータについては、両側スチューデントt検定を使用した;特に明記がない限り、エラーバーは±平均値の標準誤差SEMとして示される。結果は、P<0.05の場合、有意であると見なした。結果RTV-NPの特性評価およびインビトロの薬物動態リトナビルNPは、ナノARTの代表的な製剤であり、そのため細胞粒子局在化および放出のアッセイのために使用した。RTV-NPは、mPEG2000-DSPE、P188、およびDOTAPのリン脂質界面活性剤で薄層コーティングされた遊離塩基RTVの薬物結晶からなった。図8Aに、粒子の物理的性質サイズ、形状、およびゼータ電位を示す。P188およびmPEG2000-DSPEは、粒子安定性を増加させたが、一方DOTAPコーティングは正の表面電荷を可能にした。多分散性指数は0.196であり、これは、RTV-NPの大多数は計算された平均測定サイズであるが、粒子集団全体は不均一であることを示す。P188単独、Pl88/mPEG2000-DSPE、またはPl88/mPEG2000-DSPE-DOTAPは、RTV-NPの細胞取り込みに影響を及ぼさないことは留意すべきである。走査型電子顕微鏡では、RTV-NPの滑らかな棒様形態が示され、サイズ測定および分布が確認された図8B。RTV-NPのMDM取り込みに関する細胞ベースの薬物動態および放出を評価した。細胞をDMEM中の100μMRTV-NPに曝露し、薬物取り込みをHPLCにより評価した。この薬物濃度は、3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、黄色のテトラゾールアッセイおよびRT活性によりそれぞれアッセイした場合に、細胞毒性および強力な抗レトロウイルス効果を制限したことを示す以前の観察に基づいて選択した。MDMにおけるRTV-NPの内部移行は、30分に観察され、4時間にピークに達した図8C。内部移行した粒子は、最大15日間MDMに検出された図8D。マクロファージへのRTV-NPの侵入機序を分析するために、化学ブロッカーを使用して、クラスリンおよびカベオラ媒介細胞侵入を阻害した。100μΜdynasoreダイナミンの阻害によってクラスリン被覆ピット形成を妨害するまたはインドメタシンカベオラ阻害剤で1時間前処理した後に、MDMを蛍光RTV-NPに曝露した。フローサイトメトリーおよびHPLC分析により、RTV-NPの内部移行がクラスリン被覆ピットを介して起こることが実証された図8Eおよび8F。プロテオ-ム解析による、RTV-NPを含有するエンドサイトーシスコンパートメントの同定透過型電子顕微鏡による、RTV-NP積載MDMのイメージングにより、明瞭な細胞質小胞へのインタクト粒子の取り込みが確認された図9A。次いで、MDM内部におけるRTVNPの細胞内分布を研究した。RTV-NPをブリリアントブルーR-250色素で標識し、MDMに12時間加えた。MDMを機械的に破壊し、RTV-NPを含有するエンドサイトーシスコンパートメント青色を、ショ糖勾配上の青色バンドとして収集した図9B。これらの分画の質量分析により、明瞭なエンドソーム集団に結合した38のタンパク質を同定した図10。それらの仮定される細胞内局在に基づいて、タンパク質を、クラスリン被覆ピット、初期エンドソームEE、再循環エンドソームRE、多小胞体、後期エンドソームLE、およびリソソームLに分類した。タンパク質は、初期および再循環エンドサイトーシス細胞コンパートメントに主として分布したEE[24]およびRE[22]図9C。これらのデータは、RTV-NPの細胞内選別における再循環コンパートメントの役割を示す。RTV-NPの細胞内分布についての共焦点顕微鏡検査プロテオミクスによる発見をさらに実証するために、共焦点顕微鏡検査を実施して、初期EEA1、再循環Rab8、11、および14、および分解エンドサイトーシスコンパートメント後期分解エンドソーム[Rab7]、ならびにLLAMP1に伴うRTV-NPの細胞内分布を視覚化し、定量化した。MDMを、DiDまたはDiOのいずれかで蛍光標識したRTVNPで12時間処理し、次いで、プロテオ-ム解析により同定されたエンドサイトーシスコンパートメントに対して免疫染色した図11。共焦点イメージングにより、主としてEEおよびREと共局在する細胞質および核周囲領域の全体にわたって、NPが点状パターンで分布することが示された図11A~H。ピアソンの共局在検定を使用する、フルオロフォアオーバーラップの定量により、EEA19.5±0.4[平均値±SEM];n=41初期エンドソーム、ならびにRab812.8±0.2;n=56、Rab1131.0±0.6;n=33、およびRabl422.8±0.5;n=189REに伴うRTV-NPの蓄積が、Rab7LE4.1±0.4;n=47およびL5.0±0.9;n=28;図11Gなどの分解コンパートメントと比較して、有意であることが示されたp<0.001。これらのデータは、ヒトMDMにおいて、粒子は分解ではなくエンドサイトーシス再循環を受けることを示す。siRNAおよびブレフェルジンAによるエンドサイトーシス再循環の破壊は、RTV-NP放出を阻止するRTV-NP移行のための再循環経路を確認するために、Rab8、11、および14をsiRNAにより抑制した。siRNAおよびDiD標識RTV-NPに曝露したMDMを、細胞分布については共焦点顕微鏡検査により、薬物保持細胞溶解物および放出培地についてはHPLCにより分析した。未処理MDMおよびスクランブルscrambledsiRNAまたは標的siRNAのいずれかに曝露されたMDMを使用するウエスタンブロットにより、Rabタンパク質サイレンシングが確認された図12C。共焦点顕微鏡検査により、siRNA処理MDMでは、未処理およびスクランブル処理MDMと比較して、RTV-NPの分布が相当変化することが示された図11および12A。処理細胞では、RTV-NPとRab8、11、および14との共分布の減少、細胞質点状分布の消失および核に隣接した粒子凝集が示された図12A。HPLC分析により、Rab11およびRabl4のsiRNAで処理された細胞が、未処理、siRNAスクランブル処理、およびRab8のsiRNA処理のMDMよりも、より多くの薬物を保持し図12D、培地により少ない薬物を放出する図12Eことが示された。ブレフェルジンABFA;再循環および分泌活性の破壊物質による処理でも同様の結果が得られ、核周囲領域へのRTV-NPの凝集が起こった図12B。HPLC分析により、BFAで処理されたMDMが、未処理およびsiRNAスクランブル処理細胞よりも、より多くの薬物を保持し、より少ない薬物を放出することが示された図12Dおよび12E。その結果、BFA処理細胞の培地には、RTV-NPはほとんど検出されなかった。これらのデータをまとめると、RTV-NPの細胞内移行および放出の両方におけるエンドサイトーシス再循環経路が実証される。エンドサイトーシスコンパートメント間のインタクトRTV-NPの移行後期分解エンドソームおよびLへのRTV-NPの最小分布は、実際に薬物が分解経路を回避するか否かについて疑問を抱かせた。界面活性剤薬物結晶ではないのみが脂溶性色素DiDおよびDiOで蛍光標識されたので、粒子がインタクトの状態で移行されたか否かを検討した。RTV-NPに曝露した細胞を機械的に破壊し、EEA1、Rab11、およびLAMP1に結合したプロテインA/G常磁性ビーズを使用して、EE、RE、およびLを免疫単離した図13A。ビーズに結合したエンドサイトーシスコンパートメントを、磁気分離により収集し、デジタル画像化し、次いで薬物含量をHPLCにより分析した図13A。興味深いことには、ビーズペレット茶色を覆う薬物白色の薄層は、免疫単離されたRab11エンドソームにおいては容易に見ることができたが、他のコンパートメントでは見ることはできなかった図13B。共局在共焦点検査と一致して、HPLC分析により、Rab11エンドソーム中に薬物が存在すること、また、さらに重要なことには、EEA1またはLAMP1結合小胞と比較して、著しく多量に存在することが確認された図13C。これらの結果は、ポリマーコートおよびRTV-NPの薬物結晶部分が実際に同じ選別再循環経路に入ることを示す。RTV-NPがエンドサイトーシス移行の間保護され、インタクトの状態で放出されるか否かを判定するために、取り込み後24時間に培養液から収集したRTV-NPを、薬物含量の測定に加えて、画像化した。オリジナルRTV-NPの収集を回避するために、MDMをDiD標識RTV-NPに12時間曝露し、徹底的に洗浄しPBS1mlで5回、蛍光顕微鏡で画像化して細胞内粒子のみの存在を確認し、次いで、取り込み後24時間薬物を放出させた。走査型電子顕微鏡画像により、放出されたRTV-NPはインタクトであり図14B、オリジナル粒子図14Aと同じサイズおよび形状を示すことがわかる。しかし、縁が滑らかで、すべてが個々に識別される本来の粒子図14Aとは対照的に、放出された粒子は粗い縁を示し、凝集物として放出された図14B。放出されたRTV-NPが細胞培養液中に同定されたので、溶解した遊離薬物と比較した、粒子形態で存在する薬物の相対量を測定した。粒子状RTVを超遠心分離により可溶性RTVから分離し、HPLCにより定量した。図14Cに示すように、RTVの総量のうち、32が培地に溶解し、68がインタクトNPとして存在した。これらのデータは、薬物の大多数が粒子形態で細胞から放出されることを示す。デキストラン結合pH感受性色素pH<5.5で明赤色蛍光を発するにより標識される酸性分解コンパートメントへの分布が最小であることから、REの温和なpH環境がRTV-NPの完全性を維持する可能性を示唆する図11G。さらに、TfnコンパートメントとRTV-NPが相当オーバーラップすることは、細胞膜への迅速な再循環もインタクト粒子の維持に寄与している可能性を示す図11E。これらの結果は、RTV-NPの物理的性質および形態が、マクロファージ内での移行中に影響を受けないことを示す。RTV-NPは、細胞放出後に抗レトロウイルス活性を維持する。抗レトロウイルス活性が粒子放出後に維持されるか否かを試験するために、MDMを、同じ濃度の本来のRTV-NP、放出されたRTV-NP、および遊離薬物に曝露した後、HIV感染に曝露した。抗レトロウイルス作用は、HIVp24の発現およびRT活性により測定した。遊離RTVによる前処理は、感染を防御しなかったが、本来のRTV-NPおよび放出されたRTV-NPの両方は、同等に、HIVの複製p24染色および多核巨細胞の形成を有意にp<0.01抑制することができた図14Dおよび14F。逆転写酵素活性は、未処理細胞および遊離薬物に曝露された細胞と比較して、オリジナルRTV-NPおよび放出RTV-NPに曝露されたMDMでは有意に抑制された図14E。これらの発見は、エンドサイトーシス選別がRTV-NPの抗レトロウイルス効果に影響を及ぼさないことを実証し、効率的な薬物積載粒子送達ビヒクルとしてのマクロファージの高い可能性を示唆する。単核食細胞MP;単球および組織マクロファージによる輸送のためにART薬物をナノ結晶に再製剤化すると、臨床の薬物効果が改善する。実際、生物学的障壁により防御されたHIVの潜伏場所への薬物送達ビヒクルとしてMPを利用することは、薬物レジメンを単純化するだけでなく、それらの治療係数を高めるためにも役立つ。ART薬物は水に不溶であり、したがって水溶液中で安定な結晶を形成することができる。その食作用および遊走機能のために、MPは外来物質を容易に摂取し、かつ微生物感染および炎症の部位に移動することができる。薬物NPが負荷されると、これらの細胞は、そうでなければ物理的または生化学的障壁のいずれかが存在するために接近できない部位に薬物を送達する。MPは、HIVの標的であり、かつウイルスのリザーバーおよびトランスポーターの両方として機能しうるので、ナノARTを輸送するための理想的な候補となる。特に、ナノ製剤は、癌化学療法および一連の微生物感染のために開発されてきた例えば、Blythetal.2010CochraneDatabaseSyst.Rev.2:CD006343;Chuetal.2009Curr.Med.Res.Opin.,25:3011-3020;Paganoetal.2010BloodRev.24:51-61;Destacheetal.2009BMCInfect.Dis.,9:198;Destacheetal.2010J.Antimicrob.Chemother.,65:2183-2187;Beduneauetal.2009PLoSONE4:e4343;Brynskikhetal.2010Nanomed.,5:379-396;Gorantlaetal.2006J.Leukoc.Biol.,80:1165-1174;Liuetal.2008J.Neuroimmunol.,200:41-52。さらに、MPの遊走機能が治療効果のために利用可能であるという考えは、実際的な意味をなす。その理由は、この同じ細胞がウイルスの標的および担体であり、強健な食作用能を示し、かつ持続的なウイルス増殖および炎症の部位に容易に遊走するからである。特に、ナノARTとマクロファージとの間の相互作用は、治療への転換が達成されることになれば、重要である。興味深いことには、RTV-NPの大多数は、保護環境を提供するコンパートメント内に含有され、これらの粒子が抗レトロウイルス活性を保持したインタクトな状態で放出されることが可能になる。重要なことには、RTV-NPのエンドサイトーシスコンパートメントは、HIVの生活環で使用されるものをそのまま写したものである。これらの結果は、活性薬物の細胞媒介送達が効果的であることを強く示す。限定された細胞毒性に基づいて、ウイルス標的組織リンパ系およびCNSを含むでの高い抗レトロウイルス薬レベルの維持を、養子細胞移入で観察されるように、実現することができる。病院で広範囲に使用されるためには、ナノART合成をスケールする必要があろう。沈殿、ホモジナイゼーション、および湿式粉砕などの手法を使用して、十分な薬物負荷、適切な浸透圧濃度、粘性、および無菌に適した物理的および化学的安定性を備えたナノARTを調製することができるMarreetal.2010Chem.Soc.Rev.,39:1183-1202;Muchowetal.2008DrugDev.Ind.Pharm.,34:1394-1405;Takatsukaetal.2009Chem.Pharm.Bull.Tokyo57:1061-1067。本明細書では、NPが主としてクラスリン媒介経路Kumarietal.2010CellRes.20:256-275を通してマクロファージに入ることを実証する。NPの細胞内分布は、再循環エンドソームコンパートメントに認められた。実際、共局在免疫細胞化学研究により、他のコンパートメントよりも、RE、具体的にはRab11小胞内に顕著に多くのRTV-NPが存在することが実証された。RTV-NPの細胞内分布パターンは核周囲領域に濃縮されており、これはREへのそれらの局在化をさらに支持したHattulaetal.2006J.CellSci.,119:4866-4877;Junutulaetal.2004Mol.Biol.Cell,15:2218-2229;Lombardietal.1993EMBOJ.12:677-682;Seaman,M.N.2008CellMol.LifeSci.,65:2842-2858。RTV-NPの存在が、酸性小胞との限定的な粒子オーバーラップによりLEおよびLでも観察されたが、LEおよびLの内部に含有された粒子は分解されずにむしろ再循環コンパートメントに再移送される可能性がある。例えば、プロテオ-ム解析により同定されたRab9は、トランスゴルジ網と最終的に融合し、REに包括されるLEの逆行性輸送と関係しているBarberoetal.2002J.CellBiol.,156:511-518;Bonifacinoetal.2006Nat.Rev.Mol.CellBiol.,7:568-579。これらの結果は、RTV-NPが細胞内分解を回避し、再循環コンパートメント内に主として貯留され、最終的に細胞表面で放出されることを示唆する。機能研究では、RE移行に関連したタンパク質を除去すると、RTV-NP含有細胞からの薬物放出が阻害されることが実証された。具体的には、細胞内再循環のマーカーHoekstraetal.2004J.CellSci.,117:2183-2192;Hsuetal.2010Curr.Opin.CellBiol.,22:528-534;Jingetal.2009Histol.Histopathol.24:1171-1180;Jonesetal.2006Curr.Opin.CellBiol.18:549-557;Maxfieldetal.2004Nat.Rev.Mol.CellBiol.5:121-132;Sonnichsenetal.2000J.CellBiol.149:901-914;Zerialetal.2001Nat.Rev.Mol.CellBiol.2:107-117であるRab11が、粒子移行および放出の両方を促進するように見えた。エンドソーム再循環には2つの主なタイプ、緩除タイプと迅速タイプがある。Rab11はRab9と共にこれら両方はプロテオ-ム解析中に同定された、緩除循環に関与するタンパク質として認識されてきたCayouetteetal.2010Biochim.Biophys.Acta1803:805-812;Sheffetal.1999J.CellBiol.145:123-139;Ullrichetal.1996J.CellBiol.135:913-924;vanderSluijsetal.1992EMBOJ.11:4379-4389。さらに、迅速再循環として知られる、ゴルジから直接細胞表面に輸送するように導くRab8および14とは対照的に、Rab11は、緩除再循環として知られる、ゴルジからエンドソームを介した、最終的に細胞表面への物質輸送を制御することができる点でエンドサイトーシスにおいてある役割を果たすことが示されてきたChenetal.2001MethodsEnzymol.329:165-175;Laranceetal.2005J.Biol.Chem.280:37803-37813。これにより、Rabタンパク質の除去の結果認められた機能的差異を説明することができた。すべての場合に、再循環Rabタンパク質を除去すると、RTV-NPが核近辺に極めて高密度に再分布するようになり、これらのタンパク質すべてが、粒子移行に関与することが示唆された。しかし、Rab8を除去しても薬物放出は阻害されず、Rabl4を除去するとほんのわずか薬物放出が低下した。一方、Rab11を除去すると極めて顕著な阻害効果があり、粒子の一部は迅速に放出されうるが、主要機序としてRab11を介する細胞膜への緩除再循環がおそらく含まれることが示唆された。Rab11がTfnの迅速再循環に関与しておりCoxetal.2000Proc.NatlAcad.Sci.97:680-685、相当量の粒子がTfnと共局在することが観察されたことは注目に値する。Rab11の除去が薬物放出を完全には阻害しなかったので、RTV-NPの迅速再循環が生じている可能性がある;しかし、RTV-NPが2週間を超えてMDM中に残存するので、粒子の大多数は実際には緩除再循環している可能性の方が高い。理論に拘束されるものではないが、RTV-NPの取り込みから放出までの細胞内移行の提案された経路を図15に示す。最終的に、Rab11は、細胞骨格フィラメントに沿って小胞を輸送する、アクチンおよび微小管の両方をベースとしたモータータンパク質複合体を動員することが知られているJordensetal.2005Traffic6:1070-1077。これらのタンパク質の多くもプロテオ-ム解析中に同定された。まとめると、これらのデータから、RTV-NPが細胞内分解を回避し、細胞膜に再循環される経路が明らかになる。これは、粒子積載MDMから放出されたインタクトRTV-NPを視覚的に同定することにより実証された。これらの放出された粒子が完全な抗レトロウイルス活性を保持ことがさらに実証された。この点で、MDMは、HIV複製を阻害するインタクトRTV-NPを取り込み、保持し、輸送し、そして放出する。これにより、マクロファージが、活性薬物をウイルス感染部位に送達する、ナノARTの真のトロイの木馬として機能できることが示される。第2に、少量のRTV-NPがウイルス複製を完全に抑制することができる一方、同量の遊離薬物には効果がない以上、RTV-NPは、細胞内機序を介してウイルス複製を阻害することができると考えられる。NP-マクロファージ相互作用のこの面は、RTV-NPが、HIVのようにクラスリン被覆ピットによってマクロファージに入るという考えを支持するVendevilleetal.2004Mol.Biol.Cell15:2347-2360。さらに、ウイルスの生活環の重要な構成要素がRE内部に存在するMurrayetal.2005J.Virol.79:11742-11751;Varthakavietal.2006Traffic7:298-307。まとめると、これらの発見は、RTV-NPがHIVと共に細胞に入るだけでなく、同一の細胞内目的地も有しうることを示し、したがって、特定の細胞内コンパートメントに薬物をターゲティングすることが可能になる。これは、ナノARTが、幅広い意味で、極めて低い細胞内濃度でも強力な抗レトロウイルス効果を発揮しうる理由に有力な理論的根拠を提供する。この細胞内レベルでHIV複製が直接抑制されることにより、その結果としてARTの治療係数が向上し、それによって、ウイルス複製を阻害するために必要とされる薬物量が低下する。実施例3材料および方法材料および機器ポロキサマー188P188;Pluronic登録商標F68、ポロキサマー407P407;Pluronic登録商標F-127、および葉酸は、Sigma-AldrichSaintLouis,MOから入手した。N-ヒドロキシスクシンイミド、Ν,Ν’-ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびトリエチルアミンは、AcrosOrganicsMorrisPlains,NJから購入した。LH-20は、GEHealthcarePiscataway,NJから入手した。ATV硫酸塩は、GymaLaboratoriesofAmericaInc.Westbury,NYから購入し、次いで、抽出によりトリエチルアミンを用いて遊離塩基にした。指定されていない限り、他のすべての試薬および溶媒は、FisherScientificPittsburgh,PAまたはAcrosから購入した。1Hおよびスペクトルは、500MHzの核磁気共鳴分光計Varian,PaloAlto,CAで記録した。アタザナビルナノ懸濁液は、NETZSCHMicroSeriesWetMillNETZSCHPremierTechnologies,LLC,Exton,PAまたはAvestinC5高圧ホモジナイザーにより調製した。葉酸末端P188FA-P188およびP407FA-P407の合成p-トルエンスルホニル末端P188の合成TOS-P188、2。P1888.4g、1mmolをトルエン3×50mLと共蒸発させて脱水し、次いで、DMAP61mg、0.5mmolおよびTEA1.01g、l0mmolと共に無水DCM20mLにアルゴン下で溶解した。この反応混合物を0°Cに冷却し、p-トルエンスルホニルクロリド1.9g、l0mmolを加えた。室温で一晩反応させた後、混合物を濾過して濃縮し、エーテルで沈殿させた。次いで、粗生成物をDCM/Brineで抽出し、有機層を無水硫化マグネシウムで乾燥し、次いで減圧下で濃縮した。次いで、溶媒をエーテルで沈殿させて粗生成物を得た。LH20カラムでさらに精製することにより分析純度の生成物を得た。収率:6.8g。1HNMRDMSO-d6δppm7.78d,J=7.32Hz,7.48d,J=7.32Hz,4.11t,J=4.39Hz,3.64-3.37m,1.04d,J=3.90Hz。アジド末端P188アジド-Pl88、3の合成。TOS-P1885.22g、0.6mmolをDMF20mLに溶解し、次いでアジ化ナトリウム0.39g、6mmolを加えた。反応を100°Cで2日間、撹拌しながら実施した。濾過後、真空下で溶媒を除去した。粗生成物をジクロロメタン20mLに溶解し、塩水3×l5mLで抽出した。有機層を無水硫化マグネシウムで乾燥した。有機溶媒の除去後、粗生成物をLH20カラムによりさらに精製して、分析純度の生成物を得た。収率:4.5g1HNMRDMSO-d5δppm3.65t,J=4.39Hz,3.61-3.38m,1.04d,J=3.90Hz。アミン末端P188アミン-Pl88、4の合成。N3-P1881.26g、0.15mmolおよびPd/C10mg10重量を、丸底フラスコ中、H2雰囲気下で、室温72時間、無水MeOH10ml中で撹拌した。反応混合物を濾紙により濾過してPd/Cを分離し、溶媒を蒸発させた。生成物のさらなる精製を、ジクロロメタン/エーテル混合物から0°Cで沈殿させることにより実施した。生成物を濾過し、真空下で乾燥して固体を得た。収率:0.9g。1HNMRDMSO-d6δppm2.65t,J=4.39Hz,3.64-3.43m,1.03d,J=3.90Hz。葉酸活性エステル葉酸-NHS、6の合成。葉酸0.5gを、DMSO10mlおよびトリエチルアミン0.25mlに溶解する。モル比1.1のNHS0.13gおよびDCC0.23gを加える。この混合物を、室温で一晩、暗所で撹拌する。副生成物であるジシクロヘキシル尿素を濾過により除去する。濾液中のNHS-葉酸をジエチルエーテルで沈殿させ、無水エーテルで数回洗浄し、乾燥させた後、黄色粉末として保存した。収率:0.4g。1HNMRDMSO-d6δppm8.66s,1H,8.16d,J=6.8Hz,1H,7.65d,J=7.80Hz,2H,6.93t,J=5.85Hz,1H,6.64d,J=7.80Hz,2H,4.50d,J=5.85Hz,2H,4.23m,1H,2.83s,4H,2.31t,J=6.83Hz,2H,2.03m,1H,1.93m,1H。葉酸末端P188FA-P188、7の合成。アミン-Pl880.84g、0.1mmolをDMSO10mLに溶解し、この溶液に葉酸-NHS322mg、0.6mmolを徐々に加え、室温で一晩、暗所にて反応させた。粗生成物をエーテルに沈殿させ、LH20カラムでさらに精製した。収率:0.6g。1HNMRDMSO-d6δppm8.66s,7.65d,J=8.78Hz,6.92t,J=4.88Hz,6.64d,J=8.78Hz,4.48d,J=5.37Hz,4.28m,3.65t,J=4.39Hz,3.60-3.41m,2.18b,2.08-1.89m,1.04d,J=5.85Hz。上記と同じ手順を使用して、より多くのFA-P188および葉酸末端P407FA-P407を、この研究のために合成した。葉酸アタザナビルナノ懸濁液FA-P188-ATVおよびFA-P407-ATVの調製および特性評価葉酸アタザナビルナノ懸濁液の調製については、以下の界面活性剤の組合せを使用した:10.5P188単独;20.05FA-P188および0.45P188;30.1FA-P188および0.4P188;40.15FA-P188および0.35P188;50.5P407単独;60.025FA-P407および0.475P407;70.1FA-P407および0.4P407;80.2FA-P407および0.3P407を、l0mMHEPES緩衝液pH7.8に別々に懸濁した。次いで、遊離塩基型ATV1重量を、界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、Ultra-turrax登録商標T-18ローター-ステータミキサーを使用して均一分散になるまで撹拌した。湿式粉砕によるナノ懸濁液の調製については、懸濁液を、0.8mm粉砕媒体ジルコニウムセラミックビーズ50mLと共に、NETZSCHMicroSeriesWetMillNETZSCHPremierTechnologies,LLC,Exton,PAに移し、600~4320rpmの範囲の速度で、30分~1時間粉砕して、所望の粒子サイズのATVナノ懸濁液を調製した。ホモジナイゼーションによるナノ懸濁液の調製については、懸濁液をAvestinC5高圧ホモジナイザーに移し、約30パスの間、または所望の粒子サイズが得られるまで、20,000ポンド/平方インチでホモジナイズした。粒子サイズ、多分散性、および表面電荷は、MalvernNano-ZetasizerMalvernInstrumentsInc.,Westborough,MAで分析した。所望の粒子サイズが得られた後、試料を4°Cで30分間、10,000×gで遠心分離した。得られたペレットを、0.925ショ糖および0.5ポリマー溶液で2回洗浄し、次いで、ホモジナイゼーション後に浸透圧を調整するための0.925ショ糖と共にそれぞれの界面活性剤溶液に再懸濁した。ナノ懸濁液中のATV濃度は、高速液体クロマトグラフィーHPLCを使用して測定した。MDMにおけるFA-ATVナノ懸濁液の取り込み、保持、および放出7日間の分化の後、単球由来マクロファージMDMを0および50ng/mLのLPSで24時間活性化した。次いで、これらの活性化MDMおよび非活性化MDMの一部を、0、10、および30のFA-P188を含有する100μΜFA-P188-ATVで処理した。これらのMDMの別の一部を、最初に葉酸で処理し、次いで0、10、および30のFA-P188を含有する100μΜFA-P188-ATVで処理した。FA-P188-ATVの取り込みは、8時間培地交換せずに、種々の時点で評価した。付着したMDMをリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、PBS中に掻き取って集めた。細胞を4°Cで10分間、950×gで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール200μl中で短時間超音波処理し、4°Cで10分間、20,000×gで遠心分離した。メタノール抽出物を、HPLC分析まで-80°Cに保存した図17。MDMによるFA-P407-ATVの取り込みは、FA-P188-ATVと同じ方法を使用して評価した。FA-ATVナノ懸濁液の抗レトロウイルス活性MDMを100μΜATVナノ懸濁液で8時間処理し、洗浄して過剰な薬物を除去し、ナノART処理後10および15日目に、0.01感染性ウイルス粒子/細胞の感染多重度にてHIV-1ADAで感染させた。ウイルス感染に続いて、一日おきに培地の半分を交換しながら、10日間細胞を培養した。培地試料を、逆転写酵素RT活性により分析される子孫ウイルス粒子産生の測定のために10日目に収集した。感染細胞によるHIV-1p24抗原の発現についての並行分析を、免疫染色により実施した。結果葉酸-ポロキサマーの合成抗レトロウイルス剤をHIV感染部位にターゲティング送達するために、葉酸修飾ポロキサマーを設計し、下記工程により合成した図16。手短に言えば、過剰量のp-トルエンスルホニルクロリドでポロキサマーP188およびP407、1を活性化した後、トシル化された生成物2を、100°Cで一晩、DMF中の過剰量のアジ化ナトリウムと反応させることによりアジド-ポロキサマー3に変換し、次いでトリフェニルホスフィンでアミン-ポロキサマー4に還元した。最後に、葉酸5をDCC/NHSで活性化し、得られた活性化エステル6をアミン-ポロキサマーと反応させて、所望の葉酸-ポロキサマーFA-P188およびFA-P407、7を得た。LH-20カラムによる精製後、純粋なFA-P188およびFA-P407約2.5gを、MDMの取り込み、保持、放出、および抗レトロウイルス試験のために統合した。本試験で使用したナノ製剤は、同様のサイズ、電荷、および形状であった。粒子サイズは、ホモジナイゼーションにより調製されたP188-ATVH3001の場合の281nmから、界面活性剤として5FA-P407/95P407を用いて調製されたFA-P407-ATVH3024の場合の440nmまでの範囲となった表3。粒子はすべて負に荷電した。最大荷電の製剤はホモジナイゼーションにより調製されたP188-ATVH3001であり、最小負荷電のものは20FA-Pl88/80P188H3016を含有する製剤であった。葉酸修飾またはポリマーにかかわらず、粒子はすべて長い棒状形状であった図17。MDMによるATVナノ懸濁液の取り込みおよび保持ナノ結晶のポリマーコーティングの葉酸修飾により、MDMによるナノ製剤の処理方法が改変されることになるか否かを判定するために、細胞取り込みを測定した。結果によれば、葉酸受容体の発現が非活性化マクロファージよりも活性化マクロファージで大きいことが示された。したがって、FA-ATVナノ懸濁液の取り込みが培養MDMの活性化により影響を受けることになるか否かを最初に判定した。ATVナノ懸濁液FA-ポロキサマーを含有または非含有の添加前に、50ng/mlのLPSでMDMを24時間処理して活性化した。ナノ製剤の取り込みを1および8時間で測定した。ほとんどのATVナノ懸濁液について、全取り込みの95超が8時間までに起こることを実証した以前の研究に基づいて、最大取り込みに関して8時間を使用した。FA-P188で修飾されたATVナノ懸濁液の取り込みは、FA-P188で修飾されていないATVナノ懸濁液の取り込みよりも約2倍超大きかった。取り込みの増強は、P188-ATVナノ懸濁液中のFA-P188のパーセントにより影響を受けなかった図18A。興味深いことには、FA-P188-ATVの取り込みの増強は、LPSによるMDMの活性化により増加せず図18B、LPS活性化が、使用したMDMの細胞表面上の葉酸受容体の発現を増加させないことが示唆された。FA-P188-ATVの取り込みの増強が受容体媒介性であるか否かを判定するために、ATVナノ懸濁液の添加の30分前に葉酸2.5mMを培地に加えた。その結果より、過剰量の葉酸の添加が葉酸修飾ATVナノ懸濁液の取り込みの増強を阻止すること、およびFA-P188を含有するATVナノ懸濁液の取り込みが、FA-P188を含有しないATVナノ懸濁液の取り込みに類似すること図18Cが示され、FA-ATVナノ懸濁液の取り込みの増強およびターゲティング能力が示された。P188の高いCMCプロフィールのために、FA-P188-ATVナノ製剤は、ATVナノ懸濁液のターゲティング任務を遂行しないFA-P188ユニマーを大量に含有することになる。次いで、CMCが低いP407を、ATVを製剤化するための代替賦形剤として選択した。このポリマーも葉酸で修飾して、FA-P407-ATVナノ懸濁液を調製し、種々のパーセントのFA-P407を含有するATVナノ懸濁液におけるMDMの取り込みの差を、FA-P188-ATVと同じ条件下で測定した。図19に示すように、5、20、または40のFA-P407H3020を含有するATVナノ製剤の取り込みは、非修飾P407-ATVナノ懸濁液の取り込みよりも大きく、FA-P407のパーセントに依存した。40のFA-P407を含有する製剤の取り込みは、非修飾P407のみを含有するATVナノ製剤の取り込みよりも8時間において5倍大きかった。これらの結果に基づいて、P188単独H3001、20のFA-P188H3016、P407単独H3019、または40のFA-P407H3020を含有するATVナノ懸濁液を、8時間にわたるMDM取り込みならびに15日間にわたるそれらの保持および放出を直接比較するさらなる試験のために選択した。8時間後における、P407でコーティングされたATVナノ懸濁液の取り込みは、p188でコーティングされた粒子の取り込みよりも2.3倍増強された20.7μg/106細胞対8.8pg/106細胞。ATVナノ懸濁液の葉酸修飾は、非修飾ATVナノ懸濁液に対して、MDM取り込みを2.9倍P188または1.6倍P407増加させた。15日間にわたる、ATVナノ懸濁液の保持プロフィールは、研究されたすべての製剤について同様であったが、MDMにおけるFA-ATVナノ懸濁液の保持は、非FA修飾ATVナノ懸濁液よりも顕著に高かった。H3001、H3019、H3016、およびH3020の負荷に続いてそれぞれ、最初の24時間の細胞放出の間に、MDMから薬物の24、37、17、および13が消失し、すべての製剤について、処理後15日間を通して、細胞ATVレベルは比較的一定に維持され、培地へのそれらの放出は持続的であった図20。15日目では、細胞薬物濃度は、1日目の薬物濃度の67H3001~100H3016であった。これらの結果は、これらの製剤が持続的な抗レトロウイルス作用を有することを示す。ATVナノ懸濁液の抗レトロウイルス効果製剤の抗レトロウイルス効果を判定するために、P188単独H3001、20のFA-P188H3016、P407単独H3019、または40のFA-P407H3020を含有するATVナノ懸濁液を、これらの試験のために選択した。MDMは、ATVナノ懸濁液で8時間負荷し、次いで、ATVナノ懸濁液の負荷後、1、5、10、または15日目にHIV-1ADAウイルスに曝露した。ウイルスの暴露後10日目に、培地中の逆転写酵素活性および細胞のHIV-1p24染色を測定した。HIV-1ウイルス感染は、すべての製剤により同等に阻害された。ATVナノ懸濁液処理後10日目にウイルス暴露を行った場合は、RT活性は70~90阻害され、ナノ粒子処理後15日目にウイルス曝露を行った場合は、70超阻害された図21。p24抗原の発現は、RT活性について観察されたウイルス阻害を確認した図22。p24染色茶色の染色は、ATVナノ懸濁液処理後1および5日目にウイルスに曝露された細胞ではほとんど観察されなかった。ATVナノ懸濁液処理後10および15日目にウイルスに曝露すると、これらの細胞において、いくつかの明白なp24染色が生じた。これらの結果をまとめると、葉酸修飾ポロキサマーでコーティングされたATVナノ懸濁液は、非修飾ポロキサマーでコーティングされた粒子と同様の抗ウイルス効果を有することが示される。実施例4材料および方法活性エステルペンチン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル、9の合成4-ペンチン酸1.0g10mmolをCH2Cl240mlに溶解した。N-ヒドロキシスクシンイミドNHS1.27g11mmolを加えた図23を参照。次いで、l-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDCを加えた2.11g、11mmol。反応は、室温で一晩撹拌した。反応混合物を塩水で3回抽出した。有機層を蒸発乾固し、純生成物を得た。収量:1.5g。2-ブロモエチル-O-α-D-マンノピラノシドの合成111.5gのAmberlite商標IR-120を2-ブロモエタノール20.3g;0.164モル11.5mlに懸濁した。この混合物を、冷却器を装着したフラスコ中、90°Cで加熱した。30~40分後、約1.5gのD-マンノース0.0083モルを1回で加えた。反応混合物を同じ条件で3時間撹拌し、次いで室温に冷却して濾過した。真空下で溶媒を除去した。得られた粘着性残査をメタノールに溶解し、シリカゲル5gをフラスコに加えて懸濁液を作製した。溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。シリカ支持反応混合物を、あらかじめSi02が充填されたカラムに負荷し、酢酸エチル、次いでエチル酢酸:メタノール、19:1v/vで前溶出した。収率:61。2-アジドエチル-O-α-D-マンノピラノシド12の合成アジ化ナトリウム0.46g0.007モルおよび2-ブロモエチル-O-α-D-マンノピラノシド1g0.0035モルを、DW3mlに溶解した。次いで、この混合物にアセトン20mlを加えて、わずかに混濁した溶液を形成させた。反応は、24時間撹拌しながら還流するまで加熱した。反応混合物の精製は、溶出液として酢酸エチル:メタノール5:1を用いてカラムクロマトグラフイーにより行った。アセチレン末端F127アセチレン-F127、14の合成NH2-F1272.56g、0.2mmolをDCM10mlに溶解し、次いでペンチン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル0.39g2mmolをこの溶液に加えた。反応溶液を室温で2日間撹拌した。反応溶液を濃縮し、次いでエーテルで沈殿させた。次いで、粗生成物をLH20カラムで精製した。収量:1.9g。マンノース末端F127マンノース-F127、15の合成アセチレン末端F1271.25g、0.1mmol、2-アジドエチル-O-α-D-マンノピラノシド100mg、0.4mmol、安定化剤8.7mg、20μmol、およびCuS04-5H205mg、20μmolを、4mlのメタノール/H20に撹拌しながら溶解した。アルゴンを泡立たせて酸素を除去し、次いで0.5mLのH20中のアスコルビン酸ナトリウム40mg、0.2mmolをこの溶液に一滴ずつ加えた。反応混合物を室温で2日間撹拌した。真空下で溶媒を除去した。粗生成物をLH-20カラムにより精製した。収量:0.8g。ナノ懸濁液の調製マンノース-Fl27をl0mMHEPES緩衝液pH7.8に懸濁した。次いで、遊離塩基型ATZ0.1重量を界面活性剤溶液に加えた。この懸濁液を、Ultra-turrax商標T-18ローター-ステータミキサーを使用して均一分散になるまで撹拌した。次いで、この混合物を、0.8mm粉砕媒体ジルコニウムセラミックビーズ50mLと共に、NETZSCHMicroSeriesWetMillに移した。試料を約4krpmの速度で約1時間処理して、所望の粒子サイズを有するナノARTを調製した。結果ナノARTの取り込みを培地交換せずに種々の時点で評価した。付着したMDMをリン酸緩衝生理食塩水PBSで洗浄し、PBS中に掻き取って集めた。細胞を4°Cで10分間、950×gで遠心分離してペレットにした。細胞ペレットを、メタノール200μl中で短時間超音波処理し、4°Cで10分間、20,000×gで遠心分離した。このメタノール抽出物を、HPLC分析まで-80°Cで保存した。図24に、マンノースATVナノATが、非標識ATVナノARTよりも高レベルにマクロファージに取り込まれることを示す。実施例5P188-ATVナノARTを0日目および7日目にNSGマウスに投与した。血清薬物レベルを1、6、および14日目に分析し、組織薬物レベルを14日目に分析した。毒性は、血清化学的および組織病理学的評価からは明白ではなかった。2回目の250mg/kg投与後7日目の血清レベル400ng/mlは、最小のヒト治療血清レベルである150ng/mlを超えていた。ATVレベルは、2回目の投与後7日目の肝臓において最も高かった1650ng/g、w/250mg/kg。脾臓、腎臓、および肺のATVレベルは同等であった140~150ng/g、w/250mg/kg。脳のATVレベルは定量限界であった。血清および組織の濃度は用量依存的であることがわかった。次に、PBLで再構成したNSGマウスに、HIV-1感染前に投与した単回ナノナノATV/RTV処置が、持続的な血清および組織薬物送達および同じ用量の遊離薬物にまさる改善された抗ウイルス効果を提供するか否かを研究した。ナノART処置後9日目の血清薬物レベルは、遊離薬物後のレベルを2ログ上回った。より具体的には、ナノARTATV、RTV、またはEFVは、14日間の時間経過にわたり遊離薬物より顕著に高い血清レベルを保持した。組織薬物レベルは、ナノART処置マウスにおいて、遊離薬物処置よりも100~1000倍高かった。CD4細胞の数は、ナノART処置マウス対遊離薬物処置マウスにおいて差がなかった。ナノART処置は脾臓におけるHIV-1p24を抑制したが、これは遊離薬物単独では観察されなかった。次いで、PBLで再構成したマウスにHIV-1感染後に2回の毎週投与がなされた場合、ナノATV/RTVまたはナノATV/RTV/EFVが、治療血清ATVレベル、リンパ組織におけるリザーバー薬物レベル、および抗レトロウイルス効果を提供するか否かを判定した。手短に言えば、PBLを-7日目にNSGマウスに投与した。これらのマウスを-0.5日目にHIV-1に曝露した。ナノARTを0および7日目に投与したナノATV/RTVを250mg/kgまたはナノATV/RTV/EFVを100mg/kg。血清薬物レベルを1、6、および14日目に検査し、組織薬物レベルを、CD4細胞およびp24染色またはRNA検出と共に14日目に分析した。ATVの治療血清レベルは、ナノARTの2回用量で処置されたマウスで得られた。肝臓のATVレベルは、同様のナノATV/RTV用量で処置された通常NSGマウスよりも2倍高かった。脾臓のATVレベルは、通常NSGマウスとは異なり、処置マウスにおいて肝臓ATVレベルよりも1ログ高かった。脳のATVレベルは、定量限界であった。HIV-1感染マウスのナノART処置後のCD4細胞とCD4CD8細胞との比は、非感染マウスと同様であった。しかし、ナノATV/RTVおよびナノATV/RTV/EFVは両方とも、これらのマウスのHIV-1感染に対して防御的であった両方の療法は、p24レベルをほぼ検出不可能なレベルに低下させた。また、マウスに、わずか10mg/kgのナノ粒子または遊離薬物をSC注射により投与した。表4に見られるように、この低用量のナノ粒子が、遊離薬物より優れた、驚くほど高レベルの薬物濃度をインビボでもたらした。最後に、賦形剤として葉酸修飾ポリマーを含有するナノATV/RTVが、血清のATV薬物レベルの増加、リンパ組織のATVレベルの増加、および治療効果の改善をもたらすか否かを判定した。葉酸-P407のATVナノARTを、HIV-1暴露後に、上記のようにPBLで再構成したNSGマウスに投与した。脾臓および肺のATVレベルは、Pl88-ナノATV/RTVで処置された動物と同様であった。腎臓、肝臓、および脳のATVレベルは、非修飾ナノARTよりも葉酸修飾ナノARTで処置されたマウスにおいて、それぞれ約5分の1に低下、約5倍上昇、および約10倍上昇していた。CD4細胞数とCD4/CD8細胞数との比は、非感染マウスで観察されたレベルに増加した。脾臓におけるHIV-1p24細胞およびRNAは、葉酸修飾ナノART処置マウスにおいて、ほぼ検出不可能なレベルに低下した。いくつかの刊行物および特許文献を、本発明が属する現況技術を記載するために上述の明細書の全体にわたって引用する。これらの引用文献のそれぞれの開示全体を、参照により本明細書に組み込むものとする。いくつかの本発明の好ましい実施形態を、上記に記載しかつ具体的に例示しているが、本発明をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲で述べられる本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。"