生物サンプル中のハプトグロビンマトリックスメタロプロテイナーゼ9複合体を検出するための方法であって、固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートしてHpMMP9を捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体を含むステップ、および結合したHpMMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHpMMP9を検出するステップを含む方法。生物サンプル中のHpMMP9の濃度を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。HpMMP9の濃度を決定するステップが、HpMMP9と結合する検出可能な抗体の量を一組の標準物質と比較するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。生物サンプル中のHpMMP9の濃度が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを示す濃度の範囲内であるかどうか決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを診断するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。濃度の範囲が約900ngml~約1500ngmlのHpMMP9である、請求項4に記載の方法。生物サンプルが哺乳動物から得られる、請求項1に記載の方法。哺乳動物がヒトおよび畜牛から選択される、請求項6に記載の方法。生物サンプルが畜牛から得られる、請求項5に記載の方法。Hpと結合する検出可能な抗体が、発色検出剤、蛍光検出剤、酵素検出剤、および電気化学発光検出剤から選択される検出剤を含む、請求項1に記載の方法。検出剤がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項9に記載の方法。検出可能な抗体がHRP結合ウサギ抗ウシHpである、請求項10に記載の方法。体液サンプル中のHpMMP9の濃度を決定することにより急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を同定するための方法であって、MMP9またはHpの1つに特異的な第一のモノクローナル抗体を入手し、前記モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、患者から体液のサンプルを入手するステップであって、前記サンプルがHpMMP9またはHpMMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、前記サンプルをステップの前記モノクローナル抗体に加えるステップであって、前記サンプル中に含有される前記HpMMP9またはHpMMP9の免疫原性断片を前記モノクローナル抗体によって捕捉するステップ、他のMMP9およびHpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、前記第二の抗体を検出物質で標識するステップ、ステップの前記第二の抗体をステップ中で捕捉した前記HpMMP9またはHpMMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップの前記第二の抗体がステップ中で捕捉した前記HpMMP9またはHpMMP9の免疫原性断片と結合するステップ、前記検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および前記反応産物を測定して前記サンプル中のHpMMP9の濃度を決定するステップ、および前記サンプル中の前記HpMMP9の濃度がHpMMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より高く上昇するかどうか決定するステップであって、前記上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを同定するステップを含む方法。前記カットオフ濃度が約900ngmlである、請求項12に記載の方法。検出物質がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項12に記載の方法。レポーターが過酸化水素である、請求項14に記載の方法。生物サンプル中のHpMMP9を検出するための方法であって、MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、生物サンプルをマイクロタイタープレートに加えるステップ、Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、過酸化水素をマイクロタイタープレートに与えるステップ、およびステップ~の結果として生じる反応を標準曲線と比較してHpMMP9のレベルを決定するステップを含む方法。生物サンプル中のHpMMP9のレベルが急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを示す濃度の範囲内であるかどうか決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを診断するステップをさらに含む、請求項16に記載の方法。濃度の範囲が約900ngml~約1500ngmlのHpMMP9である、請求項17に記載の方法。生物サンプルが哺乳動物から得られる、請求項16に記載の方法。哺乳動物がヒトおよび畜牛から選択される、請求項19に記載の方法。生物サンプルが畜牛から得られる、請求項18に記載の方法。本発明のいくつかの例示的な態様を以下に述べる。これらの態様は本発明のいくつかの形がとり得る簡単な要約を読者に提供するためのみに表すこと、およびこれらの態様は本発明の範囲を制限することは意図しないことは理解されるはずである。実際本発明は、以下で明確には述べることができない様々な態様を包含することができる。前に記載したように、対象が急性炎症状態またはそのリスクに罹患しているかどうか検出するための、信頼できる有効な方法は現在存在しない。経時的に一地点において1つのバイオマーカーを正確且つ迅速に測定する技法により診断を施し、それによって早期診断および診断に必要な時間中の疾患進行の最小化を可能にすることが理想的である。以前に、Hpとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の共有結合した、ヘテロマー複合体が、腹部または胸部の急性敗血症性炎症を有する畜牛の好中球顆粒および血清において確認されているBannikovGA、MattoonJS、AbrahamsenEJ、PremanandanC、GreenChurchKB、MarshAE、LakritzJ、Biochemicalandenzymaticcharacterizationofpurifiedcovalentcomplexesofmatrixmetalloproteinase9andhaptoglobinreleasedbybovinegranulocytesinvitro、AmJVetRes68995~1004頁。大部分のこれらの例では、混合型の細菌性敗血症が明らかであったBannikovGA、MattoonJS、AbrahamsenEJ、PremanandanC、GreenChurchKB、MarshAE、LakritzJ、Biochemicalandenzymaticcharacterizationofpurifiedcovalentcomplexesofmatrixmetalloproteinase9andhaptoglobinreleasedbybovinegranulocytesinvitro、AmJVetRes68995~1004頁。炎症中に主に肝臓によって産生される遊離Hpとは対照的に、HpMMP9複合体は脱顆粒時に好中球から放出されるBannikovGA、MattoonJS、AbrahamsenEJ、PremanandanC、GreenChurchKB、MarshAE、LakritzJ、Biochemicalandenzymaticcharacterizationofpurifiedcovalentcomplexesofmatrixmetalloproteinase9andhaptoglobinreleasedbybovinegranulocytesinvitro、AmJVetRes68995~1004頁。これは、血清中に存在するHpMMP9複合体は、好中球活性化および脱顆粒の症状発現であることを示唆する。本発明の様々な態様は、invitroで好中球により産生され急性期血清において見られる、ハプトグロビンとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の複合体、すなわちHpMMP9複合体は、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独とは異なる特異的機能有意性を有するという概念を対象とする。したがって、HpMMP9の血清中濃度は、急性炎症中に生じる臨床上重要な事象の独立指標として働き得る。このように、ヒト、畜牛、および他の哺乳動物における全身性好中球活性化を具体的に確認する方法を提供することにより、哺乳動物における急性敗血症性炎症疾患の指標としての非複合体HpまたはMMP9単独に関するELISAと比較した、HpMMP9複合体ELISAの有用性が存在する。したがって、本発明の一態様は、対象由来のサンプル中のバイオマーカー、または特定濃度のバイオマーカーの存在を検出することにより、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出する方法を提供する。サンプルは、血清分画などの血液サンプルであってよい。一実施形態では、バイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質を含むことができる。バイオマーカーは、血清タンパク質ハプトグロビン、または血清タンパク質ハプトグロビンのアイソフォームを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素と複合体形成した血清タンパク質などのタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ9などを含むことができる。バイオマーカーは、様々なアイソフォームのHpMMP9複合体を含むことができる。一実施形態では方法は、対象から回収したサンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するステップを含むことができる。この実施形態の方法は、その濃度と一定範囲の標準濃度を比較するステップも含むことができる。別の実施形態では、方法は、異なるときに対象から回収したサンプル中のバイオマーカーのレベルを比較するステップを含むことができる。さらに別の実施形態では、方法は、同じ対象または異なる対象由来の参照バイオマーカーとバイオマーカーを比較するステップを含むことができる。本発明の別の態様は、前に記載した方法を実施するための試験を提供する。一実施形態では、試験は酵素結合免疫吸着アッセイであってよい。1つのこのようなELISA試験の実施形態は、生物サンプル中のHpMMP9複合体の1つまたは複数のアイソフォームを検出するための方法を対象とする。この方法は、固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートして複数のHpMMP9のアイソフォームを捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体などの抗体を含むステップ、および結合したHpMMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHpMMP9を検出するステップを含む。別のELISA試験の実施形態は、体液サンプル中のHpMMP9の濃度を決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を確認するための方法を対象とする。この方法は、MMP9に特異的なモノクローナル抗体を入手し、モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、患者から体液のサンプルを入手するステップであって、サンプルがHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、サンプルをステップのモノクローナル抗体に加えるステップであって、サンプル中に含有されるHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片を前記モノクローナル抗体によって捕捉するステップ、Hpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、第二の抗体を検出物質で標識するステップ、ステップの第二の抗体をステップ中で捕捉したHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップの第二の抗体がステップ中で捕捉したHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片と結合するステップ、検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および反応産物を測定してサンプル中のHpMMP9の濃度を決定するステップ、およびサンプル中のHpMMP9の濃度がHpMMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より上昇するかどうか決定するステップであって、上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを確認するステップを含む。別のELISA試験の実施形態は、血漿または血清中のHpMMP9を検出して急性炎症状態またはそのリスクをスクリーニングするための方法を対象とする。この試験は、MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、血清または血漿をマイクロタイタープレートに加えるステップ、Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、過酸化水素を反応物質としてマイクロタイタープレートに与えるステップ、およびステップ~の結果として生じる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したHpMMP9のレベルを決定するステップを含む。本特許または出願は色を施した少なくとも1つの図面を含有する。色付き図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要求に応じて必要な料金を支払うことにより特許事務所により提供される。本出願中に組み込まれ、本出願の一部を構成する添付の図面は、本発明の原理を説明するのに役立つ、前に示した本発明の一般的記載および以下に示す実施形態の詳細な説明と一緒に、本発明の実施形態を例示する。本発明の1つまたは複数の具体的な実施形態を以下に記載する。これらの実施形態の簡潔な説明を提供するための尽力において、実装の全ての特徴を本明細書中に記載できるわけではない。任意の工学または設計プロジェクトなどの、任意のこのような実装の開発において、多数の実装固有の決定を施して、一実装から他の実装で変わり得るシステム関連およびビジネス関連制約に関するコンプライアンスなどの、開発者の具体的な目標を達成するに違いないことは理解されるはずである。さらに、このような開発尽力は複雑で時間を浪費する可能性があるが、それにもかかわらず、当業者にはこの開示の利点を有する設計、製作、および製造の通常の作業であることは理解されるはずである。前に記載したように、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出するための、信頼できる有効な方法は現在存在しない。定義本明細書で使用する用語HpMMP9は、ハプトグロビンとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の複合体を指す。複合体は2つ以上の結合ポリペプチド鎖の一群であり、本明細書においてHpMMP9複合体は、2つの結合ポリペプチド鎖、ハプトグロビンに関する鎖およびマトリックスメタロプロテイナーゼ9に関する鎖の一群である。当業者には知られているように、ハプトグロビンはヒトにおいてHp遺伝子によってコードされるタンパク質である。血漿中で、ハプトグロビンは赤血球から放出された遊離ヘモグロビンと高い親和性で結合し、これによってその酸化活性を阻害する。次いでハプトグロビンヘモグロビン複合体は細網内皮系により除去される。マトリックスメタロプロテイナーゼは亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。それらは全ての種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解することができるだけでなく、いくつかの生物活性分子を処理することもできる。それらは、細胞表面受容体の切断、アポトーシスリガンドの放出、およびケモカインサイトカイン活性化に関与することが知られている。MMPは、細胞増殖、移動、分化、血管新生、アポトーシスおよび宿主防御などの細胞挙動に関して主要な役割を果たすとも考えられる。MMPは共通のドメイン構造を共有する。3つの共通ドメインは、プロペプチド、触媒ドメイン、および柔軟なヒンジ領域により触媒ドメインと連結したヘモペキシン様C末端ドメインである。MMPの中で、2つ、MMP2とMMP9はゼラチナーゼである。ゼラチナーゼの主要基質はIV型コラーゲンとゼラチンであり、これらの酵素は触媒ドメイン中に挿入された追加的ゼラチン結合ドメインの存在によって区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフの直前に位置し、触媒ドメインの構造を妨害しない別個のフォールディングユニットを形成する。用語検出は、標的分子の定性測定と定量測定の両方を含むように広い意味で使用される。一態様では、本明細書に記載する検出法は、生物サンプル中の単なるHpMMP9の存在を確認するために使用する。別の態様では、この方法を使用して、サンプル中のHpMMP9が特定レベルであるかどうか試験する。さらに別の態様では、この方法を使用して、サンプル中のHpMMP9の量を定量化することができ、さらに異なるサンプル由来のHpMMP9レベルを比較することができ、またはサンプル中のHpMMP9の量を参照標準物質と比較することができる。用語生物サンプルは、任意の哺乳動物など、例えばヒトなどの、任意の動物由来の身体のサンプルを指す。このようなサンプルには、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、濾胞液、精液、羊水、乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、肺洗浄液、涙、汗、粘液などの生体液、および組織培養培地、および均質組織などの組織抽出物、ならびに細胞抽出物がある。用語捕捉用試薬は、捕捉用試薬標的分子複合体をサンプルの残りから切り離すことができるような適切な条件下で、サンプル中の標的分子と結合し捕捉することができる試薬を指す。典型的には、捕捉用試薬は固定化されるかまたは固定化可能である。サンドイッチイムノアッセイでは、捕捉用試薬は、標的抗原に対する抗体または異なる抗体の混合物であってよい。用語検出可能な抗体は、検出剤により増幅した標識を介して直接的、または例えば標識した別の抗体を介して間接的のいずれかで、検出することができる抗体を指す。直接標識に関して、典型的には、いくつかの手段により検出可能な成分と抗体を結合させる。1つのこのような抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した抗体である。用語検出剤は、検出可能な抗体の存在を検出するために使用する成分または技法を指し、マイクロタイタープレート上に捕捉された標識などの、固定化標識を増幅する検出剤を含む。1つのこのような検出剤は過酸化水素である。用語抗体は広義で使用し、それらが望ましい結合特異性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、および抗体断片を含む。本明細書で使用する用語モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る考えられる天然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、1つの抗原エピトープに対して作られている。さらに、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を典型的に含む従来の抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の1つの抗原決定基に対して作られる。修飾語モノクローナルは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要とされると解釈すべきではない。例えば、本発明に従い使用するモノクローナル抗体はKohleretalNature256495により記載されているハイブリドーマ法により作製することができ、または組換えDNA法により作製することができる。モノクローナル抗体は、例えばClacksonetalNature352624~628頁およびMarksetalJMolBiol222581~597頁中に記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。治療目的の哺乳動物は、ヒト、飼育動物、および家畜、および動物園用、スポーツ、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含めた哺乳動物として分類される任意の動物を指す。本発明の様々な態様では、哺乳動物はヒトまたは畜牛であってよい。全身性炎症反応症候群またはSIRSは、ヒトにおいて24時間の間に2つ以上の以下の条件、38°Cを超える体温または36°C未満の体温、一分間当たり90拍を超える心拍数、一分間当たり20拍を超える呼吸数、または32mmHg未満のPCo2、または必要な機械的換気、および120×109個の細胞Lを超える白血球数または40×109個の細胞L未満の白血球数のいずれか、または10を超える未熟な帯状体を有する白血球細胞によって現れる、様々な重度の臨床的傷害に対する臨床応答を指す。SIRSのこれらの症状は、将来改善される定義によって改変または変更される可能性があるSIRSの一般的な定義を表す。現在の臨床診療を明らかにするためにこの定義を使用し、本発明の重要な態様を表すものではない。SIRSがある対象には、前に定義したSIRSとして分類されるが、臨床上は敗血症とみなされない臨床症状がある。敗血症は、確認済みの感染プロセスと関係があるSIRS陽性状態を指す。敗血症の臨床的な疑いは、SIRS患者のSIRS陽性状態は感染プロセスの結果であるという疑いから生じる。本明細書で使用する敗血症は、敗血症の発症、重度の敗血症および末期段階の敗血症と関係があるMOFを含めた全段階の敗血症を含むが、これらだけには限定されない。敗血症の発症は、敗血症の初期段階、すなわち臨床症状発現が敗血症の臨床的疑いを支持するのに十分であるときの段階以前を指す。本発明の方法は、従来技法を使用して敗血症が疑われるときより前の敗血症を検出するために使用されるので、敗血症の症状発現が臨床上より明らかであるとき、初期敗血症における患者の病状は回顧的にのみ確認することができる。それによって患者が敗血症になる正確なメカニズムは、本発明の重要な態様ではない。本発明の方法は、感染プロセスの源とは無関係にバイオマーカープロファイルの変化を検出することができる。どのように敗血症が生じるかとは無関係に、本発明の方法は、以前に使用された基準によって分類される敗血症またはSIRSを有する、または有する疑いが有る患者の状態を決定することができる。重度の敗血症は、臓器不全、低灌流異常、または敗血症誘導型低血圧と関係がある敗血症を指す。低灌流異常には、乳酸アシドーシス、尿量減少、または精神状態の急性変化があるが、これらだけには限定されない。敗血症性ショックは、適切な静脈内液注入に反応せず末梢低灌流の症状発現を伴う敗血症誘導型低血圧を指す。バイオマーカーは、生物サンプル中に存在し、生物サンプルから単離可能またはそこで測定することができる、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機または無機化合物、天然ポリマー、および小分子などの、ほぼ任意の生物学的化合物である。さらに、バイオマーカーは完全で無傷の分子であってよく、またはバイオマーカーは、一部分が機能的であり得るか、または例えば抗体もしくは他の特異的結合タンパク質によって認識され得る、分子の一部であってよい。バイオマーカーは、そのバイオマーカーの測定可能な態様が、敗血症の特定段階などの対象の所与の状態と関係があるかどうか示すと考えられる。このような測定可能な態様は、例えば、対象由来の生物サンプル中の、バイオマーカーの存在、不在、または個々の濃度を含み得る。表現型変化は、対象の所与の状態と関係があるパラメーターの検出可能な変化である。例えば、表現型変化は体液中のバイオマーカーの増大または減少を含む可能性があり、この場合変化は敗血症または敗血症の発症と関係がある。表現型変化は、バイオマーカーの測定可能な態様の変化ではない、患者の所与の状態の検出可能な態様の変化をさらに含む可能性がある。例えば、表現型の変化は、体温、呼吸数、拍数、血圧、または他の生理学的パラメーターの検出可能な変化を含む可能性がある。このような変化は、当業者によく知られている従来技法を使用して、臨床的観察結果および測定により決定することができる。本明細書で使用する従来技法は、本発明によりバイオマーカープロファイルを得ることなく、表現型の変化に基づいて個体を分類する技法である。アイソフォームは、可変スプライシングまたは翻訳後修飾を経たタンパク質を意味すると理解されよう。例えば、細胞は一般に、一遺伝子を多くの関連タンパク質に転写および翻訳する。アイソフォームと呼ばれるタンパク質間の違いは、本来翻訳されるタンパク質の変化の結果である。800を超える周知の翻訳後修飾が存在し、タンパク質切断断片、リン酸化、グリコシル化、脂質化、架橋、タンパク質フォールディング、他の分子との水素結合相互作用、他の分子とのファンデルワールス力による相互作用、および他の分子との共有結合相互作用などを含むが、これだけには限定されない。本発明の様々な態様は、invitroで好中球により産生され急性期血清において見られるHpMMP9複合体は、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独とは異なる特異的機能有意性を有するという概念を対象とする。さらに、HpMMP9の血清中濃度は、急性炎症中に生じる臨床上重要な事象の独立指標として働き得る。畜牛における急性敗血症性炎症疾患の指標としての非複合体HpまたはMMP9単独に関するELISAと比較した、HpMMP9複合体ELISAの有用性を本明細書において評価する。血清中HpMMP9複合体は急性敗血症性炎症を有する動物中に存在し、したがってヒト、畜牛、および他の哺乳動物における全身性好中球活性化を具体的に確認するための手段をもたらし得る。したがって、本発明の一態様は、対象由来のサンプル中のバイオマーカー、または特定濃度のバイオマーカーの存在を検出することにより、対象が急性炎症状態に罹患しているかまたはそのリスクがあるかどうか検出する方法を提供する。サンプルは、血清分画などの血液サンプルであってよい。一実施形態では、バイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質を含むことができる。バイオマーカーは、血清タンパク質ハプトグロビン、または血清タンパク質ハプトグロビンのアイソフォームを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素と複合体形成した血清タンパク質などのタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ9などを含むことができる。バイオマーカーは、いくつかのHpMMP9複合体のアイソフォームを含むことができる。一実施形態では方法は、対象から回収したサンプル中のバイオマーカーの濃度を決定するステップを含むことができる。この実施形態の方法は、その濃度と一定範囲の標準濃度を比較するステップも含むことができる。別の実施形態では、方法は、異なるときに対象から回収したサンプル中のバイオマーカーのレベルを比較するステップを含むことができる。さらに別の実施形態では、方法は、同じ対象または異なる対象由来の参照バイオマーカーとバイオマーカーを比較するステップを含むことができる。具体的な実施形態がバイオマーカーとしてのHpMMP9を対象としているが、当業者は、他のマーカーを使用する他の試験を、本明細書に記載する指針および技法を使用して開発することができることを理解している。例示的なバイオマーカーは、血清タンパク質などのタンパク質、核酸またはヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖タンパク質、糖脂質、タンパク質断片、ホルモン、ステロイド、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、免疫調節物質、細胞、血液学的パラメーター、サンプル中の細胞からのゲノム発現、およびこれらの組合せを含むことができる。一実施形態では、バイオマーカーは、ハプトグロビン、トランスフェリン、ヘモペキシン、アルブミンなどの血清タンパク質のアイソフォーム、およびこれらの組合せである。一実施形態では、バイオマーカーはハプトグロビンを含む。別の実施形態では、バイオマーカーはマトリックスメタロプロテイナーゼを含むことができる。バイオマーカーは、前に記載したようにタンパク質の複合体を含むことができる。特定の一実施形態では、バイオマーカーは、ハプトグロビンとマトリックスメタロプロテイナーゼ9の複合体を含むことができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーはタンパク質のアイソフォームである。バイオマーカーを検出するために使用するサンプルの例には、全血、血清分画、血漿分画などの血液の分画、または白血球細胞または赤血球細胞などの細胞分画、他の液体、細胞、組織、およびこれらの組合せがある。バイオマーカーおよびバイオマーカーのレベルは、そのバイオマーカーと選択的に結合する化合物を用いて検出することができる。選択化合物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、受容体、ファージディスプレイ、ペプチド、タンパク質断片、核酸、核酸の配列、リボ核酸、デオキシリボ核酸、小分子、およびこれらの組合せを含むことができる。選択化合物は検出系と連結または結合させて、検出バイオマーカーのレベルを示すことが可能である。例示的な検出系は、試験片、チップ、スライド、マイクロアレイ、タイタープレート、膜、電極、プローブ、ビーズ、カラム、マトリックス、ゲル、および液体を含むが、これだけには限定されない、エレメントを有し得る。しかしながら、バイオマーカーの結合以外により検出を行うことができることは、当業者によって理解される。例えば、バイオマーカーの大きさ、電荷、構造、およびまたは配列などの化学的パラメーターを分析することにより、バイオマーカーレベルを代替的に検出することができる。バイオマーカーまたはバイオマーカーのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ、ゲル電気泳動、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ、タンパク質ブロッティング、試験片、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、結合アッセイ、質量分析法、マイクロアレイ、ゲノムマイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写PCR、リアルタイムRTPCR、およびこれらの組合せを使用して検出することができる。一実施形態では、ELISAでバイオマーカーを検出する。一実施形態では、バイオマーカーのレベルの比較は、対象から回収した少なくとも2つのサンプル中の、バイオマーカーのレベルを比較することにより検出することができる。2つのサンプルは異なるときに、または異なる源から回収することができる。第二の入手サンプル中の量が第一の入手サンプル中の量より多いとき、第一サンプルからのバイオマーカーのレベルを第二サンプル中のバイオマーカーのレベルと比較して、対象中で増大したHpMMP9の存在を判定する。別の実施形態では、参照バイオマーカーのレベルとバイオマーカーのレベルを比較することにより、バイオマーカーのレベルを検出することができる。これは、急性炎症状態などの状態、またはそのリスクの有無を示し得る。一実施形態では、参照バイオマーカーは別の対象に由来する。この文脈での別の対象は、1つまたは複数の他の対象を意味すると理解され、急性炎症状態またはそのリスクのいずれかの有無を示すことがわかっている対象集団において見られる参照バイオマーカーのレベルを表し得る。本発明は、対象中のHpMMP9の存在を検出するために、前に記載した方法中で使用するためのキットも含む。キットの例示的な用途には、試験対象における炎症状態またはそのリスクの存在の判定がある。キットは、対象由来のサンプル中のバイオマーカーの存在およびレベルの検出に適合させたデバイスおよび試薬を含む。本発明の別の態様は、前に記載した方法を実施するための試験を提供する。一実施形態では、試験はELISAであってよい。1つのELISA試験の実施形態は、生物サンプル中のハプトグロビンマトリックスメタロプロテイナーゼ9複合体の複数のアイソフォームを検出するための方法を対象とする。この方法は、固体担体上に固定化した捕捉用試薬と生物サンプルをインキュベートして複数のHpMMP9のアイソフォームを捕捉用試薬と結合させるステップであって、捕捉用試薬がMMP9と結合するモノクローナル抗体などの抗体を含むステップ、および結合したHpMMP9をHpと結合する検出可能な抗体と接触させることにより、固定化捕捉用試薬と結合したHpMMP9を検出するステップを含む。別のELISA試験の実施形態は、体液サンプル中のHpMMP9の濃度を決定することにより、急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有する患者を確認するための方法を対象とする。この方法は、MMP9に特異的なモノクローナル抗体を入手し、モノクローナル抗体を固体担体に結合させるステップ、患者から体液のサンプルを入手するステップであって、サンプルがHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片を含有する疑いがあるステップ、サンプルをステップのモノクローナル抗体に加えるステップであって、サンプル中に含有されるHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片をモノクローナル抗体によって捕捉するステップ、Hpに特異的な第二の抗体を提供するステップ、第二の抗体を検出物質で標識するステップ、ステップの第二の抗体をステップ中で捕捉したHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片に加えるステップであって、ステップの第二の抗体がステップ中で捕捉したHpMMP9およびまたはHpMMP9の免疫原性断片と結合するステップ、検出物質と反応するレポーターを加えて反応産物を形成するステップ、および反応産物を測定してサンプル中のHpMMP9の濃度を決定するステップ、およびサンプル中のHpMMP9の濃度がHpMMP9の濃度を示す選択カットオフ濃度より上昇するかどうか決定するステップであって、上昇した濃度により患者が急性炎症状態または急性炎症状態のリスクを有することを確認するステップを含む。別のELISA試験の実施形態は、血漿または血清中のHpMMP9を検出するための方法を対象とする。この試験は、MMP9に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を提供するステップ、抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートを提供するステップ、血清または血漿をマイクロタイタープレートに加えるステップ、Hpと反応性があるホースラディッシュペルオキシダーゼ抗Hp結合体をマイクロタイタープレートに与えるステップ、過酸化水素を反応物質としてマイクロタイタープレートに与えるステップ、およびステップ~の結果として生じる反応を標準曲線と比較して、正常個体と比較したHpMMP9のレベルを決定するステップを含む。一実施形態では、本明細書に記載するアッセイはマルチサイトイムノアッセイである。このアッセイの一実施形態の第一ステップでは、生物サンプルを接触させ、抗MMP9モノクローナル抗体であってよい1つまたは複数の固定化捕捉試薬とインキュベートする。これらの抗体は任意の種に由来してよいが、モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体であることが多い。モノクローナル抗体は、当業者によく知られている方法によって調製することができる。例えば、ウシ好中球により産生されたアフィニティー精製MMP9モノマーとダイマーの混合物を、BALBCマウスの免疫感作に使用した。マウスは7日間隔で、100μgの精製MMP9で二回免疫感作した。4週間後、マウスを4日間毎日100μgのMMP9で追加抗原刺激し、4日後、脾細胞はB細胞ミエローマSP20と融合させ、96ウエルプレート中に平板培養した。ハイブリドーマは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、KohlerG、MilsteinC、Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity、Nature256495~497頁中に記載されているように、当業者によく知られている確立した方法に従い、100μΜのヒポキサンチン、04μΜのアミノプテリン、および16μΜのチミジンの存在下で選択した。参照により本明細書に組み込まれている、KohlerG、MilsteinC、Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity、Nature256495~497頁中に記載されているようにELISAにより試験してMMP9に対する特異性を有する抗体を分泌したクローンを、二回の限界希釈によりさらにクローニングして、クローン性を確実にした。クローン101を、バイオリアクター中での陽性反応性および細胞増幅用に選択しCelline、CL1000、SartoriusStedim、NorthAmerica、IncBohemiaNY11716、それは以下のように実施した。ハイブリドーマ細胞はCL1000の細胞コンパートメント中に維持し、約7日間隔で採取した。採取中、細胞および上清を細胞コンパートメントから回収し、採取分画は細胞コンパートメントに新鮮な培地とともに再接種した。栄養培地は除去し、採取の日に新鮮な培地と交換した。方法マウスハイブリドーマ細胞系を凍結ストックから解凍し、静置培養培地で増殖させた。静置培養培地中での一貫した細胞倍加を実証した後、CL1000デバイス中に細胞を接種した。細胞コンパートメント培地RPMI16402×Lグルタミン、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン。基本培地に10FBSを補充した。ハイブリドーマ増殖サプリメントの培地への追加補充を行い、従来型フラスコ中での同じ細胞系の事前のバッチ産生実験と一貫した状態を保った。栄養培地RPMI16402×Lグルタミン、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシンおよび08のFBS、01のVitacyte。接種第0日に静置培養培地からCL1000デバイスの細胞コンパートメントに、20ml体積で細胞を接種した。30×106個細胞mlを超える接種密度を維持した。細胞は凍結ストック初代培養物から除去し、接種前に新鮮な細胞コンパートメント培地に再縣濁した。栄養培地を栄養培地コンパートメントに供給し、デバイスは5C02、37°Cで湿度調節機能付き組織培養インキュベーター中に置いた。採取採取時に、全細胞コンパートメント体積をピペットによりCL1000ユニットから除去した。サンプルを希釈し標準的な血球計を使用して計数することにより、細胞数を測定した。生命力のある細胞は、トリパンブルー染色および位相差顕微鏡により非生存細胞と区別した。細胞コンパートメント含有物は、採取時に細胞コンパートメント中の細胞数により測定し3~5倍に戻し分けた。新鮮な細胞コンパートメント培地を細胞分画に加え20ml体積を得て、細胞縣濁液は細胞コンパートメントに戻した。採取した細胞を含有する上清分画は滅菌状態に保ち、アフィニティークロマトグラフィーによる精製まで4°Cに保存した。細胞コンパートメント採取時に、栄養培地を除去し、新鮮な培地と交換した。デバイスは次の採取までインキュベーターに戻した。デバイスはインキュベーター内で互いに積み重ねた。抗体精製製造者のプロトコールに従い、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから抗体を溶出することにより培養上清を処理した。溶出抗体分画を回収し、プールし、分光光度計およびELISAにより抗体を定量化した。ポリクローナルヤギ抗マウスIgGまたはIgM捕捉用抗体およびペルオキシダーゼで標識したポリクローナル抗マウスIgGまたはIgM抗体を用いて、サンドイッチELISAを実施した。ABTSで発色させた。SDSPAGEおよびクーマシーブルー染色により抗体純度を評価した。従来、固定化は、非水溶性マトリックスまたは表面への吸着、または例えば、米国特許第3645852号中またはRotmansetalJImmunolMethods5787~98頁中に記載されているような、硝酸および還元剤を例えば用いた担体の事前の活性化有りまたは無しで、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミド系架橋剤を使用する非共有結合もしくは共有結合により、アッセイ手順前、または例えば後の免疫沈降のいずれかで、捕捉用試薬の不溶化により実施されている。固定化に使用する固相は、例えば表面、粒子、多孔性マトリックスなどの型の支持体を含めた、ほぼ非水溶性であり免疫測定アッセイにおいて有用である、任意の不活性支持体または担体であってよい。一般に使用される支持体の例には、小片、Sephadex、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、および96ウエルマイクロタイタープレートを含めた、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造されたアッセイプレートまたは試験管、ならびに濾過紙、アガロース、架橋デキストラン、および他の多糖などの微粒子材料がある。あるいは、米国特許第3969287号、米国特許第3691016号、米国特許第4195128号、米国特許第4247642号、米国特許第4229537号および米国特許第4330440号中に記載されている臭化シアン活性化炭水化物および反応性基質などの反応性非水溶性マトリックスを、捕捉用試薬の固定化に利用するのが適している。一実施形態では、固定化された捕捉用試薬をマイクロタイタープレート上にコーティングし、特に使用する一つの例示的な固相は、一度に数個のサンプルを分析するために使用することができるマルチウエルマイクロタイタープレートである。一つのこのようなELISAプレートは、DynatechImmobilonIIとして販売されているプレートである。固相は、非共有結合または共有結合相互作用または必要に応じて物理的連結により連結することができる、前に記載した試薬などの捕捉用試薬でコーティングする。結合に関する技法には、米国特許第4376110号およびその中に引用された参照文献中に記載されている技法がある。共有結合の場合、プレートまたは他の固相は、当技術分野でよく知られている条件下で、捕捉用試薬と一緒に架橋剤と共にインキュベートする。固相基質に予め混合させた捕捉用試薬を結合させるのに、一般に使用される架橋剤には、例えば、11ビス2フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Nヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4アジドサリチル酸とのエステル、33ジチオビスなどのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、およびビスNマレイミド18オクタンなどの二官能性マレイミドがある。メチル3ジチオプロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生成する。96ウエルプレートを利用する場合、それらは一般に捕捉用試薬の混合物でコーティングする。プレートはアッセイ前に積み重ねそれ自体を長時間コーティングすることができ、次いでアッセイを、手動、ロボットの使用などにより半自動、または自動式に、いくつかのサンプルに同時に実施することができる。コーティングしたプレートは、次いで、典型的には、結合部位に非特異的に結合し飽和状態にしてプレートのウエル上の過剰部位と遊離リガンドの望ましくない結合を防止する、ブロッキング剤を用いて処理する。この目的に適したブロッキング剤の例には、例えば、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、およびノンファットミルクがある。特定の一実施形態では、BSA、20mgml、TBS中またはSuperBlockブロッキングバッファーをブロッキング剤として使用する。典型的にはブロッキング処理は、周囲温度の条件下で約1~4時間行う。コーティングおよびブロッキング後、適切に希釈した分析する生物サンプルを固定化相に加える。特定の実施形態では、希釈率は約25体積~20体積、約10体積などである。この目的で希釈に使用することができるバッファーにはTBS1mgmLBSAがある。使用する捕捉用試薬の量は、HpMMP9標準と比較して良い兆候をもたらすほど十分多い。十分な感度のため、一般に加える生物サンプルの量は、サンプルの適切な希釈後、固定化捕捉用試薬が生物サンプル中で予想される遊離HpMMP9の最大モル濃度のモル過剰であるような量である。この予想レベルは、分析する特定の生物サンプル中の遊離HpMMP9の濃度レベルと患者の臨床状態の間の、任意の知られている相関関係に主に依存する。一般に、全試薬の濃度を滴定してELISAの最適な結果を得なければならない。したがって、これらの実施形態では、捕捉用試薬の濃度は、生物サンプルの任意の必要な希釈を考慮してHpMMP9の対象の濃度範囲により一般に決定するが、捕捉用試薬の最終濃度は実験により決定して、対象の範囲にわたるアッセイの感度を最大にする。サンプルのインキュベーションおよび固定化捕捉用試薬に関する条件を選択して、アッセイの感度を最大にし解離を最小にする。一般にインキュベーションは、約3°C~約5°Cの範囲のほぼ一定温度で実施して、例えば室温より変動が少ない、低い変動係数を得る。インキュベーション時間は主に温度に依存し、一般にアッセイ感度の低下を避けるため約2時間を超えない。一般にインキュベーション時間は、捕捉用試薬と遊離HpMMP9の結合を最大にするため3°C~5°Cで約2時間である。この段階で、インキュベーション混合物のpHは通常約72~75の範囲内である。インキュベーションバッファーのpHを選択して、捕捉するHpMMP9と捕捉用試薬の有意なレベルの特異的結合を維持する。ホウ酸、リン酸、炭酸、トリスHClまたはトリスリン酸、酢酸、バルビトールなどを含めた様々なバッファーを利用して、このステップ中に望ましいpHを獲得および維持することができる。利用する個々のバッファーは本発明には重要ではない。本明細書のアッセイ法の第二のステップでは、生物サンプルを固定化捕捉用試薬から分離して非捕捉HpMMP9を除去する。洗浄に使用する溶液は一般に、インキュベーションステップ用の前に記載した考慮事項およびバッファーを使用して決定したpH、約72~75のpH範囲を有するバッファーである。洗浄は三回以上行うことができる。洗浄の温度は一般に冷蔵温度から適温であり、アッセイ期間中は一定温度、典型的には約22°C~25°Cを保つ。次のステップでは、任意の固定化複合体を、約22°C~25°Cなどの温度で検出可能な抗体と接触させ、2つの接触に関する温度および時間は利用する検出物質に主に依存する。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび過酸化水素を検出手段として使用し、接触は一般に1時間~2時間実施してシグナルを最大に増幅する。検出可能な抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。さらに、検出可能な抗体は直接検出可能であってよく、蛍光または比色定量標識を有してよい。一般に、予想される最大濃度の捕捉HpMMP9に対してモル過剰の抗体を、洗浄した後のプレートに加える。この抗体はポリクローナル抗体であってよいが、任意の抗体を利用することができる。抗体の親和性は一般に、少量の遊離HpMMP9を検出できるほど十分高いが、それが検出可能な抗体の非特異的バックグラウンド結合を引き起こすほど高くはない。アッセイ法の最後のステップでは、捕捉用試薬とその時点で結合しているHpMMP9の量を、検出可能な抗体用の検出物質を使用して測定する。したがって、固定化捕捉用試薬に加える抗体は直接標識されているか、または過剰な第一の非標識の検出可能な抗体を洗浄除去した後の、第一の抗体に対するモル過剰の第二の標識抗体の添加により、間接的に検出されるかのいずれかである。第一の抗体または第二の抗体のいずれかに使用する標識は、抗体と遊離HpMMP9の結合に干渉しない、任意の検出可能な機能性のあるものであってよい。適切な標識の例は、フルオロクロム、化学発光、発色、および放射性標識などの直接検出することができる成分、ならびに反応または誘導体化させ検出することが可能である酵素などの成分を含む、イムノアッセイにおける使用が知られている多数の標識である。このような標識の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、過酸化水素を利用する酵素と結合して色素前駆体を酸化するウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼ、ビオチンアビジン、ビオチンストレプトアビジン、ビオチンストレプトアビジンβガラクトシダーゼおよびMUG、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、レアアース擬似体またはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、23ジヒドロフタラジンジオンなどがある。従来の方法を利用して、これらの標識をタンパク質またはポリペプチドと共有結合させることが可能である。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミデート、ビスジアゾ化ベンジジンなどのカップリング剤を使用して、前に記載した蛍光、化学発光、および酵素標識で抗体をタグ化することができる。例えば、米国特許第3940475号および米国特許第3645090号HunteretalNature144945頁DavidetalBiochemistry131014~1021頁PainetalJImmunolMethods40219~230頁およびNygrenJHistochemandCytochem30407~412頁を参照。抗体とこのような標識の結合は、イムノアッセイ技法分野の当業者には標準的な操作手順である。例えば、OSullivanetalMethodsforthePreparationofEnzymeantibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay、inMethodsinEnzymology、edJJLangoneandHVanVunakis、Vol73、147~166頁を参照。最後の標識抗体の添加後、結合抗体の量を、洗浄により過剰な非結合標識抗体を除去し、次いでその標識に適した検出法を使用して結合標識の量を測定し、測定した量と生物サンプル中の遊離HpMMP9の量を関連付けることによって決定する。例えば酵素の場合、発色量および測定量は、存在するHpMMP9の量の直接的測定値である。キット便宜上、本発明のアッセイ法はキットの形で提供することができる。このようなキットは、ヒトHpMMP9分子に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体からなる捕捉用試薬、およびHpMMP9と結合する検出可能な抗体からなる検出用試薬の基本構成要素を含むパッケージ化された組合せである。一般にキットは、別の構成要素として提供することができる捕捉用試薬用の固体担体をさらに含み、または固体担体上に捕捉用試薬が既に固定化されている。したがって、キット中の捕捉用抗体は固体担体上に固定化することができ、またはそれらは、キットに含まれるかまたはキットと別に提供される担体上に固定化することができる。例えば、捕捉用試薬はマイクロタイタープレート上にコーティングすることができる。検出用試薬は直接検出される標識抗体、または異なる種で産生した非標識抗体に対する標識抗体により検出される非標識抗体であってよい。標識が酵素である場合、キットは酵素に必要とされる基質およびコファクターを通常含み、標識がフルオロフォアである場合、検出可能なクロモフォアをもたらす色素前駆体である。検出用試薬が非標識である場合、キットはさらに、蛍光検出形式などで、非標識抗体に対する標識抗体などの検出可能な抗体用の、検出物質を含むことができる。キットはまた、アッセイを実施するための説明書、およびまたは抗原標準物質としてHpMMP9、ならびに例えば安定剤、洗浄およびインキュベーションバッファーなどの他の添加剤を典型的に含有する。キットの構成要素は所定の割合で提供することができ、様々な試薬の相対量を適切に変えて、アッセイの感度をほぼ最大にする試薬の溶液中濃度をもたらす。特に、溶解時に試験対象のサンプルと組合せるのに適した濃度を有する試薬溶液をもたらす、賦形剤を含めた、通常は凍結乾燥状態の乾燥粉末として試薬を提供することができる。本発明の様々な態様を、以下の非制限的な実施例に関してさらに詳細に記載する。この実施例は、HpMMP9複合体が、非複合体型の遊離HpおよびMMP9単独と異なる特異的診断有意性を有することを実証する。且つ、本実施例は、HpMMP9複合体用の試験として使用することができるELISA、および急性炎症状態、またはそのリスクの指標として使用することができるHpMMP9複合体濃度の範囲を記載する。材料および方法動物35匹の畜牛をこの実施例において試験した。これらの動物は、様々な障害を評価するためにTheOhioStateUniversityVTHに与えられた動物、またはOhioStateUniversityWatermanDairyからサンプル採取した動物であった。動物は、通常の臨床病理学的後処理用、またはウシ群感染疾患調査の一部のためとして出血させた。凝固後に遠心分離により通常の形式で血清を採取し、分析まで20°Cに凍結させた。動物の年齢、品種、性別を、患者およびまたはウシ群の記録から記録した、Table1B、およびTable1Cにおいて開示する。畜牛は、死亡したかまたは安楽死させた動物における臨床兆候、病歴、ならびに臨床病理学的および病的評価の結果に基づいて、急性敗血症疾患、慢性疾患および正常な動物に分類した。これらの動物は院内で獣医師により調べられたので、それらは、ELISAによる血清中タンパク質の分析前に、それらの疾患カテゴリーに関して分類された。ELISAによりサンプルを分析した個体は個々の動物のアイデンティティーまたは分類が分からず、動物研究室の指定で唯一与えられた凍結血清サンプルであった。基準に含めるための動物の選択は、TheOhioStateUniversityVTHHospitalExecutiveCommitteeの臨床試験調査による承認の指針、およびTheOhioStateUniversityInstitutionalAnimalCareandUsecommitteeから得た研究試験結果の承認の下でそのように実施した。MMP9分子種の精製ウシMMP9モノマー、ダイマーおよびHpMMP9複合体の精製を、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、BannikovGA、MattoonJS、AbrahamsenEJ、PremanandanC、GreenChurchKB、MarshAE、LakritzJ、Biochemicalandenzymaticcharacterizationofpurifiedcovalentcomplexesofmatrixmetalloproteinase9andhaptoglobinreleasedbybovinegranulocytesinvitro、AmJVetRes68995~1004頁中に以前に記載されているように実施した。簡単に言うと、新鮮なウシの血液由来の好中球をPMAで刺激し、馴化培地を、反応性Red120アガロースクロマトグラフィー、ゼラチンアガロースアフィニティークロマトグラフィー、およびUltragelAcA34ゲル濾過にかけた。分画をSDSPAGEにより分析し、プールし、濃縮し20°Cで保存した。モノクローナル抗体の産生ウシ好中球により産生されたアフィニティー精製MMP9モノマーとダイマーの混合物を、BALBCマウスの免疫感作に使用した。マウスは7日間隔で、100μgの精製MMP9で二回免疫感作した。4週間後、マウスを100μgのMMP9で追加抗原刺激し、4日後に屠殺し、脾細胞はB細胞ミエローマSP20と融合させ、96ウエルプレート中に平板培養した。ハイブリドーマは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、KohlerG、MilsteinC、Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity、Nature256495~497頁中に記載されているように、当業者によく知られている確立した方法に従い、100μΜのヒポキサンチン、04μΜのアミノプテリン、および16μΜのチミジンの存在下で選択した。KohlerG、MilsteinC、Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity、Nature256495~497頁中に記載されているようにELISAにより試験してMMP9に対する特異性を有する抗体を分泌したクローンを、二回の限界希釈によりさらにクローニングして、クローン性を確実にした。クローン101を、以前に記載されているように実施してCelline、CL1000、SartoriusStedim、NorthAmerica、IncBohemiaNY11716、バイオリアクター中での陽性反応性および細胞増幅用に選択した。ハイブリドーマ上清の反応性は、酵素により活性化したMMP9モノマーおよびダイマーを用いて還元および非還元条件下で、精製モノマーおよびダイマーのウエスタンイムノブロットを使用して試験した。さらに、ウシ好中球由来、および末梢血白血球由来の全細胞溶解物を、モノクローナル抗体を用いてイムノブロット処理した。モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは、市販のモノクローナル抗体アイソタイプ決定キットThermoFisherScientific、Rockford、IL61105から市販されているPierceRapidELISAマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キットを使用して決定した。ハイブリドーマ培地由来のIgGはThermoFisherScientific、Rockford、IL61105から市販されているプロテインGアガロースで精製し、4°Cにおいて1mgmlの濃度で保存した。抗ウシMMP9モノクローナル抗体は、酵素活性化後に還元または非還元とは無関係に、ウエスタンブロットにおいてウシMMP9モノマーおよびダイマーと陽性反応を示した。クローン101抗体は、ウエスタンブロットにおいてヒト起源の組換えMMP9とも陽性反応を示した。101抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体約1mgの精製モノクローナル抗体101を、製造者の説明書に従いRocheのHRPタンパク質標識キットを用いてHRPと結合させたペルオキシダーゼ標識キット、RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN46250から市販されている。得られた抗体HRP結合体はSigmaAldrichCo、StLouis、MO63178から市販されているUltragelAcA34でのゲル濾過により精製し、4°Cにおいて60μgmlの濃度で保存した。ELISAアッセイ血清中HpのELISA血清中Hpの濃度を、製造者の説明書に従い、市販のウシハプトグロビンELISA試験キットウシハプトグロビン96ウエルELISA、LifeDiagnostics、WestChesterPA19380から市販されているを使用して決定した。標準曲線は、78~500ngmLの濃度範囲で、キットを含め精製ウシハプトグロビン標準物質を使用して作製した。血清サンプルはキットの説明書に従い希釈し、または低濃度のHpを含有するサンプルに関して低希釈で使用し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、5BSA、TBS中、および対照ウエルであった。血清中MMP9のELISA捕捉用抗体として非結合ウシMMP9モノクローナル抗体101、および結合MMP9の検出用にHRP結合101抗体を利用する、ウシMMP9用のELISAが研究室で開発された。これらの濃度は予備実験に基づいて選択した。捕捉用抗体の結合後、プレートはTBSで3×5分間洗浄し、TBS中に20mgmlの濃度においてウシ血清アルブミンFisherScientific、ThermoFisherScientific、PittsburgPA15275から市販されているウシ血清アルブミン、分画Vで、またはSuperBlockブロッキングバッファーTharmoFisherScientific、RockfordIL61105から市販されているPierceSuperBlockブロッキングバッファーで、ウエルをブロッキングした。ブロッキングウエルの洗浄、および連続希釈した血清サンプルまたは既知濃度の精製ウシMMP9モノマーの添加後、プレートは再度TBSで5×5分間洗浄し、HRP結合モノクローナル抗体をそれぞれのウエルに1200の最終濃度で加えた。過剰なHRP結合体は洗浄によって除去し、その後100μLのTMBを、HRP活性を測定するためにそれぞれのウエルに加えた。ウエルをインキュベートし、マイクロタイタープレートリーダーを使用し経時的に比色分析を続けた。最高濃度の標準物質において発色が最大になったとき、1Nの塩酸を加えることにより反応を停止させた。次いでλ450nmを使用して発色を測定した。MMP9タンパク質の量は、39~2500ngmlの濃度範囲を含む較正曲線として精製ウシMMP9タンパク質を使用して測定した。39ngmL未満で登録したサンプルはゼロであると考えた。疾患状態および健常動物由来の血清サンプルを、二連で1mgmlのBSAを含有するTBSを用いて各サンプルを連続希釈することにより分析した。各サンプルのセットを分析した後、標準曲線の直線範囲内に存在した希釈からの吸光度値を使用しMMP9濃度を定量化した。分析用に、血清は1mgmlのBSAを含有するPBSで連続希釈し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、TBS中5BSA、および対照ウエルであった。血清中HpMMP9複合体のELISA精製モノクローナル抗体101を、前に記載したように捕捉用抗体として使用した。しかしながら、選択した検出抗体はImmunologyConsultantsLaboratory、RHPT10P、Newberg、OR97132から入手したアフィニティー精製したHRP結合ウサギ抗ウシハプトグロビンであり、、TBS中0033μgml、1mgmlのBSAの最終濃度で使用した。捕捉用抗体と検出抗体の両方のこれらの濃度は、予備実験に基づいて選択した。ウシ血清アルブミン、TBS中20mgml、またはSuperBlockブロッキングバッファーを、ブロッキング剤として使用した。精製ウシHpMMP9複合体を使用して、40~5000ngmlの濃度を使用し標準曲線を作製した。40ngmL未満で登録したサンプルはゼロngmLであると考えた。各サンプルのセットを分析した後、標準曲線の直線範囲内に存在した希釈からの吸光度値を使用しHpMMP9濃度を定量化した。分析用に、血清は1mgmlのBSAを含有するPBSで連続希釈し、二連で実施した。含まれていた対照は、正常ウシ血清、、TBS中5BSA、および対照ウエルであった。血清中HpMMP9ELISAの特異性前に記載したように得たアフィニティー精製ウシHp、MMP9モノマーおよびHpMMP9複合体を使用した。捕捉用抗体が抗ウシMMP9モノクローナル抗体であったプレート中、高濃度のHp、MMP9およびHpMMP9複合体を別個のウエルに加え結合させた。洗浄後、HRP結合二次抗体を、以下のように加えた。1Hpを加えたウエルに、抗ウシHpHRP結合体または抗ウシMMP9HRP結合体を加えた。2アフィニティー精製MMP9を加えたウエルに、、抗ウシHpHRP結合体または抗MMP9モノクローナル抗体HRP結合体を加えた。3最後に、HpMMP9複合体を加えたウエルに、、抗ウシHpHRP結合体または抗ウシMMP9HRP結合体を加えた。TMB基質の添加後、450nmでプレートリーダーにより測定した各ウエルの吸光度の測定により、抗体結合の定量化。ウエスタンブロットによるELISA結果の確認ELISAにより検出した個々の血清サンプル中のHpMMP9複合体の存在を確認するため、独立した方法を使用した。選択血清のゼラチン結合断片はウエスタンブロッティングにより分析した。SDSPAGE分析前に、3mlの各血清を05MのNaClに調節し、05MのNaCl、2mMのCaCl2、20mMのトリスHClpH75で事前に平衡化した300μlのゼラチンアガロースとインキュベートした。徹底的な洗浄後、20mMのトリスHClpH75、10mMのNaCl、2mMのCaCl2、0015のBrij35および10のDMSOを含有する3mlのバッファーで、結合タンパク質をゼラチンアガロースから溶出した。溶出液はDMSOを含まない同じバッファーで6mlに希釈し、iCon濃縮器ThermoFisherScientificRockford、IL61105から市販されているPierce濃縮器、9KMWCO、7ml中で300μlに濃縮した。2mlに希釈した後、サンプルはiCon濃縮器中で200μlに再度濃縮した。サンプルは4×LDSサンプルバッファーで希釈し、4~20トリスグリシンゲルを介した電気泳動にかけたInvitrogenCorp、Carlsbad、CA92008から市販されているMuPAGELDSサンプルバッファー、InvitrogenCorp、Carlsbad、CA92008から市販されているNovexの4~20トリスグリシンゲル10mm、12ウエル。分子量マーカーを1つのウエル中に置き、ゼラチンアフィニティーマトリックスから溶出したタンパク質のおよその分子量を決定したInvitrogenCorp、Carlsbad、CA92008から市販されているMagicMarkXPウエスタンタンパク質標準物質。HpおよびMMP9バンドは、ウサギ抗ウシハプトグロビンICL、Inc、Newburg、OR97132から市販されているウサギ抗ウシハプトグロビンポリクローナル抗体、およびヤギ抗ヒトMMP9RDSystemsInc、Minneapolis、MN55413から市販されているヤギ抗ヒトMMP9アフィニティー精製ポリクローナルABを用いた標識により可視化にした。HRP結合抗ウサギおよび抗ヤギ抗体は二次抗体として使用し、次いでECLで可視化したCellSignalingTechnology、Danvers、MA01923から市販されている20×Lumiglo試薬および20×ペルオキシド。統計解析動物を、臨床試験、研究室、または他の診断の所見に基づく臨床診断結果、または検死に基づく死後診断のいずれかにより分類した。これらの診断の結果に基づき、急性敗血症疾患、慢性または代謝性疾患、または正常として動物を表した。急性敗血症疾患動物は数字1で表し、慢性または代謝性疾患動物は数字2で表し、正常動物は数字3で表した。疾病分類の予備知識なしで個々によりELISAアッセイを実施した。3ELISAアッセイのそれぞれに関する各動物からのデータを、次いで動物IDによりスプレッドシートに配置した。各分類中の、3ELISAアッセイのそれぞれに関する動物からのデータを、次いで統計的に記載した。データは正規分布ではなかったので、ノンパラメトリック法を使用して、3ELISAのそれぞれおよび3群のそれぞれに関する結果を比較した。データのさらなる試験は、ウィルコクスン順位和検定を使用する3ELISAアッセイのペアワイズ比較を含んでいた。複数のペアワイズ比較を考慮するため、ボンフェローニの調整を行い、P値47ugmLの血清中コルチゾールの急速な上昇と関係があり、これらの9匹の子牛中でLPS注入後3時間までに63ugdLのピークに達した。コルチゾールの急速な増加は、リンパ球数の劇的な減少がおそらく原因であると考えられる。末梢血白血球数はLPS注入後約4時間は少ない状態であり、細胞数は次の20時間は徐々に増大し正常に戻った。ここで図5を参照すると、未成熟バンドPMNはLPS注入後約8時間で0uLから600uLの平均値まで増大した。LPS注入後約6時間で、血清中コルチゾールの減少および末梢血におけるWBCリバウンドの開始に付随して、血清中HpMMP9複合体が検出可能であり、LPS注入後36時間でピークまで増大した。LPS注入後36~96時間から、血清内のHpMMP9の濃度は徐々に減少した。同様に、ここで図6を参照すると、血清中HpMMP9を検出したとき、血清中の全ハプトグロビンがカットオフポイント未満に存在し、約20時間でのみこの閾値を超える。血清中の全ハプトグロビンの濃度対経時変化は、HpMMP9出現後6~10時間遅れていたにもかかわらず、血清中HpMMP9のそれと形状が非常に類似していた。さらに、得られた血清中の全ハプトグロビンの程度は、前のLPS誘導型血清中Hpの試験で観察したそれの約半分であった。以前に報告されたように、これらのLPS誘導型HpMMP9複合体および血清中Hpは、8日ではなく96時間以内に正常に戻ることを観察した。いかなる理論によっても束縛されないが、これは、血清中の全ハプトグロビンのELISAを使用して検出され得る好中球HpMMP9複合体の初期放出に、原因がある可能性があると考えられる。対照的に、ここで図7を参照すると、別の血清中急性期タンパク質が、この実施例中に記載する試験の行程にわたり有意に変わることはなかった。血清中Hpのアッセイと同様に、この一元放射免疫拡散法形式イムノアッセイは全AGPを測定する。以前に報告された試験と同様に、血清中AGPが、血清中HpMMP9複合体に関する情報と類似した情報を与えるわけではないようである。これらのデータは、血清中HpMMP9の放出は好中球活性化の初期指標であり、静脈内LPSに関する末梢血白血球の急速な減少および増大に付随して起こることを示唆する。この実施例は、実験的マイコプラズマボビスによる肺感染は、血清中HpMMP9複合体と関係があることを示す。血清サンプルをDrDavidAndersonの研究室から得て、ウシ呼吸器疾患の血清マーカーをアッセイした。実験的マイコプラズマボビス接種に関するHpMMP9複合体アッセイ用の血清が提供された。動物を109cfuの生命力があるマイコプラズマボビスを気管内注入する直前に出血させ、滅菌生理食塩水を擬似注入した。次いで全ての子牛を第7日と第14日に出血させた。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更することができることを、当業者は理解している。血清中HpMMP9複合体は、試験開始前に28匹中26匹の動物において存在しなかった。検出可能な血清中HpMMP9を有する1匹の動物は、試験開始時に多量の血中心筋トロポニンIも有しており、胸部炎症を示唆した。他の動物は第14日に多量の血清中ハプトグロビンを有しており、慢性の、非特異的な炎症異常を示唆した。血清中HpMMP9複合体は、第7日に28匹中4匹の動物において、および第14日に28匹中18匹の動物において検出された。この実施例は、骨関節炎と比較して、自己免疫疾患を有するヒト患者における血清中HpMMP9複合体を調べる。血清中HpMMP9複合体の分析用に、29対象由来の血清サンプルをDrMichaelWisemanの研究室から得た。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更することができることを、当業者は理解している。これらのサンプルは、そのアイデンティティー、疾患および疾患期間がこれらのサンプルに関するELISA試験を実施する個体に適用できない3つの異なる患者群由来であった。患者群番号1由来のサンプルは慢性骨関節炎を有する患者に由来し、患者群番号2由来のサンプルは全身性エリテマトーデスを有する患者に由来し、且つ患者群番号3由来のサンプルは関節リウマチを有する患者に由来した。血清中HpMMP9のELISAアッセイはこれらの盲検サンプルに実施し、データはCedarSinaiMedicalCenterに返却した。血清サンプルに実施したELISA試験は実施例1中で前に記載した通りであるが、実施例5中で以下に記載するように、パラメーターを変更することができることを、当業者は理解している。データの返却後、次いでDrWisemanは試験管数と関係がある疾患プロセスを与え、したがってそれらの疾患プロセスは血清中HpMMP9濃度と一致した。SLE患者とOA患者の間、およびRA患者とOA患者の間の血清中HpMMP9濃度の差は有意な傾向に向かい、OA患者と比較してHpMMP9SLEおよびRA患者において活性好中球仲介の炎症を示唆した。したがって血清中HpMMP9は、好中球活性化を特徴とする疾患に罹患したヒト中に存在するようである。さらに、これらの患者の病歴臨床データを入手して、このデータの有意性をさらに解明することができる。この実施例は、本明細書に記載するHpMMP9ELISAを変更および確認するための、さらなる方法を対象とする。前に記載した実施例は、実施例1中に記載したように、アフィニティー精製した捕捉用物質、アフィニティー精製した検出用物質および精製HpMMP9複合体で確認するELISAを利用して実施した。これらの試験は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、Bannikov、GAetal、2011VetImmunolImmunopath13941~49頁中に記載されているように確認した。このとき以来、敗血症のウシ由来の血清サンプルの使用に焦点が当てられており、標準に関する以前の試験の一部として分析されている。周知のHpMMP9濃度を有する血清が、ELISA条件を最適化するために現在使用されている。較正曲線として使用する血清サンプルを調製し、チェッカーボード滴定を実施しコーティング抗体濃度および検出用抗体を評価した。これは、コーティング抗体濃度2ugウエルは十分であること、および標準曲線は15Kから1160K検出用抗体まで直線的であることを実証した。しかしながら、第二抗体の濃度が低下すると、較正曲線の直線勾配およびダイナミックレンジは15Kから1160Kまで減少する。さらに、コーティング、洗浄およびブロッキングバッファーおよび洗浄剤濃度の評価により、最大5のtween20を取り込んだBSAは非特異的バックグラウンドを減少させ、較正曲線の底部から上部までアッセイのダイナミックレンジを1吸光度単位増大させることを測定した。陽性対照カリブレーターに関する相対標準偏差は06~47であった。前に記載した実施例は、周知の感染因子および炎症刺激に対する本明細書で開示するアッセイの適性を実証する。刺激試験の使用は、感染刺激に関するサンプリング時間地点の知識をもたらす。これらの応答を使用して、実地試験で使用するのに最適なサンプリング時間を定義することができる。LPS試験から、到着第0日と第4日の間で得たサンプルが有用である可能性があると思われる。本発明者らは、これらの時間地点はマンヘミアヘモリチカの試験においても有用であると予想する。マイコプラズマボビスの試験から、0~7日の間のサンプリング時間が有用である可能性がある。この情報は、本明細書で示すようなBRDの実地調査におけるHpMMP9試験の有用性を定義する際に有用である。さらに、方法特徴付け試験は、アッセイは確かなものであり、実地用途に適合し得ることを実証している。HpMMP9の合成源の産生により、畜牛における潜在性BRDに関して市販の患者側検定を首尾よく実施する能力が改善するはずである。本明細書中に列挙する本発明の実施形態は単なる例示的なものであることを意図し、当業者は、本発明の精神から逸脱せずに、それに対する多数の変形および変更形態を作製することができる。例えば、前に記載した実施例は、畜牛における急性炎症状態を試験するのに有用なELISAおよび複合濃度範囲を開示するが、このようなELISAは、ヒトなどの他の哺乳動物におけるHpMMP9複合体の試験に適用することができ、本明細書中に記載する方法は、過度の実験無しにこのような他の哺乳動物における急性炎症状態を示す有用な複合濃度範囲を決定することができることは、当業者によって理解される。さらに、HpMMP9複合体ELISAは、急性敗血症とは異なるが好中球脱顆粒と関係がある、他の状態の診断においておそらく有用である。これらの状態は、様々な型の関節炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈プラーク形成などを含み得る。前述の事項にもかかわらず、特定の変形および変更形態は、最適未満の結果をもたらす一方で、満足のいく結果を依然もたらすことができる。全てのこのような変形および変更形態は、本発明の範囲内に存在するものとする。