"化学式II、IIa、もしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるを有する化合物であって、の構造を有する化合物を除く化合物、またはその塩。R2が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの1以上で所望により置換されていてもよいC1-6アルキルまたはC3-6シクロアルキルである、請求項1に記載の化合物。R1が、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択される、請求項1または2に記載の化合物。R1が、-OCH2mNEt2、-OCH2mNMe2、-OCH2mNHEt、-OCH2mNHMe2、-OCH2mモルホリニル、-OCH2m置換モルホリニル、-OCH2mスルホキシモルホリニル、-OCH2m置換スルホキシモルホリニル、-OCH2mピロリジニル、-OCH2m置換ピロリジニル、-OCH2mピペラジニル、-OCH2m置換ピペラジニル、-OCH2mピペリジニル、-OCH2m置換ピペリジニル、-OCH2mNMeCH22NMe2、-OCH2mNMeCH22NHMe、-OCH2mNMeCH22NEt2、-OCH2mNMeCH22NHEt、-OCH2mOCH22NMe2、-OCH2mOCH22NHMe、-OCH2mOCH22NEt2、-OCH2mOCH22NHEt、-OCH2mOCH22ヘテロシクロアルキル、および-OCH2mOCH22置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項1または2に記載の化合物。R9が、OH、NH2、NHMe、NMe2、NEt2、OCH22NH2、NHCH22OH、NMeCH22NMe2、からなる群から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物。Hetが、からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物。Hetがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの1以上で置換されている、請求項6に記載の化合物。R1が、H、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項6または7に記載の化合物。化学式IIまたはIIIの構造を有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の化合物。からなる群から選択される化合物またはその塩。からなる群から選択される化合物またはその塩。請求項1~11のいずれか1項に記載の化合物と担体とを含む組成物。請求項1~11のいずれか1項に記載の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、クモ膜腔内投与、眼内投与または吸入投与に適した、請求項13に記載の医薬組成物。細胞を、増殖を抑制する量の請求項1~11のいずれか1項に記載の化合物と接触させることを含む、細胞の増殖を抑制する方法。前記細胞ががん細胞である、請求項15に記載の方法。前記がん細胞が、ウイルス誘発性がん、カポジ肉腫、鼻咽頭癌腫EBV、慢性骨髄性白血病CML、黒色腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞異形成、骨髄増殖性障害または膠芽腫である、請求項16に記載の方法。前記がんが、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、固形腫瘍または結腸がんである、請求項16に記載の方法。前記化合物が前記細胞の内因性の脱ユビキチン化酵素DUBを阻害する、請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。前記化合物がDUBのユビキチンC末端加水分解酵素UCH触媒ドメインを阻害する、請求項15~19のいずれか1項に記載の方法。脱ユビキチン化酵素Dubを化学式I:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるの化合物またはその塩と接触させることを含む、脱ユビキチン化酵素を阻害する方法。病原体または細胞を化学式I:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるの化合物またはその塩と接触させることを含む、細胞における病原性の感染を抑制する方法。病原体に感染した細胞を化学式I:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるの化合物またはその塩と接触させることを含む、病原性の感染による症状を治療する方法。前記症状が、胃腸炎、脳炎、気道感染、SARS、インフルエンザ、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱、リフトバレー熱、リステリア症およびトキソプラズマ症から選択される、請求項23に記載の方法。前記症状が、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症または皮膚感染である、請求項23に記載の方法。前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌または寄生体である、請求項21~25のいずれか1項に記載の方法。前記ウイルスが、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍OTU様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルスまたはナイロウイルスである、請求項26に記載の方法。前記ウイルスがポリオーマウイルスまたはレトロウイルスである、請求項26に記載の方法。前記ウイルスが、脳心筋炎ウイルスEMCV、シンドビスウイルスSiNV、ラクロスウイルスLaCV、ノーウォークウイルス、エプスタインバールEBV、ヘルペスウイルス、デングウイルス、呼吸器系合胞体ウイルスRSV、パピローマウイルスおよびインフルエンザからなる群から選択される、請求項26または27に記載の方法。前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、BKウイルス、C型肝炎ウイルスまたはHIVである、請求項26または27に記載の方法。前記細菌が、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリアおよびマイコバクテリウムからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。前記細菌が黄色ブドウ球菌である、請求項26に記載の方法。前記細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌MRSAである、請求項32に記載の方法。前記寄生体または真菌が、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum、トキソプラズマゴンヂToxoplasmagondii、エントアメーバヒストリティカEntamoebahistolytica、ランブル鞭毛虫Giardialamblia、ブルーストリパノソーマTrypanosomabrucei、クルーズトリパノソーマTrypanosomacruzi、セストダCestoda、クロノルキスClonorchis、オピストルキスOpisthorchis、ストロンギロイデスStrongylocides、カンジダCandida、アスペルギルスAspergillusおよびクリプトコックスCryptococcusからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。前記化合物が脱ユビキチン化酵素Dubを阻害する、請求項22~34のいずれか1項に記載の方法。前記脱ユビキチン化酵素が前記病原体の内因性の脱ユビキチン化酵素である、請求項35に記載の方法。前記脱ユビキチン化酵素が前記細胞の内因性の脱ユビキチン化酵素である、請求項35に記載の方法。前記細胞が哺乳類の細胞である、請求項22~37のいずれか1項に記載の方法。前記細胞がヒトの細胞である、請求項38に記載の方法。前記細胞が動物の細胞である、請求項22~37のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が鳥類の細胞である、請求項40に記載の方法。前記破線が二重結合を示す、請求項21~41のいずれか1項に記載の方法。R3が、からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、R7が、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、各R8が、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Arがアリールまたは置換アリールであり、Zがアルキレン、置換アルキレン、アミノまたは置換アミノであり、Z1がアルキレンまたは置換アルキレンであり、nが1、2、3、または4である、請求項21~42のいずれか1項に記載の方法。R6が、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、フェニル、1-ピペリジニルpiperdynl、2-2H-ピラニル、および2-2H-チオピラニルから選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項21~43のいずれか1項に記載の方法。R6が2-ピリジルまたは置換2-ピリジルである、請求項44に記載の方法。R4がCNである、請求項21~45のいずれか1項に記載の方法。R3が、である、請求項21~46のいずれか1項に記載の方法。化学式Iの化合物が、からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項21~47のいずれか1項に記載の方法。化学式Iの化合物が、化学式IIもしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるの化合物またはその塩を含む、請求項21~41のいずれか1項に記載の方法。R2が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの1以上で所望により置換されていてもよいC1-6アルキルまたはC3-6シクロアルキルである、請求項49に記載の方法。R1が、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択される、請求項49または50に記載の方法。R9が、OH、NH2、NHMe、NMe2、NEt2、OCH22NH2、NHCH22OH、NMeCH22NMe2、からなる群から選択される、請求項49~51のいずれか1項に記載の方法。Hetが、からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項49~52のいずれか1項に記載の方法。Hetがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの1以上で置換されている、請求項53に記載の方法。R1が、H、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項53または54に記載の方法。化学式Iの化合物が、化学式IIa:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるの化合物またはその塩を含む、請求項21~41のいずれか1項に記載の方法。R2が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの1以上で所望により置換されていてもよいC1-6アルキルまたはC3-6シクロアルキルである、請求項56に記載の方法。R1が、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9、-OCH2mR9、-OCH2mNEt2、-OCH2mNMe2、-OCH2mNHEt、-OCH2mNHMe2、-OCH2mモルホリニル、-OCH2m置換モルホリニル、-OCH2mスルホキシモルホリニル、-OCH2m置換スルホキシモルホリニル、-OCH2mピロリジニル、-OCH2m置換ピロリジニル、-OCH2mピペラジニル、-OCH2m置換ピペラジニル、-OCH2mピペリジニル、-OCH2m置換ピペリジニル、-OCH2mNMeCH22NMe2、-OCH2mNMeCH22NHMe、-OCH2mNMeCH22NEt2、-OCH2mNMeCH22NHEt、-OCH2mOCH22NMe2、-OCH2mOCH22NHMe、-OCH2mOCH22NEt2、-OCH2mOCH22NHEt、-OCH2mOCH22ヘテロシクロアルキル、および-OCH2mOCH22置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項56または57に記載の方法。R9が、OH、NH2、NHMe、NMe2、NEt2、OCH22NH2、NHCH22OH、NMeCH22NMe2、からなる群から選択される、請求項56~58のいずれか1項に記載の方法。以下の構造:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるを有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患を治療する方法。以下の構造:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるを有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、神経変性疾患に伴う1以上の症状を治療する方法。以下の構造:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるを有する化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、遺伝子疾患に伴う1以上の症状を治療する方法。前記破線が二重結合を示す、請求項60~62のいずれか1項に記載の方法。R3が、からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、R7が、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、各R8が、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Arがアリールまたは置換アリールであり、Zがアルキレン、置換アルキレン、アミノまたは置換アミノであり、Z1がアルキレンまたは置換アルキレンであり、nが1、2、3、または4である、請求項60~63のいずれか1項に記載の方法。R6が、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、フェニル、1-ピペリジニルpiperdynl、2-2H-ピラニル、および2-2H-チオピラニルから選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項60~64のいずれか1項に記載の方法。R6が2-ピリジルまたは置換2-ピリジルである、請求項64に記載の方法。R4がCNである、請求項60~66のいずれか1項に記載の方法。R3が、である、請求項60~67のいずれか1項に記載の方法。化学式Iの化合物が、からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項60~62のいずれか1項に記載の方法。化学式Iの化合物が、からなる群から選択されるか、またはそれらの塩である、請求項60~62のいずれか1項に記載の方法。化学式Iの化合物が、化学式II、IIaもしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるの化合物またはその塩を含む、請求項60~68のいずれか1項に記載の方法。R2が、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシおよび置換アルコキシのうちの1以上で所望により置換されていてもよいC1-6アルキルまたはC3-6シクロアルキルである、請求項71に記載の方法。R1が、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択される、請求項71または72に記載の方法。R1が、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9、-OCH2mR9、-OCH2mNEt2、-OCH2mNMe2、-OCH2mNHEt、-OCH2mNHMe2、-OCH2mモルホリニル、-OCH2m置換モルホリニル、-OCH2mスルホキシモルホリニル、-OCH2m置換スルホキシモルホリニル、-OCH2mピロリジニル、-OCH2m置換ピロリジニル、-OCH2mピペラジニル、-OCH2m置換ピペラジニル、-OCH2mピペリジニル、-OCH2m置換ピペリジニル、-OCH2mNMeCH22NMe2、-OCH2mNMeCH22NHMe、-OCH2mNMeCH22NEt2、-OCH2mNMeCH22NHEt、-OCH2mOCH22NMe2、-OCH2mOCH22NHMe、-OCH2mOCH22NEt2、-OCH2mOCH22NHEt、-OCH2mOCH22ヘテロシクロアルキル、および-OCH2mOCH22置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される、請求項71または72に記載の方法。R9が、OH、NH2、NHMe、NMe2、NEt2、OCH22NH2、NHCH22OH、NMeCH22NMe2、からなる群から選択される、請求項71~74のいずれか1項に記載の方法。Hetが、からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である、請求項71~75のいずれか1項に記載の方法。Hetがアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノおよび置換アミノのうちの1以上で置換されている、請求項76に記載の方法。R1が、H、アミド、置換アミドおよびハライドからなる群から選択される、請求項76または77に記載の方法。前記化合物が化学式IIまたはIIIの構造を有する、請求項71~78のいずれか1項に記載の方法。DUBを阻害する方法を本明細書において開示する。方法は、付加的にまたは代替的にUCH触媒ドメインの阻害に関する。さらに、病原性の感染を治療する方法および病原性の感染による症状を治療する方法を本明細書において開示する。また、細胞の増殖を抑制するか細胞の生存を低下させる方法を本明細書において開示する。さらに、神経変性障害または神経変性障害の症状を治療する方法を本明細書において開示する。また、遺伝子障害の症状を治療する方法を本明細書において開示する。本明細書で開示する方法において有用な化合物は、以下の化学式:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるを有する化合物またはその塩を含む。さまざまな場合において、本明細書で開示する方法において有用な化合物は、化学式II、IIa、もしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるを有する化合物またはその塩を含む。具体的な化合物については後述するが、上記した方法の1以上において、そのいずれの化合物を使用してもよい。さらに、化学式II、IIa、もしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるを有する化合物またはその塩を本明細書において開示する。タンパク質のユビキチン化は、複数の酵素の関与を必要とする厳密に制御されたプロセスであり、これらの酵素により標的タンパク質のリジン残基がユビキチンUbの単量体または重合鎖で修飾される。ユビキチン経路の酵素群は、真核細胞の細胞周期タイミング、タンパク質分解およびシグナル伝達のメディエータmediatorである。最近の研究より、Ub調節は、真核宿主細胞と同様に、原核細胞およびウイルスのライフサイクルのさまざまな段階においても重要であることが示唆されている。したがって、特定のUb調節酵素を阻害または抑制することにより抗菌活性が示される可能性がある。DUBは、がん化、細胞周期調節、アポトーシス防御および薬剤耐性に関わるタンパク質の調節において多様な役割を担っていることから、好適な治療標的になると考えられる。最近、USP2およびUSP9xの下方調節が、それぞれサイクリンD1およびMCL-1の分解促進を通じて腫瘍細胞の増殖を抑制することが示されており、腫瘍細胞において特定のDUBの発現を抑制することは、がん遺伝子依存性細胞または薬剤耐性細胞における安全かつ有効な治療となり得ることが示唆されている。また、他の研究により、がん、ウイルス性および細菌性病因ならびに神経変性障害を含む広範囲の疾患におけるDUBの役割も立証されている。DUB調節活性を有することが報告されている化合物は少ないが、それらの多くは、DUB阻害に伴って抗腫瘍活性、抗増殖活性または抗ウイルス活性を有することが報告されている例えば、UCH-L1およびUSP7、SARSプロテアーゼ。したがって、本明細書において、DUBを阻害する方法、UCH触媒ドメインを阻害する方法、病原性の感染を抑制または予防する方法、細胞の生存または増殖を抑制する方法、神経変性障害を治療する方法、神経変性障害の1以上の症状を治療する方法、遺伝子障害の1以上の症状を治療する方法、およびDUBを阻害可能な化合物を開示する。本発明により提供される方法においては、DUBを、例えば、化学式I:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるの化合物またはその塩と接触させる。デユビキチナーゼDUB脱ユビキチン化酵素すなわち、デユビキチナーゼまたはDUBは、一般にシステインプロテアーゼであり、サブグループとしてユビキチン特異的プロテアーゼUSPとユビキチンC末端加水分解酵素UCHに分類され得る。DUBの例としては、例えば、USP5、USP6、USP4、USP8、USP13、USP2、USP11、USP14、USP7、USP9X、USP10、USP1、USP12、USP16、USP15、USP17、USP19、USP20、USP3、USP9Y、USP18、USP21、USP22、USP33、USP29、USP25、USP36、USP32、USP26、USP24、USP42、USP46、USP37、USP28、USP47、USP38、USP44、USP50、USP35、USP30、Mername-AA088ペプチダーゼ、Mername-AA091ペプチダーゼ、USP45、USP51、USP34、USP48、USP40、USP31、Mername-AA129ペプチダーゼ、USP49、USP17様ペプチダーゼ、USP54、USP53、USP39、UCH-L1、UCH-L3、UCH-BAP1、UCH37、セザンヌ脱ユビキチン化ペプチダーゼ、セザンヌ2、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質3、TRABIDタンパク質、VCPp97/p47相互作用タンパク質、オツバインotubain1、オツバイン2、CylDタンパク質、SENP1ペプチダーゼ、SENP3ペプチダーゼ、SENP6ペプチダーゼ、SENP2ペプチダーゼ、SENP5ペプチダーゼ、SENP7ペプチダーゼ、SENP8ペプチダーゼ、SENP4ペプチダーゼ、Poh1ペプチダーゼ、Jab1/MPNドメイン金属酵素、Mername-AA165ペプチダーゼ、Mername-AA166ペプチダーゼ、Mername-AA167ペプチダーゼ、Mername-AA168タンパク質、COP9シグナロソームサブユニット6、26Sプロテアソーム非ATPアーゼ調節サブユニット7、真核細胞翻訳開始因子3サブユニット5、IFP38ペプチダーゼホモログが挙げられる。考えられる他のDUBとしては、オートファジンautophaginATG、卵巣腫瘍OTUドメインタンパク質、ジョセフィンJosephinドメインJDまたはマシャドジョセフ病MJDタンパク質、ユビキチン様タンパク質特異的プロテアーゼULP、およびJAMMJab1/MPNドメイン会合金属イソペプチダーゼドメインタンパク質が挙げられる。具体的なDUB阻害剤本明細書で開示する方法において使用される化合物は、化学式I:式中、破線は、所望により選択される二重結合を示し、R3は、アミノアルキレンアリールまたは置換アミノアルキレンアリールであり、R4は、CN、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アルキレンチオエーテル、置換アルキレンチオエーテル、アルキル、置換アルキル、アジド、アルキレンアジド、および置換アルキレンアジドからなる群から選択され、R5は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、チオエーテル、置換チオエーテル、アミノ、置換アミノ、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、およびSHからなる群から選択され、R6は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルケニル、置換ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アルキレンアリール、置換アルキレンアリール、アルキレンヘテロアリール、置換アルキレンヘテロアリール、アルキレンヘテロシクロアルケニル、置換アルキレンヘテロシクロアルケニル、アルキレンヘテロシクロアルキル、および置換アルキレンヘテロシクロアルキルからなる群から選択されるの化合物またはその塩を含む。いくつかの場合において、破線は、二重結合を示す。さまざまな場合において、考えられる具体的なR3構造としては、からなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であるR3が挙げられ、R7は、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、単糖類、単糖類誘導体、アリール、およびアルキレンアリールからなる群から選択されるか、または所望により置換されていてもよいそれらの基であり、各R8は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールおよび置換アリールからなる群からそれぞれ独立して選択され、Arは、アリールまたは置換アリールであり、Zは、アルキレン、置換アルキレン、アミノ、または置換アミノであり、Z1は、アルキレンまたは置換アルキレンであり、nは、1、2、3、または4である。いくつかの場合において、考えられる具体的なR6構造としては、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、フェニル、1-ピペリジニルpiperdynl、2-2H-ピラニル、および2-2H-チオピラニル、またはそれらの置換体が挙げられる。いくつかの特定の場合において、R6は、2-ピリジルまたは置換2-ピリジルである。さまざまな特定の場合において、R4は、CNである。いくつかの場合において、R3は、である。いくつかの特定の場合において、Arは、フェニルまたは置換フェニルである。考えられるいくつかの具体的な化合物としては、以下の構造:または、それらの塩が挙げられる。さらに考えられる阻害剤としては、またはそれらの塩が挙げられる。さらに考えられるものとしては、の構造を有する阻害剤、またはその塩が挙げられる。いくつかの実施形態において、化学式Iの化合物は、化学式II、IIa、もしくはIII:式中、各R1は、H、アミド、置換アミド、ハライド、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択されるが、化学式IIの化合物においては2つのR1がいずれも水素である場合は除外され、Xは、フルオロまたはクロロであり、R2は、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールであり、Hetは、2-ピリジルを除くヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールであり、R9は、アミノ、置換アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロヘテロアルキル、または置換シクロヘテロアルキルであり、mは、2、3、または4であるの化合物またはその塩である。さまざまな場合において、R1は、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択される。さまざまな場合において、R1は、-OCH2mNEt2、-OCH2mNMe2、-OCH2mNHEt、-OCH2mNHMe2、-OCH2mモルホリニル、-OCH2m置換モルホリニル、-OCH2mスルホキシモルホリニル、-OCH2m置換スルホキシモルホリニル、-OCH2mピロリジニル、-OCH2m置換ピロリジニル、-OCH2mピペラジニル、-OCH2m置換ピペラジニル、-OCH2mピペリジニル、-OCH2m置換ピペリジニル、-OCH2mNMeCH22NMe2、-OCH2mNMeCH22NHMe、-OCH2mNMeCH22NEt2、-OCH2mNMeCH22NHEt、-OCH2mOCH22NMe2、-OCH2mOCH22NHMe、-OCH2mOCH22NEt2、-OCH2mOCH22NHEt、-OCH2mOCH22ヘテロシクロアルキル、および-OCH2mOCH22置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。さまざまな場合において、R1は、-OCH2mNHCOアルキレン-ビオチンである。さまざまな場合において、本発明の化合物は、化学式IIまたはIIIの化合物である。いくつかの場合において、R2は、C1-6アルキルまたはC3-6シクロアルキルであり、ヒドロキシ、アミノ、置換アミノ、アルコキシ、および置換アルコキシのうちの1以上で所望により置換されていてもよい。いくつかの特定の場合において、化学式IIまたはIIaの化合物のR1は、H、-CH2mR9、-NHCH2mR9、-NHCOCH2mR9、-CONHCH2mR9および-OCH2mR9からなる群から選択される。さまざまな場合において、R1は、H、アミド、置換アミド、およびハライドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、R9は、OH、NH2、NHMe、NMe2、NEt2、OCH22NH2、NHCH22OH、NMeCH22NMe2、からなる群から選択される。いくつかの場合において、上記化学式IIまたはIIIの化合物は、具体的に、の構造を有する化合物を除く。本明細書において使用される用語アルキルは、1~40個の炭素原子を有する飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。1~6個の炭素原子のアルキルも考えられる。用語アルキルは、架橋アルキル、すなわち、二環式または多環式炭化水素基、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ[2.2.2]オクチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[3.2.1]オクチル、またはデカヒドロナフチルを含む。アルキル基は、例えば、ヒドロキシOH、ハライド、チオールSH、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびアミノで所望により置換されていてもよい。特に、本明細書に記載の化合物において、上記アルキル基は、1~40個の炭素原子からなり、好ましくは1~25個の炭素原子からなり、好ましくは1~15個の炭素原子からなり、好ましくは1~12個の炭素原子からなり、好ましくは1~10個の炭素原子からなり、好ましくは1~8個の炭素原子からなり、好ましくは1~6個の炭素原子からなることが考えられる。ヘテロアルキルは、ヘテロアルキルが酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含むこと以外は、アルキルと同様に定義される。本明細書において、用語シクロアルキルは、環状炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、およびシクロペンチルを指す。ヘテロシクロアルキルは、その環が酸素、窒素、および硫黄からなる群から独立に選択される1~3個のヘテロ原子を含むこと以外は、シクロアルキルと同様に定義される。ヘテロシクロアルキル基の例は、ピペリジンpiperdine、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロフラン、モルホリン、チオフェンなどを含むが、これらに限定されない。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、例えば、アルキル、アルキレンOH、CONH2、NH2、オキソ=O、アリール、ハロアルキル、ハロ、およびOHからなる群から独立に選択される1~3個の基で所望により置換されていてもよい飽和または部分不飽和環系であり得る。ヘテロシクロアルキル基は、さらにアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキレンアリール、またはアルキレンヘテロアリールで所望によりN-置換されていてもよい。本明細書において使用される用語アルケニルは、少なくとも1個の炭素二重結合を含む2~10個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、1-プロペニル、2-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニルなどを含むが、これらに限定されない。用語シクロアルケニルは、1以上の二重結合を有するシクロアルキル基を指す。ヘテロシクロアルケニルは、1以上のヘテロ原子例えば、N、S、O、またはそれらの組合せを有するシクロアルケニル基を指す。本明細書において使用される用語アルキニルは、少なくとも1個の炭素三重結合を含む2~10個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素基を指し、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニルなどを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される用語ハライドは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。本明細書において使用される用語アルキレンは、置換基を有するアルキル基を指す。例えば、用語アルキレンアリールは、アリール基で置換されたアルキル基を指す。アルキレン基は、所望により選択されるアルキル置換基として先に列挙した1以上の置換基で所望により置換されていてもよい。例えば、アルキレン基は、-CH2CH2-または-CH2-であり得る。本明細書において、用語アリールは、単環式または多環式芳香族基、好ましくは単環式または二環式芳香族基を指し、例えば、フェニルまたはナフチルを指す。特に断りのない限り、アリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、OCF3、NO2、CN,NC、OH、アルコキシ、アミノ、CO2H、CO2アルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立に選択される1以上の置換基、特に1~4個の置換基で置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、クロロフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ニトロフェニル、2,4-メトキシクロロフェニルなどを含むが、これらに限定されない。本明細書において、用語ヘテロアリールは、1または2個の芳香族環を含み、該芳香族環において少なくとも1個の窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を含む単環式または二環式環系を指す。特に断りのない限り、ヘテロアリール基は、非置換であってもよく、また例えば、ハロ、アルキル、アルケニル、OCF3、NO2、CN,NC、OH、アルコキシ、アミノ、CO2H、CO2アルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される1以上の置換基、特に1~4個の置換基で置換されていてもよい。いくつかの場合において、ヘテロアリール基は、アルキル基およびアルコキシ基のうちの1以上で置換されている。ヘテロアリール基の例は、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、チオフェニル、イソキノリル、インドリル、トリアジニル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、およびチアジアゾリルを含むが、これらに限定されない。本明細書において、ヘテロアリールは、用語Hetと交換可能に使用される。いくつかの場合において、Hetは、からなる群から選択されるか、またはそれらの置換体である。いくつかの場合において、Hetは、2-ピリジル、3-ピリジル、および/または4-ピリジルを除く。いくつかの特定の場合において、Hetは、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、および置換アミノのうちの1以上で置換されている。本明細書において使用される用語アルコキシは、--O--結合によって親分子に共有結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、n-ブトキシ、sec-ブトキシ、t-ブトキシなどを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される用語チオアルキルは、アルキル基に結合した1以上のチオ基を指す。本明細書において使用される用語チオエーテルは、--S--結合を介して親分子に共有結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基またはシクロアルキル基を指す。チオエーテル基の例は、-SCH3、-SCH2CH3、-SCH2CH2CH3、-SCHCH32、-SCH2CH2CH2CH3、-SCH2CHCH32、-SCCH33などを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される用語ヒドロキシアルキルは、アルキル基に結合した1以上のヒドロキシ基を指す。用語アジドは、-N3基を指す。用語ニトロは、-NO2基を指す。本明細書において使用される用語アミノは、-NR2式中、Rは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールであるを指す。アミノ基の例は、NH2、NHCH3、およびNCH32を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合において、Rは、それぞれ独立して水素またはアルキルである。本明細書において使用される用語アミドは、-CONH2、-CONR2、-NRCORまたは-NHCOH式中、各Rは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールであるを指す。いくつかの場合において、アミド基は、-NHCOアルキルまたは-NHCOHである。さまざまな場合において、アミド基は、-CONHアルキルまたは-CONH置換アルキルである。アミド基の例は、-NHCOCH3であるが、これに限定されない。本明細書において、置換体は、非置換の親構造の1以上の水素原子が別の原子または基で置換されたものである。本明細書において使用される置換基は、以下の群から選択される基を意味する。A-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、ならびにB以下のiおよびiiから選択される少なくとも1個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール、i-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、およびii以下のaおよびbから選択される少なくとも1個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール、a-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、およびb-OH、-NH2、-SH、-CN、-CF3、-NO2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換アルコキシ、非置換アリールオキシ、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチルから選択される少なくとも1個の置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アミノ、アミド、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、シリル、スルホニル、スルホキシル、アルコキシ、アリールオキシ、およびヘテロアリール。本明細書において使用される用語カルボキシまたはカルボキシルは、-COOHまたはその脱プロトン体-COO-を指す。C1-10カルボキシは、所望により置換されていてもよい、カルボキシ構造を有するアルキル基またはアルケニル基を指す。例としては、-CH2COOH、-CH2CHCOOHCH3、および-CH2CH2CH2COOHが挙げられるが、これらに限定されない。用語アルコキシカルボニルは、-CO-O-アルキル式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよいを指す。アルコキシカルボニル基の例は、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基などを含むが、これらに限定されない。用語アルキルカルボニルは、-CO-アルキル式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよいを指す。アルキルカルボニル基の例は、メチルカルボニル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基などを含むが、これらに限定されない。用語スルホンアミドは、-SO2NR2式中、Rは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールであるを指す。いくつかの場合において、スルホンアミド基は、-SO2NR2式中、Rは、それぞれ独立して、水素または所望により置換されていてもよいアルキルであるである。スルホンアミド基の例は、-SO2NCH32および-SO2NH2を含むが、これらに限定されない。用語スルホニルは、-SO2R式中、Rは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールであるを指す。いくつかの場合において、スルホニル基は、-SO2アルキル式中、アルキル基は、所望により置換されていてもよいである。スルホニル基の1つの例は、メチルスルホニル例えば、-SO2CH3である。用語スルホキシルは、-SOR式中、各Rは、それぞれ独立して、水素、所望により置換されていてもよいアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロアルキル、所望により置換されていてもよいシクロアルキル、所望により置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されていてもよいアリール、または所望により置換されていてもよいヘテロアリールであるを指す。スルホニル基の1つの例は、メチルスルホニル例えば、-SOCH3である。いくつかの場合において、上記置換基は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、アルコキシカルボニル、ニトロ、シリル、トリハロメタンスルホニル、トリフルオロメチル、およびアミノモノ置換アミノ基およびジ置換アミノ基を含む、ならびに保護基を有するそれらの誘導体からそれぞれ独立して選択される1以上の基である。上記置換基の保護誘導体を形成し得る保護基は、当業者に公知であり、GreeneandWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis;3rdEdition,JohnWileyandSons:NewYork,2006などの文献に見出すことができる。置換基が所望により置換されていてもよいと記載されている場合、その置換基は、上述した置換基で置換されていてもよい。不斉炭素原子が存在してもよい。そのような異性体ジアステレオ異性体および鏡像異性体ならびにそれらの混合物を含むはすべて、本開示の範囲に含まれることが意図される。いくつかの特定の場合において、化合物は、互変異性体として存在し得る。すべての互変異性体は、本開示の範囲に含まれることが意図される。同様に、化合物がアルケニル基またはアルケニレン基を含む場合は、その化合物にはシス異性体およびトランス異性体が存在する可能性がある。本開示の範囲において、シス異性体、トランス異性体、ならびにシス異性体およびトランス異性体の混合物が考えられる。本開示の治療剤の塩例えば、薬学的に許容可能な塩は、適切な塩基または酸を化学量論的当量の治療剤と反応させることによって調製することができる。薬学的に許容可能な塩を形成するために一般に使用される酸は、無機酸二硫化水素、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸など、有機酸para-トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、二酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、ギ酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、乳酸、シュウ酸、para-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸など、ならびに関連の無機酸および有機酸を含む。したがって、このような薬学的に許容可能な塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-ジオン酸塩、ヘキシン-1,6-ジオン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、O-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン-2-スルホン酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。一実施形態において、薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸により形成されたもの、および特にマレイン酸などの有機酸により形成されたものを含む。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンにより形成され得る。化合物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な陽イオンにより調製してもよい。好適な薬学的に許容可能な陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ金属陽イオン、アルカリ土類金属陽イオン、アンモニウム陽イオン、および第4級アンモニウム陽イオンを含む。また、薬学的に許容可能な塩基付加塩としては、炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、または鉄などである。好適なアミンは、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、およびプロカインを含む。同様に、当業者に一般に公知の方法によって、治療剤の薬学的に許容可能な誘導体例えば、エステル、代謝産物、水和物、溶媒和物およびプロドラッグを調製してもよい。したがって、別の実施形態では、活性化合物のプロドラッグである化合物を提供する。一般に、プロドラッグは、インビボで代謝されて例えば、脱アミノ、脱アルキル、脱エステル化などの代謝変換によって活性化合物を提供する化合物である。薬学的に許容可能なプロドラッグは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを呈することなく患者に対して薬学的に好適に使用できるとともに目的の用途に対して有効である化合物を意味し、治療剤の薬学的に許容可能なエステルや、可能である場合、両性イオン形態を含む。本明細書において、用語薬学的に許容可能なエステルは、インビボで加水分解するエステルを指し、ヒトの体内で容易に分解して親化合物またはその塩を遊離するエステルを含む。好適なエステル基としては、例えば、薬学的に許容可能な脂肪族カルボン酸、特に、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカンジオン酸由来のエステル基アルキル基またはアルケニル基がそれぞれ6個以下の炭素原子を有する場合有利であるが挙げられる。具体的なエステルの代表例としては、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、およびエチルコハク酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なプロドラッグの種類の例は、HiguchiandStella,Pro-drugsasNovelDeliverySystems,Vol.14oftheA.C.S.SymposiumSeries,andinRoche,ed.,BioreversibleCarriersinDrugDesign,AmericanPharmaceuticalAssociationandPergamonPress,1987に記載されており、いずれも本明細書において参照により援用される。また、本明細書に記載の化合物および組成物は、代謝産物も含み得る。本明細書において、用語代謝産物は、実施形態に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、類似体もしくは誘導体の代謝により生じる物質であって、開示の治療剤と同様の活性をインビトロまたはインビボで示す物質を意味する。また、本明細書に記載の化合物および組成物は、水和物および溶媒和物も含み得る。本明細書において、用語溶媒和物は、溶質本明細書においては治療剤と溶媒によって形成される複合体を指す。実施形態の目的に即した好ましい溶媒は、溶質の生物活性を妨げない溶媒である。溶媒は、例えば、水、エタノール、または酢酸であり得る。治療方法本明細書で開示する方法は、障害を治療する方法、例えば、DUB活性に関連する障害またはDUB活性の調節により影響を受ける障害などを治療する方法、またはDUB活性に関連する障害および/またはDUB活性の調節により影響を受ける障害を治療するための医薬の調製における、本明細書で開示する化合物の使用を含む。さらに考えられるのは、UCH触媒ドメインを阻害することを伴う治療の方法である。考えられる具体的な障害としては、病原性の感染、がん、発達障害および神経変性障害、Riddle症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびDUBを要するまたはDUBにより調節される遺伝子障害例えば、ファンコーニ貧血が挙げられる。いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、DUBの活性調節により影響を受ける障害を有する対象を同定すること、およびその対象に本明細書で開示するような化合物を投与することをさらに含む方法である。さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、予防の方法であり、本明細書で開示するような化合物または組成物を、障害の発症前に投与する。いくつかの特定の場合において、上記方法は、DUB活性に関連するおよび/またはDUB調節により影響を受ける障害例えば、本明細書で開示するようなウイルス、細菌、および/または寄生体を罹患するおそれのある対象を同定すること、および本明細書で開示するような化合物の有効量を投与することをさらに含む。いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、細胞における病原性の感染を抑制する方法であって、本明細書で開示するような化合物を病原性の感染を抑制する量投与することを含む方法である。さまざまな場合において、細胞を上記化合物と接触させる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、動物の細胞、より具体的には、哺乳類の細胞または鳥類の細胞、さらにより具体的にはヒトの細胞である。さまざまな場合において、上記方法は、病原性の感染による症状を治療することを含む。考えられる病原性の感染は、本明細書内に別途記載する。さまざまな実施形態において、上記方法は、病原性の感染および/または病原性の感染による症状を有するヒトを同定すること、および本明細書で開示するような化合物の有効量を投与して病原性の感染を抑制することをさらに含む。いくつかの場合において、本明細書において提供される方法は、細胞の増殖を抑制する方法であって、細胞を本明細書で開示するような化合物の有効量と接触させて増殖を抑制することを含む方法である。いくつかの場合において、上記細胞は、がん細胞である。考えられるがん細胞は、本明細書内に別途記載する。さまざまな場合において、上記化合物は、上記細胞の内因性のDUBを阻害し、増殖を抑制する。さまざまな場合において、本明細書において提供される方法は、神経変性疾患を治療する方法であって、本明細書で開示するような化合物の有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む方法である。考えられる神経変性疾患は、本明細書内に別途記載する。いくつかの場合において、上記方法は、上記神経変性疾患の1以上の症状を治療する。また、本明細書で開示する方法は、遺伝子障害の1以上の症状を治療する方法であって、本明細書で開示するような化合物の有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含む方法である。さまざまな場合において、上記化合物は、DUBを阻害して遺伝子障害の1以上の症状を緩和する。考えられる遺伝子障害は、本明細書内に別途記載する。いくつかの場合において、本明細書で開示する方法は、第2の治療剤を投与することをさらに含む。第2の治療剤は、本明細書で開示するような化合物と同時にまたは時間差をおいて例えば、約1時間~約12時間の間隔を空けて投与してもよい。これら2種の剤を同時に投与する場合は、これらの剤を合わせて1つの製剤として調製してもよく、また別々の製剤として調製して同時にまたは約30分以内の時間差をおいて投与してもよい。考えられる第2の剤としては、例えば、抗ウイルス剤、抗寄生体剤、抗菌剤、抗がん剤、遺伝子障害の1以上の症状を治療する剤、および/または神経変性障害を治療する剤が挙げられる。病原性の感染本明細書で開示する方法および化合物は、病原性の感染の治療において有用であり、例えば、病原性の感染または病原性の感染の症状の予防、抑制および/または緩和において有用である。いくつかの場合において、本明細書で開示する方法および化合物は、病原性の感染による症状の治療において有用である。食品および水道に対する故意の汚染は、米国国民全体における健康および健康関連サービスならびに世界中で従事している米国軍隊にとって大きな脅威である。水および食品を媒介するカテゴリーBに属する病原体の多くは、この種のバイオテロリズムの有力な候補とならしめる特定の性質を有する例えば、低感染用量、高安定性。この潜在的な脅威を阻止するために、これら特定の病原体に対して防御または予防することが可能な方法または剤が緊急に必要とされている。理想的には、広範囲の脅威に対して防御することが可能な剤が望ましい。本明細書で開示する化合物は、複数の病原体に対して広い活性を有する。例えば、WP1130は、カテゴリーAおよびBに属する種々の病原体、ならびにこれらと同科に属する関連する病原体による感染、具体的には、マウスノロウイルス、リステリアモノサイトゲネスListeriamonocytogenesおよびトキソプラズマゴンヂToxoplasmagondiiによる感染、ならびにノーウォークウイルス複製の強力な阻害剤である。また、WP1130は、脳心筋炎ウイルス、シンドビスSindbisウイルスおよびラクロスLaCrosseウイルスに対する抗ウイルス活性も示す。特定の細胞において、WP1130がデユビキチナーゼを阻害すると、細胞内の細胞質およびアグリソームコンパートメントにユビキチン化タンパク質が蓄積する。これにより、標的細胞内に病原体の感染または複製にとっては好ましくない環境が確立されると考えられる。したがって、WP1130は、複数の病原体を効果的に抑制することができる抗菌剤として使用されている。この化合物ならびに化学式I、II、IIaおよび/またはIIIで表される他の化合物は、カテゴリーAおよび/もしくはBの病原体、ならびに/またはこれらと同科に属する関連する病原体による感染を阻止する。感染機序においてDUBを利用する病原体が考えられる。いくつかの場合において、上記病原体は、感染細胞の内因性のDUBを利用する。さまざまな場合において、上記病原体は、病原体自体の内因性のDUBを利用する。考えられる病原性の感染による疾患または障害としては、胃腸炎、脳炎、気道感染例えば、SARS、インフルエンザ、ウイルス誘発性がん、狂犬病、出血熱例えば、クリミアコンゴ、デング、リフトバレー熱、リステリア症、またはトキソプラズマ症が挙げられる。考えられる病原性の感染による疾患または障害としては、髄膜炎、心筋炎、肝炎、菌血症、および皮膚感染も挙げられる。考えられる病原体としては、ウイルス性、細菌性、真菌性、および寄生性の病原体が挙げられる。考えられる病原性ウイルスとしては、カリシウイルス例えば、ノロウイルス、サポウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルテリウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、パピローマウイルス、卵巣腫瘍OTU様プロテアーゼをコードするウイルス、バキュロウイルス、またはナイロウイルスが挙げられる。考えられる他の病原性のウイルスとしては、ポリオーマウイルスおよびレトロウイルスが挙げられる。考えられる具体的なウイルスとしては、脳心筋炎ウイルスEMCV、シンドビスウイルスSiNV、ラクロスウイルスLaCV、ノーウォークウイルス、エプスタインバールEBV、ヘルペスウイルス、デングウイルス、呼吸器系合胞体ウイルスRSV、パピローマウイルス、およびインフルエンザが挙げられる。さらに考えられる具体的なウイルスとしては、サイトメガロウイルス、BKウイルス、C型肝炎ウイルス、およびHIVが挙げられる。考えられる細菌としては、クラミジア、エシェリヒア、サルモネラ、イェルシニア、バークホルデリア、ヘモフィルス、リステリア、およびマイコバクテリウムが挙げられる。考えられる他の細菌としては、黄色ブドウ球菌Staphylococcusaureus、より具体的にはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌MRSAが挙げられる。考えられる寄生体または真菌類としては、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum、トキソプラズマゴンヂToxoplasmagondii、エントアメーバヒストリティカEntamoebahistolytica、ランブル鞭毛虫Giardialamblia、ブルーストリパノソーマTrypanosomabrucei、クルーズトリパノソーマTrypanosomacruzi、セストダCestoda、クロノルキスClonorchis、オピストルキスOpisthorchis、ストロンギロイデスStrongylocides、カンジダCandida、アスペルギルスAspergillus、およびクリプトコックスCryptococcusが挙げられる。がん本明細書で開示する方法および化合物は、がんの治療、例えば、がんまたはがんの症状の予防、抑制および/または緩和において有用である。いくつかの場合において、がんを治療する上記方法は、DUB例えば、がんの生存または増殖に関与するDUBを阻害することを含む。さまざまな場合において、がんを治療するための上記化合物は、WP1130である。式中、Prは、n-プロピル基を示す。考えられる具体的ながんとしては、慢性骨髄性白血病CML、黒色腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞異形成、骨髄増殖性障害、膠芽腫、カポジ肉腫、および鼻咽頭癌腫EBVが挙げられるが、これらに限定されない。考えられる他のがんとしては、肺がん、結腸がん、膵臓がん、乳がん、前立腺がん、および固形腫瘍が挙げられる。投薬および医薬製剤本明細書において使用される用語治療に有効な量および予防に有効な量は、同定された疾患または症状を治療、緩和または予防するのに十分な化合物の量、または検出可能な治療効果、予防効果または抑制効果を発揮するのに十分な化合物の量を指す。このような効果は、例えば、病態の改善、症状の軽減によって、または本明細書に記載の任意のアッセイまたは臨床診断検査によって検出することができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、大きさおよび健康、症状の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。所定の状況における治療および予防に有効な量は、臨床医の技量および判断の範囲内である通常の試験により決定することができる。治療剤の用量は、交互にalternately、mg/kg単位で示される投与量として投与され得る。本明細書に開示する治療剤の考えられるmg/kg投与量としては、約0.001mg/kg~約1000mg/kgが挙げられる。mg/kg単位の投与量の具体的な範囲としては、約0.1mg/kg~約500mg/kg、約0.5mg/kg~約200mg/kg、約1mg/kg~約100mg/kg、約2mg/kg~約50mg/kg、および約5mg/kg~約30mg/kgが挙げられる。本明細書において、本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を用いて医薬組成物として調製することができる。本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、疾患または症状の治療を可能にする任意の経路によって投与される。投与の一経路は、経口投与である。また、本明細書に記載の化合物または該化合物を含む組成物は、非経口静脈内、腹腔内、肺内、皮下または筋肉内など、クモ膜腔内、局所、経皮、直腸内、経口、鼻内または吸入を含む、任意の標準的な投与経路を使用して患者に送達することができる。また、消化管内で活性化合物の放出を制御して体液と接触させ、かつ該活性化合物の実質的に一定かつ有効な血漿レベルを提供するために、本明細書に記載の化合物を徐放製剤として調製してもよい。この目的のために、上記化合物の結晶体を、生分解性ポリマー、水溶性ポリマーまたはこれらの混合物、さらに必要に応じて好適な界面活性剤を配合して構成されるポリマーマトリクス内に組み込んでもよい。この場合、組み込むとは、ポリマーのマトリクス内に微粒子を包含させることを意味し得る。また、制御放出製剤は、公知の分散技術または乳化コーティング技術による分散微粒子または乳化微小液滴のカプセル化によっても得ることができる。投与は、単回投与であってもよく、また本明細書で開示するような化合物を一定期間にわたって複数回に分けて投与するか、または持続放出が可能な製剤もしくは投与方法例えば、ポンプにより投与してもよい。実施形態の化合物をどのような方法を用いて対象に投与しようとも、投与される化合物の量および選択される投与経路は、病態に対して効果的な治療が提供されるように選択されるべきである。一実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、個々の投与方法および剤形に応じて、1以上の薬学的に許容可能な賦形剤担体、溶媒、安定化剤、補助薬、希釈剤などを用いて調製される。本発明に係る医薬組成物は、一般に、生理学的に適合可能なpHとなるように調製されるべきであり、製剤および投与経路に応じて、約pH3~約pH11、好ましくは約pH3~約pH7の範囲であり得る。別の実施形態において、pHは、約pH5.0~約pH8の範囲に調節される。より詳細には、本発明に係る医薬組成物は、治療または予防に有効な量の、本明細書に記載の少なくとも1つの化合物を、1以上の薬学的に許容可能な賦形剤とともに含有することができる。また、本発明に係る医薬組成物は、必要に応じて、本明細書に記載の化合物を組み合せて含有することも、細菌感染の治療または予防に有用な第2の活性成分例えば、抗細菌anti-bicterial剤または抗菌anti-microbial剤を含有することもできる。例えば、非経口投与または経口投与のための製剤として最も一般的なものは、固形剤、液剤、乳剤または懸濁剤であり、肺内投与のための吸入可能な製剤は、一般に、液剤または散剤である。また、医薬組成物は、投与の前に生理学的に適合可能な溶媒を用いて再構築される凍結乾燥固体として調製してもよい。また、医薬組成物は、シロップ剤、クリーム、軟膏、錠剤などとして調製してもよい。用語薬学的に許容可能な賦形剤は、本明細書に記載の化合物などの薬剤の投与のための賦形剤を指す。この用語は、過度の毒性を示すことなく投与され得る任意の医薬賦形剤を指す。薬学的に許容可能な賦形剤は、投与される個々の組成物、およびその組成物を投与するために使用される個々の方法により決定されるものでもある。したがって、医薬組成物の好適な製剤には多種多様な形態が存在する例えば、Remington’sPharmaceuticalSciencesを参照。好適な賦形剤としては、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子といった大型で代謝の遅い高分子などの担体分子が挙げられる。他の賦形剤の例としては、酸化防止剤例えば、アスコルビン酸、キレート剤例えば、EDTA、炭水化物例えば、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、および/またはヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸、液体例えば、油、水、生理食塩水、グリセロールおよび/またはエタノール、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などが挙げられる。また、リポソームも薬学的に許容可能な賦形剤の定義に含まれる。本明細書に記載の医薬組成物は、目的の投与方法に好適な任意の形態に調製される。例えば、経口使用を目的とする場合、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁剤、非水性液剤、分散性散剤もしくは顆粒剤微粉化粒子またはナノ粒子を含む、乳剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤として調製することができる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造分野で公知の任意の方法にしたがって調製することができ、そのような組成物は、口当たりの良い製剤を提供するために1以上の剤甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤を含むを含有してもよい。錠剤と共に使用される特に好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤セルロース、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど、崩壊剤架橋ポビドン、トウモロコシスターチ、またはアルギン酸など、結合剤ポビドン、スターチ、ゼラチン、またはアラビアゴムなど、および潤滑剤ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどが挙げられる。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、また消化管での崩壊および吸収を遅らせて長期間にわたって持続作用を提供できるように公知の手法マイクロカプセル化を含むによってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの放出遅延物質を単独で使用してもよく、またロウとともに使用してもよい。また、経口用製剤は、活性成分を不活性な固体希釈剤例えばセルロース、ラクトース、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合した硬ゼラチンカプセルであってもよく、また活性成分を非水性媒質または油性媒質グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油などと混合した軟ゼラチンカプセルであってもよい。別の実施形態において、医薬組成物は、実施形態の化合物を懸濁剤の製造に好適な少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤と混合した懸濁剤として調製してもよい。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、好適な賦形剤を添加することによって懸濁剤の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤として調製してもよい。懸濁剤に関連して使用される好適な賦形剤としては、懸濁化剤例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、アラビアゴム、分散剤または湿潤剤例えば、天然のホスファチド例えば、レシチン、酸化アルキレンと脂肪酸例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレンとの縮合産物、酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコール例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールとの縮合産物、酸化エチレンと、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステル例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンとの縮合産物、および増粘剤例えば、カルボマー、蜜ロウ、固体パラフィンまたはセチルアルコールが挙げられる。また、懸濁剤は、1以上の防腐剤例えば、酢酸、p-ヒドロキシ-安息香酸メチルまたはp-ヒドロキシ-安息香酸n-プロピル、1以上の着色剤、1以上の着香剤、および1以上の甘味剤スクロースまたはサッカリンなどを含有してもよい。また、本発明に係る医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油オリーブ油またはラッカセイ油など、鉱油液体パラフィンなど、またはこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤としては、天然ゴムアラビアゴムおよびトラガントゴムなど、天然のホスファチド大豆レシチンまたは脂肪酸由来のエステルもしくは部分エステルなど、無水ヘキシトールモノステアリン酸ソルビタンなど、および上記部分エステルと酸化エチレンとの縮合産物モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどが挙げられる。また、乳剤は、甘味剤および着香剤を含有してもよい。シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤グリセロール、ソルビトール、またはスクロースなどを用いて調製してもよい。また、そのような製剤は、粘滑剤、防腐剤、着香剤または着色剤を含有してもよい。また、本発明に係る医薬組成物は、滅菌された注射可能な製剤滅菌された注射可能な水性乳剤または油性懸濁剤などの形態であってもよい。この乳剤または懸濁剤は、当業者により、上述したものを含む好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる。また、滅菌された注射可能な製剤は、毒性がなく非経口で許容可能な希釈剤または溶媒を用いて調製された、滅菌された注射可能な液剤または懸濁剤1,2-プロパン-ジオールを用いて調製された液剤などであってもよい。また、滅菌された注射可能な製剤は、凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。また、滅菌された不揮発性油も、溶媒または懸濁媒質として使用することができる。この目的のために、無刺激性blandの不揮発性油合成モノまたはジグリセリドを含むを使用してもよい。また、脂肪酸例えば、オレイン酸も同様に、注射剤の調製に使用することができる。安定な水溶性剤形の医薬組成物を得るために、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩を、有機酸または無機酸の水性溶液コハク酸、より好ましくは、クエン酸の0.3M溶液などに溶解してもよい。可溶性の塩が得られない場合は、化合物を好適な1種の共溶媒または2種以上を好適に組み合わせた共溶媒に溶解してもよい。好適な共溶媒の例としては、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール300、ポリソルベート80、グリセリンなどが挙げられ、その濃度は全量の約0~約60の範囲である。一実施形態においては、活性化合物をDMSOに溶解したものを水で希釈する。また、本発明に係る医薬組成物は、活性成分の塩形態を適切な水性ビヒクル水、等張食塩水または等張デキストロース溶液などに溶解した溶液の形態であってもよい。また、送達により適したものになるように例えば、溶解度、生物活性または口当たりの良さの改善、副作用の低減など化学構造または生化学的構造の置換または付加によって、例えばエステル化、グリコシル化、PEG化などによって、修飾を施した化合物も考えられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の化合物は、経口投与を目的として、溶解度の低い化合物に適した脂質系製剤として調製してもよい。一般に、脂質系製剤とすることにより、そのような化合物の経口バイオアベイラビリティを向上させることができる。この場合、医薬組成物は、治療または予防に有効な量の本明細書に記載の化合物とともに、中鎖脂肪酸およびそのプロピレングリコールエステル例えば、食用脂肪酸カプリル脂肪酸およびカプリン脂肪酸などのプロピレングリコールエステルならびに薬学的に許容可能な界面活性剤ポリオキシル40硬化ヒマシ油からなる群から選択される少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、水溶液における溶解促進剤としてシクロデキストリンを添加してもよい。シクロデキストリンの例としては、α-、β-、およびγ-シクロデキストリンのヒドロキシプロピル誘導体、ヒドロキシエチル誘導体、グルコシル誘導体、マルトシル誘導体、およびマルトトリオシル誘導体が挙げられる。具体的なシクロデキストリン系溶解促進剤は、ヒドロキシプロピル-o-シクロデキストリンBPBCであり、これは、上記組成物のいずれに添加しても実施形態の化合物の水溶解特性をさらに向上させることができる。一実施形態において、上記組成物は、約0.1~約20のヒドロキシプロピル-o-シクロデキストリン、より好ましくは約1~約15のヒドロキシプロピル-o-シクロデキストリン、さらにより好ましくは約2.5~約10のヒドロキシプロピル-o-シクロデキストリンを含む。使用される溶解促進剤の量は、組成物中の本発明の化合物の量に依存する。併用療法また、実施形態の方法は、病態を治療するための、本明細書に記載の1以上の化合物と、1以上の別の治療剤との併用を含む。したがって、例えば、併用する活性成分は、11つの製剤とした組合せ製剤として調製し、同時に投与または送達してもよく、2別々の製剤として交互でまたは並行して送達してもよく、または3当該技術分野で公知の任意の他の組合せ治療レジメンにより送達してもよい。交互療法alternationtherapyにおいて送達される場合、本明細書に記載の方法は、活性成分を、例えば、別々の液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、もしくはカプセル剤として、または別個の注射器に充填した注射剤として、順次投与または送達することを含む。一般に、交互療法においては、各活性成分の有効量を順次すなわち、連続して投与するが、同時療法simultaneoustherapyにおいては、2以上の活性成分の有効量を一緒に投与する。また、間欠的併用療法をさまざまな順序で使用してもよい。いくつかの場合において、本明細書で開示する化合物は、第2の治療剤例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗寄生体剤、および/または化学療法剤例えば、抗がん剤とともに投与および/または製剤化される。本発明において使用可能な抗ウイルス剤としては、アシクロビルacyclovir、ドコサノールdocosanol、リバビリンribarivin、インターフェロンなど;酢酸セルロース、カーボポールcarbopolおよびカラギナン、プレコナリルpleconaril、アマンタジンamantidine、リマンチジンrimantidine、ホミビルセンfomivirsen、ジドブジンzidovudine、ラミブジンlamivudine、ザナミビルzanamivir、オセルタミビルoseltamivir、ブリブジンbrivudine、アバカビルabacavir、アデホビルadefovir、アンプレナビルamprenavir、アルビドールarbidol、アタザナビルatazanavir、アトリプラatripla、シドフォビルcidofovir、コンビビルcombivir、エドクスジンedoxudine、エファビレンツefavirenz、エムトリシタビンemtricitabine、エンフビルチドenfuvirtide、エンテカビルentecavir、ファムシクロビルfamciclovir、ホスアンプレナビルfosamprenavir、ホスカルネットfoscarnet、ホスホネットfosfonet、ガンシクロビルganciclovir、ガーダシルgardasil、イバシタビンibacitabine、イムノビルimunovir、イドクスウリジンidoxuridine、イミキモドimiquimod、インジナビルindinavir、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ラミブジンlamivudine、ロピナビルlopinavir、ロビリドloviride、mk-0518、マラビロクmaraviroc、モロキシジンmoroxydine、ネルフィナビルnelfinavir、ネビラピンnevirapine、ネキサビルnexavir、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド類似体、オセルタミビルoseltamivir、ペンシクロビルpenciclovir、ペラミビルperamivir、ポドフィロトキシンpodophyllotoxin、リマンタジンrimantadine、リトナビルritonavir、サキナビルsaquinavir、スタブジンstavudine、テノホビルtenofovir、テノホビルジソプロキシルtenofovirdisoproxil、チプラナビルtipranavir、トリフルリジンtrifluridine、トリジビルtrizivir、トロマンタジンtromantadine、ツルバダtruvada、バラシクロビルvalaciclovir、バルガンシクロビルvalganciclovir、ビクリビロックvicriviroc、ビダラビンvidarabine、ビラミジンviramidine、ザルシタビンzalcitabine、モルフォリノmorpholinoオリゴヌクレオチド、リボザイム、プロテアーゼ阻害剤、アセンブリ阻害剤例えば、リファンピシン、およびジドブジンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用可能な抗菌剤としては、β-ラクタム系抗生物質天然ペニシリン、半合成ペニシリン、天然セファロスポリン、半合成セファロスポリン、セファマイシン、1-オキサセフェムoxacephem、クラブラン酸、ペネムpenem、カルバペネム、ノカルジシン、モノバクタムmonobactamなど;テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、アントラサイクリン;アミノグリコシド;ヌクレオシドN-ヌクレオシド、C-ヌクレオシド、炭素環式ヌクレオシド、ブラストサイジンSなど;マクロライド12員環マクロライド、14員環マクロライド、16員環マクロライドなど;アンサマイシンansamycin;ペプチドブレオマイシン、グラミシジン、ポリミキシン、バシトラシン、ラクトン結合を含有する大員環状ペプチド抗生物質、アクチノマイシン、アンホマイシンamphomycin、カプレオマイシン、ジスタマイシンdistamycin、エンジュラシジンenduracidins、ミカマイシンmikamycin、ネオカルチノスタチンneocarzinostatin、ステンドマイシンstendomycin、バイオマイシン、ヴァージニアマイシンなど;シクロヘキシミド;シクロセリン;バリオチンvariotin;サルコマイシンA;ノボビオシン;グリセオフルビン;クロラムフェニコール;マイトマイシン;フマギリン;モネンシン;ピロルニトリン;ホスホマイシンfosfomycin;フシジン酸;D-p-ヒドロキシフェニルグリシン;D-フェニルグリシン;エンジインenediyne;ベンジルペニシリンカリウム、プロカイン、ベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、プロピシリン、カルベニシリンジナトリウム、フェニルナトリウム、インダニルナトリウム、スルベニシリン、チカルシリンジナトリウム、メチシリンナトリウム、オキサシリンナトリウム、クロキサシリンナトリウム、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、メズロシリン、ピペラシリンナトリウム、アモキシシリン、シクラシリン、ヘクタシリンhectacillin、スルバクタムナトリウム、タランピシリン塩酸塩、バカンピシリン塩酸塩、ピブメシリナム、セファレキシン、セファクロル、セファログリシン、セファドロキシル、セフラジン、セフロキサジン、セファピリンナトリウム、セファロチンナトリウム、セファセトリルナトリウム、セフスロジンナトリウム、セファロリジン、セファトリジン、セフォペラゾンナトリウム、セファマンドール、ベホチアンvefotiam塩酸塩、セファゾリンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフメノキシム塩酸塩、セフロキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフォキシチン、セフメタゾール、セフォテタン、ラタモキセフ、クラブラン酸、イミペネム、アズトレオナム、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン塩酸塩、デメチルクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、メタサイクリン、ドキシシサイクリン、ロリテトラサイクリン、ミノサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩、ドキソルビシン、アクラルビシン、カナマイシン硫酸塩、ベカナマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン硫酸塩、ジベカシン、アミカシン、ミクロノマイシン、リボスタマイシン、ネオマイシン硫酸塩、パロモマイシン硫酸塩、ストレプトマイシン硫酸塩、ジヒドロストレプトマイシン、デストマイシンA、ハイグロマイシンB、アプラマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン硫酸塩、スペクチノマイシン塩酸塩、アストロマイシン硫酸塩、バリダマイシン、カスガマイシン、ポリオキシン、ブラストサイジンS、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、リン酸オレアンドマイシン、トリアセチルオレアンドマイシンtracetyloleandomycin、キタサマイシン、ジョサマイシン、スピラマイシン、タイロシン、イベルメクチン、ミデカマイシン、ブレオマイシン硫酸塩、ペプロマイシン硫酸塩、グラミシジンS、ポリミキシンB、バシトラシン、コリスチン硫酸塩、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、エンラマイシン、ミカマイシン、ヴァージニアマイシン、硫酸カプレオマイシン、バイオマイシン、エンビオマイシン、バンコマイシン、アクチマイシンD、ネオカルジノスタチン、ベスタチン、ペプスタチン、モネンシン、ラサロシド、サリノマイシン、アンホテリシンB、ニスタチン、ナタマイシン、トリコマイシン、ミトラマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸パルミチン酸クリンダマイシン、フラボホスホリポール、シクロセリン、ペシロシンpecilocin、グリセオフルビン、クロラムフェニコール、クロラムフェニコールパルミチン酸エステル、マイトマイシンC、ピロルニトリン、ホスホマイシン、フシジン酸、ビコザマイシン、チアムリン、またはシッカニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、抗ウイルス剤は、病原性物質の産生を阻害する。この場合、細菌は、病原性因子毒素などの産生が妨げられ、免疫系によって排除され得る。例えば、以下を参照のこと。Linetal.,ArchBiochemBiophys.2010Sep15;5012:214-20.Epub2010Jun15;Darbyetal.,JAntimicrobChemother.2010Jul;657:1424-7.Epub2010Apr30;Bryketal.,Biochemistry.2010Mar2;498:1616-27;Linetal.,Nature.2009Oct1;4617264:621-6.Epub2009Sep16;deCarvalhoetal.,JMedChem.2009Oct8;5219:5789-92;Nathanetal.,TuberculosisEdinb.2008Aug;88Suppl1:S25-33;Bryk,etal.,CellHostMicrobe.2008Mar13;33:137-45;Casenghi,etal.,PLoSMed.2007Nov6;411:e293;Huetal.,MolMicrobiol.2006Mar;595:1417-28;andKlineetal.,JMedChem.2008Nov27;5122:7065-74.本発明において使用可能な抗寄生体剤としては、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオールBNPD、β-ニトロスチレンBNS、ドデシルグアニジン塩酸塩、2,2-ジブロモ-3-ニトリロプロピオンアミドDBNPA、グルタルアルデヒド、イソチアゾリン、メチレンビスチオシアナート、トリアジン、塩化n-アルキルジメチルベンジルアンモニウム、リン酸トリナトリウム系抗菌剤、酸化トリブチルスズ、オキサゾリジン、硫酸テトラキスヒドロキシメチルホスホニウムTHPS、フェノール、クロム化ヒ酸銅、亜鉛ピリチオン、銅ピリチオン、カーバメート、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、臭化ナトリウム、ハロヒダントインBr、Cl、ピリメタミン、スルファジアジン、スルファドキシン、クリンダマイシン、およびスピラマイシンまたはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用可能な化学療法剤としては、アルキル化剤窒素マスタードメクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロランブシルなど;ニトロソ尿素カルムスチンBCNU、ロムスチンCCNU、およびセムスチンメチル-CCNUなど;エチレンイミン/メチルメラミントリエチレンメラミンthriethylenemelamineTEM、トリエチレン、チオホスホルアミドthiophosphoramideチオテパ、ヘキサメチルメラミンHMM、アルトレタミンaltretamineなど;スルホン酸アルキルブスルファンなど;トリアジンダカルバジンDTICなどを含む;代謝拮抗物質葉酸類似体メトトレキセートおよびトリメトレキセートtrimetrexateなど、ピリミジン類似体5-フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシドAraC、シタラビン、5-アザシチジン、2,2’-ヂフルオロデオキシシチジンなど、プリン類似体6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、アザチオプリン、2’-デオキシコホルマイシンdeoxycoformycinペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニンEHNA、フルダラビンリン酸エステル、および2-クロロデオキシアデノシンクラドリビン、2-CdAなどを含む;天然産物有糸分裂抑制薬パクリタキセル、ビンカアルカロイドビンブラスチンVLB、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む、タキソテールtaxotere、エストラムスチン、およびエストラムスチンリン酸エステルなど;エピポドフィロepipodophylo毒素エトポシドおよびテニポシドteniposideなど;抗生物質アクチノマイシンD、ダウノマイシンルビドマイシンrubidomycin、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンplicamycinミトラマイシンmithramycin、マイトマイシンC、およびアクチマイシンなど;酵素L-アスパラギナーゼなど;生物応答調節物質biologicalresponsemodifierインターフェロン-α、IL-2、G-CSF、およびGM-CSFなどを含む;その他の種々の剤白金配位錯体シスプラチンおよびカルボプラチンなど、アントラセンジオンanthracenedioneミトキサントロンなど、置換尿素ヒドロキシ尿素など、メチルヒドラジン誘導体N-メチルヒドラジンMIHおよびプロカルバジンを含む、副腎皮質抑制剤ミトタンo,p’-DDDおよびアミノグルテチミドなど;ホルモンおよびアンタゴニスト副腎皮質ステロイドアンタゴニストプレドニゾンおよび同等物など、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミドなど;プロゲスチンヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン酢酸エステルおよびメゲストロール酢酸エステルmegestrolacetateなど;エストロゲンジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール同等物など;抗エストロゲンタモキシフェンなど;アンドロゲンテストステロンプロピオン酸エステルおよびフルオキシメステロン/同等物を含む;抗アンドロゲンフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリドleuprolideなど;非ステロイド系抗アンドロゲンフルタミドなどを含む;キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、BH3模倣剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、stat阻害剤、およびナノ粒子を含むが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の例示的な実施形態を詳細に示す以下の実施例を参照することによって本発明はさらに完全に理解されるだろう。しかし、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本開示全体におけるすべての引用は、参照により本開示において明示的に援用される。DUB阻害剤の抗がん作用の評価慢性骨髄性白血病CMLは、造血幹細胞の染色体異常によって、制御不能なチロシンキナーゼ活性を有するBcr-Ablが発現する疾患である。このような所見は、CML患者に対して顕著な臨床有効性を示した最初のBcr-Ablキナーゼ阻害剤であるイマチニブの開発試験および臨床試験により裏付けられている。イマチニブは、CMLおよびBcr-Ablを発現する他の白血病に対する第一選択の治療薬であり、慢性期にイマチニブを投与された患者の大半において、完全な細胞遺伝学的応答が得られている。しかし、寛解期にイマチニブを投与された患者では、分子学的な検討により、多くの場合Bcr-Ablの発現がなおも検出されること、およびイマチニブ治療を中断すると往々にして再発することが示されている。また、進行したCML患者においてはイマチニブ応答の得られる期間が限定的であることは一般的であり、どのステージにおいてもイマチニブに対する耐性は生じる可能性がある。イマチニブ耐性の獲得および疾患の進行においては、多くの場合、イマチニブの結合およびキナーゼ阻害に影響を及ぼすBcr-Ablの変異および翻訳後修飾が観察されることが特徴である。イマチニブ耐性疾患における分子上の変化は、より高い親和性でBcr-Ablに結合するかまたはイマチニブ耐性に関わるイマチニブ非感受性キナーゼを阻害する第二世代のチロシンキナーゼ阻害剤を用いて克服できるものもある。しかし、これらの阻害剤の活性も、変異などの過程により制限される可能性がある。いくつかの知見により、Bcr-Ablがタンパク質の足場として機能することにより、キナーゼ活性に完全には依存しないシグナル伝達複合体を構成し得ることが示唆されている。このような所見より、場合によっては、Bcr-Ablタンパク質のレベルを調節する化合物の方がCML治療に対して高い有効性や適性を示す可能性があることが示唆される。DUB阻害活性を有する低分子のWP1130は、Bcr-Ablのユビキチン化を速やかに誘導し、それによりBcr-Ablは細胞質からアグリソームaggresomeと呼ばれるコンパクトな細胞内タンパク質複合体へと移行される。このような修飾により、下流のBcr-Abl発がんシグナル伝達は失われる。WP1130は、デユビキチナーゼの1つであるUsp9xを直接阻害する。Usp9xは、多くの腫瘍血液悪性腫瘍を含むで発現する抗アポトーシスタンパク質Mcl-1の安定性を調節することが近年報告されている。Mcl-1は、造血悪性腫瘍における薬剤耐性および生存に関与する。WP1130によるUsp9x阻害は、Mcl-1レベルの低下およびBcr-Ablキナーゼシグナル伝達の阻害を伴い、ひいては速やかなアポトーシスの開始につながる。これらの結果により、ユビキチンサイクルの特定のレギュレータregulatorを標的とすることは発がんタンパク質シグナル伝達を阻害し、上昇したアポトーシス閾値を低下させる新規の治療方法となることが示唆される。抗がん治療薬としてのWP1130の作用機序について検討した。CML細胞において発現および活性化される複数のキナーゼをスクリーニングした結果、WP1130によりBcr-Ablの下方調節のみが検出された。これを精査したところ、WP1130の作用は細胞の細胞質画分内で開始されることが示された。これは、主に細胞質に存在するBcr-Ablタンパク質に対する選択性を説明し得るものでもある。Jak2、LynおよびPI3-Kなどの他のキナーゼは、膜画分において検出されるか、または膜貫通受容体に会合していることが報告されている。いくつかの種類の腫瘍を分析したところ、HERファミリー、c-kitおよびFlt-3などの膜貫通キナーゼがWP1130に対して非感受性であることが示され、これにより、WP1130が特定の細胞質キナーゼに対して選択性を示すという所見が裏付けられた。しかし、Bcr-Ablを発現しない血液腫瘍では、WP1130に応答してJak2が急速にユビキチン化されてアグリソームへと輸送される。このことは、これまでに報告された、WP1130およびこれより低活性の誘導体WP1066およびWP1034などのJak/Stat阻害活性を説明し得る。本明細書で報告した活性結果および過去の所見に基づくと、WP1130は、Bcr-Ablなどのタンパク質のユビキチン化に至る一連のイベントを開始させる。このユビキチン修飾により、タンパク質が細胞小器官に輸送または移行されるようシグナルが発せられ、Bcr-Ablの場合、主な移行先はアグリソームであると考えられる。アグリソームは、通常、タンパク質の誤った折り畳みまたは過剰生成に応答して形成され、過剰なタンパク質が細胞代謝の妨げとなるのを防いで細胞を保護すると考えられている。しかし、Bcr-Ablの場合、シグナル伝達の喪失は、短期間であっても、CML細胞のアポトーシスの開始を伴う。この点で、WP1130によって開始されたBcr-Ablのコンパートメント化は、細胞保護プロセスを細胞破壊プロセスへと変化させると言える。WP1130によるDUB活性の阻害という所見に基づくと、DUBの標的が、上記で見られたWP1130の活性に関与していると考えられる。WP1130によるタンパク質ユビキチン化およびそのアポトーシス活性の一部に関しては、あるサブセットのDUB酵素の存在が根底にあると考えられる。WP1130と接触させたCML細胞において、全体的なDUB活性に大きな変化は検出されなかったが、Usp9xなどの特定のDUBの阻害は検出された。Usp9x活性は、細胞、細胞溶解液および酵素調製物を用いたアッセイにおいて、Bcr-Ablの輸送やアポトーシスの誘導に必要な濃度のWP1130によって影響を受けた。最近の報告により、Usp9xは、脱ユビキチン化によってMcl-1のプロテアソーム分解を阻害し、その結果、Mcl-1の安定性の向上およびMcl-1の半減期の延長をもたらすことが示唆されている例えば、Schwickart,etal.,Nature,463:103-1072010を参照。WP1130処理細胞において、Usp9x活性の阻害とともに、Mcl-1レベルが低下した。Usp9x阻害がBcr-Ablの輸送に関与するか否かを調べるために、CML細胞においてUsp9xの発現を抑制したところ、Mcl-1の下方調節は見られたが、Bcr-Ablのユビキチン化またはその細胞局在化には影響がなかった。Usp9xの発現および活性は、複数の腫瘍において、Mcl-1制御と密接な関係にあるが、Bcr-Ablキナーゼ阻害に対してはあまり応答しないCML幹細胞の生存率の維持にも非常に重要な働きをしている可能性がある。複数の研究により、初期段階の白血病前駆細胞は多くの上流カスケードの活性化Bcr-Abl活性化およびサイトカインによるStat活性化を含むにより、Mcl-1を過剰発現することが示されている。最近まで、がん化した細胞におけるMcl-1活性のモジュレータmodulatorとしてのUsp9xの役割は知られていなかったが、Usp9xの阻害剤は、多くの場合において、治療上重要である。この点で、WP1130はCMLをベースとした治療に非常に適している。なぜなら、WP1130は、アグリソームへのキナーゼ隔離によるBcr-Ablのシグナル伝達CML幹細胞の生存の安定化に不可欠と考えられるへの間接的な作用を有し、Usp9x活性を直接阻害するからである。Mcl-1レベルの制御におけるUsp9xの重要性を考慮すると、WP1130のような化合物は、Usp9x活性およびMcl-1保護が関わるアポトーシス耐性を克服するのに有用である。すべての化合物の20mMストック溶液DMSO中を作製し、-20°Cで冷凍保存した。これらを水性媒質で希釈してから使用した。本研究において使用した他の試薬は、以下の供給元から得た:ボルテゾミブMillenniumPharmaceuticals;ケンブリッジ、MA、Mini-CompleteおよびPhosSTOP阻害カクテルRocheAppliedScience、インディアナポリス、IN、Ub-AMC、血球凝集素標識ユビキチンビニルメチルスルホンHA-UbVs、Suc-LLVY-AMC、Boc-LRR-AMC、MG-132、ラクタシスチンLactacystinおよび20SヒトプロテアソームBostonBiochem、ケンブリッジ、MA。また、Rap80-アガロースビーズアフィニティマトリクス、アタキシンAtaxin-アガロースビーズアフィニティマトリクスおよび精製ポリユビキチン鎖K-48/K-63結合型も、BostonBiochemから入手した。17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン17-AAGは、LCLaboratoriesウーバーン、MAから購入した。細胞株および患者サンプル-K562、K562R、BV-173、BV-173RおよびWDT-2の各細胞株の増殖維持は、過去の報告に記載の方法と同様に行った。BaF3細胞も同じ培地で維持したが、培地には、1ng/mlのIL-3PeproTech、ロッキーヒル、NJを添加した。また、BaF3細胞は、過去の報告に記載の方法と同様に、野生型または変異型Bcr-Ablを用いて、または上流にeGFPコード配列をインフレームで挿入したBcr-Abl発現ベクターを用いて形質転換した。すべての細胞は、加湿雰囲気中37°Cで培養および維持した。患者由来の標本は、イマチニブ治療による疾患の継続的な制御が達成できなかったCML患者から提供されたものである。単核細胞は、血液サンプルから密度勾配遠心分離Ficoll-Hypaqueによって分離した後、PBSで洗浄して細胞培養培地に再懸濁しRPMI-1640、10ウシ胎仔血清、5CO2インキュベータにおいて37°Cで一晩インキュベートした後、阻害剤で処理した。プラスミドおよび電気穿孔法-eGFPコード領域は、EcoR1制限部位を有する5’プライマー:GAATTCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG配列番号1およびEcoRV制限部位を有する3’プライマー:GATATCGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG配列番号2を用いて、PCRによりpLEGFPcからクローニングした。p210Bcr/AblcDNApSG5由来を含有するpBSskベクターをClaIおよびEcoRIで消化し、EcoR1部位を平滑化した。eGFPフラグメントをClaIおよびEcoRVで消化し、pBSsk/p210Bcr/Ablに挿入することによって、5’標識eGFPp210Bcr/Ablを作製した。pMX/eGFPp210Bcr/Ablは、EcoRIおよびNotIを用いて、eGFPp210Bcr/AblをIRESeGFP欠失pMXpuroベクターに挿入することによって構築した。BaF3細胞に、pMX/eGFPp210Bcr/AblまたはpMX/eGFPp120Bcr/Abl-T315IpSG5-Bcr/Abl/T315IベクターからKpn1/BsrG1部位を利用してサブクローニングすることにより構築を電気穿孔法により導入した。すべての変異およびベクターへの挿入断片は、シーケンシングによって確認した。細胞は、ピューロマイシン2μg/ml;2週間耐性の有無により選抜し、eGFP陽性細胞をFACSFACSCANTO-II、BectonDickensonで選別することによってBcr-Abl発現細胞を濃縮した。Bcr-Abl発現およびサイトカイン非依存性は、免疫ブロット法およびイマチニブとのインキュベーションIL-3は添加したままによるアポトーシス誘導によって確認した。溶解液の調製、抗体およびウエスタンブロット法-1×レムリLaemmli還元サンプル緩衝液中で細胞ペレットを煮沸および超音波処理することにより、全細胞溶解液を調製した。界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製するために、細胞に冷却した等張溶解緩衝液[Mini-CompleteおよびPhosSTOPとともに10mMトリス-HClpH7.5、0.5トリトンX-100および150mMNaClを含む]を加えて氷上で15分間処理することにより溶解し、20,000RCFで10分間遠心分離した。清澄化した上清を、界面活性剤可溶性細胞画分として使用した。残存するペレットをレムリ還元サンプル緩衝液で洗浄および抽出し、軽く超音波処理して、界面活性剤不溶性画分を得た。等量の細胞溶解液または等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルにロードして電気泳動を行い、ニトロセルロース膜Whatmann、Dassel、Germanyへの転写を行った。タンパク質の検出は、免疫ブロット法によって行った。この実験に使用した抗体は、以下の供給元から購入した:抗pY-Stat5、pY-CrkL、抗PARP、抗Mcl-1CellSignalingTechnology、ダンバース、MA、抗アクチンSigma-Aldrich、セントルイス、MO、ポリクローナル抗ABLK12、モノクローナル抗ABLSH2ドメイン、8E9、抗ユビキチンクローンP4D1、抗HSP90、抗HSP70、抗Jak2、抗CrkL、抗α-チューブリン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ/マウス/ラットIgGSantaCruzBiotechnology、サンタクルーズ、CA、抗HAクローン3F10RocheAppliedScience、インディアナポリス、INおよび抗Usp9xBethylLaboratories、モントゴメリー、TX。プロテアソーム活性アッセイ-20Sプロテアソームのキモトリプシン様活性の測定はは、蛍光発生基質であるSuc-LLVY-AMCを用いて行った。プロテアソーム阻害のインビボアッセイにおいては、細胞をWP11305μMまたはMG1325μMで2時間処理し、氷冷した溶解緩衝液50mMHEPES、pH7.5、5mMEDTA、150mMNaCl、1トリトンX-100を加えて溶解した。溶解液を20,000RCFで10分間遠心分離することにより清澄化し、各サンプルからそれぞれ等量のタンパク質を採取して、100μMの蛍光発生基質とともに37°Cでインキュベートした。20Sプロテアソームに対する直接的な阻害を調べるインビトロアッセイにおいては、精製した20Sヒトプロテアソーム200ngをWP11305μM、MG1325μMまたはラクタシスチン5μMとともに37°Cで30分間インキュベートした後、基質を加えた。蛍光強度は、分光光度計を用いて励起波長360nmおよび蛍光波長460nmで測定した。アッセイは3重測定で行い、統計学的有意性は、対応のあるスチューデントのt-検定により求めた。活性酸素種ROSアッセイ-白血病細胞1×106を、DMSO、WP11305μMまたはROS含有量に対する正エフェクタ[H2O20.5mM]もしくは負エフェクタ[DTT1mM]により37°Cで2時間処理した。上記細胞を洗浄して、10μMDCFDAを含有するPBSに再懸濁し、さらに15分間暗所でインキュベートした。PBSで洗浄した後、上記細胞を96ウェルプレートのウェルに移し、分光光度計を用いて励起波長492nmおよび蛍光波長520nmで蛍光強度を測定した。アッセイは3重測定で行い、統計学的有意性は、対応のあるスチューデントのt-検定により求めた。共焦点顕微鏡法-対照のeGFP-Bcr/Abl形質転換BaF3細胞および処理したeGFP-Bcr/Abl形質転換BaF3細胞を、それぞれPBSで2回洗浄した後、4ホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。上記細胞を、Cytopro遠心分離機Wescor、ローガン、UTを用いて、ポリリジンでコーティングされたスライド上に塗抹し、0.5トリトンX-100による膜透過処理を5分間行った。次いで、スライドをブロッキング溶液5ヤギ血清に浸し、室温で1時間インキュベートした。一次抗体1:100とのインキュベーションを、室温で4時間または4°Cで一晩行い、スライドを0.2トリトンX-100/PBS緩衝液で3回洗浄した。2次抗体として、Alexa-Fluor抗マウス免疫グロブリン抗体およびAlexa-Fluor抗ウサギ免疫グロブリン抗体を使用した。スライドを3回洗浄し、核をHoechst33342で染色した。オリンパス共焦点顕微鏡FV-500東京、日本を用いて画像を取得した。インビトロ脱ユビキチン化アッセイ-Ub-AMCプロテアーゼアッセイ。細胞に50mMトリス-HCl、pH7.5、0.5NP-40、5mMMgCl2、150mMNaClおよび1mMフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する氷冷したDUB緩衝液を加えて溶解した。簡単に説明すると、非処理の細胞または処理した細胞から調製した5μgの清澄化溶解液を、反応液量を100μLとして、500nMUb-AMCとともに37°Cでインキュベートし、AMCに基づく蛍光の発生を、分光蛍光計を用いてex/em380/480で記録した。500μgの細胞溶解液からUSP9xを免疫沈降させ、反応液量を100μLとして、NEM、WP1130またはDMSOを含有するDUB緩衝液中で30分間インキュベートした。500nMUb-AMCを加えることによって反応を開始させ、AMCに基づく蛍光の発生を記録した。Ub鎖分解。精製したポリユビキチン鎖K-48/K-63結合型のインビトロ分解試験は、過去の報告に記載の方法と同様に行った。非処理の細胞またはWP1130で処理した細胞から、DUB緩衝液を用いて5μgの溶解液を調製し、K48-またはK-63結合型鎖1μgとともに37°Cで10分間インキュベートした。鎖の分解の程度をユビキチン免疫ブロット法により評価した。デユビキチナーゼ標識アッセイ細胞内のデユビキチナーゼの活性変化を測定するために、白血病細胞にDUB緩衝液50mMトリスpH7.4、5mMMgCl2、150mMNaClを加えて4°Cで10分間処理することにより溶解した。溶解液を20,000RCFで10分間遠心分離し、その上清をDUB標識に使用した。それぞれ等量の溶解液を500ngのHA-UbVsとともに室温で1時間インキュベートした後、還元サンプル緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEにより分離した。HA免疫ブロット法により、標識されたDUBを検出した。Bcr-Ablに対する選択性を確認するために、CML細胞内で発現する複数のキナーゼBcr-Abl、c-Abl、BCR、アクチン、Jak2、gp130、Lyn、Akt、Pt-3K、Jnk、Erk1/2を含むがWP1130によって下方調節されるかどうかを調べた5μMWP1130で2時間。WP1130処理によりBcr-Ablのタンパク質レベルのみが減少したことから、WP1130はこのキメラタンパク質に対して特異性を有することが示唆された。eGFP-Bcr-Ablで形質転換したBaF3細胞を、非処理のままにするか、または5μMイマチニブもしくはWP1130で2時間処理し、それぞれ等量のタンパク質を含有する細胞溶解液を調製して、含まれるBcr-Ablおよびアクチンの量を調べた。BaF3細胞において、eGFP標識Bcr-AblWTの発現は確認されたが、WP1130処理によりこの異所的に発現したBcr-Ablは速やかに下方調節されることが確認された。Bcr-Ablの野生型WTおよびT315I変異体を発現する安定なBaF3細胞株を構築したところ、いずれの細胞株も、WP1130が誘導するアポトーシスに対して高い感受性を示した。BaF3細胞を、T315IBcr-Abl変異を含むeGFP-Bcr-AblとT315IBcr-Abl変異を含まないeGFP-Bcr-AblW/Tで形質転換し、イマチニブまたはWP1130を用いて指示濃度で72時間処理した後、MTT染色により細胞の増殖および生存を調べた。また、蛍光顕微鏡法により、WP1130のeGFP-Bcr-Ablに対する作用についても調べた。WP1130でインキュベートすることにより、eGFP-Bcr-Ablがコンパクトで高密度のBcr-Abl集積体に速やかに蓄積されることが確認された。ゲルダナマイシンgeldenamycinおよびその類似体によるHsp90の阻害が、Bcr-Ablの安定性および細胞内分布に影響することが報告されている。そこで、Hsp90阻害剤17-AAGの抗増殖効果を、WP1130と比較した。WP1130および17-AAGはいずれも、野生型Bcr-AblBV-173またはT315I変異型Bcr-AblBV-173Rを発現するCML株において抗増殖効果を示したが、アポトーシスの開始においては差異が見られた。17-AAGで処理した細胞では、Hsp90とBcr-Ablの会合が抑制され、これによりユビキチン化を経てBcr-Ablが下方調節されると考えられる。しかし、WP1130で処理した場合は、Bcr-AblとHsp90との会合は促進された。このことは、Bcr-Ablの下方調節の機序が異なっていることを示唆するものである。Hsp90の阻害によりHsp70が誘導されることから、細胞内のユビキチン化タンパク質のレベルおよびHsp70タンパク質のレベルに対するWP1130および17-AAGの影響を調べた。ユビキチン化タンパク質のレベルは17-AAGによる影響を全く受けなかったが、Hsp70は17-AAGにより誘導された。WP1130により、界面活性剤可溶性細胞画分におけるユビキチン化タンパク質が速やかに増加し、より後の測定時点では界面活性剤不溶性画分にもかなりの量の蓄積が見られた。WP1130で処理した細胞においても、Hsp70のレベルは増加したが、Hsp90の阻害に関連したものではなかった。BV-173細胞を5μMWP1130で0、1または2時間処理した後、全細胞溶解液、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分中のBcr-Abl、pY-Stat5、およびJak2のタンパク質レベルを調べた。BV-173細胞およびBV-173R細胞を5μMWP1130で2時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液および界面活性剤不溶性細胞溶解液を用いて、Bcr-AblについてK12抗体によるブロットを行った。K562R細胞を5μMWP1130で2時間処理した後、全細胞画分、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分に含まれるタンパク質中のBcr-Abl、Jak2、pY-Lyn、およびLynについて調べた。T315I変異を有するeGFP-Bcr-Ablで形質転換したBaF3細胞を5μMWP1130で0、0.5、1、2、4、または6時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液を用いて、Bcr-Abl、pY-Stat5、Stat5、およびPARPについて免疫ブロットを行った。イマチニブ治療が進行中の2名のCML患者から得られた単核細胞を5μMWP1130で4時間処理した後、界面活性剤可溶性細胞画分または界面活性剤不溶性細胞画分を示すそれぞれ等量の細胞溶解液中に含まれるBcr-Ablについて調べた。また、Bcr-Ablの基質であるリンタンパク質pY-Stat5、pY-CrkLおよびそれらの総タンパク質レベルについて調べるために、界面活性剤可溶性細胞画分を用いて免疫ブロットを行った。ユビキチン化はタンパク質の分解や細胞内輸送を媒介すると考えられることから、WP1130処理細胞におけるBcr-Abl含有量を調べた。WP1130で処理した結果、Bcr-Ablは界面活性剤可溶性画分から界面活性剤不溶性細胞画分へと速やかにかつほぼ完全に輸送されていた。Bcr-Ablの不溶性画分へのコンパートメント化とともに、Stat5のリン酸化の阻害が見られたが、Jak2への影響は見られなかった。しかし、全細胞抽出物におけるBcr-Ablタンパク質の含有量には有意な変化は見られなかった。また、イマチニブ耐性CML細胞T315I-Bcr-Ablを発現するBV-173RおよびLynキナーゼを過剰発現するK562Rなどにおいても、界面活性剤不溶性細胞画分におけるBcr-Ablタンパク質の含有量の増加が観察されたが、Jak2およびLynの界面活性剤に対する溶解性においてはWP1130による影響は見られなかった。Bcr-Ablを発現するBaF3形質移入体において、界面活性剤可溶性画分からのBcr-Ablの喪失とともに、基質のリン酸化pY-Stat5阻害およびアポトーシスの開始PARP開裂が見られた。また、イマチニブ耐性患者由来の初代培養CML細胞をWP1130でインキュベートした場合にも、Bcr-Ablの界面活性剤不溶性画分への移行や、Bcr-Abl基質pY-Stat5、pY-CrkLのリン酸化阻害が見られた。界面活性剤不溶性画分には、細胞骨格タンパク質およびアグリソームと呼ばれる細胞構造の構成要素が豊富に含まれている。これらの結果より、WP1130はBcr-Ablのコンパートメント化によってBcr-Abl基質のリン酸化を阻害することが示唆される。K562細胞を5μMWP1130とともに30分間インキュベートした後、界面活性剤可溶性細胞抽出物に対してHsp90の免疫沈降を行い、次いで、Bcr-Abl、ユビキチンまたはHsp90について免疫ブロットを行った。K562細胞をWP11305μM、H2O2500mMまたはDTT1mMとともに37°Cで2時間インキュベートした後、細胞を洗浄して再び播種し、DCFDAを含む培地中、37°Cで20分間インキュベートした。DCFDAに基づく蛍光量を測定し、処理サンプルにおけるROS生成の指標として使用した。他の2つのCML細胞株WDT-2、BV-173においても、同様の結果が得られた。K562細胞を非処理のままにするか、または5μMのWP1130またはMG-132により37°Cで2時間処理し、それぞれ調製したタンパク質溶解液をプロテアソームの基質とともにインキュベートした後、蛍光発生基質の切断によるプロテアソーム活性を求めた。精製した20Sプロテアソームを5μMMG-132、ラクタシスチンまたはWP1130とともにインキュベートした後、プロテアソーム活性を測定した。他の2つのCML細胞株においても、同様の結果が得られた。K562細胞を50nMボルテゾミブBzまたは5μMWP1130で処理した後、界面活性剤可溶性細胞溶解液、界面活性剤不溶性細胞溶解液および全細胞溶解液をそれぞれ等量用いて、Bcr-Ablまたはユビキチンについて免疫ブロットを行った。BzおよびWPはいずれも、ユビキチン含有量を増加させたが、Bcr-Ablおよび界面活性剤不溶性のユビキチン化タンパク質のレベルに影響を及ぼしたのはWPのみだった。ユビキチン化タンパク質の含有量は、プロテアソーム阻害、タンパク質シャペロン活性の喪失またはタンパク質の誤った折り畳みを引き起こす細胞の酸化亢進によって増加する可能性がある。しかし、WP1130処理細胞においては、Hsp90のBcr-Ablとの会合阻害も、活性酸素種の増加も観察されなかった。さらに、WP1130は、CML細胞においても、精製した20Sプロテアソームサブユニット調製物においても、20Sプロテアソーム活性を抑制しなかった。これにより、WP1130がプロテアソーム阻害剤として作用する可能性は排除された。WP1130と強力な20Sプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブとを比較して、両者がタンパク質ユビキチン化およびBcr-Ablコンパートメント化に対して共通の作用を有している否かを確認した。いずれの化合物も、ユビキチン化タンパク質の含有量を増加させたが、界面活性剤不溶性のユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導したのはWP1130のみであった。WP1130処理により、界面活性剤可溶性画分に含まれるBcr-Ablが減少して、界面活性剤不溶性画分へと移行したが、全体のBcr-Abl含有量には変化が見られなかった。ボルテゾミブは、ユビキチン化タンパク質のレベルを上昇させたが、Bcr-Ablの界面活性剤に対する溶解性またはタンパク質レベルに対しては影響を及ぼさなかった。WP1130処理細胞においてBcr-Ablがユビキチン化されているかどうかを確認するために、CML細胞をWP1130で短時間30分間処理して、界面活性剤可溶性画分からBcr-Ablを回収した直接的免疫沈降による。WP1130は、CML細胞においてBcr-Ablのユビキチン化および輸送を促進する働きがある。WDT-2細胞をビヒクル単独対照または5μMWP1130により37°Cで30分間処理した後、それぞれ等量の溶解液から全細胞溶解液、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製し、含まれるBcr-Ablまたはユビキチンについて調べた。WP処理細胞または対照細胞からそれぞれ等量のタンパク質400μgを含む界面活性剤可溶性細胞溶解液を調製して、1SDSで60°Cで処理し、0.1SDSに希釈し、抗AblK12を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物を洗浄し、ゲル上で分離し、Ablまたはユビキチンについて免疫ブロットを行った。K562細胞またはBV-173細胞をWPまたは対照で処理し、それぞれ等量のタンパク質を含む界面活性剤可溶性細胞溶解液に対して、Ablの免疫沈降を行った後、Ablおよびユビキチンについてブロットを行った。また、対照細胞および処理細胞からそれぞれ得られた等量の溶解液200μgに対して、K48結合型またはK63結合型ユビキチンポリマーを用いて親和性濃縮K48結合型の場合はアタキシンを、K63結合型の場合はRap80を使用を行った。結合したタンパク質を溶出し、Ablの免疫ブロットを行った。eGFP-Bcr-Abl形質転換BaF3細胞をビヒクル単独または5μMWP1130で4時間処理し、細胞を固定した後、スライド上にサイトスピンcytospinにより塗抹し、膜透過処理を行った。反応性部位をブロックした後、スライドを抗ユビキチン抗体1:100とともにインキュベートし、洗浄後、Alexa-Fluor抗体を用いて抗原の検出を行った。スライドを再度洗浄し、核を検出するためにHoechst33342で染色した。WP1130処理細胞から免疫沈降により回収したBcr-Ablの免疫ブロット分析より、界面活性剤可溶性抽出物から回収したBcr-Ablはやや減少していたが、ユビキチン化Bcr-Ablは顕著に増加することが示された。ブロット分析により、WP1130処理細胞の不溶性画分においては、Bcr-Ablおよびユビキチン化タンパク質の有意な増加が確認された。WP1130によるBcr-Abl修飾がBcr-Ablへの特定のユビキチンポリマーの転移によるものか否かを調べるために、可溶性細胞溶解液に対して、K48結合型またはK63結合型ユビキチンポリマーに対して高い親和性を有するタンパク質K48結合型の場合はアタキシン、K63結合型の場合はRap80が結合したアガロースビーズを用いて免疫沈降を行い、タンパク質溶出物を用いて、Bcr-Ablについて免疫ブロットを行った。WP1130処理細胞において、Bcr-Abl/K63結合型ユビキチンポリマーの方が多く回収されたことから、Bcr-Abl上のK63結合型ユビキチンポリマーの増加が、Bcr-Ablの界面活性剤不溶性複合体への移行のためのシグナルの基礎となっていると考えられる。eGFP-Bcr-Abl形質転換BaF3細胞を用いて、共焦点顕微鏡法によりBcr-Ablのユビキチン化および細胞内分布についてさらに調べた。WP1130処理により、Bcr-Ablとユビキチンとが集積して、アグリソームに似た核近傍juxta-nuclear複合体を形成した。生化学的に分析したところ、WP1130処理細胞における該複合体には、アグリソームであることを定義するように、Bcr-Ablとともに他のタンパク質も含まれることが分かった。これらの結果より、WP1130は主としてK63結合型ポリマーによるBcr-Ablのユビキチン化を促進し、Bcr-Ablのアグリソームへの移行を引き起こすと考えられる。立体的にアクセス可能な求電子性β炭素を2個有する交差共役cross-conjugatedα,β-不飽和ジエノンは、イソペプチダーゼまたはデユビキチナーゼDUBに対する阻害活性に関わる分子決定因子である。この決定因子がWP1130に存在したことから、WP1130のDUB阻害活性の可能性が調べられることになった。非処理の細胞またはWP1130で処理した細胞から得られた溶解液を、精製したユビキチンポリマーUb1~Ub5とともにインキュベートし、該ポリマーの相対的な回収量を免疫ブロット法によって評価した。WP1130で処理したCML細胞から得られた溶解液においては、K48結合型およびK63結合型ユビキチンポリマーのいずれも分解から部分的に保護されることが示された。これは、WP1130によるDUB阻害の可能性を裏付けるものであった。DUB阻害をより詳しく調べるために、非処理のCML細胞、WP1130で処理1~8時間したCML細胞、またはN-エチルマレイミド[NEM]で処理したCML細胞の溶解液を蛍光性DUB基質Ub-AMCとともにインキュベートし、経時的にDUB活性をモニタした。非特異的なDUB阻害剤NEMで処理した細胞から得られた溶解液は、基質の加水分解を完全に阻害したが、WP1130で処理したCML細胞の溶解液は、Ub-AMCの加水分解を限定的にしか阻害しなかった。これらの結果より、WP1130によるユビキチン変化は、1種のDUBまたは限定的なサブセットに属するDUBの阻害により起こる可能性が示された。特定のDUB活性への影響を調べるために、過去の報告に記載の方法と同様に、CML細胞をWP1130で処理し、溶解液をHAで標識された不可逆性のDUB基質であるHA-UbVSとともにインキュベートした。DUBが共有結合を介してこの構築物で修飾されることで、DUB活性をHA免疫ブロット法により分析することが可能になる。WP1130によるDUB活性の阻害は、HAで標識されたWP1130感受性DUBの減少によって検出することができる。WP1130処理細胞の溶解液は、Usp9xと同定される、極めて高い分子量を有するDUBに対して標識する能力が低いことが示された。Usp9xは、主に、界面活性剤に可溶性の細胞質画分で発現しており、Usp9xの回収量やタンパク質含有量にWP1130処理による影響は見られなかった。WP1130がUsp9x活性に直接影響を与えるかどうかを調べるために、CML細胞の溶解液をWP1130とともに1時間インキュベートした後、DUB基質であるHA-UbVsとともにインキュベートし、HAブロット法により分析した。Usp9xの標識化は、WP1130の存在下で完全に阻害されたことから、WP1130はUsp9xを直接阻害すると考えられる。また、矢印で示した他のDUBもWP1130による影響を受けたことから、特異性や選択性に関してはまだ不明であるが、他のDUBもWP1130の標的であると考えられる。直接的なDUB阻害を確認するために、Usp9xを免疫沈降して十分に洗浄し、WP1130とともにインキュベートした後、蛍光性DUB基質であるUb-AMCを用いてDUB活性を調べた。この基質の加水分解速度を測定し、DMSOでインキュベートした場合と、WP1130でインキュベートした場合とで比較して、WP1130によるパーセントDUB阻害率を算出した。正常IgG免疫沈降物、およびUsp9x免疫沈降物のNEM処理物においては、基質の加水分解は見られなかった。対照の反応と比較したところ、WP1130によりUsp9x活性は>80低下した。これより、WP1130は、Usp9xに対して阻害活性を有するサブセット特異的DUB阻害剤として作用することが示された。最近の報告により、Usp9xは、Mcl-1の脱ユビキチン化および分解を制御することが示されている。WP1130によるUsp9x阻害がCML細胞のMcl-1レベルに影響を与えるかどうかを調べるために、全細胞抽出物を用いて、Mcl-1について免疫ブロットを行った。WP1130は、Usp9x阻害と同調して経時的にMcl-1レベルを減少させ、イマチニブ感受性CML細胞およびイマチニブ耐性CML細胞のいずれにおいても有効であった。Bcr-AblまたはJak2の阻害によってもUsp9x活性が低下するか否かを確認するために、CML細胞をWP1130、Bcr-Abl選択的阻害剤イマチニブ、Jak2選択的阻害剤TG101209またはマルチキナーゼ阻害剤ダサチニブで4時間処理した後、細胞溶解液をHA-UbVsによる標識化および直接的なUsp9x免疫ブロットに供した。また、直接的なUsp9x阻害を確認するために、細胞溶解液をWP1130でインビトロ処理5μM、30分間したものも用意した。WP1130は、Usp9x活性を効果的に低下させたが、試験に用いたキナーゼ阻害剤にはいずれも有意なUsp9x阻害活性は見られなかった。白血病および骨髄腫におけるDUB阻害ユビキチン化およびユビキチン様タンパク質修飾は、ほとんどの細胞内タンパク質の機能および運命の方向付けに大きな役割を担っている。罹患した細胞では、このような修飾経路における複数の重要な酵素が増幅されるかまたは修飾されていることから、そのような活性を阻害または調節する低分子の開発が行われている。このような修飾経路における特定の酵素を選択的に標的とする方法は大きく進展し、臨床効果を示すものもある。DUBはユビキチンサイクルにおいて特化した役割を有するだけでなく、複数のシグナル伝達経路および発がんタンパク質の制御においてもその役割が新たに発見されていることから、DUB阻害剤は抗がん剤として有用である。WP1130は、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進する能力を有することから、有用な抗がん剤として同定されている。ユビキチンアルデヒドおよびユビキチンビニルスルホンUbVSなどの強力な作用を有するペプチド性不可逆的DUB阻害剤が知られている。しかし、分子量が大きく、細胞内バイオアベイラビリティが低いため、それらの治療効果は制限されている。その他に、D12-プロスタグランジンJ2などの低分子化合物が、細胞内でユビキチンイソペプチダーゼ活性を阻害しIC50=約30μM、ユビキチン化タンパク質の細胞内蓄積および細胞死を引き起こすことが示されている。この化合物において、DUB阻害活性に必要とされる重要な分子決定因子である、立体的にアクセス可能なβ炭素を有するα,β-不飽和ケトンが確認されたことが、同様の活性を有するさらなる阻害剤ジベンジリデンアセトンDBA;IC50=約20~40μM、クルクミンIC50=約80~100μM、およびシコシンshikoccinNSC-302979;IC50=約15μMなどの同定へとつながった。しかし、これらの化合物の影響を受ける特定のDUBのプロファイルについての報告はない。本明細書では、複数のインビボアッセイおよびインビトロアッセイを用いて、作用機序の観点から、WP1130が部分的に選択性を有するDUB阻害剤として作用することを証明している。本明細書におけるデータにより、WP1130が主要な細胞内デユビキチナーゼUSP5、UCH-L1、USP9x、USP14、およびUCH37などの活性を抑制することが示されている。複数種のDUBの阻害により、iポリユビキチン化タンパク質/未結合のポリユビキチン鎖の蓄積量の増加、ii単量体ユビキチンプールの減少、iiiポリユビキチン分解の速度低下、iv個々のDUB活性の全体的な低下、およびvDUBに調節されるp53およびMcl-1などの発がんタンパク質の細胞内レベル/活性への影響といった複数の細胞内変化をもたらすことが予測される。USP5およびUCH37は、K48結合型およびK63結合型ポリユビキチン化タンパク質のいずれも脱ユビキチン化することが知られている。プロテアソーム阻害または細胞内DUB活性の阻害によって生じる、細胞内のユビキチン化タンパク質の顕著な増加は、アグリソーム形成の引き金になると考えられる。ストレス条件下でアグリソームが形成されると、細胞内で一時的に細胞保護イベントが起こり、大量に蓄積されたユビキチン化タンパク質がアグリソームを含む不溶性画分へと移行する。データによれば、WP1130処理によって、ポリユビキチン化されたJak2およびBcr-Ablが界面活性剤不溶性のアグリソームに蓄積し、それにより腫瘍細胞の増殖が抑制されることが示唆されている。したがって、増殖、生存および成長因子シグナル伝達において重要な役割を担う発がんタンパク質がアグリソームここでは発がんタンパク質は機能できないへ移行することは、腫瘍細胞にとっては不利になることが予想される。しかし、そのような発がん性キナーゼの調節に重要な役割を担っているDUBは、現在不明である。CMLおよび黒色腫の異種移植マウスモデルにおいて、WP1130による処置は、インビボにおいて腫瘍の成長を効果的に抑制する。これらの所見から、WP1130はDUB活性に対する作用を通じて治療剤として機能することが示唆される。なお、WP1130の標的DUBの中に、特定のがん遺伝子およびアポトーシスレギュレータMcl-1およびp53を含むの安定性および代謝回転の重要なレギュレータであることが最近示されたDUBがあることは注目すべきである。その他に、がん化およびユビキチン化タンパク質のプロテアソームへの移行の制御において直接的な役割を担うことが示唆されているDUBも存在する。さらに、WP1130の標的と考えられているDUBの中には、調節不能な細胞増殖および腫瘍細胞のがん遺伝子依存において役割を担うことが最近示されたものもある。細胞培養、化学試薬および酵素-ヒト多発性骨髄腫MM1.S細胞およびヒトマントル細胞リンパ腫Z138細胞は、10ウシ胎仔血清FBSInvitrogen、カールズバッド、CAを含むRPMI-1640中で増殖させた。ヒト胎児由来腎臓細胞293THEK293Tなどの付着細胞株は、10FBSを含有するダルベッコ変法基本培地DMEM中で培養した。すべての細胞は、加湿雰囲気中37°Cで培養および維持した。RPMI-1640およびDMEMは、HyCloneThermoFisherScientific、ウォルサム、MAから購入した。プラスミドおよびsiRNAトランスフェクション-HEK293T細胞105細胞/ウェルをトランスフェクションの24時間前に6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションは、各ウェル500ngのHA標識ユビキチンWT/63O/48OとFugeneHDRocheとを用いて、製造元のプロトコルにしたがって行った。トランスフェクション後、一晩インキュベートして、細胞を2つのウェルに分割し、さらに24時間インキュベートした後、ビヒクル単独DMSOまたはWP1130で処理した。HEK293T細胞におけるUSP9xおよびUSP5のノックダウンは、USP9xおよびUSP5に対するON-TARGETplussiRNAThermo-scientific-Dharmacon各30nMとLipofectamine2000とを用いて行った。トランスフェクションから72時間後に、タンパク質レベルをウエスタンブロット法によって推定した。ウエスタンブロット法-細胞ペレットを1×レムリ還元サンプル緩衝液中で煮沸および超音波処理することにより、全細胞溶解液を調製した。界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分を調製するために、細胞に冷却した等張溶解緩衝液[Mini-CompleteおよびPhosSTOPとともに10mMトリス-HClpH7.5、0.5トリトンX-100、150mMNaClを含む]を加えて氷上で15分間処理することにより溶解し、20,000RCFで10分間遠心分離した。清澄化した上清を、界面活性剤可溶性細胞画分のストックとして使用した。残存するペレットを等量の沸騰した1×レムリ還元サンプル緩衝液中で超音波処理することにより、界面活性剤不溶性画分を抽出した。等量の細胞溶解液または等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルにロードして電気泳動を行った。この実験に使用した抗体は、以下の供給元から購入した:抗アクチンSigma-Aldrich、セントルイス、MO、抗ユビキチンクローンP4D1、抗HDAC6、抗HSP90、抗HSP70、抗20Sプロテアソーム、抗HDAC6、ヤギ抗ウサギ/マウス/ラットIgG標識セイヨウワサビペルオキシダーゼSantaCruzBiotechnology、サンタクルーズ、CA、抗フロチリンflotillin1、抗MCL1BDBiosciences、サンノゼ、CA、抗p53Millipore、ビルリカ、MA、抗USP9x、抗USP5Bethyllaboratories、モントゴメリー、TX、抗PARPCellsignalingTechnology、ダンバース、MA、抗HAクローン3F10RocheAppliedScienceインディアナポリス、IN。細胞内分画-Z138細胞を5μMWP1130またはDMSOで2時間処理した後、細胞を溶解し、さらに処理して細胞質画分、膜画分、核画分および細胞骨格画分に分離した。ProteoExtractSubcellularProteomeExtractionKitCalbiochem、サンディエゴ、CAを用い、製造元の取扱説明書にしたがって各画分を抽出した。各画分の純度を調べるために、画分ごとにマーカーを加えた。共焦点顕微鏡法-WP1130またはDMSOで4時間処理したHEK293T細胞をPBSで2回洗浄した後、4ホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。細胞に0.5トリトンX-100を加えて、5分間膜透過処理を行った。次いで、スライドをブロッキング溶液5ヤギ血清に浸し、室温で1時間インキュベートした。一次抗体1:100を用いたインキュベーションを4°Cで一晩行い、スライドを0.2トリトンX-100/PBS緩衝液で3回洗浄した。2次抗体として、Alexa-Fluor抗マウス免疫グロブリン抗体およびAlexa-Fluor抗ウサギ免疫グロブリン抗体を使用した。スライドを3回洗浄し、核を検出するためにHoechst33342で染色した。オリンパスFluoView登録商標500東京、日本を用いて画像を取得した。それぞれの画像は、サンプルごとに得られたZスタックZ=0.5μm画像を示す。MTTによる細胞増殖評価およびアポトーシス分析-細胞を96ウェルプレートに5,000細胞/ウェルで播種し、濃度が異なるWP1130の存在下、CO2インキュベータにおいて37°Cで3日間インキュベートした。20μLの5g/L3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドMTT溶液を各ウェルに加えて、37°Cで2時間インキュベートした。次いで、細胞に10SDS緩衝液を加えて溶解し、対照波長630nmに対する570nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。細胞の増殖が50阻害される濃度IC50値を算出した。アネキシンAnnexinV染色およびヨウ化プロビジウムpropidiumPI染色を用いて、WP1130処理細胞におけるアポトーシスを測定した。簡単に説明すると、105/mLの細胞を組織培養プレートから回収し、室温で2500rpm、5分間遠心分離した。培地上清を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した。次いで、細胞を0.4mlの冷却したアネキシンV結合緩衝液に再懸濁し、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロビジウムを加えた。サンプルを暗所にて室温で10分間インキュベートし、ナイロンメッシュでろ過し、FacScanアナライザーBecton-Dickinson、サンノゼ、CAを用いたフローサイトメトリーにより分析した。精製したDUBをそれぞれ至適濃度USP5;20nM、UCH-L1;20nM、UCH-L3;5nM、USP9x;500μgのZ138細胞溶解液から免疫沈降させたに調製し、反応液量100μLとして、WP1130、ビヒクル単独DMSOまたは1mMNEMDUB阻害における陽性対照を含有するDUB緩衝液中で30分間インキュベートした。500nMUb-AMCを加えて反応を開始し、AMCに基づく蛍光の発生を分光蛍光計を用いてex/em380/480で記録した。デユビキチナーゼ標識アッセイ-細胞内のデユビキチナーゼの活性変化を測定するために、Z138細胞およびHEK293細胞にDUB緩衝液50mMトリスpH7.4、5mMMgCl2、150mMNaClを加えて4°Cで10分間処理することにより溶解した。溶解液を20,000RFCで10分間遠心分離し、上清をDUB標識に使用した。それぞれ等量の溶解液を500ngのHA-UbVsとともに室温で1時間インキュベートした後、還元サンプル緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEにより分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写した後、HA免疫ブロット法を用いて、標識されたDUBを検出した。マントル細胞リンパ腫Z138細胞は、WP1130処理の2~4時間後にPARP開裂を示したことから、WP1130IC50=約1μMに対して高いアポトーシス感受性を示すことが分かった。WP1130を、マントル細胞腫瘍に対する臨床的な有効性が認められているAG490またはボルテゾミブと直接比較することにより、各化合物のアポトーシスの開始および活性における差異を明らかにした。WP1130は、ボルテゾミブと同様に、HEK293細胞に対しても、他のさまざまな骨髄およびリンパ系起源の腫瘍細胞株に対しても強力な抗増殖特性を示した。WP1130で処理したZ138細胞の全細胞抽出物WCEを分析したところ、ユビキチン化タンパク質の顕著な蓄積が濃度依存的に示された。K562、MM.1S、HeLaおよびHEK293を含む、WP1130で処理した他の細胞においても、タンパク質のユビキチン化の亢進が同様に見られた。WP1130およびプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブとは対照的に、AG490で処理したZ138細胞においては、より長い時間インキュベートしても、細胞内のタンパク質ユビキチン化における変化は見られなかったことから、WP1130とその親化合物AG490とでは作用機序が異なることが示唆される。WP1130でインキュベートしたZ138細胞においては、界面活性剤可溶性画分および界面活性剤不溶性画分のいずれも、ユビキチン化タンパク質の経時的な蓄積が見られた。ボルテゾミブ処理では、不溶性のユビキチン化タンパク質の有意な蓄積は見られず、8時間処理しても、界面活性剤不溶性画分におけるユビキチン含有量はほとんど変化しなかった。これらの結果より、WP1130で処理した細胞とボルテゾミブで処理した細胞とではタンパク質ユビキチン化の機序および下流エフェクタが異なることが示唆される。プロテアソーム阻害に続いてユビキチン化タンパク質の蓄積が起こる可能性があることから、WP1130の20Sプロテアソーム活性に対する影響を調べた。WP1130でインキュベート5μM、2時間した場合、プロテアソームキモトリプシン様活性の有意な低下はインビボp値>0.07でもインビトロp値>0.78でも見られなかった。一方、MG-132公知のプロテアソーム阻害剤は、いずれのアッセイにおいてもプロテアソーム活性を大幅に阻害した。これらの結果より、WP1130は、MG-132またはボルテゾミブと異なり、20Sプロテアソームの活性を直接阻害するものではないことが示唆される。また、酸化ストレスもユビキチン化タンパク質の蓄積に関与すると考えられているが、WP1130で処理した細胞においては、活性酸素種の生成量の増加は見られなかった。WP1130に応答して蓄積するユビキチンの結合様式をさらに明確にするために、HEK293T細胞に、ユビキチンWT/K48のみ/K63のみのHA標識変異体を発現するプラスミドをトランスフェクションした。HEK293T形質移入体をWP1130で処理したところ、K48結合型ポリユビキチン鎖を含有するユビキチン化タンパク質も、K63結合型ポリユビキチン鎖を含有するユビキチン化タンパク質も蓄積量が増加した。プロテアソーム阻害では、K48結合型ユビキチン鎖を含有するタンパク質の蓄積は促進されるが、K63結合型ユビキチン鎖に対しては限定的な影響しか見られない。アグリソーム形成-ユビキチン化タンパク質の不溶性凝集体は、一般に、アグリソームと呼ばれる核周囲構造と関わりがある。プロテアソーム阻害、折り畳まれていないタンパク質応答、熱ショック応答または酸化ストレスは、アグリソーム形成を誘導すると考えられる。アグリソームには、ポリユビキチン化タンパク質とともに、HSP90/70、20SプロテアソームおよびHDAC6が豊富に含まれる。WP1130処理細胞においては、ユビキチン化タンパク質が界面活性剤不溶性画分へと速やかに蓄積されることから、細胞内分画を行い、処理後にユビキチン化タンパク質を多く含む細胞内コンパートメントを同定した。すべての細胞内画分において、ユビキチン化タンパク質の含有量に何らかの変化は見られたが、WP1130処理細胞の細胞骨格コンパートメントにおいては、ユビキチン化タンパク質結合体の顕著な蓄積が見られた。この細胞内分画により、WP1130処理後にユビキチン化タンパク質を多く含む細胞骨格画分には、アグリソームマーカータンパク質が存在することが示された。WP1130処理によって正真正銘アグリソームが形成されることを確認するために、HEK293細胞をユビキチン、DAC6および20Sプロテアソームなどの主要なアグリソームマーカーで染色した。WP1130処理細胞において、ポリユビキチン化タンパク質の核近傍堆積物にアグリソームのマーカーが局在することが示された。デユビキチナーゼ阻害剤として作用するWP1130-細胞内のデユビキチナーゼ阻害により、プロテアソーム阻害が起こらなくても、分子量の大きなユビキチン化タンパク質が増加する可能性がある。Z138細胞を5μMWP1130で2時間処理したところ、単量体ユビキチンが速やかに減少した後、未結合/遊離のポリユビキチン鎖Ub4~5レベルが増加した。一方、ボルテゾミブ処理による、遊離ユビキチンまたは未結合のユビキチン鎖のレベルへの有意な影響は見られなかった。この所見により、WP1130はデユビキチナーゼ活性の阻害によりユビキチンのリサイクルを抑制し、ユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導し得ることが示唆される。WP1130処理細胞におけるDUB活性への影響を直接評価するために、対照細胞および処理した細胞の細胞溶解液をユビキチン-AMCとともにインキュベートし、基質の切断により生成される蛍光をDUB活性の指標として測定した。Z138細胞を、1、2、または4時間、5μMWP1130、50nMボルテゾミブ、もしくは1mMNEMで処理するか、または処理せず、次いで細胞抽出物5μgを蛍光発生基質とともにインキュベートした。WP1130処理により、Z-138細胞におけるDUB活性は有意に低下し、4時間で50近く低下したp値=0.0095。興味深いことに、ボルテゾミブで処理した細胞においては、DUB活性の変化は全く見られなかったものの、NEM公知のDUB阻害剤処理では、細胞内のDUB活性が1時間で80低下した。精製したK48結合型またはK63結合型ポリユビキチン鎖のインビトロ脱ユビキチン化/分解に対する、WP1130処理の効果を調べた。WP1130で処理2時間した細胞または非処理の細胞の溶解液を、1μgの未結合のポリユビキチン鎖とともに37°Cで5、10および15分間インキュベートした。非処理の細胞の溶解液では、ポリユビキチン鎖がほぼ完全に分解したが、WP1130処理細胞の溶解液では、限定的な分解しか見られなかった。WP1130処理細胞の溶解液において、K48結合型およびK63結合型ポリユビキチン鎖のいずれも分解が阻害されたことは、WP1130処理により、両方のユビキチン結合様式の蓄積量が増加するという上述の所見とも一致する。これらの結果より、WP1130処理によって、K48特異的ユビキチン結合およびK63特異的ユビキチン結合の分解にそれぞれ必要とされる細胞内のDUB酵素が阻害されることが示唆される。インビトロにおけるWP1130のデユビキチナーゼ酵素阻害-血球凝集素標識ユビキチンビニルメチルスルホンHA-UbVsは、DUB自殺基質として作用し、活性DUB酵素と共有結合して付加物を形成する。種々の細胞において先に示したように、抗HA抗体を用いたHAブロット法により、特定の細胞内DUBを同定することができる。特定のDUBの活性変化は、対照細胞および処理した細胞の溶解液におけるHA標識量をモニタすることによって測定することができる。Z138細胞を、WP11301、5、または10μMまたはAG490250μMで1時間処理して、溶解した。20μgの清澄化上清を200nMのHA-UbVSとともに37°Cで1時間インキュベートした。WP1130処理細胞では、USP9x、USP5、USP14およびUCH37を示すDUBに対する標識量が用量依存的かつ経時的に減少した。これとは対照的に、AG490で処理した細胞においては、DUBに対する標識量に全く変化は見られなかった。これにより、親分子であるチロホスチンtyrphostinとWP1130とでは活性および作用機序が異なることが確認された。WP1130による直接的なDUB阻害を確認するために、細胞溶解液を用いてインビトロ分析を行った。簡単に説明すると、非処理のZ138細胞溶解液をビヒクル単独または5μMWP1130とともに37°Cで1時間インキュベートした後、HA-UbVsで標識した。細胞溶解液をWP1130とともにインキュベートした場合、細胞をWP1130で処理した場合と同種のDUBにおいて、HA標識量が減少することが示された。これにより、WP1130はDUBを直接阻害することが示唆された。WP1130がDUB活性を直接阻害するかどうかを確認するために、USP5、UCH-L1およびUCH-L3などの精製DUBをビヒクル単独またはWP1130とともに、DUB緩衝液中、37°Cで30分間インキュベートした。USP9xをZ138細胞溶解液から免疫沈降させて、DUB緩衝液で調製し、USP9x結合ビーズをビヒクル単独またはWP1130とともに30分間インキュベートした。Ub-AMC500nMを各反応液に加え、蛍光量を30分間にわたって毎分モニタした。対照DUBおよびWP1130処理DUBによる基質の切断において直線性領域の終点で観察された最大蛍光をDUB活性および阻害を推定するための指標として使用した。5μMWP1130処理により、USP9x、USP5およびUCH-L1の活性は80以上低下したが、UCH-L3活性に対しては全く阻害が見られなかったことから、WP1130は部分的な選択性を有することが示唆される。HA-UbVs標識によってもUSP5活性の阻害が確認され、WP1130とのインキュベーションにより、HA標識量は約80減少することが示された。DUBによるアポトーシス促進タンパク質レベルおよび抗アポトーシスタンパク質レベルの調節-USP5は、未結合のポリユビキチン鎖のレベルの維持に大きな役割を果たすことが知られている。USP5の阻害によって、ユビキチン化p53と競合する遊離ポリユビキチン鎖が蓄積することにより、p53が安定化することが報告されている。また、リンパ腫および他の腫瘍におけるMCL-1とUSP9xのレベルの増加には正の相関がある。USP9xをsiRNAでノックダウンしたところ、腫瘍細胞のMCL-1が速やかに分解され、アポトーシス刺激に対する感受性が増大した。WP1130処理によって、p53タンパク質レベルの増大が観察された。Z138細胞をシクロヘキシミド50μg/mLおよびWP1130で同時処理したところ、p53タンパク質の誘導というよりも該タンパク質の安定化が確認された。さらに、WP1130処理によりMCL-1レベルの速やかな低下も観察された。MCL-1レベルの調節におけるUSP9xの役割、およびp53レベルの調節におけるUSP5の役割を再確認するために、HEK293T細胞において、USP9xおよびUSP5をsiRNAでノックダウンした。USP9xの阻害によりMCL-1レベルは約50減少し、USP5の阻害によりp53レベルは約2倍に増加した。これらの結果より、WP1130は細胞内のDUB活性を選択的に阻害することにより、抗アポトーシスタンパク質の安定性も、アポトーシス促進タンパク質の安定性も調節することが示された。WP1130のDUB阻害により誘導されるアポトーシス-WP1130は、DUBの活性部位に存在するシステインのスルフヒドリル基sulfhydrylとマイケル付加反応により相互作用するとされているα,β-不飽和カルボニル基例えば、Straus,etal.,MedicinalResearchReviews,21:185-2102001を参照を含有する。AG490にも同様のカルボニル基は存在するが、AG490では細胞における明確なDUB阻害活性は見られない。Z138細胞を、1mMDTTの存在下および非存在下にて、WP11300.3~5μMとともにインキュベートした。興味深いことに、DTTの存在下では、WP1130によるアポトーシス誘導および抗増殖作用が完全に阻止された。この所見は、WP1130によるユビキチン化の誘導およびDUB阻害がDTTの存在下で阻止されることに関係する。WP1130によるアポトーシス誘導およびDUB阻害活性がDTTの存在下で阻止されることから、WP1130による活性DUBの抑制はWP1130のアポトーシス作用の直接の原因であることが示唆される。WP1051およびWP1052は、初期に開発されたWP1130の2つの化学的類似体である。WP1051は腫瘍細胞の増殖抑制に効果的であったただし用量はWP1130より高いが、WP1052は、抗腫瘍特性を全く示さなかった。このことは、WP1051およびWP1052が化学的には同一で構造的に異なる異性体であるため、予想外であった。WP1130のアポトーシス特性/抗増殖特性は、細胞内のDUBを抑制し、ユビキチン化タンパク質の蓄積を誘導する能力に関係する。そこで、WP1051およびWP1052がタンパク質のユビキチン化およびDUB活性に影響を与え得るかどうかを調べた。Z138細胞を指示濃度のWP1051およびWP1052で処理したところ、WP1051はユビキチン化タンパク質の蓄積を用量依存的に誘導したが、WP1052はユビキチン化タンパク質に対して全く影響を与えなかった。WP1051またはWP1052で処理した細胞の溶解液におけるDUB標識プロファイルを調べた結果、WP1051はUSP9xに対応するDUBの活性を抑制したが、WP1052はDUB阻害を全く示さなかった。これらの結果より、このクラスの化合物のDUB阻害によって正確な化学構造活性相関が示されることが分かった。DUB阻害剤の抗ウイルス活性MNVは、初代培養または株化のマウスマクロファージおよびマウス樹状細胞において容易に複製する。MNV侵入阻害剤を同定することを目的として、関与する特定のキナーゼについて調査が進められた結果、Jak2キナーゼ輸送の誘導物質であるWP1130ならびに化学的に関連する化合物WP1051およびWP1052が得られた。MNV-1に感染させたRAW264.7細胞をWP1130またはWP1051で前処理したところ、細胞生存率には影響はなかったが、感染から8および12時間hpi後のウイルス力価は低下した。構造的に関連するWP1052による前処理ではウイルス力価の低下は見られなかった。RAW264.7細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、阻害剤5μMWP1130、20μMWP1052、または20μMWP1051またはDMSOビヒクル対照処理なしを含有する培地に置き換えた。プレインキュベーションを37°Cで30分間行った後、細胞を氷上にてMNV-1MOI=5に感染させた。ウイルスを除去し、化合物を再度加え、8または12時間静置した。ウイルス力価はプラークアッセイにより求めた。細胞生存率をWST-1Rocheを用いて測定したところ、80超を維持していた。このMNV-1感染抑制レベル対数減少率:約2は、高用量のIFNα1000U/ml非常に強力な公知の抗ウイルス性分子で前処理したRAW264.7細胞で見られる抑制レベルと同等である。MNV-1のライフサイクルは、9~12時間であると推定される。レプリコン系におけるWP1130によるノーウォークウイルスNV複製の抑制ヒトノロウイルスノーウォークウイルスを含む感染の研究に現在利用できる確立された細胞培養系はない。したがって、細胞におけるNV複製を研究し、取扱いに細心の注意を要するヒトノロウイルスに対する抗ウイルス剤を同定するために、NVレプリコンを有する細胞を開発した。簡単に説明すると、NVのRNAゲノムのcDNAコンセンサス配列クローニングしたものを含有するプラスミドNV101を、主要なカプシドタンパク質であるORF2内にネオマイシン耐性遺伝子をコードするように作製した。得られたプラスミドをpNV-Neoと名付けた。pNV-Neoから得られたRNA転写産物をHuh-7にトランスフェクションした。G418の存在下で生細胞コロニーを選択し、HG23細胞と名付けた。全長ゲノムおよびサブゲノムNVRNA種センスおよびアンチセンスの発現ならびに非構造性タンパク質の発現を、ノーザンブロット分析、免疫蛍光アッセイおよびウエスタンブロット分析によりそれぞれ確認した。このレプリコンを有する細胞を用いて、WP1130の抗NV作用について調べた。すなわち、HG23細胞を5μMWP1130で処理して、WP1130のNV複製に対する作用を調べた。この実験において、強力な抗ウイルス性分子であるインターフェロンIFN-αを陽性対照として使用した。48時間処理した後に、NVゲノムをqRT-PCRにより分析した。全RNAを調製して定量的リアルタイムPCRに供し、NVゲノムおよびβ-アクチンを検出した。阻害剤によるNVゲノムの減少率は、偽処理mock-treatmentのものを基準として算出し、次いで、各ゲノムレベルをβ-アクチンレベルで標準化した。WP1130のHG23細胞に対する非特異的な細胞毒性作用は、細胞毒性アッセイキットAnaSpec、サンノゼ、CAを用いてモニタした。HG23細胞において、WP1130は5μMで有意な抗NV作用を示し、これはIFNαと同等レベルであった。しかし、10μMより高い濃度では、化合物による細胞毒性がHG23細胞において観察された。このように、WP1130は、抗ウイルス剤が現在利用可能でないマウスノロウイルスおよびヒトノロウイルスに対して抗ウイルス活性を有する。広い抗ウイルス活性を有するWP1130WP1130がノロウイルスの複製を阻害するというデータに基づき、より広範囲のウイルスに対しても抗ウイルス活性を示すかどうかを調べた。RNAゲノムを有するウイルス群を対象にしたところ、WP1130は脳心筋炎ウイルスEMCV、シンドビスウイルスSiNV、ラクロスウイルスLaCVの感染を阻止し、水疱性口内炎VesicularStomatitisVirusVSVの感染は阻止しないことが分かった。EMCVは、カリシウイルス科ノロウイルスを含むに最も近縁のピコルナウイルス科に属するセンスRNAウイルスである。シンドビスウイルスは、トガウイルス科南北アメリカに見られる東部/西部/ベネズエラ馬脳炎ウイルスに関連する科に属するセンスRNAウイルスである。カテゴリーBのラクロスウイルスおよび水疱性口内炎は、それぞれブニヤウイルス科例えば、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルスおよびラブドウイルス科例えば、狂犬病ウイルスに属する-センスゲノムを有するRNAウイルスである。ウイルスゲノムの極性がWP1130の有効性を決定づけているようには見えないが、このデータより、WP1130が広い抗ウイルス作用を有することが示された。さらに重要なことに、WP1130は、カテゴリーAハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、B東部/西部/ベネズエラ馬脳炎ウイルス、およびC狂犬病、クリミアコンゴ出血熱ウイルスに属する病原体を含む科のウイルスに対しても活性を有する。WP1130の抗細菌活性リステリアモノサイトゲネスは、該細菌で汚染された食品の摂取により死に至る可能性のあるリステリア症を起こすグラム陽性桿状細菌である。リステリアモノサイトゲネスは、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7などの非食細胞および食細胞に感染する通性の細胞内病原体である。細菌は食胞から逃避して細胞内複製を始める。細胞内でこのようなライフサイクルを示すことから、この食物媒介病原体に対するWP1130の有効性について試験を行った。マウスマクロファージをL.モノサイトゲネスに感染させる前にWP1130で前処理するか、または対照として感染後にこの化合物で処理した。RAW264.7細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、5μMWP1130またはDMSOビヒクル対照を含有する培地に置き換えた。プレインキュベーションを37°Cで30分間行った後、細胞をL.モノサイトゲネス株10403SMOI=1と37°Cで30分間接触させて感染させた。細胞をPBSおよび10μg/mlのゲンタマイシンを含有する培地で3回洗浄し、WP1130を細胞に再度加えた。後処理に関しては、感染後1時間経ってからWP1130を加えた。感染から8時間後に、RAW264.7細胞を滅菌水中で溶解し、細菌を増殖培地プレートに接種した。これを37°Cで24時間インキュベートした後、コロニー形成単位CFUを求めて、ビヒクル対照に対して標準化した。細胞生存率をWST-1Rocheを用いて測定したところ、80超を維持していた。細胞をWP1130で前処理すると、ビヒクル対照群または後処理群と比べて、増殖した細菌は有意に少なかった。興味深いことに、感染から1時間後にWP1130で処理した場合は、コロニー形成単位の低下は見られなかった。このことは、この化合物がリステリアのライフサイクルの早い段階で作用していることを示す。これらのデータより、WP1130は、抗ウイルス活性に加えて抗細菌性を有することが分かる。したがって、WP1130は、広いスペクトルを有する抗菌剤として優れた候補化合物であると言える。WP1130の抗寄生体活性トキソプラズマゴンヂは、寄生性原生動物に属する原虫であり、トキソプラズマ症の原因病原体である。トキソプラズマ症を予防および治療する現在の薬物療法は、効果が限定的であるとともに重篤な副作用を引き起こす可能性もある。Tゴンヂは、ほとんどすべての有核細胞に感染する偏性細胞内病原体である。この寄生体は、タキゾイトとブラディゾイトという2つの形態を有する。半数体であるタキゾイトは、急速に分裂し、可逆的に潜伏性のブラディゾイトとなって、慢性感染の特徴とされる細胞内組織嚢胞を形成する。感染中、トキソプラズマは、寄生体胞parasitophorousvacuoleと呼ばれる細胞内コンパートメントを形成し、これを宿主細胞の機能を調節するためのプラットホームとして利用する。そこで、WP1130の抗寄生体機能について試験を行った。初代培養ヒト包皮線維芽細胞HFFをWP1130またはビヒクル対照の存在下で24時間タキゾイトに感染させた。HFF細胞を播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、5μMWP1130またはDMSOビヒクル対照を含有する培地に置き換えた。WP1130またはビヒクル対照存在下、1.25×105のタキゾイトRH株MOI=1をチャンバースライドの各ウェルに加えた。感染から24時間後、細胞を4パラホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。次いで、細胞をPBSで洗浄し、免疫蛍光顕微鏡法により分析した。抗SAG1抗体Tゴンヂの免疫優勢表面抗原immunodominantsurfaceangigenで寄生体を染色した後、Alexa594標識2次抗体およびDAPIで染色した。液胞中の寄生体数を計数して、定量分析を行った。感染細胞の免疫蛍光分析により、WP1130は液胞当たりの寄生体数を有意に減少させることが示され、よってWP1130は寄生体の複製を阻害することが実証された。これらのデータより、WP1130は、複数の異なる種類の細胞初代培養細胞を含むで、広範囲の病原体に対して抗菌活性を示すことが示された。WP1130誘導体の抗ウイルス活性RAW264.7細胞またはスイスウェブスターSwissWebsterマウス由来の初代培養骨髄由来マクロファージを播種し、一晩放置して付着させた。翌日、培養培地を吸引し、阻害剤5μMWP1130または5μMWPDTTまたはDMSOビヒクル対照を含有する培地に置き換えた。抗ウイルス作用を有する陽性対照として、IFN-βで細胞を処理した。プレインキュベーションを37°Cで30分間行った後、細胞を氷上にてMNV-1MOI=5に感染させた。ウイルスを除去し、化合物を再度加え、8または12時間静置した。WPDTTによっても、WP1130と同様にウイルス力価の低下が見られた。宿主に対して細胞毒性を示さないWP1130の抗ウイルス活性RAW264.7細胞を、MNV-1に感染させる前に、濃度が異なるWP1130で前処理した。感染後12時間の時点で、各濃度におけるウイルス力価および細胞生存率WST-1生存率アッセイ、Rocheを比較した。抗ウイルス活性を示すEC50は1.9μMと推定され、生存率に対するIC50は7.6μMと推定された。これらの値から治療指数を約4.0と算出した。WP1130によるタンパク質ユビキチン化の亢進およびUsp9x対応DUB活性の抑制RAW264.7細胞を5μMWP1130で2時間処理した後、等量のタンパク質を含有する細胞溶解液20μgをSDS-PAGEに供してタンパク質を分離し、抗ユビキチン抗体を用いた免疫ブロット法によりユビキチン化タンパク質のレベルを調べた。RAW264.7細胞を5μMWP1130またはビヒクル単独対照とともに2時間インキュベートした後、細胞溶解液を調製し、HA-UbVS200ngとともにさらに1時間インキュベートした後、HAブロット法によりDUB活性を検出した。次いで、同じ膜を用いて、Usp9xについてもブロットを行った。その結果、RAW264.7細胞をWP1130でインキュベートすることによりUsp9xが阻害されることが示された。また、HEK293溶解液に対しても、Usp9xについて免疫ブロットを行った。MNV-1感染により誘導されるDUB活性のWP1130による阻害RAW264.7細胞を非処理のままにするか、または指示濃度のWP1130で2時間処理し、次いで、細胞を偽感染させるか、またはMNV-1に感染させたMOI=5。細胞を37°Cでさらに2時間インキュベートした後、細胞溶解液を調製し、HA-UbVS200ngとともにさらに1時間インキュベートした後、HAブロット法によりDUB活性を検出した。MNV-1感染により、複数種のDUBの活性が増大した。また、抗ウイルス作用を示すのに有効な濃度のWP1130を使用した場合、MNV-1感染によって誘導されるDUB活性が抑制されることが分かった。これより低い濃度のWP11301.25μMは、MNV-1の阻害にも、MNV-1感染に伴うDUB活性化の阻害にも効果的ではなかった。これらの結果より、WP1130の抗ウイルス活性は、MNV-1感染によって誘導されるDUB活性化の阻害に関わることが示唆される。化学合成経路本明細書で開示する化合物は、熟練した通常の化学者が容易に利用可能な任意の手段によって調製することができる。これらの化合物の一部について合成経路の例を以下のスキームに示す。当業者であれば、これらの合成スキームを容易に改変して本明細書に記載の化合物に到達することができるだろう。1-4-メトキシメトキシ-フェニルブタン-1-オン2。五酸化リン21.6g、152mmolを、ジクロロメタン180mL中にメチラール41.7g、548mmolおよび4-ヒドロキシブチロフェノン1;5.0g、30.5mmolを撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた。48時間後、反応液を約500mLの氷冷した2M炭酸ナトリウム水溶液に加え、十分に撹拌した。水層を反応フラスコに再導入して暗色のスラッジ状残渣と反応させ気体の発生、次いでワークアップworkup反応液と再度合わせた。十分に混合した後、そのまま放置して層を分離させた。有機層を分取し、水層を少量のジクロロメタンを用いて抽出した。抽出液を合わせて、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、5.7gの透明な琥珀色油状物を得た。これをシリカゲルカラム35×75mmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Hxa/EtOAc/アセトン8:1:1を用いて溶出し、4.1g65の薄い膜状の無色透明の油状物TLCにて単一スポットを示した、Rf=0.40と、1gのやや純度の低い透明な黄色油状物とを得た。1-4-メトキシメトキシフェニルブタン-1-オンオキシム3。塩酸ヒドロキシルアミン2.7g、39.4mmolを、エタノール30mL中に1-4-メトキシメトキシ-フェニルブタン-1-オン4.1g、19.7mmolおよびピリジン94.67g、59.1mmolを撹拌させた溶液に加えて、1.5時間加熱還流し、そのまま放置して冷却した。エタノールの大部分を減圧濃縮により留去し、残渣に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。層を分離し、水相をジクロロメタンを用いて2回抽出した。抽出液を合わせて水で2回洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、5.1gのやや不透明な無色の粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム50×70mmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Hxa/EtOAc/アセトン8:1:1を用いて溶出し、3.4g77の雪白色の結晶性固体を得たmp74~76°C。1-4-メトキシメトキシフェニルブタン-1-アミン4。テトラヒドロフラン50mL中に1-4-メトキシメトキシフェニルブタン-1-オンオキシム3.4g、15.2mmolを含む溶液を、テトラヒドロフラン100mL中に水素化リチウムアルミニウム1.83g、45.7mmolを撹拌させた懸濁液に、窒素雰囲気下、室温で滴下した。気体の発生が止まってから、反応液を徐々に加熱して還流した。7時間加熱還流した後、反応液をそのまま放置して冷却し、さらに1.0gの水素化リチウムアルミニウムを反応液に加えた。これを4時間加熱還流した後、再度そのまま放置して冷却した。さらに0.2gの水素化リチウムアルミニウムを加えて1時間加熱還流した後、そのまま放置して冷却した。3mLの水を滴下した後、3mLの15水酸化ナトリウム水溶液、次いで9mLの水を加えた。析出物が十分に粒状になるまで撹拌した後、反応液をろ過し、残渣をテトラヒドロフランで2回洗浄した。ろ液/洗浄液を減圧濃縮して得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、残渣として2.9gの淡紫色の粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム50×90mmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Hxa/EtOAc/アセトン8:1:1を用いて溶出し、透明な黄金色の油状物として0.4gの純粋な生成物を得るとともに、1.4g合計で57のやや純度の低い物質を得た。2-シアノ-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアセトアミド5。塩化オキサリル1.03g、8.15mmolを、テトラヒドロフラン15mL中にシアノ酢酸0.67g、7.9mmolを撹拌させた溶液1~2滴のDMFを加えたものに、窒素雰囲気下、氷浴温度で滴下した。反応液を1時間撹拌し、次いで一部を、THF15mL中に1-4-メトキシメトキシフェニルブタン-1-アミン1.1g、5.3mmolを撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、氷浴温度でゆっくりと加えた。反応液をそのまま放置して徐々に室温に戻し、20時間後に、50mLの飽和重炭酸ナトリウム水溶液に加えて撹拌し、ジクロロメタンを用いて3回抽出した。抽出液を合わせて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させて、減圧濃縮し、1.5gの暗紫色の粘性液体を得た。これをシリカゲル43~60μmカラム50×70mmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Hxa/EtOAc1:1を用いて溶出し、1.0g69の透明な暗色油状物を得たTLCにて単一スポットを示した。E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアクリルアミド6。β-アラニン1.42g、16mmolおよび6-ブロモピリジン-2-カルボキシアルデヒド744mg、4mmolを順次、エタノール/水28mL/17mL中に2-シアノ-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアセトアミド276mg、1.0mmolを撹拌させた溶液に室温で加えた。72時間後、TLC25EtOAc/ヘキサンにおいてを実施し、これにより単一の生成物と複数の出発物質の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色の油状物830mgを粗生成物として得た。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し、標題化合物を黄色油状物253mgとして57の収率で得た。1HNMRδ759752727722696682519385349167139094質量スペクトルESmz4440および4660E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-ヒドロキシフェニルブチルアクリルアミド7。3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアクリルアミド14mg、0.031mmolをHCl/MeOH1.25M、2mLに溶解し、室温で18時間撹拌した。TLC50EtOAc/ヘキサンにおいてにより、単一の生成物の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色の固体20mgを粗生成物として得た。この粗生成物を分取TLCにより精製し、標題化合物を淡黄色固体12mgとして95の収率で得た。1HNMRδ7557487187076786683781621340881HNMRδ16191572151414201408139013191294128912451165115811524952922009137質量スペクトルESmz422;mp195°Cで分解開始.元素分析:C5673H451N1033.3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-メトキシフェニルブチルアクリルアミド8および9:アセトン中に3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-ヒドロキシフェニルブチルアクリルアミド21mg、0.05mmolを含む溶液に、MeI32.6μL、0.52mmolおよび炭酸カリウム粉末7.25mg、0.05mmolを加えて、室温で4時間撹拌した後、酢酸エチルを加えた。次いで、有機層を水1回と、飽和食塩水1回とで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して黄色油状物を粗生成物として得た。この粗生成物を分取TLCプレートを用いて精製し、E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-メトキシフェニルブチルアクリルアミド8を淡黄色固体9.2mg、42収率として、およびZ-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-メトキシフェニルブチルアクリルアミド9を白色固体4.4mg、20収率として得た。質量スペクトルES、m/z=414.0mH。E-異性体8:1HNMRδ759752727722683681389383381165139094.Z-異性体9:1HNMRδ783779761752715693384384379157137094.E-2-シアノ-3-1H-イミダゾール-2-イル-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアクリルアミド10:β-アラニン71.3mg、0.8mmolおよび1H-イミダゾール-2-カルボアルデヒド19.2mg、0.2mmolを順次、エタノール/水2.0mL/0.8mL中に2-シアノ-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアセトアミド5;27.6mg、0.1mmolを撹拌させた溶液に室温で加えた。72時間後、TLC50EtOAc/ヘキサンにおいてを実施し、これにより単一の生成物の形成が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色油状物55mgを粗生成物として得た。この粗生成物をカラムクロマトグラフィにより精製し、標題化合物を黄色油状物23mgとして65の収率で得た。1HNMRδ1059814742723717713712707522386375351164153136093質量スペクトルESmz3551.E-2-シアノ-N-1-4-ヒドロキシフェニルブチル-3-1H-イミダゾール-2-イルアクリルアミド11:E-2-シアノ-3-1H-イミダゾール-2-イル-N-1-4-メトキシメトキシフェニルブチルアクリルアミド14.8mg、0.041mmolをHCl/MeOH1.25M、2mLに溶解し、室温で18時間撹拌した。TLCにより、単一の生成物の存在が確認された。反応液に重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して淡琥珀色固体9mgを粗生成物として得た。この粗生成物を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶化し、標題化合物を淡黄色固体6mgとして46の収率で得た。1HNMRδ784728718699682373153130088質量スペクトルESmz3111.1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-オン13:炭酸セシウム5.7g、17.5mmolを、ジメチルホルムアミド25mL中に4-ヒドロキシプロピオフェノン12;2.5g、16.7mmolを撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた後、ブロモメチルメチルエーテル1.43g、17.5mmolを加えた。20時間後、反応液を200mLの水に加えて撹拌し、次いで、ジクロロメタンを用いて3回抽出した。抽出液を合わせて、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、3.4gの外見上結晶質の淡黄色固体を得たmp31~35°C;質量スペクトルESm/z=209m1。1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-オンオキシム14:塩酸ヒドロキシルアミン2.27g、32.7mmolを、エタノール25mL中に1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-オン3.4g、16.3mmolおよびピリジン3.87g、49.0mmolを撹拌させた溶液に加えて、4時間加熱還流し、そのまま放置して冷却した。エタノールの大部分を濃縮により留去し、残渣に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。層を分離し、水相をジクロロメタンを用いて2回抽出した。抽出液を合わせて水で2回洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を濃縮により留去し、次いで残渣をトルエンに溶解し、再度濃縮した。この操作をもう一度繰り返した後、残渣を減圧乾燥させて、3.52gの生成物をクリーム色の結晶性固体として得たmp74~80°C;質量スペクトルESm/z=224m1。1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-アミン15:テトラヒドロフラン20mL中に1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-オンオキシム1.5g、6.7mmolを含む溶液を、テトラヒドロフラン48mL中に水素化リチウムアルミニウム0.78g、20.55mmolを撹拌させた懸濁液に、窒素雰囲気下、室温で滴下した。18時間後、反応液を3時間還流加熱し、そのまま放置して冷却した。0.8mLの水を滴下した後、0.8mLの15水酸化ナトリウム水溶液、次いで2.4mLの水を加えた。数分後、反応液をろ過し、残渣をテトラヒドロフランで2回洗浄した。ろ液および洗浄液を合わせて減圧濃縮し、1.34gの透明な黄金色の油状物を得た。これをシリカゲルカラム5×10cmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、Hxa/EtOAc/アセトン8:1:1を用いて溶出し、0.83gの生成物を透明な黄金色の油状物として得た質量スペクトルESm/z=210m1。2-シアノ-N-1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロピルアセトアミド16:塩化オキサリル0.19g、1.49mmolを、ジクロロメタン5mLと2滴のジメチルホルムアミドとの混合液中にシアノ酢酸0.107g、1.25mmolを撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、氷浴温度で加えた。2時間後、一部の溶液を、テトラヒドロフラン/ジクロロメタン1:14mL中に1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロパン-1-アミン0.25g、1.2mmolおよびトリエチルアミン0.13g、1.3mmolを含む溶液に0~5°Cで加え、そのまま放置してゆっくりと室温に戻した。4時間後、80mLの水を加え、30分以上後に、ジクロロメタン30mLを加えた。層を分離し、水層をさらにジクロロメタンを用いて抽出した。抽出液を合わせて、1N重炭酸ナトリウム水溶液、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、不透明な琥珀色粘性液体を得た。これをEtOAc/Hxa1:1に溶解し、シリカゲルの短カラムで加圧下にてろ過した。流出液を減圧濃縮し、0.24gの生成物を不透明な淡琥珀色粘性液体として得た次の工程に十分な純度であった。E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-2-メトキシエトキシフェニルプロピル-アクリルアミド17:カリウムt-ブトキシド0.014g、0.127mmolを、ジメチルスルホキシド10mL中に6-ブロモ-2-ピリジンカルボキシアルデヒド0.094g、0.51mmolおよび2-シアノ-N-1-4-2-メトキシエトキシ-フェニルプロピルアセトアミド0.07g、0.25mmolを撹拌させた溶液に、窒素雰囲気下、室温で加えた。26時間後、反応液に水を加えて振盪し、次いで酢酸エチルで複数回抽出した。抽出液を合わせて水で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、0.10gの透明な琥珀色粘性液体を得た。これをシリカゲルカラム5×10cmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供して、ジクロロメタン/EtOAc10:0から徐々に12:1に変化を用いて勾配をかけて溶出し、0.040gの生成物を透明な淡黄色の粘性液体として得た質量スペクトルESm/z=444、466m1,m23。3-6-ブロモ-ピリジン-2-イル-2-シアノ-3-2,3-ジヒドロキシ-4-メルカプト-ブチルスルファニル-N-1-フェニル-ブチル-プロピオンアミド19:アセトニトリル6mL中にWP113018;0.05g、0.13mmolを含む溶液を、アセトニトリル13mL中にジチオトレイトール2g、13mmolを撹拌させた溶液に室温で加えた。20時間後、TLC[Hxa/EtOAc1:1]を実施し、これにより出発物質が存在せず、単一の生成物が存在することが確認された。反応液を、アセトニトリルを含むシリカゲル短カラムでろ過し、ろ液から溶媒を減圧留去して無色の粘性液体を得た。この粘性液体を酢酸エチルに溶解し、酢酸エチルを含むシリカゲルカラム35×70mmを用いたフラッシュクロマトグラフィに供し、透明な黄色油状物0.02gを得た。これを放置すると結晶化が始まった質量スペクトルES;m/z=560、562m23および538、540m1。3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-3-2,3-ジヒドロキシプロピルチオ-N-S-1-フェニルブチルプロパンアミド20。チオグリセロール42μL、0.5mmolを、アセトニトリル0.5mL中にWP113019mg、0.05mmolを撹拌させた溶液に加えて、室温で17時間撹拌した。反応液に水とジクロロメタンとを加えて液液分配を行った。分離した有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。分取TLCヘキサン/酢酸エチル6:4を用いて溶出で精製することにより、2020mg、82を透明な油状物として得たMSESm/z492.0MH。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21。2-ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩624mg、3.65mmolを、無水アセトン6mL中にp-ヒドロキシブチロフェノン200mg、1.21mmolを撹拌させた溶液に加えた後、炭酸カリウム668mg、4.84mmolを加えて、48時間加熱還流した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィに供して、1:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出し、21315mg、98を淡黄色油状物として得たMSESm/z264.1MH。1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン22。2-ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩の代わりに、2-ジメチルアミノエチルクロリド塩酸塩を使用した以外は21の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ1:1ヘキサン/酢酸エチルから酢酸エチルへの勾配溶出により精製し、22580mg、81を淡黄色油状物として得たMSESm/z236.1MH。1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブタン-1-オン23。2-ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩の代わりに、1-2-クロロエチルピロリジン塩酸塩を使用したこと以外は21の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ3:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、23455mg、87を透明な油状物として得たMSESm/z262.1MH。1-4-2-モルホリノエトキシフェニルブタン-1-オン24。2-ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩の代わりに、N-2-クロロエチルモルホリン塩酸塩を使用したこと以外は21の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗油状物が得られた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ1:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、24550mg、定量的を透明な油状物として得たMSESm/z278.1MH。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25。シアノ水素化ホウ素ナトリウム155mg、3.5mmolを、メタノール2mL中に1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21;186mg、0.7mmolおよび酢酸アンモニウム1.63g、21.2mmolを懸濁させた液に加えて、40°Cで72時間加熱した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和NaHCO3水溶液2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して粗生成物25110mg、59を黄色油状物として得たMSESm/z265.1MH。さらなる精製は行わずに、このまま次の工程で使用した。1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン26。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21の代わりに、1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン22を使用した以外は25の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物26410mg、73を黄色油状物として得たMSESm/z237.1MH。1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブタン-1-アミン27。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21の代わりに、1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブタン-1-オン23を使用した以外は25の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物27188mg、45を黄色油状物として得たMSESm/z263.2MH。1-4-2-モルホリノエトキシフェニルブタン-1-アミン28。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21の代わりに、1-4-2-モルフォリノエトキシフェニルブタン-1-オン24を使用した以外は25の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより、粗生成物28390mg、70を淡黄色油状物として得たMSESm/z279.2MH。2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29。DMF2mL中にシアノ酢酸37mg、0.43mmolを含む氷冷溶液に、7-アザ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOAt;59mg、0.43mmol、O-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩HATU;165mg、0.43mmol、ジイソプロピルエチルアミンDIPEA;167μL、0.958mmolおよび1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25;115mg、0.43mmolを加えて、室温で18時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和NaHCO3水溶液2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して濃黄色の油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ5:95メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出で精製することにより、29116mg、80を黄色油状物として得たMSESm/z332.2MH。2-シアノ-N-1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド30。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25の代わりに、1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン26を使用した以外は29の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ5:95メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、30320mg、61を濃黄色油状物として得たMSESm/z304.1MH。2-シアノ-N-1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブチルアセトアミド31。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25の代わりに、1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブタン-1-アミン27を使用した以外は29の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ5:95メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、31140mg、60を濃黄色油状物として得たMSESm/z330.2MH。2-シアノ-N-1-4-2-モルフォリノエトキシフェニルブチルアセトアミド32。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25の代わりに、1-4-2-モルフォリノエトキシフェニルブタン-1-アミン28を使用した以外は29の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィメタノール/ジクロロメタンの4:96混合液を用いて溶出により精製し、32370mg、76を透明な油状物として得たMSESm/z346.2MH。E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアクリルアミド33。エタノール2mL中に2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29;116mg、0.35mmolを含む溶液に、β-アラニン499mg、5.6mmolおよび水2mLを加えた。6-ブロモピコリンアルデヒド260mg、1.4mmolを加えて、室温で18時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和NaHCO3水溶液2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して固体の粗生成物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ5:95メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出で精製することにより、33140mg、80を濃黄色油状物として得たMSESm/z=499.1MH。E-2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチル-3-6-フルオロピリジン-2-イルアクリルアミド34。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに、6-フルオロピコリンアルデヒドを使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ4:96メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、34105mg、61を黄色油状物として得たMSESm/z439.2MH。E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノ-N-1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブチルアクリルアミド35。2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりに、2-シアノ-N-1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニル-ブチルアセトアミド30を使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ4:96メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、35120mg、76を黄色油状物として得たMSESm/z471.1MH。E-2-シアノ-3-6-フルオロピリジン-2-イル-N-1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブチルアクリルアミド36。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに6-フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりに2-シアノ-N-1-4-2-ピロリジン-1-イルエトキシフェニルブチルアセトアミド31を使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ4:96メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、3665mg、35を淡黄色油状物として得たMSESm/z437.2MH。E-2-シアノ-3-6-フルオロピリジン-2-イル-N-1-4-2-モルフォリノエトキシフェニルブチルアクリルアミド37。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに6-フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりに2-シアノ-N-1-4-2-モルフォリノエトキシフェニルブチルアセトアミド32を使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ4:96メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、37130mg、77を淡黄色油状物として得たMSESm/z453.2MH。E-2-シアノ-N-1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブチル-3-1H-イミダゾール-2-イルアクリルアミド38。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに1H-イミダゾール-2-カルボアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりに2-シアノ-N-1-4-2-ジメチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド30を使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ8:92メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、3880mg、63を淡黄色油状物として得たMSESm/z453.2MH。S-2-シアノ-N-1-フェニルブチルアセトアミド39。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25の代わりに、S-1-フェニルブチルアミンを使用した以外は29の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ7:3ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、39375mg、58を白色固体として得たMSESm/z217.1.1MH。S,E-2-シアノ-3-6-フルオロピリジン-2-イル-N-1-フェニルブチルアクリルアミド40。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに6-フルオロピコリンアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりにS-2-シアノ-N-1-フェニルブチルアセトアミドを使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ8:2ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、40115mg、96を透明な油状物として得たMSESm/z324.1MH。S,E-2-シアノ-3-6-クロロピリジン-2-イル-N-1-フェニルブチルアクリルアミド41。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに6-クロロピコリンアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりにS-2-シアノ-N-1-フェニルブチルアセトアミドを使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ8:2ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、41105mg、95を透明な油状物として得たMSESm/z340.1MH。S,E-2-シアノ-3-1H-イミダゾール-2-イル-N-1-フェニルブチルアクリルアミド42。6-ブロモピコリンアルデヒドの代わりに1H-イミダゾール-2-カルボアルデヒドを使用し、かつ2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりにS-2-シアノ-N-1-フェニルブチルアセトアミドを使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ1:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、4292mg、94を透明な油状物として得たMSESm/z295.1MH。1-4-2-2-2-ヨードエトキシエトキシエトキシフェニルブタン-1-オン43。2-ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩の代わりに、1,2-ビス-2-ヨードエチルオキシエタンを使用した以外は21の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ4:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、433.85g、52を透明な油状物として得たMSESm/z407.0MH。2-2-2-4-ブチリルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル44。ジ-tert-ブチルイミノジカルボキシレート3.05g、14.07mmolおよびカリウムtert-ブトキシド1.58g、14.07mmolをDMF50mLに加えて、15分間撹拌した後、1-4-2-2-2-ヨードエトキシエトキシエトキシフェニルブタン-1-オン43;3.81g、9.38mmolを加えて、窒素雰囲気下、18時間撹拌し、次いで200mLの酢酸エチルに加えた。この溶液を水2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して液体を得た。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ3:1ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、442.27g、49を透明な油状物として得たMSESm/z496.2MH。2-2-2-4-1-アミノブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル45。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-オン21の代わりに、2-2-2-4-ブチリルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-t-ブチルエステル44を使用した以外は25の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ酢酸エチルを用いて溶出により精製し、45730mg、73を透明な油状物として得たMSESm/z497.3MH。2-2-2-4-1-2-シアノアセトアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル46。1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブタン-1-アミン25の代わりに、2-2-2-4-1-アミノブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル45を使用した以外は29の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ3:2ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、4695mg、84を透明な油状物として得たMSESm/z564.3MH。E-2-2-2-4-1-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノアクリルアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル47。2-シアノ-N-1-4-2-ジエチルアミノエトキシフェニルブチルアセトアミド29の代わりに、2-2-2-4-1-2-シアノアセトアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル46を使用した以外は33の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ7:3ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出により精製し、47105mg、85を透明な油状物として得たMSESm/z731.2MH。N-2-2-2-4-1-E-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノアクリルアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチル-5-3aS,4S,6aR-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イルペンタンアミド48。E-2-2-2-4-1-3-6-ブロモピリジン-2-イル-2-シアノアクリルアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル47;105mg、0.14mmolおよびトリフルオロ酢酸0.3mLの混合物をジクロロメタン3mLに加えて、1.5時間撹拌した。この溶液を濃縮し、残渣をN,N-ジメチルホルムアミドに溶解した。この溶液に、D-ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステル49mg、0.14mmolおよびDIPEA75μL、0.43mmolを氷浴温度で加えて、同温度で2時間撹拌し、次いでジクロロメタンと水とを加えて液液分配を行った。有機相を水2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ7:93メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出で精製することにより、4855mg、51を淡黄色油状物として得たMSESm/z757.2MH。2-2-2-4-1-2-ジエトキシホスホリルアセトアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル49。4-ジメチルアミノピリジンDMAP;197mg、1.61mmolおよび1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDCHCl;309mg、1.61mmolの混合物を、N,N-ジメチルホルムアミド10mL中にジエチルホスホノ酢酸129μL、0.805mmolおよび2-2-2-4-1-アミノブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル45;400mg、0.805mmolを撹拌させた溶液に加えて、窒素雰囲気下、室温で3時間撹拌し、次いで100mLの酢酸エチルに加えた。この溶液を1NHCl水溶液2回および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ酢酸エチルを用いて溶出で精製することにより、49540mg、定量的を透明な油状物として得たMSESm/z675.3MH。E-2-2-2-4-1-3-6-ブロモピリジン-2-イルアクリルアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル50。テトラヒドロフラン1.0mL中にNaH52mg鉱油中に60含有、1.31mmolを懸濁させた液に、テトラヒドロフラン2mL中に2-2-2-4-1-2-ジエトキシホスホリルアセトアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチルイミドジカルボン酸1,3-ビス-tert-ブチルエステル49;295mg、0.43mmolを含む溶液を氷浴温度で加えて、室温で30分間撹拌し、次いでテトラヒドロフラン2mL中に6-ブロモピコリンアルデヒド81mg、0.43mmolを含む液を滴下した。反応液をさらに30分間撹拌し、次いで水を用いて慎重に急冷した。この溶液を酢酸エチルを用いて抽出し3回、有機溶媒による抽出液を合わせて飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して油状物を得た。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ7:3ヘキサン/酢酸エチルを用いて溶出で精製することにより、50205mg、67を透明な油状物として得たMSESm/z706.2MH。N-2-2-2-4-1-E-3-6-ブロモピリジン-2-イルアクリルアミドブチルフェノキシエトキシエトキシエチル-5-3aS,4S,6aR-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イルペンタンアミド51。シアノアクリルアミド47の代わりに、アクリルアミド50を使用した以外は48の調製と同様にして、標題化合物を調製した。これにより粗生成物が得られた。これをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ7:93メタノール/ジクロロメタンを用いて溶出により精製し、5150mg、定量的を透明な油状物として得たMSESm/z731.2MH。DUB阻害活性に関する化合物評価CML、骨髄腫およびマントル細胞リンパ腫の各細胞株を対象として、化合物のDUB阻害活性およびアポトーシス活性の有無をスクリーニングし、WP1130と比較した。選択した化合物による細胞増殖および生存に対する効果をWP1130と比較して表1に示す。例えば、高感度な化合物とは、WP1130より高い阻害活性を有する化合物であり、低感度な化合物とは、WP1130より低い阻害活性を有する化合物である。また、選択した化合物のDUB阻害の有無についても、細胞表2および細胞より分離したDUBUsp9x-UCHドメイン酵素調製物表3を用いて調べた。これらのアッセイにおいて使用した方法の概要は、例えば、以下の文献に記載されている。Kapuria,etal.,AnovelsmallmoleculedeubiquitinaseinhibitorblocksJak2signalingthroughJak2ubiquitination,CellSignal,2011,inpress;Kapuria,etal.,Deubiquitinaseinhibitionbysmall-moleculeWP1130triggersaggresomeformationandtumorcellapoptosis.CancerRes,2010.7022:p.9265-76;Sun,etal.,Bcr-AblubiquitinationandUsp9xinhibitionblockkinasesignalingandpromoteCMLcellapoptosis.Blood,2011.11711:p.3151-62;Kapuria,etal.,Proteincross-linkingasanovelmechanismofactionofaubiquitin-activatingenzymeinhibitorwithanti-tumoractivity.BiochemPharmacol,2011.824:p.341-9;andBartholomeusz,etal.,ActivationofanovelBcr/AbldestructionpathwaybyWP1130inducesapoptosisofchronicmyelogenousleukemiacells.Blood,2007.1098:p.3470-8.化合物のウイルス阻害活性また、表4に示すように、種々のウイルスに対する、化合物の抗ウイルス作用についても調べた。ノーウォークウイルスのゲノム力価の測定は、レプリコン含有細胞株をWP1130で24時間処理した後、qRT-PCRを実施することにより行ったChang,Sosnovtsevetal.2006。その他の実験は以下のように実施した。細胞を5μMの化合物により37°Cで30分間前処理した。細胞へのウイルス感染は氷上で1時間行った。次いで、細胞を洗浄して、未結合のウイルスを除去した。細胞を化合物の存在下でさらに8~12時間インキュベートした後、ウイルス力価をプラークアッセイにより測定したWobus,Karstetal.2004。細胞をWP1130で前処理5μMで30分間したところ、プラークアッセイにより求めたウイルス力価は、マウスノロウイルス、ラクロスウイルス、脳心筋炎ウイルス、およびシンドビスウイルスにおいて低下し、2~2.5の対数減少率を示した。また、レプリコン細胞株において、ヒトノロウイルスであるノーウォークウイルスのゲノム力価は50低下することがqRT-PCRによって示された。複数の細胞株マウスマクロファージRAW264.7、初代培養マウスマクロファージ、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞Vero、ヒト神経細胞Be2-c、ヒト肝細胞Huh-7細胞で試験を行った結果、化合物の阻害作用は細胞の種類に依存しないことが分かった。プラークアッセイにおけるウイルス力価の低下2~2.5の対数減少率は、マウスノロウイルスに感染させたRAW264.7細胞およびラクロスウイルスに感染させたBe2-c細胞において化合物33を使用した場合にも同様に観察された。他の化合物については、RAW264.7細胞におけるマウスノロウイルス阻害活性に関してのみ、プラークアッセイによる試験を行った。化合物35、40および41により、ウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は2であった。これらより作用は弱いが、化合物38および42によってもウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は0.5であった。他の化合物については、RAW264.7細胞におけるマウスノロウイルス阻害活性に関してのみ、プラークアッセイによる試験を行った。化合物35、41、40、34および36により、ウイルス力価の低下が見られ、対数減少率は2であった。これらより作用は弱いが、化合物37、38および42によってもウイルス力価の低下が見られ、化合物37による対数減少率は1であり、化合物38および42による対数減少率は0.5であった。ビオチン化化合物48により、プラークアッセイにおけるマウスノロウイルスの力価の低下が見られ、対数減少率は1.5であったが、ビオチン化空プローブ51においてはマウスノロウイルスの力価の低下は見られなかった。化合物の真菌類に対する阻害活性また、WP1130は、初代培養ヒト包皮線維芽細胞において、アピコンプレックス門apicomplexanに属するトキソプラズマゴンヂの複製を阻害する。細胞をWP1130で処理し、タキゾイトRH株MOI=1に24時間感染させた後、免疫蛍光法を用いて寄生体含有液胞を計数した。寄生体を1個のみ含有する液胞数は約3倍に増加し、寄生体を4個含有する液胞数は約5分の1に減少した。化合物の細菌感染に対する阻害活性RAW264.7マクロファージを5μMWP1130で処理したところ、感染後8時間の間にリステリアモノサイトゲネスの力価は3~10分の1に低下した。力価は、細胞内のコロニー形成単位を経時的に測定することにより求めた。上記マクロファージと接種細菌との接触は、MOI=1で30分間行った。WP1130処理および感染の前にリポ多糖類およびインターフェロン-γで活性化した初代培養骨髄由来マクロファージにおいても、同様の効果が観察された。またWP1130処理によって、感染後8時間の間にRAW264.7マクロファージ内のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌MRSAの生存は3~4分の1に低下した。また、この効果は、MRSAに感染したヒト子宮頸管上皮HeLa細胞においても観察された。RAW264.7細胞において33および40を使用した場合にも、同様の細菌生存の低下がMRSAにおいて見られた。"