"少なくとも1つの標的に結合する少なくとも1つの結合体bindingentityの同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む濃縮ライブラリーを作製する方法であって、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、i少なくとも100の異なる結合体Bnn=100以上のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造が直接同定され前記核酸分子遺伝子型に連結された前記結合体の構造即ち表現型を以下B構造Bstructureと呼ぶ。、ii少なくとも1つの標的Tnn=1以上が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的は工程iのライブラリーに存在する結合体の少なくとも1つに結合する能力を有する前記核酸分子遺伝子型に連結された前記標的の構造即ち表現型を以下T構造Tstructureと呼ぶ。工程を含み、当該方法は、iii工程iのライブラリーのXXは104よりも大きな数である個のB構造を含む溶液を、工程iiのYYは102よりも大きな数である個のT構造を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも1つが少なくとも1つの標的に結合して、T構造に結合したB構造を含む複合体が生成されこれを以下B結合T構造BBoundToTstructureと呼ぶ。、ivインビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、B構造、T構造及びB結合T構造が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを含み、v同じ個別コンパートメント内に存在するB構造とT構造との核酸分子を融合し、即ち、B構造の核酸分子をT構造の核酸分子に融合しこの構造を以下BT融合構造BTFusedstructureと呼ぶ。、前記BT融合構造は、工程iの結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程iiの特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、viB構造の核酸分子とT構造の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程vで形成されなかった新たなBT融合構造が形成されない条件下で、工程vの個別コンパートメントの内容物を併合することにより、BT融合構造のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的と結合実体binderentityとの非結合対に由来するBT融合構造に比べて、標的と結合実体との結合対に由来するBT融合構造の種が濃縮されたライブラリーであることを特徴とする、方法。工程iの結合体即ち表現型が核酸分子遺伝子型に、例えば共有結合で連結され、工程iiの標的即ち表現型が核酸分子遺伝子型に共有結合で連結され、B構造の核酸分子がDNAであり、T構造の核酸分子がDNAである、請求項1に記載の方法。B構造のDNA核酸分子遺伝子型が二本鎖核酸分子であり、T構造のDNA核酸分子遺伝子型が二本鎖核酸分子である、請求項2に記載の方法。B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型がPCRプライミング部位を含み、T構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型がPCRプライミング部位を含む、請求項1~3の何れか一項に記載の方法。工程iのインビトロライブラリーが少なくとも105の異なる結合体を含み即ちBnn=105であり、工程iの結合体が平均分子量MW5000ダルトン未満の化合物である、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。工程iiにおいて少なくとも2つの異なる標的が存在する即ちTnn=2以上である、請求項1~5の何れか一項に記載の方法。少なくとも1つの標的がタンパク質である請求項1~6の何れか一項に記載の方法。工程iiiにおいて、ある所定のT構造が少なくとも105コピー存在し、即ちYが少なくとも105であり、工程iiiにおけるT構造の濃度が、少なくとも109Mである、請求項1~7の何れか一項に記載の方法。工程iiiの結合条件が、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造に比べて、対応するT構造に100倍の効率で結合条件である、請求項1~8の何れか一項に記載の方法。前記方法が更に、工程ivの前に実施される追加の工程として、iii-b結合条件、即ち、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する条件下で、工程iiiの溶液を少なくとも100倍に希釈することを含む、請求項1~9の何れか一項に記載の方法。工程ivにおいて、工程iiiで存在するY個のT構造と比べ、少なくとも100倍の個別コンパートメントが存在するとともに、工程ivにおいて、工程iiiのX個のB構造と比べ、少なくとも10の平方根3.16倍の個別コンパートメントが存在する、請求項1~10の何れか一項に記載の方法。工程ivのインビトロのコンパートメント化系が油中水waterinoilエマルション系であり、平均コンパートメント体積が1012リットル未満である、請求項1~11の何れか一項に記載の方法。工程vの同じ個別コンパートメントに存在するB構造の核酸分子とT構造の核酸分子との融合が、aDNAリガーゼによって3’-OHと5’-リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成することにより、又は、bDNAポリメラーゼを用いて例えばエマルションPCRを用いて実施される、請求項1~12の何れか一項に記載の方法。工程ivのインビトロのコンパートメント化系が油中水エマルションであり、工程viにおいて、油コンパートメントを破壊することにより、工程vの個別コンパートメントの内容物が併合される、請求項12に記載の方法。更なる工程viiとして、工程viの濃縮ライブラリー内に存在するBT融合構造をPCRで増幅し、その後にDNA配列決定を行うことにより、少なくとも1つの所定の標的に結合する少なくとも1つの個別の結合体を同定することを含む、請求項1~14の何れか一項に記載の方法。更なる工程viiとして、工程viの濃縮ライブラリーを用いて、少なくとも1つの所定の標的に結合する少なくとも1つの個別の結合体を同定することを含む、請求項1~15の何れか一項に記載の方法。工程ivの個別コンパートメントにおいて、B結合T構造が溶液内に懸濁されている、請求項1~16の何れか一項に記載の方法。前記方法が固体支持体への標的の固定化を必要としない、請求項1~17の何れか一項に記載の方法。本発明が解決しようとする課題は、例えば、興味のある標的例えば医薬関連受容体等に結合する少なくとも1つの結合体例えば化合物等を含む濃縮ライブラリーを作製するための、インビトロディスプレイに基づく改善された方法を提供することである。多くの場合、治療薬の開発で最も顕著であるが、結合体薬物に関する2つのパラメーターが特に重要である。即ち、力価potency親和性及びオフ比offrate薬物:標的複合体の解離半減期である。本発明は、これらの重要な結合パラメーターの双方を濃縮するためのインビトロディスプレイ法について、より優れた解決策を提供する。他の場合では、結合同一性のオン比特性onratecharacteristicが望ましい。本発明は、結合同一性のオン比特性を濃縮するインビトロディスプレイ方法について、より優れた解決策を提供する。解決策として、例えば以下が挙げられる。i核酸分子に連結された結合体のインビトロディスプレイライブラリーの作製。この工程は例えば、斯かるインビトロディスプレイライブラリーを作製する既知の先行技術に基づいて実施することができる。ii核酸分子遺伝子型に連結された標的すなわち表現型を含む構造の作製。この工程は例えば、斯かる構造を作製する既知の先行技術に基づいて実施することができる。本発明において記載する方法は、更に以下を有することを特徴とする。iii結合工程を溶液中例えば水性条件下で行う。iv適切なインビトロコンパートメント化系例えば油中水滴型エマルション系を用いて、標的分子より多くの個別コンパートメントを作製する。v共コンパートメント化された標的及び結合体遺伝子型を融合する。viコンパートメントを解消する。融合された遺伝子型を濃縮するインビトロディスプレイライブラリー中の陽性の結合物質は、非結合物質よりも融合され易い傾向を有する。vii更に任意により、例えば融合した遺伝子型を精製し、及び/又は、優先的に増幅する。当業者であれば、本明細書の詳細な説明及び技術常識に基づいて、種々の異なる方法で工程iiiから工程viを実施することが可能である。工程viiは任意の工程である。本明細書で記載するように、工程viiの濃縮ライブラリーが得られたら、このライブラリーを本技術分野に従って様々な方法で用いることができる。例えば、濃縮ライブラリーを濃縮されたインビトロディスプレイライブラリーとして、例えば選択濃縮の第2ラウンドに使用してもよい。或いは、工程viの濃縮ライブラリーから、興味ある特定の結合体の構造を直接同定してもよい。上述したように、本発明に関連する所謂IVCの先行技術は、以下のように分けることができる。グループaコンパートメント化工程の後に表現型の活性を照合する技術。グループbコンパートメント化工程の間に表現型の活性を照合する技術。上記から明らかなように、また、本明細書において更に議論するように、本発明に記載される方法は、これらの所謂IVCの先行技術とは概念的に異なる。例えば、表現型活性は第1の観点の工程iiiにおいて照合されるが、これは、第1の観点のコンパートメント化工程ivの前に行われる。本明細書に記載の新規な方法の原理を簡単に説明すれば、以下のとおりである。ディスプレイライブラリー中の非結合物質は、コンパートメントに無作為に分配され、惹いてはコンパートメント数と標的分子数との比率に応じた頻度で、標的と一緒に無作為に共コンパートメント化される。対照的に、結合物質はその結合活性ゆえに、コンパートメント数と標的分子数との比率とは無関係に、標的分子と一緒に共コンパートメント化される。従って、コンパートメント数と標的分子数との比率が1よりも大きければ、結合物質は濃縮されることになる。比率が高いほど、より濃縮されることになる。本明細書に記載の新規な方法の例を図1及び2に示す。本発明に関連する多数の結合体及び所定の標的の例を実施例1及び2に示す。実施例1及び2の結論から明らかなように、本明細書に記載の方法を用いれば、例えばライブラリーに含まれる結合物質を1000倍に濃縮することができる。従って、本発明の第1の観点は、少なくとも1つの標的に結合する少なくとも1つの結合体bindingentityの同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む濃縮ライブラリーを作製する方法であって、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、i少なくとも100の異なる結合体Bnn=100以上のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造が直接同定され前記核酸分子遺伝子型に連結された前記結合体の構造即ち表現型を以下B構造Bstructureと呼ぶ。、ii少なくとも1つの標的Tnn=1以上が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的は工程iのライブラリーに存在する結合体の少なくとも1つに結合する能力を有し前記核酸分子遺伝子型に連結された前記標的の構造即ち表現型を以下T構造Tstructureと呼ぶ。、iii工程iのライブラリーのXXは104よりも大きな数である個のB構造を含む溶液を、工程iiのYYは102よりも大きな数である個のT構造を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも1つが少なくとも1つの標的に結合して、T構造に結合したB構造を含む複合体が生成されこれを以下B結合T構造BBoundToTstructureと呼ぶ。、ivインビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、B構造、T構造及びB結合T構造が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを含み、v同じ個別コンパートメント内に存在するB構造とT構造との核酸分子を融合し、即ち、B構造の核酸分子をT構造の核酸分子に融合しこの構造を以下BT融合構造BTFusedstructureと呼ぶ。、前記BT融合構造は、工程iの結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程iiの特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、viB構造の核酸分子とT構造の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程vで形成されなかった新たなBT融合構造が形成されない条件下で、工程vの個別コンパートメントの内容物を併合することにより、BT融合構造のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的と結合実体binderentityとの非結合対に由来するBT融合構造に比べて、標的と結合実体との結合対に由来するBT融合構造の種が濃縮されたライブラリーである、方法に関する。本明細書に記載の第1の観点の方法は、共コンパートメント化による濃縮EnrichmentbyCoCompartmentalization:ECCと呼ぶことができる。本明細書に記載のECC法の利点は、重要な結合特性の濃縮を分離して最適化できる点である。ECCは均質アッセイであるので、標的を固体支持体に固定化する必要がない。先行技術の方法は不均質系であり、固体支持体例えばビーズ、カラム、細胞、プラスチック、ろ過器などへの標的固定化に依存する。不均質アッセイは、例えばアビディティー作用avidityeffects、被膜の密度、アッセイに対する固体支持体自体の干渉等により、均質アッセイと比べて遥かに制御が困難である。上に議論されたように、本発明に関連するインビトロディスプレイの先行技術例えば上述の先行技術等では、インビトロディスプレイライブラリー内に存在する適切な結合体の選択は通常、ディスプレイライブラリー結合事象の前又は後に、固体支持体例えばガラス板、カラム、ビーズ、ニトロセルロースフィルター、細胞などに標的例えば受容体を固定化することにより行われる。非結合物質及び低親和性結合物質は概ね洗い流されるため、結合物質が濃縮された集合物が固体支持体から回収される。従って、当業者であれば理解するように、本発明に関連する上述の先行技術の方法が固体支持体への標的固定化に依存する方法であるとすれば、適切な結合体の選択は固体支持体への標的の固定化に依存し、これは適切な結合体を選択するための必須要素となる。当業者に明らかなように、第1の観点の方法は、斯かる固体支持体への標的固定化に依存する先行技術の方法とは異なる。第1の観点の工程ivで規定するように、結合体の選択は、個別コンパートメント内へのB結合T構造の分離に基づいて行われるからである。上記に従い、また、当業者であれば理解するように、第1の観点の方法において、理論的には例えば、工程iiにおける標的T構造がビーズを含む場合を想定することができる。それは理論上、標的がビーズに結合されたT構造であってもよい。更には、工程iiにおけるT構造の特定の標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む核酸分子が、ビーズに結合されていてもよい。当業者に明らかなように、ビーズを含む斯かる特別なT構造は、第1の観点の方法が、固体支持体への標的の固定化に依存して適切な結合体を選択する方法ではない、という事実を変更することはない。上記に従い、また、当業者であれば理解するように、本発明との関連において、第1の観点の方法は、第1の観点の工程ivの個別の/分離されたコンパートメント内の溶液にB結合T構造すなわち標的結合体複合体が懸濁された状態で維持されることを示唆する方法と考えてもよい。ECCによれば、標的に結合体を結合するための主な結合特性を独立して最適化することが可能となる。例えば、力価親和性、会合率オン比、結合体と標的の解離半減期オフ比等である。親和性に基づいた選択は、均衡条件を用いることにより達成され、混合工程結合工程の標的濃度により制御される。親和性に基づいた選択は、均衡条件を用いることにより達成され、混合工程結合工程の標的濃度により制御される。すなわち、標的濃度の10分の1に等しいKdを有するディスプレイライブラリー中の結合体分子は、90が標的に結合される。一方、標的濃度と同程度のKdを有している結合体分子は、50が標的に結合し、標的濃度の10倍に等しいKdを有する結合体分子は、10が標的に結合される。従って、親和性の濃縮は、混合工程の標的濃度によって容易に制御することができる。本発明の別の観点は、第1の観点の工程viの濃縮ライブラリーに関連し、かつ第1の観点の方法によって、或いは本発明に関連する第1の観点の態様から得られる。本発明の態様を以下に記載するが、これらはあくまでも例示にすぎない。インビトロディスプレイライブラリー~第1の観点の工程iインビトロディスプレイライブラリーinvitrodisplaylibraryという語は、本技術分野に従い理解される。すなわち、多数の異なる結合体を含むライブラリーであって、各結合体が核酸分子に連結され、核酸分子が、結合体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含むライブラリーを意味する。すなわち、多数の異なる結合体を含むライブラリーであって、各結合体が核酸分子に連結され、核酸分子が、結合体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含むライブラリーを意味する。本願明細書では、核酸分子遺伝子型に連結された結合体すなわち表現型の構造を、B構造と呼ぶ。本明細書で議論するように、先行技術には、斯かるインビトロディスプレイライブラリーすなわち工程iのインビトロディスプレイライブラリーを作製する、多くの異なる方法が記載されている。換言すれば、核酸分子遺伝子型に結合体すなわち表現型が連結された構造本明細書ではこれをB構造と呼ぶは、現在では当業者であれば定型的な作業によって適切に作製することが可能である。本技術分野では周知のように、結合体の核酸分子への連結は、共有結合等によるものでもよく、高親和性非共有結合等によるものでもよい。本発明では、結合体すなわち表現型が共有結合によって核酸分子遺伝子型に連結されることが好ましい。工程iのインビトロディスプレイライブラリーは多くの異なるB構造を含む。即ち、上述の通り、工程iのインビトロディスプレイライブラリーを作製することは、当業者にとっては定型的な作業である。好ましい例としては、EP1809743B1EP1402024B1EP1423400B1NatureChemBiol5647654WO0023458NatureMethods35615702006NatBiotechnol200422568574Nature346818822orProcNatlAcadSciUSA9412297302等が挙げられる。言い換えれば、第1の態様の工程iのインビトロディスプレイライブラリーは、先行技術に記載されるような様々な方法で作製することができる。理論に束縛されるものではないが、本発明において適切なインビトロディスプレイライブラリー技術の例としては、DNAコード化化合物ライブラリーDNAEncodedChemicalLibrary技術、アプタマー技術、CISディスプレイ等のRNA/DNAディスプレイ技術、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、又はコード化に核酸を用いたビーズディスプレイ系が挙げられる。先行技術に記載されるように例えば欧州特許第1809743号Vipergen参照、B構造の核酸分子としては、PNA、LNA、RNA、DNA又はその組み合わせが挙げられる。好ましくは、B構造の核酸分子はDNAである。本発明の好ましい態様によれば、B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、二本鎖核酸分子である。本発明の好ましい態様によれば、B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、少なくとも0二本鎖すなわち一本鎖、少なくとも10二本鎖、少なくとも20二本鎖、二本鎖、少なくとも30二本鎖、少なくとも40二本鎖、少なくとも50二本鎖、少なくとも60二本鎖、少なくとも70二本鎖、少なくとも80二本鎖二本鎖、少なくとも90二本鎖、あるいは100二本鎖である。本発明の好ましい態様によれば、B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、PCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明の好ましい態様によれば、B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、2つのPCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明の好ましい態様によれば、B構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、少なくとも3つのPCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、PCRプライミング部位の断片は、少なくとも5つのヌクレオチド、少なくとも6つのヌクレオチド、少なくとも7つのヌクレオチド、少なくとも8つのヌクレオチド、少なくとも9つのヌクレオチド、少なくとも10のヌクレオチド、少なくとも11のヌクレオチド、少なくとも12のヌクレオチド、少なくとも13のヌクレオチド、少なくとも14のヌクレオチド、少なくとも15のヌクレオチド、少なくとも16のヌクレオチド、少なくとも17のヌクレオチド、少なくとも18のヌクレオチド、少なくとも19のヌクレオチド、又は少なくとも20のヌクレオチドを含む。本発明のある態様によれば、B構造で結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、B構造の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、B構造において結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、B構造の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。オーバーハングは、好ましくは1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド又は10ヌクレオチド長である。結合体結合体としては興味のある任意の結合体が用いられる。第1の観点の工程iでは、少なくとも100の異なる結合体Bnn=100以上と規定する。実際には、工程iのライブラリーには、遥かに多くの異なる結合体が存在していてもよい。例えば、少なくとも104、少なくとも105、又は少なくとも106の、異なる結合体即ち、n=少なくとも104、n=少なくとも105又はn=少なくとも106が存在していてもよい。従って、理論的な状況として、仮にライブラリーがちょうど104の異なる結合体を含む場合、本明細書ではこれをBnn=104又はB104と表現する。理論に束縛されるものではないが、1020を超える異なる結合体を有するライブラリーを作製するのは難しいであろう。適切な例として、結合体は、タンパク質、ポリペプチド、核酸及び化合物好ましくは平均分子量MW10000ダルトン未満、より好ましくは平均分子量MW5000ダルトン未満、より一層好ましくは平均分子量MW1000ダルトン未満の小化合物からなる群より選択される、少なくとも1つの結合体である。本発明に関連する結合体の適切な例は、先行技術に記載されている。例えば、EP1809743B1EP1402024B1EP1423400B1NatureChemBiol5647654WO0023458NatureMethods35615702006NatBiotechnol200422568574Nature346818822orProcNatlAcadSciUSA9412297302等を参照。要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある結合体となり得る膨大な数の物質を挙げることができるであろう。第1の観点の工程ii本明細書で議論するように、標的は、工程iのライブラリー中にある結合体の少なくとも1つに結合することができるものとする。そうでなければ、少なくとも1つの標的に結合する特異的結合実体を同定するために使用できる適切な標的にはならない。上述のように、核酸分子遺伝子型に適切に標的すなわち表現型を連結することにより、核酸分子遺伝子型に連結された標的すなわち表現型の構造すなわち本発明にいうT構造を作製することは、現在では当業者にとって定型的な作業である。言い換えれば、例えば工程iのインビトロディスプレイライブラリーの作製との関連で先に議論した先行技術文献等に基づいて、本発明に関連するT構造を作製してもよい。本技術分野では周知のように、標的すなわち表現型の核酸分子遺伝子型への連結は、共有結合等によるものでもよく、高親和性非共有結合等によるものでもよい。本発明では、標的すなわち表現型が共有結合によって核酸分子遺伝子型に連結されることが好ましい。第1の観点の工程iは、少なくとも1つの標的Tnn=1以上と記載する。本明細書で議論するように、本発明に記載の方法の利点の一つは、例えば、2つ以上の標的に結合し得る結合体を同時に、効率的且つ迅速に選別することができるという点にある。例えば、標的は2つの異なる受容体分子であってもよく、この場合、本発明に記載の方法は、一方の受容体に結合する1つの結合体と、別の受容体に結合する別の結合体とを、同時に同定することができる。上述の例2つの異なる受容体標的の例では、標的はTnn=2或いはT2と表現される。即ち、工程iiには少なくとも2つの異なる標的が存在してもよく即ちTnn=2以上、工程iiに少なくとも3つの異なる標的が存在してもよく即ちTnn=3以上、工程iiに少なくとも10の異なる標的が存在してもよく即ちTnn=10以上、工程iiに少なくとも100の異なる標的が存在してもよい即ちTnn=100以上。理論に束縛されるものではないが、工程iiにおいて、100,000を超える異なる標的すなわち100,000を超える異なるT構造を有するのは難しいであろう。先行技術に記載されるように例えば欧州特許第1809743号Vipergen参照、T構造の核酸分子としては、PNA、LNA、RNA、DNA又はその組み合わせが挙げられる。好ましくは、T構造の核酸分子はDNAである。本発明の好ましい態様によれば、T構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、少なくとも5ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも30ヌクレオチド長、少なくとも40ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長、少なくとも60ヌクレオチド長、少なくとも70ヌクレオチド長、少なくとも80ヌクレオチド長、少なくとも90ヌクレオチド長、少なくとも100のヌクレオチド長、少なくとも200ヌクレオチド長、少なくとも300ヌクレオチド長、少なくとも400ヌクレオチド長、又は少なくとも500ヌクレオチド長である。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、二本鎖核酸分子である。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された二本鎖核酸分子遺伝子型は、少なくとも5塩基対長、少なくとも10塩基対長、少なくとも20塩基対長、少なくとも30塩基対長、少なくとも40塩基対長、少なくとも50塩基対長、少なくとも60塩基対長、少なくとも70塩基対長、少なくとも80塩基対長、少なくとも90塩基対長、少なくとも100の塩基対長、少なくとも200塩基対長、少なくとも300塩基対長、少なくとも400塩基対長、又は少なくとも500塩基対長である。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、少なくとも0二本鎖すなわち一本鎖、少なくとも10二本鎖、少なくとも20二本鎖、二本鎖、少なくとも30二本鎖、少なくとも40二本鎖、少なくとも50二本鎖、少なくとも60二本鎖、少なくとも70二本鎖、少なくとも80二本鎖二本鎖、少なくとも90二本鎖、あるいは100二本鎖である。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、PCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、2つのPCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明の好ましい態様によれば、T構造の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、少なくとも3つのPCRプライミング部位又はその断片を含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、PCRプライミング部位の断片は、少なくとも5つのヌクレオチド、少なくとも6つのヌクレオチド、少なくとも7つのヌクレオチド、少なくとも8つのヌクレオチド、少なくとも9つのヌクレオチド、少なくとも10のヌクレオチド、少なくとも11のヌクレオチド、少なくとも12のヌクレオチド、少なくとも13のヌクレオチド、少なくとも14のヌクレオチド、少なくとも15のヌクレオチド、少なくとも16のヌクレオチド、少なくとも17のヌクレオチド、少なくとも18のヌクレオチド、少なくとも19のヌクレオチド又は少なくとも20のヌクレオチドを含む。本発明のある態様によれば、T構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、B構造の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。本発明のある態様によればT構造の結合体表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、B構造の遺伝子型の一本鎖オーバーハングに対して逆相補的な一本鎖オーバーハングを含んでいてもよい。オーバーハングは、好ましくは1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド又は10ヌクレオチド長である。本発明のある態様によれば、T構造において標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、各標的分子について独自の特定配列UniqueMoleculeIdentifier:UMIを含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、T構造に標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、各標的分子について、少なくとも16のNN=A、C、G又はT少なくとも17のN、少なくとも18のN、少なくとも19のN、少なくとも20のN、少なくとも21のN、少なくとも22のN、少なくとも23のN、少なくとも24のN、少なくとも25のN、少なくとも26のN、少なくとも27のN、少なくとも28のN、少なくとも29のN又は少なくとも30のNからなる、独自の特定配列UniqueMoleculeIdentifier:UMIを含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、T構造において標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、各標的分子について、連続的な配列からなる独自の特定配列UniqueMoleculeIdentifier:UMIを含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、T構造において標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、各標的分子について、不連続な配列からなる独自の特定配列UniqueMoleculeIdentifier:UMIを含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、T構造において第1の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、第2の標的の第2の遺伝子型配列と異なる多重化を可能にする第1の配列を含んでいてもよい。本発明のある態様によれば、T構造において第1の標的表現型に連結された核酸分子遺伝子型は、第2の標的の第2の遺伝子型配列と異なる多重化を可能にする第1の配列を含んでいてもよく、ここで第1及び第2の標的遺伝子型は、異なるPCRプライミング部位を含んでいてもよい。標的標的としては興味のある任意の標的が用いられる。本発明の好ましい態様によれば、所望の特性を有する結合体の同定を促進するための具体的な濃縮方法としては、限定されるものではないが、標的分子に連結された核酸の濃縮が挙げられる。この手法によれば、標的分子は例えばDNA、RNA、タンパク質、炭水化物、有機又は無機分子である。本技術分野では周知のように、適切な標的としては、例えばヒト等の体内の受容体分子が挙げられる。受容体に結合し得る結合体例えば化合物の同定は興味深い。先行技術によれば、好適な例として、標的はDNA、RNA、タンパク質、炭水化物、有機若しくは無機分子、又はその断片である。先行技術によれば、好適な例として、標的は、自己抗原、細菌タンパク質、血液タンパク質、細胞接着タンパク質、サイトカイン、細胞骨格タンパク質、DNA結合性タンパク質、発生関連タンパク質、遺伝子改変タンパク質、酵素、細胞外基質タンパク質、GTP結合タンパク質調節因子、糖タンパク質、発育因子、熱ショックタンパク質、リポタンパク質、膜タンパク質、金属タンパク質、運動タンパク質、リンタンパク質、プリオン、タンパク質複合体、タンパク質ドメイン、RNA結合タンパク質、受容体、組換タンパク質、種子貯蔵タンパク質、構造タンパク質、転写共調節因子タンパク質、輸送タンパク質、ウィルスタンパク質、又はその断片である。要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある標的となり得る膨大な数の物質を挙げることができるであろう。第1の観点の工程iii:図1に示す例において、この工程iiiは、1.結合に相当する。上に議論したように、工程iiiは、工程iのライブラリーのXXは104よりも大きな数である個のB構造を含む溶液を混合しと記載する。B構造の数に関する記号Xは、工程iのライブラリーにおけるB構造の総数を表すと理解するものとする。例えば、ライブラリーが100の異なる結合体を有しBnn=100、これら100の異なるB構造が各々100コピーずつ存在する場合には、Xは100×100=104に等しい数となる。実際には、Xは遥かに大きな数でもよい。例えば、ライブラリーが106の異なる結合体を有しBnn=106、これら106の異なるB構造が各々104コピーずつ存在する場合には、Xは106×104=1010に等しい数となる。上に議論したように、工程iiiは、工程iiのYYは102よりも大きな数である個のT構造を含む溶液と記載する。T構造の数に関する記号Yは、工程iiのライブラリーにおけるT構造の総数を表すと理解するものとする。例えば、工程iiにおいて標的が1つしかなくTnn=1、このT構造が102コピー存在する場合には、Yは1×102=102に等しい数となる。上に議論したように、例えば2の異なる標的例えば2つの異なる受容体分子が存在してもよい。この場合、工程iiにおいて2つの標的[Tnn=2]が存在し、それに対応する2つの異なるT構造が各々102コピーずつ存在する場合には、Yは2×102=200に等しい数となる。実際には、多くの場合、関連するT構造のコピー数は、遥かに大きな数となる。その理由は、構造の標的がB構造の結合体に結合する可能性をできるだけ高くするために、関連するT構造のコピー数をできるだけ多くすることが好ましいからである。従って、好ましい態様によれば、興味あるT構造のコピー数は、少なくとも100、少なくとも101、少なくとも102、少なくとも103、少なくとも104、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010、少なくとも1011、少なくとも1012、少なくとも1013、少なくとも1014、少なくとも1015、又は少なくとも1016である。本明細書に記載のECC法の利点は、重要な結合特性の濃縮を独立に最適化できるという点にある。ECCは均質アッセイであるので、標的を固体支持体に固定化する必要がない。先行技術の方法は不均質系であり、固体支持体例えばビーズ、カラム、細胞、プラスチック、ろ過器などへの標的固定化に依存する。不均質アッセイは、例えばアビディティー作用avidityeffects、被膜の密度、アッセイに対する固体支持体自体の干渉等により、均質アッセイと比べて遥かに制御が困難である。ECCによれば、標的に結合体を結合するための主な結合特性を独立して最適化することが可能となる。例えば、力価親和性、会合率オン比、結合体と標的の解離半減期オフ比等である。工程において、親和性に基づく選択は、例えば、平衡条件を用いることで達成され、また、混合工程の標的濃度によって制御される。即ち、標的濃度の10分の1に等しいKdを有するディスプレイライブラリー結合体分子は、90が標的に結合される。一方、標的濃度と同程度のKdを有する結合体分子は、50が標的に結合し、標的濃度の10倍に等しいKdを有する結合体分子は、10が標的に結合される。従って、親和性の濃縮は、混合工程の標的濃度によって容易に制御することができる。本発明の好ましい態様によれば、混合工程iiiにおけるT構造の濃度は、少なくとも1015M、少なくとも1014M、少なくとも1013M、少なくとも1012M、少なくとも1011M、少なくとも1010M、少なくとも109M、少なくとも108M、少なくとも107M、少なくとも106M、少なくとも105M、少なくとも104M、又は少なくとも103Mである。あるいは、会合比率に基づく選択は、混合工程iiiに割り当てられる時間を制御することでも達成される。即ち、混合工程を、結合平衡条件に達する所要時間より短い時間で行ってもよい。工程iiiは更に、結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも1つが少なくとも1つの標的に結合して、T構造に結合したB構造を含む複合体が生成されこれを以下B結合T構造BBoundToTstructureと呼ぶ。と記載する。より効率的に結合するbindsmoreefficientlyとの記載は、技術常識に従って、例えば、より高い親和性、より速いオン比、又は、より遅い解離速度として理解されるものとする。当業者には周知のように、本発明との関連において、より効率的に結合する条件下で工程iiiを実施することは、当業者であれば定型的な作業で可能である。例えば、このより効率的に結合する作用は、例えば、工程iiiの結合条件下でハイブリダイゼーションによる塩基対形成等により実質的に結合しないB及びT構造遺伝子型を用いることによって、容易に達成することができる。当業者には明らかなように、B及びT構造の遺伝子型として、一本鎖塩基対のオーバーラップが殆ど又は全く存在しない二本鎖DNAを使用することにより、これを達成することができる。工程iiiにおいて所望のより効率的に結合する作用を得る目的で、工程iiiの結合条件を最適化することは、当業者であれば定型的な作業で可能である。当業者には周知のように、本発明に関連する最適化パラメーターとしては、例えばイオン強度、温度等が挙げられる。従って、本発明に関連する現実の環境において、工程iiiの結合条件を例えば結合条件に適宜、定型的な調節を加えることにより達成できることは、当業者であれば些かの合理的な疑いも抱かないであろう。好ましい態様では、工程iiiは、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造よりも、10倍より好ましくは100倍、更に好ましくは1000倍効率的に、対応するT構造に結合するような結合条件の下で行なわれる。工程iii-b~希釈工程~好ましい態様:図1に示す例において、任意の工程iii-bは2.稀釈工程に相当する。本発明では、混合工程iiiに続いて希釈段階を行うことが好ましい。これは工程iii-bと呼ばれ、第1の態様の工程ivの前に行なわれる。即ち、好ましい態様によれば、第1の観点の方法は、第1の観点の工程ivの前に実施される追加の工程iii-b、即ち、iii-b結合条件、即ち、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する結合条件下で、少なくとも2倍に希釈する工程を含む。希釈工程iii-bにおいて採用される希釈溶液や希釈条件温度等は、混合工程iiiでの結合条件等に応じて異なる。しかし、上述の作用は、希釈工程iii-bでも維持されるようにする。工程iii-bでは、工程iiiの溶液を少なくとも102倍に、工程iiiの溶液を少なくとも103倍に、工程iiiの溶液を少なくとも104倍に、工程iiiの溶液を少なくとも105倍に、工程iiiの溶液を少なくとも106倍に、工程iiiの溶液を少なくとも107倍に、工程iiiの溶液を少なくとも108倍、又は工程iiiの溶液を少なくとも109倍に希釈することが好ましい。この希釈工程の利点は、濃縮がBT構造の解離半減期に基づいて行われるため、希釈度及びインキュベーション時間によって、濃縮を容易に制御することができる、という点である。工程iiiの混合溶液を希釈すると、結合体と標的との結合が生じる可能性は低くなるのに対して、非結合事象unbindingeventであるオフ比解離半減期は稀釈に依存せずに生じる。その結果、非常に希薄された溶液T構造濃度<<Kdでは、実質的に解離のみが生じることになる。従って、BT構造の解離半減期の濃縮は、希釈度及びインキュベーション時間によって容易に制御することができる。解離半減期は、親和性と並んで、結合体の有用性にとって最も高い重要性を有する。とりわけ、有効な新医薬品の開発においては、高い親和性及び長い解離半減期を有することが、薬理効果を発揮する上で臨界的なパラメーターとなるNatureReviewsDrugDiscovery5730739。本発明の新たな方法は、先例がない有効且つ制御可能な手法で、これらの2つのパラメーターの濃縮を可能とする。さらに、これら2つのパラメーターは、相互に独立に制御することができる。第1の観点の工程iv:この工程を簡単に言えば、工程iiiの結合体と標的との結合が、B構造とT構造との共コンパートメント化に転換される工程である。この工程ivの条件は、工程iiiの作用に対応する作用を与えるような結合条件とするものとする。上記参照。図1に示す例において、この工程ivは、工程3.エマルジョンw/oに相当する。第1の観点の工程ivは、更に前記コンパートメント化系は工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを含みと記載する。これは、本発明では必須の工程である。即ち、工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを有することは必須である。図1におけるインビトロコンパートメント化系は、例えば油中水滴型エマルション系である。以下に更に議論するように、本発明に適した油中水乳剤系は、本技術分野では周知である。図1に示す理論上の仮想例によれば、工程iiでは標的は1種しか存在せずTnn=1、そのT構造は3コピー存在する。即ち、Yは3となる。従って、この図1の理論上の例では、インビトロコンパートメント化系には少なくとも2×3=6つの個別コンパートメント例えば油滴が存在することになる。なお、図1には30未満の個別コンパートメントが存在することに留意されたい即ち、図1は、本明細書に記載の方法の一部の要素を例示するものに過ぎない。上に議論したように、実際には、例えば少なくとも104コピーのT構造が存在してもよい。この場合、Yは104となり、インビトロのコンパートメント化系には、少なくとも2×104=2×104の個別コンパートメント例えば油滴が存在することになる。Y個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを有することによる利点は、以下のとおりである。即ち、ディスプレイライブラリー中の非結合物質は、コンパートメント数と標的分子数との比率この場合1対10に応じた頻度で、コンパートメントに無作為に分配され、標的と一緒に共コンパートメント化される。一方、結合物質は、その結合活性ゆえに、コンパートメント数と標的分子数との比率理想的には1対1とは無関係に、標的分子と一緒に共コンパートメント化される。従ってこの場合、結合物質は非結合物質に比べて2倍に濃縮されることになる。従って、インビトロコンパートメント化系における個別コンパートメントが多いほど、より濃縮を好適に行うことができる。好ましい態様によれば、工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも10倍の個別コンパートメントが存在し、より好ましくは工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも100倍の個別コンパートメントが存在し、より好ましくは工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも10000倍の個別コンパートメントが存在し、より好ましくは工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも100000倍の個別コンパートメントが存在し、より好ましくは工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも1000000倍の個別コンパートメントが存在する。本発明の好ましい態様によれば、コンパートメントの数は、工程iiiのT構造の数Yの2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、500000倍、1000000倍、5000000倍、又は10000000倍である。第1の観点の工程ivは、更に、B構造、T構造及びBT構造が個別コンパートメント内に無作為に入る条件下と記載する。本文言は、本明細書の文脈において当業者が当然理解するように理解すべきである。この点に関して、本発明において有利な濃縮を行うには、B構造、T構造及びBT構造が個別コンパートメント内に無作為に入る条件を得る必要がある。言い換えれば、B構造、T構造及びBT構造が所与のコンパートメントにコンパートメント化される傾向は、前記コンパートメントの体積及び全体積に依存する。言い換えれば、B構造、T構造及びBT構造が事実上全て、ある特定の単一の個別コンパートメントに入ってしまうと、本明細書で議論するような有利な濃縮が得られないのは明らかである。以下に議論するように、例えば適切な油中水エマルション系をインビトロのコンパートメント化系として用いれば、B構造、T構造及びBT構造が個別コンパートメント例えば個々の油滴内に無作為に入る条件を容易に特定することができるであろう。実際には、B構造、T構造及びBT構造が事実上全て、ある特定の単一の個別コンパートメント例えば個々の油滴に入ってしまうような条件を特定する方が、遥かに困難であろう。工程ivの好ましい態様によれば、工程iiiのB構造の個数Xに対して、少なくとも10の平方根3.16倍の個別コンパートメントが存在する。コンパートメントのB構造の分布がポアソン分布によって記述されると仮定する。これは、すべてのコンパートメントが等容積であることを前提とする。コンパートメントにn=0、1又は2以上のB構造物分子がある可能性は、下記式から計算することができる。ここでλは、B構造の数Xとコンパートメント数との比率である。λが平方根103.16である場合、2以上のB構造を有するコンパートメントの比率は5未満4.1となる。これはすなわち、濃縮されない陽性結合体の比率が5未満であることを意味する。これは多くの場合、問題にならない比率である。上に議論したように当業者であれば理解するように、本発明との関連において、第1の態様の方法は、第1の態様の工程ivの個別の/分離されたコンパートメント内の溶液に、B結合T構造すなわち標的結合体複合体が懸濁された状態で維持されることを含意しているということができる。従って、これを100明確にするには、第1の観点の方法、及び、本発明に関連するこの方法の各種態様は、第1の観点の工程ivの個別コンパートメント内の溶液内に、B結合T構造が懸濁された状態で維持される方法である、と言い換えてもよい。言い換えれば、この方法は、上に議論されるような本発明に関連する先行技術の方法とは異なり、標的の固体支持体への固定化に依存しないのである。インビトロのコンパートメント化系上に議論したように、本発明において適切なインビトロコンパートメント化系として、例えば油中水滴型エマルション系が挙げられる。インビトロのコンパートメント化系が油中水エマルション系である場合、工程ivのインビトロのコンパートメント化系を工程iiiの溶液に適用しは、工程iiiの溶液を油中水エマルション系に加えと言い換えてもよい。本発明における適切な油中水滴型エマルション系は、公知文献に記載されている。例えば、NatMethods2006Jul354550NatMethods2006Jul35519ProcNatlAcadSciUSA2003Jul22100881722JBiotechnol2003Apr2410211724orBiomacromolecules618241828等が挙げられる。当業者には明らかなように、コンパートメント化系としてエマルジョンを使用する場合には、同様のサイズ分布に準えて、コンパートメント体積分布はゴールトンGalton分布と呼ばれる対数正規分布としてモデル化される。対数正規分布を仮定し、実際の液滴サイズの測定を行なうことによって、特定の実験についての期待値平均及び標準偏差を計算することができる。この分布によれば、コンパートメント体積の95が平均ログ体積からL対数単位内の範囲に存在することになる。ここでLは、ログ体積の標準偏差の1.96倍である。本発明の好ましい態様によれば、データを分析する際に、平均コンパートメントサイズ、変動及び標準偏差を考慮する。本発明の好ましい態様によれば、平均コンパートメントサイズの2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍の体積を有するコンパートメントを、実験から除外する。本発明の好ましい態様によれば、平均コンパートメントサイズの1/100、1/90、1/80、1/70、1/60、1/50、1/40、1/30、1/20、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3、又は1/2未満の体積を有するコンパートメントを、実験から除外する。当業者には明らかなように、コンパートメントの体積に基づいて一部のコンパートメントを実験から除外するには、幾つかの技術が使用可能である。例えば、FACS選別、平衡遠心、濾過、微小流体システム等である。あるいは、インビトロコンパートメント化系は、アガロース小滴微小流体技術であってもよいLabChip2010Sep13EpubaheadofprintAgarosedropletmicrofluidicsforhighlyparallelandefficientsinglemoleculeemulsionPCRLengXZhangWWangCCuiLYangCJ。或いは、インビトロのコンパートメント化系は、単純に溶液を工程iiiのマイクロタイタープレート内に分散させ、マイクロタイタープレートの個別のウェル即ち個別コンパートメント内に無作為に入れたものであってもよい。周知のとおり、この作業は現在では、適切なロボット機器やオープンウェル系を用いることにより、迅速且つかつ効率的に実施することが可能である。マイクロタイタープレートと機能的に同等な、ナノリッターPCRの高密度アレイに基づく斯かる系の例であるナノプレート系によれば、標準的なスライドガラス大の装置で、最大3,072のPCR反応を同時に実施することができるMethodsMolBiol200949616174。別の例として、マイクロメートルサイズの穴を有する大型アレイを配置したシリコンデバイスが挙げられる。このデバイスは、フェムトリッターレベルの少量の溶液を多数、長期間に亘って堅牢に保持することが可能である。斯かるマイクロチップによれば、チャンバが均一且つ正確に配置されているNatBiotechnol2005Mar233615。当業者には明らかなように、微小流体装置を、インビトロコンパートメント化系で使用することができる概説については、例えばAngewChemIntEdEngl2010Aug949584668参照。本発明の好ましい態様によれば、適切な平均コンパートメント体積は、106リットル未満、107リットル未満、108リットル未満、109リットル未満、1010リットル未満、1011リットル未満、1012リットル未満、1013リットル未満、1014リットル未満、1015リットル未満、1016リットル未満、1017リットル未満、1018リットル未満、1019リットル未満、1020リットル未満、1021リットル未満、又は1022リットル未満である。当業者には明らかなように、コンパートメント体積は無限小にはなり得ない。コンパートメントは、コンパートメント化される分子よりも大きくなければならないからである。要するに、当業者であれば、本発明との関連において興味ある膨大な数のインビトロコンパートメント化系を挙げることができるであろう。第1の観点の工程v第1の観点の工程vは、同じ個別コンパートメント内に存在するB構造とT構造との核酸分子を融合し、即ち、B構造の核酸分子をT構造の核酸分子に融合しと記載する。この工程を簡単に言えば、工程ivで形成されたB構造とT構造との共コンパートメント化が、同族の遺伝子型の融合へと変形されるtransformedということになる。本発明との関連において、B構造の核酸分子をT構造の核酸分子に融合させるとは、コンパートメント内の2つの遺伝子型が有する遺伝子情報を連結するとの意味に解するものとする。当業者には周知のように、これを達成する方法は、以下のように幾つか挙げられる。aPCRやオーバーラップゲノム伸長外部プライマーを用いないオーバーラップPCR等による情報移送。ある遺伝子型に由来する鎖がプライマーとして機能し、別の遺伝子型に由来する鎖をテンプレートとして使用する。b容易に増幅可能な結合を形成する酵素によって触媒される情報連結。例えば、各ゲノムの少なくとも一方の鎖同士の間に、DNA連結酵素等によってホスホジエステル結合を形成する。c増幅不能な結合を形成する酵素によって触媒される情報連結。例えば、酵素によって連結され得る部位が各ゲノムに存在する場合に、各遺伝子型の少なくとも一方の鎖同士の2部位間を酵素によって連結する。d酵素によって触媒されない情報連結。例えば、各ゲノムに化学反応性基が存在する場合に、各遺伝子型の少なくとも一方の鎖同士の2部位間を化学結合によって連結する。e一時的な情報連結。例えば、各ゲノムにアフィニティータグ同一でも異なっていてもよいが存在する場合に、両タグに親和性を有する剤を導入することにより、両遺伝子型を含む三量体を形成する。図1に示す例において、この工程vは、左から3番目の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の核酸分子を融合させることに相当する。本発明において非常に重要な利点は、この工程の際に、結合体と標的との結合が全く関連しないという点である。即ち、本工程で核酸分子の融合を行なう条件を決定するに際して、標的と結合体との結合や空間的配置をについて配慮する必要はない。この工程を簡単に言えば、工程i由来の結合体と標的との結合が、ここでB構造とT構造との共コンパートメント化に転換されるということである。これは、本明細書に記載の方法の非常に大きな利点であるということができる。例えば、塩基対重複部位のハイブリダイゼーションによって、B構造及びT構造の核酸分子の融合を形成しようとする場合、この工程vでは、結合体と標的との結合が破壊されないように配慮する必要はなく、所望の塩基対ハイブリダイゼーションが達成されるように、十分に温度を変更することができる。従って、工程vを実施する際の条件は、工程iの結合体の何れかと工程iiの標的の何れかとが実質的に結合しない条件であってもよい。既に上で議論したように、B構造及びT構造の核酸分子の融合は、塩基対重複部位のハイブリダイゼーション等とは異なる方法で行ってもよい。例えば、工程vでリガーゼ酵素を用いて融合核酸分子を得る場合には、工程iのB構造の核酸分子遺伝子型と、工程iiのT構造の核酸分子遺伝子型との間に、塩基対重畳領域を配置する必要はない。当業者には明らかなように、リガーゼ又はポリメラーゼ酵素を使用する場合、このリガーゼ酵素は、工程vにおいて関連する個別コンパートメント内に適切に存在するようにするために、工程iiiの溶液に対して、或いは任意の希釈工程iii-bの際に、加えておくことが好ましい。当業者には明らかなように、ゲノムの融合には幾つかの異なる酵素反応が使用できる。多数の酵素反応が文献に記載されている。例えば、KabanovetalBiochimicaetBiophysicaActa996147152SalonetalBiochemistry19923180728079AnarbaevetalBiochimicaetBiophysicaActa13841998315324OngetalJMolBiol36153750GhadessyFJOngJLandHolligerPProcNatlAcadSciUSA9845524557ProteinEngineeringDesignSelectionvol17no3pp2012042004LevyetalRNA1115551562TurneretalNucleicAcidsRes2008August36e82等が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、共コンパートメント化された遺伝子型は、酵素によって融合される。当業者には明らかなように、コンパートメント化前の溶液における遺伝子型の濃度が非常に低い例えばピコモルからマイクロモルの範囲にもかかわらず、他の遺伝子型と共コンパートメント化されたコンパートメント内における遺伝子型の濃度は高くなる。例えば、コンパートメントの体積がフェムトリッター1015リットルの範囲であれば、遺伝子型の濃度はナノモル109Mの範囲になり、コンパートメントの体積がアトリッター1018リットルの範囲であれば、遺伝子型の濃度はマイクロモル106Mの範囲になり、コンパートメントの体積がゼプトリッター1021リットルの範囲であれば、遺伝子型の濃度はミリモル103Mの範囲になる。従って、コンパートメント内における遺伝子型の濃度を調節することによって、酵素反応や、更には旧来の化学反応についても、容易化を図ることが可能となる。当業者には明らかなように、エマルジョン中で誘導可能な化学架橋を使用する場合に、誘導化剤や他の試薬をコンパートメント化前に用いる必要はなく、後で所定のコンパートメントに送達してもよい。例えば、誘導物質として、連続相を介して送達される光、温度又は化学的な活性化因子を用いればよい。斯かる態様は、特に小型のコンパートメントを所望する場合には有利であろう。本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。求核置換反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ZJGartneretalJAmChemSoc20011236961本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。芳香族求核置換反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ClarketalNatureChemicalBiology5647654本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。共役付加は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ZJGartneretalJAmChemSoc20011236961本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。還元的アミノ化は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ZJGartneretalAngewChemIntEd2002411796本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。アミンアシル化は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ZJGartneretalAngewChemIntEd2002411796本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。ホスホロアミド酸形成は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。LutherAetalNature1998396245248本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。アルドール縮合反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。ZhuoTangetalAngewChemIntEd20074672977300本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。シクロ付加反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。BulleretalBioorganicMedicinalChemistryLetters1859265931FujimotoKJAmChemSoc200012256465647GartnerZJetalAngewChemIntEdEngl20024117961800GartnerZJetalAngewChemIntEdEngl20034213701375PoulinKerstienATetalJAmChemSoc20031251581115821本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。ジスルフィド架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。MaysJRetalTetrahedronLett2007484579TheodoropoulosDetalJournalofMedicinalChemistry1985vol2810p15361539LorenzKatrinBetalJournalofOrganicChemistry2004vol6911p39173927本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。カップリング試薬:ビス4-ニトロフェニルカーボネート尿素架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。欧州特許第1809743号Vipergen本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。ウィッティヒWittigオレフィン化反応は、例えば以下に記載の方法で行うことができる。GartnerZJetalAngewChemIntEdEngl20024117961800本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。ウィッティヒWittigオレフィン化反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。GartnerZJetalAngewChemIntEdEngl20024117961800本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。遷移金属触媒反応は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。CzlapinskiJLetalJAmChemSoc200112386188619GartnerZJetalAngewChemIntEdEngl20024117961800CalderoneCTetalAngewChemIntEdEngl20054415KananMWetalNature4315455492004本発明の好ましい態様によれば、化学架橋は例えば以下のように行なわれる。光架橋は、例えば以下に記載の方法で、実質的に行うことができる。QuamrulAetalBioorganicMedicinalChemistryLetters1859235925WeberTetalJournaloftheAmericanChemicalSociety1171130843095CheeGetalBioorganicandMedicinalChemistry182830838NassalMJournaloftheAmericanChemicalSociety10675407545PandurangiRSetalBioorganicChemistry2527787PatentKENTSTATEUNIVERSITYLELANDSTANFORDJUNIORUNIVERSITYUS201029952要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の核酸分子を融合する方法を、多数熟知しているであろう。当業者であれば理解するように、第1の態様の方法の工程iii及びivでは、B構造及びT構造の核酸分子の融合が実質的に形成されないことが好ましい。言いかえれば、工程vの前には、BT融合構造が実質的に形成されないことが好ましい。工程viof第1の観点工程viは工程vの個別コンパートメントの内容物を併合すると記載する。ここで明らかなように、工程vの個別コンパートメントの内容物の併合は、工程ivで使用されるインビトロコンパートメント化系に応じた適切な方法で行われる。例えば、工程ivで使用したインビトロコンパートメント化系が、マイクロタイタープレート型のフォーマット上記参照である場合には、個々のウェルの内容物を単に併合すれば組み合わせればよい。例えば、工程ivで使用したインビトロコンパートメント化系が、適切な油中水エマルションである場合には、遠心分離、昇温、又は適切な有機溶媒の添加等によって、個々の油コンパートメントを単に破壊すればよい。要するに、本発明において、工程vの個別コンパートメントの内容を併合することは、当業者であれば定型的な作業で達成可能である。工程viは更にB構造の核酸分子とT構造の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程vで形成されなかった新たなBT融合構造が形成されない条件下でと記載する。上に議論したように、本発明において所望されるBT融合構造の濃縮は、上述の工程で既に得られたということができる。即ち、当業者には明らかなように、この工程は、新たなBT融合構造自体を形成することを意図するものではない。工程viを斯かる条件下で行なうことは、当業者であれば定型的な作業で実施可能である。例えば、工程vで所望のBT融合構造を得るためにリガーゼを使用した場合には、工程viの前に、このリガーゼを例えば温度を適切に上昇させることにより不活性化すればよい。本明細書での議論を考慮すれば、この工程viの結果として、BT融合構造のライブラリーが得られることは、当業者には明らかであろう。当業者には明らかなように、このBT融合構造のライブラリーは、結合体及び標的の同定を可能にする核酸配列情報を含むBT融合構造種が濃縮されたライブラリーであると記載することができる。即ち、標的と結合実体との結合対に由来する工程i及びiiの配列情報が、標的と結合実体との非結合対に由来するBT融合構造と比べて、濃縮されたライブラリーである。任意工程vii~即ち、第1の観点の工程ivの濃縮ライブラリーのその後の使用上に議論したように、工程viiは任意の工程である。本明細書で記載するように、工程viiの濃縮ライブラリーが得られたら、このライブラリーを本技術分野に従って様々な方法で用いることができる。例えば、濃縮ライブラリーを濃縮されたインビトロディスプレイライブラリーとして、例えば選択/濃縮の第2ラウンドに使用することができる。或いは、工程viの濃縮ライブラリーから、興味ある特定の結合体の構造を直接同定してもよい。従って、本発明のある態様は、本明細書に記載の方法において、更なる工程viiとして、工程viの濃縮ライブラリーを用いて、少なくとも1つの所定の標的に結合する少なくとも1つの個別の結合体を同定することを含む方法に関する。融合された遺伝子型の精製本発明の適切な態様によれば、融合された遺伝子型即ちBT融合構造sを精製してもよい。本技術分野の当業者は、融合した遺伝子型を精製する定型的な手法として、多数の異なる手法を挙げることができる。例としては、限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、スパンカラム、酵素処理、HPLCによる精製、アフィニティーによる精製、又はキャピラリー電気泳動法等が挙げられるMolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPress。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型は、コンパートメント化後に、ゲル精製や不所望の核酸種の酵素分解等によって精製される。本技術分野の当業者であれば、斯かる手順は容易に設計することが可能であろう。例えば、遺伝子型の融合にオーバーラップPCRを使用する場合には、ゲル精製を促進する適切な遺伝子型のサイズを選択することが可能である。例えば、ディスプレイライブラリー遺伝子型の長さが約250bpであり、標的遺伝子型の長さが約100bpであり、重畳領域が約20塩基である場合には、結果として得られる融合された遺伝子型は約330bpとなり、これは標準的なアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、元の融合していない種から、容易に分離精製することができる。更に、未融合の遺伝子型をテンプレートとして用いたプライマー伸長に由来する未使用のプライマー及びssDNAは、ExoSAPITAmershamBiosciences等の酵素によって好適に分解することができる。遺伝子型の融合にリガーゼ又は化学的橋架又は一時的連結を使用する場合の別の例として、ゲル精製を促進するように遺伝子型のサイズを選択してもよい。例えば、例えば、ディスプレイライブラリー遺伝子型の長さが約250bpであり、標的遺伝子型の長さが約100bpである場合には、結果として得られる融合された遺伝子型は約350bpとなり、これは標準的なアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、元の融合していない種から、容易に分離精製することができる。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型はゲル精製される。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子を精製する方法を、多数熟知しているであろう。融合された遺伝子型の洗練polish本発明の好ましい態様によれば、DNA増幅と互換性を有さない手法で融合された遺伝子型を、融合したゲノム内の2つの遺伝子型間に増幅可能な結合を形成するように洗練polishしてもよい。ここで、増幅可能な結合とは、融合された遺伝子型内の1の遺伝子型の3’末端と別の遺伝子型の5’末端とのホスホジエステル結合又は類似の結合である。当業者であれば、融合された遺伝子型を精製する手法として、多数の異なる手法を定型的な作業で実施することが可能であろう。例えば、限定されるものではないが、酵素的な手法例えば大腸菌EcoliDNAリガーゼ、TaqDNAリガーゼ、90NDNAリガーゼ、T4DNAリガーゼ、T4RNAリガーゼ1ssRNAリガーゼ、T4RNAリガーゼ2dsRNAリガーゼ、T4RNAリガーゼ2、切断型等や、化学的な手法が挙げられる。当業者には明らかなように、コンパートメント化後における同族のcognate遺伝子型同一のコンパートメントに由来する遺伝子型間に正しく形成されたホスホジエステル結合又は類似の結合は、偽分子内反応であって、遺伝子型の濃度とは独立であるから、容易に制御することが可能である。これとは逆に、同族ではないnoncognate遺伝子型間に誤って形成されたホスホジエステル結合又は類似の結合は、分子間反応であって、遺伝子型の濃度に依存する。本発明の好ましい態様によれば、洗練にはDNAリガーゼを使用する。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子を洗練polishする方法を、多数熟知しているであろう。核酸に連結された標的の除去又は不活性化本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的を除去又は不活性化してもよい。当業者であれば、融合された遺伝子型に連結された標的を除去又は不活性化する手法として、多数の異なる手法を定型的な作業で実施することが可能であろう。例えば、限定されるものではないが、熱、プロテアーゼ処理、6Mの塩化グアニジン、又は、標的が開裂可能なリンカーによって連結されている場合には、リンカーの開裂等が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、熱、プロテアーゼ処理、又は6Mの塩化グアニジンによって除去又は不活性化される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、プロテアーゼK処理によって除去される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型に連結された標的は、プライマー伸長による置換によって除去される。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子に連結された標的を除去又は破壊する方法を、多数熟知しているであろう。ECCの次ラウンド本発明の好ましい態様において、融合された遺伝子型は、次の一ラウンドのECCに供されてもよい。すなわち、次のラウンドにおいて、融合された遺伝子型は、新たな標的の遺伝子型と融合されるだろう。新たな標的は、以前の標的と同一の種類であってもよく、異なる種類であってもよい。当業者であれば認識するように、ステップの融合された遺伝子型の濃縮ライブラリーは、インビトロディスプレイライブラリーである。本発明の好ましい態様によれば、核酸に連結された以前のラウンドのECC標的は、次回のラウンドのECCの前に除去又は破壊される。本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのECCの標的は、以前のラウンドのECCの標的と同一である。本発明の好ましい態様によれば、次回ラウンドのECCの標的は、以前のラウンドのECCの標的と同一ではない。本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのECCにおける標的の遺伝子型は、結合体の元の遺伝子型の遊離末端に融合される。本発明の好ましい態様によれば、次回のラウンドのECCにおける標的の遺伝子型は、前回のラウンドのECC由来の標的の遺伝子型の遊離末端に融合される。従来の選択濃縮法:本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型は、従先行技術における従来の既知の選択/豊富化法のラウンドに供されてもよい。本発明の好ましい態様によれば、核酸に連結された以前のラウンドのECC標的は、従来の選択/豊富化法のラウンドの前に除去又は破壊される。当業者であれば、従来の選択/豊富化法のラウンドを実施する手法として、多数の異なる手法を挙げることができる。例としては、限定されるものではないが、EP1809743B1EP1402024B1EP1423400B1NatureChemBiol5647654WO0023458NatureMethods35615702006NatBiotechnol200422568574Nature346818822orProcNatlAcadSciUSA9412297302等が挙げられる。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子のライブラリーについて、従来の選択/豊富化法のラウンドを実施する方法を、多数熟知しているであろう。融合された遺伝子型の増幅:本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸を増幅してもよい。即ち、ステップviの濃縮ライブラリーの中にあるBT融合構造を増幅してもよい。当業者であれば、融合された遺伝子型内の核酸を増幅するための手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、PCREmulsionPCR11724DigitalPCRDigitalPCRProcNatlAcadSciUSA96923641NASBA912orRollingCircleAmplification等が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、コンパートメント解消工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、PCRによって行なわれたコンパートメント化工程に続いて増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位がT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の一部が第1のT構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残部が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位が第1のT構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の一部がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残部が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位の一部が第1のT構造遺伝子型内に存在し、順方向PCRのプライミング部位の残部がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の30~70が第1のT構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残る30~70が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位が第1のT構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の30~70がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位の残る30~70が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型内の核酸は、順方向PCRのプライミング部位の30~70が第1のT構造遺伝子型内に存在し、順方向PCRのプライミング部位の残る30~70がB構造遺伝子型内に存在し、逆方向プライミング部位が第2のT構造遺伝子型内に存在するPCRによって行なわれたコンパートメント化工程後に増幅される。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子内の核酸を増幅する方法を、多数熟知しているであろう。翻訳本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を増幅し、翻訳過程に供してもよい。ここで、濃縮された融合遺伝子型のライブラリーは、新たな濃縮インビトロディスプレイライブラリーに翻訳される。当業者であれば、融合された遺伝子型を増幅し、翻訳過程に供する手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、EP1809743B1EP1423400B1WO0023458NatureMethods35615702006Nature346818822orProcNatlAcadSciUSA9412297302等が挙げられる。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された核酸分子を増幅し、翻訳過程を実施するする方法を、多数熟知しているであろう。同定及び組成の分析:本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を同定及び組成決定するために分析してもよい。当業者であれば、融合された遺伝子型の核酸の同定及び組成決定のための分析を行うための手法として、多数の異なる手法を定型的に実施することができる。例としては、限定されるものではないが、塩基配列決定概説として、MetzkerMichaelLSequencingtechnologiesthenextgenerationNatRevGenet113146、DNAハイブリダイゼーション技術Science270467470、制限酵素消化、PCR方法、例えばEP1809743B1EP1402024B1EP1423400B1NatureChemBiol5647654WO0023458NatureMethods35615702006NatBiotechnol200422568574Nature346818822orProcNatlAcadSciUSA9412297302WO06053571A2等の手法が挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸をDNA塩基配列決定によって分析することにより、同定及び組成決定を行ってもよい。本発明の好ましい態様によれば、融合された遺伝子型の核酸を、454technologyMarguliesMEgholmMAltmanWEetalGenomesequencinginmicrofabricatedhighdensitypicolitrereactorsNature43737680を用いたDNA塩基配列決定によって分析することにより、同定及び組成決定を行ってもよい。要するに、当業者であれば、同一の個別コンパートメント内に存在するB構造及びT構造の融合された遺伝子型の核酸分子について、同定及び組成決定を行うための分析法を、多数熟知しているであろう。本発明の異なる独立の側面本発明の異なる独立の側面について以下に説明する。当業者であれば理解するように、本発明のこの異なる独立の側面に係る方法は、本発明及びそれに関連する態様の最初の態様について上述したのと同じ基礎的な技術原理を使用する。従って、当業者であれば理解するように、本発明の最初の側面の特定の好ましい態様例えば、工程ivのインビトロコンパートメント化システムが油中水滴型エマルション系である態様は、本発明のこの異なる独立した側面の好ましい態様とも対応していてもよい。従って、本発明の別の独立の観点は、少なくとも1つの標的に結合する少なくとも1つの結合体bindingentityの同定を可能にする特定の核酸配列情報を含む濃縮ライブラリーを作製する方法であって、前記特定の結合体はインビトロディスプレイライブラリー内に存在し、前記方法は、i少なくとも100の異なる結合体Bnn=100以上のインビトロディスプレイライブラリーを作製し、ここで各結合体は核酸分子に連結され、前記核酸分子は前記結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、これにより前記核酸分子の特定の核酸配列情報から、前記核酸分子に連結された前記特定の結合体の構造が直接同定され前記核酸分子遺伝子型に連結された前記結合体の構造即ち表現型を以下B構造Bstructureと呼ぶ。、ii少なくとも1つの標的Tnn=1以上が連結された核酸分子を作製し、ここで前記核酸分子は特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報を含み、ここで前記標的は工程iのライブラリーに存在する結合体の少なくとも1つに結合する能力を有し前記核酸分子遺伝子型に連結された前記標的の構造即ち表現型を以下T構造Tstructureと呼ぶ。、iiia工程iのライブラリーのXXは104よりも大きな数である個のB構造を含む溶液を、工程iiのYYは102よりも大きな数である個のT構造を含む溶液と、結合条件下で混合し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造により効率的に結合する条件であり、これにより前記結合体の少なくとも1つが少なくとも1つの標的に結合して、T構造に結合したB構造を含む複合体が生成されこれを以下B結合T構造BBoundToTstructureと呼ぶ。、iiib工程iiiaに存在するY個のT構造に対して、少なくとも2倍の核酸分子を含む工程iiiaの溶液を混合し、ここで、当該核酸分子は、特異的標的これを以下標的DNAtargetDNAと呼ぶ。の同定を可能とする特定の核酸配列情報を含有しivインビトロのコンパートメント化系を結合条件下で適用し、ここで結合条件は、標的分子に結合する能力を有する結合体を含むB構造が、同じ標的に結合する能力を有しない結合体を含むB構造と比べて、対応するT構造より効率的に結合する条件であり、ここで前記コンパートメント化系は、B構造、T構造、B結合T構造及び標的DNAが個別コンパートメント内に無作為に入る条件下で、工程iiiで存在するY個のT構造と比べて、少なくとも2倍の個別コンパートメントを含み、v同じ個別コンパートメント内に存在するB構造と標的DNAとの核酸分子を融合しこの構造を以下BT融合構造BTFusedstructureと呼ぶ。、前記BT融合構造は、工程iの結合体の同定を可能にする特定の核酸配列情報と、工程iiの特異的標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報とを含み、viB構造の核酸分子とT構造の核酸分子との融合がない条件、即ち、工程vで形成されなかった新たなBT融合構造が形成されない条件下で、工程vの個別コンパートメントの内容物を併合することにより、BT融合構造のライブラリーを取得し、ここで前記ライブラリーは、標的と結合実体binderentityとの非結合対に由来するBT融合構造に比べて、標的と結合実体との結合対に由来するBT融合構造の種が濃縮されたライブラリーである、方法に関する。当業者には周知のように、2つのDNA分子を融合させることが可能な酵素の適切な例としては、リガーゼ、ポリメラーゼ等が挙げられる。本発明の第1の側面の議論に従えば、本発明において適切な核酸分子は、DNA分子であることが好ましい。また、これに従えば、リガーゼ又はポリメラーゼは、DNAリガーゼ又はDNAポリメラーゼであることが好ましい。本発明の文脈において、当業者であれば理解するように、本発明のこの個別の独立した側面における工程vのB構造及び標的DNAの核酸分子の融合は、本発明のこの個別の独立した側面における工程iiのT構造に存在するように、2つのDNA分子を融合させることができる酵素例えばリガーゼまたはポリメラーゼによって行われる。本明細書で議論した第1の側面の方法2以上の標的Tが存在していてもよいとは異なり、本発明のこの個別の独立した側面では、1つの標的Tのみが存在する。従って、本発明のこの個別の独立した側面の工程iiibにおいて、核酸分子の特定の標的の同定を可能にする特定の核酸配列情報は、単に本発明と関連する特性決定のための単一の配列であってもよい。本発明の第1の側面の議論に従えば、特定の標的の同定を可能にする、この特定の核酸配列情報は、PCR増幅可能な配列であることが好ましい。工程vのBT融合構造をその後にPCRすることができるからである。実施例1:ジーンタイプgenetype-遺伝子型融合-スパイキング実験のためのオーバーラップePCRを用いた共コンパートメント化による濃縮概要については図2を参照。方法使用したDNAオリゴヌクレオチドヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログの連続鎖HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTATvip1461ATACGCCCAAGATCGAACAGvip2501xTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2504CTGTTCGATCTTGGGCGTATGAGAAGAGCCAGAAACGTGGCTTCAGGCACCAAGGAAGACvip2512GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAGvip2502CTGTTCGATCTTGGGCGTATvip2500xGCCTTGCCAGCCCGCTCAGvip157GCCTTGCCAGCCCGCTCAGvip660TGGTCCCTGGCAGTCTvip1481GAACAGGACCGAvip1471CTGTTCGATCTTGGGCGTATヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーの調製ライブラリーの構築は、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327に従い、更に以下の変更を加えて行う。スプリントオリゴヌクレオチドvip1481及びオリゴヌクレオチドvip1471を用いて逆方向プライミング部位を導入する。コード化DNAに連結された既知の標的結合物質ビオチンの調製ヨクトリアクターライブラリー配列に対する連続鎖DNAアナログを、vip1461プライマー及び5’-ビオチンを有するvip2501プライマーを用いたPCRに供する。それにより5’-ビオチンがヨクトリアクターDNAアナログに導入される。プロトコールPCR混合物:50μL2XPCRmastermix40mMTrisHCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、0.2TritonX100、0.2mg/mLBSA、0.4mM各dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP、pH8.825°C10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL50μMvip2501終濃度0.5μM1μL50μMvip1461終濃度0.5μM1μL107分子sのヨクトリアクターyoctoreactorに対する連続鎖DNAアナログ1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ36μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施する。92°Cで2分、25サイクル92°Cで30秒、72°Cで1分、72°Cで2分、72°Cで2分185bpのDNA断片を、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従ってPAGE精製し、エタノール沈殿する。標的DNATDの調製99量体の標的DNAを、単工程オーバーラップPCRプロトコールで調製した後、10TBE-PAGEネーティブゲルで精製する。プロトコールPCR混合物50μL2XPCRmastermix40mMTris-HCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、0.2TritonX100、0.2mg/mLBSA、0.4mM各dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP、pH8.825°C10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL50μMvip2500終濃度0.5μM1μL50μMvip2502終濃度0.5μM1μL20pMvip2504終濃度0.2pM1μL20pMvip2512終濃度0.2pM1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ35μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。92°Cで2分、25サイクル92°Cで30秒、72°Cで1分、72°Cで2分99bpのDNA断片を、標準的な手順3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従ってPAGE精製し、エタノール沈殿した。DNA-標的コンジュゲーション材料塩酸1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドEDC、100mMの新規調製ストック、AldrichE6383N-ヒドロキシスルホスクシンイミドs-NHS、200mMストック、Aldrich56485モルホリノエタンスルホン酸、MES緩衝剤pH6.0、500mMβ-メルカプトエタノール、500mMストック低鎖に5’カルボキシル基を有するPCR産物上述ストレプトアビジンタンパク質AbCam78833標的タンパク質プロトコール末端カルボキシルを有するカルボキシル修飾オリゴヌクレオチド1本鎖DNA又はPCR産物は、標的タンパク質との反応に先立って、EDC/s-NHS系を使用して、予め活性化することができる種々のカルボキシル活性化の例については文献を参照。標的タンパク質をEDCに暴露すると、例えばチロシン又はシステイン残査の化学修飾によって、標的タンパク質が不活性化されてしまう場合がある。従って、DNAカルボキシルと標的タンパク質との混合前に、任意により、例えばβ-メルカプトエタノールを終濃度20mMとなるように加える等の手法で、残留EDCをクエンチしてもよい。例:予活性化混合物終濃度10μLDNAssDNA又はdsDNA10μL500mMMES、pH6100mM2.5μL100mMEDC5mM2.5μL200mMs-NHS10mM25μL水計50μLカルボン酸活性化は、20°Cで15~30分間インキュベートすればよい。任意:残留EDCをクエンチするために、500mMβ-メルカプトエタノール水溶液2μLを加えた終濃度20mM。その後、s-NHS-活性化エステルは直ちに使用する。予活性化試験前活性化混合物25pモルの1本鎖DNAのアリコートを、水と、MeCN活性化エステルをクエンチする第一級アミン中1フェネチルアミンとで希釈する。この混合物を15分間反応させた後、EtOHを用いて沈殿させる。100mM酢酸トリエチルアンモニウムTEAA、pH7に溶解させた後、DNA産物をRP-HPLCにより、100mMTEAA中MeCNの勾配を用いて分析することができる。当初の保持時間からより高い保持時間への変更は、1カルボキシルからNHSエステルへの転換、及び、2その後のアミンとの反応を示している。標的タンパク質との反応酵素製品緩衝組成物に第一級アミンが含まれるか確認すること。このプロトコールでは、タンパク質ストック液中にDTTやEDTA等が存在することは許容されるが、第一級アミンは透析によって除去しなければならない。第一級アミンは、活性化エステルをクエンチし、DNA-タンパク質架橋を阻害してしまう。或いは、予活性化混合物と混合する酵素として、可能な限り濃縮された酵素を用い、化学反応を促進すること。20°Cで1~2h反応が遅い場合はできるだけ一晩インキュベートした後、電気泳動でDNAタンパク質複合体を精製する。連結混合物106の異なる分子及び計109の分子即ち、二本鎖dsDNAに連結される潜在的なリガンドからなる多様なヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーを、106のdsDNAに連結されたビオチン分子既知の標的結合物質でスパイクした。スパイクされたライブラリーを、107分子のdsDNAに連結されたストレプトアビジンDNAに連結された標的と混合する。混合物中の分子を、総体積3μlの結合バッファーPBS、0.05tween20、0.2のBSAと、室温で1時間接触させ、平衡に達するまで放置する。ストレプトアビジン標的の濃度は約6pMであり、ビオチンストレプトアビジン複合体について報告されているKdである10~14mol/Lの100倍以上である。これは、事実上全てのビオチンが平衡状態でストレプトアビジンに結合されることを意味する。PCR混合物67mMTris-HClpH8.8、16.6mMNH4SO4、6.7mMMgCl2、10mM2-メルカプトエタノール、1mMの各dNTP、7.5μMの各プライマーvip157及びvip660、45ユニットのTaqポリメラーゼ、総体積610μL。エマルションPCR1ml当たりの約5×109コンパートメントからなるエマルジョン2mLを、Dressmanetal2003に記載の方法と同様の方法で調製する。標的ストレプトアビジン又はリガンド非結合又は結合に連結されたDNA断片にはそれぞれオーバーラップ領域が存在し、これによって3つの断片が連結されて集合断片を形成し得る。すなわち、アセンブリーPCRによって、一混合物当たり2種類の結合断片が生成され得る。断片Aは、ストレプトアビジンとビオチンとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。断片Bは、ストレプトアビジンと無作為のライブラリー分子結合したビオチンではないとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。これら2種類の断片は、塩基配列決定法、又は、制限部位消化によって区別することができる。1mL及び500μL1.5mLの連続相を、以下の手順で調製する。即ち、5mlの丸底Cryoバイアル内で、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌1,400rpmしながら、鉱油に0.40体積/体積のTween80を溶解させ、次いで0.05体積/体積のトリトンX-100及び4.5体積/体積のSpan80を溶解させる。この連続相を、2つの5mlの丸底Cryoバイアルに600μLずつ分割する。597μlのPCR混合物を3μLの連結混合物に加えて水相を調製する。2つの連続相の各々を、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌1400rpmしながら、300μLの水相を徐々に加える15s当たり10μLずつ。水相添加後、撹拌を30分間継続する。エマルジョンを各々100μLずつ、96ウェルのPCRプレートの約20のウェルへ等分する。増幅プログラムは、次の工程を有する30サイクルから構成する。92°Cで2分間の初期変性;92°Cで30秒のdsDNA変性、72°Cで2分間のプライマーアニーリング、及び72°Cで30秒の伸長からなる20サイクル;並びに72°Cで2分間の最終伸長。エマルションの破壊エマルジョンPCR由来のDNA断片は、エマルジョンをプールし25°Cで5分間、13,000gで遠心分離することにより回収される。油相を廃棄する。以下の抽出を2回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去する。1mlの水飽和ジエチルエーテルを加え、チューブを攪拌し、上部溶剤相を廃棄。予測される結果仮定:等サイズの球状コンパートメント、コンパートメント内の分子及び複合体のランダムな分布、ストレプトアビジンビオチン複合体の100の会合、ストレプトアビジンビオチン複合体の解離なし、yRライブラリーのストレプトアビジンに対して十分な結合親和力を有する結合物質は殆ど、又は全く存在しないと仮定、PCR反応のバイアスなし、並びに、PCRサイクリングにおけるプライマー伸張時の反応効率100単一のプライミング部位が存在、共コンパートメント化なし、両プライミング部位存在時に10000倍増幅共コンパートメント化。エマルションPCR後の異なるDNA種の理論量は以下の通り:ストレプトアビジン断片100bp:107分子ストレプトアビジン断片100nt:20サイクル時間107分子=2×108分子ヨクトリアクターyoctoreactor断片250bp:109分子sヨクトリアクターyoctoreactor断片250nt:20サイクル時間109分子=2×1010分子何れも元のビオチン断片が融合種に転換されると仮定、以下参照融合遺伝子型-既知結合物質:断片Aストレプトアビジン-ビオチンDNA断片330bp:10000×106分子=1010ビオチン断片のPCR増幅回数-上記仮定の下でビオチン断片が標的DNAと共コンパートメント化される可能性は1。融合遺伝子型-非結合物質:断片B無作為共コンパートメント化断片330bp:10000×103×109分子=1010PCR増幅回数掛ける無作為共コンパートメント化確率掛ける当初のyRライブラリー分子数-上記仮定の下で非結合物質が共コンパートメント化される確率は標的分子/コンパートメント=107/1010=103従って、本手順後、330個のbp断片の50が、ビオチン由来のDNAを含む。更に、330bpの断片は約15ナノグラムとなり、総二本鎖DNA量の殆どを占める。一本鎖DNAは、ExoSAPITアマシャムバイオサイエンスを用いて、メーカーの指示に従って好適に除去される。また、330個のbp断片は、標準的な手順に従って、PAGEで好適に精製される。454シークエンシング技術を用いたDNA配列決定による濃縮の分析プライマーを末端A及びB配列と用いたPCRによって、454シークエンシングプライミング部位を導入する。結果として得られる断片をPAGEで精製し、メーカーのプロトコールに従って454DNAシークエンシングに供する。DNA塩基配列を分析し、ビオチン遺伝子型の頻度を計算する。結論s上記から理解されるように、本明細書に記載の方法を用いることで、1000倍の濃縮が達成される。上記の計算によれば、ビオチン遺伝子型は高頻度で、即ち最大2分の1の確率で見出されると予測される。一方、非結合ヨクトリアクターライブラリーの各メンバーは、最大でも平均200万分の1程度であると予測される。従って、非結合物質に対して、結合物質は1000倍に濃縮されたことになる。これは、本発明の実現可能性を実証するだろう。実施例2:遺伝子型-遺伝子型融合にeLigationを用いた共コンパートメント化による濃縮-スパイク化実験。概要については図1参照。方法使用するDNAオリゴヌクレオチドvip1481:GAACAGGACCGAvip1471:CTGTTCGATCTTGGGCGTATvip2513:ACGCCCAAGATCGAACAGヨクトリアクターyoctoreactorに対するビオチン修飾連続一本鎖DNAアナログ:xCGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTATx=5’-ビオチン-TEGヨクトリアクターyoctoreactorに対するビオチン修飾連続一本鎖DNAアナログは、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327に実質的に記載の、5’-ビオチンTEG修飾オリゴヌクレオチドを5’部位に有する小型のオリゴヌクレオチドから調製される。vip2514:xGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGGGAAGGACGTTGGTGTAGAAGCGTTCACTTGGTGGAAGTATx=5’カルボキシルvip2515:ACTTCCACCAAGTGAACGCTvip157:GCCTTGCCAGCCCGCTCAGvip660:TGGTCCCTGGCAGTCTヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーの調製本ライブラリーは、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327の記載に従い、更に以下の変更を加えて構築する。1スプリントオリゴヌクレオチドvip1481及びオリゴヌクレオチドvip1471を用いて逆方向プライミング部位を導入する。2オリゴヌクレオチドvip2513を用いてプライマー伸長によるヨクトリアクターyoctoreactorの破壊を行う。コード化DNAに連結された既知の標的結合物質ビオチンの調製二本鎖コード化DNAに連結された既知の標的結合物質ビオチンは、ヨクトリアクターyoctoreactorによるビオチン修飾連続一本鎖DNAアナログを、vip2513を用いたプライマー伸長で破壊することにより作製するHansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327。2ntの3’-オーバーハングが作製されるようにプライマーを選択する。3’-オーバーハングによって以下の連結反応が促進されるであろう。二本鎖DNA断片を、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従ってPAGE精製し、エタノール沈殿した。標的DNATDの調製プロトコール61量体のターゲットDNAを、プライマー伸張で調製し、続いて10のTBE-PAGEネーティブゲルで精製する。ヨクトリアクター3’-オーバーハングの3’-オーバーハングに相補的な2つのヌクレオチド3’-オーバーハングが作製されるようにプライマーを選択する。更に、プライマーのリン酸化により連結反応が可能になる。実施例プライマーのリン酸化2μL200pmolvip251520μL10×緩衝剤O50mMTris-HClpH7.5、37°C、10mMMgCl2、100mMNaCl、0.1mg/mLBSA2μL100mMATP終濃度2mM10μLT4ポリヌクレオチドキナーゼ100u66μL水、ヌクレアーゼ不含リン酸化反応は37°Cで30分間実施し、キナーゼの不活性化は75°Cで10分間のインキュベーションにより行う。DNAをエタノール沈澱で沈殿させ、70エタノールで洗浄し、10μLTEバッファーに再懸濁させる。プライマー伸長10μLリン酸化vip2515200pモル10μL10×緩衝剤ONewEnglandBiolabs2μL10mMdNTPミックスdATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの終濃度0.2mM77μL水1μL5uKlenowexo、5u/μL反応を15分間進行させ、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従って、15アクリルアミドゲルから抽出することにより、精製された二本鎖DNAを取得し、これをエタノールで沈殿させる。DNA-標的コンジュゲーション材料塩酸1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドEDC、100mM新規調製ストック、AldrichE6383N-ヒドロキシスルホスクシンイミドs-NHS、200mMストック、Aldrich56485モルホリノエタンスルホン酸、MES緩衝剤pH6.0、500mMβ-メルカプトエタノール、500mMストック低鎖に5’カルボキシル基を有するPCR産物上述ストレプトアビジンタンパク質AbCam78833標的タンパク質プロトコール末端カルボキシルを有するカルボキシル修飾オリゴヌクレオチド1本鎖DNA又はPCR産物は、標的タンパク質との反応に先立って、EDC/s-NHS系を使用して、予め活性化することができる種々のカルボキシル活性化の例については文献を参照。標的タンパク質をEDCに暴露すると、例えばチロシン又はシステイン残査の化学修飾によって、標的タンパク質が不活性化されてしまう場合がある。従って、DNAカルボキシルと標的タンパク質との混合前に、任意により、例えばβ-メルカプトエタノールを終濃度20mMとなるように加える等の手法で、残留EDCをクエンチしてもよい。実施例予活性化混合物終濃度10μLDNAssDNA又はdsDNA10μL500mMMES、pH6100mM2.5μL100mMEDC5mM2.5μL200mMs-NHS10mM25μL水計50μLカルボン酸活性化は、20°Cで15~30分間インキュベートすればよい。任意:残留EDCをクエンチするために、500mMβ-メルカプトエタノール水溶液2μLを加えた終濃度20mM。Subsequently、thes-NHSactivatedエステルshouldbeusedimmediatelyその後、s-NHS-活性化エステルは直ちに使用する。予活性化試験前活性化混合物25pモルの1本鎖DNAのアリコートを、水と、MeCN活性化エステルをクエンチする第一級アミン中1フェネチルアミンとで希釈する。この混合物を15分間反応させた後、EtOHを用いて沈殿させる。100mM酢酸トリエチルアンモニウムTEAA、pH7に溶解させた後、DNA産物をRP-HPLCにより、100mMTEAA中MeCNの勾配を用いて分析することができる。当初の保持時間からより高い保持時間への変更は、1カルボキシルからNHSエステルへの転換、及び、2その後のアミンとの反応を示している。標的タンパク質との反応酵素製品緩衝組成物に第一級アミンが含まれるか確認すること。このプロトコールでは、タンパク質ストック液中にDTTやEDTA等が存在することは許容されるが、第一級アミンは透析等によって除去しなければならない。第一級アミンは、活性化エステルをクエンチし、DNA-タンパク質架橋を阻害してしまう。或いは、予活性化混合物と混合する酵素として、可能な限り濃縮された酵素を用い、化学反応を促進すること。20°Cで1~2h反応が遅い場合はできるだけ一晩インキュベートした後、電気泳動等でDNA-タンパク質複合体を精製する。連結混合物106の異なる分子及び計109の分子即ち、二本鎖dsDNAに連結される潜在的なリガンドからなる多様なヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーを、106のdsDNAに連結されたビオチン分子既知の標的結合物質でスパイクした。スパイクされたライブラリーを、107分子のdsDNAに連結されたストレプトアビジンDNAに連結された標的と混合する。混合物中の分子を、総体積3μlの結合バッファーPBS、0.05tween20、0.2のBSAと、室温で1時間接触させ、平衡に達するまで放置する。ストレプトアビジン標的の濃度は約6pMであり、ビオチンストレプトアビジン複合体について報告されているKdである~10~14mol/Lの100倍以上である。これは、事実上全てのビオチンが平衡状態でストレプトアビジンに結合されることを意味する。ライゲーション混合物1×Tagライゲーションバッファー20mMTris-HCl、25mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、1mMNAD、10mMジチオスレイトール0.1TritonX100pH7.625°Cを、2μL40u/μLTaqDNAリガーゼに加え、総体積を610μLとする。67mMTris-HClpH8.8、16.6mMNH4SO4、6.7mMMgCl2、10mM2-メルカプトエタノール、各dNTP1mM、7.5μMの各プライマーvip157及びvip660、45ユニットのTaqポリメラーゼを、総体積610μLに含む。エマルション内でのライゲーション1ml当たりの約5×109コンパートメントからなるエマルジョン2mLを、Dressmanetal2003に記載の方法と同様の方法で調製する。標的ストレプトアビジン又はリガンド非結合又は結合にそれぞれ連結されたDNA断片は、一方の鎖においてライゲートすることができる。すなわち、ライゲーションによって、一混合物当たり2種類の結合断片が生成され得る。断片Aは、ストレプトアビジンとビオチンとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。断片Bは、ストレプトアビジンと無作為のライブラリー分子結合したビオチンではないとが同一のコンパートメント内に存在していたことを示す。これら2種類の断片は、塩基配列決定法又は制限部位消化によって区別することができる。1mL及び500μL1.5mLの連続相を、以下の手順で調製する。即ち、5mlの丸底Cryoバイアル内で、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌1,400rpmしながら、鉱油に0.40体積/体積のTween80を溶解させ、次いで0.05体積/体積のトリトンX-100及び4.5体積/体積のSpan80を溶解させる。この連続相を、2つの5mlの丸底Cryoバイアルに600μLずつ分割し、氷冷して維持する。597μlのPCR混合物を3μLの氷冷ライゲーション混合物に加えて水相を調製する。2つの連続相の各々を、ピボット輪を有する磁気撹拌子を用いて一定速度で撹拌1400rpmしながら、300μLの水相を徐々に加える15s当たり10μLずつ。水相添加後、撹拌を30分間継続する。エマルションを45°Cに加熱し、1時間ライゲートさせる。エマルションの破壊ライゲーション混合物に各々30μLの500mMEDTAを加え、軽く攪拌する。DNA断片は、エマルジョンをプールし25°Cで5分間、13,000gで遠心分離することにより回収される。油相を廃棄する。以下の抽出を2回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去する。1mlの水飽和ジエチルエーテルを加え、チューブを攪拌し、上部溶剤相を廃棄。DNAを沈殿によって濃縮し、変性10ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、ライゲートされた断片を、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従って、PAGEで単離精製し、エタノール沈殿し、10μLTE緩衝剤に再溶解させる。ライゲートされたDNAの増幅最後に、ライゲートされた断片をPCRで増幅する。例:PCR混合物:10μL精製ライゲートDNA50μL2×PCRmastermix40mMTris-HCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、0.2TritonX100、0.2mg/mLBSA、dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mM、pH8.825°C10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL50μMvip167終濃度0.5μM1μL50μMvip660終濃度0.5μM1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ27μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。92°Cで2分、25サイクル92°Cで30秒、72°Cで1分、72°Cで2分結果として得られたDNA断片のライブラリーを配列決定し、結合断片の濃縮率を計算する。予測される結果仮定:等サイズの球状コンパートメント、コンパートメント内の分子及び複合体のランダムな分布、ストレプトアビジンビオチン複合体の100の会合、ストレプトアビジンビオチン複合体の解離なし、yRライブラリーのストレプトアビジンに対して十分な結合親和力を有する結合物質は殆ど、又は全く存在しないと仮定、ライゲーション反応又はその後のPCR反応のバイアスなし、ライゲーション時に共コンパートメント化なし、ライブラリー及び標的DNA断片が共コンパートメント化される場合に100の反応効率。エマルションのライゲーション後、ライゲートされたDNA種の理論量は以下の通り。何れも元のビオチン断片が融合種に転換されると仮定、以下参照ライゲート遺伝子型-既知結合物質:断片Aストレプトアビジン-ビオチンDNA断片250bp:106分子-上記仮定の下でビオチン断片が標的DNAと共コンパートメント化される可能性は1。融合遺伝子型-非結合物質:断片B無作為共コンパートメント化断片250bp:103×109分子=106無作為共コンパートメント化の確率掛ける当初のyRライブラリー分子数-上記仮定の下で非結合物質が共コンパートメント化される確率は、標的分子/コンパートメント=107/1010=103最後のPCR増幅は、2種の分子の何れについても、同じ効率となると予測される。従って、この過程の後、330bpの断片の50が、ビオチン-ストレプトアビジン結合に由来するDNAを含むと予測される。454シークエンシング技術を用いたDNA配列決定による濃縮の分析プライマーを末端A及びB配列と用いたPCRによって、454シークエンシングプライミング部位を導入する。結果として得られる断片をPAGEで精製し、メーカーのプロトコールに従って454DNAシークエンシングに供する。DNA塩基配列を分析し、ビオチン遺伝子型の頻度を計算する。結論上記から理解されるように、本明細書に記載の方法を用いることで、1000倍の濃縮が達成される。上記の計算からは、ビオチン遺伝子型は高頻度で、即ち最大2分の1の確率で見出されると予測される。一方、非結合ヨクトリアクターライブラリーの各メンバーは、最大でも平均200万分の1程度であると予測される。従って、非結合物質に対して、結合物質は1000倍に濃縮されたことになる。これは、本発明の実現可能性を実証するだろう。下記の実施例は全て、開示した技術情報例えば上記の実施例に開示の情報に基づき、更に当業者の技術常識に基づいて作製された。実施例3:オーバーラップePCRを遺伝子-型遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による濃縮ECCの原理、結合パートナーの共コンパートメント化、及び、その結果として連結されたDNAの融合は、結合パートナーとしてビオチン及びストレプトアビジンSAを用いて実証された。ビオチンDNAコンジュゲートyRbiotinを、標的としてDNASATD001に連結されたSAを用いたECCに供した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたSA_TD001を標的として用いて、ECCを並行に実施した。概観については図2参照。方法s適用したDNAオリゴヌクレオチド:ヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログの連続鎖に適用HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327:CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTATvip1481:GAACAGGACCGAvip1471:CTGTTCGATCTTGGGCGTATYRビオチンに適用vip1461:ATACGCCCAAGATCGAACAGvip2501:xTGGTCCCTGGCAGTCTCCx=ビオチン-TEGEPCRに適用vip157:GCCTTGCCAGCCCGCTCAGvip660:TGGTCCCTGGCAGTCTTD001に適用vip2500:xGCCTTGCCAGCCCGCTCAGx=カルボキシル修飾vip2502:CTGTTCGATCTTGGGCGTATvip2512:GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAGvip2507:CTGTTCGATCTTGGGCGTATTGTTTTAGCTGCCCCAACTCCTTCAGGCACCAAGGAAGACレスキューPCRに適用vip2549:GCAAGTCTTACAGCCGATCAvip660:TGGTCCCTGGCAGTCTyRの調製ヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログの連続鎖は、実施例1の記載に従って調製した。yRビオチンの調製yRに結合された既知の標的結合物質ビオチンは、実施例1の記載に従って調製した。標的DNATD001の調製TD001の調製は、Vip2504の代わりにオリゴvip2507を適用した他は、実施例1の記載に従って調製した。材料MOPS3-N-モルホリノプロパンスルホン酸SigmaAldrichシリコーンポリエーテル/シクロペンタシロキサンDowCorningDC5225Cシクロペンタシロキサン/トリメチルシロキシシリケートDowCorningDC749AR20シリコンオイルSigmaAldrich塩酸1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドEDC、100mM新規調製ストック、AldrichE6383N-ヒドロキシスルホスクシンイミドs-NHS、200mMストック、Aldrich56485モルホリノエタンスルホン酸、MES緩衝剤pH6.0、500mMβ-メルカプトエタノール、500mMストック低鎖に5’カルボキシル基を有するPCR産物上述ストレプトアビジンタンパク質AbCam78833標的タンパク質SlideAlyzerminiPierce組織LyzerIIQiagenDNA-標的コンジュゲーション予活性化予活性化は、5.4μLのTD001[9.3μM]を、1μLMOPSpH6[1M]、1μLEDC[50mM]、1μLs-NHS[100mM]、及び1.6μLの水と混合して行った。20°Cで30分間インキュベートすることにより、カルボン酸を活性化させた。残留EDCをクエンチするために、250mMβ-メルカプトエタノール水溶液1μlを加えた。標的タンパク質との反応コンジュゲーションに先立って、SlideALyzermini透析装置を用いて、メーカーPierceの指示に従い、SAを透析バッファー10mMMOPSpH8、50mMNaClに対して2回、30分間透析した。透析されたSA5μL[58μM]を、1.6μlMOPSpH6[1M]、1.6μlNaCl水溶液[1M]、及び11μlTD001[4.6μM]に加えた。20°Cで2時間反応させた。反応をクエンチするために、2μlトリスpH8[1M]を加えた。SATD001コンジュゲートを、6TBEゲルを用い、200Vで40分間PAGEし、反応物から分離した。バンドを500μl抽出バッファー50mMトリスpH8、150mMNaCl、0.1Tween20中、4°C30分/on/30分で3回抽出する。残留ゲルを濾過によって除去し、得られたサンプルを、MicroconYM30装置を用い、メーカーミリポアの指示に従い濃縮した。コンジュゲートの濃度は、Picogreenを用い、メーカーMolecularProbesの指示に従ってDNA濃度を測定したところ、0.38μMと推定された。連結反応結合反応yRビオチンとSATD001との結合に先立って、総体積50μLの連結用バッファーassociationbuffer10mMTris-HClpH7.8、0.05TritonX100中6e8分子のSATD001分子/μLを、1μMビオチン6e11分子ビオチン/μLの共存又は不在下で30分間20°Cでインキュベートした。連結用バッファー中で以下の結合反応を実施した。13e8のyRビオチン分子μL及び3e8のSATD001分子μLを総体積50μL中、ビオチンとプレインキュベートさせていないSATD001と反応させた。23e8のyRビオチン分子μL及び3e8のSATD001分子μLを総体積50μL中、ビオチンとプレインキュベートさせたSATD001と反応させた。結合反応物を20°Cで1時間インキュベートした後、連結用バッファー中、yRビオチンが3e6分子/μL、SATD001が3e6分子/μLの濃度となるように希釈した。エマルションPCRePCRyRとTD001との融合、及び、エマルション中での融合分子yRTD001のPCRによる増幅。連続相連続相はTurnerandHurlesNatProtoc2009417711783の記載に従って調製した。1200μLの連続相は、1反応当たり以下からなる。480μLシリコンポリエーテル/シクロペンタシロキサンDC5225C360μLシクロペンタシロキサン/トリメチルシロキシシリケートDC749360μLAR20シリコンオイルPCR水相600μLのPCR水相は、1反応当たり以下からなる。60μLPfu緩衝剤10×12μLBSA50mg/mL12μLdNTP10mM3μLVip157100μM3μLVip660100μM4μLPfuturbo2.5u/μL446μL水60μLテンプレート結果として、yRビオチン及びSATD001の濃度は各々3e5分子/μLとなる。エマルション化一反応当たり、2mlのエッペンドルフチューブ中、1000μLの連続相及び500μLのPCR相、並びに5mmのスチールビーズを加えた。反応物をTissuelyserIIにより、30Hz、20°Cで8分間混合することにより、エマルション化させた。各PCRチューブに100μlのエマルジョンを加え、混合物をPCR機器により、以下のプログラムを適用した熱サイクリングに供した。92°Cで2分、30サイクル92°Cで30秒、55°Cで1分、及び72°Cで1.5分、並びに72°Cで5分。DNAの回収各PCRチューブに100μlの1-ブタノールを加えることによりエマルジョンを破壊した。一条件当たり8本のPCRチューブの内容物をプールし、600μlNaCl水溶液[4M]を加えた。内容物を最高速度で10秒攪拌して混合し、14000gで1分間の遠心分離後に有機相を除去した。プールされたPCR産物に、更に800μlの1-ブタノールを加えて、攪拌及び遠心分離工程を繰り返した。1-ブタノールによる抽出をもう一度繰り返した。PCR精製カラムを用い、メーカーMachereyNagelの指示に従って、DNAを更に精製した。一条件当たり50μlの溶出バッファーで溶出。溶出されたDNAを、レスキューPCRに先立ち、稀釈バッファー10mMトリスpH7.8、20mMNaCl、0.1TritonX100で20倍に希釈した。レスキューPCR融合分子yRTD001の増幅PCR混合物は一反応当たり以下を含む。50μL2×PCRmastermix40mMTris-HCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、0.2TritonX100、0.2mg/mLBSA、dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mM、pH8.8、25°C1μL50μMvip2549終濃度0.5μM1μL50μMvip660終濃度0.5μM1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ10μLテンプレート37μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。92°Cで2分、20サイクル92°Cで30秒、55°Cで1分、及び72°Cで1.5分、72°Cで5分。結果融合産物yRTD001は、245bpの長さを有すると予測される。10TBEPAGEを用い、200Vで40分間分離することにより、DNA産物を視覚化した。結果によれば、ビオチンとのプレインキュベーションなしで連結反応を行った場合、予測通りのバンドが存在していたレーン1のに対して、ビオチンとプレインキュベーション後に連結反応を行った場合、予測されたバンドは不在であったレーン2。図4参照。結論この結果は、結合パートナーが共コンパートメント化され、その結果として、それらに連結されたDNAが融合されたことを実証するものであった。実施例4:オーバーラップePCRを遺伝子型-遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による濃縮標的としてSATD001を用い、多様化diverseyRライブラリーへとスパイクされたyR_ビオチンを濃縮することにより、ECCを実証した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたSATD001を標的として用いて、ECCを並行に実施した。方法DNAオリゴヌクレオチドsappliedヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログの連続鎖に適用HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327:CGCTAAtggtccctggcagtctccTTAGCGgaccGACTCcTgctcGAAGACAACGGTgttttacACCGTTGTCTTCgagcTgtACCTGCgcAAGTGCgttttacGCACTTgcGCAGGTacTgtGCATCgacAAGACCgttttacGGTCTTgtcGATGCacTgGAGTCggtcCTGTTCGATCTTGGGCGTATvip1481:GAACAGGACCGAvip1471:CTGTTCGATCTTGGGCGTATYRビオチンに適用vip1461:ATACGCCCAAGATCGAACAGvip2501:xTGGTCCCTGGCAGTCTCCx=ビオチン-TEGEPCRに適用vip157:GCCTTGCCAGCCCGCTCAGvip660:TGGTCCCTGGCAGTCTTD001に適用vip2500:xGCCTTGCCAGCCCGCTCAGx=カルボキシル修飾vip2502:CTGTTCGATCTTGGGCGTATvip2512:GCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCAAGTCTTACAGCCGATCAGTCTTCCTTGGTGCCTGAAGvip2507:CTGTTCGATCTTGGGCGTATTGTTTTAGCTGCCCCAACTCCTTCAGGCACCAAGGAAGACレスキューPCRに適用vip2549:GCAAGTCTTACAGCCGATCAvip660:TGGTCCCTGGCAGTCTYR多様化diverseライブラリーのPCRに適用vip341:TGGTCCCTGGCAGTCTCCvip1461:ATACGCCCAAGATCGAACAG454PCRに適用vip2593:CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGTCTTCCTTGGTGCCTGAAGvip2465:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2467:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2468:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2469:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCACTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2470:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2471:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCATTGGTCCCTGGCAGTCTCCyRビオチンの調製yRビオチンは実施例1の記載に従って調製した。多様化diverseヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーの調製yRライブラリーは、実質的にHansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327の記載に従って調製した。多様化yRライブラリーを以下の方法でPCR増幅した。PCR混合物は、1反応当たり以下からなる。50μL2×PCRmastermix40mMTris-HCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、02TritonX100、0.2mg/mLBSA、dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mM、pH8.8、25°C10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL50μMvip341終濃度0.5μM1μL50μMvip1461終濃度0.5μM1μL108分子の連続鎖ヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログ1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ36μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。92°Cで2分、15サイクル92°Cで30秒、72°Cで1分、72°Cで2分185bpのDNA断片を、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従ってPAGE精製し、エタノール沈殿した。連結反応結合反応結合反応は、実施例3に記載の手順に、以下の変更を加えて実施した。yRbiotin及びSATD001の結合に先立って、総体積50μlの連結用バッファー中、6e8分子/μlのSATD001を、1μMビオチン6e11分子ビオチン/μlの共存又は不在下で、20°Cで30分間インキュベートした。連結用バッファー中で以下の結合反応を実施した。13e8のyR_ビオチン分子/μL及び3e8のSATD001分子/μLを総体積50μL中、ビオチンとプレインキュベートさせていないSATD001と反応させた。23e8のyR_ビオチン分子/μL及び3e8のSATD001分子/μLを総体積50μL中、ビオチンとプレインキュベートさせたSATD001と反応させた。20°Cで1時間インキュベートして結合反応を行った。以下の条件を設定した。Aビオチンとのプレインキュベーションなし:結合反応物1の1000倍希釈、3e7分子yRライブラリー/μL終濃度を含む連結用バッファー中、yRビオチン濃度3e4分子/μL、SATD001濃度3e5分子/μL。Bビオチンとのプレインキュベーションあり:結合反応物2の1000倍希釈、3e7分子yRライブラリー/μL終濃度を含む連結用バッファー中、yRビオチン濃度3e4分子/μL、SATD001濃度3e5分子/μL。CyRビオチンなし:連結用バッファー中、3e7分子/μLのyRライブラリー及び3e5分子/μLのSATD001を含む。エマルションPCRePCRは、実施例3の記載に従って実施したが、同一条件を2連で、40PCRサイクルに亘って実施した。DNAの回収エマルションの破壊は、実施例3の記載に従って実施したが、16のPCRチューブからエマルションをプールし、一条件当たり100μLの溶出バッファーで溶出することにより行った。レスキューPCRレスキューPCRは、実施例3の記載に従って実施したが、PCR増幅時には以下の熱プロファイルを用いた。92°Cで2分、20サイクル92°Cで30秒、72°Cで1.5分、72°Cで5分。454シークエンシングの調製454配列タグを含む予測サイズ309bpのyR_TD001融合分子を増幅するためのPCRプロトコール。各条件を二連で実施し、独自の正方向プライマーを適用した。PCR混合物は、1反応当たり以下からなる。50μL2×PCRmastermix40mMTris-HCl、20mMNH42SO4、20mMKCl、16mMMgSO4、0.2TritonX100、0.2mg/mLBSA、dATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mM、pH8.8、25°C10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL50μMvip2593終濃度0.5μM2μL25μMvip2465、vip2467、vip2468、vip2469、vip2470又はvip2471終濃度0.5μM各条件のテンプレート5μL、二連duplicate1μL2u/μLVentexoポリメラーゼ31μL水PCR精製カラムを用い、メーカーMachereyNagelの指示に従って、DNAを精製し、分光測光器Eppendorfを用いてDNA濃度を決定した。10TBEゲルで200V、40分間分離し、産物の相対的な目視確認により濃度を調節した。何れのDNA産物も同程度の量のDNAを含むように、DNA産物をプールした。プールされたDNAを、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従って、10TBEPAGEゲルで分離し、約309bpのDNA断片をPAGE精製し、エタノール沈殿した。454シークエンシング454シークエンシングは、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327の記載に従って実施した。結果配列決定の結果によれば図5参照、yRビオチンをスパイクして、yRライブラリーの1000分の1の濃度としたが、yRビオチンカウントのパーセンテージは、条件aの二連実験、即ち、SATD001をビオチンとプレインキュベートせずに濃縮した場合には、37.6及び32、条件bの二連実験、即ち、SATD001をビオチンとプレインキュベートした後で濃縮した場合には、0.30及び0.72、条件bの二連実験、即ち、yRビオチンをサンプルに含まない状態で濃縮した場合には、0.02及び0.05となった。従って、標的としてSATD001を用いることにより、yR_ビオチンの300倍を超える濃縮が観察された。対照的に、負の対照標的である、ビオチンと共にプレインキュベートされたSATD001によれば、得られた濃縮は3~7倍であった。結論標的としてSATD001を用い、多様化yRライブラリーへとスパイクされたyR_ビオチンを濃縮することにより、ECCが実証された。実施例5eLigationを遺伝子型遺伝子型融合のために用いた共コンパートメント化による濃縮ECCの原理、結合パートナーの共コンパートメント化、及び、その結果として連結されたDNAの融合は、結合パートナーとしてデスチオビオチンdesBio及びストレプトアビジンSAを用いて実証された。デスチオビオチンDNAコンジュゲートyRdesBioを、標的としてDNASATD002に連結されたSAを用いたECCに供した。負の対照として、ビオチンと共にプレインキュベートしたSATD002を標的として用いて、ECCを並行に実施した。概観については図1参照。方法実施例2に記載のDNAオリゴヌクレオチドを使用した。加えて、以下を適用した。デスチオビオチン標識yRに適用desBioyRvip2815:xTGGTCCCTGGCAGTCTCCxデスチオビオチンvip2535:CACCACGATGGCAATGCATTCTTCGCTGCCATTCTGレスキューPCRに適用:vip660:TGGTCCCTGGCAGTCTvip2824:CGATGTCCTGAGGTGGAAGTスカベンジャーScavengerDNAに適用:vip2554:GGCAAGTGATTGTCCATGTGCATGAGAAGAGGCCCACATTvip2555:CACATGGACAATCACTTGCCvip2556:AATGTGGGCCTCTTCTCATGTD002に適用:vip2528:TCCACATCCTCCAGTTCAvip2529:ACTTCCACCTCAGGACATCGAGCTGGAGCTTGCTGTTAGCvip2530:AGGTTCGCTCCCTCCTTAAGTCAGGAGGATGTGACACCAAvip2531:CGATGTCCTGAGGTGGAAGTTGAACTGGAGGATGTGGACAvip2532:CTTAAGGAGGGAGCGAACCTGCTAACAGCAAGCTCCAGCTvip2558:xTTGGTGTCACATCCTCCTGAx=C6-アミノ修飾デスチオビオチン標識yRdesBioyRの調製プライマーvip2815及びvip2535を用いたPCRにより、連続鎖ヨクトリアクターyoctoreactorに対するDNAアナログライブラリー配列をテンプレートDNAとして、5’-デスチオビオチンをyRアナログ内に導入したHansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327。ストレプトアビジンにコンジュゲートされた標的DNAへのライゲーションに適した2bpのオーバーハングを形成するために、PCR産物をBseMIで消化した。標的DNATD002の調製プロトコールTD002GAヌクレオチドオーバーハング及び5’カルボキシル基を低鎖に有する98bp二本鎖DNAを、リン酸化オリゴヌクレオチドvip2528、vip2529、vip2530、vip2531及びvip2532及び非リン酸化オリゴヌクレオチドvip2558のライゲーションによって構築した。T4ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化及びT4DNAリガーゼによるライゲーションは、メーカーの指示Fermentasに従って実施した。二本鎖DNA断片を、標準的な手順MolecularCloningALaboratoryManual3rdEdition200101byJosephSambrookDavidWRussellPublisherColdSpringHarborLaboratoryPressに従ってPAGE精製し、エタノール沈殿した。ライゲーション先立って、vip2559を修飾し、5’カルボキシル基を付与した。即ち、単純なC6アミノ修飾を、ジスクシンイミジルスベラートDSS、C8ジ-NHSエステル、ピアス21580番処理によって、カルボン酸に転換した。オリゴヌクレオチドを、水-NMPの1:1混合液中のHEPBS緩衝剤pH9中で、40mMDSSで処理した後、更にLiOHで一晩処理し、NHSエステルを加水分解した。中和及び沈殿の後、粗製のカルボキシ修飾オリゴヌクレオチドを、更に修飾することなく用いた。ストレプトアビジンとコンジュゲートされた標的DNASATD002の調製SATD002は実施例3の記載に従って調製された。連結反応結合反応材料1MTris-HCl、pH7.54MNaCl10TritonX10010μMビオチンSATD002desBioyRプロトコール総体積0.5μlの結合緩衝剤10mMトリス-HClpH7.5、50mMNaCl、0.1Triton中、3E8desBioyR分子を、1μMビオチン阻害剤の共存又は不在下で、1.4E9分子SATD002と混合した。分子の連結は、氷上で結合混合物を1時間インキュベートすることにより行った。解離反応希釈材料標準ライゲーションバッファー50mMTris-HCl、pH7.550mMNaCl0.1TritonX1000.75μMBSA9mMKCl4.5グリセロール0.2mMEDTA1mMDTT2mMATP1μMT4DNAリガーゼFermentas0.01μMスカベンジャーDNA40量体ニック化dsDNA断片:単一のニックを含む40量体のdsDNA断片は、オリゴヌクレオチドvip2554、リン酸化vip2555及びvip2556を組み合わせることにより調製した。連続相は実施例3の記載に従って調製された。スクリューキャップを有する2mLのマイクロチューブプロトコール結合混合物0.12μLを、1μMT4DNAリガーゼ標準ライゲーション緩衝剤を含む600μLの水相を入れた2mLのエッペンドルフチューブの蓋まで転送した。チューブを2度反転し、更に10秒間チューブを攪拌して、結合混合物と水相とを混合することにより、解離反応を開始した。マイクロ遠心分離で軽く撹拌した後、500μLの混合物を、1mLの連続相を含む2mLの氷冷マイクロチューブに移送し、氷上で更に放置して、最終的に2分間の解離時間を得た。エマルション化材料誘導緩衝剤:50mMTris-HCl、pH7.550mMNaCl0.1TritonX1001.5μMBSA10mMKCl5グリセロール0.2mMEDTA1mMDTT2mMATP135mMMgCl2プロトコールPrecellys24ベルタンテクノロジーズを用い、5500rpmで3×20秒間20秒間の撹拌の間に10秒間の休止を挟んだエマルション化し、連続相1mLと水相0.5mLとを混合することによって、解離反応を開始からちょうど2分後に終了させた。並行して、135mMMgCl2を含む1mLの連続相及び0.5mLの水相誘導緩衝剤を5500rpmで3×20秒間エマルション化することにより、マグネシウムを含むがT4DNAリガーゼ活性化用リガーゼを含まない誘導エマルションを調製した。エマルション内でのライゲーションプロトコール1エマルション当たり150μLのMgCl2含有誘導エマルションを加え、RTで1時間撹拌混合することにより、T4DNAリガーゼを活性化させた。エマルション内のdesBioyR及びSATD002のライゲーションは、エマルション1650μLを熱ブロック内で16時間、16°C及び300rpmでインキュベートすることにより行った。エマルションの破壊及びDNAの回収材料1-ブタノールイソプロパノール100エタノール100bp無制限DNAPCRクリーンアップキットNucleoSpinExtractIIMachereyNagel10TritonX100プロトコールチューブを65°Cで30分間インキュベートし、更にマイクロ遠心分離で軽く撹拌することにより、ライゲーション反応を停止させた。エマルションを破壊するために、各エマルションの容量の半分を、清潔な2mLのエッペンドルフチューブに転送した。各チューブに、850μLの1-ブタノールと、15ngの100bp無制限DNA[10ナノグラム/μL]とを加え、10秒間よく攪拌して混合した。チューブを14,000×gで1分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。1容量の1-ブタノールを加え、1-ブタノール抽出をもう一度繰り返すことにより、余剰のシリコーン油及び界面活性剤をエマルションから除去した。先に分離したエマルションの回収された水相を1本のチューブにプールし、サプライヤーの推奨に従って、PCRクリーンアップキットNucleoSpinExtractIIMachereyNagelを使用し、DNA断片desBioyRTD002SA融合分子を、精製によって回収した。0.1のTritonX100を含むEB緩衝剤5mMトリス/HCl、pH8.5でDNAを溶出した。qPCR分析に先立って、溶出されたDNAを、稀釈緩衝剤10mMトリス-HClpH7.5、10mMNaCl、0.05TritonX100で10倍に希釈した。ライゲートされたDNAの増幅及び分析レスキューPCR材料2×PCRMastermixpH8.8、25°C40mMTris-HCl20mMNH42SO420mMKCl16mMMgSO4,0.2TritonX100、0.2mg/mLBSAホットスタートhotstartPCRに適したヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mMCleanAmpTriLinkプロトコール異なるエマルションに存在するdesBioyRTD002SA融合分子の数を分析するために、プライマーvip660及びvip2824を用い、10倍希釈精製回収DNAサンプル5μLをテンプレートとして、qPCRを実施した。標準曲線3E8、3E7、3E6、3E5又は3E4については、予めライゲートされたyRTD002対照テンプレートのコピーを、各qPCR反応に加えた。qPCR混合物は、1反応当たり以下からなる。5μLテンプレート10μL2×PCRmastermix2μL5Mベタイン終濃度0.5M0.4μLSyBRGreen終濃度2.5E-50.2μL100μMvip660終濃度1μM0.2μL100μMvip2824終濃度1μM0.2μL2u/μLVentexoポリメラーゼFermentas2μL水混合物に対して、qPCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。92°Cで10分30サイクル、95°Cで30秒及び72°Cで2分30秒72°Cで5分結果異なるqPCR反応物中の融合分子の数を計算するために、標準曲線を定義した。desBioyRTD002SA融合分子の計算された数をカラムチャートに変換し、1μMビオチンの共存又は不在下でインキュベートされた連結反応で得られた信号間の差異を視覚化した図6。得られた結果によれば、阻害剤ビオチンが存在する状態で連結反応を行った場合と比べて、ビオチンの不在下で連結反応を行った場合には、有意に多い数の融合分子が存在することが分かる。結論この結果は、デスチオビオチンストレプトアビジン結合に由来するdesBioyR及びSATD002分子が共コンパートメント化され、その結果としてそこに連結されたDNAがライゲートされたことを実証するものである。実施例6:遺伝子型遺伝子型融合のためのeライゲーションを用いた共コンパートメント化の濃縮-スパイク化実験標的としてヒト炭酸脱水酵素IIを使用して、多様化diverseyRライブラリーへとスパイクされたyRDNABSByRにコンジュゲートされたN-ベンジル-4-スルファモイルベンズアミドを濃縮することにより、ECCを実証した。並行して、負の対照として、BSBとプレインキュベートされた標的を用いてECCを実施した。更に、同じ系によって、解離時間依存濃縮が実証された。概要については図1参照。方法実施例2及び5に記載したDNAオリゴヌクレオチドを使用した。更に、以下を適用した。BSB標識yRBSByRに使用vip2260:ATGAAAGACGTGGCCATTGCvip2724vip2607:CTGACATGGTCCCTGGCAGTCTCCTGTCAGGACCGACTCCXGCTCGAAGACx=dT-C6-アミノ修飾vip2970:CTATCGGTTTTACCGATAGGTCTTCGAGCTGTACCTGCGCvip2973:AGCTAGGTTTTACCTAGCTGCGCAGGTACTGTGCATCGACvip2980:CTATCGGTTTTACCGATAGGTCGATGCACTGGAGTCGGTCTD003に使用:vip2536:CTTATGCTGGCAGTTTCAvip2529:ACTTCCACCTCAGGACATCGAGCTGGAGCTTGCTGTTAGCvip2538:AGGTTCGCTCCCTCCTTAAGCCAGCAGTGGTAATTCGACAvip2996:CGATGTCCTGAGGTGGAAGTTGAAACTGCCAGCATAAGGAvip2532:CTTAAGGAGGGAGCGAACCTGCTAACAGCAAGCTCCAGCTvip2559:xTGTCGAATTACCACTGCTGGx=C6-アミノ修飾454シークエンシングに使用:Vip3018:CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGCGATGTCCTGAGGTGGAAGTvip2459:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2460:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2461:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACACTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2462:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACTGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2463:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGAGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2464:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGCATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2465:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2466:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGTCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2467:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2468:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATGCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2469:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCACTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2470:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2471:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCATTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2472:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2473:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2474:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTACTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2475:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTCATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2476:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2477:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTTGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2478:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGAACTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2479:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGACATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2480:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGAGTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2481:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGATGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2482:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCAATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2483:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTCTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2484:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTGATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2485:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2486:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2487:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCAGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2488:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCATGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2489:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGTTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2490:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2491:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGACTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2492:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGTGTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2493:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCTGGTCCCTGGCAGTCTCCvip2494:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGTGGTCCCTGGCAGTCTCCヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーの調製ライブラリーは、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327に従って調製したが、トリマー形態の代わりにテトラマー形態を用いた。BSB標識yRBSByRの調製材料10mMFmoc-NH-PEG12-CO2H100mM4-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル-4-メチルモルホリニウムクロリドDMT-MM200mMN-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-4-ブタンスルホン酸pH9HEPBSN-メチル-2-ピロリドンNMP0.5Mピペリジン、NMP中10mMFmoc-L-フェニルグリシンFmoc-L-Phg10mM4-カルボキシベンゼンスルホンアミド0.1Mアセトニトリル/酢酸トリエチルアンモニウムpH7BSB:BSBはDrabovichetalAnalChem200981490494に従って合成した。プロトコールBSB_yRはライゲーションによって調製した。位置2オリゴヌクレオチドvip2970、位置3オリゴヌクレオチドvip2973、及び位置4オリゴヌクレオチドvip2980を調製し、これらをT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いたリン酸化により、メーカーの指示Fermentasに従ってライゲーションを実施した。位置1オリゴヌクレオチドvip2724vip2607のBSBラべリングは、以下の反応スキームに従って合成した。アミノ-PEG12由来オリゴヌクレオチドは、51量体オリゴヌクレオチドvip2724vip2607[5nmol]と、Fmoc-NH-PEG12-CO2H[10mM]に連結された内部修飾dTアミノ-C6-dTとから、100mMDMT-MM、200mMHEPBSpH9、200μLのNMP:水1:1中溶液中で合成した。1時間後、混合物をエタノール沈殿し、100μLの水に溶解させた。NMP中0.5Mピペリジン100μLを加え、25°Cで2時間インキュベートした。アミノ-PEG12-オリゴヌクレオチドをエタノール沈殿で単離し、更に精製することなく示談に使用した。BSB-PEG12標識位置1コンジュゲートは、Fmoc-L-Phgを51量体アミノ修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることにより合成した。ここで、一級アミンはPEG12リンカーを介して内部修飾dTに連結される。アミノ-PEG12由来オリゴヌクレオチドは、100mMDMT-MM及び200mMHEPBSpH9の200μLのNMP:水1:1の溶液中で、Fmoc-L-Phg[10mM]に連結された。1時間後、混合物をエタノール沈殿し、100μLの水に溶解させた。0.5MピペリジンNMP溶液100μLを加え、25°Cで2時間インキュベートした。最後の4-カルボキシベンゼンスルホンアミドのカップリングは、L-Phg-PEG12誘導オリゴヌクレオチドの溶液を、100mMDMT-MM及び200mMHEPBSpH9の200μLNMP:水1:1の溶液中、4-カルボキシベンゼンスルホンアミド[10mM]で処理することにより行った。25°Cで1時間インキュベーションした後、粗オリゴヌクレオチドコンジュゲートをエタノール沈殿で単離し、C18WatersXBridgeカラムを用いた逆相HPLCで、アセトニトリル/酢酸トリエチルアンモニウムpH7、0.1M勾配6~50アセトニトリルで、20分かけて溶出することにより精製した。適切な画分を収集し、真空下で乾燥し、1680pモルのBSB標識化vip2724vip2607を得た。BSBとコンジュゲートされたステム相補的位置1オリゴヌクレオチドvip2724vip2607コンジュゲート、位置2、位置3及び位置4オリゴヌクレオチドを等量ずつ混合し、ライゲートしてyRを形成したHansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327。T4DNAリガーゼによるライゲーションはメーカーFermentasの指示に従って実施した。BSB_yRは展開後、リン酸化vip2260を用いたプライマー伸長によって二本鎖を形成させた。これはKlenowexo誘導反応をメーカーの指示Fermentasに従って行うことにより達成した。標的DNATD003の調製TD003は実施例5に記載のTD002と同様に調製した。炭酸脱水酵素IIのTD003に対するコンジュゲーションCAIITD003組換ヒトCAIIRnD系;2184CAプロトコールTD003のCAIIへのコンジュゲーションは、実施例3と同様に実施した。CAIIとのコンジュゲーション用標的DNAとの予活性化混合物。予活性化は、21μLのTD003[4.7μM]を、3μLのMOPSpH6[1M]、3μLのEDC[50mM]、及び3μLのs-NHS[100mM]と混合することにより行った。カルボン酸活性化は、20°Cで30分間のインキュベートにより行った。G25Illustraカラムを用い、メーカーGEHealthcareの指示に従って、緩衝剤を除去した。コンジュゲーションに先立ち、タンパク質を2×30分、4°Cの透析緩衝剤に対して、SlideALyzermini透析装置を用いてメーカーPierceの指示に従って透析した。コンジュゲーション反応は、1μLのMOPS[1M]pH8.0、1μLのNaCl[1M]、及び1μLの水を、9μLの透析CAIIタンパク質に対して加えることにより行った。約35μLの活性化DNAをこの混合物に加えた。反応物を4°Cで20時間インキュベートした。TrispH8を終濃度50mMとなるように加えてコンジュゲーション反応をクエンチした。実施例3の記載に従って、PAGE6TBEゲルを用いて、CAIITD003コンジュゲートを反応物から単離した。PicogreenをメーカーMolecularProbesの指示に従って用いてDNA濃度を測定したところ、コンジュゲートの濃度は0.21μMと推定された。連結反応結合反応材料1MTris-HCl、pH7.54MNaCl10Triton10μMBSBプロトコール総体積15μLの結合緩衝剤10mMTris-HClpH75、50mMNaCl、0.1TritonX100中、6.5E10のライブラリー分子と、3.3E5のBSB_yR分子5E6のBSB_yR分子で1~200000にスパイクした1E12分子からなるヨクトリアクターyoctoreactorライブラリーとを、9E9分子のCAII_TD003と、1μMBSB阻害剤の存在又は不在下で混合した。分子の連結は、氷上で結合混合物を1時間インキュベートすることにより行った。解離反応希釈材料標準ライゲーションバッファー50mMTris-HCl、pH7.550mMNaCl0.1TritonX1000.75μMBSA9mMKCl4.5グリセロール0.2mMEDTA1mMDTT2mMATP1μMT4DNAリガーゼFermentas0.01μMスカベンジャーDNA連続相は実施例3の記載に従って調製した。スクリューキャップを有する2mLのマイクロチューブプロトコール結合混合物0.12μLを、1μMT4DNAリガーゼ標準ライゲーション緩衝剤を含む600μLの水相を入れた2mLのエッペンドルフチューブの蓋まで転送した。チューブを2度反転し、更に10秒間チューブを攪拌して、結合混合物と水相とを混合することにより、解離反応を開始した。マイクロ遠心分離で軽く撹拌した後、500μLの混合物を、1mLの連続相を含む2mLの氷冷マイクロチューブに移送し、氷上で更に放置して、最終的に2分間の解離時間を得た。エマルション化材料誘導緩衝剤:50mMTris-HCl、pH7.550mMNaCl0.1TritonX1001.5μMBSA10mMKCl5グリセロール0.2mMEDTA1mMDTT2mMATP135mMMgCl2プロトコールPrecellys24ベルタンテクノロジーズを用い、5500rpmで3×20秒間20秒間の撹拌の間に10秒間の休止を挟んだエマルション化し、連続相1mLと水相0.5mLとを混合することによって、解離反応を開始からちょうど2分後に終了させた。並行して、135mMMgCl2を含む1mLの連続相及び0.5mLの水相誘導緩衝剤を5500rpmで3×20秒間エマルション化することにより、マグネシウムを含むがT4DNAリガーゼ活性化用リガーゼを含まない誘導エマルションを調製した。エマルションでのライゲーションプロトコール1エマルション当たり150μLのMgCl2含有誘導エマルションを加え、RTで1時間撹拌混合することにより、T4DNAリガーゼを活性化させた。ライゲーションは、エマルション1650μLを熱ブロック内で16時間、16°C及び300rpmでインキュベートすることにより行った。エマルション破壊及びDNA回収材料1-ブタノールイソプロパノール100エタノール100bp無制限DNA組織LyserIIQiagenPCRクリーンアップキットNucleoSpinExtractIIMachereyNagel10TritonX100プロトコールチューブを65°Cで30分間インキュベートし、更にマイクロ遠心分離で軽く撹拌することにより、ライゲーション反応を停止させた。エマルションを破壊するために、1エマルジョン当たり300μLの1-ブタノール、150μLのイソプロパノール、50μLのエタノール、及び20ngの100bp無制限DNA[10ng/μL]を加え、15Hzで1分間TissueLyserIIQiagenで混合した。続いて、チューブを14,000×gで2分間遠心分離し、RTで1時間振盪し、上澄みを廃棄した。以下の抽出を2回繰り返し、エマルジョンから残留鉱油及び界面活性剤を除去した。1-ブタノールを加え、TissueLyserで15Hzで1分間混合し、上部相を廃棄。サプライヤーの推奨に従って、PCRクリーンアップキットNucleoSpinExtractIIMachereyNagelを使用し、DNA断片を、精製によって回収した。0.1のTritonを含むEB緩衝剤5mMトリス/HCl、pH8.5でDNAを溶出した。ライゲートされたDNAレスキューPCRの増幅材料2×PCRMastermixpH8.8、25°C40mMTris-HCl20mMNH42SO420mMKCl16mMMgSO4,0.2TritonX100、0.2mg/mLBSAホットスタートPCR適したヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP、及びdCTP各0.4mMCleanAmpTriLinkプロトコールライゲートされた断片を、10μLの精製回収DNAサンプルをテンプレートとして用いて、総体積100μLとしてPCRにより回収した。PCR混合物10μLテンプレートDNA50μL2×PCRMastermix10μL5Mベタイン終濃度0.5M1μL100μMvip660終濃度1μM1μL100μMvip2824終濃度1μM1μL2u/μLVentexoポリメラーゼFermentas27μL水混合物に対して、PCR機器で以下のプログラムを適用することにより、熱サイクリングを実施した。95°Cで10分32サイクル、95°Cで30秒、72°Cで2分30秒72°Cで2分調製for454シークエンシングプロトコール454シークエンシング用のサンプルは、実施例4でyRTD001融合分子について記載したのと同様の手順によって調製した。454シークエンシングタグを加え、独自の順方向プライマーvip2459~vip2494を用いて、yRTD003融合分子をPCR増幅した。DNA配列決定プロトコール454シークエンシングは、HansenetalJAmChemSoc2009131pp13221327の記載に従って行った。DNA配列を分析し、BSB遺伝子型の頻度を計算した。結果配列決定の結果図7によれば、2分間の解離時間を用いることにより、BSByRはCAIIによって首尾よく約1300倍に濃縮された。これに対して、30分間の解離時間を用いた場合、又は、結合工程に先立ってCAIIをBSBとプレインキュベートした場合には、BSB_DNAの濃縮は見られなかった。結論標的としてCAIIを用い、多様化yRライブラリーへとスパイクされたBSByRを、解離時間依存的に濃縮することにより、ECCが実証された。文献リスト1EP1809743B12EP1402024B13EP1423400B14NatureChemBiol56476545WO00234586NatureMethods3561570720067NatBiotechnol2004225685748Nature3468188229ProcNatlAcadSciUSA941229730210WO06053571A211BertschingeretalProteinEngineeringDesignSelectionvol20no2pp576812MillerOJBernathKAgrestiJJAmitaiGKellyBTMastrobattistaETalyVMagdassiSTawfikDSGriffithsADDirectedevolutionbyinvitrocompartmentalizationNatMethods2006Jul35617013DoiNandYanagawaHFEBSLett45722723014YonezawaMDoiNKawahashiYHigashinakagawaTandYanagawaHNucleicAcidsRes31e11815TawfikDSandGriffithsADManmadecelllikecompartmentsformolecularevolutionNatBiotechnol1665265616GhadessyFJOngJLandHolligerPProcNatlAcadSciUSA984552455717TayYHoCDrogePGhadessyFJSelectionofbacteriophagelambdaintegraseswithalteredrecombinationspecificitybyinvitrocompartmentalizationNucleicAcidsRes2010Mar38e25Epub2009Dec418ZhengYRobertsRJSelectionofrestrictionendonucleasesusingartificialcellsNucleicAcidsRes200735e83Epub200719MastrobattistaETalyVChanudetETreacyPKellyBTGriffithsADHighthroughputscreeningofenzymelibrariesinvitroevolutionofabetagalactosidasebyfluorescenceactivatedsortingofdoubleemulsionsChemBiol2005Dec12129130020LevyMGriswoldKEEllingtonADDirectselectionoftransactingligaseribozymesbyinvitrocompartmentalizationRNA2005Oct11155562Epub2005Aug3021SeppAChooYCellfreeselectionofzincfingerDNAbindingproteinsusinginvitrocompartmentalizationJMolBiol2005Nov253542129Epub2005Oct322BernathKMagdassiSTawfikDSDirectedevolutionofproteininhibitorsofDNAnucleasesbyinvitrocompartmentalizationandnanodropletdeliveryJMolBiol2005Feb4345101526Epub2004Dec723BertschingeretalProteinEngineeringDesignSelectionvol17no9pp69970724ChenYuetalNucleicAcidResearchVol36Nr19PagesArticleNoE12825HansenetalJAmChemSoc2009131pp1322132726DrabovichetalAnalChem20098149049427TurnerandHurlesNatProtoc2009417711783"