"アンジオポエチン-2に特異的に結合する単離ポリペプチド該ポリペプチドは、少なくとも1個の相補性決定領域CDRを含有し、該CDRは、a式:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17配列番号199式中、X1はR、S、T、G、E、Dであり;X2はS、G、A、R、N、T、Y、Hであり;X3はS、D、N、Q、T、Y、A、G、Eであり;X4はQ、K、S、N、A、G、I、M、W、Lであり;X5はS、L、G、A、M、H、Nであり;X6はL、G、N、P、V、D、W、S、T、Iであるか又は存在せず;X7はL、Y、I、K、S、N、Vであるか又は存在せず;X8はH、T、G、Q、S、A、D、であるか又は存在せず;X9はS、Y、N、A、T、E、G、Fであるか又は存在せず;X10はN、T、A、G、S、Y、K、D、F、Lであるか又は存在せず;X11はG、S、Y、F、L、P、A、F、D、Nであるか又は存在せず;X12はY、V、D、A、F、G、Nであるか又は存在せず;X13はN、S、V、H、Q、K、Tであるか又は存在せず;X14はY、H、S、Tであるか又は存在せず;X15はL、Yであるか又は存在せず;X16はD、N、Lであるか又は存在せず;X17はD又は存在しない。のアミノ酸配列を含有するCDR1領域;b式:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18配列番号200式中、X1はL、Q、D、N、K、G、H、A、Y、E、T、R、V、Wであり;X2はG、D、N、A、V、T、I、F、Mであり;X3はS、F、N、H、G、D、K、T、I、W、Y、Rであり;X4はN、K、E、L、S、Q、H、T、G、P、Y、Aであり;X5はR、V、L、S、I、D、G、E、Y、T、Nであり;X6はA、P、T、F、G、L、N、H、Sであり;X7はS、T、G、Kであり;X8はS、T、I、N、E、Wであるか又は存在せず;X9はT、A、I、K、N、Y、Dであるか又は存在せず;X10はY、N、K、F、I、S、G、であるか又は存在せず;X11はY、N、D、Aであるか又は存在せず;X12はA、S、P、Y、Dであるか又は存在せず;X13はD、Q、S、A、Fであるか又は存在せず;X14はS、K、L、Vであるか又は存在せず;X15はV、F、K、S、Lであるか又は存在せず;X16はK、Q、S、L、F、Gであるか又は存在せず;X17はG、Rであるか又は存在せず;X18はGであるか又は存在しない。のアミノ酸配列を含有するCDR2領域;又はc式:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19配列番号201式中、X1はD、M、G、Q、F、A、P、E、Sであり;X2はL、Q、V、A、R、T、S、Y、E、P、H、G、Iであり;X3はL、A、V、W、E、P、G、S、Y、I、D、T、Q、F、Rであり;X4はD、L、G、F、T、S、W、V、Y、P、N、H、I、Eであり;X5はY、Q、D、S、T、H、A、F、W、G、M、R、Nであり;X6はD、T、F、A、S、E、W、R、G、Y、I、M、N、Lであり;X7はI、P、D、T、M、L、S、V、G、H、Y、W、A、N、Rであり;X8はL、P、W、A、V、S、D、G、F、N、Y、I、R、E、Tであり;X9はT、L、V、F、A、G、P、D、S、H、N、M、Yであるか又は存在せず;X10はG、S、V、N、F、A、M、D、Y、L、W、I、Tであるか又は存在せず;X11はP、F、Y、W、D、E、I、G、A、V、L、S、Mであるか又は存在せず;X12はY、F、V、G、I、V、M、A、Dであるか又は存在せず;X13はA、D、Y、V、F、H、I、Gであるか又は存在せず;X14はY、V、D、I、S、F、Mであるか又は存在せず;X15はI、Dであるか又は存在せず;X16はA、I、Vであるか又は存在せず;X17はFであるか又は存在せず;X18はDであるか又は存在せず;X19はIであるか又は存在しない。のアミノ酸配列を含有するCDR3領域である。。配列番号69から104及び配列番号213から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含有する、請求項1のポリペプチド。配列番号105から143及び配列番号214から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含有する、請求項1のポリペプチド。配列番号144から198、配列番号212及び配列番号215から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含有する、請求項1のポリペプチド。抗体である、請求項1の単離ポリペプチド。ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体である、請求項5の抗体。一本鎖抗体である、請求項6の抗体。請求項6に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。請求項1のポリペプチドをコードする核酸分子。請求項9の核酸分子を含有するベクター。請求項10のベクターを含有する宿主細胞。請求項5、6又は7の抗体をコードする核酸分子。請求項12の核酸分子を含有するベクター。請求項13のベクターを含有する宿主細胞。抗体を作製する方法であって、a請求項5、6又は7の抗体をコードする少なくとも1つの核酸分子によって宿主細胞を形質転換すること;b前記宿主細胞中で核酸分子を発現させること;及びc前記特異的結合物質を単離することを含む、方法。請求項1の単離ポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において望ましくない血管形成を阻害する方法。請求項1の単離ポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法。請求項5、6又は7の抗体の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において望ましくない血管形成を阻害する方法。請求項5、6又は7に記載の抗体の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法。請求項1の単離ポリペプチド及び医薬的に許容される製剤物質を含有する、医薬組成物。請求項5、6又は7の抗体及び医薬的に許容される製剤物質を含有する、医薬組成物。請求項1の単離ポリペプチドを患者に投与することを含む、アンジオポエチン-2活性を調節又は阻害する方法。請求項5、6又は7の抗体を患者に投与することを含む、アンジオポエチン-2活性を調節又は阻害する方法。請求項1の単離ポリペプチドの治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において血管透過性又は血漿漏出の少なくとも1つを調節する方法。請求項1の単離ポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において、眼の血管新生疾患、肥満、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性の疾病、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、腫瘍性疾患、骨関連疾患又は乾癬の少なくとも1つを治療する方法。請求項5、6又は7の抗体の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において血管透過性又は血漿漏出の少なくとも1つを調節する方法。請求項5、6又は7の抗体の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において、眼の血管新生疾患、肥満、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性の疾病、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、腫瘍性疾患、骨関連疾患又は乾癬の少なくとも1つを治療する方法。請求項1の単離ポリペプチド及び化学療法剤の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法。単離ポリペプチド及び化学療法剤が同時に投与される、請求項28に記載の方法。単離ポリペプチド及び化学療法剤が同時に投与されない、請求項28に記載の方法。請求項5、6又は7の抗体及び化学療法剤の治療上有効量を投与することを含む、哺乳動物において癌を治療する方法。配列番号69から104又は配列番号213の何れかに示されるアミノ酸配列を含むCDR1を含有する、アンジオポエチン-2に結合する単離抗体。配列番号105から143又は配列番号214の何れかに示されるアミノ酸配列を含むCDR2を含有する、アンジオポエチン-2に結合する単離抗体。配列番号144から198、配列番号212又は配列番号215の何れかに示されるアミノ酸配列を含むCDR3を含有する、アンジオポエチン-2に結合する単離抗体。請求項32、33又は34の抗体をコードする核酸分子。請求項35の核酸分子を含有するベクター。請求項36のベクターを含有する宿主細胞。生物試料中のアンジオポエチン-2のレベルを検出する方法であって、a請求項1の単離ポリペプチドを前記試料と接触させること;及びb前記試料に対する特異的結合物質の結合の程度を決定すること;を含む、方法。生物試料中のアンジオポエチン-2のレベルを検出する方法であって、a請求項32、33又は34の抗体を前記試料と接触させること;及びb前記試料に対する抗体の結合の程度を決定すること;を含む、方法。重鎖及び軽鎖を含有する抗体であって、前記重鎖が、配列番号1;配列番号3;配列番号5;配列番号7;配列番号9;配列番号11;配列番号13;配列番号15;配列番号17;配列番号19;配列番号21;配列番号23;配列番号25;配列番号27;配列番号29;配列番号31;配列番号33;配列番号35;配列番号37;配列番号39;配列番号41;配列番号43;配列番号45;配列番号47;配列番号49;配列番号51;配列番号53;配列番号55;配列番号57;配列番号59;配列番号61及びその抗原結合断片からなる群から選択される重鎖可変領域を含有し;及び前記軽鎖が、配列番号12、配列番号210もしくは配列番号211のアミノ酸配列又はその抗原結合断片を含有する軽鎖可変領域を含有する、抗体。請求項40に記載の抗体をコードする核酸分子。請求項41の核酸分子を含有するベクター。請求項42のベクターを含有する宿主細胞。重鎖及び軽鎖を含有し、アンジオポエチン-2に特異的に結合する抗体であって、軽鎖が、配列番号12、配列番号210もしくは配列番号211のアミノ酸配列又はその抗原結合断片を含有する軽鎖可変領域を含有する、抗体。請求項44に記載の抗体をコードする核酸分子。請求項45の核酸分子を含有するベクター。請求項46のベクターを含有する宿主細胞。病的及び正常組織におけるAng-2発現正常組織及び病的組織においてインサイチュハイブリダイゼーションを用いて、Ang-2発現を試験した。ヒトGenbank受託番号AF004327、ヌクレオチド1274-1726及びマウスGenbank受託番号AF004326、ヌクレオチド1135-1588Ang-2配列の断片をヒト又はマウス胎仔肺cDNAから逆転写酵素-PCRにより増幅し、pGEM-Tプラスミドにクローニングし、配列決定により確認した。線状プラスミド鋳型から33P-UTP及びRNAポリメラーゼを用いて33P標識アンチチンスRNAプローブを転写した。ホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した組織のブロックを5μmに薄切し、帯電スライド上で収集した。インサイチュハイブリダイゼーション前に、組織を0.2MHClで透徹し、プロテイナーゼKで消化し、トリエタノールアミン及び無水酢酸を用いてアセチル化した。切片を放射性標識プローブと55°Cで一晩ハイブリダイズさせた後、RNase消化し、約0.1xSSC中55°Cで高ストリンジェント洗浄した。スライドをコダックNTB2エマルションに浸漬し、4°Cで2-3分間曝露し、発色させ、対比染色した。切片を暗野及び標準照明で調べ、組織形態及びハイブリダイゼーションシグナルを同時に評価した。結果から、正常出生後ヒトの場合にはAng-2発現は卵巣、胎盤及び子宮などの血管原性血管系を含む数少ない組織に限定されていることが示された。正常な成人心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、筋肉、扁桃、胸腺、虫垂、リンパ節、胆嚢、前立腺又は精巣ではAng-2発現は検出できなかった。5週齢マウス成体サルでもヒトでもない。では、腎臓は直細血管で顕著なAng-2発現を示した。この発現が胚発生の残遺物であったかどうかを調べるために、マウスAng-2プローブ及び上記した条件を用いて、1年齢までのマウス由来の腎臓でこの実験を繰り返した。Ang-2発現は出生後発生中に減少することが認められたが、1年齢マウスの腎臓でも依然として明らかであった。Ang-2発現は、大腸癌5例、乳癌10例、肺癌8例及びグリア芽腫1例などの原発性ヒト腫瘍;脳に転移した、乳癌2例、肺癌2例及び卵巣癌2例などの転移性ヒト腫瘍;及びC6ラット神経膠腫、HT29ヒト大腸癌、Colo-205ヒト大腸癌、HCT116ヒト大腸癌、A431ヒト類表皮癌、A673ヒト横紋筋肉腫、HT1080ヒト繊維肉腫、PC-3ヒト前立腺癌、B16F10マウス黒色腫、MethAマウス肉腫及びルイス肺癌などのげっ歯腫瘍モデルを含む、試験した実質的に全ての腫瘍タイプでも検出された。さらに、VEGFに応答してマトリゲルプラグに成長する新血管及びマウスの未熟児網膜症の低酸素モデルにおいて、Ang-2発現が検出された。組換えmAng-2タンパク質及びウサギポリクローナル抗-Ang-2抗血清の作製完全長のHisタグ付加マウスAng-2cDNAは、完全長ヒトAng-2に対するPCRプライマーを用いて、マウス15日胚cDNAライブラリMarathoN-Ready-cDNA:カタログ番号7459-1,Clonetech,Inc.からPCRClontechAdvantagePCRキット;カタログ番号K1905-01により得た。PCR産物をCMVプロモーター発現ベクターにライゲーションし、FuGENE6トランスフェクション試薬Roche;カタログ番号1814443を用い、HT1080ヒト線維肉腫細胞ATCCより入手へと、得られたプラスミドをトランスフェクトした。安定なクローンをG418選択により単離した。抗-HisタグELISA及びウェスタンブロッティングを用いてmAng-2-his発現クローンに対するスクリーニングを行った。組換えmAng-2ポリペプチドをこれらの細胞の馴化培地C.M.から精製した。mAng-2-Hisを含有するC.M.を2段階クロマトグラフィープロトコルにより精製した。簡単に述べると、Tris緩衝液pH9.5を約20mMの最終濃度まで添加することにより馴化培地をpH8.9とした。さらに、界面活性剤CHAPSを約5mM最終濃度まで添加した。次いでC.M.を陰イオン交換カラムQ-セファロースffPharmaciaに直接載せた。次いでカラムを約50mMNaClを含有する約10mMTrispH8.0で洗浄した。約350mMNaCl及び約5mMCHAPSを含有する10mMTrispH8.0を用いて、組換えmAng2-Hisを1段階で溶出させた。Q-セファロースカラムからの溶出液を約4mMイミダゾールに調整し、固定化金属アフィニティーカラムNi-NTAスーパーフロー;Qiagenに載せた。約5mMCHAPS及び約100mMイミダゾールを含有するPBSを用いて、結合タンパク質を溶出させた。次いで溶出液を約1.0mg/mlに濃縮した後PBSに対して透析した。mAng-2-Hisの純度は、SDS-PAGEクーマシー染色により測定したところ90以上であった。抗体を作製するために、ウサギに対して約0.2mgのmAng-2/注射で免疫付与を行った。Hunter’sTiterMaxRSigma及びmAng-21:1約1mLをウサギに注射した。4週間後、各ウサギに繰返し注射して追加免疫付与した。2週間後、さらに追加免疫付与し、7週目に血清を採取し、mAng-2に対する力価を評価した。血清力価が高い場合、50mlの産生血液を連続6週間毎週採取した。しかしながら、血清力価が低い場合、ウサギにさらに追加免疫し、50mLの産生血液を9週目から連続6週間毎週採取した。6回連続の産生血液採取後、ウサギを6週間安息状態とした。さらに血清が必要な場合、最後の産生血液採取から1ヶ月後に再び追加免疫した。中和ELISA上記を用いて、2匹のウサギ5254及び5255からの抗mAng-2ウサギポリクローナル抗血清がmAng-2:Tie2相互作用を中和することが観察された。Ang-2抗体を評価するための分子アッセイAng-2及び関連ファミリーメンバーへの直接抗体結合及びAng-2:Tie2相互作用に対する抗体の効果を評価するために分子アッセイアフィニティーELISA、中和ELISA及びBIAcoreを開発した。以下、これらのインビトロ及び細胞を利用したアッセイについて説明する。A.アフィニティーELISA候補となる抗-Ang-2抗体の最初のスクリーニングのために、精製ヒトAng-2RandDSystems,Inc.:カタログ番号623-AN、Ang-2は2つの切断型の混合物として提供される。又はマウスAng-2ポリペプチド上記のように作製を使用した。確認結合アッセイのために、完全長ヒトAng-2DNAをトランスフェクトしたヒト293T細胞の馴化培地からヒトAng-2を得、ウシ血清アルルブミンBSA約50μg/mlを含有する無血清DMEM中で培養した。マイクロタイタープレートを用いて、Ang-2約100μL/ウェルを各ウェルに添加し、プレートを約2時間インキュベートした後、約0.1Tween20を含有するリン酸緩衝生理食塩液PBSでプレートを4回洗浄した。次いで、PBS中約5BSA約250μL/ウェルを用いてウェルに対してブロッキングを行い、プレートを室温にて約2時間インキュベートした。インキュベート後、過剰のブロッキング液を捨て、候補抗Ang-2抗体約100μLを約40ナノモーラーから始め、その後約1BSA含有PBSで4倍希釈する連続希釈法で各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温にて一晩インキュベートした。インキュベート後、約0.1Tween20を含有するPBSでプレートを洗浄した。洗浄をさらに4回繰り返した後、予め1BSAウシ血清アルブミンを含有するPBSで1:5000希釈したヤギ抗-ヒトIgGFc-HRPPierceChemicalCo.,;カタログ番号31416約100μL/ウェルを添加した。プレートを室温にて約1時間インキュベートした。次いで、約0.1Tween20を含有するPBSでプレートを5回洗浄した後、TMB3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン液体基質システム;SigmaChemicalCompany、St.Louis,MO;カタログ番号T8665約100μL/ウェルの基質を添加し、青色発色が起こるまでプレートを約5-15分間インキュベートした。次いで、分光光度計を用いて約370nmで吸光度を読み取った。B.中和ELISAヒトAng-2ポリペプチドを結合したマイクロタイタープレートをアフィニティーELISAに関して上述のように調製した。約1BSA及び約1nMTie2Tie2部分が分子の可溶性細胞外部分のみを含むTie2-Fc分子として提供される;RandDSystems,Inc.:カタログ番号313-TIを含有するPBSの溶液中でアフィニティーELISAに関して上記で述べたように、候補抗-Ang-2抗体の連続希釈物を調製した。抗体/Tie2溶液約100μLを各ウェルに添加した後、プレートを室温にて一晩インキュベートし、次いで約0.1Tween20含有PBS中で5回洗浄した。洗浄後、抗-Tie2抗体PharmingenInc.;カタログ番号557039約100μL/ウェルを約1μg/mLの最終濃度まで添加し、プレートを室温にて約1時間インキュベートした。次いで、ヤギ抗-マウス-IgG-HRPPierceChemicalCO.;カタログ番号31432約100μL/ウェルを約1BSA含有PBSでの1:10000希釈状態で添加した。プレートを室温にて約1時間インキュベートした後、約0.1Tween20含有PBSで5回洗浄した。次いで、TMB基質上述約100μL/ウェルを添加し、発色させた。次いで、分光光度計を用いて約370nmで吸光度を読み取った。C.アフィニティーBIAcoreランニング緩衝液としてPBS及び0.005P20界面活性剤BIAcore,Inc.,Piscataway,NJを用い、BIAcoreR2000Biacore,Inc.を用いて、各候補Ang-2抗体のアフィニティー分析を実施した。製造業者の示唆プロトコルに従い、アミンカップリングキットBiacore,Inc.を用いて、第1級アミン基を介して研究グレードのCM5センサーチップBiacore,Inc.に組換えプロテインGRepligen,Needham,MAを固定化した。まず各候補抗-Ang-2抗体約100RUを固定化プロティンGに結合させた後、各種濃度0~100nMのhuAng-2又はmAmg-2を結合抗体表面上に約50ul/分の流速で約3分間注入することにより、結合アッセイを行った。BIA評価3.1コンピュータープログラムBIAcore,Inc.を用いて、ka会合速度定数、kd解離速度定数及びKD解離平衡定数を含む抗体結合カイネティクスを測定した。解離平衡定数が低いほど、Ang-2に対する抗体の親和性が高いことを示す。ファージディスプレイによる全長ヒトAng-2抗体の作製次のプロトコルに従い、ヒトAng-2ポリペプチドRandDSystemsInc.,カタログ番号623-ANに対してTargetQuestファージディスプレイFabライブラリTargetQuest,Inc.からピックアップすることにより、全長ヒトAng-2抗体を得た。ヒトAng-2をポリスチレン磁気ビーズの表面上に14°Cにて一晩50μg/mlでAng-2を直接コーティングする;及び24°Cにて一晩50μg/mlのヤギ抗-Ang-2抗体でAng-2を間接捕捉するという2つの方法により固定化した。ビーズ表面をPBS中2ミルクMPBSによりブロッキングした。ヒトFabファージライブラリを予備選択して、非被覆磁気ビーズ又はヤギ抗-Ang-2抗体に反応するファージクローンを除去した。次に、Ang-2被覆磁気ビーズを室温にてライブラリファージと1.5時間インキュベートした。ファージ結合段階後、約0.1Tween20含有MPBSで6回、その後約0.1Tween20含有PBSで6回、その後PBSで2回、表面を洗浄した。最初に約100ug/mlのヒトTie2-FcRandDSystems,Minneapolis,MN、次いで約100mMトリエタノールアミンで結合ファージを溶出させた。溶出ファージをE.コリTG1細胞に感染させ、増幅し、次回スクリーニングのためにレスキューした。より厳格な洗浄を行い、入力ファージ数を減らすことによりその後のスクリーニングにおける選択圧を上昇させた。3回の選択後、18個のユニークなAng-2結合Fabクローンを同定したが、これらは実質的に全て上述のELISAアフィニティーアッセイを用いて測定したところ、ヒトAng-2、マウスAng-2及びラットAng-2と認められた。これらのファージの約10がヒトAng-1にも結合した。これらのクローンを以下のようにIgG1抗体に変換した。さらにユニークなファージを得るために、同一ライブラリを用いるがプロトコルを若干変更して第二のスクリーニングを行った。このプロトコルでは、ヒトAng-2を約4°Cにて一晩、Nuncmaxisorpイムノチューブ中NaHCO3緩衝液pH9.6において一晩プレーティングした。第1回、第2回及び第3回の絞込みでそれぞれ約1.5、0.74及び0.3ug/mlにて、Ang-2をプレーティングした。PBS中約2ミルクMPBSを用いてイムノチューブ表面をブロッキングした後、2MPBS約4mL中で上述の同じファージディスプレイライブラリTargetQuestからの約2兆個のファージ粒子ライブラリ中、各ユニークなファージ約50コピーと共にインキュベートした。ファージインキュベーション段階後、PBS約0.1Tween20で20回、その後PBSで20回、表面を洗浄した。1μMhAng-2又は1μMヒトTie2上述のRandDSystemsを用いて結合ファージを溶出させた。溶出ファージをE.コリTG1細胞ファージライブリーと共に提供に感染させ、増幅し、次回スクリーニングのためにレスキューした。16個のユニークなAng-2結合FabクローンをPCR増幅により同定し、全てのファージがhAng-2又はTie2に結合し、これらのクローンを制限消化により分析した。各クローンのDNAの配列決定を行った。相補的プライマーを用いて各ファージ由来の各重鎖の可変領域をコードする配列を増幅した。このプライマーは、可変領域の5’末端にHindIII部位、XbaI部位、コザック配列及びシグナル配列翻訳ペブチドはMDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCである;配列番号202を組み込むように設計されており、同時にPCR産物の3’末端にBsmBI部位が付加された。重鎖をクローニング方法の例として、シグナル配列の最後の7アミノ酸を付加するプライマー2248-21GTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTCAGGTCCAGCTGGTGCAG;配列番号203及び可変領域の末端にBsmBI部位を付加するプライマー2502-31ATTACGTCTCACAGTTCGTTTGATCTCCAC;配列番号204を用いてクローン544の鋳型ファージDNA配列番号19を増幅させた。シグナルペプチドに9アミノ酸AQLLGLLLL;配列番号206を付加するプライマー2148-98CCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTATTGTGGTTGAGAGGTGCCAGAT;配列番号205及び2502-31、プライマー2489-36CAGCAGAAGCTTCTAGACCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGG;配列番号207及び2502-31を用い、生じた産物を増幅させた。プライマー2489-36は、5’から3’に向かってHindIII部位、XbaI部位、コザック配列及びシグナル配列の最初の6個のアミノ酸を付加した。PCR産物をXbaI及びBsmBIで消化した後、ヒトIgG1定常領域を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。このベクターはSV40プロモーター及びDHFR選択を含有する。各ファージ由来の軽鎖はκ又はλクラスの何れかであった。各軽鎖について、相補的プライマーは、5’から3’に向かってHindIII部位、XbaI部位、コザック配列及びシグナル配列上記を付加するように設計した。誤りのないコード領域を有するこれらの鎖を完全長産物としてクローニングした。1例として、シグナル配列の最後の7アミノ酸を付加するプライマー2627-69GTGGTTGAGAGGTGCCAGATGTGACATTGTGATGACTCAGTCTCC;配列番号208及び停止コドンの後にSalI部位を付加するプライマー2458-54CTTGTCGACTTATTAACACTCTCCCCTGTTG;配列番号209を用いて、ファージクローン536由来の軽鎖配列番号11及び配列番号210を完全長コード領域として増幅させた。次いで、上述のようにそれぞれプライマー2458-54の対としてさらなる5’プライマー2148-98及び2489-36を用いてこのPCR産物を増幅させて、シグナル配列及びクローニング部位を付加した。上述の哺乳動物発現ベクターに完全長軽鎖をXbaI-SalI断片としてクローニングした。ある種のλクローンは、天然のヒト定常域配列に比してその定常領域に誤りを有していた。これらの差異を補正するために、完全λ定常領域及びファージ由来可変領域をコードするDNAを用いて重複PCRを実施した。これらのクローンも上述のようにXbaI-SalI断片としてクローニングした。κ可変領域を定常領域とは別にクローン化した場合、PCR産物の3’末端にBsmBI部位を付加した。PCR産物をXbaI及びBsmBIで消化した後、ヒトκ鎖定常領域を含む発現ベクターにκ鎖可変領域をクローニングした。通常製造業者が示唆するプロトコルに従い、リン酸カルシウムトランスフェクションキットInvitrogenCorp.を用いて、各変換ファージ由来の対の軽鎖及び重鎖構築物をCHO細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションから14-16時間後に培地を交換し、製造業者が推奨するように約48時間後選択のために組織培養ディッシュに細胞を継代した。トランスフェクトされた細胞を約3週間HT選択により単離し、この時点でトランスフェクトCHO細胞コロニーをトリプシン処理し、トランスフェクト細胞のプールと合わせた。48時間後小規模の馴化培地を回収し、抗-ヒトFc抗体、抗-ヒトκ抗体又は抗-ヒトλ抗体の何れかを用いるウェスタンブロット分析により抗体産生についてアッセイした。次いで、4本の850cm2ローラーボトルにそれぞれ2x107個の生存細胞を接種し、DMSOを用いて凍結ストック細胞株を作製するのに十分な細胞が得られるまで、一般的な組織培養滅菌法を用いて、選択細胞集団を選択圧下で継代した。接種後、ローラーボトル中にグルタミン及び非必須アミノ酸を補充した約10血清含有DMEM培地Gibco/BRL,Inc中で細胞を維持した。約80の細胞集密度に達するまで細胞を2-3日間維持した。この時点で、グルタミン及び非必須アミノ酸を補充した無血清混合培地50DMEM、50F12;Gibcoへと、ローラーボトル中の培地を交換した。7日後、馴化培地を回収し、1又は2回のさらなる収集毎に新しい無血清培地を添加した。直接標準方法を用いて、プロティンGアフィニティークロマトグラフィーにより、馴化培地から直接抗体を精製した。プロティンGカラムから低pHpH約3緩衝液を用いて溶出させ、その後、1MTrispH8.5を用いて溶出抗体タンパク質を中和し、次いで10kD分子量カットオフ遠心濃縮機を用いて濃縮した。次いで、濃縮した抗体ストックをPBSへと緩衝液交換した。31種類の抗体を作製し、各抗体は下表2で示すように2つの重鎖及び2つの軽鎖κ又はλから構成されている。本明細書のようにhAng-2、mAng-2及びhAng-1への結合に対して試験した。いくつかのλ軽鎖定常領域は、複数の生殖系列λ定常領域遺伝子のキメラであると思われる。Kabat系を用いて番号を付して、最も近いλ定常領域生殖細胞系列遺伝子を、生殖細胞系列遺伝子とは異なるアミノ酸とともに示す。次の4つの表は、ファージから全長IgG1抗体に変換した、31種類の抗-Ang-2抗体の重及び軽カッパ及びラムダ鎖の配列及び配列番号を示す。KabatらSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNIHPublicationNo.91-3242;U.S.Dept.HealthandHumanServices,第5版により述べられた技術を使用するVBASEデータベースを用いてモノクローナル抗体の相補性決定領域CDRを予想した。MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UKから利用可能なツールを用いて、最も近い生殖細胞系列配列を有するデータベース中の配列に対して、Fab領域をアラインし、次いでこのような配列を目視で比較した。各可変領域に対するCDR重又は軽鎖を表7で示す。17個の抗体及びネガティブ対照IgG1RDBIと呼ぶをアフィニティー及び中和ELISA上記実施例3に記載ならびにBIAcore中和アッセイを用いて試験して、それらの親和性、中和及び特異性の能力を調べた。結果を下表8に示し、標準的な手順を用いて計算した。上述のBIAcore分析を用いてクローン536及びクローン545の2個の抗体を評価した。抗体結合をBIAcoreアッセイについて上述のように測定したが、KDが低いほど、親和性が高いことを示す。結果を下表9に示す。上記で分析したクローン536は、2種類の抗体変異体の混合物を含有し、これを表4で配列番号12536κTHW及び配列番号210536κLQTとして示す。これら2種類の536変異体を分離し、ELISA及びHTRPアッセイを用いて効力について個別に分析した。ELISAアッセイの場合、293T細胞馴化培地DMEM/50μg/mLBSA中で、37°Cにて1時間、96ウェルマイクロタイタープレートを組換えアンジオポエチンで被覆した。1nMhTie2-FcRDSystems、カタログ番号313-TIに対する最大到達結合の80を与えるアンジオポエチン濃度で馴化培地を使用した。PBS/0.1Tween-20でプレートを洗浄し、次いでPBS/5BSAを用いて室温で2時間ブロッキングした。PBS/1BSA/1nMTie2の溶液中の100nMから0.4pMまで漸増させたアンジオポエチン中和物質をアンジオポエチン被覆プレートに添加し、これを室温にて一晩インキュベートし、次いで、PBS/0.1TweeN-20で洗浄した。マウス由来抗-Tie2抗体BDPharmingenInc.,カタログ番号557039を各プレートに最終濃度1μg/mLで添加し1時間、室温にてインキューション、その後、プレートをPBS/0.1TweeN-20中で洗浄した。ヤギ抗-マウス-IgG-HRPPierce、カタログ番号31432をPBS/1BSA中の1:10,000希釈で添加し1時間、室温にてインキューション、その後、PBS/0.1Tween-20でプレートを数回洗浄した。TMB基質Sigma、カタログ番号T8665を添加し、O.D.370nm吸収を測定し、Tie2標準曲線に対して比較することにより、アンジオポエチン:Tie2中和の程度を求めた。HTRFアッセイの場合、0.8nMEuropium-結合ストレプトアビジンPERKINELMERLIFESCIENCESINC.、カタログ番号AD0062及び4.0nMビオチン化ヒトアンジオポエチン1RDSystems又はアンジオポエチン2AmgenInc.を含有するHTRF緩衝液50mMTris-HCl、pH7.5、100mMNaCl、0.05Tween20、0.1BSA50μLを各ウェルに添加することにより、96ウェルマイクロタイターミックスプレートを調製した。個々のマイクロタイタープレートにおいて、アンジオポエチン中和物質をHTRF緩衝液中400nMから20pMまで漸増させ、次いで、各連続希釈アンジオポエチン中和物質50μLを移し、ストレプトアビジン-Europium/アンジオポエチンを含有するミックスプレートと混合した。次に、室温にて1時間、このプレートを振盪器でインキュベートした。次に、HTRF緩衝液中10nMヒトアロフィコシアニン結合ヒトTie2-Fc20μLを含有するアッセイプレートに、96ウェルのそれぞれにおいて、ミックスプレートの各ウェルからの20μLを移した。最終アッセイプレートを室温で2時間振盪しながらインキュベートした。アッセイプレートの最終濃度は、1.0nMアンジオポエチン、5.0nMヒトTie2-Fc及び連続希釈アンジオポエチン-中和物質に対して100nMから50pMであった。RubystarプレートリーダーBMGLabtechnologies,Offenberg,Germanyを用いてアッセイプレートを分析した。アンジオポエチン-中和物質なしの対照阻害ゼロを表す。及びアンジオポエチンなし対照完全阻害を表す。を用いて各アンジオポエチン-中和物質希釈物の阻害を計算することにより、アンジオポエチン:Tie2中和の程度を求めた。次に、GRAFIT5.0プログラムErithacusSoftwareLtd.を用いて阻害を分析することにより、IC50値を計算した。結果は全て、下記式を用いてデュプリケートで試験した試料から計算したIC50曲線として表した。IC50の結果は、2パラメーター方程式に対する阻害データにフィットし、ここで、データ下限値は0であり即ち、データはバックグラウンド補正された。、上限値は100即ち、データは範囲補正された。であった。この方程式において、sは傾斜因子である。この方程式は、xの上昇に伴いyが落下すると仮定する。ソフトウェアプログラムGRAFIT5.0ErithacusSoftwareLimitedにおいてこの方程式を利用した。結果を表10及び11で示す。抗-Ang-2抗体を用いた治療効率試験プロティンG精製したウサギ抗-Ang-2ポリクローナル抗体の薬物動態をマウスで調べた。ポリクローナル抗-Ang-2ウサギ抗体1mg/マウスを用いて24匹のマウスを処置した。抗体を注射してから1時間、6時間、1日、3日、7日及び14日後の各時点で、処置マウス4匹を屠殺した。結果から、トータルウサギIgGの血清中循環半減期が約19日であったのに対し、トータルIgGの抗-Ang-2IgG成分の半減期は約8日であったことが示された。治療効率を評価するために、異種移植後1、5、6、7、8、12、13、14、15及び18日目に、A431腫瘍異種移植片を有するマウス1群10匹にプロティンG精製抗-Ang-2ポリクローナル抗体を10回腹腔内投与した約10mgIgG/マウス/投与。7、12、15、19及び21日目に腫瘍サイズを測定した。0、7、15及び21日目に体重を測定したところ、体重は治療により影響を受けなかった。結果から、ANOVAの繰り返し測定により、非免疫精製ポリクローナル抗血清10mgIgG/マウス/投与及びビヒクルPBSの対照と比較して、抗-Ang-2-ポリクローナル抗体が約50p=0.008、A431腫瘍異種移植片の増殖を抑制することが示された。完全ヒトモノクローナル抗-Ang-2抗体の効果をインビボで試験するために、A431腫瘍異種移植片を有するマウス1群10匹に対して抗-Ang-2抗体のクローン533、537もしくは544又はネガティブ対照のPBS又はヒトIgG1-κを腹腔内投与した。最初は約420μg/マウスのタンパク質を投与し、その後3回はそれぞれ約140μg/マウスのタンパク質を投与し、次の4回は約55μg/マウスのタンパク質を投与し、1匹のマウスあたり合計8回投与した。腫瘍体積及び体重を1週間に2回記録した。研究の最後に、動物を屠殺し、ELISAにより抗体レベルを測定するために血清を回収した。腫瘍及び一連の正常組織を全群から回収した。図1で示されるように、抗-Ang-2処理群とコントロール群との間で腫瘍増殖の点で顕著な差が見られた。3種類の抗-Ang-2処理群は全て、対照と比較して腫瘍増殖を抑制した3個全ての抗体についてANOVAの繰り返し測定を用いて、全ての処理群でhIgG1対照に対してp<0.005。その一方、対照群の腫瘍は非常に速い速度で増殖し続けた。エピトープマッピングC末端6xHisタグを有するCMV作動性哺乳動物発現ベクターに、完全長アミノ酸1-495、N末端アミノ酸1-254及びC末端アミノ酸255-495ヒトAng-2hAng-2タンパク質をクローニングした。得られた3種類の構築物及びベクター対照を293T細胞に一過的に発現させた。次いで、トランスフェクトした細胞から馴化培地を回収し、この培地中のAng-2の発現レベルを抗-6xhisELISA及びウェスタンブロッティングにより推定した。以下のプロトコルに従うELISAにより、抗-Ang-2抗体及びペプチ体の結合エピトープが3種類のヒトhAng-2を結合する能力を調べた:高結合96ウェルアッセイプレートを馴化培地100μl/ウェルで被覆し、37°Cにて1時間インキュベートした。馴化培地を吸引し、PBS中5BSA200μL/ウェルにより室温にて1時間、プレートのブロッキングを行った。その後、ブロッキング溶液を吸引した。抗体、ペプチ体又はTie2-Fc100μL/ウェルをPBS中1BSAにおいて1μg/mLになるように添加し、室温にて1時間インキュベートした。200μLのPBS中の0.1Tweenで4回ウェルを洗浄した。HRP結合ヤギ抗-ヒトIgG又はヤギ抗-マウスIgG100μL/ウェルを添加し、室温にて45分間インキュベートした。次いで、PBS中0.1Tween200μLでウェルを4回洗浄した。次いで、TMB基質100μL/ウェルを添加した。O.D.を370nmで読み取った。結果を図2A、図2B及び図2Cに示す。"