"野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。生理的条件が、invivoである、請求項2に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で約3時間にわたって観測される、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、細胞培養培地中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、細胞内でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。細胞内が、リソソーム内である、請求項7に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。リソソーム内部が、約pH5および約37°Cの条件にある、請求項8に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、減少したタンパク質分解を特徴とする、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。減少したタンパク質分解が、細胞中で生じる、請求項10に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。細胞中が、リソソーム中である、請求項11に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、非生理的条件におけるものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、タンパク質精製の際の緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、タンパク質精製の際の約7より高いpHを有する緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、タンパク質精製の際の約3未満のpHを有する緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、有機溶媒を含む緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、カオトロピック塩を含む緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、約2°C~約37°Cの範囲の温度における緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、約2°C~約8°Cの範囲の温度における緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、約20°Cの温度における緩衝溶液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、凍結融解サイクル後のものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、凍結乾燥後の再構成におけるものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、薬物配合緩衝液中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理食塩水中でのものである、請求項1に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。生理的条件が、invivoである、請求項27に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。保持されている触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で2時間または3時間の時間経過にわたって観測される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、細胞培養培地中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、細胞内で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。細胞内が、リソソーム内である、請求項32に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。リソソーム内部が、約pH5および約37°Cの条件にある、請求項33に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。保持されている触媒活性が、減少したタンパク質分解によって特徴づけられる、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。減少したタンパク質分解が、細胞中で生じる、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。細胞中が、リソソーム中である、請求項36に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。保持されている触媒活性が、非生理的条件におけるものである、請求項26記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の約7より高いかまたはそれに等しいpHを有する緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、タンパク質精製の際の約3未満またはそれに等しいpHを有する緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、有機溶媒を含む緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、カオトロピック塩を含む緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、約2°C~約37°Cの範囲の温度における緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、約2°C~約8°Cの範囲の温度における緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、約20°Cの温度において緩衝溶液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、凍結融解サイクル後に保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、凍結乾燥後の再構成後に保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、薬物配合緩衝液中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。より高い触媒活性が、生理食塩水中で保持される、請求項26に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。次の位置:316、317、321および145の一つ以上にアミノ酸変異を含む、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異F316AおよびL317Fを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項52に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項53に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項53に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項52に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項56に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項52に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項58に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項58に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異K321Nを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項61に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項62に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項62に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項61に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項65に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項61に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項67に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項67に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異K321Aを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項70に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項71に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項71に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項70に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項74に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項70に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項76に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性を、生理的条件で保持される、請求項77に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異K321Vを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項79に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項80に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項80に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約1.4倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項79に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項83に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項79に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項85に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項85に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異H145Lを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項88に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項89に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項89に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項88に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項92に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項88に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項94に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項94に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Nを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項97に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項98に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項98に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項97に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項101に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項97に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項103に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項103に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Aを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項106に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項107に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項107に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項106に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項110に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項106に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項112に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項112に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Vを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項115に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項116に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項116に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約1.4倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項115に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項119に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項115に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項121に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項121に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異H145LおよびK321Nを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項124に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項125に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項125に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項124に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項128に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項124に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項130に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項130に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異H145LおよびK321Aを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項133に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項134に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項134に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項133に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項137に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項133に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項139に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項139に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異H145LおよびK321Vを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項142に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項143に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項143に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約1.4倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項142に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項146に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項142に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項148に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項148に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。アミノ酸変異H145L、F316AおよびL317Fを更に含む、請求項51に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする、請求項151に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、生理的条件におけるものである、請求項152に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した安定性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件におけるものである、請求項152に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有することを特徴とする、請求項151に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。延長した見掛け半減期が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項155に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を保持することを特徴とする、請求項151に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件での約3時間にわたるインキュベーション後に測定される、請求項157に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。増加した触媒活性が、生理的条件で保持される、請求項157に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した触媒活性を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を製造する方法であって、a変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を発現させること、およびb変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を精製することを含む方法。請求項51、請求項52、請求項61、請求項70、請求項79、請求項88、請求項97、請求項106、請求項115、請求項124、請求項133、請求項142または請求項151のいずれか1項に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる担体を含む組成物。請求項51、請求項52、請求項61、請求項70、請求項79、請求項88、請求項97、請求項106、請求項115、請求項124、請求項133、請求項142または請求項151のいずれか1項に記載の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該タンパク質のループ1領域中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸は、該タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより安定であることを特徴とする、請求項163に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでより安定であることを特徴とする、請求項164に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲で巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする、請求項163に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHで巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする、請求項166に記載のタンパク質。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該タンパク質の活性部位付近のαヘリックスα6中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸側部は、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ1を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有する側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする、請求項168に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする、請求項169に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより活性なコンホメーションを有することを特徴とする、請求項168に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでより活性なコンホメーションを有することを特徴とする、請求項171に記載のタンパク質。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中に一つ以上の置換アミノ酸を含み、該一つ以上の置換アミノ酸側鎖は、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションを有することを特徴とする、タンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより安定であることを特徴とする、請求項173に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでより安定であることを特徴とする、請求項174に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型β-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲で異なった残基および二次構造の間により良い相互作用を有することを特徴とする、請求項173に記載のタンパク質。タンパク質が、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHで異なった残基および二次構造の間により良い相互作用を有することを特徴とする、請求項176に記載のタンパク質。リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含む方法。リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えしたがって、タンパク質生産段階からそれを必要としているヒト対象中への導入時に遭遇すると考えられる生理的条件を通して、酵素失活にそれほど感受性ではない、より安定なβ-グルコセレブロシダーゼ酵素を開発することは、好都合であると考えられる。概要0006本明細書中で提供するのは、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中において更に提供するのは、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質である。本明細書中に更に記載しているのは、次の一つ以上の位置:316、317、321および145にアミノ酸変異を有することができる変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質である。0007本明細書中に記載しているのは、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を製造する方法である。本明細書中に更に記載しているのは、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる担体を含む組成物である。本明細書中において更に提供するのは、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物である。0008本明細書中に記載しているのは、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であり、該一つ以上の置換アミノ酸は、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする。本明細書中に更に記載しているのは、タンパク質の活性部位付近のαヘリックスα6中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該一つ以上の置換アミノ酸の側鎖は、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ1を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有する側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とする。本明細書中において更に提供するのは、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質であって、該一つ以上の置換アミノ酸の側鎖は、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にするという側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とする。0009本明細書中において提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、それを必要としている対象に、次の一つ以上の位置:316、317、321および145にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。本明細書中において更に提供するのは、ゴーシェ病を処置する方法であって、それを必要としている対象に、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することによる方法である。0010本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物である。0011本明細書中において更に提供するのは、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した発現が可能であることを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質である。0012本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物を製造する方法である。本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードしている核酸を製造する方法である。図面の簡単な説明0013前述のおよび他の本発明の側面は、添付の図面に関連して考えた場合、以下の本発明の詳細な説明から明らかである。本発明を説明するために、現在のところ好適である態様を図面に示しているが、しかしながら、本発明は、開示されている特定の手段に制限されないということは理解される。図面は、必ずしも、一定尺度で描かれていない。図面においては、以下である。0017本内容は、本開示の一部分を成している添付の図面および実施例に関連して与えられる以下の詳細な説明を参照することにより一層容易に理解することができる。本発明は、本明細書中に記載のおよび/または示されている特定の装置、方法、用途、条件またはパラメーターに制限されないということ、および本明細書中で用いられる専門用語は、単に例として特定の態様を記載する目的のためにあり、特許請求の範囲に記載の発明を制限することを意図するものではないということは理解されるはずである。0018更に、添付の特許請求の範囲を含めた明細書中に用いられる場合、あるa,anおよびそのtheという単数形は、複数形を包含し、そして特定の数値への言及は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、少なくともその特定の値を包含する。複数という用語は、本明細書中で用いられる場合、一つより多いことを意味する。値の範囲が表されている場合、別の態様は、一つの特定の値からおよび/または他の特定の値までを包含する。同様に、近似値として値が表されている場合、約という先行詞の使用により、その特定の値が別の態様を成すと理解される。範囲は全て、包括的で且つ組み合わせ可能である。0019本発明の更なる理解を助けるために例を与える。用いられる特定の材料、プロトコルおよび条件は、本発明を更に説明することを意図するものであり、妥当な発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。0020特に断らない限り、変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質特性は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質特性SEQIDNO:1に相対して述べられている。本明細書中において、GlcCeraseは、β-グルコセレブロシダーゼについて用いられる略語である。アミノ酸番号は全て、SEQ.ID.NO.1に相対している。したがって、145位は、SEQ.ID.NO.1中に存在する145番目のアミノ酸であると考えられる。更に、本明細書中に開示の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質には、それらの機能性フラグメントまたは誘導体も含まれる。0021本明細書中において、ほぼ中性pHは、通常は生理的pHすなわち、37°Cで約7.5のpHと考えられるpHを包含する意味である。0022適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、細胞培養およびタンパク質生産の際に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して、細胞培養培地中への同様のまたは増加したタンパク質発現および分泌を有することを特徴とすることができる。適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して増加した安定性を有することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、生理的条件で増加した安定性を有し、そしてそれら生理的条件は、invivoでありうる。更に、これらのタンパク質は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で増加した安定性を有することを特徴とすることもできる。この増加した安定性は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で約3時間にわたって観測されうる。増加した安定性は、細胞培養培地中で保持され、しかも細胞内で保持されうる。これらのタンパク質は、リソソーム内で増加した安定性を有することもでき、そしてリソソーム内での条件は、約pH5および約37°Cでありうる。これらのタンパク質は、減少したタンパク質分解により特徴づけられる増加した安定性を有することもでき、そして減少したタンパク質分解は、細胞中で起こりうる。更に、減少したタンパク質分解は、細胞中のリソソーム中でありうる。これらのタンパク質は、タンパク質精製の際の緩衝溶液中などの非生理的条件で増加した安定性を有することもできる。これらの緩衝溶液は、タンパク質精製の際に約7より高いpHまたは約3未満のpHを有することができる。これらの緩衝溶液は、有機溶媒またはカオトロピック塩を含有することもできる。これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約2°C~約37°Cの範囲の温度で増加した安定性を有することもできる。更に、これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約2°C~約8°Cの範囲の温度で増加した安定性を有することもできる。更に、これらのタンパク質は、緩衝溶液中において約20°Cの温度で増加した安定性を有することができる。これらのタンパク質は、凍結融解サイクル後にまたは凍結乾燥後の再構成後に増加した安定性を有することもできる。これらのタンパク質は、生理食塩水などの薬物配合緩衝液drugformulationbuffer中で増加した安定性を有することもできる。0023適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、生理的条件でより高い触媒活性を保持しており、そのより高い保持されている触媒活性は、invivoでありうる。更に、これらのタンパク質は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件でより高い触媒活性を保持していることを特徴とすることもできる。このより高い保持されている触媒活性は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で約2時間にわたって観測されうる。これらのタンパク質は、細胞培養培地中でより高い触媒活性を保持しており、そのより高い保持されている触媒活性は、細胞内でありうる。更に、これらのタンパク質は、リソソーム内でより高い触媒活性を保持していることができ、そしてリソソーム内での条件は、約pH5および約37°Cでありうる。これらのタンパク質は、減少したタンパク質分解により特徴づけられるより高い触媒活性を保持していることもでき、そして減少したタンパク質分解は、細胞中で起こりうる。更に、減少したタンパク質分解は、細胞中のリソソーム中でありうる。これらのタンパク質は、タンパク質精製の際の緩衝溶液中などの非生理的条件でより高い触媒活性を保持していることもできる。これらの緩衝溶液は、タンパク質精製の際に約7より高いpHまたは約3未満のpHを有することができる。これらの緩衝溶液は、有機溶媒またはカオトロピック塩を含有することもできる。これらのタンパク質は、約2°C~約37°Cの範囲の温度でより高い触媒活性を保持していることもできる。更に、これらのタンパク質は、約2°C~約8°Cの範囲の温度でより高い触媒活性を保持していることもできる。更に、これらのタンパク質は、約20°Cの温度でより高い触媒活性を保持していることができる。これらのタンパク質は、凍結融解サイクル後にまたは凍結乾燥後の再構成後により高い触媒活性を保持していることもできる。これらのタンパク質は、生理食塩水などの薬物配合緩衝液中でより高い触媒活性を保持していることもできる。0024変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、次の一つ以上の位置:316、317、321および145にアミノ酸変異を有することもできる。これらのタンパク質は、一つまたは複数のアミノ酸変異:1F316AおよびL317F;または2K321N;または3H145L;または4H145F;または5F316A、L317FおよびK321N;または6K321A;または7K321V;8F316A、L317FおよびK321A;または9F316A、L317FおよびK321V;または10H145L、F316AおよびL317F;または11H145LおよびK321N;または12H145LおよびK321A;または13H145LおよびK321Vを有することができる。これらのタンパク質のいくつかは、細胞培養およびタンパク質生産の際に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質に相対して、細胞培養培地中への同様のまたは増加したタンパク質発現および分泌を有することを特徴とすることもできる。これらのタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した安定性を有することを特徴とすることもできる。これらのタンパク質は、生理的条件で増加した安定性を有することを特徴とすることもでき、そしてこれら条件は、ほぼ中性pHおよび約37°Cである。これらのタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持することを特徴とすることもできる。その触媒活性は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で約2時間にわたってインキュベーションした後に測定することができる。これらのタンパク質は、生理的条件でより高い触媒活性を保持することを特徴とすることもできる。アミノ酸変異F316AおよびL317Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異K321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異K321Aを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異K321Vを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約1.4倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異H145Lを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異H145Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異H145L、F316AおよびL317Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約2倍長い延長した見掛け半減期を有する。アミノ酸変異H145LおよびK321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼより少なくとも約3倍長い延長した見掛け半減期を有する。この延長した見掛け半減期は、ほぼ中性pHおよび約37°Cの条件で約2時間にわたってインキュベーションした後に測定することができる。実施例1試薬00254-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコシド4MUG蛍光発生基質は、ResearchProductsInternationalMtProspectILより購入した。DNAGelExtractionキットおよびMiniprepDNA登録商標キットは、QIAGEN登録商標ValenciaCA製であった。PureYieldMaxiprepDNAkitTMは、PromegaTMMadisonWI製であった。特に断らない限り、化学薬品は、SigmaTMStLouisMO製であった。Fugene-HDTMトランスフェクション試薬は、RocheTMIndianapolisIN製であった。pEF6/V5-HisATM哺乳動物発現ベクター、ダルベッコ改変イーグル培地Dulbecco’smodifiedEaglemediumDMEM、ウシ胎仔血清FBSおよび他の組織培養試薬は、InvitrogenTMCarlsbadCA製であった。野生型ヒト野生型β-グルコセレブロシダーゼcDNANM_000157.3は、OrigeneTMRockvilleMDより購入した。制限エンドヌクレアーゼ、Phusion-HFTMDNAポリメラーゼ、T4DNAリガーゼ、Antarcticホスファターゼ、化学的コンピテント大腸菌EcoliDH5α細胞およびエンドグリコシダーゼPNGアーゼFおよびEndoHは全て、NewEnglandBiolabsTMIpswichMAより購入した。ヒト胚性腎細胞T抗原で形質転換済み;HEK293Tは、ATCCTMからであった。検定0026変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は全て、ヒト細胞株HEK293Tにおける一過性発現によって試験し、タンパク質発現を評価した。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質または野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質の触媒活性を試験するためのレポーターシステムは、4-MU-β-グルコース蛍光発生基質を約pH5.2および約37°Cで加水分解する性能であった。これらの変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質の安定性は、ほぼ中性pHおよび約37°Cで約3時間にわたってインキュベーションした後の各々のタンパク質の触媒活性の保持を観測することによって試験した。これら実験における条件は、患者へのβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質酵素置換療法の静脈内注入の際に存在すると考えられる環境に似ているように設計した。0027より具体的には、決して制限すると解釈されるものではないが、HEK293T細胞を、10FBSを補充した1mlのDMEM培地を含む12ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして37°Cにおいて5CO2雰囲気でインキュベートした。HEK293T細胞が、80~90密集に達した時に、消費された培地を、1mlの新鮮DMEM/10FBS培地と交換し、そして各々のウェルを、個々のβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質のための1μgのプラスミドDNAまたはPBSモックトランスフェクション陰性対照のためで、3μlのFugene-HDトランスフェクション試薬を製造者のプロトコルにしたがって用いて、トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、24~72時間インキュベートし、そして培地中に分泌される組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質の発現について酵素活性検定によって毎日検査した。0028β-グルコセレブロシダーゼタンパク質発現および細胞培養培地中への分泌は、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験からの24時間、48時間または72時間後の馴化培地および4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコシド4-MUG蛍光発生基質を用いて評価した。簡単にいうと、各々の試料からの20μlの馴化培地を、指定の時点で採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中において80μlのMcIlvane緩衝液MI緩衝液:50mMクエン酸ナトリウム/リン酸ナトリウムpH5.2/0.25v/vTritonX-100/0.25w/vタウロコール酸ナトリウムで希釈した。各25μlの希釈試料を、96ウェル黒色透明底プレートの個々のウェル中に小分けし三連で行った、そして50μlの6mM4-MUG基質MI緩衝液中で調製を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらのプレートを、カバーテープで密封し、37°Cで1時間インキュベートした。酵素反応は、125μlの0.1MNaOHを加えることによって止め、そして遊離した4-MU蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて355nm励起波長および460nm発光波長をそれぞれ用いて読み取った。モックトランスフェクションした試料からの4-MU蛍光は、バックグラウンド対照として役立ち、全てのβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質試料から差し引いた。0029細胞培養培地中に存在する野生型および変異型酸性β-グルコセレブロシダーゼタンパク質の量を推定するために、一過性トランスフェクション実験からの馴化細胞培養培地を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEに供し、そして標準的な技法を用いてニトロセルロースメンブランに移した。次に、そのメンブランを、ブロッキング緩衝液BlockingBuffer:50mMTRIS緩衝生理食塩水pH7.5/0.1v/vTween-20TBST中の4w/v脱脂乳と一緒に室温で振とうしながら1時間インキュベートした。次に、メンブランを、ブロッキング緩衝液中で1:2500に希釈したウサギ抗ヒトβ-グルコセレブロシダーゼポリクローナル一次抗体ヒト酸性β-グルコセレブロシダーゼのC末端に相当する19アミノ酸ペプチドに対して産生させた;SigmaG-4171と一緒に室温で1時間または4°Cで一晩振とうしながらインキュベートした。次に、そのブロットを、TBSTで、室温において振とうしながら1時間にわたって少なくとも3回の緩衝液交換で洗浄した。次に、ブロットを、ブロッキング緩衝液中で1:10,000に希釈した酵素結合二次抗体例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体と一緒に室温で振とうしながら1時間インキュベートした。そのブロットを、TBSTで、室温において振とうしながら1時間にわたって少なくとも3回緩衝液交換して洗浄した。次に、ブロットを、化学発光基質例えば、Pierce’sSupersignalWestDuraExtendedDurationSubstrateTMと一緒に室温で5分間インキュベートし、そして画像化システムによってまたはフィルムによって可視化して、野生型および変異型酸性β-グルコセレブロシダーゼ酵素についてのタンパク質発現レベルを評価した。0030β-グルコセレブロシダーゼタンパク質安定性を評価するために、一過性発現した変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質および精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質すなわち、CerezymeTMを、中性pH緩衝液中において37°Cでインキュベートし、酵素活性について検定して、触媒活性喪失の程度を約3時間にわたって決定した。簡単にいうと、60μlの馴化培地個々の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を含有を、トランスフェクション後24時間または48時間後に採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中の420μlの0.1Mリン酸カリウムpH7.5/0.2v/vTritonX-100/0.2w/vBSAに加えた。同様に、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を、DMEM培地/10FBS中で1:12,500に段階希釈し、そして60μlのこの希釈した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質試料を、420μlの0.1Mリン酸カリウムpH7.5/0.2v/vTritonX-100/0.2w/vBSAに加えて、1:100,000の最終希釈物を得た。野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質のこの量は、経験的に、一過性発現した組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と同様の量の酵素活性を含有すると決定した。試料は全て、37°C水浴中でインキュベートし、そして70μlの各試料を、指定の時点0分、30分、60分、90分、120分または180分で取り出し、20μlの0.5MNaOAcpH5.2が入っている新しい0.5mlミクロ遠心管に加えた。それらの試料を十分に混合し、そして25μlの各希釈試料を用いて、残留する組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質酵素活性三連を上記のように測定した。t=0分での初期酵素活性を、各々の組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質について100としたが、それ以後の全ての時点の酵素活性を、初期活性に対して正規化して、残留する酵素活性を時間経過全体にわたって決定した。多重実験少なくとも2回の別々の実験からのデータを用いて、個々の時点について残留する組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質活性の平均値を得、そして示されるインキュベーション時間に相対してグラフに示した。実施例20031特定のアミノ酸置換を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質の発現を、上記の一過性トランスフェクション実験を用いて野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した図1。図1Aで理解されうるように、F316AおよびL317F変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-F316A/L317F、K321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-K321N、H145L変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145L、F316A、L317FおよびK321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-F316A/L317F/K321N、H145LおよびK321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145L/K321Nを、HEK293T細胞中において野生型GlcCeraseと共に一過性発現させた。馴化細胞培養培地を、トランスフェクションの48時間後に採取し、そしてβ-グルコセレブロシダーゼ酵素活性について、4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコシド4-MUG蛍光発生基質を用いて検定して、野生型GlcCeraseと比較してこれらの変異型GlcCerase酵素の相対発現レベルを評価した。これら結果は、異なった変異型GlcCerase酵素が、細胞培養培地中のより高い実測酵素活性によって示されるように、野生型GlcCeraseと同様にまたはより良く発現したということを示している。GlcCerase-H145F、GlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321Nを含めた他の変異型GlcCerase酵素も、野生型GlcCeraseより良く発現したデータは示さない。GlcCerase-K321AおよびGlcCerase-H145F/F316A/L317F/K321Nは、野生型GlcCeraseとおよそ同レベルで発現したが、GlcCerase-K321Vは、野生型GlcCeraseほど効率よく発現しなかったデータは示さない。馴化細胞培養培地中に存在する変異型GlcCeraseタンパク質および野生型GlcCeraseタンパク質の量は、上記のようにウェスタンブロッティングを用いて評価した。図1Bで理解されうるように、馴化細胞培養培地中には、野生型GlcCeraseより多量のGlcCerase-F316A/L317FおよびGlcCerase-K321Nタンパク質が存在した。これらのウェスタンブロッティングデータは、GlcCerase酵素活性結果と一致し、しかも特定の変異型GlcCerase酵素を野生型GlcCeraseより良く発現し且つ分泌するということを確認する。同様の結果を、他の変異型GlcCeraseタンパク質について認めたデータは示さない。実施例30032F316AおよびL317F変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-F316A/L317Fを、上記のinvitro安定性検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-F316A/L317Fは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで2時間または3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-F316A/L317Fは、30分のインキュベーション後にその初期活性の85を保持した。GlcCerase-F316A/L317Fは、60分のインキュベーション後にその初期活性の73を保持した。GlcCerase-F316A/L317Fは、120分のインキュベーション後にその初期活性の50を保持した。GlcCerase-F316A/L317Fは、180分のインキュベーション後にその初期活性の34を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0033GlcCerase-F316A/L317Fの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ120分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。GlcCerase-F316A/L317Fは、約pH8および約37°Cでも試験したが、同様の傾向を示した図3。GlcCerase-F316A/L317Fおよび野生型GlcCeraseは双方とも、約pH8および約37°Cでより安定性が低かったが、これらの結果は、GlcCerase-F316A/L317Fが、より高いpHにおいて野生型GlcCeraseより安定であるということを確認する。実施例40034K321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-K321Nを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-K321Nは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-K321Nは、30分のインキュベーション後にその初期活性の104を保持した。GlcCerase-K321Nは、60分のインキュベーション後にその初期活性の91を保持した。GlcCerase-K321Nは、120分のインキュベーション後にその初期活性の76を保持した。GlcCerase-K321Nは、180分のインキュベーション後にその初期活性の54を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0035GlcCerase-K321Nの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ180分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例50036H145L変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145Lを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-H145Lは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-H145Lは、30分のインキュベーション後にその初期活性の92を保持した。GlcCerase-H145Lは、60分のインキュベーション後にその初期活性の87を保持した。GlcCerase-H145Lは、120分のインキュベーション後にその初期活性の62を保持した。GlcCerase-H145Lは、180分のインキュベーション後にその初期活性の42を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0037GlcCerase-H145Lの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ160分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例60038H145F変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145Fを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図1で理解されうるように、GlcCerase-H145Fは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-H145Fは、30分のインキュベーション後にその初期活性の94を保持した。GlcCerase-H145Fは、60分のインキュベーション後にその初期活性の80を保持した。GlcCerase-H145Fは、120分のインキュベーション後にその初期活性の37を保持した。GlcCerase-H145Fは、180分のインキュベーション後にその初期活性の17を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0039GlcCerase-H145Fの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ100分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例70040F316A、L317FおよびK321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-F316A/L317F/K321Nを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-F316A/L317F/K321Nは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-F316A/L317F/K321Nは、30分のインキュベーション後にその初期活性の101を保持した。GlcCerase-F316A/L317F/K321Nは、60分のインキュベーション後にその初期活性の91を保持した。GlcCerase-F316A/L317F/K321Nは、120分のインキュベーション後にその初期活性の75を保持した。GlcCerase-F316A/L317F/K321Nは、180分のインキュベーション後にその初期活性の52を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0041GlcCerase-F316A/L317F/K321Nの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ180分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例80042H145L、F316AおよびL317F変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145L/F316A/L317Fを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。GlcCerase-H145L/F316A/L317Fは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-H145L/F316A/L317Fは、30分のインキュベーション後にその初期活性の77を保持した。GlcCerase-H145L/F316A/L317Fは、60分のインキュベーション後にその初期活性の80を保持した。GlcCerase-H145L/F316A/L317Fは、120分のインキュベーション後にその初期活性の56を保持した。GlcCerase-H145L/F316A/L317Fは、180分のインキュベーション後にその初期活性の39を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0043GlcCerase-H145L/F316A/L317Fの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ135分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例90044H145LおよびK321N変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-H145L/K321Nを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-H145L/K321Nは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-H145L/K321Nは、30分のインキュベーション後にその初期活性の89を保持した。GlcCerase-H145L/K321Nは、60分のインキュベーション後にその初期活性の86を保持した。GlcCerase-H145L/K321Nは、120分のインキュベーション後にその初期活性の76を保持した。GlcCerase-H145L/K321Nは、180分のインキュベーション後にその初期活性の62を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0045GlcCerase-H145L/K321Nの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ180分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例100046K321A変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-K321Aを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。図2で理解されうるように、GlcCerase-K321Aは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-K321Aは、30分のインキュベーション後にその初期活性の90を保持した。GlcCerase-K321Aは、60分のインキュベーション後にその初期活性の89を保持した。GlcCerase-K321Aは、120分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。GlcCerase-K321Aは、180分のインキュベーション後にその初期活性の49を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0047GlcCerase-K321Aの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ170分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。実施例110048K321A変異を含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質GlcCerase-K321Vを、上記の検定を用いて、精製した野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質野生型GlcCeraseと比較した。変異型および野生型のタンパク質に用いられた条件は、同一であった。GlcCerase-K321Vは、ほぼ中性pHおよび約37°Cで3時間の時間経過にわたって野生型GlcCeraseより有意に安定である。GlcCerase-K321Vは、30分のインキュベーション後にその初期活性の74を保持した。GlcCerase-K321Vは、60分のインキュベーション後にその初期活性の55を保持した。GlcCerase-K321Vは、120分のインキュベーション後にその初期活性の29を保持した。GlcCerase-K321Vは、180分のインキュベーション後にその初期活性の15を保持した。比較により、同じ実験条件下で処理された野生型GlcCeraseは、30分のインキュベーション後にその初期活性の68を保持した。野生型GlcCeraseは、60分のインキュベーション後にその初期活性の46を保持した。野生型GlcCeraseは、120分のインキュベーション後にその初期活性の20を保持した。野生型GlcCeraseは、180分のインキュベーション後にその初期活性の8を保持した。0049GlcCerase-K321Vの推定半減期この研究において、操作上、初期酵素活性の50損失を引き起こした約pH7.5および約37°Cでのインキュベーション時間として定義されるは、およそ70分であるが、野生型GlcCeraseの推定半減期は、これら実験条件下においておよそ50分である。0050上の結果を、表1に要約する。0051残留活性は、3時間インキュベーション後に残っている酵素活性の量であり、安定性検定において各々の変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質についてt=0分での初期酵素活性の百分率として表されている。各々の組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を、少なくとも2回の別々の実験表1にnで示されるで試験して、1回しか試験しなかったGlcCerase-K321VおよびGlcCerase-H145L/F316A/L317Fを除いて、3時間の時間経過中の平均残留活性を決定した。倍改善foldimprovementは、精製した野生型組換えGlcCeraseタンパク質に相対する変異型組換えGlcCeraseタンパク質の見掛け半減期の増加を意味する。0052145位、316位、317位または321位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質、またはGlcCerase-F316A/L317F、GlcCerase-K321N、GlcCerase-K321A、GlcCerase-K321V、GlcCerase-H145L、GlcCerase-H145F、またはGlcCerase-F316A/L317F/K321NまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321AまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321VまたはGlcCerase-H145L/F316A/L317FまたはGlcCerase-H145L/K321Nは、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対してより高い触媒活性を保持していると特徴づけることができ、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物中において、当業者に知られている分子生物学技法およびタンパク質精製技法を用いて製造しうると考えられる。0053145位、316位、317位または321位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質、またはGlcCerase-F316A/L317F、GlcCerase-K321N、GlcCerase-K321A、GlcCerase-K321V、GlcCerase-H145L、GlcCerase-H145F、またはGlcCerase-F316A/L317F/K321NまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321AまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321VまたはGlcCerase-H145L/F316A/L317FまたはGlcCerase-H145L/K321Nおよび薬学的に許容しうる担体を含む組成物は、当業者に知られている薬学的に許容しうる担体を用いて製造しうると考えられる。0054145位、316位、317位または321位にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質、またはGlcCerase-F316A/L317F、GlcCerase-K321N、GlcCerase-K321A、GlcCerase-K321V、GlcCerase-H145L、GlcCerase-H145F、またはGlcCerase-F316A/L317F/K321NまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321AまたはGlcCerase-F316A/L317F/K321VまたはGlcCerase-H145L/F316A/L317FまたはGlcCerase-H145L/K321Nおよび薬学的に許容しうる緩衝剤を含む組成物は、当業者に知られている薬学的に許容しうる緩衝剤を用いて製造しうると考えられる。実施例120055GlcCeraseタンパク質は、酸性pHで安定であり且つリソソーム内の蓄積したグルコシルセラミド基質を浄化する効率が極めてよいことから、改善された効力のために一層多量の活性薬物をリソソームに送達するように、好ましくない中性pH環境により良く耐えてその触媒活性を保持することができるより安定なGlcCeraseERTを開発することができる。そのGlcCerase酵素は、活性部位酵素阻害剤イソファゴミンisofagomineIFGによって結合されたそして阻害された場合に、ほぼ中性pHで安定化することができる。ほぼ中性pHでの組換えGlcCeraseのタンパク質安定性は、熱融解温度Tmの15°Cまでの増加によって示されるように、IFGで有意に改善する。IFGで誘発されるGlcCerase安定化の作用機構は、IFGと6個のGlcCerase活性部位残基との間の広範囲の水素結合ネットワークによって生じて、活性部位および周囲領域の変性を制限して、より安定なGlcCeraseコンホメーションを維持すると考えられる。活性部位および周囲領域において適当なGlcCerase構造を維持することは、触媒活性および全体のGlcCerase安定性を助ける。GlcCeraseへの多数の異なった改変は、ほぼ中性pHで触媒活性を保持し且つより安定なタンパク質構造を維持するのを助けることができる。本明細書中において、ほぼ中性pHで巻戻される傾向がより少ない、活性部位付近のより秩序化された領域を形成するのを助けるように、活性部位付近のループ構造内の戦略的場所に特定のアミノ酸置換を含む、一連の異なったGlcCerase酵素の構築を提供する。更に、本明細書中において、活性部位付近のαヘリックスへの改変であって、このヘリックスおよび隣接したループを触媒部位から引き離して、オープンで活性なコンホメーションを維持するのを助けることができる改変を提供する。0056野生型GlcCeraseより優れたタンパク質安定性を有すると予測された一連の改変GlcCerase酵素を作成するアプローチを利用した。主として、次の二つの異なるが相補的な戦略を用いた:1酵素を実際に阻害することなく好適な活性GlcCeraseコンホメーションを模倣する、触媒部位付近の特定のループおよびヘリックスの改変;および2改善されたタンパク質安定性のために異なった残基および二次構造の間の相互作用を増強することができるランダムコイル領域の改変。0057一つの例において、いくつかの残基を、ループ1領域内311位~319位で改変して、ほぼ中性pHで巻戻される傾向がより少ないと考えられる活性部位付近のより秩序化された領域を形成するのを助けた。ループ1内に改変を含むこの変異型GlcCerase-F316A/L317Fは、約pH7.5および37°CでGlcCeraseより有意に安定であることが示された。0058第二の例において、活性部位付近のαヘリックスα6を改変したが、それは、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループループ1を触媒部位から引き離して、オープンで活性なコンホメーションを維持するのを助けるためであった。したがって、ヘリックスα6内で荷電したリシン残基を非荷電の残基と交換するアミノ酸置換を321位に含有した改変GlcCerase酵素を作成して、隣接したαヘリックスおよびβ構造とのより疎水性の相互作用を促してタンパク質を安定化した。タンパク質アラインメントを、いろいろな種のGlcCerase酵素について分析し表II、そしてB.タウルスBtaurusのGlcCeraseホモログ雄牛GlcCerase;アクセッションコードDAA31806.1が、321位にアスパラギン321Asnを含有することに注目した。これは、GlcCerase触媒活性を無効にすることなく、321位のリシン321Lysを異なったアミノ酸残基と交換できる可能性があるということを示唆している。GlcCerase-K321Nは、約pH7.5および37°Cで2時間および3時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ75および54を保持した。対照的に、野生型GlcCeraseは、同じ条件下においてその初期活性の僅か21および8を保持した。GlcCerase-K321Nの推定半減期は、野生型GlcCeraseよりおよそ3.5倍長かった。同様に、GlcCerase-K321Aは、約pH7および37°Cで2時間および3時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ68および49を保持した。GlcCerase-K321Aの推定半減期は、野生型GlcCeraseよりおよそ3倍長かった。GlcCerase-K321Vは、約pH7および37°Cで2時間および3時間後に、それぞれ、その元の触媒活性のおよそ29および15を保持した。GlcCerase-K321Vの推定半減期は、野生型GlcCeraseよりおよそ1.4倍長かった。これらのデータは、ヘリックスα6内の正電荷リシン残基を除去することが、この領域をより秩序化し、この領域の巻戻しを制限し、より高いGlcCeraseタンパク質安定性を与えたということを示している。0059第三の例において、ランダムコイル領域を、βシートβ2とαヘリックスα2との間で改変したが、それは、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にすることができる。いろいろな種からのGlcCerase酵素表2のタンパク質アラインメント分析は、このランダムコイル内の145位が、異なった種の間で異なることを明らかにした。B.taurusホモログおよびS.スクロファSscrofaブタは双方とも、この位置にロイシンを含有するが、マウスGlcCeraseは、セリンを含有する。したがって、本発明者は、145位のヒスチジン145HisをLeuH145LまたはPheH145Fで置換して、これら改変がGlcCerase安定性を改善するかどうか決定した。GlcCerase-H145LGlcCeraseは、野生型GlcCeraseより安定であることが示され、野生型GlcCeraseよりおよそ3倍長い推定半減期160分対50分で、2時間後にその初期活性の62、そして3時間後に42を保持した。同様に、GlcCeraseH145Fは、野生型GlcCeraseに相対しておよそ2倍長い半減期で、2時間後にその初期活性のおよそ37、そして3時間後に17を保持した。現在のところ、これら改変がGlcCerase構造にどのように影響を及ぼすかは知られていないが、部分的に荷電した残基145Hisをロイシンかまたはフェニルアラニン疎水性残基と交換することは、この領域をより秩序化し、この領域の巻戻しを制限する可能性がある。或いは、これら改変はターンを作り出し、二次構造例えば、βシートβ2およびヘリックスα2の間の相互作用を増強することができる。0060タンパク質アラインメントデータを、表2に要約する。0061適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸を有することができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、タンパク質の活性部位付近の秩序を増大させる側鎖コンホメーションを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲で巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHで巻戻される傾向がより少ないことを特徴とする。0062適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、タンパク質の活性部位付近のαヘリックスα6中の一つ以上の置換アミノ酸であって、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ1を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有するという側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸側部を有することができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質の活性部位付近のαヘリックスα6中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、このヘリックスを安定にし且つ隣接したループ1を触媒部位から引き離し、しかもオープンで且つ活性なコンホメーションを有するという側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側部は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とすることができる。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、その一つ以上の置換アミノ酸は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、タンパク質のループ1領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでよりオープンなコンホメーションを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸を有することができる。0063適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とする一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸を有することができ、改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖は、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲でより安定であることを特徴とする。これらのタンパク質は、更に、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでの改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、約pH3~約pH8の範囲での改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。これらのタンパク質は、更に、βシートβ2とαヘリックスα2との間のランダムコイル領域中の一つ以上の置換アミノ酸であって、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質と比較して、ほぼ中性pHでの改善された安定性のために異なった残基および二次構造の間のより良い相互作用を容易にする側鎖コンホメーションconfirmationを有することを特徴とするその一つ以上の置換アミノ酸側鎖を有することができる。0064リソソーム蓄積症を処置するのに適する方法は、更に、それを必要としている対象に、与えられている野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した安定性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した触媒活性を保持することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼと比較して増加した比活性を有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。0065リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、次の位置:316、317、321および145の一つ以上にアミノ酸変異を有する変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異316AおよびL317Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異K321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異K321Aを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異K321Vを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145Lを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Aを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異F316A、L317FおよびK321Vを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145L、F316AおよびL317Fを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145LおよびK321Nを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145LおよびK321Aを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、それを必要としている対象に、アミノ酸変異H145LおよびK321Vを含む変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を投与することを含むことができる。リソソーム蓄積症を処置する方法は、更に、ゴーシェ病を処置する方法を含むことができる。処置方法は、静脈内注入による、筋肉内注射による、または当業者に知られている他の投与経路によることができる。0066適切な化合物は、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を有することができる。適切な化合物は、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を有することができる。0067適切な変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して増加した発現が可能であることを特徴とすることができる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約10増加されうる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約25増加されうる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約50増加されうる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質発現は、更に、野生型組換えβ-グルコセレブロシダーゼに相対して少なくとも約80増加されうる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、哺乳動物細胞、トランスジェニック動物または酵母細胞中で発現可能でありうる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、ヒトにおいて発現することができる。変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質は、更に、挿入された遺伝子から発現することができる。実施例130068変異型組換えGlcCeraseタンパク質および野生型GlcCeraseを、前述の方法にしたがって細胞培養物中で発現させて、野生型GlcCeraseと比較したこれらの変異型GlcCerase酵素の相対発現を評価した。多数の異なった変異型GlcCerase酵素が、一過性トランスフェクション実験において、トランスフェクション後約48時間後の馴化培地からの酵素活性によって測定されるように図1、野生型GlcCeraseより良く発現した。GlcCerase-F316A/L317Aは、野生型GlcCeraseより良く発現し約282、GlcCerase-K321Nは、野生型GlcCeraseより良く発現し約272、GlcCerase-H145Lは、野生型GlcCeraseより良く発現し約157、GlcCerase-F316A/L317A/K321Nは、野生型GlcCeraseより良く発現し約272、GlcCerase-H145L/K321Nは、野生型GlcCeraseより良く発現した約317。GlcCerase-K321Aは、野生型GlcCeraseと同等に発現したが、GlcCerase-K321Vは、野生型より低レベルで発現した約61データは示さない。0069本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質を含む化合物を製造する方法である。本明細書中において更に提供するのは、次のアミノ酸配列:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15またはSEQIDNO:16のいずれか一つを有することを特徴とする変異型組換えβ-グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードしている核酸を製造する方法である。実施例14野生型および改変GlcCerase酵素のためのプラスミド構築0070野生型および改変GlcCerase酵素の発現のためのDNAプラスミドは、オリゴヌクレオチドプライマー表3に挙げられている、または特定のアミノ酸置換を含むGlcCeraseのフラグメントをコードしている合成DNAミニジーン>400bpを用いて作成した。プライマーおよび合成DNAミニジーンは全て、IntegratedDNATechnologiesTMCoralvilleIAより購入した。野生型ヒトGlcCerasepHD101と称するは、GlcCerasecDNAをPCRによって作成し、そして哺乳動物発現ベクター中に連結することによって構築した。簡単にいうと、野生型ヒトGlcCerasecDNA全体を、その天然Kozak配列および停止コドンを含めて、Phusion-HF高忠実DNAポリメラーゼTMNEBTMおよび200μMdNTPによる二つの同一の50μl反応液中において、プライマーAおよびBならびにヒトGlcCerasecDNAクローンOrigeneTM鋳型DNAを用いて増幅させた。プライマーAは、5’BglIIおよびKozak配列の直前にある内部EcoRI制限部位を含有するように構築した、一方プライマーBは、発現ベクター中へのPCR産物のクローニングを可能にするように停止コドンに続く3’NheIおよびNotI制限部位を含有した。それらのPCR反応物をプールし、得られた約1.6キロベースkbのPCR産物を分離し、そして1w/vアガロース分取用ゲルから切り取り、そしてQIAGEN’sTMGelExtractionキットを用いて単離した。次に、そのPCR産物を、制限エンドヌクレアーゼBglIIおよびNotIで37°Cにおいて一晩消化し、そしてQIAGEN’sTMPCRクリーンアップキットを製造者の取扱説明書によって用いて再精製した。その哺乳動物発現ベクターpEF6/V5-HisATMを、BamHIおよびNotIで消化し、AntarcticホスファターゼTMを用いて脱リン酸し、そしてQIAGEN’sTMPCRクリーンアップキットを用いて単離した。BglII-NotIで消化したPCR産物2μlを、BamHI-NotIpEF6/V5-HisATMベクター1μl中に、T4DNAリガーゼNEBTMを製造者の取扱説明書にしたがって用いて連結した。化学的コンピテントE.coli細胞を、1μlの連結反応物で形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含有するLuriaBertaniLB寒天プレート上にプレーティングし、そして37°Cで一晩インキュベートして、アンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子を含有するプラスミドDNAで形質転換された明瞭な細菌コロニーを形成させた。個々のアンピシリン耐性細菌コロニーを選びとり、4mlのLBブロス100μg/mlのアンピシリンを含有中において37°Cで一晩増殖させ、そしてプラスミドDNAを、MiniprepTMQIAGENTMによって製造者の取扱説明書にしたがって翌日に単離した。単離されたプラスミドDNAを、EcoRINheIおよびBamHIをそれぞれ用いる二つの異なった制限消化反応により確認した。クローン4からの正しいプラスミドDNApHD101.4と称するを選択し、使用して、プラスミドDNAの高レベル複製について上記のように、コンピテントE.coli細胞を再度形質転換した。次に、LB寒天-アンピシリンプレートからコロニーを選択し、そして200mlのLBブロス中において37°Cで一晩増殖させ、そしてプラスミドpHD101.4を、MaxiprepTMPromegaTMによって単離した。プラスミドpHD101.4野生型ヒトGlcCerasecDNAをコードしているを、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして他のGlcCerase酵素の構築および一過性トランスフェクション実験に用いた。0071BglII制限部位をプライマー1中に包含させたため、BglIIで消化したGlcCerasePCR産物の、pEF6/V5-HisATMベクターの適合するBamHI部位中への連結が、マルチプルクローニングサイト内のBamHI制限部位を除去したが、この改変発現ベクターを、以下、pEF6’と称する。pEF6/V5-HisATM内のこのBamHI部位の除去は、GlcCerasecDNA内の唯一のBamHI部位を、特定のヌクレオチド置換を含むDNAフラグメントを挿入するのに利用して、改変GlcCerase酵素を作成することができるために必要であった。0072GlcCerase-F316A/L317FpHD105と称するを作成するために、これらアミノ酸置換を含有するGlcCeraseミニジーンを、IntegratedDNATechnologiesTMによって、天然の隣接する5’BsrGIおよび3’BamHI制限部位の間に合成した。その合成改変GlcCeraseDNAフラグメント約0.5kbを、pIDTSMARTTMプラスミドから、BsrGIおよびBamHI制限消化によって遊離させた後、分取用1アガロースゲルによって単離し、そしてBsrGIおよびBamHIで予め消化し且つ脱リン酸したpHD101.4中にインフレームで連結した。1マイクロリットルのこの連結反応液を用いて、コンピテントE.coli細胞を形質転換し、そしてその試料を、pHD101について上記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、そしてEcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン5pHD105.5と称するを選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0073GlcCerase-K321NpHD109と称するを作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップPCRによって導入した。簡単にいうと、N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびDならびに鋳型DNAとしてのpHD101.4をPCR反応1において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびCならびにpHD101.4鋳型をPCR反応2において用いて作成した。次に、K321NGlcCerasecDNA全体を、PCR反応3において、PCR反応AおよびBからの1μlならびにプライマー1および2を加えることによって合成した。得られたPCR産物3約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、そしてEcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物3を、再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に連結し、上記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン3pHD109.3と称するを選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0074GlcCerase-H145LpHD110と称するを作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップPCRによって導入した。N末端フラグメント約0.55kbは、プライマーAおよびFならびにpHD101.4鋳型DNAをPCR反応4において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約1kbは、プライマーBおよびEならびにpHD101.4鋳型をPCR反応5において用いて作成した。H145LGlcCerasecDNA全体を、PCR反応6において、PCR反応4および5からの1μlならびにプライマーAおよびBを加えることによって作成した。得られたPCR産物6約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、そしてEcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物6を、再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に連結し、前記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン2pHD110.2と称するを選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0075GlcCerase-H145FpHD111と称するを作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップPCRによって導入した。N末端フラグメント約0.55kbは、プライマーAおよびHならびにpHD101.4鋳型DNAをPCR反応7において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約1kbは、プライマーBおよびGならびにpHD101.4鋳型をPCR反応8において用いて作成した。H145LGlcCerasecDNA全体を、PCR反応9において、PCR反応7および8からの1μlならびにプライマーAおよびBを加えることによって作成した。得られたPCR産物9約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、そしてEcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物9を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に連結し、前記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン1pHD111.1と称するを選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0076GlcCerase-F316A/L317F/K321NpHD112と称するを作成するために、アミノ酸置換を、pHD105.5中にオーバーラップPCRによって導入した。N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびDならびにpHD105.5鋳型DNAをPCR反応10において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびCならびにpHD105.5鋳型をPCR反応11において用いて作成した。F316A/L317F/K321NGlcCerasecDNA全体を、PCR反応12において、PCR反応10および11からの1μlならびにプライマーAおよびBを加えることによって作成した。得られたPCR産物12約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、そしてEcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物12を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に上記のように連結した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIを用いた制限消化によって試験した。クローン7pHD112.7と称するを選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0077GlcCerase-H145L/F316A/L317FpHD113と称するを作成するために、アミノ酸置換を、pHD105.5中にオーバーラップPCRによって導入した。N末端フラグメント約0.55kbは、プライマーAおよびFならびにpHD105.5鋳型DNAをPCR反応13において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約1kbは、プライマーBおよびEならびにpHD105.5鋳型をPCR反応14において用いて作成した。H145L/F316A/L317FGlcCerasecDNA全体を、PCR反応15において、PCR反応13および14からの1μlならびにプライマーAおよびBを加えることによって作成した。得られたPCR産物15約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物15を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に前記のように連結した。0078GlcCerase-H145F/F316A/L317FpHD114と称するを作成するために、アミノ酸置換を、pHD105.5中にオーバーラップPCRによって導入した。N末端フラグメント約0.55kbは、プライマーAおよびHならびにpHD105.5鋳型DNAをPCR反応16において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約1kbは、プライマーBおよびGならびにpHD105.5鋳型をPCR反応17において用いて作成した。H145F/F316A/L317FGlcCerasecDNA全体を、PCR反応18において、PCR反応16および17からの1μlならびにプライマーAおよびBを加えることによって作成した。得られたPCR産物18約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物18を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に前記のように連結した。0079GlcCerase-H145L/K321NpHD115と称するを作成するために、pHD109.3およびpHD110.2双方を、BsrGIおよびBamHI制限酵素で消化し、そしてpHD109.3からの約0.5kbフラグメントおよびpHD110.2からの約6.9kbフラグメントAntarcticホスファターゼでの処理後を、分取用1アガロースゲルによって単離した。次に、pHD109.3からの約0.5kbフラグメントK321Nアミノ酸置換を含有を、H145L改変を含有するプラスミドpHD110.2中にインフレームで連結し、前記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、そしてEcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン5を選択し、DNA塩基配列決定によって確かめ、そして更なる特性決定に用いた。0080GlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321NpHD116と称するを作成するために、pHD112.7およびpHD110.2双方を、BsrGIおよびBamHI制限酵素で消化し、pHD112.7からの約0.5kbフラグメントおよびpHD110.2からの約6.9kbフラグメントAntarcticphosphataseTMで処理後を、分取用1アガロースゲルによって単離した。pHD112.7からの約0.5kbフラグメントF316A/L317F/K321Nアミノ酸置換を含有を、H145L改変を含有するプラスミドpHD110.2中にインフレームで連結し、前記のように処理する。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、そしてEcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験して、正しいGlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321AcDNAを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたDNAコンストラクトを、DNA塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。0081GlcCerase-K321ApHD117と称するを作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップPCRによって導入した。簡単にいうと、N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびJならびに鋳型DNAとしてのpHD101.4をPCR反応19において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびIならびにpHD101.4鋳型をPCR反応20において用いて作成した。PCR産物19および20を、分取用1アガロースゲルによって単離し、鋳型DNAとして用いて、K321AGlcCerasecDNAフラグメント全体を、PCR反応21においてプライマーAおよびBを用いて合成した。得られたPCR産物21約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物21を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に連結し、上記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン1pHD117.1と称するを選択し、更なる特性決定に用いた。0082GlcCerase-K321VpHD118と称するを作成するために、アミノ酸置換を、オーバーラップPCRによって導入した。簡単にいうと、N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびLならびに鋳型DNAとしてのpHD101.4をPCR反応22において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびKならびにpHD101.4鋳型をPCR反応23において用いて作成した。PCR産物22および23を、分取用1アガロースゲルによって単離し、鋳型DNAとして用いて、K321AGlcCerasecDNAフラグメント全体を、PCR反応24においてプライマーAおよびBを用いて合成した。得られたPCR産物24約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化した。PCR産物24を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に連結し、上記のように処理した。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験した。クローン7pHD118.7と称するを選択し、更なる特性決定に用いた。0083GlcCerase-F316A/L317F/K321ApHD119と称するを作成するために、アミノ酸置換を、pHD105.5中にオーバーラップPCRによって導入する。N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびJならびにpHD105.5鋳型DNAをPCR反応25において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびIならびにpHD105.5鋳型をPCR反応26において用いて作成する。PCR産物25および26を、分取用1アガロースゲルによって単離し、鋳型DNAとして用いて、F316A/L317F/K321A/K321AGlcCerasecDNAフラグメント全体を、PCR反応27においてプライマーAおよびBを用いて合成する。得られたPCR産物27約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化する。PCR産物27を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に上記のように連結する。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、そしてEcoRIおよびXbaIを用いた制限消化によって試験して、正しいGlcCerase-F316A/L317F/K321AcDNAを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたDNAコンストラクトを、DNA塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。0084GlcCerase-F316A/L317F/K321VpHD120と称するを作成するために、アミノ酸置換を、pHD105.5中にオーバーラップPCRによって導入する。N末端フラグメント約1.1kbは、プライマーAおよびLならびにpHD105.5鋳型DNAをPCR反応28において用いることによって作成し、一方C末端フラグメント約0.5kbは、プライマーBおよびKならびにpHD105.5鋳型をPCR反応29において用いて作成する。PCR産物28および29を、分取用1アガロースゲルによって単離し、鋳型DNAとして用いて、F316A/L317F/K321A/K321VGlcCerasecDNAフラグメント全体を、PCR反応30においてプライマーAおよびBを用いて合成する。得られたPCR産物30約1.6kbを、分取用1アガロースゲルから前記のように単離し、EcoRIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化する。PCR産物30を再精製し、そしてEcoRI/NotIで消化し且つ脱リン酸したpEF6’ベクター中に上記のように連結する。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、そしてEcoRIおよびXbaIを用いた制限消化によって試験して、正しいGlcCerase-F316A/L317F/K321VcDNAを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたDNAコンストラクトを、DNA塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。0085GlcCerase-H145L/K321ApHD121と称するを作成するために、pHD117.1およびpHD110.2双方を、BsrGIおよびBamHI制限酵素で消化し、そしてpHD117.1からの約0.5kbフラグメントおよびpHD110.2からの約6.9kbフラグメントAntarcticphosphataseTMで処理後を、分取用1アガロースゲルによって単離する。pHD117.1からの約0.5kbフラグメントK321Aアミノ酸置換を含有を、H145L改変を含有するプラスミドpHD110.2中にインフレームで連結し、前記のように処理する。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験して、正しいGlcCerase-H145L/K321AcDNAを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたDNAコンストラクトを、DNA塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。0086GlcCerase-H145L/K321VpHD122と称するを作成するために、pHD118.7およびpHD110.2双方を、BsrGIおよびBamHI制限酵素で消化し、そしてpHD118.7からの約0.5kbフラグメントおよびpHD110.2からの約6.9kbフラグメントAntarcticホスファターゼで処理後を、分取用1アガロースゲルによって単離する。pHD118.7からの約0.5kbフラグメントK321Vアミノ酸置換を含有を、H145L改変を含有するプラスミドpHD110.2中にインフレームで連結し、前記のように処理する。MiniprepDNAを、個々のクローンから単離し、EcoRIおよびXbaIでの制限消化によって試験して、正しいGlcCerase-H145L/K321VcDNAを含む形質転換細菌菌株を識別する。選択されたDNAコンストラクトを、DNA塩基配列決定によって確かめ、更なる特性決定に用いる。0087表3は、改変GlcCerase酵素を構築することについて上に挙げたプライマー配列を要約する。0088本発明を、その具体的な態様に関して記載してきたが、多くの他の変異および改変ならびに他の使用は、当業者に明らかである。したがって、本発明は、本明細書中の具体的な開示によってではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ説明されることが好適である。配列"