E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループをランダム化したランダムループ化ポリペプチドを得る工程と、前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程と、を含む、人工抗体を製造する方法。前記E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループは、下記のa’からd’に記載のループのうち、いずれか1つ又は2つ以上のループである、請求項1に記載の方法。a’配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-46番目のアミノ酸残基からなるループb’配列番号1で示されるRNF8タンパク質の49-62番目のアミノ酸残基からなるループc’配列番号1で示されるRNF8タンパク質の78-83番目のアミノ酸残基からなるループd’配列番号1で示されるRNF8タンパク質の108-118番目のアミノ酸残基からなるループ前記E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループは、下記のaからdに記載のループのうち、いずれか1つ又は2つ以上のループである、請求項1に記載の方法。a配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-43番目のアミノ酸残基からなるループb配列番号1で示されるRNF8タンパク質の53-60番目のアミノ酸残基からなるループc配列番号1で示されるRNF8タンパク質の80-82番目のアミノ酸残基からなるループd配列番号1で示されるRNF8タンパク質の109-114番目のアミノ酸残基からなるループ前記ランダムループ化ポリペプチドは、前記E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループにランダム配列が導入されたポリペプチドであり、前記ランダム配列のアミノ酸残基数は3-12残基である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程が、試験管内選択法である、請求項4に記載の方法。請求項1に記載の方法により得られる人工抗体。イントラボディである、請求項1に記載の方法により得られる人工抗体。請求項1に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体。請求項1に記載の方法により得られる人工抗体と、当該人工抗体の抗原タンパク質との複合体であって、前記抗原タンパク質が、Erk2またはTrxである複合体。請求項6に記載の人工抗体であって、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、a41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基以外の部分に1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列からなる人工抗体、或いは、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、a41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基以外の部分に1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体。イントラボディである、請求項11に記載の人工抗体。配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、a41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、a41-46番目のアミノ酸残基、b49-62番目のアミノ酸残基、c78-83番目のアミノ酸残基、及びd108-118番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチド。人工抗体としての機能を有し、また、細胞内でイントラボディとして発現させても結合活性を失わないRNF8-FHAドメイン改変タンパク質を、インビトロで効率良く製造することを目的とする。RNF8-FHAドメインは分子内ジスルフィド結合を持たない、またそれ自体が細胞内で機能するタンパク質であるため、上述のような最適化を行う必要はなく、一般的なインビトロでの選択だけで効率良く機能性抗体を得ることが可能となる。本発明の第1の側面は、人工抗体を製造する方法に関する。この方法は、E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループをランダム化したランダムループ化ポリペプチドを得る工程と、ランダムループ化ポリペプチドから抗原結合タンパク質を選択する工程とを含む。E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインは、分子内ジスルフィド結合を持たず、それ自体が細胞内で機能するポリペプチドである。本発明のランダムループ化ポリペプチドは、RNF8-FHAドメインを利用して、一般的なインビトロでの選択だけで抗原結合タンパク質を得ることができる。具体的に説明すると、FHAドメインから伸びる1~4本のループをランダム化し、対象となるターゲット分子への認識部位をFHAドメイン表面に人工的に作り出す。このランダムループ化ポリペプチドを含む、RNF8-FHAドメインライブラリーを構築する。その上で、インビトロで効率良く抗原結合タンパク質を選択する。RNF8-FHAドメインライブラリーの構築方法を、以下、より詳細に説明する。配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-43番目のアミノ酸残基からなるループLoop1、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の53-60番目のアミノ酸残基からなるループLoop2、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の80-82番目のアミノ酸残基からなるループLoop3、及び配列番号1で示されるRNF8タンパク質の109-114番目のアミノ酸残基からなるループLoop4から選択されるいずれか1つ又は2つ以上のループに、各ループの残基数と同じ残基数を有するランダム配列を導入することにより、人工抗体ライブラリーを作製する。このライブラリーから、タンパク質、ペプチド、低分子、及び糖鎖などの様々な抗原に対する結合分子の取得が可能である。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号1のa41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基以外の部分に、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。本発明の更なる態様において、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-46番目のアミノ酸残基からなるループLoop1’、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の49-62番目のアミノ酸残基からなるループLoop2’、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の78-83番目のアミノ酸残基からなるループLoop3’、及び配列番号1で示されるRNF8タンパク質の108-118番目のアミノ酸残基からなるループLoop4’から選択されるいずれか1つ又は2つ以上のループに、各ループの残基数と同じ残基数を有するランダム配列を導入することによっても、人工抗体ライブラリーを作製する。このライブラリーから、タンパク質、ペプチド、低分子、及び糖鎖などの様々な抗原に対する結合分子の取得が可能である。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号1のa41-46番目のアミノ酸残基、b49-62番目のアミノ酸残基、c78-83番目のアミノ酸残基、及びd108-118番目のアミノ酸残基以外の部分に、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。上記のランダムループ化ポリペプチドの例は、E3ユビキチンライゲースRNF8-FHAドメインのループにランダム配列が導入されたポリペプチドである。導入されたランダム配列のアミノ酸残基数の例は、3-12残基である。本発明においては、この程度の長さのランダム配列を導入することが好ましい。そして、人工抗体ライブラリーから、抗原結合タンパク質を選択する。抗原結合タンパク質を選択するための方法の例は、試験管内選択法である。試験管内選択法の例としては、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、バクテリアディスプレイが挙げられる。これらの方法は、一般的に試験管内選択系として知られている。リボソームディスプレイは、インビトロ翻訳系において、リボソーム-ペプチド-mRNA複合体を形成させ、特定の機能を有するペプチドをコードするタンパク質を選択する方法である。この方法において、一般的な大腸菌抽出液を用いるリボソームディスプレイよりも選択性が高いことが報告されている再構築タンパク質合成系である、いわゆるPUREシステムShimizuetalMethodsvol36pp299304を利用したリボソームディスプレイが好ましい。本発明の第2の側面は、上記に説明した方法により製造又は選択された人工抗体又は人工抗体と抗原との複合体に関する。この人工抗体は、好ましくは、イントラボディである。人工抗体の抗原タンパク質との複合体における抗原タンパク質の例は、Erk2extracellularsignalregulatedkinase2及びTrxThioredoxinである。具体的な人工抗体の例は、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列からなる人工抗体である。本発明の人工抗体は、配列番号21から42のうちいずれかで示されるアミノ酸配列のうち、a41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基以外の部分に1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列からなる人工抗体であってもよい。これらの人工抗体は、好ましくは、イントラボディである。上記したランダムループ化ポリペプチドの例は、配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、a41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチドである。ランダム配列が導入される例は、上記のループ部位がランダム配列で置き換わったものである。上記したランダムループ化ポリペプチドの例は、配列番号1で示されるアミノ酸配列のうち、a41-46番目のアミノ酸残基、b49-62番目のアミノ酸残基、c78-83番目のアミノ酸残基、及びd108-118番目のアミノ酸残基のいずれか1つ又は2つ以上の部位にランダム配列が導入されたポリペプチドである。ランダム配列が導入される例は、上記のループ部位がランダム配列で置き換わったものである。本発明によれば、様々な抗原に対する結合タンパク質を取得できる人工抗体として改変タンパク質を利用できる。また、細胞内タンパク質を抗原とした場合、それらを認識する結合タンパク質はイントラボディとして細胞内で機能させることが可能である。例えば、該結合タンパク質は、タンパク質-タンパク質相互作用の阻害や生細胞内のターゲットのイメージング、ターゲット分子の局在の制御などの生化学的な基礎実験から、タンパク質-タンパク質相互作用解析プロテオミクス解析、試薬、診断、治療薬への応用などのまったく新しい様々な用途への利用が可能である。本発明のRNF8-FHAドメインライブラリーの構築方法について説明する。この方法は、まず、FHAドメインから伸びる1~4本のループをランダム化し、対象となるターゲットへの認識部位をFHAドメイン表面に人工的に作り出すものである。この方法は、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-43番目のアミノ酸残基からなるループLoop1、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の53-60番目のアミノ酸残基からなるループLoop2、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の80-82番目のアミノ酸残基からなるループLoop3、及び配列番号1で示されるRNF8タンパク質の109-114番目のアミノ酸残基からなるループLoop4から選択されるいずれか又は2つ以上のループ部位に、ランダム配列を導入することで、人工抗体ライブラリーを作製する。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号1のa41-43番目のアミノ酸残基、b53-60番目のアミノ酸残基、c80-82番目のアミノ酸残基、及びd109-114番目のアミノ酸残基以外の部分に、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列を含む又は、からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。本発明の更なる態様において、この方法は、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の41-46番目のアミノ酸残基からなるループLoop1’、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の49-62番目のアミノ酸残基からなるループLoop2’、配列番号1で示されるRNF8タンパク質の78-83番目のアミノ酸残基からなるループLoop3’、及び配列番号1で示されるRNF8タンパク質の108-118番目のアミノ酸残基からなるループLoop4’から選択されるいずれか又は2つ以上のループ部位に、ランダム配列を導入することによっても、人工抗体ライブラリーを作製する。もっとも、ランダム配列が導入される配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、又は付加したものであってもよい。すなわち、上記の説明において配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに替えて、配列番号1のa41-46番目のアミノ酸残基、b49-62番目のアミノ酸残基、c78-83番目のアミノ酸残基、及びd108-118番目のアミノ酸残基以外の部分に、1又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、又は付加したアミノ酸配列を含む又は、からなるランダムループ化ポリペプチドを得てもよい。ランダム配列を導入する例は、ループ部位図2の実線の四角で囲まれた部位又はループ1’~4’から選択されるループ部位図2の破線の四角で囲まれた部位をランダム配列に置き換えるものである。ランダム配列の例は、3-12残基を有するランダム配列である。ランダム配列を導入する好ましい例は、ランダム配列を導入する部位の残基数と同じ残基数を有するランダム配列に置き換えるものである。このようなランダムループ化ポリペプチドを得るためには、配列番号1で示されるポリペプチドのDNAのうち、ループ部位に相当する部分にランダムオリゴヌクレオチドを導入すればよい。ランダムオリゴヌクレオチドの例は、NNK配列、NNS配列及びNNY配列であり、ここで、NはアデニンA、グアニンG、シトシンC、又はチミンTを意味する;KはグアニンG又はチミンTを意味する;SはシトシンC又はグアニンGを意味する;YはシトシンC又はチミンTを意味する。ランダムヌクレオチドは公知の方法に従って生成すればよい。DNA又はRNAにランダムオリゴヌクレオチドを導入する方法も公知である。次に、ランダムオリゴヌクレオチドを導入した上記ループランダムループに対応するRNAを転写させ、転写物を得る。転写工程は、バイオテクノロジーの分野において公知である。よって、公知の方法に基づいて転写工程を行うことができる。そして、得られた転写物をインビトロで翻訳する。このようにして、RNF8-FHAドメインライブラリーを得ることができる。次に、RNF8-FHAドメインライブラリーについて、抗原結合タンパク質を選択する。抗原結合タンパク質を選択するための方法としては、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、バクテリアディスプレイなどの一般的に試験管内選択系インビトロセレクションとして知られる方法を使用する。一般的な大腸菌抽出液を用いるリボソームディスプレイよりも選択性が高い再構築タンパク質合成系である、PUREシステムに基づくリボソームディスプレイが好ましい。PUREシステムは、翻訳に必要な因子を個々で調製し、それらを再構成した無細胞翻訳系である。PUREシステムは、リボソームディスプレイの効率を低下させ得るヌクレアーゼやプロテアーゼの混入がほとんど認められないため、高い選択効率を持つ事が報告されているVillemagneetalJImmunolMethodsvol313pp140148。無細胞翻訳系は、エネルギー再生系と少なくとも一種のアミノ酸とを有する。エネルギー再生系は、タンパク質の合成に必要なATPやGTP等のエネルギー源の再生に関わる要素を意味する。エネルギー再生系物質の例は、ATP再生に関わる酵素クレアチンキナーゼやピルビン酸キナーゼ、その基質クレアチンリン酸やホスホエノールピルビン酸等である。無細胞翻訳系は、アミノ酸を少なくとも一種、好ましくは天然に存在する20種のアミノ酸を含む。無細胞翻訳系は、さらに非天然のアミノ酸を含んでいても良い。無細胞翻訳系は、例えば、緩衝液例えば、HEPESカリウムやトリス酢酸等、各種の塩類、界面活性剤、RNAポリメラーゼT7、T3、及びSP6RNAポリメラーゼ等、シャペロンタンパク質DnaJ、DnaK、GroE、GroEL、GroES、及びHSP70等、RNAmRNA、tRNA等、プロテアーゼ阻害剤、又はリボヌクレアーゼ阻害剤を含んでもよい。これらの方法を使用して、上記ランダムオリゴヌクレオチド転写物をインビトロで翻訳する。この翻訳工程の例は、無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものである。この工程により、リボソーム-ペプチド-mRNA複合体が構築される。上記リボソーム-ペプチド-mRNA複合体と、予め定められた抗原とが結合することにより、抗原に結合するペプチドのmRNAをインビトロで選択することができるインビトロセレクション。抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、糖鎖などのいずれでもよい。ここで、予め抗原をビオチンで標識しておくことで、後述のELISAによる抗原結合ペプチドのスクリーニングが可能となる。この標識化の工程はバイオテクノロジーの分野において公知である。よって、公知の方法に基づいて標識工程を行うことができる。上記の方法において選択されたmRNAを回収し、回収したmRNAを逆転写させてcDNAとした後、このcDNAをPCR反応により増幅させることでセカンドラウンド以降のリボソームディスプレイ用遺伝子を再構築することができる。リボソームディスプレイは4ラウンド以上行うことが好ましい。数ラウンドのリボソームディスプレイ及びインビトロセレクションによって回収された遺伝子を発現ベクターにサブクローニングし、ELISAによりスクリーニングすることで、抗原に対して結合親和性の高い、RNF8-FHAドメイン改変タンパク質抗原結合タンパク質を発現、精製することができる。これらの工程はバイオテクノロジーの分野において公知であり、よって、公知の方法に基づいて行うことができる。上記に説明した通り、本発明の好ましい利用は、RHF8-FHAドメイン改変タンパク質のライブラリーを作製し、リボソームディスプレイを用いて、抗原に対して結合親和性の高いRHF8-FHAドメイン改変タンパク質抗原結合タンパク質をインビトロで選択する方法である。以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は、以下説明する実施例に限定されるものではなく、当業者に自明な範囲で修正を加えたものも含む。RNF8-FHAドメインライブラリーの構築RNF8のFHAドメインの立体構造図1、PDBcode:2PIEを基にして、RNF8のFHAドメイン図2、配列番号1の4つのループをランダム化NNSしたループを含むRNF8ライブラリーを設計し、140塩基以下の断片として化学合成したFASMAC。ランダム化する部分は、図2において四角で囲った、RNF8タンパク質の41-43番目のアミノ酸残基、53-60番目のアミノ酸残基、80-82番目のアミノ酸残基及び109-114番目のアミノ酸残基部分である。また、ライブラリー遺伝子は高タンパク質発現を目的としていわゆる最適コドン図2大文字表記を採用した。さらに、リボソームディスプレイを実施する上で必要となる、3’末端にFLAG配列を付加したT7プロモーターおよびSD配列を含む5’UTR配列も化学合成したFASMAC。下線部位はそれぞれのオリゴDNAが相補するオーバーラップする領域を示す。NTermCTermLOOPs12LOOP3LOOP45’UTRM13ファージのgeneIIIg3pの部分配列220-326番目のアミノ酸残基はM13KO7由来ファージゲノムを鋳型としてプライマーg3p配列番号8:GAATATCAAGGCCAATCGTCTGAC、及び、プライマーg3p-SecMstop配列番号9CTCGAGTTATTCATTAGGTGAGGCGTTGAGGGCCAGCACGGATGCCTTGCGCCTGGCTTATCCAGACGGGCGTGCTGAATTTTGCGCCGGAAACGTCACCAATGAAACを用いてKODPlusDNAPolymeraseTOYOBOによってPCR増幅変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒、サイクル:25回後、QIAquickPCRpurificationkitQIAGENによって精製した。化学合成したそれぞれの遺伝子断片5‘UTRN-TermLoop12Loop3Loop4C-termとg3pの遺伝子をそれぞれ1pmol、KODPlusDNAPolymeraseTOYOBOを含むPCR反応液を調製し、15サイクルのPCR反応変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒を実行した後、5’プライマー配列番号10gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag10pmol、プライマーSecMstop配列番号11ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg10pmol、KODPlusDNAPolymerase1μLを反応液50μL×10本に追加で加え、更に10サイクルのPCR反応変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒を実行した。1アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENで精製して最終的なランダム配列を含む遺伝子ライブラリーとした。Invitro転写精製した遺伝子ライブラリーDNA1μgを20μLのinvitrotranscriptionKitRibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7PromegaによってmRNAとし、カラム精製したRNeasyminiカラム、QIAGEN。無細胞翻訳系を用いたInvitro翻訳リボソーム-ペプチド-mRNA複合体の構築タンパク質合成反応試薬である無細胞翻訳系PUREシステムは既報ShimizuetalMethodsvol36pp299304に従い調製した。調製した反応液100μlに10pmolのmRNAライブラリーを加え、37°Cで30分間インキュベートした。氷冷したWash緩衝液[50mMTris-OAcpH7.5、150mMNaCl、50mMMgOAc2、0.5Tween20、1μg/mLSaccharomycescereviseaetotalRNASigma]を500μL加え、Blocking緩衝液[50mMTris-OAcpH7.5、150mMNaCl、50mMMgOAc2、0.5Tween20、100μg/mLSaccharomycescereviseaetotalRNASigma、5SuperBlockPIERCE]500μLを加えた。予め5SuperBlockで4°Cで一晩ブロッキングしておいたDynabeadsMyOnestreptavidinT1磁性体ビーズ100μLスラリー、Invitrogenを、500μLWash緩衝液でMagneSphereMagneticSeparationStandPromegaを用いて2回洗浄後、全量の翻訳後反応液リボソームディスプレイライブラリー溶液を加え、磁性体ビーズ及びストレプトアビジンへの前吸着操作を4°C、60分行った。その後、MagneSphereMagneticSeparationStandPromegaを用いて上清を回収した。抗原タンパク質のビオチン化Sigmaより購入した抗原タンパク質ヒトErk2および大腸菌チオレドキシンTrxは、EZ-LinkNHS-PEO4-BiotinPIERCEの標準プロトコールに従ってビオチン化した。ビオチン化したそれぞれの抗原タンパク質はSDS-PAGEによるバンドの移動度のシフトよりビオチン化が確認され、BCAProteinAssayKitPIERCEを用いて濃度を決定した。インビトロセレクション予め5SuperBlockで4°Cで一晩ブロッキングしておいたDynabeadsMyOnestreptavidinT1磁性体ビーズ100μLスラリー、Invitrogenを、500μLWash緩衝液でMagneSphereMagneticSeparationStandPromegaを用いて2回洗浄後、100nmolのビオチン化抗原タンパク質を加え、4°Cで磁性体ビーズに固定化した。30分後、500μLWash緩衝液でMagneSphereMagneticSeparationStandPromegaを用いて3回洗浄後、回収した磁性体ビーズに前吸着処理後の翻訳反応液を加え4°Cで1時間ローテーションによって攪拌した。MagneSphereMagneticSeparationStandPromegaによって上清を廃棄し、回収した磁性体ビーズに1mLのWash緩衝液を加え、4°Cで5分ローテーションによって攪拌した。この操作を30回繰り返した後、100μLElution緩衝液50mMTris-OAcpH7.5、150mMNaCl、50mMEDTAを回収した磁性体ビーズに加え、4°Cで10分静置する事によって、複合体を磁性体ビーズから遊離させた。MagneSphereMagneticSeparationStandPromegaによって上清を回収し、RNeasyMicroQIAGENによってmRNAを回収、精製した。RT-PCR回収したmRNAはTranscriptionHighFidelitycDNASynthesisKitRocheによってcDNAとした後、KODPlusDNAPolymeraseを用いてRT-PCRを行った。なお、使用したプライマーを以下に示す。逆転写リバースプライマー:C-termR配列番号12GTCAGACGATTGGCCTTGATATTC、PCRプライマー:5’プライマー配列番号10gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag及びC-termR配列番号12GTCAGACGATTGGCCTTGATATTCRT-PCR後の反応液は1アガロースを使用して電気泳動し、対応するサイズのバンドを切り出し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENを用いて精製した。リボソームディスプレイ用遺伝子の再構築セカンドラウンド以降のリボソームディスプレイ用遺伝子の再構築は以下のように行った。RT-PCR後の精製遺伝子、5’UTR、g3p遺伝子のそれぞれを1pmol、5’プライマー配列番号10gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag10pmol、プライマーSecMstop配列番号11ggattagttattcattaggtgaggcgttgagg10pmol、KODPlusDNAPolymeraseTOYOBOを含むPCR反応液トータル250μLを調製し、15サイクルのPCR反応を実行した後、1アガロースを用いた電気泳動によって、すべての遺伝子がつながったバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENで精製した。サブクローニング4ラウンド後、回収した遺伝子を大腸菌発現ベクターpET-MalStrep図3にクローニングした。すなわち、4ラウンドのRT-PCRの後、5’側にEcoRIを導入したプライマーEco1--M-FLAG_F配列番号13CCgaattcGACTATAAAGATGACGATGACAAAggC、3’側にHindIIIを導入したプライマーRNF8-Hind3_R配列番号14ggAAGCTTattCttttcAatcatttgAtcattc、及びKODPlusDNAPolymeraseTOYOBOを含む反応液トータル100μLを使用してPCRを行った。PCR反応液を20サイクルの増幅に供した後、QIAquickPCRpurificationkitQIAGENを用いて精製した。精製した遺伝子1μgおよび発現ベクターを制限酵素EcoRI-HindIIIで37°C、1時間処理し、1アガロースを使用した電気泳動によって対応するバンドを確認後、そのバンドを切り出し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENで精製した。インサート遺伝子とベクター遺伝子を31モル比で混合し、LigaFastRapidDNALigationKitPromegaを用いて、室温で30分反応後、予め調製Z-competentEColiTransformationBufferSet:ZYMORESEARCHしておいた大腸菌BL21DE3コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン終濃度50μg/mLを含むLB寒天プレート上で37°C、一晩培養した。ELISAによる抗原結合タンパク質の1次スクリーニング一晩培養した後、LB寒天プレートから95個のシングルコロニーをアンピシリン終濃度50μg/mLを含む100μLの2×YT培地に植菌し、37°Cで3-5時間培養OD600=0.5-0.8後、IPTGを添加し、25°C、一晩培養した。培養した大腸菌溶液10μLに、90μLのPBSおよび40μLの溶菌試薬20μLBugBusterProteinExtractionReagent:Novagen、20μLLysozyme溶液2.5mg/mLを加え、室温で1時間溶菌した。溶菌した溶液に12.5スキムミルク溶液PBSを40μL加え、室温で1時間ブロッキングした。平行して、1well当たり100ng/20μLで抗原タンパク質を4°Cで一晩固定しておいた384穴プレートを100μLPBSで2回洗浄し、5スキムミルク溶液PBSを100μL加え、室温で1時間ブロッキングした後、100μLPBSで2回洗浄して抗原固定プレートとした。このプレートにブロッキング済みの大腸菌抽出液を20μL加え、室温でプレートミキサーを使用して緩やかに攪拌した。1時間後、100μLPBSで5回プレートを洗浄し、20μL1:2000希釈のanti-FLAGM2-HRPコンジュゲートSigmaを加えて室温で1時間プレートミキサー上で緩やかに攪拌した。さらにプレートを100μLPBSで5回洗浄し、20μLの発色基質0.4mg/mL33’55’-Tetramethyl-benzidine0.01過酸化水素によって検出した。室温で15分間反応させた後、20μLの2NHClを加えて反応を停止させ、プレートリーダーTECANを用いて450nmにおける吸光度を測定した。DNA配列解析ELISA解析でポジティブであったクローンについてDNA配列を解析した。各ELISAポジティブクローンを培養し、プラスミドを回収QIAprepSpinMiniPrepkit:QIAGENしてDNA配列解析に供した。その際に使用したシーケンス用プライマーはpET-MALseqF配列番号15CCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCであった。抗原結合クローンの発現と精製結合活性が確認された各クローンを、アンピシリン終濃度50μg/mLを含む200mLの2×YT培地に植菌し、37°Cで3-5時間培養OD600=0.5-0.8後、IPTGを添加し、25°Cで一晩培養した。培養した大腸菌を遠心分離機によって回収し、60mLのLysisバッファー20mMTrisHClpH7.5500mMNaCl10mMβ-メルカプトエタノール5mMMgSO410U/mLDNaseで再懸濁し、超音波破砕機BioruptorUSD-250によって破砕した。遠心分離によって上清を回収し、0.22μmのフィルターを通した後、MBPTrap5mL×2本、GEHealthcareによるアフィニティー精製AKTAPurifierGEHealthcareを行った。精製後、タンパク質溶液を透析膜を用いてPBSにバッファー交換した。SDS-PAGEによって単一バンドであることを確認し、BCAプロテインアッセイキットPIERCEを用いて濃度を決定した。抗原結合クローンの比活性比較ELISAPBSで希釈した精製した各結合クローン500ng/wellを予め抗原を固定した384穴プレートに加え、上述したELISAと同様の方法によって、結合クローンの結合比活性を比較した。抗原結合クローンの親和性測定精製した各クローンの親和性は、BIACORE3000システムを使用して測定し、すべての操作はBiacoreの取扱説明書に従った。なお、ビオチン化した抗原タンパク質Erk2及びチオレドキシンのセンサーチップへの固定は、ストレプトアビジンを介したSAセンサーチップBiacoreを使用して行った。精製したErk2結合クローンタンパク質による組換えErk2タンパク質の免疫沈降実験6wellプレートで予め培養しておいたHEK293T細胞を0.1TritonX-100、プロテアーゼインヒビターカクテルRocheを含むPBS500μLを加えて4°C、10分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをx10000gで10分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。50μLの細胞溶解液に5μgのErk2タンパク質と10μgのErk2結合クローンErk2cloneN又はコントロールクローンTrxcloneAを加えた。得られた溶液に40μlの洗浄500μLPBS×3回済みFLAGM2AgaroseResinSigmaを加えて室温でローテーションにより緩やかに攪拌した。1時間後、MicroSpinColumnGEHealthcareを使用してResinを回収し、500μLPBSで3回洗浄した後、50μLのFLAGPeptide溶液500μg/mLを加えて、結合複合体を室温で5分間溶出した。最後にMicroSpinColumnGEhealthcareを使用して上清を回収し、それらのうち10μLをSDS-PAGE、1μLをウエスタンブロットで解析した。ウエスタンブロットは、1次抗体に1:1000希釈した抗ERK抗体CellSignalingTechnology、2次抗体に1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体GEHealthcareと1:10000希釈したanti-FLAGM2-HRPコンジュゲートSigmaを用いて行った。検出は、ECLadvanceGEHealthcareを用いて標準の方法で行った。哺乳動物細胞内発現Erk2結合クローンによる内在性Erk1/2の免疫沈降実験pcDNA3.1-RNF8-V5/His哺乳動物細胞発現プラスミドの調製:図4発現ベクターpcDNA3.1-V5/HisInvitrogenのEcoRI/XhoIサイトにRNF8の各クローンTrxcloneAErk2cloneAErk2cloneCErk2cloneNのDNA断片を挿入することによりpcDNA3.1-RNF8-V5/Hisを作製した各RNF8断片の3’末端にSalIを付加し、ベクターのXhoIの連結させた。制限酵素サイトを付加した各RNF8クローンのDNA断片はEcoRI-RNF8-for配列番号165’-gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc-3’及びSalI-RNF8-rev配列番号175’-gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc-3’のプライマーセットを使用するPCR反応KODPlusDNApolymerase:TOYOBO、変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒、サイクル:30回により作製した。各PCR産物はQIAquickPCRpurificationkitQIAGENを用いて精製した後、制限酵素処理を行った。制限酵素処理済みのDNA断片は1アガロースゲル電気泳動を行い、対応するバンドを切り出した後、MinEluteGelExtractionKitQIAGENを用いて精製を行った。精製済みのベクターおよびインサートのDNA断片はTaKaRaLigationkitMightyMixTaKaRaを用いて標準の方法でライゲーションを行った。ライゲーション産物は大腸菌TG1F-にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、QIAprepSpinMiniPrepkitQIAGENを用いてプラスミドの回収を行った。発現したErk2結合クローンによる内在性ERK1/2のプルダウン6wellプレートでHEK293T細胞にpcDNA3.1-RNF8-V5/Hisをトランスフェクトし、24時間後に培地を廃棄し、0.1TritonX-100、10mMイミダゾール及びプロテアーゼインヒビターカクテルRocheを含むPBS500μLを加えて4°C、10分間インキュベートして細胞を溶解させた。これをx10000gで10分間の遠心分離し、得られた上清を細胞溶解液として使用した。TALONMetalAffinityResinTaKaRa10μLを細胞溶解液に加えた。4°Cで2時間インキュベートした後、レジンを500μLPBSで5回洗浄した。洗浄済みのレジンに20μLのSDS-PAGEsamplebuffer50mMTris-HClpH6.82SDS5β-メルカプトエタノール10グリセロール少量のBromophenolBlueを加えた。この混合物を煮沸した後、10μLをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。ウエスタンブロットは、1次抗体に1:1000希釈した抗ERK抗体CellSignalingTechnology、2次抗体に1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体GEHealthcareを用いて行った。検出は、ECLadvanceGEHealthcareを用いて標準の方法で行った。pCS2-RNF8-EGFP哺乳動物細胞発現プラスミドの調製:図5はじめにEGFPのDNA断片を発現ベクターpCS2のXhoI/XbaIサイトに挿入したプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドのEcoRI/XhoIサイトに各クローンTrxcloneAErk2cloneCErk2cloneNのDNA断片を挿入することによりpCS2-RNF8-EGFPを作製したRNF8断片の3’末端にSalIを付加し、ベクターのXhoIの連結させた。制限酵素サイトを付加したEGFPのDNA断片はXhoI-EGFP-for配列番号185’-gccctcgaggtgagcaagggcgaggagctg-3’及びXbaI-EGFP-rev配列番号195’-gcctctagattacttgtacagctcgtccat-3’のプライマーセット、制限酵素サイトを付加した各RNF8クローンのDNA断片はEcoRI-RNF8-for配列番号165’-gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc-3’及びSalI-RNF8-rev配列番号175’-gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc-3’のプライマーセットを使用するPCR反応KODPlusDNApolymerase:TOYOBO、変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒、サイクル:30回により作製した。各PCR産物はQIAquickPCRpurificationkitQIAGENを用いて精製し、制限酵素処理した。制限酵素処理済みのDNA断片をアガロース電気泳動に供し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENを用いて精製した。精製済みのベクターおよびインサートのDNA断片はTaKaRaLigationkitMightyMixTaKaRaを用いて標準の方法でライゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌TG1F-にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、QIAprepSpinMiniPrepkitQIAGENを用いてプラスミドの回収を行った。次にEGFPのC末端にSV40largeT抗原由来の核移行シグナルNLSを付加したDNA断片を発現ベクターpCS2のXhoI/XbaIサイトに挿入したプラスミドを構築した。さらに、このプラスミドのEcoRI/XhoIサイトにRNF8の各クローンTrxcloneAErk2cloneAErk2cloneCErk2cloneNのDNA断片を挿入することによりpCS2-RNF8-EGFP-NLSを作製したRNF8断片の3’末端にSalIを付加し、ベクターのXhoIの連結させた。制限酵素サイトを付加したEGFP-NLSのDNA断片はXhoI-EGFP-for配列番号185’-gccctcgaggtgagcaagggcgaggagctg-3’及びXbaI-EGFP-NLS-rev配列番号205’-gcctctagatcataccttgcgcttcttctttggcggcttgtacagctcgtccatgcc-3’のプライマーセット、制限酵素サイトを付加した各RNF8クローンのDNA断片はEcoRI-RNF8-for配列番号165’-gccgaattcaccatgggcgagcctggcttcttcgtc-3’及びSalI-RNF8-rev配列番号175’-gccgtcgacattcttttcaatcatttgatc-3’のプライマーセットを使用するPCR反応KODPlusDNApolymerase:TOYOBO、変性:94°C10秒、アニーリング:58°C30秒、伸長:68°C60秒、サイクル:30回により作製した。制限酵素処理を行ったDNA断片をアガロース電気泳動に供し、MinEluteGelExtractionKitQIAGENを用いて精製した。精製済みのベクターおよびインサートのDNA断片はTaKaRaLigationkitMightyMixTaKaRaを用いて標準の方法でライゲーションした。ライゲーション産物は大腸菌TG1F-にトランスフォームし、得られたコロニーを培養し、QIAprepSpinMiniPrepkitQIAGENを用いてプラスミドの回収を行った。RNF8人工抗体の哺乳類細胞内での発現哺乳類培養細胞であるHEK293Tを10FCS添加DMEMSigma中で37°C、5CO2供給下で培養した。LipofectaminInvitrogenおよびplusreagentInvitrogenを用いて標準の方法により、pCS2-RNF8-EGFP又はpCS2-RNF8-EGFP-NLSで細胞をトランスフェクトした。Erk2抗原結合クローンによる細胞内Erk2リン酸化活性の阻害実験24wellプレートを使用して、HEK293T細胞をpCS2-RNF8-EGFPでトランスフェクトし、24時間後に終濃度100nMPMAを加えて37°Cで30分間インキュベートした。細胞のPMA処理後、直ちに培地を廃棄し、100μLのSDS-PAGEsamplebuffer50mMTris-HClpH6.82SDS5β-メルカプトエタノール10グリセロール少量のBromophenolBlueを加えて細胞を溶解した。この細胞溶解液を煮沸した後、15μLをウエスタンブロットの解析サンプルとして用いた。1次抗体に抗p90RSKCellSignalingTechnology、抗リン酸化Ser380p90RSKCellSignalingTechnology、抗リン酸化Tre359/Ser363p90RSKCellSignalingTechnology及び抗リン酸化Tre573p90RSKCellSignalingTechnologyを用い、いずれの抗体も希釈倍率は1:1000で使用した。また、2次抗体には1:10000希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体GEHealthcareを用いた。検出は、ECLAdvanceGEHealthcareを用いて標準の方法で行った。RNF8人工抗体およびErk1およびErk2Erk1/2の細胞内局在の観察pCS2-RNF8-EGFP-NLSでトランスフェクションした24時間後、HEK293T細胞を4PFAで室温、15分間のインキュベートにより固定した後、500μLPBSで3回洗浄した。これに500μL0.2TritonX-100/PBSを加えた後、室温で5分間インキュベートすることで膜透過処理を行い、500μLPBSで3回洗浄を行った。次に500μL10FCS/PBSを加え、室温で30分間ブロッキングを行った。Erk1/2を染色するために、1次抗体として抗ERK抗体CellSignalingを10FCS/PBSで1:50希釈した溶液を用いて室温で1時間、第一の反応を行い、500μLPBSで3回洗浄した。2次抗体としてAlexa555標識抗ウサギIgG抗体Invitrogenを10FCS/PBSで1:500希釈した溶液を用いて室温で1時間、第二の反応を行い、PBSで3回洗浄した。最後にHoechst33342を添加したPBSを加えて蛍光顕微鏡OLYMPUSIX70にてEGFPRNF8、ERKおよび核の三重染色像を観察した。結果及び考察選択された抗原結合タンパク質の配列解析リボソームディスプレイによるインビトロセレクション後の1stスクリーニングELISAの結果を表1に示す。2種類の抗原Erk2Trxともに良好な結果が得られ、Erk2に対しては90に近い確率でポジティブクローンを得る事ができた。これらポジティブクローンについてDNA配列解析を行い、ポジティブクローンの濃縮効率を調べた。Erk2に関しては、トータルで14種類の配列の異なるクローンが得られ、約7割がグループAに属するクローンであった。ここで、グループAからMに属するクローンはLoop1からLoop3までがまったく同一のアミノ酸配列を持ち、Loop4だけ配列が異なっていた表2、グループA~Nの配列は、それぞれ配列番号21~配列番号34に対応する。この傾向はTrxの場合においても観察された表3、グループA~Hの配列は、それぞれ配列番号35~配列番号42に対応する。これらの8種類の異なるクローンの内、グループA、C、D、E、及びFはLoop1からLoop3までが同一配列を持っていた。これらの結果より、本発明の人工抗体は主にLoop1からLoop3を使ってターゲットを認識している事が考えられる。また、選択された各種クローンの結合比活性を比較する目的で、Erk2結合クローンから1回以上得られたクローングループA、B、C、D、及びNと単独のクローングループJ、およびTrx結合クローングループA、C、D、G、及びHを発現させ、精製した。ほとんどのクローンで、最終精製量は約200-250mg/L2×YT培地の良好な回収量で得ることができた。次に、精製したすべての結合クローンを500ng/wellで調製し、ELISAによる結合活性を比較した表4。Erk2の場合、グループA、B、C、D、及びJはLoop1からLoop3までが同じアミノ酸配列であるにもかかわらず、グループA、B、及びJとグループC及びDとの間に明らかな比活性の差が認められた。Trxの場合においても同様の結果が得られ、Loop1からLoop3が同一のアミノ酸配列であるグループA、C、及びDの内、グループC及びDは明らかに比活性が低かった。これらの結果は、本発明の人工抗体のLoop4はターゲットとの親和性に大きく影響を及ぼしている事を示唆している。Erk2結合クローンの親和性測定Erk2結合クローンcloneNについて、SPRBIACOREによって親和性を解析した結果、Kd=30nMの一般的な抗体と同等の親和性を持つ事が確認された図6。精製したErk2結合クローンによる組換えErk2の免疫沈降精製したErk2結合クローンCloneNの抗原特異性を検討する目的で、哺乳動物細胞抽出液に組換えErk2タンパク質を加えて、Erk2結合クローンによる免疫沈降実験を行った図7。まず、SDS-PAGEの結果、Erk2結合クローンを加えた場合、Erk2タンパク質の分子量に相当する位置で1本のバンドが認められ、その他非特異的なバンドは検出されなかった。また、ウエスタンブロットの結果、検出されたバンドがErk2タンパク質である事が確認された。これらの結果より、細胞抽出液中でErk2結合クローンは厳密にErk2タンパク質を認識している事が確認された。哺乳動物細胞内で発現したErk2結合クローンによる内在性Erkの免疫沈降次に、精製したタンパク質による免疫沈降実験ではなく、Erk2結合クローンの遺伝子を細胞内に導入し、内在性Erk1およびErk2Erk1/2の免疫沈降を検討した図8。Erk2結合クローン遺伝子を導入した場合、内在性Erk1/2のバンドがはっきりと確認され、コントロールであるTrx結合クローン遺伝子を導入した細胞においてはバンドは確認されなかった。この結果より、RNF8人工抗体は細胞内で安定に発現し、また、高い機能性を持つことが証明された。一般的に、免疫沈降は界面活性剤等で細胞を破壊し、その細胞抽出液に精製した抗体タンパク質を加える事で実行される。この方法では、対象となるターゲットごとに抗体を精製する必要があり、スループット性が極めて低い。また、細胞抽出液からの免疫沈降であるため、より自然な細胞内環境を反映した結果を得る事はできない。本発明のRNF8人工抗体は、これらの問題がなく、加えて、様々な細胞の状態細胞周期、薬剤投与などに合わせたまったく新しい免疫沈降法を可能にする。Erk2抗原結合クローンによる細胞内Erk2リン酸化活性の阻害実験図9に示したようにErk1およびErk2Erk1/2は、p90RSK、C-Myc、及びElk1をリン酸化するシグナル伝達因子である。この点を念頭に置き、Erk2結合クローンがErkと結合する事で、p90RSKとの相互作用を阻害p90RSKのリン酸化阻害できるかどうかを調べるために実験を行った図10。その結果、Erk2結合RNF8人工ポリペプチドを導入した場合、明らかなp90RSKのリン酸化抑制が検出され、RNF8人工抗体は細胞内でErkの活性を強く阻害していることが確認され、イントラボディとしての機能性が極めて高いことが証明された。細胞内には一般的な抗体医薬では対応できなかった様々な疾患の要因とされるタンパク質が多く知られており、それゆえに、RNF8人工抗体は、基礎研究のみならず、これらのタンパク質をターゲットとした新規医薬の開発にも応用することが可能である。Erk2結合ポリペプチドによる内在性Erkの局在制御Erk2に結合するクローンに核移行シグナルNLSを導入し、これらを細胞内で発現させて、内在性Erkの局在化を観察した図11。まず、EGFPを観察した。すべての結合クローンの核内への局在が認められた。次に、抗Erk抗体によって内在性Erkを観察した。Erk2結合クローンを導入したすべての細胞で内在Erkの核内への移行が認められ、コントロールであるTrx結合分子を導入した細胞においては、内在性Erkの核内移行は認められなかった。この結果より、Erk2結合ポリペプチドによる細胞質に存在する内在性Erkの核内への共移行性が確認され、ターゲットタンパク質の細胞内局在を自由にコントロールできることが証明された。抗体をベースとしたイントラボディの場合で、ER残留signalSEKDELの付加によって、イントラボディのERへの局在を制御できることが知られておりMarascoetalProcNatlAcadSciUSAvol90pp78897893、RNF8人工抗体にある種の移行シグナルを付加する事によって核外移行シグナル:NES、核小体移行シグナル:NOS、ミトコンドリアマトリックス移行シグナル:MTS、ペルオキシソーム移行シグナル:PTSなど、様々な部位への局在を制御場合によってはターゲット複合体としてする事が可能である。