"a親水性担体、b少なくとも10個のシグナル生成基、c分析物特異的結合対成員及びdリンカーを含むコンジュゲート。前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項1に記載のコンジュゲート。a.1少なくとも10個のシグナル生成基、2分析物特異的結合対成員、3親水性担体及び4リンカーを含むコンジュゲートを、コンジュゲート/分析物複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で被験試料と接触させること;及びb.前記コンジュゲートの前記少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定することの工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。前記分析物が、1ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、2前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、3前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び4前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌に対する前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項5に記載の方法。前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項5に記載の方法。a.被験試料を、分析物/第一分析物特異的結合対成員複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で第一分析物特異的結合対成員と接触させること;b.aで生じた前記複合体を、分析物/第一分析物特異的結合対成員/コンジュゲート複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で、1親水性担体、2少なくとも10個のシグナル生成基、3第二分析物特異的結合対成員及び4リンカーを含むコンジュゲートと接触させること;及びc.前記コンジュゲートの前記少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定することの工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。前記分析物が、1ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、2前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、3前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び4前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌のフラグメントから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項10に記載の方法。前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項10に記載の方法。1親水性担体、2少なくとも10個のシグナル生成基、3分析物特異的結合対成員及び4リンカーを含むコンジュゲートを含む、被験試料における分析物の検出のためのキット。a少なくとも10個のシグナル生成基を親水性担体に組み込むこと;bリンカーを工程aで生じた前記生成物に結合させること;及びcコンジュゲートを形成するために工程bの前記結合リンカーと分析物特異的結合対成員とでコンジュゲート形成させることの工程を含む、コンジュゲートを形成する方法。前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項16に記載の方法。前記少なくとも10個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項16に記載の方法。前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項16に記載の方法。上記に鑑みて、高く且つ特異的なシグナルの生成のために10コピー以上の標識を有する安定なコンジュゲートの作製のための方法は現在のところ知られていない。本発明のような、そのようなコンジュゲートは、感染のごく初期の段階で、C型肝炎ウイルスHCV又はヒト免疫不全ウイルスHIVのコア抗原などの非常に小量の分析物pg/ml濃度以下の検出において極めて有用であると考えられる。ここで参照するすべての米国特許及び公表文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。本発明は、a親水性担体、b少なくとも10個のシグナル生成基又は標識、c分析物特異的結合対成員及びdリンカーを含むコンジュゲートを包含する。前記親水性担体は、例えば、ポリペプチド例えばBSA、多糖例えば誘導体化デキストラン又はシクロデキストラン又はポリオキシエチレンアミンでありうる。少なくとも10個でなければならない前記シグナル生成基は、例えば、発光原例えばアクリジニウムエステル及びアクリジニウムスルホンアミドなどのアクリジニウム含有化合物、フェナントリジニウム及び1,2-ジオキセタンルミノール、色素原、発蛍光団、蛍光原又は放射性同位体でありうる。さらに、それらは同じエレメント又はその混合物でありうる例えば、10個のアクリジニウムエステル又はいくつかのアクリジニウム含有化合物といくつかのフェナントリジウム化合物の混合物等。前記分析物特異的結合対成員は、例えば、抗原、抗体、あるいは抗原又は抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は抗体のフラグメント例えばFab、Fab’又はFab’2でありうる。本発明はまた、a1少なくとも10個のシグナル生成基、2分析物特異的結合対成員、3親水性担体及び4リンカーを含むコンジュゲートを、コンジュゲート/分析物複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で被験試料と接触させること;及びb前記コンジュゲートの少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって被験試料中の前記分析物の存在を判定すること、の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法を包含する。前記分析物は、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、前記ウイルス、寄生生物、細菌又は真菌のフラグメント、前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌に対する抗体のフラグメントでありうる。コンジュゲートのエレメントは上述した通りでありうる。さらに、本発明は、a被験試料を、分析物/第一分析物特異的結合対成員複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で第一分析物特異的結合対成員と接触させること;baで生じた前記複合体を、分析物/第一分析物特異的結合対成員/コンジュゲート複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で、1親水性担体、2少なくとも10個のシグナル生成基、3第二分析物特異的結合対成員及び4リンカーを含むコンジュゲートと接触させること;及びc前記コンジュゲートの少なくとも10個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって被験試料中の分析物の存在を判定すること、の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法を包含する。分析物は、コンジュゲートと同様に上述した通りでありうる。さらに、本発明は、1親水性担体、2少なくとも10個のシグナル生成基、3分析物特異的結合対成員及び4リンカーを含むコンジュゲートを含む、被験試料における分析物の検出のためのキットを包含する。また、本発明は、a少なくとも10個のシグナル生成基を親水性担体に組み込むこと;bリンカーを工程aで生じた前記生成物に結合させること;及びcコンジュゲートを形成するために工程bの前記結合リンカーに分析物特異的結合対成員を結合させること、の工程を含む、コンジュゲートを形成する方法を包含する。やはり、コンジュゲートのエレメントは上述した通りでありうる。本発明は、コンジュゲート、コンジュゲートを作製する方法及びコンジュゲートを使用する方法に関する。コンジュゲートは4つのエレメントを含む。より特定すると、コンジュゲートは、1親水性担体、2少なくとも10コピーの同じか又は異なる標識又はシグナル生成基、3リンカー及び4分析物特異的結合対成員を含む。前記親水性担体は、好ましくは少なくとも10コピー、より好ましくは少なくとも20コピー、さらに一層好ましくは少なくとも30コピー、最も好ましくは少なくとも40コピーの同じシグナル生成基又は標識あるいは異なるシグナル生成基又は標識が組み込まれている。10-40の間のすべての整数も本発明の範囲内に含まれるとみなされる。標識は親水性担体に直接結合され、その担体とへテロ二官能性リンカーを通して分析物特異的結合対成員に間接的に連結される図1参照。コンジュゲートの親水性担体は、へテロ二官能性リンカーによって分析物特異的結合対成員すなわち抗原又は抗体に結合又は連結される。コンジュゲートは、標識によって生成されるシグナルを増幅し、それによって被験試料中の分析物の検出を示す。特に、本発明のコンジュゲートは被験試料中の対象分析物についての感受性を高める能力を有する。標識又はシグナル生成化合物は、それ自体検出可能であるか又は検出可能な産物を生成するために1個以上の付加的な化合物と反応させうる。シグナル生成化合物の例は、色素原、放射性同位体例えばI-125、I-131、P-32、H-3、S-35及びC-14、化学発光化合物例えばアクリジニウム含有化合物、発蛍光団、時間分解蛍光原、発光原及び粒子可視又は蛍光を含む。酵素例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼも検出可能シグナルの生成において使用しうる。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅例えばポリメラーゼ連鎖反応及びラマン分光法などの他の検出系も有用である。本発明の標識又はシグナル生成基は、好ましくは発光原基である。同じか又は異なる発光原又は化学発光基を使用しうる。シグナル生成のための発光原基は、例えば、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウム、1,2-ジオキセタン及びルミノールから選択しうる。好ましい発光原化合物は、米国特許第5,468,646号に述べられている、アクリジニウムスルホンアミドである。これらの化合物は通常の保存条件下で安定であるが、化学的に引き金を引かれると高い量子収率で光を放出しうる。疎水性非特異的結合を軽減するために使用する親水性担体は、例えば、ポリペプチド、タンパク質例えばウシ血清アルブミンBSA、ポリオキシエチレンアミン及び多糖例えば誘導体化シクロデキストラン及びデキストランから選択しうる。前記担体は、1多くの標識を結合することができ及びその後分析物特異的結合対成員と共役反応することができる、例えばアミンなどの基で高度に官能基化されており、2高度に水溶性であり、及び3中性又は負に荷電しているべきである。最後の2つの物理的性質は、コンジュゲートの溶解度を高め、非特異的結合を低下させる。好ましい親水性担体はウシ血清アルブミンBSAである。前記担体は、分析物特異的結合物質又は成員に、抗体の場合はそのリンカーアームを使用して、2つの重鎖の間のそのヒンジ部位で結合する。高い非特異的結合と低い抗体活性の制限のゆえに、直接標識から作製されるコンジュゲートはほとんど、最適アッセイ成績のために6より高い抗体への標識の組込み率を有していない。しかし、ここで述べる新規コンジュゲートは、分析物特異的結合対成員例えば抗体又は抗原当り少なくとも10個の発光原基を担持し、意外にも、直接標識から作製した対照コンジュゲート最適組込みは抗体当り4から6個の発光基と比較したとき、バックグラウンドは等しいか又はそれより低いが、陽性対照例えばHCVコア抗原陽性対照よりも有意に良好な応答を与える。本発明のコンジュゲートを作製しうるいくつかの方法が存在する。好ましい方法では、化合物を形成するために、最初に親水性担体例えばBSAに多数のコピーの発光原基例えばアクリジニウムを組み込む図1参照。生じた生成物例えば発光原基x-親水性担体、例えばアクリジニウムx-BSAを、次に、ヘテロ二官能性リンカーで活性化する。活性化発光原基x-親水性担体化合物、例えばアクリジニウムx-BSA上の基例えばマレイミドを使用して、最終コンジュゲートを形成するために分析物特異的結合対成員例えば抗体又は抗原上の基、例えばスルフヒドリル基と反応させる。xは、各々の親水性担体分子に共有結合によって組み込んだ発光原基の平均コピー数を表わす。発光原基x-親水性担体化合物を分析物特異的結合対成員例えば抗体又は抗原に連結するために様々なヘテロ二官能性リンカーが使用できる。そのようなヘテロ二官能性リンカー、特にマレイミド活性エステルリンカーは、第一分子上のアミンと化学選択的に反応し、次に生理的pHで高度に制御された方法でチオール含有第二分子にコンジュゲート形成するので、特に好ましい。ヘテロ二官能性リンカーは、例えばスクシニミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレート、スクシニミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシ-6-アミドカポレート、伸びきりextended長鎖リンカー米国特許第4,994,385号参照から選択することができる。さらに、分析物特異的結合物質が抗体である場合は、抗体重鎖のヒンジ部位におけるジスルフィド結合の還元から生成されるスルフヒドリル基を使用しうる。このコンジュゲート形成工程は、コンジュゲートによる抗体結合部位の遮断を回避してより良好な感受性を可能にする。抗体のヒンジ部位における重鎖間のジスルフィド結合は、例えば、ジチオトレイトールDTT5から50mMによって環境温度で短時間のうちにすなわち30分以内に容易にスルフヒドリル基に還元される。例えばゲルろ過によって過剰のDTTを除去した後、前記スルフヒドリル基を、効率的にコンジュゲートの形成を生じさせる、活性化発光原基x-親水性担体例えばアクリジニウムx-BSA上のマレイミド基と選択的に反応させる。前記抗体は、例えば全IgM、IgG又はFab’2でありうる。抗原が分析物特異的結合対成員であり、発光原基x-親水性担体化合物例えばアクリジニウムx-BSAに結合しなければならないときは、いくつかの方法でスルフヒドリル基を抗原上に生成しうる。例えば、ジスルフィド結合からスルフヒドリル基を生成することができる。例えば、DTT又はシステイン2-メルカプトエチルアミンなどの還元剤を使用しうるジスルフィド結合を含む抗原に関して。あるいは、スルフヒドリル基を導入するためにTraut’sReagent、2-イミノチオラン塩酸塩PierceChemical,Rockford,ILを使用しうる。やはり、スルフヒドリル基の目的は、活性化発光原基x-親水性担体例えばアクリジニウムx-BSA上のマレイミド基と反応させることである。本発明のコンジュゲートは多くの用途を有する。例えば、被験試料における対象分析物の検出において使用しうる。特に、本発明は、不均質免疫測定法から生成される特異的発光シグナルの存在を検出することによって被験試料中の分析物の存在を判定するための方法を包含する。1つの方法では、コンジュゲート及び特にコンジュゲートの分析物特異的結合対成員に対象分析物との複合体を形成させるために、コンジュゲートを被験試料と接触させうる。そのような複合体が形成されるとき、コンジュゲートの発光原基は、次に、検出可能な化学発光シグナルを生成する。シグナルの検出は前記試料における分析物の存在を指示する。診断アッセイにおいて前記コンジュゲートを使用するもう1つの方法は、最初に対象分析物を含む被験試料を、分析物/分析物特異的結合対成員の複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で分析物特異的結合対成員と共にインキュベートして、第一混合物を形成することを含む。本発明に関して、分析物特異的結合対成員は、特異的結合対の成員である。すなわち、そのうちの1個が、化学的又は物理的手段を通して第二分子に特異的に結合する、2個の異なる分子である。それ故、一般的免疫測定法の抗原及び抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンとアビジン、糖質とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターと受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害因子と酵素を含みうる。分析物特異的結合対成員はまた、コンジュゲート上述したようなとプローブすなわち被験試料中に存在する特異的ポリヌクレオチドすなわち分析物を特定するために使用できる規定された核酸セグメントの組合せを含みうる。プローブならびにここで使用するいくつかの他の用語の定義については、例えば米国特許第6,207,380B1号参照。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合成員の類似体である成員、例えば分析物類似体を含みうる。免疫反応性特異的結合成員は、組換えDNA分子によって形成されるものを含む、抗原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体及び抗体フラグメント、及びそれらの複合体を包含する。本発明に関して、抗体の部分又はフラグメントは、結合特性に関して完全な抗体と機能的に同じように反応する抗体のサブユニットと定義される。さらに、本発明に関して、抗原の部分又はフラグメントは、抗原に由来する少なくとも3個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも8個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも15個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と定義される。ヌクレオチド配列の部分又はフラグメントは、特定ヌクレオチド配列の領域に対応するすなわち同一又は相補的少なくとも6個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも8個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも10個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15個のヌクレオチドの隣接配列を指す。被験試料は、例えば、赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿などの全血成分、腹水、尿、脳脊髄液などの何らかの生体液、ならびに対象分析物を含有しうる身体の他の成分すなわち組織でありうる。分析物は、被験試料中に存在しうる又は存在しない可能性がある、検出すべき物質である。分析物は、それに対する抗体又はそのフラグメント例えばIgM、IgG、Fab、Fab’mFab’2、抗原又はそのフラグメントなどの天然に生じる特異的結合成員が存在する物質、又はそれに対する特異的結合成員を作製することができる物質でありうる。それ故、分析物は、アッセイにおいて1個以上の特異的結合対成員に結合することができる物質である。分析物の語はまた、抗原性物質、ハプテンすなわち部分抗原、又は抗体に結合することができるが、キャリアタンパク質に結合しない限り抗体形成を誘導することができない非タンパク質結合成員、抗体又はそれらの組合せを包含する。特異的結合対の成員として、分析物は、例えばビタミンB12の測定のための特異的結合対の成員としての内因子タンパク質の使用、又は糖質の測定のための特異的結合対の成員としてのレクチンの使用のように、天然に生じる特異的結合パートナーすなわち対によって検出することができる。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、細菌、酵母、核酸配列、臨床化学アッセイにおいて検出される何らかの物質、ウイルス例えばB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びHTLV、寄生生物、上記のフラグメント例えばエピトープならびに上記物質のいずれかの代謝産物又は上記物質のいずれかに対する抗体を含みうる。そのような抗体の作製のための詳細及び特異的結合成員としての使用の適合性は当業者に周知である。ひとたび分析物/分析物特異的結合成員対の複合体が形成されれば、それらを上述したコンジュゲートと接触させうる。特に、前記コンジュゲートは、もう1つの分析物特異的結合対成員、親水性担体及び第二混合物を形成するための多数のコピーの1種類以上の発光原化合物又は基を含む。本発明に関して、コンジュゲートは、分析物に特異的な物質すなわち分析物特異的結合対成員が親水性担体を通して共有結合するリンカーアームによって少なくとも10個の発光原化合物又は基を含む。第二混合物を、次に、分析物/分析物特異的結合成員対/コンジュゲート複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。最後に、発光原基によって生成される検出可能シグナル存在を測定することによって被験試料中の分析物の存在を判定する。分析物特異的結合対成員を固相に付着させうることに先ず留意すべきである。固相は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶性にすることができる物質を指す。固相は、捕獲試薬すなわち分析物又は補助特異的結合成員のいずれかに特異的な非標識特異的結合成員を誘引し、固定化するその内在性能力によって選択しうる。あるいは、固相は、捕獲試薬又は分析物特異的結合成員を誘引し、固定化する能力を有する付加的な受容体を保持しうる。固相はまた、捕獲試薬を誘引し、固定化する能力を有する付加的な受容体を保持しうる。固相の例は、ガラス繊維、セルロース、ナイロンパッド、浸漬棒、試験紙、ポリマー又はガラスビーズ、ミクロ粒子、チューブ、シート、プレート、マイクロタイターウエル、高分子フィルム、紙、シリカゲル、アガロース、スライド、ウェッブ、テープ、試験管又は内因性電荷を有する又は荷電物質を保持しうる何らかの物質を含む。前記コンジュゲートはまた、溶液中で実施されるアッセイにおいても使用しうる。本発明のコンジュゲートはまた、特定ウイルス感染例えばHBV、HCV、HIV、HTLV等、細菌感染、寄生生物感染等に関連する特定ヌクレオチド配列又はその部分上記で定義したようなを検出するために核酸検出又は分子スクリーニングアッセイにおいても使用しうることに留意すべきである。そこで、そのようなアッセイに関して、分析物特異的結合対成員は、被験試料中の対象配列にハイブリダイズするプローブ又は核酸配列である。特に、プローブは、標的配列に相補的であり、適切な条件下で標的配列にハイブリダイズするために使用される特異的オリゴヌクレオチド配列である。プローブと分析物が特定の度合の配列同一性を有する場合、プローブ/分析物ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野の通常技術のいずれかによって決定できる例えば、NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,Hames編集、1985、Oxford;Washington,D.C.;IRLPress参照;Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版、1989、ColdSpringHarbor、NYも参照のこと。本発明のコンジュゲートを使用しうる他のアッセイは、例えば、蛍光偏光例えば溶液中での均一アッセイ、間接アッセイ、直接アッセイ、競合測定法、高速試験、分子スクリーニングアッセイ、ウエスタンブロット法、阻害アッセイ、光サイトメトリー及び組織染色アッセイを含むQuinn,TheImmunoassayHandbook,第2版、Wild編集、2001参照。そのような様式は当業者には容易に理解される。本発明はまた、上述したコンジュゲートを含むキットを包含する。そのようなキットは、例えばウイルス、細菌、真菌例えば酵母及び寄生生物感染から生じる核酸配列、抗原、抗体又はその部分例えばハプテン、エピトープ、Fabフラグメント等を検出するために使用できる。上記方法及び、特に、上記コンジュゲートは、コンジュゲートを使用する現在使用可能なアッセイにおける代替物として使用することができ、それによって1対象分析物の検出時のシグナル増幅及び2対象分析物に対する感受性を改善することに留意すべきである。本発明は、以下の非制限的実施例を使用して例示されうる:実施例Iアクリジニウムx-ウシ血清アルブミンの作製結晶性BSAを、0.1CHAPS[3-3-コラミドプロピルジメチルアミノ-1-プロパンスルホン酸塩]を含むリン酸緩衝液中に6.7mg/mlの濃度で溶解することによってウシ血清アルブミンBSAの溶液を作製した。DMF[N,N-ジメチルホルムアミド]中のアクリジニウム活性エステル290mlを、4mlアンバーバイアル中の前記BSA溶液1mlに加えた。前記活性エステルは、10-3-スルホプロピル-N-2-カルボキシエチル-9-アクリジニウムカルボキサミド米国特許第5,468,646号及びN-ヒドロキシスクシニミドから作製し、4mg/mlでDMFに溶解した。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌して混合し、その後50-60分間環境温度下に置いた。次にG25ゲルろ過のために溶液をPD10カラムAmershamBiosciences,Uppsala,Swedenに移し、0.1CHAPSを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端空隙で黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集した。タンパク質濃度及びBSA分子当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために280及び370nmでアクリジニル化BSAの吸光度を測定した。濃度は1.45mg/ml、12.8アクリジニウム/BSAと算定された。実施例IIアクリジニウムx-BSAへのマレイミド基の結合a30原子リンカーによる活性化アクリジニウムx-BSA1mlアンバーバイアル中の実施例1よりを、5mMでDMFに溶解した30原子リンカー、スクシニミジル4-トリカプロアミドシクロヘキシルメチルN-マレイミド米国特許第4,994,385号108μlに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、その後60分間環境温度下に置いた。次にゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1CHAPS及び5mMEDTA[エチレンジアミン四酢酸塩]を含むリン酸緩衝液で溶出した。前端でアクリジニウムx-BSA-30原子マレイミドを含む黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで氷浴中で保存した。b長鎖SMCCによる活性化アクリジニウムx-BSA1mlアンバーバイアル中の実施例1よりを、DMF中で5mMに新鮮溶解したスクシニミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシ-6-アミドカポレートLC-SMCC、PierceChemicalCo.,Rockford,IL108μlに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、60分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1CHAPS及びEDTAを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端でアクリジニウムx-BSA-LCマレイミドを含む黄色ピークを清浄な4mlアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで2-8°Cの冷蔵庫で保存した。実施例III還元Mabc11-10IgGとアクリジニウムx-BSA-30原子マレイミドとのコンジュゲート形成モノクローナル抗HCVコア抗原である、1.5mlバイアル中の0.1CHAPSを含むpH7.0のリン酸緩衝液1ml中のクローンc11-10TonenCorp.,Ohi-Machi,Japan3.5mgに、蒸留水中に25mMの濃度まで新鮮溶解した0.5Mジチオトレイトール50μlを加えた。溶液を静かに逆転させることによって混合し、30分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をPD10カラムに移し、0.1CHAPS及び5mMEDTAを含むpH7.0のリン酸緩衝液で溶出した。A280ピークにおける還元IgGを空隙容量から清浄な4mlアンバーバイアル中に収集し、コンジュゲート形成時まで氷浴で保存した。還元抗体の収集後10分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例IIaからのアクリジニウムx-BSA-30原子マレイミド2.2mlを、アンバーバイアル中の還元c11-10IgG1mlに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを18から20時間、2から8°Cの冷蔵庫内に置いた。そのコンジュゲート混合物を0.1の最終濃度までProclin300Rohm-Haas,Philadelphia,Penn.に加え、0.22ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを、300×7.8mmBio-SilSEC-400-5カラムBio-Rad,Richmond,Calif.によるサイズ排除高圧液体クロマトグラフィーHPLCで分画し、0.1CHAPSを含むリン酸緩衝食塩水で溶出した。HPLCはBeckmanGoldenSystemBeckmanCoulterInc.,PaloAlto,CAで実施した。流速は1ml/分であり、溶出物を280と370nmの波長の二元チャンネルで監視した。各々の注入量は200μlであり、遊離IgGのピークに先立つピーク付近で3つの分画を収集した。タンパク質濃度及びIgG分子当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために、各々の分画の吸光度をBeckmanDU-7分光光度計BeckmanCoulterInc.,PaloAlto,CAにおいて280及び370nmで測定した。以下の表はその評価を示す:10.5-11.5分の保持時間を有する分画3は、1:1のモル比のアクリジニウム-BSA及びIgGとの単量体コンジュゲートを示す、約220kDaの分子量HPLC溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づくに対応するピーク280及び370nmを含む。分画1及び2は、アクリジニウム-BSAとIgGの様々な組合せのオリゴマーコンジュゲートの混合物を示す、300から670kDaの範囲の分子量に対応する9.0から10.5分の保持時間を有する伸長前端肩部として出現した。実施例IV還元Mabc11-10IgGとアクリジニウムx-BSA-LCマレイミドとのコンジュゲート形成還元c11-10IgGを、実施例IIIで述べたのと同じ手順によってc11-10IgG1.78mg/mlから作製した。また、還元抗体の収集後10分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例IIbからのアクリジニウムx-BSA-LCマレイミド0.8mlをアンバーバイアル中の還元c11-10IgG0.25mlに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを18から20時間、2から8°Cの冷蔵庫内に置いた。0.1までのProclin300を前記コンジュゲート混合物に加え、0.22ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを実施例IIIで述べたようにSEC-HPLCで分画した。各々の注入量は200μlであり、遊離IgGのピークに先立つピーク付近で2つの分画を収集した。各々の分画を280及び370nmで測定し、IgG濃度及びIgGモル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。10.5から11.4分の保持時間を有する分画2は、1:1のモル比のアクリジニウム-BSA及びIgGとの単量体コンジュゲートを示す、約220kDaの分子量HPLC溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づくに対応する主ピーク280及び370nmを含む。分画1は、アクリジニウム-BSAとIgGの様々な組合せのオリゴマーコンジュゲートの混合物を示す、300から670kDaの範囲の分子量に対応する9.5から10.5分の保持時間を有する伸長前端肩部の一部である。実施例VMabc11-10Fab’とアクリジニウムx-BSA-LCマレイミドとのコンジュゲート形成c11-10Fab’2をペプシン消化によって作製し、Superdex200Gカラムから精製したAoyagiら、J.Clin.Mirobiol.37,p.1802-18081999。アクリジニウム-BSAとc11-10Fab’とのコンジュゲート形成を実施例IIIで述べたのと同じ手順によって実施した。但しIgGの代りにc11-10Fab’20.5mgから出発した。c11-10Fab’2のDTT還元からc11-10Fab’2を収集した後10分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例IIbからのアクリジニウムx-BSA-LCマレイミド0.8mlをアンバーバイアル中の還元c11-10Fab’0.8mlに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを18から20時間、2から8°Cの冷蔵庫内に置いた。そのコンジュゲート混合物をProclin300に加えて0.1にし、0.22ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを、VarianProStarSystemVarianInc.,WalnutCreek,Calif.において600×21mmTSK-GelG3,000カラムTosohBiosepLLC,Montgomeryville,PAによるサイズ排除HPLCで分画し、0.1CHAPSを含むリン酸緩衝食塩水で溶出した。流速は3ml/分であり、溶出物を280と370nmの波長の二元チャンネルで監視した。注入量は1mlであり、32から38分の保持時間から、毎分1つの分画で6つの分画を収集した。タンパク質濃度及びFab’当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために、各々の分画の吸光度をVarianCary50Scan分光光度計VarianInc.,WalnutCreek,CAにおいて280及び270nmで測定した。Fab’濃度及びFab’モル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。32-34分の保持時間を有する分画1及び2は、2:1のモル比のアクリジニウム-BSA及びFab’とのコンジュゲートを示す、約200kDaの分子量HPLC溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づくに対応するサイドピーク280及び370nmを含む。分画5及び6は、ほぼ、1:1のモル比のアクリジニウム-BSA及びFab’とのコンジュゲートの大きさである150kDa天然IgGの大きさに対応する36から38分の保持時間を有する主ピークから成る。分画3及び4は、コンジュゲートの2つのピークの間の重複する肩部である。すなわち、これらはおそらく両方の種類の混合物である。実施例VIHCVコア抗原に関するサンドイッチアッセイD.ShahとJ.Stewartによる出版物AutomatedPanelAnalyzers-PRISMImmunoassayHandbook、第2版、D.Wild編集、NaturePublishing,NY,NYの中に述べられているように単一チャンネルPRISM登録商標装置を使用してアッセイを実施した。簡単に述べると、対照あるいは血清又は血漿試料100μl;界面活性剤、BSA、スーパーオキシドジスムターゼSOD及び0.1アジ化ナトリウムを加えたホウ酸緩衝食塩水である標本希釈用緩衝液SDB50μl;及びc11-14Mab抗HCVコア抗原TonenからのMabと結合した微粒子50μlをステーション1のインキュベーションウエルに加えた。反応トレーを18分間かけてステーション4まで徐々に移動させた。ステーション4で、界面活性剤と0.1Proclin300を加えたトリス塩類溶液である転移洗浄緩衝液によって反応混合物を反応ウエルに移した。反応混合物中の微粒子を反応ウエル内の繊維状マトリックス液体は通過させるによって捕獲した。ステーション5で、アクリジニウム標識抗HCVコアを含むコンジュゲート50μlを反応ウエルに加えた。反応トレーを22.3分間かけてステーション8まで移動させた。ステーション8で、反応ウエル中の反応混合物を、界面活性剤と0.1Proclin300を加えたMES[2-N-モルホリノエタンスルホン酸]緩衝食塩水である最終洗浄緩衝液で洗った。次にそのトレーをステーション9まで移動させ、ステーション9でトリガー溶液、アルカリ過酸化水素を反応ウエルに注入し、そのシグナルを光電子増倍管によって測定した。各々の反応ウエルからの化学発光計数を積分し、その試料IDと共にバッチファイルに整列保存した。アッセイ対照:陰性キャリブレータNCは、HIV、HTLV、HBsAg、HBコア及びHCVに関して試験陰性のカルシウム再添加正常ヒト血漿である。HCVAg検出能を評価するためにHCV抗原陽性のAgPCをHCVAg陽性ヒト血漿NABI,BocaRaton,FLから希釈した。この血漿はHCV抗体に関して試験陰性であったが、PCR核酸ポリメラーゼ連鎖反応によって17,000,000HCVRNAコピー/mlでNAT核酸試験陽性であり、またHCVAgアッセイでも高度に試験陽性であった。実施例VIIアクリジニウムx-BSA-30原子結合c11-10IgGのコンジュゲートの試験各々実施例IIIにおいてSEC-HPLCから単離したコンジュゲート分画2及び3を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1Proclin300を加えた3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS緩衝食塩水のコンジュゲート希釈液中で100ng/mlに希釈した。10-3-スルホプロピル-N-2-カルボキシエチル-9-アクリジニウムカルボキサミドの直接標識から作製したc11-10コンジュゲートを対照として使用した。それらのコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで試験した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは6NCの平均計数であり、陽性応答は2回の試験でのAgPCの平均計数であった。注:陰性対照、NCは、プール陰性血漿から調製した;プール中の各々の標本は、試験でHBsAgに関して非反応性であり、HBc、HIV、HTLV及びHCVに対する抗体に関して陰性であった。HCV抗原陽性のAgPCは実施例VIに述べられている。P/Nは、化学発光の計数における試料応答対陰性対照応答の比率である。P/Nの数値は、アッセイにおけるHCVコア抗原の感受性又は検出能に関する良好な評価を提供する。対照コンジュゲートと比較して、コンジュゲート分画2及び3の両方が、同等のNC計数であったが、計数及びP/N値においてAgPCに対する有意により良好な応答を示した。実施例VIIIアクリジニウムx-BSA-LC結合c11-10IgGのコンジュゲートの試験実施例IVにおいてSEC-HPLCから単離したコンジュゲート分画2を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1Proclin300を加えたMOPS食塩水のコンジュゲート希釈液中で100ng/mlに希釈した。実施例VIIの直接標識アクリジニウムと同じc11-10コンジュゲートを対照として使用した。両方のコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは12NCの平均計数であり、陽性応答は4回の試験でのAgPCの平均計数であった。対照コンジュゲートと比較して、コンジュゲート分画1オリゴマーコンジュゲートは、AgPCに対する2倍以上のシグナル応答と幾分より高いNC計数を示し、一方分画2単量体コンジュゲートは、AgPCに対するさらに一層良好なシグナル応答と同等のNC計数及びP/N値の2.5倍の上昇を示した。言い換えると、単量体コンジュゲートは、オリゴマーコンジュゲート又は対照Acr-c11-10コンジュゲートと比較して、HCVコアAgの検出において有意により良好な感受性を提供する。実施例IXアクリジニウムx-BSA-LC結合c11-10Fab’のコンジュゲートの試験実施例VにおいてSEC-HPLCから単離したコンジュゲート分画を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び0.1Proclin300を加えたMOPS食塩水のコンジュゲート希釈液中で各々50ng/mlに希釈した。実施例VIIの直接標識アクリジニウムと同じc11-10コンジュゲートを対照として使用した。すべてのコンジュゲートをNC及びAgPCに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するP/N比を算定した。バックグラウンドは6NCの平均計数であり、陽性応答は2回のAgPCの平均計数であった。対照コンジュゲートと比較して、3つのコンジュゲート分画すべてが有意に低いNC計数であったが、AgPCに対してはるかに高い応答を示し、P/N値は3.6から6.6倍高かった。明らかに、1:1の比率のアクリジニウム-BSA及びFab’とのコンジュゲート分画6は、HCVコアAg検出における非常に良好な感受性上昇を示した。2:1モル比のアクリジニウム-BSA及びFab’とのコンジュゲート分画2は、最も高い感受性を示した。言い換えると、このコンジュゲートは、同じアッセイ系において、対照Ac-c11-10IgGコンジュゲートによって検出可能な濃度の1/6以下の濃度のHCVコア抗原を検出することができるはずである。"