"表1における配列の群から選択される配列を有するポリペプチド変異体。1つ以上の以下の修飾:a最大8個のアミノ酸残基のアミノ末端切断;およびb最大12個のアミノ酸残基のカルボキシル末端切断をさらに含む、請求項1に記載の変異体。ポリエチレングリコールPEGまたはポリシアル酸に共有結合している、請求項1に記載の変異体。変異体のシステインに共有結合した分岐状40kDaPEG基をさらに含む、請求項3に記載の変異体。以下:IgG定常ドメインまたはそのフラグメント;ヒト血清アルブミンHSA;およびアルブミン結合ポリペプチドの1つからなる異種アミノ酸配列に融合している、請求項1に記載の変異体。異種アミノ酸配列が変異体のアミノ末端に融合している、請求項5に記載の変異体。異種アミノ酸配列が変異体のカルボキシ末端に融合している、請求項5に記載の変異体。少なくとも1つの請求項1に記載の変異体からなる多量体。多量体がホモ二量体である、請求項8に記載の多量体。変異体76V76を含む、ポリペプチドまたはタンパク質変異体。位置154のシステイン残基でペグ化を有する、請求項10に記載の変異体。位置154で分岐状40kDaPEG基をさらに含む、請求項11に記載の変異体。表1における配列からなる群から選択される変異体を含む医薬組成物。位置154のシステイン残基でペグ化を有する変異体76V76をさらに含む、請求項13に記載の医薬組成物。治療有効量の線維芽細胞増殖因子21FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はFGF21関連障害の1つ以上を示す、方法。FGF21関連障害が、1つ以上の以下:肥満、1型および2型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎NASH、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドロームおよび他の代謝障害からなる、請求項15に記載の方法。FGF21関連障害が1型糖尿病からなる、請求項16に記載の方法。FGF21関連障害が2型糖尿病からなる、請求項16に記載の方法。治療有効量の線維芽細胞増殖因子21FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はFGF21関連障害の1つ以上を示す、方法。治療有効量の線維芽細胞増殖因子21FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体を患者に投与することを含む該患者を処置するための方法であって、該患者はFGF21関連障害の1つ以上を示し、該変異体は位置154のシステイン残基でペグ化を有する変異体76V76をさらに含む、方法。FGF21関連障害が、1つ以上の以下:肥満、1型および2型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎NASH、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドロームおよび他の代謝障害からなる、請求項20に記載の方法。FGF21関連障害が1型糖尿病からなる、請求項21に記載の方法。FGF21関連障害が2型糖尿病からなる、請求項21に記載の方法。必要とする患者における高血糖、高インスリン血症、肝臓脂質および体重増加の1つ以上を減少させるための方法であって、治療有効量の線維芽細胞増殖因子21FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体を該患者に投与することを含む、方法。変異体が、位置154のシステイン残基でペグ化を有する変異体76V76をさらに含む、請求項24に記載の方法。発明の詳細な説明タンパク質医薬、例えば、FGF21、例えば、本発明のFGF21タンパク質変異体の開発における重要な挑戦は、それらの物理化学的不安定性に対処することである。タンパク質の組成変化および特性は、特定の性質、例えば、フォールディング、立体配座安定性およびアンフォールディング/変性を定義する。このような特性は、タンパク質水溶液を利用する医薬製剤条件を開発するとき、タンパク質を安定化する必要があるWangWIntJofPharmaceutics18。興味ある治療タンパク質、例えば、本発明のFGF21タンパク質変異体を安定化する所望の効果は、タンパク質分解および酵素分解に対する耐性を増加させ、それにより、タンパク質安定性を改善し、タンパク質凝集を減少させる。具体的には、医薬タンパク質開発において、抗-微生物保存剤、例えば、フェノール、m-クレゾール、メチルパラベン、レゾルシノールおよびベンジルアルコールが、滅菌多目的製剤を意図している非経口医薬製剤において必要である。残念ながら、これらの化合物は、しばしば、タンパク質産物の安定性に悪影響を及ぼし、会合および凝集を引き起こす、特にMaaらIntJofPharmaceutics140155168LamらPharmRes14725729。本発明のFGF21ポリペプチドおよびタンパク質変異体は、当分野で知られている全長野生型FGF21ポリペプチドの修飾バージョンを示す。例えば、FGF21野生型配列とタンパク質変異体との間の比較が必要であるとき、FGF21野生型配列は、参照配列配列番号:1となる。FGF21野生型配列は、NCBI参照配列番号NP_061986.1を有し、例えば、ChironCorporationによるUS6,716,626B1のような発行済み特許において見いだすことができる。全長FGF21ポリペプチドNCBI参照配列番号NM_019113.2をコードする対応するcDNA配列は以下配列番号:2に示される。成熟FGF21配列は、リーダー配列を欠いており、また、当業者により理解されるポリペプチドの他の修飾、例えば、アミノ末端リーダー配列を有する、または該配列を有さないおよび/またはカルボキシル末端のタンパク質分解プロセッシング、より大きな前駆体からより小さいポリペプチドの開裂、N-連結および/またはO-連結グリコシル化および他の翻訳後修飾を含み得る。成熟FGF21配列の典型的な例は、以下の配列全長FGF21タンパク質配列NCBI参照配列番号NP_061986.1のアミノ酸位置29-209を示す配列番号:3を有する:成熟FGF21ポリペプチド配列番号:3をコードする対応するcDNA配列は、以下配列番号:47に示される:タンパク質の発現の分野の当業者は、メチオニンまたはメチオニン-アルギニン配列が、大腸菌における発現のために、FGF21タンパク質変異体のいずれかのN-末端に導入することができることを認識しており、本発明の文脈内に考慮される。FGF21タンパク質変異体。ヒトFGF21変異体、FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体、変異体、FGF21突然変異体などの用語は、天然すなわち、野生型FGF21アミノ酸配列が修飾されている、例えば、野生型タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている、および/または除去されているヒトFGF21を含むように定義される。さらに、変異体は、野生型FGF21タンパク質と比較してN-および/またはC-末端切断を含み得る。一般的に言えば、変異体は、野生型タンパク質のいくつかの修飾された特性、構造または機能を有する。例えば、変異体は、濃縮液中の増強または改善された物理的安定性例えば、低い疎水性媒介凝集、血漿とインキュベートしたとき増強または改善された血漿安定性、または好ましい生物活性プロフィールを維持して増強または改善された生物活性を有し得る。本発明のFGF21ポリペプチドおよびタンパク質変異体と野生型FGF21との間の違いを構成する許容されるアミノ酸置換および修飾は、1つ以上のアミノ酸置換、例えば、非天然アミノ酸アナログとの置換、および切断を含むが、これらに限定されない。したがって、FGF21タンパク質変異体は、本明細書に記載されている部位特異的FGF21突然変異体、切断FGF21ポリペプチド、タンパク質分解-耐性FGF21突然変異体、凝集減少FGF21突然変異体、FGF21組合せ突然変異およびFGF21融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。変異体は、医薬防腐剤例えば、m-クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールとの増加した互換性を有し得、したがって、保存中にタンパク質の生理化学特性および生物学的活性を維持する保存された医薬製剤の調製を可能にする。したがって、野生型FGF21と比較して増強された医薬安定性を有する変異体は、生理学的および保存された医薬製剤条件下で濃縮液中の改善された物理的安定性を有し、生物学的効力を維持している。非限定的な例のために、本発明の変異体は、それらの野生型対応物よりも、タンパク質分解および酵素分解に対してさらに耐性であり得;改善された安定性を有し得;凝集する可能性が低いかもしれない。本明細書において使用される、これらの用語は、相互排他的または限定的ではなく、全体に、挙げられた変異体が野生型タンパク質の1つ以上の修飾された特性を有することを可能にする。本発明はまた、FGF21ポリペプチドまたはタンパク質変異体、または、FGF21タンパク質変異体に対する望ましい特性、例えば、タンパク質分解-耐性、増加した半減期または凝集-減少特性およびそれらの組合せを与える特定の残基がさらに修飾されていない、配列番号:3のアミノ酸配列と少なくとも約95代替的に96、代替的に97、代替的に98、代替的に99同一であるアミノ酸配列を含む変異体をコードする核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解-耐性、凝集-減少または他の特性を与えるために修飾されているFGF21突然変異体配列における残基を除いて、FGF21突然変異体配列における全ての他のアミノ酸残基の約5代替的に4、代替的に3、代替的に2、代替的に1を修飾させることができる。このようなFGF21突然変異体は、野生型FGF21ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する。本発明はまた、コードされたFGF21タンパク質変異体のタンパク質分解-耐性、凝集-減少または他の特性を与えるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドがさらに修飾されていない、配列番号:47のヌクレオチド配列と少なくとも約95代替的に96、代替的に97、代替的に98、代替的に99同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。言い換えれば、タンパク質分解-耐性、凝集-減少または他の特性を与えるために修飾されているFGF21突然変異体配列における残基をコードするヌクレオチドを除いて、FGF21突然変異体配列における全ての他のヌクレオチドの約5代替的に4、代替的に3、代替的に2、代替的に1を修飾させることができる。このようなFGF21突然変異体ポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型FGF21ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する。本明細書において提供されるものは、FGF21ポリペプチドおよび本発明のタンパク質変異体を作製するために使用される方法であって、野生型FGF21タンパク質、例えば、野生型FGF21タンパク質の切断および野生型FGF21タンパク質の興味ある位置でのアミノ酸の部位特異的取り込みを介して、野生型FGF21タンパク質の部位特異的修飾を含む方法である。該修飾は、野生型FGF21タンパク質と比較して本発明の変異体の生物学的特性を増強し、ならびに、いくつかの場合において、固体支持体の表面へ該変異体を付着させる目的のために、例えば、標識およびタンパク質半減期延長剤に対する、付着点として役割を果たす。本発明の関連態様は、該ポリペプチドおよびタンパク質変異体を、ならびに該変異体をコードするDNAを含むベクターを生産することができる細胞を生産する方法である。1つの態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドにポリエチレングリコールPEGを結合させるために使用される。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドにPEG-コレステロール抱合体ミセルおよびリポソームを含むを結合させるために使用される。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドに糖グリコシル化を結合させるために使用される。他の態様において、このような部位特異的修飾は、FGF21野生型および/または変異体多量体、例えば、二量体ホモ二量体またはヘテロ二量体または三量体の生産のための結合手段として使用される。これらの多量体FGF21分子は、さらに、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、他のタンパク質、例えば、Fc、HSAなどに結合または融合された基、例えば、PEG、糖、および/またはPEG-コレステロール抱合体を有し得る。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドを生産するために使用され、部位特異的に組み込まれたピロリジンまたはピロリジン類似体の位置が、制御配向および固体支持体の表面上へのこのようなタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドの結合を可能にするか、または結合される基、例えば、PEG、糖および/またはPEG-コレステロール抱合体を有することを可能にする。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体を含むが、これらに限定されないヘテロ-オリゴマーを形成する。他の態様において、このような部位特異的修飾は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドを部位特異的に架橋するために使用され、それにより、タンパク質-タンパク質抱合体、タンパク質-ポリペプチド抱合体、タンパク質-ペプチド抱合体、ポリペプチド-ポリペプチド抱合体、ポリペプチド-ペプチド抱合体またはペプチド-ペプチド抱合体を形成する。定義種々の定義が、本明細書を通して使用される。多数の用語は、当業者がそれらの用語に帰属すると考える意味を有する。下記で、または本明細書の他の場所で具体的に定義された用語は、全体として、本発明の文脈で提供される意味を有し、一般的には、当業者により理解されるものである。本明細書において使用されるFGF21なる用語は、線維芽細胞増殖因子FGFタンパク質ファミリーメンバーを示す。FGF21GenBank受入番号NP_061986.1のアミノ酸配列は配列番号:1として記載されており、これと対応するポリヌクレオチド配列は配列番号:2NCBI参照配列番号NM_019113.2として記載されている。本明細書において使用されるFGF21受容体なる用語は、FGF21に対する受容体を示すKharitonenkovAらJournalofCellularPhysiology21517KurosuHらJBC2822668726695OgawaYらPNAS10474327437。FGF21ポリペプチドなる用語は、ヒトにおいて発現される天然ポリペプチドを示す。この記載の目的のために、FGF21ポリペプチドなる用語は、あらゆる全長FGF21ポリペプチド、例えば、209アミノ酸残基からなり、配列番号:2のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号:1;全長FGF21ポリペプチドのアミノ末端で28アミノ酸残基すなわち、これはシグナルペプチドを構成するが除去されている181アミノ酸残基からなるあらゆる該ポリペプチドの成熟形態、およびそれらの変異体を互換的に示すために使用することができる。単離された核酸分子なる用語は、1全核酸が供給源細胞から単離されるとき、天然に見出される少なくとも約50パーセントのタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質から分離されている、2単離された核酸分子が天然に連結されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部に連結されていない、3天然に連結されないポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、または4より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然に起こらない本発明の核酸分子を示す。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、ポリペプチド生産における使用または治療、診断、予防または研究の使用を妨げるでろう、天然環境において見られるあらゆる他の汚染核酸分子または他の汚染を実質的に含まない。ベクターなる用語は、コード情報を宿主細胞に伝達するために使用されるあらゆる分子例えば、核酸、プラスミドまたはウイルスを示すために使用される。発現ベクターなる用語は、宿主細胞の形質転換のために適当であり、挿入された異種核酸配列の発現を指向および/またはコントロールする核酸配列を含むベクターを示す。発現は、プロッセシング、例えば、転写、翻訳およびRNAスプライシングイントロンが存在するときを含むが、これらに限定されない。作動可能に連結したなる用語は、フランキング配列が通常の機能を行うように構成されるか、または集合される、フランキング配列の配置を示すために本明細書において使用される。したがって、コード配列に作動可能に連結したフランキング配列は、コード配列の複製、転写および/または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指向することができるとき、プロモーターに作動可能に連結している。正確に機能する限り、フランキング配列はコード配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、介在するまだ翻訳されていない転写配列が、プロモーター配列とコード配列間に存在することができ、プロモーター配列は、コード配列に作動可能に連結していると考えることができる。宿主細胞なる用語は、形質転換されているか、または核酸配列で形質転換され、次に、選択された興味ある遺伝子を発現することができる細胞を示すために使用される。該用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が元の親と構成される形態または遺伝子において同一であるがなかろうと、親細胞の子孫に含む。本明細書において使用されるアミノ酸なる用語は、それらの構造がこのような立体異性体形態を可能にするときDおよびL立体異性体における全てにおいて、天然アミノ酸と同様の様式において機能する、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を示す。アミノ酸は、本明細書において、IUPACIUBBiochemicalNomenclatureCommissionにより推奨される、それらの名前、それらの一般的に知られる3文字記号または1文字記号のいずれかにより示す。生物学的物質、例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などに関連して使用されるときの天然なる用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を示す。同様に、本明細書において使用される非天然は、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾または合成されている物質を示す。ヌクレオチドに関連して使用されるとき天然なる用語は、塩基アデニンA、シトシンC、グアニンG、チミンTおよびウラシルUを示す。アミノ酸に関連して使用されるとき天然なる用語は、20の慣用のアミノ酸すなわち、アラニンA、システインC、アスパラギン酸D、グルタミン酸E、フェニルアラニンF、グリシンG、ヒスチジンH、イソロイシンI、リジンK、ロイシンL、メチオニンM、アスパラギンN、プロリンP、グルタミンQ、アルギニンR、セリンS、スレオニンT、バリンV、トリプトファンWおよびチロシンY、ならびにセレノシステイン、ピロリジンPYLおよびピロリン-カルボキシ-リジンPCLを示す。ピロリジンPYLは、Methanosarcinaファミリーのメタン生成古細菌のメチルアミンメチルトランスフェラーゼ内に天然に見出されるアミノ酸である。ピロリジンは、それぞれのmRNAにおいてインフレームのUAGコドンで共翻訳的に組み込まれるリジン類似体であり、22番目の天然アミノ酸と考えられる。PCT特許公報WO2010/48582出願人IRM、LLCにおいて少なくとも記載されているとおり、大腸菌においてピロリジンPYLを生物合成する試みは、ピロリン-カルボキシ-リジンまたはPCLとして本明細書において称される脱メチル化ピロリジンの形成をもたらした。本明細書において使用されるPCLは、PCL-AまたはPCL-Bのいずれかを示す。本明細書において使用される非天然アミノ酸および非天然アミノ酸なる用語は、互換的に、同じか、または異なっている任意生物体からの修飾されていない、または修飾された遺伝子を使用して、任意の生物体において生合成的に産生することができないアミノ酸構造を示すことが意図される。該用語は、天然野生型FGF21タンパク質配列または本発明のFGF21変異体の配列に存在しないアミノ酸残基を示す。これらは、限定はしないが、20天然アミノ酸の1つではない修飾されたアミノ酸および/またはアミノ酸類似体、セレノシステイン、ピロリジンPYLまたはピロリン-カルボキシ-リジンPCLを含むが、これらに限定されない。このような非天然アミノ酸残基は、天然アミノ酸の置換、および/または天然野生型FGF21タンパク質配列または本発明のFGF21変異体の配列への非天然アミノ酸の挿入により導入することができる。非天然アミノ酸残基はまた、所望の機能性をFGF21分子に与えるように組み込むことができる、例えば、機能性部分に連結する能力例えば、PEG。加えて、このような非天然アミノ酸は、タンパク質への取り込みのために、修飾されたtRNAおよび修飾されたtRNAシンテターゼRSを必要とすることが理解される。これらの選択された直交tRNA/RSペアは、Schultzらにより開発された選択プロセスまたはランダムもしくは標的化突然変異により作製される。一例として、ピロリン-カルボキシ-リジンは、ある生物体から宿主細胞に移動させられた遺伝子により生合成的により産生されるため、および天然tRNAおよびtRNAシンテターゼ遺伝子を使用することによりタンパク質に組み込まれるため、天然アミノ酸であるが、p-アミノフェニルアラニンGenerationofabacteriumwitha21aminoacidgeneticcodeMehlRAAndersonJCSantoroSWWangLMartinABKingDSHornDMSchultzPGJAmChemSoc2003Jan291259359参照は、生合成的に産生されるが、選択された直交tRNA/tRNAシンテターゼペアによりタンパク質に組み込まれるため、非天然アミノ酸である。修飾されたコードアミノ酸は、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、O-ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、ベータ-アラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、第三級-ブチルグリシン、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2’-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-メチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロ-ヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルペンチルグリシン、N-メチルバリン、ナフトアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンを含むが、これらに限定されない。アミノ酸なる用語はまた、特定の生物体における代謝産物であるが、タンパク質への取り込みのために遺伝子コードによってコードされない天然アミノ酸を含む。このようなアミノ酸は、オルニチン、D-オルニチンおよびD-アルギニンを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用されるアミノ酸類似体なる用語は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、一例のみとして、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合されるα-炭素を有する化合物を示す。アミノ酸類似体は、可逆的にまたは不可逆的に、化学的にブロックされている天然および非天然アミノ酸、または化学的に修飾されているそれらのC-末端カルボキシ基、それらのN-末端アミノ基および/またはそれらの側鎖官能基を含む。このような類似体は、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、S-カルボキシメチル-システイン、S-カルボキシメチル-システインスルホキシド、S-カルボキシメチル-システインスルホン、アスパラギン酸-ベータ-メチルエステル、N-エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシンおよびメチオニンメチルスルホニウムを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用されるアミノ酸模擬物なる用語は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが天然アミノ酸と同様の様式において機能する構造を有する化合物を示す。生物学的に活性なFGF21変異体なる用語は、FGF21ポリペプチド変異体に導入されている修飾の型または数にかかわらず、野生型FGF21ポリペプチドの活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールを低くする;体重を減少する;および、グルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を有する本明細書に記載されているあらゆるFGF21ポリペプチド変異体を示す。野生型FGF21ポリペプチドと比較して若干減少したレベルのFGF21活性を有するFGF21ポリペプチド変異体は、それでもなお、生物学的に活性なFGF21ポリペプチド変異体と考えることができる。有効量および治療有効量なる用語はそれぞれ、野生型FGF21ポリペプチドの1つ以上の生物学的活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低くする;肝臓トリグリセリドもしくは脂質レベルを減少する;体重を減少する;または、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力の観察できるレベルをサポートするために使用されるFGF21タンパク質変異体の量を示す。例えば、FGF21関連障害例えば、1型もしくは2型糖尿病、肥満またはメタボリックシンドロームを示す、該障害に罹患している、または該障害に罹患しやすい患者に投与される治療有効量は、上記障害と関連するか、または該障害で死ぬ病理学的症状、疾患進行、生理学的状態における改善を誘導する、改善する、さもなければ引き起こす量である。本発明の目的のために、対象または患者は、好ましくはヒトであるが、動物、さらに具体的には、ペット例えば、イヌ、ネコなど、家畜例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなどおよび実験動物例えば、ラット、マウス、モルモットなどでもあり得る。本明細書において使用される薬学的に許容される担体または生理学的に許容される担体なる用語は、FGF21タンパク質変異体の送達を成し遂げるか、または増強するために適当な1つ以上の製剤物質を示す。抗原なる用語は、抗体により結合することができ、さらに抗原のエピトープに結合することができる抗体を生産するように動物において使用することができる分子または分子の一部を示す。抗原は、1つ以上のエピトープを有し得る。天然Fcなる用語は、単量体または多量体形態のいずれでも、全抗体の消化から得られる、または他の手段により生産される非抗原結合フラグメントの配列を含み、ヒンジ領域を含むことができる分子または配列を示す。天然Fcの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、任意の免疫グロブリンであってよいが、IgG1およびIgG2が好ましい。天然Fc分子は、共有すなわち、ジスルフィド結合および非共有結合により二量体または多量体形態に連結することができる単量体ポリペプチドで構成される。天然Fc分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス例えば、IgG、IgAおよびIgEまたはサブクラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA1およびIgGA2に依存して1から4の範囲である。天然Fcの1つの例は、IgGのパパイン消化から得られるジスルフィド結合二量体であるEllisonら1982NucleicAcidsRes1040719参照。本明細書において使用される天然Fcなる用語は、単量体、二量体および多量体形態の総称である。Fc変異体なる用語は、天然Fcから修飾されるが、サルベージ受容体、FcRn新生児のFc受容体に対する結合部位をまだ含む分子または配列を示す。国際公開WO97/34631およびWO96/32478は、典型的なFc変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、出典明示により包含させる。したがって、Fc変異体なる用語は、非ヒト天然Fcからヒト化された分子または配列を含むことができる。さらに、天然Fcは、本発明のFGF21突然変異体の融合分子に対して必要ではない構造的特徴または生物学的活性を提供するため、除去することができる領域を含む。したがって、Fc変異体なる用語は、1ジスルフィド結合形成、2選択された宿主細胞との不適合性、3選択された宿主細胞における発現時のN-末端不均一性、4グリコシル化、5補体との相互作用、6サルベージ受容体以外のFc受容体への結合、または7抗体依存性細胞毒性ADCCに影響するか、またはこれらと関与する、1つ以上の天然Fc部位または残基を欠いているか、または、1つ以上のFc部位または残基が修飾されている、分子または配列を含む。Fc変異体は、以下にさらに詳細に記載されている。Fcドメインなる用語は、上記定義のとおりの天然FcおよびFc変異体および配列を含む。Fc変異体および天然Fc分子と同様に、Fcドメインなる用語は、全抗体から消化されるか、または他の手段により生産される単量体または多量体形態における分子を含む。本発明のいくつかの態様において、Fcドメインは、例えば、FcドメインとFGF21配列間の共有結合を介して、FGF21またはFGF21突然変異体FGF21またはFGF21突然変異体の切断形態を含むに融合することができる。このような融合タンパク質は、Fcドメインの結合を介して多量体を形成することができ、これらの融合タンパク質およびこれらの多量体の両方が本発明の局面である。ポリエチレングリコールまたはPEGなる用語は、カップリングまたは活性化部分に対してカップリング剤または誘導体化の有無にかかわらず、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を示す。FGF21関連障害なる用語および本明細書において同様に使用される用語は、肥満、1型および2型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎NASH、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害を含むが、これらに限定されない。2型糖尿病は、インスリンの利用可能性にかかわらず過剰なグルコース生産により特徴付けられる状態であり、循環グルコースレベルが、不十分なグルコースクリアランスの結果として、過剰に高く維持される。1型糖尿病は、インスリンの完全な欠乏により引き起こされる高い血糖レベルにより特徴付けられる状態である。これは、身体の免疫系が膵臓におけるインスリンを生産するベータ細胞を攻撃し、それらを破壊するときに起こる。その結果、膵臓は、ほとんどあるいは全くインスリンを生産しない。膵炎は膵臓の炎症である。脂質異常症は、リポタンパク質過剰生産または欠乏を含むリポタンパク質代謝の障害である。脂質異常症は、血液中の、総コレステロール、低比重リポタンパク質LDLコレステロールおよびトリグリセリド濃度の上昇、ならびに高比重リポタンパク質HDLコレステロール濃度の減少により明らかにされ得る。非アルコール性脂肪性肝炎NASHは、アルコール消費と関連せず、小葉内炎症および線維症を伴う肝細胞の脂肪変化により特徴付けられる肝臓疾患である。耐糖能障害または耐糖能異常IGTは、心臓血管病理学の危険性の増加と関連する血糖異常症の前糖尿病状態である。前糖尿病状態は、対象の、グルコースの細胞への効率的な移動およびそれを効率的な燃料源としての利用を防ぎ、血液中のグルコースレベルの上昇およびある程度のインスリン耐性を引き起こす。高血糖は、血中の糖グルコースの過剰として定義される。低い血糖とも称される低血糖は、血糖レベルが、身体の活性のために十分なエネルギーを提供するためにはあまりにも低く低下したときに起こる。高インスリン血症は、正常レベルよりも高い血液中のインスリンとして定義される。インスリン耐性は、正常量のインスリンが、正常以下の生物学的応答を生じる状態として定義される。肥満は、ヒト対象に関して、体重が20パーセント、所定の集団に対する標準体重を超えるとして定義され得るRHWilliamsTextbookofEndocrinology1974p904916。メタボリックシンドロームは、少なくとも3つの以下の兆候のクラスターとして定義することができる:腹部脂肪--ほとんどの男性において、40インチ以上のウエスト;空腹後、高い血糖--少なくとも110ミリグラム/デシリットルmg/dl;血流中の高いトリグリセリド--少なくとも150mg/dL;低いHDL--40mg/dl未満;および、130/85mmHgまたはそれ以上の血圧。高血圧または高い血圧、すなわち、心臓血管損傷または他の悪影響を誘導する可能性のあるレベルへの全身動脈血圧の一時的または持続的上昇。高血圧は、140mmHgを超える収縮期血圧または90mmHgを超える拡張期血圧として独断的に定義されている。心臓血管疾患は、心臓または血管に関連する疾患である。末梢動脈疾患は、プラークが頭、臓器および手足へ血液を運ぶ動脈においてを構築するときに起こる。時間とともに、プラークは、動脈を硬化し狭め、臓器および身体の他の部分への酸素を豊富に含む血液の流量を制限し得るアテローム性動脈硬化症は、大および中動脈の内膜における不規則に分散された脂質沈着により特徴付けられる血管疾患であり、動脈内腔の狭窄を引き起こし、結局は線維症および石灰化が始まる。病変は、通常病巣であり、ゆっくり、断続的に進行する。血流の制限は、病変の分布および重症度によって異なる多くの臨床症状の原因となる。卒中は、24時間以上続く脳循環の損傷に関連するあらゆる急性臨床事象である。卒中は、循環が危険にさらされている脳組織の位置および程度に依存して、不可逆性脳損傷、症状の型および重症度に関連する。鬱血性心不全とも称される心不全は、心臓がもはや身体の他の部分へ血液を十分に供給することができない状態である。冠動脈疾患とも称される冠動脈性心臓疾患は、心臓へ血液および酸素を供給する少量の血管の狭窄である。腎臓疾患またはネフロパシーは、腎臓のあらゆる疾患である。糖尿病性腎症は、1型または2型糖尿病を有する人々における罹患率および死亡率の主な原因である。糖尿病性合併症は、高い血糖レベルにより引き起こされる他の身体機能での問題、例えば、腎臓、神経ニューロパシー、足足部潰瘍および循環不良および眼例えば網膜症である。糖尿病はまた、心臓疾患および骨関節障害に対する危険性を増加させる。糖尿病の他の長期合併症は、皮膚問題、消化問題、性機能障害および歯と歯茎との問題を含む。ニューロパシーは、脳神経または末梢もしくは自律神経系と関連するあらゆる疾患である。胃不全まひは、腸の排出遅延をもたらす胃蠕動の低下である。本発明によって包含される重症患者は、一般的に、不安定な代謝亢進状態を経験する。該不安定な代謝状態は、いくつかの栄養素における相対的な欠乏を引き起こし得る基質代謝における変化による。一般的に、脂肪および筋肉の両方の酸化の増加が存在する。さらに、重症患者は、好ましくは、全身性炎症反応症候群または呼吸困難を経験する患者である。罹患率における減少は、重症患者がさらなる病気、状態または症状を発症する可能性を減少すること、または、さらなる病気、状態または症状の重症度を減少することを意味する。例えば、罹患率を減少することは、菌血症もしくは敗血症または多臓器不全と関連する合併症の発症の減少に対応し得る。本明細書において使用される単数形a、anおよびtheは、文脈上明白に他の意味を示さない限り、複数の表示を含む。したがって、例えば、抗体に対する表示は、2つ以上のこのような抗体の混合物を含む。本明細書において使用される約なる用語は、値の/-20、/-10または/-5を示す。ポリペプチドおよびタンパク質なる用語は、互換的に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾もしくは誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができるあらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を示す。該用語は、融合タンパク質を含み、N-末端メチオニン残基を有していろうとなかろうと、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種および同種リーダー配列との融合;免疫学的タグ化タンパク質などを含むが、これらに限定されない。個体、対象、宿主および患者なる用語は、互換的に使用され、診断、処置または治療が望まれるあらゆる対象、特にヒトを示す。他の対象は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含み得る。いくつかの好ましい態様において、対象はヒトである。本明細書において使用されるサンプルなる用語は、患者由来の生物学的材料を示す。本発明によりアッセイされるサンプルは、何ら特定の型に限定されない。サンプルは、限定的な例として、単一の細胞、複数の細胞、組織、腫瘍、生物学的液体、生物学的分子もしくは上清または前記のいずれかの抽出物を含む。例えば、生検のために取り出される組織、切除中に取り出される組織、血液、尿、リンパ組織、リンパ液、脳脊髄液、粘液および糞便サンプルを含む。使用されるサンプルは、アッセイフォーマット、検出方法ならびにアッセイされる腫瘍、組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化する。サンプルを調製するための方法は、当分野でよく知られており、容易に適合させ、利用される方法に適合するサンプルを得ることができる。本明細書において使用される生物学的分子なる用語は、ポリペプチド、核酸および糖類を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される調節なる用語は、遺伝子、タンパク質または細胞の内部、外部または表面に存在するあらゆる分子の質または量における変化を示す。該変化は、該分子の発現またはレベルにおける増加または減少であり得る。調節するなる用語はまた、限定はしないが、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する;肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少する;体重を減少する;および、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力を含む生物学的機能/活性の質または量の変化を含む。本明細書において使用されるモジュレーターなる用語は、FGF21関連障害、例えば、1型もしくは2型糖尿病または代謝状態様肥満と関連する1つ以上の生理学的または生化学的事象を調節する組成物を示す。該事象は、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する;肝臓脂質もしくは肝臓トリグリセリドレベルを減少する;体重を減少する;および、グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する能力を含むが、これらに限定されない。遺伝子産物は、遺伝子により発現または生産されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、例えば、つなぎ合わされていないRNA、mRNA、スプライス変異体mRNA、ポリペプチド、翻訳後修飾されたポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチドなどであり得る。また、該用語により含まれるものは、鋳型すなわちRNAのcDNAとしてRNA遺伝子産物を使用して作製されるバイオポリマー産物である。遺伝子産物は、酵素的に、組換え的に、化学的に、または遺伝子が生来の細胞内で作製され得る。いくつかの態様において、遺伝子産物がタンパク性であるとき、それは生物学的活性を示す。いくつかの態様において、遺伝子産物が核酸であるとき、それは生物学的活性を示すタンパク性遺伝子産物に翻訳され得る。本明細書において使用されるFGF21活性の調節は、例えば、FGF21ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの薬剤の相互作用、FGF21転写および/または翻訳の阻害例えば、FGF21遺伝子またはFGF21転写産物とのアンチセンスまたはsiRNA相互作用を介して、FGF21発現を促進する転写因子の調節を介してなどの結果であり得るFGF21活性における増加または減少を示す。例えば、生物学的活性の調節は、生物学的活性における増加または減少を示す。FGF21活性は、限定はしないが、対象において血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベルをアッセイすること、FGF21ポリペプチドレベルを評価すること、FGF21転写レベルを評価することを含む方法により評価することができる。FGF21活性の比較はまた、例えば、FGF21下流バイオマーカーのレベルを測定すること、およびFGF21シグナル伝達における増加を評価することにより成し遂げることができる。FGF21活性はまた、細胞シグナル伝達;キナーゼ活性;脂肪細胞へのグルコース摂取;血液インスリン、トリグリセリドまたはコレステロールレベル変動;肝臓脂質または肝臓トリグリセリドレベル変化;FGF21とFGF21受容体間の相互作用;またはFGF21受容体のリン酸化を測定することにより評価することができる。いくつかの態様において、FGF21受容体のリン酸化はチロシンリン酸化であり得る。いくつかの態様において、FGF21活性の調節は、FGF21-関連表現型の調節を引き起こすことができる。本明細書において使用されるFGF21下流バイオマーカーは、遺伝子もしくは遺伝子産物または遺伝子もしくは遺伝子産物の測定可能な徴候である。いくつかの態様において、FGF21の下流マーカーである遺伝子または活性は、血管組織において発現の改変されたレベルを示す。いくつかの態様において、下流マーカーの活性は、FGF21モジュレーターの存在下で改変される。いくつかの態様において、下流マーカーは、FGF21が本発明のFGF21モジュレーターでかき乱されるとき、発現の改変されたレベルを示す。FGF21下流マーカーは、グルコースまたは2-デオキシ-グルコース摂取、pERKおよび他のリン酸化またはアセチル化タンパク質またはNADレベルを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される上方調節するなる用語は、活性または量の増加、活性化または刺激を示す。例えば、本発明の文脈において、FGF21モジュレーターは、FGF21受容体の活性を増加させ得る。1つの態様において、FGFR-1cまたはFGFR-4の1つまたは両方が、FGF21モジュレーターに応答して上方調節され得る。上方調節はまた、FGF21-関連活性、例えば、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドもしくはコレステロールレベルを低下する;肝臓脂質もしくはトリグリセリドレベルを減少する;体重を減少する;グルコース耐性、エネルギー消費もしくはインスリン感受性を改善する;またはFGF21受容体のリン酸化を引き起こす;またはFGF21下流マーカーを増加する能力を示すことができる。FGFR21受容体は、FGFR-1cまたはFGFR-4の1つまたは両方であり得る。上方制御は、コントロールと比較して、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも400または少なくとも500であり得る。本明細書において使用されるN-末端なる用語は、タンパク質の少なくとも最初の10個のアミノ酸を示す。本明細書において使用されるN-末端ドメインおよびN-末端領域なる用語は、互換的に使用され、タンパク質の第1のアミノ酸で始まり、タンパク質のN-末端半分における任意のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、FGF21のN-末端ドメインは、配列番号:1のアミノ酸1から配列番号:1のほぼアミノ酸10から105の間の任意のアミノ酸までである。本明細書において使用されるC-末端なる用語は、タンパク質の少なくとも最後の10個のアミノ酸を示す。本明細書において使用されるC-末端ドメインおよびC-末端領域なる用語は、互換的に使用され、タンパク質のC末端半分における任意のアミノ酸で始まり、タンパク質の最後のアミノ酸で終わるタンパク質のフラグメントを示す。例えば、FGF21のC末端ドメインは、配列番号:1のアミノ酸105から約アミノ酸200の間から任意のアミノ酸で始まり、配列番号:1のアミノ酸209で終わる。本明細書において使用されるドメインなる用語は、生体分子の知られているまたは疑われる機能に寄与する該生体分子の構造部を示す。ドメインは、領域またはその一部と同一であってよく、領域の全てまたは一部に加えて、特定の領域と異なる生体分子の一部を組み込まれていてもよい。本明細書において使用されるシグナルドメインシグナル配列またはシグナルペプチドとも称されるなる用語は、前駆体タンパク質しばしば、膜結合または分泌タンパク質のN-末端領域で一続きのアミノ酸配列にて存在するペプチドドメインを示し、翻訳後タンパク質輸送に関与する。多くの場合、シグナルドメインは、選別プロセスが完了した後、特異的シグナルペプチダーゼにより全長タンパク質から除去される。それぞれのシグナルドメインは、細胞中の前駆体タンパク質の特定の目標を指定する。FGF21のシグナルドメインは、配列番号:1のアミノ酸1-28である。本明細書において使用される受容体結合ドメインなる用語は、膜結合受容体タンパク質と接触し、細胞性応答、例えば、シグナル伝達事象を引き起こすタンパク質の任意の位置または領域を示す。本明細書において使用されるリガンド結合ドメインなる用語は、FGF21の対応する天然配列の少なくとも1つの定性結合活性を保持するタンパク質の任意の位置または領域を示す。領域なる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、領域は、タンパク質のアミノ酸配列の隣接する部分により定義される。いくつかの態様において、領域は、生体分子の機能と関連する。本明細書において使用されるフラグメントなる用語は、生体分子の一次構造の物理的に隣接する部分を示す。タンパク質の場合、部分は、タンパク質のアミノ酸配列隣接する部分により定義され、少なくとも3-5アミノ酸、少なくとも8-10アミノ酸、少なくとも11-15アミノ酸、少なくとも17-24アミノ酸、少なくとも25-30アミノ酸および少なくとも30-45アミノ酸を示す。オリゴヌクレオチドの場合、部分は、オリゴヌクレオチドの核酸配列の隣接する部分により定義され、少なくとも9-15ヌクレオチド、少なくとも18-30ヌクレオチド、少なくとも33-45ヌクレオチド、少なくとも48-72ヌクレオチド、少なくとも75-90ヌクレオチドおよび少なくとも90-130ヌクレオチドを示す。いくつかの態様において、生体分子の部分は、生物学的活性を有する。本発明の文脈において、FGF21ポリペプチドフラグメントは、配列番号:1に記載されている全FGF21ポリペプチド配列を含まない。天然配列ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段により生産することができる。したがって、天然配列ポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたは任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。本明細書において使用される同種ヌクレオチド配列もしくは同種アミノ酸配列またはそれらの変異なる句は、少なくとも特定のパーセントのヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列を示し、配列同一性と互換的に使用される。同種ヌクレオチド配列は、タンパク質のアイソフォームをコードする配列を含む。このようなアイソフォームは、例えば、RNAの代替スプライシングの結果として、同じ生物体の異なる組織において発現させることができる。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。同種ヌクレオチド配列は、限定はしないが哺乳動物を含む、ヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。同種ヌクレオチド配列はまた、限定はしないが、本明細書に記載されているヌクレオチド配列天然対立遺伝子変異および突然変異を含む。同種アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を含み、ポリペプチドが同じ結合および/または活性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、少なくとも60、70、80、85、90、95、96、97、98または99同一性を有するとき、同種である。いくつかの態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50または50-60個のヌクレオチド/アミノ酸置換、付加または欠失を有するとき、同種である。いくつかの態様において、同種アミノ酸配列は、最大5または最大3個の保存アミノ酸置換を有する。相同性または同一性パーセントは、例えば、SmithおよびWatermanのアルゴリズムAdvApplMath19812482489を使用する、デフォルト設定を使用してGapプログラムWisconsinSequenceAnalysisPackageVersion8forUNIXGeneticsComputerGroupUniversityResearchParkMadisonWIにより決定することができる。いくつかの態様において、プローブと標的間の相同性は、約75から約85である。いくつかの態様において、核酸は、配列番号:2またはその部分と少なくとも約95、約97、約98、約99および約100同種であるヌクレオチドを有する。相同性はまた、ポリペプチドレベルであり得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号:1またはその部分と約95、約97、約98、約99および約100同種である。本発明のFGF21変異体本発明配列、例えば、変異体1または配列番号:5および異なるアミノ酸配列外来配列、例えば、P174へ変化したL174を有する配列番号:1の同一性程度またはパーセントは、本発明配列または外来配列のどちらか小さい方の長さで割った2つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数として計算する。結果は、同一性パーセントとして示される。例えば、変異体1配列番号:5は、P174へ変化したL174L174を有する配列番号:1がP174に変化したを有する野生型FGF21と94.9同一性を有する。これらの2つの配列に関して、168個の同一のアミノ酸が存在し、全長は177個のアミノ酸である。したがって、同一性パーセントは、168/177×100=94.9である。本明細書において使用される混合なる用語は、同じ領域中で1つ以上の化合物、細胞、分子などを互いに合わせるプロセスを示す。これは、例えば、試験チューブ、ペトリ皿または1つ以上の化合物、細胞または分子を混合することが可能であるあらゆる容器中で行われ得る。本明細書において使用される実質的に精製されるなる用語は、天然環境から取り出されており、天然に関連する他の成分を少なくとも60、少なくとも75、および少なくとも90含まない化合物例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは抗体のいずれかを示す。薬学的に許容される担体なる用語は、治療剤、例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤の投与のための担体を示す。該用語は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産をそれ自体誘導せず、過度の毒性なく投与することができるあらゆる医薬担体を示す。適当な担体は、大型のゆっくり代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物および不活性ウイルス粒子であり得る。このような担体は、当業者によく知られている。治療組成物における薬学的に許容される担体は、液体、例えば、水、塩水、グリセロールおよびエタノールを含むことができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などもまた、このようなビヒクル中に存在することができる。システイン残基により提供される天然ジスルフィド結合は、一般的に、タンパク質の熱力学的安定性を増加させる。融解温度の増加において測定されるとき、熱力学的安定性の増加の成功例は、酵素T4リゾチームMatsumuraらPNAS8665626566およびバルナーゼJohnsonらJMolBiol268198208の多数のジスルフィド結合された突然変異体である。本発明の局面は、野生型FGF21の柔軟性を抑制し、それにより、タンパク質の疎水性コアへの保存剤のアクセスを制限する、変異体内のジスルフィド結合の存在によりなし遂げられた、保存剤の存在下でのFGF21の物理的安定性の増強である。したがって、本発明の第2の局面は、例えば、システイン残基を野生型FGF21タンパク質または本発明のポリペプチドおよびタンパク質変異体に組み込む、または置換することを介する、さらなるジスルフィド結合の取り込みにより生じる増強された医薬安定性を有するヒトFGF21の変異体またはその生物学的に活性なペプチドを提供する。当業者は、本明細書において記載されている提案された態様に加えて、天然システイン、システイン103およびシステイン121を、改善された特性を与え得る新規ジスルフィド結合を導入するために遺伝子座として利用することができることを認識している。これらは、2つ以上のいかのもの:グルタミン46、アルギニン47、チロシン48、ロイシン49、チロシン50、スレオニン51、アスパラギン酸52、アスパラギン酸53、アラニン54、グルタミン55、グルタミン56、スレオニン57、グルタミン酸58、アラニン59、ヒスチジン60、ロイシン61、グルタミン酸62、イソロイシン63、バリン69、グリシン70、グリシン71、アラニン72、アラニン73、ロイシン144、ヒスチジン145、ロイシン146、プロリン147、グリシン148、アスパラギン149、リジン150、セリン151、プロリン152、ヒスチジン153、アルギニン154、アスパラギン酸155、プロリン156、アラニン157、プロリン158、アルギニン159、グリシン160、プロリン161、アラニン162、アルギニン163、フェニルアラニン164ここで、アミノ酸の番号は、全長209アミノ酸hFGF21配列の配列番号:1に基づくに対してシステインでの置換を有するFGF-21を含む。さらに、ヒトFGF21の変異体またはその生物学的に活性なペプチドは、Cys103-Cys121の天然の1つに加えて、操作されたジスルフィド結合を提供され、以下のとおりである:Gln46Cys-Ala59Cys、Gln46Cys-His60Cys、Gln46Cys-Leu61Cys、Gln46Cys-Glu62Cys、Gln46Cys-Ile63Cys、Arg47Cys-Ala59Cys、Arg47Cys-His60Cys、Arg47Cys-Leu61Cys、Arg47Cys-Glu62Cys、Arg47Cys-Ile63Cys、Tyr48Cys-Ala59Cys、Tyr48Cys-His60Cys、Tyr48Cys-Leu61Cys、Tyr48Cys-Glu62Cys、Tyr48Cys-Ile63Cys、Leu49Cys-Ala59Cys、Leu49Cys-His60Cys、Leu49Cys-Leu61Cys、Leu49Cys-Glu62Cys、Leu49Cys-Ile63Cys、Tyr50Cys-Ala59Cys、Tyr50Cys-His60Cys、Tyr50Cys-Lue61Cys、Tyr50Cys-Glu62Cys、Tyr50Cys-Ile63Cys、Leu144Cys-Gly160Cys、Leu144Cys-Pro161Cys、Leu144Cys-Ala162Cys、Leu144Cys-Arg163Cys、Leu144Cys-Phe164Cys、His145Cys-Gly160Cys、His145Cys-Pro161Cys、His145Cys-Ala162Cys、His145Cys-Arg163Cys、His145Cys-Phe164Cys、Leu146Cys-Gly160Cys、Leu146Cys-Pro161Cys、Leu146Cys-Ala162Cys、Leu146Cys-Arg163Cys、Leu146Cys-Phe164Cys、Pro147Cys-Gly160Cys、Pro147Cys-Pro161Cys、Pro147Cys-Ala162Cys、Pro147Cys-Arg163Cys、Pro147Cys-Phe164Cys、Gly148Cys-Gly160Cys、Gly148Cys-Pro161Cys、Gly148Cys-Ala162Cys、Gly148Cys-Arg163Cys、Gly148Cys-Phe164Cys、Thr57Cys-Val69Cys、Thr57Cys-Gly70Cys、Thr57Cys-Gly71Cys、Thr57Cys-Ala72Cys、Thr57Cys-Ala73Cys、Glu58Cys-Val69Cys、Glu58Cys-Glu70Cys、Glu58Cys-G71Cys、Glu58Cys-Ala72Cys、Glu58Cys-Ala73Cys、Ala59Cys-Val69Cys、Ala59Cys-Gly70Cys、Ala59Cys-Gly71Cys、Ala59Cys-Ala72Cys、Ala59Cys-Ala73Cys、His60Cys-Val69Cys、His60Cys-Gly70Cys、His60Cys-Gly71Cys、His60Cys-Ala72Cys、His60Cys-Ala73Cys、Leu61Cys-Val69Cys、Leu61Cys-Gly70Cys、Leu61Cys-Gly71Cys、Leu61Cys-Ala72Cys、Leu61Cys-Ala73Cys、Arg47Cys-Gly148Cys、Tyr48Cys-Gly148Cys、Leu49Cys-Gly148Cys、Tyr50Cys-Gly148Cys、Thr51Cys-Gly148Cys、Asp52Cys-Gly148Cys、Asp53Cys-Gly148Cys、Ala54Cys-Gly148Cys、Gln55Cys-Gly148Cys、Gln56Cys-Gly148Cys、Thr57Cys-Gly148Cys、Glu58Cys-Gly148Cys、Arg47Cys-Asn149Cys、Tyr48Cys-Asn149Cys、Leu49Cys-Asn149Cys、Tyr50Cys-Asn149Cys、Thr51Cys-Asn149Cys、Asp52Cys-Asn149Cys、Asp53Cys-Asn149Cys、Ala54Cys-Asn149Cys、Gln55Cys-Asn149Cys、Gln56Cys-Asn149Cys、Thr57Cys-Asn149Cys、Glu58Cys-Asn149Cys、Arg47Cys-Lys150Cys、Tyr48Cys-Lys150Cys、Leu49Cys-Lys150Cys、Tyr50Cys-Lys150Cys、Thr51Cys-Lys150Cys、Asp52Cys-Lys150Cys、Asp53Cys-Lys150Cys、Ala54Cys-Lys150Cys、Gln55Cys-Lys150Cys、Gln56Cys-Lys150Cys、Thr57Cys-Lys150Cys、Glu58Cys-Lys150Cys、Arg47Cys-Ser151Cys、Tyr48Cys-Ser151Cys、Leu49Cys-Ser151Cys、Tyr50Cys-Ser151Cys、Thr51Cys-Ser151Cys、Asp52Cys-Ser151Cys、Asp53Cys-Ser151Cys、Ala54Cys-Ser151Cys、Gln55Cys-Ser151Cys、Gln56Cys-Ser151Cys、Thr57Cys-Ser151Cys、Glu58Cys-Ser151Cys、Arg47Cys-Pro152Cys、Tyr48Cys-Pro152Cys、Leu49Cys-Pro152Cys、Tyr50Cys-Pro152Cys、Thr51Cys-Pro152Cys、Asp52Cys-Pro152Cys、Asp53Cys-Pro152Cys、Ala54Cys-Pro152Cys、Gln55Cys-Pro152Cys、Gln56Cys-Pro152Cys、Thr57Cys-Pro152Cys、Glu58Cys-Pro152Cys、Arg47Cys-His153Cys、Tyr48Cys-His153Cys、Leu49Cys-His153Cys、Tyr50Cys-His153Cys、Thr51Cys-His153Cys、Asp52Cys-His153Cys、Asp53Cys-His153Cys、Ala54Cys-His153Cys、Gln55Cys-His153Cys、Gln56Cys-His153Cys、Thr57Cys-His153Cys、Glu58Cys-His153Cys、Arg47Cys-Arg154Cys、Tyr48Cys-Arg154Cys、Leu49Cys-Arg154Cys、Tyr50Cys-Arg154Cys、Thr51Cys-Arg154Cys、Asp52Cys-Arg154Cys、Asp53Cys-Arg154Cys、Ala54Cys-Arg154Cys、Gln55Cys-Arg154Cys、Gln56Cys-Arg154Cys、Thr57Cys-Arg154Cys、Glu58Cys-Arg154Cys、Arg47Cys-Asp155Cys、Tyr48Cys-Asp155Cys、Leu49Cys-Asp155Cys、Tyr50Cys-Asp155Cys、Thr51Cys-Asp155Cys、Asp52Cys-Asp155Cys、Asp53Cys-Asp155Cys、Ala54Cys-Asp155Cys、Gln55Cys-Asp155Cys、Gln56Cys-Asp155Cys、Thr57Cys-Asp155Cys、Glu58Cys-Asp155Cys、Arg47Cys-Pro156Cys、Tyr48Cys-Pro156Cys、Leu49Cys-Pro156Cys、Tyr50Cys-Pro156Cys、Thr51Cys-Pro156Cys、Asp52Cys-Pro156Cys、Asp53Cys-Pro156Cys、Ala54Cys-Pro156Cys、Gln55Cys-Pro156Cys、Gln56Cys-Pro156Cys、Thr57Cys-Pro156Cys、Glu58Cys-Pro156Cys、Arg47Cys-Ala157Cys、Tyr48Cys-Ala157Cys、Leu49Cys-Ala157Cys、Tyr50Cys-Ala157Cys、Thr51Cys-Ala157Cys、Asp52Cys-Ala157Cys、Asp53Cys-Ala157Cys、Ala54Cys-Ala157Cys、Gln55Cys-Ala157Cys、Gln56Cys-Ala157Cys、Thr57Cys-Ala157Cys、Glu58Cys-Ala157Cys、Arg47Cys-Pro158Cys、Tyr48Cys-Pro158Cys、Leu49Cys-Pro158Cys、Tyr50Cys-Pro158Cys、Thr51Cys-Pro158Cys、Asp52Cys-Pro158Cys、Asp53Cys-Pro158Cys、Ala54Cys-Pro158Cys、Gln55Cys-Pro158Cys、Gln56Cys-Pro158Cys、Thr57Cys-Pro158Cys、Glu58Cys-Pro158Cys、Arg47Cys-Arg159Cys、Tyr48Cys-Arg159Cys、Leu49Cys-Arg159Cys、Tyr50Cys-Arg159Cys、Thr51Cys-Arg159Cys、Asp52Cys-Arg159Cys、Asp53Cys-Arg159Cys、Ala54Cys-Arg159Cys、Gln55Cys-Arg159Cys、Gln56Cys-Arg159Cys、Thr57Cys-Arg159Cys、Glu58Cys-Arg159Cys、Arg47Cys-G160Cys、Tyr48Cys-G160Cys、Leu49Cys-G160Cys、Tyr50Cys-Gly160Cys、Thr51Cys-Gly160Cys、Asp52Cys-Gly160Cys、Asp53Cys-Gly160Cys、Ala54Cys-Gly160Cys、Gln55Cys-Gly160Cys、Gln56Cys-Gly160Cys、Thr57Cys-Gly160Cys、Glu58Cys-Gly160Cys、Arg47Cys-Pro161Cys、Tyr48Cys-Pro161Cys、Leu49Cys-Pro161Cys、Tyr50Cys-Pro161Cys、Thr51Cys-Pro161Cys、Asp52Cys-Pro161Cys、Asp53Cys-Pro161Cys、Ala54Cys-Pro161Cys、Gln55Cys-Pro161Cys、Gln56Cys-Pro161Cys、Thr57Cys-Pro161Cys、Glu58Cys-Pro161Cys、Arg47Cys-Ala162Cys、Tyr48Cys-Ala162Cys、Leu49Cys-Ala162Cys、Tyr50Cys-Ala162Cys、Thr51Cys-Ala162Cys、Asp52Cys-Ala162Cys、Asp53Cys-Ala162Cys、Ala54Cys-Ala162Cys、Gln55Cys-Ala162Cys、Gln56Cys-Ala162Cys、Thr57Cys-Ala162Cys、Glu58Cys-Ala162Cys、Arg47Cys-Arg163Cys、Tyr48Cys-Arg163Cys、Leu49Cys-Arg163Cys、Tyr50Cys-Arg163Cys、Thr51Cys-Arg163Cys、Asp52Cys-Arg163Cys、Asp53Cys-Arg163Cys、Ala54Cys-Arg163Cys、Gln55Cys-Arg163Cys、Gln56Cys-Arg163Cys、Thr57Cys-Arg163Cys、Glu58Cys-Arg163Cys。本発明の第3の局面は、本発明の第2の態様において示される2つ以上のアミノ酸位置でのシステインの置換と共に、本発明の第1の態様において示される任意のアミノ酸位置で任意の荷電アミノ酸および/または極性であるが非荷電アミノ酸の置換を含むヒトFGF21の変異体またはその生物学的に活性なペプチドを提供する。タンパク質医薬の開発における重要な挑戦が、タンパク質の物理化学的不安定性に取り組むことであることは、当分野でよく知られている。このことは、タンパク質医薬製剤が多数の使用を意図されるとき、さらになおさら明らかであり、注射製剤は、安定な濃縮された保存溶液を必要とすると同時に、好ましい生物活性プロフィールを維持する。野生型FGF21の詳細な生物物理学特性化は、濃縮タンパク質溶液>5mg/mlは、ストレス条件、例えば、高い温度または低いpHに暴露されたとき、加速された会合および凝集すなわち、乏しい物理的安定性および生物医薬特性を引き起こすことを確立した。医薬防腐剤例えば、m-クレゾールへのFGF21の濃縮タンパク質溶液の暴露はまた、物理的安定性に対するネガティブな影響を有した。したがって、本発明の態様は、生理学的および保存製剤の両方の条件下で、化学安定性および生物学的効力を維持するが、濃縮溶液の物理的安定性を増強することである。所定のタンパク質濃度で、温度およびイオン強度が物理的安定性に対して大きな影響を有するため、会合および凝集が疎水性相互作用によって生じ得ることが考えられる。ほとんど、非保存的と推測される表面暴露アミノ酸残基を標的とした。これらの残基の局所環境を分析し、構造的に重要であると思われないものを突然変異誘発のために選択した。特定の変化を開始する1つの方法は、グルタミン酸残基を導入することにより、タンパク質のpIをさらに減少させることであるグルタミン酸スキャン。電荷置換の導入が電荷-電荷反発を介して疎水性媒介凝集を阻害し、保存剤相溶性を改善する可能性があるという仮説を立てられる。加えて、当業者はまた、十分な程度の突然変異誘発で、負電荷の同時減少有りまたは無しでの正電荷の導入により、pIを塩基性pH範囲にシフトさせ、したがって電荷-電荷反発を起こすことができることを認識している。本発明の態様は、生理学的および保存医薬製剤の両方の条件下で物理化学的安定性に関与するが、野生型FGF21と比較して変異体の生物学的効力の維持が、同様に考慮される重要な因子である。したがって、本発明の変異体の生物学的効力は、インビトロで3T3-L1脂肪細胞2-DOG摂取細胞アッセイにおいて測定されるとき、グルコース摂取実施例3および/または、インビボでob/obマウスアッセイにおいて測定されるとき、血漿グルコースレベルならびに血漿トリグリセリドの低下実施例5に影響する変異体の能力により定義される。本発明にしたがって投与されるFGF21の変異体は、当分野で知られている任意の手段により作製および/または単離され得る。変異体を生産するための最も好ましい方法は、組換えDNA方法論を介することであり、当業者によく知られている。このような方法は、MolecularBiologyJohnWileySonsIncのCurrentProtocolsに記載されており、これを出典明示により本明細書に包含させる。さらに、好ましい態様は、本明細書に記載されている変異体に由来する生物学的に活性なペプチドを含む。このようなペプチドは、記載されている少なくとも1つの置換を含み、該変異体は、生物学的活性を有する。ペプチドは、当業者に知られているあらゆる、および全ての手段により生産され得、この例は、酵素消化、化学合成または組換えDNA方法論を含むが、これらに限定されない。特定の線維芽細胞増殖因子のペプチドのフラグメントが生物学的に活性であることが当分野で確立されている。例えば、BairdらProcNatlAcadSci8523242328およびJCellPhysSuppl5101106参照。したがって、変異体のフラグメントまたはペプチドの選択は、当分野で知られている基準に基づく。例えば、ジペプチジルペプチダーゼIVDPP-IVが、神経ペプチド、内分泌腺ペプチドおよびサイトカインの不活性化に関与するセリン型プロテアーゼであることが知られているDammeらChemImmunol724256。FGF21のN-末端HisProIleProは、DPP-IVに対する基質となる可能性がある2つのジペプチドを含み、4個のアミノ酸によってN-末端で切断されたFGF21のフラグメントをもたらし得る。予想外に、野生型FGF21の該フラグメントは、生物学的活性保持することが証明されており表2、したがって、最大4個のアミノ酸によってN-末端で切断された本発明の変異体は、本発明の態様である。本発明はまた、RNAの形態またはDNAの形態であってよい上記変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、該DNAはcDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む。DNAは二本鎖または一本鎖であってよい。本発明の変異体をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果として変化し得る。本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含み得る:変異体に対するコード配列のみ、変異体に対するコード配列およびさらなるコード配列、例えば、機能性ポリペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列または前駆タンパク質配列;変異体に対するコード配列および非コード配列、例えば、イントロンまたは変異体に対するコード配列の5’および/または3’の非コード配列。したがって、変異体をコードするポリヌクレオチドなる用語は、さらなるコードおよび/または非コード配列を含む、変異体に対するコード配列だけでなく、ポリヌクレオチドもまた含み得るポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、示される置換を含む、ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする記載されているポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ヒトFGF21配列の天然対立遺伝子変異体、非天然変異体、または上記切断変異体であり得る。したがって、本発明はまた、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびに記載されている変異体のフラグメント、誘導体またはアナログをコードするこのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。このようなヌクレオチド変異体は、第1または第2の態様の少なくとも1つの示されたアミノ酸置換が存在するかぎり、欠失変異体、置換変異体、切断変異体、および付加または挿入変異体を含む。本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現コントロール配列に作動可能に連結したすなわち、発現コントロール配列の機能を保証するように位置する後、宿主において発現する。これらの発現ベクターは一般的に、エピソームまたは宿主染色体DNAの不可欠な部分として、宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを含み得る。FGF21変異体は、適当なプロモーターのコントロール下で、哺乳動物細胞、昆虫、酵母、細菌または他の細胞において発現させることができる。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物由来のRNAを使用して、このようなタンパク質を生産するために使用することができる。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために特に有用な原核生物宿主である。使用のために適当な他の微生物宿主は、枯草菌、ネズミチフス菌ならびにセラチア、シュードモナス、連鎖球菌およびブドウ球菌の様々な種を含むが、他のものも当然選択肢として使用され得る。これらの原核生物宿主において、1つはまた、一般的に宿主細胞と適合性のある発現コントロール配列例えば、複製起点を含む発現ベクターを作ることができる。加えて、多くのよく知られているプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファンtrpプロモーター系、ベータ-ラクタマーゼプロモーター系またはファージラムダもしくはT7由来のプロモーター系が存在し得る。プロモーターは、一般的に、所望によりオペレーター配列にて、発現をコントロールし、転写および翻訳を開始および完了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。タンパク質の発現の当業者は、メチオニンまたはメチオニン-アルギニン配列が大腸菌における発現のために成熟配列配列番号:3のN-末端に導入され得ることを認識し、本発明の文脈において考慮される。したがって、特記されない限り、大腸菌において発現される本発明の変異体は、N-末端に導入されたメチオニン配列を有する。他の微生物、例えば、酵母または真菌もまた、発現のために使用され得る。メタノール資化酵母、出芽酵母、分裂酵母およびピチアアングスタは、所望の、発現コントロール配列、例えば、プロモーター、例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、および複製起点、終始配列などを有する適当なベクターと共に、好ましい酵母宿主の例である。アスペルギルスニガー、トリコデルマリーゼイ;およびスエヒロタケは、真菌宿主の例であるが、他のものも当然選択肢として使用され得る。哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現および生産するために使用され得る。無傷な変異体を分泌することができる多くの適当な宿主細胞系が、当分野で開発されているため、真核細胞が実際に好ましく、CHO細胞系、種々のCOS細胞系、NSO細胞、SyrianHamster卵巣細胞系、HeLa細胞またはヒト胚腎臓細胞系すなわちHEK293、HEK293EBNAを含む。これらの細胞のための発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現コントロール配列は、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、Raus肉腫ウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位は、SV40およびウシ成長ホルモンに由来する配列を含む。興味あるポリヌクレオチド配列例えば、FGF21の変異体および発現コントロール配列を含むベクターは、よく知られている方法により宿主細胞に移動させることができ、これは細胞性宿主の型に依存して変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞のために一般的に利用され、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の細胞性宿主のために使用され得る。タンパク質精製の種々の方法が使用され得、このような方法は、例えば、DeutscherMethodsinEnzymology182839およびScopesProteinPurificationPrinciplesandPracticeSpringerVerlagNYにおいて、当分野で知られており、記載されている。選択される精製工程は、例えば、FGF21の変異体のために使用される生産プロセスの性質に依存する。FGF21変異体含有組成物は、患者の臨床状態、FGF21変異体組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび専門家に知られている他の因子を考慮して、良い医療行為と一致する様式において処方および投与されるべきである。したがって、本明細書における目的のためにFGF21変異体の治療有効量は、このような考えにより決定される。FGF21変異体の医薬組成物および本発明の医薬組成物は、一般的に意図される目的をなし遂げる任意の手段により、1型および2型糖尿病、肥満、メタボリックシンドロームまたは重症患者を処置するために投与され得る。本明細書において使用される非経口なる用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む投与様式を示す。投与される用量は、年齢、健康状態およびレシピエントの体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、FGF21変異体が、1型または2型糖尿病、肥満またはメタボリックシンドロームの処置のために所望の医療効果をなし遂げるために有効である量において存在する全ての組成物を含む。個々の必要性はある患者から別の患者で変化し得るが、全ての成分の有効量の最適範囲の決定は、通常の臨床医の能力の範囲内である。本発明のFGF21の変異体は、薬学的に有用な組成物を調製するために、既知の方法にしたがって製剤化することができる。所望の製剤は、任意の薬学的に許容される担体、防腐剤、賦形剤または安定剤を有する高い純度の適当な希釈剤または水溶液で再構成された安定な凍結乾燥された産物である[Remington’sPharmaceuticalSciences16thedition]。本発明の変異体は、薬学的に許容されるバッファーと組み合わされて、pHを、許容される安定性および投与のために許容されるpHを提供するために調整され得る。非経口投与において、1つの態様において、FGF21変異体は、一般的に、単位用量の注射可能形態溶液、懸濁液またはエマルジョンにおける所望の純度の程度の1つ以上の該変異体を、薬学的に許容される担体、すなわち、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性であるものと混合することにより製剤化される。好ましくは、1つ以上の薬学的に許容される抗微生物剤を加えてもよい。フェノール、m-クレゾールおよびベンジルアルコールは、好ましい薬学的に許容される抗微生物剤である。所望により、1つ以上の薬学的に許容される塩は、イオン強度または緊張力を調整するために加えられ得る。1つ以上の賦形剤は、製剤の等張性をさらに調整するために加えられ得る。グリセリン、塩化ナトリウムおよびマンニトールは、等張性を調整する賦形剤の例である。当業者は、良い医療行為および個々の患者の臨床状態により決定されるとき、FGF21変異体を含む治療組成物に対する薬学的に有効な用量および投与レジメンを容易に最適化することができる。本発明のFGF21変異体に対する典型的な用量範囲は、成体に対して約0.01mg/日から約1000mg/日または週に1回の投与にて約0.05mg/週から約5000mg/週の範囲である。好ましくは、用量は、約0.1mg/日から約100mg/日または週に1回の投与にて約0.5mg/週から約500mg/週、さらに好ましくは約1.0mg/日から約10mg/日または週に1回の投与にて約5mg/週から約50mg/週の範囲である。より好ましくは、用量は、約1-5mg/日または週に1回の投与にて約5mg/週から約25mg/週である。投与されるFGF21変異体の適当な用量は、より速く、より効率的なグルコース利用により血糖レベルの低下およびエネルギー消費の増加をもたらし、したがって、1型および2型糖尿病、肥満およびメタボリックシンドロームの処置のために有用である。加えて、高血糖およびインスリン耐性が栄養補給を与えられた重症患者において一般的であるため、いくつかのICUは、食事を与えられた重症患者において過剰高血糖を処置するためにインスリンを投与する。実際に、最近の試験は、糖尿病の病歴を有するか否かにかかわらず、デシリットルあたり110mgよりも高くないレベルで血糖を維持するための外因性インスリンの使用が、外科的集中治療単位における重症患者中の罹患率および死亡率を減少させることを立証しているVandenBergheらNEnglJMed3451359。したがって、本発明のFGF21の変異体は、ユニークに、代謝的に不安定な重症患者において代謝安定性を回復させるための手助けに適している。FGF21の変異体は、グルコース摂取を刺激し、インスリン感受性を増強するが、低血糖を誘導しないという点でユニークである。本発明の別の局面において、1型および2型糖尿病、肥満、メタボリックシンドロームまたは重症患者の処置のための医薬として使用するためのFGF21の変異体が考慮される。本発明は詳細に今回記載されており、これは、以下の実施例を参照することによりさらに明白に理解されるが、実施例は、説明のみの目的のためにここに含まれ、本発明を限定されることを意図しない。本発明の実施は、他に記載のない限り、当分野の技術内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の慣用の方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences18thEditionMethodsInEnzymologyおよびHandbookofExperimentalImmunologyVolsIIVおよびSambrookらMolecularCloningALaboratoryManual参照。部位特異的FGF21突然変異体部位特異的FGF21突然変異体または置換FGF21突然変異体なる用語は、天然FGF21ポリペプチド配列のアミノ酸配列、例えば、配列番号:1と異なるアミノ酸配列を有するFGF21突然変異体ポリペプチドおよびその変異体を示す。部位特異的FGF21突然変異体は、FGF21ポリペプチドの特定の位置にて、保存または非保存のいずれかでのアミノ酸置換を導入し、天然または非天然アミノ酸を使用することにより作製することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんどあるいは全く効果がない位置で、天然アミノ酸残基すなわち、野生型FGF21ポリペプチド配列の所定の位置に見出される残基の非天然残基すなわち、野生型FGF21ポリペプチド配列の所定の位置に見出されない残基での置換を含むことができる。保存的アミノ酸置換はまた、一般的に生物学的システムにおける合成よりもむしろ化学的ペプチド合成により組み込まれる非天然アミノ酸残基を含む。これらは、ペプチド模擬物およびアミノ酸部分の他の逆または反転形態を含む。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づくクラスに分類することができる:1疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;2中性親水性:Cys、Ser、Thr;3酸性:Asp、Glu;4塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;5鎖方向に影響する残基:Gly、Pro;6芳香族性:Trp、Tyr、Phe;ならびに7セレノシステイン、ピロリジンPYLおよびピロリン-カルボキシ-リジンPCL。保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーと同じクラスの別のメンバーとの交換を含むことができる。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含むことができる。所望のアミノ酸置換保存または非保存のいずれかは、このような置換が望ましいとき、当業者により決定することができる。切断FGF21ポリペプチド本発明の1つの態様は、成熟FGF21ポリペプチド配列番号:3の切断形態である。本発明のこの態様は、優れた場合によっては、成熟FGF21ポリペプチドの非切断形態と同様の活性を提供することができる切断FGF21ポリペプチドを同定する努力から生じた。本明細書において使用される切断FGF21ポリペプチドなる用語は、アミノ酸残基がFGF21ポリペプチドのアミノ末端またはN-末端から除去されているか、アミノ酸残基がFGF21ポリペプチドのカルボキシル末端またはC-末端から除去されているか、または、アミノ酸残基がFGF21ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から除去されているFGF21ポリペプチドを示す。本明細書に記載されている種々の切断は、本明細書に記載されているとおりに調製された。N-末端切断FGF21ポリペプチドおよびC-末端切断FGF21ポリペプチドの活性は、インビトロホスホ-ERKアッセイを使用してアッセイすることができる。切断FGF21ポリペプチドの活性を試験するために使用することができるインビトロアッセイの特定の詳細は、実施例において見いだすことができる。本発明の切断FGF21ポリペプチドの活性はまた、インビボアッセイ、例えば、ob/obマウスにおいて評価することができる。一般的に、切断FGF21ポリペプチドのインビボ活性を評価するために、切断FGF21ポリペプチドを試験動物の腹腔内に投与することができる。所望のインキュベーション期間例えば、1時間またはそれ以上後、血液サンプルを取り、血糖レベルを測定することができる。a.N-末端切断本発明のいくつかの態様において、N-末端切断は、成熟FGF21ポリペプチドのN-末端からの1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸残基を含む。9個未満のアミノ酸残基のN-末端切断を有する切断FGF21ポリペプチドは、個体において血糖を低下させる成熟FGF21ポリペプチドの能力を保持する。したがって、特定の態様において、本発明は、1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸残基のN-末端切断を有する成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を含む。b.C-末端切断本発明のいくつかの態様において、C-末端切断は、成熟FGF21ポリペプチドのC-末端からの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のアミノ酸残基を含む。13個未満のアミノ酸残基のC-末端切断を有する切断FGF21ポリペプチドは、インビトロELK-ルシフェラーゼアッセイYieJらFEBSLetts5831924において野生型FGF21の有効性の少なくとも50の有効性を示し、これらのFGF21突然変異体が個体において血糖を低下させる成熟FGF21ポリペプチドの能力を保持することを示した。したがって、特定の態様において、本発明は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のアミノ酸残基のC-末端切断を有する成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を含む。c.N-末端およびC-末端切断本発明のいくつかの態様において、切断FGF21ポリペプチドは、N-末端およびC-末端切断の組合せを有することができる。N-末端およびC-末端切断の組合せを有する切断FGF21ポリペプチドは、N-末端またはC-末端切断単独のいずれかを含む対応する切断FGF21ポリペプチドの活性を共有する。言い換えれば、9個未満のアミノ酸残基のN-末端切断および13個未満のアミノ酸残基のC-末端切断の両方を有する切断FGF21ポリペプチドは、9個未満のアミノ酸残基のN-末端切断を有する切断FGF21ポリペプチドまたは13個未満のアミノ酸残基のC-末端切断を有する切断FGF21ポリペプチドと同様またはそれ以上の血糖降下活性を有する。したがって、特定の態様において、本発明は、1、2、3、4、5、6、7または8個のアミノ酸残基のN-末端切断および1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のアミノ酸残基のC-末端切断の両方を有する成熟FGF21ポリペプチドの切断形態またはFGF21タンパク質変異体を含む。本発明の全てのFGF21変異体と同様に、切断FGF21ポリペプチドは、所望により、特異的突然変異により、または細菌発現プロセスの結果として導入され得るアミノ末端メチオニン残基を含むことができる。本発明の切断FGF21ポリペプチドは、本明細書に記載されている実施例に記載されているとおりに調製することができる。標準分子生物学技術をよく知っている当業者は、本明細書の記載と組み合わせて、本発明の切断FGF21ポリペプチドを作製および使用する知識を使用することができる。標準技術は、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションに関して使用することができる。例えば、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に包含させる、上記、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual、参照。酵素反応および精製技術は、一般的に当分野で成し遂げられている、または本明細書に記載されているとおりに、製造業者の記載にしたがって行うことができる。特定の定義が提供されている場合を除いて、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学および薬学および医薬化学のの実験室的処理および技術と関連して利用される命名法が、よく知られており、当分野で一般的に使用されるものである。標準技術は、化学合成;化学分析;医薬品、製剤および送達;および患者の処置のために使用することができる。本発明の切断FGF21ポリペプチドはまた、切断FGF21ポリペプチドにさらなる特性を与えることができる別のエンティティに融合することができる。本発明の1つの態様において、切断FGF21ポリペプチドは、IgG定常ドメインまたはそれらのフラグメント例えば、Fc領域、ヒト血清アルブミンHSAまたはアルブミン結合ポリペプチドに融合することができる。このような融合は、本明細書において提供される既知の分子生物学的方法および/または案内を使用して成し遂げることができる。このような融合ポリペプチドの利益ならびにこのような融合ポリペプチドを作製する方法は、本明細書においてより詳細に記載されている。FGF21融合タンパク質本明細書において使用されるFGF21融合ポリペプチドまたはFGF21融合タンパク質なる用語は、本明細書に記載されているいずれかのFGF21タンパク質変異体のN-末端またはC-末端にて1つ以上のアミノ酸残基例えば、異種タンパク質またはペプチドの融合を示す。異種ペプチドおよびポリペプチドは、FGF21タンパク質変異体;膜貫通受容体タンパク質またはその部分、例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通および細胞内ドメイン;膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその部分;触媒的に活性である酵素またはその部分;オリゴマー形成を促進するポリペプチドまたはペプチド、例えば、ロイシンジッパードメイン;安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド、例えば、免疫グロブリン定常領域;機能性もしくは非機能性抗体またはそれらの重鎖もしくは軽鎖;ならびに、本発明のFGF21タンパク質変異体と異なる活性、例えば、治療活性を有するポリペプチドの検出および/または単離を可能にするエピトープを含むが、これらに限定されない。ヒト血清アルブミンHSAに融合されたFGF21突然変異体もまた、本発明により包含される。FGF21融合タンパク質は、FGF21タンパク質変異体のN-末端またはC-末端のいずれかにて異種配列を融合することにより作製することができる。本明細書に記載されているとおり、異種配列は、アミノ酸配列または非アミノ酸含有ポリマーであり得る。異種配列は、FGF21タンパク質変異体に直接、またはリンカーもしくはアダプター分子を介して融合することができる。リンカーまたはアダプター分子は、1つ以上のアミノ酸残基または-mer、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8または9個の残基または-mer、好ましくは10から50個のアミノ酸残基または-mer、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50個の残基または-mer、およびさらに好ましくは15から35個のアミノ酸残基または-merであり得る。リンカーまたはアダプター分子はまた、融合分子の分離を可能にするように、DNA制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位にて設計することができる。a.Fc融合本発明の1つの態様において、FGF21タンパク質変異体は、ヒトIgGのFc領域の1つ以上のドメインに融合される。抗体は、2つの機能的依存性部分、抗原に結合するFabとして知られる可変ドメインおよびエフェクター機能、例えば、補体活性化に関与し、食細胞により攻撃するFcとして知られる定常ドメインを含む。Fcは長期血清半減期を有するが、Fabは寿命が短いCaponら1989Nature33752531。治療タンパク質と連結されるとき、Fcドメインは、より長い半減期を提供するか、または、Fc受容体結合、プロテインA結合、補体結合および胎盤通過さえも含むような機能を組み込むことができるCaponら1989。インビボ薬物動態学分析は、ヒトFGF21が、迅速なクリアランスおよびインビボ分解によってマウスにおける約.5から1時間の短い半減期を有することを示した。したがって、FGF21の半減期を延長するために、Fc配列がFGF21ポリペプチドのN-もしくはC-末端に融合された。野生型FGF21へのFc領域の融合、特に、野生型FGF21のN-末端に融合されたFcは、予期されたとおり半減期が延長されなかったが、しかしながら、インビボでのFGF21のタンパク質分解性分解およびかかる分解に耐性があったFGF21突然変異体の同定の研究につながった。本明細書中、Fc-FGF21は、Fc配列がFGF21のN-末端に融合されている融合タンパク質を示す。同様に、本明細書中、FGF21-Fcは、Fc配列がFGF21のC-末端に融合されている融合タンパク質を示す。得られるFGF21融合タンパク質は、例えば、プロテインAアフィニティーカラムの使用により精製することができる。Fc領域に融合されるペプチドおよびタンパク質は、非融合対応物よりも実質的に良いインビボ半減期を示すことを見出した。また、Fc領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化/多重合を可能する。Fc領域は天然Fc領域であってよく、また、特定の質、例えば、治療的質、循環時間または凝集の減少を改善するように改変することができる。抗体のFcドメインとの融合によるタンパク質治療剤の有用な修飾は、国際公開WO00/024782において詳細に記載されており、これを出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。この文献は、ビヒクル、例えば、ポリエチレングリコールPEG、デキストランまたはFc領域への連結を記載されている。b.融合タンパク質リンカー本発明の融合タンパク質を形成するとき、リンカーは必要ではないが、使用することができる。存在するとき、スペーサーとして主に働くため、リンカーの化学構造は重要ではないかもしれない。リンカーは、ペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸からなり得る。本発明のいくつかの態様において、リンカーは、ペプチド結合により連結される1から20個のアミノ酸からなり、該アミノ酸は20個の天然アミノ酸から選択される。種々の態様において、1から20個のアミノ酸は、アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。いくつかの態様において、リンカーは、立体的障害のない大多数のアミノ酸、例えば、グリシンおよびアラニンからなる。いくつかの態様において、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンおよびアラニンの組合せ例えば、ポリGly-Alaまたはグリシンおよびセリンの組合せ例えば、ポリGly-Serである。15個のアミノ酸残基のリンカーがFGF21融合タンパク質に対して特に良く働くことが見出されたが、本発明は、任意の長さまたは組成物のリンカーを考慮する。本明細書に記載されているリンカーは典型的であり、より長く他の残基を含むリンカーが、本発明により考慮される。非ペプチドリンカーもまた、本発明により考慮される。例えば、アルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル例えば、C1-C6、低級アシル、ハロゲン例えば、Cl、Br、CN、NH2またはフェニルを含む任意の非立体的障害基によりさらに置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカーであり、該リンカーは、100から5000kD、例えば、100から500kDの分子量を有する。化学的に修飾されたFGF21突然変異体本明細書に記載されているFGF21の切断形態を含む本明細書に記載されているFGF21タンパク質変異体の化学的に修飾された形態は、本明細書に記載されている記載を考慮して、当業者により調製することができる。このような化学的に修飾されたFGF21突然変異体は、化学的に修飾されたFGF21突然変異体が、修飾されていないFGF21突然変異体と、FGF21突然変異体に結合された分子の型または位置のいずれかにおいて異なるように改変される。化学的に修飾されたFGF21突然変異体は、1つ以上の天然に結合された化学基の欠失により形成される分子を含むことができる。1つの態様において、本発明のFGF21タンパク質変異体は、1つ以上のポリマーの共有結合により修飾することができる。例えば、選択されるポリマーは、一般的に、結合するタンパク質が水性環境、例えば、生理学的環境下で沈殿しないように、水溶性である。適当なポリマーの範囲内に含まれるものは、ポリマーの混合物である。好ましくは、最終産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容される。本発明のFGF21タンパク質変異体に結合した非水溶性ポリマーもまた、本発明の局面を形成する。典型的なポリマーはそれぞれ、あらゆる分子量であってよく、分岐状または非分岐状であってよい。ポリマーはそれぞれ、一般的に、約2kDaから約100kDaの平均分子量を有する約なる用語は、水溶性ポリマーの調製において、いくつかの分子が規定された分子量以上および未満の重さであることを示す。それぞれのポリマーの平均分子量は、好ましくは、約5kDaから約50kDa、さらに好ましくは約12kDaから約40kDa、より好ましくは約20kDaから約35kDaである。適当な水溶性ポリマーまたはその混合物は、N-連結もしくはO-連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコールPEGモノ-C1-C10、アルコキシ-、もしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されているPEGの形態を含む、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン例えば、約6kDの、例えば低分子量デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ-N-ビニルピロリドンポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール例えば、グリセロールおよびポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。共有的に結合されたFGF21タンパク質変異体多量体を調製するために使用することができる二機能性架橋分子もまた、本発明により包含される。ポリシアル酸に共有結合されるFGF21突然変異体もまた、本発明により包含される。本発明のいくつかの態様において、FGF21突然変異体は、限定はしないが、ポリエチレングリコールPEG、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む1つ以上の水溶性ポリマーを含むように共有的または化学的に修飾される。例えば、米国特許第4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192;および4,179,337号、参照。本発明のいくつかの態様において、FGF21突然変異体は、限定はしないが、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ-N-ビニルピロリドン-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール例えば、グリセロール、ポリビニルアルコールまたはこのようなポリマーの混合物を含む1つ以上のポリマーを含む。本発明のいくつかの態様において、FGF21突然変異体は、PEGサブユニットで共有的に修飾される。いくつかの態様において、1つ以上の水溶性ポリマーは、FGF21突然変異体の1つ以上の特定の位置例えば、N-末端で結合される。いくつかの態様において、1つ以上の水溶性ポリマーは、FGF21突然変異体の1つ以上の側鎖にランダム的に結合される。いくつかの態様において、PEGは、FGF21突然変異体の治療的能力を改善するために使用される。特定のこのような方法は、例えば、in米国特許第6,133,426号に記載されており、これを、あらゆる目的のために本明細書に出典明示により包含させる。ポリマーがPEGである本発明の態様において、PEG基はあらゆる適当な分子量であってよく、直線状または分岐状であってよい。PEG基の平均分子量は、好ましくは、約2kDから約100kDa、さらに好ましくは約5kDaから約50kDa、例えば、10、20、30、40または50kDaの範囲である。PEG基は、一般的に、PEG部分上の反応基例えば、アルデヒド、アミノ、チオ-ルまたはエステル基からFGF21突然変異体上の反応基例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基へ、アシル化または還元的アルキル化を介して、FGF21突然変異体に結合される。Y-形PEG誘導体としても知られている分岐状PEG誘導体は、中核に結合される2つの直線状メトキシPEG鎖を含む。これらのY形PEG誘導体の立体的バルキー構造は、修飾分子の一点結合を容易にする。一例として、3つの種類のY形PEG誘導体は、Y-NHS-40Kアミンペグ化のために有用;Y-MAL-40Kチオールペグ化のために有用;およびY-ALD-40K例えば、Y-AALD-40KおよびY-PALD-40KN-末端ペグ化のために有用である。アミンペグ化のために、Y形NHSエステルは、生物学的活性分子におけるリジンまたはN-末端アミンのアミノ基と反応し、安定なアミド結合を生産する。該NHSエステルは、pH7-8で標的分子と結合する。チオールペグ化のために、Y形マレイミドは、生物学的活性分子におけるチオール基と反応し、安定な3-チオスクシンイミジルエーテル結合を産生する。該マレイミドは、他の官能基の存在下でpH5.0-6.5で標的分子と結合する。N-末端ペグ化のために、Y形アルデヒドは、好ましくは、生物学的活性分子におけるN-末端アミンと反応し、還元試薬、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で安定なアミン結合を生産する。該アルデヒドは、pH5-8で標的分子のN-末端アミンと結合する。分岐状ペグ化を再形成するための試薬は、例えば、JenKemTechnologyを介して利用できる。本発明のFGF21突然変異体を含むポリペプチドのペグ化は、当分野で知られているペグ化反応のいずれかを使用して特異的に行うことができる。このような反応は、例えば、以下の文献:Francisら1992FocusonGrowthFactors3410;欧州特許第0154316および0401384号;および米国特許第4,179,337号において記載されている。例えば、ペグ化は、本明細書に記載されている反応性ポリエチレングリコール分子または類似反応性水溶性ポリマーとのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行うことができる。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化のために、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、水安定でありポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドまたはモノC1-C10アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体例えば、米国特許第5,252,714号参照である。本発明のいくつかの態様において、ポリペプチドへのPEG基の結合のために有用な戦略は、溶液中の抱合体結合の形成を介して、それぞれが他方に対して相互に反応性の特別な機能性を有する、ペプチドおよびPEG部分を結合することを含む。ペプチドは、慣用の固相合成で容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位で適当な官能基で前活性化される。前駆体は、PEG部分での反応の前に、精製および完全に特性化される。PEGとペプチドのライゲーションは、通常、水相で行い、逆相分析HPLCにより容易にモニタリングすることができる。PEG化ペプチドは、分取HPLCにより容易に精製し、分析HPLC、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特徴付けることができる。多糖類ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる別の型の水溶性ポリマーである。したがって、多糖類ポリマーに融合された本発明のFGF21突然変異体は、本発明の態様を形成する。デキストランは、アルファ1-6結合により主に連結されるグルコースの個々のサブユニットからなる多糖類ポリマーである。デキストランそれ自体は、広い分子量範囲において利用でき、約1kDから約70kDの分子量において容易に利用できる。デキストランは、ビヒクルそれ自体または別のビヒクル例えば、Fcと組み合わせての使用のための適当な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開WO96/11953参照。治療または診断免疫グロブリンへ結合されるデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公報第0315456号参照、これを出典明示により本明細書に包含させる。本発明はまた、約1kDから約20kDのデキストランの使用を含む。一般的に、化学修飾は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される任意の適当な条件下で行うことができる。化学的に修飾されたポリペプチドを調製するための方法は、一般的に、a条件下でポリペプチドを活性化ポリマー分子例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させ、それによって、FGF21タンパク質変異体が1つ以上のポリマー分子と結合するようになること、およびb反応産物を得ることの工程を含む。最適な反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比率が高くなれば、結合されるポリマー分子のパーセントが高くなる。本発明の1つの態様において、化学的に修飾されたFGF21突然変異体は、アミノ-末端に単一のポリマー分子部分を有し得る例えば、米国特許第5,234,784号参照。本発明の別の態様において、FGF21タンパク質変異体は、ビオチンと化学的に結合させることができる。次に、ビオチン/FGF21タンパク質変異体はアビジンに結合し、四価アビジン/ビオチン/FGF21タンパク質変異体をもたらすことができる。FGF21タンパク質変異体はまた、ジニトロフェノールDNPまたはトリニトロフェノールTNPと共有的に結合させ、得られる抱合体を抗-DNPまたは抗-TNP-IgMで沈殿させ、10の価数で十量体抱合体を形成させることができる。一般的に、本発明の化学的に修飾されたFGF21突然変異体の投与により緩和または調節することができる条件は、FGF21タンパク質変異体に対して本明細書に記載されているものを含む。しかしながら、本明細書に記載されている化学的に修飾されたFGF21突然変異体は、非修飾FGF21突然変異体と比較して、さらなる活性、生物学的活性の増強または減少、または他の特性、例えば、半減期の延長または短縮を有し得る。FGF21突然変異体の治療組成物およびその投与FGF21突然変異体を含む治療組成物は、本発明の範囲内であり、具体的には、増強された特性を示すいくつかの突然変異体FGF21配列の同定を踏まえて考慮される。このようなFGF21突然変異体医薬組成物は、投与経路との適合性に対して選択される薬学的または生理学的に許容される製剤との混合物中に治療有効量のFGF21タンパク質変異体を含むことができる。許容される製剤は、好ましくは、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。医薬組成物は、例えば、組成物のpH、浸透性、粘性、明瞭さ、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、分解もしくは放出速度、吸着性または浸透を修飾、維持または保存するための製剤物質を含むことができる。適当な製剤物質は、限定はしないが、アミノ酸例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン、抗菌剤、抗酸化剤例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム、バッファー例えば、ホウ酸、重炭酸、Tris-HCl、クエン酸、リン酸または他の有機酸、増量剤例えば、マンニトールまたはグリシン、キレート化剤例えば、エチレンジアミン四酢酸EDTA、錯化剤例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン、増量剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン、タンパク質例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン、着色剤、香味剤および賦形剤、乳化剤、親水性ポリマー例えば、ポリビニルピロリドン、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン例えば、ナトリウム、防腐剤例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素、溶媒例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール、糖アルコール例えば、マンニトールまたはソルビトール、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤例えば、プルロニック;PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20またはポリソルベート80;トリトン;トロメタミン;レシチン;コレステロールまたはチロキサパール、安定性増強剤例えば、スクロースまたはソルビトール、緊張力増強剤例えば、アルキル金属ハロゲン化物;好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム;またはマンニトールソルビトール、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または医薬アジュバント例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、およびこれの後版、参照、あらゆる目的のために出典明示により本明細書に包含させるを含む。最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および所望の用量に依存して、当業者により決定される例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、上記、参照。このような組成物は、FGF21タンパク質変異体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響し得る。医薬組成物における主なビヒクルまたは担体は、実際、水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のために適当なビヒクルまたは担体は、恐らく非経口投与のための組成物によく見られる他の物質を補った、水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。他の典型的な医薬組成物は、ソルビトールまたは適当な代替物をさらに含むことができる、約pH7.0-8.5のTrisバッファーまたは約pH4.0-5.5の酢酸バッファーを含む。本発明の1つの態様において、FGF21タンパク質変異体組成物は、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態にて、所望の純度の程度を有する選択される組成物を任意の製剤と混合することによりRemington’sPharmaceuticalSciences、上記、保存用に調製することができる。さらに、FGF21タンパク質変異体産物は、適当な賦形剤、例えば、スクロースを使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。FGF21タンパク質変異体医薬組成物は、非経口投与のために選択することができる。あるいは、組成物は、消化管を介する、例えば、経口的な、吸入または送達のために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当分野の技術の範囲内である。製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、バッファーは、生理学的pHまたはわずかにより低いpHで、一般的に約5から約8のpH範囲内で、組成物を維持するために使用される。非経口投与が考慮されるとき、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望のFGF21タンパク質変異体を含むピロゲン無し非経腸的に許容される水溶液の形態においてであり得る。非経口注射のために特に適当なビヒクルは、FGF21タンパク質変異体が適当に保存される滅菌等張液として製剤化される滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、デポー注射を介して送達される産物の制御または持続放出を提供する、薬剤を有する所望の分子の製剤、例えば、注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸、ビーズまたはリポソームを含むことができる。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環の持続期間を増進する効果を有することができる。所望の分子の導入のための他の適当な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。1つの態様において、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。例えば、FGF21タンパク質変異体は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。FGF21タンパク質変異体吸入溶液もまた、エアロゾル送達のために高圧ガスで製剤化することができる。さらに別の態様において、溶液は噴霧状にすることができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載している国際公開WO94/20069にさらに記載されている。特定の製剤は経口的に投与することができることも考慮される。本発明の1つの態様において、この様式において投与されるFGF21タンパク質変異体は、固体投与形態、例えば、錠剤およびカプセルの合成において習慣的に使用される担体の有無にかかわらず製剤化することができる。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティを最大化そ、前全身性分解を最小限にするとき、胃腸管部位に製剤の活性部分を放出するように設計することができる。さらなる薬剤を、FGF21タンパク質変異体の吸収を容易にするために含むことができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた、使用することができる。別の医薬組成物は、錠剤の製造のために適当である非毒性賦形剤との混合物中に有効な量のFGF21タンパク質変異体を含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適当なビヒクルに溶解することにより、溶液は単位用量形態において調製することができる。適当な賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム;または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア;または滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクを含むが、これらに限定されない。持続もしくは制御送達製剤においてFGF21タンパク質変異体を含む製剤を含む、さらなるFGF21タンパク質変異体医薬組成物が、当業者に明らかである。種々の他の持続もしくは制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に知られている例えば、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマー性微粒子の制御放出を記載している国際公開WO93/15722、およびミクロスフェア/微粒子調製および使用を記載しているWischkeSchwendeman2008IntJPharm364298327、およびFreibergZhu2004IntJPharm282118、参照.持続放出調製物のさらなる例は、造形品の形態における半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド米国特許第3,773,919号および欧州特許第0058481号、L-グルタミン酸およびガンマエチル-L-グルタミン酸のコポリマーSidmanら1983Biopolymers2254756、ポリ2-メタクリル酸ヒドロキシエチルLangerら1981JBiomedMaterRes15167277およびLanger1982ChemTech1298105、エチレン酢酸ビニルLangerら、上記またはポリ-D-3-ヒドロキシ酪酸欧州特許第0133988号を含むことができる。持続放出組成物はまた、当分野で知られているいくつかの方法のいずれかにより調製することができるリポソームを含むことができる。例えば、Epsteinら1985ProcNatlAcadSciUSA82368892;および欧州特許第0036676、0088046および0143949号、参照。インビボ投与のために使用されるFGF21タンパク質変異体医薬組成物は、一般的に、滅菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を介する濾過により成し遂げることができる。組成物が凍結乾燥されるとき、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前、または後のいずれかに行うことができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保管することができる。加えて、非経口組成物は、一般的に、皮下注射針により貫通できるストッパーを有する滅菌点検口を有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアルに分類される。医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管することができる。このような製剤は、すぐに使える形態、または、投与前に再構成する必要なる形態例えば、凍結乾燥された形態のいずれかで保管することができる。特定の態様において、本発明は、単回投与単位を生産するためのキットである。キットは、それぞれ、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性製剤を有する第2の容器の両方を含む。単一および多チャンバー型の充填済みシリンジ例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジを含むキットも本発明の範囲内に含まれる。治療に使用されるFGF21タンパク質変異体医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に依存する。当業者は、したがって、処置に対して適当な用量レベルが、一部分において、送達される分子、FGF21タンパク質変異体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ体重、体表面または臓器サイズおよび状態年齢および全般的な健康状態に依存することを理解している。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を滴定し、投与経路を修飾することができる。典型的な用量は、上記因子に依存して、約0.1μg/kgから約100mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。他の態様において、用量は、0.1μg/kgから約100mg/kg;または1μg/kgから約100mg/kg;または5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、約100mg/kgの範囲であり得る。さらなる他の態様において、用量は、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1000μg/kg、2000μg/kg、3000μg/kg、4000μg/kg、5000μg/kg、6000μg/kg、7000μg/kg、8000μg/kg、9000μg/kgor10mg/kgであり得る。投与の頻度は、使用される製剤におけるFGF21タンパク質変異体の薬物動態パラメーターに依存する。一般的に、臨床医は、用量が所望の効果をなし遂げるように達するまで、組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投与として、時間とともに2またはそれ以上の投与として同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよいとして、または、移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与することができる。適当な用量のさらなる改善は、当業者により日常的に行われており、当業者により日常的に行われる活動の範囲内である。適当な用量は、適当な用量-応答データの使用を介して確認することができる。医薬組成物の投与経路は、既知の方法にしたがって、例えば、経口的;静脈内、腹腔内、脳内実質内、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内経路による注射を介して;持続放出系注射もされ得るにより;または、移植デバイスによりである。所望により、組成物は、ボーラス注射により、または連続的に注入により、または移植デバイスにより投与することができる。あるいは、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたは他の適当な物質の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスを使用するとき、デバイスは、任意の適当な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、定時放出ボーラスまたは連続的投与を介する送達であり得る。FGF21ポリペプチド突然変異体の治療的使用FGF21タンパク質変異体は、限定はしないが代謝障害を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用することができる。1つの態様において、処置される代謝障害は、糖尿病、例えば、2型糖尿病である。別の態様において、代謝障害は肥満である。他の態様は、代謝状態または障害、例えば、1型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎NASH、インスリン耐性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈性心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひおよび他の代謝障害を含む。適用において、障害または状態、例えば、1型または2型糖尿病または肥満は、治療有効用量において本明細書に記載されているFGF21タンパク質変異体を必要とする患者に投与することにより処置することができる。投与は、本明細書に記載されているとおり、例えば、IV注射、腹腔内注射、筋肉内注射または錠剤または液体製剤の形態における経口的に行うことができる。多くの場合、所望の用量は、本明細書に記載されているとおりに、臨床医により決定することができ、FGF21突然変異体ポリペプチドの治療有効用量を示すことができる。治療有効用量のFGF21突然変異体ポリペプチドが、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の投与単位、核酸分子またはポリペプチドが他の治療剤と組み合わせて投与されるか否か、レシピエントの免疫状態および健康状態に依存することは当業者に明白である。本明細書において使用される治療有効用量なる用語は、処置される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者、医師または他の臨床医により探求される組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学応答を引き起こすFGF21突然変異体ポリペプチドの量を意味する。医薬組成物本発明はまた、本明細書に記載されているFGF21変異体または突然変異体の1つ以上および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、医薬組成物は、液体溶液または懸濁液としてのいずれかで注射用として製造され;注射前に、液体ビヒクルでの溶液または懸濁液に対して適当な固体形態もまた製造することができる。リポソームは、薬学的に許容される担体の定義に含まれる。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸エステル塩などもまた、医薬組成物に存在することができる。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyAlfonsoGennaroLippincottWilliamsWilkinsで利用できる。融合タンパク質およびFGF21由来ペプチド化合物別の態様において、本発明のFGF21変異体は、FGF21変異体アミノ酸配列に由来する融合タンパク質またはペプチド化合物に作り替えることができる。このような融合タンパク質およびペプチド化合物は、当分野で知られている標準技術を使用して作製することができる。例えば、ペプチド化合物は、標準ペプチド合成技術を使用する化学合成により作製し、次に、ペプチドを細胞例えば、リポソームなどに導入するための当分野で知られている種々の手段により細胞に導入することができる。本発明の融合タンパク質またはペプチド化合物のインビボ半減期は、ペプチド修飾、例えば、FGF21変異体へN-連結グリコシル化部位を付加させること、または例えば、リジン-モノペグ化またはシステイン-モノペグ化を介する、ポリエチレングリコールPEG;ペグ化にFGF21変異体を結合することにより改善することができる。このような技術は、治療タンパク質薬物の半減期を延長することにおいて有益であることが証明されている。本発明のFGF21変異体のペグ化が同様の医薬的利点をもたらし得ることが予期される。加えて、ペグ化は、本発明のポリペプチドの任意の部分における非天然アミノ酸の導入によりなし遂げることができる。特定の非天然アミノ酸は、DeitersらJAmChemSoc12511782117832003WangandSchultzScience3019649672003WangらScience2924985002001ZhangらScience3033713732004または米国特許第7,083,970号に記載されている技術により導入することができる。簡潔には、これらの発現系いくつかは、ナンセンスコドン、例えば、アンバーTAGを本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに導入するための部位特異的突然変異誘発を含む。次に、このような発現ベクターは、導入されるナンセンスコドンに特異的なtRNAを利用することができる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸が負荷される。本発明のポリペプチドへ部分を結合する目的のために有益である特定の非天然アミノ酸は、アセチレンおよびアジド側鎖を有するものを含む。次に、これらの新規アミノ酸を含むFGF21変異体は、タンパク質中のこれらの選択される部位でペグ化することができる。実施例実施例1:FGF21変異体タンパク質の調製およびペグ化FGF21変異体に対する発現構築物:FGF21変異体を、Achmullerらに記載されている修飾された大腸菌発現ベクターpET30aにクローニングし、FGF21のN-末端aa33-209にヘキサ-ヒスチジンタグ、次に、Npro-EDDIEタグのインフレーム融合物を産生した。FGF21変異体の発現および精製:pET30a-His-Npro-EDDIE-FGF21発現プラスミドを、大腸菌BL21StarDE3コンピテント細胞に形質転換した。新たに形質転換された細胞の単一コロニーの一晩培養を、37°Cで50μg/mLのカナマイシンを含む50mLのTerrificBrothTBで行った。前培養物をカナマイシンを有する1LのTB培地に移し、250rpmで浸透しながら37°Cでバッフル付フラスコ中で培養した。6時間培養後、1mMの最終濃度でのIPTGの添加によりFGF21の発現を誘導し、培養物を37°Cで一晩培養した。次に、細胞を回収し、50mLの氷冷溶解バッファー;50mMのTris-HCl、pH8、150mMのNaCl、1mMのEDTAに再懸濁し、次に、microfluidizerTMを使用して溶解した。封入体IBを、4°Cで1時間30,000×gで遠心分離により沈殿させた。IBを50mMのTris-HCl、pH8、150mMのNaClで洗浄し、次に、30mLの溶解バッファー;10mMのTris-HCl、pH8、100mMのNaH2PO4、6MのGnHClに溶解させた。溶解されたIBは、25°Cで1時間30,000×gで遠心分離により浄化した。IB溶液を、溶解バッファーで平衡化されたNi-NTA高性能樹脂GEHealthcareの5mLのカラム上に負荷した。樹脂に結合したタンパク質を、pH4.5に低下させることにより溶離した。溶出液を、pHを調整し、ジチオスレイトールDTTを20mMの濃度で添加することに調整した。調整された溶出液を、1Lのリフォールディングバッファー;50mMのTris-HCl、pH8、0.5Mのアルギニン、20mMのDTTにゆっくり希釈し、次に、4°Cで2日間インキュベーションした。希釈されたサンプルを濃縮し、限外ろ過方法を使用して20mMのTris-HCl、pH9にバッファー交換した。濃縮したサンプルを、20mMのTri-HClpH9で平衡化されたQセファロース高速流樹脂GEHealthcareの10mLカラムに負荷した。平衡バッファーで樹脂を洗浄後、樹脂に結合したタンパク質を、20mMのTris-HCl、pH9、500mMのNaClで溶離した。リフォールディングされたFGF21タンパク質から開裂されたHis-Npro融合フラグメントおよびあらゆる開裂されていない融合タンパク質を除去するために、溶出液を20mMのTris、pH8.0、50mMのイミダゾールで平衡化されたNi-NTA高性能樹脂の5mLカラムに負荷し、FGF21を含むフロースルー画分を回収した。エンドトキシンレベルを減少させるために、FGF21画分を、10mMのTris、pH8、50mMのイミダゾール、500mMのNaCl、1mMのCaCl2で平衡化されたEndoTrapHD樹脂Hyglosで処理した。低エンドトキシンサンプルをPBSに対して透析し、次に、0.22μmフィルターで滅菌した。精製されたFGF21タンパク質を液体窒素でスナップ凍結させ、-80°Cで貯蔵した。タンパク質濃度を、FGF21に対するモル吸光係数として9362M-1cm-1を使用して280nmでの吸光度により決定した。タンパク質純度および完全性を、HPLC、SDS-PAGEおよび液体クロマトグラフィー-質量分析により決定した。FGF21変異体のシステインペグ化:hsFGF21R154C変異体は、操作されたシステインを介して二量体化する傾向を有する;したがって、ペグ化前に、タンパク質溶液一般的に、Trisバッファー中5mg/mlを、氷上で30分間、5mMのメルカプトエチルアミンで穏やかに還元し、20mMのTris、pH7で即座に脱塩した。次に、新たに還元されたタンパク質一般的に3mg/mlを、氷上で3時間、1.5当量の40kDaの分岐状マレイミド-PEG試薬SunbrightシリーズのNOFカタログGL2-400MAで即座にペグ化した。最後に、ペグ化タンパク質を、約25の全収率で陰イオン交換クロマトグラフィーMonoQにより精製した。FGF21変異体のN-末端ペグ化:FGF21変異体および40kDaの分岐状PEG試薬SunbrightシリーズのNOFカタログGL2-400AL3;FGF21に対して3:1モル比の最終濃度はそれぞれ、3-4mg/mLおよび9-12mg/mLであった。バッファーは、50mMの酢酸ナトリウム、pH6.0、25mMの塩化ナトリウムおよび40mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムであった。反応混合物を4°Cで44時間、穏やかにタンブルし、反応変換物をいくつかの時点にわたってモニタリングした。20時間でおよそ変換は50であり、44時間で70であった。実施例2:ヒトFGF21ジスルフィド変異体の作製クローニングライブラリー:ベクターpGAPZアルファAInvitrogenCarlsbadCAを、ベクターのユニークなBamHI部位においてβ-ラクタマーゼ発現カセットを付加することにより修飾した。β-ラクタマーゼ発現カセットは、HribarらBioTechniques4447784により記載されているとおりに作製した。アルファ接合因子分泌シグナル配列、6個のヒスチジンアフィニティー精製tag、およびタバコエッチ病ウイルスTEVプロテアーゼ認識配列を含むN-末端配列を有するインフレームにおけるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPプロモーターの後に、アミノ酸33から209をコードするヒトFGF21cDNAを、修飾pGAPZアルファAベクターにクローンした。hFGF21構築物のライブラリーを、野生型配列においてCys103およびCys121ならびにシステインに突然変異された2つの野生型アミノ酸を有するそれぞれの構築物で作製した。ライブラリーは、野生型アミノ酸の代わりにシステインをコードするプライマーでhFGF21アミノ酸33-209コード領域のPCRフラグメントを作製することにより作った。PCRフラグメントを、互いに同一の配列の16個の塩基対を共有することができるように、または、直線状修飾pGAPZアルファAベクターを、In-Fusion酵素TakaraBioCoUSAを使用して結合することができるように設計した。それぞれの構築物を配列確認し、酵母株作製のために使用した。酵母株の作製:メタノール資化酵母酵母株SMD1168HInvitrogenを、YaoらJBiotechnolJan151391316により記載されているYPS1遺伝子を破壊することにより修飾した。修飾株SMD1168HデルタYPS1は、300μg/mLのブラストサイジンに対する耐性を有した。約5-10μgの配列確認されたプラスミドDNAをAvrIIで消化し、pGAPZα-Aに対するInvitrogenのマニュアルにしたがって調製されたSMD1168HデルタYPS1細胞と混合した。細胞を、0.2cmキュベットBioRadHerculesCAにおいて直線状プラスミドと混合した。細胞および直線状プラスミドを有するキュベットを、氷上で5分間インキュベートした。キュベットに、1.5kVに合わせたボルト数、25μFに合わせたコンデンサー、および400Ohmに合わせたパルスコントローラーを備えたGenePulser-IIBioRadを使用して、パルスを発した。パルス後即座に、1mLの氷冷1Mのソルビトールをキュベットに加え、その内容物を滅菌15mLチューブに移した。チューブを、2時間震盪することなく、30°Cでインキュベートした。電気穿孔された細胞を、100μg/mLのゼオシンzeoを含むYPDS1の酵母抽出物、2のペプトン、2のデキストロース、1Mのソルビトールおよび2の寒天プレート上に広げた。プレートを30°Cで3-10日間インキュベートし、コロニー形成した。それぞれの構築物の24コロニーを取り出し、96-ウェルディープ-ウェルプレートにおいて100μg/mLのゼオシンを含む1mLのYPD増殖培地に植菌するために使用した。プレートを、900RPMで震盪器SheldonManufacturingCorneliusORで30°Cで一晩インキュベートした。それぞれの培養物の10μLのアリコートを取り出し、96-ウェルディープ-ウェルプレートにおいて990μLのPBSpH7.4に希釈した。β-ラクタマーゼ活性の比色定量のために、50μLの1:100希釈培養物を96-ウェルマイクロタイタープレートに移した。ニトロセフィン1mg;EMDChemicalsGibbstownNJを100μLのDMSOに溶解させ、1.9mLのPBSに希釈し、1mMの希釈標準溶液を得た。ニトロセフィン希釈標準溶液50uLを、500uMの最終濃度のためにそれぞれのウェルに加えた。ニトロセフィンの添加後、プレートを暗闇下で室温RTで5分間インキュベートした。492nmの吸光度をSpectramaxPlusマイクロタイタープレートリーダーMolecularDevicesSunnyvaleCAにて測定し、β-ラクタマーゼ活性を決定した。それぞれの構築物に対して最も高いβ-ラクタマーゼ活性を有する2つの株のグリセロール貯蔵物を作り、-80°Cで貯蔵した。hFGF21ジスルフィド変異体の小規模発現および精製:それぞれの構築物に対して最も高いβ-ラクタマーゼ比活性を有する2つの株からのhFGF21ジスルフィド変異体グリセロール貯蔵物を、96-ウェルディープ-ウェルプレートにおいて1mLのBufferedComplexGlucoseMedium1の酵母抽出物、2のペプトン、100mMのリン酸カリウム、pH6.0、1.34のYNB、4×10-5のビオチン、2のグルコースおよび2のカザミノ酸に植菌するために使用した。細胞増殖が飽和に達するまで、培養物を約48時間、900RPMSheldonManufacturingCorneliusORで震盪しながら30°Cで培養した。飽和培養物のアリコート25uLを、24-ウェルディープ-ウェルプレートにおいて5mLのBufferedComplexGlucoseMediumに植菌するために使用した。プレートを、350RPMで震盪器SheldonManufacturingCorneliusORで30°Cで一晩インキュベートした。約24時間後、プレートを15分間2500×gで遠心した。培地をペレット化細胞から吸引し、10kDカットオフ膜を備えたAmiconultra-15遠心フィルターユニットMilliporeBillericaMAに加えた。10mMのイミダゾールおよび1XHaltEDTA無しプロテアーゼインヒビターカクテルを含む10mLのPBS、pH7.4ThermoRockfordILを濃縮器において培地に加え、全容量を15mLにした。フィルターユニットを、30分間、SorvallLegendRTプラス遠心機Thermoにおいて4000RMPで遠心した。濃縮器フロースルーを捨て、約13mLのPBS、pH7.4を遠心された培地に加えた。フィルターユニットを、再び4000RMPで30分間遠心した。濃縮バッファー交換されたサンプルを、ニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAスピンカラムQiagenValenciaCA上に負荷した。カラムを、5分間、SorvallLegendMicro21R遠心機Thermoにおいて270×g1600rpmで遠心し、次に10mMのイミダゾールを含む600uLのPBS、pH7.4で2回洗浄した。6HISタグ化hFGF21変異体を、300mMのイミダゾールを含む200uLのPBS、pH7.4で溶離した。hFGF21ジスルフィド変異体の中規模発現および精製:2点pERK細胞性アッセイ10および100nMにおいて試験したとき、最も高い活性でhFGF21ジスルフィド変異体を発現した株からのhFGF21ジスルフィド変異体グリセロール貯蔵物を、50mLの滅菌チューブにおいて100μg/mLのゼオシンを含む5mLのBufferedComplexGlucoseMedium1の酵母抽出物、2のペプトン、100mMのリン酸カリウム、pH6.0、1.34のYNB、4×10-5のビオチン、2のグルコースおよび2のカザミノ酸に植菌するために使用した。細胞増殖が飽和に達するまで、培養物を約48時間、250RPMで震盪しながら30°Cで培養した。飽和培養物のアリコート50uLを、250mLのUltraYieldフラスコThomsonInstrumentCoOceansideCAにおいて100mLのBufferedComplexGlucoseMediumに植菌するために使用した。フラスコを300RPMで震盪器で30°Cで一晩インキュベートした。約24時間後、細胞を15分間2500×gで遠心した。培地80mLをペレット化細胞から吸引し、10kDカットオフ膜を備えたCentricon-70遠心フィルターユニットMilliporeBillericaMAに加えた。フィルターユニットを、30分間、SorvallLegendRTプラス遠心機Thermoにおいて4000RMPで遠心した。残っている浄化された培地約20mLをCentricon-70遠心フィルターに加え、フィルターにおける全容量は、10mMのイミダゾールおよび1XEDTA無しHaltプロテアーゼインヒビターカクテルを含むPBS、pH7.4を加えることにより80mLに増加した。フィルターユニットを、再び、4000rpmで30分間遠心した。フィルターユニットにおける濃縮培地の容量は、10mMを含むPBS、pH7.4を加えることにより80mLに増加した。フィルターユニットを、再び、4000rpmで30分間遠心した。濃縮バッファー交換されたサンプルを、10mMのイミダゾールを含むPBS、pH7.4で前平衡化された1mLのHis-GravitrapカラムGELifesciencesPiscatawayNJ上に負荷した。カラムを20mMのイミダゾールを含む10mLのPBS、pH7.4で洗浄した。6HISタグ化hFGF21変異体を、300mMのイミダゾールを含む2.5mLのPBS、pH7.4で溶離した。2.5mLの溶離バッファーを、10mMのイミダゾールを含む25mLのPBS、pH7.4で前平衡化された10mLのPD-10脱塩カラムに適用した。6HISタグ化ジスルフィド変異体を、10mMのイミダゾールを含む3.5mLのPBS、pH7.4で脱塩カラムから溶離した。6HISタグを、ProTEVプロテアーゼ250ユニット;PromegaMadisonWIを加え、サンプルを室温で2時間および4°Cで一晩インキュベートすることにより、脱塩アフィニティー-精製hFGF21ジスルフィド変異体から除去舌。タグ開裂hFGF21ジスルフィド変異体を、10mMのイミダゾールを含むPBS、pH7.4で前平衡化された1mLのHis-Gravitrapカラム上に負荷した。タグ開裂hFGF21ジスルフィド変異体を含むフロースルーを回収した。His-Gravitrapカラムを、10mMのイミダゾールを含むPBS、pH7.4、5mLで洗浄した。カラムフロースルーを回収し、タグ開裂反応からのフロースルーに加えた。混合フロースルーサンプル約8.5mLを、10kDaカットオフ膜を備えたAmiconultra-15遠心フィルターで約1mLに濃縮した。pERK細胞性アッセイにおいてアッセイされるまで、濃縮されたhFGF21ジスルフィド変異体を-80°Cで凍結した。実施例3:2-デオキシグルコース2-DOG摂取測定最近、FGF21は、インスリンの存在および非存在下でマウス3T3-L1脂肪細胞においてグルコース摂取を刺激する、およびob/obおよびdb/dbマウスならびに8週齢ZDFラットにおいて用量依存的に食餌および空腹時血糖、トリグリセリドおよびグルカゴンレベルを減少させることを示し、したがって、糖尿病および肥満を処置するための治療としてのFGF21の使用の基礎を提供する例えば、特許公報WO03/011213、およびKharitonenkovらJourofClinicalInvest11516271635参照。また、FGF21は、3T3-L1脂肪細胞におけるFGFR-1およびFGFR-2のチロシンリン酸化を刺激することを観察した。3T3-L1繊維芽細胞は、ATCCカタログCL173から購入した。該細胞を150cmペトリ皿においてコンフルエンシーにまで増殖させ、10ウシ胎児血清および1ペニシリン-ストレプトマイシンを補った高グルコースInvitrogen11995065を有するDMEMにおいて、さらに4日間維持した。次に、細胞を3日後、4μg/mlのインスリンSigmaカタログI-5500、115μg/mlのIBMXSigmaカタログI5879および0.0975μg/mlのデキサメタゾンSigmaカタログD1756を補った上記培地で分化し、その後、分化培地を完全DMEMと置き換えた。1つのプレートの分化された3T3-L1脂肪細胞を、培地置換えの次の日に、4つの96-ウェルプレート上に播種した。次に、脂肪細胞を完全培地において、一晩FGF21-WTおよびFGF21変異体で処理した変異体のリストに関して表2参照;30pMから100nMが使用される典型的な濃度範囲である。FGF21サンプルで処理される脂肪細胞は、ウェルあたり50μlのKRHバッファー0.75のNaCl;0.038のKCl;0.0196のCaCl2;0.032のMgSO4;0.025MのHepes、pH7.5;0.5のBSA;2mMのピルビン酸ナトリウムにおいて2時間血清飢餓である。ブランクのためのウェルに、15分間1μl最終濃度5μg/mlサイトカラシンBを加えた。[3H]-2-DOG20.6mci/mmol、1mci/mlを、5.1mMの冷2-DOGにおいて1:20希釈し、ウェルあたり1μlの希釈2-DOGを細胞に加え、5分間インキュベートした。細胞を100μl/ウェルのKRHバッファーで3回洗浄した。40μl/ウェルの1SDSを細胞に加え、細胞を少なくとも10分間震盪した。200μl/ウェルのシンチレーション液体を加え、プレートを一晩震盪し、ベータ-マイクロプレートリーダーで読んだ。サイトカラシンBで処理された全カラム/列から得られた値を平均し、全ての他の値から引いた。データをGraphPadprismソフトウェアにより分析し、該結果は表2に要約される表2.3T3-L1脂肪細胞2-デオキシ-グルコース2-DOG摂取アッセイにおけるFGF21WTおよびFGF21変異体のEC50値および相対的効力Fold-WTの要約1Fold-WTは、同じ実験において直接的で行われたFGF21-WTに対するFGF21変異体のEC50値の比率である。実施例4:細胞ウェスタンICWアッセイにおけるpERK。ヒトβ-クロトーで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞を、DMEM高グルコース、10のFBS、1のPSおよび600ng/mlのG418において培養し、ウェルあたり30,000個の細胞で一晩でポリ-D-リジン被覆96-ウェルプレートBDbioscience356640に播種した。細胞は、4時間、DMEM高グルコース、0.5のBSAおよび10mMのHEPESにおいて血清飢餓した。WTFGF21およびFGF21変異体変異体のリストに関して表3参照を、飢餓培地において、種々の濃度に希釈した100pMから300nMが使用される典型的な濃度範囲である。細胞を10分間、FGF21で刺激した。FGF21刺激後、培地をウェルから吸引し、細胞を100μlの冷PBSで1回洗浄し、次に、RTで15分間100μLの4ホルムアルデヒドで固定し、次に、100μlの氷冷メタノールでさらに10分間インキュベーションした。固定後、細胞をPBS中の0.3のトリトンX-100で4回、それぞれ5分洗浄した。150μlのOdysseyBlockingバッファーを、室温で1.5時間、透過処理した細胞に加えた。ホスホ-ERKpERK抗体を0.17μg/mlの濃度1:200希釈、または示された希釈に希釈し、全-ERKtERK抗体をOdysseyBlockingバッファーにおいて2.2μg/mlの濃度1:200希釈、または示された希釈に希釈した。50μlを、バックグラウンドのために標準化する二次抗体で処理されたのみである1つのカラムを含めない全てのウェルに加えた。プレートを湿紙タワーで被覆し、蒸発を防止するために蓋をし、次に4°Cで一晩インキュベートした。その後、一次抗体を吸引し、細胞を、PBS中の0.3のTween20でそれぞれ5分間4回洗浄した。洗浄中、二次抗体反応混合物は、1:1000-希釈または示された希釈ヤギ抗-マウスAlexa680および1:1000-希釈または示された希釈IRDye800ヤギ抗-ウサギ抗体を含むOdysseyBlockingバッファーにおいて調製した。洗浄が完了したら、40μLの反応混合物をそれぞれのウェルに加えた。プレートに黒色の蓋を被せ、光から二次抗体を保護し、プレートを震盪器上でRTで1時間インキュベートした。最後に、細胞を再び、PBS中の0.3のTween20でそれぞれ5分間4回洗浄し、次に700nm赤および800nm緑チャンネルにおいてLI-CORBioscienceOdysseyInfraredImagingSystemLiCorBiosciencesLincolnNEにてスキャンした。Alexa680は近赤外蛍光発光波長668nmでtERKを染色したが、IRDye800は緑色蛍光発光波長800nmでpERKを染色した。蛍光バックグラウンドを除去するために、二次抗体のみで処理された全体の段/列から得られた値を平均し、プレートから得られた全ての他の値から引いた。それぞれのサンプルに存在するpERKの量の標準化のために、それぞれのウェルにおけるpERKに対する値を、tERKの値で割った。データはGraphPadプリズムソフトウェアにより分析し、該結果は表3に要約される。表3.ヒトβ-クロトーで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞を使用するpERK細胞性アッセイにおけるFGF21WTおよびFGF21変異体のEC50値および相対的効力Fold-WTの要約1Fold-WTは、同じ実験において直接的で行われたFGF21-WTのEC50値に対するFGF21変異体のEC50値の比率である。実施例5:FGF21およびFGF21変異体のインビボ試験-薬物動力学および血漿暴露。ob/obマウスは、2型糖尿病のマウスモデルである。該マウスは、機能性レプチンを欠いており、高血糖、インスリン耐性、過食症、肝臓脂肪症および肥満により特徴付けられる。オスob/obマウス10-13週齢を使用し、以下:1野生型FGF21、2FGF21変異体、3ペグ化野生型FGF21、および4ペグ化FGF21変異体の血糖に対する効果を評価した。野生型FGF21、変異体FGF21またはPBSビヒクルを、1mg/kgおよび4ml/kgで1日に1回5日間s.c.投与した。試験の最初の日に、尾の血糖および体重を測定し、マウスを、グループ間で平均グルコースおよび体重を合わせて、異なるグループグループあたりn=8に配分した。1、3および5日の投与前、ならびに投与後2および4時間で、glucometerOneTouchを使用して血糖を測定した。これらの試験の結果は、表4に要約される。表4。ob/obマウスにおける5日間スクリーニング試験中の、FGF21変異体による全グルコースAUCの減少パーセント。1WTに対する倍異数変化は、同じ実験において直接的で行われたFGF21-WTのグルコースAUC減少に対するFGF21変異体のグルコースAUC減少の比率である。マウスに、ペグ化FGF21野生型を1mg/kgで、ペグ化FGF21変異体を0.3、1または3mg/kgで、またはPBSビヒクルを4ml/kgで、週に2回を2週間s.c.投与した。試験の最初の日に、尾の血糖および体重を測定し、マウスを、グループ間で平均グルコースおよび体重を合わせて、異なるグループグループあたりn=8に配分した。1、4、8および11日目の投与前に、ならびに投与後4時間で、glucometerを使用して血糖を測定した。さらなる血糖測定を、それぞれの投与後24時間で、2、5、9および12日目に行った。1日目の投与前および最後の投与後24時間で12日目に血漿インスリンを測定した。1日目の投与前および第2の投与後24時間で5日目に血漿トリグリセリドを測定した。これらの試験の結果は、表5に要約される。表5。ob/obマウスにおける12日間試験中の、ペグ化FGF21野生型WTおよび変異体による血漿グルコース、インスリン、トリグリセリドTG、体重BW増加、肝臓TG/脂質のビヒクルに対する変化。V76-154C-PEG変異体は、表5に示されるとおり、優れたインビボ代謝プロフィールを示す。V76-154C-PEGもまた、FGF21-WT-R154C-PEG-7肝臓トリグリセリド変化、ビヒクルコントロールグループと有意に異ならない;図1と比較して、優れた肝臓トリグリセリド低下特性-25肝臓トリグリセリド変化、ビヒクルコントロールグループと有意に異なる;図1を示す。両方が1mg/kgで同じ試験において投与されたときWT-R154C-PEG、exp3、両方の化合物に対する血漿暴露図2は当量であり、他の有効性終点全グルコースAUC、血漿インスリン、体重増加および血漿トリグリセリドは有意に異ならなかった。実施例6:野生型FGF21およびペグ化FGF21変異体での血漿安定性アッセイペグ化FGF21変異体と比較して野生型FGF21FGF21-WTの血漿安定性を測定するために、血漿安定性アッセイを実行した。十10μLのFGF21-WT4.84mg/mlおよび35.5μLのFGF21-V76-154C-PEG2.12mg/mlを90μlおよび264.5μLのob/obマウス血漿90および88血漿に加えた。それぞれのサンプルから5つのアリコートを作り、1時間、4時間、24時間、48時間および72時間インキュベートした。全ての時点からのサンプルを回収するまで、血漿処理サンプルを4°Cで貯蔵した。九9μLの血漿処理FGF21-WTおよび27μLの血漿処理FGF21-V76-154C-PEGを、750μLの培地1.2血漿で300nMのFGF21-WTおよび3.6血漿で450nMのFGF21-V76-154C-PEGに加え、培地で1:3に8回連続希釈された。ヒトβ-クロトーで安定にトランスフェクトされたHEK293細胞を、10分間タンパク質で処理、次にpERKICWの標準プロトコールをした。未処理FGF21-WT、FGF21-V76-154C-PEGならびに1.2および3.6マウス血漿もまた、コントロールとして含まれる。これらの実験の結果は、図3Aおよび3Bにより描写されるグラフである。FGF21-WTは、37°Cでマウス血漿とインキュベートしたとき、短い期限1-4時間で活性を失ったが、V76-154C-PEGは、対照的に、37°Cでマウス血漿とインキュベートしたとき、少なくとも72時間その完全活性を保持した。本発明は、それらの特定の態様を基準にして記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変化が作られ得、均等が置き換えられ得ることを当業者により理解されるべきである。加えて、多数の修飾が、本発明の対象、精神および範囲に対して、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程を採用され得る。全てのこのような修飾は、本発明の範囲内であると意図される。"