親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、かつ標識部分を含んでもよいブロックコポリマーであって、該親水性ポリマーセグメントが、ポリPEO、ポリMPC、およびポリビニルピロリドンPVPからなる群より選択されるポリマーを含み、該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、ブロックコポリマー:式中、RはHまたはCH3であり、RはNR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じであるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5~16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1~約10であり、xは合計で約20~約200である。前記親水性ポリマーセグメントがPEOを含む、請求項1記載のブロックコポリマー。nが1~4である、請求項1または2記載のブロックコポリマー。nが2である、請求項1または2記載のブロックコポリマー。RがCH3である、請求項1~4のいずれか一項記載のブロックコポリマー。RがHである、請求項1~4のいずれか一項記載のブロックコポリマー。xが合計で約40~約100である、請求項1~6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。xが合計で約50~約100である、請求項1~6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。xが合計で約40~約70である、請求項1~6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。xが合計で約60~約80である、請求項1~6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。xが合計で約70である、請求項1~6のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2がそれぞれ直鎖アルキルまたは分枝アルキルである、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2が連結して環を形成する、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2が同じである、請求項1~13のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2が異なる、請求項1~13のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2がそれぞれ3~8個の炭素を有する、請求項1~15のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2が一緒になって、5~10個の炭素を有する環を形成する、請求項13記載のブロックコポリマー。R1およびR2がプロピルである、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。プロピルがイソプロピルである、請求項18記載のブロックコポリマー。R1およびR2がブチルである、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。ブチルがnブチルである、請求項20記載のブロックコポリマー。R1およびR2が一緒になって5である、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。R1およびR2が一緒になって6である、請求項1~11のいずれか一項記載のブロックコポリマー。式Iの化合物を含む、請求項1~24のいずれか一項記載のブロックコポリマー:式中、Lは標識部分であり、yは0~約6であり、RはHまたはCH3であり、mは1~約10であり、zは、前記PEOのサイズが約2kD~約20kDとなるようなものであり、Rは任意の適切な部分であり、かつ構造の一部分は、任意の順に配置されてもよい。RがCH3である、請求項24記載のブロックコポリマー。RがHである、請求項24記載のブロックコポリマー。mが1~4である、請求項24~26のいずれか一項記載のブロックコポリマー。mが2である、請求項24~26のいずれか一項記載のブロックコポリマー。前記PEOのサイズが約2kD~約10kDである、請求項24~28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。前記PEOのサイズが約4kD~約6kDである、請求項24~28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。前記PEOのサイズが約5kDである、請求項24~28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。zが約114である、請求項24~28のいずれか一項記載のブロックコポリマー。yが0である、請求項24~32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。yが1~6である、請求項24~32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。yが約3である、請求項24~32のいずれか一項記載のブロックコポリマー。Lが蛍光標識である、請求項24~35のいずれか一項記載のブロックコポリマー。前記蛍光標識がテトラメチルローダミンTMRである、請求項36記載のブロックコポリマー。Lが近赤外NIR標識である、請求項24~35のいずれか一項記載のブロックコポリマー。前記NIR標識がシパートである、請求項38記載のブロックコポリマー。前記NIR標識がシパート類似体である、請求項38記載のブロックコポリマー。pH感受性ミセルを形成する、請求項1~40のいずれか一項記載のブロックコポリマー。請求項41記載のブロックコポリマーを含むpH感受性ミセルを含む、組成物。前記ミセルが約10~約200nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。前記ミセルが約20~約100nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。前記ミセルが約30~約50nmのサイズを有する、請求項42記載の組成物。前記ミセルが約1pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42~45のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約05pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42~45のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約025pH単位未満のpH転移範囲を有する、請求項42~45のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約5~約8のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約5~約6のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約6~約7のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約7~約8のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約63~約69のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約50~約62のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約59~約62のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルが約50~約55のpH転移値を有する、請求項42~48のいずれか一項記載の組成物。前記ミセルがさらに標的指向部分を含む、請求項42~56のいずれか一項記載の組成物。前記標的指向部分がVEGFR2に結合する、請求項57記載の組成物。前記標的指向部分がRAFL1mAbのFab断片である、請求項58記載の組成物。前記標的指向部分がαvβ3インテグリンに結合する、請求項57記載の組成物。前記標的指向部分がcRGDfKである、請求項60記載の組成物。前記標的指向部分が血管新生バイオマーカーに結合する、請求項57記載の組成物。前記血管新生バイオマーカーがVEGFVEGFR複合体またはエンドグリンである、請求項62記載の組成物。前記ミセル内に封入された薬物をさらに含む、請求項42~63のいずれか一項記載の組成物。前記薬物が疎水性である、請求項64記載の組成物。前記薬物が約2~約8のlogpを有する、請求項64記載の組成物。前記薬物が化学療法剤である、請求項64~66のいずれか一項記載の組成物。前記薬物がドキソルビシンである、請求項64記載の組成物。前記薬物がβラパコンである、請求項64記載の組成物。前記薬物がパクリタキセルである、請求項64記載の組成物。それを必要としている個体において癌を治療するための方法であって、請求項67~70のいずれか一項記載の組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。前記癌が固形腫瘍を含む、請求項71記載の方法。個体において腫瘍を画像化するための方法であって、a前記ブロックコポリマーが標識部分を含む、請求項42~63のいずれか一項記載の組成物を該個体に投与する段階、およびb該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法。前記個体において腫瘍を診断するために用いられる、請求項73記載の方法。前記個体において腫瘍をモニターするために用いられる、請求項73記載の方法。薬物の初期エンドソームへの送達のための方法であって、前記ミセルが約59~約65のpH転移値を有する、請求項64~70のいずれか一項記載の組成物をそれを必要としている個体に投与する段階を含む、方法。薬物の後期エンドソームまたはリソソームへの送達のための方法であって、前記ミセルが約50~約55のpH転移値を有する、請求項64~70のいずれか一項記載の組成物をそれを必要としている個体に投与する段階を含む、方法。前記薬物がリソソーム蓄積症薬である、請求項79記載の方法。個体において初期エンドソーム活性を画像化するための方法であって、a前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約59~約65のpH転移値を有する、請求項42~63のいずれか一項記載の組成物を個体に投与する段階、およびb該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法。個体において後期エンドソーム活性またはリソソーム活性を画像化するための方法であって、a前記ブロックコポリマーが標識部分を含み、かつ前記ミセルが約50~約55のpH転移値を有する、請求項42~63のいずれか一項記載の組成物を該個体に投与する段階、およびb該ブロックコポリマーのその解離型における分布を調べる段階を含む、方法。式の化合物。式の化合物。式の化合物。請求項83記載の化合物のポリマー。請求項84記載の化合物のポリマー。請求項85記載の化合物のポリマー。Rが重合反応によって生じる末端基である、請求項24~41のいずれか一項記載のブロックコポリマー。RがBrである、請求項89記載のブロックコポリマー。Rがチオラートである、請求項89記載のブロックコポリマー。Rがチオエステルである、請求項89記載のブロックコポリマー。構造の一部分が、無作為化されている、請求項24~41または89~93のいずれか一項記載のブロックコポリマー。発明の詳細な説明本発明は、ブロックコポリマー、ならびに1つまたは複数の該ブロックコポリマーを含むミセル組成物を提供し、該ミセル組成物は、癌、心血管疾患、炎症、自食作用関連疾患、もしくはリソソーム蓄積症の治療などの1つもしくは複数の治療適用およびもしくは診断適用、腫瘍画像化、ならびにまたは初期エンドソーム、後期エンドソームおよびリソソームなどの細胞内オルガネラの画像化において有用である。本発明は、そのような治療適用および診断適用におけるミセル組成物を使用する方法をさらに提供する。本発明のブロックコポリマーは、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、疎水性ポリマーセグメントはpH感受性を与えるためのイオン化可能アミン基を含む。ブロックコポリマーは、これらのイオン化可能ブロックコポリマーの超分子自己集合に基づき、pH活性化可能ミセルpHAMナノ粒子を形成する例えば、図1C参照。例えば、図1Cは、本発明のミセルの非限定的な例の設計原理を図示する。高pHでは、ブロックコポリマーが集合してミセルとなるが、低pHでは、疎水性ポリマーセグメントのアミン基のイオン化がミセルの解離を引き起こす。理論に縛られたくはないが、ミセル形成およびその熱力学的安定性は疎水性セグメントと親水性セグメントとの間のデリケートな平衡によって推進される。イオン化可能な基は異なるpH値で調整可能な親水性疎水性ブロックとして作用し得、これはミセルの動的自己集合に直接影響しうる。理論に縛られたくはないが、ミセル化は疎水性ポリマーセグメントのアミンのイオン化転移を鋭敏化して、迅速で超高感度なpH応答を与えうる。腫瘍などの様々な環境例えば、腫瘍の細胞外環境内での、または初期もしくは後期エンドソームもしくはリソソームなどの特定のエンドサイトーシス区画内での選択的活性化を達成するために、異なるブロックコポリマーを選択して、生理的範囲内の異なる転移pH値を有するミセルを提供しうる。治療適用のために、薬物をミセルの内部に組み込んでもよい。特定のpH条件例えば、腫瘍およびエンドサイトーシス区画内にある酸性pHは、ミセルの急速なプロトン化および解離を引き起こしてユニマーとし、それにより薬物を放出しうる。いくつかの態様において、ミセルは、生理的pHpH74で安定な薬物封入を提供するが、酸性環境では急速に薬物を放出しうる。本発明のミセルは、治療適用において以下などの1つまたは複数の利点を提供しうる:1以前のミセル組成物での数時間または数日間に対し、特定のpH環境例えば、酸性環境下での短時間以内例えば、数分以内のミセルの解離および薬物の迅速な放出;2薬物の高いパーセンテージの封入;3薬物の有効性を増強し、正常細胞への毒性を減少しうる、所望の部位例えば、腫瘍またはリソソームへの薬物送達の選択的標的指向例えば、図15参照;4長い血液循環時間;5特定の狭いpH範囲内での応答性例えば、特定のオルガネラの標的指向のため、および6画像化シグナルが治療有効性に対する予測因子でありうる、画像誘導療法。診断適用のために、標識部分をブロックコポリマーに結合してもよい。いくつかの態様において、pHがミセル形成に有利である場合、標識例えば、蛍光標識はミセル内に隔離され、隔離によって標識シグナルの低下が起こる例えば、蛍光消光により、例えば、図1C参照。特定のpH条件例えば、腫瘍およびエンドサイトーシス区画内にある酸性pHは、ユニマーへのミセルの急速なプロトン化および解離を引き起こして、それにより標識を曝露し、標識シグナルを増大例えば、蛍光発光を増大させうる。本発明のミセルは、診断適用において以下などの1つまたは複数の利点を提供しうる:1以前のミセル組成物での数時間または数日間に対し、特定のpH環境例えば、酸性環境下での短時間以内例えば、数分以内のミセルの解離および標識シグナルの迅速な増大;2画像化ペイロードの増大;3所望の部位例えば、腫瘍または特定のエンドサイトーシス区画への標識の選択的標的指向;4長い血液循環時間;5特定の狭いpH範囲内での応答性例えば、特定のオルガネラの標的指向のため;および6高いコントラスト感度および特異性。例えば、ミセルは正常な生理的条件例えば、血液循環下ではサイレントまたはオフ状態のままで、バックグラウンドシグナルは最低限であるが、ミセルがインビボでそれらの所期の分子標的例えば、細胞外腫瘍環境または細胞オルガネラに到達する場合には、画像化シグナルは大幅に増強されうる。非限定的な例として、血管新生バイオマーカー例えば、αvβ3への特異的標的指向後に、ミセルナノプローブは受容体仲介エンドサイトーシス後のエンドソームリソソーム内のpH活性化によりオンになりうる。図12は、血管化腫瘍における血管新生バイオマーカー例えば、VEGFR2、αvβ3の画像化のためのpH活性化可能pHAMナノプローブの例を示す。これらのナノプローブは、血液循環中はサイレントまたはオフ状態のままであるが、血管新生腫瘍内皮細胞において受容体仲介エンドサイトーシス後のpH活性化によりオンになりうる。図13は、酸性細胞内オルガネラすなわち、エンドソームリソソーム内の血管標的指向pHAMのための細胞内活性化メカニズムを図示する。定義本明細書において用いられるアルキルは、例えば、1つまたは複数の追加の飽和炭化水素部分で置換されていてもよい、直鎖、分枝鎖、または環式縮合したおよびスピロ二環式および多環式を含む飽和炭化水素部分を含む、任意の飽和炭化水素部分を指す。本明細書において用いられるpH感受性ミセル、pH活性化可能ミセルおよびpH活性化可能ミセルpHAMナノ粒子は、1つまたは複数のブロックコポリマーを含むミセルを指すように本明細書において交換可能に用いられ、pHに応じて例えば、特定のpHよりも上または下で解離する。非限定的な例として、特定のpHで、ブロックコポリマーは実質的にミセル型である。pHが変化する例えば、低下するにつれて、ミセルは解離し始め、pHがさらに変化する例えば、さらに低下するにつれて、ブロックコポリマーは実質的に解離非ミセル型で存在する。ナノプローブは、画像化標識部分を含むpH感受性ミセルを示すように本明細書において用いられる。本明細書において用いられるpH転移範囲は、ミセルが解離するpH範囲を指す。いくつかの態様において、pH転移範囲はpH応答の鋭敏度である。pH応答の鋭敏度を求める一例を以下の実施例2に記載する。簡単に言うと、ブロックコポリマーがミセル型である場合にミセル内に隔離される蛍光消光蛍光標識を含むブロックコポリマーについて、pHに対する蛍光強度を測定する例えば、図1C参照。pHが変化する例えば、低下するにつれて、ミセルは解離して、蛍光標識を曝露し、蛍光発光を引き起こす。pHに対する正規化蛍光強度NFI曲線は、ミセルのpH応答特性の定量的評価を可能にする。NFIをFFminFmaxFminの比として算出し、ここでFは任意の所与のpHでのミセルの蛍光強度であり、FmaxおよびFminはそれぞれオンオフ状態での最大および最小蛍光強度である。pH応答の鋭敏度はΔpH10~90であり、NFI値が10から90まで変動するpH範囲である。標識なしのコポリマーに対して、動的光散乱DLSまたは外部フルオロフォア例えば、ピレンを用いてpH依存性ミセル化挙動を特徴決定することができる。例えば、図14Aは、pHの関数としての、01mgmL濃度でのいくつかのPEObPRコポリマーの正規化光散乱強度を示す。異なるpH値では、溶液中でユニマーからミセルナノ粒子が形成されたことにより、光散乱強度の劇的な増大が観察された。得られたミセルの流体力学的直径は40~50nmと測定された。光散乱データは、ピレン発光λex=339nmのI1I3比それぞれ372~374および382~384nmを調べることによりさらに裏付けられた図14B。I1I3比はピレン環境の極性を反映し、ここでミセルコア中のピレンの分配はI1I3値の低下を引き起こす。本明細書において用いられるpH転移値pHtは、ミセルの半分が解離するpHを指す。pH転移値を求める一例を以下の実施例2に記載する。簡単に言うと、ブロックコポリマーがミセル型である場合にミセル内に隔離される蛍光消光蛍光標識を含むブロックコポリマーについて、pH値は測定された蛍光発光が05×であるpHであり、ここでFmaxおよびFminはそれぞれオンオフ状態での最大および最小蛍光強度である。標識なしのコポリマーに対して、動的光散乱DLSまたは外部フルオロフォア例えば、ピレンを用いてpH依存性ミセル化挙動を特徴決定することができる。例えば、図14Aは、pHの関数としての、01mgmL濃度でのいくつかのPEObPRコポリマーの正規化光散乱強度を示す。異なるpH値では、溶液中でユニマーからミセルナノ粒子が形成されたことにより、光散乱強度の劇的な増大が観察された。得られたミセルの流体力学的直径は40~50nmと測定された。光散乱データは、ピレン発光λex=339nmのI1I3比それぞれ372~374および382~384nmを調べることによりさらに裏付けられた図14B。I1I3比はピレン環境の極性を反映し、ここでミセルコア中のピレンの分配はI1I3値の低下を引き起こす。光散乱およびピレン実験からはいずれも同様のpH転移値が得られた。pHt値はPEObPDBA、PEObPDPA、PEObPC7A、PEObPC6Aについてそれぞれ50、62、70、および72であった。本明細書において用いられる治療なる用語は、治療中の疾患または障害例えば、癌の臨床病理の自然な経過を変えるよう設計された臨床介入を意味する。望ましい治療の効果には、例えば、疾患状態を改善もしくは寛解すること、障害の進行を遅延もしくは逆転させること、緩解、または予後改善が含まれる。本明細書において用いられる有効量なる用語は、所望の治療、予防、または診断の結果を達成するのに必要な用量および期間において有効な量を意味する。有効量は1回または複数回の投与で提供することができる。本明細書において用いられる個体は、ヒト、霊長類、実験動物例えば、ラット、マウスなど、家畜例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど、ペット例えば、イヌ、ネコなど、および競技動物例えば、ウマなどを含む、動物、好ましくは哺乳動物を指す。いくつかの態様において、個体はヒトである。本明細書における約~という値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に対する態様も含むかつ記載する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形1つa、1つan、およびそのtheは、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、複数の言及を含む。本明細書に記載の本発明のすべての局面および態様は、局面および態様を含む、からなる、およびから基本的になることを含むことが理解される。列挙した要素から基本的になる方法または組成物は、明記された段階または材料ならびに方法および組成物の基本的および新規特徴に著しく影響をおよぼさないものだけを含むことが理解されるべきである。本明細書に記載の任意の組成物を、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、本明細書に記載の任意の方法において用いうることが理解されるべきである。ブロックコポリマー化合物親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、かつ標識部分をさらに含んでいてもよい新規ブロックコポリマーであって、該親水性ポリマーセグメントが、ポリPEO、ポリMPC、およびポリビニルピロリドンPVPからなる群より選択されるポリマーを含み、該疎水性ポリマーセグメントが以下を含む、ブロックコポリマーを本明細書において提供する:式中、RはHまたはCH3であり、RはNR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じあるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5~16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1~約10であり、xは合計で約20~約200である。例えば、xは連続セグメントとして約20~約200であってもよくすなわち、約20~約200モノマー単位の連続セグメント、または他の部分例えば、標識を含む部分が、例えば、以下により詳細に記載するとおり、モノマー単位の間に散在していてもよい。本発明のブロックコポリマーは、例えば、式Iの化合物を含む:式中、Lは標識部分であり、yは0~約6であり、RはHまたはCH3であり、mは1~約10であり、zは、PEOのサイズが約2kD~約20kDとなるようなものであり、x、n、R、およびRは上記で定義される通りであり、Rは任意の適切な部分であり、かつ構造の一部分は、任意の順に配置されてもよい。いくつかの態様において、Rは重合反応によって生じる末端基である。例えば、原子移動ラジカル重合ATRPを用いる場合、RはBrでありうる。図1A、2A、2B、8および9における化学構造は重合反応によって生じる末端基としてBrを含みうることが理解されるべきである。例えば、可逆的付加開裂連鎖移動RAFTを用いる場合、Rはチオラートまたはチオエステルなどの硫黄含有基でありうる。いくつかの態様において、RはBrである。いくつかの態様において、Rはチオラートである。いくつかの態様において、Rはチオエステルである。末端基は、重合後に適切な部分によってさらに修飾してもよい。いくつかの態様において、構造の一部分は、無作為化されており、すなわち、であり、式中、rはR含有部分およびL含有部分の無作為の順序を示すすなわち、R含有部分およびL含有部分は無作為に散在する。いくつかの態様において、構造の一部分は、連続的に配置される。例えば、R含有部分は1つのブロックとして存在し、L含有部分はR含有部分の前または後のいずれかに1つのブロックとして存在してもよい。他の配置も用いてもよい。親水性ポリマーセグメントいくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリPEOを含む。いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリMPCを含む。いくつかの態様において、親水性ポリマーセグメントはポリビニルピロリドンPVPを含む。一般に、親水性ポリマーセグメントのPEO、MPC、またはPVPポリマーのサイズは約2kD~約20kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約2kD~約10kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約2kD~約5kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約3kD~約8kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約4kD~約6kDである。いくつかの態様において、ポリマーのサイズは約5kDである。いくつかの態様において、ポリマーは約100~約130モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーは約110~約120モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーは約114モノマー単位を有する。いくつかの態様において、ポリマーの多分散指数PDIは約12未満である。いくつかの態様において、ポリマーの多分散指数PDIは約11未満である。適切なPEO、MPC、およびPVPポリマーは購入しても例えば、PEOポリマーはAldrichSigmaから購入してもよい、または当技術分野において公知の方法によって合成してもよい。いくつかの態様において、親水性ポリマーは、疎水性モノマーを重合してブロックコポリマーを生成するための開始剤として用いることもできる。例えば、MPCポリマー例えば、分布の狭いMPCポリマーを、2ブロモ2メチルプロパン酸エチルSigmaAldrichなどの市販の小分子開始剤を用いて、原子移動ラジカル重合ATRPにより調製することができる。これらの得られたMPCポリマーを高分子ATRP開始剤として用い、他のモノマーとさらに共重合してMPCbPDPAなどのブロックコポリマーを生成することができる。PEObPRブロックコポリマーを、原子移動ラジカル重合ATRPまたは可逆的付加開裂連鎖移動RAFT法を用いて合成することができる例えば、AustralianJournalofChemistryVolume58Issue6Pages379410;ProgressinPolymerScienceVolume32Issue1Pages93146参照。ATRPまたはRAFTは、狭い多分散性<11を有するPEObPRコポリマーを生成しうるリビング重合を可能にする。異なるメタクリレートまたはアクリレートモノマーを用いて、異なるpH感受性を有するPRセグメントを生成することができる。疎水性ポリマーセグメント疎水性ポリマーセグメントは以下を含む:式中、RはHまたはCH3であり、RはNR1R2であり、ここでR1およびR2はアルキル基であり、R1およびR2は同じあるかまたは異なり、R1およびR2は一緒になって5~16個の炭素を有し、R1およびR2は連結して環を形成してもよく、nは1~約10であり、xは合計で約20~約200である。いくつかの態様において、nは1~4である。いくつかの態様において、nは2である。様々な態様において、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様において、RはCH3である。いくつかの態様において、RはHである。いくつかの態様において、xは合計で約40~約100である。いくつかの態様において、xは合計で約50~約100である。いくつかの態様において、xは合計で約40~約70である。いくつかの態様において、xは合計で約60~約80である。いくつかの態様において、xは合計で約70である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって5~14個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって5~12個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって5~10個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって5~8個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって6~12個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって6~10個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって6~8個の炭素を有する。様々な態様において、R1およびR2は一緒になって5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ3~8個の炭素を有する。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は3個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は4個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は5個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は6個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は7個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびまたはR2は8個の炭素を含む。いくつかの態様において、R1およびR2は同じである。いくつかの態様において、R1およびR2は異なる。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ独立して直鎖または分枝アルキルである。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ直鎖アルキルである。いくつかの態様において、R1およびR2はそれぞれ分枝アルキルである。R1およびR2に適したアルキル基には、例えば、n、イソ、sec、tert、ネオなどの、各アルキル基の様々な可能な骨格異性体を含む、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、およびペンタデシルが含まれ、但し、Rにおける炭素の総数が5~16である。いくつかの態様において、R1およびR2はプロピルである。いくつかの態様において、プロピルはイソプロピルである。いくつかの態様において、プロピルはnプロピルである。いくつかの態様において、R1およびR2はブチルである。いくつかの態様において、ブチルはnブチルである。いくつかの態様において、ブチルはイソブチルである。いくつかの態様において、ブチルはsecブチルである。いくつかの態様において、ブチルはtブチルである。いくつかの態様において、R1およびR2は連結して環を形成する。環は、1つまたは複数のアルキル基で置換されていてもよく、但し、Rにおける炭素の総数が5~16である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5~10個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5~8個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって、5~7個の炭素を有する環を形成する。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって5である。いくつかの態様において、R1およびR2は一緒になって6である。疎水性ポリマーセグメントを、例えば、原子移動ラジカル重合ATRPまたは可逆的付加開裂連鎖移動RAFTによって合成してもよい。疎水性ポリマーセグメントのATRP合成の例は実施例1において見いだしうる。いくつかの態様において、疎水性ポリマーセグメントの多分散指数PDIは約12未満である。いくつかの態様において、疎水性ポリマーセグメントの多分散指数PDIは約11未満である。標識部分ブロックコポリマーは、1つまたは複数の標識部分例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上を含んでいてもよい。いくつかの態様において、標識は蛍光標識である。いくつかの態様において、蛍光標識はテトラメチルローダミンTMRである。いくつかの態様において、標識は近赤外NIR標識である。いくつかの態様において、NIR標識はシパートまたはシパート類似体である。ブロックコポリマーが式Iの化合物である場合、いくつかの態様において、RはCH3である。いくつかの態様において、RはHである。いくつかの態様において、mは1~4である。いくつかの態様において、mは2である。様々な態様において、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である。いくつかの態様において、yは0である。いくつかの態様において、yは1~6である。様々な態様において、yは1、2、3、4、5、または6である。いくつかの態様において、yは3である。標識部分は、コポリマーに、直接またはリンカー部分を通じて結合してもよい。当技術分野において公知の方法を用いて、標識部分を、例えば、疎水性ポリマーに結合してもよい。結合の例は、例えば、以下の実施例1および5において見いだしうる。本発明のミセルは有利に高い画像化ペイロードを有しうる。様々な態様において、ミセルはミセル1つあたり少なくとも約500個の色素、少なくとも約1000個、少なくとも約1500個、少なくとも約2000個、少なくとも約2400個、少なくとも約3000個の色素を有する。これに比べて、数が多いほど色素消光を引き起こし、結合エピトープを改変しうるため、典型的な免疫蛍光結合体は1分子あたり4つの蛍光体を有する。特定の使用法のために、異なる標識が好ましい場合もある。例えば、テトラメチルローダミンを、例えば、共焦点画像解析におけるインビトロ細胞試験のために用いてもよいが、インビボでの動物画像解析試験のためには、NIR色素が組織透過を高めうる。例示的なブロックコポリマー本発明のブロックコポリマーの非限定的な例には、以下の実施例に記載のものが含まれる。式Iのブロックコポリマーの非限定的な例を表Aに示す。表A例示的なブロックコポリマー表Aにおいて、構造の一部分は、無作為化されており、すなわち、である。本明細書に記載の化合物に関して、重合反応はポリマー長の特定の変動性を招きうること、および特定のポリマー内のモノマー単位の数を示す本明細書に記載の数例えば、x、y、zはモノマー単位の平均数を示しうることが理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書の記載のポリマーセグメント例えば、疎水性ポリマーセグメント、親水性ポリマーセグメントは約12未満の多分散指数PDIを有する。いくつかの態様において、ポリマーセグメントの多分散指数PDIは約11未満である。いくつかの態様において、ブロックコポリマーの多分散指数PDIは約12未満である。いくつかの態様において、ブロックコポリマーの多分散指数PDIは約11未満である。ミセル組成物本明細書に記載の1つまたは複数のブロックコポリマー例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上を用いて、pH感受性ミセルを形成してもよい。いくつかの態様において、組成物は1つの型のミセルを含む。いくつかの態様において、2つまたはそれ以上例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上の異なる型のミセルを組み合わせて、混合ミセル組成物を形成してもよい。本発明のpH感受性ミセル組成物は、pH応答が非常に広いすなわち、2pH単位他のpH感受性組成物とは対照的に、有利に狭いpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約1pH単位未満のpH転移範囲を有する。様々な態様において、ミセルは約09pH単位未満、約08pH単位未満、約07pH単位未満、約06pH単位未満、約05pH単位未満、約04pH単位未満、約03pH単位未満、約02pH単位未満、約01pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約05pH単位未満のpH転移範囲を有する。いくつかの態様において、ミセルは約025pH単位未満のpH転移範囲を有する。ミセルが蛍光標識を含む場合、pHAMの狭いpH応答特性は蛍光生成の効率を改善し得る。理論に縛られたくはないが、pHAMのpH応答はブロックコポリマーの協同的中和およびミセル化の結果、ホモFRETおよびPETメカニズム両方から起こりうる例えば、図1C参照。小分子pH感受性色素またはPETに基づくミセル活性化には2pH単位が必要に比べて、pHAMからの鋭敏化されたpH応答は、腫瘍微小環境pHe=65~69または細胞内オルガネラ50~62におけるpHのわずかな変化で蛍光体の完全なターンオンをもたらしうる。ミセルは、特定の細胞または微小環境を標的とするために、生理的範囲内の異なるpH転移値を有しうる。いくつかの態様において、ミセルは約5~約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約5~約6のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約6~約7のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約7~約8のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約63~約69例えば、腫瘍微小環境のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約62例えば、細胞内オルガネラのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約59~約62例えば、初期エンドソームのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約55例えば、後期エンドソームまたはリソソームのpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ54、63、68および72の蛍光転移pH値を有する。本発明の標識ミセルは、有利に大きいシグナル応答例えば、オンおよびオフ状態の間のシグナルのより大きい差を有しうる。例えば、蛍光標識を用いる場合、FmaxとFminの比RF=FmaxFminを用いてオンオフ状態の間の蛍光応答を定量することができる。実施例に示すとおり、10~55倍の範囲のRF値を有するナノプローブを作製し表3、ナノプローブの大きい蛍光応答を示した。様々な態様において、標識ミセルは、少なくとも約10種、少なくとも約20種、少なくとも約30種、少なくとも約40種、少なくとも約50種、少なくとも約60種のシグナル応答を有する。理論に縛られたくはないが、癌療法におけるミセルの使用は、部分的にはミセルのサイズにより、抗腫瘍効果を増強し、正常組織への毒性を減少しうる。特定の化学療法剤例えば、ドキソルビシンなどの小分子は、正常および腫瘍組織の両方に入ることができるが、非標的指向ミセルナノ粒子は漏出性の腫瘍脈管構造を優先的に通過しうる例えば、図15参照。いくつかの態様において、ミセルは約10~約200nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約20~約100nmのサイズを有する。いくつかの態様において、ミセルは約30~約50nmのサイズを有する。ブロックコポリマーからミセルを生成する方法の例は、以下の実施例において見いだしうる。例えば、ブロックコポリマーをまず有機溶媒例えば、THFに溶解し、任意に超音波処理下で、水溶液に加えてもよく、ここでコポリマーは溶液中で自己集合してミセルを形成する。いくつかの態様において、ミセルは薬物をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標的指向部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物および標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物および標的指向部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは標的指向部分および標識部分をさらに含む。いくつかの態様において、ミセルは薬物、標的指向部分、および標識部分をさらに含む。標的指向部分治療適用または診断適用において、ミセルは標的指向部分をさらに含んでいてもよい。例えば、標的指向部分は、血管新生バイオマーカーなどの癌細胞表面マーカーを標的とし得る。例えば、診断適用において、標的指向ナノプローブは腫瘍の診断およびまたは分子標的抗血管新生療法の有効性評価のために有用であり得、ここで治療標的例えば、VEGFR2、αvβ3の発現レベルは特異的に測定されることができる。いくつかの態様において、標的指向部分は血管新生バイオマーカーに結合する。いくつかの態様において、血管新生バイオマーカーはVEGFVEGFR複合体またはエンドグリンである。いくつかの態様において、標的指向部分はVEGFR2に結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はRAFL1mAbのFab断片である。いくつかの態様において、標的指向部分はαvβ3インテグリンに結合する。いくつかの態様において、標的指向部分はcRGDfKである。標的指向部分を、当技術分野において公知の方法によってブロックコポリマー例えば、親水性ポリマーセグメントに結合してもよい。結合の例は以下の実施例において見いだしうる。薬物封入ミセルは、ミセル内に封入された薬物をさらに含んでいてもよい。ミセルの内部は疎水性であるため、疎水性薬物はミセル内により容易に封入されうる。いくつかの態様において、薬物は疎水性であり、低い水溶性を有する。いくつかの態様において、薬物は約2~約8のlogpを有する。いくつかの態様において、薬物は化学療法剤である。いくつかの態様において、薬物はドキソルビシンである。いくつかの態様において、薬物はβラパコンである。いくつかの態様において、薬物はパクリタキセルである。溶媒蒸発などの当技術分野において公知の方法を用いて、薬物をミセルに組み込んでもよい。薬物組み込みの例は、例えば、以下の実施例4において見いだしうる。簡単に言うと、例えば、まず薬物およびブロックコポリマーを有機溶液中に溶解することにより、薬物をミセルに封入してもよい。この溶液を、任意に超音波処理下で水溶液に加えることにより、ミセル封入薬物を得てもよい。治療法および診断法薬物を含むミセルを用いて、例えば、癌、心血管疾患、炎症、自食作用関連疾患、もしくはリソソーム蓄積症、または他の疾患を治療してもよく、ここで薬物は限局的なpH差例えば、生理的pH74とは異なるpHにより適切な部位に送達されうる。治療法のためのミセルは、標識部分例えば、治療の画像解析を助けるためおよびまたは標的指向部分例えば、特定の細胞表面マーカーを標的とするため、またはエンドサイトーシス送達のためにミセルを標的とするためをさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、治療する障害は癌である。いくつかの態様において、癌は固形腫瘍を含む。ミセルが標的指向部分を含む態様において、非固形癌を治療してもよい。いくつかの態様において、治療する障害はリソソーム蓄積症である。いくつかの態様において、ミセルは約63~約72例えば、腫瘍微小環境への送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約65例えば、細胞内オルガネラへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約62または62超例えば、初期エンドソームへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約55例えば、後期エンドソームまたはリソソームへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約63~約69のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約62のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約59~約62のpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約55のpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ54、63、68および72の蛍光転移pH値を有する。いくつかの態様において、より高いpHt例えば、72、68を有する非標的指向pHAMを用いて、薬物を腫瘍に送達してもよい。いくつかの態様において、より低いpHt例えば、54、63を有する標的指向pHAMを用いて、薬物をエンドサイトーシス区画に送達してもよい。標識部分を含むミセルを、画像化適用、例えば、腫瘍またはエンドサイトーシス区画を画像化する際に用いてもよい。診断法のためのミセルは、標的指向部分例えば、特定の細胞表面マーカーを標的とするため、またはエンドサイトーシス送達のためにミセルを標的とするためをさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、この方法を用いて個体の腫瘍を診断する。いくつかの態様において、この方法を用いて個体の腫瘍をモニターし、例えば、治療の効果をモニターする。いくつかの態様において、ミセルを用いて初期エンドソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルを用いて後期エンドソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルを用いてリソソーム活性を画像化する。いくつかの態様において、ミセルは約63~約72例えば、腫瘍微小環境への送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約65例えば、細胞内オルガネラへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約62または62超例えば、初期エンドソームへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約55例えば、後期エンドソームまたはリソソームへの送達のためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約63~約69例えば、腫瘍微小環境を画像化するためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約62例えば、細胞内オルガネラを画像化するためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約59~約62例えば、初期エンドソームを画像化するためのpH転移値を有する。いくつかの態様において、ミセルは約50~約55例えば、後期エンドソームまたはリソソームを画像化するためのpH転移値を有する。実施例に記載するとおり、ナノプローブ4、3、7および6はそれぞれ54、63、68および72の蛍光転移pH値を有する。いくつかの態様において、より高いpHt例えば、72、68を有する非標的指向pHAMを、腫瘍を画像化するために用いてもよい。いくつかの態様において、より低いpHt例えば、54、63を有する標的指向pHAMを、エンドサイトーシスの区画を画像化するために、またはエンドサイトーシスによる取り込みを介して腫瘍を画像化するために用いてもよい。本発明の組成物において複数の型の標識を用いてもよい。例えば、異なるNIR蛍光体例えば、特有の励起発光波長を有するを用いて、異なるバイオマーカーのための一連の多色ナノプローブを生成してもよい。これにより、いくつかの分子標的例えば、VEGFR2およびαvβ3の同時画像化を可能にする多色ナノプローブ群を作製し、これは血管新生腫瘍脈管構造の画像化有効性をさらに改善しうる。本発明は、ミセルと薬学的に許容される担体とを含む組成物をさらに提供する。そのような組成物を、例えば、注射例えば、静脈内注射または注入などの任意の適切な方法によって、個体に投与してもよい。投与は局所でも全身でもよい。以下の実施例は例示のために提供するにすぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定する意図はない。理解を明白にするための例証および実例として、前述の発明をいくらか詳細に記載してきたが、当業者であれば本発明の教示に照らし、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくそれに対して特定の変更および改変を行いうることが容易に明らかになるであろう。本明細書において引用するすべての出版物、特許出願、および特許は、それぞれ個別の出版物、特許出願、および特許が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると示されたかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。特に、本明細書において引用するすべての出版物は、本発明と関連して用いうる組成物および方法を記載および開示するために、特に参照により本明細書に組み入れられる。特に記載がないかぎり、温度は摂氏度で、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。実施例1:調整可能でpH活性化可能なミセルpHAMナノ粒子の合成Iメタクリレートモノマーの合成2エタノールC5A、2エタノールC6AおよびNNNNNペンタメチルジエチレントリアミンPMDETAはSigmaAldrichから購入した。2エタノールC7Aおよび2エタノールDBAはそれぞれAlfaAesarCompanyおよびTCIAmericaIncから購入した。NHSテトラメチルローダミンNHSTMRはInvitrogenCompanyから購入した。モノマーの2エチルメタクリレートDMAMA、2エチルメタクリレートDEAMA、2エチルメタクリレートDPAMAおよび2アミノエチルメタクリレートAMAはPolyscienceCompanyから購入した。AMAはイソプロパノールおよび酢酸エチル3:7で2回再結晶した。PEGマクロ開始剤、MeOPEG114Brは、臭化2ブロモ2メチルプロパノイルおよびMeOPEG114OHから、文献中の手順に従って調製したBronsteinetalJPhysChemB20051091878618798。他の溶媒および試薬は、SigmaAldrichまたはFisherScientificIncから受け取ったままで用いた。すべての新しいメタクリレートモノマーC5AMA、C6AMA、C7AMA、DBAMAは、類似の方法によって合成した。2エチルメタクリレートC6AMAの合成を代表的手順として記載する。まず、2エタノール129g、01mol、トリエチルアミン101g、01mol、および阻害剤ヒドロキノン011g、0001molを100mLテトラヒドロフランTHFに溶解し、次いで塩化メタクリロイル104g、01molを三頚フラスコ中に滴加した。溶液をTHF中で2時間還流した。反応後、溶液をろ過して沈澱したトリエチルアミンHCl塩を除去し、THF溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。得られた残渣を無色液体として減圧蒸留した005mmHgで83~87°C。合成後、モノマーを1HNMRで特徴決定した。すべてのNMRスペクトルはCDCl3中テトラメチルシランTMSを内部標準としてVarian500MHz1HNMR分光計で得た。モノマーの特徴決定および収率は以下のとおりで表1に示す。表1メタクリレートモノマーの特徴決定および収率IIPEObPRおよびPEObブロックコポリマーの合成異なる三級アミン含有セグメントPRとポリPEOセグメントとを有する2つの系列のブロックコポリマーPEObPRy0およびPEObPRrTMR、図1Aを、原子移動ラジカル重合ATRP;TsarevskyandMatyjaszewskiChemRev200710722702299;MaetalMacromolecules20033634753484により作製した。直鎖ジアルキル系列において図1B参照、R基1、2、3、および4、鎖長はメチル基からブチル基まで変動し;環状系列において図1B参照、R基5、6および7、環サイズは5員環から7員環まで変動した。pH非感受性色素、テトラメチルローダミンTMR;AlbertazzietalAmChemSoc20101321815818167をモデル蛍光体として用い、pHAMナノ粒子のpH応答特性を調べるための画像化ビーコンとしてPRブロックに結合した。以下により詳細に記載するとおり、より高いpHでは、中性PRセグメントは協同的に自己集合してミセルの疎水性コアとなり、これはTMR分子間のフェルスター共鳴エネルギー移動ホモFRETおよび三級アミンからTMRへの光誘導電子移動PeTのメカニズムを通じて蛍光体の凝集および蛍光シグナルの消光を引き起こすKobayashietalChemRev201011026202640;UchiyamaetalChemIntEd20084746674669;LakowiczPrinciplesofFluorescenceSpectroscopy3rdedSpringerNewYorkCity2006pp443475;DiazFernandezetalChemEurJ200612921930。より低いpHでは、PRセグメントはプロトン化されて正に荷電し、ミセルの分解ならびにTMRの距離の増大およびPeTの減少による蛍光発光の劇的な増大につながる図1C。PEObPRコポリマー図2Aをまず原子移動ラジカル重合ATRP法によって合成した。色素を含まないコポリマーを、ポリマーの特徴決定ならびにpKaおよび臨界ミセル濃度の測定に用いた表2および3。手順を例示するための例としてPEObPDPAを用いる。まず、DPAMA106g、5mmol、PMDETA21μL、01mmol、およびMeOPEG114Br05g、01mmolを重合チューブに加えた。次いで、2プロパノール2mLおよびDMF2mLの混合物を加えて、モノマーおよび開始剤を溶解した。凍結ポンプ解凍を3サイクル行って酸素を除去した後、CuBr14mg、01mmolを反応チューブに窒素雰囲気下で加え、チューブを減圧下で密封した。重合を40°Cで8時間行った。重合後、反応混合物を10mLTHFで希釈し、Al2O3カラムを通過させて、触媒を除去した。THF溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。残渣を蒸留水中で透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。得られたPEObPRコポリマーを1H500MHzNMR、ゲル浸透クロマトグラフィViscotechGPCmax、PolymerLabsによるPLgel5μmMIXEDDカラム、溶離剤としてTHF、1mL分により特徴決定した。表2に各コポリマーの収率、分子量MnおよびMwおよび多分散指数PDIを示す。PEObPDPA標識部分なしはブロックコポリマー3を指し、PEObPDBA標識部分なしはブロックコポリマー4を示し、PEObPC6A標識部分なしはブロックコポリマー6を指し、およびPEObPC7A標識部分なしはブロックコポリマー7を指す。表2PEObPRジブロックコポリマーの特徴決定a数平均Mn、重量平均分子量Mwおよび多分散指数PDI=MwMnは、溶離剤としてTHFを用いたGPCにより求めた。b1HNMRにより求めた。TMR色素を導入するため、コポリマー合成においてAMAを用いた図2B。PEObコポリマーの合成は前述の手順に従った。AMAモノマーの開始剤への供給比を制御することにより比=3、3つの一級アミノ基を各ポリマー鎖に導入した。これらのPEObコポリマーについて、類似の収率および分子量が得られた。TMR結合のために、PEOb50mgをまず2mLDMFに溶解した。次いで、NHSTMRエステル一級アミノ基のモル量に対して15当量を加えた。反応混合物を室温で2日間撹拌した。コポリマーを調製用ゲル浸透クロマトグラフィVarianによるPLgelPrep10μm10E3A300×25mmカラム、溶離剤としてTHF、5mL分で精製して、遊離色素分子を除去した。生成したPEObコポリマーを凍結乾燥し、保存のために20°Cで維持した。TMR含有コポリマーにおいて、PRブロックの繰り返し単位の数は70であった。IIIミセルナノ粒子の調製以前に発表された溶媒蒸発法によってミセルを調製したNasongklaetalNanoLett2006624272430。PEObの例において、24mgのコポリマーをまず1mLTHFに溶解し、次いで4mL蒸留水に超音波処理下で滴加した。THFを空気流下で4時間蒸発させた。次いで、蒸留水を加え、保存溶液としてポリマー濃度を4mgmLに調節した。ミセル形成後、ナノ粒子を透過電子顕微鏡検査TEM、JEOL1200EXモデルによりミセルのサイズおよび形態について、動的光散乱DLS、MalvernMicroVモデル、HeNeレーザー、λ=632nmにより流体力学的直径Dhについて特徴決定した。実施例2:調整可能でpH活性化可能なミセルナノ粒子の特徴決定合成したミセルナノ粒子を特徴決定して、生理的範囲50~74でのpH応答ならびにそれらの一時的応答の両方について、それらのpH応答特性を示した。I蛍光特徴決定本試験では、結合したTMR蛍光体を画像化ビーコンとして用いて、pHAMナノ粒子のpH応答特性を調べた。試験したpH範囲45~80でミセルまたは蛍光体の消光がPDMAブロックの強い親水性によって観察されない、bポリエチルメタクリレートPEObPDMA、1を常時オン対照として用いた。まず、pHAMナノプローブ3、4、6、7のおよびPEObの蛍光発光スペクトルを、Hitachi蛍光光度計F7500モデルで得た。各コポリマーについて、試料をはじめにMilliQ水中、6mgmLの濃度で調製した。次いで、保存溶液を異なるpH値を有する02Mクエン酸リン酸緩衝液で希釈した。最終ポリマー濃度を01mgmLに制御した。ナノプローブを545nmで励起し、560~700nmで発光スペクトルを収集した。発光および励起スリットはいずれも5nmであった。蛍光寿命測定のために、PEOb3およびPEOb4いずれも01mgmLからの、TMRの蛍光減衰を測定した。ナノプローブ3pHt=63について、寿命をリン酸ナトリウムクエン酸緩衝液中、pH=74および55それぞれpHtよりも上および下で測定した。同様に、ナノプローブ4pHt=54について、寿命をpH=74および49で測定した。両方の実験において、遊離TMR色素0005mgmLも対照として測定した。これらの試験は、色素レーザーGL302におよびストロボスコープ検出器に接続した窒素レーザーGL3300からなるLaserStrobe蛍光寿命測定器PhotonTechnologyInternationalIncBirminghamNJで実施した。C540AExcitonIncDaytonOH色素溶液を用いて540nmの励起波長を生じた。減衰曲線を570nmの波長で分析した。発光モノクロメータースリットは4nmであった。すべての測定を室温で行った。IRF機器の応答関数を、グリコーゲンの溶液からの散乱光を測定することにより求めた。蛍光強度減衰データを、PTI機器と共に供給されたソフトウェアを用いて、一重指数関数的減衰関数によって解析した。異なるpH値での一連のナノプローブ溶液の蛍光画像は、各ナノプローブについて鋭敏な蛍光転移を示し、pHAMナノプローブの調整可能な超pH応答性を示している。pHに対する正規化蛍光強度NFI曲線図3Aは、pHAMナノプローブのpH応答特性の定量的評価を可能にした。NFIはF-FminFmax-Fminの比として算出し、ここで、Fは任意の所与のpHでのナノプローブの蛍光強度であり、FmaxおよびFminはそれぞれオンオフ状態での最大および最小蛍光強度であった。図3Aに示すとおり、580nmでの発光強度を用いて異なるpHAMナノプローブの超pH応答を定量した。pH応答の鋭敏度を定量するために、すべてのpHAMナノプローブについて、ΔpH10~90、すなわちNFI値が10~90まで変動するpH範囲を評価した。鋭敏値はナノプローブ4、6、3および7でそれぞれ021、023、024、および020pH単位であった。ΔpH10~90の小さい値は、プロトン濃度の<2倍の変化を表すすなわち、H10H90=10ΔpH10~90ため、顕著なpH感受性を示す。これと比べて、小分子色素UranoetalNatMed200915104109では、同じ程度の発光変化に対する鋭敏値は約2pH単位Hにおける100倍で、ヘンダーソンハッセルバルヒの式に一致しているAtkinsandDePaulaPhysicalChemistryOxfordUniversityPress2009。pHの鋭敏度に加えて、オンオフ状態の間の蛍光応答を定量するために、FmaxおよびFminの比RF=FmaxFminも測定した。RFの値は10~55倍の範囲であり表3、ナノプローブの大きい蛍光応答を示している。ミセルにおける発光強度低下に一致して、データはTMRの励起状態例えば、ミセル中のナノプローブ3では044nspH=74は、pH74での遊離色素197nsまたはpH55での分解ユニマー184nsよりもはるかに短い寿命を有することを示した。表3PEObナノプローブの特徴決定apH滴定実験により求めた。bpH74におけるピレンプローブのI1I3比により求めた。c1mgmLのコポリマー濃度およびpH=74におけるDLSにより求めた。dローダミン蛍光発光強度により求めた。e20μLの5mgmLポリマー溶液を80μLのリン酸緩衝液pH55と混合することによるストップトフロー測定により求めた。f4の低いpHt値54を説明するために、pH=49の緩衝液を用いた。要約すると、pH活性化可能なミセルナノ粒子は、生理的範囲pH50~74における調整可能性および超高感度pH応答、オンオフ状態の間の発光強度の大幅な増大最大55倍を示し、かつ活性化のために<025のpHしか必要としない。IIpH一時的応答本試験は、合成したpH活性化可能なミセルナノ粒子における蛍光活性化を測定するために、ストップトフロー測定を用いた。pHAMナノプローブのストップトフロー測定は、BioLogicSFM3機器を用いて行った。すべての実験は、室温でリン酸ナトリウムクエン酸緩衝液中の異なるpHで行った。モノクロメーターを540nmでの励起のために用い、570nmロングパスで蛍光強度を記録した。実験をBioKine16V303ソフトウェアで制御し、推定不感時間15msを有した。ストップトフロー実験により、蛍光活性化は非常に速く、ほとんどのナノプローブは低pHでは5ms以内に完全に活性化される例えば、4のτ12=37ms、図3Bことが示された。超高感度pH応答は、ナノプローブ4、3、7および6でのみ観察された。蛍光転移pH値pHt、F=05×のpHは、ナノプローブ4、3、7および6についてそれぞれ54、63、68および72であった図3A。他のコポリマーはいかなるpH応答も示さなかった例えば、1か、または広いpH応答のみ例えば、2、5、データは示していないのいずれかであった。要約すると、ストップトフロー実験により、pH活性化可能なミセルナノ粒子は5ms未満の範囲の迅速な一時的応答を有することが示された。IIIコポリマーおよび成分モノマーのpH滴定曲線およびその後の1HNMRスペクトル解析理論に縛られたくはないが、疎水性ミセル化がpHAMの超pH応答性の推進力であり、協同的応答を達成するにはPRセグメントにおける疎水性についての臨界閾値が必要と考えられる。この仮説を試験するために、2つの代表的ブロックコポリマー、5および7、ならびにそれらの対応するモノマーのpH滴定曲線を比較した図4A。典型的な手順において、PEObPRコポリマーまたはその対応するモノマーをまず01NHClに溶解し、最終濃度5~10mgmLとした。少量50~100μL増分の01NNaOH溶液を撹拌下に加えることにより、pH滴定を行った。2~11までの範囲のpH増大をNaOHの全添加量VNaOHの関数としてモニターした。pH値を、微小電極を備えたMettlerToledopH計を用いて測定した。図4Aは、環状PEObPRコポリマー5および7および対応するモノマーの代表的滴定曲線を示す。各試料について、滴定曲線における2つの当量点の中央のpHとしてpKa値を算出した。すべてのPEObPRコポリマーおよび対応するモノマーのpKa値を表3に示した。両方のモノマーは、加えたNaOHの量の範囲で広いpH応答を有するイオン化可能な小分子のように挙動した。コポリマー5は同様の広いpH応答を示した。これに対して、コポリマー7は劇的に鋭敏化されたpH転移を示し、大幅に増大した緩衝能力を示した。三級アミンの異なるイオン化状態R3NHR3N0での5および7の重水素化1HNMRは、仮説をさらに支持している図4B。PEOセグメントはそのピーク強度を変化させず、内部標準として用いた。イオン化状態全体にわたり、5のPRセグメントのプロトン共鳴ピークは容易に可視化されたが、ピーク強度はより高いpHでピーク幅の広幅化に伴って低下し、コポリマーのバルク凝集挙動を反映していた。7について、コポリマーの中性状態すなわち、0は、高度に緻密なミセルコアの形成により、PRセグメントにおける完全に抑えられた共鳴ピークを導いた。水溶液中の7の透過電子顕微鏡検査TEMは、そのpKa67よりも高いpH74でミセルの形成、およびpH55で完全なミセル分解を示した図4C。これと比べて、いずれのpHでも5からミセルは形成されなかったデータは示していない。要約すると、これらのデータは、疎水性ミセル化は、観察された7のアンモニウム基の協同的脱プロトン化挙動の主な推進力であることを示唆していた。IVPEObPRジブロックコポリマーの臨界ミセル濃度CMCの測定各PEObPRコポリマーのCMCを02Mリン酸ナトリウム緩衝液中、pH74で測定した。まず、コポリマー保存溶液3mgmLを同じ緩衝液中で異なる濃度に希釈した。各溶液において、5μLのピレンのTHF溶液2×104molLを2mLのポリマー溶液に加えて、5×107molLの最終ピレン濃度を得た。蛍光スペクトルをHitachi蛍光計F7500モデルで、励起波長339nmならびに励起および発光スリットそれぞれ100nmおよび10nmを用いて記録した。I1およびI3値を、それぞれ約372および382nmの最大発光強度として測定した。I1I3比を異なるpH値でのポリマー濃度の関数としてプロットした。I1I3比はピレン環境の極性を反映し、ここで疎水性ミセルコアへのピレンの分配はI1I3値の低下につながるKalyanasundarametalJAmChemSoc19779920392044;WinnikChemRev199393587614。CMC値を、溶液中でミセルが形成される臨界ポリマー濃度として測定した。TMR干渉を避けるために、TMR結合していないPEObPRコポリマーをこれらの試験で用いた。pH74でのCMC値を表3に示した。実施例3:細胞内pHAMTMRナノプローブ活性化の部位およびメカニズムIヒト肺癌細胞における共焦点レーザー走査型顕微鏡検査pHAMの細胞内活性化を調べるために、ヒトH2009肺癌細胞中のナノプローブ3を共焦点レーザー走査型顕微鏡検査により検査し、H2009細胞中のpHAMナノプローブの活性化を相対蛍光強度により定量した図5。H2009細胞を、5ウシ胎仔血清FBS、100IUmLペニシリンおよび100μgmLストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地Invitrogen、CA中、37°C、5CO2雰囲気下で培養した。細胞内輸送および同時局在試験のために、OrganelleLightsEndosomesGFPおよびLysosomesGFPBacMam10キットMolecularProbes、ORを、それぞれRab5a初期エンドソームマーカーおよびLamp1後期エンドソームリソソームマーカー標識のために用いて、H2009細胞にバキュロウイルスを形質移入した。次いで、細胞をさらなる解析のために成長培地中で培養した。ミセル取り込みおよび細胞内活性化の共焦点画像解析試験のために、H2009細胞を2mLの完全RPMI培地中でガラス底皿MatTek、MAに播種し、ポリマー濃度02mgmL、pH74でナノプローブ3と共にインキュベートした。共焦点画像をミセル添加後0、15、30、45、および60分で捕捉した。60分のインキュベーション後、01NHCl溶液250μLを培地に加えて培地をpH50まで酸性化し、細胞をただちに画像化した。画像をImageJソフトウェアを用いて解析した。5回の独立した測定値を平均±標準偏差として提示した。同時局在実験のために、Rab5aGFPまたはLamp1GFPを発現している形質移入細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、PBSpH74中の04mgのナノプローブ3または45mgmLコポリマー溶液を培地に加えて、最終ポリマー濃度02mgmLとした。画像を指定の時点で、100×対物レンズを備えたNikonECLIPSETE2000E共焦点顕微鏡により捕捉した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。pHAMナノプローブは、中性pHではサイレントであるため、これらを培地に直接適用し、その内部移行の動力学を培地を除去する必要なしにモニターした。ナノプローブの添加直後、H2009細胞も培地も観察可能な蛍光シグナルは示さなかった。15分の時点で、細胞内に断続的な蛍光の点が現れた。蛍光点の数は経時的に増加した。H2009細胞のシグナル対ノイズ比SNR細胞、バックグラウンドノイズとして0時間の蛍光強度を用いるにより、経時的なナノプローブ取り込み増大および活性化のさらなる定量が可能となった。60分の時点で、培地SNR培地=693±91、P<0001に比べてSNR細胞の31倍の増大214±017×103が観察され、ここでナノプローブの大部分はまだ存在していた図5A。次いで、01NHCl溶液を加えて培地をpH50まで酸性化し、培地バックグラウンドの蛍光強度のかなりの増大がみられた。蛍光コントラストの逆の傾向が見られ、ここでSNR細胞はSNR培地の74P<005であった図5B。これらのデータは、pHAMナノプローブが潜在的に常時オンナノプローブHCl添加後の場合のようにに比べて癌細胞のコントラスト感受性を劇的に増大させうることを示していた。IIヒト肺癌細胞のエンドサイトーシスオルガネラにおけるpHAMの活性化異なるエンドサイトーシスオルガネラがpHAMを選択的に活性化しうるかどうかをさらに調べるために、H2009細胞に初期エンドソームおよび後期エンドソームリソソームにおけるそれぞれ緑色蛍光タンパク質GFP融合Rab5aおよびLampIバイオマーカーを形質移入した。H2009細胞を2mLの完全RPMI培地中でガラス底皿MatTek、MAに播種し、ポリマー濃度02mgmL、pH74でナノプローブ3と共にインキュベートした。共焦点画像をミセル添加後0、15、30、45、および60分で捕捉した。60分のインキュベーション後、01NHCl溶液250μLを培地に加えて培地をpH50まで酸性化し、細胞をただちに画像化した。画像をImageJソフトウェアを用いて解析した。5回の独立した測定値を平均±標準偏差として提示した。同時局在実験のために、Rab5aGFPまたはLamp1GFPを発現している形質移入細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、PBSpH74中の04mgのナノプローブ3または45mgmLコポリマー溶液を培地に加えて、最終ポリマー濃度02mgmLとした。画像を指定の時点で、100×対物レンズを備えたNikonECLIPSETE2000E共焦点顕微鏡により捕捉した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。バフィロマイシンA1によるリソソームの酸性化の阻害に関するならびにナノプローブ3および4の細胞内活性化に対するその効果に関する実験のために、Lamp1GFPを発現している形質移入H2009細胞を2mLのフェノールレッドを含まない完全RPMI1640培地中でガラス底皿に播種した。24時間の細胞成長後、培地を、バフィロマイシンA1最終濃度=1μMを含む新鮮培地で置き換え、細胞を37°Cで1時間インキュベートした。次いで、PBSpH74中の04mgのナノプローブ3または4を培地に加えて、最終ポリマー濃度02mgmLとした。37°Cで1時間インキュベートした後、細胞を100×対物レンズを備えたNikonECLIPSETE2000E共焦点顕微鏡により画像化した。GFPおよびTMRをそれぞれ488および543nmで励起した。GFPおよびTMRの発光波長はそれぞれ515および595nmであった。画像捕捉後、培地を新鮮培地で置き換えた。細胞を37°Cで5時間インキュベートし、続いて共焦点顕微鏡分析を行った。2つのpHAMナノプローブ3および4、それぞれのpHtは63および54をH2009細胞と共にインキュベートし、共焦点画像解析を用いてpHAM活性化の細胞内位置を調べた。20個またはそれ以上の同時局在化ドットすなわち、初期エンドソーム内またはリソソーム内の活性化pHAMを有するH2009細胞N=30~50を陽性として特定し、パーセンテージを定量した図6Aおよび6B。ナノプローブ3について、30分の時点で80の細胞が初期エンドソームとの同時局在において陽性であったが、後期エンドソームリソソームと同時局在していたのは12にすぎなかった。経時的に、初期エンドソームとの活性化3の同時局在は減少したが、後期エンドソームリソソームとの活性化3の同時局在は増大した図6A。これに対して、ナノプローブ4PHt=54は活性化のための細胞内位置の異なるパターンを示した。すべての時点で、初期エンドソーム同時局在が見られた陽性細胞は10未満であった。代わりに、ほとんどすべての活性化ナノプローブ4は後期エンドソームリソソームと同時局在していた図6B。図6Cおよび図6Dは、2つのナノプローブの細胞内取り込みおよび活性化の異なるプロセスを示す。ナノプローブ3は、より高い小胞pH59~62で初期エンドソーム内で速やかに活性化され得CaseyetalNatRevMolCellBiol2010115061;ModietalNatNanotech20094325330、活性化は、ナノプローブが後期エンドソームリソソームへと移動するにつれて持続する。対照的に、ナノプローブ4は、より低い小胞pH50~55でほとんど後期エンドソームリソソーム内でのみ活性化されるCaseyetalNatRevMolCellBiol2010115061;ModietalNatNanotech20094325330。同様の結果がヒトSLK腫瘍内皮細胞でも見られたデータは示していない。これらのデータは、pHAMナノ粒子によって異なるエンドサイトーシスオルガネラ内の小胞pHの小さい差を標的とすることの実現可能性を示している。pHAMの細胞内活性化メカニズムを検証するために、H2009細胞をバフィロマイシンA1と共に1時間インキュベートし、次いでナノプローブ3を加えた。バフィロマイシンは、原形質膜を越えるプロトンポンピングと、細胞内オルガネラ例えば、リソソームの酸性化とを担う、液胞型HATPアーゼVATPアーゼ;GagliardietalCurrMedChem1999611971212の特異的阻害剤である。データは、バフィロマイシンA1存在下で、TMR蛍光の非存在によって示されるとおり、ナノプローブ3は活性化されなかった。培地中のバフィロマイシンA1および3の除去後、TMR蛍光のlamp1GFP標識リソソームとの同時局在により3の活性化が現れた。同様の結果がH2009細胞においてナノプローブ4でも見られた。これらの実験は、合成ナノ粒子が、pH74の培地中ではサイレントであるが、細胞への取り込み後に活性化されうることを示していた。さらに、63および54のpH転移を有するナノ粒子は、初期エンドソームpH59~62およびリソソーム50~55などの、異なるエンドサイトーシス区画において選択的に活性化されうる。これらのデータは、pHAMナノ粒子によって異なるエンドサイトーシスオルガネラ内の小胞pHの小さい差を標的とすることの実現可能性を示している。実施例4:化学療法剤のpHAMナノ粒子への封入本試験は、pHAMナノ粒子が高いパーセンテージの化学療法剤を封入し、その後、腫瘍細胞で観察されるものと同様の酸性環境に曝露されると速やかに放出しうることを示そうとするものであった。Iドキソルビシンのミセルへの封入PEObPC6Aを前述のとおりに合成した実施例1IおよびII参照。ドキソルビシンのミセルへの封入を、まずドキソルビシンおよびPEObPC6Aを水および塩酸に溶解することによって達成した。次いで、この溶液を01MpH9緩衝液に、超音波処理下で滴加した。この方法を用いることにより、10パーセントの理論ローディングのうち、5~6パーセントの間のドキソルビシンローディングパーセンテージが得られた。ドキソルビシン封入ミセルをクロロホルムに溶解し、次いでUV吸光度を測定することにより、薬物ローディングを算出した。II酸性環境への曝露後のドキソルビシンの放出ドキソルビシン放出実験を、様々なpH環境でドキソルビシンをローディングしたミセルの異なる時点での蛍光強度を測定することにより行った。最初に、キュベット中で125μLのドキソルビシンローディングミセルを175μLの水と混合し、初期蛍光スペクトルを取った。次いで、10~20μLの5MpH緩衝液をキュベットに加えて、経時的ドキソルビシン放出を測定した。薬物濃度を、水中およびpH緩衝液中の遊離ドキソルビシンの蛍光較正曲線に基づいて算出した。低濃度<0025mgmLでは、蛍光強度と濃度は直接比例する。より高濃度では蛍光消光が起こる。放出試験は、ドキソルビシンはpH50では迅速にミセルから放出されること、およびpH74ではミセルは比較的安定であることを示している。pH50では、ミセルは最初の2時間でドキソルビシンを迅速に放出し、その後、この放出は非常に遅い。pH74では、ドキソルビシンは数時間後にミセルからゆっくり放出されるが、薬物の大部分は封入されたままである図7。低濃度<0025mgmLでは、蛍光強度と濃度は直接比例する。より高濃度では蛍光消光が起こる。本試験は、ポリマーミセルが高いパーセンテージのドキソルビシン約6を封入しうること、および酸性条件でプロトン化されるポリマーが、低pH値で加水分解を受けるポリマーよりもはるかに速く解離しうることを示した。放出試験は、ミセルがpH50ではドキソルビシンを迅速に放出し得、薬物の大部分が最初の2時間で放出されることを示した。IIIパクリタキセルのミセルへの封入パクリタキセルをローディングしたミセルを、以前に発表された手順に従って調製した。簡単に言うと、20mgのMeOPEO5kPDPA25kおよび2mgのパクリタキセルを1mLのTHFに溶解した。次いで、混合物を10mLのMilliQ水に超音波処理下で急速に加えた。混合物を微小限外ろ過装置を用いて6回超限外ろ過し、THFを除去した。得られたミセル溶液を室温で4時間放置し、045μmのセルロース膜を通してろ過し、ミセル溶液中のいかなる沈澱も除去した。ポリマーミセル中のパクリタキセルローディング含有量を、アセトニトリル中のミセルの分解によって求めた。パクリタキセル濃度を、34アセトニトリルおよび66水からなる移動相で逆相C18カラム5μm、46×250mmを用い、227nm、流速1mL分でのHPLCによって求めた。MeOPEO5kPDPA25kミセル中のパクリタキセル含有量は83±06であった。実施例5:腫瘍血管新生画像化のためのシパートを含むpHAMNIR蛍光体の生成INIRpHAMの合成シパートNHSエステルNIR色素を、発表された手順に従って合成した図8;LopalcoetalOrgBiomolChem20097856859;YeetalBioconjugChem200719225234。図8は、NIRNHSおよびPEObコポリマーの代表的合成スキームを示す。12ジクロロベンゼン中、110°Cでの、122トリメチル1HベンズeインドールAの3ブロモプロパン酸との反応により、Bを得た。Bをマロンアルデヒドビス1塩酸塩n=1またはグルタコンアルデヒドジアニル1塩酸塩n=2とさらに反応させて、対応するNIR蛍光体Cを得た。Cを無水DMF中、O1133テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートTSTUおよびNNジイソプロピルエチルアミンDIEAで処理して、NIRNHSエステルを得た。最後に、NIRNHSの一級アミノ基を有するブロックコポリマーへの結合により、PEObを合成した。シパート含有コポリマーにおいて、PRブロックにおける繰り返し単位の数は70であった。合成後、ポリマーをゲル浸透クロマトグラフィ、1HNMR、および蛍光分光法によって完全に特徴決定した。異なる励起発光波長例えば、n=1の場合λexλem=678704nm;n=2の場合λexλem=781808nmを有する有用な類似体を続いて生成した。IINIRpHAM蛍光体の最適化TMRpHAMにおける予備的試験は、PRの長さおよびTMRの数が超pH応答に影響をおよぼしうることを示している。十分なPR長は協同的ミセル化を提供し得、pH応答、すなわちΔpH10~90に直接影響をおよぼす。TMR密度は蛍光応答を制御し得る。例えば、y=3においてTMRナノプローブ3に対して55の最適FmaxFminが得られ、オン状態で観察可能な分子内蛍光消光は見られなかった。これと比べて、y=1では、10のFmaxFminしか得られなかったデータは示していない。NIRpHAM開発のために、PR長70を維持してポリマー鎖あたりの最適NIR密度を調べる。異なる蛍光体すなわち、シパートとTMRは異なるホモFRETおよびPET消光効果を有すると予想され、これは最適なpHAM組成物に影響をおよぼしうる。ホモFRETおよびPETからの寄与を定量するために、NIR結合ポリマーをNIRなしポリマーと混合し、NIR結合ポリマーのモル比を系統的に変動させる。ミセルあたり1つのNIR色素に対する消光係数の外挿により、PET寄与の定量が可能となる。次いで、PRセグメント上のシパート密度例えば、y=1、3、6を系統的に増大させる。消光効率を測定し、r6rはミセルコアにおける色素対の間の距離であるに反比例するホモFRETモデルと相関させるLakowiczPrinciplesofFluorescenceSpectroscopyEdn3rd443475と、MALPEObPRのモル比10モルで混合した。ミセル形成後、cRGDSHペプチドをチオールマレイミド連結によって結合した。ペプチド結合を、1HNMRによりマレイミド基67ppmの消失、およびcRGDfK上のDPheからの芳香族基70~75ppmの生成によってモニターした。アミノ酸分析をさらに用いて、pHAMナノプローブの表面上のペプチド密度を定量したKhemtongetalCancerRes20096916511658。TEMおよびDLSを用いて粒子のサイズおよび形態におけるリガンド機能付与を調べ、蛍光分光光度法を用いてpHAMのpH応答蛍光特性を検証した。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査は標的指向pHAMの細胞取り込みおよび細胞内活性化の動力学を調べるための主なツールであった。ヒト臍血管内皮細胞HUVECをこれらの試験において用いた。この細胞株は、血管新生内皮細胞のインビトロでの細胞培養モデルとして十分に認められ、αvβ3インテグリンがHUVEC細胞上で過剰発現されるEllisetalJVaseRes200340234243;VagetalContrastMediaMolImaging20094192198。図10は、HUVEC細胞におけるcRGDコード化PEGbpHAMpH転移=63のコントラスト特異性を示す。cRGDcRADの表面密度を20モルで制御した。αvβ3特異性を調べるために、cRADコード化pHAMおよび遊離cRGDブロックcRGDコード化pHAMを対照として用いた。HUVEC細胞をEGM培地中で培養した後、異なるpHAM試料ポリマー濃度:02mgmLを3時間インキュベートした。cRGDブロック対照において、20モル過剰量の遊離cRGDペプチドは、cRGDpHAMと同時インキュベートされて、αvβ3結合に対して競合した。pHAMは、培地のpHでサイレントであるため、HUVEC細胞内でのpHAMの活性化を、培地を除去する必要なしで直接画像化することができる。データから、細胞のインキュベーション後、cRGDpHAMがHUVEC細胞内で蛍光強度の劇的な増大を示すことが判明した。これと比べて、cRADpHAMおよびcRGDブロック対照は蛍光シグナルをほとんど示さなかった。異なるHUVEC細胞のROI分析は、cRGDpHAM、cRADpHAM、およびcRGDブロック対照の平均蛍光強度はそれぞれ152±35、14±02、15±02であることを示した図10A。ほぼ同等のROIサイズの培地バックグラウンドの蛍光は056±009であった。異なるpHAM状態のコントラスト対ノイズ比CNR=FI培地、式中、FIpHAMおよびFI培地はそれぞれpHAM試料および培地の蛍光強度であるを算出するために、培地をバックグラウンドノイズとして用いた。cRGDpHAM、cRADpHAM、およびcRGDブロック対照のCNR値はそれぞれ261±62、15±04、および16±04であった図10B。cRGDpHAMのCNRにおける>10倍の増大が2つの対照で観察されたことは注目に値し、αvβ3特異的標的指向を示しているP<001。特に、このコントラストは、細胞培養用培地中、高濃度02mgmLのサイレントpHAMナノプローブ存在下で観察された。実施例7:腫瘍を有するマウスにおいてインビボで特有の血管新生バイオマーカー画像化における標的指向pHAMの特異性および有効性の評価I腫瘍脈管構造におけるpHAM活性化TMRは短い励起発光波長λex=540nm、λem=580nmを有するため、これらの試験はcRGDコード化TMR結合pHAMナノ粒子を用いて、腫瘍脈管構造におけるpHAM活性化を示した。A549腫瘍異種移植片を有する無胸腺ヌードマウス100~200mm3、各群n=3をこれらの試験において用いた。cRGDおよびcRADコード化PEGbpHAMナノプローブを表面密度20モルで用いた。ナノプローブを14μmolTMRkgの用量で尾静脈から注射し、動物をpHAM注射の3時間後に屠殺した。様々な器官を摘出し、ペトリ皿に入れ、IVISSpectrumにより画像化した。cRADコード化およびcRGDコード化TMRpHAMからの、外植した器官および腫瘍組織のTMRシグナルを、Maestro蛍光画像化装置により、同じ画像化条件で直接観察することができる。TMRは組織透過が限られているにもかかわらず、cRGDコード化pHAMからの腫瘍は明らかに、cRADコード化pHAMからのものよりも、ならびに隣接する筋組織よりも高い蛍光強度を示した。両方の群で、血液の滴はいかなる蛍光シグナルも示さず、血中のpHAMの所期のバックグラウンド抑制効果を示していた。一方、肝臓は両方のpHAM製剤を取り込む主な器官であると考えられ、ナノサイズの粒子のRESクリアランスと一致していたMoghimietalPharmacolRev200153283318。エクスビボ画像化後、腫瘍組織を凍結し、8μmで切断した。腫瘍組織の共焦点画像解析は、cRGDpHAM処理した腫瘍において、cRADpHAM対照よりも顕著な蛍光強度の増大を示した。pHAM活性化の部位を検証するために、腫瘍切片をまずPECAMCD31に対するラット一次抗マウスmAbで染色し、続いて洗浄し、Delight488結合抗ラット二次抗体で染色した。重ね合わせ画像は、pHAM活性化の大部分は脈管構造染色と同時局在していたことを示し、腫瘍脈管構造における活性な標的指向およびcRGDコード化pHAMの活性化を示している。本試験は、腫瘍を有するマウスにおいて、cRGDコード化pHAMによって特定の血管新生バイオマーカーすなわち、αvβ3を標的とすることの実現可能性を示している。TMR色素の短い組織透過を克服するために、NIRpHAMナノプローブ例えば、シパート、n=2の場合、λexλem=781808nmを、さらなるインビボでの動物試験のために用いてもよい。II最適なpHt値を有する標的指向NIRpHAMナノプローブの評価血管新生バイオマーカーの画像化特異性に対するpHtの影響を調べる。この一連の試験において、cRGDコード化NIRpHAMをモデルシステムとして、およびcRADコード化NIRpHAMを対照として用いる。NIR結合PEGbPDBApHt=54、PEGbPDPA63、またはPEObPC7A68ナノプローブを評価する。より大きいpHt値例えば、68を有するcRGDpHAMナノプローブは、初期段階のエンドソーム内でより速い蛍光応答をもたらしうる。しかし、これは、腫瘍微小環境における酸性pHなどの、他の非αvβ3関連メカニズムによって、より活性化されやすいと考えられる。逆もまた同じで、より低いpHt値例えば、54を有するcRGDpHAMは、αvβ3仲介性エンドサイトーシスによって、より特異的にオンとなり得るが;血管新生内皮細胞においてそれらが活性化されるにはより長い時間がかかると考えられる。この一連の実験において、本発明者らは、異なるpHtを有するcRGDおよびcRADコード化NIRpHAMを、A549腫瘍を有するマウスの尾静脈から注射する。腫瘍および他の器官の蛍光強度を経時的に記録して、pHAM活性化の動力学を調べる。LivingImage40ソフトウェアを用いて、マウス解剖学的構造に重ね合わせた3Dボリューム画像を表示する。腫瘍組織について、蛍光強度を経時的にプロットして、cRGDコード化NIRpHAMに飽和動力学が存在するかどうか受容体飽和から予想されるとおりを調べる。飽和動力学が観察される場合には、受容体飽和を可能にする最小用量としての最適pHAM用量を求める。次いで、この用量をその後の試験で用いて、他の器官例えば、肝臓における非特異的取り込みを最小限に抑える。次いで、cRGDコード化対cRADコード化NIRpHAMについて、周囲の筋組織に対する腫瘍のCNRを算出し、αvβ3仲介性エンドサイトーシスによる標的特異的コントラストを調べるために比較する。異なるpHt値を有するNIRpHAMについて、異なるNIRpHAM設計全てにわたる標的指向すなわち、cRGDコード化群と非標的指向すなわち、cRADコード化群との間のCNRを比較する。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるステルスpHAMPEO表面活性化におけるデータと相関している。本試験のこの結果により、インビボで特定の血管新生バイオマーカーを画像化するために、NIRpHAMの最適なpHt設計が選択される。cRGDコード化NIRpHAMNIR結合PEGbPDPApHt=63をモデルシステムとして、および非標的指向NIRpHAMを対照として用いた。NIR結合PEGbPDPAは、以下のとおりの式Iの構造を有した。標的指向NIR結合PEGbPDPAはcRGDの表面密度10モルを有した。cRGDコード化および非標的指向NIR結合PEGbPDPAを、A549肺腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスの尾静脈から静脈内注射した。インビボNIR蛍光強度を注射後3時間記録した。比較群において、cRGDfKペプチドのブロッキング用量をcRGDコード化NIR結合PEGbPDPA投与の30分前に注射した。cRGDコード化NIR結合PEGbPDPAからの腫瘍は明らかに、非標的指向NIR結合PEGbPDPAよりもまたはcRGDブロッキング群からのものよりも高い蛍光強度を示した。IIIcRGDコード化pHAMの薬物動態試験本試験は、A549腫瘍を有するマウスにおける、cRGDコード化pHAM標的指向ミセルおよびcRGDなしのpHAM非標的指向ミセルの血中循環時間を示した。雌無胸腺ヌードマウス20~25gの右側腹部にヒト非小細胞肺癌A549細胞5×106細胞マウスを皮下接種した。腫瘍を200~300mm3に到達させた後、ミセルを注射した。PK試験のために、cRGDなしのpHAMまたは10cRGDコード化PEGbpHAMを20mgkgミセルの用量で尾静脈から注射した。血液を静脈内注射の2分、3、6、12、24および48間後に採取した。1000rpmで10分間の遠心沈降により血漿をRBCから分離した。血漿をさらなる分析のために4°Cで保存した。ポリマーを血漿から酸性メタノール01MHCl:MeOH、3:7、vvで抽出し、励起および発光波長それぞれ545および580nmを用いて蛍光計で検出した。cRGDコード化pHAMおよびcRGDなしのpHAMはいずれも長い血中循環時間を示した。cRGDコード化pHAMおよびcRGDなしのpHAMの血中半減期はそれぞれ100および95時間であった図11。IVいくつかの腫瘍異種移植片モデルにおいてαvβ3インテグリンおよびVEGFR2を画像化する際のNIRpHAMナノプラットフォームの普遍性の試験最適pHtを有するNIRpHAM製剤をこれらの試験において用いる。VEGFR2標的指向ナノプローブのために、本発明者らはNIRpHAM結合のためのRAFL1mAbのFabR2SH断片を精製する。非特異的FabSHも対照ラットIgGから調製する。FabSHをチオールマレイミド化学によりNIRpHAM表面に結合する。RAFL1NIRイミノ結合体を常時オン対照として用いる。αvβ3標的指向NIRpHAMのために、小分子色素結合体としてのcRGDNIRも合成する。これらの常時オンプローブは標的とする部位で高い血中シグナルおよび限られた画像化ペイロード増大を有し、これらは対応するNIRpHAMナノプローブに比べて有意に低いコントラスト感受性を有する。標的指向ナノプローブを、雌ヌードマウスの乳房パッドにおける正所性MDAMB231乳房腫瘍モデルRanetalNeoplasia20035297307nunuマウスにおける正所性MiaPaca2膵臓腫瘍モデルKorpantyetalCancerRes200713323330における他のより臨床的に関連する腫瘍モデルにおいて調べる。両方の腫瘍モデルは高いレベルの血管新生バイオマーカー例えば、VEGFR2、αvβ3、エンドグリンを発現する。これらの腫瘍モデルにおけるNIRpHAMナノプローブの画像化特異性および有効性を評価し、結果を組織切片におけるこれらの血管新生バイオマーカーの免疫組織化学によって確認する。実施例8酸性腫瘍における非標的指向NIRpHAMの活性化の評価細胞外pHは腫瘍微小環境および代謝を試験するための重要な生理的パラメーターになってきている。CardoneetalNatureRevCancer20055786795;GerweckandSeetharamanCancerRes19965611941198;HelmlingeretalNatureMedicine19973177182。好気性解糖ワールブルク効果としても知られる、すなわち酸素存在下でのグルコースの乳酸への変換が、癌で特有に観察される。正常な細胞内pH約72を維持するために、癌細胞はいくつかの輸送システム例えば、NaH交換、液胞型HATPアーゼVATPアーゼ、NaHCO3交換を用いて、内部細胞からプロトンを搬出する。これは、ECM分解および血管形成の促進を通じて癌侵入をさらに助長する、微小環境アシドーシスを引き起こす。pHAM活性化を試験する前に、腫瘍のマップをまず、インビボで組織pHを画像化するためのMRI緩和時間測定法を用いて測定するGarciaMartinetalMagnReasonMed200655309315;RaghunandetalMagnReasonMed200349249257。MRIによる測定後、腫瘍微小環境における非標的指向NIRpHAMの活性化を評価する。pHAMのサイズが小さいため直径40~50nm、これらは漏出性腫瘍微小脈管構造を通じて腫瘍間質に蓄積する。典型的な実験において、NIRpHAMナノプローブを尾静脈から注射する。経時的な3D活性化マップおよび動的コントラストをIVISSpectrumで測定する。製造者によって提供されるLivingImageソフトウェアを用いてNIRpHAMナノプローブの空間的および時間的活性化を分析する。さらに、定量的3D蛍光FLIT4ツールセットを用いて、光学画像をMRIからのマップと共に記録する。次いで、腫瘍のマップによるpHAM活性化のパターンを比較する。NIRpHAM活性化特性を検査し、異なるpH転移すなわち、54、63、68、72を有するナノプローブについて比較する。実験は以下を示す:1腫瘍微小環境pHとNIRpHAM活性化との間のそれぞれ密接に相関するpHeおよびpHtの関係;2高pH転移すなわち、68または72を有するNIRpHAMについて、試験したpHAMナノプローブの超pH応答すなわち、オフオン転移のための<025pH単位のため、これらは酸性腫瘍に対する高感度画像化プローブであり、腫瘍薬物送達のために有用であること;および3低pH転移すなわち、54または63を有するNIRpHAMについて、酸性腫瘍微小環境によるそれらの活性化の欠如により、血管新生バイオマーカーに対する画像化特異性が得られること。PEGPC7ACy55ナノプローブを試験した。用いたPEGPC7ACy55の構造は以下のとおりの式Iの構造を有した。PEGPC7ACy55ナノプローブpHt=67を、A549肺腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスの尾静脈から静脈内注射した25mgkg。比較群において、α-シアノ4ヒドロキシシンナメート、すなわちモノカルボキシレートトランスフェラーゼ1MCT1阻害剤をナノプローブ投与の24時間前に注射した。非標的指向PEGPC7ACy55ナノプローブからの腫瘍は明らかに、MCT1阻害剤群からのものよりも高い蛍光強度を示した。実施例9:VEGFR2を標的とするpHAMの開発本試験は、内皮細胞の表面上のVEGFR2受容体を特異的に標的指向するためのFabR2機能付与ミセルの開発を示す。VEGFR2は血管新生腫瘍内皮細胞において過剰発現されるため、RAFL1mAbのFab断片をVEGFR2受容体に対する特異的標的指向のために用いる。RAFL1mAbはVEGFR2に高い親和性15pMおよび特異性で結合しRanetalNeoplasia20035297307、表面機能付与のためのRAFL1のFabR2SH断片の精製後、FabR2機能付与リポソームは対照リポソームに比べてマウス内皮細胞における細胞取り込みの>30倍の増大を示したMarconescuPhDThesisUTSouthwesternMedicalCenterDallas2008。全mAbに比べて、FabR2SHはより小さい標的指向部位50対150kDを導入する利点、およびpHAM表面上の結合エピトープの優れた提示すなわち、全mAbの無作為の配向の代わりにfacingsolutionを有する。pHAM表面でのリガンド結合のためにチオールマレイミド化学を用いる。MALPEObPRをPEObと異なるモル比例えば、20モルのMALPEObPRで混合する。各pHAMコポリマーについて、次いでその対応するマレイミド末端コポリマーを合成する図8。ミセル形成後、FabR2SHペプチドをチオールマレイミド連結によって結合する。アミノ酸分析をさらに用いて、pHAMナノプローブの表面上のペプチド密度を定量するKhemtongetalCancerRes20096916511658。TEMおよびDLSを用いて粒子のサイズおよび形態におけるリガンド機能付与を調べ、蛍光分光光度法を用いてpHAMのpH応答蛍光特性を検証する。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査は、標的指向pHAMの細胞取り込みおよび細胞内活性化の動力学を調べるための主なツールである。