少なくとも1つの抗原を樹状細胞DCに負荷する段階;該DCを少なくとも1種のTLRアゴニストで活性化する段階;該DCを凍結保存する段階;および該DCを解凍する段階;を含む、免疫療法で使用するための、抗原を負荷して活性化した樹状細胞DCを生成させる方法であって、該DCが、T細胞応答を生じさせるのに有効な量の少なくとも1種のサイトカインを産生する、方法。抗原が腫瘍抗原である、請求項1記載の方法。抗原が微生物抗原である、請求項1記載の方法。TLRアゴニストがLPSである、請求項1記載の方法。凍結保存する段階がDCを約70°C以下の温度で凍結することを含む、請求項1記載の方法。解凍後のDCの回収率および生存率が約70以上である、請求項1記載の方法。解凍後のDCの回収率および生存率が約80以上である、請求項1記載の方法。DCが少なくとも約1週間凍結保存される、請求項1記載の方法。サイトカインがIL12である、請求項1記載の方法。DCがキラー機能を示し、それによりDCが標的癌細胞を溶解することができる、請求項1記載の方法。抗原負荷して活性化したDCを含む以前に凍結保存された組成物を、その必要がある哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を引き出す方法であって、該DCが凍結保存される前に抗原を負荷されかつ活性化されたものである、方法。抗原が腫瘍抗原である、請求項11記載の方法。抗原が微生物抗原である、請求項11記載の方法。TLRアゴニストがLPSである、請求項11記載の方法。凍結保存する段階がDCを約70°C以下の温度で凍結することを含む、請求項11記載の方法。解凍後のDCの回収率および生存率が約70以上である、請求項11記載の方法。解凍後のDCの回収率および生存率が約80以上である、請求項11記載の方法。DCが少なくとも約1週間凍結保存される、請求項11記載の方法。サイトカインがIL12である、請求項11記載の方法。DCがキラー機能を示し、それによりDCが標的癌細胞を溶解することができる、請求項11記載の方法。少なくとも1つの抗原を負荷されたDCを含有する、哺乳動物において免疫応答を引き出すための保存可能な組成物であって、該DCが、少なくとも1種のTLRアゴニストに曝露することによって活性化されており、かつ該組成物が凍結保存されているかどうかに関係なく、該DCが、T細胞応答を生じさせるのに有効な量の少なくとも1種のサイトカインを産生する、組成物。抗原が腫瘍抗原である、請求項21記載の組成物。抗原が微生物抗原である、請求項21記載の組成物。TLRアゴニストがLPSである、請求項21記載の組成物。約70°C以下の温度で凍結保存されている、請求項21記載の組成物。解凍後のDCの回収率および生存率が約70以上である、請求項25記載の組成物。解凍後のDCの回収率および生存率が約80以上である、請求項25記載の組成物。少なくとも約1週間凍結保存される、請求項25記載の組成物。サイトカインがIL12である、請求項21記載の組成物。DCがキラー機能を示し、それによりDCが標的癌細胞を溶解することができる、請求項21記載の組成物。詳細な説明本発明は、好ましくは疾患過程の早い段階で使用したときに、臨床的に有効な免疫応答を引き出すための、Toll様受容体アゴニストによって活性化された、成熟した抗原負荷DCの開発および凍結保存に関する。本発明のDCは、サイトカインおよびケモカインの産生を介して、強力なTh1細胞応答の方へ条件づける能力があり、さらに腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力がある。本発明のDC開発技術はまた、高転移能をもつ細胞を排除することができる新規な分子および癌幹細胞を標的とするためのプラットフォームを提供する。また、本発明は、抗原を提示する能力および機能性を保持することに加えて、解凍後に種々のサイトカインおよびケモカインの産生をも保持する方法で、これらの活性化DCを凍結保存することに関する。定義本明細書中で用いる以下の各用語は、このセクションではそれと関連した意味を有する。冠詞aおよびanは、その冠詞の文法上の物体が1つであるかまたは1つより多いすなわち、少なくとも1つであることを指すために本明細書中で用いられる。一例として、エレメントanelementは1つのエレメントまたは1つより多くのエレメントを意味する。用語約は、当業者によって理解されており、それが使用される状況によりある程度変化するだろう。本明細書中で用いる用語抗体とは、抗原上の特定のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。抗体は天然源または組換え供給源に由来する完全な免疫グロブリンであり得るが、完全な免疫グロブリンの免疫活性部分であってもよい。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF2、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含めて、さまざまな形態で存在することができるHarlowetal1988Houstonetal1988Birdetal1988。本明細書中で用いる用語抗原またはAgは、免疫応答を惹起する分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生、または特定の免疫適格細胞の活性化、またはこれらの両方を含むことができる。当業者であれば、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む巨大分子はどれも抗原として機能し得ることが理解されるであろう。さらに、抗原は組換えまたはゲノムDNAに由来することもある。当業者には理解されるように、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAは、それゆえに、本明細書中で用いられる用語抗原をコードしている。さらに、当業者には理解されるように、抗原は遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。本発明は、限定するものではないが、1つより多くの遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、そしてこれらのヌクレオチド配列は所望の免疫応答を誘発するためにさまざまな組み合わせで配置されることが容易に明らかである。また、当業者であれば、抗原は遺伝子によってコードされる必要はまったくないことが理解されるであろう。抗原が合成的に生成され得ること、または生物学的サンプルから誘導され得ることは容易に明白である。そのような生物学的サンプルには、限定するものではないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または体液を含めることができる。抗原提示細胞APCは、T細胞を活性化することができる細胞であり、限定するものではないが、単球/マクロファージ、B細胞および樹状細胞DCが挙げられる。用語樹状細胞またはDCとは、リンパ系または非リンパ系組織に見られる形態学的に類似した細胞型の多様な集団の任意のメンバーを指す。これらの細胞はその独特の形態と高レベルの表面MHCクラスII発現によって特徴づけられる。DCは多くの組織源から単離することができる。DCはMHC拘束性T細胞を感作するための高い能力を持っており、T細胞にその場で抗原を提示するのに非常に効果的である。抗原は、T細胞の分化および寛容時に発現される自己抗原、ならびに正常な免疫過程において存在する外来抗原であり得る。本明細書中で用いる活性化DCとは、Toll様受容体アゴニストに曝露されたDCである。活性化DCは抗原を負荷されていても、負荷されていなくてもよい。本明細書中で用いる用語成熟DCとは、高レベルのMHCクラスII、CD80B71およびCD86B72を含む分子を発現する樹状細胞として定義される。これとは対照的に、未成熟な樹状細胞は低レベルのMHCクラスII、CD80B71およびCD86B72分子を発現するが、まだ抗原を取り込むことができる。抗原負荷APCまたは抗原パルスAPCには、抗原に曝露されて、その抗原によって活性化されたAPCが含まれる。例えば、APCはインビトロで、例えば抗原の存在下で培養している間に、Ag負荷させることができる。また、APCは抗原への曝露によってインビボで負荷することもできる。抗原負荷APCは伝統的に次の2つの方法のいずれかで調製される:1抗原ペプチドとして知られる小さなペプチド断片をAPCの外側に直接パルスする;または2APCを全タンパク質またはタンパク質粒子とインキュベートするその後、該タンパク質はAPCによって取り込まれる。こうしたタンパク質はAPCによって小さなペプチド断片に消化され、最終的にはAPC表面に輸送されて提示される。さらに、抗原負荷APCは、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによっても生成することができる。本明細書中で用いる用語自己免疫疾患は、自己免疫反応から生じる疾患として定義される。自己免疫疾患は自己抗原に対する不適切で過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、とりわけ以下が挙げられる:アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病1型、栄養障害性表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎。本明細書中で用いる用語自己とは、同じ個体に由来する任意の物質を指し、その物質は後でその個体に再導入されることになっている。本明細書中で用いる用語癌は、異常な細胞の急速かつ制御不能な増殖によって特徴づけられる疾患として定義される。癌細胞は、局所的にまたは血流やリンパ系を介して身体の他の部分に、広がることができる。さまざまな癌の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる:乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌など。本明細書中で用いる用語凍結保存されたまたは凍結保存は、凍結用培地中cryomediumに再懸濁されて、約70°C以下の温度で凍結された細胞を指す。本明細書中で用いる用語凍結用培地は、細胞サンプル中の少なくとも一部の細胞が回収されて、解凍後に生存し続けることができるような、凍結に備えて細胞サンプルと混合される任意の培地を指す。ドナー抗原とは、レシピエントに移植されるドナー組織によって発現される抗原を指す。レシピエント抗原とは、ドナー抗原に対する免疫応答の標的を指す。本明細書中で用いるエフェクター細胞とは、抗原に対する免疫応答を媒介する細胞を指す。エフェクター細胞の例としては、限定するものではないが、T細胞およびB細胞が挙げられる。本明細書中で用いる内因性とは、生物、細胞、組織もしくは系に由来する、またはその内部で産生される任意の物質を指す。本明細書中で用いる外因性とは、生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入される、またはその外部で産生される任意の物質を指す。本明細書中で用いる用語エピトープは、Bおよび/またはT細胞応答を誘導する、免疫応答を引き出すことができる抗原上の小さい化学分子として定義される。抗原は1つまたは複数のエピトープを持つことができる。ほとんどの抗原は多数のエピトープを持つ;すなわち、それらは多価である。一般的に、エピトープは約5アミノ酸および/または糖の大きさである。当業者は、一般に、その分子の特定の直鎖状配列よりもむしろ、全体的な三次元構造が抗原特異性の主な基準であり、したがって、あるエピトープを他のエピトープと区別することを理解している。本明細書中で用いる用語ヘルパーT細胞は、その主な機能が他のBおよびTリンパ球および/またはマクロファージの活性化と機能を促進することである、エフェクターT細胞として定義される。大部分のヘルパーT細胞はCD4T細胞である。本明細書中で用いる免疫原とは、哺乳動物において体液性抗体および/または細胞性免疫応答を刺激または誘導することができる物質を指す。本明細書中で用いる用語免疫グロブリンまたはIgは、抗体として機能するタンパク質のクラスとして定義される。タンパク質のこのクラスに含まれる5つのメンバーはIgA、IgG、IgM、IgD、およびIgEである。IgAは、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、および呼吸器と尿生殖器の粘液分泌物など、身体の分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは最も一般的な血中循環抗体である。IgMは、ほとんどの哺乳動物において一次免疫応答で産生される主な免疫グロブリンである。それは凝集反応、補体結合および他の抗体応答において最も効果的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは既知の抗体機能をまったくもたない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として機能することができる。IgEは、アレルゲンへの曝露時に肥満細胞と好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏反応を媒介する免疫グロブリンである。本明細書中で用いる用語主要組織適合遺伝子複合体またはMHCは、遺伝子の特定のクラスターであって、その遺伝子の多くが、組織適合性の最も重要な決定要因の一つである抗原提示に関与する、進化的に関連する細胞表面タンパク質をコードするものとして定義される。MHCクラスI、つまりMHCIは、主にCD8Tリンパ球への抗原提示に機能する。MHCクラスII、つまりMHCIIは、主にCD4Tリンパ球への抗原提示に機能する。本明細書中で用いる用語モジュレートするとは、生物学的状態の変化を指し、すなわち、増加する、減少するなどを意味する。本明細書中で用いる用語ポリペプチドは、通常は特定された配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で用いる用語ポリペプチドは用語ペプチドおよびタンパク質を相互に含む。本明細書中で用いる用語自己抗原は、宿主の細胞または組織により発現される抗原として定義される。自己抗原は腫瘍抗原とすることができるが、特定の態様では、正常細胞と腫瘍細胞の両方で発現される。当業者は、自己抗原が細胞内で過剰発現され得ることを容易に理解するだろう。本明細書中で用いる実質的に精製された細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。実質的に精製された細胞はまた、それが天然に存在する状態で通常結合している他の細胞型から分離された細胞を指す。ある場合には、実質的に精製された細胞の集団は細胞の均質な集団を指す。他の場合には、この用語は、単に、それらが天然の状態でもともと結合している細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様では、これらの細胞はインビトロで培養される。他の態様では、これらの細胞はインビトロで培養されない。本明細書中で用いる用語T細胞は、さまざまな細胞性免疫反応に関与する胸腺由来の細胞として定義される。本明細書中で用いる用語B細胞は、骨髄および/または脾臓由来の細胞として定義され、B細胞は抗体を産生する形質細胞へと分化することができる。本明細書中で用いる用語Toll様受容体、つまりTLRは、自然免疫系において役割を果たすタンパク質のクラスとして定義される。TLRは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する1回膜貫通型、非触媒性の受容体である。TLRはリガンドに結合することで免疫細胞応答を活性化する。本明細書中で用いる用語Toll様受容体アゴニスト、つまりTLRアゴニストは、免疫細胞応答を活性化するためにTLRに結合するリガンドとして定義される。本明細書中で用いる治療的有効量とは、治療用組成物が投与される哺乳動物に有益な効果をもたらすのに十分な、治療用組成物の量のことである。本明細書中で用いる用語ワクチンは、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトへの物質の投与後に、免疫応答を引き出すために用いられる物質として定義される。範囲:本開示を通して、本発明のさまざまな局面は、範囲の形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に利便性と簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことを、理解すべきである。したがって、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、1~6のような範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば1、2、27、3、4、5、53、および6を具体的に開示していると考えるべきである。このことは、その範囲の広さに関係なく適用される。説明本明細書で意図されるように、本発明は、T細胞に対するより強いシグナルを産生する上で優れた機能性をもつDCを生成して凍結保存するための方法であって、結果として、より強力なDCベースの抗腫瘍ワクチンをもたらす方法を提供する。この種の細胞を効果的に凍結保存することによって、サンプルを貯蔵して、後で用いるために解凍することが可能であり、それによりワクチン製造時に繰り返されるフェレーシスおよびエルトリエーションelutriation法の必要性を低減することができる。これらの方法はまた、発癌性シグナル伝達経路に関与する分子および癌幹細胞CSCを直接標的とするために利用することができる。本発明は、Toll様受容体アゴニストによって活性化された、成熟した、抗原負荷したDCを包含し、かかるDCは、好ましくは疾患過程の早い段階で使用したとき、臨床的に有効な免疫応答を誘導する。本発明のDCは、望ましいレベルのサイトカインおよびケモカインを産生し、さらに腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力がある。本発明はさらに、TLRリガンドが提示細胞を活性化するだけでなく、適応応答を制限するように機能する制御性細胞を抑制することを実証する。特定の態様において、TLR2、TLR4、TLR8およびTLR9を含む複数のToll様受容体を介したシグナル伝達は、免疫制御性CD4CD25Foxp3T細胞本明細書ではTregと呼ばれるによる抑制を逆転させることが示された。本明細書では、TLR4活性化樹状細胞が、レスポンダー細胞へのTregの効果を阻害するだけでなく、レギュレーターそれ自体をIFNγ産生エフェクターへと変換するようであることを実証する。本発明はまた、これらの活性化DCを、抗原を提示する上でのその能力および機能性を保持することに加えて、解凍後に種々のサイトカインおよびケモカインの産生をも保持する方法で凍結保存することに関し、結果的に、凍結保存してから解凍された活性化DCは、新たに収集されて活性化されたDCと同じくらい臨床的に有効である。DCによる免疫療法DCは抗原提示細胞APCとして機能する多能性単球から誘導される。DCは末梢組織に遍在しており、そこでそれらは抗原を捕捉するように準備される。抗原捕捉後、DCは抗原を小さなペプチドへとプロセッシングして、二次リンパ器官に向かって移動する。このリンパ器官内で、DCは抗原ペプチドをナイーブT細胞に提示し、それによってT細胞分化を偏向させるシグナルのカスケードを開始する。曝露されると、DCはMHCクラスIまたはクラスII結合ペプチドのいずれかに結合された抗原分子を提示して、それぞれCD8またはCD4T細胞を活性化するSteinman1991AnnuRevImmunol9271296Banchereauetal1998Nature392245252Steinmanetal2007Nature449419426Ginhouxetal2007JExpMed20431333146Banerjeeetal2006Blood10826552661Sallustoetal1999JExpMed189611614Reidetal2000CurrOpinImmunol12114121Bykovskaiaetal1999JLeukocBiol66659666Clarketal2000MicrobesInfect2257272。DCは適応免疫応答の誘導、協調および制御に関与しており、かつまた、免疫系の自然アームinnatearmと適応アームadaptivearmのエフェクター間の情報伝達をまとめるように機能する。こうした特性は、DCを免疫療法の有力な候補にしている。DCには、マクロピノサイトーシスおよび受容体依存性エンドサイトーシスを介して環境をサンプリングするためのユニークな能力があるGerneretal2008JImmunol181155164Stoitzneretal2008CancerImmunolImmunother5716651673LanzevecchiaA1996CurrOpinImmunol8348354Delamarreetal2005Science307571516301634。DCはまた、その抗原提示能力を高めるために成熟化シグナルを必要とする。DCは、TNFα、CD40Lまたはカルシウムシグナリング剤などの追加の成熟化シグナルを提供することによって、CD80およびCD86第2のシグナル分子としても知られるなどの表面分子の発現をアップレギュレートするCzernieckietal1997JImmunol15938233837Bedrosianetal2000JImmunother23311320Mailliardetal2004CancerRes6459345937Brossartetal1998Blood9242384247Jinetal2004HumImmunol6593103。TNFα、IL1β、IL6およびプロスタグランジンE2PGE2を含むサイトカインの混合物は、DCを成熟させる能力を持っていることが証明されているJonuleitetal2000ArchDermRes292325332。DCはまた、抗原をパルスする前に、カルシウムイオノフォアで成熟させることもできる。病原体認識受容体、例えばPKRおよびMDA5に加えてKalalietal2008JImmunol18126942704Nallagatlaetal2008RNABiol53140144、DCはまた、Toll様受容体TLRとして知られる一連の受容体を含んでおり、これらの受容体も病原体からの危険を感知することが可能である。これらのTLRがトリガーされると、DCにおいて一連の活性化変化が誘起され、これはT細胞の成熟化とシグナル伝達につながるBoullartetal2008CancerImmunolImmunother571115891597Kaishoetal2003CurrMolMed34373385Pulendranetal2001Science2935528253256Napolitanietal2005NatImmunol68769776。DCはナチュラルキラーγδT細胞およびαβT細胞などの細胞性応答のさまざまなアームを活性化して増やすことができ、そして一度活性化されると、DCはその免疫能力を保持するSteinman1991AnnuRevImmunol9271296Banchereauetal1998Nature392245252Reidetal2000CurrOpinImmunol12114121Bykovskaiaetal1999JLeukocBiol66659666Clarketal2000MicrobesInfect2257272。シグナルのDC産生成熟DCはT細胞性免疫応答を活性化する上でより有利であると考えられているJonuleitetal2001IntJCancer93243251Prabakaranetal2002AnnSurgOncol9411418Xuetal2003JImmunol17122512261。成熟DCは、未成熟DCと比較して、より大きなT細胞応答を生成することができるが、それは一部には、特定のサイトカインが成熟DCによって分泌され、それらがより強力で効力のあるT細胞応答を増強するからである。例えば、成熟DCはCD4T細胞との相互作用によりIL12を産生するKochetal1996JExpMed184741746Heifleretal1996EurJImmunol26659668。IL12、IL18およびIL23などのTh1駆動性サイトカインを分泌するDCは、1型偏向DC、つまりDC1と呼ばれているKalinskietal1999ImmunolToday20561567Lanzavecchiaetal2000Science29054899297。成熟DCによって産生されたサイトカインはT細胞応答に多様な影響を及ぼす。例えば、ヘテロ二量体のサイトカインであるIL12はDCによって産生され、IFNγ分泌CD4およびCD8T細胞を生産しかつ抗菌および抗腫瘍応答を高めるのに極めて重要であるGeeetal2009InflammAllergyDrugTargets84052。IL12はまた、卵巣癌OVHMマウスモデルにおいて原発腫瘍だけでなく転移性腫瘍細胞の増殖を抑制することができるTatsumietal2001CancerRes6175637567。IL12はまた、高親和性の抗腫瘍T細胞の生成を媒介することができXuetal2003JImmunol17122512261、それによって抗腫瘍T細胞機能を改善する。DCはまた、第4のシグナルとしてケモカインを産生し、これらはT細胞の蓄積をもたらし、さらにT細胞応答を生じさせるXiaoetal2003Cytokine23126132。DCは、T細胞活性化にさらに影響を与える他のサイトカインを分泌することができる。例えば、DCは、Th17細胞を活性化するIL1、IL6およびIL23を分泌し得る。Th17細胞は、その特徴的なサイトカインIL17の産生によって病原体のクリアランスおよび組織の炎症に寄与する、近年確定された炎症性T細胞のサブセットであるKiklyetal2006CurrOpinImmunol18670675。IL12産生はより強力なTh1応答をもたらすことができる一方で、IL23産生はTh17細胞の成熟化をもたらすことができる。実際、IL12を産生するDCはIL23の存在下で主にTh1応答に偏向させることができるが、これに反して、IL12の非存在下でIL23を産生するDCは強いTh17応答に偏向させるRosesetal2008JImmunol18151205127AcostaRodriguezetal2007NatImmunol8639646。このように、特定のDC分泌型サイトカインはT細胞機能にそうした重大な影響を及ぼすので、成熟DCのサイトカインプロファイルを正確に把握することの重要性は、潜在的なT細胞エフェクターが結果として何を生じさせるかのかなり大きな尺度となる。したがって、成熟DCは、表面分子の発現のみによる従来の特徴づけよりもむしろ、その主要なサイトカインの産生およびT細胞へのシグナルのその後の影響によって、より効果的に特徴づけることができる。負荷したパルスした免疫細胞の生成本発明は、抗原に曝露された、または抗原でパルスされた細胞を包含する。例えば、DCなどのAPCは、例えば抗原の存在下でのエクスビボ培養によりインビトロで、または抗原への曝露によりインビボで、Ag負荷させることができる。当業者には容易に理解されるように、APCは、APCの表面への抗原の提示を促進するのに十分な時間にわたりAPCをその抗原に曝露する方法で、パルスすることができる。例えば、APCを、抗原ペプチドとして知られる小さなペプチド断片の形の抗原に曝露することができ、その抗原ペプチドはAPCの外側に直接パルスされるMehtaDamanietal1994;あるいは、APCを、全タンパク質またはタンパク質粒子とインキュベートすることができ、こうしたタンパク質は後でAPCによって取り込まれる。これらの全タンパク質はAPCによって小さなペプチド断片に消化され、最終的にAPCの表面に運ばれて提示されるCohenetal1994。ペプチドの形をした抗原は、本明細書に記載する標準的なパルス技術によって細胞に曝露することができる。どのような特定の理論によっても拘束されることを望まないが、外来抗原または自己抗原の形をした抗原は、その抗原の免疫原性形態を保持するために、本発明のAPCによってプロセッシングされる。抗原の免疫原性形態は、断片化による抗原のプロセッシングを含み、これにより免疫細胞、例えばT細胞により認識されかつ該細胞を刺激することができる抗原の形態が生成される。好ましくは、そのような外来抗原または自己抗原は、APCによってペプチドにプロセッシングされるタンパク質である。APCによって産生される関連ペプチドは、免疫原性組成物として使用するために抽出および精製することができる。APCによってプロセッシングされたペプチドは、APCによってプロセッシングされたタンパク質に対する免疫寛容を誘導するためにも使用することができる。本発明の抗原負荷APC別名パルスAPCとしても知られるは、インビトロまたはインビボのいずれかでAPCを抗原に曝露することにより生成される。APCがインビトロでパルスされる場合には、APCを培養皿に播種し、抗原をAPCに結合させるのに十分な量でかつ十分な時間にわたり、抗原に曝露することができる。APCへの抗原の結合を達成するのに必要な量および時間は、当技術分野で公知の方法あるいは本明細書で開示する方法を用いることにより、決定することができる。当業者に知られた他の方法、例えばイムノアッセイまたは結合アッセイを用いて、抗原に曝露した後のAPC上の抗原の存在を検出することもできる。本発明のさらなる態様では、APCによる特定のタンパク質の発現を可能にするベクターを用いて、APCをトランスフェクトすることができる。APCにより発現されたタンパク質は次にプロセッシングされて、細胞表面に提示される。その後、トランスフェクトされたAPCは、ベクターによりコードされたタンパク質に対する免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物として使用され得る。本明細書中の他の箇所で説明するように、ベクターは、免疫応答が望まれるタンパク質をコードしかつ発現する特定のポリヌクレオチドを含むように作製することができる。好ましくは、細胞に感染させるためにレトロウイルスベクターが用いられる。さらに好ましくは、細胞に感染させるためにアデノウイルスベクターが用いられる。別の態様において、ベクターは、APC上の受容体により認識されるタンパク質またはその一部をコードするようにウイルスベクターを修飾することによって、APCを標的とすることができ、それにより、APC受容体がそのベクターによって占有されると、ベクターのエンドサイトーシスが開始されて、ウイルスベクターの核酸によりコードされた抗原のプロセッシングおよび提示が可能となる。ウイルスにより運ばれる核酸は、そのウイルスにもともと存在するものであってよく、APC上に発現されるとき、ウイルスタンパク質をコードしており、その後そのウイルスタンパク質はプロセッシングされて、APCのMHC受容体上に提示される。本明細書中で意図されるように、ポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクトするためにさまざまな方法を用いることができる。こうした方法としては、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、コロイド分散系すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系、例えば水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが挙げられる。これらの方法は当技術分野で理解されており、当業者がこれらの方法を実施できるようにするために、既刊文献に記載されている。別の態様においては、抗原をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローン化して、そのベクターをAPCに導入することで、負荷APCを別の方法で生成することができる。さまざまなタイプのベクターおよび核酸を細胞に導入する方法は、入手可能な既刊文献に説明されている。例えば、発現ベクターは物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。例えば、Sambrookら2001MolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNewYork、およびAusubelら1997CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkを参照されたい。抗原をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入がパルス細胞をもたらすことは容易に理解される。本発明は、APCにパルスするためのさまざまな方法を包含し、限定するものではないが、タンパク質、cDNAまたはmRNAの形態の全抗原をAPCに負荷する方法が含まれる。しかし、本発明は、APCにパルスするために用いられる抗原の特定の形態に限定されると解釈されるべきでない。それどころか、本発明は抗原負荷APCを生成するための当技術分野で公知の他の方法を包含する。好ましくは、APCは特定した抗原をコードするmRNAでトランスフェクトされる。配列が知られている遺伝子産物に対応するmRNAは、適切なプライマーおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RTPCRを転写反応と一緒に用いて、インビトロで速やかに生成することができる。APCのmRNAによるトランスフェクションは、パルスAPCを生成するための他の抗原負荷技術より有利である。例えば、顕微鏡的微量の組織すなわち、腫瘍組織からRNAを増幅する能力は、多数の患者にワクチン接種するためのAPCの利用を拡大する。抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原組成物は細胞、組織または哺乳動物例えば、ヒトにおいてその抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。本明細書中で用いる免疫学的組成物は、抗原例えば、ペプチドまたはポリペプチド、抗原をコードする核酸例えば、抗原の発現ベクター、または抗原もしくは細胞成分を発現しているか提示している細胞を含むことができる。特定の態様において、抗原組成物は本明細書に記載される任意の抗原の全部もしくは一部、またはその免疫学的に機能性の等価物を含有するか、またはコードする。他の態様では、抗原組成物が追加の免疫刺激性物質またはそのような物質をコードする核酸を含有する混合物である。免疫刺激性物質としては、限定するものではないが、追加の抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞またはアジュバントが挙げられる。他の態様では、追加の物質の1つまたは複数が、任意の組み合わせで、抗原または免疫刺激性物質に共有結合される。特定の態様では、抗原組成物はHLAアンカーモチーフのアミノ酸にコンジュゲート化されるか、またはそれを含む。ワクチンは、本明細書で意図されるように、核酸および/または細胞成分のその組成において変化し得る。非限定的な例において、抗原をコードする核酸はアジュバントを用いて処方されてもよい。当然ながら、本明細書に記載の各種組成物は追加の成分をさらに含み得ることが理解されるだろう。例えば、1種または複数種のワクチン成分は脂質またはリポソーム内に含まれていてよい。別の非限定的な例では、ワクチンは1種または複数種のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチンとその各種成分は、本明細書に開示される方法により、または当業者に知られているように、本開示を踏まえて、調製および/または投与することができる。理解されるように、本発明の抗原組成物は当技術分野で周知の方法により調製することができ、こうした方法として、限定するものではないが、固相合成による化学合成とHPLCによる化学反応の他の生成物からの精製、またはインビトロ翻訳系もしくは生細胞での本発明の抗原を構成するペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列例えば、DNA配列の発現による生産が含まれる。さらに、抗原組成物は生物学的サンプルから単離された細胞成分を含むことができる。抗原組成物は単離され、1種または複数種の望ましくない低分子量分子を除くために十分に透析され、そして/または所望のビヒクルへの即時製剤化のために凍結乾燥される。さらに理解されるように、ワクチン成分に追加のアミノ酸、突然変異、化学的修飾などがあれば、それらはエピトープ配列の抗体認識を実質的に妨げないことが好ましい。本発明の1つまたは複数の抗原決定基に対応するペプチドまたはポリペプチドは、一般的に、長さが少なくとも5または6アミノ酸残基であるべきであり、そして最大約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45または約50残基ほどを含むことができる。ペプチド配列は、当業者に公知の方法で、例えばAppliedBiosystems社、FosterCityCAFosterCityCAから入手可能なような、自動ペプチド合成機を用いるペプチド合成により、合成することができる。より長いペプチドまたはポリペプチドは、例えば組換え手段によって、調製することもできる。特定の態様において、本明細書に記載される抗原組成物および/または成分をコードする核酸を用いて、例えば、本発明の種々の組成物および方法のためにインビトロまたはインビボで抗原組成物を生産してもよい。例えば、特定の態様では、抗原をコードする核酸が、例えば、組換え細胞内のベクター中に含まれる。その核酸を発現させて、抗原配列を含むペプチドまたはポリペプチドを生産することができる。そのペプチドまたはポリペプチドは細胞から分泌されてもよく、または細胞の一部としてまたは細胞内に含まれてもよい。特定の態様では、免疫応答は、抗原をコードする核酸を哺乳動物にトランスフェクトまたは接種することによって促進することができる。標的哺乳動物内に含まれる1つまたは複数の細胞が、哺乳動物への該核酸の投与後に、該核酸によってコードされる配列を発現する。ワクチンはまた、例えば、抗原のペプチドまたはポリペプチド配列の全部または一部をコードする核酸例えば、cDNAまたはRNAの形態であってもよい。該核酸のインビボ発現は、例えば、プラスミド型ベクター、ウイルスベクター、またはウイルス/プラスミド構築物ベクターによって行うことができる。別の態様では、核酸は、適切な抗原またはその免疫学的に機能性の等価物をコードする配列の全部または一部をコードするコード領域を含む。当然ながら、核酸は追加の配列を含むおよび/またはコードすることができ、限定するものではないが、1種または複数種の免疫調節剤またはアジュバントが含まれる。抗原本明細書で意図されるように、本発明は、免疫応答を引き出すための、APCに負荷するのに適した抗原の使用を含むことができる。一態様では、腫瘍抗原が用いられる。腫瘍抗原は大きく2つのカテゴリーに分けられる:共有の腫瘍抗原;および特異な腫瘍抗原。共有抗原は多くの腫瘍により発現される一方で、特異な腫瘍抗原は物理的または化学的な発癌物質を通して誘導される突然変異に起因することがあり、したがって、個別の腫瘍によってのみ発現される。特定の態様では、共有の腫瘍抗原が本発明のDCに負荷される。他の態様では、特異な腫瘍抗原が本発明のDCに負荷される。本発明の文脈において、腫瘍抗原とは、特定の過剰増殖性疾患に一般的に見られる抗原を指す。特定の局面では、本発明の過剰増殖性疾患の抗原は、限定するものではないが、以下を含む癌に由来するものである:原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌など。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として作用し得る多くのタンパク質を発現する。こうした分子としては、限定するものではないが、黒色腫におけるMART1、チロシナーゼおよびGP100などの組織特異的抗原、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼPAPおよび前立腺特異的抗原PSAが挙げられる。他の標的分子は、癌遺伝子HER2/Neu/ErbB2のような、形質転換関連分子のグループに属する。標的抗原のさらに別のグループは、癌胎児性抗原CEAなどの胎児腫瘍性抗原である。B細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍にユニークな、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。B細胞分化抗原、例えばCD19、CD20およびCD37は、B細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原のいくつかCEA、HER2、CD19、CD20、イディオタイプは、モノクローナル抗体を用いた受動免疫療法の標的として使用されて、一応の成功を収めている。腫瘍抗原およびその抗原性癌エピトープは、一次臨床分離株、細胞株などの天然源から精製し単離することができる。癌ペプチドとその抗原性エピトープはまた、当技術分野で知られた化学合成または組換えDNA法によって取得することもできる。化学合成法は、Stewardetal1969Bodanskyetal1976Meienhofer1983およびSchroderetal1965に記載されている。さらに、Renkvistetal2001に記載されるように、当技術分野では多数の抗原が知られている。類似体または人工的に改変されたエピトープは具体的に記載されていないが、当業者であれば、当技術分野の標準的な手段によりそれらを取得または生成する方法を理解している。抗体により同定され、そしてSerex技術Sahinetal1997およびChenetal2000参照により検出されるような、他の抗原は、Ludwig癌研究所LudwigInstituteforCancerResearchのデータベースにおいて同定される。さらに別の態様において、本発明は、APCによる提示のための微生物抗原を含むことができる。本明細書で意図されるように、微生物抗原の起源はウイルス、細菌または真菌であり得る。感染性ウイルスの例としては、以下が挙げられる:レトロウイルス科例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV1HTLVIII、LAVもしくはHTLVIII/LAV、またはHIVIIIとも呼ばれる;および他の分離株、例えばHIVLP;ピコルナウイルス科例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;腸内ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス;カリシウイルス科例えば、胃腸炎を引き起こす株;トガウイルス科例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス;フラビウイルス科例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス;コロナウイルス科例えば、コロナウイルス;ラブドウイルス科例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス;フィロウイルス科例えば、エボラウイルス;パラミクソウイルス科例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス;オルソミクソウイルス科例えば、インフルエンザウイルス;ブンヤウイルス科例えば、ハンタンウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス;アレナウイルス科出血熱ウイルス;レオウイルス科例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス;ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科B型肝炎ウイルス;パルボウイルス科パルボウイルス;パポバウイルス科乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス;アデノウイルス科ほとんどのアデノウイルス;ヘルペスウイルス科単純ヘルペスウイルスHSV1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスCMV、ヘルペスウイルス;ポックスウイルス科痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス;およびイリドウイルス科例えば、豚コレラウイルス;ならびに未分類のウイルス例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体B型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられる、非A非B型肝炎の病原体クラス1=内部的に伝染する;クラス2=非経口的に伝染するすなわち、C型肝炎;ノーウォークウイルスと関連ウイルス、およびアストロウイルス。感染性細菌の例としては、以下が挙げられる:ヘリコバクターピロリ、ボレリアブルグドルフェリ、レジオネラニューモフィラ、マイコバクテリウム属細菌例えば、ヒト型結核菌、Mアビウム、Mイントラセルラーレ、Mカンサシ、Mゴルドナエ、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿レンサ球菌A群レンサ球菌、ストレプトコッカスアガラクティエB群レンサ球菌、レンサ球菌ビリダンス群、糞便レンサ球菌、ストレプトコッカスボビス、レンサ球菌嫌気性菌種、肺炎レンサ球菌、病原性カンピロバクター属細菌、エンテロコッカス属細菌、ヘモフィルスインフルエンザ、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属細菌、豚丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクターエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラムルトシダ、バクテロイデス属細菌、フゾバクテリウムヌクレアーツム、ストレプトバシラスモニリフォルミス、トレポネーマペルテニュ、レプトスピラ属、およびアクチノマイセスイスラエリー。感染性真菌の例としては、以下が挙げられる:クリプトコッカスネオフォルマンス、ヒストプラスマカプスラーツム、コクシジオイデスイミチス、ブラストマイセスデルマチチジス、クラミジアトラコマチス、およびカンジダアルビカンス。その他の感染性生物すなわち、原生生物には、熱帯熱マラリア原虫およびトキソプラズマ原虫が含まれる。DCの活性化従来のDCベースのワクチン以前は臨床試験の中心になっていたは、最終的に無菌性炎症を刺激するTNF、IL6、PGE2およびIL1βの組み合わせを含むサイトカインカクテル混合物を用いてDCを成熟させたが、本発明は代わりにTLRアゴニストを利用して、DCを成熟させ、かつシグナルの産生を刺激するものである。本発明の一局面によれば、TLRリガンドの組み合わせを用いたDCの刺激は、増加した量のIL12の産生をもたらす。さらに、TLRアゴニストの組み合わせによるDCの活性化は、より顕著なCD4およびCD8T細胞応答をもたらすことができるWargeretal2006Blood108544550。したがって、本発明のDCは、TLRをトリガーするこれらのリガンドに曝露することによって、IL12などのTh1駆動性サイトカインを分泌することができる。例えば、IL1β、TNFα、およびIFNγに対するTLR3アゴニストであるポリICの添加は、高レベルのIL12産生により特徴づけられる強力な1型偏向DCを生成することができるHeifleretal1996EurJImmunol26659668。特定の態様では、TLRアゴニストへの曝露に先立ってDCに抗原を負荷することができる。他の態様では、TLRアゴニストへの曝露に続いてDCに抗原を負荷することができる。本発明の一局面によれば、TLR活性化を介して強力な抗腫瘍免疫応答を生み出す極めて効果的なDCを生成するために、新規な統合的アプローチが用いられる。活性化された先天的自己導入による免疫条件づけimmuneconditioningbyactivatedinnateautologoustransferICAITと呼ばれることもあるこのアプローチは、細菌感染をシミュレートする生体分子により特に活性化された単球由来DCを利用するものであり、それによってICAITDCが構築される。このユニークな活性化法は、無菌性炎症をもシミュレートするTNF、IL6、PGE2およびIL1βのサイトカインカクテル従来の成熟化で成熟させたDCには見られない性質を備えたDCを与えるLombardietal2009JImmunol18233723379。一態様において、本発明のICAITDCは、TLR4アゴニスト、細菌性リポ多糖LPS、TLR7/8アゴニスト、レシキモドR848および/またはIFNγの組み合わせを用いて活性化することができるAmatietal2006CurrPharmDes1242474254。TLR4アゴニストと細菌性LPSでDCを活性化することによって、従来の成熟化法により生成されたDC1と表現型の点で少なくとも実質的に同一であるICAITDCが生成される。これらのICAITDCはCD83、CD80、CD86およびHLADRを含む表面分子の高発現を有する。他の態様では、リポテイコ酸LTAなどのTLR2アゴニスト、ポリICなどのTLR3アゴニスト、および/またはMPLなどの他のTLR4アゴニストを使用してもよい。本明細書で意図されるように、任意のTLRアゴニスト、またはTLRアゴニストの組み合わせは、そのようなリガンドが活性化DCによるサイトカインおよびケモカインシグナルの産生を刺激するという条件で、DCを活性化するために用いることができる。他の多くのTLRアゴニストが当技術分野で公知であり、本発明とともに使用するために既刊文献中に見いだすことができる。ICAITDCと従来法で成熟させたDCの間には表現型の点で類似性があるにもかかわらず、本発明のICAITDCは多くの顕著な利点を示す。例えば、図1に示すように、ICAITDCは、従来法で成熟させたDCと比較して、より高いレベルのTNF、ならびに高レベルのIL12、CCL3MIP1αおよびCCL4MIP1β、CCL5RANTES、およびCXCL10IP10を産生する。これらの各因子は抗腫瘍免疫の側面を増強することができる。例えば、CXCL10IP10は腫瘍拒絶を高めるNK細胞を化学的に誘引するZingetal2005JInterferonCytokineRes25103112。TNFとIL12は抗血管新生であり、腫瘍への血液供給を欠乏させるAlbinietal2009JTranslMed75。IL12は、IFNγを分泌するTh1細胞の分化と動員を促進し、かつNK細胞を活性化する。これとは対照的に、従来法で成熟させたDCはこれらすべての生体分子の発現が非常に低いが、その代わりに、アレルギー反応とTh2細胞の動員に関連したサイトカインCCL17TARCを強く発現するXiaoetal2003Cytokine23126132。図1には、従来のDCが欠如しているユニークなキラー機能を発揮するICAITDCの能力も示されており、それによって、それらは乳癌細胞株を溶解することができる。こうして、本発明のICAITDCは有効な抗腫瘍分子であることが知られているサイトカインの産生を示すだけでなく、ICAITDCはまた感作されたT細胞の性質に良い影響を与える。図2に示すように、従来法で成熟させたDCとICAITDCはいずれも腫瘍抗原に対してT細胞をうまく感作することができるが、ICAITDCだけがHER2発現腫瘍を実際に認識するようにT細胞を条件づけることができる。このことは、腫瘍が従来のDC活性化に関連した手段によって感作T細胞による認識から腫瘍を保護するメカニズムを備えているが、こうしたメカニズムはICAITDCにより条件づけられた感作T細胞によって断たれることを示唆している。したがって、ICAITDCは従来のDCが保有しないユニークな性質を示し、そしてICAITDCモデルは優れたT細胞感作の条件づけ、腫瘍転移病巣tumordepositへの多系列エフェクターの走化性誘引、および癌細胞の直接破壊における支援を可能にする。免疫療法でのICAITDCの使用DCベースの癌ワクチンの開発に進展があったものの、現在のDCベースの癌ワクチンの成功を制限する相当数の課題が依然として存在する。最優先課題の一つは免疫系を回避する腫瘍の能力を取り除くことであった。それは、組織特異的な腫瘍関連抗原が弱い免疫原性を有し、したがって、宿主免疫応答を回避することができる、または免疫応答が腫瘍を免疫エディティングし、そのため抗原陰性腫瘍細胞を残して抗原陽性細胞を排除することができる、という事実に起因し得る。この免疫エディティングのプロセスは、免疫応答が腫瘍をより攻撃的な表現型の形に変え得る方法である。単一の組織特異的抗原のみを標的とすることがかなり限られた臨床的効果しか上げていない理由を、免疫エディティングが部分的に説明する可能性がある。標的化免疫エディティングの概念とともに、エピトープ拡散の考え方もまた、エフェクターT細胞の誘導を高めるための別の可能なメカニズムとして最近注目を集めている。DCを用いた大半の臨床試験は、組織特異的腫瘍タンパク質/抗原のみを標的にしている。しかし、過剰発現された場合には腫瘍性形質転換に関連づけられるのに、いまだに標的化されていない数多くの分子が存在している。例えば、抗アポトーシスファミリーのメンバーであるサバイビンは、転写STAT3経路のシグナル伝達および活性化剤の直接の下流標的であることが理解されているGritskoetal2006ClinCancerRes121119。STAT3シグナル伝達の直接阻害はサバイビンタンパク質の発現を阻止して、乳癌細胞のアポトーシスを開始させる。また、HER2/neu過剰発現の誘導はサバイビンをアップレギュレートすると考えられるSiddiqaetal2008BMCCancer8129。よく知られた腫瘍抗原HER2/neuとシグナル伝達経路の遺伝子サバイビンとのこの関連性は、乳癌の病因における複数のエフェクターを標的にする新規な免疫治療的介入を開発するための大きな可能性を提供する。サバイビン遺伝子の他の免疫原性ペプチドが同定されており、こうして、本発明のシステムおよび方法を介した抗サバイビン、DCベースの治療法の開発は非常に説得力があり、確立された抗HER2/neu、DCベースのワクチン接種との組み合わせで、エストロゲン非依存性乳癌の退行とおそらく予防に大きな影響を及ぼすことが可能であるRekeretal2004CancerBiolTher3180183。タンパク質HER1/EGFRは、本発明のシステムおよび方法に従って開発されたDCベースのワクチンの標的として機能し得る新規な分子のさらに別の例である。サバイビンとともに、HER1/EGFRもDCベースの癌ワクチンのための新規な非組織特異的標的として役に立つ。HER1/EGFRの過剰発現または変異は、乳癌、結腸直腸癌、脳神経膠腫多形、膵臓腺癌および非小細胞肺癌に及ぶ多様な悪性腫瘍の発癌に関係しているHynesetal2009CurrOpinCellBiol21177184。DCは本明細書に記載するようにHER1/EGFRでパルスして活性化することができ、したがって、抗HER1/EGFRT細胞応答を発現させることができる。ムチン1MUC1もまた、癌ワクチンの標的として機能することができる。MUC1は、乳癌、胆管腺癌および膵臓腺癌を含めて、多くの腺癌において高度に発現されかつ異常にグリコシル化される、上皮細胞の糖タンパク質であるVladetal2004AdvImmunol82249293vonMensdorffPouillyetal2000IntJBiolMarkers15343356。MUC1の過剰発現は腫瘍の浸潤および転移に関係している。MUC1の過剰発現がいくつかの血液および上皮の悪性腫瘍と関連づけられることを考えると、抗MUC1DCベースのワクチンを組織特異的腫瘍標的に対するワクチンと組み合わせることにより、臨床的に意義のある結果が得られる可能性がある。これらの分子を標的とすることは腫瘍性細胞の増殖に大きな影響を及ぼすことができ、したがって、疾患の進行を止めることができる。DCベースのワクチンはサバイビンおよびHER1/EGFRなどのタンパク質を含むことができるため、疾患の進行は多重標的化ワクチン接種のアプローチを用いて臨床的に影響される可能性がある。本明細書で意図されるように、CSCもまた、本発明の新規なDCベースのワクチンのための免疫治療標的である。幹細胞の亜集団は、さまざまな新生物を駆動しかつ維持すると考えられているWichaetal2006CancerRes6618831890。CSCに関連する経路は調節を欠いており、こうして、従来の治療に抵抗性の腫瘍を生成するCSCの無制御な自己複製を起こすと考えられているEyleretal2008JClinOncol2628392845。現在の癌治療介入は分化した腫瘍細胞を標的にしているが、CSCの集団は残したままとするEyleretal2008JClinOncol2628392845。しかし、病気の再発を開始させかつ/または標準的な治療法の治療効果を制限する可能性があるのは、CSCの集団である。したがって、これらの細胞において新たな治療標的を同定するために、CSCの自己複製および生存の側面を制御するシグナル伝達経路のより良い理解に基づいて、新戦略を設計することが不可欠である。幹細胞マーカーは、血液の悪性腫瘍、ならびに脳腫瘍、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、頭頸部癌、および結腸癌を含めて、多くのヒト悪性腫瘍において同定されている。幹細胞マーカーの同定に加えて、Wnt、NotchおよびHedgehogなどの、自己複製および細胞分化を調節する経路も非常に詳しく解析されつつあるKakaralaetal2008JClinOncol2628132820Medinaetal2009ClinTranslOncol11199207Bolosetal2009ClinTranslOncol111119Bissonetal2009CellRes196683697。特定の腫瘍標的化DCワクチンの開発に採用されているのと同じメカニズムが、CSCに固有の分子を標的とするためにも利用可能である。すべての乳癌細胞が同等であるとは限らないこと、そして乳房CSCのサブセットが浸潤および転移性疾患の発生に関与しているかもしれないことが考えられる。ヒト乳癌は、幹細胞の性質を示す、細胞表面マーカーCD44/CD24low/linの発現により特徴づけられる細胞集団を含むAlHajjetal2003ProcNatlAcadSciUSA10039833988。幹細胞集団を制御する分子の中にHER2/neuがある。幹細胞マーカーアルデヒドデヒドロゲナーゼ1の発現とHER2/neuの過剰発現の間には相関関係がある。例えば、一連の477の乳癌において、正常ヒト乳腺上皮細胞および乳癌におけるHER2/neu過剰発現は、ALDH1を発現する幹細胞の割合の増加と相関しているGinestieretal2007CellStemCell5555567。HER2/neu発現と幹細胞のこの相関は、CSCの特定のマーカーを同定することで、本発明のシステムおよび方法腫瘍抗原を標的にするだけでなく、幹細胞などの自己調節細胞を排除することを目指しているを用いたDCベースのワクチンの開発がいかに促進され得るか、の絶好の例になる。CSCと常にリンクしている分子を標的にすることは、発癌のイニシエーターとして機能し得る多能性細胞のクローンを減らすことによって、一部には癌の予防に効果的であり得る。DCベースのワクチンの開発に関連して本発明を考慮に入れることによって、癌ワクチンの開発は同様に、CSCに特有の分子を標的にすることに狙いを定めることができる。CSCで発現される分子を標的にすることによって、おそらく、全身再発の多くに関与しかつ現在の抗癌治療の失敗の原因である細胞のクローンを排除することが見込まれる。それを達成するために、CSCに特有の分子を同定し、その後、本明細書で意図されるとおりに、DCベースの免疫療法を実行に移して、幹細胞に特有の分子を標的にすることができる。制御性細胞機能の阻害本発明はさらに、TLRリガンドが提示細胞を活性化するだけでなく、適応応答を制限するように機能する制御性細胞をも阻害することを実証する。特定の態様において、TLR2、TLR4、TLR8およびTLR9を含む複数のToll様受容体を介したシグナル伝達は、Tregによる抑制を逆転させる。TLR4活性化樹状細胞は、レスポンダー細胞に対するTreg効果を阻害するだけでなく、レギュレーターそれ自体をIFNγ産生エフェクターに変換するらしいことが実証される。LPSおよびIFNγで活性化された樹状細胞は、レスポンダー細胞の増殖に対する制御性T細胞の阻害効果を打ち消したが、サイトカインで成熟させたDCはそうでなかった。この効果は、TLR活性化DCの存在下でのアポトーシスマーカーの発現に変化がないので、細胞死に起因するものではない。本明細書で実証されるように、TLR活性化樹状細胞を半透膜によってレギュレーターとレスポンダーの両方から分離したときでさえ、レスポンダー細胞増殖の回復が観察された。この効果は可溶性因子によるものであるが、IL6およびIL12のいずれにも非依存性である。さらに、この未知の可溶性メディエーターは、レスポンダー細胞ではなく、レギュレーターそれ自体に少なくとも部分的に作用するようである。本明細書で実証されるように、TLR活性化樹状細胞は、制御性T細胞におけるサイトカイン産生とエフェクター機能を誘導することができる。制御性T細胞はTLR活性化樹状細胞の存在下で相当量のIFNγを産生するが、未成熟なまたはサイトカインで成熟させた樹状細胞の存在下では産生しない。IFNγ産生はTh1転写レギュレーターTbetのアップレギュレーションと関連しており、そしてIFNγ産生レギュレーターのかなりの割合がTbetとFoxP3を同時発現している。レスポンダー細胞増殖へのLPS活性化樹状細胞の効果はIL12非依存性であるが、Tbetのアップレギュレーションは中和抗IL12抗体によって阻害される。したがって、LPSで活性化された単球由来DCは、サプレッサーT細胞を阻害しかつこれらのレギュレーターを動員してTh1エフェクターにすることによって、部分的に免疫応答の表現型を誘導することができる。凍結保存先に説明したように、本発明は、ICAITDCの開発を介して優れたAPCを生成するためのシステムおよび方法を提供するだけでなく、解凍後にT細胞機能にとって欠かせないシグナルを産生する能力を保持する方法で、これらの活性化DCを凍結保存するためのシステムおよび方法をも提供する。本明細書で意図されるように、本発明は、当業者が理解しているような、さまざまな凍結保存技術および凍結用培地を包含する。例えば、特定の態様において、培養細胞のための凍結用培地は約5~10のDMSOまたはグリセロールおよび10~50の血清、例えばヒト血清を含むことができる。他の態様では、凍結用培地は無血清であり得る。特定の態様では、速度制御凍結を用いることができる一方で、他の態様では、絶縁容器の使用を含むことができ、そこでは凍結用培地と混合された細胞のバイアルが、例えば約70°C~80°Cの温度のフリーザー内に配置される。本発明は、活性化ICAITDCを保存するための方法であって、こうした細胞の臨床応用をさらに促進し、かつ広範に繰り返されるフェレーシスおよびエルトリエーション段階の必要性を減らすやり方で保存する方法を提供する。本明細書で意図されるように、凍結保存技術は小規模および大規模の両バッチに使用することができる。活性化DCの広範な有用性を考えるとき、凍結保存した活性化DCを安定して供給できるということは、このような細胞の多様な治療上の使用を促進することができるという大きな利点を表している。例えば、活性化DCの大規模培養物は、本発明の方法に従って、適当なサイズのアリコートに分けて凍結保存することができ、その結果、各用量の細胞を特定の免疫治療プロトコルにおいて後で用いることができる。特定の態様では、活性化DCを約70°C以下の温度で2~24週間凍結保存することが可能である。より低い温度、例えば約120°C以下では、活性化DCを少なくとも1年間またはそれより長く凍結保存することができる。例示的な一態様において、DCはヒト血清および約10v/vのDMSO中に懸濁される。あるいは、ウシ胎児血清などの他の血清型を使用してもよい。懸濁した細胞は、18mlバイアル中などに、より小さいサンプルに等分して、約70°C以下で貯蔵することができる。他の態様では、凍結用培地が約20の血清および約10のDMSOを含んでいてよく、懸濁した細胞を約180°Cで貯蔵することができる。さらなる態様には、血漿増量剤である約55のオキシポリゼラチン、約6のヒドロキシエチルデンプン、および約5のDMSOを含有する培地が含まれる。他の例示的な凍結用培地は、約12のDMSOおよび約25~30の血清を含むことができる。本明細書に記載の本発明は特定の濃度の血清を含むことができるが、当業者には理解されるように、凍結用培地中の血清の正確な量はさまざまに変化してよく、いくつかの態様では完全になくてもよいが、一般的には約1~30の範囲内である。当然ながら、約50の細胞生存率および/または約50の細胞回収率をもたらす血清濃度はどれも、本発明の任意のICAITDC組成物において、ならびに本明細書に記載の任意の凍結保存法とともに使用することができる。所定の凍結用培地中の凍結保存細胞を回収する際には、好ましくは少なくとも60、さらに好ましくは少なくとも約70、あるいはさらに80の細胞生存率および回収率が望まれる。同様に、本明細書に記載の本発明は特定の濃度のDMSOを含むことができるが、いくつかの態様ではDMSOが完全になくてもよい一方で、他の態様では約5から約20もの高い濃度を凍結用培地中で使用することができ、また、本明細書に記載の凍結保存法に含めることができることを当業者は認識すべきである。一般的には、約5~約10のような、低い濃度のDMSOが好適である。しかし、解凍後に、少なくとも50の細胞生存率と少なくとも50の細胞回収率、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも約70、より好ましくは約80、さらにより好ましくは約90またはそれ以上の細胞生存率および回収率をもたらす、DMSOの任意の濃度を用いることができる。本明細書に記載の本発明は速度制御凍結への言及を含むことができるが、速度を制御したまたは制御しないやり方で凍結する方法をルーチンに使用できることが当業者には理解されるはずである。また、本明細書に記載のさまざまな凍結保存培地は血清を含んでもよいし、無血清であってもよいことが当業者には理解されるはずである。無血清培地の例には、XVIVO10、XVIVO15、XVIVO20、StemPro、ならびに市販の無血清培地が含まれる。無血清の凍結用培地を利用する場合、本発明の凍結保存法は一般的に、感染性病原体、抗原性であり得る抗体および外来タンパク質、ならびに血清ベースの凍結用培地中に通常見いだされる他の外来分子を含まない。抗原負荷した活性DCの凍結保存は、TLRアゴニストで細胞を活性化した後の任意の時点で行うことができる。一態様では、活性化DCはTLRアゴニストに曝露してから約6~8時間後に凍結保存される。好ましくは、活性化細胞を凍結保存するために選ばれる時点は、その細胞のシグナルの産生、特にIL12産生の最大化に基づくべきである。治療への応用本発明は、凍結保存から解凍されたとき、相当なレベルのサイトカインおよびケモカインを産生する、抗原負荷および活性化したAPCの生成を含み、ここで、抗原負荷および活性化したAPCは哺乳動物、好ましくはヒトの免疫療法において使用される。APCにより提示された抗原への応答は、細胞溶解性T細胞応答、ヘルパーT細胞応答、および/または抗原に対する抗体応答の誘導を、当技術分野で周知の方法を用いてモニタリングすることによって測定することができる。本発明は、以下の段階を含む、哺乳動物における免疫応答の増強方法を包含する:哺乳動物例えば、患者から得られた単球から未成熟DCを生成する段階;未成熟DCを、抗原組成物を含む組成物でパルスする段階;抗原負荷したDCを少なくとも1種のTLRアゴニストで活性化する段階;抗原負荷して活性化したDCを凍結保存する段階;抗原負荷して活性化したDCを解凍し、その後、抗原負荷して活性化したDCを、それを必要とする哺乳動物に投与する段階。前記組成物は少なくとも抗原を含み、さらに、哺乳動物のエクスビボ免疫化および/またはインビボ治療のためのワクチンであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。エクスビボでの手順は当技術分野でよく知られており、以下でより詳しく説明される。簡単に述べると、細胞を哺乳動物好ましくは、ヒトから分離する。その細胞は治療効果を与えるために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、細胞は該レシピエントに対して自己であってよい。あるいは、細胞は該レシピエントに対して同種異系、同系または異種とすることもできる。一態様では、末梢血単球を白血球フェレーシスとエルトリエーションの組み合わせによって患者から取得する。単球はGMCSFとIL4を含むSFM中で一晩培養することができる。翌日、未成熟DCを抗原でパルスし、続いて該DCをIFNγおよびLPSと接触させることができる。活性化されたDCはその後凍結用培地に懸濁させて、免疫療法での使用準備が整うまで凍結することができる。凍結保存したICAITDCは、新たに活性化したICAITDCと比較して、細胞の回収パーセントおよび生存パーセントをもたらすのに効果的な条件下でエクスビボで培養することができる。凍結保存サンプルから生成されたICAITDCは、新たに調製したICAITDCと比較して、同様の安定性を示すことができる。さらに、凍結保存した成熟DCと新たに調製したDCのそれとの比較は、実質的に同一の表現型ならびにシグナル分泌プロファイルを示すことができる。本明細書で意図されるように、ICAITDCは、小規模と大規模の両方で、本明細書に記載のさまざまな凍結用培地中にて約70°C~80°Cの温度で約2~24週間保存することができる。約120°C以下の温度では、細胞の回収率、生存率、およびDCの機能性に影響を及ぼすことなく、貯蔵期間を無限にまたは少なくとも24週を超えて延長することができる。例えば、特定の態様では、活性化した細胞は、少なくとも1年間保存しても、解凍後にシグナルを産生する能力をまだ保持することができる。本発明は、細胞の解凍時に有効な回収率および生存率のプロファイルを提供し、さらに本明細書に記載の凍結保存条件は、本明細書全体を通して説明されるように、シグナルプロファイルを保持するICAITDCの能力に影響を与えない。例示的な態様において、ICAITDCの活性化後に、細胞を予め冷却したヒト血清中に再懸濁させ、続いてそのサンプルに約10のDMSOを加えることによって、凍結保存を行うことができる。その後、混合物を18mlバイアルに分注し、凍結チャンバー内で約80°Cにて一晩凍結することができる。翌日、バイアルを液体窒素タンクに移すことができる。約2~24週の凍結保存後、凍結ICAITDCを解凍して、その回収率と生存率を調べることができる。そのようなICAITDCの回収率は約70以上とすることができ、同時に生存率も約70以上であり得る。他の態様では、DCまたは単球を、細胞の活性化に先立って凍結保存することが可能である。あるいはまた、造血幹細胞および造血前駆細胞のエクスビボ増殖のための手順が、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5199942号に記載されており、そうした手順を本発明の細胞に適用することができる。米国特許第5199942号に記載される細胞増殖因子に加えて、flt3L、IL1、IL3およびckitリガンドなどの他の因子を細胞の培養と増殖のために用いることができる。さまざまな細胞選別技術が、細胞集団から細胞を同定して分離するために知られている。例えば、モノクローナル抗体または他の特定の細胞結合タンパク質は、細胞上に見られるマーカータンパク質または表面抗原タンパク質に結合させるために使用することができる。幾つかのそのようなマーカーまたは細胞表面抗原が当技術分野で知られている。ワクチン製剤本発明はさらに、免疫療法で使用するのに適したワクチン製剤を包含する。特定の態様において、ワクチン製剤は、癌および感染症などの疾患の予防および/または治療に用いられる。一態様では、癌を予防および/または治療するための本発明に従うワクチンの患者への投与は、癌を摘出する外科手術の前または後に、癌を治療するための化学療法の前または後に、そして癌を治療するための放射線療法およびこれらの任意の組み合わせの前または後に、行うことができる。他の態様では、ワクチン製剤は他の組成物または医薬品との併用または組み合わせで患者に投与することができる。本発明はまた、癌にかかっていないものの、癌を発症するリスクがある個体において、癌を予防するためにも使用可能であることを認識すべきである。本発明に従って調製される癌ワクチンの投与は、癌ワクチンの一部を形成する抗原の選択によって部分的に決定される癌の予防または治療に広く適用可能である。本発明の実施により適切に治療され得る癌としては、限定するものではないが、以下が挙げられる:肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、食道癌、脳腫瘍、精巣癌、子宮癌、ならびに各種の白血病およびリンパ腫。一態様において、本発明によるワクチンは治療すべき腫瘍または癌細胞から誘導することができる。例えば、肺癌の治療において、肺癌細胞は肺癌ワクチンを製造するために上述したように処理されるだろう。同様に、乳癌ワクチン、結腸癌ワクチン、膵臓癌ワクチン、胃癌ワクチン、膀胱癌ワクチン、腎臓癌ワクチンなどが製造され、そのワクチンが製造された腫瘍または癌細胞を予防および/または治療するための実施基準に従って免疫療法剤として使用されるだろう。他の態様において、本発明によるワクチンは、述べたように、病原体により培養培地中に流された関連抗原を回収することによって、哺乳動物に影響を与えるさまざまな感染症を治療するために製造することができる。同じ疾患を引き起こす生物の多様な変種から発現された、免疫原性のある防御抗原のタイプには異質性が存在するので、重要な異なる抗原を発現する生物のプールからワクチンを調製することによって、多価ワクチンを製造することができる。本発明の別の態様では、ワクチンは鼠径部リンパ節にリンパ節内注射によって投与することができる。あるいは、ワクチンの標的に応じて、ワクチンは治療を受ける患者の四肢、腕と脚、に皮内または皮下投与することができる。このアプローチは、感染症の予防または治療を含めて、黒色腫および他の癌にとって一般に満足のいくものであるが、筋肉内または血流内などの他の投与経路を使用することも可能である。さらに、ワクチンは、ワクチンの活性および患者の応答を高めるために、アジュバントおよび/または免疫調節剤と一緒に投与することができる。そのようなアジュバントおよび/または免疫調節剤は当業者に理解されており、入手可能な既刊文献にわかり易く記載されている。本明細書中で意図されるように、そして生成されるワクチンのタイプに応じて、ワクチンの生産は、必要ならば、バイオリアクターまたは発酵槽または細胞の大量増殖に適する他のそのような容器もしくはデバイスで細胞を培養することによって、スケールアップすることができる。そうした装置では、任意の物質または抗原が培養培地中で分解される前にそのような物質または抗原を培地から回収するために、培養培地が定期的に、頻繁に、または連続的に集められる。必要に応じて、本発明に従って生産および回収されたワクチンまたは抗原を含有する、持続的または間欠的放出に適するデバイスまたは組成物は、実際には、そのような物質の体内への比較的遅い放出または徐放のために、体内に埋め込まれるか、そこに局所的に適用される。ワクチン製造の他の手順は、特定のワクチンの要件を満たすために個別化することができる。そのような追加の手順については当業者が理解しているだろう。例えば、集められた特定の抗原物質を濃縮し、ある場合には界面活性剤で処理し、そして移植アロ抗原を除くために遠心分離することができる。本明細書に記載のこれらの方法は決して包括的なものではなく、特定の使用に適合するさらなる方法が当業者には明らかだろう。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが知られている化合物から類推して、さらに近似させることができる。本発明を以下の実施例を参照しながら説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明はこれらの実施例に限定されるのではなく、本明細書中に提供される教示の結果として明白な、すべての変更を包含する。本明細書に開示される実験は、免疫療法で用いるために解凍したときの、抗原負荷して活性化したDCの機能性に及ぼす凍結保存の影響を調べるために実施された。解凍された細胞は、サイトカインおよびケモカインの産生を介して、強いTh1細胞応答の方へ条件づける能力を保持しており、さらに腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力を備えている。ここで、本明細書に開示された実験および実施例で用いられる材料と方法を説明する。ICAITDCの凍結保存:DCを穏やかなスクレーピングにより回収した。すべての培地と細胞は常に氷上で保持した。細胞を約800rpmで10分間遠心分離することにより穏やかに洗浄した。10×106個の細胞をヒト血清および10DMSO中に慎重に懸濁させて、18mlバイアルに移した。細胞を80°Cの発泡絶縁Nalgen容器内のイソプロパノール浴中で凍結させた。凍結状態は1°C/分ずつ温度を下げて実験室で達成された。凍結源としてN2を用いる生物学的冷凍装置内で細胞を凍結することもできる。18~24時間後、細胞を液体N2タンクの蒸気相にすばやく移動させた。タンクの蒸気領域は、温度が約135°Cより高くならないように、外部から制御される。DCの解凍:細胞を37°Cの水浴に移した。ほぼ解凍されたら、細胞を氷冷DC培地中に懸濁させるために、細胞を含むピペットを該培地中に穏やかに下げて、細胞を該培地に滴下放出させた。細胞を800rpmで5分間遠心分離し、再懸濁させた。細胞をカウントして、使用に備えた。凍結保存のためのICAITDCの調製:新たにエルトリエートした骨髄性単球を6ウェルのマイクロプレート12×106個/ウェルで培養した。培養培地はSerumFreeMediumSFMInvitrogen社CarlsbadCAから成っていた。添加したGMCSFの最終濃度は50ng/mlで、IL4の最終濃度は1000U/mlであった。細胞を37°C、5CO2で一晩培養した。一部のバッチでは、細胞を16~20時間後に適切なペプチドでパルスし、さらに6~8時間培養してから1000U/mlのIFNγを添加した。樹状細胞をTLRアゴニストLPSTLR4、10ng/mlまたはR848TLR8、1μg/mlで成熟させた。成熟化時間は少なくとも約6時間とした。それ以降は、TLRアゴニスト活性化DCは、凍結保存または即時使用の準備ができた状態であった。ここで、本明細書に提示した実験の結果を説明する。実施例1:凍結保存された活性化ICAITDCは新たに生成されたICAITDCと同様のレベルでシグナル産生を保持する最初に、凍結保存された活性化DCの生存率と回収率を測定した。トリパンブルー排除を用いて、凍結保存ICAITDCの生存率と回収率を、凍結保存前および凍結保存DCの解凍と洗浄遠心分離によるの直後に測定した。図3Aおよび3Bに示すように、凍結保存DCの2バッチの5つの単一例が示される。生存率は新たに調製したDC1と凍結保存したDC1の間で同等であり、回収率は一般的に約80~90であった。回収率は、新たに調製したDC1の収集による細胞の損失のため、新たに調製したDC1からの回収率よりも凍結保存サンプルにおいてはるかに優れていた。次に、シグナルの産生を、新鮮なICAITDCと凍結保存ICAITDC間で比較し、同時に、サイトカイン媒介DC成熟化CMDCなどの従来の成熟化技術からのシグナル産生レベルと比較した。図4Aに示すように、シグナル3IL12の継続的な産生がELISAアッセイにより測定された。凍結保存ICAITDCは同様にかなりのレベルのIL12産生を示した。重要なことは、凍結保存ICAITDCからのIL12産生が凍結保存CMDCまたは新鮮なCMDCのいずれよりも顕著に高かったことであり、これは、凍結保存ICAITDCが従来法で成熟させたDCより優れたサイトカインおよびケモカインプロファイルを保持しており、結果的にT細胞応答を誘発する上でより効果的な細胞であることを実証している。図4Bに示すように、解凍後2時間および12時間でのIL12産生レベルは、凍結保存前に見られたIL12産生レベルと同様であった。CD4T細胞のアロ感作allosensitizationを調べるために、精製した同種CD4細胞の2つのサンプル1×106個/ウェルを、凍結保存したTLRアゴニスト刺激DC1×105個/ウェルと共培養し、凍結保存単球から調製したDC1と比較した。図5に示すように、9日後、T細胞を収集し、抗CD3および抗CD28抗体をコーティングしたプレート上で再刺激した。24時間後に上清中のT細胞から産生されたIFNγレベルを分析した。実施例2:CD4CD25T細胞は未成熟な樹状細胞の存在下でレスポンダー細胞増殖を阻害するがDC1樹状細胞の存在下では阻害しない以前に、エルトリエートした精製CD14単球は、DCシグナル伝達剤で処理したとき、活性化DCの特性を獲得することが実証されたCzerniecki1997。最近では、IFNγおよびTLR4アゴニストLPSを用いて生成された、これらの単球由来の腫瘍抗原担持樹状細胞LPS活性化DCは、非浸潤性乳管癌の患者において標的化免疫応答を促進することが実証されたCzernieckietal2007CancerRes6718421852。これまでの研究は、LPSを含むTLRアゴニストがCD4CD25Foxp3T細胞により媒介される免疫抑制を抑止することができることを一貫して実証した文献。したがって、TLR活性化DCはTreg媒介免疫抑制を逆転させる能力があるかもしれないと仮定される。この仮説を検討するために、未成熟な樹状細胞iDC対LPS活性化単球由来DCの存在下で、TCR刺激抗CD3に対するCD4およびCD8リンパ球の増殖を阻害するヒトCD4CD25T細胞の能力を比較する実験が設計された。125×105個のソーティングされたCD4CD25T細胞を、25×105個のCFSE標識未分画リンパ球CD4およびCD8陽性および1×105個の未成熟樹状細胞と混ぜ合わせた。図6に示すように、5日目のCD4およびCD8陽性T細胞の増殖応答はどちらも、Tregの非存在下に対してTregの存在下で阻害された。ソーティングされたCD4CD25T細胞の増殖が同様に阻害され、この結果が未分画レスポンダーを用いることの純粋に人為的な結果である可能性を除外するデータは示さず。これとは対照的に、IFNγおよびLPSを用いて成熟させたDC樹状細胞を含めると、レギュレーターの存在にもかかわらず、CD4およびCD8陽性T細胞の両方の増殖が回復した。TregおよびLPS活性化DCの存在下でのレスポンダーの増殖は、レギュレーター集団の非存在下での増殖に類似していた。単球由来DCを成熟させるために用いたLPSが共培養物を汚染してこの結果につながったということは、LPSによるiDCの短時間15分の前処理によって除外された。抑制はこの設定で影響を受けておらず、これはDC集団が正式に成熟化される必要があること、そして汚染LPSがその結果に関与しないことを示している。注目すべきことに、従来のサイトカインベースの成熟化カクテルIL1、IL6、TNFα、PGE2を用いて成熟させた樹状細胞は、レギュレーターの存在下でエフェクターの増殖を十分に回復しなかった。これらの結果は、単球由来のLPS成熟化DCが、抗CD3に応答して、CD4およびCD8陽性T細胞の両方のTreg媒介抑制を阻害することを実証している。CFSEの使用、より具体的にはエフェクター細胞のみのラベリングは、この実験モデルの中心的な側面である。他の多くの研究で抑制を実証するために用いられた増殖アッセイは、トリチウムチミジンへの依存に悩まされている。制御性T細胞は完全にはアネルギー性でなく、実際には、特に炎症シグナルとの関連において、相当な増殖能を持っていることが多数の報告で実証されているBrinsteretal2005JImmunol17573327340Kleinetal2003ProcNatlAcadSciUSA10088868891。トリチウムチミジンに基づくアッセイは、確認された増殖の違いが少なくとも一部には制御性成分に起因している可能性を除外することができない。CFSEベースのアッセイは、特にエフェクター細胞間の増殖を追跡しており、そしてTregおよび/またはさまざまな樹状細胞集団の存在/非存在下でこれらのエフェクターの増殖を直接比較している。そうすることで、それは、CD4CD25レギュレーターによる増殖が結果の誤解釈を促進する可能性を排除している。実施例3:DC1樹状細胞によるTreg機能の阻害は可溶性因子によって生じるがIL6およびIL12非依存性であるDC1集団がTreg媒介抑制を阻害するメカニズムを特徴づけるための実験が設計された。DC1樹状細胞が制御性T細胞補完物でのアポトーシスを誘導することによってTreg媒介抑制を阻害するのかどうかを調べるため、ソーティングされたCD4CD25T細胞をiDCおよびLPS活性化DCと共培養し、24時間後にアポトーシスマーカーであるアネキシンVおよび7AADの発現を比較した。5日目に確認された増殖性の違いがかなり早くアポトーシス事象から生じるという推定により、その時点として1日目が選ばれた。24時間の培養後、図7Aアネキシン/7AADおよびアネキシン/7AADグループについてp>02に示すように、アネキシンVと7AADの両方の発現は、どちらの樹状細胞集団と共培養したTreg間でも同様であった。これらのデータは、未成熟な樹状細胞と比較して、LPS活性化DC集団がTregアポトーシスを大幅に変更しないことを示唆している。Treg媒介抑制に対するLPS活性化単球由来DC細胞の効果がアポトーシスによるものでないことが立証されたので、この効果が細胞接触依存性であるのかまたは可溶性因子によって媒介されるのかを調べるために、CFSE標識エフェクター細胞を、未成熟樹状細胞の存在下で、その後半透性Transwell登録商標メンブレンで分離された別のDC集団を添加して、未標識CD4CD25T細胞と共培養した。未成熟樹状細胞の追加の補完物をTranswell登録商標メンブレンに添加した場合は、図7Bに示すように、iDCの存在下で抑制に対する効果が見られなかった。しかし、LPS活性化DC集団をTranswell登録商標メンブレンに添加した場合は、TregをこれらのDCと直接共培養したときに見られたものと同様のTreg媒介抑制の中断が観察された。DCそれ自体がTranswell登録商標を通って移動したことにより抑制を中断したという可能性を照合するために、制御性T細胞を、樹状細胞の非存在下で、しかしメンブレンによって分離されたLPS活性化DCを添加して、CFSE標識エフェクターと共培養した。ごくわずかな増殖が認められた。これらのデータは、まとめると、LPS活性化DC集団が細胞接触非依存的にTreg媒介抑制を阻害することができることを示唆している。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、抑制の中断のための最も可能性の高い2つの可溶性メディエーターはIL12とIL6であると考えられる。LPS活性化DC集団は、主にTh1免疫応答の発現に関与している大量のIL12の分泌によって特徴づけられるXuetal2003JImmunol17122512261。IL6はインビトロでTreg媒介抑制のLPS媒介逆転の中心に位置することが分かっているPasareetal2003Science29910331036。IL6またはIL12の中和がLPS活性化DCの存在下でTregの抑制効果を復元するかどうかを試験したところ、図7Cに示すように、TregおよびIFNγ/LPS活性化DCの存在下でのエフェクターの増殖は、中和抗IL12抗体を含めることによって最小限に影響を受け、そして抗IL6を含めることによって本質的に影響を受けないことが判明した。Transwell登録商標実験と一緒にまとめると、これらのデータは、IL6およびIL12以外の可溶性因子がLPS活性化DCにより生じた抑制の中断を媒介しており、かつアポトーシスに依存しない方法でそうすることを示唆している。前述の実験は、DC集団がレギュレーター自体に作用するのか、またはTreg阻害からレスポンダー細胞を単に解放するのか、判別することができない。DC効果は可溶性因子を介して生じるので、LPS活性化DCから採取した培地によるレギュレーターまたはレスポンダーの前処理がTreg媒介抑制を逆転するかどうかを評価するために、ソーティングされたCD4CD25T細胞またはCFSE標識エフェクター細胞を、等量ずつの培養培地とLPS活性化DC培養物から移した培地中で培養した。これらの細胞を24時間後に収集して洗浄し、その後、共培養に利用した。図7Dに示すように、LPS活性化DCの培地でレスポンダーを前処理することは、Treg媒介抑制に何の影響も与えなかった。しかし、共培養に先立ってレギュレーターを前処理すると、それらの存在下でのレスポンダー細胞の増殖がやや回復した。LPSのみ5ng/mLでTregを前処理しても、増殖は増えなかったデータは示さず。これらの知見をまとめると、可溶性因子はレギュレーターそれ自体に少なくとも部分的に作用して抑制を中断し得ることが示唆される。最近の多くの研究は、TLR2、TLR4、TLR8およびTLR9を含めて、さまざまなToll様受容体がTreg媒介抑制を抑止することができることを実証しているUrryetal2009JClinInvest119387398Pasareetal2003Science29910331036Pasareetal2003Science29910331036Sutmulleretal2006JClinInvest116485494Pengetal2005Science30913801384Porrettetal2008JImmunol18116921699LaRosaetal2007ImmunolLett108183188Pasareetal2003Science29910331036。これらの著者らは、LPSで活性化された樹状細胞がCD4CD25T細胞による抑制からエフェクター細胞を解放する可溶性因子1種または複数種を分泌することを実証した。IL6はこの効果のために必要とされたが、1種または複数種の他のサイトカインと相乗的に作用するようであった。本明細書に示された結果はこれらの知見と一致するが、いくつかの点でそれらを拡張する。第一に、本実験は、免疫療法に現在使用されている樹状細胞を含むヒト細胞集団を用いて実施された。腫瘍免疫療法に現在使用されているヒト細胞集団での同様の効果はこれらの知見を直接臨床の場に結びつけることが観察された。第二に、これらの著者らは、樹状細胞に直接LPSを添加してその効果を誘導したが、本実験は、LPSで活性化してからTregとエフェクターを含む共培養物に移した樹状細胞が、依然として抑制を抑止することができることを示した。この知見はAPCに対する永続的な効果を示し、そして抑制を中断することができる可溶性メディエーター1種または複数種の長期分泌を示唆している。この研究では、LPSが直接サプレッサー集団またはエフェクターに作用することによってTreg媒介抑制を中断することは除外されている。それどころか、その効果を媒介するのはLPS活性化樹状細胞である。第三に、本実験は、IL6およびIL12非依存性であるが、可溶性因子によって媒介されるように見える効果を実証している。この因子が上述した研究でIL6と相乗的に作用するということは、妥当と考えられる。最後に、本実験は、LPS活性化樹状細胞が、Treg制御からエフェクターを単に解放するのではなく、レギュレーター自体を不活性化する因子を分泌する可能性があることを示唆している。実施例4:サプレッサーCD4CD25T細胞はDC1樹状細胞の存在下でTbetをアップレギュレートし、FoxP3をダウンレギュレートし、そしてエフェクターサイトカインを分泌するいくつかの実験モデルでの最近の研究は、さまざまな表現型の樹状細胞が制御性T細胞を抗原特異的な自己免疫エフェクターに変換することができることを示したBabanetal2009JImmunol1832475248318Radhakrishnanetal2008JImmunol18131373147。機構的に、この知見は転写制御因子FoxP3のダウンレギュレーションによって特徴づけられ、そしてエフェクターサイトカインのアップレギュレーションを伴うことがある。最も一貫して認められるのは、Th17免疫を媒介する可能性が高いIL17産生エフェクター細胞へのTregの変換であるBabanetal2009JImmunol1832475248318Radhakrishnanetal2008JImmunol18131373147Beriouetal2009Blood11342404249。抑制の中断が制御性T細胞の単純な失活を反映するのか、それとも免疫応答をさらに増強するエフェクター細胞へのそれらの変換を反映するのかを調べるために、IFNγ/LPS活性化DCがIL12の力強い生産を示しかつTh1免疫の強力な誘導因子であることを考慮して、エフェクターへの変換はIL17の産生よりもIFNγによって特徴づけられる可能性が高いという仮説を立てた。この仮説を検証するために、TregおよびCD4CD25エフェクターを典型的な125:1の比で共培養し、ELISAを用いてそれらのサイトカイン産生を測定した。未成熟な樹状細胞と共培養されたCD4CD25TregおよびCD4CD25エフェクター細胞はどちらも、本質的にIFNγを作らないことがわかった。しかし、図8Aに示すように、両方の集団は、LPS活性化単球由来DCと共培養したときには、かなりの量のIFNγを作った。測定されたサイトカインがT細胞によって産生され、樹状細胞補完物によって産生されたものでないことを検証するために、細胞を共培養後に収集して、IFNγの細胞内産生を評価した。図8Aに示すように、CD4T細胞のかなりの割合がIFNγ陽性であった。これとは対照的に、CD11c陽性樹状細胞のはるかに少ない数がサイトカイン陽性であったデータは示さず。ソーティングされたCD4CD25集団の純度は確実に>99であり、サイトカインの産生が汚染細胞によって媒介されるという可能性は除外されるデータは示さず。しかし、ソーティングされたCD4CD25集団のかなりの比率がFoxP3陰性である約20;データは示さず。したがって、抑制の最大の原因とされるFoxP3細胞が単に失活されて、サイトカインの産生が主にこのFoxP3陰性コホートからもたらされるということは、妥当と考えられる。エフェクター細胞へのTregの変換を実証する研究は、この表現型の変化を、転写制御因子FoxP3のダウンレギュレーションおよび種々のサイトカインのアップレギュレーションと関連づける。このLPS活性化DC集団は、IFNγ産生T細胞の発生を助長するその力強いIL12産生のため、Th1免疫応答に偏向させることが知られている。Th1細胞の分化は、Tボックス因子Tbetを含む数種の転写因子の作用を介してプログラムされている。本研究におけるIFNγ産生エフェクター細胞へのTregの変換は、Treg特異的転写因子FoxP3のダウンレギュレーションおよびTbetのアップレギュレーションと関連づけることができるという仮説を立てた。この前提を検証するために、CD4CD25レギュレーターを未成熟またはLPS活性化DCおよび可溶性CD3と共培養し、その後FoxP3およびTbetの発現を分析するために細胞内サイトカイン染色を用いた。図8Bに示すように、未成熟な樹状細胞と比較して、LPS活性化DCはCD4CD25T細胞間でTbetのアップレギュレーションを誘導した。興味深いことに、TbetのアップレギュレーションはFoxP3陽性細胞で最も顕著であった。CD4CD25T細胞のかなりの割合は、FoxP3とTbetの両方を発現することが2日目に認められた。未成熟樹状細胞の存在下でインキュベートしたCD4CD25T細胞はTbetをアップレギュレートせず、そしてごくわずかな細胞が二重陽性として測定された。5日目に認められた増殖性およびサイトカイン産生の違いは転写因子発現のより早い段階での変化を反映しているという推定のもとで、少し早い時点2日目が選ばれた。これらのデータは、LPS活性化DCと共培養されたCD4CD25T細胞によるIFNγの産生が、特にFoxP3陽性細胞でのTbetのアップレギュレーションと相関することを示している。これらのデータはまた、ELISAにより検出されたサイトカインがFoxP3陰性CD4CD25T細胞の増殖によって生成されるという可能性を低くしている。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、大多数のTbet陽性細胞がFoxP3陽性でもあるという事実は、制御性T細胞がサイトカイン産生エフェクターに変換されることを示唆すると考えられる;FoxP3陰性細胞が検出されたサイトカインを生成するために増殖したという可能性は、あまり高くない。エフェクターに移行するTregが複数の転写制御因子を少なくとも一過性に発現するということは、Th17細胞への変換において報告されているBeriouetal2009Blood11342404249Sharmaetal2009Blood11361026111。IL12はTh1分化とその後のIFNγ産生にきわめて重要であるので、ここで認められたIFNγ産生細胞へのレギュレーターの変換がIL12依存性であるのかを調べた。これらの1型DCは、レスポンダー細胞増殖に対するTregの効果を、IL12に依存しないやり方で打ち消すことが示されたとはいえ、異なるシグナルがエフェクターへの変換を支配していそうである。したがって、Tregを中和抗IL12抗体の存在下でLPS活性化DCと共培養して、FoxP3およびTbetの発現を評価した。図8Bに示すように、Tbetのアップレギュレーションは中和抗体の存在下で最低であることがわかった。これらの知見は、免疫系に制御性T細胞を組み込むための新しいパラダイムを提案する。Tregは現在、炎症性免疫反応の発生を緩和するのに役立ち、そして自己免疫を防止するのに役立つ、末梢性寛容の主なメディエーターと見なされている。これらの細胞の存在および活性にもかかわらず生産的な免疫応答がどのように開始されるかは、まだ定かでない。炎症状況下でのT細胞制御の中止を目下実証する研究の多くは、1つのモデルを提案する:すなわち、病的傷害の状況で直面する炎症シグナルが免疫応答を発現する際にレギュレーターを失活させるというモデルである。注目すべきは、TLR活性化DCは、Tregの存在にもかかわらず、レスポンダー細胞の増殖を回復させる。抗原特異的Th17細胞へのTregの変換を示す最近の研究は、Tregが生産的な免疫応答の一部になり得ることを示唆することで、このモデルを拡大するBabanetal2009JImmunol18324752483Radhakrishnanetal2008JImmunol18131373147Beriouetal2009Blood11342404249Sharmaetal2009Blood11361026111。本明細書に提示したデータは、LPS活性化DC集団の存在下で、Tregが、主にIFNγを分泌するためにTh1細胞によく似ているように見えるエフェクター様コンパートメントに動員されることを示している。興味深いことに、この知見は増殖性応答で認められた効果とは異なりIL12依存性であった。まとめると、これらのデータは、発現している免疫応答にTregがどのように組み込まれるかに関して、いくつかの可能性を提起する。第一は、明確なシグナルがサイトカイン産生エフェクターへの変換に対してTreg活性の中止を指令する、ということである。免疫応答の開始時に存在する可溶性シグナルが、Tregが受動的にバイスタンドbystandするのかまたはサイトカイン産生エフェクターとして寄与するのかを決めることによって、部分的にその大きさmagnitudeを決定するということは、妥当と考えられる。第二は、Tregが、傷害の性質により命じられる免疫応答のタイプに応じて、抗原特異的エフェクターの各種サブセットTh1、Th2、Th17に変換され得る、ということである。分子基盤では、これは分化特異的転写因子例えば、Tbetのアップレギュレーションを介して起こる可能性があり、細胞は制御性表現型とエフェクター表現型の両方を指令する因子を高レベルで少なくとも一過性に発現することができる。これらの細胞はその後、免疫力を最大にするために、同様に分化して放出されたFoxP3陰性細胞と相乗的に作用することができる。これらの結果はまた、腫瘍免疫療法ワクチンの設計に関して重要性を持っている。制御性T細胞は、1980年代以来、腫瘍免疫を誘導するための本発明者らの試みにおいて問題があることが判明している。いくつかの最近の研究から、さまざまなワクチン接種戦略は制御性T細胞の頻度および/または効力を増加させることが示されたLacelleetal2009ClinCancerRes1568816890Eggermont2009ClinCancerRes1567456747Francoisetal2009CancerRes6943354345。おそらく最も注目すべき点として、ワクチンを生成するためにしばしば用いられた従来のサイトカインカクテルで成熟させた樹状細胞は、サプレッサー機能をもつように見えるFoxP3high細胞を増やすことが判明したBanerjeeetal2006Blood10826552661。これは抗腫瘍免疫の発現と持続を危うくする可能性がある。これらの知見を踏まえて、最近のいくつかのプロトコルでは、抗腫瘍ワクチンとTregを枯渇させる物質とが併用される;これらの物質の併用は、どちらか一方の物質のみと比べて、しばしば大きな利益をもたらすDellucetalCancerImmunolImmunother5816691677Yamamotoetal2009OncolRep22337343Morseetal2008Blood112610618Rechetal2009AnnNYAcadSci117499106Shimizuetal1999JImmunol16352115218Turketal2004JExpMed200771782Dannulletal2005JClinInvest11536233633。したがって、ワクチンの有効性を最適化するには、正常な制御プロセスの転覆が必要になるかもしれない。この点で、LPS活性化単球由来樹状細胞ワクチンは、それがT細胞媒介抑制を活性化するのではなく阻害するように見え、これらの細胞を腫瘍反応性エフェクターに変換するという利点をもち得るという点で、理想的である。LPS活性化DCワクチンと、従来のプロトコルを用いて成熟させた樹状細胞との直接比較は行われていないものの、ここで実証されたTreg機能に対する効果はDCワクチンの有効性につながる可能性を持っている。付加的な利点は、この性質が固有のものであり、併用プロトコルで現在使用されているさまざまな外因性Treg枯渇療法に伴う毒性をもたない可能性がある、ということである。本明細書中で引用した、ありとあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。特定の態様を参照して本発明を開示してきたが、本発明の他の態様および変更が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および同等の変更を含むと解釈されることが意図される。