"組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニンHAタンパク質を含むウイルス様粒子VLPであって、前記HAタンパク質が、前記HAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する1つまたは複数のアミノ酸変異を含むVLP。前記HAタンパク質がトリインフルエンザウイルス株に由来する、請求項1に記載のVLP。前記トリインフルエンザウイルス株がH5N1である、請求項2に記載のVLP。前記トリインフルエンザウイルス株がH9N2である、請求項2に記載のVLP。前記HAタンパク質がブタインフルエンザウイルス株に由来する、請求項1に記載のVLP。前記ブタインフルエンザウイルス株がH1N1である、請求項5に記載のVLP。前記HAタンパク質が季節性インフルエンザウイルス株に由来する、請求項1に記載のVLP。前記季節性インフルエンザウイルス株がA型インフルエンザウイルス株である、請求項7に記載のVLP。前記季節性インフルエンザウイルス株がB型インフルエンザウイルス株である、請求項7に記載のVLP。前記HAタンパク質がパンデミックインフルエンザウイルス株に由来する、請求項1に記載のVLP。前記HAタンパク質がプレパンデミックインフルエンザウイルス株に由来する、請求項1に記載のVLP。前記HAタンパク質がヘマグルチニン活性を示す、請求項1~11のいずれか一項に記載のVLP。前記HAタンパク質がキメラタンパク質である、請求項1~12のいずれか一項に記載のVLP。前記1つまたは複数のアミノ酸変異が、前記HAタンパク質の受容体結合ドメインRBD内に生じる、請求項1~13のいずれか一項に記載のVLP。前記1つまたは複数のアミノ酸変異が、前記HAタンパク質中のNXT/S配列番号1配列を変化させるものであり、Xが任意のアミノ酸であり、T/Sがスレオニンまたはセリン残基である、請求項1~14のいずれか一項に記載のVLP。前記アミノ酸変異が、配列番号2の170~172および181~183から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する、請求項15に記載のVLP。前記VLPがインフルエンザマトリックスM1タンパク質を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載のVLP。前記M1タンパク質がトリインフルエンザウイルス株に由来する、請求項17に記載のVLP。前記トリインフルエンザウイルス株がH9N2である、請求項18に記載のVLP。前記トリインフルエンザウイルス株がH5N1である、請求項18に記載のVLP。前記トリインフルエンザウイルス株がAIndonesia505である、請求項20に記載のVLP。AIndonesia505由来の前記M1タンパク質が配列番号3を含む、請求項21に記載のVLP。前記M1タンパク質がブタインフルエンザウイルス株に由来する、請求項17に記載のVLP。前記ブタインフルエンザウイルス株がH1N1である、請求項23に記載のVLP。前記M1タンパク質が配列番号3の100~103位に対応するアミノ酸位にアミノ酸残基YKKLを含む、請求項17に記載のVLP。前記VLPがインフルエンザノイラミニダーゼNAタンパク質を含む、請求項1~25のいずれか一項に記載のVLP。前記NAタンパク質がノイラミニダーゼ活性を示す、請求項26に記載のVLP。前記VLPが、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように変異していないHAタンパク質を含む親VLPよりも、哺乳動物に強力な免疫応答を誘導する、請求項1~27のいずれか一項に記載のVLP。請求項1~28のいずれか一項に記載のVLPを含むワクチンであって、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチン。前記哺乳動物がヒトである、請求項29に記載のワクチン。インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、請求項1~28のいずれか一項に記載のVLPを含む、少なくとも1つの有効用量のワクチンを前記哺乳動物に投与することを含む方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項31に記載の方法。インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、請求項1~28のいずれか一項に記載のVLPの有効用量を前記製剤に加えることを含み、前記ワクチンが、前記哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法。VLPを作製する方法であって、a組換えインフルエンザウイルスヘマグルチニンHAタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスコンストラクトを構築する工程であって、前記HAタンパク質が、前記HAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する1つまたは複数のアミノ酸変異を含む工程と、b前記組換えバキュロウイルスにより適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換し、前記HAタンパク質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、c前記宿主細胞においてVLPの形成を可能にする工程と、d前記VLPを含有する感染細胞培地を回収する工程と、e前記VLPを精製する工程とを含む方法。前記HAタンパク質がトリインフルエンザウイルスに由来する、請求項34に記載の方法。前記トリインフルエンザウイルスがH5N1である、請求項35に記載の方法。前記トリインフルエンザウイルスがH9N2である、請求項35に記載の方法。前記HAタンパク質がブタインフルエンザウイルスに由来する、請求項34に記載の方法。前記ブタインフルエンザウイルスがH1N1である、請求項38に記載の方法。前記HAタンパク質が季節性インフルエンザウイルスに由来する、請求項34に記載の方法。前記季節性インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項40に記載の方法。前記季節性インフルエンザウイルスがB型インフルエンザウイルスである、請求項40に記載の方法。前記HAタンパク質がキメラタンパク質である、請求項34~42のいずれか一項に記載の方法。前記1つまたは複数のアミノ酸変異が、前記HAタンパク質の受容体結合ドメインRBD内に生じる、請求項34~43のいずれか一項に記載の方法。前記アミノ酸変異が、前記HAタンパク質中のNXT/S配列番号1配列を変化させるものであり、Xが任意のアミノ酸であり、T/Sがスレオニンまたはセリン残基である、請求項34~44のいずれか一項に記載の方法。前記アミノ酸変異が、配列番号2の170~172および181~183から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する、請求項45に記載の方法。現在使用されているHA含有インフルエンザVLPは、予防的な投与の後の忍容性は良好であるが、特定の集団、特に若年者、高齢者、および慢性的な病気に罹患した個体において効力が疑わしいことが示されている。したがって、これらの高度に感染しやすい患者集団での使用のために、インフルエンザVLPワクチンを改良する必要性がある。本発明者らは、特にインフルエンザVLPの文脈の中で発現される場合に、免疫原性の増強を誘導するインフルエンザHAタンパク質を開発することにより、この必要性に取り組んだ。本発明者らは、インフルエンザヘマグルチニンHAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去すると、驚くべきことに、免疫応答を誘導するHAタンパク質の能力が改善されることを観察した。さらに、本発明者らは、改変されて1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去されたHAタンパク質が依然としてその高次構造を維持し、かつ予想外のことには、インフルエンザVLPの文脈の中で発現される場合に、M1およびNAなどの他のインフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する能力を保持していることを観察した。したがって、適切な発現系で産生される場合、そのような糖鎖付加部位の改変は、HAベースのインフルエンザワクチン例えば、インフルエンザVLPワクチンの免疫原性を全般的に改善することになる。このようにして、この発見によりさらに、ワクチンの1用量当たりに使用されるウイルス抗原の必要量が低減され、同時に、製造されたワクチンの1バッチ当たりのワクチン収率の増加がもたらされる。したがって、一態様では、本発明は、ヘマグルチニンHAタンパク質上の位置すなわち、糖鎖付加部位から1つまたは複数のグリカンを除去するように改変されたHAタンパク質を提供する。このような改変HAタンパク質は、その未改変対応物よりも強力な免疫応答をインフルエンザウイルスによる感染に対して誘導すると期待することができる。除去のために選択されるグリカンは、HAタンパク質のステム領域または球状頭部のいずれかに見出すことができる。特定の実施形態では、除去の標的となる1つまたは複数のグルカンが球状頭部の受容体結合ドメインRBD内に見出される。本明細書に記載の種々の実施形態では、除去されるグリカンはN-結合グリカンであるすなわち、アスパラギンまたはアルギニンの側鎖の窒素に結合したグリカン。一実施形態では、HAタンパク質は、前記HAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する1つまたは複数のアミノ酸変異を保有するようにHAタンパク質を操作することにより改変される。HAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する1つまたは複数のアミノ酸変異は、一実施形態では、1アミノ酸変異、または2アミノ酸変異、または3アミノ酸変異、または4アミノ酸変異、または5アミノ酸変異である。一実施形態では、アミノ酸変異は、ステム領域で作製される。別の実施形態では、アミノ酸変異は、球状頭部で作製される。さらに別の実施形態では、アミノ酸変異は、ステム領域および球状頭部領域の両方で作製される。一実施形態では、アミノ酸変異の1つまたは複数は、改変HAタンパク質の球状頭部内の受容体結合ドメインRBD内に生じる。さらなる実施形態では、アミノ酸変異はすべて、改変HAタンパク質の球状頭部内のRBDに生じる。特定の実施形態では、アミノ酸変異の1つまたは複数は、HAタンパク質中のNXT/S配列番号1糖鎖付加コンセンサス配列を変化させることにより作製される。配列中、Xは任意のアミノ酸であり、T/Sはスレオニン残基またはセリン残基である。典型的な実施形態では、アミノ酸変異は、配列番号2の170~172および181~183から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する。別の実施形態では、HAタンパク質は、酵素的処理を介して1つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。一実施形態では、HAタンパク質は、エンドグリコシダーゼによる処理を介して1つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。他の実施形態では、HAタンパク質は、化学処理を介して1つまたは複数のグリカンを除去するように改変される。特定の実施形態では、1つまたは複数のグリカンは、ヒドラジン様化学反応により化学的に除去される。本発明の改変インフルエンザウイルスHAタンパク質は、インターパンデミック例えば、通年性または季節性インフルエンザ株に由来してもよく、あるいはHAタンパク質は、パンデミック発生を引き起こす可能性がある株に由来してもよいすなわち、現在広まっている株のヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを有するインフルエンザ株、または鳥類被験体に病原性があり、ヒト集団の中に水平感染する可能性があるインフルエンザ株もしくはヒトに病原性のあるインフルエンザ株。特定の季節およびワクチンに含まれるHA抗原の性質に依存して、インフルエンザウイルスHAは、以下の亜型の1つまたは複数に由来することがある:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16。典型的な実施形態では、インフルエンザウイルスHAは、H1、H2、H3、H5、H7、またはH9亜型に由来する。本明細書に記載の種々の実施形態では、HAタンパク質はトリインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はH5N1である。別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はH9N2である。さらに別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はH7N3である。さらに別の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株はH7N7である。別の実施形態では、HAタンパク質はブタインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はH1N1である。別の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はH1N2である。さらに別の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株はH3N2である。別の実施形態では、HAタンパク質はヒトインフルエンザウイルス株に由来してもよい。一実施形態では、ヒトインフルエンザウイルス株はH1N1である。別の実施形態では、ヒトインフルエンザウイルス株はB株である。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は2つ以上の改変HAタンパク質を含んでもよい。例えば、免疫原性組成物は、トリインフルエンザウイルス株由来の改変HAタンパク質およびブタインフルエンザウイルス株由来の改変HAタンパク質を含むことができる。一実施形態では、改変HAタンパク質はヘマグルチニン活性を示す。そのような改変HAタンパク質は、赤血球redbloodcell赤血球erythrocyteに結合し凝集させる能力を保持する。別の態様では、本発明は、1つまたは複数の改変インフルエンザHAタンパク質を含むウイルス様粒子VLPを提供する。改変インフルエンザHAタンパク質を含むそのようなVLPは、未改変インフルエンザHAタンパク質を含むそれらのVLP対応物よりも、インフルエンザウイルスに対して、より強力な免疫応答を誘導すると予測することができる。一実施形態では、改変HAタンパク質は、前記HAタンパク質から1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去する1つまたは複数のアミノ酸変異を含む。さらなる実施形態では、アミノ酸変異の1つまたは複数は、改変HAタンパク質の受容体結合ドメインRBD内に生じる。特定の実施形態では、アミノ酸変異の1つまたは複数は、HAタンパク質中のNXT/S配列番号1糖鎖付加コンセンサス配列を変化させることにより作製される。配列中、Xは任意のアミノ酸であり、T/Sはスレオニン残基またはセリン残基である。典型的な実施形態では、アミノ酸変異は、配列番号2の170~172および181~183から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸位に位置する。本明細書に記載の種々の実施形態では、本発明のVLPは、限定しないが、M1、M2、NA、NP、PB1、PB2、およびNS2を含む、さらなるインフルエンザタンパク質を含んでもよい。典型的な実施形態では、本発明のVLPはM1、NA、および改変HAタンパク質を含む。一実施形態では、M1タンパク質は、配列番号3の100~103位に対応するアミノ酸位にアミノ酸残基YKKLを含む。別の実施形態では、M1タンパク質はトリインフルエンザウイルス株に由来する。さらに別の実施形態では、M1タンパク質は、H5N1、H9N2、H7N3、およびH7N7から選択されるトリインフルエンザウイルス株に由来する。特定の実施形態では、M1タンパク質は、トリインフルエンザウイルス株AIndonesia505H5N1に由来する。さらに特定の実施形態では、トリインフルエンザウイルス株AIndonesia505H5N1由来のM1タンパク質は、配列番号3を含む。別の実施形態では、M1タンパク質はブタインフルエンザウイルス株に由来する。さらに別の実施形態では、M1タンパク質は、H1N1、H1N2、およびH3N2から選択されるブタインフルエンザウイルス株に由来する。特定の実施形態では、M1タンパク質は、ブタインフルエンザウイルス株ACalifornia0409H1N1に由来する。さらに特定の実施形態では、ブタインフルエンザウイルス株ACalifornia0409H1N1由来のM1タンパク質は、配列番号4を含む。本発明はまた、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された1つまたは複数のHAタンパク質を含む少なくとも1つの有効用量のワクチンを投与することを含む方法を提供する。典型的な実施形態では、本発明は、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物に、インフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導する方法であって、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された1つまたは複数のHAタンパク質を含むインフルエンザVLPを含む少なくとも1つの有効用量のワクチンを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、前記方法は、動物に前記ワクチンを、経口的に、非経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内で、静脈内に、または皮下に投与することを含む。本発明はまた、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された1つまたは複数のHAタンパク質を含む有効用量のワクチンを、前記製剤に加えることを含む方法を提供する。典型的な実施形態では、本発明は、インフルエンザに感染しやすい哺乳動物にインフルエンザウイルス感染に対する実質的な免疫を誘導するワクチンを製剤化する方法であって、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された1つまたは複数のHAタンパク質を含むインフルエンザVLPを含む有効用量のワクチンを、前記製剤に加えることを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つのさらなる構造タンパク質をコードする1つまたは複数の組換えコンストラクトを構築することにより、インフルエンザ由来のVLPを作製する方法を提供する。典型的な実施形態では、VLPは、M1、NA、および1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質を含む。一実施形態では、1つまたは複数の組換えコンストラクトは、適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換させるために使用される。典型的な実施形態では、組換えコンストラクトはバキュロウイルスコンストラクトである。宿主細胞は、改変HAタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、VLPが宿主細胞の中に形成される。インフルエンザVLPを含有する感染細胞培地が回収され、VLPが精製される。本明細書に記載の種々の実施形態では、宿主細胞は真核細胞であってよく、典型的な実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。本発明はまた、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変された1つまたは複数のHAタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つのさらなる構造タンパク質を含むインフルエンザVLPを含有する原体を製剤化する方法を特色とする。一実施形態では、改変HAタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つの構造タンパク質をコードする1つまたは複数の組換えコンストラクトは、適切な宿主細胞をトランスフェクション、感染、または形質転換させるために使用される。典型的な実施形態では、組換えコンストラクトはバキュロウイルスコンストラクトである。宿主細胞は、改変HAタンパク質およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養され、VLPが宿主細胞の中に形成される。インフルエンザVLPは単離および精製され、原体はこのインフルエンザVLPを含有して製剤化される。原体はさらにアジュバントを含んでもよい。加えて、本発明は、インフルエンザVLPを含有するそのような原体を脂質小胞、すなわち、非イオン性脂質小胞と混合することにより、薬物製品を製剤化する方法を提供する。したがって、インフルエンザVLPは、感染細胞から被包粒子として出芽することができる。出芽したインフルエンザVLPは、原体として、超遠心分離またはカラムクロマトグラフイーにより単離および精製し、ワクチンなどの薬物製品として、単独でまたはNovavaxInc製品であるNovasomesなどのアジュバントと共に製剤化することができる。免疫学的効果を増強するNovasomes登録商標は、米国特許第4,911,928号にさらに詳細に記載されており、これは参照により本明細書に援用される。詳細な説明定義:本明細書で使用される用語抗原製剤または抗原組成物は、脊椎動物、特に鳥類または哺乳動物に投与された場合、免疫応答を誘導する調製物を指す。本明細書で使用される用語アジュバントは、製剤において特定の免疫原例えば、VLPと組み合わせて使用された場合、結果として生ずる免疫応答を増強、またはそうでなければ改変もしくは修飾する化合物を指す。免疫応答の修飾には、抗体および細胞性免疫応答のいずれかまたはその両方の強化またはその特異性の拡大が含まれる。免疫応答の修飾はまた、特定の抗原特異的免疫応答の低減または抑制を意味することもある。本明細書で使用される用語トリインフルエンザウイルスは、主として鳥類に見出されるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、トリインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトに感染または伝染することがある。ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスは、インフルエンザパンデミック、すなわちヒトの罹患および/または死亡を引き起こす可能性がある。パンデミックは、インフルエンザウイルスの新株ヒトが自然免疫を有していないウイルスが出現し、個々の場所を越えて、おそらく地球全体に伝播し、一度に多くのヒトに感染した場合に起こる。本明細書で使用される用語キメラタンパク質は、単一高分子例えば、融合タンパク質に少なくとも2つの異種タンパク質が連結しているコンストラクトを指す。本明細書で使用される有効用量は、概して、免疫の誘導、インフルエンザウイルス感染の予防および/もしくは寛解、またはインフルエンザ感染の少なくとも1つの症状の軽減、ならびに/またはさらなる用量のVLP効力の増強に十分な本発明のVLP量を指す。有効用量は、インフルエンザ感染の発症を遅延または最小限にするのに十分なVLP量を指すこともある。有効用量はまた、インフルエンザ感染の治療または管理において治療的有益性を提供するVLP量を指すこともある。さらに、有効用量は、単独でまたは他の療法と組み合わせて、インフルエンザ感染の治療または管理において治療的有益性を提供する本発明のVLPに関する量である。有効用量はまた、インフルエンザウイルスへのその後の曝露に対する、被験体例えば、ヒト自体の免疫応答を増強するのに十分な量であってもよい。免疫のレベルは、例えば、中和分泌および/または血清抗体の量の測定、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着、またはマイクロ中和実験アッセイによりモニターすることができる。ワクチンの場合には、有効用量は、疾患を予防するかまたは症状の重症度を軽減する量である。本明細書で使用される用語インフルエンザVLPは、少なくとも1つのインフルエンザタンパク質を含むVLPを指す。前記VLPは、さらなるインフルエンザタンパク質および/または非インフルエンザタンパク質を含むことができる。本明細書で使用される用語ヘマグルチニンまたはHAまたはHAタンパク質またはヘマグルチニンタンパク質は、そのアミノ酸配列がHAの少なくとも1つの特有な配列を含むポリペプチドを指す。インフルエンザ単離物に由来する、多種多様のHA配列が当技術分野で公知である;実際、国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIは、本願出願時に9000を超えるHA配列を含んだデータベースwwwncbinlmnihgovgenomesFLUfluhtmlを保持している。当業者は、このデータベースを参照しながら、HAポリペプチド全般、および/または特定のHAポリペプチド例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16ポリペプチド;または特定の宿主、例えばトリ、ラクダ、イヌ、ネコ、シベット、エンバイロンメントenvironment、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、イワツバメ、ブタ、トラ、クジラ等の感染を媒介するHAに特有な配列を容易に同定することができる。本明細書で使用される用語ヘマグルチニン活性は、HAを含有するタンパク質、VLP、またはそれらの一部が赤血球赤血球に結合し凝集させる能力を指す。本明細書で使用される用語N-結合グリカンおよびN-結合オリゴ糖は、N-グリコシド結合によりコンジュゲート例えば、HAに共有結合するオリゴ糖を指す。本明細書で使用される用語ノイラミニダーゼ活性は、NAを含有するタンパク質、VLP、またはそれらの一部が、フェチュインなどのタンパク質を含めた基質からシアル酸残基を切断する酵素活性を指す。本明細書で使用される用語感染因子は、脊椎動物に感染を引き起こす微生物を指す。通常、この生物はウイルス、細菌、寄生生物、および/または真菌類である。この用語はまた、同じ感染因子の異なる抗原変異体を指す。本明細書で使用される用語免疫刺激物質は、生体自体の化学伝達物質サイトカインを介して免疫応答を増強する化合物を指す。これらの分子は、インターロイキン例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13;増殖因子例えば、顆粒球-マクロファージGM-コロニー刺激因子CSF;およびマクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2等の他の免疫刺激分子など、免疫刺激性、免疫増強性、および炎症促進性の活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインを含む。免疫刺激分子は、インフルエンザVLPと同じ製剤で投与することも、別個に投与することもできる。このタンパク質またはこのタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを免疫刺激効果をもたらすために投与することができる。本明細書で使用される用語免疫は、脊椎動物の免疫系の誘導を指し、前記誘導により、前記脊椎動物の少なくとも1つの感染症状の予防、寛解、および/または軽減が得られる。免疫はまた、本発明のVLPが脊椎動物に投与され、前記VLPがインフルエンザウイルスのHAに対する免疫応答を誘導した場合における、40以上の赤血球凝集阻止HI力価を指すこともある。本明細書で使用される用語受容体結合ドメインまたはRBDは、HAのシアル酸結合部位を含む約148個のアミノ酸ドメインを指す。HA受容体結合ドメインのサブ領域は、RBD-A頭頂ドメインとして知られており、インフルエンザ株ASouthCarolina11918由来のHAに対して確立された番号付けに基づくと、アミノ酸131~143、170~182、205~215、および257~262内に含有される。本明細書で使用される用語季節性インフルエンザウイルスは、世界の国立インフルエンザセンターNationalInfluenzaCentersが実施した疫学調査に基づいて、所与のインフルエンザ季節の間、ヒト集団内に蔓延していると判断されたインフルエンザウイルス株を指す。これらの疫学的調査および単離されたインフルエンザウイルスの一部は、4つの世界保健機構WorldHealthOrganizationWHOの参考検査室その1つはアトランタAtlantaの疾病管理予防センターCentersforDiseaseControlandPreventionCDCにあるの1つに詳細な試験のために送られる。これらの検査室では、現在のワクチンに対して作られた抗体が、広まっているウイルスおよび新規のインフルエンザウイルスにどの程度良好に反応するかを試験する。この情報は、インフルエンザ活性に関する情報と共にまとめられ、米国食品医薬品局FoodandDrugAdministrationFDAの諮問委員会およびWHOの会議に提示される。これらの会議により、次の秋および冬のためのインフルエンザワクチンに入れる3種のウイルスインフルエンザA型ウイルスの2つの亜型および1つのインフルエンザB型ウイルスが選択される。この選択は、北半球に対しては2月に、南半球に対しては9月に行われる。通常、ワクチンの中の3種のウイルス株の1つまたは2つが毎年変更される。本明細書で使用される用語ブタインフルエンザウイルスは、主としてブタで見出されるが、ヒトまたは他の動物にも感染することができるインフルエンザウイルスを指す。場合によっては、ブタインフルエンザウイルスは、ヒトからヒトに感染または伝染することがある。ヒトに感染するブタインフルエンザウイルスは、インフルエンザパンデミック、すなわちヒトの罹患および/または死亡を引き起こす可能性がある。パンデミックは、インフルエンザウイルスの新株ヒトが自然免疫を有していないウイルスが出現し、個々の場所を越えて、おそらく地球全体に伝播し、一度に多くのヒトに感染した場合に起こる。本明細書で使用される用語ワクチンは、死んだ病原体もしくは弱体化した病原体の調製物、またはその病原体に対する抗体形成もしくは免疫を誘導するために使用される誘導抗原決定基の調製物を指す。ワクチンは、疾患、例えばインフルエンザウイルスが原因のインフルエンザに対する免疫を備えさせるために投与される。加えて、用語ワクチンは、防御免疫、すなわち、感染に付随した疾患の重症度を防止または軽減する免疫をもたらすために脊椎動物に投与される免疫原例えば、VLPの懸濁液または溶液も指す。本発明は、免疫原性があり、感染に付随した疾患に対する防御作用を提供しうるワクチン組成物を提供する。本明細書で使用される用語脊椎動物または被験体または患者は、限定しないが、ヒトならびにチンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル類を含む他の霊長類を含めた、脊索動物亜門の任意のメンバーを指す。ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなどの家畜;イヌおよびネコなどのペット哺乳動物;マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物;ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなど、ペット鳥類、野生鳥類、および狩猟鳥類を含む鳥類等もまた非限定例である。用語哺乳動物および動物はこの定義に含まれる。成熟個体および新生個体の両方が包含されるように意図される。本明細書で使用される用語ウイルス様粒子VLPは、少なくとも1つの性状でウイルスに類似しているが、感染性があると実証されていない構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保持しない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠損し、そのため非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は、多くの場合、異種発現により多量に産生することができ、かつ容易に精製することができる。インフルエンザヘマグルチニンHA:インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子particularの膜に埋め込まれた、2種の糖タンパク質であるヘマグルチニンHAおよびノイラミニダーゼNAを含有する脂質膜エンベロープを特徴とするRNAウイルスである。16種の公知HA亜型および9種のNA亜型があり、種々のインフルエンザ株は、その株のHA亜型およびNA亜型の数に基づいて命名される。アミノ酸配列同一性および結晶構造の比較に基づいて、HA亜型は2つのメイングループと4つのより小さなクレードに分類された。異なるHA亜型は、必ずしも強固なアミノ酸配列同一性を共有していないが、異なるHA亜型の全体的な3次元構造は互いに類似しており、分類目的に使用することができるいくつかの微妙な差異がある。例えば、中央のα-ヘリックスに対する膜遠位サブドメインの特定の配向は、HA亜型を決定するために一般に使用される構造特性の1つであるRusselletalVirology3252872004。HAはホモ三量体の内在性膜糖タンパク質である。HAは円柱形状であり、球状頭部とステム領域から構成された外部ドメインを含有する。HAの球状頭部およびステム領域は両方とも、このタンパク質の機能特性に影響を及ぼしうるN-結合オリゴ糖を保持する。例えば、1つまたは複数のステムオリゴ糖を欠損するHA変異体は細胞融合能の低下を示し、これによって、ステム領域のオリゴ糖が細胞融合に必要なHAの準安定形態を維持するという結論が得られたOhuchietal1997JVirology71371925。さらに、HAのタンパク質分解活性部位の近傍にグリカンが存在すると、切断が調節され、インフルエンザウイルスの病原性が影響を受けることが示されているDeshpandeetal1987ProcNatlAcadSciUSA843640。さらに、インフルエンザウイルスHAの糖鎖付加は、タンパク質分解から保護するために重要であるSchwartzetal1976JVirology1978291。グリカンの構造および組成がどのようにHA活性に影響を及ぼすかに関してはほとんど知られていないが、HAのコンフォメーションの安定化に及ぼすグリカンの役割、およびHAが他のインフルエンザタンパク質と相互作用する能力に対するグリカンの影響が示唆されているWilsonetal1981Nature2893738。実際に、球状頭部領域から1つまたは複数のグリカンが欠損しているウイルスの成長が、MDCK細胞および有胚鶏卵では損なわれていることが見出されたWagneretal2001IntlCongSeries121937582。これは、変異HAの受容体親和性が増強された結果、宿主細胞由来の子ウイルスの放出が制限されたことに主に起因する。Id。さらに、グリカンがHAステムから除去された場合には、得られるウイルスは細胞培養および鶏卵においてテンペレート感受性な成長を示した。これらのウイルスはpH安定性が低下しており、これによって適切なコンフォメーションにHAタンパク質を維持するためにグルカンが重要であることが指摘される。改変ヘマグルチニンHAタンパク質:本発明者らは、1つまたは複数のグリカンが欠失しているHAタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子VLPが作製可能であり、しかも驚くべきことに、HAおよびNAの活性および効力を保持することを見出した。HAのコンフォメーションおよび安定性の維持におけるグリカンの主張される役割が具体的に想定される場合、このような結果は予想外である。さらに、改変HAタンパク質は、単独でまたはインフルエンザVLPの文脈の中で発現される場合、それらの未改変対応物と比較して、免疫原性が増強されている。したがって、一態様では、本出願は、改良ワクチンの作製を容易にしうる、免疫原性が増大した改変HAタンパク質の生成について記載する。本発明によると、HAタンパク質上の位置すなわち、糖鎖付加部位からグリカンを除去する、任意の数の改変をHAタンパク質に施すことができ、一実施形態では、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力を増大させるために、複数のグリカン例えば、2、3、4、5、または6個のグリカンを除去することができる。典型的な実施形態では、除去のために選択される1つまたは複数のグリカンはN-結合グリカンである。さらなる実施形態では、N-結合グリカンのみが除去される。このような改変は、操作された点変異、フレームシフト変異、欠失、または挿入の結果として起こりうるものであり、1つまたは複数例えば、1、2、3、4、5、6、7以上の点変異が好ましい。別の実施形態では、1つまたは複数のグリカンは、酵素的または化学的処理を介して除去することができる。例えば、HAタンパク質は、エンドグリコシダーゼ処理を介して1つまたは複数のN-結合グリカンを除去するように改変することができる。他の実施形態では、N-結合グリカンは、ヒドラジン様化学反応により化学的に除去することができる。一態様では、1つまたは複数の糖鎖付加部位は、HAタンパク質をコードする核酸配列を変異させることにより、前記HAタンパク質から除去することができる。1つまたは複数のグリカンを除去するための変異は、当業者に公知の任意の方法論も使用して、本発明のHAタンパク質に導入することができる。例えば、コード化DNA分子に沿って、任意の決定部位におけるあらゆる可能な種類の塩基対変化を可能にするオリゴヌクレオチド定方向変異を使用して、改変HAタンパク質を作製することができる。一般に、この手法には、目的のHAタンパク質をコードする一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な1つまたは複数のミスマッチを除いてオリゴヌクレオチドをアニールすることが含まれる。次いで、このミスマッチオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼにより伸長され、一方の鎖の配列に所望の変化を含有する二本鎖DNA分子が生成する。例えば、配列中のこの変化により、アミノ酸の欠失、置換、または挿入を得ることができる。次いで、二本鎖ポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入することができ、したがって変異または改変ポリペプチドを産生することができる。上記オリゴヌクレオチド定方向変異は、例えばPCRを介して実行することができる。本発明の組成物および方法で使用されるHAタンパク質には、インフルエンザウイルス感染に対する免疫原性応答を刺激する能力を有する任意のHAタンパク質が含まれる。このようなHAタンパク質としては、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、およびH16が挙げられる。当業者が理解するように、糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質は、当技術分野でルーチン的で周知の組換え技術または遺伝子工学技術により得ることができる。改変HAタンパク質は、例えば、部位特異的またはランダム変異誘発により目的のHAタンパク質をコードする遺伝子を変異させて得ることができる。そのような変異としては、点変異、欠失変異、および挿入変異を挙げることができる。例えば、1つまたは複数の点変異例えば、1つまたは複数の異なるアミノ酸による、1つまたは複数のアミノ酸の置換を使用して、本発明の改変HAタンパク質を構築することができる。本発明は、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変され、インフルエンザに対する免疫応答を刺激する能力が増大したことを示す、野生型HAタンパク質とアミノ酸レベルで5、10、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、または99同一である相同HAタンパク質をさらに含む。本発明はまた、上記に記載のHAタンパク質をコードする核酸分子を含む。本発明はまた、少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、または600のアミノ酸残基を含み、かつ改変HAタンパク質に付随した1つまたは複数の活性を保持する改変HAタンパク質の断片を含む。このような断片は、当技術分野でルーチン的で周知の組換え手法を使用する欠失変異により、またはいくつかの周知のタンパク質分解酵素のいずれかを使用して目的のHAタンパク質を酵素消化することにより得ることができる。本発明は、上記に記載の改変HAタンパク質およびHAタンパク質断片をコードする核酸分子をさらに含む。一態様では、標的アミノ酸置換は、目的のHAタンパク質の1つまたは複数の糖鎖付加部位で行われる。この態様に従う一実施形態では、NXT/SのN-結合糖鎖付加コンセンサス配列における1つまたは複数のアミノ酸を変異させて、糖鎖付加シグナル配列を消失させる。このような変異により、N-結合糖鎖付加が全般的に防止され、前記HAタンパク質の免疫原性が改善されることになる。目的のHAタンパク質のN-結合糖鎖付加部位を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、NetNGlyc10サーバーデンマーク工科大学TechnicalUniversityofDenmarkを使用して、NAのN-結合糖鎖付加部位を予測することができる。このソフトウェアは、マッチさせる配列を公知のN-結合糖鎖付加部位のデータベースと比較し、糖鎖付加可能スコアを提示する。0.5を超えるスコアが糖鎖付加の可能性がある部位を示し、0.5未満が可能性の低い部位を示す。次いで、NetNGlyc10ソフトウェアを使用して同定された推定上の糖鎖付加部位について、天然のインフルエンザウイルス中のマッチさせる配列を対象として、BLASTを使用してNCBIタンパク質データベースを検索することができる。一実施形態では、1つまたは複数の糖鎖付加部位が球状頭部領域から除去される。別の実施形態では、1つまたは複数の糖鎖付加部位がステム領域から除去される。さらに別の実施形態では、1つまたは複数の糖鎖付加部位が球状頭部領域およびステム領域の両方から除去される。典型的な実施形態では、シアル酸結合部位を保有する約148個のアミノ酸ドメインである受容体結合ドメインRBDとして知られる領域にある、球状頭部の上部から1つまたは複数の糖鎖付加部位が除去される。受容体結合部位RBSとしても知られるRBDは、各HAモノマーの膜遠位末端にあり、シアル酸に対するその特異性および隣接ガラクトース残基へのその結合の性質が、宿主域制限を決定する。特定の実施形態では、1つまたは複数の糖鎖付加部位がRBD-Aとして知られるRBDのサブ領域から除去される。RBD-A頭頂ドメインは、インフルエンザ株ASouthCarolina11918由来のHAに対して確立された番号付けに基づくと、アミノ酸131~143、170~182、205~215、および257~262内に含有されるGenBank受託番号AF117241ChihJenWeietaL2010SciTranslMed224ra21。一実施形態では、アミノ酸置換は、RBD中の1つまたは複数のNXT/SのN-結合糖鎖付加コンセンサス配列で行われる。配列中、Xは任意のアミノ酸であり、T/Sはスレオニン残基またはセリン残基のいずれかである。典型的な実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸置換は、AIndonesia505のHAタンパク質配列番号2の170~172および181~183から選択されるアミノ酸残基に対応する位置で行われる。したがって、これらの位置にある天然アミノ酸の1つまたは複数は、Ala、Asn、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびValを含む任意の他のアミノ酸で置換することができる。インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力が増大したことを示すHAタンパク質の具体例は、1172位のスレオニンがアラニンで置換され、かつ/または2183位のスレオニンがアラニンで置換されたHAタンパク質である。本出願の開示を習得した当業者ならば理解するように、AIndonesia505のHAタンパク質配列番号2のアスパラギン残基170および/または181に対応する位置でアミノ酸変異を行うと、同様の結果を得ることができる。本発明によると、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激するHAタンパク質の能力を増大させるために、1つまたは複数の変異を目的の任意のHAタンパク質の中に行うことができる。そのような変異には、点変異、フレームシフト変異、欠失および、挿入が含まれる。一実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸置換を生じる1つまたは複数の点変異が、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力が増大したHAタンパク質を産生するために使用される。本発明の典型的な実施形態では、目的の他のHAタンパク質に所望の結果をもたらすために、AIndonesia505配列番号2のHAタンパク質のN170位例えば、N170D、T172位例えば、T172A、N181位例えば、N181D、および/またはT183位例えば、T183Aと同等または対応する位置に1つまたは複数の変異を行うことができる。本明細書で同定されたHAタンパク質例えば、配列番号2のAIndonesia505のHAの対応する位置は、当業者によって他のHAタンパク質について容易に同定することができる。したがって、本出願に記載の指定領域およびアッセイが与えられれば、目的の任意のHAタンパク質において、インフルエンザウイルス感染に対する免疫応答を刺激する能力を増大させるであろう1つまたはいくつかの改変を当業者は行うことができる。好ましい実施形態では、改変HAタンパク質は、野生型のHAタンパク質と比較して、N170、T172、N181、および/またはT183に対応する位置から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。他の実施形態では、改変HAタンパク質は、それぞれの野生型HAタンパク質と比較して、他の位置でさらなるアミノ酸置換を有する。したがって、改変HAタンパク質は、それぞれの野生型HAと比較して、他の位置に少なくとも約2、3、4、5、6、7以上の異なる残基を有することがある。当業者が認識するように、アミノ酸置換を有しうるさらなる位置の数は、変異体を生成するために使用される野生型HAタンパク質に依存することになる。例えば、X31インフルエンザ株由来のHAは、7つのN-結合糖鎖付加部位を示すErmonvaletal2000Glycobiology107787。したがって、場合によっては、7以上ほどの異なるN-グリカンが標的アミノ酸置換を介して除去されうる。上記のように、別の実施形態では、1つまたは複数のグリカンを酵素的処理によって除去することができる。例えば、エンドグリコシダーゼによる処理を介して1つまたは複数のN-結合グリカンを除去するように、HAタンパク質を改変することができる。本明細書で使用される場合、エンドグリコシダーゼは、オリゴ糖を含む基質から糖成分を顕著に切断することができる酵素またはその機能性部分、誘導体および/もしくはアナログを指すために使用される。糖タンパク質例えば、HAまたは糖脂質からオリゴ糖を放出させるそのような酵素の使用は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第7,632,654号に記載されている。N-グリカンの除去に適したエンドグリコシダーゼの例としては、エンドグリコシダーゼD、F、F1、F2、およびHが挙げられる。他の実施形態では、1つまたは複数のN-結合グリカンは化学的に除去することができる。一実施形態では、化学反応は1つまたは複数のヒドラジン様試薬により媒介される。ヒドラジンおよびヒドラジン様試薬を使用する、N-結合グリカン放出のための方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第5,539,090号に見出される。手短に言えば、ヒドラジン試薬の作用すなわち、ヒドラジン分解にHAを供する前に、好ましくは、HAタンパク質およびヒドラジン試薬を以下のように調製する。複合糖質は、例えば、適切なシステムでの透析、ゲル濾過、またはクロマトグラフィーにより、基本的に無塩にする。いったん無塩にしたならば、HAは、例えば凍結乾燥により基本的に無水にし、少なくとも、25°Cで25ミリバールの凍結乾燥条件下で平衡に達成するまで水分を減少させる。ヒドラジン試薬の水分も同様に重要であり、4v/vを超えるべきでない。したがって、ヒドラジン試薬の乾燥は、数多くの報告された方法の1つによって達成することができるが、無水ヒドラジン試薬のほとんどの商品は適切である。次いで、適切なヒドラジン試薬を気密容器中の適切に調製された試料に加える。HAとヒドラジン試薬との間の反応は、例えば温度上昇によるエネルギー投入により微視的または巨視的に開始させることができる。エネルギー投入のいずれの方法についても、反応の最適条件は種々の実験的手法から推定することができる。本開示では、反応開始の好ましい方法は、定常状態への温度の上昇によるものである。さらに他の実施形態では、N-結合グリカンを除去するためにアルカリ性溶液を使用することができる。N-グリカンをコンジュゲートに結合させるN-グリコシド結合は、アルカリ性で不安定であり、したがって、N-グリカン放出のためにアルカリ性溶液を使用することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第5,539,090号明細書に記載のように、100°Cで4時間の1MNaOHとのインキュベーションの使用が成功している。本明細書に記載の方法および組成物で使用するのに適したHAタンパク質をコードする遺伝物質の供給源として種々のインフルエンザウイルス株が利用できることが理解される。本明細書に記載の種々の実施形態では、本発明の改変HAタンパク質は、当技術分野で公知のインフルエンザ単離物に由来する公知のHA配列の任意のものから誘導することができる。例えば、国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyinformationNCBIは、公知のHA配列のデータベースwwwncbinlmnihgovgmomesFLUfluhtmlを維持している。加えて、インフルエンザHA野生型配列またはMDCK細胞および鶏卵に継代の配列についてのデータベースが、GlobalInitiativeonSharingAllInfluenzaDatabaseEpiFluデータベースから入手可能である。当業者は、これらのデータベースを参照しながら、HAポリペプチド全般、および/または特定のHAポリペプチド例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、またはH16ポリペプチド;または特定の宿主例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ブタ、トラ、クジラ等の感染を媒介するHAに特有な配列を容易に同定することができる。本明細書に記載の方法により改変可能なそのようなHAタンパク質を含む亜型の例としては、限定しないが、ANewCaledonia2099H1N1、AIndonesia505H5N1、AchickenNewYork1995、AherringgullDE67788H2N8、ATexas322003、AmallardMN3300、AduckShanghai12000、AnorthernpintailTX82818902、ATurkeyOntario611868H8N4、AshovelerIranG5403、AchickenGermanyN1949H10N7、AduckEngland56H11N6、AduckAlberta6076H12N5、AGullMaryland70477H13N6、AMallardGurjev26382、AduckAustralia34183H15N8、AblackheadedgullSweden599H16N3、BLee40、CJohannesburg66、APuertoRico834H1N1、ABrisbane592007H1N1、ASolomonIslands32006H1N1、ABrisbane102007H3N2、AWisconsin672005H3N2、BMalaysia25062004、BFlorida42006、ASingapore157H2N2、AAnhui12005H5N1、AVietnam11942004H5N1、ATealHongKongW31297H6N1、AEquinePrague56H7N7、AHongKong107399H9N2が挙げられる。本発明の方法により改変可能なHAタンパク質の典型的なリストを、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2010/0239610号に見出すことができる。一実施形態では、目的の改変のために選択されるHA配列は、鶏卵に適合したHA配列である。鶏卵に適合したHA配列を入手および同定する方法は当技術分野で公知であるRobertsonetal1991JGenVirology7226717。さらに、感染体由来のタンパク質に融合した改変インフルエンザHAタンパク質の膜貫通ドメインおよび/または細胞質尾部を含むキメラHAタンパク質が本発明の範囲内に包含される。別の実施形態では、改変インフルエンザHAタンパク質の膜貫通ドメインおよび/または細胞質尾部は、膜貫通ドメインを通過して約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20から約50アミノ酸までN末端またはC末端から伸長し、他の感染因子由来の前記タンパク質に融合する。感染因子はウイルス、細菌、真菌類、および/または寄生生物であってもよい。前記感染因子タンパク質が由来しうるウイルスの非限定例としては、以下のものがある:コロナウイルス例えば、SARSを引き起こす因子、肝炎ウイルスA、B、C、D、およびE3、ヒト免疫不全ウイルスHIV、ヘルペスウイルス1、2、6、および7、サイトメガロウイルス、帯状疱疹、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスRSV、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス例えば、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ピコマpicomaウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス複数の型、アデノウイルス複数の型、パラインフルエンザウイルス複数の型、トリインフルエンザ種々の型、船積み熱ウイルス、西部および東部ウマ脳脊髄炎WesternandEasternequineencephalomyelitis、日本脳脊髄炎、鶏痘、狂犬病ウイルス、遅延型脳ウイルスslowbrainvirus、ラウス肉腫ウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコマウイルス科Picomaviridae、ポックスウイルス科痘瘡またはワクチニアなど、レオウイルス科例えば、ロタウイルス、レトロウイルス科HTLV-I、HTLV-II、レンチウイルス、トガウイルス科例えば、ルビウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウェストナイル熱ウイルス、ダニ媒介脳炎、黄熱病、チクングニアウイルス、およびデング熱ウイルスすべての血清型。改変HAタンパク質を含むワクチン:本出願は、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたインフルエンザHAタンパク質を提供する。本明細書に記載の種々の態様では、本発明の改変HAタンパク質は、インフルエンザ感染の治療および/または予防のためのワクチンなどの免疫原性組成物において有用性がある。脊椎動物に中和抗体を与えることによりインフルエンザ感染を予防することができるので、改変インフルエンザHAタンパク質を含むワクチンは、脊椎動物に投与した場合に、インビボで中和抗体を誘導することができる。改変インフルエンザHAタンパク質は、インフルエンザ感染の予防および/または治療に好ましくは使用される。したがって、この開示の別の態様は、インフルエンザに対する免疫応答を誘発するための方法に関する。この方法は、改変インフルエンザHAタンパク質を含有する組成物の免疫学的に有効な量を被験体ヒトまたは動物の被験体などに投与することを含む。免疫学的に有効な量の組成物を投与すると、改変インフルエンザHAタンパク質上に存在するエピトープに特異的な免疫応答が誘発される。このような免疫応答としては、B細胞応答例えば、中和抗体の産生および/またはT細胞応答例えば、サイトカインの産生を挙げることができる。好ましくは、改変インフルエンザHAタンパク質により誘発された免疫応答は、改変インフルエンザHAタンパク質上に存在する少なくとも1つの立体エピトープに特異的な要素を含む。本発明の範囲内の改変HAタンパク質を含むワクチンには、不活化インフルエンザワクチン、弱毒化生ウイルスワクチン、およびウイルス様粒子VLPが含まれる。以下の3つの型の不活化インフルエンザワクチンが現在世界で使用されている:全ウイルスワクチン、スプリット産物splitproductワクチン、および表面抗原またはサブユニットワクチン。これらのワクチンはすべて、来たる季節にヒト集団の中に広まると予想されるインフルエンザウイルス株の表面糖タンパク質、ヘマグルチニンHA、およびノイラミニダーゼNAを含有する。ワクチンに組み込まれるこれらの株を、雌鶏の有胚鶏卵の中で成長させ、次いでウイルス粒子を精製してさらなる処理を行う。一実施形態では、既存のインフルエンザワクチンの免疫原性を改善するために、1つまたは複数の糖鎖付加部位を既存の鶏卵に適合したHA配列から除去する。鶏卵に適合したHA配列を調製するための方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第5,162,112号に記載されている。さらに、改変HAタンパク質は、インフルエンザの多価ワクチン例えば、1価、2価、または3価の1つまたは複数から誘導することができる。一態様では、改変HAタンパク質は、インフルエンザに対する3価不活化ワクチンTIVの1つから誘導することができる。TIVの標準成分には、インフルエンザウイルスの3つの異なる株に由来するヘマグルチニンHAおよびノイラミニダーゼが含まれる。使用することができるTIVの例としては、限定しないが、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxが挙げられる。一態様では、本発明は、免疫系に提示され、個体に免疫応答を誘導することができる改変HAタンパク質の組成物を含むワクチンを提供する。一部の実施形態では、この組成物はアジュバントまたは担体をさらに含む。別の実施形態では、本明細書に記載の改変HAタンパク質は、少なくとも1つの3価不活化インフルエンザワクチンTIVの1つまたは複数の成分を含む。一部の実施形態では、TIVは、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxからなる群から選択される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の改変HAタンパク質は、Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac、およびFluvaxからなる群から選択されるTIVと併せて投与することができる。改変HAタンパク質を含むウイルス様粒子:本発明はまた、インフルエンザ感染またはその少なくとも1つの疾患症状から脊椎動物例えば、ヒトを防御するためのワクチンまたは抗原製剤に製剤化することができる、改変HAタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子VLPを包含する。VLPは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16、またはそれらの断片もしくは一部を含む、1つまたは2つ以上の亜型に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。このようなHAタンパク質を含む亜型の例としては、ANewCaledonia2099H1N1AIndonesia505H5N1、AchickenNewYork1995、AherringgullDE67788H2N8、ATexas322003、AmallardMN3300、AduckShanghai12000、AnorthernpintailTX82818902、ATurkeyOntario611868H8N4、AshovelerIranG5403、AchickenGermanyN1949H10N7、AduckEngland56H11N6、AduckAlberta6076H12N5、AGullMaryland70477H13N6、AMallardGurjev26382、AduckAustralia34183H15N8、AblackheadedgullSweden599H16N3、BLee40、CJohannesburg66、APuertoRico834H1N1、ABrisbane592007H1N1、ASolomonIslands32006H1N1、ABrisbane102007H3N2、AWisconsin672005H3N2、BMalaysia25062004、BFlorida42006、ASingapore157H2N2、AAnhui12005H5N1、AVietnam11942004H5N1、ATealHongKongW31297H6N1、AEquinePrague56H7N7、AHongKong107399H9N2が挙げられる。本発明の態様では、HAタンパク質は、H1、H2、H3、H5、H6、H7、またはH9亜型であってもよい。別の態様では、H1タンパク質は、ANewCaledonia2099H1N1株、APuertoRico834H1N1株、ABrisbane592007H1N1株、またはASolomonIslands32006H1N1株に由来するものであってもよい。さらに、H3タンパク質は、ABrisbane102007H3N2株またはAWisconsin672005H3N2株に由来するものであってもよい。本発明のさらなる態様では、H2タンパク質は、ASingapore157H2N2株に由来するものであってよい。H5タンパク質は、AAnhui12005H5N1株、AVietnam11942004H5N1株、またはAIndonesia52005株に由来するものであってもよい。本発明の態様では、H6タンパク質は、ATealHongKongW31297H6N1株に由来するものであってよい。H7タンパク質は、AEquinePrague56H7N7株に由来するものであってよい。本発明の態様では、H9タンパク質は、AHongKongl07399H9N2株に由来するものであってよい。本発明のさらなる態様では、HAタンパク質は、BMalaysia25062004またはBFlorida42006を含む、B型ウイルスでありうるインフルエンザウイルスに由来するものであってよい。一部の実施形態では、1つまたは複数の改変インフルエンザHAタンパク質を含むVLPは、M1、NA、M2、およびNPなどのさらなるインフルエンザタンパク質をさらに含む。HA、NA、M1、M2、およびNPタンパク質は、パンデミック株および季節性株を含むインフルエンザウイルスのいずれの株に由来するものでもよい。本発明のVLPは、トリインフルエンザM1タンパク質を含むことができる。一実施形態では、トリインフルエンザM1タンパク質は、H9N2インフルエンザ株に由来する。本明細書に記載の種々の実施形態では、インフルエンザM1は、AquailHongKongGl97、AHongKong107399、AHongKong210803、DuckHKY28097、CKHKG997、GfHKSSP60703、PhHKCSW132303、WDkST480801、CKHKNT14203、CKHKWF12603、SCkHKWF28503、CKHKYU46303、CKHKYU57703、SCkHKYU66303、CkHKCSWl6103、およびGFHKNTl0103からなる群から選択されるH9N2インフルエンザウイルスの任意の1つから単離することができる。典型的な実施形態では、H9N2インフルエンザ株はAHongKong107399である。別の実施形態では、トリインフルエンザM1タンパク質はH5N1インフルエンザ株に由来する。本明細書に記載の種々の実施形態では、インフルエンザM1は、AVietnam119404、AVietnam120304、AHongkong21303、AIndonesia22005、ABarheadedgooseQuinghai1A2005、AAnhui12005、およびAIndonesia505からなる群から選択されるH5N1インフルエンザウイルスの任意の1つから単離することができる。典型的な実施形態では、H5N1株はAIndonesia505である。別の実施形態では、本発明のVLPは、ブタ起源のΗ1Ν1株からのものなど、非トリ供給源に由来するインフルエンザM1タンパク質を含むことができる。一実施形態では、M1タンパク質はインフルエンザACalifornia0409に由来する。他の実施形態では、M1タンパク質は、インフルエンザACalifornia0809またはインフルエンザAMexico410809に由来するものであってよい。本発明者らは、配列番号3の残基100~103に対応するアミノ酸位にYKKLL-ドメイン配列を含むインフルエンザM1タンパク質を使用すると、インフルエンザVLP産生の効率が増大することを見出した。したがって、本明細書に記載の典型的な実施形態では、本発明のVLPは、YKKLL-ドメイン配列を含有するインフルエンザM1タンパク質を含む。一実施形態では、配列番号3の残基100~103に対応するアミノ酸位にYKKLLドメイン配列を含むインフルエンザM1タンパク質は、トリインフルエンザM1タンパク質である。別の実施形態では、配列番号3の残基100~103に対応するアミノ酸位にYKKLLドメイン配列を含むインフルエンザM1タンパク質は、非トリインフルエンザM1タンパク質である。さらなる実施形態では、非トリインフルエンザM1タンパク質はブタインフルエンザM1タンパク質である。さらなる実施形態では、ブタインフルエンザM1タンパク質はインフルエンザ株ACalifornia0409に由来する。典型的な実施形態では、ACalifornia0409に由来するM1タンパク質は、配列番号4から構成される。推定上のYKKLL-ドメインを保有するM1タンパク質を利用するVLPを作製する方法は、共同所有される同時係属中の米国特許出願第12/832,657号に記載されている。本明細書で同定されたインフルエンザM1タンパク質の対応する位置例えば、配列番号3および4の残基100~103に対応する位置にあるYKKLアミノ酸は、他のインフルエンザM1タンパク質において当業者が容易に同定することができる。したがって、本出願に記載の指定領域およびアッセイ法が与えられれば、当業者は、VLP形成を媒介する能力が増大したことを示す、天然のインフルエンザM1タンパク質を同定することができる。同様に、本出願の開示があれば、当業者は、目的の任意のインフルエンザM1タンパク質において、VLP形成を媒介する能力を増大させる、1つまたは複数の改変を行うことができよう。したがって、配列番号3および4の残基100~103に対応する位置にYKKLアミノ酸を有する天然のインフルエンザM1タンパク質、ならびに配列番号3および4の残基100~103に対応する位置にYKKLL-ドメインを含有するように、天然にまたは遺伝子工学によって変異させられたインフルエンザM1タンパク質は本発明の範囲内にある。一実施形態では、VLPは、少なくとも2つの異なるインフルエンザウイルスに由来するタンパク質を含むことができる。例えば、VLPは、トリインフルエンザウイルス由来の改変HAすなわち、Η5Ν1およびブタインフルエンザウイルスすなわち、H1N1由来のNAを含むことができる。別の実施形態では、VLPは、2つ以上の型のインフルエンザウイルスすなわち、H5N1およびH1N1に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。これらの実施形態では、前記VLPは、いくつかのタンパク質に対して、したがって、インフルエンザウイルスのいくつかの株に対して免疫応答を誘導することができる多価VLPである。別の実施形態では、前記多価VLPはインフルエンザM1タンパク質を含む。一実施形態では、M1タンパク質は、配列番号3の残基100~103に対応するアミノ酸位にYKKLを含むL-ドメイン配列含む。別の実施形態では、M1タンパク質はブタインフルエンザM1タンパク質である。さらなる実施形態では、ブタインフルエンザM1タンパク質はインフルエンザ株ACalifornia0409に由来する。典型的な実施形態では、ACalifornia0409由来のM1タンパク質は、配列番号4から構成される。さらに別の実施形態では、M1タンパク質はトリインフルエンザM1タンパク質である。さらなる実施形態では、トリインフルエンザM1タンパク質は、インフルエンザ株AIndonesia505に由来する。典型的な実施形態では、インフルエンザ株AIndonesia505由来のM1タンパク質は、配列番号3から構成される。本発明はまた、本発明のVLPの上または中に発現される前記タンパク質の変異体を包含する。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列の変化を含有することができる。タンパク質に関する用語変異体は、参照配列に対して1つまたは複数のアミノ酸が変化したアミノ酸配列を指す。変異体は保存的変化を有することができ、そこでは置換アミノ酸は類似の構造または化学的性質を有する例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換。あるいは、変異体は非保存的変化例えば、グリシンのトリプトファンへの置換を有することができる。類似した少数の変異体は、さらにアミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を含むことができる。生物学的または免疫学的活性を消失させることなく、いずれのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失可能であるかを判定する指針を、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAソフトウェアを使用して見出すことができる。天然変異体はタンパク質中の変異により生じうる。これらの変異は、感染因子、例えばインフルエンザのそれぞれのグループ内に抗原多様性をもたらすことができる。したがって、インフルエンザ株に感染した人は、新しいウイルス株が出現すると、そのウイルスに対する抗体を発現し、古い株に対する抗体はもはや新しいウイルスを認識せず、再感染が起こりうる。本発明は、VLPを作製するための、感染因子に由来するタンパク質のすべての抗原および遺伝的多様性を包含する。クローニング、変異、細胞培養等の本発明に適用可能な分子生物手法を記載する一般的な教科書としては、BergerandKimmelGuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymologyVol152AcademicPressIncSanDiegoCalifSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualVol13ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY2000、およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyFMAusubeletaledsCurrentProtocolsajointventurebetweenGreenePublishingAssociatesIncandJohnWileySonsIncが挙げられる。これらの教科書は、例えばHA、NA、および/またはM1のクローニングおよび変異に関連する変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、および多くの他の関連トピックについて記載している。したがって、本発明はまた、本発明のVLPの上または中に発現されるタンパク質の特性を改善または改変するためのタンパク質工学および組換えDNA技術の公知の方法を使用することを包含する。タンパク質分子をコードする変異体核酸を生成および/または単離するために、かつ/または本発明のVLPの中または上のタンパク質をさらに改変/変異させるために、種々のタイプの変異誘発を使用することができる。これらの方法としては、限定しないが、部位特異的、ランダム点変異誘発、相同組換えDNAシャフリング、ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド定方向変異誘発、およびホスホロチオアート修飾DNA変異誘発、ギャップのある二本鎖DNAを使用する変異誘発等が挙げられる。さらなる適切な方法としては、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラコンストラクトが関与する変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、変異誘発は、天然分子または改変または変異を受けた天然分子についての公知の情報、例えば配列、配列比較、物理的性質、結晶構造等を指針とすることができる。本発明は、実質的な生物活性を示す、例えば、本発明のVLPの上または中に発現されると、効果的な抗体産生応答を誘発することができるタンパク質変異体をさらに含む。このような変異体は、活性にほとんど影響を及ぼさないように、当技術分野で公知の一般規則に従って選択された欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む。前記タンパク質をクローニングする方法は当技術分野で公知である。例えば、特定のウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、ウイルスDNAまたはRNAウイルスに感染した細胞から抽出されたポリアデニル化mRNAのRT-PCRにより、またはDNAウイルスに感染した細胞でのPCRにより単離することができる。得られる産物遺伝子は、ベクターの中にDNA挿入断片としてクローニングすることができる。用語ベクターは、生物間、細胞間、または細胞成分間で核酸を伝搬および/または移動させることができる手段を指す。ベクターとしては、自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体の中に組み込まれうるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等が挙げられる。ベクターはまた、自律的に複製しない、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖内にあるDNAおよびRNAの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン結合DNAまたはRNA、ペプチド結合DNAまたはRNA、リポソーム結合DNA等であってもよい。すべてではないが多くの一般的な実施形態では、本発明のベクターはプラスミドまたはバクミドである。したがって、本発明は、本発明のVLPの形成を誘導する細胞の中で発現することができる発現ベクターにクローニングされたタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。発現ベクターは、そこに挿入される核酸の発現および複製を促進することができるプラスミドなどのベクターである。典型的には、発現される核酸は、プロモーターおよび/またはエンハンサーに機能的に連結されており、プロモーターおよび/またはエンハンサーにより転写調節制御を受けている。一実施形態では、ベクターは、M1、NA、および改変HAをコードするヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、サイレントな置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされたタンパク質の特性および活性も、そのタンパク質の作製方法も変化させない改変を含有する変異を、前記タンパク質は含むことができる。ヌクレオチド変異体は、種々の理由で、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために作製することがあるヒトmRNAのコドンをSf9細胞などの昆虫細胞にとって好ましいコドンに変更する。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第2005/0118191号を参照されたい。加えて、ヌクレオチドを配列決定して、適正なコード領域をクローニングし、望ましくない変異が少しも含有されていないことを確認することができる。ヌクレオチドは、任意の細胞での発現のために、発現ベクター例えば、バキュロウイルスにサブクローニングすることができる。上記のものは、インフルエンザタンパク質をクローニングすることができる方法の一例にすぎない。当業者は、さらに他の方法が利用可能であり、実行可能であると理解している。本発明はまた、上記のインフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドを含むコンストラクトおよび/またはベクターを提供する。インフルエンザタンパク質を含むコンストラクトおよび/またはベクターは、非限定例であるAcMNPVポリへドリンプロモーターまたは他のバキュロウイルス、λファージPLプロモーター、大腸菌Ecolilac、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーターなどの適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、所望の宿主細胞および/または発現率に応じて、当業者には公知であろう。発現コンストラクトは、転写の開始部位、終結部位、および転写領域では翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有することになる。コンストラクトにより発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始点の翻訳開始コドンおよび終点に適正に位置する終止コドンを含むことになる。発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択可能マーカーを含むことになる。そのようなマーカーとしては、真核細胞の培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素、G418、またはネオマイシン耐性、及び大腸菌Ecoliおよび他の細菌における培養については、テトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。中でも好ましいベクターには、バキュロウイルス、ポックスウイルス例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、豚痘ウイルス等、アデノウイルス例えば、イヌアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスベクターがある。本発明で使用することができる他のベクターは、細菌で使用されるベクターを含み、これらは、pQE70、pQE60およびpQE9、pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK2233、pKK2333、pDR540、pRIT5を含む。中でも好ましい真核生物ベクターは、pFastBac1pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1およびpSG、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLである。他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。次に、上述の組換えコンストラクトは、トランスフェクション、感染、または形質転換のために使用することができ、真核細胞および/または原核細胞の中へインフルエンザタンパク質を発現させることができる。したがって、本発明は、インフルエンザタンパク質をコードする核酸を含有するベクターを含む宿主細胞を提供し、VLPの形成を可能にする条件下で、前記宿主細胞中での前記コンストラクトの発現を可能にする。真核生物宿主細胞の中には、酵母、昆虫、鳥類、植物、C.エレガンスCelegansまたは、線虫、および哺乳動物宿主細胞がある。昆虫細胞の非限定例は、スポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaSf細胞、例えばSf9、Sf21、イラクサギンウワバTrichoplusiani細胞、例えばHighFive細胞、およびショウジョウバエDrosophilaS2細胞である。真菌酵母を含む宿主細胞の例は、S.セレビシエScerevisiae、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactisK.ラクチスKlactis、C.アルビカンスCalbicansおよびC.グラブラタCglabrataを含むカンジダCandida種、アスペルギルスニデュランスAspergillusnidulans、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombeS.ポンベSpombe、ピキアパストリスPichiapastoris、ならびにヤロウイアリポリチカYarrowialipolyticaである。哺乳動物細胞の例は、COS細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスL細胞、LNCaP細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、ヒト胎児腎臓HEK細胞、およびアフリカミドリザル細胞、CV1細胞、HeLa細胞、MDCK細胞、Vero、およびHep-2細胞である。アフリカツメガエル卵母細胞、または両生類起源の他の細胞も使用することができる。原核生物宿主細胞としては、細菌細胞、例えば、大腸菌Ecoli、B.スブチリスBsubtilis、およびミコバクテリアが挙げられる。ベクター、例えば、インフルエンザタンパク質のポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で周知の方法に従って宿主細胞をトランスフェクションすることができる。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによって行うことができる。一実施形態では、前記ベクターは組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、前記組換えバキュロウイルスは真核細胞にトランスフェクションされる。好ましい実施形態では、前記細胞は昆虫細胞である。別の実施形態では、前記昆虫細胞はSf9細胞である。別の実施形態では、前記ベクターおよび/または宿主細胞は、1つまたは複数の改変HAタンパク質ならびにM1、NA、M2、およびNPから選択される1つまたは複数のさらなるインフルエンザタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。典型的な実施形態では、ベクターおよび/または宿主細胞は、1つまたは複数の改変HAタンパク質ならびにM1および/またはNAタンパク質をコードするヌクレオチドを含む。別の実施形態では、前記ベクターおよび/または宿主細胞は、1つまたは複数の改変HAタンパク質ならびにM1および/またはNAタンパク質から本質的になる。さらなる実施形態では、前記ベクターおよび/または宿主細胞は、1つまたは複数の改変HAタンパク質ならびにM1および/またはNAタンパク質からなる。これらのベクターおよび/または宿主細胞は、複製起点、選択マーカー等のさらなるマーカーを含有することができる。本発明はまた、VLP産生の効率をさらに増大させることになるコンストラクトおよび方法を提供する。例えば、M1、HA、および/またはNAタンパク質にリーダー配列を付加すると、細胞内でのタンパク質輸送の効率を改善することができる。例えば、異種のシグナル配列を、M1、HA、および/またはNAに融合させることができる。一実施形態では、シグナル配列を、昆虫前駆体タンパク質の遺伝子から取り出し、M1、HA、および/またはNAに融合させることができる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、キチナーゼシグナル配列であり、これはバキュロウイルス発現系で効率的に機能する。本発明はまた、本発明のVLPを産生する方法であって、細胞培養発現系において、1つまたは複数の改変HAタンパク質とM1、NA、M2、およびNPから選択される1つまたは複数のさらなるインフルエンザタンパク質とをコードする核酸を発現すること、ならびに細胞培養上清から前記VLPを精製することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、1つまたは複数の改変HAタンパク質ならびにM1および/またはNAタンパク質をコードする核酸を、VLPの形成を可能にする条件下で、真核細胞中で発現させる。一実施形態では、発現のために利用する真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、および哺乳動物細胞からなる群から選択される。典型的な実施形態では、真核細胞は昆虫細胞である。一実施形態では、細胞培養発現系はバキュロウイルス発現系である。選択された発現系および宿主細胞に応じて、VLPは、組換えタンパク質が発現され、VLPが形成される条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。適切な成長条件の選択は、当技術分野の技術または技術者の範囲内である。本発明のVLPを産生するように操作された細胞を成長させる方法としては、限定しないが、バッチ、バッチ-フェド、連続、および灌流細胞培養技法が挙げられる。細胞培養とは、細胞が増殖して、精製および単離のためのタンパク質例えば、組換えタンパク質を発現するバイオリアクター発酵チャンバー内での細胞の成長および増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクター内で、無菌、制御された温度および大気条件の下で行なわれる。バイオリアクターは、温度、大気、攪拌、および/またはpHなどの環境条件をモニターすることができる、培養細胞に使用されるチャンバーである。一実施形態では、前記バイオリアクターはステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、前記バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチック袋例えば、CellbagWaveBiotechBridgewaterNJである。他の実施形態では、前記予め滅菌されたプラスチック袋は、約50L~1000Lである。次いで、VLPは、例えば塩化セシウム、スクロース、イオジキサノールの勾配遠心分離ならびに例えばイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準精製手法など、その完全性を保持する方法を使用して単離される。以下は、本発明のVLPを作製、単離、および精製する方法の例である。通常、VLPは、VLPを形成するように操作された組換え細胞株から、前記細胞が細胞培養で成長すると産生される上記参照のこと。当業者ならば、本発明のVLPを作製および精製するために利用することができるさらなる方法があり、したがって、本発明は記載の方法に限定されないことを理解するであろう。本発明のVLPの産生は、Sf9細胞非感染を振盪フラスコに播種し、細胞が拡大することを可能にし、細胞の成長および増加に伴いスケールアップする例えば、125mlフラスコから50Lウェーブ袋Wavebagにことにより開始することができる。細胞を成長させるために使用する培地は、適切な細胞株のために調製されたものである好ましくは無血清培地、例えば昆虫培地ExCe11420、JRH。次に、前記細胞を最も効率的な感染多重度例えば、細胞当たり約1~約3のプラーク形成単位で組換えバキュロウイルスにより感染させる。いったん感染が起こると、トリインフルエンザM1などのM1および少なくとも1つのインフルエンザ異種タンパク質すなわち、本発明の改変HAタンパク質および/またはNAタンパク質がウイルススゲノムから発現し、VLPに自己組織化し、感染の約24~72時間後に細胞から分泌される。通常、感染は、細胞が対数増殖期中期にあるとき最も効率的であり4~8×106細胞/ml、少なくとも約90が生存可能である。本発明のVLPは、感染の約48~96時間後、細胞培養培地中のVLPレベルがほぼ最大になっているが、広範な細胞溶解が起こる前に回収することができる。回収時点でのSf9細胞の密度及び生存率は、色素排除アッセイにより示される場合、約0.5×106細胞/ml~約1.5×106細胞/mlで、少なくとも20の生存率となりうる。次に、培地を取り出し、清澄にする。培地にNaClを約0.4~約1.0M、好ましくは約0.5Mの濃度まで添加して、VLPの凝集を回避することができる。本発明のVLPを含有する細胞培養培地からの細胞及び細胞デブリの除去は、使い捨ての予め滅菌された中空繊維0.5または1.00μmフィルターカートリッジまたは同様の装置による接線流ろ過TFFにより達成することができる。次に、清澄化した培養培地中のVLPを、使い捨ての予め滅菌された500,000分子量カットオフ中空繊維カートリッジを使用する限外ろ過により濃縮することができる。濃縮したVLPは、0.5MのNaClを含有する、pH7.0~8.0の10容量リン酸緩衝生理食塩水PBSに対しダイアフィルトレーションを行い、残留培地成分を除去することができる。濃縮し、ダイアフィルトレーションしたVLPは、0.5MのNaClを含有するpH7.2のPBS緩衝液中の20~60不連続スクロース勾配上で、約4°C~約10°Cにおいて6,500×gで18時間遠心することによりさらに精製することができる。通常、VLPは、約30~約40のスクロースの間に、または界面に20および60ステップ勾配において明確な目に見えるバンドを形成するが、これを勾配から回収して保存することができる。この生成物は、精製法の次の工程のために、調製物中に200mMのNaClを含むように希釈することができる。この生成物はVLPを含有することに加え、無傷のバキュロウイルス粒子を含有することがある。VLPのさらなる精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー、または44等密度スクロースクッション遠心分離により達成することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、スクロース勾配上記参照のことからの試料を、陰イオンを含む媒体例えば、MatrixFractogelEMDTMAEで充填されたカラムに負荷し、VLPを他の混入物例えば、バキュロウイルス及びDNA/RNAから分離することができる塩勾配約0.2M~約1.0MのNaClを介して溶出する。スクロースクッション法では、VLPを含む試料を44スクロースクッションに添加し、30,000gで約18時間遠心する。VLPは、44スクロースの最上部にバンドを形成し、一方バキュロウイルスは底に沈殿し、他の混入タンパク質は最上部の0スクロース層に留まる。VLPピークまたはバンドを回収する。必要に応じて、無傷のバキュロウイルスを不活性化することができる。不活性化は、化学的な方法、例えばホルマリンまたはβ-プロピオラクトンBPLにより達成することができる。無傷のバキュロウイルスの除去および/または不活性化は、上記に例示されるように、当該技術分野で公知の選択的沈殿法およびクロマトグラフ法を使用することによっても、大部分は達成することができる。不活性化の方法は、VLPを含有する試料を0.2のBPL中で3時間、約25°C~約27°Cでインキュベートすることを含む。バキュロウイルスはまた、VLPを含有する試料を0.05BPLにおいて4°Cで3日間、次に37°Cで1時間インキュベートすることにより不活性化することができる。不活性化/除去工程の後、VLPを含む生成物を別のダイアフィルトレーション工程に通して不活性化工程からのいかなる試薬もおよび/またはいかなる残留スクロースも除去し、VLPを所望の緩衝液例えば、PBS中に入れることができる。VLPを含む溶液は、当技術分野において公知の方法により滅菌し例えば、ろ過滅菌、冷蔵庫または冷凍庫に保存することができる。上記の技法は、種々の規模にわたって実施することができる。例えば、T型フラスコ、振盪フラスコ、スピナーボトル、工業規模のバイオリアクターに至るまで可能である。バイオリアクターは、ステンレス鋼タンクまたは予め滅菌されたプラスチック袋例えば、WaveBiotech、Bridgewater、NJにより販売されるシステムのいずれかを含むことができる。当業者は、その目的にとって最も望ましいものを知っているであろう。バキュロウイルス発現ベクターの増幅および産生ならびに細胞の組換えバキュロウイルス感染による組換えインフルエンザVLPの産生は、前述のように、昆虫細胞、例えばSf9昆虫細胞で達成することができる。好ましい実施形態では、細胞は、本発明のVLPを産生するように操作された組換えバキュロウイルスに感染したSf9である。医薬製剤またはワクチン製剤および投与:別の態様では、本発明は、1つまたは複数の改変HAタンパク質を含むVLPを含む抗原製剤を提供する。VLPは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16、またはそれらの断片もしくは一部を含む、1つまたは2つ以上の亜型に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。一実施形態では、VLPは、限定しないが、M1、M2、NA、およびNPを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変HAタンパク質、M1タンパク質、およびNAタンパク質を含むVLPを含む抗原製剤を含む。一実施形態では、本発明の製剤は、1つまたは複数の精製または部分精製された改変HA抗原と組み合わせた、またはそれらと一緒に製剤化された、本明細書に記載の1つまたは複数のVLPを含むことができる。例えば、一実施形態では、製剤は、インフルエンザACalifornia0409由来の改変HAタンパク質を、同じウイルス由来の精製された改変HAタンパク質と組み合わせて含むVLPを含む。別の製剤では、VLPを同種または異種のHAまたはNAと組み合わせる。別の実施形態では、少なくとも1つのVLPおよび少なくとも1つのHAまたはNAについて別々の製剤を作製し、患者または被験体に同時にまたは別々に投与する。一部の実施形態では、HA抗体価または他の尺度により測定される抗体産生量は、VLPおよびHAを単一製剤または別々の製剤で同じ患者または被験体または動物に投与した場合に優れている。本発明の前記製剤は、本発明のVLPおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。薬学的に許容可能な担体としては、限定しないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張緩衝水溶液、およびそれらの組合せが挙げられる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および他の賦形剤ついての詳細な議論は、RemingtonsPharmaceuticalSciencesの中に提示されている。製剤は、投与方法に適合するものにすべきである。別の実施形態では、製剤は、ヒトへの投与に適したものであり、好ましくは無菌、非微粒子、および/または非発熱性である。本明細書で有用な医薬組成物は、組成物を投与された脊椎動物に有害な免疫応答の生成をそれ自体は誘導しない任意の医薬品を含み、かつ過度の毒性なしに投与することができる、任意の適切な希釈剤または賦形剤を含めた薬学的に許容可能な担体、および本発明のVLPを含有する。本明細書で使用する用語薬学的に許容可能なとは、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または哺乳動物およびより具体的にはヒトにおける使用について、米国薬局方、欧州薬局方、もしくはその他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび/または抗原組成物として有用となりうる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤を含有することができる。組成物は、再構成するのに適した凍結乾燥粉末などの固形形態、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤、または粉末であってもよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。本発明はまた、1つまたは複数の改変HAタンパク質を含むVLPを含むワクチンを含む。VLPは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16、またはそれらの断片もしくは一部を含む、1つまたは2つ以上の亜型に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。一実施形態では、VLPは、限定しないが、M1、M2、NA、およびNPを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変HAタンパク質、M1タンパク質、およびNAタンパク質を含むVLPを含むワクチンを含む。本発明はまた、本発明のワクチン製剤の成分の1つまたは複数で充填された1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。一実施形態では、キットは、2つの容器を含み、一方はVLPを含有し、他方はアジュバントを含有する。別の実施形態では、キットは、2つの容器を含み、一方は凍結乾燥VLPを含有し、他方は前記VLPを再懸濁するための溶液を含有する。このような容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形式の通知を添付することができ、この通知は機関によるヒト投与に対する製造、使用、または販売の承認を反映するものである。本発明はまた、VLP製剤が組成物の分量を示すアンプルまたはサシェットなどの密封容器にパッケージされることを提供する。一実施形態では、VLP組成物は液体として、別の実施形態では、乾燥滅菌された凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密封容器に供給され、例えば水または生理食塩水により、被験体への投与に適した濃度に再構成することができる。一実施形態では、前記容器は、少なくとも約50μg/ml、より好ましくは、少なくとも約100μg/ml、少なくとも約200μg/ml、少なくとも500μg/ml、または少なくとも1mg/mlの本発明のVLP付随抗原を含む。別の実施形態では、VLP組成物は、VLP組成物の分量および濃度を示す密封容器の中に液体形態で供給される。VLP組成物の液体形態は、少なくとも約50μg/ml、より好ましくは、少なくとも約100μg/ml、少なくとも約200μg/ml、少なくとも500μg/ml、または少なくとも1mg/mlの本発明のVLP付随抗原で、密封容器の中に供給される。一般に、本発明のVLPは、1つまたは複数の感染因子に対する免疫応答を刺激するのに十分な有効量または有効分量上記に定義のとおりで投与される。好ましくは、本発明のVLPの投与は、感染因子に対する免疫を誘発する。典型的には、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時間、および他の臨床的要因に基づき、この範囲内で調整することができる。予防ワクチン製剤は、例えば、注射針および注射器または無針注射器具を使用する皮下または筋肉内注射により全身投与される。あるいは、ワクチン製剤は、点鼻液、大型粒子エアロゾル約10ミクロン超、または上気道への噴霧のいずれかにより鼻腔内投与される。上記の送達経路のいずれも免疫応答を生じさせるが、鼻腔内投与は、インフルエンザを含む多くのウイルスの侵入部位で粘膜免疫を誘発するさらなる有益性を付与する。したがって、本発明はまた、感染またはその少なくとも1つの症状に対する免疫を哺乳動物に誘導するワクチンまたは抗原組成物を製剤化する方法であって、本発明のVLPの有効用量を前記製剤に加えることを含む方法を含む。VLPワクチンおよび/または抗原製剤を含む組成物の投与方法としては、限定しないが、非経口投与例えば、皮内、筋肉内、静脈内、および皮下、硬膜外麻酔、粘膜例えば、鼻腔内および経口もしくは経肺経路、または坐剤によるが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、または皮内に投与される。組成物は、任意の従来の経路により、例えば点滴またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜裏層例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽腔、口腔咽頭、腟、尿道、膀胱、および腸粘膜等を介する吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。一部の実施形態では、本発明のVLPを含む組成物の鼻腔内または他の粘膜投与経路は、他の投与経路より実質的に高度な抗体または他の免疫応答を誘導することができる。別の実施形態では、本発明のVLPを含む組成物の鼻腔内または他の粘膜投与経路は、感染を引き起こす他の株または生物に対する交差防御を誘導する抗体または他の免疫応答を誘導することができる。例えば、インフルエンザタンパク質を含むVLPは、脊椎動物に投与された場合、いくつかのインフルエンザ株に対して交差防御を誘導することができる。投与は全身的であっても局所的であってもよい。さらに別の実施形態では、ワクチンおよび/または抗原製剤は、免疫部位で免疫応答を誘発するために、粘膜組織を標的にするような方法で投与される。例えば、腸管関連リンパ組織GALTなどの粘膜組織は、特定粘膜標的特性を有するアジュバントを含有する組成物の経口投与を使用することにより、免疫の標的にすることができる。鼻咽頭リンパ組織NALTおよび気管支関連リンパ組織BALTなどのさらなる粘膜組織もまた、標的にすることができる。本発明のワクチンおよび/または抗原製剤はまた、例えば、ワクチン組成物の初回投与とそれに続く追加免疫投与の投与スケジュールで投与することができる。特定の実施形態では、組成物の第2の用量は、初回投与の大体2週間~1年後、好ましくは約1、約2、約3、約4、約5ヶ月~約6ヶ月後に投与される。さらに、第3の用量は、第2の用量後でかつ初回投与の約3ヶ月~約2年後またはそれを超えた後でも、好ましくは約4,約5、または約6ヶ月もしくは約7ヶ月~約1年後に投与することができる。第3の用量は、第2の用量後、特定の免疫グロブリンが被験体の血清および/または尿または粘液分泌物の中に検出されないかまたは低レベルで検出される場合、任意選択で投与することができる。好ましい実施形態では、第2の用量は、初回投与の約1ヶ月後に投与され、第3の用量は、初回投与の約6ヶ月後に投与される。別の実施形態では、第2の用量は、初回投与の約6か月後に投与される。別の実施形態では、本発明の前記VLPは、併用療法の一部として投与することができる。例えば、本発明のVLPは、他の免疫原性組成物、抗ウイルス剤、および/または抗生物質と共に製剤化することができる。医薬製剤の投薬量は、例えば、予防的または治療的免疫応答を誘発するのに効果的な用量を、例えば、ウイルス特異的免疫グロブリンの血清力価の測定により、または血清試料、尿試料、または粘膜分泌物の中の抗体の阻害率の測定により、最初に特定することによって、当業者が容易に決定することができる。前記投薬量は、動物試験から決定することができる。ワクチンの効力を試験するために使用される動物の非限定的リストには、モルモット、ハムスター、フェレット、チンチラ、マウス、およびコトンラットが含まれる。ほとんどの動物は、感染因子の自然宿主でないが、その疾患の種々の様相に関する試験にはなお有用となりうる。例えば、上記のいずれの動物においても、ワクチン候補、例えば本発明のVLPを投薬して、誘導される免疫応答を部分的に特徴づけること、および/またはいずれの中和抗体が産生されるかを判定することができる。例えば、マウスは小型であり、その低コストのため、研究者が試験を大規模に実施することが可能になるので、多くの試験がマウスモデルで実施されている。加えて、ヒト臨床試験を実施して、当業者がヒトに対する好ましい有効用量を決定することができる。そのような臨床試験は当技術分野ではルーチン的で周知である。使用される正確な用量は、投与ルートにも依存することになる。有効用量は、インビトロまたは動物の実験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。さらに、当技術分野で周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的な刺激物質の使用により増強することができる。アジュバントは未知の抗原に対する免疫の全般的な増大を促進するために実験的に使用されている例えば、米国特許第4,877,611号。長年、免疫プロトコールでは応答を刺激するためにアジュバントが使用されており、そのためアジュバントは、当業者には周知である。アジュバントの一部は、抗原提示の様式に影響を及ぼす。例えば、タンパク質抗原をミョウバンにより沈殿させると、免疫応答が増大する。また、抗原を乳化すると、抗原提示の期間が延長される。あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、VogeletalACompendiumofVaccineAdjuvantsandExcipientsに記載されるいずれのアジュバントも包含されることが、本発明の範囲内に想定される。典型的なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント死滅したマイコバクテリウムツベルクローシスMycobacteriumtuberculosisを含有する非特異的な免疫応答刺激物質、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントには、GMCSPとBCG、水酸化アルミニウム、thur-MDPおよびnor-MDPなどのMDP化合物、CGPMTP-PE、リピドA、ならびにモノホスホリルリピドAMPLが含まれる。細菌から抽出される3つの成分であるMPL、トレハロースジミコレートTDM、および細胞壁骨格CWSを、2スクアレン/Tween80乳剤中に含有するRIBIもまた考慮される。MF59、Novasomes登録商標、MHC抗原もまた使用することができる。本発明の一実施形態では、アジュバントは、脂質二重層を含まない大きな無定形の中心腔を取り囲む、水層により分離された、実質的に球状のシェル形態で配置された約2~10の二重層を有する少重層膜paucilamellar脂質小胞である。少重層膜脂質小胞は、非特異的刺激物質として、抗原用の担体として、さらなるアジュバントの担体として、およびそれらの組合せとして、いくつかの様式で免疫応答を刺激するように作用することができる。例えば、抗原が小胞に対して細胞外に留まるように、予め形成した小胞と抗原を混ぜ合わせてワクチンを調製すると、少重層膜脂質小胞は非特異的免疫刺激物質として作用する。抗原を小胞の中心腔内に封入することにより、小胞は免疫刺激物質および抗原用担体の両方として作用する。別の実施形態では、小胞は主に非リン脂質小胞から作製される。他の実施形態において、小胞はNovasomes登録商標である。Novasomes登録商標は、約100nm~約500nmの範囲の少重層膜非リン脂質小胞である。これは、Brij72、コレステロール、オレイン酸、およびスクアレンを含む。Novasomes登録商標は、インフルエンザ抗原に対して有効なアジュバントであることが示されているあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される、米国特許第5,629,021号、同第6,387,373号、および同第4,911,928号を参照のこと。免疫応答を誘導する別の方法は、免疫刺激物質と共に本発明のVLPを製剤化することにより達成することができる。これらは、免疫系の応答を増大させる、生体自体の化学伝達物質サイトカインである。免疫刺激物質としては、限定しないが、インターロイキン例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13;増殖因子例えば、顆粒球-マクロファージGM-コロニー刺激因子CSF;およびマクロファージ炎症因子、Flt3リガンド、B7.1;B7.2等の他の免疫刺激分子など、免疫刺激性、免疫増強性、および炎症促進性の活性を有する種々のサイトカイン、リンホカイン、およびケモカインが挙げられる。免疫刺激分子は、RSVVLPと同じ製剤で投与しても、別個に投与してもよい。タンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターのいずれかを投与して、免疫刺激効果をもたらすことができる。したがって、一実施形態では、本発明は、アジュバントおよび/または免疫刺激物質を含む抗原製剤およびワクチン製剤を含む。したがって、本発明の一実施形態は、VLPならびにアジュバントおよび/または免疫刺激物質を含む製剤を含む。別の実施形態では、前記アジュバントはNovasomes登録商標である。別の実施形態では、前記製剤はヒト投与に適している。別の実施形態では、製剤は、脊椎動物に対して、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与される。別の実施形態では、異なるVLPを一緒にブレンドして多価製剤を作製する。これらのVLPは、異なるインフルエンザウイルス株に由来する改変HAタンパク質を含むことがある。単回用量による免疫の刺激が好ましいが、所望の効果を達成するために、同じかまたは異なる経路によりさらなる投薬量を投与することができる。新生児および幼児では、例えば、十分なレベルの免疫を誘発するために複数回投与が要求されることがある。感染からの防御を十分なレベルで維持するために必要ならば、幼年期を通してある間隔で投与を継続することができる。同様に、例えば医療従事者、デイケア従事者、年少児の家族、高齢者、および心肺機能が損なわれている個体など、反復感染または重篤感染を特に受けやすい成人は、防御免疫応答の確立および/または維持のために複数回の免疫付与を必要とすることがある。誘導免疫のレベルは、中和分泌および血清抗体の量を測定することによりモニターすることができ、所望の防御レベルを誘発または維持するために、必要に応じて、投薬量を調製するかまたはワクチン接種を反復することができる。免疫応答を刺激する方法:上述のように、本発明のVLPは、感染因子に対する免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。粘膜免疫および細胞性免疫は両方とも、感染因子および疾患に対する免疫に寄与することができる。上気道において局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する抵抗性の主要な因子である。分泌性免疫グロブリンAsIgAは上気道の防御に関与し、血清IgGは下気道の防御に関与する。感染により誘導される免疫応答は、同じウイルスまたは抗原的に同様のウイルス株による再感染を防御する。例えば、インフルエンザは頻繁かつ予測不能の変化を受ける;したがって、自然感染後、宿主の免疫により提供される防御の有効期間は、その地域で広まるウイルスの新株に対して数年のみである場合がある。本発明のVLPは、脊椎動物例えば、ヒトに投与されると、前記脊椎動物に免疫を誘導することができる。免疫は、前記脊椎動物において、感染を防御するかもしくは寛解する、または少なくとも感染の症状を軽減する、本発明のVLPに対する免疫応答から生じる。場合によっては、前記脊椎動物が感染すると、前記感染は無症候性になる。応答は、完全防御応答ではないこともある。この場合、前記脊椎動物が感染因子に感染すると、この脊椎動物は、非免疫脊椎動物と比較して、症状の軽減または短い症状期間を経験することになる。本発明は、脊椎動物に免疫を誘導する方法であって、1つまたは複数の改変HAタンパク質を含むVLPを、前記脊椎動物に投与することを含む方法を含む。VLPは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16、またはそれらの断片もしくは一部を含む、1つまたは2つ以上の亜型に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。一実施形態では、VLPは、限定しないが、M1、M2、NA、およびNPを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変HAタンパク質、M1タンパク質、およびNAタンパク質を含むVLPを含むワクチンを含む。一実施形態では、誘導される免疫応答は体液性免疫応答である。別の実施形態では、誘導される免疫応答は細胞性免疫応答である。本明細書で使用される場合、抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的または部分的にコードされた1つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順にそれぞれ、免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。典型的な免疫グロブリン抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、2つの同一ポリペプチド鎖対から構成され、各対は、1つの軽鎖約25kDおよび1つの重鎖約50~70kDを有する。各鎖のN末端は、抗原認識の主たる役割を担う約100~110以上のアミノ酸の可変領域を定義する。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化により生成したいくつかの十分特徴づけられた断片として存在する。別の実施形態では、本発明は、被験体において感染またはその少なくとも1つの症状に対して防御細胞応答を誘導する方法であって、1つまたは複数の改変HAタンパク質を含む本発明の前記VLPの少なくとも1つの有効用量を投与することを含む方法を含む。VLPは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H1O、H11、H12、H13、H14、H15、もしくはH16、またはそれらの断片もしくは一部を含む、1つまたは2つ以上の亜型に由来する改変HAタンパク質を含むことができる。一実施形態では、VLPは、限定しないが、M1、M2、NA、およびNPを含む、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含むことができる。典型的な実施形態では、本発明は、改変HAタンパク質、M1タンパク質、およびNAタンパク質を含むVLPを含むワクチンを含む。上述のように、本発明のVLPは、被験体に投与された場合、前記被験体におけるインフルエンザの少なくとも1つの症状を予防または軽減することができる。インフルエンザのほとんどの症状は当技術分野で周知である。したがって、本発明の方法は、インフルエンザに付随した少なくとも1つの症状の予防または軽減を含む。症状の軽減は、例えば、被験体による自己評価により、臨床医の評価により、または適切なアッセイまたは測定例えば、体温の実施により、主観的または客観的に判定することができ、これには、例えば、生活の質の評価、感染もしくはさらなる症状の進行の遅延、症状の重症度の軽減、または適切なアッセイ例えば、抗体価および/またはT細胞活性化アッセイが含まれる。客観的な評価は、動物およびヒトの評価の両方を含む。本発明は、インフルエンザによる感染またはその症状を予防および/または軽減する方法であって、本発明のVLPを前記脊椎動物に投与することを含む方法を含む。集団発生例えば、インフルエンザ中に感染症を制御するための戦略は、小児を含む健常個体に遍くワクチン接種することである。例えば、流通しているインフルエンザワクチンを地域の生徒の約80にワクチン接種すると、成人における呼吸器疾患および高齢者における過剰死亡が減少したReichertetal2001。この概念は地域免疫または集団免疫として知られており、疾患から地域を防御する重要な役割を果たすと思われている。ワクチン接種を受けた人は、感染因子、例えばインフルエンザウイルスを中和する抗体を有するので、その人が他の人に前記因子を伝染させる可能性は極めて低い。したがって、ワクチン接種を受けていない人およびワクチン接種の効力が弱くなっている人またはワクチンが十分効力を発揮してない人は、彼らのまわりのワクチンを受けた人々が病気になっていないので、多くの場合、集団免疫により保護することができる。ワクチン接種を受けた人の割合が上昇するほど、集団免疫はより効果的になる。集団免疫を達成するためには、地域の人々の約95がワクチンにより防御されなければならないと考えられる。免疫されていない人々によって、彼らおよび他の人々がその疾患になる可能性が高まる。したがって、本発明はまた、集団におけるインフルエンザの重症度を軽減する方法であって、前記集団中の十分な個体に本発明のVLPを投与して、前記集団中の他の個体に伝染する可能性を防止または低減することを含む方法を含む。本発明はまた、免疫無防備状態の個体またはワクチン接種を受けなかった個体の間での感染の発生率を低減するために、地域の集団に本発明のVLPを投与することによって、集団または地域にインフルエンザウイルスに対する免疫を誘導する方法を包含する。一実施形態では、本発明のVLPの投与によりほとんどの学齢期児童を免疫にする。別の実施形態では、本発明のVLPの投与により地域のほとんどの健常個体を免疫にする。別の実施形態では、本発明のVLPは、動的ワクチン接種法dynamicvaccination戦略の一部である。動的ワクチン接種法は、出現するパンデミック株に関連するが、抗原連続変異により、哺乳動物に完全な防御を提供することができない効力の低いワクチンの安定した生成であるGermannetal2006を参照のこと。限定として解釈されるべきではない以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明する。本出願全体を通して引用されたすべての参考文献、特許、および公開済み特許出願の内容ならびに図および配列表は、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。実施例1改変ヘマグルチニンHAタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子VLPの生成この実施例は、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質と共に作製されるインフルエンザH5N1VLPの産生について記載する。改変HAタンパク質を構築するために、AIndonesia052005H5N1HA1配列番号2タンパク質のアミノ酸位170~172および181~183にあるNXT/S配列の1つまたは両方を変異させた図1。具体的には、HA1タンパク質の172および/または183位においてスレオニンからアラニンへの変異を作製した。HA遺伝子を改変した後、改変HA遺伝子を、AIndonesia52005H5N1由来のNAおよびM1遺伝子と共発現させた。HA、NA、およびM1遺伝子を、バキュロウイルス発現系を使用して、スポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaSf9昆虫細胞の中で発現させた。感染したSf9細胞の発現産物を、SDS-PAGE分析により特徴づけた。図2に示すように、予測分子量のHA、NA、およびM1タンパク質それぞれ、64kd、60kd、および31kdが検出された。同じレーン中のM1およびHAのバンドの存在は、VLP形成の証明となるM1会合体と会合するHAを示している。アミノ酸位170~172レーン4~6、アミノ酸位181~183レーン2、またはアミノ酸位170~172および181~183の両方レーン3の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質を含むVLPは正常に形成した。これらのデータは、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAを含むインフルエンザVLPを作製することが可能であるという証拠を提供し、これは、糖鎖付加パターンの改変に続いて生じるタンパク質コンフォメーションの変化の報告を考えると驚くべき結果である。実施例2改変ヘマグルチニンHAタンパク質を含むインフルエンザVLPは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性を保持するこの実施例では、野生型AIndonesia052005H5N1VLPにおけるHAおよびNAタンパク質のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性をそれぞれ、AIndonesia052005HAタンパク質配列番号2の170~172および181~183位にある1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質を含むH5N1VLPからの同じ活性と比較した。インフルエンザVLPの赤血球凝集活性を測定するために、野生型インフルエンザVLPまたは改変HAタンパク質含有インフルエンザVLPを含有するショ糖勾配画分の2倍希釈系列を調製した。次に、これらのVLPをモルモット赤血球とPBS中で混合し、4°Cで1~16時間インキュベートした。赤血球凝集の程度を視覚的に判定し、モルモット赤血球を凝集させることができる最も高い稀釈度を決定した。野生型インフルエンザVLPについて観察された最も高い赤血球凝集価は、1:4096であった。それに比較して、単一T172A糖鎖付加部位改変のHAタンパク質を含むインフルエンザVLPは、1:2048の赤血球凝集価を示し、一方、T172AおよびT183A糖鎖付加部位改変のHAタンパク質を含むインフルエンザVLPは、1:1024の赤血球凝集価を示した。これらの結果より、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質を含むH5N1VLPが赤血球凝集活性を保持することが実証される。加えて、インフルエンザVLP含有ショ糖勾配画分中のノイラミニダーゼ活性量は、NAタンパク質が基質フェチュインに作用してシアル酸を放出するノイラミニダーゼアッセイを使用して測定した。遊離シアル酸量に比例してピンク色を産生するチオバルビツール酸を用いて、遊離されたシアル酸量を化学的に判定し、発色団の量は波長594nmで分光光度計を使用して測定する。ノイラミニダーゼ活性は、野生型インフルエンザVLP、単一T172A糖鎖付加部位改変のHAタンパク質を含むVLP、ならびにT172AおよびT183A糖鎖付加部位改変のHAタンパク質を含むインフルエンザVLPにおいて検出され、1つまたは複数の糖鎖付加部位を除去するように改変されたHAタンパク質を含むH5N1VLPが赤血球凝集活性を保持することが示された。実施例3NetNGlyc10ソフトウェアを使用する、N-結合糖鎖付加部位の同定この実施例では、NetNGlyc予測分析ソフトウェアを使用して、3つの季節性インフルエンザ株における球状頭部上部のN-結合糖鎖付加部位を同定した。この実施例における第1の分析株は、ACalifornia072009H1N1であった。NetNGlyc予測ソフトウェアにより、28位付随するアミノ酸配列NSTDと共に、40位NVTV、304位NTSL、および557位NGSLに糖鎖付加部位を同定した。これらの部位の中に、頭頂領域に位置するものはない。したがって、パンデミックACalifornia072009H1N1由来のHAは、HA球状頭部の上部近傍領域に糖鎖付加部位を保有しない。この実施例における第2の分析株は、APerth162009H3N2であった。NetNGlyc予測ソフトウェアは、24位NSTA、38位NGTI、79位NCTL、142位NWTG、149位NGTS、181位NVTM、262位NSTG、および301位NGSIに糖鎖付加部位を同定した。これらの部位のうち、以下の4部位が頭頂領域に位置する:142、149、181、および262。これらの結果に基づいて、以下の4つの提案された変異部位が示唆された:N142D、T151A、T183A、およびN262D。これらの4つの提案された変異のうち、N142D、T151A、およびN262Dは天然に存在する。これに対して、T183A変異は天然には存在せず、この糖鎖付加部位が極めて保存的であることが示唆される。この実施例における第3の分析株は、BBrisbane602008であった。NetNGlyc予測ソフトウェアは、40位NVTG、74位NCTD、160位NITN、181位NKTA、212位NETQ、248位NQTE、319位NKSK、348位NGTK、および578位NVSCに糖鎖付加部位を同定した。これらの部位のうち、以下の4部位が頭頂領域に位置する:160、181、212、および248。これらの結果に基づいて、以下の4つの提案された変異部位が示唆された:T162A、T183A、T214A鶏卵をベースとした変異、およびN248D。これらの4つの提案された変異のうち、T214AおよびN248Dは天然に存在する。これに対して、T162AおよびT183A変異は天然には存在せず、この糖鎖付加部位が極めて保存的であることが示唆される。前述の詳細な説明は、理解を明瞭にするためにのみ提示されたものであり、当業者には変更形態が明らかであるため、そこから不必要な限定があると理解されるべきではない。本明細書に提供される情報はいずれも、ここに特許請求される発明の従来技術もしくは関連技術であると認めるものではなく、具体的にもしくは黙示的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であると認めるものではない。他に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本出願は、読者の注意を具体的な実施形態に向けるようにセクションに分割されているが、そのようなセクションが実施形態間の区分であると解釈されるべきではない。各セクションの教示及びそこに記載の実施形態は、他のセクションに適用可能である。本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更形態が可能であり、本出願が、概して本発明の原理に従い、かつ本発明が関する技術分野の範囲内の公知または通例の実施範囲内に含まれるような、また、以上に示され、添付の特許請求の範囲に従う本質的な特徴が適用されうるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形形態、使用、または適合形態を網羅するように意図されることは理解されるであろう。"