a少なくとも4つの結合部位を含む骨格スキャフォールドであって、該結合部位のうち少なくとも2つが本質的に同じ結合特異性を有する、該骨格スキャフォールド;およびb該4つの結合部位のそれぞれに結合された酵素成分であって、該酵素成分のうち少なくとも3つが異なる酵素成分である、該酵素成分を含む、粒子フリーまたは粒子結合型の複合体。ナノ粒子、好ましくはコーティングされかつ化学的に官能化されたナノ粒子、より好ましくはポリスチレンでコーティングされた強磁性ナノ粒子からなる群より選択される粒子に結合されている、請求項1記載の複合体。骨格スキャフォールドが直鎖状の合成骨格または生物学的骨格である、請求項1または2記載の複合体。骨格スキャフォールドが、ドックリンのためのコヘシン結合部位を少なくとも4つ有している、請求項1~3のいずれか一項記載の複合体。骨格スキャフォールドが1つまたは複数のタンパク質からなり、該1つまたは複数のタンパク質が化学的相互作用またはコヘシンドックリン相互作用によって一緒に連結されており、それによって、該連結の相互作用の結合特異性が酵素の結合特異性とは異なっている、請求項1~4のいずれか一項記載の複合体。骨格スキャフォールドが、セルロース分解性のセルロソーム形成微生物由来の非触媒足場タンパク質またはその遺伝子改変誘導体に由来する、請求項1~5のいずれか一項記載の複合体。骨格スキャフォールドが、クロストリジウムサーモセラムClostridiumthermocellum由来の非触媒足場タンパク質CipAまたはその遺伝子改変誘導体に由来する、請求項1~6のいずれか一項記載の複合体。骨格スキャフォールドが、配列番号24に示されるCBMc1c1d3、配列番号22に示されるc3c1c1d2、配列番号26に示されるc2c1c1、またはそれらのコヘシンモジュールにおいて60を超えるアミノ酸配列同一性を有するそれらの誘導体を含む、請求項7記載の複合体。骨格スキャフォールドが糖質結合モジュールCBMを含む、請求項1~8のいずれか一項記載の複合体。糖質結合モジュールが、直鎖状骨格スキャフォールドに組み込まれているかまたは結合されている、クロストリジウムサーモセラムのcipA遺伝子由来の糖質結合モジュールCBM3である、請求項9記載の複合体。酵素成分が、酵素の触媒モジュールとドックリンモジュールとを含む、請求項1~10のいずれか一項記載の複合体。酵素成分が、多糖分解性微生物由来のグリコシダーゼ、プロセッシブもしくは非プロセッシブエンドβ14グルカナーゼ、およびプロセッシブエキソβ14グルカナーゼ、またはそれらの遺伝子改変誘導体からなる群より選択される、請求項1~11のいずれか一項記載の複合体。酵素成分が、クロストリジウムサーモセラムのセルロソームのドックリンモジュール含有成分に由来するか、またはクロストリジウムサーモセラムの非セルロソーム成分にドックリンモジュールを融合させたものに由来する、請求項12記載の複合体。酵素成分が、配列番号8に示されるCelKd1、配列番号10に示されるCelRd1、配列番号14に示されるCelTd1、配列番号16に示されるCelEd1、配列番号6に示されるCelSd1、および配列番号4に示されるBglBd1、またはそれらのドックリンモジュールにおいて50を超えるアミノ酸配列同一性を有するそれらの誘導体を含む、請求項1~13のいずれか一項記載の複合体。以下の工程を含む、請求項1~14のいずれか一項記載の複合体を調製する方法:a請求項1および11~14のいずれか一項記載の酵素成分を組換え生産する工程;b請求項1および3~9のいずれか一項記載の骨格スキャフォールドを組換え生産する工程;c精製された、部分的に精製された、または精製されていない、工程aおよびbの成分をインビトロで混合する工程;ならびにd該酵素成分を該骨格スキャフォールドにランダムに結合させる工程。組換え生産された前記骨格スキャフォールドまたは組換え生産された前記酵素成分を粒子に結合させる工程をさらに含む、請求項15記載の方法。前記粒子が、ナノ粒子、好ましくはポリスチレンでコーティングされた強磁性ナノ粒子である、請求項16記載の方法。工程cにおける骨格スキャフォールドの総量および酵素成分の総量が、コヘシンモジュール1に対して酵素成分1のモル比で一緒に混合され、かつ少なくとも3つの酵素成分が、互いに対して1:1~1:15のモル比で一緒に混合される、請求項15~17のいずれか一項記載の方法。請求項15~18のいずれか一項記載の方法により調製された複合体。以下の工程を含む、多糖基質を酵素的に加水分解する方法:a請求項1~13のいずれか一項記載の複合体を不溶性セルロースと混合する工程;および、任意でb分解産物を単離する工程。多糖基質を酵素的に加水分解するための、請求項1~14のいずれか一項記載の複合体の使用。多糖基質が結晶セルロースまたは結晶セルロース含有基質である、請求項20記載の方法、または請求項21記載の使用。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は純粋に本発明の例示であることを意図したものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものと考えるべきでない。実施例では、スキャフォールディンCipAセルロソーム統合タンパク質を模倣する骨格スキャフォールドであるタンパク質担体に、組換え発現された6つのセルラーゼが結合されたシステムによる、加水分解的セルロース分解が示される。骨格スキャフォールドはコヘシン結合モジュールを有し、このコヘシンモジュールは酵素成分のC末端を形成するドックリンモジュールに強固かつ特異的に結合する。これは、好熱嫌気性細菌クロストリジウムサーモセラムのセルロソームに似ている、インビトロで構築された複合体である。コヘシンとドックリンは互いに自発的に結合する。そうした複合体は、正しい成分を正しい比で用いてインビトロで再構成した場合、結晶セルロースに対して、細菌から単離された天然のセルロソームよりも高い活性を示す。実施例1:非セルロソーム形成変異体の単離Cサーモセラムの変異誘発培養物から、変異体を単離した図1。コロニーの周囲のセルロースにクリアなハローを形成する能力が低下しているかまたは欠如している6個のコロニーをランダムに選択した。Cサーモセラム変異体のうちの1つであるSM1は、スキャフォールディンタンパク質CipAまたは活性コヘシンを産生する能力を完全に失っていた。野生型セルロソームをもつおよび変異体SM1セルロソームなし;遊離の酵素由来の酵素を、オオムギβグルカン、CMC両方とも対照、および微結晶セルロースMN300について試験した。オオムギβグルカンおよびCMCに対する酵素活性は、両菌株についてそれぞれ約85および10Umg1タンパク質であった表1。これとは対照的に、結晶セルロースに対する比活性は、変異体SM1において劇的に、野生型と比較して最大15倍、低下した。変異体は、完全に欠失していたCipA成分スキャフォールディンCipAを除いて、野生型に比較してほぼ等しい量のセルロソーム成分を産生した。超分子複合体は変異体において完全に失われていた。このことは、変異体がセルロソームを適正に形成できないことを示している。その結果、約50のセルロソームタンパク質成分が、分散した、可溶性の、複合体化されていないタンパク質として現れた。これらのタンパク質は野生型で観察されたものと同様の量および分布で生産された。表1オオムギβグルカン、CMC両方とも可溶性およびMN300セルロース結晶質に対する変異体SM1および野生型の濃縮培養上清の酵素活性実施例2:セルロソームの再構成A:酵素成分の調製人工セルロソームを再構成するために、変異体SM1および変異型上清タンパク質SM901を選択した。また、セルラーゼ成分をコードする遺伝子をクローニングして、最適pHおよび温度、さまざまな基質に対する活性など、それらの生化学的パラメータについて特性解析した。セルラーゼ活性のある、5つの最も顕著な酵素成分を、セルロソームの組成に関する以前のデータから選択した11。さらに、いくつかの糖分解性好熱細菌に由来するβグルコシダーゼを生化学的に特性解析した。サーモトガマリティマ由来のβグルコシダーゼBglBが、その高い熱安定性とセロデキストリンに対する高い活性のために選択された。当該遺伝子を、CサーモセラムのセルラーゼCelAに由来する下流のドックリンモジュールに融合させた。最適な発現条件を決定した。それにより形成された、触媒モジュールおよび非触媒モジュールドックリンモジュールを含むを含む酵素を、本明細書においてCelKd1、CelRd1、CelTd1、CelEd1、CelSd1およびBglBd1と呼ぶ。CelKd1、CelRd1、CelTd1、CelEd1、CelSd1およびBglBd1のアミノ酸配列は、配列番号4、6、8、10、14および16に示される。精製を容易にするために、それらをN末端にHisタグを有するようにクローニングし、アフィニティクロマトグラフィーによる精製を容易にした。最先端の技術を用いて、増幅したDNA断片は、プロモーターオペレーター配列および6×His配列の下流の制限部位例えば、Quiagen社からのpQEべクターに読み枠を合わせてクローニングした。諸成分のモル化学量論は、コヘシンとドックリンの数を計算することによって適正なバランスに保った。B:骨格スキャフォールドの調製以下に記載するミニスキャフォールディンは、CサーモセラムのCipA遺伝子由来、Cサーモセラムのセルロソーム成分由来、およびCジョスイ由来の、コヘシン、ドックリンおよびCBM配列を組み合わせることによって構築した。これらの配列は大腸菌Ecoliのコドン使用頻度について最適化された。すなわち、AGAAGG、AUA、およびCUAコドンを認識する、ほとんど発現されないtRNA遺伝子argU、ileY、およびleuWの最も稀なコドンを、同義コドンで置き換えた。このような由来の配列を合成し、当該技術に従って、pQEなどの大腸菌プラスミドベクターで発現させた。一態様では、cipA由来のコヘシン3~4I型およびCBM3、ならびにCサーモセラムのolpB由来のコヘシンc3II型およびドックリンd3を使用し、または、cipAのc2およびクロストリジウムジョスイのセルロソーム成分由来のドックリンd2を使用した。実施例で用いた骨格スキャフォールドを、本明細書においてCBMc1c1d3、c3c1c1d2、c2c1c1と呼ぶ。CBMc1c1d3、c3c1c1d2、c2c1c1のアミノ酸配列は配列番号22、24および26に示される。C:ドックリン酵素成分の発現、精製および濃縮酵素成分は最初、変異体SM1によって生産された。しかし、Cサーモセラムは、その嫌気的生活スタイルでのエネルギー制限のため、限られた量の細胞外タンパク質しか生産することができない。菌株の開発でさえも細胞外タンパク質の量の大幅な増加にはつながらない。30を超える成分からなる天然の酵素混合物を人工のセルラーゼ混合物で置き換えるために、主要なセルロソーム成分を組換え宿主から調製した。実験を単純にするために、宿主として大腸菌を用いた。組換えタンパク質を低コスト、高収率で生産することに関しては、他の細菌の方が適している可能性もある。所定のタンパク質について高収率をもたらす工業生産株はいずれも適している。酵素成分は、組換え宿主から単離して、Hisタグアフィニティクロマトグラフィーで精製するか、または大腸菌タンパク質の熱沈殿によって濃縮したそれにより、組換えタンパク質は可溶性相に残留する。熱沈殿は、タンパク質溶液を65°Cに10分間加熱し、沈殿した大腸菌タンパク質を当該技術に従って遠心分離により除去することによって実施した。濃縮は限外ろ過カットオフ10000ダルトンでも成功した。D:酵素成分と骨格スキャフォールドとの複合体形成次に、それらは、糖質結合モジュールを含むかまたは含まない、各種コヘシンからなる組換え骨格ミニスキャフォールド、例えばCBMc1c1に結合させた。その複合体は、カルシウムの存在下で、一態様では20mMCaCl2の存在下で、酵素成分の混合物に単純な化学量論混合物中に存在するコヘシンモジュールあたり1つのドックリン含有成分にて加えることによって、当該成分から再構成することができる。組換えミニスキャフォールディン構築物のサンプル構造は図2に示される。複合体形成は、ドックリン酵素成分と、各種コヘシンからなるミニスキャフォールディンとが、コヘシンドックリン相互作用を介して自発的に組み合わさることによって起こる。その後、それらは、天然の酵素または組換え宿主から単離された酵素とともに、複合体形成の効果を測定するために使用された。実施例3:人工セルロソーム複合体の活性CBMを含むかまたは含まない前記複合体の混合物を、最適化された脂肪族リンカー分子を介してポリスチレンナノ粒子の表面に結合させた。そうした構造は図3に模式的に示される。各種ミニスキャフォールディン複合体の結合は、ナノ粒子を密に被覆したことに起因する、立体障害や酵素成分の自由度のある程度の低下にもかかわらず、結晶セルロースの加水分解において活性の増加をもたらした図3、4。また、タンパク質を粒子に結合させた場合、酵素のpH範囲が広がった図5。このことは、セルラーゼの温度安定性にも言えることであった図6。これらの結果はどちらも、技術的応用にとっての重要な利点となる。このアプローチの実現可能性を試験するために、SM901成分の混合物の一部を組換えセルラーゼの1つまたは複数で置き換えた。組換え生産された成分を1つ加えた場合、混合物中のSM901成分の減少にもかかわらず、結果は、結晶セルロースに対する複合体の活性がわずかに増加したことを示した。組換え酵素の混合物を加えた場合は、それが大幅に増加した図9。特定の混合物では、合成混合物の活性が天然のセルロソームの活性より高かった。完全な置換および正しくバランスのとれた化学量論によって、合成複合体はさらに高い活性を示す。産物グルコースおよびセロデキストリンのパターンは、可溶性セルロースだけでなく不溶性セルロースに対しても、遊離の酵素SM901と、人工複合体と、天然セルロソームとの間で同一であった図11。基質として不溶性セルロースを用いる場合は、主産物はセロビオースであり、二次産物として若干のグルコースを含む。セロビオースは、複合体へのβグルコシダーゼの添加によって、さらにグルコースに分解される必要がある。ドックリンモジュールに遺伝的に融合された、サーモトガネアポリタナ由来のβグルコシダーゼ遺伝子が成功裏に使用されて、還元糖の生産を約2倍に増加させた。セルロソームの再構成はこのように可能であった。したがって、スキャフォールディンに沿った諸成分の順序はランダムのようであり、また、インビトロで再構成されたセルロソームの活性は天然セルロソームの活性に少なくとも匹敵することを、初めて実証することができた。天然セルロソームを工業量で生産することはできない。結果結果は、異なるコヘシンが等しくセルロソーム成分に結合し、異なるドックリンモジュールを含むセルロソーム成分間を区別しないことを明確に示した。コヘシンへの結合はランダムであった。コヘシンとドックリンとの集合は迅速かつ自発的であった。いったん結合すると、諸成分はスキャフォールディンに強固に固定された。骨格スキャフォールド中のコヘシン数の増加は、コヘシンドックリン相互作用によって個々の骨格スキャフォールドタンパク質を連結することにより、結晶セルロースに対する活性を増加させた図6。さらに、図6は、複合体へのあるタイプのCBMの追加が活性を増加させたことを示している図6。さらに、再構成されたセルロソームを形成する完全なスキャフォールディンは、たとえ系統的な最適化の前でも天然セルロソームの活性より高い最高の活性を示した。実施例4:ナノ粒子への結合任意超常磁性を示す強磁性体コアにポリスチレンコーティングを施した、0110±0007μmの平均直径を有するナノ粒子を選択し、その表面をCOOH残基で化学的に官能化した。当該表面にヘテロ二官能性リンカー分子を化学的にカップリングさせ、それを選択された骨格スキャフォールドに結合させ;スキャフォールドのコヘシンにおいて、酵素成分に結合されたドックリンとのタンパク質タンパク質相互作用非共有結合コヘシンドックリン相互作用によって、酵素を担持させることができる。好ましいナノ粒子の模式図は図12に示される。ナノ粒子の表面にリンカー分子を結合させるために、官能基遊離COOH基を活性化させた。水溶性のカルボジイミド、1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩EDCは、水溶性化合物NヒドロキシスルホスクシンイミドスルホNHSを用いると、カルボキシレート基と活性エステル基を形成する。EDCはカルボキシレート基と反応して活性エステルOアシルイソウレア脱離基を形成する。スルホNHSエステルは標的分子上のアミンと速やかに反応する親水性の活性基である18。しかし、エステルのカルボニル基への攻撃が可能なアミン求核試薬の存在下では、スルホNHS基が速やかに脱離して、アミンと安定したアミド結合を生成する。スルホNHSをEDCに添加することの利点は、活性中間体の安定性を向上させることであり、その活性中間体は最終的に攻撃性のアミンと反応する。EDCとカルボキシレート基との反応は、水溶液中では数秒以内に加水分解される。スルホNHS上のヒドロキシル基とEDC活性エステル複合体との反応からスルホNHSエステル中間体を形成させると、活性化されたカルボキシレートの半減速度halfrateが数時間に延長される19。ナノ粒子の表面に結合した分子の構造については、図4を参照されたい。A活性化20mgのカルボキシル修飾ナノ粒子を、強力なNdFeBディスク磁石141~145テスラを用いた分離によって、ガラスバイアル中の2ml活性化緩衝液50mMMES05MNaClpH60で3回洗浄した。新たに調製したEDC溶液とスルホNHS溶液を、最終濃度がそれぞれ2mM、5mMとなるよう添加することにより、粒子の修飾表面を活性化させた。その混合物を室温で15分間反応させた。Bリンカーとのカップリング2mlの反応緩衝液01Mリン酸ナトリウム、05MNaCl、pH72を用いて、液体から磁気による分離を行うことにより、粒子を2回洗浄した。5mgのO2アミノエチル02カルボキシエチルポリエチレングリコール3000塩酸塩NH2PEGCOOHを100μlの反応緩衝液中に窒素雰囲気下で溶解し、活性化粒子に添加した。活性化粒子とPEGベースのリンカーのアミノ基との間の共有結合による連結を室温で3時間以内に行った。緩衝液を2mlの活性化緩衝液に交換し、共有結合されたリンカーの末端のカルボキシレート基を上記のようにEDCとスルホNHSで活性化させた。2mlの反応緩衝液を用いた2回の洗浄工程の後、10mgのNαNαビスカルボキシメチルLリシン水和物NTAを加えた。リンカーの活性化カルボキシレート基へのNTAのカップリングを室温で3時間以内に行った。粒子を2mlの蒸留水で3回洗浄した。1mlの1MNiS04を加えた。遊離のNi2イオンをNTAのカルボキシレート基で錯体化して、NTANiを形成させた。5分後、粒子を2mlの蒸留水で2回洗浄し、さらに2mlの50mMMOPS、01MNaCl、5mMCaCl2、pH60で2回洗浄した。CHisタグ付きタンパク質担体のコンジュゲーション上記の粒子を、2mlの50mMMOPS、01MNaCl、5mMCaCl2、pH60中で1~15mgのタンパク質と共に一晩インキュベートすることによって、修飾ナノ粒子に骨格スキャフォールドタンパク質を結合させた。糖質結合モジュールCBMを含むかまたは含まない、異なる数のコヘシンをもつ骨格スキャフォールドCBMc1c1およびc1c1を、表面修飾ナノ粒子の表面に固定した。ナノ粒子へのタンパク質のカップリング効率を、架橋前および架橋後のタンパク質含量の光吸収の分光光度測定590nm、Bradfordアッセイにより決定した。タンパク質を担持したナノ粒子を、反応溶液から磁気によって分離した。最初に加えたタンパク質量から反応溶液中の残存タンパク質を差し引くことによって、カップリング効率を算出した。還元糖は、1単位の酵素が1分あたり1μmolのグルコース当量を遊離させると仮定して、35ジニトロサリチル酸法20による反応の線形範囲内で少なくとも3回反復して定量した。結果表面結合固定化は、多くの場合、酵素とその活性を安定化させることが示されている。セルラーゼを用いた実験では、ナノ粒子の表面への加水分解酵素Cサーモセラム由来のセルラーゼの直接固定化により、その比活性が低下することが判明している。これは、酵素の活性ドメインまたは構造ドメインが表面への直接的な共有結合カップリングによって影響される可能性があることを示している。したがって、セルロソームの骨格スキャフォールドへの方向特異的カップリングは酵素活性を維持するように選択された。試験したすべての反応の最高のカップリング結果は、2mmolのEDC、5mmolのスルホNHSを用いて得られた。80μgmgのナノ粒子のカップリング効率を達成することができた。これは、粒子あたり約1300の骨格スキャフォールド分子の算定平均数に相当する。カルボキシ修飾粒子間の架橋は観察されなかった。その上、遊離カルボキシ基とその結果生じる親水性表面が原因で、COOHビーズは非常によく再懸濁された。分離は図13に示される。マグネタイトナノ粒子の再生のため、粒子をEDTA10mMで3回洗浄して錯体化Ni2イオンを除去し、同じ溶液中において室温で一晩懸濁させた。脱イオン水による3回の洗浄工程後に、粒子にNi2および6×Hisタグ付き骨格スキャフォールドタンパク質酵素成分に対して算定された等モル比の骨格スキャフォールドタンパク質を再び担持させた。1mgの新しいCOOH修飾ナノ粒子は、約80μgの骨格スキャフォールドタンパク質を担持することができた。同量の再利用ナノ粒子は約50μg回収率625のスキャフォールディンタンパク質を結合することができ、そして2回再利用したナノ粒子は約25μg回収率312のタンパク質をこの実験で固定化することができた。セルラーゼは、骨格スキャフォールドナノ粒子複合体の表面に、コヘシンドックリン認識によって固定化された。粒子にSM901変異体酵素を担持させ、可溶性、非晶質、および不溶性のセルロースに対するその比活性を、他に記載されるようにジニトロサリチル酸試薬を用いて還元糖の生産について測定した。分解の効率は基質のタイプに左右される。加水分解に最も利用しやすい基質は、可溶性β1314グルカンとしてのオオムギβグルカンである。オオムギβグルカンに対するSM901変異体酵素のβグルカナーゼの比活性は約8Umgタンパク質であった。カルボキシメチルセルロースの分解に対する比活性は約11Umgタンパク質である。非晶質セルロースリン酸膨潤セルロースは分解に比較的利用しやすく、約28Umgタンパク質の比活性をもたらす。ナノ粒子に結合していない同様の複合体との比較は、セルロソーム型骨格スキャフォールドを介した加水分解酵素の固定化が、試験したすべての基質の分解率にマイナスの影響を及ぼさなかったことを示している。結晶セルロースMN300またはアビセルに対して、遊離の変異体酵素はそれぞれ30mUmgおよび12mUmgの比活性を示した。9個のコヘシンと糖質結合モジュールをもつ精製された天然セルロソームは、基質としてMN300を用いた場合に423mUmgの比活性を示し、アビセルの場合には198mUmgの比活性を示した。SM901変異体酵素と、より多い数のコヘシンをもつ骨格スキャフォールドとの複合体形成は、その加水分解活性をそれぞれ63mUmgおよび28mUmgの比活性に増強させた。活性の増強は遊離の酵素に比べて21倍および23倍であった。3個のコヘシンとファミリー3の糖質結合モジュールをもつ複合体を用いた場合には、分解率が非結合型ヒドロラーゼと比較して49倍および37倍増加した図5。比較のため、CBMを含まないかまたはCBMを含む骨格スキャフォールドタンパク質c1c1およびCBMc1c1を使用した。CBMが骨格スキャフォールドに存在する場合、基質MN300では比活性が62mUmgから102mUmgに増加し、アビセルでは44mUmgから108mgmUに増加した。ナノ粒子結合型ミニスキャフォールディンへの加水分解酵素の固定化は、可溶性基質および不溶性基質の分解率にマイナスの影響を与えなかった。また一方で、pH安定性と温度安定性が大幅に増加したそれぞれ図6および7。参考文献: