"aN-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体のγ-カルボン酸を活性化する工程;bD-グルタミン酸をシリル化する工程;およびc工程aで製造された活性化カルボン酸誘導体と工程bのシリル化生成物とを反応させて、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を与える工程;を含む、L-Glu-γ-D-Gluジペプチドの合成方法。工程aで、活性化が、前記N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体の活性化誘導体、例えば、混合無水物への変更を含む、請求項1に記載の方法。活性化が、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体とアルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基との処理を含む、請求項2に記載の方法。クロロギ酸がイソブチルクロロギ酸である、請求項3に記載の方法。前記N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体が、アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の低温溶液にゆっくり添加される、請求項2~4のいずれか1項に記載の方法。アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の溶液が-10°C~-50°Cの温度、好ましくは約-30°Cである、請求項5に記載の方法。第三級アミン塩基がN-メチルモルホリンである、請求項3~6のいずれか1項に記載の方法。前記N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体が、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルである、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。工程bにおいて、シリル化がD-グルタミン酸とシリル化剤との処理を含む、請求項1~8に記載の方法。前記シリル化剤が、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSAである、請求項9に記載の方法。工程bにおいて、D-グルタミン酸がシリル化剤の数等量と溶解され、工程cにおいて、当該溶液が工程a由来のカルボン酸誘導体の冷溶液に添加され、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種のシリルエステル化された溶液を形成する、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。前記N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体がN-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルであり、生成物が2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸のシリルエステル化された溶液である、請求項11に記載の方法。反応後、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸のシリルエステル化された溶液が脱シリル化の水処理を受け、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸を良収率および良純度で製造する、請求項12に記載の方法。脱シリル化処理が、水と有機溶媒との溶液の分離を含む、請求項13に記載の方法。d前記保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を脱保護する工程;をさらに含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。脱保護が、ベンジルおよび/またはベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸を生成する、請求項15に記載の方法。脱保護が水素化分解を含む、請求項15または16に記載の方法。水素化分解が、適切な遷移金属触媒を用いた、水溶性エタノール中での水素化分解を含む、請求項17に記載の方法。触媒がパラジウム炭素触媒を含む、請求項18に記載の方法。脱保護後、<10ppmのパラジウムを含む生成物を得るために、生成物がチオシリカゲルで処理される、請求項15~19のいずれか1項に記載の方法。シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種と6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸とをカップリングする工程を含む、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物の合成方法。カップリングが、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸のカルボン酸部分の活性化とシリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を用いた処理を含む、請求項21に記載の方法。活性化が、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物とカップリング剤との処理による、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸の活性化HOBTエステルへの変換を含むシ絵急行22に記載の方法。.前記カップリング剤がジイミドである、請求項23に記載の方法。前記シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種が、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ジペプチドのシリル化により製造される、請求項21~24のいずれか1項に記載の方法。前記シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種が、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法で製造されたL-Glu-γ-D-Gluジペプチドから調製される、請求項25に記載の方法。シリル化がシリル化剤を用いた処理を含む、請求項26に記載の方法。前記シリル化剤がO,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSAである、請求項27に記載の方法。カップリング反応がアセトニトリル中で実施される、請求項21~28のいずれか1項に記載の方法シリル化剤の存在下での任意の操作が、-10°C~10°Cの範囲の温度で実施される、請求項21~29のいずれか1項に記載の方法。塩基水溶液好ましくは、飽和炭酸水素ナトリウムまたは酸水溶液好ましくは、ギ酸の注意深く限定された量の添加による濾過、希釈、および沈殿を含む精製プロセスをさらに含む、請求項21~30のいずれか1項に記載の方法。以下の工程を含む2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の3ナトリウム塩ONX-0801の調製方法:iナトリウム塩基水溶液中、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩基性の溶液の提供工程;ii必要に応じて、pHの調整工程;iiiカラムクロマトグラフィーをする工程;iv任意に、工程iiiで溶出された生成物の濃縮工程;およびv凍結乾燥工程。工程iで使用される2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらのナトリウム準化学量論的な塩が、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法により調製される、請求項32に記載の方法。工程iで、前記ナトリウム塩基水溶液が炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの溶液である、請求項32または33に記載の方法。工程iiで、前記pHがpH7.5-9.0の範囲に調整される、請求項32~34のいずれか1項に記載の方法。工程iiiで、クロマトグラフィーが、改善されたポリスチレン樹脂カラム上、水または1~10の水混和性溶媒を含む水で溶出するカラムクロマトグラフィーによる精製を含む、請求項32~35のいずれか1項に記載の方法。工程ivで、連続エバポレーション技術例えば、ワイプされた膜エバポレーション;膜ベース濃度プロセス例えば、限外濾過;またはカラム充填および除去を用いて、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩の希薄水溶液を含む、回収されたクロマトグラフィーの分画の濃縮を含む、請求項32~36のいずれか1項に記載の方法。カラム溶離後0°C~10°Cで限外濾過を用いて4倍~16倍に濃縮することを含む、請求項37に記載の方法。水溶液の低分子量不純物の量を少なくするため、0°C~10°Cでの限外濾過装置中、残余分の透析濾過をさらに含む、請求項38に記載の方法。工程vで生成された凍結乾燥ケーキが水を10質量以下含む、請求項32~39のいずれか1項に記載の方法。R-ビスO-トリメチルシリル2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;R-2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;S-O-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル-4-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸;R-ビスO-トリメチルシリル2-S-4-4-S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸;S-O-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル-4-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸;R-ビスO-トリメチルシリル2-S-4-4-S-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸;から選択される、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸およびその3ナトリウム塩の合成で有用な化合物。請求項1~19のいずれか1項に記載の方法によるL-Glu-γ-D-Gluジペプチドの合成;請求項25~30のいずれか1項に記載の方法による、前記L-Glu-γ-D-Gluジペプチドから、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の合成;および請求項31~39のいずれか1項に記載の方法による、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸から2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の3ナトリウム塩ONX-0801の調製および精製を含む、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の3ナトリウム塩ONX-08012の調製方法。上記で説明されたように、化合物1のジペプチド単位の複素環式コアすなわち分子3および7へ添加する先行技術の方法は、最終生成物を単離する前に、カップリング工程および1つまたは2つの脱保護工程を含む。この化学は、その高い費用に加えて、いくつかの欠点を有し、薬物を市販用に製造するのに全く適さない。上記報告された化学は、とても少量で、生成物1の純度プロファイルの詳細な分析なく行われた。化合物1のこれまでに説明されていない適切な分析技法である、酸性条件下での化合物1の実験は、水溶液中、pH5以下で限定的に安定性を有することを示す。1の単純なモノトリフルオロ酢酸塩は、固体形態とトリフルオロ酢酸TFA溶液の両方で限定された安定性を有する。5またはその2-脱ピバロイル化等価体からt-ブチルエステルの除去は、強い酸性条件を必要とするので、これは、脱保護に必要とされる実際の設定を非常に強制している。トリフルオロ酢酸は反応混合物から除去されうる。しかしながら、TFA溶液中での安定性の問題は、量が増加したとき、トリフルオロ酢酸の除去が低温で相対的に迅速にされなければならないことを必要とする。とても特別な装置なしで、この任意の量に大規模化するのは容易にはし得ない。この化学は、API医薬品有効成分を0.5~1kgの量で製造するとき、総合的に実現不可能となるだろう。さらに、この化合物が非経口的に使用されるとき、不溶性の遊離酸1は、製剤であり得ず、上記言及される特許出願は、最終的な製剤での形態であるナトリウム塩2の効率的な調製および適切な精製を示唆しない。2の有効な抗癌活性に起因して、2のより優れた合成方法は大きな利益と有用性を有する。本発明は、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ジペプチドの新規な合成方法、および2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸1の合成でのその使用方法を提供する。有利なことに、本発明の方法は、容易に入手できかつ安価な前駆体から、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ジペプチド、好ましくは、保護されていないL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ジペプチドの合成を可能としてよい。非経口投与形態で長期の保存および使用に好適な形態にある、上述の酸の3ナトリウム塩2の効率的な単離および精製方法も提供される。第1の態様で、本発明は、aN-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体のγ-カルボン酸を活性化する工程;bD-グルタミン酸をシリル化する工程;およびc工程aで製造した活性カルボン酸誘導体と工程bのシリル化生成物とを反応させて、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を与える工程;を含むL-GIu-γ-D-GIuの合成方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、d上記保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を脱保護する工程;をさらに含む。第2の態様で、本発明は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸、もしくはそれらの薬学的に許容できる塩またはそれらの溶媒和物の合成方法であって、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸を、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種とカップリングする工程を含む合成方法を提供する。好ましくは、上記保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、本発明の第1の態様に従う方法により製造され、または、当該種から調製される。さらなる態様では、本発明は、以下の工程を含む2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の3ナトリウム塩ONX-0801の調製方法および精製方法を提供する:iナトリウム塩基水溶液中、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩を溶解する工程;ii必要に応じて、pHを調整する工程;iiiカラムクロマトグラフィーをする工程;iv任意に、工程iiiで溶出された生成物を濃縮する工程;およびv凍結乾燥する工程。好ましくは、工程iで使用されている2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸は、本発明の第1の態様および/または第2の態様に記載されている工程を含む方法により調製される。追加の態様で、本発明は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸およびその3ナトリウム塩の合成に有用な化合物ならびに中間体を提供する;例えば、R-ビストリメチルシリル2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;R-2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;S-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル4-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イルプロプ-2-イニルアミノ安息香酸;R-ビストリメチルシリル2-S-4-4-S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イルプロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸;S-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル4-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イルプロプ-2-イニルアミノ安息香酸;R-ビストリメチルシリル2-S-4-4-S-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イルプロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸。L-Glu-γ-D-Gluの合成本発明は、aN-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体のγ-カルボン酸を活性化する工程;bD-グルタミン酸をシリル化する工程;およびc工程aで製造された活性カルボン酸誘導体と工程bのシリル化生成物とを反応させて、完全に保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を与える工程;を含む、L-Glu-γ-D-Gluの合成方法を提供する。工程a-N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体の活性化工程aは、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体のγ-カルボン酸を活性化を含む。いくつかの実施形態では、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体は、一般式のジプロテクトされた誘導体である:式中、PCは、カルボン酸保護基であり、PNは、アミン保護基である。好適なカルボン酸保護基は、当該技術分野で公知であり、例えば、それらは、TW.GreeneおよびPGMWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis第3版.WileyNewYork,1999年.p.387-431に記載されており、それは参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、L-グルタミン酸誘導体のα-カルボン酸の保護基PCは、ベンジルまたは任意に置換されたベンジルエステル;アリルエステル;t-ブチルエステル;または2-トリメチルシリルエチルエステルから選択される。好適なアミン保護基も、当該技術分野で公知であり、例えば、それらは、TW.GreeneおよびPGMWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis第3版.WileyNewYork,1999年.p.503-572に記載されており、それは参照により本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、L-グルタミン酸誘導体のアミン保護基PNは、カルバメート;ベンジルまたは任意に置換されたベンジルカルバメートから選択され、これらに限定されないが、4-メトキシベンジルカルバメート;アリルカルバメート;t-ブチルカルバメート;9-フルオレニルメチルカルバメート;または2-トリメチルシリルエチルカルバメートを含む。いくつかの好ましい実施形態では、L-グルタミン酸のアミンおよびα-カルボン酸の両方は、基PN、PCにより保護され、それらは、同じ化学的工程で除去されうる。例えば、ベンジルエステルに同じまたは異なる任意の置換基を有する任意に置換されたベンジルカルバメートの使用は、両方の基の水素化分解により除去されることを可能とする。アリルエステルを有するアリルカルバメートを使用すること、両方の基が触媒的パラジウムおよびギ酸塩を用いて除去されうることを可能とする。t-ブチルエステルを有するt-ブチルカルバメートの使用は、両方の基を酸性条件下で除去されることを可能とする。好ましい実施形態では、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体は、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルまたは別の好適なN-αO-ジプロテクトL-Glu誘導体である。いくつかの実施形態では、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体は、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルである。いくつかの実施形態では、活性化は、上記N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体のγ-カルボン酸の活性化誘導体への変換を含む。いくつかの実施形態では、活性化は、γ-カルボン酸、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-αベンジルエステルの活性化誘導体への変換を含む。種々の活性カルボン酸誘導体およびそれらを生成方法は、当該技術分野で公知である。具体例は、酸塩化物、酸フッ化物、酸無水物、対称および非対称の両方のO-アシルウレア、チオエステル、活性化エステル例えば、p-ニトロフェニル、および1,O-オキシベンゾトリアゾールエステル、活性化アミド例えば、N-アシルイミダゾール、混合無水物例えば、O-アシルホスホン酸エステルおよびO-アシルスルホン酸エステルならびにアシルアジドを含む。これらの多くのおよびPeptideSynthesis;APracticalHandbookM.BodanszkySpringer-Verlag1993年に例示されている他の活性化カルボン酸は、ペプチド合成反応での使用に好適である。いくつかの実施形態では、活性化誘導体は無水物である。いくつかの実施形態では、無水物は混合無水物である。いくつかの実施形態では、活性化は、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体の活性化誘導体例えば、無水物への変換を含む。例えば、下記式無水物である:式中、R1はC1~4アルキル基であり、ならびにPCおよびPNは、これまでに定義されたとおりである。いくつかの実施形態では、活性化は、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルの活性化誘導体例えば、下記式の無水物への変換を含む:式中、R1は、C1-4アルキル基である。いくつかの実施形態では、R1はイソブチルである。いくつかの実施形態では、活性化は、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体、好ましくは、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルとアルキルクロロギ酸例えば、R1OC=0Clとの処理を含む。いくつかの実施形態では、活性化は、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体、好ましくは、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルとアルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基との処理を含む。いくつかの実施形態では、クロロギ酸はイソブチルクロロギ酸である。いくつかの実施形態では、第三級アミン塩基はN-メチルモルホリンであるNMM。いくつかの実施形態では、活性化は、低温で、アルキルクロロギ酸の溶液に、トリアルキルアンモニウム塩として、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体の溶液、好ましくは、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルの逆添加を含む。いくつかの実施形態では、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体は、アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の低温溶液にゆっくり添加される。いくつかの実施形態では、低温溶液は、約-10°C~-50°Cの温度であり、好ましくは約-30°Cの温度である。いくつかの実施形態では、追加温度は、-25~-40°Cの範囲である。いくつかの実施形態では、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体例えば、N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステル:第三級アミン塩基:クロロギ酸の割合は、約1:1.2:1.1である。いくつかの実施形態では、反応は、溶媒としてTHF中で実施される。工程b-D-グルタミン酸のシリル化工程bは、D-グルタミン酸のシリル化を含む。いくつかの実施形態では、シリル化がD-グルタミン酸とシリル化剤との処理を含む。いくつかの実施形態では、シリル化がD-グルタミン酸とシリル化剤との処理を含み、以下の式のシリル化D-Glu種を製造する。式中、各RSiおよびRSi’は、独立に以下に定義されているシリル保護基であり、同じであってよいし異なっていてよい。いくつかの実施形態では、すべてのRSi基およびRSi’基は、同じシリル保護基である。種々のシリル保護基、およびシリル保護基の導入のために好適なシリル化剤は、当該技術分野で公知である例えば、TW.GreeneおよびPGMWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis第3版.WileyNewYork,1999年参照。いくつかの実施形態では、RSiおよびRSi’は、それぞれ独立に、トリメチルシリル-SiMe3、トリエチルシリル-SiEt3、t-ブチルジメチルシリル-SitBuMe2、フェニルジメチルシリル-SiPhMe2、t-ブチルジフェニルシリル-SitBuPh2またはトリイソプロピルシリル-SiiPr3から選択される。いくつかの実施形態では、RSiは、トリメチルシリル-SiMe3である。いくつかの実施形態では、RSi’は、トリメチルシリル-SiMe3である。いくつかの実施形態では、RSiおよびRSi’は、両方トリメチルシリル-SiMe3である。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSAである。いくつかの実施形態では、当該シリル化剤は、D-グルタミン酸に対して少なくとも3当量の量で使用される。いくつかの実施形態では、シリル基は、トリメチルシリルより加水分解およびアルコール分解条件にはるかに高い安定性を有するシリルエステルを形成するために選択される。完全に保護された種を単離することが意図されている場合および/または連続工程までシリル化種を有していることが望まれる場合、例えば、t-ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリルまたはトリイソプロピルシリルエステルが好ましいかもしれない。工程c-工程aおよびbの生成物の反応工程cは、工程aで製造した活性化カルボン酸誘導体と工程bのシリル化生成物とを反応させて、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を与えることを含む。いくつかの実施形態では、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は完全に保護されたL-Glu-γ-D-Glu種である。いくつかの実施形態では、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、以下の式の化合物である:式中Rは、シリル保護基である。いくつかの実施形態では、工程b由来のシリル化D-Glu種の溶液は、工程a由来の活性化カルボン酸誘導体の冷溶液に添加される。いくつかの実施形態では、シリル化D-Glu種の溶液は、工程bの反応混合物から直接添加される。いくつかの実施形態では、工程bで、D-グルタミン酸は、シリル化剤の数等量で溶解され;その後、工程cで、その溶液は、工程a由来のカルボン酸誘導体の冷溶液に添加され、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸のシリルエステル化された溶液を形成する。いくつかの実施形態では、溶媒はTHFである。いくつかの実施形態では、工程bで、D-グルタミン酸は、約1.1当量の量で使用され、工程cで、シリル化剤は、N-αO-ジプロテクト-L-Glu誘導体の量に対して、約3.5等量の量で使用される。いくつかの実施形態では、方法は、カップリング工程の後に後処理を含む。いくつかの実施形態では、後処理は、シリルエステルを開裂しない。いくつかの実施形態では、後処理は、脱シリル化水溶液の後処理を含む。いくつかの実施形態では、反応後、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸ジシリルエステル、好ましくは、O.O-ビストリメチルシリルエステルを含むシリルエステル化された溶液は、脱シリル化水溶液の後処理を受け、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸を良収率および良純度で製造する。従って、いくつかの実施形態では、工程cから得られる保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は下記式の化合物である:いくつかの実施形態では、脱シリル化処理は、水-有機分離、すなわち水と有機溶媒との溶液の分離を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は酢酸エチルである。いくつかの実施形態では、脱シリル化処理は、酸の添加を含む。いくつかの実施形態では、酸の溶液のpHを約pH2に調整するために添加される。いくつかの実施形態では、水-有機分離後、酸は水部分を酸性にするために添加される。いくつかの実施形態では、酸は、塩酸である。いくつかの実施形態では、後処理は、溶媒交換を含む。いくつかの実施形態では、溶媒交換は、最初の溶媒と新しい溶媒とを置換する溶媒交換を含む。いくつかの実施形態では、溶媒交換は、第1溶媒の除去、例えば、エバポレーションおよび/または共沸混合物の除去の溶媒交換を含む。いくつかの実施形態では、最初の溶媒は酢酸エチルである。いくつかの実施形態では、新しい溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、得られた保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、新しい溶媒から再結晶され、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸を良収率および良純度で提供する。工程d-L-Glu-γ-D-Glu種の脱保護いくつかの実施形態では、上記の方法は、さらに以下の工程を包含する:d上記保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を脱保護する工程。いくつかの実施形態では、脱保護は、完全な脱保護、すなわち保護されたL-Glu-γ-D-Glu種からすべての保護基の除去を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、部分的な脱保護、すなわち保護されたL-Glu-γ-D-Glu種からいくつかの保護基だけの除去を含む。例えば、脱保護は、L-Glu部分の保護基の除去を含み、一方、除去されていないD-Glu部分に、任意のシリル保護基を残すことを含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、任意に置換されたベンジルおよび/またはベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルを製造する。いくつかの実施形態では、脱保護は、t-ブチルおよび/またはt-ブチルオキシカルボニル保護基を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸を製造する。いくつかの実施形態では、脱保護は、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸からベンジルおよびベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸を製造する。いくつかの実施形態では、脱保護は、アリルおよび/またはアリルオキシカルボニル保護基の除去を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルを製造する。いくつかの実施形態では、脱保護は、脱シリル化を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、2-トリメチルシリルエチルおよび/または2-トリメチルシリルエチルおよび/または2-トリメチルシリルエトキシカルボニル保護基の除去を含み、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸を製造する。脱保護工程で選択される条件は、除去される保護基に依存する。種々のアミンおよびカルボン酸保護基の除去の条件は、当該技術分野で公知であるTW.GreeneおよびPGMWuts、ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis第3版.WileyNewYork、1999年参照。複数の種の保護基が除去される場合、複数の脱保護工程を用いてよい。いくつかの実施形態では、脱保護は、酸性条件下の保護基の除去例えば、TFAトリフルオロ酢酸中での分解を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、フッ化物イオンを用いた保護基の除去例えば、TBAFフッ化テトラブチルアンモニウムまたはピリジン、HF錯体を用いた処理を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、水素化分解を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、ギ酸塩および適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含む。いくつかの実施形態では、脱保護は、水性エタノール中、適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含む。いくつかの実施形態では、遷移金属触媒は、パラジウム炭素触媒含む。いくつかの実施形態では、水素化分解は、15~50psiで水素の使用を含む。いくつかの実施形態では、水素化分解は、室温で実施される。いくつかの実施形態では、水素化分解は、室温で実施され、次いで、60°Cに温められる。いくつかの実施形態では、60°Cに暖め、次いで熱濾過される。いくつかの実施形態では、脱保護は、水性エタノール中、適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含み、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸:エタノール:水の最初の比は、約1グラム:10mL:2mLである。いくつかの実施形態では、2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸:エタノール:水の最初の比は、約1グラム:7.9グラム:7グラムである。いくつかの実施形態では、水素化分解は、化合物が結晶性の固体として良収率で単離されることを可能とする後処理を続けて行われる。いくつかの実施形態では、後処理は、Pd/Cを除く最初の濾過を含む。いくつかの実施形態では、最初の濾過の後、残査は、出発物質のグラムにつき、約10mLのエタノールおよび約1mLの水で洗浄される。いくつかの実施形態では、後処理は、加熱を含む。いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含む。いくつかの実施形態では、後処理は、チオシリカを用いて処理、好ましくは60°Cで処理し、次いで再濾過を含む。いくつかの実施形態では、後処理は、材料を冷却して晶出を可能とすることを含む。いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含み、最初の濾過の残査は、出発物質のグラムあたり約5-6グラムのエタノールで洗浄される。いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含み、最初の濾液および洗浄は、チオシリカ好ましくは、出発物質に基づき約2wtを用いて、好ましくは4時間、好ましくは60°Cで処理されることを含む。いくつかの実施形態では、混合物は、その後、熱濾過される。その後、当該濾過の残査は、さらなるエタノール例えば、約2グラム/出発物質1グラムで洗浄される。その後、濾液は、好ましくは、常温にゆっくり冷却され、その後5~10°Cに冷却される。いくつかの実施形態では、生成物は、約5~15wtの水を含む結晶性固体として単離される。いくつかの実施形態では、生成物は、約10ppm未満のパラジウムを含む。2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の合成本発明は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸、もしくはそれらの薬学的に許容できる塩またはそれらの溶媒和物の合成方法であって、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸と保護されたL-Glu-γ-D-Glu種とカップリングする工程を含む合成方法を提供する。いくつかの実施形態では、カップリングは、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸のカルボン酸部分の活性化し、次いで、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種を用いた処理を含む。いくつかの実施形態では、活性化は、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸の活性化カルボン酸誘導体、好ましくは活性化エステル誘導体への変換を含む。種々の活性化カルボン酸誘導体およびそれらの作製方法は、前もって上記されているように当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、活性化は、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸を活性化HOBTエステルへの変換例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物HOBTおよびカップリング剤との処理によるを含む。いくつかの実施形態では、カップリング剤は、ジイミドカップリング剤である。いくつかの実施形態では、カップリング剤は、EDCIN-3-N,N-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩である。いくつかの実施形態では、変換は、THF中で実施される。いくつかの実施形態では、変換は、アセトニトリルACN中で実施される。いくつかの実施形態では、変換は、約0°C~約25°Cの温度で実施される。いくつかの実施形態では、活性化カルボン酸誘導体は、O-1,N-ベンゾトリアジル6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸である。いくつかの実施形態では、変換は、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびN-3-N,N-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩の1.0:1.1~1.3:1.1~1.5の範囲のモル比での反応を含む。いくつかの実施形態では、シクロペンタ[g]キナゾリニル酸の充填は、約20~約40グラム/リットルの範囲である。いくつかの実施形態では、HPLCシステムは、カップリング反応中の活性化カルボン酸誘導体の製造過程の形態を観測するために使用される。いくつかの実施形態では、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、シリル保護されたL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸である。いくつかの実施形態では、保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、以下の化学式である:式中、各RSiおよびRSi’は、上記のシリル保護基であり、同じであってよいし異なっていてよい。いくつかの実施形態では、すべてのRSi基およびRSi’基は、同じシリル保護基である。いくつかの実施形態では、シリル保護基は、トリメチルシリル-SiMe3である。他の実施形態では、RSiおよびRSi’は、異なるシリル保護基である。いくつかの実施形態では、各RSiは、t-ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリルまたはトリイソプロピルシリルから選択され、各RSi’は、トリメチルシリルである。シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、好ましくはL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸のシリル化により製造される。別の実施形態では、シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ジシリルエステルのさらなるシリル化により製造される。いくつかの実施形態では、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸、またはそれらのジシリルエステルは、上で論じたように本発明の方法により製造される。いくつかの実施形態では、シリル化は、シリル化剤を用いた処理を含む。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドである。いくつかの実施形態では、シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種は、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルのシリル化および可溶化によりインシチュで生成され、その活性化カルボン酸誘導体は得られた溶液に直接添加される。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、保護されていないジペプチド、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸を溶液とするために使用されてよく、従って、反応を起こさせる。シリル化剤は、一般的な穏和な乾燥剤としても作用し、加水分解の副反応を抑制するかもしれない。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、反応混合物中、活性化カルボン酸誘導体の第一級アルコールを追加的にシリル化してよくすなわち、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸の活性化エステルの2-ヒドロキシメチル基をシリル化し、2-シロキシメチル基、好ましくは2-トリメチルシリルオキシ基を製造してよく、しかし、当該シリル化剤は、その後のカップリング反応に影響を及ぼさない。反応混合物は、それゆえ、例えば、S-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イルー4-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸のようなシリル化活性化エステルを含んでよい。カップリング反応の生成物は、それゆえ、例えば、R-ビスO-トリメチルシリル2-S-4-4-S-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イルプロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸のような完全にシリル化されたカップリング生成物を含んでよい。いくつかの実施形態では、固体のL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸は、あらかじめ形成された活性化カルボン酸誘導体の溶液に直接添加され、その後にシリル化剤が添加される。いくつかの実施形態では、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸のスラリーを含む反応混合物は、シリル化剤の添加前に約-5~-10°Cに冷却される。好ましくは、添加中、および添加後の任意の期間、混合物の反応温度は、10°C超上昇させない。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、徐々に添加される。好ましくは、添加の上で気になる発熱は注意深く制御される。いくつかの実施形態では、シリル化剤は、約7~10モル当量の量で使用される。いくつかの実施形態では、このプロセスの溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、固体のL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸は、シリル化剤の添加後、活性化カルボン酸誘導体の前もって形成された溶液に直接添加される。いくつかの実施形態では、シリル化剤およびL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸は、前もって形成された活性化カルボン酸誘導体の溶液に添加する前に、分離反応気で一緒に反応させられる。いくつかの実施形態では、シリル化剤およびL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸の反応は、20~25°Cで、2~24時間の間、THF中で行われる。いくつかの実施形態では、カップリング反応は、工程中のHPLCで観測される。好ましくは、後処理は、中間体のO-ベンゾトリアゾール-1-イル6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸が≧99消費された時点で開始される。いくつかの実施形態では、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸とL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸のモル比は、1:1.2~1.5の範囲である。いくつかの実施形態では、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸の水分含量は、0~4重量の範囲である。いくつかの実施形態では、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸の水分含量は、5~15重量の範囲である。いくつかの実施形態では、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸の水分含量は、9~12重量の範囲である。いくつかの実施形態では、活性化カルボン酸誘導体の前もって形成された溶液は、インシチュで生成されたL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸ポリシリル化エステルに添加される。シリル保護されたL-Glu-γ-D-Glu種への活性化カルボン酸誘導体のカップリングは、シリル化2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸を製造する。いくつかの実施形態では、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の粗製溶液は、物理的な相に基づく方法例えば、沈殿または液-液抽出技術を使用して、最初に精製される。いくつかの実施形態では、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の最初の精製は、反応溶媒の交換、好ましくは減圧下で反応混合物の除去、代替溶媒での再構成を含む。いくつかの実施形態では、反応溶媒はTHFである。いくつかの実施形態では、代替溶媒は、ナトリウム塩基水溶液例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、このようにして製造された水溶性の弱アルカリ溶液pH7~0は、有機不純物の多くを除くため、水混和性の低い溶媒で数回洗浄される。いくつかの実施形態では、当該洗浄溶媒は、酢酸エチルである。いくつかの実施形態では、このようにして製造された水溶性の弱アルカリ溶液pH7-10は、水混和正の低い有機溶媒例えば、酢酸エチルで最初に洗浄され、その後、さらに限外濾過により精製される。いくつかの実施形態では、上記洗浄および/または限外濾過に続けて、例えば、窒素または他の不活性ガスを散布され、または制限されたエバポレーションの減圧下で、有機溶媒の存在している量を減少させる。いくつかの実施形態では、上記のプロセスで得られた純粋な水溶液は、例えば、第3の態様に後述するように、生成物をクロマトグラフィーカラムに乗せるために使用されてよい。いくつかの実施形態では、上記のプロセスで製造される水溶液は、酸性にされ、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸が沈殿され、回収および乾燥される。含水ギ酸は、沈殿物に包含される傾向がとても低いので、この沈殿のために好ましい酸であるかもしれない。従って、この生成物は、例えば、第3の態様で後述するように希ナトリウム塩基水溶液に再溶解され、クロマトグラフされてよい。いくつかの実施形態では、代替溶媒はアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、反応溶媒は、アセトニトリルであり、その場合、溶媒交換は必要とされないかもしれない。いくつかの実施形態では、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の初期精製は、アセトニトリル中、反応混合物を濾過することを含む。いくつかの実施形態では、精製は、従って、濾液を0~5°Cにさらに冷却することを含み、好ましくは、アセトニトリルでさらに希釈しながらである。いくつかの実施形態では、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸に対するアセトニトリルの最終の割合は、80~120L/kgである。いくつかの実施形態では、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の精製は、さらに沈殿を含む。いくつかの実施形態では、沈殿は、計量された少量の水相の添加を含む。この水相は、単なる水であってよく、または、pHの高い水相例えば、ナトリウム塩基水溶液例えば、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、または、pHの低い水相例えば、2Mギ酸溶液であってよい。好ましくは、これらの水相は、低温の撹拌反応混合物にゆっくり添加される。好ましくは、添加の後にその温度で数時間撹拌される。いくつかの実施形態では、その後、減圧濾過され、好ましくは、窒素下で、低温のまま行われる。いくつかの実施形態では、粗製の2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸、またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩は、自由流動固体として単離される。いくつかの実施形態では、使用される水、含水ギ酸溶液またはナトリウム塩基水溶液の量は、カップリング反応で使用される6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸の約0.8~1.0グラム/グラムの範囲である。例えば、脱シリル化し、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸がかなり精製された形態で単離する方法は、以下を含んでよい:反応混合物の濾過、さらにアセトニトリルを用いて、初めの酸6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸10グラム毎にアセトニトリルを約1リットルである溶液を製造するための希釈、その後の限定された量の水、含水ギ酸のゆっくりの添加、好ましくは2M、または水溶性炭酸水素ナトリウム溶液、好ましくは、飽和、約10mL/アセトニトリル1リットルを添加し、冷却、撹拌された反応溶液、その後、窒素雰囲気下で生成した沈殿物の回収し、次いで、真空オーブン中、室温で乾燥工程を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、BSAの添加から固体沈殿物の回収まで、または反応混合物の水溶性クエンチのプロセスの全体にわたって、10°C以下に維持される。ONX-0801の3ナトリウム塩の調製本発明は、以下の工程を含む2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩ONX-0801の調製方法および精製方法をさらに提供する:iナトリウム塩基水溶液中、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の溶液を提供する工程;ii必要に応じて、pHを調整する工程;iiiカラムクロマトグラフィーをする工程;iv任意に、工程iiiで溶出された生成物を濃縮する工程;およびv凍結乾燥する工程。工程i-3ナトリウム塩の形成3ナトリウム塩は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸と適切なナトリウム塩基の処理により形成される。いくつかの実施形態では、ナトリウム塩基は、ナトリウム塩基水溶液である。工程iは、それゆえ、ナトリウム塩基水溶液中に2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の溶液の提供を含む。いくつかの実施形態では、3ナトリウム塩は、酸の溶解またはナトリウム塩基水溶液例えば、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムの水溶液中でのそれらの準化学量論的なナトリウム塩の溶解により形成される。いくつかの実施形態では、3ナトリウム塩は、固体の2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸、またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩、好ましくは、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の粗製固体の溶解により形成される。いくつかの実施形態では、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸は、ナトリウム塩基水溶液中で溶液として調製されていてよく、そして、それゆえ、直接工程i~vで使用されうる。好ましくは、工程iで使用される2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの溶液は、本発明の第1の態様および/または第2の態様に記載されている工程を含む方法により調製される。例えば、固体の2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩は、上記のとおり、第2の態様のカップリング反応から沈殿されてよい。あるいは、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の水溶液は、上記のとおり、ナトリウム塩基水溶液との溶媒交換後、第2の態様のカップリング反応で得られてよい。いくつかの実施形態では、工程iで、ナトリウム塩基水溶液は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸の生成後、直接反応混合物に添加され、例えば、反応をクエンチする。当該溶液は、上記のとおり種々の方法で、洗浄されてよい。いくつかの実施形態では、工程iで、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の粗製沈殿は、希薄な炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの撹拌されている低温の水溶液に添加され、好ましくはすべての固体が溶解するまで撹拌される。工程ii-pHの調製いくつかの実施形態では、工程iで製造された溶液のpHは、pH7.5~9.0の範囲にあるように調整される。いくつかの実施形態では、pHは、pH8~9に調整される。いくつかの実施形態では、pHは、水酸化ナトリウムの添加により調整される。工程iii-カラムクロマトグラフィー2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩の水溶液は、好適な樹脂クロマトグラフィーシステムで、カラムクロマトグラフィーにより精製される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、樹脂カラムを含む。いくつかの実施形態では、樹脂は、修飾されたポリスチレン樹脂である。いくつかの実施形態では、樹脂は、例えばSP207SSおよびHP20SSから選択される。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、水または1~10の水混和性溶媒を含む水で溶出することを含む。いくつかの実施形態では、水混和性溶媒は、THFまたはアセトニトリルである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、初め水で溶出し、次いで、必要であれば、水中で2~10未満の段階上の勾配のあるアセトニトリルにより溶出することを含む。いくつかの実施形態では、名目どおりの約40~50mg/mLの濃度で、3ナトリウム塩含む水溶液を、カラムに乗せる。いくつかの実施形態では、工程iまたはiiで製造された3ナトリウム塩を含む水溶液は、直接カラムに乗せられる。いくつかの実施形態では、樹脂に3ナトリウム塩の名目の乗せる量は、1:40~1:100wt:wtの間である。いくつかの実施形態では、樹脂に3ナトリウム塩の名目の乗せる量は、約1:50~約1:60wt:wtの間の量である。いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは水で溶出される。いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは、2のアセトニトリル水溶液で溶出する前に、10回のカラム体積の水で溶出される。いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは、水でのみ溶出される。いくつかの実施形態では、十分な純度のすべての分画は、99.0~99.7の間の純度の最終生成物を製造するために混合される。いくつかの実施形態では、溶液のpHは、例えば、溶液がpH7以下であることがわかったら、この段階で、調整されて上げられる。いくつかの実施形態では、pHの調整は、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムの水溶液の添加により行われる。いくつかの実施形態では、カラム分画および/または貯蔵されたカラム分画は、0~10°Cの間の温度で貯蔵されている。工程iv-クロマトグラフィー生成物の濃縮いくつかの実施形態では、工程ivは、工程iiiのロマトグラフィで溶出された生成物の濃縮を含む。クロマトグラフィーの後、集めた分画は、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩の希薄水溶液を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの後、集めた分画は、溶液を濃縮する技術を使用して濃縮され、材料の最小量のロスと最小量の分解を確認した。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの後、集めた分画は、例えば、連続エバポレーション技術例えば、ワイプドフィルムエバポレーションを使用して;または、膜に基づいた濃縮プロセス例えば、限外濾過、透析濾過、ナノ濾過、または逆浸透を使用して;またはキャッチアンドリリース型の親和性カラム;またはカラム充填および除去を使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、この濃縮は、限外濾過装置であり、好ましくは、5PallCentrasette0.65Kdカットフィルター膜のような膜を使用して実施される。いくつかの実施形態では、限外濾過装置の温度は、10°C未満に維持される。いくつかの実施形態では、貯蔵されたカラム分画は、凍結乾燥工程の前に3倍~15倍に濃縮される。いくつかの実施形態では、貯蔵されたカラム分画は、凍結乾燥工程の前に8倍~12倍に濃縮される。いくつかの実施形態では、限外濾過の後に濃縮された溶液は、限外濾過装置中、様々な体積の水で透析濾過された。つまり、溶液は、例えば、2倍~3倍の倍数に水で再希釈され、次いで、水溶液中の溶媒または他の水溶液の低分子量不純物の量を減らすために、再濃縮して最初の量に戻される。この処理は、一回以上繰り返されてよい。この処理は、0~10°Cの濃度で行われてよい。いくつかの実施形態では、凍結乾燥の前に、濃縮された溶液は、内毒素を除去するために濾過される。いくつかの実施形態では、この濾過は、分子量5000カットフィルター例えば、ペリコンPellicon2マキシカセット分子量5000カットフィルターを通して行われる。工程v-凍結乾燥最後の工程で、任意に濃縮された溶液の凍結乾燥は、頑丈だが、潮解性がある凍結乾燥ケーキとして、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩を与える。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、棚状の凍結乾燥機を使用して実施される。いくつかの実施形態では、約3~50mg/mLの2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩を含む溶液は、凍結乾燥の工程に使用される。いくつかの実施形態では、溶液は、-30~-65°Cの範囲に凍結され、そして、-15~-25°Cの温度の棚を有する20~200mtorrの真空に、10~30時間さらされる。いくつかの実施形態では、その後、棚の温度は、約-15°Cに上げられ、スケールに応じて、真空は、1~10日間、約20~80mtorrに調整された。いくつかの実施形態では、その後、棚の温度は、少なくとも1日の間-5°Cに上昇される。いくつかの実施形態では、中間体の乾燥は、0°Cの棚温度で実施される。いくつかの実施形態では、最後の乾燥は、20°Cの棚温度で実施され、真空は、10~25mtorrに調整される。いくつかの実施形態では、乾燥は、カールフィッシャー水分計が、プロセスが完了したことを示すまで継続される。いくつかの実施形態では、最後の凍結乾燥工程は、1~5wtの水を含む安定な凍結乾燥のケーキを生成する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥のケーキは、10重量以下の水を含む。化合物2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸およびその3ナトリウム塩の合成に有用な以下の化合物および中間体が提供される;R-ビストリメチルシリル2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;R-2-S-5-ベンジルオキシ-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-5-オキソペンタンアミドグルタール酸;S-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸;R-ビストリメチルシリル2-S-4-4-S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸;S-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール-1-イル4-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸24;R-ビストリメチルシリル2-S-4-4-S-2-トリメチルシロキシメチル-4-オキソ-4,6,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミド-5-オキソ-5-トリメチルシリルオキシペンタンアミドグルタール酸25。議論および実施例本発明者らは、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸7SおよびD-Glu12と比較的安価な保護されたL-Glu誘導体例えば、Cbz-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステル16から2工程で製造された単純なジペプチドL-Glu-γ-D-Glu15から2の調製、単離、ならびに精製の費用効率が高いならびに効率的な合成方法論を提供する。例えば、以下のスキーム4に示される化学は、本発明の好ましい実施形態を表し、L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸15の効率的かつ拡張可能な作製方法を提供し、化合物1および2のペプチド部分の費用を大きく減少させる。その後、それは、非経口薬物の形態に好適な形態で、ジペプチド15と6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸7Sを2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩12に変換させる。この後のカップリングおよび単離で記載される化学は、最適化されたとき実施する直接的であり、マルチキロスケールで行うことがとても困難または不可能である工程を避け、2の前もっての調製での収率でのかなりの増加>2倍をもたらし、同時に、クロマトグラフィーならびに余分な単離および反応を行う必要性を排除する。また、全体の順序を、以前のプロセスより、より簡単に観測および制御し、同時にこれらお工程の全体の費用を大きく低下させる。当該プロセスは、2つのペプチドのカップリングを含み、両方、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSAまたは他の適切なシリル化剤の使用、単離および精製の間のシリルエステルのインシチュでの脱保護、水素化分解の脱ベンジル化、および単純なクロマトグラフィー例えば、修飾されたポリスチレン樹脂を用いて、次いで凍結乾燥し、化合物2を貯蔵に安定な凍結乾燥ケーキとして種々の製剤形態での直接の使用に好適なものによって促進される、として与える。N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステル16のγ-カルボン酸は、たとえば、混合無水物例えば、17に変換することにより、好ましくはイソブチルクロロギ酸を使用して活性化される。分離したベッセルのD-グルタミン酸12は、BSAまたは他の適切なシリル化剤を用いた拡張された処理により、シリルエステル例えば、ビス-トリメチルシリルエステル18およびN-トリメチルシリル化も可能に変換される。2つの溶液が混合され、反応が完了するとき、完全に保護されたジペプチド19の中間体は、脱シリル化水溶液の後処理を受け、所望のジプロテクト-L-Glu-γ-D-Glu誘導体20を与え、反応混合物から直接単離され、高純度に再結晶化され、都合よく貯蔵される。化合物20は、接触水素化により簡易に脱保護され、親ジペプチドのL-グルタミル-γ-D-グルタミン酸15になり、化合物15は、所望に応じて貯蔵もされうる。カルボン酸を活性化して、好ましくは、その1-オキシベンゾトリアゾールエステル21に変換することにより、N-シクロペンタキナゾリン-6-イルアミノ安息香酸7Sを完了させ、その後これを22別のベッセルで作製され、単離されなくてもよいまたはインシチュで生成されてもよい15のトリストリメチルシリルエステルと反応させる。この反応が完了したとき、おそらくはトリス-シリル化中間体23を単離することがなされる必要性を試みる必要性はなく、しかし、遊離酸、それらの準化学量論的なナトリウム塩のどちらかがいわば後処理され得、または3ナトリウム塩2が後処理で直接単離される。当該化合物の最後の精製は、水系媒体中、3ナトリウム塩2、および精製された塩2を、できる限り、最初の濃縮工程の後、例えば、逆浸盪を使用することにより、凍結乾燥して単離する。本発明の方法の好ましい実施形態の限定を意図しない実施例は、以下でより詳細に議論される。乾燥THF中、D-グルタミン酸の懸濁液は、室温で、窒素下で撹拌され、3.5当量のシリル化剤例えば、BSAが5~15分間超滴下して加えられてよい。固体は、徐々に溶解し、ビス-トリメチルシリルエステル18を形成し、できる限り、アミン窒素もシリル化する。撹拌は、室温で、24~28時間続けられる。第2のベッセルで、乾燥THF中、D-Gluに基づき0.9当量のN-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルは、固体のすべてが溶解し、その上で、得られた溶液が約-25°Cに冷却され、約1.2当量の第三級アミン塩基例えば、N-メチルモルホリンが添加され塩を形成する。従って、この冷たい塩の溶液は、カップリング剤の-30°Cの溶液、好ましくはイソブチルクロロギ酸のTHF溶液も逆にゆっくり添加されてよく、窒素下で撹拌されてよい。逆添加は、この反応で形成されるN-ベンジルオキシカルボニルL-グルタモイル-α-ベンジルエステル無水物を減少させるかもしれない。理論に結び付けられることは望まないが、イソブチルクロロギ酸との酸16の反応は、不斉無水物を大量に生成し、反応の量が増加するように増加するかもしれない。この不斉無水物は、次の工程で所望の化合物を形成するが、16の分子は、不斉の無水アシルD-Gluが結局未反応の出発物質となり、全反応の収率を低下させ、その条件例えば、逆添加は、好ましくは選択され、これを減少させる。酸16が完全に混合無水物17に変換されたとき、D-Glu18のビス-シリルエステルは、十分ゆっくり反応混合物に添加され、かなりの温度上昇を避ける。低温での任意の追加時間の後、反応混合物は、室温までゆっくり加温され、その後、数時間その温度で撹拌され、反応を完結させる。ジシリルエステルジペプチド19の溶液を、その後、水と酢酸エチルとの間で分配し、この水相を酸性化し、例えば、約pH2にする。存在するシリルエステルを完全に分解し、製造された20は、遊離酸形態にあり、有機相に溶解しているであろう一方で、残存しているD-Gluは、水相に分画されている。相を分離し、有機相を2、3回洗浄してよい。有機相は、主に所望の生成物20および少量の未反応の原料のN-Cbz-L-GluO-ベンジルエステル16を含んでいる。溶媒のほとんどを、その後除去し得、その残りの溶媒をアセトニトリルで共沸除去してよい。極性がより低い原料のエステル16は、溶解性が高くないので、最終的なスラリーを、その後、アセトニトリルから再結晶してよい。再結晶されたジプロテクトジグルタミン酸20を、この1つのシークエンスで、収率80~85かつ純度99で得ることができ、最も安価に購入できるD-グルタミン酸の原料、すなわちその酸そのものを使用して16の極めて効率的なワンステップのグルタモイル化をすることができる。N-ベンジルオキシカルボニルO-ベンジルエステル20の2つの水素化分解をして、保護されていないL-グルタモイル-Y-D-グルタミン酸16を与えることは、直接的であり、高度に先例のある化学反応である。しかしながら、出発物質と生成物の間に大きく異なる物理特性があり、水不溶性の20から2つの親油性のベンジル基がないことは、きわめて水溶性であるがほとんどの有機溶媒に良好な溶解性を有しない、高極性かつ酸性のジペプチド16をもたらす。水素化分解は、不均一系触媒を使用するので、基質は、反応媒体に理想的な溶解性を有し、反応を起こすのに好ましい。生成物が触媒上に沈殿すると、反応が停止するかもしれないので、好ましくは、生成物は、触媒上に沈殿しない。さらに、生成物から触媒を分離する最も実用的な方法は、濾過であり、好ましくは、すべての生成物16は、溶液中にある。この化合物は最終APIにとても似ているので、高純度が確保される。不要なエステル化を抑制し、生成物を穏和な過熱により完全に溶解させるので、水性エタノールの使用は好ましく、触媒を濾過により除去することを可能とする。水素化のためエタノールへの水の好ましい割合は、出発物質のすべてを溶解させないが、十分な出発物質が、水素化が理想的な速度で進行するために溶液中にあることを可能とする。それらはは、反応混合物に生成物の十分な溶解を可能とし、触媒を不活性にする触媒上へ沈殿し、反応を停止しない。さらに、選択された水性エタノール混合物は、エチルエステル副生成物の不要な形成を抑制する。濾過後、混合物にエタノールのさらに添加および結晶化が起こることを可能とする溶液を再生するために加熱することは、ジペプチド16を高純度かつ高収率で直接回収する。さらに、暖め、前もって結晶化し、2のチオシリカゲルを含む溶液を処理し、磨き濾過の前に残留するパラジウムを捕捉除去することは、許容可能な低いパラジウム量<5ppmを有するジペプチド16を製造する。沈殿後、ジペプチド16は、かなりの量の水を含み、次の反応以下参照で有害であり得る。しかしながら、比較的温和な乾燥条件45°C、窒素を放出する真空オーブンを使用してでも、低い水分含量約8未満としようとすることは、質量分析で測定したとき、M-18イオンが示され、脱水生成物の形成がもたらされてよい。存在する場合、これらの生成物は、次の反応でカップリングされてよく、その時、固有のM-18イオンは、最終カップリング生成物で現れ、所望の生成物からの分離は困難であってよい。それゆえ、乾燥は、好ましくは注意して実施され、高温を避け、9~14wtの水の水分含量が、検出可能な量のこれらの脱水生成物を生成することなく、次の工程で任意の使用を可能とすることが見出された。この反応シーケンスの最後の工程の第一の部分で、EDCI1.1~1.25モル当量のようなカップリング剤は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物HOBT.H201.25-1.5モル当量のスラリーを含むTHFまたはアセトニトリルのような溶媒中で、20~25°Cで反応器中撹拌されている、6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸7S好ましくは、0.5~5重量の水を含むの溶液に添加される。12~18時間の時間を越えて、HPLC分析は、酸7SのHOBTエステル21への完全な変換が起こることを示す。驚くべきことに、この反応は、驚くべきことに、この反応は、いかなる外因性の塩基が添加されることおよび慣用的な第三級アミンの除去は必要とされてなく、またはこのプロセス由来の他の弱塩基は、最終生成物の純度をかなり増加させることが示されている。この最後の反応シークエンスの第2の工程で、現在進行中HPLCが酸7SのHOBTエステル21への>99の変換を示すと同時に、固体のL-Glu-γ-D-Glu161.5~2.0モル当量の一部は、スラリーの多い反応混合物に直接添加されてよい。ジペプチドは、アセトニトリルに完全に不溶性であり、多くの白いスラリーを形成し、HPLC分析は反応が起こらないことを示す。このスラリーは、その後、-5~-10°Cに冷却され、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSA8~10モル当量は、10~30分超の時間をかけておそらく、量に依存して、より長くなる、反応温度は、10°Cを超過しないことを保障する速度で、流しこまれる。穏和な発熱が見られ、ほとんどの固体は徐々に溶解する。HPLC分析は、HOBTエステル21の消失を示し、1つの大きな新しいピークが現れることを示す。理論に結び付けられることは望まないが、反応種は、全体的にまたは部分的に、溶解性の低い16のシリルエステル、またはトリス-エステル22のN-シリル誘導体でさえありうるが、BSAは、トリストリメチルシリルエステル22のようなジペプチド16を溶解することが推測される。あるいは、トリス-シリルエステル22は、アセトニトリル中、BSA8~10モル当量とジペプチド16の反応により、別の反応器で形成されてよい。すべての固体が溶液になったとき、22の溶液は、21の溶液に投入される。このプロセスは、第1の記載されたプロセスより多い溶媒および装置を使用する。BSAの添加の完結後直ぐに、反応混合物は、10°Cまたはわずかに低い温度で現在進行中のHPLCが、エステル21の消滅により、反応が≧99完了していることを示すまで保持され、その時、添加後およそ3~5時間、現在薄い懸濁液である反応混合物は、メカニカルスターラーおよび窒素注入口を備え固定された反応器へ濾過される。これは、透明な淡黄色の溶液であり、この時点で存在する主な種は、ビス-O-トリメチルシリル2,R-4,S-トリメチルシロキシカルボニル-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸23、またはおそらくその2-トリメチルシロキシ相同体25であると考えられている。化合物2325は、この段階で、ポリトリメチルシリル種として単離されていない。ジペプチド16が結晶化して得られるとき、ジペプチド16は、水分含量>15wtを伴った高い水和固体として得られる。16の水分含量が約13超である場合、反応がきれいに進み完結させるため、過剰のBSAを添加するのが好ましい。他方、ジペプチド3を乾燥させ強すぎるようにする場合上記参照に増加する少量の未同定の脱水生成物は、HOBTエステル21とカップリングして、酸1に極めて類似し、最後のAPIから除去するのが難しい不純物を生成しうる。それゆえ、予想に反して、この反応は、5~15wtの水、好ましくは9~13wtの水を含むジペプチド16を伴って最良に進行し、少量の外因性の水が反応の初めに添加される場合、全反応を援助するかもしれないことが見出された。同様に、酸7Sは、水性の沈殿を経て最後の反応工程から最も都合よく単離され、最初に>10wtの水を含んで得られてよい。この水のほとんどは、真空下、60°Cで乾燥して除去され得、最後のカップリング工程は、水分含量が21の形成をゆっくりにする上であるけれども、最大5wtの水を含む7Sを、大きな効果はなく許容することがわかった。予想に反した方法で、最後のカップリング反応は、両方の前駆体化合物が最適な量の水を含む場合、実際に洗浄性生物を与え、酸7Sが3wt/wt未満の水を有する場合、少量の水を最初の活性化工程に添加するのに都合がよいかもしれないことが見出された。前に述べられたように、本発明のこの例となるプロセスで反応混合物中に存在する主な種は、少量の低級トリメチルシリルエステルも存在するけども、ビス-O-トリメチルシリル2,R-4,S-トリメチルシロキシカルボニル-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸23またはより高いシリル化体25であると推測される。これらのエステルは、比較的少量の水、含水ギ酸,または飽和炭酸水素ナトリウム溶液の添加により、今加水分解されてよい。シリルエステルは、水の添加後、自然に加水分解し、溶液からゆっくり沈殿する。実際には、加水分解/沈殿は速く、添加された水溶液のpHが中性に近くなければより満足した固体を与えることが見出され、2Mギ酸と飽和炭酸水素ナトリウム溶液の両方は、飽和炭酸水素ナトリウム溶液が好ましいけれど、使用される。この沈殿は、25~100mol炭酸水素ナトリウムが添加されて満足のいく働きをするので、沈殿される主な種は、遊離塩基2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸1,または部分的にモノ-ナトリウム塩のいずれかであるとわかる。溶液は、数時間0~5°Cで撹拌しながら沈殿され、次いで、混合物は、冷却して濾過され、固体は、窒素雰囲気下で、フィルター上に減圧濾過により集められ、アセトニトリルで洗浄される。うまく行えば、この沈殿は、ほとんどのHOBTおよび過剰に存在するL-Glu-γ-D-Glu16をBSAアセトアミド、N-トリメチルシリルアセトアミドおよびヘキサメチルジシロキサンから副生成物のほとんどを取り除くと同時に上手く取り除き、吸湿性の固体ではあるが、自由流動性を与える。この精製工程は、次の樹脂クロマトグラフィーの精製をよりよく働かせもするかもしれない。最後のAPIのアセトアミドの含有量は、弱発がん性のせいで密接に一般化されており、この沈殿の組み合わせは、最後のAPI中のアセトアミドのより低い量を可能とするので、その工程でのほとんどのアセトアミドの除去も有益である。粗製固体の三酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩は、直ちに冷たい希薄な炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、最後のAPI、3ナトリウム塩2のおよそ25mg/mLの溶液を与える。pHは、必要であれば、pH8~9の範囲、好ましくはpH8.5~9.0に水酸化ナトリウムで調製されてよく、その溶液は、プレウォッシュ加工され、かつ例えば、メタノール、その後水で平衡とされたクロマトグラフィーカラム例えば、HP20SS樹脂クロマトグラフィーカラムに、約50gの樹脂/最終生成物1gの名目上の割合で乗せられる。カラムは、その後、大量の水、もし要請があれば、続いて1~5のアセトニトリルの水勾配で溶出される。分画は、HPLCにより観測され、より純粋な分画は集められ、所望の純度通常99.0~99.7面積の2の希薄な溶液2~3g/Lを与える。少量で、この物質は直接凍結乾燥され、最終のAPI2を全収率45~65かつ純度>99で与えられてよい。凍結乾燥で、より濃縮された溶液の使用は、より短くかつより経済的な凍結乾燥を可能とし、精製された凍結乾燥ケーキは、連続して操作し、貯蔵するより良好な物理特性を有するかもしれない。従って、大量で、最後の凍結乾燥の前の濃縮工程におかれるのは、有用であるかもしれない。連続エバポレーション技術例えば、ワイプドフィルムエバポレーションの使用により、APIを含む溶液は、装置を通過することにあたり、数秒間、穏和な加熱~45°Cにさらされるだけで、APIの損失またはAPIの純度の損失はなく、通過して少なくとも3倍に溶液が濃縮されることを示した。あるいは、API溶液は、API溶液がHP20SSに結合するよりしっかりと結合する樹脂に乗せられ濃縮され、次いで適切な溶媒の使用によりはるかに濃縮された形態で除去されうる。例えば、API1の低濃度の溶液は、HP20SSクロマトグラフィーによって得られ、適切な分画の貯蔵は、それが吸着するSP207SS樹脂カラムに乗せられうる。25アセトニトリルの水ですばやくカラムをすることは、得られる濃度で少なくとも10倍の増加を伴ってAPIをカラムを流す。あるいは、API溶液は、限外濾過の使用により濃縮されうる。カラムの溶離液を、少なくとも4倍、できる限り16倍の程度に<10°Cに冷却した5PallCentrasette0.65Kdカットフィルター膜を備えた限外濾過装置を使用して、濃縮することは有利であることはわかった。水の様々な量で例えば、およそ当量、限外濾過装置中の残余分のダイアフィルトレーション透析濾過は、アセトニトリルおよびアセトアミドのようなより小さい分子量の不純物を減らす点で有利であることが示された。トリストリメチルシリルエステル23を所望のAPI2へ加水分解する代替の方法は、THFまたはアセトニトリル反応溶液を炭酸ナトリウム水溶液に単に入れてクエンチすることであり、好ましくは最後の混合物のpHは7超であることを好ましくは保障する。この溶液は、原則として、直接樹脂カラム例えば、HP20SSに直接乗せられ、精製される。APIおよび不純物を追跡しながら物質損失を減少するため、クロマトグラフィーの前に酢酸エチルで数回水溶液を前洗浄するのが好ましくてよい。HPLCの研究は、クロマトグラフィーの前に、HOBTの半分超、およびかなりの量のアセトアミドならびにTHFまたはアセトニトリルを除去することを示すが、ONX-0801は、評価しうる量で酢酸エチルに分配しない。このような水溶液によるクエンチ、および酢酸エチルを用いた洗浄は、沈殿させる代替となり、このプロトコルは、沈殿よりかなり多くの耐性がある。これらの2の基本的な水溶液に希釈および濃縮の限外濾過サイクルを繰り返することは、全体のクロマトグラフィーによる精製でさらに改善をもたらすクロマトグラフィーの前に低分子量不純物も除去するだろう。しかし、全体のよりよい結果は、適切に実行されたとき、沈殿で得られるかも知れない。2R-N-S-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸20250mLのフラスコマグネチックスターラー、滴下ロートおよびN2注入口に、D-グルタミン酸10.9g、74.1mmolおよびTHF110mLを充填した。Ν,Ο-ビストリメチルシリルアセトアミド53.1g、261mmolを5分超、撹拌を開始し、滴下ロートを使用して滴下した。このスラリーを28時間常温で撹拌した。N-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステル25.0g、67.3mmolとTHF80mLを、第2の250mLのフラスコマグネチックスターラー、熱電対、充電ポートおよびN2注入口に充填し、撹拌して均一な溶液を得た。当該溶液を-25±5°Cに冷却し、N-メチルモルホリン8.28g、81.8mmolをシリンジにより添加し、当該溶液を約30分間、その温度で撹拌した。1Lの主反応フラスコメカニカルスターラー、熱電対、充電ポートおよびN2注入口に、THF170mLを充填し、-30±5°Cに冷却した。この時点で、イソブチルクロロギ酸10.0g、73.2mmolにN-ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミン酸-α-ベンジルエステルN-メチルモルホリン塩を充填し、-30±5°Cに反応混合物の温度を保持しながら、約2.0mL/minの速度で、ピストンポンプおよびテフロン登録商標チューブを使用して、主反応フラスコに移送した。45分後に移し終えた。当該反応混合物混合無水物/不斉無水物の割合が95.5/0.28を、約40分間、-30±5°Cで撹拌し、次いで、ペルシリル化したD-グルタミン酸エステル溶液を、移送中、-30±5°Cの温度に維持しながら、35分間超、ポンプを使用して混合無水物溶液に移送した。当該反応混合物を、1時間、この温度で撹拌し、その後、ゆっくり常温に加温し、一晩撹拌した。当該反応を、注意して、水75mLを添加してクエンチし、EtOAc200mLで希釈し、その後、37HCL1.6gでpH1~2まで酸性にした。有機相を水2×50mL、20ブライン2×50mLで洗浄し、有機相を112mの体積まで、真空中で減らした。生成物の溶液を、MeCN285mLで希釈し、反応フラスコに移送し、溶液を大気圧で蒸留し、310mLの留出分を集めた。残渣を0.2含水MeCN456mLで希釈し、加熱して還流させて均一な溶液を得た。当該溶液をゆっくり、常温に冷却し、得られた密度の高いスラリーを一晩撹拌した。固体を濾過して集め、ケーキをMeCN45mLで洗浄し、濾液を真空下で除いた。その後、ケーキを、窒素気流下、一定の重量に乾燥した。収量:29.2g86.8純度:99.1A.C,H,N分析:理論:C,59.99;H,5.64;N,5.60.実測:C,59.96;H,5.48;N,5.51L-グルタモイル-γ-D-グルタミン酸16水素化容器に、2S-N-R-4-ベンジルオキシカルボニル-4-ベンジルオキシカルボニルアミノ-1-オキソブチルアミノグルタール酸1.90kg、3.796mol、Pd/C10、デグサDegussaタイプE101-New、100g、EtOH15L、および水13.3Lを充填した。結果として得られる混合物を、窒素下で、3回、真空脱気し、常温で4時間H240psi下で撹拌し、次いで、LC-MSとHPLCで測定した。未反応の出発物質または部分的に脱保護された中間体を観測されなかった。その後、水素雰囲気を除去し、当該混合物に、3回、窒素ガスで40psiに加圧し、次いで、圧力を放出した。反応混合物を60°Cに加熱し、0.2ミクロンのフィルターで濾過し、さらに60°CでのEtOH10.51kgで洗浄した。混合した濾液をすべての固体が溶解するまで、60°Cで撹拌し、2のチオシリカ40gを添加し、さらに9時間その温度で撹拌し続けた。反応混合物を0.2ミクロンのフィルターで熱濾過し、さらに熱EtOH3.8kgで洗浄した。混合した濾液を、12時間超で22°Cに冷却し、次いで、さらに12時間超で2°Cに冷却し、その後、固体をGF濾紙を通して濾過して集め、冷エタノール3°C、7.5kgで洗浄し、20時間、微量の窒素パージの下45°Cの真空オーブン中、乾燥して、L-グルタモイル-γ-D-グルタミン酸16900g、85.7を99.1Aの純度で白色固体として得た。カールフィッシャー水分計は、10.9wt/wtの水を示し、Pd分析は、1ppm未満のPdを示した。1HNMRD20δ:1.96-2.021H,m,2.12-2.233H,m,2.484H,t,J=7Hz,3.821H,t,J=6Hz,4.36,1H,dd,J=8.8,5Hz.2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸1アセトニトリル1.5Lを、メカニカルスターラー、窒素注入口およびJ-KEM温度計を備えた5Lの三つ口フラスコに加え、20±2°Cで撹拌した。6S-4,N-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノ安息香酸7S50.0g、0.1284molおよびUSP-PW水12.0gを添加し、当該混合物を30分間撹拌した。N-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物26.2g、0.1711molを添加し、温度が~1°C低下した。混合物を20°Cで2時間激しく撹拌し、次いで、N-3-N,N-ジメチルアミノプロピル-N-エチルカルボジイミド塩酸塩27.30g0.1419molを、スラリーに加え、反応を、20±2°Cで、15時間撹拌し、密度の高いスラリーを形成した。この時点で、一定分量を、反応から取り、HPLCによって分析した。当該HPLCにより、中間体のヒドロキシベンゾトリアゾールエステル21の形成が完了していることが明らかとなった。L-グルタミル-γ-D-グルタミン酸53.20g、0.1926molを添加して、反応混合物を撹拌し、当該反応混合物を2°Cに冷却し、その温度で1時間維持し、次いで、当該反応混合物を、さらに-6°C冷却した。その後、O,N-ビストリメチルシリルアセトアミドBSA450mL、374.4g、1.84molを滴下ロートにより15分超、添加した。添加の間の発熱は、BSAの添加速度により制御され、反応温度は添加中に7°C上がった。当該添加直後、反応混合物を、氷浴中、10分間撹拌し、次いで、徐々に10°C加温した。当該添加の完結後、反応の完結後、2時間と3.5時間に一定分量を、当該反応から取り、HPLCで分析した。3.5時間のサンプルのHPLCは反応が完了していることを明らかにした。3.5時間後、10°C懸濁液を濾過して、メカニカルスターラーおよび窒素注入口を備えた12Lフラスコに入れた。当該濾過残査をさらにアセトニトリル200mLで洗浄し、フラスコの内容物をさらにアセトニトリル3.5Lで希釈した。溶液を2°Cで撹拌し、次いで、46mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液~1.2Mで作製された新たな溶液を15分間超滴下し、淡黄褐色の沈殿物を形成した。窒素雰囲気で、当該沈殿物を2~3°Cで2時間形成し、次いで、当該混合物をブフナー濾過し、アセトニトリル1Lで洗浄し、30分間、吸引して乾燥した。固体の環が、反応フラスコに残り、これは取り出され、30分間アセトニトリル500mLを用いてスラリー化された。この固体を既に述べたとおり、窒素下でブフナー濾過により集め、アセトニトリル100mLで洗浄し、主サンプルを乾燥した。2つの取得物を15時間、室温、高真空下で乾燥し、104.1gおよび10.5gのベージュ色の自由流動性固体をそれぞれ得た。HPLC分析は、両方の取得物が実質的に同じ物質であることを示し、それらを混合し、粗製2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸または準化学量論的なそのナトリウム塩の114.6g>100、HPLC分析で、不要の2R,4Rジアステレオ異性体を含んでいたを得た。2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩2ガラスクロマトグラフィーカラムに、メタノール15LにスラリーであるHP-20SS樹脂5kgを充填し、水全体で40Lで洗浄することにより平衡にした。撹拌機およびJ-KEM温度計を備えた12Lの3つ口フラスコに、新たに調製された飽和炭酸水素ナトリウム溶液1.1Lと水1.1Lを入れ、2°Cに冷却した。粗製2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩114.6gを添加し、わずか1°Cの発熱が測定され、そして10分以内に固体を溶解した。1時間後、pHをチェックし、水酸化ナトリウム溶液1M,440mLをこの溶液にゆっくり添加し、2°C発熱し、溶液のpHを約7.45に上げた。さらに、水酸化ナトリウム溶液~10mLを加え、pHを8.0超9.0未満に上げた。この溶液を樹脂カラムに充填し、水89Lで溶離し、同じ大きさではないが、20分画を集めた。99A超の純度にある所望の物質を含むことをHPLC分析が示す分画7~18を混合し、10°C未満に保持して、5PallCentrasette0.65Kdカットフィルター膜を使用して限外濾過装置中、-56L~約12Lに濃縮した。残余分を水で2回希釈し10、20L、それぞれ、~12Lに再濃縮した。これは、その後、Pellicon2maxiカセットw/5000MWカットフィルターを通して濾過し、内毒素を除去し、棚状の凍結乾燥機に置いた。得られた生成物を-59°Cに冷凍し、その後、40mtorrの圧力で-20°Cの棚温度で凍結乾燥した。20時間後、棚温度を40時間かけて-15°Cまで上げ、次いで27時間かけて-5°Cに上げた。最後の乾燥は、20°Cの棚温度かつ10mtorr未満に落とされている圧力で数日をかけてなされ、2,R-4,S-カルボキシ-4-4,N-6S-2-ヒドロキシメチル-4-オキソ-3,4,7,8-テトラヒドロ-3H-シクロペンタ[g]キナゾリン-6-イル-N-プロプ-2-イニルアミノベンズアミドブタンアミドグルタール酸3ナトリウム塩2をふわふわした白色の凍結乾燥物として生成した。8.9のKF水分析で補正して、44.6g、収率44.35。分析データ.FTIRν:3283,1598,1503,1397,1088,830,766cm-1.1HNMR9:1D20:CD3ODδ:1.63-1.711H,m,1.82-2.162H,m2.22-2.414H,m,2.42-2.464H,m,2.72-2.841H,m,2.87-2.981H,m,3.56,3.701H,1H,ABq,J=18.6Hz,3.931H,dd,J=4.8,8.4Hz,4.271H,dd,J=5.0,7.8Hz,4.442H,s,5.231H,t,J=7.8Hz,6.792H,d,J=8.8Hz,7.231H,s,7.532H,d,J=8.8Hz,7.611H,s.13CNMR9:1D20:CD3ODδ:29.49,29.83,30.34,31.26.33.98,35.36,36.95,56.71,56.77,62.02,64.92,74.05,82.60,114.41,119.99,122.28,122.83,123.00,130.01,142.64,148.19,152.07,153.77,157.97,165.34,170.27,176.48,179.84,180.20,183.20.化学純度HPLC99.8A.ジアステレオマー過剰率HPLC99.75A.CHN:C,45.41;H,5.01;N,8.23,Na9.85."