"カルシウム陽イオンによって架橋されたアルギン酸塩の水溶液を含む治療用組成物であって、前記アルギン酸塩は25~250kDaの分子量及び1w/vの濃度を有し、前記カルシウム陽イオンは、0.3w/vの濃度で存在するグルコン酸カルシウムによって与えられることを特徴とする治療用組成物。前記グルコン酸カルシウムが0.3w/vの濃度で与えられることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記組成物がニードルを介して前記体組織中に投与可能であることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記ニードルが18~27ゲージのニードルであることを特徴とする請求項3に記載の治療用組成物。前記組成物がカテーテルを介して前記体組織に投与可能であることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。細胞をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記細胞は、筋芽細胞、心筋細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、始原細胞、および幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項6に記載の治療用組成物。少なくとも一種の治療薬剤をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記少なくとも一種の治療薬剤は、抗生物質、増殖因子、血管形成因子、サイトカイン、抗炎症性薬物、ホルモン、抗アポトーシス薬物、および幹細胞刺激因子からなる群から選択されることを特徴とする請求項8に記載の治療用組成物。損傷した体組織を修復するためのキットであって、a請求項1の治療用組成物;b必要としている患者の心臓部位に前記治療用組成物を投与するためのシリンジ又はカテーテル;およびc前記治療用組成物をどのように使用するかについての指示マニュアルを含むキット。前記損傷した体組織が心臓組織であることを特徴とする請求項10に記載のキット。心筋の損傷、リモデリングおよび/または機能不全から生じる状態の処置のためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記状態は、左心室リモデリング、梗塞拡大、心不全および虚血性僧帽弁逆流からなる群から選択されることを特徴とする請求項12に記載の治療用組成物。治療的血管形成の誘導のためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。損傷した組織の修復および再生を促進させるためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。前記損傷した組織が心臓組織であることを特徴とする請求項15に記載の治療用組成物。心筋の収縮性を改善するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。心臓細胞の増殖を誘導するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。心筋梗塞を処置するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。心筋梗塞後の瘢痕の厚さを増強するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。心筋梗塞後の収縮期機能を改善するためのものであることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。a前記アルギン酸塩を水または水性緩衝液に溶解し;b工程aで得られたアルギン酸塩溶液を、均一な溶液が得られるまで激しく撹拌しながら、2w/vのグルコン酸カルシウム溶液を加えることによって、カルシウム陽イオンを用いて架橋することによって調製されることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。室温で少なくとも24時間貯蔵されることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。400cP以下の粘度を有することを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。カルシウム陽イオンの単一源からなり、前記組成物が室温で少なくとも24時間その溶液形態を維持することを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。室温以下の温度で少なくとも24時間安定であることを特徴とする請求項1に記載の治療用組成物。カルシウム陽イオンによって架橋されたアルギン酸塩の水溶液を含む治療用組成物であって、前記アルギン酸塩は25~250kDaの分子量及び1w/vの濃度を有し、前記カルシウム陽イオンは、0.1~10Hzの小さい変形の振動周期が溶液に加えられたときにG′-G′′クロスオーバーを生じる量のグルコン酸カルシウムによって与えられることを特徴とする治療用組成物。下記の略号が本明細書において使用される:BMP:骨形態形成タンパク質bFGF:塩基性繊維芽細胞増殖因子CHF:慢性心不全2-D:二次元DDW:2回蒸留水ECM:細胞外マトリックスEDA:拡張期終期面積ESA:収縮期終期面積GPC:ゲル浸透クロマトグラフィーIGF:インスリン様増殖因子LA:左心房LAD:左前下行LV:左心室LVEF:LV駆出率LVID:LV内部大きさMALLS:多角度レーザー光散乱MHC:ミオシン重鎖MI:心筋梗塞Mn:分子数MR:僧帽弁逆流Mw:分子量PD:多分散度PM:乳頭筋SDF:間質細胞由来因子SMA:平滑筋アクチンTGF:トランスフォーミング増殖因子VEGF:血管内皮細胞増殖因子WMSI:壁運動スコア指数動物モデルにおける心臓細胞移植または組織工学の有望な結果は、LV壁の構造、厚さおよび弾力性を維持する細胞外マトリックスECMの再構築に起因すると部分的には考えられている。本発明者らは、架橋されたアルギン酸塩に基づく生体適合材料の注入によるECMの操作が、治癒および自己再生のための足場を提供しながら、LVの構造および機能を効率的に保持し得るかどうかを調べてきた。驚くべきことに、本発明者らは、下記の実施例において示されるように、ラットモデルにおける梗塞した心筋に注入されたとき、架橋されたアルギン酸塩の溶液の注入による、心筋梗塞後のLVの拡張および心筋機能不全の弱化が、胚性心筋細胞の移植によって達成される弱化と同等であったことを見出した。従って、心臓の梗塞部を処置するための注入可能なポリマー溶液の使用は、心筋梗塞MIおよび慢性心不全CHFの処置において、得ることが困難な胚性細胞の使用に代わる効率的な代替であり得る。この目的のために、本発明者らは、固体ゲルを形成する体内の所望する位置に注入されるまでは液体として流動し、しかし、十分な粘稠度を依然として維持する架橋されたアルギン酸塩生体適合材料を開発した。この架橋されたアルギン酸塩は、0°C~30°Cの間で変化する温度において、好ましくは、21°C~25°Cの間である室温において、体外ではその流動可能な形態で無限に保つことができ、そして、注入部位においてのみ、固体または半固体のゲルマトリックスを形成する。下記において詳しく記載されるようなそのレオロジー挙動に基づいて、本明細書中において開発された架橋されたアルギン酸塩生体適合材料は、実施例1において示されるように永続的な架橋を有さず、また、強く振動数に依存し、G’-Gクロスオーバーを有し、かつ、低い振動数では液体として流動する点で強い共有結合性ゲルとは区別される絡み合った網目組織として定義される。従って、第1の局面において、本発明は、その弾性応答が、小さい変形の振動周期が加えられたとき、その粘性応答と同等またはそれ以上になり、かつ、べき乗則の関係の剪断弱化挙動を示す架橋されたポリマー溶液に関する。剪断弱化挙動は、より低い剪断速度ではニュートン流体よりも粘性であり、より大きい剪断速度では粘性がさらになくなる溶液に特徴的である。べき乗則の関係を示す溶液は、その粘度が、その剪断速度が増大するに従って低下する溶液である。そのような性質を有する溶液を達成するために、本発明の架橋されたポリマー溶液は、ニュートン挙動を示し、かつ、小さい変形の振動周期が加えられたとき、その粘性応答がその弾性応答よりも大きいポリマー前駆体溶液から調製される。ニュートン挙動を示すポリマー溶液はまた、ニュートン流体すなわち、一定の温度および圧力においてすべての剪断速度で一定の粘度を有し、また、変形率が、流体に加えられた応力に正比例する流体とも呼ばれる。架橋したとき、溶液の弾性応答は、小さい変形の振動周期が加えられたとき、その粘性応答と同等またはそれ以上になる。前記の加えられた小さい変形の振動周期は0.01Hz~100Hzの粘弾性限界の範囲内であり、好ましくは、約0.1Hz~10Hzの範囲内である。本発明によって使用される好ましいポリマーは、例えば、多糖のようなヒドロゲル形成ポリマーである。より好ましくは、前記多糖はアルギン酸塩である。アルギン酸塩は、カルシウムイオンなどの二価カチオンにより架橋されたとき、固体または半固体のゲルを形成するまで粘度の増大を受ける水溶性多糖である。実施例1において例示されるように、前記アルギン酸塩は様々なMwを有することができ、好ましくは10Kダルトン~300Kダルトンの間の範囲にあり、より好ましくは25Kダルトン~250Kダルトンの間の範囲にある。本発明のポリマー溶液の架橋は、水分子を捕捉する構造化された網目組織を生じさせるために、共有結合、イオン結合および水素結合のいずれかによって行うことができる。1つの実施形態において、アルギン酸塩溶液は、混合物が、均質な架橋されたアルギン酸塩生体適合材料を得るために均質化されている間に二価カチオンまたは多価カチオンカルシウムイオンまたは他のイオンにより架橋される。本明細書中において規定されるように、典型的な架橋された溶液は0.1~4w/vのアルギン酸塩を含み、好ましくは0.5~2のアルギン酸塩を含む。そのうえ、架橋された溶液は貯蔵安定性である。すなわち、架橋された溶液は、その溶液形態およびシリンジ注入性を長期間にわたって維持する。通常の場合、架橋されたアルギン酸塩溶液は、室温または室温以下の温度で、少なくとも24時間の期間にわたって、好ましくは、少なくとも7日間にわたって、より好ましくは、1年までの期間にわたって安定である。本明細書中で使用される用語のシリンジ注入性は、溶液がその流体的特性を維持し、かつ、シリンジおよびニードルを用いて注入によって、カテーテルまたはシャントを介してカテーテル法によって、あるいは、電気機械的な位置決めカテーテルまたはMRI誘導カテーテルを含む、ガイドワイヤを有する心臓送達デバイスを含む任意の好適な経皮心臓送達システム、そして同様に、左心室腔、動脈または静脈の冠状系を介して心筋を評価するために設計された任意の経皮心臓デバイス、ならびに、必要としている対象の身体の任意の部分に流体を投与するための任意のさらなる好適な方法および手段特に、非外科的方法によって投与され得ることを意味するように理解しなければならない。従って、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液は、本明細書中上記に詳しく記載される手段のいずれかによって、必要としている対象に投与することができる。本発明の架橋されたアルギン酸塩生体適合材料は流動可能であり、18G~27Gのニードルを介して身体組織例えば、梗塞した心筋に注入することができる。あるいは、上記に記載されるような他の好適な心臓送達システムを使用することができる。注入部位インビボにおいて、この架橋された生体適合材料はゲルを形成し、固体または半固体になる。本明細書中において示されるように、ゲルが、液体通常、ヒドロゲルの場合には水が散在する網目組織からなることに留意することは重要である。ゲルを定義する2つの一般的な基準は、iゲルは液体を含有しなければならないこと、およびiiゲルはサンプル全体に広がる網目組織を有しなければならないということである。別の局面において、本発明は、その弾性応答が、小さい変形の振動周期が加えられたとき、その粘性応答と同等またはそれ以上になり、かつ、べき乗則の関係の剪断弱化挙動を示す架橋されたアルギン酸塩溶液を調製する方法を提供し、この場合、前記方法は、aアルギン酸ナトリウムを水または任意の他の好適な水性緩衝液に溶解する工程;b工程aで得られたアルギン酸塩溶液を、好適な架橋剤を用いて、均一な架橋されたアルギン酸塩溶液が得られるまで激しく撹拌しながら、前記架橋剤の水溶液を加えることによって架橋する工程を含む。架橋は、イオンを使用することによって、またはpHを変化させることによって、または温度を変化させることによって達成することができる。イオン性の架橋剤には、金属カチオン例えば、カルシウム、銅、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、スズ、亜鉛、クロムなど、二官能性、三官能性および四官能性の有機カチオンが含まれる。ポリアミノ酸、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミンおよびカチオン性多糖類などのポリイオンを使用することができる。従って、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液を調製する方法の1つの具体的な実施形態において、前記架橋剤はカルシウムイオンであり、好ましくは、2w/vのグルコン酸カルシウム溶液によって提供されるカルシウムイオンである。架橋度により、注入したときにインビボで形成される固体貯留物の侵食速度が決定されることに留意しなければならない。注入可能な溶液におけるポリマーの濃度はその分子量に依存し、また、意図された架橋度に依存する。調製の設計は、液体/固体の適切な相転移を達成するために必要な要因例えば、ポリマーのMwおよび濃度、ならびに架橋剤の濃度などを考慮に入れなければならない。そのような設計は製薬分野の当業者の能力の範囲内である。実施例1は、本発明のポリマー溶液を達成するための好ましい条件の例示である。本発明によって使用される架橋されたポリマーは、インビボでゲル化し、従って、注入部位においてヒドロゲル貯留体を形成することができる生体適合性ポリマーでなければならない。ポリマーは、非酵素的に分解可能で、かつ生体侵食性でなければならない。最も重要なことは、ポリマーは好ましくは非免疫原性であることである。下記の実施例において示されるように、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液は、この溶液が注入された実験動物のいずれもが、架橋されたアルギン酸塩に対する免疫反応の徴候を何ら示さなかったため、非免疫原性である。従って、本質的には、本発明は、その弾性応答が、小さい変形の振動周期が加えられたとき、その粘性応答と同等またはそれ以上になり、かつ、べき乗則の関係の剪断弱化挙動を示す架橋されたアルギン酸塩溶液を調製する方法で、aアルギン酸ナトリウムを水または任意の他の好適な水性緩衝液に溶解する工程;b工程aで得られたアルギン酸塩溶液を、均一な溶液が得られるまで激しく撹拌しながら、好適な体積の2w/vグルコン酸カルシウム溶液を加えることによってカルシウムイオンにより架橋する工程を含む方法を提供する。必要に応じて、工程aで得られるアルギン酸塩溶液は、一連の好適なメンブランフィルター例えば、1.2μm、0.45μmおよび0.2μmのナイロンフィルターによりろ過することができ、その後、工程bに進むことができる。従って、本発明はまた、本明細書中に記載される方法によって調製される架橋されたアルギン酸塩溶液を提供する。予想外にも、本発明者らは、架橋されたアルギン酸塩生体適合材料のみの注入により、損傷した心筋の再生およびその機能の増大を、細胞同時移植に対する必要性を伴うことなく促進させ得ることを見出した。その結果として、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液は、損傷した心臓組織の修復および再生を促進させるために使用することができる。さらなる局面において、本発明は、本明細書中に規定されるようなポリマー溶液を有効成分として含む組成物を提供する。ポリマー溶液において使用され得るポリマー組成物に含まれる有効成分の例には、多糖などのヒドロゲル形成ポリマーがある。好ましくは、ポリマーはアルギン酸塩である。本発明の方法によって調製される注入可能な調製物は、心筋梗塞後における損傷した心臓組織の処置のために、かつ/または慢性心不全の処置のために特に好適である。特に、本発明の方法によって製造される注入可能な調製物は、心筋事象後において左心室壁を厚くするために意図される。その結果として、本発明の組成物は、損傷した組織好ましくは心臓組織、特に左心室壁の修復および再生を促進させるために使用することができる。本発明の組成物の1つの実施形態において、前記損傷は、心筋梗塞、虚血性心筋損傷、毒性心筋損傷、炎症性心筋損傷または機械的心筋損傷からなる群から選択される。別の実施形態において、本発明の組成物は、心筋の損傷、リモデリングおよび機能不全から生じる状態の防止および/または処置における使用のためのものであり、この場合、前記状態は、左心室リモデリング、梗塞拡大、心不全および虚血性僧帽弁逆流からなる群から選択される。また、本発明の注入可能な調製物は、不整脈から生じる組織損傷の処置のために好適であり得ることが予想される。電気化学的な位置決めを使用して、本発明の注入可能な調製物は、バイオ除去のために、すなわち、不整脈の病巣および経路への注入による心臓不整脈の除去のために使用することができる。肥厚による心臓の順応は患者を心不全および潜在的には致死性不整脈に罹りやすくさせ得る。不整脈の機構は限局性またはリエントリー性のいずれかとして記載される。リエントリーは単純な概念であり、最も臨床的に重要な不整脈の機構である。リエントリーにより、その発生点に戻る経路上の心筋を通る電気的活性化の波面の進行が記述される。これにより、1サイクルのリエントリー回路が完成し、そして、ある種の臨界的な条件が存在するならば、伝導が何度も繰り返してその回路の周りで継続して、規則的な不整脈をもたらす。類似する巡回伝導経路をもたらす構造的変化が存在する何らかの状態では、それが先天的例えば、補助的経路により媒介される頻脈、房室結節リエントリー性頻脈、および、おそらくは心房粗動などまたは後天的例えば、心筋梗塞後の心室性頻脈などであったとしても、リエントリー性不整脈の潜在的可能性が存在する。対照的に、構造的な心臓疾患の多くの形態において存在するように、心筋の電気的性質の重篤かつ全体的な破壊が存在するときには、リエントリー波面が、一定の経路に従うことなく心筋を介して目的もなく蛇行して流れ、細動を生じさせ得る。限局性不整脈の基礎となる機構は、心筋の他の部分に広がる一群の細胞の異常な迅速かつ自発的な電気的活動である。アルギン酸塩生体適合材料の注入によるカテーテル除去の目的は、リエントリー回路を横断し、かつ遮断するか、または病巣を除去する最も安全かつ最も操作可能な地点を突き止め、その地点を除去することによって不整脈を除くことである。この技術では、心臓の関係した部分からの電気的シグナルを記録するために、X線透視装置による誘導のもとでの心臓への電極カテーテル一時的なペーシングワイヤと酷似する、電極をその先端に有する絶縁されたワイヤの経皮導入を伴う。不整脈の機構が明らかにされると、電極カテーテルの1つが、除去エネルギー高周波電流、これは予測可能であり、効果的であり、かつ十分に寛容されるが、不整脈の原因を破壊する限局化された瘢痕を生じさせるために送達される重要な部位に進められる。まとめると、架橋されたアルギン酸塩がリエントリー性経路または不整脈病巣に注入され、これにより、線維形成、および不整脈回路の妨害がもたらされる。従って、代替として、本発明の組成物は、限局性不整脈またはリエントリー性不整脈の処置において使用することができる。本発明の組成物の別の使用は治療的血管形成においてである。本発明の組成物はまた、幹細胞の走化性を導き、損傷した心筋に向かわせることにおける使用のためのものである。さらなる実施形態において、本発明の組成物はさらに、必要に応じてさらなる治療薬剤を含有する。この場合、前記さらなる治療薬剤は、抗生物質、増殖因子、抗炎症性薬物、ホルモン、抗アポトーシス薬物、成長刺激因子および幹細胞刺激因子からなる群から選択される。様々な増殖因子をさらなる治療薬剤として使用することができ、例えば、血管形成刺激因子および血管再生増強因子例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子bFGF、血管内皮細胞増殖因子VEGF、インスリン様増殖因子IGF、TGFファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質BMP、血小板由来増殖因子、アンギオポイエチン、および他の因子例えば、筋原性因子、転写因子、サイトカインおよびホメオボックス遺伝子産物などを使用することができる。サイトカイン、増殖因子および血管形成因子を、組織再生を高めるために、生分解性のマイクロ粒子またはナノ粒子にカプセル化することができ、また、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液のような生体適合材料に埋め込むことができる。注入されたとき、インビボでゲル化する本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液の注入によって作製される足場のような、細胞マトリックスを模倣することができる足場は、下記の実施例において示されるように、直接的な血管再生だけでなく、新しい心筋の成長を刺激する潜在的能力を有する。本発明の組成物のさらにさらなる実施形態において、組成物はさらに、心筋の血管形成および再生を促進させ得る細胞好ましくは、筋芽細胞、心筋細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、始原細胞、幹細胞または他の好適な細胞を含む。実施例6において示されるように、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液と一緒での筋芽細胞の注入は、注入部位における移植された筋芽細胞の保持を高め、血管形成および機能的な血管の形成を誘導した。筋芽細胞は、骨格性横紋を見せる多核性繊維に分化した。医薬組成物の調製はこの分野では十分に知られており、多くの論文および教本に記載されている。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciencesGennaroA.R.編、MackPublishingCo.、Easton、PA、1990、特にその1521頁~1712頁を参照のこと。なおさらなる局面において、本発明は、損傷した組織の修復および再生を促進させるための医薬組成物の調製における本発明のポリマー溶液の使用を提供する。好ましくは、前記ポリマーは、架橋されたアルギン酸塩であり、前記組織は心臓組織であり、より好ましくは左心室壁である。前記損傷は様々な起源例えば、心筋梗塞、虚血性心筋損傷、毒性心筋損傷、炎症性心筋損傷または機械的心筋損傷に由来し得る。従って、さらにさらなる局面において、本発明は、本発明において規定されるようなポリマー溶液を必要性のある対象に投与することを含む、損傷した組織を処置する方法を提供する。好ましくは、前記ポリマーは、架橋されたアルギン酸塩である。1つの実施形態において、処置される前記組織は心臓組織であり、好ましくは左心室壁である。本発明の架橋されたアルギン酸塩または組成物は、不整脈惹起性基質を除去するために、損傷した心筋に投与されるはずである。本発明において、本発明者らは、広範囲のMIのラットモデルにおける梗塞した心筋への、アルギン酸塩に基づく生体適合材料の注入により、LVの拡張および心筋の機能不全が弱まることを初めて示している実施例2。この結果は、重篤な心筋損傷の後においてLVの幾何形状および機能を保持するための、また、LVの機能不全を防止するための注入可能な生体適合材料足場の概念の証拠および新規な選択肢を提供している。この研究は、適切な数の機能的なドナー細胞を心臓組織工学のために達成する際の様々な困難に対する実行可能な代替法を示唆している[Etzion,S.他2001、AmJCardiovascDrugs、1:233~244]。さらに、そのような代替法は、血管新生およびSDF-1生存因子の発現を誘導することによって、細胞の保持、定着および生存を改善するために細胞送達と一緒に使用することができる。アルギン酸塩生体適合材料の注入が組織の修復および再生をどのように生じさせるかの機構は明らかではない。おそらくは、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液の注入は、心室のサイズを安定化させ、瘢痕の厚さを増大させることによって壁応力を低下させる。この機構は、この心筋領域において、梗塞の拡大を阻害することができ、かつ、動脈瘤形成を妨げることができる。あるいは、アルギン酸塩注入の好都合な効果は、その制約された機械的性質を超えていることがあり、部分的には血管新生および再生の誘導に関係づけられ得る。壁応力の同時増大を伴うLVの拡大および球状変形はLVリモデリングの病理発生における重要な要素である[SuttonおよびSharpe2000、同上;Mann1999、同上]。このことが、進行性の左心室拡張および変形を是正することを目指す網状移植片移植による受動的な外部からの閉じ込めのための理論的根拠である。MIまたは拡張型心筋症の動物モデルまたは患者を使用するいくつかの研究では、心筋の構造および機能に対する受動的な心臓閉じ込めの有益な効果が明らかにされている[Kelley,S.T.他、Circulation、1999、99:135~142;Pilla,J.J.他2002、Circulation、106:I207~211;Saavedra,W.F.他2002、JAmCollCardiol、39:2069~2076;Lembcke,A.他2004、EurJCardiothoracSurg、25:84~90]。心臓拡大を抑制することに加えて、包囲効果は、領域的な心室壁応力および心筋活動を低下させることが仮定される。注入された生体適合材料が、傷害を受けたECMに取って代わり、遊走中の細胞または埋め込まれた細胞が自身のECMを産生し、より強固な瘢痕をもたらすまで、一時的な足場を提供することが可能である。本研究における興奮させる新しい発見は、アルギン酸塩の注入により処置された心臓の梗塞域および境界域における強いSDF-1発現である。SDF-1は、幹細胞の呼び寄せおよび走化性の重要な調節因子である。この効果は、注入された生体適合材料により、血管新生および心筋の再生に関係する幹細胞を注入部位に引き寄せるシグナル伝達系が活性化されることを示唆している。従って、1つのさらなる局面において、本発明はまた、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、SDF-1の発現を増強する方法を提供する。明らかではあるが、循環している幹細胞は、SDF-1の勾配の方に向かう移動能力を示すインビトロ実験[Kollet,O.他、Blood、2001、97:3283~3291;Lapidot,T.およびPetit,I.2002、ExpHematol、30:973~981]によって明確に明らかにされるように、SDF-1濃度の高い病巣に向かう。免疫不全マウスの脾臓および骨髄へのヒトSDF-1の注入は脾臓および骨髄への移植されたヒト幹細胞の迅速な呼び寄せを生じさせた[Kollet他2001、同上]。他のデータは、幹細胞の呼び寄せが骨髄に限定されないだけでなく、傷ついた心臓においてもまた見出され得るというSDF-1の概念と一致する[Askari,A.T.他、Lancet、2003、362:697~703;Pillarisetti,K.およびGupta,S.K.、Inflammation、2001、25:293~300]。従って、SDF-1は、これらの呼び寄せ効果を引き起こすことにおいて重要な役割を有し得る。SDF-1は、CXCR4を介して、血管形成をインビボで誘導する[Salcedo,R.他、AmJPathol、1999、154:1125~1135;Tachibana,K.他、Nature、1998、393:591~594;Salvucci,O.他、Blood、2002、99:2703~2711]。SDF-1およびCXCR4は直接的に細胞の生存を高める[Broxmeyer,H.E.他2003、J.Leukoc.Biol.、73:630~638;YamaguchiJ-I他2003、Circulation、107:1322~1328]。Yamaguchiおよび共同研究者ら[Yamaguchi他2003、同上]は、血管新生に対するSDF-1の影響が、移植された内皮始原体細胞EPCの補充および取り込みを高めるその能力に由来するようであることを示した。別の研究において、Askariおよび共同研究者らは、顆粒球コロニー刺激因子による幹細胞の可動化と組み合わせられた、SDF-1を発現する遺伝子組み換えされた心臓繊維芽細胞の移植は、低下した心筋機能を回復させ得ることを示した[Askari他2003、同上]。さらに、SDF-1は、CXCR4を介して始原体細胞の生存/抗アポトーシスを直接的に高める[Broxmeyer,H.E.他2003、同上;Yamaguchi他2003、同上]。従って、別のさらなる局面において、本発明は、架橋されたアルギン酸溶液、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、幹細胞の走化性を導くか、または、損傷した心筋に向かわせる方法を提供する。リモデリング過程の不可欠な成分は心筋梗塞瘢痕内における血管新生の発達である。正常な状況のもとでは、梗塞床毛細管網目組織に対する血管新生の寄与は、収縮性代償のために要求される組織成長と足並みをそろえるためには不十分であり、また、肥厚しているが、成長可能な心筋のより大きな要求を支えることができない。肥厚した心筋細胞に対する酸素および栄養分が比較的不足することは、進行性の梗塞拡大および線維性置換をもたらす、他の場合には成長可能な心筋の死における重要な病因的要因であり得る。ヒトおよび動物モデルの両方における梗塞血管床の遅い再灌流は心室リモデリングに著しい利益を与えるため、血管新生は、肥厚しているが、他の場合には成長可能な心筋細胞の喪失を妨げることによって心臓機構を改善し得る。処置された心臓の顕微鏡検査図8A~図8Dでは、アルギン酸塩の注入により、梗塞した心筋において、多くの筋繊維芽細胞が補充され、集中的な血管形成が促進されたことが明らかにされた。梗塞周囲領域に向かう血流の回復が全体的なより良好な梗塞治癒と関連し得ることが考えられる[Kocher,A.A.他2001、NatMed、7:430~436]。血液が満たされた冠状動脈血管床によってもたらされる起立力としての血管新生足場の有益な役割がSalisbury他[Salisbury,P.F.他1960、CircRes、8:794~800]によって最初に示唆されており、Braunwald[Braunwald,E.、Circulation、1989、79:441~444]の研究の結果によってさらに裏付けられている。さらに、HaleおよびKlonerは、遅く再灌流されたラットの梗塞部における放射状応力に対する増大した抵抗性を示す厚くなっている瘢痕を報告した[Hale,S.L.およびKloner,R.A、AmHeartJ、1988、116:1508~1513]。まとめると、広範囲のMIの後における血管新生は細胞死を防止し、生存性を維持し、かつ、LVのリモデリングおよび機能不全を防止することができる[Kocher他2001、同上;Abbate,A.他、JCellPhysiol、2002、193:145~153;Abbate,A.他、Circulation、2002、106:1051~1054]。それにより、LVの拡張および機能不全を防止する生物学的な足場および受動的な抑制がもたらされ得る。上記で議論された結果を考慮して、さらにさらなる局面において、本発明は、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、血管新生を誘導する方法を提供する。急性MIに由来する筋肉損傷の程度を低下させるための様々な試みが多くの方法で成功しており、しかし、梗塞後の瘢痕化、リモデリング、拡張、およびその後の心不全の問題が残っている。残念ながら、梗塞を制限する現代の方法例えば、早期再灌流、洗練された線維素溶解性の抗血小板処置、および心筋保護などの利点はすべてが、それらの明らかな限界に近づきつつある。その結果、研究者は、最初の損傷を制限または防止することにもっぱら集中するのではなく、古い梗塞した心筋を新しい組織により置換することを目指した新しい方法を積極的に開発し続けている。治療的血管形成が、従来の経皮的方法または外科的方法を容易に受けつけない症候性虚血性心臓疾患を処置することに対する潜在的に新しい方法として出現している。選択肢がないそのような患者が、閉塞性冠状動脈疾患の処置のために照会された全患者の12もの多くを表し得る。新しい血管の形成および側副循環を誘導することによって、治療的血管形成は、虚血性組織の灌流および生存性、治癒を高め、進行性の心筋損傷を防止する。従って、なおさらにさらなる局面において、本発明は、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、治療的血管形成を誘導する方法を提供する。血管新生および血管形成のこれらの用語は本明細書中では交換可能に使用される。さらに、本発明は、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、左心室リモデリング、梗塞拡大、心不全、虚血性僧帽弁逆流からなる群から選択される状態を防止する方法を提供する。もう1つのさらなる局面において、本発明は、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象の除去部位に投与することを含む、限局性不整脈またはリエントリー性不整脈を処置する新規な代替方法を提供する。本発明の架橋されたアルギン酸塩は、心筋収縮の特性例えば、力、最大圧力、強さ、駆出時間および心拍出量などによって定義される収縮期機能を改善するために使用することができる。そのため、本発明の究極的なさらなる局面において、本発明において規定されるような架橋されたアルギン酸溶液または組成物を必要性のある対象に投与することを含む、心筋の収縮性を改善する方法が提供される。興味深いことに、本発明者らは、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液が注入されたとき、心筋細胞が、増殖するように誘導されたことを明らかにしている。このことは、Ki67細胞増殖マーカーに対して反応性の抗体が、梗塞した心臓において陽性に反応した実施例4において例示された。このことは、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液は、細胞増殖または細胞分裂、および、その結果としてDNA合成を誘導することができることを示唆している。すなわち、架橋されたアルギン酸塩溶液は、細胞周期に再び入るように周りの組織を誘発する。従って、本発明のもう1つの局面は、心臓細胞の増殖を誘導する方法であり、この方法は、インビボまたはインビトロにおいて、前記細胞を本発明の架橋されたアルギン酸溶液または組成物と接触させることを含む。最後に、本発明は、a本発明において規定されるようなポリマー溶液またはその組成物;b必要としている患者の心臓部位にポリマー溶液を投与するための手段;c前記ポリマー溶液をどのように使用するかの指示マニュアル;を含む、損傷した組織を修復するためのキットを提供する。本発明によって提供されるキットの1つの実施形態において、前記ポリマーは好ましくは、架橋されたアルギン酸塩である。本発明によって提供されるキットの別の実施形態において、ポリマーを投与するための前記手段は、18G~27Gのニードルを有するシリンジ、電気機械的な位置決めカテーテルまたはMRI誘導カテーテルを含む、ガイドワイヤを有する心臓送達デバイスを含む任意の好適な経皮心臓送達システム、および、左心室腔、動脈または静脈の冠状系を介して心筋を評価するために設計された任意の経皮心臓デバイスのいずれかであり得る。本明細書中に示されるようなインシチュー組織工学のこの概念の重要な利点は、カテーテルに基づく方法を用いて、従って、手術による開胸に対する必要性を避けて、インプラント、または、インプラントを形成する前駆体物質本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液のような物質を導入するための実現可能性である。従って、本研究は、アルギン酸塩の注入は、幹細胞の呼び寄せ、定着および自己修復のための環境を生じさせ得る新しい選択肢であることを示唆する。本発明は請求項によって定義され、その内容は、本明細書の開示に含まれるように読まなければならない。開示および記載されている場合、本発明は、本明細書中に開示される特定の例、プロセス工程および材料に限定されないことを理解しなければならない。そのようなプロセス工程および材料は幾分か変化し得るためである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載するために使用されるのみであり、また、本発明の範囲は、添付された請求項およびその均等物によってのみ限定されるため、限定であることが意図されないこともまた理解しなければならない。本明細書および添付された請求項において使用されるように、a、anおよびtheの単数形態は、内容が明らかに別途指示しない限り、複数の指示体を包含することに留意しなければならない。本明細書および下記の請求項を通して、内容が別途要求しない限り、語含むcompriseおよび変化形例えば、comprisesおよびcomprisingなどは、言及された完全体または段階または一群の完全体もしくは段階を含むことを意味し、しかし、何らかの他の完全体または段階または一群の完全体もしくは段階の排除を意味しないことが理解される。下記の実施例は、本発明の様々な局面を実施する際に本発明者らによって用いられた技術を表す。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態を例示する一方で、本開示に照らして、当業者は、数多くの改変が、本発明の精神および意図された範囲から逸脱することなく行われ得ることを理解しなければならない。実験手法本研究は、ベングリオン大学動物管理使用委員会およびテルアビブ大学Sheba医療センターのガイドラインに従って行われ、アメリカ心臓学会および実験室動物の管理および使用のためのガイド保険福祉省、NIH刊行物番号85-23の方針に合致している。架橋されたアルギン酸塩生体適合材料の調製アルギン酸ナトリウム3kDa~300kDaの範囲にあるMw;FMCBiopolymers、Drammen、ノルウェーを2回蒸留水DDWに溶解して、2w/vの最終濃度にした。このアルギン酸塩溶液を、よりなめらかな溶液が得られるまで激しく撹拌しながら、2w/vのグルコン酸カルシウム溶液D-グルコン酸、ヘミカルシウム塩;Sigmaを加えることによってカルシウムイオンにより架橋する。架橋されたアルギン酸塩溶液の粘度は、カルシウムイオンおよびアルギン酸塩の重量比を変化させることによって、そしてまた、ポリマーの分子量および組成M/G比を慎重に選択することによって操作することができる。それにもかかわらず、すべての場合において、架橋されたアルギン酸塩溶液は、注入することを可能にする粘度を有した。架橋はホモジナイザーによって行われた。架橋されたアルギン酸塩の典型的な注入溶液は1w/vのアルギン酸塩および0.3w/vのグルコン酸カルシウムからなり、例えば、1mLの2w/vのアルギン酸塩、0.3mLの2w/vグルコン酸カルシウム溶液、および0.7mLの水を混合して、2mLの架橋されたアルギン酸塩組成物を作製することによって調製される。架橋されたアルギン酸塩は、その後、使用まで4°Cで置かれる。ブタにおいて、1mL~5mLの間で、本発明の架橋されたアルギン酸塩が注入される。0.2mL~5mLの間で、架橋されたアルギン酸塩をヒトに注入することができる。しかし、最適な注入量および注入頻度は、処置中の患者を担当する専門家によって決定されなければならない。本発明者らによって開発されたプロセスは、アルギン酸塩ゲルを調製するために使用された以前の方法とは実質的に異なる。1つの方法において、アルギン酸塩ゲルが、アルギン酸ナトリウム溶液をCaCl2の濃縮液に滴下して加えることによって調製された。このプロセスは、主として液滴の表面における、アルギン酸塩の小液滴の迅速かつ広範囲の架橋を伴う。カルシウムイオンが液滴内に拡散するに従い、アルギン酸塩は粘性の溶液から高度に架橋された固体ゲルに急速に変化する。そのような配合は、通常的には、細胞のカプセル化のために使用され、半透過性膜を形成させるために、アルギン酸塩と正荷電ポリマーとの間での別の反応を伴うことが多い[Lim,F.およびSun,A.M.1980、人工内分泌膵臓としてのマイクロカプセル化された膵島、Science、210:908~910]。対照的に、本発明の方法では、カルシウムイオン溶液が、激しい撹拌を使用してアルギン酸塩水溶液により分散され、これにより、カルシウムが架橋することによって維持されるアルギン酸塩生体適合材料の均質な絡み合った網目組織が得られる。国際特許出願公開WO94/25080に記載される方法この方法は注入可能なアルギン酸塩のために主に適用されるでは、硫酸カルシウムが固体粒子として、アルギン酸塩溶液に加えられる。従って、アルギン酸塩のゲル化速度は硫酸カルシウムの溶解性に依存し、硫酸カルシウムの溶解性は塩の粒子サイズに依存する。通常、塩粒子は、その溶解性速度に影響を及ぼす広範囲のサイズ分布を有する粒子が小さいほど、粒子は速く溶解する。このことは、アルギン酸塩のゲル化の制御不能なプロセス、および不均一なゲルの形成をもたらす。対照的に、本発明者らによって開発された方法は、レオロジー研究によって示されるように、均一な互いに浸透し合う網目組織物の製造を可能にする。アルギン酸塩の分子量を測定するためのGPC-MALLS様々なサンプルを、Waters606ポンプと、その後に直列につながれた2つのPSSSupremaゲル浸透カラムとを含むクロマトグラフィーシステムで分離した。カラムの説明:大きさ、300x8mm2;粒子サイズ、10mm;多孔性、3000Aおよび10000A。流速は0.5mL/分であった。カラムは、TechlabK-4の制御された加熱炉の内側で25°Cの一定の温度で保たれた。このクロマトグラフィーシステムは、632.8nmで作動するHe/Neレーザー、K5屈折セル、および14°~163°の角度での18個の検出器を備えるDawnDSPWyattTechnologyCorporation多角度レーザー光散乱MALLS光度計に取り付けられた。濃度を、校正された干渉分光法屈折計OptilabDSPWyattTechnologyCorporationによってモニターした。データ処理およびモル質量の計算を、WyattASTRAソフトウェアバーション4.7を用いて行った。各サンプルは、再現性を保証するために3回注入された。アルギン酸塩のdn/dcは、Wyattdn/dcソフトウェアによって制御されるOptilabDSPを用いて測定されたとき、0.155mL/g水性緩衝液であることが見出された。緩衝液水溶液を、0.1MのNaNO3、0.02w/vのNaN3および10mMのイミダゾールが補充された超純水0.055μs/cm、USFSERALPurelabRO75、それに続くUSFSERALPurelabUVから調製した。緩衝液をNaNO3により滴定してpH7.0にし、0.1μmのフィルターGelmanSciencesVacuCap60によりろ過した。レオロジー測定レオロジー測定を、コーンプレートモード1°および4°のコーン角度、60mmおよび40mmの直径をそれぞれ有するで操作されるCarriMedCLS50制御の応力レオメーターCarriMedInstrumentsLtd.、Dorking、英国において行った。小さい振幅の振動剪断の実験0.1Hz~10Hzを線形粘弾性限界内で行った。振動数走査を、サンプルに対する損傷を防止するためにできる限り低い応力で行った。応答の直線性を、線形の粘弾性を確認するために連続してモニターした。MIのラットモデルおよび注入MIモデルは本発明者らによって以前に記載された[Etzion他2001、同上;Leor他1996、同上]。オスSprague-Dawleyラット250gまでを40mg/kgのケタミンおよび10mg/kgのキシラジンの組合せで麻酔し、ラットは挿管され、機械的に通気された。胸部を左開胸術によって開き、心膜を除き、近位左冠状動脈を壁内縫合により永続的に閉塞させた。梗塞後1週間目に、ラットを麻酔し、無菌技術下で胸部を開いた。梗塞した領域を、表面の瘢痕および壁運動の無動に基づいて目視により確認した。ラットを、27ゲージのニードルを使用する100μL~200μLのアルギン酸塩系生体適合材料または無血清培養培地のいずれかの注入に対して選択した。瘢痕内への注入の後、手術による切開を縫合して閉じた。組織学的検査および免疫組織学的検査注入後8週で、動物を過剰量のフェノバルビタールで屠殺した。心臓を集め、組織学的検査および免疫組織学的検査のために処理した。隣接するブロックをパラフィンに包埋し、5μmの薄片に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。連続した切片を、胚性心筋細胞に存在するが、成体の正常な心筋細胞には存在しないα-アクチン平滑筋SMAイソ型[Leor,J,他1996、Circulation、94:II332~336]に対する抗体、早性ミオシン重鎖MHCに対する抗体Sigma、Ki67に対する抗体NovocastraLtd、SDF-1RDsystemsに対する抗体により免疫標識した。血管新生の評価梗塞した心筋および梗塞周囲の心筋における血管新生に対するアルギン酸塩注入の影響を、周細胞および細動脈に対する抗α-SMA抗体Sigmaによる代表的なスライド片の免疫組織学的染色によって評価した。低倍率での検査の後、5つの連続した隣接する視野を200倍の倍率で各切片から写真撮影した。血管の数を、コンピュータ処理された画像分析によって顕微鏡写真から評価して、移植群および対照群の心臓において、血管の数を数え、かつ血管密度1mm2あたりの毛細管および細動脈の平均数を計算した。リモデリングおよび収縮性を評価するための超音波心臓造影法経胸壁超音波心臓造影法を、MI後24時間以内ベースラインとなる心エコー図およびMI後8週においてすべての動物に対して行った。以前の報告では、ラットにおける経胸壁超音波心臓造影法の正確性および再現性が明らかにされている[Etzion他2001、同上;Leor,J.他2000、同上;Litwin,S.E.他1994、Circulation、89:345~354;Schwarz,E.R.他1998、BasicRes.Cardiol、93:477~486]。心エコー図を、以前に報告されたように、12MHzフェーズドアレイ変換器を備える市販の超音波心臓造影法システムHewlettPackardを用いて行った。測定されたパラメーターは下記の通りであった:LV前壁の厚さ;LV拡張終期の最大の大きさ;Mモードおよび2D画像化における左心室収縮終期の最小の大きさ;ならびに、収縮期機能の尺度としての縮まり率これはFS=[LVIDd-LVIDs/LVIDd]x100として計算された;式中、LVIDはLVの内部の大きさを示し、sは収縮期であり、dは拡張期である。LV面積の変化指数が[EDA-ESA/EDA]x100として計算された式中、EDAはLV拡張終期の面積を示し、ESAはLV収縮終期の面積を示す[Mehta,P.M.他1988、J.Am.Coll.Cardiol.、11:630~636]。すべての測定は、3回の連続した心臓周期について平均化され、処置群について知らされていない経験豊かな技師によって行われた。ブタにおける心筋梗塞の発生心筋梗塞を生じさせるために使用された方法は、以前に記載された方法[Yau,T.M.他2003、AnnThoracSurg、75:169~176;Watanabe,E.他1998、CellTransplant、7:239~246]と同じであった。簡単に記載すると、メスSincklaireミニブタを使用した体重、30kg~40kg。ブタに対するすべての手術処置は全身麻酔下および連続した心電図記録法モニターリングのもとで行われた。動物は、4イソフルランによる麻酔誘導の前にケタミン20mg/kg~30mg/kg、筋肉内で準備投薬された。麻酔をイソフルラン1~2.5で維持した。右大腿動脈を単離し、導入シースによりカニューレ挿入した。これを介して、X線透視装置による誘導のもとで、心臓カテーテルを左前下行動脈LADの中央部分に入れ、塞栓形成コイルBostonScientific、米国をガイドワイヤによりカテーテルから押し出し、LADの遠位部分に設置した。この手法は血栓を誘導し、これにより、血管造影法および心電図記録法により確認される左心室における心筋梗塞を生じさせた。電気的DCの電気的除細動を必要なときには与えた。僧帽弁逆流MRの発生僧帽弁逆流を、回旋冠状動脈のコイル塞栓形成の後、広範囲の後部MIを生じさせることによって発生させた。アルギン酸塩生体適合材料の注入アルギン酸塩の注入をMI後7日目~10日目に行った。ブタに麻酔し、無菌条件下で胸部を開いた。梗塞した領域を、表面の瘢痕および壁運動の異常に基づいて目視により確認した。ブタを、梗塞した心筋への2回~3回のアルギン酸塩の注入2.5mLまで、または対照としての生理的食塩水の注入2.5mLまでに無作為に割り当てた。空気を胸部から追い出して、手術による切開を縫合して閉じた。最初の一連の先導実験において、この手法の技術的側面を改善した。移植後8週目に、ブタをフェノバルビタールの過剰量で安楽死させた。心臓を組織学および免疫組織化学のために集め、切片化して、処理した。LVリモデリングおよび機能の超音波心臓造影法評価超音波心臓造影法を、2.5MHzフェーズドアレイ変換器を超音波システムSonos5500、Hewlett-Packard、Andover、Massachusettsとともに使用して、MI直後、移植前、MI後10日目、ならびにMI後の30日目および60日目に麻酔下で行った。画像をVHSビデオテープに記録した。拡張終期および収縮終期のフレームを先端および胸骨近辺の標準的な図から選択した。総LV駆出率LVEFを目視により推定した。VL体積を、心内膜境界の>80が先端の4房室図および2房室図の両方において検出され得るときには一平面内修正シンプソンアルゴリズムを使用して左心室腔を手でなぞることによって、また、心内膜境界の80が先端の4房室図においてのみ検出され得るときには一平面によって測定した。領域別の心筋評価および壁運動スコア指数を、アメリカ超音波心臓造影法学会によって勧告されるように、セグメントスコア1=正常、2=運動低下、3=無運動、4=運動異常を16個の左心室セグメントのそれぞれに割り当てることによって決定した[Schiller,N.B.他1989、J.Am.Soc.Echocardiogr.、2:358~367]。すべてのセグメントスコアを加え、分析されたセグメントの数によって除して、壁運動スコア指数を得た。領域別のLV機能を、標準的な16個のセグメントを使用することによって評価した[Schiller,N.B.他1989、J.Am.Soc.Echocardiogr.、2:358~367]。各セグメントについて、収縮期の壁運動および肥厚化を、下記の半定量的なスコア化システム1~4を使用して目視により段階づけた:1=正常または運動過剰;2=運動低下;3=無動;および4=運動異常。左心室壁の運動スコア指標WMSIを、分析されたセグメントの総数によって除された個々のスコアの和を使用して得た。領域別の運動スコア指標を、中央LAD区域梗塞に関連した動脈区域のセグメントについて同じ方法によって計算した。研究は1人の経験豊かな観察者によって解釈され、すべての測定が1人の技術者によって個別に得られた。MRを、左心房噴流の偏りの中における噴流の広がりを組み込んだアルゴリズムと、近位領域のサイズとを使用するカラードップラー流動マッピングによって段階づけた。MRは、逆流噴流面積が、ベースライン変動を伴うことなく認められる壁噴流および近位の等速度表面領域の非存在下でLA面積の20未満を占めたときには軽度と見なされた。MRは、噴流面積がLA面積の40を超えるすべての患者では重度と見なされた。噴流の偏りまたは相当の近位流動収束半径噴流面積が20未満である患者では0.6mm、噴流面積が20~40の間である患者では0.9mmはMRの程度を1階級上げた。形態学的研究および組織学的研究心室機能の浸襲的研究が終了した後、心臓を塩化カリウムにより停止させ、速やかに摘出した。心房を除き、心臓の重量を測定した。その後、冠状動脈を100mLの10ホルムアルデヒドにより灌流し、心臓を、7日間、ホルムアルデヒド溶液中で30mmHgの心室内圧力を用いて拡張期の状態で固定処理し、その後、組織学のために切片化した。固定処理後、心臓を5mm厚の薄片に薄片化し、各切片を写真撮影した。各切片における平均瘢痕長さを心外膜瘢痕長さおよび心内膜瘢痕長さの平均値として計算した。その後、瘢痕面積を、0.5cmを乗じたその切片に対する平均瘢痕長さとして計算した。総瘢痕面積をすべての切片についての瘢痕面積の和として計算した。瘢痕の厚さを各切片において計算し、瘢痕体積を、平均瘢痕厚さを乗じた総瘢痕面積として計算した。一辺が5mmである梗塞域の中心部からの組織立方体をパラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンによる染色のために5μmの切片に切断した。免疫組織化学研究のために、組織薄片を、トルエンによる脱パラフィン化の後、100、95および70のエタノールにおいて連続的に水和した。サンプルにおける内因性ペルオキシダーゼをブロッキング処理し、サンプルを抗体により染色した。隣接するブロックをパラフィンに包埋し、5μmの薄片に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。連続した切片を、SMAに対する抗体、遅性MHCに対する抗体Sigma、Ki67に対する抗体NovocastraLtd.、およびSDF-1に対する抗体RDSystemsにより免疫標識した。統計学的分析対照群と処置群との間における一変量差を、連続変数についてのt検定を用いて評価した。両群における各ラットはそれ自身の対照として使用されたため、対照群および処置群におけるベースラインと8週目との間での変化を、ペアードt検定を用いて評価した。対照群および処置群におけるベースラインから8週目の変化の比較を、Windows登録商標用GraphPadPrismバージョン4.00GraphPadSoftware、SanDiego、California、米国を使用して、反復測定によるANOVAを用いて行った。ANOVAモデルには、対照対処置およびベースライン対8週目が因子として含められ、また、これら2つの因子の間での相互作用が含められた[Perin,E.C.他2003、Circulation、107:2294~2302]。p≦0.05の確率値を統計学的に有意であると見なした。実施例1注入可能な架橋されたアルギン酸塩生体適合材料の調製およびレオロジー評価生物ポリマーであるアルギン酸塩の分子量Mwおよびその多分散度PD分子量の分布範囲の目安は、得られる絡み合った網目組織の形成速度および構造に対する影響を有し得る。従って、GPC-MALLSを実験手法において記載されるように使用して、アルギン酸塩のMwおよびPDを特徴づけた表1。レオロジーアルギン酸塩ゲルは、永続的でもなく、また、共有結合による架橋ほど強くない物理的な架橋が形成される物理的ゲルの範疇に含まれる。定常剪断速度粘度ηは、流れに対する流体の抵抗の尺度である。粘度ηは、剪断速度γに対する剪断応力τの比として定義される。1η=τ/γ流体がすべての剪断速度について式1に従うとき、その流体はニュートン性であることを意味する[Ferry,J.D.1980、Viscoelasticpropertiesofpolymers、JohnWileySons]。本明細書中に記載される1w/vのアルギン酸ナトリウム溶液はニュートン性である表2。カルシウムイオンが加えられたとき、カルシウムイオンはアルギン酸塩の架橋を開始し、これにより、絡み合った網目組織の構造化および形成をもたらす。カルシウムにより架橋されたアルギン酸塩については、変形による大きい定常剪断結果が粘度η対剪断速度γのプロットとして表される。図1および図2は、剪断速度とともに変化する見かけの粘度を示す。そのような挙動は剪断弱化および擬似塑性的と呼ばれる。べき乗則の関係η~γ-1がlogη対logγのプロットについて観測された。これは構造化材料に典型的である[Lapasin,R.およびPricl,S.1995、Rheologyofindustrialpolysaccharide:Theoryandapplication、London、Blackbie、620頁]。小さい変形の振動測定材料本件ではポリマー、すなわち、アルギン酸塩溶液に関するレオロジー情報を得るために、動的粘弾性測定が使用される。動的粘弾性測定は、材料の構造が乱されず、また、材料の粘性特性および弾性特性の両方についての情報が得られるため、粘度測定法による測定よりも好ましい。測定は、振動数fの正弦波状の応力または歪みをサンプルに加え、その応答を測定することによって行われる。応答は、i加えられた応力または歪みと一致する弾性部分と、ii一致しない粘性部分とに分けられる。これら2つの成分のために、複素表記法が使用される。複素剪断弾性係数が、下記の式によって定義されるGによって示される:G=G’jG式中、G’は貯蔵弾性係数すなわち、弾性部分であり、Gは損失弾性係数粘性部分であり、j2=-1。振動数の関数としての弾性係数のプロットは材料の機械的スペクトルと呼ばれることが多い。振動数依存性を、logG’=nlogfK式中、Kは定数であるによって示される、振動数fに対するG’のlog-logプロットにおける傾きnによって表すことができる。物理的ゲルではn>0であり、これに対して、共有結合性ゲルではn=0である。小さい変形の振動測定値が、角振動数の関数として貯蔵弾性係数G’弾性応答および損失弾性係数G粘性応答に関して示される。この場合、G’はゲル様構造化系の一次指標として使用される。図3および図4は、異なるカルシウムイオン濃度の添加前および添加後における1w/vのLF5/60アルギン酸塩サンプルまたはLVGアルギン酸塩サンプルの機械的スペクトルをそれぞれ示す。1w/vのアルギン酸塩溶液カルシウムイオンがない場合の両方について、Gの値がG’の値を超えている。これはランダムコイル多糖溶液の典型的な挙動である。カルシウムイオンを加えたとき、得られた系の機械的スペクトルはG’-Gクロスオーバーを明らかにする。これは絡み合った網目組織タイプの物理的ゲルの典型的な特徴である。このタイプのゲルは、i永続的な架橋を有しないこと;ii強く振動数に依存すること;iiiG’-Gクロスオーバーを有すること;およびiv低い振動数では液体として流れることにおいて、強い共有結合性ゲルとは区別される。強いゲルは、永続的な網目組織共有結合的を有し、ほんのわずかな振動数依存性のみを有する剪断弾性係数を示す[Clark,A.およびRoss-Murphy,S.B.1987、生物ポリマーゲルの構造的および機械的な性質、Adv.Poly.Sci.、Springer-Verlag、Berlin、Heidelberg]。弱いゲルは中間的なタイプであり、絡み合った網目組織よりも小さい振動数依存性を有し、10-2rad/s~102rad/sの振動数においてG’-Gクロスオーバーを有しない。弱いゲルはG’-Gクロスオーバーを有することがあるが、より低い振動数では異なった挙動を示す。実施例2MIのラットモデルにおけるアルギン酸塩生体適合材料と心臓細胞移植との治療効果の比較広範囲のMIの7日後、ラットを、心筋瘢痕内への、アルギン酸塩に基づく生体適合材料の注入、胚性心筋細胞1.5x106個の埋め込み、または培地注入に無作為に割り当てた。上記で記載されたように、アルギン酸塩生体適合材料はカルシウム架橋され、それにもかかわらず、注入条件のもとでは依然として流動した。超音波心臓造影法研究を埋め込み前ならびに埋め込み後の1ヶ月および2ヶ月において行って、LVリモデリングおよび機能を評価した。心臓を組織学的評価のために埋め込み後2ヶ月において集めた。連続した超音波心臓造影法研究では、架橋されたアルギン酸塩系生体適合材料の注入は瘢痕の厚さを増強し、LVの拡張および機能不全を妨げ、心臓細胞の移植と同等であり、一方で、対照動物は、LV収縮性における進行性の悪化を伴う著しいLV拡張を発生させたことが明らかにされた。結果が表3に要約される。これらの結果は、ラットモデルにおける梗塞した心筋への、アルギン酸塩に基づく生体適合材料の注入により、LVの拡張および心筋の機能不全が弱まることを示唆している。これらの結果は、胚性心筋細胞の移植によって達成される結果と同等である。これらの結果は、MIおよびCHFを処置するための適切な細胞を達成することにおける困難なことに対する実行可能な代替法を示唆している。実施例3カルシウム架橋されたアルギン酸塩生体適合材料により処置されるMIの動物モデル合計で39匹のラットが本研究に含まれた。13匹のラットが、MIを誘導するための手術処置の後で死亡した。超音波心臓造影法研究および分析が24匹のラットに対して行われた。15匹のラットがアルギン酸塩生体適合材料の注入により処置され、対照群n=9は無血清培養培地の注入を受けた。2匹のラットが、正常な心筋におけるその安全性および影響を調べるために、正常な心臓へのアルギン酸塩の注入を受けた。超音波心臓造影法による機能的研究アルギン酸塩生体適合材料の注入は瘢痕厚さを著しく増大させた表4、p<0.0001。さらに、アルギン酸塩生体適合材料の注入は、広範囲の前壁MIを合併するLV拡張の典型的な経過を効率的に弱めた図5、表4。LV室の内径および面積の増大が認められたが、その増大は、対照動物において観測された増大よりも著しく小さかった図5および表4。LVリモデリングに対するアルギン酸塩生体適合材料の有益な効果は、縮まり率およびLV面積変化率の悪化における低下によって反映されるように、LV機能不全の防止に変えられた図6、表4。生体適合材料により処置されたラットと比較したとき、対照群は、広範囲の心筋梗塞、LVリモデリングおよび心不全の典型的な経過を示した。LVの拡張期内径および収縮期内径における著しい増大が観測された図5および図6、表4。LVの拡張終期腔面積および収縮期腔面積がそれぞれ75および100超と著しく増大した図5および図6、表4;p<0.05。この過程は、広範囲な前壁MIの後でヒト患者において観測される過程と類似している[Pilla、J.J.他2002、Circulation、106:I207~211]。ベースラインからの進行性のLV拡張にはまた、研究終了時における縮まり率の悪化ベースラインにおける30±5から22±3に;p<0.05およびLV面積変化率の百分率の悪化49±5から38±3に;p<0.05によって反映されるLV成績の著しい悪化が伴った。図7組織学的分析および免疫組織化学的分析正常な心筋へのアルギン酸塩生体適合材料の注入は、α-SMAに対する抗体による免疫染色によって示されるように、集中的な血管形成および筋芽細胞の遊走をもたらした図8A。アルギン酸塩の注入により処置された梗塞した心臓の切片の検査では、集中した血管新生、および、梗塞した心筋に存在する数多くの筋繊維芽細胞が示された図8B、図8C、図8D。注入可能なアルギン酸塩生体適合材料により処置された動物の抗Ki67抗体による免疫染色図11では、内皮内の陽性の染色および梗塞部位における心筋細胞が明らかにされた。このことはDNA活性および複製を示している。従って、アルギン酸塩が、心臓の再生に関連する細胞複製を誘導することは明らかである。抗SDF-1抗体により免疫染色されたスライド片の顕微鏡検査では、SDF-1タンパク質の強い発現が、内皮細胞、SMC、繊維芽細胞において、また、予想外ではあったが、境界域での心筋細胞において明らかにされた図9。アルギン酸塩生体適合材料の注入は、非処置動物と比較して、梗塞した部位においてSDF-1の発現を増強させた。SDF-1は幹細胞呼び寄せの重要な調節因子であるため、この効果は、注入された生体適合材料により、血管新生および心筋再生に関係する幹細胞を注入部位に引き寄せるシグナル伝達系が活性化されることを示唆している。処置された動物の梗塞した心筋における血管密度1mm2あたりの毛細管および細動脈の平均数±S.E.は対照動物よりも著しく大きかった231±13対180±16;p<0.02;図10。実施例4アルギン酸塩の注入による心筋梗塞のブタモデルの処置合計で18匹のブタが本研究に含まれた。周術期死亡率は27であった18匹中5匹。超音波心臓造影法研究および分析が、前壁MIを有する10匹のブタに対して行われた。5匹のブタがアルギン酸塩の注入により処置され、対照群n=5はPBSの注入を受けた。4匹のブタが後側部MIMR研究に付された。免疫組織化学LAD閉塞または回旋閉塞MR研究の8週間後、アルギン酸塩の注入を受けているブタでは、Ki67に対して反応性のモノクローナル抗体による免疫染色によって明らかにされるように、高頻度の内皮細胞図11Aおよび心筋細胞図11BがDNA活性を伴って明らかにされた。対照的に、生理的食塩水を受けている動物では、繊維芽細胞の形態学およびKi67との反応性を有する高頻度の細胞が梗塞域内にのみ認められた。これらの結果は、アルギン酸塩生体適合材料は、成体の心臓ではこの活性を通常の場合には有しない心筋細胞などの細胞において細胞増殖を誘導する能力を有することを示唆している。そのような現象は通常、心臓再生に関連する。実施例5超音波心臓造影法による機能的研究:逆転した心室リモデリングは虚血性僧帽弁学流MRを低下させる虚血性MRは、遅発性死亡率を2倍にする冠状動脈疾患の一般的な合併症である[Lamas、G.A.他1997、Circulation、96:827~833]。広範囲の証拠により、虚血性MRが、乳頭筋PMの位置をずらし、僧帽弁尖を先端で拘束し、これにより僧帽弁の閉鎖を制限する左心室のゆがみから生じることが示されている。しかしながら、虚血性MRのための治療は依然として問題である。僧帽弁輪の輪状形成術がバイパス手術時に適用されることが多いが、これは僧帽弁の輪状サイズを減少させ、しかし、拘束による虚血性LVゆがみのより広い問題には直接的には対処していない。従って、その利益は、特にLVリモデリングが手術後も進行し続けているときには、不完全である。不確かな利益、ならびに心房切開および心肺バイパスに対する必要性は手術による修復を躊躇させ得る。外部からのデバイスを使用してPMを正常な位置に戻すことにより、虚血性MRを軽減することができる。本明細書中に示される予備実験では、架橋されたアルギン酸塩に基づく生体適合材料の注入は、LV機能を損なうことなく、PMを正常な位置に戻し、虚血性MRを軽減することが示される。そのうえ、この比較的簡便な技術は鼓動中の心臓において適用することができる図12。実施例6架橋されたアルギン酸塩溶液における骨格性筋芽細胞懸濁物の、ラットの正常な心臓への注入アルギン酸塩生体適合材料を、血管形成を促進させ、細胞移植物の保持および生存を改善するために心臓の筋肉に注入した。本実施例は、アルギン酸塩生体適合材料の注入が、同時注入された細胞例えば、骨格性筋芽細胞などの長期間の保持のために好都合であり得ることを示す。Sprague-Dawley新生児ラットの後肢筋肉に由来する筋芽細胞を、以前に記載された手法[Rosenblatt,J.D.1995、InVitroCellDev.Biol.Anim.、31:773~779]に従って単離し、精製した。集団内の筋芽細胞の割合を確認するために、培養された細胞を、筋芽細胞を染色するデスミンSigmaにより染色した図13A。注入可能なアルギン酸塩溶液を本明細書中上記に記載されるように調製した。オスSprague-Dawleyラット250gまでを40mg/kgのケタミンおよび10mg/kgのキシラジンの組合せで麻酔し、ラットは挿管され、機械的に通気された。胸部を左開胸術によって開き、心膜を除き、ラットを、左心室の自由壁筋肉への、27ゲージのニードルを使用する、100μL~200μLのアルギン酸塩系生体適合材料に懸濁された骨格性筋芽細胞の注入に供した。心臓筋肉内への注入の後、手術による切開を縫合して閉じた。注入後4週で、動物を過剰量のフェノバルビタールにより屠殺した。心臓を集め、組織学的検査および免疫組織学的検査のために処理した。隣接するブロックをパラフィンに包埋し、5μmの薄片に切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。連続した切片を、早性MHCに対する抗体Sigma、英国により免疫標識した。図13A~図13Cに示されるように、本発明の架橋されたアルギン酸塩溶液と一緒での筋芽細胞の注入は、赤血球の存在図13Bによって立証され得る機能的な新しい血管の形成によって示されるように、血管新生を誘導した。さらに、アルギン酸塩生体適合材料との同時注入は、移植された筋芽細胞の注入部位での保持を増大させた。筋芽細胞は、骨格性横紋を見せる多核性繊維に分化した。実施例7架橋されたアルギン酸塩生体適合材料の注入は梗塞した心筋への幹細胞の呼び寄せを高める無胸腺ヌードラットを心筋梗塞にさらし、その後、架橋されたアルギン酸塩生体適合材料を梗塞した組織に注入した。梗塞後1週目に、動物を、ヒト臍帯血由来のCD133の始原体細胞2~4x106個の細胞の静脈内注入により処置した。輸注後1週間で、心臓を集め、代表的な切片を固定処理または凍結切片化のいずれかに供した。受容心臓におけるヒトドナー細胞の存在を、HLA-DRについての免疫染色によって確認した。HLA免疫染色図14、褐色の色では、注入されたドナー細胞が、架橋されたアルギン酸塩を瘢痕組織において注入した部位に向かい、定着したことが明らかにされた。この実験は、架橋されたアルギン酸塩の損傷した組織への注入が幹細胞の呼び寄せを高めたことを明瞭に明らかにしている。このことは、注入部位におけるSDF-1の強い発現と一致している。実施例6および実施例7は、鼓動中の心臓に移植された細胞の保持に対する、架橋されたアルギン酸塩生体適合材料の好都合な効果を示している。対照的に、ポリマーの非存在下での細胞の注入は甚だしい細胞漏出をもたらし、従って、細胞のほとんどが注入部位に保持されず、その一方で同時に、高い割合の細胞死が認められる。"