標的核酸分子を捕捉し配列決定する方法であって、a個体支持体を、ハイブリダイズ条件下で標的核酸分子を含んでなる核酸の混合物に曝露し、ここで標的核酸分子はプライミング能力のある構造で個体支持体に固定されたプライマーと特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、b個体支持体から非結合核酸および非特異的結合核酸を分離し、c個体支持体を重合条件下でポリメラーゼおよびヌクレオチドに曝露し、d標的核酸分子の核酸配列を、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を固定されたプライマーから検出することにより決定することを含む、方法。標的核酸分子がゲノムDNA領域に由来する、請求項1に記載の方法。標的核酸分子がエキソンをすべてまたは部分的に含む、請求項2に記載の方法。標的核酸分子がRNAであり、ポリメラーゼが逆転写酵素であり、プライマーが3’ポリT配列を含む請求項1に記載の方法。標的核酸分子がDNAであり、ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである請求項1に記載の方法。ヌクレオチドが末端のリン酸に標識されている請求項1に記載の方法。ポリメラーゼがFRETドナーで標識されており、ヌクレオチドがFRETアクセプターで標識されている請求項6に記載の方法。FRETドナーが蛍光ナノ粒子である請求項7に記載の方法。ゲノムDNA断片のメチル化状態を決定する方法であって、aゲノムDNA断片を個体支持体に固定し、b個体支持体に固定されたゲノムDNA断片の核酸配列を、固定されたゲノムDNA断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより決定し、c固定されたゲノムDNA断片を亜硫酸水素塩処理に供し、d固定された亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNA断片の核酸配列を、固定された亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNA断片を鋳型として使用するポリメラーゼによる核酸重合を検出することにより決定し、ebで決定された核酸配列をdで決定された配列と比較し、ここでゲノムDNA断片中のシトシン残基の変換は該残基が亜硫酸水素塩処理前はメチル化されていなかったことを示し、ゲノムDNA断片中のシトシン残基が変換されないことは該残基が亜硫酸水素塩処理前にメチル化されていたことを示す、方法。ゲノムDNA断片が個体支持体にアダプターによって固定される請求項9に記載の方法。アダプターがプライマー結合部位を含み、プライマー結合部位中のシトシンが保護される請求項10に記載の方法。bおよび/またはdのポリメラーゼが、プライマー結合部位にアニールされたプライマーから核酸鎖を重合する請求項11に記載の方法。bおよび/またはdの核酸重合が、標識ヌクレオチドの取り込みを検出することにより検出される請求項9に記載の方法。標識ヌクレオチドが末端のリン酸に標識されている請求項13に記載の方法。bおよび/またはdのポリメラーゼがFRETドナーで標識されており、ヌクレオチドがFRETアクセプターで標識されている請求項14に記載の方法。FRETドナーが蛍光ナノ粒子である請求項15に記載の方法。I定義亜硫酸水素塩処理は、核酸を亜硫酸水素イオン例えば亜硫酸水素マグネシウムや亜硫酸水素ナトリウムに未保護シトシンのウラシル変換に十分な濃度で曝露することを指す。亜硫酸水素塩処理はまた、核酸を、未保護シトシンをウラシルに変換するのに使用されうる他の試薬、例えば二亜硫酸塩および重亜硫酸塩などに適切な濃度で曝露することを指す。亜硫酸水素塩処理は一般に、核酸を亜硫酸水素イオンまたは他の試薬に曝露した後、例えばNaOHなどの塩基に曝露することを含む。シトシン残基の変換は、亜硫酸水素塩処理の結果としてシトシン残基がウラシル残基に変換することを指す。エキソンは、ゲノムのコード領域を指す。ハイブリダイズ条件は、相補的核酸鎖のハイブリダイゼーションを許容する条件を指す。核酸配列決定は、標的核酸分子の少なくとも1個のヌクレオチドのアイデンティティを決定することを指し、いくつかの実施態様では、標的核酸分子の複数のヌクレオチドのアイデンティティを決定することを指す。固定されたおよび固定するは、相補的塩基対形成以外の方法により、直接的または間接的に、核酸を個体支持体に付着させることを指す。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、ある特異的ハイブリダイゼーション複合体の核酸の二本鎖のうち少なくとも一方が個体支持体に固定されていれば、上述のように個体支持体に固定されているとみなされる。標識は、直接的または間接的に検出されうる任意の部分を指す。核酸は、任意長のヌクレオチドのポリマーを指す。ヌクレオチドは、伸長する核酸鎖にポリメラーゼによって取り込まれることができるヌクレオチドおよびそのアナログを指す。ヌクレオチドは、限定ではないが、一般にDNAに取り込まれる4種類のヌクレオチドアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン、一般にRNAに取り込まれる4種類のヌクレオチドアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル、イノシン酸などの修飾塩基を有するヌクレオチドおよび標識されるかまたはそれ以外の修飾されたヌクレオチドを含む。ポリメラーゼは、重合条件下で伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込むことができる、天然のまたは天然ではない酵素またはその酵素的活性断片を指し、限定ではないが、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。重合条件は、ポリメラーゼがヌクレオチドを核酸鎖に取り込むことを許容する条件を指す。プライマーは、ポリメラーゼによりヌクレオチドが付加されうる核酸を指す。付加されるは、ヌクレオチドがポリメラーゼによりプライマーに直接付加されることと、次いでヌクレオチドがプライマー由来の伸長する核酸鎖に付加されることを指す。プライミング能力のあるprimingcompetent構造は、プライマーが、ポリメラーゼがヌクレオチド付加に利用できる反応基を有することを指す。個体支持体は、任意の個体支持体を指す。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でおよび/またはストリンジェントな洗浄条件下で形成可能かまたは実質的に維持される特異的ハイブリダイゼーション複合体を指す。標的核酸分子は、対象となる任意の標的核酸分子を指す。鋳型は、ポリメラーゼが相補的核酸鎖を合成するのに使用できる、一本鎖の核酸か、または二本鎖の核酸の変性された領域を指す。II標的核酸分子の捕捉および配列決定一実施態様では、本発明は、個体支持体に固定された、例えばプライマーなどの相補的核酸を使用して、標的核酸分子を捕捉する方法に関する。ある実施態様では、次いで、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによるプライマーからの核酸重合を検出することにより、標的核酸分子の核酸配列が決定される。検出は、単分子レベルで発生し、リアルタイムまたはほぼリアルタイムである。標的核酸分子様々な実施態様では、標的核酸分子はDNAである。一実施態様では、標的核酸分子は、ヒトゲノムまたは他の任意の生物のゲノムなどのゲノムの任意の領域標的領域に相当しうる。標的領域は、1つまたは複数の複数メガベースの連続するブロック、1つまたは複数の染色体の全エキソンなどの複数のより小さい連続する領域または非連続の領域、またはSNPを含むことがわかっている部位などでありうる。標的領域を含むゲノムは部分的であっても完全であってもよい。ゲノムは、患者試料またはプールされた患者試料、セルラインまたはセル培地、生検材料、正常な組織試料または腫瘍や他の疾患の組織および当業者が認めうる他の生物学的供給源などの任意の生物学的供給源に由来しうる。一実施態様では、標的核酸を含むゲノムDNAは、例えば超音波処理または水力学的力により剪断され、一般に約200~600塩基対の断片にされ、標的核酸分子はこれらの断片またはその分画部分から捕捉される。別の実施態様では、標的核酸分子は、コード配列または非コード配列でありうる。このような一実施態様では、標的核酸分子はエキソンであるか、またはその一部分である。様々な実施態様では、標的核酸分子はRNAである。一実施態様では、標的核酸分子は、mRNA転写物であるか、またはその一部分である。このような一実施態様では、標的核酸分子は、mRNA転写物であるか、またはそのポリAテールを有する一部分である。ポリAテールの存在により、一般にプライマーの3’末端に十分な長さのポリT配列を含むプローブまたはプライマーにハイブリダイゼーションが可能になる。別の実施態様では、標的核酸分子は、例えば逆転写酵素などによりRNAから生じたcDNAである。捕捉様々な実施態様では、標的核酸分子は、例えばRNA、DNA例えばゲノムDNAまたはcDNAの分子などの核酸の混合物から捕捉される。一実施態様では、混合物中の核酸は、標的核酸分子の捕捉前に増幅される。これは、例えばユニバーサルなプライミング部位を含むアダプターを混合物中の核酸分子の末端にライゲートさせて得られ、末端はライゲーション前に随意に末端修復しうる。ユニバーサルプライマーは、混合物中の核酸増幅にこのように使用されうる。様々な実施態様では、標的核酸分子は、個体支持体に固定された相補的核酸を使用して捕捉される。相補的核酸は、標的核酸分子に対し完全に相補的である必要はなく、標的核酸分子と相補的核酸分子が特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成可能である限りミスマッチを含有してよい。一実施態様において、相補的核酸はプライマーである。このような一実施態様では、プライマーは、プライミング能力がある構造で個体支持体に固定される。例えば、3’OHを有するプライマーは個体支持体に固定されており、3’OHはポリメラーゼがプライマーの3’末端にヌクレオチドを付加するのに利用できる。これは、プライマーにプライミング能力がある限り、例えばプライマーをその5’末端で、またはプライマーの内部領域で個体支持体に固定することで得られうる。プライマーは、標的核酸分子と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成可能である限り、任意長でよく、ある実施態様では、プライマー長は、少なくとも10、15、20、25、50、75、100、200、300、400または500塩基対である。当分野は、核酸を個体支持体に固定する方法に通じている。例えば、上記提供された相補的核酸などの核酸は、共有結合または非共有結合などで個体支持体に固定されうる。適切な化学的リンカーまたは他の結合法は、当業者には公知である。例えば、一実施態様では、固定される核酸はビオチン化され例えば、1つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドを含む、個体支持体は、その表面にストレプトアビジンを有し、核酸のビオチン部分がストレプトアビジンに結合して核酸を固定する。別の実施態様では、上記の実施態様で提供された固定処理は、核酸を個体支持体に合成して得られる。例えば、プライマーは、個体支持体に対し遠位のプライマー末端に利用可能な3’OHを残して、ヌクレオチドを5’から3’の方向に重合させることにより個体支持体に合成されうる。高密度マイクロアレイなどの、オリゴヌクレオチドを個体支持体に5’から3’方向に合成する化学的方法は、当分野では公知であり、本明細書に記載の目的に使用されうる。その全体を本明細書に引用として組み込まれるAlbertらのLightdirected5’→3’synthesisofcomplexoligonucleotidemicroarraysNucleicAcidsRes31e35を参照されたい。様々な実施態様では、個体支持体は、核酸が固定されうる任意の基材substrateでよい。このような基材は、限定ではないが、ガラス例えば顕微鏡ガラススライド、金属、セラミック、高分子ビーズおよび他の基材を含む。ある実施態様では、個体支持体は、例えばマイクロアレイなどのアレイの形態でよい。ある実施態様では、核酸は例えばビーズなどの個体支持体に固定されてから捕捉されるか、または例えばガラススライドまたはマイクロアレイなどの別の個体支持体に固定されてよい。ある実施態様では、相補的核酸が固定された個体支持体は、標的核酸分子を含む核酸の混合物にハイブリダイズ条件下で曝露される。標的核酸分子はこのようにして相補的核酸と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。別の実施態様では、個体支持体は非結合核酸および非特異的結合核酸を除去するために洗浄され、これにより特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有される標的核酸分子を混合物中の他の核酸から分離する。ある実施態様では、個体支持体を核酸混合物に曝露することおよび/または個体支持体を洗浄することは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下および/またはストリンジェントな洗浄条件下でそれぞれ行われる。本明細書では、ハイブリダイゼーションは相補的核酸鎖の対形成を指す。ハイブリダイゼーションとその強度すなわち核酸鎖間の会合強度は、核酸間の相補性の程度、条件のストリンジェンシー、ハイブリダイゼーション複合体のTmおよび核酸のG:C比率といった要因の影響を受ける。本発明は特定のハイブリダイゼーション条件の組に限定されるものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が使用されうる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ルーチンな方法を使用して当業者が経験的に決定してよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、配列に依存すると同時に塩濃度および有機溶媒の存在などの環境的要因に依存する。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびpHで、特異的核酸配列の熱融解点Tmよりも約5°Cから20°C低く選択される。ある実施態様では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、相補的核酸に結合する特異的核酸の熱融解点よりも約5°Cから10°C低い。Tmとは、核酸例えば標的核酸分子の50が完全適合するプライマーに規定のイオン強度およびpHでハイブリダイズする温度である。同様に、ストリンジェントな洗浄条件は、ルーチンな方法を使用して当業者が経験的に決定してよい。例えば、ストリンジェントな洗浄条件は、例えばアレイなどの個体支持体に固定された特異的ハイブリダイゼーション複合体から非特異的に結合した核酸を確実に分離しうる条件である。一実施態様では、アレイは、ハイブリダイゼーション条件例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に曝露された後、順次低濃度となる塩を含むバッファーおよび/または高濃度の洗浄剤および/または上昇する温度で、特異的ハイブリダイゼーション対非特異的ハイブリダイゼーションのシグナル対ノイズ比率が、特異的ハイブリダイゼーション、例えば完全にまたは実質的に完全な相補性を共有する核酸鎖間のハイブリダイゼーションを容易に検出できるほど高くなるまで洗浄される。ある実施態様では、ストリンジェントな洗浄条件は、約30°C、37°C、42°C、45°C、50°Cまたは55°Cの温度を含む。ある実施態様では、ストリンジェントな洗浄条件の塩濃度は、≦1M、≦500mM、≦250mM、≦100mM、≦50mMまたは≦25mMを含むが、≧10mMは含まない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、50ホルムアミド、5×SSC0.75MNaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウムpH6.8、0.1ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト液、超音波処理したサケ精子DNA50μg/ml、0.1SDSおよび10デキストラン硫酸中42°Cである。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、0.1×SSCEDTAを含有中55°Cである。配列決定標的核酸分子特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有されるは、混合物の他の核酸から分離された後、配列決定されうる。様々な実施態様では、この工程は一般に再配列決定と称され、リファレンスゲノムからの標的領域の配列は既知である。再配列決定の現行法では、標的核酸分子を増幅させた後、特異的ハイブリダイゼーション複合体から溶出させることが必要であり、増幅された標的核酸分子は次いで次世代配列決定技術例えばパラレルで高スループットの配列決定ができる配列決定プラットフォームまたは再配列決定アレイ核酸の個々のセグメントにおける変異の有無を特異的に検出するプローブを含むマイクロアレイを使用して配列が決定される。溶出工程および増幅工程の要件は時間とリソースを消費し、試料の欠失または標的核酸分子群内の個別の標的核酸分子のバイアス表示のおそれがある。したがって、様々な実施態様では、特異的ハイブリダイゼーション複合体から標的核酸分子を溶出させることなく標的核酸分子の再配列決定を行う。これは、一実施態様では、特異的ハイブリダイゼーション複合体に含有される相補的核酸が、プライミング能力のある構造で個体支持体に固定されたプライマーである場合に達成される。例えば、プライマーは、標的核酸分子の特定領域に、当該核酸分子の残りの部分は一本鎖の形態で、ハイブリダイズされうる。したがって、ポリメラーゼは、標的核酸分子の一本鎖のハイブリダイズされていない部分を鋳型として使用し、プライマーの利用可能な3’OHにヌクレオチドを付加することが可能になる。ポリメラーゼにより合成された核酸鎖は、標的核酸分子の配列を決定するのに使用される。したがって、特異的ハイブリダイゼーション複合体がプライマーを通じて固定される個体支持体は、重合反応混合物に曝露されうる。一実施態様では、重合反応混合物は、ポリメラーゼとヌクレオチドを含む。ポリメラーゼはDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素でよい。標的核酸分子がRNAである場合、ポリメラーゼは逆転写酵素でよい。標的核酸分子がDNAである別の実施態様では、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。ある例示的DNAポリメラーゼは、限定ではないが、細菌性DNAポリメラーゼ例えばE.coliDNA、polI、II、III、IVおよびVならびにDNApolIのKlenow断片、ウイルス性DNAポリメラーゼ例えばT4およびT7DNAポリメラーゼ、古細菌性DNAポリメラーゼ例えばテルムスアクアティクスTaqDNAポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサスPfuDNAポリメラーゼ、ディープベントDeepVentDNAポリメラーゼNewEnglandBioLabs、真核生物DNAポリメラーゼおよびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。ある例示的RNAポリメラーゼは、限定ではないが、T7、T3およびSP6RNAポリメラーゼならびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。ある例示的逆転写酵素は、限定ではないが、HIV、MMLVおよびAMVからの逆転写酵素ならびにスーパースクリプトInvitrogenCarlsbadCAなどの市販の逆転写酵素などを含む。ある実施態様では、重合反応混合物中のヌクレオチドおよび/またはポリメラーゼは標識される。一実施態様では、1、2、3または4種類のヌクレオチドが区別して標識される。このような一実施態様では、4種類のヌクレオチドが異なる4つの標識で標識される。例えば、dNTPの場合、アデニンまたはその機能的に同等のアナログ、グアニンまたはその機能的に同等のアナログ、シトシンまたはその機能的に同等のアナログおよびチミンまたはその機能的に同等のアナログはそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。同様に、rNTPの場合、アデニンまたはその機能的に同等のアナログ、グアニンまたはその機能的に同等のアナログ、シトシンまたはその機能的に同等のアナログおよびウラシルまたはその機能的に同等のアナログはそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。適切な標識は、限定ではないが、発光性の、光ルミネセンスの、エレクトロルミネセンスの、バイオルミネセンスの、化学ルミネセンスの、蛍光のおよび/またはリン光性の標識を含む。蛍光の標識は、限定ではないが、キサンチン染料、フルオレセイン、シアニン、ローダミン、クマリン、アクリジン、テキサスレッド染料、BODIPY、ALEXA、GFPおよびそれらの変更を含む。標識は、ヌクレオチドに直接付着させるか、または適切なリンカーを介して付着させてよい。標識は、ポリメラーゼが伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込む能力に有意に干渉しない、任意の位置に付着させてよい。一実施態様では、標識をヌクレオチドのリン酸、例えばヌクレオチドの末端のリン酸に付着させるので、ヌクレオチドのリン酸鎖および標識は、伸長する核酸鎖にヌクレオチドが取り込まれると切断される。標識ヌクレオチドおよび/またはポリメラーゼは、ポリメラーゼに合成された核酸鎖の検出を可能にしうる。ある実施態様では、標的核酸分子の配列は、ポリメラーゼによって伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドを、取り込まれる順に同定することで決定される。一実施態様は、伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドの標識を、ヌクレオチドが取り込まれる順に、直接的または間接的に検出することと、検出された標識をヌクレオチドのアイデンティティと相関させることで伸長する核酸鎖の配列を確認することを含む。このように、標的核酸分子または、プライマーが標的核酸分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらにハイブリダイズするかによって、その相補鎖の配列が決定される。このような実施態様では、標識の検出および基本的には標的核酸分子の配列決定は、リアルタイムかつ単分子レベルで行われる。上述し、また以下にも例示するが、ヌクレオチドが伸長する核酸鎖に取り込まれるのと同時に標識は除去されるので、得られる核酸鎖は標識されない。伸長する核酸鎖に取り込まれる標識ヌクレオチドを検出するいくつかの方法は、国際公開第2010/002939号に記載されている。このような方法は、分子同士が違いに十分近い距離にあるときのドナー分子FRETForster共鳴エネルギー転移ドナーとアクセプター分子FRETアクセプター間のForster共鳴エネルギー転移に依拠する。特定の実施態様では、ポリメラーゼは、FRETドナーフルオロフォアで標識され、ヌクレオチドはFRETアクセプターフルオロフォアで標識されている。ポリメラーゼがヌクレオチドを伸長する核酸鎖に取り込むと、FRETドナーフルオロフォアおよびFRETアクセプターフルオロフォアは互いに近づき、FRETドナーフルオロフォアからFRETアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの移動が可能になる。エネルギー移動により、FRETドナーフルオロフォアからの発光強度は低減し、FRETアクセプターフルオロフォアの発光強度は増加する。FRETアクセプターの発光スペクトルの検出は、取り込まれているヌクレオチドのアイデンティティを示す。一実施態様では、ポリメラーゼに付着したFRETドナーは、国際公開第2010/002939号に記載のように、蛍光ナノ粒子、例えばナノ結晶、より具体的には量子ドットである。FRETドナーは、ドナー発光が生成されるレーザーなどの励起源で照射しうる。別の実施態様では、異なるFRETアクセプターが1つまたは複数の種類のヌクレオチドそれぞれに、より具体的には3種類または4種類のヌクレオチドそれぞれに付着している。FRETアクセプターは、上述のどの蛍光標識であってもよい。標識は、限定ではないが、電荷結合素子および全反射顕微鏡などの任意適切な方法または装置を使用して検出されうる。標的核酸分子がポリRNAである実施態様では、標的核酸分子はポリT配列を含むプライマーを使用して捕捉される。cDNAは、逆転写酵素を使用してプライマーから合成されるが配列は決定されない。標的核酸分子は次いで、新たに合成されたcDNA鎖を残して個体支持体の特異的ハイブリダイゼーション複合体から変性され、プライマーを介して個体支持体に固定される。個体支持体は次いで、新たに合成されたcDNAにハイブリダイズする、ポリAを含むプライマーに曝露される。新たに合成されたcDNAは、上述のように、個体支持体を重合反応混合物に曝露することにより配列決定され、DNAポリメラーゼが核酸鎖をポリAプライマーから合成する。上記の方法を用いて、複数の標的核酸分子は、対象となる標的核酸分子のそれぞれに特異的なプライマーを選択し、例えばマイクロアレイなどの個体支持体の個々の区域にプライマーを固定することにより、分離され配列決定されうる。このようにして、対象となる標的核酸分子は、高スループットで分離され配列決定されうる。IIIメチル化状態の決定別の態様では、本発明は、ゲノムDNA断片内のCpGジヌクレオチドのメチル化状態をゲノムDNA断片を個体支持体に固定することにより決定し、固定されたゲノムDNA断片の核酸配列をゲノムDNA断片を鋳型として使用するポリメラーゼによるヌクレオチド重合の検出により決定し、固定されたゲノムDNA断片を新たに合成された核酸鎖から変性させ、個体支持体を亜硫酸水素塩に曝露し、ゲノムDNA断片の核酸配列を、標的核酸分子を鋳型として使用するポリメラーゼによるヌクレオチド重合の検出により決定する方法に関する。ゲノムDNA断片ゲノムDNA断片は、ヒトゲノムまたは他の任意の生物由来のゲノムなどの任意のゲノムから得られうる。ゲノムは部分的であっても完全であってもよい。ゲノムは、患者試料またはプールされた患者試料、セルラインまたはセル培地、生検材料、正常な組織試料または腫瘍や他の疾患の組織および当業者が認めうる他の生物学的供給源などの任意の生物学的供給源に由来しうる。一実施態様では、ゲノムDNAは、例えば超音波処理または水力学的力により剪断され、一般に約200~600塩基対の断片にされる。別の実施態様では、ゲノムDNAは酵素消化により断片化される。ゲノムDNA断片の固定ゲノムDNA断片は、様々な方法のうち任意の方法で個体支持体に固定されうる。ゲノムDNA断片は、共有結合または非共有結合などで個体支持体に直接的または間接的に固定されうる。適切な化学的リンカーまたは他の結合法が当業者には公知である。特定の実施態様では、ゲノムDNA断片は変性され、個体支持体に一本鎖の形態で固定される。ゲノムDNA断片、例えば一本鎖のゲノムDNA断片は、結合用の核酸またはアダプターを介して個体支持体に固定される。例えば、アダプターは個体支持体に固定された状態で、ゲノムDNA断片の一端または両端にライゲートされうる。アダプターは、例えばオリゴヌクレオチドなどの一本鎖でありうる。ある実施態様では、アダプターは最初にゲノムDNA断片にライゲートされ、次いで個体支持体に固定されるか、あるいは、アダプターは最初に個体支持体に固定され、次いでゲノム断片が個体支持体上のアダプターにライゲートされる。別の実施態様では、アダプターはビオチン化され例えば、1つまたは複数のビオチン化ヌクレオチドを含む、個体支持体は、その表面にストレプトアビジンを有し、ビオチン部分がストレプトアビジンに結合してアダプターを固定する。固定されたゲノムDNA断片の方向は、個体支持体から5’→3’でも、個体支持体から3’→5’でもよい。一実施態様では、固定されたゲノムDNA断片は、個体支持体から3’→5’に向けられる。別の実施態様では、固定されたゲノムDNA断片は一本鎖である。別の実施態様では、一本鎖ゲノム断片は、例えばオリゴヌクレオチドなどのアダプターを介して個体支持体に固定される。特定の実施態様では、ゲノムDNA断片は一本鎖であり、個体支持体に固定されたアダプターにライゲートされ、アダプターとゲノムDNA断片は、個体支持体から3’→5’に向けられる。配列決定固定されたゲノムDNA断片の配列は、個体支持体上で決定される。ある実施態様では、ゲノムDNA断片は、一本鎖の形態で個体支持体に固定されるか、または二本鎖の形態で個体支持体に固定され、その全体または一部は個体支持体に固定されたままの一本鎖に変換可能である。ある実施態様では、個体支持体は、ハイブリダイゼーション条件下でプライマーに曝露され、プライマーとゲノムDNA断片は特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ある別の実施態様では、個体支持体は、ハイブリダイゼーション条件下でプライマーに曝露され、プライマーとアダプターは特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成する。このような一実施態様では、アダプターはゲノムDNA断片がライゲートされるオリゴヌクレオチドであり、アダプターは個体支持体に固定される。前述の実施態様では、ゲノムDNA断片またはアダプター中のプライマーが結合する核酸配列中のシトシンは、亜硫酸水素塩処理の結果の脱アミノ化から、例えば保護基を有することにより保護される。保護基は例えばメチル基でよく、保護されるシトシンは5メチルシトシンでありうる。別の実施態様では、個体支持体は重合反応混合物に曝露される。一実施態様では、重合反応混合物はDNAポリメラーゼとヌクレオチドを含み、DNAポリメラーゼはゲノムDNA断片を鋳型として使用してプライマーから核酸鎖を合成する。このような一実施態様では、DNAポリメラーゼは、アダプターと特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成するプライマーから核酸鎖を合成し、アダプター随意とゲノムDNA断片は鋳型として使用される。例えば、アダプターとゲノムDNA断片が個体支持体から3’→5’方向に向いており、アダプターがゲノムDNA断片を個体支持体に結合させている場合、プライマーは個体支持体から5’→3’方向にアダプターにハイブリダイズしうるので、プライマーは、ポリメラーゼによるアダプターおよび随意でゲノムDNA断片を鋳型として使用する5’→3’方向の合成をプライミングする。別のこのような実施態様では、DNAポリメラーゼは、ゲノムDNA断片と特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成するプライマーから核酸鎖を合成し、ゲノムDNA断片は鋳型として使用される。適切なDNAポリメラーゼは、限定ではないが、細菌性DNAポリメラーゼ例えばE.coliDNA、polI、II、III、IVおよびVならびにDNApolIのKlenow断片、ウイルス性DNAポリメラーゼ例えばT4およびT7DNAポリメラーゼ、古細菌性DNAポリメラーゼ例えばテルムスアクアティクスTaqDNAポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサスPfuDNAポリメラーゼ、ディープベントDeepVentDNAポリメラーゼNewEnglandBioLabs、真核生物DNAポリメラーゼおよびこれらの操作または修飾した変異体などを含む。ある実施態様では、重合反応混合物中のヌクレオチドおよび/またはポリメラーゼは標識される。一実施態様では、1、2、3または4種類のヌクレオチドが区別して標識される。このような一実施態様では、4種類のヌクレオチドが異なる4つの標識で標識される。例えば、dNTPの場合、アデニンまたはその機能的に同等のアナログ、グアニンまたはその機能的に同等のアナログ、シトシンまたはその機能的に同等のアナログおよびチミンまたはその機能的に同等のアナログはそれぞれ、例えば異なるフルオロフォアなどの別々の標識で標識される。適切な標識は、限定ではないが、発光性の、光ルミネセンスの、エレクトロルミネセンスの、バイオルミネセンスの、化学ルミネセンスの、蛍光のおよび/またはリン光性の標識を含む。蛍光の標識は、限定ではないが、キサンチンダイ、フルオレセイン、シアニン、ローダミン、クマリン、アクリジン、テキサスレッドダイ、BODIPY、ALEXA、GFPおよびそれらの変更を含む。標識は、ヌクレオチドに直接付着させるか、または適切なリンカーを介して付着させてよい。標識は、ポリメラーゼが伸長する核酸鎖にヌクレオチドを取り込む能力に有意に干渉しない、任意の位置に付着させてよい。一実施態様では、標識をヌクレオチドのリン酸、例えばヌクレオチドの末端のリン酸に付着させるので、ヌクレオチドのリン酸鎖および標識は、伸長する核酸鎖にヌクレオチドが取り込まれると切断される。標識ヌクレオチドおよび/またはポリメラーゼは、ポリメラーゼに合成された核酸鎖の検出を可能にしうる。ある実施態様では、ゲノムDNA断片の配列は、ポリメラーゼによって伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドを、取り込まれる順に同定することで決定される。一実施態様は、伸長する核酸鎖に取り込まれるヌクレオチドの標識を、ヌクレオチドが取り込まれる順に、直接的または間接的に検出することと、検出された標識をヌクレオチドのアイデンティティと相関させることで伸長する核酸鎖の配列を確認することを含む。このように、ゲノムDNA断片または、ゲノムDNA断片のセンス鎖またはアンチセンス鎖のどちらが固定されるかによって、その相補鎖の配列が決定される。このような実施態様では、標識の検出および基本的にはゲノムDNA断片の配列決定は、リアルタイムかつ単分子レベルで行われる。上述し、また以下にも例示するが、ヌクレオチドが伸長する核酸鎖に取り込まれるのと同時に標識は除去されるので、新たに得られる核酸鎖は標識されない。伸長する核酸鎖に取り込まれる標識ヌクレオチドを検出するいくつかの方法は、国際公開第2010/002939号に記載されている。このような方法は、分子同士が違いに十分近い距離にあるときのドナー分子FRETForster共鳴エネルギー転移ドナーとアクセプター分子FRETアクセプター間のForster共鳴エネルギー転移に依拠する。特定の実施態様では、ポリメラーゼは、FRETドナーフルオロフォアで標識され、ヌクレオチドはFRETアクセプターフルオロフォアで標識されている。ポリメラーゼがヌクレオチドを伸長する核酸鎖に取り込むと、FRETドナーフルオロフォアおよびFRETアクセプターフルオロフォアは互いに近づき、FRETドナーフルオロフォアからFRETアクセプターフルオロフォアへのエネルギーの移動が可能になる。エネルギー移動により、FRETドナーフルオロフォアからの発光強度は低減し、FRETアクセプターフルオロフォアの発光強度は増加する。FRETアクセプターの発光スペクトルの検出は、取り込まれているヌクレオチドのアイデンティティを示す。一実施態様では、ポリメラーゼに付着したFRETドナーは、国際公開第2010/002939号に記載のように、蛍光ナノ粒子、例えばナノ結晶、より具体的には量子ドットである。FRETドナーは、ドナー発光が生成されるレーザーなどの励起源で照射しうる。別の実施態様では、異なるFRETアクセプターが1つまたは複数の種類のヌクレオチドそれぞれに、より具体的には3種類または4種類のヌクレオチドそれぞれに付着している。FRETアクセプターは、上述のどの蛍光標識であってもよい。標識は、限定ではないが、電荷結合素子および全反射顕微鏡などの任意適切な方法または装置を使用して検出しうる。上記の方法を用いて、複数のゲノムDNA断片は、例えばマイクロアレイなどの個体支持体の個々の区域にゲノムDNA断片を固定することにより、分離され配列決定されうる。このようにして、対象となるゲノムDNA断片は、高スループットで固定され配列決定されうる。亜硫酸水素塩処理および処理後の配列決定ゲノムDNA断片の配列決定に次いで、新たに合成されたDNA鎖とゲノムDNA断片からなる特異的ハイブリダイゼーション複合体は例えば熱または塩基の変性により変性され、新たに合成されたDNA鎖がゲノムDNA断片から分離される。個体支持体上のゲノムDNA断片は亜硫酸水素塩処理に供される。亜硫酸水素塩処理の実施法は当分野では公知であり、例えばHermanら1996のProcNatlAcadSciUSA9398219826に記載されている。ゲノムDNA断片の未保護非メチル化シトシンは、こうしてウラシルに変換される。ゲノムDNA断片は、次いで上述のような配列決定プロトコールに供される。得られた配列は亜硫酸水素塩処理前に得られた配列と比較され、配列決定プロトコールにより生成された新たに合成された鎖に、例えばグアニンの代わりにチミンが存在することに示されるように、ゲノムDNA断片中でウラシル残基に変換されたシトシン残基が同定される。変換された残基はゲノムDNA断片中の非メチル化状態を示すが、変換されなかった残基はゲノムDNA断片中の保護された、すなわちメチル化状態を示す。このようにして、ゲノムDNA断片のメチル化状態が決定される。aDNA分子の直接的捕捉およびリアルタイムの配列決定対象となる標的核酸分子を含むDNA例えば、対象となるタンパク質コード領域を有するゲノムDNAが、図1Bおよび図2Bに示すように適切な大きさに剪断される。対象となる領域の相補的オリゴヌクレオチドを収容する、例えばアレイ図1Aに示すまたはビーズ図2Aに示すなどの基材が使用される。対象となる領域は、例えばエキソンでありうる。剪断されたDNAからの該当領域を含む核酸が、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを通じて基材上で捕捉される。図1では、剪断されたDNAからの該当する領域を含む核酸が、オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによりアレイ上で捕捉されている。図2では、剪断されたDNAからの該当する領域を含む核酸が、ビーズ上の溶液に捕捉されている。非結合DNAおよび非特異的結合DNAは洗い流される。図2Cでは、ビーズは、例えば規則的アレイまたは不規則的アレイなどの別の基材に載置される。捕捉されたDNAは、図1Cおよび図2Cに示すように、直接的配列決定に供される。これは、リアルタイムのDNA合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを可能にするオリゴヌクレオチドの自由3’末端プライマーとして機能する、標識ポリメラーゼおよび標識dNTPを使用して得られる。bRNA分子の直接的捕捉およびリアルタイムの配列決定図3Bおよび4Bに示すように、ポリAテールを含むRNAが使用されうる。ポリdTを含むオリゴヌクレオチドを含む、例えばアレイ図3Aに示すまたはビーズ図4Aに示すなどの基材も使用される。RNAは、図3Cおよび図4Cに示すように、ポリAテールがポリdTを含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを通じて基材に捕捉される。非結合RNAおよび非特異的結合RNAは洗い流され、捕捉されたRNAは、ポリdTの自由3’末端と逆転写酵素を使用してcDNAに変換される。RNAからcDNAへの変換後、cDNA配列が決定される。cDNA配列決定の一実施態様では、オリゴヌクレオチドアダプターが新たに合成されたcDNAの自由3’末端にライゲートされ、次いでプライマーがそのアダプターにアニールされる。cDNAは、リアルタイムのDNA合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする当該プライマー、標識ポリメラーゼおよび標識dNTPを使用して、配列決定される。あるいは、捕捉されたRNAは、リアルタイムのcDNA合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする標識逆転写酵素および標識dNTPを使用して、直接的に配列決定されうる。図3C及び4Cを参照されたい。c同一鋳型の再帰的配列決定によるメチル化状態決定DNA例えばゲノムDNAのメチル化状態を決定するため、最初にDNAは適切な大きさに剪断され、好ましくは図5Bおよび図6Bに示すように一本鎖に変換される。メチル化オリゴヌクレオチドすなわちメチルシトシンを含むオリゴヌクレオチドを含む、例えばアレイ図5Aに示すまたはビーズ図6Aに示すなどの基材が使用される。剪断されたDNAは、図5Cおよび図6Cに示すように、メチル化オリゴヌクレオチドにライゲートされる。ライゲートされたDNAは、次いでリアルタイムのDNA合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にする、アレイまたはビーズ上のメチル化オリゴヌクレオチドの相補的プライマー、標識ポリメラーゼおよび標識dNTPを使用して、配列決定される。ライゲートされたDNAの配列決定後、図5Dおよび図6Dに示すように、新たに合成された鎖は除去され、もとのDNAはメチル化シトシンのウラシル変換が可能になるように亜硫酸水素塩で処理される。処理されたDNAは、リアルタイムのDNA合成の間、付加された塩基とポリメラーゼの直接的モニタリングを単分子レベルで可能にするプライマー、標識ポリメラーゼおよび標識dNTPを使用して、配列決定される。同一分子から得られた亜硫酸水素塩処理前と後の配列を比較することで、DNAのメチル化状態が決定できる。本明細書内で引用されるすべての特許および刊行物は参照により組み込まれる。