"コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1を作用させ、コンドロイチン硫酸のA構造を形成するステップA1と、前記A構造に、硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、コンドロイチン硫酸のE構造を形成するステップA2と、前記E構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、コンドロイチン硫酸のtriS構造を形成するステップA3と、を含む高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法。コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1および硫酸基転移酵素C6ST-1を作用させ、1分子のコンドロイチン中にA構造とC構造とを形成するステップB1と、前記C構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、D構造を形成するステップB2と、前記D構造の形成後、前記A構造に硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、E構造を形成するステップB3と、を含む高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法。前記硫酸基転移酵素C4ST-1および前記硫酸基転移酵素C6ST-1を同時に作用させることにより、前記A構造と前記C構造とを形成する請求項2に記載の合成方法。前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類を構成する複数の二糖単位のうち、少なくとも50が2硫酸化または3硫酸化されている請求項1~3のいずれか1項に記載の合成方法。前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、硫酸化度が100以上である請求項1~4のいずれか1項に記載の合成方法。コンドロイチンオリゴ糖にコンドロイチンポリメラーゼを作用させることにより、前記コンドロイチンを合成するステップをさらに含む請求項1~5のいずれか1項に記載の合成方法。請求項1~6のいずれか1項の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類。請求項7に記載の高硫酸化コンドロイチン硫酸類を含み、生理活性分子または細胞表面分子と、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸類とを特異的に相互作用させるための解析用試薬。前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、担体固定化用の末端修飾基が付加されている請求項8の解析用試薬。前記高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、蛍光検出用の末端修飾基が付加されている請求項8の解析用試薬。上述したように、D構造やE構造を有するコンドロイチン硫酸は、高い生理活性を有している。そのため、高頻度に硫酸化されたコンドロイチン硫酸が求められている。しかしながら、従来の硫酸化方法では、求められる程度に高度に硫酸化したコンドロイチン硫酸を合成することは困難であった。本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、高硫酸化されたコンドロイチン硫酸類を合成する技術を提供することにある。上記課題を解決するために、本発明のある態様の高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1を作用させ、コンドロイチン硫酸のA構造を形成するステップA1と、A構造に、硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、コンドロイチン硫酸のE構造を形成するステップA2と、E構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、コンドロイチン硫酸のtriS構造を形成するステップA3と、を含む。この態様によると、triS構造などの高硫酸化構造を高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を効率的に合成することができる。なお、本明細書中でコンドロイチン硫酸類というときには、コンドロイチン硫酸およびその誘導体を意味するものとする。また、本明細書中で高硫酸化とは、コンドロイチン硫酸類を構成する複数の二糖単位のうち少なくとも50が2硫酸化D構造、E構造、およびDE構造などまたは3硫酸化triS構造されていることを意味する。これに加えて、またはこれに代えて、高硫酸化とは、後述の硫酸化度が100以上であることを意味してもよい。本発明の別の態様は、高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法である。この高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1および硫酸基転移酵素C6ST-1を作用させ、1分子のコンドロイチン中にA構造とC構造とを形成するステップB1と、C構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、D構造を形成するステップB2と、D構造の形成後、A構造に硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、E構造を形成するステップB3と、を含む。この態様によると、DE構造などの高硫酸化構造を高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を効率的に合成することができる。本発明の別の態様は、高硫酸化コンドロイチン硫酸類である。この高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、上述したいずれかの態様の高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成方法により合成される。この態様によると、triS構造やDE構造などを高頻度に有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を提供することができる。本発明の別の態様は、解析用試薬である。この解析用試薬は、上述したいずれかの態様により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類を含み、生理活性分子または細胞表面分子と、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸類とを特異的に相互作用させる。この態様によると、triS構造やDE構造などを高頻度に有し、生理活性分子または細胞表面分子との相互作用解析に有用な解析用試薬を提供することができる。本発明によれば、高硫酸化されたコンドロイチン硫酸類を合成することができる。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。本発明者は、コンドロイチンCHまたはコンドロイチン硫酸CSに硫酸基転移酵素を組み合わせて段階的に反応させることで、特定の糖水酸基位置に高頻度で硫酸基が結合した高硫酸化コンドロイチン硫酸を合成できる合成方法を見出した。この合成方法により合成されたコンドロイチン硫酸は、天然には存在しない程度に高度な硫酸基修飾がなされている。また、合成されたコンドロイチン硫酸は、コンドロイチンまたはコンドロイチン硫酸を化学的に硫酸化したときのようなランダムな硫酸化は起こっていない。したがって、合成されるコンドロイチン硫酸の性質をある程度制御することが可能となる。図2Aは、第1の実施の形態に係る合成方法を示す図である。図2Bは、第2の実施の形態に係る合成方法を示す図である。図1、図2Aおよび図2Bに基づいて、高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成経路を説明する。第1の実施の形態第1の実施の形態の合成方法経路Aは、ステップA1~A3を含む。ステップA1は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1を作用させ、ほぼ完全にA構造[GlcA-GalNAc4S]を有するコンドロイチン硫酸のA構造CSAを形成するステップである。ステップA2は、ステップA1で形成されたA構造に、硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、大部分がE構造[GlcA-GalNAc4S,6S]であるコンドロイチン硫酸のE構造CSEを形成するステップである。ステップA3は、ステップA2で形成されたE構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、天然には微量にしか存在しないtriS構造[GlcA2S-GalNAc4S,6S]を含む高硫酸化CtriSを形成するステップである。経路Aにより、二糖単位が高頻度で2硫酸化E構造などまたは3硫酸化triS構造された高硫酸化コンドロイチン硫酸類が得られる。得られる高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、二糖単位のうち少なくとも50が2硫酸化E構造などまたは3硫酸化triS構造された構造を有する。また、後述の硫酸化度が100以上である構造を有している。第2の実施の形態第2の実施の形態の合成方法経路Bは、ステップB1~B3を含む。ステップB1は、コンドロイチンに、硫酸基転移酵素C4ST-1および硫酸基転移酵素C6ST-1を同時にまたは順不同で作用させ、A構造[GlcA-GalNAc4S]とC構造[GlcA-GalNAc6S]とが1分子中に混在したCSACを形成するステップである。ステップB2は、ステップB1で形成されたCSAC中のC構造に、硫酸基転移酵素USTを作用させ、C構造がD構造[GlcA2S-GalNAc6S]となったCSADを形成するステップである。ステップB3は、D構造の形成後、ステップB2で形成されたCSAD中のA構造に硫酸基転移酵素GalNAc4S-6STを作用させ、A構造の大部分をE構造に変換させ、DE構造に富む高硫酸化CSDEを形成するステップである。なお、図2Bでは、例示的に図の左側にCSA、右側にCSCが並んだCSACを示したが、CSAとCSCとの並びはこれに限られない。たとえば、CSCとCSAとの順序は逆であってもよい。また、CSAが連続する構造、またはCSCが連続する構造を有していてもよい。CSAD、CSDEについても同様である。ステップB1では、CHにC4ST-1とC6ST-1を同時に作用させることが好ましい。これにより、酵素量に応じた割合で1つの分子中にA構造とC構造とを有するCSACが1つのステップで合成できる。ここで同時に作用させるとは、C4ST-1とC6ST-1とを同一の系で、少なくとも一時的に反応がオーバーラップすればよいことを意味する。つまり、C4ST-1とC6ST-1との作用の開始時刻および終了時刻の少なくともいずれかは、異なっていてもよい。経路Bにより、二糖単位が高頻度で2硫酸化DE構造などされた高硫酸化コンドロイチン硫酸類が得られる。得られる高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、二糖単位のうち少なくとも50が2硫酸化DE構造などされた構造を有する。また、後述の硫酸化度が100以上である構造を有している。なお、第1の実施の形態および第2の実施の形態で用いる硫酸化反応前のコンドロイチン類は、市販の化学的脱硫酸化したコンドロイチンを原料として用いることが出来る。また、コンドロイチンオリゴ糖oligoCHともいうに大腸菌由来のコンドロイチンポリメラーゼK4CPを作用させて合成したコンドロイチンCH類を用いることもできるステップ0。この方法で得られたCH類は任意の糖鎖長のコンドロイチンを合成することが可能なのでより好ましい。ステップ0により合成されたCH類を用いることにより、経路Aおよび経路Bの高硫酸化コンドロイチン硫酸類の合成を効率的に行うことができる。ただし、既に合成されたCHを使用できるのであれば、ステップ0は省略できる。ステップ0で使用するコンドロイチンオリゴ糖は2糖以上であれば糖鎖長に制限はないが、4糖コンドロイチン四糖:CH4以上のコンドロイチンオリゴ糖であることが好ましく、6糖コンドロイチン六糖:CH6以上のコンドロイチンオリゴ糖であることがさらに好ましい。コンドロイチンオリゴ糖は、コンドロイチンを加水分解酵素で限定分解することにより得られる。また、コンドロイチンオリゴ糖には、還元末端が標識されていてもよい。このような標識として、たとえばヘキサメチレンジアミン基HMDA、ピリジルアミン基PA、およびベンジルアミド基ABが考えられる。まず、以下の実験例1~8について詳細に説明する前に、各実験例および各比較実験例に共通する測定方法、硫酸化度、CHの調製、および硫酸基転移酵素の調製について説明する。蛍光不飽和二糖分析方法各実験例で合成されたコンドロイチン硫酸類は、以下の方法で定量および組成分析した。合成コンドロイチン硫酸類をコンドロイチナーゼABCまたはコンドロイチナーゼACII生化学工業製で完全に分解し、その分解物をSenshuPAKDOCOSILカラム4.6×150mm、センシュウ科学社製で分離し、シアノアセトアミドを反応させるポストカラム微量蛍光二糖分析HPLCシステムToypdaH.etal.J.Biol.Chem.27520002269-2275を使用して分析した。濃度既知の不飽和二糖標準品生化学工業社製を同時に分析し、標準品との比較から、各二糖成分の組成比を算出し、二糖成分量の合計から元のコンドロイチン硫酸の含量を算出した。硫酸化度本明細書では、硫酸化の程度を表す指標として、硫酸化度を規定した。コンドロイチンの二糖単位では、GlcA残基2位、GalNAc残基4位および6位の3か所が、硫酸化されうる。硫酸化されていない二糖単位の割合をA、1硫酸化されている二糖単位の割合をB、2硫酸化されている二糖単位の割合をC、3硫酸化されている二糖単位をDただし、ABCD=100とすると、硫酸化度は以下の式1により定義される。硫酸化度=A×0B×1C×2D×3式1第1の実施の形態または第2の実施の形態に示した合成方法を用いた場合、硫酸化度は、100以上であることが好ましく、120以上であることがより好ましく、140以上であることがさらに好ましい。CH類の調製ステップ0高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するための基質として、還元末端が標識されていないコンドロイチン六糖CH6、還元末端ヘキサメチレンジアミンHMDA標識コンドロイチン六糖CH6-HMDA、還元末端ピリジルアミンPA基標識コンドロイチン六糖CH6-PA、還元末端ベンジルアミドAB基標識コンドロイチン六糖CH6-ABの4つをそれぞれ用いた。還元末端が標識されたoligoCHを原料として合成されたコンドロイチン硫酸類は、後述の用途のとおり、固定化や検出に使用できる点で有用である。なお、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するための基質として、ここではコンドロイチン六糖を示したが、糖鎖長が2糖以上のコンドロイチンオリゴ糖を使用できる点は、上述の通りである。CH6およびoligoCHは、天然コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したコンドロイチン生化学工業社製をヒツジ睾丸由来ヒアルロニダーゼシグマ社製で限定分解することにより合成したN.Sugiuraetal.Glycoconj.J.252008521-530。CH6-HMDAは、CH6に100倍量のHMDAと50倍量のNaBH3CNをpH5に調製した水溶液中で、70°Cで一晩19時間反応させ、ゲルろ過Superdex30カラム、GEヘルスケア社製することにより合成した。CH6-PAは、CH6に100倍量のアミノピリジンと15倍量のNaBH3CNをpH6.2に調製した水溶液中で、90°Cで一晩20時間反応させ、Superdex30カラムでゲルろ過精製することにより合成したN.Sugiuraetal.Glycoconj.J.252008521-530。CH6-ABは、CH6に100倍量の2-アミノベンズアミドと200倍量のNaBH3CNを30酢酸-DMSO混合液中で、65°Cで一晩16時間反応させ、Superdex30カラムでゲルろ過精製することにより合成したA.Kinoshitaetal.Anal.Biochem.2691999367-378。CH60.24mg、CH6-HMDA0.26mg、CH6-PA0.26mg、CH6-AB0.27mgをそれぞれ、大腸菌由来コンドロイチンポリメラーゼK4CP:T.Ninomiyaetal.J.Biol.Chem.277200221567-215750.5μg、UDP-GlcA6nmol、およびUDP-GalNAc6nmolを含む50mMTris-HCl,pH7.2,0.15MNaCl,0.2mMMnCl2水溶液3.2ml中にて、30°Cで48時間振盪させながら反応させた。反応後、100°Cで5分間加熱して酵素を失活させ、Superdex30カラムでゲルろ過精製して、CH類CHまたは還元末端標識CHが得られた。具体的には、CH10k、CH10k-HMDA、CH10k-PA、CH10k-ABが、それぞれ1.6mg、1.86mg、1.54mg、1.72mg得られた。得られたCH類の基本骨格は、分子量が約1万10k:糖鎖数約46個であった。コンドロイチンCHの分子量は、1万10kに限られず、約10001k~約100万1000kであってもよい。これらの分子量は、酵素量、基質量および反応時間などにより調整することができる。硫酸基転移酵素の調製ステップA1およびステップB1にて使用する硫酸基転移酵素であるC4ST1アクセッション番号:NM_018713、ステップB1にて使用するC6ST1アクセッション番号:NM_004273、ステップA3およびステップB2にて使用するUSTアクセッション番号:NM_005715、ステップA2およびステップB3にて使用するGalNAc4S-6STアクセッション番号:NM_015892を調製した。これらの酵素は、以下のとおり、動物細胞安定発現株の培養により発現精製したものを用いたが、他の発現系、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、無細胞系で発現および精製したものを用いてもよい。また、天然物から精製した酵素を用いてもよい。PCRの鋳型として、C4ST1用にpFLAG-CMV3-DEST-C4ST1、C6ST1用にpFLAG-CMV3-DEST-C6ST1、UST用にpFLAG-CMV3-DEST-UST、GalNAc4S-6ST用にpFLAG-CMV3-DEST-GalNAc4S-6STいずれも産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター提供をそれぞれ使用した。これらを鋳型として、FLAGタグを含む硫酸転移酵素遺伝子のDNAフラグメントをPCRで増幅した。増幅されたDNAフラグメントを、pIRESpuro発現ベクタークロンテック社製のMCS領域にライゲーションし、C4ST1用にpIRESpuro-FLAG-C4ST1、C6ST1用にpIRESpuro-FLAG-C6ST1、UST用にpIRESpuro-FLAG-UST、GalNAc4S-6ST用にpIRESpuro-FLAG-GalNAc4S-6STプラスミドをそれぞれ作製した。これらのプラスミドDNAをLipofectamin2000インビトロジェン社製を用いて動物細胞株HEK293Tにトランスフェクションした。継代細胞をピューロマイシンでセレクションして、各硫酸基転移酵素安定高発現株を樹立した。C4ST1、C6ST1、UST、GalNAc4S-6STの安定高発現HEK293T細胞株を、10ウシ胎児血清および5μg/mlピューロマイシン含有GlutaMax-DMEM液体培地インビトロジェン社製にて37°Cで7日間培養し、培養液上清を抗FLAG抗体固定化樹脂シグマ社製カラムに通し、10mMTris-HCl,150mMNaCl,5glycerol,0.01Tween20,pH7.4緩衝液で洗除後、10mMTris-HCl,150mMNaCl,20glycerol,200μg/mlFLAGpeptide,pH7.4緩衝液で溶出させて、精製酵素液とした。C4ST1は980pmol/min/ml,C6ST1は1580pmol/min/ml,USTは280pmol/min/ml,GalNAc4S-6STは950pmol/min/mlの酵素液がそれぞれ得られた。[実験例]以下、実験例1~4は経路A、実験例5~8は経路Bに関する実験例を示す。CH類として、実験例1、5ではCH10k-HMDAを、実験例2、6ではCH10kを、実験例3、7ではCSAC10k-PAを、実験例4、8ではCSAC10k-ABを、それぞれ用いた。酵素液は、上述の調製により得られた酵素液を用いた。[実験例1]ステップA1CH10k-HMDA0.5mgを、C4ST1溶液1.8ml、3’-ホスホアデニル5’-ホスホ硫酸PAPS、シグマ社製11.5μmolおよび2mMジチオスレイトールDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液3mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が4位硫酸化されたCSA10k-HMDAが0.34mg得られた。ステップA2得られたCSA10k-HMDA0.2mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.52ml、PAPS4.6μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、GalNAc4S-6ST0.26mlおよびPAPS2.3μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を92.5、4位硫酸化された二糖単位を7.5もつCSE10k-HMDAが0.22mg得られた。ステップA3得られたCSE10k-HMDA0.2mgを、UST溶液0.95ml、PAPS4.6μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1.6mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された三硫酸化二糖単位を18、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を75、4位硫酸化された二糖単位を8もつCtriS10k-HMDAが0.14mg得られた。実験例1では、二糖単位のうち約92が少なくとも2硫酸化された構造E構造、triS構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、0×08×175×218×3=約212であった。[実験例2]ステップA1CH10k0.4mgを、C4ST1溶液1.6ml、PAPS10μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液3mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が4位硫酸化されたCSA10kが0.36mg得られた。ステップA2得られたCSA10k0.12mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.36ml、PAPS3.2μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、GalNAc4S-6ST0.15mlおよびPAPS0.8μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を86、4位硫酸化された二糖単位を13もつCSE10kが0.13mg得られた。ステップA3得られたCSE10k0.005mgを、UST溶液0.05ml、PAPS0.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.15mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された三硫酸化二糖単位を51、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を39、4位硫酸化された二糖単位を8もつCtriS10kが0.003mg得られた。実験例2では、二糖単位のうち約90が少なくとも2硫酸化された構造E構造、triS構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、2×08×139×251×3=約239であった。[実験例3]ステップA1CH10k-PA0.1mgを、C4ST1溶液0.4ml、PAPS2.5μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が4位硫酸化されたCSA10k-PAが0.08mg得られた。ステップA2得られたCSA10k-PA0.03mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.09ml、PAPS0.8μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.25mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、GalNAc4S-6ST0.03mlおよびPAPS0.2μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を68、4位硫酸化された二糖単位を29もつCSE10k-PAが0.04mg得られた。ステップA3得られたCSE10k-PA0.005mgを、UST溶液0.8ml、PAPS0.8μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1.8mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された3硫酸化二糖単位を11、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を54、4位硫酸化された二糖単位を28もつCtriS10k-PAが0.003mg得られた。実験例3では、二糖単位のうち約65が少なくとも2硫酸化された構造E構造、triS構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、7×028×154×211×3=約169であった。[実験例4]ステップA1CH10k-AB0.1mgを、C4ST1溶液0.4ml、PAPS2.5μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.8mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が4位硫酸化されたCSA10k-ABが0.08mg得られた。ステップA2得られたCSA10k-AB0.02mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.06ml、PAPS0.52μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、GalNAc4S-6ST0.03mlおよびPAPS0.26μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を57、4位硫酸化された二糖単位を41もつCSE10k-ABが0.02mg得られた。ステップA3得られたCSE10k-AB0.001mgを、UST溶液0.15ml、PAPS0.9μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された3硫酸化二糖単位を8、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を48、4位硫酸化された二糖単位を40もつCtriS10k-ABが0.0008mg得られた。実験例4では、二糖単位のうち約56が少なくとも2硫酸化された構造E構造、triS構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、4×040×148×28×3=約160であった。[実験例5]ステップB1CH10k-HMDA0.3mgを、C4ST1溶液0.66ml、C6ST1溶液0.27ml、PAPS6.9μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位硫酸化が48、6位硫酸化が51のCSAC10k-HMDAが0.19mg得られた。ステップB2得られたCSAC10k-HMDA0.14mgを、UST溶液1.13ml、PAPS3.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、UST0.56mlおよびPAPS1.6μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を48、4位硫酸化された二糖単位を52もつCSAD10k-HMDAが0.14mg得られた。ステップB3得られたCSAD10k-HMDA0.1mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.18ml、PAPS2.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.3mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を20、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を48、4位硫酸化された二糖単位を32もつCSDE10k-HMDAが0.32mg得られた。実験例5では、二糖単位のうち約68が少なくとも2硫酸化された構造DE混在構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、0×032×168×20×3=約168であった。参考実験1CH10k-HMDA0.2mgを、C6ST1溶液0.6ml、PAPS4.6μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が6位硫酸化されたCSC10k-HMDAが0.14mg得られた。実験例5のステップB1にかえて実験例1のステップA1と本参考実験1の反応とを組み合わせることにより、CSAC10k-HMDAを合成してもよい。[実験例6]ステップB1CH10k0.2mgを、C4ST1溶液0.44ml、C6ST1溶液0.20ml、PAPS4.5μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位硫酸化が42、6位硫酸化が56のCSAC10kが0.14mg得られた。ステップB2得られたCSAC10k0.07mgを、UST溶液1.1ml、PAPS3.2μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、UST0.55mlおよびPAPS1.6μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を42、4位硫酸化された二糖単位を44、6位硫酸化された二糖単位を8もつCSAD10kが0.04mg得られた。ステップB3得られたCSAD10k0.006mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.03ml、PAPS0.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.15mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を19、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を44、4位硫酸化された二糖単位を26、6位硫酸化された二糖単位を8もつCSDE10kが0.007mg得られた。実験例6では、二糖単位のうち約63が少なくとも2硫酸化された構造DE混在構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、3×034×163×20×3=約160であった。参考実験2CH10k0.2mgを、C6ST1溶液0.5ml、PAPS4.2μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液2mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が6位硫酸化されたCSC10kが0.15mg得られた。実験例6のステップB1にかえて実験例2のステップA1と本参考実験2の反応とを組み合わせることにより、CSAC10kを合成してもよい。[実験例7]ステップB1CH10k-PA0.05mgを、C4ST1溶液0.11ml、C6ST1溶液0.05ml、PAPS1.1μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.5mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位硫酸化が38、6位硫酸化が61のCSAC10k-PAが0.14mg得られた。ステップB2得られたCSAC10k-PA0.02mgを、UST溶液0.3ml、PAPS0.9μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.5mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、UST0.15mlおよびPAPS0.45μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を30、4位硫酸化された二糖単位を38、6位硫酸化された二糖単位を31もつCSAD10k-PAが0.011mg得られた。ステップB3得られたCSAD10k-PA0.005mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.02ml、PAPS0.2μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.15mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を31、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を30、4位硫酸化された二糖単位を7、6位硫酸化された二糖単位を28もつCSDE10k-PAが0.005mg得られた。実験例7では、二糖単位のうち約61が少なくとも2硫酸化された構造DE混在構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、4×035×161×20×3=約157であった。参考実験3CH10k-PA0.1mgを、C6ST1溶液0.25ml、PAPS2.1μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が6位硫酸化されたCSC10k-PAが0.08mg得られた。実験例7のステップB1にかえて実験例3のステップA1と本参考実験3の反応とを組み合わせることにより、CSAC10k-PAを合成してもよい。[実験例8]ステップB1CH10k-AB0.1mgを、C4ST1溶液0.22ml、C6ST1溶液0.10ml、PAPS2.1μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.8mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位硫酸化が39、6位硫酸化が59のCSAC10k-ABが0.07mg得られた。ステップB2得られたCSAC10k-AB0.01mgを、UST溶液0.15ml、PAPS0.5μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.3mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、UST0.09mlおよびPAPS0.25μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を24、4位硫酸化された二糖単位を38、6位硫酸化された二糖単位を35もつCSAD10k-ABが0.008mg得られた。ステップB3得られたCSAD10k-AB0.001mgを、GalNAc4S-6ST溶液0.05ml、PAPS0.5μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.1mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、GalNAc残基の4位と6位が共に硫酸化された二糖単位を26、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位が共に硫酸化された二糖単位を24、4位硫酸化された二糖単位を12、6位硫酸化された二糖単位を34もつCSDE10k-ABが0.0007mg得られた。実験例8では、二糖単位のうち約50が少なくとも2硫酸化された構造DE混在構造などを有する高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することができた。この場合、硫酸化度は、4×046×150×20×3=約146であった。参考実験4CH10k-AB0.1mgを、C6ST1溶液0.25ml、PAPS2.1μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液0.8mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製することで、98以上のGalNAc残基が6位硫酸化されたCSC10k-ABが0.08mg得られた。実験例8のステップB1にかえて実験例4のステップA1と本参考実験4の反応とを組み合わせることにより、CSAC10k-ABを合成してもよい。[比較実験例]次に、図2に示した経路Aおよび経路Bの反応に用いた3つ以上の酵素を同時に反応させた比較実験例1および比較実験例2の結果を示す。比較実験例1経路Bに用いる4つの酵素であるC4ST1、C6ST1、UST、GalNAc4S-6STを同時に反応させた。具体的には、CH10k-HMDA0.1mgを、C4ST1溶液0.26ml、C6ST1溶液0.09ml、UST溶液0.76ml、GalNAc4S-6ST溶液0.18ml、PAPS2.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1.5mlに溶解させ、37°Cで48時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、4Sが66.3、6Sが12.0の二糖単位組成であり、2硫酸化二糖単位は合成できなかった。この場合、硫酸化度は、21.7×078.3×10×20×3=約78.3であった。比較実験例2経路Aに用いる3つの酵素であるC4ST1、UST、GalNAc4S-6STを同時に反応させた。具体的には、CH10k-HMDA0.1mgを、C4ST1溶液0.33ml、UST溶液0.76ml、GalNAc4S-6ST溶液0.18ml、PAPS2.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1.5mlに溶解させ、37°Cで48時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、4Sが30.5の二糖単位組成であり、2硫酸化二糖単位および3硫酸化二糖単位は合成できなかった。この場合、硫酸化度は、69.5×030.5×10×20×3=約30.5であった。CH10k-HMDAを基質として3つ以上の酵素を同時に反応させた場合、2硫酸化二糖単位および3硫酸化二糖単位は合成できなかった。したがって、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成するためには、図2の経路Aまたは経路Bの順序で反応を行う必要があることが明らかとなった。なお、経路BのステップB1においてのみ複数の酵素C4ST1とC6ST1を同時に反応させても合成効率を維持できる。次に、図2の経路BのステップB2において、CSAが存在しない状況下でCSCからCSDへの合成反応が進むかどうかを検討した結果を比較実験例3として示す。比較実験例3実験例5のステップB1で得られたCSC10k-HMDA0.1mgを、UST溶液0.76ml、PAPS2.3μmolおよび2mMDTTを含む50mMTriS-HCl,pH6.8緩衝液1.5mlに溶解させ、37°Cで24時間反応させた後、UST0.38mlおよびPAPS1.1μmolを追加し37°Cでさらに24時間反応させた。反応液をSuperdex30カラムでゲルろ過精製した。得られた硫酸化糖鎖は、GlcA残基の2位とGalNAc残基の6位がいずれも硫酸化された二糖単位D構造が4であり、6位硫酸化された二糖単位が94残ったものであった。CSAが存在しない状況下では、CSC10k-HMDAからCSD10k-HMDAへの合成効率は著しく低下した。このことから、CSD10k-HMDAを効率よく合成するためには、CSC構造に加えてCSA構造が同一分子中に存在する必要があることが明らかとなった。以上、説明したように、いずれの基質の場合も、経路AでCtriS、経路BでCSDEを、いずれも高収率で合成することができた。一方、これらの経路を経ない場合3つ以上の酵素を同時に反応させた場合には、高硫酸化コンドロイチン硫酸類を合成することはできなかった。なお、各反応に使用する基質の量を増やした場合、経路AのCtriS、経路BのCSDEとも、さらに合成効率を向上させることができると考えられる。用途本発明に係る合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、たとえば以下の用途に使用することができる。本発明の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、糖鎖と特異的に作用する生理活性分子との相互作用解析などの機能性研究試薬に利用することができる。本発明の合成方法実験例1により合成された還元末端HMDA修飾体は、活性エステルやエポキシなどで活性化したプレートやチップなどの担体に共有結合で固定化することができる。そのため、本発明の合成方法により合成された還元末端がHMDAで修飾された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、各種生理活性分子などや細胞表面分子との親和性解析分子間相互作用解析に有用である。本発明の合成方法により合成された高硫酸化コンドロイチン硫酸類は、還元末端をPAやABで修飾した場合PA修飾:実験例3、AB修飾:実験例4、蛍光で検出できる。そのため、本発明の合成方法により合成された還元末端がPAやABで修飾された高硫酸化コンドロイチン硫酸を、1pmol以下の極めて微量使用する場合にも、当該高硫酸化コンドロイチン硫酸をトレース可能である。以上、本発明を上述の実施の形態や実験例を参照して説明したが、本発明は上述の実施の形態や実験例に限定されるものではなく、実施の形態や実験例の構成を適宜組み合わせたものや置換したものについても本発明に含まれるものである。また、当業者の知識に基づいて実施の形態や実験例における組合せや工程の順番を適宜組み替えることや各種の設計変更等の変形を実施の形態に対して加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態や各実験例も本発明の範囲に含まれうる。"