ポリペプチドの精製の精製段階において少なくとも2度目の使用をされる再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物について、該ポリペプチドの該精製の該精製段階における分離能が低下しているか否かを決定する方法であって、a少なくとも2度目の使用をされる該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データを同定および決定する段階、b少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータの該イナートな変化の該実験データのフィッティングにより、式Iの関数のパラメータを決定する段階、c少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータの該イナートな変化の該実験データと、段階bにおいて決定されたパラメータを伴う式Iの関数との間の差を決定する段階、d段階cにおいて決定された差の最大値と最小値との間の差を算出し、かつ該差を正規化する段階、e段階dにおいて算出された差の絶対値が01より大きい場合に、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の分離能が低下していると決定する段階を含むことを特徴とし、ここで、式Iの関数が式Iであり、使用される溶媒により決定される絶対シグナル値Aおよびy0、基となるガウス分布関数の平均値および標準偏差xc、w、基となる指数減衰関数の時定数t0を伴い、かつ使用されるerf関数がとして定義される、方法。再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を用いる少なくとも1つのクロマトグラフィー段階を含む、クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製する方法であって、a少なくとも2度目の使用をされる該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データを同定および決定する段階、b少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータの該イナートな変化の該実験データのフィッティングにより、式Iの関数のパラメータを決定する段階、c少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータの該イナートな変化の該実験データと、段階bにおいて決定されたパラメータを伴う式Iの関数との間の差を決定する段階、d段階cにおいて決定された差の最大値と最小値との間の差を算出し、かつ該差を正規化する段階を含むことを特徴とし、ここで、式Iの関数が式Iであり、使用される溶媒により決定される絶対シグナル値Aおよびy0、基となるガウス分布関数の平均値および標準偏差xc、w、基となる指数減衰関数の時定数t0を伴い、かつ使用されるerf関数がとして定義され、かつ-段階dにおいて算出された差の絶対値が006以下である場合、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物をさらに使用する段階、または-段階dにおいて算出された差の絶対値が006より大きいが02より小さい場合、精製されたポリペプチドの追加的な特徴決定および/もしくは評価を行う段階、または-段階dにおいて算出された差の絶対値が02以上である場合、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を交換する段階を含む、方法。前記再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータの前記イナートな変化が、該移動相における、該再使用可能なカラム充填物と相互作用しない物質の濃度の変化によりもたらされる変化であることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。前記イナートな変化が、電気伝導度または280nmでの吸着における変化であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。前記再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータの前記イナートな変化が、変性剤を含有する溶液100から該変性剤を含有しない溶液100への変化であるか、またはその逆であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。前記変性剤が、水酸化ナトリウム、塩化グアニジウム、尿素、または有機溶媒から選択されることを特徴とする、請求項5記載の方法。前記イナートな変化がS字形変化であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。前記イナートな変化が経時的な変化であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。発明の詳細な説明本明細書において、関与する装置の寄与および効果から分離および独立して、充填されたクロマトグラフィー材料マトリクスのパラメータを決定する方法を報告する。これは、クロマトグラフィーでの分離に影響を及ぼす別々の物理的効果の区別および/または割当を可能にし、かつ、分析規模および産業規模などの規模とは独立した使用されるクロマトグラフィー装置の包括的な特徴決定も可能にすることが、見出されている。本明細書において報告する第1の局面は、ポリペプチドの精製の精製段階において少なくとも2度目の使用をされる再使用可能なカラムクロマトグラフィーカラム充填物について、同一のポリペプチドの同一の精製の同一の精製段階において1度目の使用をされた時の分離能と比較して、分離能が低下しているか否かを決定する方法であって、以下の段階を含む方法である:aイナートな変化を同定する段階、および、クロマトグラフィーカラム充填物の少なくとも1度目の使用の後に、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の、変性剤を含有する溶液100から該変性剤を含有しない溶液100へのイナートな変化またはその逆の、物理化学的パラメータの実験データを経時的に決定する段階、b段階aにおいて取得された少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データのフィッティングにより、式Iの関数のパラメータを決定する段階、c少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データと、段階bにおいて決定されたパラメータを伴う式Iの関数との間の差を決定する段階、d段階cにおいて決定された差の最大値と最小値との間の差を算出し、かつ該差を正規化する段階、e段階dにおいて算出された差の絶対値が006より大きい場合に、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の分離能が低下していると決定する段階、ここで、式Iの関数は式Iであり、それぞれシグナル変化を表すパラメータAおよびy0、それぞれ基となるガウス分布関数の平均値であるxc、および標準偏差であるw、ならびに、基となる指数減衰関数の時定数を表すパラメータt0を伴う。さらに、使用されるerf関数はとして定義される。本明細書において報告する方法で、充填されたクロマトグラフィー材料マトリクスの寄与、およびまた充填されたマトリクスの周囲の装置の寄与が、クロマトグラフィーカラム充填物およびカラムクロマトグラフィー分離の品質を評価するために使用され得ることが、見出されている。再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物という用語は、クロマトグラフィーカラム中に充填されるクロマトグラフィー材料であって、精製後において、改変されていない形態で、すなわち精製前と同一の特徴を有する形態で得られるクロマトグラフィー材料を意味する。精製段階とは、一般に、クロマトグラフィーカラム充填物のコンディショニング、粗製ポリペプチド溶液のアプライ、任意でクロマトグラフィー材料の洗浄、クロマトグラフィーカラム充填物からの精製されたポリペプチドの回収、およびクロマトグラフィーカラム充填物の再生を含むサイクルを意味する。本明細書において報告する局面の1つの態様において、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータのイナートな変化は、物理化学的パラメータの、経時的な変化、および/またはクロマトグラフィーカラム充填物のコンディショニング時における変化、および/またはクロマトグラフィーカラム充填物の再生時における変化である。上記で概要を述べた再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の定義は、精製のすべての個々の段階が完全に可逆的であることを要求する。しかしこれは現実的ではない。精製段階の間に、例えば充填されたクロマトグラフィー材料の完全に均質であるという性質が乱される可能性があり、かつ分離マトリクスを通した流れは損なわれ得る。1つの時点で、再使用可能なクロマトグラフィー材料の分離能および/または回収および/または充填品質は、副産物からのポリペプチドの精製を可能にするのにまだ十分であるが、該ポリペプチドの規格の要求を満たす純度において十分ではない。結果として、ポリペプチドのこのバッチはおそらく治療用物質として使用することができず、さらに処理するかまたは廃棄しなければならない。本明細書において報告する方法では、iカラム材料の完全性を決定するために粗製ポリペプチド溶液の分離に先立ってさらなるトレーサー化合物を使用および注入することを必要とせず、またはiiこの精製段階の歴史的データを必要とせずに、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の分離効率および/もしくは充填品質における低下を決定すること、ならびに/または当該カラム充填物からの回収における低下を決定することが可能である。従って、本発明による方法は、ポリペプチドのクロマトグラフィー精製段階の間に通常取得されるデータに基づいて、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の品質を決定することを可能にし、トレーサー物質の注入などの追加的な段階を不要にする。本明細書において報告する方法は、ポリペプチドの精製の間に再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータのイナートな変化が、クロマトグラフィー材料の分離能および/または充填品質を決定するために使用され得るという知見に基づく。そのようなイナートな変化とは、移動相に含まれる物質の濃度などの、少なくとも1つの、好ましくは1つの物理化学的パラメータの経時的な変化であるか、または精製段階における移動相自体の変化である。当該物質は、ポリペプチドの精製をもたらすクロマトグラフィー材料の機能とは相互に影響を及ぼさない。再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータの例示的なイナートな変化は、i変性条件から非変性条件への変化、またはii強アルカリ性条件から緩衝条件への変化、またはiii有機溶媒から水への変化である。1つの態様において、変化は、05~1M水酸化ナトリウム溶液100または5M塩化グアニジウム溶液100または8M尿素溶液100または有機溶媒100から、緩衝液100、または任意で最大1vvまでのトリフルオロ酢酸などのイオン化剤を含む水100への変化である。または逆に、変化は、i非変性条件から変性条件へ、またはii緩衝条件から強アルカリ性条件へ、またはiii水から有機溶媒への変化である。別の態様において、変化は、緩衝液100、または任意で最大1vvまでのトリフルオロ酢酸などのイオン化剤を含む水100から、05~1M水酸化ナトリウム溶液100へ、または5M塩化グアニジウム溶液100へ、または8M尿素溶液100もしくは有機溶媒100への変化である。分離能/充填品質における低下を示さないイナートな変化についてのクロマトグラムを図1に示し、分離能/充填品質における低下を示すイナートな変化についてのクロマトグラムを図4に示す。1つの態様において、少なくとも1つの物理化学的パラメータの経時的なイナートな変化は、クロマトグラフィーカラムから出る移動相の280nmでの吸収もしくは電気伝導度、またはクロマトグラフィーカラムから出る有機溶媒の濃度などの、精製中に記録される実験データにより決定される。移動相という用語は、カラムクロマトグラフィーにおいて使用され、かつ、クロマトグラフィーカラム充填物であるクロマトグラフィー材料こちらは固定相であるを取り囲む液体を意味する。再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の少なくとも2度目の使用におけるイナートな変化の間に記録された実験データと、式Iの関数にフィッティングさせた、該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の少なくとも2度目の使用におけるイナートな変化の間に記録されたデータとの比較から、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の分離能/充填品質を決定できることが見出された。1つの態様において、実験データは、この使用に先立って同一のポリペプチドの同一の精製の同一の精製段階において1回または複数回使用されたクロマトグラフィー材料で作製されたカラム充填物でのポリペプチドの少なくとも2度目の精製の間に記録される。式Iの関数は以下のとおりである:式I使用される溶媒により決定される絶対シグナル値Aおよびy0、基となるガウス分布関数の平均値および標準偏差xc、w、基となる指数減衰関数の時定数t0を伴う。さらに、使用されるerf関数はとして定義される。本明細書において報告する方法は、カラムの充填物についての品質特性、すなわち、充填されたマトリクスの滞留時間およびピーク広幅化に対応するxc、wの値をもたらす、指数関数的に改変された積分型ガウス分布を使用する。充填されたマトリクスにより決定されるパラメータに加えて、装置の特徴が指数関数の時定数t0により説明される。式Iの関数により、カラム入口における、ほぼ矩形のパルスに含有される化合物の完全に拡散が制御された分配機構からのずれを決定することができる。例えば、産業規模の装置を用いることにより、延長された混合時間による該装置の寄与が、矩形パルス型からの有意なずれをもたらし得るという事実のため、このことは、上述の指数関数的に改変された式を使用することによって説明されなければならない。分離能の決定、すなわち充填されたマトリクスの品質および装置の特徴の決定は、ポリペプチドの精製において同定されたイナートな変化の間に記録された実験データにフィッティングされた式Iの関数を、記録された実験データ自体と比較することにより達成され、望ましい特徴の精製されたポリペプチドを提供するためには、フィッティングさせていない実験データおよびフィッティングされた関数のイナートな変化の間の差は、所定の閾値を超えるべきではない。比較は、式Iの関数にフィッティングさせた実験データと、フィッティングされた式Iの関数との間の差を算出することにより行う。互いに比較可能な個々の精製の結果を作製するために、例えば、イナートな変化の間の物理化学的パラメータの実験データの最大値で値を割ることにより、結果または差を正規化する。1つの態様において、以下の式IIに示す正規化された差分関数を使用する。式II従って、1つの態様において、段階bは、少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データのフィッティングにより式Iの関数のパラメータを決定すること、およびそれと共に式IIの正規化された差分関数のパラメータを決定することを指し、段階cは、少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データと、段階bにおいて決定されたパラメータを伴う式IIの関数との間の差を決定することを指す。別の態様において、当該正規化は、イナートな変化の間の物理化学的パラメータの実験データの最大値で差を割ることで該差を正規化することにより、実験データと該実験データにフィッティングされた式Iの関数との間の決定された差の最大値と最小値との間の差を算出する段階において行われる。分離能および/または充填品質の低下を伴わないイナートな変化のクロマトグラムについての例示的な差分関数を図3に示し、分離能および/または充填品質の低下を伴うイナートな変化のクロマトグラムについての例示的な差分関数を図6に示す。絶対差分値の算出のために、実験データと、各実験データ点について算出されたフィッティングされた実験データとの間の差の全体的な最大値および全体的な最小値を決定する。この最大値と最小値との間の差を算出し、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物の充填品質を決定することができるパラメータを提供する。1つの態様において、算出された差分値を、算出に使用された実験データの最大値で割ることにより、差を正規化する。精製されるポリペプチドおよび達成されるその特徴に依存して、差分関数の最大値と最小値との間の絶対差についての閾値を与えることができ、各閾値の個々の超過により、行うべき行動が求められる。1つの態様において、正規化された差分関数の最大値と最小値との間の差を容認することができ、かつ算出された差の絶対値が02または01または006より小さい場合、充填物をさらに使用することができる。1つの態様において、正規化された差の最大値と最小値との間の差を容認することができるが、絶対値が006以上であるが02より小さいか、または01以上であるが02より小さいか、または01以上であるが015より小さい場合、精製されたポリペプチドの規格適合を保証するために追加的な分析および/または評価を行わなければならない。1つの態様において、正規化された差の最大値と最小値との間の差を容認することができず、かつ絶対値が02以上であるか、または015以上である場合、充填物を交換/更新しなければならない。従って、本明細書において報告する別の局面は、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を使用する少なくとも1つのクロマトグラフィー段階を含む、クロマトグラフィーによりポリペプチドを精製する方法であって、a該再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を通過する移動相の少なくとも1つの物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データを同定および決定する段階、b少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データのフィッティングにより、式Iの関数のパラメータを決定する段階、c少なくとも2度目の使用についての物理化学的パラメータのイナートな変化の実験データと、段階bにおいて決定されたパラメータを伴う式Iの関数との間の差を決定する段階、d段階cにおいて決定された差の最大値と最小値との間の差を算出し、かつ該差を正規化する段階を含むことを特徴とし、ここで、式Iの関数は式Iであり、使用される溶媒により決定される絶対シグナル値Aおよびy0、基となるガウス分布関数の平均値および標準偏差xc、w、基となる指数減衰関数の時定数t0を伴い、かつ使用されるerf関数はとして定義され、かつ-段階dにおいて算出された差の絶対値が006以下である場合、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物をさらに使用する段階、または-段階dにおいて算出された差の絶対値が006以上であるが02より小さい場合、精製されたポリペプチドの追加的な評価および/もしくは特徴決定を行う段階、または-段階dにおいて算出された差の絶対値が02以上である場合に、再使用可能なクロマトグラフィーカラム充填物を交換する段階を含む。ポリペプチドは、天然に生産されようとまたは合成的に生産されようと、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約20アミノ酸残基より小さいポリペプチドはペプチドと呼ばれ得るのに対して、2つまたはそれ以上のポリペプチドからなる分子、または100アミノ酸残基より大きい1つのポリペプチドを含む分子はタンパク質と呼ばれ得る。ポリペプチドはまた、炭水化物群、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含み得る。非アミノ酸成分は、ポリペプチドを発現する細胞により付加され得、かつ細胞のタイプと共に変化し得る。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸に関して定義される。炭化水素基などの付加物は一般には明記されないが、それにもかかわらず存在し得る。1つの態様において、ポリペプチドは組み換えで生産される。別の態様において、ポリペプチドはイムノグロブリンまたはイムノグロブリン結合体である。イムノグロブリンという用語は、イムノグロブリン遺伝子により実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているイムノグロブリン遺伝子は、様々な定常領域遺伝子および無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子を含む。イムノグロブリンは、例えば、Fv、Fab、およびF2ならびに一本鎖scFvまたはダイアボディを含む様々な形式で存在し得る例えば、HustonJSetalProcNatlAcadSciUSA8558795883;BirdREetalScience242423426;一般に、HoodLEetalImmunologyBenjaminNY2ndedition;およびHunkapillerTandHoodLENature3231516。イムノグロブリン結合体という用語は、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドに結合されたイムノグロブリン重鎖または軽鎖の少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。さらなるポリペプチドは、ホルモン、もしくは増殖受容体、もしくは抗融合性antifusogenicペプチド、もしくは補体因子などのような非イムノグロブリンペプチド、または、Fv、Fab、およびF2、ならびに一本鎖抗体scFvもしくはダイアボディなどのイムノグロブリン断片のいずれかである。ポリペプチドおよびイムノグロブリンを精製するための方法はよく確立され、かつ広範に用いられ、かつ単独または組み合わせのいずれかで使用される。そのような方法は、例えば、ある特定の態様において、微生物由来のタンパク質を用いる親和性クロマトグラフィー例えば、プロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー例えば、陽イオン交換カルボキシメチル樹脂、陰イオン交換アミノエチル樹脂、および混合様式交換クロマトグラフィー、チオフィリックthiophilic吸着例えば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドでの、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリックazaarenophilic樹脂、またはmアミノフェニルボロン酸、金属キレート親和性クロマトグラフィー例えば、NiおよびCu親和性材料での、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに調製用電気泳動法ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などであるVijayalakshmiMAApplBiochemBiotech7593102。1つの態様において、クロマトグラフィーカラム充填物は、親和性クロマトグラフィー材料、またはイオン交換クロマトグラフィー材料、またはチオフィリック吸着クロマトグラフィー材料、または疎水性相互作用クロマトグラフィー材料、または芳香族吸着クロマトグラフィー材料、または金属キレート親和性クロマトグラフィー材料、またはサイズ排除クロマトグラフィー材料より選択されるクロマトグラフィー材料である。別の態様において、本明細書において報告する方法は、クロマトグラフィー材料以外のプロセス機器の分離能が低下しているか否かを決定するために使用される。以下の実施例および図面は本発明の理解を助けるために提供されたものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において示される。本発明がなされた時にポリペプチドであるエリスロポエチンおよび抗HER2抗体が本発明者らの実験室において十分な量で利用可能であったため、本発明はこれらのポリペプチドで例証される。これは本発明の限定としてではなく、単に実施例として理解されるべきである。本発明の趣旨から逸脱することなく、示される手順において改変がなされ得ることが理解される。実施例1エリスロポエチンの発酵および精製エリスロポエチンは、例えば国際公開公報第0187329号に従って生産および精製することができる。精製は、いくつかのクロマトグラフィー段階を含む。これらのうちの1つがBlueSepharoseクロマトグラフィーである。BlueSepharoseは、表面にCibacron青色色素が共有結合で結合したセファロースビーズからなる。エリスロポエチンは大抵の非タンパク質性夾雑物よりも強くBlueSepharoseに結合するため、この段階においていくつかのタンパク質性不純物およびPVA、エリスロポエチンを濃縮することができる。BlueSepharoseカラムでの溶出は、塩濃度およびpHを上昇させることにより行う。カラムをBlueSepharoseで満たし、NaOHで再生させ、かつ平衡緩衝液塩化ナトリウム/カルシウムおよび酢酸ナトリウムで平衡化する。酸性化および濾過した発酵槽の上清をロードする。ロードが完了した後、より高い塩化ナトリウム濃度を含有する平衡緩衝液に類似した緩衝液でカラムを最初に洗浄し、続いてTRISベースの緩衝液で洗浄する。生成物をTRISベースの緩衝液で溶出し、マスター溶出プロファイルに従って単一画分において収集する。クロマトグラフィーサイクルの平衡化、分離、および再生段階の間に、カラムの出口での移動相の電気伝導度を標準的な電気伝導度計測装置で決定および記録する。抗HER2抗体の発酵および精製抗HER2抗体は、例えば米国特許第5821337号または米国特許第5677171号に従って、生産および精製することができる。採取した細胞培養液試料中の抗体を、特異的親和性クロマトグラフィー樹脂を用いて、捕捉および精製することができる。プロテインA樹脂MilliporeProsepvAHighCapacityを、抗体精製のための親和性樹脂として選択した。樹脂をカラムに充填した。樹脂を、260~560cm/時間の線流速で、緩衝液および採取した細胞培養液HCCFに曝露した。樹脂を、25mMトリス、25mMNaCl、5mMEDTA、pH71で平衡化した。各精製のために、樹脂に、1mLの樹脂当たり5~15mgの抗体をローディングした。ローディング後、樹脂を、25mMトリス、25mMNaCl、5mMEDTA、05MTMAC、pH5で洗浄し、次に、抗体を、01Mクエン酸、pH28を用いて溶出した。溶出物のプールは、カラム後にインラインで測定した280nmでのUV吸収に基づいた。精製した溶出プールを、1Mトリス緩衝液を用いてpH5~6にpH調整した。01M塩酸グアニジウムでの樹脂の再生後、同一のまたは同様の充填された樹脂を、その後の他のHCCF溶液の精製のために使用した。精製したプロテインAプール中の抗体濃度を、UV分光測定法を用いて280nmで測定した。精製したプロテインA溶出プールを、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し、分子量150kDaの無傷の抗体のパーセンテージを定量化した。実施例2カラム特性における変化本明細書において報告する方法を用いて、プロセスの間中、継続的にカラムをモニタリングすることができる。他のプロセスパラメータの変化とは独立して、微妙な変化が検出可能になる。図8および9において、カラム充填物における変化を、抗HER2抗体の精製に使用されるProsepAカラムの全寿命にわたって示す。再充填が必要になった場合において、充填されたベッドの品質に由来するパラメータにおける変化が明確に示されている図8を参照されたい。