"GSSGを検出するための方法であって、以下の工程、a.試料をスルフヒドリル修飾剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、b.前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程と、c.シグナルを検出する工程と、を含むことを特徴とする方法。前記シグナルが、定量化される、請求項1に記載の方法。GSH:GSSGの比率を決定するための方法であって、以下の工程、a.任意で試料を溶解剤と接触させる工程と、b.前記試料の一部を除去する工程と、c.残りの試料をスルフヒドリル修飾剤と接触させる工程と、d.前記残りの試料に、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、を添加して第1の溶液を形成する工程と、e.前記第1の溶液のシグナルを測定する工程と、f.前記除去した試料を、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させて第2の溶液を形成する工程と、g.前記第2の溶液のシグナルを測定する工程と、h.前記第2の溶液の前記シグナルを前記第1の溶液の前記シグナルと比較してGSH対GSSGの比率を決定する工程と、を含むことを特徴とする方法。試料中の酸化ストレスを決定する方法であって、以下の工程、a.前記試料をスルフヒドリル修飾剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、b.前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼと、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程と、c.前記シグナルを測定する工程と、を含むことを特徴とする方法。前記試料が、細胞、培地、血漿、血清、血液、又は組織抽出物を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記シグナルが、蛍光である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記シグナルが、発光である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記基質が、GSH及びグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼの存在下でルシフェリンに変換されるルシフェリン誘導体である、請求項1~5及び7のいずれか1項に記載の方法。前記基質が、式III、で示される化合物であり、式中、Xは、N又はOであり、R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、C1-6アルキル、CF3、ハロゲン、NO2、CO2Rであるか、又はいずれか2つの隣接するR1-R5が縮合環を形成することができるが、但し、R1、R3、又はR5のうちの少なくとも1つはNO2であって、3つ全てがNO2でなく、Rは、H又はC16アルキルである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記基質が、下式、で示される化合物であり、式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、Yは、O、OSO2、又はOPOORRは任意のアルキル又はアリールエステルであるであり、R1は、H、F、又はOHであり、R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、R3、R3’、R4は、独立して、NO2、CF3、又はHであり、Zは、CH又はNである、請求項9に記載の方法。前記基質は、下式、で示される化合物であり、式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、R1は、H、F、又はOHであり、R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、R3、R3’、又はR4は、独立して、NO2、CF3、又はHである、請求項9に記載の方法。前記縮合環が、ベンゾ、ナフト、又は複素環である、請求項9に記載の方法。前記基質が、次式、の化合物である、請求項1~5及び7~9のいずれか1項に記載の方法。前記ルシフェリンが、ルシフェラーゼによって検出される、請求項1~5及び7~13のいずれか1項に記載の方法。前記スルフヒドリル修飾剤が、NEMである、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。前記還元剤が、DTTである、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。少なくとも1つのステップが、自動化される、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。本質的にGSHを含まない、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ。本発明の方法は、試料中のGSSGの量を測定するために酵素反応を使用する。本発明の方法は、試料、例えば、細胞複数可を含有する試料を、溶解剤及び修飾剤、例えば、N‐エチルマレイミドNEM等のスルフヒドリルアルキル化剤と接触させることを含む。試料、例えば、溶解した細胞複数可は、次いで、基質、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼGST、及び過剰な還元剤と接触させられ、GSTと基質の相互作用によって生成されるシグナルが検出される。使用される特定の酵素反応は、還元型グルタチオンGSHに特異的であり、試料中に存在する可能性のある他のスルフヒドリルからのシグナルは発しない。酵素反応の特異性のために、はるかに過剰なアルキル化剤中にスルフヒドリル還元剤、例えばDTTを添加してアルキル化試薬を大いに圧倒することによって、活性なアルキル化試薬例えば、NEMを排除することができる。上記添加は、試料中のいずれのGSSGもGSHに還元し、過剰なアルキル化剤を不活性化してGSSGをGSHに還元し、これらの操作の各々のための別個のステップの必要性を排除するという付加的な利点も有する。また、本発明の方法において使用される濃度では、アルキル化剤例えば、NEMと還元剤との反応は本質的に瞬間的であるまた、還元剤は、それ自体では、又は存在する酵素を用いてもしくは用いずに使用されるアルキル化試薬との組み合わせにおいて、シグナルを発しないため、還元剤をGSH検出反応に単純に添加することができ、それによってGSH検出のための別個のステップを排除する。更に、還元剤は、他の反応構成成分とともに添加されたときに、プレルシフェリンによって発光シグナルを発する種を形成しない。よって、試料中に存在するスルフヒドリル部分の量を超えるようなアルキル化剤例えば、NEMの量を添加し、いずれの過剰なアルキル化剤も直ちに不活性化され、試料中のいずれのGSSGもGSHに還元されることを確実にするようにスルフヒドリル還元剤DTT等の量を添加し、GSSGのレベルを検出するためにGSH検出剤を添加することにより、本発明の方法を試料中のGSSGのレベルの測定のために使用することができる。本発明の方法の別の利点は、本方法がGSHに特異的なシグナルのみを生成するということであり、すなわち、本方法は、[エルマン試薬又は化学検出試薬、例えば、ブロモビマン等によってシグナルを発するもののようにClin.Chem.1988.vol.44,pp.825-832及びBiochemJ.2006.vol393,pp.575-582]試料中の全てのSH基からのシグナルを発しないということであり、したがって、例えば、試料の酸性化によるタンパク質変性後に、遠心分離によって沈殿したタンパク質を除去することにより、試料からタンパク質を除去する必要がないということである。上記特徴を組み合わせることにより、本発明の方法は、タンパク質沈殿又は過度の試料処理の必要なく、細胞抽出物、細胞培地、又は他の生物試料、例えば、血漿、血清、血液等の生理液中の非常に低レベルの酸化型グルタチオンの正確かつ迅速な測定を可能にする。本発明のステップの組み合わせは、非常に予測不可能である一方で、本方法が成功するように必要に応じて行われる多くの要因に依存する。例えば、1.還元型グルタチオンからのシグナル生成のために使用される試薬は、試料中に存在する他のSH基からの実質的なシグナルを生成してはならない。2.GSH検出反応の特異性も、試料中に存在するタンパク質上に存在するものを含む、反応中に存在する他のSH基の存在からはシグナルを生成しない。3.アルキル化剤と試料中に存在する全てのSH基との反応は、本質的に即時的であり、非常に短期間のうちに完了しなければならず、よって、試薬がGSHに到達することができるとすぐに、試料中の既存のGSHを完全に排除することができる。4.細胞からGSHを放出するために使用される物質は、アルキル化試薬を不活性化してはならないが、迅速かつ完全に細胞を溶解させることができなければならず、よって、試薬が添加されるとすぐに、試料からのGSHを完全に排除することができ、それによって試料中のあらゆるGSHのGSSGへの酸化を防止し、そうすることで試料中のGSSGのレベルを本質的に凍結させる。5.添加される還元剤の添加は、それが、還元剤が試料中のGSSGから形成する可能性のあるいずれかのGSHを修飾することができる前にアルキル化剤を最初に不活性化しなければならないか、又はGSH検出酵素この場合はGSTを不活性化させる。6.ルシフェラーゼに基づく検出システムの感度は、試料中に存在するGSSGの量から生成された非常に低レベルのルシフェリンを正確に検出することができなければならない。したがって、長年の間存在してきた問題を解決するためのこれら全ての要因の組み合わせは、新規であると同時に予期せぬものである。定義本明細書で使用される場合、以下の用語及び表現は、指示された意味を有する。本発明の化合物は、非対称に置換された炭素原子を含有し、光学活性形態又はラセミ形態に単離されてもよいことを認識されたい。ラセミ形態の分割による又は光学活性出発材料からの合成による等の光学活性形態の調製の仕方は、当該技術分野において周知である。ある構造の全てのキラル、ジアステレオ異性、ラセミ形態、及び全ての幾何異性体形態が、本発明の一部である。ラジカル、置換基、及び範囲について以下に列挙する特定の値は、例示のためであるに過ぎず、それらは、他の規定値又はラジカル及び置換基に関する規定範囲内の他の値を除外するものではない。本明細書で使用される場合、置換されたという用語は、置換されたを使用した表現において指示された基上の1つ以上例えば、1、2、3、4、又は5個、いくつかの実施形態において1、2、又は3個、他の実施形態において1又は2個の水素が、指示された基複数可から選択される基又は当業者に既知の好適な基で置換されることを意味することを意図するが、但し、指示された原子の通常の原子価を超えず、その置換によって安定な化合物がもたらされるものとする。好適な指示される基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、リン酸塩、硫酸塩、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシルアルキルアミン、及びシアノを含む。更に、好適な指示される基は、例えば、-X、-R、-O、-OR、-SR、-S、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC=OR、-C=OR、-C=ONRR、-S=O2O、-S=O2OH、-S=O2R、-OS=O2OR、-S=O2NR、-S=OR、-OP=OO2RR-P=OO2RR、-P=OO2、-P=OOH2、-C=OR、-C=OX、-CSR、-COOR、-COO、-CSOR、-COSR、-CSSR、-CONRR、-CSNRR、-CNRNRR式中、各Xは、独立してハロゲンハロ:F、Cl、Br、又はIであり、各Rは、独立してH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基、又はプロドラッグ部分であるを含んでもよい。当業者には容易に理解されるように、置換基がオキソ=O又はチオキソ=S等である場合、置換された原子上の2つの水素原子が置換される。本明細書で使用される場合アルキルという用語は、例えば、1~30個の炭素原子、しばしば1~12個、又は1~約6個の炭素原子を有する分岐鎖、非分岐鎖、又は環状の炭化水素を指す。その例は、限定されないが、メチル、エチル、1-プロピル、2-プロピル、1-ブチル、2-メチル-1-プロピル、2-ブチル、2-メチル-2-プロピルt-ブチル、1-ペンチル、2-ペンチル、3-ペンチル、2-メチル-2-ブチル、3-メチル-2-ブチル、3-メチル-1-ブチル、2-メチル-1-ブチル、1-ヘキシル、2-ヘキシル、3-ヘキシル、2-メチル-2-ペンチル、3-メチル-2-ペンチル、4-メチル-2-ペンチル、3-メチル-3-ペンチル、2-メチル-3-ペンチル、2,3-ジメチル-2-ブチル、3,3-ジメチル-2-ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等を含む。アルキルは、非置換であってもよいか又は置換されていてもよい。また、アルキルは、任意で、部分的に又は完全に不飽和であってもよい。このため、アルキル基の列挙は、アルケニル基及びアルキニル基の両方を含む。アルキルは、上に記載及び例示したような一価の炭化水素ラジカルであってもよいか、又は二価の炭化水素ラジカルすなわちアルキレンであってもよい。アルケニルという用語は、モノラジカルの分岐鎖又は非分岐鎖の部分不飽和炭化水素鎖すなわち、炭素‐炭素、sp2二重結合を指す。一実施形態において、アルケニル基は、2~10個の炭素原子、又は2~6個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルケニル基は、2~4個の炭素原子を有する。その例は、限定されないが、エチレン又はビニル、アリル、シクロペンテニル、5-ヘキセニル等を含む。アルケニルは、非置換であってもよいか又は置換されていてもよい。アルキニルという用語は、完全に不飽和である点すなわち、炭素-炭素、sp三重結合を有するモノラジカルの分枝鎖又は非分枝鎖炭化水素鎖を指す。一実施形態において、アルキニル基は、2~10個の炭素原子、又は2~6個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルキニル基は、2~4個の炭素原子を有することができる。この用語は、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、1-オクチニル等の基によって例示される。アルキニルは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。シクロアルキルという用語は、単環式環又は多縮合環を有する3~10個の炭素原子の環状アルキル基を指す。シクロアルキル環は、3~7個の炭素原子又は5~6個の炭素原子を有することができる。そのようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単環構造、又はアダマンタニル等の多環構造を含む。シクロアルキルは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。シクロアルキル基は、一価又は二価であってもよく、アルキル基について前述したように、任意で置換されてもよい。シクロアルキル基は、任意で1つ以上の不飽和の部位を含むことができ、例えば、シクロアルキル基は、例えば、シクロへキセン、1,3-シクロヘキサジエン、1,4-シクロヘキサジエン等の1つ以上の炭素‐炭素二重結合を含むことができる。アルコキシという用語は、基アルキル-O-アルキルは本明細書に定義されるものであるを指す。一実施形態において、アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、n-ブトキシ、tert-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、1,2-ジメチルブトキシ等を含む。アルコキシは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。本明細書で使用される場合、アリール又はArは、親芳香族環系の単一炭素原子から1つの水素原子を除去することに由来する芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、親環系の飽和炭素原子又は不飽和炭素原子に存在してもよい。アリール基は、6~30個の炭素原子を有することができる。他の実施形態において、アリール基は、6~12個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単環例えば、フェニル又は多縮合縮合環を有することができ、少なくとも1つの環は芳香族例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリルである。典型的なアリール基は、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等に由来するラジカルを含む。アリールは、アルキル基について前述したように、非置換であってもよいか、又は任意で置換されていてもよい。ハロという用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。同様に、ハロゲンという用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。ハロアルキルという用語は、同じか又は異なってもよい、本明細書に定義される1つ以上のハロ基によって置換された本明細書に定義されるアルキルを指す。一実施形態において、ハロアルキルは、1、2、3、4、又は5個のハロ基で置換されてもよい。別の実施形態において、ハロアルキルは、1、2、又は3個のハロ基で置換されてもよい。又はロアルキルという用語は、ペルフルオロ-アルキル基も含む。代表的なハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、3-フルオロドデシル、12,12,12-トリフルオロドデシル、2-ブロモオクチル、3-ブロモ-6-クロロヘプチル、1Η,1Η-ペルフルオロオクチル等を含む。ハロアルキルは、アルキル基について前述したように、任意で置換されていてもよい。ヘテロアリールという用語は、1個、2個、又は3個の芳香環を含有し、芳香環中に少なくとも1つの窒素、酸素、又は硫黄原子を含有し、置換されたの定義において前述したように、非置換であってもよいか、又は、例えば1つ以上の、特に1~3個の置換基で置換されていてもよい、単環式、二環式、又は三環式の環系として本明細書において定義される。典型的なヘテロアリール基は、1つ以上のヘテロ原子に加えて2~20個の炭素原子を含有する。他の実施形態において、ヘテロアリール基は、1つ以上のヘテロ原子に加えて3~15個の炭素原子を含有してもよいか、又は1つ以上のヘテロ原子に加えて4~10個の炭素原子を含有してもよい。特定の実施形態において、ヘテロアリール環は、炭素及びヘテロ原子の両方を含む全部で5~12個の環原子、又は5~10個の環原子、又は5~7個の環原子を含有する。ヘテロアリール基の例は、限定されないが、2H-ピロリル、3H-インドリル、4H-キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ[b]チエニル、ベンゾチアゾリル、β-カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ[b,d]フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、及びキサンテニルを含む。一実施形態において、ヘテロアリールという用語は、炭素と、非過酸化物酸素、硫黄、及びNZZは存在しないか、又はH、O、アルキル、アリール、もしくはC1-C6アルキルアリールであるから独立して選択される1、2、3、又は4個のヘテロ原子とを含有する5個あるいは6個の環原子を含有する単環式芳香環を意味する。別の実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロアリールに由来する約8~10個の環原子のオルト縮合二環式複素環、特に、ベンゾ誘導体、又はプロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレンジラジカルをそこに縮合させることによって誘導される誘導体を意味する。複素環という用語は、酸素、窒素、及び硫黄の群から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含有し、任意で、置換されたという用語の下に本明細書に定義される1つ以上の基で置換される、飽和又は部分的不飽和環系を指す。複素環は、1つ以上のヘテロ原子を含有する単環式、二環式又は三環式基であってもよい。いくつかの実施形態において、複素環は、全部で3~20個の環原子、又は全部で5~20個の環原子、又は5~12個の環原子を含有する。特定の実施形態において、複素環は、1~4個のヘテロ原子、又は1個、2個、3個、又は4個のヘテロ原子を含む。また、複素環基は、該環に結合したオキソ基=O又はチオキソ=S基を含有することができる。複素環基の非限定的な例は、1,3-ジヒドロベンゾフラン、1,3-ジオキソラン、1,4-ジオキサン、1,4-ジチアン、2H-ピラン、2-ピラゾリン、4H-ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、及びチオモルホリンを含む。複素環という用語は、限定ではなく例として、Paquette,LeoA.;PrinciplesofModernHeterocyclicChemistryW.A.Benjamin,NewYork,1968、特に、Chapters1,3,4,6,7,及び9、TheChemistryofHeterocyclicCompounds,ASeriesofMonographsJohnWileySons,NewYork,1950~現在、特にVolumes13,14,16,19,及び28、ならびにJ.Am.Chem.Soc.1960,82,5566に記載される複素環のモノラジカルを含むことができる。一実施形態において、複素環は、1つ以上例えば、1、2、3、又は4個の炭素原子がヘテロ原子例えば、O、N、又はSで置換されている、本明細書において定義される炭素環を含む。限定ではなく例示として、複素環の例はジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジルピペリジル、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジルピペリジル、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、6H-1,2,5-チアジアジニル、2H,6H-1,5,2-ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンチニル2H-ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、3H-インドリル、1H-インダゾリル、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、べンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、イサチノイル、及びビス-テトラヒドロフラニルを含む。限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの2、3、4、5、又は6位、ピリダジンの3、4、5、又は6位、ピリミジンの2、4、5、又は6位、ピラジンの2、3、5、又は6位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールの2、3、4、又は5位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの2、4、又は5位、イソオキサゾール、ピラゾール又はイソチアゾールの3、4、又は5位、アジリジンの2又は3位、アゼチジンの2、3、又は4位、キノリンの2、3、4、5、6、7、又は8、あるいはイソキノリンの1、3、4、5、6、7、又は8位に結合する。炭素結合複素環は、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、5-ピリジル、6-ピリジル、3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル、6-ピリダジニル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ピリミジニル、6-ピリミジニル、2-ピラジニル、3-ピラジニル、5-ピラジニル、6-ピラジニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル等を含む。限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、2-ピロリン、3-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、2-イミダゾリン、3-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、2-ピラゾリン、3-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、1H-インダゾールの1位、イソインドール又はイソインドリンの2位、モルホリンの4位、及びカルバゾール又はβ‐カルボリンの9位に結合されてもよい。一実施形態において、窒素結合複素環は、1-アジリジル、1-アゼテジル、1-ピロリル、1-イミダゾリル、1-ピラゾリル、及び1-ピペリジニルを含む。炭素環という用語は、単環として3~8個の炭素原子、二環として7~12個の炭素原子、及び多環として約30個までの炭素原子を有する飽和環、不飽和環、又は芳香環を指す。単環式炭素環は、典型的には3~6個の環原子、更により典型的には5又は6個の環原子を有する。二環式炭素環は、ビシクロ[4,5]、[5,5]、[5,6]もしくは[6,6]系として配置された7~12個の環原子、又はビシクロ[5,6]もしくは[6,6]系として配置された9又は10個の環原子を有する。炭素環の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、1-シクロペント-1-エニル、1-シクロペント-2-エニル、1-シクロペント-3-エニル、シクロヘキシル、1-シクロへクス-l-エニル、1-シクロへクス-2-エニル、1-シクロへクス-3-エニル、フェニル、スピリル、及びナフチルを含む。炭素環は、アルキル基について前述したように、任意で置換されていてもよい。アルカノイル又はアルキルカルボニルという用語は、-C=OR式中、Rは、以前に定義されたアルキル基であるを指す。アシルオキシ又はアルキルカルボキシという用語は、-O-C=OR式中、Rは、以前に定義されたアルキル基であるを指す。アシルオキシ基の例は、限定されないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、及びペンタノイルオキシを含む。アシルオキシ基を形成するために、上で定義されたいずれのアルキル基を含む。アルコキシカルボニルという用語は、-C=OOR又はCOOR式中、Rは、以前に定義されたアルキル基であるを指す。アミノという用語は、-NH2を指す。アミノ基は、置換されたという用語について本明細書に定義されるように、任意で置換されていてもよい。アルキルアミノという用語は、-NR2式中、少なくとも1つのRはアルキルであり、第2のRはアルキル又は水素であるを指す。アシルアミノという用語は、NRC=OR式中、Rは、独立して水素、アルキル、又はアリールであるを指す。中断されたという用語は、中断されたという用語を使用した表現において言及される特定の炭素鎖の2つの隣接する炭素原子及びそれらが付着している水素原子例えば、メチルCH3、メチレンCH2、又はメチンCH間に別の基が挿入されることを意味するが、但し、指示された原子の各々の通常の原子価を超えず、その中断によって安定な化合物がもたらされるものとする。炭素鎖を中断することができる好適な基は、例えば、1つ以上の、非過酸化物オキシ-O-、チオ-S-、イミノ-NH-、メチレンジオキシ-OCH2O-、カルボニル-C=O-、カルボキシ-C=OO-、カルボニルジオキ-OC=OO-、カルボキシレート-OC=O-、イミンC=NH、スルフィニルSO、及びスルホニルSO2を有するものを含む。アルキル基は、前述の好適な基のうちの1つ以上例えば、1、2、3、4、5、又は約6によって中断されてもよい。また、中断の部位は、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が結合している炭素原子との間であってもよい。ルシフェラーゼという用語は、別途指定のない限り、天然に発生するルシフェラーゼ、組換えルシフェラーゼ、又は変異体ルシフェラーゼを指す。天然に発生する場合、ルシフェラーゼは、当業者によって生物から容易に得ることができる。ルシフェラーゼが、天然に発生するルシフェラーゼであるか、又は組換えもしくは変異体ルシフェラーゼである場合、すなわち、ルシフェラーゼ-ルシフェリン反応において、天然に発生するルシフェラーゼの活性を保持するルシフェラーゼである場合、それは、ルシフェラーゼをコードする核酸を発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養物から容易に得ることができる。更に、組換え又は変異体ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いてインビトロの無細胞系から誘導することができる。ルシフェラーゼは、PromegaCorporation、Madison,Wis.から入手可能である。本明細書で使用される場合、フルオロフォアは、ある波長域でエネルギーを吸収することができ、その波長域以外の波長域ではエネルギーを放出することができる分子を含む。好適なフルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、又は任意の好適なキサンテン色素、レゾルフィン、もしくはクレシルバイオレットを含む。励起波長という用語は、フルオロフォアがエネルギーを吸収する波長の範囲を指す。発光波長という用語は、フルオロフォアがエネルギーを放出するか、又は蛍光を発する波長の範囲を指す。本明細書で使用される場合、生物発光アッセイ又は生物発光反応又は発光アッセイ又は発光反応は、非ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体との反応の生成物がルシフェラーゼのための基質である反応、又はルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体を有する非酵素反応の生成物がルシフェラーゼのための基質である反応、又はルシフェラーゼと、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体との反応が生物発光性である、すなわち、測定可能な量の光を生成する反応を含む。本明細書で使用される場合、生物発光又は発光は、光を発生する酵素と基質との反応の結果として生成される光である。そのような酵素生物発光酵素の例は、ホタルルシフェラーゼ、例えば、北米産ホタル又はペンシルバニアホタル、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、発光エビルシフェラーゼ、例えば、トゲオキヒオドシエビ、エクオリン発光タンパク質、オベリン発光タンパク質等を含む。ルシフェラーゼ反応混合物は、ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェラーゼ酵素に光シグナルを生成する材料とを含有する。発光シグナルを生成するために必要な材料、ならびに該必要な材料の特定の濃度及び/又は量は、使用されるルシフェラーゼ酵素、及び行われるルシフェラーゼに基づくアッセイの種類に応じて異なる。一般に、ホタルルシフェラーゼの場合、これらの材料は、ATP、マグネシウム塩塩化マグネシウム等、ホタルルシフェラーゼ酵素、及びルシフェリンがホタルルシフェラーゼのための基質として使用された場合に光を発生することができるルシフェリンを含み得る。反応を適切なpHで維持するための緩衝液;ルシフェラーゼの活性を維持するのに役立つPRIONEX又はウシ血清アルブミンBSA等の添加剤;還元剤;界面活性剤等を含む他の材料が溶液に添加されることが多い。本明細書で使用される場合、ルシフェリンの誘導体又はアミノルシフェリンの誘導体は、非ルシフェラーゼ酵素例えば、GSTのための基質であって、ルシフェラーゼのプロ基質である分子か、又は非ルシフェラーゼ酵素例えば、GSTのための基質であって、ルシフェラーゼのための基質である分子である。本発明の誘導体は、D-ルシフェリン又はアミノルシフェリン骨格の環のうちの1つ以上に結合する3つの環及び/又は置換基のうちの1つ以上に対する1つ以上の修飾を有する図1を参照。蛍光アッセイ又は蛍光反応は、非ルシフェラーゼのタンパク非分解性酵素GST等とフルオロフォアの誘導体との反応の生成物が蛍光性である反応を含む。シグナル生成部分又はレポーター部分は、フルオロフォア、又はルシフェラーゼのための基質、例えば、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジン、又は化学発光部分、例えば、アダマンチル1,2-ジオキセタンを含む。使用方法一態様において、本発明は、試料中のGSSGを検出する方法を提供する。別の態様において、本発明は、試料中のGSH対GSSGの比率を検出する方法を提供する。GSH対GSSGの比率は、しばしば細胞のレドックス状態をモニタリングするために使用されるため、本発明の方法は、細胞におけるレドックス状態を検出するために使用することができる。一般的に、本発明の方法は、試料を溶解剤及び修飾剤と接触させることを含む。例えば、試料は、溶解した細胞を含んでもよく、それは、次いで、基質、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼGST、及び過剰な還元剤と接触させられ、GSTと基質との相互作用によって生成されるシグナルが検出される。特定の実施形態において、シグナルは発光である。他の実施形態において、シグナルは蛍光である。基質が、ルシフェラーゼのための基質、例えば、ルシフェリン又はルシフェリンの誘導体である場合、ルシフェラーゼ反応混合物が添加され、発光が検出される。代替として、基質が、レポーター部分、例えば、フルオロフォアを含む場合、それは当業者に既知の適切な手段を使用して検出される。試薬は、逐次的に又は同時に添加されてもよい。例えば、溶解剤及びスルフヒドリル修飾剤が、逐次的に又は同時に添加されてもよい。試薬が同時に添加される場合、それらは単一の溶液又は複数の溶液中に存在してもよい。シグナルは、必要に応じて定量化されてもよい。シグナルは、標準曲線と比較することができる。シグナルの強度は、試料中のGSSG又はGSHの存在又は量の関数である。好適な溶解剤は、標準的な溶解緩衝液を含む。動物細胞の場合、TritonX-100もしくはTergitol等の0.1~1.0の非イオン界面活性剤、又はイオン界面活性剤、例えば、DTAB、を含む緩衝液が典型的には適当である。細菌、植物、真菌、又は酵母の細胞は、通常、溶解させるのがより困難である。界面活性剤、凍結解凍サイクル、低張緩衝液、超音波処理、キャビテーション、又はそれらの方法の組み合わせが用いられてもよい。好適なスルフヒドリル修飾剤は、N-エチルマレイミドNEM、4ビニルピリジン4-VP、及びヨードアセトアミド等のアルキル化剤を含む。本発明の方法において典型的に使用されるスルフヒドリル試薬の量は、予想される試料中の還元型グルタチオンのレベルよりも約2~10倍高くあるべきである。例えば、96ウェルプレート中の約1,000~20,000個の培養哺乳類細胞の処理には、50~250μΜNEM溶液の50μlの濃縮が必要である。好適な還元剤は、スルフヒドリル基を含む還元剤、例えば、ジチオトレイトールDTT、2-メルカプトエタノール、システイン、及びシステインアミンである。本発明の方法において典型的に使用されるスルフヒドリル試薬の量は、試料に添加されるアルキル化剤の濃度よりも約2~5倍高くあるべきである。例えば、96ウェル細胞培養プレート中の哺乳類細胞のウェルを処理するには、50μlの100~1,250μΜDTT溶液が必要である。全てのアルキル化剤又は還元剤が水溶液中で高度に安定しているわけではないことに留意されたい。例えば、NEMは、加水分解して、スルフヒドリル基をアルキル化しない生成物を生成することができる。よって、使用する直前に試薬を作製した場合に最良の結果が達成される。グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼGSTの好適な源は、本質的にグルタチオンを含まない酵素調製物、例えば、Promega社製グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼGST酵素カタログ番号V687を含む。本発明の方法を行う場合、本質的にグルタチオンを含まないGST酵素調製物を使用することが非常に重要である。好適には、それは、GSTサブユニット1モル当たり1モル未満のGSHが存在することを意味する。多くのGST酵素の源は、酵素を生成するために使用される精製技術の結果として、高レベルのグルタチオンを含有する。そのような調製物は、少数の哺乳類細胞から放出されるグルタチオンのレベルを測定するために使用されたときに、許容できないほど高いバックグラウンド値を得るのに十分なグルタチオンを含有することが多い。本発明の方法において、試料中に存在するグルタチオンから効果的にシグナルを生成するのに十分な量でGSTが添加される必要がある。例えば、100μlの反応物の場合、約1~10μgのGST酵素、より好ましくは2~4μgの酵素の添加が、シグナルを生成するために必要である。本発明は、任意の細胞、例えば、実験室で培養された細胞、又は動物から得られた細胞中の、GSSGの存在又は量を決定するために使用することができる。動物から得られた細胞は、組織、組織抽出物、組織溶解物、又はホモジネート等であってもよい。細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫、又は限定されないが、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、もしくはブタの細胞を含む哺乳類の細胞、あるいは原核細胞、あるいは2つ以上の異なる生物からの細胞、あるいはそれらの細胞溶解物又は上清であってもよい。細胞は、組換え技術によって遺伝子改変されていてもよい。特定の態様において、細胞は、動物、例えば、トランスジェニック動物中に、又は生理液、例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌等の中に存在してもよい。一実施形態において、本発明の方法は、インビトロで行われてもよい。別の実施形態において、本発明の方法は、インビボで行われてもよい。更に、本明細書に記載される生物発光アッセイのうちのいずれかのために、限定されないが、ルシフェラーゼの不活性化を阻害もしくは防止するか、又はさもなければ、発光シグナルを延長もしくは増強する試薬を含む他の試薬が反応混合物に添加されてもよい。基質は、ルシフェラーゼのためのプロ基質であるか、又はレポーター部分に連結された、非ルシフェラーゼ酵素例えばGSTのための基質を含む。レポーター部分は、蛍光部分、例えば、クマリン及びフルオレセイン、化学発光部分、又は視覚的手段によってもしくはその吸光度によって検出され得る色を生成する部分であってもよい。基質好適な基質は、限定されないが、下の式I、II、及びIIIの化合物を含む。式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、Yは、O、OSO2、又はOPOOR式中、Rは任意のアルキル又はアリールエステルであるであり、R1は、H、F、又はOHであり、R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、R3、R3’、R4は、独立して、NO2、CF3、又はHであり、Zは、CH又はNである。式中、nが0であって、XがSであるか、又はnが1であって、XがCHであり、R1は、H、F、又はOHであり、R2は、H、アルキル、アリール、CH2Ar、又はCH2CH2OHであり、R3、R3’、又はR4は、独立して、NO2、CF3、又はHである。式中、Xは、N又はOであり、R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、H、低級アルキルC1-C6、CF3、ハロゲン、NO2、CO2R式中、Rは、HもしくはC16アルキルであるであるか、又は任意の2つの隣接するR1-R5が縮合環例えば、ベンゾ、ナフト、複素環を形成することができるが、但し、R1、R3、又はR5のうちの少なくとも1つはNO2であり、3つ全てがNO2ではないものとする。更なる基質を図2A~D及び3に示す。本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。実施例16-2ニトロ-4-トリフルオロメチル-フェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-3の合成2-シアノ-6-2-ニトロ-4-トリフルオロメチル-フェノキシキノリンの合成DMSO30ml中の2-シアノ-6-ヒドロキシキノリン0.50g、2.94mmol、2-ニトロ-4-トリフルオロメチルベンゼンクロリド0.67g、2.94mmol、及び炭酸カリウム0.41g、2.97mmolの混合物を100°Cまで30分加熱した。室温まで冷却してから、30mlの冷水に混合物を注ぎ入れ、塩化メチレンで3回抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。ヘプタン/塩化メチレン1:2を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、35の収率で生成物を精製した。1HNMRCD2Cl2:8.36d,1H,8.25dd,1H,7.94dd,1H,7.75d,1H,7.67dd,1H,7.43d,1H,7.31d,1H.MSESm/eM2:361.GST-3の合成MeOH/CH2Cl2/水中の6-2-ニトロ-4-トリフルオロメチルフェノキシ-2-シアノ-キノリン1.079g、3.0mmol及びD-システイン0.53g、3.0mmolの均一な溶液に、pHを7.5~8に調整するのに十分な量のK2CO3を添加した。出発材料が完全に消費されたことがTLCによって示唆されるまで30分間混合物を撹拌した。次いで、酢酸を用いて溶液のpHを4~5に調整し、CH2Cl2で3回抽出し、Na2SO4上で有機層を乾燥した。溶媒を除去した後、塩化メチレン/メタノール95:5を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、20の収率で化合物を精製した。1HNMRd6-DMSO:8.55s,1H,8.42d,1H,8.19m,2H,8.06d,1H,7.82s,1H,7.71d,1H,7.46d,1H,5.22t,1H,CHCOO,3.45-3.75m,2H,CH2.MSESm/eM1:464.MeOH中λmax328nm,εmax9,900cm1M1.実施例2メチル6-2-ニトロ-4-トリフルオロメチル-フェノキシキノリニル-ルシフェリンエステルGST-4の合成エーテル20ml中のKOHの混合物40、6mlに、N-メチル-n,n-ニトロソウレア2.0g、0.0194molを0°Cで添加した。得られた混合物を更に5分間撹拌した。エーテル層を別のフラスコにデカントし、KOH上で0°Cで乾燥した。THF5mL中のキノリンルシフェリン0.2gの溶液に、該溶液が濃黄色になるまで上記ジアゾメタンエーテル溶液を添加した。混合物を30分間撹拌し、酢酸1mlを添加することにより反応を停止した。水10mlを添加し、酢酸エチルで混合物を3回抽出し、Na2SO4上で乾燥した。ヘプタン/酢酸エチルを溶媒として使用したフラッシュカラムにより化合物を精製した。1HNMRCD2Cl2:8.23s,1H,8.0-8.2m,3H,7.75d,1H,7.50d,1H,7.39s,1H,7.15d,1H,7.46d,1H,5.42t,1H,CHCOO,3.74s,3H,CH3,3.58d,2H,CH2.MSESm/eM1:478.λmaxnm/εmaxcm1M1:MeOH中322/10,800;328/8,800.実施例36-4-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-5の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-5を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.39d,1H,8.28d,2H,8.19m,2H,7.74s,1H,7.60d,1H,7.28s,1H,5.37t,1H,CHCOO,3.59d,2H,CH2.MSESm/eM2:397.MeOH中λmax328nm,εmax17,200cm1M1.実施例46-2-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-6の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-6を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.39d,1H,8.13m,3H,7.78t,1H,7.63d,1H,7.56s,1H,7.48t,1H,7.38d,1H,5.37t,1H,CHCOO,3.59m,2H,CH2.MSESm/eM2:397.λmaxnm/εmaxcm1M1:MeOH中323/10,400;327/9,500;337/8,300.実施例56-3-トリフルオロメチル-4-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-7の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-7を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.47d,1H,8.15-8.30m,3H,7.85d,1H,7.78d,1H,7.73dd,1H,7.55d,1H,5.45t,1H,CHCOO,3.5-3.7m,2H,CH2.MSESm/eM1:464.MeOH中λmax321nm,εmax11,000cm1M1.実施例66-2-トリフルオロメチル-4-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-8の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-8を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.56d,1H,8.47d,2H,8.20dd,2H,7.92d,1H,7.72dd,1H,7.33d,1H,5.44t,1H,CHCOO,3.5-3.7m,2H,CH2.MSESm/eM1:464.MeOH中λmax328nm,εmax10,100cm1M1.実施例76-5-トリフルオロメチル-2-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-9の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-9を調製した。MeOH中λmaxnm/εmaxcm1M1:321/10,400;328/8,300.実施例86-4-フルオロ-2-ニトロフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-10の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-10を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.38d,1H,8.02-8.2m,3H,7.6-7.8m,2H,7.5-7.6m,2H,1H,5.34t,1H,CHCOO,3.5-3.7m,2H,SCH2.MSESm/eM2:415.MeOH中λmax321nm,εmax10,600cm1M1.実施例96-2-ニトロ-4-メチルカルボキシルフェノキシキノリニル-ルシフェリンGST-11の合成GST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-11を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.68d,1H,8.15-8.30m,2H,8.1-8.2m,2H,7.64-7.74m,2H,7.33d,1H,5.42t,1H,CHCOO,3.81s,3H,CH3,3.5-3.7m,2H,CH2.MSESm/eM2:455.MeOH中λmax321nm,εmax16,200cm1M1.実施例106-2-ニトロ-ベンゼンスルホン酸ルシフェリンエステルGST-13の合成2-シアノ-6-2-ニトロ-ベンゼンスルホン酸ベンゾチオゾールの合成無水塩化メチレン15ml中の6-ヒドロキシ-2-シアノベンゾチオゾール0.50g、2.84mmol及び2-ニトロベンゼン-スルホニルクロリド0.63g、2.84mmolの溶液にTEA0.58g、5.68mmolを添加した。得られた混合物を3時間撹拌した。ヘプタン/酢酸エチル/塩化メチレン70/30/15を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、55の収率で生成物を精製したGST-13の合成ルシフェリンGST-3の合成実施例1に使用したものと同様の方法を用いてGST-13を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.14-8.26m,2H,8.17s,1H,8.07td,J=7.5Hz,J=1.3Hz,1H,7.99dd,J=8.0Hz,Hz,J=1.2Hz,1H,7.85td,J=7.8Hz,J=1.2Hz,1H,7.34dd,J=9.0Hz,J=2.4Hz,1H,5.44t,J=9.0Hz,1H,CH-COOH,3.6-3.9m,2H,CH2.MSES:m/eM1,466.MeOH中λmax292nm,εmax19,100cm1M1.実施例116-4-ニトロ-ベンゼンスルホン酸ルシフェリンエステルGST-14の合成GST-13の合成実施例10に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-14を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.42d,2H,8.17m,3H,8.08d,1H,7.25dd,1H,5.44t,1H,CH-COOH,3.6-3.9m,2H,CH2.MSES:m/eM1,466.MeOH中λmax292nm,εmax19,400cm1M1.実施例126-2-ニトロ-ベンゼンスルホン酸キノリニル-ルシフェリンエステルGST-15の合成GST-13の合成実施例10に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-15を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.54d,1H,7.9-8.3m,6H,7.85t,1H,7.57dd,1H,5.41t,1H,CH-COOH,3.5-3.7m,2H,CH2.MSES:m/eM1,460.MeOH中λmax285nm,εmax9,010cm1M1.実施例136-4-ニトロ-ベンゼンスルホン酸キノリニル-ルシフェリンエステルGST-16の合成GST-13の合成実施例10に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-16を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.23d,J=8.7Hz,1H,8.43d,J=8.7Hz,2H,8.18m,3H,8.13d,J=9.3Hz,1H,7.89d,J=2.7Hz,1H,7.51dd,J=9.3Hz,J=3Hz,1H,5.42dd,J=8.4Hz,J=8.4Hz,1H,CHCOO,3.5-3.7m,2H,CH2.MSESm/eM1:461.MeOH中λmax285nm,εmax12,400cm1M1.実施例146-2-ニトロ-4-トリフルオロベンゼンスルホン酸ルシフェリンエステルGST-17の合成GST-13の合成実施例10に使用したものと同様の方法を用いて化合物GST-17を調製した。1HNMRd6-DMSO:8.82s,1H,8.15-8.30m,4H,7.43d,1H,5.43t,1H,CHCOO,3.6-3.9m,2H,SCH2.MSESm/eM1:534.MeOH中λmax292nm,εmax18,600cm1M1.実施例157-5-トリフルオロメチル-2-ニトロフェノキシ-4-メチル-クマリンの合成GST-3実施例1の前駆体の合成に使用したものと同様の方法を用いて化合物を調製した。1HNMRCD2Cl2:8.37s,1H,7.88d,2H,7.70m,2H,7.28d,1H,7.05d,1H,7.00s,1H,6.25s,1H,2.43s,3H,CH3.MSESm/eM2:367.MeOH中λmax320nm,εmax12,700cm1M1.実施例16bis-5-トリフルオロメチル-2-ニトロフェノキシ-フルオレセインラクトンの合成DMSO50ml中のフルオレセイン2.0g、60mmol、2-ニトロ-4-トリフルオロメチルベンゼンクロリド3.0g、13.3mmol、及び炭酸カリウム2.0g、14.5mmolの混合物を100°Cまで1時間加熱した。室温まで冷却してから、30mlの冷水に混合物を注ぎ入れ、塩化メチレンで3回抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。ヘプタン/塩化メチレン/酢酸エチル7/3/0~7/3/を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、88の収率で生成物を精製した。1HNMRCD2Cl2:8.28s,br,2H,8.05d,1H,7.84d,2H,7.66-7.82m,2H,7.26d,2H,7.03d,2H,6.92d,2H,6.84dd,2H.実施例17PBI4146の合成20mlのCH2Cl2中のp-ニトロベンゼンスルホニルクロリド0.63g、2.85mmol及び7-ヒドロキシル-4-メチルクマリン0.5g、2.84mmolの溶液にTEA0.29g、0.4mlを添加した。得られた混合物を30分間撹拌した。ヘプタン/CH2Cl2、及び酢酸エチルを溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、87の収率で化合物を精製した。1HNMRCD2Cl2:8.4d,2H,8.08d,2H,7.6d,1H,6.9-7.19m,2H,6.27s,1H,2.4s,3H.MSm/z:362.0M1.実施例18PBI4153の合成トリエチルアミン0.18g、1.78mmolを含むジクロロメタン10mlに7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン0.17g、0.97mmolを溶解した。4-ニトロナフタレン-l-スルホニルクロリド0.33g、1.21mmolを少しずつ添加した。反応混合物を4時間撹拌し、酢酸エチル及び水で抽出した。有機相を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーヘプタン/酢酸エチル:1/1により残渣を精製し、生成物を得た0.35g、87。1HNMR300MHz,CD2Cl2,δ:8.95m,1H,8.42m,1H,8.24d,J=9Hz,1H,7.97m,3H,7.51d,JMSESIm/z412.1M1.実施例19GST-21の合成2-メチル-4-ニトロベンゼン-l-スルホニルクロリド濃縮HC130ml及び酢酸10mlの混合物に、芳香族アミン10.0g、65.7mmol1部を室温で撹拌しながら添加した。白色の塩酸塩が直ちに形成され、得られた混合物を-15°Cまで冷却した。温度を-5°C~-10°Cに維持しながら、水15ml中の亜硝酸ナトリウムの溶液5.44g、78.9mmolを滴下で加え、次いで、得られた混合物をこの温度範囲で45分間撹拌した。酸性の酸70mlにより0°Cで30分間二酸化硫黄を泡立たせた。溶液に塩化銅I1.65gを添加し、該溶液が淡青色に見えるまで更に約30分間、二酸化硫黄中、0°Cで混合物を泡立たせ続けた。上記ジアゾニウム溶液を0°Cで二酸化硫黄溶液に添加し、0°Cで10分間撹拌した。次いで、混合物を氷水に注ぎ入れ、エーテルで3回抽出した。合わせた有機相をかん水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を除去した後、ヘプタン/塩化メチレン7/3~6/4を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製した収率29。1HNMRCD2Cl2δppm:8.12d,J=8.1Hz,1H,7.67s,1H,7.64d,J=8.4Hz,1H.2-シアノベンゾチアゾール-6-イル2-メチル-4-ニトロベンゼンスルホン酸塩乾燥塩化メチレン10ml中のベンゼンスルホニルクロリド誘導体0.7g、2.98mmol及び2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール又は2-シアノ-6-ヒドロキシキノリン2.84mmolの溶液に、トリエチルアミン0.58g、5.68mmolを室温で添加し、得られた混合物を3時間撹拌した。ヘプタン/塩化メチレン1/2を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製した収率85。:1HNMRCDCl3δppm:8.30d,J=2.0Hz,1H,8.16d,J=9.3Hz,1H,8.13dd,J=8.7Hz,J=2.0Hz,1H,8.04d,J=8.7Hz,1H,7.78d,J=2.4Hz,1H,7.27dd,J=9.0Hz,J=2.4Hz,1H,2.95s,3H,CH3.MSESm/eM1:376.ルシフェリン2-メチル-4-ニトロベンゼンスルホン酸塩GST-21メタノール20ml、CH2CI210ml及びH2O5ml中のニトロベンゼンスルホン酸塩誘導体1.07mmol及びD-システイン1.28mmolの溶液に、トリエチルアミン1.6mmolを添加した。混合物を室温で30~60分間撹拌し、次いで、酸性の酸で弱酸性に中和した。真空下で有機溶媒を除去した後、濾過により固体を回収し、水で3回洗浄し、塩化メチレン/メタノール90/10を溶出剤として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。冷エーテル中で生成物を固化し、濾過により白色粉末を回収し、真空下で乾燥した収率62。1HNMRd6-DMSOδppm:8.48s,1H,8.1-8.2m,2H,8.08d,J=2.4Hz,1H,8.01d,J=8.7Hz,1H,7.27dd,J=8.7Hz,J=2.4Hz,1H,5.453t,J=8.7,1H,CH-COOH,3.6-3.9m,2H,CH2,2.84s,CH3,3H.MSES:m/eM1,480.MeOH中λmax293nm,εmax19,700cm1M1.実施例20GST-22の合成GST-21実施例19の合成に使用したものと同様の方法を用いてGST-22を調製した。2-ニトロ-4-メチルベンゼンスルホニルクロリド収率53:1HNMRCDCl3δppm:8.13d,J=8.4Hz,1H,7.67s,1H,7.61d,J=8.1Hz,1H.2-シアノベンゾチアゾール-6-yl2-ニトロ-4-メチルベンゼンスルホン酸塩収率67:1HNMRCD2Cl2δppm:8.23d,J=9.0Hz,1H,8.02d,J=2.4Hz,1H,7.82d,J=8.4Hz,1H,7.80s,1H,7.5-7.6m,2H,2.58s,3H,CH3.MSESm/eM1:376.ルシフェリン-2-ニトロ-4-メチルベンゼンスルホン酸塩GST-22収率62:1HNMRd6-DMSOδppm:8.18d,J=9.0Hz,1H,8.16d,J=2.4Hz,1H,8.06s,1H,7.84d,J=8.1Hz,1H,7.65d,J=8.1Hz,1H,7.33dd,J=9.0Hz,J=2.4Hz,1H,5.44dd,J=8.7,J=8.7Hz,1H,CH-COOH,3.6-3.9m,2H,CH2,2.48s、CH3、3H、DMSOと重複.MSES:m/eM1,480.MeOH中λmax292nm,εmax20,500cm1M1.実施例21GST-23の合成GST-21の合成実施例19に使用したものと同様の方法を用いてGST-23を調製した。2-シアノキノリン-6-yl2-ニトロ-4-メチルベンゼンスルホン酸塩収率40:1HNMRCD2Cl2δppm:8.34d,J=8.4Hz,1H,8.16d,J=9.3Hz,1H,7.82d,J=2.7Hz,1H,7.81d,J=8.1Hz,1H,7.69s,1H,7.66dd,J=9.0Hz,J=2.7Hz,1H,7.47d,J=8.1Hz,1H,2.52s,CH3,3H.MSESm/eM1:370.キノリニル-ルシフェリン-2-ニトロ-4-メチルベンゼンスルホン酸塩GST-23収率55:1HNMRde-DMSOδppm:8.55d,J=8.4Hz,1H,8.19d,J=8.4Hz,1H,8.13d,J=9.0Hz,1H,8.07s,1H,7.98d,J=3.0Hz,1H,7.87d,J=8.4Hz,1H,7.65d,J=8.1Hz,1H,7.33dd,J=9.3Hz,J=3.4Hz,1H,5.45dd,J=8.7,J=8.7Hz,1H,CH-COOH,3.5-3.8m,2H,CH2,2.48s、CH3,3H、DMSOと重複.MSES:m/eM1,474.MeOH中λmax286nm,εmax11,500cm1M1.実施例22GST-24の合成GST-21の合成実施例19に使用したものと同様の方法を用いてGST-24を調製した。2-ニトロ-5-メチルベンゼンスルホニルクロリド収率33:1HNMRCD2Cl2δppm:1HNMRCDCl3δppm:8.05d,J=8.4Hz,1H,7.81s,1H,7.68d,J=8.1Hz,1H.2-シアノベンゾチアゾール-6-yl2-ニトロ-5-メチルベンゼンスルホン酸塩収率85:1HNMRCD2Cl2δppm:8.21d,J=9.0Hz,1H,7.96d,J=2.4Hz,1H,7.83d,J=8.4Hz,1H,7.80s,1H,7.66d,J=8.4Hz,1H,7.52dd,J=9.0Hz,J=2.4Hz,1H,2.46s,CH3,3H.MSESm/eM1:376.ルシフェリン2-ニトロ-5-メチルベンゼンスルホン酸塩GST-24収率48:1HNMRd6-DMSOδppm:8.18-8.22m,2H,8.11d,J=8.4Hz,1H,7.80-7.98m,2H,7.36dd,J=9.0Hz,J=2.4Hz,1H,5.44dd,J=8.7,J=8.7Hz,1H,CH-COOH,3.6-3.9m,2H,CH2,2.42s,CH3,3H.MSES:m/eM1,480.MeOH中λmax292nm,εmax19,700cm1M1.実施例23GST-25の合成GST-21の合成実施例19に使用したものと同様の方法を用いてGST-25を調製した。2-シアノキノリン-6-yl2-ニトロ-5-メチルベンゼンスルホン酸塩収率56:1HNMRCD2Cl2δppm:8.34d,J=8.1Hz,1H,8.18d,J=9.3Hz,1H,7.80-7.86m,3H,7.78d,J=8.7Hz,1H,7.69dd,J=9.6Hz,J=2.7Hz,1H,7.65d,J=8.4Hz,1H,2.58s,CH3,3H.MSESm/eM1:370.キノリニル-ルシフェリン2-ニトロ-5-メチルベンゼンスルホン酸塩GST-25収率42:1HNMRd6-DMSOδppm:8.56d,J=9.0Hz,1H,8.20d,J=8.7Hz,1H,8.15d,J=9.3Hz,1H,8.11d,J=8.4Hz,1H,8.0d,J=2.7Hz,1H,7.89s,1H,7.85d,J=8.1Hz,1H,7.59dd,J=9.3Hz,J=2.7Hz,1H,5.45dd,J=8.7,J=8.7Hz,1H,CH-COOH,3.5-3.8m,2H,CH2,2.49s,CH3,3H.MSES:m/eM1,474.MeOH中λmax285nm,εmax11,600cm1M1.実施例24ルシフェリン誘導体を使用したグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼGST又は還元型グルタチオンGSHの測定ルシフェリン誘導体GST-3をGSTのための基質として調製し、2段階形式でテストした。第1段階において、グルタチオンを含むか又は含まないGST酵素を含有する混合物にGST-3を添加した。反応開始後の異なる時点で、反応物の一部をルシフェラーゼ反応混合物と混合した。経時的に光の生成が増加した反応は、誘導体GST-3が、GSTのための基質であり、GST及び/又は還元型グルタチオンGSHを検出するためのアッセイにおいて使用できることを示唆する。種々のGST酵素形態を使用して、GST又はGSHを検出するためのGSTのための基質としてのGST-3の使用をテストした。表1に示すように、個々の0.5ml微量遠心管に反応物を集めた。GST酵素を除く全ての構成成分を添加した。次いで、GST酵素の形態を表1に示す反応物に添加し、反応物を混合した。0.1、5、10、及び15分に、10μlの各反応物を90μlのルシフェリン検出溶液P450-GloBufferPromegaと混合したLuciferinDetectionReagentPromegaと混合し、TurnerTD20/20LuminometerPromegaを使用して直ちに発光を検出した。発光値RLUを表2に示す。グルタチオンを含まない反応物1、3、5、及び7番から得られた発光には、経時的に大きな増加が見られなかった。しかしながら、グルタチオン及びGSTの両方を含有する反応物2、4、6、及び8番の発光は、経時的に大幅に増加した。これは、グルタチオンと組み合わせたGSTの作用により、ルシフェリン誘導体GST-3が、ルシフェラーゼに基づく反応において使用することができるルシフェラーゼのための基質に変換されることを実証するものである。したがって、GST-3は、GSTのための基質であり、GST及び/又はGSHを検出するために使用することができる。実施例25ルシフェリン誘導体を使用したGSSGの蛍光検出以下の実施例は、GSTのためのルシフェリン誘導体基質を使用してGSSGの蛍光検出を達成することができることを実証するものである。96ウェル黒壁/透明底プレートに、10μlの1×PassiveLysisBufferPLB、Promegaを半分のウェルに添加し、10μlのN-エチルマレイミドNEM、Sigma:1×PLB中で2.5mlに希釈されたDMSO中の50ulの50mMNEMを残りの半分のウェルに添加した。次いで、NEMの存在下又は非存在下1×PLBのみで種々の条件をテストした。1.滴定0、5、10、15、20、及び25uM還元型グルタチオンGSH、Sigma:1mlの1×PLBに希釈された100mMの1ul2.滴定0、5、10、15、20、及び25uM酸化型グルタチオンGSSG、Sigma:1mlの1×PLBに希釈された10mMの2ul3.滴定0、5、10、15、20、及び25uM酸化型グルタチオン高濃度25uMの還元型グルタチオン/GSHの存在下4.グルタチオン対照なし適切な混合物を適切なウェルに添加した後、DTT及びGST-22の混合物20μl100mMHEPESpH7.5に希釈された100mMの150μl及び240μlのGST-22Promegaを各試料に添加した。トランスイルミネーターによるUV励起AlphaInnotechCorporationを使用してAmbisSystemAlphaInnotechCorporation上で蛍光を画像化し、FluorChem8000ソフトウェアAlphaInnotechCorporationを使用して分析した。画像化後、20μlのGST3mlの100mMHEPESpH7.5に希釈された450μlのGSTPromegaを全ての試料に添加した。いくつかの異なる時点3、10、20、及び30分で上記のようにプレートを再び画像化した。蛍光読み取り値を確認するために、蛍光画像化後に発光読み取り値を計測した。40μlの各反応物を96ウェル照度計のプレートに移し、40μlのGSH-GloLuciferinAssayReagentPromegaを全てのウェルに添加した。次いで、GloMax登録商標LuminometerPromega上で発光を検出した。相対発光量RLUで表した発光値を表3に示す図4。2通りのウェルの平均値を求め、表4及び5に列挙する図4。表4及び5では、結果の解釈を簡略化するために、GSSGを含まない試料の結果を表中のゼロ濃度の位置に配した。予想結果還元型グルタチオンの滴定:EMに曝露されていない場合、還元型グルタチオンの量の増加により、GSTの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。しかしながら、酵素を添加する前に還元型グルタチオンをNEMで処理した場合、NEMが還元型グルタチオンと反応し、プレルシフェリンをルシフェリンに変換するためにGSTによって使用されない新しい化学種を生成するため、シグナルは本質的に失われるはずである。これが正解である場合、時間の増加及びNEMを含有する試料中のグルタチオン濃度の増加に伴って蛍光の増加が見られるはずであり、また、グルタチオン濃度の増加に伴って発光の増加が予想される。その一方で、NEMを含有するウェルには、化合物を含まない試料を超えるごくわずかな蛍光又は発光が見られることが予想される。酸化型グルタチオンの滴定:各試料に還元剤DTTも添加することにより試料中のGSSGを減少させ、NEMを不活性化させるため、酸化型グルタチオンの量の増加によっても、GSTの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。GSSGはNEMによってアルキル化されないため、最初にGSHに還元されない限り、経時的に及びGSSGの濃度とともに、GSSGの滴定を含む試料において同様の光の増加が予想される。高レベルの還元型グルタチオンの存在下における酸化型グルタチオンの滴定:これらの試料には高レベルの還元型グルタチオンが添加されているため、NEMも含有しない試料は、非常に高いシグナルを発することが予想され、実際には、GSSGからの追加シグナルは還元型グルタチオンからのシグナルに加えられるため、GSSGの滴定においてさらなる蛍光又は発光の増加をあまり示さない可能性がある。NEM、大量のGSH、及び様々な量のGSSGを含有する試料は、NEMによって排除された還元型グルタチオンからのシグナルを有することが予想され、よって、蛍光及び発光の増加率は、還元型グルタチオンを添加せずにGSSGを添加した試料の増加率と同様であることが予想される。実際の結果NEMを添加していない還元型グルタチオンのウェル:NEMを添加していない還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光を測定することによって検出することができ、蛍光のレベルが、溶液中に存在する還元型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、発光の増加が見られた図4。NEMを添加した還元型グルタチオンのウェル:GSHの添加によって生成されたシグナルをNEMが中和させることが予想されたため、NEMが存在する還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、ごくわずかな蛍光の増加を示した。また、予想されたように、GSHを含有しない試料と、最も高いレベルのGSHを含有する試料との間に、ごくわずかな発光の差が見られた表4と表5を比較図4。NEMを添加したか又は添加していない、GSHを添加していない酸化型グルタチオンのウェル:NEMの存在下又は非存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光的に検出することができ、蛍光のレベルが、存在する酸化型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、これらの試料から発光の増加が見られた。また、NEMの非存在下で測定された値は、NEMの存在下で測定された値と同様である表4と表5を比較図4。NEMの非存在下ではあるが、大量の還元型グルタチオンの存在下で滴定した酸化型グルタチオンのウェル:NEMは用いないが、高濃度の還元型グルタチオンの存在下での酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、還元型グルタチオンの非存在下で酸化型グルタチオンの滴定に見られたものよりもはるかに高かった。これらのウェルにおけるシグナル生成のために存在するグルタチオンの合計レベルが非常に高いため、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料には非常に強い発光が認められた表4図4。高レベルの還元型グルタチオン及びNEMの存在下で滴定された酸化型グルタチオンのウェル:高レベルの還元型グルタチオン及びNEMの存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、GSHを添加していない酸化型グルタチオンの滴定を含むウェルに非常に類似していた。還元型グルタチオンのシグナルを生成する電位はNEMによって排除されているはずであり、よって、生成されたいずれのシグナルも、ウェルに添加された酸化型グルタチオンの結果であるはずであるから、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料からの発光は、酸化型グルタチオンを単独で添加したウェルからの発光と非常に類似しており表4と表5を比較図4、25μΜGSHの存在下及びNEMの非存在下でGSSGを含有する試料から測定されたものよりもはるかに低い表4図4。高度に蛍光性の化合物ではないものの、この結果は、ルシフェリン誘導体を使用してGSSGの蛍光検出を行うことができることを実証するものである。また、試料中のGSSGからのシグナルは、適切な試料処理を行った場合、高濃度のGSHを含有する試料において測定することができる。更に、本発明の方法を使用することにより、いずれのタンパク質除去ステップも必要とすることなく、そのような測定を迅速かつ容易に行うことができる。実施例26他のルシフェリン誘導体を用いたGSSGの測定固体のGSTルシフェリン誘導体GST30及びGST28をDMSOに溶解して4mg/mlの溶液を作製した。3つの異なる96ウェル照度計のプレート中に、酸化型グルタチオンを水中で10mMの原液から、0、0.1、0.5、及び2.5uMに段階希釈し、2通りの反応を行った。GST30原液の試料30μlをGSHGloReactionBufferPromegaで3mlに希釈し、プレートのうちの1つに25μlを添加した30。GST28の試料30μlをGSHGloReactionBufferで3mlに希釈し、第2のプレートに25μlを添加した28。GST-22の試料110μLをGSHGloReactionBufferで3mlに希釈し、第3のプレートに25μlを添加したGST-22又はNT。次いで、50μlのGSHGloReactionBufferを各プレートの半分の試料に添加した。DTTを含む25μlのGSHGloReactionBuffer150μlの100mMDTT対15mlのGSHGloReactionBufferを各プレートの残りの半分の試料に添加した。GSTPromegaの試料60μlをGSHGloReactionBufferで1mlに希釈し、各プレートの2つのカラムに50μlを添加した。室温で30分のインキュベーション後、100μlのGSHGloLuciferinAssayReagentPromegaを各試料に添加し、照度計を使用して15分後に発光を読み取った。得られた発光を収集し、2つのカラムの平均値を求めた。3つのGSSG濃度からGSSGの非存在下で測定された発光を引き、得られた値を表6に表す。GST30又はGST28のいずれかによる反応は、反応物中に存在するGSSGの量に比例する強い発光を示したのに対し、酵素及びDTTを含まない、又は酵素を含まないがDTTを含む反応物では、発光にごくわずかな変化が見られたのみであった。よって、GST30及びGST28も、本発明の方法においてGSSGの測定のために使用することができる。実施例27クマリン誘導体を使用したグルタチオンの蛍光検出この実施例では、GST及びグルタチオンの使用により、クマリン誘導体から蛍光シグナルを生成する。200μlの10Prionex登録商標Sigmaと9.8mlの10mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4を混合してPrionex登録商標溶液を作製し、96ウェルマイクロタイタープレート試料プレートの全てのウェルに75μlを添加した。GST酵素GSTPromegaCorp.V689B、GSTA、GSTB、及びGSTPタンパク質1モル当たり1モル未満のGSHを有するように精製したの原液2mg/mlを、10mMリン酸カリウム緩衝液pH7.4/Prionex溶液150ulに12ulの酵素を添加することによって希釈した。次いで、これらの希釈した原液をウェルに添加した。75ulの希釈した原液を列Aのウェルに添加し、列Aから75ulから列Hに移すことで1:1の段階希釈した酵素溶液を生成した。異なる96ウェルマイクロタイタープレートに、25μlの希釈したPBI415310mMリン酸カリウムpH7.45mlを含むPBI4153のlmg/ml溶液25μlをプレートのウェルA1~H10に添加した4153。別の異なる96ウェルマイクロタイタープレートに、25μlの希釈したPBI414610mMリン酸カリウムpH7.45mlを含むPBI4146の1mg/ml溶液25μlをプレートのウェルA1~H10に添加した4146。次いで、25μlの希釈した酵素溶液を添加した。ルシフェリン誘導体を用いた以前の実験に基づいて、GSTが存在して反応を触媒しない限り、遊離する還元型グルタチオンがクマリン誘導体と反応して蛍光クマリン種を放出することができるとは予想されなかった。よって、GSTを含有しない試料において、蛍光の大きな変化は予想されなかった。GST酵素形態のうちの1つ以上が、グルタチオンの存在下でクマリン化合物を触媒することができた場合、GST酵素形態を含有する試料は蛍光の増加を有するであろう。GST酵素形態がクマリン誘導体を良好に利用できるほど、蛍光の増加がより急速となり、経時的に大幅な蛍光の増加をもたらすことができるために必要なGST酵素の濃度がより低くなる。結果図6は、GST酵素の添加後1、3、5、及び20分のプレート4153の画像を示す。緩衝液のみを有する試料対照ウェルの蛍光には明らかな増加は見られず、クマリン誘導体を含む還元型グルタチオンの存在のみでは蛍光種が生成されないことを裏付けている。しかしながら、含有するGSTMの量を減少させた試料には比較的急速な蛍光の増加が見られ、含有するGSTAの量を減少させた試料ではより緩やかな増加率、そしてGSTを含有する試料では更により緩やかな増加率であった。これらの結果は、GSTMが、蛍光クマリン誘導体を生成するための基質としてクマリン化合物を迅速に利用することができることを示している。GSTAも化合物を利用することができるが、より緩やかな速度である。PromegaV689BからのGSTも化合物を利用したが、GSTAよりも更に緩やかな速度であった。GSTPでは、この酵素形態を含有するウェルには蛍光の増加が見られなかったことから、化合物を利用しなかったか、又は極々緩やかな速度で利用したかのいずれかであった。図7は、GST添加後1、3、5、及び20分のプレート4146の画像を示す。緩衝液のみを有するウェル対照ウェルA1~F2の蛍光には明らかな増加は見られず、クマリン誘導体を含む還元型グルタチオンの存在のみでは蛍光種が生成されないことを裏付けている。ウェルA7~F8に蛍光の増加が見られ、A3~F4ではより緩やかな速度であった。これらの結果は、GSTMが、蛍光クマリン誘導体を生成するためにクマリン化合物を迅速に利用することができることを示している。PromegaからのGSTも化合物を利用することができるが、GSTMよりも更に緩やかな速度である。GSTA及びGSTPでは、これらの酵素形態を含有するウェルには蛍光の増加が見られなかったことから、化合物を利用しなかったか、又は極々緩やかな速度で利用したかのいずれかであった。これらの結果は、種々のGST形態が、前蛍光性pre-fluorescentのクマリン誘導体を低濃度の還元型グルタチオンと合わせて利用して、蛍光シグナルを生成することができることを示している。予想しなかったわけではなかったが、GST形態のうちのいくつかは、化合物のうちのいくつかを他の形態よりも良好に利用し、よって、還元型グルタチオンを単独で測定するために好ましいか、又は本発明の方法における酸化型グルタチオンから生成される場合に好ましい。実施例28GSH:GSSGの比率の決定本発明の方法は、接着性哺乳類細胞及び懸濁哺乳類細胞中の還元型グルタチオンGSH対酸化型グルタチオンGSSGの比率及び/又はGSSGのみを測定するように設計される。セクションBでは、試料中のGSHのモルをGSSGのモルで除すことにより、どのように比率が算出されるかを説明する。A.GSSG及びGSHレベルの決定i.接着性細胞の播種アッセイは、ウェル当たり5,000~10,000細胞のHeLa又はHepG2細胞、及び10,000~20,000細胞/ウェルの肝細胞等の、低い細胞密度に最適化されている。HeLa又はHepG2細胞は、CorningCostar390396ウェル平底組織培養プレート白色に処理済み、透明底を有する上に播種した。肝細胞は、BDBioCoat商標465096ウェルCollagen1Cellware上に播種した。業者の推奨する肝細胞培地を用いて肝細胞を培養した。透明な壁の組織培養プレートを使用する場合は、ルシフェラーゼ検出試薬LDRの添加後に、反応物を照度計のプレートに入れるための移動ステップが行われなければならない。細胞を播種し、5CO2の培養インキュベータにて37°Cで一晩インキュベートする。ii.接着性細胞の処理メナジオンは、反応性酸素種ROS誘導物質であり、陽性対照として使用される。クレブスリンゲル液、クレブスヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩HBSS緩衝液中で40μΜメナジオンを調製した。血清、フェノールレッド、及びシステイン等の細胞培養培地の構成成分は、アッセイ化学に干渉する可能性があるため、他の緩衝液がメナジオンを希釈するために使用されてもよい。メナジオンで細胞を処理するのと同時に細胞の培養培地を緩衝液ビヒクルと交換することにより、処理対照ビヒクルのみは行わなかった。iii.懸濁細胞の播種及び処理Jurkat又はHela細胞等の懸濁細胞をクレブスリンゲル液、クレブスヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩HBSS緩衝液中で洗浄し、培地及び血清の痕跡を除去した。次いで、細胞を数え、所望の密度で上記緩衝液のうちの1つに希釈した。Jurkat細胞の場合、10,000~20,000細胞/ウェルを使用した。次いで、所望の密度の細胞懸濁液20μlを96ウェルプレートのウェルに添加した。化合物の処理、ビヒクルのみの処理、及び処理対照なしについてテストするために、十分な細胞をウェルに播種した。次いで、5μlのテスト化合物、例えば5×濃度のメナジオンを、テスト化合物で処理した細胞に添加し、5μlのビヒクルのみ、例えばDMSOを、ビヒクルのみで処理した細胞に添加した。次いで、5CO2インキュベータにて、37°Cで60分間細胞をインキュベートした。iv.GSSGの反応のための酸化型グルタチオン試薬GSSGの測定のために以下の試薬を調製した。溶液は、GSHをブロックするための250μΜN-エチルマレイミドNEM及びプロルシフェリン基質GST-22を細胞溶解溶液中に含有する。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。iv.GSHの反応のための総グルタチオン試薬及びGSH標準曲線GSHの測定のために以下の試薬を調製した。GSH溶液は、NEMを含有しない。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。v.全ての反応のためのルシフェリン生成試薬ルシフェリン生成試薬は、GSH-GlobufferPromega、カタログ番号V6911に希釈されたDTT及びグルタチオン-SトランスフェラーゼPromegaを含有する。全てのアッセイウェルに試薬を添加した。96ウェルプレートの各ウェルは、50μlを必要とする。vi.ルシフェリン検出試薬LDR凍結乾燥したルシフェリン検出試薬Promega、カタログ番号V859Bをエステラーゼを含有する再構成緩衝液Promega、カタログ番号V144A1瓶で再構成することにより、ルシフェリン検出試薬を調製した。96ウェルアッセイの各ウェルは、100μlのLDRを受容する。vii.GSH標準曲線、0~16μΜGSH標準曲線の包含により、発光相対発光量又はRLUの生成とGSH及びGSSGの濃度との相関が可能になる。5mMグルタチオンを水中で320μΜに希釈することにより、20×濃度のグルタチオンを調製した。例えば、32μlの5mMGSHを468μlの水に希釈した。250μlの320μΜGSHを250μlの水に移すこと等によって段階希釈を行った。5μl/ウェルの各GSHを3回希釈した。例えば、5μlの320μΜGSHは、標準曲線の16μΜGSHに対応する。GSHの標準曲線は、接着性細胞アッセイ及び懸濁細胞アッセイの両方で同じであった。viii.アッセイの手順接着性細胞から化合物処理を除去し、廃棄した。GSSGの測定のために、25μl/ウェル又は50μl/ウェルの酸化型グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。GSHの測定のために、25μl/ウェル又は50μl/ウェルの総グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。GSHの標準曲線の測定のために、50μl/ウェルの総グルタチオン試薬を添加した。プレート振盪機上でプレートを5分間室温で振盪させ、50μl/ウェルのルシフェリン生成試薬を全てのウェルに添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で30分間インキュベートした後、100μl/ウェルのルシフェリン検出試薬を添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で10分間インキュベートして発光を読み取った。B.GSSG:GSHの比率の算出GSSG:GSHの比率は、試料中のGSHのモルを試料中のGSSGのモルで除すことによって算出される。GSSGの各モルは2モルのGSHを生成するため、また、アッセイは、GSSGの還元によって生成される全てのGSHからシグナルを生成するため、GSHの標準曲線によって定量化されるGSHのモル数には2倍の調整が必要である。i.正味のRLUを用いた比率の算出細胞を含まない対照から生成された発光RLU又は標準曲線から生成された0μΜのGSHをバックグラウンドに用いた。処理細胞及び未処理細胞について、処理細胞及び未処理細胞から生成されたRLUから、全てのウェルからのバックグラウンドの平均を引いて正味のRLU値を求めた。次の式を使用して、未処理細胞のGSH/GSSGの比率を算出した。次の式を使用して、処理細胞のGSH/GSSGの比率を算出した。ii.GSHの標準曲線を使用した比率の算出発光RLU対GSHの濃度μΜをプロットした。第2のプロットは、GSSGの濃度を決定するために作製した:X軸上に、GSH値を2で除すことによってGSSGの濃度を求めた。注GSSG1モル当たり2モルのGSHなので、GSHの濃度を2で除すとGSSGの濃度が得られる。各標準曲線の直線部分によって生成された勾配m及び式Y-B/mを使用して、処理細胞及び未処理細胞の平均RLU正味のRLUではない値をGSSG及びGSHのμΜに変換した。細胞を含まない対照からのRLU値、すなわち、0μΜのGSHを、式Y-B/mにおいてBとして使用した。したがって、未処理細胞のGSH/GSSGの比=未処理GSHのμΜ-未処理GSSのμΜ×2/未処理GSSGのμΜであり、処理細胞のGSH/GSSGの比=処理GSHのμΜ-処理GSSGのμΜ×2/処理GSSGのμΜ図7である。C.A及びBに記載した方法を使用した例i.5,000細胞/ウェルのHeLa細胞を、40uMメナジオン又は0.1DMSOビヒクルで60分間処理した。Aに記載した方法によりGSSG及びGSHを検出した。Bに記載したようにGSH/GSSGの比率を算出した。ii:20,000細胞/ウェルのラット肝細胞を、iのように処理した。Aに記載した方法によりGSSG及びGSHを検出した。Bに記載したようにGSH/GSSGの比率を算出した。iii.5,000細胞/ウェルのHepG2細胞を、iのように処理した。Aに記載した方法によりGSSG及びGSHを検出した。Bに記載したようにGSH/GSSGの比率を算出した。iv.10,000細胞/ウェル又は20,000細胞/ウェルのJurkat細胞を、iのように処理した。Aに記載した方法によりGSSG及びGSHを検出した。Bに記載したようにGSH/GSSGの比率を算出した。実施例29GSHを含まないGST日本住血吸虫酵素の精製試薬細胞再懸濁緩衝液:PBS、10mMDTT、2.5mMPMSFカラム洗浄及び平衡化緩衝液:PBS、10mMDTT10×緩衝液A:200mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、5MNaCl1×緩衝液A:20mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、500mMNaCl溶出緩衝液:20mMリン酸ナトリウム、一塩基、pH4.0、500mMNaCl、8M尿素TEDG緩衝液:1×TE、1mMDTT、10グリセロール保存緩衝液:1×PBS、50グリセロール細胞の再懸濁100gの細胞ペースト大腸菌を発現する日本住血吸虫GST酵素を600mlの細胞再懸濁緩衝液に再懸濁した緩衝液6ml/細胞ペースト1g。細胞懸濁液が均一になるまで溶液を混合し、次いで、溶液を氷上に置いた。細胞の破砕細胞懸濁液を9000psiでマントンゴーリンに2回通過させることにより再懸濁した細胞を破砕し、氷塩浴中に置いたステンレススチール製バケツに可溶化液を回収した。2回目に通過させた後、100~200mlの細胞再懸濁緩衝液でマントンゴーリンを洗浄し、可溶化液と合わせた。次いで、4°Cで60分間、16,000×gで可溶化液を遠心分離した。カラム精製還元型グルタチオンを含むGST親和性樹脂及びSepharoseCL-4Bゲル濾過媒体Sigmaを使用して精製カラムを調製した。樹脂2ml/細胞ペースト1gの樹脂対細胞ペーストの比率で147mlのGST親和性樹脂をカラムに充填した。9ml/分27.5cm/時間の流速で1000mlのカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化した。次いで、カラムに1100mlの可溶化液を負荷し、9ml/分27.5cm/時間の速度で流した。次いで、9ml/分27.5cm/時間の流速で1500mlのカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄した。溶出緩衝液高塩緩衝液に対する1×緩衝液A低塩緩衝液の直線勾配溶出を用いて、精製したGSTをカラムから溶出した。最初に、375mlの1×緩衝液Aを0.47ms/cmの伝導率になるようにカラムに添加した。次いで、375mlの溶出バッファを0.66ms/cmの伝導率になるように添加した。各溶出の流速は、15ml/分45.9cm/時間であった。フラクションコレクターを1.3分/画分の速度で使用して、51個の20ml勾配画分を収集した。各勾配操作の後に、750ml5カラム体積の溶出緩衝液、次いで1500ml10カラム体積のカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いて洗浄を行った。各画分のGST濃度を決定するために、4ulの各画分をCoomassiePlusProteinAssayReagentPierce1mlと混合し、製造者の指示に従ってタンパク質濃度を決定した。次いで、画分をプールし、4mg/mlの最終濃度を有するGST酵素溶液を作製した。透析最初に、プールした各GST酵素溶液を、20LのTEDG緩衝液10~20プール体積中、4°Cで2.5時間、それぞれ2回透析した。10Lの保存緩衝液10プール体積中でそれぞれ2回最終透析を行った:最初に4°Cで25時間行い、2回目に4°Cで15時間行った。次いで、それぞれの透析した画分を、保存緩衝液中で4mg/mlの濃度になるよう調整し、使用するまで酵素溶液を4°Cで保存した。実施例30培地の試料抽出による反応性酸素の効果の検出この実施例では、細胞中の反応性酸素種の生成に影響を与える可能性がある化合物複数可又は化学物質複数可を用いた処理の後に、細胞の健康をモニタリングするための方法を提供する。種々の研究者によって、哺乳類細胞が、細胞から酸化型グルタチオンGSSGを輸送するトランスポーターを発現することが同定されているMinich,T.et.al,J.Neurochem.2006,vol97,p373-384。GSSGの輸送は、細胞中に存在するGSSGのレベルと関連しているはずであり、したがって、化合物複数可又は化学物質複数可の輸送は、グルタチオン還元酵素等の酵素による細胞中のGSSGからのGSHの再生と競合する。よって、細胞外GSSGの増加を測定することによって、細胞中のGSSGレベルの増加を検出することが可能であり得る。培地及び血清の多くの源は、相当なレベルのグルタチオンを含有するため、そのような測定を行うためには、細胞を処理する際に使用される細胞培地がグルタチオンを含有しないこと、及び血清が添加されていないことが有利である。ウシ胎仔血清を含むDMEM等の細胞培地が使用される場合、培地中のグルタチオンの出発レベルのために、輸送されるグルタチオンの測定がより困難となる。この理由から、本実施例における培地としてハンクス平衡塩HBSSが選択された。10ウシ胎仔血清を含む100ulのDMEM中の96ウェル組織培養プレートに、ウェル当たり5,000細胞の密度でA549細胞を播種し、10CO2で48時間、37°Cでインキュベートした。インキュベーション後、培地を除去して廃棄し、40uMメナジオンを含むか又は含まないHBSS緩衝液と交換した。次いで、10CO2で1時間、37°Cでプレートをインキュベートした。1時間の処理後、細胞からのHBSS緩衝液を新しい96ウェルプレートに移した。次いで、100ulの新しいHBSS緩衝液と、NEMを含むか又は含まないPLBの濃縮溶液とを細胞に添加した。これらの操作から次の3通りの条件がもたらされた。1.細胞の可溶化液から細胞のGSH及びGSSGを測定したが、溶解する前に、HBSS緩衝液を含むビヒクル又はメナジオン処理を除去した。2.培地のGSH及びGSSGは、細胞から移したHBSS緩衝液から測定した。3.GSH合計及びGSSG合計は、HBSS緩衝液で処理した細胞の可溶化液から測定したが、PLBを添加する前にHBSS緩衝液を除去しなかった。GSSGの測定のために、GST-22、25mMNEM、及び1×PassiveLysisBufferを含有する混合物を試料に添加した。GSHの測定のために、GST-22及び1×PassiveLysisBufferを含有する混合物を試料に添加した。室温で5分間試料をインキュベートし、100mMDTT及びGSTを含む25μlのLDRを添加した。次いで、室温で30分間試料をインキュベートし、150μlのLDRを添加した。室温でのインキュベーションから15分後に、発光を検出した。3つの条件からの平均RLU読み取り値を表7及び図9に示す。培地及び細胞からのグルタチオン種の合計は、ウェル測定値の合計とほぼ等しくなると予想できることに留意されたい。この計算を表7の3列目に示す。GSH対GSSGの比率も決定した図10。表7及び図9のデータから、培地のみのGSSG測定値でも、メナジオン処理が細胞に与えたある程度の影響が示唆されたことは明らかである。細胞の画分の溶解も培地のGSSG値を劇的に上昇させたかもしれないが、この場合、細胞溶解の測定値LDH放出及びATPレベルは、いずれかの溶解が起こったことを示唆しなかったデータは示さず。したがって、このデータは、本発明の方法を使用した細胞培地中のGSSG及びGSHの測定が、化合物複数可が細胞の健康に与える影響を検出するために使用できることを示唆するものである。多くの実験において、細胞培地は典型的に除去及び廃棄されるため、細胞の健康の尺度としての細胞培地の使用は、いずれの細胞又は細胞可溶化液も犠牲にすることなく行うことができ、単一試料からより多くの情報を得ることができるように、細胞に対する他のアッセイ、例えば、細胞生存アッセイ又は酵素アッセイを行うことができる。全ての出版物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明を、その特定の好ましい実施形態に関連して記載し、例示の目的で多くの詳細を記述してきたが、当業者には、本発明はさらなる実施形態を許容すること、及び本明細書に記載される詳細のうちのいくらかは、本発明の原則から逸脱することなく大幅に変更されてもよいことは明白であろう。"