"核酸ドメインに連結されたタンパク質性分析物結合パートナーを含むプローブを用いて試料中の分析物を検出するプローブベースの検出アッセイにおける、核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質のコンジュゲートの、遮断試薬としての使用。試料中の分析物を検出する方法であって、核酸ドメインに連結されたタンパク質性分析物結合パートナーを含むプローブの使用を含み、核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質のコンジュゲートが遮断試薬として使用される、方法。核酸ドメインに連結されたタンパク質性分析物結合パートナーを含む近接プローブを用いて試料中の分析物を検出する近接プローブベースの検出アッセイにおける、核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質のコンジュゲートの、遮断試薬としての使用である、請求項1に記載の使用。核酸ドメインに連結されたタンパク質性分析物結合パートナーを含む近接プローブの使用を含み、核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質のコンジュゲートが遮断試薬として使用される、試料中の分析物を検出する方法である、請求項2に記載の方法。検出アッセイ又は検出の方法がイムノPCR又はイムノRCAである、請求項1又は2に記載の使用又は方法。遮断試薬がプローブより過剰に使用される、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の非分析物特異的結合タンパク質成分が、血清タンパク質又はストレプトアビジン若しくはストレプトアビジン様タンパク質又はその修飾体、誘導体若しくは変異体又はそれらの組合せである、請求項1~6のいずれか一項に記載の使用又は方法。血清タンパク質成分が単一の特異的なタイプの血清タンパク質であってもよく、又は複数の異なる血清タンパク質を含んでもよい、請求項7に記載の使用又は方法。血清タンパク質成分がグロブリン及び/又はアルブミンタンパク質である、請求項7又は8に記載の使用又は方法。グロブリンが血清グロブリンである、請求項9に記載の使用又は方法。血清グロブリンが少なくとも70のγ-グロブリンを含む、請求項10に記載の使用又は方法。γ-グロブリンが免疫グロブリン、好ましくはIgGである、請求項11に記載の使用又は方法。IgGがバルクIgGである、請求項12に記載の使用又は方法。アルブミンタンパク質が血清アルブミンである、請求項9に記載の使用又は方法。血清アルブミンが、異なる血清アルブミンタンパク質の組合せである、請求項14に記載の使用又は方法。血清タンパク質が、近接プローブのタンパク質性標的分析物結合ドメインと同じ種に由来する、請求項7~15のいずれか一項に記載の使用又は方法。ストレプトアビジン様タンパク質が、ストレプトアビジン又はその修飾体、誘導体若しくは変異体に類似する構造的及び/又は機能的特性を有するタンパク質である、請求項7に記載の使用又は方法。ストレプトアビジン若しくはストレプトアビジン様タンパク質又はその修飾体、誘導体若しくは変異体が、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン登録商標、エクストラアビジン登録商標及びニュートラライト登録商標からなるリストから選択される、請求項7又は17に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが同種のものである、請求項1~18のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが異種のものである、請求項1~18のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが、アッセイにおいて使用されるプローブの核酸ドメイン、スプリント若しくは他のオリゴヌクレオチドに対して又は近接プローブ間の相互作用を検出するのに使用される任意の核酸に対して80未満の配列同一性を有する、請求項1~20のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが、1つ又は複数のランダムに生成された核酸配列を含む、請求項1~21のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが少なくとも8つのヌクレオチドを含む、請求項1~22のいずれか一項に記載の使用又は方法。遮断試薬の核酸ドメインが一本鎖DNAを含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の使用又は方法。非分析物特異的結合タンパク質が共有結合によって核酸に連結されている、請求項1~24のいずれか一項に記載の使用又は方法。共有結合が化学的架橋である、請求項25に記載の使用又は方法。非分析物特異的結合タンパク質が非共有結合性会合によって核酸に連結されている、請求項1~24のいずれか一項に記載の使用又は方法。非共有結合性会合が、ストレプトアビジン-ビオチンベースの連結を介したものである、請求項27に記載の使用又は方法。遮断試薬の非分析物特異的結合タンパク質成分と核酸ドメインを連結するために使用されるリンカーが、プローブの核酸ドメインをタンパク質性分析物結合ドメインに連結するリンカーと同じである、請求項1~28のいずれか一項に記載の使用又は方法。a前記試料を、請求項4~29のいずれか一項で定義される遮断試薬と接触させるステップと、b前記試料を、少なくとも第1及び第2の近接プローブの少なくとも1つのセットとさらに接触させるステップであって、これらのプローブが各々、タンパク質性分析物結合ドメイン及び核酸ドメインを含み、分析物に同時に結合することができる、ステップと、c近接プローブの分析物への結合の際に近接プローブの核酸ドメインが相互作用できるようにするステップであって、該相互作用がライゲーション反応又は伸長反応を含む、ステップと、d前記ライゲーション又は伸長を検出するステップと、を含む、請求項4に記載の方法。試料中の分析物を検出するための方法において使用するためのキットであって、a核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質を含む遮断試薬と、bプローブの少なくとも1つのセットであって、セット中の各プローブがタンパク質性分析物結合ドメイン及び核酸ドメインを含む、セットと、を含むキット。a核酸に連結された非分析物特異的結合タンパク質を含む遮断試薬と、b少なくとも第1及び第2の近接プローブの少なくとも1つのセットであって、各セットにおける少なくとも1つのプローブ、より好ましくは各プローブがタンパク質性分析物結合ドメイン及び核酸ドメインを含み、各プローブセットにおける各プローブが分析物に同時に結合することができる、セットと、c任意選択で、前記第1及び第2の近接プローブの核酸間の相互作用を媒介するための手段と、d任意選択で、前記相互作用を検出するための手段と、を含む、請求項31に記載のキット。c前記プローブの核酸ドメインと相互作用して、検出可能なシグナルを生成するための手段であって、好ましくは、前記検出可能なシグナルが核酸分子である、手段と、d任意選択で、前記検出可能なシグナルを検出するための手段と、をさらに含む、請求項31に記載のキット。遮断試薬が、請求項6~29のいずれか一項で定義されるものである、請求項31~33のいずれか一項に記載のキット。遮断試薬を製造するための方法であって、a血液から血清タンパク質を抽出するステップと、b核酸を調製するステップと、caのタンパク質をbの核酸と連結するステップと、を含み、前記血清タンパク質は複数の異なる血清タンパク質を含み、プローブベースの検出アッセイの標的分析物に対する結合親和性が低い又はそれを有しない、方法。ステップaの血清タンパク質が請求項9~16のいずれか一項で定義されるものであり、ステップbの核酸が請求項19~24のいずれか一項で定義されるものであり、ステップcの連結が請求項25~29のいずれか一項で定義されるものである、請求項35に記載の方法。血清タンパク質がバルクIgGである、請求項35又は36に記載の方法。請求項35~37のいずれか一項に記載の方法によって得られた又は得られる遮断試薬。[実施例1]材料及び方法:抗体のコンジュゲーション:抗体の共有結合性SMCCコンジュゲーション:標的特異的プローブについて、ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、製造業者のプロトコールPierceBiotechnology,Rockford,IL,USAに従って3’及び5’オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたスルホ-SMCCスルホサクシニミジル-4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシラートであった。遮断プローブを作製するために、ランダム化されたN40オリゴヌクレオチドは、同一のコンジュゲーションプロトコールを用いてヤギから作られたポリクローナルIgG抗体にコンジュゲートされた。抗体の共有結合性イノバコンジュゲーション:10μg1mg/mLの抗体は、製造業者のプロトコールInnovaBiosciences,Cambridge,UnitedKingdomに従って3’及び5’オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた。遮断プローブを作製するために、ランダム化されたN40オリゴヌクレオチドは、同一の手順でヤギから作られたポリクローナルIgG抗体にコンジュゲートされた。試料:ヒトEDTA血漿及び血清試料は、OlinkBioscienceから8名の健康なボランティアにより快く提供された。K3-EDTA抗凝固性チューブHettichLabinstrument,Sollentuna,Swedenは血漿試料に使用され、血餅活性化因子を含有するチューブHettichLabinstrument,Sollentuna,Swedenは血清試料に使用された。試料はすべて室温で1~2時間インキュベートされ、一定分量化に先立って3000rpmで10分間さらに遠心分離され、-20°Cで保存された。試料調製:血漿及び血清試料並びにバッファーは、Olink血漿希釈バッファー、PBSpH7.4、5mMEDTA、0.13mg/mLサケ精子DNA、0.1BSA、0.25mg/mLIgG、0.02アジ化ナトリウム、2.5μMの遮断試薬のあり又はなしに1対2で希釈され、室温で20分間インキュベートされた。プローブインキュベーション:プローブ混合物は、FBBPBSpH7.4、25mMトリスpH8、0.1フィッシュゼラチン、4mMEDTA、1mMビオチン、0.016mg/mLサケ精子DNA、0.02アジ化ナトリウム、0.1トリトンTritonX-100/1BSA中に3’及び5’プローブを50~200pM間の濃度まで希釈することにより調製された。各ポリプロピレンキャップSarstedt,Numbrecht,Germanyに2μLのプローブ混合物が移され、続いて2μLの適切に希釈された試料が移された。キャップがポリプロピレンチューブ上に置かれ、短時間遠心処理され、4°Cで一晩インキュベートされた。ライゲーション及びリアルタイムPCR:25mMKCl、2.5mMMgCl2、20mMトリス-HClpH8、0.004ワイス単位のT4DNAリガーゼFermentas,St.Leon-Rot,Germany、100nMコネクターオリゴヌクレオチド、2mMDTT及び80μMATPを含有する100μLのライゲーション混合物は、各4μLインキュベーション試料に添加され、37°Cで10分間インキュベートされ、65°Cで10分間熱失活させた。リアルタイムPCRのための全反応容量は20μlであり、11μlの200nMタックマンプローブ、500nMユニバーサルプライマー、1×TEpH8.0、2×FastTaqmanUniversalMasterMixAppliedBiosystems,FosterCity,CA及び9μlのライゲートされた産物を含有していた。試料は4通りに使用され、サイクリング条件は95°Cで2分、続いて95°Cで15秒及び60°Cで60秒を45サイクルであった。増幅及び検出は、ABIPRISM7900HTAppliedBiosystems,FosterCity,CAを用いて実施された。データ解析:q-PCR機器からの生データSDSファイルの計算及び解析にはエクセルを使用した。実験の原理:以下の実験は、NGFとIL-2などの、相互作用をしない2つの異なるタンパク質分析物に特異的な2つのPLAプローブを用いて実施された。血清又は血漿試料がそのような検出反応に添加されると、プローブを接近させそれによって偽の陽性シグナルを生じるPLAプローブによる非特異的結合事象が存在しなければ、バッファーバックグラウンドを超えるシグナルは検出可能ではないはずである。近接ライゲーションアッセイはタンパク質分析物を、次の実験でリアルタイムPCRによって読み取られるDNAアンプリコンに変換する。平均Ctは標準偏差と一緒に報告される。[実施例2]遮断試薬の存在又は不存在下のPLAの特異性:非特異的シグナルは、非マッチドプローブ対を用いてヒト血漿試料において近接ライゲーションアッセイを実施することにより実験的にモニターされた。そのような非マッチド又はミスマッチドプローブ対は純粋なバッファー由来のノイズを超える血漿由来のシグナルを生じないはずである。第1のプローブはNGFを標的にし、もう一方のプローブはIL-2を標的にした。血漿シグナルはそのようなミスマッチド検出に由来しており、遮断試薬の使用及びその使用をアッセイに含むことによって顕著に減少した図1。アッセイは、コンジュゲートされていないバルクIgG及びコンジュゲートされていないランダム化されたオリゴヌクレオチドの存在下でも別々に及び同時に実施された。これらの反応はアッセイ特異性を著しく改善することはなかった、すなわち、これらの試薬は、非特異的バックグラウンドシグナルの減少を得るためにはコンジュゲートしなければならない。[実施例3]特異性増強効果遮断効果は、特異的遮断試薬ランダム化されたオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた抗体に由来し、試薬の個々の構成成分に由来するのではないことを実証するためのアッセイ:遮断効果は、ランダム化されたN40オリゴヌクレオチドがバルクIgG抗体に連結していたときだけ得られることを検証するために、個々の構成成分の効果が別々に調べられ遮断試薬の効果と比較された。室温で20分間、N40オリゴヌクレオチド血漿又は血清、血漿又は血清の希釈液50対50、血漿若しくは血清とバッファーのプレインキュベーション中7.5μMのみ又はバッファーのみを添加しても、添加物が全くなしの場合と比べて非特異的シグナルにいかなる変化も生じなかった。IgG抗体2.5μMを添加すると非特異的シグナルはわずかに減少したが、それでも血漿及び血清試料には著しい交差反応性が存在した。しかし、遮断プローブ2.5μMの抗体と3倍コンジュゲーション過剰のN40オリゴヌクレオチドを添加すると交差反応性は完全に取り除かれた図2。[実施例4]標的抗体の入手源の種とは異なる種由来のIgGから作製される遮断試薬の遮断効果:遮断試薬の効果をさらに評価するために、発明者は、ヤギIgGで作製されたプローブを使用する効果がヤギ以外の種から作製されたミスマッチドプローブに対して同じ遮断効果を有することができるかどうかを調べた。発明者は、ミスマッチドプローブ対の3つの異なる組合せ[ウサギウサギ図3A、マウスウサギ図3B及びヒツジマウス図3C]を試験し、3つの異なるヒト血漿試料7P、8P、11Pにおいて交差反応性を調べた。血漿希釈液又はバッファー中に遮断試薬が存在しない、ウサギウサギ図3A及びヒツジマウス図3Cの組合せを使用した場合に、ミスマッチドプローブ間でいくらかでも交差反応性を示す唯一の試料は11Pであった。この交差反応性は、いくつかの特定の試料に現れることがあり得る非特異的シグナルを取り除くためには遮断試薬が必要であることを例証している。したがって、遮断試薬が血漿希釈液又はバッファー中でインキュベートされると、非特異的シグナルの交差反応性は取り除かれた。この実験は、遮断試薬のタンパク質成分は、標的特異的分析物結合ドメインが由来する種と同一の種に由来する必要はないことを実証している。[実施例5]遮断試薬に1つのコンジュゲーション化学を標的特異的プローブに異なるコンジュゲーション化学を使用する遮断試薬の遮断効果:次の実験では、1つの連鎖タイプ4ステップイノバが遮断試薬に対して使用され、別の連鎖タイプ1ステップイノバが標的特異的プローブに対して使用された。5つの異なる血漿試料3P、4P、7P、8P、11Pが実験に含まれ、2つのミスマッチドプローブの組合せ51_7及び7_51;配列番号51は抗ICAM抗体に、配列番号7はTIMP-1に一致が使用された。プローブの両方の組合せに対して遮断試薬ヤギプローブを使用した場合は、血漿試料における非特異的結合は顕著に減少した図4A~B。したがって、遮断試薬の核酸ドメインをコンジュゲート/連結するのに使用される方法及びリンカーは、近接プローブの核酸ドメインと分析物結合ドメインをコンジュゲートするのに使用されるリンカーと同一である必要はない。この実験は、血漿試料の一部のみが非特異的シグナルを示したが、遮断試薬を使用すればすべての非特異的シグナルを取り除くことができたことも実証している。"