"本願明細書に記載された発明。発明の概要Dkk-1に選択的に結合する種々の結合剤を提供する。該試剤はまた、Dkk-1とLRP5および/またはLRP6との間の結合を阻止するか、または減少させることができ、それによってWntシグナル伝達と関連する少なくとも1つの活性を刺激できる。該試剤は、抗体またはその免疫機能性フラグメントであり得、したがって天然構造、ならびに抗原結合ドメイン例えば、ドメイン抗体を持つポリペプチド類を有する抗体を含む。これらの抗体およびフラグメントは、骨質量の喪失に関連する病態の予防または治療を含む種々の異なる疾患を治療するために、または新骨の産生を刺激するために、ならびに種々の非骨関連疾患に使用できる。抗体の生産に有用である核酸分子、ベクター、および宿主細胞ならびに選択的結合剤もまた提供する。提供される幾つかの抗体および免疫機能性フラグメントとしては、ai配列番号70と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR1;ii配列番号72と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR2;およびiii配列番号74と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖LC相補性決定領域CDR;bi配列番号76と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR1;ii配列番号78と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR2;およびiii配列番号80と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR3、よりなる群から選択される1つまたは複数の重鎖HCCDR;またはcaの1つまたは複数のLCCDRおよびbの1つまたは複数のHCCDRが挙げられる。このような抗体またはフラグメントは、Dkk-1ポリペプチドに特異的に結合できる。一定の抗体またはフラグメントには、前述のCGRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含む。他の抗体またはフラグメントの軽鎖および重鎖は、上記に記載されたとおりであるが、前述の配列と少なくとも90の配列同一性を有する。さらに他の複数抗体またはそれらのフラグメントは、CDR1が、配列番号70に記載されたアミノ酸配列を有し、CDR2が、配列番号72に記載されたアミノ酸配列を有し、および/またはCDR3が、配列番号74に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖を有するものである。幾つかの抗体およびフラグメントはまた、CDR1が、配列番号76に記載されたアミノ酸配列を有し、CDR2が、配列番号78に記載されたアミノ酸配列を有し、および/またはCDR3が、配列番号80に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖も有することができる。一定の抗体またはフラグメントは、配列番号74のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3および/または配列番号80のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む。提供される一定の他の抗体および免疫機能性フラグメントとしては、a配列番号84、28または32と少なくとも80の配列同一性を有する軽鎖可変領域VL;b配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも80の配列同一性を有する重鎖可変領域VH;またはcaのVLおよびbのVHが挙げられる。他の抗体またはフラグメントは、構造が類似しているが、VLは、配列番号84、28または32と少なくとも90の配列同一性を有し;VHは、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも90の配列同一性を有する。一定の抗体またはフラグメントにおいて、VLは、配列番号84、28または32と少なくとも95の配列同一性を有し;VHは、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも95の配列同一性を有する。さらに他の抗体またはフラグメントは、配列番号84、28または32のアミノ酸配列を有するVL、および/または配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68のアミノ酸配列を有するVHを含むものである。幾つかの抗体またはフラグメントは、配列番号82、26、または30のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる軽鎖および/または配列番号89、34、38、42、46、50、54、58、62、または66のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる重鎖を含む。配列番号2のアミノ酸32~266からなる成熟ヒトDkk-1タンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその免疫機能性フラグメントであって、前記抗体が、2つのループを含むエピトープに結合し、前記ループは、配列番号2の220と237との間および配列番号2のシステイン残基245と263との間のジスルフィド結合によって形成されているものも含まれる。開示されている他の抗体またはフラグメントは、Dkk-1ポリペプチドに対する特異的結合に関して上記のものなどの抗体と競合する。例えば、幾つかの抗体およびフラグメントは、2本の同一重鎖および2本の同一軽鎖からなる抗体と競合し、該重鎖は、配列番号12のアミノ酸20~465からなり、前記軽鎖は、配列番号10のアミノ酸21~234からなる。提供される種々の抗体およびフラグメントとしては、軽単鎖および/または重単鎖あるいは単一の可変軽ドメインおよび/または単一の可変重ドメインを挙げることができる。他の抗体およびフラグメントとしては、2本の軽鎖および/または2本の重鎖が挙げられる。該抗体またはフラグメントが、2本の軽鎖および/または2本の重鎖を含む場合、幾つかの場合において2本の軽鎖は、互いに同一であり;同様に幾つかの場合において、2本の重鎖は、同一である。提供される抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を挙げることができる。免疫機能性フラグメントとしては、限定はしないが、scFv、Fab、Fab’、Fab’2またはドメイン抗体を挙げることができる。幾つかの場合において、抗体またはフラグメントは、5×10-4s-1以下のkdkeffでDkk-1ポリペプチドから解離する。任意の前述の抗体および免疫機能性フラグメントのいずれかを含む薬学的組成物もまた提供される。このような組成物はまた、典型的に緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤および保存剤も含む。薬学的組成物または医薬品の製剤における前述の抗体および免疫活性フラグメントの使用法もまた記載される。前述の抗体をコードする種々の核酸もまた提供される。幾つかの核酸は、例えば、a配列番号70、72および/または74に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖CDR;および/またはb配列番号76、78および/または80に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖CDRをコードし、その結果、コード化CDRは、Dkk-1ポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする。一定の他の核酸は、抗体および免疫活性フラグメントの可変軽鎖領域VLおよび/または可変重鎖VHをコードする配列を含むか、またはそれからなり、該VLは、配列番号84、28または32と少なくとも80、90または95の配列同一性を有し、該VHは、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも80、90または95の配列同一性を有する。幾つかの核酸は、配列番号84、28または32を含むか、またはそれらからなるVLをコードする配列および/または配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68を含むか、またはそれらからなるVHをコードする配列を含む。さらに他の核酸は、前述の配列特性を有するVLまたはVHの双方をコードする配列を含む。前述の核酸を含む発現ベクター、またこのような発現ベクターを含む細胞例えば、CHO細胞もまた、本明細書に開示されている。このような発現ベクターを含有する細胞を培養することによる抗体またはその免疫活性フラグメントを生産する方法もまた記載されている。別の態様において、種々の疾患の治療における前述の抗体または免疫機能性フラグメントのある使用法を開示している。一定の方法は、例えば、関節炎、幹細胞再生に応答性の疾患、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、および皮膚疾患を治療するために、投与を必要とする患者に本明細書に記載された抗体または免疫活性フラグメントの有効量を投与することを含む。幾つかの治療方法は、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、および骨関節炎を治療することを含む。一定の抗体およびフラグメントは:a幹細胞再生に応答性であり、糖尿病、慢性心不全および筋肉疾患よりなる群から選択されるか;bクローン病、大腸炎および炎症性腸疾患よりなる群から選択される炎症性疾患であるか;cアルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病よりなる群から選択される神経性疾患であるか;d黄斑変性症および網膜症よりなる群から選択される眼疾患であるか;e末期腎疾患、慢性腎疾患、腎炎、尿細管間質性腎炎およびIgA腎障害よりなる群から選択される腎疾患であるか;f慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、および嚢胞性線維症よりなる群から選択される肺疾患であるか;またはg腸管上皮に対する化学療法誘導性損傷から生じる皮膚疾患である、疾患を治療するために使用される。さらに、本明細書に記載された抗体またはその免疫機能性フラグメント例えば、配列番号10のアミノ酸44~54、配列番号10のアミノ酸70~76および配列番号10のアミノ酸109~117よりなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDR、および/または配列番号12のアミノ酸50~54、配列番号12のアミノ酸69~85および配列番号12のアミノ酸118~128よりなる群から選択される少なくとも1つの重鎖CDRを含む抗体または免疫機能性フラグメントの治療的有効量を、骨質量喪失の治療または予防を必要とする患者に投与することを含む骨質量の喪失を治療または予防する方法を本明細書に提供する。本実施形態の一態様において、患者は骨に転移する癌を患っている患者であり、別の態様において、患者は多発性骨髄腫を患っている患者である。さらに別の態様において、患者は、骨粗しょう症、骨減少症、ページェット病、歯周病、リウマチ様関節炎、および固定化による骨喪失を患っている患者から選択される。骨質量の増加を誘導する方法もまた開示する。このような方法は、本明細書に開示された抗体またはその免疫機能性フラグメント例えば、配列番号10のアミノ酸44~54、配列番号10のアミノ酸70~76および配列番号10のアミノ酸109~117よりなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDR、および/または配列番号12のアミノ酸50~54、配列番号12のアミノ酸69~85および配列番号12のアミノ酸118~128よりなる群から選択される少なくとも1つの重鎖CDRを含む抗体または免疫機能性フラグメントの治療的有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む。一態様において、患者は骨に転移する癌を患っており、別の態様において、患者は多発性骨髄腫を患っている。さらに別の態様において、患者は、骨粗しょう症、骨減少症、ページェット病、歯周病、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および固定化による骨喪失を患っている患者から選択される。本法のさらなる態様において、患者は、骨移植レシピエントまたは骨折を患っている患者である。本明細書記載された抗体またはその免疫機能性フラグメント例えば、配列番号10のアミノ酸44~54、配列番号10のアミノ酸70~76および配列番号10のアミノ酸109~117よりなる群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDR、および/または配列番号12のアミノ酸50~54、配列番号12のアミノ酸69~85および配列番号12のアミノ酸118~128よりなる群から選択される少なくとも1つの重鎖CDRの治療的有効量を、患者に投与することを含む、Wnt活性の誘導を必要とする患者におけるWnt活性を誘導する方法もまた提供される。例えば、本願発明は以下の項目を提供する。項目1ai配列番号70と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR1;ii配列番号72と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR2;およびiii配列番号74と少なくとも80の配列同一性を有するLCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖LC相補性決定領域CDR;bi配列番号76と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR1;ii配列番号78と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR2;およびiii配列番号80と少なくとも80の配列同一性を有するHCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数の重鎖HCCDR;あるいはcaの1つまたは複数のLCCDRおよびbの1つまたは複数のHCCDRを含む、単離抗体またはその免疫機能性フラグメントであって、前記抗体またはその免疫機能性フラグメントが、Dkk-1ポリペプチドに特異的に結合できる単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目2ai配列番号70と少なくとも90の配列同一性を有するLCCDR1;ii配列番号72と少なくとも90の配列同一性を有するLCCDR2;およびiii配列番号74と少なくとも90の配列同一性を有するLCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数のLCCDR;bi配列番号76と少なくとも90の配列同一性を有するHCCDR1;ii配列番号78と少なくとも90の配列同一性を有するHCCDR2;およびiii配列番号80と少なくとも90の配列同一性を有するHCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数のHCCDR;またはcaの1つまたは複数のLCCDRおよびbの1つまたは複数のHCCDRを含む、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目3ai配列番号70に記載されたアミノ酸配列を有するLCCDR1;ii配列番号72に記載されたアミノ酸配列を有するLCCDR2;およびiii配列番号74に記載されたアミノ酸配列を有するLCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数のLCCDR;bi配列番号76に記載されたアミノ酸配列を有するHCCDR1;ii配列番号78に記載されたアミノ酸配列を有するHCCDR2;およびiii配列番号80に記載されたアミノ酸配列を有するHCCDR3よりなる群から選択される1つまたは複数のHCCDR;またはcaの1つまたは複数のLCCDRおよびbの1つまたは複数のHCCDRを含む、項目2に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目4配列番号74のアミノ酸配列を有するLCCDR3または配列番号80のアミノ酸配列を有するHCCDR3を含む、項目3に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目5配列番号74のアミノ酸配列を有するLCCDR3および配列番号80のアミノ酸配列を有するHCCDR3を含む、項目4に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目6aおよびbに記載されたCDRの少なくとも2つのCDRを含む、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目7aおよびbに記載されたCDRの少なくとも3つのCDRを含む、項目6に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目8aおよびbに記載されたCDRの少なくとも4つのCDRを含む、項目7に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目9aおよびbに記載されたCDRの少なくとも5つのCDRを含む、項目8に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目10aおよびbに記載されたCDRの6つ全てを含む、項目9に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目11ドメイン抗体である、項目1に記載の単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目125×10-4s-1以下のkdでDkk-1ポリペプチドから解離する、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目13モノクローナル抗体である、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目14scFv、Fab、Fab’またはFab’2である、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目15ヒト抗体またはヒト化抗体である、項目1に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目16a配列番号84、28または32と少なくとも80の配列同一性を有する軽鎖可変領域VL;b配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64もしくは68と少なくとも80の配列同一性を有する重鎖可変領域VH;またはcaのVLおよびbのVH、を含む、単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目172つの同一VHおよび2つの同一VLからなる、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目18前記VLが、配列番号84、28または32と少なくとも90の配列同一性を有し;前記VHが、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも90の配列同一性を有する、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目192つの同一VHおよび2つの同一VLからなる、項目18に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目20前記VLが、配列番号84、28または32と少なくとも95の配列同一性を有し;前記VHが、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68と少なくとも95の配列同一性を有する、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目212つの同一VHおよび2つの同一VLからなる、項目20に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目22前記VLが、配列番号84、28または32のアミノ酸配列を有し;前記VHが、配列番号91、36、40、44、48、52、56、60、64または68のアミノ酸配列を有する、項目21に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目232つの同一VHおよび2つの同一VLからなる、項目22に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目24配列番号82、26または30のアミノ酸配列を含む軽鎖;配列番号89、34、38、42、46、50、54、58、62、または66のアミノ酸配列を含む重鎖、または配列番号82、26、または30のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号89、34、38、42、46、50、54、58、62、または66のアミノ酸配列を含む重鎖、を含む、項目22に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目252本の同一軽鎖および2本の同一重鎖からなる、項目24に記載の単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目26モノクローナル抗体である、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目27scFv、Fab、Fab’またはFab’2である、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目28ヒト抗体またはヒト化抗体である、項目16に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目29配列番号2のアミノ酸32~266からなる成熟ヒトDkk-1タンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその免疫機能性フラグメントであって、該抗体は、2つのループを含むエピトープに結合し、該ループが、配列番号2の220と237との間および配列番号2のシステイン残基245と263との間のジスルフィド結合によって形成されている、単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目30モノクローナル抗体である、項目29に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目31scFv、Fab、Fab’またはFab’2である、項目29に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目32ヒト抗体またはヒト化抗体である、項目29に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目33Dkk-1ポリペプチドとの特異的結合に関して項目24に記載の抗体と競合する、抗体またはその免疫機能性フラグメント。項目342本の同一重鎖および2本の同一軽鎖からなる抗体と競合する項目33に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメントであって、該重鎖は配列番号12のアミノ酸20~465からなり、該軽鎖は配列番号10のアミノ酸21~234からなる、単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目355×10-4s-1以下のkdでDkk-1ポリペプチドから解離する、項目34に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。項目36a配列番号70、72および/または74に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖CDR;および/またはb配列番号76、78および/または80に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖CDRをコードする核酸であって、抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする、核酸。項目37項目16に記載の抗体または免疫活性フラグメントの前記VH、前記VLまたは前記VHおよび前記VLの双方をコードする配列を含む、核酸。項目38項目22に記載の抗体または免疫活性フラグメントの前記VH、前記VLまたは前記VHおよび前記VLの双方をコードする核酸セグメントを含む、核酸。項目39項目37に記載の核酸を含む、発現ベクター。項目40項目39に記載の発現ベクターを含む、単離細胞。項目41項目40に記載の細胞を培養する工程を包含する、抗体またはその免疫機能性フラグメントを産生する方法。項目42項目1に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントと、緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤および保存剤よりなる群から選択される成分とを含む、組成物。項目43項目16に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントと、緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤および保存剤よりなる群から選択される成分を含む、組成物。項目44疾患を処置する方法であって、該方法は、項目1に記載の抗体またはその免疫活性フラグメントの有効量を、該処置を必要とする患者に投与する工程を包含し、該疾患は、関節炎、幹細胞再生に応答性の疾患、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、および皮膚疾患よりなる群から選択される、方法。項目45前記疾患が、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、および骨関節炎である、項目44に記載の方法。項目46前記疾患が、a幹細胞再生に応答性があり、糖尿病、慢性心不全および筋肉疾患よりなる群から選択されるか;bクローン病、大腸炎および炎症性腸疾患よりなる群から選択される炎症性疾患であるか;cアルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病よりなる群から選択される神経性疾患であるか;d黄斑変性症および網膜症よりなる群から選択される眼疾患であるか;e末期腎疾患、慢性腎疾患、腎炎、尿細管間質性腎炎およびIgA腎障害よりなる群から選択される腎疾患であるか;f慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、および嚢胞性線維症よりなる群から選択される肺疾患であるか;またはg腸管上皮に対する化学療法誘導性損傷から生じる皮膚疾患である、項目44に記載の方法。発明の詳細な説明I.定義本明細書において、別に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、通常の当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質と核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法は、当業界で周知であり、かつ一般に使用されているものである。本発明の方法と技術は、他に指定されない限り、本明細書を通して引用され、検討されている種々の一般的かつより具体的な引用文献に記載されている当業者に周知の従来の方法に従って一般に実施される。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarbourLaboratoryPress、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州1989およびAusubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology、GreenPublishingAssociates1992、およびHarlowandLaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarbourLaboratoryPress、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州1990を参照されたい。これらは参照として本明細書に組み込まれている。酵素反応および精製法は、当業界で一般に達成されているか、または本明細書に記載されているとおり、製造元の仕様書に従って実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および薬品化学ならびに薬学的化学に関連して用いられる用語および、それらの実験室手順および技法は、当業者に周知であり、かつ一般に使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達ならびに患者の処置に関しては標準的な技法が使用できる。本開示に利用される以下の用語は、別に指定されない限り、当然のことながら以下の意味を有する:本明細書に用いられるDkk-1は、例えば、Dkk-1のラット、マウスおよびヒトの天然形態を含む。ヒトおよびマウスのDkk-1タンパク質をコードする代表的なヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号1および3に示され:対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号2および4に示される。ヒトDkk-1タンパク質配列番号2は、配列番号2のアミノ酸1~31からなるリーダー配列を有する。代表的なラットDkk-1タンパク質配列は、GenBank登録XP219804に記載されている。この用語はまた、これらの天然タンパク質と免疫的に交差反応するこのような天然配列の変異体を含む。これらのタンパク質は、LRP5またはLRP6とWntとの間の相互作用を阻害できる。ヒトLRP5をコードする代表的なヌクレオチド配列は、配列番号5で与えられ、対応するアミノ酸配列は、配列番号6で示される。ヒトLRP6をコードする代表的なヌクレオチド配列は、配列番号7で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号8で示される。この用語はまた、抗体が特異的に結合するエピトープを含有するDkk-1の天然形体または変異体のフラグメントを称することもできる。用語のポリヌクレオチドまたは核酸とは、一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド類は、リボヌクレオチド類もしくはデオキシリボヌクレオチド類またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形体であり得る。前記修飾としては、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、2’、3’-ジデオキシリボースなどのリボース修飾、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。この用語は、一本鎖および二本鎖形体の双方を含む。用語のオリゴヌクレオチドとは、200以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、10から60塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、または20から40までのオリゴヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築における使用を目的として一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識などの標識を含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。単離核酸分子とは、ゲノムのDNAまたはRNA、mRNA、cDNA、または単離ポリヌクレオチドが天然に見られるそのポリヌクレオチドの全てまたは一部に関連していないか、または天然で結合しないポリヌクレオチドに結合している合成起源またはその幾つかの組合せを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当然のことながら無処置の染色体を包含しない。特定の核酸配列を含む単離核酸分子は、特定の配列に加えて、10まであるいはさらに20までの他のタンパク質またはその一部に関するコード配列を含み得るか、または挙げられた核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に結合された調節配列を含み得、および/またはベクター配列を含み得る。別に特定されない限り、本明細書で考察された任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向の末端は5’末端であり;二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は5’方向と称される。新生RNA転写体の5’から3’方向の付加は、転写方向と称され;RNA転写体の5’に対して5’末端である、RNA転写体と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、上流配列と称され;RNA転写体の3’に対して3’末端である、RNA転写体と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、下流配列と称される。用語の制御配列とは、結合するコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を称す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に関する制御配列としては、プロモータ、リボソーム結合部位、および転写末端配列を挙げることができる。例えば、真核生物に関する制御配列としては、転写因子に対する1つまたは複数の認識部位を含むプロモータ類、転写エンハンサー配列、および転写末端配列を挙げることができる。本発明による制御配列は、リーダー配列および/または融合パートナー配列を含むことができる。用語のベクターとは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子または物質例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウィルスを意味する。用語の発現ベクターまたは発現構築体とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、作動可能にそれに結合した1つ以上の異種コード領域の発現を方向付けおよび/または制御する核酸配列を含有するベクターを称す。発現構築体としては、限定はしないが、転写、翻訳に影響を及ぼすか、または制御し、イントロンが存在する場合は、作動可能にそれに結合したコード領域のRNAスプライシングに影響を及ぼす配列を挙げることができる。本明細書に用いられる作動可能に連結したとは、該用語が適用される成分が、好適な条件下でそれらの固有の機能を実施できる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合した条件下で達成されるように、タンパク質コード配列に作動可能に連結したベクター中の制御配列はタンパク質コード配列に結合している。用語の宿主細胞とは、核酸配列により変換されているか、または変換されることが可能であり、それによって対象となっている遺伝子を発現する細胞を意味する。該用語は、対象となっている遺伝子が存在する限り、後代が、形態において、または遺伝子組立てにおいて元の親細胞と同一であっても同一でなくても、親細胞の後代を含む。用語の形質導入とは、通常はバクテリオファージにより一細菌から別の細菌への遺伝子の移行を意味する。形質導入はまた、レトロウィルスによる真核細胞配列の獲得および移行を称す。用語のトランスフェクションとは、細胞による外来または外因性DNAの取込みを意味し、外因性DNAが細胞膜内に導入された場合に細胞はトランスフェクトされている。多数のトランスフェクション技法が当業界に周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Grahamら、1973年、Virology52:456頁;Sambrookら、2001年、MolecularCloning:ALaboratoryManual、同文献;Davisら、1986年、BasicMethodsinMolecularBiology、Elsevier;およびChuら、1981年、Gene13:197頁を参照されたい。このような技法は、1つ以上の外因性DNA部分を好適な宿主細胞を導入するために使用できる。用語の形質転換とは、細胞の遺伝子特性の変化を称し、細胞が改変されて、新規なDNAまたはRNAを含有した場合に細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技法を介して新規な遺伝子材料を導入することにより、その天然状態から遺伝子的に改変されている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換DNAは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによりその細胞のDNAと組換えできるか、または複製されることなくエピソーム構成要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製できる。形質転換DNAが、細胞分裂により複製される場合に、細胞は安定に形質転換されたと考えられる。用語のポリペプチドまたはタンパク質とは、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子、すなわち、天然細胞および非組換え細胞により産生されるか、または遺伝子工学的にまたは組換え細胞により産生されて、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の1つまたは複数のアミノ酸の欠失、添加、および/または置換を有する分子を含むタンパク質を意味する。用語のポリペプチドおよびタンパク質は、特に抗Dkk-1抗体、または抗Dkk-1抗体の1つまたは複数のアミノ酸の欠失、添加、および/または置換を有する配列を包含する。用語のポリペプチドフラグメントとは、完全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および/または内部欠失のあるポリペプチドを称す。このようなフラグメントはまた、天然タンパク質と比較して、修飾アミノ酸を含有できる。一定の実施形態において、フラグメントは、約5から500のアミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくとも5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400、または450のアミノ酸長であり得る。本発明に有用なポリペプチドフラグメントは、結合ドメインを含む抗体の免疫機能性フラグメントを含む。抗Dkk-1抗体の場合、有用なフラグメントとしては、限定はしないが、CDR領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、2つのCDRを含む抗体鎖の一部またはその可変領域のみが挙げられる。本明細書に称される用語の単離タンパク質とは、対象タンパク質が、1通常見られると考えられる少なくとも幾つかの他のタンパク質がないか、2同じ起源、例えば、同じ種からの他のタンパク質が本質的にないか、3いろいろな種の細胞により発現されるか、4少なくとも約50パーセントのポリヌクレオチド類、脂質類、炭水化物類、または天然関連の他の材料から分離されているか、5天然とは関連していないポリペプチドと作動可能共有または非共有相互作用によりで結合しているか、または6天然に生じない、ことを意味する。合成起源のゲノムDNA、cDNA、mRNAまたは他のRNA、またはそれらの任意の組合せは、このような単離タンパク質をコードできる。単離タンパク質には、その治療的、診断的、予防的研究または他の使用を妨害すると考えられる、その天然環境に見られるタンパク質もしくはポリペプチド類または他の混入物が実質的に無いことが好ましい。ポリペプチド例えば、抗体の変異体は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に比してアミノ酸配列に挿入され、アミノ酸配列から欠失され、および/またはアミノ酸配列が置換されるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドの誘導体は、例えば、別の化学部分との結合を経て、挿入、欠失、または置換変異体とはいくらか異なる様式で化学的に修飾されているポリペプチド例えば、抗体である。用語の抗体とは、標的抗原との特異的結合に関して無処置抗体と競合でき、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む任意のイソタイプの無処置免疫グロブリン、またはそのフラグメントを称す。無処置抗体は、一般的に少なくとも2本の完全長重鎖および2本の完全長軽鎖を含むが、重鎖のみを含み得るラクダ科の天然抗体などの幾つかの場合においては、より少数の鎖を含み得る。本発明による抗体は、単独源のみに由来するか、あるいはキメラであってもよい。すなわち、抗体の種々の部分が、2つの異なる抗体に由来し得る。例えば、CDR領域は、ラット源またはマウス源に由来し、一方、V領域のフレームワーク領域は、ヒトなどの異なる動物源に由来し得る。本発明の抗体または結合フラグメントは、組換えDNA技法、または無処置抗体の酵素的または化学的開裂によりハイブリドーマにおいて作製できる。別に指定されない限り、用語の抗体は、2本の完全長重鎖および2本の完全長軽鎖に加えて、それらの誘導体、変異体、フラグメント、および突然変異タンパク質を含み、その例は、以下に記載されている。用語の軽鎖は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、VL、および定常領域ドメイン、CLを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドの網の末端にある。本発明による軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。用語の重鎖は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、VH、および3つの定常領域ドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含む。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインはカルボキシル末端にあり、CH3は-COOH末端に最も近接している。本発明による重鎖は、IgGIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のサブタイプを含む、IgAIgA1およびIgA2のサブタイプを含む、IgMおよびIgEなど、任意のイソタイプのものであり得る。本明細書に用いられる用語、免疫グロブリン鎖の免疫機能性フラグメントまたは単にフラグメントとは、完全長鎖に存在するアミノ酸のうち少なくとも幾つかを欠くが、抗原に特異的に結合できる抗体軽鎖または重鎖を称す。このようなフラグメントは、標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープに対する特異的な結合に関して無処置抗体と競合できる点で生物学的に活性である。本発明の一態様において、このようなフラグメントは、完全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、幾つかの実施形態において、重単鎖および/または軽単鎖またはそれらの一部を含む。これらの生物学的に活性なフラグメントは、組換えDNA技法により作製でき、あるいは無処置抗体の酵素的または化学的開裂により作製できる。本発明の免疫機能性免疫グロブリンフラグメントとしては、限定はしないが、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、ドメイン抗体および単鎖抗体が挙げられ、限定はしないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギなどの任意の哺乳動物源に由来し得る。本発明の抗体の機能性部分、例えば、1つまたは複数のCDRを、第2のタンパク質または小型の分子に共有結合させて、二機能性治療特性を有するか、または血清中半減期の延長性を有する、体内における特定の標的に特異的な治療剤創製の可能性がさらに考慮されている。Fabフラグメントは、1本の軽鎖およびC1Hならびに1本の重鎖の可変領域からなる。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。Fc領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む2本の重鎖フラグメントを含有する。2本の重鎖フラグメントは、2つ以上のジスルフィド結合およびCH3ドメインの疎水性相互作用により一緒に保持される。Fab’フラグメントは、1本の軽鎖ならびにVHドメインとCH1ドメイン、およびCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域を含む1本の重鎖の一部を含有する結果、2つのFab’フラグメントの2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成でき、Fab’2分子が形成される。Fab’2フラグメントは、2本の軽鎖ならびに、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常領域の一部を含有する結果、2本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Fab’2フラグメントは、2本の重鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持される2つのFab’フラグメントを含む。Fv領域は、重鎖および軽鎖双方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。単鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変領域が屈曲性リンカーにより結合して、単ポリペプチド鎖を形成し、これが抗原結合領域を形成しているFv分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第88/01649号、米国特許第4,946,778号および米国特許第5,260,203号に詳細に考察されており、それらの開示は、参照として組み込まれている。ドメイン抗体は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫機能性免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合において、二価ドメイン抗体を創製するために、2つ以上のVH領域をペプチドリンカーによって共有結合させる。二価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同じ抗原でも異なる抗原でも標的にできる。二価抗体は、2つの抗原結合部位を含む。幾つかの場合において、2つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であり得る下記参照。多重特異性は、1つ超の抗原またはエピトープを標的にするものである。二重特異性、デュアル二相特異性または二機能性抗体は、2つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、多重特異性抗体の一種であり、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの結合などの種々の方法により生産できる。例えば、SongsivilaiLachmann1990、Clin.Exp.Immunol.79:315-321頁;Kostelnyら1992、J.Immunol.148:1547-1553頁を参照されたい。二重特異性抗体の2つの結合部位は、同一かまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る2つの異なるエピトープに結合する。用語の中和抗体とは、リガンドに結合し、その結合パートナーに対するリガンドの結合を妨げ、そうでない場合には、その結合パートナーに対するリガンド結合から生じるであろう生物学的応答を妨害する抗体を称する。抗体またはその免疫機能性フラグメントの結合性および特異性の評価において、過剰の抗体が、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、97、99またはそれ以上インビトロでの競合的結合アッセイにて測定された、リガンドに結合した結合パートナーの量を減少させる場合、抗体またはフラグメントは、その結合パートナーへのリガンド結合を実質的に阻害することになる。Dkk-1に対する抗体類の場合、中和抗体は、LRP5またはLRP6に結合するDkk-1の能力を減少させることによって、Wnt活性の測定可能な増加を誘導する。同一のエピトープに対して競合する抗体の文脈で用いられる用語の競合するとは、抗体間での競合を意味し、試験下での抗体または免疫機能性フラグメントが、共通の抗原例えば、Dkk-1またはそのフラグメントへの参照抗体の特異的結合を防止するか、または阻止するアッセイによって判定される。以下の多数のタイプの競合的結合アッセイが使用できる。例えば:固相の直接的または間接的放射免疫アッセイRIA、固相の直接的または間接的酵素免疫アッセイEIA、サンドイッチ競合アッセイ例えば、Stahliら1983MethodsinEnzymology9:242-253頁を参照;固相の直接的ビオチン-アビジンEIA例えば、Kirklandら、1986J.Immunol.137:3614-3619頁を参照;固相の直接的標識アッセイ、固相の直接的標識サンドイッチアッセイ例えば、HarlowandLane1988Antibodies,ALaboratoryManual、ColdSpringHarbourPressを参照;I-125を用いた固相の直接的標識RIA;固相の直接的ビオチン-アビジンEIA例えば、Cheungra1990Virology176:546-552頁を参照;固相の直接的標識アッセイRIA例えば、Modenhauerら、1990Scand.J.Immunol.32:77-82頁を参照。典型的に、このようなアッセイは、固相表面に結合させた精製抗原またはこれらのいずれかを有する細胞、未標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下、固相表面に結合させた標識または細胞の量を判定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイによって確認された抗体競合抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および立体障害を発生する上で、参照抗体により結合したエピトープに十分近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。競合結合性を判定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、少なくとも40、45、50、55、60、65、70または75、共通抗原への参照抗体の特異的結合を阻害する。幾つかの場合、結合は、少なくとも80、85、90、95、97またはそれ以上阻害される。用語の抗原とは抗体などの選択的結合剤により結合することができ、さらにその抗原に結合できる抗体を産生するために、動物に使用できる分子または分子の一部を称す。抗原は、異なる抗体と相互作用できる1つまたは複数のエピトープを有することができる。用語のエピトープは、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは、その抗原を特異的に標的とする抗体が結合する抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。多くの場合、エピトープは、タンパク質上に存在するが、幾つかの場合、核酸など他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定因子としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を挙げることができ、特定の三次元構造特性、および/または特定の荷電特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および/または高分子の複合体混合物における標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。本発明の抗体は、解離定数kdが≦10-8Mである場合、その標的抗原に特異的に結合すると言われる。該抗体は、kdが≦10-9Mである場合、高親和性で、kdが≦10-10Mである場合、超高親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、10-9Mのkdおよび約1×10-4/秒のオフレートを有する。本発明の一実施形態において、該オフレートは<1×10-5である。本発明の他の実施形態において、抗体は、10-8Mと10-10Mとの間のkdでヒトDkk-1に結合し、さらに他の実施形態において、kd≦2×10-10Mで結合する。用語の同一性とは、配列のアラインメントおよび比較によって判定された2つ以上のポリペプチド分子間の関係、あるいは2つ以上の核酸分子間の関係を称す。同一性パーセントとは、比較された分子におけるアミノ酸間またはヌクレオチド間で同一残基のパーセントを意味し、比較されている最小の分子のサイズに基づいて算出される。これらの算出のために、アラインメントおけるギャップもしあればは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラムすなわち、アルゴリズムにより処理しなければならない。アラインメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために用いることのできる方法としては、ComputationalMolecularBiology、Lesk,A.M.編集、1988年、ニューヨーク:オックスフォード大学プレス;BiocomputingInformaticsandGenomeProjects、Smith,D.W.編集、1993年、ニューヨーク:AcademicPress;ComputerAnalysisofSequenceData,PartI、Griffin,A.M.andGriffin,H.G.編集、1994年、ニュージャージー州:HumanaPress;vonHeinje,G.、1987年、SequenceAnalysisinMolecularBiology、ニューヨーク:AcademicPress;SequenceAnakysisPrimer、Gribskov,MandDevereux,J編集、1991年、ニューヨーク:M.StocktonPress;およびCarilloら、1988年、SLAMJ.AppliedMath.48:1073頁に記載されたものが挙げられる。同一性パーセントの算出において、比較されている配列は、配列間で最大のマッチが得られる方法でアラインメントされる。同一性パーセントを判定するために用いられるコンピュータプログラムは、GAPを含むGCGプログラムのパッケージであるDevereuxら、1984年、NuvlAcidRes12:387頁;GeneticsComputerGroup、ウィスコンシン大学、マジソン、ウィスコンシン州。配列同一性パーセントを判定する予定の2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントするためにコンピュータアルゴリズムGAPが用いられる。配列は、それら個々のアミノ酸またはヌクレオチドの最適マッチングアルゴリズムにより判定されるマッチドスパンのためにアラインメントする。ギャップオープニングペナルティ3X平均対角線として算出され、平均ダイアゴナルとは、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり;ダイアゴナルとは、特定の比較マトリックスにより各々の完全アミノ酸マッチに割り当てられたスコアまたは数であるおよびギャップ延長ペナルティ通常ギャップオープニングペナルティの1/10倍である、ならびにPAM250またはBLOSUM62などの比較マトリックスが、該アルゴリズムに関連して用いられる。一定の実施形態において、標準比較マトリックスPAM250の比較マトリックスに関しては、Dayhoffら、1978年、AtlasofProteinSequenceandStructure5:345-352頁;BLOSUM62の比較マトリックスに関しては、Henikoffら、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919頁を参照もまた、該アルゴリズムにより用いられる。GAPプログラムを用いてポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列に関する同一パーセントを判定するための推奨されるパラメータは以下のものである:アルゴリズム:Needlemanら、1970年、J.Mol.Biol.48:443-453頁;比較マトリックス:HemikoffらのBLOSUM62、1992年、上記文献;ギャップペナルティ:12しかし、エンドギャップに関してペナルティはないギャップ長ペナルティ:4類似性の閾値:0。2つのアミノ酸配列をアラインメントするための一定のアラインメント方式では、2つの配列の短い領域だけのマッチングが生じ得、この小さなアラインメントされた領域は、たとえ2つの完全長配列間に有意な関係がなくても、極めて高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアラインメント法GAPプログラムは、それが望ましいならば、標的ポリペプチドの少なくとも50の連続アミノ酸に及ぶアラインメントが生じるように調整できる。本明細書に用いられる実質的に純粋とは、記載された分子種が存在している優占種であること、すなわち、同じ混合物において、それが他の個々の種よりもモル基準で豊富であることを意味する。一定の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも50モル基準でを含む組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全ての高分子種のうち少なくとも80、85、90、95、または99を含む。他の実施形態において、対象種は本質的に均一に精製され、従来の検出法により混入種を組成物中に検出できず、したがって該組成物が、検出可能な単一の高分子種からなる。用語の骨減少症とは、正常な骨塩量BMDを有すると考えられる標準的患者と比較して少なくとも1つの標準偏差の骨喪失患者を称す。当目的のために、該測定は、二重エネルギーX線吸収測定法DEXAにより判定され、患者のBMDを、年齢と性別対応基準Zスコアと比較する。骨減少症を判定する上で、BMD測定は、1つまたは複数の骨からとることができる。用語の治療的有効量とは、哺乳動物において治療応答を生じさせると判定された抗Dkk-1抗体量を称す。このような治療的有効量は、通常の当業者により容易に確認される。アミノ酸は、当業界におけるその通常の意味を含む。20種の天然アミノ酸およびそれらの略語は、従来の使用法に従う。任意の目的のために参照として本明細書に組み込まれている、Immunology--ASynthesis、第2版、編集者E.S.GolubandD.R.Gren、SinauerAssociate:サンダーランド、マサチューセッツ州1991を参照されたい。20種の従来のアミノ酸、α-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、および他の非慣例的アミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体例えば、D-アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに好適な成分であり得る。非慣例的アミノ酸の例としては:4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、および他の同様なアミノ酸ならびにイミノ酸例えば、4-ヒドロキシプロリンが挙げられる。本明細書に用いられるポリペプチド表記法において、標準的使用法および慣例に従って左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシ末端方向である。II.概要本発明は、Dkk-1に特異的な免疫グロブリンの抗体および抗原結合部位を含む新規な組成物例えば、配列番号2のアミノ酸32から266までからなるポリペプチドまたは配列番号4のアミノ酸32から272までからなるポリペプチドを提供する。これらの抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ラット、マウスおよびヒトのDkk-1など、幾つかの哺乳動物源と交差反応し得る。これらの抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ある種のDkk-1に対して他の種Dkk-1に対するよりも高い親和性を有する例えば、抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ラットまたはマウスDkk-1と比較してヒトDkk-1に、より高い親和性を有し;他の抗体は、ヒトDkk-1と比較してラットまたはマウスDkk-1に、より高い親和性を有する。本発明はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体などの新規な中性抗体、ならびにヒトDkk-1における立体配座エピトープに結合する抗体およびその免疫機能性フラグメントを提供する。抗体およびフラグメントをコードする核酸も開示し、ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現する方法も開示する。別の態様において、本発明は、抗体抗原結合部位の免疫結合特性を示すことができる分子例えば、免疫機能性フラグメントおよびポリペプチド類に関する。本明細書に開示される抗体および免疫機能性フラグメントは、種々の有用性を有する。抗体およびフラグメントの幾つかは、例えば、特異的な結合アッセイ、Dkk-1またはそのリガンドのアフィニティー精製、およびDkk-1活性の他のアンタゴニストを確認するためのスクリーニングアッセイに有用である。抗体のうちの幾つかは、Dkk-1の活性に関連する種々の疾患を治療するために使用できる。したがって幾つかの抗体およびフラグメントは、骨塩密度の増加、新規骨の合成、全身骨喪失例えば、骨侵食の治療、骨修復、および種々の形態の関節炎などの骨に関する種々の治療に使用できる。幾つかの抗体はまた、溶骨細胞活性を増加させ、骨吸収を誘導させるために使用できる。しかしながら、開示される抗体およびフラグメントのうちの幾つかは、骨疾患に無関係である種々の疾患を治療するために使用できる。下記でより詳細に記載されるように、このような疾患の例としては、幹細胞の再生促進が望ましいもの例えば、糖尿病および筋肉疾患、炎症性疾患例えば、クローン病および炎症性腸疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、および種々の皮膚疾患が挙げられる。III.抗体および免疫機能性フラグメントDkk-1活性を調節するのに有用な種々の選択的結合剤を提供する。これらの薬剤としては、例えば、抗原結合ドメイン例えば、単鎖抗体類、ドメイン抗体類、免疫接着剤、および抗原結合領域を有するポリペプチド類を含有し、特にDkk-1ポリペプチド例えば、ヒト、ラットおよび/またはマウスDkk-1ポリペプチドに結合する抗体および免疫機能性フラグメントが挙げられる。該薬剤の幾つかは、例えば、Dkk-1のLRP5および/またはLRP6への結合を阻害するのに有用であり、したがってWntシグナル伝達に関連する1つまたは複数の活性を刺激するために使用できる。A.天然抗体の構造提供される結合剤の幾つかは、典型的に天然抗体に関連した構造を有する。これら抗体の構造単位は、典型的に1つまたは複数の四量体を含んでなり、その各々は、2つの同一対のポリペプチド鎖から構成されているが、哺乳動物の幾つかの種は、重単鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体において、各々の組または対は、1つの完全長軽鎖一定の実施形態において約25kDaおよび1つの完全長重鎖一定の実施形態において約50~70kDaを含む。それぞれ個々の免疫グロブリン鎖は、幾つかの免疫グロブリンドメインから構成され、その各々は凡そ90から110のアミノ酸からなり、特徴的な折たたみパターンを発現する。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成している塩基単位である。各鎖のアミノ末端部は、典型的に抗原認識を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部は、その鎖の他の末端よりも進化的に保存され、定常領域またはC領域と称される。ヒトの軽鎖は、一般的にカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類され、これらの各々が、1つの可変ドメインおよび1つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的にミュー鎖、デルタ鎖、ガンマ鎖、アルファ鎖、またはイプシロン鎖として分類され、これらは、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして抗体のイソタイプを定義する。IgGは、限定はしないが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4など、幾つかのサブタイプを有する。IgMサブタイプとしては、IgM1およびIgM2が挙げられる。IgAサブタイプとしては、IgA1およびIgA2が挙げられる。ヒトにおけるIgAおよびIgDイソタイプは、4本の重鎖および4本の軽鎖を含有し;IgGおよびIgEイソタイプは、2本の重鎖および2本の軽鎖を含有し;IgMイソタイプは、5本の重鎖および5本の軽鎖を含有する。重鎖C領域は、典型的にエフェクター機能を担い得る1つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域のドメイン数は、イソタイプに依存する。IgG重鎖において、各々は、例えば、CH1、CH2およびCH3として知られている3つのC領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有し得る。本発明の一定の実施形態において、抗Dkk-1抗体は、IgG1、IgG2またはIgG4サブタイプのものである。完全長の軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は約12以上のアミノ酸のJ領域により結合しており、重鎖はまた約10以上のアミノ酸のD領域を含む。例えば、FundamentalImmunology、第2版、7章Paul,W.編集1989年、ニューヨーク:RavenPress全ての目的のために参照としてその全体が本明細書に組み込まれているを参照されたい。各軽鎖/重鎖対の可変領域は、典型的に抗原結合部位を形成する。免疫グロブリン鎖の可変領域は、しばしば相補性決定領域またはCDRと呼ばれる、3つの高度可変領域により結合されている比較的保存されたフレームワーク領域FRを含む一般に同じ全体構造を示す。上記の各重鎖/軽鎖対の2本鎖CDRは、標的タンパク質上の特定のエピトープ例えば、Dkk-1と特異的に結合する構造を形成するためにフレームワーク領域により典型的にアラインメントされる。N末端からC末端にかけて、天然軽鎖および重鎖可変領域の双方は、典型的に以下の順序のこれら要素:FR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4と一致する。これらドメインの各々における位置を占有するアミノ酸に対して番号を割り当てるためにナンバリングシステムが考案されている。このナンバリングシステムは、KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest1987年および1991年、NationalInstitutesofHealth、ベセスダ、メリーランド州、またはChothiaLesk、1987年、J.Mol。Biol.196:901-917頁;Chothiaら、1989年、Nature342:878-883頁に定められている。提供される幾つかの抗体の完全長の軽鎖および重鎖ならびに対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の具体例は、表1に要約されている。表1に挙げられた各々の軽鎖を、表1に示された任意の重鎖と組合せて抗体を形成できる。このような組合せの例としては、H1~H10と結合したL1、またはH1~H10と結合したL2およびH1~H10と結合したL3すなわち、L1H1、L1H2、L1H3、L1H4、L1H5、L1H6、L1H7、L1H8、L1H9、L1H10、L2H1、L2H2、L2H3、L2H4、L2H5、L2H6、L2H7、L2H8、L2H9、L2H10、L3H1、L3H2、L3H3、L3H4、L3H5、L3H6、L3H7、L3H8、L3H9、およびL3H10が挙げられる。幾つかの場合において、抗体には、表1に挙げられたものからの、少なくとも1本の重鎖および1本の軽鎖を含む。他の場合において、抗体は、2本の重鎖および2本の軽鎖を含む。例として、抗体または免疫機能性フラグメントとしては、2本のL1軽鎖および2本のH1重鎖、または2本のL2軽鎖および2本のH3重鎖、または2本のL軽鎖および2本のH4重鎖または2本のL2および2本のH5重鎖、および表1に掲げられた軽鎖対および重鎖対の他の同様の組合せを挙げることができる。このような抗体の具体例として、一実施形態において、抗Dkk-1抗体は、ラットに由来するモノクローナル抗体である。前述の立体配座エピトープに結合できる代表的な抗体は、モノクローナル抗体11H10および1F11下記の例を参照であり、その各々が軽鎖および重鎖を含む。11H10の完全軽鎖は、配列番号9に示されるヌクレオチド配列によりコードされ、また11H10の完全重鎖は、配列番号11に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。11H10の対応する軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号10と12に示される。配列番号10の残基1~20および配列番号12の残基1~19は、それぞれ11H10の軽鎖および重鎖これらのシグナル配列に対応する。シグナル配列のない軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号82に示され;シグナル配列を欠いている重鎖のアミノ酸配列は、配列番号89に示される。このように、前述の実施形態の一態様において、重鎖は、配列番号12のアミノ酸20~465すなわち、配列番号89に相当するH1からなり得、また本実施形態の別の態様において、軽鎖は、配列番号10のアミノ酸21~234すなわち、配列番号82に相当するL1からなり得る。本実施形態の別の態様において、抗体は、配列番号12のアミノ酸20~465からなる重鎖および配列番号10のアミノ酸21~234からなる軽鎖の双方を含む。幾つかの場合において、抗体は、各々が配列番号12のアミノ酸20~465からなる2本の同一重鎖、および各々が配列番号10のアミノ酸21~234からなる2本の同一軽鎖からなる。別の具体的な例は、軽鎖L2配列番号26および重鎖配列番号34を含む抗体である。これらの軽鎖およぼ重鎖のコード配列は、それぞれ配列番号25と33に表される。これらの抗体は、2本の同一重鎖および軽鎖を含むことができる。表1に掲げた他の重鎖および軽鎖は、同様の様式で組合わせることができる。提供される他の抗体は、表1に示された重鎖および軽鎖の組合わせにより形成された抗体の変異体であり、これら鎖のアミノ酸配列に対して各々が、少なくとも、70、75、80、85、90、95、97または99同一性を有する軽鎖および/または重鎖を含む。幾つかの場合において、このような抗体は、少なくとも1本の重鎖および1本の軽鎖を含むが、一方、他の場合において、このような変異体は、2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖を含有する。B.抗体の可変ドメイン表2に示されるVL1、VL2、VL3よりなる群から選択される軽鎖可変領域および/またはVH1~VH10よりなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗体、これら軽鎖および重鎖可変領域の免疫機能性フラグメント、誘導体、突然変異タンパク質および変異体も提供される。このタイプの抗体は、一般に式VLxVHyにより表示でき、表1に掲げたように式中xは、軽鎖可変領域の数であり、yは、重鎖可変領域の数に相当する。一般にxおよびyは、それぞれ1または2である。したがって、VL2VH1は、VL2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ドメインおよびVH1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体を称す。したがって提供される抗体としては、限定はしないが、以下の形態を有するものが挙げられる:VL1VH1、VL1VH2、VL1VH3、VL1VH4、VL1VH5、VL1VH6、VL1VH7、VL1VH8、VL1VH9、VL1VH10、VL2VH1、VL2VH2、VL2VH3、VL2VH4、VL2VH5、VL2VH6、VL2VH7、VL2VH8、VL2VH9、VL2VH10、VL3VH1、VL3VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL3VH5、VL3VH6、VL3VH7、VL3VH8、VL3VH9、およびVL3VH10。幾つかの場合において、前述の抗体は、2つの軽鎖可変領域ドメインおよび2つの重鎖可変領域ドメイン例えば、VL12VH12などを含む。このような抗体の具体例として、ある一定の抗体またはその免疫機能性フラグメントは、11H10の軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含んでなり、該軽鎖可変領域は、配列番号10のアミノ酸21~127すなわち、配列番号84に相当するVL1からなり、該重鎖可変領域は、配列番号12のアミノ酸20~139すなわち、配列番号91に相当するVH1からなる。本実施形態の一態様において、抗体は、2本の同一重鎖および2本の同一軽鎖からなる。例えば、配列番号10のアミノ酸21~127からなる軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合抗体もしくはその免疫機能性フラグメントを含んでなり、さらに配列番号12のアミノ酸20~139からなる重鎖可変領域を含む抗体も提供される。ある一定の抗体は、L1、L2またはL3から選択される軽鎖可変ドメインの配列とは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15のアミノ酸残基だけが異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなり、このような配列各々の相違は、独立して1つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。幾つかの抗体における軽鎖可変領域は、VL1、VL2またはVL3の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも、70、75、80、85、90、95、97または99同一性を有するアミノ酸配列を含む。提供される幾つかの抗体は、H1~H10から選択される重鎖可変ドメインの配列とは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15のアミノ酸残基だけが異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなり、このような配列各々の相違は、独立して1つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。幾つかの抗体における重鎖可変領域は、VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも、70、75、80、85、90、95、97または99同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の抗体または免疫機能性フラグメントは、いま記載した変異体軽鎖および変異体重鎖の変異体形態を含む。C.抗体のCDR所与の抗体の相補性決定領域CDRおよびフレームワーク領域FRは、Kabatら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、米国厚生省、PHS、NIH、NIH刊行番号91-3242、1991年に記載されたシステムを用いて同定できる。本明細書に開示される一定の抗体は、表3にまとめた1つまたは複数のCDRのアミノ酸配列と同一か、または実質的に配列同一性を有する1つまたは複数のアミノ酸を含む。提供される抗体および免疫機能性フラグメントは、上記に掲げた複数CDRのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含むことができる。幾つかの抗体またはフラグメントは、軽鎖CDR3および重鎖CDR3の双方を含む。ある一定の抗体は、CDRの表3に掲げたCDRの変異体を有し、1つまたは複数例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの各々は、表3に掲げたCDRと少なくとも80、85、90または95の配列同一性を有する。例えば、抗体またはフラグメントは、各々が、表3に掲げた、軽鎖CDR3および重鎖CDR3それぞれと少なくとも80、85、90または95の配列同一性を有する軽鎖CDR3および重鎖CDR3の双方を含むことができる。任意の所与のCDRに関するアミノ酸配列が、1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのアミノ酸残基のみ表3に掲げた配列と異なるように、提供される幾つかの抗体のCDR配列は、表3に掲げたCDR配列と異なり得る。掲げた配列との相違は、通常は保存的置換である下記参照。具体例として、提供される抗体および免疫機能性フラグメントは、11H10軽鎖から以下のCDR配列の1つまたは複数を含むことができる:CDR1:配列番号10のアミノ酸44~54、これはまた配列番号70配列番号9のヌクレオチド130~162配列番号85または配列番号69によりコード化されたにも相当する;CDR2:配列番号10のアミノ酸70~76、これはまた配列番号72配列番号9のヌクレオチド208~228配列番号86または配列番号71によりコード化されたにも相当する;CDR3:配列番号10のアミノ酸109~117、これはまた配列番号74配列番号9のヌクレオチド325~351配列番号87または配列番号73によりコード化されたにも相当する;本発明のさらなる抗体および免疫機能性フラグメントは、11H10重鎖から以下のCDR配列の1つまたは複数を含むことができる:CDR1:配列番号12のアミノ酸50~54、これはまた配列番号76配列番号11のヌクレオチド148~162配列番号92または配列番号75によりコード化されたにも相当する;CDR2:配列番号12のアミノ酸69~85、これはまた配列番号78配列番号11のヌクレオチド205~255配列番号93または配列番号77によりコード化されたにも相当する;CDR3:配列番号12のアミノ酸118~128、これはまた配列番号80配列番号11のヌクレオチド352~384配列番号94または配列番号79によりコード化されたにも相当する。1つまたは複数の軽鎖または重鎖CDRを含むポリペプチド類は、さらに詳細に下記に記載される好適な宿主細胞においてポリペプチドを発現するために好適なベクターを用いることにより生産できる。表2および表3に開示されている重鎖および軽鎖可変領域および複数CDRは、限定はしないが、ドメイン抗体、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体およびscFvsなど、当業界に公知である任意の種々のタイプの免疫機能性フラグメントのいずれかを調製するために使用できる。D.抗体および結合エピトープ抗体が、Dkk-1などの特定の残基内のエピトープに結合される場合、例えば、該抗体は、特定の残基からなるポリペプチドに特異的に結合することを意味する。このような抗体は、必ずしもDkk-1内の全ての残基と接触するとは限らない。また、Dkk-1内の単一のアミノ酸の置換または削除の全てが、必ずしも結合親和性に有意な影響を及ぼすとは限らない。抗体のエピトープ特異性は、種々の方法で測定できる。例えば、1つのアプローチは、Dkk-1配列の範囲にある約15のアミノ酸の重なりペプチドの集合、および少数のアミノ酸例えば、3つのアミノ酸の増分の相違を試験することを含む。該ペプチドを、マイクロタイター皿のウェル内に固定化する。固定は、該ペプチドの1つの末端をビオチン化することにより達成することができる。任意に同じペプチドの異なるサンプルを、N末端およびC末端でビオチン化し、比較目的のために別々のウェル内で固定化できる。これは、末端特異的抗体を確認するために有用である。任意にさらなるペプチドを含めて、対象の特定アミノ酸で終結させることができる。このアプローチは、Dkk-1の内部フラグメントに対する末端特異的抗体を確認するために有用である。抗体または免疫機能性フラグメントは、種々のペプチドの各々に対する特異的結合に関してスクリーニングされる。エピトープは、抗体が特異的結合を示す全てのペプチドに共通であるアミノ酸のセグメントによって生じるものとして確定される。エピトープを確定する具体的なアプローチに関する詳細は、実施例6に記載されている。Dkk-1のカルボキシ末端部に位置する立体配座エピトープに結合する抗体およびその免疫機能性フラグメント図1を参照もまた提供される。Dkk-1のカルボキシ末端は、幾つかのループを創製するジスルフィド結合のクラスターを形成する幾つかのシステイン残基を含有する。本発明は、これらのループのうちの2つに結合することによって、Dkk-1の能力を中和し、Wnt活性を抑制する抗体を提供する。前述の立体配座エピトープに結合できる代表的な抗体は、モノクローナル抗体11H10および1F11であり、それらは各々、軽鎖および重鎖を含む。11H10の完全軽鎖は、配列番号9に示されたヌクレオチド配列によりコード化され、11H10の完全重鎖は、配列番号11に示されたヌクレオチド配列によりコード化される。11H10の対応する軽鎖および重鎖アミノ酸配列シグナル配列を含むは、それぞれ配列番号10と12に示される。シグナル配列のない成熟形態は、配列番号82と89に相当する。これら2つのループを含むエピトープは、配列番号2のシステイン残基220と237との間、また配列番号2のシステイン残基245と263との間のジスルフィド結合により形成される。したがって、エピトープを形成する2つのループの本体は、配列番号2のアミノ酸221~236および246~262を含む。結合に関与するこのループ内のセグメントは、配列番号2のアミノ酸221~229および配列番号2のアミノ酸246~253を含む。このように本明細書に提供される一定の抗体およびフラグメントは、前述の領域に特異的に結合する。抗体およびフラグメントの幾つかは、例えば、配列番号2のアミノ酸221から262を含むか、またはそれらからなるペプチドに結合する。本発明の一態様において、配列番号2のアミノ酸221~229および/または246~253を含むか、またはそれらからなるペプチドが提供される。他のペプチドは、配列番号2のアミノ酸221~236および/または246~262を含むか、またはそれらからなる。さらに提供される他のペプチドは、配列番号2のアミノ酸221~262の領域および/または配列番号2のアミノ酸221~253の領域を含むか、またはそれらからなる。このようなペプチドは、天然のDkk-1の完全長タンパク質配列よりも短い例えば、ペプチドは、1つまたは複数の前述の領域を含み得、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、30、40、50、75、100、150、または200のアミノ酸長であり得る。これらのペプチド類は、免疫原性を増加させるために別のペプチドに融合させることができ、したがって融合タンパク質の形態であり得る。E.競合抗体Dkk-1に対する特異的結合に関して例示の抗体または機能性フラグメントの1つと競合する抗体およびそれらの免疫機能性フラグメントもまた提供される。このような抗体およびフラグメントはまた、例示の抗体のエピトープと同じエピトープに結合し得る。例示の抗体またはフラグメントと同じエピトープと競合するか、または結合する抗体およびフラグメントは、同様な機能的特性を示すと考えられる。例示の抗体およびフラグメントとしては、表1~3に挙げられた重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびCDRを有するものを含め、上記のものが挙げられる。競合抗体または免疫機能性フラグメントとしては、上記の抗体およびエピトープの節に記載されたエピトープに結合するものを挙げることができる。具体的一例として、いくつかの競合抗体またはフラグメントとしては、配列番号2のアミノ酸36から266、または配列番号4のアミノ酸32から272からなるDkk-1タンパク質に特異的に結合し、配列番号12のアミノ酸20から465からなる2本の同一重鎖、および配列番号10のアミノ酸21から234からなる2本の同一軽鎖からなる抗体の、ヒトDkk-1に対する結合を防止または減少させることができるものが挙げられる。他の競合抗体は、表1に挙げられたものなどの、2本の同一重鎖および2本の同一軽鎖からなる抗体の、ヒトDkk-1に対する結合を防止または減少させる。F.モノクローナル抗体提供される抗体には、Dkk-1に結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて、例えば、免疫化スケジュール完了後、形質転換動物から採取した脾臓細胞の固定化により、製造できる。脾臓細胞は、当業界に公知の任意の方法を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを製造することによって固定化できる。ハイブリドーマ製造融合法に用いられる骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素が欠失しているために一定の媒体中で増殖する能力がなく、所望の融合細胞ハイブリドーマのみの増殖を支持することが好ましい。マウスの融合に用いられる好適な細胞系の例としては、Sp-20、P3-X63/Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7およびS194/5XX0Bulが挙げられ;ラットの融合に用いられる好適な細胞系の例としては、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞系は、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6である。いくつかの場合、ハイブリドーマ細胞系は、Dkk-1免疫原によって動物例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する形質転換動物を免疫化し;免疫化した動物から脾臓細胞を採取し;採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合することによって、ハイブリドーマ細胞を作製し;ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞系を確立し、Dkk-1ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することによって生産される。このようなハイブリドーマ細胞系、およびそれらによって作製された抗Dkk-1モノクローナル抗体は、本発明に包含される。ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはmAb類は、Wnt誘導活性を阻止する能力などの特性を有するmAbを同定するために、さらにスクリーニングできる。そのようなスクリーニングの例は、下記の実施例に提供されている。G.キメラ抗体およびヒト化抗体前述の配列に基づいたキメラ抗体およびヒト化抗体もまた提供される。治療薬に用いられるモノクローナル抗体は、使用前に、種々の方法において修飾できる。一例は、機能的な免疫グロブリンの軽鎖または重鎖、またはその免疫機能的部分を作製するために共有結合させた異なる抗体のタンパク質セグメントからなる抗体であるキメラ抗体である。一般に、重鎖および/または軽鎖の一部は特定種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その鎖の残部は、他の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属している。キメラ抗体に関する方法については、例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855頁1985を参照されたい。CDRグラフティングは、例えば、全ての目的のために、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第5,585,089号および5,530,101号に記載されている。一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図された親種のアミノ酸数が最大化されているキメラを創製することである。一例は、抗体が、特定種の1つまたは複数の相補性決定領域CDRを含むか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その抗体鎖の残部が、他の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属しているCDRグラフト抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯類抗体のV領域または選択されたCDRがヒト抗体にグラフトされて、ヒト抗体の天然V領域またはCDRと置き換わることが多い。キメラ抗体の1つの有用なタイプは、ヒト化抗体である。一般に、ヒト化抗体は、最初、非ヒト動物において増加させたモノクローナル抗体から製造される。このモノクローナル抗体の非抗原認識部分に典型的に由来する該抗体における一定のアミノ酸残基は、対応するイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同であるように修飾される。ヒト化は、例えば、齧歯類の可変領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域と置換することにより、種々の方法を用いて実施できる例えば、米国特許第5,585,089号および台,693,762号;Jonesら、1986年、Nature321:522-25号;Riechmannら、1988年、Nature332:323-27頁;Verhoeyenら、1988年、Science239:1534-36頁を参照。本発明の一態様において、本明細書に提供された抗体の軽鎖および重鎖表3を参照の可変領域のCDRを、同じかまたは異なる系統種の抗体のフレームワーク領域FRにグラフトする。例えば、11H10抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のCDRを、コンセンサスヒトFRにグラフトできる。コンセンサスヒトFRを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のFRをアラインメントして、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。他の実施形態においては、11H10抗体の重鎖または軽鎖のFRを、異なる重鎖または軽鎖のFRによって置換する。本発明の一態様において、抗Dkk-1抗体の重鎖および軽鎖のFRにおける希少アミノ酸は置換せず、残りのFRアミノ酸は置換する。希少アミノ酸は、この特定アミノ酸が通常はFRに見られない位置にある特定のアミノ酸である。あるいは、11H10抗体のグラフト可変領域を、11H10の定常領域とは異なる定常領域と共に使用できる。本発明の他の実施形態において、グラフト可変領域は、一本鎖Fv抗体の一部である。一定の実施形態において、ヒト以外の種の定常領域をヒト可変領域と共に使用して、ハイブリッド抗体を製造できる。H.完全ヒト抗体完全ヒト抗体もまた提供される。ヒトを抗原に曝露させることなく、所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体完全ヒト抗体を作製する方法が利用できる。完全ヒト抗体の作製を実施する1つの手段は、マウスの体液性免疫系のヒト化である。内因性Ig遺伝子を不活化したマウスにヒト免疫グロブリンIg座を導入することは、任意の所望の抗原によって免疫化できる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体MAbを作製する1つの手段である。完全ヒト抗体の使用により、マウスのまたはマウス誘導Mab類を治療薬としてヒトに投与することによって時折生じ得る免疫原性およびアレルギー性応答を最少化することができる。完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体のレパートリーを作製することができる形質転換動物通常はマウスの免疫化によって作製できる。この目的のための抗原は、典型的に、6つ以上の連続アミノ酸を有し、任意に、ハプテンなどのキャリアに結合させる。例えば、Jakobovitsら、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551-2555頁;Jakobovitsら、1993年、Nature362:255-258頁およびBruggermannら、1993年、YearinImmunol.7:33頁を参照されたい。このような方法の一例において、形質転換動物は、その中のマウスの重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムDNAの大型フラグメントを、マウスゲノムに挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン座の完全相補体未満を有する部分的修飾動物を交雑育種し、所望の免疫系修飾を全て有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらの形質転換動物は、その免疫原に免疫特異的ではあるが、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、参照として、本明細書に組み込まれている国際公開第96/33735号および第94/02602号を参照されたい。ヒト抗体作製用の形質転換マウスに関するさらなる方法は、米国特許第5,545,807号;第6,713,610号;6,673,986号;6,162,963号;5,545,807号;第6,300,129号;第6,255,458号;第5,877,397号;第5,874,299号および代,545,806号に;PCT国際公開第91/10741号、国際公開第90/04036号に、欧州特許第546073B1号および欧州特許第546073A1号に記載されており、これらは全て、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。本明細書において、HuMabマウスと称される上記の形質転換マウスは、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的変異と共に、再配列していないヒト重鎖μおよびγおよびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小型遺伝子座を含有するLonbergら、1994年、Nature368:856-859頁。したがって、このマウスは、マウスIgMまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答し、導入されたヒトの重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラス転換および体細胞変異を受けて、高親和性ヒトIgGκモノクローナル抗体を作出する。Lonbergら、上記;LonbergおよびHuszar、1995年、Intern.Rev.Imunol.、13:65-93頁;HardingおよびLonberg、1995年、Ann.N,Y.Acad.Sci.764:536-546頁。HuMabマウスの調製は、Taylorら、1992年、NucleicAcidsResearch、20:6287-6295頁;Chenら、1993年、InternationalImmunology5:647-656頁;Tuaillonら、1994年、J.Immunol.152:2912-2920頁;Lonbergら、1994年、Nature368:856-859頁;Lonberg、1994年、HandbookofExp.Pharmacology113:49-101頁;Tailorら、1994年、InternationalImmunology6:579-591頁;LonbergおよびHuszar、1995年、Intern.Rev.Immunol.13:65-93頁;HardingおよびLonberg、1995年、Ann.N,Y.Acad.Sci.764:536-546頁;Fishwildら、1996年、NatureBiotechnology14:845-851頁に詳細に記載されており、前述の文献は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。さらに、米国特許第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,789,650号;第5,877,397号;第5,661,016号;第5,814,318号;第5,874,299号;および第5,770,429号;ならびに米国特許第5,545,807号;国際公開第93/1227号;第92/22646号;および第92/03918号を参照されたい。これら全ての開示は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。これらの形質転換マウスにおいてヒト抗体を作製するために利用される技法は、参照として本明細書に組み込まれている国際公開第98/24893号、およびMendezら、1997年、NatureGenetics15:146-156頁にも開示されている。例えば、ヒト抗Dkk-1抗体を作出するために、HCo7およびHCo12形質転換マウス株を使用できる。ハイブリドーマ技法を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトMAb類を作製し、上記のものなどの形質転換マウスから選択することができる。このような抗体をクローン化し、好適なベクターおよび宿主細胞を用いて発現させることができるか、または培養ハイブリドーマ細胞から抗体を採集することができる。完全ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーHoogenboomら、1991年、J.Mol.Biol.227:381頁;およびMarksら、1991年、J.Mol.Biol.222:581頁に開示されているに由来し得る。ファージ表示法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの表示による免疫選択、および引き続いて、選択抗原に対するそれらの結合によるファージの選択を模倣している。このような方法の1つが、PCT国際公開第99/10494号参照として本明細書に組み込まれているに記載されており、ここには、そのような方法を用いた、MPLおよびmsk受容体に対する高親和性で機能的なアゴニスト抗体の単離が記載されている。I.二特異的または二機能的抗体提供される抗体はまた、上記の1つまたは複数のCDRもしくは1つまたは複数の可変領域を含む二特異的抗体および二機能的抗体も含む。いくつかの例において、二特異的抗体または二機能的抗体は、2つの異なる重/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二特異的抗体は、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの結合などの種々の方法によって作製できる。例えば、SongsivilaiLachmann、1990年、Clin.Exp.Immunol.79:315-321頁;Kostelnyら、1992年、J.Immunol.148:1547-1553頁を参照されたい。J.種々の他の形態提供されるくつかの抗体または免疫機能性フラグメントは、上記に開示された抗体およびフラグメントの変異体である例えば、表1~3に挙げられた配列を有するもの。例えば、抗体またはフラグメントのいくつかは、表1~3に挙げられた1つまたは複数の重鎖または軽鎖、可変領域またはCDRにおける1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するものである。天然のアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けられる:1疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;2中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;3酸性:Asp、Glu;4塩基性:His、Lys、Arg;5鎖の方向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および6芳香族:Trp、Tyr、Phe保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、同じクラスの他のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態が含まれる。非保存的置換は、上記クラスの1つのメンバーを、他のクラスのメンバーと交換することを含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体に相同的な抗体領域、または該分子の非相同領域内に導入できる。このような変更を行う場合、一定の実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮できる。タンパク質の疎水性親水性プロフィルは、各アミノ酸に数値疎水性親水性指標を指定し、次いで、ペプチド鎖に沿って、これらの値を繰り返し平均化することによって算出される。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が指定されている。それらは:イソロイシン4.5;バリン4.2;ロイシン3.8;フェニルアラニン2.8;システイン/シスチン2.5;メチオニン1.9;アラニン1.8;グリシン-0.4;トレオニン-0.7;セリン-0.8:トリプトファン-0.9;チロシン-1.3;プロリン-1.6;ヒスチジン-3.2;グルタメート-3.5:グルタミン-3.5;アスパルテート-3.5:アスパラギン-3.5:リジン-3.9;およびアルギニン-4.5である。タンパク質における相互作用的な生物学的機能の検討における疎水性親水性プロフィルの重要性は、当業界に認識されている例えば、Kyteら、1982年、J.Mol.Biol.157:105-131頁を参照。一定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性の指標またはスコアを有し、かつ類似の生物学的活性を保持している他のアミノ酸と置換できることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて交換を行う場合、一定の実施形態において、疎水性親水性指標が±2以内のアミノ酸の置換が含まれる。本発明のいくつかの態様において、±1以内のものが含まれ、本発明の他の態様においては、±0.5以内のものが含まれる。このようなアミノ酸置換は、特にそのことによって作出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、当該の場合のように免疫学的実施形態における使用が意図されている場合、親水性に基づいて効率的に行うことができる。一定の実施形態において、隣接アミノ酸の親水性に制御されるタンパク質の最大局所平均親和性は、その免疫原性と抗原結合性または免疫原性に関連しており、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に関連している。これらのアミノ酸残基に、以下の親水性値が指定されている:アルギニン3.0;リジン3.0;アスパルテート3.0±1;グルタメート3.0±;セリン0.3:アスパラギン0.2;グルタミン0.2;グリシン0;トレオニン-0.4;プロリン-0.5±1;アラニン-0.5;ヒスチジン-0.5;システイン-1.0;メチオニン-1.3;バリン-1.5;ロイシン-1.8;イソロイシン-1.8;チロシン-2.3;フェニルアラニン-2.5;およびトリプトファン-3.4。類似の親水性値に基づいて交換を行う場合、一定の実施形態において、親和性値が±2以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態においては、±1以内のものが含まれ、さらに他の実施形態においては、±0.5以内のものが含まれる。いくつかの例においては、親和性に基づいて一次アミノ酸配列のエピトープを同定することもできる。これらの領域はまた、エピトープコア領域とも称される。代表的な保存的アミノ酸置換を表4に記載する。当業者は、周知の方法を用いて、本明細書に記載されたポリペプチドの好適な変異体を判定できるであろう。当業者は、活性に重要ではないと考えられる標的領域により、活性を消失させることなく交換し得る分子の好適な領域を確認できる。当業者はまた、類似のポリペプチドの中で保存される分子の残基および部分を確認することもできるであろう。さらなる実施形態において、生物学的活性にとって、または構造にとって重要と考えられる領域も、生物学的活性を消失させることなく、あるいは、該ポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。また、当業者は、活性または構造にとって需要である類似のポリペプチドにおける残基を同定して、構造-機能試験を再検討することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基による、化学的に類似したアミノ酸の置換を選択することができる。また当業者は、類似ポリペプチドにおける構造に関連した三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような知見を鑑み、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを、その三次元構造に関して予測することができる。当業者は、タンパク質の表面にあると予想されたアミノ酸残基に根本的な変化を生じさせることがないように、選択を行うことができる。このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関係していることがあり得るからである。さらに当業者は、所望の各アミノ酸残基における単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を創製できる。次いでこれらの変異体を、Dkk-1中和化活性に関するアッセイ下記実施例を参照を用いてスクリーニングでき、このようにして、どのアミノ酸が交換でき、どのアミノ酸を交換してはいけないかということに関する知見が得られる。言い換えると、このようなルーチン実験から収集された知見に基づいて、当業者は、単独での、または他の変異と組み合わせたさらなる置換を避けるべきアミノ酸位置を容易に判定することができる。多数の科学刊行物が、二次構造の予測に充てられてきた。Moult、1996年、Curr.Op.inBiotech.7:422-427頁;Chouら、1974年、Biochemistry13:222-245頁;Chouら、1974年、Biochemistry113:211-222頁;Chouら、1978年、Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.47:45-148頁;Chouら、1979年、Ann.Rev.Biochem.47:251-276頁;およびChouら、1979年、Biophys.J.26:367-384頁を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用できる。二次構造を予測する1つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、30超の配列同一性、または40超の類似性を有する2つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベースPDBの最近の増大により、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の可能な折りたたみ数を含めた二次構造の予測性が増強されている。Holmら、1999年、Nucl.Acid.Res.27:244-247頁を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質における折りたたみ数には制限があり、一旦、構造の限界数が決まれば構造式予測は飛躍的に正確になることが提案されているBrennerら、1997年、Curr.O.Struct.Biol.7:369-376頁。二次構造予測のさらなる方法としては、スレッディングJones、1997年、Curr.Opin.Struct.Biol.7:377-87頁;Sipplら、1996年、Structure4:15-19頁、プロフィル分析Bowieら、1991年、Science253:164-170頁;Gribskovら、1990年、Meth.Enzym.183:146-159頁;Gribskovら、1987年、Proc.Nat.Acad.Sci.84:4355-4358頁、および進化的連関Holm、1999年、上記;およびBrenner、1997年上記を参照が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、1タンパク質分解に対する脆弱性を減少させる、2酸化に対する脆弱性を減少させる、3タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変化させる、4リガンドまたは抗原の結合親和性を変化させる、4このようなポリペプチドに関する他の物理化学的または機能的特性を与えるかまたは改変する、アミノ酸置換が行われる。例えば、天然配列において、単一のまたは複数のアミノ酸置換一定の実施形態においては保存的アミノ酸置換を行うことができる。ドメインの外側にあって、分子間接触を形成する抗体の一部に置換を行うことができる。このような実施形態において、親配列の構造式的特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換例えば、親抗体または天然抗体を特徴づけている二次構造を破壊しない1つまたは複数のアミノ酸置換を用いることができる。当業界に認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins,StructuresandMolecularPrinciplesCreighton編集、1984年、W.H.NewYork:Freeman社;IntroductiontoProteinStructureBrandenandTooze編集、1991年、ニューヨーク:GarlandPublishing;およびThorntonら、1991年、Nature354:105頁に記載されており、これらは各々参照として、本明細書に組み込まれている。本発明はまた、グリコシル化部位の数および/またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列に比較して変化している、本発明の抗体のグリコシル化変異体も包含する。一定の実施形態において、抗体タンパク質変異体は、天然抗体よりも多いまたは少ない数のN結合グリコシル化部位を含む。N結合グリコシル化部位は、配列:Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrを特徴とし、式中、Xで示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である。この配列を作り出すアミノ酸残基の置換によって、N結合炭水化物鎖付加にとって新たに可能性のある部位が提供される。あるいは、この配列を除去または変化させる置換によって、天然ポリペプチドに存在するN結合炭水化物鎖の付加が防がれる。例えば、Asnの欠失または異なるアミノ酸によるAsnの置換によってグリコシル化を減少させることができる。他の実施形態において、1つまたは複数の新たなN結合部位が作出される。抗体は典型的に、Fc領域にN結合グリコシル化部位を有する。例えば、本明細書に記載される11H10抗体は、アミノ酸315配列番号12にN結合グリコシル化部位を有する。さらなる好ましい抗体変異体としては、親または天然アミノ酸配列における1つまたは複数のシステイン残基が、他のアミノ酸例えばセリンから欠失しているか、またはそれによって置換されているシステイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、抗体が生物学的に活性なコンホメーションにリフォールドされなければならない場合、とりわけ有用である。システイン変異体は、天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、典型的には、不対システインから生じる相互作用を最少化するために偶数を有する。Dkk-1ポリペプチドに特異的に結合できる抗原結合領域を含有するポリペプチドを調製するために、開示されている重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびCDRを使用することができる。例えば、表3に挙げられた1つまたは複数のCDRを、共有的にまたは非共有的に分子例えば、ポリペプチド内に組み込んで、免疫アドヘシンを作製することができる。免疫アドヘシンは、CDRをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むか、CDRを他のポリペプチド鎖に共有的に結合させるか、またはCDRを非共有的に組み込むことができる。CDRは、免疫アドヘシンが、対象となっている特定の抗原例えば、Dkk-1ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合することを可能にする。本明細書に記載されている可変領域ドメインおよびCDRに基づいた模倣物例えば、ペプチド模倣物またはペプチド模擬物もまた提供される。これらの類縁体は、ペプチド類、非ペプチド類またはペプチド領域と非ペプチド領域の組み合わせであり得る。任意の目的のために、参照として本明細書に組み込まれている、Fauchere、1986年、Adv.DrugRes.15:29頁;VeberおよびFreidinger、1985年、TINS、392頁;およびEvansら、1987年、J.Med.Chem.30:1229頁。治療に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物を用いて、類似の治療的または予防的効果を生じさせることができる。このような化合物は、コンピュータ化分子モデリングの補助によって開発されることが多い。一般に、本発明のペプチド模倣物は、本明細書ではDkk-1に特異的に結合する能力などの所望の生物学的活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当業界に周知の方法により、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-シスおよびトランス、-COCH2-、-CHOHCH2-、および-CH2SO-から選択される結合によって任意に置換された1つまたは複数のペプチド結合を有するタンパク質である。本発明の一定の実施形態において、より安定なタンパク質を創製するために、コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸の、同じタイプのD-アミノ酸による系統的な置換が使用できる。さらに、当業界に公知の方法により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することのできる内部システイン残基の付加により、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドを創製できるRizoおよびGierasch、1992年、Ann.Rev.Biochem.61:387頁。本明細書に記載されている抗体の誘導体および免疫機能性フラグメントもまた提供される。誘導体化した抗体またはフラグメントは、具体的使用において、該抗体またはフラグメントに半減期延長などの所望の性質を付与する任意の分子または物質を含んでなり得る。誘導体化した抗体は、例えば、検出可能または標識部分例えば、放射性、比色、抗原分子または酵素分子、検出可能ビーズ磁気または高電子密度例えば金ビーズ、または他の分子例えば、ビオチンまたはストレプトアビジンに結合する分子、治療的または診断的部分例えば、放射性、細胞毒性、または薬剤活性部分、または具体的使用例えば、ヒト対象などの対象への投与、または他のインビボまたはインビトロ使用に関して、抗体の好適性を増大させる分子を含んでなり得る。抗体を誘導体化するために使用できる分子の例としては、アルブミン例えば、ヒト血清アルブミンおよびポリエチレングリコールPEGが挙げられる。抗体のアルブミン結合誘導体およびPEG化誘導体は、当業界に周知の方法を用いて調製できる。一実施形態において、抗体を、トランスチレチンTTRまたはTTR変異体と複合化または結合させる。TTRまたはTTR変異体は、例えば、デキストラン、ポリn-ビニルピロリドン、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類よりなる群から選択される化学物質によって化学的に修飾できる。他の誘導体としては、抗Dkk-1抗体ポリペプチドのN末端またはC末端に融合させた異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、抗Dkk-1抗体またはそれらのフラグメントと、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有複合体または凝集複合体が挙げられる。例えば、複合ペプチドは、異種シグナルまたはリーダーポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであり得る。抗Dkk-1抗体含有融合タンパク質は、例えば、ポリ-Hisの精製または同定を助けるために付加されたペプチドを含み得る。抗Dkk-1抗体ポリペプチドはまた、Hoppら、Biotechnology6:1204、1988年、および米国特許第5,011,912号に記載されたFLAGペプチドに結合させることもできる。FLAGペプチドは、高抗原性であり、特異的モノクローナル抗体mAbと可逆的に結合したエピトープを提供し、発現組換えタンパク質の迅速なアッセイと容易な精製を可能にする。所与のポリペプチドにFLAGペプチドを融合させた融合タンパク質を調製するための有用な試薬が市販されているSigma、ミズーリ州、セントルイス。一種または複数種の抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含有するオリゴマーを、Dkk-1アンタゴニストとして使用できる。オリゴマーは、共有結合または非共有結合した二量体、三量体、またはより多量体のオリゴマーの形態であり得る。2種以上の抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含むオリゴマーは、一例としては、ホモダイマーとしての使用が考慮されている。他のオリゴマーとしては、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモテトラマー、ヘテロテトラマーなどが挙げられる。一実施形態は、抗Dkk-1抗体ポリペプチドに融合させたペプチド部分間の共有または非共有相互作用により結合した複数の抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含むオリゴマーに関するものである。このようなペプチドは、ペプチドリンカースペーサーであり得るか、またはオリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであり得る。該ペプチドの中でも、付加した抗Dkk-1抗体ポリペプチドのオリゴマー化を促進できる、抗体由来のロイシンジッパー類および/または一定のポリペプチド類があり、下記により詳細に記載されている。特定の実施形態において、該オリゴマーは、2つから4つの抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含む。該オリゴマーの抗Dkk-1抗体部分は、上記の任意の形態、例えば、変異体またはフラグメントであり得る。該オリゴマーは、Dkk-1結合活性を有する抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含むことが好ましい。一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて調節される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分Fcドメインなどに融合させた一定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenaziら、1991年、PNASUSA88:10535頁;Byrnら、1990年、Nature344:677頁;およびHollenbaughら、1992年、ConstructionofImmunoglobulinFusionProteind、inCurrentProtocolsinImmunology、補遺4、10.19.1=10.19.11頁によって記載されている。本発明の一実施形態は、抗Dkk-1抗体のDkk-1結合フラグメントを、ある抗体のFc領域に融合させることによって創製された2種の融合タンパク質を含むダイマーに関するものである。該ダイマーは、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターによって形質転換した宿主細胞において該遺伝子融合を発現させ、発現融合タンパク質を抗体分子様に集結させ、その際、Fc部分間に鎖内ジスルフィド結合が形成して、ダイマーを与えることによって、作製することができる。本明細書に用いられる用語のFcポリペプチドには、抗体のFc領域由来のポリペプチドの天然形態および変異タンパク質形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態もまた含まれる。Fc部分を含む融合タンパク質およびそれらから形成されたオリゴマーは、タンパク質Aまたはタンパク質Gカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。PCT出願国際公開第93/10151号および米国特許第5,426,048号および5,262,522号これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれているに記載されている1つの好適なFcポリペプチドは、ヒトIgG1抗体のFc領域のN末端ヒンジ領域から天然C末端まで延在している一本鎖ポリペプチドである。他の有用なFcポリペプチドは、米国特許第5,457,035号obiBaumra,1994nen,EMBOJ.13:3992-4001頁に記載されているFc変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸19がLeuからAlaに変化しており、アミノ酸20がLeuからGluに変化しており、アミノ酸22がGlyからAlaに変化している以外は、国際公開第93/10151号に提示されている天然Fc配列のアミノ酸配列と同一である。この変異タンパク質は、Fc受容体に対する親和性減少を示す。他の実施形態において、本明細書に開示されているような抗Dkk-1抗体の重鎖および/または軽鎖の可変部分を、ある抗体の重鎖および/または軽鎖の可変部分で置換できる。あるいは、該オリゴマーは、ペプチドリンカースペーサーペプチドを有する、または有さない複数の抗Dkk-1抗体ポリペプチドを含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中でも、米国特許第4,751,180号および第4,935,233号に記載されているものがある。オリゴマーの抗Dkk-1抗体誘導体を調製するための他の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、もともといくつかのDNA結合タンパク質において確認されLandschulzら、1988年、Science240:1759頁、以来、種々のタンパク質において見出されている。知られているロイシンジッパーの中でも、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびそれらの誘導体がある。好適なオリゴマータンパク質を作製するために好適なロイシンジッパードメインの例は、PCT出願国際公開第94/10308号に記載されており、また、肺表面活性タンパク質DSPDに由来するロイシンジッパーは、Hoppeら、1994年、FEBSLetters344:191頁に記載されており、参照として、本明細書に組み込まれている。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Fanslowら、1994年、Semin.Immunol.6:267-78頁に記載されている。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合させた抗Dkk-1抗体フラグメントまたは誘導体を含む組換え融合タンパク質を、好適な宿主細胞内に発現させ、可溶性のオリゴマー抗Dkk-1抗体フラグメントまたはそれが形成する誘導体を、培養上澄み液から回収する。提供されるいくつかの抗体は、例えば、下記の実施例に記載されたとおりに測定された、少なくとも104または105/Mx秒の、Dkk-1に対する結合親和性Kaを有する。他の抗体は、少なくとも106、107、108または109/Mx秒のkaを有する。提供される一定の抗体は、低い解離速度を有する。例えばいくつかの抗体は、1×10-4s-1、1×10-5s-またはより低いKoffを有する。他の実施形態において、Koffは、以下の可変領域ドメイン:VL1VH1、VL1VH2、VL1VH3、VL1VH4、VL1VH5、VL1VH6、VL1VH7、VL1VH8、VL1VH9、VL1VH10、VL2VH1、VL2VH2、VL2VH3、VL2VH4、VL2VH5、VL2VH6、VL2VH7、VL2VH8、VL2VH9、VL2VH10、VL3VH1、VL3VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL3VH5、VL3VH6、VL3VH7、VL3VH8、VL3VH9、VL3VH10の組み合わせを有する抗体と同じである。他の態様において、本発明は、インビトロまたはインビボで例えば、ヒト対象に投与した場合、少なくとも1日の半減期を有する抗Dkk-1抗体を提供する。一実施形態において、該抗体は、少なくとも3日の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその部分は、4日以上の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその部分は、8日以上の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されていない、または修飾されていない抗体に比較して、より長い半減期を有するように、誘導体化または修飾される。他の実施形態において、該抗体は、血清半減期を延長させるために、本明細書に組み込まれている、2000年2月24日に発行された国際公開第00/09560号に記載されているような点変異を含有する。IV.核酸本発明の抗体の一方または双方の鎖またはそのフラグメント、誘導体、変異タンパク質または変異体をコードする核酸、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異生成または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述の相補的配列もまた提供される。該核酸は、任意の長さであり得る。それらは、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、30、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000またはそれ以上のヌクレオチド長であり得、および/またはより長い核酸、例えばベクターの一部であり得る。該核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、また、RNAおよび/またはDNAヌクレオチド、およびそれらの変異体例えばペプチド核酸を含んでなり得る。本明細書に提供される一定の抗体が結合するエピトープをコードする核酸もまた提供される。したがって、配列番号2のアミノ酸221~229および/または246~253をコードするいくつかの核酸が含まれ、また、配列番号2のアミノ酸221~236および/または246~262をコードする核酸、および配列番号2のアミノ酸221~262または配列番号2のアミノ酸221~253をコードする核酸が含まれる。これらのペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸もまた提供される。抗体ポリペプチド例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長をコードするDNAは、Dkk-1またはその免疫原性フラグメントで免疫化されたマウスのB細胞から単離できる。該DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応PCRなどの常法により単離できる。ファージ表示は、抗体の誘導体を調製できる公知の他の方法である。一方法において、対象となっている抗体の成分であるポリペプチドを、任意の好適な組換え発現系において発現させ、発現したポリペプチドを組み立てて抗体分子を形成する。該抗体および免疫機能性フラグメントの軽鎖および重鎖、可変領域およびCDRをコードする、提供された代表的核酸は、上記の表1~3に挙げてある。遺伝コードの縮重により、表1~3に挙げられたポリペプチド配列の各々は、表1~3に挙げられたもの以外の多数の他の核酸配列によってもコードされる。本発明は、本発明の各抗体をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。本発明はさらに、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸例えば、表1~3に挙げられたヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。核酸をハイブリダイズする方法は当業界に十分に知られている。例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons,ニューヨーク州1989、6.3.1-6.3.6を参照されたい。本明細書に定められているとおり、中等度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC、0.5SDS、1.0mMEDTApH8.0、約50ホルムアルデヒドのハイブリダイゼーション緩衝液、6×SSCを含有する予備洗浄溶液、および55°Cハイブリダイゼーション温度または42°Cのハイブリダイゼーション温度を用いて、約50のホルムアミドを含有するものなどの他の同様なハイブリダイゼーション溶液および0.5×SSC、0.1SDS中、60°Cの洗浄条件が用いられる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、45°Cで、6×SSC中、ハイブリダイズし、引き続き、68°Cで、0.1×SSC、0.2SDS中で1回以上洗浄する。さらに当業者は、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98または99同一性のヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させるために、ハイブリダイゼーション条件および/または洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的パラメーターならびに好適な条件を考察するための指針は、例えば、Sambrook、Fritsch、andManiatis1989年、MolecularCloning:ALaboratoryMannual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、9章および11章;およびCurrentProtocolsinMolecularBiology、1995年、Ausubelら編集、JohnWileySons社、2.10節および6.3~6.4節に記載されており、例えば、該DNAの長さおよび/または塩基組成に基づいて、当業界で通常の技術を有する者によって容易に決定することができる。変異によって核酸に変化を導入し、それによって、該核酸がコードするポリペプチド例えば、本発明の抗体または抗体誘導体のアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。変異は、当業界に公知の任意の方法を用いて導入できる。一実施形態において、1つまたは複数のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的変異誘発プロトコルを用いて変化させる。他の実施形態において、1つまたは複数のランダムに選択された残基を、例えば、ランダム変異誘発プロトコルを用いて変化させる。変異ポリペプチドは、どんな方法で作製されても、所望の性質に関して、発現させ、スクリーニングすることができる。核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させることなく、該核酸に変異を導入することができる。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非本質的なアミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる1つまたは複数の変異を該核酸に導入することができる。例えば、該変異は、生物学的活性を量的にまたは質的に変化させることができる。量的変化の例としては、該活性の増大、減少または除去が挙げられる。質的変化の例としては、該抗体の抗原特異性の変化が挙げられる。他の態様において、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できるフラグメント、または本発明のポリペプチドの活性部分例えば、Dkk-1結合部分をコードするフラグメントのみを含んでなり得る。本発明の核酸配列に基づいたプローブは、本発明のポリペプチドをコードする核酸または類似の核酸、例えば転写体の検出に使用できる。該プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでなり得る。このようなプローブは、該ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用できる。他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部例えば、1つまたは複数のCDRまたは1つまたは複数の可変領域ドメインを含有するフラグメントをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例としては、限定はしないが、プラスミド、ウィルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。該組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現させる核酸配列に作動可能に結合させた1つまたは複数の調節配列を含む。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現に関するもの例えば、SV40初期遺伝子エンハンサー、ニワトリ肉腫ウィルスプロモーターおよびサイトメガロウィルスプロモーター、一定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現に関するもの例えば、組織特異的調節配列、参照として、本明細書にそれらの全体が組み込まれているVossら、1986年、TrendsBiochem.Sci.11:287頁、Maniatisら、1987年、Science236:1237頁を参照、および特定の処理または条件に応答したヌクレオチド配列の誘導発現に関するもの例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーターおよび原核系および真核系双方におけるtet応答および/またはストレプトマイシン応答プロモーター上記参照が挙げられる。当業者にとって当然のことではあるが、発現ベクターのデザインは、形質転換させる宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、本明細書に記載された核酸によってコードされた融合タンパク質またはペプチドなどのタンパク質またはペプチドを製造することができる。他の態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞例えば、大腸菌または真核細胞例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞例えばCHO細胞であり得る。ベクターDNAは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入できる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション法により、該ゲノムに外来DNAを組み込むのは、細胞の少フラクションのみでよいことが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般的には、選択的マーカー例えば、抗体に対する耐性に関するをコードする遺伝子を、対象となっている遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択的マーカーとしては、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、他にも方法はあるがその中でも、薬物選択によって同定できる例えば、選択的マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残り、他の細胞は死滅する。V.抗体の調製提供される非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類サル例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどまたは類人猿例えばチンパンジーなどの任意の抗体産生動物に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロ細胞培養および細胞培養に基づく適用、または該抗体に対する免疫応答が生じないか、有意ではないか、防止できるか、重要でないか、または所望されている任意の他の適用において使用できる。本発明の一定の実施形態において、該抗体は、完全長Dkk-1またはDkk-1のカルボキシ末端側によって免疫化することによって製造できる。あるいは、本明細書に提供されている一定の抗体が結合するエピトープの一部例えば、11H10、図1を参照を形成するヒトDkk-1のセグメントである、配列番号2のアミノ酸221-236および/またはアミノ酸246-262によって免疫化することによって、一定の非ヒト抗体を増加させることができる。該抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナルであり得るか、または組換えDNAの発現によって宿主細胞内で合成できる。完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座を含有する形質転換動物を免疫化することによって、またはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージ表示ライブラリーを選択するによって、上記のとおり調製できる。本発明のモノクローナル抗体mAbは、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、KohlerおよびMilstein、1975年、Nature256:495頁の標準的体細胞ハイブリダイゼーション法などの種々の方法によって作製できる。あるいは、モノクローナル抗体を作製する他の方法、例えば、Bリンパ球のウィルス性または発癌性の形質転換を使用できる。ハイブリドーマを作製する好適な動物系の1つは、十分に確立された方法であるマウス系である。免疫化脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび方法は、当業界に知られている。このような方法では、免疫化マウスのB細胞を、マウス骨髄腫細胞系などの好適な固定化された融合パートナーに融合させる。所望の場合、マウスの代わりにラットまたはそれ以外の他の動物を免疫化し、このような動物のB細胞をマウス骨髄腫細胞系に融合させて、ハイブリドーマを形成できる。あるいは、マウス以外の出所の骨髄腫細胞系を使用できる。ハイブリドーマを作製するための融合法もまた十分に知られている提供される一本鎖抗体は、アミノ酸架橋短ペプチドリンカーを介して重鎖および軽鎖の可変ドメインFv領域を結合させ、単一のポリペプチド鎖を生じさせることによって形成できる。このような一本鎖FvscFvは、2種の可変ドメインポリペプチドVLおよびVHをコードするDNA間のペプチドリンカーをコードする融合DNAによって調製できる。生じるポリペプチドは、それら自体で折り返されて、2つの可変ドメイン間の屈曲性リンカーの長さに依って、抗原結合単量体を形成できるか、または多量体例えば、二量体、三量体または四量体を形成できるKorttら、1997年、Prot.Eng.10:423頁;Korttら、2001年、Biomol.Eng.18:95-108頁。種々のVLおよびVHを含むポリペプチドを組み合わせることによって、種々のエピトープに結合する多量体scFv類を形成することができる。Kriangkumら、2001年、Biomol.Eng.18:31-40頁。一本鎖抗体作製のために開発された方法としては、米国特許第4,946,778号;Bird、1988年、Science242:423頁;Hustonら、1988年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879頁;Wardら、1989年、Nature334:544頁、deGraafら、2002年、MethodsMolBiol.178:379-87頁に記載されたものが挙げられる。本明細書に提供された抗体に由来する一本鎖抗体としては、限定はしないが、可変ドメインの以下の組み合わせ:VL1VH1、VL1VH2、VL1VH3、VL1VH4、VL1VH5、VL1VH6、VL1VH7、VL1VH8、VL1VH9、VL1VH10、VL2VH1、VL2VH2、VL2VH3、VL2VH4、VL2VH5、VL2VH6、VL2VH7、VL2VH8、VL2VH9、VL2VH10、VL3VH1、VL3VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL3VH5、VL3VH6、VL3VH7、VL3VH8、VL3VH9、VL3VH10を含むscFv類が挙げられる。本明細書に提供されたあるサブクラスの抗体を、サブクラス転換法を用いて異なるサブクラスの抗体へ変化させることができる。したがって、IgG抗体は、例えばIgM抗体から誘導でき、また逆もあり得る。このような方法によって、所与の抗体親抗体の抗原結合性を有し、かつ親抗体のイソタイプまたはサブクラスとは異なる抗体イソタイプまたはサブクラスに関連した生物学的性質も示す新規抗体の調製が可能となる。組換えDNA法が使用できる。このような方法には、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化DNA、例えば、所望のイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするDNAが使用できる。例えば、Lanttoら、2002年、MethodsMol.Biol.178:303-16頁を参照されたい。したがって、提供される抗体としては、例えば、以下の可変ドメインの組み合わせを含むものが挙げられる:所望のイソタイプ例えば、IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、およびIgDを有するVL1VH1、VL1VH2、VL1VH3、VL1VH4、VL1VH5、VL1VH6、VL1VH7、VL1VH8、VL1VH9、VL1VH10、VL2VH1、VL2VH2、VL2VH3、VL2VH4、VL2VH5、VL2VH6、VL2VH7、VL2VH8、VL2VH9、VL2VH10、VL3VH1、VL3VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL3VH5、VL3VH6、VL3VH7、VL3VH8、VL3VH9、VL3VH10ならびにそれらのFabまたはFab’2フラグメント。さらに、IgG4が所望される場合、IgG4抗体における異種性をもたらし得るH鎖内ジスルフィド結合形成の傾向性を減少させるために、参照として本明細書に組み込まれているBloomら、1997年、ProteinScience6:407頁に記載されているヒンジ領域における点変異CPSCP>CPPCPを導入することもまた望まれ得る。さらに、種々の性質すなわち、結合する抗原に対する種々の親和性を有する抗体を誘導する方法も知られている。チェーンシャッフリングと称されるこのような方法の1つは、しばしばファージ表示とも称される、線維状バクテリオファージ表面上での免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子のレパートリー表示を含む。チェーンシャッフリングは、Marksら、1992年、Biotechnology、10:779頁に記載されているとおり、ハプテン2-フェニルオキサゾール-5-オンに対する高親和性抗体を調製するために使用されている。機能的および生化学的特徴を有する抗Dkk-1抗体を作製するために、表1に記載された重鎖および軽鎖に対する保存的改変ならびにコード核酸の対応する修飾を行うことができる。このような改変を達成するための方法は、上記にある。本発明による抗体およびそれらの機能性フラグメントは、種々の方法においてさらに修飾できる。例えば、それらが治療目的に使用される場合、血清半減期を延長させるため、またはタンパク質送達を増加させるために、それらをポリエチレングリコールに結合させることペギル化ができる。あるいは、対象抗体またはそれらのフラグメントのV領域を、異なる抗体分子のFc領域に融合させることができる。この目的で使用されるFc領域は、該融合タンパク質が治療薬として用いられる場合、相補体に結合しないことで、親における細胞溶解の傾向性を減少させるように修飾できる。また、対象抗体またはそれらの機能性フラグメントは、該抗体またはそのフラグメントの血清半減期を延長させるために、ヒト血清アルブミンに結合させることができる。本発明の抗体またはそれらのフラグメントにとって他の有用な融合パートナーは、トランスチレチンTTRである。TTRは、四量体を形成する能力を有し、したがって、抗体-TTR融合タンパク質は、結合活性を増加させ得る多価抗体を形成することができる。あるいは、本明細書に記載された抗体およびフラグメントの機能的および/または生化学的特徴における実質的な修飾は、a置換領域における分子主鎖の、例えばシート状またはらせん状コンホメーションとしての構造、b標的部位における分子の電荷または疎水性、またはc側鎖の嵩高性、の維持に及ぼすそれらの影響が有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換を生じさせることによって達成できる。保存的アミノ酸置換には、天然のアミノ酸残基を、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に及ぼす影響がほとんどないか、または全くない非天然残基によって置換することが含まれる。さらに、ポリペプチドにおける任意の天然残基を、アラニンスキャン変異誘発に関して先に記載したとおり、アラニンによって置換することもできる。対象抗体のアミノ酸置換保存的であろうと非保存的であろうとは、ルーチン法を適用して当業者により実施できる。本明細書に提供された抗体の重要な残基を同定するために、またはヒトDkk-1に対するこれらの抗体の親和性を増加または減少させるために、または本明細書に記載された他のDkk-1抗体の結合親和性を改変するために、アミノ酸置換を用いることができる。VI.抗Dkk-1抗体の発現抗Dkk-1抗体および免疫機能性フラグメントは、任意の多数の常法により調製できる。例えば、抗Dkk-1抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて組替え発現系により生産できる。例えば、MonoclonalAntibodies,Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses、Kennetら編集PlenumPress、ニューヨーク1980:およびAntibodies:ALaboratoryMannual、HarlowandLane編集、ColdSpringHarborLaboratoryPress、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州1988を参照されたい。本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系またはハイブリドーマ以外の細胞系に発現できる。抗体をコードする発現構築物は、例えば、哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換させるために使用できる。形質転換は、ウィルスまたはバクテリオファージにおけるポリヌクレオチドのパッケージングや、米国特許第4,399,216号、米国特許第4,912,040号、米国特許第4,740,461号、および米国特許第4,959,455号これらの特許は、任意の目的のために参照として本明細書に組み込まれているにより例示される当業界に公知のトランスフェクション法により、宿主細胞を該構築物によって形質導入することなど、ポリヌクレオチド類を宿主細胞に導入する任意の公知の方法を用いて実施できる。使用される最適の形質転換法は、形質転換される宿主細胞型に依存する。異種ポリヌクレオチド類の哺乳動物細胞への導入方法は、当業界に周知であり、限定はしないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド類のリポソームへのカプセル化、核酸と陽電荷脂質との混合、および核へのDNAの直接的ミクロ注入が挙げられる。本発明の組換え発現構築物は、典型的に1つまたは複数の以下のものを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む:重鎖定常領域例えば、CH1、CH2および/またはCH3;重鎖可変領域;軽鎖定常領域;軽鎖可変領域;抗Dkk-1抗体の軽鎖または重鎖の1つまたは複数のCDR。これらの核酸配列を、標準的連結法を用いて適切な発現ベクター内に挿入する。一実施形態において、11H10の重鎖または軽鎖定常領域を、Dkk-1に特異的な重鎖または軽鎖可変領域のC末端に付加させて、発現ベクターに連結する。ベクターは典型的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択されるすなわち、ベクターは、宿主細胞の仕組みと適合し、遺伝子の増幅および/または発現を生じさせ得る。幾つかの実施形態において、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いてタンパク質フラグメント相補性アッセイを使用するベクターが用いられる例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第6,270,964号を参照。好適な発現ベクターは、例えば、InvitrogenLifeTechnologiesまたはBDBiosciences旧名Clontechから購入できる。本発明の抗体およびフラグメントをクローニングおよび発現するのに他の有用なベクターとしては、参照として本明細書に組み込まれているBianchiandMcGrew、BiotechBiotechnolBioeng844:439-44頁2003に記載されているものが挙げられる。さらなる好適な発現ベクターは、例えば、参照として本明細書に組み込まれているMethodsEnzymol、185巻D.V.Goeddel編集、1990年、ニューヨーク:AcademicPressに考察されている。典型的に任意の宿主細胞に用いられる発現ベクターは、プラスミドまたはウィルス維持のための配列、および異種ヌクレオチド配列発現のための配列を含有する。フランキング配列と総称されるこのような配列は、以下の作動可能に結合されるヌクレオチド配列の1つまたは複数を典型的に含む:プロモーター、1つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカー要素。任意に、ベクターは、タグコード配列、すなわち、コード配列の5’または3’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、ポリHisをコードするオリゴヌクレオチド配列ヘキサHisなど、または別のタグそれに関してFLAG登録商標、HAインフルエンザウィルスのヘマグルチニン、またはmycなど、市販の抗体が存在しているを含有する。タグは、典型的に発現の際に抗体タンパク質に融合させ、宿主細胞の抗体のアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィにより達成できる。任意にタグは、引き続き開裂用の一定のペプチダーゼ類を用いることなど、種々の手段により精製された抗体ポリペプチドから除去できる。発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種すなわち、宿主細胞と同じ種および/または株に由来でも、異種すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来でも、ハイブリッドすなわち、1種以上の起源のフランキング配列の組合わせでも、合成でも、または天然でもよい。フランキング配列が、宿主細胞の仕組みにおいて機能的であり、それによって活性化できるならば、このようにフランキング配列の起源は、任意の原核生物でも真核生物でも、任意の脊椎生物でも無脊椎生物でも、また植物であってもよい。本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当業界に周知の任意の幾つかの方法によって得ることができる。典型的に、本明細書に有用なフランキング配列を、マッピングおよび/または制限エンドヌクレアーゼ消化によって前もって確認しておくことによって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離できる。幾つかの場合、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列は公知であり得る。この場合、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書に記載された方法を用いて合成できる。フランキング配列の全てまたは一部だけが知られている場合、それは、PCRを用い、および/または同一種または別の種からの好適なオリゴヌクレオチドおよび/またはフランキング配列フラグメントによるゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するDNAフラグメントを、例えば、コード配列またはさらに別の遺伝子を含有し得るDNAのより大きな部分から単離できる。単離は、適切なDNAフラグメントを作製するための制限エンドヌクレアーゼ消化、次いでアガロースゲル精製、Quiagen登録商標カラムクロマトグラフィChatsworth、カリフォルニア州を用いた単離、または当業技術者に公知の他の方法により達成できる。この目的を達成するのに好適な酵素の選択は、当業者にとって容易に明らかとなろう。複製起点は、典型的に原核動物発現ベクターの一部であって、特に商品として購入されるものであり、この起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択されたベクターが、増幅部位の起点を含有しない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成でき、ベクターに結合できる。例えば、プラスミドpBR322の複製起点NewEnglandBiolabs、ビバリー、マサチューセッツ州は、たいていのグラム陰性細菌に好適であり、種々の起点例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウィルス、水疱性口内炎ウイルスVSV、あるいはHPVまたはBPVなどのパピローマウィルスは、哺乳動物細胞におけるベクターをクローニングするために有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターにとって哺乳動物の複製起点は必要ではない例えば、SV40源は、初期プロモーターを含有するという理由だけで使用されることが多い。本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的に宿主生物によって認識されるプロモーターを含有し、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする核酸に作動可能に結合している。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドン一般に約100から1000bpの範囲の上流に位置する未転写配列である。プロモーターは、従来から2つのクラスのプロモーターおよび構成的プロモーターのうちの1つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養物の有無または温度変化などの培養条件における何らかの変化に応答してそれらの制御下でDNAからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する:すなわち、遺伝子発現上の実験的制御が殆どないか、または全くない。種々の宿主細胞となる可能性のあるものにより認識される多数のプロモーターはよく知られている。制限酵素消化によりDNA源からプロモーターを除去することにより、またはポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを増幅させ、所望のプロモーター配列をベクターに挿入させることにより、好適なプロモーターを抗Dkk-1抗体をコードするDNAに作動可能に結合させる。酵母宿主との使用に好適なプロモータもまた、当業界に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利である。哺乳動物の宿主細胞との使用に好適なプロモーターは周知であり、限定はしないが、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルスアデノウィルス2など、ウシパピロウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス、最も好ましくはサルウィルス40SV40などのウィルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。本発明の組換え発現ベクター類の実施に好適な特定のプロモーターとしては、限定はしないが:SV40の初期プロモーター領域BernoistandChambon、1981年、Nature290:304-10頁;CMVプロモーター;ラウス肉腫ウィルスの3’長末端反復に含有されるプロモーターYamamotoら、1980年、Cell22:787-97頁;メタロチオニン遺伝子の制御配列Brinsterら、1982年、Nature296:39-42頁;ベータ-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクターVilla-Kamaroffら、1978年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、75:3727-31頁;またはtacプロモーターDeBoerら、1983年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、80:21-25頁が挙げられる。組織特異性を示し、遺伝子導入動物に利用されている以下の動物の転写制御領域もまた使用できる:膵腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子制御領域Swiftら、1984年、Cell38:639-46頁;Ornitzら、1986年、ColdSpringHarbourSymp.Quant.Biol.50:399-409頁;MacDonald、1987年、Hepatology7:425-515頁;膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域Hanalan、1985年、Nature315:115-22頁;精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウィルス制御領域Lederら、1986年、Cell45:485-95頁;肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域Pinkertら、1987年、GenesandDevel1:268-76頁;肝臓において活性であるアルファ-胎児性タンパク質遺伝子制御領域Krumlaufら、1985年、Mol.Cell.Biol.5:1639-48頁;Hammerら、1987年、Science235:53-58頁;肝臓において活性であるアルファ1-抗トリプシン遺伝子制御領域Kelseyら、GenesandDevel.1:161-71頁;骨髄性細胞において活性であるベータ-グロブリン遺伝子制御領域Mogramら、1985年、Nature315:338-40頁;Kolliasら、1986年、Cell46:89-94頁;脳内の乏突起神経膠芽細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域Reaheadら、1987年、Cell48:703-12頁;骨格筋において活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域Sani、1985年、Nature314:283-86年;視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域Masonら、1986年、Science234:1372-78頁;および特にたいていのリンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域Grosschedlら、1984年、Cell38:647-58頁;Adamesら、1985年、Nature318:535-38頁;Alexanderら、1987年、Mol.CellBiol.7:1436-44頁。エンハンサー配列をベクターに挿入して、本発明の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする高等真核生物の核酸における転写を増加させることができる。エンハンサーは通常約10~300bp長であり、プロモーターに作用して転写を増加させるDNAのシス作用性因子である。エンハンサーは、比較的、方向および位置から独立している。それらは、転写単位の5’および3’に見られる。哺乳動物の遺伝子から利用できる幾つかのエンハンサー配列が知られている例えば、グロビン、エラスターゼ、アルファ-胎児性タンパク質およびインスリン。ウィルスからのエンハンサー配列もまた使用できる。SV40エンハンサーサイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーは、真核生物プロモーターを活性化する代表的な促進因子である。エンハンサーは、核酸分子に対して5’または3’位でベクター内にスプライスできるが、典型的にはプロモーターに対して5’部位に置かれる。発現ベクターにおいて、転写終結配列は、典型的にポリペプチドコード領域の3’末端に位置する。原核生物細胞の発現に用いられる転写終結配列は、典型的にポリ-T配列へと続くG-C豊富なフラグメントである。該配列は、ライブラリから容易にクローン化されるか、またはさらにベクターの一部として商品として購入されるが、本明細書に記載されたものなどの核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。選択マーカー遺伝子要素は、選択的培養培地中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターに用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、a原核生物宿主細胞に対する抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与し;b細胞の栄養要求欠乏性を補足し;またはc複合培地から利用できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。選択マーカーの例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。細菌ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物宿主細胞の双方における選択のために使用できる。他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅させるために使用できる。増幅は、単一コピーでは、ある一定の選択条件下で細胞の生存および増殖させるのに十分な高レベルで発現できない遺伝子を、組換え細胞の連続世代の染色体内でタンデムに反復させる過程である。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素DHFRおよびプロモーターのないチミジンキナーゼが挙げられる。これらマーカーの使用において、哺乳動物細胞の形質転換体は、ベクターに存在する選択遺伝子のために該形質転換体のみが独自に順応して生存する選択圧下に置かれる。培地中の選択剤の濃度が連続的に増加することによって、選択遺伝子が増幅された哺乳動物細胞のみを生存させる条件下で形質転換された細胞を培養することにより、選択圧が課される。これらの状況下で、本発明の抗体をコードするDNAなどの選択遺伝子に隣接したDNAを、選択遺伝子と共に同時増幅させる。その結果、増幅DNAから抗Dkk-1ポリペプチド量が増加して合成される。リボソーム結合部位は、通常mRNAの翻訳開始に必要であり、シャインダルガーノ配列原核生物またはコザークKozak配列真核生物を特徴とする。この因子は、典型的にプロモーターに対して3’に、また発現されるポリペプチドのコード化配列に対して5’に位置する。幾つかの場合において、例えば、真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれる場合、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチドを操作できる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変えるか、またはやはりグリコシル化に影響を及ぼし得るシグナルペプチドを付加できる。最終タンパク質産物は、発現し易い1つまたは複数の付加アミノ酸を1位成熟タンパク質の第1のアミノ酸に関してに有することがあり、これらは完全に除去されていないと考えられる。例えば、最終タンパク質産物は、ペプチダーゼ開裂部位に見られるアミノ末端に結合した1つまたは2つのアミノ酸残基を有することができる。あるいは、幾つかの酵素開裂部位の使用により、該酵素が成熟ポリペプチド内のような領域で切断する場合は、僅かに切断されてはいるが、依然として活性な形態の所望のポリペプチドが生じ得る。市販の発現ベクターが、上記の所望のフランキング配列の幾つかを欠いている場合、これらの配列をベクター内に個々に結合させることによって該ベクターを修飾できる。ベクターが選択され、所望のとおり修飾された後、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする核酸分子を、ベクターの適切な部位に挿入する。本発明の抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする配列を含有する完全ベクターを、増幅および/またはポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入する。抗体、その免疫機能性フラグメントに関する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トタンスフェクション法、感染法、塩化カルシウム法、電気穿孔法、ミクロ注入法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン法などの方法を含む周知の方法または他の公知の技法により達成できる。選択された方法は、一部使用される宿主細胞型の機能である。これらの方法および他の好適な方法は、当業者に周知である。適切な条件下で培養される場合、形質転換宿主細胞は、抗体またはその免疫機能性フラグメントを合成し、これを引き続き培養培地から宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合、またはそれを産生する宿主細胞それが分泌されない場合から直接採取できる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性にとって望ましいか、または必要なポリペプチド修飾グリコシル化またはリン酸化などおよび生物活性分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子に依存する。発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は当業界に周知であり、限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、Hela細胞、ベビーハムスター腎BHK細胞、サル腎細胞COS、ヒト肝細胞癌細胞例えば、HepG2、および多数の他の細胞系など、AnericanTypeCultureCollectionATCCから入手できる多くの固定化細胞系が挙げられる。一定の実施形態において、特定のDNA構築体を発現する最良の細胞系は、種々の細胞系を試験してどの細胞系が最高レベルの発現レベルを有し、構成的Dkk-1結合性を有する抗体を生産するかを判定することにより選択できる。VI.薬学的組成物A.代表的な製剤一定の実施形態において、本発明はまた、以下の1つまたは複数:薬学的に受容可能な希釈剤;キャリア;可溶化剤;乳化剤;保存剤;および/またはアジュバント、と共に対象の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物を提供する。このような組成物は、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントの有効量を含有できる。したがって、本明細書に提供される抗Dkk-1抗体およびその免疫活性フラグメントの、薬学的組成物または医薬品の調製における使用もまた含まれる。このような組成物は、下記の代表的な有用性の節に挙げられたような種々の疾患の治療に使用できる。薬学的調製のための受容可能な製剤成分は、使用される投与量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。提供される抗体および免疫機能性フラグメントに加えて、本発明による組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着または透過性、を改変、維持または保存するための成分を含有できる。薬学的組成物を製剤化するための好適な材料としては、限定はしないが、アミノ酸グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど;抗菌剤;抗酸化剤アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど;緩衝剤酢酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸類など;増量剤マンニトールまたはグリシンなど;キレート化剤エチレンジアミン四酢酸EDTAなど;錯化剤カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリンなど;充填剤;単糖類、二糖類;および他の炭水化物グルコース、マンノースまたはデキストリン類など;タンパク質血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど;着色剤、風味剤および希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー類ポリビニルピロリドンなど;低分子量ポリペプチド類;塩形成対イオン類ナトリウムなど;保存剤塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など;溶媒類グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど;糖アルコール類マンニトールまたはソルビトールなど;懸濁剤;界面活性剤または湿潤剤プルロニック、PEG、ソルビタンエステル類、ポリソルベート20、ポリソルベート80などのポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール;安定性増強剤ショ糖またはソルビトールなど;等張性増強剤ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど;送達媒体;希釈剤;賦形剤および/または薬学的用アジュバント類が挙げられる。参照として本明細書に組み込まれているRemington’sPharmaceuticalSciences、第18版、A.R.Gennaro編集、1990年、MackPublishing社を参照。薬学的組成物における主要媒体またはキャリアは、水性でも非水性でもよい。このような組成物に好適な媒体またはキャリアとしては、注射用水、生理的食塩水または人工脳脊髄液が挙げられ、場合によっては、非経口投与用組成物に一般的な他の材料が添加される。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる代表的媒体である。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケークまたは水溶液形態の任意の製剤化剤と混合することにより、保存用に調製できる。さらに、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、ショ糖などの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化できる。製剤成分は、受容できる濃度で投与部位に存在する。緩衝剤は、生理的pHあるいは僅かにより低いpHで、典型的には約4.0から約8.5あるいは約5.0から8.0の間でのpH範囲内に該組成物を維持するために使用することが有利である。薬学的組成物は、約pH6.5~8.5のトリス緩衝液、または約pH4.0~5.5の酢酸緩衝液を含むことができ、さらにソルビトールまたはその好適な代替物を含むことができる。薬学的組成物は、錠剤製造に好適である非毒性賦形剤と混合した抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントの有効量を含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適切な媒体に溶解することにより、液剤を単位用量形態で調製できる。好適な賦形剤としては、限定はしないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム、乳糖、またはリン酸カルシウムなどの不活性材料;または澱粉、ゼラチン、またはアラビアゴムなどの結合剤;またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。さらなる薬学的組成物は、持続型または制御送達製剤の形態である。リポソームキャリア、生体侵食性ミクロ粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射などの種々の他の持続型または制御送達手段を製剤化する方法を用いることができる例えば、薬学的組成物の送達用多孔性ポリマーミクロ粒子の制御放出を記載している、国際出願PCT/米国第93/00829号を参照。持続型放出製剤としては、形状化製品の形態での半透過性マトリックス、例えば、薄膜、またはミクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド米国特許第3,773,919号および欧州特許第058,481号、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメートとのコポリマーSidmanら、1983年、Biopolymers22:547-556号、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレートLangerら、1981年、JBiomedMaterRes15:167-277頁およびLanger、1982頁、ChemTech12:98-105頁、エチレンビニルアセテートLangerら、同書またはポリ-D--3-ヒドロキシ酪酸欧州特許第133,988号を挙げることができる。持続型放出組成物としてはまた、当業界に公知の任意の幾つかの方法により調製できるリポソーム類を挙げることができる。例えば、Epsteinら、1985年年Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688-3692頁;欧州特許第036,676号;欧州特許第088,046号および欧州特許第143,949号を参照されたい。インビボ投与に用いられる薬学的組成物は、一般的に滅菌である。滅菌は、滅菌ろ過膜を通すろ過により達成できる。組成物が凍結乾燥される場合、滅菌は、凍結乾燥および再構成の前か後に実施できる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保存できる。一定の実施形態において、非経口用組成物は、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能な密栓を有する静脈溶液用バッグまたはバイアル、または注入用に即時使用できる前充填滅菌シリンジに入れる。本発明の薬学的組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または乾燥または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存できる。このような製剤は、即時使用できる形態または投与前に再構成される形態例えば、凍結乾燥されたで保存できる。薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、高純度であることが好ましく、有害となる可能性のある不純物が実質的にないことが好ましい例えば、少なくとも米国食品NFグレード、一般に少なくとも分析グレード、またより典型的には少なくとも薬学的グレード。さらに、インビボ使用に意図された組成物は、通常は滅菌されている。所与の化合物を使用前に合成する必要がある場合、生じた製造物は典型的に、合成または精製工程時に存在し得る毒性となる可能性のある薬剤、特にエンドトキシン類のいずれもが実質的に無い。非経口用組成物はまた、滅菌で、実質的に等張性であり、GMP条件下で製造される。本発明は、複数回用量または単回用量投与単位を作製するためのキットを提供する。例えば、本発明によるキットは各々、例えば、単一および複数チャンバの前充填されたシリンジ例えば、液体シリンジ、リオシリンジまたは針なしシリンジなどの、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性希釈剤を有する第2の容器の双方を含むことができる。本発明の薬学的組成物は、典型的には注射により非経口的に送達できる。注射は、眼内、腹腔内、門脈内、筋肉内、静脈内、くも膜下腔内、病巣内、病巣周囲または皮下であり得る。点眼剤は、眼内投与のために使用できる。幾つかの場合において、注射は、処置が標的とする特定の1本の骨または複数本の骨の近傍に局在化させることができる。非経口投与のために、抗体は、薬学的に受容可能な媒体中、所望の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む、発熱物質のない非経口的に受容可能な水溶液中で投与できる。特に非経口注射に好適な媒体は、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントが、適切に保存された滅菌等張性液として製剤化されている滅菌蒸留水である。対象の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物は、放出持続を達成するために、輸液による大量瞬時投与または連続投与、移植デバイス、持続型放出システムまたは他の手段により投与できる。薬学的組成物はまた、所望の分子が吸収されているか、またはカプセル化されている膜、スポンジまたは別の適切な材料を介して局所的に投与できる。移植デバイスが用いられる場合、該デバイスは、任意の好適な組織または臓器に移植でき、所望の分子の送達は、拡散、定時放出大量瞬時投与、または連続放出であり得る。この製剤は、製品の制御放出または持続放出を提供できる注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物ポリ乳酸;ポリグリコール酸;またはコポリ乳/グリコール酸PLGAなど、ビーズまたはリポソームなどの物質によって製剤化でき、次いで蓄積注射により送達できる。ヒアルロン酸による製剤化は、循環時間の持続を助長する効果を有する。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む対象組成物は、吸入用に製剤化できる。これらの実施形態において、抗Dkk-1抗体は、吸入用の乾燥粉末として製剤化されるか、または抗Dkk-1抗体の吸入溶液もまた、噴霧化などにより、エーロゾル送達用噴射剤と共に製剤化できる。肺送達は、化学的修飾タンパク質の肺送達が記載され、参照として本明細書に組み込まれている国際出願PCT/米国第94/001875号にさらに記載されている。本発明のある一定の薬学的組成物は、経口など、消化管を介して送達できる。この様式で投与される対象の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、錠剤およびカプセル剤などの固形剤形の配合に慣例的に使用されるキャリアと共に、またはキャリアなしで製剤化できる。カプセル剤は、生物学的利用能が最大であり、全身前分解が最少である時に胃腸管内の箇所で製剤の活性部分を放出させるようにデザインできる。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントの吸収を促進させるために、追加の試剤を含ませることができる。経口投与では、消化酵素に対する耐性を付与するために、修飾アミノ酸を使用できる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用できる。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む対象組成物はまたエキソビボでも使用できる。このような場合において、患者から取り出された細胞、組織または臓器を、抗Dkk-1抗体に暴露するか、それと共に培養する。次いで培養細胞を、その患者または異なる患者に戻して移植できるか、または他の目的のために使用できる。一定の実施形態において、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、ポリペプチドを発現し、分泌させるために、本明細書に記載されたものなどの方法を用いて、遺伝子操作された一定の細胞を移植することによって送達できる。このような細胞は、動物細胞でもヒト細胞でもよく、また、自己種でも、異種でも、異種間でもよく、また不死化のものであってもよい。免疫応答の機会を減少させるために、細胞はカプセル化して周囲組織の侵入を避けることができる。カプセル化材料は、典型的には生体適合性であって、タンパク質製品は放出させるが、患者の免疫系または周囲組織からの他の有害な因子による細胞破壊を防ぐような半透過性封入体または膜である。B.投与量提供される薬学的組成物を、予防処置および/または治療処置のために投与できる。有効量とは、一般に症状の重症度および/または頻度の軽減または除去および/または損傷の改善または治療である所望の効果を達成するために、活性成分すなわち、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントの十分ではあるが、非毒性である量を称す。治療的有効量とは、疾患状態または症状を治療するために十分な量、あるいは、疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を防ぐか、妨げるか、遅らせるかまたは反転させる上で十分な量を称す。予防的有効量とは、疾患状態または症状の発生を防ぐか、妨げるかまたは遅らせる上で有効な量を称す。一般に、該抗体またはフラグメントの毒性および治療的有効性は、例えば、LD50集団の50が致死する量およびED50集団の50に治療的有効な用量の測定など、細胞培養および/または実験動物における標準的薬学手法に従って判定できる。毒性作用と治療作用との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。細胞培養および/または動物試験から得られたデータは、ヒトへの投与量範囲を製剤化するのに使用できる。活性成分の投与量は、典型的に、毒性が殆ど無いか、全く無いED50を含む濃度を循環させる範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依ってこの範囲内で変わり得る。治療的または予防的に使用される、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的に依る。したがって、一定の実施形態による治療のための適切な投与量レベルは、部分的に、送達される分子、抗Dkk-1抗体が用いられる適応症、投与経路、および患者のサイズ体重、体表面または臓器サイズに依って変わり得ることを当業者は認識するであろう。臨床医は、投与量の力価を測ることができ、最適の治療効果を得るために投与経路を変更できる。典型的な投与量は、上記の因子に依って、約0.1μg/kgから約100mg/kgまで、またはそれ以上の範囲である。一定の実施形態において、投与量は、0.1μg/kgから約150mg/kgまで;または1μg/kgから約100mg/kgまで;または5μg/kgから約50mg/kgまでの範囲であり得る。投与回数は、製剤中の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントの薬物動態パラメータに依存する。例えば、ある投与量が、所望の効果達成に到達するまで、臨床医は、該組成物を投与するであろう。したがって、該組成物は、単回用量、または経時的に2回以上の用量所望の分子の同一量を含有しても、しなくてもよい、または移植デバイスまたはカテーテルを介した連続輸液として投与できる。治療は、経時的に連続的であっても、または断続的であってもよい。適切な投与量のさらなる改善は、通常の当業者によりルーチンに成され、彼らによりルーチンに実施される業務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用により確認することができる。Dkk-1の異常発現または過剰発現を特徴とする医学的障害を治療するために、対象の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物は、障害の重症度を反映する少なくとも1つの指標において持続された改善を誘導する上で十分な量および時間で患者に投与できる。患者が、少なくとも1日から7日、または幾つかの場合においては1週間から6週間離れた少なくとも2つの機会に改善を示す場合に、改善が持続されていると考えられる。適切な間隔は、ある程度、治療されている病態に依存し;改善が持続されているかどうかを判定するための適切な間隔を決定するのは、当業医師の権限内にある。改善の程度は、徴候または症状に基づいて判定され、また生活の質のアンケートなど、患者に渡されるアンケートも使用できる。患者の病気の程度を反映する種々の指標を、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定するために評価できる。選択された1つまたは複数の指標に関するベースライン値は、抗体の最初の用量投与前の患者の検査により確立される。ベースライン検査は、最初の用量投与の約60日以内に行われることが好ましい。例えば、骨折の治療など急性症状を治療するために抗体を投与する場合、傷害が生じたら実際にはできるだけ早く最初の用量が投与される。患者が、選択された1つまたは複数の指標に関するベースラインを超えた改善が明示されるまで抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントを投与することにより改善が誘導される。慢性病態の治療において、この改善度は、少なくとも1ヵ月以上の期間、例えば、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月以上、または無期限に亘ってこの医薬品を反復投与することにより得られる。1週間から6週間の期間、または単回用量でも、急性病態の治療に十分であることが多い。傷害または急性病態に関して、単回用量でも十分であり得る。治療後の患者の病気の程度が、1つまたは複数の指標に従って改善されたように見えても、治療を、同じレベルでまたは用量または回数を減じて無期限に継続できる。いったん治療を減少、または中止しても、後で症状が再び現れたら、元のレベルで再開できる。VII.抗Dkk-1抗体に関する代表的な有用性A.検出およびスクリーニング対象の抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、生体サンプルにおけるDkk-1を検出するために使用できる。このような使用は、該タンパク質を産生する細胞または組織の確認を可能にするか、あるいはDkk-1が過剰産生、または過少産生される病態を検出するための診断として役立つ。提供される抗体およびフラグメントは、Dkk-1に結合する分子をスクリーニングする方法にも使用できる。例えば、種々の競合的スクリーニング法が使用できる。幾つかの方法において、Dkk-1抗体が結合するDkk-1分子またはそのフラグメントを、別の分子すなわち、候補分子と共に、本明細書に開示された抗体またはフラグメントに接触させる。該抗体またはフラグメントとDkk-1との間の結合減少は、該分子がDkk-1に結合する指標である。該抗体またはフラグメントの結合は、種々の方法、例えばELISAを用いて検出できる。Dkk-1抗体またはフラグメントとDkk-1との間の結合の検出は、抗体を検出可能に標識することによって簡便化できる。幾つかの方法において、最初のスクリーニングで結合を示す分子を、それがDkk-1活性を示すかどうか例えば、該分子がWntシグナル伝達を活性化するかどうかを判定するためにさらに分析する。B.骨関連障害の治療他の態様において、提供される抗体および免疫機能性フラグメントの幾つかは、例えば、Dkk-1活性の阻害に応答する疾患など、種々の異なる疾患を有する患者を治療するために使用できる。これらの抗体およびフラグメントはまた、Wntシグナル伝達の誘導に応答する疾患を治療するためにも使用できる。本明細書に用いられる用語の患者は、他に記載されない限りヒトおよび動物対象を含む。このような疾患の例としては、限定はしないが、骨質量低下状態、全身骨減少、骨形成抑制および骨侵食などの骨障害に関与する種々の疾患が挙げられる。該抗体およびフラグメントの幾つかは、骨修復にも使用できる。抗体および免疫機能性フラグメントの幾つかは、骨芽細胞活性を刺激し、骨塩密度または骨質量を増加させる治療的使用を有する。したがってこれらの抗体およびフラグメントは、過度の骨減少に関係する種々の医学的障害を患っている患者または過度の骨芽細胞活性が必ずしもないと思われる場合でも新骨形成を必要とする患者を治療するために有用である。Dkk-1活性の遮断により、Wntタンパク質によって伝達されるシグナル伝達を介して骨芽細胞活性化がもたらされる。過度の破骨細胞活性化は、骨減少症、骨粗しょう症、歯周病、ページェット病、固定化による骨減少、溶解性骨転移およびリウマチ様関節炎、乾癬性関節炎などの関節炎、強直性脊椎炎および骨侵食に関係する他の病態など、提供される抗体および免疫機能性フラグメントにより治療できる多くの骨減少症障害に関連する。限定はしないが、グルココルチコイド誘導骨粗しょう症、移植後誘導骨粗しょう症、化学療法に伴う骨粗しょう症すなわち、化学療法誘導骨粗しょう症、固定化誘導骨粗しょう症、機械的荷重除去による骨粗しょう症、および抗痙攣薬使用に伴う骨粗しょう症などの種々の形態の骨粗しょう症など、種々の他の骨質量低下状態もまた治療できる。幾つかの抗体またはフラグメントにより治療できるさらなる骨疾患としては、腎不全に伴う骨疾患、ならびに栄養、胃腸および/または肝臓関連の骨疾患が挙げられる。骨関節炎およびリウマチ様関節炎などの例が挙げられる種々の形態の関節炎もまた治療できる。該抗体およびフラグメントはまた、関節炎例えば、リウマチ様関節炎に伴う全身性骨減少を治療するために使用できる。関節炎の治療において、患者は、病巣周囲または病巣内へ、対象抗体またはそのフラグメントを注入することにより利益を得ることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを、炎症性関節に隣接して、または直接に注入することにより、その部位の損傷骨の修復を刺激することができる。乳癌および前立腺癌などの幾つかの癌は、破骨細胞活性を増加させ、骨再吸収を誘導させることが知られている。骨髄に生じる多発性骨髄腫もまた、おそらく部分的には、血漿細胞によるDkk-1の発現増加による骨減少を伴い、次いで近傍での骨芽細胞の骨構築活性を抑制する。対象の抗体およびその免疫機能性フラグメントの投与によりDkk-1活性を減少させることによって、過度の破骨細胞活性に反作用することに役立つ骨芽細胞活性の増加をもたらすことができ、それによって患者における前述の重症度の障害を軽減し、骨侵食を軽減し、新骨形成を誘導する。幾つかの抗Dkk-1抗体または免疫機能性フラグメントによる治療により、骨減少性障害を患っている患者における骨塩密度の有意な増加を誘導することができる。本明細書に記載された抗体または免疫機能性フラグメントによるDkk-1の阻害はまた、種々の骨修復適用にも使用できる。例えば、ある一定の抗体およびフラグメントは、人工関節に伴う摩耗デブリの骨破壊の遅延化、骨折修復の促進、および移植された骨移植片の周囲の生骨への取込み増強に有用となり得る。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、単独でまたは他の治療剤と併用して、例えば、癌治療剤、破骨細胞活性を阻害する薬剤、または骨芽細胞活性を増強させる他の薬剤と併用して投与することができる。例えば、本発明の抗体は、放射線療法または化学療法を受けている癌患者に投与できる。本発明の抗体と併用して用いられる化学療法剤としては、アントラサイクリン類、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、オキサロプラチン、Velcade登録商標[1R-3-メチル-1-[[2S-1-オキソ-3-フェニル-2-[ピラジニルカルボニルアミノ]プロピル]アミノ]ブチル]ボロン酸および/または癌治療に使用される他の小型分子薬物を挙げることができる。乳癌患者は、化学療法剤と抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントとを含む併用治療と同時にアロマターゼ阻害剤の投与から利益を得るであろう。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、骨質量の減少をもたらす上記に挙げた病態の治療のために単独で、または、限定はしないが、BNP-1からBMP-12と称される骨形態形成因子;形質転換成長因子-βおよびTGF-ベータファミリーメンバー;線維芽細胞成長因子FGF-1からFGF-10;インターロイキン-1阻害剤IL-1ra、IL-1に対する抗体およびIL-1受容体に対する抗体など;TNFα阻害剤エタナーセプトetanercept、アダリブマブadalibumabおよびインフリキシマブinfliximabなど;RANKリガンド阻害剤溶解性RANK、オステオプロテゲリンosteoprotegerinおよびRANKまたはRANKリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体など、副甲状腺ホルモン、Eシリーズプロスタグランジン類、ビスホスホネート類およびフッ化物ならびにカルシウムなどの骨増強無機塩類、などの骨成長促進アナボリック剤または骨抗再吸収剤と併用して使用できる。本発明の抗体およびその機能性フラグメントと併用して使用できるアナボリック薬剤としては、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様成長因子IGFが挙げられ、後者の薬剤は、IGF結合タンパク質と複合化されていることが好ましい。このような併用治療に好適なIL-1受容体アンタゴニストは、国際公開第89/11540号に記載されており、好適な溶解性TNF受容体-1は、国際公開第98/01555号に記載されている。代表的なRANKリガンドアンタゴニストは、例えば、国際公開第03/086289号、国際公開第03/002713号、米国特許第6,740,511号および米国特許第6,479,635号に開示されている。前述の特許および特許出願は全て、参照として本明細書に組み込まれている。さらに、抗Dkk-1抗体は、腫瘍細胞に結合し、腫瘍成長に対して細胞毒性効果および/または細胞増殖抑制効果を誘導する抗体と併用して患者に投与できる。このような抗体の例としては、細胞表面のタンパク質Her2、CDC20、CDC33、ムチン様糖タンパク質および腫瘍細胞に存在する上皮細胞成長因子EGFRに結合し、これらのタンパク質を示す腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果および/または細胞毒性効果を誘導するものが挙げられる。このような抗体の例としては、乳癌の治療のためのHERCEPTIN登録商標および非ホジキンリンパ腫の治療のためのRITUXAN登録商標が挙げられ。また、ERBITUX登録商標およびAVASTIN登録商標などの抗体ベース薬物が挙げられる。また、併用療法としては、TNF関連ポリペプチドTRAILなどの腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導する、癌治療剤としてのポリペプチド類を挙げることができる。対象の抗体またはその免疫機能性フラグメントを、同じ条件で投与される他の処置および治療剤と共に同時に投与できる。本明細書に用いられる同時投与は、同時または連続的に投与される処置を包含する。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、初期病期IまたはIIの癌による骨質量の減少発生を防ぐか、あるいは緩和させるために予防的に投与できるか、または骨に対する転移による既存の骨質量減少病態を寛解させるために投与できる。本発明の抗Dkk-1抗体は、骨内の腫瘍細胞の増殖を防ぎ、および/または処置するために使用できる。腫瘍細胞は破骨細胞を刺激して、内部骨マトリックスを再吸収させるために、骨に転移する癌を容易に拡がり得る。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントによる処置は、骨芽細胞活性増大を刺激することにより、このような転移部位での骨塩密度の維持を助ける。骨へ転移する可能性のある癌は、転移が生じる前後に投与された抗Dkk-1抗体により予防または処置できる。多発性骨髄腫は、抗Dkk-1抗体またはその抗原結合フラグメントによって予防および/または治療できる癌タイプの一例である。罹患患者は、骨の局在化領域における破骨細胞の活性化増大のため骨質量の減少を典型的に示す。骨髄細胞は、破骨細胞を活性化して、骨髄空間に埋め込まれている骨髄腫細胞の周囲の骨を溶解するタンパク質であるRANKリガンドを直接的または間接的に産生する。次いで骨髄腫細胞に隣接する正常な破骨細胞がIL-6を産生し、骨髄腫細胞の成長および増殖をもたらす。さらに多発性骨髄腫細胞は、Dkk-1を産生することによって骨芽細胞の活性を阻害し、さらにこの疾患における骨再吸収活性を促進させる。抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントによる動物の治療により、骨芽細胞活性が刺激され、それによって腫瘍部位での骨質量が増加する。このような治療は、骨痛の軽減をもたらし、腫瘍細胞により利用される骨栄養素を放出する再吸収活性を防ぐことにより、骨へのさらなる転移を遮断できる。この疾患の治療において、抗Dkk-1抗体またはその免疫機能性フラグメントは、RANKリガンドまたはIL-6に対する抗体に対して特異的であるアンタゴニスト抗体と同時に投与できる。C.他の障害の治療骨障害に関連する前述の使用に加えて、提供される抗体または免疫機能性フラグメントの幾つかは、他の疾患を治療するために使用できる。これら種々の疾患におけるDkk-1の役割は、種々の異なる組織におけるその発現により部分的に支持される。例えば、該抗体およびフラグメントは、幹細胞再生を促進することが望ましい疾患を治療するために使用できる。このような疾患としては、限定はしないが、糖尿病、慢性心不全および種々の筋疾患[例えば、固定化またはベッド安静から生じる不使用萎縮症;加齢による脆弱高齢者の肉腫;筋ジストロフィ;癌、AIDSまたは感染症に関連する悪液質;腎不全/尿毒症におけるタンパク質エネルギー失調症、および肥満症における筋萎縮]が挙げられる。種々の感染性疾患、例えば、クローン病、大腸炎、および感染性腸疾患もまた治療できる。該抗体およびフラグメントは、種々の神経系疾患例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病の治療にも使用できる。眼疾患例えば、黄斑変性症および種々の網膜症もまた、該抗体およびフラグメントの幾つかにより治療できる。種々の腎疾患例えば、末期腎疾患、慢性腎疾患、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎およびIgA腎症もまた、幾つかの抗体により使用できる。さらに、皮膚疾患および上皮疾患などの種々の肺疾患例えば、慢性閉塞性肺疾患、特発性後腹膜繊維化症および嚢胞性線維症および種々の皮膚障害もまた治療できる。治療できる皮膚障害の例としては、損傷腸管上皮例えば、化学療法誘導損傷、および腸管上皮の成長および生存を刺激することが望ましい他の疾患が挙げられる。VIII.キット本明細書に記載された抗体または免疫機能性フラグメントまたは薬学的組成物を含むキットもまた提供される。幾つかのキットには、容器例えば、バイアルまたはサンプル中に抗体、フラグメントまたは組成物などを含み、上記の種々の検出、スクリーニングおよび治療適用における該抗体またはフラグメント使用のための取扱い説明書もまた含むことができる。抗体、フラグメントまたは組成物は、例えば、溶液の一部として、または固体例えば、凍結乾燥粉末としてなど、種々の形態であり得る。この取扱い説明書には、適切な液体中に該抗体またはフラグメントを調製する方法例えば、溶解または再構成および/または上記疾患例えば、骨低質量、全身骨減少症、骨形成抑制および骨侵食などの骨障害;幹細胞再生;感染性疾患;神経系疾患;眼疾患;腎疾患および皮膚障害の治療のために該抗体またはフラグメントを投与する方法に関する説明書を含むことができる。キットはまた、緩衝剤、塩類、錯化金属イオン類および上記の薬学的組成物の節で記載された他の薬剤などの種々の他の成分を含むことができる。これらの成分は、該抗体またはフラグメントと一緒に含んでもよく、または別々の容器に入れてもよい。キットはまた、該抗体またはフラグメントと一緒に投与するための他の治療剤を含むことができる。このような薬剤の例としては、限定はしないが、癌を治療する薬剤、腫瘍細胞に結合する骨促進剤および抗体、ならびに上記の他の薬剤が挙げられる。以下の実施例は、本明細書に提供される抗体、フラグメントまたは組成物のある一定の態様を単に説明するために提供されており、したがって請求された本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。実施例1マウスおよびラットにおけるマウスDkk-1に対するモノクローナル抗体の産生A.免疫化抗原として使用された組換えマウスDkk-1は、公的に入手可能な配列GenBank登録番号AF030433.1を用いてマウス胎盤cDNAからクローン化された。抗マウスDkk-1抗体の交差反応性を試験するために用いられたヒトDkk-1のクローニングは、米国特許第6,344,541号に記載されたとおりに行った。抗原として使用するマウスDkk-1を調製するために、850cm2ローラーボトルで、5FBS、1×非必須アミノ酸、1×pen/strep/glutおよび1×ピルビン酸ナトリウムを有するDMEM完全DMEM、GIBCO、グランドアイランド、ニューヨーク州中の4~5×107接着293T細胞CellularandMolecularTechnologiesから入手したヒト胎性腎細胞を接種し一晩置いた。翌日、細胞を形質移入した。675μlのFuGene6トランスフェクション剤を、6.75mlの無血清DMEMRocheDiagnosticsおよび112.5μgのpcDNA3.1DNAこのプラスミドはFLAGに結合されたマウスDkk-1を発現する中に希釈した。室温で30分間インキュベーション後、DNA混合物を各ローラーボトル全部で約30本のボトルに加え、5CO2インキュベーター中でインキュベートした。24時間後、1×非必須アミノ酸、1×pen/strep/glut、1×ピルビン酸ナトリウム、1×インスリン-トランスフェリン-セレン補足剤Invitrogenおよび0.5DMSOを含有する100mlの無血清DMEMを、各ボトルに加えた。この培地を採取し、14日間48時間毎に新鮮な培地と取替えた。プールされた澄明な培養培地から、マウスDkk-1を精製した。下記のとおりマウスおよびラットを、完全長組換えマウスDkk-1の注入により免疫化した。幾つかの実験では、マウスラットではなくに、PADREペプチドEpimmuneへの注入前に結合した組換えマウスDkk-1を注入した。結合は、マウスDkk-1と25倍モル過剰のN-スクシンイミジル6-マレイミデオカプロエートMICAFluka63177とを室温で3時間反応させることによって実施した。マレイミド活性化マウスDkk-1を、SephadexG-25で充填した8mm×125mmカラムにより未処理MICAから分離した。1mgのマレイミド活性化マウスDkk-1を、0.5mgのPADREペプチドAKFVAAWTLKAAAC;配列番号13および0.5mgのPADREペプチドCAKXVAAWTLKAAAX=シクロヘキシル-アラニン;配列番号14と共に室温で1時間インキュベートし、次いでPBSに対して透析した。Balb/cマウスおよびC57BL/6マウスJacksonLaboratoriesならびに遺伝子導入AGP3マウスKhareら、PNAS97:3370-3375頁、2000年を、下記のとおり末梢排出リンパ節または脾臓を標的として免疫化した。ルイスラットは、脾臓のみを標的にして免疫化した。リンパ節を標的にするために、1:1比のDkk-1:アジュバントを用いて10~13日に亘って12箇所背部6箇所、腹部6箇所に5回皮下注入した。使用されたアジュバントは、完全/不完全フロイントアジュバント混合物PierceまたはRIBICorixaのいずれかとした。最終注入から1日から3日後に、各注入マウスからの末梢リンパ節を採取し、下記のとおり誘電電気泳動細胞融合を用いてマウスSP2/0.Ag14骨髄腫細胞ATCC番号CRL1581に融合した。注入ラットに対して、最後の抗原注入から13日後にリンパ節を取り出し、リンパ球を、ラットに由来するY3Ag1.2.3融合パートナー細胞ATCC番号CRL1631に融合した。脾臓を標的にするために、マウスに対して1:1比のmuDkk-1:完全フロイントアジュバントまたはmuDkk-1-PADRE:完全フロイントアジュバントのいずれかを用いて2~4箇所の部位に皮下注入した。2週間後に、1:1比のmuDkk-1:RIBIアジュバントまたはmuDkk-PADRE:RIBIアジュバントを用いて2箇所の皮下部位および1箇所の腹腔内部位に第2の免疫化を実施した。抗Dkk-1抗体応答に関して分析するために、血液サンプルを10日後に採取した。最も良く応答したものには、PBS中mDkk-1の腹腔内注入をして増強した。5日後、マウスSP2/0.Ag14骨髄腫細胞に融合させるリンパ球調製のために脾臓を取り出した。B.リンパ球融合プロトコル免疫化動物のリンパ節または脾臓から単離したリンパ球を、以下の最適プロトコルを用いてマウスSP2/0.Ag14またはY3Ag1.2.3ラット細胞に融合した。単一細胞懸濁液を、脾臓細胞または末梢リンパ節PLN細胞から調製し、30~40mlの無血清培地を用い、100μmの細胞ろ過器を通して50mlチューブにろ過した。2000rpmで5分間チューブを遠心分離し細胞を採取した。赤血球存在する場合を溶解させるために、細胞を、10mlのRBC溶解緩衝液0.01MTRIS/HCl中、8.3g/L塩化アンモニウム、pH7.2に再懸濁し、さらに溶解緩衝液を全部で30ml加えた。細胞を2~5分間放置してから、2000rpmで5分間遠心分離した。赤色がペレット中に残存している場合は、この溶解法を繰り返した。溶解ステップ後、細胞をSF媒体に再懸濁し、計数のために一定分割量を取り出し、次いで細胞を全部で50mlのSF媒体中で洗浄した。融合に使用される前に、これらの細胞を以下の選別法に2回供した。この選別は、これらの処置に抵抗した細胞を選別する目的のために実施するもので、以下のとおり2回繰り返した。選別は、幾つかのステップの融合プロトコル、すなわち、遠心分離、ECF融合緩衝液中のインキュベーションCytopulseSciencesCytofusionMediumC、カタログ番号CPS-LCMおよび融合過程の電流による整列工程の実施から成った。この選別を受けたSP2/0.Ag14骨髄腫細胞は、SP2/0-ECF-F細胞と称され、選別を受けたY3.AG1.2.3細胞は、Y3-ECF-F細胞と称される。B細胞濃縮ステップは、マウスにのみ実施された。なお、AGP3マウスを用いる場合、このステップは行われない。手短に言えば、このステップは、SF中、107個の脾臓細胞またはリンパ節細胞を懸濁し、SF媒体で予め洗浄した10μlのCD90磁気ビーズMiltenylBiotecカタログ番号130-049-101を加え、緩やかに攪拌しながら4~12°Cで15分間インキュベートすることからなる。次に細胞を、媒体により1:3に希釈し、40μmろ過器を通してろ過した。全部で2×108個の細胞108個の陽性細胞まで、LSカラムMiltenylBiotecカタログ番号130-042-401上に装填し、溶出物をCD90-フラクションとして採取した。融合を実施する前に、融合用チャンバを70エタノールで滅菌し、次いで無菌フード内で風乾した。B細胞濃縮が実施される場合、骨髄腫およびCD90-を1:1で組合わせ、50mlチューブ内で十分に混合した。B細胞濃縮が実施されたら、骨髄腫および脾細胞またはPMNsを1:2.5比で組合わせた。無血清培地を40ml加え、細胞を2000RPMで5分間遠心分離した。細胞ペレットを、25mlの等浸透圧融合緩衝液ECFで2回洗浄した。細胞をある容量のECFに再懸濁し1ml当り2×106から1×107までの最終濃度を得た。2mlの懸濁細胞を、2mlの融合用チャンバに移し、ケーブルに接続した。60ボルトのACを、30秒間印加し、次いで30マイクロ秒間1500ボルトのDCの3連続パルスを1秒間隔で、次いで60ボルトのACを3秒間印加した。この処理中、洗浄液も含め等浸透圧融合緩衝液への細胞の暴露は3時間以内とした。融合後、細胞を室温で15~45分間融合用チャンバ内で静置し、その後で、続きの処置を実施した。融合細胞を、融合用チャンバから取り出し、15低IgGFBSGibco、1×PSGGibco、55μmβ-メルカプトエタノールGibco、1×OPISigmaおよび5Origenクローニング因子IgenInternationalを含有するBDQuantumYield培地BectonDickinson中、1~5×105個の細胞/mlに再懸濁した。Y3Ag1.2.3融合パートナーを含む実験において、1ng/mlのIL-6を、Origenクローニング因子の代わりに用いた。96ウェル培養プレートFalconの個々のウェルに、100μlの細胞を接種し、37°C、6.5CO2中でインキュベートした。翌日1×HATSigmaを含有する100μlの同じ培地を各ウェルに加え、このプレートをさらに7日間インキュベートし、その後培地を除去し、200μlの同じ培地に置き換えた。総日数10~14日のインキュベーションの後にELISAスクリーニングを実施した。融合は全て、CytopulseSciencesCytofusionMediumCCellカタログ番号CPS-LCM中で実施した。骨髄腫細胞に対する細胞融合は、ECM2001およびエンハンサー400パルスモニターを用いて以下のとおり達成した。用いられた条件を、下表5に示しす。一般に、融合リンパ球は、後の分析のために融合直後に凍結させた。凍結のために、t-150フラスコに、融合培地中、1~3×105/mlの間の骨髄腫細胞密度で新鮮に融合したハイブリッドを接種した。翌日、細胞を採取し、10DMSOを含有する90FBS中で凍結した。実施例2Dkk-1に対する中性抗体を産生するハイブリドーマの単離実施例1に記載されたハイブリドーマを、ELISAアッセイを用いて最初にスクリーニングした。ELISAのために、リン酸緩衝生理食塩水PBS:GIBCO中、50μlの1~5μg/ml組換えmuDkk-1を高結合ELISAプレートCOSTAR登録商標の各ウェルに加えてプレートを1時間調製した。次いで、ハイブリドーマ上澄液の非特異的結合を阻止するために、ウェルを、1ウシ血清アルブミンBSAおよび1ヤギ血清GIBCOを含有する200μlのPBSと共に1時間インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、40μlのハイブリドーマ上澄液を各ウェルに加えてから、プレートを1時間インキュベートした。もう一度PBSで洗浄後、HRPPierceに結合したヤギ抗muIgGFe特異的またはHRPに結合したヤギ抗ラットIgG.HLの1:10,000希釈液の50μlを各ウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートした、プレートをPBSで再度洗浄し、その後1ウェル当り、50μlのABTS基質2,2’-アジノ-ビス3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸;KPLを加えた。この基質は、HRPとの反応の際に水溶性緑色産物を産生する。光学密度を、SpectramaxプレートリーダーMolecularDevicesを用いて読取り、データは、SoftmaxプロソフトウェアMolecularDevicesを用いて解釈した。下表6は、免疫化された動物の各カテゴリから得られたELISA陽性クローン数を示している。抗原反応性の全てのハイブリドーマを、抗体の産生およびさらなる試験のために細胞培養において増加させた。A.TCF/lef-ルシフェラーゼアッセイ実施例1に記載されたとおり得られた数百のハイブリドーマを、ルシフェラーゼ発現がWntの制御下にあるTCF/lef-ルシフェラーゼレポーター構築体を利用して試験した。この構築体により形質移入された細胞が、生物学的に活性なWntに暴露された場合、ルシフェラーゼ活性が誘導される。Wnt誘導ルシフェラーゼ活性は、組換えDkk-1タンパク質をこの構築体を含有する細胞に加えることによって抑制できる。本実験に関して、Wnt3aおよびDkk-1の双方を最初に、Wnt依存ルシフェラーゼ発現の凡そ80を抑制する最適化量で細胞に加えた。抗Dkk-1抗体のこれら同じ細胞へのさらなる添加は、Wnt活性を再生させ、したがってルシフェラーゼ発現を増加させることが予想される。したがって、Wnt/ルシフェラーゼ構築体を形質移入された細胞においてルシフェラーゼ発現を再生できるかどうかを判定するために、ハイブリドーマの上澄液を試験した。ルシフェラーゼ活性は、下記のとおり定量化した。0日目に、新鮮にトリプシン化した293T細胞を、フィブロネクチン被覆96ウェルプレート内に2.5×104/ウェルで平板培養した。次いで細胞に、ホタルルシフェラーゼをコードするDNAおよびウミシイタケルシフェラーゼをコードするDNAを同時トランスフェクトした。1日目の各ウェルで、30μlのDMEMマイナス抗体中10ngのTCF/lef-ルシフェラーゼDNAUpstateのTOPflash、番号21-170および1ngのウミシイタケルシフェラーゼDNApRL-TK;Promega番号E2241を、1:10PolyfectTransfectionReagebt登録商標Quiagen301107の20μlと混合し、PolyFect-DNA複合体を形成させるために室温で10分間インキュベートした。このインキュベーション後、100μlの増殖培地を該複合体に加えた。次に培養培地を各ウェルから取り出し、増殖培地中の複合体をウェルに加えた。ウェル中の増殖培地を3時間後に取り出し、馴化培地と置き換えた。3日後、細胞をPBSで1回洗浄し、デュアルルシフェラーゼキットPromega、番号PAE1960中に含まれた40μlの新鮮に作製された受動溶解用緩衝液を各ウェルに加えた。受動溶解用緩衝液はまた、Promega番号E1941から別に入手できる。プレートを室温で20分間振とうして細胞溶解を生じさせる。1アッセイ当り10μlの溶解液を、製造元のプロトコルに従ってPromega、番号PAE1960を用いて96ウェル白色プレートVWR62402-980中、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施するために使用した。MolecularDevicesからのLmaxデュアル注入器を有するルミノメータを用いて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼからの発光シグナルを双方とも記録し、これらのシグナルの比率を用いて、EC50を決定し、用量応答曲線をプロットした。最初に、ホタルルシフェラーゼの基質を細胞溶解液に注入し、発光シグナルを記録した。次いでウミシイタケルシフェラーゼの基質を、同じウェルに注入し、生じた第2の発光シグナルを記録した。上記の表2は、このアッセイにおける陽性結果を誘導したハイブリドーマ数を報告しているが、このように、それらが産生したモノクローナルはWntを中和できたことを示している。ST2細胞アッセイを用いるハイブリドーマスクリーニングルシフェラーゼアッセイにおいて陽性と試験されたこれらのハイブリドーマのさらなるスクリーニングのために、マウス骨髄に由来する間質細胞系RIKEN、細胞番号RCB0244を使用した。Wnt3aシグナル伝達に応答して、ST2は、骨芽細胞マーカータンパク質アルカリホスファターゼALPを発現する骨芽細胞に分化する。これらの細胞におけるWnt3aによるALPの誘導は、Wnt阻害剤Dkk-1を培養培地に加えることによって阻止でき、ALP発現は、中和抗Dkk-1抗体など、Dkk-1活性を中和できる試剤に細胞を暴露することによってこれらの条件下で再生できる。したがって、、ハイブリドーマは、Wnt3aの存在下でST2に対するALP活性を再生する能力に関してスクリーニングされた。アッセイに関する調製において、ST2細胞を、10ウシ胎児血清、1×ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンおよび1×ピルビン酸ナトリウム全てこれらの試剤は、GIBCOから入手したを含有するMEM-α中で培養した。細胞を、1ウェル当り22μlの培養培地を有する96ウェルプレート内で1×104個の細胞/ウェルで平板培養した。細胞を、5CO2を有する加湿インキュベーター中、37°Cで24時間まで一晩インキュベートした。アッセイ0日目に、各ウェルに、20μlの緩衝液プラスマウスL-Wnt3a安定細胞系に由来する20μlのWnt3a馴化培地中、200ngの組換えマウスまたはヒトDkk-1を加えた。馴化培地は、Wnt3a源を提供した。これら2つの試剤すなわち、Dkk-1およびWnt3a量は、これらの細胞におけるALPの約10の完全動態範囲を可能にするために互いに相対的調整を行った。次に試験される各抗体を1:2間隔でDMEMに滴定してALP活性を再生する能力を測定した。試験範囲の高端で、各ウェルは1ml当り100μgの抗体を受けた。ヤギ抗ヒトDkk-1ポリクローナル抗体RDSystemsカタログ番号:AF1096は、陽性コントロールとして役立った。偽形質移入馴化培地または上記のST2培養培地のいずれかを陰性コントロールとして用いた。抗体またはコントロール培地を添加後、該プレートを37°で72時間インキュベートした。3日目に培地を除去し、細胞を0.1MTRISpH7.4でリンスした。次に、1ウェル当り、グリシン緩衝液中、150μlの0.1IGEPALCA-630Sigmaカタログ番号I-3021を加え、その後プレートを-80°Cに凍結してから解凍した。解凍したら、ALPをアッセイするために、100μlの各ウェルの細胞溶解液を、新鮮な96ウェルプレートに移した。基質としてグリシン緩衝液0.1Mグリシン、1mMのMgCl2、pH10.5中、100μlの4mg/mlのp-ニトロフェノールリン酸二ナトリウムSigma:カタログ番号104-40を、1ウェル当り2mg/mlの最終基質濃度に加えた。ALPによる加水分解時に、この基質は黄色を有するp-ニトロフェノールを生じる。次いでプレートを37°Cで30分間インキュベートしてALPによって基質を加水分解させた。このインキュベーション後、1ウェル当り50μlの0.5NNaOHを添加することにより反応を中止させた。プレートを405~410nMで読み取った。ALPアッセイは、BCAタンパク質アッセイを用いて正規化し、製造元Pierceカタログ番号23223、23224の取扱い説明書に従って実施した。正規化PNPnmol/タンパク質1mgは、真のアルカリホスファターゼ誘導測定を妨げ得る各ウェルが経験する細胞数の変化を相殺させるために実施した。ALPアッセイの結果を陽性および陰性コントロールと比較し、その結果は表7に報告した。表7のデータは、試験された多数のクローンのものを示しているが、最も強力な中和活性を発現する2つは、ラットに由来する1F11-2および11H12の両者であった。要約すると、全部で19,250のハイブリドーマを、ELISAアッセイにおいてスクリーニングした。これらのうち、ELISAアッセイにおける728の結合Dkk-1、および中和化アッセイTCR/lefレポーターアッセイまたはST2細胞アッセイの1つまたは双方において10が、陽性であった。表7におけるデータは、陽性クローンのものを示し、11H10クローンは、最良の活性を有した。例えば、11H10クローンは、8nmのヒトDkk-1に対して3.5nMのEC50および8nmのマウスDkk-1に対して6.1nMのEC50を有した。実施例3Dkk-1に対するモノクローナルの親和性結合上記のとおり、細胞ベースのアッセイにおいて最良のDkk-1中和アッセイを示すハイブリドーマは、ラット由来の11H10および1F11であった実施例2を参照。11H10抗体は、IgGIイソタイプのものである。本実施例は、これら2つの抗体が双方ともマウス、ラットおよびヒトDkk-1に対して高親和性で結合することを例証している。そのより良好な中和活性と一致して、11H10クローンもまた、これらのアッセイにおいてDkk-1に対して1F11よりも高い親和性を有した。動態学的分析は、BiaCore2000BIACORE、Uppsala、スウェーデン国を用いてDkk-1に対する11H10抗体および1F11抗体の結合を試験するために実施した。ラットDkk-1260μg/ml、マウスDkk-1690μg/mlおよびヒトDkk-1900μg/mlを、CM5チップ表面に免疫化し、種々の濃度0.78nMから約100nMの抗体を、免疫化Dkk-1表面上に注入した。結合センサーグラムを、BIAevaluation3.2を用いて分析した。データを、下表8および9に要約する。11H10が、Dkk-1に対してより高い親和性を有し、標的に対するその親和性がBiaCoreアッセイの感度限界を超えたことが、BiaCore結果から明らかであった。したがって、Dkk-1に対する11H10の結合親和性を、より高感度のKinExA登録商標3000SapidyneInstruments社、Boise、アイダホ州を用いて平衡結合分析によりさらに評価した。これらの測定では、Reacti-Gel6×ビーズPierce、ロックフォード、イリノイ州を、マウス、ラットまたはヒトDkk-1で予め被覆し、BSAにより遮断した。100pM、300pM、または1000pMの11H10抗体を、ヒト、マウスまたはラットDkk-1の1pMから50nMまでの濃度範囲の種々の濃度で混合し、室温で8時間平衡化した。次にこの混合物を、Dkk-1被覆ビーズ上に通過させた。ビーズ結合抗Dkk-1抗体量を、蛍光タグで標識されたヤギ抗ラットIgG抗体Cy5;JacksonImmunoResearch、ウェストグローブ、ペンシルバニア州を用いて定量化した。測定された蛍光シグナル量は、平衡での各反応混合物中の遊離抗Dkk-1抗体の濃度に比例した。解離平衡定数Kdは、KinExAソフトウェアを使用したデュアル曲線ワンサイト相同モデルを用いて競合曲線の非線形回帰式から得られた。11H10に関するKinExAアッセイの結果により、ヒトDkk-1に対するKdは、1.3×10-10Mであり、マウスDkk-1およびラットDkk-1に対しては、それぞれ1.65×10-10Mおよび5.4×10-10Mであったことを示した。結合動態試験は、上表1に記載された軽鎖および重鎖各鎖の同一対の幾つかの異なる組合わせにより実施した。一般にこれらの抗体は、104/Mx秒と106/Mx秒との間のKa値、および10-4s-1と10-5s-1との間のKoffKdを有する。実施例4ハイブリドーマ11H10のインビボ試験若齢マウス動物モデルにおけるDkk-1の中和化により、骨塩密度BMDおよび骨形成のためのマーカーである血清中オステオカルシンの増加を生じるかどうかを判定するために実験を実施した。これらの実験に関して、11H10抗体は、培養された11H10ハイブリドーマ細胞培地から精製した。採取された培養培地を、50kDMWCOスクリーニングチャネルカセットMilliporeを装着したPellicon限外ろ過デバイスAmiconを用いて12倍に濃縮した。濃縮した培地を0.2μmポアフィルタを通してろ過してから、タンパク質GセファロースPharmaciaに結合させた。少なくとも4容量のPBSでタンパク質Gセファロースを洗浄後、抗体をIgG溶出緩衝液Pierceで溶出してから、5v/v1MTris-HClを加えることにより中性pHに緩衝処理した。次に抗体をPBSに対して透析した。透析液を、0.2μmフィルタを通してろ過し、0.06EU/mlPyrotellLALバイアルAssociatesofCapeCodによりエンドトキシンを試験した。精製抗体におけるタンパク質濃度は、1.35の吸光係数を用いて280nmでの吸光度により測定した。4週齢オスBDF-1マウスAPR233757、CharlesRiverに、表10に示されたとおり、精製11H10モノクローナル抗体の3用量5、10、20mg/kgのうちの1用量を用いて3週間に亘り皮下注入した。1群当り5匹のマウスを用いた。陰性コントロールマウスは、媒体PBSを注入し、陽性コントロールマウスは、これらのマウスにおける骨密度の増加を刺激することが知られているDempsterら、EndocrineReviews146:690-709頁1993副甲状腺ホルモンアミノ酸1~34を注入した。1注入当り、0.001NHCl、0.15MNaCl、2BSA、pH8.0中の100μg/kgのPTH1~34を用いた。この実験を、表10に示されたとおり、丁度2回反復したが、20mgのラットIgGを受けた陰性コントロールマウスの群が追加された。さらに、これらの実験を、組換え発現11H10により反復させた。オステオカルシンアッセイおよび臨床化学パネルのために、血液をベースライン0日目、3日目、5日目、7日目、14日目眼窩後部、21日目終末心穿刺に採血した。血清中オステオカルシン濃度は、マウスオステオカルシンに特異的な免疫放射線アッセイIRMAキットImmunotopics社、サンクレメンテ、カリフォルニア州を用いて測定した。アッセイ前に血清サンプルを室温に平衡化させ、全てのアッセイを2重反復で実施した。このアッセイでは、マウスオステオカルシンに対して2種の抗体を使用した。第1の抗体は、オステオカルシン分子のC末端の中央領域を認識するアフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗体であり;この抗体を、捕捉剤として用いられるプラスチック上に固定化した。他の抗体は、オステオカルシン分子のアミノ末端を認識するアフィニティー精製ポリクローナル抗体であり;この抗体は、オステオカルシンの検出に使用するために放射標識された。マウス血清サンプルを、抗体被覆ビーズおよび125I標識抗体と共に室温で18時間から24時間インキュベートして、固定化抗体および放射標識抗体にオステオカルシンを結合させ、標識ビーズ結合サンドイッチを形成した。インキュベーション後、未結合標識抗体を除去するためにビーズを2回洗浄し、ガンマカウンターでカウントし、カウントをバックグラウンドに関して修正した。これらのアッセイにおいて、抗体複合体の反応性は、血清中のマウスオステオカルシン量に直接比例した。サンプル中のマウスオステオカルシンの濃度は、キット中のこの目的のために提供されたコントロールオステオカルシンから作成した標準曲線から直接決定した。3日目およびその後、11H10の全ての用量が、媒体処置マウスと比較してオステオカルシンの増加を誘導した。増加度は、用量依存であった。10mg/kgおよび20mg/kg用量では、7日の時点で統計的に依然として有意のままであった。投与された全ての用量で、オステオカルシン誘導が、11H10処置開始3日後の早期に見られ、観察された総増加度は、PTH処置動物に見られたものと同様か、またはそれらより大きかった。BMDをアッセイするために、第1週末、第2週末および第3週末にマウス全体のX線写真を、Faxitron番号43855AX線システムバッファローグローブ、イリノイ州およびKodakX-OMATTLフィルムロチェスター、ニューヨーク州を用いて56kvpで49秒間撮影した。生じたx線フィルムを、10種の骨における骨密度の増加に関して、肉視検査した。媒体またはPTH緩衝液で処置された群では増加が認められなかった。しかしながら、PTH1~34または11H10で処置された群は、1週目までに5種以上の骨において、また3週目末までに10種の骨の大部分に密度増加を示した。3週目末の注入期間において、pQCTBMD分析を、脛骨幹端近位で実施し、全体密度、小柱密度および皮質密度を測定した。pQTCにより測定された全BMDは、11H10の最高用量において、主に小柱BMD増加による陽性応答を示した。表11は、実施した2つの実験のうちの1つで得られたBMD測定値を示している。双方の実験で同様の結果が得られた。表11の数字は、媒体コントロールと比較した変化パーセントを表している。表11中の星印は、11H10群とコントロール群との間に統計的有意差があることを示しているANOVAp<0.05。全体的に、11H10によって誘導されたBMD増加量は、PTH1~34陽性コントロールによって誘導された増加量と同等であった。実施例5種々の抗体のインビボ試験骨密度を増加させる中和Dkk1の能力にさらにアクセスするために、若齢6週齢および老齢8.5ヵ月齢マウスの双方を、上記実施例4のとおりラット11H10で処置した。マウスを、pQCTおよびミクロCTμCTによるBMD変化について分析した。μCTに関しては、eXploreLocusSPMicro-CTSystemGEHealthcare、ウォークシャ、ウィスコンシン州、米国を用いてマウス大腿骨における小柱構造および皮質幾何学的形状を調べた。PBSで満たし、ガーゼで固定された骨密度ファントムを有する2cmクライオチューブに大腿骨を入れた。大腿骨全体を、密度ファントムで検量した200°80kVp、80uAに関して0.5°回転でスキャンし、再構成して18×18×18μmのボクセルサイズを有する画像を生じさせた。対象領域を、皮質および小柱形態計測パラメータならびに密度パラメータGEHCMicroViewソフトウェアに関して分析した。大腿骨幹の中央10長さでを、平均骨内膜周長および骨膜周長、ならびに皮質面積および容積BMD閾値=640mg/ccに関して分析した。大腿骨遠位から小柱骨の領域を単離し、骨容量フラクションBV/TV、小柱厚Tb.Th、小柱数Tb.N、および容積BMD閾値=320mg/ccなどのBMDおよび立体的解析パラメータに関して分析した。これらの領域を、大腿骨長10の長さに基づいて選択し、成長プレート海綿状近位に配置した。pQCTおよびμCTの双方が、11H10処置の若齢および老齢マウスのrにおいてBMDの有意な変化を示した。さらに許容されたμCTは、ラット11H10による中和Dkk1活性により、若齢および老齢マウスの双方において小柱数の有意な増加をもたらすことを示した図2。老齢マウスにおけるラット11H10の最高用量は、骨内膜周長の減少をもたらし、ラット11H10はまた、海綿骨に加えて皮質骨成長にも積極的に影響を及ぼすことを示した。Dkk1中和化が、エストロゲン欠乏のための骨減少の回復を補助できるかどうかを判定するために、卵巣摘出OVXマウスを、ラット11H103、10,30mg/kg、皮下注入により1週2回により処置した。この実験において、7ヵ月齢CDF-1マウス、5ヵ月齢OVX後マウスを、ラット11H10mPTH100μg/kgまたは媒体で処置した。BMDを、ベースライン、7日目、14日目、21日目および28日目のpQCTにより分析した。28日目のデータを、脛骨および腰椎に関するベースラインからの変化パーセントとして下記に示す図3。別の実験において、h11H10RTIgG1イソタイプおよびh11H10RTIgG2イソタイプ軽鎖および重鎖ならびに可変領域に関する配列は表1および2を参照の有効性は、上記と同様のプロトコルを修飾して用いて若齢マウスにおいて判定し、h11H10RTIgG1イソタイプおよびh11H10RTIgG2イソタイプをラット11H10およびPTHと比較した図4。これら2種の抗体もまた、マウスにおいてDEXA分析により測定されたようにBMDを増加させたことを、このデータは示している。上記の実験結果は、本明細書に記載された抗体の幾つかによるDkk-1活性の中和化が、骨形成に対してアナボリック効果を有することを示している。実施例611H10抗体に結合するヒトDkk-1エピトープの特性化ヒトDkk-1は、N-末端近傍およびC-末端近傍に位置する2つのジスルフィドドメインを含有し、本明細書ではN-およびC-末端ジスルフィドドメインと称される。N-末端ジスルフィドドメイン以後、ジスルフィドドメイン1は、55のアミノ酸残基配列番号2のアミノ酸85~139を含有し、10個のシステインを有して5つの分子内ジスルフィド結合を形成する。C-末端ジスルフィドドメイン以後、ジスルフィドドメイン2は、約75のアミノ酸残基配列番号2のアミノ酸189~263を含有し、10個のシステインを含有して5つの分子内ジスルフィド架橋を形成し、その結果、完全折りたたみタンパク質中に7つのループが形成される図1参照。Dkk-1のジスルフィドドメイン2は、カノニカル補リパーゼ折りたたみ体と同様の分子構造を有することが提案されており、その結晶構造は、ブタ補リパーゼを用いて決定されているAravind,A.andKoonin,E.V.、CurrentBiology8:R477-479頁1998。ヒトDkk-1のジスルフィドドメイン2の7つのループは、配列番号2のアミノ酸190~194、196~199、202~209、211~219、221~236、240~244および246~262からなる。還元剤を用いた処理により、11H10に結合するDkk-1の能力が無効になり、この抗体により標的にされるエピトープが、立体配置的であり、このタンパク質における少なくとも幾つかのジスルフィド結合の維持を必要とすることが示された。この立体配置的エピトープを特性化するために、臭化シアンCNBrおよび数種のプロテアーゼによるヒトDkk-1の切断を含んだ方法が適用され、次いで生じたフラグメントが、11H10抗体に依然として結合できるかどうかを調べるために試験した。生じたデータは、判定されるエピトープの位置が決定されることを可能にした。手短に言うと、ペプチド消化物を、抗体と共に、または抗体なしでインキュベートし、10Kカットオフ膜を通して抗体に結合したペプチド約150,000Daを捕捉し、次にHPLCペプチドマッピングに供した。抗体に暴露させたサンプル中のHPLCピークの高さの減少により、そのピークのペプチドが抗体に結合しており、したがってエピトープの一部を形成したことを示した。個々のHPLCピークを採取し、ペプチドを同定し、N末端配列決定によりマップ化した。ペプチドが11H10に結合できるかどうかを判定するために、それらを、結合のためのバイオセンサーとしてタンパク質A捕捉抗Dkk-1抗体を用いて、BiaCoreワークステーションによるリアルタイムの生体特異的相互作用アッセイに供した。これら試験用の全てのHPLC分析は、逆相C5カラム1mmi.d.×10cm長を用いて実施された。HPLCペプチドマッピングは、0.05トリフルオロ酢酸移動相A中から0.05トリフルオロ酢酸中の90アセトニトリルの線形勾配により実施した。カラムは、0.15ml/分の流速で70分に亘り展開された。CNBr消化hDkk-1のCNBr開裂により、2種の大型フラグメント、CNBr1およびCNBr2が生成した。これらは、それぞれジスルフィドドメイン2およびジスルフィドドメイン1を表した。CNBr1は、ジスルフィド結合により一緒に保持された2種のペプチド配列番号2のアミノ酸179~206および配列番号2のアミノ酸207~266からなった。CNBr2もまた、ジスルフィド結合により一緒に保持された2種のペプチド配列番号2のアミノ酸32~122および配列番号2のアミノ酸127~178からなった。BiaCore分析の結果、11H10は、CNBr1には有意に結合できたが、CNBr2には全く結合しないことが示された。したがって、11H10は、Dkk-1のジスルフィドドメイン2に位置したエピトープに結合することが結論付けられた。トリプシン消化次にヒトDkk-1を、argおよびlysの後で開裂するトリプシンで消化した。0.5~1.0mg/mlでDkk-1の約200μgを、8μgのこれらのプロテアーゼのうちの1種または他種と共に37°Cで20時間PBSpH7.2中でインキュベートしてDkk-1の完全消化を達成した。トリプシン消化物のHPLCクロマトグラフィにより、複数ピークが生じた。トリプシンフラグメントのどれが、抗体に結合する能力を保持しているかどうかそれが存在するならばを判定するために、消化物を、11H10抗体と1:2のモル比において、0°Cで2時間インキュベートした。抗体およびそれに結合したペプチドをMicrocon膜30,000分子量をカットオフ上で捕捉した。Microconフィルタからの流液中ペプチドをHPLC上で分析し、抗体に結合したためにどのピークが減少または除去されたかを判定した。抗体に暴露させたサンプルに関するHPLCの結果を、11H10なしの同じ方法に供されたコントロール消化物と比較した。下記に考察されるように、トリプシン消化により生成したフラグメントのいずれも11H10に結合する能力を保持していなかった。配列分析は、トリプシン消化後のHPLCから回収されたピークにおけるペプチドを同定し、マッピングするために実施した。2本のピーク、Tryp40.5保持時間40.5分約6~7kDaおよびTryp45約8kDaは、それぞれジスルフィドドメイン2およびジスルフィドドメイン1にマッピングされた配列を含有することが確認された。Microcon膜捕捉またはBiaCore結合実験により試験された場合、Tryp40.5またはTryp45のいずれも11H10に結合しなかった。Tryp40.5は、ジスルフィドドメイン2の5つのジスルフィド結合により一緒に保持された7種の小型ペプチド6つから12のアミノ酸長からなった。ジスルフィドドメイン2の配列の3種の小型セグメントが、Tryp40.5から欠落していた。これらの欠落配列は、配列番号2のアミノ酸204~208、223~226および247~249であった。Tryp40.5は、11H10に結合できないことから、これら3種の欠落ペプチドの1つまたは複数が、この抗体が結合するエピトームの必須部分を形成しているにちがいないことは明らかである。エンドLysC消化エンドLysClysの後のみ開裂によるヒトDkk-1の消化もまた、上記のとおりHPLCに供された場合、幾本かのピークを生成した。1つだけのHPLCフラクション、LysC48.7は、HPLC分析前に消化物を抗体とインキュベートした場合にピーク高の減少を示した。LysC48.7は、ジスルフィドドメイン2の5つ全てのジスルフィド結合により一緒に保持された3種のペプチドフラグメントからなった。配列分析により、これら3種のペプチドは、配列番号2のアミノ酸183~222、227~249、および250~266からなることを示した。配列分析により、LysC48.7は、ジスルフィドドメイン2の1つのセグメント、すなわち、配列番号2のアミノ酸223~226だけを欠落していることが明らかとなった。したがって、LysC48.7は、ジスルフィドドメイン2の3つのドメインを欠落したTryp40.8よりも構造的により完全であった。LysCフラクションに結合する11H10の能力を、BisCore結合アッセイを用いて測定した。LysC48.7フラクションのみが、何らかの結合活性を示した。LysC48.7フラクションは、強いオンレートの抗体結合を示した。しかしながら、オフレートは極めて速く、結合は速やかにバックグラウンドレベルまで減少した。これらのデータにより、配列番号2のアミノ酸223~226が、ジスルフィドドメイン2から切り取られない場合は、11H10に対する標的エピトープは、抗体に対する結合を保持しないことを示している。したがって、11H10がDkk-1に結合する際に残基223~226が11H10に直接接触することになり得るか、または折りたたみタンパク質のアミノ酸223~226の即近傍内の他のアミノ酸残基に、抗体を有効に接触させる三次元構造を維持するために、これらの残基が必須であることが結論付けられる。AspN消化11H10結合エピトープをさらに描写するために、hDkk-1をプロテアーゼAspNで消化し、生じたフラグメントを上述のとおり分析した。消化物を11H10に予め暴露した場合、AspN消化により生成した主要なHPLCピークのうち、3本の高さが減少し、これらのペプチドが抗体に結合したことを示した。抗体に結合したピークは、AspN48.7、AspN49.6およびAspN52であった。配列分析により、これら3本の抗体反応性ピークは、ジスルフィドドメイン2に由来することが示された。AspN48.7とAspN49.6とは、アミノ酸配列が同一であり、それらの各々は、ジスルフィドドメイン2における5つのジスルフィド結合により一緒に保持されるペプチドからなった。これら2本のピークのHPLC移動の相違は、恐らくAsn256に結合した炭水化物の異質性によるものであった。これら2つのペプチドは、配列番号2のアミノ酸166~231および232~266であった。AspN52は、配列番号2のアミノ酸166~266に相当する単一のペプチドのみを含有した。したがって、AspN52は、明らかに部分的消化産物であり、その配列は、AspN48.7とAspN49.6に大部分は重なるが、後者の2つは、AspN52と比較して、Leu231とGlu232との間で余分な切取りを受けた。この切取りは、配列番号2のアミノ酸221と236との間にあるループ内で生じる。これらピークの3本全てが、Microcon捕捉実験およびBiacore結合分析において11H10に対して有意な結合を示した。これらのデータにより、hDkk-1配列番号2のアミノ酸231と232との間のペプチド結合の分裂は、11H10がその標識エピトープを認識する能力に影響を及ぼさないことが示されている。消化結果の分析上記の結果により、11H10は、タンパク質のジスルフィドドメイン2に位置しているヒトDkk-1の非線形エピトープに結合し、また該エピトープは、配列番号2のジスルフィド結合Cys220-Cys245、Cys239-Cys263およびCys200-Cys237により形成された2つの大型ループに存在することを示している図1を参照。図1に示されるように、エピトープを形成2つのループは、Cys220とCys237との間およびCys245とCys263との間にあり、したがって2つのループの本体は、配列番号2のアミノ酸221~236および246~262を含む。Dkk-1のトリプシン消化により、アミノ酸223~226および247~249が取り除かれることによりCys220/Cys237ループおよびCys245/Cys263ループが開いた。これら2種のペプチドが除去されたことにより、トリプシン消化産物は、11H10に結合できなかった。第3のペプチド配列番号2のアミノ酸204~208もまた、トリプシン消化により除去されたが、他のプロテアーゼが、これらのアミノ酸類が存在するループを切り取ることなく抗体結合を減少できることから、これはエピトープ外にあると思われた。抗体結合を大幅に減少させたLysC消化はまた、配列番号2のアミノ酸223~226を除去することによりCys220/Cys237ループを開き、またLys249配列番号2における単一ペプチド結合で開裂させることによりCys245/Cys263ループを開いた。したがって、LysC消化結果もまた、11H10結合に関するCys220/Cys237ループおよびCys245/Cys263ループに関係した。AspN消化は、抗体結合を減ずることなくCys220/Cys237ループ内のGlu232配列番号2で切り取り、したがって適切なエピトープコンフォメーションの保存にとって、このループが全く完全であることが必要でないことを示唆した。しかしながら、上記に示されたように、LysCによるこの同じループから配列番号2のアミノ酸223~226の除去が、抗体結合を破壊したため、このループは明らかに重要である。これらの分析によれば、11H10に結合するエピトープは、ジスルフィドドメイン2のCys220/Cys237ループおよびCys245/Cys263ループの近傍に位置しており、したがって、配列番号2のアミノ酸220~237およびアミノ酸245~263は、抗体結合にとって極めて重要である。このC末端ドメインジスルフィドクラスター内の他のジスルフィド結合により形成されたループは、この抗体による認識には関与していないようである。この結果はまた、このドメイン内のジスルフィド結合は、抗体結合を可能にする立体配置にエピトープを保持するために完全でなければならないことを示している。エピトープ内で、結合を保持するために必要であると思われる最小部分としては、配列番号2のアミノ酸221~229これは、Glu232における開裂が結合に影響を与えなかったという事実から導かれるおよび構造的考察により、このループ内の他のアミノ酸が11H10に結合することを妨げることができる嵩高い炭水化物部分にAsp256が結合していることが示されることから配列番号2のアミノ酸246~253が挙げられる。実施例71F11抗体はDkk-1への結合に関して11H10と競合する1F11モノクローナル抗体が、11H10と同じDkk-1上のエピトープに結合し得るかどうかを判定するために実験を実施した。この事柄は、これらのモノクローナル抗体の双方が、Dkk-1の生物活性を中和することから興味深かった。下表12に示されるとおり、1F11は、TCF-lefアッセイにおいてマウス、ラットおよびヒトDkk-1活性を中和するが、11H10ほどではない。11H10と1F11との間の競合実験は、上記のとおり、BiaCore2000を用いて実施した。ヒトDkk-1を捕捉するために、11H10または1F11を固定化したBiaCoreチップを使用された。捕捉ステップ後、Dkk-1へのさらなる結合が達成されるかどうかを調べるために、1F11または11H10を、チップ表面上に注入した。これらの実験において、チップ上に注入された抗体はいずれも、捕捉されたヒトDkk-1に結合できなかった。すなわち、11H10は、1F11により捕捉されたヒトDkk-1に結合できなかったし、また、1F11は、11H10により捕捉されたヒトDkk-1に結合できなかった。これらのデータは、これら2つの抗体が、ヒトDkk-1上の同じエピトームに結合することを強く示しており、したがって、この特定のエピトームを標的にすることは、Dkk-1活性を中和するために特に有効な手段であることを示唆している。表1に掲げた重鎖および軽鎖を含む他の幾つかの抗体重鎖および軽鎖の同一対が、ラット11H10および1F11により認識された同じエピトープに関して競合し得るかどうかを判定するために他の実験を実施し、そのようであることが分かった。実施例811H10はLRP6へのDkk-1の結合を妨害するDkk-1とLRP6および推定上LRP5の相互作用を妨害することにより、11H10が、その生物学的影響を及ぼすかどうかを判定するために、我々は、フローサイトメトリーを利用するKRP6Dkk-1結合アッセイを確立した。このアッセイでは、入手した市販のLRP6-Fc融合タンパク質RDSystems、番号1505-LRおよびアミノ末端ビオチンタグ化ヒトDkk-1を用いる。ビオチンタグ化Dkk-1融合構築体は、哺乳動物発現構築体においてビオチンのC末端に融合発現されるようにhDkk-1をコードするDNAをクローニングすることにより作出された。この構築体は、一時的に293T細胞にトランスフェクトされ、トランスフェクション48時間後に馴化培地を収集した。11H10が、LRP6に対するDkk-1結合を妨害できるかどうかを判定するために、LRP6を、11H10の有り無なしのもとで馴化培地に加えた。次にストレプトアビジンビーズをこの調製物に加え、ビオチンDkk-1融合タンパク質をビーズに結合させた。Dkk-1へのLRP6の結合を、LRP6-Fc融合構築体のFc部分に特異的なFITC結合抗体を用いることにより測定した。Dkk-1へのLRP6結合は、フローサイトメトリー用いることにより検出した。6.46の特異的結合シグナル特異的結合は、観察された全シグナルマイナスDkk-1不在下で観察されたシグナルに等しいが、LRP6とDkk-1で検出された。LRP6添加前のDkk-1と11H10とのインキュベーションによりこのシグナルが2.66に減少したが、これは抗体無しで観察された特異的結合の50未満であり、このことから11H10が、LPR6へのDkk-1の結合を妨害することが示された。実施例911H10重鎖および軽鎖cDNAのクローニング総RNAを、製造元の取扱い説明書に従ってTRIzol登録商標試薬Invitrogenによりラットハイブリドーマ11H10細胞から単離し、次いでQuiagenRNeasy登録商標カラムを用いてさらに精製した。5’RACEcDNA末端の迅速増幅オリゴヌクレオチド5’-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3’;配列番号15を、GeneRacer商標キットInvitrogen成分およびプロトコルを用いてRNAに結合させた。このオリゴヌクレオチドは、mRNA分子の5’末端に2つのユニークなプライミング部位を提供する。第1鎖のcDNAは、延長アダプター5’-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3’;配列番号16を有するランダムプライマーを用いてこの修飾RNAから合成した。ラット抗体遺伝子の保存配列を利用して、5’RACEPCR反応を実施し、て抗muDkk-1抗体をコードするこれらのcDNA類を増幅させた。11H10の完全軽鎖をクローンするために、正方向プライマーとしてGeneRacer商標プライマー5’CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’;配列番号17を用い、逆方向プライマーとして5’-GCAACAGTGGTAGGTCGCTTGTGG-3’配列番号18を用いてRACEPCRを実施した。この逆方向プライマーは、ラットカッパ鎖3’未翻訳領域のヌクレオチド74~98に相当する。次にこのPCR産物を、正方向プライマーとしてGeneRacer商標入れ子プライマー5’GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’配列番号19および同じ逆方向プライマー配列番号18を用いる入れ子PCR用のテンプレートとして用いた。重鎖の可変領域に対するRACEPCRでは、正方向プライマーとしてGeneRacer商標プライマーを用い、逆方向プライマーとしてラットIgG定常領域におけるヌクレオチド10から39に相当する5’-AGGAGCCAGTGGATAGACAGA-3’配列番号20を用いた。次にこのPCR産物を、正方向プライマーとしてGeneRacer商標入れ子プライマーおよび同じ逆方向プライマー5’-AGGAGCCAGTGGATAGACAGA-3’配列番号20を用いて、入れ子PCR用のテンプレートとして用いた。次にRACEPCR産物を、クローニングベクターpCR4-TOPOTAInvitrogenにクローン化した。これらクローンのDNA配列は、クローニング部位をフランキングしているpCR4ベクタープライマー、色素標識ヌクレオチドおよびABIDNAシーケンサーを用いて決定した。11H10軽鎖および重鎖可変領域に関するコンセンサス配列を構築し、コード配列のアミノ末端部に特異的な5’PCRプライマーをデザインするために用いた。これらのプライマーはまた、クローニングおよびKozak配列に関するSaII制限部位を含有した。軽鎖用にデザインされた5’PCRプライマーは、以下のヌクレオチド配列:5’-AAGCTCGAGGTCGACTAGACCATGGGTGTGCCTACTCATCTC-3’配列番号21;重鎖に関しては、5’-AAGCTCGAGGTCGACTAGACCACCATGGACATCAGGCTCAGCTTGG-3’配列番号22を有した。次にこれら5’プライマーを、コード配列のカルボキシ末端部に特異的で、クローニングのためのNotI制限部位を含有する3’プライマーと共に用いた。軽鎖に関する3’プライマーは、以下のヌクレオチド配列:5’-AACCGTTTAAACGCGGCCGCCTAACACTCATTCCTGTTGA-3’配列番号23を有し;および重鎖に関する3’プライマーは、5’-AACCGTTTAAACGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGTGGGAG-3’配列番号24を有した。これらのプライマーは、11H10抗体の軽鎖および重鎖遺伝子の完全コード領域を増幅させるためのPCR反応に用いた。クローン化配列は、BianchiおよびMcGrew、2003年に記載されたCHO細胞に発現させた。11H10完全軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号9および11に示され、配列番号10および12は、それらのアミノ酸配列を示す。11H10の軽鎖は、アミノ酸1~20配列番号9のヌクレオチド1~60によりコードされたからなるリーダー配列を有し;したがって成熟タンパク質は、配列番号10のアミノ酸21で開始する。11H10の軽鎖可変領域は、配列番号10のアミノ酸21~127配列番号84も参照に相当する配列番号9のヌクレオチド61~381配列番号83も参照によりコードされる。11H10軽鎖CDR1は、配列番号10のアミノ酸44~54配列番号70も参照をコードする配列番号9のヌクレオチド130~162配列番号85も参照によりコードされ;11H10軽鎖CDR2は、配列番号10のアミノ酸70~76配列番号72も参照をコードする配列番号9の208~228配列番号86も参照によりコードされる残基であり;11H10軽鎖CDR3は、配列番号10のアミノ酸109~117配列番号74も参照をコードする配列番号9のヌクレオチド325~351配列番号87も参照によりコードされる。11H10重鎖は、アミノ酸1~19配列番号11のヌクレオチド1~57によりコードされたからなるリーダー配列を有し、したがって成熟タンパク質は、配列番号12の残基20で開始し、ヌクレオチド58~1395によりコードされる。重鎖可変領域は、配列番号12のアミノ酸20~139配列番号91も参照をコードする配列番号11のヌクレオチド58~417配列番号90も参照によりコードされる。重鎖CDR1は、配列番号12のアミノ酸50~54配列番号76も参照をコードする配列番号11のヌクレオチド148~162配列番号93も参照によりコードされ;11H10重鎖CDR2は、配列番号11のアミノ酸69~85配列番号78も参照をコードする配列番号11のヌクレオチド205~255配列番号93も参照によりコードされ;重鎖CDR3は、配列番号12のアミノ酸118~128配列番号80も参照をコードする配列番号11のヌクレオチド352~384配列番号94も参照によりコードされる。当然のことではあるが、本明細書に記載された実施例および実施形態は、単に説明を目的とするものであり、それを鑑みて種々の修飾または変更が当業者に示唆され、また、それらは本出願の精神および範囲内および添付の請求項の範囲内に含まれるべきである。個々の刊行物、特許および特許出願が、参照として組み込まれていることが具体的かつ個々に示されていても、本明細書に引用された全ての刊行物、特許または特許出願は、同じ程度に全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。"