"フィブロネクチンIII型第10ドメイン10Fn3を含むポリペプチドであって、該10Fn3は、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有し、該ポリペプチドは前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型PCSK9に結合するポリペプチド。500nM未満のKDでPCSK9に結合する、請求項1に記載のポリペプチド。BCループが、式X1ZX2G配列番号:449による配列であって、式中、X1は任意のアミノ酸であり、Zは6-9の数であり、そしてX2はYまたはHである配列を含む、請求項1または2に記載のポリペプチド。BCループが、表3に示される配列番号:2-17,107-135および301-303のいずれかの網掛け部分を含む、請求項1-3のいずれかに記載のポリペプチド。BCループが配列番号:2-17、107-135および301-303から選択される、請求項3または4に記載のポリペプチド。DEループが、式X1X1X1X3配列番号:450による配列であって、式中、X1は任意のアミノ酸であり;そしてX3はGまたはSである配列を含む、請求項1-5のいずれかに記載のポリペプチド。DEループが、表3に示される配列番号:18-27および136-141のいずれかの網掛け部分を含む、請求項1、2または6に記載のポリペプチド。DEループが、配列番号:18-27および136-141から選択される、請求項6または7に記載のポリペプチド。式EX4X1X5X1X1X6GYX4HR配列番号:451による配列であって、式中、X1は任意のアミノ酸であり;X4はYまたはFであり;X5はY、FまたはWであり;そしてX6はSまたはAである配列を含む、請求項1-8のいずれかに記載のポリペプチド。FGループが、表3に示される配列番号:28-38および142-172のいずれかの網掛け部分を含む、請求項1、2または9のいずれかに記載のポリペプチド。FGループが、配列番号:28-38および142-172から選択される、請求項9または10に記載のポリペプチド。BC、DEまたはFGループアミノ酸配列が、配列番号:2-38、106-172および301-303のいずれかと少なくとも80同一である、請求項1、2、3、6または9のいずれかに記載のポリペプチド。配列番号:39-76、173-290および304-309のいずれかと少なくとも80同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1-12のいずれかに記載のポリペプチド。ポリエチレングリコール、シアル酸、Fc、Fcフラグメント、トランスフェリン、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される1つ以上の薬物動態学PK部分をさらに含む、請求項1-10のいずれかに記載のポリペプチド。血清アルブミン結合タンパク質が、フィブロネクチンIII型第10ドメイン10Fn3を含む、請求項14に記載のポリペプチド。10Fn3ドメインがHSAに結合する、請求項15に記載のポリペプチド。PK部分がポリエチレングリコールである、請求項14に記載のポリペプチド。本質的にエンドトキシンを含まない、請求項1-17のいずれかに記載のポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物。発明の詳細な説明定義ポリペプチドは、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、2つ以上のアミノ酸のあらゆる配列を意味する。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、米国特許第6,559,126号出典明示により本明細書に包含させるに記載されているもののような天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい;カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい;アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい;またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するように修飾されていてもよい。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの別の構造、例えば、環状化合物または他の分子の結合を含み得、また、1つ以上のアミノ酸を改変された立体配置すなわち、RもしくはS;またはLもしくはDで含むポリペプチドを含み得る。本発明のペプチドは、PCSK9に特異的に結合するように修飾されているフィブロネクチンの第10III型ドメイン由来のタンパク質であり、抗-PCSK9アドネクチンまたはPCSK9アドネクチンとして本明細書において称される。PKなる用語は、薬物動態学に対する頭字語であり、一例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を含む。PK調節タンパク質またはPK部分は、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与されるとき、生物学的に活性な分子の薬物動態学的特性に影響するあらゆるタンパク質、ペプチドまたは部分を示す。PK調節タンパク質またはPK部分の例は、PEG、ヒト血清アルブミンHSAバインダー米国公開第2005/0287153および2007/0003549号、PCT公開WO2009/083804およびWO2009/133208に記載されているような、ならびに本明細書に記載されているSABA分子、ヒト血清アルブミン、FcまたはFcフラグメントおよびそれらの変異体および糖例えば、シアル酸を含む。本明細書におけるアミノ酸配列同一性パーセントは、配列同一性の一部として保存的置換は考慮することなく、必要なとき配列同一性最大パーセントなし遂げるように、配列をアラインし、ギャップを導入した後に、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内の種々の方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalignDNASTAR登録商標ソフトウェアを使用して、なし遂げることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントをなし遂げるために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定することができる。単離されたポリペプチドは、天然環境の成分から同定および分離および/または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、1Lowry法により決定される95重量以上の、および、より好ましくは99重量以上のポリペプチドに、2スピニングカップシークエネーターの使用により、N-末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも残基を得るために十分な程度に、または3クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でSDS-PAGEにより均質性に精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内でinsituでポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程により製造される。mpk、mg/kgまたはkgあたりのmgなる表記は、1キログラムあたりのミリグラムを示す。全ての表記は、本記載中で互換的に使用される。アミノ酸配列または化合物の半減期は、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および/または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって、インビボでポリペプチドの血清濃度が、50低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、それ自体既知の任意の方法、例えば、薬物動態学分析により決定することができる。適当な技術は当業者に明らかであり、例えば、一般的に、適当な用量のアミノ酸配列または本発明の化合物を霊長類へ適当に投与する工程;一定間隔で該霊長類から血液サンプルまたは他のサンプルを回収する工程;該血液サンプル中のアミノ酸配列または本発明の化合物のレベルまたは濃度を決定する工程;および、このように得られたデータのプロットから、アミノ酸配列または本発明の化合物のレベルまたは濃度が投与時の最初のレベルと比較して50低減されるまでの時間を計算する工程を含む。例えば、標準ハンドブック、例えば、KennethAらChemicalStabilityofPharmaceuticalsAHandbookforPharmacistsおよびPetersらPharmacokineteanalysisAPracticalApproachが参照される。また、GibaldiMらPharmacokinetics2ndRevEditionMarcelDekkerも参照される。半減期は、パラメーター、例えば、t1/2-アルファ、t1/2-ベータ、HL_ラムダ_zおよび曲線下面積AUCを使用して示すことができる。本願明細書において、半減期における増加は、これらのパラメーターのいずれか1つ、これらのパラメーターのいずれか2つ、これらのパラメーターのいずれか3つ、またはこれらのパラメーターの全4つにおける増加を示す。半減期における増加は、特に、t1/2-アルファおよび/またはAUCまたは両方における増加を伴って、または伴わずのいずれかで、t1/2-ベータおよび/またはHL_ラムダ_zにおける増加を示す。概観本出願は、ヒトPCSK9に対するアドネクチンを提供する。PCSK9特異的アンタゴニストを同定するために、PCSK9を、アドネクチンの大型合成ライブラリーに提供した。PCSK9に結合したアドネクチンを、PCSK9結合、生物物理的特性およびPCSK9阻害活性についてスクリーニングした。抗-PCSK9アドネクチンを変異させ、標的濃度を低下させ、スローオフ速度で抗-PCSK9アドネクチンを選択することによるさらなる選択圧に付した。この最適化処理から、アドネクチンファミリーが好ましい生化学的および生物物理的特性を有するPCSK9特異的阻害剤として同定された。フィブロネクチンベースのスカフォールド本出願の1つの局面は、1つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異化されているFn3ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメイン10Fn3の野生型第10モジュール由来のFn3ドメインである:VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT配列番号:1。10Fn3配列において、BC、DEおよびFGループは下線を引かれている。本明細書に記載されているとおり、10Fn3の非リガンド結合配列、すなわち10Fn3スカフォールドは改変され得るが、10Fn3はリガンド結合機能および/または構造安定性を保持する。種々の変異体10Fn3スカフォールドが報告されている。1つの局面において、1つ以上のAsp7、Glu9およびAsp23は、別のアミノ酸、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基例えば、Asn、Lysなどにより置換される。これらの変異は、野生型形態と比較して、中性pHで変異体10Fn3のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されているPCT公開WO02/04523参照。有益または中立のいずれかである10Fn3スカフォールドにおける種々のさらなる改変が開示されている。例えば、BatoriらProteinEng1510151020KoideらBiochemistry401032610333参照。変異体および野生型10Fn3タンパク質の両方は、同じ構造、即ち、AからGと示される7つのベータ鎖ドメイン配列ならびに7つのベータ鎖ドメイン配列に連結する6つのループ領域ABループ、BCループ、CDループ、DEループ、EFループおよびFGループにより特徴付けられる。N-およびC-末端に最も近くに位置するベータストランドは、溶液中でベータ様コンフォメーションをとり得る。配列番号:1において、ABループは残基15-16に対応し、BCループは残基21-30に対応し、CDループは残基39-45に対応し、DEループは残基51-56に対応し、EFループは残基60-66に対応し、FGループは残基76-87に対応するXuらChemistryBiology9933942。いくつかの態様において、10Fn3ポリペプチドは、配列番号:1に示されるヒト10Fn3ドメインと少なくとも40、50、60、65、70、75、80、85または90同一であり得る。可変性の多くは、一般的に1つ以上のループ中で起こる。10Fn3ポリペプチドのベータまたはベータ様鎖のいずれかは、本質的に、配列番号:1の対応するベータまたはベータ様鎖の配列と少なくとも80、85、90、95または100同一であるアミノ酸配列からなり得るが、このような変異は生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を乱さない。いくつかの態様において、本記載は、第10フィブロネクチンIII型10Fn3ドメインを含むポリペプチドであって、該10Fn3ドメインは、ループ、AB;ループ、BC;ループ、CD;ループ、DE;ループ、EF;およびループ、FGを含み;ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、BCおよびFGループは改変され、いくつかの態様において、BC、DEおよびFGループは改変され、すなわち、Fn3ドメインは非天然ループを含む。いくつかの態様において、AB、CDおよび/またはEFループは改変される。改変は、鋳型配列対応するヒトフィブロネクチンドメインと比較して1つ以上のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の改変は、一般的に核酸コード配列の意図的な、盲検的なまたは自発的な配列変異を介して成し遂げられ得、任意の技術、例えば、PCR、エラープローンPCRまたは化学的DNA合成により起こり得る。いくつかの態様において、BC、DEおよびFGから選択される1つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、2-25個のアミノ酸により伸長され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、1-11個のアミノ酸により減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、10Fn3のループの長さは、抗原結合において最大の可能な柔軟性および親和性を得るように、長さならびに配列において改変され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号:1の非ループ領域と少なくとも80、85、90、95、98、99または100同一であるアミノ酸配列を含むFn3ドメインであって、BC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループは、改変されているFn3ドメインを含む。いくつかの態様において、改変されたBCループは、最大10個のアミノ酸置換、最大4個のアミノ酸欠失、最大10個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、改変されたDEループは、最大6個のアミノ酸置換、最大4個のアミノ酸欠失、最大13個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、FGループは、最大12個のアミノ酸置換、最大11個のアミノ酸欠失、最大25個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。上記のとおり、配列番号:1の残基21-30、51-56および76-87に対応するアミノ酸残基は、それぞれBC、DEおよびFGループを定義する。しかしながら、該ループ領域内のすべての残基が、所望の標的例えば、PCSK9に対する強い親和性を有する10Fn3バインダーをなし遂げるために、修飾される必要はないことを理解すべきである。例えば、配列番号:1に示されるBCループの残基21Sおよび22Wは、PCSK9への結合のために修飾される必要はない。すなわち、PCSK9への高親和性結合を有する10Fn3ドメインは、配列番号:1に示されるループBCの残基23-30のみを修飾することにより得ることができる。表3に例示されているBCループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のBCループは、表3に示される配列番号:2-17、106-135および301-303のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、BCループは、配列PPPSHGYG配列番号:2の残基3-10、DAPAHAYG配列番号:5の残基3-10、EPFSRLPGGGE配列番号:106の残基3-13またはDAPADGGYG配列番号:107の残基3-11を含み得る。同様に、配列番号:1に示されるループDEの位置51Pおよび56Tは、PCSK9への結合のために修飾される必要はない。すなわち、PCSK9への高親和性結合を有する10Fn3ドメインは、配列番号:1に示されるループDEの残基52-55のみを修飾することにより得ることができる。表3に例示されているDEループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のDEループは、表3に示される配列番号:18-27および136-141のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、DEループは、配列PGKG配列番号:18の残基2-5、VGVG配列番号:27の残基2-5またはVSKS配列番号:137の残基2-5を含み得る。同様に、配列番号:1に示されるFGループの位置87Pは、PCSK9への結合のために修飾される必要はない。すなわち、PCSK9への高親和性結合を有する10Fn3ドメインは、配列番号:1に示されるFGループの残基76-86のみを修飾することにより得ることができる。表3に例示されているFGループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のFGループは、表3に示される配列番号:28-38および142-172のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、FGループは、配列EYPYKHSGYYHR配列番号:28における残基1-12、EYPYDYSGYYHR配列番号:142における残基1-12またはEFDFVGAGYYHR配列番号:167における残基1-12を含み得る。いくつかの態様において、本出願は、BC、DEおよびFGループ領域が、一般的に、コンセンサス配列によって表すことができることを証明する。例えば、BCループは、一般的に、コンセンサス配列SWX1ZX2G配列番号:323により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり、Zは6-9の数であり、そしてX2はYまたはHである。このコンセンサス配列は、配列番号:106により定義されたBCループを除けば、表3に示されるBCループにより例示される。他の態様において、Zは2-5から選択される数である。1つの態様において、Zは10-15から選択される数である。いくつかの態様において、X2は任意の芳香族性残基すなわち、Y、F、WまたはHである。別の態様において、DEループは、一般的に、コンセンサス配列PX1X1X1X3T、配列番号:324により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり、そしてX3はGまたはSである。このコンセンサスは、表3に示されるDEループにより例示される。別の態様において、FGループは、一般的に、コンセンサス配列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP配列番号:325により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり;X4はYまたはFであり;X5はY、FまたはWであり;そしてX6はSまたはAである。1つの態様において、X4およびX5は、それぞれ独立してY、F、WまたはHから選択される芳香族性残基である。このコンセンサスは、表3に示されるFGループにより例示される。したがって、1つの態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列SWX1ZX2G配列番号:323を有するBCループ、配列PX1X1X1X3T配列番号:324を有するDEループおよび配列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP配列番号:325を有するFGループを含むPCSK9結合アドネクチンを提供する。別の態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列SWEPFSRLPGGGE配列番号:106を有するBCループ、配列PX1X1X1X3T配列番号:324を有するDEループおよび配列EX4X1X5X1X1X6GYX4HRP配列番号:325を有するFGループを含むPCSK9結合アドネクチンを提供する。1つの態様において、BCループは、一般的に、コンセンサス配列X1ZX2G配列番号:449により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり、Zは6-9の数であり、そしてX2はYまたはHである。このコンセンサス配列は、配列番号:106により定義されたBCループを除けば、表3に示されるBCループにより例示される。他の態様において、Zは2-5から選択される数である。1つの態様において、Zは10-15から選択される数である。いくつかの態様において、X2は任意の芳香族性残基すなわち、Y、F、WまたはHである。1つの態様において、DEループは、一般的に、コンセンサス配列X1X1X1X3配列番号:450により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり、X3はGまたはSである。このコンセンサスは、表3に示されるDEループにより証明される。1つの態様において、FGループは、一般的に、コンセンサス配列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR配列番号:451により定義され得、式中X1は任意のアミノ酸であり;X4はYまたはFであり;X5はY、FまたはWであり;そしてX6はSまたはAである。いくつかの態様において、X4およびX5はそれぞれ独立してY、F、WまたはHから選択される芳香族性残基である。このコンセンサスは、表3に示されるFGループにより例示される。したがって、1つの態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列X1ZX2G配列番号:449を含むBCループ、配列X1X1X1X3配列番号:450を含むDEループおよび配列EX4X1X5X1X1X6GYX4HR配列番号:451を含むFGループを有するPCSK9結合アドネクチンを提供する。1つの態様において、10Fn3スカフォールドに基づく抗体様タンパク質は、一般的に、以下の式により定義することができる:EVVAATXaSLLIXxYYRITYGEXbQEFTVXyATIXcDYTITVYAVXzISINYRT配列番号:328配列番号:328において、ABループはXaにより示され、CDループはXbにより示され、EFループはXcにより示され、BCループはXxにより示され、DEループはXyにより示され、そしてFGループはXzにより示される。Xは任意のアミノ酸を示し、Xの次の下付きはアミノ酸の数の整数を示す。特に、aは1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3または1-2アミノ酸の範囲であり得;そして、b、c、x、yおよびzは、それぞれ独立して、2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7または6-7アミノ酸の範囲であり得る。好ましい態様において、aは2アミノ酸であり、bは7アミノ酸であり、cは7アミノ酸であり、xは9アミノ酸であり、yは6アミノ酸であり、そしてzは12アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号:1に示される対応するアミノ酸と比較して、全7つのスカフォールド領域にわたって0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1個の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。典型的な態様において、ベータストランドの配列は、配列番号:1に示される対応するアミノ酸と比較して、全7つのスカフォールド領域にわたって0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1個の範囲の保存的置換を有し得る。1つの態様において、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で起こる。典型的な態様において、Xx、XyおよびXzによりそれぞれ示されるBC、DEおよびFGループは、表3に示されるPCSK9バインダーのいずれかのBC、DEおよびFGループ配列、またはそれらの網掛け部分、またはコンセンサス配列323-325もしくは449-451を含むポリペプチドで置換される。1つの態様において、10Fn3スカフォールドに基づく抗体様タンパク質は、一般的に配列により定義され得る:EVVAATPTSLLIXxYYRITYGETGGNSPVQEFTVXyATISGLKPGVDYTITVYAVXzISINYRT配列番号:329配列番号:329において、BCループはXxにより示され、DEループはXyにより示され、そしてFGループはXzにより示される。Xは任意のアミノ酸を示し、Xの次の下付きはアミノ酸の数の整数を示す。特に、x、yおよびzは、それぞれ独立して、2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7または6-7アミノ酸の範囲であり得る。好ましい態様において、xは9アミノ酸であり、yは6アミノ酸であり、そしてzは12アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号:1に示される対応するアミノ酸と比較して、全7つのスカフォールド領域にわたって0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。典型的な態様において、ベータストランドの配列は、配列番号:1に示される対応するアミノ酸と比較して、全7つのスカフォールド領域にわたって0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1個の範囲の保存的置換を有し得る。1つの態様において、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で起こる。典型的な態様において、Xx、XyおよびXzによりそれぞれ示されるBC、DEおよびFGループは、表3に示されるPCSK9バインダーのいずれかのBC、DEおよびFGループ配列、またはそれらの網掛け部分、またはコンセンサス配列323-325もしくは449-451を含むポリペプチドで置換される。1つの態様において、本明細書に記載されている抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:328または329に記載されている配列を含み得、式中Xx、XyおよびXzによりそれぞれ示されるBC、DEおよびFGループは、表3におけるクローンのいずれかの特定のBC、DEおよびFGループのそれぞれのセット、または、表3に記載されているクローンのBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75、80、85、90、95、97、98または99同一の配列で置換される。典型的な態様において、本明細書に記載されている抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:329により定義され、表3に記載されているクローンのいずれかのBC、DEおよびFGループ配列のそれぞれのセットを有する。例えば、表3におけるクローン1459D05は、配列番号:2、18および28にそれぞれ記載されているBC、DEおよびFGループを含む。したがって、これらのループに基づく抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:328または329を含み得、式中Xxは配列番号:2を含み、Xyは配列番号:18を含み、そしてXzは配列番号:28を含む。同様の構築物は、表3における他のクローンからのBC、DEおよびFGループのセット、またはコンセンサス配列323-325または449-451を利用することが考えられる。このような抗-PCSK9アドネクチンのスカフォールド領域は、配列番号:1のスカフォールドアミノ酸残基と比較して、0から20、0から15、0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このようなスカフォールド修飾は、抗-PCSK9アドネクチンが所望のKDでPCSK9に結合することができる限り、作成され得る。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のBCループは、SWPPPSHGYG配列番号:2、SWRPPIHAYG配列番号:3、SWDAPIHAYG配列番号:4、SWDAPAHAYG配列番号:5およびSWDAPAVTYG配列番号:6、SWSPPANGYG配列番号:7、SWTPPPKGYG配列番号:8、SWRPPSHAYG配列番号:9、SWDPPSHAYG配列番号:10、SWEPPSHAYG配列番号:11、SWSPPSHAYG配列番号:12、SWRPPSNGHG配列番号:13、SWVPPSDDYG配列番号:14、SWVPSSHAYG配列番号:15、SWDPSSHAYG配列番号:16およびSWEPSSHAYG配列番号:17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のBCループは、配列番号:106-135および301-303から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のBCループは、表3に示される配列番号:2-17、106-135および301-303のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、BCループは、配列PPPSHGYG配列番号:2の残基3-10、DAPAHAYG配列番号:5の残基3-10、EPFSRLPGGGE配列番号:106の残基3-13またはDAPADGGYG配列番号:107の残基3-11を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のDEループは、PPGKGT配列番号:18、PIVEGT配列番号:19、PGSEGT配列番号:20、PGSKGT配列番号:21、PGSKST配列番号:22、PVGRGT配列番号:23、PVGEGT配列番号:24、PIGKGT配列番号:25、PVNEGT配列番号:26およびPVGVGT配列番号:27からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のDEループは、配列番号:136-141から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のDEループは、表3に示される配列番号:18-27および136-141のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、DEループは、配列PGKG配列番号:18の残基2-5、VGVG配列番号:27の残基2-5またはVSKS配列番号:137の残基2-5を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質のFGループは、EYPYKHSGYYHRP配列番号:28、EYTFKHSGYYHRP配列番号:29、EYTYKGSGYYHRP配列番号:30、EYTYNGAGYYHRP配列番号:31、EYTYIGAGYYHRP配列番号:32、EYTYEGAGYYHRP配列番号:33、EYAYNGAGYYHRP配列番号:34、EYPWKGSGYYHRP配列番号:35、EFPFKWSGYYHRP配列番号:36、EFPWPHAGYYHRP配列番号:37およびEYAFEGAGYYHRP配列番号:38からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のFGループは、配列番号:142-172から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のFGループは、表3に示される配列番号:28-38および142-172のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、1つの態様において、FGループは、配列EYPYKHSGYYHR配列番号:28における残基1-12、EYPYDYSGYYHR配列番号:142における残基1-12またはEFDFVGAGYYHR配列番号:167における残基1-12を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号:2-17、106-135および301-303を有するBCループ配列から選択される1つのBCループ配列、または表3に示される配列番号:2-17、106-135および301-303のいずれかの網掛け部分;配列番号:18-27および136-141を有するDEループ配列から選択される1つのDEループ配列、または表3に示される配列番号:18-27および136-141のいずれかの網掛け部分;ならびに、配列番号:28-38および142-172を有するFGループ配列から選択される1つのFGループ配列、または表3に示される配列番号:28-38および142-172のいずれかの網掛け部分を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号:2-38、106-172、301-303のいずれか1つと少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一のBC、DEおよびFGループアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質は、表3に示される配列番号:2-38、106-172、301-303のいずれかの網掛け部分と少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一のBC、DEおよびFGループアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:39-76、173-290および304-309のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:39-76、173-290および304-309のいずれか1つの位置3-96からのFn3ドメインアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、配列番号:39-76、173-290および304-309のいずれかと少なくとも70、75、80、85、90、95、98、99または100同一のアミノ酸配列を含む。フィブロネクチンは、天然に、インテグリン結合モチーフ、アルギニン-グリシン~アスパラギン酸RGDを介してインテグリンの特定の型に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、RGDインテグリン結合モチーフを欠く10Fn3ドメインを含む。インテグリン結合ドメインは、アミノ酸置換、欠失または挿入によってRGD配列を改変することにより除去され得る。1つの態様において、本発明の抗-PCSK9アドネクチン分子は、N-末端伸長配列および/またはC-末端伸長を含むように修飾され得る。例えば、MG配列は、配列番号:1により定義される10Fn3のN-末端で置換され得る。Mは、通常、切断され、N-末端でGを放出する。あるいは、表4に示される抗-PCSK9アドネクチンの最初の10アミノ酸は、表6すなわち、配列番号:371-379に示される本明細書においてN-末端伸長と称される代替N-末端配列で置換され得る。加えて、M、GまたはMGはまた、配列番号:371-379を有するN-末端伸長のいずれかのN-末端側で置換され得る。本明細書に記載されている抗-PCSK9アドネクチンはまた、本明細書においてC-末端伸長配列と称される代替C-末端テール配列を含み得る。例えば、表4に示される抗-PCSK9アドネクチン配列は、配列番号:1のT94に対応するスレオニンで切断され得るすなわち、配列のINYRT配列番号:636部分後に切断される。このような切断バージョンは、切断形態において治療分子として使用され得るか、または代替C-末端伸長がスレオニン残基後に加えられ得る。典型的なC-末端伸長配列は、配列番号:380-395として表6に示される。C-末端伸長配列を含む典型的な抗-PCSK9アドネクチンは、表4に示される。例えば、配列番号:49クローン1813E02は、天然C-末端伸長EIDKPSQ配列番号:380次にHis6タグ配列番号:637を含む。しかしながら、His6タグは完全に任意であることが理解されるべきである。1つの態様において、C-末端伸長配列テールとも呼ばれるは、EおよびD残基を含み、8から50、10から30、10から20、5から10および2から4アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、テール配列はEDベースのリンカーを含み、該配列はEDのタンデムリピートを含む。典型的な態様において、テール配列は、2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4または5EDリピートを含む。1つの態様において、EDベースのテール配列はまた、さらなるアミノ酸残基、例えば:EI配列番号:385、EID、ES、EC、EGSおよびEGCを含み得る。このような配列は、一部、既知のアドネクチンテール配列、例えば、残基DおよびKが除去されているEIDKPSQ配列番号:380に基づく。典型的な態様において、EDベースのテールは、EDリピート前にE、IまたはEI配列番号:385残基を含む。他の態様において、N-もしくはC-末端配列は、抗-PCSK9アドネクチン融合分子を設計するとき、必要なとき、他の既知のリンカー配列例えば、表6における配列番号:396-419と組み合わされ得る。典型的なリンカー配列を含む抗-PCSK9アドネクチンは、表4に示される例えば、配列番号:53、55および57。いくつかの態様において、配列は、薬物動態学部分の結合を容易にするように、10Fn3ドメインのC-末端で置換され得る。例えば、システイン含有リンカー、例えば、GSGC配列番号:77は、システイン残基における部位特異的ペグ化を容易にするように、C-末端に付加され得る。薬物動態学部分1つの局面において、本出願は、薬物動態学PK部分をさらに含む抗-PCSK9アドネクチンを提供する。改善された薬物動態学は、認識される治療的必要性にしたがって評価され得る。しばしば、恐らくタンパク質が投与後の血清において利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること、および/または投与間の時間を増加させることが望ましい。場合によっては、時間とともにタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること例えば、投与直後および次の投与直前の、タンパク質の血清濃度における違いを減少させることが望ましい。抗-PCSK9アドネクチンは、哺乳動物例えば、マウス、ラットまたはヒトにおけるポリペプチドのクリアランス速度を、非修飾抗-PCSK9アドネクチンと比較して3倍以上低減させる部分に結合させてもよい。改善された薬物動態学の他の尺度は、しばしば、アルファ相およびベータ相に分類される血清半減期を含み得る。いずれかの相または両方の相は、適当な部分の付加により有意に改善され得る。本明細書においてPK部分と称される血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向がある部分は、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖例えば、シアル酸、および耐容性良好であるタンパク質部分例えば、Fcならびにそのフラグメントおよび変異体、トランスフェリンまたは血清アルブミンを含む。抗-PCSK9アドネクチンは、米国公開第2007/0048282号に記載されているアルブミンまたはアルブミンのフラグメント部分もしくは変異体に融合され得る。いくつかの態様において、PCSK9アドネクチンは、本明細書に記載されているとおりに、1つ以上の血清アルブミン結合アドネクチンに融合され得る。いくつかの態様において、PK部分は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば、米国公開第2007/0178082および2007/0269422号に記載されているものである。いくつかの態様において、PK部分は、血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、米国公開第2007/0178082号に記載されているものである。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンはポリエチレングリコールPEGを含む。1つ以上のPEG分子は、タンパク質上の異なる位置で結合してもよく、、このような結合は、アミン、チオールまたは他の適当な反応基との反応によりなし遂げられ得る。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのN末端で見られる第一級アミンまたはリジンもしくはアルギニンのようなアミノ酸に存在するアミン基であり得る。いくつかの態様において、PEG部分は、aN-末端;bN-末端および最もN-末端側のベータストランドまたはベータ様鎖間;c標的結合部位と反対側のポリペプチドの表面上に位置するループ;dC-末端および最もC-末端側のベータストランドまたはベータ様鎖間;ならびにeC-末端からなる群から選択されるポリペプチドの位置で結合する。ペグ化は、適当な反応基が、ペグ化が優先的に起こる部位を作るように、タンパク質に導入されている部位特異的ペグ化によりなし遂げられ得る。いくつかの態様において、タンパク質は、所望の位置でシステイン残基を導入するように修飾され、システイン上の部位特異的ペグ化を可能にする。PEGは、分子量を広範に変化し得、分岐状または直線状であり得る。1つの態様において、PEGは2つの分岐を有する。別の態様において、PEGは4つの分岐を有する。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、免疫グロブリンFcドメインまたはそのフラグメントもしくは変異体に融合される。典型的な態様において、Fcドメインは、IgG1サブクラス由来である、しかしながら、他のサブクラス例えば、IgG2、IgG3およびIgG4もまた使用され得る。以下に示されているものは、ヒトIgG1免疫グロブリンFcドメインの配列であり、Fcドメイン内のそれぞれの領域の相対位置は、EU番号付けフォーマットに基づいて示される:コアヒンジ配列は下線を引かれており、CH1領域はイタリック体であり;CH2およびCH3領域は通常の文字列である。C-末端リジンは任意であることが理解されるべきである。融合物は、抗-PCSK9アドネクチンをFc分子のいずれかの末端に結合させることにより、すなわち、Fc-抗-PCSK9アドネクチンまたは抗-PCSK9アドネクチン-Fc配置で形成され得る。1つの態様において、Fcおよび抗-PCSK9アドネクチンは、リンカーを介して融合される。典型的なリンカー配列は、AGGGGSG配列番号:310、GSGSGSGSGSGS配列番号:311、QPDEPGGS配列番号:312、ELQLEESAAEAQDGELD配列番号:313、TVAAPS配列番号:314、KAGGGGSG配列番号:620、KGSGSGSGSGSGS配列番号:621、KQPDEPGGS配列番号:622、KELQLEESAAEAQDGELD配列番号:623、KTVAAPS配列番号:624、KAGGGGSGG配列番号:625、KGSGSGSGSGSGSG配列番号:626、KQPDEPGGSG配列番号:627、KELQLEESAAEAQDGELDG配列番号:628、KTVAAPSG配列番号:629AGGGGSGG配列番号:630、GSGSGSGSGSGSG配列番号:631、QPDEPGGSG配列番号:632、ELQLEESAAEAQDGELDG配列番号:633およびTVAAPSG配列番号:634を含む。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチン融合物において使用されるFc領域は、Fc分子のヒンジ領域を含む。本明細書において使用されるヒンジ領域は、EU番号付けによる位置221-236に対応するIgG1の配列番号:315のコアヒンジ残基にまたがる位置104-119DKTHTCPPCPAPELLG;配列番号:316を含む。1つの態様において、the抗-PCSK9アドネクチン-Fc融合物は、一部、ヒンジ領域内で配列番号:315の位置109および112それぞれ、EU番号付け226および229でのシステイン残基のため、多量体構造例えば、ダイマーを採用する。他の態様において、本明細書において使用されるヒンジ領域は、配列番号:315に示されるコアヒンジ配列の側面に位置するCH1およびCH2領域由来の残基をさらに含み得る。いくつかの態様において、ヒンジ配列は、望ましい薬物動態学的、生物物理学的および/または生物学的特性を与える置換を含み得る。いくつかの典型的なヒンジ配列は、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS配列番号:317;コアヒンジ領域は下線を引かれている、EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS配列番号:318;コアヒンジ領域は下線を引かれている、EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS配列番号:319;コアヒンジ領域は下線を引かれている、DKTHTCPPCPAPELLGGPS配列番号:320;コアヒンジ領域は下線を引かれているおよびDKTHTCPPCPAPELLGGSS配列番号:321、コアヒンジ領域は下線を引かれているを含む。1つの態様において、配列番号:315の位置122EU番号付け238での残基Pは、Fcエフェクター機能を除去するようにSで置換されている;該置換は、配列番号:318、319および321のいずれか1つを有するヒンジにおいて例示される。別の態様において、配列番号:315の位置104-105EU番号付け221-222での残基DKは、可能性のあるクリップ部位を除去するようにGSで置換されている;該置換は、配列番号:319において例示される。別の態様において、配列番号:315の位置103EU番号付け220でのCは、軽鎖の非存在下で不適当なシステイン結合形成を防止するようにSで置換されている;該置換は、配列番号:317-319において例示される。1つの態様において、抗PCSK9アドネクチン-Fc融合物は、以下の立体配置を有し得る:1抗-PCSK9アドネクチン-ヒンジ-Fc、または2ヒンジ-Fc-抗-PCSK9アドネクチン。したがって、本発明の任意の抗-PCSK9アドネクチンは、これらの立体配置によるヒンジ配列を含むFc領域に融合させることができる。いくつかの態様において、リンカーは、抗-PCSK9アドネクチンをヒンジ-Fc部分に結合するために使用され得る、例えば、典型的な融合タンパク質は、立体配置ヒンジ-抗-PCSK9アドネクチン-リンカー-Fcを有し得る。さらに、融合ポリペプチドが生産される系に依存して、リーダー配列は、融合ポリペプチドのN-末端で置換され得る。例えば、融合物が哺乳動物系において生産されるとき、リーダー配列、例えば、METDTLLLWVLLLWVPGSTG配列番号:326は、融合分子のN-末端に付加され得る。融合物が大腸菌において生産されるとき、融合配列は、メチオニンが先行する。以下の配列は、哺乳動物系において生産される抗-PCSK9アドネクチン-ヒンジ-Fc構築物を例示する:したがって、Fcドメインは、以下のとおりのヒトIgG1CH2およびCH3領域を含む:VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号:448および配列番号:319のヒンジ配列。配列番号:322において、リーダー配列は太字であり、抗-PCSK9アドネクチン配列はイタリック体であり、ヒンジ領域は下線を引かれている。配列番号:322の末端でのリジンは任意であることが理解されるべきである。配列番号:322に記載されているポリペプチド融合物本明細書においてPRD460としても記載されているの有効性は、実施例4において証明される。典型的なPCSK9アドネクチン-Fc融合物は表1に示される。全ての配列は、メチオニンまたは哺乳動物リーダー配列例えば、配列番号:326で開始され得る。表1典型的な抗-PCSK9アドネクチン-Fc融合物タンパク質いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、Fn3ドメインおよびPK部分を含む。いくつかの態様において、Fn3ドメインは10Fn3ドメインである。いくつかの態様において、PK部分は、Fn3ドメイン単独と比較して、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000以上、またはそれ以上ポリペプチドの血清半減期を増加させる。いくつかの態様において、PK部分はポリマー糖である。いくつかの態様において、PK部分はポリエチレングリコール部分である。いくつかの態様において、PK部分は血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの態様において、PK部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、PK部分は血清免疫グロブリン結合タンパク質である。いくつかの態様において、PK部分はトランスフェリンである。いくつかの態様において、PK部分は、血清タンパク質、例えば、HSAに対して特異的な別のアドネクチンである。本出願は、本明細書に記載されているとおり、特異的血清アルブミン結合アドネクチン分子またはSABAを提供する。1つの態様において、SABAに融合されたPCSK9アドネクチンは、一般的に、以下のとおりに定義することができる:X1-PCSK9アドネクチンコア-X2-X3-X4-SABAコア-X5配列番号:618、またはX1-SABAコア-X2-X3-X4-PCSK9アドネクチンコア-X5配列番号:619、式中X1およびX4は任意のN-末端伸長配列を示し、X2およびX5は任意のC-末端伸長配列を示し、そしてX3はリンカーである。1つの態様において、配列番号:618および619のアドネクチンPCSK9または血清アルブミン結合のいずれかは、アドネクチンのコア領域を含む、すなわち、PCSK9アドネクチンコア配列は、表4に示されるPCSK9アドネクチン配列のいずれか1つであり得、該配列は配列番号:1のE8に対応するアミノ酸残基で開始し、配列番号:1の残基T94に対応するアミノ酸で終結し;そして、SABAコア配列は、表6に示されるSABAコア配列のいずれかから選択され得る。いくつかの態様において、X1およびX4は独立して任意であり、存在するとき、独立して表6に記載されている配列番号:371-379から選択され、そして、このような残基がすでに存在しないとき、所望によりN-末端でM、GまたはMG配列を含み得る。哺乳動物系における発現のために、融合タンパク質は、N-末端でリーダー配列、例えば、METDTLLLWVLLLWVPGSTG配列番号:326をさらに含み得る。いくつかの態様において、X2およびX5は独立して任意であり、存在するとき、独立して表6に記載されている配列番号:380-395から選択される。1つの態様において、X3は、表6に記載されている配列番号:396-419から選択されるリンカー配列である。表2に示される配列は、抗-PCSK9アドネクチンおよびSABAの典型的な融合物を示す。本出願に記載されているあらゆるPCSK9アドネクチンおよびSABA配列が、これらの立体配置に組み込まれ得ることを理解すべきである。表2生物物理学的および生化学的特性化本出願は、PCSK9に結合するFn3ドメインを含むアドネクチンを提供する。標的分子へのポリペプチド結合は、平衡定数例えば、解離、KDおよび速度定数例えば、結合の速度定数、Konおよび解離の速度定数、koffについて評価され得る。アドネクチンは、一般的に、500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、100pM未満のKDで標的分子に結合するが、より高いKD値は、Koffが十分に低いか、またはKonが十分に高いとき許容され得る。本発明の抗-PCSK9アドネクチンのBC、DEおよびFGループの配列番号は、表3に示される。表3抗-PCSK9アドネクチンBC、DEおよびFGループ†37°CでOctetRedを使用して決定されたKD;25°CでProteOnを使用して決定されたKD;^37°CでITCを使用して決定されたKD;1ループにおける変異に加えて、これらのクローンはまた、変異V45LおよびE47Qを有し;2ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異V1I、S2TおよびV45Lを有し;3ループにおける変異に加えて、これらのクローンはまた、変異E47Qを有し;4ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異V45LおよびE47Gを有し;5ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異S2T、L8M、P44T、V45LおよびE47Qを有し;6ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異V1I、S2V、V45KおよびE47Qを有する。本発明の抗-PCSK9アドネクチンのファミリーの配列番号は、表4に示される。表4抗-PCSK9アドネクチンファミリー本発明のペグ化抗-PCSK9アドネクチンのファミリーの配列番号は、表5に示される。表5ペグ化を可能にする抗-PCSK9アドネクチンファミリーシステイン変異体注意:記載されているいくつかのタンパク質は、まだペグ化されていないが、システイン変異を介してペグ化可能である。ペグ化されているタンパク質は、アステリスクにより示される。核酸-タンパク質融合技術1つの局面において、本出願は、PCSK9に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するFn3ドメインを迅速に生成し、試験する1つの方法は、AdnexusaBristolMyersSquibbRDCompanyの核酸-タンパク質融合技術である。本記載は、核酸-タンパク質融合物RNA-およびDNA-タンパク質融合物を利用して、タンパク質への結合のために重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、PROfusionと称されるインビトロ発現およびタグ技術を利用する。核酸-タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報に共有的に連結する技術である。RNA-タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明のために、Szostakら、米国特許第6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018および6,818,418号;ならびにRobertsらProcNatlAcadSci941229712302出典明示により本明細書に包含させる参照。ベクターおよびポリヌクレオチド態様本明細書に記載されている種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に対して開発されている。例えば:MayfieldらProcNatlAcadSciUSA100438442SinclairらProteinExprPurif2696105ConnellNDCurrOpinBiotechnol12446449MakridesらMicrobiolRev60512538およびSharpらYeast7657678参照。核酸操作の一般的な技術は、例えば、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual2ndEditionVols13ColdSpringHarborLaboratoryPressまたはAusubelFらCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenPublishingandWileyInterscienceNewYorkおよび定期的アップデートされたもの出典明示により本明細書に包含させるに記載されている。一般的に、ポリペプチドをコードするDNAは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節要素に作動可能に連結される。このような調節要素は、転写プロモーター、転写をコントロールするための任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結をコントロールする配列を含む。宿主において複製する能力は、通常、複製起点により与えられ、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子がさらに組み込まれる。本明細書に記載されているタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのN-末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に生産され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセッシングされるすなわち、シグナルペプチダーゼにより切断されるものである。哺乳動物系におけるポリペプチドの生産のための典型的なN-末端リーダー配列は、次の発現で宿主細胞により除去されるMETDTLLLWVLLLWVPGSTG配列番号:326である。天然シグナル配列を認識せず、プロセッシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダーサッカロミセスおよびクルイベロマイセスアルファ因子リーダーを含むまたは酸性ホスファターゼリーダー、C.アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、または米国特許第5,631,144号に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルを利用できる。このような前駆体領域のDNAは、タンパク質をコードするDNAにリーディングフレームにおいてライゲートされ得る。発現およびクローニングベクターの両方は、ベクターが1つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体DNAと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点は多数のグラム陰性菌に適当であり、2ミクロンプラスミド起源は酵母に適当であり、種々のウイルス起源SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVは哺乳動物細胞においてクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要ではないSV40起点は一般的に、単に初期プロモーターを含むため、使用され得る。発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、a抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える、b栄養要求性欠失を補足する、またはc複合培地から利用できない決定的な栄養素を提供するタンパク質をコードする、例えば、バチルスのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するために適当なプロモーターは、phoAプロモーター、ベータ-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンtrpプロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えば、tanプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが適当である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、本発明のタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結したシャイン-ダルガノS.D.配列を含む。真核生物のためのプロモーター配列は知られている。実質的には、全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約25から30塩基上流に位置するAT-リッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から70から80塩基上流に見出される別の配列はCNCAAT領域であり、Nは任意のヌクレオチドであってよい。多数の真核遺伝子の3’末端に、コード配列の3’末端へのポリAテールの付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列がある。これらの配列の全ては、真核発現ベクターに適当に挿入される。酵母宿主と共に使用するための適当な促進配列の例は、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス例えば、アデノウイルス2、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびより好ましくはシミアンウイルス40SV40のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによりコントロールすることができ、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするDNAの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が、現在、知られているグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン。しかしながら、一般的に、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後ろ側においてSV40エンハンサーbp100-270、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側においてポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについて、YanivNature2971718も参照。エンハンサーは、ペプチドコード配列に対して5’または3’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、プロモーターの5’側に位置することが好ましい。真核宿主細胞例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のため、およびmRNAを安定化させるために必要な配列を含む。このような配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および、時折3’非翻訳領域から一般的に利用できる。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびそこに記載されている発現ベクター、参照。組換えDNAはまた、タンパク質を精製するために有用であり得るあらゆる型のタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例は、限定はしないが、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、mycタグ、HAタグまたはGSTタグを含む。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、CloningVectorsALaboratoryManualこの関連の記載は、出典明示により本明細書に包含させるにおいて見出すことができる。発現構築物は、当業者に明らかであるとおりに、宿主細胞に対して適当な方法を使用して宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法は、当分野で知られており、限定はしないが、エレクトロポレーション;塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および感染ベクターが感染性因子であるを含む。適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、大腸菌またはバチルス種を含む。好ましくはサッカロミセス種由来の酵母、例えば、サッカロミセスセレビシエがまた、ポリペプチドの生産のために使用され得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系をまた、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、Luckowらにより概説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例は、内皮細胞、COS-7サル腎臓細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣CHO、ヒト胚腎臓細胞、HeLa、293、293TおよびBHK細胞系を含む。精製ポリペプチドは、適当な宿主/ベクター系を培養し、組換えタンパク質を発現させることにより調製される。多数の適用のために、本明細書に記載されている小さいサイズの多数のポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現させる。次に、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。タンパク質生産宿主細胞は、タンパク質生産のために本明細書において記載されている発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された慣用の栄養培地中で培養される。本明細書に示される例において、ハイスループットタンパク質生産HTPPおよび中規模生産のために使用された宿主細胞は、HMS174-細菌株であった。本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。市販の培地、例えば、Ham’sF10Sigma、最小必須培地MEM、Sigma、RPMI-1640Sigmaおよびダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Sigmaは、宿主細胞を培養するために適当である。加えて、HamらMethEnzymol5844、BaritesらAnalBiochem102255、米国特許第4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502号、または米国特許第RE30,985号に記載されている培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要なとき、ホルモンおよび/または他の増殖因子例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子、塩例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート、バッファー例えば、HEPES、ヌクレオチド例えば、アデノシンおよびチミジン、抗生物質例えば、ゲンタマイシン薬、微量元素マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補給され得る。任意の他の必要な栄養補助剤がまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかである。本明細書に記載されているタンパク質はまた、細胞-翻訳系を使用して生産することができる。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写がmRNAを生産することを可能にし、利用される特定の無細胞系真核、例えば、哺乳動物または酵母無細胞翻訳系、または原核生物、例えば、細菌無細胞翻訳系におけるmRNAの無細胞翻訳を可能にするように修飾されるべきである。本発明のタンパク質はまた、化学合成例えば、SolidPhasePeptideSynthesis2ndEditionThePierceChemicalCoRockfordILに記載されている方法によるにより生産することができる。タンパク質に対する修飾はまた、化学合成により生産することができる。本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般的に知られているタンパク質に対する単離/精製方法により精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶化、塩析例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配またはこれらの任意の組合せを含む。精製後、ポリペプチドは、異なるバッファーに交換され、および/または限定はしないが、濾過および透析を含む当分野で既知の任意の種々の方法により濃縮され得る。精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも85純粋、または好ましくは少なくとも95純粋、およびより好ましくは少なくとも98純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品として使用するために十分に純粋である。プラットホーム製造工程を使用して、抗-PCSK9アドネクチンを調製した。抗-PCSK9アドネクチンは、大腸菌において生産される。大腸菌BLRDE3細胞を、タンパク質を可溶性形態において細胞内に生産する発現ベクターpET9d/ATI001173で形質転換した。組換え株を、かくはん発酵槽において増殖させる。発酵の最後に、細胞を回収し、溶解し、精製のための調製において浄化する。ATI001173は、ATI001114の非-hisタグバージョンである。精製された抗-PCSK9アドネクチンを、マレイミドリンカーを使用して40kDaの分岐メトキシPEGに結合させる。次に、結合した物質を再精製し、遊離PEG、遊離抗-PCSK9アドネクチンおよび製造工程由来不純物を除去する。品質管理試験を、バルク薬物にて行う。インビボでの治療使用1つの局面において、本出願は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置において有用な抗-PCSK9アドネクチンを提供する。本出願はまた、抗-PCSK9アドネクチンを対象に投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容される。薬学的に許容されるポリペプチドは、重大な有害な医学的結果なしで、例えば、本質的にエンドトキシンなしで、または非常に低いエンドトキシンレベルで動物に投与されるポリペプチドを示す。製剤および投与本出願は、さらに、本明細書に記載されている抗-PCSK9アドネクチンまたはその融合タンパク質を含む薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンを含まない組成物を提供する。抗-PCSK9アドネクチンまたはその融合物を含む治療製剤は、所望の程度の純度を有する記載されているポリペプチドを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤OsolARemingtonsPharmaceuticalSciences16thEditionと混合することにより、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態において保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸;抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン;防腐剤例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール;低分子量約10残基未満ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストラン;キレート化剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体例えば、Zn-タンパク質複合体;および/または非イオン性界面活性剤、例えば、Tween、PLURONIC登録商標またはポリエチレングリコールPEGを含む。本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応のために必要なとき2つ以上の活性化合物、好ましくは互いに有害に影響しない相補的活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量において組合せで適当に存在する。インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を介する濾過により容易に成し遂げる。当業者は、それぞれの治療剤の用量が薬剤の正体に依存することを理解している。治療的適応のために、抗-PCSK9アドネクチンまたは抗-PCSK9アドネクチンを含む融合タンパク質は、薬学的に許容される投与形態において対象に投与される。それらは、ボーラスとして静脈内に、または期間にわたって連続的な注入により、または皮下経路により投与することができる。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤はよく知られており、臨床状態が保証されたとき、当業者により決定することができる。適当な担体、希釈剤および/または賦形剤の例は、1ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、20.9の生理食塩水0.9w/vNaCl、および35w/vデキストロースを含む。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施することができる。共投与または連続投与であろうとなかろうと、抗-PCSK9アドネクチンまたはその融合物および1つ以上のさらなる治療剤の投与は、治療的適応のために上記のとおりに生じ得る。共投与のための適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者により理解されており、投与される特定の治療剤の正体に依存する。凍結乾燥されるよりむしろ、水性投与形態において存在するとき、タンパク質は、一般的に、約0.1mg/mlから100mg/mlの濃度で製剤化されるが、これらの範囲の外側の広範な変化も許される。疾患の処置のために、抗-PCSK9アドネクチンまたはその融合物の適当な用量は、処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、タンパク質が予防もしくは治療目的のために投与されるか否か、以前の治療の経過、患者の病歴およびタンパク質に対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。タンパク質は、一度で、または一連の処置にわたって、患者に適当に投与される。血清アルブミン結合アドネクチンSABAの融合物1つの局面において、本出願は、ヒト血清アルブミンに結合する10Fn3ドメインに融合した抗-PCSK9アドネクチン血清アルブミン結合アドネクチン10Fn3ドメインまたはSABAを含む融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質は、抗-PCSK9アドネクチン単独例えば、PK部分に結合していないと比較して、アルブミンの存在下で伸長した血清半減期を有する。10Fn3ドメインは、~10kDaの小さいサイズのために、腎臓濾過および分解を介して血中から迅速にクリアランスされるt1/2=マウスにおいて15-45分;サルにおいて1-3時間。血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンHSAに特異的に結合する10Fn3ドメインを含む第2のポリペプチドへの10Fn3ドメイン、例えば、抗-PCSK9アドネクチンの融合物は、抗-PCSK9アドネクチンのt1/2を延長するために使用され得る。1つの態様において、SABAに融合させた抗-PCSK9アドネクチンの血清半減期は、SABAに結合していないときの抗-PCSK9アドネクチンの血清半減期と比較して増加される。1つの態様において、SABA融合物の血清半減期は、SABAに融合していないときの抗-PCSK9アドネクチンの血清半減期と比較して、少なくとも20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800、1000、1200、1500、1800、1900、2000、2500または3000長い。他の態様において、SABA融合物の血清半減期は、SABAに融合していないときの抗-PCSK9アドネクチンの血清半減期と比較して、少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍または50倍長い。いくつかの態様において、SABA融合物の血清半減期は、少なくとも10時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、50時間、60時間、70時間、80時間、90時間、100時間、110時間、120時間、130時間、135時間、140時間、150時間、160時間または200時間である。1つの態様において、SABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、3uM、2.5uM、2uM、1.5uM、1uM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDでHSAに結合する。1つの態様において、SABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、25°Cまたは37°Cで5.5から7.4のpH範囲で3uM、2.5uM、2uM、1.5uM、1uM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、100pM、50pMまたは10pM未満のKDでHSAに結合する。いくつかの態様において、SABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、pH7.4での結合と比較して、pH7.4未満でHSAにさらにしっかりと結合する。したがって、本明細書に記載されているSABA融合物分子は、抗-PCSK9アドネクチンおよびSABA間の融合を作ることにより、抗-PCSK9アドネクチンの半減期を増加させるために有用である。このような融合分子は、PCSK9の生物学的活性に応答する状態を処置するために使用され得る。本発明は、PCSK9の異常制御により引き起こされる疾患におけるSABA融合物分子の使用を考慮する。融合物は、抗-PCSK9アドネクチンをSABA分子のいずれかの末端に結合させることにより、すなわち、SABA-抗-PCSK9アドネクチンまたは抗-PCSK9アドネクチン-SABA配置で形成され得る。HSAは、ヒトにおいて600μMの血清濃度および19日間のt1/2を有する。HSAの伸長されたt1/2は、一部、新生児のFc受容体FcRnを介してリサイクルされることに起因している。HSAは、内皮細胞へのエンドソーム摂取後にpH依存性においてFcRnに結合し;該相互作用は、HSAを血流にもう一度リサイクルし、それによりリソソーム分解から離れる。FcRnは広範に発現され、再循環経路は常時的であると考えられる。大多数の細胞型において、多数のFcRnは、細胞内選別エンドソームに属する。HSAは、液相飲作用の非特異的メカニズムにより容易に内在化され、FcRnによるリソソームにおける分解から救出される。エンドソームにおいて見出される酸性pHで、FcRnに対するHSAの親和性は増加されるpH6.0で5μM。FcRnに結合すると、HSAは、リソソーム分解経路から離れて、トランスサイトーシスされ、細胞表面にで放出される。1つの態様において、本明細書に記載されているSABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分はまた、サル、ラットまたはマウスの1つ以上からの血清アルブミンに結合し得る。1つの態様において、本明細書に記載されているSABA融合タンパク質のHSA結合部分は、3uM、2.5uM、2uM、1.5uM、1uM、500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pMまたは100pM未満のKDで、アカゲザル血清アルブミンRhSAまたはカニクイザル血清アルブミンCySAに結合する。1つの態様において、本明細書に記載されているSABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、HSAのドメインIおよび/またはドメインIIに結合する。1つの態様において、本明細書に記載されているSABA融合タンパク質のHSA結合部分は、HSAのドメインIIIに結合しない。1つの態様において、SABA融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、野生型10Fn3ドメイン配列番号:1と少なくとも40、50、60、70、75、80または85同一性を有する配列を含む。1つの態様において、少なくとも1つのBC、DEまたはFGループは、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾される。別の態様において、少なくとも2つのBC、DEまたはFGループは、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾される。別の態様において、全3つのBC、DEおよびFGループは、野生型10Fn3ドメインと比較して修飾される。他の態様において、SABAは、表6に示される26コアSABA配列すなわち、配列番号:334、338、342、346および348-370のいずれか1つ、または表6に示される伸長されたSABA配列すなわち、配列番号:420-447マイナス6×HISタグのいずれか1つと少なくとも40、50、60、70、75、80、85、90または95同一性を有する配列を含む。1つの態様において、10Fn3スカフォールドに基づく血清結合アドネクチンは、以下の配列により一般的に定義することができる:EVVAATXaSLLIXxYYRITYGEXbQEFTVXyATIXcDYTITVYAVXzISINYRT配列番号:3281つの態様において、10Fn3スカフォールドに基づく血清結合アドネクチンは、配列により一般的に定義することができる:EVVAATPTSLLIXxYYRITYGETGGNSPVQEFTVXyATISGLKPGVDYTITVYAVXzISINYRT配列番号:329抗-PCSK9アドネクチンに対して本明細書に記載されているとおり、配列番号:328および329は、同じ方法においてSABA分子を定義し、該分子に適用することができる。典型的な態様において、Xx、XyおよびXzによりそれぞれ示されているBC、DEおよびFGループは、以下の表6に示されるHSAバインダーのいずれかすなわち、表6における配列番号:330、334、338、342、346および348-370のBC、DEおよびFGループ配列を含むポリペプチドで置換される。1つの態様において、表6に示されるBC、DEまたはFGループ配列は、N-および/またはC-末端の側面に1つ以上のさらなる残基を含み得る。特に、BCループは、配列番号:328においてXxを置換するとき、表6に示されるBCループ配列のN-末端でSWを含み得る。同様に、DEループは、配列番号:328においてXyを置換するとき、ループDEの前にPおよびループDEの後に残基Tを含み得る。FGループは、配列番号:328においてXzを置換するとき、FGループの後にPを含み得る。例えば、配列番号:330は、BC、DEおよびFGループが、それぞれHSYYEQNS配列番号:638、YSQT配列番号:639およびYGSKYYY配列番号:640を含むことを示す。しかしながら、配列番号:328においてXx、XyおよびXz、すなわち、BC、DEおよびFGループを置換するとき、Xx配列はSWHSYYEQNS配列番号:641であり得、Xy配列はPYSQTT配列番号:642であり得、Xz配列はYGSKYYYP配列番号:643であり得る。1つの態様において、本明細書に記載されている融合物における使用のためのSABAは、配列番号:328または329に記載されている配列を含み得、式中Xx、XyおよびXzによりそれぞれ示されるBC、DEおよびFGループは、26コアSABA配列のいずれかの特定のBC、DEおよびFGループすなわち、表6における配列番号:330、334、338、342、346および348-370のそれぞれのセット、または、26コアSABA配列のBC、DEおよびFGループ配列と少なくとも75、80、85、90、95、97、98または99同一の配列で置換される。典型的な態様において、本明細書に記載されているSABAは、配列番号:329により定義され、所望により上記ループ配列へのN-および/またはC-末端付加を有する、26コアSABA配列すなわち、表6における配列番号:330、334、338、342、346および348-370のいずれかのBC、DEおよびFGループ配列のセットを有する。例えば、SABA1は配列番号:330に記載されているコア配列を有し、配列番号:331-333に記載されているそれぞれのBC、DEおよびFGループを含む。したがって、SABA1コアに基づくSABAは、配列番号:328または329を含み得、式中Xxは配列番号:331を含み、Xyは配列番号:332を含み、そしてXzは配列番号:333を含む。いくつかの態様において、Xx、XyおよびXzを置換する配列は、上記ループの末端のいずれか、または両方におけるさらなる残基を含む。同様の構築物は、他のSABAコア配列からのBC、DEおよびFGループのセットを利用することが考えられる。このようなSABAのスカフォールド領域は、配列番号:1のスカフォールドアミノ酸残基と比較して、0から20、0から15、0から10、0から8、0から6、0から5、0から4、0から3、0から2または0から1の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このようなスカフォールド修飾は、SABAが所望のKDで血清アルブミン、例えば、HSAに結合することができる限り、作成され得る。1つの態様において、SABA例えば、SABAコア配列または上記に基づく配列は、N-末端伸長配列および/またはC-末端伸長を含むように修飾され得る。典型的な伸長配列は表6に示される。例えば、SABA1.1として示される配列番号:420は、N-末端配列MGVSDVPRDLE配列番号:371、AdNT1として示されるおよびC-末端配列EIDKPSQ配列番号:380、AdCT1として示されるを有するコアSABA1配列配列番号:330を含む。SABA1.1はC-末端でHis6タグをさらに含むが、しかしながら、His6タグは完全に任意であり、N-もしくはC-末端伸長配列内のどこにでも位置てよく、または互いの配列に存在しないことが理解されるべきである。さらに、表6において提供される典型的なN-もしくはC-末端伸長配列のいずれか配列番号:371-395、およびそれらの変異体のいずれかを、表6において提供されるあらゆる所定のSABAコア配列を修飾するために使用することができる。1つの態様において、C-末端伸長配列テールとも呼ばれるは、EおよびD残基を含み、8から50、10から30、10から20、5から10および2から4アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、テール配列はEDベースのリンカーを含み、該配列はEDのタンデムリピートを含む。典型的な態様において、テール配列は、2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4または5EDリピートを含む。1つの態様において、EDベースのテール配列はまた、さらなるアミノ酸残基、例えば:EI、EID、ES、EC、EGSおよびEGCを含み得る。このような配列は、一部、既知のアドネクチンテール配列、例えば、残基DおよびKが除去されているEIDKPSQ配列番号:380に基づく。典型的な態様において、EDベースのテールは、EDリピート前にE、IまたはEI残基を含む。他の態様において、テール配列は、SABA融合物分子を設計するとき、必要なとき、他の既知のリンカー配列例えば、表6における配列番号:396-419と組み合わされ得る。コンジュゲーション/リンカーSABA融合物は、共有的または非共有的に連結され得る。いくつかの態様において、血清アルブミン結合10Fn3は、直接的またはポリペプチドリンカーを介して間接的に抗-PCSK9アドネクチンに連結され得る。Fn3ドメインを結合するために適当なリンカーは、個々のドメインが互いに独立してフォールディング可能であり、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するものである。本記載は、これらの必要条件を満たす多くの適当なリンカー、例えば、グリシン-セリンベースのリンカー、グリシン-プロリンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列PSTSTST配列番号:416を有するリンカーを提供する。本明細書に記載されている例は、ポリペプチドリンカーを介して連結したFn3ドメインが標的結合機能を保持することを証明する。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン-セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、8から50、10から30および10から20アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列GS7配列番号:403、GGS6配列番号:398およびGGS7G配列番号:400を有するリンカーを含む。他のリンカーは、グルタミン酸を含み、例えば、GSE5配列番号:405およびGGSEGGSE配列番号:409を含む。他の典型的なグリシン-セリンリンカーは、GS4配列番号:402、GGGGS7配列番号:411、GGGGS5配列番号:412およびGGGGS3G配列番号:413を含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン-プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、3から30、10から30および3から20アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列GP3G配列番号:414、GP5G配列番号:415およびGPGを有するリンカーを含む。他の態様において、リンカーは、3から30、10から30および3から20アミノ酸長を有するプロリン-アラニンベースのリンカーであり得る。プロリンアラニンベースのリンカーの例は、例えば、PA3配列番号:417、PA6配列番号:418およびPA9配列番号:419を含む。最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成物は、本明細書において提供される教示を考慮して、日常の実験により決定することができると考えられる。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、血液または標的組織中のプロテアーゼにより切断可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介してSABAに連結される。このような態様は、より良い送達もしくは治療特性またはより効率的な生産のために抗-PCSK9アドネクチンを放出するために使用することができる。さらなるリンカーまたはスペーサーは、Fn3ドメインおよびポリペプチドリンカー間のFn3ドメインのC末端に導入され得る。さらなるリンカーまたはスペーサーは、Fn3ドメインおよびポリペプチドリンカー間のFn3ドメインのN末端に導入され得る。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、SABAに、直接的またはポリマーリンカーを介して間接的に連結される。ポリマーリンカーは、融合物のそれぞれの成分間の距離を最適に変化させ、1つ以上の以下の特性を有するタンパク質融合物を生成するために使用することができる:1興味あるタンパク質に結合するときの、1つ以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の減少または増加、2タンパク質安定性または溶解度の増加、3タンパク質凝集の減少、および4タンパク質の全体的な親和力または親和性の増加。いくつかの態様において、抗-PCSK9アドネクチンは、生体適合性ポリマー、例えば、ポリマー糖を介してSABAに連結される。ポリマー糖は、血液または標的組織中の酵素により切断可能である酵素切断部位を含むことができる。このような態様は、より良い送達もしくは治療特性またはより効率的な生産のために抗-PCSK9アドネクチンを放出するために使用することができる。配列の要約上記血清アルブミン結合アドネクチンSABAの融合物およびコンジュゲーション/リンカーの欄に示されている多数の配列は、以下の表6に要約される。特記されない限り、全てのN-末端伸長は、一本下線で示され、全てのC末端テール/伸長は、二本下線で示され、リンカー配列は囲まれている。ループ領域BC、DEおよびFGは、それぞれのコアSABA配列に対して網掛けされている。さらに上記のとおり、修飾配列例えば、NまたはC末端伸長およびリンカーはまた、抗-PCSK9アドネクチン分子を修飾するために使用することができる。表6典型的な配列の要約実施例1本明細書において使用される材料および方法ハイスループットタンパク質生成HTPPpET9dベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞に形質転換された選択されたバインダーを、24-ウェルフォーマットにおいて50μg/mLのカナマイシンを含む5mlのLB培地に播種し、37°Cで一晩増殖させた。新鮮な5mlのLB培地50μg/mLのカナマイシン培養物を、一晩培養物から200μlの吸引および適当なウェルにに分配することにより、誘導発現のために調製した。培養物を、37°CでA6000.6-0.9まで増殖させた。1mMのイソプロピル-β-チオガラクトシドIPTGでの誘導後、培養物を30°Cで6時間で発現させ、4°Cで2750gで10分間の遠心分離により回収した。細胞ペレット24-ウェルフォーマット中を、450μlの溶解バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1×CompleteProteaseInhibitorCocktail-EDTAfreeRoche、1mMのPMSF、10mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、1mg/mlのリゾチーム、30μg/mlのDNAse、2μg/mlのアプロチニン、pH8.0中に再懸濁し、1-3時間室温で振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、96-ウェル、1.2mlのキャッチプレートが取り付けられた96-ウェルWhatmanGF/DUNIFILTER登録商標に移すことにより96-ウェルフォーマットに再び移し、陽圧により濾過した。浄化された溶解物を、平衡バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、40mMのイミダゾール、pH8.0で平衡化されている96-ウェルNi-ChelatingPlateに移し、5分間インキュベートした。結合していない物質を減圧により除去した。樹脂を、洗浄バッファー150mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、5mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、pH8.0で2×0.3ml/ウェルで洗浄し、それぞれの洗浄液を減圧により除去した。溶離前に、それぞれのウェルを50μlの溶離バッファーPBS20mMのEDTAで洗浄し、5分インキュベートし、この洗浄液を減圧により除去した。タンパク質を、さらなる100μlの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより溶離した。室温で30分インキュベーション後、プレートを200gで5分間遠心分離し、溶出されたタンパク質を、溶離前に溶離キャッチプレートの底に加えた5μlの0.5MのMgCl2を含む96-ウェルキャッチプレートに回収した。溶出されたタンパク質を、タンパク質標準としてSGEを使用するBCAアッセイを使用して定量した。不溶性フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製不溶性クローンの発現のために、クローン、次にHIS6タグを、pET9dEMDBioscienceSanDiegoCAベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞において発現させる。20mlの接種培養物単一被覆コロニーから産生されたを使用し、50μg/mlのカルベニシリンおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地に播種する。培養物を37°CでA6000.6-1.0まで増殖させる。1mMのイソプロピル-β-チオガラクトシドIPTGで誘導後、培養物を30°Cで4時間増殖させ、4°Cで≧10,000gで30分間の遠心分離により回収する。細胞ペレットを-80°Cで凍結する。細胞ペレットを、氷上でULTRA-TURRAX登録商標ホモジェナイザーIKAworksを使用して、25mlの溶解バッファー20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1×CompleteProteaseInhibitorCocktail-EDTAfreeRoche、1mMのPMSF、pH7.4に再懸濁する。細胞溶解は、ModelM-110SMICROFLUIDIZER登録商標Microfluidicsを使用する高圧ホモジナイゼーション≧18,000psiによりなし遂げる。不溶性画分を、4°Cで23,300gで30分間の遠心分離により分離する。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを20mMのリン酸ナトリウム/500mMのNaCl、pH7.4で洗浄する。ペレットを、超音波処理で20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaClpH7.4の6.0Mの塩酸グアニジンに再溶解し、次に37°Cで1-2時間インキュベーションする。再溶解されたペレットを0.45μmに濾過し、20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/6.0MのグアニジンpH7.4バッファーで平衡化されたHistrapカラム上に負荷する。ローディング後、カラムを、同じバッファーでさらなる25CVのために洗浄する。結合しているタンパク質を、20mMのリン酸ナトリウム/500mMのNaCl/6.0Mのguan-HClpH7.4の50mMのイミダゾールで溶離する。精製されたタンパク質は、50mMの酢酸ナトリウム/150mMのNaClpH4.5に対する透析により再フォールディングされる。可溶性フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製可溶性クローンの発現のために、クローン、次にHIS6タグを、pET9dEMDBioscienceSanDiegoCAベクターにクローニングし、大腸菌HMS174細胞において発現させた。20mlの接種培養物単一被覆コロニーから産生されたを使用し、50μg/mlのカルベニシリンおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地に播種した。培養物を37°CでA6000.6-1.0まで増殖させた。1mMのイソプロピル-β-チオガラクトシドIPTGで誘導後、培養物を30°Cで4時間増殖させ、4°Cで≧10,000gで30分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを-80°Cで凍結した。細胞ペレットを、氷上でULTRA-TURRAX登録商標ホモジェナイザーIKAworksを使用して、25mlの溶解バッファー20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1×CompleteProteaseInhibitorCocktail-EDTAfreeRoche、1mMのPMSF、pH7.4に再懸濁した。細胞溶解は、ModelM-110SMICROFLUIDIZER登録商標Microfluidicsを使用する高圧ホモジナイゼーション≧18,000psiによりなし遂げた。可溶性画分を、4°Cで23,300gで30分間の遠心分離により分離した。上清を0.45μmフィルターを介して浄化化した。浄化した溶解物を、20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaClpH7.4であらかじめ平衡化されたHistrapカラムGE上に負荷した。次に、カラムを、25カラム容量の同じバッファー、次に20カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/25mMのイミダゾール、pH7.4、次に、35カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/40mMのイミダゾール、pH7.4で洗浄した。タンパク質を、15カラム容量の20mMのリン酸ナトリウム/500MのNaCl/500mMのイミダゾール、pH7.4で溶離し、画分をA280での吸光度に基づいてプールし、1×PBS、50mMのTris、150mMのNaClpH8.5または50mMのNaOAc;150mMのNaCl;pH4.5に対して透析した。あらゆる沈殿物が、0.22μmで濾過することにより除去された。実施例2インビトロの非臨床薬理学SPRによるKD結合特性は、表面プラズモン共鳴SPRにより特徴付けた。ヒトPCSK9およびカニクイザルPCSK9を、ProteOnXPRBio-Radチップ表面の一次元上の別々のチャネル上に固定し、同じSPRチップ表面の他の次元において6つの異なる濃度の2013E01に暴露した。これは、再生の非存在下での速度論的定量を与えた。デュプリケートチップを、25°CでのヒトおよびカニクイザルPCSK9の速度論的定量のために使用した。速度論的パラメーターの評価は、Langmuir相互作用モデルおよびProteOnManagerソフトウェアでの定数パラメーターフィッティングを使用して行った。これらの条件下、抗-PCSK9アドネクチンは、80pMから1.6nMの範囲の解離定数KDでヒトPCSK9に、および8nMから24nMの範囲の解離定数KDでcynoPCSK9に結合した表7。会合速度は約105M-1s-1であり、加えて、解離は一般的に10-3-10-5s1であった。同じアドネクチンにおいて、ヒトPCSK9からのオフ速度は、ヒトPCSK9からのこれらの解離定数測定を概算することを可能にするような、SPR技術の検出限界に近いスロー10-5s1の桁であった。表7直接的に固定されたヒトおよびCynoPCSK9に対する抗-PCSK9アドネクチンに対するSPR決定速度論的パラメーターBLIによるKDアドネクチンおよびヒトPCSK9の結合特性はまた、バイオレイヤー干渉法BLIにより決定した。ビオチン化ヒトPCSK9をスーパーストレプトアビジンセンサーチップ上に固定し、次に結合相の期間、希釈されたアドネクチンを含むウェルに浸した。次に、チップを、アドネクチン解離の観察のために、バッファーのみのウェルに浸した。実験を、25または37°Cのいずれかで温度コントロール環境下で行い、振動スピードは1500rpmに合わせた。結合相互作用分析を、Fortebioの専有ソフトウェアFortebioDataAnalysisSoftwareバージョン6.3.0.36を使用して行った。全体的適合を、1:1結合モデルを使用して全てのサンプルに対して行った。これらの全体的適合の特性は、互いに束縛された結合および解離速度の一対に、全濃度値を強いた。親和性KD、結合および解離速度を、分析において使用された種々のローディングレベルにわたって平均化した。これらの条件下、アドネクチンは、表8に示されるとおり、ヒトPCSK9に200pMから7.5nMの親和性で結合した。会合速度は104-105M-1s-1であり、加えて、解離は一般的に10-3-10-5s-1であった。表8ヒトPCSK9に対するPCSK9アドネクチンに対するBLI決定速度論的パラメーター1ATI001168はR23E置換を有する1922G04の脱免疫化バージョンである。2ATI001175はR23D置換を有する1922G04の脱免疫化バージョンである。溶液相親和性KinExAヒトPCSK9に対するATI001081およびATI001174の溶液親和性は、KineticExclusionAssayKinExAを使用して測定した。相対的非結合アドネクチン濃度は、hPCSK9固体マトリックス上の捕捉、次に、アドネクチンスカフォールドを認識する蛍光的に標識された抗体での検出により測定した。技術的限界によって、試験することができたアドネクチンの最も低い濃度は1nMであった。全体的KD分析では、ATI001081に対してKD=70pM95信頼区間内で28-127pMおよびATI001174に対してKD=223pM95信頼区間内で54-585pMの範囲と概算する。表9ITCヒトPCSK9へのアドネクチンATI001174およびATI001081の結合の熱力学および化学量論は、等温滴定熱量計ITCにより特徴付けた。溶液相結合は、37°Cで25mMのHEPES、pH7.41、150mMのNaCl中で測定した。1.3±0.2nMの平均単分子結合定数がATI001174に対して、および1.4±0.4nMがATI001081に対して観察された。詳細な熱力学的分析は、表10および図13に示される。2つのアドネクチンに対して観察されるエンタルピーの違い-3.3kcal/molは、ATI001174が、エントロピーにおける対応する違い-10.4cal/molKによって少なくとも部分的に相殺される、ペグ化によってPCSK9に対する親和性における大きさの減少の秩序をもたらすということを示唆する。表103つの実験の平均蛍光共鳴エネルギー移動FRETアッセイこれらのFRETベースのアッセイは、MaioらMiaoBらMethEnzymol357180188参照により以前に記載されている一般的な方法から採用されたPCSK9結合アドネクチンの結合親和性および効力を決定するために開発された。PCSK9:EGFAFRETアッセイ図2および3によって、バキュロウイルスにおいて発現される組換えヒトPCSK9および合成40-merEGFAペプチドビオチン化を使用して、低比重リポタンパク質受容体LDLR上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメインEGFAドメインへのPCSK9結合の阻害を測定した。EGFAは、PCSK9とLDLRの重要な相互作用ドメインを示すことが示されているKwonHJらProcNatlAcadSciUSA10518201825。このアッセイは、ストレプトアビジン/アロフィコシアニンフルオロフォア複合体を介するビオチン化EGFAとのFRET相互作用を提供するために、Eu-キレートで標識化されたPCSK9C-末端ドメイン結合mAbmAb4H5を使用した。2つの他の関連した、PCSK9依存性FRETアッセイもまた構築した。これらのアッセイの1つにおいて、ビオチン化アドネクチン-ATI000972またはATI001125のアドネクチンによる競合的置換を定量する図4に示されるATI000972結果。ATI000972は1459D05のビオチン化バージョン、ATI001125はATI001081のビオチン化バージョンである。別のアッセイにおいて、PCSK9へのアドネクチンhisタグされているの直接結合は、抗-his6抗体を使用してアッセイする図5。FRETアッセイのそれぞれにおいて、ヒトPCSK9濃度は1または5nMのいずれかであった。いくつかの場合において、カニクイザルPCSK9をhPCSK9と置き換えた。表11は、これらの3つのFRETアッセイからの全てのデータを要約する。表11ヒトPCSK9を使用する3つのFRETアッセイおよびCynoPCSK9に対する1つのアッセイに対するアドネクチン試験データの要約PCSK9アドネクチンによるPCSK9活性の細胞ベースの阻害DiI-LDL摂取アッセイ細胞培養方法を、アドネクチンがLDLRにおけるPCSK9活性を阻害する能力をアッセイするために開発した。細胞性LDLR活性を測定するための有効な方法は、LagaceTAら29953005により示されているとおりに、標識化LDLの摂取に関するアッセイを通す。本試験は、Teupserら193198により最初に示された方法から採用された蛍光標識化LDLDiI-LDL摂取を使用するLDLR機能活性のための方法をさらに採用した。最初に、細胞を示されているアドネクチンの存在および非存在下で組換えヒトPCSK9タンパク質10ug/mL、135nMとプレインキュベートした。2時間後、残りのLDLR活性を、2時間DiI-LDL5ugとのインキュベーション、次に、高含量蛍光顕微鏡およびイメージング分析Cellomicsを使用する細胞内の蓄積されたDiI-LDLの評価によりアッセイした。図6は、PCSK9活性を阻害し、HepG2細胞においてLDLR機能活性を回復させるいくつかのアドネクチンの効果を示す。このアッセイにおいて、アドネクチンは、以下のEC50値でPCSK9を阻害し、DiI-LDL摂取を回復させた:1459D05、EC50=190nM;1784F03、210nM;2012A04、130nM;2013E01、160nM。LDLR枯渇アッセイHepG2細胞を、10のFBSHycloneを有する完全培地、Eagle’sMinimumEssentialMediumEMEM、ATCC登録商標中で培養し、トリプシン0.25Invitrogenで週に2回スプリットした。LDL受容体の上方調節を誘導するために、細胞をLPDS培地[5のリポタンパク質欠失血清Intracel、100nMのスーパーステイションBMSおよび50uMのメバロン酸ナトリウムSigmaを有するRPMIATCC]中で一晩インキュベートした。次の日、細胞を、簡潔にはトリプシン0.05Invitrogenでトリプシン処理し、2×10^6個の細胞/mlで再懸濁し、次にV底96ウェルプレート中100ul/ウェルでアリコートした。その後、アドネクチンを37°Cで1時間LPDS培地中でPCSK9とプレインキュベートそた。1時間後、細胞を遠心し、100ulのアドネクチン/PCSK9混合物に再懸濁し、37°Cで一晩インキュベートした。次の日、細胞をLDL受容体に対する抗体RDからのBAF2148、次にフィコエリトリンPE-ストレプトアビジン結合二次抗体BDPharmingenからのBD554061で標識化し、FACSCantoIIBDにおけるFACSにより分析した。10nMのPCSK9を、HepG2細胞に加える前に、アドネクチン候補物の濃度の増加につれて1時間プレインキュベートした。一晩インキュベーション後、LDLRレベルをFACSにより測定し、PCSK9誘導LDLR枯渇の阻害パーセントをグラフにし、EC50をPRISMを使用して決定した。1459D05は、試験されたものの中で最も低い効力の候補物を表し、最大阻害に到達しなかったが、他のクローンはPCSK9の150-200最大阻害に到達した図7。PCSK9アドネクチンのインビトロ薬理学的データの要約は、以下の表12に示される。表12実施例3PCSK9アドネクチンのインビボ薬物動力学効果ヒトPCSK9トランスジェニックマウスモデルPCSK9アドネクチンは、2つの異なるヒトトランスジェニックマウスモデルにおけるインビボでの薬物動力学効果を示した。1つのマウスモデルはヒトPCSK9レベルを著しく過剰発現し、結果として高コレステロール血症を示すLagaceTAらJClinInvest11629953005。他のマウスモデルは、マウスPCSK9と同様に肝臓において制御され、血漿中でほぼヒト正常レベルのhPCSK9を発現するゲノムhPCSK9トランスジェニックBAC-トランスジェニックである。これらの試験のために、種特異的、部位特異的標識された抗体およびアドネクチンを使用するELISAアッセイを、標的分子への結合の指標としての血漿非結合ヒトPCSK9レベルすなわち、投与されたアドネクチンと複合体化していないhPCSK9を測定するために開発した。ペグ化形態におけるPCSK9アドネクチンの単回投与を、図8-9に示される用量で過剰発現体hPCSK9トランスジェニックマウスモデルに腹腔内に注射した。PBSまたは透析物サンプルもまた、コントロールとして注射した。アドネクチン1459D05-PEG100mg/kg腹腔内処置は、血漿総コレステロール図8AおよびLDL-C示されていないを4時間でベースライン以下に、>35迅速に減少させた。アドネクチン処置マウス中のコレステロールレベルは、試験期間48時間中、コントロールレベル未満を維持した。これは、アドネクチン処置トランスジェニックマウス中の非結合hPCSK9の血中レベルにおける鋭い減少と同時に起こった図8B。並行試験において6時間で得られた肝臓のウェスタンブロットは、LDLRタンパク質レベルがアドネクチン処置マウスにおいて~2倍増加したことを示した本明細書に示されていない。このトランスジェニックマウスモデルにおけるさらなる試験において、ATI001114を10または60mg/kgで投与した。血漿コレステロールの著しい用量依存的迅速な低下が、非結合hPCSK9レベルにおける用量依存的減少と同時に見られた図9。これらの試験は、高コレステロール血症ヒトトランスジェニックPCSK9マウスモデルにおける有効なコレステロール低下剤としての、PCSK9アドネクチンに対するインビボでの概念実証を示す。インビボ試験を、正常発現体hPCSK9トランスジェニックマウスモデルにおいて行った。1459D05-PEGまたはATI001114の単回投与の注射5mg/kgは、血漿中の非結合hPCSK9レベルにおける迅速かつ強い減少をもたらした図10。非結合hPCSK9におけるこの薬物動力学効果は、より高い親和性/効力アドネクチンに対して観察される効果のより大きな規模および期間で、1459D05-PEGと比較してATI001114後により顕著であった。用量依存性のさらなる試験は、50阻害量ED50が、図11に示されるとおり、投与3から48時間後の時点で、ATI001114について0.1mg/kg未満であったことを示した。正常発現体トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの発見は、PCSK9阻害アドネクチンが、LDLR制御およびLDLコレステロール低下と相関している薬物動力学終点における著しい、親和性依存性および用量依存効果を示すことを示す。カニクイザル薬物動力学試験を、正常な細身のカニクイザルにおいて行った。アドネクチンATI001114を5mg/kgでcynoの静脈内に投与し、血漿サンプルをLDL-Cアッセイおよび薬物動態学評価のために時間間隔で回収した。ATI001114の単回投与は、48時間以内に、ベースラインまたはPBSコントロールグループに対して、血漿LDL-Cレベルを>50に迅速に低下させた図12。LDL-Cにおける効果の期間は1週間以上持続し、3週間でベースラインへ最終的に戻った。この効果を、抗-PCSK9アドネクチンの二分岐および四分岐40kDaペグ化形態それぞれATI001114およびATI001211の両方で観察した。ATI001211は、40kDaの4分岐NOFPEG部分と有するATI001081である。総コレステロールは同様のパターンを示したが、HDLまたは他の代謝パラメーターにおける効果は観察されなかった本明細書に示されていない。薬物動態学分析は、血漿半減期がcynoにおけるLDL低下の薬物動力学と一致する約80-120時間であったことを示した。これらの発見は、PCSK9アドネクチンが、カニクイザルモデルにおいてLDL-C低下に対して迅速な、強力な、特異的な効果で有効かつ即効性であることを示す。実施例4PCSK9アドネクチン-Fc融合タンパク質であるPRD460のインビトロおよびインビボでの薬理学的評価PRD460の生産PRD460をコードするベクターを、ポリエチレンイミンPEIを使用してHEK-2936E細胞にトランスフェクトした。細胞を、80加湿および5CO2で37°Cで5日間培養した。次に細胞をペレット化し、上清を0.22umフィルターに通し、次に、タンパク質Aカラムに負荷した。カラムをPBSで洗浄し、タンパク質を20mMのGylcine、150mMのNaClpH2.8に溶離した。溶出されたタンパク質を濃縮し、50mMのMES、100mMのNaClpH5.8中でsuperdex200カラムを通した。SPRによるPRD460KD結合特性は、表面プラズモン共鳴SPRにより特徴付けられた。抗-ヒト抗体は、BIACORE登録商標チップ上に固定され、PRD460配列番号:322に記載されている配列をチップ表面上に捕捉した。種々の濃度のhPCSK9をフロー溶液に置き、サイクル間のチップ再生のためにMgCl23Mを使用した。比較のために、ATI-1081を、BIACORE登録商標チップ上に固定される抗-His抗体に捕捉した。PRD460に対するデュプリケート実験を異なる日に実施した。速度論的定量を25°Cで実施した。速度論的パラメーターの評価を、BIACORE登録商標評価ソフトウェアにおける1:1結合アルゴリズムを使用して実施した。これらの条件下、ATI-1081は25°Cで6.7nMの解離定数KDでヒトPCSK9に結合し、PRD460は25°Cで3.29/-0.55nMの解離定数KDでヒトPCSK9に結合した表13。このアッセイフォーマットを使用するオフ速度決定は、固定された捕捉抗体からの捕捉されたリガンドのオフ速度により人為的限定され得、したがって、PCSK9の直接的固定化を使用するアッセイフォーマットは、ATI-1081に対する解離定数KDのさらに正確な反映である。表13捕捉されたヒトPCSK9に対するPRD460およびATI-1081に対する速度論的パラメーターPCSK9結合FRETアッセイ2つの蛍光共鳴エネルギー移動FRETベースのアッセイを使用して、hPCSK9へのPRD460および他のアドネクチンの競合的結合効力を決定した。PCSK9:EGFAFRETアッセイは、可溶性上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメイン-AEGFAペプチドおよび組換えヒトPCSK9を使用して、LDLRへのPCSK9の結合を測定する。PCSK9:ATI972FRETアッセイは、PCSK9からビオチン化アドネクチンATI-972のアドネクチンによる競合的置換を測定する。PCSK9:EGFAFRETアッセイ5nMのPCSK9において、PRD460は、EC50=0.7nMでEGFAをPCSK9結合部位から完全に、かつ強く置換した図1、左パネル。PRD460は、ATI-1174EC50=1.9nMまたはATI-1081EC50=3.7nMのいずれかよりもこのアッセイにおいてより強力であった図14。このアッセイにおけるPRD460のより良い明白な効力は、ATI-1081およびATI-1174による一価1:1結合と比較して、PCSK9へのアドネクチンPRD460の二価2:1結合により説明され得る理論的に。PCSK9:ATI-972FRETアッセイ5nMのヒトPCSK9を使用して、PRD460は、ATI-1114に対して0.8nMおよびATI-1081に対して2.8nmと比較して、EC50=0.3nMで阻害した図15。これらの発見は、PRD460がビオチン化アドネクチンATI-972をPCSK9上の結合部位から強く置換したことを示す。ATI-1081およびATI-1174と比較してPRD460のより高い効力は、PRD460による二価結合と一致する。HepG2細胞におけるPCSK9誘導LDLR枯渇の阻害ヒトPCSK9は、HepG2細胞の表面からのLDLRの枯渇を促進する。PCSK9のPCSK9アドネクチンとのプレインキュベーションは、LDLRへのPCSK9結合を阻害し、細胞表面からのLDLRの枯渇を防止する。このアッセイは、ATI-1081、ATI-1174およびPRD460が細胞表面からのLDLRのPCSK9誘導枯渇を阻害する効力を測定するために使用された。PCSK9アドネクチンの希釈シリーズを、37°Cで1時間、10nMのヒトPCSK9とプレインキュベーションし、プレインキュベーションされた混合物をHepG2細胞に加え、該細胞を24時間インキュベートした。該インキュベーション後、HepG2細胞上のLDLRのレベルを、FACS分析を使用して測定した。PCSK9誘導LDLR枯渇の阻害パーセントを計算し、グラフで示した図15。このアッセイにおいて、ATI-1081、ATI-1174およびPRD460は、同等のEC50それぞれ9nM、8nMおよび6nMでPCSK9を阻害したが、応答曲線の左方向-シフトは、一貫して、PRD460に対して観察された。これらのEC50は、アッセイの限界を示す。HepG2細胞におけるPCSK9細胞への侵入アッセイ肝細胞の表面上のLDLRへのPCSK9結合は、LDLRエンドサイトーシス中、LDLR-PCSK9複合体の共内在化をもたらし、LDLRの増強された分解をもたらす。。細胞ベースアッセイを、蛍光PCSK9のLDLR依存性細胞侵入を測定するために開発した。ヒトPCSK9を、フルオロフォアALEXAFLUOR登録商標-647AF647を使用して共有的に標識化した。PCSK9-AF647を、PCSK9-アドネクチンの存在または非存在下でHepG2細胞とインキュベートし、細胞内蛍光を、高含量蛍光顕微鏡および画像分析Cellomicsにより定量した。PCSK9-AF647細胞への侵入のLDLRエンドサイトーシスへの依存が、予備実験において確立された。HepG2細胞を、10nMのPCSK9-AF647および種々のレベルのアドネクチンと37°Cで4時間インキュベートした。このアッセイにおいて、PCSK9-AF647細胞内蛍光の強力な阻害は、PRD460EC50=6nMならびにATI-1174EC50=10nMに対して観察された図16。これらの発見は、アドネクチンPRD460およびATI-1174が、培養中のヒト肝臓由来の細胞系においてPCSK9の細胞表面LDLRへの結合を有効にブロックし、それにより、LDLRエンドサイトーシス中、PCSK9-AF647の内在化を減少させたことを示す。インビボでのトランスジェニックマウス試験インビボ試験を、正常発現体hPCSK9トランスジェニックマウスモデルにおいて実施した。血漿中のアドネクチンのPCSK9への結合は、非結合遊離血中PCSK9の測定された量における減少をもたらすことが予期される。非結合PCSK9における減少は、最初の薬物動力学事象であり、PCSK9-LDLR相互作用の阻害およびLDLコレステロール低下をもたらす。トランスジェニックマウスへのPRD460の単回投与i.p.投与0.6から18mg/kgは、血漿非結合hPCSK9レベルにおいて迅速な、強い減少を引き起こした図17。非結合PCSK9における用量依存的増加は、3時間の時点でED50<0.6mg/kgで観察された。正常発現体ヒトPCSK9トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの発見は、PRD460がインビボで血中hPCSK9に強く、強力に結合することを示す。カニクイザルにおけるインビボでの薬物動力学PCSK9アドネクチンPRD460の薬物動力学効果は、正常な細身のカニクイザルにおいて評価した。PRD460を、15mg/kgでのi.v.投与によりサルに投与し、LDL-Cおよび遊離PCSK9レベルのアッセイのために血漿サンプルを4週間にわたって時間間隔で回収した。PRD460の単回投与は、サルにおいて血漿LDL-Cレベルを迅速に低下させ、投与3日後までにベースラインLDL-Cの42の平均最大効果58減少;n=3匹サルに到達した図18。LDL-Cレベルは、投与で1週間、50またはそれ以上減少し、3週間ベースライン以下を有意に維持し、4週間でベースラインに戻った。総コレステロールは同様のパターンを示したが、HDLでは効果が観察されなかった示されていない。PRD460での処置は、非結合、遊離形の血漿PCSK9において、0付近定量下限以下への即座の低下を引き起こした図18。遊離PCSK9レベルは、数日間、検出下限付近を維持し、4週間の終わりまでにベースラインレベルに徐々に戻り、血漿LDL-Cとの因果関係と一致した。該データは、血漿LDL低下が遊離PCSK9レベルにおける低下を反映し、インビボでのPRD460での処置後、LDLR機能を制御するPCSK9阻害と一致することを示す。薬物動態学分析は、アドネクチンPRD460の血漿半減期が該カニクイザル試験において約70時間であったことを示した。これらの発見は、PCSK9アドネクチン-Fc融合タンパク質が、カニクイザルモデルにおいてLDL-C低下に対する強力な、特異的な、かつ長期の効果で高度に有効的かつ即効性であることを示す。非修飾PCSK9アドネクチンATI-1081のインビボでの薬理学的評価PK部分例えば、ペグ化およびFc-融合アドネクチンを含む修飾アドネクチンに加えて、非修飾裸のPCSK9アドネクチンもまた投与することができる。非修飾PCSK9アドネクチン処置のための戦略は、より短いPK半減期に適応させるためにより頻繁な投与、または吸収相の長さを増加させ、薬物動力学効果を伸長させるために持続放出皮下製剤の使用を含む。多数のこのような製剤は、1つの例として、吸収速度を遅延させ、血中でアドネクチンへの暴露時間を増加させるためにプロピレングリコール/PBS溶液を含むことを構想することができる。非修飾アドネクチンATI-1081を、PBSビヒクル中10mg/kgでカニクイザルにi.v.投与した。ATI-1114同じアドネクチンのペグ化バージョンもまた、比較としてPBS中1mg/kgで投与した。ATI-1081は、非結合血中PCSK9レベルの迅速な、一過性の阻害を引き起こした。30分以内で、最初の阻害の程度は100定量限界未満に近づき、数時間後にベースラインに戻った図19。同時に、LDL-Cレベル低下の傾向は、ATI-1081処置サルにおいて最初の24時間にわたって観察された図20。非修飾アドネクチンATI-1081もまた、PBSビヒクルと比較して、50:50プロピレングリコール:PBSビヒクルPGビヒクルを使用する単一の持続放出皮下製剤において、正常発現体hPCSK9トランスジェニックマウスに投与した。この製剤は、アドネクチン吸収速度を穏やかに遅延させ、血中でATI-1081への暴露時間を増加させ、したがって薬物動力学応答を改善することが期待される。PBSビヒクル中1mg/kgでATI-1081の投与腹腔内は、0.3mg/kgでATI-1114において>85低下と比較して、3時間で非結合血漿PCSK9の~50低下をもたらした図21。トランスジェニックマウスにおける第2の実験において、PGビヒクル中で皮下注射により投与されたATI-1081は、試験の最初の6時間にわたって効果の改善された期間で、ATI-1174と比較して非結合LDLにおいてほぼ同等の減少をもたらした図22。これらの発見は、非修飾PCSK9アドネクチンATI-1081が、単一の持続放出ビヒクルにおいて皮下に投与されたとき、インビボで標的ヒトPCSK9に結合し、最初の薬物動力学応答を引き起こすことを示す。応答の時間依存性は、非修飾PCSK9アドネクチンに関する効果の期間を延長する持続放出と一致した。実施例5血清アルブミン結合アドネクチンSABA実施例5A.候補血清アルブミン結合アドネクチンのスクリーニングおよび選択概観PROfusionとして知られる選択技術例えば、RobertsらProcNatlAcadSciUSA941229712302およびWO2008/066752参照を、10Fn3のBC、DEおよびFGループに設計された可変領域を有するDNAライブラリーに適用した。1013個以上の分子のランダムライブラリーをこの設計から作りだし、選択圧をHSAのビオチン化形態に対して適用し、望ましい結合特性を有する候補血清アルブミン結合アドネクチンSABAを単離した。ハイスループットタンパク質生産HTTP処理種々のHSA結合アドネクチンを、ハイスループットタンパク質生産処理HTPPを使用して精製した。選択されたバインダーを、HIS6タグを含むpET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21DE3pLysS細胞に形質転換した。形質転換細胞を24-ウェルフォーマット中で50μg/mLのカナマイシンを含む5mlのLB培地に植菌し、37°Cで一晩培養した。新鮮な5mlのLB培地50μg/mLのカナマイシン培養物を、誘導発現のために、一晩培養物から200μl吸引し、適当なウェルに分配することにより調製した。培養物をA6000.6-0.9まで37°Cで培養した。1mMのイソプロピル-β-チオガラクトシドIPTGで誘導後、培養物を30°Cでさらに4時間培養し、4°Cで3220×gで10分遠心分離により回収した。細胞ペレットを-80°Cで冷凍した。細胞ペレット24-ウェルフォーマット中を、450μlの溶解バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1×CompleteProteaseInhibitorCocktail-EDTAfreeRoche、1mMのPMSF、10mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、1mg/mlのリゾチーム、30ug/mlのDNAse、2ug/mlのアプロチニン、pH8.0中に再懸濁し、1時間室温で振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、96-ウェル、650μlキャッチプレートが取り付けられた96-ウェルWhatmanGF/DUNIFILTER登録商標に移すことにより96-ウェルフォーマットに再び移し、200×gで5分遠心した。浄化された溶解物を、平衡バッファー50mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、10mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、pH8.0で平衡化されている96-ウェルNi-ChelatingPlateに移し、5分間インキュベートした。結合していない物質を除去した。樹脂を、洗浄バッファー150mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、5mMのCHAPS、40mMのイミダゾール、pH8.0で2×0.3ml/ウェルで洗浄した。次に、樹脂をPBSで3×0.3ml/ウェルで洗浄した。溶離前に、それぞれのウェルを50μlの溶離バッファーPBS20mMのEDTAで洗浄し、5分インキュベートし、この洗浄液を減圧により除去した。タンパク質を、さらなる100ulの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより溶離した。室温で30分インキュベーション後、プレートを200×gで5分間遠心分離し、溶出されたタンパク質を、Ni-プレートの底に加えた5μlの0.5MのMgCl2を含む96-ウェルキャッチプレートに回収した。溶出されたタンパク質を、タンパク質標準としてSGEコントロールアドネクチンを使用するBCAタンパク質アッセイを使用して定量した。SGEアドネクチンは、インテグリン結合ドメイン位置78-80でアミノ酸RGDがSGEで置換されている野生型10Fn3ドメイン配列番号:1である。HSA、RhSAおよびMuSA直接結合ELISAHSAに対する直接的バインダーをアッセイするために、MaxiSorpプレートNuncInternationalRochesterNYをPBS中10ug/mLのHSASigmaStLouisMOで4°Cで一晩でコーティングし、カゼインブロックバッファーThermoScientificRockfordILで室温で1-3時間ブロックした。一点スクリーニングアッセイのために、精製されたHTPPアドネクチンをカゼインブロックバッファーで1:20に希釈し、それぞれのウェル中で室温で1時間HSAに結合させた。用量応答アッセイのために、0.1nMから最大1μMの範囲の濃度を使用した。非結合アドネクチンを除去するためにPBSTで洗浄後、カゼインブロックバッファーで1:2500に希釈された抗-HismAb-HRPコンジュゲートRDSystemsMNを結合His-タグアドネクチンに室温で1時間で加えた。過剰なコンジュゲートをPBSTで洗浄することにより除去し、結合したアドネクチンを製造業者の指示にしたがってTMB検出試薬BDBiosciencesを使用して検出した。分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集測定サイズ排除クロマトグラフィーSECをHTPPから得られるSABAにおいて実施した。HTPP由来物質のSECを、A214nmおよびA280nmでのUV検出ならびに蛍光検出励起=280nM、発光=350nmにて、Agilent1100または1200HPLCシステムにおいてSUPERDEX登録商標2005/150またはSUPERDEX登録商標755/150カラムGEHealthcareを使用して実施した。100mMの硫酸ナトリウム、100mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーをSECカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準BioRadLaboratoriesHerculesCAを分子量校正のために使用した。HTPP精製SABAにおけるSECの結果は、主にモノマーであることが示され、ほぼ10kDaの範囲対球状ゲル濾過標準BioRadにおいて溶離した。候補血清アルブミン結合アドネクチンSABAの同定HSA/RhSA/MuSA結合および生物物理学基準のスクリーニングの結果として、4つのユニークな血清アルブミン結合アドネクチンSABAが、マウスにおいて評価されたそれらの半減期を有するように同定され、選択された。インビトロおよびインビボでの特性化を行うために、中規模を4つのSABAのために行った。表6は、SABA1-26として示されるPROfusionから同定された26個のユニークなSABAコア配列の配列を提供する。SABA4は、スカフォールド変異を有し、中規模化の前に固定された。SABA4のスカフォールド-完全バージョンはSABA5である。SABA4およびSABA5は、BC、DEおよびFGループにおいて同一の配列を有する。実施例5B.候補物SABAの生産および製剤SABAの中規模タンパク質生産実施例5Aに記載されている選択されたSABA、次にHis6タグを、pET9dベクターにクローニングし、大腸菌BL21DE3pLysS細胞において発現させた設計されたSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1およびSABA5.1のそれぞれのHis-タグSABA配列について表6参照。20mlの接種培養物単一被覆コロニーから産生されたを使用し、50μg/mLのカナマイシンを含む1リットルのLB培地に播種する。培養物を37°CでA6000.6-1.0まで増殖させた。1mMのイソプロピル-β-チオガラクトシドIPTGで誘導後、培養物を30°Cでさらに4時間増殖させ、4°Cで≧10,000gで30分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを-80°Cで凍結した。細胞ペレットを、氷上でULTRA-TURRAX登録商標ホモジェナイザーIKAworksを使用して、25mLの溶解バッファー20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、1×CompleteProteaseInhibitorCocktail-EDTAfreeRoche、pH7.4に再懸濁した。細胞溶解は、ModelM-110SMICROFLUIDIZER登録商標Microfluidicsを使用する高圧ホモジナイゼーション≧18,000psiによりなし遂げた。可溶性画分を、4°Cで23,300gで30分間の遠心分離により分離した。上清を0.45μmフィルターを介して洗浄した。浄化された溶解物を20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、pH7.4で平衡化されたHISTRAP登録商標カラムGE上に負荷した。次に、カラムを、25カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、pH7.4、次に20カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、25mMのイミダゾールpH7.4、次に35カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、40mMのイミダゾールpH7.4で洗浄した。タンパク質を、15カラム容量の20mMのNaH2PO4、0.5MのNaCl、500mMのイミダゾールpH7.4で溶離し、画分をA280での吸光度に基づいてプールし、1×PBS、50mMのTris、150mMのNaClpH8.5または50mMのNaOAc;150mMのNaCl;pH4.5に対して透析した。あらゆる沈殿物が、0.22μmで濾過することにより除去された。中規模発現および精製は、可溶性形態において発現され、細菌サイトゾルの可溶性画分から精製された高度に純粋な、かつ活性なアドネクチンをもたらした。100mMのNaPO4、100mMのNaSO4、150mMのNaCl、pH6.8GEHealthcareの移動相におけるSUPERDEX登録商標200またはSUPERDEX登録商標7510/30GLにおけるSEC分析は、主にモノマーアドネクチンを証明した。SABA1.2の製剤1つの特定のSABA、SABA1.2配列番号:411を、予備的製剤スクリーンのために選択した。SABA1.2は、10Fn3のコア1配列においてED5伸長を含む表6における配列番号:421参照。SABA1.2において、10mMのコハク酸、8のソルビトール、5のグリシンpH6.0および5mg/mLの生成物濃度の安定な製剤を同定した。この製剤化において、タンパク質融解温度は1.25mg/mLのタンパク質濃度を使用して示差走査熱量測定DSCにより決定されたとき、75°Cであった。該製剤は、4°Cおよび25°Cで1.2の最初の凝集レベルを有する満足な物理化学的安定性を提供した。1月安定後、凝集レベルは非常に低かった4°Cで1.6および25°Cで3.8。該タンパク質はまた、-80°Cおよび-20°Cから環境温度への変化としての凍結融解の5サイクル後に該製剤中で安定であった。加えて、この製剤化において、SABA1.2は、沈殿または凝集の増加なしで4°Cおよび環境温度で少なくとも20mg/mLのタンパク質濃度まで溶解できた。実施例5C.候補物SABAの生物物理学特性化サイズ排除クロマトグラフィー標準サイズ排除クロマトグラフィーSECを、中規模プロセスから得られた候補物SABAについて実施した。中規模midscaled材料のSECを、A214nmおよびA280nmでのUV検出ならびに蛍光検出励起=280nM、発光=350nmにて、Agilent1100または1200HPLCシステムにおいてSUPERDEX登録商標20010/30またはSUPERDEX登録商標7510/30カラムGEHealthcareを使用して実施した。100mMの硫酸ナトリウム、100mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH6.8のバッファーを、SECカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準BioRadLaboratoriesHerculesCAを分子量校正のために使用した。中規模精製SABAにおけるSECの結果は、主にモノマーアドネクチンであることが示され、ほぼ10kDaの範囲対球状ゲル濾過標準BioRadにおいて溶離した。熱安定性中規模SABAの示差走査熱量測定DSC分析を実施して、それぞれのTmを決定した。1mg/mlの溶液を、N-DSCII熱量計CalorimetrySciencesCorpにおいて、3気圧下で1分当たり1°Cの速度で5°Cから95°Cに勾配をつけることによりスキャンした。データは、OrginソフトウェアOrginLabCorpを使用し、最適適合を使用して、適当なバッファーのコントロール実施に対して分析した。SECおよびDSC分析の結果を表14に要約する。表14候補物SABAにおけるSECおよびDSC分析の要約実施例5D.血清アルブミンへの候補物SABA1結合の特性化実施例5Aおよび5Bに記載されているHTPPおよび/または中規模材料から精製された選択されたSABAクローンの動力学を、BiasensorCM5チップの表面上のそれぞれの血清アルブミンHSA/RhSA/MuSAを捕捉し、参照フロー細胞および捕捉アルブミンの両方に、濃度系列のSABAを流すことにより決定した。加えて、アルブミンへの結合を、pH5.5からpH7.4の範囲の種々のpH条件下で行った。HSA結合アドネクチンSABA2.1、SABA3.1、SABA4.1およびSABA1.1はRhSAと公差反応したが、MuSAと公差反応しなかった。SABA2およびSABA4結合はpH感受性であるが、クローンSABA3は、pH6.0に至るまでHSAへのpH抵抗性結合を証明した。SABA1.1は、pH5.5に至るまでpH抵抗性および親和性/動力学に対する生化学的基準に合う。ドメインマッピングをBIACORE登録商標により決定した。HTPPおよび/または中規模材料から精製された選択されたSABAクローンを、BiasensorCM5チップの表面上のちょうどHSA-ドメインIIIまたはHSA-ドメインIIIからなるHSAまたは構築物を捕捉し、参照フロー細胞および捕捉アルブミンの両方に、濃度系列のSABAを流すことにより決定した。クローンSABA2SABA1は、HSAおよびHSA-ドメインI-II構築物に結合したが、HSA-ドメインIII構築物に結合しなかった。クローンSABA3SABA4は、HSAに結合したが、HSA-ドメインI-IIまたはHSA-ドメインIII構築物のいずれにも結合しなかった。該結果を表15に要約する。表15候補物SABASABA1.1、2.1、3.1および4.1の結合親和性および動力学実施例5E.候補物SABAのインビボt1/2の試験HSA結合アドネクチンがMuSAと交差反応しないため、マウスにおいてHSAの半減期を、マウスにおいてHSA結合アドネクチンの評価を可能にするように決定した。HSAを、20mg/kg図23Aおよび50mg/kg用量図23Bで約6週齢Ncrnudeメスマウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおけるHSAの濃度をELISAにより決定した。20mg/kgおよび50mg/kgでマウスに注射されたHSAのt1/2は、それぞれ~24時間および~20時間であると決定された。マウスにおけるSABA1-4の半減期決定HSA結合クローンSABA1.1、SABA2.1、SABA3.1およびSABA4.1の1リットルの大腸菌培養物を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。それぞれのSABA変異体をマウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおける濃度をELISAにより決定した。それぞれのSABAの薬物動態学プロフィールを、約6週齢のNcrnudeメスマウスにおいてHSAの存在または非存在下で比較した。結合クローンはHSAおよびRhSAに対して選択的であり、マウス血清アルブミンに結合しないため、HSAを共注入されたマウスは、それぞれのSABA3-4モル過剰におけるHSAと前混合されたHSAを有した。マウス血漿中のSABA1.1クローン1318H04の半減期は0.56時間であったが、HSAを共注入されたSABA1.1の半減期は5.6時間であり、半減期において~10倍増加した図24A。マウス血漿中のSABA2.1の半減期は0.24時間であったが、HSAを共注入されたSABA2.1の半減期は2.8時間であり、半減期において~12倍増加した図24B。マウス血漿中のSABA3.1クローン1245H07の半減期は0.28時間であったが、HSAを共注入されたSABA3.1の半減期は0.53時間であり、半減期において~2倍増加した図24C。マウス血漿中のSABA4.1の半減期は0.66時間であったが、HSAを共注入されたSABA4の半減期は4.6時間であり、半減期において~7倍増加した図24D。実施例の要約は図25に示される。表16は、SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1およびSABA5.1に対する同様のデータを要約し;比較は、利用できるときcynoにおける半減期にて作成する。表16カニクイザルにおけるSABA1.1およびSABA5.1の半減期決定SABA1.1図26AおよびSABA5.1図26Bの概念試験の3週間単回投与試験をカニクイザルにおいて行い、2匹のカニクイザルにおいて1mg/kgmpkのIV投与にて薬物動態学を評価した。薬物動態学は、血漿サンプル中のアドネクチンを検出するために開発された定量ELISAベースのアッセイを使用して評価した。SABA1.1は、96-137時間図26Aおよび表17Aの範囲の半減期を有した。SABA5.1は、約12時間の半減期を有し、唯一、ELISAにおいて最大120時間測定可能であった図26B。表17Aは、SABA1.1に対するデータを要約し;表17Bは、SABA5.1に対するデータを要約する。表17ASABA1.1表17BSABA5.1実施例5F.血清アルブミンへのSABA1結合の特性化SABA1.1および1.2はHSAおよびRhSAに結合するED5伸長を含むコア110Fn3であるSABA1.2表6における配列番号:421は、中性pHおよび25°Cで8.21E03M-1s-1の平均会合速度定数kaおよび4.43E-04s-1の平均解離速度定数kd、計算された55.3nMの平均Kdにてヒト血清アルブミンHSAに結合した表18。アカゲザル血清アルブミンRhSAについて、測定された平均会合速度定数は6.6E03M-1s-1であり、解離速度定数は3.78E-03s-1であり、580nMの計算された平均Kdであった。SABA1.2とマウスまたはラット血清アルブミン間の測定可能な相互作用は、最大1μMで観察することができなかった表18および図27。37°Cで、kaおよびkdは2から5倍増加し、HSAに対する親和性において~2倍増加ならびにRhSAに対する親和性において1/2となった表18。表18HBS-Pバッファー中のアルブミンへのSABA1.2結合に対する速度論的パラメーターさらに、熱量滴定を行い、SABA1およびHSA間の化学量論を決定した。本試験において、His6伸長を含むコア10Fn3であるSABA1.1表6における配列番号:420を使用した。HSA115μMのタンパク質溶液の注射あたり10μlを8.1μMの濃度でSABA1.1を含む熱量測定セルに注射した。該実験は、37°CでPBSバッファーpH7.4中で行った。図28は、SABA1.1が1:1化学量論でHSAに結合することを示す。SABA1.2は低pHでHSAに強く結合するアルブミンの長半減期例えば、HSAのt1/2は19日間であるは、主に、エンドソーム内部に存在する低pH条件下で新生児のFc受容体であるFcRnに結合することによりエンドサイトーシス経路からリサイクルされるという事実による。表19に示されるとおり、SABA1.2は5.5のpHでエンドソームにてHSAに強く結合し、SABA1のt1/2は、HSAに結合すると、また、FcRnリサイクルメカニズムから利益を得ることを示唆した。表19MESバッファー中のpH7.4および5.5でのアルブミン結合動力学の比較SABA1.2はHSAのドメインIおよびIIに結合するが、ドメインIIIに結合しないアルブミン上の結合部位SABA1.2は、組換えHSAフラグメントを使用してN-末端ドメインIまたはIIにマッピングされ、ドメインIIIへの検出可能な結合は有さなかった図29。ドメインIIIが主にFcRnと相互作用するHSAのドメインであるため、SABA1.2がFcRnへのHSA結合に対して競合する可能性は少なく、再び、半減期の延長のためにリサイクルメカニズムを少なくとも利用する可能性を増加させる。実施例5G.SABA1.2のインビボ薬理学的SABA1.2の4週間、単回投与、前毒性試験を、カニクイザルにおいて行い、2つの異なる用量レベルで薬物動態学および免疫原性を評価した。薬物動態学および免疫原性もまた、静脈内および皮下腕投与の両方を含む3週間、単回投与、前毒性試験において評価した。さらに、SABA1.2の薬物動態学を、血漿サンプル中のSABA1.2を検出するために開発された定量ELISAベースのアッセイを使用して、カニクイザルにおける2回別々、単回投与、前毒性試験において評価した。SABA1.2を、1mpkおよび10mpkでIVでサルに投与した。WINNONLIN登録商標ソフトウェアを使用する非区画分析を行って、薬物動態パラメーターを評価した。図30および以下に記載されるパラメーターに示されるとおり、SABA1.2は、濃度-時間曲線下面積AUC評価により決定されるとおり、本試験において用量依存的薬物動態学を示した。10mpkでSABA1.2に対するクリアランスCLは0.15ml/hr/kgであり、ベータ相半減期t1/2は143時間であり、分布容量Vzは30mL/kgであり、全薬物暴露AUCallは5,609,457hrnmol/Lであった表20。1mpkでSABA1.2に対するクリアランスCLは0.4ml/hr/kgであり、半減期t1/2は124時間であり、分布容量Vzは72mL/kgであり、全薬物暴露AUCallは214,636hrnmol/Lであった表20。SABA1.2のSCまたはIV投与後、ベータ相薬物動態学プロフィールは同様であった図31。1mpkでIVでSABA1.2に対するクリアランスCLは0.22ml/hr/kgであり、ベータ相半減期t1/2は125時間であり、分布容量Vzは40mL/kgであり、全薬物暴露AUCallは357,993hrnmol/Lであった表20。1mpkでSCでSABA1.2に対するクリアランスCLは0.32ml/hr/kgであり、ベータ相半減期t1/2は134時間であり、分布容量Vzは62mL/kgであり、全薬物暴露AUCallは251,339hrnmol/Lであった表20。IVと比較してSC相対バイオアベイラビリティFは0.7であった。表20サルにおけるSABA1.2に対する薬物動態パラメーター"