"腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体であって、CD13のリガンドペプチドと、ジョイニングペプチドと、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成された融合蛋白質である、ことを特徴とする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。前記ジョイニングペプチドが1~25個のアミノ酸残基から構成される、ことを特徴とする請求項1に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。環状構造を有し、且つNGR配列を含有するショートペプチドと、ジョイニングペプチドと、前記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成された融合蛋白質である、ことを特徴とする請求項1に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。前記ジョイニングペプチドが1~25個のアミノ酸残基から構成される、ことを特徴とする請求項3に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。前記腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、ポリエチレングリコールと脂肪酸で酸性にして修飾した、または、抗体のFc断片またはアルブミンを加えた組み換えで修飾した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体である、ことを特徴とする請求項1に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコード遺伝子を人工合成または遺伝子クローンによって構成し、一般的な遺伝子操作方法を使用して該コード遺伝子の遺伝子発現及び分離精製を実現する、ことを特徴とする請求項1または3に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体。請求項1または3に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の大腸菌組み換え発現菌株を、35°C~10°Cの低温下で培養及び誘導発現を行う、ことを特徴とする請求項1または3に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の大腸菌における可溶性型発現方法。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分離精製方法において、請求項1または3に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体をイオン交換クロマトグラフィー及び金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製する、ことを特徴とする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分離精製方法。CD13リガンド及びジョイニングペプチドの連続配列をコードするcDNAであって、前記コードが腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体から選ばれたcDNA。請求項6のcNDAを含む遺伝子治療担体。請求項1、請求項3または請求項5に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、腫瘍治療薬剤の調製における応用。請求項1、請求項3または請求項5に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、腫瘍治療薬剤の調製における、従来の腫瘍治療薬剤及び技術との、腫瘍治療における併用。請求項9または請求項10に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体cDNA及びその遺伝子治療担体の、腫瘍治療薬剤の調製における応用。請求項9または請求項10に記載の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体cDNA及びその遺伝子治療担体の、腫瘍治療薬剤の調製における、従来の腫瘍治療薬剤及び技術との、腫瘍治療における併用。以上の報告は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの臨床における重複及び持続的な使用による潜在的な毒性副作用を、医者に大いに危惧させるものである。従って、腫瘍の治療時に、癌以外の組織に対する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの毒性副作用を如何にして防止するかは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドTRIALの、臨床応用面において技術的課題となっている。野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍治療面における欠点を克服するため、本発明の目的は、腫瘍組織ターゲティング能を有する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを発明し、前記誘導リガンドの治療効果を向上し、その毒性副作用を低減するように、前記誘導リガンドを腫瘍組織に標的搬送することで、腫瘍疾患治療に応用することである。非特許文献1によれば、アミノペプチダーゼNAminopeptidaseN,APN/CD13蛋白は、腫瘍新生血管内皮細胞のみに発現する蛋白質であり、静止状態における正常血管内皮細胞はわずかにCD13を発現するだけである。また、非特許文献2乃至非特許文献4によれば、最近、アミノペプチダーゼN/CD13も腫瘍の転移及び予後と関連することが発見された。本発明は以下の技術的手段により、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの標的搬送を実現し、その抗腫瘍治療効果を向上し、その毒性副作用を低減する目的を達成して実現するものである。本発明の一態様では、腫瘍組織ターゲティングを有する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体であって、配列表における配列1のアミノ酸残基配列を有する蛋白質であり、遺伝子操作方法によって、CD13のリガンド、ジョイニングペプチド、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体融合蛋白質を構築する。即ち、一般的な遺伝子操作方法を使用して、人工合成またはクローンによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコード遺伝子を構築し、可溶性型に組み換え発現し、及び容易に分離精製する。前記CD13リガンドはNGR配列を含有するポリペプチドであってもよく、好ましくは、環状構造を有し、NGR配列を含有するポリペプチド、例えばショートペプチドCNGRCである。前記CD13のリガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体との間に、柔軟性構造を有し、側鎖アミノ酸を含まないショートペプチドを添加してもよい。なお、ショートペプチドは、1~25個のアミノ酸残基からなり、主にグリシン、アラニン、セリンなどの、側鎖を含まないアミノ酸によって構成される。前記CD13のリガンドを、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのN端に配置する場合、発現時にN端アミノ酸の分解が発生してCD13リガンドの機能に影響することを防止するために、CD13のリガンドの前に側鎖を含まないアミノ酸、主にアラニンまたはグリシンの配列を増加する。前記CD13の合成リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍治療の薬剤調製に良好に応用できる。前記腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによって調製した腫瘍治療薬剤は、従来の化学治療、放射線治療、中医薬治療、生物治療などの方法と、腫瘍治療において併用療法することができる。また、本発明の別の態様では、大量の、高純度の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の重合体を、大腸菌において可溶性型に発現し、且つ容易に分離精製する方法を提供する。現在腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは大腸菌における発現の多くが非生物活性の封入体生成物であるが、本発明における腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分子構造及び分子量が野生型の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べより複雑で大きいため、大腸菌において発現する時に、その封入体の形成がより多くなり、精製がより複雑となる。本発明では、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を低温培養及び誘導発現する発現方法を採用することで、発現生成物に封入体が形成することを有効に防止できる。本発明は同時に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンとキレート化する生物機能を有することを利用し、イオン交換クロマトグラフィーと金属アフィニティークロマトグラフィーとを連結することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に精製し、高純度の蛋白質生成物を得、且つ前記高純度生成物は含有率の高い重合体型を有するため、非常に良好な生物活性を有する。なお、前記低温は35°C~10°Cを指す。また、CD13は腫瘍の新生血管内皮細胞にのみ発現するが、他方、静止状態にある正常血管内皮細胞にはわずかにしか発現しない。最近の研究では、CD13蛋白が塩基性線維芽細胞成長因子bFGFの調節によって、1F6悪性黒色腫などの腫瘍細胞表面に選択的に高発現し、且つ腫瘍の悪性浸潤及び転移と密接に関連することを明らかにしている。本発明者達はフローサイトメトリーを使用して、CD13の、様々な種類の細胞における発現レベルを分析した。その結果、ヒト毛細血管内皮細胞がCD13を高レベルで発現し、ヒト子宮頚癌細胞Hela腫瘍細胞もCD13の発現レベルが比較的高く、結腸癌細胞HCT-15は中程度のCD13分子を発現し、結腸癌細胞COLO-205はCD13分子を極微量にまたは発現しないことを表らかにした。前記CD13リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体とによって構成した腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、その腫瘍組織における分布を大幅に向上させ、その腫瘍組織における標的搬送を実現させ、その抗腫瘍効果を大幅に向上させるとともに、同時に、その使用量を顕著に低減することができる。同時に腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のcDNAのコードを公開したが、これによって腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのdDNAを介してコードされるCD13リガンド及びジョイニングペプチドのDNA配列調製を促進することができる。この結果、前記構成の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のcDNAを遺伝子治療に用いることができる。本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、ポリエチレングリコールと脂肪酸で酸性にして修飾する、または、抗体のFc断片またはアルブミンを加えた組み換えで修飾することができ、それによって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の半減期を延長し、薬物動態学的により良好な効果を達成する。従来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体と比べ、本発明は以下の有益な効果を有する。1より良好な腫瘍組織ターゲティング能:従来の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドは、腫瘍組織に対する相対的な選択的作用を、主に腫瘍組織が発現する細胞死受容体4及び受容体5を使用して顕著に実現するが、一方、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、腫瘍組織が発現する細胞死受容体4及び受容体5を使用する以外に、さらに腫瘍組織がCD13を多量に発現する特徴を利用して、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍組織に対する標的搬送をより有効に実現する。2より高効率の抗腫瘍効果:腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍組織における標的投与を実現するため、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は、同様な用量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べた場合、及び、腫瘍細胞表面のインテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-L-TRAIL特許文献1参照と比べた場合、単独使用でも、あるいは、従来の化学治療、放射線治療、中医薬治療、生物治療などの方法との併用でも、ともにより強い抗腫瘍効果を示した。3より低い使用量:腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が、同様な用量の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べてより強い抗腫瘍効果を有するため、使用時に、同程度な抗腫瘍治療効果を奏したい場合、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質の用量を大幅に低減することができる。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質の投与量の低減は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの、腫瘍治療における潜在的な副作用を克服することができ、同時に、腫瘍患者の治療費用を削減でき、高い有効性、低毒性副作用、低コストの腫瘍治療効果を達成する。4発現及び生産の容易さ:腫瘍細胞特異性抗体及びその抗体断片によってターゲティングする腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド融合蛋白質と異なって、本発明は腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをCD13のショートペプチドと融合しても、分子量の増加が大きくないために、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の遺伝子クローンの、発現及び生産により有利であり、生産量がより高い。5可溶性型の発現及び容易な分離精製:現在、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを大腸菌において発現する時に非生物活性の封入体生成物を形成しやすい。一方で、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の分子構造及び分子量は野生型の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べより複雑で大きい。従って、本発明は腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を低温下で培養及び誘導発現する発現方法を開発することにより、発現生成物に封入体が形成することを有効に防止可能とした。本発明は同時に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドが金属イオンをキレート化する生物機能を有することを利用し、金属アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとを連結することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に精製し、高純度の蛋白質生成物を得た。本発明は可溶性型の発現及び容易な分離精製方法を最適化することによって精製した生成物に、含有率の高い重合体型を最終的に得た。それによって、得られた生成物が非常に良好な生物活性を有することを証明した。含有率の高い重合体型の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を生産することは、本発明と同類の研究に対して顕著な相違点となる。本発明によって、高い重合体含有率の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を有効に発現し及び高効率に得る発現方法及び精製プロセスを提供できる。6CD13リガンドのN端に側鎖を含まない1個のアミノ酸を結合することで、発現時にN端アミノ酸の分解を抑制し、CD13リガンドの機能に影響することを有効に防止する。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の調製コンピュータ支援構造を使用してシミュレーション及び分子設計を行い、SGIコンピュータワークステーションにおいて、MSI社の分子設計ソフトInsightII、Discoverなどモジュールを使用して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの結晶構造を元に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのN端に対してCD13リガンドショートペプチドを付加して分子モデル構築及び分子設計を行い、ジョイニングペプチドのアミノ酸の長さを確定した。前記分子設計に基づいて、まずジョイニングペプチドが5個のグリシンを選択して設計案とした。その理由は、コンピュータシミュレーションから、前記案のジョイニングペプチドが比較的短いので、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの蛋白質の構造、及びCD13との結合に対して共に大きい影響を与える可能性があったためである。その他の設計案のジョイニングペプチドの多くはCD13リガンドと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの分子表面とがある程度の距離を有するため、この相互作用及び影響が小さくなる。また、ジョイニングペプチドがアラニンまたはグリシン、アラニン-グリシン-グリシン-セリン-セリン-グリシン-グリシン-グリシンであるショートペプチドの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体、及び3回以上重複するグリシン-アラニン-グリシン-グリシン-セリン-セリン-グリシン-グリシン-グリシン3の25個のアミノ酸残基の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の発現を試してみたが、共に類似な結果を得た。以上の結果から、コンピュータ分子設計の正確性が証明された。更に、上記結果を比較した場合、5個のシステインをもつ腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の発現レベルが最も高く100mg/L、その他の変異体の発現レベルがやや低いが、共に約50-100mg/Lのレベルであった。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体のコンピュータ支援分子設計において、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体に対して構造シミュレーション及び分子設計を行ったことを利用して、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド結晶構造に基づき、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとCD13リガンドとの間のジョイニングペプチドのアミノ酸配列及び長さに対して分子モデル構築及び分子設計を行い、ジョイニングペプチドのアミノ酸長さを確定した。その結果、コンピュータ分子設計時に計算された1~25個のアミノ酸ショートペプチド長以内に、ショートペプチドが側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きいアミノ酸残基、例えばグリシン、アラニン、セリンなどから構成されたものであれば、共に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの構造に対していずれの影響もなく、CD13リガンドの機能にも影響しないことを発見した。且つ分子動力学により計算した側鎖を含まず、柔軟性の比較的大きい25個のアミノ酸ショートペプチド長範囲内において、ショートペプチド長がより長いほど、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの構造に対する相互作用がより小さくなり、定性的に言えば、長さが短かすぎれば、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド蛋白質の構造に対してある程度の影響を与える可能性があり、及び、CD13リガンドとCD13との結合に影響を与える可能性もあることが分かった。野生型ヒト腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド遺伝子は、ヒト胎盤から得た伝令RNAを逆転写することによって得た。CNGRCショートペプチドが融合した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体遺伝子のPCRプライマーのヌクレオチドの配列は以下の通りである。プライマー1:5’-GGAATTCCATATGTGCAATGGTCGTTGCGGTGGTGGTGGTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’;プライマー2:5’-ATGGATCCTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’。PCR反応を通じて、コードCNGRCショートペプチドと5個のグリシンとから構成したジョイニングペプチドの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAIL遺伝子を得た。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAIL遺伝子をNovagen社のpET-23a発現担体にクローニングした。得た組み換え発現プラスミドはE.coliBL21DE3において発現した。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILの可溶性型発現を行うため、発現条件を以下の通りにした。一夜成長させた組み換え発現菌をLB培地に100倍希釈し、37°Cで2.5時間培養し、その後さらに24°Cで1~2時間培養し、24°C下で0.5mMまでIPTGを加えて、その後細菌を24°C下で一夜誘導発現した。細菌を遠心した後、分裂分解液50mMリン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、1mMジチオトレイトール、pH7.6に懸濁して超音波粉砕を行った。組み換え腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAIL蛋白質の含有液をSP-sepharoseカチオン性樹脂を通して精製し、300mMNaCl溶出精製物を収集した。溶出蛋白をNi-NTAアガロースゲルQiagen社アフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製し、250mMイミダゾールを用いて溶出を行い、その後SephdexG-25で脱塩した。実験に使用した全ての水は共にエンドトキシンを除去した超精製水であり、蛋白質の定量を南京建成生物工程研究所により提供されたBCA蛋白質測定試薬キットを使用して測定した。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白質の純度及び分子量はSDS-PAGE電気泳動銀染色法によって測定し、分子量は質量スペクトル分析によって確認したAppliedBiosystems社、4700ProteomicsAnalyzer。インテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-LTRAILの構築、発現及び精製は特許文献1に従って行った。従来の報告によれば、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が大腸菌において発現するときに、常に非生物活性の封入体生成物の形で存在する。本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は4個のシステイン即ち2対のジスルフィド結合を形成したが増加しており、該変異体が大腸菌において発現するときに野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと比べ非生物活性の封入体生成物をより形成しやすくなるので、精製もより難しくなる。しかし、本発明は発現条件及び分離精製過程を最適化することによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体を、可溶性型で発現させることに成功し、且つカチオン性樹脂層析及びニッケル金属アフィニティークロマトグラフィーによって、生物活性を有し、純度の高い腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体蛋白質を得ることができた。収量は100mg/Lであった。変性還元条件下の15ポリアクリルアミゲル電気泳動銀染色法の分析図1の1A及び質量スペクトルで配列を測定した分析結果は共に発現生成物が間違いないことを証明した。且つ本発明の発現条件及び精製プロセス下で、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体は共に非常に高い含有率の重合体図1の1Bを有したが、これはその他の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの発現及び精製における同種の操作ではほとんど見られなかった。腫瘍壊死因子スーパーファミリー蛋白は共に単量体、二量体及び三量体を形成する特性を有し、且つそれらの生物学活性は二量体及び三量体の形に依存し、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドも例外ではない。そこで、CNGRC分域構造を融合した後、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が、重合体を形成する能力に影響するか否かを測定するため、非変性非還元ポリアクリルアミゲル電気泳動の分析を行った。その結果、前記組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白が重合体を形成する能力を有することを示した。以上から、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと腫瘍ターゲティング変異体蛋白、及びRGD-TRAILが共に分子量が約20,000、40,000、60,000ダルトンである3つのバンドを有し、この3つの分子量のバンドは単量体、二量体及び三量体図1の1Bと対応することが示された。これらの結果から、本発明が発現、精製する腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体蛋白が確かに正確な3次元構造を有し、従来報告された大腸菌に発現したTRAILと比べより良好な生物活性を有することが証明された。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体と内皮細胞との結合実験腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体NGRL-TRAIL、及びRGD-L-TRAIL変異体をそれぞれフルオレセインSigma社で標識を行い、標識した蛋白はSephadex-G25分子篩によって遊離フルオレセインを除去した。ヒト皮膚微小血管細胞はトリプシンによって消化された後、2のウシ胎児血清を含有する氷冷リン酸緩衝液を用いて2回洗い、その後改めて懸濁し、1μgの標識蛋白を加え、4°C下で1時間育成した。実験はフルオレセインで標識したウシ血清アルブミンを対照とした。染色した細胞を3回洗浄した後フローサイトメトリーBectonDickinson社を使用して結合能力を分析した。さらに、フルオレセイン標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体NGR-L-TRAIL、及びインテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-L-TRAIL特許文献1参照の、ヒト皮膚微小血管内皮細胞と直接結合する能力を評価した。フローサイトメトリーの測定結果は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILの、ヒト皮膚微小血管内皮細胞と結合する能力が、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びインテグリンαVβ3、αVβ5受容体にターゲティングする変異体RGD-L-TRAILよりも遥かに高いことを示した。これらの結果から、CD13リガンドショートペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体と血管内皮細胞との特異的結合能力を顕著に向上し、該腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILと血管内皮細胞との特異的結合能力が、インテグリンαVβ3、αVβ5リガンドショートペプチドが向上した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体RGD-LTRAILと血管内皮細胞との特異的結合能力よりも大幅に向上したことを明らかにした図2。ヒト微小血管内皮細胞表面での蛋白質の発現は、CD13及びインテグリンαVβ3、αVβ5を有することが別々の研究者らによってそれぞれ発見されたものである。本発明者らは、初めに同一の実験システムにおいてヒト微小血管内皮細胞表面のCD13及びインテグリンαVβ3、αVβ5の存在比を比較し、CD13の発現存在比がインテグリンαVβ3、αVβ5の存在比と比べ顕著に高いことを発見し、それによって、CD13がインテグリンαVβ3、αVβ5と比べて、よりよいヒト微小血管内皮細胞の定方向ターゲット分子であることを発見した。インテグリンαVβ3、αVβ5が国際上最も認められた新生血管のマーカーであり、RDG配列を含有するリガンドは現在すでに腫瘍の前期成長及び腫瘍の早期転移を診断するプローブとして汎用されている。本発明はCD13が、インテグリンαVβ3、αVβ5よりも優れた腫瘍ターゲット分子であり、CD13を腫瘍ターゲティングとすると、インテグリンαVβ3、αVβ5より遥かに優れた効果を得ることができることを国際的に初めて証明した。これは当業の科学者を驚かせる結果であり、予想外の発明成果である。よって、上記発見は本発明の最も重要な新規知見の1つであるといえる。CD13及びインテグリンαVβ3、αVβ5の発現分析細胞表面のCD13またはインテグリンの発現存在度は間接標識法でフローサイトメトリーを用いて分析測定した。消化後の細胞は2ウシ胎児血清を含有する氷冷リン酸緩衝液で2回洗浄し、細胞を改めて懸濁した後氷上Anti-CD13モノクロナル抗体eBioscience社、Anti-αVβ3インテグリン抗体MAB23C6eBioscience社、またはAnti-αVβ5インテグリン抗体MAB1961ChemiconInternational社で1時間抗体コーティングし、陰性対照として、精製同型ラット免疫グロブリンGeBioscience社を採用した。1次抗体コーティング細胞を2回洗浄した後、緑色フルオレセイン結合のヒツジ抗ラット免疫グロブリンG1γCaltagLaboratories社を加えて、30分間2次抗体遮光標識した。その後、3回洗浄し、さらに4ホルマリンを含有するリン酸緩衝液で固定し、最後にフローサイトメトリーにおいてCD13またはインテグリンαVβ3、αVβ5発現の存在比を測定分析した。なお、全ての染色実験は3回繰り返した。CNGRCは、2対のジスルフィド結合を形成でき、環状構造を有し、NGR配列を含有するCD13のリガンドであるので、良好なCD13への親和性及び選択性を有する。本発明ではCD13に対するターゲット設計を行なうので、まず内皮細胞及び腫瘍細胞表面のCD13発現状況を分析した。フローサイトメトリー分析結果は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞表面は高レベルのCD13を発現し、ヒト皮膚微小血管内皮細胞表面のCD13発現レベルはインテグリンαVβ3、αVβ5の発現レベルよりも高いことを示した。また、注目すべき点として、複数種の腫瘍細胞も、様々なレベルでCD13を発現し、HDMVEC及びHelaは高レベルのCD13を発現し、結腸癌HCT-15は中等レベルの存在比のCD13を発現し、結腸癌COLO-205のCD13発現量は極微弱か、または発現しなかった。腫瘍新生血管及び腫瘍細胞表面はCD13、及びインテグリンαVβ3、αVβ5を発現するが、CD13とインテグリンαVβ3、αVβ5と比較して、どちらが腫瘍ターゲティングのよりよいターゲットであるかは、誰も詳細に研究及び対比してこなかった。本発明は、腫瘍新生血管及び腫瘍細胞表面CD13、及びインテグリンαVβ3、αVβ5の発現レベルを丁寧に比較し、且つ細胞及び動物モデルレベルにおいて、それぞれCD13にターゲティングするTRAIL変異体NGR-L-TRAIL及びインテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-L-TRAILの抗腫瘍活性を評価したところ、驚くべき、且つ予想と反する結果を得た。本発明はCOLO-205表面のCD13及びインテグリンαVβ3、αVβ5の発現状況を比較し、COLO-205表面ではほとんどCD13分子を発現せずに、但し低レベルのインテグリンαVβ3及び高レベルのインテグリンαVβ5を発現することを発見した図3。これを裏付けるデータとして、CD13にターゲティングするTRAIL変異体NGR-L-TRAILの、COLO205細胞のアポトーシス誘導活性がやや増加し図4、一方、インテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-L-TRAILの、COLO-205細胞のアポトーシス誘導活性が10倍も向上したCOLO-205細胞に対して、TRAILの半数致死量が3.5ng/mLで、RGD-L-TRAILの半数致死量が0.37ng/mLである。そのため、COLO-205細胞表面のターゲティング発現レベルからも、NGR-L-TRAIL及びRGD-L-TRAILの、COLO-205細胞半数致死量に対する増加レベルからも、RGD-L-TRAILは共にNGR-L-TRAILより優れていた。この結果より、COLO-205インビボ腫瘍モデルにおいて、RGD-L-TRAILの抗腫瘍効果が、NGR-L-TRAILより顕著に優れているはずであると推考した。しかし、COLO-205インビボ腫瘍モデル実験において、NGR-L-TRAILの抗腫瘍効果は、同用量100μgのRGD-L-TRAILより顕著に優れ、ひいては、1/520μgのNGR-L-TRAILの抗腫瘍効果は、ほぼ5倍の用量100μgのRGD-L-TRAILの抗腫瘍効果と同等であった。前記結果は、抗腫瘍薬剤のインビボ抗腫瘍生物活性というものは、そのインビボ実験活性及び人々の一般的な論理及び理解に基づいて推測及び演繹することが不可能であり、着実な科学実験を通じてステップごとに検証しなければ発見不可能であり、どの様なレベルの実験でも欠かすことができないものであることを、明確に教示した。本発明において、インビトロの複数の実験は共にRGD-L-TRAILの抗腫瘍活性がNGR-L-TRAILより顕著に優れることを示したが、インビボ腫瘍動物モデルの抗腫瘍実験は全く異なる結果を示した。アネキシンAnnexinV及びピリジニウムヨージドPI双染色法による細胞アポトーシスの測定腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体NGRTRAIL、及びRGD-L-TRAIL変異体に処理された細胞をトリプシンで消化した後、培養プレートから吸出し、リン酸緩衝液で2回洗浄し、300g遠心力下で5分間遠心し、上澄み液を除去し、その後100μL結合緩衝液を用いて改めて懸濁し、最終濃度が2μg/mLのAnnexinV-FITCBDPharmgen社を加えて室温で育成し、10分間後400μLの結合緩衝液を補充し、細胞をフロー分析管内に転移し、管ごとに1μgのピリジニウムヨージドSigma社を加えた。細胞を30分以内にフローサイトメトリーで分析した。各々の細胞系は少なくとも3回繰り返して実験した。次に、COLO-205、HCT-15及びHT-29腫瘍細胞を用いてそれぞれ腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-TRAILの、腫瘍細胞アポトーシス誘導活性を評価した図4。腫瘍細胞を一連の濃度分布のTRAIL変異体またはTRAILで誘導処理した後、AnnexinV-FITCとPI双染色の方法を使用して、フローサイトメトリーで測定分析を行った。その結果、腫瘍細胞が異なると、TRAILに対して感受性が異なることが明示された。COLO-205細胞が最も感受性を有し、HCT-15細胞はその次であり、Hela細胞では、比較的感受性がなかった。但し、Hela腫瘍細胞において、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するNGR-L-TRAILの活性は、顕著に向上し、NGR-L-TRAIL対Helaの細胞半数致死量EC50は約18.5ng/mLであり、TRAIL対Helaの細胞半数致死量EC50は、約145ng/mLであったことから、NGRショートペプチドの追加は、Hela細胞対TRAILの感受性を8倍も向上した。COLO-205及びHCT-15腫瘍細胞に対して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するNGR-L-TRAILの活性は、TRAILよりやや高かった。NGR-L-TRAIL及びTRAILが、これらの腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導する程度の差が、腫瘍細胞表面のCD13分子の発現及び存在比と、正に相関した。CD13高発現のHela腫瘍細胞において、NGR-L-TRAILでの、腫瘍細胞アポトーシス誘導活性の顕著な向上は、NGR-L-TRAILにおけるNGR分域構造がTRAIL変異体蛋白を、標的細胞表面に誘導し、細胞表面に多量に分布させたからであろう。それによって、標的細胞表面腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の局所濃度を増加し、変異体分子における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド部分を、TRAIL受容体により容易に、頻繁に及び有効に接近させ、細胞アポトーシス経路を活性化する信号を増強し、それによって、NGR-L-TRAILの活性を増強する原因になったと推考する。且つ、このような細胞アポトーシス活性の増強程度が腫瘍細胞表面CD13発現の存在比によって決まり、存在比が高ければ活性増強程度も高く、その逆も同様となった。例えば、CD13高発現のHela腫瘍細胞において、高いCD13発現量によって、NGR-L-TRAILの活性が8倍も向上した図4。一方、CD13低発現のCOLO-205結腸癌細胞に対しては、NGR-L-TRAILの活性向上は低かった。以上の結果は、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILの活性向上は、CNGRCのターゲティング能によって得られたことをはっきり明示した。カスパーゼ-8及びカスパーゼ-3の酵素活性測定カスパーゼ-8及びカスパーゼ-3の酵素活性は蛍光検出試薬キットOncogene社を使用して測定した。実験はメーカ提供の方法を使用した。蛍光値は酵素標識固相免疫測定装置で測定し、蛍光パラメータは、励起波長400nm、発光波長505nmで行った。腫瘍細胞と異なり、正常なヒト皮膚微小血管内皮細胞、293T腎細胞及び初代の肝細胞を、300ng/mLの腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体により24時間処理しても、顕著な細胞毒性が認められなかった。これによって、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体が、正常細胞と腫瘍細胞とを区分できたため、腫瘍細胞アポトーシスは誘導できたが、正常細胞に対しては比較的安全性が高いことを示した。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティングヒト変異体により処理した後、Hela細胞におけるカスパーゼ-8及びカスパーゼ-3の活性を蛍光法で測定した。この結果、NGR-L-TRAILにおけるNGR分域構造が、TRAIL変異体蛋白を標的細胞の表面に誘導できて、細胞表面に多量に分布させ、それによって、標的細胞表面腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の局所濃度を高め、変異体分子における腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド部分を、TRAIL受容体により容易に、頻繁に及び有効に接近させ、細胞アポトーシス経路を活性化する信号を増強したことを明らかにした。更に、FADD-/-及びカスパーゼ-8-/-突然変異のJurkat細胞において、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体は、共に細胞アポトーシスを誘導することが検出できなかった。以上の実験結果から、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体が、同様に、共に受容体-FADDカスパーゼ-8ルートを経由して細胞アポトーシスを誘導する作用を奏することが明らかになった。腫瘍動物モデルの抗腫瘍治療効果実験5~6週齢のメスヌードマウスは上海実験動物センターから購入した。ヌードマウスに対してまず尾静脈へ100μgの、自然殺傷性細胞を阻害する特異抗体-精製AsialoGM-1抗体和光純薬工業株式会社、日本を静注した。24時間後、ヌードマウス背部の右上側に10万個のCOLO-205、HT-15またはHT-29結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍サイズが70mm3に達した時点で、ランダムに群を分け、治療を開始した。組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドとその腫瘍ターゲティング変異体NGR-TRAIL、及びRGD-L-TRAIL変異体蛋白を、腹腔を経由して投与し、1日1回投与で、連続で10~14日間投与した。水溶性のカンプトテシンCPT-1111-ヒドロキシ-カンプトテシン、商品名:カンプト、Pharmacia/Upjohn社製品は週ごとに1回、合計2回投与した。組み換え蛋白及びカンプトテシンは共にリン酸緩衝液によって希釈した。腫瘍サイズをノギスで計測し、次式で求めた。計算式:長×幅2/2、とした。また、胸腺を持っていないヌードマウスにおいて、COLO-205及びHT-15、2種の結腸癌モデルを用いて、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体NGR-L-TRAILの抗腫瘍活性を測定及び比較した。COLO-205及びHT-15結腸癌が共にTRAILに対して感受性があったそのうちCOLO-205が最も感受性があったため、単独のNGR-L-TRAIL対TRAILの治療効果を、この2つのモデルにおいて評価した。実験結果は図4、6に示されるように、NGR-L-TRAILは極めて顕著に腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍増殖抑制効果は野生型TRAIL及びRGD-L-TRAILより顕著に強かった。また、COLO-205モデルにおいて、100μg/日用量のNGR-L-TRAILが、腫瘍の成長を抑制する効果は、100μg/日の野生型TRAILより大幅に強くp<0.01、100μg/d用量のNGR-L-TRAILが、腫瘍の成長を抑制する効果は、100μg/日のRGD-L-TRAILよりも強かったp<0.01。仮に、NGR-L-TRAILの用量を野生型の1/520μg/日まで下げた場合でも、腫瘍の成長を抑制する効果は、野生型TRAIL100μg/日より優れておりp<0.01、要するに、20μg/日用量のNGR-L-TRAILの腫瘍成長抑制効果は、すでに100μg/日用量のRGD-L-TRAILの腫瘍成長抑制効果と近い効果であった図6。HCT-15モデルにおいて、同様な用量の処理下400μg/日で、NGR-L-TRAILは、野生型TRAILより腫瘍抑制効果が良好でありp<0.05、RGD-LTRAILよりも強くp<0.05、NGR-L-TRAIL80μg/日の投与量を、野生型TRAILの1/5までに下げた場合、その腫瘍抑制効果は野生型TRAIL400μg/日に相当した両者の間に有意差はなかった図7。80μg/日投与量のNGR-L-TRAILの腫瘍抑制効果は、すでに400μg/日のRGD-L-TRAILの腫瘍抑制効果と近い効果であった。治療過程において、NGR-LTRAILが、腫瘍の成長を抑制することは用量依存的であった。以上の結果は、CNGRCペプチドをTRAILと融合した後TRAILのインビボ抗腫瘍活性を顕著に向上させ、さらに、NGR-L-TRAILの抗腫瘍効果がRGD-L-TRAILより顕著に強いことを明確に示した。本発明では、さらに腫瘍ターゲティングTRAIL変異体と化学治療薬剤CPT-11とを併用する抗腫瘍効果を検討した。胸腺を持っていないヌードマウスのCOLO-205、HCT-15及びHT-29結腸癌モデルを用いて、NGR-L-TRAILと化学治療薬剤CPT-11との併用後のインビボにおける抗腫瘍効果を評価した。COLO-205、HCT-15がTRAIL感受性型であり、且つCOLO-205が最も感受性が高いが、一方、HT-29は、TRAIL不感受性型である。NGR-L-TRAILまたはTRAILは毎日腹腔内に一回、蛋白質を注射し、合計2週間注射し、CPT-11は2日ごとに尾静脈に1回注射して、合計7回注射した。併用投与群中、TRAILに対して感受性であるCOLO-205腫瘍モデルにおいて、1回、比較的低いCPT-11用量6.25mg/kg/回を選択し、異なる用量のNGR-L-TRAIL30または80μg/日/個、またはTRAIL270μg/日/個または90μg/日/個と併用し、TRAILに対して抵抗性のあるHT-29結腸癌モデルにおいて、比較的高い用量のCPT25mg/kg/回を選択してNGR-L-TRAILまたはTRAIL400μg/日/個と併用した。COLO-205モデルにおいて、30μg/日NGR-L-TRAILと6.25mg/kg/回CPT-11とを併用する群の、腫瘍成長を抑制する効果が、単独の6.25mg/kg/回CPT-11群より大幅に強くp<0.01、単独の30μg/日NGR-L-TRAIL群より強かったp<0.05。つまり、270μg/日TRAILと6.25mg/kg/回CPT-11とを併用する群の効果に相当し、90μg/日TRAILと6.25mg/kg/回CPT-11とを併用する群より優れていたp<0.05図6。また、HCT-15腫瘍モデルにおいて、80μg/日NGR-L-TRAILと6.25mg/kg/回CPT-11とを併用する群において、腫瘍増殖を抑制する効果が、単独の6.25mg/kg/回CPT-11または80μg/日NGR-L-TRAILより強く、且つ400μg/日TRAIL群及び400μg/日TRAILと6.25mg/kg/回CPT-11とを併用する群より良好であった図7。ここで注目するべき点は、400μg/日/個の用量のNGR-L-TRAILCPT-11の併用治療群において、28日目後10匹の投与マウスのうち、8匹のマウスの腫瘍が消滅し、400μg/日/個のTRAILCPT-11の併用治療群において10匹の動物のうち、7匹のマウスの腫瘍が消滅したことである図7b。TRAILが耐性をもつHT-29結腸癌モデルにおいて、NGR-L-TRAILを単独に使用する場合、毎日腹腔内に400μg/個ヌードマウスまで高用量を注射しても、弱い抗腫瘍効果のみしか観察されなかった。他方、NGR-TRAILCPT-11併用で治療した場合、腫瘍成長を顕著に抑制でき、且つTRAILCPT-11の併用より治療効果がより良好であり、且つTRAILCPT-11の併用と比べ治療効果がより良好であった。400μg/日のNGR-L-TRAILと25mg/kg/日のCPT-11との併用群の治療効果が最も良好で、400μg/日のNGR-L-TRAIL群よりも非常に優れておりp<0.01、25mg/kg/日のCPT-11群より強くp<0.05、400μg/日のTRAILと25mg/kg/日のCPT-11との併用群よりも強かったp<0.05。以上をまとめると、前記3種の腫瘍モデルにおいて、化学治療薬剤CPT-11と併用した後、NGR-L-TRAILの抗腫瘍活性が共にNGR-L-TRAILまたはCPT-11を単独に使用する治療効果より強く、且つNGR-L-TRAILとCPT-11との併用効果がTRAILとCPT-11との併用効果より優れていた。TRAIL感受性のCOLO-205及びHCT-15に対して、TRAILに相当する腫瘍増殖抑制効果を達成し、NGR-L-TRAILの使用量がそれぞれTRAILの1/9~1/3及び1/5だけで、TRAIL不感受性のHT-29腫瘍に対して、同様な用量のNGR-L-TRAILとCPT-11との併用群は、抗腫瘍効果がTRAILとCPT-11との併用群より優れていた。この結果、腫瘍ターゲティング変異体蛋白NGR-L-TRAILが化学治療薬剤CPT-11との併用時、抗腫瘍活性が単独使用時より顕著に増強され、且つ腫瘍増殖抑制効果が野生型のTRIALと化学治療薬剤との併用より優れていた。これのみならず、併用によって、さらにTRAILの応用範囲を拡大し、腫瘍ターゲティング変異体蛋白は、TRAILに対して不感受性である腫瘍例えばHT-29結腸癌に対してより有効に増殖を抑制できた。インビボの動物モデル実験から、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILが、野生型腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、及びインテグリンαVβ3、αVβ5にターゲティングするTRAIL変異体RGD-LTRAILと比べて、より優れた治療効果を有することをさらに証明した。これにより、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをCD13にターゲティングする腫瘍ターゲティングペプチドと融合した後、動物腫瘍モデル体内レベルにおいて確かにその抗腫瘍生物活性を向上できることを明らかにした。同様に、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体は単独使用時に薬効を向上できるだけでなく、化学治療薬剤CPT-11と併用する場合にも、顕著な相乗効果を有し、治療効果がより顕著に現れた。腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体をCPT-11と併用して治療を行うことは、各患者の使用量を下げ、潜在的全身性毒性を最低限に抑制できるだけでなく、もともと腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに対して感受性がない腫瘍治療にも適用拡大することが可能となる図8。インビボ動物実験は、腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の治療効果が、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド、ひいては、インテグリンαVβ3、αVβ5ターゲティングTRAIL変異体RGD-L-TRAILの治療効果よりも優れることを十分に証明した。腫瘍組織における組み換え蛋白質の薬剤分布測定組み換え腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドと腫瘍ターゲティング変異体NGR-TRAIL、及びRGD-L-TRAIL変異体をそれぞれ放射性同位体125ヨウ素標識試薬キットPierce社で標識した。標識結果:125I-腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドの比放射能が7.86μCi/μg蛋白、125I-腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の比放射能が7.49μCi/μg蛋白であった。ヌードマウスにCOLO-205結腸癌を接種した後、腫瘍サイズが400~500mm3に到達した後ランダムに群を分け、野生型群と2種の変異体群とに分け、各群に5回の測定時間点を設け、それぞれ5、30、60、120、240分とし、各時間点で3匹の動物を用いた。各担腫瘍ヌードマウスに、100μLの、5μCi含有の標識蛋白質を注射した。各時間点で、マウスの腫瘍を剥離して且つ重量を測り、液体シンチレーション計数器において放射剤量を測定した。腫瘍組織における蛋白質の分布量の標識は、グラムごとの組織の測定放射量と注射放射量との百分率ID/gで表示した。腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、動物モデルにおける抗腫瘍活性の増強は、腫瘍組織にターゲティングして多量に分布させることができることをさらに証明した。同時に、さらにNGR-L-TRAILとRGD-L-TRAILとの体内腫瘍動物モデルにおけるターゲティング能力を比較するため、ヨウ素125同位体で標識した腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILとRGD-L-TRAIL、及び野生型TRAILの、腫瘍組織における分布を測定した。同様な放射量のヨウ素125標識の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその変異体を、それぞれCOLO-205担腫瘍ヌードマウスに注射し、注射後、5、30、60、120及び240分時間点で、マウス腫瘍組織を手術して剥離し且つ重量を測り、それぞれ液体シンチレーション計数器におい同位体量を測定した。この結果、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドTRAILは、CD13のショートペプチドリガンドCNGRC、及びαVβ3、αVβ5インテグリンのショートペプチドリガンドACDCRGDCFCペプチドを融合した後、TRAIL蛋白の、COLO-205腫瘍組織分域にターゲティングして多量に分布させる能力を顕著に増強し、NGR-L-TRAILが腫瘍組織に存在させ及び特異的に分布させ得ることを示した。注射の初期、腫瘍組織における125IRGD-L-TRAILの分布は125I-TRAILの約2倍で、腫瘍組織における125I-NGR-L-TRAILの分布は125I-TRAILの約2.5倍であり、COLO-205腫瘍組織におけるNGR-L-TRAILの分布程度がRGD-L-TRAILと比べ顕著に高かった図9。腫瘍組織に対するNGR-L-TRAIL及びRGD-L-TRAILの親和力が増強され、腫瘍組織における分布が増加され、循環血液中におけるその消失速度を大幅に遅くするため、腫瘍組織における分布時間を延長した結果である。注射後240分時点では、腫瘍組織におけるTRAILの分布は、全個体では測定できなかったが、依然相当多くのRGD-L-TRAILが腫瘍区域に持続的に分布しており図9、且つその時腫瘍組織におけるNGR-L-TRAILの含有量がRGD-L-TRAILの2倍であった。前記結果は、CNGRCペプチドがTRAILと融合した後CNGRCペプチドが腫瘍領域の血管内皮細胞と結合し且つその増殖を抑制し及びアポトーシスを誘導する生物学機能を維持した事実をよく説明していた。そのため、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体の、動物体内腫瘍組織区域における分布の増加と、動物モデルにおいて観察されたその抗腫瘍活性の増強と、の2つ事実は、共に、本発明の腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体NGR-L-TRAILは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドに非常に優れた、変異体RGD-L-TRAILより強い腫瘍ターゲティング能を与え、且つ投与量を下げ、最終的に抗腫瘍効果を向上できることを証明した。CD13リガンドを、現在腫瘍早期診断において汎用されているインテグリンIntegrinのリガンドRGDと比べた場合、ターゲティング能がより優れた腫瘍プローブであることが、本発明によって初めて証明された。体内における、組み換え蛋白質と腫瘍組織との結合腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド及びその腫瘍ターゲティング変異体NGR-L-TRAIL、RGD-L-TRAIL変異体、ウシ血清アルブミンを、緑色フルオレセインによって標識した。標識した蛋白を、ゲル分子篩Sephadex-G25を用い、遊離のフルオレセインを除去した。腫瘍が400~500mm3の大きさに成長した担腫瘍マウスに対して500μgフルオレセインで標識した蛋白を尾静脈へ静注し、静注後30分時点で、マウス腫瘍を手術して剥離し、腫瘍細胞単細胞懸濁液を調製し、生理食塩水で複数回洗浄し、癌細胞を6万個採取してフローサイトメトリー測定を行い、組み換え蛋白質の、腫瘍細胞表面における結合状況を分析した。データ統計は社会科学データパケットソフトウェアを使用して分析した。全ての実験は少なくとも3回繰り返し、細胞アポトーシス及び付着実験の結果は平均値及び標準偏差によって表示し、腫瘍サイズを平均値及び標準偏差で表示した。p<0.05は有意差があり、p<0.01は極めて有意差がある、それぞれ1つの及び2つのでマークした。なお、他器官におけるNGR-L-TRAILの分布がTRAILと類似し、その他の臓器において特異的に分布することはなかった図10a、10b。体内におけるNGR-L-TRAILの代謝は、主に腎臓を経由して体外に排出された図10b。そのため、動物体内腫瘍組織区域分布の増加及び動物モデルにおいて観察された抗腫瘍活性の増強は、設計した分子におけるNGR-L-TRAILがRGD-TRAILと比べより優れており、TRAIL蛋白により優れたターゲティング能を与え、最終的に抗腫瘍効果を向上できることを十分に証明した。"