"リンカーを介して抗体またはその抗原結合部の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物。リンカーが、配列番号1の番号付けによるアミノ酸位置79、125、または129における連結残基の側鎖を通じてFGF21分子に共有結合している、請求項1に記載の組成物。残基129がシステインであり、リンカーがシステイン129のチオール基に共有結合している、請求項2に記載の組成物。リンカーが式X-Y-Zを含み、式中、Xは、C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択される任意の原子を含む生物学的に適合性の接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含んでいてもよく、リンカーが直鎖状である場合は連結残基に共有結合により連結しており、Yは、少なくとも1つの環状構造を含む、存在してもよい認識基であり、Zは、抗体の結合部位におけるアミノ酸側鎖への共有結合性連結を含む結合部分である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。Yが、置換されていてもよい構造:を有し、式中、a、b、c、d、およびeは、独立して、炭素または窒素であり、fは、炭素、窒素、酸素、または硫黄である、請求項4に記載の組成物。Yがフェニルである、請求項5に記載の組成物。Zが、抗体に共有結合するとき、式を有し、q=1または2である、請求項4から6のいずれか一項に記載の組成物。q=2である、請求項7に記載の組成物。Xが、3つの成分、すなわち、Xp-Xs-Xyを含む基であり、式中、Xpは、FGF21タンパク質の連結残基の側鎖と結合できるように特に適合された基であり、Xsは、X基のスペーサー領域であり、Xyは、Y基に結合するように適合された基である、請求項4から8のいずれか一項に記載の組成物。Xyが、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジン結合から選択される、請求項9に記載の組成物。Xyが式:を有する、請求項10に記載の組成物。Xpが式:を含む、請求項4から11のいずれか一項に記載の組成物。Xsが、からなる群から選択され、式中、n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、mは、存在するか、または存在しない、請求項4から12のいずれか一項に記載の組成物。Xsが式:を含む、請求項13に記載の組成物。式:を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、S-FGF21は、連結残基のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、n=1、または2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、mは、存在するか、または存在しない、請求項14に記載の組成物。式:を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、S-FGF21は、連結残基のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、n=1、または2、3、4、5、6、7、8、9、または10である、請求項13または14に記載の組成物。n=1、2、3、または4である、請求項15または16に記載の組成物。式:を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位で連結されており、S-FGF21は、連結残基のチオールを持つ側鎖で連結されている、請求項17に記載の組成物。リンカーが、Kabat番号付けによる抗体の重鎖のリシン93のε-アミノ基に共有結合によりコンジュゲートされている、前記請求項のいずれかに記載の組成物。抗体が、h38c2もしくはm38C2に由来するVHドメインおよびVLドメインを含む全長抗体、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、dsFv、scFv、VH、VL、ダイアボディ、ミニボディ、またはh38c2もしくはm38C2に由来するVHドメインおよびVLドメイン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群から選択される定常ドメインを含む全長抗体であり、h38C2IgG1であってもよい、前記請求項のいずれかに記載の組成物。抗体がアルドラーゼ抗体である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。アルドラーゼ抗体が配列番号27を含むVL領域を含む、請求項21に記載の組成物。アルドラーゼ抗体が配列番号28を含むVH領域を含む、請求項22に記載の組成物。アルドラーゼ抗体が配列番号25を含む軽鎖を含む、請求項23に記載の組成物。アルドラーゼ抗体が配列番号26を含む重鎖を含む、請求項24に記載の組成物。FGF21分子が、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、および配列番号16からなる群から選択される配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。FGF21分子が配列番号3の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。FGF21分子が配列番号10の配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の組成物。式を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号25および配列番号26を含み、S-FGF21は、配列番号10のCys129のチオールを持つ側鎖である、請求項28に記載の組成物。式を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号25および配列番号26を含み、S-FGF21は、配列番号7のCys125のチオールを持つ側鎖である、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物。式を含み、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号25および配列番号26を含み、S-FGF21は、配列番号12のCys79のチオールを持つ側鎖である、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物。配列番号1の番号付けによる残基番号79、125、または129に位置する連結残基において、半減期延長部分に共有結合により接続されたFGF21分子を含む組成物。配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選択される組成物。リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体が、以下の特性、すなわち、aマウスモデルにおいて、少なくとも約30時間のSC注射後の血漿T1/2、bGlut1Taqmanアッセイにおいて、約4nM未満の効力のうちの少なくとも1つを有し、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体が、式:を有することを特徴とし、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号25および配列番号26を含み、S-FGF21は、配列番号7のCys125または配列番号10のCys129のいずれかのチオールを持つ側鎖である、組成物。リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体が、以下の特性、すなわち、aマウスモデルにおいて、少なくとも約33時間のSC注射後の血漿T1/2、bラットモデルにおいて、少なくとも約35時間のSC注射後の血漿T1/2、c霊長類モデルにおいて、少なくとも約45時間のSC注射後の血漿T1/2、dGlut1Taqmanアッセイにおいて、約3nM未満の効力のうちの少なくとも1つを有し、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体が、式:を有することを特徴とし、式中、抗体は、結合部位で連結されており、配列番号25および配列番号26を含み、S-FGF21は、配列番号10のCys129のチオールを持つ側鎖である、組成物。薬学的に許容できる担体と組み合わせて、治療有効量の前記請求項のいずれかに記載の組成物を含む医薬組成物。糖尿病、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、HDLレベル、または非エステル化遊離脂肪酸もしくはアディプシンのレベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはC反応性タンパク質のレベルを低減する方法であって、治療有効量の請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物または請求項36に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、HDLレベル、または非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはC反応性タンパク質のレベルを低減するための薬剤の調製における、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物または請求項36に記載の医薬組成物の使用。しかし、タンパク質コンジュゲートを有用な、費用効果的な医薬品に発展させることは、重要で多くの場合競合するいくつかの課題を提起する。インビボ効力、インビボ半減期、インビトロ貯蔵の安定性、ならびにコンジュゲーションの効率および特異性を含めた製造の容易さおよび効率の間でバランスを取らなければならない。一般に、コンジュゲーションプロセスは、対象とするタンパク質の所望の生物学的作用を排除しない、または著しく低減しないことが不可避である。機能に要求されるタンパク質間相互作用は、タンパク質の複数の領域が協調して作用することを必要とする場合があり、コンジュゲートが近傍に存在する状態でこれらのいずれかが混乱すると、活性部位複数可に支障をきたし、活性部位の機能を低減するように三次元構造を十分に変化させる場合がある。コンジュゲーションがN’末端またはC’末端を通じたものでない限り、連結を促進するための内部突然変異が必要となり得る。これらの突然変異は、タンパク質の構造および機能に対して予測不可能な効果を有する可能性がある。したがって、代替のFGF21に基づく治療剤の必要性が依然としてある。本明細書におけるいずれの技術への参照も、参照された技術が共通の一般的な知見の一部を形成するいずれの形態または示唆も承認するものではなく、こうした承認として解釈されるべきでない。本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合している、組成物に関する。連結残基は、システインまたはリシンとすることができる。連結残基は、配列番号1の番号付けによるアミノ酸残基番号56、59、69、79、86、122、125、および129からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、配列番号1の番号付けによるアミノ酸残基番号56、59、86、および122からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、配列番号1の番号付けによる残基79、125、および129からなる群から選択される位置に位置し得る。いくつかの態様では、本発明は、配列番号1の番号付けによる残基番号56、59、69、79、86、122、125および/または129に位置する連結残基において、少なくとも1つの半減期延長部分half-life-increasingmoietyに共有結合により接続されたFGF21分子を含む組成物を提供する。いくつかの態様では、FGF21分子は、1つの半減期延長部分に共有結合により接続されている。いくつかの態様では、連結残基は、残基番号79、125、および129からなる群から選択される。用語半減期延長部分は、FGF21分子に接続される場合、FGF21分子の循環半減期を延長し、かつ/またはFGF21分子の腎クリアランスを阻害もしくは低減する任意の分子を指す。半減期延長部分の例として、PEG、mPEG、ホスホリルコリン含有ポリマー、Fcドメイン、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、dsFv、scFv、VH、VL、ダイアボディdiabody、ミニボディminibody、抗体、触媒抗体以下で論じられる、タンパク質アルブミンなど、および当技術分野で公知である他の巨大分子が挙げられる。連結残基の側鎖は、チオール基を含むことができる。連結残基は、システインとすることができる。FGF21分子は、配列番号3を含み得る。FGF21分子は、配列番号4を含み得る。FGF21分子は、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選択される配列を含み得る。連結残基は、配列番号1の番号付けによる125位に位置し得る。FGF21分子は、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、FGF21配列は、配列番号7である。連結残基は、配列番号1の番号付けによる129位に位置し得る。FGF21分子は、配列番号3、配列番号4、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、FGF21配列は、配列番号10である。連結残基は、配列番号1の番号付けによる79位に位置し得る。FGF21分子は、配列番号3、配列番号4、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、FGF21配列は、配列番号13である。いくつかの実施形態では、連結残基は、配列番号1の番号付けによる1、2、56、59、69、および122からなる群から選択される位置に位置し得る。いくつかの実施形態では、連結残基は、配列番号1の番号付けによる1、2、56、59、および122からなる群から選択される位置に位置し得る。連結残基は、リシンとすることができる。FGF21分子は、配列番号17を含み得る。FGF21分子は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、および配列番号23からなる群から選択される配列を含み得る。ある特定の適当なリンカーは、US2009098130に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。特に、そこで具体的かつ一般的に記載される、リンカーを記述する一般式、特定のリンカー構造、リンカーの合成、ならびにX基、Y基、およびZ基の様々な要素の組合せに関係するUS2009098130の態様は、本明細書に含まれている。リンカーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、1つまたは複数の炭素環基または複素環基を含んでもよい。リンカー長は、直鎖状原子の数に関してとらえることができ、芳香環などの環状部分は、環の周囲の最短経路を採用して数えられる。いくつかの実施形態では、リンカーは、5~15原子、他の実施形態では、15~30原子、さらに他の実施形態では、30~50原子、さらに他の実施形態では、50~100原子、およびさらに他の実施形態では、100~200原子の間の直鎖状ストレッチを有する。他のリンカーの考慮事項には、得られる化合物の物理的または薬物動態学的性質、例えば、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性より安定またはより不安定、および計画された分解、剛性、柔軟性、免疫原性、および抗体結合の調節、ミセルまたはリポソーム中に組み込まれる能力などに対する効果が含まれる。本発明のいくつかの態様では、化合物は、連結残基の側鎖に共有結合により連結されたリンカーを含む。リンカーは、式:X-Y-Zを含むことができ、式中、Xは、C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br、およびIからなる群から選択される任意の原子を含む生物学的に適合性の接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含んでいてもよく、リンカーが直鎖状である場合は連結残基に共有結合により連結しており、Yは、少なくとも1つの環状構造を含む、存在してもよい認識基であり、Zは、抗体の結合部位におけるアミノ酸側鎖への共有結合性連結を含む結合部分である。存在する場合、Yは、置換されていてもよい構造:を有することができ、式中、a、b、c、d、およびeは、独立して、炭素または窒素であり、fは、炭素、窒素、酸素、または硫黄であり、Yは、十分な価数の任意の2つの環位置で、独立してXおよびZに結合しており、a、b、c、d、e、またはfのうちの4つ以下が同時に窒素であり、好ましくは、環状構造中のa、b、c、d、およびeは、それぞれ炭素である。いくつかの態様では、Yは、フェニルとすることができる。いずれの理論によっても束縛されることを望まないが、Y基は、Z基が反応性アミノ酸側鎖と反応することができるように、反応基を抗体結合部位中に配置するのを補助することができると考えられる。リンカーは、抗体、タンパク質、またはこれらの断片などの巨大分子との結合を共有結合または非共有結合により形成することができる反応基を含有するように設計することができる。反応基は、特定の結合部位中の反応性残基とともに使用するために選ばれる。例えば、アルドラーゼ抗体によって修飾するための化学部分は、ケトン、ジケトン、βラクタム、活性エステルハロケトン、ラクトン、アンヒドリド、マレイミド、α-ハロアセトアミド、シクロヘキシルジケトン、エポキシド、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン例えば、ケタール、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどであってもよい。本発明のペプチドをリンカーと連結する本発明の実施形態では、Zは反応基である。いくつかの実施形態では、Zは、抗体の結合部位中の残基の側鎖とコンジュゲートする前に、アジチジノンazitidinone、ジケトン、アシルβ-ラクタム、活性エステル、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン基、アルデヒド、マレイミド、活性化アルケン、活性化アルキン、または一般に、求核置換もしくは求電子置換に感受性の脱離基を含む分子を形成するように配列された1つまたは複数のC=O基を含む。他の基として、ラクトン、アンヒドリド、α-ハロアセトアミド、イミン、ヒドラジド、またはエポキシドを挙げることができる。抗体の結合部位中の反応性求核基例えば、リシン側鎖またはシステイン側鎖に共有結合により結合することができる例示的なリンカーの求電子性反応基として、アシルβ-ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスフェート、ホスホネート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン例えば、ケタール、ラクタム、スルホネートなど、マスクされたC=O基、例えば、イミン、ケタール、アセタールなど、および任意の他の公知の求電子性基が挙げられる。ある特定の実施形態では、反応基は、アシルβ-ラクタム、単純ジケトン、スクシンイミド活性エステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、またはアルデヒドを形成するように配置された1つまたは複数のC=O基を含む。Zは、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルアルキルとすることができ、ここで、少なくとも1つの置換基は、1,3-ジケトン部分、アシルβ-ラクタム、活性エステル、α-ハロケトン、アルデヒド、マレイミド、ラクトン、アンヒドリド、α-ハロアセトアミド、アミン、ヒドラジド、またはエポキシドである。Z基は、本発明のペプチドに半減期の延長をもたらし得る巨大分子骨格に共有結合により連結することができる。Z基は、存在する場合、抗体の結合部位に共有結合により連結することができる。いくつかの態様では、コンジュゲートする前に例えば、抗体の結合部位と、Zは、構造:を有し、式中、q=0~5である。qは1または2であってもよい。qは1であってもよい。他の態様では、qは2であってもよい。いくつかの態様では、抗体の結合部位とコンジュゲートした後に、Zは、構造:を有し、式中、q=0~5であり、抗体-N-は、抗体の結合部位中の側鎖への共有結合である。qは1または2であってもよい。qは1であってもよい。他の態様では、qは2であってもよい。Xは、3つの成分、すなわち、Xp-Xs-Xyを含む基とすることができ、式中、Xpは、FGF21タンパク質の連結残基の側鎖と結合できるように特に適合された基であり、Xsは、X基のスペーサー領域であり、Xyは、Y基に結合するように適合された基である。いくつかの態様では、Xyは、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジン結合から選択される。Xyは、Y基に隣接する2原子以内で水素分子をもたらすように選択することができる。理論によって束縛されることを望まないが、H原子は、特に、h38C2などの触媒抗体の結合溝の疎水性ポケットに関して、H結合相互作用を通じた疎水性ポケットのY基の認識を補助することができると考えられる。したがって、アミド結合は、例えば、NH基がY基に直接結合され、水素結合のためにNH基のHを提供するように配向することができる。あるいは、アミドのC=O基は、Y基に結合し、NH基のHが、Y基に最大2原子で隣接するが、H結合に依然として利用可能である場合がある。いくつかの実施形態では、Xyは存在しない。いくつかの実施形態では、Xy基は、式:を有する。いくつかの態様では、Xsは、Xsが過度に反応性の基を提供しないように選択される。Xsは、2~15原子の間のX基の全長をもたらすように選択することができる。Xsは、X基の全長が、2~10原子の間であるように選択することができる。Xsは、X基の全長が、4~8原子であるように選択することができる。Xsは、X基の全長が、5原子であるように選択することができる。Xsは、X基の全長が、6原子であるように選択することができる。いくつかの態様では、Xsは、以下の式のうちの1つを含むことができ:式中、n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、mは、存在するか、または存在せず、nは、1、2、3、4、5、または6であってもよく、nは、1、2、3、または4であってもよく、nは、1であってもよく、nは、2であってもよく、nは、3であってもよく、nは、4であってもよい。いくつかの態様では、Xsは、以下の式のうちの1つを含む:Xpは、理想的には、FGF21タンパク質の連結残基への特定の方向性の共有結合性連結ストラテジーを可能にするように選択される。例えば、連結残基が求核基を含む場合、Xpは、求電子基とすることができ、逆の場合も同様である。例えば、連結残基の側鎖がアミン基、例えば、K、H、Y、オルニチン、Dap、またはDabなどを含む場合、Xpは、COOH、または他の同様に反応性の求電子体とすることができる。連結残基がDまたはEである場合、Xpは、アミン基などの求核基を含むことができる。これらのストラテジーのいずれも、アミド結合形成ストラテジーによって、Xp基と連結残基との間に共有結合を形成することを可能にする。連結基がアミン基である場合、Xpは、式:を含むことができる。連結残基が、C、Cの同族体、または他のチオール基含有残基である場合、Xpは、マレイミド基または同様のものを含むことができ、チオール-マレイミド付加反応ストラテジーを可能にすることによって、Xp基を連結残基に共有結合により連結する。いくつかの態様では、Xpは、チオール基を含むこともでき、連結残基とXp基の間にジスルフィド架橋が形成されるのを可能にする。いくつかの態様では、Xpは、マレイミド:とすることができ、ここで、矢印は、FGF21連結残基への結合箇所を示し、波線は、リンカーのY基への結合を表す。FGF21連結残基がシステイン残基、または他のチオールを持つ側鎖である場合、コンジュゲーションの機構は、以下の通りとなり得る:いくつかの態様では、Xp基は、置換マレイミド:を含む。いくつかの態様では、コンジュゲーションの前後のXY成分は、以下から選択することができる:成分XY-1、XY-2、XY-3、およびXY-4は、FGF21分子上のチオール基を持つ側鎖にコンジュゲートする実施形態において特に有用である。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-1L1とすることができる:L1が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L1複合体は、式:を含むことができる。L1がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L1-FGF21複合体は、式:を含むことができる。L1が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L1-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-2L2とすることができる:L2が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L2複合体は、式:を含むことができる。L2がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L2-FGF21複合体は、以下の式のうちの1つ:を含むことができる。L2が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L2-FGF21複合体は、以下の式のうちの1つ:を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-3L3とすることができる:L3が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L3複合体は、式:を含むことができる。L3がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L3-FGF21複合体は、以下の式のうちの1つ:を含むことができる。L3が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L3-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-4L4とすることができる:抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L4複合体は、式:を含むことができる。FGF21分子にコンジュゲートされる場合、L4-FGF21複合体は、式:を含むことができる。L4が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L4-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-5L5とすることができる:L5が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L5複合体は、式:を含むことができる。L5がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L5-FGF21複合体は、式:を含むことができる。L5が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L5-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは、リンカー-6L6とすることができる。L6が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L6複合体は、式:を含むことができる。L6がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L6-FGF21複合体は、L5-FGF21についての式と同じ式を含み得る。同様に、L6が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L6-FGF21複合体は、Ab-L5-FGF21についての式と同じ式を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-7L7とすることができる:抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L7複合体は、式:を含むことができる。FGF21分子にコンジュゲートされる場合、L7-FGF21複合体は、式:を含むことができる。抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L7-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、リンカー-8L8とすることができる:L8が抗体にコンジュゲートされる場合、抗体-L8複合体は、式:を含むことができる。L8がFGF21分子にコンジュゲートされる場合、L8-FGF21複合体は、式:を含むことができる。L8が抗体およびFGF21分子にコンジュゲートされる場合、抗体-L8-FGF21複合体は、式:を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ab-リンカー-FGF21コンジュゲートは、式:のものとすることができ、式中、抗体結合部位は、リンカーに共有結合により連結されており、S-FGF21は、FGF21分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、n=1、または2、または3、または4、5、6、7、8、9、または10であり、nは、1、2、3、4、5、または6であってもよく、nは、1であってもよく、nは、2であってもよく、nは、3であってもよく、nは、4であってもよく、mは、任意選択である。mは、存在しなくてもよい。mは存在してもよい。いくつかの実施形態では、Ab-リンカー-FGF21コンジュゲートは、式:のものとすることができ、式中、抗体結合部位は、リンカーに共有結合により連結されており、S-FGF21は、FGF21分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結であり、n=1、または2、または3、または4、5、6、7、8、9、または10であり、nは、1、2、3、4、5、または6であってもよく、nは、1であってもよく、nは、2であってもよく、nは、3であってもよく、nは、4であってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、式:を含み、式中、抗体は、抗体の結合部位への共有結合性連結であり、S-FGF21は、FGF21分子上のチオールを持つ側鎖への共有結合性連結である。いくつかの実施形態では、FGF21分子は、配列番号10を含む。いくつかの実施形態では、FGF21分子は、配列番号7を含む。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されるリンカーおよびリンカー成分、特に、それだけに限らないが、本明細書に記載されるX基を対象とする。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されるリンカーまたはリンカー基に共有結合によりコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合部を含む組成物を対象とする。いくつかの態様では、リンカーまたはリンカー基は、さらにペプチドまたはタンパク質に直接または間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーおよび抗体リンカーコンジュゲートの有用性は、FGF21分子を用いた用途に限定されず、前記Ab-リンカーコンジュゲートは、他のペプチド、タンパク質、および治療剤、およびターゲティング剤とコンジュゲートすることができることが明らかになるであろう。これらの目的のために、S-FGF21およびNH-FGF21を表す、本明細書に記載されるのと同じ構造は、他のタンパク質、ペプチド、および治療剤、および標的化分子に当てはまり、表されている構造のFGF21という用語は、前記タンパク質、ペプチド、または分子に置き換えられることを理解することができる。いくつかの態様では、本発明は、式:のリンカーを提供し、式中、n=1、または2、または3、または4、5、6、7、8、9、または10であり、nは、1、2、3、4、5、または6であってもよく、nは、1であってもよく、nは、2であってもよく、nは、3であってもよく、nは、4であってもよい。mは、存在しなくてもよい。mは、存在してもよい。いくつかの態様では、本発明は、式:のリンカーを提供し、式中、n=1、または2、または3、または4、5、6、7、8、9、または10であり、nは、1、2、3、4、5、または6であってもよく、nは、1であってもよく、nは、2であってもよく、nは、3であってもよく、nは、4であってもよい。mは、存在しなくてもよい。mは、存在してもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、およびL8、ならびに本明細書に記載される他の特定のリンカーの式および一般的なリンカーの式からなる群から選択されるリンカーを含む組成物を対象とする。いくつかの態様では、本発明は、前記リンカー、およびその抗体-リンカーコンジュゲート、タンパク質-リンカーコンジュゲート、または抗体-リンカー-タンパク質コンジュゲートを作製する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体の皮下半減期が、マウスモデルにおいて少なくとも約20時間である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、SC半減期は、少なくとも約25時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、少なくとも約30時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、少なくとも約33時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、ラットモデルにおいて少なくとも約35時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、ラットモデルにおいて少なくとも約36時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約40時間である。いくつかの実施形態では、SC半減期は、霊長類モデルにおいて少なくとも約45時間である。いくつかの実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて少なくとも約28時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約55時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約55時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ラットモデルにおいて少なくとも約60時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約60時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、霊長類モデルにおいて少なくとも約65時間のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトにおいて少なくとも約30時間の単回投与後のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトにおいて少なくとも約35時間の単回投与後のIV半減期を有するコンジュゲートされた抗体-タンパク質複合体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーが、マウスモデルにおいて少なくとも約50である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、少なくとも約55である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、少なくとも約65である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、ラットモデルにおいて少なくとも約50である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約50である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約60である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、霊長類モデルにおいて少なくとも約65である。いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体の皮下バイオアベイラビリティーが、マウスモデルにおいて少なくとも約50である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、少なくとも約55である。いくつかの実施形態では、SCバイオアベイラビリティーは、少なくとも約65である。いくつかの実施形態では、本発明は、リンカーを介して抗体の結合部位に共有結合しているFGF21分子を含む組成物であって、リンカーが、FGF21内の連結残基の側鎖に共有結合しており、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体を形成し、その結果、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体が、約5nM未満のGlut1TaqmanアッセイにおけるEC50効力を有する、組成物に関する。いくつかの実施形態では、Glut1TaqmanアッセイにおけるEC50効力は、約4nM未満である。いくつかの実施形態では、Glut1TaqmanアッセイにおけるEC50効力は、約3nM未満である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされたタンパク質-抗体複合体は、2つ以上の好都合な利点、例えば、SC半減期、IV半減期、グルコース取込み、効力、バイオアベイラビリティー、製造の容易さ、コンジュゲーション効率、インビボ安定性、インビトロ安定性、加水分解に対する耐性、ならびに抗体、リンカー、およびタンパク質の間の適合性などを兼ね備える。抗体US2006205670の内容、特に、抗体技術の他の要素の中で、抗体、これらの有用な断片および変異体および一時的変異、結合部位およびCDR、抗体調製、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、グリコシル化、ADCC、CDC、抗体の血清半減期の延長、発現ベクター、哺乳動物宿主システム、および折り畳みを記述している段落[0153]~[0233]は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において、結合部位抗体結合部位としても知られるは、適切な抗原または構造的に同様のタンパク質の決定基と化合するまたは化合することができる免疫グロブリンまたはIgドメインの領域を指す。この用語は一般に、抗原結合に関与するCDRおよび隣接フレームワーク残基を含む。アルドラーゼ抗体は、本明細書において、阻害されていない場合例えば、コンジュゲーションによって、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプターとの間のアルドール付加反応を触媒する結合部位部を含有する抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、免疫性-反応性の動物を、キャリアタンパク質にカップリングした式:の1,3ジケトンハプテンを含む免疫原で免疫することによって生成され得、抗体の結合部位において反応性ε-アミノ基を伴ったリシンを有することによってさらに特徴づけられる。アルドラーゼ抗体は、1,3-ジケトンハプテンと触媒抗体のリシンのε-アミノ基との間で複合体を形成することによって、1,3-ジケトンハプテンで阻害を受けやすいその触媒活性によってさらに特徴づけられる。論じたように、ある特定の実施形態では、本発明の化合物とともに使用することができるある特定の抗体は、抗体結合部位中に反応性側鎖を必要とする場合がある。反応性側鎖は、天然に存在していてもよく、または突然変異によって抗体中に置かれてもよい。抗体結合部位の反応性残基は、この残基が、抗体を作製するのに最初に同定されるリンパ系細胞内に存在する核酸によってコードされる場合などに、抗体に付随し得る。あるいは、アミノ酸残基は、特定の残基をコードするようにDNAを意図的に突然変異させることによって生じ得る例えば、WO01/22922。反応性残基は、例えば、本明細書で論じられるユニークコドン、tRNA、およびアミノアシル-tRNAを使用する生合成的組込みによって生じる非天然残基とすることができる。別の手法では、アミノ酸残基またはその反応性官能基例えば、求核性のアミノ基またはスルフヒドリル基は、抗体結合部位中のアミノ酸残基に結合することができる。したがって、本明細書において、抗体の結合部位中のアミノ酸残基を通じて起こる抗体との共有結合性連結は、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接のもの、または抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結された化学部分を通じたものとすることができることを意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸はシステインであり、側鎖の反応基はスルフヒドリル基である。他の実施形態では、アミノ酸残基はリシンであり、側鎖の反応基はε-アミノ基である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Kabat番号付けによる重鎖上のLys93である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、HCh38C2配列番号26上のLys-99である。触媒抗体は、1つまたは複数の反応性アミノ酸側鎖を含む適当な結合部位を有する抗体の1つの源である。このような抗体には、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、およびアミダーゼ抗体が含まれる。一実施形態は、アルドラーゼ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体mAb33F12およびmAb38C2、ならびにこのような抗体の適切なキメラバージョンおよびヒト化バージョンなど例えば、h38C2、配列番号25および26を含む。マウスmAb38C2およびh38C2は、HCDR3の付近であるが外側に反応性リシンを有し、反応性免疫化によって生成された触媒抗体の新規クラスのプロトタイプであり、天然アルドラーゼ酵素を機構的に模倣する。C.F.Barbas3世ら、Science278:2085~20921997を参照。使用することができる他のアルドラーゼ触媒抗体には、ATCC受託番号PTA-1015を有するハイブリドーマ85A2;ATCC受託番号PTA-1014を有するハイブリドーマ85C7;ATCC受託番号PTA-1017を有するハイブリドーマ92F9;ATCC受託番号PTA-823を有するハイブリドーマ93F3;ATCC受託番号PTA-824を有するハイブリドーマ84G3;ATCC受託番号PTA-1018を有するハイブリドーマ84G11;ATCC受託番号PTA-1019を有するハイブリドーマ84H9;ATCC受託番号PTA-825を有するハイブリドーマ85H6;ATCC受託番号PTA-1016を有するハイブリドーマ90G8によって生成される抗体が含まれる。反応性リシンを通じて、これらの抗体は、天然アルドラーゼのエナミン機構を使用してアルドール反応およびレトロ-アルドール反応を触媒する。アルドラーゼ抗体およびアルドラーゼ抗体を生成する方法は、米国特許第6,210,938号、同第6,368,839号、同第6,326,176号、同第6,589,766号、同第5,985,626号、および同第5,733,75号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の化合物は、チオエステラーゼ触媒抗体およびエステラーゼ触媒抗体の結合部位中に見出されるものなどの反応性システインに本発明の化合物を連結することによっても形成することができる。適当なチオエステラーゼ触媒抗体は、K.D.Jandaら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:2532~25361994によって記載されている。適当なエステラーゼ抗体は、P.Wirschingら、Science270:1775~17821995によって記載されている。反応性アミノ酸含有抗体は、反応性アミノ酸をコードするように抗体結合部位の残基を突然変異させること、または反応基を含有するリンカーを用いて抗体結合部位中のアミノ酸側鎖を化学的に誘導体化することを含めて、当技術分野で周知である手段によって調製することができる。抗体は、ヒト化抗体とすることができる。本発明の化合物が抗体の結合部位に共有結合により連結され、このような抗体がヒト化される場合、このような抗体は、Z基に対する高い連結親和性を保持してヒト化されることが重要である。様々な形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体が企図されている。一実施形態では、ヒト定常ドメインCκおよびCγ11を有するヒト化アルドラーゼ触媒抗体h38c2IgG1またはh38c2Fabを使用する。C.Raderら、J.Mol.Bio.332:889~8992003は、h38c2Fabおよびh38c2IgG1を生成するのに使用することができる遺伝子配列およびベクターを開示している。ヒト生殖系列Vk遺伝子DPK-9およびヒトJk遺伝子JK4は、m38c2のκ軽鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用され、ヒト生殖系列遺伝子DP-47およびヒトJH遺伝子JH4は、m38c2の重鎖可変ドメインをヒト化するためのフレームワークとして使用された。図1は、m38c2、h38c2、およびヒト生殖系列における可変軽鎖と可変重鎖の間の配列アライメントを例示する。h38c2は、そのアロタイプのいずれかを含む、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常ドメインを利用することができる。抗体がG1mfアロタイプを含むh38c2IgG1である、本発明の化合物のある特定の実施形態では、Zは、重鎖の99位でリシン残基の側鎖に結合する。別の実施形態では、h38c2の可変ドメインVLおよびVH配列番号27および28、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来する定常ドメインを含むキメラ抗体を使用する。抗体は、h38c2に由来するVHドメインおよびVLドメインを含む、全長抗体、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、dsFv、scFv、VH、VL、ダイアボディ、またはミニボディとすることができる。抗体は、h38c2に由来するVLドメインおよびVHドメイン、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群から選択される定常ドメインを含む抗体であってもよい。抗体は、h38C2IgG1配列番号25および26であってもよい。抗体は、ヒトIgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE抗体に由来する定常領域を含むマウスアルドラーゼ抗体のヒト化バージョンであってもよい。別の実施形態では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体に由来するVL領域およびVH領域、ならびにヒトIgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE抗体に由来する定常領域を含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、m38C2に由来するVL領域およびVH領域配列番号29および30を含む。さらなる実施形態では、抗体は、天然または固有のヒトIgG、IgA、IgM、IgD、またはIgE抗体に由来するポリペプチド配列を含むマウスアルドラーゼ抗体の完全ヒトバージョンである。様々な形態のヒト化アルドラーゼ抗体断片も企図されている。一実施形態では、h38c2Fab’2を使用する。h38c2Fab’2は、h38c2IgG1のタンパク質消化によって生成することができる。別の実施形態では、介在リンカーGly4Ser3配列番号31によって接続されていてもよい、h38c2に由来するVLドメインおよびVHドメインを含むh38c2scFvを使用する。ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化または触媒抗体の場合では反応性免疫化の後に、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるトランスジェニック動物例えば、マウスを作製することが現在では可能である。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用することによって、免疫されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変Vドメイン遺伝子レパートリーを使用して、インビトロでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。上記に示したように、ヒト抗体は、インビトロ活性化B細胞、例えば、米国特許第5,567,610号および同第5,229,275号によって生成することもできる。本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列修飾複数可は、企図されている。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、この残基への挿入、および/またはこの残基の置換が含まれる。最終的な構築物に到達するように、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが行われ、ただし、最終的な構築物は、所望の特性を有する。グリコシル化部位の数または位置の変化などのアミノ酸変化はまた、抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。本発明の抗体または抗体部は、別の分子例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に誘導体化または連結することができる。一般に、抗体またはその一部分は、リンカーの、抗体結合部位に共有結合によりコンジュゲートする能力が誘導体化または標識化によって悪影響されないように誘導体化される。したがって、本発明の抗体および抗体部は、本明細書に記載される抗体のインタクトな形態および修飾形態の両方を含むことが意図されている。例えば、本発明の抗体または抗体部は、1つまたは複数の他の分子実体、例えば、別の抗体例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ、検出剤、細胞毒性薬、医薬品、および/または別の分子ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなどとの抗体もしくは抗体部の付随を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどに機能的に連結することができる化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、または他の方法によって。他の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部は、融合抗体、または別のポリペプチドに連結された抗体とすることができる。いくつかの態様では、抗体の可変領域のみがポリペプチドに連結される。いくつかの態様では、抗体は、結合部位の結合能力を妨害しないようにペプチドに共有結合によりコンジュゲートされる。ポリペプチドは、治療剤、例えば、ターゲティング剤、ペプチド、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節因子、ホルモン、毒素、成長因子、または他の調節タンパク質などであっても、西洋わさびペルオキシダーゼなどの、容易に可視化され得る酵素などの診断剤であってもよい。さらに、2つまたはそれ以上の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作り出すことができる。これは、1本のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合に有用である。一タイプの誘導体化抗体は、2つ以上の抗体例えば、二重特異性抗体を作り出すために、同じタイプまたは異なるタイプのを架橋することによって生成される。適当な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された2つの別個に反応性の基を有するヘテロ二官能性例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはホモ二官能性例えば、スベリン酸ジスクシンイミジルであるものが含まれる。別のタイプの誘導体化抗体は、標識抗体である。本発明の抗体または抗体部が誘導体化され得る有用な検出剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体などを含めた蛍光化合物が含まれる。抗体は、検出に有用である酵素、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどで標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識される場合、これは、酵素が使用する追加の試薬を添加して、見分けることができる反応生成物を生成することによって検出される。例えば、作用物質の西洋わさびペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加すると、検出可能である着色した反応生成物がもたらされる。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合という間接的測定を通じて検出することができる。抗体は、ガドリニウムなどの磁性剤で標識してもよい。抗体は、二次レポーター例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグによって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。抗体は、化学基、例えば、ポリエチレングリコールPEG、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基などで誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善する、例えば、血清半減期を延長し、または組織結合を増大させるのに有用となり得る。医薬組成物本発明の別の態様では、本発明の組成物および/または化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明の組成物を含む作用物質を製剤化し、全身的に投与することができる。製剤化および投与のための方法は、Remington’sPharmaceuticalSciences、18版、1990、MackPublishingCo.、Easton、PAに見出すことができる。注射用に、本発明の組成物は、液剤、乳剤、もしくは懸濁剤、もしくは非水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散剤、または再構成して滅菌した注射用液剤もしくは分散剤にするのに適した滅菌粉末もしくは凍結乾燥物で製剤化することができる。適当な水性および非水性の希釈剤、溶媒、および担体の例として、水、エタノール、ポリオールプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど、これらの適当な混合物、および油が挙げられる。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合の要求される粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持または改善することができる。本発明の組成物は、生理学的に適合性の緩衝液、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、またはリン酸塩などを含有する水溶液で製剤化することができる。必要な場合、このような製剤は、様々な張性調整剤、可溶化剤および/または安定化剤例えば、塩化ナトリウムなどの塩、スクロース、マンニトール、およびトレハロースなどの糖、アルブミンなどのタンパク質、グリシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸、ポリソルベートTweenなどの界面活性剤、またはエタノール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの共溶媒も含有することができる。本発明の組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、分散剤、ならびに保存剤なども含むことができる。本発明の組成物は、懸濁化剤、例えば、寒天、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、エトキシ化イソステアリルアルコール、微結晶性セルロース、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステル、ならびにトラガカント、またはこれらの混合物なども含むことができる。本発明の組成物は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸なども含むことができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。本発明の注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させることができる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって影響され得る。本発明の組成物は、例えば、pH、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または組成物の浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。適当な製剤材料として、それだけに限らないが、アミノ酸グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン、抗菌剤、抗酸化剤L-メチオニン、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど、緩衝剤酢酸ナトリウム、乳酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス-HCl、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など、増量剤マンニトールもしくはグリシンなど、キレート化剤エチレンジアミン四酢酸EDTA、DPTAなど、錯化剤カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなど、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど、タンパク質血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど、着色剤、香味剤、および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマーポリビニルピロリドンなど、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオンナトリウムなど、保存剤塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など、溶媒グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど、糖アルコールマンニトールもしくはソルビトールなど、懸濁化剤、界面活性剤、もしくは湿潤剤プルロニック;PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート20もしくはポリソルベート80などのポリソルベート;トリトンtriton;トロメタミン;レシチン;コレステロールもしくはチロキサパルtyloxapalなど、安定性増強剤スクロースもしくはソルビトールなど、張性増強剤アルカリ金属ハロゲン化物-好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム-もしくはマンニトール、ソルビトール、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、ならびに/または医薬アジュバントが挙げられる。製剤成分は、投与の部位に許容される濃度で存在し得る。緩衝剤を使用することによって、組成物を生理的pH、またはわずかにより低いpH、一般的に、約5~約8のpH範囲内に維持することができる。いくつかの態様では、本発明の化合物が、化合物を制御放出または徐放するために製剤化されている本発明の医薬組成物を調製することができる。例として、ヒアルロン酸など、ポリマーゲル、ビーズ、粒子、注射用ミクロスフェア、リポソーム、フィルム、マイクロカプセル、徐放マトリックス、および移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。いくつかの態様では、本発明の医薬組成物は、単室または多室充填済みシリンジで提供される。いくつかの態様では、本発明は、医薬組成物中に使用するのに適した少なくとも1つの追加の成分と一緒に、本発明の少なくとも1つの化合物または組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様では、本発明は、患者に前記組成物を送達するための少なくとも1つの手段と一緒に、本発明の少なくとも1つの化合物または組成物を含むキットを提供する。本発明の組成物は、リンカーにFGF21分子を共有結合により連結し、多価抗体の結合部位にリンカーをコンジュゲートすることによって合成することができる。例えば、FGF21-リンカーコンジュゲートは、リンカーがジケトンまたはAZDβ-ラクタム反応性部分を含む場合、h38C2IgG1などのアルドラーゼ抗体0.5当量とともにインキュベートすることによって、本発明の組成物を生成することができる。使用方法ヒトにおける治療用途について、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはヒトキメラ抗体、またはこれらの抗原結合部が、本発明の化合物または組成物の抗体部の好適な抗体形態である。本発明の一態様は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療するための方法であって、糖尿病または糖尿病関連状態を罹患している対象に、治療有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるインスリン分泌を増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における血中グルコースレベルを減少させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における肥満症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における体重レベルを管理または低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における異脂肪血症dislipidemiaを治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における高血圧症を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における脂肪肝hepatosteatosisを治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における心血管疾患を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるグルカゴンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるトリグリセリドレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における低密度コレステロールレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるC反応性タンパク質レベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるフルクトサミンレベルを低減するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象における血糖コントロールを管理するための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるアディプシンのレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。本発明の別の態様は、対象におけるHDLのレベルを増大させるための方法であって、治療有効量の本発明の組成物またはその医薬誘導体を対象に投与するステップを含む方法である。いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、または非エステル化遊離脂肪酸、HDLもしくはアディプシンのレベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはC反応性タンパク質のレベルを低減する方法であって、治療有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、糖尿病関連状態、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、または心血管疾患を治療し、または体重レベルを管理もしくは低減し、または血糖コントロールを管理し、またはインスリン分泌、HDLもしくは非エステル化遊離脂肪酸レベルを増大させ、または血中グルコース、グルカゴン、トリグリセリド、フルクトサミン、低密度コレステロール、またはC反応性タンパク質のレベルを低減するための薬剤の調製における、本発明の組成物または医薬組成物の使用を提供する。用語治療有効用量は、本明細書において、治療されている疾患または障害の症状の軽減を含む、研究者、医師、または他の臨床家によって得ようとされている、組織系、動物、またはヒトにおける生物学的応答または医薬の応答を誘発する、本発明の化合物、組成物、または医薬組成物の量を意味する。投与の方法および投与量本発明の組成物の投与経路として、筋肉内、SC、または髄内注射、ならびにクモ膜下、直接心室内、IV、および腹腔内の送達を含めた非経口送達を挙げることができる。いくつかの実施形態では、投与は静脈内である。本発明の組成物は、製剤の直接注射、または注入基質、例えば、生理食塩水、D5W、乳酸化リンガー液、もしくは他の一般に使用される注入媒質などとの本発明の組成物の製剤の混合物の注入による非経口経路のいずれかを通じて投与することができる。糖尿病または糖尿病関連状態あるいはいくつかの態様では、以下の状態の1つまたは複数:糖尿病、肥満症、異脂肪血症、高血圧症、脂肪肝、心血管疾患、高血中グルコース、低インスリンレベル、または本明細書に論じられる状態もしくは本明細書に論じられる症状と関連した状態を有するヒトを含めた哺乳動物の治療において、治療有効量の本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体が投与される。例えば、本発明の組成物は、体重1kg当たり約0.1mg~体重1kg当たり約15mgの1日のIV注入として投与することができる。したがって、いくつかの実施形態では、体重1kg当たり約0.5mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約0.75mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約1.0mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約2.5mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約5mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約10.0mgの用量を提供する。他の実施形態では、体重1kg当たり約15.0mgの用量を提供する。本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体の用量は、1日に約1回~1週間に2回、または代わりに、1週間に約1回~1カ月に1回の間隔で投与されるべきである。いくつかの実施形態では、用量は、約.002mg/ml~30mg/mlの、本発明による本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体のピーク血漿濃度を実現するように投与される。これは、適切な製剤中の投与される成分の溶液化学の当業者に公知の任意の適当な製剤溶液を使用することができるの滅菌注射によって実現することができる。望ましい血中レベルは、有効な分析的方法によって測定される血漿レベルによって確認される場合、本発明による本発明の組成物の持続注入によって維持することができる。個体に本発明の組成物を投与するための一方法は、個体にFGF21-リンカーコンジュゲートを投与するステップと、これにインビボで適切な抗体の結合部位との共有結合性化合物を形成させるステップとを含む。インビボで形成する本発明の組成物の抗体部は、FGF21-リンカーコンジュゲートの投与の前、同時、または後に個体に投与することができる。代わりに、またはさらに、抗体は、適切な免疫原で免疫した後の個体の血液循環中に存在し得る。例えば、触媒抗体は、キャリアタンパク質にコンジュゲートした基質の反応性中間体で免疫することによって生成することができる。特に、アルドラーゼ触媒抗体は、ジケトン部分に連結したキーホールリンペットヘモシニアンを投与することによって生成することができる。したがって、組成物は、経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として、単回用量として、2回以上の用量としてこれは、同じ量の所望の分子を含有していても、含有していなくてもよい投与することができる。適切な投与量のさらなる微調整は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される職務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量-応答データを使用することによって確認することができる。医薬組成物の投与経路は、公知方法によるもの、例えば、経口によるもの、SC、IV、腹腔内、脳内実質内、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内の経路による注射を通じたもの;徐放システムによるもの;または移植デバイスによるものである。望まれる場合、組成物は、ボーラス注射によって、または注入により連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。代わりに、またはさらに、組成物は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適当な組織または臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介したものとすることができる。併用療法本発明の別の態様では、本発明の組成物は、糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、またはインスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させ、または本明細書に論じられる状態のいずれかを治療するために使用される他の治療剤と併用して使用することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、インスリン、例えば、即効型、短時間作用型、中間時間作用型、または持続型のインスリンを含めた合成ヒトインスリンなどと併用して投与することができる。他の実施形態では、本発明の組成物は、α-グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素、メグリチニド、ビグアナイド、またはチアゾリジンジオンTZDファミリーに属する化合物と併用して投与することができる。本発明の組成物は、グルコキナーゼGKなどの代謝調節タンパク質metabolism-modifyingproteinもしくはペプチド、グルコキナーゼ調節タンパク質GKRP、脱共役タンパク質2および3UCP2およびUCP3、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1および2Glp1およびGlp2、エキセンジンエキセンジン-4など、胃抑制ポリペプチドGIP、Glp2ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αPPARα、レプチン受容体OB-Rb、DPP-IV阻害剤、スルホニル尿素、または他のインクレチンペプチドと併用して投与することもできる。当業者は、糖尿病または糖尿病関連状態の治療に現在使用されている多種多様な作用物質が分かるはずである。糖尿病または糖尿病関連状態を治療し、インスリン分泌を増大させ、または血中グルコースレベルを減少させるために使用される他の治療剤と併用した、本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体の潜在的な治療有効性を評価するために、これらの組合せを当技術分野で公知の方法を使用して試験することができる。例えば、インスリン分泌を増大させる、本発明の組成物と別の治療剤の組合せの能力は、インビトログルコース刺激性インスリン分泌アッセイを使用して測定することができる。このようなアッセイでは、膵β細胞が、一定期間、様々な濃度のグルコースで処理され、インスリンレベルが当技術分野で公知の方法、例えば、ラジオイムノアッセイなどを使用して測定される。インスリン分泌に対する本発明の組成物と他の治療剤の効果は、対象に直接作用物質を投与し、様々な時点で体液試料中のインスリンレベルを測定することによって、インビボで測定することもできる。併用療法で使用するのに、対象に公知の治療剤を投与するための方法は、臨床医療提供者に十分に分かるであろう。投与される本発明の組成物の有効投与量は、生物学的半減期、バイオアベイラビリティー、および毒性のようなパラメータを扱う当業者に周知の手順を通じて決定することができる。本発明の組成物またはその薬学的に許容できる誘導体と併用して使用される治療剤の有効量は、これらの作用物質について当業者に公知の推奨用量に基づく。これらの推奨レベルまたは公知のレベルは、好ましくは、本発明の組成物または薬学的に許容できる誘導体と併用してこれらの投与量の有効性を試験した後、言及された投与量の10~50下げられることになる。主治医は、毒性、骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能不全、または有害な薬物間相互作用のために投与量を下げるのに、どのようにかついつ療法を終わらせ、中断し、または調整するかが分かるはずであることに留意されるべきである。主治医は、臨床応答が不十分である場合、レベルを高めるために処置を調整することも知っているはずである毒性を防いで。治療有効用量は、患者における症状の寛解、または生存時間の延長をもたらすのに十分な化合物の量を指す。本発明の組成物の有効なインビトロ濃度は、EC50を測定することによって求めることができる。インビボでのこのような作用物質の毒性および治療有効性は、例えば、LD50集団の50に致死性である用量およびED50集団の50において治療的に有効な用量を求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は、治療指数であり、これは、比LD50/ED50として表すことできる。大きい治療指数を示す化合物が好適である。これらの細胞培養液アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を構築するのに使用することができる。このような化合物の投与量は、ほとんどまたはまったく毒性を伴わないED50を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形、および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変更することができる。任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養液アッセイから最初に推定することができる。IC50すなわち、細胞培養液中で求めた未処置対照と比較して、感染細胞からのRT産生の最大半量阻害を実現する試験化合物の濃度を含む循環血漿濃度範囲を実現する用量を動物モデルにおいて構築することができる。このような情報を使用することによって、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーHPLCによって測定することができる。本発明の組成物が他の治療剤と併用して投与される実施形態では、作用物質の併用効果は、式:を使用して、ChouおよびTalalayの多剤分析法T.C.ChouおよびP.Talalay、Adv.EnzymeRegul.22:27~551984によって計算することができ、式中、CIは、併用指数であり、Dx1は、単独でxパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物1の用量であり、D1は、D2と併用して、同じxパーセントの効果を生じさせるのに必要とされる薬物1の用量である。Dx2およびD2の値は、薬物2から同様に得られる。αの値は、半有効方程式medianeffectequation:を使用して用量効果曲線のプロットから求められ、式中、faは、用量Dによって影響される部分であり、fuは、影響されない部分であり、Dmは、50の効果に必要とされる用量であり、mは、用量-効果曲線の傾きである。相互に排他的な薬物すなわち、同様の作用機序について、単独での薬物および半有効プロットにおけるこれらの平行線の両方。相互に非排他的な薬物すなわち、独立した作用機序は、半有効プロットにおいて平行線を与えることになるが、混合物では、上に凹の曲線を与えることになる。作用物質が相互に排他的である場合、αは0であり、これらが相互に非排他的である場合、αは1である。相互の非排他性を仮定して得られる値は、相互に排他的な薬物より常にわずかに大きい。1未満のCI値は、相乗作用を示し、1超の値は、アンタゴニズムを示し、1に等しい値は、相加効果を示す。併用薬物効果も、BiosoftCambridge、UKからのCalcuSynソフトウェアパッケージを使用して計算することができる。本発明による化合物は、溶媒和、特に水和することができる。水和は、化合物または化合物を含む組成物を製造する間に行うことができ、または水和は、化合物の吸湿性のために経時的に起こり得る。本発明の化合物は、凍結乾燥することができる。本発明は、本発明の化合物の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、および薬学的に許容できる塩も提供する。本発明は、本明細書に開示される配列のいずれかによる化合物も提供する。配列配列番号1は、H1は任意選択であり、残基146は、LまたはPとすることができる、181残基の発現タンパク質を示す。コンジュゲーションについて試験される残基位置には下線が引かれ、太字である。配列番号1の番号付けは、全体を通して使用される。ヒト化38c2IgG1の一実施形態の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列それぞれ、配列番号25および26も示されている。可変領域VCおよびVHには下線が引かれており、相補性決定領域CDRは太字で示されている。側鎖が、本明細書に記載されるリンカーと共有結合により結合するリシン99は、HCCDR3に隣接する。本発明の多用性は、以下の実施例によって例示されており、これらは、本発明の一般的な実施形態を例示し、特許請求の範囲または明細書を決して限定しない。実施例1FGF-21の最適な係留部位の同定FGF21を、リンカーを介して触媒抗体結合部位にコンジュゲートするための最適部位を同定するための試験を行った。2つのコンジュゲーションストラテジー、すなわち、表面リシン側鎖を通じたコンジュゲーション、および表面システイン側鎖を通じたコンジュゲーションを考察した。一般に、球状タンパク質は、その表面上に対になっていないシステイン残基を有さず、したがって、特定のコンジュゲーションのために単一部位において操作するために、タンパク質表面内の1つのシステインの組込みを使用することができる。しかし、システインを用いた表面残基の突然変異は、多くの場合、分子間二量体化、天然のジスルフィド結合の誤対合、および受容体結合に対する障害などの問題を引き起こし得る。これらの理由のために、タンパク質コンジュゲーションは、リシン残基を通じて最も一般に影響される。FGF21受容体の相同性モデリングおよびその活性化機構FGF21は、FGFR1cおよびFGFR4の両方に結合するが、受容体複合体は、FGFR1cを通じてのみ活性化され得る。FGFR1bとFGFR1cは、87の同一性を共有するがFGFR1bは、IIIb/c代替スプライシング領域を除いてFGFR1cと同一である、FGF21は、FGFR1cのみを特異的に認識する。ここでは、FGF21-FGFR1cの複合体構造の相同性モデリングを、鋳型としてFGFR2-FGFR1c結晶構造を使用することによって実施した。相同性モデリングおよび構造分析のためにMOEソフトウェアを使用した。受容体の活性化は、別の細胞-表面受容体、βKlothoを必要とする。βKlothoは、ヒト細胞質ゾルβ-グルコシダーゼに非常に類似した約35同一2つのドメインを有する。ヒトβKlotho構造を、ヒト細胞質ゾルβ-グルコシダーゼを使用することによってモデル化し、FGF21-FGFR1cのモデル化された構造における構造を位置合わせした。このモデル化された複合体構造は、最適なリシンコンジュゲーション部位およびFGF21中の最適なシステイン残基組込みについての合理的な指針をもたらし、これらは、FGF21とFGFR1cの間、およびFGF21とβKlothoの間の結合界面を遮るべきでない。コンジュゲーション部位選択のために、以下の基準を使用した。1残基は、可能な限り多く構造中で溶媒に曝露されるべきであり、2残基は、ジスルフィド結合から離れているべきであり、3残基は、受容体結合表面およびβ-Klotho結合表面から離れているべきである。溶媒への曝露は、アクセス可能な表面積ASAに基づいて評価することができる。FGF21のモデル化された構造からのASAの計算は、CCP4ソフトウェアTheCCP4Suite:ProgramsforProteinCrystallography、1994ActaCryst.D50、760~763および社内プログラムを用いて行った。簡単に言えば、CCP4中のプログラムは、そのログファイルにおいて1残基当たりの平方オングストロームでの値を計算する。ASAの割合fASAを計算するために、社内プログラムを使用することによって、1残基当たりのASAを正規化した。表1は、ASAの残基およびfASAを示す。側鎖が表面によって覆い隠されると予測される残基は含まれない。列1は、アミノ酸名称であり、列2は、残基数であり、列3は、ASA平方オングストロームとしてであり、列4は、曝露される割合である。fASA値は、所与のポリペプチド中のアミノ酸残基への溶媒のアクセスのしやすさを定義する。0に近いfASA値は、残基が溶媒にアクセス不能であることが予測されることを示し、これが、コンジュゲーションのためにリンカーにアクセス可能である可能性がより低いことを示唆する。特に可能性のある候補コンジュゲーション部位を示唆する1.00超の表面積値とともに、0.3の絶対最小fASA値を使用した。ASA分析に基づいて、K122164.4の表面積およびK59117.2の表面積を、コンジュゲーションにとって最も有望な候補部位とみなした。K69表面積91およびK56表面積73も、比較による目的のためにコンジュゲートした。実施例2FGF21タンパク質および突然変異体の生成FGF21cDNAは、ATCCから購入した。哺乳動物発現ベクターおよび細菌発現ベクターを、それぞれ、pcDNA3.1Invitrogen登録商標およびpET21bEMDを使用することによって構築した。FGF21の突然変異体のために、QuikChange登録商標部位特異的突然変異誘発キットStratagene登録商標を使用して、発現ベクター中に突然変異を導入した。所望の突然変異の存在は、DNA配列決定によって検証した。哺乳動物の発現のために、HEK293F細胞Invitrogen登録商標に、293fectin試薬Invitrogen登録商標を使用してFGF21の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトし、無血清培地で増殖させた。滅菌濾過した馴化培地を、緩衝液A20mMのトリス-HC1、pH7.5に対して透析し、緩衝液Aでプレ平衡化されたHiTrapQカラムGEhealthcare登録商標に装填した。FGF21タンパク質を、緩衝液Aから緩衝液B20mMのトリス-HC1、pH7.5、および100mMのNaClへの線形勾配を用いて溶出した。プールした画分を濃縮し、リン酸緩衝溶液PBS、pH7.4を含むセファデックス300に装填した。得られたタンパク質溶液を濃縮し、-80°C未満で貯蔵した。純度は、SDS-PAGEおよびRP-HPLCによって確認した。大腸菌E.coli由来のFGF21ΔHを生成するために、細菌発現ベクターを、宿主系統BL21-DE3-RILStratagene登録商標中にトランスフォームした。トランスフォーム細胞を、LB培地1リットル中で、37°Cで増殖させ、1mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを添加することによって、発現を開始した。4時間後に細胞を回収し、-20°Cで凍結させた。凍結細胞ペーストを、溶解緩衝液50mMのトリス、10mMのEDTA、pH7.5中に懸濁させ、微小流動化装置microfluidizerに4回通過させた。17,000×g、4°Cで30分遠心分離した後、封入体IB含有ペレットを、50mMのトリス、pH7.5中に再懸濁させた。洗浄したIBスラリーを遠心分離した30分、17,000×g、4°C。このIBペレットを-80°Cで貯蔵した。1~10mg/mlのFGF21で、7Mの尿素、5mMのDTT、および50mMのビス-トリスプロパン、pH10.5を用いて凍結IBペレットを可溶化し、1時間撹拌することによって、タンパク質を溶解および還元した。次いで、可溶化したIBを、50mMのビス-トリスプロパン、pH8.0中に10倍希釈した。最終的なタンパク質濃度は、0.1~1mg/mLであった。溶液を約2日間撹拌し、20mMのトリス-HCl、pH7.54リットルに対して透析した。タンパク質溶液を、14,000×gで30分間遠心分離した。上清をHiTrapQHPGEHealthcare登録商標に装填し、緩衝液Aで平衡化した上記を参照。非結合の細菌タンパク質を、緩衝液Aで洗浄し、FGF21タンパク質を、緩衝液Bの線形勾配を用いて溶出した。次いで、FGF21画分を、PBS緩衝液でプレ平衡化されたHiTrapキレート化HPカラムGEHealthcare登録商標に装填した。FGF21タンパク質を、PBSからPBS緩衝液と100mMのイミダゾールpHを7.4に調整したへの線形勾配を用いて溶出した。画分を収集および濃縮し最大50mg/mLまで、タンパク質溶液を、PBSGibco登録商標、pH7.4で平衡化されたサイズ排除カラムHiload26/60、スーパーデックス300に施した。精製タンパク質を0.22μmフィルターによって滅菌し、-80°Cで貯蔵した。培地8LからのFGF21ΔHの一般的な収量は、600~700mgであった。一般的な純度は、95超であった。一般的なエンドトキシンレベルは、約1EU/mgであった。FGF21のシステインおよびリシンからアルギニンへの突然変異体を生成し、FGF21ΔHと類似の様式で精製した。精製タンパク質の一般的な収量は、350~400mgであった。遊離システインは、エルマン試薬を使用して確認した。実施例3リンカー1の合成リンカー1の合成:約35°Cで、窒素雰囲気下で、13A例えば、約5g、約20.1mmolのメタノール例えば、約200mL懸濁液に、炭素上のパラジウム例えば、約1.0g、約0.47mmolを1回で、その後塩酸例えば、約2.5mL、約30.2mmolを滴下添加した。約35°Cで、溶液に水素をゆっくりとバブリングして入れ、この溶液を、その温度でおよそ約2時間撹拌した。固体をセライトのベッドに通して濾過し、収集した。濾液を減圧下で濃縮し、固体を真空下で乾燥させることによって、塩酸塩として13Bを得た。化合物13Bをジクロロメタン例えば、約200mLおよび炭酸水素ナトリウムの飽和溶液例えば、約250mLと混合し、ジクロロメタン層を分離した。ジクロロメタン層を飽和した塩化ナトリウム例えば、約250mLで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機層を濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーSiO2、ヘキサン中約60の酢酸エチルを使用して精製することによって、約68の収率例えば、約2.94gの13Cを得た。13C例えば、約4.65g、約21.3mmol、13D例えば、約7.00g、約21.3mmol、N-3-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミドヒドロクロリド例えば、約3.3g、約21.3mmol、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン例えば、約2.75g、約21.3mmolのジクロロメタン例えば、約200mL溶液を、約0°Cで、窒素下で5分間撹拌し、室温で約4時間撹拌した。有機層を希炭酸水素ナトリウム溶液、および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーSiO2、アセトニトリルを使用して精製することによって、リンカー1を得た例えば、約8.25g、約73の収率。実施例4リンカー2の合成シトラコン酸無水物、14例えば、約2.0mg、約16.7mmol、β-アラニン、17例えば、約1.5g、約16.7mmolのDMF例えば、約10mL溶液を、室温で約5時間撹拌した。次いで、反応溶液を約0°Cに冷却し、ジイソプロピルカルボジイミド例えば、約2.6mL、約16.7mmolおよびHOBT例えば、約1.9g、約16.7mmolを含有するDMF例えば、約10mL溶液を添加した。ジイソプロピルエチルアミン例えば、約5当量、約83.5mmolを添加し、反応混合物を室温に加温し、さらに約16時間撹拌した。反応物を水中に注ぎ、1NのHClで酸性化し、酢酸エチル例えば、約3×約30mLで抽出した。有機層を水例えば、約2×約30mLおよびブライン例えば、約30mLで洗浄し、次いで硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーによって精製した。所望の画分をプールし、減圧下で濃縮することによって、17Aを得た。化合物17A例えば、約0.5g、約2.09mmolを、ジクロロメタン中約15のトリフルオロ酢酸中で、室温で約2時間撹拌し、減圧下で濃縮して乾燥させた。遊離酸18を、テトラヒドロフラン例えば、約20mL中のN-ヒドロキシスクシンイミド例えば、約0.25g、約2.09mmolに添加し、その後、ジイソプロピルカルボジイミド例えば、約0.33ml、約2.09mmolを添加し、室温で約4時間撹拌した。ジイソプロピル尿素を濾別したfilteredoff。濾液を蒸発させて乾燥させた。石油エーテル例えば、約30mLを残渣に添加し、粉砕し、振盪し、石油エーテル層をデカンテーションした。この手順を、石油エーテルを用いてさらに1回繰り返し、生成物18を真空下で乾燥させた。アミン-peg2-tブチルエステル、19例えば、約0.5g、2.09mmolを、活性化された18のTHF溶液に添加し、その後、過剰のDIPEA例えば、約3当量を添加した。この溶液を室温で最低1時間撹拌し、343および399の質量Massを収集してHPLC-MSによって精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥することによって20を収集した。残渣を、ジクロロメタン中の約15のトリフルオロ酢酸および数滴の水中に溶解させ、室温で約2時間撹拌した。反応物を濃縮して約1mlにし、水で処理することによって生成物を沈殿させた。粗物質をHPLC-MSを使用して精製することによって21を得たM343。酸21例えば、約60mg、約0.18mmol、HBTU例えば、約137mg、約0.36mmol、およびアニリン塩酸塩22例えば、約45mg、約0.18mmol、ジイソプロピルエチルアミン例えば、約0.14ml、約0.90mmolのDMF例えば、約2mL溶液を、室温で約30分間撹拌し、HPLC-MSで精製した。所望の画分をプールし、濃縮することによってL2例えば、約16mg、約0.03mmolを収集した。実施例5リンカー3の合成シトラコン酸無水物、14例えば、約0.5g、約16.4mmol、アミン-peg2-tブチルエステル23例えば、約1.0g、約4.2mmolのDMF例えば、約10mL溶液を室温で約2時間撹拌した。ジイソプロピルカルボジイミド例えば、約0.8mL、約5.2mmolおよびHOBT例えば、約0.7g、約6.1mmolを添加し、この反応物を約80°Cで約2時間加熱した。この反応物を室温まで一晩冷却させ、尿素を濾過した。濾液を水中に注ぎ、DCMで抽出した。有機層をブラインで洗浄し濃縮して油状物にした。粗生成物をアセトニトリル中約50の6NのHCl中に溶解させることによって、酸を脱保護した。生成物をDMF中に溶解させ、濾過し、HPLC-MSを使用して精製することによって、24例えば、約208mg、約0.7mmolを収集した。マレイミド、24例えば、約0.16g、約0.6mmol、およびアニリン塩酸塩22例えば、約150mg、約0.6mmolのDMF溶液に、過剰のHBTUおよびDIEA例えば、それぞれ約3当量超を添加した。粗物質を、HPLC-MS上で約2回の注入を介して精製した。最も純粋な物質を含有する所望の画分をプールし、凍結乾燥することによって、L3例えば、約17.3mg、約36.7mmolを収集した。実施例6リンカー4の合成窒素N2下の、シトラコン酸無水物14、例えば、約510mg、約4.55mmol、およびtrans-4-アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸13、例えば、約716mg、約4.55mmolのジメチルホルムアミド例えば、DMF、約5mL溶液を、室温で約6時間撹拌した。反応溶液を約0°Cに冷却し、DIPEA例えば、約1.98mL、約11.4mmolを添加し、その後DMF例えば、約3mL中のペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩例えば、約1.96mL、約11.4mmolを添加した。反応混合物を室温に加温し、N2下でさらに約16時間撹拌した。固体を濾過し、濾液を水約30mL中に注ぎ、ジクロロメタン例えば、約2×約30mLで抽出し、ジクロロメタン層をNa2SO4上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィーにより精製することによって、ペンタフルオロフェニルエステル中間体約550mgを得た15、例えば、約29の収率。N-メチルモルホリン例えば、約290μL、約2.64mmolを、ペンタフルオロフェニルエステル中間体15、例えば、約550mg、約1.32mmol、および3-[2-2-アミノ-エトキシ-エトキシ]-プロピオン酸tert-ブチルエステル例えば、約295mg、約1.32mmolのテトラヒドロフランTHF、例えば、約5mL溶液に添加し、室温で約2時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をDMF中に溶解させ、分取HPLCによって精製した。得られたtert-ブチルエステル中間体を、ジクロロメタン例えば、約4mL中の約50のトリフルオロ酢酸で約30分間処理した。溶媒を真空下で除去し、残渣を分取HPLCにより精製することによって、白色固体として酸中間体16約300mgを得た例えば、約55の収率;MS:411.2MH。上記酸中間体16、例えば、約33mg、約0.08mmol、1-[3-4-アミノ-フェニル-プロピオニル]-アゼチジン-2-オン例えば、約18mg、約0.08mmol、HOBT例えば、約25mg、約0.16mmol、およびHBTU例えば、約61mg、約0.16mmol、およびN-メチルモルホリン例えば、約44μL、約0.4mmolのDMF例えば、約1mL溶液を、室温で約2時間撹拌した。粗混合物を分取HPLCにより精製することによって、無色油状物としてL4を得た例えば、約22mg、45の収率;MS:611.4MH。実施例7リンカー5の合成ジイソプロピルカルボジイミド例えば、約3.11mL、約19.86mmol、約2.95当量を、リンカー6例えば、約6.63g、約20.69mmol、約3.07当量、およびN-ヒドロキシスクシンイミド例えば、約2.29g、約19.86mmol、約2.95当量の乾燥テトラヒドロフラン例えば、約500mL溶液に約0°Cで添加した。混合物を約0°Cで約1時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を真空で除去し、残渣を石油エーテル例えば、約2×約200mLで洗浄し、粉末を真空下で約2時間乾燥させ、後続のステップで使用した。実施例8リンカー6の合成実施例9リンカー7の合成I例えば、約438mg、約4.47mmolおよびII例えば、約1.04g、約4.47mmolのジメチルホルムアミド例えば、約25mL溶液を、窒素雰囲気下で約2.5時間撹拌した。反応物を、氷浴を使用して約0°Cに冷却した。1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン例えば、約647mg、約5.62mmol、およびN-3-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミドヒドロクロリド例えば、約1.71g、約8.92mmolを添加し、およそ室温で一晩撹拌した。有機層をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーSiO2、ヘキサン中約75の酢酸エチル~ジクロロメタン中約5のメタノールを使用して精製することによってIII例えば、約767mgを得た。III例えば、約573mg、約1.83mmolのジクロロメタン例えば、約15mLおよびトリフルオロ酢酸例えば、約1.16mL中の溶液を、およそ室温で約9.5時間撹拌した。この物質を減圧下で濃縮し、真空ポンプで一晩乾燥させることによってIVを得た。粗製のIVをジクロロメタン例えば、約15mL、およびジメチルホルムアミド約2滴中に溶解させ、塩化オキサリル例えば、約465mg、約3.66mmolとともに約2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油状物を真空下で1時間乾燥させた。この油状物をジクロロメタン例えば、約15mL中に溶解させ、13B例えば、約464mg、約1.83mmolおよびジイソプロピルエチルアミン例えば、約2.9mL、約16.5mmolとともに、窒素下で約30分間撹拌した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーSiO2、ヘキサン中約85の酢酸エチル~約100の酢酸エチルを使用して精製することによって、リンカー7を得た例えば、約323mg、約39。実施例10リンカー8の合成V例えば、約980mg、約1.91mmol、13C例えば、約484mg、約1.91mmol、ジイソプロピルエチルアミン例えば、約2mL、約11.5mmolのジクロロメタン溶液を、およそ室温で約6時間撹拌した。別の約1当量の13C例えば、約484mg、約1.91mmolおよび約3当量のジイソプロピルエチルアミン例えば、約1mL、約5.73mmolを添加し、およそ室温で一晩撹拌した。この反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥させ硫酸ナトリウム、濾過し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー約100酢酸エチル~酢酸エチル中約5のメタノール~酢酸エチル中約10のメタノールを使用して精製することによって、リンカー8を得た例えば、約285mg、約24。実施例11タンパク質およびリンカーのコンジュゲーションFGF21変異タンパク質を、関連したリンカーと1:10のモル比で、室温で2時間反応させた。次いで、すべてのリンカー結合FGF21タンパク質を、PD-10カラムを使用して精製し、緩衝液を20mMのトリス-HCl、20mMのNaCl、pH7.0中に交換した。実施例12タンパク質-リンカー複合体の抗体とのコンジュゲーションすべてのリンカー結合FGF21タンパク質を、h38C2IgG1配列番号25および2620mMのトリス-HCl、20mMのNaCl、pH7.0と6:1のモル比で、室温で一晩融合させた。タンパク質-リンカー-抗体複合体をSECによって精製した。コンジュゲーション効率は、LCMS分析によって確認した。実施例13タンパク質産生アッセイすべてのFGF21タンパク質は、大腸菌E.coli内で発現させた。細菌によって発現されたFGF21タンパク質は、封入体中に見出された。細胞を溶解させ、上清を除去した後、ペレットを、4°Cで7Mの尿素、50mMのビス-トリスプロパン、pH10.5中に溶解させた。可溶化した封入体を50mMのビス-トリスプロパン、10mMの酸化型グルタチオン、ph9.0中に希釈し、2時間撹拌し、その後、20mMのトリス-HCl、ph7.5に対して4°Cで一晩透析した。可溶性画分をHiTrapQカラムによって精製した。タンパク質をSDS-PAGE分析によって特徴づけた。リシン突然変異体の発現レベルは、10~50mg/Lであった。実施例14Glut1TaqmanアッセイqPCR法によってGlut1mRNA発現を測定するために、分化3T3-L1脂肪細胞を使用した。一晩血清飢餓した10~14日目の分化3T3-L1脂肪細胞を、化合物で6時間処理した。トータルRNAをこれらの細胞から抽出し、Glut1およびGAPDHmRNA発現を、QuantitectProbeRT-PCRキットを使用し、Taqman装置AppliedBiosystems登録商標で定量的リアルタイムPCR反応を実行して測定した。化合物の生物活性は、各試料からのGAPDHmRNAレベルによって正規化されたGlut1mRNAレベルの倍率変化によって判定した。化合物の効力の測定としてのEC50値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。実施例15グルコース取込みアッセイ分化3T3-L1脂肪細胞を、血清の非存在下で、化合物で24時間処理した。次いで細胞を14C-2-デオキシグルコースとともに1時間インキュベートし、細胞内へのグルコース取込みを、Wallac1450MicroBetaTrilux機器で定量化した。グルコース取込みは、1分当たりのカウントCPMで表した。化合物の効力の測定としてのEC50値を、アッセイにおける用量応答曲線から得た。実施例16マウスの薬物動態FGF21抗体コンジュゲートのPKを、IVまたはSC投与後のマウスにおいて検査した。抗体コンジュゲートを若い成体雄のSwiss-Websterマウス20~25gに注射し、血液試料を、投薬後5分~120時間の時点で得た。血清中の抗体コンジュゲート濃度は、ELISAを使用して求め、ELISAは、96ウェルプレートに結合したモノクローナル抗-hFGF21抗体を通じて、抗体コンジュゲートのFGF21部を捕捉した。プレートに結合したFGF21抗体コンジュゲートは、抗hFcモノクローナル抗体を通じて検出し、濃度は、血清含有アッセイ緩衝液中に希釈されたPK投薬溶液PKdosingsolutionの検量線を使用して求めた。SCバイオアベイラビリティーは、SC血清濃度プロファイルの曲線下面積AUCをIV血清濃度プロファイルのAUCで除した比として計算した。実施例17マウスでの効力FGF21抗体コンジュゲートの効力を、2つのマウス肥満インスリン耐性モデル、すなわち、ob/obマウスおよび高脂肪食誘発肥満マウスにおいて評価した。両モデルについて、雄マウスob/obについて生後6~8週間、年齢生後6週間で高脂肪食を開始したDIOについて生後12~14週間を、2~4/ケージで収容し、FGF21抗体コンジュゲートをSC注射によって投与した。毎日午前中に体重を測定した。糖耐性を、経口ブドウ糖負荷試験によって評価した。簡単に言えば、マウスに、試験日の午前中4~5時間絶食させた。基礎血液試料を得、血中グルコースレベルを、携帯型グルコメーターを使用して求めた。基礎試料の後、グルコースを経口強制飼養によって投与し、血液試料を、その15~120分後に抜き取った。糖耐性を、基礎時点から120分の時点までのAUCとして計算した。実施例18K56Ab-L5-FGF21ΔH-K56の活性FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122R配列番号18を上述したように生成および精製した。FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122Rは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があることが判明したEC50=0.9nM;n=2。グルコース取込みは、5.5nMであることが示された。FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122Rを、記載したようにK56においてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-K56を形成した。Ab-L5-FGF21ΔH-K56は、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力を保持しEC50=1.9nM;n=1、17時間のIV半減期および13時間のSC半減期を示した。バイオアベイラビリティーは66であった。実施例19K59Ab-L5-FGF21ΔH-K59の活性FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122R配列番号19を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122Rは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=0.6nM;n=1。グルコース取込みは、0.9nMであった。FGF21ΔH-K56R-K59-K69R-K122Rを、K59においてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-K59を形成した。Ab-L5-FGF21ΔH-K59は、Glut1Taqmanアッセイにおいてインビトロでの効力を保持しEC50=6.5nM;n=2、13時間のIV半減期を示した。実施例20K69Ab-L5-FGF21ΔH-K69の活性FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122R配列番号20を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122Rは、Glut1TaqmanアッセイEC50=1.3nM;n=1およびグルコース取込みアッセイEC50=5.2nMの両方において効力があることが判明した。FGF21ΔH-K56R-K59R-K69-K122Rを、K69においてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-K69を形成した。実施例21K122Ab-L5-FGF21ΔH-K122の活性FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122配列番号21を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122は、Glut1TaqmanアッセイEC50=2.6nM;n=2およびグルコース取込みアッセイEC50=1.7nMの両方において効力があった。FGF21ΔH-K56-K59R-K69R-K122を、K122においてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-K122を形成した。Ab-L5-FGF21ΔH-K122は、インビトロでの効力を保持しGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50=1.6nM;n=2、16時間のIV半減期および14時間のSC半減期を示した。バイオアベイラビリティーは、40であった。実施例22K-ヌル-P2Ab-L5-FGF21ΔH-Kヌル-P2の活性FGF21ΔH-Kヌル-P2配列番号22を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-Kヌル-P2は、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=1.2nM;n=2。FGF21ΔH-Kヌル-P2を、P2のN’末端においてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-Kヌル-P2を形成した。Ab-L5-FGF21ΔH-Kヌル-P2は、インビトロでの効力の低減Glut1TaqmanアッセイにおいてEC50=16.6nM;n=1、および17時間のIV半減期を示した。実施例23Kヌル-H1KAb-L5-FGF21ΔH-Kヌル-H1Kの活性FGF21ΔH-Kヌル-H1K配列番号23を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-Kヌル-H1Kは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=6.4nM;n=2。FGF21ΔH-Kヌル-H1Kを、H1KにおいてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔK-Kヌル-H1Kを形成した。FGF21ΔH-Kヌル-H1Kは、インビトロでの効力を保持しGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50=4.3nM;n=2、16時間のIV半減期、11時間のSC半減期、および51のSCバイオアベイラビリティーを示した。実施例24K-ヌル-S181KAb-L5-FGF21ΔH-Kヌル-S181Kの活性FGF21ΔH-Kヌル-S181K配列番号24を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-Kヌル-S181Kは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=7.5nM;n=2。FGF21ΔH-Kヌル-S181Kを、S181KにおいてL5と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L5-FGF21ΔH-Kヌル-S181Kを形成した。Ab-L5-FGF21ΔH-Kヌル-S181Kは、インビトロでの効力の喪失を示したGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50≧500nM;n=2。実施例25リシン突然変異体の活性の結果の要約すべてのリシン突然変異タンパク質は、Glut1Taqmanアッセイにおいて活性であった。コンジュゲートさせたとき、コンジュゲートの大部分K56、K59、K122、Kヌル-H1Kは、Taqmanアッセイにおいて活性を保持し、EC50値は、天然FGF21タンパク質のEC50値と同様であった。Kヌル-P2コンジュゲートは、初期効力のいくらかの低減を示し、Kヌル-S181Kコンジュゲートは、Taqmanアッセイにおいて活性の喪失を示した。実施例26システイン-マレイミドコンジュゲーションを使用する、FGF21上の最適な係留部位の同定連結残基としてシステイン置換突然変異を導入する際の課題の1つは、システイン残基は、それ自体他の残基と接触し、かつ/または塩橋もしくは水素結合を形成する場合があることである。モデル化された構造を使用して原子レベルの距離を予測することは困難であり得るが、いくつかの残基を、FGFR1c結合部位およびβKlotho結合部位から遠位に位置される潜在性に基づいて選択した:His1、Thr40、Asp79、Leu86、His125、およびAla129。6つすべての残基は、構造要素ターンおよびループ、アクセス可能な表面積ASA、ならびに環境の形状凸面および凹面に関して互いに異なっており、すべてをFGFR1c相互作用に対してタンパク質の反対側でモデル化した表2。特に、His1、Asp79、Leu86、およびHis125は、これらの部位に伴った高ASA値のために、潜在的に魅力的なコンジュゲーション部位であると同定された。実施例27H1CFGF21ΔH-H1CFGF21ΔH-H1C配列番号16を生成し、発現させた。しかし、FGF21ΔH-H1C突然変異体は、N’システイン基を欠いており、したがって、この突然変異体の調査を中止した。実施例28T40CFGF21ΔH-T40CFGF21ΔH-T40C配列番号15の生成により、重要な課題が示された。40位におけるトレオニンのシステイン突然変異は、再折りたたみ後に、RP-HPLCにおいてFGF21ΔH-T40Cの複数の化学種を生じさせた。グルタチオンを付加して、および付加しないで、タンパク質の濃度およびpHを変更することによって、再折りたたみプロセスを改善するためのさらなる試みを行った。再折りたたみプロセスは、RP-HPLCによってモニターした。グルタチオンを付加すると、T40Cの再折りたたみが効率的になるが、グルタチオンは、最も確実には、40位における導入されたシステインを通じて、FGF21上で結合されることが判明した。グルタチオン付加体は、野生型FGF21ΔHと同じ生物活性を示し、40位は、FGF21による受容体活性化に関与していないことを示した。実施例29D79CAb-L1-FGF21ΔH-D79Cの活性FGF21ΔH-D79C配列番号12を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-D79Cは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=2.1nM;n=4。FGF21ΔH-D79Cを、D79CにおいてL1と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L1-FGF21ΔH-D79Cを形成した。Ab-L1-FGF21ΔH-D79Cは、インビトロでの効力を保持しGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50=3.7nM;n=3、17時間および19時間のIV半減期n=2、20時間および20時間のSC半減期n=2、および55および70のSCバイオアベイラビリティーを示したn=2。実施例30FGF21ΔH-D79Cの安定性アッセイFGF21ΔH-D79C突然変異タンパク質を、上述したように大腸菌E.coli内で生成し、精製した。FGF21ΔH-D79Cを培養液1Lから発現させた。150mgの封入体を得、85mgの精製タンパク質を得、60の収率に相当した。FGF21ΔH-D79CおよびFGF21ΔH配列番号2の安定性を試験するために、新たに解凍した試料を7日にわたって4°Cに保持し、0日目、3日目、および7日目に、RP-HPLC、SEC_HPLC、Ellmanアッセイ、およびSDS-PAGEによってこれらの完全性について検査した。FGF21ΔH-D79Cは、中性のpH7.4で安定であることが判明し、4°Cで7日間インキュベートした後でさえ、わずかな量のFGF21ΔH-D79Cしか酸化および二量体化されないと考えられ、一方、FGF21ΔH-D79Cの半分超が、4°Cで3日間インキュベートした後、pH6.0で酸化された。PBSpH7.4、および20mMのトリス-HCl、50mMのNaClpH7.5は、FGF21ΔH-D79Cの安定性の有意な差を生じなかった。FGF21ΔH-D79Cの遊離システインがpH6.0よりpH7.4においてより安定であった理由は明らかでない。WTFGF21の計算された等電点pIは、5.43でありe.e.、FGF21-H1-P146、FGF21ΔHのpIは5.27であり、FGF21ΔH-D79CのpIは5.47であった。FGF21ΔH-D79Cの溶解度がpH6.0で低減され得る可能性がある。FGF21ΔH-D79Cの安定性を、複数の凍結/解凍サイクルで検査した。タンパク質を9回繰り返して凍結-80°Cおよび解凍4°Cさせた。いずれの試料も、RP-HPLC、SEC、およびEllmanアッセイにおいてサイクル1とサイクル9の間でまったく差を示さなかった。結論として、FGF21ΔH-D79Cは、-80°Cより4°Cにおいて著しく不安定であると考えられた。実施例31L86CFGF21ΔH-L86CFGF21ΔH-L86C配列番号14を記載したように生成および精製した。ほとんどの疎水性残基は、タンパク質コア内に埋もれているが、一部の残基は、溶媒に曝露され、これがタンパク質の不溶性の原因となり得る。Leu86は疎水性残基であり、FGF21のモデル化された構造において、溶媒に曝露されているようである。突然変異L86Cは、溶解度の利点をもたらし得るとみなした。L86C突然変異は、非効率な再折りたたみ、および低いタンパク質収率をもたらした。グルタチオンを付加すると、L86Cの再折りたたみが効率的になったが、1つを超えるグルタチオンが、最も確実には、導入されたC86および天然システイン残基を通じて1つのFGF21分子上に結合されていることが判明した。グルタチオン付加体は、生物活性の約10分の1の低減を示し、したがって、FGF21ΔH-L86Cの調査を中止した。実施例32H125CAb-L1-FGF21ΔH-H125Cの活性FGF21ΔH-H125C配列番号7を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-H125Cは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=1.2nM;n=3。FGF21ΔH-H125Cを、H125CにおいてL1と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L1-FGF21ΔH-H125Cを形成した。コンジュゲートされたとき、Ab-L1-FGF21ΔH-H125Cは、インビトロでの効力を保持しGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50=3.2nM;n=4、37時間のIV半減期、32時間のSC半減期、および67のSCバイオアベイラビリティーを示した。実施例33A129CAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの活性FGF21ΔH-A129C配列番号10を記載したように生成および精製した。FGF21ΔH-A129Cは、Glut1Taqmanアッセイにおいて効力があったEC50=1.4nM;n=6。FGF21ΔH-A129Cを、A129CにおいてL1と結合させ、h38C2とコンジュゲートさせることによって、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cを形成した。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、インビトロでの効力を保持しGlut1TaqmanアッセイにおいてEC50=2.7nM;n=7、33時間のIV半減期、37時間のSC半減期、および69のSCバイオアベイラビリティーを示したマウスにおいて。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、60時間のラットにおけるIV半減期、39時間のラットにおけるSC半減期、および52のラットにおけるSCバイオアベイラビリティーを示した。サルにおいて、IV半減期は65時間であり、SC半減期は48時間であり、SCバイオアベイラビリティーは68であった。実施例34エンドトキシン純度の改善FGF21ΔH-H125CおよびFGF21ΔH-A129Cタンパク質を大腸菌E.coli発酵培養よって生成した。エンドトキシンレベルを低減するために、エンドトキシンレベルを10EU/mlから0.1EU/mLに低減した最初のQの後に、追加のQステップを利用した。精製プロトコールを以下のように改変した。IB約10gを培地1Lから得、7Mの尿素、5mMのDTT、50mMのBTPビス-トリスプロパンpH10.540mLで可溶化した1~2時間。FGF21タンパク質の還元をRP-HPLCによってモニターした。可溶化タンパク質を、50mMのBTP、pH8.0400mL中に希釈することによって再折りたたみさせた24~36時間。FGF21の天然ジスルフィド結合の酸化をRP-HPLCによってモニターした。再折りたたみがほとんど完了した後、溶液を、20mMのトリス-HCl、pH7.54Lに対して2回透析した。未可溶化タンパク質を、20,000×gで60分間、4°Cで遠心分離することによって沈殿させた。上清をHitrapQFF上に装填し、0~200mMのNaClの勾配20CV、20mMのトリス-HCl、0.01mMのTCEP、pH7.5を用いてFGF21タンパク質を溶出した。収集画分を、0~100mMのイミダゾールの勾配10CV、0.01mMのTCEP、PBS、pH7.4を伴ったHitrapNi-NTAFF上に装填することによって、残留DNAを効率的に除去した。所望の画分を、20mMのトリス-HCl、0.01mMのTCEP、pH7.54Lに対して2回透析し、0~100mMのNaClの勾配20CV、20mMのトリス-HCl、pH7.5を伴ったHitrapQHPカラム上に装填して溶出した。精製タンパク質画分を収集し、0.22μmフィルターを用いて滅菌し、-80°Cで貯蔵した。培地1Lからの一般的な収量は、約350~約400mgであった。精製タンパク質の一般的な収量は、約220~約280mgであった。この精製技法により、95超の純度、および約1EU/mgの一般的なエンドトキシンレベルを有するタンパク質を得た。振盪フラスコの代わりに発酵槽を使用すると、収量が約4~約5倍改善した。実施例35リンカーの選択以下のL1のマレイミド環は、経時的に開環およびその後の生成物分解に感受性である場合があることが公知であるWoodnutt,G;IBCConference、BeyondAntibodies/ProteinEngineeringDesign、SanDiego、2009年9月21~23日。L1などのマレイミドリンカーは、スキーム1に示したように、チオールと反応してマレイミド部分とのチオール付加体を形成し得る。チオールのマレイミドへのこの付加反応は、マイケル反応と呼ばれる。その後、アミンを含有する基抗体h38C2などが、スキーム1に示したようにAZDβ-ラクタムと反応することによって6を生じ得る。得られるチオール-スクシンイミド付加体は安定である。しかし、スクシンイミド環は、ゆっくりとした加水分解性開裂を経時的に起こし、7および/または8をもたらす場合がある。したがって、マイケル反応を起こすその能力を保存しつつ、加水分解性開裂に対する安定性が改善したマレイミド環を有することが望ましい。実施例36マレイミドの修飾したがって、より安定なリンカーを、マレイミド環を修飾することによって生成することができるという予想とともに、L1中のマレイミド環の安定性を検査した。水によるマレイミド環の潜在的な加水分解性開裂を遅延させるために、3つの異なる手法L2~L4を採用することによって環を修飾し、安定性を改善した。最初に、環に結合した小さいアルキル基は、スクシンイミド環の加水分解性開裂を遅延させ得ると想定した。スクシンイミド環上にメチル基を有するリンカー2を調製した。環が加水分解性開裂を起こすために、水分子がカルボニル基に付加し、遷移状態として四面体中間体を形成する。メチル基が存在すると、四面体中間体の形成が立体的かつ電子的に制限され、加水分解速度が相当に遅延するはずである。第2の修飾は、マレイミド環のカルボニル基のすぐ近くにおけるプロピオンアミドカルボニル基に目を向けた。カルボニル基は一般に、水を引きつける。マレイミド環にごく接近してカルボニル基があると、水を引きつけることが助長され、マレイミド環のカルボニル基上の攻撃が促進される。プロピオンアミドカルボニル基を除去することによって、加水分解性開環反応が遅延される。この修飾は、L3において見られる。第3の修飾は、L4において見られるように、プロピオンアミド基の代わりにシクロヘキシルメチレン基を導入することであった。シクロヘキシル環のかさ高い疎水性は、環が開いた加水分解性開裂に必要とされる、環のカルボニル基への水の付加による四面体中間体の形成に対して、電子的および立体的の両方で妨害する。これにより、加水分解性開裂が遅延されることが予想された。安定性試験安定性試験のために、リンカーL1~L4から1-3-4-アミノフェニルプロパノイルアゼチジン-2-オン部を除去した。マレイミドが3アミノ酸ペプチドのグルタチオンとコンジュゲートした4つの試験化合物30~33を作製した。実施例37化合物30の合成3-2-2-3-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イルプロパンアミド-エトキシエトキシプロパン酸164mg、0.5mmolおよび還元グルタチオン154mg、0.5mmolのジメチルスルホキシド5mL溶液を、室温で17時間撹拌した。酢酸エチル25mLをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル25mLで洗浄し、乾燥させることによって化合物30252mgを得た。実施例38化合物31の合成3-2-2-3-3-メチル-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イルプロパンアミドエトキシエトキシプロパン酸42mg、0.12mmolおよび還元グルタチオン37mg、0.12mmolのジメチルスルホキシド1.2mL溶液を、室温で22時間撹拌した。エーテル10mL中50の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル25mLで洗浄し、乾燥させることによって化合物3167mgを得た。実施例39化合物32の合成3-2-2-3-メチル-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イルエトキシエトキシプロパン酸50mg、0.2mmolおよび還元グルタチオン61mg、0.2mmolのジメチルスルホキシド2mL溶液を、室温で25時間撹拌した。エーテル30mL中65の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル25mLで洗浄し、乾燥させることによって化合物3292mgを得た。実施例40化合物33の合成3-2-2-4-3-メチル-2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イルメチルシクロヘキサンカルボキサミドエトキシエトキシプロパン酸50mg、0.12mmolおよび還元グルタチオン37mg、0.12mmolのジメチルスルホキシド1.2mL溶液を、室温で22時間撹拌した。エーテル10mL中50の酢酸エチルをこの反応混合物に添加し、固体を濾過した。この固体を追加の酢酸エチル25mLで洗浄し、乾燥させることによって化合物3375mgを得た。実施例41化合物30~33の安定性試験化合物30、31、32、および33を、開環生成物の形成およびグルタチオン開裂についてLC-MSでモニターした。これらの新規類似体を、40°CでpH=6.5の緩衝液、40°CでpH=7.5の緩衝液、および4°CでpH=7.5の緩衝液で、すべて2週間の期間にわたって、これらの安定性について検査した表3A~C。化合物30、31、32、および33を室温で緩衝液中に溶解させた。試料を40°Cでインキュベートし、緩衝液を設定間隔で分析した。規定間隔で、緩衝液10μLをAgilent高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計に注入して分析した。カラムからの溶離液を、210nmおよび254nmでUV分光計を使用し、質量分析計も使用してモニターした。加水分解副生成物を、質量分析計を使用してモニターし、加水分解率を特定の質量の全イオン電流に基づいて計算した。表3A~3C中の加水分解を示すLC-MSデータから、L2、L3、およびL431~33の修飾されたマレイミド環は、L130中のマレイミド環と比較して、40°CでpH=6.5において5~10倍より安定であり、40°CでpH=7.5の緩衝液で4~15倍より安定であり、4°CでpH=7.5の緩衝液で最大20倍より安定であることが明白であった。グルタチオンコンジュゲーションの結果表3A、3B、および3C中のデータを含むは、IBCConference、BeyondAntibodies/ProteinEngineeringDesign、SanDiego、2009年9月21~23日において論じられた。実施例42FGF21にコンジュゲートされたリンカーL1~L4の安定性FGF21にコンジュゲートした後の4つのリンカーの2週間にわたる化学的安定性を調査するために、以下の実験を実施した。各リンカーをFGF21にコンジュゲートさせ、4°Cの貯蔵条件に置き、特定の時点でアリコートを取り出し、凍結させることによって急冷し、リンカーの安定性をLCMS分析によってモニターした。4つのリンカーを、凍結乾燥ストック材料からDMSO中に溶解させた。FGF21ΔH-A129Cタンパク質を0.1mMのTCEPを用いて部分的に30分間還元した後、1:1のリンカー:タンパク質比でリンカーストックを付加した。コンジュゲーション反応におけるFGF21ΔH-A129Cタンパク質濃度は、5mg/mlであった。L1は、30分間タンパク質と反応させ、L2、L3、およびL4は、2時間反応させた。コンジュゲーション反応は、サイズ排除樹脂を通じて過剰のリンカーを除去することによって停止させた。コンジュゲートされたFGF21ΔH-A129Cタンパク質を、安定性試験のために4°Cに置いた。t=0安定性試験の前、ならびにt=1日、3日、8日、および14日にアリコートを取り出した。リンカー安定性の分析を、LC-MS分析によって実施することによって、未コンジュゲートタンパク質、タンパク質リンカーコンジュゲーション、ならびにコンジュゲートされたタンパク質リンカーの1回および2回の加水分解事象の相対量を判定した。リンカーの加水分解は、本実験において極めて重要な分析的変量である。加水分解は、FGF21-リンカー複合体へのH2Oの後続の付加を観察することによってモニターした。H2Oの1つの付加、1H2Oは、4つすべてのリンカー上に存在する活性なAZD基の加水分解を示す可能性が高い。第2のH2O分子の付加、2H2Oは、リンカー中の加水分解例えば、化学的不安定性の強い指標である。L1は、マレイミド官能基が存在するので特に感受性である。以下の表4中の実験結果は、L1が2H2Oの最大の増加を起こすことを実証する。t=0において、L1~L4のそれぞれは、測定される全タンパク質の6~8の間の2H2Oの測定値を有していた。2週間の間、これらの試料をモニターし、L1において観察された2H2Oは、18まで増加した一方で、残りのリンカーL2~L4のそれぞれの値は、6~8で一定であった。このデータは、L1がL2~L4と比較して相対的に不安定であることを示唆する。実施例43L1~L4とコンジュゲートされたAb-FGF21ΔH-A129CL2~L4は、様々な条件表3A~Cを参照下でのグルタチオンコンジュゲーション、およびFGF21表4を用いて、L1より安定であることが先に示された。修飾されたマレイミドリンカーL2~L4は、FGF21ΔH-A129Cと融合させ表5に示したコンジュゲーション効率、Glut1Taqmanアッセイにおいて活性を示した表5:EC50値は、FGF21ΔHについての相対値に対して正規化されている。しかし、前述の意に反して、Ab-L2-FGF21ΔH-A129C、Ab-L3-FGF21ΔH-A129C、Ab-L4-FGF21ΔH-A129Cは、それぞれ、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cよりインビボで不安定であった。これは、IV投薬後の血液循環中のより低い維持レベル、ならびにSC投薬後の血液循環中のより低いピークおよび維持レベルとして明白であった図2A~C、表6。意外にも、これらの結果は、緩衝系において小ペプチドに融合されたリンカーを用いて行った安定性試験の結果と逆になった。これらの結果は、マウス血清中での追加の試験において裏付けられた。FGF21ΔH-A129Cを、L1、L2、L3、およびL4のそれぞれを使用してh38C2にコンジュゲートさせた。各試料をマウス血清中で希釈して0.3mg/mlにし、37°Cでインキュベートした後凍結させ、その後2DLC/MSによって分析した。参照標準と比較して、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、5分後に149、34時間後に66、72時間後に81で検出され、120時間までに検出不可能であった。対照的に、Ab-L2-FGF21ΔH-A129C、Ab-L3-FGF21ΔH-A129C、Ab-L4-FGF21ΔH-A129Cは、すべての試料中で検出不可能であった。実施例44L1L2とコンジュゲートされたAb-FGF21ΔH-A129Cのラット試験FGF21タンパク質を抗体骨格にコンジュゲートさせるのに使用したリンカーが異なる2つのバージョンのAb-FGF21ΔH-A129Cの単回用量薬物動態PKを、雄のスプラーグドーリーラットにおいて求めた。ラットにAb-L1-FGF21ΔH-A129CマレイミドリンカーまたはAb-L2-FGF21ΔH-A129CメチルマレイミドリンカーをIVまたはSC投与し3mg/kg、投与して5分後~14日後の期間で血液試料を抜き取った。血清Ab-FGF21ΔH-A129CレベルをELISAによって判定し、ELISAにおいて、FGF21コンジュゲートは、FGF21に特異的なモノクローナル抗体を介して捕捉し、抗ヒトFcによって検出した。得られたPKデータは、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cコンジュゲートは、Ab-L2-FGF21ΔH-A129CコンジュゲートT1/2:IV=52時間、SC=33時間;SCバイオアベイラビリティー=36と比較すると、優れたPK特性T1/2:IV=60時間、SC=38時間;SCバイオアベイラビリティー=52を有することを実証した図3Aおよび表7。これらの結果は、小ペプチドに融合されたこれらのリンカーを用いて緩衝系において行った安定性試験の結果を考慮すると予想されなかった。実施例45Glut1RNAに対するL1およびL2を用いたAb-FGF21ΔH-A129Cの効果8日目に、24ウェル組織培養プレートFalcon登録商標、カタログ番号353047中に3T3-L1脂肪細胞を播種し、DMEM完全培地10のFBS、2mMのL-グルタミン、1のP/S中で、37°C、5のCO2でインキュベートした。0.2のBSAを含む無血清DMEM培地で一晩細胞を飢餓にし12日目、Ab-L1-FGF21ΔH-A129CおよびAb-L2-FGF21ΔH-A129Cを用いて、0.2のBSAを含有する無血清DMEM中で、37°Cで6時間処理した。培地を吸引し、次いで、製造者の指示書に従ってRNeasyミニキットを使用して、RNAを細胞から抽出した。Spectramax登録商標Plus分光光度計を使用してA260nmでRNAを測定した。FGF21ΔH、FGF21ΔH-A129C、Ab-L1-FGF21ΔH-A129C、およびAb-L2-FGF21ΔH-A129Cによって3T3-L1脂肪細胞を刺激すると、用量依存的にGlut1が誘導された。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、Ab-L2-FGF21ΔH-A129Cより効力があると考えられた表8。実施例46リンカー長試験リンカー長のトレランスを評価するために、Ab-L1-FGF21ΔH-D79C、Ab-L7-FGF21ΔH-D79C、およびAb-L8-FGF21ΔH-D79Cを互いに試験した。すべてが、細胞ベースアッセイにおいて同様のPK図3Bおよび表9ならびに同等の効力データを示さずを示した。実施例47残基位置およびリンカー選択の要約H1C、T40C、D79C、L86C、H125C、およびA129Cを、チオール-マレイミドコンジュゲーションストラテジーを使用して、潜在的なコンジュゲーション部位として試験した。これらのうちで、H1C、T40C、およびL86Cは、発現および再折りたたみに問題を示した。D79C、H125C、およびA129Cは、すべてが許容できるレベルのタンパク質生成を示し、未コンジュゲート突然変異タンパク質は、効力があるままであることを実証したので、さらに探求した。Ab-FGF21ΔH-D79C、Ab-FGF21ΔH-H125C、およびAb-FGF21ΔH-A129Cは、FGF21ΔHと同様の生物活性を示し、これらの位置での抗体のコンジュゲーションは、受容体結合を妨害しないことを示唆した。D79C、H125C、およびA129Cは、FGF21ΔHと同様の安定性および生物活性を有する。試験したすべてのリシン突然変異体抗体コンジュゲートは、H125CおよびA129C抗体コンジュゲートより劣ったマウスのPKを示し、IV半減期は13~17時間であった表10。Ala129は、溶媒にそれほど曝露されておらず、D79またはH125より溶媒に曝露されていないが、FGF21ΔH-A129Cは、意外にも、最も安定な突然変異体および抗体コンジュゲーションついて試験した最良の位置の1つであった。これは、突然変異が非保存的であるので予期されなかった。理論によって束縛されることを望まないが、A129Cにおいてコンジュゲートすることの独特の適性についていくつかの可能な理由が存在する。第1に、Ala129およびHis125はともに、FGF21のモデル化された構造において柔軟であるループ領域内に位置する。これらの領域は通常、他のヘパリン結合FGFメンバーのためのヘパリン結合部位である。FGF19、FGF21、およびFGF23は、ヘパリンと相互作用しないので、この領域の配列忠実度を維持することは、これらの生物学的機能にとって極めて重要ではない場合がある。この位置の柔軟性は、受容体結合の妨害を回避するための抗体-コンジュゲーションにとって有利となり得る。第2に、Ala129は、正に帯電した残基、すなわち、His125、Arg126、Arg131、およびArg135によって囲繞されている。この正に帯電したパッチは、強い帯電反発のためにFGF21ΔH-A129CのSS-二量体化を回避することができる。第3に、これらの帯電残基は、マレイミドリンカーL1の安定化を促進することができ、これは、これらが存在しない場合、マレイミドを開環した後にカルボキシレートを生成し得る。したがって、マレイミド連結ストラテジーを使用してFGF21をコンジュゲートする場合、A129の特定の残基位置で連結することは、特に有利であると考えられる。Ab-L1-FGF21ΔH-A129CならびにAb-L1-FGF21ΔH-H125Cはともに、マウスモデルにおいて少なくとも30時間の高いIV半減期およびSC半減期、ならびに良好なバイオアベイラビリティーを示す。両コンジュゲートは、Glut1Taqmanアッセイにおいて4nM未満の効力を実証する。一般に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、Ab-L1-FGF21ΔH-H125Cと比較してわずかに改善された半減期および効力を示す。Ab-L1-FGF21ΔH-A129CにおいてL1を使用することはまた、インビトロ試験が示唆したものに対して意外なインビボでの利点を示し、試験したリンカーと比較して、全体的に最も有利なリンカーであると考えられた。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの構成要素抗体、リンカー、連結残基位置、連結残基、タンパク質の特定の組合せは、半減期、バイオアベイラビリティー、効力、活性、生成の容易さ、および複数の選択肢と比較した加水分解に対する耐性において最適条件をもたらすと考えられる。実施例48化合物の効力化合物Ab-FGF21ΔH-K56およびAb-FGF21ΔH-Kヌル-H1Kで処置したob/obマウスにおいて糖耐性について試験した。両化合物は、Ab-FGF21ΔH-H125C図4Aおよび4BおよびAb-FGF21ΔH-A129C図5Aおよび5Bより劣っていた。対照的に、Ab-FGF21ΔH-D79CおよびAb-FGF21ΔH-H125Cは、糖耐性を改善し、体重増加を低減することが示された図4A、4B、6A、6B、6C、6D、および表11。Ab-FGF21ΔH-A129Cは、ob/obマウスにおいて、糖耐性を改善することが判明し、白色脂肪組織WAT内でのUcp1発現の増大によって証明されるエネルギー消費量の増大により体重増加を低減し、肝脂肪変性を逆行させる図6E、6F、6G、6H、および表12。Ucp1発現について、インビボでの効力試験から収集した凍結内臓WAT試料をホモジナイズした。トータルRNAを組織ホモジネートから抽出し、Glut1およびGAPDHmRNA発現を、QuantitectProbeRT-PCRキットを使用し、TaqmanmachineAppliedBiosystemsで定量的リアルタイムPCR反応を実行して測定した。各試料からのGAPDHmRNAレベルによって正規化されたGlut1mRNAレベルの倍率変化によって、処置の効果を判定した。Ab-FGF21ΔH-A129Cは、WAT内でのUcp1発現の増大、DIOマウスにおける血清トリグリセリドレベルおよび脂肪酸レベルの低減、ならびに肝重量の減少によって示唆されるエネルギー消費量の増大により、体重減少を引き起こした図7A、7B、7C、7D、7E、および表13。肝重量の低減も、ob/obマウスにおいて観察された図7Fおよび表14。ob/obマウスにおいてさらに試験すると、ステアロイル-補酵素Aデサチュラーゼ-1SCD1、モノアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼMOGAT2、およびフォークヘッドボックスA2FoxA2のRNAレベルの低減が実証された図7G、7Hおよび7i、ならびに表15。実施例49ob/obモデルにおけるAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの血漿薬物レベルob/obマウスにおけるAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの用量関連血清レベルを、10mg/kgおよび3mg/kgで投薬後、投与して3日後、4日後、5日後、および6日後に検査した。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの血清レベルは、十分に維持されていると観察された図7Jおよび7K。これらの結果は、健康な動物における薬物動態と一致した。実施例50インスリン感受性に対するAb-L1-FGF21ΔH-A129Cのインビボでの効果意識のある、抑制のないob/obマウスにおける全身インスリン感受性グルコース注入速度として測定および高インスリン正常血糖クランプの間の肝糖産生に対するAb-L1-FGF21ΔH-A129Cのインビボでの効果を判定するための試験を行った。Ab-L1-FGF21ΔH-A129C30mMの酢酸塩緩衝液、pH4.8中を、10mg/kgの用量で、1週間に週2回SC投与した。投薬体積は、注射1回当たり2mL/kgであった。Ab-FGF21ΔH-A129Cは、試験の2日目および5日目に注射した。ビヒクル30mMの酢酸塩緩衝液、pH4.8を、試験の2日目および5日目に、注射1回当たり2mL/kgの投薬体積で週2回投与した。マウスに、手術直前にケトプロフェン2mg/kgSCおよびアンピシリン100mg/kgSCで処置した。動物1群当たりn=8を、これらの1日目の空腹時血漿グルコースおよび体重によって無作為化した。試験の1日目、4日目、7日目、および8日目に体重を記録した。意外にも、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、本試験において体重に対する効果を実証しなかったデータを示さず。空腹時血漿グルコースは、Accu-Chek手持ち式グルコメーターRocheを用いて1日目4時間の絶食、および8日目16時間の絶食に求めた。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、本試験において空腹時血漿グルコースレベルに対して効果がなかったデータを示さず。試験の7日目に、マウスを16時間絶食させた後、8日目にクランプ手順を行った。8日目に、カテーテルを露出させ、動物を注入ラインに接続した。クランプ手順を開始する90分前に-90分、6μCiボーラスの[3-3H]グルコースを頸静脈中に注射し、その後、クランプの最後まで0.1μCi/分の一定注入を行った。基礎HGPを求めるために、-10分および0分に血液を収集した。時間0分に、多様なグルコース注入50のデキストロースおよびインスリン20mU/kg/分の一定注入を開始した。血漿グルコースを、尾静脈から10分毎に測定し、定常状態に到達するまで、各動物のグルコースレベルによってグルコース注入速度を調整した。170分および180分の時点で、血液を収集してクランプされた条件下での肝糖産生HGPを求めた。クランプ手順の間に、動物は、抑制がなく、意識があった。肝糖産生HGPを、以下の式を使用して計算した:HPG=Ra-コールドグルコース注入coldglucoseinfusionの速度、式中、Ra=グルコース注入速度dpm/分=mg/kg/分血液比活性dpm/mg×体重kg出現の速度Ra=消滅の速度Rd定常状態としてAb-L1-FGF21ΔH-A129Cは、ビヒクル処置動物と比較して、ob/obマウスにおいて体重または空腹時血漿グルコースに影響しなかった。すべての動物は、順調にクランプされ、クランプの最後の30分の間に、100~110mg/dlの正常血糖性血漿グルコースレベル、および一定のグルコース注入速度に到達した。正常血糖100mg/dL~110mg/dLの血漿グルコースは、ビヒクル処置群およびAb-L1-FGF21ΔH-A129C処置群において到達した。血漿グルコースレベルは、高インスリン正常血糖クランプの全期間にわたって測定した図8A。実験クランプ期間の最後の30分の間で、ビヒクル処置動物とAb-L1-FGF21ΔH-A129C処置動物との間に統計的差異はまったくなかった。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、ビヒクルと比較してグルコース注入速度GIRを著しく増大させた図8B。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、基礎肝糖産生HGPを変化させなかったが、クランプされた高インスリン性条件下でHGPを著しく抑制した図8C。結論として、本試験において、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、体重または空腹時血漿グルコースレベルに対する効果を有することなく、ビヒクル処置動物と比較して、全身インスリン感受性の尺度であるグルコース注入速度を著しく増大させ、肝糖産生を抑制した。実施例51カニクイザルCynomolgusmacaqueにおけるAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの効果本試験の目的は、週2回のSC注射を介して、肥満インスリン耐性前糖尿病性カニクイザルCynomolgusmacaqueに投与したときの、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの血漿血糖指数および脂質指数、ならびに糖耐性および炎症性生物マーカーに対する効果を評価することであった。本試験はまた、FGF21ΔHの毎日の投薬と比較した、サルにおけるAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの薬力学的PD効果の継続時間を判定するように設計した。22匹の成体カニクイザルカニクイザルMacacafascicularisを本試験に含めた。サル13匹の雄、9匹の雌を、性別、体重、ならびに投薬開始2週間前に収集したベースライン血漿試料で測定した基礎血糖指数および基礎脂質指数に基づいて6個体の4つの処置群に階層化した。動物を高脂肪食で維持した。動物に4週間投与し、その後、4週間のウォッシュアウト期間を設けた。動物に以下のように投与した:1.5mg/kg群A;4匹の雄m、1匹の雌fおよび0.15mg/kg群B;3m、3fで、25mMのトリス、125mMのNaCl、pH7.0中のAb-L1-FGF21ΔH-A129Cを週2回SC、ビヒクル7.0の最終pHで25mMのトリスおよび125mMのNaClを週2回s.c.群C;3m、3f、ならびに0.3mg/kgでFGF21ΔHを毎日1回QD群D;3m、2f。ウォッシュアウトの3週目に試料を収集しなかったことを除いて、投薬期間およびウォッシュアウト期間の間、血液試料を毎週収集した。一晩絶食させた後16~18時間、サルに、筋肉内IM注射によってケタミン10~15mg/kgで鎮静した。体重を記録し、約1.8トリプシン阻害剤単位TIUのアプロチニンSigma、全血1mL当たり0.6TIUで前処理した、エチレンジアミン四酢酸EDTA処理済みバキュテイナー管中に、経皮大腿静脈穿刺を介して血液5mLを収集した。管を直ちに氷上に置いた。血漿を遠心分離によって調製し、得られた血漿を分注し、-80°Cで凍結させた。血漿薬物レベルサンプリングを、投薬期間の1日目、14日目、および28日目に行った。血漿Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイELISAを使用して求めた。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cを、マウス抗イディオタイプh38C2を使用して捕捉し、FGF21のN末端およびC末端に対するビオチン化マウス抗FGF21モノクローナル抗体の混合物を用いて検出した。C末端検出抗体は、FGF21の最後の4~5アミノ酸に特異性を有し、一方、N末端検出抗体は、FGF21の最初の11~12アミノ酸に対して産生させた。二重検出試薬アッセイのための最小の要求される希釈は、3のBSAリン酸緩衝溶液中で1:20であった。較正範囲は0.03~10μg/mLであり、定量化範囲は0.03~4μg/mLであった。データを、各薬力学的エンドポイントについて同様に処理した。各個々のサルについてのベースライン値を、各時点から減じることによってベースラインからの変化に対応する値を得た。ベースライン値からの変化を各処置群において各時点について平均し、平均の標準誤差SEMを計算した。結果を、試験の時間経過にわたって、各処置群についてのベースラインからの平均変化±SEMとして報告する。0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAb-L1-FGF21ΔH-A129Cで処置した動物について、各時点での統計的有意性を、ベースライン値からの変化およびスチューデントT検定対応のない標本、不等分散を使用して、ビヒクルに対して評価した。FGF21ΔH処置動物についてのビヒクル対照群が無かったので、ベースライン値からの変化ではなく未処理のデータを使用することによって統計的有意性を評価した。この場合、スチューデントT検定両側、対応のある標本は、ベースラインに対して実施した。実施例52Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの血漿薬物レベル血漿薬物レベルを表16に示す。測定可能な薬物レベルは、最初に投与して4時間後、および試験したすべての後続の時点で存在した。実施例53体重両AB-L1-FGF21ΔH-A129C投与群における2週間後、およびFGF21対照タンパク質で処置した群における1週間後において、処置に対する体重の有意な減少があった図9A。すべての群において、体重減少は、ウォッシュアウトの期間中、抑えられたままであったが、有意性は、両AB-L1-FGF21ΔH-A129C群において、4週間のウォッシュアウトまでに喪失した。FGF21ΔH処置動物は、AB-L1-FGF21ΔH-A129Cで処置した動物より高い体重減少を示した。食物摂取量は、これらの動物において直接測定しなかったが、いずれの処置群における動物のいずれにおいても、ケアスタッフによって食欲不振は観察されなかった。実施例54空腹時血漿グルコース血漿グルコースを、製造者の指示書に従って、AceAlera登録商標ClinicalChemistryAnalyzerおよび試薬AlfaWassermann登録商標、Caldwell、NJを使用して、酵素比色法を介して測定した。処置群のいずれにおいても経時的な空腹時血漿グルコースの有意な変化はなく図9B、AB-L1-FGF21ΔH-A129Cを用いて処置を延長しても、低血糖症を引き起こさないことを示す。実施例55空腹時血漿インスリン血漿インスリン濃度を、製造者の指示書に従って、Mercodia登録商標Uppsala、スウェーデン製ELISAキットを使用して求めた。処置群のいずれにおいても経時的な空腹時血漿インスリン図9Cレベルの有意な変化はなかった。実施例56空腹時血漿フルクトサミン血漿フルクトサミンを、製造者の指示書に従って、RocheDiagnostics登録商標Mannheim、ドイツ製キットを使用して、AceAleraClinicalChemistryAnalyzerを使用して、酵素比色法を介して測定した。血漿フルクトサミンレベルは、0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群においてそれぞれ処置して4週間後および3週間後、ならびにFGF21対照タンパク質処置動物において3週間後に有意に低減した図9D。この有意性は、特に1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群においてウォッシュアウト期間へと持続したが、FGF21ΔH処置動物については、時点にわたって一貫していなかった。経時的な血漿フルクトサミンレベルの有意な低減は、血糖コントロールの改善を示す。実施例57空腹時血漿グルカゴン血漿グルカゴンを、製造者の指示書に従って、BioPlex登録商標InstrumentLuminexxMAPtechnologyで、Millipore登録商標製ヒト非ヒト霊長類と交差反応する内分泌イムノアッセイキットを使用して測定した。グルカゴンレベルは、3つすべての処置群において減少し、試験全体にわたるある時点で有意性に到達したが、減少の有意性は、処置群にわたって、またはAB-L1-FGF21ΔH-A129C投与群にわたって一貫していない図9E。実施例58静脈内糖耐性試験IVGTT静脈内糖耐性試験IVGTTを、3つの時点、すなわち、ベースラインすなわち、投薬開始の2週間前、投薬して4週間後に再び、および最後に、投薬後ウォッシュアウトの4週間後に各動物で行った。これらの時点で、サルに鎮静剤を投与し、空腹時血液試料を上述したように収集した。50のデキストロース500mg/kg;1mL/kgを、約30秒にわたって末梢静脈頸部または伏在に注入し、その後食塩水洗浄した。デキストロース後5分、10分、20分、30分、および60分に、引き続いて血液試料をEDTA処理済みバキュテイナー2mL中に収集した。グルコースおよびインスリンを、IVGTT時点のそれぞれで測定した。グルコース曲線下面積およびインスリン曲線下面積を、糖耐性試験の間0~60分に計算した。ベースラインとして時間0t=0分の値を使用して、台形法則によって、グルコースおよびインスリン偏位曲線excursioncurveから、グルコースおよびインスリンについてのΔAUCを計算した。0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群について、統計的有意性を、ダネット事後検定とともにANOVAによって、ビヒクルに対して評価した。ベースラインに対するIVGTT時点にわたる有意性を、ダネット事後検定とともに反復測定ANOVAによって、FGF21ΔH群について評価した。グルコースおよびインスリンについての平均計算ΔAUC±SEMを、それぞれ図9Fおよび図9Gに示す。処置群のいずれについても、計算されたパラメータのいずれにおいても有意な変化はなかった。実施例59総血漿コレステロールTPCTPCレベルを、AceAlera分析器で酵素法を使用して測定した。すべての処置群において、処置して1週間後にTPCの有意な減少があった図9H。0.15mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置動物では、TPCレベルは、投薬およびウォッシュアウト段階全体にわたって減少したままであったが、1.5mg/kgおよびFGF21ΔH処置群では、レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに向かってリバウンドした。実施例60トリグリセリドTGTGレベルを、AceAlera分析器で酵素法を使用して測定した。1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群およびFGF21ΔH処置動物の両方において、投薬期間にわたってTGの有意な減少があった図9i。TGレベルの低減は、FGF21ΔH処置群において、ウォッシュアウト段階にわたって持続したが、1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群におけるTGレベルは、ウォッシュアウト段階でベースラインに向かう傾向があった。実施例61非エステル化遊離脂肪酸FFA非エステル化遊離脂肪酸FFAを、製造者の指示書に従って、Wako登録商標WakoDiagnostics、Richmond、VAからのプロトコールおよび試薬を使用して、RocheCobas登録商標C311臨床化学分析器で、酵素法を使用して測定した。0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群において、FFAレベルの有意な変化はなかった図9J。FGF21ΔH処置動物におけるFFAレベルは、処置の最初の2週間にわたって著しく増大し、次いでウォッシュアウト段階の1週目までにベースラインレベルに戻った。実施例62高密度リポタンパク質コレステロールHDLHDLレベルを、AceAlera分析器で酵素法を使用して測定した。処置群のいずれにおいても、処置期間にわたってHDLコレステロールの有意な変化はなかった。実施例63低密度リポタンパク質コレステロールLDLLDLレベルを、AceAlera分析器で酵素法を使用して測定した。0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群において、それぞれ処置の2週目および1週目からウォッシュアウト期間の2週目に、LDLコレステロールの有意な減少があった図9K。LDLコレステロールレベルの有意な減少は、FGF21ΔH処置動物では、処置の1週間後にのみ観察された。この処置群におけるいずれの他の時点でも有意性は見られなかった。実施例64総ケトン体TOTKTOTKを、Wako登録商標からのプロトコールおよび試薬を使用して、RocheCobas登録商標C311臨床化学分析器で、酵素法を使用して測定した。0.15mg/kgおよび1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置動物において、総ケトン体レベルの有意な変化はなかった図9L。TOTKレベルは、処置の最初の3週間にわたって、FGF21ΔH処置動物において著しく増大し、レベルは、ウォッシュアウト期間にわたってベースラインに向かう傾向があった。実施例65アディポネクチンアディポネクチンレベルを、Mercodia登録商標ELISAキットを使用して求めた。血漿アディポネクチンレベルを図9Mに示す。3匹の動物ビヒクル、1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C、およびFGF21ΔH処置群中の各1匹を、これらのアディポネクチンレベルがアッセイの検出限界未満であったため、分析から除外した。処置群のいずれにおいても、アディポネクチンレベルの有意な変化は見られなかったが、FGF21ΔH処置動物では、レベルは上昇傾向であった。実施例66C反応性タンパク質CRPC反応性タンパク質CRPを、製造者の指示書に従って、ALPCODiagnostics登録商標Salem、NH製ELISAキットを使用して測定した。血漿CRPレベルは、2週目を除いて4週間の処置期間にわたって、0.15および1.5mg/kgのAB-L1-FGF21ΔH-A129C処置動物において有意に減少した図9N。レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに戻る傾向があった。血漿CRPレベルは、FGF21ΔH処置動物においても減少したが、有意性は、1週間のウォッシュアウト時点でのみ到達した。実施例67レプチンレプチンを、製造者の指示書によるプロトコールおよび試薬を用いて、Luminex登録商標technologyMillipore登録商標カタログ番号HMH-34Kによって測定した。血漿レプチンレベルは、FGF21ΔH処置動物図9oにおいて減少したが、この減少は、時点のいずれにおいても有意性に到達しなかった。AB-L1-FGF21ΔH-A129C処置群におけるレプチンレベルの変化はなかった。実施例68アディプシンアディプシンレベルを、製造者の指示書に従って、RDsystems登録商標MinneapolisMNのヒト補体因子DQuantikineキットカタログ番号DFD00を使用して測定した。血漿アディプシンレベルは、処置の最初の3週間の間に、すべての処置動物において有意に増大した図9P。レベルは、ウォッシュアウト段階の間にベースラインに戻る傾向があった。実施例69サル試験からの結論AB-L1-FGF21ΔH-A129Cは、軽度から中程度にインスリン耐性のカニクイザルCynomolgusmacaqueにおいて、体重の低減、脂質指数TPC、TG、およびLDLの改善、および炎症性生物マーカーCRPの低減において効果的であった。空腹時血中グルコースレベルに対するAB-L1-FGF21ΔH-A129CまたはFGF21ΔHの明らかな効果はなく、低血糖症の発症もなった。IVGTTによって評価した場合、インスリン感受性に対する効果はなかった。予期されなかったが、この結果は、血漿グルコースレベルに対する効果の欠如とともに、正常な健康なカニクイザルと比較して、これらのカニクイザルにおけるグルコースおよびインスリンのベースラインレベルがほんのわずかに上昇していることに起因し得る。これは、これらの動物は、ほんの軽度のインスリン抵抗性を示すことを示唆する。サル同士間の自然のばらつき、および1群当たりの少ない動物数と合わさった、ベースラインレベルの小さい変化は、血糖指数の統計的に有意な変化を観察することを困難にしている場合がある。処置期間の最後に向かって、AB-L1-FGF21ΔH-A129C処置動物においてフルクトサミンレベルが低減していることは、これらの動物において血糖コントロールが改善されていることを確かに示す。AB-L1-FGF21ΔH-A129Cの週2回の投薬特に1.5mg/kgの用量は、対照FGF21タンパク質の毎日の投薬と同等の有利な効果を生じさせた。実施例70AB-L1-FGF21ΔH-A129Cのヒト試験の最初Ab-L1-FGF21ΔH-A129Ch38C2-配列番号10-L12の無作為化、プラセボ対照、並列漸増単回IV投与試験を、2型糖尿病を有する対象において行った。対象に、IVボーラス0.5mgおよび1.5mgまたはIV注入5、15、50、100、200mg投与として、プラセボまたはAb-L1-FGF21ΔH-A129Cを投与し、各活性物質処置投与群で10人の対象を評価し、プラセボ群において14人を評価した。これまで、最大200mgの用量レベルまでの7つのコホートを、一般に安全で耐容性良好であることが判明している最大200mgまでの単回IV投与として、最大耐量MTDを同定することなく評価した。観察された安全性/耐容性、薬物動態学的および薬力学的データの予備要約をここで提示する。単回用量を投与した後、7点の平均血漿グルコースプロファイルと空腹時血漿グルコースレベルとの間に、プラセボと比較して差異はまったくなかったが、両試験およびプラセボは、減少を示した。総コレステロール、LDLコレステロール、空腹時インスリン、空腹時グルカゴン、または空腹時β-ヒドロキシブチレートにおいて、用量関連傾向はまったく観察されなかった。プラセボと比較してHDLコレステロールの増大が、試験した上位2つの用量レベル100および200mgのIVで観察された。空腹時トリグリセリドの用量依存的減少が観察された。FGF21のインタクトなC末端およびインタクトなN末端の薬物動態を、健康な志願者において、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cを単回静脈内投与した後に別個に評価した。両方への曝露は、用量の増大と比例して増大すると考えられた。対数濃度対時間曲線の終末過程は、それぞれ、C末端について7~9時間、およびN末端について30~36時間の平均終末相半減期に応じていた。重篤な有害事象SAEはまったく報告されず、合計60の有害事象AEsが33人の対象において報告された。これらのAEのうち、54が、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cを投与されながら28人の対象において報告された。AEの大部分は、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cまたはプラセボを15mg投与して32.5時間後に始まって、中等度と等級付けされた吐き気のエピソードを除いて、強度が軽度であるとみなされた。吐き気のエピソードは、165時間続き、介入を必要とせず、治験薬処置に関係するとみなされた。Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cまたはプラセボを50mg投与して2時間後に始まり、156時間続いた、中等度と等級付けされた下痢のエピソードも報告された。このエピソードは、介入を必要とせず、治験薬処置に関係するとみなされた。下痢は、報告された最も頻繁なAEであり12対象中14のエピソード、これらのうち、9つ9のエピソードは、処置に関係するとみなされた。下痢の他のエピソードは、参加臨床研究ユニットで入院患者を拘束する間に1つのコホート中の対象に供給した水道水の塩素化処理の変更に関係するとみなされた。胃腸症状腹部膨満、腹痛、下痢、消化不良、鼓腸、胃酸過多、吐き気、および嘔吐は、5人5の対象で、用量を増加すると頻度が増加すると考えられ、コホート7200mgの用量群またはプラセボ中で9つ9のGIAEを報告している。AEの結果として試験の参加から退かれた対象はまったくなかった。IGF-1値、臨床検査、バイタルサインにおいて、用量関連傾向は観察されず、12誘導ECGが試験した用量にわたって観察された。200mg処置群において、収縮期血圧SBPの平均値は、他の処置群プラセボを含むより数値的に高い傾向があり、1日目に投与して0.5時間後における11.2mmHgのベースラインからの最大の上昇を伴い、7.0mmHgで15日目にかけて持続した。200mg処置群において観察されたベースラインからの平均変化は、群平均ベースラインの1標準偏差以内であった。さらに、200mg処置群中の個々の対象において、Ab-L1-FGF21ΔH-A129C曝露とSBP上昇の間の相関はなかった。さらに、SBPの上昇は、治験薬ウォッシュアウトの十分後の15日目にかけて持続した。これらの観察結果のすべては、観察された平均の上昇は、処置群のばらつきの範囲内であり、このばらつきに関係する可能性があることを示唆する。実施例71投薬レジメン2型糖尿病患者における、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cを単回投与した後のトリグリセリド低下の濃度-応答関係を、遅い薬理開始およびオフセットPK/PDモデルoffsetPK/PDmodelを使用して説明した。FIHファーストインヒューマントリグリセリドデータからIC50および遅い薬理動態を得たPK/PDモデル、ならびにob/obマウスOGTTデータから最大薬理を得たモデルを用量推定に使用した。4週間にわたる10mgのh38C2-配列番号10-L12の毎週の投与または5mgのAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの週2回の投与は、8のHbA1C糖尿病患者において約25の空腹時血漿グルコース低下を実現することが推定される。したがって、本発明は、約5mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの用量で患者を治療するステップを含む投薬レジメンを提供する。いくつかの態様では、約5mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、週2回投与される。いくつかの態様では、約5mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、少なくとも4週間投与される。いくつかの態様では、約5mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、少なくとも4週間わたって週2回投与される。したがって、本発明は、約10mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの用量で患者を治療するステップを含む投薬レジメンを提供する。いくつかの態様では、約10mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、週1回投与される。いくつかの態様では、約10mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、少なくとも4週間投与される。いくつかの態様では、約10mgの本発明の化合物特に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、少なくとも4週間にわたって、週1回投与される。いくつかの態様では、患者は、2型糖尿病を罹患している。いくつかの態様では、患者は、ヘモグロビンA1CHbA1Cが上昇した糖尿病患者である。いくつかの態様では、投薬レジメンは、トリグリセリドレベルを低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、HDLを上昇させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、血中グルコースを低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、血中グルコースを少なくとも約25低下させるためのものである。いくつかの態様では、投薬レジメンは、2型糖尿病を治療するためのものである。実施例72Ab-L1-FGF21ΔH-H125CAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの安定性Ab-L1-FGF21ΔH-H125CAbh38C2-FGF21ΔH-H125C-L12、およびAb-L1-FGF21ΔH-A129Ch38C2-FGF21ΔH-A129C-L12の様々な製剤を、UF-DF30000の分子量カットオフを使用する透析濾過および限外濾過によって調製し、次いで滅菌濾過した。製剤を様々なストレス条件に曝した表17を参照。次いで、外観アッセイ、UV紫外吸光度、SDS-PAGEドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーSEC、およびiCE画像化キャピラリー電気泳動を使用して試料を分析した。いくつかの試料は、生物物理学的技法、例えば、示差走査熱量測定DSC、および分析的超遠心分離法などによって分析した。試料を様々な時点表17で分析することによって、安定性傾向を評価した。ポリソルベート80の任意の有利な効果を判定するために、ポリソルベート80とともに、または伴わずに調製した選択された製剤を、撹拌ストレス300rpmの軌道振盪で4時間にかけた。さらに、いくつかの製剤は、より高い濃度も使用することによって、コンジュゲートが高濃度で水性緩衝溶媒中に可溶性であるか否かを評価し、高濃度での安定性を評価した。外観アッセイ様々な温度で貯蔵した後の粒状物形成:20mMのヒスチジン、pH6製剤中の両候補製剤AおよびFは、5°Cで4週間貯蔵し、または25°Cで4週間、40°Cで2週間、または50°Cで2週間貯蔵した後、粒状物形成を示した。これらのデータは、20mMのヒスチジン、pH6製剤は、Ab-L1-FGF21ΔH-H125CおよびAb-L1-FGF21ΔH-A129Cを不安定にすることを示唆する。40°Cで2週間ストレスをかけたとき、酢酸塩pH4およびリン酸塩pH8は、同じタンパク質濃度レベルで、ヒスチジンpH6製剤と対照的に、粒状物形成をまったく示さなかった。しかし、高いタンパク質濃度40~50mg/mLは、より低いタンパク質濃度7~10mg/mLでの同じ製剤ヒスチジン、pH6と比較した場合、粒状物形成を遅延させると考えられる。5°Cで4週間貯蔵した後のAb-L1-FGF21ΔH-H125CおよびAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの外観データを比較した場合、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、2製剤酢酸塩、pH4、およびリン酸塩、pH8中で粒子物形成に対して優れた性能を示す。ポリソルベート80を含む製剤および含まない製剤を比較する場合、ポリソルベート80の存在は、表17で分かるように、両候補において、撹拌ストレス誘導粒状物形成の防止に役立つ。撹拌ストレスは一般に、空気-水界面および機械的応力を伴う様々なプロセスステップに対する安定性を予測するのに使用される。UVの有意な変化は、経時的にまったく観察されず、表17に列挙した製剤のいくつかにおいて粒状物形成が観察されても、タンパク質の正味の濃度は、経時的に有意に影響されなかったことを示す。高分子量種HMWS形成SECを使用することによって、表17に列挙した様々な製剤についてHMWS形成を測定した結果を表18に示した。SECは、HMWSを確実に分離することができ、Ab-L1-FGF21ΔH-H125CおよびAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの両方にとって重要な安定性指示アッセイである。SECアッセイにおけるHMWSは、2ユニットのFGF21を持つコンジュゲートすなわち、h38C2-FGF21ΔH-H125C-L12およびh38C2-FGF21ΔH-A129C-L12の前に溶出する化学種として定義される。両候補についての20mMのヒスチジン、pH6中の製剤は、HMWSの高い初期形成および時間依存形成を示した。興味深いことに、高温40°Cにおける両候補の製剤のいくつか酢酸塩、pH4;リン酸塩、pH8、およびヒスチジンpH6中の高濃度製剤は、第1週中に凝集体の初期解離を示す傾向がある。経時的なタンパク質製剤の非線形凝集傾向は、文献で公知である。20mMの酢酸ナトリウム、pH4中の製剤は、20mMのヒスチジン、pH6中の製剤と比較したとき、より少ないHMWSを示した。したがって、20mMの酢酸ナトリウム、pH4中の製剤は、HMWS形成に関して、20mMのヒスチジン、pH6中より優れた安定性をもたらす。SDSPAGE分析は、これらの結果と一致した。最後に、この2つの候補を、酢酸塩、pH4製剤中の5°CでのHMWS形成の傾向について比較すると、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、Ab-L1-FGF21ΔH-H125Cより優れて機能すると考えられる表18。電荷不均一性タンパク質は、アミド分解および断片化などの翻訳語修飾によって引き起こされる電荷不均一性を有する。画像化キャピラリー等電点電気泳動法iCEは、pH勾配におけるタンパク質種の電荷差pI値に基づいてタンパク質種を分離する。iCEは、表19に示したAb-L1-FGF21ΔH-H125CおよびAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの様々な製剤中の電荷不均一性をモニターするのに使用した。iCEの実行条件は、2Mの尿素を含む約1mg/mLのタンパク質、およびPharmalyte3~10を含む。両候補についての20mMのヒスチジン、pH6および20mMのリン酸ナトリウム、pH8中の製剤は、20mMの酢酸ナトリウム、pH4中の製剤と比較して酸性種形成のより高い傾向を示した。したがって、20mMの酢酸ナトリウム、pH4中の製剤は、優れた安定性をもたらす。さらに、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cは、20mMの酢酸ナトリウム、pH4中で、同じ製剤中のAb-L1-FGF21ΔH-H125Cより低い酸性種形成の傾向を示し、したがって、電荷不均一性について優れた安定性を実証した。示差走査熱量測定DSC2つの候補の熱安定性を、DSCを使用して、温度誘導性アンフォールディングの転移の中間点Tmを測定することによって調査した。h38C2についての主要なアンフォールディング転移のTm値は、73.5°Cであった。コンジュゲートは、主要なアンフォールディング転移のより高いTmを示し、アンフォールディングに対するより高い熱安定性を示唆したAb-L1-FGF21ΔH-H125Ch38C2-FGF21ΔH-A129C-L12およびAb-L1-FGF21ΔH-A129Ch38C2-FGF21ΔH-H125C-L12の両方のTmは、79°Cであった。2つの候補の熱安定性は、内在性タンパク質トリプトファン蛍光を使用して、温度誘導性アンフォールディングの転移の中間点Tm-FLを測定することによっても調査した。このアッセイは、高温によって誘導されたアンフォールディング後に、三次構造の変化を半定量的にモニターする。主要なアンフォールディング転移のTm-FL値は、h38C2、Ab-L1-FGF21ΔH-A129C、およびAb-L1-FGF21ΔH-H125Cについてそれぞれ、約74.1°C、77.7°C、および79.7°Cであった。DSCによって測定したTm値と一致して、2つの候補は、h38C2のTm-FLよりわずかに高い同様のTm-FLを示し、h38C2単独より、コンジュゲートの高い熱力学的安定性を示唆する。分析的超遠心分離法アッセイこのアッセイは、試験した、選択した製剤中のHMWSの定性的量の直交測定orthogonalmeasurementとして使用した。これは、SECで見られたものと同様の、20mMのヒスチジン、pH6製剤中のHMWSのレベルを示す。これはまた、SECアッセイで見られた傾向と一致して定性的に、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cについての20mMの酢酸ナトリウム、pH4中のより低いレベルのHMWSを示す。分析的超遠心分離法データは、20mMの酢酸ナトリウム、pH4製剤は、20mMのヒスチジン、pH6製剤と比較して優れた安定化をもたらすという直交検証orthogonalverificationを提供する表20。本実施例で論じたいくつかの安定性指標のデータを比較すると、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの全体的な安定性プロファイルは、Ab-L1-FGF21ΔH-H125Cより優れていると考えられる。製剤のpHを下げると例えば、酢酸塩、pH4、より高いpH例えば、pH6~8と比較して安定性がより良好になることも明白である。実施例73Ab-L1-FGF21ΔH-A129CのpH-緩衝液スクリーニング様々な水性緩衝液中のAb-L1-FGF21ΔH-A129Ch38C2-FGF21ΔH-A129C-L12の安定性を、適切な安定化媒質を見つける目的で調査した。リンカー-1の不安定性、およびタンパク質成分すなわち、h38C2およびFG21の任意の加水分解性切断clippingは、低分子量種LMWSの生成をもたらす。さらに、コンジュゲートが試験した製剤中で凝集する場合、高分子量種が形成され得る。製剤を、5~8mg/mLの範囲内の目標タンパク質濃度で、緩衝液交換によって調製して所望の製剤にした。製剤を、0.2μmフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装し、所望の温度で貯蔵した。指定時点で、試料をアッセイした。SECによるHMWSおよびLMWSの測定緩衝液およびpHの顕著な効果を、2週間にわたる温度ストレス40°Cの後に観察した。データを表21に提示する。初期時点において、HMWSの増加傾向がより高いpHの製剤で見られた。ヒスチジン製剤は、高いHMWSを示すものの中にあった。pH範囲4.5~5中の酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウム製剤は、初期時点において相対的に少ない凝集体を示した。数週間にわたって40°Cで貯蔵すると、HMWSは、pH6.5および7の製剤中で実際に減少した。乳酸ナトリウム、pH4.5製剤は、HMWSに関して相対的に優れた性能を示した。LMWSの傾向は、HMWSの傾向と異なった。クエン酸ナトリウム、pH5製剤を除いて、すべての製剤は、初期時点において一貫した値のLMWSを示した。40°Cで2週間貯蔵すると、低pH製剤のいくつかは、おそらく断片化によるLMWSの顕著な増加を示した。しかし、緩衝液種の効果は、LMWS形成に対する安定化においても役割を果たすことが明らかである。pH依存性LMWSの傾向は、製剤をさらに微調整すると、安定性をさらに改善することができることを示唆する。実施例74撹拌に対するAb-L1-FGF21ΔH-A129Cの安定性9~11mg/mLの範囲内の目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、0.2μmフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。300rpmの速度で軌道振盪機を使用して撹拌を施した。指定時点で、試料をアッセイした。表22中の結果は、ポリソルベート80が存在すると、撹拌誘導性不安定性を防止するのに役立つことを実証する。実施例75Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの凍結乾燥製剤液体製剤を本発明の化合物とともに使用することができるが、凍結乾燥製剤は、より長い寿命の安定性をもたらし得る。実施例72は、本発明の化合物は、酢酸ナトリウム中で最も安定であるという意外な結果を実証した。しかし、酢酸ナトリウムは昇華し、したがって、凍結乾燥した緩衝液中に組み込むことが困難である。したがって、凍結乾燥製剤において最適な長期安定性をもたらす、本発明の化合物用の代替緩衝液を開発する必要性がある。約20mg/mLを目標とする製剤JおよびKを除いて、約10mg/mLの目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、0.2μmフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。凍結乾燥製剤を調製するために、バイアルを、凍結乾燥し、ストッパーを付け、キャップを付けた。指定時点で試料を引き抜き、SEC、およびiCEを含む様々な分析的方法によってアッセイした。液体製剤も、安定性を評価するために2週間評価した。高温で貯蔵した後の凍結乾燥製剤の性能を評価した。表23は、指定時点におけるSECおよびiCEデータを示す。凍結乾燥製剤は、より高い温度ストレスと比較した場合でも優れて機能した。凍結乾燥製剤の中で、乳酸塩製剤および酢酸塩製剤が、相対的により良好に機能した。しかし、酢酸塩は、凍結乾燥されると昇華を起こし、pHドリフトの原因となることが知られている。実際に、酢酸塩製剤は、凍結乾燥後に0.3~0.5pH単位の上昇を示した。したがって、凍結乾燥乳酸塩製剤製剤Cは、適切な安定性を実現するのに適しており、粒状物、HMWS、LMWS、および酸性種の形成からの十分な保護をもたらすと結論づけられる。実施例73で提示した製剤と比較すると、製剤C乳酸塩、トレハロース二水和物、PS20、EDTA、L-Metから構成されるは、リンカー不安定性およびタンパク質切断これらはともに、LMWS形成を生じさせる、ならびに凝集粒状物およびHMWSの形成の予防に役立つことが明らかである。実施例72および73は、乳酸塩のみを含むh38C2-FGF21ΔH-A129C-L12の製剤は、ヒスチジンなどの他の緩衝液より優れていても、望まれるより長期間の使用に適切な安定性をもたらすことができないことを示す。凍結保護物質およびリオプロテクタントとして役割を果たす糖またはポリオールなどの様々なタイプの安定剤例えば、トレハロース、スクロース、マンニトール、ならびに撹拌安定性のための界面活性剤例えば、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー、ならびにキレーター例えば、EDTA、DTPA、ならびに抗酸化剤例えば、L-メチオニンと乳酸塩を組み合わせると、安定性が相乗的に増強される。乳酸塩がリンゴ酸塩、コハク酸塩、または酢酸塩のうちの1つで置換されている表23中の組合せ製剤は、対応する緩衝液のみの製剤と比較した場合、優れた安定性をもたらす。したがって、組合せは、Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの安定性を明らかに増強する。実施例76Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cの凍結乾燥製剤製剤同士間で多様であった目標タンパク質濃度で、緩衝液交換および賦形剤添加によって製剤を調製した。調製した製剤を、0.2μmフィルターを使用して濾過し、ガラスバイアル中に包装した。凍結乾燥製剤を調製するために、バイアルを、凍結乾燥し、ストッパーを付け、キャップを付けた。指定時点で、SEC、およびiCEを含む様々な分析的方法によって試料をアッセイした。さらに、液体製剤の安定性傾向を評価するために、液体製剤も2週間評価した。凍結乾燥製剤の含水量を凍結乾燥後に試験し、すべて0.5未満であった。凍結乾燥製剤を様々な温度ストレス下で貯蔵した。表24は、指定時点におけるSEC、iCE、および還元CGEキャピラリーゲル電気泳動データを示す。CGEにより、タンパク質断片が半定量的に推定される。凍結乾燥製剤は、これらの液体対応物と比較した場合、より良好な安定性を示した。安定化賦形剤の存在下凍結保護物質/リオプロテクタントの存在下での乳酸乳酸ナトリウムの凍結乾燥製剤は、良好な安定性を示した。したがって、凍結乾燥乳酸製剤は、より長期の貯蔵安定性を試験するのに適切であると結論づけられる。乳酸製剤の中で、リンカー不安定性およびタンパク質切断による過剰な断片化を防止するために、製剤のpHのバランスが必要である。例えば、液体状態でのpH4.5の製剤Fは、他の製剤と比較して、相当な断片化を生じさせる。最後に、製剤BとLを比較したとき、安定剤すなわち、EDTAおよびL-メチオニンは、断片化を最小限にし、特に液体製剤に対して相当な利点をもたらすことが分かる。金属キレーター例えば、EDTA、DTPAと抗酸化剤例えば、L-メチオニン、純粋なアスコルビン酸の他の組合せも、安定性を実現するのに有利であると予期される。選択した製剤を、相対的な生物活性についても試験することによって、表24のデータ中に見られる物理的劣化および化学的劣化に対して相関があるか否かを探求した。生物活性を、間接的FGF-R/β-KlothoHEK-293細胞結合ELISAによって測定し、参照物質の生物活性に対して相対的なとして表した。生物活性データを表25に提示する。データから、物理的劣化と化学的劣化は相関していると考えられ、分析的方法によってアッセイして有意な劣化を示す製剤も表24、生物活性の有意な低減を示す。これらのデータは、製剤Aの成分によってもたらされる安定性および機能的完全性のさらなる信頼度をもたらす。したがって、いくつかの態様では、本発明は、約0.1~約200mg/mlの間のFGF21-コンジュゲート、および約4~約5.5の間のpHの約1~150mMの間の乳酸または酢酸ナトリウム;および以下のうちの少なくとも1つを含む製剤を提供する:i約10~約150mg/mlの間の凍結保護物質;ii約0.001~約1.0mg/mlの間のキレーター;iii約0.01~約10mg/mlの間の抗酸化剤;iv約0.02~2.0mg/mLの間の界面活性剤。いくつかの態様では、本発明の製剤は、i~ivのうちの2つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、i~ivのうちの3つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明の製剤は、i、ii、iii、およびivを含む。いくつかの態様では、本発明は、i約0.1~約200mg/mlの間のFGF21-コンジュゲート、ii約4~約5.5の間のpHの約1~150mMの間の乳酸;およびiii約10~約150mg/mlの間の凍結保護物質;iv約0.02~2.0mg/mLの間の界面活性剤を含む凍結乾燥製剤を提供する。いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約0.001~約1.0mg/mlの間のキレーターをさらに含むことができる。キレーターは、EDTAまたはDTPAとすることができ、約0.02~約0.5mg/mLの間の量で存在し得る。キレーターは、約0.05mg/mLの量で存在し得る。いくつかの態様では、凍結乾燥製剤は、約0.01~約10mg/mlの間の抗酸化剤をさらに含むことができる。いくつかの態様では、抗酸化剤は、L-メチオニンとすることができる。抗酸化剤は、約0.02~約5mg/mLの間の量で存在し得る。抗酸化剤は、約0.05~約0.2mg/mLの間の量で存在してもよい。抗酸化剤は、約0.1mg/mLの量で存在することができる。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、本明細書に記載される本発明の化合物である。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、Ab-L1-FGF21ΔH-H125CまたはAb-L1-FGF21ΔH-A129Cである。いくつかの態様では、FGF21コンジュゲートは、特定の化学種h38C2-配列番号10-L12である。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、約5mg/ml~約200mg/mlの間の量で存在する。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、約5mg/ml~約100mg/mlの間の量で存在する。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、約5mg/ml~約50mg/mlの間の量で存在する。いくつかの態様では、FGF21-コンジュゲートは、約10mg/mlの量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約1~約100mMの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約10mM~約50mMの間の量で存在する。いくつかの態様では、乳酸は、約30mMの量で存在する。pHは、約4.3~約5.3の間とすることができる。pHは、約4.8±0.5とすることができる。pHは、約4.8であってもよい。いくつかの態様では、凍結保護物質は、トレハロース二水和物、スクロース、およびマンニトールからなる群から選択される。凍結保護物質は、トレハロース二水和物とすることができる。凍結保護物質は、約50~約120mg/mlの間の量で存在し得る。凍結保護物質は、約90mg/mlの量で存在してもよい。いくつかの態様では、界面活性剤は、ポリソルベート80、ポリソルベート20、およびポロキサマーからなる群から選択することができる。界面活性剤は、ポリソルベート20とすることができる。いくつかの態様では、界面活性剤は、約0.05~約1.0mg/mLの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約0.1~約0.5mg/mLの量で存在する。いくつかの態様では、界面活性剤は、約0.2mg/mLの量で存在する。いくつかの態様では、本発明は、以下のものを含む、凍結乾燥に適した製剤を含む:i約10mg/mLのh38C2-FGF21ΔH-A129C-L12;iipH4.8±0.5の約30mMの乳酸;iii約90mg/mLのトレハロース二水和物;iv約0.05mg/mLの二ナトリウムEDTA二水和物;v約0.1mg/mLのL-メチオニン;およびvi約0.2mg/mLのポリソルベート20。別段の指定のない限り、用語Ab-L1-FGF21ΔH-A129Cが具体例の脈絡において使用される場合、これは、抗体の各アームが配列番号26のK99を通じてリンカー-1L1に共有結合により連結され、各L1分子が配列番号10中のCys129のチオール基に共有結合によりコンジュゲートされた、h38C2抗体配列番号25および26を指す配列番号1の番号付けによる。この化合物は、Ab-FGF21ΔH-A129C-L12、h38C2-FGF21ΔH-A129C-L12、およびh38C2-配列番号10-L12と記載することもできる。抗体、特定のリンカー、およびFGF21分子の配列への軽微な修飾が可能である場合があることが明らかとなるであろう。こうして、本発明を、上述した代表的な実施形態を参照して広く開示し、例示してきた。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を本発明に行うことができることを認識するであろう。すべての刊行物、特許出願、および発行済み特許は、各個々の刊行物、特許出願、または発行済み特許が、その全体が参照により組み込まれているように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。参照により組み込まれているテキスト中に含まれる定義は、これらが本開示における定義と矛盾する程度に応じて除外される。明確にするために別個の実施形態の脈絡において記載されている本発明のある特定の特徴は、1つの実施形態において組合せで提供することもできることが理解される。反対に、簡潔にするために1つの実施形態の脈絡において記載されている本発明の様々な特徴を、別個に、または適当なサブコンビネーションで提供することもできる。本発明の一実施形態に関して論じたいずれの限定事項も、本発明の任意の他の実施形態に適用することができることが特に企図されている。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法において使用することができ、本発明の任意の方法は、本発明の任意の組成物を生成または利用するのに使用することができる。特に、請求項に記載される本発明の任意の態様は、単独で、または1つもしくは複数の追加の請求項および/もしくは明細書の態様と組み合わせて、特許請求の範囲および/または明細書の他の箇所で述べた本発明の他の態様と組み合わせられると理解されるべきである。特許請求の範囲における用語またはの使用は、選択肢のみを指すことが明確に示され、または選択肢が相互に排他的であるのでなければ、および/またはを意味するのに使用されるが、本開示は、選択肢のみ、およびおよび/またはを指す定義を支持する。本明細書において文中で使用されるaまたはanは、別段の明らかな指示のない限り、1つまたは複数を意味することができる。請求項複数可において文中で使用される、単語含むとともに使用される場合の、単語aまたはanは、1つまたは1つより多いことを意味することができる。本明細書において、別のは、少なくとも第2、またはそれ以上を意味することができる。単語含むcomprises/含むcomprisingおよび単語有する/含むincludingは、本発明を参照して本明細書で使用する場合、述べた特徴、整数、ステップ、または構成要素の存在を指定するのに使用されるが、1つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはこれらのグループの存在または追加を排除しない。"