哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。哺乳動物由来の検体が生体試料であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列哺乳動物由来の検体が細胞であって、且つ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする請求項1又は5記載の評価方法。哺乳動物由来の検体が組織であって、且つ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項1又は5記載の評価方法。哺乳動物由来の検体が哺乳動物から採取した生体試料であって、且つ、当該検体の癌化度が当該生体試料を採取した当該哺乳動物のいずれかの体組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項1又は5記載の評価方法。組織が大腸組織であることを特徴とする請求項7に記載の評価方法。組織が肺組織であることを特徴とする請求項7に記載の評価方法。組織が乳腺組織であることを特徴とする請求項7に記載の評価方法。生体試料が血液、血清、血漿、体液、体分泌地物、糞尿、のいずれかであることを特徴とする請求項8記載の評価方法。前記DNAのメチル化頻度が、前記DNAの塩基配列内に存在する一つ以上の5CG3で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項1~12のいずれか記載の評価方法。哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴と評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列相関関係がある指標値が、当該塩基配列から選ばれる少なくとも1つのDNAの下流に存在する遺伝子のいずれかの発現産物の量であることを特徴とする請求項14記載の評価方法。遺伝子の発現産物の量が、遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする請求項15記載の評価方法。癌マーカーとしての、下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するメチル化DNAの使用a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列そこで、癌を早期に発見するための診断方法や治療方法等の評価に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の癌化度評価方法の開発が切望されている。本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌組織検体あるいは、がん患者由来の血液、血清、血漿、体液、体分泌地物、糞尿等の生体試料に存在するDNAおいて配列番号1-19で示されるDNA領域に含まれるCpG配列のシトシン塩基が、不死化正常細胞株及び正常組織検体あるいは健常者由来の血液、血清、血漿、体液、体分泌地物、糞尿等の生体試料に存在するDNAと比較して有意に高い頻度でメチル化されていることを見出し、本発明に至った。即ち、本発明は、1.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列2.哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前記1記載の評価方法。3.哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前記1記載の評価方法。4.哺乳動物由来の検体が生体試料であることを特徴とする前記1記載の評価方法。5.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列6.哺乳動物由来の検体が細胞であって、且つ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前記1又は5記載の評価方法。7.哺乳動物由来の検体が組織であって、且つ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前記1又は5記載の評価方法。8.哺乳動物由来の検体が哺乳動物から採取した生体試料であって、且つ、当該検体の癌化度が当該生体試料を採取した当該哺乳動物のいずれかの体組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前記1又は5記載の評価方法。9.組織が大腸組織であることを特徴とする前記7に記載の評価方法。10.組織が肺組織であることを特徴とする前記7に記載の評価方法。11.組織が乳腺組織であることを特徴とする前記7に記載の評価方法。12.生体試料が血液、血清、血漿、体液、体分泌地物、糞尿、のいずれかであることを特徴とする前記8記載の評価方法。13.前記DNAのメチル化頻度が、前記DNAの塩基配列内に存在する一つ以上の5CG3で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前記1~12のいずれか記載の評価方法。14.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、1哺乳動物由来の検体に含まれる下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するDNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び2測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴と評価方法。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列15.相関関係がある指標値が、当該塩基配列から選ばれる少なくとも1つのDNAの下流に存在する遺伝子のいずれかの発現産物の量であることを特徴とする前記14記載の評価方法。16.遺伝子の発現産物の量が、遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする前記15記載の評価方法。17.癌マーカーとしての、下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するメチル化DNAの使用a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列本発明により、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、癌マーカー例えば、大腸癌マーカー、乳癌マーカー、肺癌マーカー等としての、メチル化されたDNAの使用等に関連する発明である。本発明における癌は、例えば、肺癌非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、直腸癌、肝癌肝細胞癌、胆管細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、結腸癌、肛門癌、乳癌、子宮頸癌、子宮体癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、前立腺癌、腎臓癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣睾丸癌、上顎癌、舌癌、上、中、下咽頭癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、甲状腺癌、脳腫瘍、骨肉腫、皮膚癌基底細胞癌、有棘細胞癌等の、哺乳動物の臓器で発症する固形癌と、哺乳動物の血液で発症する非固形癌のいずれの癌も含む。尚、本発明において、癌を発症した被験者を癌患者と記載し、癌を発症していない被験者を非癌患者と記載し、ヒトの組織の非癌部位又は癌を発症していない被験者から採取した組織を正常組織と記載し、癌を発症していない被験者から採取した血液を正常血液と記載することもある。本発明における癌マーカーとしては、例えば、哺乳動物において癌が発生している組織及びその癌化度を間接的に把握しうる指標を挙げることができる。具体的には例えば、大腸癌マーカーとしては、大腸の癌の有無及び大腸癌の癌化度、癌の良性若しくは悪性等と記載される癌の性質等を間接的に把握できる生体物質からなる指標を挙げることができる。本発明においてマーカーDNAとして用いられるDNAとしては、下記の塩基配列から選ばれる少なくとも1つを有するのDNA以下、本発明DNAという場合があるを挙げることができる。a配列番号1で示された塩基配列又は配列番号1で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列b配列番号1と相補的な塩基配列又は配列番号1と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列c配列番号2で示された塩基配列又は配列番号2で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列d配列番号2と相補的な塩基配列又は配列番号2と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列e配列番号3で示された塩基配列又は配列番号3で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列f配列番号3と相補的な塩基配列又は配列番号3と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列g配列番号4で示された塩基配列又は配列番号4で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列h配列番号4と相補的な塩基配列又は配列番号4と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列i配列番号5で示された塩基配列又は配列番号5で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列j配列番号5と相補的な塩基配列又は配列番号5と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列k配列番号6で示された塩基配列又は配列番号6で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列l配列番号6と相補的な塩基配列又は配列番号6と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列m配列番号7で示された塩基配列又は配列番号7で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列n配列番号7と相補的な塩基配列又は配列番号7と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列o配列番号8で示された塩基配列又は配列番号8で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列p配列番号8と相補的な塩基配列又は配列番号8と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列q配列番号9で示された塩基配列又は配列番号9で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列r配列番号9と相補的な塩基配列又は配列番号9と相補的な塩基配列と80以上の相同性を示す塩基配列s配列番号10で示された塩基配列又は配列番号10で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列t配列番号10と相補的な塩基配列又は配列番号10と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列u配列番号11で示された塩基配列又は配列番号11で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列v配列番号11と相補的な塩基配列又は配列番号11と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列w配列番号12で示された塩基配列又は配列番号12で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列x配列番号12と相補的な塩基配列又は配列番号12と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列y配列番号13で示された塩基配列又は配列番号13で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列z配列番号13と相補的な塩基配列又は配列番号13と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aa配列番号14で示された塩基配列又は配列番号14で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ab配列番号14と相補的な塩基配列又は配列番号14と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ac配列番号15で示された塩基配列又は配列番号15で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ad配列番号15と相補的な塩基配列又は配列番号15と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ae配列番号16で示された塩基配列又は配列番号16で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列af配列番号16と相補的な塩基配列又は配列番号16と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ag配列番号17で示された塩基配列又は配列番号17で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ah配列番号17と相補的な塩基配列又は配列番号17と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ai配列番号18で示された塩基配列又は配列番号18で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列aj配列番号18と相補的な塩基配列又は配列番号18と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列ak配列番号19で示された塩基配列又は配列番号19で示された塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列al配列番号19と相補的な塩基配列又は配列番号19と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列配列番号1~19で示される塩基配列は、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationに登録されている塩基配列であり、これらは、NCBIのWEBペ-ジURL;httpwwwncbinlmnihgovから、登録番号AccessionNoをもとに、データベースを検索することによって入手することができる。本発明DNAにおける、上記~の塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列としては、好ましくは90以上、より好ましくは95以上の配列相同性を有する塩基配列があげられる。また、上記塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有するDNAも含まれる。また、本発明DNAにおける、上記~の塩基配列と相補的な塩基配列と80以上の相同性を有する塩基配列としては、好ましくは、90以上、より好ましくは95以上の配列相同性を有する塩基配列があげられる。また、上記塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有するDNAも含まれる。ここで、相補的な塩基配列とは、もとの塩基配列と塩基対を形成しうるような塩基配列をいい、塩基対とは、核酸の塩基のうち、アデニンとチミン、グアニンGとシトシンCが水素結合により対合したものをいう。哺乳動物では、遺伝子ゲノムDNAを構成する4種類の塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象がある。哺乳動物由来のゲノム上の塩基配列、例えば、配列番号1GenbankAccessionNoNT022171151217569012176178Homosapiensで示される塩基配列を有するDNAでは、当該DNAのゲノムDNAの一部のシトシンがメチル化されている。そして、DNAのメチル化修飾は、5CG3で示される塩基配列Cはシトシンを表し、Gはグアニンを表す。以下、当該塩基配列をCpGと記すこともある。中のシトシンに限られる。シトシンにおいてメチル化される部位は、その5位である。細胞分裂に先立つDNA複製に際して、複製直後は鋳型鎖のCpG中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖のCpG中のシトシンもメチル化される。従って、DNAのメチル化の状態は、DNA複製後も、新しい2組のDNAにそのまま引き継がれることになる。本発明評価方法の第一工程においてメチル化頻度とは、例えば、調査対象となるCpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。また本発明評価方法の第一工程においてメチル化頻度に相関関係がある指標値とは、例えば、配列番号1GenbankAccessionNoNT022171151217569012176178Homosapiensで示される塩基配列を有するDNAの下流の遺伝子の発現産物の量より具体的には、当該遺伝子の転写産物の量等をあげることができる。このような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するような負の相関関係が存在する。本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、生体試料をそのまま検体として用いてもよく、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いてもよい。このような検体としては、例えば、a哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液、b哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたDNA、c哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたRNAを鋳型として作製されたDNA等を挙げることができる。尚、前記組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味であり、前記体液とは血漿、血清、リンパ液等を意味し、前記体分泌物とは尿や乳汁等を意味する。癌が大腸癌である場合、被験動物から採取された大腸組織等をあげることができる。また、癌が乳癌である場合、被験動物から採取された乳房組織等をあげることができる。癌が肺癌である場合、被験動物から採取された肺組織等をあげることができる。哺乳動物由来の検体が血液、体液又は体分泌物等である場合には、定期健康診断や簡便な検査等で採取したものを利用することができる。本発明における哺乳動物としては、哺乳動物に属する動物の全てを挙げることができる。哺乳動物に属する動物とは、動物界脊索動物門脊椎動物亜門哺乳綱Mammaliaに分類される動物の総称である。より具体的には例えば、ヒト、サル、マーモセット、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。本発明における体液としては、例えば、血漿や間質液のような、固体を構成する細胞間に存在する液体多くの場合、固体の恒常性の維持機能を果たすを挙げることができる。具体的には例えば、リンパ液、組織液組織間液、細胞間液、間質液、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液髄液、関節液滑液、眼房水房水、脳脊髄液、子宮内浸出液等を挙げることができる。本発明における体分泌液としては、例えば、外分泌腺からの分泌液を挙げることができる。具体的には例えば、唾液、胃液、胆汁、腸液、汗、涙、鼻水、精液、膣液、羊水、乳汁等挙げることができる。本発明における細胞溶解液としては、例えば、細胞培養用の10cmプレート等で培養した細胞即ち、細胞株、初代培養細胞、血球細胞等を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を挙げることができる。ここで、細胞膜を破壊する方法としては、例えば、超音波による方法、界面活性剤を用いる方法、アルカリ溶液を用いる方法等を挙げることができる。尚、細胞を溶解するためには、様々な市販キット等を利用してもよい。具体的には例えば、10cmプレートでコンフルエントになるまで細胞を培養した後、培養液を捨てて、06mLのRIPAバッファー1×TBS1nonidetP4005sodiumdeo×ysholate01SDS0004sodiumazideを10cmプレートに加える。4°Cで15分間プレートをゆっくり揺り動かしてから、10cmプレート上の接着細胞を、スクレーパー等を用いて剥がし、プレート上の溶解液をマイクロチューブに移す。溶解液の110容量の10mgmLPMSFを添加してから、氷上で30~60分間放置する。4°Cで10分間、10000×gで遠心することにより、上清を細胞溶解液として取得すればよい。本発明における組織溶解液としては、例えば、哺乳動物等の動物から採取した組織中の細胞を破壊することにより得られる細胞内液を含む溶解液を挙げることができる。具体的には例えば、哺乳動物から取得した組織の重量を測定した後、カミソリ等を用いて組織を小片に裁断する。凍結組織をスライスする場合には、更に小さい小片にする必要がある。裁断後、氷冷RIPAバッファープロテアーゼインヒビター、フォスファターゼインヒビター等を添加してもよく、例えば、RIPAバッファーの110容量の10mgmLPMSFを添加しても良いを組織1gあたり3mLの比率で添加し、4°Cでホモジナイズする。ホモジナイズには、ソニケーターや加圧型細胞破砕装置を用いる。ホモジナイズの作業では、溶液を常に4°Cに維持し、発熱を抑えるようにする。ホモジナイズ液を、マイクロチューブに移して、4°Cで10分間、10000×gで遠心することにより、上清を組織溶解液として取得する。本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する方法は、例えば、以下のように行えばよい。第一の方法として、哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA大腸癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれるを分析すると、血球由来のDNAを避けて大腸癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、大腸癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。次いで、抽出されたDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、本発明DNAのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域コーディング領域の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含むDNAを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応以下、PCRと記す。で増幅し、得られる増幅産物の量を調べる。非メチル化シトシンを修飾する試薬即ち、メチル化シトシンを修飾せずに非メチル化シトシンを選択的に修飾する試薬としては、シトシンと5メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用することにより非メチル化シトシンを修飾する試薬であればよく、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩bisulfite等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたゲノムDNA試料を可能な限り均一に接触させるには、ゲノムDNAの変性を行う必要がある。例えば、まず当該DNAをアルカリ溶液pH9~14で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩bisulfite溶液中の濃度:例えば、終濃度3M等で約10~16時間一晩程度、55°Cで処理する。反応を促進するため、95°Cでの変性と、50°Cでの反応を1020回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままであるFuruichiら、BiochemBiophysResCommun41:1185~1191、1970。亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩での処理に次いで、塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含むDNAを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマーを用いてPCR法で増幅し、得られる増幅産物の量を調べればよい。重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型とし、且つ、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列[メチル化される位置のシトシンCpG中のシトシンはシトシンのままであり、メチル化されていないシトシンCpGに含まれないシトシンはウラシルとなった塩基配列]とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いるPCR以下、メチル化特異的PCRとも記すこともある。と、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型とし、且つ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマーを用いるPCR以下、非メチル化特異的PCRとも記すこともある。とを行う。上記PCRにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合前者には、解析対象とするシトシンがメチル化されているDNAが増幅され、一方、非メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合後者には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないDNAが増幅される。これらの増幅産物の量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチル化頻度を測定することができる。ここで、メチル化特異的プライマーは、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、且つ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して、メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的なPCRプライマーメチル化特異的プライマーを設計し、また、メチル化を受けていないシトシンを含む塩基配列に特異的なPCRプライマー非メチル化特異的プライマーを設計する。重亜硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなったDNA鎖を基に設計することから、元来二本鎖であったDNAのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを作製することもできる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの3末端近傍にCpG中のシトシンを含むように設計することが好ましい。また、解析を容易にするために、プライマーの一方を標識してもよい。メチル化特異的PCRにおける反応液としては、例えば、鋳型とするDNAを50ngと、10pmolμlの各プライマー溶液を各1μlと、25mMdNTPを4μlと、10×緩衝液を25μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ5Uμlを02μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95°Cにて10分間保温した後、95°Cにて30秒間次いで55~65°Cにて30秒間さらに72°Cにて30秒間を1サイクルとする保温を30~40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物の量を比較する。例えば、メチル化特異的プライマーを用いたPCRと非メチル化特異的プライマーを用いたPCRで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動である場合には、電気泳動後のゲルをDNA染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。ここでDNA染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標としてバンドの濃度を比較することもできる。また、定量を必要とする場合には、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、例えば鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは既に市販されている。第二の方法として、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩での処理に次いで、蛍光に基づくリアルタイムPCR米国特許第6331393号;Eadsら、NucleicAcidsRes28:E32、2000以下、メチライト法という場合があるを利用すすることもできる。メチライト法では、5末端に蛍光レポーター色素を有し、かつ、3末端に消光色素を有する位置特異的PCRプライマーを用い、蛍光に基づくリアルタイム定量的PCRによりメチル化DNAを増幅する。PCR反応の間に蛍光レポーター色素が、酵素によって放出されるため、PCR産物の量に比例し蛍光強度が増加する。従ってメチル化の程度に比例する蛍光を、自動ヌクレオチドシーケンサー装置において連続的に検出することができる。第三の方法として、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩での処理に次いで、シークエンシングすることもできる。一般的には、ゲノムDNA試料の変性と亜硫酸水素塩による処理に続いて、プライマー伸張によってdsDNAを取得し、さらに、PCR技術によって増幅するClarkら、NuclAcidsRes22:2990~2997、1994方法である。次に、当該PCR産物を標準的なDNAシークエンシング法によって配列を決定しシトシン亜硫酸水素塩による処理前のメチルシトシンに相当するを検出する。シークエンス法としては、ジデオキシ法だけでなく、パイロシークエンス法SOLiDシステム等の方法であっても、塩基配列を決定する方法であれば何でもよい。または前記PCR産物をプラスミドベクターにクローニングした後、個々のクローンをシークエンシングすることができるが、単一のDNA分子のメチル化マップを提供することも可能である。シークエンスによりメチルシトシンを決定するための幾つかの変法RadlinskaSkowronek、ActaMicrobiolPol47:327~334、1998が知られている。具体的に、dsDNAをPCR法により増幅して塩基配列を決定するために、PCRにおける反応液としては、例えば、鋳型とする重亜硫酸ナトリウム処理したDNA溶液をDNAが20ng又は80ng相当含まれる総液量50μLの反応液を調製し、これを用いればよい。具体的には、鋳型とする重亜硫酸ナトリウム処理したDNA溶液と、5μMに調製された各オリゴヌクレオチドプライマー溶液とを夫々総液量の3/5と、GeneAmpRdNTPMi×を総液量の1/10と、10×緩衝液5μLを総液量の1/10と、25mMMgCl2溶液を総液量の1/50と、耐熱性DNAポリメラーゼAmpliTaqGold、5UμL、ABI社製を025μLと、滅菌超純水とを混合することにより、総液量50μLの反応液を調製すればよい。当該反応液を、95°Cにて10分間保温した後、95°Cにて30秒間次いで55°Cにて30秒間更に72°Cにて45秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRすればよい。PCRを行った後、15アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した後、得られたDNA断片についてクローニングを行えばよい。クローニングにはTOPOTACloningRKitForSequencingインビトロジェン社を使用すればよい。SaltSolutionを04μLと、TOPOvectorを04μLと、前記のPCR増幅産物を16μLとを氷上で混合し、これを室温で5分間静置した。ライゲーション反応液を2μLとコンピテントセルを50μLとを混合し、氷中に30分間静置する。静置後、42°Cで30秒間インキュベートし、氷中に保存すればよい。反応液にSOC培地を250μL加え振盪培養する。Xgal溶液10mgmLDMFを100μLを塗布したLBプレートアンピシリン終濃度50μgmLに、培養液を塗布し、培養37°C、18時間すればよい。培養液を塗布し、培養したLBプレート上に得られる大腸菌コロニーのうち、白色のコロニーを、爪楊枝でピックアップし、2mLのLB培地アンピシリン終濃度50μgmLでさらに培養し、得られた大腸菌からプラスミド抽出装置PI50、KURABOを用いてプラスミドを抽出すれば、プラスミド溶液を取得できる。当該プラスミド溶液を2μLと、BigDyeRTerminatorv31CycleSequencingRR100ABI社を1μLと、BigDyeRTerminatorv11v31SequencingBufferABI社を2μLと、シークエンス反応のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーM13Rの32μM溶液を1μLと、滅菌超純水を4μLとを混合する。当該反応液を、96°Cにて1分間保温した後、96°Cにて10秒間次いで50°Cにて5秒間更に60°Cにて4分間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でシークエンス反応をおこなえばよい。PCRにおける反応液としては、例えば、鋳型とするDNAを25ngと、20pmolμlの各プライマー溶液を各1μlと、2mMdNTPを3μlと、10×緩衝液を25μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ5Uμlを02μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95°Cにて10分間保温した後、95°Cにて30秒間次いで53°Cにて30秒間さらに72°Cにて30秒間を1サイクルとする保温を30~40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定する。即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシトシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミンウラシルであるかを判定する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象とするシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミンウラシルを示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法として、PCRで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られた複数のクローンから、それぞれクローニングされたDNAを調製し、当該DNAの塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。第四の方法として、目的とするDNAの塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含むDNAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとをハイブリダイゼーションさせ、前記DNAと当該プローブとの結合の有無を調べることもできる。具体的には、検体から抽出したゲノムDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬を作用させてから、シトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブをハイブリダイゼーションさせる方法が挙げられる。当該ハイブリダイゼーションに用いられるプローブは、解析対象とするシトシンを含む塩基配列を基にして、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、且つ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して設計するとよい。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列[メチル化される位置のシトシンCpG中のシトシンはシトシンのままであり、メチル化されていないシトシンCpGに含まれないシトシンはウラシルとなった塩基配列]又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計する。尚、このようなプローブは、DNAとプローブとの結合の有無についての解析を容易にするために標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じて担体上に固定して用いてもよいが、この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出されたDNAを予め標識しておくとよい。非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩bisulfite等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いてもよい。非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたDNAを接触させるには、例えば、まず当該DNAをアルカリ溶液pH9~14で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩bisulfite溶液中の濃度:例えば、終濃度3M等で約10~16時間一晩程度、55°Cで処理する。反応を促進するため、95°Cでの変性と、50°Cでの反応を1020回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型として第二の方法と同様にPCRを行うことにより当該DNAを予め増幅させておいてもよい。次いで、重亜硫酸塩等で処理されたDNA又は前記PCRで予め増幅されたDNAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダイゼーションを行う。メチル化特異的プローブと結合するDNAの量と、非メチル化特異的プローブと結合するDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、SambrookJFrischEFManiatisT著、モレキュラークローニング第2版MolecularCloning2ndedition、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行ColdSpringHarborLaboratorypress等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下に行われる。ここでストリンジェントな条件下とは、例えば、6×SSC1.5MNaCl、0.15Mクエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSCとするを含む溶液中で45°Cにてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50°Cにて洗浄するような条件MolecularBiologyJohnWileySonsNY631636等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、2×SSCで50°Cの条件低ストリンジェンシーな条件から0.2×SSCで50°Cまでの条件高ストリンジェンシーな条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温低ストリンジェンシーな条件から65°C高ストリンジェンシーな条件から選択することができる。また、塩濃度と温度との両方を変えることもできる。かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合したDNAの量と、非メチル化特異的プローブと結合したDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシン即ち、プローブの設計の基となった塩基配列に含まれるCpG中のシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。第五の方法として、目的とするDNAの塩基配列中の、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素に作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方法をあげることもできる。当該方法で用いられるシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素以下、メチル化感受性制限酵素と記すこともある。とは、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該DNAは切断されず、一方、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII等をあげることができる例えば、NucleicAcidResearch9、25092515参照。当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、前記DNAを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含み、当該認識配列以外には前記制限酵素の認識配列を含まないDNAを増幅可能なプライマー対を用いてPCRを行い、DNAの増幅増幅産物の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたDNAの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。即ち、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAがメチル化されていれば、前記メチル化感受性制限酵素がメチル化状態であるDNAを切断しないという特性を利用することにより、前記哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。言い換えれば、前記メチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断される。また、仮に哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたPCRを実施することにより、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpG対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、PCRによる増幅産物は得られず、一方、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記メチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpG対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、PCRによる増幅産物が得られることになる。定量を必要とする場合には、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、例えば鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは既に市販されている。また、当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させたDNAに対して、Argininevasopressinreceptor1A遺伝子に由来し、且つ、当該制限酵素の認識配列を含まないDNAをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたDNAの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長いDNAが検出される。検出された長いDNAの量と短いDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAのメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、例えば、大腸癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる目的とするDNAのメチル化頻度対照とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAのメチル化頻度が対照と比較して高ければ本発明DNAが対照と比較の上で高メチル化状態であれば、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。ここで癌化度とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における癌細胞の存在量等を意味している。第六の方法として、目的とするDNAに含まれるシトシンのメチル化割合を、SEQUENOM社のMassARRAYシステムを用いて定量的にメチル化シトシンを測定することもできる。具体的には、検体から抽出したゲノムDNAに、非メチル化シトシンを修飾する試薬を作用させてから、目的とするDNA領域をPCR法により増幅する。次に、増幅したDNA領域をRNAポリメラーゼによりRNAへ転写する。さらに、得られた転写産物をRNaseで処理し、MASSによる質量分析を行う。本方法は、非メチル化シトシンを修飾する試薬を作用させることにより、分子量が変化することに基づいて、検体中のDNAに含まれるメチルシトシンを定量する方法である。より具体的には、SEQUENOMアプリケーションノートに示されるMassARRAYシステムを用いた定量的DNAメチル化解析用EpiTYPERの概論に従った以下の手法を用いてもよい。メチル化解析用に以下のプライマーシステムを設計する。Invitro転写に適した産物を得るため、T7プロモータを付加したリバースプライマー。サイクリング失敗を防ぐために8bpインサートを挿入する。また、PCRのバランスをとるために10merタグを付加したフォワードプライマーとする。Bisulfite処理:サンプルゲノムDNAのBisulfite変換処理にはZymoResearch社のEZ96DNAMethylationKitまたはEZDNAMethylationKitを使用する。このプロトコルの初回インキュベーション後、以下のとおりサイクル反応をおこなう。45サイクル:95°C30分50°C15分1ステップ1:増幅385マイクロタイターフォーマットを用いて総容量5μL中1μLのDNAを増幅する1反応あたり最終濃度2ngμLとするために10ngμL以上のDNAを100μL以上使用する。各反応液を2種類の切断反応T切断反応とC切断反応に分ける。プレートを密封し、以下のとおりサイクル反応をおこなう。94°C15分45サイクル94°C20秒56°C30秒72°C1分72°C3分2ステップ2:脱リン酸化各PCR反応液5μLにエビ由来アルカリフォスファターゼSAP酵素2μLを添加し、PCRに組み込まれなかったdNTPを脱リン酸化する。プレートを37°Cで20分インキュベートし次いで85°Cで5分インキュベートする。3ステップ3:Invitro転写とRNase切断各切断反応TおよびC用に転写RNaseAカクテルを調製する。標準セットアップでは1プレートあたり、1つの転写RNaseAカクテルを調製する。サイクル反応をおこなっていない新しいマイクロタイタープレートに、転写RNaseAカクテル5μLとPCRSAPサンプル2μLを添加する。プレートを1分間遠心し、次にプレートを37°Cで3時間インキュベートする。4ステップ4:サンプルコンディショニング384穴プレートの各サンプルにddH2O20μLを加える。レジンプレートを用いて各穴にCleanResinを6mg加える。10分間攪拌し、3200xgで5分間スピンダウンする。5ステップ5:サンプルの移動10~15nLのEpiTYPER反応産物を384穴SpectroCHIPに分注する。ステップ6:サンプル解析MassARRAYシステムを用いて2種類の切断反応のスペクトルを得る。6ステップ6:解析ソフトウェア結果をEpiTYPERソフトウェアにより解析し、目的とするDNAのメチル化割合を測定する。本発明DNAは、以下のメチル化DNA含量測定方法により、メチル化されたDNAの含量を測定することができる。メチル化DNA含量測定方法は、哺乳動物由来の検体中に含まれる目的とするDNA領域の塩基配列が有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、1哺乳動物由来の検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、2第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第二工程、及び、3下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖DNAを、固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA正鎖にする工程第一前工程と、第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のDNA正鎖を、一本鎖状態であるDNA正鎖が有する塩基配列の部分塩基配列正鎖であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列正鎖の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列正鎖、に対して相補性である塩基配列負鎖を有する伸長プライマーフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を二本鎖DNAに伸長形成させる工程第二前工程と、第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA負鎖に一旦分離する工程第三前工程を有し、且つ、本工程としてa生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A工程本工程と、b生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA負鎖を鋳型として、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性である塩基配列負鎖の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖、に対して相補性である塩基配列正鎖を有する伸長プライマーリバース用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程本工程とを有し、さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする。本発明メチル化DNA含量測定方法における相補性であるとは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖DNAを形成することを意味する。例えば、DNAを構成する二本鎖の各々一本鎖DNAを構成する塩基が、プリンとピリミジンとの塩基対合により二本鎖を形成することであり、具体的には例えば、複数の連続した、チミンとシトシンとの間の水素結合による塩基結合、又は、グアニンとアデニンとの間の水素結合による塩基結合により、二本鎖DNAを形成することを意味する。相補性によって結合することを相補的な結合と記載することもある。相補的な結合は、相補的に塩基対合しうる又は相補性により結合と記載することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに相補性を有する相補性によって結合相補的な塩基対合による結合と記載することもある。尚、本発明メチル化DNA含量測定方法においては、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン若しくはチミンと水素結合で結合することも、相補性であるに含まれる。本発明メチル化DNA含量測定方法における目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA負鎖とは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAとの結合体二本鎖を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするDNA領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、相補的塩基配列あるいは相補配列と記載することもある。また、相補的塩基配列は、相補的と表現することもある。本発明メチル化DNA含量測定方法におけるメチル化されたDNA、メチル化DNAとは、DNAの塩基配列中の5’-CG-3’で示される塩基配列以下、当該塩基配列をCpGと記すこともある。中のシトシンの5位がメチル化されたDNAを意味する。本発明メチル化DNA含量測定方法におけるの第一工程においてメチル化頻度とは、本発明評価方法でのものと同じ意味であり、例えば、調査対象となるCpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。また本発明評価方法の第一工程においてメチル化頻度に相関関係がある指標値とは、本発明評価方法でのものと同じ意味であり、例えば、本発明DNAの発現産物の量より具体的には、当該本発明DNAの転写産物の量や、当該本発明DNAの翻訳産物の量等をあげることができる。このような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するような負の相関関係が存在する。本発明メチル化DNA含量測定方法における固定化メチル化DNA抗体としては、例えば、メチルシトシン抗体等を挙げることができる。当該固定化メチル化DNA抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、支持体に固定化され得るものとは、固定化メチル化DNA抗体を支持体へ直接的又は間接的に固定できることを意味する。このように固定化されるためには、固定化メチル化DNA抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット装置等に従って、支持体に固定すればよい固相への結合。具体的には、固定化メチル化DNA抗体をビオチン化して得られたビオチン化固定化メチル化DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等に固定する方法を挙げることができる。また固定化メチル化DNA抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、合成樹脂等から作製された支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを5個直列に連結してなるようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。更に、固定化メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また固定化メチル化DNA抗体に対する抗体二次抗体を支持体に固定化し、当該二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。尚、一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。本発明メチル化DNA含量測定方法で用いられるメチル化感受性制限酵素具体的には、シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素とは、本発明評価方法でのものと同じ意味であり、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該DNAは切断されず、一方、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII等をあげることができる例えば、NucleicAcidResearch9、25092515参照。本発明メチル化DNA含量測定方法におけるメチル化感受性制限酵素としては、例えば、本発明DNAの塩基配列を目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素又はHhaI等を挙げることができる。本発明メチル化DNA含量測定方法の応用として、当該方法における第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う方法もありうる。本発明メチル化DNA含量測定方法の第二工程は、第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料に含まれるメチル化された二本鎖DNAをメチル化された一本鎖DNAに分離する第A工程即ち、第二工程における第A工程と、当該第A工程で得られたメチル化一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体と結合させる第B工程即ち、第二工程における第B工程とから構成されてもよい。本発明メチル化DNA含量測定方法の第二工程において、第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料に含まれるメチル化された二本鎖DNAをメチル化された一本鎖DNAに分離するには、二本鎖DNAを一本鎖DNAにするための一般的な操作を行えばよい。具体的には例えば、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料を適当量の超純水に溶解し、95°Cで10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。本発明メチル化DNA含量測定方法の第二工程において、上記のようにして分離されたメチル化一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体と結合させることによって一本鎖DNAを選択するには、上記の固定化メチル化DNA抗体に係る説明で述べたように、具体的には例えば、固定化メチル化DNA抗体としてビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体を使用して以下のように実施すればよい。aビオチン化メチルシトシン抗体を適当量例えば、01μg50μLアビジン被覆PCRチューブに添加し、その後、これを室温で約1時間静置することにより、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンとの固定化を促す。PCRチューブ内から残溶液の除去及び洗浄後、洗浄バッファー例えば、005Tween20含有リン酸バッファー1mMKH2PO4、3mMNa2HPO7H2O、154mMNaClpH74を100μLチューブの割合で添加する。PCRチューブ内から溶液の除去及び洗浄後当該洗浄操作を数回繰り返した後、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をPCRチューブ内に残す。b哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の二本鎖DNAとバッファー例えば、33mMTrisAcetatepH79、66mMKOAc、10mMMg2、05mMDithothreitolとを混合し、得られた混合物を95°Cで数分間加熱する。加熱後、前記混合物を約0~4°Cの温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温することにより、一本鎖DNAを形成させる。得られた混合物を室温に戻す。c形成された前記一本鎖DNAを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆PCRチューブに添加し、得られた混合物を室温で約1時間静置することにより、ビオチン化メチルシトシン抗体と前記一本鎖DNAのうちメチル化された一本鎖DNAとの結合を促す結合体の形成この段階で、少なくともメチル化されてないDNA領域を含む一本鎖DNAは結合体を形成しない。。その後、PCRチューブ内から残溶液を除去し、洗浄を行う。PCRチューブ内に洗浄バッファー例えば、005Tween20含有リン酸バッファー1mMKH2PO4、3mMNa2HPO7H2O、154mMNaClpH74を100μLチューブの割合で添加した後、PCRチューブ内から溶液を取り除く。当該洗浄操作を数回繰り返すことにより、洗浄された結合体をPCRチューブ内に残す結合体の選択。上記bにおいて使用されるバッファーとしては、生物試料由来のゲノムDNA由来の二本鎖DNAを一本鎖DNAへ分離するために適したものであればよく、前記バッファーに限ったわけではない。上記a及び上記cにおける洗浄操作では、溶液中に浮遊している固定化されていない固定化メチル化DNA抗体、固定化メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖DNA、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA等を反応溶液から取り除くために重要な操作である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離の固定化メチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖DNA等の除去に適したものであればよく、前記洗浄バッファーに限らず、DELFIAバッファーPerkinElmer社製、TrisHClpH78withTween80、TEバッファー等でもよい。他に第二工程における第A工程において、メチル化された一本鎖DNAを分離する際の好ましい態様としては、例えば、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとしては、例えば、目的とするDNA領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものを挙げることができる。通常10~100塩基、より好ましくは、20~50塩基の長さに設計したものを好ましく挙げることができる。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマー又はリバース用プライマーが目的とするDNA領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAに比し、大過剰で添加され、目的とするDNA領域を一本鎖正鎖にした後、固定化メチル化DNA抗体と結合させる際に、目的とするDNA領域の相補鎖負鎖と目的とするDNA領域を一本鎖正鎖が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするDNA領域にメチル化DNA抗体を結合させて、DNAのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化DNA抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域に比べて、少なくとも10倍、通常は100倍以上の量が添加されることが好ましい。ここで、メチル化された一本鎖DNAを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加するとは、具体的には、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを選択するために、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするDNA領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記DNA試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドとの混合物に、緩衝液330mMTrisAcetatepH79、660mMKOAc、100mMMgOAc2、5mMDithiothreitol5μLと、100mMのMgCl2溶液5μLと、1mgmLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合して、95°Cで10分間加熱し、70°Cまで速やかに冷却し、その温度で10分間保温し、次いで、50°Cまで冷却し10分間保温し、さらに37°Cで10分間保温した後室温に戻せばよい。本発明メチル化DNA含量測定方法の第三工程は、以下の各工程を含む1前工程i第一前工程、ii第二前工程、iii第三前工程2本工程i第A工程、ii第B工程3繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程1第三工程における前工程i第三工程における前工程での第一前工程第二工程で選択された一本鎖DNAを、固定化メチル化DNA抗体から分離して遊離の一本鎖状態のDNAにする工程具体的には例えば、第二工程で選択された一本鎖DNAに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を95°Cで数分間加熱することにより、一本鎖状態であるDNA正鎖を得る。ii第三工程における前工程での第二前工程第一前工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のDNA正鎖と、一本鎖状態であるDNA正鎖が有する塩基配列の部分塩基配列正鎖であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列正鎖の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列正鎖、に対して相補性である塩基配列負鎖を有する伸長プライマーフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるDNA正鎖を二本鎖DNAに伸長形成させる工程具体的には例えば、第一前工程で得られた一本鎖状態のDNA正鎖とフォワードプライマーとを、滅菌超純水を1785μL、最適な緩衝液例えば、100mMTrisHClpH83、500mMKCl、15mMMgCl2を3μL、2mMdNTPを3μL、5Nベタインを6μL加え、次いで得られた混合物にAmpliTaqDNAポリメラーゼの1種:5UμLを015μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合する。得られた混合物を37°Cで約2時間インキュベーションすることにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を二本鎖DNAに伸長形成させる。iii第三工程における前工程での第三前工程第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA負鎖に一旦分離する工程具体的には例えば、第二前工程で伸長形成された二本鎖DNAに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を95°Cで数分間加熱することにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAに一旦分離する。2第三工程における本工程i第三工程における本工程での第A工程生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を鋳型として、前記フォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A工程後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよいが、具体的には例えば、生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖に、前記のフォーワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォーワード用プライマーのTm値の約0~20°C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。その後、室温に戻す。上記でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記のフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる。ii第三工程における本工程での第B工程生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA負鎖を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性である塩基配列負鎖の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖、に対して相補性である塩基配列正鎖を有する伸長プライマーリバース用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよいが、具体的には例えば、上記の第三工程における本工程での第A工程と同様な操作方法等に準じて実施すればよい。3第三工程における繰り返し工程i第三工程における繰り返し工程での増幅工程第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅する工程具体的には例えば、上記2の第三工程における本工程での第A工程及び第B工程と同様な操作方法等に準じて実施すればよい。ii第三工程における繰り返し工程での定量工程第三工程の繰り返し工程における増幅工程により増幅されたDNAの量を定量する工程尚、本発明メチル化DNA含量測定方法の第三工程は、前工程における第一前工程から開始して本工程及び繰り返し工程に至るまでの反応を、一つのPCR反応として実施することもできる。また、前工程における第一前工程から第三前工程まで、各々、独立した反応として実施し、次いで本工程のみをPCR反応として実施することもできる。本発明メチル化DNA含量測定方法において、選択された一本鎖DNAに含まれる目的とするDNA領域即ち、目的領域を増幅する方法としては、例えば、PCRを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。PCR反応液としては、例えば、本発明の第二工程で得たDNAに、50μMのプライマーの溶液を015μlと、2mMdNTPを25μlと、10×緩衝液を25μlと、AmpliTaqGoldを02μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液を挙げることができる。目的とするDNA領域即ち、目的領域は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95°Cにて10分間保温した後、95°Cにて30秒間、次いで55~65°Cにて30秒間、更に72°Cにて30秒間、を1サイクルとする保温を30~40サイクル行う条件を挙げることができる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、上述と同様な洗浄精製操作を実施した後、蛍光標識体の量の測定によりPCR反応での増幅産物の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合には、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせた後、目的領域に結合した当該プローブの量を測定すればよい。また、増幅産物の量をより精度よく測定するには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。ここでリアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子の量に関して2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法をいう。当該リアルタイムPCR法としては、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。更に、本発明評価方法においてメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する際の実施態様の一例としては、例えば、以下に示される方法1~7等も挙げることができる。[方法1]第一工程、第二工程、第三工程、第四工程前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程哺乳動物由来検体中に含まれる本発明DNAの塩基配列を目的とするDNA領域として、目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、1哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、2第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料から目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を取得し、該一本鎖DNA正鎖と、該一本鎖DNAの3’末端の一部但し、前記の目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記一本鎖DNAを選択する第二工程、3第二工程で選択された一本鎖DNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第三工程、及び、4下記の各本工程の前工程として、第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程前工程を有し、且つ、本工程としてa生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程と、を有する第A工程本工程と、b生成した一本鎖状態であるDNA負鎖を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性のある塩基配列負鎖の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖に対して相補性のある塩基配列正鎖を有するプライマーリバース用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程本工程とを有し、更に前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、を有することを特徴とする方法。[方法2]第一工程、第二工程、第三工程、第四工程前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程第二工程において目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と、該一本鎖DNAの3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性のある塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させる前記方法1に記載される方法。[方法3]第一工程、第二工程、第三工程、第四工程前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程二価陽イオンがマグネシウムイオンである前記方法2に記載される方法。[方法4]第一工程、第二工程、第三工程、第四工程前工程追加前工程を含む、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程第四工程の前工程の前操作段階において、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性のある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、第四工程の各本工程として、下記の1つの工程を更に追加的に有する方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、前記追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程本工程[方法5]第一工程、第二工程、第三工程、第四工程前工程追加前工程、追加再前工程を含む、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程第四工程の前工程の後操作段階において、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性のある塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、第三工程及び前記追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程追加再前工程を有し、且つ、第四工程の各本工程として、下記の1つの工程を更に追加的に有する方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、前記追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程本工程[方法6]前記方法1~5のいずれか一に記載された方法の工程として、下記の2つの工程を更に追加的に有するメチル化割合の測定方法。5前記方法1~5のいずれか一に記載の方法の第一工程を行うことなく、発明1~5のいずれか一に記載の方法における第二工程から第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNAメチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、6前記方法1~5のいずれか一に記載の第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程[方法7]前記1~6の方法に記載された第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う方法。前記方法1~7に記載された第二工程において、第一工程で得られた消化処理が行われたDNA試料から目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を取得し、該一本鎖DNA正鎖と、該一本鎖DNAの3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記一本鎖DNAを選択する。前記方法1~7に記載される一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチド以下、本固定化オリゴヌクレオチドと記すこともある。である。本固定化オリゴヌクレオチドは、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を選択するために用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、5~50塩基長であることが好ましい。本固定化オリゴヌクレオチドの5’末端側は、担体と固定化され得るものであり、一方その3’末端側は、後述する第三工程及び第A2工程により5’末端から3’末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であってもよい。または、本固定化オリゴヌクレオチドは、5’或いは3’末端が担体と固定化されてもよい。前記方法1~7に記載される担体と固定化され得るものとは、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されていればよく、1該一本鎖DNA正鎖と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合前の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよく、また2該一本鎖DNA正鎖と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよい。このような構造を得るには、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド以下、本オリゴヌクレオチドと記すこともある。の5’末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット装置等に従い、担体に固定すればよい固相への結合。具体的には例えば、本オリゴヌクレオチドの5’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等に固定する方法を挙げることができる。また、本オリゴヌクレオチドの5’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを5個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの5’末端側から化学合成させる方法も挙げられる。前記方法1~7に記載される第二工程は、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、aまず、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に、アニーリングバッファー及びビオチン化オリゴヌクレオチド該一本鎖DNA正鎖と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるものを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に存在する目的とするDNA領域を含む二本鎖DNAを一本鎖にするために、95°Cで数分間加熱する。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのTm値の約10~20°C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。bその後、室温に戻す。cストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記bで得られた混合物を添加し、さらに、これを37°Cで数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。因みに、前述の如く、上記a~cでは、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。即ち、例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化オリゴヌクレオチドに、哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料を添加することにより混合物を得て、得られた混合物を哺乳動物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に存在する目的とするDNA領域を含む二本鎖DNAを一本鎖にするために、95°Cで数分間加熱し、その後ビオチン化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、ビオチン化オリゴヌクレオチドのTm値の約10~20°C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温してもよい。dこのようにしてビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄DNA精製を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに哺乳動物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、哺乳動物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄DNA精製を行う。当該操作は、固定化されていないDNA、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているDNAが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と哺乳動物由来検体中DNAとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するDNA例えば、ヒトの哺乳動物由来検体の場合は、ラットDNA等を大量に哺乳動物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。前記方法1~7に記載される第二工程における好ましい態様としては、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と、該一本鎖DNAの3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで二価陽イオンを含有する反応系とは、前記一本鎖DNA正鎖と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩例えば、Mg2、MgCl2等を1mM~600mMの濃度で含まれることがよい。前記方法1~7に記載される第三工程において、第二工程で選択された一本鎖DNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる。この場合、該一本鎖DNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させるためには、DNAポリメラーゼを用いて伸長反応を実施すればよい。前記方法1~7に記載される第三工程は、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施すればよい。前記第二工程で選択された前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAに、滅菌超純水を1785μL、最適な10×緩衝液100mMTrisHClpH83、500mMKCl、15mMMgCl2を3μL、2mMdNTPを3μL、5Nベタインを6μL加え、次いで該混合物にAmpliTaqDNAポリメラーゼの1種:5UμLを015μL加えて液量を30μLとし、37°Cで2時間インキュベーションする。その後、インキュベーションされた溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに哺乳動物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに哺乳動物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、哺乳動物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加し、その後該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄DNA精製を行う。また、前記方法1~7に記載される第三工程は、前記第二工程で選択された一本鎖DNAを固定化オリゴヌクレオチドから分離して一本鎖状態に一旦分離する工程を有し、生成した一本鎖状態であるDNA正鎖を鋳型として、前記目的とするDNA領域の塩基配列正鎖の3’末端より更に3’末端側に位置する部分塩基配列正鎖に対して相補性のある塩基配列負鎖を有するフォーワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる工程であってもよい。この場合の方法としては、具体的に例えば、二本鎖DNAを一本鎖にするために、95°Cで数分間加熱すればよい。さらに、フォーワード用プライマーを添加した後、フォーワード用プライマーのTm値の約10~20°C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、前記の生成した一本鎖状態であるDNA正鎖とフォーワード用プライマーとの二本鎖を形成させる。生成した二本鎖DNAの溶液に、最適な10×緩衝液100mMTrisHClpH83、500mMKCl、15mMMgCl2を3μL、2mMdNTPを3μL、5Nベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaqDNAポリメラーゼの1種:5UμLを015μL加え、滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37°Cで2時間インキュベーションする。尚、第三工程は、第四工程と独立に実施しても良いし、第四工程で実施されるPCR反応と連続して実施しても構わない。前記方法1~7に記載される第四工程において、下記の各本工程の前工程として、第三工程で得られた伸長形成された二本鎖DNA前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程前工程を有し、且つ、本工程としてa生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程とを有する第A工程本工程と、b生成した一本鎖状態であるDNA負鎖を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性である塩基配列負鎖の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖、に対して相補性である塩基配列正鎖を有する伸長プライマーリバース用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第B工程本工程とを有し、さらに第四工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。前記方法1~7に記載される第四工程では、まず、下記の各本工程の前工程として、第三工程で得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する。具体的には例えば、第三工程で得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を95°Cで数分間加熱する。その後、本工程として、生成した一本鎖状態であるDNA正鎖を、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド負鎖にアニーリングさせるために、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチド負鎖のTm値の約10~20°C低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。その後、室温に戻す。第A工程における第A1工程上記で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる即ち、第A工程における第A2工程。具体的には例えば、後述の説明や前述の方法1~7に記載の第二工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。生成した一本鎖状態であるDNA負鎖を鋳型として、前記一本鎖状態であるDNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性である塩基配列負鎖の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖、に対して相補性である塩基配列正鎖を有する伸長プライマーリバース用プライマーを伸長プライマーリバース用プライマーとして、該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる即ち、第B工程。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の方法1~7に記載の第二工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。さらに第四工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと例えば、第A工程及び第B工程により、前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の方法1~7に記載される第四工程における前工程、第A工程及び第B工程での操作方法等に準じて実施すればよい。前記方法1~7に記載されるメチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的とするDNA領域即ち、目的領域を増幅する方法としては、例えば、PCRを用いることができる。目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用いることができるので、もう一方のプライマーのみ添加してPCRを行うことにより、増幅産物が得られ、その増幅産物も固定化されることとなる。この際、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。PCR反応液としては、例えば、前記方法1~7に記載の第三工程で得たDNAに、50μMのプライマーの溶液を015μlと、2mMdNTPを25μlと、10×緩衝液を25μlと、AmpliTaqGoldを02μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液を挙げることができる。目的とするDNA領域即ち、目的領域は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記ように反応液を、95°Cにて10分間保温した後、95°Cにて30秒間次いで55~65°Cにて30秒間さらに72°Cにて30秒間を1サイクルとする保温を30~40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄精製操作を実施後、固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。リアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法である。該リアルタイムPCR法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。更に、前記方法1~7に記載される固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のビオチン化オリゴヌクレオチドを片側のプライマー、又は、固定化オリゴヌクレオチドより、3’端側に新しいビオチン化オリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマーとし、その相補側プライマーを用いて、目的領域を増幅することもできる。この場合、得られた増幅産物は、ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定化されるので、例えば、ストレプトアビジンコートPCRチューブでPCRを実施した場合には、チューブ内に固定されるため、上記の通り、標識されたプライマーを用いれば、増幅産物の検出が容易である。また、先の固定化オリゴヌクレオチドが共有結合等による固定化の場合であれば、PCRで得られた増幅産物を含む溶液をストレプトアビジン被覆支持体が存在する容器に移し、増幅産物を固定化することが可能である。検出については、上述の通り実施すればよい。目的領域を増幅する相補側のプライマーは、メチル化感受性制限酵素の認識部位を1つ以上有する目的領域を増幅でき、且つ、その認識部位を含まないプライマーでなければいけない。この理由は、以下の通りである。選択及び1回伸長反応で得られた二本鎖DNAの固定化オリゴヌクレオチド側のDNA鎖新生鎖の一番3’端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位のみがメチル化されていない場合には、その部分だけがメチル化感受性制限酵素で消化されることになる。消化後、前述のように洗浄操作を行っても、新生鎖で言う3’端の一部だけを失った二本鎖DNAが固定化されたままの状態で存在する。相補側のプライマーが、この一番3’端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位を含んでいた場合には、該プライマーの3’端側の数塩基が、新生鎖の3’端の数塩基とアニーリングし、その結果、目的領域がPCRにより増幅する可能性があるからである。前記方法1~7に記載される方法は、第四工程の前工程の前操作段階又は後操作段階において、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有するような変法を含む。即ち、変法1前記方法1~7に記載される方法の第四工程の前工程の前操作段階において、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、前記方法1~7に記載の方法の第四工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程本工程変法2前記方法1~7に記載される方法の第四工程の前工程の後操作段階において、前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、第三工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である伸長形成された二本鎖DNA前記メチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程追加再前工程を有し、且つ、前記方法1~7に記載の方法の第四工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法以下、方法1~7に記載のメチル化割合測定方法と記すこともある。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、該プライマーを1回伸長させることにより、前記一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第C2工程とを有する第C工程本工程前記方法1~7に記載される方法において、当該変法では、外部から前記目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加すること等により、第四工程における前述の目的とするDNA領域の増幅効率を容易に向上させることが可能となる。なお、追加前工程で反応系内に添加される一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖は、一本鎖DNAの3’末端の一部但し、前記目的とするDNA領域を含まない。に対して相補性である塩基配列であって、5’末端が、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じである塩基配列を有する遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドであれば、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列であっても、又は、短い塩基配列であっても、或いは、長い配列であっても良い。ただし、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドよりも長い配列の場合には、前記リバース用プライマー正鎖を伸長プライマーとし、該一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できない遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドでなければならない。前記方法1~7に記載される方法において、目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして固定化オリゴヌクレオチドを用いて、もう一方のプライマーのみ添加してPCRを行う例を前記したが、目的産物の検出のために他の方法例えば、PCRで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法を実施するのであれば、上記の如く、目的領域を増幅する際に、固定化オリゴヌクレオチドを一方片側のプライマーとして使用せず、一対のプライマーを添加してPCRを実施してもよい。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物の量を求める。前記方法1~7に記載される方法において、第四工程は繰り返し工程を有するが、例えば、第A1工程における生成した一本鎖状態であるDNA正鎖とは、第1回目の第四工程の操作及び第2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において生成した遊離の一本鎖状態であるDNA正鎖を意味することになる。また、第B工程における生成した一本鎖状態であるDNA負鎖とは、第1回目の第四工程の操作及び第2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において生成した固定の一本鎖状態であるDNA正鎖を意味する。但し、第四工程がさらに追加的にC工程を有する場合には、第1回目の第四工程の操作において生成した固定の一本鎖状態であるDNA正鎖を意味し、一方、第2回目以降の第四工程の繰り返し操作において生成した固定の一本鎖状態であるDNA正鎖と生成した遊離の一本鎖状態であるDNA正鎖との両者を意味することになる。また、前記方法1~7に記載される方法において、第四工程の各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAとは、第A工程の場合には、第1回目の第四工程の操作において前記メチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを意味し、一方、第2回目以降の第四工程の繰り返し操作において前記メチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAと前記メチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のCpG対を含む伸長形成された二本鎖DNAとの両者を意味することになる。第B工程の場合には、第1回目の第四工程の操作及び第2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において前記メチル化感受性制限酵素の認識部位では全てがアンメチル状態のCpG対である伸長形成された二本鎖DNAを意味することになる。尚、第四工程がさらに追加的にC工程を有する場合にも同様である。また、前記方法1~7に記載される方法において、第四工程がさらに追加的にC工程を有する場合において、第C1工程における生成した一本鎖状態であるDNA正鎖とは、第1回目の第四工程の操作及び第2回目以降の第四工程の繰り返し操作の両操作において生成した遊離の一本鎖状態であるDNA正鎖を意味することになる。また前記方法1~7に記載される方法における工程として、下記の2つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法即ち、前記方法1~7に記載のメチル化割合測定方法を含んでもよい。5前記方法1~7に記載される方法の前記変法を含む、第一工程及び第二工程を行った後、前記方法1~7に記載される方法前記変法を含むの第三工程を行うことなく、前記方法1~7に記載前記変法を含むされる第四工程を行うことにより、前記目的とするDNA領域のDNAメチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第五工程、及び、6前記方法1~7に記載される方法前記変法を含むの第四工程により定量されたDNAの量と、第五工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第六工程。このような本発明又は本発明メチル化割合測定方法において、本発明DNAの塩基配列を目的とするDNA領域として、目的とするDNA領域のメチル化されたDNA量の測定、メチル化割合の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。また更に、本発明評価方法においてメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する際の他実施態様の一例としては、例えば、以下に示される方法1~8等を挙げることができる。[方法1]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、1生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と、当該一本鎖DNAの目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖DNAを選択し、選択された一本鎖DNAと前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが結合してなる二本鎖DNAを結合形成させる第一工程、2第一工程で結合形成させた二本鎖DNAを少なくとも1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpG対を含む二本鎖DNAを除去する第二工程、及び、3下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である結合形成された二本鎖DNA前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない結合形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程第一前工程と、生成した遊離の一本鎖状態であるDNA正鎖と、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した遊離の一本鎖状態であるDNAを選択し、選択された一本鎖DNAと前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとが結合してなる二本鎖DNAを結合形成させる工程第二A前工程と、当該工程第二A前工程で結合形成された二本鎖DNAを、前記の選択された一本鎖DNAを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖DNAを伸長形成された二本鎖DNAとする工程第二B前工程とを有する工程第二前工程と、第二前工程で伸長形成された二本鎖DNA前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを、一本鎖状態であるDNA正鎖と一本鎖状態であるDNA負鎖に一旦分離する工程第三前工程とを有し、且つ、本工程としてa生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを選択する第A1工程と、第A1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる第A2工程とを有する第A工程本工程と、b生成した一本鎖状態であるDNA負鎖を鋳型として、前記の一本鎖状態であるDNA負鎖が有する塩基配列の部分塩基配列負鎖であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列正鎖に対して相補性である塩基配列負鎖の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列負鎖、に対して相補性である塩基配列正鎖を有し、且つ、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドを鋳型とする伸長反応に利用できない伸長プライマーリバース用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする第B工程本工程とを有し、さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。[方法2]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程第一工程において、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖と、当該一本鎖DNAの目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする前記方法1に記載される方法。[方法3]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする前記方法2に記載される方法。[方法4]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程追加前工程を含む、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載される第三工程の第一前工程の前操作段階において、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載の第三工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする第C2工程とを有する第C工程本工程;[方法5]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程追加前工程及び追加再前工程を含む、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載される第三工程の第一前工程の後操作段階において、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖DNA前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程追加再前工程を有し、且つ、前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載の第三工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする第C2工程とを有する第C工程本工程[方法6]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程追加前工程を含む、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載される第三工程の第三前工程の前操作段階において、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、前記方法1~3のいずれかの前記方法記載の第三工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする第C2工程とを有する第C工程本工程;[方法7]第一工程、第二工程、第三工程第一前工程追加前工程及び追加再前工程を含む、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、iii第C工程、繰り返し工程i増幅工程、ii定量工程前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載される第三工程の第三前工程の後操作段階において、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA正鎖の3’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖を反応系内に添加する工程追加前工程を追加的に有し、且つ、第二工程及び上記の追加前工程を経て得られた未消化物である二本鎖DNA前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpG対を含まない伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離する工程追加再前工程を有し、且つ、前記方法1~3のいずれかの前記方法に記載の第三工程の各本工程として、下記の1つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。ci生成した一本鎖状態であるDNA正鎖と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを選択する第C1工程と、ii第C1工程で選択された一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド負鎖をプライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする第C2工程とを有する第C工程本工程[方法8]第一工程、第三工程第一前工程、第二前工程i第二A前工程、ii第二B前工程、第三前工程、本工程i第A工程i1第A1工程、i2第A2工程、ii第B工程、第四工程i増幅工程、ii定量工程、第五工程前記方法1~7のいずれかの前記方法に記載される方法の工程として、下記の2つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。4前記方法1~7のいずれかの前記方法に記載される方法の第一工程を行った後、前記方法1~7のいずれかの前記方法に記載される方法の第二工程を行うことなく、前記方法1~7のいずれかの方法記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするDNA領域のDNAメチル化されたDNA及びメチルされていないDNAの総量を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第四工程、及び、5前記方法1~7のいずれかの前記方法に記載の第三工程により定量されたDNAの量と、第四工程により定量されたDNAの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの割合を算出する第五工程、を有することを特徴とする方法。本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法としては、例えば、本発明DNAの下流に存在する遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、リアルタイムPCR法、ノザンブロット法MolecularCloningColdSpringHarborLaboratory1989、insituRT-PCR法NucleicAcidsRes213159-31661993、insituハイブリダイゼーション法、NASBA法Nucleicacidsequence-basedamplificationnature35091-921991等の公知な方法を用いればよい。哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAの下流に存在する遺伝子の転写産物であるmRNAを含む試料は、通常の方法に準じて当該検体から抽出、精製等により調製すればよい。調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにノザンブロット法が用いられる場合には、検出用プローブは本発明DNAの下流に存在する遺伝子又はその一部本発明DNAの下流に存在する遺伝子の制限酵素切断、本発明DNAの下流に存在する遺伝子の塩基配列に従い化学合成した約100bp~約1000bp程度のオリゴヌクレオチド等を含むものであればよく、前記試料中に含まれるmRNAとのハイブリダイゼーションにおいて用いられる検出条件下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。また調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにリアルタイムPCR法が用いられる場合には、使用されるプライマーは、本発明DNAの下流に存在する遺伝子のみを特異的に増幅できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。リアルタイムPCR法による転写産物の量を測定することもできる。定量を必要とする場合には、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは既に市販されている。また本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれる本発明DNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法としては、例えば、本発明DNAの下流に存在する遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、当該タンパク質に対する特異的抗体モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体を用いた、細胞工学ハンドブック、羊土社、207等に記載されるイムノブロット法、免疫沈降による分離法、間接競合阻害法ELISA法等の公知な方法を用いればよい。因みに、タンパク質に対する特異的抗体は、当該タンパク質を免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれる目的とするDNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する。測定されたメチル化頻度に相関関係がある指標値と、例えば、大腸癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる目的とするDNAのメチル化頻度に相関関係がある指標値対照とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれる目的とするDNAのメチル化頻度に正の相関関係がある指標値が対照と比較して高ければ又は負の相関関係がある指標値が対照と比較して低ければ目的とするDNAが対照と比較の上で高メチル化状態であれば、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。本発明評価方法における、目的とするDNAのメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定するための各種方法で使用し得るプライマー、プローブ又は特異的抗体は、大腸癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等を試薬として含有する大腸癌細胞等の癌細胞の検出用キットや、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等が担体上に固定化されてなる大腸癌細胞等の癌細胞の検出用チップも提供しており、本発明評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例1シトシンのメチル化割合の測定Biochain社より下表に示されるヒト組織由来ゲノムDNA入手し、MassARRAYシステムを用いたMassARRAY解析を実施した。詳細はSEQUENOMアプリケーションノートに示される定量的DNAメチル化解析用EpiTYPERの概論に従った手法にしたがって、配列番号119に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるアンプリコン1-19に含まれるシトシンのメチル化割合を測定した。ヒト組織由来ゲノムDNA:アンプリコン1-19を以下に示す。アンプリコン1:TACTAGGAGGAGAGACCTGGAAGGCAATCACAAAAAGTCTCATTTAAATTCCTGGAAAGCACAGCTTCTCCAAACACAGCTATTCAGCTCTTTGGAAGGCAGCACTTGCGGGAGCCATTGAGTTTAACTTCACTCAGTCCCCCAACACAGAACCGGCAAATCCGAATGAGATGGACGTCACACTCCCTACTCAAAAGAATGCATCAAATATCCACTCCGTAACACCGCGGAAAGTAAACCCAAAAGCGGAGTTTGCCGCCTGCCAACTACATAAGAATTAACACTCGGGTATTTAGGATTCTAAAGATCCCTACTACCCCAAACATTATAGCCACAGAGAACCAGAAATGAACAGAACACACTTTAACCTTTAAGAAGTGCAGTTTTGTACGGGGGTTGGCTGAAGAAAGACAAAAATCTTCACTCCCTTCCAGAGCCAAAAGAGCCAAAATAAAAGATCACCTTTACTGAGCCACAGGGGCACAACTG配列番号1アンプリコン2:TGTTATGCACAAGGCCAAGTGGCTTTGCTCATTCCCAAAACAGGCCAGCCAGCTCGTGGCGATTAGTGAGATAATGAGCTTGCATGTCCCTGGCACAGGATCTGTGCCCGACAATGCTTTCCTTTCTTTAGCGTAGGCAATGTGTGTACTGAATTTCAGTGATTTCATTTGGTACTACTGTATGTGCTTGCTCCATATTTTTAATCCAACCAGTTCTGAGCGACTTTATGAGAACACACATTTTAACATAAATGCATTTGGATTTATTGTTCTTAAGTAGAAAGCTGAGTAGTTTCTATATAAGGGAAATCTAAAGCCTATAGGATAGAAATTATCTGTTCAGCAAAGTCTTACTTGAAGATTAAGAACAGGGACTTTTTTGCGGGGGGACGGGAGGGATGGAGTCTCCCTCTGTCACCCAGGCTGGAGTTCAGTGGCATGATCTCAGCTCACTACAACCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGA配列番号2アンプリコン3:TGATGGCTCACTCAGGGGGCCCTATAGAAACGCCCCCAAGGATTCAACCACCTGGGAGGCTCTTTACTTCTGGTATTTCTCCTAAGGATGAAACTTGCAATTCAAACACTCTCGTTGCCGATTCTCTCCTCCCGCACCGCTCTTACCTCCACTCCCACATTCCCCTCCCAGCAAGGTTAGCGCACTGGAAGCAATGTGAAGGGGCTGTGGGGAAGGTGAGGCCCGAGTTTCAGGCTACTTTTGTCTGATTCAGACTCTTTCAGAATGACCAGCAAGTTCAACCTGTACCGCAGAGCCAGGACTCACTGGGGAGAAATGACTTTTGCATC配列番号3アンプリコン4:GTGTGGTGTGGGCTCATTCCTCAGTACACCAGTGCCCTCTAATGGACAAAACAACAGTCCCAAGGTCACGGTTGTTCCAAAGTGGACCGTGCACACTTGAAACAGCTACCATCGCTCAGCACCTAAGTCAAATGTCAGAAGGCAGAAAGCTGTTCAGAATGTTTAGCTTAACTCCCTGTTTGTAATGAAAAGGAAACCAAGGTCCTAATTGCAAGACTGAACGTGATGGTGGCATGATTACGGTCATTTGACCAGCAATCATCTCGCCATCTGAGCACCTGCTGTGGAAGCAGCCCCTGACCTAAGGCTGTGTGTGCAGTGAGCCATCCATCCTCACAGTGAGCCAGGGGTAGGGCGATCCCTATCCTCTTACAGATGAAGACACAGGCAGGGCCCTCTGTGACTTTATGGGAAAGCCTGAGTGTGCACTAGAA配列番号4アンプリコン5:AGGTGTCCCAGGGCAGTGTCAGGGATCCTGGCTTTCTCCATCCTGTTGCCCTGCCTACCAGGCAGAGCTGCCTTGGTCCCTGGAAACTGGGCTTCTTACTGGTTGGCTGGGTCTGGCCCAGCCTTGGAGCTCAGTTCTGAGCACTGGACCCCATCTTCTTCTCTGGACTGGAAGATCCACTCCCGCCAGACCTGGTGACCTCCTGTGGGGTCGCCTTACTCCAAGCCCTGACCAGGTACCTACTTGGCTAAGGCTTGGAGCCCGGCTGTGAAGGGCTGAGAATCACCAAGGTTGAGCTCTGCAAGCCTGAACCCGGATGCTTCCGCACAGAAAGGGCCTTGGATGCTGGGTTGAGATCTTTTGCCTTAAA配列番号5アンプリコン6:AAATACTCACTTCTGGGAAACATGGGCGAATTCAGTGGGAATCGTGCTAGAAGTTACGAGCAGAGGAGCCTGGGTGGGGACTTATACTGGCCTTGACGGCCCGTGGAAAGGAACTGGCGGCAATTCCTTCCGTTTTCCGTCAATTTCTTCACGGGTCGCTCAGAAGCTACGGAAGCAAAGTAGAAAGGAGTGATAGGGACAGGCCACAGTACCGGCGGACGGTGATGGCGTTGCGTTTAAAAGGGTGGTCACTGAAACCCTTTGT配列番号6アンプリコン7:GGACAGACCAGTTGAGCTCTTTGGGTATGCACGTAATGTCGCATTTTTATTTTCAGTTCAGGAAATGCTGATATTGGAGCTTCTGAGGGAGCTGCAGTGATTTCCCGATTTCCTGCGCGCCTGTGTGGAAAGTTAGAAGCGGAATCTACCGGCAGCTTTGAGACTAAGCATGACGGTGGAAACAGCTAATTTTATTAGCTTTTGTCTGAAATGCAAAAGATGAGAAAGAAAATTCCCGTTTGTTTGCTCCACATACTTCTCTTAGAAGCCTATGGAAAGCCAACTTTCCCCCTGAAGAAACTCCTCCTGGCATTTGCAAAGAGCTCCTTTACTCCTCTTGTCCAGCTCTTCTCTCAAAAGGACTCTGCAGAGCTGGACAG配列番号7アンプリコン8:AACCACACATGGGTGGGAAGGTGCTGAGAGCAACAGAGGGCTGGACTGTGCATCGTGGTGGGGGTTGAGCGCCAGAAGCCACTGCAACAGCACTTTCCTCTGTGGATCCTGTACAGGGTTCATGTGGCCTTGGCAAGCAGCCATTAGATCTGGGCAAGTTGCCCACCACGTCGGCCCTTCCCCCATAGCACATCTCTCCTGGGTCCCAGCACTGGTCACTTTTTCCTTTTCTTAATGAACGGCTTGGAGTGGGTGGGAAAGGGAAGATAATGAGTAAAGTAAGGAAGTGATTTTCGTAGGCCTGTGTCTTTGTCTTTCTCCCCAAACTTACAGCCTCCCGCCCTGACATGGACAGGCTCAGGCAGGCCTGGGAGACCTGAACTCCCTCTCCAGATAACTGGGAGCCTGGAGAGCAAATTCGGGGCTGGGACTCAGGATGGTGACACTGGCCA配列番号8アンプリコン9:TGCCCTTTCAGGAACAATGTGGGAATAAATTTTAGTCTGAAATTGCTGTTATTTACACTTTCTTTCAAGTTTGTTGAAGCACAAATACATTTGGGATAATTAATGTTCTGATGGATTATTTCATCCTACTATGTCTTCTTAACCTTCTACCGGTTTCATTCCTTTTTCTGCCTCACATTGTGACAAATTTGTAGTCTTTGTTACACAGTACAAGGAGCACTGAGAATAAGGGCGGTATCCTTGAAGGAATACCTATGAATACAAATTGTATTACGTAATGCATCCCTTTCCAGGAAAACACAGAGAAGGAATTCTTTTCTTTAGGCGACCAGCAAATGGTCACAGGCAGGGATTTTGCAGGGTCTGATCTGTAGAGGCGGGTCGATACATTCACCGAAGAGAGATAACGGGAAACCGTTTAAGGGGTGCGGCCTAACACGACAGAACTGCTGCGGGAAGGGTCCTGGGGTGAGGAGGTGACATAAAGGGAGGAGGGCACC配列番号9アンプリコン10:AATACAGCCTGGAGACAAATGGTGGGGAGGGTTTCCCCTAAATTTGGACATCTCCAGATTAAGACCTCCGCCGAATCCGTGAGGCTTTCCCTCTCCAAGGAGCTCCTAAGAGAATTTCCCAGTAAAATCGCCTCAACTGCGGTAAATAGGCTGTTCCCCGCGCCAGCATTTGAGAAGAGCTGGTCCCCAGAGTGTAAAGGAGTTAGGATGTTGGCAGGAGGAAGGATGTGTCGCCGGATGAGGAAAAGAAAGGTGGGTGTCTGCGGTGCAGTCCTTGGTCTTTCTGGCAAGTGAGGCGCTCTCCCCCTAAATGTCTCAGAGGGAGACAAATCAGCGGACTACCTTGCTTCCTTTGATGACTTGGA配列番号10アンプリコン11:CTCAGACCCAGGGGCTGGGCCCCCAGCCCCCAGTCCCGATCCCAGCTGGGTCGAGCCATGCTGCGCTACCTGCTGAAAACGCTGCTGCAGATGAACTTGTTCGCGGACTCTCTGGCCGGGGACATCTCCAACTCCAGCGAGCTGCTCTTGGGCTTCAACTCCTCGCTGGCGGCGCTCAACCACACCCTGCTGCCTCCCGGCGATCCCTCTCTCAACGGTGAGACCCTGCCTCTTGGGGATATGGGATCCTGGGATGGGGATGAGGTGAGAGGGCGGCGTGGAAGGGAAGGAGAAGCGCTCCTGTCCCGAGGTCCGGGATTGAGTGGCGCCTCCCAGCGCCTCCCTGGGTCGTGGGGTCTAAGGGATAATTTGGAGCTTCGAGCACATGAGTGGGGGTACCCGCGGGAGGTCGAGGGCTTGGGAGAAGATGGCTACTGAGTC配列番号11アンプリコン12:GAGACCCTGCCTCTTGGGGATATGGGATCCTGGGATGGGGATGAGGTGAGAGGGCGGCGTGGAAGGGAAGGAGAAGCGCTCCTGTCCCGAGGTCCGGGATTGAGTGGCGCCTCCCAGCGCCTCCCTGGGTCGTGGGGTCTAAGGGATAATTTGGAGCTTCGAGCACATGAGTGGGGGTACCCGCGGGAGGTCGAGGGCTTGGGAGAAGATGGCTACTGAGTCTTTTTACACCTCCTTCCCTTCCCCTACAACGCCCACCCCAGGTGAGAAGAACCGTTGCTGGTAACGGGCAGGGAAGTCCGAGCTAAGAAAGGCCCGGGCCCAGCGCAGGGAGGGCAGAGGAGGGGGCACAGTCTCCCGCCGGCCTCGGCCAAGCCAGGTCACTCGGTGACCCACCCAGGCAGCTGGTCTTCGGAACCCCGAAGTTTCCCAAGAACTCACTTAGGACCAGAGGAAGCCAAAATGCTGGA配列番号12アンプリコン13:TGGCCAGATCTTGGTGCCCTTGCTCAGACTCCTCTGCGGGTGCCGCTGAGGCTGCTCCCTGGGTACCTTTGCGGAACAGGATAAATGTTTGATTTGTTTCTCCCAGGTAGAGAAGCTTCTCTCCCAAGAGAGCCCCGGGCTTCCACACTCTTCAGAGATCGGGCAGGTGGCCGCGGAGGGCGGGGGCAGAGCCGGGGGTCAGATCTCGCCTGCAGGTTCCACTGTTCGTGTGCCAGGCACCGCTGGCACTGCCGCTGCCTCGGAGTAGGCAGCAAGCCCTTCTCCGGTACTTAGAGAAAAGTTGCGGAGGAGGGGAGGAAAAGGAATTTGGCAACTGCGCTGAGCTCCTGTAGGAAAGCGCTTGGGAGCCAGTTCTCCCTTCCCGGGCTCATGTCCTTTCAGAGAATTGCAAATAGCTGGGGAAAGACAGACTTT配列番号13アンプリコン14:AGACTGTCCAAAGATGGTTCTGTGGGCGGGCCGAGTCTTCTGCTGAATAACTCACCCAGGTGTGCAGCCAACATCTGTGCCTTCAGACAGCAGGCCGAGGGGAGTTACCGCCGCACGGGGCCTTATCTTTCTAATTACAAACACATGTGCTAACCTTGGGCACTCTGCCAACACGCAAAGCCTGCAAAGGGCCACTCTGTAATACCTAAGTGATTGTCCATCTGGCAAAGCATCTTGGGAATATTTTCATCCTTCTCGTCATCCTCCTGGAGGACTGGAGACATATTCCAGATCACAACCTTCCCAGAATCCTGCCCTGGAACAAAGGAGCAGAAATGGCT配列番号14アンプリコン15:GGGCAGCAGTAACCAGGACACCAGGGTCCGACCACGGCCTCCACACACCTGTGCCCGTGGAAGACGCGGGCGCCGGGGTAGGCAGCATCCACGTGCTCCACAGCTGCCGGTGCTGGGCAGGCTGGAGACTCACGGGAGAGGCAGGAGGAGAATCAGCGTGTTGAGTCCCTCGCTGTGTTAGTGTGAAAAATTCTCATTACAGTTGCAAATAAAAGGGATCACGATCACTAGCCCCGGAAACCCTCATCTCCCGGACCATCAGGATCGCACTGAACAGAATGGTCCCCTAATGGTCCCTGAGG配列番号15アンプリコン16:TTCTGGAGTAAAGAGGGATTACTCTCCCATTATCTTTCTCTAATTCTTTCATTTCTCTCCCTTGTCTGACTTCCTAACATTGATTGAGGCTTCCACTGCTTTGTCCTCATTGTTAGAGACGTCGTTAGACATCATTCTTAGACAATGCGACCTTCCCTCTTGAATTCCACTTGCATGTCTCTGAGAGCTTATATGAATTTTCCGCTTTGACCCCCTGTTGTCACTACATTATCTGTGTTTAGCGGGACTTAGCCATTTTCCTCATGTATGTCTTTCAAATTGTAGTTATATAACTTTTCTCTCAGTCATTTGCTCTATCCCTCACCAGATGTATCTAAACTGAGGCCCACTAGACTTAAGCACACCATTGTGGTTCCCACAGCTCAGTGAGCAGGG配列番号16アンプリコン17:GGTTTGAAGGACACAGAGAGAGCCTACTGACACTTCACTTTCGCTACACGTGGTGATTTTTCCAGTGCTTCCGGAGACACTGAAATTTAGTTCCAAACATTGCCTTAGAGGATTCTTCATTTTATTCATTCTACCGATGATCCACTCAGAAAATCAAACCTGAGTACGGAGACATTGGAGAAGTCGTTAAAGTATTGGACCAAGTCGGTTCGTCACGAGTGACAAAGTTATTCCACACTCTACTTGTACATACTCTGCTTTGCCTTCATGATGGCAAAGA配列番号17アンプリコン18:TGAAGTGTCAGTAGGCTCTCTCTGTGTCCTTCAAACCGCCCATATGGTCGTTACAAACGGCGGCTTGAGGAAAGGTGGTTTTGGAATCGGTTTCTCTCTGGTCTTACATGATGCATCTATACTATACTGCATTATAATACAGGAAAGGGTCACTTGCTGACATAAAGCACAGCAGGCAGGAATAGAAGAGTCAACTTAGGGGAAAAAAAGAAAGTGCTTTGTGATTTCAATTTGGTGTCTGCAGTTTGGAAAACGGTTGATCAGTTTAACTGTTTTCGTGGTGACTCACAAAAATACATATGAGCGTTGAAATTCTGCAGAAGAACAACAATCGGGGAAACATTTCTGCAAGCTCCAATTACTGGAACCCAGACATAAGCCTACAAGCTAAGACAGAGCTACACCAGGCTTCAGCAGGAAACCATACAGATCTCCTGGGAAGGGCTTCCC配列番号18アンプリコン19:TGTTCTTGTTGGCCACTGTTGCCTCTCTAAATAGGATGCCATCTCACCAGGCAGAGTTCCCTGGGCTCACGGCCCCGTTGTTCCCGTTGTCCCTCCTCAGTCGTCCAAAATAGGCCGTAAGGGCGACACCCCAGACCAGGGTAGGTGGACAAATGCCCTTCCTGTCCTTGCTTCTCCCGCAGCCCAGCGGGAAGAGCAAAGACTGCGTGTTCACGGAGATCGTGCTGGAGAACAACTATACGGCCTTCCAGAACGCCCGGCACGAGGGCTGGTTCATGGCCTTCACGCGGCAGGGGCGGCCCCGCCAGGCTTCCCGCAGCCGCCAGAACCAGCGCGAGGCCCACTTCATCAAGCGCCTCTACCAAGGCCAGCTGCCCTTCCCCAACCACGCCGAGAAGCAGAAGCAGTTCGAGTTTGTGGGCTCCGCCCCCACCCGCCGGACCAAGCGCACACGGCGGCCCCAGCCCCTCACGTAGTCTGGGAGGCAGGGGGCAGCA配列番号19上記の19アンプリコンで示される塩基配列をBisulfite処理して得られるDNAを増幅させるために設計された19プライマーセットを以下に示す。アンプリコン1に対するプライマーセットは、プライマーF1とプライマーR1である。アンプリコン2に対するプライマーセットは、プライマーF2とプライマーR2である。アンプリコン3に対するプライマーセットは、プライマーF3とプライマーR3である。アンプリコン4に対するプライマーセットは、プライマーF4とプライマーR4である。アンプリコン5に対するプライマーセットは、プライマーF5とプライマーR5である。アンプリコン6に対するプライマーセットは、プライマーF6とプライマーR6である。アンプリコン7に対するプライマーセットは、プライマーF7とプライマーR7である。アンプリコン8に対するプライマーセットは、プライマーF8とプライマーR8である。アンプリコン9に対するプライマーセットは、プライマーF9とプライマーR9である。アンプリコン10に対するプライマーセットは、プライマーF10とプライマーR10である。アンプリコン11に対するプライマーセットは、プライマーF11とプライマーR11である。アンプリコン12に対するプライマーセットは、プライマーF12とプライマーR12である。アンプリコン13に対するプライマーセットは、プライマーF13とプライマーR13である。アンプリコン14に対するプライマーセットは、プライマーF14とプライマーR14である。アンプリコン15に対するプライマーセットは、プライマーF15とプライマーR15である。アンプリコン16に対するプライマーセットは、プライマーF16とプライマーR16である。アンプリコン17に対するプライマーセットは、プライマーF17とプライマーR17である。アンプリコン18に対するプライマーセットは、プライマーF18とプライマーR18である。アンプリコン19に対するプライマーセットは、プライマーF19とプライマーR19である。プライマーF1:AGGAAGAGAGTATTAGGAGGAGAGATTTGGAAGGT配列番号20プライマーR1:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCAATTATACCCCTATAACTCAATAAAAA配列番号21プライマーF2:AGGAAGAGAGTGTTATGTATAAGGTTAAGTGGTTTTG配列番号22プライマーR2:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCACTTAAACCCAAAAAACAAAAAT配列番号23プライマーF3:AGGAAGAGAGTGATGGTTTATTTAGGGGGTTTTAT配列番号24プライマーR3:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAATACAAAAATCATTTCTCCCCAAT配列番号25プライマーF4:AGGAAGAGAGGTGTGGTGTGGGTTTATTTTTTAGT配列番号26プライマーR4:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTTCTAATACACACTCAAACTTTCCCA配列番号27プライマーF5:AGGAAGAGAGAGGTGTTTTAGGGTAGTGTTAGGGA配列番号28プライマーR5:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTTTAAAACAAAAAATCTCAACCCAA配列番号29プライマーF6:AGGAAGAGAGAAATATTTATTTTTGGGAAATATGGG配列番号30プライマーR6:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTACAAAAAATTTCAATAACCACCCTT配列番号31プライマーF7:AGGAAGAGAGGGATAGATTAGTTGAGTTTTTTGGG配列番号32プライマーR7:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCTATCCAACTCTACAAAATCCTTTTA配列番号33プライマーF8:AGGAAGAGAGAATTATATATGGGTGGGAAGGTGTT配列番号34プライマーR8:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTAACCAATATCACCATCCTAAATCC配列番号35プライマーF9:AGGAAGAGAGTGTTTTTTTAGGAATAATGTGGGAA配列番号36プライマーR9:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAATACCCTCCTCCCTTTATATCACC配列番号37プライマーF10:AGGAAGAGAGAATATAGTTTGGAGATAAATGGTGGG配列番号38プライマーR10:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCCAAATCATCAAAAAAAACAAAAT配列番号39プライマーF11:AGGAAGAGAGTTTAGATTTAGGGGTTGGGTTTTTA配列番号40プライマーR11:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAACTCAATAACCATCTTCTCCCAAA配列番号41プライマーF12:AGGAAGAGAGGAGATTTTGTTTTTTGGGGATATG配列番号42プライマーR12:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCCAACATTTTAACTTCCTCTAATCC配列番号43プライマーF13:AGGAAGAGAGTGGTTAGATTTTGGTGTTTTTGTTT配列番号44プライマーR13:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAAAATCTATCTTTCCCCAACTATTTACA配列番号45プライマーF14:AGGAAGAGAGAGATTGTTTAAAGATGGTTTTGTGG配列番号46プライマーR14:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAACCATTTCTACTCCTTTATTCCAAA配列番号47プライマーF15:AGGAAGAGAGGGGTAGTAGTAATTAGGATATTAGGGTT配列番号48プライマーR15:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCCTCAAAAACCATTAAAAAACCATT配列番号49プライマーF16:AGGAAGAGAGTTTTGGAGTAAAGAGGGATTATTTTT配列番号50プライマーR16:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCCCTACTCACTAAACTATAAAAACCACA配列番号51プライマーF17:AGGAAGAGAGGGTTTGAAGGATATAGAGAGAGTTTATTG配列番号52プライマーR17:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCTTTACCATCATAAAAACAAAACAAA配列番号53プライマーF18:AGGAAGAGAGTGAAGTGTTAGTAGGTTTTTTTTGTGTT配列番号54プライマーR18:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTAAAAAACCCTTCCCAAAAAATCTAT配列番号55プライマーF19:AGGAAGAGAGTGTTTTTGTTGGTTATTGTTGTTTTT配列番号56プライマーR19:CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTACTACCCCCTACCTCCCAAACTAC配列番号57以下にSEQUENOMアプリケーションノートに示されるMassARRAYシステムを用いた定量的DNAメチル化解析用EpiTYPERの概要を示す。プライマー設計:メチル化解析用に以下のプライマーシステムを設計する。Invitro転写に適した産物を得るため、T7プロモータを付加したリバースプライマー。サイクリング失敗を防ぐために8bpインサートを挿入する。また、PCRのバランスをとるために10merタグを付加したフォワードプライマーとする。Bisulfite処理:サンプルゲノムDNAのBisulfite変換処理にはZymoResearch社のEZ96DNAMethylationKitまたはEZDNAMethylationKitを使用する。このプロトコルの初回インキュベーション後、以下のとおりサイクル反応をおこなう。45サイクル:95°C30分50°C15分1ステップ1:増幅385マイクロタイターフォーマットを用いて総容量5μL中1μLのDNAを増幅する1反応あたり最終濃度2ngμLとするために10ngμL以上のDNAを100μL以上使用する。各反応液を2種類の切断反応T切断反応とC切断反応に分ける。プレートを密封し、以下のとおりサイクル反応をおこなう。94°C15分45サイクル94°C20秒56°C30秒72°C1分72°C3分2ステップ2:脱リン酸化各PCR反応液5μLにエビ由来アルカリフォスファターゼSAP酵素2μLを添加し、PCRに組み込まれなかったdNTPを脱リン酸化する。プレートを37°Cで20分インキュベートし次いで85°Cで5分インキュベートする。3ステップ3:Invitro転写とRNase切断各切断反応TおよびC用に転写RNaseAカクテルを調製する。標準セットアップでは1プレートあたり、1つの転写RNaseAカクテルを調製する。サイクル反応をおこなっていない新しいマイクロタイタープレートに、転写RNaseAカクテル5μLとPCRSAPサンプル2μLを添加する。プレートを1分間遠心し、次にプレートを37°Cで3時間インキュベートする。4ステップ4:サンプルコンディショニング384穴プレートの各サンプルにddH2O20μLを加える。レジンプレートを用いて各穴にCleanResinを6mg加える。10分間攪拌し、3200xgで5分間スピンダウンする。5ステップ5:サンプルの移動10~15nLのEpiTYPER反応産物を384穴SpectroCHIPに分注する。6ステップ6:サンプル解析MassARRAYシステムを用いて2種類の切断反応のスペクトルを得る。7ステップ7:解析ソフトウェア結果をEpiTYPERソフトウェアにより解析する。上記の解析により得られたメチル化DNA割合の結果をグラフ化し、図1~22に示した。ヒト大腸がん組織ゲノムDNAのメチル化割合はヒト大腸健常組織ゲノムDNAのメチル化割合に比して高いことが示された。ヒト乳がん組織ゲノムDNAのメチル化割合はヒト乳腺健常組織ゲノムDNAのメチル化割合に比して高いことが示された。ヒト肺がん組織ゲノムDNAのメチル化割合はヒト肺健常組織ゲノムDNAのメチル化割合に比して高いことが示された。以上より、1ヒト大腸組織ゲノムDNAのメチル化割合を測定することにより、大腸がんか否か、2ヒト乳腺組織ゲノムDNAのメチル化割合を測定することにより、乳がんか否か、あるいは3ヒト肺組織ゲノムDNAのメチル化割合を測定することにより、肺がんか否かを診断できることが確認された。