"E1Aタンパク質を含む群から選択される第2のタンパク質に先立って、E1Bタンパク質およびE4タンパク質を含む群から選択される第1のタンパク質を発現するアデノウイルス。第1のタンパク質がE1Bタンパク質、好ましくはE1B55kdタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載のアデノウイルス。第1のタンパク質がE4タンパク質、好ましくはE4orf6タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載のアデノウイルス。第1のタンパク質が、E1Bタンパク質とE4タンパク質の組み合わせ、好ましくはE1B55kDタンパク質とE4orf6タンパク質の組み合わせであることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E1Aタンパク質がE1A12Sタンパク質であることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが、E1Bタンパク質、E4タンパク質及びE1Aタンパク質を含む群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を含み、その際、少なくとも1つのタンパク質が、野生型アデノウイルスにおけるタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、請求項1~5のいずれか1項に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質がE1Bタンパク質、好ましくはE1B55kDタンパク質であることを特徴とする、請求項6に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質がE4タンパク質、好ましくはE4orf6タンパク質であることを特徴とする、請求項6又は7に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質が、E1Aタンパク質、好ましくはE1A12Sタンパク質であることを特徴とする、請求項6~8のいずれか1項に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質が、E1Bタンパク質とE4タンパク質の組み合わせ、好ましくはE1B55kDタンパク質とE4orf6タンパク質の組み合わせであることを特徴とする、請求項6~9のいずれか1項に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質が、E1Bタンパク質とE1Aタンパク質の組み合わせ、好ましくはE1B55kDタンパク質とE1A12Sタンパク質の組み合わせであることを特徴とする、請求項6~9のいずれか1項に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質が、E4タンパク質とE1Aタンパク質との組み合わせ、好ましくは、E4orf6タンパク質とE1A12Sタンパク質の組み合わせであることを特徴とする、請求項6~9のいずれか1項に記載のアデノウイルス。少なくとも1つのタンパク質が、E1Bタンパク質とE4タンパク質とE1Aタンパク質との組み合わせ、好ましくは、E1B55kDタンパク質とE4orf6タンパク質とE1A12Sタンパク質との組み合わせであることを特徴とする、請求項6~9のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E1Bタンパク質の発現がプロモーターにより制御され、その際、該プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターがE1Bプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項6~13のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E4タンパク質の発現がプロモーターにより制御され、その際、該プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターがE4プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項6~14のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスプロモーターがE1Aプロモーターである、請求項14又は15に記載のアデノウイルス。E1Aタンパク質の発現がプロモーターにより制御され、その際、該プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターがE1Aプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項6~16のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E1Aタンパク質の発現を制御するプロモーターがYB1により制御されるか、又はYB-1によって調節することができることを特徴とする、請求項14~17のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E1Aタンパク質の発現を制御するプロモーターがアデノウイルスE2後期プロモーターであることを特徴とする、請求項14~18のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E4タンパク質、好ましくはE4orf6タンパク質及びE1Bタンパク質、好ましくはE1B55kdタンパク質が同一又は共通のプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項1~19のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが少なくとも1つのアデノウイルスタンパク質を介して核にYB-1を提供するか、又は核内のYB-1の提供には少なくとも1つのアデノウイルスタンパク質が介在し、その際、好ましくは、アデノウイルスタンパク質はE1Aとは異なることを特徴とする、請求項1~20のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが少なくとも1つのアデノウイルスタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためにYB-1を提供する、又はアデノウイルスの複製のためのYB-1の提供には少なくとも1つのアデノウイルスタンパク質が介在し、その際、好ましくは、アデノウイルスタンパク質はE1Aとは異なることを特徴とする、請求項1~21のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスタンパク質が、E4orf6とE1B55kDとの複合体であることを特徴とする、請求項21又は22に記載のアデノウイルス。アデノウイルスの核酸が少なくとも1つの機能的に不活性のアデノウイルス領域を含み、その際、該領域が、E1領域、E3領域、E4領域及びこれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項1~23のいずれか1項に記載のアデノウイルス。該領域がE1領域であることを特徴とする、請求項24に記載のアデノウイルス。該領域がE3領域であることを特徴とする、請求項24又は25に記載のアデノウイルス。該領域がE4領域であることを特徴とする、請求項24~26のいずれか1項に記載のアデノウイルス。該領域が、E1領域、E3領域、及びE4領域を含むことを特徴とする、請求項24~27のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが少なくとも1つの発現カセットを含み、その際、該発現カセットが、少なくとも1つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、その際、アデノウイルスタンパク質がE1Bタンパク質、好ましくは、E1B55kDタンパク質であることを特徴とする、請求項1~28のいずれか1項に記載のアデノウイルス。プロモーターがE1Bプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項29に記載のアデノウイルス。プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、該プロモーターはE1Bプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項30に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが少なくとも1つの発現カセットを含み、該発現カセットが、少なくとも1つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、その際、アデノウイルスタンパク質がE4タンパク質、好ましくは、E4orf6タンパク質であることを特徴とする、請求項1~31のいずれか1項に記載のアデノウイルス。プロモーターがE4プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項32に記載のアデノウイルス。プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターはE4プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項33に記載のアデノウイルス。プロモーターがE1Aプロモーターであることを特徴とする、請求項29~34のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが少なくとも1つの発現カセットを含み、該発現カセットが、少なくとも1つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、その際、アデノウイルスタンパク質がE1Aタンパク質、好ましくは、E1A12Sタンパク質であることを特徴とする、請求項1~35のいずれか1項に記載のアデノウイルス。プロモーターがE1Aプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項36に記載のアデノウイルス。プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択されることを特徴とする、請求項37に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが核酸を含み、該核酸がYB-1をコードすることを特徴とする、請求項1~38のいずれか1項に記載のアデノウイルス。YB-1をコードする核酸がプロモーターの制御下にあり、その際該プロモーターが好ましくはE2後期プロモーターであることを特徴とする、請求項39に記載のアデノウイルス。YB-1をコードする核酸がプロモーターの制御下にあり、該プロモーターがYB-1依存性及びYB-1制御性であることを特徴とする、請求項39又は40に記載のアデノウイルス。YB-1をコードする核酸が、E1Aタンパク質をコードする核酸、好ましくはE1A12Sタンパク質をコードする核酸を含む発現カセットの一部であることを特徴とする、請求項35~41のいずれか1項に記載のアデノウイルス。E1Aタンパク質をコードする核酸が、IRES配列を介してYB-1をコードする核酸から分離されることを特徴とする、請求項42に記載のアデノウイルス。E4タンパク質、好ましくはE4orf6タンパク質をコードする核酸及びE1Bタンパク質、好ましくはE1B55kDタンパク質をコードする核酸が発現カセットに含有され、その際、好ましくは2つのコーディング配列がIRES配列を介して分離されることを特徴とする、請求項29~43のいずれか1項に記載のアデノウイルス。発現カセットのプロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターが、E4プロモーターとは異なり、かつE1Bプロモーターとは異なり、好ましくは野生型E4プロモーターとは異なり、かつ野生型E1Bプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項44に記載のアデノウイルス。アデノウイルスがプロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、その際、核酸配列がアプタマー、リボザイム、アプタザイム、アンチセンス分子及びsiRNAを含む群から選択されることを特徴とする、請求項1~45のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスがプロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、その際、核酸配列がコーディング核酸を含み、該核酸が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アンチカリン、抗体及び抗体断片を含む群から選択される分子をコードすることを特徴とする、請求項1~45のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが発現カセットを含み、その際、発現カセットがプロモーター及び核酸配列を含み、その際、核酸配列が、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、プロテアーゼ阻害剤、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン及び血管形成阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、請求項1~45のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが組換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項1~48のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスがアデノウイルス突然変異体であることを特徴とする、請求項1~49のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが複製欠損性であることを特徴とする、請求項1~50のいずれか1項に記載のアデノウイルス。アデノウイルスが、調節解除されたYB-1を含む細胞又は核内にYB-1を有する細胞中で複製可能であることを特徴とする、請求項51に記載のアデノウイルス。細胞周期とは無関係に、細胞が核内にYB-1を含有することを特徴とする、請求項52に記載のアデノウイルス。請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルスをコードする核酸。請求項54に記載の核酸及びヘルパーウイルスの核酸を含み、その際、ヘルパーウイルスの核酸が請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルスの1以上の発現カセットを含む、複製システム。アデノウイルス又はそれをコードする核酸がヘルパーウイルスが含む発現カセットを欠いていることを特徴とする、請求項55に記載の複製システム。請求項54に記載の核酸及び/又は請求項55~56のいずれか1項に記載の複製システムを含む、ベクター。ベクターが発現ベクターであることを特徴とする、請求項57に記載のベクター。請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス及び/又は請求項54に記載の核酸及び/又は請求項55又は56に記載の複製システム及び/又は請求項57又は58に記載のベクターを含む、細胞。細胞が真核細胞であり、好ましくは動物細胞であり、さらに好ましくは哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項59に記載の細胞。哺乳動物細胞が、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ及びヒトを含む群から選択される細胞であることを特徴とする、請求項60に記載の細胞。請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞を含み、その際、生物がマウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む群から選択される生物、好ましくは哺乳動物生物。アデノウイルスの複製、好ましくはアデノウイルスのインビトロでの複製のための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。アデノウイルスの製造、好ましくはアデノウイルスのインビトロでの製造のための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。遺伝子の発現、好ましくは細胞溶解、好ましくはアデノウイルスの複製中の細胞溶解を促進する遺伝子、及び/又はアデノウイルスが介在する細胞溶解を促進する遺伝子の発現のための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。薬物の製造のための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。アデノウイルスが複製している細胞が、その核内にYB-1を有する、好ましくは、細胞周期とは無関係に、核内にYB-1を有することを特徴とする、請求項63~66のいずれか1項に記載の使用。アデノウイルスが複製している細胞が、調節解除されたYB-1を含むことを特徴とする、請求項63~66のいずれか1項に記載の使用。薬物が腫瘍性疾患の治療のためであることを特徴とする、請求項66に記載の使用。腫瘍性疾患が、悪性疾患、癌、癌性疾患及び腫瘍を含む群から選択されることを特徴とする、請求項69に記載の使用。腫瘍が、固形腫瘍、非固形腫瘍、悪性腫瘍及び良性腫瘍を含む群から選択されることを特徴とする、請求項70に記載の使用。腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が核内にYB-1を有し、好ましくは、細胞周期とは無関係に核内にYB-1を有することを特徴とする、請求項69~71のいずれか1項に記載の使用。腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、調節解除されたYB-1を含むことを特徴とする、請求項69~72のいずれか1項に記載の使用。腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、Rb陽性又はRb陰性であることを特徴とする、請求項69~73のいずれか1項に記載の使用。腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、医薬的に活性な薬剤に対して耐性、好ましくは多剤耐性を有することを特徴とする、請求項69~73のいずれか1項に記載の使用。耐性が複合耐性であることを特徴とする、請求項75に記載の使用。耐性が抗腫瘍剤、好ましくは細胞増殖抑制剤に対するものであり、及び/又は耐性は照射により誘発されることを特徴とする、請求項75又は76に記載の使用。薬物を意図する患者が複数の細胞を含み、その際、細胞が請求項72~76のいずれか1項に記載したような細胞であることを特徴とする、請求項69~77のいずれか1項に記載の使用。薬物が少なくとの1つのさらなる医薬的に活性な薬剤を含むことを特徴とする、請求項69~78のいずれか1項に記載の使用。薬物がさらなる医薬的に活性な薬剤と一緒に投与されるか又はそれを意図することを特徴とする、請求項68~79のいずれか1項に記載の使用。さらなる医薬的に活性な薬剤が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、細胞増殖抑止剤、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、プロテオソーム阻害剤、信号伝達カスケードの阻害剤、プロテインキナーゼ、及び組換え抗体を含む群より選択されることを特徴とする、請求項79又は80に記載の使用。照射の前、その間、その後に薬物が投与されることを特徴とする、請求項69~79のいずれか1項に記載の使用。腫瘍を治療する目的で、放射線が投与されることを特徴とする、請求項82に記載の使用。処置されるべき細胞又は生物が手段の対象とされ、その際、手段が、照射、細胞増殖抑制剤の投与及び温熱療法を含む群から選択されることを特徴とする、請求項69~83のいずれか1項に記載の使用。手段が局所的に、又は全身性に適用されることを特徴とする、請求項69~84のいずれか1項に記載の使用。照射が、高エネルギー放射線を使用する、好ましくは、腫瘍性疾患の治療で使用されるいかなる照射も使用することを特徴とする、請求項69~85のいずれか1項に記載の使用。腫瘍性疾患が、乳腫瘍、骨腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚付属器の腫瘍、頭頚部腫瘍、子宮腫瘍、滑膜腫瘍、咽頭腫瘍、食道腫瘍、舌腫瘍、前立腺腫瘍を含む群から選択され、好ましくは、上記腫瘍性疾患の1つが請求項1~86のいずれか1項に記載されたような特徴を有することを特徴とする、腫瘍性疾患を治療するための薬物を製造するための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。腫瘍特異的プロモーターが、薬物が使用される腫瘍に特異的であるプロモーターである、腫瘍性疾患を治療するための薬物を製造するための、請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞の使用。請求項1~53のいずれか1項に記載のアデノウイルス、請求項54に記載の核酸、請求項55又は56に記載の複製システム、請求項57又は58に記載のベクター、或いは請求項59~61のいずれか1項に記載の細胞、及び場合により薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物。薬物が少なくとも2つの薬剤の組合せを含み、各薬剤は細胞増殖抑止剤を含む群より個々に及び独立して選択されることを特徴とする、請求項69~88のいずれか1項に記載の使用。少なくとも薬剤の2つが、異なる標的分子を対象にすることを特徴とする、請求項90に記載の使用。少なくとも薬剤の2つが、異なる作用機序によって活性を有することを特徴とする、請求項91に記載の使用。少なくとも1つの薬剤が、細胞が感染される能力を増加させ、そのような細胞中でウイルスが複製することを特徴とする、請求項90~92のいずれか1項に記載の使用。少なくとも1つの薬剤が、細胞の成分の有効性に影響を及ぼし好ましくは成分の利用可能性を増し、その成分はウイルスの取り込みを仲介することを特徴とする、請求項90~93のいずれか1項に記載の使用。少なくとも1つの薬剤が、YB-1の核の中への輸送を仲介し、好ましくは前記輸送を増加させることを特徴とする、請求項90~94のいずれか1項に記載の使用。少なくとも1つの薬剤がヒストンデアシラーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項90~95のいずれか1項に記載の使用。ヒストンデアシラーゼ阻害剤が、トリコスタチンA、FR901228、MS-27-275、NVP-LAQ824、PXD101、アピシジン、及びスクリプタイドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項96に記載の使用。少なくとも1つの薬剤が、トリコスタチンA、FR901228、MS-27-275、NVP-LAQ824、PXD101、アピシジン、及びスクリプタイドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項90~96のいずれか1項に記載の使用。少なくとも1つの薬剤がトポイソメラーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項90~98のいずれか1項に記載の使用。トポイソメラーゼ阻害剤がカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、DX-895If、SN-38、9-アミノカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン及びエトポシドを含む群より選択されることを特徴とする、請求項99に記載の使用。薬剤がトリコスタチンA及びイリノテカンを含むことを特徴とする、請求項63~100のいずれか1項に記載の使用。ウイルスが、特に請求項1~101のいずれかに記載のウイルスが、少なくとも2つの薬剤から分離されていることを特徴とする、請求項63~101のいずれか1項に記載の使用。ウイルスの少なくとも1単位の用量が、1つ又は少なくとも2つの薬剤の少なくとも1単位の用量から分離されていることを特徴とする、請求項68に記載の使用。ウイルス、好ましくは先行する請求項のいずれかに記載のウイルス、及び少なくとも2つの薬剤であって、任意の薬剤が細胞増殖抑止剤を含む群より個々に及び独立して選択される薬剤を含むキット。発明により使用されるアデノウイルスが含むE1A修飾のタイプ図1はAdE1/E3マイナス、即ちE1/E3欠失アデノウイルスと野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスdl520の構造デザインを示している。アデノウイルスAdE1/E3マイナスは機能的E1Aまたは機能的E1BもしくはE3をコードする領域を有しておらず、本実験では毒性に関するコントロールに用いられる。野生型E1A遺伝子は、E1ARNAの異なる位置でのスプライシングから生じる合計で5種類のタンパク質をコードしている。とりわけ2種類のタンパク質、即ち289アミノ酸タンパク質および243アミノ酸タンパク質が生成される。dl520はE1A遺伝子のCR3ストレッチ内に欠失を持つために13S遺伝子産物を欠いているため、289アミノ酸タンパク質をコードしていない。発明に用いられるアデノウイルスdl520は当業者からは12S-E1Aウイルスと呼ばれる。先行技術周知のアデノウイルスdl347WongおよびZiff、JVirol、68、4910~4920、1994年はまた12S-E1Aでもあり、これは本発明に使用することができる。13S-E1AのmRNAによりコードされる289アミノ酸タンパク質の中には、各種アデノウイルスサブタイプに保存されている3つの領域がある。これらはCR1、CR2およびCR3と呼ばれる。CR1およびCR2は両E1Aタンパク質E1A12SおよびE1A13S、即ち289アミノ酸および243アミノ酸タンパク質に存在するが、CR3領域は上記タンパク質のうちの大きい方だけに存在する。CR3領域はウイルス遺伝子、特にE1B、E2、E3およびE4の活性化に必要である。小型、即ち243アミノ酸タンパク質のみを含むウイルスは、極弱くしかウイルス遺伝子をトランス活性化できず、核内にYB-1を持たない細胞でのアデノウイルス複製を促進しない。YB-1は腫瘍細胞でのみ核内に存在すること、そしてその中にのみ見出すことができることから、このベクターは腫瘍特異的複製の誘導に好適である。dl520はCR3を欠失していることから、このアデノウイルスは本明細書で輸送とも呼ばれる細胞質YB-1の細胞核内への移動を行うことができず、それ故にYB-1核陰性である細胞では複製できないことから、このウイルスは本発明で使用可能なウイルスであり、そしてこのウイルスは本発明に必要なトランス活性化に使用できる。細胞のRb状態に依存したアデノウイルスの作用様態図2はp300,p107およびp105の結合に関係するE1Aタンパク質の結合ドメインを示している。P300およびP107は、細胞質結合タンパク質である。腫瘍抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質pRbの結合は、CR1およびCR2を通じて媒介される。研究からpRbおよびp107/p300は細胞転写因子E2Fと組み合わさり効率的に転写制御することが示されている。野生型E1Aタンパク質はE2FのRbへの結合を妨害する。即ち放出されたE2FはE2初期プロモーターに結合して、アデノウイルスの複製を誘導する。E1A発癌タンパク質内の特定の欠失がRb-陰性細胞で優先的に複製することが可能であり、そして本発明に用いることができる以下に述べるような組換え体アデノウイルスベクターを生成することが従来知られていた。例えばアデノウイルスベクターdl922-947は、CR2領域アミノ酸位置122~129内に欠失を持ち、ベクターCB016はCR1アミノ酸位置27~80およびCR2領域アミノ酸位置122~129に欠失がある。ベクターE1Adl01/07はCR2領域アミノ酸位置111~123内に欠失を持つ。更に、N-末端アミノ酸位置4~25に追加の欠失があることから、タンパク質p300への結合は認められない。アデノウイルスベクターAdΔ24はCR2領域アミノ酸位置120~127に欠失を持っている。欧州特許第EP0931830号に記載のアデノウイルスベクターはCR1領域よびCR2領域に欠失を含んでいる。E2F/RBの結合メカニズムおよびE1Aを媒介するE2Fの放出は、本発明の基礎を成すメカニズムとは基本的に異なるものである。先行技術での予想とは異なり、ウイルス複製にとって必須ではないが、重要であるのはRbタンパク質からのE2Fの放出ではなく、ヒト転写因子であるYB-1が核内に局在することである。この転写因子は、正常細胞に於いては、細胞周期の大部分について細胞質内にのみに存在している。アデノウイルスが感染すると、特定の条件の下にYB-1は核内に導かれるか、例えば乳ガン、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、神経芽腫、メラノーマ、小細胞肺癌および結腸直腸癌を含むが、もとよりこれらに限定されないある種の腫瘍疾患といったある種の細胞システムでは核内に既に存在している。U2OS細胞の感染100,000個のU2OS細胞をウェルに播いた。翌日細胞に図3に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清DMEM培地500μl中で、37°Cで1時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地10FCS/DMEM2mlと交換した。3日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。図3から分かるように核内にYB-1を持たないU2OS細胞は、本発明に使用できる2種類のアデノウイルス、即ちE1/E3マイナスと呼ばれるE1/E3欠失ウイルスおよびアデノウイルスdl520で感染させた後にクリスタルバイオレット染色を行ったところ、溶解を示していなかった。この場合、まず培地を取り除いた。続いて細胞にクリスタルバイオレット液50ETOH、3ホルムアルデヒド、5酢酸、1クリスタルバイオレットを重層して室温で5~10分間インキュベーションした。続いて6ウェル型プレートを水でよく濯いでから室温で乾かした。これから、本発明で使用するウイルスを誘導し、感染細胞を溶解させるには、YB-1の存在が必要であるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。257RDB細胞の感染100,000個の257RDB細胞をウェルに播いた。翌日細胞に図4に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清DMEM培地500μl中で、37°Cで1時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地10FCS/DMEM2mlと交換した。3日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。この実験の結果を図4に示す。E1/E3を欠失したE1/E3マイナスと呼ばれるアデノウイルスは、核内にYB-1を持つ257RDB細胞への感染については、低MOIpfu/細胞では溶解を示さなかった。これに対し実施例3で示した、YB-1核陰性細胞では複製せず、同時に本発明に従い発癌遺伝子タンパク質をトランス活性化するE1Aをコードしているdl520は、40pfu/細胞というMOI感染多重度で実質完全な溶解をおこし、10pfu/細胞のMOIでも顕著な溶解を起こした。このことから、dl520およびここに記したdl1119/1131またはAdXvirといった同様のウイルスが必要とするMOIは、E1欠失またはE1/E3欠失アデノウイルスに比べ約1桁10倍低く、臨床使用が可能であると結論される。図7に示すように、dl520のタンパク質E1AはそのCR3領域を欠失することを特徴とし、その結果本発明による使用に求められるトランス活性化およびYB-1核陽性細胞での複製を起こす。dl1119/1131による257RDBおよびU2OS細胞の感染図5に示すように、E1Aタンパク質のアミノ酸4~138およびそれをコードする核酸を欠失しており、さらにアミノ酸218の後に停止コドンを含むために発現する断頭型truncateE1Aタンパク質が完全なE1Aタンパク質のCR3領域を含んでいるアデノウイルスdl1119/1131をYB-1核陰性U2OS細胞に感染した場合、20pfu/細胞のMOIでは溶解は起きなかった。陰性コントロールには非感染細胞層を用いた。これに対し核内にYB-1を含む、即ちYB-1核陽性である、257RDBの様な細胞系では、アデノウイルスdl1119/1131の影響を受けて、20pfu/細胞のMOIで細胞層は実質的に完全に溶解した。この限りにおいて本実施例は、図7に示す様に例えばCR3領域のみを含み、そしてCR1領域およびCR2領域を欠いている修飾型E1A発癌遺伝子タンパク質が、発明によるアデノウイルスの複製に必要なYB-1核陽性細胞でのトランス活性化を提供していることを示す別の証拠である。即ちアデノウイルスdl1119/1131は、本発明に使用可能である別のアデノウイルスである。CR3領域に関してdl1119/1131と同様にデザインされているが、それと異なりCR1領域および/またはCR2領域も含んでいるウイルスを使用できることも、本発明の範囲内である。多剤耐性細胞での核内YB-1の検出本実施例は核内YB-1が転写因子としてmdr1プロモーター多剤耐性プロモーター内にあるY-ボックスCAAT配列に結合しなければならないという考察に基づいている。これを検出するために、いわゆるEMSA分析電気泳動移動度シフトアッセイを行った。これに関連して、核タンパク質を単離し、続いてタンパク質1~10μgを短いDNA鎖オリゴと共の37°Cでインキュベーションした。核内YB-1を決定するために以下のオリゴヌクレオチドを使用した;U2O3と反対のmdr1プロモーター位置-86~-67:TGAGGCTGATTGGCTGGGCAXボックスには下線を付した。その前にこのDNA断片の5’末端を32Pで放射線標識した。続いて未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。タンパク質YB-1がオリゴヌクレオチド内の配列に結合すると、その結合は、結合したオリゴヌクレオチドに比べて非結合のオリゴヌクレオチドはゲル中をより早く移動することから検出できるHolmPSら、JBC277、10427~10434、2002年Bargou、RCら、NatureMedicine3、447~450、1997年。図6に示すように、EMSA分析よりYB-1が多剤耐性細胞257RDB、181RDBおよびMCF-7Ad細胞の核内に存在すること、そして細胞株U2OSおよびHeLa細胞には存在しないことが分かる。実施例4および5に示した結果は、アデノウイルスdl520およびdl1119/1131が257RDBの様なYB-1核陽性細胞では複製してその溶解を誘導するが、U205では複製、溶解を誘導しないことを確認した。このことは、本発明のアデノウイルスの使用に関する所見が確認された。さらに結果は、野生型のアデノウイルスと比べて、修飾型または欠失型E1A遺伝子産物を介したYB-1核陽性細胞でのウイルス遺伝子の弱いトランス活性化が、例えば多剤耐性細胞を含む核内にYB-1が存在する細胞での良好な複製および良好な細胞溶解をもたらすこと、そしてここに記したアデノウイルスがかかる腫瘍の溶解に利用できることを確認している。E1-マイナスアデノウイルスの複製効率上昇本実施例は初期ウイルス遺伝子E1B-55KおよびE4orf6をプラスミドpE4orf6によるトランスフェクションおよびE1/E3欠失アデノウイルスAd-55Kによる感染で置換えられることを示す。Ad-55KはE1B-55KをE1にクローニングし、CMVの制御下に置いたE1/E3欠失ウイルスである。この置換は、AdYB-1、即ちYB-1を発現するアデノウイルスがこれら初期遺伝子を発現していないという事実、および本発明者が核内にYB-1を含む複製系でのこれら初期遺伝子を置換することで複製効率および粒子形成能率をそれぞれ野生型アデノウイルスであるAd5型のそれと同程度まで上げることができることを認識していたという事実より必要であった。以下を実施した:リポフェクタミンを用いた各105個のU2OS細胞へのプラスミドpE4orf6のトランスフェクション。プラスミドpEorf6はCMV制御下にある初期ウイルス遺伝子E4orf6をコードするDNA配列を保持している。プラスミドpE4orf6をトランスフェクションした24時間後に、細胞にYB-1発現E1/E3欠失アデノウイルスAdYB-150pfu/細胞およびE1/E3欠失E1B-55KアデノウイルスAd-55K50pfu/細胞を感染させた。Ad-55KはCMV制御下にあるウイルス遺伝子E1B-55Kをトランス遺伝子として保持するE1/E3欠失ウイルスである。続いて感染5日後=トランスフェクション後に細胞を培地2mlから取り出した。凍結と融解凍結/融解を交互に3回行って、単離細胞からのウイルス粒子を放出させた。次にプラークアッセイを293細胞を使って実施し、生成した感染粒子を決定したプラーク形成単位/mlpfuml。結果は図8および9に示す。図8は絶対量で表した場合のプラークアッセイの結果である。AdYB-1単独感染例と最も大きな差は、プラスミドpE4orf6を感染させた例および2種類のウイルスAdYB-1およびAd-55Kを同時感染させた例との間で観察された。図9は図8の結果を、AdYB-1の複製効率の倍率として複製効率の増加の形で表したものである。細胞にプラスミドpE4orf6を感染させた後AdYB-1およびE1B-55KAd-55Kを感染させると、最大25倍高いpfumlを示した。これらの結果より、E1B-55KおよびE4orf6による置換はE1/E3-欠失アデノウイルスAdYB-1感染後に形成されるウイルス数pfumlを最大25倍増加すると結論できる。プラーク形成単位pfu生成に及ぼすE1B-55KおよびE4orf6の追加効果は、これら2遺伝子産物単独の効果に比べて有意に高かった。EGFPを発現するプラスミドを使ったコントロール実験は、選択した実験方法では、プラスミドpE4orf6でトランスフェクションされたのは僅かに細胞の10だけであることを明瞭に示した。E1B-55KおよびE4orf6の両方を発現する細胞で形成された粒子の数は、ヒトアデノウイルス5型野生型のそれに匹敵した。このことから、E4orf6およびE1B-55Kの発現は、YB-1の核内局在と組み合わさると、アデノウイルス、特にE1A-欠失アデノウイルスの複製および粒子形成を、野生型Ad5のそれに匹敵する程度まで誘導できるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。細胞増殖抑制薬投与によるYB-1核陰性細胞では複製しないアデノウイルスのYB-1核陽性細胞での複製増加各種細胞増殖抑制薬の添加がヒト転写因子YB-1の核内局在化を誘導することは、先行技術において知られていた。本発明者が見出したように、核内に局在したYB-1は、アデノウイルスのE2-後期プロモーターの活性化によりアデノウイルスの複製をコントロールする。両効果の組み合わせを利用すれば特異的な腫瘍溶解を得ることができる。癌溶解アッセイを実施するに当たっては、以下の手順に従った:200、000個の細胞それぞれHeLaおよびU2OSを6ウェル型プレートの核ウェル内に接種した。翌日ダウノルビシン40ngml最終濃度を加えた。3時間インキュベーションした後、それぞれの細胞をdl520で、10~30pfu/細胞の割合で感染させた。続いて細胞を、細胞増殖抑制薬を含まない培地でインキュベーションした。3~5日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。図10および11から分かるように、ダウノルビシンの添加はYB-1の核内局在化を通じてdl520の複製を誘導した。即ちdl520は、細胞増殖抑制薬と組み合わさった状態で、ダウノルビシン単独例に比べてより大きな癌溶解作用を発揮した。dl520によるインビボの癌溶解本インビボ試験で使用したHeLaYB-1核陰性および257RDBYB-1核陽性細胞は、無菌細胞培養条件にて拡大した。細胞をマウス系統CD1NuNuに注射して皮下腫瘍を形成させる前に、細胞をトリプシン処理して集め、DMEM培地10FCSに加え、細胞数を測定してからPBSで1回洗浄した。続いて細胞を遠心分離してPBSを除き、細胞を希望数する細胞数になるよう新鮮PBS中に分配した。本研究で皮下注射した細胞の数は両細胞系統とも5×106細胞であった。注射は動物の一方の側腹部に行い、より区別し易いようにHeLa細胞は右側に、そして257RDB細胞は左側に注射した。腫瘍の増殖を週2回調べ、ノギスを使って腫瘍の長さおよび幅を測定した。その結果を用い、次式より腫瘍の容積を計算した:3/4πa/2b/22a=長さ、b=幅腫瘍の大きさが200~520mm3に達した時点で、ウイルスおよび陰性コントロールであるPBSをそれぞれ腫瘍内に投与した。注射量は同一で、1回50μlであった。この作業を3連続日繰り返した。投与したウイルスの総量は5×108pfuであった。次に腫瘍の増殖を毎週2回の割合で記録し続け、その容積を計算した。試験最終日にマウスを屠殺して、腫瘍を取り出し詳しく分析した。結果は図12および13に示した。図12は、腫瘍容積の経時変化を処理の種類別に示したグラフである。腫瘍がRDB257により形成された例では、PBS注射時に腫瘍は約438mm3から1466mm3へと有意に増大した。本発明に従い用いられるベクターdl520を作用させると、腫瘍の成長は有意に低下した。平均腫瘍サイズ344mm3から総容積543mm3へと、腫瘍サイズは僅かに21増加しただけであった。本実施例では、RDB257を基本とする腫瘍にPBSを投与したのと同様にPBSを投与したHeLa細胞より成る腫瘍をコントロールとして用いた。HeLa細胞を基本とする、dl520で処理された腫瘍は、まだ有意な腫瘍成長の増加を示し、311mm3から1954mm3に増加した。図13はRDB257を用いて増殖した腫瘍を持つ、屠殺したヌードマウスの像である。本発明のアデノウイルスdl520を作用させた後に、腫瘍の顕著な縮小が起こったことが明瞭に分かる。本例では、腫瘍容積の減少も見られたウイルスdl520投与1日後:515mm3;ウイルスdl520投与30日後:350mm3。腫瘍DNAのサザンブロット実施例9で発育させた腫瘍の中央部から取り出した腫瘍試料からDNAを抽出した。単離のためにQiagenのDneasyTissueKitを用いた。製造元の指示書に従ってDNA抽出を行った。それに従って、アルカリ溶解を介して細胞からDNAを取り出した。続いて、単離したDNAをカラムで精製した。続いて、260nmの光度測定により単離したDNAの濃度を決定した。制限酵素KpnI、10単位で消化したDNA試料2μgを用いて解析を行った。続いて、0.8アガロースゲルで試料を電気泳動的に分離した。続いて、DNAをナイロン膜にブロットしたSchleicherSchuellの系に従って。膜にブロットさせたDNAを特異的な1501bpのDNAプローブとハイブリッド形成させた。1501bpのプローブは、E2AをコードするAd5の配列の中で3369bpのKpnI断片に特異的に結合する。プローブはそれに先立ってPCRで調製しプライマー:5’-GTCGGAGATCAGATCCGCGT配列番号2、5’-GATCCTCGTCGTCTTCGCTT配列番号3、32Pを用いて放射性標識を行った。続いて、膜を洗浄し、フィルムに暴露した。腫瘍DNAのサザンブロットの結果は図14に示した。分析より、レーン3、4および5が示すように、dl520だけが耐性細胞RDB257でインビトロ複製することが確認された。レーン1は陽性コントロールのAd-5dを、レーン6、7、および8はdl520を感染したHeLa細胞由来のDNAを示す。HeLa細胞はYB-1核陽性ではないため、ウイルスdl520は複製せず、そのためE2A配列は検出できなかった。dl520に関するさらなる結果を図15に示した。プラークアッセイを利用して、dl520および野生型のアデノウイルスを感染させた後の粒子形成pfumlを調べた。各種YB-1核陽性257RDBおよび181RDB腫瘍細胞、ならびにYB-1核陰性腫瘍細胞にdl520および野生型アデノウイルスを感染させた。次の手順で実施した:100、000~200、000個の各細胞を6個のウェルを持つプレート6ウェルプレート、FCSを10含むL15培地耐性細胞およびDMEM非耐性細胞に接種した。24時間後にdl520および野生型アデノウイルスを感染させた10pfu/細胞。感染3日後インフェクション後、凍結と融解を3回繰り返して細胞浮遊液よりウイルス粒子を放出させた。次に293細胞を使ってプラークアッセイを行い、形成した感染粒子プラーク形成単位/mlpfumlを決定した。結果を図15に示す。プラークアッセイの結果は、dl520がYB-1核陽性細胞257RDBおよび181RDBでは野生型アデノウイルスの場合と同様に複製することを示した。この限りにおいて、本発明に従ってここに記載のアデノウイルスを使用する場合には、野生型アデノウイルスと同様の複製効率が観察できた。アデノウイルスベクターXvir03の構造設計図16はアデノウイルスベクターXvir03の構造設計を示す。アデノウイルスXvir03は、いわゆるE1/E3欠失アデノウイルスである。このことは、アデノウイルス複製に機能するE1A、E1BE1B55k及びE1B19kタンパク質及びE3タンパク質が生成されないことを意味する。E1領域の欠失は342~3528の範囲に亘り;E3領域の欠失は塩基位置27865~30995の欠失である。本明細書で用いられる用語E1欠失ウイルスとは、E1がもはや機能的に作用しないウイルスを意味する。これは、不活性である以外は核酸配列及びアミノ酸配列をそれぞれが殆どインタクトなままで不活性化することにより達成することもできるが、しかし、E1領域がコードする様々なサイズを有するタンパク質の欠失を意味することもできる。E1A及びE1Bタンパク質及びそれらをコードする核酸を欠くことにより、E4orf6のようなE4領域は弱く発現されるのみであるか野生型アデノウイルスの約1~5、又は全く発現されない。ウイルス遺伝子ElB55k及びE4orf6はXvir03内に導入された異種のCMVプロモーターClontech:PlasmidpShuttleによりE1領域内で発現される。CMVプロモーターに代わって、E1Aの発現に関連して本明細書中に開示されたいずれのプロモーターでも用いることができる。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるIRES配列内部リボソーム進入部位により互いに連結しているPelletier,J.andSonenberg,N.Nature1988334320~325。このエレメントNovagen:pCITEは1種類のmRNAから2種類のタンパク質を発現させるベクターを以下のように作製した:Clontech社のシステムAdeno-XプラスミドE1B55k-pShuttleを、M.Dobelsteinマールブルグ大学から得たpCGNE1Bから、XbaI及びBfrIによってE1B55kのオープンリーディングフレームをClontech製のpShuttleベクター内にクローニングすることによって作製した。あるいは、pCGNElBベクターから得たBamHI断片を、末端を平滑化した後、対応して調製したClontechのpShuttleベクター中にクローニングした。続いてpShuttle中のE1B55kをApaIを用いて直線化し、末端を、平滑末端化し、NheIを用いて切断した。第二のベクターであるpcDNA3.1Invitrogen中に、前後して、Novagen社製のpCITE-4aを鋳型に用いPCR産物であるIRESエレメントをTAクローニング法によりEcoRV切断部位にクローニングし、そしてプラスミドpCMV-E4orf6M.Dobelstein、マールブルグ大学より得たE4orf6を、BamHIによりクローニングした=IRES-E4orf6-pcDNA3.1。pcDNA3.l中のIRES-E4orf6をNotIを用いて直線化し、端部を平滑末端化した後に断片IRES-E4orf6をNheIで切り出した。断片IRES-E4orf6をオープンベクターE1B55k-pShuttle平滑端、NheIと連結した。カセットを次に、E1B55k-IRES-E4orf6-pShuttleから、CMVプロモーター及びウシ成長ホルモンBGH-ポリAと共に、ΔE1、ΔE3Adeno-X-プラスミドClontech内にI-CeuI及びPI-SceIを用いてクローニングし、AdcmvE1B/IRES/E4orf6と名付けた。次にアデノウイルスをメーカーClontech指示書に従い作製した。PacIにより直線化した、発現エレメントCMV-E1B55k-IRES-E4orf6-BGHポリAを有する、アデノプラスミドをHEK293細胞内にトランスフェクションし、トランスフェクション11日後に融解させる細胞を培地と共に取り出して凍結融解サイクルを繰り返し、生成されたアデノウイルスを放出させた。QBIOGENE及びMicrobixのシステムAdEasyなどの他のシステムを、本発明によるアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にカセットE4orf6-IRES-E1B55k及びYB-1-IRES-E1A12Sを個々に及び/又は共に含むものの製造に用いることができるということは、本発明の範囲内であり、また本明細書に提供される技術的な教示に関して当業者にとって実行可能である。さらに、個々の導入遺伝子をカセット間で交換してもよい。本発明により、カセットがE1B55k-IRES-E4orf6及びE1A12S-IRES-YB1の設計を有するようなアデノウイルスを製造し用いることができるのも、また本発明の範囲内である。本発明に関連して、カセットE4orf6-IRES-E1B55kを含む、いわゆるEI/E3欠失組換えアデノウイルスを用いた。しかし、ウイルスがE1の欠失のみを含み、それはE3領域がインタクトなままに留まっていることを意味することは、実施態様の範囲内である。E4領域が部分的に及び/又は完全に欠失してもよい。様々なシステムを用いるベクターの作製では、以下のようにそれを進行させた。インタクトなE3領域を有するアデノウイルスAd-Xvir3’UTRの、GrahamMicrobix社のベクターシステムによる生成。ベクターCMV-E4ORF6-IRES-E1B55k3’UTR-polyAのpDeltaE1sp1A中へのクローニングプラスミドE1B55k3’UTR-pShuttleClontechのために、3’UTRを有するオープンリーディングフレームを、アデノウイルス5型のDNAからの増幅により調製してE1B55kの順方向プライマー=5’-ATGGAGCGAAGAAACCC-3’、及び、E1B55k3’UTRの逆方向プライマー=5’-CACGTCCTGGAAAAAATACAC-3’、末端を平滑化したNhel制限部位それはT末端TAクローニングを有しており、Clontech社のpShuttleプラスミドへクローニングされているに導入した。したがって、導入遺伝子は、5’末端にhCMV-プロモーター及び3’末端にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを所持していた。ベクターE4ORF6-IRES-pcDNA3.1のクローニングアデノウイルス5型DNAを鋳型として用いるE4orf6の順方向プライマー:5’-CTTCAGGATCCATGACTACGTCCGGCG-3’、及び、E4orf6の逆方向プライマー:5’-GAAGTGAATTCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGT-3’、及びBamHIにより切断されたプラスミドpCMVE4-34kDからの、増幅物E4orf6、及び鋳型としてNovagen社のpCITE-4aを有するIRESエレメントIRESの順方向プライマー=5’-TCCGGTTATTTTCCACCATATTGC-3’及びIRESの逆方向プライマー=5’-TTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-3’、を続いてpcDNA3.1ベクターのマルチクローニング部位へクローンニングした。そのような目的のために、E4orf6導入遺伝子に対して、オープンリーディングフレームの5’末端にBamHI切断部位を、及び3’末端にEcoRI切断部位を生成するプライマーを用いた。増幅物をそれぞれの制限酵素で消化し、またその末端を、BamHIとEcoRlを用いて開かれたベクター中への指向されたクローニングに適合するようにした。次に、pcDNA3.1中のプラスミドE4orf6をEcoRVにより直線状にして、T末端を加え、増幅物をIRESエレメント中へクローニングした。IRESエレメントの正確な方向をチェックした後に、ベクターをさらなるクローニングに用いた。両方の導入遺伝子のIRESエレメントとの連結は、NotIにより直線状にし、末端を平滑化し、続いてXbalにより切断した、以前に生成されたプラスミドCMV-ElB55k3’UTR-polyA-pShuttleClontech中への、E4orf6-IRESカセットのクローニングの結果であった。pcDNA3.1中のE4orf6-IRESをNotIにより直線状にし、末端を平滑末端にして、さらにNheIにより消化した。E4orf6-IRESインサートをCMV-E1B55k3’UTR-polyA-pShuttleClontechとライゲーションさせることによって、pShuttleClontech中でXVIR-3’UTRを生成した。使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成現在Microbix社のアデノウイルス生成システムに用いられているシャトルベクターpΔE1sp1Aは、CMVプロモーターも、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをpΔE1sp1Aへクローニングした。その目的のために、ClaIでpΔE1sp1Aを直線化し、末端を平滑化し、またEcoRIによって切断した。エレメントCMV-MCSマルチクローニング部位-polyAをMfeIでpShuttleClontechから直線化し、末端を平滑末端化し、さらにEcoRlにより切断した。続いて、カセットClontechから得たXvir3’UTRpShuttleを、さらにPmeIで切断されていて続いて脱リン酸化されたCMV-MCSポリApΔE1sp1Aベクター中へ、PmeIによりクローニングした。クローニング生成物Xvir-3’UTR-pΔE1sp1Aをウイルス生成に用いた。ウイルスの生成Xvir-3’UTR-pΔE1sp1A及びpBHGE3Microbixから得た、野生型アデノウイルス5型に対応するE3領域を含むをHEK293細胞へ共トランスフェクションした。それにより両方のベクターの相同配列の組換えによりウイルスAd-Xvir-3’UTRE3が生成された。AdEASYシステムQbiogene社を用いるアデノウイルスAd-Xvir3’UTR-AdEASYE3の生成使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成ここで用いるシステムのためには、ベクターpShuttle-AdEASYは、CMVプロモーターもウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをpShuttle-AdEASへクローニングした。その目的のために、プラスミドをEcoRIによって消化し、T4ポリメラーゼ及びdNTPsで末端を満たすことによって平滑化し、骨格を脱リン酸化し、また生成された両方の消化生成物を再びライゲーションした。そうすることによって、EcoRIの制限認識部位を除去した。このようにして得られたプラスミドをpShuttle-EcoRI-AdEASYと呼んだ。次に、ClontechのpShuttleから得たカセットCMV-MCS-polyAをMfeI及びEcoRIにより切断し、末端を平滑末端化し、そしてベクターpShuttle-EcoR1-AdEASY中へクローニングした。これはそのような目的のために、XbaIで直線化し、平滑末端化し、また脱リン酸化しておいたものである。このようにして、プラスミドCMV-MCS-polyA-pShuttle-AdEASYが生成された。カセットE4Orf6-IRES-E1B55k-3’UTRをこのプラスミドへ、MluI及びEcoRIを用いて、クローニングした。そうすることによって、pShuttleAdEASY中のプラスミドXvir3’UTRが生成された。これをBst1107I及びMroIで直線化し、エレクトロポレーションによってレスキュープラスミドpAdEASYと共にBJ5183ECバクテリアへ導入した。相同組換えによって、アデノウイルスのプラスミドAd-Xvir-3’UTR-pAdEASYが生成され、HEK293細胞へトランスフェクションされた後にウイルス産生をもたらした。野生型E3領域のpAdEASYへの導入プラスミドpAdEASYでは実質的にE3領域が欠失しているので、E3領域をプラスミドpAdEASYからSpeI及びPacIによってプラスミドCMV-MCS-polyApShuttleAdEASY中へ再構成のためにクローニングして、プラスミドE3E4-pShuttle-AdEASYが生成された。NdeIによる制限切断、及び再ライゲ-ションにより2つのNdeI制限部位のうちの1つの制限部位を欠失させ、したがって、プラスミドからマルチクローニングサイトを除いた。この手続きにより、プラスミドE3E4-pShuttle-NdeI-AdEASYが生成された。続いて、4007bpの野生型E3領域断片を野生型アデノウイルス5型からSpeI及びNdeIにより切り出し、SpeIとNdeIによって開かれたE3E4-pShuttle-NdeI-AdEASYへクローンニングした。このようにして生成されたベクターをwtE3E4-pShuttleNdel-AdEASYと呼んだ。次に、E3E4-pShuttle-Ndel-AdEASYから野生型E3E4領域をSpeI及びPacIによって切断して、pAdEASYへクローニングし、またSpeIとPacIで切断した。それによってプラスミドpAdEASY中で、E3領域が再確立されたpAdEASY-E3。BJ5183ECバクテリアをプラスミドXvir-3’UTRによって形質転換する際の相同組換えにより、pShuttleAdEASY及びpAdEASY-E3中に、XVir-3’UTR-pAdEASY-E3が生成された。言及したシステムすべてのためのE4の操作治療用遺伝子及び導入遺伝子のためのスペースを提供するために、及び望ましくない相同組換えを回避するために、プラスミドE3E4-pShuttle-NdeI-AdEASY中のE4領域を特別に欠失させることができる。その目的のためにE4orf6領域を、約0.6kB、好ましくは634bp、PstIによる切断及び再ライゲ-ションによって短縮する。これは図17に記述されているように、Xvir03/01に関連して遂行することができる。それぞれの欠失は、組換えアデノウイルスを生成するための種々のシステムにおいて、当業者によって実現可能である。特にAd-Xvir3’UTR-AdEASYE3中へのRGDモチーフのクローニング他のシステムにも適用可能感染力を増加させるために、ファイバーノブドメインのHIループをDmitrievetal1998AnAdenovirusVectorwithGeneticallyModifiedFibersDemonstratesExpandedTropismviaUtilizationofaCoxsackievirusandAdenovirusReceptorIndependentCellEntryMechanismに従って修飾する:それぞれの領域をプライマーRGD-Hpa順方向5’-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG-3’、RGD-EcoRV逆方向5’-CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG-3’、及びRGD-EcoRV順方向5’-GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG-3’及びRGD-Bfr逆方向5’-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3’を用いて増幅し、これにより、EcoRV制限部位が生成された。この制限部位に、Arg-Gly-AspRGD-ペプチドをコードする対のオリゴヌクレオチド:RGD-oligo15’-CACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCCC-3’及びRGD-oligo25’-GGGCAGAAACAGTCTCCGCGGCAGTCACAAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG-3’をクローニングした。これにより、RGDモチーフがファイバーノブドメインのHIループ中に存在する。上記ベクターは、原則として本発明による使用に関して、本明細書に記載したその他ウイルスと同様に好適である。具体的には、上記ベクターは、YB-1核陽性細胞及びYB-1が脱制御状態にある細胞、即ちYB-1が正常細胞及び非腫瘍細胞それぞれに比べて過剰発現している細胞での複製及びその限りにおいて溶解始動について好適である。このベクターの使用は、特に本発明に従って用いられるものとして本明細書に記載されている他のアデノウイルスならびに本明細書に開示されている本発明の他のアデノウイルスに関連し開示されている疾患、患者群、又は患者集団に適応する。アデノウイルスベクターXvir03/01の構造設計図17からわかるように、Xvir03/01はXvir03を更に発展させたものである。例えば本明細書に記した遺伝子の様な治療目的の遺伝子や導入遺伝子をE3領域内にクローニングできる。さらに、E4領域内に欠失を導入してXvir03の発現カセットに由来するE4orf6との間で相同組換えが起こるのを回避した。これによってより大型の導入遺伝子をこのコンストラクト中にクローニングすることが可能になった。欠失されたE3領域にはカセット導入に適したSacI、NdeI及びNheI切断部位があり、ここに例えば治療用導入遺伝子をクローニングすることができる。しかし、E3領域はまたインタクトなままでよい。また、治療用遺伝子はE4領域中への連続体でありうる。これにより、特に、アデノウイルス細胞死タンパク質ADPの発現が保証される。E3領域内への治療用遺伝子クローニング及びE4領域内への欠失生成のためのプラスミドの調製:ClontechのシステムAdeno-XClontech社製pAdenoX-Plasmidには3’ITR領域の後に野生型アデノウイルスには無いSfuI向けの制限部位がある。E3~E4領域をSpeI位置23644及びSfuIにより、pAdenoXClontechから取り出し、pcDNA3.1、しかしこれは臨床応用では実現できないことを承知している。この現象は文献ではE1A様活性と呼ばれている。本明細書で用いるアデノウイルスAd312はE1A欠失ウイルスである。使用した力価20pfu/細胞はまだ臨床応用には高すぎるが、この力価ではE1B55k及びE4orf6などの初期アデノウイルス遺伝子は発現しないか、又は極少量しか発現しないにより修飾した:それぞれの領域を、プライマーRGD-Hpa順方向5’-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG-3’、RGD-EcoRV逆方向5’-CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG-3’、及びRGD-EcoRV順方向5’-GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG-3’及びRGD-Bfr逆方向5’-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3’、並びにこのようにして生成されたEcoRV切断部位を用いて増幅した。この切断部位へ、Arg-Gly-AspRGDペプチドをコードするRGDオリゴ15’-CACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTTGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGCCC-3’及びRGDオリゴ25’-GGGCAGAAACAGTCTCCGCGGCAGTCACAAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG-3’の、対のオリゴヌクレオチドをクローニングした。したがって、RGDモチーフがファイバーノブドメインのHIループに含まれている。図30及び31に、クローニングされたE1B55k-3’UTRについてより詳細に記述し、AdeasyシステムにおけるpE3/E4シャトルプラスミドを図32に表示する。このプラスミドは、領域E3及びE4に操作と欠失をそれぞれ施して、種々のカセットを、E3領域用のNheI及びE4領域用のPstIなどの様々な制限部位によって、E4orf6及びL5以外のオープンリーディングフレームに悪影響を及ぼすことなくクローニングすることを可能にしたという点で特徴づけられる。さらに、RGDモチーフの配列をHIループの領域へ導入する。欠失の、野生型アデノウイルス配列に対応する位置。E3欠失:28138-30818E4欠失:33246-33875RGDモチーフ:326789つのアミノ酸が導入され、中央の3つのアミノ酸がRGDである:CDCRGDCFCアデノウイルスdl520によるHela細胞の感染ディッシュ当たり100,000個のHela細胞を入れた。翌日、種々の力価のアデノウイルスdl520を細胞に感染させた。感染は、500μLの無血清DMEM培地にて37°Cで1時間行った。続いて、感染培地を除き、完全培地10FCS/DMEM2mLに取り替えた。クリスタルバイオレット染色を用いて、3~5日後、分析を行った。この実験の結果を図23に示す。アデノウイルスdl520は、核にYB-1を有さないHela細胞に感染させた場合、低いMOI5~10pfu/細胞でいかなる溶解も示さなかった。それとは対照的に、dl520は、細胞当たり100~200pfuのMOI感染の多重度で実際、完全な溶解を示し、細胞当たり50pfuのMOIでも優勢な溶解を示した。これらのことから、高いMOIでアデノウイルス遺伝子E1B55K及びE4orf6のスイッチを入れることが可能であるdl520及び類似のウイルスは、過剰発現されたYB-1又は調節解除されたYB-1を核に直接的に又は間接的に輸送し、従って細胞溶解するのに好適であると結論付けることができる。E2後期プロモーター活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイYB-1が核においてアデノウイルスE2後期タンパク質に結合しHolmetalJBC27710427204342002、このプロモーターが核酸の発現によく適していることは既知である。アデノウイルスのE2後期プロモーターの使用は、それがYB-1によって調節されることができ、その際、YB-1は陽性のエフェクターとして作用する、すなわち、該プロモーターは核におけるYB-1の存在下でのみ活性があるという事実によって特に動機付けられる。その程度において、前記アデノウイルスE2後期プロモーターは、高度に選択的な様式で調節されることができるので、核にYB-1が存在する系で使用され、実際、YB-1がエフェクター又はレギュレータとして核に存在しない場合、アデノウイルスE2後期プロモーターの制御下にある核酸のいかなる発現も回避する。E2後期プロモーターは、E2遺伝子の活性化に関連する3つのYボックスCCAATを含む。様々なE2後期プロモーターの構築物が調製され、その特異性及び活性について調べられている。分析は以下のように行った。3種の異なった細胞濃度を用いて、6穴プレートに、核にYB-1を有する細胞株EPG-257RDB上皮性胃癌、Hela細胞上皮性子宮頚癌及びU20S骨肉種を播いた。翌日70の集密度を示したウェルを形質移入に用いた。各ウェルについて、ルシフェラーゼベクターPromegaから市販、出発プラスミド:pGL3-エンハンサ内の様々なE2後期プロモーター構築物のスピンミニプレップQiagenで精製したプラスミドDNA500ngを、1.5mLの密栓付き反応容器内のOpiMEM500μL及び500μLさらなる密栓付き反応容器内のDOTAP5μLに加えた。双方の溶液を合わせて混合した。複合体形成のために混合物を室温にて30分間インキュベートした。細胞をPBSで3回すすぎ、形質移入用混合物の層で覆った。プレートを37°Cで5時間インキュベートし、続いて再びPBSで3回洗浄し、完全培地を提供した。インキュベートの48時間後、細胞をPromegaのルシフェラーゼアッセイシステムキットカタログ番号E1500で処理した。各ウェルに溶解緩衝液500μLを提供し、室温にて10分後、1mLのピペットにてウェルプレートから細胞をすすぎ取り、1.5mLの密栓付き反応容器に移した。4°Cにて14,000rpmで15分間、細胞溶解物を遠心した。各50μLの上清に、100μLのルシフェラーゼ基質を加え、96穴の黒色プレートにて945nmの波長で、トップカウントCanberraPackardGmBH63303Dreieichマイクロプレートシンチレーション発光カウンタにて測定した。タンパク質は、BCAタンパク質アッセイキット、カタログ番号23227PierceRockfordIllinoisUSAにより、570nmにてMolecularDynamicsの生物照度計Biolumin960動的蛍光/吸光プレートリーダーにおいて測定した。試料の相対的光シグナルをタンパク質量RLU/タンパク質μgに変換した。以下のプラスミドを使用した:BamHI2250bp及びBsaBI2003bpによりエンハンサを除いたpGL3-エンハンサPromega、ブランクの読み取りとして働くもの。種々のE2プロモーターを、制限部位ApaI及びSacIによってエンハンサを欠くpGL3ベクターでのMCSにクローニングした。hCMVプロモーターを、BglII及びHindIIIによってpGL3エンハンサにクローニングし、陽性対照として働かせた。陽性対照により形質移入効率を概算し、またそれは、ルシフェラーゼ活性の参照値として役立った。各細胞株についてCMV対照を100に設定し、E2プロモーター構築物により生じた酵素活性をそれと関係付け、図24に棒グラフとして表した。種々のコンストラクトは以下のように引用した。1.塩基25932~26179に相当するYボックスI、II、及びIIIを含む野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスE2領域の部分も参照のこと2.塩基25932~26127に相当するYボックスII、及びIIIを含む野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスE2領域の部分も参照のこと3.塩基25932~26004に相当するYボックスIIIを含む野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスE2領域の部分も参照のこと4.ブランクの読み取りとして作用するようにYボックスを含まない。アデノウイルスE2領域の部分Virology1862802851992から引用YB-1結合部位は太字で印刷されている図24で提示された結果は、様々なE2後期/Yボックスを含有する個々のプロモーター断片はYB-1核陽性の腫瘍細胞における治療用導入遺伝子の発現に好適であるので、本発明の意味でプロモーターとして使用してもよいことを印象的に裏付けている。アデノウイルスにより発現されたYB-1の粒子形成における効果E1/E3を欠失したアデノウイルスベクターAdYB-1及びE1Aのみの欠失を有するAd312を、50pfu/細胞のMOIにてヒト骨肉種細胞U20Sに感染させた。AdYB-1は、ゲノムに、細胞性転写因子YB-1をコードする配列を含有するので、Y-ボックス結合タンパク質1YB-1を発現する。感染後、プラーク形成単位pfuとしてのウイルス粒子の放出を評価するために、培養培地の上清及び残りの細胞層をそれぞれ、感染後2日目及び5日目に単離した。細胞内の粒子は3回の凍結乾燥により放出させた。293細胞におけるプラークアッセイによって粒子数を分析した。結果は図25に示すが、黒棒は細胞内に残っていたウイルス粒子を示し、斜線の棒は放出された細胞外のウイルス粒子を示す。図25に示された結果は、AdYB-1は全体として、Ad312よりも大きなpfuを生じ、多くの粒子を放出することを裏付けている。5日目では、AdYB-1に感染させた細胞は、Ad312に感染させた細胞とは対照的に細胞変性効果CPEを明瞭に示した。イリノテカン添加後の細胞中のアデノウイルス複製アデノウイルスの複製に対するイリノテカンの影響を決定するために、106個のU373腫瘍細胞を10cm2のペトリ皿にプレートした。最初の反応では、5μMイリノテカンを24時間後に加えた。さらに24時間の後、細胞に10pfu細胞のdl520を感染させた。イリノテカンなしで3日間インキュベーション後に、実施例10に記述した手続きに従ってDNAを分離した。並行した反応においては、このように準備したU373細胞を予めイリノテカンでインキュベーションしなかった。イリノテカンなしで48時間細胞を培養した後に、それらに10pfu細胞のdl520を感染させ、さらに3日の間イリノテカンなしで続いてインキュベーションした。上述したようにDNAを分離した。続いて2μgDNAを制限酵素KpnIで消化し、サザンブロット解析を行なった。PCRによって生成されたアデノウイルスゲノムの一部位置:22734-24235をプローブとして用いた。結果を図26に示す。図26は、イリノテカンとのインキュベーション後に、イリノテカンとインキュベーションを行なわない無処理の対照レーン1と比較して、イリノテカン処理後にレーン2U373細胞中でアデノウイルスの複製が著しく増加することを示す。これは、イリノテカンの影響下でアデノウイルスの複製が増加することを意味する。トリコスタチンA投与後の細胞中のアデノウイルスの複製アデノウイルスの複製に対するトリコスタチンAの影響をテストするために、106個のU373腫物細胞を10cm2のペトリ皿にプレートした。24時間後に0.25、0.5、及び0.75μMのトリコスタチンAを加えた。さらに24時間後、細胞に10pfu細胞のdl520を感染させた。3日間トリコスタチンのない培地でインキュベーションした後、DNAを分離した。次に2μgDNAを制限酵素KpnIで消化し、サザンブロット解析を行なった。PCRによって生成されたアデノウイルスのゲノムの一部位置:22734~24235をプローブとして用いた。結果を図27に示す。図27は、トリコスタチンA濃度を増加させてインキュベーションした後レーン2、3及び4では、U373細胞中のアデノウイルス複製が、トリコスタチンAとインキュベーションしなかった未処理の対照レーン1と比較して、著しく増加することを示す。これは、ウイルスの複製がトリコスタチンAの影響下で増加することを意味する。トリコスタチンAの添加に応答して、U373細胞のコクサッキーウイルスアデノウイルスレセプターCARの発現に影響を及ぼす200000個のU373細胞を6ウェルプレートにプレートした。24時間後、細胞を1μMトリコスタチンと共に24時間培養した。さらに24時間後、細胞を単離した。次にCAR発現の解析を、Facs解析及びUpstate社から得た一次抗体、抗-CARクローンRmcB、及び二次抗体としてウサギ-抗-マウスFITCDAKO社を用いる標準プロトコルにより実施した。結果を図28に示す。トリコスタチン処理をしない場合、細胞の11.3がCAR陽性であったが、細胞を1μMトリコスタチンとインキュベーションした後は、細胞の56.2がCAR陽性であった。図はテストに用いた全細胞のパーセンテージである。図28から、ヒストンデアシラーゼ阻害剤トリコスタチンAの影響下で、アデノウイルスの結合の重要な因子であるCARがより高いレベルで、またより利用可能性が高く発現され、それはこのように処理した細胞のトランスフェクションの効率を増加させることが分かる。イリノテカン及びトリコスタチンAによる細胞の併用処理後のアデノウイルスによるU373細胞の腫瘍崩壊。200000個のU373細胞を6ウェルプレートにプレートした。24時間後に、2μMイリノテカン又は1μMトリコスタチンA、あるいは1μMイリノテカン0.5μMトリコスタチンを培地に加えた。24時間のインキュベーションの後、細胞に10、20、及び30pfu細胞のdl520を感染させた。3~5日後に、クリスタルバイオレット染色を用いて、解析を行なった。分析を二重に行なった。結果を図29に示す。パネル1中に表した6つのプレートは、クリスタルバイオレット染色によって示される、イリノテカン及びトリコスタチンAの組合せとのインキュベーションに影響されなかった完全な細胞層を示す。パネル1の次の2つのウェルは、10及び20pfu細胞のdl520による感染後の細胞層をそれぞれ示す。そのような条件下でも、dl520の複製がないため、細胞崩壊がない。したがって、10又は20pfu細胞のdl520も、1μMイリノテカン0.5μMトリコスタチンAのみも、細胞溶解を引き起こすには適当でないことを示す。本明細書でパネル2、3及び4とも呼ぶ、図29中に示したさらなる6ウェルプレート2、3及び4を、基本的にこのスキームに従って処理した。個々のウェルに、前に記述したようにU373細胞を接種し、細胞をその中で培養した。正副2つのウェルに、10、20、又は30pfu細胞のdl520を接種した。3枚の6ウェルプレート間には、用いた細胞増殖抑止剤の種類に差異が存在した。パネル2では2μMイリノテカン、パネル3では1μMトリコスタチンA、ならびにパネル4では1μMイリノテカン及び0.5μMトリコスタチンAを、個々のウェルに加えた。2μMイリノテカンを加えた6ウェルプレート2パネル2では、30pfu細胞のdl520により細胞が溶解された。1μMトリコスタチンAを加えた6ウェルプレート3パネル3では、20及び30pfu細胞のdl520により細胞が溶解された。1μMイリノテカン0.5μMトリコスタチンAを加えた6ウェルプレート4パネル4ではそれらと対照的に、すでに10pfu細胞のdl520により細胞が溶解された。図26~29に結果が表されているテストは、イリノテカントリコスタチンdl520から成る組合せが、化合物単独のいずれよりも有効な腫瘍細胞の細胞溶解を引き起こすことを示す。これは一方では、CAR発現を増加させ、従って細胞の感染可能性を著しく改善するトリコスタチンAに起因する。他方では、イリノテカンがYB-1を細胞核に移行させ、従ってアデノウイルス複製の増進を引き起こす。さらに、細胞のYB-1はdl520による感染の後にアデノウイルスの複製を支援しており、もはやDNA修復プロセスに利用できない。見方によって、これは、一方でdl520の効率の改善をもたらし、また他方では細胞増殖抑止剤の効率の増加をもたらす。"