"蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法。請求項1に記載の組織染色方法において、前記蛍光物質を複数集積した粒子は、前記蛍光物質を複数内包した粒子である組織染色方法。請求項1または2に記載の組織染色方法において、前記蛍光物質は、蛍光色素、半導体粒子又は希土類粒子である組織染色方法。請求項1~3のいずれか一項に記載の組織染色方法において、前記蛍光物質を複数集積した粒子の粒子径は、40nm~500nmである組織染色方法。蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織切片を染色し、当該染色された組織切片の蛍光輝点の数を計測し、当該計測された蛍光輝点の数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質認識部位に対応する生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法。請求項5に記載の組織評価方法において、前記染色された組織切片の各蛍光輝点の輝度を計測し、前記計測された蛍光輝点の数及び各蛍光輝点の輝度から輝度分布を求め、当該輝度分布に基づいて前記蛍光物質集積粒子1粒子当たりの輝度を算出し、前記計測された各蛍光輝点の輝度の和及び前記算出された蛍光物質集積粒子1粒子当たりの輝度に基づいて、前記染色された組織切片に結合している蛍光物質集積粒子の粒子数を算出し、当該算出された蛍光物質集積粒子の粒子数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法。病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第1の生体物質認識部位が結合し、かつ、第1の蛍光物質を複数集積した第1の粒子と、前記第1の生体物質認識部位とは異なる第2の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第1の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第2の蛍光物質を複数集積した第2の粒子とを、用いることを特徴とする生体物質検出方法。請求項7に記載の生体物質検出方法において、前記第1の生体物質認識部位が抗ヒトER抗体であり、前記第2の生体物質認識部位が抗HER2抗体であることを特徴とする生体物質検出方法。請求項7または8に記載の生体物質検出方法において、前記第1の蛍光物質および前記第2の蛍光物質が、蛍光有機色素または量子ドットから選択されることを特徴とする生体物質検出方法。請求項7~9のいずれか一項に記載の生体物質検出方法において、前記生体物質を検出する工程では、前記生体物質の発現レベルを輝点数の計測によりおこなうことを特徴とする生体物質検出方法。請求項7~9のいずれか一項に記載の生体物質検出方法において、前記生体物質を検出する工程では、前記生体物質の発現レベルを発光輝度の計測によりおこなうことを特徴とする生体物質検出方法。これに対し、近年、抗体医薬を中心とした分子標的薬治療の広がりに伴い、分子標的薬をより効率的に使用するため、正確な診断法の必要性が高まってきている。病理診断においても、より正確に疾病の診断を行うため、極微量のバイオマーカーを組織切片上で定量的に検出することが求められている。しかし、従来の病理組織染色方法では、安定した定量性能、微量検出性能を得ることは困難であった。本発明は、上記の従来技術における問題に鑑みてなされたものであり、微量の生体物質バイオマーカーを定量的に検出することを課題とする。上記課題を解決するために、本発明の第1の態様によれば、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織を染色する組織染色方法が提供される。本発明の第2の態様によれば、蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いて組織切片を染色し、当該染色された組織切片の蛍光輝点の数を計測し、当該計測された蛍光輝点の数に基づいて、前記染色された組織切片における前記生体物質認識部位に対応する生体物質の発現レベルを評価する組織評価方法が提供される。本発明の第3の態様によれば、病理切片から生体物質を特異的に検出する生体物質検出方法において、染色試薬を用いて前記病理切片を染色する工程と、染色後の前記病理切片から前記生体物質を検出する工程とを、有しており、前記病理切片を染色する工程では、前記染色試薬として、第1の生体物質認識部位が結合し、かつ、第1の蛍光物質を複数集積した第1の粒子と、前記第1の生体物質認識部位とは異なる第2の生体物質認識部位が結合し、かつ、前記第1の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する第2の蛍光物質を複数集積した第2の粒子とを、用いることを特徴とする生体物質検出方法が提供される。本発明の第1の態様によれば、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、蛍光観察時の1粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。本発明の第2の態様によれば、微量の生体物質を定量的に検出することができるのに加え、組織切片から計測された蛍光輝点の数に基づいて、生体物質の発現レベルを評価するので、生体物質の定量評価において、安定した評価結果を得ることができる。本発明の第3の態様によれば、微量の生体物質を定量的に検出することができるのに加え、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が複数集積された粒子を用いるから、1つの病理切片から複数の生体物質を検出することができる。以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。本実施形態では、組織染色方法と、これを利用した組織評価方法および生体物質検出方法とを、提供する。本実施形態にかかる組織染色方法では、生体物質認識部位が結合した蛍光物質を集積したナノ粒子を用いる。本実施形態にかかる組織評価方法では、生体物質認識部位が結合された蛍光物質又は蛍光物質集積粒子を用い、その輝点の数に基づいて組織切片上に存在するバイオマーカーと結合した蛍光物質又は蛍光物質集積粒子の数を求める。本実施形態にかかる生体物質検出方法は、病理切片から生体物質を特異的に検出する方法であり、基本的には、1染色試薬を用いて病理切片を染色する工程と、2染色後の病理切片から生体物質を検出する工程とを、有している。特に、2の工程では、染色試薬として2種類のナノ粒子を使用する。一方のナノ粒子には、一定の生体物質認識部位が結合され、かつ、一定の蛍光物質が内包されている。他方のナノ粒子には、一方のナノ粒子の生体物質認識部位とは異なる生体物質認識部位が結合され、かつ、一方のナノ粒子の蛍光物質とは異なる蛍光波長を有する蛍光物質が内包されている。すなわち、各ナノ粒子には、互いに異なる生体物質認識部位が結合され、蛍光波長が互いに異なる蛍光物質が内包されている。そのため、蛍光物質に起因する蛍光波長の違いから、生体物質認識部位に応じた2種の生体物質を検出することができるし、生体物質認識部位の選定から、将来的には現在未確認の抗原を特定することもできると考えられる。なお、本発明の好ましい実施形態では、2種類のナノ粒子を用いた例を示すが、生体物質認識部位と蛍光物質蛍光波長とが互いに異なれば、3種類以上のナノ粒子を用いて3種類以上の生体物質を検出するものとしてもよい。蛍光物質などの種類や特性、生体物質検出方法の詳細は下記のとおりである。蛍光物質本発明で用いられる蛍光物質としては、有機蛍光色素、量子ドット半導体粒子、希土類粒子を挙げることができる。200~700nmの範囲内の波長の紫外~近赤外光により励起されたときに、400~900nmの範囲内の波長の可視~近赤外光の発光を示すことが好ましい。有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、AlexaFluorインビトロジェン社製系色素分子、BODIPYインビトロジェン社製系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、NBD系色素分子、ピレン系色素分子、TexasRed系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。具体的には、5-カルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-フルオレセイン、5,6-ジカルボキシ-フルオレセイン、6-カルボキシ-2’,4,4’,5’,7,7’-ヘキサクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-2’,4,7,7’-テトラクロロフルオレセイン、6-カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、5-カルボキシ-ローダミン、6-カルボキシ-ローダミン、5,6-ジカルボキシ-ローダミン、ローダミン6G、テトラメチルローダミン、X-ローダミン、及びAlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500、AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor635、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、BODIPYFL、BODIPYTMR、BODIPY493/503、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665以上インビトロジェン社製、メトキシクマリン、エオジン、NBD、ピレン、Cy5、Cy5.5、Cy7等を挙げることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。量子ドットとしては、II-VI族化合物、III-V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドットそれぞれ、II-VI族量子ドット、III-V族量子ドット、IV族量子ドットともいう。のいずれかを用いることができる。単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。具体的には、CdSe、CdS、CdTe、ZnSe、ZnS、ZnTe、InP、InN、InAs、InGaP、GaP、GaAs、Si、Geが挙げられるが、これらに限定されない。上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがCdSe、シェルがZnSの場合、CdSe/ZnSと表記する。例えば、CdSe/ZnS、CdS/ZnS、InP/ZnS、InGaP/ZnS、Si/SiO2、Si/ZnS、Ge/GeO2、Ge/ZnS等を用いることができるが、これらに限定されない。量子ドットは必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するCdSe/ZnSインビトロジェン社製、表面アミノ基を有するCdSe/ZnSインビトロジェン社製等が挙げられる。希土類粒子としては、例えば、酸化ネオジム、塩化ネオジム、硝酸ネオジム、酸化イッテルビウム、塩化イッテルビウム、硝酸イッテルビウム、酸化ランタン、塩化ランタン、硝酸ランタン、酸化イットリウム、塩化イットリウム、硝酸イットリウム、塩化プラジオセム、塩化エルビウム、オルトリン酸、リン酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム等を用いることができる。蛍光物質を複数集積した粒子本発明において蛍光物質を複数集積した粒子とは、蛍光物質がナノ粒子内部に分散されたもの蛍光物質を複数内包したナノ粒子蛍光物質内包ナノ粒子、粒子外部に集積したもの、粒子の内部、外部によらず集積したものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していても、していなくてもよい。ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、ポリスチレン、ポリ乳酸、シリカ等を挙げることができる。本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子は、公知の方法により作製することが可能である。例えば、有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア8巻2921ページ1992に記載されているFITC内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。FITCの代わりに所望の有機蛍光色素を用いることで種々の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュージャーナルオブケミストリー33巻561ページ2009に記載されているCdTe内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。量子ドットを外包したシリカナノ粒子は、ケミカルコミュニケーション2670ページ2009に記載されているCdSe/ZnSを5-amino-1-pentanolとAPSでキャッピングした粒子を表面に集積したシリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。有機蛍光色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許43260081982に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許53266921992に記載されているポリスチレンナノ粒子への有機蛍光色素の含浸法を用いて作製することができる。量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャーバイオテクノロジー19巻631ページ2001に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。本発明で用いられる蛍光物質を複数集積した粒子の平均粒径は特に限定されないが、30~800nm程度のものを用いることができる。平均粒径が30nm未満の場合には、集積粒子に含まれる蛍光物質が少なく、目的とする生体物質の定量評価が困難となり、800nmを超える場合には、病理組織での生体物質との結合が困難となるためである。なお、平均粒径は、40~500nmの範囲内であることがより好ましい。ここで、平均粒径を40~500nmとしたのは、40nm未満の場合には、高価な検出系が必要となり、500nmを超える場合には、物理的な大きさから定量範囲が狭まるためである。また、粒径のばらつきを示す変動係数=標準偏差/平均値×100は特に限定されないが、20のものを用いることができる。平均粒径は、走査型電子顕微鏡SEMを用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、1000個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、1000個の粒子の粒径分布から算出した値とした。緩衝液緩衝液とは、抗原-抗体反応に適した環境を安定して維持するための溶媒である。例えば、リン酸緩衝液生理的食塩水PBS、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、MES緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液等である。生体物質認識部位と蛍光物質を集積したナノ粒子との結合本発明に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合及び/又は反応する部位である。例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるHER2に特異的に結合する抗HER2抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体ERに特異的に結合する抗ER抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗HER2抗体及び抗ER抗体を蛍光物質集積ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。また、生体物質認識部位と蛍光物質集積ナノ粒子の間を連結する有機分子があってもよい。例えば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、ThermoScientific社製SMPEG12を用いることができる。蛍光物質集積シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基等の官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤例えば、Gelest社製PEG-silaneno.SIM6492.7等が挙げられる。シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。有機蛍光色素集積シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で12時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、EDC1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimideHydrochloride:Pierce社製のような縮合剤を用いることもできる。必要により、有機分子で修飾された有機蛍光色素集積シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつsulfo-SMCCSulfosuccinimidyl4[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate:Pierce社製を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素集積シリカナノ粒子ができる。蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が有機蛍光色素の場合でも、量子ドットの場合でも、希土類粒子の場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基等の官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ有機蛍光色素、量子ドット又は希土類粒子を含浸することにより、官能基もつ蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降EDC又はsulfo-SMCCを用いることで、抗体結合した蛍光物質集積ポリスチレンナノ粒子ができる。染色方法生体物質検出方法以下、本発明の染色方法生体物質検出方法について述べる。本発明の染色方法は病理切片組織に限定せず、細胞染色にも適用可能である。本発明の染色方法が適用できる切片の作製法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。1脱パラフィン工程キシレンを入れた容器に、病理切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に病理切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に、病理切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。2賦活化処理公知の方法にならい、目的とする生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mクエン酸緩衝液pH6.0、1mMEDTA溶液pH8.0、5尿素、0.1Mトリス塩酸緩衝液等を用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50-130°C、時間は5-30分で行うことができる。次いで、水、PBSを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。3生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子を用いた染色生体物質認識部位が結合された蛍光物質集積ナノ粒子のPBS分散液を病理切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光物質集積ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。複数2種以上の生体物質を検出しようとする場合は、生体物質認識部位が異なる蛍光物質内包ナノ粒子PBS分散液をそれぞれ調製し、病理切片に載せ、目的とする生体物質との反応を行う。病理切片に載せる際に、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子PBS分散液をあらかじめ混合してもよいし、別々に順次載せてもよい。混合比は特に限定されるものではないが、本発明の効果が表れるには両者の比は1:1~5:1でよい。蛍光物質集積ナノ粒子のPBS分散液には、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤やTween20等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、30分以上24時間以下であることが好ましい。蛍光物質集積ナノ粒子による染色を行う前に、BSA含有PBS等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。次いで、PBSを入れた容器に、染色後の切片を浸漬させ、未反応蛍光物質集積ナノ粒子の除去を行う。PBS溶液にはTween20等の界面活性剤を含有させてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3分以上30分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。組織の形態観察のため、ヘマトキシリン-エオジン染色を行ってもよい。カバーガラスを切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。4蛍光顕微鏡下の観察染色した病理切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、目的とする生体物質の発現レベルを輝点数又は発光輝度に基づいて評価する。輝点数又は発光輝度の計測では、用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応した励起光源は及び蛍光検出用光学フィルターを選択する。輝点数又は発光輝度の計測は、画像解析ソフト、例えば、公開解析ソフトImageJ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Countを用いて行うことができる。次に、本発明を上記実施形態に基づいて具体的に実施した実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されない。[手順1:蛍光物質内包粒子の合成]テトラメチルローダミンインビトロジェン社製TAMRA-SE6.6mgと3-アミノプロピルトリメトキシシラン3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM9033μLをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mlを48mlのエタノール、0.6mlのTEOSテトラエトキシシラン、2mlの水、2mlの28アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作製した混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行った。得られたテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子のSEM観察を行い、200粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径104nm、変動係数は12であった。同様の方法で、Cy5-SEロシュ社製を用いて平均粒子径20、42、103、204、498nmのCy5内包シリカナノ粒子を得た。また、同様の方法で、FITC-SEインビトロジェン社製を用いて平均粒子径106nmのFITC内包シリカナノ粒子を得た。[手順2:蛍光物質内包粒子への抗体の結合]手順1で得られた蛍光物質内包シリカナノ粒子テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子、Cy5内包シリカナノ粒子、FITC内包シリカナノ粒子のそれぞれを、EDTAエチレンジアミン四酢酸を2mM含有したPBSリン酸緩衝液生理的食塩水を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度が10mMとなるようSMPEG12サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[N-maleomidopropionamid-dodecaethyleneglycol]esterを混合し、1時間反応させた。この混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。一方、抗ヒトER抗体を1MジチオスレイトールDTTで還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで抗ヒトER抗体結合蛍光物質内包シリカナノ粒子を得た。[手順3:蛍光物質内包粒子を用いた組織染色]手順2で作製した抗ヒトER抗体結合蛍光物質内包シリカナノ粒子を用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライドCB-A712を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、10mMクエン酸緩衝液pH6.0中で15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、PBS緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で1時間1BSA含有PBS緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、1BSA含有PBS緩衝液で0.05nMに希釈した各抗ヒトER抗体結合蛍光物質内包シリカナノ粒子を組織切片と3時間反応させた。抗ヒトER抗体結合蛍光物質内包シリカナノ粒子と反応させた後、組織アレイスライドをPBS緩衝液で洗浄し、MerckChemicals社製Aquatexを用いて封入した。[手順4:蛍光物質内包粒子を用いて染色した組織の輝点計測]手順3で染色した組織切片についてオリンパス社製DSU共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、G-countを用いて輝点の計測を行った。Cy5の観察は、励起フィルター640/30nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター660nm、蛍光フィルター690/50nmのバンドパスフィルターのフィルターセットを用いた。テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター550/25nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター570nm、蛍光フィルター605/70nmのバンドパスフィルターのフィルターセットを用いた。FITCの観察は、励起フィルター470/40nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター495nm、蛍光フィルター525/50nmのバンドパスフィルターのフィルターセットを用いた。組織アレイスライド中の予めDAB染色で染色濃度が異なることが予測された8スポットについて、各30細胞の輝点の数を計測し、1細胞当たりの輝点の数平均値を求めた。また、同様に、8スポットについて、各30細胞の発光輝度を計測し、1細胞当たりの発光輝度平均値を求めた。[比較例:蛍光色素単体を用いた組織染色]比較例として、Cy5、テトラメチルローダミン、FITC蛍光色素単体に抗ヒトER抗体を結合させたものを用い、手順3と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順4と同様の方法で組織の輝点を計測した。具体的には、組織アレイスライド中の8スポットについて、各30細胞の輝点の数及び発光輝度を計測し、1細胞当たりの輝点の数及び1細胞当たりの発光輝度を求めた。[実験結果A]まず、標識体に含まれる蛍光色素の違いすなわち、発光波長の違いによるバイオマーカーERの検出感度の差について検討した。表1に、Cy5内包シリカナノ粒子平均粒子径103nm、テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子平均粒子径104nm、FITC内包シリカナノ粒子平均粒子径106nmのそれぞれを用いた場合に計測された1細胞当たりの輝点数を示す。表1において、-は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。表1に示すように、いずれの蛍光物質内包粒子を用いた場合でも、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。ただし、スポット番号2の組織切片について、Cy5内包シリカナノ粒子及びテトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能であったのに対し、FITC内包シリカナノ粒子を用いた場合には、バックグラウンドレベル以上の輝点は計測されなかった。すなわち、励起波長が長いCy5励起波長650nm、発光波長670nm、テトラメチルローダミン励起波長550nm、発光波長570nmの内包粒子の方が、FITC励起波長495nm、発光波長520nmの内包粒子と比べて、より微量のバイオマーカーを検出できることがわかる。[実験結果B]次に、標識体の粒子径の違いによるバイオマーカーERの検出感度の差について検討した。表2に、Cy5内包シリカナノ粒子平均粒子径20、42、103、204、498nmのそれぞれと、Cy5色素単体比較例とを用いた場合に計測された1細胞当たりの輝点数を示す。表2において、-は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。表2に示すように、平均粒子径が42、103、204、498nmのCy5内包シリカナノ粒子を用いた場合には、輝点数を計測可能な各スポットにおいて、輝点数の差によりバイオマーカーの定量評価が可能となっている。しかし、平均粒子径が498nmのCy5内包シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号6の組織切片において輝点の区別がつかなくなっており、バイオマーカーが高頻度に発現している場合の定量範囲が狭まることがわかる。また、Cy5色素単体を用いた場合、平均粒子径20nmのCy5内包シリカナノ粒子を用いた場合には、スポット番号1~4の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号5~8の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。[実験結果C]次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカーERの検出感度を輝点数で比較した。表3に、Cy5内包シリカナノ粒子平均粒子径103nm、テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子平均粒子径104nm、FITC内包シリカナノ粒子平均粒子径106nm、Cy5、テトラメチルローダミン、FITCのそれぞれを用いた場合に計測された1細胞当たりの輝点数を示す。表3において、-は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示し、は、発光が強く、周囲の輝点と区別がつかないことを示している。表3から、蛍光色素単体を用いて組織染色を行った場合には、スポット番号1~4の組織切片では、バックグラウンドレベル以上の輝点がなく、スポット番号5~8の組織切片では、周囲の輝点と区別がつかないため、微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価が不可能なことがわかる。一方、標識体として蛍光物質内包粒子を用いた場合には、微量のバイオマーカーに対しても、精度良く定量的に検出することができる。[実験結果D]次に、蛍光色素内包粒子と蛍光色素単体とによるバイオマーカーERの検出感度を発光輝度で比較した。表4に、Cy5内包シリカナノ粒子平均粒子径103nm、テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子平均粒子径104nm、FITC内包シリカナノ粒子平均粒子径106nm、Cy5、テトラメチルローダミン、FITCのそれぞれを用いた場合に、DSU共焦点顕微鏡により取得された画像データに基づいて計測された1細胞当たりの発光輝度を示す。発光輝度の単位はa.u.任意単位である。表4において、0は、バックグラウンドレベル以下の発光であることを示している。表4から、蛍光色素単体を用いた場合と比較して、蛍光物質内包粒子を用いた場合には、より微量なバイオマーカーを検出可能なことがわかる。以上説明したように、蛍光物質を複数集積した粒子に生体物質認識部位が結合されたものを染色試薬として用いることにより、組織切片を蛍光観察する際の1粒子当たりの輝度が高くなるため、微量のバイオマーカー生体物質認識部位に対応する生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。また、蛍光物質を複数内包した粒子を用いる場合には、蛍光物質が粒子に内包されることにより、蛍光物質の耐久性が高まる。[手順1:蛍光物質集積粒子の合成]テトラメチルローダミンインビトロジェン社製TAMRA-SE励起波長550nm、発光波長570nm6.6mgと3-アミノプロピルトリメトキシシラン3-aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM9033μLをDMF中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。得られたオルガノアルコキシシラン化合物0.6mlを48mlのエタノール、0.6mlのTEOSテトラエトキシシラン、2mlの水、2mlの28アンモニア水と3時間混合した。上記工程で作製した混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を2回ずつ行った。得られたテトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子のSEM観察を行い、200粒子の粒子径を測定したところ、平均粒径104nm、変動係数は12であった。同様の方法で、Cy5-SEロシュ社製励起波長650nm、発光波長670nmを用いて平均粒子径103nmのCy5集積シリカナノ粒子を得た。[手順2:蛍光物質集積粒子と量子ドットへの抗体の結合]手順1で得られた蛍光物質集積シリカナノ粒子テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、Cy5集積シリカナノ粒子のそれぞれを、EDTAエチレンジアミン四酢酸を2mM含有したPBSリン酸緩衝液生理的食塩水を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度が10mMとなるようSMPEG12サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[N-maleomidopropionamid-dodecaethyleneglycol]esterを混合し、1時間反応させた。この混合液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで抗体結合用シリカナノ粒子を得た。一方、抗ヒトER抗体を1MジチオスレイトールDTTで還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去することにより、シリカ粒子に結合可能な還元化抗体溶液を得た。上記で得られた抗体結合用シリカナノ粒子と還元化抗体溶液とを、EDTAを2mM含有したPBS中で混合し、1時間反応させた。10mMメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を10000Gで20分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行うことで抗ヒトER抗体結合蛍光物質集積シリカナノ粒子を得た。インビトロジェン社製QD655抗体標識キットQ22021MPを用いて量子ドットに抗ヒトER抗体を結合させた。抗体の結合はキットの処方にしたがい、SMCCによる量子ドットの活性化、DTTによる抗体の還元工程を経て、量子ドットと抗体の結合反応を行うことで行った。[手順3:蛍光物質集積粒子と量子ドットを用いた組織染色]手順2で作製した抗ヒトER抗体結合蛍光物質集積シリカナノ粒子と抗ヒトER抗体結合量子ドットを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片は、コスモバイオ社製の組織アレイスライドCB-A712を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理した後、組織アレイスライドを浸漬する液体をキシレン、エタノール、水の順に置換して洗浄し、10mMクエン酸緩衝液pH6.0中で15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドは、PBS緩衝液を用いて洗浄後、湿潤箱中で1時間1BSA含有PBS緩衝液を用いてブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、1BSA含有PBS緩衝液で0.05nMに希釈した各抗ヒトER抗体結合蛍光物質集積シリカナノ粒子又は抗ヒトER抗体結合量子ドットを組織切片と3時間反応させた。その後、組織アレイスライドをPBS緩衝液で洗浄し、MerckChemicals社製Aquatexを用いて封入した。[手順4:染色した組織の輝点、輝度、粒子数計測]手順3で染色した組織切片についてオリンパス社製DSU共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオングストローム社製の輝点計測ソフトウェア、G-countを用いて輝点の計測を行った。Cy5の観察は、励起フィルター640/30nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター660nm、蛍光フィルター690/50nmのバンドパスフィルターのフィルターセットを用いた。テトラメチルローダミンの観察は、励起フィルター550/25nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター570nm、蛍光フィルター605/70nmのバンドパスフィルターのフィルターセットを用いた。QD655の観察は、励起フィルター350/50nmのバンドパスフィルター、ビームスプリッター400nm、蛍光フィルター590nmのロングパスフィルターのフィルターセットを用いた。組織アレイスライド中の予めDAB染色で染色濃度が異なることが予測された8スポットについて、各60細胞の輝点の数と各輝点の輝度を計測した。[実験結果A]まず、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いた場合に得られた各輝点の輝度分布輝度毎の輝点数に基づいて、1粒子当たりの輝度を求めた。具体的には、輝度分布から、最も頻度の高い輝度を1粒子当たりの輝度とする。Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655のそれぞれを用い、8スポット各スポットにつき各60細胞から輝点を計測した。その結果、Cy5集積シリカナノ粒子を用いた測定では輝度82の輝点数が最も多く、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子を用いた測定では輝度69の輝点数が最も多く、QD655を用いた測定では輝度64の輝点数が最も多かった。表5に、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655のそれぞれを用いた場合の、8スポット全体60細胞×8スポットから計測された各輝点の輝度分布を示す。輝度の単位はa.u.任意単位である。表5は、輝度が0-30、31-60、61-90、91-120、121-150、151-180、181-210、211-255の範囲の輝点数を示している。表5から、Cy5集積シリカナノ粒子では、輝度が61-90、151-180、211-255の範囲にピークが存在していることがわかる。Cy5集積シリカナノ粒子では、輝度82の輝点数が最も多いため、輝度151-180に含まれる輝点は2粒子分の合計輝度であり、輝度211-255に含まれる輝点は3粒子分の合計輝度であることがわかる。このように、輝度分布に基づいて、蛍光物質集積粒子や量子ドット1粒子当たりの輝度を求めることができる。[実験結果B]次に、実験結果Aの結果に基づいて、Cy5集積シリカナノ粒子では1粒子当たりの輝度を82、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子では1粒子当たりの輝度を69、QD655では1粒子当たりの輝度を64と仮定して、各スポットでの1細胞当たりの輝度の和を1粒子当たりの輝度で割ることで、各スポットでの1細胞当たりの粒子数を求めた。表6に、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655のそれぞれを用いた場合の、各スポットでの1細胞当たりの粒子数を示す。表6において、-は、バックグラウンドレベル以上の輝点がないことを示している。表6に示すように、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655のそれぞれについて、1細胞当たりの粒子数の差によりバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することができる。しかし、より微量のバイオマーカーに対する輝点レベルの定量評価スポット番号2、3においては、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子を用いた場合の方が、QD655を用いた場合よりも、検出感度が優れていることがわかる。[実験結果C]次に、蛍光物質集積粒子又は量子ドットを用いて染色した組織における輝点の経時変化について検討した。手順3で染色した組織切片を作製してから0日、3日、30日、90日後に、手順4に従って組織アレイスライド中のスポット番号6の組織切片の60細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Bと同様の方法で、1細胞当たりの粒子数を算出した。また、各輝点の輝度の和を細胞数で割ることにより、1細胞当たりの輝度を算出した。図1に、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655のそれぞれを用いた場合の、スポット番号6の組織切片について算出された1細胞当たりの粒子数と1細胞当たりの輝度の経時変化を示す。図1から、1細胞当たりの輝度は、組織切片の作製から時間が経過するにつれて次第に減少しているが、1細胞当たりの粒子数は、組織切片作製後90日後も安定した数値を示すことがわかる。すなわち、各粒子が発する蛍光輝度は次第に減少するが、組織切片に存在するバイオマーカーと結合した粒子の数は変化しない。したがって、1細胞当たりの粒子数の差に基づいてバイオマーカーの発現レベルを定量的に評価することで、より安定した評価結果を得ることができる。[実験結果D]次に、蛍光物質集積粒子や量子ドットを用いて染色した場合と蛍光色素単体を用いた場合とを比較した。蛍光色素単体を用いた場合の例として、Cy5、テトラメチルローダミンに抗ヒトER抗体を結合させたものを用い、手順3と同様の方法で組織アレイスライドを染色し、手順4と同様の方法で組織アレイスライド中の8スポットについて、各60細胞に含まれる輝点の数と各輝点の輝度を計測した。次いで、実験結果Bと同様の方法で、1細胞当たりの粒子数を算出した。表7に、Cy5集積シリカナノ粒子、テトラメチルローダミン集積シリカナノ粒子、QD655、Cy5、テトラメチルローダミンのそれぞれを用いた場合の、各スポットでの1細胞当たりの粒子数を示す。表7において、-は、バックグラウンドレベル以上の発光がないことを示し、は、バックグラウンドレベル以上の発光はあるが、輝点の判定はできないことを示している。表7から、蛍光色素単体での組織染色では、バイオマーカーに対する輝点レベルでの定量評価が不可能であることがわかる。以上説明したように、組織切片から計測された蛍光輝点の数に基づいて、生体物質の発現レベルを評価するので、生体物質の定量評価において、安定した評価結果を得ることができる。また、蛍光物質を複数集積した蛍光物質集積粒子を用いることにより、蛍光観察時の1粒子当たりの輝度が高くなるため、微量の生体物質を感度良く、定量的に検出することができる。[蛍光物質内包ナノ粒子a~fの合成][合成例1:蛍光有機色素内包シリカ:Cy5内包シリカナノ粒子の合成]下記工程1~4の方法により、ナノ粒子aを作製した。工程1:Cy5のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製1mg0.00126mmolとテトラエトキシシラン400μL1.796mmolとを混合した。工程2:エタノール40mL、14アンモニア水10mLを混合した。工程3:工程2で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程1で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程4:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。得られたシリカナノ粒子aの走査型電子顕微鏡SEM;日立社製S-800型観察を行ったところ、平均粒径は110nm、変動係数は12であった。[合成例2:蛍光有機色素内包シリカ:TAMRA内包シリカナノ粒子の合成]下記工程1~4の方法により、ナノ粒子bを作製した。工程1:TAMRAのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製2mg0.00126mmolとテトラエトキシシラン400μL1.796mmolとを混合した。工程2:エタノール40mL、14アンモニア水10mLを混合した。工程3:工程2で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程1で調製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程4:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。得られたシリカナノ粒子bの走査型電子顕微鏡SEM;日立社製S-800型観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は15であった。[合成例3:量子ドット内包シリカ:発光波長655nmのCdSe/ZnS内包シリカナノ粒子の合成]下記工程1~4の方法により、ナノ粒子cを作製した。工程1:CdSeZnSデカン分散液インビトロジェン社Qdot65510μLとテトラエトキシシラン40μLとを混合した。工程2:エタノール4mL、14アンモニア水1mLを混合した。工程3:工程2で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程1で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程4:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。得られたシリカナノ粒子cのSEM観察を行ったところ、平均粒径は130nm、変動係数は13であった。[合成例4:量子ドット内包シリカ:発光波長585nmのCdSe/ZnS内包シリカナノ粒子の合成]下記工程1~4の方法により、ナノ粒子dを作製した。工程1:CdSe/ZnSデカン分散液インビトロジェン社Qdot58510μLとテトラエトキシシラン40μLとを混合した。工程2:エタノール4mL、14アンモニア水1mLを混合した。工程3:工程2で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程1で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程4:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。得られたシリカナノ粒子dのSEM観察を行ったところ、平均粒径は120nm、変動係数は12であった。[合成例5:蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子:Cy5内包ポリスチレンナノ粒子の合成]下記工程1~3の方法により、ナノ粒子eを作製した。工程1:Cy5のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製1mg0.00126mmolを、ジクロロメタン60μL、エタノール120μLに溶解させた。工程2:表面官能基アミノ基で粒径100nmポリスチレンナノ粒子水分散液micromod社製1.5mLを激しく撹拌しているところに、工程1で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程3:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。得られたポリスチレンナノ粒子eのSEM観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は5であった。[合成例6:蛍光有機内包ポリスチレンナノ粒子:TAMRA内包ポリスチレンナノ粒子の合成]下記工程1~3の方法により、ナノ粒子fを作製した。工程1:TAMRAのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製2mg0.00126mmolを、ジクロロメタン60μL、エタノール120μLに溶解させた。工程2:表面官能基アミノ基で粒径100nmポリスチレンナノ粒子水分散液micromod社製1.5mLを激しく撹拌しているところに、工程1で作製した混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。工程3:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。得られたポリスチレンナノ粒子fのSEM観察を行ったところ、平均粒径は100nm、変動係数は6であった。[蛍光物質内包シリカナノ粒子への抗体の結合]蛍光物質内包シリカナノ粒子a~dに対し、以下の手順により抗体結合を行った。詳しくは、ナノ粒子a,cに対して工程1~7,工程8~9,工程12~14の操作をおこなって抗体を結合し粒子A,Cを形成し、ナノ粒子b,dに対して工程1~7,工程10~11,工程15~17の操作をおこなって抗体を結合し粒子B,Dを形成した。工程1:1mgのナノ粒子a~dを純水5mLに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。工程2:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。工程3:エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を1回ずつ行った。得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子a~dのFT-IR測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。工程4:工程3で得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子a~dを、EDTAエチレンジアミン四酢酸を2mM含有したPBSリン酸緩衝液生理的食塩水を用いて3nMに調整した。工程5:工程4で調整した溶液に最終濃度10mMとなるようSMPEG12サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[N-maleomidopropionamid-dodecaethyleneglycol]esterを混合し、1時間反応させた。工程6:反応混合液を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した。工程7:EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLPBSを用い再分散させた。工程8:100μgの抗ヒトER抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程9:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗ヒトER抗体溶液を得た。工程10:100μgの抗HER2抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程11:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。工程12:粒子aまたは粒子cを出発原料にして、工程7で得られた粒子分散液と工程9で得られた還元化抗ヒトER抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。工程13:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程14:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用い再分散させ、抗ヒトER抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Aおよび粒子Cを得た。工程15:粒子bまたは粒子dを出発原料にして、工程7で得られた粒子分散液と工程11で得られた還元化抗HER2抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。工程16:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程17:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用い再分散させ、抗HER2抗体結合した蛍光物質内包シリカナノ粒子Bおよび粒子Dを得た。[蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子への抗体の結合]蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子e,fに対し、以下の手順により抗体結合を行った。詳しくは、ナノ粒子eに対して工程1~2,工程5~7の操作をおこなって抗体を結合し粒子Eを形成し、ナノ粒子fに対して工程3~4,工程8~10の操作をおこなって抗体を結合し粒子Fを形成した。工程1:100μgの抗ヒトER抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程2:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗ヒトER抗体溶液を得た。工程3:100μgの抗HER2抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程4:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。工程5:粒子eの分散液と工程2で得られた還元化抗ヒトER抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。工程6:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程7:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用い再分散させ、抗ヒトER抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Eを得た。工程8:粒子fの分散液と工程4で得られた還元化抗ヒトHER2抗体溶液とをPBS中で混合し、1時間反応させた。工程9:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程10:反応混合物を10000gで60分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、EDTAを2mM含有したPBSを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を3回行った。最後に500μLのPBSを用い再分散させ、抗HER2抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子Fを得た。[蛍光物質への抗体結合]比較として、抗ヒトER抗体をCy5に結合させた色素Gと、抗HER2抗体をTAMRAに結合させた色素Hとを、以下の手順により作製した。詳しくは、工程1~2,工程5~6,工程9~11の操作をおこなって色素Gを形成し、工程3~4,工程7~8,工程12~14の操作をおこなって色素Hを形成した。工程1:100μgの抗ヒトER抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程2:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗ヒトER抗体溶液を得た。工程3:100μgの抗HER2抗体を100μLのPBSに溶解させたところに、1MジチオスレイトールDTTを添加し、30分反応させた。工程4:反応混合物についてゲルろ過カラムにより過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。工程5:Cy5のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製1mg0.00126mmolを、EDTAエチレンジアミン四酢酸を2mM含有したPBSリン酸緩衝液生理的食塩水を用いて3nMに調整した。工程6:工程5で調整した溶液に最終濃度10mMとなるようSMPEG12サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[N-maleomidopropionamid-dodecaethyleneglycol]esterを混合し、1時間反応させた。工程7:TAMRAのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体GEヘルスケア社製2mg0.00126mmolを、EDTAエチレンジアミン四酢酸を2mM含有したPBSリン酸緩衝液生理的食塩水を用いて3nMに調整した。工程8:工程7で調整した溶液に最終濃度10mMとなるようSMPEG12サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl-[N-maleomidopropionamid-dodecaethyleneglycol]esterを混合し、1時間反応させた。工程9:工程6で得られた反応混合物に、工程2で得られた還元化抗ヒトER抗体溶液をPBS中で混合し、1時間反応させた。工程10:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程11:ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、Cy5結合した還元化抗ER2抗体溶液色素Gを得た。工程12:工程6で得られた反応混合物に工程4で得られた還元化抗HER2抗体溶液をPBS中で混合し、1時間反応させた。工程13:10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。工程14:ゲルろ過カラムにより過剰のメルカプトエタノールを除去し、TAMRA結合した還元化抗HER2抗体溶液色素Hを得た。以上の処理により形成した粒子A~F,色素G~Hの特性を表8に示す。[評価実験:1粒子A~F,色素G~Hを用いた組織染色]作製した粒子A~F,色素G~Hを用いてヒト乳房組織の免疫染色を行った。染色切片はコスモバイオ社製の組織アレイスライドCBA712を用いた。あらかじめDAB染色によりERおよびHER2染色濃度を観察し、1ER発現量が高くてHER2発現量も高い、2ER発現量が高くてHER2発現量が低い、3ER発現量が低くてHER2発現量も低い異なる3種のロットを用意し、それぞれ染色を行った。1:キシレンを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回キシレンを交換した。2:エタノールを入れた容器に病理切片を30分浸漬させた。途中3回エタノールを交換した。3:水を入れた容器に、病理切片を30分浸漬させた。途中3回水を交換した。4:10mMクエン酸緩衝液pH60に病理切片を30分浸漬させた。5:121°Cで10分オートクレーブ処理を行った。6:PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分浸漬させた。7:1BSA含有PBSを組織に載せて、1時間放置した。8:1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗ヒトER抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子A10μLと、1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子B10μLとを混合し、組織に載せて3時間放置した。9:1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗ヒトER抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子C10μLと、1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子D10μLとを混合し、8とは別なスライドの組織に載せて3時間放置した。10:1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗ヒトER抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子E10μLと、1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体結合した蛍光体内包ナノ粒子F10μLとを混合し、8および9とは別なスライドの組織に載せて3時間放置した。11:1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗ヒトER抗体結合した色素G10μLと、1BSA含有PBSで0.05nMに希釈した抗HER2抗体結合した色素H10μLとを混合し、8~10とは別なスライドの組織に載せて3時間放置した。12:PBSを入れた容器に、染色後の切片をそれぞれ30分浸漬させた。13:MerckChemicals社製Aquatexを滴下後、カバーガラスを載せ封入した。[評価実験:2粒子A~F,色素G~Hを用いて染色した組織の輝点計測]染色した組織切片に励起光を照射して蛍光発光させ、その組織切片からオリンパス社製DSU共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ジーオンオングストロング社製輝点計測ソフト、G-countを用いて輝点数および発光輝度を計測した。Cy5およびQdot655については、励起波長633nm、検出波長660nmとした。TAMRAおよびQdot585については、励起波長543nm、検出波長580nmとして観察を行った。輝点数は、組織アレイスライド中の8スポットについて各30細胞の輝点を計測し、その平均値を求めた。発光輝度は、8スポットそれぞれについて視野全体の蛍光強度を合算し、その平均値を求めた。表9,表10に、3種のロットと粒子A~F,色素G~Hの組合せとに応じた実験例1~7における輝点数および発光輝度の計測結果を示す。表9から、蛍光有機色素を単独で抗体に結合した実験例4では、蛍光強度が弱くバックグランド光と区別がつかず、標的とする生体物質が検出できなかった。これに対し、蛍光物質内包粒子を用いた実験例1~3では、蛍光強度が高く、標的とする生体物質の検出が容易に可能となった。表10から、ER2およびHER2の発現量の異なる切片を用いた実験例5~7では、それぞれの発現量に応じて輝点数および蛍光強度が変化しており、蛍光物質,生体物質認識部位が互いに異なる粒子を染色試薬として使用すれば、複数の生体物質の発現レベルを同一切片で計測できることがわかった。"