"配列番号161718のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAbTNV148の重鎖相補性決定領域123および配列番号222324のアミノ酸配列をそれぞれ有するmAbTNV148の軽鎖CDR123を含む抗体。請求項1記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。請求項2記載の核酸分子を含む組換えベクター。請求項2記載の核酸分子または請求項3記載のベクターを含む宿主細胞。請求項1記載の抗体、および医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。請求項1記載の抗体を含む、診断用または治療用組成物。免疫関連疾患治療用の請求項6記載の組成物。実施例1:哺乳動物細胞中でのTNF抗体のクローニングおよび発現典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介する少なくとも1つのプロモーター要素、抗体コード配列および転写の終結および転写物のポリアデニレーションに必要なシグナルを含む。さらなる要素にはエンハンサー、Kozak配列およびRNAスプライシングのための供与および受容部位により挟まれた介在配列を含む。高度に効率的な転写はSV40に由来する初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIに由来する長い末端反復配列LTRS、およびサイトメガロウイルスCMVの初期プロモーターにより達成され得る。しかし細胞要素例えばヒトアクチンプロモーターも使用することができる。本発明を実施するために適当な発現ベクターには、例えばpIRES1neo、pRetroOff、pRetroOn、PLXSNまたはpLNCXクローンテックラボズ、pcDNAZeoまたはpcDNA31HygroインビトロゲンInvitrogen、PSVLおよびPMSGファルマシア、ウプサラ、スウェーデン、pRSVcatおよびpBC12MIを含む。使用できた哺乳動物宿主細胞には、ヒトHela293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、quailQC13細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞を含む。あるいは遺伝子は染色体に組み込まれた遺伝子を含む安定な細胞系で発現させることができる。dhfr、gpt、ネオマイシンまたはヒグロマイシンのような選択可能なマーカーを用いたコートランスフェクションcotransfectionにより、トランスフェクトした細胞の同定および単離が可能となる。トランスフェクトした遺伝子は、大量のコードされた抗体を発現させるために増幅することもできる。DHFRジヒドロ葉酸レダクターゼマーカーは、数百またはさらに数千の目的遺伝子のコピーを持つ細胞系の開発するために有用である。別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼGSBebbingtonetalBioTechnology10169175である。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地で成長させ、そして最高の耐性を持つ細胞を選択する。これらの細胞系は、染色体に組み込まれた増幅した遺伝子1つまたは複数を含む。チャイニーズハムスター卵巣CHOおよびNSO細胞は、抗体の生産によく使用される。発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスCullenetalMolecCellBiol5438447の強力なプロモーターLTRに加えてCMVエンハンサーのフラグメントBoshartetalCell41521530を含む。多クローニング部位例えば制限酵素開裂部位であるBamHI、XbaIおよびAsp718を含むは、目的遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターは3イントロンに加えて、ラットのプレプロインスリン遺伝子のポリアデニレーションおよび終結シグナルを含む。CHO細胞中でのクローニングおよび発現ベクターpC4をTNF抗体の発現に使用する。プラスミドpC4は、プラスミドpSV2dhfrATCC寄託番号37146の誘導体である。プラスミドはマウスDHFR遺伝子をSV40初期プロモーターの制御下に含む。これらのプラスミドでトランスフェクトしたジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣-または他の細胞は、細胞を化学療法剤であるメトトレキセートを補充した選択培地例えばアルファマイナスMEM、ライフテクノロジーズLifeTechnologies、ゲチスバーグ、メリーランド州中で成長させることにより選択することができる。メトトレキセートMTXに対して耐性の細胞中のDHFR遺伝子の増幅が十分に示された例えば、FWAltetalJBiolChem25313571370JLHamlinandCMaBiochemetBiophysActa1097107143およびMJPageandMASydenhamBiotechnology96468を参照にされたい。MTXの濃度を上昇させて成長させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として目的酵素であるDHFRの過剰生産により薬剤への耐性を生じる。第2遺伝子がDHFR遺伝子に連結されている場合、これは通常、同時に増幅されcoamplified、そして過剰に発現される。当該技術分野では、この取り組みが1000コピー以上の増幅した遺伝子1つまたは複数を持つ細胞系を発生するために使用できることが知られている。続いてメトトレキセートを離脱する時、宿主細胞の1以上の染色体1つまたは複数に組み込まれた増幅された遺伝子を含む細胞系が得られる。プラスミドpC4は目的遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスCullenetalMolecCellBiol5438447の長い末端反復配列の強力なプロモーターLTRに加えて、ヒトサイトメガロウイルスCMVの前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントBoshartetalCell41521530を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能とするBamHI、XbaIおよびAsp718制限酵素開裂部位である。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドはラットのプレプロインスリン遺伝子の3イントロンおよびポリアデニレーション部位を含む。他の高効率プロモーター、例えばヒトbアクチンプロモーター、SV40初期および後期プロモーターまたは他のレトロウイルス例えばHIVおよびHTLVIに由来する長い末端反復配列も発現に使用することができる。クローンテックのTetOffおよびTetOn遺伝子発現系および同様な系は、哺乳動物細胞中で調節された様式でTNFを発現させるために使用できるMGossenandHBujardProcNatlAcadSciUSA8955475551。mRNAのポリアデニレーションには、他のシグナル、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子に由来するシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を持つ安定な細胞系は、gpt、G418またはヒグロマイシンのような選択可能マーカーを用いたコトランスフェクションでも選択できる。始めに1より多くの選択可能なマーカーを例えばG418に加えてメトトレキセート使用することが有利である。プラスミドpC4は制限酵素で消化し、そして次いでウシの腸ホステァターゼを使用して既知の手法により脱リン酸化される。次いでベクターは1アガロースゲルから単離される。単離された可変および定常領域をコードするDNAおよび脱リン酸化ベクターは、次いでT4DNAリガーゼで連結される。大腸菌EcoliHB101またはXL1ブルー細胞を形質転換し、そして細菌が例えば制限酵素分析を使用してプラスミドpC4中に挿入されたフラグメントを含むことを確認する。活性なDHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞をトランスフェクションに使用する。5gの発現プラスミドpC4を05gのプラスミドpSV2neoを用いてリポフェクチンを使用してコトランスフェクトする。プラスミドpSV2neoは、G418を含む抗生物質群に対して耐性を付与する酵素をコードするTn5に由来する優性選択性マーカーであるneo遺伝子を含む。この細胞を、1gmlのG418を補足したアルファマイナスMEMにまく。2日後、細胞をトリプシン処理し、そして10、25または50ngmlのメトトレキセートに加えて1gmlのG418を補足したハイブリドーマクローニングプレートグレイナーGreiner、独国アルファマイナスMEM中にまく。約10~14日後、1つのクローンをトリプシン処理し、そして異なる濃度のメトトレキセート50nM、100nM、200nM、400nM、800nMを使用して6ウェルのペトリ皿または10mlのフラスコにまく。最高濃度のメトトレキセートで成長させたクローンを、さらにより高濃度のメトトレキセート1mM、2mM、5mM、10mM、20mMを含む新たな6ウェルプレートに移す。100~200mM濃度で成長するクローンが得られるまで、同じ手順を繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を例えばSDSPAGEおよびウエスタンブロットにより、または逆相HPLC分析により分析する。実施例2:トランスジェニックマウスを使用したヒトTNFに反応性の高親和性ヒトIgGモノクローナル抗体の生成要約ヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを使用して、1以上のTNF媒介疾患を処置するためにTNFの作用を治療的に阻害するために使用できる高親和性の完全にヒトのモノクローナル抗体を生成した。重および軽鎖の両方のヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含むCBAJxC57BL6JF2ハイブリッドマウスを、ヒト組換えTNFで免疫感作するTayloretalIntlImmunol6579591LonbergetalNature368856859NeubergerMNatureBiotech14826FishwildetalNatureBiotechnology14845851。幾つかの融合物が完全なヒトTNF反応性IgGモノクローナル抗体の1以上のパネルを生じた。完全なヒト抗TNF抗体をさらに特徴つける。すべてがIgG1である。そのような抗体は1×109から9×1012の間あたりの親和性定数を有することがわかる。これらの完全なヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、TNF関連疾患、病理または障害における治療的応用に適する候補となる。略号BSA-ウシ血清アルブミンCO2-二酸化炭素DMSO-ジメチルスルフォキシドEIA-酵素イムノアッセイFBS-ウシ胎児血清H2O2-過酸化水素HRP-西洋ワサビペルオキシダーゼID-皮内Ig-免疫グロブリンTNF-組織壊死因子アルファIP-腹腔内IV-静脈内Mab-モノクローナル抗体OD-光学密度OPD-oフェニレンジアミンジヒドロクロライドPEG-ポリエチレングリコールRSA-ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンRT-室温SQ-皮下vv-容量あたりの容量wv-容量あたりの重量材料および方法動物ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスIgMまたはIgを発現しない、ヒト抗体を発現できるトランスジェニックマウスは当該技術分野では知られており、そして市販されている例えば、ジェンファームインターナショナル、サンジョーズ、カリフォルニア州;アビジェニックスJ連結、重鎖クラススイッチ、および免疫グロブリンのヒト配列のレパートリーを生成する体性の突然変異を受けるヒト配列導入遺伝子を含むLonbergetalNature368856859。軽鎖導入遺伝子は、例えば一部は生殖細胞系ヒトV領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来することができる。加えて、重鎖導入遺伝子はヒトμおよびヒト1および/または3定常領域の両方をコードすることができる。適当な遺伝子系統に由来するマウスを免疫感作および融合法に使用して、TNFに対する完全なヒトモノクローナル抗体を生成することができる。免疫感作1以上の免疫感作スケジュールを使用して、抗TNFヒトハイブリドーマを作成することができる。例示的な免疫感作プロトコールにしたがった後、最初に幾つかの融合を行うことができるが、他の類似の既知のプロトコールを使用することもできる。数匹の14~20週齢のメスおよび/または外科的に精巣を除去したトランスジェニック体のオスのマウスを、100~400μl例えば200の最終容量中に等容量のTITERMAXまたは完全フロインドアジュバントで乳化した1~1000μgの組換えヒトTNFを用いてIPおよび/またはIDで免疫感作する。各マウスは場合により1~10μg100μLの生理食塩水中を2つの各SQ部位に受容することができる。マウスは1~7、5~12、10~18、17~25および/または21~34日後にIP1~400μgおよびSQ1~400μg×2で、等容量のTITERMAXまたは不完全フロインドアジュバントで乳化したTNFを免疫感作することができる。マウスは12~25および25~40日後に、後-眼窩穿刺により抗凝固剤無しで採血することができる。次いで血液をRTで1時間凝固させ、そして血清を集め、そしてTNFELISAアッセイを使用して既知の方法に従い滴定する。融合は反復注射が力価の上昇を引き起こさない時に行う。その時点で、マウスには100μLの生理食塩水中に希釈した1~400μgのTNFの最後のIV追加注射を与えることができる。3日後、マウスは頸部転位により屠殺し、そして脾臓を無菌的に摘出し、そして100UmLのペニシリン、100μgmLのストレプトマイシンおよび025μgmLのアンホテリシンBPSAを含む10mLの冷リン酸緩衝化生理食塩水を含有する105mLのRPMI1640培地を1分間にわたりゆっくりと加えることにより停止することができる。融合した細胞を500~1500rpmで5分間遠心する。次いで細胞をHAT培地25mMHepes、10胎児クローンI血清、1mMピルビン酸ナトリウム、4mMLグルタミン、10μgmLゲンタマイシン、25オリジェンOrigen培養補給物フィッシャーFisher、10653コンディショニングRPMI1640Hepes培地、50μM2メルカプトエタノール、100μMヒポキサンチン、04μMアミノプテリンおよび16μMチミジンに再懸濁し、そして次いで200μLウェルで15個の96ウェルの平底組織培養プレートにまく。次いでプレートは5CO2および95空気を含む37Cの加湿インキューベーター中に7~10日間、置く。マウス血清中のヒトIgG抗TNF抗体の検出固相EIAsを使用して、ヒトTNFに特異的なヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングすることができる。簡単に説明すると、プレートを2μgmLのTNFで一晩コートすることができる。002のTween20を含む015Mの塩水で洗浄した後、ウェルを1BSAカルボジイミドヒドロクロライドの溶液200μLの水中を100μLの23mgNHSの溶液200μLの水中に加える。40μLの生成した溶液をチップに注入する。6μLのヒトTNF溶液10mM酢酸ナトリウム、pH48中の15μgmLをチップに注入し、約500RUの上昇を生じる。バッファーをTBSCaMgBSAラニングバッファーに変え、そしてチップを平衡化し、そして任意の未反応スクシンイミドエステルを加水分解またはキャップするためにチップ上に一晩流す。抗体をラニングバッファーに3333、1667、833および417nMで溶解する。流速は30μL分、そして装置温度は25°Cに調整する。2つのフローセルを動力学実験に使用し、1つにはTNFが固定化されサンプル、そして2つ目は非誘導化フローセルブランクである。各濃度の抗体120μLをフローセルに30μL分で注入し結合相、続いて連続した360秒間のバッファー流を注入する。チップの表面は、30μLの各2Mグアニジンチオシアネートを2回連続して注入することにより再生する組織壊死因子アルファ/抗体複合体の解離。データの分析は、当該技術分野で既知のBIA評価30またはCLAMP20を使用して行う。各抗体濃度について、ブランクのセンソグラムsensogramをサンプルのセンソグラムから引く。全体的な適合は、解離Kd、sec1および結合Ka、mol1sec1について行い、そして解離定数KD、molを算出するkd/ka。捕捉された抗体のRUが>100であるほど抗体の親和性が十分に高い場合、さらに抗体を希釈して実験する。結果および考察抗ヒトTNFモノクローナル抗体の生成幾つかの融合を行い、そして各融合は15プレート1440ウェル/融合にまいて、ヒトTNFに特異的な数ダースの抗体を得る。もちろん中にはヒトおよびマウスIg鎖の組み合わせから成るものもある。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖および軽鎖のみから成る抗TNF抗体を分泌する。ヒトのハイブリドーマはすべて、IgG1になると予想される。ヒト抗ヒトTNF抗体の結合動力学ELISA分析では、これらのほとんどのハイブリドーマに由来する精製抗体が濃度依存的様式でTNFに結合することを確認する。図1~2は、これら抗体の相対的結合効率の結果を示す。この場合、抗体のそのコグネイト抗原エピトープに関するアビディティを測定する。EIAプレートへのTNFの直接結合はタンパク質の変性を引き起こし、そして外見上の結合親和性は非変性タンパク質に対する結合を反映できないことに注目すべきである。50の結合が1つの濃度範囲で見られる。定量的な結合定数はヒト抗体のBIAcore分析を使用して得、そして幾つかのヒトモノクローナル抗体が1×109~7×1012の範囲のKDの高い親和性であることが明らかである。結論幾つかの融合は、ヒトTNFを免疫感作したヒト可変およびヒト定常領域抗体の導入遺伝子を含むハイブリッドマウスの脾臓細胞を使用して行う。数セットの完全なヒトTNF反応性IgGモノクローナル抗体IgG1アイソタイプを生成する。完全なヒト抗TNF抗体をさらに特性決定する。幾つかの生成した抗体は、1×109から9×1012の間の親和定数を有する。予期せずに、これら完全なヒトモノクローナル抗体の高親和性により、それらはTNF依存性疾患、病理または関連状態における治療的応用に適するようになる。実施例2:ヒトTNF∀に反応性のヒトIgGモノクローナル抗体の生成要約重および軽鎖に関するヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含むF2ハイブリッドマウスは、組換えヒトTNF∀で免疫感作した。GenTNVと命名された1つ融合体は、固定化した組換えヒトTNFαに結合する8つの全部のヒトIgG1κモノクローナル抗体を生じた。同定してからすぐに、8つの細胞系をさらに特性決定するために分子生物学へ移した。これらのMabは配列が全部ヒトであるので、cA2Remicadeよりはヒト対する免疫原性が低いと予想される。略号BSA-ウシ血清アルブミンCO2-二酸化炭素DMSO-ジメチルスルフォキシドEIA-酵素イムノアッセイFBS-ウシ胎児血清H2O2-過酸化水素HC-重鎖HRP-西洋ワサビペルオキシダーゼIg-免疫グロブリンIP-腹腔内IV-静脈内Mab-モノクローナル抗体OD-光学密度OPD-oフェニレンジアミンジヒドロクロライドPEG-ポリエチレングリコールRSA-ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンRT-室温SQ-皮下TNF∀-腫瘍壊死因子アルファvv-容量あたりの容量wv-容量あたりの重量はじめにヒトの重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを使用して、組換えヒトTNF∀に特異的な全部がヒトのモノクローナル抗体を生成した。cA2RemicadeがTNF∀が媒介する疾患に関与する炎症プロセスを治療的に阻害するために使用されるように、これらの独自な抗体は血清半減期を上げ、そして免疫原性に関連する副作用を下げて使用できることが期待される。材料および方法動物ヒト免疫グロブリンを発現するがマウスIgMまたはIgκを発現しないトランスジェニックマウスは、ジェンファームインターナショナルにより開発された。これらのマウスは、VJ連結、重鎖クラススイッチ、および抗原-特異的なヒトの免疫グロブリンのレパートリーを生成する体性の突然変異を受ける機能的なヒト抗体導入遺伝子を含む1。軽鎖導入遺伝子は、一部は生殖細胞系ヒトVκ座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。幾つかのVH遺伝子に加えて、重鎖HC導入遺伝子はヒトμおよびヒトγ1および/またはγ3定常領域の両方をコードする。HCo12KCo5遺伝子型系統に由来するマウスを、ここに記載するモノクローナル抗体を生成するための免疫感作および融合法に使用した。ヒトTNF∀の精製ヒトTNF∀はC237A細胞に由来する組織培養上清からアフィニティークロマトグラフィーにより、Sepharose4BファルマシアにカップリングしたTNF∀受容体-Fc融合タンパク質p55sf2を充填したカラムを使用して精製した。細胞上清はその19容量の10×ダルベッコのPBSDPBSと混合し、そして4°Cで4mL分でカラムに通した。次いでカラムをPBSで洗浄し、そしてTNF∀を01Mクエン酸ナトリウム、pH35で溶出し、そして2MTrisHCl、pH85で中和した。精製したTNF∀は10mMTris、012M塩化ナトリウムpH75にバッファーを変え、そして02μmのシリンジフィルターを通して濾過した。免疫感作メスのGenPharmマウス約16週齢は、0、12および28日に等容量のTitermaxアジュバントで乳化した100μgのTNF∀に51497に受けた。細胞系は、10FBSセルカルチャーラボズ;CellCultureLabs、1mMピルビン酸ナトリウム、01mMNEAA、2mMLグルタミンすべてJRHバイオサイエンスBioscienceからを補充したRPMI培地JRHBiosciencesで拡大し、そして95FBSおよび5DMSOシグマ中で寒冷保存し、そしてCBS中で蒸気相液体窒素フリザー中で保存した。細胞バンクは滅菌状態でありクオリティコントロールセントコールQualityControlCentocor、マルベランMalvern、そしてマイコプラズマを含まなかったバイオユニークラボラトリーズ。細胞バンクは滅菌状態でありクオリティコントロールセントコール、マルベラン、そしてマイコプラズマを含まなかったバイオユニークラボラトリーズ。細胞融合細胞融合は、11比率の653マウスミエローマ細胞および生きているマウス脾臓細胞を使用して行った。簡単に説明すると、脾臓細胞およびミエローマ細胞を一緒にペレットとした。次にペレットをゆっくりと30秒間にわたり、1mLの50を1分間にわたりゆっくりと加えることにより停止した。融合した細胞を750rpmで5分間遠心した。次いで細胞をHAT培地10ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMLグルタミン、10μgmLゲンタマイシン、25オリジェンOrigen培養補給物フィッシャー、50μM2メルカプトエタノール、1653コンディショニングRPMI培地、100μMヒポキサンチン、04μMアミノプテリンおよび16μMチミジンを含むRPMIHEPES培地に再懸濁し、そして次いで200μLウェルで5個の96ウェルの平底組織培養プレートにまいた。次いでプレートは5CO2および95空気を含む37°Cの加湿インキューベーター中に7~10日間、置いた。マウス血清中のヒトIgG抗TNF∀抗体の検出固相EIAsを使用して、ヒトTNF∀に特異的なヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングした。簡単に説明すると、プレートを1μgmLのTNF∀PBS中で一晩コートした。002容量/容量のTween20を含む015Mの塩水で洗浄した後、ウェルを1重量/容量BSA、200μL/ウェルでRTにて1時間ブロックした。プレートは直ちに使用したか、または使用するまで-20°Cで凍結した。マウス血清は、ヒトTNF∀をコートしたプレート上に50μLウェルで2倍の連続希釈でRTにて1時間インキューベーションした。プレートを洗浄し、そして次いで130000に希釈した1BSAPBS中50μLウェルのHRP標識ヤギ抗ヒトIgG、Fc特異的アキュレートAccurateでRTにて1時間、釣り上げた。再度プレートを洗浄し、そして100μL/ウェルのクエン酸リン酸基質溶液01Mクエン酸および02Mリン酸ナトリウム、001H2O2および1mgmLOPDをRTで15分間加えた。次いで停止溶液4N硫酸を25μLウェルで加え、そしてODは490nmで自動化プレート分光光度計を介して読んだ。ハイブリドーマ上清中の全部ヒトの免疫グロブリンの検出GenPharmマウスはマウスおよびヒト免疫グロブリン鎖の両方を生産することができるので、2つの別個のEIAアッセイを使用して、ヒト軽鎖およびヒト重鎖の両方の存在について成長陽性ハイブリドーマクローンを試験した。プレートは上記のようにコートし、そして希釈していないハイブリドーマ上清を37°Cで1時間プレート上でインキューベーションした。プレートを洗浄し、そしてHRP結合ヤギ抗ヒトカッパサザンバイオテックSouthernBiotech抗体1BSAHBSS中で110000に希釈またはHRP結合ヤギ抗ヒトIgGFc特異的抗体1BSAHBSS中で130000に希釈で37°Cにて1時間、釣り上げた。次いでプレートを基質溶液と上記のようにインキューベーションした。抗ヒトカッパおよび抗ヒトIgGFcEIA形式の両方で陽性のシグナルを与えなかったハイブリドーマクローンは捨てた。アイソタイピング抗体のアイソタイプの決定は、特異的力価についてマウス免疫血清をスクリーニングするために使用したものと同じ形式のEIAを使用して行った。EIAプレートは上記のようにヤギ抗-ヒトIgGHLを10gml炭酸ナトリウムバッファー中で4ECにて一晩コートし、そしてブロックした。24ウェルカルチャーからのそのままの上清をプレート上でRTにて1時間インキューベーションした。プレートを洗浄し、そして14000で1BSAPBSに希釈したHRP標識ヤギ抗ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4バインディングサイトBindingSiteでRTにて1時間、釣り上げた。プレートを再度洗浄し、そして基質溶液と上記のようにインキューベーションした。結果および考察全部がヒトの抗ヒトTNF∀モノクローナル抗体の生成GenTNVという名の1つの融合を、組換えヒトTNF∀タンパク質で免疫感作したジェンファームのマウスから行った。この融合から196個の成長陽性ハイブリドーマがスクリーニングされた。ヒトTNF∀と反応性の全部がヒトのIgG抗体を分泌した8個のハイブリドーマ細胞系を同定した。これらの8個の細胞系は各々が、ヒトIgG1κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、そしてすべてが限定希釈により2回サブクローン化されて、安定な細胞系>90均一を得た。細胞系の名前および各々のCコード表示は、表1に与える。各細胞系は、12バイアルの研究細胞バンクで液体窒素中にて凍結された。各8つの細胞系について24ウェルの培養皿のウェルから集めた元の細胞を、トランスフェクションおよびさらなる特性決定のために分子生物学グループに21899に渡した。結論GenTNV融合は、セントコールで調製した組換えヒトTNF∀で免疫感作したヒト可変およびヒト定常領域抗体の導入遺伝子を含むハイブリッドマウスの脾臓細胞を使用して行った。8つの全部がヒトのTNF∀反応性IgGモノクローナル抗体IgG1κアイソタイプが生成した。元の細胞系は、さらなる特性決定および開発のために分子生物学グループに移した。これらの新しいヒト抗体の1つが抗炎症に有用であることを示し、Remicadeに比べて免疫原性およびアレルギー性の合併症が低い利点を示すことができる。実施例3:ヒト抗TNV∀抗体を発現する細胞系のクローニングおよび調製要約TNVの名を持つ8つのヒトモノクローナル抗体mAbのパネルは、明らかに高いアビディティで固定化ヒトTNF∀に結合することが分かった。8つのうちの7つのmAbは、組換えTNF受容体に結合するhuTNF∀を効率的に遮断することが示された。7つのmAbをコードするDNAの配列分析により、すべてのmAbがヒトV領域を有することが確認された。DNA配列は、3対のmAbが互いに同一であるので、元の8つのmAbパネルがわずか4種のmAb、TNV14、TNV15、TNV148およびTNV196により表されることも明らかとなった。mAbの推定されるアミノ酸配列およびインビトロTNF∀中和データの結果の分析に基づき、mAbTNV148およびTNV14がさらなる実験に選択された。TNV148重鎖中の75位フレイムワーク3のプロリン残基は、データベースの調査中に同じサブグループの他のヒト抗体中のその位置に見いだせなかったので、部位-特異的DNA突然変異誘発法を行い、既知の生殖細胞系フレイムワークe配列と一致させるためにその位置にセリン残基をコードした。セリン修飾mAbはTNV148Bと命名した。TNV148BおよびTNV14の重鎖および軽鎖可変領域をコードするPCR増幅したDNAを、2000年10月7日に出願した米国特許出願第号明細書引用により全部、本明細書に編入するにIL12抗体、組成物、方法および使用IL12AntibodiesCompositionsMethodsandUsesという表題で開示された、別のヒトmAb12B75の最近クローン化された重および軽鎖遺伝子に基づく新たに調製された発現ベクターにクローン化した。P3X63Ag8653細胞またはSp20Ag14mAbを生産する細胞系について2回のサブクローニングを行ってスクリーニングした。期間にわたる成長曲線およびmAb生産の安定性の評価は、653トランスフェクション体クローンC466DおよびC466Cが約125gmlのrTNV148BmAbをスペントspent培養で安定に生産する一方、Sp20トランスフェクション体17312122は約25gmlのrTNV148BmAbをスペント培養で安定に生産したことを示した。同様の分析で、Sp20-トランスフェクション体クローンC476Aが18gmlのrTNV14をスペント培養で生産したことを示した。はじめにヒトTNV∀-免疫感作Genpharma/MedarexマウスHCo12KCo5遺伝子型に由来する8つのmAbパネルは以前、ヒトTNV∀に結合し、そして全部がヒトのIgG1、カッパアイソタイプを有することが示された。単純な結合アッセイを使用して、本発明の例示的なmAbもTNF∀中和活性を有するのかどうかを、それらが組換えTNF受容体への結合からTNF∀を遮断する能力について評価することにより決定した。いくつかのmAbのこれらの結果、DNA配列結果およびインビトロ特性に基づき、TNV148をさらに特性決定するために選択した。TNV148mAbをコードするDNA配列をクローン化し、適当な定常領域をコードする遺伝子発現ベクターに合うように修飾し、十分に特性が知られた653およびSp20マウスミエローマ細胞に導入し、そして生成したトランスフェクトした細胞系は、サブクローンが元のハイブリドーマ細胞系よりも40倍多いmAbを生産することを確認するまでスクリーニングした。材料および方法試薬および細胞TRIZOL試薬はギブコBRLから購入した。プロティナーゼKは、シグマケミカルカンパニーから得た。逆転写酵素はライフサイエンス社から得た。TaqDNAポリメラーゼはパーキンエルマーシータスから購入した。WizardプラスミドminiprepキットおよびRNaseはプロメガからであった。Optiplateはパッカードから得た。125ヨウ素はアマーシャムAmershamから購入した。カスタムオリゴメクレオチドはキーストーン/バイオソースインターナショナルから購入した。この実験で使用したオリゴヌクレオチド名、確認番号および配列は、表1に示す。表1.TNVmAb遺伝子をクローン化し、工作し、または配列決定するために使用するオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド514sおよびHuHJ6によりコードされるアミノ酸を、配列の上に示す。Mアミノ酸残基は、翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド514sおよびHuHJ6中の下線を付した配列は、それぞれBsiWIおよびBstBI制限部位を記す。HuHJ6中のスラッシュは、エキソン/イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、3-5方向で書くことに注意されたい。653マウスミエローマ細胞の1つの凍結バイアルを得た。このバイアルをその日に解凍し、そしてTフラスコ中でIMDM、5FBS、2mMグルタミン培地で拡大した。これらの細胞は、本明細書に記載するように抗TNFDNAを用いて2~3週間後にトランスフェクトするまで連続培養で維持した。幾らかのカルチャーを解凍日から5日後に回収し、遠心によりペレット化し、そして95FBS、5DMSO中に再懸濁し、30バイアルのアリコートとし、凍結し、そして将来使用するまで保存した。同様にSp20マウスミエローマ細胞の1つの凍結バイアルを得た。このバイアルを解凍し、新たに上記のようにフリーズ-ダウン調製し、そして凍結バイアルをCBCフリーザーボックスAAおよびABに保存した。これらの細胞を解凍し、そして本明細書に記載するようにすべてのSp20トランスフェクションに使用した。受容体に対するTNF結合の阻害に関するアッセイTNVmAbを含むハイブリドーマ細胞上清を使用して、mAbが125I標識TNF∀が組換えTNF受容体融合タンパク質、p55sf2に対する結合を遮断する能力についてアッセイしたScallonetalCytokine7759770。501のp55sf2を05gmlPBS中でOptiplateに加えて37°Cで1時間のインキューベーション中、ウェルをコートした。8つのTNV細胞上清の連続希釈は、PBS01BSAを希釈物として使用して96ウェル丸底プレート中に調製した。抗IL18mAbを含む細胞上清を陰性対照として含め、そしてcA2抗TNFキメラ抗体、Remicade、米国特許第5770198号明細書引用により全部、本明細書に編入するでスパイクした同じ抗IL18上清を、陽性対照として含んだ。125I標識TNF∀58Cig、DShealyを100:1の細胞上清に加えて、5ngmlの最終TNF∀濃度とした。混合物をRTで1時間、プレインキューベーションした。コートしたOptiplateを洗浄して非結合p55sf2を除去し、そして501の125I標識TNF∀/細胞上清混合物をOptiplateに移した。RTで2時間後、OptiplateをPBSTweenで3回洗浄した。1001のMicroscint20を加え、そして結合したcpmをTopCountガンマカウンターを使用して測定した。V遺伝子の増幅およびDNA配列分析ハイブリドーマ細胞はTRIZOL試薬をRNA調製物に加える前にPBSで1回洗浄した。7×106から17×107の間の細胞を1mlのTRIZOに再懸濁した。200μlのクロロホルムを加えた後、試験管を激しく振盪した。サンプルを4°Cで10分間遠心した。水性相を新しいミクロ遠心管に移し、そして等容量のイソプロパノールを加えた。試験管を激しく振盪し、そして室温で10分間インキューベーションした。次いでサンプルを4°Cで10分間遠心した。ペレットを1回、1mlの70エタノールで洗浄し、そして真空乾燥機でかるく乾燥した。RNAペレットを40μlのDEPC処理水に再懸濁した。RNA調製物の品質は1アガロースゲル中で05μlを分画することにより決定した。RNAを-80°Cの冷凍庫で使用するまで保存した。重および軽鎖cDNAを調製するために、3μlのRNAおよび1μgのオリゴヌクレオチド119重鎖またはオリゴヌクレオチド117軽鎖のいずれか表1を参照にされたいを含む混合物を115μlの容量中に調製した。混合物を70°Cで10分間、水浴中でインキューベーションし、そして氷上で10分間冷却した。別の混合物を調製し、これは25μlの10×逆転写酵素バッファー、10μlの25mMdNTPs、1μlの逆転写酵素20単位、および04μlのリボヌクレアーゼインヒビターRNasin1単位から作られた。135μlのこの混合物を115μlの冷却したRNA/オリゴヌクレオチド混合物に加え、そして反応物を42°Cで40分間、インキューベーションした。cDNA合成反応物を-20°Cの冷蔵庫に使用するまで保存した。非精製重および軽鎖cDNAを鋳型として使用して、可変領域コード配列をPCR増幅した。5個のオリゴヌクレオチド対366354、367354、368354、369354、370354、表1を、それらが重鎖DNAの増幅をプライムする能力について同時に試験した。2個のオリゴヌクレオチド対362208および363208を、それらが軽鎖DNAの増幅をプライムする能力について同時に試験した。PCR反応は2単位のPLATIUM高忠実度TaqDNAポリメラーゼを使用して、全50μlの容量で行った各反応物には2μlのcDNA反応物、10pmolの各オリゴヌクレオチド、02mMdTNPs、5μlの10×HIFIバッファーおよび2mMの硫酸マグネシウムを含んだ。熱循環プログラムは95°Cで5分間、続いて30サイクルの94°Cで30秒、62°Cで30秒、68°Cで15分であった。次いで68°Cで10分間の最終インキューベーションであった。直接的なDNAシークエンシング用のPCR産物を調製するために、それらをQIAquick商標PCR精製キットを使用して製造元のプロトコールに従い精製した。DNAは50μlの滅菌水を使用してスピンカラムから溶出し、そして次いで真空乾燥機を使用して10μlの容量に下げた。次いでDNAシークエンシング反応は、1μlの精製PCR産物、10μMのオリゴヌクレオチドプライマー、4μlのBigDyeTerminator即反応ミックスおよび14μlの滅菌水を20μlの全容量に設定した。オリゴヌクレオチド対367354で作成した重鎖PCR産物を、オリゴヌクレオチドプライマー159および360で配列決定した。オリゴヌクレオチド対363208で作成した軽鎖PCR産物は、オリゴヌクレオチド34および163で配列決定した。シークエンシングの熱循環プログラムは、96°Cで30秒、50°Cで15秒、60°Cで4分の25サイクル、続いて4°Cで一晩であった。反応生成物をポリアクリルアミドゲルを通して分画し、そしてABI377DNAシークエンサーを使用して検出した。アミノ酸を変えるための部位特異的突然変異法TNV148mAb中のPro75をセリン残基に置き換えるために、TNV148重鎖可変領域DNA配列中の1つのヌクレオチドを変えた。相補的オリゴヌクレオチド、399および400表1を設計し、そしてこの変化を使用して注文製造元のプロトコールに従い、翻訳開始部位のすぐ上流の独自なBsiWIクローニング部位。生成したプラスミドをp1747と命名した。可変領域の3末端にBstBI部位を導入するために、SalIおよびBstBI部位を持つ5オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このプライマーをpUC逆プライマーと使用して、p1747から275kbフラグメントを増幅した。次いでこのフラグメントを12B75可変領域中の自然に存在するSalI部位およびHindIII部位にクローン化して戻し、これにより独自のBstBI部位を導入した。生成した中間ベクター突然変異誘発法により可変領域の5末端に独自なSalI制限部位を導入した。生成した中間ベクターであるp1746は独自なSalIおよびAflII制限部位を有し、これに可変領域フラグメントをクローン化することができた。p1746にクローン化された任意の可変領域フラグメントは、好ましくは軽鎖遺伝子の3半分に連結された。この目的に使用することができる12B75軽鎖遺伝子の3半分から制限フラグメントを調製するために、オリゴヌクレオチドBAHN1およびBAHN2を互いにアニール化して、制限部位BsiWI、AflII、HindIIIおよびNotIを含み、そしてKpnIおよびSacI部位に連結できる末端を含む2本鎖リンカーを形成した。このリンカーをpBCのKpnIとSacI部位の間にクローン化してプラスミドp1757を得た。AflIIを用いたp1558の消化により生成した12B75軽鎖定常領域を含む71kbのフラグメントをHindIIIで部分消化し、p1757のAflIIおよびHindIII部位の間にクローン化してp1762を得た。この新規プラスミドは、BsiWIおよびAflIIに関する独自な部位を含み、この中にプロモーターおよび可変領域を含むBsiWI/AflIIフラグメントを移して遺伝子の2つの半分をつなげた。cDNAクローニングおよび発現プラスミドの集成すべてのRTPCR反応物上記参照は、クレノー酵素で処理してさらにDNA末端を満たした。重鎖PCRフラグメントを制限酵素BsiWIおよびBstBIで処理し、次いでプラスミドL28のBsiWIとBstBI部位を間にクローン化したL28は12B75に基づく中間ベクターp1750がまだ調製されていなかったので使用した。クローン化した挿入物のDNA配列分析は、生成した構築物が正しく、そしてPCR増幅中に導入された誤りがなかったことを示した。これらのL28プラスミド構築物に割り当てられた確認番号TNV14、TNV15、TNV148、TNV148BおよびTNV196を表2に示す。TNV14、TNV148およびTNV148B重鎖に関するBsiWI/BstBI挿入物はL28ベクターから新たに調製された中間ベクターp1750に移された。これらの中間プラスミドに割り当てられた確認番号を表2に示す。このクローニング工程および続く工程は、TNV15およびTNV196については行わなかった。可変領域を次いで2つの異なるヒトIgG1発現ベクターに移した。制限酵素EcoRIおよびHindIIIを使用して、可変領域をセントコールにより以前に使用したIgGベクターであるp104に移した。GmアロタイプのIgG1をコードする生成した発現プラスミドを、p1781、p1782遺伝子に由来するIgG1定常領域の上流にクローン化した。G1mアロタイプのIgG1をコードするこれらの発現プラスミドも表2に掲げる。表2.種々の重および軽鎖プラスミドのプラスミド確認番号。L28ベクターまたはpBCベクターは、最初のAbcDNAクローンを表す。これらプラスミド中の挿入物を、不完全12B75に基づくベクターに移して中間プラスミドを作成した。さらなる転移工程により直線化された後に細胞に導入されるか、または細胞のトランスフェクション前にmAb遺伝子挿入物を精製するために使用する最終的な発現プラスミドを得た。ND=行わず。軽鎖PCR産物を制限酵素SalIおよびSacIIで消化し、次いでプラスミドpBCのSalIおよびSacII部位の間にクローン化した。1つのアミノ酸が異なる2つの異なる軽鎖変更体を、p1748およびp1749と命名した表2。DNA配列分析では、これらの構築物が正しい配列を有することが確認された。p1748およびp1749のSalI/AflIIフラグメントを、次いで中間ベクターp1746のSalIとAflII部位との間にクローン化して、それぞれp1755およびp1756を作成した。軽鎖遺伝子のこれら5半分は、p1755およびp1756に由来するBsiWI/AflIIフラグメントを新たに調製した構築物p1762に移すことにより、遺伝子の3半分と連結し、最終的な発現プラスミドp1775およびp1776をそれぞれ調製した表2。細胞のトランスフェクション、スクリーニングおよびサブクローニングマウスミエローマ細胞の全部で15のトランスフェクションは、種々のTNV発現プラスミドを用いて行った結果および考察の章の表3を参照にされたい。これらのトランスフェクションは、1宿主細胞がSp20か、または653か;2重鎖定常領域がセントコールの以前のIgG1ベクターまたは12B75重鎖定常領域によりコードされるのか;3mAbがTNV148B、TNV148、TNV14または新たなHCLCの組み合わせか;4DNAが直線化されたプラスミドか、または精製されたAb遺伝子挿入物か;および5重鎖遺伝子中の完全なJCイントロン配列が存在するか、存在しないのかにより分けられた。さらに幾つかのトランスフェクションを繰り返して、多数のクローンをスクリーニングする見込みを上げた。Sp20細胞および653細胞は各々、すでに記載された標準的条件下KnightDMetalMolecularImmunology3014431453でエレクトロポレーションにより重および軽鎖DNA各々8~12gの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクション番号1、2、3および16については、トランスフェクション前に制限酵素での消化により適当な発現プラスミドを直線化した。例えばSalIおよびNotI制限酵素を使用して、それぞれTNV148B重鎖プラスミドp1783および軽鎖プラスミドp1776を直線化した。残りのトランスフェクションについては、mAb遺伝子のみを含むDNA挿入物を、重鎖プラスミドをBamHIで、そして軽鎖プラスミドをBsiWIおよびNotIで消化することによりプラスミドベクターから分離した。次いでmAb遺伝子挿入物は、アガロースゲル電気泳動およびQiex精製樹脂により精製した。精製した遺伝子挿入物によりトランスフェクトした細胞は、選択可能なマーカーの供給源として3~5gのPstI直線化pSV2gptプラスミドp13を用いて同時にトランスフェクションした。エレクトロポレーション後、細胞を96ウェル組織培養皿中のIMDM、15FBS、2mMグルタミンにまき、そして37°Cで5CO2インキューベーター中でインキューベーションした。2日後、等容量のIMDM、5FBS、2mMグルタミン、2×MHX選択1XMHX=05gmlマイコフェノール酸、25gmlヒポキサンチン、50gmlキサンチンを加え、そしてプレートをさらに2~3週間インキューベーションし、この間にコロニーが形成した。コロニーを含むウェルから集めた細胞上清は、記載のようにELISAによりヒトIgGについてアッセイした。簡単に説明すると、希釈を変動させた細胞上清をポリクローナルヤギ抗ヒトIgGFcフラグメントでコートした96ウェルのEIAプレート中でインキューベーションし、そして結合したヒトIgGをアルカリホスファターゼ-結合ヤギ抗ヒトIgGおよび適当な発色基質を使用して検出した。標準として細胞上清中で測定される同じ精製mAbを使用した標準曲線を、各EIAプレートに含めて上清中のヒトIgGの定量を可能とした。最もヒトIgGを生産しているように見えるこれらのコロニー中の細胞を、スペント培養でのさらなる生産測定のために24ウェルプレートで継代し、そして最高に生産している元のコロニーを引き続き同定した。最高に生産している元のクローンをサブクローン化して、より高い生産サブクローンを同定し、そしてより均一な細胞系を調製した。96ウェル組織培養プレートにウェルあたり1細胞またはウェル4細胞をIMDM、5FBS、2mMグルタミン、1×MHX中にまき、そして37°Cで5CO2インキュベーター中で12~20日間、コロニーが現れるまでインキューベーションした。細胞上清は、ウェルあたり1つのコロニーを含むウェルから集め、そしてELISAにより記載のように分析した。選択したコロニーを24ウェルプレートで継代し、そしてカルチャーを消耗させたspent後にそれらの上清中のヒトIgGレベルを定量することにより最も生産しているサブクローンを同定した。選択した第1回目のサブクローンを第2回目のサブクローニングに供して、この工程を繰り返した。最良の第2回目のサブクローンを生育のための細胞系として選択した。細胞サブクローンの特性最良の2回目のサブクローンを選択し、そしてmAb生産レベルおよび細胞増殖特性を評価するためのに成長曲線を作成した。T75フラスコに1×105細胞/ml30mlのIMDM、5FBS、2mMグルタミンおよび1×MHXまたは無血清培地中でまいた。300μlのアリコートを24時間の間隔で採取し、そして生きている細胞の密度を決定した。分析は生きている細胞数が1×105細胞/ml未満になるまで続けた。集めた細胞上清のアリコートを存在する抗体の濃度についてアッセイした。ELISAアッセイは標準としてrTNV148BまたはrTNV14JG92399を使用して行った。サンプルは1時間、ポリクローナルヤギ抗ヒトIgGFcをコートしたELISAプレート上でインキューベーションし、そして結合したmAbを11000希釈でアルカリホスファターゼ-結合ヤギ抗ヒトIgGを用いて検出した。変動するMHX選択量の存在下での成長速度を比較する目的で、異なる成長曲線分析を2つの細胞系について行った。細胞系C466AおよびC466BをMHXを含まない培地IMDM、5FBS、2mMグルタミン中で解凍し、そしてさらに2日間培養した。次いで両細胞カルチャーは、MHX無し、02XMHXまたは1XMHX1XMHX=05gmlマイコフェノール酸、25gmlヒポキサンチン、50gmlキサンチンを含む3つのカルチャーに分割した。1日後、新しいT75フラスコに1×105細胞/mlの出発密度のカルチャーを用いてまき、そして細胞を1週間、24時間間隔で計数した。mAb生産に関するアリコートは集めなかった。これらのサンプルについて、SOPPD32025で与えられた式を使用して倍化時間を算出した。さらなる実験を行って時間経過にわたるmAb生産の安定性を評価した。カルチャーは24ウェルプレート中のIMDM、5FBS、2mMグルタミン、MHX選択有り、または無しで成長させた。カルチャーはコンフルエントになった時にはいつでも新しい培養に分け、そして古いカルチャーを消耗spentさせた。この時点で、上清のアリコートを採取し、そして4°Cで保存した。アリコートは55~78日間採取した。この期間の終わりに、記載のように上清は抗ヒトIgGFcELISAにより存在する抗体の量を試験した。結果および考察組換え受容体へのTNF結合の阻害簡単な結合アッセイを行って、ハイブリドーマの細胞上清中に含まれる8種のTNVmAbが受容体へのTNF∀の結合を遮断することができるかどうかを決定した。各細胞上清中のTNVmAb濃度を、最初にヒトIgGについて標準ELISA分析により決定した。次いで組換えp55TNF受容体/IgG融合タンパク質であるp55sf2をEIAプレートにコートし、そして125I標識TNF∀を変動するTNVmAb量の存在下でp55受容体に結合させた。図1に示すように、8つのTNVmAbのうち1つTNV122を除き、p55受容体へのTNF∀結合を効率的に遮断した。実際にTNVmAbは、陰性対照であるハイブリドーマ上清に誘起したcA2陽性対照mAbよりもTNF∀結合を効率的に阻害するように見えた。これらの結果はTNVmAbが細胞に基づくアッセイおよびインビボにおいてTNF∀生物活性を遮断し、それゆえにさらなる分析は高度に保証されるであろうことを示していると解釈された。DNA配列分析RNAがヒトmAbをコードする確認受容体結合アッセイでTNF∀遮断活性を示した7種のTNVmAbとは異なるアロタイプGmfのTNVmAbを発現することである。これはジェンファームのマウスに由来する12B75重鎖遺伝子がCH1ドメインのC末端でArg残基をコードする一方、セントコールのIgG1発現ベクターp104がその位置でLysをコードするからである。ここでJCイントロン、完全な定常領域コード配列および3フランキング配列は12B75重鎖遺伝子に由来するが、これらの遺伝子でトランスフェクトされた細胞系は生産細胞系として選択されなかった別の重鎖発現プラスミド例えばp1786およびp1788を調製した。ベクターは慎重に設計して、最終的な発現プラスミドをもたらす将来のPCR増幅されるV領域の1段階クローニングを可能とした。PCR増幅した可変領域cDNAはL28またはpBCベクターから、中間段階の12B75に基づくベクタープロモーター領域およびJCイントロンの一部を提供するに移したプラスミド確認番号については表2を参照にされたい。抗体遺伝子の5半分を含む制限フラグメントをこれらの中間段階のベクターから、各遺伝子の3半分を提供する最終発現ベクターに移して、最終的な発現プラスミドを形成したプラスミド確認番号については表2を参照にされたい。細胞のトランスフェクションおよびサブクローニング発現プラスミドは制限消化により直線化するか、または各プラスミド中の抗体遺伝子挿入物をプラスミド骨格から精製した。Sp20および653マウスミエローマ細胞を重鎖および軽鎖DNAを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。15種類のトランスフェクションを行った。そのほとんどが遺伝子が直線化された全プラスミド上でも、または精製された遺伝子挿入物でも、および宿主細胞系でも、Ab遺伝子に特徴的な性質のAbにより定められるように独自であった表3にまとめた。マイコフェノール酸に耐性のクローンに由来する細胞上清はELISAによりヒトIgGの存在についてアッセイし、そして参照標準曲線として精製したrTNV148Bを使用して定量した。最高に生産するrTNV148B細胞系rTNV148トランスフェクション2から最高に生産する653の元の系の10個スペント24ウェル培養で5~10gmlを生産したをサブクローン化して、より高く生産している細胞系をスクリーニングし、そしてより均一な細胞群を調製した。元の系2320からの2つのサブクローン232017および232020が、スペント24ウェル培養で約50gmlを生産し、これはそれらの元の系より5倍増加した。サブクローン化した系232017および232020の2回目のサブクローニングは導いたAsecondroundofsubcloningofsubclonedlines232017and232020led。表3.細胞トランスフェクションのまとめ。各mAbをコードする重鎖および軽鎖プラスミドの確認番号を示す。精製したmAb遺伝子挿入物を用いて行ったトランスフェクションの場合、プラスミドp13pSV2gptをgpt選択性マーカーの供給源として含めた。重鎖定常領域は、Remicade旧をコードするために使用した同じヒトIgG1発現ベクター、または12B75で培養した同じ細胞よりも早く成長すると思われ最近の観察により促された。マイコフェノール酸のような細胞傷害的濃度の化合物は、傾向なのでBecausethecytotoxicconcentrationsofcompoundssuchasmycophenolicacidtend数桁にわたって測定することでtobemeasuredoverordersofmagnitude、mAb生産の安定性を犠牲にすることなく細胞の倍化時間を有意に速める、より低濃度のMHXの使用を考えることが可能であった。細胞系C466AおよびC466BはMHX無し、02XMHXまたは1XMHXのいずれかで培養した。生きている細胞数を7日間、24時間の間隔で取った。結果はMHX濃度に依存的な細胞の成長速度が明らかとなった図8。細胞系C466Aは1XMHX中での250時間の倍化時間を示したが、MHX無しではわずか207時間であった。同様に細胞系C466Bは1XMHX中での324時間の倍化時間を示したが、MHX無しではわずか229時間であった。重要であるのは両方の細胞系について02XMHXでの倍化時間が1XMHXよりもMHX無しで観察された時間により近いことであった図8。この観察により倍化時間が重要なパラメーターであるバイオリアクター中での強化された細胞性能が、より少ないMHXを使用して実現できることになる可能性が高まる。しかし安定性の試験結果は以下を参照にされたい、細胞系C466DがMHXが存在しなくても少なくとも60日間、rTNV148Bを安定に生産できることを示唆し、そしてまた安定性試験はMHXの不存在下に比べてMHXの存在下での細胞を培養した時により高いmAb生産レベルを示した。約60日の期間にわたり、種々の細胞系からのmAb生産を評価するために、安定性試験はMHX選択を含むか、または含まないいずれかの培養で行った。すべての細胞系が高いmAb生産を維持したわけではなかった。培養からちょうど2週間後、クローンC466Aは実験の始のおよそ45未満を生産した。クローンC466Bからの生産も有意に低下したようにみえた。しかしクローンC466CおよびC466Dはかなり安定な生産を維持し、C466Dは最高の絶対生産レベルを示した図9。結論ヒトTNF∀に対する8種のヒトmAbの最初のパネルから、タンパク質配列およびTNF中和効力を含む幾つかの基準に基づきTNV148BならびにTNV14が好適であると選択された。100gmlのrTNV148Bおよび19gmlrTNV14より多くを生産する細胞系を調製した。実施例4.単回のボーラス注射を使用した、抗TNF抗体および対照を使用した関節炎マウス実験約4週齢のTg197実験マウスを、性別および体重に基づき9処置群の1つに割り当て、そしてダルベッコのPBSDPBSまたは1mgkgもしくは10mgkgのいずれかの本発明の抗TNF抗体TNV14、TNV148またはTNV196を単回、腹腔内ボーラス投与で処置した。結果:体重を投与前からの変化として分析した時、10mgkgのcA2で処置した動物は実験を通してDPBS処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は3~7週間で有意であった。10mgkgのTNV148で処置した動物も、実験の7週間目に有意な体重増加に達した。図10を参照にされたい。図11A~Cは、関節炎指数に基づき疾患の重篤度の進行を表す。10mgkgのcA2で処置した群の関節炎指数は、DPBS対照群よりも3週間目から始まり、その後の実験中、低かった7週。1mgkgTNV14で処置した動物および1mgkgcA2で処置した動物は、DPBS処置群と比べた時に3週間後のAIに有意な減少を示すことができなかった。各々を他の同様な用量と比較した時または1mgkgの抗体TNV148、rTNV148Bの単回腹腔ボーラス投与を用いて処置した。投与前からの変化として体重を分析した時、10mgkgのcA2で処置した動物は、実験を通してDPBS処置動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は1および3~8週で有意であった。1mgkgのTNV148で処置した動物も、実験の5、6および8週で有意な体重増加に達した。図17は関節炎指数に基づく疾患の重篤度の進行を表す。10mgkgのcA2で処置した群の関節炎指数はDPBS対照群よりも、4週から始まり、そして残りの実験を通して8週有意に低かった。TNV148で処置した群および1mgkgのcA2で処置した群は両方とも4週でAIにおける有意な低下を示した。以前の実験P099017は、TNV148が単回の1mgkgの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の低下にわずかに効果的であることを示したが、この実験ではTNV抗体の両変更体で処置した群からのAIはわずかに高いことが示された。1mgkgのcA2で処置した群は、10mgkgのcA2で処置した群と比べた時に有意に上昇せず6週を除く、そしてTNV148で処置した群は7および8週で有意に高いが、1mgkgのcA2、1mgkgのTNV148および1mgkgのTNV148B間には実験の任意の時点でAIに有意差はなかった。本発明は前述の説明および実施例に特に記載した以外にも実施することができるのは明らかである。本発明の種々の修飾および変更は、上記の教示に照らして可能であり、したがってそれらは前記特許請求の範囲内である。本発明により、以下が提供される:[1]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体。[2]上記抗体が、少なくとも109M、少なくとも1010M,少なくとも1011Mまたは少なくとも1012Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[1]に記載のTNF抗体。[3]上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[1]に記載のTNF抗体。[4]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体をコードする単離された核酸。[5][4]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。[6][5]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。[7]上記宿主細胞が、COS1、COS7、HEK293、BHK21、CHO、BSC1、HepG2、653、SP20、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[6]に記載の宿主細胞。[8]TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[4]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗TNF抗体の生産法。[9]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。[10]少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[9]に記載の組成物。[11]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。[12]細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:a配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。[13]上記の有効量が、0001~50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[12]に記載の方法。[14]上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[12]に記載の方法。[15]上記aの接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[12]に記載の方法。[16]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、上記の少なくとも1つの抗TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。[17]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。[18]上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[17]に記載の製品。[19]配列番号7または8を含んで成る少なくとも1つの可変領域を有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。[20][19]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗TNF抗体。[21]i配列番号1、2および3の重鎖相補性決定領域CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべてのいずれかを含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体。[22]上記抗体が、少なくとも109M、少なくとも1010M,少なくとも1011Mまたは少なくとも1012Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[21]に記載のTNF抗体。[23]上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[21]に記載のTNF抗体。。[24]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべてのいずれか、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体をコードする単離された核酸AnisolatednucleicacidencodingatleastoneisolatedmammalianantiTNFantibodyeitheralloftheheavychainCDRaminoacidsequencesofSEQIDNOS12and3orallofthelightchainCDRaminoacidssequencesofSEQIDNOS45and6。[25][4]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。[26][25]に記載の単離された核酸を含んで成る原核または真核生物宿主細胞。[27]上記宿主細胞が、COS1、COS7、HEK293、BHK21、CHO、BSC1、HepG2、653、SP20、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[26]に記載の宿主細胞。[28]TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[24]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗TNF抗体の生産法。[29]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。[30]少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[29]に記載の組成物。[31]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。[32]細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって、ai配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。[33]上記の有効量が、0001~50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[32]に記載の方法。[34]上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[32]に記載の方法。[35]上記aの接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[32]に記載の方法。[36]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが該少なくとも1つの抗TNF抗体を、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により接触または投与することに適する上記医療用デバイス。[37]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の溶液または凍結乾燥形態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。[38]上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[37]に記載の製品。[39]i配列番号1、2および3の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;またはii配列番号4、5および6の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。[40][39]に記載の方法により生産された少なくとも1つの抗TNF抗体。[41]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る、少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体。[42]上記抗体が、少なくとも109M、少なくとも1010M,少なくとも1011Mまたは少なくとも1012Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[41]に記載のTNF抗体。[43]上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[41]に記載のTNF抗体。[44]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体をコードする単離された核酸。[45][44]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。[46][45]に記載の単離された核酸を含んで成る、原核または真核生物宿主細胞。[47]上記宿主細胞が、COS1、COS7、HEK293、BHK21、CHO、BSC1、HepG2、653、SP20、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[46]に記載の宿主細胞。[48]TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[44]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗TNF抗体の生産法。[49]配列番号1、2、3、4、5または6の少なくとも1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。[50]少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[49]に記載の組成物。[51]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。[52]細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:a少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。[53]上記の有効量が、0001~50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[52]に記載の方法。[54]上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[52]に記載の方法。[55]上記aの接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[52]に記載の方法。[56]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、該少なくとも1つの抗TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。[57]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の溶液または凍結乾燥形態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。[58]上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[57]に記載の製品。[59]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。[60][59]に記載の方法により生産された少なくとも1つの抗TNF抗体。[61]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体。[62]上記抗体が、少なくとも109M、少なくとも1010M,少なくとも1011Mまたは少なくとも1012Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[61]に記載のTNF抗体。[63]上記抗体が、少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[61]に記載のTNF抗体。[64]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体をコードする単離された核酸。[65][64]に記載の単離された核酸を含んで成る単離された核酸ベクター。[66][65]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。[67]上記宿主細胞が、COS1、COS7、HEK293、BHK21、CHO、BSC1、HepG2、653、SP20、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[66]に記載の宿主細胞。[68]TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[64]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗TNF抗体の生産法。[69]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。[70]少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[69]に記載の組成物。[71]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。[72]細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:a少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。[73]上記の有効量が、0001~50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[72]に記載の方法。[74]上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[72]に記載の方法。[75]上記aの接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[72]に記載の方法。[76]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体を含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、上記の少なくとも1つの抗TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。[77]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。[78]上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[77]に記載の製品。[79]少なくとも1つの配列番号1、2、3、4、5または6のアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んで成る抗体と同じTNFタンパク質の領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。[80][79]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗TNF抗体。[81]少なくとも1つのヒトCDRを含んで成る少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体であって、該抗体が配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する上記抗体AtleastoneisolatedmammalianantiTNFantibodycomprisingatleastonehumanCDRwhereinsaidantibodyspecificallybindsatleastoneepitopecomprisingatleast13totheentireaminoacidsequenceofSEQIDNO9。[82]上記抗体が、少なくとも109M、少なくとも1010M,少なくとも1011Mまたは少なくとも1012Mから選択される少なくとも1つの親和性でTNFに結合する、[81]に記載のTNF抗体。[83]上記抗体が少なくとも1つのTNFタンパク質の少なくとも1つの活性を実質的に中和する、[81]に記載のTNF抗体。[84]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体をコードする単離された核酸であって、該抗体が配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する上記核酸AnisolatednucleicacidencodingatleastoneisolatedmammalianantiTNFantibodyhavingatleastonehumanCDRwhereinsaidantibodyspecificallybindsatleastoneepitopecomprisingatleast13totheentireaminoacidsequenceofSEQIDNO9。[85][84]に記載の単離された核酸を含んで成る、単離された核酸ベクター。[86][85]に記載の単離された核酸を含んで成る原核生物または真核生物宿主細胞。[87]上記宿主細胞が、COS1、COS7、HEK293、BHK21、CHO、BSC1、HepG2、653、SP20、293、HeLa、ミエローマまたはリンパ腫細胞、またはそれらから誘導され、不死化されまたは形質転換した細胞のすべてから選択される少なくとも1つである、[86]に記載の宿主細胞。[88]TNF抗体が検出可能または回収可能な量で発現するように、[84]に記載の核酸をインビトロ、インビボまたはインシトゥーの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つの抗TNF抗体の生産法。[89]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体ここで該抗体は、配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、および少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含んで成る組成物。[90]少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、[89]に記載の組成物。[91]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体に特異的に結合するここで該抗体は配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体またはフラグメント。[92]細胞、組織、器官または動物のTNF関連状態を診断または処置する方法であって:a少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体の有効量を含んで成る組成物ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するを、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。[93]上記の有効量が、0001~50mg/キログラムの該細胞、組織、器官または動物である、[92]に記載の方法。[94]上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、[92]に記載の方法。[95]上記aの接触または投与の前、と同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド系抗炎症剤NSAID、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒剤、コルチコステロイド、同化性ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン代用剤、放射性薬品、抗鬱剤、抗精神病剤、刺激物質、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたは同族体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することをさらに含んで成る、[92]に記載の方法。[96]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するを含んで成る医療用デバイスであって、該デバイスが非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、該少なくとも1つの抗TNF抗体を接触または投与するために適する、上記医療用デバイス。[97]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するの溶液または凍結乾燥状態を含んで成る包装材料および容器を含んで成る、ヒトの薬剤または診断に使用するための製品。[98]上記の容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、網内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、バッカル、舌下、鼻内または経皮送達デバイスまたはシステムの部品である、[97]に記載の製品。[99]少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳動物の抗TNF抗体ここで該抗体は配列番号9の少なくとも1~3から全アミノ酸配列を含んで成る少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するの生産法であって、回収可能な量の該抗体を発現することができる宿主細胞またはトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。[100][99]に記載された方法により生産された少なくとも1つの抗TNF抗体。[101]本明細書に記載の発明。"