"以下の工程を含む、被検物質の酵素活性を検出する方法:a被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させる工程、及びb工程aにおける反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する工程。酵素活性が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される一種の酵素の活性である、請求項1に記載の方法。ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物が、下記式I:[式中、R1は、-CN、-CONH2、-CH=CH-CN又は-CH=CH-CONH2を表し、R2はC1-4アルキル基を表し、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はC1-4アルキル基を表し、R5は、水素原子、C1-4アルキルカルボニル基又はC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基を表す]で示される化合物、その塩又はそれらの水和物である、請求項1に記載の方法。R1が-CN又は-CH=CH-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項3に記載の方法。R1が-CONH2又は-CH=CH-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項3に記載の方法。蛍光が、フローサイトメトリーを用いて測定されるものである、請求項1に記載の方法。下記式I:[式中、R1は、-CN、-CONH2、-CH=CH-CN又は-CH=CH-CONH2を表し、R2はC1-4アルキル基を表し、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はC1-4アルキル基を表し、R5は、水素原子、C1-4アルキルカルボニル基又はC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基を表す]で示される化合物、その塩又はそれらの水和物。請求項7に記載の化合物、その塩又はそれらの水和物を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用蛍光基質。ニトリル関連酵素が、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項8に記載の基質。R1が-CN又は-CH=CH-CNであり、ニトリル関連酵素がニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼである、請求項8に記載の基質。R1が-CONH2又は-CH=CH-CONH2であり、ニトリル関連酵素がアミダーゼである、請求項8に記載の基質。請求項8~11のいずれか1項に記載の基質を含む、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キット。以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2010年5月25日に出願された日本国特許出願特願2010-119431号の明細書及び図面に記載の内容を包含する。1.概要本発明は、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物以下、本発明の化合物とも称する。及び該化合物を含むニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質に関する。また、本発明は、被検物質と本発明の化合物とを反応させ、この反応で生じた蛍光の波長及び強度を測定することにより、被検物質の酵素活性を検出する方法に関する。本発明者らは、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための化合物として、ニトリル関連酵素と反応することにより蛍光が変化する化合物の合成を試みた。合成した化合物の蛍光を測定した結果、酵素反応前の化合物の蛍光よりも、酵素反応により生成されると考えられる化合物の蛍光が上昇することを見出した。そこで、本発明者らは、合成した化合物はニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であると考え、本発明を完成するに至った。2.化合物本発明において、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とは、酵素の作用により、化合物に含まれるニトリル基-CNがアミド基-CONH2又はカルボキシル基-COOHに、又は化合物に含まれるアミド基がカルボキシル基に変換されるのに伴って蛍光が変化する化合物を意味する。本発明の化合物は、蛍光団及びニトリル基又はアミド基を有するものであり、化合物中のニトリル基がアミド基又はカルボキシル基に変換されることにより、又は化合物中のアミド基がカルボキシル基に変換されることにより、蛍光団に由来する蛍光が変化するという特徴を有するものであれば、限定されるものではない。また、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化するメカニズムは一様ではないが、例えば式Iで示される化合物については以下のように説明することができる。本化合物においては、ニトリル関連酵素の反応前には、PeT光誘起電子移動:Photo-inducedElectronTransferによりほぼ無蛍光又は低蛍光である。しかしながら、酵素反応によりニトリル基やアミド基が加水分解されるとPeTが起こらなくなり、蛍光を発する。Petは、光励起されることにより生じる電子移動反応である。例えば、後述する化合物1は、そのキサンテン部位からベンゼン環部位へのPeTにより、励起蛍光団であるキサンテン環部位からの蛍光が消光されており、ほぼ無蛍光の状態となっている。しかしながら、化合物1のニトリル基がニトリラーゼにより加水分解され、化合物5が生成すると、PeTが起こらなくなり、化合物5は蛍光を発する。本発明において、ニトリル関連酵素とは、ニトリル関連化合物ニトリル基を有する化合物及びアミド基を有する化合物に作用する酵素を意味する。このような酵素しては、例えば、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼが挙げられる。ニトリル関連酵素の作用とは、水和反応又は加水分解反応を意味する。蛍光の変化とは、蛍光波長のシフト及び/又は蛍光強度の変化を意味する。変化したか否かは、以下の基準に基づき判断することができる。蛍光強度が強くなる場合は、1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上になる場合をいい、蛍光強度が弱くなる場合は、2/3以下、好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下になる場合をいう。また、蛍光波長が変化する場合は、10nm、好ましくは30nm、より好ましくは60nm以上、長波長側または短波長側にシフトする場合をいう。本発明において、ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物としては、例えば、以下の式Iで示される化合物が挙げられる。式Iにおいて、R1で表される置換基としては、ニトリル関連酵素と反応する置換基であれば限定されるものではなく、-CN、-CONH2、-CH=CH-CN又は-CH=CH-CONH2が挙げられる。R2で表される置換基としては、C1-4アルキル基が挙げられる。R3及びR4で表される置換基としては、水素原子、ハロゲン原子又はC1-4アルキル基が挙げられる。R5で表される置換基としては、水素原子、C1-4アルキルカルボニル基又はC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基が挙げられる。本発明において、C1-4アルキル基とは、炭素数が1~4個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基などが挙げられるが、好ましくはメチル基である。本発明においてC1-4アルキルカルボニル基としては、例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピオニルカルボニル基、イソブチルカルボニル基などが挙げられるが、好ましくはアセチル基である。本発明においてC1-4アルキルカルボニルオキシメチル基としては、例えば、アセトキシメチル基、エトキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基などが挙げられるが、好ましくはアセトキシメチル基である。本発明においてハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子又は塩素原子である。R2が水素原子ではなくC1-4アルキル基であることが好ましい理由としては、R2が水素原子の場合、ベンゼン環の電子密度が十分に低くはないため、光誘起電子移動による蛍光団の消光が起こりにくいことが挙げられる。すなわち、R2が水素原子の場合、酵素反応前でも蛍光強度が大きいため、ニトリル関連酵素による酵素反応による大きな蛍光強度変化が望めない。一方、R2をC1-4アルキル基にした場合、ベンゼン環の電子密度は十分に低下し、これにより光誘起電子移動による蛍光団の消光が起こり、酵素反応による蛍光強度の変化が期待できる。式Iで示される化合物の代表例を以下に示す式中、Meはメチル基を表す。上記式Iで示される化合物は、その塩又は水和物を形成してもよい。塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N,N′-ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩有機アミン塩、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。また、本発明の化合物としては、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。式Iで示される化合物は、以下の方法により製造することができる。まず、出発物質である化合物aは、東京化成工業TCIより購入することにより取得することができる。次に、化合物aをDMF中のAc2O及びCs2CO3と室温で1時間反応させることにより化合物bを得る。次に、化合物bを12NHClに溶かし、氷浴上でNaNO2を滴下し、攪拌する。30分0°Cで攪拌した後、水に溶かしたKIを滴下し10分攪拌する。室温に戻し、一時間反応させることにより化合物cを得る。さらに、化合物cをTHF中CuI、PdPPh34触媒下で、KCNと約80°Crefluxで3時間反応させることにより化合物dを得る。化合物dをMeOH中でMeONaと室温で10分反応させることにより、化合物eを得る。最後に、化合物eをCsF及びDMF中で1当量のCH3Iと室温で約1時間反応させることにより化合物1を得ることができる。3.蛍光基質上記式Iで示される化合物、その塩又はそれらの水和物は、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として用いることができる。以下、上記式Iで示される化合物が蛍光を生じるメカニズムについて説明する。上記式Iで示される化合物は、ニトリル関連酵素の反応前には、PeT光誘起電子移動:Photo-inducedElectronTransferによりほぼ無蛍光である。しかしながら、酵素反応によりニトリル基やアミド基が加水分解されるとPeTが起こらなくなり、蛍光を発する。Petは、光励起されることにより生じる電子移動反応である。例えば、化合物1は、そのキサンテン部位からベンゼン環部位へのPeTにより、励起蛍光団であるキサンテン環部位からの蛍光が消光されており、ほぼ無蛍光の状態となっている。しかしながら、化合物1のニトリル基がニトリラーゼにより加水分解され、化合物5が生成すると、PeTが起こらなくなり、化合物5は蛍光を発する図1。蛍光を検出することができれば、被検サンプル中にニトリル関連酵素が存在していることがわかる。本発明において、ニトリル関連酵素としては、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、及びアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、式Iで示される化合物において、R1が-CN又は-CH=CH-CNである場合は、ニトリル関連酵素はニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼであることが好ましく、R1が-CONH2又は-CH=CH-CONH2である場合は、ニトリル関連酵素はアミダーゼであることが好ましい。4.酵素活性の検出方法本発明は、酵素活性の検出方法を提供する。具体的には、被検物質の酵素活性を検出する方法であって、a被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させる工程;及びb工程aにおける反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する工程を含む。本発明において、被検物質としては、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質又は当該タンパク質をコードするDNAを含むと予測されるものであれば限定されるものではないが、例えば、自然界から取得したメタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーなどに含まれる物質が挙げられる。さらに、被検物質には、DNA及びタンパク質だけでなく、当該タンパク質を産生する細胞も含まれる。このような細胞としては、細菌、真菌酵母、糸状菌など、植物細胞、動物細胞などが挙げられる。さらに、前記細胞には、ニトリル関連酵素の酵素活性を有するタンパク質を発現するように形質転換された細胞が含まれる。前記細胞としては、限定されるものではないが、例えば、宿主ベクター系の開発されているエシェリヒアEscherichia属、バチルスBacillus属、シュードモナスPseudomonas属、セラチアSerratia属、ブレビバクテリウムBrevibacterium属、コリネバクテリイウムCorynebacterium属、ストレプトコッカスStreptococcus属、ラクトバチルスLactobacillus属、ロドコッカスRhodococcus属、ストレプトマイセスStreptomyces属等の等の細菌、サッカロマイセスSaccharomyces属、クライベロマイセスKluyveromyces属、シゾサッカロマイセスSchizosaccharomyces属、チゴサッカロマイセスZygosaccharomyces属、ヤロウイアYarrowia属、トリコスポロンTrichosporon属、ロドスポリジウムRhodosporidium属、ピキアPichia属、キャンディダCandida属等の酵母、ノイロスポラNeurospora属、アスペルギルスAspergillus属、セファロスポリウムCephalosporium属、トリコデルマTrichoderma属等の糸状菌、などが挙げられる。メタゲノムライブラリーとは、自然環境中に存在する多様な微生物のDNAから構築されたゲノムライブラリーであり、微生物の培養を行うことなく環境試料から直接DNAを抽出し、ライブラリー化したものである。変異酵素遺伝子ライブラリーとは、既知の酵素をコードするDNAにランダムに変異を導入し、ライブラリー化したものである。メタゲノムライブラリーの作製方法については、例えば特開2007-159417に記載され、変異酵素遺伝子ライブラリーの作製方法については、MolecularCloning:AlaboratoryMannual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.,1989.や、CurrentProtocolsinMolecularBiology,Supplement1~38,JohnWileySons1987-1997などに記載されており、当業者であればこれらの文献に基づいて前記ライブラリーを作製することができる。本発明の検出方法は、具体的には、例えば以下のような方法で行うことができる。メタゲノムライブラリー又は変異酵素遺伝子ライブラリーを被検物質として用いる場合、これらのライブラリーに含まれるDNAを細胞に形質導入し、形質転換体のライブラリーを作製する。次に、形質転換体に本発明の化合物又は蛍光基質を導入することにより、形質転換体中で産生されたタンパク質と本発明の化合物又は蛍光基質とを反応させる。その後、前記反応により生じた蛍光の波長及び強度を測定する。蛍光の測定には、蛍光検出機器である蛍光分光光度計やイメージャー、フローサイトメトリー等を用いることができる。フローサイトメトリーflowcytometryは、レーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、フローセル中を通過する単一細胞の大きさ、DNA量、細胞表面抗原の分布状態、細胞内酵素活性などを計測する方法をいう。本発明の方法においては、被検物質とニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物とを反応させ、この反応により生じた蛍光を、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。フローサイトメトリーは、市販されているフローサイトメーターを用い、製造業者の説明書に従って行うことができる。フローサイトメーターは、レーザー発生装置、光学系、ノズル、データ処理装置を含む装置であり、蛍光を生じる細胞の自動分離、蛍光の分析及びコンピューターによる解析をすることができる。特に、細胞の分取機能を有するフローサイトメーターセルソーターは、目的の蛍光を生じる細胞のみを高速に選別及び分取することが可能である。セルソーターは、セルソーター内のノズルを超音波振動させることによりシース流に液滴を形成させ、目的の細胞を含むシース流が液滴を形成する瞬間に荷電する。荷電した液滴はマイナスに荷電した偏向板に引き付けられ、チューブに回収される。このようにして、目的の蛍光を有する細胞は選別及び分取される。市販されているフローサイトメーターとしては、例えば、BDFACSCaliburTMフローサイトメーター、BDFACSAriaTMIIIセルソーター日本ベクトンディッキンソン株式会社などが挙げられる。本発明においては、被検物質と本発明の化合物との反応により生じた蛍光をフローサイトメトリーを用いて測定し、目的の蛍光を生じる細胞、すなわち目的の酵素活性を有する物質を含む細胞を高速でスクリーニングし、分離又は分取することができる。フローサイトメトリーを用いない場合、一日当たり数百個の細胞の蛍光を測定することが可能であるのに対し、FACSFluorescence-activatedcellsortingシステムによるフローサイトメトリーを用いた場合、一日あたり数万~数百万個の細胞の蛍光を測定することが可能である。このことは、FACSによる処理細胞数が1秒当たり数百個である場合、百万個の細胞の測定が1~2時間で完了することを意味し、より高性能のFACS1秒当たり約7000個であれば、百万個の細胞の測定を数分で完了することを意味する。従って、本発明の方法においてフローサイトメトリーを用いて蛍光を測定することにより、被検物質の酵素活性の検出を自動化及び高速化することができるだけでなく、目的の酵素活性を有する物質を含む細胞の選別及び分取を自動化及び高速化ハイスループットスクリーニングすることが可能である。5.キット本発明は、上記式Iで示される化合物を含む蛍光基質を含有する、ニトリル関連酵素の酵素活性検出用キットを提供する。本発明のキットは、本発明の蛍光基質の他に、溶解液、緩衝液、使用説明書など、ニトリル関連酵素の酵素活性の検出に必要な他の任意の構成要素を適宜含めることができる。以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。1.ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物の合成1式Iで示される化合物ニトリル関連酵素の作用により蛍光が変化する化合物として、本発明における式Iで示される化合物の代表例を以下に示す式中、Meはメチル基を表す。2式Iで示される化合物の合成化合物1は、以下のスキーム1に従って合成した。<スキーム1:化合物1の合成>出発物質である化合物aは、東京化成工業TCIより購入することにより取得した。次に、化合物aをDMF中のAc2O及びCs2CO3と室温で1時間反応させることにより化合物bを得た。次に、化合物bを12NHClに溶かし、氷浴上でNaNO2を滴下し、攪拌した。30分0°Cで攪拌した後、水に溶かしたKIを滴下し10分攪拌した。室温に戻し、一時間反応させることにより化合物cを得た。さらに、化合物cをTHF中CuI、PdPPh34触媒下で、KCNと約80°Crefluxで3時間反応させることにより化合物dを得た。化合物dをMeOH中でMeONaと室温で10分反応させることにより、化合物eを得た。最後に、化合物eをCsF及びDMF中で1当量のCH3Iと室温で約1時間反応させることにより化合物1を得た。化合物11HNMR300MHz,CD3OD:δ6.82d,2H,J=9.33Hz,6.68-6.73m,4H,3.65s,3H,7.89d,1H,J=1.11Hz,8.14dd,1H,J=1.47,8.25Hz,8.40d,1H,J=8.10HzHRMSESI-:Calcdfor[M-H]-,370.0716,Found,370.0672-4.38mmu化合物2も上記スキーム1に準ずる方法により合成した。化合物21HNMR300MHz,CD3OD:δ3.66s,3H,6.67-6.74m,4H,6.96-6.99m,2H,6.64d,1H,J=8.07Hz,8.18dd,1HJ=8.07,1.47Hz,8.61d,1H,J=1.47HzHRMSESI-:Calcdfor[M-H]-,370.07155,Found,370.06831-3.24mmu化合物3及び4は、以下のスキーム2に従って合成した。<スキーム2:45-CONH2フルオレセインメチルエステルの合成>まず、出発物質である化合物fは、SIGMA社から購入することにより得た。次に、化合物fをDMF中のAc2O及びCs2CO3と室温で1時間反応させることにより化合物gを得た収率96。次に、化合物gをTsCl及びトリエチルアミン中で、シリカゲルに担持したNH4Clと室温で10分反応させることにより化合物hを得た。さらに、化合物hをMeOH中でMeONaと室温で10分反応させることにより化合物iを得た。最後に、化合物iをCsF及びDMF中で1当量のCH3Iと室温で1時間反応させることにより化合物3及び4を得た収率2.3。化合物31HNMR300MHz,CD3OD:δ8.37d,1H,J=8.07Hz,8.23dd,1H,J=8.07,1.47Hz,7.89d,1H,J=1.47Hz,7.01m,2H,6.64m,4H,3.64s,3HHRMSESI:Calcdfor[MH],390.09776,Found,390.09473-3.04mmu化合物41HNMR300MHz,CD3OD:δ8.79d,1H,J=2.20Hz,8.30dd,1H,J=8.07,2.20Hz,7.55d,1H,J=8.07Hz,7.00m,2H,6.72m,4H,3.66s,1HHRMSESI:Calcdfor[MH],390.09776,Found,390.09457-3.19mmu化合物5及び6は、以下のスキーム3に従って合成した。<スキーム3:45-COOHフルオレセインメチルエステルの合成>化合物jをH2SO4中のMeOHと100°Crefluxで1時間反応させることにより化合物kを得た収率8.6。次に、化合物kをMeOH中の1当量のNaOHと100°Crefluxで2時間反応させることにより化合物5及び6を得た微量trace。化合物5及び6HRMSESI:Calcdfor[MH],391.08178,Found,391.085363.57mmu2.化合物の蛍光及び蛍光量子収率の測定上記化合物1~6の蛍光を測定した。その結果を図2に示す。図2において、CNは化合物1を表し、CONH2-1は化合物4を表し、CONH2-2は化合物3を表す。また、COOH-1は5-COOHフルオレセインを表し、COOH-2は化合物5及び6の混合物を表す。また、化合物1~6の蛍光量子収率Φf1を測定した。その結果、化合物1~6の蛍光量子収率は、それぞれ、0.007、0.161、0.018、0.397、0.0729、0.565であった。なお、化合物5及び6については、HPLCから求めた濃度比に基づき、単離した場合の値を算出した。これらの測定結果を以下に示す。上記結果より、化合物1はほぼ無蛍光であり、ニトリル基-CNがアミド基-CONH2まで加水分解されて化合物3になったとしてもあまり蛍光は上昇しないが、アミドがさらに加水分解されて化合物5になると蛍光が大きく上昇することが明らかとなった表1。この結果から、化合物1は、ニトリラーゼの酵素活性を検出するための蛍光基質として用いることができることが示された。また、化合物3はほぼ無蛍光であり、化合物3のアミド基が加水分解されると蛍光性の化合物5となることから、化合物3はアミダーゼの酵素活性を検出するための蛍光基質として使用できることが示された。さらに、化合物2は、ニトリル基-CNが、アミド基-CONH2、カルボキシル基-COOHに変換されるのに伴って蛍光強度が上昇することから、ニトリルヒドラターゼ及びニトリラーゼの活性を検出するための蛍光基質の候補となることが明らかとなった表2。以上より、本実施例において設計及び合成した化合物は、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの酵素反応を、蛍光の変化という形で可視化できる蛍光特性を有しており、酵素活性を検出するための蛍光基質として機能することが示された。ニトリルヒドラターゼによる反応1.ニトリルヒドラターゼ粗酵素液細胞抽出液の調製ロドコッカス属細菌においてロドコッカスロドクロウスJ1株由来ニトリルヒドラターゼを構成的に発現させるためのプラスミドpSJ034をロドコッカスロドクロウスATCC12674株に導入した。pSJ034は、プラスミドpSJ023から特開平10-337185号明細書記載の方法により作製したものである。pSJ023は、形質転換体R.rhodochrousATCC12674/pSJ023FERMBP-6232として産業総合技術研究所特許生物寄託センターに寄託されている。プラスミドpSJ034によりロドコッカスロドクロウスATCC12674株を形質転換し、ATCC12674株/pSJ034株を作製した。ベクターpK4を導入した12674株を対照実験に用いた。ATCC12674株の形質転換は次のようにして行った。ATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド溶液1μlと菌体懸濁液10μlを混合し、氷冷した。これを遺伝子導入装置GenePulserBIORAD用キュベットに移し、同装置を用いて2.0KV、200OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置後、37°Cで10分間インキュベートし、MYK培地0.5ポリペプトン、0.3バクトイーストエキス、0.3バクトモルトエキス、0.2K2HPO4、0.2KH2PO4500μlを加え、30°C、5時間静置した後、50μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30°C、3日間培養した。得られたコロニーを培養し、プラスミドが導入されていることを確認した。培養は、次のように行った。カナマイシン50mg/Lを含むMYK培地10mlに植菌し、30°Cにて24時間前培養を行った。培養液を1ml取り100mlの同培地に加え、30°Cにて48時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離3,700×g、10分間、4°Cにより菌体を回収し、10mMリン酸-ナトリウム緩衝液pH7.0で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液から1mlを用い、超音波破砕機VP-15Sタイテック、日本を用いて、出力コントロール4、DUTYCYCLE40、PULS、TIMER=Bモ-ド10sの条件で氷冷しながら3分間破砕した。次に遠心分離を行い10,000×g、5分間、4°C、得られた上清を細胞抽出液として採取した。2.酵素反応10μLリン酸-ナトリウム緩衝液pH7.0、75μL滅菌水および5μLの0.01mMニトリル蛍光基質化合物2:10DMSOに溶解を混合し、30°Cでプレインキュベーションを行った。上記のように調製した細胞抽出液10μLを加えることにより反応を開始した。30°Cで1時間反応後、96穴マイクロプレートに移し、蛍光イメージャーBioRad社PharosFXmolecularImager、励起488nm、検出530nmにて蛍光を検出した。結果を図3に示した。対照サンプルであるベクターpK4を導入した組換え体より得られた細胞抽出液では蛍光に変化が無かったのに対し、ニトリルヒドラターゼを発現させた組換え体を用いた場合には、顕著な蛍光強度の増加が認められた。この結果により、本発明の化合物が、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であることが示された。ニトリラーゼによる反応1.ニトリラーゼ粗酵素液細胞抽出液の調製ロドコッカスsp.SK92株由来ニトリラーゼを高発現する大腸菌組換え体JM109/pSK002特開平8-173169を1mlの50μg/mlアンピシリンを含むLB培地1バクトトリプトン、0.5バクトイーストエキス、0.5NaClに植菌し、37°Cにて7時間前培養を行った。培養液を0.1ml取り、100mlの同培地50μg/mlアンピシリン、1mMIPTG含有に加え、37°Cにて15時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離3,700×g、10分間、4°Cにより菌体を回収し、10mMリン酸-ナトリウム緩衝液pH7.0で洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。対照株としてJM109/pUC118を用いた。得られた菌体懸濁液から1mlを用い、超音波破砕機VP-15Sタイテック、日本を用いて、出力コントロ-ル4、DUTYCYCLE40、PULS、TIMER=Bモ-ド10sの条件で氷冷しながら1分間破砕した。次に遠心分離を行い10,000×g、5分間、4°C、得られた上清を細胞抽出液として採取した。2.酵素反応実施例2と同様にして、ニトリル蛍光基質化合物2を用いて反応を行い、蛍光イメージャーにて検出した。結果を図4に示した。対照サンプルであるJM109/pUC118より得られた細胞抽出液では蛍光に変化が無かったのに対し、ニトリラーゼを発現させた組換え体由来の細胞抽出液を用いた場合には、顕著な蛍光強度の増加が認められた。この結果により、本発明の化合物が、ニトリル関連酵素の酵素活性を検出するための蛍光基質として有用であることが示された。10μLリン酸-ナトリウム緩衝液pH7.0、75μL滅菌水および5μL0.1mMニトリル蛍光基質化合物2:DMSOに溶解を混合し、30°Cでプレインキュベーションを行った。実施例3と同様の方法で調製した細胞抽出液10μLを加えることにより反応を開始した。24時間反応後、対照サンプルであるJM109/pUC118より得られた細胞抽出液では色の変化はほとんど認められなかったのに対し、ニトリラーゼを発現させた組換え体由来の細胞抽出液を用いた場合には、顕著な緑色の蛍光が認められた図5。この結果により、本発明の蛍光基質の蛍光強度は、肉眼で対照と区別できるほど顕著に高いものであることが示された。"