"炭素源としてのグリセロールから商業上関心が持たれる化学品を生産するために遺伝子改変された微生物であって、該微生物は、調節解除されたグリセロール資化経路を含み、該グリセロール資化経路が、促進グリセロール拡散因子、グリセロールキナーゼ、およびグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼを含む微生物。大腸菌Escherichiacoliである、請求項1に記載の微生物。グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性の実質的な低下をもたらす変異を含む、請求項1に記載の微生物。グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーをコードする遺伝子が欠失している、請求項1に記載の微生物。該変異または欠失がglpR遺伝子にある、請求項4または5に記載の微生物。グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース-1,6-二リン酸による阻害に対して実質的に耐性にする変異を含む、請求項1に記載の微生物。グリセロールキナーゼの比活性を、ホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素IIAGlcによる阻害に対して実質的に耐性にする変異を含む、請求項1に記載の微生物。グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース-1,6-二リン酸による阻害およびホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素IIAGlcによる阻害に対して実質的に耐性にする変異を含む、請求項1に記載の微生物。2つ以上の変異を含み、変異の一つは、グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性を実質的に低下させ、もう一つは、グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース-1,6-二リン酸による阻害またはホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素IIAGlcによる阻害に対して実質的に耐性にする、請求項1に記載の微生物。グリセロール資化経路の調節解除が、glpD、glpFKX、およびglpABCからなる群より選択される1つ以上の遺伝子またはオペロンのネイティブプロモーターを、構成的に活性なプロモーターで置き換えることによって達成される、請求項1に記載の微生物。該化学品がコハク酸、リンゴ酸、乳酸、またはフマル酸である、請求項1に記載の微生物。該微生物が大腸菌MH28株である、請求項1に記載の微生物。商業上関心が持たれる化学品をグリセロールから生産するための方法であって、グリセロールを炭素源とする発酵槽中で請求項1に記載の微生物を増殖させ、該発酵槽から該化学品を収穫することを含む方法。該化学品がコハク酸、L-リンゴ酸、L-乳酸、D-乳酸、またはフマル酸である、請求項12に記載の方法。通気速度がブロス1リットルあたり毎分0.15リットル未満の酸素を供給する、請求項12に記載の方法。通気速度がブロス1リットルあたり毎時20mgを上回る酸素を供給する、請求項12に記載の方法。通気速度がブロス1リットルあたり毎分0.15リットル未満の酸素かつブロス1リットルあたり毎時20mgを上回る酸素を供給する、請求項12に記載の方法。グリセロールが副産物としてバイオディーゼル生産プロセスに由来する、請求項12に記載の方法。発酵におけるグリセロールの使用に先だって、実質的な量の1つ以上の夾雑化合物が、バイオディーゼル生産プロセス由来のグリセロールから除去されている、請求項17に記載の方法。バイオディーゼル生産プロセス由来のグリセロールがメタノールまたはエタノールを実質的に含まない、請求項18に記載の方法。バイオディーゼル生産プロセス由来のグリセロールが夾雑イオンを実質的に含まない、請求項18に記載の方法。バイオディーゼル生産プロセス由来のグリセロールが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン、硫酸イオン、およびリン酸イオンを実質的に含まない、請求項20に記載の方法。発明の概要本発明は、炭素源としてグリセロールを用いる生物学的発酵によって、商業上関心が持たれる1つ以上の化学品を生産するための微生物およびプロセスを提供する。炭素源としてのグリセロールと、本発明の微生物およびプロセスとを使って、商業上関心が持たれるさまざまな化学品、例えば限定するわけではないが、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、エタノールおよび酢酸などを製造することができる。好ましい一実施形態では、本発明に適したグリセロールはバイオディーゼル産業に由来する。最も好ましい一実施形態において、本発明は、バイオディーゼル産業に由来するグリセロールであって、夾雑化合物が除去されたものを使用する。ある態様では、バイオディーゼル産業由来のグリセロールは、メタノールやエタノールなどの夾雑化合物を含まない。本発明のもう一つの態様では、バイオディーゼル産業に由来するグリセロールは、夾雑イオン、例えば限定するわけではないがナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、およびそれらの混合物などを含まない。もう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを用いて、商業上関心が持たれる1つ以上の化学品を製造するのに適した微生物であって、該微生物が調節解除されたグリセロール資化経路を含み、そのグリセロール資化経路が促進拡散因子、グリセロールキナーゼ、およびグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼを含む微生物を提供する。本発明の一態様では、グリセロール資化経路の調節解除は、グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性の本質的低下をもたらす、glpR遺伝子または他の調節遺伝子中の変異を伴う。本発明のもう一つの態様では、グリセロール資化経路の調節解除は、glpK、glpF、glpDおよびglpABC遺伝子のプロモーター領域を、構成的プロモーターとして作用するであろうDNA配列で置き換えることを伴う。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる1つ以上の化学品を生産するための微生物であって、glpK遺伝子中またはグリセロールキナーゼをコードする他の遺伝子中に、フィードバック阻害に対する耐性を付与する変異を有する微生物を提供する。ある態様において、本発明は、グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース-1,6-二リン酸による阻害に対して実質的に耐性にする変異を、glpK遺伝子中に含む微生物を提供する。もう一つの態様において、本発明は、グリセロールキナーゼの比活性を、ホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素IIAGlcによる阻害に対して実質的に耐性にする変異を、glpK遺伝子中に含む微生物を提供する。さらにもう一つの態様において、本発明は、2つ以上の変異を含み、変異の一つが、グリセロール資化遺伝子の発現を負に調節するリプレッサーの活性を実質的に低下させ、もう一つが、グリセロールキナーゼの比活性を、フルクトース-1,6-二リン酸による阻害および/またはホスホトランスフェラーゼ系の非リン酸化酵素IIAGlcによる阻害に対して実質的に耐性にするものである、微生物を提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる1つ以上の化学品を生産する方法であって、マイクロエアレーションmicroaerationを含む方法を提供する。ある態様において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる化学品を生産する方法であって、発酵ブロスに、ブロス1リットルあたり毎分0.15リットル未満の酸素が供給される方法を提供する。もう一つの態様において、本発明は、炭素源としてグリセロールを使用して、商業上関心が持たれる化学品を生産する方法であって、発酵ブロスに、ブロス1リットルあたり毎時少なくとも20mgの酸素が供給される方法を提供する。好ましい実施形態の詳細な説明本発明を使って、商業上関心が持たれる工業的に有用な化学品を数多く製造することができる。これら商業上関心が持たれる化学品の大半は微生物代謝における中間体である。本発明では、これらの微生物中間体の1つ以上が、有意な量かつ商業的に好都合な形で生産されるように、微生物ゲノムおよび増殖条件が適切に操作される。そのような化学品の例には、エタノール、ブタノール、ラクテート、スクシネート、フマレート、マレート、スレオニン、メチオニンおよびリジンなどがあるが、これらに限るわけではない。有機酸は遊離酸としても塩例えば限定するわけではないがナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムなどの塩としても存在することができるので、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、スレオニン、メチオニン、およびリジンなどの化学名は、遊離酸とその任意の塩との両方を包含するものとする。同様に、スクシネート、フマレート、マレート、アスパルテートなどの任意の塩も、遊離酸を包含するものとする。本発明は、炭素源としてのグリセロールを含む無機塩培地における嫌気性または微好気性増殖条件下でのコハク酸生産について、高い収量、力価および容積生産性を示す株を得るために、特異的遺伝子修飾の技法を、代謝的進化のプロセスと組み合わせる。本発明の説明では、以下の定義を使用することとする。本発明において使用する用語力価は、発酵ブロスにおける特定化合物の1リットルあたりのグラム数またはモル濃度を意味する。したがって、本発明によるコハク酸生産用の発酵プロセスにおいて、100mMのコハク酸力価とは、測定時の発酵ブロスが、発酵ブロス中に、1リットルあたり100ミリモルまたは1リットルあたり11.8グラム11.8g/lのコハク酸を含有したことを意味することになる。本発明において使用する用語収量は、発酵プロセス中に消費された炭素源1モルあたりの、生産された特定化合物のモル数、または発酵プロセス中に消費された炭素源1グラムあたりの、生産された特定化合物のグラム数を指す。したがって、炭素源としてグリセロールを用いてコハク酸を生産するための発酵プロセスにおいて、収量という用語は、消費されたグリセロール1グラムあたりの、生産されたコハク酸のグラム数を指す。本発明において使用する用語容積生産性は、単位時間あたり単位容積あたりの、グラム数で表した特定化合物の生産量を指す。したがって、コハク酸の場合、0.9gL-1h-1の容積生産性値とは、1時間の増殖中に発酵ブロス1リットルに0.9グラムのコハク酸が蓄積することを意味することになる。本発明において使用する用語遺伝子は、あるDNA配列の1つまたは複数のオープンリーディングフレームならびに上流および下流調節配列を包含する。上流調節領域はその遺伝子のプロモーター領域とも呼ばれる。下流調節領域はターミネーター配列領域とも呼ばれる。機能的に類似するという表現は、本明細書に開示する方法によって同じ生物または異なる生物に見いだされる任意の野生型または変異型のDNA配列、遺伝子、酵素、タンパク質と等価であるか類似した生物学的機能を有する、任意の生物に由来する任意の野生型または変異型のDNA配列、遺伝子、酵素、タンパク質を広く意味する。機能的類似性は配列相同性を必ずしも必要としない。アレルは、特定遺伝子のDNA配列の2つ以上の形態のうちの1つである。各遺伝子は、変異により、異なるアレルを有しうる。変異を何も持たない遺伝子を、変異を有する対応遺伝子と比較して、野生型アレルという。ホモログとは、共通する祖先DNA配列からの出自によってもう一つの遺伝子と関係づけられる遺伝子である。ホモログという用語は、種分化の事象によって分離された遺伝子間の関係にも適用できるし、遺伝子重複の事象によって分離された遺伝子間の関係にも適用できる。オルソログとは、種分化によって共通する先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子である。通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保つ。オルソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼できる予測にとって極めて重要である。種分化は、新しい生き方をすることができる新しい種が、その起源となる種から発生することである。このプロセスの一部として、これは、親種との遺伝子交換に対する何らかの障壁も獲得している。パラログは、ゲノム内での重複によって関係づけられる遺伝子である。オルソログは進化の過程で同じ機能を保つが、パラログは、元の機能に関係するとはいえ、新しい機能を進化させる。変化した活性を有する遺伝子またはタンパク質は、関連する野生型遺伝子または野生型タンパク質と比較した場合に測定可能な性質に測定可能な相違を生じる遺伝子またはタンパク質と広く定義される。変化した活性は、一般的に、変化した遺伝子またはタンパク質を含有する株の増殖速度またはスクシネート生産効率の増加または減少として現れうる。他の測定可能な性質には、例えば酵素活性、酵素の基質特異性、酵素の速度論的パラメータ、例えば基質に対するアフィニティまたは速度、酵素の安定性、酵素の調節的性質、遺伝子発現レベル、さまざまな条件下での遺伝子発現の調節、1つ以上の阻害剤に対する感受性などがあるが、これらに限られるわけではない。本発明において使用される変異という用語は、オープンリーディングフレーム、上流調節領域および下流調節領域を含む遺伝子に対してなされる遺伝子修飾を指す。遺伝子変異は、その遺伝子のオープンリーディングフレームの転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションもしくは完全な阻害をもたらすか、変異型遺伝子がコードするタンパク質の活性の変化をもたらしうる。遺伝子変異は、遺伝子の全コード領域またはコードヌクレオチド配列の一部を欠失させるか、フレームシフト変異、ミスセンス変異、および挿入を導入するか、停止コドンを導入することによって、またはそれらの組み合わせによって達成することができる。変異は、酵素反応または細胞膜を横切る有機分子の輸送などといった生物学的機能に直接関与するタンパク質をコードする構造遺伝子中に存在しうる。あるいは、変異は、生物学的機能に直接関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする調節遺伝子中に存在しうる。他の遺伝子の発現を制御するタンパク質は調節タンパク質と呼ばれ、これらの調節タンパク質をコードする遺伝子は調節遺伝子と呼ばれる。変異には、関連する野生型生物と比較したDNA配列のいかなる変化も含まれるものとする。例えば、KJ122株に見いだされる変異は、変異した領域のDNA配列をATCC8739としても知られる親野生型株大腸菌Cと比較した場合に見いだすことができるDNA配列の任意の変化である。変異は、任意の塩基対数の追加DNAの挿入、または任意の塩基対数のDNAの欠失であることができる。挿入変異の一特定タイプは遺伝子重複である。遺伝子は自然変異事象によって重複されうるかこの場合、遺伝子の第2のコピーは元のコピーに隣接して配置されうる、遺伝子は遺伝子工学によって重複されうるこの場合、遺伝子の第2のコピーは、元のコピーとは遠く離れたゲノム中の部位に配置されうる。変異はある塩基タイプからもう一つの塩基タイプへの変化、例えばアデニンからグアニン塩基への変化であることができる。遺伝学の言葉でいうと、変異は、ミスセンスこれはあるコドンがコードするアミノ酸を変化させるであるか、ノンセンスこれはあるコドンを停止コドンに変えるであるか、フレームシフトこれは、3の倍数ではないくつかの塩基の挿入または欠失であり、読み枠を変化させ、変異の下流でコードされているアミノ酸配列を変え、しばしば変異の下流に停止コドンを導入するであるか、逆位これは、DNA配列が欠失するのではなく極性を入れ換えることによって起こるであることができる。遺伝子名の前につく記号Δは、その遺伝子のコード配列が完全にまたは部分的に排除されており、その遺伝子が機能的に不活性であることを示している。ヌル変異は、関連遺伝子の全オープンリーディングフレームの欠失と実質的に同一な表現型を付与する変異、または関連遺伝子の測定可能な活性を全て除去する変異である。変異体は、1つ以上の変異を含有するゲノムを持つ微生物である。本発明において使用する用語外因性は、細胞の外側に由来する分子または活性が宿主微生物中に導入されていることを意味するものとする。微生物細胞中に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立したプラスミドとして存在してもよいし、宿主染色体DNA中に組み込まれてもよい。タンパク質をコードする外因性核酸は、それ自身の調節配列、例えばプロモーター配列およびターミネーター配列と共に、発現可能な形態で微生物細胞中に導入することができる。あるいは、外因性核酸分子は、宿主染色体DNA中に組み込まれて、宿主調節配列の制御を受けることもできる。内在性という用語は、宿主細胞内に存在する分子および活性を指す。生合成活性に関して使用する場合、外因性という用語は、宿主参照生物中に導入された活性を指す。供給源は、例えば、宿主微生物への導入後に当該活性を発現する相同コード核酸または異種コード核酸であることができる。タンパク質をコードする核酸が同じ種の微生物から得られる場合、それを相同DNAという。核酸が異なる微生物種に由来する場合、それを異種DNAという。DNAの性質とは無関係に、それが相同であれ異種であれ、宿主細胞に導入された場合は、そのDNA、ならびに導入されたDNAに由来する活性を、外因性であるという。それゆえに、本発明のコード核酸の外因性発現には、異種コード核酸および相同コード核酸のどちらか一方または両方を利用することができる。本発明は、商業上有用な化学品の製造においてグリセロールを炭素源として使用することができる微生物を提供する。大腸菌細菌を使って本発明を実証するが、本発明は、シトロバクターフロインデイCitrobactorfreundii、グルコノバクターオキシダンスGluconobacteroxydans、グルコノバクターアサイイGluconobacterasaii、アクロモバクターデルマルヴェAchromobacterdelmarvae、アクロモバクタービスコーサスAchromobacterviscosus、アクロモバクターラクチカムAchromobacterlacticum、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens、アグロバクテリウムラジオバクターAgrobacteriumradiobacter、アルガリゲネスフェカリスAlcaligenesfaecalis、アルスロバクターシトレウスArthrobactercitreus、アルスロバクターツメセンスArthrobactertumescens、アルスロバクターパラフィネウスArthrobacterparaffineus、アルスロバクターヒドロカルボグルタミカスArthrobacterhydrocarboglutamicus、アルスロバクターオキシダンスArthrobacteroxydans、オーレオバクテリウムサペルダエAureobacteriumsaperdae、アゾトバクターインディカスAzotobacterindicus、ブレビバクテリウムアンモニアゲネスBrevibacteriumammoniagenes、ジバリカタムdivaricatum、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムBrevibacteriumlactofermentum、ブレビバクテリウムフラバムBrevibacteriumflavum、ブレビバクテリウムグロボスムBrevibacteriumglobosum、ブレビバクテリウムフスカムBrevibacteriumfuscum、ブレビバクテリウムケトグルタミカムBrevibacteriumketoglutamicum、ブレビバクテリウムヘルコラムBrevibacteriumhelcolum、ブレビバクテリウムプシラムBrevibacteriumpusillum、ブレビバクテリウムテスタセウムBrevibacteriumtestaceum、ブレビバクテリウムロセウムBrevibacteriumroseum、ブレビバクテリウムイマリオフィリウムBrevibacteriumimmariophilium、ブレビバクテリウムリネンスBrevibacteriumlinens、ブレビバクテリウムプロトファルミアエBrevibacteriumprotopharmiae、コリネバクテリウムアセトフィラムCorynebacteriumacetophilum、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicum、コリネバクテリウムカルナエCorynebacteriumcallunae、コリネバクテリウムアセトアシドフィラムCorynebacteriumacetoacidophilum、コリネバクテリウムアセトグルタミカムCorynebacteriumacetoglutamicum、エンテロバクターアエロゲネスEnterobacteraerogenes、エルウィニアアミロボラErwiniaamylovora、エルウィニアカロトボラErwiniacarotovora、エルウィニアヘルビコラErwiniaherbicola、エルウィニアクリサンテミErwiniachrysanthemi、フラボバクテリウムペレグリナムFlavobacteriumperegrinum、フラボバクテリウムフカタムFlavobacteriumfucatum、フラボバクテリウムアウランチナムFlavobacteriumaurantinum、フラボバクテリウムレナナムFlavobacteriumrhenanum、フラボバクテリウムセワネンスFlavobacteriumsewanense、フラボバクテリウムブレベFlavobacteriumbreve、フラボバクテリウムメニンゴセプチカムFlavobacteriummeningosepticum、ミクロコッカス属CCM825Micrococcussp.CCM825、モルガネラモルガニイMorganellamorganii、ノルカジアオパカNocardiaopaca、ノルカジアルゴサNocardiarugosa、プラノコッカスユーシナツスPlanococcuseucinatus、プロテウスレッゲリProteusrettgeri、プロピオニバクテリウムシェルマニイPropionibacteriumshermanii、シュードモナスシンキサンタPseudomonassynxantha、シュードモナスアゾトフォルマンスPseudomonasazotoformans、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens、シュードモナスオバリスPseudomonasovalis、シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri、シュードモナスアシドボランスPseudomonasacidovolans、シュードモナスムシドレンスPseudomonasmucidolens、シュードモナステストステローニPseudomonastestosteroni、シュードモナスアエルギノーサPseudomonasaeruginosa、ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis、ロドコッカスロドクラウスRhodococcusrhodochrous、ロドコッカス属ATCC15592Rhodococcussp.ATCC15592、ロドコッカス属ATCC19070Rhodococcussp.ATCC19070、スポロサルチーナウレエSporosarcinaureae、スタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus、ビブリオメチニコフィイVibriometschnikovii、ビブリオチロゲネスVibriotyrogenes、アクチノマヅラマヅレActinomaduramadurae、アクチノミセスビオラセオクロモゲネスActinomycesviolaceochromogenes、キタサトスポリアパルローサKitasatosporiaparulosa、ストレプトミセスセリカラーStreptomycescoelicolor、ストレプトミセスフラベラスStreptomycesflavelus、ストレプトミセスグリセオラスStreptomycesgriseolus、ストレプトミセスリビダンスStreptomyceslividans、ストレプトミセスオリバセウスStreptomycesolivaceus、ストレプトミセスタナエンシスStreptomycestanashiensis、ストレプトミセスバージニアエStreptomycesvirginiae、ストレプトミセスアンチビオチクスStreptomycesantibioticus、ストレプトミセスカカオイStreptomycescacaoi、ストレプトミセスラベンジュレStreptomyceslavendulae、ストレプトミセスビリドクロモゲネスStreptomycesviridochromogenes、エロモナスサルモニシダAeromonassalmonicida、バチルスプミルスBacilluspumilus、バチルスサーキュランスBacilluscirculans、バチルスチアミノリチカスBacillusthiaminolyticus、バチルスリケニフォルミスBacilluslicheniformis、バチルススブチリスBacillussubtilis、バチルスアミロリクイファシエンスBacillusamyloliquifaciens、バシラスコアギュランスBacilluscoagulans、エシェリキアフロインデイEscherichiafreundii、ミクロバクテリウムアンモニアフィラムMicrobacteriumammoniaphilum、セラチアマルセセンスSerratiamarcescens、サルモネラチフィムリウムSalmonellatyphimurium、サルモネラシュトムレリSalmonellaschottmulleri、クレブシエラオキシトカKlebsiellaoxytoca、クレブシエラニューモニアKlebsiellapneumoniaおよびキサントモナスシトリXanthomonascitriを含む、広範な細菌種に応用することができる。本発明は、商業上有用な化学品の生産のために選択される酵母株、例えば限定するわけではないが、次に挙げる属から選択される酵母において、グリセロールを炭素源として使用する能力を付与するのにも有用である:サッカロミセスSaccharomyces、クリベロミセスKluyveromyces、カンジダCandida、ザイゴサッカロミセスZygosaccharomyces、トルロプシスTorulopsis、トルロスポラTorulospora、ウィリオプシスWilliopsis、イサタケンキアIssatchenkia、ピキアPichia、シゾサッカロミセスSchizosaccharomyces、ファフィアPhaffia、クリプトカスCryptoccus、ヤロウイアYarrowia、サッカロミコプシスSaccharomycopsisなど。本発明において供給材料として使用されるグリセロールは、バイオディーゼル産業に由来するものであることができる。バイオディーゼル産業由来のグリセロールは、商業上有用な化学品を生産するための発酵プロセスにおけるその使用に先だって、その夾雑物を除去しておくことが好ましい。好ましい一実施形態では、グリセロールが、夾雑構成要素がごく少量であるグリセロールの生産につながる不均一系触媒が使用されるバイオディーゼル産業に由来する。エタノールやメタノールなどの一部の夾雑物は蒸留によって除去することができる。元のグリセロール原液の希釈は、夾雑物の効果を低減するもう一つのアプローチである。バイオディーゼル製造からのグリセロール副産物は、水、メタノールまたはエタノールなどのいくつかの少量夾雑化合物ならびにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン、硫酸イオン、およびリン酸イオンなどの塩イオンを含有することが知られている。この粗グリセロールを約5倍~10倍希釈すれば、夾雑化合物は、本発明の微生物を含む微生物が耐容性を示すはずの濃度にまで希釈されるであろう。それでもなお、発酵に先だって夾雑化合物を少なくとも部分的には除去することが好ましい。グリセロールは大量副産物であり、2つ以上のバイオディーゼル製造施設に由来するかもしれないので、バッチ間には何らかの予測不可能な変動性が存在するかもしれないし、そうであれば、一部のバッチまたはロットでは夾雑物のレベルが望ましくないものであるかもしれない。加えて、イオン性夾雑物は、発酵後の除去と比較して、発酵前に除去した方が費用がかからないかもしれない。所望の生成物例えば有機酸が夾雑物のうちの1つ以上を含まないことが望まれる場合は、その夾雑物を発酵前か発酵後のどちらかに除去しなければならない。例えば、生産される有機酸が化学修飾例えば水素化され、かつ/またはプラスチックに重合される予定である場合は、触媒を被毒から守るために、あらゆる形態の硫黄およびリンを、少なくとも部分的には除去しなければならない。もう一つの例として、メタノールまたはエタノールは、反応性基を一つしか持たないので、重合中に連鎖停止剤としても作用するかもしれない。メタノールやエタノールなどの低級アルコールは、蒸留および/または減圧によって除去することができる。イオン性夾雑物はイオン交換樹脂によって除去することができる。グリセロールは極端なpHでなければ無荷電であるから、粗グリセロールを、水素H型で始まる陽イオン交換樹脂に通し、次に水酸化物OH-型で始まる陰イオン交換樹脂に通すか、その逆を行うことができる。あるいは、2タイプの樹脂の混合物を含んでいる混床式イオン交換樹脂に粗グリセロールを通すこともできる。2つの異なる樹脂を直列に使用することの方が混合床より好ましい。そのほうが樹脂の再生が容易だからである。イオン交換はカラムを使って行うか、バッチ式に行うことができる。グリセロールは、どちらのタイプの樹脂にも結合しないはずであるが、イオンは樹脂によって保持されるはずである。イオンは、他の周知の方法、例えば電気透析によって、またはグリセロールと望ましくない夾雑物とを識別することができる荷電膜もしくは非荷電膜を介したろ過によって、粗グリセロールから除去することもできる。グリセロールは蒸留または減圧蒸留によって精製することもできる。商業上有用な化学品の生産に適した微生物は、いくつかの異なる方法で得ることができる。好ましい一実施形態では、グリセロール以外の炭素源、例えばグルコースなどを使って特定の商業上有用な化学品を生産するために遺伝子工学と代謝的進化との混合プロセスによって得られた微生物細胞を、親株として使用する。例えば、コハク酸の商業的生産においてグリセロールを炭素源として使用することができる株を得るために、詳しく記述されている大腸菌のKJ122株Jantamaetal.,2008a;Jantamaetal.,2008b;Zhangetal.,2009a;Zhangetal.,2009bを、親株として使用することができる。炭素源としてグリセロールを用いるコハク酸の生産に有用な株を作出するための第1段階では、KJ122株を、グリセロールの取り込みおよび代謝を強化するための特異的遺伝子操作に付す。グリセロール代謝経路の遺伝子操作の後に、炭素源としてグリセロールを用いるコハク酸の生産に関して、商業的に魅力的な収量、力価、および生産性を持つ細菌株が得られるように、代謝的進化のプロセスを行うことができる。微生物細胞内でのグリセロール代謝経路に関する我々の現在の理解によれば、グリセロール代謝経路内で、遺伝子操作の適当なターゲットを同定することができる。図1に、微生物細胞内でのグリセロール代謝経路に関する我々の現在の理解の概要を示す。培養培地から微生物細胞中へのグリセロールの進入は、glpF遺伝子がコードする促進拡散タンパク質によって媒介される。ひとたび細胞に入れば、グリセロールは、ジヒドロアセトンリン酸の形成につながる2つの異なるルートによって代謝される。嫌気条件下で活性であると考えられる一方の経路では、gldA遺伝子がコードするグリセロールデヒドロゲナーゼによる作用を、グリセロールが受ける。グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールの酸化は、NADHの形成を伴って、ジヒドロキシアセトンを与える。次の段階では、dhaKLMがコードするホスホエノールピルビン酸依存性またはATP依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼによって、ジヒドロキシアセトンがリン酸化される。このリン酸化反応は、ジヒドロキシアセトンリン酸の形成につながる。グリセロール代謝のためのこの経路は、グリセロール代謝のための非古典的経路と呼ばれる。好気条件下またはナイトレートもしくはフマレートなどの代替的電子受容体が存在する嫌気条件下で作動すると考えられる微生物細胞内のグリセロール代謝のためのもう一つのルートでは、グリセロールがリン酸化されてグリセロール-3-リン酸を生じる。次のステップでは、GlpDまたはGlpABCがコードするグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼによってグリセロール-3-リン酸が酸化されて、ジヒドロキシアセトンリン酸が形成されることになる。グリセロール代謝のためのこの経路は、グリセロール代謝のための古典的経路と呼ばれる。グリセロール代謝のための古典的経路と非古典的経路の両方によって生じたジヒドロキシアセトンは、トリオースリン酸イソメラーゼの作用を受けて、グリセルアルデヒド-3-リン酸が形成されることになる。こうして形成されたグリセルアルデヒド-3-リン酸は、解糖経路の残りの部分を通って、最終的にトリカルボン酸サイクルに入り、解糖、発酵およびトリカルボン酸サイクル経路中で起こった遺伝子変化の性質に基づいていずれかの代謝中間体の蓄積をもたらしうる。グリセロール代謝のための古典的経路と非古典的経路は、関与する酵素および補因子の性質の相違だけでなく、これらの2つのグリセロール代謝経路の作動を制御する調節の性質も互いに異なる。古典的グリセロール経路は2つの異なる方法で調節される。第1に、glpF、glpK、glpD、およびglpABCの発現は、全て、中間体G3Pの存在下で、glpRがコードするタンパク質によって抑制される。第2に、GlpK酵素は、フルクトース1,6二リン酸によって阻害され、またホスホトランスフェラーゼ系PTSの構成要素である酵素IIAGlcEIIAGlcとも呼ばれ、以前は酵素IIIGlcまたはEIIIGlcと呼ばれたこれは大腸菌の場合であればcrr遺伝子によってコードされるの非リン酸化型によって阻害される。これらの調節機序の結果は、培地中にグルコースが存在する場合には、グリセロールの利用が強く阻害されるということである。細胞をグルコースの存在下で増殖させると、GlpKの阻害剤の濃度はどちらも増加する。この特許出願においては、フルクトース1,6二リン酸またはEIIAGlcによるGlpK活性の阻害をフィードバック阻害または負の調節機序という。調節解除されたグリセロール経路という用語は、グリセロール資化のための経路であって、グリセロール資化経路に対して作動する1つ以上の負の調節機序が、宿主生物における遺伝的変化によって、機能低下しているか、または完全に除去されているものと定義される。そのような遺伝的変化には、例えば1GlpRなどのリプレッサーの機能に関する減少または排除、2フルクトース-1,6-二リン酸などの代謝中間体による、または酵素IIAGlcなどのホスホトランスフェラーゼ系PTS構成要素の非リン酸化型などといったタンパク質による、GlpKなどのグリセロールキナーゼの阻害の一部または全部の軽減、3例えばグルコースを輸入または代謝する細胞の能力を減少させることなどによる、グリセロール資化のグルコース阻害の減少、および/または4glpD、glpFKXおよび/またはglpABCなどのグリセロール資化遺伝子またはオペロンのネイティブプロモーターを、glpR遺伝子がコードするGlpRタンパク質による抑制を受けない、より強いまたはより構成的なプロモーターで置き換えることなどがあるが、これらに限られるわけではない。いくつかの構成的に活性なプロモーターが当技術分野ではよく知られており、本発明では、それらをどれでも、野生型細菌細胞においてGlpRタンパク質の制御下にあるglpFKX、glpD、およびglpABC遺伝子/オペロンのネイティブプロモーターを置き換えるために使用することができる。構成的に活性なプロモーターによる任意の遺伝子のネイティブプロモーターの置き換えは、微生物遺伝子工学の分野においてよく知られているいずれかの遺伝子工学技法を使って、例えばcat,sacBカセットの挿入によってネイティブプロモーターを置き換え、次にそれを、当技術分野において周知の構成的に活性なプロモーター配列で置き換える、実施例6に記載の2ステップアレル置換法などを使って、達成することができる。G3Pもしくは非リン酸化酵素IIAGlcまたはその両者によるフィードバック阻害に対して耐性なglpKの変異体アレルの報告はいくつかあるBell,1974;Pettigrewetal.,1996。これらのアレルの一部は、元々は、グルコースグリセロールでの増殖に関する選択によってG3P栄養要求体から得られたBB20-14およびBB26-36と呼ばれる株において、CronanおよびBellによって分離されたものであるCronanandBell,1974a;CronanandBell,1974b。これらの株は、フィードバック耐性グリセロールキナーゼを含有すると推定された。これらの株からのglpK遺伝子のDNA配列は、今までのところ公表されていない。エール大学米国コネチカット州ニューヘブンのColiGeneticStockCenterCGSCは、これら2つの株を提供することができ、キュレーターは、これら2つの株のアレルを、それぞれglpK15fbRおよびglpK14fbRと名づけている。簡単にするために、本明細書では、これらのアレルをそれぞれglpKi15およびglpKi14と呼ぶことにする。ここで、上付きのiは、フィードバック阻害に対する非感受性を表す。glpKi22と名付けられたglpKのもう一つのフィードバック耐性アレルは、Lin43と名付けられた株において、ZwaigおよびLinが初めて分離したものでありZwaigandLin,1966、後にPettigrewetal.1996らによって特徴づけられ、配列決定された。この変異体は、グルコースの存在下で放射性グリセロールを取り込むその能力によって同定された。glpKのフィードバック耐性アレルを分離する際にとられたもう一つのアプローチは、一定のPTS変異の抑制について選択することであったBermanandLin,1971。このアプローチにより、フルクトース1,6-二リン酸による阻害に対して耐性であるグリセロールキナーゼを含有するLin225株が生じたが、この株からのglpK遺伝子が特徴づけられることはなかった。Lin225株中のglpKアレルは、エール大学のColiGeneticStockCenterにより、glpKi31と名付けられた。グリセロールに基づく増殖培地への適応中に選択的増殖優位性を伝達する変異の獲得および固定を監視するための大腸菌の全ゲノム配列決定により、グリセロールキナーゼの遺伝子における一連の変異が同定されたIberraetal.,2002;Herringetal.,2006;Honischetal.,2004。変異体glpK遺伝子を発現する細胞からの部分精製タンパク質は、グリセロールキナーゼ酵素に関して野生型より51~133高い反応速度を示し、一部の変異体は、フルクトース-1,6-二リン酸によるグリセロールキナーゼの阻害に低減を示したHerringetal.,2006。本発明において、フィードバック耐性グリセロールキナーゼは、フルクトース1,6-二リン酸の存在下もしくは同じ生物に由来するホスホトランスフェラーゼ系PTS構成要素である酵素IIAGlcの非リン酸化型の存在下または両阻害剤の存在下で、関連する野生型酵素よりも高い比活性を有するグリセロールキナーゼと定義される。フィードバック耐性は、グリセロールキナーゼ酵素、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、またはグリセロールキナーゼのアレルを議論する際に言及することができる。このように、当技術分野では、フィードバック耐性glpKアレルを分離するための方法が4つ知られている:1グルコースグリセロールにおけるG3P栄養要求体の増殖に関する選択、2グルコースの存在下での放射性グリセロールの取り込み、3PTS酵素I変異体の抑制、4最少グリセロール培地におけるより迅速な増殖についての選択Bell,1974;ZwaigandLin,1966;BermanandLin,1971;Honischetal.,2006。フィードバック耐性glpKアレルを分離する際に、本発明では、これら4つの方法をどれでも使用することができる。本発明において提供される例は大腸菌に基づくが、任意の細菌種、特にクレブシエラKlebsiella属、サルモネラSalmonella属、エンテロバクターEnterobacter属、セラチアSerratia属、およびシトロバクターCitrobacter属の他の任意の細菌種において、同様のアプローチをとることができる。これらのglpKのフィードバック耐性アレルはどれでも、特定の商業上重要な化学品の生産用に既に開発されている細菌株における野生型glpK遺伝子を置き換えるために使用することができる。コハク酸の商業的生産用に既に開発されている大腸菌のKJ122株中の野生型glpK遺伝子を、フィードバック阻害に対して耐性である変異体glpKアレルで置き換えることができる。あるいは、glpKの変異体アレルによる野生型glpK遺伝子の置き換えを野生型大腸菌で行い、その結果生じたglpKの変異体アレルを持つ細菌株を、コハク酸の商業的生産のための株を開発する際の親株として使用することができる。glpKの変異体アレルによるglpKの野生型アレルの置き換えは、微生物遺伝子工学の分野においてよく知られているいずれかの遺伝子工学技法を使って達成することができる。一般的には、親株中の野生型glpK遺伝子をまず、その座位に抗生物質マーカー遺伝子を挿入することによって置き換える。第2段階では、その抗生物質マーカー遺伝子を、glpKの変異体アレルで置き換える。glpKの変異体アレルは、バクテリオファージを介した形質導入プロセスを使って、glpKの変異体アレルを有するとされる株から受容株へと移すことができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使って、受容株からプラスミドベクター中に、または直接、染色体中に、変異体アレルをクローニングすることもできる。その場合は、変異体glpKアレルを持つプラスミドベクターを使って、受容細菌株を形質転換することができる。本発明のもう一つの態様では、glpK遺伝子中の変異の性質がヌクレオチドレベルでわかっている場合に、合成オリゴヌクレオチドによるインビトロ変異導入を使って、プラスミドベクター中に変異体glpKアレルを作製する。プラスミドベクターからの変異体glpKアレルを使って、形質転換によって野生型glpKアレルを置き換え、次に二重組換えを行うことができる。あるいは、線状DNAフラグメント上に含まれる変異体glpKアレルを使って、形質転換によって野生型glpKアレルを置き換え、次に二重組換えを行うこともできる。本発明のもう一つの実施形態では、グリセロール経路の調節解除が、glpR遺伝子がコードするリプレッサータンパク質GlpRによるglpF、glpK、およびglpABC遺伝子の発現の抑制を克服することによって付与される。GlpRタンパク質の抑制効果は、2つの異なる方法によって克服することができる。第1の方法では、GlpRタンパク質がglpF、glpK、およびglpABC遺伝子の発現抑制にはもはや有効でなくなるように、glpR遺伝子配列が改変される。好ましい実施形態では、GlpRタンパク質の合成そのものが阻害される。GlpRタンパク質合成の阻害は、glpR遺伝子配列の挿入不活化によって達成することができる。例えば、抗生物質マーカーカートリッジを、GlpRタンパク質がもはや生産されなくなるように、glpRオープンリーディングフレームに挿入することができる。最も好ましい実施形態では、glpRオープンリーディングフレームが正確に除去され、この座位には外来ヌクレオチド配列が残っていない。微生物細胞内のグリセロール資化経路が完全に調節解除されていることを確実にするには、機能的なglpR遺伝子を完全に排除することに加えて、フィードバック耐性glpKアレルを持っておくことが好ましい。これら2つの遺伝子修飾を野生型細菌株で行うことにより、完全に調節解除されたグリセロール資化経路を持つ親細菌株を作出することができる。次に、グリセロール資化経路が完全に調節解除されている親細菌株を、さらに特異的遺伝子修飾と代謝的進化とに付して、コハク酸や乳酸などの特定代謝産物の生産に関して高い収量および生産性を有する細菌株を得ることができる。好ましい実施形態では、glpR遺伝子の不活化およびglpKのフィードバック耐性アレルの導入が、特定の商業上有用な化学品を生産するために既に遺伝子改変され代謝的に進化させた株で行われる。例えば、glpR遺伝子の不活化およびglpK遺伝子のフィードバック耐性アレルの導入は、炭素源としてグルコースを用いるコハク酸生産のために既に開発されている大腸菌のKJ122株で行うことができる。もう一つの実施形態では、glpF、glpK、およびglpABC遺伝子発現のGlpRによる抑制が、GlpRリプレッサータンパク質による調節に対して感受性であるglpF、glpK、およびglpABC遺伝子のネイティブプロモーター領域を、GlpRタンパク質による抑制に対して感受性でない構成的プロモーターで置き換えることによって克服される。好ましい一実施形態では、GlpRによる抑制に対して感受性でない構成的プロモーターを持つ細菌株において、glpK遺伝子の野生型アレルを、フィードバック耐性glpKアレルで置き換える。グリセロール資化経路の調節解除につながるこれら2つの遺伝子修飾は、野生型細菌株において行うことができ、それにより、調節解除されたグリセロール資化経路を持つ親株の形成がもたらされる。グリセロール資化経路が調節解除されているそのような親株を、遺伝子操作および代謝的進化にさらに付して、炭素源としてグリセロールを用いて商業上有用な化学品を生産する能力を有する細菌株を作出することができる。あるいは、具体的化学品の商業的生産のために既に開発されている細菌株において、glpF、glpKおよびglpABC遺伝子のネイティブプロモーターを、詳細の明らかな、構成的に活性なプロモーターで置き換えること、およびglpKの野生型アレルをフィードバック耐性glpKアレルで置き換えることもできる。本発明の微生物は、マイクロエアレーションを行っている発酵培地中で増殖させる。本発明における好ましい酸素の供給速度3Lの出発体積において空気の形態で40ml/分は、発酵槽中の培地の出発体積に基づいて、約0.0026/分であり、これは、約228mg/リットル-時の酸素に相当する。この速度は、TrinhおよびSriencの先行技術2009が提唱している至適速度0.15/分であると述べられているよりかなり低く、GonzalezおよびCampbellの先行技術WO/2010/051324が提唱している至適濃度1~20mg/リットル-時と報告されているよりかなり高い。本明細書において使用する用語遺伝子改変または遺伝子工学は、微生物のゲノムDNAまたはプラスミドを操作することによって微生物中の1つ以上の酵素の発現を改変させる行為を指す。ゲノム操作は、特異的DNA配列の改変、付加またはゲノムDNAからの除去を伴う。遺伝子操作は、微生物のゲノムDNA配列への外来DNA配列の挿入も伴う。本発明の最も好ましい実施形態では、遺伝子操作の一部が、外来DNAを何も導入することなく微生物のゲノムDNAから特異的DNA配列を除去することによって達成される。特定タンパク質産物をコードする遺伝子の発現を不活化するために必要な一定の遺伝子操作は、微生物のゲノムへの外来DNA配列の挿入を必要とする。本発明の最も好ましい実施形態では、遺伝子工学プロセスが終わった時点で微生物がその元のゲノムDNA中に外因性DNAを何も持たないように、導入された外因性DNA配列は、最終的には、微生物のゲノムDNAから除去される。本発明の好ましい実施形態の目的を達成するために必要なさまざまな技法は、代謝的進化のためのプロセスを含めて、Jantamaetal2008a,2008bに詳述されている。米国特許第7,629,162号および米国特許出願公開第2009/0148914号ならびに特許協力条約に基づいて国際公開第2008/115958号および同第2010/115067号として公開された国際特許出願にも、本発明のさまざまな実施形態を実施する際に役立つ遺伝子工学技法が記述されている。言及したこれらの科学文献ならびに特許文書は、本発明に役立つ遺伝子光学技法に関する詳細を提供する目的で、引用により本明細書に組み込まれる。実施例1KJ122株におけるグリセロール取り込みおよびグリセロール資化の負の調節の除去細菌株の平板選択、試験管におけるスクシネート生産、またはpH制御発酵槽におけるスクシネート生産には、3つの異なる最少培地を使用することができる。最少培地を表1に列挙する。リッチなブロスまたはプレートはLBとも呼ばれるルリアLuriaブロスとした10g/lトリプトン、5g/l酵母エキス、5g/l塩化ナトリウム。以下の株をエール大学コネチカット州ニューヘブンのColiGeneticStockCenterCGSCから入手した:JW3386-1ΔglpR::kanおよびJW3897-1ΔglpK::kan。P1virによる普遍ファージ形質導入を使って、JW3897-1からのΔglpK::kanアレルをKJ122に組み入れて、LB中の50mg/l硫酸カナマイシン25mMクエン酸ナトリウムを使ってカナマイシン耐性について選択し、グリセロールを唯一の炭素源とする最少プレートでの増殖の欠如によってΔglpK::kanの正しい組み入れを確認した図2。結果として生じた株をRY812と名づけた。並行して、BB20-14株イリノイ大学シャンペーン-アーバナ校イリノイ州のJohnCronanから入手中に存在する野生型ラムダプロファージを、選択用のN::kanを含む欠損ラムダプロファージを含有する供与株としてのTAP106株ATCC47075としても知られているからのP1vir形質導入によって取り除き、上述のようにカナマイシン耐性について選択することによってRY808株を得た。第2ステップでは、glpKi15アレルを含有するRY808からのglpK領域をRY812に形質導入し、最少SSグリセロールプレート表1参照での増殖について選択し、カナマイシン耐性の喪失について確認することにより、RY829C株を得た。第3ステップでは、JW3386-1のΔglpR::kanアレルをRY829Cに形質導入し、上述のようにカナマイシン耐性について選択することで、RY819J株を得た。これは、隣接するpckアレルを保っていることが示される分離株であったZhangら2009a;Zhangetal.,2009b。実施例2試験管におけるグリセロールからのスクシネートの生産KJ122株およびRY819J株をルリアブロス中で好気的に終夜増殖させた後、スクリューキャップ付き15mlポリプロピレン試験管中の、20g/lグリセロールを含有する12.5mlのNBS培地に、OD600が0.05になるように接種した。管に固く蓋をして、37°C、約60rpmで48時間、NewBrunswickScientificローラードラム上で転がした。Costarスピンフィルターによる遠心分離で細胞を除去することによって培養試料を調製し、必要に応じて0.008M硫酸に希釈し、BioRadAminexHPX-87Hカラムを装備したAgilentモデル1200装置を用いる高速液体クロマトグラフィーHPLCで分析した。カラムを50°Cで稼働し、0.008M硫酸を溶媒とし、検出は屈折率と210nmにおける吸収との両方によった。試料を、コハク酸、グリセロール、グルコース、アセテート、および他の副産物の濃度について分析した。各化学品の濃度は純粋な市販化合物で作成した標準曲線を使って算出した。KJ122は0.06g/lのスクシネートを生産したが、RY819Jは0.61g/lのスクシネートを生産し、出発株からの改良は明白だった。実施例3RY819Jの代謝的進化RY819J株を、10g/lグルコースおよび10g/lグリセロールを含有するNBS培地中で好気的に終夜増殖させてから、50g/lグリセロールおよび50g/lグルコースを含有する300mlのAM1培地表1参照が入っている作業容積500mlの有蓋発酵槽に、出発OD600が0.2になるように接種した。磁気撹拌子を使って発酵槽を150rpmで撹拌したが、意図的な通気は行わなかった。このように発酵槽は厳密な嫌気性ではなかった。試料採取中に、また塩基添加から、多少の空気は入ることができるからである。pHは3M炭酸カリウムの添加によって6.5に制御し、温度は40°Cに維持した。スクシネートを約48時間生産した。グリセロールとグルコースは並行して消費されたが、48時間後は、グリセロールの一部が残っていた。最終細胞密度は約3.0のOD600であった。同じ培地を使用し、第1発酵槽からの試料を使って、出発OD600が0.2になるように第2発酵槽に接種し、増殖とスクしネート生産を再開した。この再接種手順を本明細書では継代transferと呼ぶことにする。スクシネート生産が止まった後に、第3発酵槽への接種物の2回目の継代を上述のように行い、その後、さらに数回の継代を行った。最初の数回の継代中は、増殖を刺激するために、グルコースが培地中に存在した。一般に、最初の数回の継代では、ある程度のグルコースまたは硝酸カリウムが存在しない限り、増殖が遅かったので、後続の継代のために十分な増殖が得られるように、グルコースまたは硝酸塩をさまざまな時点で発酵槽に加えて、増殖を増強した。最初の4回の継代は50g/lグルコース50g/lグリセロールで開始した。第5~9継代は50g/lグリセロールだけで開始し、グルコースを含まなかったが、次の継代のために十分な増殖が得られるように、発酵中に10g/lグルコースを加えた。第10継代では、まず1g/l硝酸カリウムを補足し、後に10g/lグルコースを補足した。添加物および発酵槽への添加の時点を、表2に要約する。11回目の継代からは、グルコースも硝酸塩も培地に加えず、唯一の炭素源を50g/lグリセロールとした。それでも、ようやく、継代を行うのに十分な増殖が得られた。試料をさまざまな時点で、上述のようにHPLCで、分析した。第11継代では、384時間後に、グリセロールの全てが消費されており、スクシネート力価は425mMであった。これは、塩基による希釈後に、消費されたグリセロール1グラムあたり1.08グラムのスクシネートという収量を与えることになると計算された。さらに3回の継代を行ったが、コハク酸生産に関して株の性能のさらなる有意な改良は見られなかった。14回目の継代から単一コロニーを分離し、その分離株をRY819J-T14と名づけた図2実施例4さまざまなglpKアレルのDNA配列決定ここで使用した株の多くの元となった大腸菌CATCC8739および大腸菌K-12のglpFKXオペロンの野生型DNA配列は、米国国立衛生研究所のGenBankデータベース、アクセッション番号NC_010468およびNC_000913に、それぞれ見出すことができる。glpF遺伝子のほぼ半分とglpX遺伝子の半分とに囲まれたglpK遺伝子を、次の大腸菌株からのゲノムDNAを使って、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅した:BB20-14、BB26-36、Lin225およびLin298。最後の3株は全て、エール大学コネティカット州ニューヘブンのColiGeneticStockCenterCGSCから入手した。CGSCによれば、これら4つの株、すなわちBB20-14、BB26-30、Lin225およびLin298はそれぞれ、なかんずく、glpKi15、glpKi14、glpKi31、およびglpKi22を含有している。これらのうち、glpKi22だけが配列決定されいて、G304Sアミノ酸変化が明らかになっていたPettigrewら,1996;Honischら,2004。しかしこの配列は、CGSCからは入手できないLin43株に由来するものであった。そこで本発明者らは、入手可能であってLin43に由来するとされているLin298を使用した。増幅に使用したPCRプライマーは、BY19配列番号1およびBY44配列番号2である。PCRプライマーおよびシークエンスプライマーのDNA配列を表3に掲載する。PCR用の試薬類はNewEnglandBioLabsのPhusionMasterMixであり、これらを供給者の推奨どおりに使用した。その結果生じた、BB20-14、BB26-30、Lin225およびLin298からの平滑末端DNAフラグメントをゲル精製し、それをpRY521配列番号10のEcoRV部位にクローニングすることで、それぞれプラスミドpMH4-20、pMH4-26、pMH4-225、およびpMH4-298を得た。これらのプラスミドのそれぞれからのglpK遺伝子および隣接配列を、シークエンスプライマーBY15配列番号3、BY16配列番号4、BY19配列番号1、BY30配列番号6、およびBY44配列番号2を用いるサンガーSangerチェーンターミネーション法によって配列決定した。4つのプラスミドのうちの3つがglpKコード領域に変異を含有していた。本明細書に掲載するDNA配列位置情報は全て、オープンリーディングフレームの最初の塩基を1と数え、アミノ酸位置情報は全て開始コドンを1と数えている。3文字アミノ酸コードについては、2007-2008NewEnglandBioLabsCatalogの361頁を参照されたい。pMH4-20はglpK中に2つの点変異G163A;Ala55ThrおよびG470A;Arg157Hisを持ち、意外にも、glpF中に単一の点変異C821T;Pro274Leuを持っていた。pMH4-26は、glpK中に単一の点変異C164T;Ala55Valを持ち、意外にもglpF中に単一の点変異G724A;Val242Ileを持っていた。pMH4-225は、glpK中に単一の点変異C176A;Ser59Tyrを持っていたが、glpF中には変異を持っていなかった。pMH4-298は配列決定した領域には変異を持っていなかった。最後の結果は、Lin298株がLin43と同じglpK変異上記参照を持つはずであることを暗示する公表文献と矛盾する。本発明者らが使用したLin298の分離株はどういうわけかglpKi22アレルを失っていたか、あるいは本発明者らの分離株が実際にはLin298株ではなかったか、あるいはLin298は実際にはLin43に由来していなかったと思われる。上記の結果の最も可能性が高い解釈は、glpK遺伝子中の点ミスセンス変異が、コードされているGlpK酵素の実証されたフィードバック耐性または推定されるフィードバック耐性の説明になるということである。glpKi15アレルは2つの別個の変異を含有したので、どちらか一方の変異が単独でフィードバック耐性表現型を付与しうることが考えられるが、いずれにせよ、本発明者らは、BB20-14におけるグリセロールキナーゼのフィードバック耐性表現型にはこれら2つの変異の組み合わせで十分であると結論付けることができた。上記プラスミドに加えて、2つの類似プラスミドをKJ122およびRY819JのglpK領域から構築することで、それぞれpMH4-KJおよびpMH4-RY819を得た。クローニングされたインサートのDNA配列は予想どおりだった。pMH4-KJは野生型glpKおよびglpF配列を含有し、一方、pMH4-RY819は、glpK中の2つの点変異およびglpF中の単一の点変異を含めてpMH4-20と同一の配列を含有していた。実施例5RY819J-T14からのカナマイシン耐性遺伝子の除去RY819J-T14株は、KeioCollectionのメンバーであるJW3386-1株Babaetal.,2006から形質導入されたΔglpR::kanアレルを含有している。したがって、ヘルパープラスミドpCP20をこの株に通すことによって、カナマイシン耐性遺伝子kanを除去して、短いDNA痕scarを残すことができるDatsenkoandWanner,2000。このプロセスをRY819J-T14で行ったところ、カナマイシン感受性誘導体MH23株が生じた。実施例6RY819Jおよび子孫のglpF遺伝子に見いだされる変異の矯正BB20-14株のglpF遺伝子には点変異が見つかった。この変異はglpK遺伝子と密に連鎖しているので、RY819Jに組み入れられることになり、MH22株にも伝達された実施例1および5参照。Jantamaetal.2008a,2008bに記載されているものと類似する2ステップ遺伝子置換法を使ってこの領域を野生型DNA配列で置き換えることにより、glpF中の変異を取り除いた。第1ステップでは、テンプレートとしてのpCA2配列番号11とプライマーBY71配列番号6およびBY72配列番号7とを用いるPCRによって、cat,sacBカセットを増幅した。その結果生じた3.2キロベースDNAフラグメントを、ヘルパープラスミドpKD46DatsenkoandWanner,2000を含有するMH23株に形質転換し、LB30mg/lクロラムフェニコール上でクロラムフェニコール耐性について選択することで、MH27株glpF::cat,sacBを得た。第2ステップでは、テンプレートとしての大腸菌CATCC8739DNAとプライマーBY73配列番号8およびBY74配列番号9とを用いるPCRによって、野生型glpF領域を増幅した。その結果生じた1.7キロベースDNAフラグメントをMH27に形質転換し、LB6スクロース上でスクロース耐性について選択し、LB30mg/lクロラムフェニコール上でクロラムフェニコール感受性について確認した。その結果生じた株を、pKD46の除去後に、MH28と名づけた図3。MH28のglpFおよびglpK領域を配列決定することで、野生型glpFが組み入れられていること、およびglpK中のフィードバック耐性変異が、株構築の全ステップを通して保持されていることを確認した。実施例7pH制御発酵槽におけるKJ122およびMH28によるグリセロールからのスクシネートの生産出発株KJ122および派生株MH28を、7リットルNewBrunswickScientific発酵槽におけるスクシネート生産について、接種物を含む3.15リットルの出発容積で評価した図5および6。20g/lグリセロールと0.1MMOPS緩衝液pH7.0とを含有するNBS培地表1参照を使って、150mlの接種物を、振とうフラスコ中で好気的に終夜増殖させた。その接種物を、名目上120g/lグリセロールA.C.S.グレード、MallinckrodtChemicals、カタログ番号5092-02、CAS番号56-81-5を唯一の炭素源として含む3リットルの発酵培地表1参照が入っている発酵槽に加えた。時刻0および発酵の終了時におけるグリセロール濃度の測定値については表4を参照されたい。温度は39°Cに保ち、必要に応じて3M炭酸カリウムをポンプ注入することによってpHを7.0に保った。マイクロエアレーションは、空気を40ml/分の速度この速度は、通気速度を体系的に変化させることによって、魅力的なスクシネート生産レベルにとって十分であることが示されたでポンプ注入することによって一定にした。インペラー速度は750rpmとした。試料を採取し、上述のようにHPLCを使って、有機酸およびグリセロールについてアッセイした。MH28株では、48時間までに、グリセロールが完全に消費されたが、親株KJ122ではそうならなかった表4参照。MH28は84.3g/lのスクシネートを生産し、収量は1.0g/g-消費グリセロールであった。唯一際立った副産物は3.3g/lのアセテートであった。対照的に、出発株であるKJ122は18.9g/lのスクシネートしか作らず、48時間の時点で最終ブロスに83.5g/lのグリセロールが残ったので、スクシネート収量は0.6g/g-消費グリセロールになった。試験した条件では、MH28株が、スクシネート生産に関して、KJ122株よりはるかに改良されていることは明らかである。当技術分野の科学者であれば、本明細書に記載した方法を使って、MH28に類似しているが、フィードバック耐性グリセロールキナーゼをコードするglpK遺伝子の他のアレルを含有する株を、構築することができるであろう。考えられるアレルは、例えばglpKi14、glpKi22、およびglpKi31アレル、ならびにHonischetal.2004に記載のアレルなど、上でいくつか言及した。例えば、グリセロールキナーゼにおけるアミノ酸変化:Gln28Pro、Trp54Gly、Val62Leu、Asp73Ala、Asp73Val、Gly231Asp、および235GlyGlyLysの挿入を引き起こす変異を、フィードバック耐性表現型を付与するために使用することができる。当業者であれば、ここに開示した方法を使って、グリセロールを発酵させて、商業上関心が持たれる他の有機酸、例えばラクテート、マレート、およびフマレートなどにする株を構築できることも、わかるであろう。本明細書に記載する具体例では生産生物として大腸菌を使用し、実施例で使用した遺伝子には、大腸菌命名法を使用したが例えばglpRグリセロール-3-リン酸依存性リプレッサー、glpKグリセロールキナーゼ、glpABCグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびglpFグリセロール促進拡散因子、他の微生物における発酵による商業上関心が持たれる化学品の生産について、グリセロール利用の強化を達成するために、他の微生物に由来するこれらの構成要素の機能的類似体および構造的ホモログである遺伝子およびタンパク質を、本明細書に教示されているように改変しうることは、当業者であればわかるだろう。[参考文献]読者の便宜のために、参考文献を全てここに列挙する。各文献はそのまま本明細書に組み込まれる。米国特許第5,000,000号米国特許第5,028,539号米国特許第5,424,202号米国特許第5,482,846号米国特許第5,916,787号米国特許第6,849,439号米国特許第7,098,009号米国特許第7,223,567号米国特許第7,241,594号米国特許第7,244,610号米国特許第7,262,046号米国特許第7,470,530号米国特許第7,629,162号米国特許第7,790,416号米国特許出願第2009/0176285号米国特許出願第2009/0186392号米国特許出願第2009/0148914号米国特許出願第2010/0184171号米国特許出願第2011/0008851号国際公開第2007/115228号国際公開第2008/115958号国際公開第2009/024294号国際公開第2009/048202号国際公開第2010/051324号国際公開第2010/092155号国際公開第2010/115067号Baba,T.,Ara,T.,Hasegawa,M.,Takai,Y.,Okumura,Y.,Baba,M.,Datsenko,K.A.,Tomita,M.,Wanner,B.L.,andMori,H.2006ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-geneknockoutmutants:theKeiocollection.MolSystBiol2:20060008.Bell,R.M.1974MutantsofEscherichiacolidefectiveinmembranephospholipidsynthesis:macromolecularsynthesisinansn-glycerol3-phosphateacyltransferaseKmmutant.JBacteriol117:1065-1076.Berman,M.,andLin,E.C.1971Glycerol-specificrevertantsofaphosphoenolpyruvatephosphotransferasemutant:suppressionbythedesensitizationofglycerolkinasetofeedbackinhibition,JBacteriol105:113-120.Blankschien,M.D.,Clomburg,J.M.,andGonzalez,R.2010MetabolicengineeringofEscherichiacolifortheproductionofsuccinatefromglycerol.MetabEng12:409-419.Chen,Z.,Liu,H.,Zhang,J.,andLiu,D.2010ElementarymodeanalysisfortherationaldesignofefficientsuccinateconversionfromglycerolbyEscherichiacoli.JBiomedBiotechnol2010:,518743.Clomburg,J.M.,andGonzalez,R.2010BiofuelproductioninEscherichiacoli:theroleofmetabolicengineeringandsyntheticbiology.ApplMicrobiolBiotechnol86:419-434.Clomburg,J.M.,G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