"被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表1-1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表1-2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表2に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択されたペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択されたペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表4に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表5に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表6に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法。工程5において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、前記表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することを特徴とする、請求項3に記載の評価方法。工程1における、免疫沈降法によるMDA-LDLの分取に利用される、抗MDA-LDLモノクローナル抗体は、MDA-LDL中に含まれる、MDA化を受けたApoB100タンパク質に特異的なモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の評価方法。また、工程3における、等電点電気泳動法を適用するペプチド断片の分画は、等電点タンパク質分離チップを利用して実施することを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の評価方法。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第一の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第二の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第三の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法。心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表7-1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表7-2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法。心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表8に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法。心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表10に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表11に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表12に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法。選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、前記表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することを特徴とする、請求項12に記載のマーカーの選択方法。上記のsandwichELISA法を利用する、対象抗原目的タンパク質の検出、定量方法は、捕獲抗体の認識部位第一のエピトープ、一次抗体認識部位第二のエピトープがそれぞれ特異的であるため、この二つの認識部位以外の領域に、酸化や変性が生じているか、否かの判定はできない。従って、酸化LDL、変性LDLのうち、捕獲抗体の認識部位第一のエピトープならびに一次抗体認識部位第二のエピトープを共に保持する酸化LDL、変性LDLの総量を定量する目的に利用されている。具体的には、捕獲抗体として、酸化LDL、変性LDLを認識するが、LDLは認識しない特異的な抗体を採用し、一方、一次抗体として、酸化LDL、変性LDL、LDLのいずれも認識する抗体を採用する検出系が報告されている非特許文献1、特許文献1参照。前記酸化LDL、変性LDLを認識するが、LDLは認識しない特異的な抗体として、例えば、抗酸化LDLモノクローナル抗体DLH3が報告されている非特許文献1参照。該DLH3抗体は、未処理のLDL、アセチル化LDL、MDA-LDL、糖化LDLとは結合せず、また、LDLに含まれるリン脂質のホスファチジルコリンPC、あるいは、その他の脂質コレステロールエステルなどとも結合せず、PCの酸化で生じる、アルデヒド型酸化PCと結合する。さらに、前記酸化LDL、変性LDLを認識するが、LDLは認識しない特異的な抗体として、例えば、ヒトMDA-LDLに対するモノクローナル抗体も報告されている特許文献1参照。ヒトMDA-LDLは、LDLの核となるタンパク質であるApoB100タンパク質に対して、マロンジアルデヒドmalondialdehydeMDAが結合したものである。LDLの酸化過程では、例えば、PCの過酸化過程に伴い、その高度不飽和脂肪酸の炭素鎖の酸化産物として、MDAを含む各種のアルデヒド分子が生成される。生成するMDAは、CH2CHO2⇔HO-CH=CH-CHOのケト-エノール互変異性が可能であり、タンパク質に含まれるLys残基の側鎖上にあるアミノ基-NH2との反応により、例えば、-NH-CH=CH-CHOの形状の修飾を行う。従って、酸化LDLでは、少なくとも、含まれるリン脂質、例えば、PCの酸化と、ApoB100タンパク質に対するMDA化とが進行している。LDLと、LDL受容体との結合は、LDL受容体に対するApoB100タンパク質の結合に因っている。ApoB100タンパク質に対するMDA化が進行すると、LDL受容体に対するApoB100タンパク質の結合能が損なわれる。一方、マクロファージは、そのスキャベンジャー受容体を介して、酸化LDLを結合し、細胞内に取り込み、泡沫細胞を形成する。生活習慣病の予防対策が政策の一つに挙げられるように、その対策の効果は、社会的経済的に大きく波及する。なかでも、動脈硬化症は、虚血性心疾患、脳梗塞などの主因となる。従って、動脈硬化症の予防的対策は、医学的、社会的に重要な課題である。動脈硬化は、次のような機序で進行すると考えられている。血管内皮下層にコレステロールエステルが蓄積する。コレステロールエステルの蓄積が生じた部位には、平滑筋細胞、結合組織なども集まってくる。次いで、粥腫アテロームと呼ばれる状態を形成し、粥腫の形成に伴い、さらに肥厚する。最終的に、粥腫の形成部位では、血管は硬化し、動脈の機能が低下する。前述の動脈硬化の進行過程中、粥腫の形成段階は、泡沫細胞が主に関与している。粥腫の形成に関与する泡沫細胞は、マクロファージが、酸化LDLを取り込むことにより生じると報告されている。マクロファージによる酸化LDLの取り込みは、LDL受容体に対する親和性を失った酸化LDLを、スキャベンジャー受容体を介して、該酸化LDLを結合し、その細胞内に取り込む機構に因っている。すなわち、該酸化LDLは、MDAがLDLの主成分タンパク質であるApoB100に結合して形成されるMDA-LDLの形状となっている。従って、酸化LDL、特には、MDA-LDLが、動脈硬化の初期病変に関与していることを査証する結果が報告されている非特許文献2参照。以上の動脈硬化症の進行の機序を考慮し、血液中の酸化LDL、特に、MDA-LDLの検出、定量を目的として、抗MDA-LDL抗体を利用するELISA法による検査が実用化されている特許文献1参照。しかしながら、抗MDA-LDL抗体を利用するELISA法による酸化LDLの検出は、酸化LDLの血中濃度の把握が主な目的であり、酸化LDL、特に、MDA-LDL中、ApoB100タンパク質中の酸化部位MDA化部位の特定には、利用できない。従って、酸化LDL、特に、MDA-LDL中、ApoB100タンパク質中の酸化部位MDA化部位と、動脈硬化症、さらには、虚血性心疾患を含め、アテローム性動脈硬化に起因する心疾患の病態との関連付けなどには、利用できない。その理由は、ELISA法による検査で利用する捕獲抗体は、抗原目的タンパク質の特定の部位エピトープを高い選択性で認識するものであり、該特定の部位エピトープ以外の部分を俯瞰するには、本来、不向きであるためである。以上の状況から、現時点では、酸化LDL中のApoB100タンパク質に対する修飾状態と、動脈硬化の進行度や動脈硬化発症機序の詳細など、所謂、臨床情報との関連について、明確な報告は少ない。この現状を考慮した結果、本発明者らは、下記の課題が存在することを見出した。動脈硬化の進行、特には、アテローム性動脈硬化の進行は、酸化ストレスによるLDLの酸化の結果、酸化LDLの血中濃度の上昇と、酸化LDL中のApoB100タンパク質に対する修飾MDA化の結果、LDL受容体に対する親和性を失うことに起因している。従って、酸化LDLの血中濃度の測定に加えて、酸化LDL中のApoB100タンパク質における修飾MDA化状態を測定することは、酸化ストレスの水準を推定することを可能とする。加えて、酸化LDLの血中濃度の測定、酸化LDL中のApoB100タンパク質における修飾MDA化状態の測定を同時に行い、動脈硬化の進行度や動脈硬化発症機序の詳細など、所謂、臨床情報との関連を見出すと、動脈硬化の進行度を合理的に推定する際に有効な、臨床的検査手段の開発に役立つ。本発明は、前記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、まず、酸化LDL中のApoB100タンパク質における酸化部位、修飾部位MDA化部位のうち、動脈硬化の進行度を反映して、酸化、修飾を受ける確率が明確に変化する、特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位の一群を特定することにある。同時に、本発明の目的は、特定される特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位の一群について、各酸化部位、修飾部位MDA化部位が酸化、修飾を受けているか、否かを、簡便に、高い確度で定量的に検出することが可能な、該特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位の酸化、修飾状態の検出方法を提供することにある。加えて、本発明の目的は、酸化LDL中のApoB100タンパク質における、該特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位の酸化、修飾状態の検出方法を利用し、該特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位が酸化、修飾を受けている比率を測定し、測定された比率に基づき、動脈硬化の進行度を統計的に推定する方法を提供することにある。従来、アテローム性動脈硬化を示す動脈硬化症、さらには、アテローム性動脈硬化に起因する心疾患、特には、虚血性心疾患の病態の進行度、すなわち、冠動脈病変枝数ACITIPIscoreの評価を行う際、しばしば、カテーテル検査が、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に利用されていた。従って、本発明の目的は、前記冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に利用されているカテーテル検査に代えて、患者から採取した血液サンプルを用いて、該血液サンプル中に含まれる、酸化LDL中のApoB100タンパク質における、該特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位が酸化、修飾を受けている比率を測定し、測定された比率に基づき、冠動脈病変枝数の評価に利用可能な、動脈硬化の進行度を統計的に推定する方法を提供することにある。本発明者らは、前記課題を解決すべく、酸化LDL中のApoB100タンパク質における酸化部位、修飾部位MDA化部位のうち、動脈硬化の進行度を反映して、酸化、修飾を受ける確率が明確に変化する、特異的な酸化部位、修飾部位MDA化部位の一群の特定を進めた。先ず、本発明者らは、以下の予想を行った。酸化LDLの血中濃度の上昇は、酸化ストレスに起因するLDLの酸化により引き起こされる。その過程では、LDLに含有される脂質を構成する、脂肪酸の炭素鎖、特には、高度不飽和脂肪酸の炭素鎖の酸化に伴い、酸化産物として、MDAを含む各種のアルデヒド分子が生成される。酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成されるアルデヒド分子の量、例えば、MDAの量が異なる。MDAは、ApoB100タンパク質中のLys残基側鎖のアミノ基と反応し、MDA化を行うが、生成されるMDAの量が増すと、MDA化されるLys残基数が増す。すなわち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化LDLの血中濃度が変動するのみでなく、生成する酸化LDL中のApoB100タンパク質中のMDA化Lys残基MDA化部位の総数も変動することが予想される。加えて、生成する酸化LDL中のApoB100タンパク質において、Met残基の側鎖-CH2-S-CH3のイオウ原子の酸化も進行する。酸化ストレスの水準が高くなるとともに、酸化を受けるMet残基数が増す。すなわち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化LDLの血中濃度が変動するのみでなく、生成する酸化LDL中のApoB100タンパク質中の酸化されたMet残基酸化部位の総数も変動することも予想される。その際、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中に見出されるMDA化Lys残基は、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中においても、同様にMDA化Lys残基となっている。一方、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中では見出されない、複数個のMDA化Lys残基が、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中には存在すると予想される。同様に、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中に見出される酸化化Met残基酸化部位は、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中においても、同様に酸化Met残基となっている。一方、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中では見出されない、複数個の酸化Met残基が、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質中には存在すると予想される。次に、報告されている、ヒトMDA-LDLに対するモノクローナル抗体抗MDA-LDLモノクローナル抗体は、酸化LDL中のMDA化ApoB100タンパク質に選択的に結合することに着目した。具体的には、酸化LDL中のMDA化ApoB100タンパク質中に存在する、複数個のMDA化Lys残基のうち、特定のMDA化Lys残基が、該抗MDA-LDLモノクローナル抗体のエピトープ中に含まれることに着目した。その際、該抗MDA-LDLモノクローナル抗体が、酸化ストレスの水準が低い状況下で生成される酸化LDL中のMDA化ApoB100タンパク質と、酸化ストレスの水準が高い状況下で生成される酸化LDL中のApoB100タンパク質の双方に結合する場合、エピトープ中に含まれる、特定のMDA化Lys残基は、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にMDA化を受けるLys残基共通MDA化部位の一つであると判断される。従って、血液中に含まれる酸化LDLの定量に利用される、上記抗MDA-LDLモノクローナル抗体は、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にMDA化を受けるLys残基共通MDA化部位の一つを、そのエピトープ中に含んでいると判断される。換言すると、上記抗MDA-LDLモノクローナル抗体を捕獲抗体として使用する、免疫沈降法を適用すると、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、共通にMDA化を受けるLys残基共通MDA化部位の一つを有するMDA化ApoB100タンパク質を含んでいる酸化LDLMDA-LDLを選択的に分離できると判断される。一方、従来から、酸化LDLの血中濃度を測定する際には、採取された血液サンプルから、細胞成分を除去した、血漿bloodplasma、あるいは、細胞成分、繊維素原、凝固因子を除去した、血清bloodserumを調製する。次いで、該血漿サンプル、または、血清サンプル中に含まれる酸化LDLの濃度を、ELISA法により測定している。該血漿サンプル、または、血清サンプル中には、酸化されていないLDLと、酸化LDLが含まれている。酸化ストレスの水準が高い状況下においても、酸化されていないLDLの含有濃度CLDLと、酸化LDLの含有濃度COxLDLの比率は、COxLDL/CLDL<1ngμgLDLの範囲に留まる。実際、冠動脈病変枝数が高い、急性心筋梗塞AMI患者において測定されるCOxLDL/CLDLAMIと、冠動脈病変枝数が低い、健常者において測定されるCOxLDL/CLDLnormalを比較すると、その平均値は、COxLDL/CLDLAMI/COxLDL/CLDLnormalは3.5程度であると報告されている非特許文献1参照。免疫沈降法を適用することで分離される、酸化LDLは、実際は、その酸化の程度にある範囲の分布を有する、酸化LDLの混合物となっている。酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成される酸化LDLの混合物中における、酸化の程度の分布が相違している。その酸化の程度の分布の相違に起因して、生成する酸化LDL中のApoB100タンパク質中のMDA化Lys残基の総数の分布、ならびに、酸化Met残基の総数の分布に相違が生じていると予想される。ビーズ担体、例えば、磁気ビーズの表面に、抗MDA-LDLモノクローナル抗体を固定化した、抗体固定ビーズを用いる免疫沈降法を適用して、酸化LDL中、MDA-LDLを選択的に抗体に結合した後、固液分離によりビーズを回収し、洗浄すると、酸化LDLのうち、MDA-LDLのみを分離することができる。抗MDA-LDLモノクローナル抗体に選択的に結合されている、酸化LDLMDA-LDLは、MDA化ApoB100タンパク質と、酸化を受けた脂質とで構成されている。その際、結合されている酸化LDLMDA-LDLに、切断部位特異性を有するプロテアーゼを用いた消化処理、例えば、トリプシン消化処理を施すと、MDA化ApoB100タンパク質はペプチド断片化される。生成される一群のペプチド断片は、液相中に溶出される。MDA化ApoB100タンパク質の断片化に伴い、液相に溶出する、一群のペプチド断片は、脂質成分とも分離される。固液分離により、液相とビーズを分離し、液相を回収すると、回収された液相中に、MDA化ApoB100タンパク質の酵素消化で生成する、一群のペプチド断片が回収される。ApoB100タンパク質自体は、4563アミノ酸残基からなる巨大タンパク質であるため、ApoB100タンパク質のトリプシン消化処理で生成する、一群のペプチド断片の総数は、400種類を超える。従って、一群のペプチド断片を全て分離した上で、個々のペプチド断片中に、MDA化Lys残基MDA化部位あるいは、酸化されたMet残基酸化部位が存在するか、否かを判定することは、原理的には不可能ではないが、技術的には困難である。その点を考慮し、400種類を超える一群のペプチド断片を、その等電点pIに基づき、複数のグループに分画すると、分画された個々のグループは、20種類程度のペプチド断片からなる群とできることを見出した。また、各グループを構成する、20種類程度のペプチド断片は、その等電点pIは類似しているが、偶々、分子量Mpeptideが一致している二種のペプチド断片が、同じグループに含まれる確率は、殆ど皆無であることに想到した。従って、その等電点pIが類似している、各グループを構成する、20種類程度のペプチド断片について、質量分析法を利用して、ペプチド断片の分子量Mpeptideを測定すると、各ペプチド断片は、pIMpeptideのペプチド断片として、検出できることを見出した。その際、各ペプチド断片のアミノ酸配列は、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中の部分アミノ酸配列である。例えば、トリプシン消化処理では、Arg残基またはLys残基のC末端側でペプチド鎖の切断がなされるので、各ペプチド断片のC末端のアミノ酸残基は、Arg残基またはLys残基であり、各ペプチド断片のN末端のアミノ酸残基は、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、Arg残基またはLys残基のC末側に位置するアミノ酸残基となっている。ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、前記の条件を満足する部分アミノ酸配列を選別して、該部分アミノ酸配列からなる推定ペプチド断片の一群を作製し、各推定ペプチド断片について、部分アミノ酸配列から推定される分子量Mpredictedpeptideを算出する。測定されたpIMpeptideのペプチド断片の分子量Mpeptideと、測定誤差範囲内で一致する、部分アミノ酸配列から推定される分子量Mpredictedpeptideが見出されると、測定されたpIMpeptideのペプチド断片のアミノ酸配列は、その部分アミノ酸配列であると、高い確度で推定できることを見出した。一方、測定されたpIMpeptideのペプチド断片が、MDA化Lys残基MDA化部位または酸化Met残基酸化部位を含む場合、測定された分子量Mpeptideと、測定誤差範囲内で一致する、部分アミノ酸配列から推定される分子量Mpredictedpeptideが見出される確率は、殆ど皆無であることに想到した。換言すると、測定されたpIMpeptideのペプチド断片のうち、測定された分子量Mpeptideと、測定誤差範囲内で一致する、部分アミノ酸配列から推定される分子量Mpredictedpeptideが見出されないものは、そのアミノ酸配列中に、MDA化Lys残基MDA化部位または酸化Met残基酸化部位を含む可能性があることに想到した。測定されたpIMpeptideのペプチド断片のうち、測定された分子量Mpeptideと、測定誤差範囲内で一致する、部分アミノ酸配列から推定される分子量Mpredictedpeptideが見出されないものは、そのアミノ酸配列中に、少なくとも、何らかの修飾を受けたアミノ酸残基を含む可能性が高いことに想到した。酸化ストレスの水準の高低に依存して、生成される酸化LDLの混合物中における、酸化の程度の分布が相違している。その酸化の程度の分布の相違に起因して、生成する酸化LDL中のApoB100タンパク質中のMDA化Lys残基の総数の分布、ならびに、酸化Met残基の総数の分布に相違が生じていると予想される。従って、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化LDL中、特に、MDA-LDL中のApoB100タンパク質に由来する、一群のペプチド断片中、そのアミノ酸配列中にMDA化Lys残基または酸化Met残基を含んでいるペプチド断片pIMpeptideの含有濃度CpIMpeptideも、変動すると予測される。例えば、MDA-LDLの含有濃度CMDALDLと、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含んでいるペプチド断片pIMpeptideの含有濃度CpIMpeptideとの比、CpIMpeptide/CMDALDLは、酸化ストレスの水準の高低に依存して、変動すると予測される。その際、酸化ストレスの水準の高低に依存せず、MDA-LDL中のApoB100タンパク質中に共通して見出される、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含んでいるペプチド断片pIMpeptideでは、CpIMpeptide/CMDALDLは、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動は小さいと予想される。一方、酸化ストレスの水準の高低に依存して、MDA-LDL中のApoB100タンパク質中に見出される確率が大きく変動する、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含んでいるペプチド断片pIMpeptideでは、CpIMpeptide/CMDALDLは、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動は大きいと予想される。前記の予想を考慮して、本発明者らは、MDA-LDL中のApoB100タンパク質のアミノ酸配列中に、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片pIMpeptideの群を選別し、さらに、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片pIMpeptideの群のうち、CpIMpeptide/CMDALDLにおける、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群の選別を進めた。その際、酸化LDLである、MDA-LDLの1粒子には、ApoB100タンパク質が1分子のみ含まれている点に着目して、MDA-LDLの含有濃度CMDALDLの測定に代えて、MDA-LDL中のApoB100タンパク質分子の含有濃度CMDALDLApoB100と、ペプチド断片pIMpeptideの含有濃度CpIMpeptideとの比、CpIMpeptide/CMDALDLApoB100を採ると、CpIMpeptide/CMDALDLApoB100=CpIMpeptide/CMDALDLと見做すことが可能であることを見出した。酸化LDLである、MDA-LDL中のApoB100タンパク質の酵素消化で生成する、総種類数Npeptideの一群のペプチド断片pIMpeptideの含有濃度CpIMpeptideの平均値、CpIMpeptideav=ΣCpIMpeptide/Npeptideは、MDA-LDL中のApoB100タンパク質分子の含有濃度CMDALDLApoB100とほぼ等しくなる、すなわち、CpIMpeptideav≒CMDALDLApoB100となる。また、等電点電気泳動により、その等電点pIに基づき、グループ化した後、各グループを構成するペプチド断片の群から、質量分析によって、pIMpeptideのペプチド断片として分別された、pIMpeptideのペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]は、該pIMpeptideのペプチド断片の含有濃度CpIMpeptideに比例している。pIMpeptideのペプチド断片から、該ペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]の生成効率イオン化効率ppIMpeptideを考慮すると、IpI[MpeptideH]≒ppIMpeptideCpIMpeptideと近似的に表記できる。総種類数Npeptideの一群のペプチド断片pIMpeptideについて、測定された該pIMpeptideのペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]について、IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide≒CpIMpeptideの平均値、{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}av=Σ{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}/Npeptide≒ΣCpIMpeptide/Npeptideは、MDA-LDL中のApoB100タンパク質分子の含有濃度CMDALDLApoB100に比例する。すなわち、{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}av∝CMDALDLApoB100の比例関係が成り立つ。さらには、測定された該pIMpeptideのペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]と、{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}avの比;IpI[MpeptideH]/{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}avは、CpIMpeptide/CMDALDLApoB100に比例する。すなわち、IpI[MpeptideH]/{IpI[MpeptideH]/ppIMpeptide}av∝CpIMpeptide/CMDALDLApoB100の比例関係が成り立つ。上記の比例関係を利用して、本発明者らは、pIMpeptideのペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]のピーク位置mZ=Mpeptide11から特定される分子量Mpeptideに基づき、そのアミノ酸配列中に、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片pIMpeptideの群を選別し、さらに、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含む可能性があると推定されるペプチド断片pIMpeptideの群のうち、IpI[MpeptideH]/IpI[MpeptideH]avにおける、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群の選別を行った。IpI[MpeptideH]/IpI[MpeptideH]av∝CpIMpeptide/CMDALDLApoB100の比例関係を考慮すると、選別される部分群は、CpIMpeptide/CMDALDLにおける、酸化ストレスの水準の高低に起因する変動が一定水準を超えている、部分群と実質的に等価となる。特に、質量分析法として、Matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry法を採用すると、トリプシン消化処理により得られる、そのC末端のアミノ酸残基は、Arg残基またはLys残基であるペプチド断片に由来する、イオン種[MpeptideH]の生成効率イオン化効率ppIMpeptideは相対的に高い。そのため、測定された該pIMpeptideのペプチド断片由来のイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定確度も高くなることを確認した。加えて、トリプシン消化処理により得られる、ペプチド断片は、Arg残基またはLys残基のC末端側で酵素消化されているため、原則的に、そのC末端のArg残基またはLys残基以外に塩基性アミノ酸残基を有していない。従って、トリプシン消化処理により得られる、ペプチド断片の等電点pIは、概ね、塩基性アミノ酸のArgまたはLysのいずれか一つと、含まれている酸性アミノ酸のAspとGluの総数に依存する。その特徴を利用すると、含有される酸性アミノ酸の総数が0である部分群、含有される酸性アミノ酸の総数が1である部分群、含有される酸性アミノ酸の総数が2以上である部分群に区分でき、それぞれの部分群は、pIに基づき、分離可能であることを確認した。すなわち、偶々、ペプチド断片の分子量Mpeptideが一致している場合、該ペプチド断片中に含有される酸性アミノ酸の総数が相違すると、そのpIは有意な差異を示すので、それぞれのペプチド断片pIMpeptideは、等電点電気泳動により、予め分離することが可能であることを確認した。さらに、そのアミノ酸配列中に、MDA化Lys残基を含む場合、トリプシン消化処理を施した際、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化される確率は、MDA化を受けていないLys残基のC末端側で酵素消化される確率と比較して、有意に低くなることも確認した。従って、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けず、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、MDA化Lys残基を内部に含有する特異なペプチド断片が得られることも確認した。すなわち、MDA化の進行とともに、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、MDA化Lys残基を内部に含有する特異なペプチド断片の濃度が相対的に上昇することも確認した。一方、Lys残基がMDA化を受けていない場合、そのLys残基のC末端側で酵素消化されない確率は、一般に低いため、連続する二つのペプチド断片が連結された形状のペプチド断片の濃度は、通常、低い水準に留まる。また、連続する二つのペプチド断片が連結された形状のペプチド断片と、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、MDA化Lys残基を内部に含有する特異なペプチド断片とは、含まれる酸性アミノ酸の総数は等しいは、塩基性アミノ酸の数に相違があるため、その等電点pIは明確に相違している。従って、この二つのペプチド断片は、等電点電気泳動により、予め分離することが可能である。同時に、MDA化の進行とともに、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度も、相対的に上昇することも確認した。但し、トリプシン消化処理を施した際、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化される確率は、一般に低いため、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度は、通常、低い水準に留まる。しかし、MDA化の進行が顕著となると、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度は、相当の水準に達する。MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片は、MDA化Lys残基を有していない、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片と、含有する酸性アミノ酸の総数は同じであるが、Lys残基に代えて、MDA化Lys残基を有しており、その等電点pIは酸性側に有意に偏移している。従って、この二つのペプチド断片は、等電点電気泳動により、予め分離することが可能である。酸化Met残基を含むペプチド断片と、酸化Met残基を含まず、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片は、含有する酸性アミノ酸の総数は等しいため、類似する等電点pIを示す。勿論、酸化Met残基と酸化を受けていないMet残基の質量は相違しているため、質量分析により、この二つのペプチド断片を区別することが可能である。Met残基の酸化の進行とともに、酸化Met残基を含むペプチド断片の濃度が上昇し、一方、酸化Met残基を含まず、同じアミノ酸配列を有するペプチド断片の濃度は減少する。酸化Met残基を含むペプチド断片の濃度上昇は、Met残基の酸化の進行を反映する指標となる。以上の点を考慮すると、そのアミノ酸配列中に、MDA化Lys残基または酸化Met残基を含むペプチド断片pIMpeptideのうち、特に、酸化Met残基を含むペプチド断片、連続する二つのペプチド断片が連結された形状の、MDA化Lys残基を内部に含有する特異なペプチド断片、MDA化Lys残基のC末端側で酵素消化を受けることで生成するペプチド断片の濃度変化に基づき、酸化ストレスの水準の推定を行うことが可能であると判断した。以上の検討の後、ヒトの血液中に含有される、LDL中に含まれるApoB100タンパク質のうち、酸化LDL、特には、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中に存在するMDA化Lys残基、ならびに酸化Met残基のうち、酸化ストレスの水準の差異に起因して、MDA化を受ける確率が明確に変化するMDA化Lys残基、ならびに、酸化を受ける確率が明確に変化する明確に変化する酸化Met残基の選別を行った。酸化ストレスの水準に代えて、虚血性心疾患の病態の進行度、すなわち、冠動脈病変枝数ACITIPIscoreの評価結果が、冠動脈病変枝数3と判定された患者群から採血した血液サンプル、冠動脈病変枝数0と判定された健常者群から採血した血液サンプルを、それぞれ、酸化ストレスが高水準の血液サンプル、酸化ストレスが低水準の血液サンプルと見做す。酸化ストレスが高水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質と、酸化ストレスが低水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質を比較した際、MDA化を受ける確率が明確に相違しているMDA化Lys残基MDA化部位、ならびに、酸化を受ける確率が明確に相違している酸化Met残基の選別を行った。その際、MDAによる、Lys残基側鎖のアミノ基-NH2に対する修飾には、MDA一分子が関与する修飾である、Lys残基のMDA化-NH-CH=CH-CHOに加えて、MDA複数分子が関与する修飾に相当する、Lys残基のDHPdihydroxypyridine化も存在することが確認された。Lys残基のDHP化は、MDA複数分子が関与する修飾に相当しており、酸化ストレスの水準が高い場合に、起こると推断される。従って、酸化ストレスが高水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質と、酸化ストレスが低水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質を比較した際、DHP化を受ける確率が明確に相違しているDHP化Lys残基DHP化部位の選別も行った。本発明者らは、上記の選別の結果、酸化ストレスが高水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質と、酸化ストレスが低水準の血液サンプル中に含有される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質を比較した際、MDA化を受ける確率が明確に相違しているMDA化Lys残基MDA化部位、DHP化を受ける確率が明確に相違しているDHP化Lys残基DHP化部位、ならびに、酸化を受ける確率が明確に相違している酸化Met残基酸化部位として、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、後述の表1-1、表1-2に示す、アミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、Met残基を選別した。すなわち、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにMDAによる修飾の進行の程度酸化の進行度を評価する際、採取されたMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の中、表1-1、表1-2に示す、アミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、Met残基において、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基へと修飾、あるいは、酸化Met残基へと酸化が生じている比率に基づき、酸化の進行度を高い確度で評価可能であることを見出した。MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにMDAによる修飾の進行の程度酸化の進行度は、酸化ストレスの水準に依存しているので、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、酸化ストレスの水準の高低を高い信頼性で推定することが可能であることを見出した。さらに、酸化ストレスの水準は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行に関連しており、酸化ストレスの水準の高低を高い信頼性で推定した結果は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして利用可能である。すなわち、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果を、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、酸化ストレスに由来する病態を反映する指標の一つとして利用可能であることを見出した。換言するならば、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価に利用可能なMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に由来するペプチド断片は、心疾患の病態を反映するバイオマーカー、具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を反映するバイオマーカーとして利用可能であることを見出した。本発明者らは、以上の述べた一連の知見に基づき、本発明を完成するに至った。まず、本発明の第一の形態は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにMDAによる修飾の進行の程度酸化の進行度を評価する方法の発明である。本発明の第一の形態の第一の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表1-1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表1-2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法である。本発明の第一の形態の第二の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表2に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択されたペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択されたペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法である。本発明の第一の形態の第三の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、下記工程1~工程6の工程を有しており、工程1抗MDA-LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA-LDLを分取する工程;工程2分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;工程3等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;工程4等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量Mpeptideを、質量分析手段として、MALDI-TOF-MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点pIと質量Mpeptideに基づき、それぞれ、ペプチド断片pI,Mpeptideと特定し、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]を測定する工程;工程5特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群中から、下記の表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表4に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表5に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表6に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;工程6選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredに基づき、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;前記工程6において、酸化の進行度の評価は、サブステップ6-1特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotalpeptideとし、特定されたペプチド断片pI,Mpeptideの一群に含まれる、総数Ntotalpeptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avを算出する工程;サブステップ6-2選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の測定値、IpI[MpeptideH]measuredと、算出されたピーク強度IpI[MpeptideH]の平均値、IpI[MpeptideH]avとを対比し、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;サブステップ6-3分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;上記、サブステップ6-1~サブステップ6-3の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行うことを特徴とする、評価方法である。本発明の第一の形態の第三の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法において、工程5において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、前記表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することが好ましい。本発明の第一の形態の評価方法において、工程1における、免疫沈降法によるMDA-LDLの分取に利用される、抗MDA-LDLモノクローナル抗体は、MDA-LDL中に含まれる、MDA化を受けたApoB100タンパク質に特異的なモノクローナル抗体であることが好ましい。また、工程3における、等電点電気泳動法を適用するペプチド断片の分画は、等電点タンパク質分離チップを利用して実施することができる。次ぎに、本発明の第二の形態は、上記の本発明の第一の形態にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにMDAによる修飾の進行の程度酸化の進行度を評価する方法を利用して、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価し、その酸化の進行度の評価結果に基づき、分取されるMDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法の発明である。本発明の第二の形態の第一の態様にかかるMDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第一の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法である。本発明の第二の形態の第二の態様にかかるMDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第二の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法である。本発明の第二の形態の第三の態様にかかるMDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法は、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、下記の工程Aと工程Bを含み工程A被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第三の態様にかかるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;工程B被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA-LDLがLDLから生成される過程において、該MDA-LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定することを特徴とする、推定方法である。本発明の第三の形態は、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を使用する方法である。具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を、その評価に利用するマーカーとして選択する方法の発明である。従って、本発明の第三の形態は、心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法に相当する発明であり、より具体的には、心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法の発明である。本発明の第三の形態の第一の態様にかかる心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法は、心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表7-1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表7-2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法である。本発明の第三の形態の第二の態様にかかる心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法は、心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表8に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法である。本発明の第三の形態の第三の態様にかかる心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法は、心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、前記評価に利用するマーカーとして、下記の表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表10に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表11に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表12に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択することを特徴とする、マーカーの選択方法である。本発明の第一の形態の第三の態様にかかる心疾患診断に利用可能な診断マーカーの選択方法において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、前記表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択することが好ましい。本発明の方法によれば、血清血漿などの比較的患者の精神的肉体的負担のかからないサンプルから心疾患の病態にかかわるバイオマーカーを迅速かつ容易に検出することが可能となる。以下に、本発明の第一の形態~第三の形態に関して、より詳しく説明する。まず、本発明の第一の形態~第三の形態は、いずれも、本発明者らが、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、新たに見出した心疾患診断マーカーを利用する発明に相当している。本発明において利用されている心疾患診断マーカーは、下記の探索手順により、患者被験者における、虚血性心疾患の病態の進行度を反映して、明確な量的変化を示すマーカーとして特定されたものである。具体的には、虚血性心疾患の病態の進行度の高い患者被験者群、具体的には、冠動脈病変枝数3と判定された患者群と、冠動脈病変枝数0と判定された健常者非患者群を比較した際、健常者非患者群において検出される量を基準として、患者群において検出される量は、有意に高い、または、有意に低いという、統計学的検定結果を示すマーカーとして特定されたものである。本発明において利用されている心疾患診断マーカーと、その探索手順、ならびに、特定された心疾患診断マーカーが、実際に、健常者非患者群において検出される量を基準として、患者群において検出される量は、有意に高い、または、有意に低いという、統計学的検定の結果について、より詳しく説明する。本発明者らは、虚血性心疾患の病態の進行度を反映する指標として、被験者から採血した血液中における、酸化されていないLDLの含有濃度CLDLと、酸化LDLの含有濃度COxLDLの比率、COxLDLCLDLが、実際に利用可能であると、既に検証がなされている点に着目した非特許文献1参照。加えて、酸化LDL、特には、MDA-LDLが、動脈硬化の初期病変に関与していることを査証する結果が報告されている点にも着目した非特許文献2参照。従って、虚血性心疾患の病態の進行度、具体的には、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を反映する指標として、被験者から採血した血液中における、MDA-LDLの含有濃度CMDALDLと、酸化されていないLDLの含有濃度CLDLの比率も、利用可能であると判断した。その際、体内において、LDLから、MDA-LDLが生成される過程では、LDLの酸化に伴って生成される、MDAがLDL中に含有されるApoB100タンパク質、特に、該ApoB100タンパク質中のLys残基に作用し、Lys残基側鎖のアミノ基-NH2に対する修飾が起こる。具体的には、Lys残基は、図10に示すように、MDA一分子が関与する修飾である、アミノ基-NH2のMDA化により生成するMDA化Lys残基、あるいは、MDA複数分子が関与する修飾に相当する、アミノ基-NH2のDHPdihydroxypyridine化により生成するDHP化Lys残基に変換される。酸化ストレスによって、LDLの酸化が進行するため、LDL中に含有されるApoB100タンパク質中のアミノ酸残基、例えば、Met残基側鎖の-CH2-S-CH3の酸化も進行し、-CH2-SO-CH3一酸化体:MetO、ならびに、-CH2-SO2-CH3二酸化体:MetO2に変換される。酸化ストレスの水準が高いほど、LDLの酸化が進行するため、MDA-LDLの生成量は増加し、同時に、生成したMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質における、MDAによる修飾量、具体的には、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率も増加する。勿論、酸化ストレスの水準が高いほど、生成したMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質における、酸化修飾を受けたMet残基の含有比率も増加する。本発明者らは、被験者から採血した血液中に含有される、MDA-LDLを分取し、分取されたMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質における、MDAによる修飾量、具体的には、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率の測定結果に基づき、LDLからMDA-LDLが生成する過程において、酸化ストレスの水準が高い環境であったか、酸化ストレスの水準が低い環境であったかを、判定することが可能であることに想到した。この手法では、被験者から採血した血液中に含有される、MDA-LDLを全量回収する必要はなく、MDA-LDLの一部をサンプリングし、このサンプル中に含まれるMDA-LDLについて、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率、あるいは、酸化修飾を受けたMet残基の含有比率を測定する形態を利用できる。LDL中に含まれるApoB100タンパク質は、三次構造を形成しており、ApoB100タンパク質中に含まれる、複数のLys残基のうち、三次構造の内部に位置するものは、MDAによる修飾を受けず、三次構造の表面に露呈しているLys残基が、MDAによる修飾を受ける。また、ApoB100タンパク質中に含まれる、複数のMet残基のうち、三次構造の内部に位置するものは、酸化修飾を受けず、三次構造の表面に露呈しているMet残基が、酸化修飾を受ける。さらには、ApoB100タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のLys残基のうちでも、MDAによる修飾を受ける確率に差異が存在するため、酸化ストレスの水準の高低に依存して、ApoB100タンパク質全体において、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率が変化する。また、ApoB100タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のMet残基のうちでも、酸化修飾を受ける確率に差異が存在するため、酸化ストレスの水準の高低に依存して、ApoB100タンパク質全体において、酸化修飾を受けたMet残基の含有比率が変化する。換言すると、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質全体における、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率の測定結果に代えて、ApoB100タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のLys残基のうち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、MDAによる修飾を受ける確率が明確に変動する、特定のLys残基部位を選別し、その選別されたLys残基部位における、MDA化Lys残基、あるいは、DHP化Lys残基へ変換される比率の測定結果に基づき、LDLからMDA-LDLが生成する過程におえる酸化ストレスの水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。また、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質全体における、酸化修飾を受けたMet残基の含有比率の測定結果に代えて、ApoB100タンパク質の三次構造表面に露呈している、複数個のMet残基のうち、酸化ストレスの水準の高低に依存して、酸化修飾を受ける確率が明確に変動する、特定のMet残基部位を選別し、その選別されたMet残基部位における、酸化修飾を受けたMet残基へ変換される比率の測定結果に基づき、LDLからMDA-LDLが生成する過程におえる酸化ストレスの水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。加えて、ApoB100タンパク質全体において、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率が増加すると、本来トリプシン消化を受け易い切断部位のLys残基が、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基に変換される確率が上昇する。その際、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基への変換に起因して、かかる本来トリプシン消化を受け易い部位におけるトリプシン消化の確率は減少する。一方、かかる部位の周囲に存在する、Lys残基、Arg残基におけるトリプシン消化の確率は、相対的に上昇する場合があることに想到した。換言すると、酸化ストレスの水準の高低に依存して、本来トリプシン消化を受け易い切断部位のLys残基が酸化修飾を受ける確率が明確に変動する結果、該部位の周囲に存在する、Lys残基、Arg残基におけるトリプシン消化効率の変動が誘起される場合がある。従って、酸化ストレスの水準の上昇により誘起される、前記トリプシン消化効率の相対的上昇に伴って、生成効率が上昇するペプチド断片の量の相対的変化の測定結果に基づき、LDLからMDA-LDLが生成する過程におえる酸化ストレスの水準の高低を、判定することが可能であることに想到した。なお、前記トリプシン消化効率の相対的上昇に伴って、生成効率が上昇するペプチド断片自体は、そのC末端は、修飾を受けていないLys残基、Arg残基であり、さらに、該ペプチド断片中にMDA化Lys残基、DHP化Lys残基、あるいは、酸化修飾を受けたMet残基を内在している必要は無いことにも想到した。例えば、後述する表13に記載するMDA化Lys残基、DHP化Lys残基、ならびに、酸化修飾を受けたMet残基を含んでいないペプチド断片であっても、酸化ストレスの水準の上昇に伴って、該ペプチド断片の周囲に存在する、Lys残基、Arg残基におけるトリプシン消化効率の変動が誘起されると、かかるペプチド断片の生成効率が相対的に上昇することがあることにも想到した。本発明において利用されている心疾患診断マーカーは、前記の選別基準に基づき、酸化ストレスの水準の高低に依存して、当該アミノ酸残基部位における、MDAによる修飾を受ける確率、あるいは、酸化修飾を受ける確率が明確に変動する部位として選別された、特定のアミノ酸残基部位を含む、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片の一群に相当している。本発明において利用されている心疾患診断マーカーである、前述の特定のアミノ酸残基部位を含む、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、MDAによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果は、勿論、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を反映している。従って、本発明の第一の形態は、心疾患診断マーカーとして選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、MDAによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果に基づき、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、アミノ酸残基の酸化、ならびにMDAによる修飾の進行の程度酸化の進行度を評価する方法の発明である。本発明の第二の形態は、心疾患診断マーカーとして選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片における、当該アミノ酸残基部位における、MDAによる修飾を受けている確率、あるいは、酸化修飾を受けている確率の測定結果に基づき、酸化の進行度を評価し、その酸化の進行度の評価結果を利用して、分取されるMDA-LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法の発明である。すなわち、本発明の第二の形態にかかる酸化ストレスの水準の高低を推定する方法は、評価対象の血液サンプルを採取した被験者の体内の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法に相当している。本発明の第三の形態は、心疾患、特には、虚血性心疾患の主要因である、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度を評価する際、病態を反映する指標の一つとして、被験者の体内の酸化ストレスの水準の高低の推定結果を利用することを意図した発明である。その際、本発明の第三の形態では、前記本発明の第二の形態にかかる酸化ストレスの水準の高低を推定する方法、すなわち、評価対象の血液サンプルを採取した被験者の体内の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法を適用して、被験者の体内の酸化ストレスの水準の高低の推定を行う。本発明の第二の形態では、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価し、その酸化の進行度の評価結果に基づき、酸化ストレスの水準の高低の推定を行う。本発明の第二の形態にかかる酸化の進行度の評価方法では、上記の選別基準に基づき、選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片を、酸化の進行度の評価に適合するマーカーとして利用している。本発明の第三の形態は、冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、その評価に利用するマーカーを、上記の選別基準に基づき、選別された、特定のアミノ酸残基部位を含むペプチド断片の一群から、選択する方法の発明である。従って、本発明の第三の形態は、上記の選別基準に基づき、選別された心疾患診断マーカーの一群から、心疾患診断に利用可能な診断マーカーを選択する方法に相当している。冠動脈におけるアテローム性動脈硬化の進行の程度の評価に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する。その際、その評価に利用するマーカーとして、先に説明したように、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質全体における、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基の含有比率、酸化修飾を受けたMet残基の含有比率、あるいは、酸化修飾を受けたその他のアミノ酸残基例えば、Tyr残基の含有比率を高い確度で推定することが可能なマーカーのいずれも利用可能である。その多様なマーカーの群のうち、本発明の第三の形態では、上記の選別基準に基づき、選別された心疾患診断マーカーの一群から、評価に利用するマーカーを選択する点に、技術的な特徴がある。上記の選別基準に基づき、本発明において利用されている心疾患診断マーカーの選別の手順を以下に説明する。心疾患診断マーカーの選別の手順、すなわち、マーカー探索プロセスの全体構成を、図1に示す。該プロセスは、サンプル前処理工程101、等電点電気泳動工程102、MALDI-TOFMS質量分析工程103、サンプルプロファイリング工程104、データ解析マーカー特定工程105の五つの工程で構成されている。本発明では、選別された心疾患診断マーカーについて、心疾患診断に先立ち、被験者から採取される血液サンプルを用いて、その量を測定することを最終目的とする。従って、被験者から採取される血液サンプルの量を考慮し、少量の血液サンプルを利用する測定に適する、サンプル前処理、等電点電気泳動、MALDI-TOFMS質量分析の条件を選択し、その条件において、心疾患診断マーカーの選別を行っている。従って、心疾患診断マーカーの選別の際に採用する、サンプル前処理、等電点電気泳動、MALDI-TOFMS質量分析の条件と同じ条件を用いて、心疾患診断に先立ち、被験者から採取される血液サンプルを用いて、その量を測定することが可能となる。具体的には、等電点電気泳動工程では、後述する等電点タンパク質分離チップを利用する等電点電気泳動を行い、その後、該等電点タンパク質分離チップ内に保持した状態で乾燥処理を施し、さらに、乾燥処理を施した等電点タンパク質分離チップ内に保持した状態で、MALDI-TOFMS質量分析を実施する形態を採用している。1サンプル前処理工程サンプル前処理工程101は、図2に示す、4つのステップ:血液サンプルから血清を調製する血清調製ステップ201;抗MDA-LDL抗体を用いる免疫沈降法を利用して、血清中から、MDA-LDLを分取する免疫沈降処理ステップ202;トリプシン消化処理を利用して、分取されたMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群を調製する断片化処理ステップ203;調製されたペプチド断片群を含む、トリプシン消化処理反応液中の溶媒を除去し、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物として回収する断片化ペプチド回収ステップ204で構成されている。血清調製ステップ201まず、心疾患診断マーカーの選別を行う対象は、被験者から採血した血液中に含有される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質である。血液中、MDA-LDLは、血清中に溶存しているので、定法に従って、被験者から採血した血液サンプルから、血清を調製する。血液の凝固処理後、遠心分離により、血餅沈澱物を分離し、血清を回収する。回収された血清を保存する際には、-80°C以下の温度で冷凍保存する。すなわち、前記冷凍保存を行うことで、保存する間に、血清中に含まれるMDA-LDLに対して、さらに、MDA化、酸化が進行することを防止する。免疫沈降処理ステップ202回収された血清中に、種々の可溶性タンパク質、脂質が溶解している。特に、MDA-LDL以外に、MDA化されていない酸化LDL、酸化を受けていないLDLも、該血清中に共存している。血清中から、MDA-LDLのみを選択的に分取するため、抗MDA-LDL抗体を用いる免疫沈降法を利用する。抗MDA-LDL抗体を担体上に固定化した、アフィニティー担体を、血清中に加え、抗原抗体反応により、MDA-LDLのみを選択的に抗MDA-LDL抗体と反応させ、捕獲する。その後、固液分離により、アフィニティー担体を回収することで、血清中に含有されている、MDA-LDLのみを分取する。なお、血清中に含有されている、MDA-LDLの濃度は不明であるが、血清中に含有されている、MDA-LDLの全量を回収する必要は無いので、通常、使用するアフィニティー担体の量は、血清100μL当たり、抗MDA-LDL抗体の添加量が、2μg~4μgの範囲となるように選択することができる。抗MDA-LDL抗体を固定化する担体として、例えば、IgG抗体の固定化に適する磁気ビーズを利用すると、抗原抗体反応後、固液分離により、アフィニティー担体を回収する際、該磁気ビーズを、磁力を利用して、選択的に回収できるので好ましい。血清中には、MDA-LDL以外に、MDA化受けていないLDL、例えば、酸化に起因する修飾を全く受けていないLDLが大量に共存している。一般に、血清中に含まれる酸化LDLの含有濃度は、10μg/dL以上、100μg/dL未満であるが、全LDLの含有濃度は、50~100mg/dL程度であると報告されている。従って、血清中における、MDA-LDLの含有濃度C[MDA-LDL]と、全LDLの含有濃度C[totalLDL]の比率;C[MDA-LDL]/C[totalLDL]は、通常、C[MDA-LDL]/C[totalLDL]<0.2の範囲と推定される。アフィニティー担体を回収する際、非選択的に担体の表面に吸着した、MDA化受けていないLDL、例えば、酸化に起因する修飾を全く受けていないLDLが混入することを防止するため、固液分離後、アフィニティー担体を十分に洗浄する。十分な洗浄を終えた時点では、回収されたアフィニティー担体の表面には、未反応の抗MDA-LDL抗体と、MDA-LDLと複合体を形成している抗MDA-LDL抗体のみが固定化されている。該免疫沈降処理ステップ202で利用する抗MDA-LDL抗体として、例えば、抗体No29225積水メディカル社などの抗MDA-LDLモノクローナル抗体が好適である。ヒトMDA-LDLを免疫原として、マウスを免疫することにより、抗ヒトMDA-LDLモノクローナル抗体を創製する手法は、既に報告されている特許第3115587号公報参照。該手法で創製される抗ヒトMDA-LDLモノクローナル抗体のうち、ヒトMDA-LDL中に含まれる、ヒトApoB100タンパク質と特異的な反応性を示すものを選別し、該免疫沈降処理ステップ202で利用する抗MDA-LDL抗体として利用することができる。断片化処理ステップ203洗浄後、回収されたアフィニティー担体の表面に固定化された、抗MDA-LDL抗体と複合体を形成している、MDA-LDLを、トリプシンを用いて酵素消化し、分取されたMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群を調製する。酵素消化に先立ち、アフィニティー担体の表面に固定化された、抗MDA-LDL抗体と複合体を形成している、MDA-LDLを、該抗体から分離し、アフィニティー担体の表面に固定化された、抗MDA-LDL抗体を固液分離して、液相にMDA-LDLを回収する操作を施すことが、一般に望ましい。抗体から、その抗原を遊離する手段としては、抗体の抗原に対する反応性を低下する処理が利用される。通常、抗原中に存在するエピトープ抗原性決定基と、抗体中のCDR相補性決定領域の結合は、疎水的相互作用に因っている。例えば、抗原中に存在するエピトープ抗原性決定基と、抗体中のCDR相補性決定領域の相互作用を低下させるため、アセトニトリルなどの極性有機溶媒を添加して、抗体中のCDR相補性決定領域を該極性有機溶媒によって、溶媒和被覆する手段が利用可能である。また、SDSなどの界面活性剤型のタンパク質変性剤を添加することで、抗体の可変領域を変性させ、抗原中に存在するエピトープ抗原性決定基に対する親和性を消失させる手法も利用可能である。一方、MDA-LDLを抗体から分離することなく、抗MDA-LDL抗体と複合体を形成している、MDA-LDLに、トリプシンを作用させ、酵素消化し、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群を調製する形態を採用することも可能である。その場合には、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群に加えて、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群も生成される。抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群は、別途特定できるため、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群と、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群の混合物から、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群を特定することが可能である。その他、トリプシンを用いる酵素消化を行う際には、トリプシンの自己消化に起因して、トリプシン由来のペプチド断片群も生成される。このトリプシンの自己消化に起因する、トリプシン由来のペプチド断片群も、別途特定できるため、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群の混合物から、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群を特定することが可能である。断片化処理ステップ203においては、分取されたMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質の全量を、トリプシンを用いる酵素消化により断片化する。その際、トリプシンは、Arg残基のC末側のペプチド結合、Lys残基のC末側のペプチド結合を切断するが、一般に、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基のC末側のペプチド結合が切断される効率は、修飾を受けていないLys残基のC末側のペプチド結合が切断される効率より低い。特定の部位のLys残基が、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基に変換されている比率を調べる際には、前記の切断効率の差異が明確になる反応条件を選択することが望ましい。すなわち、Arg残基のC末側のペプチド結合、修飾を受けていないLys残基のC末側のペプチド結合の切断は完了するが、MDA化Lys残基、DHP化Lys残基のC末側のペプチド結合の切断の進行比率は、明確に劣っている反応条件を選択することが望ましい。従って、トリプシンを用いる酵素消化の反応条件を、例えば、反応液中のトリプシン濃度を50ngμL~100ngμLの範囲に選択し、反応液の攪拌を行いつつ、液温を35°C~38°Cの範囲に、反応時間を12時間~24時間の範囲に選択することが望ましい。また、例えば、血清300μL中から分取されたMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質に対するトリプシンを用いる酵素消化を行う際、反応液全体の液量は、15μL~40μLの範囲に選択することが望ましい。MDA-LDLを抗体から分離する処理を施した場合、トリプシンを用いた酵素消化反応液は、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンを含んでいる。MDA-LDLを抗体から分離することなく、抗MDA-LDL抗体と複合体を形成している、MDA-LDLを使用する場合、トリプシンを用いた酵素消化反応液は、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシン、抗MDA-LDL抗体を担持しているアフィニティー担体を含んでいる。抗MDA-LDL抗体を担持しているアフィニティー担体を、固液分離により除去すると、残る液相中には、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンが含まれている。いずれの場合も、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群の全量を含む液相部分を、断片化処理済みの試料液として回収する。回収される断片化処理済みの試料液の液量は、実質的に前記酵素消化反応液全体の液量と等しい。断片化ペプチド回収ステップ204回収された断片化処理済みの試料液中に含まれる溶媒除去し、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物として回収する。回収される断片化処理済みの試料液の液量が、15μL~40μLの範囲である場合、溶媒除去による乾燥に、例えば、遠心エバポレーターを利用することができる。乾燥処理を行った後、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物を保存する場合、例えば、-30°C以下の温度で冷蔵保存する。2等電点電気泳動工程一般に、血清中に含まれる酸化LDLの含有濃度は、10μg/dL以上、100μg/dL未満であるので、血清300μL中に含有されている酸化LDLは、30ng以上、300ng未満である。酸化LDL1粒子中に含まれるApoB100タンパク質の重量比率は、25質量程度であり、含有されている酸化LDLが、30ng以上、300ng未満であると、含まれるApoB100タンパク質は、8ng以上、80ng未満と見積もられる。回収される調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプル中には、一サンプル当たり血清300μL当たり、合計で、8ng以上、80ng未満の範囲のMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質に由来するペプチド断片群が含有されている。換言すると、一サンプル当たり血清300μL当たり、0.015pmol以上、0.15pmol未満の範囲のMDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群が含有されている。一サンプル中に含まれる、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質に由来する、各ペプチド断片は、ApoB100タンパク質一分子から、それぞれ断片が切り出されるので、各ペプチド断片の分子数は、ApoB100タンパク質の分子数または、それ以下である。従って、血清300μLから調製される、一サンプル中に含まれる、各ペプチド断片pI,Mpeptideの含有量MpI,Mpeptideは、0.015pmol以上、0.15pmol未満の範囲になっていると推定される。一方、等電点電気泳動で分離される、各ペプチド断片pI,Mpeptideのスポットについて、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のmz値と、各スポットにおける流路方向の拡がりの状況を示す、該イオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の分布を、MALDIMS質量分析を利用して、十分な精度と確度で測定する必要がある。その際、一サンプル中に含まれる、各ペプチド断片pI,Mpeptideの総量MpI,Mpeptideは、各ペプチド断片pI,Mpeptideのスポットの流路方向の拡がりσpIと、流路の幅Wの積、W×σpIで示されるスポットの面積SpI,Mpeptide内に存在すると見做せる。MpI,Mpeptide/SpI,Mpeptideは、該スポットにおける、ペプチド断片pI,Mpeptideの平均的な面密度に相当する。各スポットにおける流路方向の拡がりの状況を示す、該イオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]の分布を、MALDIMS質量分析を利用して、十分な精度と確度で測定するためには、該スポットにおける、ペプチド断片pI,Mpeptideの平均的な面密度、MpI,Mpeptide/SpI,Mpeptideを十分に水準にことが必要である。従って、等電点電気泳動を行う際、等電点タンパク質分離チップを利用することで、各ペプチド断片pI,Mpeptideのスポットの面積SpI,Mpeptideを狭くし、ペプチド断片pI,Mpeptideの平均的な面密度、MpI,Mpeptide/SpI,Mpeptideを十分な水準としている。具体的には、等電点タンパク質分離チップの流路の長さLを35mmとして、その流路に沿って、pIが3~10の範囲のペプチド断片をそれぞれのスポットに分離することにより、流路方向の拡がりσpIが、σpI=0.2程度である際、そのスポットの長さδLを、1mm程度としている。等電点電気泳動工程102では、回収される調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプル中に含まれる、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンを、等電点電気泳動により、それぞれのスポットに分離する。その後、等電点タンパク質分離チップの流路に沿って、分離されているスポットを保持した状態で、等電点タンパク質分離チップ全体を、-30°Cに冷却することで、流路内の泳動後のサンプル溶液を氷結する。さらに、氷結された泳動後のサンプル溶液を流路内に保持した状態で、凍結乾燥処理を施す。該凍結乾燥処理の結果、等電点タンパク質分離チップの流路に沿って、分離されているスポットから、その位置において、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットへと変換される。凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットは、該ペプチド断片pI,Mpeptideの等電点pIを中心として、流路方向の拡がりσpIを示す。すなわち、スポットを構成する凍結乾燥処理済みのペプチド断片の面密度は、等電点pIを中心とする、ガウス分布と近似できる、流路方向の変化を示し、該ガウス分布の標準偏差が、流路方向の拡がりσpIに相当している。MALDIMS質量分析を適用して、スポットの形成している、該ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のイオン強度IpI[MpeptideH]を測定し、流路方向の分布を解析することで、該スポットの中心pImeanを特定することが可能である。また、該pImeanを中心とするガウス分布を仮定し、測定されたイオン強度IpI[MpeptideH]分布を良く近似できる標準偏差を算出し、流路方向の拡がりσpIとすることが可能である。等電点電気泳動においては、その流路に沿って、pIが3~10の範囲のペプチド断片をそれぞれのスポットに分離する。その間を、71の区画に分割して、各区画内に存在しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のm/zと、そのイオン強度IpI[MpeptideH]を測定する。各区画のpIの差分ΔpIは、10-3/70=0.1程度と見做すことが可能である。実際には、等電点電気泳動を行った際、流路に沿って形勢されるpHの勾配dpHdLは、若干のバラツキを示すため、泳動用のサンプル液中に、pIが既知のペプチド、タンパク質を複数、pI標準物質として添加し、該pI標準物質複数種のスポット位置を基準として、流路に沿って、各スポット位置のpIを推定する。一方、MALDIMS質量分析を適用して、各区画に存在しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]の測定を行うため、使用されるMALDIMS質量分析装置が利用するレーザ光の照射スポット径dlaserを基準として、各区画の長さΔLを、ΔL≧dlaserを満たすように設定する。同時に、流路の幅Wも、該レーザ光の照射スポット径dlaserを基準として、W≧dlaserを満たすように設定する。各区画に存在しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]の測定は、各区画の中央に、照射スポット径dlaserのレーザ光を照射して、該照射スポット径dlaser内に存在するペプチド断片pI,Mpeptideをイオン化させる。等電点電気泳動工程102で利用する、等電点タンパク質分離チップと電気泳動乾燥装置の構成と、その使用法の概要を以下に説明する。等電点タンパク質分離チップ図3に、等電点電気泳動工程102で利用する等電点タンパク質分離チップの構成の一例を、模式的に示す。図3に模式的に示す構成例では、1本の流路302を設ける単一流路構成であるが、同時の複数のサンプルについて、等電点電気泳動を実施するため、複数本の流路302を並行に配置するマルチ流路構成を採用することもできる。図3のAは、フタ304の上面図を、図3のBは、基板303の上面図を、図3のCは、組み立てたチップ300のAA断面図をそれぞれ示す。図3のDは、基板303に形成されている、流路302の拡大図を示す。流路302の底面部には、複数の親水性の柱状体301が形成されており、底面部の両側に側壁部が形成され、溝状構造を構成している。流路302の両端には、リザーバ305a、305bが設けられる。フタ304は、平板状のフタ基材部306と、フタ基材部306の下面に位置し、基板303と接するフタ樹脂部307とで構成される。また、フタ304には、流路302両端のリザーバ305a、305bに対応する位置に、溶液注入用の貫通穴が形成されている。組み立てたチップ300では、基板303上面にフタ304を重ねる際、流路302両端のリザーバ305a、305bと、フタ304に形成されている溶液注入用の貫通穴が一致する配置とする。その際、流路302の上面は、フタ304のフタ樹脂部307で覆われる。フタ304のうち、この流路302の上面を覆い、少なくとも流路302内に導入されるサンプル溶液と接する表面は、疎水性または撥水性とされている。特には、フタ304のフタ樹脂部307の下面の表面全体を、疎水性または撥水性とすることが好ましい。等電点電気泳動を行う際には、流路302の両端を利用して、流路302内に導入されるサンプル溶液に対して、高電圧を印加する。印加される高電圧によって、流路302内に導入されるサンプル溶液中に、流路302に沿った電位勾配電界を形成する。そのため、流路302内に導入されるサンプル溶液から、基板303を絶縁しておく必要がある。従って、基板303自体を、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。また、フタ304のフタ樹脂部307の下面も、流路302内に導入されるサンプル溶液と接するため、流路302内に導入されるサンプル溶液から、フタ304のフタ樹脂部307を絶縁しておく必要がある。従って、少なくとも、フタ304のフタ樹脂部307自体を、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。また、フタ304の基材部306自体も、高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。基板303には、流路302を形成するため、その流路構造を加工するにあたって、十分な精度で加工可能な高絶縁性材料を使用して作製することが望ましい。前記の要件を満足する高絶縁性材料の一例として、石英もしくはガラス、更には、PCポリカーボネイト、PMMAポリメチルメタクリレート等の高い絶縁特性を有するプラスチック材料を挙げることができる。なお、図3に例示する流路302は直線状流路であり、流路302内に導入されるサンプル溶液中に、流路302に沿った電位勾配電界を形成する際、適する形状である。が、基板303の上面に複数本の流路を併設する、なお、流路302内に導入されるサンプル溶液中に、流路302に沿った電位勾配電界を形成することが可能である限り、直線状流路以外の平面形状を採用することもできる。流路302自体の平面形状、流路の配置、流路の長さは、利用されるサンプルや電気泳動の条件に応じて、適宜選択される。具体的には、流路302の断面形状は、流路の幅W、流路の深さDが3μm~2000μmの範囲に選択されることが望ましい。流路の全長L、流路の幅W、ならびに、流路の深さDは、質量分析を行い際に必要とされる単位底面積あたりのペプチド断片の量の要件を満足できる範囲に選択する。同時に、前記流路のサイズは、等電点電気泳動時、流路内で発生するジュール熱の放散に十分な熱効率による温度制御と高効率な流体制御を可能とできる範囲に選択する必要もある。前記二つの要件を満たすとともに、基板303の作製に使用する材料の加工精度等を考慮して、前記流路のサイズの選択を行う。フタ基材部306を作製する材料としては、該フタの機械的強度の保持や、貫通穴作製などの加工が可能で、絶縁特性に優れている材料が好適に利用される。フタ基材部306の作製に、例えば、石英もしくはガラス、ポリカーボネイト、PMMAなどのアクリル樹脂、PDMSなどのシリコーン樹脂をはじめとした高分子樹脂材料を利用することができる。一方、フタ樹脂部307は、流路の上面を覆い、流路の側壁部の上面と、フタ樹脂部307の下面と密着させ、該流路内に充填されるサンプル溶液の漏洩、染み出しを生じさせない構成を採用している。同時に、フタ剥離を行う際、フタ304のうち、少なくともフタ樹脂部307は弾性変形して剥離の境界部に撓み構造を設ける。このため、フタ樹脂部307の作製には、弾性変形性が高い絶縁性材料を用いることが好ましい。例えば、フタ樹脂部307の基材に利用する、弾性変形性が高い絶縁性材料として、PDMSや、PTFEポリテトラフルオロエチレン、PPポリプロピレン、PEポリエチレン、ポリ塩化ビニルなどのポリオレフィン、またはポリエステルなどを挙げることができる。加えて、フタ樹脂部307の下面のうち、少なくとも、流路上面に相当する領域は、疎水性または撥水性を示す表面とすることが好ましい。従って、フタ樹脂部307の下面を疎水性または撥水性を示す表面とするとするため、特に、PDMS等のシリコーン樹脂、PTFE等のフッ素系樹脂などの撥水性を有する材料による被覆が好適に利用できる。あるいは、これら撥水性を有し、弾性変形性が高い絶縁性材料を、フタ樹脂部307の基材として利用してもよい。また、少なくとも、フタ304の外形の一端部には、基板303の外形より張り出した部分を設ける。この張り出した一端部は、フタ剥離のための外力の印加に利用される。基板303を固定して押さえつつ、フタ304の一端部に外力を印加すれば、フタ剥離が進行する。例えば、矩形の基板303、フタ304を選択した場合、基板303の長辺方向に該フタの剥離方向を選択する場合、フタ304の外形は、かかる長辺方向の長さを、該基板の長辺よりも長くする。フタ304の長辺方向に張り出した部分に外力を印加すると、その部分に外力の作用点が設定される。さらにはフタ304の剥離を終えた後、該フタを保持し、基板303上面から移動させ、除去する操作を行う際、フタ304の端部を支えるための領域をかかる張り出し部分に設定することが可能となる。また、フタ304を剥離除去する際、外力を印加する部位として、基板303の長辺と沿って設ける、フタ304の短辺方向の張り出し部分を利用する形態を選択することも可能である。なお、基板303上面とフタ樹脂層307との密着強度は、基板303の上面に形成される流路302から、流路内に充填される溶液の漏洩、染み出しを生じさせない程度の密着状態達成には十分だが、所定の外力を加えることで、この密着面で剥離が進行する。また、基板303上面とフタ樹脂層307との緻密な密着状態の維持においては、フタ樹脂層307自体の密着性は低くし、両者間を密着させる外的な力の負荷に依る形態で補うことも可能である。上記のフタ剥離を行う手法として、例えば、国際公開第2006/085539号パンフレットに開示される方法を採用することもできる。電気泳動乾燥装置上述の等電点タンパク質分離チップを利用する等電点電気泳動と、その後の凍結乾燥処理の操作に使用される電気泳動乾燥装置の構成を以下に説明する。図4は、等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置400の全体構成を模式的に示す図である。電気泳動乾燥装置400は、少なくとも、チップを収容する機構401と、等電点電気泳動の際、チップ中の流路に電圧を印加するための電源402電極部403と、チップの温度を制御する機構404とを備えている。また、等電点電気泳動後、前記流路上において分離され、各スポットを形成しているペプチド断片、ならびに、タンパク質を、当該スポットを保持した状態で凍結乾燥処理して、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットとして固定化する、乾燥機構405を備えている。該電気泳動乾燥装置400を用いて、等電点タンパク質分離チップの流路内のサンプル溶液を等電点電気泳動した後、温度制御機構404を用いて、流路内のサンプル溶液を急速凍結する。急速凍結することで、流路内のサンプル溶液中において、各スポットを形成しているペプチド断片、ならびに、タンパク質の分離状態を固定する。急速凍結を終えた後、その冷却温度に保持した状態で、フタ304を基板303から剥離し、除去する。その結果、基板303上に形成されている流路内に保持されている、泳動後のサンプル溶液の氷結体が露呈される。該氷結体は、凝固した液体成分水を含んでおり、流路内で凍結状態に保持したまま、乾燥機構405を用いて、凝固した液体成分水を除去し、凍結乾燥処理を施す。この凍結乾燥処理の際、温度制御装置404を利用して、凍結状態に保持し、凝固した液体成分水の除去は、密閉槽や減圧機構等を備えた乾燥機構405を用いて実施される。該凍結乾燥処理の結果、等電点タンパク質分離チップの流路に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットとして、乾燥固定される。次に、より具体的な例示により、等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置を構成する各機構とその機能を説明する。なお、等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置の構成は、下記の具体的な実施態様に示す構成に限定されるものではない。等電点電気泳動を行う際、等電点タンパク質分離チップの基板303上面とフタ樹脂層307との緻密な密着状態を維持する。その際、両者間に外力を負荷して、両者の緻密な密着状態を維持する手法を採用することが好ましい。両者間に加える外力の負荷手段として、フタ304の上面から荷重を負荷する形態である、負荷荷重印加機構を利用することができる。この負荷荷重印加機構は、基板303とフタ樹脂層307との密着面全面に実質的に均等な負荷荷重の分散が可能な形態を選択することが望ましい。緻密な密着状態を維持することにより、流路302に導入されるサンプル溶液が、基板303上面とフタ樹脂層307下面の接する部位から流路外に漏れ出す液漏れを防止する。従って、サンプル溶液の流路302への導入に先立ち、前記負荷荷重印加機構を動作させて、緻密な密着状態を維持する。等電点電気泳動を終了した後、急速凍結により、泳動後のサンプル溶液の氷結体を作製すると、液漏れを防止する必要が無くなる。従って、急速凍結を終えた後、前記負荷荷重印加機構を用いた外力負荷を終える。その結果、急速凍結を終えた後、フタ304を剥離する操作を実施する際には、フタ304の上面は、荷重が負荷されていない状態となる。基板303を安定的に固定するには、基板303の底面、あるいは基板303の上面を固定する形式が望ましい。例えば、基板303の底面を平坦な平面に加工した上で、真空チャック方式の固定ステージ上の所定位置に基板303の底面を固定する形式が好適に利用される。また、基板303上面を圧迫固定することも、容易な手法であり、好適である。この場合、基板303上面のフタ304がない部分を圧迫固定することが望ましい。なお、基板303を安定的に固定する目的では、基板303上面のフタ304がある部分を圧迫固定する形態を採用することも可能である。基板303を固定した状態で、基板303からフタ304を剥離除去する。従って、基板303上面のフタ304がある部分を圧迫固定し、フタ304を剥離する際に、その圧迫固定を解除する形態を採用すると、フタ304を剥離する時点で、基板303を安定的に固定することが困難となる。基板303上面のフタ304がある部分を圧迫固定する形式を採用する場合には、フタ304を剥離する際、基板303の底面を固定する形式、あるいは、基板303上面のフタ304がない部分を圧迫固定する形式を使用する。基板303からフタ304を剥離除去する際には、基板303を固定した上で、フタ304の一端部に外力を印加し、基板303とフタ304との密着面に対して実質的に垂直方向に、そのフタ304の一端部を強制的に変位させる。この一端部の変位に付随して、フタ304は、接着面に対して撓み構造を有するものとなる。その外力を印加した段階において基板303の移動を防止するため、上記の通り、基板303を固定する。乾燥機構は、流路内で凍結状態に保持したまま、泳動後のサンプル溶液の氷結体に対して、凍結乾燥処理を施すことが可能である限り、その構成に特に制限はない。例えば、基板303からフタ304を剥離除去した後、露出された泳動後のサンプル溶液の氷結体を流路内で。凍結状態に保持するための温度調節機構、ならびに、該泳動後のサンプル溶液の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分水を昇華させる、あるいは、蒸散させるための密閉槽と減圧機構等を備えた凍結乾燥機構が挙げられる。前記凍結乾燥機構を使用して、密閉槽中に基板303を配置し、密閉槽内を減圧することにより、泳動後のサンプル溶液の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分水を昇華させ、流路302に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットとして、乾燥固定される。等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置は、操作の容易性の観点から、さらに制御部を備えることが好ましい。制御部は、等電点電気泳動を行う際、電流モニター部を用いて、流路302内のサンプル溶液中を流れる電流値をモニターし、電源402から供給する電圧を制御するために用いることができる。さらに、制御部は、電流値のモニター、電圧の印加時間、使用電力量に基づき、等電点電気泳動の終了を判断するために、また、冷却機構の動作を制御するために用いることができる。さらに、制御部は、フタ304を吸着する、あるいは、基板303の上面にフタ304を接触固定する機と、基板303を吸着する、あるいはチップ台上に基板303を接触固定する機構と、固定した基板303の上面から、フタ304を剥離した後、相対的に遠ざける移動機構の動作を制御し、流路302を露出させる一連の操作を実行するために用いることができる。さらに、制御部は、溶液注入機構として、差圧を発生させる減圧加圧機構を制御するために、また、乾燥機構として、温度調節機構や減圧機構を制御するために、あるいは、信号検出部として、等電点電気泳動による、ペプチド断片の分離状態を確認するために用いることができる。上記等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置を使用する際、その使用方法について、以下に簡単に記述する。まず、チップ300を、チップガイドに沿ってチップ収容部に設置する。チップ収容部は、チップ台と密閉槽で構成される。チップ300は、チップ台上に固定される。固定されているチップ300の温度制御は、このチップ台を通して熱の授受を行い、温度制御機構温度センサー、ペルチェ素子等を用いて行う。温度制御機構は、等電点電気泳動時にチップの温度を一定に保持するため、急速凍結時にチップを冷却するため、凍結乾燥処理時にチップ温度を加熱する、あるいは凍結状態に保持するため、氷点以下の温度に維持するために用いられる。次に、フタ304を基板303の上面に圧迫させて、フタ304を固定し、密着状態を保持する。流路302の両端に設けるリザーバ305a、305bの一方に、サンプル溶液を注入する。その後、吸引操作等を行い、流路302全体にサンプル溶液を満たす。続けて、流路302の両端に設けるリザーバ305a、305bに、それぞれ陰極液、陽極液を注入する。以上の操作、フタ304の圧迫固定、サンプル溶液の注入後、吸引操作等の各操作に利用される機構は、全て、制御部で、それらの機構の動作を制御し、実行させることもできる。さらに、フタ304の溶液注入用の貫通穴を介して、電極部の陽極陰極を、それぞれ、陽極液、陰極液に接するように配設する。電源から配線を通じて電極部に電圧を印加し、電流モニター部を用いて電極部の陽極陰極間の電流値を測定する。流路302に導入されているサンプル溶液中を流れる電流は、電圧印加時から徐々に減少するため、この電流値あるいは電力値を測定し、その時間的変化をモニターすることにより、等電点電気泳動による分離終了を判断できる。等電点電気泳動を終了した直後に、温度制御機構を用いて、チップ300を冷却し、流路302内の泳動後のサンプル溶液を凍結させる。流路302内の泳動後のサンプル溶液中では、流路302に沿って、等電点電気泳動によって分離された、ペプチド断片やタンパク質が、それぞれスポットを形成して溶解している状態となっている。その溶媒は水であるが、流路302内にpH勾配を形成するために使用された、酸、塩基、両性担体成分などが溶解しており、凝固点降下のため、氷結が開始する温度は氷点0°Cよりも低くなっている。そのため、流路302内の泳動後のサンプル溶液全体を、氷結が開始する温度よりも有意に低い温度まで急速に冷却し、一旦過冷却状態とすることで、溝状の流路302内の泳動後のサンプル溶液全体を一気に氷結させることが望ましい。すなわち、チップ台に接する、チップ300の基板303の底面から、流路302全体を均一な温度となるように急速に冷却し、氷結が開始する温度よりも有意に低い温度とすることで、一旦過冷却状態とする基板冷却機構、つまり、温度制御機構404を利用することが好ましい。この冷却機構は、基板303の底面全体を均一に冷却するため、基板303の底面全体と均一に熱的接触する配置を採ることが望ましく、チップ台と温度制御機構とを一体化する形態が望ましい。次に、基板303の上面からフタ304を剥離する。このとき、チップ収容部にある、チップ300を冷却し続けることで、泳動後のサンプル溶液の氷結体を流路302内に保持したまま、基板303上面を露出することができる。基板303上面とフタ304下面とを密着させ、所定の配置で接着状態を達成している接着力を開放するため、基板303上面に対して実質的に垂直な方向成分を有する外力を、フタ304の端部に印加して、フタ304を撓ませ、この撓みを所定の曲率に保持しつつ、フタ304の端部を上方に持ち上げる形式で所望の速度で剥離を進める。このフタ304の剥離の過程で、フタ304のフタ樹脂部307の下面と接触している、溝状流路302内の泳動後のサンプル溶液の氷結体上面でも、速やかに剥離が進み、泳動後のサンプル溶液の氷結体は溝状流路302内に残された状態で、フタ304の剥離を完了させる。その後、分離されたフタ304は、例えば、フタ304の端部をツマミ部でチャックした状態に保持し、ツマミ部を移動させることで、基板303上面から取り除かれる。泳動後のサンプル溶液の氷結体は流路302内に残され、露呈された状態となっており、そのまま、凍結乾燥処理を行うことが可能である。フタ304の剥離後、泳動後のサンプル溶液の氷結体を凍結状態に保持しつつ、チップ300を加熱するか、あるいは、チップ300の温度を制御しつつ、密閉槽であるチップ収容部の減圧を行って、凍結乾燥処理を実施する。泳動後のサンプル溶液の氷結体中に含まれる、凝固した液体成分水を除去する凍結乾燥処理が完了すると、流路302に沿って、分離されている各スポットは、その位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットとして、乾燥固定される。凍結乾燥処理の完了後、チップ300の温度を、外気に含まれる水蒸気が結露する温度露点温度を超える温度に上昇した後、チップ収容部の内圧を大気圧にまで戻す。サンプル前処理工程101において調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプルに対して、上述の手順に従って、等電点タンパク質分離チップに適合する電気泳動乾燥装置を使用する等電点電気泳動工程102を実施する。その結果、調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプル中に含まれる、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群は、流路302に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットの一群として、流路302上に乾燥固定される等電点電気泳動条件等電点電気泳動の対象となるトリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群は、下記の6つのタイプに大別される。タイプA-0C末にArg残基又はLys残基を有し、酸性アミノ酸残基を含まないペプチド断片;タイプA-1C末にArg残基又はLys残基を有し、酸性アミノ酸残基一つを含むペプチド断片;タイプA-2C末にArg残基又はLys残基を有し、酸性アミノ酸残基二つ以上を含むペプチド断片;タイプA’-0C末にMDA化Lys残基を有し、酸性アミノ酸残基を含まないペプチド断片;タイプA’-1C末にMDA化Lys残基を有し、酸性アミノ酸残基一つを含むペプチド断片;タイプA’-2C末にMDA化Lys残基を有し、酸性アミノ酸残基二つ以上を含むペプチド断片;これらタイプA-0~タイプA’-2のペプチド断片のpIは、恐らくは、タイプA-0>タイプA-1>タイプA’-0>タイプA-2>タイプA’-1>タイプA’-2の序例で小さくなり、少なくとも、pI3~10の範囲に含まれると予測される。従って、等電点電気泳動においては、pI3~10の範囲のペプチド断片を分離する条件を採用する。陽極液として、アルカリ溶液、例えば、40mM水酸化ナトリウム水溶液pH12、陰極液として、酸溶液、例えば、100mMリン酸水溶液約pH2を利用し、流路内にpH勾配を形成する。なお、H3PO4オルトリン酸のpKaは、pKa1212pKa2721pKa3126725°Cと報告されている。等電点電気泳動のサンプル溶液は、サンプル前処理工程101において調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプルを、下記の等電点電気泳動用サンプル調製溶液中に溶解して調製する。等電点電気泳動用サンプル調製溶液は、例えば、66cIEFgel、3Carrierampholyteを含む水溶液を利用する。該サンプル調製溶液中には、pIと分子量Mが既知のタンパク質をpIの標準として添加し、等電点電気泳動後、流路に沿ってスポットの形成しているペプチド断片のpIを推定する際、その基準に利用する。例えば、該サンプル調製溶液中に、500fmolμLangiotensinIIpI6.74、500fmolμLfibrinopeptideBpI4.0を添加する。加えて、必要に応じて、2蛍光マーカーpI4,5.5,9の3種類を、該サンプル調製溶液中に添加することもできる。該蛍光マーカー三種は、等電点電気泳動後、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、pI4、pI5.5、pI9に相当する位置にスポットを形成する。従って、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、蛍光顕微鏡により、各蛍光マーカーのスポットからの蛍光を観察することで、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、pI4、pI5.5、pI9に相当する位置を判別する際、利用できる。サンプル前処理工程101において、例えば、血清300μL中に含まれる、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質を分取して調製されたペプチド断片群全量を含む乾燥物サンプルを、前記サンプル調製溶液8μL中に溶解することができる。等電点タンパク質分離チップの流路302の全長Lは、例えば、35mm、また、流路の幅Wは、例えば、2mmに選択する。後述するように、MALDI-TOFMS質量分析工程103では、流路302の全長Lを71の区画に分割して、各区画において、MALDI-TOFMSスペクトルを測定する際、各区画の長さΔLは、約0.5mm、各区画のpIの変化量ΔpIは、0.1程度となる。流路302の底面部に形成される柱状体301の形状、長さLpillar、幅Wpillar、高さHpillarは、通常、Lpillar>Hpillar>Wpillarとなるように選択する。柱状体の長さLpillarは、前記各区画の長さΔLの110以下に選択することが望ましい。また、柱状体の幅Wpillarは、流路の幅Wの110以下に選択することが望ましい。この柱状体は、流路302を作製する際、同時に作製される。従って、流路302の深さDは、該流路302の底面部に形成される柱状体の形状、長さLpillar、幅Wpillar、高さHpillarを考慮し、流路302の深さDは、2Hpillar>D≧Hpillarの範囲に選択することが望ましい。例えば、流路302の深さDを、D=Hpillarとなるように選択することがより望ましい。該柱状体の側壁面は、親水性を示すことが望ましく、例えば、柱状体の側壁面上に、親水性コートを施すことが好ましい。また、流路302の底面部に形成される柱状体を規則的に配置し、親水性の側壁面を有する柱状体間に生じる隙間が、サンプル溶液に対して、毛管現象を生起するに十分な狭さを示すものとすることが望ましい。流路302中にサンプル溶液を導入する際、一方のリサーバに注入したサンプル溶液は、親水性の流路302の底面に濡れ拡がり、さらに、流路302の底面部に形成される柱状体間の狭い隙間を、毛管現象を利用することで進行することで、流路302の底面部全体に濡れ拡がることができる。最終的に、一方のリサーバに注入したサンプル溶液は、流路302中、底面部に柱状体301が形成されている領域全体に進入するため、流路302全体に均一に導入された状態となる。この毛管現象を利用する、サンプル溶液の導入手段を利用するので、吸引操作を使用することなく、サンプル溶液を流路302全体に均一に導入することができる。その後、流路302の両端に設けるリザーバ305a、305bに、それぞれ注入される陰極液、陽極液は、流路302内に既に充填されている、サンプル溶液と流路302の両端で接する状態となる。リザーバ305a、305bに、それぞれ注入される陰極液、陽極液の間に電圧を印加すると、流路に沿って、電圧勾配電界が形成され、また、pHの勾配も形成される。流路に沿って形成される、電圧勾配電界とpHの勾配を利用して、流路302中に導入されているサンプル溶液中に含有されるペプチド断片、タンパク質、ならびに、蛍光マーカーの等電点電気泳動がなされる。等電点電気泳動時には、陰極液、陽極液の間の電圧印加は、例えば、1.5kV、60s;0V、30s;3.0kV、720sとすることで、まず、サンプル溶液中に含有されるペプチド断片、タンパク質、ならびに、蛍光マーカーを電圧勾配電界を利用し、流路の中央部に集積した後、形成されるpHの勾配と電圧勾配電界を利用して、それぞれのpIに従って、分離し、スポットを形成させる。3MALDI-TOFMS質量分析工程凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットの一群として、流路302上に乾燥固定されている、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片の一群について、MALDI-TOFMS質量分析を利用して、各ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のm/z、該イオン種[MpeptideH]のイオン強度IpI[MpeptideH]の流路方向の分布を測定する。具体的には、流路302に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、pIが3~10の範囲で、乾燥固定されている各スポットを構成するペプチド断片pI,MpeptideのpIは増加している。従って、流路302に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、71の区画に分割して、各区画内に存在しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のm/zと、そのイオン強度IpI[MpeptideH]を測定する。各スポットを構成しているペプチド断片pI,Mpeptideは、そのpIに相当する区画において、該ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のイオン強度IpI[MpeptideH]は極大を示し、そのスポットの流路方向の分布に伴って、その前後の区画で測定されるイオン強度IpI[MpeptideH]は減少する。各区画jの中央のpI値をpIjj=1~71、該区画jにおいて検出されるmz=Mk11のイオン種[MkH]のイオン強度IpIj[MkH]を、pIj,mz平面上に二次元プロットすると、図8に例示するように、各スポットを構成しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]は、該pIj,mz平面上において、pImean,Mpeptide11に極大点を示すイオン強度分布を与えるはずである。MALDI-TOFMS質量分析工程103では、流路302に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットの一群を特定するため、流路302に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、71の区画に分割して、各区画jj=1~71において、MALDI-TOFMSスペクトルを測定する。各区画jにおいて測定されるMALDI-TOFMSスペクトルに基づき、該区画jにおいて検出される、複数のイオン種kのmz=Mk11と、そのイオン強度IpIj[MkH]を決定することができる。以下に、MALDI-TOFMS質量分析工程103において、流路302に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、71の区画に分割して、各区画jj=1~71において、MALDI-TOFMSスペクトルを測定する手順を、説明する。等電点電気泳動チップの流路上には、等電点電気泳動工程102において、分離され、そのスポット位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットの一群として、乾燥固定されている。該等電点電気泳動チップの流路に、MALDI-TOFMSの測定で利用されるマトリックス剤溶液を塗布し、乾燥処理して、測定用マトリックスを流路上に形成する。測定用マトリックスを形成した後、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、71の区画に分割された、各区画jj=1~71について、順次、MALDI-TOFMSスペクトルを測定する。以下に、MALDI-TOFMSの測定で利用されるマトリックス剤溶液、マトリックス剤溶液の塗布に利用する溶液塗布装置、MALDI-TOFMSスペクトルの測定に利用されるMALDI-TOFMS質量分析装置について、説明する。31マトリックス剤溶液ApoB100タンパク質自体は、アミノ酸数が4500を超える巨大タンパク質であるが、測定対象は、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質をトリプシン消化することで得られるペプチド断片であるため、アミノ酸数は50以下であり、マトリックス剤として、シナピン酸35ジメトキシ4ヒドロキシケイ皮酸、CHCAαシアノ4ヒドロキシケイ皮酸、DHB25ジヒドロキシ安息香酸等が好適に用いられる。一方、測定を行う、各区画jj=1~71に存在している、ペプチド断片に由来するイオン種[MkH]のmz=Mk11を高い確度で決定する必要がある。従って、各区画jj=1~71で測定されるMALDI-TOFMSスペクトル中に、そのmz値の更正に利用される、質量Mが既知のペプチド、タンパク質に起因するイオン種[MH]のピークを複数含むことが好ましい。例えば、質量更正用ペプチドとして、900fmolμLBradykininfragment17M=7573997、200fmolμLACTHfragment1839M=24651986、200fmolμLInsulinBchainoxidizedM=34946513を含有させる。等電点電気泳動において、スポットを形成しているペプチド断片は、通常、電気的に中性となっている。また、凍結乾燥処理を行った時点でも、ペプチド断片は、通常、電気的に中性となっている。凍結乾燥処理後、通常、該ペプチド断片中に存在するカルボキシル基は、-COOHとなっているが、一部、金属塩型の-COONaの形態となっているものが混入する場合がある。質量分析に先立ち、金属塩型の-COONaを-COOHの形態に変換することが望ましい。その目的で、マトリックス剤溶液中には、プロトン供与体となる、トリフルオロ酢酸を僅かに加える。また、マトリックス剤溶液を塗布した後、含まれる溶媒の蒸散を容易に行うため、水より沸点が有意に低く、水と均一に混合する極性溶媒と、水との混合溶媒を使用する。マトリックス剤溶液として、例えば、20μmolμLsinnamicacid、005TFA、2formamide、70acetonitrile沸点82°C、900fmolμLBradykininfragment17、200fmolμLACTHfragment1839、200fmolμLInsulinBchainoxidizedを含む水溶液を利用することができる。前記組成のマトリックス剤溶液を使用する際には、深さDの流路302、例えば、深さ10μmの流路に対して、マトリックス剤溶液の塗布膜厚は、該流路302の深さDを超えない範囲に選択する。上述する質量更正用ペプチド、マトリックス剤の含有濃度を選択することにより、測定に必要とされる、単位面積当たりのマトリックス剤の量、添加されている質量更正用ペプチドの量を満足することが可能である。等電点電気泳動チップの流路内に、マトリックス剤溶液を均一な塗布膜厚で塗布する。なお、マトリックス剤溶液の塗布膜厚は、流路の深さDを超えない範囲に選択される。従って、流路とその両端に設けるリザーバ部分からなる、窪み領域全体として、塗布されるマトリックス剤溶液の液量の合計は、該窪み領域の全容量を超えない範囲に選択される。32溶液塗布装置流路内に、マトリックス剤溶液を均一な塗布膜厚で塗布するため、溶液塗布装置が利用される。通常、溶液塗布装置は、微細な円筒から、シリンジあるいはガスによる圧力でマトリックス剤溶液を適量ずつ押し出す機構と、前記微細な円筒とチップとの相対位置を変える機構とを具えるディスペンサーの構成をとる。該溶液塗布装置を利用して、各流路に対して、流路とその両端に設けるリザーバ部分からなる、窪み領域全体に対して、所定のマトリックス剤溶液液量を供給する。流路の底面部は、親水性であるため、供給されるマトリックス剤溶液は、流路の底面部全体を均一に覆うように濡れ拡がる。塗布されたマトリックス剤溶液の乾燥は、マトリックス剤溶液中に含まれる溶媒成分の蒸散を促進するため、加熱して行う。その際、加熱温度Tdryingは、マトリックス剤溶液中に含まれる溶媒成分の沸点Tbpに対して、Tdrying<Tbpの範囲に選択される。例えば、上に例示するマトリックス剤溶液の場合、溶媒成分として、ホルムアルデヒド、アセトニトリル、水を含んでおり、そのうち、最も低い沸点を有するアセトニトリルの沸点82°Cよりも低い、80°Cに加熱温度Tdryingを設定することができる。すなわち、溶媒成分の沸点を超えると、気泡が発生し、均一に乾燥処理されたマトリックスの形成が困難とすることを回避する。33MALDI-TOFMS質量分析装置流路に沿って、分離され、そのスポット位置を保持したまま、凍結乾燥処理済みのペプチド断片のスポットの一群を特定するため、流路に沿って、酸側からアルカリ側に向かって、71の区画に分割して、各区画jj=1~71において、MALDI-TOFMSスペクトルを測定する。各区画のpIの変化量ΔpIは0.1程度であるため、スポットを構成するペプチド断片pImean,Mpeptideに由来するイオン種は、該スポットの流路方向の拡がりσpIを考慮すると、pImeanに相当する区画に加えて、その前後、pImean±σpIの範囲に相当する、複数の区画においても、検出される。また、各区画jのpIの範囲に、pImeanを示すペプチド断片pImean,Mpeptideも複数種存在する。従って、各区画jにおいて測定されるMALDI-TOFMSスペクトル中には、相当数のペプチド断片に由来するイオン種[MkH]のピークが含まれる。これら相当数のペプチド断片に由来するイオン種[MkH]のピークについて、そのmz=Mk11を高い確度で決定するとともに、そのイオン強度IpIj[MkH]を高い精度で測定する必要がある。少なくとも、mz=Mk11については、測定誤差Δmz0.2程度の確度であることが望ましい。また、スポットを構成するペプチド断片pImean,Mpeptideについて、スポットの流路方向の拡がりσpIに起因する、イオン強度IpI[MpeptideH]の分布に基づき、該スポットの中心のpImeanを特定する際、隣接する区画で測定される、イオン強度IpIj[MkH]の比較を行う必要がある。各区画で測定されるスペクトル間でピーク強度の比較を行うため、マトリックス剤溶液中に添加されている内部標準のペプチドに由来するイオン種のイオン強度を基準として、各区画で測定されるスペクトル中のピーク強度の標準化を行う。このピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドとして、上述の質量更正用ペプチドの一つを使用することが望ましい。例えば、先に例示したマトリックス剤溶液の場合、質量更正用ペプチドのうち、Bradykininfragment17の添加量を高く設定し、ピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドとしても利用している。測定に使用するMALDI-TOFMS質量分析装置は、チップを質量分析装置内にセットするターゲットホルダーと、レーザ光照射位置に、チップ上の流路に沿って区画している、各区画を移動させ、レーザ光を照射する光照射機構と、各区画に対するレーザ光照射によりイオン化される、ペプチド断片に由来するイオン種[MkH]を検出し、質量スペクトルを得る解析機構とを具えている。レーザ光の照射スポット径dlaserは、50μm~200μmの範囲に選択する。利用するマトリックス剤の種類に応じて、MALDI-TOFMSで利用する、パルスレーザ光の波長を選択する。パルスレーザ光照射を繰り返し、検出される、イオン種[MkH]のイオン強度を積算することで、各区画の質量スペクトルを測定する。パルスレーザ光照射の繰り返し回数は、ピーク強度の標準化に利用する、内部標準のペプチドに起因するイオン種のピーク強度が、所定の強度範囲になるように選択される。測定するイオン種[MkH]のmzの範囲は、対象のペプチド断片は、アミノ酸数5以上のペプチド断片に限定するため、400<mz<15000の範囲に設定する。例えば、測定されるスペクトル上における、上記の三種質量更正用ペプチドに由来するイオン種[MMassstandardH]のピーク位置に基づき、mzの更正を行う。また、各区画jにおいて測定される、質量更正用ペプチドのうち、Bradykininfragment17に由来するイオン種[MBradykininH]のピーク強度IjBradykininを基準として、ペプチド断片に由来するイオン種[MkH]のピーク強度IpIj[MkH]を標準化し、相対値IpIj[MkH]IjBradykinin×100≡IrelpIj[MkH]を利用して、異なる区画のスペクトルの比較を行う。4サンプルプロファイリング工程104サンプルプロファイリング工程104では、流路に沿って、71の区画に分割して、各区画jj=1~71において測定された、MALDI-TOFMSスペクトルに基づき、等電点電気泳動工程において、分離されている、各スポットを形成しているペプチド断片pImean,Mpeptideについて、そのpImeanと分子量Mpeptideを特定する。各区画jのpI値pIjの推定まず、流路に沿って、71の区画に分割して、各区画jj=1~71について、該区画j中、MALDI-TOFMSスペクトルの測定の際、レーザ光照射位置、区画jj=1~71の中央位置、LmeanjのpI値pIjを推定する。等電点電気泳動を行う際、サンプル溶液中に添加した、蛍光マーカーpI4,5.5,9の3種類は、等電点電気泳動が終了した時点で、流路に沿って、pI4,5.5,9に相当する位置にそれぞれスポットを形成している。凍結乾燥処理を終えた時点で、蛍光顕微鏡を用いて、これら蛍光マーカーに起因する蛍光を発している位置を特定する。各蛍光マーカーのスポットの中心位置、LpI=4、LpI=5.5、LpI=9は、各区画jj=1~71の中央位置、Lmeanjのいずれと一致しているかを特定する。前記LpI=4、LpI=5.5、LpI=9と、それぞれ一致している、区画jの中央位置、LmeanjのpI値pIjは、それぞれ、pIj≒4、pIj≒5.5、pIj≒9である。また、pIを推定する際、その基準に利用するpI標準ペプチド、angiotensinIIpI6.74、MangiotensinII=1045.534、fibrinopeptideBpI4.0、MfibrinopeptideB=1569.669のスポットを特定する。蛍光マーカーのスポット位置から決定された、pIj≒4、pIj≒5.5、pIj≒9の各区画を基準として、前記二つのpI標準ペプチドのスポットの中心が位置する区画を推定する。推定された区画を中心として、前後5つの区画で測定されるMALDI-TOFMSスペクトル中、angiotensinIIに由来するイオン種[MangiotensinIIH]のピークmz=MangiotensinII1、ならびに、fibrinopeptideBに由来するイオン種[MfibrinopeptideBH]のピークmz=MfibrinopeptideB1を、それぞれ特定する。特定されたangiotensinIIに由来するイオン種[MangiotensinIIH]のピーク強度相対値IrelpIj[MangiotensinIIH]を比較すると、ピーク強度相対値IrelpIj[MangiotensinIIH]が極大を示す、一つの区画を見出すことができる。angiotensinIIのスポット中心が見出される、区画jの中央位置、LmeanjのpI値pIjは、pIj≒6.74である。特定されたfibrinopeptideBに由来するイオン種[MfibrinopeptideBH]のピーク強度相対値IrelpIj[MfibrinopeptideBH]を比較すると、ピーク強度相対値IrelpIj[MfibrinopeptideBH]が極大を示す、一つの区画を見出すことができる。fibrinopeptideBのスポット中心が見出される、区画jの中央位置、LmeanjのpI値pIjは、pIj≒4.0である。また、流路の両端の区画の中央位置、すなわち、区画1の中央位置Lmean1のpI値pI1、区画1の中央位置Lmean71のpI値pI71は、それぞれ、陰極液、例えば、100mMリン酸水溶液の約pH2、陽極液、例えば、40mM水酸化ナトリウム水溶液のpH12から、pI1≒2、pI71≒12である。以上の操作によって、計7つの区画の中央位置、LmeanjのpI値pIjが特定される。流路に沿って、区画されている、各区画jの中央位置、LmeanjのpI値pIjは、特定された計7つの区画の中央位置、LmeanjのpI値pIjに基づき、内挿することにより、推定される。推定された各区画jの中央位置、LmeanjのpI値pIjの誤差は、±0.1程度である。等電点電気泳動を行う、サンプル溶液中には、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンも含まれている。抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンについてが、そのpIと分子量Mは予め判明しているので、そのスポット位置と、イオン種のピーク位置mzも、上記pI標準ペプチドに適用した手法を用いて、特定される。以上に述べた、pIと分子量Mが既知である、抗MDA-LDL抗体由来のペプチド断片群、トリプシン由来のペプチド断片群と、トリプシンに由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpIj[MkH]は、いずれのサンプル溶液でも、原則的には同じである。MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群のpImean、Mpeptideの決定次に、流路に沿って、71の区画に分割して、各区画jj=1~71において測定された、MALDI-TOFMSスペクトル中から、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群に由来するイオン種のピークを抽出し、該ペプチド断片が形成するスポットの中心のpImeanを特定する手順について、説明する。すなわち、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片群について、該ペプチド断片を特定するpImean、Mpeptideを決定する手順について、説明する。MALDI-TOFMSスペクトル中のイオン種のピークの抽出サンプル溶液中に含まれる、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片の濃度が低い場合があり、含有濃度の低いペプチド断片に由来するイオン種のピーク強度は小さくなる。このようにピーク強度が小さなイオン種のピークも、各区画jj=1~71において測定された、MALDI-TOFMSスペクトル中から抽出するため、測定されたスペクトルのスムージングを行う。MALDI-TOFMSスペクトルは、実際には、飛行時間tiとtiδtの間時間窓幅δtに検出系に到達したイオン種の個数Ntiをカウントしたものである。従って、実際は、ti,Ntiの形式の離散的なデータ列となっている。tiの増分Δtiに対して、δtを十分に狭く設定している。各レーザ光パルスによりイオン化され、この時間窓幅δtの間に、検出系に到達するイオン種の個数Nmtiは、中心値Nmeantiのポワソン分布に従っている。レーザ光パルス多数回mについて、各回のカウント数Nmtiを積算した、ΣNmti=Ntiは、ポワソン分布によるバラツキが平均化され、積算回数mが増すとともに、mNmeantiに近くなる。ポワソン分布におけるバラツキの程度は、中心値Nmeantiに対して、Nmeanti12程度であり、Nmeanti12/Nmeantiは、中心値Nmeantiが小さくなると、顕著に大きくなる。そのため、ピーク強度が小さなイオン種のピークでは、本来のピーク中心の位置tipeakにおいて、ΣNmtiが極大値を示さず、見かけ上、極大を示す点が若干ずれる場合がある。測定されたスペクトルのスムージングを行うことにより、本来のピーク中心の位置tipeakを推定することができる。加えて、検出系に到達したイオン種の個数をカウントする際、ノイズ成分が存在しており、ピーク強度が小さなイオン種のピークでは、元来、S/N比が相対的に低く、測定されたスペクトルのスムージングを行うことにより、ノイズの影響を相対的に低減することが可能である。測定されたスペクトルのスムージングは、原理的には、ti、Ntiの形式の離散的なデータ列に対して、移動平均を取ることに相当している。実際的には、SavitzkyGolayfilterを用いて、指定した数ごとにスペクトルのmzとシグナル値ti、Ntiの平均をとることで、質量スペクトルのスムージングを行う。図7に、測定されたスペクトルのスムージングを行った結果の一例を示す。スムージング処理後、極大を示すtipeakobs、Ntipeakobsを選び、該ピークのm/zの測定値とする。スムージング処理に伴い、本来のピーク中心のtipeak、Ntipeakに対して、該ピークのm/zの測定値は、±0.2程度の系統的誤差δを示す場合がある。一方、同じスペクトル上に観測されるピーク間のm/zの差は、最小でも、±1であるため、隣接するピークは、十分に分離されている。隣接する区画で測定されるスペクトルを比較する場合には、二つのスペクトル上で観測されている、m/zが誤差範囲内で一致するピークが、同じペプチド断片に由来するイオン種であるか、否かの判断を行う必要がある。等電点電気泳動により、流路に沿って、分離される、ペプチド断片pI,Mpeptideは、pImeanを中心とし、流路方向の拡がりσpIを示すスポットを形成している。該スポットにおける、ペプチド断片pI,Mpeptideの量の分布は、pImeanを中心とし、流路方向の拡がりσpIを示すガウス分布と見做せる。従って、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のイオン強度IpI[MpeptideH]を測定すると、pImeanを中心とし、流路方向の拡がりσpIを示すガウス分布様の強度変化を示す。各区画で測定されるスペクトル上に見出される、ピークpIjmzkのピーク強度相対値IrelpIjmzkを、pIj,mz平面上に二次元プロットすると、スポットを形成しているペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度相対値IrelpI[MkH]は、ガウス分布様の強度変化を示す。スムージング処理に伴い、ピークのm/zの測定値は、±0.2程度の系統的誤差を示すことを考慮すると、ピークのm/zkの測定値が±0.2以内で一致し、ピーク強度相対値IrelpIjmzkがガウス分布様の強度変化しているピークは、同じペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークと判断することができる。図8に、上記の判断基準に従って、pIj,mz平面上に二次元プロットした、ピークpIjmzkのピーク強度相対値IrelpIjmzkの分布に基づき、同じペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークを特定した例を示す。その際、各スポットの流路方向の拡がりσpIは、中心値pImeanがほぼ同じ場合には、流路方向の拡がりσpIの程度もほぼ同じになる。標準的な流路方向の拡がりσpIは、各pI領域では、それぞれ、蛍光マーカー、pI標準ペプチドのスポットで見出される流路方向の拡がりσpIとほぼ等しくなる。例えば、分子量Mpeptideが等しく、pImeanの差ΔpImeanが、流路方向の拡がりσpIに対して、ΔpImean≒σpIである、二つのペプチド断片pImean,Mpeptide、pImeanΔpImean,Mpeptideが分離されている場合、このpI領域で見出される、mz=Mpeptide1のピークのピーク強度相対値IrelpIjMpeptide1の分布は、流路方向の拡がりσpIが異常に広いスポットを示す。このような場合であっても、このpI領域における、標準的な流路方向の拡がりσpIを有する、二つの中心値を有するガウス分布の重なりとして、分離することで、二つのペプチド断片pImean,Mpeptide、pImeanΔpImean,Mpeptideに由来するイオン種のピークを抽出することが可能である。換言するならば、それぞれのpI領域における、標準的な流路方向の拡がりσpIを有する、ガウス分布を仮定して、pIj,mz平面上に二次元プロットした、ピークpIjmzkのピーク強度相対値IrelpIjmzkの分布を解析することにより、単一のペプチド断片pI,Mpeptideがスポットを形成しているか、偶々、分子量が一致しており、僅かにpImeanが異なるペプチド断片のスポットが重なりあっているかの判定を行うことができる。但し、偶々、分子量Mpeptideが一致しており、pImeanの差ΔpImeanが、0.1≧ΔpImeanである場合には、前記の判定手順では、複数のペプチド断片のスポットが重なりあっているか、否かの判定は不能である。上述のピークの抽出処理を行うと、その流路に沿って、分離されているトリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片pI,Mpeptideのスポット中心のpImeanと、該ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度相対値IrelpI[MkH]が決定される。その際、ペプチド断片pI,Mpeptideのスポット中心のpImeanの特定の誤差は、そのpI領域における、標準的な流路方向の拡がりσpIを超えることは無いが、誤差δpImeanは、±12σpI程度となっている。従って、誤差δpImeanは、最大、±0.4となる。複数の血清サンプル間における、抽出されたピークの対応付け同定複数の血清サンプル間において、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片pI,Mpeptideの量を比較するため、各血清サンプルから調製されるサンプル溶液を同一の条件で、等電点電気泳動とMALDI-TOFMS質量分析を行う。各血清サンプルから調製されるサンプル溶液の等電点電気泳動を行った、各流路に沿って、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkについて、同じペプチド断片pI,Mpeptideであるか、否かの対応付け同定を行う。上記の手順に従って、それぞれの流路に沿って、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkでは、各区画jのpIjを内挿法で推定しているため、pIjの推定値は、±0.1程度の誤差δpIiを有し、また、スポット中心のpImeanの特定時の誤差δpImeanは、最大、±0.4となっている。従って、任意の二つの流路間で、ピークの抽出がなされた、同じペプチド断片pI,Mpeptideについて、そのスポット中心のpImeanの特定結果を比較すると、両者のpImean推定値の見かけ上の相違は、最大、δpIiδpImean、±0.5に達する場合がある。一方、スムージング処理に伴う、系統的誤差δは、最大±0.2であることを考慮すると、両者の分子量Mkの推定値の見かけ上の相違は、最大、±0.3に達する場合がある。従って、任意の二つの流路間で、それぞれ、流路に沿って、分離され、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkについて、前記のpImean推定値の見かけ上の相違、分子量Mkの推定値の見かけ上の相違を考慮して、同じペプチド断片pI,Mpeptideであるか、否かの対応付け同定を行う。等電点電気泳動により分離される、ペプチド断片pI,Mpeptideのスポットの流路内での相対順序は、本来のpIの順序に従うため、任意の二つの流路間で、相対順序が逆転することは無い。従って、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkについて、流路内におけるpImean,Mkの相対順序に従って、対応関係を決定することが可能である。具体的には、流路に沿って、pI3~pI10の範囲を、各蛍光マーカーのスポットの中心位置、LpI=4、LpI=5.5、LpI=9、pI標準ペプチド、angiotensinIIpI6.74、fibrinopeptideBpI4.0のスポットの中心位置、LpI=6.74、LpI=4.0において、5つの領域3に分割する。それぞれの流路について、分割された各領域中において、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkの一群に関して、pImean,Mkの相対順序を決定する。同じペプチド断片pI,Mpeptideである場合、分子量Mkの推定値の見かけ上の相違が±0.3以内であるという条件を考慮しつつ、分割された領域中におけるpImean,Mkの相対順序が従って、二つの流路間において、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkが同じペプチド断片pI,Mpeptideであるか、否かの対応付け同定を進める。同じペプチド断片pI,Mpeptideと対応付け同定される際には、二つの流路に沿って、ピークの抽出がなされた、ペプチド断片pImean,Mkの由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpIjmzkの極大点座標pImeanmzkを、それぞれ、pIj,mz平面上に二次元プロットすると、二つの二次元プロット上において、pIjの推定に伴う、系統誤差δpIiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δの範囲内で、極大点座標pImeanmzkは対応している。pIjの推定に伴う、系統誤差δpIiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δの範囲内で、対応する極大点座標pImeanmzkが見出されないペプチド断片pImean,Mkは、一方のサンプル溶液中にしか含まれていないペプチド断片pI,Mpeptideと判断される。被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の差異を反映する、ペプチド断片を選別するため、複数の個人から提供された血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の試料について、それぞれ、上記の手順で、複数の血清サンプル間における、抽出されたピークの対応付け同定を行う。5データ解析マーカー特定工程各個人から提供された血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の試料について、上記の手順で、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片pI,Mpeptideに対応すると対応付け同定された、ペプチド断片pImean,Mkの由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpIjmzkは、当該個人において特定された、トリプシン消化による生成される、MDA-LDL中に含まれるApoB100タンパク質由来のペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度相対値IrelpI,Mpeptide1である。各個人に対して、同定されたペプチド断片pImean,Mkに由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpIjmzkの極大点座標pImeanmzkは、上述するように、pIjの推定に伴う、系統誤差δpIiと、スムージング処理に伴う、系統的誤差δを含んでいる。従って、複数の個人、具体的には、虚血性心疾患と診断された患者群冠動脈病変枝数310名、非患者群冠動脈病変枝数023名、合計33名に対して、同定されたペプチド断片pImean,Mkの由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpIjmzkの極大点座標pImeanmzkを平均して、その平均値pImeanmzkAvを、対応付け同定されたペプチド断片のpIと、該ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]の=Mpeptide1とする。前記33名の各個人に対して、対応付け同定されたペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種のピーク強度相対値IrelpI,Mpeptide1と、極大点座標pI,Mpeptide1のリストを作成している。このリストに記載されるペプチド断片pI,Mpeptideは、ピーク強度相対値IrelpI,Mpeptide1は別として、前記33名の各個人のいずれでも、サンプル溶液中に存在することが確認されたものとなっている。勿論、このリストに記載されるペプチド断片pI,Mpeptideは、各個人から提供された血液サンプル中から、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質をトリプシン消化することで生成されるペプチド断片である。また、患者群冠動脈病変枝数310名、非患者群冠動脈病変枝数023名の間では、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は明確に相違しており、患者群冠動脈病変枝数310名では、酸化の進行度は高く、非患者群冠動脈病変枝数023名では、酸化の進行度は低くなっている。一方、合計33名から提供された血液サンプル中から分取される、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の量は、各個人によって、異なっているため、前記リストに記載される、ピーク強度相対値IrelpI,Mpeptide1は、直接比較することはできない。各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値IrelpIMpeptide1を、それぞれ、サンプル溶液の調製に利用した血清サンプルから、分取されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の量に対して、正規化する必要がある。サンプル溶液を調製する際、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質をトリプシン消化することで生成されるペプチド断片の量モル量は、用いたMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の量モル量に、比例している。そのため、リストに記載する、ペプチド断片pI,Mpeptideの全てについて、そのペプチド断片の量モル量を平均すると、その平均値も、用いたMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質の量モル量に比例している。勿論、リストに記載する、ピーク強度相対値IrelpI,Mpeptide1は、そのペプチド断片pI,Mpeptideの量モル量に、比例している。一方、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]は、サンプル溶液中のペプチド断片pI,Mpeptideの濃度;CpI,Mpeptideと、該イオン種[MpeptideH]の生成効率イオン化効率ppIMpeptideを用いて、IpI[MpeptideH]=ppI,MpeptideCpI,Mpeptideと表記することができる。データ解析マーカー特定工程105で、好適に利用可能な解析手順を以下に説明する。対応付け同定がなされたペプチド断片pI,Mpeptideの一群について、各ペプチド断片pI,Mpeptideに対して、上記平均値pImeanmzkAvを算出し、対応付け同定された該ペプチド断片のpIと、該ペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]の=Mpeptide1としている。一方、各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値IrelpIMpeptide1は、各区画jにおいて測定される、質量更正用ペプチドのうち、Bradykininfragment17に由来するイオン種[MBradykininH]のピーク強度IjBradykininを基準として、ペプチド断片に由来するイオン種[MkH]のピーク強度IpIj[MkH]を標準化し、相対値IpIj[MkH]IjBradykinin×100≡IrelpIj[MkH]とされている。各個人のリストに記載する、ピーク強度相対値IrelpIMpeptide1は、前記標準化処理を施した標準化済ピーク強度であるが、合計33名から提供された血液サンプル中における定量的な比較を行うため、次の手順、に従って、各個人Smのリストに記載する、標準化済ピーク強度IrelpIMpeptide1Smに、対数変換処理と、正規化処理を施し、正規化ピーク強度IpIMpeptide1normalSmを算出する。対数変換処理各個人Smのリストに記載する、標準化済ピーク強度IrelpIMpeptide1Smの対数変換を行い、対数標準化済ピーク強度lnIrelpIMpeptide1Smに変換する。各流路のサンプル溶液中のペプチド断片pI,Mpeptideの濃度;CpI,MpeptideSmと、該イオン種[MpeptideH]の生成効率イオン化効率ppIMpeptideを用いて、IpI[MpeptideH]Sm=ppI,MpeptideCpI,MpeptideSmと表記することができる。該イオン種[MpeptideH]の生成効率イオン化効率ppIMpeptideは、本来、同じイオン種に対しては、等しい。また、各流路で測定されるBradykininfragment17に由来するイオン種[MBradykininH]のピーク強度IjBradykininは、原則的に等しくなっている。従って、対数標準化済ピーク強度lnIrelpIMpeptide1Sm=lnCpI,MpeptideSmlnppIMpeptidelnIjBradykininのうち、{lnppIMpeptidelnIjBradykinin}の部分は、本来、何れの流路でも、等しいはずである。正規化処理まず、各個人Smについて、対応付け同定がなされたペプチド断片pI,Mpeptideの一群Npeak種類において、対数標準化済ピーク強度lnIrelpIMpeptide1Smの平均値、lnIrelpIMpeptide1avSm=1NpeakΣlnIrelpIMpeptide1Smと、該平均値に対する、標準偏差:σlnIrelpIMpeptide1Smを算出する。該平均値は、lnIrelpIMpeptide1avSm=1NpeakΣlnIrelpIMpeptide1Sm={1NpeakΣlnCpI,MpeptideSm}{1NpeakΣlnppIMpeptide}lnIjBradykininとなる。そのうち、{1NpeakΣlnppIMpeptide}lnIjBradykininの部分は、本来、何れの流路でも、等しいはずである。各個人Smについて、対応付け同定がなされた各ペプチド断片pI,Mpeptideの正規化ピーク強度IpIMpeptide1normalSmは、IpIMpeptide1normalSm=lnIrelpIMpeptide1Sm-lnIrelpIMpeptide1avSmσlnIrelpIMpeptide1Smと、定義される。Zスコア化処理各個人Smについて、対応付け同定がなされたペプチド断片pI,Mpeptideの一群Npeak種類に対して、それぞれ、正規化ピーク強度IpIMpeptide1normalSmを算出した後、各ペプチド断片pI,Mpeptideの正規化ピーク強度IpIMpeptide1normalSmに、下記の手順に従って、Zスコア化処理を施す。各個人Smに対して算出された、各ペプチド断片pI,Mpeptideの正規化ピーク強度IpIMpeptide1normalSmに付いて、合計33名の個人Smのサンプルからなる、全サンプル群中において、その全サンプル群中の平均値;IpIMpeptide1normalav=133ΣIpIMpeptide1normalSmと、該全サンプル群中の平均値に対する、全サンプル群中の標準偏差:σIpIMpeptide1normalを算出する。次いで。算出される全サンプル群中の平均値と全サンプル群中の標準偏差用いて、各個人Smに対して算出された、該ペプチド断片pI,Mpeptideの正規化ピーク強度:IpIMpeptide1normalSmについて、IpIMpeptide1normalSm-IpIMpeptide1normalavσIpIMpeptide1nprmalを算出し、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmとする。各個人Smに対して算出された、それぞれのペプチド断片pI,MpeptideのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmを利用して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルについて、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値を算出し、該疾患群冠動脈病変枝数310サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.60以上、好ましくは、0.70以上であるピークを選別する。前記の基準に基づき選別されるピークは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、正規化ピーク強度:IpIMpeptide1normalSmが統計的に有意に大きいピークに相当している。実際、合計33サンプルの全てについて、Z値を合計すると、0であるので、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値は、-0.65×10/23≒-0.28よりも、さらに負な値となっている。従って、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値と、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値との差は、少なくとも全サンプル群中の標準偏差:σIpIMpeptide1normalの0.93以上であり、統計的に有意な差があると見做すことが可能である。各個人Smに対して算出された、それぞれのペプチド断片pI,MpeptideのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmを利用して、receiveroperatingcharacteristic解析を行う。各個人Smに由来するサンプルの測定結果から算出した、ペプチド断片pI,MpeptideのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmを、大きい順に並べると、1位~33位までの順位付けがなされる。疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内であるサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRpIMpeptide1:Nth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内であるサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内に入っていないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRpIMpeptide1:Nth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRpIMpeptide1:NthTNRpIMpeptide1:Nth=1となっている。X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、算出されるTNRpIMpeptide1:Nth、TPRpIMpeptide1:NthNth=1~33をプロットする。TNR,TPRで表記されるROC空間上、0,1と1,0ならびに、前記33個のプロット点を通るROC曲線を描く。描かれるROC曲線と、X軸Specificityとで挟まる領域の面積Aplotを数値積分により算出する。算出される面積Aplotは、AUCareaundertheROCcurveに相当している。前記のROC解析により算出されるAUC値が、少なくとも、0.60以上、好ましくは、0.70以上であるという基準に基づき、疾患群冠動脈病変枝数3とコントロール非患者群冠動脈病変枝数0の推定に有効なペプチド断片pI,Mpeptideを選別することができる。なお、総数33個のサンプルは、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルとコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成されているので、Nth=10の場合のプロット点TNRpIMpeptide1:10、TPRpIMpeptide1:10が、ROC空間上、perfectpredictionに相当する1,1に一致すると、AUC値は1となるさらには、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.65以上であるという基準に基づき、選別されるピークも、疾患群冠動脈病変枝数3とコントロール非患者群冠動脈病変枝数0の推定に有効なペプチド断片pI,Mpeptideに相当している。上記のROC解析により算出されるAUC値に基づく選別基準に基づき、AUC値が、少なくとも、0.60以上と算出されるピークを選別する。選別されるピークについて、該ピークを与える、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片pI,Mpeptideのアミノ酸配列を特定する。選別されるピークを与える、ペプチド断片pI,Mpeptideのアミノ酸配列の特定選別されるピークは、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質をトリプシン消化することで生成するペプチド断片に由来している。MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質は、MDAが関与する化学修飾、あるいは、活性酸素種自体が関与する酸化を受けていることが想定される。その際、Lys残基の側鎖のアミノ基-NH2は、直接MDA化を受け、-NH-CH=CH-CHOに変換されていることが想定される。Lys残基に対するMDAによる酸化がさらに進行すると、Lys残基の側鎖のアミノ基-NH2は、最終的に、dihydorxypyridineとなる。これらMDAが関与する化学修飾によるリジンの分子量の変化は、MDA化54、DHP化134である。図10に、LysがMDA化を受けたときの構造、DHP化を受けたときの構造をそれぞれ示す。また、Met残基の酸化も想定される。Met残基が酸化されて化学修飾を受けた場合、その側鎖の-S-が、-SO-、-SO2-に変換され、16、32の分子量変化が生じる。選別されたピークpIavmzavは、全て、電荷数z=1のイオン種、すなわち、イオン種[MpeptideH]型のピークである。そのmzavは、400<mzav<15000の範囲であり、すなわち、400<Mpeptide1<15000の範囲である、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークであると仮定する。少なくとも、400<Mpeptide1<15000の範囲である、ペプチド断片pIav,Mpeptideのアミノ酸配列は、アミノ酸残基数は、4以上、50以下の範囲である。まず、酸化を受けていないApoB100タンパク質のトリプシン消化に起因して生成する可能性を有する、アミノ酸残基数が50以下のペプチド断片の一群を、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、予測する。具体的には、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Lys残基ならびにArg残基において、トリプシン消化が起こる結果、生成する可能性がある、アミノ酸残基数が50以下の全てのペプチド断片を予測し、ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群とする。ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、各ペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、その分子量Mpeptideを計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片は、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Lys残基ならびにArg残基の内、任意の二つを選択して、トリプシン消化を行うことで生成され、その間の部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数が50以下である、ペプチド断片である。従って、該理論的予測ペプチド断片のC末端は、Lys残基またはArg残基であるが、そのアミノ酸残基数が50以下のアミノ酸配列中に、さらに、Lys残基またはArg残基を含むものも含まれている。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Lys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基の一つが、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54を計算する。さらに、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn1個が、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54×n1を計算する。同様に、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Lys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基の一つが、DHP化修飾を受けた際の分子量Mpeptide134を計算する。さらに、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn2個が、DHP化修飾を受けた際の分子量Mpeptide134×n2を計算する。加えて、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn2個が、DHP化修飾を受け、含まれるLys残基のn1個が、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54×n1134×n2を計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Met残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基の一つが、酸化を受け、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16を計算する。さらに、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn3個が、酸化を受け、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16×n3を計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Met残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基の一つが、酸化を受け、二酸化体MetO2に変換された際の分子量Mpeptide32を計算する。さらに、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn4個が、酸化を受け、二酸化体MetO2に変換された際の分子量Mpeptide32×n4を計算する。加えて、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn4個が、二酸化体MetO2に変換され、含まれるMet残基のn3個が、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16×n332×n4を計算する。上記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、酸化修飾が無いペプチド断片の分子量Mpeptide;含まれるLys残基にMDA化修飾またはDHP化修飾が生じているペプチド断片の分子量Mpeptide54×n1134×n2;含まれるMet残基が、一酸化体MetOまたは二酸化体MetO2に変換されているペプチド断片の分子量Mpeptide16×n332×n4;以上の計算された分子量の予測値Mcalリスト中から、実際に、分子量の予測値Mcalが、400<Mcal1<15000の範囲内であるものを選抜し、候補ペプチド断片の分子量の予測値Mcalリストを作成する。かかる候補ペプチド断片の分子量の予測値Mcalリスト中から、選別されたピークpIavmzavのmzavから推定される、分子量Mobs=mzav-1と、測定誤差範囲±0.3で一致する、分子量の予測値Mcalの候補を選別する。すなわち、選別されたピークpIavmzavに対して、分子量の類似性のみに基づき、分子量の予測値Mcalの候補の特定と、該候補ペプチド断片のアミノ酸配列の決定帰属を行うことが可能である。後述する実施態様中において、より具体的に説明するように、AUC値が0.65以上の基準を満たす、表13、表14~17に示すペプチド断片が、本発明にかかるバイオマーカーとして、選別されている。実施態様本実施態様では、図1に示す診断マーカーとして利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスに従って、診断マーカーとして利用可能なペプチド断片の一群を探索した結果と、実際に、その探索に利用した等電点タンパク質分離チップ、電気泳動乾燥装置、溶液塗布装置、質量分析計、解析プログラム用コンピューター、ならびに、具体的な解析過程を以下に示す。本実施態様においては、解析対象のペプチド断片は、トリプシンによる断片化により採取されるため、探索された診断マーカーとして利用可能なペプチド断片の一群は、表13、表14~表17に記載するように、該ペプチド断片の切断末端は、トリプシン消化に特異的なものとなっている。本実施態様においては、診断マーカーとして利用可能な酸化ペプチド断片の一群として、表18-1、表18-2に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片が利用可能であることを明らかにしている。本実施態様では、解析対象のペプチド断片は、トリプシンによる断片化により採取されるため、表18-1、表18-2に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片として、該ペプチド断片の切断末端は、トリプシン消化に特異的なもの、例えば、表14~表17に記載される一群の酸化ペプチド断片が選別されている。表18-1、表18-2に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片は、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化した際にも、診断マーカーとして利用可能な酸化ペプチド断片となる。本発明にかかる心疾患診断マーカーの技術的範囲は、表18-1、表18-2に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片全般を含み、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化された、表18-1、表18-2に記載される修飾アミノ酸を含むペプチド断片の一群をも包含している。また、図1に示す診断マーカーとして利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスは、解析対象のペプチド断片は、トリプシンによる断片化により採取される形態は勿論のこと、解析対象のペプチド断片が、トリプシン以外の消化酵素を利用して断片化されている形態でも、本発明にかかる心疾患診断マーカーを探索する際、同様に有効な手法である。以下に、図1に示す診断マーカーとして利用可能な酸化ペプチド断片の一群の探索プロセスに従って、診断マーカーとして利用可能なペプチド断片の一群を探索した結果と、具体的な解析過程を示す。まず、本実施態様の探索に利用した等電点タンパク質分離チップ、電気泳動乾燥装置、溶液塗布装置、質量分析計、解析プログラム用コンピューターを以下に説明する。1等電点タンパク質分離チップ図5は、該実施態様において使用される、等電点タンパク質分離チップの具体的な構成を示す。図5のBに、等電点タンパク質分離チップの外観を示す。図5のAに、該チップ基板上に設ける流路の配置と、該流路の幅Wと全長Lを示す。図5のCに、チップ基板と、チップのフタの断面形状を模式的に示し、フタを装着した時点の流路の深さD、ならびに、流路両端のリザーバの位置を示す。図5のDは、流路の底面に形成されるピラー構造柱状体の周期的な配置の概要とそのサイズを示し、図5のEは、流路の底面に形成されるピラー構造柱状体の別の一例を示す。該実施態様において使用される、等電点タンパク質分離チップでは、流路のサイズは、幅W2mm、全長L35mm、深さD10μmに選択されている。該流路の底面に形成されているピラー構造柱状体は、個々のピラーのサイズは、幅Wpillar3.75μm、長さLpillar12.5μm、高さHpillar10μmであり、該ピラーは、その長手方向を、流路の長手方向と一致させて、等間隔で周期的に配置されている。流路内壁面側壁と底面、ならびにピラー構造柱状体の壁面には、線形ポリアクリルアミドがコートされている。線形ポリアクリルアミドコートにより流路は親水性を保ち、同時に、等電点電気泳動時の電気浸透流も抑えられている。なお、該実施態様で使用している、流路と、該流路に設ける柱状構造ピラー構造のサイズについて、具体的な数値を記載しているが、これらの数値は、本発明の実施に利用可能な等電点タンパク質分離チップの流路ならびに、該流路に設ける柱状構造ピラー構造の一例を示すものであり、かかる具体例の構造に限定されるものではない。2電気泳動乾燥装置図6は、該実施態様において使用される、電気泳動乾燥装置の具体的構成を示す。チップ台不図示に等電点タンパク質分離チップが設置されている。温度制御機構不図示にて、チップ台を通して、チップ温度を制御する。図6に示す電気泳動乾燥装置の乾燥機構は、凍結乾燥機構であり、密閉槽構築のための密閉用ガラス蓋と、減圧装置不図示と、真空排気口とで構成されている。電極は、流路両端のリザーバに挿入され、配線によって、電源やコントローラ不図示と電気的に接続される。3溶液塗布装置不図示MUSASHIENGINEERING製ディスペンサー装置であるSuperSigmaCMV2を用いている。本実施態様で使用するマトリックス溶液は、20μmolμLsinnamicacid、005TFA、2formamide、70acetonitrile沸点82°C、さらに質量更正用ペプチドとして、900fmolμLBradykininfragment17M=757.3997、200fmolμLACTHfragment1839M=2465.1989、200fmolμLInsulinBchainoxidizedM=3494.6513を含む水溶液である。4質量分析計不図示Shimadzu社製MALDITOFMSであるKratosAXIMACFRplusを用いている。タンパク質分離チップを質量分析計に設置する際には、専用のターゲットプレートを利用している。該専用のターゲットプレートは、Shimadzu社より提供される標準ターゲットプレートを参考にして、前述の等電点タンパク質分離チップがセットできるように採寸した窪みを有するターゲットプレートに加工したものである。該専用のターゲットプレートの窪み内に、マトリックス塗布済みの等電点タンパク質分離チップをセットし、質量分析計本体内に設置する。レーザ光走査は、流路の端から端までを71の区画に分け、各区画に、パルスレーザ光照射を一定回数行い、各パルスレーザ光照射により得られるスペクトルを積算して、該区画の質量分析スペクトルの測定結果としている。5解析プログラム用コンピューター解析プログラム用コンピューターを使用して、後述のデータ解析を行った。各区画の質量分析スペクトルの測定結果ごとに、ピーク強度標準化を行っている。ピーク強度の標準化は、質量更正用ペプチドとしてマトリックス中に予め一定濃度で添加しているBradykininfragment17のピーク強度を、内部標準として利用し、各区画で測定されるBradykininfragment17のピーク強度に対する相対値を、標準化済ピーク強度とする。≪サンプル解析工程≫サンプル前処理捕捉断片化回収1-1.抗MDALDL抗体を用いた、血清サンプルに対する免疫沈降消化回収操作操作1-1-IInvitrogen社の磁気ビーズDynaBeadsマグネットを用いることで、溶液と磁気ビーズを容易に分離可能を用いている。懸濁液状態の磁気ビーズDynaBeadsを、血清サンプル1検体当たり20μL用意する。操作1-1-II抗MDALDL抗体血清サンプル1検体当たり8μg、積水メディカル社を磁気ビーズに吸着させる。抗MDALDL抗体を吸着させた後、該磁気ビーズ懸濁液20μLに、300μLの血清サンプルと、900μLのHEPESバッファーを加えて懸濁し、室温で抗原抗体反応を1時間行う。使用する抗MDALDL抗体として、特許第3115587号公報に記載する方法に従って、マウスをMDA-LDLで免疫することで創製された抗ヒトMDA-LDLモノクローナル抗体:抗体No29225積水メディカル社が好適である。操作1-1-III抗原抗体反応後、磁気ビーズをHEPESバッファーで一度洗浄する。次いで、磁気ビーズをPBSバッファーで洗浄する。さらに、磁気ビーズを10倍希釈のPBSバッファーで再洗浄する。操作1-1-IV抗原抗体反応洗浄処理済の磁気ビーズに対して、20μLのトリプシン溶液72ngμL25mMammoniumbicarbonateを加えて、37°C、16時間、1200rpmの振動を与えながら、消化反応を行う。消化反応後、マグネットを使用して磁気ビーズと消化産物であるペプチド溶液とを分離し、ペプチド溶液を回収する。回収したペプチド溶液を、遠心エバポレーターを使用して乾燥する。乾燥処理済みのペプチドサンプルは、チップによる等電点電気泳動を行うまでの間、30°Cにて保管する。等電点電気泳動1-2.等電点タンパク質分離チップを用いた等電点電気泳動操作1-2-I66cIEFgel、3Carrierampholyte、500fmolμLangiotensinIIpI6.74、500fmolμLfibrinopeptideBpI4.0、必要に応じて、2蛍光マーカーを添加してなる水溶液を調合する。この水溶液をチップ用のサンプル調製溶液として使用する。なお、既知の等電点を有する標準ペプチド、angiotensinIIpI6,74、fibrinopeptideBpI4.0は、等電点の指標として、利用される。操作1-2-II乾燥処理済みのペプチドサンプル1検体を、サンプル調製溶液8μLに溶解させる以下、サンプル溶液と称する。更に、ボルテックスを使用して、該サンプル溶液を3分間撹拌し、氷温に30分間静置する。操作1-2-III等電点電気泳動の直前に、ボルテックスを用いて、サンプル溶液を3分間撹拌する。等電点タンパク質分離チップの流路端に位置するリザーバに、サンプル溶液1μLをアプライする。該リザーバから流路に、サンプル溶液を導入する。操作1-2-IV流路の両端に位置する酸側リザーバとアルカリ側リザーバに、電極液である100mMリン酸溶液約pH2と40mM水酸化ナトリウム溶液pH12とを、各々7μLアプライする。操作1-2-V流路の両端に位置する各リザーバに電極をセットし、電圧15kV、0V、30kVを、それぞれ60s、30s、720s印加する。操作1-2-VI電気泳動終了後、直ちにチップを30°Cに冷却する。分離状態を保持しつつ、サンプル溶液を氷結させる。操作1-2-VII氷結したサンプル溶液を流路内に保持させたまま、等電点タンパク質分離チップのフタを取り外す。操作1-2-VIIIフタを取り外すことにより、流路上端が開放されたチップを、冷却した状態で密閉環境下に置き、真空引きする。冷却した状態で、真空引きすることにより、サンプルを凍結乾燥する。操作1-2-IX凍結乾燥後、蛍光スキャナーあるいは蛍光顕微鏡を用いて、各流路における蛍光マーカーの分離状態をモニターする。MALDITOFMS質量分析1-3.MALDITOFMSを用いた質量分析操作1-3-Iマトリックス溶液を調合する。調合するマトリックス溶液は、20μmolμLsinnamicacid、005TFA、2formamide、70acetonitrileの水溶液であり、さらに質量更正用ペプチドとして、900fmolμLBradykininfragment17M=7573997、200fmolμLACTHfragment1839M=24651986、200fmolμLInsulinBchainoxidizedM=34946513を含有する。操作1-3-II各流路における蛍光マーカーの分離状態のモニターを終えた後、80°Cに保たれたチップステージに、サンプルの凍結乾燥を行った等電点タンパク質分離チップを載せて固定する。溶液塗布装置を使用して、等電点タンパク質分離チップの流路上にマトリックス溶液を塗布する。溶液塗布装置の圧力設定を調整し、等電点タンパク質分離チップの各流路あたり、約75μLのマトリックス溶液を塗布する。操作1-3-III塗布されたマトリックス溶液を乾燥させる。乾燥後、専用のターゲットプレートを利用して、等電点タンパク質分離チップを質量分析計に設置するまでの間、等電点タンパク質分離チップが、30°Cにて保管する。操作1-3-IV専用のターゲットホルダーの窪み内に等電点タンパク質分離チップを固定し、該専用のターゲットホルダーごと、質量分析計本体内に設置する。操作1-3-V全長L35mmの流路を、0.5mm間隔の区画に分割し、酸側の区画からアルカリ側の区画まで計71の区画に順次、パルスレーザ光照射をして、区画ごとに質量分析スペクトルを測定する。解析1解析1では、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル、合計33サンプルについて、各サンプルの流路の区画ごとに測定された質量分析スペクトルの測定結果を用いて、下記の手順に従って、サンプルプロファイリング、データ解析マーカー特定を行っている。データ解析マーカー特定の過程では、各サンプルSmにおいて測定される、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度IpI[MpeptideH]Smを定量的に比較する必要がある。そのため、サンプル毎に、標準化済ピーク強度:IpI[MpeptideH]relativeSmを用いて、正規化処理を行い、正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmを算出する。さらに、各サンプルSmSm1~33において測定される、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]に対する、正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmを用いて、合計33サンプルからなる、全サンプル群中において、正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmに対して、Zスコア化処理を行い、各サンプルにおいて測定される、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピーク強度:IpI[MpeptideH]のZ値IpI[MpeptideH]ZscoreSmを算出する。正規化処理と、Zスコア化処理の手順は、次のとおりである。1標準化済ピーク強度IpI[MpeptideH]relativeSmの対数変換lnIpI[MpeptideH]relativeSmを行う。2各サンプルSmSm1~33の流路内で抽出された、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]の対数標準化済ピーク強度:lnIpI[MpeptideH]relativeSmの平均;lnIpI[MpeptideH]relativeavSm=1NpeakΣlnIpI[MpeptideH]relativeSmと、該平均値に対する、標準偏差:σlnIpI[MpeptideH]relativeSmを算出する。各サンプルSmSm1~33で算出される平均値:lnIpI[MpeptideH]relativeavSmと、標準偏差:σlnIpI[MpeptideH]relativeSmを用いて、対数標準化済ピーク強度:lnIpI[MpeptideH]relativeSmについて、lnIpI[MpeptideH]relativeSm-lnIpI[MpeptideH]relativeavSmσlnIpI[MpeptideH]relativeSmを算出し、正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmとする。3各サンプルSmSm1~33に対して算出された、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]の正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmに付いて、合計33サンプルからなる、全サンプル群中において、その全サンプル群中の平均値;IpI[MpeptideH]normalav=133ΣIpI[MpeptideH]normalSmと、該全サンプル群中の平均値に対する、全サンプル群中の標準偏差:σIpI[MpeptideH]normalを算出する。次いで。算出される全サンプル群中の平均値と全サンプル群中の標準偏差用いて、各サンプルに対して算出された正規化ピーク強度:IpI[MpeptideH]normalSmについて、IpI[MpeptideH]normalSm-IpI[MpeptideH]normalavσIpI[MpeptideH]nprmalを算出し、Z値IpI[MpeptideH]ZscoreSmとする。サンプルプロファイリングとデータ解析マーカー特定I合計33サンプルの全てについて、各サンプルSmSm1~33の流路において、各区画で測定される質量分析スペクトルをデータベースに格納する。II各サンプルSmSm1~33の流路において、該流路の各区画におけるpI値を推定する。サンプル溶液に含まれている、既知のpIを示す蛍光マーカー、ならびに、意図的に加えた等電点指標ペプチド:angiotensinIIpI6.74とfibrinopeptideBpI4.0や、例えば、トリプシンの自己消化に由来する既知のペプチド断片など、全サンプル溶液に共通する、等電点が既知のペプチド群のスポット位置情報pI,Mを利用して、各区画におけるpI値を算出推定する。III各サンプルSmSm1~33の流路において、スポットを形成している、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークを抽出する。該流路の各区画ii=1~71において測定される質量分析スペクトルのイオン強度データIiと、該区画におけるpI値の推定値pIに基づき、下記の手順III1~III3に従って、スポットを形成している、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークを抽出する。III1SavitzkyGolayfilterを用いて、各区画で測定される質量分析スペクトルのイオン強度データIiについて、指定した数毎に、mzとイオン強度Iiの平均移動平均をとることで、各区画で測定される質量分析スペクトルのスムージングを行う。図7に、スムージング処理を施した質量分析スペクトルIismoothingの一例を示す。III2各区画iについて、前記スムージング処理を施した、該区画iの質量分析スペクトルIismoothing中、極大値を示す部分をピークの候補として抽出する。III3隣接する区画で測定される質量分析スペクトル中で抽出されたピークの候補のイオン強度Iismoothingを、mzと各区画iにおけるpI値の推定値pIの二次元座標pI,mz上にプロットし、連結した上で、最終的なピークの抽出を行う。各区画iで抽出されたピークの候補に対して、隣接区画にほぼ同一のmzのピークの候補がある場合、二次元座標pI,mz上において、これらのピークの候補を連結して、質量分析スペクトル中において、共通の1つのピーク位置mzを示すピークとする。このピーク抽出操作により、1つの流路において、各区画で測定される質量分析スペクトルのイオン強度データIiのセットから、二次元座標pI,mz上にプロットした際、ピーク位置mzは共通し、pI方向に広がりを示すスポットを形成している、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークを抽出することが可能になる。図8に、ピークの候補の連結によって、ピークを抽出した一例を示す。抽出したピークにおいて、pI方向において、イオン強度の極大を示すpIを探索し、該ピークのスポット中心のpI値pImeanSmとする。また、該ピークのスポット中心のpI値pImeanSmにおける、ピーク位置mzを、抽出されたピークの中心位置mzmeanSmとする。IV異なる流路間から抽出されたスポットを形成している、ペプチド断片pI,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークpImeanSm,mzmeanSmの対応付けシグナルマッチングを行う。pIとmzの許容範囲等電点方向±1、分子量方向±0.3を設定し、その範囲内に存在するピークを同一ピークと見做す。許容範囲内に対応するピークが存在しない流路については、その流路では対応するピークは存在していないと見做す。V合計33サンプルの全てについて、異なる流路間で対応付けされたピークに対して、その中心pI値pImeanSmの平均値pIavとmzmeanSmの平均値mzavからなる二次元座標pIav,mzavを示すピークとして、その標準化済ピーク強度:IpIavmzavrelativeSmのリストを作成する。各サンプルSmSm1~33の流路間において、対応付けされたピークのピーク強度の比較を行うため、標準化済ピーク強度に対して、上述の正規化処理を施し、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmを算出する。合計33サンプルの全てについて、対応付けされたピークに対して、二次元座標pIav,mzavを示すピークとして、その正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmのリストを作成する。VI合計33サンプルの全てについて、対応付けされた、二次元座標pIav,mzavを示すピークの一群について、その正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmのリストに基づき、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルの二つの部分群間において、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmが統計的に有意な差異を有するか、否かを調べる。具体的には、対応付けされた、二次元座標pIav,mzavを示すピークの一群中から、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmが統計的に有意に大きいピークを選別する。あるいは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmが統計的に有意に小さいピークを選別する。合計33サンプルの全てについて、対応付けされた、二次元座標pIav,mzavを示すピークの一群について、その正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmの比較をより効率的に行うため、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmに対して、上述のZスコア化処理を施し、Z値:IpI[MpeptideH]ZscoreSmを算出する。Z値が正の値である場合、その正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmは、全サンプル群中の平均値;IpIavmzavnormalav=133ΣIpIavmzavnormalSmよりも大きいことを意味している。疾患群冠動脈病変枝数310サンプルについて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値を算出し、該疾患群冠動脈病変枝数310サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.65以上であるピークを選別する。前記の基準に基づき選別されるピークは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmが統計的に有意に大きいピークに相当している。実際、合計33サンプルの全てについて、Z値を合計すると、0であるので、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値は、-0.65×10/23≒-0.28よりも、さらに負な値となっている。従って、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値と、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値との差は、少なくとも全サンプル群中の標準偏差:σIpIavmzavnormalの0.93以上であり、統計的に有意な差があると見做すことが可能である。各個人Smに対して算出された、それぞれのペプチド断片pI,MpeptideのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmを利用して、receiveroperatingcharacteristic解析を行う。各個人Smに由来するサンプルの測定結果から算出した、ペプチド断片pI,MpeptideのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmを、大きい順に並べると、1位~33位までの順位付けがなされる。疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内であるサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRpIMpeptide1:Nth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内であるサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値IpIMpeptide1ZscoreSmが上位Nth位以内でないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRpIMpeptide1:Nth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRpIMpeptide1:NthTNRpIMpeptide1:Nth=1となっている。X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、算出されるTNRpIMpeptide1:Nth、TPRpIMpeptide1:NthNth=1~33をプロットする。TNR,TPRで表記されるROC空間上、0,1と1,0、ならびに、前記33個のプロット点を通るROC曲線を描く。描かれるROC曲線と、X軸Specificityとで挟まる領域の面積Aplotを数値積分により算出する。算出される面積Aplotは、AUCareaundertheROCcurveに相当している。前記のROC解析により算出されるAUC値が、少なくとも、0.60以上、好ましくは、0.70以上であるという基準に基づき、疾患群冠動脈病変枝数3とコントロール非患者群冠動脈病変枝数0の推定に有効なペプチド断片pI,Mpeptideを選別することができる。なお、総数33個のサンプルは、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルとコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成されているので、Nth=10の場合のプロット点TNRpIMpeptide1:10、TPRpIMpeptide1:10が、ROC空間上、perfectpredictionに相当する1,1に一致すると、AUC値は1となる。更には、前記33個のプロット点Nth=1~33のうち、ROC空間上、perfectpredictionに相当する1,1に最も近い点で採用される推定基準が、順位付けを利用する推定手法において、最も高い確度の推定結果を与える推定基準と見做すことができる。上記の順位付けを利用する推定手法で採用される、上位Nth位以内であるという閾値の設定は、そのサンプルのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmが、Nth位のZ値IpIMpeptide1ZscoreSmと等しいか、より大きいという閾値の設定に相当している。従って、サンプルのZ値IpIMpeptide1ZscoreSmが、設定される閾値のZ値:IpIMpeptide1ZscoreNthに対して、IpIMpeptide1ZscoreSm≧IpIMpeptide1ZscoreNthであるという推定基準を利用する推定手法に対して、ROC解析を行っても、本質的に同じ結果となる。上記のROC解析により算出されるAUC値に基づく選別基準に基づき、AUC値が、少なくとも、0.60以上と算出されるピークを選別する。選別されるピークについて、後述する解析2において、該ピークを与える、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片pI,Mpeptideのアミノ酸配列を特定した結果を記載する。さらには、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける、算出されたZ値:IpIMpeptide1ZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.65以上であるという基準に基づき、選別されるピークも、疾患群冠動脈病変枝数3とコントロール非患者群冠動脈病変枝数0の推定に有効なペプチド断片pI,Mpeptideに相当している。疾患群冠動脈病変枝数310サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.65以上であるという基準に基づき、選別されるピークについても、後述する解析2において、該ピークを与える、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片pI,Mpeptideのアミノ酸配列を特定した結果を記載する。実際に、前記AUC値に基づく選別基準に基づき選別されるピークの一つ、その二次元座標pIav,mzavがpIav=6.74,mzav=1306のピークについて、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmが統計的に有意に大きいことを、t検定により検証した結果を、図9に示す。図9には、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルついて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmと、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmを区分して、プロットしている。コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルついて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの分布と、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおいて、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの分布との間に、統計的に有意な差異があるか、否かを、t検定により判定すると、p=0.007で、有意な差異があると判定された。VII前記mzav=1306のイオン種[MpeptideH]を与える、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片について、別途、LCMSMS法を適用し、そのアミノ酸配列に関して、内部配列情報を取得した。その結果から、該断片は、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片の一つである、そのアミノ酸配列はIISDYHQQFRである断片であると同定される。解析2解析1において、前記AUC値に基づく選別基準に基づき選別されるピークは、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。加えて、解析1において、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルの部分群における、算出されたZ値:IpIavmzavZscoreSmの平均値が、少なくとも、0.65以上であるという基準に基づき、選別されるピークも、MDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。また、抗MDA-LDL抗体を使用する免疫沈降では、MDA-LDLが選択的に分取され、回収されるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質は、MDAが関与する化学修飾、あるいは、活性酸素種自体が関与する酸化を受けていることが想定される。その際、Lys残基の側鎖のアミノ基-NH2は、直接MDA化を受け、-NH-CH=CH-CHOに変換されていることが想定される。Lys残基に対するMDAによる酸化がさらに進行すると、Lys残基の側鎖のアミノ基-NH2は、最終的に、dihydorxypyridineとなる。これらMDAが関与する化学修飾によるリジンの分子量の変化は、MDA化54、DHP化134である。図10に、LysがMDA化を受けたときの構造、DHP化を受けたときの構造をそれぞれ示す。また、Met残基の酸化も想定される。Met残基が酸化されて化学修飾を受けた場合、その側鎖の-S-が、-SO-、-SO2-に変換され、16、32の分子量変化が生じる。解析2では、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、より酸化を受けていると推断される、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中で、その生成比率が有意に高いピークとして、解析1で選別されたピークpIavmzav全てについて、該ピークを与えるMDA-LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質からトリプシン消化により生成する、ペプチド断片の同定を行っている。解析1で選別されたピークpIavmzavは、全て、電荷数z=1のイオン種、すなわち、イオン種[MpeptideH]型のピークであると仮定する。そのmzavは、400<mzav<15000の範囲であり、すなわち、400<Mpeptide1<15000の範囲である、ペプチド断片pIav,Mpeptideに由来するイオン種[MpeptideH]のピークであると仮定する。少なくとも、400<Mpeptide1<15000の範囲である、ペプチド断片pIav,Mpeptideのアミノ酸配列は、アミノ酸残基数は、4以上、50以下の範囲である。まず、酸化を受けていないApoB100タンパク質のトリプシン消化に起因して生成する可能性を有する、アミノ酸残基数が50以下のペプチド断片の一群を、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、予測する。具体的には、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Lys残基ならびにArg残基において、トリプシン消化が起こる結果、生成する可能性がある、アミノ酸残基数が50以下の全てのペプチド断片を予測し、ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群とする。ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、各ペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、その分子量Mpeptideを計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片は、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中に含まれる、Lys残基ならびにArg残基の内、任意の二つを選択して、トリプシン消化を行うことで生成され、その間の部分アミノ酸配列のアミノ酸残基数が50以下である、ペプチド断片である。従って、該理論的予測ペプチド断片のC末端は、Lys残基またはArg残基であるが、そのアミノ酸残基数が50以下のアミノ酸配列中に、さらに、Lys残基またはArg残基を含むものも含まれている。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Lys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基の一つが、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54を計算する。さらに、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn1個が、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54×n1を計算する。同様に、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Lys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基の一つが、DHP化修飾を受けた際の分子量Mpeptide134を計算する。さらに、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn2個が、DHP化修飾を受けた際の分子量Mpeptide134×n2を計算する。加えて、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、複数のLys残基を含むペプチド断片について、含まれるLys残基のn2個が、DHP化修飾を受け、含まれるLys残基のn1個が、MDA化修飾を受けた際の分子量Mpeptide54×n1134×n2を計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Met残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基の一つが、酸化を受け、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16を計算する。さらに、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn3個が、酸化を受け、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16×n3を計算する。前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、Met残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基の一つが、酸化を受け、二酸化体MetO2に変換された際の分子量Mpeptide32を計算する。さらに、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn4個が、酸化を受け、二酸化体MetO2に変換された際の分子量Mpeptide32×n4を計算する。加えて、前記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、複数のMet残基を含むペプチド断片について、含まれるMet残基のn4個が、二酸化体MetO2に変換され、含まれるMet残基のn3個が、一酸化体MetOに変換された際の分子量Mpeptide16×n332×n4を計算する。上記ApoB100タンパク質由来の理論的予測ペプチド断片の群に含まれる、酸化修飾が無いペプチド断片の分子量Mpeptide;含まれるLys残基にMDA化修飾またはDHP化修飾が生じているペプチド断片の分子量Mpeptide54×n1134×n2;含まれるMet残基が、一酸化体MetOまたは二酸化体MetO2に変換されているペプチド断片の分子量Mpeptide16×n332×n4;以上の計算された分子量の予測値Mcalリスト中から、実際に、分子量の予測値Mcalが、400<Mcal1<15000の範囲内であるものを選抜し、候補ペプチド断片の分子量の予測値Mcalリストを作成する。かかる候補ペプチド断片の分子量の予測値Mcalリスト中から、解析1で選別されたピークpIavmzavのmzavから推定される、分子量Mobs=mzav-1と、測定誤差範囲±0.3で一致する、分子量の予測値Mcalの候補を選別する。前記の選別操作によって、解析1で選別されたピークpIavmzavのmzavから推定される、分子量Mobs=mzav-1に対して、選別された分子量の予測値Mcalの候補を、下記の表13、表14~表17に示す。表13には、解析1で選別されたピークpIavmzav中、酸化修飾が無いペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピークと同定されるものが纏められている。なお、前記表13に記載する各ペプチド断片について、その等電点pIと分子量Mwを下記の表13-2に示す。表14には、解析1で選別されたピークpIavmzav中、ペプチド鎖中に含まれるLys残基にMDA化修飾が生じているペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピークと同定されるものが纏められている。表15には、ペプチド鎖中に含まれるLys残基にDHP化修飾が生じているペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピークと同定されるものが纏められている。表16には、解析1で選別されたピークpIavmzav中、ペプチド鎖のC末端のLys残基にMDA化修飾が生じているペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピークと同定されるものが纏められている。表17には、解析1で選別されたピークpIavmzav中、ペプチド鎖中に含まれるMet残基に酸化修飾が生じているペプチド断片に由来するイオン種[MpeptideH]のピークと同定されるものが纏められている。なお、表17中、番号601のペプチド断片GISTSAASPAVGTVGMDMDEDDDFSKと、番号603のペプチド断片HEQDMVNGIMLSVEK中に含まれるMet残基に酸化修飾は、その分子量の増加から、一酸化体MetOと判断される。一方、表17中、番号602のペプチド断片FNEFIQNELQEASQELQQIHQYIMALR中に含まれるMet残基に酸化修飾は、分子量の増加が、32である、二酸化体MetO2であると判断される。表13、表14~表17中では、各ピークに対して選別された分子量の予測値Mcalの候補を、その候補ペプチドのアミノ酸配列、ならびに、ApoB100タンパク質中における存在位置アミノ酸残基番号を用いて、記載している。また、各ピークに対して、上記解析1における選別時に選別基準としたAUCの値も併せて記載する。表14に示す候補ペプチドのアミノ酸配列中では、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、4145番目、2402番目、4461番目、1311番目、3229番目、1852番目、117番目、3404番目、1291番目、1295番目、2825番目、2829番目、3531番目、3537番目、616番目、620番目、3221番目、3227番目、2426番目、2428番目、2002番目、2004番目、2403番目、2410番目、2418番目、2425番目、3995番目、4021番目、4034番目、以上の位置のLys残基が、MDA化修飾を受けていることが判る。表15に示す候補ペプチドのアミノ酸配列中では、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、539番目、1034番目、745番目、616番目、114番目、157番目、4261番目、293番目、3973番目、2139番目、4187番目、2575番目、732番目、2369番目、2371番目、4274番目、4278番目、3944番目、3946番目、3673番目、3682番目、2418番目、2425番目、612番目、613番目、3537番目、3547番目、4478番目、4485番目、以上の位置のLys残基が、DHP化修飾を受けていることが判る。表16に示す候補ペプチドのアミノ酸配列中では、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、557番目、1724番目、2002番目、2208番目、3221番目、1344番目、以上の位置のLys残基が、MDA化修飾を受けていることが判る。表17に示す候補ペプチドのアミノ酸配列中では、ApoB100タンパク質のアミノ酸配列中、4011番目、4013番目、4382番目、750番目、755番目、以上の位置のMet残基が、酸化修飾を受けていることが判る。従って、表14~表17に示す候補ペプチドのアミノ酸配列は、下記の表18-1に示すアミノ酸残基位置のLys残基に対する、MDA化修飾あるいはDHP化修飾の進行度、ならびに、下記の表18-2に示すアミノ酸残基位置のMet残基に対する、酸化修飾の進行度を評価する際、評価マーカーとして適する、酸化ペプチド断片であると判断される。解析3解析2では、解析1で選別されたピークpIavmzavについて、該ピークのmzavに基づき、推定される分子量Mobs=mzav-1と、測定誤差範囲±0.3で一致する、分子量の予測値Mcalの候補、該候補ペプチドのアミノ酸配列の特定を行っている。上記表13、表14~表17中に記載するピークpIavmzavは、何れも、そのAUCの値は、少なくとも、0.64以上の範囲となっている。すなわち、解析1で利用した、合計33サンプル中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと比較して、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中で、その生成比率が有意に高いものと判断される。さらに、解析1で選別されたピークpIavmzavを複数種組み合わせ、該複数種のピークの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmの和{ΣIpIavmzavnormalSm}について、上述のZスコア化処理を施し、複数種のピークの組み合わせに対する、Z値:{ΣIpIavmzav}ZscoreSmを算出する。かかる複数種のピークの組み合わせに対する、Z値:{ΣIpIavmzav}ZscoreSmに関して、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルにおける分布と、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける分布を比較すると、その分布には有意な差異が見出される。例えば、表13中に示す、番号207のピーク:LYSILK27582763、表14中に示す、番号301のピーク:GASGTTGTYQEWKDK41334147、表15中に示す、番号451のピーク:ELLKDLSKEAQEVFK42714285の組み合わせを考慮する。番号207のピーク:LYSILK27582763の正規化ピーク強度を、I207normalSmと表記し、該I207normalSmの全サンプル群中の平均値を、I207normalav=133ΣI207normalSmと、該全サンプル群中の平均値に対する、全サンプル群中の標準偏差をσI207normalと表記する。また、番号207のピークの正規化ピーク強度I207normalSmについて、上述のZスコア化処理を施すことで算出される、Z値を、I207ZscoreSmと表記する。合計33サンプル中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルについて、該I207ZscoreSmを用いて、ROC解析を行い算出される、表13中に記載する、番号207のピークに関するAUC値は、0.673である。番号301のピーク:GASGTTGTYQEWKDK41334147の正規化ピーク強度を、I301normalSmと表記し、該I301normalSmの全サンプル群中の平均値を、I301normalav=133ΣI301normalSmと、該全サンプル群中の平均値に対する、全サンプル群中の標準偏差をσI301normalと表記する。また、番号301のピークの正規化ピーク強度I301normalSmについて、上述のZスコア化処理を施すことで算出される、Z値を、I301ZscoreSmと表記する。合計33サンプル中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルについて、該I301ZscoreSmを用いて、ROC解析を行い算出される、表14中に記載する、番号301のピークに関するAUC値は、0.769である。番号451のピーク:ELLKDLSKEAQEVFK42714285の正規化ピーク強度を、I451normalSmと表記し、該I451normalSmの全サンプル群中の平均値を、I451normalav=133ΣI451normalSmと、該全サンプル群中の平均値に対する、全サンプル群中の標準偏差をσI451normalと表記する。また、番号451のピークの正規化ピーク強度I451normalSmについて、上述のZスコア化処理を施すことで算出される、Z値を、I451ZscoreSmと表記する。合計33サンプル中、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルについて、該I451ZscoreSmを用いて、ROC解析を行い算出される、表15中に記載する、番号451のピークに関するAUC値は、0.727である。各個人Smに対して算出された、I207ZscoreSm、I301ZscoreSm、I451ZscoreSmを利用して、receiveroperatingcharacteristic解析を行う。各個人Sm対して算出された、I207ZscoreSm、I301ZscoreSm、I451ZscoreSmを、それぞれ、大きい順に並べると、1位~33位までの順位付けがなされる。疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、Z値I207ZscoreSmが上位Nth位以内である、Z値I301ZscoreSmが上位Nth位以内である、Z値I451ZscoreSmが上位Nth位以内である、そのいずれかの条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPR207301451:Nth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値I207ZscoreSmが上位Nth位以内である、Z値I301ZscoreSmが上位Nth位以内である、Z値I451ZscoreSm>0が上位Nth位以内である、そのいずれかの条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、Z値I207ZscoreSmが上位Nth位以内でない、Z値I301ZscoreSmが上位Nth位以内でない、Z値I451ZscoreSが上位Nth位以内でない、この三条件を満たすサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNR207301451:Nth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPR207301451:NthTNR207301451:Nth=1となっている。X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、算出されるTNR207301451:Nth、TPR207301451:NthNth=1~33をプロットする。ROC空間上、0,1、1,0と、前記33個のプロット点を通るROC曲線を描く。描かれるROC曲線と、X軸Specificityとで挟まる領域の面積Aplotを数値積分により算出する。算出される面積Aplotは、AUCareaundertheROCcurveに相当している。前記のROC解析により算出されるAUC値は、番号207のピーク、番号301のピーク、番号451のピークの組み合わせに関するAUC値であり、0.858となることが判った。この結果は、上記合計33サンプルからなる群においては、番号207のピーク、番号301のピーク、番号451のピークの組み合わせに基づき、例えば、Nth=10の条件、Z値I207ZscoreSmが上位10位以内である、Z値I301ZscoreSmが上位10位以内である、Z値I451ZscoreSm>0が上位10位以内である、そのいずれかの条件を満たす場合、冠動脈病変枝数3の被験者のサンプルと推定するという推定基準に基づき、各サンプルに関して、冠動脈病変枝数3の被験者のサンプルか、否かの推定を行うと、より高い確度の推定がなされることが判る。具体的には、番号207のピーク、番号301のピーク、番号451のピークの組み合わせを採用することで、個々のピークにおけるバラツキに起因する誤った推定を排除でき、組み合わせ全体では、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルであるか、否かの推定が、より高い確度で行えることを査証している。解析1で選別されたピークpIavmzavは、何れも、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルにおける分布と、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける分布を比較すると、有意な分布の差異が見出される。先に例示したように、複数種のピークの組み合わせを採用すると、個々のピークにおけるバラツキに起因する誤った推定を排除でき、複数種のピークの組み合わせ全体では、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルにおける分布と、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルにおける分布を比較すると、その二つの部分群間に存在する分布の差異が、より明確化される。従って、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0と、疾患群冠動脈病変枝数3の二つの部分群間における、病態の進行度の差異を識別する目的で利用する診断マーカーとして、先に例示するような複数種のピークの組み合わせの利用はより効果的であることが示される。例えば、選別された診断マーカーを利用して、被験者Smtestが、疾患群冠動脈病変枝数3に属するか、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属するかの推定を行う手順を説明する。先ず、上述する手法に準じて、該被験者Smtestから採取した血液サンプル中から分取される、MDA-LDL中のApoB100タンパク質に由来するペプチド断片のピークpIavmzavについて、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmtestを算出する。診断マーカーのピークpIavmzavに関して、設定される正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthと、該被験者Smtestの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmtestを比較する。その比較の結果、判定条件:IpIavmzavnormalSmtest≧IpIavmzavnormalthを満たす場合、該被験者Smtestは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する;前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smtestは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属すると、推定を行う。前記推定操作に利用する、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthは、例えば、下記の手順に従って設定することが可能である。具体的には、解析1において、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと疾患群冠動脈病変枝数310サンプルからなる、合計33サンプル中の、各個人Smに対して、それぞれ、算出される、該ピークpIavmzavの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmを利用して、交差検定Crossvalodationの手法を応用して、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthの最適化を行うことが可能である。例えば、leaveoneoutcrossvalidationの手法を応用することで、下記の手順により、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthの最適化を行うことができる。合計33サンプル中、1個人Smを取り出し、テスト事例testingsetとし、残る32個人からなる群Smを、訓練事例trainingsetとする。テスト事例testingsetとする、1個人Smは、33種類あり、それに対応して、訓練事例trainingsetSmも、33種類作成される。テスト事例testingsetとする、1個人Smが、疾患群冠動脈病変枝数3に属する場合、訓練事例trainingsetSmは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する9サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成される。一方、テスト事例testingsetとする、1個人Smが、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する場合、訓練事例trainingsetSmは、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する22サンプルで構成される。作成される訓練事例trainingsetSmに対して、判定条件:IpIavmzavnormalSm≧IpIavmzavnormalthを満たす場合、該被験者Smは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する;前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属すると、推定を行う。該訓練事例trainingsetSmが、疾患群冠動脈病変枝数3に属する9サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成されている場合、疾患群冠動脈病変枝数39サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRSm≠t:IpIavmzavnormalth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRSm≠t:IpIavmzavnormalth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRSm≠t:IpIavmzavnormalthTNRSm≠t:IpIavmzavnormalth=1となっている。該訓練事例trainingsetSmが、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する22サンプルで構成されている場合、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRSm≠t:IpIavmzavnormalth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数022サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数022サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRSm≠t:IpIavmzavnormalth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRSm≠t:IpIavmzavnormalthTNRSm≠t:IpIavmzavnormalth=1となっている。作成される合計33種類の訓練事例trainingsetSmについて、それぞれ、算出されるTPRSm≠t:IpIavmzavnormalthとTNRSm≠t:IpIavmzavnormalthの組み合わせ、合計33の組み合わせを、X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、プロットする。ROC空間上、0,1、1,0と、前記33個のプロット点TNRSm≠t:IpIavmzavnormalth,TPRSm≠t:IpIavmzavnormalthを通るROC曲線を描く。描かれるROC曲線と、X軸Specificityとで挟まる領域の面積Aplotを数値積分により算出する。算出される面積Aplotは、AUCareaundertheROCcurveに相当している。前記のROC解析により算出されるAUC値は、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthに基づく、上記判定条件に対するAUC値、AUCと見做す。合計33サンプル中の、各個人Smに対して、それぞれ、算出される、該ピークpIavmzavの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmを、大きい順に並べると、1位~33位までの順位付けがなされる。順位付けされた1位~33位までの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmを、それぞれ、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthとして、前記のROC解析により算出される、上記判定条件に対するAUC値、AUCを求める。求められる、33種類のAUCを、正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthとして採用した、正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmの順位に従って、横軸を順位、縦軸をAUCとしてプロットする。すると、順位が10位の近辺で、AUCが極大となる。この極大を示す、AUCを与える、ピークpIavmzavに対する正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthは、最適化された正規ピーク強度の閾値:IpIavmzavnormalthと見做すことが可能である。例えば、番号207のピーク、番号301のピーク、番号451のピークの組み合わせに基づき、被験者Smtestが、疾患群冠動脈病変枝数3に属するか、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属するかの推定を行う際には、下記のような判定条件を設定することができる。番号207のピークに対する正規ピーク強度の閾値:I207normalth、番号301のピークに対する正規ピーク強度の閾値:I301normalth、番号451のピークに対する正規ピーク強度の閾値:I451normalthを、それぞれ設定する。設定される正規ピーク強度の閾値:I207normalth、正規ピーク強度の閾値:I301normalth、正規ピーク強度の閾値:I451normalthと、該被験者Smtestの正規化ピーク強度:I207normalSmtest、正規化ピーク強度:I301normalSmtest、正規化ピーク強度:I451normalSmtestを、それぞれ比較する。その比較の結果、判定条件I207normalSmtest≧I207normalth、I301normalSmtest≧I301normalth、I451normalSmtest≧I451normalthのいずれかを満たす場合、該被験者Smtestは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する;前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smtestは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属すると、推定を行う。前記推定操作に利用する、正規ピーク強度の閾値:I207normalth、正規ピーク強度の閾値:I301normalth、正規ピーク強度の閾値:I451normalthは、例えば、下記の手順に従って設定することが可能である。具体的には、解析1において、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルと疾患群冠動脈病変枝数310サンプルからなる、合計33サンプル中の、各個人Smに対して、それぞれ、算出される、該ピークpIavmzavの正規化ピーク強度:IpIavmzavnormalSmを利用して、交差検定の手法を応用して、正規ピーク強度の閾値:I207normalth、正規ピーク強度の閾値:I301normalth、正規ピーク強度の閾値:I451normalthの最適化を行うことが可能である。例えば、leaveoneoutcrossvalidationの手法を応用することで、下記の手順により、正規ピーク強度の閾値:I207normalth、正規ピーク強度の閾値:I301normalth、正規ピーク強度の閾値:I451normalthの最適化を行うことができる。合計33サンプル中、1個人Smを取り出し、テスト事例testingsetとし、残る32個人からなる群Smを、訓練事例trainingsetとする。テスト事例testingsetとする、1個人Smは、33種類あり、それに対応して、訓練事例trainingsetSmも、33種類作成される。テスト事例testingsetとする、1個人Smが、疾患群冠動脈病変枝数3に属する場合、訓練事例trainingsetSmは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する9サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成される。一方、テスト事例testingsetとする、1個人Smが、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する場合、訓練事例trainingsetSmは、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する22サンプルで構成される。作成される訓練事例trainingsetSmに対して、判定条件I207normalSm≧I207normalth、I301normalSm≧I301normalth、I451normalSm≧I451normalthのいずれかを満たす場合、該被験者サンプルSmは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する;前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smサンプルは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属すると、推定を行う。該訓練事例trainingsetSmが、疾患群冠動脈病変枝数3に属する9サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプルで構成されている場合、疾患群冠動脈病変枝数39サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthTNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth=1となっている。該訓練事例trainingsetSmが、疾患群冠動脈病変枝数310サンプルと、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属する22サンプルで構成されている場合、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数022サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数022サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthnormalth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthTNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth=1となっている。作成される合計33種類の訓練事例trainingsetSmについて、それぞれ、算出されるTPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthとTNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthの組み合わせ、合計33の組み合わせを、X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、プロットする。ROC空間上、0,1、1,0と、前記33個のプロット点TNRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalth,TPRSm≠t:I207normalth、I301normalth、I450normalthを通るROC曲線を描く。描かれるROC曲線と、X軸Specificityとで挟まる領域の面積Aplotを数値積分により算出する。算出される面積Aplotは、AUCareaundertheROCcurveに相当している。前記のROC解析により算出されるAUC値は、I207normalth、I301normalth、I450normalthの組み合わせに基づく、上記判定条件に対するAUC値、AUCと見做す。合計33サンプル中の、各個人Smに対して、それぞれ、算出される正規化ピーク強度:I207normalSm、正規化ピーク強度:I301normalSm、正規化ピーク強度:I405normalSmを、それぞれ、大きい順に並べると、それぞれ、1位~33位までの順位付けがなされる。順位付けされた1位~33位までの正規化ピーク強度:I207normalSm、正規化ピーク強度:I301normalSm、正規化ピーク強度:I405normalSmを、それぞれ、正規ピーク強度の閾値:I207normalth、正規ピーク強度の閾値:I301normalth、正規ピーク強度の閾値:I451normalthとすると、延べ33×33×33種類の閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalth=I207normalSm、I301normalSm、I450normalSmの群が作成される。延べ33×33×33種類の閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthに基づく、判定条件について、前記のROC解析により算出される、上記判定条件に対するAUC値、AUCを求める。求められる、延べ33×33×33種類のAUCを、大きい値を示す順に並べると、1位~33×33×33位までの順位付けがなされる。1位のAUCを与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalth=I207normalSm、I301normalSm、I450normalSmは、最適化された閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthと見做すことが可能である。実際には、順位付けされたAUC中、上位1位~27位までは、然程、値に差がないと判断できる。上位1位~27位までAUC値を与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalth=I207normalSm、I301normalSm、I450normalSmについて、それぞれ、下記の判定条件I207normalSm≧I207normalth、I301normalSm≧I301normalth、I451normalSm≧I451normalthのいずれかを満たす場合、該被験者サンプルSmは、疾患群冠動脈病変枝数3に属する;前記判定条件を満たさない場合、該被験者Smサンプルは、コントロール非患者群冠動脈病変枝数0に属すると、合計33サンプル中の各個人Smに対して、推定を行う。前記上位1位~27位までの閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthに基づく、判定条件による、合計33サンプル中の各個人Smに対する推定結果を用いて、それぞれ、下記の確率を算出する。各閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthに基づく、判定条件を用いた推定結果から、疾患群冠動脈病変枝数310サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合TruepositiverateまたはSensitivity:TPRI207normalth、I301normalth、I450normalth;コントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たすサンプル数の割合Falsepositiverate:FPRコントロール非患者群冠動脈病変枝数023サンプル中、前記判定条件を満たさないサンプル数の割合TruenegativerateまたはSpecificity、TNRI207normalth、I301normalth、I450normalth;以上の3つの確率を算出する。勿論、FPRI207normalth、I301normalth、I450normalthTNRI207normalth、I301normalth、I450normalth=1となっている。上位1位~27位までの各閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthに対して、算出されるTNRI207normalth、I301normalth、I450normalthとTPRI207normalth、I301normalth、I450normalthを、X軸をTNR、Y軸をTPRとする、ROC空間上に、プロットする。ROC空間上にプロットされている、合計27個のプロット点TNRI207normalth、I301normalth、I450normalth,TPRI207normalth、I301normalth、I450normalthと、ROC空間上の1,1との距離DI207normalth、I301normalth、I450normalthを算出する。算出されるROC空間上の1,1との距離DI207normalth、I301normalth、I450normalthを、小さい順に並べると、1位~27位までの順位付けがなされる。通常、順位付けされたAUC中1位の値を与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthが、順位付けされた距離DI207normalth、I301normalth、I450normalth中、1位の距離DI207normalth、I301normalth、I450normalthを与えるはずである。稀に、順位付けされた距離DI207normalth、I301normalth、I450normalth中、1位の距離DI207normalth、I301normalth、I450normalthを与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthは、順位付けされたAUC中1位の値を与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthと相違している場合がある。その際には、順位付けされた距離DI207normalth、I301normalth、I450normalth中、1位の距離DI207normalth、I301normalth、I450normalthを与える、閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthを、最適化された閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthと見做すことが可能である。すなわち、leaveoneoutcrossvalidationの手法を応用することで、選別される、1位の閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthが、実際に、最適な閾値の組み合わせに相当するか、否かを、合計33サンプル中の各個人Smに対する推定結果に基づき、検証することが可能である。さらに、leaveoneoutcrossvalidationの手法を応用することで、選別される、1位の閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthと、2位以下の閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthとの間の差異が、極僅かである際には、合計33サンプル中の各個人Smに対する推定結果に基づき、より適正な閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthを、選択することが可能である。なお、番号207のピーク、番号301のピーク、番号451のピークの個々について、それぞれ、最適化を行い、最適化済み正規ピーク強度の閾値:I207normalthopt、最適化済み正規ピーク強度の閾値:I301normalthopt、最適化済み正規ピーク強度の閾値:I451normalthoptを選別し、この最適化済み閾値の組み合わせI207normalthopt、I301normalthopt、I451normalthoptを使用することもできる。該最適化済み閾値の組み合わせI207normalthopt、I301normalthopt、I451normalthoptは、少なくとも、上位1位~8位までの閾値の組み合わせI207normalth、I301normalth、I450normalthに含まれている。心疾患における病態の診断において、本質的に重要なのは、LDL中に含まれるApoB100タンパク質の酸化変化である。従って、本発明によって明らかにされた、ApoB100タンパク質の酸化程度の相違を明確に反映する、表18-1、表18-2に示す酸化部位を含むペプチド断片であれば、表14~表17に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド断片と同様に、心疾患の診断マーカーとして有効である。すなわち、本発明による心疾患診断マーカーは、表14~表17に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド断片に限定されるものではない。"