"受託番号MTCC-5185を有するコニディオボルスブレフェルディアヌスConidiobolusbrefeldianus真菌株。炭素、窒素および使用される誘導物質に応じて、受託番号MTCC-5185を有するコニディオボルスブレフェルディアヌス由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼからなる群から単独または同時に選択される1種以上の酵素の調製方法であって、a好気条件下、5.0~10の範囲のpHおよび15°C~37°Cの範囲の温度ならびに2~5日間の期間で、炭素および窒素源ならびに誘導物質を含む培地で該コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185真菌株を培養すること、b該培地を回収すること、およびc従来の方法によって液相中で該酵素を分離/抽出すること、を含む方法。液中条件で該コニディオボルス属の種を培養することを含む、請求項2に記載の方法。固相発酵で該コニディオボルス属の種を培養することを含む、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、限定されるものではないが、アルカリプロテアーゼ、エラスターゼ、ケラチナーゼおよびペプチダーゼの単独またはそれらの組合せから選択される、請求項2に記載の方法。該カルボヒドラーゼは、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、特にグリカナーゼ、より詳細には、キチナーゼ、ラミナリナーゼ、コンドロイチナーゼの単独またはそれらの組合せから選択される、請求項2に記載の方法。該リパーゼがエステラーゼを含む、請求項2に記載の方法。該炭素源が、限定されるものではないが、糖類、糖アルコール類、多糖類、オリーブ油、ヒマワリ油、大豆油、胡麻油、カラシ油、ヒマシ油、ヤシ油、落花生油、トリブチリンからなる群から選択される油脂、農産物、農業副産物/廃棄物などの単独またはそれらの組合せを含む、請求項2に記載の方法。該糖類が、グルコース、フルクトース、アラビノース、スクロースおよびラクトースからなる群から選択され、糖アルコール類が、グリセリン、マンニトールおよびソルビトールであり、多糖類が澱粉であり、農産物/廃棄物が、大豆粉、大豆ミール、落花生粕、カラシ種子粕、綿実粕、小麦ふすまおよび米糠、酪農、家禽、肉および食品加工からの廃棄物、毛髪、羽毛などのケラチン豊富な廃棄物、漁場からの廃棄物、酸で膨張したキチン、キチン含有廃棄物である、請求項8に記載の方法。該窒素源が、任意に有機または無機窒素源の単独またはそれらの組合せである、請求項2に記載の方法。該無機窒素源が、限定されるものではないが、リン酸水素二アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび尿素から選択される、請求項10に記載の方法。該有機窒素源が、限定されるものではないが、ペプトン、トリプトン、ソイトース、大豆ペプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、魚粉、羽毛粉、羽毛、コーンスティープリカーならびに大豆粉、大豆ミール、ベサン粉、緑豆粉、カラシ種子粕、綿実粕、落花生粕、小麦ふすまおよび米糠によって例示される窒素豊富なマメ科の基質の単独またはそれらの組合せから選択される、請求項2に記載の方法。該酵素を、従来の方法によって液相で分離/抽出する、請求項2に記載の方法。該酵素を、凍結乾燥、噴霧乾燥によって、あるいは有機溶媒、塩析法または限外濾過を用いて濃縮する、請求項2に記載の方法。該酵素を、無機塩を用いて部分的に精製および濃縮する、請求項2に記載の方法。該無機塩が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムの群から選択される、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、4~40°Cの範囲の温度で安定である、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、30~60°Cの温度範囲で活性であり、3~12のpH範囲、好ましくはpH7で安定である、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、洗剤、水混和性有機溶媒および水不混和性有機溶媒の存在下で安定である、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが50°Cまで安定である、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、6~11のpH範囲、およびキレート剤、金属イオンの存在下で活性である、請求項2に記載の方法。該粗製プロテアーゼおよび部分精製プロテアーゼが、カゼイン、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン、エラスチン-オルシン、アゾカゼイン、アゾコール、N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリドBAPNAおよびゼラチンに対して活性である、請求項2に記載の方法。該プロテアーゼが、セリンプロテアーゼであり、フッ化フェニルメチルスルホニルPMSFによって阻害される、請求項2に記載の方法。プロテアーゼが本物のコラーゲンに対して不活性である、請求項2に記載の方法によって調製された酵素。該リパーゼが、4~9のpH範囲および20~60°Cの温度範囲で活性である、請求項2に記載の方法によって調製された酵素。該酵素が、粗製型、固定化型、細胞結合型、純化型および精製型であり、限定されるものではないが、噴霧乾燥、凍結乾燥、濾過、濃縮、純化および精製から選択される方法に供される、請求項2に記載の方法によって調製された酵素。革の製造での脱毛作業、写真フィルムからの銀の回収、絹の精練、廃棄精練液および洗剤組成物からの付加価値生成物の回収のための、限定されるものではないが、受託番号MTCC-5185を有するコニディオボルス属の種由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択された少なくとも1種の酵素を含む請求項2に記載の方法によって調製された酵素の使用。限定されるものではないが、真菌源、すなわち、これまでに知られていないコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株由来のプロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、赤血球凝集活性および糖タンパク質分解活性を有する酵素から選択される少なくとも1種の酵素を含む酵素組成物が本明細書に開示されている。酵素組成物の調製方法およびその使用も開示されている。本発明の酵素組成物は、単独またはそれらを組み合わせた本明細書に開示されている酵素を含む。コニディオボルスブレフェルディアヌス真菌株を植物有機堆積物から単離し、これに受託番号MTCC-5185を付した微生物株保存機関、インドのチャンディーガルChandigarh。コニディオボルスブレフェルディアヌスの供給源は、土壌、昆虫、落葉および木の小枝などである。図1は、原形質の内容物と、油滴を有する厚い壁のある接合胞子による、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185真菌の菌糸体の顕微鏡画像を示す。図2は、他の微生物との18SリボソームDNA遺伝子の配列相同性を示す。18SリボソームDNA配列相同性によれば、本発明の単離株は、コニディオボルスブレフェルディアヌスAF368506.1株に対して99の相同性を示し、異なるコニディオボルスコロナトゥス株に対して98の相同性を示す。MTCC-5185、すなわち新規なコニディオボルスブレフェルディアヌス株の18SリボソームDNA遺伝子配列は、受託番号FJ895304でNCBI遺伝子バンクに寄託した。本発明のプロテアーゼは、限定されるものではないが、単独またはそれらを組み合わせた、アルカリプロテアーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、ケラチナーゼおよびペプチダーゼから選択される。本発明のカルボヒドラーゼは、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、特にグリカナーゼ、より詳細には、単独またはそれらを組み合わせた、キチナーゼ、ラミナリナーゼ、コンドロイチナーゼから選択される。本発明のリパーゼはエステラーゼを含む。本明細書に記載されている方法によって酵素活性の測定を行った。反応混合物は、2mlの総体積で、一定分量の好適に希釈した酵素溶液と、10mgのハマーステインカゼインの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0とを含んでいた。50°Cで10分間のインキュベーション後に、3mlの5トリクロロ酢酸濃塩酸で酸性にしたを添加して、反応を終了させた。形成された沈殿物を室温で30分間放置した後、ワットマンNo.1濾紙で濾過した。トリクロロ酢酸の可溶性画分の吸光度を280nmで測定した。産生したチロシンのマイクログラムは、チロシン濃度に対して予め較正した280nmでの吸光度のグラフから計算し、その単位を、アッセイ条件下で1分ごとに放出されるチロシンのμモルとして表す。1ラミナリンの50mMリン酸カリウム緩衝液pH7を用いてラミナリナーゼβ-1,3グルカナーゼ活性を測定した。1mlの総反応混合物は、0.5mlの好適に希釈した酵素と0.5mlの基質とを含み、これを50°Cで30分間インキュベートした。放出された還元糖を、ジニトロサリチル酸法P.Bernfeld著、1955年、AmylaseαβMethodsinEnzymologyアミラーゼ:αおよびβ、酵素学での方法、第1巻、149頁で測定した。ラミナリナーゼ活性を、アッセイ条件下で1分ごとに産生された還元糖グルコース同等物としてのμモルとして表した。2つの異なる方法でリパーゼ活性を測定した。a.基質として酪酸p-ニトロフェノールpNPBを用いた分光学的アッセイ:30mgのpNPBを、10mlの2-プロパノールおよび0.1mlのトリトン-X-100に溶解し、50mMリン酸塩緩衝液pH7で体積を100mlにした。アッセイ混合物は、0.9mlの基質と0.1mlの好適に希釈した酵素とを含んでいた。アッセイ混合物を50°Cで30分間インキュベートし、2mlの2-プロパノールを添加して、反応を終了させた。放出されたp-ニトロフェノールの量を410nmで測定した。リパーゼ活性を、アッセイ条件下で30分ごとに放出されるp-ニトロフェノールのμモルとして表す。b.リパーゼの滴定アッセイ:20mlのオリーブ油、165mlの10アラビアゴムおよび15gの氷を粉砕混合機で10分間混合することによって基質を調製し、ガラスウールで濾過し、4°Cで保存した。リパーゼアッセイのために、反応混合物は、2mlのリン酸塩緩衝液50mM、pH7.0、5mlの基質および1mlの粗製培養液を含み、これを、50rpmで振盪させながら、50°Cで1時間インキュベートした。4mlのアセトン:エタノール1:1の添加によって反応を終了させた。ブランクでは、アセトン:エタノールによる反応の終了後に酵素を添加した。放出された遊離脂肪酸を10mMのNaOHで滴定した。リパーゼ活性を、アッセイ条件下で1分ごとに放出される遊離脂肪酸のμモルとして表す。0.7キチンを用いてキチナーゼ活性を測定した。反応混合物は、基質として1mlの酵素、1mlの50mM酢酸塩緩衝液pH5および1mlの0.7キチンを含んでいた。反応混合物を50°Cで1時間インキュベートした。p-ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いて分光測定により585nmで吸光度を測定することによって、放出されたN-アセチルグルコサミンを推定した。1単位の活性を、アッセイ条件下で1分ごとに1μモルのN-アセチルグルコサミンを放出するのに必要な酵素の量として定める。分光光度測定法によってコンドロイチナーゼ活性を37°Cで測定した。適切に希釈した酵素0.8mlを37°Cで10分間平衡させた後、250mMのトリスHClおよび300mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH8で調製し、0.2mlの0.5コンドロイチン硫酸Aの0.05ウシ血清アルブミン溶液を添加し、すぐに混合した。反応混合物を37°Cで最長21分間インキュベートした。0.1mlの一定分量を3分間隔で取り出し、pH8に調整した0.9mlの50mMのKClを含む管に移し、インキュベーションを37°Cでさらに10分間続けた。10分後、内容物を遠心分離し、吸光度を232nmで測定した。0分時点の吸光度をアッセイのブランクとして用いた。活性を、以下に示すように時間に対する吸光度のグラフの直線部分の勾配吸光度の増加/分から計算した。1単位を、アッセイ条件下で、1分ごとに1マイクロモルの2-アセトアミド-2-デオキシ-3-O-β-D-グルコ-4-エン-ピラノシルウロン酸-4-O-スルホ-D-ガラクトースをコンドロイチン硫酸Aから放出させるのに必要な酵素の量として定める。式中、5.1は、コンドロイチン硫酸Aのための不飽和二糖のミリモル吸光係数である。伝統的に、ケラチナーゼは、羽毛粉、肥料および接着剤などの製造のために使用されている。それらの適用範囲は徐々に拡大しており、現在では、洗剤、製剤、化粧品、革、薬および動物の飼料などの他の領域に益々使用されている。より最近では、ケラチナーゼは、狂牛病の治療プリオンの分解、生分解性プラスチックおよび羽毛粉の製造に適用されている。軽度のエラスチン分解活性を有するがコラーゲン分解性を欠いているケラチナーゼの適用は、革の製造での脱毛過程について調査されている。皮および生皮は、相当量の有益なGAG生重量で0.2~0.3を含有する。リパーゼ、ケラチナーゼ、コンドロイチナーゼおよびキチナーゼを含む酵素組成物は、脱毛に有用であろう。本発明の酵素組成物は、食品、化粧品、医薬品、革、織物産業、およびラセミ混合物からの光学異性体の分割で使用されている。プロテアーゼは、農業、革、織物、絹の精練、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、動物組織培養、廃棄写真フィルムおよびナノ粒子合成からの銀の除去、肥料、ならびに、植物、動物、ペプチド合成からの培地成分およびタンパク質加水分解産物の調製、分子生物学、化粧品、アミノ酸のラセミ混合物の分離および廃棄物処理などに適用されている。ケラチナーゼは、革、洗剤、および狂牛病でのプリオンの分解に適用されている。リパーゼは、農業、革、織物、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、肥料、化粧品、廃棄物処理および高分子化合物の合成などに適用されている。キチナーゼは農業に適用されている。コンドロイチナーゼは脊髄損傷に適用されている。以下、本発明について、実施例を用いて本明細書に説明するが、それらは単に例示であり、どのようないかなる方法であっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下、本発明について、実施例を用いて本明細書に説明するが、それらは単に例示であり、どのようないかなる方法であっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例1本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185の単離および形態学的特性によるその同定を例示する。真菌培養物を、インドマハラシュトラ州プネーから回収した植物有機堆積物を分解することによって単離した。植物有機堆積物の微粒子を、ペトリ皿の蓋の内面に付着させたMGYP寒天麦芽エキス-0.3、酵母エキス-0.3、ペプトン-0.5、グルコース-1、寒天-2ブロックに重ね合わせ、プレートを28°Cでインキュベートした。強制的に放出された分生子から発生する単一の単離コロニーを取り出し、MGYP寒天斜面に移し、28°Cで2~3日間インキュベートした。微生物は急速に増殖し、基部に乳頭状突起を有する強制的に放出された大きな球形の分生子の形態に基づいてコニディオボルス属に属する株として同定した。菌糸体は無隔であるが、後期には有隔となる。分生子柄は短系であるが、菌糸体とは区別がつかない。分生子柄の先端では、強制的に放出される大きな球形の分生子が形成される。分生子の大きさは、35~45ミクロンの間で様々である。分生子は発芽して、菌糸体を生じるか、または放射状小柄上に小分生子を生じるか、あるいは二次分生子に遷移する。放出された分生子は、増殖する培養物の上方にあるガラス上の白みがかった/クリーム色がかった堆積物として目視可能である。微生物は接合胞子であり、接合胞子休眠胞子は、2つの異なった壁層と内部に粒状内容物を含む丸くて滑らかな厚い壁を有する図1。実施例2A本実施例は、臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB法によって、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185のゲノムDNAの単離を例示する。DNAの単離のために、その組成が麦芽エキス-3、酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-10g/Lである麦芽エキスグルコース酵母エキスペプトンMGYP:MaltextractGlucoseYeastextractPeptone培地を含む液体フラスコで真菌を増殖させた。7日齢のMGYP斜面からの胞子を接種することによって増殖を開始した。フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで48時間インキュベートした。内容物を8000rpmで15分間遠心分離し、繰り返し洗浄して培地成分を除去した。3~5gの湿った菌糸体を液体窒素中で粉砕した後、そこに、0.2β-メルカプトエタノールを含有する8~10mlのCTAB抽出緩衝液pH8を添加し、その後、20μlのプロテイナーゼK20mg/mlを添加し、65°Cで1時間インキュベートした。この後に、20μlのリボヌクレアーゼA10mg/mlを添加し、65°Cで15分間さらにインキュベートした。遠心分離8000rpm、10分後に回収した上澄みに、10mlのクロロホルム:イソアミルアルコール24:1を添加した。混合物を5分間振盪し、10,000rpmおよび4°Cで15分間遠心分離した。2倍量のCTAB沈殿緩衝液を上澄みに添加し、室温で1時間維持した。遠心分離後に回収したペレットを、5mlの1.2MのNaClに溶解し、5mlのクロロホルム:イソアミルアルコール24:1を添加した。2倍量の無水アルコールを水相に添加してDNAを沈殿させた。DNAを巻き取って取り出し、70エタノールで洗浄し、5mlの0.1MトリスEDTA緩衝液pH8.0に溶解し、保存した。分光光度計を用いて260nmで試料の吸光度を測定することによってDNAの定量化を行い、0.8アガロースゲル電気泳動で純度を確認した。実施例2B本実施例は、18SリボソームDNA遺伝子のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応PCRによる増幅を例示する。真菌種の同定のために使用したプライマーは、真菌の汎用な18SリボソームDNArDNAプライマーNS1-F、NS8-Rであった。ポリメラーゼ連鎖反応物25μlを準備して、ゲノムDNAを用いて18SrDNA遺伝子を増幅した。反応混合物は典型的に、ゲノムDNAを0.70μl、10×PCR緩衝液を2.50μl、0.2mMのdNTPを2.5μl、前方及び後方プライマーをそれぞれ10~20ピコモル~1.25μl、蒸留水を16.60μlおよび1単位のTaqDNAポリメラーゼ-を0.2μl含んでいた。18SrDNA遺伝子の増幅のためのPCR条件は、95°Cで3分間の最初の変性、次いで、94°Cで1分間、57°Cで30秒間、72°Cで2分間を35サイクル、および72°Cで10分間の最終的な伸長であった。5μlの上記PCR増幅産物を使用して、1.0アガロースゲルで増幅を確認した。実施例2C本実施例は、PCR増幅産物の精製を例示する。20μlのPCR増幅産物に、12μlの20PEG-NaClポリエチレングリコール-NaCl溶液を添加し、37°Cで30分間インキュベートした。次いで、それを、12,000rpmで20分間遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを、70エタノールで二回洗浄し、12,000rpmで20分間遠心分離することによって分離した。ペレットを乾燥し、10μlの再蒸留水に溶解し、-20°Cで保存した。実施例2D本実施例は、精製したPCR産物の配列決定を例示する。製造業者の手順に従って、ABIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitPerkinElmerAppliedBiosystemsDivision社、カリフォルニア州フォスター市を用い、TaqDNAポリメラーゼを用いて、配列決定反応を行った。本キットは、BigDyeTerminatorと呼ばれる異なる蛍光標識を有する4種類のddNTPを含む。2μlのPCR産物および3ピコモルの配列決定プライマーを、20μlの配列決定反応物に使用した。配列決定プライマーは、配列決定用のNS1、NS2、NS3、NS4、NS5、NS6、NS7およびNS8Whiteら、1990年であった。配列決定反応混合物を、PerkinElmer社製サーマルサイクラー9700の25サイクルに供した。各サイクルは、95°Cで10分間、50°Cで5分間および60°Cで4分間から構成されていた。ABI1500自動配列決定装置でDNA塩基配列決定を行った。実施例2E本実施例は、上記実施例で得られた18SrDNA配列に基づく、コニディオボルス属の種の新規なMTCC-5185株の同定および系統的関係を例示する。得られた配列は小さな断片であったため、配列を重なることによって適切に位置合わせした。18SrDNAの得られた配列を用いたコニディオボルス属の種の新規な株の相同性の割合および系統的関係をNCBIデータベースで確認した。ヌクレオチド配列は、基本的な局所アラインメント検索ツールBLASTプログラムを用いて、ジェンバンクデータベースを用いて分析した。表1の結果は、NCBIデータベースにおける18SrDNA配列の最初の10件のBLASTヒットを示す。18SrDNAは、コニディオボルスブレフェルディアヌスの1つの株AF368506.1との最大99の配列相同性を示した。MTCC-5185、すなわちコニディオボルスブレフェルディアヌスの新規な株の18SrDNA配列は、、受託番号FJ895304でNCBI遺伝子バンクに寄託した。図2は、他の微生物との18SrDNAの配列相同性を示す。コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株がコニディオボルスコロナトゥス菌株群には該当しないことが分かる。実施例3本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。発酵は、グルコース-20、酵母エキス-3、大豆ミール-301リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで行った。その組成がグルコース-10、酵母エキス-31リットル当たりのグラム数である種培養物の調製のために、3日齢のMGYP斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。振盪フラスコ実験は、回転振盪機200rpmで28°Cで72時間行った。プロテアーゼ活性を、Laxmanら2005年、ProcessBiochemistryプロセス生化学、第40巻、3152~3158頁2005年に従って推定した。活性の1つの単位を、1分ごとに1マイクロモルのTyrを放出するのに必要な酵素の量として定める。3日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼ活性は、36~38IU/mlであった。実施例4本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。グルコース-20、リン酸水素二アンモニウム-1.6、大豆ミール-301リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。その組成がグルコース-10、酵母エキス-3、ペプトン-51リットル当たりのグラム数である種培養物の調製のために、3日齢のMGYP斜面からの胞子を使用した。これを回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。振盪フラスコ実験は、回転振盪機200rpmで28°Cで72時間行った。3日後の細胞非含有培養液中の活性は、34~40IU/mlであった。実施例5本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いて、装備付き発酵槽における撹拌および通気制御条件下での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。5Lの作業体積を有する7.5LのNewBruinswick発酵槽で発酵を行った。3日齢のMGYPプレート/斜面からの胞子を使用して、その組成が酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-10GYEP1リットル当たりのグラム数である250mlの培地を含む1Lのフラスコで接種菌を増殖させ、28°Cおよび220rpmで24時間インキュベートした。発酵槽に、500ml10v/vの24時間植物接種菌を接種した。7.5L発酵槽内の産生培地4.5Lは、基礎培地として2商用グレードグルコース、0.3酵母エキスを含んでいた。3の濃度の大豆ミールを誘導物質として使用した。通気および撹拌機の速度をそれぞれ、3~4rpmおよび350~400rpmに維持し、温度を26~28°Cに維持した。2~3日後の細胞非含有培養液中の活性は、36~40IU/mlであった。実施例6本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた、装備付き発酵槽における撹拌および通気制御条件下での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。50Lの作業体積を有する75Lの発酵槽で発酵を行った。産生のために、以下の発酵パラメータに従った:ストックとしての3日齢のMGYP斜面、その組成が酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-10GYEP1リットル当たりのグラム数である培地で増殖させた15時間齢の事前接種菌、その組成が酵母エキス-3およびグルコース-10GYE1リットル当たりのグラム数である培地で増殖させた15時間齢の接種菌、2の市販のグルコース、0.16の肥料グレードリン酸水素二アンモニウムDAPおよび3の大豆ミールSBMを含有する産生培地。最初に、泡止め剤と共にSBMを121°Cで30分間滅菌した。冷却後、グルコースおよびDAPを添加し、20分間再滅菌し、接種まで正圧を維持した。発酵の間中、温度を28~30°Cに維持した。撹拌は、最初に80rpmに維持し、発酵終了時の最大120rpmまで徐々に上昇させた。通気は、最初に0.8vvmに維持し、36時間後の1.2~1.4vvmまで上昇させた。2~3日後の細胞非含有培養液中の活性は、36~40IU/mlであった。実施例7本実施例は、プレートアッセイを用いてコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185によって分泌されたリパーゼ活性の検出を例示する。酵素のためのプレートアッセイを、グルコース-1.5、酵母エキス-1.5、ペプトン-5、牛肉エキス-5、寒天-20および1乳化トリブチリン1リットル当たりのグラム数からなる25mlのMikami培地を含む使い捨てのペトリ皿で行った。その組成が酵母エキス-3およびグルコース-101リットル当たりのグラム数であるGYE接種菌を調製するために、2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。24時間の増殖後、1白金耳量の増殖物をプレートにスポット接種し、28°Cで72時間インキュベートした。トリブチリンの分解による増殖中の真菌コロニーの周りの隙間領域が観察され、これは微生物によるリパーゼの分泌を示していた図3。実施例8本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株によるプレートアッセイを用いたキチナーゼ活性の検出を例示する。プレートアッセイを、0.01の酸で膨張したキチンを含有する25mlの2寒天を含む使い捨てのペトリ皿で行った。3日齢の斜面からの胞子を、その組成が酵母エキス-3、グルコース-10および酸で膨張したキチン-0.11リットル当たりのグラム数である産生培地に接種し、180~200rpmで振盪しながら28°Cでインキュベートした。試料を24、48および72時間後に取り出し、50μlの細胞非含有上澄みをプレート上に作られたウェルに添加し、37°Cで1時間インキュベートした。キチナーゼ活性の検出のために、プレートを0.1ラニパルranipalに15分間浸した後、蒸留水で二回それぞれ30分間洗浄した。プレートを紫外線の下で観察した。試料スポットの周りの薄青色の透明領域は、キチン分解により観察され、これは真菌株によるキチナーゼの分泌を示していた図4。無菌水が添加された場所ウェル1に隙間領域は存在しなかったが、隙間領域は発酵時間と共に増加し、最大の隙間が72時間後の試料ウェル4で観察された。実施例9本実施例は、プレートアッセイを用いてコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185によって分泌されたコンドロイチナーゼの活性の検出を例示する。酵素のためのプレートアッセイを、ウシ血清アルブミンBSAおよびコンドロイチン硫酸Aを添加したMGYP寒天培地を含む使い捨てのペトリ皿で行った。麦芽エキス-0.15g、酵母エキス-0.15g、ペプトン-0.25g、グルコース-0.5gを、40mlの蒸留水に溶解し、1gの寒天を添加し、加圧滅菌した。BSA500mgおよびコンドロイチン硫酸A20mgを、10mlの蒸留水に溶解し、濾過滅菌し、培地に添加し、無菌のペトリ皿に入れた。2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用して、その組成が酵母エキス-3およびグルコース-101リットル当たりのグラム数であるGYE培地に接種した。24時間の増殖後、10v/vの栄養増殖物をグルコース-20、リン酸水素二アンモニウム-1.6、大豆ミール-301リットル当たりのグラム数を含む培地に移し、28°Cおよび180rpmでインキュベートした。48時間後、1白金耳量の増殖物をプレートにスポット接種し、28°Cでインキュベートした。4日後、プレートを2N酢酸に浸し、室温で15分間放置した。BSAに結合した未分解のコンドロイチン硫酸Aは不透明な外観を与えるが、コロニーの周りに隙間領域が認められ、これは、コンドロイチン硫酸Aを加水分解させるコンドロイチナーゼの分泌を示していた図5。実施例10本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるリパーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン-5、牛肉エキス-5、酵母エキス-1.5、グルコース-1.51リットル当たりのグラム数を含有するMikami培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。2濃度のオリーブ油を、リパーゼ産生のための誘導物質として使用した。培地をpH7に調整した。基質として酪酸p-ニトロフェニルを用いて、分光光度法で、3日後の細胞非含有培養液中のリパーゼ活性を測定し、活性は、0.5~0.6IU/mlの範囲であった。実施例11本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるリパーゼの産生に対する様々な油脂の誘導作用を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン-5、牛肉エキス-5、酵母エキス-1.5、グルコース-1.51リットル当たりのグラム数を含有するMikami培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。リパーゼ産生のための誘導物質として、2濃度の以下の油:大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油およびトリブチリンを使用した。培地をpH7に調整した。4日後の細胞非含有培養液中のリパーゼ活性を滴定法で測定した。大豆、オリーブおよびヒマワリ油中のリパーゼ活性は、0.41~0.43U/mlの範囲であったが、トリブチリンでは0.63u/mlのより高い活性が得られた。実施例12本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびリパーゼの調製を例示する。その組成が麦芽エキス-3、ペプトン-5、グルコース-10、酵母エキス-31リットル当たりのグラム数である発酵培地に接種するために、2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。培地をpH7に調整した。プロテアーゼおよびリパーゼ産生のための誘導物質として、大豆ミール2および大豆油1をそれぞれ使用した。3日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびリパーゼ活性をそれぞれ、カゼイン分解法および滴定法によって測定した。プロテアーゼおよびリパーゼ活性はそれぞれ、12~15IU/mlおよび1~1.2IU/mlの範囲であった。実施例13本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるキチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、3日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン-5、牛肉エキス-5、酵母エキス-1.5、グルコース-1.51リットル当たりのグラム数を含有するMikami培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。キチナーゼ産生のための誘導物質として1濃度のキチンを使用した。培地をpH7に調整した。2日および3日後の細胞非含有培養液中のキチナーゼ活性はそれぞれ、0.011IU/mlおよび0.016IU/mlであった。実施例14本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびキチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、3日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース-20、キチン-0.1、リン酸水素二アンモニウム-1.61リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をpH7に調整し、大豆ミールを、3濃度の誘導物質として添加した。2日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびキチナーゼ活性はそれぞれ、25~29IU/mlおよび0.014~0.016IU/mlであった。実施例15本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびラミナリナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、3日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース-20、リン酸水素二アンモニウム-1.61リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をpH7に調整し、大豆ミールを、3濃度の誘導物質として添加した。2日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびラミナリナーゼ活性はそれぞれ、26~28IU/mlおよび0.95~1.21IU/mlであった。実施例16本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびケラチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、2日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン-5、牛肉エキス-5、酵母エキス-1.5、グルコース-1.51リットル当たりのグラム数を含有するMikami培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をpH7に調整し、ケラチナーゼのための誘導物質として鶏羽毛1を各フラスコに別々に添加した。振盪フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで48時間インキュベートした。BressollierらAppliedEnvironmentalMicrobiology応用環境微生物学、第65巻6、2570~2576頁、1999年に従って、ケラチナーゼ活性を測定した。酵素活性の1つの単位を、1分ごとに595nmで0.01だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。24時間および48時間後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼ活性はそれぞれ、3.34IU/mlおよび7.90IU/mlであった。24時間および48時間のケラチナーゼ活性はそれぞれ、150.02および252.45U/mlであった。実施例17本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびコンドロイチナーゼの調製を例示する。実施例28に記載されているようなAmicon濃縮酵素試料はそれぞれ、222.12U/mlおよび0.1~0.16U/mlのプロテアーゼおよびコンドロイチナーゼ活性を示した。実施例18本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵による各種炭素源を用いたプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース-10、酵母エキス-31リットル当たりのグラム数である種培養物の調製のために、2日齢のMGYP斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。炭素源-10、酵母エキス-3、大豆ミール-301リットル当たりのグラム数を含む培地に入れた振盪フラスコで発酵を行った。炭素源として、1濃度のフルクトース、グルコース、グリセリン、ラクトース、マンニトールおよび澱粉を使用した。振盪フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで72時間インキュベートした。48時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表2に示す。グルコースが最良の炭素源であることが分かった。実施例19本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース-10、酵母エキス-31リットル当たりのグラム数である種培養物の調製のために、3日齢のMGYP斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース-10、酵母エキス-3、誘導物質-201リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。以下の誘導物質:大豆ミール、綿実粕、カラシ種子粕、落花生粕、ベサン粉、緑豆粉、ソイトース、脱脂粉乳、トリプトン、カゼインおよびカザミノ酸を使用した。振盪フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで72時間インキュベートした。48時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表3に示す。試験した全ての誘導物質がプロテアーゼ産生を誘導した。実施例20本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵による、誘導物質として異なる濃度の大豆ミールを用いたプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース-10、酵母エキス-31リットル当たりのグラム数である種培養物の調製のために、2日齢のMGYP斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース-10、酵母エキス-3、大豆ミール-0、10、20、30、40、501リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。振盪フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで72時間インキュベートした。48時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表4に示す。実施例21本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた深部発酵による、20~45°Cの温度範囲でのプロテアーゼ産生を例示する。その組成が麦芽エキス-3、酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-101リットル当たりのグラム数であるMGYP種培養物を調製するために、3日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。麦芽エキス-3、酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-10、大豆ミール-201リットル当たりのグラム数を含有するMGYP液体培地を含む振盪フラスコで産生を行い、pHを6.5~7に調整した。フラスコを回転振盪機200rpmで20~45°Cの温度範囲で48時間インキュベートした。プロテアーゼ産生は20~37°Cの温度範囲で観察され、28°Cで最も高い活性が認められた表5。実施例22本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185株を用いた、5~10のpH範囲での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス-3、グルコース-101リットル当たりのグラム数であるGYE種培養物を調製するために、3日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で28°Cで24時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース-20、酵母エキス-3、大豆ミール-201リットル当たりのグラム数を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地のpHは、無菌のNaOHまたはHClの添加により、pH5~10の範囲で様々であった。振盪フラスコを、回転振盪機200rpmで28°Cで48時間インキュベートした。プロテアーゼ産生は、5~10のpH範囲で観察された表6。実施例23本実施例は、前記株によって分泌されたプロテアーゼが活性となるpH範囲を例示する。プロテアーゼにとって最適なpHの決定のために、酵素を希釈し、5~12の範囲の異なるpHの緩衝液でアッセイした。0.1Mの濃度の以下の緩衝液を使用した:酢酸塩pH5、リン酸ナトリウム緩衝液pH6、7、トリスHCl緩衝液pH8および炭酸-重炭酸塩pH9および10、リン酸ナトリウム-NaOHpH11、12およびKCl-NaOHpH12.0。その結果を本明細書の一部をなす添付の表7に示す。酵素はpH6~11で活性となることが観察された。実施例24本実施例は、前記株によって分泌されたプロテアーゼが活性となる温度範囲を例示する。最適な温度の決定のために、30~70°Cの範囲の温度の炭酸-重炭酸塩緩衝液0.1M、pH9を用いてプロテアーゼ活性を測定した。実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表8に示した。酵素が30~60°Cで活性となることが観察される。実施例25粗製プロテアーゼのリン酸塩緩衝液pH7.0を40°Cで最長2時間インキュベートすることによって、時間に対する40°Cでの前記プロテアーゼの安定性を測定した。実施例4に記載されているように粗製プロテアーゼを産生した。一定分量を15分の一定の間隔で取り出し、残存活性を50°CおよびpH9で推定した。その結果を表9に示し、ここでは、プロテアーゼが40°Cで最長2時間安定であり、約60の活性を保持した。実施例26本実施例は、凍結乾燥によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例4に記載されているように産生し、かつ36.33U/mlの活性を有するプロテアーゼ100mlを、液体が完全に蒸発して、乾燥した吸湿性の粉末が得られるまで6時間凍結乾燥した-55°C。凍結乾燥した粉末を脱イオン水に溶解し、プロテアーゼ活性を推定した。凍結乾燥した試料は、191.88U/mlの活性を示した。プロテアーゼの回収は95を超えることが分かった。これは、プロテアーゼが凍結乾燥に対して安定であることを示している。実施例27本実施例は、限外濾過によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例4に記載されているように産生したプロテアーゼを、10,000rpmで遠心分離した。25.84IU/mlの活性を有する透明な上澄み1200mlを、Amicon膜濾過装置で、3,000ダルトンの分画分子量を有するYM-3膜で濃縮した。濃縮後の体積は150mlであり、206.72IU/mlのプロテアーゼ活性を有していた。濾過後の回収率は95~98であった。また、別の組では、1000mlの上澄みを、85の回収率で、PM-10膜10,000ダルトンの分画分子量で100mlまで濃縮した。実施例28本実施例は、90の飽和を有する硫酸アンモニウム沈殿によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例6に記載されているように産生したプロテアーゼを10,000rpmで遠心分離した。濃縮のために、31.29IU/mlの活性を有する透明な上澄み1000mlを使用した。ゆっくりと連続混合しながら600gの硫酸アンモニウムを添加することによって、沈殿を4°Cで行った。完全な沈殿のために撹拌をさらに2時間続け、放冷して沈殿させた。透明な上澄みを別の容器に移し、懸濁液の体積を250mlまで減らし、4倍の濃度のプロテアーゼを得た。10,000rpmで遠心分離した後に得られた沈殿物を10mMトリスHCl緩衝液pH8に溶解した後に、懸濁液中のプロテアーゼ活性を推定した。90を超えるプロテアーゼが回収され、懸濁液中の活性は118.12IU/mlであった。実施例29本実施例は、洗剤の存在下でのコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼの安定性を例示する。実施例4に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、0.7mg/mlの洗剤最終濃度と共に40°Cで最長1時間インキュベートした。試料を15分間隔で取り出し、残存活性を測定し、各洗剤による初期活性を100とした場合の割合として表す。プロテアーゼは、全ての洗剤の存在下で安定であり、洗剤に応じて15分後に75~94の活性を保持した表10。1時間後であっても、約35~50の活性が保持された。実施例30本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185によって分泌されるプロテアーゼが各種金属の存在下で活性であることを例示する。実施例4に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを使用した。プロテアーゼ活性を金属の存在下で推定した。金属100mMの原液を調製し、5mMの最終濃度でアッセイ混合物に添加した。実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表11に示した。プロテアーゼは、Ca、Cd、Co、K、MgおよびMnの存在下で活性であったが、NiおよびZnにより、35~40の阻害が生じた。CuおよびHgは、プロテアーゼ活性を完全に阻害した。実施例31本実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが1時間安定となる温度範囲を例示する。温度安定性を決定するために、実施例27に記載されているような限外濾過した粗製プロテアーゼを、4~70°Cの範囲の温度で1時間インキュベートし、残存活性を50°CおよびpH9で測定した。その結果を表12に示し、ここでは、酵素が50°Cまで安定であることが観察される。実施例32本実施例は、50°Cでのプロテアーゼの安定性を例示する。50°Cで最長2時間プロテアーゼをインキュベートすることによって、時間に対する50°Cでの前記プロテアーゼの3種類の異なる試料の安定性を決定した。実施例4、27および28に記載されているような粗製培養濾液、硫酸アンモニウム沈殿物および限外濾過した膜プロテアーゼ試料を、安定性の調査のために使用した。一定分量を30分の一定間隔で取り出し、残存活性を50°CおよびpH9で推定した。その結果を表13に示し、ここでは、全てのプロテアーゼ試料の活性が、30分後に50°Cで60を超えて保持された。培養濾液およびPM-10保持液が2時間後に約25~27の活性を保持したのに対して、2時間後に約40の活性を保持した硫酸アンモニウム沈殿試料は、より安定であることが分かった。実施例33本実施例は、糖アルコールの存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例27に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、20濃度のグリセリン、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールの存在下で50°Cで最長3時間インキュベートした。一定分量を30分の一定間隔で取り出し、残存活性を50°CおよびpH9で推定した。その結果を表14に示す。全ての糖アルコールにより酵素の安定性は増加し、30を超える活性が3時間後に保持された。その中で、ソルビトールは、47の残存活性により、プロテアーゼにより大きな耐熱性を与えた。実施例34本実施例は、ソルビトールおよびトレハロースの存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例27に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、20、40および50のソルビトールおよびトレハロースの存在下50°Cで最長4時間インキュベートした。一定分量を60分の一定間隔で取り出し、残存活性を50°CおよびpH9で推定した。その結果を表15に示す。トレハロースおよびソルビトールの濃度の増加と共に安定性は増加した。添加剤を含まない対照が12.67の残存活性を示したのに対して4時間後であっても約80の活性を保持した50のソルビトールおよびトレハロースにより、耐熱性がほぼ5~6倍増加した。実施例35本実施例は、塩の存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例27に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、10mMのCaCl2、0.5MのNaCl、0.5Mのグリシンおよび15の硫酸アンモニウムの存在下50°Cで最長3時間インキュベートした。一定分量を30分の一定間隔で取り出し、残存活性を50°CおよびpH9で推定した。その結果を表16に示す。全ての塩の存在下で安定性が増加した。塩化カルシウムおよび硫酸アンモニウムは、熱変性に対するより大きな保護を提供し、ここでは、対照が約20の残存活性を示したのに対して、3時間後の残存活性は約55であった。実施例36本実施例は、28°Cでの粗製プロテアーゼの安定性に対する水混和性および水不混和性有機溶媒の効果を例示する。以下の有機溶媒:アセトン、アセトニトリル、1-ブタノール、ジメチルスルホキシド、2-プロパノールおよびメタノールを使用した。実施例4に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、20v/vの有機溶媒有効濃度と共に28°Cでインキュベートした。試料を異なる時間間隔で取り出し、残存活性を推定した。有機溶媒を含まない試料は対照として機能した。各溶媒による最初の活性を100とした表17。全ての他の溶媒において95を超える活性が最長5時間保持されたのに対して75.26の残存活性を示したブタノールを除いて、プロテアーゼは有機溶媒の存在下で安定であった。28°Cで12時間のインキュベーション後に、ブタノールを除いて、プロテアーゼは50を超える活性を保持したのに対して、ブタノールでの残存活性は約40であった表17。実施例37本実施例は、37°Cでの粗製プロテアーゼの安定性に対する水混和性および水不混和性有機溶媒の効果を例示する。以下の有機溶媒:アセトン、アセトニトリル、1-ブタノール、ジメチルスルホキシド、2-プロパノールおよびメタノールを使用した。実施例4に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、20v/vの有機溶媒有効濃度と共に37°CおよびpH7でインキュベートした。試料を異なる時間間隔で取り出し、残存活性を推定した。有機溶媒を含まない試料は対照として機能した。各溶媒による最初の活性を100とした表18。2時間後に50を超える活性がアセトン、メタノールおよびジメチルスルホキシドで保持されたのに対して35未満の残存活性を示したアセトニトリル、ブタノールおよび2-プロパノールを除いて、プロテアーゼは有機溶媒の存在下で安定であった表18。実施例38本実施例は、NMITLI-1およびコラゲナーゼ-1基質を用いた蛍光調査による、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼの非コラゲナーゼ性を例示する。最初に、NMITLI-1基質に対して粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼを用いて蛍光実験を行った。トリエタノールアミン緩衝液TEA中で、室温およびpH8で蛍光実験を行った。典型的には、アッセイは、1.8μΜのNMITLI-1基質濃度10μlの112μΜ原液を有する290μlの100mMのTEA緩衝液pH8を含んでいた。5μlの酵素試料を添加することによって反応を開始した。励起波長は340nmであり、異なる時間間隔で425~625nmの蛍光を走査した。AEDANS発色団の蛍光が3倍増加し、これは、酵素試料のタンパク分解性を示していた。NMITLI基質-1粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼ試料がNMITLI-1基質に対する活性を示したため、それらを、コラゲナーゼ基質-Iによるコラゲナーゼ活性についてもスクリーニングした。トリエタノールアミン緩衝液TEA中で、室温およびpH8で蛍光実験を行った。典型的には、アッセイは、1.6μΜの基質コラゲナーゼ基質-I濃度5μlの80mM原液を有する、290μlの100mMのTEA緩衝液pH8を含んでいた。5μlの酵素試料を添加することによって反応を開始した。励起波長は340nmであり、異なる時間間隔で425~625nmの蛍光を走査した。AEDANS発色団-の蛍光の増加は認められず、これは、コラゲナーゼ活性が存在しないことを示している。コラゲナーゼ基質-Iこれらの結果は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼがコラゲナーゼ基質-Iに対して不活性であったことを示し、これは、プロテアーゼの非コラゲナーゼ性を示している。実施例39本実施例は、エラスチン-オルシンに対するコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼの活性の測定を例示する。反応混合物は、3mlの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼ酵素と、20mgのエラスチン-オルシンの50mMのトリスHCl緩衝液pH8.0とを含んでいた。熱不活化酵素15分間の沸騰によるをブランクとした。50°Cで30分間のインキュベーション後に、内容物をワットマンNo.1濾紙で濾過し、濾液の吸光度を578nmで測定した。酵素活性の1つの単位を、1分ごとに578nmで1単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。118.12IU/mlのカゼイン分解活性を有する実施例28に記載されているような硫酸アンモニウム沈殿懸濁液は、エラスチン-オルシンに対して3.84U/mlの活性を示した。実施例40本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼのアゾコール活性の測定を例示する。反応混合物は、2.5mlの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼと、10mgのアゾコールの0.05MのトリスHCl緩衝液pH8.0とを含んでいた。熱不活化酵素15分間の沸騰によるをブランクとした。37°Cで10分間のインキュベーション後に、ワットマンNo.1濾紙で濾過することによって反応を終了させた。濾液の吸光度を580nmで測定した。酵素活性の1つの単位を、1分ごとに580nmで1単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。実施例3に記載されているように増殖させた粗製培養濾液は、16~18U/mlのアゾコール活性を有していた。実施例41本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼのアゾカゼイン活性の測定を例示する。反応混合物は、500μlの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼと、1mgのアゾカゼインの0.05Mの炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0とを含んでいた。熱不活化酵素15分間の沸騰によるをブランクとした。50°Cで30分間のインキュベーション後に、500μlの10TCAの添加によって反応を終了させた。氷上での15分間の冷却後に、内容物を8000rpmで10分間遠心分離した。800μlの上澄みに、200μlの1.8MのNaOHを添加し、吸光度を420nmで測定した。酵素活性の1つの単位を、1分ごとに420nmで1単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。実施例3に記載されているように増殖させた粗製培養濾液は、40~45U/mlの活性を示した。実施例42本実施例は、N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリドBAPNAに対するコニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼの活性を例示する。0.16mlの3mMのN-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリドBAPNAのDMSO溶液、0.5mlの50mMリン酸塩緩衝液pH7.2および0.1mlの適切に希釈した酵素試料からなるアッセイ混合物を、37°Cで1時間インキュベートした。0.5mlの1MのNa2CO3の添加によって反応を終了させた。吸光度を420nmで測定した。活性の1つの単位を、1分ごとに410nmで1単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。20.7U/mlのカゼイン分解活性を有する実施例3に記載されているような粗製酵素は、1.41U/mlの活性を示した。実施例43本実施例は、基質としてカゼイン、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミンを用いた、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼ活性の測定を例示する。実施例3に記載されているように増殖させた粗製培養濾液を、PM-10膜で限外濾過によって濃縮し、調査のために使用した。反応混合物は、2mlの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼ酵素と、10mgの基質の0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0とを含んでいた。50°Cで10分間のインキュベーション後に、3mlの5トリクロロ酢酸濃塩酸で酸性にしたの添加によって反応を終了させた。形成された沈殿物を、30分間室温で放置した後に、ワットマンNo.1濾紙で濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を280nmで測定した。プロテアーゼは、様々な程度まで上記基質を分解することができる表19。実施例44本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を例示する。以下の阻害剤:フッ化フェニルメチルスルホニルPMSF、エチレンジアミン四酢酸EDTA、ヨード酢酸およびジメチルスルホキシドDMSOについて調査した。実施例3に記載されているように増殖させた粗製培養濾液を、実施例27に記載されているようにPM-10およびYM-3膜で限外濾過によって濃縮し、阻害調査のために使用した。両プロテアーゼ調製物を、各阻害剤を含む100mMトリス-HCl緩衝液pH8.0中で1時間プレインキュベートし、残存活性を50°CおよびpH9.0で測定した。阻害剤を含まないプロテアーゼは対照として機能した。プロテアーゼは、1mMのPMSFによって完全に阻害され、これは、セリンプロテアーゼであることを示していた表20。実施例45本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を例示する。以下の阻害剤:N-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトンTPCK、N-トシル-L-リジンクロロメチルケトンTLCKおよびベンズアミジンについて調査した。粗製プロテアーゼを、各阻害剤の100mMのトリス-HCl緩衝液pH8.0と共に30分間プレインキュベートし、残存活性を50°CおよびpH9.0で測定した。阻害剤を含まないプロテアーゼは対照として機能した。TPCKおよびTLCKによる阻害はそれぞれ9および29であったが、ベンズアミジンは阻害せず、これは、プロテアーゼがトリプシン様活性を有しないことを示していた表21。実施例46本実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性となるpH範囲を例示する。リパーゼにとって最適なpHの決定のために、滴定法によって、50°Cおよび4~9の範囲のpHで酵素をアッセイした。以下の緩衝液:酢酸塩pH4および5、リン酸塩pH6、7、トリスHClpH8および炭酸-重炭酸塩pH9を使用した。その結果を本明細書の一部をなす添付の表22に示す。酵素はpH4~9で活性となることが観察された。実施例47本実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性となる温度範囲を例示する。最適な温度の決定のために、リパーゼ活性を、pH7および30~60°Cの範囲の温度で滴定法によって測定した。実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表23に示す。酵素が30~60°Cで活性となることが観察される。実施例48本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185プロテアーゼの均一精製を例示する。実施例4に記載されているように真菌を増殖させ、10,000rpmで10分間の遠心分離後に得られた透明な上澄みを酵素源として使用した。培養液の硫酸アンモニウム分別沈殿を4°Cで行い、透析した硫酸アンモニウム沈殿物50~80飽和を、50mMリン酸塩緩衝液pH7.0で平衡したジエチルアミノエチルセルロースDEAEセルロースカラム2.5cm×25cmに充填した。非吸着酵素を、20ml/時間の流速で、50mMリン酸塩緩衝液pH7.0で溶出させた。プロテアーゼ活性を示す画分を貯留し、SpeedVac登録商標で濃縮し、50mMリン酸塩緩衝液pH7で平衡したセファデックスG-100カラム1.2cm×150cmに充填した。カラム充填物を、12ml/時間の流速で、50mMリン酸塩緩衝液pH7.0で溶出させた。プロテアーゼ活性を示す画分を貯留し、-20°Cで保存した。実施例49本実施例は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型質量分析MALDI-TOFによる精製プロテアーゼの純度および分子量の決定を例示する。MsBioRad社製のSDS-PAGE用分子質量標識キットCatNo.161-0305は、炭酸脱水酵素35.88kDa、大豆トリプシン阻害剤27.86kDa、リゾチーム18.81kDa、ウシ血清アルブミン87.55kDa、ホスホリラーゼb101.47kDaおよび卵白アルブミン52.74kDaで構成されていた。SDS-PAGEによる酵素の分子質量は、炭酸脱水酵素の分子量よりも僅かに低い約29kDaであることが分かった図6。また、精製プロテアーゼの分子質量を、37nm窒素レーザーを備えたVoyagerDESTRを用い、MALDI-TOF質量分析を用いて測定した。精製酵素を、等体積のシナピン酸のアセトニトリル溶液と混合し、20μlの調製済試料を分析用MALDIプレート上に配置した。精製酵素は、MALDI-TOFでは27.8kDaの分子量を示し図7、これは、SDS-PAGEによって得られた29kDaの分子量とほぼ同じであった。実施例50実施例6に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、70~80の回収率で、150~160°Cの入口温度ならびに60~65°Cおよび70~80°C出口温度により、添加剤として10および15マルトデキストリンを用いて噴霧乾燥した。噴霧乾燥したプロテアーゼの安定性を、4°C~37°Cの範囲の温度で調査した。試料を小瓶に分配し、4°C、28°Cおよび37°Cで保存した。各温度でインキュベートした1つの小瓶を定期的に取り出し、残存活性を確認した。噴霧乾燥したプロテアーゼは、試験した全ての温度で、最長25ヶ月760日間安定であり、85~90の活性を保持していた図8aおよび図8b。実施例51本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185の粗製プロテアーゼ、バイオマス濾液およびバイオマスを用いた廃棄X線フィルムからの銀の除去を例示する。1cm×1cmに切断した5gの黒いX線フィルムを蒸留水で洗浄した。これらの断片を、250mlの円錐形のフラスコ中で、50mlの総体積で20uのプロテアーゼの10mM炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9と共に37°Cおよび180rpmでインキュベートした。プロテアーゼを含まない対照も同一条件下でインキュベートした。フィルムからのゼラチン層の剥離が数分以内に始まり、1時間以内に完了した。黒みがかった銀により溶液は黒みがかっているように見え、フィルムは綺麗であり、白色であった図9a。バイオマス濾液を用いた除去のために、微生物を、その組成が麦芽エキス-3、酵母エキス-3、ペプトン-5およびグルコース-101リットル当たりのグラム数であるMGYP液体培地で、200rpmおよび28°Cで振盪しながら24時間増殖させた。4グラムのバイオマス含水重量を、10,000rpmの遠心分離で回収し、50mlの再蒸留水で二回洗浄し、50mlの蒸留水に懸濁し、28°Cおよび180rpmでインキュベートした。2時間後、ワットマンNo.1濾紙で濾過によって濾液を回収した。2グラムの洗浄したX線フィルム2cm×2cmの断片に切断したを、50mlのバイオマス濾液と共に、37°Cおよび200rpmで振盪しながらインキュベートした。バイオマス濾液を含まない対照を同一条件下でインキュベートした。フィルムからのゼラチン層の剥離が数分以内に始まり、1時間以内に完了した。黒みがかった銀により溶液は黒みがかっているように見え、フィルムは綺麗であり、白色であった図9b。バイオマスを用いた除去のために、上記のようなMGYP液体培地で、28°Cおよび200rpmで24時間好気的に真菌を増殖させた。バイオマスを遠心分離で回収し、再蒸留水で二回洗浄した。湿ったバイオマス0.1gを、洗浄したX線フィルム3cm×2cmにペーストとして塗布し、37°Cでインキュベートした。1時間後に、ゼラチン層の完全な除去および綺麗なフィルムの外観が観察された図9c。実施例52本実施例は、絹の精練のための、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼの使用を例示する。絹の撚糸をオーブンに入れて110°Cで3時間または一定の重量に到達するまで乾燥した。1gの乾燥した絹を、実施例3に記載されているように50°Cで1時間断続的に手動で振盪しながら調製した粗製プロテアーゼと共にインキュベートした。精練のために、4種類の異なるプロテアーゼ濃度50~200u/gの絹を使用した。固体:液体の比を1:30に維持した。精練後に、絹繊維を、最初に水道水冷たい洗浄液、次いで、熱い洗浄液65°Cで20分間で洗った。洗浄後、絹を一晩空気乾燥した後、オーブン110~120°Cに入れて2~3時間または一定の重量に到達するまで乾燥し、精練した絹の重量を記録した。最初の重量と最終的な重量との差から、精練後の重量の減少を計算した。精練後の重量の減少は、酵素濃度の増加に伴って増加し、13~22の範囲であった表24。従来どおりに精練した繊維の重量の減少は約24.4であった。得られた繊維は、滑らかな感触および光沢を有していた図10aおよび図10b。走査型電子顕微鏡写真は、繊維の強度特性に影響を与えないセレシンの除去を示した図11aおよび図11b。精練液中の不溶性残留物セリシン除去によるは、プロテアーゼ濃度の増加に伴って増加した図12。実施例53本実施例は、絹の精練および精練液からのセリシンタンパク質/ペプチドの分離のための、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来のプロテアーゼの使用を例示する。4gの絹の撚糸をオーブンに入れて110°Cで3時間または一定の重量に到達するまで乾燥し、実施例3に記載されているように50°Cで1時間断続的に手動で振盪しながら調製した800Uのプロテアーゼと共にインキュベートした。固体:液体の比を1:30に維持した。精練後に、絹繊維を、最初に水道水冷たい洗浄液、次いで、熱い洗浄液65°Cで20分間で洗った。洗浄後、絹を一晩空気乾燥した後、オーブン110~120°Cに入れて2~3時間または一定の重量に到達するまで乾燥し、精練した絹の重量を記録した。精練後の重量の減少は約20であった。精練液DGLからの不溶性セリシン白みがかった残留物を、6000rpmで5分間の遠心分離によって分離した。この不溶性残留物を再蒸留水に懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEに供した。従来の方法121°Cで60分間の加圧滅菌によって得られたセリシンを比較のために含めた。従来の方法によって得られたセリシンではゲル上に筋模様が存在するのに対して、酵素精練の場合には銀染色後に3種類のタンパク質バンドが可視化され、これは、その完全な分解を示していた図13。実施例54本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼを用いたペースト法によるヤギ皮の脱毛プロセスを例示する。実施例6に記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿90飽和に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵ヤギ皮を取り出し、6時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。水漬け重量に基づいて0.5~1.5のプロテアーゼおよび10の水からなるペーストを皮の肉面に塗布し、6時間積み重ねた。10の石灰、3の硫化物および15の水からなるペーストを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。対照の皮も6時間積み重ねた。次いで、対照および実験用の皮を脱毛した。実験用の皮の脱毛有効性は、85~100の範囲であり、これは、化学物質系脱毛プロセスでの脱毛有効性に類似していることが分かった。その毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物系の脱毛によって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、CODおよび硫化物の有意な減少が認められることを示している。実験的プロセスの廃液流のBOD/COD比が0.72であることが分かり、これは、上記廃水の分解性および処理可能性が、BOD/COD比が0.4であった化学プロセス系の廃水と比べて非常に良好であることを示している。実施例55本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼを用いた牛皮の脱毛プロセスを例示する。実施例6に記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿90飽和に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵牛皮を洗浄して、8時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。この皮を、15の水および3~4の酵素を用いてドラムで処理した。150の水、10の石灰および3の硫化ナトリウムを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。実験的プロセスの場合には、1時間ごとに10分間断続的にドラムを稼働させた。6時間の稼動後、毛皮を洗浄した。脱毛は100であった。対照の場合、1時間ごとに5分間断続的に1日中ドラムを稼働させた。翌日、毛皮を脱毛した。脱毛有効性は100であった。実験用の毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物による脱毛プロセスによって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、実験の場合には、0.69のBOD/COD比によりCODおよび硫化物の有意な減少を示し、これは、廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。実施例56本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼを用いたペースト法による羊皮の脱毛プロセスを例示する。実施例6に記載されているようにプロテアーゼを産生した。これを硫酸アンモニウム沈殿90飽和に供し、羊皮の脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵羊皮を洗浄し、5時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。水漬け重量に基づいて0.5~1.5のプロテアーゼおよび10~15の水からなるペーストを調製し、皮の肉面に塗布した。この皮を6時間積み重ねた。10の石灰、3の硫化物および15の水からなるペーストを用いて、化学物質に基づく対照プロセスも行った。対照の皮も6時間積み重ねた。次いで、対照および実験用の皮を脱毛した。実験用の皮の脱毛有効性は、85~100の範囲であり、これは、化学物質系脱毛プロセスでの脱毛有効性に類似していることが分かった。その毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物系の脱毛によって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、CODおよび硫化物の有意な減少が認められることを示している。実験の廃液流のBOD/COD比は0.70であることが分かった。これは、実験からの廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。実施例57本実施例は、コニディオボルスブレフェルディアヌスMTCC-5185由来の粗製プロテアーゼを用いた水牛皮の脱毛プロセスを例示する。実施例6Bに記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿90飽和に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵水牛皮を取り出し、洗浄し、8時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。この皮を、15の水および3~4の酵素を用いてドラムで処理した。150の水、10の石灰および3の硫化ナトリウムを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。実験の場合、1時間ごとに10分間断続的にドラムを稼働させた。6時間の稼動後、毛皮を洗浄した。脱毛は100であった。対照の場合、1時間ごとに5分間断続的に1日中ドラムを稼働させた。翌日、毛皮を脱毛した。脱毛有効性は100であった。実験用の毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物による脱毛プロセスによって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、実験の場合には、0.74のBOD/COD比によりCODおよび硫化物の有意な減少を示し、それは、廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。実施例58本実施例は、洗剤処方へのプロテアーゼの適用について記載する。1枚の白色の布を血液に浸し、空気乾燥した。血液のシミがついた布をそれぞれ0.5gの4つの等しい断片に切断し、4つの異なるペトリ皿に入れた2のホルムアルデヒドに2分間浸し、水で洗い流して、過剰なホルムアルデヒドを除去した。これらの断片を30mlの反応混合物に浸し、異なる条件下で28~30°Cで30分間インキュベートした:a対照水のみ、b洗剤のみ、c粗製プロテアーゼのみ10U、およびd洗剤粗製プロテアーゼ10U。布の断片を水道水で4回洗い流した。洗剤およびプロテアーゼを一緒に使用した場合に、洗浄能力は最高であった。洗剤のみでは凝血塊は除去されなかったが、プロテアーゼ単独で、凝血塊と共に血液のシミを除去することができた図14。本発明の主要な利点は以下のとおりである:1.当該真菌株は、新規な単離株である。2.本発明に記載されている真菌株は、単独またはキチナーゼ、リパーゼ、コンドロイチナーゼおよびケラチナーゼと共に、プロテアーゼを産生することができる。3.これらの酵素混合物は、革、織物、洗剤および食品産業などの多くの産業上の用途を有する。4.プロテアーゼは、皮革工業における事前なめし作業でのその用途について既に評価されている。5.粗製プロテアーゼは、石灰および硫化物などのあらゆる添加化学物質を必要とすることなく動物の皮/生皮を脱毛することができる。6.粗製プロテアーゼ調製物は、幅広い基質特異性を有し、革および洗剤産業での用途で必要とされるように、アルブミン、ヘモグロビン、ゼラチン、ケラチンなどの様々なタンパク質を分解することができる。7.粗製プロテアーゼは、絹の精練に使用することができる。8.セリシンペプチドなどの付加価値産物を、プロテアーゼによる酵素精練後に廃液から分離することができる。"