少なくとも一のニューロピリン媒介性の生物学的活性を阻害することができる抗ニューロピリン1抗体。NRP1のセマフォリンとの相互作用を阻害することができる、請求項1に記載の抗体。NRP1の血管性内皮細胞増殖因子との相互作用を阻害することができる、請求項1に記載の抗体。a1a2ドメイン内のNRP1に結合し、NRP1のVEGFへの結合を遮断することなく、NRP1のセマフォリンへの結合を遮断する、請求項1に記載の抗体。NRP1媒介性の血管新生を阻害することができる、請求項4に記載の抗体。相補性決定領域アミノ酸配列:CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項4に記載の抗体。配列番号:3の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる、請求項6に記載の抗体。CDRアミノ酸配列:CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項4に記載の抗体。配列番号:4の重鎖可変ドメイン配列を含んでなる、請求項8に記載の抗体。配列番号:3の軽鎖可変ドメイン配列と配列番号:4の重鎖可変ドメイン配列を含んでなるYW643抗体である、請求項4に記載の抗体。b1b2ドメイン内のNRP1に結合し、NRP1のセマフォリンへの結合を遮断することなく、NRP1のVEGFへの結合を遮断する、請求項1に記載の抗体。CDRアミノ酸配列:CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項11に記載の抗体。配列番号:5の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる、請求項12に記載の抗体。CDRアミノ酸配列:CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項11に記載の抗体。配列番号:6の重鎖可変ドメイン配列を含んでなる、請求項14に記載の抗体。配列番号:5の軽鎖可変ドメイン配列と配列番号:6の重鎖可変ドメイン配列を含んでなるYW107487抗体である、請求項11に記載の抗体。前記抗体がマウスのNRP1とヒトのNRP1の両方に結合することができる、請求項1に記載の抗体。前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。前記抗体が二重特異性抗体である、請求項1に記載の抗体。前記抗体が合成抗体である、請求項1に記載の抗体。哺乳動物の病理学的血管新生と関係する疾患の治療又は予防のための医薬の製造における請求項1に記載の抗NRP1抗体の使用。前記疾患が癌である、請求項21に記載の使用。前記癌が乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、肝癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、中皮腫及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項22に記載の使用。前記治療が第二治療薬剤を更に含む、請求項23に記載の使用。前記第二治療薬剤が抗血管新生剤、抗腫瘍性組成物、化学療法剤及び細胞障害性剤からなる群から選択される薬剤である、請求項24に記載の使用。前記抗血管新生剤がVEGFアンタゴニストである、請求項25に記載の使用。前記VEGFアンタゴニストが抗hVEGF抗体である、請求項26に記載の方法。前記抗hVEGF抗体が抗体A461と同じVEGFエピトープに結合可能である、請求項27に記載の方法。前記抗hVEGF抗体がベバシズマブ又はラニビズマブである、請求項28に記載の方法。前記第二治療薬剤が、バタラニブ、エルロチニブ、OSI7904、ZD6474、ZD6126、ZD1839、スニチニブ、セマキサニブ、AMG706、AG013736、イマチニブ、MLN518、CEP701、PKC412、ラパチニブ、VELCADE、AZD2171、ソラフェニブ、XL880及びCHIR265からなる群から選択されるレセプターチロシンキナーゼ阻害薬である、請求項24に記載の方法。実施例1抗NRP1抗体の生成A.抗体ファージライブラリの作製ファージにディスプレイされるか又は他の技術を使用してディスプレイされた抗体ライブラリを生成するためには、様々な方法が当分野で公知である。これらのライブラリの利点のうちの1つは、従来のハイブリドーマ技術と比較して、免疫寛容を導入することなくインビトロでの選別及びスクリーニングが可能であるので、異種間の機能的抗体を生成するために非常に適することである。SmithScience22813151317;BradburyandMarksJImmunolMethods2902949。一般的に、2つのタイプの組合せ抗体ライブラリが開発され、元となるレパートリーによって分類された。現在までの大部分のライブラリは、その多様性の供給源として天然のレパートリを用いた天然の抗体ライブラリであり、ナイーブないしは免疫化の動物ないしはヒトの免疫細胞のメッセージRNAとしての遺伝子を増幅し、ファージディスプレイ又は他のディスプレイ技術のためにベクターにクローニングしたものである。天然抗体は通常多数のフレームワークを有しており、可変CDR配列とともに軽鎖ないし重鎖の組換えによってライブラリの多様性を形成したものである。レパートリがライブラリサイズより全体的に大きいので、ライブラリの性能はライブラリの大きさで決まる。一方、合成ライブラリは、多様性が合成DNAによってライブラリ内に設定及び作製されたライブラリの新規の一技術である。単一又は多数のフレームワークが用いられている。単一のフレームワークライブラリでは、多様性は、多様なCDRループを作製するように設定した合成DNAの縮重に単に依存する。ライブラリの多様性設定およびサイズは、ライブラリ性能に重要であり、その性能はライブラリにみられる抗体の親和性によって測定することができる。Knappik等JMolBiol2965786;Sheets等ProcNatlAcadSciUSA9561576162;deHaard等JBiolChem2741821818230。可変重鎖相補性決定領域内の溶媒に露出された位置に合成多様性を導入することによって、Lee等は、単一のヒトフレームワークに構築されるファージディスプレイ合成抗体ライブラリを開発した。Sidhu等JMolBiol338299310;Lee等JMolBiol34010731093;Carter等ProcNatlAcadSciUSA8942854289。このVHライブラリは、二価の抗原結合性フラグメントとしてディスプレイされ、あつらえたコドンを用いてヒト免疫グロブリンに観察される天然の多様性を模倣する。Lee等JImmunolMethods284119132。由来する抗体の親和性及び機能から測定されるようにVHライブラリは十分に機能するが、対象の抗原標的の機能的抗体を生成する際にはライブラリ設定を更に修飾するのが望ましい。オリゴヌクレオチド合成のためのトリヌクレオチドの新しい有効性により、DNA多様性を増やすことなくアミノ酸多様性を増やすことができる。したがって、本明細書中に記述されるように、CDRH3及びCDRL3は抗原結合部位の内球を形成するので、CDRL3内の非常に可変な部位をさらに多様化した新規なVH/VLライブラリが生成される。Mian等JMolBiol217133151。物質及び方法コンセンサスCDRL1、L2、L3、H1及びH2を有するVH/VLナイーブライブラリ鋳型を、CDRH3に停止コドンを有するファジミドpV03504へのオリゴヌクレオチド誘導性突然変異誘発を用いて、M13バクテリオファージ粒子の表面に二価でディスプレイして生成される。Lee等JMolBiol34010731093。CDRL3、H1、H2及びH3内の設定した部位に突然変異を導入してCDRH3停止コドンを修復するように設定した変異原性オリゴヌクレオチドの混合により、既に記載のあるようにMethodsEnzymol204125139、キュンケル突然変異誘発法を用いてファージディスプレイライブラリを構築した。記載のあるように、突然変異誘発反応物を大腸菌SS320細胞に電気穿孔した。結果本明細書中に記載のVH/VLライブラリは、ハーセプチン由来のVLκI及びVHサブグループIIIフレームワークをVHライブラリに用いられるように利用した。このライブラリは、バクテリオファージ上に十分にディスプレイされ、大腸菌内で十分に発現され、哺乳動物細胞で十分に発現する完全長IgGに迅速に変換されうることが示されている。Lee等JMolBiol34010731093;Carter等ProcNatlAcadSciUSA8942854289。ファージコートタンパク質P3に融合させることによって、ライブラリが二価のFabとしてファージ表面にディスプレイされる。この二価のディスプレイは、固定した抗原に対する見かけの結合親和性を増し、ほとんどない又は低い親和性ファージ抗体クローンの回復の改善を促すためのものであった。VHライブラリの軽鎖に維持されるハーセプチン由来のCDR配列から受け継がれる潜在的バイアスを回避するために、コンセンサスκICDR配列を、VH/VLライブラリの鋳型に導入した。天然のヒト抗体に存在する最も一般的なアミノ酸を選択することによって、コンセンサスCDR残基を決定する。3つすべてのCDR内での突然変異誘発を確認するためにVHライブラリの重鎖に既に用いた停止コドンを、CDRH1及びCDRH2のコンセンサスサブグループIII配列と同様に置換した。コンセンサスCDR配列は、各位置での最も一般的なアミノ酸を表す。CDRH3は抗原認識において顕著な役割を果たすので、いくつかの停止コドンをH3に配置して、ライブラリからの機能的抗体クローンが互いに異なることを確認した。Xu等Immunity133745。ヒトのコンセンサスCDR配列の存在により、部分的に変異した変異体のディスプレイと潜在的な結合での機能の維持が可能になることが予測された。この方法では、VH/VL設定は、ライブラリの機能的ファージ抗体クローンの比率を増やすという利点がある。表Iに示すように、使用するCDR配列は、CDRL1ではSISSYL、CDRL2ではGASSRA、CDRL3ではYYSSPL、CDRH1ではFTFSSYAMS、及びCDRH2ではRISPSGGSTY、及びCDRH3ではWXXXRPXXMDYである。また、ヒト抗体における各々の位置の保持率も表Iに示す。VH/VLライブラリの多様性は、天然の抗体配列の中での溶媒曝露の高さ及び/又は特に高い変異性に基づいてCDR位置のサブセットに導入した。導入された突然変異誘発及び多様性のために選択される位置を表IIに示す。例えば、CDRH1では、位置27、28、30、31、32、33及び34を選択して多様化した。VH/VLライブラリ設定のために、最も一般的なアミノ酸が表されるように、変性オリゴコドン又はトリヌクレオチドを用いて各々の位置に多様性を導いた。例えばCDRH1では、セリンはおよそ50の天然の多様性を表すので、およそ52のセリン及び2.5のシステイン以外の他のアミノ酸を有するトリヌクレオチドの混合物を用いた。CDRH3及びCDRL3は抗原結合部位の中心を形成するので、構造的に公知の抗体抗原複合体において最も高い頻度で抗原接触を示す。Chothia等Nature342877883。最も高い変異性を有するCDRL3の5つの残基をランダム化した。全体のCDRH3は、長さ、配列及び構造に関して最も多様で、天然の抗体の多様性の重要な成分である。XuandDavisImmunity133745;Wu等Proteins1617。したがって、12のサブライブラリは、9から20のアミノ酸範囲の異なる長さのCDRH3により構築した。加えて、これらのサブライブラリは、天然の抗体のおよそ90のCDRH3長変化を含む。CDRH3をコードするオリゴヌクレオチドは、トリヌクレオチドコドンを用いて合成した。これにより、我々は容易に、システインを欠失させて、CDRH3の最も多い残基であるグリシン、チロシン及びセリンのレベルを上げることができる。Mian等JMolBiol217133151。それぞれおよそ15.6のセリン、チロシン及びグリシンのトリヌクレオチド混合物であるコドンX7は、それぞれ3.1のシステイン以外の残りのアミノ酸とともに、CDRH3内のそれぞれの位置に用いた。また、トリヌクレオチドの異なる組み合わせを、CDRH1、H2、H3及びL3の選択された位置に用いた。表II及び補足の表Iに示すように、コドンX1からX6には、高い割合でセリン、チロシン又はグリシンが存在する。X1は52.5のセリンを有し、X2は52.5のチロシンを有し、X3は10のチロシン、グリシン又はセリンを有し、X4は28.8のグリシンを有し、X5は19.2のチロシン、グリシン又はセリンを有し、X6は20のチロシン又はセリンを有する。VH/VL抗体ファージライブラリはおよそ1010の変異体をディスプレイしたと推定される。表I.VH/VLライブラリの鋳型におけるCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及びCDRH2のコンセンサス配列。コンセンサスCDR残基は、天然のヒト抗体に存在する最も一般的なアミノ酸を選択することによって決定する。所定の位置のヒト抗体における各残基の保持率を、およそ1600のヒト軽鎖配列のアラインメントとカバットデータベースJBiolChem25266096616における3500のヒト重鎖配列から算出される。表II.VH/VLライブラリのためのCDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3の設定された多様性。CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3のランダム化のために選択されるCDR位置を、ライブラリ鋳型中のコンセンサス残基とともに挙げる。それぞれの位置でコードされるアミノ酸の種類の割合がデータベースで見られるアミノ酸の種類に近いか50より高くなるように、設定した多様性は、トリヌクレオチドコドンの混合によってコードされるシステイン以外の19アミノ酸コドンであるか、又はあつらえた縮重コドンによってコードされる残基群である。特定の位置について、システイン以外の19アミノ酸のすべては、Tyr、Gly及びSerに対して異なるバイアスを有するトリヌクレオチドコドン混合物を用いて導入される。B.ファージ由来のモノクローナル抗NRP1抗体の生成材料及び方法抗NRP1抗体を同定するためのライブラリ分類及びスクリーニング-ヒト及びマウスのNRP1コンストラクトを、哺乳類の発現ベクターにクローニングして、CHO細胞において発現させた。NRP1の切断型であるa1a2及びb1b2ドメインをバキュロウイルスにおいて発現させた。NUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを標的抗原にて4°Cで終夜コートして、ファージ遮断バッファPBSTにて室温で1時間かけて遮断した。抗体ファージライブラリを抗原プレートに加え、RTで終夜インキュベートした。翌日、抗原コートプレートをPBTにて10回洗浄し、結合したファージを50mMHCl及び500mMNaClにて30分間かけて溶出し、等量の1Mトリス塩基pH7.5にて中和した。回収したファージを大腸菌XL1ブルー細胞中で増幅させた。その後の選別ラウンドの間、抗原コートプレートとの抗体ファージのインキュベートを2~3時間に短縮し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に上げた。抗NRP1抗体結合親和性、特異性及びフローサイトメトリー分析-記述されるように競合的ファージ結合ELISAを用いて、ファージ抗体IC50値を決定した。Lee等JMolBiol34010731093。競合曲線を4パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラムにあてはめて、ファージディスプレイ抗体の固定抗原への結合が50阻害される溶液結合段階での抗原の濃度として算出されるIC50値を決定した。次いで、個々のクローンのVL領域及びVH領域をそれぞれLPG3ベクター及びLPG4ベクターにクローニングすることによって対象とするクローンをIgGに再形成させProcNatlAcadSciUSA8942854289、過渡的に哺乳動物細胞中で発現させ、プロテインAカラムにて精製した。抗NRP1IgGの結合親和性決定のために、BIAcoreTM3000計測器による表面プラズモン共鳴測定値を用いた。抗NRP1IgGを、およそ500反応単位に達成するように活性化したCM5バイオセンサーチップにカップリングして、その後1Mエタノールアミンにて反応していない基を遮断した。動態学的測定値のために、ニューロピリンの2倍階段希釈液を、30μl/分の流速で25°CのPBSTバッファに注入した。会合速度と解離速度は、単一の1対1ラングミュア結合モデルを用いて算出した。平衡解離定数を比率koff/konとして算出した。結合特異性試験のために、10μg/mlのIgGを含むPBSTバッファを2μg/mlの抗原コート96ウェルMaxisorpプレートとともに少なくとも1時間インキュベートして、プレートをPBTバッファにて洗浄した。結合した抗体を抗ヒト抗体HRPコンジュゲートにて検出し、およそ5分間、TMB基質にて反応させ、1MH3PO4にて反応を止め、450nmを分光測定で読み取った。フローサイトメトリー分析のために、HUVEC細胞を、細胞解離バッファにて組織培養フラスコから分離した。解離した細胞をPBSで洗浄して、2胎仔ウシ血清を含有するPBSに再懸濁した。細胞を、10μg/mlの抗NRP1抗体又はコントロール抗体を含むFACSバッファにて氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSにて2回洗浄して、Fc特異的抗体であるPEFab2ヤギ抗ヒトIgGを含むFACSバッファにて氷上で30分間かけて染色した。2回のPBS洗浄後、細胞を200μlのFACSバッファに再懸濁して、CellQuestソフトウェアを用いたフローサイトメトリーにて分析した。結果第1ラウンドの選別では、固定したCHO細胞発現のhNRP1Fcタンパク質に対して、12のVH/VLサブライブラリを個々にパンした。各々のサブライブラリから溶出されたファージを増幅させて、第2ラウンドの選別のために組み合わせた。hNRP1Fcを抗原として用いたので、抗Fcファージ抗体の回復を最小限にするために、第1ラウンドのパニングの後に、プールしたファージを過剰な無関係なFc融合タンパク質にて吸収した。第4ラウンドのパニングの後、95のランダムに選択したファージクローンを、NRP1に特異的に結合する能力について評価した。90のクローンはhNRP1結合についてポジティブであり、40のポジティブクローンはヒトとマウス両方のNRP1を結合した。これらのファージクローンを配列決定し、10の異なるクローンを更なる特徴付けのために選択した。すべてが、ファージELISAにおいて70nM未満のIC50でヒト及びマウス両方のNRP1を結合した。クローンYW643はそれぞれ0.5及び3.4nMのIC50でヒト及びマウスのNRP1を結合した。10のクローンの配列は、長さが異なるCDRH3とCDRH1、H2及びL3の全体にわたって分散する様々な変異を有するが、ライブラリ鋳型のいくつかのコンセンサスCDR配列が保持されているVH/VLライブラリデザインであることを表す。クローン64.3及び64.29は、4つすべてのCDRに変異を有し、また、ヒト及びマウス両方のNRP1に対して最も良い結合親和性を有する。表III.部分的なCDR配列と抗NRP1抗体に対する結合親和性。VH/VLライブラリから初めに同定された11の異なるファージクローンのランダム化した位置のCDRアミノ酸配列のみを示す。hNRP1及びmNRP1に対するIC50値としての親和性を競合的ファージELISAにより測定した。hNRP1のドメイン切断型変異体を用いて、クローンのための結合エピトープを同定し、すべてをhNRP1のa1a2ドメインにマップした。NRP1のb1b2ドメインに結合して潜在的にVEGFの結合を遮断するファージ抗体を選択するために、V発明者等は、固定された抗原としてバキュロウイルス発現hNRP1Hisを用いた新規なパニング方法を開発した。4ラウンドの選別の後、ヒト及びマウス両方のNRP1を結合した唯一の特有クローンであったYW1074が同定された。ファージELISAにおいて、YW1074は6及び38nMのIC50でヒト及びマウスのNRP1に結合した。選択された抗NRP1IgGの特徴づけ-表IIIから選択した抗NRP1クローンを、完全長ヒトIgG1に再フォーマットし、CHO細胞において発現させ、更なる特徴付けのために精製した。抗NRP1ファージ抗体であるYW643及びYW1074はヒト及びマウスのNRP1に特異的に結合したが、ヒト又はマウスのNRP2、ErbB2ECD又はBSAには結合しなかった。図1A。他の8つのファージ抗体それぞれは類似の特異性を示した。表面プラスモン共鳴によって、固定されたYW643及びYW1074IgGは、500nMまでの濃度ではこれらの抗原と相互作用しなかった。しかしながら、YW643及びYW1074はそれぞれ、0.9及び5nMのKdでヒトNRP1を結合すると同時に、7.8及び11nMのKdでマウスNRP1を結合した。これらの抗体はプレート固定の抗原を用いて選択されたが、FACS分析により、すべての精製したIgGが内生的にhNRP1を発現するHUVEC細胞にも結合したことが示された。C.抗NRP1抗体の親和性成熟YW1074はそれぞれ6及び38nMのファージIC50でヒト及びマウスのNRP1のb1b2ドメインに結合した。インビボの力価を向上させるために、このクローンをヒトのNRP1Hisを用いて親和性成熟した。物質及び方法クローンYW1074の親和性成熟のためのライブラリ鋳型を生成するために、まず親のファジミドのGCN4ロイシンジッパーをキュンケル突然変異誘発を用いて取り除き、一価性ディスプレイFab形式を提供した。停止コドンはCDRL3に組み込んだ。親和性成熟にソフトランダム化を用いた。これにより、野生型ヌクレオチドを成す塩基の70101010混合物による変異原性DNA合成によって選択した位置におよそ50の変異率がもたらされる。Gallop等JMedChem3712331251。CDRループの組み合わせである、L1/L2/L3、L3/H1/H2及びL3/H3ランダム化を有する3つの異なるライブラリは、CDRL1の位置2832、CDRL2の位置50及び5355、CDRL3の位置91、92、93、94及び96、CDRH1の位置2835、CDRH2の位置5058及びCDRH3の位置95100の選択された残基をソフトランダム化することによって生成された。親和性成熟されたクローンを選択するために、記述されるように、ファージライブラリは第1ラウンドでプレート分類を行い、その後溶液段階分類を4ラウンド行った。Lee等JMolBiol34010731093。プレート分類の第1ラウンドで、hNRP1コートプレートに3つのライブラリを別々に加えて37°Cに1時間おいた。その後、4ラウンドの溶液相分類を行い、以下のようにストリンジェンシーを上げながら親和性ベースの選別の効率を上げた:ラウンド2、ラウンド3、ラウンド4、及びラウンド5。選択工程の間、ビオチン化hNRP1を含まない反応を含め、各ラウンドのパニングの濃縮を算出するためのバックグラウンドファージ結合とした。5ラウンドのパニングの後、記述されるように、ハイスループット単一ポイント競合的ファージELISAを用いて高親和性クローンを迅速にスクリーニングした。Sidhu等JMolBiol338299310。hNRP1の非存在下での吸光度に対して5nMhNRP1の存在下での450nmの吸光度の比率が低いクローンを更なる特徴付けのために選択した。結果3つの異なるCDRの組合せであるL1/L2/L3、L3/H1/H2及びL3/H3を、選択した位置が回数の50パーセントだけ変異するように、野生型配列バイアスを維持するソフトランダム化方策を用いたランダム化のターゲットとした。Gallop等JMedChem3712331251。親和性成熟のために、二価性Fabよりむしろ一価性Fabをファージ上にディスプレイさせて、選別の間、結合活性を低減した。各サブライブラリのCDRL3に停止コドンを導入した。既に相対的に高い会合速度定数を有するが、解離速度定数は相対的に早いので、解離速度選別方策を行って、YW1074の親和性を改善した。選別の第1ラウンドでは、3つすべてのCDRソフトランダム化ライブラリを固定したhNRP1に対してパンした後に、溶液相分類方策によるラウンドを行い、標的濃度を限定して親和性ベースの選別を高めた。ビオチン化hNRP1の濃度は、5nMから0.5nMまで徐々に下げ、500倍の過剰な非ビオチン化hNRP1を加えて早い解離速度の結合体と競合させた。また、混合物を37°Cで最高2時間インキュベートした。L1/L2/L3ライブラリはラウンド5の後に有意な濃縮を示した。96のクローンをランダムに選別し、配列決定して親和性分類した。23の異なるファージクローンを選別して、更なる特徴付けのために精製した。ファージ競合ELISAによって決定されるように、ほとんどのクローンはhNRP1に対する親和性を向上させた。驚くべきことに、選択工程を省いたのにもかかわらずmNRP1に対する親和性も改善された。これは、クローンが保存されたエピトープに結合したことを示唆する。選択されたクローンには、3つの軽鎖CDRに4~7つの変化があった。CDRL1の位置28及び30はそれぞれ、チロシン及びヒスチジンに置換される傾向があるのに対して、CDRL3の位置92、93及び96はより多様であった。ヒト及びマウスのNRP1に対して最も高い親和性を有するクローンを再フォーマットして、完全長抗体として発現させた。6つすべてのIgGは、hNRP1に対する親和性を向上し、VEGFA結合の完全な遮断を維持した。ヒト及びマウスのNRP1に対する親和性は0.4から1.8nMまで変動した。YW107487の解離速度定数を改善すると、ヒト及びマウスのNRP1に対する親和性が最終的におよそ10倍改善したのに対して、ヒト又はマウスのNRP2に対する結合は観察されなかった。また、YW107487も細胞表面NRP1への結合の改善を示した。表IV.CDR配列と親和性改善されたYW1074クローンに対する結合親和性。ランダム化された軽鎖CDR位置の親和性成熟されたYW1074クローンの推定されるアミノ酸配列を示す。競合ファージELISAのhNRP1及びmNRP1に対する個々のクローンのFabファージIC50値を用いて、親和性改善をYW1074と比較した。表V.25°Cの抗NRP1IgGの結合動力学解析。抗NRP1IgGの結合親和性を、hNRP1又はmNRP1の希釈物を25°Cで流し通すIgG固定バイオセンサーチップを用いたBIAcore3000測定器にて測定した。各測定値はKdおよそ±25の誤差を有する。実施例2抗NRP1抗体の生物学的活性YW643及びYW107487の抗体配列を図3に示す。本出願では、抗NRP1抗体活性の以下の記載において、YW643と抗NRPAは交換可能に用いられ、YW107487と抗NRPBは交換可能に用いられる。物質及び方法細胞培養HUVEC、HUAEC、及びHMVECはCambrexから購入し、EGM2培地にて培養した。細胞及び組織培養物を5CO2、95の湿度恒温器中で37°Cで維持した。DRG及び海馬崩壊アッセイマウスE125DRGからの軸索上の崩壊アッセイは、HeandTessierLavigneCell90739751に記載されるように行った。簡単に言うと、DRG外植片を、ラミニンコート8チャンバスライドに播き、50ng/mlのNGFを含むN3F12培地中で5CO2、95の湿度恒温器にて37°Cで培養した。ヒトのセマフォリン3Aを、C末端ヘキサヒスチジン融合タグを有する真核生物発現ベクターpRK5にクローニングした。タンパク質をCHO細胞中で過渡的に発現させ、NiNTA親和性クロマトグラフィにて精製した。N末端配列決定を用いて、クーマシー染色したSDSPAGEゲル上で90kDaのバンドとしてタンパク質を可視にて確認した。インヒビターの存在下及び非存在下において8ng/ml以下の精製したSema3Aを加え、外植片を37°Cで30分間インキュベートして崩壊を誘導した。視覚化のために、成長円錐を、4PFA及び15スクロースに固定して、1:40のローダミンファロイジンを含むPBSにて30分間染色して、その後洗浄してFluoromountGにてマウントした。海馬崩壊アッセイを行うために、E17マウス脳を、冷却PBSにて解剖し、組織チョッパーを用いて250μm厚に水平方向にスライスした。細いタングステン針を用いて海馬の選択した切片から、さらに歯状回を切り出した。外植片を、ラミニンコート8チャンバスライドに播き、B27を添加した神経基礎培地中で37°Cで終夜培養した。崩壊を誘導するために、外植片を、mock形質移入COS細胞又はSema3F形質移入COS細胞調製培地の存在下にて、コントロール又は抗NRP1抗体とともに37°Cで30分間インキュベートした。細胞移動アッセイ細胞移動アッセイは、8μm孔径ファルコン24-マルチウェル挿入システムを有する変更ボイデンチャンバアッセイを用いて行った。プレートは、上下両方のチャンバ中で、37°Cで16時間かけて8μg/mlのラミニンにて予めコートした。HUVECは、トリプシンにて回収し、計数して、遠心分離して、5×105細胞個/mlの濃度で、0.1BSAを含むEBM2に再懸濁した。100μl細胞をトランスウェルシステムの上部チャンバに加えた。インヒビターを細胞を含む上部チャンバに加えた直後に、0.1BSAを含む500μlのEBM2を含む下部チャンバに刺激を加えた。次いでプレートを37°Cに終夜置いた。アッセイを止めるために、膜の上部面上の細胞はスポンジ綿を用いて取り除き、下部面上の細胞はメタノールにて固定して、Cytoxグリーンにて染色した。膜の下部面上に移動した細胞の数はAxiPhot蛍光顕微鏡を用いて計数し、結果を、ImageJプログラムにて分析した。ビーズ成長アッセイデキストランコートCytodex3マイクロキャリアビーズを、1mlのEGM2培地中でビーズ当たり400細胞の濃度のサブ集密的なHUVECとともに、20分ごとにゆっくりと撹拌しながら5CO2恒温器にて37°Cで4時間インキュベートした。次いで、ビーズを25cm2組織培養フラスコに移し、5mlのEGM2中で37°Cで12~16時間インキュベートした。次いで、HUVECコートビーズを1mlのEGM2にて3回洗浄し、200ビーズ/mlの密度で、2.5μg/mlのフィブリノーゲンを含むPBSに再懸濁した。0.5mlのフィブリノーゲン/ビーズ溶液を、0.625単位のトロンビンを含有する24ウェル組織培養プレートの1ウェルに移して、凝固を誘導した。フィブリノーゲン/ビーズ溶液は、室温で5分間インキュベートした後、5CO2恒温器にて37°Cで20分間インキュベートした。凝固が完了した後、1mlのEGM2を各ウェルに加え、凝血塊を37°Cで30分間かけて平衡化した。培地を取り除き、EGM2培地中に2000/mlの濃度の皮膚線維芽細胞1mlを凝固塊の上に播いた。次いで、異なる抗体を各ウェルに加え、2~3日ごとに培地を交換しながら8日間アッセイをモニターした。ビーズの10×分解画像は倒立顕微鏡にてキャプチャーし、100、200及び300μmの間隔の同心円を各画像のビーズ周辺でデジタル的に描画した。各々の線を越えている脈管の数を計数し、各距離と条件の平均を得た。FACS分析集密的なHUVECを、5CO2恒温器において10μg/mlのコントロール又は抗NRP1抗体とともに37°Cで、5分、2時間又は20時間インキュベートした。細胞を、酵素を含まない細胞解離バッファにて回収して、等量のFACSバッファにて中和して、ウェル当たりの500000細胞でプロ結合U底96ウェルアッセイプレートに移した。細胞ペレットを2k回転数/分で遠心分離して回収し、好適なビオチン化抗体を1100で含有する25μlの染色バッファに再懸濁して、4°Cで2時間インキュベートした。抗体は、FluoReporterminibiotinxxタンパク質標識キットを用いてビオチン化した。次いで、細胞をFACSバッファにて2回洗浄して、11000のストレプトアビジンPEを含有する25μlのFACSバッファにてインキュベートした。最後に、細胞を洗浄して、FACSバッファに再懸濁して、FacsCaliburシステムにて分析した。細胞接着アッセイサブ集密的なHUVECを、コントロール又は抗NRP1抗体を含む100μlのメディウム199にて37°Cで30分間かけて予めインキュベートし、次いで、1μg/mlのフイブロネクチンにてコートしたNUNCmaxisorp平底96ウェルプレートに1ウェル当たり10000細胞を播いた。プレートを、140gで1分間遠心して基質と細胞の萎縮を同期させ、37°Cで30分間インキュベートした。次いで、プレートをPBSにて3回洗浄し、-80°Cで2時間かけて凍結した。細胞密度はCyQuantキットにより決定した。マウス新生仔網膜血管アッセイ新生仔CD1マウスに、10mg/kgの濃度の異なる抗体を腹腔内投与した。出生後5日に試験するために出生後1日目及び3日目に、P8に試験するために1、3及び5日目に注射した。眼を採取し、4PFAのPBSにて4°Cで16時間かけて固定し、その後PBS洗浄を行った。切開した網膜は10マウス血清を含むPBStにて3時間かけてブロックし、次いでビオチン化したイソレクチンB425μg/mlを含むPBLECとともに4°Cで終夜インキュベートした。次いで、網膜をPBStにて4回洗浄し、Alexa488ストレプトアビジンとともに4°Cで終夜インキュベートした。染色が完了したあと、網膜をPBStにて4回洗浄し、その後4PFAのPBSにて固定して、PBSにてさらに4回洗浄した。平らにマウントした網膜の画像は、共焦点蛍光顕微鏡法によってキャプチャーした。マウス皮膚脈管透過性アッセイ5~7週齢のC57BL6J雌マウスに、150μlの0.5エヴァンブルー溶液を静脈内注入した。動物の背部及び脇側の領域を剃り、首から下と臀部より上の体毛を取り除き、剃った領域を4つの注射領域に分割した。エヴァンブルー注射の1時間後に、抗体を含む場合又は含まない場合のBSA又はhVEGFを含有する20μlのPBSを4つの領域のうちのいずれか1つに皮下注射した。皮下注射の1時間後に、動物を屠殺し、4つの領域を含む皮膚を切り出した。皮膚のデジタル画像を得た。8mmの皮膚生検穿孔を用いて注射部位上の同じ領域の皮膚試料を切り出し、皮膚試料をホルムアミド溶液中で55°Cで48時間インキュベートし、エヴァンブルー染色を組織から抽出した。次いで、分光計によって605nmの溶液の吸光度を測定した。細胞増殖アッセイ細胞増殖ELISAキットにて細胞増殖を分析した。一時的に、90の集密的なHUVECを回収して、アッセイ培地に再懸濁し、1のゼラチンでプレコートした黒色96ウェル組織培養プレートに1ウェルにつき3000の細胞で播いた。細胞は、16時間、37°Cでインキュベートし、新鮮なアッセイ培地と交換して、さらに8時間インキュベートした。VEGF及び異なる抗体を培養物に加え、細胞20時間インキュベートした。BrdU標識溶液は10mMの終濃度で加え、細胞は37°Cでさらに24時間インキュベートした。BrdU取込みを、化学ルミネセンス免疫検定で測定した。VEGFR2リン酸化アッセイ総VEGFR2及びホスホVEGFR2は、DuoSet集積回路ELISAキットで決定した。簡単に言うと、サブ集密的なHUVECをPBSにてすすぎ、提供された溶解緩衝液に溶解した。細胞溶解物は4°Cで5分間の14kgで遠心分離し、上清をきれいなチューブへ移した。その後ELISAアッセイを行った。イムノブロッティング集密的なHUVECを0.2のFBS及び0.1のBSAを有するEBM2にて16時間飢餓状態にし、0.1のBSAを有するEMB2に交換し、その後37°Cで90分のインキュベートした。コントロール及び抗NRP1抗体を50μg/mlで加え、細胞を37°Cで30分間インキュベートした。細胞は、37°Cで10分間かけてVEGFにて刺激し、氷冷PBSにて2回洗浄し、溶解緩衝液を含有している20mMのトリス7.5、150mMNaCl、1トリトンX100、ホスファターゼインヒビター反応混液I及びII及び完全なプロテアーゼインヒビター錠剤に溶解した。溶解物の一定量を4-20NovexトリスGlycineSDSゲルにて電気泳動し、InvitrolonPVDF膜に電気的に移した。この試験で用いた一次抗体は抗Erk、抗リン酸Erk、抗Akt、抗リン酸Akt、抗p38、抗リン酸p38、抗Src及び抗リン酸Srcであった。