"LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させた、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すことを特徴とする高脂血症モデルブタ。高コレステロール血症が、LDLコレステロール及びVLDLコレステロールの濃度がコントロールと比べて高いことを特徴とする、請求項1に記載の高脂血症モデルブタ。高コレステロール血症が、IIb型遺伝性高脂血症であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の高脂血症モデルブタ。採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、LDLR遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核を注入することで得られる体細胞核移植クローン動物又はその子孫であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の高脂血症モデルブタ。LDLR遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核が、LDLR遺伝子エクソン4の一部をネオマイシン耐性遺伝子で置換したブタ体細胞核であることを特徴とする、請求項4に記載の高脂血症モデルブタ。体細胞核移植クローン動物の子孫が、体外受精及び人工授精の手法を組み合わせて作製されたことを特徴とする、請求項4又は5に記載の高脂血症モデルブタ。請求項1~6のいずれか1項に記載の高脂血症モデルブタに由来するブタ臓器又は細胞。以下の工程a~cを備えたことを特徴とする、高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法。a請求項1~6のいずれか1項に記載のLDLR遺伝子ノックアウトブタ又はLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程;b工程aの被検対象のLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程;c工程bにおいてLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程;LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタを、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法。本発明の課題は、ヒト高脂血症の病態を十分に再現することができる高脂血症モデル動物を提供することや、かかる高脂血症モデル動物を利用した高脂血症治療予防薬のスクリーニング方法を提供することにある。発明者らは、体が大きく寿命が長い、雑食の動物としてブタに着目し、LDLR遺伝子ノックアウトクローンブタを作製し、血漿中コレステロール画分及び中性脂肪画分の組成を調べた。LDLR遺伝子ノックアウトマウスが通常食では高脂血症を示さないことから、LDLR遺伝子の単独ノックアウトでは、通常食では高脂血症を示さないだろうという予測に反して、LDLR遺伝子ノックアウトブタは通常食でも高脂血症の症状を示した。また、血漿中コレステロール画分の組成VLDL、LDL、HDLにおいて、ヒトの家族性高脂血症を十分に再現し得たことから、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタは従来のげっ歯類等の高脂血症モデル動物よりも優れた高脂血症モデル動物であるという確証を得て、本発明を完成するに至った。本発明は、プライムテック株式会社及び独立行政法人農業生物資源研究所の共同研究の成果である。すなわち、本発明は1LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させた、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すことを特徴とする高脂血症モデルブタや、2高コレステロール血症が、LDLコレステロール及びVLDLコレステロールの濃度がコントロールと比べて高いことを特徴とする、前記1に記載の高脂血症モデルブタや、3高コレステロール血症が、IIb型遺伝性高脂血症であることを特徴とする、前記1又は2に記載の高脂血症モデルブタに関する。また、本発明は4採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、LDLR遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核を注入することで得られる体細胞核移植クローン動物又はその子孫であることを特徴とする、前記1~3のいずれか1つに記載の高脂血症モデルブタや、5LDLR遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核が、LDLR遺伝子エクソン4の一部をネオマイシン耐性遺伝子で置換したブタ体細胞核であることを特徴とする、前記4に記載の高脂血症モデルブタや、6体細胞核移植クローン動物の子孫が、体外受精及び人工授精の手法を組み合わせて作製されたことを特徴とする、前記4又は5に記載の高脂血症モデルブタや、7前記1~6のいずれか1つに記載の高脂血症モデルブタに由来するブタ臓器又は細胞に関する。また、本発明は8a前記1~6のいずれか1つに記載のLDLR遺伝子ノックアウトブタ又はLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程;b工程aの被検対象のLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程;c工程bにおいてLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程;の工程a~cを備えたことを特徴とする、高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法や、9LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタを、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法に関する。本発明によれば、LDLR遺伝子ノックアウトブタ及びその子孫を提供することができ、高脂血症モデルブタとして使用することができる。また、かかるLDLR遺伝子ノックアウトブタを用いた高脂血症治療薬や予防薬のスクリーニング方法を提供することもできる。本発明の高脂血症モデルブタとしては、LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたトランスジェニックブタであって、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すLDLR遺伝子ノックアウトブタ又はその子孫であればよく、ブタの性別、年齢、品種も特に制限されない。本明細書において単に高脂血症モデルブタもしくはLDLR遺伝子ノックアウトブタといった場合、これらの後代の子孫をも含む。本発明においてコントロールとは、普通食、すなわち一般的脂肪含量の通常飼料を与えられた野生遺伝子型のブタ等の、高脂血症を発症していないブタにおける測定値をいう。普通食通常飼料は、市販品を購入することができ、この通常飼料における一般的脂肪含量としては脂肪含量2~5を挙げることができる。ブタLDLR遺伝子としては、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation等のデータベースにおいてGeneID:396801として登録されており、またGenBankからアクセッション番号NC0104443、バージョンGI347618792としてDNA配列を取得することも、そのmRNA配列やアミノ酸配列等の情報を入手することもできる。また、これらの配列に基き、DNAやアミノ酸の性質ならびにタンパク質ドメイン構造の類似性等を指標に、別のデータベースを用いて適宜LDLR遺伝子のDNA配列やアミノ酸配列を入手することも、ブタの異なる品種のLDLR遺伝子を同定することも、エクソン構造やSNP一塩基多型等の各種情報を得ることもできる。本発明においてLDLR遺伝子としては、前記GeneID:396801の他、タンパク質のドメイン構造や先行文献からLDLR遺伝子として認められる遺伝子を挙げることができる。本発明においてLDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる方法としては特に制限されず、ゲノム上のブタLDLR遺伝子のプロモーター等の制御配列又はLDLR遺伝子の一部又は全部を、欠失あるいは別のDNA配列で置換することにより、LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を可逆的又は非可逆的に抑制する方法を挙げることができ、それにより、機能的なLDLR遺伝子の発現を抑制又は阻害することや、野生型よりも機能が低い又は野生型のドミナントネガティブ型変異体LDLRタンパク質を発現させること等の効果を得ることができ、LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させることができる。これらは複数を組み合わせて用いてもよく、LDLR遺伝子の一部を薬剤耐性遺伝子と置換する方法を好適に例示することができ、かかる遺伝子変異はホモ型であっても、ヘテロ型であってもよい。LDLR遺伝子の全部又は一部の機能の欠失は、LDLRタンパク質の発現や、細胞や組織におけるLDLRタンパク質の局在、LDLのエンドサイトーシス等を調べるにより、評価することができる。LDLRタンパク質の発現は、LDLR遺伝子のmRNAの発現を定量PCR法、リアルタイムPCR法等の常法により調べることができ、LDLR遺伝子のmRNAの複数箇所の領域についてmRNA量を調べることが好ましい。かかる方法に使用するプライマーやプローブは、LDLR遺伝子のDNA配列に基いて適宜設計して作製することも、市販品を入手することもできる。また、LDLRタンパク質の発現を抗LDLR抗体を用いて検出することもでき、ウェスタンブロッティング法やELISA法等の分子生物学的常法により調べることができる。抗LDLR抗体は、ブタLDLRタンパク質を認識できればよく、ブタLDLR遺伝子のアミノ酸配列に基いてペプチドを設計し抗体を作成することも、市販品を入手することもできる。LDLRタンパク質の局在は、細胞や組織を用いて、抗LDLR抗体を用いた蛍光免疫染色や免疫組織染色等の観察用サンプルを作製し、細胞や組織におけるLDLRタンパク質の局在を共焦点蛍光顕微鏡等で観察する等の分子生物学的常法により調べることができる。LDLのエンドサイトーシスは、細胞や組織等を4°Cに保って蛍光標識したLDLを添加し、細胞表面上のLDLRに蛍光標識LDLを結合させてから細胞や組織等を37°Cにすることによりエンドサイトーシスを開始させ、LDLRや蛍光標識LDLの細胞内への取り込みを、蛍光顕微鏡で観察する等の分子生物学的常法により調べることができる。また、前記のLDLRやLDLのリアルタイムでの振る舞いを、タイムラプス機能を備えた共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察することもできる。前記のLDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる遺伝子変異は、ゲノムDNAに遺伝子変異を有する体細胞核を、除核した未受精卵にインジェクションして、体細胞クローンブタを作製することも、受精卵の核内ゲノムDNAにおいて遺伝子変異を引き起こして、トランスジェニックブタを作製することもでき、体細胞クローンブタを作製する方法を好適に例示することができる。これらの体細胞クローンブタやトランスジェニックブタを用いて後代を得ることができ、その際に通常の交配の他、体外受精や人工授精等の手段を用いることもできる。相同組み換えが起こったゲノムDNAからは、標的遺伝子の野生型タンパク質は発現せず、前記標的遺伝子の機能は損なわれると考えられる。前記ゲノム上のブタLDLR遺伝子のプロモーター等の制御配列又はLDLR遺伝子の改変は、遺伝子ターゲッティング法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ法等を用いて行うことができ、その確認はサザンブロット解析やPCR反応、制限酵素反応、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼによる処理や電気泳動法等の遺伝子工学的常法を用いて行うことができる。遺伝子ターゲッティング法は、細胞内にターゲッティングベクターDNAを導入し、ゲノムDNAとターゲッティングベクターDNAとの相同組み換えにより、標的遺伝子の一部の配列を耐性遺伝子等の配列に置換して正常な標的遺伝子配列を破壊するとともに、かかる耐性遺伝子の機能を指標に相同組み換え体を検出する方法である。ターゲッティングベクターはゲノム上の標的遺伝子における標的部位の5’末端側のDNA配列5’側相同領域と、薬剤耐性遺伝子発現カセットと、ゲノム上の標的遺伝子における標的部位の3’末端側のDNA配列3’側相同領域とを順に備えたものであればよく、他にベクターとして機能するために必要な配列を備えていてもよい。また標的部位は特に制限されず、エクソンであることが好ましく、中でもエクソン4であることが好ましい。5’側相同領域及び3’側相同領域の長さも、相同組み換えが起こる限り特に制限されず、好ましくは100塩基b;base~20キロ塩基kb、更に好ましくは200b~15kb、最も好ましくは500b~10kbである。ターゲティングベクターは制限酵素処理等により線状化したDNAとして細胞内に導入してもよく、かかる細胞内への導入方法はリン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法や市販のトランスフェクション試薬などを適宜使用することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ法では、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ゲノムDNAの標的遺伝子に二本鎖切断DSB;DoubleStrandBreakを起こさせることにより、ゲノム配列の編集を容易に行う事ができ、標的遺伝子の欠損、挿入、改変置換が生じた細胞生物を得ることができる特表2005519631号公報、特表2006518372号公報、特表2009538141号公報等参照。すなわち、DSBが誘導されると、その後のDNAの修復過程で変異が導入されて、あるいは相同組換えが高効率で誘導され標的遺伝子の一部の配列が耐性遺伝子等の配列に置換されて、正常なタンパク質発現が損なわれる。ここで前記キメラジンクフィンガーヌクレアーゼとは、DNA結合能を有するジンクフィンガータンパク質とII型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメインが融合したキメラタンパク質であり、標的遺伝子のDSB標的部位に応じてジンクフィンガータンパク質を適宜設計することができる。ヌクレアーゼFokIはヘテロダイマーを形成してDNAを切断するため、ゲノムDNAのDSB標的部位近傍に、それぞれの相補鎖にジンクフィンガーの標的配列を設定して、対として機能するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる。かかるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼはmRNAや発現ベクターとして細胞に導入することができ、細胞への導入方法はリン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法や市販のトランスフェクション試薬などを適宜使用することができる。キメラジンクフィンガーヌクレアーゼは、遺伝子組み換え技術を用いて作製することも、CompoZr商標登録ZincFingerNucleaseSigmaAldrich社製等の市販品を入手することもできる。また、LDLR遺伝子のノックアウトは、受精卵や発生初期段階から生じていても、Cre-loxP系等を用いて時期や部位特異的に誘導されて発生途中や成長後に生じたものでもよいが、ターゲッティングベクターを用いて、相同組み換えによりゲノム上のLDLR遺伝子のエクソン4をネオマイシン耐性遺伝子に置換することによりLDLR遺伝子機能を欠損させた体細胞核を用いて体細胞クローンを作製する、LDLR遺伝子ノックアウトを好適に例示することができる。前記の相同組み換えを行うためのターゲッティングベクターとしては、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの5’側にゲノムLDLR塩基配列のエクソン4の5’側領域を含む5’側相同領域を、3’側にエクソン4の3’側領域を含む3’側相同領域を備えている例が好ましく、これらの相同領域の位置、長さは適宜調節することができ、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの5’側にゲノムLDLR塩基配列のエクソン3からエクソン4にかかる約1kbの5’側相同領域を、3’側にエクソン4から9にかかる約9kbの3’側相同領域を備えている例が好ましい。本発明の高脂血症モデルブタとしては、LDLR遺伝子ノックアウト染色体をヘテロあるいはホモでもつ遺伝子型のいずれでもよく、ホモのLDLR遺伝子ノックアウト遺伝子型であることが好ましい。また、前記LDLR遺伝子ノックアウトブタは、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、LDLR遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたゲノムDNAを有するブタ体細胞核を注入することで、体細胞核移植クローン動物として作製することができる。かかる体細胞核移植クローンブタは、通常程度の繁殖能力を有する場合は野生型又は前記体細胞核移植クローンブタ等と交配させて後代を得ることができ、同様にして、通常の繁殖方法で系統を維持し後代の子孫を得ることができる。また、前記体細胞核移植クローンブタの健康状態が好ましくなく、通常の方法での繁殖に適さない場合は、前記体細胞核移植クローンブタから採取した配偶子、好ましくは精子を用いて体外受精及び人工授精の手法を組み合わせてクローンブタの後代を得て、前記LDLR遺伝子ノックアウトブタを作製することもできる。本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症も出るブタの系統は、前記体外受精及び人工授精の手法で維持することも、通常の繁殖方法によって系統を維持して後代の子孫を得ることができ、いずれもLDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたトランスジェニックブタである限りはその後代の子孫も同様に、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに含まれる。本発明における高コレステロール血症としては、血中総コレステロール濃度がコントロールに比べて高ければよく、高脂血症ブタの血中総コレステロール濃度がコントロールの1.5倍以上、好ましくは3倍以上、更に好ましくは4倍以上である例を挙げることができる。また、血中コレステロール濃度に加えて、高脂血症ブタの血中総中性脂肪濃度もコントロールよりも高いことが好ましい。本発明において高コレステロール血症と高脂血症が意味するところは本質的に同一である。ヒト高脂血症は血中の脂質成分量からI、IIa、IIb、III、IV、V型に分類することができ、IIb型はVLDHコレステロール濃度とLDLコレステロール濃度が健常者よりも高く、HDLコレステロール濃度が健常者と同程度の高脂血症である。本発明の高脂血症モデルブタは、VLDHコレステロール濃度とLDLコレステロール濃度がコントロールよりも高く、HDLコレステロール濃度がコントロールと同程度でありIIb遺伝性高脂血症と同様の血中脂肪成分組成を示すことから、IIb型遺伝性高脂血症のモデルブタとすることもできる。本発明において、HDLコレステロール、LDLコレステロール、又はVLDLコレステロールの濃度は、血漿や血清等の血液由来サンプルのコレステロール区分におけるHDL、LDL、VLDL濃度として測定することができ、同様にHDLトリグリセライド、LDLトリグリセライド、又はVLDLトリグリセライドの濃度としては、血漿や血清等の血液由来サンプルのトリグリセライド中性脂肪区分におけるHDL、LDL、VLDL濃度として測定することができる。血中の脂質の測定は適宜常法を用いることができ、測定業者に試料を提供してデータを得ることも、測定用機器を用いて測定することもできる。血中の脂質の測定には全血を用いても、適宜血清サンプルや血漿サンプル、さらに分画したサンプルを使用してもよく、これらは測定を阻害しない限りヘパリン等の抗凝固剤、防腐剤、防カビ剤、pH調整剤や緩衝液等を適宜添加することもできる。例えば、VLDL、LDL、及びHDLの各成分を定量する場合には、血清サンプルをまず各成分に分画し、それぞれの画分についてデタミナーLTCIIやデタミナーTC555協和メデックス株式会社製、アクアオートカイノスT-CHO試薬株式会社カイノス製等酵素法用キットを使用して酵素法による定量を行うことができる。また、VLDL、LDL、及びHDLの各成分を分画するためには、血清中のリポタンパク質を分析可能なゲル濾過カラム、例えばTSKgelLipopropakXL、TSKgelLipopropak東ソー株式会社製等を用い、高速液体クロマトグラフィーHPLC法により解析することもできる。本発明において、本発明の高脂血症モデルブタの血液中HDLコレステロールの濃度はコントロールと同程度であればよく、LDLR遺伝子ノックアウトブタの血漿中コレステロール区分におけるHDL濃度が、コントロールの0.7~1.5倍、好ましくは0.8~1.3倍、より好ましくは0.9~1.2倍であることが好ましい。また、本発明の高脂血症モデルブタのLDLコレステロール及びVLDLコレステロールの濃度はコントロールと比べて高ければよく、血漿中コレステロール区分においてLDL及びVLDLの濃度がコントロールの1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上、更に好ましくは4倍以上であることを好適に例示することができる。本発明の高脂血症モデルブタの血中の総コレステロール、総中性脂肪、HDLコレステロール、LDLコレステロール及びVLDLコレステロール等の他の血中脂質成分濃度や血液組成物については特に制限されないが、本発明の高脂血症モデルブタの血中LDLトリグリセライドが、コントロールに比べて高い例を好適に例示することができる。また、これらの血中コレステロール値は、年齢、飼育環境、餌の種類により変化し、加齢や高コレステロール食等の給餌や運動制限等により高脂血症の症状が進行する。したがって、本発明の高脂血症モデルブタは、たとえ出生直後や成長過程で高脂血症を示していなくとも、血液中のコレステロール測定時に高コレステロール血症であればよく、好ましくは測定時に血液中HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度である、より好ましくは、測定時に血液中HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、かつLDLコレステロール及びVLDLコレステロールの測定時に高コレステロール血症を示している例を挙げることができる。本発明においてブタの通常食とは、一般的にブタが飼育される際に与えられる通常飼料であればよく、市販品を購入することができ、例えば飼料名えつけやはつらつJA全農製、飼料名フレンドUやマザーブリード清水港飼料株式会社製等を挙げることができ、脂肪含量が0.01~8、より好ましくは0.1~7、さらに好ましくは1~5の飼料を挙げることができる。それに対し高コレステロール食としては、通常食よりも高い脂肪含量であれば特に制限されず、通常食にラード、高脂肪食油や油脂等をコレステロールとして混入して作製することもできる。高コレステロール食のコレステロール含量としては、好ましくは0.5~5、より好ましくは2を挙げることができ、脂肪含量としては13~50、より好ましくは14~30、さらに好ましくは15~25を挙げることができる。通常食を与えられたブタは、血中の総コレステロール値が50~100mg/dlであるに対し、高コレステロール食を与えられたブタは血中の総コレステロール値が500~800mg/dlの高脂血症となることが報告されているDixonJLetalArteriosclerThrombVascBiol19991929812992;MMichaelSwindleSwineintheLaboratorysecondedition314315CRCPress参照。本発明の一態様として、LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタを、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法とすることができる。本発明のLDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタを、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法としては特に制限されず、高脂血症や高脂血症に起因する疾患、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞等の判定や、それらの治療技術の開発並びに習得に使用する練習台としての使用を好適に例示することができる。本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、普通食を与えられた条件下でも動脈硬化や心筋梗塞を発症しやすく、これらの症状を誘発するために適宜高コレステロール食を与えることもできる。また、かかる症状が発症しやすいためにブタを加齢させることもできる。普通食又は高コレステロール食を与えられた本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、高脂血症の判定や、動脈硬化や心筋梗塞の有無の判定や、動脈硬化や心筋梗塞の手術法や手術用器具の開発並びに手術技術の練習のための、練習用モデルブタとして使用することができる。前記手術法としては特に制限されないが、ステント留置術、バイパス手術、カテーテル手術、頸動脈内膜切除術CEA等の高脂血症に起因する心筋梗塞や脳梗塞等の疾患の治療において行われる手術を挙げることができ、手術用器具としてはステントやカテーテル等を挙げることができる。練習用ブタの個体、並びにその血液、血管及び組織を用いて、高脂血症並びに動脈硬化や心筋梗塞の有無の判定の練習を行うことができる。例えば、練習用モデルブタについて心拍数、脈拍数、血圧等の測定結果、並びに、血糖値、赤血球値、白血球値、血中LDLコレステロール値、血中HDLコレステロール値、及び血中VLDLコレステロール値等の血液検査結果や、超音波検査法エコーや磁気共鳴画像診断法MRIなどの検査結果から、高脂血症並びに動脈硬化や心筋梗塞の有無を判定する練習を行うことができる。また、かかる練習用モデルブタから採取された、血液等の体液や、血管、心臓等の組織についても、血液検査や解剖、組織化学染色等を行い、高脂血症や動脈硬化、心筋梗塞の判定の練習を行うことができる。また、動脈硬化や心筋梗塞を発症した本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、動脈硬化モデルブタや心筋梗塞モデルブタとして使用することができ、ブタ個体並びに動脈硬化を起こした血管やかかる血管を有する組織、心筋梗塞を起こした心臓を用いてヒトにおいてかかる判定を行う練習に利用することができる。また、同様にして高脂血症や高脂血症に起因する疾患の判定方法や治療法、手術法の開発を行うことができる。また、本発明のLDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタを、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法として、LDLR遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタを薬効評価動物として使用する例を挙げることもできる。普通食又は高コレステロール食を与えられた本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに、高脂血症や高脂血症に起因する疾患の治療薬候補薬剤を投与し、血中コレステロール値や動脈硬化、心筋梗塞の病状の改善、又はそれらが悪化しないことを指標として、前記治療薬候補薬剤の薬効を調べることができ、また同時にその副作用を調査することもできる。本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタは、LDLコレステロール及びVLDLコレステロールの濃度がコントロールと比べて高く、HDLコレステロールの濃度がコントロールと同程度であること、また通常食においても高コレステロール血症を示すことから、ヒトIIb型遺伝性高脂血症の病態をよく再現しており、IIb型遺伝性高脂血症のモデル動物として有用である。また、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに由来する臓器又は細胞としては、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに由来する生体試料であればよく、頭部、頸部、胸部、腹部、脚、における生体組織、例えば臓器、骨、体液等の他、細胞を挙げることができ、かかる細胞としては上皮細胞や肝細胞、線維芽細胞、腎臓細胞等の体細胞や、神経細胞、免疫細胞、ES細胞、原始生殖細胞、精子や卵子を挙げることができ、これらの細胞の初代培養細胞や細胞由来の細胞株、すなわちこれらの細胞から増殖した細胞をも含む。本発明の高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法としては、a前記LDLR遺伝子ノックアウトブタ又はLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程;b工程aの被検対象のLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程;c工程bにおいてLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程;の工程a~cを備えていればよく、他の工程を含んでもよい。また、適宜野生型ブタ等のコントロールを併用することもできる。本発明のスクリーニング方法の工程aは、被検対象である本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタ又はLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に被検物質を投与する工程であればよく、被検物質は適宜選択することができる。被検物質としては、化学物質、タンパク質、ペプチド、ステロイド等を挙げることができ、これらは合成や抽出等により作製することも市販品を購入することもでき、市販のライブラリーを使用することもできる。また本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタ又はLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞への被検物質の投与方法も適宜選択することができ、LDLR遺伝子ノックアウトブタへは経口、注射、点滴、塗布等の方法を挙げることができ、LDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞へは、細胞培養液への添加やトランスフェクション試薬やエレクトロポレーション法を用いた細胞内への投与方法を挙げることができる。被検物質の投与期間や投与回数、投与量も投与対象の大きさ、年齢、性別、症状等によって適宜選択することができる。被検対象のブタの飼育環境や年齢、被検対象の細胞の培養条件等は適宜選択することができる。被検対象のブタの飼料としてコレステロール食を給餌してもよいが、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタは普通食において高脂血症を呈するという特性を有することから、通常食を給餌することができる。本発明のスクリーニング方法の工程bは、工程aの被検対象ブタの高脂血症の程度を調べることができればよく、血漿中コレステロール区分におけるLDLあるいはVLDLの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる例を挙げることができ、これらを組み合わせても、他に血漿中の総コレステロール濃度やコレステロール区分におけるHDL等の濃度、総中性脂肪濃度や中性脂肪区分におけるLDL、HDL、VLDLの濃度等も合わせて調べても、また、他の検査項目、例えば血糖値や赤血球量、白血球量等を調べてもよい。また、動脈硬化症は、超音波検査法エコーや磁気共鳴画像診断法MRI等によって、あるいは被検対象から血管組織サンプル等を採取して組織化学的に調べることもできる。被検対象がLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞である場合には、その増殖速度や代謝速度、細胞内のLDLコレステロールやVLDLコレステロール量等を生化学的、細胞生物学的に一般的な手法により調べることができる。本発明のスクリーニング方法の工程cは、工程bで得た測定結果からLDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防及び/又は治療剤の候補薬剤として選択する工程であればよく、被検対象の健康状態や他の検査項目の結果等も参考とすることもできる。特に、LDLコレステロールあるいはVLDLコレステロールの濃度が減少した場合は、高脂血症の予防及び/又は治療剤の候補薬剤として有望であると判断することができる。また、本発明のスクリーニング方法の別の様態として、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の組織や細胞を、適宜目的に応じたスクリーニングに利用することも可能である。すなわち、従来の系統育種により選抜され表現型と遺伝子型との因果関係が明らかではない高脂血症モデルWHHLウサギ由来の細胞や組織では信頼性に足るスクリーニングやデータを得ることは困難であり、またウサギはHDLからLDLへの変換酵素がない等ヒトと異なる問題があるが、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタは、LDLR遺伝子のみに変異を有するため、LDLR遺伝子に着目したスクリーニングや、LDLRや細胞機能の解析等の医学生物学的研究等において有用である。例えば、本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞を用いて解析対象のシグナル因子の変動を指標としてスクリーニングを行うことができ、具体的には、a’本発明のLDLR遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞又は組織に、被検物質を投与する工程;b’工程a’の被検対象におけるシグナル因子の変化を調べる工程;c’工程b’におけるシグナル因子の変化がコントロールと異なる被検物質を選択する工程;の工程a’~c’を備えたスクリーニングを行うこともでき、適宜他の工程を含んでもよい。LDLRやリポタンパク質代謝の関与する生命現象に関わる因子や、シグナル因子の制御物質をスクリーニングにより同定することができる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。<方法:LDLRKOクローンブタの作出>1LDLRターゲッティングベクターの構造ベクター名:LDLRex4TVLDLRex4TVベクターの作製のためのLDLRゲノム領域ACCESSIONNoNC010444、62049795から62063187のゲノム領域を、ブタLWDランドレース×大ヨークシャー×デュロック三元交雑種のゲノムDNAより分離した。LDLRex4TVベクターは、図1に示したように、ゲノムLDLR塩基配列のエクソン3からエクソン4にかかる約1Kbの5’側相同領域及びエクソン4から9にかかる約9kbの3’側相同領域を、pKJ2BoerPHetalPolymorphismsinthecodingandnoncodingregionsofmurinePgk1allelesBiochemicalgenetics28299308から得られたPGKneopカセットの両側に連結し、さらに5’側相同領域の外側に、pMC1DtpTaniguchiMetalDisruptionofsemaphorinIIIDgenecausessevereabnormalityinperipheralnerveprojectionNeuron19519530から切り出したMC1DTApカセットを配置したものである。5’側相同領域は、PCRプライマー名:LDLRex3F2:5TCAGCAGGACTGCGAGAATG3及びLDLRex4R3:5CATCTTGGGAGCACGTCTTG3を用いてPCR増幅した。また、3’側相同領域は、プライマー名LDLRex4F1:5AAGTCTGACGAGGAGAACTG3及びLDLRR3:5AGAAGAGGTAGGCGATGGTG3を用いてPCR増幅した。このターゲッティングベクターベクター名:LDLRex4TVはエレクトロポレーションによる遺伝子導入の前にNotI制限酵素消化で直線化した。2胎児線維芽細胞の採取ランドレースL雌×ランドレースL雄で交配後、妊娠68日目の胎児L及び妊娠62日目の胎児LWを採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織1g当たり10mlの0.25トリプシン0.04EDTA-2Na液に懸濁し、一晩冷蔵した4°C。遠心処理1500rpm、5分により上清を除去した後、37°Cに保温したウォーターバスにて20-30分間処理した。保温処理後、胎児組織1g当たり10mlのDMEM10FCSを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に10mlのDMEM10FCSを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようDMEM10FCSにて調整した後、75cm2細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、37°Cで5CO2でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。3遺伝子導入とG418薬剤選択LDLR遺伝子ノックアウト細胞の作出分離及び増殖した胎児線維芽細胞は、0.25トリプシン-0.04EDTA-2Na液で剥離させ、DMEM10FCSにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理1500rpm、5分した後、上清を除去し、冷HBSに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が2.5×107cells/mlになるようにHBSにて調整した。キュベットに細胞溶液0.4ml1.0×107cells/mlと100μlの調製済みDNA液5nMの直線化したターゲッティングベクターを添加、図1を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を300V、950μF、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、10分間室温にて静置した。静置した細胞は、DMEM10FCSに懸濁後、3枚の10cmシャーレに分けて培養した。パルス後48時間目に800μg/mlのネオマイシンG418を培養液に添加し、G418耐性細胞株を選別した。7-12日間薬剤選択後、G418耐性細胞コロニーを濾紙ディスクにより分離させ、24穴細胞培養用ディッシュに移した。移した細胞がコンフルエントに達した後、トリプシン処理により剥離させた。剥離させた細胞の半分をPCR分析に用い、残りはそのまま残して培養した。4PCR解析によるターゲッティングの検出細胞を、200g/mlのプロテナーゼKproteinaseKを含む50μlの超純水に再懸濁し、55°Cで3時間保温した後、95°C10分間加熱してプロテナーゼを失活させた。PCR分析は、20μl量の反応液中に消化した50μlのサンプルから鋳型として1μlを採取してAmpliTaqGold登録商標AppliedBiosystems社製を用いて実施した。PCRサイクルのパラメーターは、最初に94°Cを10分間後、94°Cを30秒、60°Cを25秒、72°Cを1分15秒の1サイクルを35サイクルで行い、最後に72°Cで7分間処理した。プライマーはFP25ACCAAATTAAGGGCCAGCTC3及びLDLRex3F45GCAAGATAGGGGACTTTAGC3を用いた。このプライマーセットにより、1.1kbの変異アレル特異的な産物が増幅される。精製したDNAに対するPCRは、鋳型として100ngの精製DNAを使用した点を除いて同様に実施した。5ホルモン処理による採卵方法ランドレースL及びランドレース、大ヨークシャーW、デュロックDの三元交雑種LWDの生後160~194日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにeCGピーメックス、三共製薬株式会社製を1500IU投与し、その72時間後にhCGプペローゲン、三共製薬株式会社製を500IU投与した。hCG投与48時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌豚からの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠21-50日後に流産処置し行った。核移植予定5日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mgプラネート、武田製薬株式会社製:2ml量を臀部筋肉内に投与した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCGピーメックス、三共製薬株式会社製を臀部筋肉内に1500IU投与した。PGF2αeCG投与72時間後にhCGプペローゲン、三共製薬株式会社製を500IU投与した。hCG投与46時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。6体内成熟卵子の準備摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液PBSCa2、Mg2不含、TAKARA社製0.1ウシ血清アルブミンBSA、Sigma社製、CatNoA4503100mlあたり1mlの添加抗生物質AntibioticAntimycotic、Sigma社製、CatNoA7292で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は0.1ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、PZM-3液を用いてインキュベーター38.5°C、5CO2、5O2、90N2内で供試するまで体外培養を行った。7屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、PBS-液にて35°C保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、37°Cに保温したPBS-にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径3-6mmの卵胞を選び、16G注射針付き10mlシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、50mlディスポチューブに回収し、5分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、TALP-Hepes液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を2-3回繰り返した。卵丘細胞が3層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体COCとCOCに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞-卵丘細胞卵子複合体GCOCを選別採卵をした。8体外成熟培養採取したCOC及びGCOCは、約15~20個/穴で改変NCSU37を100μl分注し、100μl流動パラフィンオイルカバーした6穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変NCSU-37は、10ブタ卵胞液、0.6mMシステイン、50μMβメルカプトエタノール、1mMジブチリルcAMP、10IU/mlPMSGピーメックス;1000IU、三共製薬株式会社製、10IU/mlhCGプペローゲン;1500IU、三共製薬株式会社製を添加して作製した。20~22時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルcAMP無添加改変NCSU37に移して供試時まで培養した。成熟培養は39°C、気相条件は、5CO2、5O2、90N2の条件で実施した。成熟培養時間は、42-44時間で行い、成熟卵子第一極体放出卵子のみを試験に使用した。9卵子核の除去操作除核操作除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンBSigma社製:CatNoC6762が5μg/ml濃度含むPZM3液に移し、15分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンBが含まれるPZM3液で作製したドロップ内10cmプラスチックシャーレの中心付近に50μlでドロップを作製し、ミネラルオイル20mlで被ったで行った。卵子は、第一極体が、12時から3時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレータプライムテック社製に取り付けた除核用ピペット外径25-30μm、先端を30~45度の角度で研磨により、第一極体ごと細胞質を1/4~1/3量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、20PVP液Sigma社製:CatNoPVP360ドロップにて、吸引排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンBが含まれないPZM3液に移し、洗浄を行う。洗浄には、PZM3液が3ml入った35mmディッシュFalcon1008で2回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンBを除去した。その後、注入操作まで、PZM3液ドロップ35mmディッシュ:Falcon3001に100μlのドロップを作製し、4mlミネラルオイルで被ったに移し、インキュベーター内で培養した。10ドナー組換え体細胞の準備PCR解析によりLDLR遺伝子がノックアウトされていると判定した雄胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはDMEM10FCSを用い、植え継ぎ回数は0~5回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、3~14日間放置し、細胞周期をG1/G0期に同調した。核移植に用いる約1時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、PBS-にて3回以上洗浄を行い、0.25トリプシン0.04EDTA-2Na液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に10FCS添加DMEMを加え、懸濁した後、遠心処理1,500rpm、5分、室温を行った。遠心処理後、上清を除去し、PZM3液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。11体細胞核の注入操作注入用チャンバー10cmシャーレにPZM3液50μlでドロップを作製し、ミネラルオイル20mlで被ったのドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子50~100個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット外径7-10μm、鈍端を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より5mmの位置にフロリナートを3-5mm幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず20PVP液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄ピペッティングやPVPドロップへのピペット先端の出し入れした。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った1-3時間。12卵子の活性化処理体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激SSH2、島津製作所製を、1.5kV/cm100μ秒×1回の条件にて行った。チャンバーには2mm幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には0.05mMCaCl2、0.1mMMgSO4ならびに0.02BSAを含む0.28Mマンニトール溶液を用いた。13活性化卵子の第2極体放出抑制処理活性化処理卵子は5μg/mlサイトカラシンBSigma社製:CatNoC6762を含むPZM3液で2時間培養し、第2極体の放出を抑制させる処理を行った。14活性化卵子の体外培養活性化後2倍体処理をした卵子は、PZM3液にて体外培養を行い、活性化処理後2日目に分割胚のみ胚移植に用いた。15ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法仮腹の同期化は妊娠豚を人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵豚のものより、1日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄豚希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後21-50日目の妊娠豚を用いた。核移植予定6日前にPGF2α類縁体クロプロステロール約0.2mgプラネート、武田製薬株式会社製:2ml量を臀部に注射した。その24時間後に、同様にPGF2α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にeCGピーメックス、三共製薬株式会社製を1000IU投与した。PGF2αeCG投与72時間後にhCGプペローゲン、三共製薬株式会社製を500IU投与した。hCG投与、約68時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はPPカテーテル富士平工業株式会社製を卵管へ挿入して行った。16組み換えクローン胎児の採取及び細胞分離作業同定したPCR陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの39~72日目に胎児を採取した。採取した胎児は、3と同様に細胞を分離すると同時にゲノムDNAを採取し、相同組み換え個体であるか4と同様の条件でPCR解析した。PCR解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりLDLR遺伝子ノックアウトクローン個体の作出に供した。17サザンブロット解析ゲノムDNAは、クローン胎児もしくはクローン産子より採取した細胞又は組織耳から抽出した。その細胞及び細切した組織断片は、lysisbuffer50mMTris、pH8.0、100mMEDTA、100mMNaCl、1SDS、0.5mg/mlプロテナーゼKで55°Cにて一晩処理し、溶解した。DNAは、フェノールとフェノール/クロロホルムにより処理した後、エタノール沈殿により抽出した。サザンブロッティング用に、子豚及び胎児細胞より抽出したゲノムDNA10μgを、HindIIIもしくは、SphIにて切断した後、別々に0.8アガロースゲルにて電気泳動後、HybondNメンブレンにブロッティングした。HindIIIにて処理したゲノムDNAをブロッティングしたメンブレンは5’プローブ、SphIにて処理したゲノムDNAをブロッティングしたメンブレンは3’プローブを、それぞれ用いて、ハイブリダイゼーションを行った。5’プローブは5’側相同領域の外側にある5’隣接領域に相当するイントロン1の一部、エクソン2、イントロン2を含む領域を、PCR法プライマー;LDLRint1F1:5ATCCTCCACGATGTTGTTGG3及びLDLRint2R2:5GGAGGGCCATTAAAGGAAAG3で増幅することにより作製した。また、3’プローブは、3’側相同領域の外側にある3’隣接領域に相当するイントロン10の一部、エクソン11、イントロン11の一部を含む領域を、PCR法プライマー;LDLRint10F3:5CCAGTCCTCACACTGGAATG3及びLDLRint11R3:5GCAAGGCAGCTCAGTTTGGG3で増幅することにより作製した。プローブは、HighPrimeRoche社製を用いたランダムプライミング法により、[α32-P]dCTPを用いて標識した。そのメンブレンは、32P標識したプローブを用いてハイブリダイズし、ImagingPlate富士フイルム社製上で一晩感光させ、FLA3000Gimageanalyzer富士フイルム社製を用いて解析した。18誕生したクローンブタのPCR判定誕生したクローンブタから採取可能な組織耳、臍帯組織や血液等からDNAを抽出し、5に準じてPCR解析を行った。19クローンブタの後代の作出ほとんどのクローンブタが、呼吸過多や体温上昇の症状により起立不能となり、死亡し、一部生存していた個体においても精液採取は行えず後代が得られなかったことから、クローンブタの死亡時に死体から精巣上体精子を回収し、体外受精及び人工授精により後代を作出した。体外受精は、Kikuchiらの方法BiolReprod2002Apr66103341に準じて行った。人工授精は、37°Cに保温したモデナ液により希釈した精巣上体精子を用いて豚人工授精用スパイラルカテーテルを用いて、発情開始した雌豚に対して、発情終了時まで、朝夕の2回ずつ2~3日間実施した。20ホモ型ヘテロ型の判定PCR法による判定は、変異アレル及び野生型アレルについて、それぞれを特異的に検出することにより行った。変異アレルの検出は、4に準じた方法で行い、野生型アレルの検出は、プライマーとして、LDLRex3F45GCAAGATAGGGGACTTTAGC3及びLDLRex4R15GAGTCACAGACAAACTTTGG3を用いる以外は、同様の方法で行った。検出されたアレルの組み合わせにより、ホモ型ヘテロ型を判定した。また、サザンブロットによる判定は、17に準じた方法で行った。検出されたバンドのサイズにより、変異型アレルと野生型アレルを判別し、その組み合わせにより、ホモ型ヘテロ型の判定を行った。21血液検査血漿の分離へパリン採血管により、ブタ静脈より、血液を採取し、2000rpm、15分間の遠心分離により、血漿を分離した。分離した血漿は、OkazakiらArteriosclerThrombVascBiol200525578584のHPLC法により、コレステロール及び中性脂肪の4分画及び20分画値を解析した。22飼料ブタの飼料としては、以下の脂肪含量日本標準飼料成分表に基づくの通常飼料普通食を使用した。3~4週齢:脂肪含量4.0飼料名:えつけ5週齢~5カ月:脂肪含量3.5飼料名:はつらつ、フレンドU5カ月以降:脂肪含量2.5飼料名:マザーブリード<研究成績の概要:LDLRex4TVターゲッティングベクターによる相同組換え細胞作出試験>1ブタL胎児雄68日齢より細胞を採取し、LDLRex4TVターゲッティングベクター図1によりエレクトロポレーションを4回行い、ネオマイシン400μg/mlで薬剤選択を約1週間行い、その2-3日後にコロニーをピックアップした。PCR解析を行った総コロニー数は1260クローン、その内5クローンが陽性の結果となった表1。2ブタLW胎児雄62日齢より細胞を採取し、LDLRex4TVターゲッティングベクターによりエレクトロポレーション1回を行い、ネオマイシン400μg/mlで薬剤選択を約1週間行い、その2-3日後にコロニーをピックアップした。PCR解析を行った総コロニー数は413クローン、その内1クローンが陽性の結果となった表1。31で得られたLDLR遺伝子ノックアウト細胞No.91を用いて核移植試験16回体内成熟卵子3回、体外成熟卵子13回行い、分割胚3401個体内成熟卵子由来170個、体外成熟卵子由来3231個が得られた表2。43で得られた分割胚を16頭の仮腹へ移植した結果、5頭が妊娠し、それら仮腹を屠殺したところ、6頭のクローン胎児が得られた。得られた胎児全て、非組換え体であることが確認された表2。52で得られたLDLR遺伝子ノックアウト細胞のNo.1-16を用いて核移植試験6回vivo卵子1回、vitro卵子5回行い、分割胚1290個invivo卵子由来70個、invitro卵子由来1220個が得られた表2。65で得られた分割胚を6頭の仮腹へ移植した結果、2頭が妊娠し、それら仮腹を屠殺したところ、9頭のクローン胎児が得られた図2A、B。得られた胎児の内、7頭が相同組換え体であることが確認された表2。相同組換え胎児より大量に細胞分離を行うことに成功した。7さらに、6で得られたLDLRKOクローン胎児由来細胞を用いて、核移植胚移植試験を7例実施した。4742個の体外成熟卵子を用いて核移植を実施し、3812個の卵子が生存生存率80.4し、1889個が分割した分割率49.6、表3。分割胚1889個を7頭の仮腹に胚移植することにより、7頭全てが妊娠し、合計38頭のクローンブタが誕生し、内29頭が生存産子だった。8PCR解析の結果、全ての産子においてLDLR遺伝子のノックアウトが確認された。誕生したクローンは、生後の死亡が相次ぎ、特に生後1ヶ月以内及び4~5ヶ月齢時の死亡例が多かった。7ヶ月齢を越した生存個体は2頭に過ぎなかった表4。多くのクローンにおいて急な呼吸過多と体温上昇が観察され、ひどい場合に起立不能になり死に至った点は、他のノックアウトブタ作製の先行研究等からは予期しなかった事象であり、死亡原因は病理検査の結果からも不明であった。9誕生したLDLR遺伝子ノックアウトクローンヘテロ型の、4~5ヶ月齢時における血漿中のコレステロール各分画VLDL、LDL、HDL濃度を測定した。その結果、総コレステロール値が対照区よりも2倍以上高くなり、その原因としてVLDL及びLDLの各分画における高い値が影響していることが明らかになった表5及び図3。10生存産子29頭のLDLR遺伝子ノックアウトクローンブタの内、7ヶ月齢以降の性成熟に達したのは、2頭のみであった。しかし、7ヶ月齢以降においても、2頭から射出精液を採取することはできなかった。2頭の内1頭は11ヶ月齢時に突然死し、死体の精巣上体尾部よりを活力のある精子を採取した。また残る1頭も12ヶ月齢時に起立不能になったため、安楽死させ、同様に精巣上体尾部より活力ある精子を採取した。これらの精巣上体精子を用い、体外受精と人工授精を行った。2回の体外受精により得られた体外受精胚を4頭の仮親に移植した結果、4頭全てが妊娠し、35頭の生存産子及び1頭の死産産子が誕生した。また人工授精した2頭も妊娠し、19頭の生存産子及び4頭の死産子が得られた表6。離乳に至った51頭の産子の遺伝子型を調べた結果、ヘテロ型LDLR遺伝子ノックアウトブタが21頭雄6、雌15、野生型が30頭雄16、雌14と判定された表7。誕生した後代では、クローンで多発した突然死もなく、順調に発育した。また、一部のノックアウトブタにおいて、血漿中コレステロールの各分画VLDL、LDL、HDL濃度を測定した結果、F0となるクローン同様、VLDL及びLDLの濃度が野生型の2~3倍高いことが明らかになったデータは示していない。11さらに、F1世代同士の雌雄を、4例交配することにより、F2世代38頭を得ることに成功した表8。F2世代産子の遺伝子型を調べた結果、ホモ型LDLR遺伝子ノックアウトブタが12頭雄7、雌5、ヘテロ型が18頭雄9、雌9、野生型が8頭雄3、雌5と判定された表8。12F2世代の3週齢と7週齢で、血漿中コレステロールの4分画CM、VLDL、LDL、HDL濃度を測定した結果、ホモ型が、野生型及びヘテロ型に比べて、VLDL及びLDLの濃度が、有意に高いことが明らかになった図4A、B。3カ月齢時の血中の総コレステロール値は、ホモ型ノックアウトで645mg/dL、コントロール野生型で137mg/dLであった。また、7カ月齢時の血中の総コレステロール値は、ホモ型ノックアウトで598mg/dL、コントロール野生型で113mg/dLであった。13F2世代の7週齢において、血漿中コレステロールの4分画のVLDL及びLDL濃度を測定した結果、ヘテロ型が、野生型に比べて、有意に高いことが明らかになった図5B、P<0.05。14同様に、F2世代の3週齢と7週齢で、血漿中コレステロールの20分画濃度を測定した結果、ホモ型が、野生型及びヘテロ型に比べて、G3分画を除く、G4~G7分画のVLDL及びG8~13分画のLDLの濃度が、有意に高いことが明らかになった図5A、B、P<0.05。15また、F2世代の7週齢で、血漿中コレステロールの20分画濃度を測定した結果、ヘテロ型が、野生型に比べて、G8~G11及びG13分画のLDLの濃度が、有意に高いことが明らかになった図5B、P<0.05。16コレステロールのHDL値は、4分画で測定した結果、ホモ型が低い傾向にあったが、有意差は認められなかった。さらに、詳細に20分画濃度で解析した結果では、G15分画にてホモ型は他よりもHDL値が有意に高かった図5A、B、P<0.05。一方、7週齢時のG17分画では、ホモ型は他よりもHDL値が有意に低かった図5B、P<0.05。173週齢及び7週齢の4分画で解析した総TG中性脂肪:トリグリセライド値は、ホモ型が高い傾向にあり、ヘテロとの間で有意に高かった図4C、D、P<0.05。特にLDLは、ホモ型は、ヘテロ型及び野生型よりも有意に高い値を示した図4C、D、P<0.05。一方、7週齢の中性脂肪のHDLにおいてヘテロ型が、ホモ型及び野生型に比べて有意に高い値を示した図4D、P<0.05。18さらに、詳細に20分画で、3週齢及び7週齢のTG中性脂肪:トリグリセライドを解析した結果、LDLのG10~G13分画で、ホモ型は他に比べて有意に高くなった図5C、D、P<0.05。"