"本願明細書に記載された発明。したがって、上記問題を解決するための化合物を開発することが必要であり、且つ多数の潜在的利点を有する。このような化合物、関連する組成物、およびその使用方法を、本明細書および特許請求の範囲に記載する。簡単な要旨本明細書中および特許請求の範囲に記載の発明は、多数の特質および実施形態を有し、上記に記載のものまたは本要旨に記載または参照されるものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中および特許請求の範囲に記載の発明は、本要旨で特定した特徴または実施形態に制限されず、これらは、例示のみを目的として含まれ、本発明を制限しない。組織工学に有用な化合物アンチセンス化合物が含まれるを本明細書中に提供する。眼病用手順に関連する組織損傷を軽減するためのアンチセンス化合物および方法も提供する。本方法は、例えば、アンチセンス化合物を被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で被験体の眼に投与する工程を含む。コネキシンタンパク質発現が阻害されることが好ましい一方で、単独の化合物アンチセンス化合物が含まれるまたはヒトコネキシン発現を阻害するアンチセンス化合物または他の化合物との組み合わせによる修飾のために他のタンパク質を標的化することができると予想される。一定の実施形態では、眼病用手順は、眼病用手術であり、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、角膜移植、屈折矯正手術、眼表面新生物切除、結膜もしくは羊膜の移植、翼状片および瞼裂斑の切除、眼形成手術、眼瞼腫瘍切除、先天性異常のための眼瞼再構築手順、外反症および眼瞼外反の修復、斜視手術眼筋、または任意の穿通性眼外傷が含まれるが、これらに限定されない。一般に、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、発現阻害が望ましいコネキシンであることが公知である。好ましくは、アンチセンス化合物は、1つまたは複数の特定のコネキシンアイソタイプを標的化する。アンチセンス化合物によって標的化することができるコネクチンの特定のアイソタイプには、43、37、31.1、および26が含まれるが、これらに限定されない。標的化されるコネクチンはヒトであることが好ましいが、必要ではない。コネキシン例えば、ヒトは、例えば、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有し得る。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。一定の他の実施形態では、第2のアンチセンス化合物を被験体例えば、眼に投与し、1つまたは複数の他のアンチセンス化合物が配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン例えば、ヒトをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。少なくとも第2のアンチセンス化合物は、例えば、第1のアンチセンス化合物と異なるコネキシンを標的化する。本発明の種々の態様で使用することができるアンチセンス化合物型の例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、dsRNA、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNAザイム、および5’端変異Ul核内低分子RNA、ならびに前記のアナログ;本明細書中に記載されているか当該分野で公知の他の化合物例えば、オクタノール、グリセレチン酸glycerhetinicacid、およびヘプタノールなどの非特異的脱共役剤が含まれるが、これらに限定されないが含まれる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、天然に存在する核酸塩基および未修飾のヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート結合を有するものが含まれるである。適切なアンチセンス化合物には、例えば、少なくとも1つの修飾糖部分を含むオリゴヌクレオチドも含まれる。適切なアンチセンス化合物には、例として、少なくとも1つの修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。一定の実施形態では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、別の化合物例えば、組織損傷の軽減、炎症の軽減、治癒の促進、またはいくつかの他の所望の活性に有用な化合物と組み合わせて投与する。別の態様では、本発明は、被験体へのアンチセンス化合物の投与による被験体例えば、患者の治療方法を含む。一定の実施形態では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、局所投与または局部投与によって投与する。本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、例えば、全身投与するか眼内注射によって投与することもできる。本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、例えば、創傷形成眼病用手順例えば、手術で起こる創傷などに対して所定の時間被験体に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順を実施する前、眼病用手順中、または眼病用手順後に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順が行われる数分または数時間前後に被験体に投与することができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、眼病用手順を行った後に投与し、例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順から約4時間以内、眼病用手順から約3時間以内、より典型的には、眼病用手順から2時間以内、または眼病用手順から1時間以内に投与する。別の態様では、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、組織工学的方法で投与することができる。例えば、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法と組み合わせて投与することができる。このような方法を、眼病用手順例えば、手術と組み合わせても、組み合わせなくても良い。例として、本明細書中に記載のアンチセンス化合物を、被験体の角膜に関連する細胞例えば、角膜細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法と組み合わせて投与することができる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、瘢痕形成を減少させる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、炎症を軽減する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、創傷治癒を促進する。一定の好ましい実施形態では、例えば、アンチセンス化合物を、外科的移植手段に際して使用する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物はコネキシン43に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物はコネキシン31.1に指向し、外層角質化を調節するために投与する。一定の実施形態によれば、例えば、眼病用手順は、白内障摘である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、角膜移植である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、屈折矯正手術である。別の実施形態では、例えば、眼病用手順は、放射状角膜切開術である。別の実施形態では、例えば、眼病用手順は、緑内障濾過手術である。さらに他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、角膜移植術である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼表面新生物切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、結膜もしくは羊膜の移植である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、翼状片および瞼裂斑の切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼形成手術である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、眼瞼腫瘍切除である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、先天性異常のための眼瞼再構築手順である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、外反症および眼瞼外反の修復である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、斜視手術眼筋である。他の実施形態では、例えば、眼病用手順は、任意の穿通性眼外傷である。一定のさらなる実施形態では、例えば、化合物および組成物を使用して、角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防し、角膜に関連する細胞は眼の任意の細胞であり、角膜細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書中に記載の薬剤アンチセンス化合物が含まれるは、被験体の角膜組織の厚さを増加させることができる。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物を、組織損傷の軽減または治癒の促進に有用な別の化合物と組み合わせて使用する。例えば、アンチセンス化合物を、成長因子またはサイトカインなどと同時投与することができる。別の態様では、例えば、眼病用手術に関連する組織損傷の軽減のための薬学的組成物を提供する。例えば、被験体の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む薬学的組成物を、被験体の眼への局部または局所投与のために適切に処方する。アンチセンス化合物は、例えば、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン例えば、ヒトをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化することが好ましい。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物の形態であり、薬剤またはアンチセンス化合物は、被験体の創傷治癒の促進に十分な量で存在する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、局部投与に適切な形態被験体の眼への局部投与または局所投与に適切な形態が含まれるであり得る。一定のさらなる実施形態では、例えば、組成物および処方物は、ゲル、クリーム、または本明細書中に記載されているか当該分野で公知の任意の形態現存の形態またはこの先認められる形態であり得る。別の態様では、本発明は、アンチセンス化合物を含む薬学的組成物を含む。1つの実施形態では、例えば、眼病用手順例えば、手術に関連する組織損傷の軽減のための薬学的組成物であって、薬学的組成物を被験体の眼への局部投与または局所投与のために処方し、薬学的組成物が、被験体の眼に関連する細胞中にヒトコネキシンタンパク質の発現の阻害に十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む、薬学的組成物を提供する。一定の実施形態では、例えば、アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン例えば、ヒトをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。一定の実施形態では、例えば、薬学的組成物は、緩衝化プルロニック酸またはゲルを含む薬学的に許容可能なキャリアを含む。これは、1つの実施形態では、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水中に約30までのプルロニック酸を含む。別の態様では、1つまたは複数のコネキシンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン方法を提供する。この方法は、選択された標的を有する特定のオリゴヌクレオチドの熱安定性、親和性、および特異性などの選択されたパラメータの至適化を含み得る。この方法を使用して、1つまたは複数の所望のポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択および開発することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、mRNAを切断する能力またはコネキシンタンパク質の翻訳を遮断する能力と組み合わせて試験することができる。本願発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1被験体における眼病用手順に関連する組織損傷を減少させるための方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で、該手順と組み合わせて該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。項目2眼病用手順に関連する組織工学のための方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害し、該被験体の眼の細胞または眼に関連する細胞の増殖、移動、または分化を調節するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。項目3被験体の眼または眼に関連する組織中の上皮細胞の蓄積を促進する方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を包含する、方法。項目4被験体の眼または眼に関連する組織中の細胞過形成を阻害する方法であって、アンチセンス化合物を、該被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で該被験体の眼に投与する工程を含包含する、方法。項目5前記アンチセンス化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、RNAi分子、siRNA分子、PNA分子、DNAザイム、および5′末端変異U1分子核RNA、ならびにこれらのアナログからなる群より選択される、項目1~項目4のいずれか1項に記載の方法。項目6前記眼病用手順が、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、レンズ置換手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、または他の型の屈折の矯正手術もしくはレンズ交換手術から選択される眼病用手術である、項目1~5のいずれか1項に記載の方法。項目7前記アンチセンス化合物が、配列番号1~11から選択される核酸塩基配列を含む、項目6に記載の方法。項目8前記アンチセンス化合物が、1つ以上のコネキシン43、26、37、30、および/または31.1に対して標的化される、項目6に記載の方法。項目9前記アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基に対して標的化される、項目6に記載の方法。項目10第2のアンチセンス化合物が前記被験体の眼に投与され、該第2のアンチセンス化合物が配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基に対して標的化され、該第2のアンチセンス化合物が項目4に記載のアンチセンス化合物とは異なるコネキシンに対して標的化される、項目9に記載の方法。項目11前記アンチセンス化合物が、15核酸塩基長と35核酸塩基長との間のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目3に記載の方法。項目12前記アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約12核酸塩基に対して標的化される、項目6に記載の方法。項目13前記アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約18核酸塩基に対して標的化される、項目6に記載の方法。項目14前記アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約25核酸塩基に対して標的化される、項目6に記載の方法。項目15前記アンチセンス化合物が、配列番号1~11から選択される核酸塩基配列を含む、項目3に記載の方法。項目16前記アンチセンス化合物が、天然に存在する核酸塩基および未修飾のヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目6に記載の方法。項目17前記アンチセンス化合物が、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目6に記載の方法。項目18前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、項目17に記載の方法。項目19前記アンチセンス化合物が、少なくとも1つの修飾糖部分を含むオリゴヌクレオチドである、項目6に記載の方法。項目20前記アンチセンス化合物が、少なくとも1つの修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドである、項目6に記載の方法。項目21前記アンチセンス化合物が、局所投与または局部投与によって投与される、項目6に記載の方法。項目22前記アンチセンス化合物が、外科的創傷への直接適用によって投与される、項目6に記載の方法。項目23前記アンチセンス化合物が、眼内注射によって投与される、項目6に記載の方法。項目24前記アンチセンス化合物が、組織損傷の減少または治癒の促進に有用な第2の化合物と組み合わせて使用される、項目6に記載の方法。項目25前記第2の化合物が、成長因子またはサイトカインである、項目6に記載の方法。項目26前記第2の化合物が、FGF、NGF、NT3、PDGF、TGF、VEGF、BDGF、EGF、KGF、インテグリン、インターロイキン、プラスミン、およびセマフォリンが含まれるが、これらに限定されない成長因子またはサイトカインなどから選択される、項目25に記載の方法。項目27前記アンチセンス化合物が所定の時間に投与される、項目6に記載の方法。項目28前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順が行われる前に投与される、項目6に記載の方法。項目29前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順の間に投与される、項目6に記載の方法。項目30前記アンチセンス化合物が、前記外科的手順が行なわれた後2時間以内に投与される、項目6に記載の方法。項目31前記被験体におけるエキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー手順と組み合わせて実施される、項目6に記載の方法。項目32前記眼病用手術が白内障摘出である、項目6に記載の方法。項目33前記眼病用手術が角膜移植である、項目6に記載の方法。項目34前記眼病用手術が屈折矯正手術である、項目6に記載の方法。項目35前記眼病用手術が放射状角膜切開術である、項目6に記載の方法。項目36前記被験体の角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する、項目6に記載の方法。項目37前記眼病用手術が緑内障濾過手術である、項目6に記載の方法。項目38前記眼病用手術が角膜移植術である、項目6に記載の方法。項目39前記被験体の角膜組織の厚さを増加させる、項目6に記載の方法。項目40前記被験体の角膜細胞における組織損傷が減少される、項目6に記載の方法。項目41前記被験体の角膜に関連する細胞における組織損傷が減少される、項目6に記載の方法。項目42前記被験体の眼のかすみを減少する、項目6に記載の方法。項目43前記被験体の眼の瘢痕化を減少する、項目6に記載の方法。項目44手術の24~48時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する、項目6に記載の方法。項目45手術の24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再構築を調節し、かすみを減少する、項目6に記載の方法。項目46前記眼病用手順がエキシマレーザー手順であり、該方法が前記被験体の間質細胞の細胞過形成を減少する、項目6に記載の方法。項目47前記眼病用手順がエキシマレーザー手順であり、前記方法が前記被験体の角膜の再上皮形成を促進する、項目6に記載の方法。項目48前記被験体の眼の上皮細胞移動を増加させる、項目6に記載の方法。項目49前記被験体の眼への前記アンチセンス化合物の投与の12時間以内に上皮細胞移動の増加を生じる、項目48に記載の方法。項目50前記被験体の眼への前記アンチセンス化合物の投与の24時間以内に上皮細胞移動の増加を生じる、項目48に記載の方法。項目51処置した被験体の眼の間質後部の間質密度を増加させることなく間質前部の間質密度を増加させる、項目6に記載の方法。項目52手術の24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する、項目6に記載の方法。項目53手術の24~72時間後の上皮過形成を減少する、項目6に記載の方法。項目54手術の1週間後までの筋線維芽細胞の活性化を減少する、項目6に記載の方法。項目55細胞外基質を改変する細胞分化を調節する、項目6に記載の方法。項目56細胞増殖を減少する、項目6に記載の方法。項目57中枢神経系の損傷を治療する方法であって、該方法は、該中枢神経系の損傷を治療するために被験体に実施した外科的手順に関連する中枢神経系の既存の創傷から近位の部位にアンチセンス化合物を投与する工程を包含し、該アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基に標的化される、方法。項目58前記中枢神経系の損傷が、脊髄損傷である、項目57に記載の方法。項目59前記アンチセンス化合物が、脊髄の身体的な外傷後少なくとも24時間で被験体に投与される、項目57に記載の方法。項目60前記アンチセンス化合物が、被験体の脊髄損傷領域への神経組織の移植手順と合わせて投与される、項目57に記載の方法。項目61前記アンチセンス化合物が瘢痕形成を減少する、項目57に記載の方法。項目62前記アンチセンス化合物が炎症を減少する、項目57に記載の方法。項目63前記アンチセンス化合物が創傷治癒を促進する、項目57に記載の方法。項目64外科的移植手順に関連して使用される、項目57に記載の方法。項目65前記アンチセンス化合物がコネキシン43に関連し、上皮基底細胞の分裂および増殖を調節するために投与される、項目57に記載の方法。項目66前記アンチセンス化合物がコネキシン31.1に関連し、外層角質化を調節するために投与される、項目57に記載の方法。項目67眼病用手順に関連する組織損傷を減少させるための医薬の調製におけるアンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害する、使用。項目68眼病用手順に関連する組織工学のための医薬の調製におけるアンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、被験体の眼または眼に関連する細胞中のコネキシンタンパク質の発現を阻害する、使用。詳細な説明本発明の実施には、当業者の範囲内の種々の従来の分子生物学的技術組換え技術が含まれる、微生物学的技術、細胞生物学的技術、生化学的技術、核酸化学的技術、および免疫学的技術を使用することができる。このような技術は、文献で十分に説明されており、例示のみを目的として、以下が含まれるが、これらに限定されない:MolecularCloning:ALaboratoryManual,secondeditionSambrooketal.,1989andMolecularCloning:ALaboratoryManual,thirdeditionSambrookandRussel,2001本明細書中で集合的および個別にSambrookという;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait,ed.,1984;AnimalCellCultureR.I.Freshney,ed.,1987;HandbookofExperimentalImmunologyD.M.WeirC.C.Blackwell,eds.;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.MillerM.P.Calos,eds.,1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubeletal.,eds.,19872001年までの増補版を含む;PCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullisetal.,eds.,1994;CurrentProtocolsinImmunologyJ.E.Coliganetal.,eds.,1991;TheImmunoassayHandbookD.Wild,ed.,StocktonPressNY,1994;BioconjugateTechniquesGregT.Hermanson,ed.,AcademicPress,1996;MethodsofImmunologicalAnalysisR.Masseyeff,W.H.Albert,andN.A.Staines,eds.,Weinheim:VCHVerlagsgesellschaftmbH,1993,HarlowandLane1988Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork,andHarlowandLane1999UsingAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY本明細書中で集合的および個別にHarlowandLaneという,Beaucageetal.eds.,CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistryJohnWileySons,Inc.,NewYork,2000;andAgrawal,ed.,ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,SynthesisandPropertiesHumanaPressInc.,NewJersey,1993。定義本発明を一般的および種々の非限定的な特定の実施形態でさらに説明する前に、発明を説明する状況下で使用される一定の用語を説明する。他で示さない限り、本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。明細書中の以下または他で定義されていない用語は、その分野で認識されている意味を有するものとする。アンチセンス化合物は、遺伝子の発現、翻訳、または機能を阻害するように作用する異なる分子型を含み、治療に適用するためのmRNAの配列特異的標的化によって作用するものが含まれる。したがって、アンチセンス化合物には、主な核酸ベースの遺伝子サイレンシング分子例えば、化学修飾アンチセンスオリゴデオキシリボ核酸ODN、リボザイム、およびsiRNAが含まれるScherer,L.J.andRossi,J.J.NatureBiotechnol.21:1457-14652003。アンチセンス化合物には、アンチセンス分子例えば、ペプチド核酸PNAsBraasch,D.A.andCorey,D.R.,Biochemistry41,4503-45102002、モルホリノホスホロジアミデートHeasman,J.,Dev.Biol.,243,209-2142002、DNAザイムSchubert,S.etal.,NucleicAcidsRes.31,5982-59922003.Chakraborti,S.andBanerjea,A.C.,Mol.Ther.7,817-8262003,Santoro,S.W.andJoyce,G.F.Proc.NatlAcad.Sci.USA94,4262-42661997、および最近開発された5’-末端変異U1核内低分子RNAFortes,P.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100,8264-82692003も含まれ得る。用語アンチセンス配列は、アンチセンス化合物活性を有するポリヌクレオチドをいい、例えば、RNA配列に相補的であるか、部分的に相補的である配列が含まれるが、これらに限定されない。したがって、アンチセンス配列には、例えば、mRNAまたはその一部に結合してリボゾームによってmRNAの転写を遮断する核酸配列が含まれる。アンチセンス法は、一般に、当該分野で周知である。例えば、PCT公開W094/12633号およびNielsenetal.,1991,Science254:1497;OligonucleotidesandAnalogues,APracticalApproach,editedbyF.Eckstein,IRLPressatOxfordUniversityPress1991;AntisenseResearchandApplications1993,CRCPressを参照のこと。本明細書中で使用される、メッセンジャーRNAには、3文字表記を使用してタンパク質を暗号化するための配列情報だけでなく、5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、および5’キャップ領域を形成する関連リボヌクレオチド配列ならびに種々の二次構造を形成するヌクレオチド配列も含まれる。本発明にしたがって、これらの配列のいずれかの全部または一部を標的化するオリゴヌクレオチドを形成することができる。一般に、核酸オリゴヌクレオチドが含まれるを、DNA様すなわち、2’-デオキシ糖一般に、U塩基よりもむしろT塩基を有するまたはRNA様すなわち、2’-ヒドロキシル糖または2’修飾糖一般に、T塩基よりもむしろU塩基を有すると記載することができる。核酸ヘリックスは、1つを超える構造型を選択することができ、最も一般的にはA形態およびB形態である。一般に、B形態様構造を有するオリゴヌクレオチドはDNA様であり、A形態様構造を有するものはRNA様である。と考えられている。用語相補的は、一般に、許容された塩および温度条件下での塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば、配列A-G-Tは、相補配列T-C-Aに結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のうちのいくつかのみが結合する場合の部分的であり得るか、一本鎖分子間で全て相補的である場合の完全であり得る。核酸分子間の相補性の程度は、分子間のハイブリッド形成の効率および強度に有意に影響を与える。ハイブリッド形成可能なおよび相補性は、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオチドとが安定に結合するのに十分な相補性の程度を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成するその標的核酸配列と100相補的である必要はないと理解され、結合は標的特異的であってよく、または非特異的結合が治療または他の目的を有意または望ましくなく阻止しない限り、他の非標的分子に結合することができるとも理解される。活性を喪失または減少させるためにオリゴヌクレオチドを使用して標的分子の正常な機能を阻害し、特定の結合が望まれる条件下すなわち、インビボアッセイまたは治療上の処置の場合の生理学的条件下またはインビトロアッセイの場合のアッセイが行われる条件下で非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的または望ましくない結合を回避するのに十分な相補性の程度であることが好ましい。本発明の一定の実施形態の状況では、絶対的な相補性は必要ない。生理学的条件下で20°C、30°C、または40°Cを超える融点を有する二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するポリヌクレオチドが一般に好ましい。障害は、本発明の分子または組成物での治療から恩恵を受ける任意の容態本明細書中に記載されているか特許請求の範囲に期さされているものが含まれるである。これには、慢性および急性障害または疾患哺乳動物が問題の障害にかかりやすい病的状態が含まれるが含まれる。選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチドの標的化は、多段階過程であり得る。この過程は、その機能が調整される核酸配列の同定から開始され得る。これは、例えば、その発現が特定の病状に関連する細胞遺伝子または遺伝子から作製されたmRNAまたは感染因子由来の外来核酸RNAまたはDNAであり得る。標的化過程はまた、所望の効果すなわち、タンパク質発現の阻害、タンパク質検出の減少、または他の活性の調整が得られるようなオリゴヌクレオチド相互作用のための核酸配列内の部位の決定を含み得る。一旦標的部位が同定されると、標的と所望の調整を得るのに十分または望ましく相補的なすなわち、十分且つ適切なまたは望ましい特異性でハイブリッド形成するアンチセンス化合物例えば、オリゴヌクレオチドが選択される。本発明では、標的には、1つまたは複数のコネキシンをコードする核酸分子が含まれる。標的化過程は、所望の結果が得られるようなアンチセンス相互作用部位の決定も含み得る。例えば、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子の読み取り枠ORFの翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを含む領域である。翻訳開始コドンは、典型的には、5’-AUG転写mRNA分子中;対応するDNA分子中では5’-ATGであり、AUGコドン、開始コドン、またはAUG開始コドンともいうことができる。少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されているRNA配列を有する翻訳開始コドン5’-GUG、5’-UUG、または5’-CUGおよび5’-AUA、5’-ACG、および5’-CUGを有する。したがって、用語翻訳開始コドンおよび開始コドンは、典型的には、どの場合にも開始アミノ酸がメチオニン真核生物またはホルミルメチオニン原核生物である場合でさえ、多数のコドン配列を含み得る。真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子が2つまたはそれ以上の別の開始コドンを有することができ、そのうちのいずれか1つを特定の細胞型もしくは組織または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に使用することができることも当該分野で公知である。用語オリゴヌクレオチドには、天然に存在する塩基、糖、および糖間骨格結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシド単量体のオリゴマーまたはポリマーが含まれる。用語オリゴヌクレオチドには、同様に機能する天然に存在しない単量体またはその一部を含むオリゴマーまたはポリマーも含まれ得る。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込み、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、または増強された標的親和性などの性質のために、しばしば、天然形態よりも好ましい。多数のヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾により、未変性のオリゴヌクレオチドODNよりも高いヌクレアーゼ消化耐性が組み込まれたオリゴヌクレオチドが作製されることが示されている。ヌクレアーゼ耐性を、細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とのオリゴヌクレオチドのインキュベーションおよび通常はゲル電気泳動による長期間にわたり残存するインタクトなオリゴヌクレオチド範囲の測定によって日常的に測定する。そのヌクレオチド耐性を増強するために修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドよりも長期間インタクトで生存することができる。多数の修飾により、オリゴヌクレオチドのその標的への結合親和性が増加することが示されている。オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性を、オリゴヌクレオチド/標的対のTm融点オリゴヌクレオチドおよび標的が解離する温度であるによって日常的に決定する。分光光度法で解離を検出する。Tmが増加するほど、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性が増加する。いくつかの場合、標的結合親和性を増強するオリゴヌクレオチド修飾もヌクレアーゼ耐性を増強することができる。ポリヌクレオチドは、複数のヌクレオチドを意味する。したがって、用語ヌクレオチド配列、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはオリゴデオキシヌクレオチドは全て、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列をいう。これらの句はまた、一本鎖または二本鎖であってよく、ペプチド核酸PNAまたは任意のDNA様物質もしくはRNA様物質に対してセンス鎖またはアンチセンス鎖を示し得るゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAをいう。コネキシン、コネキシンフラグメント、またはコネキシン変異型をコードするポリヌクレオチドには、以下をコードするポリヌクレオチドが含まれる:天然に見出されるコネキシンの成熟形態;天然で見出されるコネキシンの成熟形態およびさらなるコード配列例えば、リーダー配列、シグナル配列、またはプロタンパク質配列;前述の配列および非コード配列例えば、天然に見出されるポリペプチドの成熟形態のコード配列の5’および/または3’のイントロンまたは非コード配列;天然に見出されるコネキシンの成熟形態のフラグメント;および天然に見出されるコネキシンの成熟形態の変異型。したがって、コネキシンコードポリヌクレオチドなどは、所望のコネキシン、フラグメント、または変異型のコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。用語ペプチド模倣物および模倣物は、本明細書中に提供したアンチセンスポリペプチドと実質的に同一の構造および機能的特徴を有し、コネキシン特異的阻害活性を少なくとも一部およびある程度模倣する合成化合物をいう。ペプチドアナログは、一般に、医薬産業でテンプレートペプチドに類似の性質を有する非ペプチド薬として使用される。これらの非ペプチド化合物型を、ペプチド模倣物またはペプチドミメティックpeptidomimeticsというFauchere,J.Adv.DrugRes.15:291986;VeberandFreidinger;TINS;3921985;andEvansetal.,J.Med.Chem.30:12291987;BeeleyN.,TrendsBiotechnol.1994Jun;126:213-6.;Kieber-EmmonsT,etal.;CurrOpinBiotechnol.1997Aug;84:435-41。治療に有用なペプチドと構造的に類似のペプチド模倣物を使用して、等価または増強された治療効果または予防効果を得ることができる。一般に、ペプチドミメティックは、アンチセンスポリヌクレオチドなどのパラダイムポリペプチドすなわち、生物活性または薬理学的活性を有するポリペプチドと構造的に類似しているが、以下からなる群より選択される結合と任意選択的に置換される1つまたは複数のペプチド結合を有する:例えば、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-シスおよびトランス、-COCH2-、-CHOHCH2-、および-CH2SO-。模倣物は、完全にアミノ酸の合成非天然アナログから構成され得るか、一部が天然ペプチドアミノ酸であり、且つ一部がアミノ酸の非天然アナログであるキメラ分子である。保存的置換によって模倣物の構造および/または活性が実質的に変化しない限り、模倣物はまた、任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を組み込むことができる。例えば、模倣組成物は、例えば、ギャップ結合媒介性細胞-細胞伝達などのコネキシンタンパク質の生物活性を下方制御することができる場合、本発明の範囲内に含まれる。用語組成物は、1つまたは複数の成分を含む生成物を含むことを意図する。本明細書中で使用される、用語、コネキシン活性のモジュレーターおよび調整は、その種々の形態で、コネキシンの発現または活性の全部または一部の阻害を含むことを意図する。このようなモジュレーターには、コネキシン機能または発現の小分子アゴニストおよびアンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖分子、およびRNAiポリヌクレオチド、ならびに遺伝子治療方法などが含まれる。用語同一率は、2つまたはそれ以上の配列比較で見出された配列類似性の比率をいう。同一率を、任意の適切なソフトウェアを使用して電子工学的に決定することができる。同様に、2配列間または配列のいずれかまたは両方の1つまたは複数の一部の類似性を、第1の配列と第2の配列との比較によって決定する。薬学的に許容可能なは、例えば、処方物の他の成分と適合し、且つそのレシピエントへの投与に適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤を意味する。一般に、用語タンパク質は、ペプチド結合によって連結した2つまたはそれ以上の各アミノ酸天然または非天然の任意のポリマーをいい、一方のアミノ酸またはアミノ酸残基のα炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が隣接アミノ酸のα炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合するようになった場合に得られる。これらのペプチド結合およびこれらを含む原子すなわち、α炭素原子、カルボキシル炭素原子およびその置換酸素原子、およびアミノ窒素原子およびその置換水素原子は、タンパク質のポリペプチド骨格を形成する。さらに、本明細書中で使用される、用語タンパク質には、用語ポリペプチドおよびペプチド時折、本明細書中で交換可能に使用することができるが含まれると理解される。同様に、タンパク質のフラグメント、アナログ、誘導体、および変異型を、本明細書中で、タンパク質ということができ、他で示さない限り、タンパク質であると見なすべきである。用語、タンパク質のフラグメントは、タンパク質の全アミノ酸残基未満を含むポリペプチドをいう。認識されるように、タンパク質のフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端、および内部天然のスプライシングなどによるで短縮されたタンパク質形態であってよく、変異型および/または誘導体であってもよい。タンパク質のドメインはフラグメントでもあり、天然に存在するタンパク質に対応する生化学的活性を付与するために必要なタンパク質のアミノ酸残基を含む。核酸分子またはポリペプチドなどの線状生体高分子である短縮分子は、分子のいずれかの末端の1つまたは複数の欠失、ならびに/または分子の非末端領域由来の1つまたは複数の欠失を有することができ、このような欠失は、約1~1500この連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失、好ましくは約1~500個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失、より好ましくは約1~300個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31~40、41~50、51~74、75~100、101~150、151~200、201~250、または251~299個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失が含まれるであり得る。用語ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチド間でハイブリッド形成する条件をいう。ストリンジェントな条件を、塩濃度、有機溶媒例えば、ホルムアミドの濃度、温度、および当該分野で周知の他の条件によって定義することができる。ストリンジェンシーを、塩濃度の減少、有機溶媒例えば、ホルムアミドの濃度の増加、またはハイブリッド形成温度の上昇によって増加させることができる。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mMNaCl未満および75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mMNaCl未満および50mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約250mMNaCl未満および525mMクエン酸三ナトリウム未満である。有機溶媒の非存在下で低ストリンジェンシーのハイブリッド形成を得ることができ、有機溶媒の存在下で例えば、少なくとも約35のホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約50ホルムアミド、高ストリンジェンシーのハイブリッド形成を得ることができる。ストリンジェントな温度条件には、通常、少なくとも30°C、より好ましくは少なくとも約37°C、最も好ましくは少なくとも約42°Cの温度が含まれる。種々のさらなるパラメータ例えば、ハイブリッド形成時間、界面活性剤例えば、ドデシル硫酸ナトリウムSDSの濃度、およびキャリアDNAの封入または排除は、当業者に周知である。必要に応じたこれらの種々の条件の組み合わせによって、種々のストリンジェンシーレベルが達成され、この組み合わせは当業者の範囲内である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件を、標的配列より約5°C~約20°Cまたは25°C低い融点Tm範囲の条件および標的と正確またはほぼ正確に相補的なプローブによって定義することもできる。本明細書中で使用される、融点は、二本鎖核酸分子集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のTmの計算方法は、当該分野で周知である例えば、BergerandKimmel,1987,MethodsInEnzymology,Vol.152:GuideToMolecularCloningTechniques,SanDiego:AcademicPress,Inc.andSambrooketal.,1989MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryを参照のこと。標準的な参考文献によって示されるように、Tm値の簡潔な推定値を、以下の式によって計算することができる:Tm=81.50.41GC核酸が1MNaCl水溶液中に存在する場合例えば、AndersonandYoung,QuantitativeFilterHybridizationinNucleicAcidHybridization1985を参照のこと。ハイブリッドの融点およびそれによるストリンジェントなハイブリッド形成条件は、プローブの長さおよび性質DNA、RNA、塩基組成、標的の性質溶液中または固定されているDNA、RNA、塩基組成など、ならびに塩および他の成分例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無の濃度などの種々の要因影響を受ける。これらの因子の効果は周知であり、標準的な参考文献で考察されている例えば、Sambrook,supraandAusubel,supraを参照のこと。典型的には、ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には、約0.01~1.0MナトリウムイオンpH7.0~8.3の塩濃度、短いプローブ例えば、10~50ヌクレオチドについては少なくとも約30°C、長いプローブ例えば、50ヌクレオチド超については少なくとも約60°Cの温度である。示すように、ストリンジェントな条件を、ホルムアミドなどの脱安定剤destabilizingagentの付加によって達成することもでき、この場合、より低い温度を使用することができる。本発明では、ポリヌクレオチドは、約50°C~約60°Cでの0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウムなどの高ストリンジェンシーの培地条件下でコネキシンmRNAとハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。用語治療有効量は、所望の応答例えば、研究者、獣医、医師、または他の臨床家によって模索される組織、系、動物、またはヒトの生物学的応答または医学的応答を誘発する本化合物の量を意味する。治療は、治療上の処置および予防的または防止的手段をいう。治療が必要な者には、既に障害を罹患している者および障害を防止すべき者が含まれる。用語ベクターは、細菌、酵母、無脊椎動物、および/または哺乳動物宿主細胞で機能的であり得るプラスミド、ファージ、またはウイルスへの核酸送達ためのプラスミド、ファージ、ウイルス、または他の系天然または合成の形態の核酸分子の増幅、複製、および/または発現のための送達体をいう。ベクターは、宿主細胞のゲノムDNAと無関係なままであり得るか、全てまたは一部がゲノムDNAに組み込まれていても良い。ベクターは、一般に、ベクターと適合する任意の宿主細胞で機能的であるために必要な要素を全て含むが、その必要はない。発現ベクターは、適切な条件下での外因性ポリヌクレオチド例えば、結合ドメイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を指示することができるベクターである。本明細書中に記載される、用語相同性およびホモログには、コネキシンポリヌクレオチド中の配列と相同であり得るポリヌクレオチド例えば、mRNAが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、典型的には、関連する配列例えば、少なくとも約15、20、30、40、50、100またはそれ以上の相同配列の連続するヌクレオチドと、少なくとも約70相同、好ましくは少なくとも80、90、95、97、または99相同である。相同性を、当該分野の任意の方法に基づいて計算することができる。例えば、UWGCGパッケージは、相同性計算に使用することができる例えば、そのデフォルト設定で使用されるBESTFITプログラムを備えているDevereuxetal.1984NucleicAcidsResearch12,p387-395。例えば、AltschulS.F.1993;JMolEvol36:290-300;Altschul,S.F.etal.;1990;JMolBiol215:403-10に記載のように、PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを使用して、典型的には、そのデフォルト設定での相同性またはラインナップ配列を計算することができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、NationalCenterforBiotechnologyInformationhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Lから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の数の閾値スコアTと適合するか満たすクエリ配列中の長さWの短いワードの同定による高スコアの配列対の同定を含む。Tは、隣接ワードスコア閾値をいうAltschuletal.,supra。これらの初期隣接ワードのヒットは、ヒットを含むHSPを見出すための検索開始のための種seedとして作用する。累積アラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿った両方向にワードヒットを拡大する。各方法へのワードヒットの拡大を以下の場合に停止した:累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xまで低下した場合;1つまたは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロまたはそれ以下に低下した場合;または配列のいずれかの末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度およびスピードを決定づける。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワード長W11、BLOSUM62スコアリング行列HenikoffandHenikoff1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919を参照のこと、アラインメントB50、期待値E10、M=5、N=4、および両鎖の比較を使用する。BLASTアルゴリズムは、2配列間の類似性の統計分析を行う例えば、KarlinandAltschul1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787を参照のこと。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然起こる可能性の指標が提供される最小和の確率smallestsumprobabilityPNである。例えば、第1の配列と比較した最小和の確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは0.01未満、最も好ましくは0.001未満である場合、配列は別の配列と類似すると見なされる。相同配列は、典型的には、少なくともまたはそれ未満約1、2、5、10、15、20またはそれ以上の変異置換、欠失、または挿入であり得るで関連配列と異なる。これらの変異を、相同性の計算に関して上記の任意の領域にわたって測定することができる。相同配列は、典型的には、バックグラウンドを有意に超えるレベルで元の配列と選択的にハイブリッド形成する。典型的には、中等度から高いストリンジェンシー条件例えば、約50°C~約60°Cでの0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウムを使用して、選択的ハイブリッド形成を行う。しかし、当該分野で公知の任意の適切な条件下でこのようなハイブリッド形成を行うことができるSambrooketal.1989,MolecularCloning:ALaboratoryManualを参照のこと。例えば、高ストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、60°Cで0.2×SSCが含まれる。より低いストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、60°Cで2×SCCが含まれる。細胞は、所望の適用に適切な任意の生きた細胞を意味する。細胞には、真核細胞および原核細胞が含まれる。用語遺伝子産物は、遺伝子から転写されたRNA分子または遺伝子によってコードされたかRNAから翻訳されたポリペプチドをいう。用語組換えは、インビトロで合成または操作されたポリヌクレオチド例えば、組換えポリヌクレオチド、細胞もしくは他の生物系で遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドの使用方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド組換えタンパク質をいう。したがって、組換えポリヌクレオチドを、その産生方法またはその構造のいずれかによって定義する。その産生方法に関して、過程は、例えば、典型的にはヌクレオチド配列の選択または産生でのヒトによる介入を含む組換え核酸技術の使用をいう。あるいは、これは、天然には連続しない2つまたはそれ以上のフラグメントの相互の融合を含む配列の生成によって作製されたポリヌクレオチドであり得る。したがって、例えば、任意の合成オリゴヌクレオチド過程を使用して得た配列を含むポリヌクレオチドである場合、任意の天然に存在しないベクターでの細胞の形質転換によって作製された産物が含まれる。同様に、組換えポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドから発現したポリペプチドである。組換え宿主細胞は、ベクター例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む細胞または目的のタンパク質を発現させるための組換え技術によって操作された細胞である。本発明は、創傷治癒例えば、手術関連創傷治癒および/または組織再造形への適用のためのギャップ結合関連タンパク質発現の部位特異的調整のための化合物および組成物の使用方法を含む。本発明は、例えば、レーザー手術と組み合わせた視覚障害の矯正、インビトロ角膜エンジニアリング、および角膜の再造形が望ましい直接的な眼の治療単独または眼に対して行われる手順例えば、手術と組み合わせて行われる治療が含まれるに有用である。直接的細胞-細胞伝達のアンチセンス調整を、組織中の細胞間の結合を直接または間接的に減少させる分子によって媒介することが好ましい。このような分子には、特異的コネキシンイソ型を標的化してタンパク質イソ型の翻訳を減少させ、細胞ギャップ結合の機能を阻害する、アンチセンスデオキシヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、RNAi、およびデオキシリボザイムが含まれる。これらのアンチセンス化合物の投与により、コネキシン発現が下方制御される部位でギャップ部結合媒介性細胞-細胞伝達が減少する。コネキシンは、ギャップ結合媒介細胞-細胞シグナル伝達で重要な役割を果たす。コネキシンの過剰発現は、術後瘢痕および外傷後誘導性組織再造形に関連する。本発明の一定の実施形態によれば、コネキシンは、角膜外傷および術後組織再造形に関連する副作用の治療ならびに直接的細胞-細胞伝達の局所的破壊が望ましい疾患および障害の有用な標的を表す。特に、コネキシン発現の調整は、組織再造形/組織エンジニアリングへの適用のためのギャップ結合関連タンパク質発現の部位特異的調整に有用であり得る。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、眼病用手順または手術例えば、白内障手術、眼内レンズ手術、角膜移植手術、ならびにいくつかの緑内障手術型および本明細書中に記載の他の手順などに関連するコネキシンの調整のために使用することができる。一定の実施形態では、コネキシン調整を、後眼部網膜およびレンズが含まれるに影響を与える眼科疾患で適用することができる。本発明の別の態様では、コネキシンの調整を、前眼部角膜、結膜、および強膜が含まれるに影響を与える眼科疾患で適用することができる。本発明の状況では、後眼部障害には、黄斑円孔および変性、網膜裂孔、糖尿病網膜症、硝子体網膜症、および種々の障害が含まれる。また、本発明の状況では、レンズ障害には、白内障が含まれ得る。さらに別の態様では、角膜障害は、放射状角膜切除術の続発症、眼乾燥、ウイルス性結膜炎、潰瘍性結膜炎、および創傷治癒例えば、角膜上皮創傷における瘢痕形成、およびシェーグレン症候群などの屈折障害であることが意図される。本発明は、コネキシンをコードする核酸分子機能を調整し、最終的にコネキシンの産生量を調整するのに使用されるアンチセンス化合物特に、オリゴヌクレオチドを開示する。コネキシンをコードする核酸好ましくはmRNAと特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを得ることによってこれを行う。オリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物とハイブリッド形成するその相補的核酸標的との間のこの関係を、一般に、アンチセンスという。本明細書中で使用される、選択された核酸標的へのオリゴヌクレオチドの標的化は、典型的には、多段階過程である。この過程は、通常、その機能が調整される核酸配列の同定から開始される。これは、例として、発現が特定の病状に関連する細胞遺伝子または遺伝子から作製したmRNAであり得る。本発明では、標的は、コネキシンをコードする核酸、言い換えれば、コネキシンをコードする遺伝子またはコネキシン遺伝子から発現したmRNAである。コネキシンをコードするmRNAは、現在、好ましい標的である。標的化過程はまた、遺伝子発現が調整されるようなアンチセンス相互作用のための核酸配列内の部位の決定を含む。本発明の状況では、メッセンジャーRNAは、3文字表記を使用したタンパク質をコードするための情報だけでなく、5’非翻訳領域、3’非翻訳領域、5’キャップ領域、およびイントロン/エクソン連結点リボヌクレオチドとして公知の領域を形成する関連リボヌクレオチドも含む。したがって、本発明にしたがって、これらの関連リボヌクレオチドならびに情報リボヌクレオチドを全部または部分的に標的化するオリゴヌクレオチドを処方することができる。したがって、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位領域、翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域、イントロン/エクソン連結部、コード配列、翻訳終結コドン領域、または5’もしくは3’非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリッド形成することができる。翻訳開始コドンが、典型的には、5’-AUG転写mRNA分子中;対応するDNA分子中では5’-ATGであるので、翻訳開始コドンは、AUGコドン、開始コドン、またはAUG開始コドンともいう。少数の遺伝子は、インビボで機能することが示されているRNA配列を有する翻訳開始コドン5’-GUG、5’-UUG、または5’-CUGおよび5’-AUA、5’-ACG、および5’-CUGを有する。したがって、用語翻訳開始コドンおよび開始コドンは、典型的には、どの場合にも開始アミノ酸がメチオニン真核生物またはホルミルメチオニン原核生物である場合でさえ、多数のコドン配列を含み得る。真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子が2つまたはそれ以上の別の開始コドンを有することができ、そのうちのいずれか1つを特定の細胞型もしくは組織または特定の条件下で翻訳開始のために優先的に使用することができることも当該分野で公知である。本発明の状況では、開始コドンおよび翻訳開始コドンは、このようなコドンの配列と無関係にコネキシンをコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳開始させるためにインビボで使用されるコドンをいう。遺伝子の翻訳終結コドンまたは終止コドンが3つの配列のうちの1つすなわち、5’-UAA、5’-UAG、および5’-UGA対応するDNA配列は、それぞれ5’-TAA、5’-TAG、および5’-TGAであるを有し得ることも当該分野で公知である。用語開始コドン領域、AUG領域、および翻訳開始コドン領域は、翻訳開始コドンからいずれかの方向ですなわち、5’または3’約25~約50の連続ヌクレオチドを含むこのようなmRNAまたは遺伝子の一部をいう。この領域は、好ましい標的領域である。同様に、用語終止コドン領域および翻訳終結コドン領域は、翻訳終結コドンからいずれかの方向ですなわち、5’または3’約25~約50の連続ヌクレオチドを含むこのようなmRNAまたは遺伝子の一部をいう。この領域は、好ましい標的領域である。当該分野で公知の読み取り枠ORFまたはコード領域は、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域をいい、有効に標的化することができる領域でもある。他の好ましい標的領域には、翻訳開始コドンから5’方向のmRNAの一部をいうことが当該分野で公知であり、それにより遺伝子上のmRNAまたは対応するヌクレオチドの5’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間にヌクレオチドを含む5’非翻訳領域5’UTR、ならびに翻訳終結コドンから3’方向のmRNAの一部をいうことが当該分野で公知であり、それにより遺伝子上のmRNAまたは対応するヌクレオチドの翻訳終結コドンと3’末端との間にヌクレオチドを含む3’非翻訳領域3’UTRが含まれる。mRNAの5’キャップは、5’-5’三リン酸結合を介してmRNAの5’のほとんどの残基に連結したN7メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は、5’キャップ構造自体およびキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと見なされる。5’キャップ領域も好ましい標的領であり得る。いくつかの真核生物mRNA転写物が直接翻訳されるにもかかわらず、多くが、イントロンとして公知の1つまたは複数の領域を含み、イントロンは、プレmRNA転写物から切り出されて1つまたは複数の成熟mRNAを生成する。残存するしたがって、翻訳された領域は、エクソンとして公知であり、相互にスプライシングされてmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位すなわち、エクソン-エクソンまたはイントロン-エクソン連結点も好ましい標的領域であってよく、異常なスプライシングが疾患に関連する状況または特定のmRNAスプライス産物の過剰発現が疾患に関連する状況で特に有用である。再編成または欠失による異常な融合連結点も好ましい標的である。選択的にスプライシングされたmRNA中の特定のエクソンの標的化も好ましいかもしれない。イントロンも有効であり得るので、例えば、DNAまたはプレmRNAに標的化したアンチセンス化合物の好ましい標的領域であり得ることも見出された。本発明の状況では、アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、コネキシンmRNAの全部または一部とハイブリッド形成することができる。典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンmRNAのリボゾーム結合領域またはコード領域とハイブリッド形成する。ポリヌクレオチドは、コネキシンmRNAの全部または一部の領域に相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンmRNAの全部または一部の正確な相補物であり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および/または翻訳を阻害し得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、コネキシン遺伝子の転写および/または翻訳の特異的インヒビターであり、他の遺伝子の転写および/または翻訳を阻害しない。産物は、iコード配列の5’、および/またはiiコード配列、および/またはiiiコード配列の3’のいずれかでコネキシン遺伝子またはmRNAに結合することができる。一般に、アンチセンスポリヌクレオチドにより、減少すべき細胞中のコネキシンmRNAおよび/またはタンパク質が発現する。アンチセンスポリヌクレオチドは、一般に、コネキシンmRNAに対してアンチセンスである。このようなポリヌクレオチドは、コネキシンmRNAとハイブリッド形成することができ、コネキシンmRNA代謝の1つまたは複数の態様転写、mRNAプロセシング、核からのmRNA輸送、翻訳、またはmRNA分解が含まれるの阻害によってコネキシン発現を阻害することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、コネキシンmRNAとハイブリッド形成してmRNAの翻訳の直接阻害および/または不安定化を引き起こし得る二重鎖を形成する。このような二重鎖は、ヌクレアーゼによる分解に感受性を示し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNAとのハイブリッド形成は、1つまたは複数のmRNAの正常な機能を阻害する。阻害されるmRNAの機能には、全ての生体機能例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAからタンパク質の翻訳、1つまたは複数のmRNA種を生成するためのRNAのスプライシング、およびRNAに関与し得る触媒活性などが含まれる。RNAへの特異的タンパク質の結合を、RNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって阻害することもできる。mRNA機能の全体的な阻害効果は、コネキシン発現の調整である。本発明の状況では、調整には、阻害または刺激すなわち、発現の増加または減少のいずれかが含まれる。この調整を、当該分野で日常的な方法例えば、本願の実施例で教示のmRNA発現のノーザンブロットアッセイ、逆転写PCR、またはタンパク質発現のウェスタンブロットもしくはELISA、またはタンパク質発現の免疫沈降アッセイで測定することができる。本願の実施例に教示のように、細胞増殖または腫瘍細胞成長に対する効果を測定することもできる。ここでは阻害が好ましい。一旦標的部位が同定されると、標的と十分に相補的なすなわち、非常に十分な特異性でハイブリッド形成して所望の調整が得られるオリゴヌクレオチドを選択する。アンチセンス核酸DNA、RNA、修飾、およびアナログなどを、任意の適切な核酸産生方法を使用して作製することができる。他のコネキシンタンパク質に指向するオリゴヌクレオチドを、任意の認識されたアプローチ例えば、コンピュータプログラムMacVectorおよびOligoTechOligosetc.Eugene,Oregon,USAなどによってそのヌクレオチド配列の用語に関して選択することができる。このような合成装置は、MacVectorおよびOligoTechOligosetc.Eugene,Oregon,USAを含むいくつかの販売店を通じて利用可能である。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般的方法については、AntisenseRNAandDNA,D.A.Melton,Ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY1988を参照のこと。Dagleetal.,NucleicAcidsResearch,19:18051991も参照のこと。アンチセンス療法については、例えば、Uhlmannetal.,Chem.Reviews,90:543-5841990を参照のこと。典型的には、ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、発現の阻害が望ましいコネキシンで知られている。好ましくは、アンチセンス化合物は、1つまたは複数の特異的コネキシンアイソタイプを標的化する。アンチセンス化合物によって標的化することができるコネキシンの特異的アイソタイプには、43、37、31.1、26、および本明細書中に記載の他のアイソタイプが含まれるが、これらに限定されない。標的化されたコネキシンはヒトであることが好ましいが、必要というわけではない。コネキシンは、例えば、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有し得る。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも8個の核酸塩基を標的化する。一定の他の実施形態では、第2のアンチセンス化合物を被験体の眼に投与し、第2のアンチセンス化合物は配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする少なくとも約8個の核酸塩基を標的化し、第2のアンチセンス化合物は、第1のアンチセンス化合物と異なるコネキシンを標的化する。コネキシン標的は、操作または再造形すべき組織の型に依存して変化し、本発明で使用されるアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキシンタンパク質に依存する。オリゴヌクレオチドによって標的化されるコネキシンタンパク質は、下方制御が指示される部位に依存する。これは、コネキシンサブユニット組成の点から全身の異なる部位でのギャップ結合の不均一な構成を反映する。しかし、いくつかのコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関して他のものより偏在する。本明細書中に記載されるように、コネキシン43などの角膜関連コネキシンがいくつかの実施形態で好ましい。したがって、本発明の状況では、オリゴヌクレオチドは、単独または組み合わせて、角膜エンジニアリングまたは再造形への適用に適切なコネキシン43、26、37、30、および/または31.1を標的化する配列番号1~11を参照のこと。本発明の1つの態様では、オリゴデオキシヌクレオチドは、未修飾ホスホジエステルオリゴマーであり得る。本発明の別の態様では、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。個別のコネキシンタンパク質を標的化するオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することができる例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の異なるコネキシンを標的化することができることも意図される。例えば、コネキシン43および1つまたは複数の他のコネキシンファミリーのメンバーコネキシン26、30、31.1、37、および43などを標的化するODNを組み合わせて使用することができる。各アンチセンスポリヌクレオチドは特定のコネキシンに特異的であり得るか、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上の異なるコネキシンを標的化ことができることも意図される。特異的ポリヌクレオチドは、一般に、コネキシン遺伝子またはコネキシン間で保存されないmRNA中の配列を標的化するのに対して、非特異的ポリヌクレオチドは保存配列を標的化する。したがって、一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ヒトコネキシン26、コネキシン30、コネキシン31.1、ヒトコネキシン37、コネキシン43をコードする核酸分子の少なくとも8個の核酸塩基を標的化し、アンチセンス化合物は、患者の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害する。一定の実施形態では、コネキシンをコードする核酸分子は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有する。一定の実施形態では、組成物は、2つまたはそれ以上のヒトコネキシンタンパク質を標的化し、2つまたはそれ以上のヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害する。さらなる一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。選択されたコネキシン43に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、GTAATTGCGGCAAGAAGAATTGTTTCTGTC配列番号1、GTAATTGCGGCAGGAGGAATTGTTTCTGTC配列番号2、およびGGCAAGAGACACCAAAGACACTACCAGCAT配列番号3が含まれる。コネキシン26に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、配列TCCTGAGCAATACCTAACGAACAAATA配列番号4を有する。選択されたコネキシン37に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、5’CATCTCCTTGGTGCTCAACC3’配列番号5および5’CTGAAGTCGACTTGGCTTGG3’配列番号6が含まれる。選択されたコネキシン30に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、5’CTCAGATAGTGGCCAGAATGC3’配列番号7および5’TTGTCCAGGTGACTCCAAGG3’配列番号8が含まれる。選択されたコネキシン31.1に対する例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドには、5’GGTCCGAGCCCAGAAAGATGAGGTC3’配列番号9;5’AGAGGCGCACGTGAGACAC3’配列番号10および5’TGAAGACAATGAAGATGTT3’配列番号11が含まれる。さらなる実施形態では、以下の配列から選択されたオリゴデオキシヌクレオチドは、コネキシン43発現の下方制御に特に適切である。さらに別の実施形態では、以下の配列から選択されるオリゴデオキシヌクレオチドは、コネキシン26、37、30、および31.1に特に適切である。本明細書中に提供したアンチセンス化合物は、一般に、約8~約40個の核酸塩基すなわち、約8~約40個の連結ヌクレオチドを含み、より典型的には、約12~約40個の核酸塩基を含み、より典型的には約30個の核酸塩基を含む。ポリヌクレオチドを含むアンチセンス化合物は、少なくとも40ヌクレオチド長例えば、少なくとも60または少なくとも約80ヌクレオチド長、100、200、300、400、500、1000、2000、または3000、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。適切なアンチセンス化合物には、例えば、30量体のODNが含まれる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。他の実施形態では、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約10個、少なくとも約12個、少なくとも約14個、少なくとも約16個、少なくとも約18個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約30個、少なくとも約35個の核酸塩基を標的化する。ヒトコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも8個と35との間の核酸塩基を標的化するオリゴヌクレオチドが含まれるアンチセンス化合物のサイズは、8核酸塩基長またはそれ以上、8個と100個との間の核酸塩基長、8個と50個との間の核酸塩基長、8個と40個との間の核酸塩基長、10個と50個との間の核酸塩基長、12個と50個との間の核酸塩基長、14個と50個との間の核酸塩基長、16個と50個との間の核酸塩基長、18個と50個との間の核酸塩基長、20個と50個との間の核酸塩基長、25個と50個との間の核酸塩基長、および15個と35個との間の核酸塩基長、であり得る。本発明の他のアンチセンス化合物は、より小さいかより大きいサイズ例えば、100核酸塩基長を有するであり得る。アンチセンス化合物には、アンチセンスオリゴヌクレオチドODN、アンチセンスポリヌクレオチド、デオキシリボザイム、モルホリノオリゴヌクレオチド、RNAi分子またはそのアナログ、siRNA分子またはそのアナログ、PNA分子またはそのアナログ、DNAザイムまたはそのアナログ、5’末端変異Ul核内低分子RNAおよびそのアナログが含まれる。本明細書中に提供されるアンチセンス化合物は、オリゴデオキシヌクレオチドODNの使用を含み得る。ODNは、一般に、20ヌクレオチド長であり、プレmRNAおよびmRNAとのハイブリッド形成によって作用してリボヌクレアーゼHRNアーゼHの基質を生成し、この基質は、形成されたRNA-DNA二重鎖のRNA鎖を特異的に分解する。RNアーゼHの作用を妨害する方法で修飾された場合、ODNは、立体障害を介してmRNAの翻訳を阻害するか、プレmRNAのスプライシングを阻害することができる。ODNおよびその修飾物を使用して、三重らせんの形成による転写阻害についてdsDNAが標的化されている。認識された自動化合成方法によってODNを得ることができ、任意の配列のODNを得てアンチセンス塩基対合を介して遺伝子発現を遮断することは比較的容易である。一定の態様では、ODNのホスホジエステル骨格を、標的特異的な遺伝子発現の遮断薬としてのその有効性を増加させるように修飾することができる。ODNの安定性を改善し、その細胞取り込みを増強するために、これらの骨格を修飾した。最も広く使用されている修飾は、隣接酸素を硫黄原子に置換してホスホロチオエートODNを作製する修飾である。少なくとも1つのホスホロチオエートODNは、FDAで承認されており、いくつかの他のホスホロチオエートアンチセンスODNは、種々の癌および炎症疾患について初期段階の臨床試験が行われている。遺伝子機能の遮断に関するODNの作用機構は、ODNの骨格に依存して変化するBranch,A.D.Hepatology24,1517-15291996;Dias,N.andStein,C.A.Mol.CancerThor.1,347-3552002;Stein,C.A.andCohen,J.S.,CancerRes.48,2659-26681988;Zon,G.Ann.N.Y.AcadSci.,616,161-1721990。正味の負電荷ODNホスホジエステルおよびホスホロチオエートなどは、標的mRNAのRNアーゼH媒介性切断を誘発する。その電荷の不足または標的RNAを使用して形成されたヘリックス型によってRNアーゼHを採用しない他の骨格修飾を、立体障害ODNと分類することができる。広く使用されているこの後者の群のメンバーには、モルホリノ、U-O-メチル、2’’-O-アリル、固定核酸lockednucleicacid、およびペプチド核酸PNAが含まれる。他の阻害標的のうちで、これらのODNは、スプライシング、翻訳、核-細胞質輸送、および翻訳を遮断することができる。別の態様では、コネキシン発現の調整は、リボザイムの使用を含む。リボザイムは、完全なタンパク質の非存在下でさえも酵素として作用するRNA分子である。リボザイムは、高い特異性で共有結合を破壊および/または形成し、それにより、何桁もの大きさで標的化された反応の自発的速度を加速させる触媒活性を有する。リボザイムは、ワトソン-クリック塩基対合を介してRNAに結合し、ホスホジエステル骨格の加水分解の触媒によって標的RNAを分解するように作用する。いくつかの異なるリボザイムクラスが存在し、ハンマーヘッドリボザイムは最も広く研究されている。その名前が意味するように、ハンマーヘッドリボザイムは、その標的mRNAとハイブリッド形成した場合に固有の二次構造を形成する。リボザイム内の触媒的に重要な残基は、標的RNA切断部位に隣接した標的相補配列に隣接している。リボザイムによる切断には、2価のイオンマグネシウムなどが必要であり、標的RNAの構造および接近可能性にも依存する。局在化シグナルの使用による細胞内でのリボザイムの標的RNAとの同時局在化により、そのサイレンシング効率が非常に増加する。ハンマーヘッドリボザイムは、化学合成するのに十分に短く、ベクターから転写することができ、それにより、細胞内でリボザイムを連続的に産生可能である。テトラヒメナの自己スプライシンググループIのイントロンおよびRNアーゼのRNA部分についてのRNAの触媒として作用する能力が最初に証明された。これら2つのRNA酵素の発見後、酵母、真菌、および植物のミトコンドリアならびに葉緑体の自己スプライシンググループIIイントロン、一本鎖植物ウイロイドおよびウイロイドRNA、デルタ肝炎ウイルス、およびアカパンカビミトコンドリア由来のサテライトRNAに関連するRNA媒介性触媒が見出されている。リボザイムは天然に存在するが、シス同一核酸鎖上またはトランス非共有結合核酸の特定の配列の発現および標的化のために人為的に操作することもできる。インビトロ分泌プロトコールの使用およびRNA以外の基質に対して作用する新規のリボザイムモチーフの生成によって新規の生化学活性が得られる。テトラヒメナのグループIイントロンは、ゲノム研究および可能な治療薬として有用となるトランス反応形態に変換される第1のシス切断リボザイム本発明者らは、イントロン/リボザイムと呼ぶであった。トランススプライシング反応では、標的化されたmRNAの欠損エクソンを、イントロン/リボザイムに共有結合する正確なエクソンと交換することができる。これは、トランスエステル化反応において標的転写物の5’’末端に共有結合することができるようなイントロンに結合したエクソンが標的mRNAへの塩基対合によって配置されるスプライシング反応によって起こる。この反応を使用して、野生型配列を鎌状細胞グロビン転写物および変異p53転写物にトランススプライシングし、筋緊張性ジストロフィー対立遺伝子中のプロテインキナーゼ転写物の3’’-UTR中の拡大expandedトリプレットと置換する。エンドリボヌクレアーゼであるRNアーゼPは、自然界の至るところで見出される。この酵素は、RNAおよび1つまたは複数のタンパク質成分単離される生物に依存するを有する。大腸菌および枯草菌の酵素由来のRNA成分は、一定の塩およびイオン条件下でのタンパク質トレーダーproteintraderの非存在下で部位特異的切断因子として作用することができる。ヒトおよび細菌の酵素の基質要件の研究により、いずれかの酵素の最小基質はメッセンジャーRNA分子のセグメントに類似することが示されている。この構造を、標的RNAと対合して試験管および細胞の両方においてRNアーゼP媒介性部位特異的切断の基質としての役割を果たす固有にデザインしたアンチセンスRNAによって模倣することができる。アンチセンス成分をRNアーゼPRNAに共有結合し、それにより、酵素が目的の標的RNAのみに指向することができることも示されている。研究者は、アンチセンスRNAのデザインにおいてこの性質を活用しており、標的の部位特異的切断を刺激し、細胞培養物中の単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスの標的化阻害のために目的の標的mRNAと対合させる。多数の小植物病原性RNAウイロイド、サテライトRNA、およびウイルソイド、アカパンカビミトコンドリアDNAプラスミド由来の転写物、および動物デルタ肝炎ウイルスは、タンパク質の非存在下でインビトロにて自己切断反応を受ける。この反応には、中性pHおよびMg2が必要である。自己切断反応は、複製のインビボローリングサークル機構の不可欠な部分である。これらの自己切断RNAを、切断部位を形成する配列および二次構造による群にさらに分類することができる。小リボザイムは一本鎖植物ウイロイドおよびウイルソイドRNA中に見出されるモチーフに由来している。共有する二次構造および保存されたヌクレオチド組に基づいて、用語ハンマーヘッドは、この自己切断ドメインの1つの群に分類されている。ハンマーヘッドリボザイムは、30ヌクレオチドから構成される。ハンマーヘッド触媒ドメインの簡潔さにより、トランス作用性リボザイムのデザインで一般に選択されている。ワトソン-クリック塩基対合を使用して、任意の標的RNAを切断するようにハンマーヘッドリボザイムをデザインすることができる。切断部位の要件は比較的簡素なことであり、実質的に任意のUH配列モチーフはU、C、またはAであるを標的化することができる。タバコ輪点サテライトRNAのマイナス鎖で最初に同定された第2の植物由来の自己切断モチーフは、ヘアピンまたはペーパークリップと名付けられている。ヘアピンリボザイムは、2’’、Y-環状リン酸、および5’’-ヒドロキシT1末端を生成する可逆的反応においてRNA基質を切断する-この触媒モチーフの操作バージョンもトランスで種々の標的の複数のコピーを切断して代謝回転する。ヘアピンの基質要件には、Gのすぐ上流が切断されるGUC含まれる。ヘアピンリボザイムは切断反応でより頻繁に使用されるにもかかわらず、ヘアピンリボザイムはライゲーション反応も触媒する。特定の細胞およびウイルス標的の下方制御のためにハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの両方が多数適用されている。HaseloffandGerlachは、正確な標的と塩基対合するアームの修飾によって任意の標的を切断するように操作することができるハンマーヘッドモチーフをデザインしたHaseloffandGerlach;Nature.1988Aug18;3346183:585-91。Ramemzaniらは、抗ヒト免疫不全ウイルスHIVgagリボザイムを発現するように操作した細胞を使用してウイルスの遺伝子発現および複製が事実上完全に阻害された研究において、このハンマーヘッドリボザイムモチーフが潜在的に治療に適用されることを証明したRamezaniA.etal.,FrontiersinBioscience7:a,29-36;2002。別の態様では、コネキシン発現の調整は、触媒DNAまたはDNAザイムの使用を含む。RNA標的を部位特異的に切断することができる小DNAを、インビトロ進化によって作製した公知のDNA酵素が天然に存在しないので。異なる切断部位特異性を有する2つの異なる触媒モチーフを同定した。最も一般的に使用される10~20種の酵素は、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムと同様にワトソン-クリック塩基対合を介してそのRNA基質に結合して標的RNAを部位特異的に切断して、2;3’’環状リン酸および5’’-OH末端が得られる。標的mRNAの切断によって破壊され、DNAザイムを再利用して複数の基質を切断する。触媒DNAは比較的安価に合成され、良好な触媒特性を有し、それにより、アンチセンスDNAまたはリボザイムのいずれかの基質に有用である。細胞培養におけるDNAザイムのいくつかの適用が公開されており、vegFmRNAの阻害およびそれによる血管形成の防止、ならびに慢性骨髄性白血病に特徴的なbcr/abl融合転写物の発現の阻害が含まれる。触媒DNAを外因的に送達させ、キャリアの非存在下での全身送達を最適にするために骨格修飾することができる。本発明の別の態様で、構成性コネキシン遺伝子の調整は、モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドの使用を含む。Summerton,J.E.andWeller,D.D.の米国特許第5,034,506号。本発明の別の態様では、アンチセンスポリヌクレオチドを、ヌクレアーゼ耐性を増強して細胞侵入効率を増加させるために化学修飾することができる。例えば、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび適切に配置した修飾オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのセグメントを含む混合骨格オリゴヌクレオチドMBOを使用することができる。MBOは、ホスホロチオエート結合および他の修飾オリゴヌクレオチドの他のセグメントメチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、N3’P5’-ホスホラミデート、およびオリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートなどならびに非イオン性でヌクレアーゼまたは2’-O-アルキルオリゴリボヌクレオチドに強い耐性を示すその2’-O-アルキルアナログおよび2’-O-メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートを有する。当該分野で公知のように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。このような複素間塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドのために、リン酸基を、糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドの形成では、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシドに共有結合して線状ポリマー化合物を形成する。この線状ポリマー構造の各末端が次々にさらに結合して環状構造を形成することができるが、一般に、開いた線状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成をいう。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は、3’から5’ホスホジエステル結合である。本発明で有用なアンチセンス化合物には、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれ得る。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子が保持されたものおよび骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本発明の状況では、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドと見なすことができる。本発明で有用な修飾オリゴヌクレオチド骨格を有するアンチセンス化合物には、例えば、通常の3’-5’結合を有するホスホチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが含まれる、ホスフィネート、ホスホラミデート3’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートが含まれる、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの2’-5’結合アナログおよび隣接するヌクレオシド単位の対が3’-5’と5’-3’または2’-5’と5’-2’とで結合した極性が逆のものが含まれ得る。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。1つの態様では、リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格が、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有することが意図される。これらには、モルホリノ結合一部がヌクレオシドの糖部分から形成されている;シロキサン骨格;硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファメート骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;および混合N、O、S、およびCH2構成部分を有する他の骨格を有するものが含まれる。1つの態様では、オリゴヌクレオチド模倣物糖結合およびヌクレオシド間結合の両方すなわち、ヌクレオチド単位の骨格を新規の基に置換することが意図される。適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために、塩基単位を保持する。1つのこのようなオリゴマー化合物優れたハイブリッド形成特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣物を、ペプチド核酸PNAという。PNA化合物では、オリゴヌクレオチドの糖-骨格を、アミド含有骨格特に、アミノエチルグリシン骨格に置換する。核酸塩基を保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合させる。PNAのさらなる教示を、Nielsenetal.Science,1991,254,1497-1500に見出すことができる。1つの態様では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド特に、--CH2--NH--O--CH2--、--CH-2NCH3--O--CH--2メチレンメチルイミノまたはMMI骨格、--CH2--O--NCH3--CH2-、--CH2--NCH3--NCH3--CH2--、および--O--NCH3--CH2--CH2--式中、未変性のホスホジエステル骨格を、--O--P--O--CH2--と示すを意図する。さらに別の態様では、モルホリノおよびアミド骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも意図する。別の態様では、修飾オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の置換糖部分も含み得ることを意図する。例えば、2’位に以下のうちの1つを含むオリゴヌクレオチド:OH;F;O--、S--、またはN-アルキル、O-アルキル-O-アルキル、O--、S--、またはN-アルケニル、またはO--、S--、またはN-アルキニル式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルを、Cl~C10アルキルまたはC2~C10アルケニルおよびアルキニルに置換しても置換しなくても良い。O[CH2nO]mCH3、OCH2nOCH3、OCH22ONCH32、OCH2nNH2、OCH2nCH3、OCH2nONH2、およびOCH2nON[CH2nCH3]2式中、nおよびmは1~約10であるが特に好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位に以下のうちの1つを含み得る:Cl~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルもしくは0-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基、類似の性質を有する他の置換基。好ましい修飾には、2’-メトキシエトキシ2’-O-2-メトキシエチルまたは2’-MOEとしても公知の2’--O--CH2CH2OCH,3Martinetal.Helv.Chim.Acta1995,78,486-504すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。他の修飾には、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2’-DMAOEとしても公知のOCH22ONCH32基、および2’-ジメチルアミノ-エトキシエトキシ2’-DMAEOEすなわち、2’--O--CH2--O--CH2--NCH22が含まれる。修飾には、2’-メトキシ2’--O--CH3、2’-アミノプロポキシ2’--OCH2CH2CH2NH2、および2’-フルオロ2’-Fが含まれ得ることがさらに意図される。オリゴヌクレオチドの他の位置特に、3’末端ヌクレオチド上の3’末端の糖の3’位または2’-5’結合オリゴヌクレオチド中、および5’末端ヌクレオチドの5’位で類似の修飾を行うこともできる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。別の態様では、オリゴヌクレオチドが核酸塩基当該分野でしばしば塩基と呼ばれるの修飾または置換を含み得ることを意図する。本明細書中で使用される、未修飾または天然の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニンAおよびグアニンG、ピリミジン塩基であるチミンT、シトシンC、およびウラシルUが含まれる。修飾核酸塩基には、以下などの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる:5-メチルシトシン5-me-Cまたはm5c、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒドロキサンチン、2-アミノカデニン、6-メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、および2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル、および他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示の核酸塩基、ConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering1990,pages858-859,Kroschwitz,J.JohnWileySonsに開示の核酸塩基、Englischetal.AngewandteChemie,InternationalEdition1991,30,613-722に開示の核酸塩基、およびSanghvi,Y.S.,Chapter15,AntisenseResearchandApplications1993,pages289-302,Crooke,S.T.andLebleu,B.,ed.,CRCPressに開示の核酸塩基が含まれる。これらの一定のヌクレオチドは、オリゴマー化合物の結合親和性の増加に特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2、N-6、およびO-6置換プリン、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンが含まれるが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性が0.6~1.2°C増加することが示されおりSanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,eds.,AntisenseResearchandApplications1993,CRCPress,BocaRaton,pages276-278、現在のところ好ましい塩基置換であり、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、さらにより好ましい。別の態様では、オリゴヌクレオチドの修飾が、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強するオリゴヌクレオチドへの1つまたは複数の一部または抱合体の化学結合を含むことを意図する。このような部分には、以下が含まれるが、これらに限定されない:コレステロール部分などの脂質部分Letsingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1989,86,6553-6556、コール酸Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,4,1053-1059、チオエーテル例えば、ヘキシル-S-トリチルチオールManoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.1992,660,306-309;Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Let.1993,3,2765-2770、チオコレステロールOberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.1992,20,533-538、脂肪族鎖例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ.1991,10,1111-1118;Kabanovetal.,FEBSLett.1990,259,327-330;Svinarchuketal.,Biochimie1993,75,49-54、リン脂質例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネートManoharanetal.,TetrahedronLett.1995,36,3651-3654;Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.1990,18,3777-3783、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖Manoharanetal.,NucleosidesNucleotides1995,14,969-973、アダマンタン酢酸Manoharanetal.,TetrahedronLett.1995,36,3651-3654、パルミチル部分Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta1995,1264,229-237、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.1996,277,923-937。キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドの使用も意図する。本発明の状況で、キメラなオリゴヌクレオチドまたはキメラは、それぞれ少なくとも1つのヌクレオチドから構成された2つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解耐性を増加させ、細胞取り込みを増加させ、そして/または標的核酸に対する結合親和性を増加させるためにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも1つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化によってRNA標的が切断され、それにより、遺伝子発現のアンチセンス阻害効率が非常に増強される。RNA標的の切断を、ゲル電気泳動および必要に応じて当該分野で公知の関連核酸ハイブリッド技術によって日常的に検出することができる。RNA標的のこのRNアーゼH媒介性切断は、核酸を切断するためのリボザイムの使用とは異なる。キメラオリゴヌクレオチドの例には、通常、互いに化学的に等価であるがギャップが異なる2つの領域に隣接した中央領域を有する3つの異なる領域が存在するギャップマーgapmerが含まれるが、これらに限定されない。ギャップマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分ギャップがRNアーゼHの基質としての役割を果たし、好ましくは、2’-デオキシヌクレオチドから構成される一方で、隣接部分5’および3’ウィングが標的RNA分子に対する親和性がより高いが、ヌクレアーゼ活性を支持することができないように修飾された例えば、フルオロまたは2’-O-メトキシエチル置換オリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、糖の修飾を有するものだけでなく、修飾骨格例えば、ホスホロチオエートP=SおよびホスホジエステルP=O骨格結合領域またはMMIおよびP=S骨格結合領域を有するオリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドも含まれ得る。他のキメラには、当該分野でヘミマーhemimerとしても公知のウィングマーwingmerすなわち、2つの異なる領域を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。ウィングマーの好ましい例では、オリゴヌクレオチドの5’部分はRNアーゼHの基質としての役割を果たし、好ましくは、2’-デオキシヌクレオチドから構成される一方で、標的RNA分子に対する親和性がより高いが、ヌクレアーゼ活性を支持することができないような様式例えば、2’-フルオロまたは2’-O-メトキシエチル置換で3’部分が修飾されているか、その逆である。1つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分に2’-O-メトキシエチル2’--O--CH2CH2OCH3修飾を含む。この修飾により、その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方が増加することが示されている。本発明によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの1つ、複数、または全てが2’-O-メトキシエチル--O--CH2CH2OCH3修飾を含み得る。2’-O-メトキシエチル修飾を有する複数のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の任意のヌクレオチドサブユニットにこのような修飾を有することができ、キメラオリゴヌクレオチドであり得る。21-O-メトキシエチル修飾とは別であるか、これに加えて、アンチセンス効率、有効性、または標的親和性を増強する他の修飾を含むオリゴヌクレオチドも意図する。本発明はまた、例えば、コネキシンRNAの折りたたみ領域またはコネキシン遺伝子中の二本鎖または二重鎖コネキシン核酸に結合して三重らせんを含むか、三重鎖の核酸を形成するポリヌクレオチド例えば、DNA、RNA、またはPNAなどを提供する。三重らせんの形成により、例えば、コネキシン遺伝子の転写を防止し、それにより、細胞内のコネキシン活性を減少または排除ことによってコネキシン発現が阻害される。いかなる特定の機構に拘束されることを意図しないが、三重らせん対合が、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に二重らせんを開ける能力を含むと考えられる。三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを、三重らせん形成の塩基対合規則例えば、Chengetal.,J.Biol.Chem.263:151101988;FerrinandCamerini-Otero,Science354:14941991;Ramdasetal.,J.Biol.Chem.264:173951989;Strobeletal.,Science254:16391991;およびRigasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:95911986を参照のこと、コネキシンmRNA、および/または遺伝子配列を使用して構築する。典型的には、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、コネキシンRNAまたは遺伝子中の特定の配列と相補的な約10~25ヌクレオチドまたはそれ以上すなわち、安定な三重らせんを形成するのに十分であるが、所望ならばインビボで投与するのには小さい送達様式に依存するの特定の配列を含む。この状況では、相補的なは、安定な三重らせんを形成することができることを意味する。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドを、コネキシン遺伝子の調節領域例えば、コネキシン5’隣接配列、プロモーター、およびエンハンサーまたは転写開始部位例えば、転写開始部位から-10と10との間に特異的に結合するようにデザインする。三重鎖DNAを使用した最近の治療の進歩についての概説については、例えば、Geeetal.,inHuberandCarr,1994,MolecularandImmunologicApproaches,FuturaPublishingCo,MtKiscoNYandRininslandetal.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5854を参照のこと。本発明はまた、コネキシン活性の阻害に有用なリボザイムを提供する。リボザイムは、コネキシンmRNAに結合し、特異的に切断および不活化する。有用なリボザイムは、コネキシンmRNAに相補的な5’および3’末端配列を含むことができ、当業者がコネキシンmRNA配列に基づいて操作することができる。本明細書中に提供したリボザイムには、グループIイントロンリボザイムの特徴を有するリボザイムCech,Biotechnology13:3231995および他のハンマーヘッドリボザイムEdgington,Biotechnology10:2561992が含まれることを意図する。リボザイムには、GUA、GUU、およびGUCなどの切断部位を有するリボザイムが含まれる。切断部位を含む標的コネキシン遺伝子領域に対応する15と20との間のリボヌクレオチド長の短鎖RNAオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドをより望ましくすることができる二次構造の特徴について評価することができる。切断部位の安定性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した相補オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成の容易さの試験または当該分野で公知の標準的手順によるインビトロリボザイム活性試験によって評価することもできる。アンチセンスおよびリボザイム機能を1つのオリゴヌクレオチド中で組み合わせることができるアンチセンス化合物をさらに意図する。さらに、リボザイムは、本明細書中に提供した例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドの説明と組み合わせて、上記のように、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの間の修飾結合を含み得る。本発明はまた、RNA干渉RNAiなどの方法によるコネキシン活性の阻害に有用なポリヌクレオチドを提供する。この技術および他の遺伝子発現技術は、当該分野で周知である。この技術の概説は、Science288:1370-13722000に見出される。RNAiは、転写後レベルに合わせて操作し、配列特異的である。過程は、細胞または細胞外環境への部分的または全ての二本鎖の特徴を有するRNA、このようなRNAの前駆体、またはこのようなRNAをコードする前駆体の移入を含む。Fireetal.の米国特許第6,506,559号に記載のように、RNAは、1つまたは複数の重合リボヌクレオチド鎖を含み得る。1つの自己相補RNA鎖または2つの相補RNA鎖によって二本鎖構造を形成することができる。RNAは、リン酸-糖骨格またはヌクレオシドのいずれかを修飾することができる。細胞内または細胞外のいずれかでRNA二重鎖形成を開始することができる。研究により、1つまたは複数のリボヌクレアーゼが二本鎖RNAに特異的に結合して短いフラグメントに切断することが証明されている。リボヌクレアーゼはこれらのフラグメントに会合したままであり、その後相補mRNAに特異的に結合するすなわち、コネキシン遺伝子の転写mRNA鎖に特異的に結合する。コネキシン遺伝子のmRNAはまた、リボヌクレアーゼによって短いフラグメントに分解され、それにより、コネキシン遺伝子の翻訳および発現を回避されてコネキシン活性が阻害される。さらに、RNAポリメラーゼは、短いフラグメントの多数のコピーの合成を促進するように作用し、それにより、系の効率が指数関数的に増加させることができる。この遺伝子発現経路の固有の特徴は、スプライシングが開始される細胞に制限されないことである。遺伝子サイレンシング効果を生物の他の部分に拡大し、生殖系列を介して数世代にわたり伝達させることができる。1つの態様では、RNAiの二本鎖dsRNA依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングストラテジーは、短鎖干渉RNAsiRNAの使用を含む。一般的なRNAiアプローチの使用は、一定の制限長いdssRNA分子に応答して活性化された哺乳動物細胞における非特異的抗ウイルス防御機構が含まれるに制約されるGilJ,EstebanM,InductionofapoptosisbythedsRNA-dependentproteinkinasePKR:Mechanismsofaction.Apoptosis2000,5:107-114。この分野の進展により、21個のヌクレオチドRNAの合成二重鎖が遺伝的抗ウイルス防御機構を誘発することなく哺乳動物細胞中で遺伝子特異的RNAiを媒介することができることが証明されたElbashirS,etal.,Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature2001,411:494-498;CaplenN.etal.,ProcNatlAcadSci2001,98:9742-9747。したがって、siRNAは、遺伝子特異的調整のための強力なツールとして認識されつつある。本明細書中で記載されるように、RNAiは、末端エフェクター分子が、例えば、小さな21~23ヌクレオチドのアンチセンスRNAであるこれに限定されない多数の共通の生化学成分を共有する関連遺伝子サイレンシング機構群を含む。1つの機構は、細胞酵素であるDicerによって、例えば、短いsiRNAと呼ばれる21~23ヌクレオチドのdsRNAこれに制限されないにプロセシングされる比較的長いdsRNAトリガーを使用する。標的RNAに相補的なsiRNA鎖は、RNA誘導性サイレンシング複合体RISCと呼ばれる多タンパク質複合体に組み込まれるようになり、標的部位内のmRNA鎖のエンドヌクレアーゼ的切断のガイドとしての役割を果たす。これにより、全mRNAが分解され、アンチセンスsiRNAを再利用することができる。下等生物では、RNA依存性RNAポリメラーゼはまた、プライマーとしてアニーリングされたガイドsiRNAを使用し、標的からより多数のdsRNAが生成され、これがDicer基質としての役割を果たし、それにより、より多くのsiRNAが生成され、siRNAシグナルが増幅される。この経路は、植物においてウイルス防御機構として一般に使用される。本明細書中に記載されるように、siRNAは、例えば、末端の2つの3’’-ヌクレオチドが対合していない3’’オーバーハング21~32個のヌクレオチドの2つの個別のアニーリングされた一本鎖これに限定されないからなり得る。あるいは、siRNAは、しばしば短鎖ヘアピンRNAshRNAと呼ばれる1つのステム-ループの形態であり得る。典型的にはしかし、常にではない、shRNAのアンチセンス鎖はまた、si/shRNAのセンスパートナー鎖に完全に相補的である。哺乳動物細胞では、長鎖dsRNA通常、30ヌクレオチド長を超えるは、インターフェロン経路を誘発し、タンパク質キナーゼRおよび2;5’’-オリゴアデニレートシンセターゼを活性化する。インターフェロン経路の活性化により、翻訳の全体的下方制御および全体的RNA分解が起こり得る。しかし、哺乳動物細胞に外因的に移入されたより短いsiRNAは、インターフェロン経路を迂回することが報告されている。siRNAアンチセンス産物はまた、内因性ミクロRNAに由来し得る。ヒト細胞では、最初の形態siRNAおよびミクロRNAまたはプロセシング経路に関係なく、最終成熟例えば、mRNAに完全に相同的な21~23ヌクレオチドのアンチセンスRNAこれに限定されないが、mRNA切断を指示する。一般に、siRNAと標的部位との間のミスマッチの効果により、部分的にしか理解されていない理由によってほとんど効果なしから活性の完全な無効に変化し得るが、少なくとも1つの場合、部分的相同性によってmRNA翻訳が阻害された。一般に、原型的なミクロRNA-標的相互作用を模倣するようにデザインした標的ミスマッチを有するsiRNAは、特異的相互作用およびmRNA中の標的部位数の両方に依存して、種々の程度の翻訳抑制を媒介することができる。事前に形成したsiRNAの外因性送達またはsiRNAもしくはshRNAのプロモーターベースの発現によってRNAiを活性化することができる。短鎖干渉RNAsiRNAを、化学合成するか、DNAベースのベクター系によって生成することができる。一般に、これは、細胞内で効率的にプロセシングしてsiRNAを形成する短鎖ヘアピンshRNAの転写を含むPaddisonP,CaudyA,HannonG:StablesuppressionofgeneexpressionbyRNAiinmammaliancells.ProcNatlAcadSciUSA2002,99:1443-1448;PaddisonP,CaudyA,BernsteinE,HannonG,ConklinD:ShorthairpinRNAsshRNAsinducesequence-specificsilencinginmammaliancells.GenesDev2002,16:948-958;SuiG,etal.,ProcNatlAcadSci2002,8:5515-5520;BrummelkampT,etal.,Science2002,296:550-553。したがって、この状況では、siRNAを、遺伝子発現の組織特異的標的化および調整のための有効なストラテジーとして使用することができる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドを、周知の固相合成技術によって都合良く且つ日常的に作製することができる。このような合成のための装置は、当該分野で公知のいくつかの業者から販売されている。任意の他の合成手段も使用することができ、実際のオリゴヌクレオチド合成は、当該分野で十分に認識されている。ホスホロチオエートおよび2’-アルコキシまたは21-アルコキシアルコキシ誘導体2’-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを調製するための類似の技術を使用することが周知であるMartin,P.Helv.Chim.Acta1995,78,486-504。蛍光標識されたビオチン化オリゴヌクレオチドまたは他の抱合オリゴヌクレオチドを合成するために、類似の技術、市販の修飾アミダイト、および多孔質ガラスCPG製品ビオチン、フルオレセイン、アクリジン、またはソラレン修飾アミダイト、および/またはCPGなどGlenResearch,Sterling,Va.から市販されているを使用することが周知である。方法別の態様では、本発明は、被験体へのアンチセンス化合物の投与による被験体例えば、患者の治療方法を含む。一般に、これらの方法は、医学的手順眼病用手順が含まれるが、これらに限定されないに関連する組織エンジニアリングおよび組織損傷の軽減方法を含む。方法は、例えば、アンチセンス化合物を被験体の眼または眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で被験体の眼に投与する工程を含み得る。ヒトコネキシンタンパク質の発現が阻害されることが好ましいが、他のタンパク質は、アンチセンス化合物のみまたはヒトコネキシン発現を阻害するアンチセンス化合物との組み合わせによる調整のための標的であり得ると予想される。一定の実施形態では、眼病用手順は、眼病用手術であり、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、白内障摘出、角膜移植、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、緑内障濾過手術、角膜移植術、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー、角膜移植、屈折矯正手術、眼表面新生物切除、結膜もしくは羊膜の移植、翼状片および瞼裂斑の切除、眼形成手術、眼瞼腫瘍切除、先天性異常のための眼瞼再構築手順、外反症および眼瞼外反の修復、斜視手術眼筋、穿通性眼外傷が含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、局所または局部投与によって投与する。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、全身または眼内注射によって投与することもできる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、眼病用手順例えば、手術で起こる創傷などの創傷の形成に対する所定時間に被験体に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順を行う前、眼病用手順中、または眼病用手順後に投与することができる。例えば、アンチセンス化合物を、眼病用手順の数分または数時間前後以内に被験体に投与することができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、眼病用手順後の実施後に投与し、例えば、アンチセンス化合物を、手順から約4時間以内、手順から約3時間以内、より典型的には、眼病用手順から約2時間以内、または眼病用手順から約1時間以内に投与する。あるいは、アンチセンス化合物を、眼病用手順から数分以内例えば、眼病用手順から5分、10分、15分、20分、30分、45分以内に投与することができる。アンチセンス化合物を、眼病用手順から4時間後に投与することもできる。別の態様では、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、組織エンジニアリング法で投与することができる。これらの実施形態および本明細書中に提供したいくつかの他の実施形態では、アンチセンス化合物を、典型的には、長期間例えば、数日、数週間、数ヵ月、またはそれ以上にわたって投与し、患者に行った特定の手順眼に行った手順などと無関係に投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法眼病用手順と関連しない方法およびアンチセンス化合物を眼病用手順例えば、手術と関連させて投与する方法が含まれると組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、例えば、被験体の角膜に関連する細胞例えば、角膜細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼の瘢痕を減少させる方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼のかすみを軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、好ましくは、手術から24~48時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、好ましくは、手術から24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再造形を調整し、かすみを軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼の上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼へのアンチセンス化合物の投与から12時間以内に上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、被験体の眼へのアンチセンス化合物の投与から24時間以内に上皮細胞移動が増加する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、間質細胞密度の増加を防止する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術から24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術から24~72時間後の上皮過形成を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、手術後1週間までの筋線維芽細胞の活性化を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、細胞外基質を調整する細胞分化を調整する方法と組み合わせて投与することができる。本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、細胞増殖を軽減する方法と組み合わせて投与することができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、瘢痕形成を減少させる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、炎症を軽減する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、創傷治癒を促進する。一定の好ましい実施形態では、アンチセンス化合物を、外科的移植手順に際して使用する。一定の好ましい実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン43に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン31.1に指向し、外層角質化を調節するために投与する。他の実施形態では、被験体の角膜に関連する細胞の治癒を促進するか組織損傷を予防する方法。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、被験体の角膜組織の厚さを増加させる方法、被験体の角膜細胞における組織損傷を減少させる方法、被験体の角膜に関連する細胞における組織損傷を減少させる方法、被験体におけるエキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミーに際して行った方法、好ましくは手術から24~48時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成を調節する方法、好ましくは手術から24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質の再造形を調整し、かすみを軽減する方法、手術から24~72時間後のレーザー誘導性病変部位に関連する間質水腫を阻害する方法、好ましくは手術から24~72時間後の上皮過形成を軽減する方法、手術後1週間までの筋線維芽細胞の活性化を軽減する方法、細胞外基質を調整する細胞分化を調整する方法、または細胞増殖を軽減する方法で使用する。一定の実施形態では、眼病用手順は、白内障摘出である。他の実施形態では、眼病用手順は、角膜移植である。他の実施形態では、眼病用手順は、屈折矯正手術である。他の実施形態では、眼病用手順は、放射状角膜切開術である。他の実施形態では、眼病用手順は、緑内障濾過手術である。さらに他の実施形態では、眼病用手順は、角膜移植術である。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、局所投与または局部投与によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、外科的創傷への直接適用によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、眼内注射によって投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、手術手順を行う前に投与する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、手術手順中に投与する。一定の制限されない実施形態では、アンチセンス化合物または組成物を、眼病用手順を行う15分前までまたは眼病用手順を行った2時間後までに投与する。一定の他の実施形態では、例えば、組織エンジニアリングのために、本明細書中に提供したアンチセンス化合物を、数日または数ヵ月間でさえも投与することができる。一定のさらなる実施形態では、化合物および組成物を使用して、角膜に関連する細胞中の組織損傷の治癒を促進するか予防し、角膜に関連する細胞は、眼内の任意の細胞角膜細胞が含まれるが、これに限定されないであり得る。本明細書中に提供した薬剤アンチセンス化合物が含まれるは、被験体の角膜の厚さを増加させることができる。一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、組織損傷の減少または治癒の促進に有用な別の化合物と組み合わせて使用する。例えば、アンチセンス化合物を、成長因子またはサイトカインなどFGF、NGF、NT3、PDGF、TGF、VEGF、BDGF、EGF、KGF、インテグリン、インターロイキン、プラスミン、およびセマフォリンが含まれるが、これらに限定されないと同時投与することができる。別の態様では、眼病用手術に関連する組織損傷の減少のための薬学的組成物を提供する。被験体の眼に関連する細胞中でのヒトコネキシンタンパク質の発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む薬学的組成物を、被験体の眼への局部投与または局所投与のために適切に処方する。アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化することが好ましい。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物の形態であり、薬物またはアンチセンス化合物は、被験体の創傷治癒の促進に有効な量で存在する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、局部投与に適切な形態被験体の眼への局部投与または局所投与に適切な形態が含まれるであり得る。一定のさらなる実施形態では、組成物および処方物は、ゲル、クリーム、または本明細書中に記載の任意の形態であり得る。別の態様では、中枢神経系の損傷を治療する方法を提供する。この方法は、中枢神経系の損傷を治療するために患者に実施した手術手順に関連する中枢神経系の既存の創傷から近位の部位にアンチセンス化合物を投与する工程と、前記アンチセンス化合物が、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化することを含む。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄の身体的な外傷によるニューロンの欠損に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、外傷の結果である創傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、手術の結果である創傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄損傷に隣接する部位に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物はコネキシン43に指向し、上皮基底細胞の分裂および成長を調節するために投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は創傷治癒を促進する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は炎症を軽減する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は瘢痕形成を軽減する。方法の一定の実施形態では、中枢神経系の損傷は脊髄損傷である。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、脊髄の身体的な外傷から少なくとも24時間で患者に投与する。方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物を、外科的移植手順と組み合わせて投与する。方法の一定のさらなる実施形態では、外科的移植手順を、創傷治癒を促進するためにアンチセンス化合物で前処置した移植片と組み合わせる。別の態様では、アンチセンス化合物は、ニューロン損失によって特徴づけられる患者の既存の創傷の治療手順と組み合わせてニューロンの再生を促進することができる。一定の実施形態では、薬剤は、ヒトコネキシンをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する40核酸塩基長までのアンチセンス化合物であり、アンチセンス化合物は、患者の既存の創傷の治療のためにニューロン再生を促進する手順と組み合わせて1つまたは複数のヒトコネキシン発現を阻害する。創傷には、ニューロン損失によって特徴づけられる創傷が含まれる。標的化することができるコネキシンには、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシンが含まれる。これらの実施形態では、アンチセンス化合物を、ニューロン損失が起こる患者の脊髄の身体的な外傷から少なくとも24時間で患者に投与する。アンチセンス化合物を、ニューロン損失が起こる身体的な外傷から数週間、数ヵ月、または数年の期間脊髄の身体的な外傷から少なくとも24時間を超えて患者に投与する。薬学的組成物および方法の一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ヒトコネキシン30またはヒトコネキシン37をコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。好ましくは、アンチセンス化合物は、患者の眼に関連する細胞中のトコネキシン30または37タンパク質の発現を阻害する。他の薬学的組成物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン例えば、ヒトをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化するアンチセンス化合物であり、好ましくは、アンチセンス化合物は、ニューロン損失によって特徴づけられる患者の既存の創傷の治療のためにニューロン再生を促進する手順と組み合わせてヒトコネキシン発現を阻害する。薬学的組成物別の態様では、本発明は、アンチセンス化合物を含む薬学的組成物を含む。1つの実施形態では、眼病用手順例えば、手術に関連する組織損傷の減少のための薬学的組成物であって、薬学的組成物を被験体の眼への局部投与または局所投与のために処方し、薬学的組成物が、被験体の眼に関連する細胞中のヒトコネキシンタンパク質発現を阻害するのに十分な量で存在するアンチセンス化合物を含む、薬学的組成物を提供する。一定の実施形態では、アンチセンス化合物は、配列番号12~31から選択される核酸塩基配列を有するコネキシン例えば、ヒトをコードする核酸分子の少なくとも約8核酸塩基を標的化する。一定の実施形態では、薬学的組成物は、緩衝化プルロニック酸またはゲル例えば、約30までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水を含む薬学的に許容可能なキャリアを含む。アンチセンス組成物は、異なる量のプルロニック酸またはゲル約5までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約10までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約15までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約20までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、約25までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水、および約30までのプルロニック酸を含むリン酸緩衝化生理食塩水が含まれるが、これらに限定されないを含み得る。本明細書中に提供したアンチセンス化合物はまた、2価の化合物薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグが含まれるを含み得る。これは、任意の薬学的に許容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、動物ヒトが含まれるに投与した場合に生物活性代謝産物またはその残渣を直接または間接的に得ることができる任意の他の化合物を含むことを意図する。したがって、例えば、核酸の薬学的に許容可能な塩およびこのような核酸のプロドラッグも開示する。薬学的に許容可能な塩は、本明細書中に提供した核酸の生理学的および薬学的に許容可能な塩すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持するが、望ましくない毒物学的効果に影響を与えない塩である例えば、Bergeetal.,J.ofPharmaSci.1977,66,1-19を参照のこと。オリゴヌクレオチドのために、薬学的に許容可能な塩の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:aナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオンを使用して形成された塩、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなど、b無機酸例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸などを使用して形成した酸付加塩、c有機酸例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸などを使用して形成した塩、ならびにd塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオンから形成された塩。さらにまたはあるいは、本明細書中に提供したオリゴヌクレオチドを、プロドラッグ形態で送達させるように調製することができる。用語プロドラッグは、内因性酵素または他の化学物質および/もしくは条件の作用によって体内またはその細胞内で活性形態すなわち、薬物に変換される不活性形態で調製される治療薬を示す。特に、オリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンを、1993年12月9日公開のGosselinetal.のWO93/24510号に開示の方法にしたがって、SATEリン酸S-アセチル-2-チオエチルとして調製することができる。アンチセンス化合物を、薬学的組成物オリゴヌクレオチドに加えて、薬学的に許容可能なキャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、中性またはカチオン性の脂質、脂質複合体、リポソーム、透過増強剤、キャリア化合物、および他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤などが含まれ得るに処方することができる。薬学的組成物はまた、インターフェロン、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などの1つまたは複数の有効成分を含み得る。非経口投与のための処方物は、緩衝液、リポソーム、希釈剤、および他の適切な添加物も含み得る滅菌水溶液を含み得る。本明細書中に提供したオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物は、オリゴヌクレオチドの栄養送達を増強するための透過増強剤を含み得る。透過増強剤を、5つの広範なカテゴリーすなわち、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤、および非界面活性剤のうちの1つに属するように分類することができるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,8,91-192;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1990,7,1-33。1つまたは複数のこれらの広範なカテゴリー由来の1つまたは複数の透過増強剤が含まれ得る。透過増強剤として作用する種々の脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、レシンレエートrecinleate、モノオレインa.k.a.1-モノオレオイル-rac-グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アクリルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド、およびその生理学的に許容可能なその塩すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,page92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1990,7,1;El-Haririetal.,J.Pharm.Pharmacol.199244,651-654。胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれるBrunton,Chapter38In:GoodmanGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,9thEd.,Hardmanetal.McGraw-Hill,NewYork,N.Y.,1996,pages934-935。種々の天然の胆汁塩およびその合成誘導体は、透過増強剤として作用する。用語胆汁塩には、任意の天然に存在する胆汁成分および任意のその合成誘導体が含まれる。1つまたは複数の透過増強剤を含む複雑な処方物を使用することができる。例えば、胆汁塩を、脂肪酸と組み合わせて使用して複雑な処方物を作製することができる。キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウムEDTA、クエン酸、サリチル酸塩例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸、およびホモバニリン酸塩、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9、およびβ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体エナミンが含まれるが、これらに限定されないLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,page92;Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1990,7,1-33;Buuretal.,J.ControlRel.1990,14,43-51。キレート剤は、DNアーゼインヒビターとしての役割を果たすという利点もある。界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-20-セチルエーテルLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,page92;およびFC-43などのペルフルオロ化合物乳濁液Takahashietal.,J.Pharm.Phamacol.1988,40,252-257が含まれる。非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1991,page92;および非ステロイド系抗炎症薬ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどYamashitaetal.,J.Pharm.Pharmacol.1987,39,621-626が含まれる。本明細書中で使用される、キャリア化合物は、不活性すなわち、それ自体は生物活性を示さないであるが、例えば、生物活性核酸の分解または循環からのその除去の促進によって生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって核酸として認識される核酸またはそのアナログをいう。核酸とキャリア化合物典型的には、過剰量の後者の物質の同時投与により、おそらく、キャリア化合物と核酸との間の共通の受容体の競合によって、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵所extracirculatoryreservoirに回収される核酸量が実質的に減少し得る。キャリア化合物と対照的に、薬学的に許容可能なキャリア賦形剤は、1つまたは複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁液、または任意の他の薬理学的に不活性な賦形剤である。薬学的に許容可能なキャリアは、液体であっても固体であってもよく、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせた場合に所望のかさ、一貫性などが得られることを考慮した計画された投与様式を使用して選択する。典型的な薬学的に許容可能なキャリアには、結合剤例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど;充填剤例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど;潤滑剤例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど;崩壊剤例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど;または湿潤剤例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に提供した組成物は、従来よりその技術で確立された使用レベルで薬学的組成物中で見出される他の付加成分をさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合可能な薬学的に活性な物質例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬などを含み得るか、本発明の組成物の種々の投薬形態の物理的処方に有用なさらなる物質色素、香味物質、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などを含み得る。しかし、このような物質は、添加した場合、本明細書中に提供した組成物の成分の生物活性を過度に阻害すべきではない。オリゴヌクレオチドを患者に移入する方法に関係なく、コロイド分散系を送達賦形剤として使用して、オリゴヌクレオチドのインビボ安定性を向上させ、そして/または特定の器官、組織、または細胞型にオリゴヌクレオチドを標的化することができる。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系水中油滴型乳濁液、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および特徴づけられていない構造の脂質:オリゴヌクレオチド複合体が含まれるが含まれるが、これらに限定されない。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソームは、二重層構造に配置された脂質から作製された1つまたは複数の外層に囲まれた水性コアを有する微視的球体である一般に、Chonnetal.,CurrentOp.Biotech.1995,6,698-708を参照のこと。アンチセンスポリヌクレオチドは、実質的に単離された形態で存在し得る。生成物を、生成物の意図する目的を妨害しないキャリアまたは希釈剤と混合することができ、この生成物は依然として実質的に単離されていると見なされると理解される。生成物はまた、実質的に精製された形態であり得るが、この場合、一般に、調製物のポリヌクレオチドまたは乾燥質量の90例えば、少なくとも約95、98、または99を含む。アンチセンスポリヌクレオチドを、局所的に治療すべき部位に投与することができる。好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて薬学的組成物を生成する。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理学的食塩水例えば、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。組成物を、非経口投与、筋肉内投与、脳内投与、静脈内投与、皮下投与、または経皮投与のために処方することができる。哺乳動物細胞による核酸取り込みを、いくつかの公知のトランスフェクション技術例えば、トランスフェクション剤を使用する技術によって増強する。投与される処方物は、このような薬剤を含み得る。これらの薬剤の例には、カチオン性薬剤例えば、リン酸カルシウムおよびDEAE-デキストランおよびリポフェクタント例えば、リポフェクタム商標およびトランスフェクタム商標が含まれる。1つの態様では、オリゴヌクレオチドは、部位特異的送達が必要であり得る。これらはまた、長期間にわたって送達する必要がある。明らかに、送達期間が、下方制御が誘導される部位および所望の治療効果の両方に依存する一方で、24時間またはそれ以上の連続的送達がしばしば必要である。本発明の1つの態様では、特に、局部投与のための処方物形態で、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と共にアンチセンス化合物を処方物に含めることによってこれを行う。特に、本明細書中に記載のクリームおよびドロップなどの局所処方物を使用して、上皮基底細胞の分裂および成長コネキシン43を標的化するアンチセンス化合物を使用ならびに外層角質化コネキシン31.1を標的化するアンチセンス化合物を使用を調節することができる。局部投与用処方物には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれる。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性の基剤、および増粘剤などは、必要であるか、望ましいかもしれない。コーティングされたコンドームおよびグローブなども有用であり得る。経口投与用組成物には、顆粒、水性溶媒または非水性溶媒の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。非経口投与用組成物には、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含むことができる滅菌水溶液が含まれ得る。いくつかの場合、治療計画の有効性を増大させるための他の伝統的な治療法と組み合わせてオリゴヌクレオチドを使用して患者を治療するのにより有効であり得る。本明細書中で使用される、用語治療計画は、治療法、緩和療法、および予防法を含むことを意味する。治療組成物の処方およびその後の投与は、当業者の範囲内と考えられる。投与は、治療すべき病状の重症度および応答性に依存し、治癒するか病態が軽減するまで、治療を数日から数ヵ月間継続する。選択的投薬計画を、患者の体内の薬物蓄積量の測定値から計算することができる。当業者は、適切な投薬量、投与方法、および繰り返し率を容易に決定することができる。至適投薬量は、各オリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して変化し得るが、一般に、インビトロおよびインビボ動物モデルで有効であることが見出されたEC50に基づいて評価することができる。一般に、投薬量は、0.01mg/kg体重~100mg/kg体重であり、1日、1週間、1ヶ月、または1年に1回またはそれ以上、または2~20年毎に1回投与することができる。当業者は、測定した体液または組織中の薬物の滞留時間および濃度に基づいて投与繰り返し率を容易に評価することができる。首尾の良い治療後、病状の再発を予防するために、患者は、0.01mg/kg体重~100mg/kg体重の範囲の維持量のオリゴヌクレオチドを1日1回またはそれ以上から20年毎に1回投与する維持療法を受けることが望ましい。コネキシン調整が必要な容態の治療または予防において、適切な投薬量レベルは、一般に、約0.001~100mg/kg患者体重/日であり、単回または複数回投与することができる。好ましくは、投薬量レベルは、約1~約40mg/kg/日である。本発明のオリゴヌクレオチドを、診断、治療、予防、研究試薬として、およびキットで使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドがコネキシンをコードする核酸とハイブリッド形成するので、この事実を活用するために、サンドイッチアッセイ、熱量測定アッセイ、および他のアッセイを容易に構築することができる。オリゴヌクレオチドのコネキシン遺伝子またはmRNAとのハイブリッド形成の検出手段の準備を日常的に行うことができる。このような準備には、酵素の抱合、放射性標識、または任意の他の適切な検出システムが含まれ得る。コネキシンの有無の検出キットも準備することができる。本発明のオリゴヌクレオチドを、研究目的で使用することもできる。したがって、オリゴヌクレオチドによって示された特異的ハイブリッド形成を、アッセイ、精製、細胞生成物の調製、および当業者が認識することができる他の方法で使用することができる。本明細書中に記載の一定の実施形態で標的化することができる例示的コネキシンには、以下が含まれるが、これらに限定されない。本発明の種々の態様を、以下の実験の部を参照して記載し、これらの態様は、例示のみを目的として提供し、本発明の範囲を制限するものではないと理解される。以下の実施例を、例示を目的として記載し、これらは、本発明を制限するものではない。実施例1:インビボ分析材料と方法レーザー処置雌Wistarラットd32~34を、実験動物の使用に関するARVO規則と一致した条件下で飼育した。動物を、Hypnorm商標10mg/ml、JasenPharmaceutica,BelgiumとHypnovel登録商標5mg/ml、RocheproductsLtd,NewZealandとの1:1混合物の0.83ml/100g体重の用量での腹腔内投与によって麻酔した。Technolas217ZエキシマレーザーBauschLombSurgical,USAを使用して、インタクトな上皮に対してエキシマレーザー処置を行った。眼を、瞳孔が中心になるようにし、以下のパラメータを使用して焼灼を行った:処置領域は直径2.5mm、深さ70μmであった。これにより、間質前部および全上皮を薄く除去した。エキシマレーザー処置を優先的に使用して再生可能な病変を作製し、角膜再造形および外傷後のエンジニアリングに対するコネキシン43ASODNの効果を調査した。術後、全動物を、各ケージに収容し、任意の不快症状について詳細にモニタリングした。細隙灯生体顕微鏡および/またはスリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して、術後インビボ評価を行った。スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡法角膜レーザー治処置前後に、各動物を、Confoscan2FortuneTechnologiesAmerica,USAスリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して臨床的に観察した。Confoscan2は、収集時間毎に画像を直接デジタル化するという明確な利点を有するスリットスキャニングテクノロジーの改良型である。動物を麻酔し、それぞれ収集ヘッドの前にインビボ強焦点顕微鏡の対物レンズの位置がくるように調整した特別にデザインしたプラットフォームに置いた。スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡により、角膜の全厚さにわたって異なるレベルで生きた角膜を光学的に切片にする。内皮から実験を開始し、前部-後部切片数は、カスタマイズされた設定に依存する。スリットスキャニングテクノロジーは、実験領域に対して垂直の軸に沿って前後して移動する対物レンズを使用する。簡潔に述べれば、ハードウェアは、ハロゲンランプ100W/12V、2つのスリット、2つのチューブレンズ、前部対物レンズ、および高感度デジタルCCDカメラからなる。スキャニング前に、浸漬物質として1滴のViscotearsCIBAVisionOphthalmicsを対物レンズの先端に滴下する。スキャニング中、動物の眼を大きく見開いたままにし、角膜面が常に接眼レンズ40倍、N.A.0.75の光軸に対して垂直となるように配向させる。画像収集時間は、約14秒である。ゲルによって常に対物レンズに眼が接触しないようにする。ラット角膜について、実験あたり250枚までの連続デジタル画像が得られ、ハードディスクドライブに直接保存した。予備実験で収集パラメータを調整し、その後の全実験で一定に保持した。パラメータは以下であった:光度をヒト患者で一般的に使用される光度の半分に減少し、4回の通過1回の通過は、完全な往復移動と見なすを使用し、400μmの作業距離を選択した。ラット角膜について、瞳孔の明確な視覚化によってセントレーションを容易にし、それにより非常に良好な局所的再現性が得られる。インビボ共焦点画像スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して収集した全画像を、ハードディスクドライブに保存し、その後、NAVISプロプラエタリソフトウェアConfoscan2,NidekCoLtdによって分析した。立体学的原理に従って、間質の力学的性質を評価した。間質前部および間質後部の細胞数を記録した。光学的解剖器具間隙を介して等しい確率粒子probabilityparticleをサンプリングするプローブとして機能するので、インビボ共焦点顕微鏡自体によって主な立体成分stereologicalcomponentを得た。実際、インビボ共焦点顕微鏡によって特定体積の光学的薄片が得られ、薄片はそれぞれ切片にされた組織サンプルである。結果として、間質細胞の計数は、1対のフレームインビボ共焦点顕微鏡によって記録された連続写真の選択からなり、一方のフレームは、焦点の合った粒子間質細胞を有し、コフレームは、ピンぼけしているが、同一粒子の画像を認識可能である光学的な影。定義領域Aμm2中の最も明瞭なフレームから細胞数nを記録する。2フレーム間の距離dμmも記録する。したがって、単位体積Vあたりの細胞数は、以下に相当する:V=細胞数n/dμm×Aμm2。エキソビボ共焦点画像適切な角膜切片を、異なる目的のための異なるマーカーで免疫組織化学的に染色した。核染色剤Hoechst33258を使用して染色を使用して、角膜中心または周辺角膜の上皮細胞数および間質細胞数を評価した。この目的のために、AnalySIS登録商標3.2ソフトウェアSoftImagingSystem,USAを使用して、目的の領域を、最初に適切な角膜領域のTIFFファイル画像上にフリーハンドで描き、領域の値をソフトウェアによって自動的に得た。次いで、手動計数オプションを使用して、その領域内の細胞を計数し、単位領域あたりで示す。アンチセンス化合物の適用30プルロニック酸ゲルBASFCorpを含むリン酸緩衝化生理食塩水分子グレードの水を使用して、未修飾のα1コネキシンコネキシン43特異的アンチセンスODNをレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後の麻酔ラットの結膜下に送達させた。FITCタグを使用した予備試験では、処方物は24時間まで眼の前房に残存することが示された示さず。これらの実験で使用したアンチセンス分子は、DBIGTAATTGCGGCAGGAGGAATTGTTTCTGTC配列番号65であった。共焦点レーザースキャニング顕微鏡法を使用して観察したところ、DBIODNへのFITCタグの添加は、プローブの細胞内透過を証明した。ODNを、最終濃度2μMで適用した。組織エンジニアリングまたは再造形効果のモニタリングアンチセンス適用後、レーザー手術から2時間、12時間、24時間、48時間、72時間、1週間、および2週間後の角膜を、スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用して試験した。コントロールラットは、レーザー手術のみを受けた。表1は、各測定点で調査した角膜数をまとめている。表1スリットスキャニングインビボ共焦点顕微鏡を使用したインビボ追跡のために使用したコントロールCおよびASODN処置角膜数ODN=ASODN処置した眼レーザー手術後1回投与。角膜の各細胞層を分析し、コントロール群とODN処置群との間で細胞型、数、および外観を比較した。再上皮形成抗コネキシン43ODNでの処置により、上皮回復が促進された。ASODN処置角膜の90で、PRKレーザー手術から12時間以内に擦過性上皮細胞が認められ、コントロールでは認められなかった図1B。この段階で、30のコントロール角膜で停止内皮細胞のみが認められた図1A。24時間までに、全コントロール細胞およびアンチセンス処置角膜で上皮細胞が認められたが、コントロールの61に対して処置群の72が活発な擦過性細胞が認められた。これは、再上皮形成は、コントロールよりもコネキシン43特異的ASODN処置角膜で迅速に進行することを示す。間質細胞密度選択された測定点でのコントロールとODN処置角膜との間の間質細胞数を比較するための時間とMannWhitneyノンパラメトリック統計的検定との関数としての各群内間質前部および間質後部の細胞密度を比較するための反復測定を使用した両側サンプルt検定を使用して、レーザー手術から24時間後のみで統計的に有意な結果が得られた表2。この測定点で、コントロールおよびODN処置群では、間質前部の間質細胞密度は、術前値と比較して非常に増加したp値<0.05。コントロール角膜の間質後部では、間質細胞密度はまた、術前値と比較して増加したがp値<0.05、ODN処置角膜の間質後部では、間質細胞密度は術前値と統計的に有意に異ならないp値>0.05。間質前部および間質後部の2群間の間質細胞密度を比較した場合、ODN処置角膜は、常にコントロール角膜よりも間質細胞密度が低かったp値<0.05。これは、コントロール角膜と比較してODN処置角膜がより少数の細胞が間質再造形またはエンジニアリングに関与するという概念を支持する。これは、抗コネキシン43ODNの適用によって手術部位の細胞過形成が減少することを示す最初の報告である。エキソビボ組織化学分析実施例IIは、この細胞過形成が望ましくない間質マトリクスstromalmatrix再造形および瘢痕を誘導する筋肉線維芽細胞に関連することを示す。表2.レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー前およびその24時間後のコントロールおよびASODN処置角膜中の間質細胞数。細胞密度を、標準偏差の平均として示す実施例II-エキソビボ分析材料と方法組織学:組織の採取および固定適正な数の動物Wistrarラットを、レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後の選択された測定点で屠殺し、上記の実施例1に記載のようにDB1抗コネキシンODNを麻酔ラットに投与し、組織学的分析のために角膜切片を調製した。コントロールラットには、レーザー手術のみを受けさせた。眼全体およびコントロール組織を、OxoidPBSでリンスし、その後にTissue-Tek登録商標OCTSakuraFinetek,USAに包埋し、液体窒素中で凍結させた。必要に応じていくつかの抗体の使用のために、凍結組織を、冷アセトン-20°C中で5分間固定し、クリオカットで切断した。組織の切断低温切片作製手順は以下のように行った:非固定組織の凍結塊を-80°Cでの貯蔵庫から取り出し、LeicaCM3050Sクルオスタットに約20分間入れて、クリオスタットと同一の温度すなわち、-20°Cに平衡化した。組織の平衡化が達成された時点で、標本をTissueTek登録商標OCTを備えた標本皿に置いた。厚さが12μmの切片H/E染色のためまたは25μm免疫標識のための切片に切断し、Superfrost登録商標PlusslidesMenzel-Gleser,Germany上に置いた。低温切断直後に、組織塊を-80°Cの貯蔵庫に戻し、低温切片を支持するスライドを直後に使用するか、-80°Cで保存した。眼の光軸と平衡に切片にした。ヘマトキシリン/エオシンH/E染色および核染色一連の異なる染色試薬への浸漬を容易にするために、スライドをガラスラックに入れた。表面張力を下げるための試薬にラックを入れて震盪し、各溶液を交換する毎に排出させた。Gill’sIIヘマトキシリン/エオシン染色前に、-80°Cで保存していたスライドを、最初に1~2分間室温まで加温し、冷アセトン中で固定し、そして/または直後に水道水に短期間浸して水和した。スライドをGill’sIIヘマトキシリン中で2分間染色し、その後、過剰な染色を水道水でリンスオフした。Scottの水道水代替物STWSへの4秒間の浸漬によって識別染色staindifferentiationを行った。次いで、流水で1分間リンスし、30分間の継続的な浸漬により1エオシンで染色した。最後に、切片を水道水で即座にリンスし、95、100EtOHで脱水し、キシレンで洗浄し、DPX封入剤Sigmaを使用してマウントした。核の対比染色H/Eまたは免疫組織化学分析と並行のために、Hoechst33258Sigmaを使用した。H/E染色切片に対して角膜の厚さを測定した。免疫組織化学切片を、部位特異的モノクローナル抗体を使用してコネキシン43について免疫標識し、α平滑筋アクチンを認識する抗体を使用して筋線維芽細胞について免疫標識し、抗ラミニン-1抗体を使用して基底膜蓄積について免疫標識した。さらに、抗ビメンチン抗体を使用して、角膜間質細胞と筋線維芽細胞とを識別し、Ki-67抗体を使用して細胞増殖を示した。エキソビボ組織学分析結果は、エキシマレーザー光焼灼によって作製された病変が術後24時間までに閉じることを示した図2。角膜の周囲および中心への単核/多核および/または円形、卵形細胞による間質への典型的な侵入が両群で認められ、術後24時間で最も顕著であるが、アンチセンスODN処置群は、コントロール群と比較してこれらの細胞数が有意に少なかった図2A、B、C。これは、実施例1で認められたインビボ共焦点顕微鏡写真由来の所見に匹敵する。上皮の厚さは、レーザー誘導性病変部位の図2で認められるコントロール角膜図A、B、焼灼領域下の瘻孔図A、B、および周囲間質図Cで様々であり、コントロール角膜中の円形細胞による広範な侵入細胞過形成が認められた。図Bおよび図Cで顕著な間質水腫も認められた。アンチセンスODN処置角膜では、上皮は均一な厚さであり図D、E、中央領域図Dおよび周囲間質図Eでは、間質水腫の徴候はほとんどなかった。さらに、間質では、円形細胞はほとんど存在しなかった。図2のスケールバーは、20ミクロンを示す。レーザー処置後のコネキシン43ODNでの処置後の間質の厚さの変化を、表3に示し、これは、コントロールとODN処置角膜との間の間質の厚さの変化を比較している。間質の厚さを、適切な組織染色切片から測定した。両側サンプルt検定を使用してODN処置群について得たデータの統計的分析により、調査した3つ全ての測定点で術後24時間、48時間、および72時間、中央の間質の厚さが術後の値よりも統計的に有意に薄くp値<0.05、周囲間質の厚さは術前値と有意に異ならないことが示された。対照的に、コントロール角膜は、中央角膜および周囲角膜の両方において有意な間質腫脹浮腫を示す図2A、B、C術前値と比較して間質の厚さが2倍。表3.コントロールおよびAS処置角膜におけるエキシマレーザー手術後の間質の厚さの変化手術に供していない角膜の中央間質の厚さは250μmであるが、エキシマレーザー手術を使用して、70μmの角膜組織上皮および間質の一部を含むを除去した。正常な角膜上皮の厚さは50μm平均であるので、20μmの間質組織をレーザー手術によって除去した。したがって、創傷から24時間後、48時間後、および72時間後の中央間質の厚さと術前の中央間質の厚さとを統計的に比較するために、除去した厚さと術前の中央間質の厚さとを調整して使用した250-20=230μm。コネキシン43発現の減少は、間質侵入の減少および上皮過形成の減少と関連する顕微鏡による観察により、コントロール角膜と比較してODN処置角膜中に存在するコネキシン43レベルの減少が認められた。図3は、顕微鏡画像の組み合わせを示す。上の列はコントロール角膜を示し、下の列はアンチセンスODN処置角膜を示す。円形細胞による典型的な間質の侵入が、縁部、周囲、および中央領域で24時間以内に両群で認められた。しかし、ODN処置角膜における円形細胞の密度はより低かった。両群の縁部で、抗コネキシン43は間質に均一に分布したが3A、D、処置群は、コントロール3Bと比較して周囲3Eのレベルが低かった。この段階では、コネキシン43レベルは、両群の上皮で正常に戻ったが、コントロール群では、瘢痕様間質3Cまたは過形成以下の図4を参照のことが認められたのに対し、アンチセンス処置角膜では、正常レベルのコネキシン43を有する正常な上皮が認められた3F。スケールバーA、D、E、Fは、10ミクロンを示し、BおよびCは20ミクロンを示す。これらの図では、コネキシン43は、白色の点状標識として認められ、細胞核が灰色で出現する。図3に示した結果により、コネキシン43タンパク質レベルが抗コネキシン43ODNでの処置後に減少し、それにより、間質中の細胞動員度がより小さくなることが示唆される。さらに、コントロール角膜の31術後24時間で25、術後48時間で67、術後72時間で0と比較して、たった7術後24時間で0、術後48時間で0、術後72時間で20のODN処置角膜しか上皮過形成の徴候を示さない。これを、H/E染色切片およびKi-67標識切片に対して評価した。筋線維芽細胞標識ビメンチン抗体での標識は、ASODN処置角膜と比較したコントロール角膜の間質中の細胞数の増加が未分化の角膜間質細胞起源ではないことを示したので、α平角筋アクチン抗体を使用して標識を行った。この標識は、コントロール角膜が手術部位下により多数の筋線維芽細胞を有するが、周辺の周囲間質にも有することを示した。この筋線維芽細胞数および罹患領域の増加は、術後24時間で顕著になり、48時間および72時間から少なくとも1週間にわたって持続した表4。図4は、レーザー手術から1週間後の筋線維芽細胞標識抗α平滑筋アクチンを示す。図4A、B、およびCはコントロールであり、図4D、E、およびFはアンチセンス処置角膜である。創傷後1週間までに、コントロール角膜では、少数から中程度の数の筋線維芽細胞が周囲間質の前半部に存在し4A、中程度から密集レベルで中間周囲間質領域に存在し4B、中程度のレベルで中央領域の間質の後半部に認められる4C。対照的に、処置角膜では、非常に少数の筋線維芽細胞が周囲間質4Dまたは中間周囲間質4Eに存在し、中程度から少数が中央間質に存在する4F。中央間質のいくつかの場合、筋線維芽細胞は、上皮の真下の領域に密集している示さず。したがって、上記実施例1細胞過形成および図2で認められた細胞数の増加は、筋線維芽細胞の分化および侵入に起因するようである。筋線維芽細胞は、瘻孔中の瘢痕組織蓄積、それに伴う結晶蓄積の減少および創傷コラーゲンIII分泌の減少を担うことが公知であるAhmadiA.J.andJakobiecF.A.;2002;IntOphthalmolClin.Summer;423:13-22.。表4:コントロールおよびアンチセンスODN処置角膜における筋線維芽細胞のα平滑筋アクチン標識のまとめ筋線維芽細胞数を、密集D、中程度M、少数L、またはなしとして定量する。比率は、特定レベルで罹患した動物の比率をいう。st=間質、epi=上皮。コントロールとアンチセンス処置角膜との間の有意差を、太字で強調している。基底膜蓄積レーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後、再生上皮と共に基底膜が再形成される。ラミニン-1に対する抗体での標識は、再形成された基底膜が不連続であり、上皮-間質が不規則に結合していることを示す図5。24時間後、コントロールは焼灼領域の縁部図5Aおよびより中央の領域図5Bにラミニン蓄積はほとんどなく、そして/または不規則であるのに対して、アンチセンス処置角膜は、これらの両領域でより規則的なラミニン蓄積を示した図5C、図5D。48時間後、コントロールは連続的にラミニンを蓄積せず図5E-焼灼領域の縁部;図5F-中央、非常に不規則であった図5E。対照的に、アンチセンスODN処置角膜は、創傷縁部図5Gおよび中央図5Hで連続的且つ比較的平らな基底膜を有していた。図5中の全スケールバーは、20ミクロンを示す。コネキシン43アンチセンス処置角膜は、24時間以内にあまり不規則でないより密集したより連続的な基底膜を形成した。図6に示すように、ラミニンの不規則性を定量した。図6中の黒色の実線は、ラミニン-1の蓄積を示す。各領域について、分散を、山と谷の間の差として測定した図6A、B、C、D。アンチセンスODN処置角膜の平均分散の4.74ミクロンと比較して、コントロール角膜の平均分散は、6.98ミクロンであった。2群間の相違は、統計的に有意であったp<0.0001。実施例III-エキソビボ組織エンジニアリング角膜を、エキソビボ臓器培養モデルおよびアンチセンスODNを使用して調整した特異的コネキシンに置いた。2つのコネキシンコネキシン43およびコネキシン31.1がこれらの実験で標的化された。コネキシン43の下方制御を使用して、コネキシンをインビトロで制御することができることを証明し、コネキシン31.1は、角膜から剥がれ落ちようとしている細胞中の角膜の上皮外層中に発現するので、コネキシン31.1が標的化された。コネキシン31.1発現の減少によって上皮組織の肥厚を操作することを目的とした。材料と方法30~34日齢のWistrarラットを、Nembutalまたは二酸化炭素で安楽死させ、ラットの全眼を切り出した。眼表面を切り出し、0.1mg/mlペニシリン-ストレプトマイシンで5分間殺菌し、滅菌PBSでリンスした。次いで、全眼を、角膜を上にして60mmの培養皿中の滅菌ホルダー上に移した。眼を、空気-培地界面に角膜上皮を曝露させてマウントし、無血清培地Opti-MEM,インビトロgen中にて34°Cの加湿5CO2インキュベーター中で48時間培養した。上皮を湿らせるために、100μlの培地を8時間~12時間毎に表面に滴下した。培地レベルを、結膜縁部レベルに維持した。アンチセンスオリゴマーを、最終濃度が2μMになるまで氷上で30w/wのプルロニックF127ゲルSigmaと混合し、10μlを角膜に適用した。3~4つの角膜が実験あたりの各処置のサンプルサイズであった。予備試験は、本発明者らのポジティブコントロールDB1の8時間の二重処置が本発明者らの角膜培養においてコネキシン43タンパク質発現に対する効果がほとんどないことを示した。したがって、角膜を24時間培養し、コネキシン特異的オリゴマーを8時間毎に適用した。コネキシン43、26コントロール、および31.1に対する抗体を使用して、実験2に記載のように免疫組織化学的標識を行った。上記のように、組織をH/Eでも染色した。核を、0.2μMヨウ化プロピジウムで対比染色した。コネキシンレベルを定量するために実験群内に維持された電圧およびオフセット設定を備えたLeicaTCS4DまたはTCSSP2共焦点レーザースキャニング顕微鏡で画像を収集した。定量のために、3ミクロンにわたる4つの光学スライスを、TCS4D上の質量重心解剖学的投影オプションtopographicalprojectionoptionを使用して、単一の焦点を拡大した光学画像に処理した。コネキシンレベルを、256階調のグレースケール画像に対する90~100ピクセル強度での閾値化後に、NIHImageScionCorp.USAを使用して定量した。手術を受けていない角膜では、インビトロコネキシン代謝回転率は、上記の実施例1および2に記載のエキシマレーザー焼灼角膜中の組織再造形過程と比較して、比較的低かった。それにもかかわらず、アンチセンスODNでの3回の処置後、コネキシンレベルは、コントロールと比較して50以上減少した図7A、Bは、コントロールと比較したASODN処置角膜でのコネキシン43の減少を示す。コネキシン43特異的アンチセンスODNを適用した場合、コネキシン26レベルは一定のままであったコネキシンレベルの減少は特異的であり、処置の副作用は認められないことを示す。これらの画像では、コネキシン43は上皮の2つの基底層により大きな点として出現し、コネキシン26は層2~6中の支配的により細かい点状標識として出現する。コネキシン31.1アンチセンスODNはコネキシン31.1レベルを減少させたが、予備段階の結果は、24時間以内に上皮の厚さ層の数が増加することも示した図7C、D。この厚さの増加は、H/E染色を使用した免疫組織化学的に図7C標識した切片で認められた。本研究に記載の結果は、組織エンジニアリング特に、角膜のエキシマレーザー手術後が含まれるまたは組織エンジニアリングおよび移植のためのインビトロ臓器培養におけるコネキシン特異的アンチセンスODNの使用の基礎をなす。本明細書中に提供した実験結果は、エキシマレーザーフォトリフラクティブケラテクトミー後のコネキシン43特異的アンチセンスODNでの1回の処置が多数の使用上の利点を有するそのうちのいくつかを、以下に記載することを証明する。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、上皮細胞移動が促進される。術後12時間で、90のアンチセンス処置角膜でレーザー誘導性病変部位に擦過性上皮細胞の存在が認められたが、コントロールでは認められない。上皮細胞は、30のコントロール角膜に存在したが、静止/非擦過性であった。したがって、コネキシンによる直接細胞-細胞伝達の制御を使用して、上皮細胞の模様づけpatterningの変化を操作することができる。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、術後24時間~48時間でレーザー誘導性病変部位での筋線維芽細胞分化に関連する細胞過形成の制御が促進される。この期間中、アンチセンスODN処置角膜39より多くのコントロール角膜63が、全間質中で強い細胞過形成を示す。したがって、直接細胞-細胞伝達の制御を使用して、細胞分化を調整して細胞外基質を調整することができる。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、術後24時間~72時間で間質の再造形を調節し、それによりレーザー誘導性病変部位のかすみが軽減される。この期間で、アンチセンス処置角膜39より多くのコントロール角膜64が、全間質中で強いかすみを示す。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、再造形の初期段階での間質水腫が阻害される。したがって、直接細胞-細胞伝達の制御により、レーザー手術由来の結果が改善される。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、再造形の初期段階での細胞増殖が減少する。したがって、直接細胞-細胞伝達の制御を使用して、組織再造形中の細胞増殖を制御することができる。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、上皮過形成が78まで減少し、均一の上皮を操作することができる術後24~72時間に評価。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、術後1週間まで筋線維芽細胞の活性化が減少するより早い段階で角膜間質細胞が喪失する。直接細胞-細胞伝達の制御により、外科的再造形中の組織損傷をより正確に調節することができ、結果の予測が改善され、視覚的欠点がより少なくなる。コネキシン特異的アンチセンスODNの投与により、組織再造形中の上皮-間質接着基質がより規則正しく且つ密になる。したがって、直接細胞-細胞伝達の制御を使用して、組織基底膜を操作することができる。さらに、本明細書中で使用されるエキソビボ角膜培養モデルは、直接細胞-細胞伝達の制御を使用して、インビトロで組織を操作するのに使用することができる例えば、コネキシン31.1アンチセンスODNを使用した上皮の厚さの増加ことを示す。この処置はまた、インビボでの、例えば、円錐角膜上皮の肥厚などの角膜疾患の緩和のための肥厚角膜の操作を意図する。結果は、細胞-細胞伝達を妨害する活性分子を組織エンジニアリングおよび再造形に使用することができることを示す。詳細には、コネキシンタンパク質を標的化するアンチセンスデオキシヌクレオチドを特に矯正レーザー手術後の角膜再造形ならびにインビボおよびインビトロの組織エンジニアリングで使用することができることが示される。したがって、本明細書中に記載のアンチセンス化合物および方法は、手術介入の結果の改善ならびに眼の疾患過程の改善および組織エンジニアリングに有意な潜在性を有する。実施例IV:エキソビボ培養モデル成体動物モデルにおける脳または脊髄損傷後のギャップ結合タンパク質コネキシン43に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用により、病変の拡大が遮断され、炎症反応およびその後の瘢痕形成が軽減される。本発明者らは、本発明者らのアンチセンスアプローチを、確立された病変のための修復ストラテジーを精査するための脊髄セグメントおよびインタクトな脊髄についてのエキソビボ培養モデルのためになおさらに開発した。脊髄を、P7~P14仔ラットから切り出し、尾部セグメント、胸郭セグメント、および吻側セグメントに分ける。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含むプルロニックゲルを、培地に入れる間に脊髄セグメントの切断末端に適用し、これにより、コネキシン43タンパク質レベルが24~48時間減少し、組織の生存可能性が有意に改善される。最優先される注目すべき所見は、腫脹が起こらないことである培養への配置から24時間後の脊髄セグメントを示す図8A~B。この処置により、脊髄の切断末端からの拡大が遮断される。処置サンプルの灰白質中のニューロン生存の増加は、トルイジンブルー染色樹脂切片で非常に明らかである図9A。際立って対照的に、図9Bでは、ニューロンの浮腫および空胞化はコントロール組織全体に認められる未処置、ゲルのみ、無作為なオリゴデオキシヌクレオチドを含むゲル。その後の20日目までの標識および免疫組織化学研究は、処置脊髄セグメント中のニューロンNeuronal-N標識がこの期間生存するのに対して、コントロールセグメントではたった3日後にほとんど生存していないことを示す。イソレクチン-B4標識は、培養5日目以内にコントロールセグメントの強く活性化されたマクロファージ表現型小グリア侵入を示す。処置サンプルでは、活性化小グリア細胞は、外縁白質軸索神経路が予め且つ切断末端に制限されるに制限される。顕著には、MAP-2標識ニューロン過程のマーカーは、MAP-2標識を全く示さないコントロールセグメントと比較して、処置脊髄セグメントで再生の有意な潜在性を示す図10A~B。実施例V:脊髄病変にわたる末梢神経の移植末梢神経移植のために、本発明者らは、移植時にコネキシン43特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで組織を再処置し、それにより、移植部位からの病変の拡大および宿主組織の神経集団が単離されてニューロン修復が制限される小グリアの活性化を予防する。末梢神経移植脊髄セグメントを、35mm皿中の培養インサートMilliporeMillicellに入れ、セグメント上にメニスカスminiscusが形成されるまで培養培地レベルを増加させた。コネキシン43特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド30量体、濃度1μMを含む30プルロニックゲルを、直ちに脊髄組織上に注ぐ。生理学的温度に加温されるとゲルは固化し、アンチセンスオリゴヌクレオチドが徐放される。この処置により、24時間と48時間との間のコネキシン43タンパク質レベルが減少し、処置から6~8時間後に最も減少する。培養で安定化し、その後切創に再曝露したこのような脊髄セグメントは、インビボでの手術介入と同一の症状切断領域への病変拡大および組織腫脹が含まれるを示す。この効果を、切開時のコネキシン43特異的アンチセンスオリゴマーでの処置によって防止することができ、したがって、切断末端は鋭いままであり、浮腫または組織腫脹の明らかな徴候は認められない。セグメントの末端同士を向き合わせるが、1~5mmの間隙をあける。1~3日間の培養物の安定化後、P7~P14仔ラット由来の座骨神経の移植片を、ギャップと交わるように置く。以前の研究では、両座骨神経またはその伏在枝Yick,L.W.etal.,1999,ExpNeurol.159:131-138;Aguayo,A.J.etal.,1981,J:Exp.Biol.95:231-240または肋間神経Cheng,H.,etal.,1996,Science,273:510-513移植が軸索延長およびニューロンの生存を誘導する高い可能性を有することが示されている。移植直後に、コネキシン43特異的アンチセンスオリゴマーから再処置を開始し、その後数日間にわたりニューロン挙動評価を行った。インビボ研究術後15日から7ヶ月と比較して移植後の培養期間が比較的短いので15日まで、以下に詳述の修復応答結果の判定を評価するための種々のマーカーを使用する。ニューロンの増殖および/または移動の誘導で役割を果たし得る外因性成長因子FGFまたはNGFを添加するか添加しないで実験を行う。実施例VI:末端同士を向き合わせたセグメントの間のシュワン細胞シード移植物の挿入処置セグメントの間の移植物のために、軸索再生の強力なプロモーターであることが示されているので、シュワン細胞を選択したXu,X.M.etal.,1999,J.Neurosci.11:1723-1740;Keirstead,H.S.etal.,1999,Exp.Neurol.159:225-236。移植された細胞は、中枢神経系軸索再生のための許容性環境を提供することができ、軸索再生の誘導に有効であることが証明されている。末端同士を向き合わせた脊髄セグメントの間に配置したシュワン細胞シードミニチャネル移植物またはマトリゲルを、この適用のために使用すべきである。ここでの原則は、脊髄修復介入では、最終的に瘢痕組織を切除してその空間に移植物質を充填することを望むであろうということである。使用した方法は、Morrisseyetal.andXuetal.Morrissey,T.K.etal.,1991,JNeurosci.11:2433-2442;Xu,X.M.etal.,1995,J.Comp.Neurol.351:145-160に記載されている。本質的に、座骨神経を成体ラットから採取し、次いで、神経上膜および結合組織を除去し、長さ1mmの外植片を、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM-Gibco,USAを含む培地に入れる。遊走細胞の生成物は、主に、線維芽細胞であり、外植片がコンフルエントに到達した場合、外植片を新規の皿に移す。出現した細胞が主にシュワン細胞であるようになるまで、これを3~5世代にわたり繰り返す。これらを分離し、コポリマーまたはマトリゲルガイダンスチャネルへの播種のために成長させるSchmidt,C.E.andBaierLeach,J.,2003,Ann.Rev.Biomed.Eng.5:293-347。一旦移植物物質が調製されると、培養セグメントを、瘢痕切除を模倣するためにその末端を再切断し、末端同士を向き合わせ、移植物物質をその間に押し込む。移植直後に、サンプルを、コネキシン43アンチセンスオリゴマーで再処置し、ニューロン挙動をその後数日間にわたりモニタリングする。測定結果移植片組織に対する即時型応答、遅延型応答、または連続的応答が存在することを確立するために末梢移植片および移植物の両方についての経時変化実験を行う。いくつかのマーカーを使用して、ニューロン応答および修復潜在性を評価する。これらには、以下が含まれる:ニューロンNeuronal-Nに対する抗体、神経細繊維MAP-2およびSMI-31に対する抗体、および細胞質マーカーCMFDA、および膜色素Di-IまたはAxongrease-MolecularProbes,Oregon,USA。ニューロン新芽形成の増加、軸索移動距離の増加距離移動比に対する橋長、および移植片に向かうか通過する軸索成長数の増加を特にモニタリングする。細胞特異的マーカー樹状細胞についてはGFAP、小グリア細胞についてはIsolectin-B4、およびシュワン細胞についてはS-100。グリア細胞の分布および密度、ならびに髄鞘形成レベルを評価する。脊髄セグメントから再生した軸索とは対照的に、抗CGRP末梢神経マーカーを使用して、末梢神経起源の軸索を識別する。GAP-43成長関連タンパク質抗体を使用して、ニューロン成長錐体を同定する。トルイジンブルー染色半薄切片および移植片断面の電子顕微鏡法を、形態学的分析のために使用する。二次抗体を、Alexa色素と抱合する。二重または三重標識のために、本発明者らは、必要に応じて、ZenonプローブMolecularProbes,Oregon,USAを使用する。全抗体および色素標識を、TheUniversityofAuckland’sBiomedicalImagingResearchUnitLeicaTCS4DおよびSP2共焦点レーザースキャニング顕微鏡を使用して分析する。HItachiH-7000電子顕微鏡にて電子顕微鏡法を行う。画像分析プログラムAnalySISまたはNIHImageJを使用して、コントロールと処置移植片との間の装置を定量する。実施例7-アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドデザイン材料本明細書中で使用した材料には、当該分野で認識されている抗体およびプラスミド例えば、ラットコネキシン43T7291およびコネキシン26のプラスミド;マウスコネキシン43およびコネキシン26インビボgen,USA、マウス抗ラットコネキシン43およびウサギ抗ラットコネキシン26Zymed51-2800のプラスミド;ならびにMolecularProbes,EugeneORのヤギ抗マウスAlexa488およびヤギ抗ウサギAlexa568二次抗体などが含まれる。Hoechst33258色素Sigmaを使用して核を染色した。全てのデオキシリボザイムおよびオリゴデオキシヌクレオチドを、脱塩オリゴマーとしてSigmaGenosys,Australiaから購入した。TaqMan標識オリゴマーを、AppliedBiosystems,USAから購入した。全てのオリゴデオキシヌクレオチドを、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドとして購入した。デオキシリボザイムのデザインデオキシリボザイムのデザインおよび教示は、以前の研究で記載されているものに類似していたSantoro,S.W.andJoyce,G.F.Proc.NatlAcad.Sci.USA,1997,94,4262-4266andCairns,M.J.etal.,1999Nat.Biotech17,480-486。簡潔に述べれば、標的コネキシンのmRNA配列中の全てのAUおよびGU部位を、AまたはGの各端上の8または9ヌクレオチドを使用して選択した。デオキシリボザイムは、AまたはGが10~23触媒コアggctagctacaacgaに置換されたセンスコード配列の相補物である。コントロールデオキシリボザイムは、1つの点変異g→Aを有する欠損触媒コアggctaActacaacgaを有していたS.W.andJoyce,G.F.Biochem37,13330-13342。本発明者らはまた、以下の3つの要件を満たさないAUおよびGUデオキシリボザイムによって残存するギャップを対象とするためのGCおよびAC特異的デオキシリボザイムをデザインした。各デオキシリボザイムを、ATG開始コドンからのAまたはGの位置にしたがって命名した。インビトロアッセイのために選択したデオキシリボザイムは、以下の3つの要件を満たさなければならなかった。1温度安定性:選択されたデオキシリボザイムは安定な二次構造ヘアピンループまたはホモ二量体を形成すべきではない。生理学的温度での標的配列に結合することができないと仮定すると、37°Cを超えるヘアピンまたはホモ二量体の融点を有する任意のデオキシリボザイムを破棄した。2親和性:両結合アームの総ΔG値は、-30Kcalよりも高くあるべきではない。それぞれの各結合アームは、-10kcalと-15kcalとの間である。これは、結合特異性/誤プライミング高CG含量によるとデオキシリボザイムについての有効な結合/代謝回転率要件との間で妥協される。いずれかの切断部位の結合アームの長さを、理想のΔG値が見出されるように調整し、チェックのために工程1を繰り返す。3特異性:全標的結合配列は、特異性をチェックするためにGeneBankを使用して検索するBLASTnであったhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。他のコネキシン遺伝子または他の公知のげっ歯類遺伝子と相同するデオキシリボザイムを破棄した。デオキシリボザイムのインビトロ試験マウスコネキシン43およびコネキシン26のcDNAを、NcoIおよびNheIを使用してpORFベクターインビボgenから切り出し、インビトロ転写の前にpGEM-TPromegaにサブクローン化した。全長2.4kbラットコネキシン43cDNAおよび200ヌクレオチドの5’非翻訳領域を含む全長コード1.4kbラットコネキシン43cDNAを、インビトロ転写のために使用した。全長mRNAを、PromegaRiboprobeキットを使用して、線状化プラスミドDNAから転写した。得られたmRNAを、PCRスピンカラムQiagenを使用して精製した。濃度を、260nmのODの分光光度計読み取りによって決定した。次いで、デオキシリボザイム最終濃度40μMおよびmRNA0.01~0.05μg/μl総mRNAを、2×切断緩衝液100mMTris7.5;20mMMgCl2;300mMNaCl;0.02SDSを使用して37°C5~10分間個別に予め平衡化した。次いで、mRNAおよびデオキシリボザイムとの混合物を、37°Cで1時間インキュベートし、その後、10×Bluejuiceインビトロgenを添加して切断反応を停止させ、混合物を氷上に保持した。次いで、反応混合物を、1×TBE緩衝液および7M尿素を含む予備泳動4ポリアクリルアミドゲル19:1アクリル:ビス比、BioRadにロードし、2時間まで泳動した。ゲルを、10000倍希釈のSYBRgreenIIMolProbes,USAを含むTBEbufferで染色し、BioRadChemiDocsystemを使用して画像化した。アンチセンスオリゴマーのデザインインビトロで首尾よくmRNAを切断するデオキシリボザイム結合アームの20ヌクレオチド配列に基づいて、アンチセンス配列を選択した。選択した配列を、30量体のオリゴのデザインで使用するために選択したBrysch,W.1999.AntisenseTechnologyintheVentralNervousSystem,ed.H.A.Robertson;OxfordUniversityPress21-41およびWaltonS.,etal.,2002BiophysicalJournal82,366-377。簡単に述べれば、無関係の遺伝子GGGGおよびCpGモチーフとの8~10CG対合の部分的配列相補性などの配列に関連する悪影響を回避した。できれば誤プライミングを防止するために、最後の5ヌクレオチド中にチミジンまたは3つを超えるCまたはGを有する3’末端を有するアンチセンスも回避する。ホモ二量体、回文モチーフ、または二次ヘアピン構造などの安定な二次構造を形成するオリゴマーは、標的mRNAに結合するオリゴマーを妨害する。交差ハイブリッド形成、非特異的タンパク質結合、および毒性に起因する化学的に関連する悪影響の可能性を評価するために、コントロールオリゴマーセンス、スクランブル、逆、およびミスマッチオリゴマーが含まれるもデザインした。角膜臓器培養およびアンチセンスオリゴマーでの処置30~34日齢のWistrarラットを、二酸化炭素で安楽死させ、ラットの全眼を切り出した。眼表面を切り出し、0.1mg/mlペニシリン-ストレプトマイシンで5分間殺菌し、滅菌PBSでリンスした。次いで、全眼を、角膜を上にして60mmの培養皿中の滅菌ホルダー上に移した。眼を、空気-培地界面に角膜上皮を曝露させてマウントし、無血清培地Opti-MEM,インビトロgen中にて34°Cの加湿5CO2インキュベーター中で48時間培養した。上皮を湿らせるために、100μlの培地を8時間~10時間毎に表面に滴下した。培地レベルを、結膜縁部レベルに維持した。以前に記載のように、アンチセンスオリゴマーを、最終濃度が2μMになるまで氷上で30w/wのプルロニックF127ゲルSigmaと混合し、10μlを角膜に適用した。Becker,D.L.,etal.;1999bDev.Genet.24:33-42;Green,C.R.,etal.;2001,MethodsMolBiol154,175-185を参照。3~4つの角膜が実験あたりの各処置のサンプルサイズであった。予備試験は、本発明者らのポジティブコントロールDB1の8時間の二重処置が本発明者らの角膜培養においてコネキシン43タンパク質発現に対する効果がほとんどないことを示した。したがって、角膜を24時間培養し、コネキシン特異的オリゴマーを8時間毎に適用した。しかし、本発明者らは、培養を24時間維持した場合、内因性コネキシン26発現が影響をうけることを見出した。したがって、本発明者らは、コネキシン26特異的オリゴマー処置角膜の培養期間を12時間に減少し、アンチセンスオリゴマーの適用を4時間毎とした。培地を、アンチセンスまたはコントロールオリゴマーの反復適用前に10回交換した。所定時間で、角膜をPBSでリンスし、OCTTissueTek,Japanに浸漬し、液体窒素中で瞬間冷凍した。次に、25μmの低温切片を、LeicaクリオスタットCM3050sで切断し、SuperFrostPlusスライドMenzel,Germanyにマウントした。Cx43およびCx26mRNA分析のために、角膜を、1回のアンチセンス処置から8時間後に採取した。RNAの単離およびリアルタイムPCR製造者のプロトコールにしたがってTRIzol試薬GIBCO,インビトロgen,USAを使用して、単離ラット角膜から総RNAを抽出した。RNAサンプルの質を、臭化エチジウム染色アガロースゲルでの電気泳動によって評価し、18Sおよび28SrRNAバンドをUV照明下で視覚化した。抽出収率を、260nmでの分光光度法で定量した。リアルタイムPCRのために、cDNAを、20μlの最終反応体積でのオリゴdTおよびsuperscriptIIRnアーゼH逆転写酵素LifeTechnologies,インビトロgen,USAの使用によって5μgの総RNAから調製した。製造者の説明書に従ってTaqManUniversalPCRMasterMixAppliedBiosystems,USAを使用して、50μlの体積の各サンプルについて100ngの総RNAのcDNA等価物を使用した96ウェル光学反応プレート中で定量的PCR反応を行った。ABIPRISM7700配列検出システム装置AppliedBiosystems,USAにてPCRを実施した。サーマルサイクリング条件は、製造者の標準的プロトコールを使用して、95°Cで10分間の最初の変性、50サイクルの2工程PCR95°Cで15秒間の変性、60°Cで1分間のアニーリング-伸長が含まれるを含んでいた。全実験を、3連で繰り返した。各標的についてのネガティブコントロールのモニタリングでは、キャリーオーバーは認められなかった。他のRNA値を標準化することができる内部標準として18SrRNAの増幅を行った。標的および18SrRNAの増幅効率はほぼ等しく、式2-ΔΔCtを使用して、検量線を必要とすることなくmRNAの相対レベルを計算した。標的および18SrRNAの増幅効率が有意に異なる場合、相対検量線法を使用して、測定したCt由来の各実験についてのmRNAおよび18SrRNAの絶対量を計算し、標的遺伝子の相対mRNAレベルを、18SrRNAに対する正規化後に定量したコントロールと比較した。全計算を、PRISM3.02ソフトウェアGraphPad,SanDiegoを使用して行った。群間の統計的相違を、スチューデントt検定の使用によって決定した。ANOVAによって数群間の比較を行い、ダネットの多重比較検定の使用によって有意性を計算した。翻訳遮断に対するアンチセンスオリゴマー効率の評価Cy3およびTaqManFam,Tamra標識オリゴマーを使用して、透過および安定性を評価した。Cy3標識オリゴマーSigmaGenosysおよびTaqManFAM,TAMRA標識オリゴマーAppliedBiosystemsを、プルロニックゲルと共に適用して、オリゴマーの安定性および角膜上皮への透過の両方を測定した。処置した角膜を、4パラホルムアルデヒド中で20分間固定し、1寒天にマウントし、40×浸水レンズ下でホールマウントとして観察した。オリゴマー透過の深さを、LeicaSP2共焦点顕微鏡のZ-スキャンオプションおよび測定したz距離に対する強度のプロットを使用して測定した。TaqManオリゴマーの破壊を、共焦点のLamdbaスキャンオプションを使用して測定した。FAMドナーとTAMRA受容体分子との間の蛍光共鳴エネルギー転移またはFRETは、インタクトな30量体オリゴマー中で起こる。オリゴマーが破壊される場合、FAMおよびTAMRAはもはや極めて接近せず、FRETはもはや生じない。免疫蛍光標識前に記載のように、角膜切片に対するコネキシンの免疫標識を行った。簡潔に述べれば、切片を、10ヤギ血清でブロッキングし、250倍希釈マウス抗ラットコネキシン43または500倍希釈ウサギ抗ラットコネキシン26の一次抗体と4°Cで一晩インキュベートした。次いで、切片をPBSで洗浄し、400倍希釈のAlexa488標識二次抗体と室温で2時間インキュベートし、その後、4パラホルムアルデヒドで固定し、0.2μMヨウ化プロピジウムまたは50倍希釈のHoechst332358で10分間対比染色を行った。切片を、Citifluroantifade倍地AgarscientificUKにマウントした。LeicaTCS-4DまたはLeicaSP2共焦点レーザースキャニング顕微鏡を使用して全画像を収集し、TIFファイルとして保存した。全画像を、一定の電圧520~540Vおよびオフセット-2設定を使用して収集した。コントロール組織の画像のグレースケールを最大にするようにグロー-垂直二連式ディスプレイglow-over-underdisplayオプションを使用して、電圧およびオフセットを設定した。次いで、、同一実験内の全サンプルについて、同一の設定を使用した。定量のために、3μmにわたる4つの光学スライスを、TCS4D上の質量中心局所投影オプションを使用して、単一の焦点を拡大した光学画像に処理した。コネキシンレベルのスポットを、256階調のグレースケール画像に対する90~100ピクセル強度での閾値化後に、NIHImageScionCorp.USAを使用して計数した。角膜上皮領域も測定し、単位領域あたりのコネキシン密度を計算した。4つの拡大焦点画像の平均を使用して、各角膜の絶対コネキシン密度を計算した。次いで、この数を、センスコントロール処置またはゲル処置した角膜の中程度のコネキシン密度を使用して正規化した。本発明者らは、異なる処置と比較した場合の比率の低下knockdownとしてデータを示した。デオキシリボザイムは、インビトロで選択的にmRNAを切断するげっ歯類コネキシン43mRNAに対して特異的に66種のデオキシリボザイムをデザインした表5。マウスおよびラットコネキシン43mRNAの両方を認識するために、22種のデオキシリボザイムをデザインした。本発明者らはまた、ネガティブコントロールとして、10-23触媒コア中に1つの点変異を有する2つの欠損デオキシリボザイムを購入した。デオキシリボザイム切断結果は、ラットコネキシン43mRNA1.1Kb長示さずおよびラットコネキシン43mRNA2.4Kb長図11Aと類似していた。両ラット図11Aおよびマウスk図11Bでは、コネキシン43mRNAは、デオキシリボザイムに接近可能な類似の領域を有するようである。結果は、曝露されてデオキシリボザイム切断に利用可能なげっ歯類コネキシン43mRNA上の4つの領域を示す。これらの領域は、ATG開始コドンからおよそ367~466塩基、526~622塩基、783~885塩基、および1007~1076塩基に位置する。2つの欠損デオキシリボザイムdf605およびa1df783は、げっ歯類コネキシン43mRNAの切断は認められなかった。ラットコネキシン43mRNAの非翻訳領域の200塩基対に対してデザインされたデオキシリボザイムも、いかなる切断活性も示さなかった。表5.ラットコネキシン43に対して種々の程度のインビトロおよびインビボ活性を示すデオキシリボザイムdzおよびアンチセンスasオリゴデオキシヌクレオチドのまとめ表5は、インビボ分析mRNAおよび/またはタンパク質レベルのためのインビトロリボザイム切断研究に基づいて選択したか、欠損リボザイムコントロール配列番号56および配列番号59を正常なリボザイムと比較した場合のリボザイムおよびアンチセンス配列を示す。オリゴマーの名称は、ラットコネキシン43のみと特異的な場合に接頭辞r43を有し、接頭辞a1は、マウスおよびラットの両方に対する特異性を示す。全オリゴマー配列は、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドである。ggctagctacaacgaは、デオキシリボザイムの10~23触媒コアを示し、ggctaActacaacgaは、欠損変異コントロールである。DB1は、as885小文字で示すの30量体バージョンであり、DBlsは、DB1配列のセンスコントロールである。インビトロ効果を、各デオキシリボザイムによるmRNA切断の比率として測定した。インビボ効果を、角膜切片中のコネキシン43の免疫標識図15または残存mmRNAレベルのリアルタイムPCR評価図16によって測定した。は>75を意味し、は50~70を意味し、は25~50を意味し、-は0~25のmRNAのインビトロ切断またはタンパク質およびmRNA発現のインビボでの減少を意味する。upは、DB1センス処置またはゲルのみのコントロール処置と比較した場合のコネキシン43タンパク質発現の増加を意味する。本発明者らはまた、げっ歯類コネキシン26mRNAに対して特異的にデザインした4種のデオキシリボザイムを試験し表6、そのうちの17種がマウスおよびラットのコネキシン26mRNAの両方と適合する。ラットコネキシン26mRNAは、クローニングプラスミド上の2つのT7RNAポリメラーゼプロモーターの存在によってゲル上に二重鎖として出現した。切断結果は、コネキシン26mRNAが、318~379および493~567塩基領域にデオキシリボザイムに接近可能な少なくとも2つの領域を有することを示す図12A、12B。これらの図は、最も一貫して切断したデオキシリボザイムは1時間以内に両mRNA種を切断するcx26dz330であることを示す。2つの欠損デオキシリボザイムb2df351およびb2df379は、げっ歯類コネキシン26mRNAを切断しなかった。デオキシリボザイムcx26dz341、dz351、dz375、dz379は、マウスコネキシン26mRNAと比較して、より高い比率でラットコネキシン26mRNAを一貫して切断する。他方では、mcx26dzl53およびdz567は、ラットと比較した場合、マウスでより優れたコネキシン26デオキシリボザイムのようである。表6.げっ歯類コネキシン26に対して種々の程度のインビトロおよびインビボ活性を示すデオキシリボザイムdzおよびアンチセンスasオリゴデオキシヌクレオチド配列表6は、インビトロで一貫して切断されるmRNAを、インビボ分析のためのインビトロリボザイム切断研究に基づいて選択するかmRNAおよび/またはタンパク質レベル、欠損リボザイムコントロールとして使用する場合のリボザイムおよびアンチセンスを示す。オリゴマーの名称は、マウスまたはラットコネキシン26mRNAのみと特異的な場合に接頭辞m26またはr26を有し、接頭辞b2は、両方の種に対する特異性を示す。全オリゴマー配列は、未修飾ホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドである。ggctagctacaacgaは、デオキシリボザイムの10~23触媒コアを示し、ggctaActacaacgaは、欠損変異コントロールである。逆コントロールrvを使用して、アンチセンスオリゴマーの任意の非特異的効果も調節した。インビボ効果を、角膜切片中のコネキシン26の免疫標識および標的mRNA発現のリアルタイムPCRによって測定した図17。は>75を意味し、は50~70を意味し、は25~50を意味し、-は0~25のmRNAのインビトロ切断またはタンパク質およびmRNA発現のインビボでの減少を意味する。プルロニックゲルにおける蛍光標識ODNは、角膜上皮を透過することができるラット角膜は、臓器培養におけるコネキシン43およびコネキシン26の発現を維持し、30プルロニックF-127ゲルによるアンチセンスオリゴマーの送達に容易に利用可能である。したがって、ラット角膜臓器培養を、インビトロモデル由来のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドデザインの有効性を試験するためのモデル系として選択した。本発明者らは、ラット角膜を24時間培養し、内皮がインタクトなままであることを見出した。しかし、48時間を超える培養時間は、角膜の不透明度に影響をあたえるようであり、それにより、使用しなかった。Cy3標識オリゴマーを使用して、培養角膜へのオリゴマーの透過度を決定した。インタクトな角膜全体の共焦点光学スライドは、蛍光シグナルがCY3標識オリゴマーと共に存在することを示し、図13Aは、最初の処置から1時間後の培養角膜の蛍光シグナルの深さが10μmであることを示す。オリゴデオキシヌクレオチドに抱合したTaqManプローブを使用して、30プルロニックゲルを含むインタクトなオリゴデオキシヌクレオチドの角膜上皮への送達を測定し、照明した。有意なオリゴマーの比率は、治療1時間後にインタクトなままであった図13B、13C。インタクトなオリゴマーの点状シグナル図13Cで起こるFRETは、赤色グレースケールで示すの波長として認められる一方で、分解オリゴマー由来のシグナルFRETなしは、緑色グレースケールで示すの発光スペクトルで出現する図13B。デオキシリボザイムアッセイは、角膜上皮でコネキシン43タンパク質をノックダウンすることができるODNを予測する予備実験では、本発明者らは、本発明者らのポジティブコントロールDB1を1回適用したラット角膜を試験し、8時間後にコネキシン43タンパク質発現の有意な変化は認められなかった。8時間間隔で3回適用した24時間後に明らかなタンパク質ノックダウンが認められた。デオキシリボザイム切断アッセイ由来の結果に一部基づいて、本発明者らは、インビボで一定のアンチセンスオリゴマーDB1、r43as605、r43as783、r43as885、r43as953、およびr43aslO76、非機能的と予想されるアンチセンスオリゴマーr43asl4、r43as769、およびr43as892、およびネガティブコントロールDB1センスを試験した。本発明者らは、コントロールと比較した治療から24時間後のコネキシン43タンパク質レベルのノックアウトを見出し図14A、決定された全アンチセンスオリゴマーが陽性のはずである図14C、14E、14G。陰性と予想される3つ全てのオリゴマーおよびネガティブコントロールオリゴマーは、コネキシン43発現に影響を与えなかった。図14B、14D、4F、4H。DB1as885の30量体は、より短いas885と類似のノックダウン率を示したほぼ50ノックダウン本実験で同定されたより良好なアンチセンスオリゴマーの1つは、タンパク質レベルを64減少させるas605のようであった。これらの定量結果のまとめを、図15に示す。他のコネキシンのための技術を試験するために、さらなるオリゴデオキシヌクレオチドをデザインし、コネキシン26について試験した。r26as330Nおよび375Nと命名した30量体のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを、その適切な逆コントロールオリゴデオキシヌクレオチドと共に、b2dz330およびb2dz375の切断領域内の領域に基づいてコネキシン26に対してデザインした。しかし、本発明者らは、アンチセンスオリゴマー処置培養物を逆コントロール処置角膜と比較した場合、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドas330Nおよびas375Nはこれらの実験の12時間以内のタンパク質発現レベルが有に異なることを見出した。アンチセンスODNは、コネキシン43mRNAおよびコネキシン26mRNAを減少させるリアルタイムPCRを使用して、mRNAレベルに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの効果を決定した。コネキシン43タンパク質発現をノックダウンするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドas605、as885、DB1はまた、処置後8時間以内にコントロール角膜と比較してコネキシン43mRNAレベルが低いことが確認された。コネキシン43mRNAの相対レベルの減少率は、コネキシン43タンパク質の減少レベルと十分に相関した。ネガティブアンチセンスオリゴマーas769およびネガティブコントロールDB1センス、ゲルのみは、コントロール角膜と比較してコネキシン43mRNAレベルが変化しなかった。コネキシン26mRNA発現も、アンチセンス処置から8時間以内にas30Nおよびas375Nによって有意に減少した図17。as330Nの逆配列コントロールおよびゲルのみのコントロールは、mRNAに対する効果は示されなかった。全ての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、ならびに他の書類および本明細書中で引用または言及された資料は、本発明に属する当業者のレベルを示し、このような各々の引用された書類および資料は、あたかもその全体が個別に参考として援用されているか、その全体が本明細書中に記載されているのと同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。出願人は、任意のこのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電気的に利用可能な情報、および他の引用された資料または書類由来の任意および全ての資料および情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。本明細書中に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表し、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者の本明細書の考慮により他の目的、態様、および実施形態が得られ、これは、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の範囲内に含まれる。本発明の範囲および精神を逸脱することなく本明細書中に開示の本発明に関する種々の代替形態および修正形態を得ることができることが当業者に容易に理解される。本明細書中に適切に例示した本発明は、本明細書中で特に不可欠と開示していないいかなる要素または制限を用いることなく実施することができる。したがって、本明細書中の各々の例、実施形態、または本発明の実施例において、comprising、consistingessentiallyof、およびconsistingofのいずれかを、明細書中で他の2つの用語のいずれかと置換することができる。また、用語comprising、inclusing、containingなどは、広く且つ制限することなく読み取るべきである。本明細書中に例示的に記載した方法およびプロセスを、工程の異なる順序で実施することができ、本明細書中または特許請求の範囲に示した工程の順序に制限される必要はない。他で明確に示さない限り、本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形a、an、およびtheには、複数形が含まれる。いかなる場合でも、本特許を、本明細書中に開示の特定の例、実施形態、または方法に制限されると解釈されない。いかなる場合でも、本特許を、任意の審査官、特許庁の任意の他の職員によって作製された記述が具体的に留保qualificationまたは保留reservationすることなく出願人の応答書で明確に採用されない限り、このような記述に制限されると解釈されない。使用した用語および表現は、説明のために使用し、本発明を制限せず、表示および記載した特徴の任意の等価物またはその一部を排除するためのこのような用語および表現の使用を意図しないが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内で種々の修正形態が可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および最適な特徴によって具体的に開示しているが、当業者は本明細書中に開示の概念の修正形態および変形形態を使用することができ、このような修正形態および変形形態は添付の特許請求の範囲に定義の本発明の範囲内に含まれると見なされると理解される。本発明を、本明細書中に広範且つ一般的に記載している。属概念の開示内に含まれるそれぞれのより狭い種概念および下位概念も本発明の一部を形成する。これには、除外された要素が具体的に本明細書中で引用されるかどうかに関係なく、類概念から任意の主題を除く条件または消極的限定を含む本発明の属概念の記述が含まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特長または態様がマーカッシュ形式で記載されているが、当業者は、マーカッシュ形式により、本発明がマーカッシュ形式の任意の各選択肢memberまたは選択肢の下位集団に関して記載されると認識する。"