"宿主細胞タンパク質HCPを減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも1種のHCPを含む試料混合物から生成するための方法であって、前記方法は、a前記試料混合物のラマン分光分析を実施するステップ;bクロマトグラフィー樹脂がこの飽和結合容量の約50-100までローディングされるように、前記試料混合物を該樹脂に接触させるステップ;及びcクロマトグラフィー試料を回収するステップ;及びd前記クロマトグラフィー試料のラマン分光分析を実施して、前記クロマトグラフィー試料がHCPを減少させた目標タンパク質調製物であることを確認するステップを含む方法。クロマトグラフィー樹脂が、親和性クロマトグラフィー樹脂、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。目標タンパク質が、酵素;ペプチドホルモン;ポリクローナル抗体;ヒトモノクローナル抗体;ヒト化モノクローナル抗体;キメラモノクローナル抗体;一本鎖抗体;Fab抗体フラグメント;Fab’2抗体フラグメント;Fd抗体フラグメント;Fv抗体フラグメント;単離CDR;ダイアボディー;及び免疫接着物質からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。クロマトグラフィー樹脂が、入口及び出口バルブを含む流体管により分離された一連の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、流体接続されたカラムの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12本のカラムからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。最長約0.5、最長約1、最長約2、最長約3、最長約4、最長約5、最長約6、最長約7、最長約8、最長約9、最長約10、最長約11及び最長約12分からなる群から選択される滞留時間を得るように、試料混合物をクロマトグラフィー樹脂に接触させる、請求項1に記載の方法。試料混合物との接触前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するステップ及び試料混合物との接触後にクロマトグラフィー樹脂を洗浄するステップをさらに含み、ここで、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液は同一の緩衝液である、請求項1に記載の方法。クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップをさらに含み、ここで、試料をクロマトグラフィー樹脂に接触させるステップが方法の時間の約20から約80であるように保つために、クロマトグラフィー樹脂洗浄ステップ、溶離ステップ及び再生ステップを計算及びプログラムすることができる、請求項1に記載の方法。前述のことの観点から、治療抗体を含むタンパク質をより効率的に精製するための改善された方法の当技術分野におけるニーズが存在する。本発明は、タンパク質の精製に改善された疑似移動床分離ストラテジーを組み込むことによって、このニーズに取り組む。3.発明の要旨特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞タンパク質HCPを減少させた目標タンパク質調製物を、目標タンパク質及び少なくとも1種のHCPを含む試料混合物から生成する方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明の方法は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含み、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物並びに親和性クロマトグラフィー樹脂、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を含む。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、目標タンパク質は、酵素;ペプチドホルモン;ポリクローナル抗体;ヒトモノクローナル抗体;ヒト化モノクローナル抗体;キメラモノクローナル抗体;一本鎖抗体;Fab抗体フラグメント;Fab’2抗体フラグメント;Fd抗体フラグメント;Fv抗体フラグメント;単離CDR;ダイアボディーdiabody;DVD;及び免疫接着物質からなる群から選択される。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、クロマトグラフィー樹脂は、流体管により分離された一連の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、流体接続されたカラムの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12本の個別カラムからなる群から選択される。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、クロマトグラフィー樹脂は、流体管により分離された一連の少なくとも2個の流体接続されたカラムに充填されており、ここで、カラムは、緩衝液、例えば平衡化緩衝液、洗浄緩衝液及び溶離緩衝液の導入並びに溶離液の回収を可能にする流体管により分けられている。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ、並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、試料混合物を、約0.5から約12分の範囲から選択される滞留時間を得るためにクロマトグラフィー樹脂と接触させ、一実施形態において、これは、最長約0.5、最長約1、最長約2、最長約3、最長約4、最長約5、最長約6、最長約7、最長約8、最長約9、最長約10、最長約11及び最長約12分からなる群から選択することができる。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、該方法は、試料混合物との接触前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するステップ及び試料混合物との接触後にクロマトグラフィー樹脂を洗浄するステップをさらに含み、ここで、平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液は、同一の緩衝液である。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。本発明の特定の実施形態は、樹脂が、この飽和結合容量の約50超、約60超、約70超、約80超及び約90超を含む約50-100までローディングされるようにクロマトグラフィー樹脂と目標タンパク質含有試料混合物を接触させるステップ並びにクロマトグラフィー試料を回収するステップを含むHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成を対象とし、ここで、前記クロマトグラフィー試料は、前記HCPを減少させた目標タンパク質調製物を含み、該方法は、クロマトグラフィー樹脂洗浄及び再生ステップをさらに含み、ここで、このようなステップは、試料をクロマトグラフィー樹脂に接触させるステップが、方法の時間の約20から約80であるように維持するために計算及びプログラミングすることができ、一つの特定の実施形態において、これは約50である。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法が、このようなHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関わる1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用される。4.図面の簡単な説明5.発明の詳細な説明本発明は、改善された疑似移動床分離ストラテジーを使用する抗体、例えばモノクローナル抗体などのクロマトグラフィー精製のための組成物及び方法に関する。明確にするためにまた限定するものでなく、この詳細な説明は、以下の下位部分に分けられる。5.1.定義;5.2.抗体の作製;5.3.抗体の生成;5.4.抗体の精製;5.5.例示的精製ストラテジー;及び5.6.ラマン分光法5.1.定義用語抗体には、ジスルフィド結合によって相互連結された4本のポリペプチド鎖、2本の重H鎖及び2本の軽L鎖からなる免疫グロブリン分子が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域本明細書でHCVR又はVHと短縮される及び重鎖定常領域CHからなる。重鎖定常領域は、3種のドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域本明細書でLCVR又はVLと短縮される及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1種のドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域FRと呼ばれる、より保存されている領域がちりばめられている相補性決定領域CDRと呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割することができる。各VH及びVLは、次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された3種のCDR及び4種のFRからなる。抗体の用語抗原結合部分又は抗体部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示された。抗体の用語抗原結合部分に包含される結合フラグメントの例には、iFabフラグメント、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価フラグメント;iiFab’2フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2種のFabフラグメントからなる二価フラグメント;iiiVH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント;iv抗体のシングルアームのVL及びVHドメインからなるFvフラグメント、vVHドメインからなるdAbフラグメントその全体の教示を参照により本明細書に組み込むWardら、1989Nature341:544-546;並びにvi単離された相補性決定領域CDRが含まれる。さらに、Fvフラグメントの二つのドメイン、VL及びVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、その中でVL及びVH領域が一対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらが作られることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、これらは、結合することができる単一鎖FvscFvとして知られている;例えば、それらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込むBirdら1988Science242:423-426;及びHustonら1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883を参照されたい。。このような一本鎖抗体は、同様に、抗体の用語抗原結合部分に包含されるよう意図されている。一本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディーなども、同様に包含される。ダイアボディーは、それらの中で、VH及びVLドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の2種のドメインの間で一対になることを可能にするには短すぎるリンカーを使用するので、従って、該ドメインが別の鎖の補足ドメインと一対になり、2種の抗原結合部位を生成するよう強制される、二価の二重特異性抗体である例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むHolliger,P.ら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.ら1994Structure2:1121-1123を参照されたい。。さらに、抗体又はこの抗原結合部分は、抗体又は抗体部分の1種又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の部分であってもよい。このような免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を生成するためのストレプトアビジンコア領域の使用その全体の教示を、参照により本明細書に組み込むKipriyanov,S.M.ら1995HumanAntibodiesandHybridomas6:93-101及び二価及びビオチン化scFv分子を生成するためのシステイン残基、マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグの使用その全体の教示を、参照により本明細書に組み込むKipriyanov,S.M.ら1994Mol.Immunol.31:1047-1058を含む。抗体部分、例えばFab及びFab’2フラグメントなどは、通常の技術、例えば全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などを使用して全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、本明細書に記載された標準の組換えDNA技術を使用して得ることができる。一態様において、抗原結合部分は、完全ドメイン又は完全ドメインの対である。用語カバットナンバリングKabatnumbering、カバット定義Kabatdefinition及びカバット標識Kabatlabelingは、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、当技術分野で認められているが、抗体又はこの抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基に比べてより可変であるすなわち、超可変であるアミノ酸残基に番号付与するシステムを意味するKabatら1971Ann.NYAcad,Sci.190:382-391及びKabat,E.A.ら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242、これらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込む。。重鎖可変領域について、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置31から35、CDR2についてアミノ酸位置50から65及びCDR3についてアミノ酸位置95から102の範囲に及ぶ。軽鎖可変領域について、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置24から34、CDR2についてアミノ酸位置50から56及びCDR3についてアミノ酸位置89から97の範囲に及ぶ。用語ヒト抗体には、Kabatらによって記載されたヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変及び定常領域を有する抗体が含まれるKabatら1991SequencesofproteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242を参照されたい。。本発明のヒト抗体は、例えば、CDR及び特にCDR3に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異によって又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異を含んでもよい。突然変異は、選択的突然変異アプローチを使用して導入することができる。ヒト抗体は、少なくとも1個の位置を、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされない活性増強アミノ酸残基で置換させることができる。ヒト抗体は、最大20個の位置を、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置換させることができる。他の実施形態において、最大10個、最大5個、最大3個又は最大2個の位置が置換される。一実施形態において、これらの置換は、CDR領域内である。しかし、本明細書で使用される用語ヒト抗体は、他の哺乳類種、例えばマウスなどの生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むよう意図されていない。語句組換えヒト抗体には、組換え手段によって調製、発現、生成又は単離された抗体、例えば宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え組合せヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物例えば、マウスから単離された抗体その全体の教示を参照により本明細書に組み込むTaylor,L.D.ら1992Nucl.AcidsRes.20:6287-6295を参照されたい。或いはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成又は単離された抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有するKabat,E.A.ら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242を参照されたい。。しかし、特定の実施形態において、このような組換えヒト抗体を、インビトロ突然変異生成にかけ又は、ヒトIg配列を遺伝子導入した動物が使用される場合、インビボ体細胞変異、従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来し関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に自然に存在し得ない配列である。しかし、特定の実施形態において、このような組換え抗体は、選択的突然変異アプローチ又は復帰突然変異又は両方の結果である。単離抗体には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体が含まれる例えば、特定の標的に特異的に結合し、特定の標的以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない単離抗体。特定のヒト標的に特異的に結合する単離抗体は、他の種からの同じ標的に結合し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び/又は化合物を実質的に含まないこともある。本明細書で使用される用語Koffは、抗体/抗原複合体からの抗体の解離の解離速度定数を意味するよう意図されている。本明細書で使用される用語Kdは、特定の抗体-抗原相互作用の解離定数を意味するよう意図されている。語句核酸分子には、DNA分子及びRNA分子が含まれる。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよいが、一態様において、二本鎖DNAである。抗体又は抗体部分例えば、VH、VL、CDR3をコードする核酸に関して本明細書で使用される語句単離核酸分子は、例えば、特定の標的に結合するものであり、その中で、該抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、該特定の標的以外の抗原に結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸を含み、これらの他の配列は、ヒトゲノムDNAにおける核酸を自然にフランクし得る。語句単離核酸分子は、同様に、二価の二重特異性抗体、例えば、VH及びVL領域が、ダイアボディーの配列以外の他の配列を含まないダイアボディーなどをコードする配列を含むよう意図されている。語句組換え宿主細胞又は単に宿主細胞には、組換え発現ベクターが導入されている細胞が含まれる。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫も意味するよう意図されていることは理解されるべきである。特定の変更が、突然変異又は環境の影響のいずれかによって後続世代に生じることがあるので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではないこともあるが、本明細書で使用される用語宿主細胞の範囲内に含まれる。本明細書で使用される用語約は、参照値より約10-20大きい又は小さい範囲を意味するよう意図されている。特定の環境において、当業者は、参照値の性質により、用語約は、この値からおおよそ10-20の偏差を意味することがあることを理解されよう。本明細書で使用されるクロマトグラフィーは、分子の混合物からの興味のある標的分子の分離のために使用される分析技術を意味し、固相への混合物の成分間の選択的引力に依存する。例には、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。混合物における興味のある標的分子に関して精製されたは、この相対濃度該混合物における全ての成分又は画分の重量で割った標的の重量が、少なくとも20だけ増加することを示す。一連の実施形態において、相対濃度は、少なくとも約40、約50、約60、約75、約100、約150又は約200だけ増加する。興味のある標的分子は、同様に、それらからこれが精製される成分の相対濃度混合物における全ての成分又は画分の重量で割ったそれからこれが精製される成分又は画分の重量が、少なくとも約20、約40、約50、約60、約75、約85、約95、約98又は約100だけ減少する場合に精製されたと言うことができる。別の一連の実施形態において、興味のある標的分子は、少なくとも約50、約65、約75、約85、約90、約97、約98又は約99の相対濃度に精製される。一実施形態における興味のある標的分子が、他の成分又は画分から分離される場合、他の実施形態において、該成分又は画分が、本明細書に提供された濃度に精製されることは理解されよう。5.2抗体の作製本節において使用される用語抗体は、完全抗体又はこの抗原結合フラグメントを意味する。本開示の抗体は、興味のある抗原による動物の免疫化及び次いでの通常のモノクローナル抗体方法、例えば、KohlerandMilstein1975Nature256:495の標準の体細胞交雑技術を含む様々な技術によって作製することができる。体細胞交雑手法は、原則として一般的であるが、モノクローナル抗体を生成するための他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換を使用することができる。ハイブリドーマを調製するための一つの典型的な動物システムは、マウスシステムである。ハイブリドーマ生成は、非常に確立された手法である。免疫化プロトコル及び融合のための免疫化脾細胞の単離の技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー例えば、マウス骨髄腫細胞及び融合手順も知られている。抗体は、一般的に、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってよい。本開示のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上記に記載されたように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、興味のある非ヒトハイブリドーマから得て、標準の分子生物学技術を使用して非マウス例えば、ヒト免疫グロブリン配列を含むよう作り変えることができる。例えば、キメラ抗体を生成するために、マウスの可変領域を、当技術分野で知られている方法を使用して、ヒトの定常領域に連結することができる例えば、Cabillyらへの米国特許第4,816,567号を参照されたい。。ヒト化抗体を生成するために、マウスのCDR領域を、当技術分野で知られている方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる例えば、Winterへの米国特許第5,225,539号及びQueenらへの米国特許第5,530,101号;5,585,089号;5,693,762号及び6,180,370号を参照されたい。。一つの限定されない実施形態において、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、マウスシステムではなくヒト免疫システムの部分を有するトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックマウス及びトランスクロモソミックマウスには、本明細書でHuMAbMouse登録商標Medarex,Inc.、KMMouse登録商標Medarex,Inc.及びXenoMouse登録商標Amgenと呼ばれるマウスが含まれる。さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代わりのトランスクロモソミック動物システムが、当技術分野で利用可能であり、本開示の抗体を培養するために使用することができる。例えば、TCマウスと呼ばれるヒト重鎖トランスクロモソーム及びヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を有するマウスを使用することができ、このようなマウスは、Tomizukaら2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖及び軽鎖トランスクロモソームを有するウシが、当技術分野で記載されており例えば、Kuroiwaら2002NatureBiotechnology20:889-894及びPCT出願国際公開第2002/092812号、本開示の抗体を培養するために使用することができる。本発明の組換えヒト抗体は、組換え組合せ抗体ライブラリー、例えば、ヒトリンパ球由来のmRNAから調製されるヒトVL及びVHcDNAを使用して調製されるscFvファージ提示ライブラリーのスクリーニングによって単離することができる。このようなライブラリーを調製及びスクリーニングする方法は、当技術分野で知られている。ファージ提示ライブラリーを作製するための市販キット例えば、thePharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,catalogno.27-9400-01;及びtheStratageneSurfZAPTMphagedisplaykit,catalogno.240612、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。に加えて、抗体提示ライブラリーの作製及びスクリーニングにおける使用に特に適する方法及び試薬の例は、例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む、Ladnerら米国特許第5,223,409号;KangらPCT国際公開第92/18619号;DowerらPCT国際公開第91/17271号;WinterらPCT国際公開第92/20791号;MarklandらPCT国際公開第92/15679号;BreitlingらPCT国際公開第93/01288号;McCaffertyらPCT国際公開第92/01047号;GarrardらPCT国際公開第92/09690号;Fuchsら1991Bio/Technology9:1370-1372;Hayら1992HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseら1989Science246:1275-1281;McCaffertyら、Nature1990348:552-554;Griffithsら1993EMBOJ12:725-734;Hawkinsら1992JMolBiol226:889-896;Clacksonら1991Nature352:624-628;Gramら1992PNAS89:3576-3580;Garrardら1991Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboomら1991NucAcidRes19:4133-4137;及びBarbasら1991PNAS88:7978-7982に見出すことができる。本開示のヒトモノクローナル抗体は、同様に、その中にヒト免疫細胞が、ヒト抗体応答が、免疫化によって生成され得るように、再構成されているSCIDマウスを使用して調製することができる。このようなマウスは、例えば、Wilsonらへの米国特許第5,476,996号及び5,698,767号に記載されている。本発明のさらに別の実施形態において、抗体又はこれらのフラグメントは、該抗体の定常領域が、非修飾抗体に比べて少なくとも一つの定常領域媒介生物エフェクター機能を減少するよう修飾されたものに変更することができる。Fc受容体への減少した結合を示すように本発明の抗体を修飾するために、該抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを、Fc受容体FcR相互作用のために必要な特定領域において突然変異させることができる例えば、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むCanfieldandMorrison1991J.Exp.Med.173:1483-1491;及びLundら1991J.ofImmunol.147:2657-2662を参照されたい。。抗体のFcR結合能の減少は、FcR相互作用に依存する他のエフェクター機能、例えば、オプソニン化及びファゴサイトーシス及び抗原依存性細胞障害なども減少させ得る。5.3.抗体の生成本発明の抗体を発現するために、部分又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAを、遺伝子が、転写及び翻訳調節配列に操作可能に連結operativelylinkするように1種又は複数の発現ベクターに挿入する。例えば、その全体の教示を、参照により本明細書に組み込む米国特許第6,914,128号を参照されたい。これに関連して、用語操作可能に連結されたは、抗体遺伝子を、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調整することのこれらの意図された機能に役立つようにベクターにライゲートすることを意味するよう意図されている。発現ベクター及び発現調節配列は、使用される発現宿主細胞に適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ又はより一般的には、両方の遺伝子を同一の発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子を、標準の方法で発現ベクターに挿入する例えば、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション。抗体又は抗体に関連する軽鎖又は重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターが、抗体定常領域配列を既に有する場合がある。例えば、特定のVH及びVL配列を完全長抗体遺伝子に変換する一つのアプローチは、それぞれ、VHセグメントが、該ベクター内のCHセグメント複数可に操作可能に連結され、VLセグメントが、該ベクター内のCLセグメントに操作可能に連結されるように、重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター中にこれらを挿入することである。さらに又は別法として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム単位で連結するようにベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチドすなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチドであってよい。抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖遺伝子の発現を制御する1種又は複数の調節配列を有し得る。用語調節配列は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子例えば、ポリアデニル化シグナルを含むよう意図されている。このような調節配列は、例えば、その全体の教示を参照により本明細書に組み込むGoeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA1990に記載されている。発現ベクターのデザインは、調節配列の選定を含めて、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることは当業者によって理解されよう。哺乳類宿主細胞発現に好適な調節配列には、哺乳類細胞における高濃度のタンパク質発現を指示するウイルス因子、例えば、サイトメガロウイルスCMV由来のプロモーター及び/又はエンハンサーCMVプロモーター/エンハンサーなど、SimianVirus40SV40SV40プロモーター/エンハンサーなど、アデノウイルス例えば、アデノウイルス主後期プロモーターAdMLP及びポリオーマなどが含まれる。ウイルス調節因子及びこれらの配列のさらなる説明について、例えば、それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込むStinskiによる米国特許第5,168,062号、Bellらによる米国特許第4,510,245号及びSchaffnerらによる米国特許第4,968,615号を参照されたい。抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、1種又は複数の追加の配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列例えば、複製起点及び/又は選択的マーカー遺伝子を有し得る。選択的マーカー遺伝子は、それらの中にベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する例えば、それらの全体の教示を、参照により本明細書に組み込む、全てAxelらによる米国特許第4,399,216号、4,634,665号及び5,179,017号を参照されたい。。例えば、一般的に、選択的マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入されている宿主細胞に、薬物、例えばG418、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどに対する耐性を与える。好適な選択的マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素DHFR遺伝子メトトレキセート選択/増幅を用いるdhfr-宿主細胞における使用のため及びneo遺伝子G418選択用が含まれる。本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えで抗体を発現させるために、宿主細胞に、軽鎖及び重鎖が、宿主細胞に発現され、宿主細胞が培養されている培地中に分泌され、この培地から抗体を回収することができるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするDNAフラグメントを有する1種又は複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトする。標準の組換えDNA方法を使用して、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、宿主細胞、例えば、それらの全体の教示を本明細書に組み込むSambrook,FritschandManiatis編,MolecularCloning;ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989,Ausubelら編CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,1989及び米国特許第4,816,397号及び6,914,128号に記載されたものなどに該ベクターを導入する。軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター複数可を、標準の技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語トランスフェクションの様々な形態は、外来性DNAの原核又は真核宿主細胞への導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含するよう意図されている。本発明の抗体を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のいずれかに発現させることは、理論的に可能であるが、真核細胞、例えば哺乳類宿主細胞における抗体の発現は、このような真核細胞、特に哺乳類細胞が、原核細胞に比べて、適切に折り畳まれた免疫活性な抗体を集め分泌しやすいので好適である。抗体遺伝子の原核細胞発現は、高収率の活性抗体の生成のためには効果のないことが報告されているその全体の教示を参照により本明細書に組み込むBossandWood1985ImmunologyToday6:12-13。本明細書でベクターにDNAをクローニング又は発現させるために好適な宿主細胞は、上記の原核生物細胞、酵母細胞又は高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物には、真性細菌目eubacteria、例えば、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、エスケリキア属Escherichiaなどの腸内細菌科Enterobacteriaceae、例えば、E.コリE.coli、エンテロバクテル属Enterobacter、エルウィニア属Erwinia、クレブシエッラ属Klebsiella、プロテウス属Proteus、サルモネッラ属Salmonella、例えば、サルモネッラチュピムリウムSalmonellatyphimurium、セッラチア属Serratia、例えば、セッラチアマルケスカンスSerratiamarcescans及び赤痢菌属Shigella、同様にバキッリBacilli、例えばB.スブチリスB.subtilis及びB.リケニフォルミスB.licheniformis例えば、1989年、4月12日に公開されたDD266,710に開示されたB.リケニフォルミス41P、プセウドモナス属Pseudomonas、例えばP.アエルギノサP.aeruginosa並びにストレプトミュケス属Streptomycesが含まれる。E.コリB、E.コリX1776ATCC31,537及びE.コリW3110ATCC27,325などの他の菌株は好適であるとはいえ、一つの好適なE.コリのクローニング宿主は、E.コリ294ATCC31,446である。これらの例は、限定的ではなく例示的である。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに好適なクローニング又は発現宿主である。サッカロミュケスケレウィシアエSaccharomycescerevisiae又は一般のパン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的使用されている。しかし、多くの他の属、種及び系、例えば、スキゾサッカロミュケスポムベSchizosaccharomycespombe;クルユウェロミュケスKluyveromyces宿主、例えば、K.ラクティスK.lactis、K.フラギリスK.fragilisATCC12,424、K.ブルガリクスK.bulgaricusATCC16,045、K.ウィクケラミイイK.wickeramiiATCC24,178、K.ワルティイK.waltiiATCC56,500、K.ドロソピラルムK.drosophilarumATCC36,906、K.テルモトレランスK.thermotolerans及びK.マルクシアヌスK.marxianusなど;ユアッロウィアyarrowiaEP402,226;ピキアパストリスPichiapastorisEP183,070;カンディダCandida;トリコデルマレエシアTrichodermareesiaEP244,234;ネウロスポラクラッサNeurosporacrassa;スクワンニオミュケスSchwanniomyces、例えば、スクワンニオミュケスオッキデンタリスSchwanniomycesoccidentalis;及び糸状菌、例えば、ネウロスポラNeurospora、ペニキッリウムPenicillium、トリュポクラディウムTolypocladium及びアスペルギッルス属Aspergillus宿主、例えば、A.ニデュランスA.nidulans及びA.ニゲルA.nigerが、一般的に利用可能で本明細書において有用である。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物から導かれる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変種及びスポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperda毛虫、アエデスアエギュプティAedesaegypti蚊、アエデスアルボピクトゥスAedesalbopictus蚊、ドロソピラメラノガステルDrosophilamelanogasterミバエ及びボムビュクスモリBombyxmoriなどの宿主からの対応する許容状態の昆虫宿主細胞が確認されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、アウトグラパカリフォルニカAutographacalifornicaNPVのL-1変種及びボムビュクスモリBombyxmoriNPVのBm-5株などが、公的に利用可能であり、このようなウイルスは、特にスポドプテラフルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書におけるウイルスとして使用することができる。木綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も同様に宿主として使用することができる。本発明の組換え抗体を発現させるために好適な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞それらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む、例えば、KaufmanandSharp1982Mol.Biol.159:601-621に記載されたDHFR選択的マーカーと共に使用されるUrlaubandChasin,1980PNASUSA77:4216-4220に記載されたdhfr-CHO細胞を含む。、NS0骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又はその中で宿主細胞が培養されている培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間、宿主細胞を培養することによって生成される。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚腎臓株懸濁培地における培養のためにサブクローニングされた293又は293細胞、Grahamら、J.GenVirol.36:591977;ベビーハムスター腎臓細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、Urlaubら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980;マウスセルトリ細胞TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243-2511980;サル腎臓細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頸癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎臓細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞HepG2、HB8065;マウス乳癌細胞MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matherら、AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-681982;MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌細胞株HepG2であり、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。宿主細胞に、抗体の生成のための上述の発現又はクローニングベクターを形質転換し、プロモーターを誘発すること、形質転換体を選択すること又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅することのために適切に調節された通常の培養液中で培養する。抗体を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。Ham’sF10商標Sigma、MinimalEssentialMedium商標MEM、Sigma、RPMI-1640Sigma及びDulbecco’sModifiedEagle’sMedium商標DMEM、Sigmaなどの市販の培地が、宿主細胞を培養するために好適である。さらに、Hamら、Meth.Enz.58:441979、Barnesら、Anal.Biochem.102:2551980、米国特許第4,767,704号;4,657,866号;4,927,762号;4,560,655号;又は5,122,469号;WO90/03430;WO87/00195;又は米国再発行特許第30,985号に記載された培地のいずれも宿主細胞のための培地として使用することができ、これらの全体の教示を参照により本明細書に組み込む。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び/又は他の成長因子インスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など、塩塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩、緩衝液HEPESなど、ヌクレオチドアデノシン及びチミジンなど、抗生物質ゲンタマイシン薬など、微量元素ミクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される。及びグルコース又は同等のエネルギー源を、補うことができる。任意の他の必要なサプリメントも当業者に知られている適切な濃度で含まれる場合がある。培養条件、例えば温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者には明らかであろう。宿主細胞は、完全抗体の部分、例えばFabフラグメント又はscFv分子などを産生するためにも使用することができる。上記の手順の変形は、本発明の範囲内であることを理解されたい。例えば、特定の実施形態において、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖両方ではなくのいずれかをコードするDNAをトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えDNA技術は、抗原結合のために必要ではない軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするDNAのいくつか又は全てを除去するためにも使用することができる。このような切断DNA分子から発現された分子も本発明の抗体に包含される。さらに、1種の重鎖及び1種の軽鎖が本発明の抗体であり、他の重鎖及び軽鎖が元の抗原以外の抗原について特異的である二官能性抗体を、本発明の抗体を、標準の化学架橋法によって第二の抗体に架橋することによって生成することができる。本発明の抗体又はこの抗原結合部分の組換え発現のために好適なシステムにおいて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってdhfr-CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子は、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節因子にそれぞれ操作可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、同様に、DHFR遺伝子を有し、これは、メトトレキセート選択/増幅を使用してベクターをトランスフェクトしたCHO細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞を培養して、抗体重鎖及び軽鎖の発現を可能にし、完全抗体を培地から回収する。標準の分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体に選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。組換え技術を使用する場合、抗体はペリプラスムスペースに細胞内に産生することができ又は培地中に直接分泌することができる。一態様において、抗体が細胞内に産生される場合、第一ステップとして、宿主細胞又は溶解細胞例えば、ホモジェネートによるもののいずれかの粒子片は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、このような発現系からの上澄みは、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon商標又はMilliporePellicon商標限外濾過ユニットを使用して濃縮することができる。本発明のプロセスの前の、細胞片からの抗体の精製の手順は、当初は、抗体の発現の部位によって決まる。いくつかの抗体は、周囲の培地中に細胞から直接分泌される場合があり、他は細胞内に生成される。後者の抗体について、精製プロセスの第一ステップは、一般的に、細胞の溶解を含み、これは、機械的剪断、浸透圧衝撃又は酵素処理を含む様々な方法によって行うことができる。このような破壊は、細胞の全内容物をホモジェネート中に放出し、加えて、それらの小さなサイズのため除去することが困難である細胞より小さいフラグメントを生成する。これらは、一般的に分画遠心法によって又は濾過によって除去される。抗体が分泌される場合、このような発現系からの上澄みは、一般的に、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon商標又はMilliporePellicon商標限外濾過ユニットを使用して濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、同様に、例えば、接線流濾過によって細胞培地から分離することができる。抗体は、本発明の抗体精製法を使用して培地からさらに回収することができる。5.4.抗体の精製5.4.1抗体の精製全般本発明は、抗体及び少なくとも1種のHCPを含む混合物から精製された又はHCPを減少させた抗体製剤を生成する方法を提供する。抗体が、上述された方法及び当技術分野における通常の方法を使用して生成される場合、本発明の精製プロセスは、分離ステップにおいて開始する。表1は、精製スキームの一実施形態を要約している。それだけには限らないが、イオン交換ステップの順序が逆転された変形を含む本スキームの変形が想定され、本発明の範囲に含まれる。抗体を含む浄化された溶液又は混合物が得られ次第、細胞、例えばHCPなどによって生成された他のタンパク質からの抗体の分離を、親和性分離ステップ複数可、イオン交換分離ステップ複数可及び疎水性相互作用分離ステップ複数可を含む様々な精製技術の組合せを使用して実施する。分離ステップは、それらの結合特性、電荷、疎水性の程度又はサイズに基づいてタンパク質の混合物を分離する。本発明の一態様において、親和性、陽イオン性、陰イオン性及び疎水性相互作用を含むクロマトグラフィーを使用して分離を実施する。いくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂が、これらの技術のそれぞれに利用可能であり、関係している特定のタンパク質に対する精製スキームの正確な調整を可能にする。分離方法のそれぞれの本質は、タンパク質は、異なる速度でカラムを下に移動し、これらがカラムをさらに下の方へ通過するにつれて増加する物理的分離を達成し又は分離媒体に選択的に付着し、次いで、異なる溶媒によって差別的に溶出させることができることである。いくつかの場合において、不純物がカラムに特異的に付着し、抗体が付着しない、即ち、抗体がフロー中に存在する場合、抗体が不純物から分離される。上述のとおり、精製スキームの正確な調整は、精製すべきタンパク質の考察に依存する。特定の実施形態において、本発明の分離ステップが、1種又は複数のHCPから抗体を分離するために使用される。本発明は、一般的にタンパク質の精製を対象としているが、これは、抗体の精製に特異的に適合させることができる。例えば、本明細書に記載された方法を使用して首尾良く精製され得る抗体には、それだけには限らないが、ヒトIgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及びIgM抗体が含まれる。特定の実施形態において、本発明の精製ストラテジーは、IgG3抗体が、非効率的にタンパク質Aに結合するので、例えば、IgG3抗体の精製との関連で、タンパク質A親和性クロマトグラフィーの使用を排除する。精製スキームの特異的な調整を可能にする他の因子には、それだけには限らないが、タンパク質AがFc領域に結合するのでFc領域の存在又は非存在例えば、そのFabフラグメントと比較した完全長抗体との関連で;興味のある抗体の作製に使用される特定の生殖系配列;及び抗体のアミノ酸組成例えば、抗体の一次配列及び分子の全電荷/疎水性が含まれる。1種又は複数の特徴を共有する抗体は、この特徴を利用するよう調整された精製ストラテジーを使用して精製することができる。5.4.2.疑似移動床クロマトグラフィー上に概要が記載されたとおり、抗体の精製は、一般的に、1つ又は複数のクロマトグラフィー分離ステップを組み込む。このようなクロマトグラフィー分離ステップは、伝統的に、バッチモードで実施されているが、このようなバッチモード分離は、精製プロセスに著しい非効率を持ち込む場合がある。例えば、バッチモードにおけるクロマトグラフィーカラムの使用は、カラムが、これらの動的容量だけローディングされることしか求めないので、バッチモードは、カラムがこれらの飽和容量までローディングされた場合と比べて2倍から3倍多くの樹脂の使用を必要とする。タンパク質クロマトグラフィー樹脂は、しばしば非常に高価であるため、この非効率は、全体コストを大きく増加させ得る。さらに、バッチカラムクロマトグラフィーにおける洗浄及び溶離プロセスは、かなりの流体体積を必要とし、これは、精製プロセスのコストを増加させるのみならず、このような分離を終えるために必要な時間をかなり増加させる。特定の実施形態において、本発明は、1種又は複数の疑似移動床SMBクロマトグラフ分離の使用を対象とする。特定の実施形態において、このようなSMB分離は、1種又は複数の伝統的なバッチモード分離に加えるものであり又はこれらに取って代わる。SMBクロマトグラフィー分離は、それらの飽和容量近くまでローディングされるカラムの使用を含むので、これらは、より小さい体積のクロマトグラフィー樹脂を必要とする。さらに、SMB分離は、より効率的な洗浄及び溶離プロセスを可能にするので、SMB分離の使用は、緩衝液のかなり減少した消費及びより時間効率のよい精製プロセスをもたらす。特定の実施形態において、SMBシステムは、固相クロマトグラフィー支持体がローディングされた1つ又は複数のモジュールを含む。このような支持体には、それだけには限らないが、親和性クロマトグラフィー樹脂、イオン交換クロマトグラフィー樹脂及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂が含まれる。特定の実施形態において、一つの特定のモジュールは、1個又は複数のクロマトグラフィーカラムを含むことができ、但し、該システムは、少なくとも2個のクロマトグラフィーカラムを含むことを条件とする。特定の実施形態において、各モジュール及び多数モジュールシステムにおける各モジュールの様々な態様は、互いに流体連絡している。特定の実施形態において、このような流体連絡は、相互接続した流体管によって達成される。特定の実施形態において、このような管は、流体の導入及び/又は抜き取りを可能にするためのバルブ又は他の手段によって分離されている。本発明の特定の実施形態において、流体管は、SMBシステムの上流及び下流末端を相互接続して、それを通って流体混合物が継続的に循環されるループを形成する。特定のポイントにおいて、流体の流れが導入されることがあり、他のポイントにおいて、流出液の流れが抜き取られることがある。特定の実施形態において、供給材料のための入口、溶離緩衝液のための入口、解離された成分のための出口及び結合していない又はあまり結合していない成分のための出口を選択的に位置づけるために、管及びバルブの多岐管システムを提供することができる。特定の実施形態において、各入口及び出口ポイントは、別々のモジュール又はカラムに通じている。例えば、特定の実施形態において、供給材料は、指定されたポイントでシステムに入り、連続した内部再循環フローによって固相を通して動かされる。この移動接触は、供給原料の成分のクロマトグラフィー分離をもたらす。結合していない成分は、比較的速い速度で流れるが、最初の洗浄流出液の流れの除去などによって結合していない成分の出口から取り出される。固相から結合した化合物を解離する緩衝液が、結合成分及び結合していない成分のそれぞれの出口バルブ位置の間のこの入口バルブにおいて添加される。特定の実施形態において、指定された入口及び出口バルブ位置は、次の固相床カラムに対して多岐管上で一つの位置だけ下流に位置がずらされている。ステップ時間は、バルブの指定が、内部の再循環流れと適切に同期化されるよう選択される。これらの条件下で、システムは、最終的に定常状態に到達し、特定の生成物の特性が、各バルブ位置において順々に所定の間隔で出現する。固相が、再循環ループの周りを一定の連続した速度で移動し、各バルブにおいて一定の品質の生成物が生成されるが、このタイプのシステムは、バルブが単一の位置に固定されているように偽装する。特定の実施形態において、バルブ位置は固定されたままであるが、カラムが、手動で又は機械的カルーセルによって物理的に動かされる代わりの装置を使用することができる。モジュール及びバルブ位置の数が増加するにつれて、SMB分離プロセスは、実際の移動床システムの特徴に近づく。特定の実施形態において、モジュールの数は、最大2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、ここで、各モジュールは、1個又は複数の個別のクロマトグラフィーカラムを含む。特定の実施形態において、SMBシステムは、4又は8個のクロマトグラフィーカラムを含む。特定の実施形態において、疑似移動床プロセスが親和性クロマトグラフィーとの関連で使用される。特定の実施形態において、クロマトグラフィー材料は、興味のある抗体に選択的に又は特異的に結合し得る。このようなクロマトグラフィー材料の限定されない例には、タンパク質A、タンパク質G、興味のある抗体により結合された抗原を含むクロマトグラフィー材料及びFc結合タンパク質を含むクロマトグラフィー材料が含まれる。特定の実施形態において、親和性クロマトグラフィーステップは、一次回収試料を、好適なタンパク質A樹脂を含むカラムに通すステップを含む。タンパク質A樹脂は、変種抗体イソタイプ、特にIgG1、IgG2及びIgG4の親和性精製及び単離のために有用である。タンパク質Aは、主としてこのFc領域を通して哺乳類IgGに結合する細菌細胞壁タンパク質である。その天然状態において、タンパク質Aは、5個のIgG結合ドメイン及び未知の機能の他のドメインを有する。特定の実施形態において、疑似移動床プロセスが、イオン交換クロマトグラフィーとの関連で使用される。イオン交換分離は、それによって2種の物質が、これらのそれぞれのイオン電荷の違いに基づき分離される任意の方法を含み、陽イオン交換材料又は陰イオン交換材料のいずれかを使用し得る。陽イオン交換材料対陰イオン交換材料の使用は、タンパク質の全電荷に基づく。従って、陽イオン交換ステップの使用の前に陰イオン交換ステップを使用すること又は陰イオン交換ステップの使用の前に陽イオン交換ステップを使用することは、本発明の範囲内である。さらに、陽イオン交換ステップのみを使用すること、陰イオン交換ステップのみを使用すること又は二つの任意の直列組合せを使用することは、本発明の範囲内である。イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換分離技術としても使用することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、分子の全電荷の間の差異に基づき分子を分離する。抗体の精製のために、抗体は、結合するために、イオン交換材料、例えば、樹脂に結合させられた官能基のそれと反対の電荷を有する必要がある。例えば、抗体は、これらのpIより小さい緩衝液pH中で全体として正電荷を一般的に有するが、負に帯電した官能基を含む陽イオン交換材料によく結合する。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、周囲の緩衝液のイオン強度が低いことを条件として、溶質の表面上の帯電したパッチは、クロマトグラフィーマトリックスに付着した反対電荷によって引きつけられる。溶離は、一般的に、イオン交換マトリックスの帯電した部位について溶質と競合するように緩衝液のイオン強度すなわち、伝導性を増加させることによって達成される。pHを変化させ、これにより溶質の電荷を変えることは、溶質の溶離を達成するための別の方法である。伝導性又はpHの変化は、漸進的勾配溶離又は段階的段階溶離であってよい。陰イオン又は陽イオン置換基を、クロマトグラフィーに陰イオン又は陽イオン支持体を形成するためにマトリックスに結合させることができる。陰イオン交換置換基の限定されない例には、ジエチルアミノエチルDEAE、第四級アミノエチルQAE及び第四級アミンQ基が含まれる。陽イオン置換基には、カルボキシメチルCM、スルホエチルSE、スルホプロピルSP、ホスフェートP及びスルホネートSが含まれる。DE23商標、DE32商標、DE52商標、CM-23商標、CM-32商標及びCM-52商標などのセルロースイオン交換樹脂は、WhatmanLtdMaidstone,Kent,U.K.から市販されている。HADEX登録商標ベース及び架橋イオン交換体も知られている。例えば、DEAE-、QAE-、CM-及びSP-HADEX登録商標及びDEAE-、Q-、CM-及びS-HAROSE登録商標及びHAROSE登録商標FastFlowは、全てPharmaciaABから市販されている。さらに、TOYOPEARL商標DEAE-650S又はM及びTOYOPEARL商標CM-650S又はMなどの両方ともDEAE及びCM誘導体化エチレングリコール-メタクリレートコポリマーは、TosoHaasCo.,Philadelphia,Paから市販されている。イオン交換ステップは、HCPなどの不純物を減少させながら興味のある抗体の捕捉を促進する。特定の態様において、イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムである。例えば、限定するものではなく、このような陽イオン交換カラムに適する樹脂は、CMHyperDF商標樹脂である。これらの樹脂は、PallCorporationなどの商業供給源から市販されている。この陽イオン交換手順は、室温において又はこの周辺で実施することができる。特定の実施形態において、疑似移動床プロセスは、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICとの関連で使用される。イオン交換クロマトグラフィーは、それらを単離するために抗体の電荷に依存するが、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、抗体の疎水性を使用する。抗体上の疎水性基は、カラム上の疎水性基と相互に作用する。タンパク質がより疎水性であれば、これは、それだけ強くカラムと相互に作用する。従って、HICステップは、宿主細胞由来の不純物例えば、DNA及び他の高及び低分子量生成物関連種を除去する。疎水性相互作用は、高いイオン強度において最も強く、従って、この形態の分離は、塩析沈殿又はイオン交換手順に続いて好都合に実施される。抗体のHICカラムへの吸着は、高い塩濃度が好ましいが、実際の濃度は、抗体及び特定の選択されるHICリガンドの性質に応じて広範囲に変わり得る。様々なイオンを、これらが、疎水性相互作用塩析効果を促進し又は水の構造を崩壊カオトロピック効果させ、疎水性相互作用の低下をもたらすかに応じていわゆる疎溶媒性系列soluphobicseriesに並べることができる。陽イオンは、塩析効果を増すことの観点からBa;Ca;Mg;Li;Cs;Na;K;Rb;NH4と準位付けされるが、陰イオンは、カオトロピック効果を増すことの観点からP0---;S04--;CH3CO3-;Cl-;Br-;NO3-;ClO4-;I-;SCN-と準位付けすることができる。一般的に、Na、K又はNH4硫酸塩は、HICにおいてリガンド-タンパク質相互作用を有効に促進する。次の関係:NH42SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCNで与えられるように相互作用の強度に影響を与える塩を表すことができる。一般的に、約0.75及び約2Mの硫酸アンモニウムの間又は約1及び4MのNaClの間の塩濃度が有用である。HICカラムは、通常、それに対して、疎水性リガンド例えば、アルキル又はアリール基が結合しているベースマトリックス例えば、架橋アガロース又は合成コポリマー材料を含む。好適なHICカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂例えば、PhenylSepharose商標カラムを含む。多くのHICカラムは市販されている。例には、それだけには限らないが、低又は高置換されたPhenylSepharose商標6FastFlowカラムPharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden;PhenylSepharose商標HighPerformanceカラムPharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden;OctylSepharose商標HighPerformanceカラムPharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden;Fractogel商標EMDPropyl又はFractogel商標EMDPhenylカラムE.Merck,Germany;Macro-Prep商標Mehyl又はMacro-Prep商標t-ButylSupportsBio-Rad,California;WPHI-PropylC3商標カラムJ.T.Baker,NewJersey;及びToyopearl商標エーテル、フェニル又はブチルカラムTosoHaas,PAが含まれる。5.5.例示的な精製ストラテジー特定の実施形態において、SMB分離プロセスは、一連のタンパク質Aカラムを使用する。一つの特定の限定されない例において、SMB分離プロセスは、4個のタンパク質Aカラムを使用する。特定の実施形態において、4個のタンパク質Aカラムは、1.6cmの直径及び5cmの高さを有し、MabSelectタンパク質A樹脂が充填されている。代わりの実施形態において、追加のカラム、例えば、5、6、7、8、9又は10個のカラムを使用することができ、カラムは、実質的により大きな直径及び高さのもので、最大約2、最大約3、最大約4、最大約5、最大約6、最大約7、最大約8、最大約9、最大約10、最大約11、最大約12、最大約13、最大約14、最大約15、最大約16、最大約17、最大約18、最大約19、最大約20、最大約25、最大約30、最大約40、最大約50、最大約60、最大約70、最大約80、最大約90、最大約100リットル又はこれより大きいローディングカラム体積となるものであってよい。特定の実施形態において、特定のSMB分離スキームに使用される各タンパク質Aカラムは、試料のローディング前に好適な緩衝液で平衡化させることができる。好適な緩衝液の限定されない例は、約7.2のpHのトリス緩衝液である。好適な平衡化条件の限定されない例は、約7.2のpHの350mMトリス緩衝液である。この平衡化に続いて、試料をカラムにローディングすることができる。カラムのローディングに続いて、カラムを、例えば、平衡化緩衝液を使用して1又は複数回洗浄することができる。カラムを溶離する前に、異なる緩衝液を使用する洗浄を含めて他の洗浄を使用することができる。例えば、1又は複数のカラム容積の約7.2のpHの25mMトリスを使用して、カラムを洗浄することができる。場合によって、この洗浄に続いて、平衡化緩衝液を使用する1又は複数回の洗浄を行うことができる。次いで、タンパク質Aカラムを、適切な溶離緩衝液を使用して溶離することができる。好適な溶離緩衝液の限定されない例は、約3.5のpHの酢酸/NaCl緩衝液である。好適な条件は、例えば、約3.5のpHの0.1M酢酸である。溶離液は、当業者によく知られている技術を使用して監視することができる。例えば、OD280における吸収を追跡することができる。約0.5AUの初期動揺で開始し、溶離ピークの立ち下がりにおける約0.5AUの読み取りまでカラム溶離液を回収することができる。次いで、興味のある溶離画分複数可を、さらなる処理のために準備することができる。例えば、回収した試料は、約10のpHのトリス例えば、1.0Mを使用して約5.0のpHに滴定することができる。場合によって、この滴定した試料を、濾過し、さらに処理することができる。特定の実施形態において、試料のローディング量は、特定の目標滞留時間をもたらすように計算される。特定の実施形態において、試料のローディング量は、約0.5から約12分の範囲にわたる目標滞留時間をもたらすように計算され、特定の実施形態において、これは、最大約0.5、最大約1、最大約2、最大約3、最大約4、最大約5、最大約6、最大約7、最大約8、最大約9又は最大約10分からなる群から選択される。特定の実施形態において、目標滞留時間は、3分である。特定の実施形態において、試料のローディング量も、同様に、カラムの飽和結合容量の最大約50、最大約60、最大約70、最大約80、最大約90又は最大約100をもたらすように計算する。特定の実施形態において、SMB分離プロセスは、平衡化緩衝液、ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、溶離緩衝液、再生緩衝液及び貯蔵緩衝液の導入のための一つの特定のプログラムを含む。特定の実施形態において、上記プログラムは、3部:第1運転、第2から第n-1運転及び最終運転から構成される。このようなプログラムの限定されない例は以下の通りである。特定の実施形態において、第一洗浄ステップは、平衡化緩衝液と同一の緩衝液を使用する。特定の実施形態において、第一洗浄ステップは、試料ローディングステップに統合することができる。特定の実施形態において、ローディング時間が運転の約50となるように保つために、洗浄、溶離及び再生ステップを計算しプログラムすることができる。5.5.ラマン分光法ラマン分光法は、物質への単色の入射光は、固有の様式で、反射、吸収又は散乱され、これは、放射を受ける特定の分子又はタンパク質によって決まるという原理に基づく。大部分のエネルギーは同じ波長で散乱されるがRayleigh散乱、少量例えば10-7の放射が、いくらか異なる波長で散乱されるStokes及びAntistokes散乱。この散乱は、回転、振動及び電子準位遷移と関係がある。散乱光子の波長の変化は、化学的及び構造的な情報を提供する。特定の実施形態において、ラマン分光法は、本明細書に記載されたSMB技術との関連で使用されるものなどの多成分混合物に実施して、成分の高度に特異的な指紋を提供することができる。混合物のラマン分光分析からもたらされるスペクトル指紋は、各個別成分の重ね合わせである。帯域の相対強度は、特定の成分の相対濃度と関係がある。従って、特定の実施形態において、ラマン分光法は、成分の混合物を定性的及び定量的に特徴付けるために使用することができる。従って、このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法は、本発明のHCPを減少させた目標タンパク質調製物の生成に関与する1種又は複数の多成分混合物の組成を測定及び/又は決定するために使用することができる。ラマン分光法は、非常に短いシグナル収集時間で、固体、液体、スラリー、ゲル、フィルム、粉末及び気体を含む大部分の試料を特徴付けるために使用することができる。一般的に、試料は、特別な調製技術を必要とせず、問題のバイオプロセスから直接採取することができる。また、入射光及び散乱光は、長距離にわたって伝送することができ、遠隔監視が可能になる。さらに、水は、弱いラマン散乱しか与えないので、水性試料は、水からの著しい干渉を受けずに特徴付けることができる。本明細書に記載された適用可能なプロセス及び組成物は、市販のラマン分光分析器に基づいて分析することができる。例えば、KaiserOpticalSystems,Inc.AnnArbor,MIから市販されているRamanRX2商標分析器又は他の分析器を使用することができる。代わりに、ラマン分析器は、例えば、PerkinElmerWaltham,MA,RenishawGloucestershire,UK及びPrincetonInstrumentsTrenton,NJから市販されている。市販のラマン分光分析器のための技術的詳細及び操作パラメーターは、それぞれの供給メーカーから得ることができる。好適な曝露時間、試料サイズ及びサンプリング頻度は、例えば、ラマン分光分析器及びこれが例えば、UF/DFバイオプロセス処理のリアルタイムモニタリングを提供するプロセスにおいて使用されるプロセスに基づいて決定することができる。同様に、適切なプローブ配置も、分析器及び分析器が使用されるプロセスに基づいて決定することができる。例えば、浸漬プローブが適切なシグナルを提供するための試料サイズは、20mL未満又は10mL未満例えば、8mL以下であってよい。適切なシグナルを提供するための曝露時間は、2分未満又は1分未満例えば、30秒であってよい。量子化が望まれる成分及び2以上のpH依存性イオン化形態で存在する成分例えば、ヒスチジンについて、ラマン分光法の較正を、成分例えば、ヒスチジンの測定がpH依存性にならないように、変動する濃度及び/又は様々なpHにおいて実施して、所与のpH範囲にわたる濃度を予想することができる。例えば、様々なpH依存性形態のヒスチジンのための較正モデルを、様々なイオン化形態のヒスチジンを測定及び定量化するために使用することができるので、溶液の性質を確かめることができる。シグナル処理を実施することができ、これは、強度補正例えば、標準正常変量SNV及び/又は基線補正例えば、一次導関数を含み得る。代表の試験溶液のCCD飽和を測定し、これらが許容される機器の範囲例えば40-80であることを確実にすることによって、曝露時間を決定することができる。いくつかの実施形態において、pH制御又はpH範囲モデリングを特定の成分例えば、ヒスチジンなどの緩衝液のために使用する。いくつかの実施形態において、入射光を最小化し、これは、例えば、周囲の光源が分光に干渉することを阻止する覆い例えば、アルミニウムホイルの使用によって達成することができる。例えば、抗体などのタンパク質が帯電していない種で濃縮される特定の実施形態において、タンパク質は、溶液の著しい体積を占め、著しい量の溶質を排除する。これは、帯電していない種の濃度の純減少をもたらす。この効果は、体積排除と呼ばれ、これは、タンパク質濃度と比例する。特定の実施形態、例えば帯電した成分のアッセイを伴う実施形態などにおいて、より高い濃度において、タンパク質の電荷は溶液中の全体の帯電種に著しい寄与となるので、Donnan効果が生じる。平衡が薄膜の両側に確立されると予想されるので、電気的中性の要件は、薄膜の濃縮水側の正帯電種例えば、緩衝液種における純減少をもたらす。この現象はDonnan効果と呼ばれる。本出願の特定の実施形態によれば、RamanRX2商標分析器が使用される。この分析器及び他の市販のラマン分析器は、同時の完全スペクトル範囲を有する最大4つのチャンネルを測定する能力を提供する。特定の実施形態において、標準のNIRレーザー励起が試料適合性を最大化するために使用される。例えば、RamanRX2商標分析器によるプログラム可能な連続モニタリングフォーマットを使用することができ、該装置は、プロセス光学素子に適合し、一つの分析器のタイプが発見段階から生産段階まで使用されることを可能にする。携帯用筐体及び光ファイバーサンプリングインターフェースは、分析器が多様な場所で使用されることを可能にする。本開示の主題の特定の実施形態において、所定量の知られている成分を含む少なくとも1種の多成分混合物標準すなわち、多成分混合物標準は、未知の成分及び/又は未知の濃度の既知若しくは未知の成分を有する混合物での使用のためのモデル例えば、較正曲線を得るためにラマン分光法によって特徴付けられる。好ましくは、所定量の既知の成分を有する一連の多成分混合物標準は、モデルを得る目的でラマン分光法によって特徴付けられる。未知の成分及び/又は未知の濃度の既知若しくは未知の成分を有する混合物での使用のためのモデルを得るための方法は、当業者が決定することができる。例えば、多成分試験混合物に存在することが予想される主要成分に基づく部分的最小二乗回帰分析。また、ラマン分光法供給メーカーから入手できるソフトウェアプログラムを、多成分混合物標準を設計するために使用することができ、これは、同様に、多成分試験混合物での使用のためのモデルを開発するために使用することができる。所定量の既知の成分を有する多成分混合物標準を提供すること及び多成分混合物標準にラマン分光分析を実施すること及びより一般的に、未知の成分又は未知の濃度の成分を有する多成分混合物を特徴付けるためのモデルを開発することは、平行分析すなわち、現場で得られるデータ並びに多成分混合物標準、すなわち、既知の成分、既知の濃度を有する多成分混合物のための以前に得られた又は以前に記録された結果例えば、ラマンスペクトル指紋への参照の両方を含むことは理解されたい。例えば、供給メーカーの製品文献から得られるラマンスペクトル結果への参照は、所定量の既知の成分を有する多成分混合物標準を提供すること及び多成分混合物標準にラマン分光分析を実施することによって包含される。本出願の特定の実施形態は、それだけには限らないが、SMB処理を含むバイオプロセス処理に使用される成分例えば、多成分混合物を特徴付けるためにラマン分光法技術を使用する。例えば、特定の実施形態において、ラマン分光法がSMB分離との関連で生物活性剤例えば、モノクローナル抗体と混合されるよう意図されている製剤を特徴付けるために使用される。これらの製剤は、しばしば製剤緩衝液と呼ばれるが、一般的に、生物製剤中の添加剤濃度を決定する多成分混合物である。例えば、このような製剤は、一般的に、以下のもの:pH緩衝液例えば、クエン酸塩、トリス、酢酸塩又はヒスチジン化合物、界面活性剤例えば、ポリソルベート80、糖又は糖アルコール例えば、マンニトール及び/又はアミノ酸例えば、L-アルギニン又はメチオニンの1種又は複数を含む。製剤緩衝液における誤りは、しばしば、不合格バッチをもたらし、これらは、同様に、著しい損失をもたらす。本明細書に開示された技術の使用は、このような非効率を低減又は排除し得る。特定の実施形態において、ラマン分光法技術は、タンパク質集合、例えば、それだけには限らないが、SMB処理中に形成することがあるものを同定するために使用することができる。例えば、制限を目的とするものではないが、本発明のラマン分光法技術は、特定の実施形態において、それだけには限らないが、抗体製剤原料試料及び抗体製剤試料を含む、タンパク質製剤試料及び製剤試料の集合を同定することができる。特定の実施形態において、ラマン分光法は、それだけには限らないが、SMB処理と共に実施される処理を含む、濾過処理例えば、限外濾過/ダイアフィルトレーション処理、例えば、生物活性剤、例えばモノクローナル抗体が精製される濾過処理などに存在する製剤を試験及び特徴付けるために使用することができる。例えば、限定を目的とするものではないが、本発明のラマン分光法技術は、オンライン又はオフラインで得られる試料を得、1回の読み取りで、存在する成分の同定及び量の両方を確かめるために使用することができる。特定の実施形態において、タンパク質濃度を、添加剤濃度に加えて測定することができる。このような実施形態のいくつかにおいて、0から150mg/mlの範囲のタンパク質濃度を分析することができる。特定の実施形態において、ラマン分光法は、バイオプロセス処理、例えば、それだけには限らないが、SMB処理と共に実施されるものなどを測定、検証、試験及び従って制御するために使用することができる。バイオプロセス処理と共に使用される単位処理、例えば、クロマトグラフィー、濾過、pH変更、成分の添加又は溶液の希釈による組成変化は、全て、有機又は無機成分及び生体分子からなる混合物をもたらす。従って、例えば、ラマン分光法を使用することによって、中間体の組成を迅速に正確に測定することは、処理及び生物学的生成物の一貫性及び品質を改善及び維持するための機会を提供する。特定の実施形態において、ラマン分光法による混合物中の個別成分の組成の測定は、生体分子が存在するまた存在しないこのような混合物の正確な調製を可能にする。例えば、特定の実施形態において、このような測定は、バイオプロセス処理に広範囲に使用される緩衝溶液の調製において有用であり、調製の一貫性を改善し又は緩衝溶液のほぼリアルタイムの調製を提供する利益をもたらす。特定の実施形態において、これは、緩衝溶液の調製、保持及び配送のための複雑な装置の必要性を排除する。特定の実施形態において、ラマン分光法の使用は、緩衝液配合における潜在的誤り例えば、化学成分濃度、薬品の間違いなどが、簡単な機器の使用でリアルタイムに検知される緩衝溶液の試験及び使用許可を可能にする。試験し得る製剤には、それだけには限らないが、タンパク質を含まない3成分製剤緩衝液糖アミノ酸、タンパク質及び糖製剤、タンパク質及び界面活性剤製剤並びにタンパク質及び緩衝液製剤が含まれる。特定の実施形態において、溶液組成の正確な測定は、添加剤陰イオン、陽イオン、疎水性、溶媒などの正しい目標組成を達成することができるような生物学的溶液の調節を可能にする。現在、このような測定は、面倒であり、リアルタイムの使用の実現に適さない巧みな分析法を必要とする。ラマン分光法の使用は、規制産業の期待である文書化を伴う非常に高度な確実さを提供する測定を可能にする。特定の実施形態において、本発明の技術は、化学的、物理的又は生物学的手段によって達成されるタンパク質-タンパク質反応、タンパク質-小分子反応及び/又はタンパク質修飾を監視及び制御することを可能にする。このような実施形態のいくつかにおいて、反応物質その起源状態において生物学的及び生成物その最終状態において生物学的及び性質が化学的又は生物学的のいずれかである他の反応物質/触媒の独特の生化学的な痕跡が、ラマン分光法を使用して監視される。このようなやり方で反応物質複数可及び生成物複数可を監視することは、とりわけ、反応条件及び反応物質量のフィードバック制御を可能にする。特定の実施形態において、生成物品質又はこのようなシステムの性能を最適化、改善又は維持するために、反応副生成物及び/又は生成物を継続的に取り出すシステムを設計することも可能である。特定の実施形態において、ラマン分光法は、それだけには限らないが、SMB処理を含む、クロマトグラフィー処理において生物学的生成物の単離及び精製も可能にする。このような実施形態のいくつかにおいて、生成物/生成物変種/生成物イソ型又は不純物の溶離液を監視することができ、カラム流出液の分別を所望の生成物品質又はプロセス性能に基づいて実施することができる。特定の実施形態において、他の単位処理、例えば、それだけには限らないが、濾過及びクロマトグラフィーではない分離などにおいて画分の単離/濃縮にラマン分光法を適用することも可能である。特定の実施形態において、ラマン分光法は、非侵襲的手段として配置され得る。例えば、限定を目的とするものではないが、ラマン分光法測定は、シグナルに干渉しない材料を通して行うことができる。これは、それらの混合物を収容する入れ物/容器の完全性を保つことが重要であるバイオプロセス処理において追加の独特の利点を提供する。特定の実施形態において、ラマン分光法は、他の成分による溶液の汚染を検知する極めて有用な手段であり得る。このような実施形態のいくつかにおいて、一つの精製ステップから他へのクロマトグラフィー支持体又はこの一部の繰り越しが検知される。特定の実施形態において、このような繰り越しには、それだけには限らないが、タンパク質Aクロマトグラフィー支持体から滲出されるタンパク質Aが含まれる。このような実施形態のいくつかにおいて、汚染された溶液から得られたラマン分光法データは、統計的又はスペクトル比較技術を使用して予想されるスペクトルと比較し、異なる場合、これらがバイオプロセスで使用される前に、これらの溶液の配合の誤りの迅速な検知を可能にすることができる。特定の実施形態において、コンセプトの証明として以下の実施例を通して示されるとおり、宿主細胞、タンパク質、DNA、脂質などを含む細胞培養回収材料からの不純物を含む混合物中の抗体の濃度を、ラマン分光法を使用して定量的に測定することができる。このような実施形態において、前記方法を、未精製混合物を含むバイオプロセス処理からの流入液及び流出液を監視するために使用することができる。例には、それだけには限らないが、カラム、フィルター及びクロマトグラフィーではない分離デバイス膨張床、流動床、二相抽出などのためのローディング及び溶離処理が含まれる。提供された例は、0.1から1g/Lの抗体濃度は、化学的に定義された培地に基づく細胞培養プロセスから調製された浄化された回収物溶液がローディングされたタンパク質A親和性クロマトグラフィーカラムからの非結合画分を含むマトリックスにおいて定量化することができることを示している。ラマン分光法がインラインに組み込まれる場合、このような測定は、カラムローディングの直接の監視及び制御を可能にし、動的結合容量又は静的平衡容量の百分率を表す予め定義された結合容量においてカラムの一貫した最適なローディングを可能にする。当業者は、このような技術は、上述された様々な他の処理に適用し得ることを理解されよう。特定の実施形態において、ラマン分光法は、バイオプロセス精製処理において品質管理及び/又はフィードバック制御のために使用することができる例えば、治療抗体精製プロセスのためにインライン緩衝液の希釈を制御すること。このような実施形態のいくつかにおいて、ラマン分光法を、その全体を参照により本明細書に組み込むAnal.Chem.、77:1228-12362005に記載されたタンパク質接合反応又は他の化学反応例えば、液相Heck反応を伴うプロセスにおいて品質管理及び/又はフィードバック制御のために使用することができる。6.実施例6.1.事例研究:mAbX供給流れとしてmAbXプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Aクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図4は得られたクロマトグラムを示している。偶数のUVピークは溶離を示し、奇数のUVピークはローディング直後の洗浄1を示している。次の緩衝液を全てのSMB運転のために使用した。次の表は、mAbXのためのSMB精製プログラムの概略を記す。プログラムの3部分:第1運転、第2から第n-1運転及び最終運転が存在する。ロード2ブロックを、飽和結合容量SBC研究の曲線下面積AUCによって計算した以下を参照されたい。。次の分離プロセスは、実際のSBCに比べて20少なく実施したことに留意されたい。第1分離プロセスを、1分の滞留時間で実施し、第2を3分の滞留時間で実施した。図8のデータは、mAbXの飽和結合容量SBC研究を示している。カラムの貫流を、カラムに結合していない生成物の量を測定するためにPorosAHPLCアッセイによって分析した。73g/Lの飽和結合容量までの曲線下面積AUCは、40g/Lの一般的な結合動的結合に対してのSMBによって達成された改善を示している。AUCは、第2サイクルから最終サイクルまでのローディング量を計算するために、飽和結合容量から差し引いた図8を参照されたい。。6.2.事例研究:mAbY供給流れとしてmAbYプロセス中間体及び親和性クロマトグラフィー樹脂として一般的なアガロースベースの親和性タンパク質Aクロマトグラフィー媒体を使用して、事例研究を実施した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムをそれぞれ飽和までローディングし、図6は得られたクロマトグラムを示している。偶数のUVピークは溶離を示し、奇数のUVピークはローディング直後の洗浄1を示している。これらの緩衝液を全てのSMB運転のために使用した。次の表は、mAbYのためのSMB精製プログラムの概略を記す。プログラムの3部分:第1運転、第2から第n-1運転、及び最終運転が存在する。ローディング2ブロックを、飽和結合容量SBC研究の曲線下面積AUCによって計算した以下を参照されたい。。ローディング時間が運転の50となるよう保つために、洗浄1、洗浄2及び再生ステップを計算し、3分の滞留時間をもたらすよう、ローディングステップを計算した。次の分離プロセスは、実際のSBCに比べて20少なく実施したことに留意されたい。図8のデータは、mAbYの飽和結合容量SBC研究を示している。カラムの貫流を、カラムに結合していない生成物の量を測定するためにPorosAHPLCアッセイによって分析した。86g/Lの飽和結合容量までのAUCは、45g/Lの一般的な結合動的結合に対してのSMBによって達成された改善された結合容量を示している。このAUCは、第2サイクルから最終サイクルまでのローディング量を計算するために、飽和結合容量から差し引いた図9を参照されたい。。6.3.事例研究mAbX、不純物繰り越しの検知第2のSMB分離をmAbXを使用して実施した。この分離において、mAbXは、化学的に定義された培地に存在した。合計8サイクルを4個のカラムを用いて実施した。カラムは、それぞれ飽和までローディングした。次の緩衝液を全てのSMB運転のために使用した。次の表は、mAbXのためのSMB精製プログラムの概略を記す。プログラムの3部分:第1運転、第2から第n-1運転及び最終運転が存在する。ロード2ブロックを、飽和結合容量SBC研究の曲線下面積AUCによって計算した。次の分離プロセスは、実際のSBCに比べて20少なく実施したことに留意されたい。第1分離プロセスは、1分の滞留時間で実施し、第2は、3分の滞留時間で実施した。このSMB分離の全体収率は85であった。実施された分析アッセイは、mAb濃度及び各溶離運転後の繰り越されたタンパク質Aの存在を決めるためのタンパク質A浸出物leachableELISAを測定するためのPorosAアッセイを含んだ。後者は、タンパク質A浸出物は、第1サイクル溶離運転1-4に比べて第2サイクル溶離運転5-8についてより高いことを示し、この不純物についてのいくらかの繰り越し効果を示した。6.4.パイロット規模におけるmAbZ事例研究上記のタンパク質Aプロセスをパイロット規模に拡大し、mAbZ分離との関連で使用した。3個のカラム各直径10cm×高さ8cm、785mLにタンパク質Aクロマトグラフィー支持体を充填した。上記に概略が記された小規模の分離と同様に、カラムの切り替えは、手動で操作した。3個のカラムのみを用いて、ワークフローを図10に描いたとおり実施することができる。mAbZ細胞培養回収物を酸性にして細胞及び細胞片を沈殿させた。このような不純物の沈殿は、後続の遠心分離の有効性を改善し、デプスフィルター及び薄膜フィルターの能力を増加させた。回収物を浄化することは、簡単な洗浄ステップでタンパク質Aカラムへの試料ローディングを可能にし、クリーニング手順を簡易化した。インラインフィルターをカラムの前に追加して、これを細胞片から保護し、空気トラップをカラムの前に追加して、これを空気から保護した。簡易化した緩衝システムを全ての処理ステップに使用した。平衡化緩衝液、全ての洗浄緩衝液、溶離緩衝液は、2種の成分:トリス及び酢酸からなった。確定した量の各成分を用いて、pHは、各成分のモル濃度によって制御することができる。従って、pH調節は、全ての緩衝液に必要ではなく、緩衝液の調製において著しく時間を節約した。以下はパイロット処理に使用された緩衝液である。全ての3個のカラムを、クリーニングの間、直列に接続し、これは、使用した清浄剤の量を節約する。3個のカラムに増加した圧力降下を提供するために、流速を200cm/時に減少させた。このプロセスの全収率は91であり、mAbZ細胞培養回収物は、酸性化、続いての遠心分離/デプスフィルター濾過によって浄化し、タンパク質A親和性クロマトグラフィーによって捕捉することができ、単純なmAb捕捉プロセスをもたらすことを示した。6.53成分製剤緩衝液の試験アルギニン、クエン酸及びトレハロースの所定の混合物を含む製剤緩衝液を、水溶媒を用いて調製した。成分は0から100mMまで多様であった。800から1700cm-1の範囲にわたるラマンスペクトルを、RAMANRXN2商標分析器2スペクトル/混合物を使用して各混合物の15mLアリコートから得た。分光フィルタリングパラメーターを、標準正常分散SNV強度正常化、15ポイント補正による一次導関数gap基線補正、平均強度値=0である平均中心差スペクトルに設定した。これは、分光フィルターではなくデータ位取りであると考えられる。試料当たり30秒の曝露時間で浸漬プローブを使用して、スペクトルを収集した。主成分方法を、モデルを開発するために使用した。PLS潜在構造に対する部分的最小二乗予測モデルを、成分間の相関関係を求めるために3成分のそれぞれに適用した。この結果は、スペクトル強度例えば、1700-800cm-1を濃度ax1bx2......zx900=濃度に翻訳する線形モデルである。本明細書に示された較正結果に使用されたソフトウェアは、ThermoGalactic製のPLSplus/IQアドインを有するGRAMS/AIV7.02であった。SIMCAPを、グラフ及び実験モデル生成の多くに使用した。試料は、2つの試料を動かすことによってクロス確認した。相関関係及びクロス確認のための試験のステップを、成分間の相関関係が2の誤差限界値を下回るまで繰り返すように、データ分析を行った。緩衝液成分の正確な量子化例えば、2以内を、1回の読み取りで提供することができる。較正曲線は、RandomMixtureDesignを使用して得ることができる。上記に開発された3成分モデルを、アルギニン、クエン酸及びトレハロースのランダム混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した図11。モデルが±2の所定の許容範囲限界に入ることを確かめるために、これらの予測を実測スペクトルに対して比較した。結果を図12及び13に示す。モデルが、測定を行うために使用することができることを確かめるために、ランダム混合物の単独の測定を得た。6.64成分製剤緩衝液の試験実施例6.5の方法を、4成分を含む製剤緩衝液に適用し、ここで、成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びTween商標ポリソルベート80であった。所定の混合物の測定したスペクトルを図14-16に示す。波数は、Far-IR領域からMid-IR領域の範囲に及ぶ。サファイアカバーによる制限のために、100-800cm-1の範囲を、この特定の例において無視してよく、較正は、800-1800cm-1で行う。実施例6.5において得られた3成分モデルと同様に4成分緩衝システムのためのモデルを得た。得られたモデルに基づく予測を、ランダム混合物の実測スペクトルに対して比較して、モデルは十分に正確であることを確認した。結果を図17及び18に示す。6.7タンパク質を含む3成分製剤緩衝液の試験実施例6.6の方法を、0から100mg/mlの範囲の濃度におけるタンパク質と共に3成分を含む製剤緩衝液に適用した。成分は、マンニトール、メチオニン、ヒスチジン及びD2E7アダリムマブであった。所定の混合物の測定したスペクトルを図19-21に示す。実施例6.6において得られた4成分モデルと同様にタンパク質を含む3成分緩衝システムのためのモデルを得た。得られたモデルに基づく予測を、ランダム混合物の実測スペクトルに対して比較して、モデルは十分に正確であることを確認した。結果を図22に示す。測定R2の係数及び実測対予想スペクトルのクロス確認SECV値の標準誤差を、以下の表2に示す。6.8アダリムマブUF/DFプロセスアダリムマブの溶液に添加剤を導入するために、図23に示された限外濾過/ダイアフィルトレーションプロセスUF/DFを確立する。フィードポンプ100は、接線流濾過薄膜を通る直交流を提供し、容器中のアダリムマブ含有溶液を薄膜に通す。ダイアフィルトレーション緩衝液メチオニン、マンニトール及びヒスチジンを含む製剤緩衝液を、薄膜の濾過速度に適合させるために容器にポンプで注入する薄膜の透過水側を流れる液体110。フィードタンクを出る供給流れ120は、ポンプ130によって薄膜モジュール140に向けられる。比較的より小さな分子サイズを有する水、緩衝液成分などを含む透過水流れ150は、薄膜モジュールを通過する。濃縮されたアダリムマブを含む濃縮水流れ160は、濃縮水バルブ170によって制御されて、再びフィードタンクに向けられる。KaiserOpticals製のRamanRX2商標分析器190に適合するラマンプローブ180を、定期的にタンクの内容物を特徴付ける能力を提供するためにフィードタンク内に置く。得られたスペクトルを較正ファイルを使用して成分濃度に変換し、従って、ダイアフィルトレーションプロセスの進行を監視することができる。さらに、Donnan及び電荷排除効果に起因するタンパク質の濃度の増加によって起こる添加剤濃度の変化を監視し、場合によって制御することができる。RamanRX2商標分析器以外の他のラマンシステムも、アダリムマブ精製プロセスの品質管理の一環として定期的に限外濾過/ダイアフィルトレーションプロセスからのオンライン試料を特徴付けるために使用することができる。例えば、ラマン分析からの結果を、ダイアフィルトレーションプロセスの完了及び最終添加剤濃度を評価するために使用することができる。ヒスチジン、マンニトール及びメチオニンの混合物を、UF/DF薄膜を通してダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、30秒の曝露、10回の繰り返し10回の走査からなった。図24-25は、ダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。個別の成分の予想された濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。図24-25は、ダイアフィルトレーションプロセスのオンラインモニタリングからの結果を提供する。図24において、糖、緩衝液及びアミノ酸濃度が、様々なダイアフィルトレーション時間について提供されている。図24及び25に示されたとおり、アミノ酸は、メチオニンであり、濃度mMを、y軸にプロットし、糖は、マンニトールであり、w/vを、y軸にプロットし、緩衝液は、ヒスチジンであり、濃度mMを、y軸に沿ってプロットする。図24-25におけるプロットのそれぞれについてのx軸は、滞留時間であり、ここで、0から81分までの濃度を測定しx軸に沿ってプロットした。次に、水中に約40mg/mlで存在するアダリムマブを、5キロダルトンUF/DF薄膜0.1平方メートルを通して7ダイアボリュームdiavolumeにわたって糖溶液にダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、30秒の曝露時間、繰り返し10回10回の走査からなった。続いて、タンパク質を140g/Lに濃縮した。図26は、UF/DFシステムで使用され、上記のとおり測定された糖/タンパク質システムマンニトール/アダリムマブから得られた較正データを提供している。図26からの較正曲線は、図27及び28におけるマンニトール及びアダリムマブ濃度を確かめるために使用した。図27及び28は、糖のダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。右のプロットは、ダイアフィルトレーション及び続いての限外濾過中のタンパク質濃度を示している。図27及び28において、糖濃度を滞留体積ゼロから6に対してプロットし、アダリムマブ濃度g/Lを滞留体積ゼロから6に対してプロットする。予想のとおり、糖の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。タンパク質は目標濃度に達する。図27において、50g/Lに較正されたモデルを使用した。図28は、120g/Lのタンパク質及び糖混合物で得られた較正を使用して計算された糖及びタンパク質濃度を示している。水中に約20mg/mlで存在するアダリムマブを、5キロダルトンUF/DF薄膜0.1平方メートルを通して7ダイアボリュームにわたってヒスチジン溶液50mMにダイアフィルターした。ラマンプローブを濃縮水容器中に置いた。ラマンスペクトルを、特定の間隔で得、各読み取りは、30秒の曝露、繰り返し10回10回の走査からなった。続いて、タンパク質を50g/Lに濃縮した。図29は、緩衝液ヒスチジン/タンパク質アダリムマブ系から得られた較正データを提供している。これは、50g/Lのタンパク質までのヒスチジン/アダリムマブ混合物の較正モデルである。図30は、緩衝液/タンパク質系中の緩衝液及びタンパク質の低濃度についてのダイアフィルトレーション体積0から6ダイアフィルトレーション体積対ヒスチジン濃度nM及びアダリムマブ濃度g/lのプロットを提供している。プロットは、ヒスチジンnMのダイアフィルトレーション中の濃度の変化を示している。右のプロットは、ダイアフィルトレーション及び続いての限外濾過中のタンパク質濃度g/lを示している。予想のとおり、糖の濃度は、ダイアフィルトレーション中に増加し、水平域に達する。タンパク質は、目標濃度に達する。このプロット図29において、50g/Lに較正したモデルを使用した。プロットにおける濃度は、モデルの制限によって予想より低く、これは、ヒスチジンのイオン化に関係することが後に確認された。モデルは、ヒスチジンのイオン化状態を、実測の合計ヒスチジン濃度及び溶液特性と相互に関連付けることができる。データは、タンパク質及び追加の単一成分を含む低及び高濃度UF/DF処理を監視する能力を示している。濃度を、3分毎に読むことができ、従ってリアルタイム又はほぼリアルタイムで濃度を監視する能力が提供される。糖/タンパク質系において、非常に高い精度が、全ての濃度のタンパク質について糖で得られた。緩衝液/タンパク質系において、高い緩衝精度が、より高い緩衝液濃度及びより低いタンパク質濃度において得られた。体積排除効果及びDonnan効果を検知及び測定する能力も、リアルタイム又はほぼリアルタイムで提供される。従って、ラマン分光法は、タンパク質溶液中の添加剤濃度測定のための手段として有用であり、プロセス制御を提供するために添加剤濃度に加えてタンパク質濃度を測定する能力も提供する。6.9タンパク質を含む2成分製剤緩衝液の試験実施例6.5の方法を、2成分、トリス及びアセテート及びタンパク質、アダリムマブを含む製剤緩衝液に適用した。成分を、次の範囲:トリス50-160mM;アセテート30-130mM;及びアダリムマブ4-15g/Lで含んだ。較正曲線を、実施例6.5に概略が記されたとおりに得ることができる。上記で開発されたモデルを、表3の濃度に従って調製された試料において、トリス、アセテート及びアダリムマブの混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した。これらの予測を、実測スペクトルに対して比較して、モデルが所定の許容範囲に入ることを確認した。結果を図31A-Cに示す。6.10タンパク質を含む細胞培養回収物の試験実施例6.5の方法を、成分、Tween商標及びタンパク質、アダリムマブを含む化学的に定義された細胞培養培地回収物に適用した。細胞培養培地を、細胞培養バッチから回収し、濾過し、タンパク質Aカラムにローディングした。タンパク質Aカラムの貫流を集め、次いで貯蔵及び試験の前に除菌濾過した。この方法は、タンパク質Aカラムローディングの終点を決定するために使用する。濾過した細胞培養回収物を、捕捉カラム一般的にタンパク質Aに適用する。カラムローディングアウトプットを監視するための現在の方法は、A280吸収を使用する。しかし、培養回収物は、280nmにおいて光を吸収する多くの構成要素を含む。A280吸収は、通常、飽和され、A280法でカラムローディング段階に抗体のブレイクスルーを測定することを困難にする。ラマン分光法は、捕捉カラムローディングアウトプット流れカラム貫流中の抗体のための特定の測定を提供する。この試験は、様々な濃度の生成された抗体API製剤原料例えば、アダリムマブを、タンパク質A貫流のプールにスパイクすることによって、提案されたオンライン抗体測定の模擬実験をする。スパイキング実験に使用されるAPI試料は、0.1のTween商標を含んだ。直接スパイキング実験の間、Tween商標の濃度は、抗体との直接の割合で変化し、ラマンスペクトル較正中に抗体と間違えられることがある。これを回避するために、Tween商標を追加の成分とみなし、抗体の濃度と無関係にスパイクした。従って、成分は、次の範囲:Tween商標0.1-1.0及びアダリムマブ0.1-1.0g/Lに含まれた。較正曲線を、実施例6.5に概略を記したとおりに得ることができる。上記に開発されたモデルを、表4の濃度に従って調製された試料において、Tween商標及びアダリムマブの混合物のスペクトルについての予測を生成するために使用した。これらの予測を、モデルが所定の許容範囲に入ることを確認するために、実測スペクトルに対して比較した。結果を図32A-Bに示す。6.11抗体集合体検知の試験2種の抗体D2E7及びABT-874を、非修飾タンパク質の光誘起架橋PICUPを使用して別々に集合させた。抗体を、0-4時間図33及び34、集合を起こす光源に曝露し、サイズ排除クロマトグラフィーSECによって集合体を定量化した。試料を、ラマン分光法によって測定し、スペクトルを、主成分分析PCA図35及び36及び部分的最小二乗解析PLS図37A及び37Bを使用して模擬実験した。図35及び36は、集合した試料が明確な主成分の痕跡を有し、ラマン分光法を使用して集合体から分別することができることを示している。図37A及び37Bは、ラマン分光法の結果とSEC測定の間のいくらかの相関関係を示している。様々な刊行物が本明細書に引用されているが、これらの内容は、これらの全体を本明細書に組み込む。"