"複数の継代を通して能力を維持する間充織幹細胞MSCの集団を、被験者から分離する方法であって、a前記被験者からMSCを含む生物学的試料を得ること;及びb前記生物学的試料からNotch2受容体を発現するMSCを選択し、Notch2MSCの集団を得ることを含む方法。工程bを、Notch2受容体抗体を用いて実施する、請求項1記載の方法。工程bを、蛍光活性化細胞選別FACS又は親和性クロマトグラフィーを用いて実施する、請求項1記載の方法。前記Notch2受容体抗体が基質と結合している、請求項2記載の方法。前記基質が可動式固体支持体である、請求項4記載の方法。前記可動式固体支持体が蛍光ビーズである、請求項5記載の方法。前記基質が固定式固体支持体である、請求項4記載の方法。前記固定式固体支持体がカラムである、請求項7記載の方法。前記固定式固体支持体がプレートである、請求項7記載の方法。前記Notch2MSCの集団が、間充織幹細胞と関連する1つ以上の追加のマーカーを発現する、請求項1記載の方法。前記1つ以上の追加のマーカーが、CD73、CD90、CD105、CD106、CD156、CD44、CD29、CD166、Stro-1、FGF10、Prx1、Oct4、Sox2、及びNanogからなる群から選択される、請求項10記載の方法。前記Notch2MSCの集団が、CD11b、CD34、CD45、CD14、及びCD31からなる群から選択される造血又は内皮細胞系列と関連する1つ以上のマーカーを発現しない、請求項1記載の方法。前記Notch2MSCの集団が、CD105及びCD156を発現する、請求項1記載の方法。前記被験者からの試料が、骨髄、脂肪組織、滑膜、骨膜、軟骨膜、軟骨、歯の組織、胎盤組織、肝臓組織、筋肉組織、肺組織、心臓組織、結合組織、及び脾臓組織からなる群から選択される、請求項1記載の方法。前記試料が骨髄である、請求項14記載の方法。Notchシグナル経路の活性化剤の存在下に、MSCを培養することを含む、請求項1記載の方法に由来するNotch2MSCの集団を培養する方法。前記Notchシグナル経路の活性化剤がJagged1である、請求項16記載の方法。前記Notchシグナル経路の活性化剤が、delta-like1、delta-like3、delta-like4、Jagged2、Dlk1/Pref1、DNER、Contactin1F3、Contactin6NB3、CCN3/NOV、MAGP1、及びMAGP2からなる群から選択される、請求項16記載の方法。前記Notchシグナル経路の活性化剤が、Notch受容体の細胞内ドメインである、請求項16記載の方法。前記Notch受容体が、Notch1、Notch2、Notch3、又はNotch4である、請求項19記載の方法。前記Notch2MSCの集団が拡張する、請求項16記載の方法。前記Jagged1が、培養皿に少なくとも部分的に固定化されている、請求項17記載の方法。前記1つ以上の分化誘導薬の存在下にNotch2MSCの集団を培養することをさらに含む、請求項16記載の方法。前記1つ以上の分化誘導薬が、軟骨形成、骨原性又は脂肪細胞形成系列への分化を選択的に誘導する、請求項23記載の方法。前記Notch2MSCの集団を被験者に投与することを含む、間葉細胞系列における欠陥又は異常と関連する障害を患っている被験者を治療する方法。前記Notch2MSCの集団が、同一又は異なる被験者に由来する、請求項25記載の方法。前記Notch2MSCの集団が、同一の被験者に由来する、請求項25記載の方法。前記被験者が、骨又は軟骨の異常を有している、請求項25記載の方法。前記骨の異常が骨折骨粗鬆症である、請求項28記載の方法。前記軟骨の異常が関節軟骨の異常である、請求項28記載の方法。前記骨又は軟骨の異常部位又はその近くで、被験者にNotch2MSCを投与する、請求項25記載の方法。前記Notch2MSCを被験者に全身投与する、請求項25記載の方法。Notch2受容体Notch2MSCを発現する、MSCの相対的に純粋な集団。前記Notch2MSCが、複数の継代を通して拡張する能力を維持している、請求項30記載のNotch2MSC。前記Notch2MSCが、CD105及びCD156を発現する、請求項30記載のNotch2MSC。前記Notch2MSCが、CD105、CD106、CD156、CD44、CD29、CD166、Stro-1、FGF10、Prx1、Oct4、Sox2、及びNanogからなる群から選択される、間充織幹細胞と関連する1つ以上のマーカーを発現する、請求項30記載のNotch2MSC。前記Notch2MSCが、CD34、CD45、CD14及びCD31からなる群から選択される、造血及び内皮細胞系列と関連する1つ以上のマーカーを発現しない、請求項30記載のNotch2MSC。請求項1~16のいずれか1項記載の方法により製造された、Notch2MSCの相対的に純粋な集団。請求項30記載のNotch2MSCを被験者に投与することを含む、被験者における骨又は軟骨の異常の治療方法。前記骨又は軟骨の異常部位又はその近くで、被験者にNotch2MSCを投与する、請求項39記載の方法。前記Notch2MSCを被験者に全身投与する、請求項39記載の方法。本明細書において、間充織幹細胞MSCの集団を被験者から分離する方法が提供される。この方法は、被験者からMSCを含む生物学的試料を得る工程、及び生物学的試料からNotch2受容体を発現するMSCを選択し、Notch2MSCの集団を得る工程を含む。また、本発明は、Notch2受容体を発現するMSCNotch2MSCの相対的に純粋な集団を提供する。本発明において、Notchシグナル経路の活性化剤の存在下に、MSCを培養する工程を含む、Notch2MSCの集団を培養する方法が提供される。また、本発明は、間葉細胞系列における欠陥又は異常と関連する疾患を患っている被験者を治療する方法を提供する。この治療法は、Notch2MSCの集団を被験者に投与することを含む。1つ以上の実施形態の詳細を、添付図面及び以下の詳細な説明に示す。他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明及び図面、並びに請求項から明らかであろう。間充織幹細胞MSC内におけるNotch経路についての作用の正確な役割及び様式を決定するため、組織特異的機能喪失Prx1Cre;Rbpjκf/f、機能獲得Prx1Cre;Rosa-NICDf/及び遺伝子レスキューマウスPrx1Cre;Rosa-NICDf/;Rbpjκf/fを生成し、初期肢発生の際のMSC増殖及び分化における欠陥について分析した。結果を以下の実施例1に示す。データは、Hes1が、MSC内で発現するHes/Heyファミリーの主要なRBPjκ-依存性Notch標的遺伝子であることを示す。さらに、これらのデータは、RBPjκ-依存Notchシグナル経路が、骨格発達の際のMSCの維持及び拡張のために重要であることを示す。したがって、Notch経路の操作は、MSC集団を利用する、骨格修復及び再生医療用途のために、MSCの分化を維持、拡張及び調節する手段を提供する。hMSCのNotch活性化の制御は、hMSCの維持及び拡張を促進するが、それらの軟骨形成、骨形成及び脂肪細胞形成分化の可能性を維持する。したがって、本明細書に開示されるものは、MSCの相対的に純粋な集団、及びMSCの分離及び培養方法を開示する。Notch2受容体Notch2MSCを発現するMSCの相対的に純粋な集団が提供される。本明細書で用いられる場合、相対的に純粋という用語は、Notch2を発現する集団における、MSCの少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100を意味する。場合により、Notch2MSCは、複数の継代を通じて拡張する能力を維持する。Notch2MSCは、CD105、CD106、CD156、CD44、CD29、CD166、Stro-1、FGF10、Prx1、Oct4、Sox2、及びNanogからなる群から選択される間充織幹細胞と関連する1つ以上の追加のマーカーを発現する。場合により、Notch2MSCは、CD105及びCD156を発現する。場合により、Notch2MSCは、CD34、CD45、CD14及びCD31からなる群から選択される造血又は表皮細胞系列と関連する1つ以上のマーカーを発現しない。Notch2MSCの比較的に純粋な集団は、非分化培養条件において安定である。本明細書で用いられる場合、非分化培養条件には、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件が含まれるが、これに限定されない。例えば、細胞は、ウシ胎児血清、又は分化を起こさない血清を含まない代替物の存在下に、例えばDMEM、RPMI等で維持することができる。具体的には、被験者からMSCを分離する方法が提供される。この方法は、被験者からMSCを含む生物学的試料を得、生物学的試料からNotch2受容体を発現するMSCを選択し、Notch2MSCの集団を得る工程を含む。また、提供される方法により製造されるNotch2MSCの相対的に純粋な集団が提供される。MSCは、複数の継代を通じて拡張する能力を維持している。MSCは、少なくとも約5、10、15又は20回、又は5~20回の任意の回数継代することができる。場合により、MSCは10回以上継代することができる。例えば、MSCは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20回継代することができる。本明細書で用いられる場合、継代又は継代するは、細胞を継代培養することを意味する。細胞を培養及び継代培養する方法及び材料は公知である。例えば、細胞は、インキュベーター内の、例えば、皿又はプレートのような培地を含む基質上で増殖させられる。継代培養の際、培地を除去し、細胞を洗浄し、次いで、基質から細胞を分離する薬剤を加える。分離した培地を懸濁し、懸濁液内の適切な数の細胞を新しい基質に移し、新しい培地を加え、新しい基質をインキュベーターに入れ、そのサイクルを再度開始する。細胞は、場合により、100未満増殖の対数期であるが、密集の10以上に維持される。細胞は、少なすぎるかあまりに密集すると死滅する。選択工程は、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、パニング、蛍光活性化細胞選別FACS又は親和性クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない種々の方法の任意の1つを用いて実施される。例えば、フローサイトメトリー又はFACSは、蛍光強度、並びに細胞のサイズ及び光の散乱のようなその他のパラメータに基づき細胞集団を分離するために用いられることができる。選択工程は、場合により、Notch2受容体抗体又は他のNotch2受容体リガンドを用いて実施される。場合により、抗体又はリガンドは基質に結合し、例えば、基質は可動式又は固定式の固体支持体であってもよい。場合により、可動式固体支持体は蛍光ビーズである。場合により、固定式固体支持体はカラム又はプレートである。試料を基質と接触させ、Notch2細胞を有する基質をNotch2細胞を欠く基質から選別するか、試料中の結合MSCを、例えば競争結合工程によって基質から分離する。蛍光ラベル又は他の標識手段は、MSCを選別するために用いることができる。FACSのような選別方法を用いて、特に所望の発現プロフィールを有するMSCの種々の集団を選別することができる。被験者からの試料は、例えば、骨髄、脂肪組織、滑膜、骨膜、軟骨膜、軟骨、歯の組織、胎盤組織、肝臓組織、筋肉組織、肺組織、心臓組織、結合組織、及び脾臓組織からなる群から選択されるMSC含有試料から選択される。分離したNotch2MSCを、例えば、細胞の生存度を維持する任意の適切な培地内に集める。場合により、培地は、収集容器、例えば、試験管に配置される。種々の培地は市販されており、それを用いてもよく、場合によりウシ胎児血清を追加していてもよい、ダルベッコ修飾イーグル培地DMEM、ハンクス平衡塩溶液HBSS、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液dPBS、ロズウェルパーク記念研究所RPMI培地、Iscove培地等を含むが、これらに限定されない。また、Notchシグナル経路の活性化剤の存在下に、MSCを培養する工程を含む、Notch2MSCの集団の培養法法が提供される。場合により、培養条件は、Notch2MSCの集団が拡張される条件である。種々の培地が市販されており、MSCを培養するために用いてもよく、これらは場合によりウシ胎児血清を追加していてもよいDMEM、HBSS、dPBS、RPMI培地、Iscove培地等を含むがこれらに限定されない。場合により、Notchシグナル経路の活性化剤は、delta-like1、delta-like3、delta-like4、Jagged1、Jagged2、Dlk1/Pref1、DNER、Contactin1F3、Contactin6NB3、CCN3/NOV、MAGP1、及びMAGP2からなる群から選択される。場合により、Notchシグナル経路の活性化剤は、Notch受容体の細胞内ドメインである。場合により、Notch受容体は、Notch1、Notch2、Notch3又はNotch4である。Notchシグナル経路の活性化剤は、培養皿に部分的又は完全に固定化していてもよい。また、活性化剤は培地内で可溶性であってもよい。Notch活性化は、Notch細胞内ドメインICDの切断及び遊離を引き起こすリガンドにより誘導され得る。NICDは核へ転位し、RBPjkと相互作用し、標的遺伝子を活性化する。MSC内でのNotchシグナルは、NotchICDを直接発現することによっても活性化され得る。NotchICDの発現は、細胞内でペプチドを発現させる任意の手段を用い、例えば発現ベクター例えば、ウイルスベクターを用いて提供することができる。NotchICDの発現は一時的であるか、又は安定である。培養方法は、1つ以上の分化誘導薬の存在下にNotch2MSCの集団を培養する工程をも含む。Notchの活性化が停止し、細胞の分化が可能になる。場合により、1つ以上の分化誘導薬は、軟骨形成、骨形成又は脂肪細胞形成系列への分化を選択的に誘導する。異なる培養条件下でのNotch2MSCの培養は、所望のタイプの表現型、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞等を有する選択細胞を濃縮する培養環境においてMSCを培養又は分化させることにより実施される。したがって、培地は、特定の系列への分化を増大させる薬剤を含んでいてもよい。例えば、軟骨形成分化は、9-グリセロールホスフェート、アスコルビン酸及びレチン酸を含む培地中でMSCを培養することにより増大させることができるCowanら、2005TissueEngineering11:645-658。脂肪細胞形成分化は、例えば、デキサメタゾン、インドメタシン、3-イソブチル-1-メチルキサンチンIBMX及びインスリンを含む培地中でMSCを培養し、次いでインスリンを含む培地内で維持することにより、増大させることができる。筋細胞分化は、例えば、5-アザシチジンを含む培地Fukudaら、2001ArtificialOrgans25:187、又はウマ血清、デキサメタゾン及びヒドロコルチゾンを含む培地Eunら2004StemCells22:617-624内で培養することにより、増大させることができる。軟骨細胞分化は、例えば、Williamsら、2003TissueEngineering94:679を含むか又は含まない、デキサメタゾン、アスコルビン酸2-ホスフェート、インスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸を含む培地中で培養することにより増大させることができる。培養における分離に続き、得られた細胞を直接用いるか、例えば、MSC及び他の未分化細胞を除去するための陰性選択においてさらに分離してもよい。さらに、所望の細胞型の濃縮は、細胞に特有のマーカーの選択により、例えば、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、パニング等により得られることは公知である。Notch2MSCの集団を被験者に投与することを含む、間葉細胞内の欠陥又は異常に関連する疾患を患っている患者の治療方法を提供する。Notch2MSCの集団は、同一又は異なる被験者に由来する。Notch2MSCは、必要に応じて被験者に投与される。例えば、Notch2MSCは、骨又は軟骨の異常部位又はその近くで被験者に投与され、又は被験者に全身投与される。Notch2MSCは、意図する組織に移植され、移動し、機能的欠陥部位を再構成又は再生できるような方法で投与される。場合により、MSCの表面の標的分子は、所望の部位への適切な移動を促進するように用いられる。例えば、MSCは、軟骨、成長板、骨及び腱/靱帯、並びに自家軟骨細胞移植片を設計するために用いることができる。したがって、MSCの投与は、比較的に純粋な集団により、又は再生医療を用いて生成される構築物内で細胞を投与することにより、実施することができる。Notch2MSCの投与は、骨の手術骨の手術は、顔の形成、上顎又は下顎の再構築、骨折修復、骨移植、プロテーゼ移植、関節置換術臀部及び膝置換術からなる群から選択されるに続く骨の形成を促進し得る。場合により、Notch2MSCは分化し上述したように、被験者の患部に送達される。例えば、骨形成系列は、骨の疾患又は欠陥を患っている被験者に送達することができる。本明細書で用いられる場合、骨の疾患又は欠陥は、骨に対する健康又は完全な状態の喪失をもたらすか、それにより特徴づけられる、あらゆる骨の欠陥、疾患又は病状を意味し、骨粗鬆症、骨減少症、不完全な骨形成又は骨吸収、パジェット病、骨の破砕及び骨折、癌の骨への転位、骨化石症、骨硬化症及び骨軟骨症を含むが、これらに限定されない。骨の欠陥及び疾患には、骨折、及び先天性又は後天性の病状、例えば、骨形成不全症又は骨粗鬆症が含まれる。本明細書に開示される方法にしたがって治療及び/又は予防することのできる骨の疾患又は欠陥には、対応する病気ではない骨のものと比較して減少した骨質量によって特徴付けられる骨の疾患例えば、骨粗鬆症、骨減少症及びパジェット病が含まれる。軟骨の欠陥には、外相、又は、変形性関節症又はリウマチ性関節炎のような疾患により引き起こされうる関節軟骨の欠陥又は脊椎版の欠陥が含まれる。骨又は軟骨の欠陥若しくは疾患、又は、骨若しくは軟骨の欠陥若しくは疾患に関連する症状の治療は、発症後に、症状を遅くし、改善すること、又は、疾患若しくは症状を反転させることに積極的に介在することを包含する。本明細書で用いられる場合、治療は、骨又は軟骨の質量又は完全性を、対応する影響を受けていない骨同じタイプの対応する骨、例えば、長い脊椎部分の骨、又は、病気でない、若しくは、影響を受けていない状態の軟骨のものに、より近似させる方法を意味する。例として、手術後の治療の後、骨又は軟骨が、健康で外科的に影響を受けていない骨のようになる。Notch2MSCは、医薬組成物の形態で投与することができる。このような組成物は、治療的有効量のMSC及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。製剤は、投与様式に適したものとすべきである。場合により、MSC組成物は、静脈、関節内、又は椎間投与用に製剤化される。静脈投与用組成物は、例えば、無菌の等張水性バッファーによる溶液である。本明細書に開示された方法に用いるためのNotch2MSCを含む組成物は、持続性及び/又は持効性製剤として製剤化することもできる。このような、持続性及び/又は持効性製剤は、持続放出手段、送達装置又は組織工学による構築物により製造することができる。組成物は、1つ以上の活性成分をゆっくりと又は持続的な放出を提供するためにのために用いることができ、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマー材料、ゲル、透過膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア又はそれらの組合せを用いて、種々の特性において所望の放出プロフィールを与えることができる。種々の適切な持続放出製剤は、本明細書に開示された組成物と一緒に用いられるために容易に選択することができる。場合により、組成物は制御放出システムにより送達することができる。例えば、組成物は、静脈内注射、移植可能な浸透圧ポンプ、リポソーム、又は他の投与法法を用いて投与することができる。制御放出システムは、標的の近くに置くことができる。例えば、マイクロポンプは、関節に直接、又は、骨若しくは軟骨に直接に制御用量を送達することができ、その結果、全身投与量の一画分のみが必要となった。例えば、少なくともマイクロポンプに関する資料について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Goodson,1984,inMedicalApplicationsofControlledRelease,vol.2,pp.115-138を参照されたい。他の例においては、組成物は、ヒドロゲル用いて製剤化される例えば、少なくともヒドロゲルに関する資料について、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,702,717号;第6,117,949号;第6,201,072号を参照されたい。組成物を局所的に、すなわち治療を必要とする領域に投与することが望ましい。局所投与は、例えば、手術の際の点滴、局所投与、注射又はインプラントによる局所注射により達成される。インプラントは、浸透性、非浸透性、若しくはシリコン膜のような膜を含むゼリー状の材料であってもよく、骨若しくは軟骨のような組織を置換するように設計された組織再生医療構築物を含む。Notch2MSCは有効量で用いられる。一般に、このような量は、体重1kgあたり少なくとも1×104MSCから体重1kgあたり3×105MSCの範囲である。場合により、MSCは、1×106MSC/体重1kgで投与される。MSCは、例えば、1日あたり1~3回投与され、最適な効果及び薬学的用量に適合するように調整してもよい。当業者は、投与経路、受容者の年齢、性別、健康状態及び体重、症状の性質及び程度、同時に行っている治療の種類、治療の頻度及び所望の効果に基づき、投与量及び頻度を決定することができる。また、本発明は、本明細書に記載された1つ以上の成分例えば、Notchシグナル経路の活性化剤、又はNotch2MSCで満たされた1個つ以上の容器を含む、パック又はキットを提供する。したがって、例えば、本明細書に開示されたキットは、Notch2MSCの集団を含む。また、Notch2MSCを分離するための組成物を含むキットが開示されている。場合により、キットは、Notch2MSCを培養するための薬剤をさらに含む。このようなキットは、必要に応じ、又は所望であれば、溶液及びバッファーを含んでいてもよい。場合により、使用のための使用説明書が、このようなパック又はキットに関連付けられる。明細書を通して用いられるように、被験者は個体を意味する。したがって、被験者には、例えば、ネコ及びイヌのような家畜、家畜例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ及びヤギ、実験動物例えば、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、霊長類、非ヒト霊長類、げっ歯類動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類及び他の任意の動物が含まれる。被験者は、霊長類はヒトのような動物であってもよい。用いることができ、併せて用いることができ、製造のために用いることができ、開示される方法及び組成物の産物である、材料、組成物及び成分が開示される。これらの及びその他の材料は本明細書に開示されており、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されるとき、様々な単位の各々や集合的な組み合わせと並べ替えの具体的な参照は明確に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に熟慮され、本明細書に記載されることが理解される。例えば、方法が開示され議論され、この方法になし得る多くの修飾が議論されているなら、方法のありとあらゆる組み合わせ及び並べ替え、可能な修飾は、そうではないと特に示されない限り、特に熟考される。同様に、これらのあらゆるサブセット又は組み合わせも、具体的に熟考され、議論される。この概念は、これらに限定されないが、MSC自体及び開示されたMSCを分離し、培養し、使用する方法の工程を含む本開示の全ての態様に当てはまる。したがって、実施可能な様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示された方法のうちの任意の特定の方法工程、又は、方法工程の組み合わせと共に実施することができ、そのような組み合わせの各々、又は、組み合わせのサブセットが特に熟考され、開示されていると考えるべきであると理解される。本明細書を通じて種々の出版物に言及される。これらの出版物の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。多くの態様が開示されてきた。それにもかかわらず、種々の改変をなし得ることが理解されるであろう。さらに、1つの特徴又は工程が開示されているなら、組み合わせが明確に示されていなくても、それは任意の他の特徴又は工程と組み合わせることができる。したがって、他の態様は、請求項の範囲内である。実施例1:骨格発達の間にRBPjk依存性Notchシグナル伝達は間充織幹細胞MSCを維持し、増殖させる。材料と方法マウス系統Rosa-NICD、Rbpjκ、及び、Prx1Creを含む全てのマウス系統は以前に説明されているHanetal.,Int.Immunol.14:637-452002、Loganetal.,Genesis33:77-802002、及び、Murtaughetal.,PNAS100:14290-52003。Prx1CreマウスはJacksonLaboratoryBarHarbor、メーン州より手に入れられた。マウス胚の解析マウス胚は胎生11.0日より胎生12.5日にリン酸緩衝生理食塩水PBS中に回収され、10の中性緩衝ホルマリン中において一晩室温で固定され、それから、4μmの切片を作成する前に加工されてパラフィンに包埋された。組織構造、及び、肢芽の軟骨の構成を解析するために、標準的なアルシアンブルー/オレンジG染色が行われた。Insituハイブリダイゼーションが、以前に説明されたようにHiltonetal.,Development132:4339-512005、Hiltonetal.,Dev.Biol.308:93-1052007、及び、Hiltonetal.,Nat.Med.14:306-142008、35Sで標識されたリボプローブを用いて行われた。未発表のリボプローブは次のcDNAクローンより作成された。Sox94165469、Agc15345931、Hes110469606、Hey19792713、Jag110699187、Dll110698888、及び、Dll47492828。cDNAクローンはOpenBiosystemsHuntsville、アラバマ州、又は、ATCCManassas、バージニア州より入手可能である。Gfpプローブは強化型Gfpコーディング配列をpGEM-TEasyベクターにクローニングすることにより作成された。Notch1、Notch2、Notch3、Fgf8、及び、Fgf10のcDNAとリボプローブは説明されるとおりであるBelluscietal.,Development124:4867-781997、CrossleyandMartin,Development121:439-511995、及び、Mitsiadisetal.,J.CellBiol.130:407-181995。BrdU免疫染色解析のために、妊娠中の雌マウスは、回収の2時間前に0.1mg/g体重の割合でBrdUを注入された。BrdUの検出は、ZymedLaboratoriesサンフランシスコ、カリフォルニア州発売のキットを用いて、製造業者の説明書にしたがい、バラフィン切片上で行われた。増殖に関する研究は、製造業者の説明書にしたがうマウス肢芽パラフィン切片の抗Ki67免疫染色DAKO、デンマークを用いて確認された。アポトーシス性のMSCの解析は、製造業の説明書にしたがうマウス肢芽パラフィン切片上の抗CleavedCaspase-3免疫染色CellSignaling;Danvers、マサチューセッツ州とTUNEL染色RocheCellDeathInsituKit;Roche;バーゼル、スイスを用いて行われた。胚の全組織標本骨格染色は以前に説明されたように行われたHiltonetal.,Development132:4339-512005、McLeod,Teratology22:299-3011980。肢芽MSC細胞培養、及び、C3H10T1/2細胞培養肢芽由来MSCは胎生11.5日のCD1マウス胚より以前に説明されたように単離されたZhangetal.,Bone34:809-172004。軟骨形成分化のため、MSCは小塊状で10Tl中1×105細胞1.5時間、12穴プレートに接種され、その後、標準培地、DAPT1μMを含む培地、又は、Hes1shRNAレンチウィルスを含む培地が加えられた。軟骨染色1アルシアンブルー/3氷酢酸、又は、全RNA単離のために回収される前に、細胞は6時間、3日、5日、及び、7日のタイムコースで培養された。肢芽由来MSCはまた21日間単層培養され、DAPTを含む、及び、含まない骨形成性培地10nMデキサメタゾン、50mMアスコルビン酸、10mMβ-グリセロールリン酸、又は、脂肪細胞形成性培地Millipore;Billerica,マサチューセッツ州のどちらかの培地で処理された。固定されたMSCは、造骨細胞分化についてはアルカリホスファターゼ染色法ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリホスフェートP-トルイジン塩を用いて染色され、脂肪細胞分化についてはオイルレッド-O染色溶液0.36を用いて染色された。全RNAは、リアルタイムRT-PCRで使用するために21日目の単層培養細胞から単離された。C3H10T1/2細胞は以前に説明されたように増殖させられ、実験のために単層になるようプレートに蒔かれたDenkeretal.,Differentiation64:67-761999、HaasandTuan,Differentiation64:77-891999。単層培養細胞は、製造業者のプロトコルで示唆されるように、Lipofectamine2000試薬Invitrogen;Carlsbad、カリフォルニア州を用いて500ngのCMV-Hes1、若しくは、CMV対照プラスミドで形質移入されるか、又は、対照ィルスに、若しくは、Hes1、Hey1、及び、HeyLSigma;セントルイス、ミズーリ州に対するshRNAレンチウィルスで感染させられるかのどちらかであった。形質移入/感染の1日後、細胞はトリプシン処理され、12穴プレートの各穴に10Tlの培地あたり1x105細胞の密度で小塊状に再び蒔かれた。細胞はアルシアンブルー染色と全RNA単離のために5日目、10日目、及び、14日目に回収された。リアルタイムRT-PCR胚性肢芽組織、又は、小塊培養物は液体窒素で凍結され、それから、25ゲージの注射針と注射筒を通してTrizolReagentInvitrogen;Carlsbad、カリフォルニア州の中でホモジネート化された。全細胞性RNAが製造業者のプロトコルにしたがって抽出された。RNAはNanoDrop分光光度計NanoDrop;Wilmington、デラウェア州を用いて定量され、等濃度の全RNAがcDNAの合成のためにプールされた。製造業の説明書にしたがってiScriptTMcDNA合成キットBio-Rad;Hercules、カリフォルニア州を使用して全RNA1μgが逆転写された。逆転写されたcDNAは、Sox9、Runx2、Col2a1、Agc1、Col1a1、Ap、Oc、Pparg、Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes3、Hes5、Hes7、Hey1、Hey2、HeyL、及び、CyclinD1に対するマウス特異的なプライマーを用いるリアルタイムRT-PCRによって解析された。プライマーはAppliedBiosystemsソフトウェアAppliedBiosystems;FosterCity、カリフォルニア州を用いて設計された。配列は請求に応じて利用可能である。DNA増幅はSYBRGreenPCRマスターミックスAppliedBiosystems;FosterCity、カリフォルニア州、及び、RotorGeneリアルタイムDNA増幅システムCorbettResearch;シドニー、オーストラリアを使用して成し遂げられた。遺伝子発現はβ‐アクチン発現レベルに対して正規化され、その後、対照サンプルに対して正規化された。ウェスタンブロット解析全タンパク質が、Golden溶解緩衝液を用いて、マウス肢芽組織全体、又は、肢芽由来MSC培養細胞のどちらかより単離された。肢芽由来MSC培養細胞は10cmのディッシュに6X106の濃度で蒔かれ、DAPT1umを含む、そして、含まない10FBSDMEM培地中で一晩培養された。各単離に由来するタンパク質サンプル~100μgはその後、10SDSポリアクリルアミドで分離され、PVDF膜に転写された。NICD1とNICD2の切断されたタンパク質はbTAN20Notch1一次抗体、及び、C651.6DdHNNotch2一次抗体0.4μg/mlを用い、並びに、さらに適切な二次抗体3000倍希釈で探索されて検出された。等量のタンパク質を添加したことについて、抗β‐アクチン抗体Sigma;セントルイス、ミズーリ州が対照として使用された。免疫ブロットはSuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstratePierce;Rockford、イリノイ州を用いて検出された。結果インビトロとインビボのMSC分化の間に起こるNotch経路構成因子の発現5種類のマウスNotchリガンドJagged1Jag1、Jagged2Jag2、Delta-like1Dll1、Delta-like3Dll3、及び、Delta-like4Dll4、4種類のNotchレセプターNotch1N1、Notch2N2、Notch3N3、Notch4N4、及び、6種類のNotch標的遺伝子Hes1、Hes5、Hes7、Hey1、Hey2、及び、HeyLの肢芽MSC分化中の、及び、インビトロ軟骨形成中の正確な時間的発現を同定するためにリアルタイムRTPCRが行われた。胎生11.5日のマウス胚から肢芽MSCが単離され、小塊状で6時間、3日間、及び、7日間培養された。5種類のNotchリガンドの可能性があるものの内、Jag1、Dll1、及び、Dll4のみがかなりのレベルで検出され、Jag1は全ての時点で最も高い発現レベルを示した図1A。4種類のNotchレセプターの内3種類N1、N2、及び、N3のみが肢芽MSC分化の間に検出され、Notch2はその他のNotchレセプターと比較して各時点で劇的に高い発現レベルを示した図1B。肢芽MSC分化と軟骨形成に重要なNotchシグナル伝達経路の下流に位置する構成因子を判定するために、RBPjκ依存性Notch標的遺伝子の発現が調査された。6種類の標的の可能性があるものの内、Hes1、Hey1、及び、HeyLのみが同定された。Hey1とHeyLは最も大量に存在するNotch標的遺伝子で、インビトロでのMSC分化の間に増加し、各時点で同様の発現レベルを示した図1C。Hes1はHey1、及び/又は、HeyLと比較して低レベルの発現を示したが、Hes1の発現は初期肢芽MSCにおいて最も顕著であり、MSC分化の間に発現レベルが低下した図1C。これは、軟骨細胞系列へのMSCのコミットメントの初期段階の制御における潜在的な役割を示している。RT-PCR解析で同定されたNotchシグナル伝達分子について正確なインビボでの空間的発現パターンを同定するために、Insituハイブリダイゼーション解析が胎生11.5日および胎生12.0日の肢芽切片に対して行われた。これらのデータは、NotchリガンドであるJag1、Dll1、及び、Dll4は全て、非常に異なる発現特性を持つことを示した。胎生11.5日目で、Jag1は肢芽間充織の大部分において中程度に発現されるが、頂端領域に隣接する先端部内側間充織の集中した領域で大いに発現した図1D1。その他の二種類のNotchリガンドのうち、胎生11.5日目でDll1は肢芽間充織を通じて散発的に発現し図1D2、一方、Dll4は血管構造の周りにより集中する発現パターンを示した図1D3、高倍率挿入図。Dll4は血管新生の制御因子で、それは、Notch1とともに血管内皮の重要な制御因子であるHellstrometal.,Nature445:776-802007、Shutteretal.,GenesDev.14:1313-82000。NotchレセプターNotch1はまた、胎生11.5日目で、血管性組織の領域図1D4、高倍率挿入図と初期外肺葉で主に発現し、肢芽間充織のある部分ではより低レベルの発現が観察される。Notch2は同時期で肢芽の大部分においてより広範囲に発現する図1D5。Notch3は肢芽間充織内で散発的に、基部MSCおよび末梢MSCにおいてより高い濃度で発現する。Hes1発現のわずかな上昇が、Jag1発現が集中する領域と重なる遠位内側MSCにおいて観察されることができたが図1D1、及び、1D7、Notch標的遺伝子、Hes1およびHey1は、胎生11.5日目で、それぞれNotch2のそれに類似する発現パターンを有した図1D5、1D7、及び、1D8。胎生12.0日目から胎生12.5日目までに、ほとんどのNotch経路構成因子はinsituハイブリダイゼーションにより検出することが困難である。Notch2とHes1の発現のみが軟骨形成凝集の周囲の肢芽MSCにおいて維持されたが、凝集そのものの内側においてはわずかな発現低下を示し図1D9、及び、1D10、白黒の輪郭、一方、Hey1のような構成因子はより広範に分布する発現パターンを維持した。どのNotchレセプターが肢芽間充織において活性があるのか決定するために、Notch阻害剤であるN-3,5-ジフルオロフェニルアセチル-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルDAPT,Calbiochem;サンディエゴ、カリフォルニア州存在下、および、非存在下で培養されたMSCから、又は、野生型胎生11.5日齢の全肢芽組織から全タンパク質が直接的に単離され、前記レセプターの切断型、若しくは、活性型NICDを検出することができるNotch1抗体、及び、Notch2抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析により、Notch2は胎生11.5日齢の肢芽MSCにおいて活性化される顕著なレセプターであり、培養MSCのDAPT処理は大量に存在する切断型Notch2NICD2を減少させることができることが明らかにされた図1E。Notch1NICD1は、100μgまでのタンパク質濃度ではほぼ検出不可能であった。それゆえ、まとめると、これらのデータは、Notch2はMSCで活性化される主要なNotchレセプターであり、一方、Notch経路のその他の構成因子Jag1、Dll1、N3、Hes1、Hey1、及び、HeyLはまた、肢発生の間、MSCの増殖と分化に重要なメディエーターでありうることを示唆する。Notchシグナル伝達はMSC分化の全般的な制御因子である。MSCにおけるNotchシグナル伝達の役割を判定するために、Notch機能欠損アッセイが、Notch阻害剤DAPTを用いた胎生11.5日齢の肢芽由来のMSC培養物に対して行われた。軟骨形成はまず、1mMDAPTの存在下、及び、非存在下での軟骨小結節形成を測定することにより、肢芽小塊培養物において調査された。DAPT処理は軟骨小結節形成を大いに増強した図2A。これは、Notch阻害がMSCの軟骨細胞系列へのコミットメントを加速することを示し、ある先行研究Fujimakietal.,J.BoneMiner.Metab.24:191-82006と一致する発見である。DAPTの効果はまた、軟骨形成マーカーのSox9、Col2a1、及び、Agc1の発現をリアルタイムRT-PCRによって評価された。未処理の培養物と比較すると、DAPTは培養3日目から5日目の間にSox9、Col2a1、及び、Agc1の発現図2Aを増強したが、Agc1の発現は7日目までに大いに減少した。このことは、Notchは軟骨細胞成熟、又は、コミットした軟骨細胞表現型の維持において後期の役割を果たすことを示す。Notchが軟骨形成を特異的に調節するのか、又は、MSC分化を全般的に制御するのかどうか判定するために、肢芽MSC分化アッセイが骨形成性条件、及び、脂肪細胞形成性条件の両方の条件で行われた。肢芽MSCは単層に蒔かれ、そして、DAPT1mMの非存在下、及び、存在下、骨形成性培地において21日間培養された図2B。DAPT処理はMSCの正常な造骨細胞への分化を増強した。培養物は、上昇したアルカリホスファターゼ染色を示し、リアルタイムRT-PCR解析は造骨細胞マーカー遺伝子であるCol1a1、AP、及び、Ocの発現の著しい増加を示した図2B。最後に、肢芽MSCは単層に蒔かれ、そして、DAPT1mMの非存在下、及び、存在下、脂肪細胞形成性培地において21日間培養された図2C。DAPT処理はMSCの正常な脂肪細胞への分化を同様に増強した。培養物は上昇したオイルレッド-O染色を示し、リアルタイムRT-PCR解析は脂肪細胞マーカー遺伝子であるPpargの発現の著しい増加を示した図2C。これらのデータは、インビトロでのNotchシグナル伝達の阻害が肢芽MSCの軟骨細胞系列、造骨細胞系列、及び、脂肪細胞系列への分化を増強することを示すものである。これは、MSCの維持におけるNotchシグナル伝達について全般的な役割を示す。RBPjκ依存性Notchシグナル伝達は軟骨形成の間にMSC分化を抑制する。インビボで肢芽MSC分化中の、及び、軟骨形成中のNotchシグナル伝達に対する要件を評価する第一段階として、標準的なNotchエフェクターであるRbpjκがPrx1Cre導入遺伝子を用いて初期肢間充織において選択的に欠質させられるPrx1Cre;Rbpjκf/f、fはfloxed対立遺伝子であることを表す。マウスにおいて胚性マウス肢芽が解析された図3。Prx1Creは、発達中の肢の内部で軟骨細胞、造骨細胞、及び、結合組織細胞を生じるが、筋芽細胞、血液系譜細胞、若しくは、血管内皮細胞を生じない側板中胚葉のMSCを特異的に標的とするので、本研究においてPrx1Creマウス系列が使用された。肢芽MSCの軟骨細胞系列の細胞へのコミットメントにおける変化をアッセイするために、アルシアンブルー染色、insituハイブリダイゼーション、及び、リアルタイムRT-PCRがSox9、Col2a1、及び、Agc1に対して行われた。胎生12.5日齢のPrx1Cre;Rbpjκf/f変異RBPjκ肢芽は、ほとんど検出不可能なレベルのアルシアンブルー染色を示す対照と比較して、軟骨形成原基痕跡のアルシアンブルー染色の増加を示した図3A1、及び、3A2。insituハイブリダイゼーション解析により、RBPjκ変異体切片におけるCol2a1、及び、Agc1の両方の発現の増加が明らかになった。Col2a1陽性の変異体細胞の全てはまた、Agc1を発現した図3A6、及び、3A8。これは、これらの細胞はこの時点で完全にコミットした軟骨細胞であることを示す。この時期の野生型切片により、Col2a1陽性細胞のうちの中央部の芯にあたる細胞のみがAgc1を発現することが示された図3A5、及び、3A7。これは、軟骨細胞分化の正常な進行を強調するものである。さらに、RBPjκ変異体切片はSox9発現レベルの低下を示した。これは、前記変異体細胞が軟骨形成の最初期の段階を越えて進行したことを示唆する。胎生12.5日齢の肢芽全体より単離したmRNAに対して行われたリアルタイムRT-PCR解析は、軟骨形成マーカー遺伝子であるSox9、Col2a1、及び、Agc1の各々についてのinsituハイブリダイゼーションの結果と一致する図3B。より初期の肢芽胎生11.5日齢に対して行われたリアルタイムRT-PCRでは、RBPjκ変異体サンプルから上昇した全ての軟骨形成マーカーの発現が示された。これらのデータは、RBPjκ依存性Notchシグナル伝達が肢芽MSCを正常に維持し、そして、RBPjκの欠損が、軟骨形成の過程を経ると決定されているこれらの細胞に関して軟骨形成分化を促進するということを示唆する。持続的Notch活性化がRBPjκ依存的な方法でMSCを維持、増殖させる。インビトロのNotch活性化が発生中の肢におけるMSC分化と軟骨形成を抑制することができるか、又は、遅らせることができるかどうか判定するために、Notch機能獲得型実験が行われた。マウスNotch1の細胞内ドメインとGFPNICD-IRES-GFPがloxP部位によって挟み込まれた転写停止配列を上流に含むRosa26レポーター遺伝子座を標的とするRosa-NICD-IRES-GFPマウスモデルシステムを用いて機能獲得型実験が行われた。Cre活性化に引き続き、Creを発現する細胞集団内に特異的にNICDとGFPの発現が維持されることが確定されてきているMurtaughetal.,PNAS100:14920-52003。Prx1Cre導入遺伝子が、軟骨形成の前に初期肢芽MSC内でNICD発現を誘導し、持続的Notch活性を誘導するために使用されたPrx1Cre;Rosa-NICDf/。これより後、このマウスはNICD変異体と称される。胎生18.5日齢のNICD変異体骨格標本の解析は、Prx1Creが特異的に発現する領域の全てである肢黒矢印、頭蓋星印、及び、胸骨灰色矢印の正常な形成の明白な抑制を示した図4A1、及び、4A2。前記肢をより詳しく調査することにより、最基底部、及び、最先端部軟骨原基痕跡のうちのわずか少数がNICD変異体において発生したが、これらの単位は、遅滞した軟骨発生の証拠を有し、低形成である図4A3~4A6。前記肢の表現型が軟骨形成の間のMSC分化の抑制から生じるのかどうか判定するために、同腹仔のNICD変異体と野生型対照で胎生12.5日齢の肢芽が解析された。NICD変異体肢芽の切片は凝集をほとんど示さず、対照と比較して低下したアルシアンブルー染色を示した図4B1、及び、4B2。変異体は常に3本の指の凝集第1指、及び、第5指の明らかな喪失を示し、しばしば、より先端の領域で凝集を発達させなかった。基底部の凝集が起きるとき、それらは常に低形成であり、軟骨形成分化過程において遅滞した。軟骨形成とMSC分化における混乱を評価するために、Sox9、Col2a1、及び、Agc1についてinsituハイブリダイゼーションが行われた。NICD変異体切片はこれらのマーカー遺伝子のほぼ完全な抑制を示したが、形成された原基痕跡指凝集では、各マーカー遺伝子がかなりのレベルで発現したようである図4B3~4B8。これらの原基痕跡凝集がNICD変異体においていったい何故起きたのか調べるために、NICD-IRES-GFP転写産物を活発に発現し、そのためにNotch活性化を有するMSCに印をつけるGFPについてinsituハイブリダイゼーションが行われた。原基痕跡凝集のそれぞれは明らかなGFP発現を示さなかったが、一方、肢芽内部のその他のほとんどのMSCは強度のGFP発現を示した図4B9、及び、4B10。このことは、Prx1Cre導入遺伝子はこの細胞集団を効率的に標的としていなかったことを示唆する。胎生12.5日齢の肢芽全体から単離されたmRNAに対してRT-PCR解析が行われた。これらのデータはSox9、Col2a1、及び、Agc1のかなりの発現低下を示し図4C、前記骨形成マーカー遺伝子の各々についてのinsituハイブリダイゼーションの結果と一致する。初期造骨細胞分化制御因子であるRunx2はSox9のようにNICD変異体においてかなり低下したレベルの発現を示すが、そのRunx2もまた発現した図4C。RBPjκ依存性Notch標的遺伝子であるHes1、Hey1、及び、HeyLの解析により、同腹仔である野生型対照と比較してNICDにおいて上昇した発現レベルが示された図4C。これらのデータは、おそらくRBPJκ依存的シグナル伝達機構を介して、Sox9、及び、Runx2の上流で作用する局所的で、そしておそらく細胞自律的な方法でのMSC分化をNotchシグナル伝達が抑制することを示唆する。持続的なNotch活性化が骨格パターン形成、及び、成長を損なった、又は、MSCのアポトーシスを大量に誘導したという可能性を排除するために、肢パターン形成制御因子の発現が解析され、細胞増殖とアポトーシスにおける変化が評価された。肢発生とパターン形成の重要な制御因子がNICDの過剰発現によってかなり影響を受けるかどうか判定するために、FGF、及び、Shhシグナル伝達分子であるFgf8、Fgf10、及び、Ptc1について、胎生11.0日齢の後肢切片に対してinsituハイブリダイゼーション研究が行われた。AERのわずかな肥厚とFgf8、及び、Fgf10の発現上昇が観察された図5A1~5A4が、一方、これらの動物において先に観察されたMSC分化の細胞自律的抑制をこのことで説明できるとは考えられなかった。さらに、Patched1Ptc1発現はNICD切片と野生型切片の間で変化せず図5A5、及び、5A6、正常な指パターン形成と指アイデンティティーのために重要な不断のShh活性を示した。胎生11.0日齢の後肢切片でアポトーシスを起こしているMSCを検出するために、TUNEL標識と切断型Caspase-3免疫組織化学実験がその後に行われた。同腹仔の野生型対照と比較して、NICD変異体切片はMSCのアポトーシスについて有意な変化を示さなかった図5B、及び、図8。MSC分化のもっと後の時点でのアポトーシスに有意な変化は検出されなかった。最後に、持続的Notch活性化がMSC細胞増殖と肢成長に有害な効果を持つかどうか判定するために、胎生11.5日齢の後肢切片でBrdU標識実験が行われた。データは、NICD変異体切片が肢芽中でBrdU標識された細胞核のパーセンテージのかなり上昇を示すが、高増殖性の頂端領域AZ、又は、進行帯の近傍の領域破線のボックスにおいてそれはたいへん明白であった図5C1~5C3。BrdUデータを確認するために、細胞増殖と細胞周期の制御因子であるCyclinD1について、胎生11.5日齢のNICD変異体肢芽と対照肢芽に由来するRNAを用いてRT-PCRが行われた。NICD変異体は対照と比較して30以上のCyclinD1発現の増加を示した図5C4。これらのデータにより、NICD変異体における肢表現型はMSC分化の細胞自律的抑制により生じたものであるようであり、肢パターン形成の混乱、MSCアポトーシス、又は、MSC細胞増殖によるものではないようであるということが示された。さらに、これらのデータにより、肢芽MSCにおける持続的なNotch活性化がこの細胞集団を維持し、且つ、増殖させることが示される。MSC分化および軟骨形成のNotch抑制がもっぱらRBPjκ依存シグナル伝達機構によって仲介されたかどうか判定するために、Notchの機能獲得型の実験がRBPjκ転写エフェクターのない状態で行なわれた。Prx1Cre導入遺伝子、活性化可能Rosa-NICD対立遺伝子、及び、ホモ接合型Rbpjκfloxed対立遺伝子Prx1Cre;Rosa-NICDf/;Rbpjκf/fを持つマウスが作成されたNICD;RBPjκ。アリザリンレッドおよびアルシアンブルーで染色された胎生18.5日齢の骨格の分析により、正常な四肢、特定の頭蓋骨、及び、胸骨を欠くNICD変異体とは対照的に、NICD;RBPjκ変異体動物はこれらの単位の発生において類似の停止を示しそこなうことが示された図6A1、6A2、及び、6A4。より詳しく調査すると、NICD;RBPjκ変異体動物は、同腹仔の野生型と比較して短い骨格単位矢印は脛骨の長さを強調する。を持つRBPjκ変異体の骨格と極めて似ていた図6A1、6A3、及び、6A4。同腹仔の野生型、NICD変異体、及び、NICD;RBPjκ変異体に由来する胎生12.5日齢の後肢切片の詳細な組織学的、及び、分子的解析により、Notch活性化によるMSC分化の抑制にRBPjκが必要とされることがさらに示された。本実験のためにPrx1Cre;Rosa-NICDf/;Rbpjκf/の遺伝子型を持つNICD変異体は、先述したPrx1Cre;Rosa-NICDf/変異体マウスと同一の表現型を示した図4のNICD変異体と比較される図6のNICD変異体。Rbpjκ対立遺伝子の一つを欠くNICD突然変異体は、MSC分化のほぼ完全な抑制をまたも示し、先端部に3か所だけの指凝集を備えた四肢を生じた。胎生12.5日齢のNICD肢芽切片は、先端部の3か所の指に限局される細胞内を除いて、アルシアンブルー染色の低下、及び、軟骨形成マーカー遺伝子発現Sox9、Col2a1およびAgc1の完全な喪失を示した図6B2、6B5、6B8および6B11。Gfp発現が評価されたとき、3か所の指凝集は再度、Gfp発現のほぼ不在と、それ故、持続的なNICD活性化の欠如を示した図6B14。両方のRbpjκ対立遺伝子を欠くNICD変異体NICD;RBPjκは、MSC分化と軟骨形成の完全な救出を示した。胎生12.5日齢のNICD;RBPjκ変異体肢芽切片は、同腹仔の野生型対照と比較されるとき、わずかに拡大し、より強くなったアルシアンブルー染色を有するあらゆる軟骨形成単位の再出現を示した図6B1、6B3。さらに、NICD;RBPjκ変異体切片のinsituハイブリダイゼーション解析は、前記二重変異体は同腹仔の野生型対照と比較して増加され拡大したSox9、Col2、及び、Agc1発現を示し、それは同腹仔のRBPjκ変異体に極めて類似した表現型であった図6B4、6B6、6B7、6B9、6B10、及び、6B12。NICD;RBPjκ変異体におけるMSC分化の遺伝的な救出は不完全な組換えとNICD発現の喪失のためではないということを確定するために、隣接する切片に対してGfp発現についてのinsituハイブリダイゼーション解析が行われた。NICD;RBPjκ変異体は、NICD変異体切片で先に同定された領域を除外して、強度のGfp発現を、それ故、NICD活性化を示した図6B14、6B15。それ故、これらのデータは、MSC分化と軟骨形成のNotch抑制はRBPjκ依存的シグナル伝達機構によってのみ仲介されるということを初めて示すものである。RBPjκ依存的Notch標的遺伝子Hes1は軟骨形成の間のMSC分化に重要な制御因子である。前記データは軟骨形成のNotch制御はRBPjκ依存的Notchシグナル伝達機構によって仲介されることを示す。Hes、及び、HeyファミリーのいくつかのRBPjκ依存的Notch標的遺伝子は、いくつかの器官系において幹細胞/前駆細胞分化のNotch制御を仲介する。Hes1、Hey1、及び、HeyLは、高密度の小塊で培養される肢芽MSC、及び、C3H10T1/2間葉細胞においてかなり発現される数少ない古典的なNotch標的遺伝子である図1B。それ故、高密度の小塊で培養されている間に容易に形質導入可能なC3H10T1/2間葉細胞をHes1shRNAウィルス、Hey1shRNAウィルス、及び、HeyLshRNAウィルスで感染させることにより機能喪失型実験が行われた。肢芽MSCと同様に、多分化能間葉細胞株C3H10T1/2は、2週間の培養時間に高密度小塊で培養されると、軟骨形成を起こすDenkeretal.,Differentiation64:67-761999、及び、HaasandTuan,Differentiation64:77-891999。Hey1shRNA、又は、HeyLshRNAではなくHes1shRNAウィルスで形質導入されたC3H10T1/2では、その他のNotch機能喪失型研究と同様にアルシアンブルー染色とSox9、Col2a1、及び、Agc1についてのリアルタイムRT-PCRによりアッセイされ、軟骨形成の促進、又は、増強が生じた図9A1~9A6、及び、9C。Hey1shRNA、及び/又は、HeyLshRNAで形質導入された培養物はアルシアンブルー染色では有意な変化を示さず、一貫性が無く比較的変化のない軟骨形成マーカー遺伝子発現を有した。さらに、一時的なCMV-Hes1過剰発現機能獲得型実験がC3H10T1/2小塊培養物で行われ、その実験はアルシアンブルー染色でアッセイすると軟骨形成のかなりの抑制を示し図9B1~9B6、RT-PCR解析がその他のNotch機能獲得型研究と同様にSox9、Col2a1、及び、Agc1の軟骨形成マーカーのそれぞれについて行われた図9D。Hes1はC3H10T1/2細胞モデルを用いる間葉細胞分化と軟骨形成の重要な制御因子であるように見えたので、類似のHes1shRNA機能喪失型研究が、3日間、5日間、及び、7日間、高密度小塊で培養された肢芽由来MSCを使用して行われた。Hes1発現の著しい低下により軟骨形成が促進されることとなり、Hes1shRNA培養物においてアルシアンブルー染色が増強され図7A1~7A6、軟骨形成マーカーであるSox9、Col2a1、及び、Agc1の遺伝子発現がほぼすべての時点で上昇した図7B。後半のタイムポイントである5日目と7日目では、Agc1発現は変化しなかった、又は、軽度に抑制された。これは、軟骨細胞の成熟の促進、又は、コミットした軟骨細胞表現型の維持におけるHes1の役割を示すものである。これは、高密度小塊で培養された肢芽由来MSCがNotch阻害剤のDAPTで処理される実験図2Aと一致した。総体として、これらのデータにより、Hes1がMSCにおいて発現されるHes/Heyファミリーの主要なRBPjκ依存性Notch標的遺伝子であり、それは軟骨形成中のMSC分化のNotchを介した抑制に必要とされるということが示された。さらに、これらのデータは、RBPjκ依存性Notchシグナル伝達経路は骨格発達の間にMSCの維持と増殖に重要であることを示した。したがって、Notch経路の操作により、骨格修復およびMSC集団を利用する組織工学的応用を目的として、生体外でMSCの分化を維持し、増殖させ、制御する手段が提供される。実施例2:ヒトMSChMSCのNotch制御Notchシグナル伝達がどのようにhMSCの維持と増殖を制御するのか探求するために、LonzaInc.バーゼル、スイスより購入された第1継代培養で骨髄由来のhMSCからの各Notchレセプター、及び、すべての既知のRBPjκ依存性Notch標的遺伝子Hes1、Hes5、Hes7、Hey1、Hey2、HeyLの発現特性図10。全てのNotchレセプター、および、Hes/Hey標的遺伝子のほとんどは様々なレベルで発現した。Notch2図10AおよびHes1図10Bは最も高発現であるhMSCのNotch構成因子として同定された。これは、初期発生中のマウス肢骨格のMSCにおけるNotch構成因子発現と機能を解析した実施例1のデータと一致した。hMSCをレンチウィルスコンストラクトと感染させ、Jag1をコートしたプレートによってhMSCにおけるNotchシグナル伝達を誘導する能力を示すため、いくつかの対照実験が行われた。hMSCはまず、ATCCより入手されたEF.v.CMV.GFP対照レンチウィルスコンストラクトで感染させられた。このレンチウィルスは、24時間後に、及び、細胞の多数の継代の間に感染効率を決定することを可能にするGFPを発現する。その結果は、長期にわたる培養と継代の間にhMSC成長に、又は、細胞生存に明らかな変化もなく維持される24時間以内の85以上の感染効率を示した。5μg/ml、10μg/ml、及び、15μg/mlの濃度のJag1と10μg/mlのIgGを対照として用いる組換えJag1タンパク質で培養ディッシュをコートするプロトコルが確立された。コートされたプレート上のJag1タンパク質の抗Jag1抗体を用いる免疫染色および呈色反応により、10μg/mlの濃度の組換えJag1タンパク質で最大で均一なプレートのコーティングが達せられることが示された。それ以上高い濃度が前記培養ディッシュに結合したJag1の量を増加させるようには見えなかった。あるいは、5μg/mlの濃度により、かなり低い濃度であり、並びに、前記ディッシュの周辺部の周りにタンパク質が不均一に分布するように見えるJag1コーティングが示された。IgG対照プレートはまた、Jag1組換えタンパク質を含まないプレートについて予想されるように、呈色反応を示さなかった。次に、このJag1コーティング技法がhMSCにおいてNotchシグナル伝達を誘導することを確認するために、RBPjP依存性Notchルシフェラーゼレポーターで形質移入されたhMSCが5μg/ml、10μg/ml、及び、15μg/mlの濃度のJag1とIgGでコートされたプレート上で培養された。そのデータにより、10μg/mlのJag1タンパク質が最大ルシフェラーゼ活性を誘導することが示された。hMSCは、細胞のサイズ、形態、又は、細胞生存について明らかな変化も無くIgGコートプレート、及び、Jag1コートプレートの両方で正常に成長するように見えたことはまた注目に値する。Notchシグナル伝達はhMSCの幹細胞性の強力な制御因子なので、初期継代hMSCにおいて高発現するNotch分子Notch2およびHes1は、細胞が幾世代か継代するにつれ、その発現レベルを変化させ、徐々にその幹細胞様の特質を失うであろう。同じ合理がOct4、Sox2、及び、Nanogを含む幹細胞性の重要な制御因子に当てはまるであろう。それ故、RT-PCR実験が行われ、通常の培養プレート上の間充織幹細胞成長培地MSCGMTMLonza,Inc;バーゼル、スイス中で継代されたhMSCに由来するNotch2、Hes1、Oct4、Sox2、及び、Nanogの遺伝子発現を解析した。第1継代培養P1、及び、第15代継代培養P15に引き続いてこれらの遺伝子の発現が比較された。これらのデータはNotch分子Notch2、Hes1と多分化能幹細胞マーカーOct4、Sox2、NanogはP15hMSCではP1と比較して著しく減少したことを示す図11A。これらのデータは、これらの細胞が生体外で継代する間にhMSCの幹細胞性の維持においてこれらの因子の各々が持つ役割を示す。標準的なhMSC培養条件での第2継代培養、及び第10継代培養に引き続く、hMSC細胞表面マーカーCD105とNotchレセプターNotch2についてのフローサイトメトリーのデータがまた行われた図12A、及び、12B。Notchシグナル伝達が幹細胞維持の重要な制御因子を誘導することができるかどうか判定するために、第3継代培養hMSCがJag1コートプレート、及び、IgGコートプレート上で24時間培養され、リアルタイムRT-PCR解析のためにRNAが単離された図11B。この研究は、Jag1コートプレート10μg/mlは効率的にRBPjP依存性Notchシグナル伝達を誘導し、対照に対して約7倍にHes1発現を強化することを示した。さらに、Jag1はOct4、Sox2、及び、Nanogの発現を誘導したが、Oct4発現はSox2、及び、Nanogと比較して軽度に増強されただけであった。それ故、Jag1/Notchシグナル伝達は、幹細胞因子のこのネットワークによりhMSCの維持と増殖を制御した。最後に、比較的短い間隔の時間でJag1がhMSCの細胞増殖を制御できるかどうか判定するために、同じ培養系と第3継代培養hMSCが用いられた。BrdU酵素結合性免疫吸着検定法ELISA法が、Jag1コートプレート、及び、IgGコートプレート上で24時間培養されたhMSCに対して行われた。データは、Jag1誘導Notchシグナル伝達は、対照と比較して50を超える値にまでBrdUの取り込みを増加させることを示した図11C。これはNotchシグナル伝達が生体外でのhMSCの維持と増殖の両方を制御したことを示す。実施例3:Notch2で選択されたhMSCにおけるJagged-1を介したNotch活性化図13Aで示すように、Notch2で選択されたhMSCにおけるJagged-1を介したNotch活性化は幹細胞制御因子、細胞増殖、及び、幹細胞増殖を誘導した。より具体的には、Jag1コートプレート上の総hMSC培養、及び、Notch2で選択されたhMSC培養におけるNotchシグナル伝達分子Notch2、及び、Hes1、重要な幹細胞制御分子Oct4、Sox2、及び、Nanog、及び、細胞増殖のマーカーCycD1についてのRT-PCR遺伝子発現解析により、Notch2で選択されたhMSCにおける遺伝子発現の上昇が示された。図13Bは、Jag1コートプレート上で培養された総hMSC、Notch2陰性hMSC、及び、Notch2陽性hMSCに対し行われたBrdUELISA検定の結果を示す。総hMSC、又は、Notch2陰性hMSCと比較して、Notch2陽性hMSCは細胞増殖の増強を示した。図13Cは、Jag1コートプレート上で培養された総hMSC、Notch2陰性hMSC、及び、Notch2陽性hMSCに対し行われたCFU-Fアッセイの結果を示す。総hMSC、又は、Notch2陰性hMSCと比較して、Notch2で選択されたhMSCは幹細胞増殖の増大を示した。実施例4:Notch2で選択されたhMSCは軟骨形成と骨形成の強化された特質を示す。図14A、及び、14Cで示されるように、Notch2で選択されたhMSCは軟骨形成と骨形成の強化された特質を示した。リアルタイムRT-PCR遺伝子発現解析により、二週間から三週間、軟骨形成性条件、又は、骨形成性条件での培養の後、総hMSC、及び、Notch2陰性hMSCと比較して、Notch2陽性hMSCにおける軟骨形成マーカー遺伝子Sox9、Col2a1、及び、Agc1A及び骨形成マーカー遺伝子Col1a1、Ap、及び、OcCの増加が示された。軟骨形成分化に引き続く総hMSC、Notch2陰性hMSC、及び、Notch2陽性hMSC第2継代培養のアルシアンブルー染色が図14Bに示される。軟骨形成分化に引き続くNotch2陰性hMSC、及び、Notch2陽性hMSC第2継代培養、及び、第5継代培養のAP染色が図14Dに示される。hMSCは、最初、Jag1コートプレートで二週間培養された3日から4日/継代。これらの例は、Notch2及びHes1がヒト骨髄由来MSChMSCにおいて発現されるNotchシグナル伝達分子であることを示す。これらのNotch遺伝子と重要な幹細胞制御因子の発現は、hMSCが継代されるにつれ、減少した。hMSCのNotch活性化はNotch標的遺伝子の発現ばかりか重要な幹細胞制御分子を誘導することもまた示される。さらに、Notch2で選択されたhMSCは、Notch活性化の後、総hMSC,又は、Notch2陰性hMSCと比較して優れたNotch経路遺伝子と幹細胞制御分子の発現誘導、及び、優れた幹細胞増殖を示した。Notch2で選択されたhMSCはまた、例えば、Jagged1を介したhMSCの維持と増殖からはずされた後、総hMSC,又は、Notch2陰性hMSCと比較して、軟骨形成分化、及び、骨形成分化を起こす優れた能力を示した。実施例5:生体外で増殖したNotch2陽性細胞集団の大腿骨同種移植モデルマウスにおける骨欠損治癒に対する効果Notch2陽性細胞集団のインビボの効果を評価するために、本明細書に記載される新規のMSC選択法、並びに、Jagged1誘導MSC維持法、及び、増殖法を用いて十分な数のNotch2陽性マウスMSCが作り出される。Notch2で選択されたMSCと総マウスMSC慣例にしたがって選択されたマウスMSCが、前記細胞を生体内で捜し出すことができるRosa26LacZマウスより単離される。細胞の維持と増殖に引き続き、MSCはJagged1コートプレートよりはずされ、重大な分割型骨欠損の大腿骨同種移植モデルマウスへの移植のための失活した同種移植片に前記細胞が接種される。MSC無しの失活した同種移植片が負の対照群として働く。MSCの取り込み、骨新生、及び、同種移植骨結合過程を評価するためのX線解析、マイクロCT解析、組織学解析、免疫組織化学IHC解析、insituハイブリダイゼーションISH解析、及び、細胞系列追跡LacZ染色解析に用いるため、移植後3日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び、28日目にマウス集団5~8匹から大腿骨が回収される。実験群と対照群の各々に由来する治癒しつつある骨の強度と完全性を評価するために、特定のエンドポイントで生体力学的なねじり試験もまた行われる。方法骨同種移植片の失活失活した同種移植片の提供のため、129系統の10週齢メスマウスがJacksonLabsから入手される。簡単に説明すると、マウスは安楽死させられ、4mmの中央骨幹部分大腿骨長の約20が回転ドレメルと注文により4mmの間隔で並行して取り付けられた2枚のダイヤモンド刃を用いる骨切断により各大腿骨から取り外される。同種移植片は25ゲージの注射針で骨髄を洗い流され、骨膜は手作業で引きはがされ、移植片は70エタノールで少なくとも4時間、繰返し洗浄される。同種移植片は検査され、必要であれば、残っている細胞が最終的に取り除かれる。前記同種移植片は失活過程を完結するために少なくとも30日間、100エタノール中-80°Cで保存される。失活した同種移植片へのMSCの接種上述したJagged1を介したMSC維持と増殖に引き続き、Notch2で選択されたhMSC、及び、総MSCが失活した同種移植片に接種される。簡単に説明すると、前記失活した同種移植片は-80°Cの冷凍庫から取り出され、室温に平衡化される。移植片は、5×105個のMSCの最初の接種の30分前に標準培地を含む96穴培養プレートに配置される。MSCは失活化した移植片上で、さらに30分間、37°C、5二酸化炭素中で保温される。前記移植片は180°回転され、さらに5×105個のMSCが移植片の他方の面に接種され、MSCが完全に、且つ、均一に分布するようにされる。MSCが接種されて再活性化した同種移植片は37°C、5二酸化炭素中で約1時間、保温され、細胞が前記移植片に十分に付着して同化する。MSCを受け取らない前記の失活した同種移植片は移植の前に同じ培養条件におかれる。失活した骨同種移植片、及び、MSCで再活性化した骨同種移植片のすべては、その後、C57BL/6Jレシピエントマウスに作られた4mmの区域性欠損に移植される。マウス大腿骨欠損の外科的再建10週齢のメスC57BL/6Jマウスが同種移植のレシピエントとして全ての実験において用いられた。前記マウスはケタミン60mg/kg体重及びキシラジン4mg/kg体重の腹腔内注射により麻酔される。7mmから8mmの側方皮膚切開がなされ、鈍的に筋肉を切開することにより大腿骨の中軸が露出される。4mmの中央骨幹部分が上述したように骨切断により大腿骨から取り外される。22ゲージの注射針を用いて髄管が近位に、及び、遠位に切開される。前記の調製された失活した同種移植片、及び、MSCで再活性化された同種移植片が、それから、4mmの前記欠損に挿入され、髄内の髄腔を通して配置される滅菌されたチタニウムのピンによって固定される。髄内のピンは膝と臀部の両方で曲げられ、ピンが固定化される。前記切開は、最初の画像研究を考慮して断続絹糸縫合によって閉じられ、それに引き続いて、皮膚が外科用ホッチキスにより閉じられた。骨移植によって誘起されるどのような激しい疼痛をも制御するために、ブプレノルフィン0.5mg/kgが手術後に与えられうる。移植されたサンプルは、移植片治癒、並びに、骨形成に対するMSCの寄与の評価のため、3日目、7日目、10日目、14日目、21日目、及び、28日目に回収される。マイクロCT骨画像解析14日目、21日目、及び、28日目のサンプルに由来する再建された大腿骨のうちのいくつか5サンプルは、慎重な切開と髄内のピンの除去の後、マイクロCTシステムVivaCT40,ScancoMedicalを用いて画像化される。簡単に説明すると、55kVpおよび145iAの高解像度10.5ミクロンX線エネルギー設定、200ミリ秒の積分時間、及び、円錐ビーム再構築アルゴリズムを利用するプロトコルを用いて前記大腿骨がスキャンされる。移植された同種移植片上の中央部に位置する中央骨幹の約8.00mm約800枚の領域がスキャンされる。骨と移植片の容積、及び、骨塩量BMDの定量がScanco解析ソフトウェアを用いて行われる。生体力学的試験マイクロCT画像化の後、標本は生理食塩水で湿らされ、生体力学的試験のために融解されるまで-20°Cで凍結される。直線的な軸の配列を確保し、7mmから8mmのゲージ長を維持するために、前記大腿骨の末端は、注文生産の治具内のPMMAを用いて6.35mm平方のアルミニウムチューブホルダーに接着され、各末端で少なくとも3mmの長さがホルダーに収まるようにされる。組織の再水和とPMMAの硬化を見越して、標本はホルダーに収められた後、室温で2時間PBSに浸される。標本はEnduraTecTestBenchTMシステム200N.mmトルクセル;BoseCorporationに据えられ、1°/秒の速度で破損するまでねじれ力について試験される。トルクデータは、回転ひずみゲージ長で正規化され、rad/mmで表される。に対してプロットされ、終局トルクTUlt、降伏トルク、ねじり剛性TR;トルクで正規化された回転ひずみ曲線の直線部分の傾きから計算される。、及び、ねじり破断エネルギートルクひずみ曲線の下の面積が決定される。破損するまでの試験されたのち、破損の様式を検討するために、全てのサンプルはX線で調べられる。移植された大腿骨の組織学的、及び、分子的評価組織学分析、及び、分子的解析に用いられる予定の大腿骨サンプルは中性緩衝ホルマリン中で3日間固定され、14EDTApH7.2の中で脱カルシウム化され、そして、パラフィン中で加工される。3日目、7日目、10日目、14日目、21日目、28日目のサンプル由来のパラフィン包埋サンプル5サンプルは5μmの厚みの切片にされる。治癒しつつある大腿骨内の定められた深度にある、ブロックあたり何枚かの切片がオレンジG/アルシアンブルーHEで染色され、軟骨、骨、及び、繊維組織の寄与が判定されるであろう。間に存在する未染色の切片は、先述したようにS-35標識されたリボプローブを用いて軟骨細胞分化の特異的なマーカーSox9、Col2a1、Agc1、Col10a1、及び、Mmp13、及び、造骨細胞分化の特異的なマーカーCol1a1、Ap、Bsp、及び、Ocについてのinsituハイブリダイゼーションを行うために使用される。前記骨組織のリモデリングがまたTRAP染色法を用いてモニターされるであろう。組織形態計測的解析、並びに、細胞染色と遺伝子発現の領域の定量がOsteoMetricsシステム、及び、OsteoMeasureソフトウェアを用いて行われるTiyapatanaputietal.Anovelmurinesegmentalfemoralgraftmodel.JOrthopRes2004;22-6:1254-60.を参照のこと。。βガラクトシダーゼ染色、及び、MSC細胞系列追跡MSC細胞系列追跡解析に使用される予定の大腿骨サンプルは、4パラホルムアルデヒドで2時間固定され、14EDTApH7.2の中で脱カルシウム化され、15と30のショ糖勾配を通して加工され、O.C.T.包埋媒体中で凍結される。3日目、14日目、及び、28日目のサンプル由来の凍結サンプル3サンプルは8μmの厚みの切片にされるであろう。治癒しつつある大腿骨内のさまざまな深度に由来する切片が集められ、βガラクトシダーゼについて染色されるであろう。切片は以下に説明するように解析される。凍結された切片の何枚かがLacZ染色細胞の細胞系列の範囲を定めるための二重染色法に利用されるであろう。これらの切片は、まず、βガラクトシダーゼ染色にかけられ、それから直ちに、軟骨細胞系列Col2a1、Col10a1、及び、造骨細胞系列Bsp、Ocに特異的なプローブ、及び、抗体を用いるinsituハイブリダイゼーション、及び/又は、免疫組織化学のために使用されるであろう。二重に標識された組織切片の染色、画像化、及び、画像解析は先に説明されたように行われたHiltonetal.,Notchsignalingmaintainsbonemarrowmesenchymalprogenitorsbysuppressingosteoblastdifferentiation.NatMed2008;14-3:306-14を参照のこと。X線法、マイクロCT法、組織学的方法、IHC法、ISH法、LacZ染色法、及び、生体力学試験法によって測定されるとき、Notch2で選択され、維持され、増殖されたマウスMSCは、慣例的に選択されたMSCを用いる再活性化された同種移植片、又は、失活した同種移植片のみよりも強力な効果を再活性化された同種移植片の取り込みに対して示すであろう。さらに、組織学的、及び、分子的解析により、Notch2で選択されたMSCで再活性化された同種移植片は軟骨形成分化での早い時期の増強とそれに引き続く造骨細胞分化の増強と骨の蓄積を示すことが示されるであろう。骨リモデリング過程は、TRAP染色で評価すると、Notch2で選択されたMSC集団と総MSC集団の両方において類似するであろう。最後に、Notch2で選択されたMSCを使用して再活性化された同種移植片に由来するβガラクトシダーゼ染色と細胞系列追跡のデータは、総MSCを使用して再活性化された同種移植片と比較して、増強された、直接ドナー細胞からの骨形成に至るより多くの軟骨形成に分化した細胞系列と骨形成に分化した細胞系列を示すであろう。多くの実施形態が記載されてきた。それでも、様々に改変がなされうることが理解されるであろう。したがって、その他の実施形態は、次の請求項の範囲内である。"