"2,4-ジヒドロキシ酪酸2,4-DHBを生成する方法であって、リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を4-ホスホ-リンゴ酸に変換する第1のステップ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、4-ホスホ-リンゴ酸をリンゴ酸-4-セミアルデヒドに変換する第2のステップ、DHB脱水素酵素を使用して、リンゴ酸-4-セミアルデヒドを2,4-DHBに変換する第3のステップを含む方法。前記リンゴ酸キナーゼが、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、請求項1に記載の方法。前記リンゴ酸キナーゼが、アスパラギン酸キナーゼである、請求項2に記載の方法。前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項3に記載の方法。前記変異アスパラギン酸キナーゼが、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異を含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項4に記載の方法。前記リンゴ酸キナーゼが、配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、請求項1から5の何れか1項に記載の方法。前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4-ホスホ-リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項1から6の何れか1項に記載の方法。前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項7に記載の方法。前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項8に記載の方法。配列番号68、より明確には配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64もしくは配列番号66または配列番号231によって表される、請求項9に記載の方法。前記DHB脱水素酵素が、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、コハク酸セミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素、L-トレオニン-3-脱水素酵素またはホモセリン還元酵素といったβ-ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項1から10の何れか1項に記載の方法。前記DHB脱水素酵素が、酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸-4-セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項11に記載の方法。前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項12に記載の方法。配列番号74、配列番号76または配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、請求項11から13に記載の方法。リンゴ酸を4-ホスホ-リンゴ酸に変換することを特徴とする、リンゴ酸キナーゼ。酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および/または基質親和性を改善する、請求項15に記載のリンゴ酸キナーゼ。前記酵素が、アスパラギン酸キナーゼである、請求項16に記載のリンゴ酸キナーゼ。前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S39、T45、V115、E119、F154および/またはS201の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項17に記載のリンゴ酸キナーゼ。配列番号9、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26によって表される、請求項88に記載のリンゴ酸キナーゼ。リシン阻害に対して非感受性であり、以下のアミノ酸:E250、M318、S321、V339、S338、F324、L325、V339、S345、E346、D340、T344および/またはT352に、少なくとも1つの変異をさらに含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項18または19に記載のリンゴ酸キナーゼ。配列番号39、配列番号41、配列番号43または配列番号45によって表される、請求項20に記載のリンゴ酸キナーゼ。4-ホスホ-リンゴ酸をリンゴ酸-4-セミアルデヒドに変換することを特徴とする、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。酵素の少なくとも1つの変異によって得ることができ、前記変異が、4-ホスホ-リンゴ酸への変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項22に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項22または23に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:T136、Q162、I230、E241および/またはH274の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項24に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。配列番号68、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66または配列番号231によって表される、請求項24に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。リンゴ酸-4-セミアルデヒドを2,4-DHBに変換することを特徴とする、DHB脱水素酵素。β-ヒドロキシ-脱水素酵素またはホモセリン脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項27に記載のDHB脱水素酵素。酵素の少なくとも1つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸-4-セミアルデヒドへの変異酵素の活性および/または基質親和性を改善する、請求項27または28に記載のDHB脱水素酵素。前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置:S40、N43、H39、T49、F85、Q108、L281および/またはN305の1つにおいて、少なくとも1つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の19種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項29に記載のDHB脱水素酵素。配列番号81、配列番号225または配列番号227によって表される、請求項30に記載のDHB脱水素酵素。請求項15から21の何れか1項に記載のリンゴ酸キナーゼをコードする、単離された核酸配列。配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号38、配列番号40、配列番号42または配列番号44によって表される、請求項32に記載の単離された核酸。請求項12から16の何れか1項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、または配列番号230によって表される、請求項34に記載の単離された核酸。請求項27から31の何れか1項に記載のDHB脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。配列番号82、配列番号224、配列番号226または配列番号228によって表される、請求項36に記載の単離された核酸。転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、請求項22から27の何れか1項に記載の少なくとも1つの核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む、キメラ遺伝子。転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、請求項22または23に記載の核酸配列、請求項24または25に記載の核酸配列、請求項26もしくは27に記載の、または配列番号73もしくは配列番号75もしくは配列番号82によって表される核酸配列、および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を含む、請求項38に記載のキメラ遺伝子。配列番号229によって表される、請求項39に記載のキメラ遺伝子。請求項32から37のいずれか1項に記載の核酸または請求項38から40に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。リンゴ酸キナーゼ、および/またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および/またはDHB脱水素酵素を発現する、宿主微生物。請求項32から37に記載の核酸の少なくとも1つで、請求項38または39に記載のキメラ遺伝子の少なくとも1つで、および/または請求項31に記載の発現ベクターの少なくとも1つで形質転換された、請求項42に記載の宿主微生物。細菌、酵母または真菌である、請求項42または43に記載の宿主微生物。Escherichiacoli、Saccharomycescerevisiae、Corynebacteriumglutamicum、ZygosaccharomycesrouxiiまたはAspergillusflavusの中からより詳細には選択される、請求項44に記載の宿主微生物。Escherichiacoliであり、表12において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つにおける破壊をさらに含むおよび/または表14において一覧表にした遺伝子の少なくとも1つを過剰発現する、請求項45に記載の宿主生物。リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素を発現する請求項42から46の何れか1項に記載の宿主微生物を培養するステップを含む、2,4-DHBの生成の方法。前記宿主生物が、リンゴ酸または別の有機酸、例えばピルビン酸、サクシネートまたはフマル酸が加えられた培地において培養される、請求項47に記載の2,4-DHBの生成の方法。前記培養培地が、別の炭素源をさらに含む、請求項48に記載の方法。リンゴ酸を過剰生成する微生物による、リンゴ酸または他の有機酸の生成である第1のステップを含む、2,4DHBの生成の方法。リンゴ酸-4-セミアルデヒドを2,4-DHBに変換するための、メチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用。前記メチルブチルアルデヒド還元酵素が、配列番号74によって表される、請求項51に記載の使用。コハク酸セミアルデヒド還元酵素が、配列番号76、配列番号81または配列番号;225もしくは配列番号227によって表される、請求項51に記載の使用。リンゴ酸を4-ホスホ-リンゴ酸に変換するための、請求項15から21の何れか1項に記載のリンゴ酸キナーゼの使用。4-ホスホ-リンゴ酸をリンゴ酸-4-セミアルデヒドに変換するための、請求項22から26の何れか1項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用。4-ホスホ-リンゴ酸。[実施例]例1:アスパラギン酸およびリンゴ酸キナーゼに関する、EscherichiacoliおよびSaccharomycescerevisiaeそれぞれに由来するアスパラギン酸キナーゼLysCおよびHom3の試験アスパラギン酸キナーゼの野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築:プラスミドpLYSCwtを、高忠実度ポリメラーゼhighfidelitypolymerasePhusion商標Finnzymes、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にNdeIおよびBamHI制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー5’CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3’配列番号1および5’CTTCCAGGGGATCCAGT-ATTTACTCAAAC3’配列番号2を使用して、PCRによって、lysC遺伝子を増幅することによって構築した。E.coliDH5α由来のゲノムDNAを、鋳型として使用した。PCR生成物をNdeIおよびBamHIで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pET28aNovagen発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。生じたpAKIIIwtプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列配列番号3を有する全長lysC遺伝子を含有することが示された。対応するタンパク質は、配列番号4によって表される。プラスミドpHOM3wtを、高忠実度ポリメラーゼPhusion商標Finnzymes、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にNheIおよびEcoRI制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー5’TATAATGCTAGCATGCCAATGGATTTCCAACC3’配列番号5および5’TATAATGAATTCT-TAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGTTC3’配列番号6を使用して、PCRによって、HOM3遺伝子を増幅することによって構築した。S.cerevisiaeBY4741wt由来のゲノムDNAを、鋳型として使用した。PCR生成物をNheIおよびEcoRIで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pET28aNovagen発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。生じたpHOM3wtプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列配列番号7を有する全長HOM3遺伝子を含有することが示された。対応するタンパク質は、配列番号8によって表される。酵素の発現:E.coliBL21D3星細胞starcellを、適切なプラスミドで形質転換した。N末端hexa-Hisタグを有する酵素を、0.1のOD600で一晩の培養から接種され、0.6のOD600まで増殖された250mlLB培養物において発現させ、その後タンパク質発現を、培養培地への1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGの追加によって誘導した。タンパク質発現の3時間後、細胞を、13000gでの10分間の遠心分離によって採取し、別の分析まで-20°Cで保管した。増殖およびタンパク質発現を、37°Cで行った。培養培地は、50μg/Lカナマイシンを含有した。酵素の精製:発現培養物の凍結した細胞ペレットを、0.5mLの切断緩衝液breakagebuffer50mMHepes、300mMNaCl、pH7、5に再懸濁し、30まで設定された電力出力での超音波処理BioblockScientific、VibraCell商標72437の4回の連続したラウンドによって、壊し開けた。粗抽出物を13000gで4°Cで15分間、遠心分離し、清澄な上清を保持することによって、細胞片を取り出した。15mg/mLストレプトマイシンSigmaを加え、試料を13000gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を保持することによって、RNAおよびDNAを抽出物から取り出した。清澄なタンパク質抽出物を、0.75mLの総容積のTalon商標Cobalt親和性樹脂Clontechで、4°Cで1時間インキュベートした。懸濁液をテーブルトップ遠心分離機において700gで遠心分離し、上清を取り出した。樹脂を10総容積の洗浄緩衝液50mMHepes、300mMNaCl、15mMImidazole、pH7.5で洗浄し、アスパラギン酸キナーゼを0.5mLの溶出緩衝液50mMHepes、300mMNaCl、500mMImidazole、pH7.5で溶出した。溶出した酵素の純度を、SDS-PAGE分析によって検証した。酵素アッセイ:ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸脱水素酵素の存在下で、キナーゼ反応におけるADP生成をNADH酸化にカップリングすることによって、アスパラギン酸またはリンゴ酸キナーゼ活性をアッセイした。反応スキーム:アスパラギン酸またはリンゴ酸キナーゼアスパラギン酸またはリンゴ酸ATP→4-ホスホ-L-アスパラギン酸または4-ホスホ-L-リンゴ酸ADPピルビン酸キナーゼADPホスホエノールピルビン酸→ATPピルビン酸乳酸脱水素酵素ピルビン酸NADH→NAD乳酸アッセイ混合物は、50mMHepespH7.5、50mMKCl、5mMMgCl2、0、24mMNADH、0、96mMATP、0、96mMPEP、9μg/mLの乳酸脱水素酵素Sigma、L2500、12.4μg/mLピルビン酸キナーゼSigma、P1506、および適切な量の精製されたアスパラギン酸リンゴ酸キナーゼを含有した。反応を、50mML-アスパラギン酸またはL-リンゴ酸を加えることによって、開始した。酵素アッセイを、250μLの最終体積において、96ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて、30°Cで行った。反応の後、マイクロプレートリーダーBioRad680XRにおける340nmでのNADHの特性吸収が続いた。ヒドロキサム酸アッセイ:野生型または変異アスパラギン酸キナーゼによる、基質のリン酸化、すなわちリン酸アシル無水物acylphosphateanhydrideの形成を検証するために、キナーゼ反応の生成物を、ヒドロキシルアミンでインキュベートし、対応するアスパラギン酸またはリンゴ酸ヒドロキサム酸malatehydroxamate誘導体を形成した。アッセイ混合物は、120mMHepespH8、200mMKCl、10mMATP、200mMヒドロキシルアミン、10mMアスパラギン酸またはリンゴ酸、および適切な量の精製されたタンパク質を含有した。反応を、等しい体積の1M塩酸中の1.7w/vFeCl3の追加によって、30分後に停止した。ヒドロキサム酸-鉄錯体の形成を、マイクロタイタープレートリーダーにおける、540nmでのその特性吸光度を測定することによって検証した。ATPを除いたすべての成分を含有するアッセイ混合物を、ブランクとして使用した。結果:精製されたLysCHis-tagを有さない、配列番号4およびHom3His-tagを有さない、配列番号7酵素は、ヒドロキサム酸アッセイKengViola、1996によって検証されるように、アスパラギン酸キナーゼ活性を示したが、リンゴ酸をリン酸化することができなかった。アスパラギン酸に対するLysCおよびHom3に関する最大活性は、それぞれ、4.5μmol/minmgprotおよび1.6μmol/minmgprotであった。アスパラギン酸に関するKm値は、種々の基質濃度cでの、最初の反応速度vを測定することによって、およびv対v/cプロットの勾配を抽出することによって、EadieおよびHofsteeの方法で推定した。精製されたHisタグをつけたLysCのKmは、約0.6mMと推定され、これは、Hisタグをつけたタンパク質が、0.6mMであると報告されたタグをつけていない精製された酵素と同じ基質親和性を有することを示しているMarco-Marinら、2003。例2:Escherichiacoli由来のアスパラギン酸キナーゼLysCの部位特異的な変異誘発およびリンゴ酸キナーゼ活性に関する変異酵素の試験。部位特異的な変異誘発を、表1において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびpLYSCwt配列番号3プラスミドを鋳型として使用して行った。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、表1において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、PCRPhusion1U、HF緩衝液20v/v、dNTP2.5mM、ダイレクトおよび逆方向プライマー各1μΜ、鋳型プラスミド200ng、水によって導入した。PCRによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、サイレント変異を使用して導入されたNco1に関する新しい制限部位を含有した。PCR生成物をDpnIによって37°Cで1時間消化して鋳型DNAを取り出し、NEB5-アルファコンピテントE.coli細胞NEBに形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。位置119における変異を表す配列は、配列番号9によって表すことができ、ここで、位置119における残基はXであり、Xは、グルタミンを除く19種の天然のアミノ酸のいずれかである。変異酵素を発現させ精製し、例1において記載したようにアスパラギン酸およびリンゴ酸キナーゼ活性に関して試験した。結果を、表2にまとめる。表2において一覧表にした変異体のいずれも、アスパラギン酸に対する活性を有さなかった。結果は、保存グルタメートを、システイン、グリシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニンまたはバリンによって位置119で置き換えることによって、アスパラギン酸キナーゼをリンゴ酸キナーゼに形質転換することができることを示している。表2において一覧表にした酵素の対応する核酸配列は、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25および配列番号27である。例3:リシンによる阻害への強く低下した感受性を有するリンゴ酸キナーゼの構築部位特異的な変異誘発を、表3において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびpLYSC_E119Gプラスミドを鋳型として使用して、行った。pLYSC_E119Gプラスミドは、例2において記載したように、lysC遺伝子:配列番号15のDNA配列における以下の変化を導入することによって得た。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、表1において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、PCRPhusion1U、HF緩衝液20v/v、dNTP2.5mM、ダイレクトおよび逆方向プライマー各1μΜ、鋳型プラスミド200ng、水によって導入した。可能な場合、PCRによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、サイレント変異を使用して導入された新しい制限部位を含有した。PCR生成物をDpnIによって37°Cで1時間、消化して鋳型DNAを取り出し、NEB5-アルファコンピテントE.coli細胞NEBに形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。i位置250におけるグルタミン酸のリシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysCE119Gの核酸配列は、配列番号38によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号39によって表され;ii位置344におけるトレオニンのメチオニンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysCE119Gの核酸配列は、配列番号40によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号41によって表され;iii位置352におけるトレオニンのイソロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysCE119Gの核酸配列は、配列番号42によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号43によって表され;iv位置345におけるセリンのロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質LysCE119Gの核酸配列は、配列番号44によって表され;その対応するアミノ酸配列は、配列番号45によって表される。酵素の発現および精製:Hisタグをつけた酵素LysCE119G、LysCE119GE250K、LysCE119GT344M、LysCE119GS345L、LysCE119GT352Iに関するタンパク質発現を、例1において記載したように行った。酵素アッセイ:リンゴ酸キナーゼ活性を、例1において記載したように、アッセイした。反応緩衝液におけるリシン濃度は、異なっていた。結果:LysCE119G中への変異E250K、T344MまたはS345Lの導入は、リンゴ酸キナーゼ活性を、上昇したリシン濃度に対して大いに非感受性にした図4を参照。例4:アスパラギン酸およびリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性に関するEscherichiacoli由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素Asdの試験アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築:プラスミドpASDwtを、高忠実度ポリメラーゼPhusion商標Finnzymes、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にNheIおよびBamHI制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー5’TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3’配列番号46および5’TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3’配列番号47を使用して、PCRによって、E.coliのasd遺伝子を増幅することによって構築した。E.coliDH5α由来のゲノムDNAを、鋳型として使用した。PCR生成物をNheIおよびBamHIで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pET28aNovagen発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。生じたpASDwtプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列配列番号48を有する全長asd遺伝子を含有することが示された。前記酵素の対応するアミノ酸配列は、配列番号49によって表される。酵素の発現および精製:Hisタグをつけた酵素Asdに関するタンパク質発現を、例1において記載したように行った。酵素アッセイ:アスパラギン酸またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を、それぞれ、アスパラギン酸またはリンゴ酸セミアルデヒドの4-ホスホ-L-アスパラギン酸または4-ホスホ-L-リンゴ酸への酸化中のNADPの還元を追跡することによって、逆方向生合成方向において、アッセイしたRobertsら、2003。L-アスパラギン酸セミアルデヒドまたはL-リンゴ酸セミアルデヒドNADPPi→4-ホスホ-L-アスパラギン酸または4-ホスホ-L-リンゴ酸NADPHアッセイ混合物は、200mMHepespH9、50mMK2HPO4、0、25mMNADPを含有した。反応を、L-アスパラギン酸セミアルデヒドまたはL-リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始した。L-アスパラギン酸セミアルデヒドを、ホモセリン脱水素酵素およびアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の酵素試験に適した基質である、分解を防ぐためにpH3で維持したL-アスパラギン酸β-セミアルデヒド水和物トリフルオロ酢酸L-asparticacidβ-semialdehydehydratetrifluoroacetateの形で加えたRobertsら、2003。不安定なリンゴ酸セミアルデヒドを、安定なリンゴ酸セミアルデヒド誘導体2-[4S-2,2-ジメチル-5-オキソ-1,3-ジオキソラン-4-イル]アセトアルデヒドDMODAの脱保護によって、酵素試験に先立って、新たに作製した。DMODAを2M塩酸において25°Cで15分間インキュベートし、遊離したアセトンの蒸発35°C、50mbarによって、リンゴ酸セミアルデヒドを得た。リンゴ酸セミアルデヒド溶液のpHは、重炭酸ナトリウムを使用して、3で固定した。酵素アッセイを、96ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて、250μLの最終体積において30°Cで行った。反応の後、マイクロプレートリーダーBioRad680XRにおける340nmでのNADPHの特性吸収が続いた。結果:Hisタグをつけた野生型アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、Asdは、160μmol/minmgprotの最大比活性で、L-アスパラギン酸セミアルデヒドを4-ホスホ-L-アスパラギン酸に酸化した。L-リンゴ酸セミアルデヒドに対して、酵素は、0.01μmol/minmgprotの活性を有した。例5:Escherichiacoli由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素Asdの部位特異的な変異誘発およびリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性に関する変異酵素の試験。Asdのアミノ酸配列における点変異を、pASDwtプラスミドを鋳型として使用し、例2において概略を述べたプロトコールに従って導入した。表4において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、位置241においてグルタメート残基または位置136においてトレオニン残基を変異させた。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって望ましい変異を有することを検証した。位置241において変異したAsdタンパク質は、配列番号68によって表すことができ、ここで、位置241における残基はXであり、Xは、グルタミンを除く他の19種の生物学的に発生するアミノ酸のいずれかである。結果:位置E241において変異したAsdの活性およびKm値を、表5にまとめる。グルタメート241が、アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニンまたはグルタミンによって置き換えられた、Asd変異体は、野生型酵素より著しく高い最大比活性で、L-アスパラギン酸-4-セミアルデヒドを4-ホスホ-L-アスパラギン酸に酸化した。二重変異体AsdE241QT136N配列番号231は、0.25μmol/minmgprotの最大比活性および0.25mMのKmを有した。対応する核酸は、配列番号55、配列番号57、配列番号48、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65および配列番号67によって表される。二重変異体AsdE241QT136Nは、配列番号230によって表される核酸配列を有する。例6:2,4DHB脱水素酵素の同定適した2,4DHB脱水素酵素を同定するために、種々の生物学的源由来のベータ-ヒドロキシ酸脱水素酵素を、リンゴ酸セミアルデヒドを還元するそれらの能力に関して試験した。試験した酵素の中に、Saccharomycescerevisiae由来のメチルブチルアルデヒド還元酵素、Ypr1FordEllis、2002配列番号73および配列番号74;およびMetallosphaerasedula由来のコハク酸セミアルデヒド還元酵素、Ms-SsrKockelkornFuchs、2009配列番号75および配列番号76があった。遺伝子YPR1およびMs-SSRを、表6において一覧表にしたプライマーを使用して増幅し、ベクターpET28制限酵素表3を参照中にクローニングし、それぞれ、プラスミドpYPR1およびpMs-SSRをもたらした。例1において記載したように、タンパク質を発現させ精製した。リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素活性に関する試験:反応:L-リンゴ酸セミアルデヒドNADPH→L-2,4-ジヒドロキシ酪酸NADPアッセイ混合物は、200mMHepespH7.5、50mMKCl、5mMMgCl20、24mMNADHまたはNADPH、および適切な量の精製された酵素を含有した。反応を、10mML-リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始したリンゴ酸セミアルデヒドは各試験のために新たに調製した、例4を参照。酵素アッセイを、250μLの最終体積において、96ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて30°Cで行った。反応の後、マイクロプレートリーダーBioRad680XRにおける340nmでのNADPHの特性吸収が続いた。結果を、表7において一覧表にする。M.sedula由来のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびS.cerevisiae由来のメチルブチルアルデヒド還元酵素は、リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素活性を有した。リンゴ酸セミアルデヒドに関するMs-SSRのKmは、1.1mMであった。例7:M.sedula由来のコハク酸セミアルデヒド還元酵素の部位特異的な変異誘発部位特異的な変異誘発を、表8において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびpMs-SSRプラスミドを鋳型として使用して行った。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、PCRPhusion1U、HF緩衝液20v/v、dNTP2.5mM、ダイレクトおよび逆方向プライマー各1μΜ、鋳型プラスミド200ng、水によって導入した。可能な場合、PCRによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、サイレント変異を使用して導入された新しい制限部位を含有した。PCR生成物をDpnIによって37°Cで1時間消化して鋳型DNAを取り出し、NEB5-アルファコンピテントE.coli細胞NEBに形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、DNA配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。表9は、変異体の動態パラメーターを要約したものである。結果は、二重変異体Ms-SSRH39RN43H配列番号81、配列番号82が、野生型酵素と比較した場合、リンゴ酸セミアルデヒドへの親和性を改善したことを実証している。対応する核の配列は、配列番号224、配列番号226および配列番号82によって表される。例8:DHBのインビトロでの生成酵素リンゴ酸キナーゼLysCE119G、配列番号15、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素AsdE241Q;配列番号67、およびリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素MsSSrR、配列番号76を、例1において記載したように発現させ精製した。50mMリンゴ酸を、50mMHepespH7.5、50mMKCl、5mMMgCl2、1mMNADPH、180μg/mLのリンゴ酸キナーゼLysE119G、325μg/mLのリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素AsdE241Q、および130μg/mLのリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素Ms_Ssr反応Aを含有する反応混合物に加えることによって、DHBの生成をインビトロで実証した。対照反応は、すべての成分を含有したが、リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素反応Bまたはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素反応Cのいずれかを欠いていた。30°Cでのインキュベーションの30分後、反応混合物を、ガスクロマトグラフィー[CPGVarianSeries430;FID検出器を備えた;オートサンプラーCP8400;スプリットレスインジェクターsplitlessinjector1177230°C;カラム:CP-WAX58/FFAP、30m×0.53mm、df0.50μm;およびライナー:InletSleeve、グースネック6.5×78.5×4mmGWOLVarianによって分析した。キャリアーガスは、25mL/minの流速で、窒素であった。水素炎イオン化を、空気-水素混合物流速は、それぞれ、300mL/minおよび30mL/minであったを使用して、行った。検出器温度は、240°Cであった。注入された試料体積は、1μLであった。温度プログラムを、表10において規定する。DHB生成が、反応Aすべての酵素の存在中に検出されたが、対照反応BおよびC中にはなかった図5。例9:M.sedulaコハク酸セミアルデヒド還元酵素のコード配列のE.coliにおけるその発現に関する最適化。変異H39RおよびN43Hを含むM.sedulaコハク酸セミアルデヒド還元酵素のコード配列を、GeneOptimizer登録商標ソフトウェアを使用して、E.coliにおける最大発現に関して最適化した。合成遺伝子を、GeneArt登録商標GeneSynthesisInvitrogenLifeTechnologieによって作製した。NheIおよびEcoRI制限部位を、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入し、pET28aNovagen中への直接的なクローニングを可能にした。生じたpSSR-H39RN43H-optプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列配列番号228を有する全長MsedulaSSRH39RN43H遺伝子を含有することが示された。例10:宿主生物としてE.coliを使用した、リンゴ酸キナーゼE.coli由来のlysC遺伝子の変異体、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素、E.coli由来のasd遺伝子の変異体、およびDHB脱水素酵素M.sedulaコハク酸セミアルデヒド還元酵素遺伝子の変異体の同時発現を促進するプラスミドの構築。プラスミドpLYSC-E119GE250K配列番号38を、オペロン構築のための主鎖として使用した。pET28Novagenリボソーム結合部位rbsおよびASD-E241Qのコード領域を含有するDNA断片を、鋳型としてpASD-E241Q配列番号55、ならびに、それぞれ、rbsの上流および終止コドンの下流にBamHIおよびEcoRI制限部位を導入したダイレクトおよび逆方向プライマー5’TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3’配列番号83および5’TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3’配列番号84を使用して、PCR高忠実度ポリメラーゼPhusion商標Finnzymesによって得た。PCR生成物をBamHIおよびEcoRIで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pLYSC-E119GE250Kの対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。生じたpLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Qプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列を有することが示された。pET28リボソーム結合部位rbsおよびコドン最適化Ms-SSR-H39RN43H-optのコード領域を含有するDNA断片を、鋳型としてpSSR-H39RN43H-opt、ならびに、それぞれ、rbsの上流および終止コドンの下流にNotIおよびPspXI制限部位を導入したダイレクトおよび逆方向プライマー5’TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3’配列番号85および5’TATAAACTCGAGCTTACGGAATAATCAGG3’配列番号86を使用して、PCRによって得た。PCR生成物をNotIおよびPspXlで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Qの対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。生じたpET28-DHBプラスミド配列番号229を単離し、DNA配列決定によって、正確な配列を有することが示された。3つの遺伝子の発現を同時に制御する5’上流プロモーター領域pET28-DHBにおけるieT7プロモーターは、pET28-DHBをSphIおよびXbaIで消化し、適した制限部位を有する別のプロモーター領域をクローニングすることによって、誘導性または構成的な任意の他のプロモーターで置き換えることができる。誘導性プロモーターの使用に関する例として、pET28-DHB主鎖のT7プロモーターを、その特性がグルコースの存在下でのタンパク質発現を可能にするtacプロモーターdeBoerら、1983によって置き換えた。プラスミドpEXT20Dykxhoomら、1996から、プラスミドをSphIおよびXbaIで消化することによって、tacプロモーターを得た。プロモーターを含有するDNA断片を精製し、SphI/XbaI消化したpET28-DHBプラスミド中にクローニングした。生じたpTAC-DHBプラスミドを単離し、DNA配列決定によって、正確な配列を有することが示された。例11:発酵によるDHB生成のための炭素フラックス再分割およびNADPH補助因子供給を最適化するためのE.coli株の構築いくつかの遺伝子を、DHB生成のための炭素フラックス再分割および補助因子供給を最適化するために、E.coli株MG1655において破壊した。遺伝子欠失を、Datsenkoらによるラムダredリコンビナーゼ法lambdaredrecombinasemethodDatsenkoWanner、2000を使用して行った。欠失カセットdeletioncassetteを、高忠実度ポリメラーゼPhusion商標Finnzymes、およびプラスミドpKD4のFRTが隣接したカナマイシン耐性遺伝子kanDatsenkoWanner、2000を鋳型として使用して、PCRによって調製した。センスプライマーは、pKD4のFRT-kan-FRTカセットに対応する20bpが後に続く、各標的遺伝子下線が引かれたの5’末端に対応する配列を含有した。アンチセンスプライマーは、カセットに対応する20bpが後に続く、各標的遺伝子下線が引かれたの3’末端領域に対応する配列を含有した。プライマーを表12に記載する。PCR生成物をDpnIで消化し、形質転換に先立って精製した。LB液体培地において37°Cで0.6のOD600まで細胞を増殖し、細胞を100倍に濃縮し、氷冷の10グリセロールで2回洗浄することによって、E.coliMG1655株をエレクトロコンピテントにした。細胞を、エレクトロポレーション2mmギャップキュベットにおいて2.5kV、200Ω、25μFによって、プラスミドpKD46DatsenkoWanner、2000で形質転換した。形質転換体をアンピシリン100μg/mLLB固形培地上で30°Cで選択した。破壊カセットを、ラムダRedリコンビナーゼ発現プラスミドpKD46を有するエレクトロコンピテントE.coli株に形質転換した。細胞を、アンピシリン100μg/mLを含有する液体SOB培地において、30°Cで増殖した。ラムダredリコンビナーゼ系を、培養物のOD600が0.1に達した際、10mMアラビノースを加えることによって誘導した。細胞を、0.6のOD600までさらに増殖し、それらを遠心分離によって採取し、氷冷の10グリセロールで2回洗浄し、エレクトロポレーションによって、破壊カセットで形質転換した。LB液体培地における30°Cでの一晩の形質発現後、細胞を、25μg/mLカナマイシンを含有する固形LB培地上に播種した。形質転換体を、30°Cでの培養後、選択した。遺伝子置換を、CrimsonTaqポリメラーゼNEBを使用して、コロニーPCRによって検証した。第1の反応を、隣接している遺伝子座特異的プライマーlocus-specificprimer表13を参照で行って、親断片parentalfragmentおよび新しい変異体特異的断片の獲得の同時喪失を検証した。2つの追加の反応を、FRT-カナマイシン耐性カセット内に、それぞれの共通の試験プライマーk1revまたはk2for表13を参照を有する、近くの遺伝子座特異的プライマーセンス遺伝子座プライマー/k1revおよびk2for/逆方向遺伝子座プライマーを使用することによって行った。その後、耐性遺伝子FRT-kan-FRTを、FLPリコンビナーゼを有するプラスミドpCP20CherepanovWackernagel、1995を使用して、1つのFRT部位を含有する痕跡領域scarregionを残して、染色体から切り出した。pCP20は、温度感受性の複製およびFLPリコンビナーゼ合成の熱誘導を示すアンピシリンおよびCmRプラスミドである。カナマイシン耐性変異体をpCP20で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を30°Cで選択した。次いで、形質転換体を固形LB培地上で37°Cで増殖し、すべての抗生物質耐性の喪失に関して試験した。FRT-カナマイシンカセットの切り出しを、crimsontaqポリメラーゼおよび隣接している遺伝子座特異的プライマー表13を使用して、コロニーPCRによって分析した。多重欠失を、上述したステップを繰り返すことによって得た。単一または多重欠失を有する株を、上述したようにエレクトロコンピテントにし、DHB経路酵素例10を参照のIPTG誘導発現を可能にするpTAC-DHBプラスミドで形質転換し、50μg/mLカナマイシンを含有する固形LB培地上で選択した。E.coliのPEPカルボキシキナーゼをコードするpck遺伝子を有するプラスミドpACT3-pckを、鋳型としてE.coliMG1655由来のゲノムDNA、ならびに、それぞれ、5’TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3’配列番号100および5’TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3’配列番号101順方向および逆方向プライマーを使用して、pckコード配列を増幅することによって構築した。DNA断片を、XmaIおよびXbaIで消化し、T4DNAリガーゼBiolabsを使用して、pACT3発現ベクターDykxhoornら、1996の対応する部位中にライゲートし、E.coliDH5α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール25μg/mLを含有する固形LB培地上で選択した。生じたプラスミドを単離し、pck遺伝子の正確な挿入を、配列決定によって検証した。それぞれ、aceA、ppc、galPもしくはpykAすべてE.coliまたはLactococcuslactis由来のpycAを有するプラスミドpACT3-aceA、pACT3-ppc、pACT3-galP、pACT3-pykAおよびpACT3-pycを、表14において一覧表にしたプライマーを使用して、相同的に構築した。上述したpACT3由来プラスミドおよびpTAC-DHBプラスミドを、表12において一覧表にした欠失の組合せを有するE.coliMG1655変異体に形質転換した。両方のプラスミドを含有する形質転換体を、クロラムフェニコール25μg/mLおよびカナマイシン50μg/mLを含有する固形LB培地上で選択した。構築された株に関する例を、表15において一覧表にする。例12:グルコースの発酵による2,4-ジヒドロキシ酪酸の生成株および培養条件:プラスミドpTAC-DHB例11を参照由来の、リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素を同時発現する株E.coliECE1、および空のプラスミドすなわち上記酵素のコード配列を有さないpTAC主鎖のみを含有する同質遺伝子型対照株で、実験を行った。1リットル培養培地は、20gグルコース、18gNa2HPO412H2O、3gKH2PO4、0.5gNaCl、2gNH4Cl、0.5gMgSO47H2O、0.015CaCl22H2O、100倍希釈した濃縮したHClにおいて調製した1mLの0.06mol/LFeCl3保存液、2mLの10mMチアミンHCl保存液、20gMOPS、50μg硫酸カナマイシン、および1mLの微量元素溶液1リットル当たり:0.04gNa2EDTA2H2O、0.18gCoCl26H2O、ZnSO47H2O、0.04gNa2MoO42H2O、0.01gH3BO3、0.12gMnSO4H2O、0.12gCuCl2H2Oを含有するを含有した。pHを7に調整し、培地をフィルター滅菌した。すべての培養を、170rpmで運転しているInfors回転振とう機上で、37°Cで行った。一晩培養物試験管における3mL培地を、グリセロールストックから播種し、500mL振とうフラスコにおいて培養した100mL増殖培養物における0.05の最初のOD600を調整するために使用した。増殖培養物におけるOD600が0.2に達した際、IPTGを1mmol/Lの濃度で加えた。LC-MS/MS分析によるDHB濃度の推定:培養培地を、遠心分離Beckmann-CoulterAllegra21R、RotorBeckmannS4180、10分、4800rpmによって、細胞から分離した。清澄な上清を、別の分析まで-20°Cで保管した。DHB含有量を、ACQUITYUPLCBEHカラムC18、1.7μm、100×2.1mm、Watersを備えたHPLCWatersを使用して定量化し、質量感受性検出器masssensitivedetectorTQ、Waters、ESIモード、毛細管電圧capillaryvoltage:2.5kV、コーン電圧25V、Extractor電圧:3V、供給源温度:150°C、脱溶媒和温度:450°C、コーンガスフロー:50L/h、脱溶媒和ガスフロー:750L/hにカップリングした。カラム温度は、30°Cで保った。移動層は、88の0.08テトラ-n-ブチルアンモニウムヒドロキシド溶液、および12アセトニトリルの混合物であった。流速を0.4mL/minで固定した。試料の注入体積は、5μLであった。結果:株E.coliECE1および対照株の培養培地のDHB含有量を、IPTGの追加によって、リンゴ酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびDHB脱水素酵素の発現を誘導した後、8時間および24時間で推定した。表16において参照することができるように、DHB経路酵素を発現した株ECE1は、対照株よりも著しく高い量のDHBを生成し、これは、図1iにおいて示した代謝経路を通してのDHBの発酵による生成の可能性を実証している。参考文献"