"糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、該糖修飾ヌクレオシドが、4’位と2’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドが、ヒトPCSK9遺伝子と結合し得る、オリゴヌクレオチド。前記ヒトPCSK9遺伝子が、以下の塩基配列:配列番号3で示される塩基配列;配列番号4で示される塩基配列;配列番号5で示される塩基配列;配列番号6で示される塩基配列;配列番号7で示される塩基配列;配列番号8で示される塩基配列;配列番号9で示される塩基配列;配列番号10で示される塩基配列;配列番号11で示される塩基配列;配列番号12で示される塩基配列;配列番号13で示される塩基配列;配列番号14で示される塩基配列;配列番号15で示される塩基配列;配列番号16で示される塩基配列;配列番号17で示される塩基配列;配列番号18で示される塩基配列;またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるDNAまたはRNAである、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。前記架橋構造が、-CH2-O-、-CH22-O-、-CH2-NR1-O-、または-CH22-NR1-O-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表す、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。前記架橋構造が、-CO-NR1-、-CH2-CO-NR1-、-CH22-CO-NR1-、-CO-NR1-X-、または-CH2-CO-NR1-X-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そしてXは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、10~25塩基である、請求項1から4のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。前記オリゴヌクレオチドの5’-末端または3’-末端に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも1つが結合している、請求項1から5のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。請求項1から6のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤。生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤である、請求項7に記載の治療剤。前記生体吸収性材料が、アテロコラーゲンまたはペプチドゲルである、請求項8に記載の治療剤。本発明は、PCSK9遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、PCSK9遺伝子の特定の標的配列と結合し得るオリゴヌクレオチドに架橋型人工核酸を含有させることによって、PCSK9遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供できることを見出し、本発明を完成させた。さらに、生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤とすることにより薬剤を低用量化できることを見出し、本発明を完成させた。本発明は、糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを提供し、該糖修飾ヌクレオシドは、4’位と2’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドは、ヒトPCSK9遺伝子と結合し得る。1つの実施態様では、上記ヒトPCSK9遺伝子は、以下の塩基配列:配列番号3で示される塩基配列;配列番号4で示される塩基配列;配列番号5で示される塩基配列;配列番号6で示される塩基配列;配列番号7で示される塩基配列;配列番号8で示される塩基配列;配列番号9で示される塩基配列;配列番号10で示される塩基配列;配列番号11で示される塩基配列;配列番号12で示される塩基配列;配列番号13で示される塩基配列;配列番号14で示される塩基配列;配列番号15で示される塩基配列;配列番号16で示される塩基配列;配列番号17で示される塩基配列;配列番号18で示される塩基配列;またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるDNAまたはRNAである。1つの実施態様では、上記架橋構造は、-CH2-O-、-CH22-O-、-CH2-NR1-O-、または-CH22-NR1-O-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表す。1つの実施態様では、上記架橋構造は、-CO-NR1-、-CH2-CO-NR1-、-CH22-CO-NR1-、-CO-NR1-X-、または-CH2-CO-NR1-X-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そしてXは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。1つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、10~25塩基である。1つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの5’-末端または3’-末端に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも1つが結合している。本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤を提供する。1つの実施態様では、上記治療剤は、生体吸収性材料を担体として含有する徐放製剤である。1つの実施態様では、上記生体吸収性材料は、アテロコラーゲンまたはペプチドゲルである。本研究によれば、PCSK9遺伝子との結合親和性、安定性および安全性に優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを提供することができる。まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。本明細書において、用語炭素数1から6の直鎖アルキル基は、炭素数1~6の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、またはn-ヘキシル基をいう。本明細書において、用語炭素数1から6の直鎖アルコキシ基は、炭素数1~6の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、n-プロピルオキシ基などが挙げられる。本明細書において、用語炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基は、炭素数1~6の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、n-プロピルチオ基などが挙げられる。本明細書において、用語炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基は、炭素数1~6の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を1つまたは2つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。本明細書において、用語分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基は、炭素数1~7の任意の直鎖アルキル基、炭素数3~7の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数3~7の任意の環状アルキル基を包含する。単に、低級アルキル基という場合もある。例えば、炭素数1~7の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、およびn-ヘプチル基が挙げられ、炭素数3~7の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、tert-ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数3~7の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。本明細書において、用語分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基は、炭素数2~7の任意の直鎖アルケニル基、炭素数3~7の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数3~7の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、低級アルケニル基という場合もある。例えば、炭素数2~7の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、1-ペンテニル基、2-ペンテニル基、3-ペンテニル基、4-ペンテニル基、1-ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数3~7の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、1-メチル-1-プロペニル基、1-メチル-2-プロペニル基、2-メチル-1-プロペニル基、2-メチル-2-プロペニル基、1-メチル-2-ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数3~7の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。本明細書において、用語ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基は、炭化水素のみで構成された炭素数6~12の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を含む炭素数3~12の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数6~12の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数3~12の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。本明細書において、用語ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、3-フェニルプロピル基、2-フェニルプロピル基、4-フェニルブチル基、2-フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、2-ピリジルエチル基、1-ピリジルエチル基、3-チエニルプロピル基などが挙げられる。本明細書において、用語ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。本明細書において、用語ヌクレオシドとは、核酸塩基および糖を含むグリコシルアミンをいう。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに、擬似塩基および/または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において、用語ヌクレオチドとは、核酸塩基と、糖にリン酸基が共有結合された糖とを含むグリコソミンglycosomineをいう。ヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。本明細書において、用語デオキシリボヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分の2’位に水素を有するヌクレオチドをいう。デオキシリボヌクレオチドは任意の種々の置換基で修飾され得る。本明細書において、用語デオキシリボ核酸DNAは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。本明細書において、用語リボヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖部分の2’位にヒドロキシを有するヌクレオチドをいう。リボヌクレオチドは、任意の種々の置換基で修飾され得る。本明細書において、用語リボ核酸RNAは、リボヌクレオチドを含む核酸をいう。本明細書において、用語修飾ヌクレオシドとは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合したヌクレオシドのうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。好適には、糖部分が修飾された糖修飾ヌクレオシドが挙げられる。本明細書において、用語オリゴヌクレオチドとは、同一または異なるヌクレオシドがリン酸ジエステル結合で2~50個結合したオリゴヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドの非天然型誘導体も含む。そのような誘導体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体;リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体;リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体;末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体;プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。以下、本発明について詳述する。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも1つ含む。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。2つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、互いに、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するDNAまたはRNAが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素ヌクレアーゼに対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトPCSK9遺伝子と結合し得る。ここで、結合し得るとは、異なる複数の1本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により2本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、2本鎖の核酸を形成し得ることをいう。2本鎖以上の鎖の核酸の融解温度Tmは特に限定されない。例えば、2本鎖核酸を形成する異なる2つの1本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸は、2本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はない。ヒトPCSK9遺伝子は、配列番号1で示される塩基配列GenBankアクセッション番号:NM174936;コーディング領域、2079塩基を含み、配列番号2で示されるアミノ酸配列をコードする。PCSK9遺伝子はLDL受容体の分解に関与する。本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るヒトPCSK9遺伝子の領域としては、好適には以下の塩基配列:配列番号3で示される塩基配列;配列番号4で示される塩基配列;配列番号5で示される塩基配列;配列番号6で示される塩基配列;配列番号7で示される塩基配列;配列番号8で示される塩基配列;配列番号9で示される塩基配列;配列番号10で示される塩基配列;配列番号11で示される塩基配列;配列番号12で示される塩基配列;配列番号13で示される塩基配列;配列番号14で示される塩基配列;配列番号15で示される塩基配列;配列番号16で示される塩基配列;配列番号17で示される塩基配列;配列番号18で示される塩基配列;またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。さらに好適には、これらの塩基配列からなるDNAまたはRNAである。本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドは、4’位と2’位との間に架橋構造を有する。上記架橋構造の1つは、-CH2-O-、または-CH22-O-で表される。このような架橋構造を、以下、BNAという場合がある。BNAとしては、例えば、α-L-メチレンオキシ4’-CH2-O-2’、β-D-メチレンオキシ4’-CH2-O-2’、エチレンオキシ4’-CH22-O-2’が挙げられるが、これらに限定されない。BNAヌクレオシドモノマーまたはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献3~7に記載の方法により合成することができる。上記架橋構造の他の1つは、-CH2-NR1-O-、または-CH22-NR1-O-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、NCという場合がある。NCとしては、例えば、オキシアミノ4’-CH2-NH-O-2’、N-メチルオキシアミノ4’-CH2-NCH3-O-2’が挙げられるが、これらに限定されない。NCヌクレオシドモノマーまたはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、非特許文献8~11に記載の方法により合成することができる。上記架橋構造の他の1つは、-CO-NR1-、-CH2-CO-NR1-、-CH22-CO-NR1-、-CO-NR1-X-、または-CH2-CO-NR1-X-で表され、ここで、R1は、水素原子;分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基;分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基;水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基;または該α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基を表し;そしてXは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、CONという場合がある。CONとしては、例えば、無置換アミド4’-CO-NH-2’、N-メチルアミド4’-CO-NCH3-2’、アセトアミド4’-CH2-CO-NH-2’、N-メチルアセトアミド4’-CH2-CO-NCH3-2’、N-オキシアセトアミド4’-CH2-CO-NH-O-2’、N-メチル-N-オキシアセトアミド4’-CH2-CO-NCH3-O-2’が挙げられるが、これらに限定されない。CONヌクレオシドモノマーまたはこれを含むオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の実施例に記載の方法により合成することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、特に限定されないが、好適には10~25塩基である。より好適には13~20塩基である。本発明のオリゴヌクレオチドの5’-末端または3’-末端の構造は、特に限定されない。例えば、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される少なくとも1つが結合している。好適には5’-末端または3’-末端にコレステロールが結合している。コレステロールの結合により、オリゴヌクレオチドの生体内安定性の向上や標的臓器である肝臓への取り込み向上が期待できる。5’-末端または3’-末端にコレステロールを結合させる方法は、特に限定されない。例えば、コレステロールをアミダイト体として導入する方法、オリゴヌクレオチド合成の固相担体として導入する方法、オリゴヌクレオチドを合成した後にコンジュゲート化する方法が挙げられる。糖修飾ヌクレオシド、特に糖修飾がCONである糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、上述のように、4’位と2’位との間の架橋構造、特にアミド結合を含む架橋構造により固定されているため、各種ヌクレアーゼにより分解されにくく、生体への投与後、長時間生体内に存在することができる。例えば、mRNAと安定な2本鎖を形成して病因となるタンパク質の生合成を阻害しアンチセンス法、あるいはゲノム中の2本鎖DNAとの間で3本鎖を形成してmRNAへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を抑えることも可能となる。また、アミド結合を含む架橋構造は、生体適合性が高いことも期待され、さらにタンパク質などの生体成分を認識するためのアプタマーとしての機能も期待できる。これらのことから、本発明のオリゴヌクレオチドは、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品アンチセンス核酸としての有用性が期待される。特に、アンチセンス法では、標的のヒトPCSK9のmRNAに対する結合親和性および生体内ヌクレアーゼに対する耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、1本鎖状態では、糖部の構造が絶えずDNA2本鎖に近い形と、DNA-RNA2本鎖やRNA2本鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。1本鎖核酸が相補的なRNA鎖と2本鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部が予め2本鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のRNA鎖と2本鎖を形成しやすく、安定に存在することができる。また、核酸2本鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。本発明のアミド結合を含む架橋構造は、親水性が高いため、より安定化され得る。さらに、糖部架橋のアミド結合は、生体酵素に認識されにくいため、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性に大きく寄与し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス核酸として、ヒトPCSK9のmRNAと結合して、ヒトPCSK9の遺伝子発現を抑制し得る。ヒトヒトPCSK9の遺伝子発現の抑制により、LDL受容体タンパク質の発現量が上昇し、LDLの細胞内への取り込みや代謝が促進することによって血中LDL濃度が低下し得る。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドは、脂質異常症治療剤としての効果を奏する。本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤とすることができる。好適には、徐放剤とすることができる。徐放剤の担体としては、特に限定されないが、好適には、生体吸収性材料である。生体吸収性材料としては、特に限定されず、例えば、アテロコラーゲン、ペプチドゲル、ヒアルロン酸ゲル、フィブリン糊、アルギン酸ゲル、ポリα-ヒドロキシ酸が挙げられる。好適には、アテロコラーゲン、ペプチドゲルである。本発明のオリゴヌクレオチドと生体吸収性材料とを、例えば、混練することにより、叙放剤が得られる。以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明が以下の実施例に限定されるものでないことは言うまでもない。実施例1CONモノマーアミダイト体の合成ヌクレオシド類縁体:2’-アミノ-3’-O-[2-シアノエトキシジイソプロピルアミノホスフィノ]-5’-O-ジメトキシトリチル-2’-N,4’-C-オキソメチレンチミジン化合物16の合成1化合物2の合成窒素気流下、化合物114.7g,36.8mmolのジクロロメタン溶液80mLにトリエチルアミン15.1mL,110mmolを加え、氷冷下ジメチルアミノピリジン0.90g,7.36mmol、tert-ブチルジメチルシリルクロライド15.1mL,58.9mmolを加えて還流した。なお、化合物1は、AAKoshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p36073630およびSKSinghら、ChemCommun、1998年、p455456に従って調製し得る。20時間後、水を加え、塩化メチレンで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。得られた粗成積体をシリカゲルクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=9:1により精製し、化合物220.4g:収率85.9を油状物質として得た。得られた化合物2の物性データは、以下のとおりであった:αD25848;IR1457137211051025cm1;1HNMR:δ103129362373403408420445455449466458576721770;13CNMR:δ1992692722756537267307427888028821048113812821282128312831288128913011339134113541363136413851387;MS:mz661:計算値C39H46O6Si:C7332H726,実測値C7344H732。2化合物4の合成上記1で得た化合物21.00g,1.57mmolの0.1濃硫酸酢酸溶液1.11mLに、無水硫酸1.78mL,18.8mmolを加えて撹拌した。3.5時間後、飽和重曹水に反応液を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物3の粗成積体1.07gを油状物質として得、続くチミン導入に用いた。窒素気流下、化合物3の粗成積体のアセトニトリル溶液5mLにチミン297mg,2.36mmolを加え、40°Cの油浴中で溶解させた後、室温にてN,O-ビストリメチルシリルアセトアミド1.34mL,5.50mmol、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル0.28mL,1.57mmolを加えて1時間還流撹拌した。飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をシリカゲルクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=10:1→1:1により精製し、化合物4367mg:収率49を白色アモルファスとして得た。得られた化合物4の物性データは、以下のとおりであった:融点:55~59°C;αD24117;IR:1747169312321113cm1;1HNMR:δ104152196371376369394441454458454458538616718763787;13CNMR:δ12019220626963872273774674977785587911131276127712771278128112831286129712991326132913551357135713721375150416361702;MS:mz749計算値C43H48N2O8SiC6896H646N374実測値C6892H645N374。3化合物5の合成上記2で得た化合物4326mg,0.435mmolのテトラヒドロフラン溶液2.4mLに40メチルアミン溶液1.1mL,13mmolを加え、室温にて30分間撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=1:1により精製し、化合物5312mg:収率100を白色アモルファスとして得た。得られた化合物5の物性データは、以下のとおりであった:融点:61~63°C;αD25122;IR340331751688146812721113cm1;1HNMR:δ106160354363364373383431441450467473595721766812;13CNMR:δ12119126864272273874274577278588190911091277127812791280128112821286130013221322135613571365137215031634;MSmz707計算値C41H46N2O7SiC6966H656N396実測値C6959H659N393。4化合物6の合成窒素気流下、上記3で得た化合物5262mg,0.37mmolのジクロロメタン溶液7mLに、ジメチルアミノピリジン181mg,1.48mmolを加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホニルクロリド0.12mL,1.11mmolを加え、緩やかに室温条件とした後、1時間撹拌した。飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、化合物6248mg:収率97を白色アモルファスとして得た。得られた化合物6の物性データは、以下のとおりであった:融点:51~54°C;αD26335;IR16671650156314821112cm1;1HNMR:δ103199329334368382431432438460481550623708766;13CNMR:δ14018926764069473484087188789911901274127612771278128112831284128512981298130113191323135313551364137015921723;MSmz689計算値C41H44N2O6SiC7148H644N407実測値C7138H649N408。5化合物7の合成上記4で得た化合物6510mg,0.74mmolのテトラヒドロフラン溶液11mLに1N水酸化ナトリウム水溶液1.90mLを加え、室温にて11.5時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液で中和後、溶媒留去ジクロロメタンで抽出し、飽和重曹水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=1:1により精製し、化合物7524mg:収率100を白色アモルファスとして得た。得られた化合物7の物性データは、以下のとおりであった:融点:67~70°C;αD26245;IR3347318416901471cm1;1HNMR:δ102165348370350362376422451478454469615729764810;13CNMR:δ12018826563969772673675381985385510951275127612781280128212851295129613241354135513681372137915111643;MSmz707計算値C41H46N2O7SiC6966H656N396実測値C6942H654N397。6化合物9の合成窒素気流下、上記5で得た化合物72.86g,4.10mmolのジクロロメタン溶液40mLに、氷冷下、ピリジン1.65mL,20.5mmol、トリフルオロメタンスルホン酸無水物1.37mL,8.20mmolを加え、氷冷条件で1時間撹拌した。水を加えて酸無水物を分解させた後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体を黄色油状物質として得、フラッシュクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=3:1→2:1により簡易精製し、化合物8の粗成積体を淡黄色アモルファスとして得た。次いで、窒素気流下、化合物81.96g,2.34mmolのジメチルホルムアミド溶液80mLにアジ化ナトリウム0.23g,3.60mmolを加えて撹拌した。48時間後、溶媒留去し、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=3:1により精製し、化合物91.71g:収率100を白色アモルファスとして得た。得られた化合物9の物性データは、以下のとおりであった:融点:53~56°C;αD27327;IR31752109168612681111cm1;1HNMR:δ099158363369369391391423447453457475603723760870;13CNMR:δ1211912696406467247387467958528791113127712771278128012821284128712971299132513281351135513571368136915021634;MSmz732計算値C41H45N5O6SiC6728H620N957実測値C6725H627N945。7化合物10の合成窒素気流下、上記6で得た化合物91.10g,1.50mmolのテトラヒドロフラン溶液30mLに1Nテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液2.20mL,2.20mmolを加え、12.5時間撹拌した。溶媒留去後、水および酢酸エチルを順次加え、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル=10:1→酢酸エチルのみにより精製し、化合物10682.2mg:収率92を油状物質として得た。得られた化合物10の物性データは、以下のとおりであった:融点:41~45°C;αD25133;IR343521131694145912681097cm1;1HNMR:δ163209373404439451455456491618726744850;13CNMR:δ122634649718738748794864875111512771282128212861287128813521365137015031635;MSmz494高分解能MS計算値C25H28N5O64942040実測値4942045。8化合物11の合成窒素気流下、上記7で得た化合物100.20g,0.40mmolのジメチルホルムアミド懸濁溶液3.1mLに、粉末モレキュラーシーブス4Å0.31gおよび二クロム酸ピリジニウム1.50g,4.00mmolを順次加え、室温条件で撹拌した。4.5時間後、水を加えて数分間撹拌した後、酢酸2mLを加え、さらに1時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、セライトで濾過し、酢酸エチルで抽出した。有機層を0.4Mシュウ酸水溶液30mLおよび0.3Mシュウ酸アンモニウム水溶液30mLで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去し、化合物110.20g:収率100を淡黄色固体として得た。得られた化合物11の物性データは、以下のとおりであった:1HNMR:δ164383384412445459465475482589654728744799931;MSmz508高分解能MS計算値C25H25N5O75081832実測値5081825。9化合物13の合成上記8で得た化合物11389.7mg,0.77mmolを水:テトラヒドロフラン=1:3の混合溶液0.8mLに溶解し、トリブチルホスフィン0.96mL,3.85mmolを加えて室温下撹拌した。3.5時間後、溶媒留去したものをメタノールに溶解し、ヘキサンで洗浄した。溶媒留去後、化合物12の粗成積体380mgを油状物質として得、続く閉環反応に用いた。窒素気流下、化合物12のDMF溶液11mLに、氷冷下、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩221mg,1.16mmolを加え、21.5時間室温下撹拌した。溶媒留去後、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をカラムクロマトグラフィーヘキサン:酢酸エチル=5:1→酢酸エチルのみにより精製し、化合物13191.3mg:収率53.6を油状物質として得た。得られた化合物13の物性データは、以下のとおりであった:αD25621;IR318616921469145512721112cm1;1HNMR:δ161396411413422456460467545658721756757924;13CNMR12358463072474078386286611091278127812811283128512861351136213741420150516381743;MSmz464。10化合物14の合成窒素気流下、上記9で得た化合物13101mg,0.22mmolのテトラヒドロフラン溶液2.2mLに20水酸化パラジウムカーボン100mgを加え、3時間撹拌した。熱時濾過を行い、温メタノール150mLで洗浄後、溶媒留去し、粗成積体を得た。メタノールで再結晶を行い、化合物1457.2mg:収率93を白色固体として得た。得られた化合物14の物性データは、以下のとおりであった:αD25316;IR3255292528521692146612311065cm1;1HNMR:δ189388404412430538786。11化合物15の合成窒素気流下、上記10で得た化合物1427.3mg,0.10mmolの無水ピリジン溶液0.8mLに、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド48.8mg,0.14mmolを加え、3時間撹拌した。飽和重曹水を加えて数分間撹拌し、溶媒留去した後、飽和重曹水/酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、粗成積体をフラッシュカラムクロマトグラフィーn-ヘキサン:酢酸エチル=10:1→酢酸エチルのみにより精製し、化合物1547.6mg:収率85を白色泡状物質として得た。得られた化合物15の物性データは、以下のとおりであった:融点:79~81°C;IR334230632928169015091270125311771035cm1;1HNMR:δ166361392378426446542686745778;MSmz586。12化合物16の合成窒素気流下、上記11で得た化合物15100mg,0.17mmolの無水アセトニトリル-テトラヒドロフラン溶液3:12.0mLに、N,N-ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド22.2mg,0.13mmol、2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト54.0μL,0.17mmolを加えて撹拌した。1.5時間後、飽和重曹水を加えて数分間撹拌した後、水/酢酸エチルで抽出し、有機層を回収して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、フラッシュカラムクロマトグラフィージクロロメタン:メタノール:トリエチルアミン=50:1:1により精製した。得られた粗成積体をn-ヘキサン中に溶解し、ジクロロメタンの添加により再沈殿を行い、化合物1629.4mg,22を白色粉体として得た。得られた化合物16の物性データは、以下のとおりであった:融点:110~112°C;31PNMR:δ1497415012;MSmz786高分解能MS計算値C41H49N5O97863268実測値7863266。実施例2オリゴヌクレオチドの標的領域の選定ヒトのPCSK9遺伝子の塩基配列配列番号1:コーディング領域、2079塩基を、GenBankより入手したアクセッション番号:NM174936。以下の4つの観点でこの塩基配列をコンピュータソフトで解析し、オリゴヌクレオチドの標的として適している領域の塩基配列を選定した。1ソフトmFoldMZuker、NucleicAcidsRes、2003年、第31巻、p34063415を用いて、マウスのPCSK9遺伝子のmRNAの折れ畳み構造を計算した。オリゴヌクレオチドが結合しやすいように、mRNA上でステムループ構造を形成しにくい領域を選択した。2ソフトJustBioURL:httpwwwjustbiocomを用いて、ヒトとマウスのPCSK9遺伝子の塩基配列を比較した。マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、ヒトとマウスとの間で塩基配列が同じ領域を選択した。3オリゴヌクレオチドと2本鎖核酸を形成した際に熱安定性が高くなるように、GC含量が多い領域を選択した。4ソフトBlastSFAltschulら、JMolBiol、1990年、第215巻、p403410を用いて、標的領域の塩基配列と類似した塩基配列がゲノムの他の領域に存在するかどうかを探索した。他のmRNAにオリゴヌクレオチドが結合しないように、ゲノムの他の領域の塩基配列と類似性が低い塩基配列からなる領域を選択した。以上の4つの条件に最も適したオリゴヌクレオチドの標的領域を選択し配列番号3~18、これに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを設計した表1-1および表1-2。なお、表1-1において、PS骨格とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基というをいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にS-オリゴヌクレオチドという。表1-1に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてS-オリゴヌクレオチドである。実施例3オリゴヌクレオチドの合成および精製非特許文献3~7に記載の方法によりBNAモノマーアミダイト体を合成した。非特許文献8~11に記載の方法によりNCモノマーアミダイト体を合成した。これらおよび実施例1で合成したCONモノマーアミダイト体をDNA合成用モノマー体として用いて、DNA合成機により必要に応じて1mgから100mginvivoグレードのオリゴヌクレオチドを合成し、HPLC精製、凍結乾燥処理に供した。得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をHPLCおよびMALDI-TOF-MSにより確認した。表1-1および表1-2に記載のように、合成したオリゴヌクレオチドPCSK9オリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含まないS-オリゴヌクレオチドDNA-オリゴヌクレオチド:PCSK9-1-Sなど、BNA-ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドBNA-オリゴヌクレオチド:PCSK9-1-BNAなど、NC-ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドNC-オリゴヌクレオチド:PCSK9-1-NCなどおよびCON-ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドCON-オリゴヌクレオチド:PCSK9-4-ii-CON-Aなどである。実施例43’-末端にコレステロールが結合したオリゴヌクレオチドの合成および精製コレステロールをアミダイト体として導入する手法により、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-BNA-3Cの大量合成を行い、10mgのオリゴヌクレオチドを得た。実施例5オリゴヌクレオチドの血清中におけるヌクレアーゼに対する耐性の評価1nmolのオリゴヌクレオチドを10μLのFBS牛胎児血清と混合し、さらに滅菌水を加えて20μLに調製した。この溶液を37°Cにて所定時間インキュベートした後、13μLのホルムアミドを加えて、ホルムアミドの最終濃度が40となるようにして、FBS中のヌクレアーゼを失活させた。このサンプルは、HPLCによる解析まで-80°Cにて保存した。HPLCによる解析のために、400μLのAバッファー25mMTris-HCl,0.5CH3CN,pH7.0をこのサンプルに加えて、ホルムアミドの最終濃度を3にし、4mmMillex登録商標-HVSyringeDrivenFilterUnitポアサイズ:0.45μm;ミリポア社製で2回ろ過したものを、HPLCによる解析のためのサンプルとした。HPLCには、JASCOLC-2000Plusシリーズ日本分光株式会社製を用い、HPLCカラムには、TSK-GEL登録商標DNA-NPR東ソー株式会社製を用いた。Aバッファー25mMTris-HCl,0.5CH3CN,pH7.0とBバッファー25mMTris-HCl,0.5CH3CN,1MNH4Cl,pH7.0を用い、最初の10分間は、A100,B0とし、次の45分間は、A100,B0からA50,B50になるように変化させ、次の10分間は、A0,B100とした。以上の一連のHPLCによる検出のための波長は260nmとした。オリゴヌクレオチドに相当するHPLCのピークの面積を、FBSと混合する前と、FBSと混合した後120分間後において測定し、これらの比より、FBSと混合した後120分間後のオリゴヌクレオチドの存在率[120分]を求めた。結果を表2および3に示す。表2および3から明らかなように、BNA-オリゴヌクレオチドの方がDNA-オリゴヌクレオチドよりも、FBSと混合した後120分間後の存在率[120分]が顕著に高かった。また、NC-オリゴヌクレオチドの方がBNA-オリゴヌクレオチドよりも、FBSと混合した後120分間後の存在率[120分]が高かった。これより、NC-オリゴヌクレオチドが、血清中のヌクレアーゼに対する耐性が最も高いことがわかった。さらに、同じ長さのBNA-オリゴヌクレオチドでは、BNA-ヌクレオシドの数が多いほどヌクレアーゼに対する耐性が高いことがわかった。BNA-ヌクレオシドの数が同じBNA-オリゴヌクレオチドでは、長さと耐性に相関がなかった。これより、BNA-ヌクレオシドの数の方がBNA-オリゴヌクレオチドの長さよりもヌクレアーゼ耐性に関係していることがわかった。実施例6オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸の構造安定性の評価緩衝液8.1mMNa2HPO4,2.68mMKCl,1.47mMKH2PO4,pH7.2中で、オリゴヌクレオチドと標的RNAとを等モル混合し、95°Cにて5分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、2本鎖核酸を形成した。紫外可視分光光度計DU800ベックマン社製のペルチェ式UVmelting装置を用いて、この2本鎖核酸の熱安定性を解析した。2本鎖核酸の温度を20°Cから95°Cまで0.5°C/分の速度で加温していき、260nmにおける吸光度Aの温度Tによる変化を測定した。2本鎖核酸の濃度は1μMとし、セルの光路長は1cmとした。この測定結果よりdA/dTvsTのグラフを描き、dA/dTの値が最も大きくなる温度、つまりAのTによる変化が最も大きくなる温度を、2本鎖核酸のTmとし、2本鎖核酸の熱安定性の指標とした。結果を表4および5に示す。表4および5から明らかなように、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸の方が、DNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸よりも多くの場合で、Tmが30°C以上高かった。これより、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸の方が、DNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸よりも、構造安定性が高いことがわかった。また、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸と、NC-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸とでは、Tmがほとんど変わらなかった。これより、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸と、NC-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸とでは、構造安定性がほとんど変わらないことがわかった。さらに、同じ長さのBNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸では、BNA-ヌクレオシドの数が多いほどTmが高かった。BNA-ヌクレオシドの数が同じBNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸でも、長さが長いほどTmが高かった。これより、BNA-ヌクレオシドの数およびBNA-オリゴヌクレオチドの長さともに、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸の構造安定性に寄与していることがわかった。実施例7オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸のRNaseH感受性の評価標的RNAの5’末端をγ-32Pで標識した。具体的には、10pmolのRNAと10pmol相当の[γ-32P]ATPパーキンエルマー社製を、T4PolynucleotideKinase東洋紡績株式会社製で反応させた。[γ-32P]標識RNAを含む反応後の産物は、スピンカラムで精製し、未反応の[γ-32P]ATPを除去した。この[γ-32P]標識RNAに、10μMの相補鎖オリゴヌクレオチド1μLを加え、95°Cにて5分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、2本鎖核酸を形成した。次いで、1μLの[γ-32P]標識2本鎖核酸を9μLの反応緩衝液40mMTris-HCl,4mMMgCl2,1mMDTT,4Glycerol,0.003BSAと混合した。ここから1μLを採取し、9μLの停止溶液0.05MEDTA,80ホルムアミド,BPBと混合した溶液をRNaseH未処理のサンプルとした。残りの9μLの反応溶液に0.6等量のRNaseH0.0006unitを混合し、37°Cにて5分間インキュベートした。ここから1μLを採取し、9μLの停止溶液と混合した溶液をRNaseH処理のサンプルとした。これらのサンプルは、電気泳動による解析まで-20°Cにて保存した。6M尿素を含む20変性ポリアクリルアミドゲルを用い、300Vにて120分間、サンプルの電気泳動を行った。DNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は4°Cにて行い、BNA-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は室温にて行い、NC-オリゴヌクレオチドと標的RNAとからなる2本鎖核酸を用いた場合の電気泳動は60°Cにて行った。電気泳動後のゲルをイメージングプレートに感光後、イメージアナライザーで解析した。結果を図1~5に示す。図1~5から明らかなように、いずれにおいてもRNaseHの添加により[γ-32P]標識RNAの分子量が低下しており、RNaseHによる[γ-32P]標識RNAの分解が起きていることがわかった。これより、いずれの2本鎖核酸もRNaseH感受性であることがわかった。実施例8オリゴヌクレオチドによるPCSK9遺伝子のinvitroにおける発現抑制効果14.0×105個/mLに調製したマウス肝臓細胞株NMuliの細胞を、1ウェルあたり2mLずつ6ウェルプレートに播き、37°Cにて5CO2下で24時間培養した。最終濃度が1、3、10、30または50nMとなるように調製するために、1μMオリゴヌクレオチド含有溶液を最終濃度1nMの場合には2.2μL、3nMの場合には6.6μL、10nMの場合には22μL、30nMの場合には66μL、そして50nMの場合には110μL各々とLipofectamine2000Invitrogen社製を14.3μLとOpti-MEMInvitrogen社製を最終濃度1nMの場合には533.5μL、3nMの場合には529.1μL、10nMの場合には513.7μL、30nMの場合には469.7μL、そして50nMの場合には425.7μL各々とを混合し、混合液を室温にて20分間インキュベートして、このうち500μLとOpti-MEM1500μLを各ウェルに添加した。オリゴヌクレオチド添加4時間後に培地を交換した。さらに20時間後に細胞を回収し、ISOGEN株式会社ニッポンジーン製で細胞を破砕し、TotalRNAを抽出した。抽出したTotalRNAを分光光度計で定量し、RNAの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。4μg/10μLになるように調製したTotalRNAに0.5μgμLオリゴdT5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’1μLおよび10mMdNTP1μLを加え、65°Cにて5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに40UμLのRNaseOUT登録商標Invitrogen社製1μL、5×FirstStrandBufferInvitrogen社製4μL、および0.1MDTT和光純薬工業株式会社2μLを加え、42°Cにて2分間インキュベートし、これにSuperScriptIISolution200UμLSuperScriptIIInvitrogen社製2μLと蒸留水6μLとを混合した溶液を1μL加えて42°Cにて50分間インキュベートし、逆転写反応を行った。反応後、70°Cにて15分間インキュベートしてSuperScriptIIを失活させた後、2UμLRNaseHInvitrogen社製1μLを加えて37°Cにて20分間インキュベートすることにより、cDNAを得た。得られたcDNA、FastSYBR登録商標GreenMasterMixAppliedBiosystems社製およびSYBR登録商標GreenRealtimePCRMasterMix東洋紡績株式会社を用いてMiniOpticon登録商標リアルタイムPCR解析システムBIO-RAD社によりリアルタイムPCRを行い、PCSK9のmRNA量を定量した。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のGAPDHのmRNA量も同時に定量し、GAPDHのmRNA量に対するPCSK9のmRNA量を評価した。用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである:PCSK9-0-BNAPCSK9Fwプライマー0:5’-TCAGTTCTGCACACCTCCAG-3’配列番号19PCSK9Rvプライマー0:5’-GGGTAAGGTGCGGTAAGTCC-3’配列番号20PCSK9-1-BNA、PCSK9-2-BNA、PCSK9-1-NC、PCSK9-2-NC、PCSK9-1-BNA-3CPCSK9Fwプライマー1:5’-CACGCTTCCACAGACAGGCG-3’配列番号21PCSK9Rvプライマー1:5’-CGTTGAGGATGCGGCTATAC-3’配列番号22PCSK9-3-BNAPCSK9Fwプライマー2:5’-GCCGGCACCTGGCGAGGACT-3’配列番号23PCSK9Rvプライマー2:5’-CCACTCTGTGACATGAAGCA-3’配列番号24PCSK9-4-BNA、PCSK9-4-BNAT,C、PCSK9-5-BNA、PCSK9-6-BNA、PCSK9-4-NCT,C、PCSK9-5-NCT,C、PCSK9-6-NCT,C、PCSK9-4-i-BNA、PCSK9-4-ii-BNA、PCSK9-4-ii-BNA-A、PCSK9-4-iii-BNA、PCSK9-4-iii-BNA-APCSK9Fwプライマー3:5’-GTGACTGCAGCACATGCTTC-3’配列番号25PCSK9Rvプライマー3:5’-CGTCCTACAGAGCAGCTGCC-3’配列番号26PCSK9-7-BNA、PCSK9-8-BNA、PCSK9-7-NCT,C、PCSK9-8-NCT,C、PCSK9Fwプライマー4:5’-GCTCTGTAGGACGGTGTGGT-3’配列番号27PCSK9Rvプライマー4:5’-GGTGTTGTGGATGCTGCAGT-3’配列番号28PCSK9-9-BNAPCSK9Fwプライマー5:5’-CCAGAAGGACCATGTTCTCA-3’配列番号29PCSK9Rvプライマー5:5’-GCACATTGCATCCAGTCAGG-3’配列番号30PCSK9-10-BNA、PCSK9-10-NCT,CPCSK9Fwプライマー6:5’-GGATCTCAGGTCCTTCAGAG-3’配列番号31PCSK9Rvプライマー6:5’-GCCTGAGGCTGTCACTGAAC-3’配列番号32GAPDH定量用GAPDHFwプライマー:5’-GTGTGAACGGATTTGGCCGT-3’配列番号33GAPDHRvプライマー:5’-GACAAGCTTCCCATTCTCGG-3’配列番号34各オリゴヌクレオチドで処理したNMuli細胞で得られたPCSK9のmRNA発現レベルの結果を図6~8に示す。図6は、BNA-オリゴヌクレオチド図6A:PCSK9-0-BNA、PCSK9-1-BNA、PCSK9-2-BNA、PCSK9-3-BNA、PCSK9-4-BNA、PCSK9-5-BNA;図6B:PCSK9-6-BNA、PCSK9-7-BNA、PCSK9-8-BNA、PCSK9-9-BNA、PCSK9-10-BNA、PCSK9-1-BNA-3C;図6C:PCSK9-4-BNAT,Cの結果を示し、図7および8は、NC-オリゴヌクレオチド図7:PCSK9-1-NC、PCSK9-2-NC、PCSK9-4-NCT,C;図8:PCSK9-5-NCT,C、PCSK9-6-NCT,C、PCSK9-7-NCT,C、PCSK9-8-NCT,C、PCSK9-10-NCT,Cの結果を示す。図6~8から明らかなように、多くのオリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの濃度依存的にPCSK9のmRNAの発現量は低下した。オリゴヌクレオチド未処理の場合のPCSK9のmRNA発現レベルを1としたときの、50nMのPCSK9-4-BNA、PCSK9-4-i-BNA、PCSK9-4-ii-BNA、PCSK9-4-ii-BNA-A、PCSK9-4-iii-BNAまたはPCSK9-4-iii-BNA-Aで処理した場合のPCSK9のmRNA発現レベルの結果を表6に示す。表6から明らかなように、PCSK9遺伝子の発現抑制については、PCSK9-4-i-BNA、ならびにより短い配列の中ではPCSK9-4-ii-BNAおよびPCSK9-4-iii-BNA-Aが優れた効果を示した。実施例9オリゴヌクレオチドによるPCSK9遺伝子のinvitroにおける発現抑制効果2NMuliに代えてヒト肝癌由来細胞株Huh-7を用いたこと以外は、実施例8と同様にして、オリゴヌクレオチドによるPCSK9遺伝子のinvitroにおける発現抑制効果を調べた。用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである:PCSK9-1-BNA、PCSK9-1-BNA-13、PCSK9-2-BNA-13PCSK9Fwプライマー1:5’-CACGCTTCCACAGACAGGCG-3’配列番号21PCSK9Rvプライマー1:5’-CGTTGAGGATGCGGCTATAC-3’配列番号22PCSK9-3-BNA-13PCSK9Fwプライマー2:5’-GCCGGCACCTGGCGAGGACT-3’配列番号23PCSK9Rvプライマー2:5’-CCACTCTGTGACATGAAGCA-3’配列番号24PCSK9-4-BNA-13PCSK9Fwプライマー3:5’-GTGACTGCAGCACATGCTTC-3’配列番号25PCSK9Rvプライマー3:5’-CGTCCTACAGAGCAGCTGCC-3’配列番号2650nMのオリゴヌクレオチドを用いた場合の結果を図9に示す。図9から明らかなように、PCSK9-4-BNA-13などの短いオリゴヌクレオチド13塩基はいずれもPCSK9-1-BNA20塩基よりもPCSK9遺伝子の発現抑制効果が高いことがわかった。実施例10オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験1被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製負荷の後、0日目に採血して、BNA-オリゴヌクレオチドまたはNC-オリゴヌクレオチドを腹腔内投与した10mg/kg/回。1週間に2回、2週間~6週間投与を行ない、その間、尾静脈より数回採血を行なった。3週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで上腸間膜静脈より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、-80°Cにて保存した。肝臓からのmRNAの抽出および定量:リアルタイムPCR凍結した肝臓の切片を1mLのTRIzolRegentInvitrogen社製内でホモジナイズし、クロロホルム200μLを加えた後、13,200rpm、4°Cにて15分間遠心した。上清220μLをイソプロパノール400μLに添加して転倒混和し、13,200rpm、4°Cにて15分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、75エタノール800μLを加えた後、13,200rpm、4°Cにて5分間遠心した。TotalRNAを含む沈殿をRNAフリー水Water,DEPCtreated,RNasetested;ナカライテスク株式会社80μLに溶解した。抽出したTotalRNAを分光光度計で定量し、RNAの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。TotalRNA10μgからHighCapacitycDNAReverseTranscriptionKitAppliedBiosystems社製を用いてcDNAを作製した。得られたcDNAおよびFastSYBR登録商標GreenMasterMixAppliedBiosystems社製を用いてリアルタイムPCRを行い、PCSK9のmRNA量を定量した。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のGAPDHのmRNA量も同時に定量し、GAPDHのmRNA量に対するPCSK9のmRNA量を評価した。用いたオリゴヌクレオチドおよびプライマーは以下のとおりである:PCSK9-1-BNA、PCSK9-1-NCPCSK9Fwプライマー7:5’-GCTCAACTGTCAAGGGAAGG-3’配列番号35PCSK9Rvプライマー1:5’-CGTTGAGGATGCGGCTATAC-3’配列番号22PCSK9-2-BNA、PCSK9-2-NCPCSK9Fwプライマー1:5’-CACGCTTCCACAGACAGGCG-3’配列番号21PCSK9Rvプライマー1:5’-CGTTGAGGATGCGGCTATAC-3’配列番号22PCSK9-4-BNA、PCSK9-4-BNAT,C、PCSK9-4-NCT,CPCSK9Fwプライマー3:5’-GTGACTGCAGCACATGCTTC-3’配列番号25PCSK9Rvプライマー3:5’-CGTCCTACAGAGCAGCTGCC-3’配列番号26GAPDH定量用GAPDHFwプライマー:5’-GTGTGAACGGATTTGGCCGT-3’配列番号33GAPDHRvプライマー:5’-GACAAGCTTCCCATTCTCGG-3’配列番号34各オリゴヌクレオチドをマウス腹腔内投与して得られた肝臓でのPCSK9のmRNA発現レベルの結果を、図10および11に示す図10:PCSK9-1-BNA、PCSK9-1-NC;図11:PCSK9-2-BNA、PCSK9-2-NC、PCSK9-4-BNA、PCSK9-4-BNAT,C、PCSK9-4-NCT,C。図10および11から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水Saline投与群に比べてPCSK9のmRNAの発現量は5以下に低下した。血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値の定量マウス尾静脈より血液を採取して、室温にて20分間静置した後、5000rpm、4°Cにて20分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、コレステロールE-テストワコー和光純薬工業株式会社製を用いて血清総コレステロール値を定量した。血清10μLに発色試液を1.5mL加えて37°Cにて5分間加温し、分光光度計を用いて600nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。リポタンパク質分析は、スカイライトバイオテック株式会社において、HPLCを用いたゲルろ過により、リポタンパク質を分子量によって3画分VLDL:Verylowdensityリポタンパク質、LDL:Lowdensityリポタンパク質およびHDL:Highdensityリポタンパク質に分画して、それぞれのコレステロール値をコレステロールE-テストワコーを用いて定量した。結果を図12に示す。図12から明らかなように、PCSK9-1-BNAおよびPCSK9-1-NCのいずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて血清総コレステロール値TC、VLDL画分中コレステロール値VLDL-C、LDL画分中コレステロール値LDL-C、HDL画分中コレステロール値HDL-Cが低下した。LDL受容体タンパク質の定量:ウェスタンブロッティング凍結した肝臓の切片50mgを500μLRIPAバッファーに入れてホモジナイズし、10,000rpm、3分間冷却遠心し、上清をBIORADDCBIO-RAD社製を用いてタンパク定量を行なった。ポリアクリルアミドゲルReadyGelJ4BIO-RAD社製の各レーンにタンパク質量7μgずつアプライし、200Vにて40分間電気泳動した。Immun-Blot登録商標PVDFMembraneBiorad社製を用いて180mAにて90分間ブロッティングを行ない、次いでBlockingoneナカライテスク株式会社を用いて1時間ブロッキングを行なった。得られたメンブレンに対し、1次抗体として、抗LDL受容体ポリクローナルヤギ抗体LDLRM-20,SantaCruzBiotechnology社を反応させ、二次抗体として、抗ヤギポリクローナル抗体DonkeyantigoatIgGHRP,SantaCruzBiotechnology社を反応させた。次いで、ECLplusWesternBlottingDetectionSystem,GEhealthcare社を用いてメンブレンを発色させ、発色量を定量した。結果を図13に示す。図13から明らかなように、PCSK9-1-BNAおよびPCSK9-1-NCのいずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて1.7~2倍にLDL受容体タンパク質の発現量が増加した。肝臓組織の病理組織学的観察オリゴヌクレオチドとして、PCSK9-2-BNA、PCSK9-2-NC、またはPCSK9-4-BNAを用い、これらを3週間に6回腹腔内投与した20mg/kg/回こと以外は、上記と同様にして、オリゴヌクレオチドのマウスへの投与実験を行った。上記と同様にして、肝臓組織を採取して、10ホルマリン緩衝液に24時間浸して固定した後6時間流水水洗し、パラフィン包埋した。薄切切片5μmを作製して、ヘマトキシリン染色を行ない、顕微鏡にて観察し、写真撮影した。結果を図14に示す40倍。図14から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて肝毒性を示さなかった。毒性評価オリゴヌクレオチドPCSK9-2-BNA、PCSK9-2-NC、PCSK9-4-BNA、PCSK9-4-BNAT,C、またはPCSK9-4-NCT,C投与後のマウス血清を用いて、AST値、ALT値およびBUN値を定量した。AST値およびALT値は、トランスアミナーゼCII-テストワコー和光純薬工業株式会社製を用いて定量した。血清10μLにAST値測定用またはALT値測定用基質酵素液250μLを加えて37°Cにて5分間加温し、発色試液250μLを加えて37°Cにて20分間加温した。次いで、反応停止液1mLを加えた後、分光光度計を用いて555nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて各値を算出した。BUN値は、血清10μLに発色試液A1mLを加えて37°Cにて15分間加温し、発色試液B1mLを加えて37°Cにて10分間加温後、分光光度計を用いて570nmの吸光度を測定した。標準試薬による検量線を用いて値を算出した。結果を図15に示すA:AST値、B:ALT値、C:BUN値。図15から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べてAST値およびALT値に有意な変化が見られず、肝毒性を示さなかった。実施例11オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験2被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、0日目に採血して、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-BNAを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。LDL画分中コレステロール値およびHDL画分中コレステロール値の結果を図16に示すLDLは、LDL画分中コレステロール値を表し、HDLは、HDL画分中コレステロール値の結果を示す。図16から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-BNA投与群では生理食塩水投与群に比べてHDL-Cに変化が見られなかったものの、LDL-Cは用量依存的に減少した。実施例12オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験3被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、0日目に採血して、PCSK9-1-BNAを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで心臓より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、-80°Cにて保存した。実施例10と同様にしてPCSK9のmRNA量を定量した。結果を図17に示す。図17から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-BNA投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるPCSK9のmRNAの発現が、各用量でほぼ完全に>97抑えられた。実施例13オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験4実施例12のPCSK9-1-BNA投与後のマウス血清を用いて、実施例10と同様にしてAST値、ALT値およびBUN値を定量した。結果を図18に示すA:AST値、B:ALT値、C:BUN値。図18から明らかなように、いずれのオリゴヌクレオチド投与群も生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるPCSK9のmRNA発現量は、顕著に低下した。また、肝臓および腎臓の急性期毒性マーカーについては顕著な上昇は認められなかったが、BUN値についてはわずかに用量依存的に上昇した。実施例14オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験5被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、0日目に採血して、PCSK9-1-NCを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5または10mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、4週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値およびリポタンパク質画分中コレステロール値を定量した。LDL画分中コレステロール値およびHDL画分中コレステロール値の結果を図19に示すLDLは、LDL画分中コレステロール値を表し、HDLは、HDL画分中コレステロール値の結果を示す。図19から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-NC投与群では生理食塩水投与群に比べてHDL-Cには変化が見られなかったものの、LDL-Cは用量依存的に減少した。実施例15オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験6被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、0日目に採血して、PCSK9-1-NCを腹腔内投与した。投与量は、0、1、5、10または20mg/kgとした。1週間に2回、6週間投与を行ない、4週間後または6週間後に尾静脈より絶食下採血を行なった。次いで、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、PBSで心臓より灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、-80°Cで保存した。実施例10と同様にしてPCSK9のmRNA量を定量した。結果を図20に示す。図20から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-NC投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓におけるPCSK9のmRNAの発現が、用量依存的に高効率>97に抑えられた。実施例16オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験7実施例15のPCSK9-1-NC投与後のマウス血清を用いて、実施例10と同様にしてAST値、ALT値およびBUN値を定量した。結果を図21に示す。図21から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-NC投与群では生理食塩水投与群に比べて肝臓および腎臓の急性期毒性マーカーの顕著な上昇は認められなかった。実施例17オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験8被験動物として6週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本クレアを各投与群で例数3匹となるように準備した。3週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、0日目に採血して、9日後および12日後に、オリゴヌクレオチドPCSK9-4-ii-BNA-A、PCSK9-4-ii-BNA-A2、PCSK9-4-ii-NC-A、PCSK9-4-ii-NC-A2、PCSK9-4-ii-CON-Aを尾静脈より投与した35mg/kg。14日後に尾静脈より絶食下採血を行なった。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図22に示す。図22から明らかなように、生理食塩水投与群では血清総コレステロール値に変化が見られなかったが、BNA-オリゴヌクレオチド、NC-オリゴヌクレオチドおよびCON-オリゴヌクレオチドのいずれの投与群も血清総コレステロール値が低下した。実施例18オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験9被験動物として3週齢のモルモットHartleyオス:日本SLCを各投与群で例数1匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製負荷の後、0日目に採血して、PCSK9-4-iii-BNA-gp5’-CATgggcagccgCC-3’;すべてPS骨格、小文字:DNA、大文字:BNA、配列番号11で示される塩基配列からなるヒトの標的領域のモルモットにおける対応領域を標的とするを腹腔内に3日間連続投与した。投与量は、1日あたり0、20または25mg/kgとした。投与後、3日後および7日後に各投与群1匹ずつ採血を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図23に示す。図23から明らかなように、オリゴヌクレオチドPCSK9-1-iii-BNA-gpを投与した結果、血清総コレステロール値は3日後に8低下し、7日後には40低下した。実施例19オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験10被験動物として3週齢のモルモットHartleyオス:日本SLCを各投与群で例数1匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1,オリエンタル酵母工業株式会社製負荷の後、0日目に採血して、生理食塩水、PCSK9-4-iii-BNA-gp、ロバスタチン生理食塩水、ロバスタチンPCSK9-4-iii-BNA-gpを腹腔内に投与した。投与量は、ロバスタチン約30mg/kg/日を9日間連続投与、PCSK9-4-iii-BNA-gp20mg/kgを9日間で3回投与とした。投与後、7日後に各投与群1匹ずつ採血を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。結果を図24に示す。図24から明らかなように、PCSK9-4-iii-BNA-gp投与群、ロバスタチン投与群、およびロスバスタチンPCSK9-4-iii-BNA-gp投与群では、それぞれ生理食塩水投与群に比べて、44、47および57血清総コレステロール値が低下した。PCSK9-4-iii-BNA-gpはロバスタチンに比べて低用量にもかかわらずコレステロール低減効果を示し、併用においてさらに高い効果を示した。また、ロバスタチン投与を中止して3日後に採血を行った場合においては、ロバスタチン投与群は生理食塩水投与群と同程度にまで血清総コレステロール値が回復したが、ロスバスタチンPCSK9-4-iii-BNA-gp投与群では生理食塩水投与群に比べて、約50血清総コレステロール値が低下し、持続してコレステロール低減効果を示した。実施例20オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験11被験動物として5週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本SLCを各投与群で例数9匹となるように準備した。PBSに溶解したPCSK9-1-BNAを腹腔内投与した。投与量は、0、0.05、0.25、0.5、1、2.5または5mg/kgとした。投与後、3日後、7日後および14日後に各投与群3匹ずつ麻酔薬ベトルファール明治製菓株式会社製、ドミトール日本全薬工業株式会社およびドルミカムアステラス製薬株式会社製の混合溶液で麻酔後、採血を行った。PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、QuickGeneKit富士フィルム社製に添付の組織溶解液4mLにて肝臓すべてを溶解し、-80°Cで保存した。解凍した肝臓溶解液からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。結果を図25に示す。図25から明らかなように、肝臓におけるPCSK9のmRNAの発現量は、PCSK9-1-BNAの投与量に依存して低下した。また、日数の経過に従って回復した。実施例21オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験12被験動物として5週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本SLCを各投与群で例数9匹となるように準備した。PBSに溶解したPCSK9-1-BNAを腹腔内に毎日連続投与した。投与量は、1日あたり0、0.009、0.018、0.036、0.071または0.18mg/kgとした。これは2週間連続投与後の総投与量が0、0.125、0.25、0.5、1または2.5mg/kgになる値である。投与後、3日後および7日後に各投与群3匹ずつ麻酔薬ベトルファール、ドミトールおよびドルミカムの混合溶液で麻酔後、採血を行った。PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、組織溶解液4mLにて肝臓すべてを溶解し、-80°Cで保存した。解凍した肝臓溶解液からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。結果を図26に示す。図26から明らかなように、肝臓におけるPCSK9のmRNAの発現は、連続投与の場合も、実施例20の単回投与の場合と同様に、PCSK9-1-BNAの投与量に依存して抑えられた。投与量の最も少ない場合3日間で総投与量0.027mg/kg、実施例20の単回投与では明らかな抑制が見られなかったが、連続投与では抑制が見られた。このことは、PCSK9-1-BNAの徐放剤化によりmRNAの抑制効果を向上できることを示唆する。実施例22オリゴヌクレオチドのinvivo投与実験13PCSK9-1-BNAの投与量および投与後採血までの経過日数を表7に記載の条件にしたこと以外は、実施例20と同様にして、PCSK9-1-BNAのマウスへの単回投与実験を行った。また、PCSK9-1-BNAの投与量および投与後採血までの経過日数を表7に記載の条件にしたこと以外は、実施例21と同様にして、PCSK9-1-BNAのマウスへの連続投与実験を行った。実施例10と同様にして血清総コレステロール値を定量した。PCSK9-1-BNAの投与後所定経過日数での単回投与実験で得られた血清総コレステロール値に対する連続投与実験で得られた血清総コレステロール値の比を図27に示す。図27から明らかなように、投与後7日および14日後の結果の多くでは、血清総コレステロール値の比連続投与/単回投与が1.0付近あるいは1.0を上回っている。これは、同じ投与量でコレステロール低減効果を比較した場合には、2週間程度の徐放化では十分な効果が得られないことを意味している。一方、投与後21日およぎ28日後の結果では、血清総コレステロール値の比連続/単回が1.0を大きく下回っている。図25および26の比較からは、同じPCSK9-1-BNA投与量では、単回投与と連続投与とで肝臓のPCSK9mRNAの抑制効果に大きな差がないことが示されているが、コレステロール低減効果については、低濃度のPCSK9-1-BNAに長時間暴露される徐放化の効果が大いに期待できることが示された。実施例23PCSK9-1-BNA含有アテロコラーゲンゲルの埋入による高脂血症ラット治療実験3質量アテロコラーゲン株式会社高研製コーケンアテロコラーゲンインプラント0.1mLに0.1mgのPCSK9-1-BNAを練り込み、37°Cにて24時間静置することによりPCSK9-1-BNA含有アテロコラーゲンゲルを作製した。被験動物として5週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本SLCを各投与群で例数2~5匹となるように準備した。2週間の高脂肪食F2HFD1:オリエンタル酵母工業負荷の後、麻酔下、PCSK9-1-BNA含有アテロコラーゲンゲルを腹腔内I.P.または皮下S.C.に埋入したBNAinGel群。比較のため、未処理群Control群およびPBS含有ゲルを埋入した群PBSinGel群、ゲルを埋入して別にPCSK9BNAを投与した群GelBNA群を設けた。埋入または投与後、3日間および14日間さらに高脂肪食を負荷した後、尾部より採血を行なった。次いで、マウスを麻酔薬ベトルファール、ドミトールおよびドルミカムの混合溶液で麻酔後、ゲルを採取し、PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、ホモジナイズし、-80°Cにて保存した。解凍した肝臓からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。また、実施例10と同様にして血清総コレステロール値およびVLDL-Cを定量した。3日後のmRNA量の結果を図28に示し、血清総コレステロール値の結果を図29に示す。また、3日後および14日後のVLDL-Cの結果を図30に示す。図28から明らかなように、PCSK9-1-BNAの腹腔内投与または皮下投与にかかわらず、PCSK9のmRNAの発現量は著しく低下した。一方、図29から明らかなように、血清総コレステロール値の著しい低下は、PCSK9-1-BNA含有アテロコラーゲンゲルを用いた群BNAinGel群でのみ見られた。これより、PCSK9-1-BNAの直接的な投与方法に比べてアテロコラーゲンゲルから徐放化させる投与方法が効率的な治療効果を奏する可能性が示された。図30から明らかなように、VLDL-Cは3日後に著しく低下したが、14日後には未処理群と同等にまで回復した。実施例24ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルからのPCSK9-1-BNAの徐放治療実験表8に示す2-ミクログロブリンを模倣したペプチド配列よりなるペプチド性インジェクタブルハイドロゲルをPCSK9-1-BNAの徐放用担体として用いた表8中のペプチド1~4のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号36~39に対応する。ペプチドは、Fmoc固相法によって合成し、1質量の濃度でDMSO/H2Oに溶解させてオリゴヌクレオチドと複合させた。ペプチド3および4は10DMSO/H2Oを溶媒としたときに均一なゲルを形成した。特にペプチド4ハイドロゲルは、5分以内の速やかなゲル化特性を示し、表9に示すように濃度依存的に高い弾性率を示した。ペプチド4水溶液ペプチド濃度:1質量;DMSO濃度:100.1mLに3μgのPCSK9-1-BNAを混合し、室温にて放置してPCSK9-1-BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。被験動物として5週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本SLCを用いた。PCSK9-1-BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを腹腔内i.p.または皮下s.c.に埋入した。埋入後、3日後にマウスをベトルファール、ドミトール、ドルミカムの混合溶液で麻酔後、PBSで肝灌流し、肝臓を採取、PBSで洗浄した後、組織溶解液4mlにて肝臓すべてを溶解し、-80°Cで保存した。解凍した肝臓溶解液からQuickGeneKitを用いて、mRNAの抽出を行った。その後のcDNAの作製、リアルタイムPCRは、実施例10と同様に行い、PCSK9のmRNA量を定量した。結果を図31に示す。図31から明らかなように、いずれの場合も、肝臓におけるPCSK9のmRNAの発現は、有意に抑えられた。数分でゲル化し、2週間で完全に生体内で消失するペプチド性インジェクタブルハイドロゲルは、オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療徐放剤の担体として有用と考えられる。実施例25ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルからのPCSK9-1-BNAの徐放化挙動蛍光色素Alexa750モレキュラープローブ社製で標識したPCSK9-1-BNAAlexa750-PCSK9-1-BNA20mgをペプチド4水溶液ペプチド濃度:1質量;DMSO濃度:10100mLに混合し、室温にて放置してPCSK9-1-BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。被験動物として5週齢のマウスC57BL6/Jオス:日本SLCを用いた。Alexa750-PCSK9-1-BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを皮下s.c.に埋入した。埋入後、InvivoイメージャーMaestroを用いて、ゲルに残存するAlexa750-PCSK9-1-BNAを経時的に定量した。結果を図32Aに示す。図32Aから明らかなように、埋入直後に、多くのAlexa750-PCSK9-1-BNAが局所から消失しており十分な徐放化効果が得られなかった。そこで、Alexa750-PCSK9-1-BNAがゲル中により長期間保持されるように、Alexa750-PCSK9-1-BNAに代えて、Alexa750-PCSK9-1-BNAとポリカチオンポリ[メタクリル酸2-ジエチルアミノエチル]:PDMAEMA;Mn=86000,Mw/Mn=1.9との複合体[PDMAEMAの窒素原子数]:[Alexa750-PCSK9-1-BNAのリン原子数]=48:1、室温にて30分間混合して調製したを用いて、同様にしてPCSK9-1-BNA含有ペプチド性インジェクタブルハイドロゲルを作製した。そして、ゲルを同様にしてマウスに埋入後、Invivoイメージャーを用いて、ゲルに残存するAlexa750-PCSK9-1-BNAを経時的に評価した。結果を図32Bに示す。図32Bから明らかなように、Alexa750-PCSK9-1-BNAの局所からの消失を大きく抑制することができた。"