"試料中の標的細菌を検出するための方法であって、標的細菌を含有する疑いがある細菌の大混合集団の試料を、P2ファージの基板結合領域BPARをコードするポリヌクレオチドおよび標的細菌に結合する受容体結合ドメインをコードする異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子操作された尾部繊維遺伝子と、前記標的細菌が感受性を有する抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子とを含む組換えP4バクテリオファージゲノムを含む組換えP4バクテリオファージと、接触させることと、前記試料および遺伝子操作されたP4バクテリオファージを培養することと、前記抗生物質の存在下で、前記標的細菌の増殖の検出により前記試料中の前記標的細菌の存在を検出することと、を含む、方法。遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を含む組換えP4バクテリオファージゲノムを含む核酸分子であって、前記遺伝子操作された尾部繊維遺伝子が、P2ファージの基板結合領域BPARをコードするポリヌクレオチドおよび受容体結合ドメインRBDをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、核酸分子。前記BPARが、P2バクテリオファージ遺伝子H産物のアミノ末端部を含む、請求項1に記載の方法、または請求項2に記載の核酸分子。前記BPARが、前記P2バクテリオファージ遺伝子H産物のアミノ酸1~157または1~158を含む、請求項1に記載の方法、または請求項2に記載の核酸分子。前記異種ポリヌクレオチドが、L-413c、PS17、BPP-1、CTX、VHML、CUS3、エプシロン15、HK620、sf6、ST64T、またはphiV10ファージに由来する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法または核酸分子。前記異種ポリヌクレオチドが、前記RBDのC末端をコードする、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法または核酸分子。前記C末端が、約347~755アミノ酸長である、請求項6に記載の方法または核酸分子。前記標的細菌が、大腸菌、シゲラ属、サルモネラ属、エルシニア属、ボルデテラ属、またはシュードモナス属の株である、請求項1、3、4、5、6、または7のいずれか1項に記載の方法。前記大腸菌株が、志賀毒素産生性大腸菌である、請求項8に記載の方法。前記細菌の大混合集団が、少なくとも100万個の細菌からなる、請求項1、3、4、5、6、7、8、または9のいずれか1項に記載の方法。前記検出された標的細菌が、前記細菌の大混合集団中1,000,000個につき1個未満である、請求項10に記載の方法。以下の例は、説明のために提供されるが、特許請求された主題事項を制限するものではない。実施例1:融合タンパク質を含む改変されたhmwバクテリオシンa相補システム本明細書に記載される改変されたhmwバクテリオシンの作製を促進するために、尾部繊維をトランスに相補するためのシステムの構築を確立した。代表的なモデルとしてR2ピオシンを用いて、緑膿菌PAO1ゲノム中のR2のprf15コード配列の欠失を作り出して、改変されたprf15遺伝子産物等の相補尾部繊維タンパク質がトランスに発現されるプラットフォームを作製した。一般に、Hoangらの方法により欠失させて、緑膿菌株PAO1Δprf15を作製した。R2シャペロンに対する配列番号4のprf16コード領域は、R2のprf15遺伝子の末端を8ヌクレオチドによって重複し、リボソーム結合部位は、配列番号3のprf15コード領域内にある。必ずしもピオシン構造に組み込まれないPRF16タンパク質は、三量体尾部繊維のアセンブリのため、ひいては最大の殺菌作用のために必要であると報告されている図8およびNakayamaetal.,2000。したがって、prf16のための転写開始部位およびそのリボソーム結合部位の両方は、シャペロンが尾部のない欠損ピオシンをコードする改変されたピオシン構築物の誘発時に産生されるように、無変性のまま維持された。簡潔に述べると、prf15のコドン11~301のインフレームでの欠失を、以下のように、PAO1中で作製した。所望の欠失の上流にある1.1kbのKpnI-AgeI断片を、プライマーAV0855’-GCTTCAATGTGCAGCGTTTGC配列番号46およびAV0885’-GCCACACCGGTAGCGGAAAGGCCACCGTATTTCGGAGTAT配列番号47を用いて、PA01ゲノムDNAからPCRによって増幅し、2.2kbのAgeI-EcoRI断片を、プライマーAV0875’-ATACTCCGAAATACGGTGGCCTTTCCGCTACCGGTGTGGC配列番号48およびAV0865’-TCCTTGAATTCCGCTTGCTGCCGAAGTTCTT配列番号49を用いて増幅した。得られた制限断片を、pEX18GmHoangらのKpnIおよびEcoRI部位にクローン化して、pEXGm-Δprf15を作製した。完成した構築物を、エレクトロポレーションChuanchuenらによって、株PAO1に形質転換した。要素は、100μg/mLのゲンタマイシンで選択され、分離固体は、5μg/mLの蔗糖を含み、NaClおよびゲンタマイシンがない培地中で選択された。欠失の候補は、PCR分析、ピオシン誘発、およびPCR増幅断片の配列決定によって確認した。株ΡΑO1Δ/prf15は、その親株PAO1と同様に増殖し、ピオシンをコードする遺伝子は、SOS応答を通して誘発可能に維持されており、これが細胞の溶解をもたらす。ピオシン遺伝子産物のいくつかの産生はあったと思われるが、安定した尾部のないピオシン粒子は、ΡΑO1Δprf15から産生されなかったと思われる。R2ピオシンのprf15は、まず、コード配列を広い宿主範囲のシュードモナス/大腸菌シャトルベクターpUCP30Tにクローン化することによってトランスに発現させた。図9を参照。いくつかの最初の構築物では、転写は、構造的にまたはプロモーターからのlacI制御下で行われた。しかし、他の構築物では、転写は、発現がSOS応答を通して調節されるように、内因性prf15プロモーターで調節されるように改変された。これにより、改変されたprf15遺伝子の発現を、PAO1Δprf15ゲノム内に存在する他のピオシン遺伝子の発現と同調して誘発することを可能にした。簡単に述べると、広い宿主範囲のベクターpUCP30TSchweizer,H.Pらは、特有のBspHI部位を充填することで改変し、pUCP30TΔBspを形成した。tacプロモーターを、MTD発現ベクターJefferyF.Miller,UCLAより寄贈から、プライマーAV1105’-TTTATTAGCGGAAGAGCCGACTGCACGGTGCACCAATG配列番号50およびAV1145’-CCCTCGAATTCATGAATACTGTTTCCTGTGTGAAATTG配列番号51を用いてPCRによって増幅し、pUCP30TΔBspにクローン化して、pUCP-tacを作製した。R2のPRF15コード領域を、プライマーAV1185’-CTTCCTTTCATGACGACCAATACTCCGAA配列番号52およびAV1165’-ACCACGAATTCTTCATCGTCCAAATGCCTC配列番号53を用いて増幅し、一方、R2のprf15およびprf16を、プライマーAV118およびAV0865’-TCCTTGAATTCCGCTTGCTGCCGAAGTTCTT配列番号49を用いてサブクローンから増幅した。prf15およびprf15/16の増幅した断片を、BspHIおよびEcoRIで消化されたpUCPtacにクローン化して、pUCP-tac-prf15およびPUCP-tac-prf15/16を得た。内因性prf15プロモーターを用いた発現については、prf15およびprf16を、prf15の上流の1088bp配列と共に、プライマーAV1075’-CACCATCTAGACAATACGAGAGCGACAAGTC配列番号54およびAV0915’-TCCTCAAGCTTACGTTGGTTACCGTAACGCCGTG配列番号55を用いてサブクローンから増幅し、XbaIおよびHindIIIで消化されたpUCP30Tにクローン化して、pUCP-R2p-prf15/16を作製した。浮遊増殖する対数期にありinlogphasesuspensiongrowth発現プラスミドを含む細菌を、3μg/mLのマイトマイシンCで処理して、ピオシンの産生を誘発した。安定なピオシンが、誘発時、野生型PAO1のものと同様の収量で産生された。ピオシンは、PAO1から産生されたR2ピオシンと同じ殺菌範囲および活性レベルを有していた。したがって、安定なピオシン複合体の産生には、他のピオシンをコードする遺伝子の発現に加えて、尾部繊維タンパク質の発現が必要であり、トランスでの尾部繊維遺伝子の発現で十分であった。prf15がtacプロモーターから構造的に発現されたとき、細胞増殖は、lacIまたは内因性プロモーターにより調節されたときよりも著しく低下した。細胞内でのPRF15のみの産生は有害であると思われるが、両方のプロモーターから生成されたピオシンの収量は同等である。プラスミド構築物を作製して、そこからR2のprf16がR2のprf15と共に共発現させて、トランスに発現されたPRF15の折り畳みのためのprf16の適切な一時的発現を確保した。b組換えhmwバクテリオシン本明細書に記載されるように、その範囲に基づいて、R1~5と称される5つの異なるR型ピオシンが確認されている。尾部繊維タンパク質をコードする遺伝子配列は、R1配列番号1およびR2配列番号3に対するもののみ知られているため、それぞれ配列番号6、8、および10の産生株中に存在するそれらの同族シャペロンをコードする配列と共に、PCRを用いて、R3配列番号5、R4配列番号7、およびR5配列番号9のピオシンの尾部繊維遺伝子を単離し、配列決定した。また、ピオシンR1およびR2のシャペロン遺伝子もクローン化し、それぞれ配列番号2および4を配列決定した。尾部繊維が範囲を決定するという仮説を確認するために、R1、R3、R4、およびR5のピオシンの尾部繊維タンパク質をコードする配列を得て、それらがR2ピオシン構造に組み込まれるように、ΡΑO1Δprf15中でトランスに発現させた。次いで、得られた組換え株のそれぞれは、ピオシンを産生するように誘発し、図2および8に示されるように、それぞれの範囲を、スポットアッセイによって測定した。cピオシン:R2-P2における機能性尾部繊維としての融合タンパク質R2尾部繊維prf15遺伝子とバクテリオファージP2の遺伝子H配列との融合物を作製し、発現させ、これを用いて、本開示のさらなる改変されたhmwバクテリオシンを産生させた。多くの大腸菌株に感染するバクテリオファージP2は、R2のprf15配列番号3、特に、N末端コード部分との高い配列類似性を有する尾部繊維をコードする遺伝子H配列番号25を有する。標的特異性を与える推定領域RBDであるP2の尾部繊維タンパク質のC末端の551のアミノ酸残基をコードする遺伝子Hの一部分を、R2のPRF15のN末端基板結合BPAR部分である164のアミノ酸をコードするprf15の一部分と融合させて、改変された尾部繊維タンパク質配列番号27をコードした。バクテリオファージP2はまた、遺伝子G配列番号26によってコードされた推定尾部繊維シャペロンもコードし、これは、R2ピオシンのprf16配列番号4によってコードされたシャペロン、および多くの他のミオウイルスファージのシャペロンによってコードされたシャペロンと類似している。遺伝子Gにコードされるシャペロンが、融合におけるP2尾部繊維タンパク質のC末端部分の折り畳みにとって重要である可能性が高いため、構築物を作製して、P2遺伝子Gを共発現させた。1から164位のアミノ酸をコードするR2のprf15の一部分を、プライマーAV118およびAV1275’-TTCTTTAAGCTTTTCCTTCACCCAGTCCTG配列番号56を用いてサブクローンから増幅し、BspHIおよびHindIIIを消化させた。158から669位のアミノ酸をコードするP2遺伝子Hの一部分を、プライマーAV1245’-CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG配列番号57およびAV1265’-TCCTTCGAATTCTTACACCTGCGCAACGT配列番号58を用いてP2ファージストックRichardCalendarから増幅した。P2遺伝子H158から669位に遺伝子Gを加えたものを、プライマーAV124およびAV1255’-CCTCCTGAATTCTTATTGCGGCATTTCCG配列番号59を用いて増幅した。P2からのPCR産物のそれぞれは、HindIIIおよびEcoRIで消化させた。pUCP-tac-R2-P2Hは、1から164位のアミノ酸断片をコードするprf15断片を、158から669位のアミノ酸断片をコードするP2遺伝子H断片と共に、BspHIおよびEcoRIで消化されたpUCP-tacにクローン化することによって作製された。pUCP-tac-R2-P2HGは、1から164位のアミノ酸断片をコードするprf15断片を、158から669位のアミノ酸断片をコードするP2遺伝子H断片に遺伝子Gを加えたものと共に、BspHIおよびEcoRIで消化されたpUCP-tacにクローン化することによって作製された。簡単に述べると、PA01Δprf15は、prf15-P2遺伝子Hの融合構築物で形質転換され、ピオシン産物は、マイトマイシンCによって誘発された。ピオシン粒子を精製し、スポット試験および細菌生存アッセイによって活性について試験した図2を参照。R2-P2融合尾部繊維を含む精製されたピオシン粒子は、大腸菌C1aに対する殺菌作用を有したが、緑膿菌株13sを死滅させることはできなかった。さらに、P2遺伝子Gの発現が、活性ピオシンを産生するために必要であった。このことは、図8に示されるように、シャペロンが、尾部繊維のC末端部分の適切な折り畳みには必要であるという仮説を支持する。大腸菌C1aを死滅させる機能性ピオシンを形成するための一連の異なるR2-P2尾部繊維タンパク質融合の能力を、一連の異なるR2-P2融合によって調べた。これらの融合の代表的な例を、大腸菌C1aに対する得られた殺菌作用を示すと共に、図4~7に示す。dピオシン:R2-L-413cにおける機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質さらなる改変されたhmwバクテリオシンが、エルシニアペスティスを標的とするように産生された。L-413cは、ほとんどのエルシニアペスティス株に感染するエルシニオファージであるRichardCalendar,personalcommunication。ほとんどのL-413cゲノムは、P2と極めて類似性が高いが、重要な例外として配列番号28の尾部繊維遺伝子Hがあり、これはP2のものとは大きく異なっている。理論に束縛されることなく、本開示の理解を向上させるために提供するものであるが、尾部繊維遺伝子Hの違い、ひいては、コードされたタンパク質の違いが、その異なる宿主範囲に最も起こり得る主な原因となる特徴である。しかしながら、L-413c遺伝子Η配列番号28のN末端は、P2の対応物配列番号25との配列相同性をかなり共有しており、これは、その基板結合の機能によるものと思われる。図10配列番号30に示されるように、融合尾部繊維を、L‐413c尾部繊維のC末端部158位から913位と融合したR2のPRF15からのN末端の1から164位のアミノ酸を用いて作製して、改変された尾部繊維を作製するために、融合体を構築した。この融合を、上述のように、L‐413c尾部繊維同族シャペロン、遺伝子G配列番号29、と共にΡΑO1Δprf15中で発現させた。誘発後、産生されたピオシン粒子は、エルシニアペスティスKIM、ならびに大腸菌Cを死滅させ、ひいては、エルシニオファージL-413cの宿主範囲と同様の死滅範囲を有した。この改変されたピオシンは、いずれのシュードモナス株も死滅させなかった。eピオシン:R2-VHMLにおける尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質緑膿菌R2ピオシンの尾部繊維BPARprf15によってコードされたとビブリオハーベイミオウイルス様VHMLバクテリオファージの2つの尾部繊維遺伝子配列番号21および22のうちの1つとの間で作製された新規の融合尾部繊維を用いて、さらなる改変されたhmwピオシン粒子が作製された。尾部繊維OakeyandOwens,2000、Oakeyetal.,2002、Doulatovetal.2004の分散可能な部分をR2ピオシンの尾部繊維に融合した。orf35遺伝子[配列番号22]およびその推定される同族シャペロンのものであるorf38[配列番号23]を、BrisbaneのAustralianNationalGenomeCenterに提供されたDr.OakeyのVHMLファージから得られた新しいDNA配列データに基づいて合成した。一連の融合体は、R2のprf15とorf35遺伝子の間で生成され、この融合体は、PA01Δprf15中のorf38と共に共発現させた。例えば、BPARR2の1~164とVHMLOrf35の26~410との融合は、精製され得る堅牢なR型ピオシン粒子を形成し、SDSPAGEによって分析されたとき、期待された大きさの融合尾部繊維を含むR型ピオシンタンパク質を示した。我々の研究所において得られたデータは、1つだけ例外として、キメラR型ピオシン尾部繊維構造のみが、精製され得るR型ピオシン粒子を形成し、SDSPAGEにおいて適切なタンパク質を示し、期待された標的細菌上で殺菌作用を示すものであったことを示している。その1つの例外が、この1つのキメラR2のprf15-VHMLorf35融合である。このキメラR型ピオシンの作製は、試験したビブリオ種のいずれに対しても殺菌性がなかったが、溶原性VHMLバクテリオファージがDNAシークエンシングのために単離されたビブリオハーベイ株は、クラスタシィアンおよびカキへの病原性のため、米国に輸出することができない。オーファンorphanキメラR2のprf15-VHMLorf35ピオシンを生成し、得られた、VHML由来のRBDを有する改変されたhmwバクテリオシンは、天然のVHMLのDGRによる多様化に供することができるという結論を出す。fピオシン:R2-V10における機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質バクテリオファージphiV10は、ポドウイルス科に属し、最も一般的な大腸菌O157:H7株に感染することができるWaddellandPoppe,2000、GenbankNC_007804。ファージphiV10は、ファージP2またはR型ピオシンの尾部繊維状のものをコードしないが、その代わり、バクテリオファージP22およびエプシロン15のものと同様の尾部スパイク状のタンパク質をコードする。これらの尾部スパイクは、一般的に、多糖類に特異的であり、それらが結合する表面多糖類構造を分解する球形タンパク質である。phiV10の尾部スパイクは、病原体の大腸菌O157:H7の表面上でO157抗原を特異的に認識し、それに結合し、分解する可能性が高い。R2ピオシン尾部繊維のaa1~161および1~164等のN末端のBPARコード部分に個別にそれらを遺伝的に融合させることによって、phiV10の尾部スパイクタンパク質配列番号60のaa204~875、211~875、および217~875等のRBDの種々のC末端部分として配置した。これらの組換え融合遺伝子R2のPrf151~164:V10尾部スパイク204~875[配列番号67]、R2のPrf151~164:V10尾部スパイク217~875[配列番号68]、およびR2のPrf151~161:V10尾部スパイク211~875[配列番号69]のうちの3つを適切なシュードモナス菌株PAO1Δprf15中で個別に発現させたとき、産生され、放出されたピオシン粒子を、それらの構造機能性のあるR2-V10尾部融合に組み込んだ。これらのキメラピオシン粒子は、我々の研究所において8つ全ての大腸菌O157:H7株に対して殺菌作用を有したが、不完全なO157抗原を有するEDL933の突然変異体を含むいずれの他の大腸菌株も死滅しなかった。さらに、大腸菌EDL933から抽出したLPSのSDSPAGEによって証明されるように、キメラR2-V10ピオシンは、O157抗原を消化した。したがって、大腸菌O157:H7の公知の毒性因子であるO157抗原を特異的に認識し、消化し、大腸菌O157:H7株を特異的に死滅させる、組換えR型ピオシンを作製した。R2-V10ピオシンにより処理された大腸菌O157:H7から現れ得るR2-V10ピオシン耐性突然変異体がそれらのO157の毒性因子を遊離するかどうかを判定するために、事前の化学的突然変異誘発する、または誘発しない、R2-V10ピオシン耐性EDL933の大腸菌然変異体を選択した。7つの独立した突然変異体のLPS構造は、SDSPAGEによって分析され、それらが変化したO抗原構造を有するかどうかを判定した。7つのそれぞれは、異なる定質的または大いに定量的に変化したO157抗原を有し、R2-V10への耐性が大腸菌O157:H7病原体から毒性因子のO157の損失をもたらすことを示した。一連のタンパク質構造分析プログラムを利用するQuickfireソフトウェアImperialCollege,Londonを用いてphiV10尾部スパイクタンパク質をモデリングする際、C末端の422個のアミノ酸[配列番号60]におけるガラクツロナナーゼ[配列番号66]との構造的相同性が予測されたことを見出した。これは、ピオシンPrf15[配列番号67、68、69等]のN末端部に融合されるとき、O157抗原と結合することによって組換えR型ピオシンが、α-D-Gal2Nacを含んだ大腸菌O157を死滅させることができるが、そのO抗原中のα-D-Gal2Nacを欠いていることが知られているTEA026突然変異体または上述のその他の7種類のEDL933突然変異体を死滅させない、V10尾部スパイク部の能力を説明した。Quickfireはまた、phiV10尾部スパイクが、サルモネラO抗原と結合し、それを分解することが知られているファージ尾部タンパク質であるファージP22尾部スパイク[配列番号70]のエンドラムノシダーゼに対して構造的相同性を有することも示した。したがって、R型ピオシンの尾部繊維のN末端のBPARに対してそのような触媒機能を有するタンパク質の融合は、その表面上で酵素の基質を発現する細菌を標的とし、死滅させる酵素の基質結合特性を利用する能力を組換えR型ピオシンに与えた。したがって、R型ピオシンは、天然にはR型ピオシンと似ていない尾部構造を有するファージからの尾部タンパク質を用いて異なる特異性を有するように遺伝子操作され、それ故に、非天然R型ピオシンを作製する。gピオシン:R2-PS17における機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質緑膿菌ファージPS17は、Felixd’HerelleReferenceCenterforBacterialViruses,UniverstieLaval,Canadaから入手した。PS17のプラークは、緑膿菌株PML14の感染によって産生された。ファージPS17に対して溶原性のPML14細胞は、未使用のトリプシン大豆寒天プレート上にプラークからの細胞をストリーキングすることによって単離された。溶原性は、Genbank配列BPSFIFIIから設計されたプライマーAV168およびAV167を用いたコロニーPCR増幅によって確認された。溶原性細胞の一晩培養物は、200mLのトリプシン大豆培養液中で1:100に希釈され、600nmでの光学密度が約0.2になるまで、37°Cで振とうした225rpm。最終濃度がμg/mLとなるようにマイトマイシンCを添加し、培養物をさらに5時間振とうし、このとき、溶解は明らかであった。デオキシリボヌクレアーゼInvitrogen、1単位/40mLを添加し、溶解液を37°Cで30分間インキュベートして、粘度を低下させた。次いで、BeckmanJA-25.50ローターにより、12,000rpmで30分間遠心分離することによって細片を除去した。溶解液を、株PML14上で滴定し、約8×109pfu/mLであると判定した。ファージDNAは、QiagenLambdaミニプレップキットを用い、製造業者の指示書に従って、キットから3つのカラムを用いて、40mLの透明溶解液から単離された。DNAは、合計40μL中で再懸濁された。プライマー配列5’から3’まで列挙:ShinomiyaandIna1989の制限マップに基づいて、約4.2kbのBglII断片をクローン化し、配列決定した。PS17ファージDNAの1μLの試料は、BglIIで消化させ、次いで、アガロースゲル中で電気泳動させた。適切な断片がゲルから切除され、精製され、BamHIで消化させたpUC19ベクターDNAと共に連結された。コンピテント大腸菌細胞は、連結された産物と共に形質転換され、形質転換細胞が、100μg/mLのカルベニシリンを含有するLB寒天プレート上に選択された。プラスミドミニプレップを作製し、DNA配列分析のために使用した。2つのオーバーラップオープンリーディングフレーム配列番号71は、様々な尾部繊維遺伝子およびシャペロンに対して有意な相同性を有することが見出された。プラスミドpUC19-PS-B3では、推定されるシャペロンオープンリーディングフレームの終止コドンとベクターポリリンカー由来のSacl制限酵素認識部位との間に約53bpがあった。pUCP30Tは、BspHIで消化され、dNTPの存在下で、DNAポリメラーゼIのKlenow断片による処理によりその末端部はその先が丸くなり、ベクターは再連結して、BspHI部位を欠いたpSW107を形成した。lacIq遺伝子およびrrnBT2終了配列は、第1の段階で鋳型としてpMAL-c2E等のlacIqを含有する好適なプラスミドベクターならびにプライマーAV140およびAV027を用い、第2の段階でプライマーAV141およびAV27を用いて、2段階PCRによって増幅させた。PCR産物は、SapIで消化させ、SapIで消化させたpSW107と共に連結して、プラスミドpDG19を形成した。tacプロモーターは、鋳型として好適なプラスミドベクターpGEX-2TならびにプライマーAV169およびAV114を用いて、PCRによって増幅させた。PCR産物は、SapIおよびEcoRIで消化させ、SapIおよびEcoRIで消化させたpDG19と共に連結して、プラスミドpDG35を形成した。推定される尾部繊維およびシャペロンオープンリーディングフレームは、プライマーAV238およびAV047を用いてプラスミドpUC19-PS-B3からPCRによって増幅させた。PCR産物は、BspHIおよびSacIで消化させ、BspHIおよびSacIで消化させたpDG35と共に連結して、pDG65を形成した。R2prf15およびprf16を含むDNA断片は、プライマーPRF13-FおよびAV086を用いてPAO1ゲノムDNAからPCRによって増幅させた。PCR産物は、InvitrogenからのZeroBluntTOPOPCRCloningKitforSequencingを用いてクローン化した。得られたクローンは、pTOPO-R2と表された。コドン1-223を表すR2prf15オープンリーディングフレームの断片は、鋳型としてpTOPO-R2ならびにプライマーAV118およびAV287を用いて、PCRによって増幅させた。コドン220からコドン779後の終止コドンに加えて推定されるシャペロンオープンリーディングフレームまでのC末端部を表すPS17の推定される尾部繊維オープンリーディングフレーム断片は、鋳型としてpUC19-PS-B3ならびにプライマーAV286およびAV293を用いて、PCRによって増幅させた。得られたPCR産物は、20bpのオーバーラップ配列を含んだ。2つの断片は、プライマーAV118およびAV293を用いて、オーバーラップPCRによりアセンブリされた。得られた断片は、BspHIおよびSacIで消化させ、BspHIおよびSacIで消化させたpDG35と共に連結して、プラスミドpSW122を形成した。PS17プラークは、通常、感受性細胞の菌叢上に不透明な牛の目の外観を有する。PS17ファージは、株PML14上に平面培養し、透明な外観を有するいくつかの稀なプラークが選択された。透明なプラークのファージは、透明な外観を有する単離されたプラークを再度平面培養し、選択することによって精製された。PS17-c5と表される単離物がさらなる使用のために選択された。緑膿菌株PA01は、実施例1においてPAO1Δprf15を作製するために説明される方法と同様の方法によって、PAO1-mΔprf15を作製するために、そのprf15コード配列配列番号3のヌクレオチド10-2067を削除した。トリプシン大豆培養液中で50mLのPAO1-mΔprf15の培養液を、600nmでの光学密度が約0.2になるまで、37°Cで振とうした。PS17-c5の1つのプラークをプレートから液体培養物に移した。37°Cでさらに3時間振とうした後、600nmでの光学密度を低下し、溶解は明らかであった。次いで、培養物を一晩16時間振とうした状態にした。一晩インキュベーションした後、培養物は、再度不透明になった。培養液の試料を、トリプシン大豆寒天プレート上にインキュベートし、一晩インキュベートした。コロニーは、プライマーAV168およびAV167を用いて、コロニーPCRによってPS17の溶原性について確認され、陰性を示した。PAO1-mΔprf15-c5Rと表されるクローン単離物が、R2-PS17の改変されたピオシンの宿主産生細菌としてさらなる使用のために選択された。ChoiandSchweizer2005によって説明された方法と同様の方法によってエレクトロコンピテントな細胞が作製され、pDG65およびpSW122で形質転換された。形質転換細胞が選択され、100μg/mLのゲンタマイシンで維持された。R2-PS17ピオシンの発現のために、100μg/mLのゲンタマイシンを添加したトリプシン大豆培養液中のPAO1-mΔprf15-c5Rの一晩培養物を、50μg/mLのゲンタマイシンを含有するG培地Shinomiya,1972に1:100で希釈した。この培養物を、600nmでの光学密度が約0.2になるまで、振とうしながら225rpm、37°Cでインキュベートした。次いで、最終濃度が3μg/mLとなるようにマイトマイシンCを添加し、培養物を37°Cで3~4時間振とうした。任意に、デオキシリボヌクレアーゼを、40mL当たり1単位で添加し、溶解物を37°Cで15~30分間インキュベートして、粘度を低下させた。BeckmanJA-25.50ローターにより、12,000rpmで、4°Cで30分間遠心分離することによって細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを22,000rpm約58,500×gで、4°Cで1時間沈殿させた。ペレットは、10mMのTris-HClpH7.5、50mMのNaCl中の3の原体積で再懸濁し、4°Cで保存した。組換えR2-PS17ピオシン調製物の殺菌作用は、PML14等のPS17に感受性のある緑膿菌株においてスポット希釈によって示された。hピオシン:R2-MTDにおける機能性尾部繊維としてのさらなる融合タンパク質ボルデテラバクテリオファージBPP-1の主要トロピズム決定因子MTDは、C型レクチンCTLドメインを有し、これは、多くの異なる生物学的状況における、多くの様々な種類の分子に対する結合決定因子として作用するDrickamer,1999、McMahonetal.,2005。BPP-1では、MTDは、ファージの尾部末端に位置するホモ三量体球状ドメインとして組み込まれており、そこで、ボルデテラブロンキセプティカおよびボルデテラパータシスBordetellapertussisの外部表面上で発現する毒性因子、表面タンパク質パーテクチンと結合することができるLiuetal.,2004。これに関して、MTDは、ファージが媒介するホーミング突然変異生成homingmutagenesisの標的でもあり、それによって、バクテリオファージが、その変化し続ける宿主に感染するための新規の結合決定因子を獲得する結果となり得る。MTDドメインおよびそのいくつかの多様化変異体に関する最近の構造研究により、三量体の繊維の先端が、10兆個を超える変異体結合リガンドを含むことができる固定された足場をいかにして形成するかが示されたMcMahonetal.2005。MTDドメインをピオシン尾部繊維タンパク質上へ融合し、その後、Millerらによって説明されたDGRシステムを用いてMTDドメインを多様化することによりLiuetal.,2004、Doulatovetal.,2004、変異体の非常に大きなライブラリーが作製され、そこから、変化した結合特異性を有するピオシン尾部をコードする遺伝子が選択され、入手される。実施例2:融合タンパク質のアッセイaピオシンの精製およびアッセイPAO1または適切な誘導体を、プラスミドを維持するために必要な場合は、50μg/mLのゲンタマイシンを添加したG培地中、200rpmで振とうしながら37°Cで増殖させた。培養物のOD600が約0.250に達したとき、最終濃度が3μg/mLとなるようにマイトマイシンCを添加した。培養物を、溶解が発生するまでさらに2.5時間インキュベートした。DNase1Invitrogenの5単位1単位/μLを、200mLの培養物に添加し、培養物をさらに30分間インキュベートした。BeckmanJLA-16.250ローターにより、12,000rpmで1時間遠心分離することによって細片を除去した。上清を氷上で攪拌しながら、そこへ、最終添加体積が溶解物の上清100mLに対して65mLとなるまで飽和硫酸アンモニウムを1mL/分の速度でゆっくり添加した。これを4°Cで一晩保存した。BeckmanJA-25.50ローターにより、12,000rpmで、4°Cで1時間遠心分離することによって硫酸アンモニウムの沈殿物を回収し、ペレットを10mLのTN50バッファー10mMtris、50mMNaCl、pH7.5中へ再懸濁した。再懸濁溶液中のピオシン粒子は、次いで、BeckmanJA-25.50ローターにより、22,000rpm58,500×gで、4°Cで1時間沈殿させ、3~5mLのTN50バッファー中へ再懸濁した。ピオシン調製物は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、>90の純度であると判断した。ピオシンの定量アッセイは、Kagayamaetal.,1964によって記載された方法を若干修正した方法により、生存細菌を計数することにより行われた。ピオシン試料を、標的細菌約1×109CFU/mLで、37°Cで40分間インキュベートした。次いで、試料を希釈し、平面培養して、生存細菌を計数した。ピオシン粒子の数と生存細菌の画分とは、ポアソン分布、m=-lnS、の関係にあり、m=致死事象の平均回数/細胞であり、Sは生存細菌の画分である。活性ピオシン粒子の合計数/mL=m×細胞/mLである。株13sは、これらのアッセイで使用された緑膿菌であり、多くの抗生物質に耐性を有するが、5つのR型ピオシン全てに感受性を有する臨床的単離株である。標的である大腸菌は、RichardCalendar氏によりご提供いただいたC1aであった。また、半定量アッセイも、スポット法で行い、ピオシン試料をTN50バッファー中で段階希釈して、標的細菌の菌叢上にスポッティングした。37°Cで一晩インキュベートした後、ピオシン活性は、菌叢上の死滅によるクリア領域によって観察することができた。図2は、このアッセイ形式による代表的な結果を示す。実施例3:遺伝子操作された尾部繊維のスクリーニングのための組換えバクテリオファージP4バクテリオファージを、遺伝子型を尾部繊維の結合表現型と連結させるように、尾部繊維融合遺伝子を内部に有するサロゲートとして使用した。これにより、所望の尾部繊維遺伝子の効率的な選択、形質導入、および単離が可能となる。バクテリオファージP2は、他の腸内の種に感染することができる溶原性大腸菌ファージであり、緑膿菌中で複製することができるが、これに感染することはできないBertaniSix,1988、Kahnetal.,1991。R型ピオシンは、遺伝子的にも構造的にもP2と近い関係にあり、遺伝子HによってコードされるP2尾部繊維タンパク質は、基板結合が生じるPRF15のN末端部分と相同性を示すHaggard-Ljungquistetal.,1992、Nakayamaetal.,2000。P2またはP4バクテリオファージを、プラスミドにコードされた尾部繊維がP2ファージにコードされた繊維の代わりにファージ粒子に組み込まれたサロゲートファージとして用いることにより、ピオシンでの意図する機能的な関連性と極めて類似する関連性において融合繊維の提示および選択が可能となる。尾部繊維遺伝子型は、ファージディスプレイ技術と同様に、遺伝子選択のために、形質導入ファージ粒子内で結合表現型と物理的に連結させた。アンバー変異をその繊維タンパク質遺伝子Hアンバー抑制遺伝子大腸菌で作製されたに有するP2ファージは、通常はバクテリオファージゲノムDNAのパッケージングに対するシグナルとして作用するcosパッケージング部位cospackagingsiteを有するP4系プラスミドを内部に有する大腸菌に感染する場合ZiermannCalendar,1991、Kahnetal.,1991、新たに合成されたP2/P4ファージ粒子の頭部にcosを含むP4プラスミドをパッケージすることになる。図12のP4系プラスミドは、尾部融合遺伝子をコードし、発現する。P2に感染した大腸菌内でP4プラスミドから発現された融合尾部繊維は、欠損アンバーが切断された遺伝子H産物P2尾部繊維タンパク質の代わりにP2/P4粒子中へ組み込まれた。P2ホリンおよびリゾチームの発現によって感染細胞の溶解により、放出されたP2/P4系形質導入粒子は、P2ゲノムではなく尾部融合遺伝子をコードするcos含有P4プラスミドを持ち、アンバーが切断されたP2尾部繊維ではなく組換え融合尾部繊維を有した。具体的には、プラスミドpSW166は、バクテリオファージP4sid1Shoreetal.1977の塩基226から2594に対応する領域を、プロモーターからなる763bp断片ならびにPCR増幅プロモーターに隣接するMfeIおよびKpnIならびに終止コドンに隣接するEcoRIによって導入された制限酵素認識部位によって側面に配置されたプラスミドpUCP30TSchweizer,2001、NCBI受入番号U33752からのaacC1ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ3-1のコード領域と置き換えることによって構築され、P4と同じ方向において遺伝子にクローン化された。プラスミドpDG211は、PLEプロモーターがaacC1と同じ極性にあり、NheI部位およびNcoI部位がKpnI部位とPLEプロモーターとの間に作製されるように、MfeI部位とKpnI部位の間に、PCR増幅によって得られ、塩基8585から8835相補鎖に対応するP4のPLEプロモーターDehoetal.,1988からなる274bp断片を挿入することによって構築された。P2遺伝子Hの尾部繊維遺伝子の1から157位のアミノ酸およびphiV10尾部スパイク遺伝子の218から875位のアミノ酸をコードするPCR増幅によって得られるDNA断片は、pDG211のNcoI部位とKpnI部位との間に挿入され、図12のpDG218を作製した。1mLのプラスミドpDG218を内部に有する大腸菌C1aの培地を、OD600が1.0になるように増殖し、1mMのCaCl2を添加し、約2の感染の多重度でP2amH72vir20Sunshineetal.,1971に感染させた。10分間の事前吸着させた後、細胞を225rpmで、37°Cで50分間振とうした。微小遠心管中で1分間遠心分離によって、細菌および細片を除去し、溶解上清液を保存した。それぞれの大腸菌TEA026および大腸菌EDL933HoandWaldor,2007標的細胞の培地200μLは、2.5mMのCaCl2および2.5mMのMgCl2を添加した。溶解物前のステップからの上清50μLを添加し、10分間事前吸着した。次いで、細胞を700μLの培養液で希釈し、225rpmで、37°Cで1時間振とうした。それぞれの細胞懸濁液のアリコート10μLを、15μg/mLのゲンタマイシンを含有するLB寒天プレート上に平面培養した。次いで、プレートを37°Cで一晩インキュベートした。およそ1000のコロニーをEDL933プレート上に増殖させたが、TEA026プレート上には増殖させなかった。pDG218図14等の場合、P2-V10の融合遺伝子ではなく、完全な融合されないP2遺伝子Hの尾部繊維遺伝子を含むように構築された対照のP4系の陰性対照プラスミドpDG212は、P2amH72vir20に感染させた後、大腸菌C1aから同様にパッケージ化された。10μLの対照溶解物を、ゲンタマイシン含有プレート上で大腸菌C1aとインキュベートしたとき、10,000を超えるコロニーが増殖したが、同じ対照溶解物がゲンタマイシン含有プレート上でEDL933とインキュベートしたとき、何も生じなかった。したがって、O157に特異的な結合特性を内部に有さないP4粒子によるトランスフェクションからのEDL933のゲンタマイシン耐性コロニーを生じるための偽陽性頻度は、104未満である。P2アンバーHと共に重感染した場合、O157株に感染することができるが、C1aには感染することができないP4粒子が産生される。PS17システムとは異なって、phiV10およびその尾部スパイクがP2とは遺伝的にも構造的にも完全に無関係であることに留意するのは重要である。これは、広い範囲の異なるファージ型がこのシステムによって利用することができ、用途の幅をさらに広げることを示す。細胞と結合し、バクテリオファージの侵入機序を誘発する能力のある形質導入ファージ粒子は、標的化に成功した細菌にゲンタマイシン耐性を付与し、そこからゲンタマイシン選択の下での細菌の複製の後、選択された繊維融合遺伝子がプラスミドから単離される。PCRによって単離された機能性V10系RBD遺伝子が、R2のprf15のBPARaa1~164に融合され、PA01Δprf15中でトランスに発現され、組換えピオシンが単離され、大腸菌TEA026および大腸菌EDL933における殺菌作用についてアッセイされた。P2/P4粒子について記載されるように、R2ピオシンPRF15からBPARに融合されたとき、V10尾部スパイクタンパク質からのRBDは、EDL933に対して殺菌性があったが、O157抗原を欠いている突然変異体TEA026に対しては殺菌性がなかったように、得られた改変されたピオシンに対して特異性を与えた。改変された尾部繊維RBDの機能の再設計および最適化を行うために、P4プラスミド上の尾部繊維遺伝子を容易にさらに操作して、多くの融合接合部を作り出し、RBDの多様化を行う。関連P4ビリオン粒子は、aa1~158をコードするP2遺伝子HのBPAR部分を、aa164~779のRBDをコードするシュードモナスファージPS17の尾部繊維遺伝子に融合させることによって生成された組換え尾部繊維を有するように作られた。遺伝子H-PS17の尾部繊維融合遺伝子は、pDG218と同様に、P4系プラスミドのpDG224から後者の同族シャペロンと共に共発現させた。一旦pDG224を内部に保持する大腸菌C1aに感染したP2amH72vir20の溶解物から回収されると、P4粒子は、緑膿菌株PML14へのゲンタマイシン耐性の形質転換が伝達されたが、緑膿菌株PA14には伝達されなかった。PS17ファージもまた、前者の緑膿菌株PML14には感染するが、後者の緑膿菌株PA14には感染しない。したがって、P4系サロゲートシステムは、細菌の属を越えてさえも、組換え遺伝子型を組換え尾部繊維結合表現型と組み合わせるための選択方法が提供されている。このアプローチはまた、従来のファージ提示システムを用いるとき、三量体のタンパク質のC末端提示により課せられる多くの問題を克服するHeldSidhu,2004。バクテリオファージP2は、遺伝学的にも形態学的にもピオシンの尾部繊維と類似している尾部繊維を有するNakayamaetal.,2000。尾部繊維は、それらのN末端によってP2およびピオシンの基板に付着し、P2およびR2ピオシン尾部繊維のN末端の有意な配列相同性があるNakayamaetal,2000、Haggard-Ljungquistetal.,1992。さらに、P2関連ファージであるPS17の尾部繊維遺伝子は、R2ピオシン尾部繊維遺伝子であるprf15を相補することができるShinomiya,1984、ShinomiyaIna,1989。あるいは、ビブリオハーベイBPP-1のように、これも機能性DGRも含有するのVHMLファージの尾部繊維遺伝子orf35の部分を、P2遺伝子HのN末端ドメインへ融合させる。次いで、この組換え構築体は、orf35RBDに組み込まれたVHMLVRのDGR駆動型の多様化を行った後、上記のように、特定の対象のRBDのP4に基づいた選択を可能にする。実施例4:所望の尾部繊維遺伝子を回収する方法遺伝子操作された尾部繊維遺伝子を持つP2またはP4バクテリオファージは、ピオシン尾部繊維遺伝子型を結合表現型と組み合わせるサロゲートとして作用する。そのようなサロゲートバクテリオファージの内部に保持される尾部繊維遺伝子の多様化された、または突然変異を起こされたライブラリーから特定の結合表現型を選択またはスクリーニングすることにより、所望の結合特異性をコードする尾部繊維遺伝子を単離することができる。選択は、まず、望ましくないバインダーを除去し、次いで、残ったサロゲートの中から意図する標的分子と結合するものを単離するか、またはその逆を行うことによってサロゲートバクテリオファージもしくは形質導入粒子を固相標的分子上へ吸着させるという単回または複数回の濃縮サイクルを行うことによって実施することができる。あるいは、選択は、いずれかの結合ステップを単独で適用することによって行うこともできる。最終的には、所望の結合表現型を示すサロゲートを、制限酵素断片のクローン化、または尾部繊維遺伝子の多様化された末梢部分の特定のDNA配列と結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR反応により、DNA抽出、および保持されている尾部繊維遺伝子の単離に付すことができる。サロゲートファージまたは形質導入P4粒子が標的を発現する細菌上でプラークを形成しない場合であっても、感染または形質導入された細菌は、内部に保持するプラスミドまたはプラスミドと共にP4プラスミドコードされたゲンタマイシン耐性等の抗生物質耐性を獲得し、したがって、選択的な増殖およびそれに続く抽出を行うことで、多コピープラスミドおよびその所望の尾部繊維遺伝子を単離することができる。これらの技術により、所望の特定の結合表現型を示すサロゲートバクテリオファージまたは形質導入粒子の同定および単離が可能となり、そこから所望の特定の非天然のhmwバクテリオシン尾部繊維遺伝子が抽出および単離される。さらに、サロゲートの哺乳類分子、細胞、または組織への結合により、治療用hmwバクテリオシンに組み込まれた場合、有害な事象を起こす恐れのある尾部繊維をコードするいかなる遺伝子もライブラリーから奪うように配置することができる。挿入突然変異体である緑膿菌株の利用可能なライブラリーがあり、この変異体は、極めて病原性の高い親PA14緑膿菌とは、それぞれの重複しない同系突然変異体から1つ欠損する形で一連の特定の毒性因子の発現が欠損していることだけが異なっているausubellab.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pal4/home.cgiのホームページを参照。これらの同系の突然変異体株は、他の一般的な表面分子ではなく、標的毒性因子に対するサロゲートバクテリオファージの特異性を確保するためのツールを提供する。例えば、サロゲートP4バクテリオファージの集団を、特定の標的毒性因子を欠損した緑膿菌の突然変異体の高密度培養物と共にインキュベートすることで、同系突然変異株および毒性の親株の両方に存在する表面分子と結合するサロゲートバクテリオファージまたは形質導入粒子を吸着させて集団から除去することができる。除去処理された集団は、所望の毒性因子と結合するサロゲートの濃縮が行われる。特定の毒性因子または適応性因子を発現する細菌と結合し、これに感染するサロゲートバクテリオファージを単離した後は、それぞれを、標的因子を欠損している同系突然変異株に感染することができないものについて直接スクリーングすることができる。選択されたプラスミドは、サロゲート形質導入粒子に再パッケージし、吸着‐除去および感染のプロセスを通してさらなる濃縮、および最終的には毒性因子または適応性因子を標的とするための所望の尾部繊維をコードするpUC系プラスミドの精製を行うことで、何度でも再利用可能である。組換えP4ゲノムにおいてコードされた組換えまたは天然の尾部繊維遺伝子は、当業者によく知られているいくつかの方法のいずれか1つによって、特に特異性を付与するRBDドメインの部分において、突然変異生成を施すことができる。突然変異したP4ゲノムプラスミドは、低多重度で大腸菌Cに形質転換され、続いて、ゲンタマイシン耐性の形質転換細胞が、ファージP2アンバーHP2amH72vir20によって感染する。上記のように、P4ビリオン粒子のライブラリーは、パッケージ化され、産生され、突然変異体RBD部分を有する尾部繊維を有し、この遺伝子は、パッケージ化された組換えP4ゲノム内で特異的にコードされる。これらの突然変異体のいくつかは、標的細菌上で所与の標的受容体に対して特異的な結合能力をコードする。所望の、実に希少である、結合能力を有する突然変異体RBDを内部に有するP4ゲノムは、ビリオンライブラリーで標的細菌の菌株を感染させ、ゲンタマイシン耐性の細菌コロニーを単離することによって選択することができる。耐性細菌は、標的細菌の菌株に対して特異性を得る突然変異体RBDをコードするP4ゲノムを内部に有する。所望の希少な結合表現型を選択し、それによって、望ましくないP4粒子の大集団から遺伝子型を選択することの例は、pDG212P2尾部繊維を内部に有する大腸菌C1aおよびpDG218P2-V10の組換え尾部繊維を内部に有する大腸菌C1aからの異なる割合のP4粒子の溶解物を混合することによって示された。この混合物が、P2-V10尾部繊維を有する0、1、99、または100のP4粒子を含む、またはP2尾部繊維を有するその逆の数のP4粒子を含むとき、コロニーを形質転換した適切な数のEDL933または大腸菌C1aを、ゲンタマイシンを含有する寒天プレート上に増殖させた。つまり、pDG218を内部に有する大腸菌から回収されたP4粒子が、唯一、トランスフェクトし、EDL933細菌へのゲンタマイシン耐性を伝達することができ、一方、pDG212を内部に有する大腸菌から回収されたものが、唯一、トランスフェクトし、大腸菌C1a細菌へのゲンタマイシン耐性を伝達することができた。pDG212を内部に有する大腸菌からのP4を用いた形質転換を試みた後、大腸菌EDL933のゲンタマイシン耐性コロニーの形成である偽陽性増殖の頻度は、105未満であった。また、pDG218を内部に有する大腸菌からのP4を用いた形質転換を試みた後、大腸菌C1aのゲンタマイシン耐性コロニーの形成であるその逆も観察され、105未満であった。所望の結合表現型を有するDNAをコードする突然変異体RBDは、RBDまでの遺伝子Hの配列5’およびRBDまでの配列3’内であるが、RBDコード領域のすぐ外側のプライマーを用いて、PCR法によって単離することができる。選択されたRBDのDNA配列は、aa1~164をコードするその部分等のR型ピオシンprf15遺伝子のBPAR部分と融合され、PA01Δprf15等の細菌または以下に記載されるような産生株中のトランスで発現させ、新規で所望の結合特異性および殺菌特異性を有する組換えR型ピオシンを作製する。実施例5:遺伝子操作されたhmwバクテリオシンを産生するための方法改変された尾部繊維遺伝子は、プラスミドが媒介する対立遺伝子交換反応を用いて、i内在するprtR、prtN、prf15、およびホリンprf9またはPA0614遺伝子が欠失もしくは無能力化されたRピオシン遺伝子クラスターエンドリシン遺伝子を含むも、例えば細菌人工染色体BAC上で、内部にも保持する産生細菌中での発現のために、調節されたプロモーターの下、プラスミド中へ組換えられるか、またはiiBACベクターそのものを含むピオシンクラスター中へ組換えられる。a大腸菌におけるR型ピオシンの発現R2ピオシン遺伝子クラスターは、PCR産物由来の5つの異なるクローン化した断片を用いて、4つの異なる変異体においてクローン化された。断片1は、PA01ゲノムDNAからプライマーAV461およびPRF13Rを用いて、PCRによって増幅され、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化させた。得られた断片は、Genbank配列AB030825の塩基4267~7856を表した。プライマーAV461は、EcoRI部位を加えた。この断片は、遺伝子prt-Rおよびprt-Nを欠いた。断片2は、PA01ゲノムDNAからプライマーAV529およびPRF13Rを用いて、PCRによって増幅され、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化させた。得られた断片は、Genbank配列AB030825の塩基2975~7856を表した。プライマーAV529は、EcoRI部位を加えた。この断片は、遺伝子prt-Rおよびprt-Nを含んだ。断片3は、PA01ゲノムDNAからプライマーAV333およびAV334を用いて増幅され、HindIIIおよびNheIで消化させた。得られた断片は、Genbank配列AB030825の塩基7856~14280を表した。この断片は、完全長prf15遺伝子を含む。断片4は、ΡΑ01-rΔprf15ゲノムDNAからプライマーAV333およびAV334を用いて増幅され、HindIIIおよびNheIで消化させた。得られた断片は、Genbank配列AB030825の塩基7856~9155および10028~14280を表した。この断片は、873bpの内部欠損を有するprf15遺伝子を含んだ。断片5は、PA01ゲノムDNAからプライマーAV407およびAV404を用いて増幅され、NheIおよびPacIで消化させた。得られた断片は、Genbank配列AB030825の塩基14,280~19,860を表した。プライマーAV404は、PacI部位を加えた。複製起点およびβ-ラクタマーゼ遺伝子を含むpBR322Genbank配列SYNPBR322のヌクレオチド2334~4353を含むの断片は、プライマーAV337およびAV338を用いて増幅された。得られた断片は、NotIで消化させ、複数のクローニング部位は、キナーゼ化およびアニール化したオリゴAV339およびAV340を用いてNotIで消化させたベクターを連結させることによって作製された。得られたプラスミドは、pDG121と表された。PCRプライマー配列:プラスミドpDG173は、断片1、3、および5を含み、pDG121のEcoRI部位とPacI部位の間にそれぞれ挿入した。プラスミドpDG174は、断片2、3、および5を含み、pDG121のEcoRI部位とPacI部位の間にそれぞれ挿入した。プラスミドpDG175は、断片1、4、および5を含み、pDG121のEcoRI部位とPacI部位の間にそれぞれ挿入した。プラスミドpDG176は、断片2、3、および5を含み、pDG121のEcoRI部位とPacI部位の間にそれぞれ挿入した。大腸菌株BL21非λDE3溶原菌、Novagenカタログ番号69449-3の化学的にコンピテントな細胞は、プラスミドpDG173、pDG174、pDG175、またはpDG176で形質転換された。プラスミドの保持が選択され、50μg/mLのカルベニシリンで維持された。ピオシンの発現のために、50μg/mLのカルベニシリンを添加したLB培養液中の株BL21の一晩培養物を、25μg/mLのカルベニシリンを含むG培地Shinomiya,1972に1:100で希釈した。この培養物を、600nmでの光学密度が約0.2になるまで、振とうしながら225rpm、37°Cでインキュベートした。次いで、33.3ng/mLが最終濃度となるようにマイトマイシンCを添加し、培養物を37°Cで一晩15~22時間振とうした。培養物はなお、不透明であった。BeckmanJA-25.50ローター中で12,000rpm約17,400×gで、4°Cで30分間遠心分離することによって、細胞および細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを22,000rpm約58,500×gで、4°Cで1時間沈殿させた。ペレットは、10mMのTris-HClpH7.5、50mMのNaCl中の3の原体積で再懸濁し、4°Cで保存した。それぞれの調製物の殺菌作用は、緑膿菌の株13s上でアッセイされた。10μLのそれぞれの試料は、分子量標準とともに4~20のポリアクリルアミドトリスグリシンSDSゲルSDS-PAGE上で電気泳動させた。pDG173およびpDG174を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、SDS-PAGE分析において、強力な殺菌作用および明らかなR型ピオシンタンパク質サブユニットを示した。pDG175およびpDG176を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、全て予測したように、SDS-PAGE分析において、殺菌作用を示さず、実質的なR型ピオシンタンパク質サブユニットも示さなかった。b蛍光菌におけるR型ピオシンの発現キナーゼ化およびアニール化したオリゴAV530およびAV531は、EcoRIおよびHindIIIで消化させた広い宿主範囲のプラスミドベクターpUCP30TGenbankXXU33752に連結させた。得られたプラスミドは、pDG171と表された。プライマー配列:約15.6kbのpDG173からのEcoRI-PacI断片は、EcoRIおよびPacIで消化させたDG171に連結されて、pDG193を形成した。約16.9kbのpDG174からのEcoRI-PacI断片は、EcoRIおよびPacIで消化させたpDG171に連結されて、pDG194を形成した。約14.7kbのpDG175からのEcoRI-PacI断片は、EcoRIおよびPacIで消化させたpDG171に連結されて、pDG195を形成した。約16.0kbのpDG176からのEcoRI-PacI断片は、EcoRIおよびPacIで消化させたpDG171に連結されて、pDG196を形成した。ChoiandSchweizer2005によって記載された方法と同様の方法によってエレクトロコンピテントな蛍光菌ATCCカタログ13525が作製され、pDG193、pDG194、pDG195、またはpDG196で形質転換された。形質転換細胞が選択され、100μg/mLのゲンタマイシンで維持された。ピオシンの発現のために、100μg/mLのゲンタマイシンを添加したトリプシン大豆培養液中の一晩培養物を、50μg/mLのゲンタマイシンを含有するG培地Shinomiya,1972に1:100で希釈した。この培養物を、600nmでの光学密度が約0.2になるまで、振とうしながら225rpm、37°Cでインキュベートした。次いで、最終濃度が3μg/mLとなるようにマイトマイシンCを添加し、培養物を37°Cで3~4時間振とうした。BeckmanJA-25.50ローター中で12,000rpm約17,400×gで、4°Cで30分間遠心分離することによって、細片を除去した。上清を未使用の遠心分離管に移し、ピオシンを22,000rpm約58,500×gで、4°Cで1時間沈殿させた。ペレットは、50mMNaCl、10mMTris-HCl、pH7.5の3の原体積で再懸濁し、4°Cで保存した。それぞれの調製物の殺菌作用は、緑膿菌の株13s上でアッセイされた。10μLのそれぞれの試料は、分子量標準とともに4~20のポリアクリルアミドトリスグリシンSDSゲルSDS-PAGE上で電気泳動させた。pDG193およびpDG194を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、SDS-PAGE分析において、強力な殺菌作用および明らかなR型ピオシンタンパク質サブユニットを示した。pDG195およびpDG196を含む大腸菌形質転換細胞からの調製物は、全て予測したように、SDS-PAGE分析において、殺菌作用を示さず、実質的なR型ピオシンタンパク質サブユニットも示さなかった。lacまたはtac等の遺伝子操作された調節可能なプロモーターを通してのprtNの直接の誘発等、ピオシン遺伝子および遺伝子操作された尾部繊維遺伝子の誘発により、宿主細胞は、栄養素が枯渇して増殖が止まるまでピオシンを合成するYoung,Ry,2006。産生細菌は、ホリン遺伝子の不活化によって細胞の溶解に必要である細菌細胞壁への細胞質エンドリシンのアクセスが妨げられるため、クロロホルムの非存在下では溶解しない。使い終わった細胞は、遠心分離または濾過で回収し、その後、細胞質を満たした溶解性ピオシンの回収を所望するまで、凍結する。解凍によって内部細胞膜が破裂し、エンドリシンが放出されて細菌が溶解し、それによって、改変されたピオシンの回収物が放出される。必要であれば、少量のクロロホルムを細菌ペーストが解凍される水性溶媒に添加することによって、細菌膜の破壊を加速もしくは完了させることができる。実施例6:組換えP4/P2バクテリオファージを用いた細菌の菌株の標的化大腸菌C1aおよび大腸菌O157:H7等の細菌の大混合集団を、その集団の1つだけの菌株を標的とするために、図14に示される構築物を含む上記のように遺伝子操作されたP4ファージ粒子と接触させたとき、標的細菌のコロニーは、ゲンタマイシンの存在下で、接触させた集団を増殖させることによって単離された。この実験では、既知数の大腸菌C-1aおよびEDL933O157:H7が、図15に提供される表A~G行中に示されるように、異なる割合で混合された。それぞれの混合した集団は、O157抗原を標的とするために、図14に示されるように、遺伝子操作されたP4粒子と20分間接触させた。次いで、それぞれの混合した培地は、15μg/mLのゲンタマイシンを含有する寒天プレート上に広げた。プレートは、37°Cで一晩インキュベートされ、翌朝撮影されたプレートの画像は、図15に示される。計数され得るそれぞれのプレート上のコロニー数は、それぞれの画像下に示される。プレートE、F、およびGから5つのコロニーがそれぞれ、PCR分析による志賀毒素Stx遺伝子1に対して試験された。プレートG上のもの以外の試験された全てのコロニーが、EDL933であると確認された。プレートG上の3つのコロニーは、PCR分析によってStx遺伝子を持たないことからも明らかなように、P4ファージ溶解物-調製物を汚染したP4プラスミドを含有する大腸菌C-1aであった。図15に示されるように、大腸菌O157:H7細菌中100万個につき1個未満の細菌が、少なくとも500万個の非O157大腸菌株の集団から単離され得る。逆に言えば、異なる細菌株を標的とし、感染するように遺伝子操作されたP4ファージの混合集団を考えると、新規のシステムは、標的細菌に対して特異的な遺伝子操作された尾部繊維を含む希少なP4ファージを単離するように配置され得ることを示した。この実験では、上記および図12に記載される方法によって作り出され、P2遺伝子HHまたはphiV10尾部スパイク遺伝子と融合されたP2遺伝子HH-V10を含む既知数の遺伝子操作されたP4ファージ粒子は、異なる割合で混合された図16の画像の左に示される。混合したP4ファージ集団は、大腸菌C-1aまたはEDL933O157:H7のいずれかの培地と10分間接触させ、これらの培地を15μg/mLのゲンタマイシンを含むプレート上でインキュベートした。プレートは、37°Cで一晩インキュベートされ、翌朝撮影された図16に提供された画像。含むincluding、含有するcontaining、有するhaving、またはによって特徴付けられるcharacterizedbyと相互交換可能に使用される含むcomprisingという用語は、包括的または制限のない言語であり、さらなる、列挙されない要素、または方法のステップを除外しない。からなるconsistingofという語句は、特許請求の範囲内で特定されないいかなる要素、ステップ、または構成要素を除外する。本質的に~からなるconsistingessentiallyofという語句は、特定の材料またはステップと、特許請求された本発明の基本的および新規の特徴付けに実質的に影響しないものに対して特許請求の範囲を制限する。本開示は、これらの語句のそれぞれの範囲に相当する本発明の組成物および方法の実施形態を企図する。したがって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が本質的にこれらの要素またはステップからなる、またはそれらからなる特定の実施形態を企図する。特許、特許出願、および刊行物を含む本明細書で引用した全ての参考文献は、過去に特に組み入れられたものであっても、そうでないものであっても、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で使用されるa、an、およびanyという用語はそれぞれ、単数形および複数形の両方を含むことを意図している。これまで、本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、および過剰な実験をすることなく、広い範囲の同等のパラメーター、濃度、および条件で同じことを実施可能であることは当業者によって理解されよう。本発明は、その具体的な実施形態と関連させて説明してきたが、さらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本出願は、一般的に本発明の原理に従い、本発明が関連する当該技術分野内での既知のまたは慣用の実践の範囲内であり、そして上述の本質的な特徴に適用され得るような、本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または適用を網羅することを意図している。本発明は、上記の実施例に関して記載されているが、修正および変更は、本発明の精神および範囲内で包含されることを理解されよう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。参考文献"