"AAV8のアミノ酸配列、配列番号2のアミノ酸1~737を有するAAVキャプシドを含んでなる単離されたアデノ随伴ウイルスAAV。上記ウイルスが配列番号1の核酸配列を有する、請求項2に記載の単離されたAAV。上記AAVがさらにAAV逆方向末端反復および宿主細胞で発現を支配する調節配列に操作可能に連結されたヘテロロガスな遺伝子を有するミニ遺伝子を含んでなる、請求項1に記載の単離されたAAV。avp1キャプシドタンパク質、アミノ酸aa1~737;vp2キャプシドタンパク質、aa138~737;vp3キャプシドタンパク質、aa203~737;aa146~152;aa182~187;aa262~264;aa263~266;aa263~266;aa381~383;383~385;aa450~474;aa451~475;aa490~495;aa491~496;aa500~504;aa501~505;aa514~522;aa533~554;aa534~555;aa581~594;aa583~596;aa658~667;aa660~669;およびaa705~719;aa707~723;aa24~42;aa25~28;aa81~85;aa133~165;aa134~165;aa137~143;aa154~156;aa194~208;aa261~274;aa262~274;aa171~173;aa185~198;aa413~417;aa449~478;aa494~525;aa534~571;aa581~601;aa660~671;aa709~723;およびaa1~184;aa199~259;aa274~446;aa603~659;aa670~706;aa724~736;aa185~198;aa260~273;aa447~477;aa495~602;aa603~659;aa660~669;およびaa707~723、ここでアミノ酸番号はAAV2キャプシド、配列番号4のアミノ酸番号およびAAV8のキャプシド、配列番号2中の対応する領域の番号である、からなる群から選択される超可変領域HVR1から12またはそれらのより小さいフラグメントを包含するフラグメント、からなる群から選択されるAAV8キャプシドタンパク質またはそのフラグメントならびにb配列番号3のaa1~625;aa1~102;aa103~140;aa141~173;aa174~226;aa227~275;aa276~374;aa375~383;aa384~446;aa447~542;aa543~555;およびaa556~625からなる群から選択されるAAV8repタンパク質またはそのフラグメント、からなる群から選択されるAAV8タンパク質またはそのフラグメントを含んでなるタンパク質。請求項4aに記載する1以上のAAV8キャプシドタンパク質フラグメントを含んでなる人工アデノ随伴ウイルスAAVキャプシドタンパク質。請求項5に記載の人工キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルスAAV。請求項4に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる分子。上記核酸配列が:vp1、nt2121~4335;vp2、nt2532~4335;およびvp3、nt2730~4335、ここでヌクレオチド番号はAAV8、配列番号1の番号である、からなる群から選択される請求項7に記載の分子。上記分子がAAVキャプシドタンパク質および機能的AAVrepタンパク質をコードするAAV配列を含んでなる、請求項7または8に記載の分子。上記核酸配列が:配列番号1の核酸905~2104;配列番号1の核酸237~2104;配列番号1の核酸905~2104;および配列番号1の核酸237~2104;からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項7ないし9のいずれかに記載の分子。上記分子がAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5およびAAV6からなる群から選択される血清型に由来するcapタンパク質または機能的AAVrep遺伝子を含んでなる請求項9に記載の分子。上記分子がプラスミドである請求項7ないし11のいずれかに記載の分子。AAV血清型キャプシドを含んでなる組換えアデノ随伴ウイルスAAVを生成する方法であって:aAAVキャプシドタンパク質をコードする分子;b機能的rep遺伝子;cAAV逆方向末端反復ITRsおよび導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子;およびdミニ遺伝子のAAVキャプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養する工程を含んでなり、該宿主細胞が請求項7ないし12のいずれかに記載の分子を含んでなる上記方法。請求項1ないし3または請求項6のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項7ないし12のいずれかに記載の分子でトランスフェクトした宿主細胞。請求項1ないし3または請求項6のいずれかに記載のAAVおよび生理学的に適合性のある担体を含んでなる組成物。導入遺伝子を細胞に送達する方法であって、細胞を請求項1ないし3または請求項6のいずれかに記載のAAVと接触させる工程を含んでなり、該rAAVが導入遺伝子を含んでなる上記方法。導入遺伝子を細胞に送達する薬剤の調製における、請求項1ないし3または請求項6のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項7ないし11のいずれかに記載の分子の使用。発明の詳細な説明本発明は、新規AAV血清型であるAAV8の核酸配列およびアミノ酸を提供する。またこれらAAV配列のフラグメントも提供する。これら各フラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。中でも望ましいAAV8フラグメントはvp1、vp2、vp3および超可変領域を含むcapタンパク質、rep78、rep68、rep52およびrep40を含むrepタンパク質、ならびにこれらタンパク質をコードする配列である。これらのフラグメントは種々のベクター系および宿主細胞で直ちに利用することができる。そのようなフラグメントは単独で、他のAAV8配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のAVVもしくは非AAVウイルス配列に由来する要素と組み合わせて使用することができる。1つの特に望ましい態様では、ベクターは本発明のAAV8capおよび/またはrep配列を含む。AAV8配列およびそのフラグメントはrAAVの生産に有用であり、そしてアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチンベクターとしても有用である。本発明はさらに核酸分子、遺伝子送達ベクターおよび本発明のAAV8配列を含む宿主細胞を提供する。適当なフラグメントは本明細書に提供する情報を使用して決定することができる。アライメントはインターネット上のウェブサーバーを通してアクセス可能なClustalWのように様々に公開または市販されて利用可能なマルチプルシークエンスアライメントプログラムMultipleSequenceAlignmentProgramを使用して行う。あるいはベクターNTIユーティリティVectorNTIutilitiesも使用する。ヌクレオチド配列の同一性の測定するために使用することができる、当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムがあり、それらには上記のプログラムに含まれるものを含む。別の例として、ポリヌクレオチド配列はFasta、GCGバージョン6.1のプログラムを使用して比較することができる。Fastaはクエリとサーチ配列との間で最高の重複領域のアライメントおよび配列同一性の割合を提供する。例えば核酸配列間の配列同一性の割合は、引用により本明細書に編入するGCGバージョン6.1に提供されているように、そのデフォルトパラメーター6のワードサイズ、およびスコアリングマトリックスについてはNOPAMファクターを用いてFastaを使用して決定することができる。同様なプログラム、例えばClustalXプログラムがアミノ酸アライメントを行うために利用可能である。一般にこれらのプログラムはデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。あるいは当業者は参照にしたアルゴリズムおよびプログラムにより提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたはアライメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。核酸またはそのフラグメントを指す時、用語実質的な相同性または実質的な類似性とは、適切なヌクレオチド挿入または欠損が別の核酸またはその相補鎖と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約95~99にヌクレオチド配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのオープンリーディングフレイム、または少なくとも15個のヌクレオチド長である他の適当なフラグメントである。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。アミノ酸またはそのフラグメントを指す時、用語実質的な相同性または実質的な類似性とは、適切なアミノ酸挿入または欠損が別のアミノ酸またはその相補鎖と最適に並べられた時に、並べられた配列の少なくとも約95~99にアミノ酸配列の同一性があることを示す。好ましくは相同性は完全長の配列、またはそのタンパク質、例えばcapタンパク質、repタンパク質、または少なくとも8個のアミノ酸、またはより望ましくは少なくとも15個のアミノ酸長であるそのフラグメントにわたる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。用語高度に保存されたとは、少なくとも80、好ましくは少なくとも90の同一性、そしてより好ましくは97より高い同一性を意味する。同一性は当業者に知られているアルゴリズムおよびコンピュータープログラムにより当業者が容易に決定できる。核酸配列の内容において同一性の割合または同一のという用語は、最大の対応について並べた時、2つの配列中で同じ残基を指す。配列同一性の比較の長さは、完全長のゲノム、完全長の遺伝子コード配列にわたることができ、または少なくとも約500~5000ヌクレオチドのフラグメントが望ましい。しかしより小さいフラグメント間、例えば少なくとも約9個のヌクレオチド、通常は少なくとも約20~24個のヌクレオチド、少なくとも約28~32個のヌクレオチド、少なくとも約36個以上のヌクレオチド間の同一性も望ましくなり得る。同様に配列同一性の割合は完全長のタンパク質またはそのフラグメントにわたるアミノ酸配列について容易に決定することができる。適当にはフラグメントは少なくとも約8個のアミノ酸長であり、そして最高約700個のアミノ酸であることができる。適当なフラグメントの例を本明細書に記載する。本明細書に記載するように、本発明のAAVキャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が他のAAV血清型に基づくベクターならびに他のウイルスベクターの効力を減少させる応用に特に良く適している。本発明のrAAVベクターはrAAV再投与および反復遺伝子治療に特に有利である。本発明のこれらのおよび他の態様および利点は、これからさらに詳細に記載する。本明細書および特許請求の範囲通して使用する用語含んでなるcompriseは、他の成分、要素、完全体integers、工程等を含むことができる。逆に用語からなるconsistsofおよびその変形は、他の成分、要素、完全体、工程等を含まない。I.AAV血清型8の配列A.核酸配列本発明のAAV8の核酸配列は、4396ヌクレオチドからなる図1[配列番号1]のDNA配列を含む。本発明のAAV8の核酸配列はさらに図1[配列番号1]に相補的である鎖、ならびに図1[配列番号1]およびその相補鎖に対応するRNAおよびcDNA配列を包含する。また本発明の核酸配列に含まれるのは、図1[配列番号1]およびその相補鎖の天然の変異体および工作した修飾である。そのような修飾には例えば当該技術分野で知られている標識、メチル化および1以上の自然に存在するヌクレオチドと縮重ヌクレオチドとの置換を含む。さらに本発明に含まれるのは、図1[配列番号1]に約90より高く、より好ましくは少なくとも約95、そして最も好ましくは少なくとも約98~99同一または相同的である核酸配列である。また本発明に含まれるのは、図1[配列番号1]のフラグメント、その相補鎖、それに相補的なcDNAおよびRNAである。適当なフラグメントは少なくとも15ヌクレオチド長であり、そして機能的フラグメント、すなわち生物学的に興味深いフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは選択的スプライスバリアント:vp1[図1、配列番号1のnt2121~4335];vp2[図1、配列番号1のnt2532~4335];およびvp3[図1、配列番号1のnt2730~4335]であるAAV8キャプシドの3つの可変タンパク質vpをコードする配列を含む。図1[配列番号1]の他の適当なフラグメントには、本明細書に記載するAAV8キャプシドタンパク質の出発コドンを含むフラグメント、およびvp1キャプシドタンパク質の超可変領域をコードするフラグメントを含む。さらに別のフラグメントには、rep78[図1、配列番号1のnt227に位置する開始コドン]、rep68[図1、配列番号1のnt227に位置する開始コドン]、rep52[図1、配列番号1のnt905に位置する開始コドン]およびrep40[図1、配列番号1のnt905に位置する開始コドン]を含むrepタンパク質をコードするものを含む。他の興味深いフラグメントには、本明細書に記載する方法により同定することができるAAV8逆方向末端反復、AAVP19配列、AAV8P40配列、rep結合部位およびターミナルリゾルートサイトterminalresolutesite:TRSを含むことができる。さらに他の適当なフラグメントが当業者には直ちに明らかとなるだろう。図面および配列表に提供する核酸配列を含むことに加えて、本発明は本発明のAAV血清型のアミノ酸配列、タンパク質およびペプチドを発現するように設計された核酸分子および配列を含む。すなわち本発明は以下の新規AAVアミノ酸配列およびこれらの配列および/またはその独自なフラグメントを使用して生成された人工AAV血清型をコードする核酸配列を含む。本明細書で使用する人工AAV血清型には限定するわけではないが、自然には存在しないキャプシドタンパク質を持つAAVを含む。そのような人工的キャプシドは本発明の新規AAV配列例えばvp1キャプシドタンパク質のフラグメントを、別のAAV血清型既知または新規から、同じAAV血清型の非連続部分から、非AAVウイルス供給源から、または非ウイルス供給源から得ることができるヘテロロガスな配列と組み合わせて使用して、任意の適切な技術により生成することができる。人工AAV血清型には限定するわけではないが、キメラAAVキャプシド、組換えAAVキャプシドまたはヒト化AAVキャプシドでよい。B.AAV8アミノ酸配列、タンパク質およびペプチド本発明はさらに本発明のAAV8核酸によりコードされるタンパク質およびそのフラグメント、および他の方法により生成されるAAV8アミノ酸を提供する。本発明はさらに合成、組換えまたは当業者に既知の他の技術を使用して生成される本発明の新規AAV血清型の配列を使用して生成されるAAV血清型を包含する。本発明は本発明の新規なAAV核酸配列から発現される新規AAVアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質に限定されず、そして例えば化学合成により、他の合成技法により、または他の方法によることを含む当該技術分野で既知な他の方法により生成されるアミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質を包含する。例えば任意の配列が種々の技術を使用して容易に生成される。適切な生産技法は当業者には周知である。例えばSambrooketal.、モレキュラークローニング:アラボラトリーマニュアルMolecularCloning:ALaboratoryManual、コールドスプリングハーバー出版コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。あるいはペプチドは周知な固相ペプチド合成法により合成することもできるMerrifieldJ.Am.Chem.Soc.,85:21491962;StewartandYoung、固相ペプチド合成フリーマンFreeman、サンフランシスコ、1969第27~62頁。これらのおよび他の適当な生産法は当業者の知識内であり、そして本発明を限定しない。特に望ましいタンパク質には上で確認したヌクレオチド配列によりコードされるAAVキャプシドタンパク質を含む。AAVキャプシドは選択的スプライス変異体である3つのタンパク質、vp1、vp2およびvp3を含んでなる。図2に提供される完全長の配列はvp1の配列である。AAV8キャプシドタンパク質にはvp1[配列番号2のaa1~737]、vp2[配列番号2のaa138~737]、およびvp3[配列番号2のaa203~737]およびそれらの機能的フラグメントを含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントは、超可変領域HPV間に位置する定常および可変領域を含む。キャプシドタンパク質の他の望ましいフラグメントにはHPV自体を含む。AAV2における配列多様性の領域を決定するために開発されたアルゴリズムでは、12の超可変領域HVRを生じ、その5個が重複するか、または4個の以前に記載された可変領域の一部である[Chiorinietal.,J.Virol,73:1309-191999;Rutledgeetal.,J.Virol,72:309-319]。このアルゴリズムおよび/または本明細書に記載するアライメント技術を使用して、新規AAV血清型のHVRを決定する。例えばAAV2vp1[配列番号4]の番号に関して、HVRは以下のように位置する:HVR1、aa146~152;HVR2aa182~186;HVR3、aa262~264;HVR4、aa381~383;HVR5、aa450~474;HVR6、aa490~495;HVR7、aa500~504;HVR8、aa514~522;HVR9、aa534~555;HVR10、aa581~594;HVR11、aa658~667;およびHVR12、aa705~719。ClustalXプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規AAVキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。AAV8キャプシドタンパク質のさらに他の望ましいフラグメントには、配列番号2のアミノ酸1~184、配列番号2のアミノ酸199~259;アミノ酸274~446;アミノ酸603~659;アミノ酸670~706;アミノ酸724~736;aa185~198;aa260~273;aa447~477;aa495~602;aa660~669;およびaa707~723を含む。さらにAAVキャプシドの他の適当なフラグメントの例には、AAV2[配列番号4]の番号付けで、aa24~42、aa25~28;aa81~85;aa133~165;aa134~165;aa137~143;aa154~156;aa194~208;aa261~274;aa262~274;aa171~173;aa413~417;aa449~478;aa494~525;aa534~571;aa581~601;aa660~671;aa709~723を含む。さらに他の望ましいフラグメントには例えばAAV7中の配列番号2のアミノ酸1~184、アミノ酸199~259;アミノ酸274~446;アミノ酸603~659;アミノ酸670~706;アミノ酸724~736;aa185~198;aa260~273;aa447~477;aa495~602;aa660~669;およびaa707~723を含む。ClustalXプログラムをデフォルト設定で使用して行う本明細書に提供されるアライメントを使用して、または他の市販されているか、もしくは公に利用可能なアライメントプログラムをデフォルト設定で使用して、当業者は本発明の新規AAVキャプシドの対応するフラグメントを容易に決定することができる。さらに他の望ましいAAV8タンパク質には、rep68/78およびrep40/52[配列番号3のaa1~625内に位置する]を含むrepタンパク質を含む。repタンパク質の適当なフラグメントには配列番号3のaa1~102;aa103~140;aa141~173;aa174~226;aa227~275;aa276~374;aa375~383;aa384~446;aa447~542;aa543~555;aa556~625を含むことができる。適当にはフラグメントは少なくとも8アミノ酸長である。しかし他の望ましい長さのフラグメントを容易に利用することができる。そのようなフラグメントは組換えで、または他の適当な手段、例えば化学合成により生成することができる。本発明はさらに本明細書に提供する配列情報を使用して同定される他のAAV8配列を提供する。例えば本明細書に提供する上記AAV8配列、感染性AAV8はゲノムウォーキング技術Siebertetal.,1995,NucleicAcidsResearch,23:1087-1088,Friezner-Degenetal.,1986,J.Biol.Chem.261:6972-6985,BDBioscienceクロンテックClontech、パロアルト、カリフォルニア州を使用して単離することができる。ゲノムウォーキングは、本発明の方法に従い同定される新規配列に隣接する配列の同定および単離に特によく適している。この技術は本明細書に提供する新規AAVキャプシドおよびrep配列に基づき、新規AAV8血清型の逆方向末端反復ITRsを単離するためにも有用である。本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組換え生産、化学合成または他の合成手段を含む任意の適当な手段により生産することができる。そのような生産法は当業者の知識の範囲内であり、そして本発明を限定しない。IV.AAV8キャプシドを持つrAAVの生産本発明は新規な野生型AAV8を包含し、その配列はこれらウイルスが天然に付随するDNAおよび/または細胞物質を含まない。別の観点では、本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用な分子の生産に、本発明の新規AAV配列そのフラグメントを含むを利用する分子を提供する。別の観点では本発明は標的細胞にヘテロロガスな遺伝子または他の核酸配列を送達するのに有用なウイルスベクターの生産に、本発明の新規AAV8配列そのフラグメントを含むを利用する分子を提供する。AAV8配列を含む本発明の分子は、宿主細胞に送達され得る任意の遺伝的要素ベクター、例えばその上に持つ配列を転移する裸のDNA、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、非ウイルス性の送達媒体例えば脂質に基づく担体中のタンパク質、ウイルス等を含む。選択したベクターはトランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の適当な方法により送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用する方法は核酸操作の技術を持つ者に知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばSambrooketal.,モレキュラークローニング:アラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。1つの態様では、本発明のベクターは最低限AAV8キャプシドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む。別の態様では、本発明のベクターは最低限AAV8repタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列を含む。場合によりそのようなベクターはAAVcapおよびrepタンパク質の両方を含むことができる。AAVrepおよびcapの両方が提供されるベクターでは、AAVrepおよびAAVcap配列が両方ともAAV8起源であることができる。あるいは本発明はrep配列がcap配列を提供している血清型とは異なるAAVの血清型に由来するベクターを提供する。1つの態様では、repおよびcap配列は別の供給源例えば別のベクター、または宿主細胞およびベクターから発現される。別の態様では、これらrep配列は異なるAAV血清型のcap配列とフレイム内で融合して、キメラAAVベクターを形成する。場合により本発明のベクターはさらにAAV5’ITRおよびAAV3’ITRに挟まれた選択した導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子を含む。このように1つの態様では、本明細書に記載するベクターは単一のAAV血清型例えばAAV8に由来することができる完全なAAVキャプシドをコードする核酸配列を含む。そのようなキャプシドは配列番号2のアミノ酸1~738を含んでなることができる。あるいはこれらのベクターはヘテロロガスなAAVまたは非AAVキャプシドタンパク質またはそれらのフラグメントに融合したAAV8キャプシドの1以上のフラグメントを含む人工キャプシドをコードする配列を含む。これらの人工キャプシドタンパク質は、AAV8キャプシドの非連続部分から、または他のAAV血清型のキャプシドから選択される。例えばrAAVはvp2および/もしくはvp3から、またはvp1から選択される1以上のAAV8キャプシド領域を含んでなるキャプシドタンパク質、またはAAV8、配列番号2のアミノ酸1~184、アミノ酸199~259;アミノ酸274~446;アミノ酸603~659;アミノ酸670~706;アミノ酸724~738から選択されるそれらのフラグメントを有することができる。別の例では、vp3タンパク質の開始コドンをGTGに改変することが望ましいかもしれない。あるいはrAAVは、本明細書で同定される1以上のAAV血清型8のキャプシドタンパク質超可変領域、または限定するわけではないがAAV8キャプシドのaa185~198;aa260~273;aa447~477;aa495~602;aa660~669;およびaa707~723を含む他のフラグメントを含んでもよい。配列番号2を参照にされたい。これらの修飾は発現、収量を上げ、かつ/または選択した発現系における精製を向上させ、あるいは別の所望する目的例えばトロピズムを変えるか、または中和抗体エピトープを改変するとすることができる。本明細書に記載するベクター、例えばプラスミドは様々な目的に有用であるが、特にAAV配列またはそのフラグメントを含んでなるキャプシドを含有するrAAVの生産での使用に良く適している。rAAVを含むこれらのベクター、それらの要素、構築および使用を本明細書に詳細に記載する。1つの観点では、本発明はAAV血清型8キャプシドまたはその部分を有する組換えアデノ随伴ウイルスAAVの生成法を提供する。そのような方法には本明細書で定義するアデノ随伴ウイルスAAV血清型8キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列;機能的rep遺伝子;最低限AAV逆方向末端反復ITRsおよび導入遺伝子を含んでなるミニ遺伝子;およびミニ遺伝子をAAV8キャプシドタンパク質にパッケージングすることを可能とする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。AAVミニ遺伝子をAAVキャプシドへパッケージングするために、宿主細胞で培養されることが必要な要素は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは必要な要素の1以上例えばミニ遺伝子、rep配列、cap配列および/またはヘルパー機能は、当業者に知られている方法を使用して1以上の必要な要素を含むように工作した安定な宿主細胞により提供され得る。最も適当には、そのような安定な宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下に必要な要素1つまたは複数を含む。しかし必要な要素1つまたは複数は構成的プロモーターの制御下でもよい。適当な誘導性および構成的プロモーターの例は本明細書において導入遺伝子を用いた使用に適する調節要素の考察で提供する。さらに別の選択では、選択した安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下に選択した成分1つまたは複数を、そして1以上の誘導性プロモーターの制御下に他の選択した成分1つまたは複数を含むことができる。例えば、293細胞これはE1ヘルパー機能を構成的プロモーターの制御下に含むに由来するが、repおよび/またはcapタンパク質を誘導性プロモーターの制御下に含む安定な宿主細胞を作成することができる。さらに別の安定な宿主細胞を当業者は作成することができる。本発明のrAAVを生産するために必要なミニ遺伝子、rep配列、cap配列およびヘルパー機能は、その上に持つ配列を移す任意の遺伝的要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択した遺伝的要素は本明細書に記載する方法を含む任意の適当な方法により送達され得る。本発明の任意の態様を構成するために使用する方法は、核酸操作における当業者には知られており、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術を含む。例えばSambrooketal.モレキュラークローニング:アラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照にされたい。同様にrAAVビリオンの作成法も周知であり、そして適当な方法の選択が本発明を限定することはない。例えばK.Fisheretal,J.Virol.,70:520-5321993および米国特許第5,478,745号明細書を参照にされたい。特に言及しない限り、本明細書に記載するAAVITRsおよび他の選択したAAV成分は限定するわけではないがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9および本発明の新規血清型AAV8を含む任意のAAV血清型の中から容易に選択することができる。これらのITRsまたは他のAAV成分は、AAV血清型から当業者が利用可能な技術を使用して容易に単離され得る。そのようなAAVは学術的、市販の、または公的な供給源例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニア州から単離または得ることができる。あるいはAAV配列は、技術文献またはGenBank、PubMed等のようなデーターベースから利用できるような公開された配列を参照にすることにより、合成または適当な手段を通して得ることができる。A.ミニ遺伝子ミニ遺伝子は最低限、導入遺伝子およびその調節配列、および5’および3’AAV逆方向末端反復ITRsを含んでなる。1つの望ましい態様では、AAV血清型2のITRsを使用する。しかし他の適当な血清型に由来するITRも選択することができる。このミニ遺伝子はキャプシドタンパク質にパッケージングされ、そして選択した宿主細胞に送達される。1.導入遺伝子導入遺伝子は、問題のポリペプチド、タンパク質または他の産物をコードする導入遺伝子を挟むベクター配列にヘテロロガスな核酸配列である。核酸コード配列は、宿主細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳および/または発現を可能とする様式で調節成分に操作可能に連結される。導入遺伝子配列の組成は、生成するベクターに課される使用に依存するだろう。例えば導入遺伝子配列の1つの種類はレポーター配列を含み、これは発現により検出可能なシグナルを生産する。そのようなレポーター配列には限定するわけではないが、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼLacZ、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質GFP、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、ルシフェラーゼ、例えばCD2、CD4、CD8を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集タンパク質、および当該技術分野で周知の他のものこれらに対する高親和性抗体が存在するか、あるいは通例の手段により生成することができる、ならびに中でもとりわけ赤血球凝集素またはMycに由来する抗原のタグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするDNA配列を含む。これらのコード配列はそれらの発現を駆動する調節要素と会合した時、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞ソーティングアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイELISA、ラジオイムノアッセイRIAおよび免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えばマーカー配列がLacZ遺伝子である場合、シグナルを持つベクターの存在は、ベータガラクトシダーゼ活性に関するアッセイにより検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを持つベクターはルミノメーター中での色または光の生産により視覚的に測定することができる。しかし望ましくは、導入遺伝子はタンパク質、ペプチド、RNA、酵素または触媒RNAのような生物学および医学で有用な産物をコードする非-マーカー配列である。望ましいRNA分子にはtRNA、dsRNA、リボソームRNA、触媒RNAおよびアンチセンスRNAを含む。有用なRNA配列の1例は、処置する動物中で標的核酸配列の発現を無効にする配列である。導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常レベルよりも低く発現される欠損、または機能的な遺伝子産物が発現されない欠損を含み得る遺伝子欠損を矯正するか、または軽減するために使用することができる。好適な種類の導入遺伝子配列は、宿主細胞で発現する治療用タンパク質またはペプチドをコードする。本発明はさらに、例えば多サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝子欠失を矯正するか、または改善するために多数の導入遺伝子を使用することを含む。特定の状況ではタンパク質の各サブユニットをコードするために、または異なるペプチドまたはタンパク質をコードするために種々の導入遺伝子を使用することができる。これはタンパク質サブユニットをコードするDNAのサイズが大きい時、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子またはジストロフィンタンパク質について望ましい。細胞が多サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞を異なる各サブユニットを含む組換えウイルスに感染させる。あるいはタンパク質の種々のサブユニットが同じ導入遺伝子によりコードされてもよい。この場合、1つの導入遺伝子が各サブユニットをコードするDNAを含み、各サブユニットのDNAは内部リボソーム結合部位IRESにより分けられている。これは各サブユニットをコードするDNAのサイズが小さい時、例えばサブユニットをコードするDNAおよびIRESの全サイズが5キロベース未満である時に望ましい。IRESに対する代わりとして、DNAは2Aペプチドこれは翻訳後反応eventで自己開裂するをコードする配列により分けられてもよい。例えば、M.L.Donnelly,etal.,J.Gen.Virol.78Pt1:13-21Jan1997;Furler,S.,etal.,GeneTher.,811:864-873June2001;KlumpH.,etal.,GeneTher.,810:811-817May2001を参照にされたい。この2AペプチドはIRESよりも有意に小さく、スペースが限定因子となる時の使用によく適している。しかし選択した導入遺伝子は任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば研究に望ましい産物もコードすることができる。適切な導入遺伝子は当業者により容易に選択され得る。導入遺伝子の選択が本発明を限定するとは考えられない。2.調節要素ミニ遺伝子に関して上記で確認した主要な要素に加えて、ベクターは本発明により生産されたプラスミドベクターでトランスフェクトした、またはウイルスに感染した細胞での転写、翻訳および/または発現を可能とする様式で導入遺伝子に操作可能に連結された、通常の必要な制御要素も含む。本明細書で使用するように操作可能に連結した配列には、問題の遺伝子に連続する発現制御配列、およびトランスで、つまり一定の距離を離れて作用して問題の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列には適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列;スプライシングおよびポリアデニレーションポリAシグナルのような効率的なRNAプロセッシングシグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を強化する配列すなわちKozak共通配列;タンパク質の安定性を強化する配列;および所望により、コードされた産物の分泌を強化する配列を含む。天然の、構成的な、誘導性のおよび/または組織特異的なプロモーターを含む莫大な数の発現制御配列が当該技術分野では知られており、そして利用することができる。構成的プロモーターの例には限定するわけではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルスRSVLTRプロモーター場合によりRSVエンハンサーを含む、サイトメガロウイルスCMVプロモーター場合によりCMVエンハンサーを含む[例えばBoshartetal.,Cell,41:521-5301985を参照にされたい]、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼPGKプロモーターおよびEF1αプロモーター[インビトロゲンInvitrogen]を含む。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、そして外から供給される化合物、温度のような環境的因子、または特別な生理学的状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、あるいは複製している細胞のみで調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、限定するわけではないがインビトロゲン、クロンテックClontechおよびアリアドAriadを含む様々な商業的供給源から入手することができる。多くの他の系が記載され、そして当業者により容易に選択され得る。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛-誘導性ヒツジメタロチオネインMTプロモーターおよびデキサメタゾンDex-誘導性マウス乳癌ウイルスMMTVプロモーター、T7ポリメラーゼプロモーター系[国際公開第98/10088号パンフレット];エクジソン昆虫プロモーター[Noetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-33511996]、テトラサイクリン-抑制系[Gossenetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-55511992]、テトラサイクリン-誘導系[Gossenetal.,Science,268:1766-17691995、またHarveyetal.,Curr,Opin.Chem.Biol.,2:512-5181998を参照にされたい]、RU486-誘導系[Wangetal.,Nat.Biotech.,15:239-2431997およびWangetal.,GeneTher.,4:432-4411997]およびラパマイシン-誘導系[Magarietal.,J.Clin.Invest.100:2865-28721997]を含む。この内容において有用となり得る誘導性プロモーターの他の例には、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製している細胞のみにより調節されるプロモーターを含む。別の態様では、導入遺伝子に天然のプロモーターを使用する。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模するべきであることが望まれる時に好適となり得る。天然のプロモーターは導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発育的に、または組織特異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時に使用することができる。さらなる態様では、エンハンサーエレメント、ポリアデニレーション部位またはKozak共通配列のような他の天然の発現制御要素を使用して、天然の発現を模することもできる。導入遺伝子の別の態様には、組織-特異的プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現が望まれる場合、筋肉中で活性なプロモーターを使用するべきである。これらには骨格筋β-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成の筋肉プロモーターを含むLietal.,Nat.Biotech.,17:241-2451999を参照にされたい。組織-特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓アルブミン、Miyatakeetal.,J.Virol.,71:5124-321997;B型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandigetal.,GeneTher.,3:1002-91996;アルファ-フェトプロテインAFP、Arbuthnotetal.,Hum.Gene.Ther.,7:1503-141996、骨のオステオカルシンSteinetal.,Mol.Biol.Rep.,24:185-961997;骨シアロプロテインChenetal.,J.BoneMiner.Res.,11:654-641996,リンパ球CD2、Hansaletal.,J.Immunol.,161:1063-81998;免疫グロブリン重鎖;T細胞レセプター鎖、ニューロン-特異的エノラーゼNSEプロモーターのような神経性Andersenetal.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-151993、ニューロフィラメント軽-鎖遺伝子Picciolietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-51991、およびニューロン-特異的vgf遺伝子Picciolietal.,Neuron,15:373-841995について知られている。場合により治療的に有用な導入遺伝子を持つプラスミドは、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシン耐性をコードする配列を含むことができる選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を含んでもよい。そのような選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子好ましくは本発明の方法によりレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置するを使用して、アンピシリン耐性のような細菌細胞中でのプラスミドの存在のシグナルを出すことができる。プラスミドの他の成分には、複製起点を含むことができる。これらおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は通例であり、そして多くのそのような配列を利用することができる[たとえばSambrooketal.、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい]。導入遺伝子、プロモーター/エンハンサーおよび5’および3’ITRsの組み合わせは、本明細書で簡便性のためにミニ遺伝子と呼ぶ。本発明の教示によれば、そのようなミニ遺伝子の設計は通例の技術により作成することができる。3.ミニ遺伝子のパーケッジンング宿主細胞への送達ミニ遺伝子は宿主細胞へ送達される任意の適当なベクター、例えばプラスミド上で運ぶことができる。本発明に有用なプラスミドは、それらが複製、そして場合により原核細胞、哺乳動物細胞または両方への組み込みに適当となるように工作することができる。これらのプラスミドまたは5’AAVITR-ヘテロロガス分子-3’ITRを持つ他のベクターは、真核および/または原核細胞中でのミニ遺伝子の複製およびこれらの系に関する選択マーカーを可能とする配列を含む。選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子は、中でもジェネティシン、ハイグロマイシンまたはプリマイシンpurimycin耐性をコードする配列を含むことができる。プラスミドはアンピシリン耐性のような細菌細胞中でのベクターの存在の信号を出すために使用できる特定の選択可能なレポーターまたはマーカー遺伝子を含むこともできる。プラスミドの他の成分には複製起点およびエプスタインバーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系のようなアンプリコンを含むことができる。このアンプリコン系または他の類似のアンプリコン成分は細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能とする。好ましくはミニ遺伝子を持つ分子は細胞にトランスフェクトされ、ここで一時的に存在することができる。あるいはミニ遺伝子5’AAVITR-ヘテロロガス分子-3’ITRを持つは、染色体にまたはエピソームのいずれかとして宿主細胞のゲノムに安定に組込まれることができる。特定の態様では、ミニ遺伝子は場合により頭-対-頭、頭-対-尾または尾-対-尾のコンカテマーの多コピーで存在することができる。適当なトランスフェクション技術が知られており、そしてミニ遺伝子を宿主細胞に送達するために容易に利用することができる。一般にミニ遺伝子を含んでなるベクターをトランスフェクションにより送達する時、ベクターは約5μg~約100μgのDNA、約10~約50μgのDNAから約1×104細胞~約1×1013細胞、または約105細胞の量で送達される。しかし宿主細胞に対するベクターDNAの相対的量は、選択するベクター、送達法および選択する宿主細胞のような因子を考慮して調整することができる。B.RepおよびCap配列ミニ遺伝子に加えて、宿主細胞は宿主細胞中でAAV8キャプシドタンパク質またはAAV8キャプシドのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質の発現を駆動する配列、およびミニ遺伝子中に見いだされるAAVITRsの血清型と同じ血清型または交差-相補血清型のrep配列を含む。AAVcapおよびrep配列は上記のようにAAVの供給源から独立して得ることができ、そして上記のように当該技術分野で知られている任意の既知の様式で宿主細胞に導入することができる。さらにAAV8キャプシド中のAAVベクターをシュードタイプ化する時、必須の各repタンパク質をコードする配列はAAV8により供給されてもよく、またはrepタンパク質をコードする配列は異なるAAV血清型例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9により供給されてもよい。例えばrep78/68配列はAAV2に由来することができ、一方rep52/40配列はAAV8に由来することができる。1つの態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にキャプシドタンパク質を安定に含む。最も望ましくは、この態様ではキャプシドタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様ではキャプシドタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質は宿主細胞で選択したキャプシドタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達することができる。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはrAAVをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばrep配列も持つ。別の態様では、宿主細胞は上記のような適当なプロモーターの制御下にrep配列を安定に含む。最も望ましくはこの態様では、必須なrepタンパク質が誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様では、repタンパク質は宿主細胞にトランスで供給される。宿主細胞にトランスで送達される時、repタンパク質は宿主細胞で選択したrepタンパク質の発現を支配するために必要な配列を含むプラスミドを介して送達される。最も望ましくは宿主細胞にトランスで送達される時、キャプシドタンパク質を持つプラスミドはrAAVをパーケッジンングするために必要な他の配列、例えばrepおよびcap配列も持つ。このように1つの態様では、repおよびcap配列は1つの核酸分子で宿主細胞にトランスフェクトされ、そしてエピソープとして細胞中で安定に存在することができる。別の態様では、repおよびcap配列は細胞の染色体に安定に組込まれる。別の態様は宿主細胞で一時的に発現されるrepおよびcap配列を有する。例えばそのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は5’から3’へ、プロモーター、プロモーターとrep遺伝子配列の開始部位との間に介在する任意のスペーサー、AAVrep遺伝子配列およびAAVcap遺伝子配列を含んでなる。場合によりrepおよび/cap配列は宿主細胞に導入される他のDNA配列を含むベクターで供給してもよい。例えばベクターはミニ遺伝子を含んでなるrAAV構築物を含むことができる。ベクターはヘルパー機能をコードする1以上の遺伝子、例えばアデノウイルスタンパク質E1、E2aおよびE4ORF6、およびVAIRNAの遺伝子を含んでなることができる。好ましくはこの構築物に使用するプロモーターは、当業者に知られているか、または上記で検討した任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。1つの態様ではAAVP5プロモーター配列が使用される。任意のこれら配列を提供するためのAAVの選択が本発明を限定することはない。別の好適な態様では、repのプロモーターは導入遺伝子の調節要素との関連で上に検討したような誘導性プロモーターである。rep発現の1つの好適なプロモーターはT7プロモーターである。T7プロモーターにより調節されるrep遺伝子およびcap遺伝子を含んでなるベクターは、T7ポリメラーゼを構成的または誘導的に発現するいずれかの細胞にトランスフェクトまたは形質転換される。例えば1998年3月12日に公開された国際公開第98/10088号パンフレットを参照にされたい。スペーサーはベクターの設計における任意の要素である。スペーサーはプロモーターとrep遺伝子のATG開始部位との間に介在するDNA配列である。スペーサーは任意の所望する設計を有することができる;すなわちスペーサーはヌクレオチドのランダムな配列でよく、あるいはスペーサーはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは典型的には開始/終止およびポリA部位を包含する遺伝子を含むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非コードDNA配列、反復非コード配列、転写制御を含まないコード配列または転写制御を含むコード配列であることができる。2つの例示的なスペーサー配列源はファージラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは例えば中でもギブコGibcoまたはインビトロゲンInvitrogenから市販されている。スペーサーはrep52、rep40およびcap遺伝子産物の発現を正常レベルにしたまま、rep78およびrep68遺伝子産物の発現を下げるために十分な任意のサイズでよい。したがってスペーサーの長さは約10bp~約10.0kbpの範囲、好ましくは約100bp~約8.0kbpの範囲となり得る。組換えの可能性を減少させるために、スペーサーは好ましくは2kbp長よりも短く;しかし発明を限定するものではない。repおよびcapを提供する分子1つまたは複数は宿主細胞に一時的に存在できるがすなわちトランスフェクションを介して、repおよびcapタンパク質の1つまたは両方およびそれらの発現を制御するプロモーター1つまたは複数が、宿主細胞中で例えばエピソームとして、または宿主細胞の染色体に組み込まれることにより安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構成するために使用する方法は、上記に引用した中に記載されるような通例の遺伝子工学または組換え工学技術である。この明細書では本明細書で提供する情報を使用して特別な構築物の具体例を提供するが、当業者は他の適当な構築物をスペーサー、P5プロモーターおよび少なくとも1つの翻訳開始および終止シグナル、および任意のポリアデニレーション部位の付加を含む他の要素の選択を使用して選択し、そして設計することができる。本発明の別の態様では、repまたはcapタンパク質は宿主細胞により安定に提供され得る。C.ヘルパー機能パッケージング宿主細胞も、本発明のrAAVをパッケージングするためにヘルパー機能を必要とする。場合によりこれらの機能は、ヘルペスウイルスにより供給される。最も望ましくは必要なヘルパー機能はそれぞれ、上記のおよび/またはバージニア州米国マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCを含む様々な供給源から入手可能であるようなヒトまたは非ヒト霊長類のアデノウイルス源から提供される。現在好適な1つの態様では、宿主細胞はE1a遺伝子産物、E1b遺伝子産物、E2a遺伝子産物および/またはE4ORF6遺伝子産物で供給されるか、かつ/またはそれらを含む。宿主細胞はVAIRNAのような他のアデノウイルス遺伝子も含むことができるが、これらの遺伝子は必要ではない。好適な態様では、宿主細胞に他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能は存在しない。E1a遺伝子産物を発現するアデノウイルスDNAとは、E1aまたは任意の機能的E1aタンパク質をコードする任意のアデノウイルス配列を意味する。E2a遺伝子産物を発現するアデノウイルスDNAおよびE4ORF6遺伝子産物を発現するアデノウイルスDNAも同様に定義する。またアデノウイルス遺伝子またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾も含む。そのような修飾は幾つかの様式でアデノウイルス機能を強化するための通例の遺伝子工学または突然変異誘発技術により意図的に、ならびに自然に存在するそれらの対立遺伝子変異体により導入され得る。これらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためのそのような修飾およびDNAの操作法は、当業者には知られている。アデノウイルスE1a、E1b、E2aおよび/またはE4ORF6遺伝子産物、ならびに任意の他の所望するヘルパー機能は、細胞でそれらの発現を可能とする任意の手段を使用して提供することができる。これら産物をコードする各配列は別のベクター上に存在するか、または1以上の遺伝子が同じベクター上に存在してもよい。ベクターはプラスミド、コスミドおよびウイルスを含む当該技術分野で既知の、または上に開示した任意のベクターでよい。ベクターの宿主細胞への導入は、中でもトランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む当該技術分野で既知の手段により、または上に開示したように達成することができる。1以上のアデノウイルス遺伝子を、エピソームとして安定に発現する宿主細胞のゲノムに安定に組込むか、または一時的に発現させることができる。遺伝子産物はエピソーム上で、または安定に組み込まれてすべてが一時的に発現されるか、あるいは遺伝子産物の幾つかが安定に発現されると同時に、他の産物は一時的に発現される。さらに各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは、例えば生物または細胞の特異的な生理学的状態すなわち分化状態により、または複製中であるか、または静止細胞、あるいは例えば外から加えられた因子により調節され得る。D.宿主細胞およびパッケージング細胞系宿主細胞自体は原核例えば細菌細胞、および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含む任意の生物から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は限定するわけではないがA549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、VERO、WI38、HeLa、293細胞機能的アデノウイルスE1を発現する、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、およびヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来する初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を含む任意の哺乳動物種から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定せず;哺乳動物細胞の種類、すなわち繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等も本発明を限定しない。使用する細胞の要件は、細胞がE1、E2aおよび/またはE4ORF6以外のアデノウイルス遺伝子を持たず;細胞はrAAVの生産中に混入ウイルスの相同的組換えを生じる可能性がある他の任意の他のウイルス遺伝子を含まず;そして細胞はDNAの感染またはトランスフェクション、およびトランスフェクトしたDNAの発現を行うことができる。好適な態様では、宿主細胞は細胞に安定にトランスフェクトされたrepおよびcapを有するものである。本発明に有用な1つの宿主細胞は、repおよびcapをコードする配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスE1、E2aおよびE4ORF6DNAおよび上記のミニ遺伝子を持つ構築物でトランスフェクトされた宿主細胞である。B-50PCT/US98/19463または米国特許第5,658,785号明細書に記載された細胞のような安定なrepおよび/またはcap発現細胞系も同様に使用することができる。別の望ましい宿主細胞はE4ORF6を発現するために十分な最少のアデノウイルスDNAを含む。さらに別の細胞系は、本発明のAAV8repおよび/またはAAV8cap配列を使用して構築することができる。本発明に従い宿主細胞の調製には選択したDNA配列の集合のような技術を含む。この集合は、通常の技術を利用して行うことができる。そのような技術には周知であり、そしてSambrooketal.,同上に記載されているcDNAおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法および所望のヌクレオチド配列を提供する他の適当な方法と組み合わせたアデノウイルスおよびAAVゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用を含む。分子プラスミドまたはウイルスとしての宿主細胞への導入も、当業者に既知の技術を使用して、そして本明細書を通して検討するように行うことができる。好適な態様では、標準的なトランスフェクション技術、例えばCaPO4トランスフェクションまたは電気穿孔、および/またはハイブリッドアデノウイルス/AAVベクターによるヒト胚性腎細胞系HEK293トランスに作用するE1タンパク質を提供する機能的アデノウイルスE1遺伝子を含むヒト腎臓細胞系のような細胞系への感染を使用する。当業者により作成されるAAV8に基づくベクターは、AA8に対する中和抗体がヒトの群で見いだされていないので、選択した宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達に有益である。当業者は当業者に知られている様々な技術を使用して、本明細書で提供されるAAV8キャプシドタンパク質を含む他のrAAVウイルスベクターを容易に調製することができる。同様にAAV8配列および他の血清型のAAVキャプシドを含むさらに他のrAAVウイルスベクターを調製することもできる。当業者は本発明のAAV8配列を、インビトロ、エクスビボまたはインビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系での使用に容易に適合させることができると容易に理解するだろう。同様に当業者は種々のrAAVおよび非rAAVベクター系で使用するために、本発明のAAV8ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、中でも例えばレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含む。これらベクター系の選択は本発明を限定しない。このように本発明はさらに、本発明の新規AAVの核酸およびアミノ酸配列を使用して生成したベクターを提供する。そのようなベクターは治療用分子の送達およびワクチン処方における使用を含む様々な目的に有用である。治療用分子の送達に特に望ましいのは、本発明の新規AAVのキャプシドを含有する組換えAAVである。本発明の新規AAV配列を含むこれらまたは他のベクター構築物をワクチン処方に、例えばサイトカインとの同時送達に、または免疫原自体の送達に使用することができる。V.組換えウイルスおよびその使用本明細書に記載する技術を使用して、当業者は本発明の血清型8のキャプシドを有するか、またはAAV8の1以上のフラグメントを含むキャプシドを有するrAAVを生成することができる。1つの態様では、単一の血清型、例えばAAV8[配列番号2]に由来する完全長のキャプシドを利用することができる。別の態様では、別の選択したAAV血清型に由来するか、またはAAV8のヘテロロガスな部分に由来する配列に枠内で融合したAAV8の1以上のフラグメントを含む完全長のキャプシドを生成することができる。例えばrAAVはAAV8の1以上の新規な超可変領域配列を含むことができる。あるいは本発明の独自なAAV8配列を、他のウイルスまたは非ウイルス配列を含む構築物に使用することができる。場合により組換えウイルスは1以上のAAV8repタンパク質をコードするAAV8rep配列を持つことができる。A.ウイルスの送達別の観点では、本発明は導入遺伝子を宿主に送達するための方法を提供し、この方法には選択した宿主細胞を本発明のAAV8配列またはその機能的フラグメントを用いて生成した組換えウイルスベクターでトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。送達法は当業者には周知であり、そして本発明を限定しない。1つの望ましい態様では、本発明はAAV8が媒介する導入遺伝子の宿主への送達法を提供する。この方法には選択した導入遺伝子およびAAV8キャプシドタンパク質の発現を支配する配列の制御下に選択した導入遺伝子を含む組換えウイルスベクターで、選択した宿主細胞をトランスフェクトまたは感染させることが含まれる。場合により選択したAAV血清型に対する抗体の存在について、宿主からのサンプルを最初にアッセイすることができる。中和抗体を検出するための様々なアッセイ形式が当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は本発明を限定しない。例えばFisheretal.,NatureMed.,33:306-3121997年3月およびW.C.Manningetal,HumanGeneTherapy,9;477-4851998年3月1日。このアッセイの結果を使用して、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不存在により、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含むどのAAVベクターが送達に好適であるかを決定することができる。この方法の1つの観点では、AAV8キャプシドタンパク質を持つベクターの送達が、異なる血清型のAAVキャプシドタンパク質を持つベクターを介する遺伝子の送達の前もしくは後に行われる。すなわちrAAVベクターを介する遺伝子送達は、選択した宿主細胞に反復して遺伝子を送達するために使用することができる。望ましくは続いて投与するrAAVベクターは最初のrAAVベクターと同じ導入遺伝子を運ぶが、続いて投与されるベクターは最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含む。例えばもし最初のベクターがAAV8キャプシドタンパク質を有するならば、続いて投与されるベクターは他の血清型の中から選択されるキャプシドタンパク質を有することができる。上記の組換えベクターは公開された方法に従い宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合性のある担体中に懸濁されたrAAVを、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与することができる。適当な担体は転移するウイルスが向けられる兆候の観点から当業者により容易に選択され得る。例えば1つの適当な担体には種々の緩衝化溶液を用いて配合される塩水例えばリン酸緩衝化生理食塩水を含む。他の例示担体には滅菌塩水、ラクトース、シュクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水を含む。担体の選択は本発明を限定しない。場合により本発明の組成物はrAAVおよび担体1つまたは複数に加えて、保存剤または化学的安定化剤のような他の通例の製薬学的成分を含むことができる。適当な例示的保存剤にはクロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。適当な化学的安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンを含む。ベクターは細胞をトランスフェクトし、そして医学的分野における当業者により決定され得る不適当な副作用を与えずに、または医学的に許容され得る生理学的効果で治療的利益を提供するために十分なレベルの遺伝子転移および発現を提供するために十分な量で投与される。通例の、そして製薬学的に許容され得る投与経路には限定するわけではないが、所望する器官例えば肝臓または肺への直接送達、経口、吸入、鼻内、気管内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は所望により組み合わせることができる。ウイルスベクターの投薬用量は、処置する状態、患者の年齢、体重および健康のような因子に主に依存し、そして患者間で変動し得る。例えばウイルスベクターの治療に有効なヒトへの投薬用量は、一般に約1×109~約1×1016ゲノムウイルスベクターの濃度を含む約1ml~約100ml溶液の範囲内である。好適なヒトへの投薬用量は約1×1013~1×1016AAVゲノムとなり得る。投薬用量は副作用に対して治療的利益のバランスを取るように調整され、そしてそのような投薬用量は組換えベクターを使用する治療的応用に依存して変動することができる。導入遺伝子の発現レベルは投薬頻度を決定するために監視することができ、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含むAAVベクターをもたらす。場合により治療目的に記載されたものに類似する投薬計画を、本発明の組成物を使用して免疫感作するために利用することができる。本発明のAAV8を含むベクターにより送達するための治療用産物および免疫原性産物の例を以下に提供する。これらのベクターは本明細書に記載するように、種々の治療用またはワクチン接種計画に使用することができる。さらにこれらのベクターは1以上の他のベクターまたは有効成分と組み合わせて、望ましい治療用かつ/またはワクチン接種計画で送達され得る。B.治療用の導入遺伝子導入遺伝子によりコードされる有用な治療用産物には、限定するわけではないがインスリン、グルカゴン、成長ホルモンGH、副甲状腺ホルモンPTH、成長ホルモン放出因子GRF、濾胞刺激ホルモンFSH、黄体形成ホルモンLH、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンhCG、血管内皮増殖因子VEGF、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子GCSF、エリトロポエチンEPO、結合組織増殖因子CTGF、塩基性繊維芽細胞増殖因子bFGF、酸性繊維芽細胞増殖因子aFGF、上皮増殖因子EGF、血小板由来増殖因子PDGF、インスリン増殖因子IおよびIIIGF-IおよびIGF-II、TGFα、アクチビン、インヒビンを含むトランスフォーミング増殖因子αスーパーファミリーの任意のもの、あるいは任意の骨形成タンパク質BMPのBMPs1~15、増殖因子のヒレグリン/ニューレグリン/ARIA/neu分化因子NDFファミリーの任意のもの、神経増殖因子NGF、脳由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィンNT-3およびNT-4/5、毛様体神経栄養因子CNTF、グリア細胞株由来神経栄養因子GDNF、ノルチュリンneurturin、アグリン、セマフォリン/コラポスリンファミリーの任意のもの、ネトリン-1およびネトリン-2、肝細胞増殖因子HGF、エフリン類ephrins、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび増殖および分化因子を含む。他の有用な導入遺伝子産物には、限定するわけではないがトロンボポエチンTPO、インターロイキンILIL-1からIL-18、単球誘引タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、flk-2/flt3リガンドのようなサイトカインおよびリンホカインを含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により生産される遺伝子産物も、本発明に有用である。これらには限定するわけではないが免疫グロブリンIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞レセプター、キメラT細胞レセプター、単鎖T細胞レセプター、クラスIおよびクラスIIMHC分子ならびに工作された免疫グロブリンおよびMHC分子を含む。有用な遺伝子産物には補体調節タンパク質、膜コファクタータンパク質membranecofactorprotein:MCP、崩壊促進因子DAF、CR1、CF2およびCD59のような補体調節タンパク質を含む。さらに他の有用な遺伝子産物には、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本発明は、低密度リポタンパク質LDLレセプター、高密度リポタンパク質HDLレセプター、超低密度リポタンパク質VLDLレセプターおよびスカベンジャーレセプターを含むコレステロール調節に関するレセプターを包含する。また本発明は、グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプター、ビタミンDレセプターおよび他の核レセプターを含むステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーの員のような遺伝子産物も包含する。加えて有用な遺伝子産物には、jun、fos、max、mad、血清応答因子SRF、AP-1、AP-2、myb、MyoDおよびミオゲニン、ETS-ボックス含有タンパク質、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子IRF-1、ウィルムス腫瘍タンパク質、ETS-結合タンパク質、STAT、GATA-ボックス結合タンパク質、例えばGATA-3、および翼型ヘリックスwingedhelixタンパク質のフォークヘッドforkheadファミリーのような転写因子を含む。他の有用な遺伝子産物には、カルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1アンチトリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-coA、デヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グリコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、H-タンパク質、T-タンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節CFTR配列、およびジストロフィンcDNA配列を含む。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素の欠損活性から生じる様々な状態に有用な酵素代替療法に有用となり得るような酵素を含む。例えばマンノース-6-ホスフェートを含む酵素は、リソソーム蓄積症例えば適当な遺伝子にはβ-グルクロニダーゼGUSBをコードするものを含むの治療に利用することができる。他の有用な遺伝子産物には、挿入、削除またはアミノ酸置換を含む自然には存在しないアミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドのような自然には存在しないポリペプチドを含む。例えば単鎖の工作された免疫グロブリンは特定の免疫抑制患者に有用となり得る。他の種類の自然には存在しない遺伝子配列には、標的の過剰発現を低下させるために使用することができるアンチセンス分子およびリボザイムのような触媒核酸を含む。遺伝子発現の減少および/または調節は、癌および乾癬のような過増殖細胞の特徴である過増殖状態を処置するために特に望ましい。標的とするポリペプチドには、正常細胞に比べて過増殖細胞で排他的に、または高レベルで生産されるポリペプチドを含む。標的抗原には、myb、myc、fynおよびトランスロケーション遺伝子bcr/abl、ras、src、P53、neu、trkおよびEGRFのような癌遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。標的抗原として癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および防御的処方のための標的ポリペプチドには、B細胞リンパ腫により作られた抗体の可変領域およびT細胞リンパ腫のT細胞レセプターの可変領域を含み、これらは態様によっては自己免疫疾患の標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体17-1Aにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞中で高レベルで見いだされるポリペプチドのような標的ポリペプチドとして使用することができる。他の適切な治療用ポリペプチドおよびタンパク質には、細胞レセプターおよび自己に向かう抗体を生産する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対して広範な防御免疫応答を与えることによる自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置するために有用となり得るものを含む。T細胞性自己免疫疾患には、慢性関節リウマチRA、多発性硬化症MS、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病IDDM、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む。これらの各疾患は、内因性の抗原に結合し、そして自己免疫疾患に関係する炎症カスケードを開始するT細胞レセプターTCRsを特徴とする。C.免疫原性導入遺伝子あるいはまたは加えて、本発明のベクターは本発明のAAV配列および選択した免疫原に対して免疫応答を誘導するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子を含むことができる。例えば免疫原は種々のウイルス科から選択することができる。免疫応答が望まれる望ましいウイルス科の例は、望ましくは一般的な風邪の原因の約50を占めるライノウイルス属;ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスおよびA型肝炎ウイルスのようなヒト腸内ウイルスを含む腸内ウイルス属;および主に非-ヒト動物において足および口の疾患の原因であるアフトウイルス属を含むピコルナウイルス科を含む。ピコルナウイルス科内のウイルスで、標的抗原はVP1、VP2、VP3、VP4およびVPGを含む。別のウイルス科には、流行性胃腸炎の重要な病原体であるウイルスのノーウォーク群を包含するカルシウイルス科を含む。ヒトおよび非-ヒト動物に免疫応答を誘導するための標的抗原として使用するために望ましいさらに別のウイルス科は、シンドビスウイルス、ロス川ウイルスおよびベネゼエラ、東部および西部ウマ脳髄膜炎を含むアルファウイルス属、および風疹ウイルスを含むルビウイルスを含むトガウイルス科である。フラビウイルス科にはデング、黄熱、日本脳炎、セントルイス脳炎およびダニ媒介性脳炎ウイルスを含む。他の標的抗原は、感染性気管支炎ウイルス家禽、ブタ伝染性胃腸炎ウイルスブタ、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルスブタ、ネコ伝染性腹膜炎ウイルスネコ、ネコ腸内コロナウイルスネコ、イヌコロナウイルスイヌのような多数の非-ヒトウイルス、および普通の風邪および/または非-A、BまたはC型肝炎の原因となり得るヒト呼吸コロナウイルスを含むC型肝炎またはコロナウイルス科から生成することができる。コロナウイルス科内で、標的抗原にはE1Mまたはマトリックスタンパク質とも呼ばれる、E2Sまたはスパイクタンパク質とも呼ばれる、E3HEまたは赤血球凝集素-エルテロースelteroseとも呼ばれる、糖タンパク質すべてのコロナウイルスに存在するわけではない、またはNヌクレオキャプシドを含む。さらに別の抗原は、ベシキュロウイルス例えば水疱性口内炎ウイルスおよび一般的な狂犬病ウイルス例えば狂犬病を含むラブドウイルス科を標的とすることができる。ラブドウイルス科内で適当な抗原は、Gタンパク質またはNタンパク質に由来することができる。マールブルグおよびエボラウイルスのような出血性の発熱ウイルスを含むフィロウイルス科も抗原の適当な供給源となり得る。パラミクソウイルス科には、1型パラインフルエンザウイルス、3型パラインフルエンザウイルス、ウシ3型パラインフルエンザウイルス、ルブラウイルスムンプスウイルス、2型パラインフルエンザウイルス、4型パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルスニワトリ、牛疫、麻疹およびイヌジステンバーを含むモルビリウイルス、および呼吸合胞体ウイルスを含むニューモウイルスを含む。インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルスの科に分類され、そして抗原の適切な供給源である例えばHAタンパク質、N1タンパク質。ブニヤウイルス科には、ブニヤウイルス属カリフォルニア脳炎、ラクロスLaCrosse、フレボウイルス属リフト渓谷熱、ハンタウイルス属プレマーラpuremalaはヘマハギンhemahagin熱ウイルスである、ナイロウイルス属ナイロビヒツジ病および種々の割り当てられていないブンガウイルス属bungavirusを含む。アレナウイルス科は、LCMおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原の供給源を提供する。レオウイルス科には、レオウイルス属、ロタウイルス属これは小児の急性胃腸炎の原因である、オルビウイルス属およびカルチウイルス属cultivirusコロラドダニ熱、レボンボLebomboヒト、ウマ脳症、ブルータングを含む。レトロウイルス科には、ネコ白血病ウイルス、HTLV1およびHTLVII、レンチウイルスlentivirinalこれはHIV、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスおよびスプーマウイルスを含むのようなヒトおよび獣医学上の疾患を包含するオンコリウイルスoncorivirinalの亜科を含む。パポバウイルス科にはポリオーマウイルスBKUおよびJCUウイルスの亜科およびパピローマウイルス癌または乳頭腫の悪性の進行に関連するの亜科を含む。アデノウイルス科には呼吸疾患および/または腸炎を引き起こすウイルスEX、AD7、ARD、O.B.を含む。パルボウイルス科のネコパルボウイルスネコ腸炎、ネコパンロイコペニアウイルスpanleucopeniavirus、イヌパルボウイルスおよびブタパルボウイルス。ヘルペスウイルス科には、シンプレックスウイルス属simplexvirusHSVI、HSVII、バリセーロウイルス属varicellovirus仮性狂犬病、水痘帯状疱疹を含むアルファヘルペスウイルス亜科、およびサイトメガロウイルス属HCMV、ムロメガロウイルス属muromegalovirusを含むベータヘルペスウイルス亜科、およびリンホクリプトウイルス属lymphocryptovirus、EBVバーキットリンパ腫、伝染性鼻気管支炎、マルク病ウイルスおよびラジノウイルス属rhadinovirusを含むガンマヘルペスウイルス亜科を含む。ポックスウイルス科にはオルソポックスウイルスバリオーラVariola痘瘡およびワクシニアVaccinia牛痘、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルスを包含する脊椎動物ポックスウイルス亜科、およびエントモポックスウイルスの亜科を含む。ヘパドナウイルス科には、B型肝炎ウイルスを含む。適当な抗原源となり得る1つの分類されていないウイルスは、デルタ肝炎ウイルスである。さらに抗原の供給源である別のウイルスはニパンNipanウイルスである。さらに別のウイルス源には、鳥類感染性嚢疾患ウイルスおよびブタ呼吸および生殖症候群ウイルスを含む。アルファウルイス科にはウマ関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。本発明はヒトまたは非ヒト動物を、ヒトおよび非ヒト動物に感染する細菌、菌類、寄生微生物もしくは多細胞寄生生物を含む他の病原体に対して免疫感作するために有用な免疫原、あるいは癌細胞または腫瘍細胞に由来する免疫原も包含する。細菌病原体の例には、病原性グラム陽性球菌を含み、それらには肺炎球菌pneumococci;ブドウ球菌staphylococciおよびそれらにより生産されるトキシン、例えばエンテロトキシンB;および連鎖球菌streptococciを含む。病原性グラム陰性球菌には髄膜炎菌meningococcus;淋菌gonococcusを含む。病原性腸内グラム陰性桿菌には、腸内細菌科enterobacteriaceae;シュードモナスpseudomonas、アシネトバクテリアacinetobacteriaおよびイケネーラ属eikenella;類鼻疽;サルモネラ属salmonella;シゲーラ属shigella;ヘモフィラス属haemophilus;モラクセーラ属moraxella;H.デュクレイducreyi軟性下疳を引き起こす;ブルセラ種brucellaブルセラ症;野兎病菌Franisellatularensis野兎病を引き起こす;ペスト菌ペストおよび他のエルシニアyersiniaパスツレラ属;ストレプトバシラスモニリホルミスstreptobacillusmoniliformisおよびスピリウム属spirillumを含む;グラム陽性桿菌にはリステアリモノシトゲネシスlisteriamonocytogenes;豚丹毒菌erysipelothrixrhusiopathiae;ジフテリア菌Corynebacteriumdiphtheriaジフテリア;コレラ;炭疽菌B.anthracis炭疽;ドノヴァン症鼠径肉芽腫;およびバルトネラ症を含む。病原性の嫌気性細菌により引き起こされる疾患には、破傷風;ボツリヌス中毒Clostridumbotulinumおよびそのトキシン;ガス壊疽菌Clostridumperfringensおよびそのイプシロントキシン;他のクロストリジウム属clostridia;結核;ハンセン病;および他のマイコバクテリア属mycobacteriaを含む。病原性スピロヘーター疾患には梅毒;トリポネーマ症;フランベジア、ピンタおよび性行為外の梅毒;およびレプトスピラ症を含む。より高等な病原性細菌および病原性真菌により引き起こされる他の感染には、馬鼻疽Burkholderiamallei;放線菌症;ノルカルジア症;クリプトコックス症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症およびコクシジオイデス真菌症;カンジダ症、アスペルギルス症およびムコール症;スポロトリクス症;パラコクシジオイドミコーシス症、ペトリリジオーシスpetrielldiosis、トルロプシス症、菌腫およびクロモミコシース;および皮膚糸状菌症を含む。リケッチア感染にはチフス熱、ロッキー山熱病、Q熱Coxiellaburnetti:およびリケッチア痘を含む。マイコプラズマおよびクラミジア感染の例には:マイコプラズマ肺炎;リンパ肉芽腫;オウム病;および周産期クラミジア感染を含む。病原性真核生物には、病原性原生成物および蠕虫を含み、そしてそれらにより引き起こされる感染には;アメーバ症;マラリア;リーシュマニア症;トリパノーマ症;トキソプラスマ症;ニューモシスティスカリニPneumocystiscarinii、トリカンスTrichans;トキソプラズマゴンジToxoplasmagondii;バベシア症;ジアルジア鞭毛虫症;旋毛虫症;フィラリア症;住虫吸虫症;線虫;吸虫綱に属する吸虫類または吸虫類;および多節条虫亜綱条虫感染を含む。多くのこれら生物および/またはそれらにより生産されたトキシンが疾病管理センター[CDC、米国の保健福祉省]により、生物学的攻撃に使用するための可能性を有する病原体として同定された。例えばこれら生物剤の幾つかには、炭疽菌Bacillusanthracis炭疽、ボツリヌス菌Clostridiumbotulinumおよびそのトキシンボツリヌス中毒、ペスト菌Yersiniapestis悪疫、大痘瘡痘瘡、野兎病菌Francisellatularensis野兎病、およびウイルス性出血熱[フィロウイルス属例えばエボラ、マールブルグ]、およびアレナウイルス属[例えばラッサ、マチュポMachupo]これらすべては現在、カテゴリーA剤に属する;Q熱リケッチア菌CoxiellaburnettiQ熱;ブルセラ種Brucellaブルセラ症、鼻疽菌Burkholderiamallei鼻疽、類鼻疽菌Burkholderiapseudomallei類鼻疽、トウゴマRicinuscommunisおよびそのトキシンリシントキシン、ガス壊疽Clostridiumperfringensおよびそのトキシンイプシロントキシン、ブドウ球菌種StaphylococcusおよびそのトキシンエンテロトキシンB、クラミジアシッタシChlamydiapsittaciオウム病、水の安全性に関する脅威例えばコレラ菌Vibriocholerae、クリトスポリジウムパルバムCrytosporidiumparvum、チフス熱発疹チフスリケッチアRichettsiapowazekiiおよびウイルス性脳炎アルファウイルス、例えばベネゼエラウマ脳炎;東部ウマ脳炎;西部ウマ脳炎;このすべてが現在、カテゴリーB剤に属する;および現在、カテゴリーC剤に分類されるニパンNipanウイルスおよびハンタウイルスを含む。さらにそのように分類されるか、または異なって分類される他の生物を、将来、そのような目的に同定し、かつ/または使用することができる。本明細書に記載するウイルスベクターおよび他の構築物は、これらの生物、ウイルス、それらのトキシンまたは副産物に由来する抗原を送達するために有用であり、これによりこれらの生物剤で感染または他の副作用が防止され、かつ/または処置されると容易に理解される。T細胞の可変領域に対する免疫原を送達するための本発明のベクターの投与は、CTLsを含む免疫応答を誘導してこれらT細胞を排除する。慢性関節リウマチRAでは、疾患に関与するTCRsの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのTCRsにはV-3、V-14、V-17およびV-17を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも1つをコードする核酸配列の送達は、RAに関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘導する。多発性硬化症MSでは、疾患に関与するTCRsの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのTCRsにはV-7およびV-10を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも1つをコードする核酸配列の送達は、MSに関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘導する。硬皮症では、この疾患に関与するTCRsの幾つかの特異的可変領域が特性決定された。これらのTCRsにはV-6、V-8、V-14およびV-16、V-3C、V-7、V-14、V-15、V-16、V-28およびV-12を含む。このようにこれらポリペプチドの少なくとも1つをコードする核酸分子の送達は、硬皮症に関与するT細胞を標的とする免疫応答を誘導する。このように本発明のrAAV8に由来する組換えウイルスベクターは、選択した導入遺伝子を、生物が1以上のAAV血清型の中和抗体を有する選択した宿主細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる効率的な遺伝子転移媒体を提供する。1つの態様では、rAAVおよび細胞はエクスビボで混合され;感染した細胞は常法を使用して培養され;そして形質導入された細胞が患者に再注入される。これらの組成物は治療目的および防御免疫を誘導することを含む免疫感作のための遺伝子送達に特によく適している。さらに本発明の組成物はインビトロで所望する遺伝子産物の生産にも使用することができる。インビトロ生産については、所望の産物例えばタンパク質は、所望の産物をコードする分子を含むrAAVで宿主細胞をトランスフェクトし、そして発現を可能とする条件下で細胞のカルチャーを培養した後に所望のカルチャーから得ることができる。次いで発現した産物を所望により精製し、そして単離する。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離に関する適当な技法は、当業者には知られている。以下の実施例は本発明の幾つかの観点および態様を具体的に説明する。AAV2ITRsを備えた組換えAAV8ウイルスゲノムの生産AAV2repを新規AAV血清型のcap配列と融合することによりキメラパッケージング構築物を作成する。これらキメラパッケージング構築物は、最初にAd5ヘルパープラスミドを使用して293細胞での3回のトランスフェクションにより、AAV2ITRsを持つ組換えAAVゲノムのシュードタイプ化に使用する。これらのシュードタイプ化ベクターはこれら新規血清型の完全かつ感染性ウイルスが単離される前に、形質導入に基づく血清型の実験における性能を評価し、そしてNHPおよび齧歯類を含む種々の動物モデルを対象として新規AAV血清型の遺伝子転移効率を評価するために使用する。A.pAAV2GFPAAV2プラスミドは、構成的プロモーターの制御下で発現するAAV2ITRsおよび緑色蛍光タンパク質を含む。このプラスミドは以下の要素を含む:AAV2ITRs、CMVプロモーターおよびGFPコード配列。B.トランスプラスミドのクローニング組換えシュードタイプ化AAV8ベクター生産用のキメラトランス-プラスミドを構築するために、p5E18プラスミドXiaoetal.,1999,J.Virol.73:3994-4003をXhoIで部分消化して、プラスミドを3169bpのみの位置のXhoI部位で線状とした。次いでXhoI切断末端をフィルインし、そして戻し連結した。この修飾されたp5E18プラスミドをXbaIおよびXhoIで完全に消化するまで制限処理してAAV2cap遺伝子配列を除去し、そしてpCRAAV86-515-4プラスミドから単離したAAV8cap遺伝子を含む2267bpのSpeI/XhoIフラグメントに置き換えた。生成したプラスミドはAAV2P5プロモーターの制御下にRep78/68のAAV2rep配列を、そしてAAV2P19プロモーターの制御下にRep52/40のAAV2rep配列を含む。AAV9キャプシド配列はAAV2P40プロモーターの制御下にあり、これはRep配列内に位置する。このプラスミドはさらにrepORFのスペーサー5’を含む。あるいはAAV8rep配列および天然のAAV8プロモーター配列を利用する類似のプラスミドを構築することができる。次いでこのプラスミドは本明細書に記載するようにrAAV8の生産に使用する。C.シュードタイプ化rAAVの生産rAAV粒子AAV8キャプシド中のAAV2ベクターは、アデノウイルスを含まない方法を使用して生成する。簡単に説明すると、シスプラスミドAAV2ITRsを含むpAAV2.1lacZプラスミド、およびトランスプラスミドpCRAAV86-515-4AAV2repおよびAAV8capを含むおよびヘルパープラスミドをそれぞれ同時に293細胞に1:1:2の比率でリン酸カルシウム沈殿によりコトランスフェクトした。pAdヘルパープラスミドの構築については、pBG10プラスミドをマイクロビックスMicrobixカナダから購入した。L2およびL3を含むRsrIIフラグメントをpBHG10から削除し、第1ヘルパープラスミドであるpAdΔF13を生じた。プラスミドAdF1は、pBHG10から単離したPmeI/Sgfl削除を含むAsp700/SalIフラグメントを、Bluescriptにクローニングすることにより構築した。MLP、L2、L2およびL3をpAdΔF1中で削除した。さらに2.3kbのNruIフラグメント、そして続いて0.5kbのRsrII/NruIフラグメントの削除によりそれぞれヘルパープラスミドpAdΔF5およびpAdΔF6を生成した。pΔF6と名付けられたヘルパープラスミドは、E1-発現ヘルパー細胞によっては提供されないE2aおよびE4ORF6の本質的ヘルパー機能を提供するが、アデノウイルスキャプシドタンパク質および機能的E1領域が削除されている。典型的には50μgのDNAシス:トランス:ヘルパーを、150mmの組織培養皿上にトランスフェクトした。293細胞をトランスフェクションから72時間後に回収し、超音波処理し、そして0.5デオキシコール酸ナトリウムで処理した37°Cで10分。細胞ライゼートを2回のCsCl勾配に供した。rAAVベクターを含むピーク画分を集め、プールし、そしてPBSに対して透析した。AAV8キャプシドを含むベクターの評価AAV12/1、AAV52/5およびAAV22/2に基づくベクターは、本質的には実施例1のAAV8について記載したように開発した。AAVベクターのゲノムコピーGC力価は、TaqMan分析によりすでに記載したように[Gao,G.etal.,2000HumGeneTher11,2079-91]、SV40ポリA領域を標的とするプローブおよびプライマーを使用して決定した。組換えビリオンはヘパリンクロマトグラフィーにより精製したAAV2/2を除き、すべての場合でCsCl2沈降により回収した。ベクターは多数のインビトロおよびインビボ実験のために各血清型について構築した。8種の導入遺伝子カセットをベクターに挿入し、そして組換えビリオンを各血清型について生成した。ゲノムコピーに基づくウイルスの回収を表1にまとめる。ベクターの収量は各血清型について高く、血清型で一貫した差異はなかった。表に示すデータは、50プレート150mmのトランスフェクションの複数生産ロットの標準偏差を含む平均ゲノムコピー収量x1013である。シュードタイプ化ベクターの血清学的分析C57BL/6マウスに異なる血清型のAAVCBA1ATベクターのベクターを筋肉内注射し5x1011GC、そして血清サンプルを34日後に集めた。AVVの各血清型に対する血清の中和および交差中和活性を試験するために、血清は形質導入に基づく中和抗体アッセイで分析した[Gao,G.P.,etal.,1996J.Virol.70,8934-43]。より具体的には、中和抗体の存在は異なる血清型のレポーターウイルスAAVCMVEGFPによる84-31細胞の形質導入を阻害する血清の能力を評価することにより決定した。具体的には各血清型のレポーターウイルスAAVCMVEGFP[表示細胞の90の形質導入を導く感染多重度MOI]を、異なる血清型のAAVを受けた動物、またはナイーブなマウスに由来する熱不活化血清とプレインキューベーションした。37°Cで1時間インキューベーションした後、ウイルスを96ウェルプレートの84-31細胞に、ウイルスの血清型に依存して48~72時間、加えた。GFPの発現はFluoroImaginモレキュラーダイナミックス:MolecularDynamicsにより測定し、そしてImageQuantSoftwareにより定量した。中和抗体力価は50未満まで形質導入を阻害した最高の血清希釈として報告した。GFP発現ベクターの利用性は、許容細胞系すなわちAd5からE4を安定に発現する293細胞での形質導入の阻害に基づく中和抗体のアッセイの開発を簡略化した。選択したAAV血清型に対する血清は、組換えウイルスの筋肉内注射により生成した。抗血清の1:20および1:80希釈によるAAV形質導入の中和を評価した表2。AAV1、AAV2、AAV5およびAAV8に対する抗血清は、抗血清が生成された血清型の形質導入を中和したがAAV1およびAAV2よりも少ない程度のAAV5およびAAV8、他の血清型に対しては中和しなかったすなわち交差中和の証拠はなく、AAV8が真に独自な血清型であることを示唆する。52名の正常個体に由来するヒト血清を、選択した血清型に対する中和についてスクリーニングした。AAV2/8を中和する血清サンプルは見いだされなかったが、AAV2/2およびAAV2/1ベクターはそれぞれ血清の20および10が中和された。60,000個体サンプルのコレクションを表すヒトのプールIqGは、AAV2/8を中和しなかったが、AAV2/2およびAAV2/1ベクターはそれぞれ1/1280および1/640に等しい血清の力価で中和した。種々の血清型のAAVベクターのインビボ評価この実験では、7種の組換えAAVゲノムであるAAV2CBhA1AT、AAV2AlbhA1AT、AAV2CMVrhCG、AAV2TBGrhCG、AAV2TBGcFIX、AAV2CMVLacZおよびAAV2TBGLacZを、種々の血清型のキャプシドタンパク質でパッケージングした。すべての7種の構築物において、ミニ遺伝子カセットをAAV2ITRsで挟んだ。ヒトα-アンチトリプシンA1AT[Xiao,W.,etal.,1999J.Virol.73,3994-4003]、アカゲザルのコリオゴナドトロピンホルモンCGのβ-サブユニット[Zoltick,P.W.Wilson,J.M.2000Mol.Ther2,657-9]、イヌ第IX因子[Wang,L.,etal.,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,11563-6]、および細菌のβ-ガラクトシダーゼすなわちLacZ遺伝子のcDNAをレポーター遺伝子として使用した。肝臓に向けた遺伝子転移には、マウスのアルブミン遺伝子プロモーターAlb[Xiao,W.1999、同上]またはヒトの甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーターTBG[Wang,1997同上]を使用して肝臓に特異的なレポーター遺伝子の発現を駆動した。筋肉に向けられた遺伝子転移実験では、サイトメガロウイルス初期プロモーターCMVまたはCMVエンハンサーCBを持つニワトリβ-アクチンプロモーターをレポーターの発現を支配するために採用した。筋肉に向けられた遺伝子転移には、ベクターを4~6週齢のNCRヌードまたはC57BL/6マウスタコニックTaconic、ジャーマンタウン、ニューヨーク州の右脛側前方に、動物あたり1×1011ゲノムコピーGCの用量で注射した。肝臓に向けられた遺伝子転移実験では、ベクターを7~9週齢のNCRヌードまたはC57BL/6マウスタコニック、ジャーマンタウン、ニューヨーク州の門脈内に、また動物あたり1×1011ゲノムコピーGCの用量で注入した。血清サンプルはベクター投与から異なる時点で眼窩内から集めた。筋肉および肝臓組織は、低温切開およびXgal組織化学染色用にlacZベクターを受容した動物から異なる時点で回収した。再投与実験については、C56BL/6マウスは最初にAAV2/1、2/2、2/5、2/7および2/8CBA1ATベクターを筋肉内に受け、そしてA1AT遺伝子発現を7週間追跡した。次いで動物はAAV2/8TBGcFIXを門脈内で処置し、そしてcFIX遺伝子発現について実験した。ELISAに基づくアッセイはすでに記載したように[Gao,G.P.,etal.,1996J.Virol.70,8934-43;Zoltick,P.W.Wilson,J.M.2000MolTher2,657-9;Wang,L.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94,11563-6]、hA1AT、rhCGおよびcFIXタンパク質の血清レベルを定量するために行った。この実験は、DNA抽出およびベクター調製[Zhang,Y.,etal.,2001MolTher3.697-707]の滴定と同じ組のプライマーおよびプローブを使用して、TaqManによる標的組織中に存在するベクターのゲノムコピーの定量的分析のために、筋肉および肝臓組織を回収するために動物が屠殺された時に完了した。新たな血清型に基づくベクターの性能は、筋肉および肝臓に向けられた遺伝子転移のマウスモデルで評価し、そして既知の血清型AAV1、AAV2およびAAV5に基づくベクターと比較した。分泌型タンパク質A1ATおよびCG-表3を発現するベクターを使用して、血清のELISA分析を介して種々の血清型間の相対的な形質導入効率を定量した。標的器官内の形質導入の細胞分布は、lacZ発現ベクターおよびXgal組織化学を使用して評価した。骨格筋中のAAVベクターの性能は、脛側前方筋に直接注射した後に分析した。ベクターは、導入遺伝子の発現を駆動するCMVの前初期遺伝子またはCMV強化β-アクチンプロモーターを持つ同じAAV2に基づくゲノムを含んだ。事前の実験では、免疫コンピテントC57BL/6マウスがAAVベクターから発現された時、ヒトA1ATタンパク質に対して限られた液性応答を誘導することが示された[Xiao,W.,etal.,1999J.Virol.73,3994-4003]。各株では、AAV2/1ベクターが最高レベルのA1ATを生産し、そしてAAV2/2ベクターは最低であり、AAV2/8ベクターは中間レべルの発現を示した。nu/nuNCRマウスの注射から28日で、CGのピークレベルはAAV2/7から最高レベル、そしてAAV2/2からは最低を示し、AAV2/8およびAAV2/1はその間であった。AAV2/1lacZベクターの注射はすべての筋肉繊維において注射部位に遺伝子発現をもたらし、実質的により少ないlacZ陽性繊維がAAV2/2およびAAV2/8ベクターで観察された。同様のマウスモデルを使用して肝臓に向けられた遺伝子転移を評価した。ゲノムコピーに基づきベクターの同一用量をマウスの門脈静脈に注入し、これを続いて導入遺伝子の発現について分析した。各ベクターは導入遺伝子の発現を駆動するために、以前に記載された肝臓に特異的なプロモーターすなわちアルブミンまたは甲状腺ホルモン結合グロブリンを使用して、AAV2に基づくゲノムを含んだ。より詳細にはCMVCGおよびTBGCGミニ遺伝子カセットを、それぞれ筋肉および肝臓に向けられた遺伝子転移に使用した。rhCGのレベルは相対的単位rUs×103として定めた。データはベクター投与から28日に集めた血清サンプルをアッセイすることから得た1群あたり4匹。表4に示すように、キャプシドタンパク質がnu/nuおよびC57BL/6マウスのA1ATベクターおよびC57BL/6マウスのCGベクターの形質導入効率に及ぼす影響は一致し、すなわちAAV2/8が肝臓に向けられた遺伝子転移用のシュードタイプに最も効率的である。すべての場合でAAV2/8ベクターは、AAV2/2ベクターで得られるよりも16~110大きい範囲の最高レベルの導入遺伝子発現を生じた:AAV2/5からの発現は中間であった。対応するlacZベクターを受容した動物のX-Gal染色した肝臓切片の分析では、形質導入した細胞の数と導入遺伝子発現の全体的レベルとの間の相関が明らかとなった。A1ATベクターを受容したC57BL/6マウスの肝臓から抽出したDNAsは、リアルタイムPCR技法を使用してベクターDNAの量について分析した。注射から56日後の肝臓に見いだされるベクターDNAの量は、導入遺伝子発現のレベルと相関した表4。この実験について、ベクターゲノムのSV40ポリA領域を標的とする1組のプローブおよびプライマーをTaqManPCRに使用した。示した値は3匹の別個の動物の平均であり、標準偏差を含む。動物はDNA抽出用の肝臓組織を回収するために56日で屠殺した。これらの実験は、形質導入された肝細胞の数の上昇から、AAV8が肝臓に向けられた遺伝子転移用の最も効率的なベクターであること示す。上記の血清学的データは、AAV2/8ベクターが他の血清型で免疫感作された後にインビボで当然、中和されないことを示唆する。C57BL/6マウスは、それらが異なる血清型のA1ATベクターの筋肉内注射を受けてから56日後、イヌの第IX因子を発現するAAV2/8ベクター1011ゲノムコピーの門脈内注射を受けた。高レべルの第IX因子の発現は、投薬を受けていないnaive動物へのAAV2/8の注入から14日後に得17±2μg/ml、N=4、これはAAV2/131±23μg/ml、N=4およびAAV2/216μg/ml、N=2で免疫感作した動物で観察されたものと有意に異ならなかった。これは検出可能な第IX因子が観察されなかったAAV2/8第IX因子ベクターを注入したAAV2/8免疫感作動物で観察された結果と好対照をなす<0.1μg/ml、N=4。cap遺伝子の保存領域に対するオリゴヌクレオチドは、独自のAAVsを表すアカゲザル由来の配列を増幅した。同一のcapサインsignature配列が、少なくとも2つの集団に由来するアカゲザルの多組織に見いだされた。1つの供給源から完全長のrepおよびcapオープンリーディングフレイムを単離し、そして配列決定した。AAV8キャプシドを持つベクターはITRsおよびAAV2に由来するrepを使用して作成されたので、ベクターとして新規AAVsのcapオープンリーディングフレイムだけがそれらの能力を評価するために必要であった。これはまた実際のベクターゲノムが種々のベクター血清型間で同一であるので、異なるベクターの比較を簡単にした。実際に、この取り組みを使用して生成された組換えベクターの収量は、血清型間で異ならなかった。AAV8に基づくベクターは免疫学的に異なるようであるすなわちそれらは他の血清型に対して生じた抗体により中和されない。さらにヒトに由来する血清はAAV8ベクターによる形質導入を中和せず、これは中和されつつある既存の免疫を有する有意な比率のヒト個体群のために現在開発中のヒトに由来するAAVsよりも実質的に有利である[Chirmule,N.,etal.,1999GeneTher6,1574-83]。新規ベクターのトロピズムは、インビボの応用に好ましい。重要なことは、現在まで安定に形質導入された肝細胞の数という意味で比較的失望してきた肝臓への遺伝子転移の効率という意味で、AAV2/8が他の血清型よりも実質な利点を提供するということである。AAV2/8は他のベクターに比べて遺伝子転移効率において10~100倍の改善を一貫して達成した。AAV2/8の改善された効率の基礎は不明であるが、おそらく肝細胞の基底外側上でより活性な種々のレセプターを介した取り込みによるのかもしれない。この改善された効率は、尿の循環障害および家族性高コレステロール血症のような形質導入された細胞の数が重要となる肝臓に向けられた遺伝子転移の開発に極めて有用となるだろう。このようにAAV8に対する既存の免疫の欠如およびベクターの肝臓に対する好ましいトロピズムは、AAV8キャプシドタンパク質を持つベクターがヒトの遺伝子治療および他のインビボの応用にベクターとして使用するのに適していることを示す。組織トロピズム実験新規AAV構築物の高処理量機能的スクリーニングスキームの設計では、非組織特異的な、そして高度に活性なプロモーターであるCBプロモーターCMV強化型ニワトリβ-アクチンプロモーターが、容易に検出可能で、しかも定量可能なレポーター遺伝子であるヒトα-アンチ-トリプシン遺伝子を駆動するために選択された。特定のAAV構築物を組織トロピズムをスクリーニングするために、各新規AAVクローン用に唯一のベクターが、3つの異なる組織、肝臓、肺および筋肉を標的とする遺伝子転移実験のために作られることが必要である。以下の表は組織トロピズム実験において新規AAVベクターから生成されたデータをまとめるAAVCBA1AT。表5は実験の14日目に得られたデータを報告する血清1mLあたりのA1ATのμg数。新規AAVsのキャプシドでシュードタイプ化された肺特異的発現用のCC10hA1ATミニ遺伝子を持つAAVベクターは、以下の表に提供するように気管内注射を介して等容量各50μlの希釈なしの元の調製物で免疫不全動物NCRヌードに与えた。ベクターも表6に示すように等ゲノムコピー1×1011GCで免疫コンピテント動物C57BL/6に投与した。動物あたり1×1011GC、C57BL/6、14日、検出限界>0.033μg/ml。示すようにAAV8が最高の肝臓形質導入物transducerである。高コレステロール血症のモデル本発明のAAV2/8構築物によるrAAV媒介型導入遺伝子発現の影響をさらに評価するために、さらなる実験を行った。A.ベクターの構築AAV8キャプシドタンパク質でパッケージングされたAAVベクターは、シュードタイプ化法[HildingerM,etal.,J.Virol2001;75:6199-6203]を使用して構築した。AAV2逆方向末端反復ITRを含む組換えAAVゲノムは、シス-プラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびキメラパッケージング構築物、AAV2のrep遺伝子を持つ新規AAV血清型のキャプシドの融合物を用いた293細胞の3回のトランスフェクションによりパッケージングした。キメラパッケージングプラスミドはすでに記載したように構築した[Hildingeretal,同上]。組換えベクターは標準的なCsCl2沈降法により精製した。収量を検討するためのTaqManアプライドバイオシステムズ:AppliedBiosystems分析は、ベクターのSV40ポリA領域を標的とするプローブおよびプライマーを使用して行った[GaoGP,etal.,HumGeneTher.2000Oct10:1115:2079-91]。生成したベクターはヒト甲状腺ホルモン結合グロブリン遺伝子プロモーターTBGの制御下で導入遺伝子を発現する。B.動物C57Bl/6バックグラウンドのLDLレセプター欠損マウスをジャクソンラボラトリーJacksonLaboratoryバーハーバー、メリーランド州、米国から購入し、そして育種集団として維持した。マウスには水を自由に与え、そしてベクター注射の3週間前から始めた高脂肪の西洋食高のコレステロールを与えた。7日に0日と同様に後眼窩出血を介して血液を得、そして脂質プロフィールを評価した。マウスは無作為に7群に分割した。ベクターは前述したように門脈内注射を介して注射した[ChenSJetal.,MolTherapy2000;23,256-261]。簡単に説明すると、マウスはケタミンおよびキシラジンで麻酔をかけた。側腹切開を行い、そして門脈を露出した。30gニードルを使用して、100μlのPBSで希釈した適切な用量のベクターを門脈に直接注射した。注射部位に圧力をかけて止血を確実とした。皮膚の創傷を閉じ、そして滅菌布で覆い、そしてマウスは翌日から慎重にモニタリングされた。肝臓に向けられた遺伝子転移から14日後に毎週の採血を開始して、血中の脂質を測定した。各群2匹の動物をベクター注射から6週および12週後の時点で屠殺して、アテローム硬化症プラークのサイズならびにレセプター発現を調査した。残りのマウスはプラークの測定および導入遺伝子発現の決定に20週で屠殺した。C.血清リポタンパク質および肝機能分析血液サンプルは6時間の絶食後、後眼窩叢retroorbitalplexusから得た。血清は遠心により血漿から分離した。血漿リポタンパク質および血清中の肝臓トランスアミナーゼの量は、自動化臨床化学分析機ACE、スキャパレリバイオシステムズSchiapparelliBiosystems、アルファヴァッセルマンを使用して検出した。D.導入遺伝子発現の検出LDLレセプター発現は免疫-蛍光染色およびウエスタンブロッティングにより評価した。ウエスタンブロットには、凍結した肝臓組織を溶解バッファー20mMTris、pH7.4、130mMNaCl、1TritonX100、プロティナーゼインヒビターコンプリート、EDTA無し、ロッシュRoche、マンハイム、ドイツで均一化した。タンパク質濃度はMicroBCAタンパク質アッセイ試薬キットピアスPierce、ロックフォールド、イリノイ州を使用して決定した。40μgのタンパク質を4~15Tris-HClレディゲルバイオラッドBioRad、ヘラクレス、カリフォルニア州に溶解し、そしてニトロセルース膜インビトロゲンに移した。抗-hLDLレセプター抗体を生成するために、ウサギにAdhLDLrprep1×1013gcを静脈内注射した。4週間後にウサギの血清を得、そしてウエスタンブロットに使用した。血清の1:100希釈を1次抗体として使用して、続いてHRP-結合抗-ウサギIgGおよびECL化学発光検出ECLウエスタンブロット検出キット、アマーシャムAmersham、アーリントンハイツ、イリノイ州を行った。D.免疫細胞化学凍結した肝臓切片中のLDLレセプター発現を決定するために、免疫組織化学分析を行った。10umの低温切片をアセトン中で5分間固定するか、または固定しなかった。ブロッキングは10のヤギ血清を用いて1時間のインキューベーション時間を介して得た。次いで切片を1時間、1次抗体と室温でインキューベーションした。ウサギポリクローナル抗体抗ヒトLDLバイオメディカルテクノロジーズ社BiomedicalTechnologiesInc,、ストートン、マサチューセッツ州を製造元の使用説明に従い希釈して使用した。切片をPBSで洗浄し、そして1:100で希釈したフルオレセインヤギ抗ウサギIgGシグマ、セントルイス、ミズーリ州とインキューベーションした。検体は最終的に蛍光顕微鏡ニコンNikonMicrophot-FXA下で調査した。すべての場合で、各インキューベーションに続いてPBSで徹底的に洗浄した。陰性対照はPBSとのプレインキューベーション、1次抗体の省略および1次抗体のアイソタイプが合った非免疫対照抗体による置換からなった。上に挙げた3種の対照は各実験について同日に行った。E.遺伝子転移効率肝臓組織はマウスを計画した時点で屠殺した後に得た。組織は液体窒素中でショック凍結しshockfrozen、そしてさらに処理するまで-80°Cで保存した。DNAは製造元のプロトコールに従いQIAampDNAMiniキットキアゲン社QIAGENGmbH、ドイツを使用して肝臓組織から抽出した。肝臓組織中のAAVベクターのゲノムコピーは、上記のようにSV40ポリAテイルに対するプローブおよびプライマーを使用してTaqman分析を使用して評価した。F.アテローム硬化症プラークの測定マウス大動脈中のアテローム硬化症のプラークを定量するために、マウスに麻酔をかけ10ケタミンおよびキシラジン、ip、開胸し、そして動脈系に左心室を通して氷冷リン酸緩衝化生理食塩水を潅流した。次いで大動脈を慎重に回収し、腹中線に沿って大動脈弓から大腿動脈にかけて切り開き、そしてホルマリンで固定した。脂質に富むアテローム硬化症のプラークがスーダンIVシグマ、ドイツで染色され、そして大動脈を黒いワックス面上にピンで平らにして止めた。ソニーSonyDXC-960MDカラービデオカメラを用いて像を取った。プラークならびに完全な大動脈表面の面積をPhase3ImagingSystemsメディアサイバーネティックス:MediaCyberneticsを使用して決定した。G.I125LDLのクリアランス実験群あたり2匹の動物を試験した。I125で標識したLDLDanRader、アペンUpennの好意により提供されたのボーラスを30秒間にわたり尾の静脈を通してゆっくりと注入した100μlの滅菌PBSで希釈した1,000,000カウントの[I125]LDL/動物。注射から3分、30分、1.5時間、3時間、6時間の時点で、血液サンプルを後眼窩叢を介して得た。血漿を全血から分離し、そして10μl血漿をガンマカウンターで計数した。最後にリポタンパク質クリアランスデータから分画異化率fractionalcatabolicrateを算出した。H.肝臓の脂質蓄積の評価凍結した肝臓切片のオイルレッドOilRed染色を行って脂質の蓄積を測定した。凍結した肝臓切片は蒸留水で簡単にすすぎ、続いて無水プロピレングリコール中で2分間、インキューベーションした。次いで切片はオイルレッド溶液中プロピレングリコール中0.5で16時間染色し、続いてMayerのヘマトキシリン溶液で30秒間カウンター染色し、そして暖めたグリセリンゼリー溶液に乗せた。肝臓コレステロールおよびトリグリセリド含量の定量には、肝臓切片を均一化し、そしてクロロホルム/メタノール2:1中で一晩インキューベーションした。0.05H2SO4を加え、そして10分間遠心した後、各サンプルの下層を集め、2つのアリコートに分け、そして窒素下で乾燥させた。コレステロールの測定には第1アリコートの乾燥脂質を1TritonX-100クロロホルム中に溶解した。いったん溶解したら、溶液を窒素下で乾燥させた。脂質をddH2O中に溶解し、そして37°Cで30分間インキューベーションした後、総コレステロール濃度をトータルコレステロールキットワコーダイアグノスティックス:WakoDiagnosticsを使用して測定した。第2アリコートについては、乾燥脂質をアルコール性KOHに溶解し、そして60°Cで30分間インキューベーションした。次いで1MMgCl2を加え、続いて氷上で10分間インキューベーションし、そして14,000rpmで30分間遠心した。上清は最後にトリグリセリドについて評価したワコーダイアグノスティックス。AAV2/8キャプシドにシュードタイプ化されたすべてのベクターは、対照に比べて総コレステロール、LDLおよびトリグリセリドを下げた。これらの試験ベクターは用量依存的様式で高コレステロール血症の表現型も矯正した。AAV2/8マウスにおけるプラーク面積の減少が最初の試験2カ月で処置したマウスに観察され、そしてこの効果は実験期間にわたり6カ月持続することが観察された。機能的第IX因子の発現および血友病の矯正A.ノック-アウトマウス機能的なイヌの第IX因子FIX発現を、血友病Bのマウスで評価した。AAV1、AAV2、AAV5またはAAV8のキャプシドを持つベクターを構築して、AAV25’ITR-肝臓特異的プロモーター[LSP]-イヌFIX-ウッドチャック肝炎後-調節要素WPRE-AAV23’ITRを送達した。ベクターは適切なキャプシドを使用して、Wangetal,2000,MolecularTherapy2:154-158に記載されているように構築した。ノック-アウトマウスはWangetal,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11563-11566に記載されているように生成した。このモデルはヒトの血友病Bの表現型を緻密に模する。異なる血清型のベクターを、成体の血友病C57Bl/6マウスの肝臓に単回の門脈内注射として1×1010GC/マウスの用量で5種類の血清型について送達し、そして第2AAV8ベクターも1×1010GC/マウスで送達した。対照群は1×1011GCのAAV2/8TBGLacZ3を注射した。各群は5~10匹のオスおよびメスのマウスを含む。マウスはベクター投与後に週2回bi-weekly、採血した。1.ELISAマウス血漿中のイヌのFIX濃度は、本質的にはAxelrodetal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:5173-5177に記載されている方法を変更して行うイヌの第IX因子に特異的なELISAアッセイにより決定した。第1抗体としてヒツジ抗-イヌ第IX因子エンザイムリサーチラボラトリーズ:EnzymeResearchLaboratoriesを使用し、そして第2抗体としてウサギ抗-イヌ第IX因子エンザイムリサーチラボラトリーズを使用した。注射から2週間後に始まる血漿レベルのcFIXの上昇がすべての試験ベクターで検出された。この上昇したレベルは実験期間を通して、すなわち12週まで治療的レベルで持続した。治療的レベルは正常レベルの5、すなわち約250ng/mLになると考えられる。最高レベルの発現はAAV2/81011でについて観察され、超生理学的superphysiologyレベルのcFIXレベル正常レベルより10倍高いで持続した。AAV2/81011の発現レベルはAAV2/2およびAAV2/81010について観察されるレベルよりも約10倍高かった。最低レベルは、それでも治療範囲よりは上であるが、AAV2/5で観察された。2.インビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイFIXノック-アウトマウスの血漿中の機能的第IX因子活性をインビトロ活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイにより決定し-マウスの血液サンプルは1/10容量のクエン酸バッファー中に後-眼叢から集めた。APTTアッセイはWangetal,により1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11563-11566に記載されているように行った。ベクターを注射したすべてのマウス血漿サンプルについてaPTTによる凝固時間は、注射から2週間後に測定した時、正常範囲内であり約60秒、そして実験期間を通して12週間正常範囲内か、正常範囲よりも短い凝固時間を維持した。持続した最低の凝固時間はAAV2/81011を受けたマウスで観察された。12週まで、AAV2/2もAAV2/8に類似する凝固時間を誘導した。しかしこの低下した凝固時間は12週までAAV2/2では観察されず、一方、AAV2/8については低下した凝固時間25~40秒の範囲が2週目の始めから観察された。処置したマウスの何匹かから回収した肝臓組織の免疫-組織化学染色を現在行っている。約70~80の肝細胞が、AAV2/8.cFIXベクターを注射したマウスにおいてイヌFIXについて陽性に染色された。B.血友病Bの犬モデル実験に基づき、F.IX遺伝子の触媒ドメインに点突然変異を有する犬はタンパク質が不安定になり、血友病Bに罹患すると思われる[Evansetal,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10095-10099。そのような犬の集団がチャペルヒルのノースカロライナ大学で20年間以上維持されてきた。これらの犬の恒常性パラメーターは十分に説明され、そして血漿F.IX抗原の不存在、正常な犬では6~8分である60分を越える全血凝固時間、および正常な犬では13~28秒である50~80秒の長期化した活性化部分トロンボプラスチン時間を含む。これらの犬は再発する自然な出血を経験する。典型的には重大な出血の病歴が10ml/kgの正常なイヌ血漿の単回静脈内注入により成功裏に管理され;場合によっては出血を制御するには繰り返し注入することが必要である。4匹の犬は以下の計画に従いAAV.cFIXを門脈内に注射された。第1の犬は3.7×1011ゲノムコピーGC/kgの用量でAAV2/2.cFIXの単回注射を受け、そして重篤な脊髄出血spinalhemorrhageにより665日に屠殺された。第2の犬はAAV2/2.cFIX2.8×1011GC/kgの第1注射、続いてAAV2/5.cFIX2.3×1013GC/kgの第2注射を1180日に受けた。第3の犬はAAV2/2.cFIXを4.6×1012GC/kgの用量で単回受けた。第4の犬はAAV2/2.cFIX2.8×1012GC/kgの注射、そして995日にAAV2/8.cFIX5×1012GC/kgの注射を受けた。血友病の犬の腹を全身麻酔の下で無菌的および外科的に開き、そしてベクターの単回注入を門脈に投与した。動物は正常なイヌの血漿を静脈内投与することにより手術期の出血を防いだ。犬を鎮静させ、全身麻酔を誘導するために挿管し、そして腹を剃り、手術の準備をした。開腹後、脾臓を手術の場に取り出した。脾臓静脈を配置し、そして縫合糸は静脈中の小さい遠位切開の近位にゆるやかに配置した。導入は迅速に静脈に挿入し、次いで縫合糸をゆるめ、そして5Fカニューレを門脈の分岐点近くの静脈内位置に糸でつながれた門脈付近の静脈内位置に通した。止血を固定し、そしてカテーテルバルーンを膨らませた後、PBSで希釈した約5.0mlのベクターを5分間の間隔で門脈に注入した。ベクター注入に続いて5.0mlの塩水を注入した。次いでバルーンを窄ませ、カニューレを取り出し、そして静脈止血を固定した。次いで脾臓を再配置し、出血皿を焼灼し、そして手術の創傷を閉じた。動物は外科的手順によく耐えながら抜管された。血液サンプルは記載した用に分析した。[Wangetal,2000,MolecularTherapy2:154-158]結果を以下の表にまとめる。犬C51、メスは、最初の注射時に13.6kg、そして6.5カ月齢であった。犬C52、オスは、最初の注射時に17.6kg、そして6.5カ月齢であった;そして2回目の注射時に17.2kg、45.2カ月齢であった。犬C55、オスは、最初の注射時に19.0kg、そして12.0カ月齢であった。犬D39、メスは、最初の注射時に5.0kg、そして2.8カ月齢であり;2回目の注射時に22.6kg、そして35.4カ月齢であった。表では、GCはAAVベクターのゲノムコピーを指す。WBCTは注射前に>60分C52=42分を除くであった。C51のベースラインaPTT=98.4秒、C52=97.7秒;C55=145.1秒;D39=97.8秒。処置後の出血は、血漿注入の処置を必要としたAAVベクター処置後の血友病Bの犬における自発的な出血病状の発現であった。1.全血凝固時間WBCTAAV2/2ベクター注射後のWBCTは幾分、変動性であり、約6.5分から30分の範囲であった。正常な犬に関するWBCTは6~12分である。WBCTにおける急激な鋭い低下がAAV2/8またはAAV2/5ベクターを注射すると即座に観察された。この鋭い低下はAAV2を注射したC55d2=9分、およびC51およびC52でも観察され、WBCTについては初期のデータ時点はチェックしなかった。鋭い低下は手術前後の犬の血漿注入によると考えられる。WBCTは低レベルのFIXに大変感受性のアッセイであり、FIXの実際のレベルにはそれほど感受性ではないaPTTがより関連する。2.aPTTアッセイベクターを注射したすべての犬の血漿サンプルについて、aPTTによる凝固時間は、最初の約700日間にわたり可変性であったが、その時点で凝固時間は正常範囲のレベルであった40~60秒、正常な犬:24~32秒。正常範囲への鋭い低下は、各2回目の注射AAV2/8またはAAV2/5後に観察された。凝固時間は正常範囲内で持続しなかったが、凝固時間は2回目の注射前に観察されたレベル未満に低下した。aPTTについて、正常な犬は24~32秒であり、そして血友病Bの犬は80~106秒である。低用量のAAV2.cFIXベクターを受けたC51およびC52については、処置後の平均aPTTが77.5および81.5秒に留まり、処置なしの血友病Bの犬と有意に異ならなかった。より高用量のAAV2はD39およびC55について、平均aPTTをそれぞれ59.1および46.4秒に改善した。AAV2/5の処置後、C52に関する平均aPTTは81.5秒から41.9秒に有意に改善された。そしてAAV2/8処置後のD39については、平均aPTTが59.1秒から改善する。3.イヌの第IX因子ELISAcFIXレベルはたとえ治療レベル未満でも、第1組の注射後に検出可能であった。AAV2/8およびAAV2/5での注射後、cFIXのレベルは治療範囲にスパイクされて上がり、ついで治療範囲内のレベルで平らになった正常は血漿中5μg/mlであり、治療レベルは正常レベルの5、これは250ng/mlである。最初の3週間のWBCT、aPTTおよびcFIX抗原は手術前後の犬の血漿注入により影響を受ける。最初の3週間については、凝固時間の低下またはcFIX抗原レベルの上昇がベクターまたは血漿注入によるのかを結論するのは難しい。しかし2/5および2/8ベクターの注射後のcFIX抗原の急激かつ劇的な上昇に注目することは興味深い。すべての犬が手術のために等量の正常な犬の血清の注入を受容しているので、これはAAV2/5および2/8を注射した犬に独特であり、そして正常の犬の血漿の注入というよりはむしろAAV2/5および2/8ベクターに起因する可能性がある。AAV2/8注射から3日後、D39の血漿中のcFIXレベルは9.5μg/mlに達し、そして6日には正常レベル5μg/mlの2倍多い10.4μg/mlのピークとなった。cFIXレベルは次第に817ng/mlC52、AAV2/5、および657ng/mlD39、AAV2/8の平均に低下した。C52では、AAV2/5ベクターの注射から3日後、cFIXレベルは2.6μg/mlに達し、そして7日に4.6μg/mlのピークに達した。D39にAAV2/8を投与した同じ用量でAAV2ベクターを受けたC55では、ピークは3日目のわずか2.2μg/mlであり、次第に低下し、そしてcFIXの正常レベルの5で維持された。C55AAV2、4.6×1012GC/kgおよびD39が2回目の注射AAV2/8、5×1012GC/kgで受容したベクターの用量は大変近かった。しかしAAV2/8ベクターによりD39で上昇したcFIX発現レベルは平均657-34=623ng/ml、正常レベルの12.5、C55のレベルよりも2.5倍高かった平均259ng/ml、正常レベルの5。これは類似用量のベクターを門脈内に注射した犬では、AAV2/8がAAV2よりも2.5倍有力であることを示唆している。同じ犬であるD39において、2倍高い用量のAAV2/8の2回目の注射により、cFIXレベルは0.7から13.1へと1回目の注射より18.7倍高く劇的に上昇した。そしてC52では、2.3×1013GC/mlのAAV2/5ベクターの2回目の注射により、平均817ng/ml正常レベルの16.3の血漿中のcFIXがもたらされた。これはAAV2/8によりD39で上昇したcFIXレベル623ng/ml、正常レベルの12.5よりもわずかに高いだけであった1.3倍。しかしC52に注射したAAV2/5の用量は、D39に注射したAAV2/8の用量よりも4.6倍高かった。これは犬においてもAAV2/8ベクターがAAV2/5ベクターより有力であることを示唆している。AAV2ベクターの最初の注射は、犬における2回目の注射後にAAV2/5およびAAV2/8ベクターによる成功裏の形質導入を遮断しなかった。異なる血清型のAAVベクターを使用した再投与は、事前にAAV2に暴露されたか、またはAAV2ベクターで処置された動物またはヒトを処置する取り組みとして使用することができる。肝臓の酵素障害のマウスモデル本明細書に記載したように生成したAAV2/8ベクターを、OTC疾患に関して認められた動物モデルにおいて[X.Yeetal.,PediatricResearch,414:527-5341997;X.Yeetal.,J.Biol.Chem.,2717:3639-3646Feb.1996]、肝臓の酵素の遺伝子オルニチントランスカルバミラーゼOTCを転移する効率について実験した。この実験結果はデータは示さず、オルニチントランスカルバミラーゼOTC遺伝子を持つ本発明のAAV2/8ベクターがOTC欠損を矯正したことを示した。本明細書に引用したすべての刊行物は、参考により本明細書に編入する。本発明は特に好適な態様について記載してきたが、本発明の精神から逸脱することなく修飾を行うことができると考える。"