明細書に記載の発明。発明の要旨従って、本発明の目的は、高収量でLトレオニンを効率的に産生するが、トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要とせずそして好ましくはアミノ酸栄養要求性を有さない微生物を提供することである。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明に記載され、そして一部はその記載から明らかでありまたは本発明の実施によって学び得る。本発明のこれらの目的および利点は、本明細書の記載された説明および請求の範囲で特に指摘された方法によって理解され達成される。これらおよび他の目的は本発明の方法によって達成され、これは、第1の実施態様では、Lトレオニンのようなアミノ酸を産生するためのプロセスに関し、これは、培地中でEcoliの株を培養する工程、および培地からアミノ酸を回収する工程を包含する。このプロセスで使用されるEcoliの株は、以下の特徴を有する:非天然プロモーターの制御下の染色体上に、トレオニンオペロンこれはトレオニン生合成酵素をコードするのようなアミノ酸生合成の遺伝子決定基を含む;およびトレオニンを産生するためのトレオニン生合成酵素をコードする遺伝子を含むいかなる組換えプラスミドも必要としない。本発明の別の実施態様は、上記の特徴を有するEcoliの株の生物学的に純粋な培養物に関する。本発明のさらなる実施態様は、Lトレオニンのようなアミノ酸を産生するプロセスに関し、これは、培地中でEcoliの株を培養する工程、および培地からアミノ酸を回収する工程を包含し、ここでEcoliの株はボレリジンに耐性である。本発明のさらなる実施態様は、トレオニンのようなアミノ酸の発酵産生に有用なEcoliの株を産生する方法に関し、これは、Ecoli原栄養性になるようにEcoli栄養要求性の染色体中にアミノ酸産生微生物からの遺伝物質を導入する工程;その発現を制御するためにアミノ酸生合成遺伝子の染色体位置の前の染色体に非天然プロモーターを挿入する工程;および、必要に応じて、染色体からアミノ酸生合成のためのアミノ酸栄養要求性を除去する工程および/または染色体からのアミノ酸生合成に対する妨害を調節する工程、を包含する。上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が例示的および説明的のみであり、そして請求の範囲として発明のさらなる説明を提供することが意図されることが、理解されるべきである。例えば、本発明は以下の項目を提供する。項目1Lトレオニンを産生するためのプロセスであって、以下の工程:培地中でEcoliの株を培養する工程;および該Ecoliによって産生されるLトレオニンを回収する工程;を包含し、ここで、該Ecoliの株が、少なくとも1つの非天然プロモーターと作動可能に連結される少なくとも1つのトレオニンthrオペロンを染色体上に含み;そしてトレオニンを産生するために1つ以上のトレオニン生合成酵素をコードする1つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要としない、プロセス。項目2前記Ecoliが、約30時間で少なくとも約50gLのLトレオニンを産生し得る、項目1に記載のプロセス。項目3前記非天然プロモーターが、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、lppプロモーター、PLプロモーター、およびPRプロモーターからなる群より選択される、項目1に記載のプロセス。項目4前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、項目1に記載のプロセス。項目5前記Ecoliがkat13株である、項目1に記載のプロセス。項目6前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、項目3に記載のプロセス。項目7前記Ecoliが、染色体上に欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、項目1に記載のプロセス。項目8前記トレオニンオペロンが、ATCC21277から得られる、項目1に記載のプロセス。項目9前記Ecoliがボレリジン耐性である、項目1に記載のプロセス。項目101つ以上のアミノ酸の生合成酵素をコードする組換えプラスミドを有さないEcoliのアミノ酸産生株を産生する方法であって、以下の工程:Ecoli株の染色体にアミノ酸産生微生物からの遺伝物質を導入する工程;その発現を制御するために、アミノ酸生合成遺伝子の染色体配置の前にそして該遺伝子と作動可能に連結して、該染色体に非天然プロモーターを挿入する工程;および必要に応じて、該染色体から、アミノ酸生合成に対する調節妨害物および/またはアミノ酸生合成のための栄養必要物を除去する工程、を包含する、方法。項目11以下の特徴:その染色体が、少なくとも1つの非天然プロモーターと作動可能に連結される少なくとも1つのトレオニンthrオペロンを含み;そしてトレオニンを産生するために、1つ以上のトレオニン生合成酵素をコードする1つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要としない、を有する微生物Ecoliの株。項目12前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼI遺伝子thrA、ホモセリンキナーゼthrB遺伝子、トレオニンシンターゼ遺伝子thrCからなる、項目11に記載の株。項目13前記Ecoliがkat13株である、項目11に記載の株。項目14前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、項目11に記載の株。項目15前記Ecoliが、染色体上に欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、項目11に記載の株。項目16前記トレオニンオペロンが、ATCC21277から得られる、項目11に記載の株。項目17前記Ecoliがボレリジン耐性である、項目11に記載の株。項目18前記EcoliがNRRLB21593株の特徴を有する、項目11に記載の株。項目19Lトレオニンを産生するためのプロセスであって、以下の工程:培地中でボレリジン耐性Ecoliの株を培養する工程;および該Ecoliによって産生されるLトレオニンを回収する工程、を包含する、プロセス。項目20前記Ecoliが、約30時間で少なくとも約50gLのLトレオニンを産生し得る、項目19に記載のプロセス。項目21前記Ecoliが、少なくとも1つの非天然プロモーターと作動可能に連結される少なくとも1つのトレオニンthrオペロンを含む、項目19に記載のプロセス。項目22前記トレオニンオペロンが、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む、項目21に記載のプロセス。項目23前記Ecoliがkat13株である、項目19に記載のプロセス。項目24前記非天然プロモーターがtacプロモーターである、項目21に記載のプロセス。発明の好ましい実施態様の詳細な説明第1の実施態様では、本発明は、アミノ酸の産生のための発酵プロセスで使用され得る新規細菌株に関する。本発明の新規細菌株は以下の特徴を有する:細胞は、非天然プロモーターの制御下で、染色体上に少なくとも1つのthrオペロンすなわち、トレオニン生合成酵素をコードする少なくとも1セットの遺伝子を含む;および細胞は、トレオニンを産生するために、トレオニン生合成酵素をコードする任意の組換えプラスミドを必要としない。好ましくは、本発明の株は、約30時間で少なくとも約50gLのLトレオニン、より好ましくは約30時間で少なくとも約70gL、さらにより好ましくは約30時間で少なくとも約80gL、および最も好ましくは約30時間で少なくとも約90gLを産生し得る。好ましくは、本発明の株は、約48時間で少なくとも約90gL、より好ましくは約48時間で少なくとも約100gL、および最も好ましくは約48時間で少なくとも約110gLのトレオニンを産生し得る。好ましくは、本発明の株は、少なくとも約2gL時間、より好ましくは少なくとも約25gL時間、さらにより好ましくは少なくとも約3gL時間、および最も好ましくは少なくとも約36gL時間の速度でLトレオニンを産生し得る。特に好ましい実施態様では、新規細菌株はまた、トレオニンの発酵産生のためのアミノ酸栄養要求性を有さない。すなわち、細胞は、増殖およびトレオニン産生にアミノ酸補充を必要としない。本発明に従って、本発明の細菌株は、トレオニン産生のためのトレオニン生合成酵素をコードする1つ以上の遺伝子を含む任意の組換えプラスミドを必要としない。すなわち、この株は、組換えプラスミドに含まれる遺伝子によってコードされる1つ以上のトレオニン生合成酵素を必要とせずにトレオニンを産生し得る。もちろん、本発明の株は、必要に応じて、所望の1つ以上の組換えプラスミドを含み得る。例えば、このようなプラスミドはトレオニン産生に必要とされないが、それにもかかわらず、本発明の株は、トレオニン産生を増加するために、トレオニン生合成酵素をコードする組換えプラスミドを含み得る。本発明の株は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼasdのような、トレオニン生合成に関連する他の酵素をコードする組換えプラスミドを同様に含み得る。好ましくは、本発明の細菌株は、Escherichiacoliの株である。より好ましくは、本発明の細菌株は、マクロライド抗生物質ボレリジンに対する耐性を示すEcoliの株である。本発明の細菌株の特に好ましい例は、Ecolikat13株であり、これは、AgriculturalResearchServiceCultureCollection1815NorthUniversityStreetPeoriaIllinois61604USAに1996年6月28日に寄託され、そして受託番号NRRLB21593を与えられた。本発明の細菌株の細胞の染色体上のトレオニンthrオペロンは、トレオニン生合成に必要な酵素をコードする。好ましくは、トレオニンオペロンは、AKHD遺伝子thrAまたはmetL、ホモセリンキナーゼ遺伝子thrB、およびトレオニンシンターゼ遺伝子thrCからなる。より好ましくは、thrオペロンは、thrAAKIHDI遺伝子、thrB、およびthrCからなる。適切なthrオペロンは、例えば、EcoliATCC21277株およびATCC21530株から得られ得る。ATCC21277株からのthrオペロンが特に好ましい。複数のコピーのthrオペロンが、染色体上に存在し得る。好ましくは、thrオペロンは、少なくとも1つのアテニュエートされない遺伝子を含む。すなわち、遺伝子の発現は、1つ以上のトレオニン生合成酵素および/またはその産物例えば、トレオニンおよびイソロイシンのレベル細胞外および/または細胞内によって抑制されない。本発明の株はまた、欠損thrアテニュエーターを含むthrオペロン転写開始部位の下流および第1の構造遺伝子の上流の調節領域またはthrアテニュエーターを全く欠くthrオペロンを含み得る。本発明の特に好ましい実施態様では、thrオペロンは、1つ以上のフィードバック耐性トレオニン生合成酵素をコードする。すなわち、酵素の活性は、トレオニン生合成の中間体および産物の細胞外および/または細胞内レベルによって阻害されない。最も好ましくは、thrオペロンは、フィードバック耐性AKIHDIのような、フィードバック耐性AKHDをコードする遺伝子を含む。フィードバック耐性AKHDの使用は、産生されているLトレオニンの存在下でさえも、トレオニン生合成のためにより高いレベルの酵素的活性を提供する。本発明の株における1つまたは複数のトレオニンオペロンの発現は、非天然プロモーター、すなわち、天然で通常見られるEcoli細菌株においてthrオペロンの発現を制御しないプロモーターによって制御される。トレオニン生合成酵素の天然プロモーターを、thrオペロンの発現を制御するために強力な非天然プロモーターに置換することは、thrオペロンの単一のゲノムコピーのみを用いても、より高いトレオニン産生を生じる。さらに、非天然プロモーターがトレオニンオペロンの発現を制御するために使用されるので、このより高いトレオニン産生を達成するためにイソロイシンについて細菌株を栄養要求性にする必要がない。適切なプロモーターの例示的な例として、lacプロモーター;trpプロモーター;λバクテリオファージのPLプロモーター;PRプロモーター;lppプロモーター;およびtacプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の細菌株における使用に特に好ましいものは、tacプロモーターである。トレオニンオペロンに加えて、本発明の細菌株の細胞中の染色体はまた、好ましくはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼasdをコードする少なくとも1つの遺伝子を含む。最も好ましくは、本発明の細胞中の染色体は、少なくとも1つのasd遺伝子、少なくとも1つのthrA遺伝子、少なくとも1つのthrB遺伝子、および少なくとも1つのthrC遺伝子を含む。染色体は、もちろん、1つ以上のこれらの遺伝子の複数のコピーを含み得る。トレオニンデヒドロゲナーゼtdhは、Lトレオニンのαアミノβケトブチレートへの酸化を触媒する。従って、特に好ましい実施態様では、本発明の細胞の染色体は、少なくとも1つの欠損トレオニンデヒドロゲナーゼtdh-遺伝子をさらに含む。欠損tdh遺伝子は、トレオニンデヒドロゲナーゼの減少した発現レベルを有する遺伝子、または天然トレオニンデヒドロゲナーゼの活性と比較して減少した酵素的活性を有するトレオニンデヒドロゲナーゼ変異体をコードする遺伝子であり得る。好ましくは、本発明の株で用いられる欠損tdh遺伝子は、トレオニンデヒドロゲナーゼを発現しない。トレオニンデヒドロゲナーゼを発現しない適切なtdh-遺伝子の例示的な例として、米国特許第5175107号に記載のように、それに挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼcat遺伝子を有するtdh遺伝子またはそれに挿入されたトランスポゾンTn5を有するtdh遺伝子が挙げられる。本発明の細菌株は、当業者に公知および利用可能な方法および技術のいずれかによって調製され得る。本発明の細菌株を構築するために適切な方法の例示的な例として、NTGのような適切な薬剤を使用する変異誘発;直鎖状DNAフラグメントを形質転換することおよび相同組換えによって媒介される、遺伝子組込み技術;およびバクテリオファージP1によって媒介される形質導入が挙げられる。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、そして、例えば、JHMillerExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;JHMillerAShortCourseinBacterialGeneticsColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;MSingerおよびPBergGenesGenomesUniversityScienceBooksMillValleyCalifornia;JSambrookEFFritschおよびTManiatisMolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;PBKaufmanらHandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicineCRCPressBocaRatonFlorida;MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyBRGlickおよびJEThompson編CRCPressBocaRatonFlorida;およびPFSmithKearyMolecularGeneticsofEscherichiacoliTheGuilfordPressNewYorkNYに記載される。本発明の特に好ましい実施態様では、増殖のためにトレオニンを必要とするEcoli472T23株は、EcoliATCC21277株アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301ParklawnDriveRockvilleMaryland20852USAから得られ得るのトレオニンオペロンを導入するためにP1媒介形質導入を使用してトレオニンプロデューサーに変換され得る。このthrオペロンは、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子thrA、ホモセリンキナーゼ遺伝子thrB、およびトレオニンシンターゼ遺伝子thrCからなる。本発明の株におけるトレオニン産生を改良するために、EcoliCGSC6945株関連遺伝子型:tdh1cat1212;EcoliGeneticStockCenter355OsborneMemorialLaboratoryDepartmentofBiologyYaleUniversityNewHavenConnecticut065208104USAから得られたからの欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、P1形質導入によって導入され得る。得られるトレオニンプロデューサーは、NTGで変異誘発することおよび/またはボレリジン耐性について選択することによってさらに改良され得る。kanカナマイシン耐性をコードするのような抗生物質耐性マーカー遺伝子、およびPLまたはtacのような強力なプロモーター好ましくは、thrAおよび野生型thrA遺伝子の数百塩基対すなわち、thrA遺伝子全体ではないの上流のDNAに隣接するを有するプラスミドが構築され、そして染色体に所望のDNAフラグメントを送達するためにビヒクルとして使用され得る。プラスミド上のフラグメントは、適切な制限酵素での消化によって単離され、そして精製され、次いで形質転換またはエレクトロポレーションによって株に導入され、トレオニンオペロンの制御領域を除去して所望のフラグメントすなわち、抗生物質耐性マーカー遺伝子およびthrA遺伝子の始まりでの強力なプロモーターでの相同組換えによって置換され得る。次いで、このフラグメントは、P1形質導入によってボレリジン耐性株に移入され得る。好ましい宿主の株472T23のイソロイシン要求性は、例えば、P1形質導入を介してマーカーの野生型対立遺伝子を導入することによって、排除され得る。他の宿主の望ましくない栄養要求性は、類似の方法でまたは当業者に公知および利用可能な他の方法に従って除去され得る。本発明の第2の実施態様は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の産生のための発酵プロセスにおける上記の細菌株の使用に関する。例えば、Lトレオニンは、少なくとも1つの炭素供給源、少なくとも1つの窒素供給源、および適宜、無機塩、増殖因子などを含む合成または天然の培地中で、本発明の細菌株を培養することによって得られる。適切な炭素供給源の例示的な例として、炭水化物例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、スターチ加水分解物、セルロース加水分解物、および糖蜜;有機酸例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸;およびアルコール例えば、グリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。適切な窒素源の例示的な例として、アンモニアアンモニアガスおよびアンモニア水溶液を含む;無機または有機酸のアンモニウム塩例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム;および他の窒素含有物肉エキス、ペプトン、コーン浸出液、カゼイン加水分解物、ダイズケーキ加水分解物、および酵母エキスを含むが挙げられるが、これらに限定されない。培養後、培養ブロス中に蓄積されたLトレオニンは、公知の方法のいずれかに従って、例えば、米国特許第5342766号に記載されるようなイオン交換樹脂の使用によって、分離され得る。この方法は、最初に遠心分離によって培養ブロスから微生物を除去する工程、および次に塩酸を使用してブロスのpHを約2に調節する工程を包含する。酸性化した溶液を、続いて強い酸性カチオン交換樹脂に通し、そして吸着剤を希釈アンモニア水溶液を使用して溶出する。アンモニアを、真空下でのエバポレーションによって除去し、そして得られる溶液を濃縮する。アルコールの添加およびその後の冷却によってLトレオニンの結晶を得る。アスパラギン酸ファミリーの他のアミノ酸は、上の詳細に記載された方法と類似の方法によって産生され得る。例えば、イソロイシンは、染色体上またはプラスミド上に、増幅されたilvA遺伝子またはtdc遺伝子その両方とも、トレオニンのイソロイシンへの生物変換に関連する最初の酵素であるトレオニンデアミナーゼをコードするを含む本発明の細菌株から調製され得る。例えば、フィードバック耐性酵素をコードするilvA遺伝子の使用によるこの遺伝子の増幅は、イソロイシンの生合成を増加させる。同様に、メチオニンは、染色体上に少なくとも1つのmetオペロンすなわち、metL遺伝子AKIIHDIIをコードする、metA遺伝子ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ、metB遺伝子シスタチオニンγシンターゼ、metC遺伝子シスタチオニンβリアーゼ、ならびにmetEおよびmetH遺伝子ホモシステインメチラーゼを含むEcoliのような微生物によって調製され得る。これらの遺伝子そのフィードバック耐性改変体を含むおよび必要に応じて非天然プロモーターは、上記のおよび/または当業者に公知の1つ以上の一般的な方法に従って宿主微生物の染色体に導入され得る。同様に、リジンは、リジン生合成酵素好ましくは、lysCおよび/またはdapAによってコードされるフィードバック耐性リジン生合成酵素、および必要に応じて非天然プロモーターをコードする遺伝子を含む微生物によって調製され得る。本発明の第3の実施態様は、Lトレオニンの産生のための発酵プロセスにおけるボレリジン耐性細菌株の使用に関する。好ましくは、ボレリジン耐性株は、Ecoli株の変異体である。このような変異体の特に好ましい実施態様は、Ecolikat13株であり、これはAgriculturalResearchServiceCultureCollection1815NorthUniversityStreetPeoriaIllinois61604USAに1996年6月28日に寄託され、そして受託番号NRRLB21593が与えられた。ボレリジン耐性は、当業者に公知の任意の利用可能な方法によって決定され得る。例えば、ボレリジン耐性株は、GNassおよびJThomaleFEBSLett39182186に記載のように、約139μMボレリジンを含む最少培地に候補株をプレーティングすることによって単離され得る。さらに、ある株におけるボレリジン耐性は、細胞の1つ以上の表現型特徴の変化として現れる。例えば、Ecoli株68およびその誘導体のボレリジン耐性変異体は、桿状よりもむしろ円形のようである。このような場合では、表現型特徴の変化の証拠は、ボレリジン耐性株を適切に同定するために十分であり得る。本発明のこの実施態様に有用なボレリジン耐性変異体は、トレオニンを産生し得る。トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子は、染色体上に存在し得るかまたはプラスミドもしくはその混合物に含まれ得る。これらの遺伝子の複数コピーもまた存在し得る。好ましくは、トレオニン生合成酵素をコードする遺伝子は、アテニュエーション制御に耐性であり、および/またはフィードバック耐性酵素をコードする。上記のように、本発明のボレリジン耐性株は、所望のように1つ以上の組換えプラスミドを含み得る。例えば、本発明の微生物は、トレオニン生合成酵素をコードする組換えプラスミドを含み得る。本発明の細菌株は、同様に、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼasdまたは増殖を増大させるための酵素のような、トレオニン生合成に関連する他の酵素をコードする組換えプラスミドを含み得る。さらに、当業者に公知および利用可能な任意の方法および技術を使用して、例えば、トレオニン産生を増加させる、栄養要求性を除去するなどのために、ボレリジン耐性株は所望のように改変され得る。ボレリジン耐性Ecoli変異体および改変体を改変するために適切な方法の例示的な例として:紫外線もしくはX線での照射による、またはニトロソグアニジンNメチルNニトロNニトロソグアニジン、メチルメタンスルホネート、ナイトロジェンマスタードなどのような化学的変異原での処理による変異誘発;直鎖状DNAフラグメントおよび相同組換えを形質転換することによって媒介されるような遺伝子組込み技術;およびP1のようなバクテリオファージによって媒介される形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、そして、例えば、JHMillerExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;JHMillerAShortCourseinBacterialGeneticsColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;MSingerおよびPBergGenesGenomesUniversityScienceBooksMillValleyCalifornia;JSambrookEFFritschおよびTManiatisMolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork;PBKaufmanらHandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicineCRCPressBacaRatonFlorida;MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnologyBRGlickおよびJEThompson編CRCPressBocaRatonFlorida;およびPFSmithKearyMolecularGeneticsofEscherichiacoliTheGuilfordPressNewYorkNYに記載される。好ましくは、本発明のボレリジン耐性変異体は、これらの遺伝子が染色体上にあるかおよび/またはプラスミドに含まれるかどうかにかかわりなく、トレオニン生合成酵素をコードする1つ以上の遺伝子の上流に、およびその遺伝子への作動可能な連結で、非天然プロモーターを含むように改変される。本発明のこの実施態様の特に好ましい態様に従って、Lトレオニンは、上記のように、少なくとも1つの炭素供給源、少なくとも1つの窒素供給源、および適宜、無機塩、増殖因子などを含む合成または天然の培地中で、少なくとも1つのボレリジン耐性細菌株を培養することによって得られる。蓄積されたトレオニンは、当業者に公知の任意の方法によって回収され得る。以下の実施例は、例示するのみであって、添付の請求の範囲に定義されるように本発明の範囲を限定することを意図しない。種々の改変および変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の方法で作成され得ることは、当業者に明らかである。従って、本発明が、添付の請求の範囲およびその等価物の範囲内であるならば、本発明の改変および変更を網羅することが意図される。本明細書中で言及されるすべての特許および刊行物は、特に、参考として援用される。実施例1:Ecolikat13株の調製A.Ecoli472T23株の染色体へのEcoliATCC21277株のトレオニンオペロンの転移アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301ParklawnDriveRockvilleMaryland20852USAから入手可能なEcoliATCC21277株米国特許第3580810号は、アミノβヒドロキシ吉草酸AHV耐性であるが、最少培地中で増殖するためにプロリン、チアミン、イソロイシン、メチオニンを必要とする。ATCC21277は、発酵プロセスにおいて620gLのトレオニンを蓄積すると報告されている。ATCC21277のトレオニンオペロンは、フィードバック耐性酵素をコードするアスパラギン酸キナーゼI-ホモセリンデヒドロゲナーゼI遺伝子thrA、ホモセリンキナーゼ遺伝子thrB、およびトレオニンシンターゼ遺伝子thrCからなる。登録番号BKIIMB2307としてUSSRAntibioticsResearchInstituteでのUSSRCollectionofCommercialMicroorganismsに寄託される、Ecoli472T23株は、グルコース、アンモニア、ビタミンB1、およびミネラル塩を含む最少培地中で増殖するためにトレオニンおよびイソロイシンを必要とすると報告される。この株は、トレオニン生合成に必須な遺伝子である欠損thrC遺伝子を有するので、トレオニンを産生し得ない。472T23株はまた、イソロイシン生合成における最初の酵素をコードする欠損トレオニンデアミナーゼ遺伝子ilvAを有する。バクテリオファージP1溶解物を、ATCC21277でファージを増殖することによって調製した。次いで、472T23株を、その中に少数のファージ粒子がATCC21277のトレオニンオペロンを有するこのP1溶解物で感染させた。感染後、トレオニンを合成する細菌を、025gLのイソロイシンを補充した最少培地E[グルコース005gL;MgSO47H2O02gL;クエン酸H2O20gL;K2HPO4100gL;NaHNH4PO44H2O35gL;寒天150gL]寒天プレート上に播種することによって選択した。ATCC21277のトレオニンオペロンを有するいくつかのトレオニン原栄養性形質導入体は、現在、イソロイシンのみを補充した最少プレート中で増殖し得た。これらの形質導入体を、以下の実施例2に記載されるように、トレオニン産生のために振盪フラスコ発酵によってスクリーニングした。トレオニンを産生するこれらの1つであるG9を、さらなる株の開発のために選択した。B.EcoliG9株の染色体へのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼcat遺伝子とともに挿入された欠損トレオニンデヒドロゲナーゼtdh-遺伝子の導入欠損トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子tdh-を有するCGSC6945株を、EcoliGeneticStockCenter355OsborneMemorialLaboratoryDepartmentofBiologyYaleUniversityNewHavenConnecticut065208104USAから得た。トレオニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼcat遺伝子がこれに挿入されるので、欠損性である。この欠損遺伝子をG9に転移するために、P1ファージをCSCG6945で増殖し、そして溶解物をG9を感染させるために使用した。G9のいくつかのクロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、そして以下の実施例2に記載されるように振盪フラスコ発酵でトレオニン産生について選択およびスクリーニングした。G9よりも高いトレオニン力価を有するこれらの1つであるG909を、さらなる開発のために選択した。C.EcoliG909株の染色体への非天然プロモーターの挿入G909の染色体へtacプロモーターを送達するために、線状DNAフラグメントとエキソヌクレアーゼVマイナス株recDの染色体との間の相同組換えを用いた。線状DNAフラグメントは、トレオニンオペロンの上流5末端の15kbの配列、カナマイシン耐性マーカー、tacプロモーター配列、および約480bpのthrA遺伝子を含んだ。それぞれ、5末端相同性、選択マーカーカナマイシン耐性、トレオニンオペロンtacへの強力および制御可能なプロモーター、ならびに3末端相同性を提供するこのフラグメントを、以下のように生成した。野生型EcoliW3110のトレオニンオペロンを、DrYujuKoharaDepartmentofMolecularBiologySchoolofScienceNagoyaUniversityChikusakuNagoyaJapanからのλクローン676のDNAを使用することによって、プラスミドpUC19の制限酵素SphI部位へクローニングした。次いで、λクローン676およびpUC19のDNAを、SphIで消化した。続いて、pUC19フラグメントを、エビアルカリホスファターゼSAPで脱リン酸化し、そしてアガロースゲル精製した。λクローンからのトレオニンオペロンの69kbフラグメントもまた精製した。続いて、これらの2つのフラグメントを、T4DNAリガーゼによって連結し、プラスミドpAD103を生成した。次いで、相同組換えおよびカナマイシン耐性マーカーについての上流隣接領域を構築した。pAD103を、制限酵素BstEII、XbaIで消化し、クレノウフラグメント処理で平滑末端にした。トレオニンオペロンの5末端上流のみしかしthrオペロン自体でもその制御領域でもないを含む15kbフラグメントを単離し、そしてpUC4KPharmaciaからのカナマイシン耐性遺伝子のフラグメントに連結し、これを、制限酵素SalIで消化し、そして3突出を満たすようにクレノウフラグメント処理し、中間体プラスミドpAD106を生成した。pAD103もまた制限酵素TaqIで消化し、そしてクレノウフラグメント処理で平滑末端にした。天然リボソーム結合部位およびthrA遺伝子の約480bpのコード配列を含むフラグメントを単離し、次いでpKK2333Pharmaciaのフラグメントに連結した。これは、プラスミドpAD115を得るために制限酵素SmaIで消化およびSAPで脱リン酸化され、tacプロモーターのDNA配列、リボソーム結合部位、および数百塩基のthrA遺伝子を含んでいる。続いて、pAD115を制限酵素BamHiで消化し、そして所望のDNA配列を含む075kbのDNAフラグメントを単離した。pAD106もまたBamHIで消化し、次いでSAPで脱リン酸化した。次いで、2つのフラグメントを連結してプラスミドpAD123を提供した。これは、トレオニンオペロンの上流のDNA配列、カナマイシン耐性マーカー遺伝子、tacプロモーター、およびthrA遺伝子の始めの約480bpを含んだ。次いで、pAD123をSpeI、BglIで消化し、そして所望のDNA配列を含むフラグメントを単離した。エキソヌクレアーゼVマイナス株recDを、argA中の同時形質導入可能なトランスポゾンTn10挿入とともにrecD遺伝子を含むEcoliKW251株関連遺伝子型:argA81Tn10recD1014;Pharmaciaから得られたでP1ファージを増殖することによって調製した。次いで、ファージから調製された溶解物を使用して、G9株を感染させ、そしてテトラサイクリン耐性形質導入体G9T7を単離した。プラスミドpAD123からのDNAフラグメントを、エレクトロポレーションによってEcoliG9T7株へ送達した。G9T7のカナマイシン耐性株を単離し、そしてP1ファージ溶解物を、この株でファージを増殖することによって作成した。次いで、P1ファージ溶解物を使用して、G909を形質導入した。G909のカナマイシン耐性形質導入体の1つであるtac3は、振盪フラスコ研究においてIPTGの存在下でより高いトレオニン力価を示し、これを単離した。続いて、P1ファージ溶解物をtac3株で調製し、次いで68株を感染させるために使用した以下に記載される。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、そしてそれらの1つである68tac3株これは、振盪フラスコ研究でtac3よりもさらに高い力価を生じたを単離した。D.EcoliG909株および68からのNTG変異誘発ならびにボレリジン耐性変異体の単離G909株の細胞を、従来の方法を使用してNメチルNニトロNニトロソグアニジンNTG処理50mgL、30分、36°Cによって変異誘発した。次いで、得られる細胞を、025gLのLイソロイシンおよび01vvのボレリジンを含む最少培地E寒天プレート上に播種した。36°Cにて3~5日間のインキュベーション後、68株を含む、プレート上に形成した大きなコロニーを、ボレリジン耐性およびLトレオニン産生の試験のために選択した。ボレリジン耐性について試験するために、各株を、20mlの種培地SM[325gLグルコース;1gLMgSO47H2O;2436gLK2HPO4;952gLKH2PO4;5gL2SO4;15gL酵母エキス;pH72]中で36°Cにて17時間振盪しながら培養した。細胞を回収し、そして最少培地Eで洗浄した。次いで、細胞懸濁液を、3mlの最少培地Eおよび0、01、05、または1mMボレリジンを含む滅菌管に接種した。振盪しながら36°Cにて24時間の培養後、増殖を660nmでの吸光度を測定することによって決定した。結果を、ボレリジンの非存在下での増殖と比較して以下に示す。E.イソロイシン要求性およびラクトースリプレッサー遺伝子lacIの除去非天然tacプロモーターおよびフィードバック耐性thrA遺伝子を導入することによって、thrオペロンthrA、thrB、thrCの発現は、もはやアテニュエーション機構によって制御されない。結果として、イソロイシンの枯渇および/またはilvA-栄養要求性マーカーの存在は、もはやトレオニン産生を必要としない。従って、野生型ilvAマーカーを、株のイソロイシン要求性を固定するために、すなわち、細胞増殖のためのイソロイシン補充培地の必要性を排除するために、68tac3への形質導入によって導入した。CGSC7334関連遺伝子型:lacI42Tn10lacZU118;EcoliGeneticStockCenter355OsborneMemorialLaboratoryDepartmentofBiologyYaleUniversityNewHavenConnecticut065208104USAから得られたから作成されたP1ファージ溶解物を使用して68tac3を感染させ、そしてイソロイシン生合成にポジティブな形質導入体を選択した。これらの形質導入体は、振盪フラスコ研究で、68tac3株とほぼ同じ量のLトレオニンを産生した。これらの形質導入体の1つである68tac3ileを、さらなる開発のために選択した。68tac3ileのトレオニンオペロンがtacプロモーターの制御下にあるので、イソプロピルβDチオガラクトシドIPTGは、thrオペロンを完全に発現するために細胞を誘導することが必要であった。しかし、thrオペロンの発現を誘導するためのIPTGの使用は、本発明の方法ではあまり好ましくない。従って、この不必要な調節障害を排除するために、欠損lacリプレッサーlacI遺伝子を、CGSC7334から作成したP1ファージでの68tac3ileの感染によって導入する。得られた形質導入体2SO45gL;MgSO47H2O1gL]に懸濁した。種を、37°Cにて250rpmの撹拌速度で24時間増殖した。次いで、15mlの発酵培地[デキストロース40gL;酵母エキス2gL;クエン酸2gL;2SO425gL;MgSO47H2O28gL;CaCO320gL;微量金属溶液2mL]をpH72で種に添加し、そして発酵プロセスを250rpmの撹拌速度で37°Cにて行った。培養後、培養ブロス中に蓄積したLトレオニンの量をHPLCISCOModel2353ポンプ、RaininModelRI1屈折インデックス検出器、およびaminexHp87CAカラムによって分析した。試験した株のそれぞれによって産生されたLトレオニンの量を以下に示す。実施例3:発酵研究本発明のEcoli株およびその前駆体株を、発酵によるLトレオニン産生について試験した。G909を、以下の条件下で試験した。2Lの遮断振盪フラスコ中の30gLのトリプシン処理ダイズブロスおよび5gLの酵母エキスを含む05Lの水性培養培地を15mLのG909で接種し、そして35°Cおよび200rpmにて85時間振盪器でインキュベートした。09mL003の成熟接種物を、30Lの種発酵培地[10gLdsのコーン浸出液、04gLのLイソロイシン、25gLのKH2PO4、20gLのMgSO47H2O、05gLの2SO4、0192gLの無水クエン酸、003gLのFeSO47H2O、0021gLのMnSO4H2O、および80gLのデキストロース]を含むガラス発酵槽に添加した。インキュベーションを、以下の条件下で行った:最初の18時間は39°C、次いで継続中は37°Cの温度;69のpHNH4OHの添加によって維持した;35LPMの空気流;最初に500rpmの撹拌、次いでこれを20でDOを維持するように増加した;ならびに1~2psiの逆圧。種発酵段階の完了を、デキストロースの枯渇によって決定した。種発酵槽からの315mL15の成熟接種物を、以下を除く上述と同じ培地主発酵培地を含むガラス発酵槽に添加した:容量は21Lでありそして034gLのLイソロイシンを添加した。インキュベーションを、以下の条件下で48時間行った:37°Cの温度;69のpHNH4OHで維持した;20時間まで35LPMの空気流、次いで40LPMまで増加した;最初に500rpmの撹拌、次いでこれを20でDOを維持するように増加した;1~2psiの逆圧;ならびに10gLのデキストロースレベル50wwデキストロース溶液を供給することによって維持した。発酵を48時間後に終了した。G909は以下の結果を生じた:274gの総生産性および232の収率での623gLのトレオニンの最終力価。tac3を、以下を除く上記のG909と同じ条件下で試験した:1mgLのIPTGを主発酵段階の開始で添加した。IPTGの添加で、tac3は、355gの総生産性および288の収率での857gLのトレオニンの最終力価を生じた。68を、上記のG909と同じ条件下で試験した。68は以下の結果を生じた:290gの総生産性および283の収率での741gLのトレオニンの最終力価。68tac3を、IPTGの添加を含む、上記のtac3と同じ条件下で試験した。68tac3は以下の結果を生じた:421gの総生産性および351の収率での993gLのトレオニンの最終力価。68tac3ileを、以下を除く上記の68tac3と同じ条件下で試験した:種発酵段階または主発酵段階のいずれかでLイソロイシンを必要としなかった。225時間では撹拌不足のため、22時間での力価のみを記録した62gLトレオニン。kat13を、以下を除く上記の68tac3と同じ条件下で試験した:IPTGを添加しなかった。これらの条件下で、kat13は、445gの総生産性および331の収率での102gLのトレオニンの最終力価を生じた。構築された株の関連遺伝子型、トレオニンの発酵的産生に必要とされる補充物、および記録された力価を、以下の表に示す:Escherichiacolikat-13株シンガポール出願人は、微生物の試料の分譲は、専門家に対してのみ行うことを要求できる。その旨の請求は、国際出願の公開のための技術的な準備が完了する前に、出願人により国際事務局へ提出されなければならない。ノルウェー出願人はここにおいて、出願がノルウェー特許庁により公開に付されるかあるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、ノルウェー特許法第22条および第33条3に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリストlistofrecognizedexpertsに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。オーストラリア出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、あるいは出願の放棄lapsing、拒絶あるいは取り下げ前において、発明に対し利害関係を有さない当業者である対象者skilledaddresseeに対してのみ行われる旨を、告知するものであるオーストラリア国特許法第3.253号規定。フィンランド出願人はここにおいて、出願が特許および統制委員会NationalBoardofPatentsandRegulationsにより公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。アイスランド出願人は、アイスランド特許庁により出願公開されるまで、または公開されることなくアイスランド特許庁により最終決定がされるまでは、試料の分譲は、当該技術に対してのみ行うことを要求することができる。Escherichiacolikat-13株デンマーク出願人はここにおいて、出願がデンマーク特許庁により公開に付されるかあるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、デンマーク特許法第22条および第33条3に基づき出願が公に利用可能にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとする。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリストlistofrecognizedexpertsに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。スウェーデン出願人はここにおいて、出願がスウェーデン特許庁により公開に付されるかあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、優先日から16ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対してなされるものとする好ましくはPCTApplicant’sGuideのVolumeIのannexZに記載された書式PCT/RO/134による。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリストlistofrecognizedexpertsに記載された任意の者か、あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。英国出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。オランダ出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取り下げあるいは放棄lapsedされる日までは、特許法31F1の規定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第22C条または第25条に基づき出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。