"癌細胞において細胞傷害性を誘導する方法であって、癌細胞をグリシルサイクリンと接触させることを含んでなる、方法。癌細胞が被験体におけるものであり、被験体に有効量のグリシルサイクリンが投与される、癌を処置するための請求項1に記載の方法。癌を処置するためのグリシルサイクリンの使用。癌の処置において用いるためのグリシルサイクリン化合物。a被験体から試験サンプルを得ること;b試験サンプルのミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量を測定すること;c試験サンプルのミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量を対照のミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量と比較すること、およびd試験サンプルのミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量が対照のミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量に比べて少なくとも2倍高い場合に被験体にチゲサイクリンを投与することを含んでなる、請求項2に記載の癌を処置する方法。対照に比べてミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量が少なくとも2倍高い癌を処置するための、請求項3に記載のチゲサイクリンの使用。グリシルサイクリンがチゲサイクリンである、請求項1または2に記載の方法、請求項3に記載の使用、または請求項4に記載の化合物。癌細胞がインビボのものである、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法、使用または化合物。癌が血液癌であるか、または癌細胞が血液癌細胞である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法、使用または化合物。血液癌が白血病、リンパ腫もしくは骨髄腫であるか、または癌細胞が白血病細胞、リンパ腫細胞もしくは骨髄腫細胞である、請求項9に記載の方法、使用または化合物。白血病がAML、ALL、CLLもしくはCMLであるか、または白血病細胞がAML細胞、ALL細胞、CLL細胞もしくはCML細胞である、請求項10に記載の方法、使用または化合物。癌が固形腫瘍癌であるか、または癌細胞が固形腫瘍癌細胞である、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法、使用または化合物。固形腫瘍癌が肺、卵巣もしくは前立腺癌であるか、または癌細胞が肺癌細胞、卵巣癌細胞もしくは前立腺癌細胞である、請求項12に記載の方法、使用または化合物。投与されるチゲサイクリンなどのグリシルサイクリンが組成物、用量または投与形に含まれてなる、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法、使用または化合物。組成物が有効量のグリシルサイクリンと場合により好適な担体またはビヒクルとを含んでなる、請求項14に記載の方法、使用または化合物。組成物が医薬組成物である、請求項15に記載の方法、使用または化合物。医薬組成物が固体投与形および液体投与形から選択される投与形である、請求項16に記載の方法、使用または化合物。組成物が非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼球投与、脳室内投与、嚢内投与、脊髄内投与、大槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与または経口投与により投与される、請求項17に記載の方法、使用または化合物。組成物が注射投与形を含んでなる、請求項18に記載の方法、使用または化合物。組成物が腫瘍内注射または腫瘍内血管注射により投与される、請求項17に記載の方法、使用または化合物。各単位投与形が約100mg~約2000mg、約100mg~約1500mg、約100mg~約1000mg、約100mg~約700mg、約100mg~約500mg、約100mg~約350mg、約100mg~約300mgまたは約100mg~約250mgのグリシルサイクリン、例えば、チゲサイクリンを含んでなる、請求項17に記載の方法、使用または化合物。各単位投与形が固体経口投与形、液体経口投与形または注射投与形に処方され、処置を必要とする被験体に対して約20~約100mgのグリシルサイクリン/kg体重、約30~約100mgのグリシルサイクリン/kg体重、約40~約100mgのグリシルサイクリン/kg体重、または約50~約100mgのグリシルサイクリン/kg体重を含んでなる、請求項17に記載の方法、使用または化合物。チゲサイクリンの投与から利益を受け得る被験体を同定する方法であって、被験体から試験サンプルを得ること;試験サンプルのミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量を測定すること;および試験サンプルのミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量を対照のミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量と比較することを含んでなり、該被験体は、その癌細胞が対照に比べて少なくとも2倍高いミトコンドリアDNAコピー数および/またはミトコンドリア質量を有する場合にチゲサイクリンの投与から利益を受け得ると同定される、方法。請求項1~23のいずれか一項に記載の方法、使用または化合物において用いるための、グリシルサイクリンおよび説明書および/または包装材料を含んでなるキット。グリシルサイクリンがチゲサイクリンである、請求項24に記載のキット。実施例1新規な治療薬を臨床試験へ速やかに進めるための戦略としての薬物再評価薬物再評価は新規な治療選択肢を臨床試験へ速やかに進めるための戦略であり、臨床的有効性を持つことが示されている。骨髄腫および脊髄形成異常を処置するための治療薬としてのサリドマイドの再評価はこの戦略のうち最もよく知られている例の1つであるが、他の成功も多く存在している。例えば、治療域の広い抗ウイルス薬リバビリンは、真核生物翻訳開始因子elF4Eの機能および細胞内局在を乱すことによって癌性形質転換を抑制することが分かっている9,10。従って、リバビリンは最近、再発または難治性M4/M5急性骨髄性白血病AML患者における第I相の用量漸増試験で評価された。リバビリンで処置した13人の患者に関するこの試験では、1人が完全緩解、2人が部分的緩解であった。よって、リバビリンはAMLの処置に効果的である可能性がある11。同様に、抗真菌ケトコナゾールはラットにおいて精巣および副腎からのアンドロゲンの生産を阻害する。この所見からして、ケトコナゾールは前立腺癌患者に関する臨床試験に速やかに進められ、そこで初期研究において臨床的有効性を示した12,13。チゲサイクリン白血病幹細胞に対して有効な化合物を特定するために、よく特徴付けられた薬物動態学および毒性学と広い治療域を有する薬物ライブラリーn=312を集めた。次に、このライブラリーに、TEX細胞およびM9-ENL1細胞の生存率を低下させる薬剤を同定するためのスクリーニングを行った。TEX細胞およびM9-ENL1細胞は、それぞれTLS-ERG癌遺伝子またはMLL-ENL癌遺伝子を形質導入した系列分離lineagedepletedヒト臍帯血細胞Lin-CBに由来するものであり、従前に示されているように階層的分化と骨髄再構築を含む幹細胞の特性を示す14,15。このスクリーニングでは、TEX細胞およびM9-ENL1細胞は化合物のアリコートで処理された。インキュベーション後、細胞増殖および生存率をMTSアッセイによって測定した。このスクリーニングから、チゲサイクリンが同定された。チゲサイクリンは、ある範囲のグラム陽性菌およびグラム陰性菌、特に薬剤耐性病原体16に対して活性があり、グラム陽性およびグラム陰性の複合感染の処置に関してFDAの認可を受けているグリシルサイクリン類の抗菌薬である。チゲサイクリンはテトラサイクリン骨格にtert-ブチル-グリシルアミド側鎖が付加されたミノサイクリンの類似体として合成により開発された17。この手法は、流出ポンプにより媒介される薬物耐性作用を低下させ、リボソームに対するその親和性を改善するために用いられた。そのデザインに一致して、チゲサイクリンは細菌タンパク質合成をそれぞれミノサイクリンおよびテトラサイクリンよりも3倍および20倍阻害することを示した18。機械的に、チゲサイクリンは細菌リボソームの30Sサブユニットに可逆的に結合して、アミノアシル-tRNA型がA部位に入るのを遮断し19、それにより、ペプチド鎖およびタンパク質合成を阻害する。チゲサイクリンは慣例的に大きな毒性なく12時間おきに静脈内に50mg投与されるが、より高用量も安全に用いられてきた。例えば、静脈内用量300mgは軽度の悪心を除いては十分許容されるものであり、抗白血病効果に必要な範囲内にある濃度であるCmax2.82μg/mL5μΜが得られる20。動物における毒性試験も行われた。30mg/kg/日を超える用量を2週間施したラットでは、可逆的貧血、血小板減少症および骨髄細胞減少を伴う白血球減少が起こった21。この30mg/kg用量は、体表面積および体重の尺度化に基づきヒトでは150mgの薬剤に相当し、薬剤の抗微生物用量の3倍以内である。しかしながら、これらの高濃度のチゲサイクリンは感染の処置には使用されず、おそらく、なぜ抗癌活性がこれまでにこの薬剤で報告されてこなかったかを説明する。さらに、動物試験では、この薬剤が骨および骨髄などの組織に19:1といった高い血漿比率で蓄積することが示された。ミトコンドリアタンパク質合成本明細書に記載の機構研究は、チゲサイクリンがミトコンドリアタンパク質合成を阻害することを示す。真核細胞は染色体中に構成されている核DNAとミトコンドリア内に存在する環状ミトコンドリアDNAの、2つの別個のゲノムを有する。ミトコンドリアDNAは16.6kbp長の二本鎖環状ゲノムからなり、イントロンを欠いている22。それは2つのrRNAと、22のt-RNAと、ミトコンドリア呼吸鎖の90のタンパク質のうち13をコードしている。呼吸鎖の残りのタンパク質は核にコードされ、ミトコンドリアに輸送され、電子伝達系の機能的複合体に組み立てられる。ミトコンドリアリボソームは細菌および真核生物のサイトゾルリボソームとは構造および化学的特性が異なる23。細菌リボソームに比べて、ミトコンドリアリボソームはおよそ半分ものrRNAおよびタンパク質の2倍を超える量を含む。ミトコンドリアリボゾームタンパク質は核遺伝子によりコードされ、サイトゾル内で翻訳される。ひと度翻訳されると、これらのタンパク質はミトコンドリアに運び込まれ、そこで2つのrRNA分子と結合してミトコンドリアの機能的リボソームを形成する。これらのミトコンドリアリボゾームタンパク質の多くは、細菌またはサイトゾルリボソームにおいて類似の類似体を持たない。ミトコンドリアリボソームは細胞質リボソームおよび細菌リボソームと構造が異なるが、機能は類似する。さらに、ミトコンドリアリボソームおよび細胞質リボソームは同じ伸長開始機構を用いる24-26。細菌タンパク質合成を阻害する抗生物質は、ヒトミトコンドリアリボソームと交差反応し、ミトコンドリアタンパク質合成を阻害することが報告されている27。例えば、クロラムフェニコールは骨髄抑制を引き起こし、ミトコンドリアリボソームのA部位に結合することによりミトコンドリアタンパク質合成阻害の阻害によるものとされている28。オキサゾリジノンはクロラムフェニコールと同じ細菌リボソーム部位に結合し、これもまた骨髄抑圧を引き起こし、ヒトミトコンドリアリボソームを阻害することができる29。方法試薬化学ライブラリーの化合物はSequoiaResearchProductsLimitedから購入した。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムPIはから購入した。細胞系統ヒト白血病OCI-AML2、HL60、U937細胞系統はRPMI1640倍地で維持した。骨髄腫LP-1、KMS11、8226、JJN3、OP-M2細胞系統はイスコフ培地で維持した。卵巣OVCAR、前立腺PC3および肺胞A549細胞系統はRPMI1640倍地で維持した。培地には10ウシ胎仔血清FCS、100μg/mLのペニシリンおよび100単位/mLのストレプトマイシン総てHycloneLoganUTからを添加した。TEX細胞はIMDM、15FBS、2mML-グルタミン、1ペニシリン-ストレプトマイシン、20ng/mLSCF、2ng/mLIL-3で維持した。M9-ENL1細胞はα-MEM、20FBS、5ヒト血漿、2mML-グルタミン、1ペニシリン-ストレプトマイシン、100ng/mLSCF、10ng/mLIL-3、5ng/mLIL-7および5ng/mLFLT3Lで維持した。細胞は総て、5CO2を加えた加湿空気雰囲気中、37°Cでインキュベートした。初代細胞ヒト原発性急性骨髄性白血病AMLサンプルを同意を得たAML患者の新鮮な末梢血サンプルから単離した。同様に、初代正常造血細胞は、幹細胞移植のために末梢血単核細胞PBSCの提供を同意を得た健常なボランティアから得た。これらのサンプルからフィコール密度勾配遠心分離によって単核細胞を単離した。初代細胞は、20FCS、1mMのL-グルタミンおよび適当な抗生物質を添加したIMDM中、37°Cで培養した。本試験のためのヒト組織の収集および使用は、UniversityHealthNetwork治験審査委員会により認可されたものである。化学スクリーンTEXおよびM9-ENL-1細胞を96ウェルポリスチレン組織培養プレートコーニング社製に播種した。播種後、細胞を終濃度10μΜおよび1μΜDMSO0.025にて、化学ライブラリーn=312の5μLアリコートで処理した。インキュベーションから72時間TEXおよび48時間M9-ENL-1後に、細胞増殖および生存率をMTSアッセイにより評価した。液体の取扱いはBiomekFXLaboratoryAutomatedWorkstationによって行った。細胞生存率アッセイ細胞増殖および生存率は、MTSアッセイにより、製造者の説明書に従って評価した。アポトーシスおよび細胞死は、製造者の説明書に従い、従前に記載されているように30、アネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって測定した。クローン性増殖を評価するために、原発性AML細胞1.0×105/mLまたは顆粒球コロニー刺激因子G-CSF動員PBSC1.0×105/mLを、IMDM中1のメチセルロース、30FCS、1ウシ血清アルブミン、3U/mLの組換えヒトエリスロポエチン、10-4Mの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、50ng/mLの組換えヒト幹細胞因子、10ng/mLのGM-CSFおよび10ng/mLのrhIL-3を含有するMethoCultGFH4434培地中、漸増濃度のチゲサイクリンとともに2反復で播種した。播種7日AMLサンプルまたは14日正常PBCS後に、コロニーの数を従前に記載されているように計数した31。マウス白血病モデルにおけるチゲサイクリンの抗白血病活性の評価OCI-AML2ヒト白血病細胞1×106をSCIDマウスの側腹部に皮下注射した。注射7日後に、腫瘍が触知可能となったところで、マウスを1日2回、チゲサイクリン50mg/kgまたは100mg/kg、i.p.注射によるまたはビヒクル対照n=10/群で14日間処置した。腫瘍体積腫瘍長×幅2×0.5236を1週間に3回カリパスを用いて測定した。細胞の注射から21日後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を摘出し、腫瘍の体積および質量を測定した。マウス原発AMLモデルにおいてチゲサイクリンを評価するために、AML患者の新鮮な末梢血サンプルからヒト原発性AML細胞を単離した。凍結アリコートを解凍し、計数し、PBSに再懸濁した。原発性細胞2×106を、24時間前にセシウム-137源からの208radで照射した10週齢の雌NOD-SCIDマウスの右大腿に注射した。AML細胞の注射から3週間後に、マウスを毎日チゲサイクリン100mg/kg、i.p.注射によるまたはビヒクル対照n=10/群で3週間処置した。その後、マウスを犠牲にし、大腿から細胞を流出させた。骨髄におけるヒトAML細胞の生着はフローサイトメトリーによってヒトCD45CD33CD19-のパーセンテージを計数することによって評価した。動物試験は総て、カナダ動物管理協会の規則に従い、施設内倫理審査委員会の認可を受けて行った。免疫ブロット法従前に記載されているように32、細胞から全細胞溶解液を調製した。要するに、細胞をリン酸緩衝生理食塩水pH7.4で2回洗浄し、プロテアーゼ阻害錠剤を含有する溶解バッファー1.5n-ドデシルβ-マルトシド、シグマアルドリッチ社製StLouisMOに懸濁させた。タンパク質濃度をDCタンパク質アッセイによって測定した。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムSDS-ポリアクリルアミドゲルに付した後、ニトロセルロース膜に転写した。膜を抗Cox-1、抗grp78、抗XIAP、抗α-チューブリン、抗β-アクチン、およびGEHealth社からの二次抗体IgGペルオキシダーゼ結合種特異的完全抗体で試験した。検出は増強化学発光法によって行った。ミトコンドリア膜電位の検出ミトコンドリア膜電位を測定するために、細胞を上記と同様にチゲサイクリンで処理した後、PBSで2回洗浄し、5μΜの5,5’,6,6’-テトラクロロ-1,1’,3,3’-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイドJC-1、シグマアルドリッチ社製とともに37°Cで20分間インキュベートした。次に、各サンプルを1mLPBSで2回洗浄し、500μLのPBSに再懸濁させた後、BDFACSCaliburで読み取った。サンプルを488nmで励起させ、526nm緑と595nm赤で発光を採取した。分析はFlowJoソフトウエアを用いて行った。ミトコンドリア膜電位赤/緑を得るために、赤色チャネルからの発光を緑色チャネルからの発光で割った。逆転写酵素のリアルタイムPCRファーストストランドcDNAを1μgのDNアーゼ処理した全細胞RNAから、ランダムプライマーおよびSuperScript商標II逆転写酵素インビトロジェン社製を製造者のプロトコールに従って用いて合成した。リアルタイムPCRアッセイは、5ngRNA当量のcDNA、SYBRGreenPCRMasterMixアプライドバイオシステムズ社製および400nmol/Lの遺伝子特異的プライマーを用い、3反復で行った。反応物を処理し、ABI7900SequenceDetectionSystemアプライドバイオシステムズ社製で分析した。ヒトCox-1および18Sに対するヒトcDNAのフォワード/リバースPCRプライマー対を用いた。相対的mRNA発現を、記載32の通りにCT法を用いて測定した。結果化学スクリーニングは潜在的抗白血病活性を有するチゲサイクリンを同定するこれまでに認識されていない白血病および白血病幹細胞に対するFDA認可薬が、それまでの毒性学および薬理学試験を考えれば、この新規な適応に関して速やかに位置付けのし直しをすることができる。このような化合物を同定するために、治療域が広く、薬物動態がよく理解されている薬剤の化学ライブラリーn=312を集めた。TEXおよびM9-ENL1白血病細胞を10μΜおよび1μΜ濃度にてこのライブラリーのアリコートで処理した。インキュベーションTEX72時間、M9-ENL148時間後、細胞増殖および生存率をMTSアッセイにより測定した。インキュベーション時間の違いは、2つの系統間の増殖速度の違いによるものであった。これらのスクリーニングから、チゲサイクリンは10μΜにおいてTEX細胞とM9-ENL1細胞の双方で細胞増殖として同定された。薬剤濃度10μMでのこのスクリーニングの結果を図1A、Bに示す。チゲサイクリンはインビトロにおいて好適な抗白血病活性を有する悪性細胞系統の増殖および生存率に対するチゲサイクリンの効果を評価するために、白血病細胞、骨髄腫細胞および固形腫瘍細胞のパネルを漸増濃度のチゲサイクリンで処理した。インキュベーション72時間後、細胞増殖および生存率をMTSアッセイにより評価した。チゲサイクリンは5~8μMのIC50で供試白血病細胞系統の生存率を低下させた図1C。ネズミ白血病細胞系統は、前白血病表現型および白血病表現型の種々の誘導物質でマウス骨髄から誘導したものである。3ND13pacpSF91細胞は前白血病モデルの代表的なものであり、セカンダリーヒットMeis1、MN1でAMLへと誘導することができる。9MN1細胞は癌遺伝子髄膜腫1MN134;PMID:17494859を形質導入し、マウスモデルにおいて急速進行性AMLの誘導が可能である。ND13panMN1細胞はMN1とND13の双方の癌遺伝子を発現するように操作されている。9MN1細胞およびND13panMN1細胞は双方とも、高頻度の白血病幹細胞を維持する。HoxA9neoMeis1細胞はHOXA9とMeis1癌遺伝子を同時発現し、マウスモデルにおいて生着可能なAML誘導が可能である。これに対し、チゲサイクリンは骨髄腫細胞および固形腫瘍細胞系統に対して細胞傷害性が低く、IC50は10μΜを超える図D、E。チゲサイクリンは、フローサイトメトリーによって、アネキシンVにより標識された細胞のパーセンテージとして測定される、TEX細胞のアポトーシスにおいて時間依存的増加を示す図1F。チゲサイクリンはミノサイクリンおよびテトラサイクリンの構造類似体であるが、TEX細胞は25μΜまでの濃度でミノサイクリンまたはテトラサイクリンのいずれにも感受性が無かったことに留意されたい図1G。チゲサイクリンは正常造血細胞よりも優先的に原発性AML細胞に細胞死を誘導する白血病細胞系統に対するチゲサイクリンの細胞傷害性を考え、原発性急性骨髄性白血病AML患者サンプルおよび正常造血細胞において細胞死を誘導するチゲサイクリンの能力を比較および評価した。原発性AML患者サンプルおよび初代正常造血細胞を漸増濃度のチゲサイクリンで48時間処理した。インキュベーション後、細胞生存率をアネキシンV染色により測定した。一部の白血病患者はチゲサイクリンに対する感受性を示したがLD505μΜ、n=13図2A、少数の患者ではインビトロでのチゲサイクリン処置に対する耐性が高かったLD50>9μΜ、n=7、図2B。感受性AML患者サンプルのうち2つは総ての現行の標準的AML化学療法計画に不応であった。初代正常造血細胞PBSCは、同種骨髄移植に対してG-CSF動員された、同意を得たドナーの末梢血から抽出した。これらの正常造血細胞は感受性原発性AMLサンプルよりもチゲサイクリンに対して耐性が高かったLD50>10μΜ、n=5、図2C。これらの正常造血細胞のCD34前駆細胞画分のチゲサイクリン感受性を分析した際、PBSCと比較して同様の活性が見られた。メチルセルロースコロニー形成アッセイにおける原発性AMLおよび正常造血細胞のクローン性増殖を阻害するチゲサイクリンの能力を評価した。チゲサイクリン5μΜは、原発性AML患者サンプルn=7のクローン性増殖を93±4引き下げた図2D。これに対し、5μΜのチゲサイクリンは、正常造血細胞のクローン性増殖を34±5n=5引き下げた図2D。従って、チゲサイクリンは細胞死を誘導し、薬理学的に達成可能な濃度で正常細胞よりも優先的にAML細胞系統および原発性患者サンプルのクローン性増殖を阻害した。チゲサイクリンはマウス白血病モデルにおいて活性を示す潜在的抗白血病薬としてのチゲサイクリンの効果を考え、マウス白血病モデルにおいてチゲサイクリンを評価した。インビボにおいてチゲサイクリンの抗腫瘍有効性を評価するために、ヒトOCI-AML2白血病細胞をSCIDマウスの側腹部に注射した。注射7日後に腫瘍が触知可能となったところで、マウスを1日2回、チゲサイクリン50mg/kgまたは100mg/kg、i.p.注射によるまたはビヒクル対照で14日間処置したn=10/群。経時的に腫瘍体積および質量を測定した図3A、B。ビヒクル対照に比べ、チゲサイクリンは有意に腫瘍質量および体積を70低下させたp<0.001。チゲサイクリンからの毒性の証拠は見られなかった。具体的には、マウスの身体または挙動に変化は無かった。この試験の結果として、剖検において臓器に大きな変化は無かった。インビボでのチゲサイクリン処置が腫瘍細胞のミトコンドリア翻訳を阻害していたかどうかを判定するため、チゲサイクリン処置マウス50mg/kg1日2回、5日間およびビヒクル処置マウス生理食塩水1日2回、5日間の腫瘍から単離されたシトクロムCオキシダーゼタンパク質サブユニットの相対的発現を調べた。チゲサイクリン処置マウスからの腫瘍は、核により翻訳され、コードされるサブユニットCox-4に比べてミトコンドリアで翻訳されるサブユニットCox-1およびCox-2発現の優先的低下を示す。従って、OCI-AML2異種移植モデルにおける腫瘍質量および体積の低下がミトコンドリア翻訳阻害と関連していた図3C。インビボにおいて白血病生着を開始させる能力により定義される原発性AML幹細胞に対するチゲサイクリンの効果もまた評価した。3人のAML患者からの原発性細胞3つの独立した実験を、致死量以下で照射を行った雌NOD-SCIDマウスの右大腿に大腿内注射した。注射3週間後にマウスを毎日チゲサイクリン100mg/kgi.p.注射によるまたはビヒクル対照n=10/群で3週間処置した。注射6週間後にマウスを犠牲にし、右大腿から細胞を流出させた。骨髄におけるヒトAML細胞の生着はフローサイトメトリーによってヒトCD45CD33CD19-細胞のパーセンテージを計数することによって評価した。ビヒクル対照で処置したマウスに比べ、チゲサイクリンは、大きな臓器毒性または体重低下なく、ヒト原発性AML細胞の生着を有意に低下させた図3D。よって、チゲサイクリンは白血病腫瘍の増殖を遅延させ、マウス白血病モデルにおいて薬理学的に達成可能な濃度で原発性AML細胞の生着を低下させた。チゲサイクリンは白血病細胞にけるミトコンドリアタンパク質合成を阻害するチゲサイクリンは30S細菌リボソームと結合し、それにより、伸長を阻害し、タンパク質合成を低下させる。従って、その翻訳がサイトゾルリボソームおよびミトコンドリアリボソームに依存するタンパク質の発現に対するチゲサイクリンの効果を評価した。TEX、OCI-AML2および2人の原発性AML患者からの細胞を漸増濃度のチゲサイクリンで処理し、ミトコンドリア翻訳タンパク質Cox-1、Cox-2およびCox-4のレベルを免疫ブロット法によって経時的に測定した。Cox-1とCox-2は、ミトコンドリアの電子伝達系の最終酵素であるシトクロムCオキシダーゼの3つの大サブユニットI、IIおよびIIIのうちの2つである。サブユニットI、IIおよびIIIはミトコンドリアゲノムによってコードされ、もっぱらミトコンドリアリボソームにより翻訳される33。Cox-1およびCox-2と対照的に、シトクロムCオキシダーゼのCox-4サブユニットは核ゲノムによりコードされ、核リボソームにより翻訳される。TEX、OCI-AML2および2人のAML患者からの細胞を漸増濃度で処理し、Coxサブユニットタンパク質の発現をウエスタンブロット法によって調べた。チゲサイクリン処置は、核翻訳サブユニットIVよりもミトコンドリア翻訳サブユニットIおよびIIの優先的低下と関連している図4A。また、チゲサイクリンは、サイトゾルリボソームにより翻訳される核コードタンパク質XIAPまたはgrp78の発現を変化させなかった図4A。チゲサイクリンで処理したTEXおよび原発性AML細胞は、定量的RT-PCRで測定した際に、ミトコンドリアによりコードされる遺伝子Cox-1、Cox-2のmRNA発現を核によりコードされる遺伝子Cox-4よりも優先的に増加させた図4B。このことは、ミトコンドリアタンパク質合成阻害はミトコンドリアによりコードされるmRNAの増加、およびミトコンドリア酵素サブユニットの安定で不変の核コードmRNAをもたらすことを示したこれまでの試験と一致する。ミトコンドリア非呼吸鎖酵素クエン酸シンターゼと比較した、呼吸鎖複合体の酵素活性に対するチゲサイクリン処置の効果を調べた。TEX白血病細胞を70時間チゲサイクリンで処理した後、クエン酸シンターゼ活性と比較して呼吸鎖酵素を分析した。同等のチゲサイクリン濃度2.5μΜおよび5μΜはクエン酸シンターゼと比較して複合体IおよびIVの酵素活性を低下させたが、複合体IIの活性への影響は小さかった図4C。同様の結果が、ミトコンドリアタンパク質合成の既知の阻害剤であるクロラムフェニコールで見られた。酸化的リン酸化の際、酸素還元とATP合成の間を介在するものが、ほとんどミトコンドリア膜電位から構成される電気化学的プロトン勾配である。ATPシンターゼ複合体Vは起電力としてプロトン勾配を用いてATPを生成する。カルボシアニン色素JC-1により測定した際のミトコンドリア膜電位に対するチゲサイクリン処置の効果を調べた。TEX細胞および3つの異なる原発性AMLサンプルは、チゲサイクリン処置5μΜ後、細胞死の開始に先立つ時点でミトコンドリア膜電位を低下させた図4D。ミトコンドリア膜電位の低下は、2人の異なるG-CSF動員正常ドナー由来の正常造血細胞では見られなかった。AMLサンプルはまた、実施例2に記載のように、ミトコンドリアDNAコピー数を増やし、ミトコンドリア質量を増大させた図5。これは正常造血細胞と比較してチゲサイクリンに対する原発性白血病芽細胞の優先的感受性と関連している可能が最も高い。電子伝達系のミトコンドリア酵素活性の副産物は反応性酸素種ROSの生成である。ミトコンドリア複合体の阻害剤は、ROSの生成に急速な増加をもたらすことがこれまでに示されている。よって、ジクロロフルオレセイン色素DCF-DAを用いて過酸化水素イオンH2O2を、また、ジヒドロエチジウムDHEを用いてスーパーオキシド陰イオンを分析することによって白血病細胞におけるROSの生成に対するチゲサイクリンの役割を調べた。チゲサイクリン処置後のTEX細胞においては、24時間までの時点でROS生成に増加は見られなかった図4D。このチゲサイクリン処置によって変わらないROS生成は、ROSレベルに急速な増加が見られたアジ化ナトリウム、ロテノン、オリゴマイシンまたはアンチマイシンなどの種々のミトコンドリア複合体酵素阻害剤の活性と比較した場合に独特なものであった。白血病細胞におけるチゲサイクリン処置は、ミトコンドリアETC阻害剤または非カップリング薬で通常見られるものとは異なる機構を介したミトコンドリア膜電位の消失をもたらしている図4D。実施例2急性骨髄性白血病細胞のミトコンドリアの特徴を評価した。ミトコンドリアDNAコピー数を、原発性AMLおよび正常G-CSF動員ドナーの末梢血からの単核細胞において求めた。細胞からDNAを抽出し、ヒトグロブリンHGBと比較してミトコンドリアND1に関してリアルタイムPCRを行った。ND1/HGB比は、1人の正常G-CSF動員ドナーからの細胞と比較して示す図5A。ミトコンドリア質量も評価した。ミトコンドリア質量はAML芽細胞塊およびCD45/CD34細胞で評価し、正常G-CSF動員個体からのCD45/CD34細胞と比較した。ミトコンドリア質量は、細胞をMitotrackerGreenFM色素とともにインキュベートした後にフローサイトメトリーを行うことによって測定した。簡単に述べれば、AML患者サンプルを5および10μMのチゲサイクリンで48時間処理した。処理後、細胞生存率をアネキシンV染色により測定した。並行して、チゲサイクリンで処理しなかった同じAML細胞をMitotrackerGreenFMで染色してミトコンドリア質量を測定した。ミトコンドリア質量は正常CD34造血系細胞のサンプルに対してノーマライズした。中央蛍光強度を1人の正常G-CSF動員ドナーと比べて示す図5B。ミトコンドリア質量を、従前に記載したMitotrackerGreenFM法を用いて11人のAML患者からの芽細胞で測定した。その後、細胞を漸増濃度のチゲサイクリンとともに48時間インキュベートした。生存率は、アネキシン-V/PI染色とその後のフローサイトメトリーにより評価した。5μΜおよび10μΜ用量でのベースラインミトコンドリア質量とチゲサイクリンに対する感受性の間の相関を示す図5C。本開示を現在のところ好ましい例であると考えられるものに関して記載してきたが、本開示は開示されている例に限定されないと理解すべきである。これに対し、本開示は添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および等価な構成を包含することを意図する。総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個々に引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが示される場合と同じ程度で、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。本明細書内で参照された参考文献のリスト"