"非コードRNA転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させるための短いRNA分子を設計する方法であって、a少なくとも前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、bステップaで決定される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的RNA配列を決定するステップと、cステップbで決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも80の配列同一性を有する短いRNA分子を設計するステップと、を含み、前記非コードRNA転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法。前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子である、請求項1に記載の方法。cで定義される前記領域は、前記遺伝子の転写開始点の逆相補体を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。前記短いRNA分子は、16ヌクレオチド長~30ヌクレオチド長である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記短いRNA分子を取り込む二本鎖siRNA分子を産生するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記二本鎖siRNA分子の各鎖は、16~30ヌクレオチド長であり、前記分子は、少なくとも12ヌクレオチド長にわたってハイブリダイズされる、請求項5に記載の方法。前記短いRNA分子は、21ヌクレオチド長である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。前記短いRNA分子は、ステップbで決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも95の配列同一性を有する、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。ステップaは、少なくとも前記遺伝子の転写開始点の500ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の500ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得ることを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。非コードRNA転写物の下方制御によって細胞内の標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、a少なくとも前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド下流の間の、前記標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を得るステップと、bステップaで決定される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的RNA配列を決定するステップと、cステップbで決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも80の配列同一性を有する短いRNA分子を設計するステップと、d前記細胞を前記短いRNA分子と接触させるステップと、を含み、前記非コードRNA転写物の存在が決定されるステップを含まない、方法。コンピュータシステムに、a少なくとも前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド上流から前記遺伝子の転写開始点の200ヌクレオチド下流の間の、標的遺伝子のコード鎖のヌクレオチド配列を受信すること、bステップaで受信される前記ヌクレオチド配列に対する逆相補的RNA配列を決定すること、およびc非コードRNA転写物の下方制御によって細胞内の前記標的遺伝子の発現を増加させるように設計される短いRNA分子であって、ステップbで決定される前記配列の領域の逆相補体であるか、または前記逆相補体と少なくとも80の配列同一性を有する、短いRNA分子を構築するための情報を出力すること、を命令するためのコンピュータ実行可能な命令を含み、前記命令は、前記非コードRNA転写物の存在を決定することを要求する命令を含まない、1つ以上のコンピュータ可読媒体。コンピュータ可読媒体上に短いRNA分子を構築するための前記情報を出力するための命令をさらに含む、請求項11に記載のコンピュータシステムに命令するためのコンピュータ実行可能な命令を含む、1つ以上のコンピュータ可読媒体。細胞内の標的遺伝子を上方制御することによって細胞の集団の分化能を維持するかまたは増加させる方法であって、前記標的遺伝子は、多能性誘導遺伝子であり、前記方法は、前記細胞を、前記細胞内の標的RNA転写物を特異的に下方制御する短いRNA分子と接触させることを含み、前記標的RNA転写物は、ia前記標的遺伝子の転写開始点の100kb上流までの遺伝子座のいずれかの鎖、b前記標的遺伝子の転写終了点の100kb下流までの遺伝子座のいずれかの鎖、またはc前記標的遺伝子と物理的に相互作用する遺伝子座のいずれかの鎖、から転写され、ii前記標的遺伝子の転写開始点の100kb上流から前記標的遺伝子の転写終了点の100kb下流の間に位置するゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、方法。前記標的RNA転写物は、前記標的遺伝子の転写開始点を含むゲノム配列に対してアンチセンスである配列を含む、請求項13に記載の方法。前記標的遺伝子は、KLF4、POU5F1、SOX2、MYC、NANOG、およびLIN28からなる群から選択される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。前記標的遺伝子は、KLF4である、請求項15に記載の方法。請求項1~9のいずれか1項に請求される方法を行うことと、それによって設計されるRNA分子を合成することと、を含む、RNA分子を生成する方法。本明細書の表1~3に記載される配列のうちのいずれか1つを有する、短いRNA分子。概要この試験の目的は、短いRNAの付加による非遺伝的手法を使用することによって、Klf4、Myc、Sox2、およびNanog等の多能性遺伝子の発現を上方制御することができるかどうかを確認することであった。Klf4[他の多能性因子の発現を制御する主要制御因子]およびMycタンパク質を上方制御するための合成オリゴを設計し、それらがCD34造血幹細胞および間葉系幹細胞に与える影響について調べた。EST領域においてアンチセンスを標的とするDB1およびDB2、ならびにKlf4遺伝子のプロモーター領域においてアンチセンス配列を標的とするPR1およびPR2の4つの構築物を設計した。造血性CD34細胞において、Klf4活性化オリゴは、DB1およびDB2構築物を有するKlf4の発現の増加をもたらした。これは、細胞増殖の増加と関連していた。別の構築物であるKlf4-PR2構築物は、Sox2遺伝子産物の発現の増加をもたらした。間葉系幹細胞において、Myc活性化オリゴPR1およびPR2が、c-mycの上方制御をもたらした。同様に、Klf4-PR1活性化オリゴが、Klf4タンパク質およびKlf4調節遺伝子c-mycおよびnanogの上方制御をもたらした。結論として、一本鎖および二本鎖オリゴは、成人骨髄由来幹細胞において多能性遺伝子の上方制御をもたらすことができ、これは、実用的用途を有し得る。材料および方法細胞増殖曲線骨髄由来の造血性CD34幹細胞をGordonetal.,2006StemCells247:1822-30に従って培養した。簡潔に述べると、CD34単離キットMiltenyiBiotechnologyを使用して、骨髄由来CD34細胞を単核細胞細胞から単離した。増殖曲線分析のために、個々のKLF4オリゴヌクレオチド100nMを用いて、製造者のプロトコルPAALtdに従ってナノフェクタミンNanofectamine試薬を使用して細胞1x105をトランスフェクトした。調べたKLF4オリゴヌクレオチドは、KLF4_DB-1、KLF4_DB-2、KLF4_Pr-1、およびKLF4_Pr-1であった。7日ごとに28日間、細胞をトランスフェクトした。週に1度、合計生細胞を数え、新鮮な培地と交換した。間葉系幹細胞[MSC]については、全ての実験において、1日目に複製ウェルに20,000個のMSCKlf4のテストには継代P8、c-Mycには継代P5を播種し、0、2、4、および6日目に、リポフェクタミンRNAiMAXを使用して各ウェルを50nMの候補オリゴでトランスフェクトした。細胞を溶解し、2、4、6、および8日目にQIAGENRNeasyキットを使用してRNAを単離した。ABIHighCapacitycDNAキットを使用してcDNAを産生させるための逆転写を行い、ABITaqmanGeneExpressionMasterMixを用いたqPCRによりサンプルを増幅した全て、製造者の標準プロトコルに従った。内部標準としてβアクチンを使用し、相対定量法によりスクランブル配列対照オリゴにサンプルを標準化した。RQが>300xであったため、Klf4オリゴによるNanogの活性化をlogスケール上に示す。ウエスタンブロットウエスタンブロット分析のために、製造者PAAの推奨に従ってナノフェクタミン試薬を使用して、KLF4_DB-2オリゴヌクレオチドを1x105細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間および72時間後に、全タンパク質溶解物を溶解バッファPBS中の1NP-40および1Triton-X100中に収集した。72時間で回収したRNAは、KLF4_DB-2オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを2回連続して受けた。タンパク質DCアッセイBio-radを用いてタンパク質濃度を測定した。約100ugのタンパク質を付加し、Novex4-20Tris-GlycineGelInvitrogen上で標準的なSDS-PAGEを使用して分解した。ゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、半乾性ブロッティング装置Bio-Radを使用してニトロセルロース膜上に移した。5脱脂乳を含むTBS中で1時間膜をブロックしてから、室温で1時間、一次抗体でインキュベートした。1:200希釈のKLF4Millipore、1:200希釈のNanogRDsystems、1:500希釈のアクチンSigmaに対する一次抗体を用いてブロットをプローブした後、1:5000希釈の適切な二次複合化アルカリホスファターゼJacksonLaboratoryを用いた。数回洗浄した後、BCIP/NTB試薬Calbiochemを用いてブロットを検出した。GeldocシステムUVPを使用してブロットを撮像した。RT-PCRKLF4_DB-2オリゴヌクレオチドを1x105細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間および72時間後に全RNAを回収した。72時間で単離したRNAは、オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを2回連続して受けた。製造者の推奨に従ってRNAqueous-MicroキットAmbionを使用して全RNAを回収した。Nanodrop2000微量サンプル定量装置を使用してRNAを定量化した。製造者の推奨に従ってOneStepRT-PCRキットQiagenを使用して各サンプルから約200ngの全RNAを逆転写した。94°Cで45秒、55°Cで45秒、および72°Cで45秒の32周期でプライマー対RDsystemsを用いたPCRにより、ヒトNanogの発現を半定量的に測定した。94°Cで45秒、60°Cで45秒、および72°C秒で1分間の36周期で、GAPDHプライマー、順方向5’GTGAAGGTCGGAGTCAACG3’および逆方向5’GGTGAAGACGCCAGTGGACTC3’をローディングコントロールとして用いた。PCR産物をアガロースゲル上で分析し、GeldocシステムUVPを使用して撮像した。結果KLF4の発現を活性化するための短いRNAの設計KLF4は、9番染色体9q31.2の長腕のサブバンド2であるバンド31に位置する。KLF4基準配列mRNANM_004235は、5つのエクソンからなり、ヌクレオチド109,286,954~109,291,868ヒトゲノムアセンブリバージョンhg18;UniversityofCaliforniaSantaCruzUCSCゲノムブラウザ、図1の9番染色体の陰性鎖から転写される。KLF4の遺伝子座から潜在的なアンチセンス転写物を同定するために、KLF4を取り囲むゲノム領域で、陽性鎖にマッピングしたスプライシングされた発現配列タグESTを検索した。通常、ESTの転写配向を決定することは困難であるが、スプライシングされたESTのスプライシング部位の特徴を用いて配向を決定することができる。KLF4と重複するスプライシングされたESTは見られなかったが、走査によりKLF4のアノテートされた転写開始点TSSの約15kb上流に1つのアンチセンスESTDB461753が同定された。したがって、このESTを標的候補として選択した。また、KLF4のプロモーター領域からの潜在的なアンチセンス転写物を標的とする短い活性化RNAを設計することも決定された。より具体的には、KLF4のTSSから500nt上流および下流のアンチセンス配列KLF4_AS_TSS/-500と略されるを第2の標的候補として用いた。目的は、2つの候補配列を下方制御するための短いRNAを設計することであった。候補の短いRNAは、標的配列の効果的な阻害をもたらすべきであり、また理想的には、潜在的なオフターゲット効果が最小限に抑えられるように、可能な限り特異的であるべきである。したがって、GPboostsiRNAの設計アルゴリズムを使用して、2つの候補配列を下方制御するための潜在的な短いRNAを同定した。予測されるsiRNA候補のリストから、アンチセンスESTDB461753の第2のエクソン中の最も有望な2つの非重複siRNA標的部位と、アンチセンスプロモーター配列中のKLF4TSSKLF4_AS_TSS/-500の各側の最も有望なsiRNA標的部位を選択した。GPboostから予測される有効性スコア、配列モチーフaaaa、cccc、gggg、およびttttが存在しないこと、20~55の中間的なGC含有量、ならびに少なくとも2つ~全ての潜在的なオフターゲット転写物のハミング距離に基づいて、候補siRNAを選択した。表4は、KLF4の発現を活性化するために得られた候補の短いRNAを示す。この表は、短いRNA二重鎖の両方の鎖を示しているが、活性化RNAは、一本鎖オリゴPMID:12230974として投与されてもよい。KLF4に対する低分子RNAasRNA候補の活性化この表は、アンチセンスESTDB461753ID:DB-1およびDB-2ならびにKLF4のプロモーター領域ID:Pr-1およびPr-2に対する最も有望な2つのsiRNAを列挙している。Posは、ESTまたはKLF4のプロモーター領域内で始まる標的部位であり、エクソンは、標的部位のエクソンの数であり、センスは、siRNAの19mer標的部位配列を示し、アンチセンスは、対応する逆相補的配列を示す。センスおよびアンチセンス配列、ならびにそれらの3’末端の2ntオーバーハング配列UU:表には記載せずが、siRNA二重鎖候補を形成する。候補の短いRNAは、CD34細胞におけるKLF4の発現を活性化するCd34を異なるKlf4活性化オリゴ[DB1、DB2、PR1、およびPR2]で処理した。Klf4-DB1は、強い増殖効果を有するようである[図3]。DB1およびDB2は、細胞内で最も高いKlf4の発現を有する[図4a]。PR2、DB1、およびPR1は、Sox2の発現の増加を示す[図4b]。候補の短いRNAは、間葉系幹細胞におけるKLF4、c-Myc、およびnanogの発現を活性化するKLF4と同じ手法を用いて、再プログラミング因子MYC、POU5F1、およびSOX2を活性化するためのオリゴを設計した表5。MSCをc-MycおよびKlf4活性化オリゴで処理した。図5は、c-myc活性化オリゴ投与後のc-mycの発現を示す。PR1およびPR2オリゴを用いると最も高い効果が観察された。図6、7、および8は、klf4活性化オリゴによるKlf4、c-myc、およびnanogの発現を示す。Klf4-PR1オリゴは、Klf4およびその下流遺伝子[c-mycおよびnanog]の最も高い発現を引き起こすことが示された。MYC、POU5F1、およびSOX2に対する低分子RNAasRNA候補の活性化この表は、アンチセンスESTならびにMYC、POU5F1、およびSOX2のプロモーター領域に対する最も有望な2つのsiRNAを列挙している。考察図面に示し、図面の説明において論じてきたように、標的遺伝子に対してアンチセンスな配列を含むRNA転写物を標的とする短いRNAは、機能的であり、標的の強い上方制御をもたらすことが示された。具体的には、標的遺伝子のプロモーター領域に対してアンチセンスである配列を含むRNA転写物を標的とするこれらの短いRNAが、最も効果的であった。短いRNAの機能は、特定の標的細胞型に依存し得る、すなわち、予想されたように、短いRNA分子が効果を有するためには、接触される細胞内に標的RNA転写物が存在することが必要である可能性がある。示したように、KLF4のRNADB-1およびDB-2等の短いRNAは、OmniCyteにおいてKLF4の強い上方制御を示したが、MSCにおける効果は低かった。これは、標的転写物が細胞型特異的発現を有することによる可能性が高い。またこの結果は、KLF4を上方制御する短いRNAも、KLF4の下流標的Nanogおよびc-Mycの上方制御をもたらすことを示している。これは、KLF4がNanogおよびc-Mycを転写的に制御し、意図される活性化RNAの機能を示す、確立されたモデルによるものである。a転写開始点の500ヌクレオチド上流から転写開始点の500ヌクレオチド下流の領域において標的遺伝子の配列を得ること、bステップaの配列に対する逆相補的RNA配列を決定すること、およびcbで決定される配列の領域に対して相補的なsaRNAを設計することによる本発明の方法に従って、以下のsaRNA分子を設計した。BCL2およびIL8に対する低分子RNAsaRNA候補の活性化saRNA分子を生成し、Omnicyteまたは体細胞HepG2およびSHSY5Yのいずれかにトランスフェクトした。RT-PCRにより標的遺伝子のmRNAレベルを定量化することによって、標的遺伝子の発現における影響を評価した。saRNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクション50mMTris-HClpH8.0、100mMNaCl、および5mMEDTAを用いてsaRNAオリゴヌクレオチド対上の表6に示すセンスおよびアンチセンスを最初にアニールし、その後、90°Cでの変性ステップ、そしてその後、室温までの漸進的なアニーリングステップを行った。次いで、製造者の指示に従ってナノフェクタミンPAA、UKを使用して、150ngの対合saRNAを細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクションから24時間後に、rtPCR分析のために細胞を回収した。半定量的rtPCRのための全RNAの単離製造者の指示に従ってRNAqueous-MicroキットAmbion,UKを使用して、全ての全RNA抽出を行った。簡潔に述べると、細胞を穏やかに遠心分離した後、溶解バッファAmbion,UK中、出力3で3パルスの超音波処理を行った。次いで、RNA結合カラムを通して細胞溶解物をプロセスした後、複数回洗浄および溶出した。単離した全RNAをNanodrop2000分光光度計により定量化した。製造者の指示に従ってOneStepRT-PCRQiagen,Germanyを使用して、500ngの全RNAを逆転写した。それぞれのプライマー対を使用した逆転写PCRrtPCRにより標的遺伝子の発現を行った。mRNAレベルをハウスキーピング遺伝子アクチンと比較して比較して表す。結果その結果を図13に示す。saRNAでトランスフェクトした細胞のmRNAプロファイルは、対照と比較して標的mRNA転写物が増加したことを示す。"