マウスサーファクタントプロテインCSPCのプロモーター領域と、その下流に配置されて発現を制御されるヒト形質転換因子β1hTGFβ1の全遺伝子領域とを含むことを特徴とするトランスジェニックマウス。前記トランスジェニックマウスは、生後10週齢から自然的に肺線維症を発症し、生後16週~18週から死亡し始めることを特徴とする請求項1に記載のトランスジェニックマウス。上記トランスジェニックマウスの系統は、C57BL6Jであることを特徴とする請求項1または2に記載のトランスジェニックマウス。ヒトTGFβ1遺伝子を含むBACにおいて、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン部分に選択用カセットを組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子を得る選択用遺伝子組換え工程、前記選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子の5側及び3側に、マウスSPCプロモータの下流の配列に相同的な配列を導入して、修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントとする修飾工程、5側及び3側にフランキング配列を有するマウスSPC全コード配列を含むBACにおいて、前記修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントを、前記マウスSPCプロモータ領域の下流側に転移させて、SPC選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとする工程、前記SPC選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントから前記選択用カセットを取り除いて、SPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物を得る工程、及び前記SPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物からSPCTGFβ1遺伝子を精製し、マウス胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを得る工程、を備えることを特徴とする請求項1~3のいずれか一つに記載のトランスジェニックマウスの作成方法。肺線維症のモデルマウスとして、肺特異的にTGFβ1を発現するマウスが望まれているが、現在までのところ、そのようなTGマウスは得られていなかった。本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供することである。上記目的を達成するための発明に係るトランスジェニックマウスは、マウスサーファクタントプロテインCSPCのプロモーター領域と、その下流に配置されて発現を制御されるヒト形質転換因子β1hTGFβ1の全遺伝子領域とを含むことを特徴とする。このとき、このトランスジェニックマウスは、生後10週齢から自然的に肺線維症を発症し、生後16週~18週で死亡し始めることが好ましい。上記トランスジェニックマウスの系統は、C57BL6Jであることが好ましい。また、上記トランスジェニックマウスの作成方法は、ヒトTGFβ1遺伝子を含むBACにおいて、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン部分に選択用カセットを組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子を得る選択用遺伝子組換え工程、前記選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子の5側及び3側に、マウスSPCプロモータの下流の配列に相同的な配列を導入して、修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントとする修飾工程、5側及び3側にフランキング配列を有するマウスSPC全コード配列を含むBACにおいて、前記修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントを、前記マウスSPCプロモータ領域の下流側に転移させて、SPC選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとする工程、前記選択用カセットを取り除いて、SPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物を得る工程、前記SPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物からSPCTGFβ1遺伝子を精製し、マウス胚にマイクロインジェクションして、トランスジェニックマウスを得る工程を備えることを特徴とする。上記発明において、選択用遺伝子は、ストレプトマイシン感受性の野生型リボソーマルS12タンパクコード遺伝子rpslであることが好ましい。本発明によれば、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供できる。このTGマウスを用いることにより、呼吸器関連疾患肺線維症、気管支喘息、肺ガン、COPDなどを含むに関する研究を飛躍的に発展させられる。次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。<試験材料と試験方法>1.試薬ダルベッコMEM、脂肪酸フリーBSA及びLグルタミンは、シグマアルドリッチSigmaAldrichから購入した。ウシ胎児血清は、バイオホイタッカーBioWhittaker、ペニシリンとストレプトマイシンは、ナカライテスクのものを用いた。非必須アミノ酸、トリゾールTRIZOL試薬、スーパースクリプトプレアンプリフィケーションシステムSuperscriptpreamplificationsystem、リポフェクチン2000、オプティMEMOptiMEMは、インビトロージェンInvitrogenから購入した。ブレオマイシンBleomycinは、日本化薬から購入した。TGFβ1、PDGF、CTGF、TF、MCP1、Smad3のsiRNAは、ハヤシ化成から購入した。その他の試薬については、試薬級または高度精製のものを一般的な市販品として購入した。2.siRNAデザイン標的配列に対するsiRNA及び混合siRNAは、エンハンストsiDirectプログラム株式会社RNAiを用いてデザインした。塩基配列として、オフターゲット作用を起こす可能性が低いものを選択した。3.野生型マウスを用いたインビボinvivo試験野生型マウスを用いた肺線維症モデルにおいて、潜在的に原因となりうる因子の経時的な変化を追うために、100mgkgBLMを経皮投与したマウスを投与後03714及び21日目に絶命させた。BALF中のTGFβ1CTGFPDGFMCP1及びTFタンパク質の濃度をEIAによって測定し、肺組織中の各mRNA量を各時点において定量的PCRによって測定した。BALF中の全タンパク質とコラーゲン濃度を各時点で測定し、21日目の肺内ヒドロキシプロリン濃度を測定した。肺繊維化におけるsiRNAの効果を評価するために、20g~22gのメス9~11週齢のC57BL6野生型WTマウスを用いた。マウスは、日本SLC浜松市から購入し、三重大学動物施設にて飼育した。本試験は、三重大学動物実験委員会によって承認された。滅菌生理食塩水にブレオマイシンを溶解し、無作為抽出されたマウスに対して、浸透圧式ミニポンプmodel2001AlzetCorporationPaloAltoCAを用いて、100mgkgを持続的に筋肉内投与することで肺障害を起こした。対照群には、BLMを含まない生理食塩水を投与した。試験開始から、いずれの動物にも死亡例は認められなかった。21日後に、全ての試験動物を腹腔内へのペントバルビタールの過剰投与によって絶命させ、気管支肺胞洗浄液、血液、及び臓器を摘出した。肺繊維化の程度は、アッシュクラフトスコアAshcroftscore、CT所見、及び組織中のコラーゲン及び/又はヒドロキシプロリンの量によって評価した。TGFβ1、CTGF、PDGF、CCL2または組織因子TFのsiRNAを気管支内に投与したときの抗繊維化効果を評価するために、BLM投与後37及び14日目にマウス特異的siRNA5mgkgを投与した。用量依存的試験のために、505及び005mgkgのマウス特異的TGFβ1siRNAを投与した。コントロール群には、気管支内に混合siRNA5mgkgまたは基材を投与した。治療について最適な疾患ステージを評価するために、疾患の急性期3及び7日目、慢性期12及び16日目、または両期37及び14日目に5mgkgのTGFβ1siRNAを投与した。TGFβ1siRNAの単回投与の効果は、BLM投与後14日目のみに投与することで評価した。ヒトとマウスに共通な配列を持つTGFβ1とSmad3のsiRNADNAキメラの抑制効果を評価するために、BLM投与37及び14日目に各キメラを気管内投与した。肺線維症に対するSmad3の抑制効果を評価するため、BLM投与によって肺線維症を起こさせたマウスに、マウス特異的Smad3siRNA、混合siRNA、または基剤のみ各5mgkgを投与し、肺線維症の程度を各投与処理から21日目に調べた。4.肺内滴下によるマウスへの処理マウスへの肺内投与の詳細は、既報非特許文献1に従って行った。簡単に説明すると、マウスの腹腔内にペントバルビタールナトリウム75mgkgを投与して睡眠状態とし、45°に傾けた処理台上に上歯を引っ掛けて吊した。舌をパッドしたピンセットを用いて引っ張り、その後から挿入した喉頭鏡を通して気管支を視認した。を気管支内微小噴霧器を用いて、肺内に75μLの試験液を投与し、機器を取り除いた。その後、マウスが完全に回復するまで監視した。この方法によって、経気管支的に投与された試験液が拡散することを75μLまたは50μLのエバンスブルーによって確認した。5.経気管支投与後の肺内TGFβ1siRNAの局在肺内のTGFβ1siRNAの局在を確認するために、C57BL6野生型マウスに浸透圧ミニポンプを用いてBLMを投与し、その後7日目にCy3をラベルしたTGFβ1siRNA100μgを経気管支投与した。3時間後にマウスを絶命し、肺を10ホルマリンに漬けた後、膨らませて、パラフィンで固定した。肺組織は、パラフィンを除き、生理食塩水-トリス緩衝液にて数回洗浄した。洗浄後、切片を抗プロサーファクタントタンパク質Cポリクローナル抗体ウサギ血清:MilliporeBedfordMAと共に4°Cにて1時間反応させ、生理食塩水-トリス緩衝液にて洗浄後、抗ウサギ抗体蛍光標識試薬AlexaFluor488antirabbitIgGによって処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬DAPI46diamidino2phenylindoleを含むSlowFadeGoldantifaeによって処理した。蛍光の局在を顕微鏡にて観察した。TGFβ1siRNAのセンス配列とアンチセンス配列は、それぞれセンス:5CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC3配列番号1、アンチセンス:5CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU3配列番号2であった。6.BALFと末梢血の回収方法ヘパリンを含むチューブ内に心臓穿刺によって血液サンプルを集めた後、遠心分離1000g10minして血漿を回収した。BALFサンプルは、既報非特許文献2に記載された方法に従って得た。BALF中の全細胞数は、ケモメテック社製ChemoMetecの細胞計数装置によって計数した。BALFを遠心分離1000g10min4°C後に上清を回収し、必要となるまで80°Cにて保存した。分画細胞の計数のために、BALF細胞をサイトスピンを用いて遠心分離し、メイグリンヴァルトギムザ染料MayGrunwaldGiemsaにて染色した。血液中の気体は、コーバスb221血液中気体システムCobasb221BloodGassystemによって解析した。7.生化学的解析全タンパク質濃度は、市販のキットBCATMproteinassaykitPierceRockfordILUSAを用いて、使用マニュアルに従って測定した。ヒト及びマウスTGFβ1RDSystemMinneapolisMIN、INFαとIFNβPBLBiomedicalLaboratoriesPiscatawayNJ、MCP1BDBiosciencesPharmingenSanDiegoCA、血液凝固活性マーカ、トロンビンアンチトロンビン複合体TATCedarlaneLaboratoriesHornbyONCanada及びTFIMUBINDTissuefactorAmericanDiagnosticaGreenwichCTの濃度については、市販のEIAキットを用いて、それぞれの使用マニュアルに従って測定した。PDGF濃度は、ポリクローナル抗PDGF抗体GenzymeCorporationCambridgeMAとビオチン化抗PDGF抗体を用いて測定した。PDGF濃度は、PDGF抗原の標準品を用いて作成した用量カーブに内挿することで求めた。PDGF測定系の日間及び日内変動は、10以内であった。8.肺の組織学的検査マウスを絶命後、肺循環を生理食塩水で洗浄した後、肺と他の臓器を取り出した。左肺はホルマリン10中性緩衝液でかん流し、ガスで膨らませて、ホルマリン中にて24時間固定した後、パラフィンに包埋した。5μm厚さの組織検査用切片を作成後、パラフィンを除き、生理食塩リン酸緩衝液にて数回洗浄した。組織切片は、ヘマトキシリン/エオジンとマッソン三色染色法にて処理した。ランダムに抽出された切片を盲験観測者によって評価した。肺の組織学的検査は、オリンパスDP70デジタルカメラを装着したオリンパスBX50顕微鏡を用いて行った。全群の各マウスについて、肺組織中の5個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、アッシュクラフト繊維化スコア非特許文献3に従って5名の盲験観測者が肺繊維化の状態を評価した。9.ヒドロキシプロリン測定肺中のコラーゲン沈澱量とヒドロキシプロリン濃度は、比色分析により測定した。簡単に説明すると、次の通りである。左肺を切除し、ホモジナイズ処理前に乾燥させた。サンプルを6N塩酸中にて20時間、110°Cにて加水分解した。96穴プレートに、いずれも3個ずつtriplicateの標準品またはサンプル5μLを用意し、5μLクエン酸酢酸緩衝液238mMクエン酸、12氷酢酸、532mM酢酸ナトリウム、85mM水酸化ナトリウム、100μLクロラミンT溶液16mLクエン酸酢酸緩衝液に0282gクロラミンTを添加した溶液、2mLnプロパノール、2ml精製水を加えて、室温にて20分間反応させた。その後、100μLエールリッヒ溶液93mLnプロパノールと39mL70過塩素酸に25gpジメチルアミノベンゾアルデヒドを加えた溶液を加えて、65°Cにて20分間反応させた後、プレートリーダーにて550nmの吸光度を測定した。10.滴下されたsiRNAのオフターゲット作用浸透圧ミニポンプにより生理食塩水を皮下投与された野生型C57BL6マウスをランダムに次の3群に分類した。生理食塩水の投与から37及び14日目に、第1群にはマウスTGFβ1siRNAを表1、第2群にはヒト及びマウスに共通な配列を持つsiRNADNAキメラをTGFβ1Ch1、表3、第3群には基剤のみを、それぞれ投与した。マウスは21日目に絶命し、BALFと肺サイトカインをEIAにて測定した。11.hTGFβ1BACトランスジェニックマウスの作成マウスSPCプロモータによって制御されるヒトTGFβ1遺伝子を持つTGFβ1BACトランスジェニックマウスは、C57BL6Jマウス胚への前核インジェクションによって作成された日本クレア株式会社。BACによるトランスジェニック動物作成の初代遺伝子導入と生殖細胞への伝達の確認は、ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン1フラグメントを[P32]でラベルしたDNAプローブを使用し、Pstlによって切断した尾部DNAを用いたサザンブロットによって行った。子孫56匹のうち7匹には、コロニーが得られた導入遺伝子を持っていた。TGマウスの作成方法について、詳細に説明すると次の通りである。NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースを用いてマウスBACエンドデータベースを検索し、RPCI23メスC57BL6Jマウスから、SPCBACクローンマウスRP23216B15を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが、全3kbのマウスSPC遺伝子配列に加えて、5側に59kb、3側に145kbのゲノムDNAを含むことを示している。NCBIのジーンバンクGenBankデータベースをブラストBLAST検索し、RPCL11ヒトBACライブラリーからヒトTGFβ1BAChTGFβ1BACクローンRP11638N16を選択した。BACエンド配列は、このBACクローンが全23kbのhTGFβゲノム配列に加えて、5側に57kb、3側に115kbのゲノムDNAを含むことを示している。両BACクローンをバックパックリソースセンターBACPACResourcesCenter;ChildrensHospitalOaklandResearchInstituteから入手した。マウスSPC遺伝子座にヒトTGFβ1の全長コードエクソンとイントロンを持つキメラSPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物コンストラクトは、BAC組み換え介在遺伝子工学法BACrecombinationmediatedgeneticengineeringによって作成した。hTGFβ1遺伝子は、RedEtカウンターセレクションBAC修飾キットRedETCounterSelectionBACModificationKitを用いて、ヒトBACクローンからマウスSPCBACクローンに転移した非特許文献4。方法を説明すると次の通りである。ヒトTGFβ1遺伝子のイントロン近傍の二つの配列によって、rpslneo用選択カセットをPCRによって増幅した。PCRに用いたプライマーと、その塩基配列は、それぞれRHODTFforward15GTATACTCTGCCACGGCTTCCAAGACGGAGACCAGCCAGGTGGCCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG:配列番号3及びRHODTFreverse15GTATACATGGGAGACTCCTACAGTCGGCCACGGAGTCCCTGGCAGTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC:配列番号4であった。増幅したrpslneo選択用カセットをRedET組み換えによって得られたヒトBACクローンのTGFβ1遺伝子中に組み込み、選択用遺伝子導入ヒトTGFβ1遺伝子とした選択用遺伝子組換え工程。hTGFβ1遺伝子の両端部分の配列をホモロジーアームとして用いて、TGFβ1遺伝子をプラスミドpDNR1rにサブクローニングした。サブクローニングしたhTGFβ1遺伝子フラグメントをマウスSPC遺伝子の非翻訳領域の40塩基隣において、スタートコドン5エンドとストップコドン3エンドの隣に直接的に配置した修飾工程。修飾後のhTGFβ1遺伝子フラグメント修飾hTGFβ1遺伝子フラグメントは、キメラSPCTGFβ1BACクローンを構築するために、RedET組み換えによってマウスBACクローンのマウスSPC遺伝子に転移し、SPC選択用hTGFβ1遺伝子フラグメントとした。hTGFβ1遺伝子のイントロン中のrpslneoカセットは、rpsLカウンターセレクションによって取り除いた。BAC修飾については、シークエンスを行って配列を確認した。SPCTGFβ1BACトランスジェニック構築物は、アベらの方法非特許文献5を改変した方法によって、マイクロインジェクションによって精製した。BACトランスジェニック構築物をヌクレオボンドプラスミド精製キットNucleobondPlasmidPurificationkitを用いて、250mLの大腸菌培養液から精製した。精製に際して、10μgのBACトランスジェニック構築物をPIScelエンドヌクレアーゼNewEnglandBiolabsIpswichMAを用いて一晩処理し、pBACe36ベクター配列中に一つだけ含まれる切断部位を切断することにより線形化した。線形化したBACDNAをパルスフィールドゲル電気泳動PFGEにかけて分離した後、電気泳動溶出してゲルから抽出した。01mMEDTAトリス緩衝液を用いて透析し、大きさと表品を用いてPFGEによって試料を得た。BACDNA構築物は、1ngμLに調整してマイクロインジェクション用とし、使用時まで4°Cにて保管した。12.肺線維症を自然発症するhTGFβ1BACTGマウスのsiRNAによる治療hTGFβ1BACTGマウスは、マイクロCTと組織学的な検討によって、10週齢から肺炎症と肺繊維化を発症する。マイクロCTによる肺炎症/肺繊維化を同程度に発症したhTGFβ1BACTGマウスをランダムに2つの群に分割した。一方の群には、ヒト特異的TGFβ1siRNAを連続する3週間に渡って毎週1回投与し、他方の群には、基剤のみを3週間に渡って毎週1回投与した。各マウスは毎週マイクロCTによって検査を行い、試験開始から21日目に絶命させ、BALF、血液及び肺組織のサンプリングを行った。13.hTGFβ1BACTGマウスにBLMを皮下投与して肺線維症を進展させた後のsiRNAによる生存曲線への影響hTGFβ1siRNAの肺内投与治療による延命効果を評価するために、10匹のhTGFβ1BACTGマウスをランダムに2群に分類し、浸透圧ミニポンプにより80mgkgBLMを皮下投与した後に037及び14日目に、一方の群BLMTGFβ1siRNAn5には、ヒト特異的TGFβ1siRNAを経気管支投与し、他方の群BLMvehiclen5には、基剤のみを投与した。BLMは、hTGFβ1BACTGマウスの肺繊維化の進行を速めるために投与した。14.半定量的PCRhTGFβ1TGマウスの各組織におけるhTGFβ1遺伝子の発現量を調べるため、逆転写酵素PCRRTPCRを行った。各組織からトリゾールTRIZOLを用いて、全RNAを抽出した。RTPCRに使用したプライマーの配列は、次の通りであった。humanTGFβ1forward5AAGACTATCGACATGGAGCTGG3配列番号5及び、reverse5GTATCGCCAGGAATTGTTGCTG3配列番号6humanGAPDHforward5CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA3配列番号7及びreverse5TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC3配列番号8mouseGAPDHforward5CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT3配列番号9及びreverse5GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG3配列番号10であった。全PCRは、各増幅反応においてプラトーとなる前の状態で実施した。PCR反応物は、2アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドを臭化エチジウムで染色した後、紫外光にて観察した。15.定量的リアルタイムRTPCRA549細胞及び器官組織から全RNAを抽出し、2μgの全RNAから逆転写反応とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを調製した。定量的リアルタイムRTPCRは、アプライドバイオシステムズ7500リアルタイムPCRシステムAppliedBiosystem7500RealTimePCRSystemによって実施した。マウス及びヒト遺伝子TGFβ1Tgfβ1CtgfF3tissuefactorpdgfamcp1に特異的なプライマーとプローブは、キアゲンQiagenから購入した。データは、アプライドバイオシステムズの7500ソフトウエアによって解析し、各遺伝子の発現量はGAPDHの転写量によって標準化した。16.マイクロCTcomputedtomographyによる肺線維症の評価マウスモデルにおける肺線維症の評価は、マイクロCT理化学研究所製を用いて行った。CTデータは、イソフルランの吸入によって呼吸抑制された麻酔下にあるマウスを用いて得られた。データ取得時のパラメータは、スキャンスピード17秒、分解能20~135μm、管電圧90kV、管電流200μAとした。イメージは、アイビューソフトウエアiVIEWsoftware;モリタ製作所によって解析した。CTデータはゼロアジャストを行い、各マウスから下部肺野の4ヶ所の断面図を採用した。換気可能な領域は、肺線維症の進展に伴って減少することから、肺断面図中の全換気可能領域が占める割合をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア三谷商事にて解析し、そのデータを野生型マウスのCT画像から得られたデータと比較して、高密度領域の割合として示した。17.上皮間葉転移epithelialmesenchymaltransitionのインビボinvivo試験37及び14日目に、生理食塩水SALvehicle、BLM基剤BLMLvehicle、またはBLMマウス特異的TGFβ1siRNABLMTGFβ1siRNAを投与されたマウス肺組織を脱パラフィン処理し、トリス緩衝液生理食塩水を用いて数回洗浄した。洗浄処理した後、切片を抗プロサーファクタントCウサギ抗血清MilliporeBedfordMAと共に4°Cにて1時間反応させ、トリス緩衝液生理食塩水にて洗浄した後、抗ウサギIgGに結合させた蛍光色素AlexaFluor594antirabbitIgGにて処理した。更に洗浄処理した後、切片を抗α平滑筋アクチンA4マウスモノクローナル抗体DAKOGlostrupDenmarkの存在下で4°C、1時間反応させ、トリス緩衝液生理食塩水で洗浄し、抗マウスIgGに結合させた蛍光色素AlexaFluor488donkeyantimouseIgGにて処理した。洗浄処理後に、サンプルを蛍光試薬を含むイメージング試薬DAPIを含むSlowFadeGoldantifaeによって処理した。スライドグラスをオリンパスFV1000D顕微鏡にて観察した。共局在化をウインドウズ版WinROOFイメージ解析ソフトウエア三谷商事にて解析した。各群について、肺組織の10個の顕微鏡視野をランダムに抽出し、盲験観察者によってEMTの評価を行った。18.マイクロRNAプロファイリングBLMによって肺線維症を誘導し、BLM投与とは異なる日にマウスTGFβ1siRNAまたは基剤で処理したマウスの肺組織から全RNAをトリゾールTRIZOLによって抽出した。RNAサンプルを3DGenemiRNAマイクロアレイプラットフォーム東レを用い、マイクロRNAプロファイリングに供した。生理食塩水を投与された無処理マウスのマイクロRNAプロファイリングについても実施した。マイクロRNAプロファイリングデータは、NCBIGEOデータベースに寄託されているaccessionNoGSE28122。19.細胞株と培養条件ヒト肺ガン由来肺胞上皮細胞株であるA549は、米国タイプカルチャーコレクションAmericanTypeCultureCollectionから入手し、マウス肺腫瘍細胞株であるLA4は、大日本住友製薬から入手した。A549細胞は、10FBS加熱処理済、50μgmLペニシリン、50μgmLストレプトマイシン、2mMLグルタミン、01mM非必須アミノ酸を含むDMEMを用い、加湿環境において5二酸化炭素、95空気の環境下で培養した。LA4細胞は、10FBS加熱処理済を含むF12HAM培養液SigmaAldrichStLouisMOにて培養した。コンフルエントとなるまで培養した後、002EDTAを含む0025トリプシン溶液ヘペス緩衝液生理食塩水Hepesbufferedsalineにて短時間処理して細胞を回収し、5~7日毎に継代した。20.TGFβ1siRNAのインビトロinvitro試験における阻害活性の測定マウスTGFβ1mRNAに対するsiRNAの活性評価をマウスLA4細胞を用いて行い、ヒトTGFβ1mRNAに対するsiRNAの活性評価をA549細胞を用いて行った。コンフルエント細胞を01BSAを含むDMEM中において血清飢餓状態にて12時間培養した後、TGFβ1に対するsiRNADNAキメラまたはsiRNAを様々な濃度でリポフェクタミンLipofectamine2000とOptiMEMを用いて遺伝子導入した。6時間後に、細胞を回収し、TGFβ1mRNAの発現量を評価した。21.siRNAがmRNAの発現を抑制することの確認5RACE法RapidamplificationofcDNAendsを実施することによって、インビボinvivoにおいてsiRNAがTGFβ1mRNAの発現を抑制することを確認した。マウス肺から得られた2μgの全RNAを用いてcDNAを合成した。5fullRACECoreSetタカラバイオと5末端リン酸化プライマー5gATCCCGTTGATTTCCACGT3:配列番号11を用いて、最初のcDNAを調製した。このcDNA2μLを用いて第1回目のPCRを行った。このときのセンスプライーマの配列は、5GCAACAATTCCTGGCGTTACC3配列番号12であり、アンチセンスプライマーの配列は、5CACATGTTGCTCCACACTTGAT3配列番号13であった。PCRの反応条件は、95°Cにて30秒間、60°Cにて30秒間、72°Cにて1分間を1サイクルとし、25サイクルを行った。次いで、第1回目のPCR産物2μLを用いて、第2回目のPCRnestedPCRを行った。このときのセンスプライマーの配列は、5CGTCACTGGAGTTGTACGGCA3配列番号14であり、アンチセンスプライマーの配列は、5TTAATCTCTGCAAGCGCAGC3配列番号15であった。PCRの反応条件は、95°Cにて30秒間、60°Cにて30秒間、72°Cにて1分間を1サイクルとし、35サイクルを行った。PCR産物は、4アガロースゲルを用いた電気泳動によって解析した。22.統計解析全データは、平均値±標準誤差mean±standarderrorによって示した。3個またはそれ以上の変数の統計的有意性は、チューキー検定Tukeystestを用いた事後解析posthocanalysisによって、分散分析を行うことによって評価した。2変数の統計的有意性は、マンホイットニーU検定MannWhitneyUtestによって評価した。生存曲線は、カプランメイヤー法KaplanMeiermethodによって計算し、有意差は、ログランクテストで計算した。統計的有意差は、危険率5p<005にて評価した。解析には、マッキントッシュ用ソフトウエアのスタットビュー41StatView41パッケージを用いた。<試験結果>1.肺線維症のマウスモデルにおける繊維形成因子の配列変異ブレオマイシンによって誘導されたマウス慢性肺線維症モデルを用いて繊維化因子を経時的に評価したところ、慢性期には、主として成長因子CTGF、PDGFとTGFβ1誘導転写因子Smad3が増加し、繊維化サイトカインCCL2と凝固活性化物質トロンビンアンチトロンビン複合体、組織因子は、急性期に有意に増加することが分かった。これに対し、TGFβ1は両期に増加したことから、TGFβ1がより一般的なターゲットであることが示唆された図7、A~N。2.肺細胞へのsiRNAの到達Cy3標識TGFβ1siRNAを気管支内投与した後に、siRNAが肺に到達したか否かを評価した。気管支内投与から3時間後に、肺胞および肺間質に蛍光が観察された図8、A~H。3.前繊維化因子に対するsiRNAの効果肺線維症に対するsiRNA療法の有効性を確認するため、TGFβ1、CTGF、PDGF、CCL2及びTFに対するマウス特異的siRNAをデザインし、肺線維症における有効性を比較した表1。BLMの皮下投与開始から3日目準急性期、7日目急性期、及び14日目慢性期にエアロゾルによりsiRNAをそのまま投与した。各因子のタンパク質及びmRNA発現量は、コントロール群に比べて、対応するsiRNAを投与した群では、有意に減少した図1A、図3A。TGFβ1とCTGFに対しては、対応するsiRNAは、他の因子の場合よりも強いタンパク質の発現抑制効果が認められた図1A、図93AB。このことから、これらの因子では、siRNAは、より強力にタンパク質の発現を抑制していると考えられる。組織学的及びアッシュクロフトスコアを用いた定量化による肺繊維化と肺ハイドロプロリン量は、TGFβ1とCCL2siRNAによって強く抑制されたものの、CTGF、PDGF及びTFsiRNAでは弱い抑制しか認められなかった図1BCが、これらのsiRNAの多くは肺胞内の全タンパク量を減少させ、炎症性細胞による肺浸潤を抑制した図9C、D。次に、TGFβ1siRNAに注目した試験を行った。これは、TGFβ1の肺での発現は、疾患の急性期及び慢性期のいずれでも維持されていたが、CCL2の肺における発現は、そうではなかったこと、及びCCL2siRNAはBALFのCCL2タンパク質量を減少できなかったためである図9C。4.TGFβ1siRNAの用量依存的な抑制効果肺内にTGFβ1siRNAを投与すると、05mgkg及び5mgkgの用量において用量依存的に、TGFβ1の発現と肺線維症の増悪を有意に効果を示した。TGFβ1の発現を有意に抑制するが、低用量のsiRNAでは、肺線維症を抑制しなかった図2ABC。混合siRNAはポジティブコントロール群に対して効果をしめさなかったことから、TGFβ1siRNAが、特異的に効果を示すことが分かった。TGFβ1mRNAがsiRNAによって抑制されることをインビボinvivo試験において5RACE法によって確認した図2D。5.肺線維症の全ステージにおけるTGFβ1siRNAの効果急性期、慢性期、または両期において、TGFβ1siRNAを投与すると、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比べ、肺におけるTGFβ1の発現および肺線維症を有意に抑制した。更に、慢性期におけるsiRNAの単回投与だけでも、コントロールマウスに比べ、肺内のコラーゲン低下を有意に抑制した図3A~D。6.ヒトと齧歯類に共通な塩基配列を持つsiRNA及びsiRNADNAキメラの抑制活性ヒト、マウス、及び/又はラットのsiRNA標的配列表2によって、インビボinvivo試験において、上皮から間葉への変化を効果的に抑制した図10AB。また、ヒト及びマウスTGFβ1及びSmad3遺伝子をターゲットとするsiRNADNAキメラについても評価をした表3。TGFβ1siRNADNAキメラは、ヒトA549および齧歯類LA4細胞株のいずれにおいてもTGFβ1の発現を有意に阻害した図4AB。TGFβ1siRNADNAキメラを気管支内投与するとTGFβ1の発現を有意に誘導した図4C。TGFβ1及びSmad3siRNADNAキメラは、混合siRNAまたは基剤のみを投与したマウスに比較すると、肺線維症を有意に阻害することが、アッシュクラフトスコア及び肺内のコラーゲンとヒドロキシプロリンの評価によって確認された図4DE。7.ヒトTGFβ1トランスジェニックTGマウスの作成従来報告されているTGFβ1トランスジェニックTGマウスとは異なり、TGFβ1BACTGマウスは、全長のヒトTGFβ1遺伝子の発現量と、潜在型及び活性型TGFβ1タンパク質の濃度をいずれも上昇させ、ヒトの形態に近似していた。こうして、ヒトの状態に近いインビボinvivoモデルとして肺線維症を研究するための良好なTGFβ1TGマウスを確立した。このマウスは、BACを利用して、サーファクタントタンパク質CSPCのプロモータの下流にヒトTGFβ1を配置した作成されたものである図5A~D非特許文献5、6。このTGマウスは、肺の発達段階においてTGFβ1の過剰発現による胚致死性のものではなかったが、10週齢において肺炎症と肺線維症が増悪する図5EF非特許文献7。導入された遺伝子は肺のみで特異的に発現し図5G、全TGFβ1及び活性型TGFβ1濃度は肺液中で増加した図5H。8.ヒト特異的TGFβ1siRNAは、自然発症性肺線維症を持つヒトTGFβ1BACTGマウスにおいて、放射性及び肺機能パラメータの評価によって、良好な結果を示すインビトロinvitro試験でヒト特異的siRNAの活性を評価した後、肺炎症/肺線維症を発症するヒトTGFβ1TGマウスを用いて、肺線維症に対するヒト特異的siRNAの効果を評価した表4。最も強いインヒビターは、siRNA13であり、001nMでも活性を示した図11A~D。マイクロCTによって肺炎症/線維症が認められた10週齢ヒトTGFβ1BACTGマウスを用いて、siRNA13の阻害活性を評価した。ブラインドテストによってマウスをランダムに2群に分け、一方の群にはTGFβ1siRNAを経気管支的に投与し週1回×3週間、他方の群には同様のプロトコールで基剤のみを投与した。最終投与から1週間後に動物を絶命させた。肺線維症の変化をCTと組織学的試験によって評価したところ、基剤のみを投与した群に比べ、TGFβ1siRNA13を投与した群では、有意に良好な結果が認められた図6A~C。基剤を投与したTGマウスでは、野生型マウスネガティブコントロールに比べて、有意に血中酸素濃度が低下した図6D。TGFβ1siRNA13を投与したTGマウスでは、野生型マウスと同等の血中酸素濃度を維持していた図6D。9.ヒト特異型TGFβ1siRNAは、BLM投与されたヒトTGFβ1BACTGマウスの生存曲線を向上させるヒトTGFβ1BACTGマウスは、10週齢から徐々に肺線維症を発症させ、16~18週齢において死亡する。BLMを皮下投与すると、肺線維症を増悪させ、TGマウスを死亡させる。生存曲線に対する影響を評価するため、ヒトTGFβ1BACTGマウスをランダムに2群に分類し、一方の群には、BLM投与から037及び14日目にヒト特異的TGFβ1siRNAを経気管支投与し、他方の群には、同様のプロトコールで基剤のみを投与した。ヒト特異的TGFβ1siRNAの肺への投与によって、TGマウスの生存曲線は有意に向上し、肺中のヒドロキシプロリン濃度及びコラーゲン量も好転した図6FGH。10.TGFβ1siRNAのオフターゲット作用TGFβ1siRNAのオフターゲット作用を確認するため、通常マウスに対して、マウス特異的TGFβ1siRNAを経気管支投与し、肺中のサイトカインの発現を測定した。通常マウスにTGFβ1siRNAを経気管支投与したところ、IL1β、IL6、TNFα、IFNα、IFNβの肺中濃度は、いずれも有意に増加せず、TGFβ1のBALF濃度は、コントロール群に比べ、TGFβ1siRNAを投与した群では、有意に完全にではないものの阻害された図12。11.Smad3siRNAのインビボinvivo試験での抑制活性Smad3を標的としたsiRNAを経気管支投与すると、肺内TGFβ1の発現と肺中コラーゲン沈澱量を僅かに抑制した図13AD。12.TGFβ1siRNAは、前繊維化miRNAを抑制する異なるステージにおいてマウス特異的TGFβ1siRNAを投与したマウス、及び異なるステージにおいてヒト特異的TGFβ1siRNAを投与したhTGFβ1BACTGマウスを用いて、前繊維化miR21miRNAの発現パターンを評価した。野生型マウスにBLMを投与した肺線維症モデルマウスを用いた場合には、全てのステージにおいて、TGFβ1siRNAは、前繊維化miR21miRNAの肺での発現を抑制し図14A、B、hTGFβ1siRNA13は、hTGFβ1BACTGマウスの前繊維化miR21miRNAの肺での発現を抑制した図15A、B:GEOdatabaseaccessionNoGSE28122。このように本願実施形態によれば、肺特異的にTGFβ1を発現し、自然発症的に肺線維症を発症するTGマウスを提供できた。このTGマウスを用いることにより、呼吸器関連疾患肺線維症、気管支喘息、肺ガン、COPDなどを含むに関する研究を飛躍的に発展させられる。