"グルコース、ガラクトース、キシロース、アラビノースおよびマンノースを含む糖組成物から1つまたは複数の発酵産物を生産するのに適した細胞であって、1種または複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子の2~15のコピーまたは1種または複数のキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼの2~15のコピー、ならびにaraA、araBおよびaraD遺伝子の2~10のコピーを含み、これらの遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれている細胞。前記細胞が、利用可能なグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトースおよびマンノースを90以上発酵産物に変換することができる、請求項1に記載の細胞。前記細胞のGAL80遺伝子が破壊されているかまたは欠失している、請求項1に記載の細胞。前記細胞がサッカロミセスSaccharomyces属、場合によっては、サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiae種に属する、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞。前記細胞がPPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1およびRKI1の過剰発現を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞。前記細胞がXKS1遺伝子を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞。アルドースレダクターゼ遺伝子が欠失している、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞。前記細胞にとって外来性の遺伝子はすべて、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項1~7のいずれか一項に記載の細胞。前記遺伝子が、a強力な構成的プロモーターの制御下にある、遺伝子araA、araBおよびaraDからなるクラスターb場合によっては強力な構成的プロモーターの制御下にある、PPP遺伝子TAL1、TKL1、RPE1およびRKI1からなるクラスター;およびアルドースレダクターゼ遺伝子の欠失;c強力な構成的プロモーターの制御下にある、xylA遺伝子およびXKS1遺伝子からなるクラスター;d強力な構成的プロモーターの制御下にある、xylA遺伝子を含むコンストラクトであって、複数の遺伝子座上でゲノムに組み込まれる能力を有するコンストラクト;ならびに混合糖細胞を生成するための混合糖コンストラクトの適応進化を宿主細胞に導入することによって前記細胞に導入される、請求項1~8のいずれか一項に記載の細胞。前記細胞が阻害物質抵抗性細胞である、請求項9に記載の細胞。前記細胞が工業用細胞である、請求項9または10に記載の細胞。グルコース、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースを含む糖組成物から1種または複数の発酵産物を生産するための方法であって、前記糖組成物が、請求項1~11のいずれか一項に記載の混合糖細胞により発酵される方法。前記糖組成物が、a前処理されたリグノセルロース系原料を産生するための、1種または複数のリグノセルロース系原料の前処理;b前記糖組成物を産生するための、前処理されたリグノセルロース系原料の酵素的処理によって、リグノセルロース系原料から産生される、請求項12に記載の方法。前記発酵が嫌気的に行われる、請求項12または13に記載の方法。前記発酵産物が、エタノール、n-ブタノール、イソブタノール、乳酸、3-ヒドロキシ-プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、マレイン酸、クエン酸、アジピン酸、リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニンおよびアスパラギン酸などのアミノ酸、1,3-プロパンジオール、エチレン、グリセロール、β-ラクタム抗生物質およびセファロスポリン、ビタミン、医薬品、動物用飼料サプリメント、特殊化学品、化学供給原料、プラスチック、溶媒、バイオ燃料およびバイオガスを含む燃料または有機ポリマー、ならびにプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼまたはキシラナーゼなどの工業用酵素からなる群から選択される、請求項12または13に記載の方法。[実施例]別に指示がない限り、本明細書に記載の方法は、標準生化学手法である。好適な一般的方法論の教科書の例として、Sambrooketal.,MolecularCloning,aLaboratoryManual1989andAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology1995,JohnWileySons,Inc.が挙げられる。[培地組成]増殖実験:サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiae株を、以下の組成:0.67w/vの酵母窒素原基礎培地または合成培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992および種々の濃度特定の詳細に関しては実施例を参照のこと;濃度は容積に対する重量w/vのグルコース、アラビノース、ガラクトースもしくはキシロースまたはこれらの基質の組合せを含有する培地上で増殖させる。寒天プレートを得るために、培地に2w/v細菌用寒天を添加する。[エタノール産生]100ml振盪フラスコにおいて、2グルコース添加Verduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,199225mlに凍結保存培養物または寒天プレートからの単一コロニーを接種することにより前培養物を調製した。旋回シェーカー280rpmで30°Cにて約24時間インキュベートした後、この培養物を採取し、CO2放出の測定およびエタノール産生実験のために使用した。エタノール産生のための培養を、BAMBiologicalActivityMonitor,Halotec,TheNetherlandsにおいて、合成モデル培地5グルコース、5キシロース、3.5アラビノースおよび1ガラクトースを含むVerduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992100ml中で、30°Cにて実施した。滅菌前に、2MNaOH/H2S04を用いて培地のpHを4.2に調整した。嫌気性培養用の合成培地には、エタノールに溶解した0.01gl-1エルゴステロールおよび0.42gl-1Tween80を添加したAndreasenandStier.J.CellPhysiol.41:23-36,1953;およびAndreasenandStier.J.CellPhysiol.43:271-281,1954。この培地に約2の開始OD600で接種した。培養物をマグネティックスターラーにより撹拌した。培養物は通気されなかったので、発酵の間に急速に嫌気性条件が進展した。CO2産生を定常的にモニターした。糖変換および産物形成エタノール、グリセロールをNMRにより分析した。LKBUltrospecK分光光度計を用いて600nmで培養物の光学濃度を追跡して増殖をモニターした。[S.セレビシアS.cerevisiaeの形質転換]GietzandWoods2002;TransformationoftheyeastbytheLiAc/SScarrierDNAPEGmethod.MethodsinEnzymology350:87-96に記載のように、S.セレビシアS.cerevisiaeの形質転換を行った。[コロニーPCR]単一コロニー単離物をプラスチック性爪楊枝で採取し、milliQ水50μlの中に再懸濁した。この試料を99°Cで10分間インキュベートした。供給業者が提供する説明書に従って、Phusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesを使用するPCR反応の鋳型として、インキュベートした試料の5μlを使用した。PCR反応条件:ステップ13’98°Cステップ21098°Cステップ31558°Cステップ2~4を30サイクル反復するステップ43072°Cステップ54’72°Cステップ63020°C[染色体DNAの単離]2グルコース含有YEP培地にて回転シェーカーで酵母細胞を増殖させた旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩。これら培養物の1.5mlを、エッペンドルフチューブに移し、最高速度で1分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを、YCPS10mMTris.HClpH7.5中の0.1SB3-14SigmaAldrich,theNetherlands;1mMEDTA200μlおよびRNアーゼウシ膵臓由来の20mg/mlRNアーゼA、Sigma,theNetherlands1μlの中に再懸濁した。細胞懸濁液を65°Cで10分間インキュベートした。この懸濁液をエッペンドルフ遠心分離機で7000rpmにて1分間遠心分離した。上清をデカントした。ペレットを、CLS25mMEDTA、2SDS200μlおよびRNアーゼA1μlの中に注意深く溶解した。65°Cで10分間インキュベートした後、懸濁液を氷冷した。PPS10M酢酸アンモニウム70μlを添加した後、溶液をボルテックスミキサー上で徹底的に混合した。遠心分離した後エッペンドルフ遠心分離機で最高速度にて5分間、上清を氷冷イソプロパノール200μlと混合した。DNAが即座に沈殿し、遠心分離最高速度で5分間によりペレットにした。このペレットを氷冷70エタノール400μlで洗浄した。室温でペレットを乾燥し、TE10mMTris.HClpH7.5、1mMEDTA50μlの中に溶解した。[エレクトロポレーションによる酵母細胞の形質転換]2グルコース含有YEP培地25mlに単一酵母コロニーを接種することにより酵母細胞を培養した。フラスコを30°Cで一晩インキュベートした。600nmの光学濃度を測定し、光学濃度0.2を得るために必要な量を、2グルコース含有YEP培地100mlに移した。2~3世代分に相当する光学濃度約1.2~1.3に到達させるために、細胞を4~5時間増殖させた。細胞を遠心分離により集め、TE10mMTris.HCI、1mMEDTA、pH7.528mlの中に再懸濁した。1MLiAC溶液濃HAcを用いてpH7.5に調整3mlを添加した。細胞を、回転式インキュベータ150rpm、30°Cの中で45分間穏やかに振盪した。1MDTTジチオスレイトール溶液500μlを添加した後、細胞をこれらの条件下で15分間もう一度インキュベートした。滅菌氷冷milliQ水を用いて容積を100mlに合わせた。細胞を遠心分離により集めた。上清を捨て、ペレット化した細胞を滅菌氷冷milliQ水50mlで洗浄し、遠心分離により集めた。続く洗浄処理を、氷冷1Mソルビトール溶液30mlを用いて行った。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷1Mソルビトール溶液4mlの中に再懸濁した。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを氷冷1Mソルビトール溶液300μlの中に再懸濁した。各形質転換のために、細胞懸濁液40μlを氷冷エッペンドルフチューブに移す。形質転換用DNAおよびサケ精子DNA担体DNAとして5μgを最大容積20μlで一緒に添加する。DNAはTEの中に溶解すべきである。内容物を穏やかに混合するためにエッペンドルフチューブを注意深くタッピングする。0.2cmギャップを備えた、あらかじめ冷却した氷上でエレクトロポレーション用キュベットに内容物を移す。1.5kV、200オームおよび25μFでパルス例えばBioRadElectroporationDeviceを使用してを印加する。パルス時間は約5msとすべきである。細胞を1Mソルビトール200μlに直ちに移す。YEP2グルコース4mlを添加し、30°Cで1時間インキュベートする。遠心分離により細胞を集め、上清を捨て、1Mソルビトール4mlの中にペレットを再懸濁する。遠心分離により細胞を集め、上清を捨て、1Mソルビトール300μlの中にペレットを再懸濁する。細胞を適度に希釈し、選択プレート上に塗布するかまたは選択培地の中で使用する。[実際の加水分解物への酵母適用試験]希酸で前処理したコーンストーバーおよび麦わらの試料を、広範囲スペクトルの実験用セルラーゼ調製物を使用して60°Cで3日間72時間酵素加水分解した。加水分解開始時のpHは5.0であった。加水分解開始時の乾燥物質含量は10w/wであった。前処理コーンファイバー試料の加水分解条件は、加水分解温度が50°Cで、加水分解開始時の乾燥物質含量が13.8であることを除いて、基本的に同じであった。加水分解72時間後に、試料を室温に冷却した。10NaOHを使用して、pHを5.5に調節した。続いて、200g/lNH42S041mlおよび100g/lKH2P041mlを添加した。最終的に、加水分解物1kg当たりに、酵母1gの酵母乾燥物質含量に相当する酵母試料を添加した。時間の経過に伴うCO2放出をAFMAlcoholFermentationMonitor;HaloteCInstrumentsBV,Veenendaal,theNetherlandsを使用して追跡した。実験は少なくとも三つ組で33°Cにて72時間実施した。三つ組の1つを一定間隔でサンプリングしてエタノール形成および残留糖濃度を分析する。これらのデータは、発酵収量を計算するために使用することができる。他の2つの実験ブロスはサンプリングしない。その代り、発酵の終了時に、BuchiK-355蒸留ユニットを使用して45蒸気で15分間ブロスを蒸留する。産生されたアルコールは、AntonPaarDMA5000比重計AntonPaarBeneluxBVBA,Dongen,theNetherlandsを使用して測定する。[定量的PCR]特にキシロースイソメラーゼ遺伝子の場合おいて、定量的PCR反応を実施して、ゲノム中に存在する遺伝子のコピー数を決定した。この目的のために、Bio-RadBio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA製のBio-RadiCycleriQシステムを使用した。iQSYBRGreenSupermixBio-Radを使用した。供給者のマニュアルの推奨に従って、実験をセットアップした。キシロースイソメラーゼ遺伝子検出用のプライマーとして、配列番号23および配列番号24のプライマーを使用した。PCR条件は以下の通りであった。95°Cで3分間のインキュベーション40サイクル:95°Cで10秒間58°Cで45秒間72°Cで45秒間95°Cで1分間のインキュベーション65°Cで1分間のインキュベーション融解曲線は、65°Cで10秒間から蛍光測定を開始して決定する。95°Cに到達するまで、温度を10秒ごとに0.5°C上昇させる。読み取りから、目的遺伝子のコピー数を計算および/または評価することができる。当業者が認識するように、この方法は、特定の閾値を上回るコピー数の正確な決定に関しては限界がある。[実施例1][BIE104A2P1株の構築][1.1アラビノース経路の遺伝子を含有する発現ベクターの構築]図2に示すプラスミドpPWT018は、以下のように構築した。ベクターpPWT006図1、SIT2遺伝子座Gottlin-NinfaandKaback1986MolecularandCellBiologyvol.6,no.6,2185-2197ならびに抗生物質G418上での形質転換体の選択およびアセトアミド上での増殖能力を可能にするマーカーからなるを、制限酵素のBsiWIおよびMluIを用いて消化した。G418に対する抵抗性を付与するkanMXマーカーはp427TEFDualsystemsBiotechから単離し、amdSマーカーを含有する断片は、文献Swinkels,B.W.,Noordermeer,A.C.M.andRenniers,A.C.H.M1995TheuseoftheamdScDNAofAspergillusnidulansasadominant,bidirectionalselectablemarkerforyeasttransformation.YeastVolume11,Issue1995A,pageS579;および米国特許第6051431号明細書に記載されている。特許出願国際公開第2008/041840号パンフレットに開示されている、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarum由来のアラビノースイソメラーゼaraA、L-リブロキナーゼaraBおよびL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼaraDをコードする遺伝子は、BaseClearLeiden,theNetherlandsにより合成した。S.セレビシアS.cerevisiae由来の強力なプロモーター、すなわちaraA遺伝子の発現を制御するTDH3プロモーター、araB遺伝子を制御するENO1プロモーター、およびaraD遺伝子を制御するPGl1プロモーターの制御下にあるまたはそれに作動可能に連結された上記3つのアラビノース遺伝子を包含する1つの大きな断片を合成した。この断片は特有の制限酵素であるAcc65IおよびMluIにより挟まれた。MluIおよびBsiWIを用いて消化されたpPWT006の中にこの断片をクローニングして、プラスミドpPWT018図2を得た。プラスミドpPWT018の配列は配列番号1で示す。[1.2酵母の形質転換]CEN.PK113-7DMATaURA3HIS3LEU2TRP1MAL2-8SUC2を、供給業者の説明書に従い、SfiINewEnglandBiolabsであらかじめ直線化したプラスミドpPWT018を用いて形質転換した。合成SfiI部位はSIT2遺伝子の5’-隣接部に設計した図2を参照のこと。G418SigmaAldrichを1ml当たり100μg含有するYPD寒天1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/L、寒天20g上に形質転換混合物を播種した。2~4日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないでは、ブランクのYPD/G418プレートが得られた。プラスミドpPWT018の組込みはSIT2遺伝子座に向けられる。形質転換体はPCRおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。プラスミドpPWT018が1コピー正確に組み込まれたことを示すPCR反応を、配列番号2と配列番号3ならびに配列番号3と配列番号4で示されるプライマーを用いて実施した。配列番号2と配列番号3のプライマー対を用いて、SIT2遺伝子座での正確な組込みをチェックした。プラスミドpPWT018が多コピー組み込まれた場合はヘッドトゥーテール組込み、配列番号3と配列番号4のプライマー対がPCR産物を与えることになる。後者のPCR産物がない場合は、pPWT018が1コピー組み込まれたことを示す。SIT2遺伝子座にプラスミドpPWT018が1コピー組み込まれた株を、BIE104R2と名付けた。[1.3マーカーレスキュー]同じ選択マーカーを使用する他のコンストラクトを用いて酵母株を形質転換できるようにするためには、選択可能マーカーを除去する必要がある。プラスミドpPWT018の設計は、染色体の中にpPWT018が組み込まれる際に、相同配列が互い隣接するようにした。この設計により、選択可能マーカーがこれらの相同領域の自然の分子内組換えにより消失することが可能になる。栄養増殖に際して、低頻度であるが、分子内組換えが起こることになる。この組換えの頻度は、ゲノム中の相同性の長さおよび遺伝子座に依存する未公表結果。培養物の亜分画を新たな培地に逐次的に継代すると、分子内組換え体が時間の経過と共に蓄積することになる。この目的のために、BIE104R2株を、単一コロニー単離物から開始して、YPD培地1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/Lの中で培養した。一晩培養物25μlを使用して、新たなYPD培地に接種した。少なくとも5回のそのような連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定して、1ml当たり約5000個の濃度に細胞を希釈した。30mMKPipH6.8、0.1NH42S04、40mMフルオロアセトアミドAmershamおよび1.8寒天Difcoを含有する酵母カーボンベース培地Difco上に細胞懸濁液を100μl播種した。BIE104R2株の細胞と同一である、すなわち細胞内組換えがない細胞は、依然としてamdS遺伝子を含有する。それらの細胞にとって、フルオロアセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、コロニーを形成することはない。しかしながら、分子内組換えが起こった場合、選択可能マーカーを消失したBIE104R2変異体は、フルオロアセトアミドを増殖阻害化合物に変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖できるようになる。それらの細胞はこの寒天培地上でコロニーを形成することになる。こうして得られたフルオロアセトアミド抵抗性コロニーを、配列番号2と配列番号3、ならびに配列番号4と配列番号5のプライマーを使用してPCR分析に供した。選択可能マーカーの組換えが意図したように起こった場合、配列番号2と配列番号3のプライマーによりバンドが得られることになる。結果として、強力な酵母プロモーターの制御下にあるaraA、araBおよびaraD遺伝子を有するカセットが、宿主株ゲノムのSIT2遺伝子座の中に組み込まれている。その場合、プライマー4が組換えにより消失する領域でプライミングする以上、配列番号4と配列番号5のプライマーを使用するPCR反応からは、PCR産物が得られるはずがない。後者のプライマーを用いてバンドが得られる場合は、ゲノム中に完全なプラスミドpPWT018が存在することを示すため、組換えは起こっていない。配列番号2と配列番号3のプライマーによりPCR産物が得られない場合は、組換えは起こったが、完全なプラスミドpPWT018のゲノム外への組換えである。選択可能マーカーだけでなく、アラビノース遺伝子も消失した。実際、野生酵母が回収されている。pPWT018の1コピー組込みと一致したPCR結果を示した単離物を、サザンブロット分析に供した。CEN.PK113-7D株およびその正確な組換え体の染色体DNAをEcoRIおよびHindIIIを用いて消化した二重消化。鋳型としてCEN.PK113-7D株の染色体DNAを使用し、配列番号6と配列番号7のプライマーを用いて、SIT2プローブを調製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図3に示す。野生株では、2.35kbのバンドが観察され、これは野生型遺伝子の予測サイズと一致する。プラスミドpPWT018の組換えによる組込みおよび部分的な消失においては、1.06kbのバンドが予測された。実際、図3レーン2に示すように、このバンドが観察される。サザンブロット上のバンドが正確なパターン図3から推定できるようにを示した株の1つは、BIE104A2と名付けられた株である。[1.4非酸化的ペントースリン酸経路の4つの構成的に発現する遺伝子の導入]araA、araBおよびaraD遺伝子を構成的に発現するサッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeBIE104A2を、プラスミドpPWT080図4を用いて形質転換した。プラスミドpPWT080の配列は配列番号8で示す。1コピー組込み形質転換体を選択した後の形質転換および選択のための手順は、セクション1.1、1.2および1.3に上記したものと同じである。手短に言えば、SfiI消化pPWT080を用いてBIE104A2を形質転換した。G418SigmaAldrichを1ml当たり100μg含有するYPD寒天1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/L、寒天20g上に形質転換混合物を播種した。2~4日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないでは、ブランクのYPD/G418プレートが得られた。プラスミドpPWT080の組込みはGRE3遺伝子座に向けられる。形質転換体はPCRおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。GRE3遺伝子座でのプラスミドpPWT080の正確な組込みは、配列番号9と配列番号10のプライマー対を使用するPCRによりチェックし、配列番号9と配列番号11のプライマー対を使用して、プラスミドpPWT080の単一または多コピーの組込みを検出した。サザン解析については、配列番号12と配列番号13を使用して、S.セレビシアS.cerevisiaeのRKI1遺伝子の一部を増幅するPCRにより、プローブを調製した。天然RKI1遺伝子の隣に、プラスミドpPWT080の組込みに起因する余分なシグナルが得られたデータを示さず。予測されるハイブリダイゼーションパターンと一致した、プラスミドpPWT080の1コピーの正確な組込みを示す形質転換体をBIE104A2F1と名付けた。プラスミドpPWT080の組込みにより導入された選択マーカーを除去するために、BIE104A2F1株を、コロニー単離物から開始してYPD培地の中で培養した。一晩培養物25μlを使用して、新たなYPD培地に接種した。5回の連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定し、1ml当たり約5000個の濃度に細胞を希釈した。30mMKPipH6.8、0.1NH42S04、40mMフルオロアセトアミドAmershamおよび1.8寒天Difcoを含有する酵母カーボンベース培地Difco上に細胞懸濁液を100μl播種した。フルオロアセトアミド抵抗性コロニーは、配列番号9と配列番号10のプライマーを使用するPCR分析に供した。正確なPCRプロフィールの場合には、正確な組込みを確認するために、再びRKI1遺伝子のプローブを使用してサザンブロット分析を実施した。サザンブロット上のバンドが正確なパターンを示した株の1つは、BIE104A2P1と名付けた株である。[実施例2][BIE104A2P1cおよびBIE201をもたらす振盪フラスコ中の適応進化。][2.1適応進化好気的に]BIE104A2P1株の単一コロニー単離物を使用して、2ガラクトースを添加したYNB培地Difcoに接種した。前培養物を、旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を採取し、1ガラクトースおよび1アラビノースを含有するYNB培地の中に、0.2の開始OD600で接種した図5。旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで細胞を増殖させた。600nmの光学濃度を一定間隔でモニターした。光学濃度が5の値に到達したときに、培養物のアリコートを、同じ培地を含有する新たなYNB培地に移した。加えた細胞量は、培養物の開始OD600が0.2になるようにした。OD600が再び5に到達した後、培養物のアリコートを、唯一の炭素源として2アラビノースを含有するYNB培地に移した図5で1により示される事象。2アラビノースを唯一の炭素源として含むYNBに移すと、約2週間後に増殖を観察することができた。600nmの光学濃度が少なくとも1の値に到達したときに、2アラビノースを添加した新たなYNB培地を含む振盪フラスコに、0.2の開始OD600で細胞を移した図5、28日目。図5に示すように、逐次的継代を3回繰り返した。アラビノース上で迅速に増殖できる得られた株をBIE104A2P1cと名付けた。[2.2適応進化嫌気的に]好気性条件下におけるアラビノース上での増殖に適応した後に、BIE104A2P1c株からの単一コロニーを、2グルコース添加YNB培地の中に接種した。前培養物を、旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を採取し、2アラビノース含有YNB培地の中に、0.2の開始光学濃度OD600で接種した。フラスコをウォーターロックで密閉して、酸素が培地およびヘッドスペースから完全に消失した後の嫌気性増殖条件を保証した。OD600が3以上に到達した後に、培養物のアリコートを、開始OD600値が毎回0.2になるように、2アラビノースを含有する新たなYNB培地に移した図6。数回移した後に得られた株をBIE104A2P1d=BIE201と名付けた。[実施例3][BIE201X9株の構築][3.1BIE201株の形質転換]BIE201株をプラスミドpPWT042を用いて形質転換した。プラスミドpPWT042の物理的地図を図7に示す。プラスミドpPWT042配列番号14は、バクテロイデスユニフォルミスBacteroidesuniformisに由来する、TDH1プロモーター制御下のコドン対最適化xylA遺伝子、およびS.セレビシアS.cerevisiaeに由来する、TPI1プロモーター制御下のXKS1遺伝子を含有する4630bpの挿入断片を含有する。BIE201の形質転換の前に、供給業者が提供する説明書に従い、制限酵素Sfilを使用してpPWT042を直線化した。G418SigmaAldrichを1ml当たり100μg含有するYPD寒天1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/L、寒天20g上に形質転換混合物を播種した。2~4日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないでは、ブランクのYPD/G418プレートが得られた。Sfilを用いてプラスミドpPWT042を消化すると、その組込みはゲノム中のSIT4遺伝子座Gottlin-NinfaandKaback1986MolecularandCellularBiologyVol.6,No.6,2185-2197に向けられる。形質転換体はPCRおよびサザンブロット法を使用して特徴づけた。プラスミドpPWT042が1コピー正確に組み込まれたことを示す、Phusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesを使用するPCR反応を、配列番号15と16SIT4遺伝子座でのpPWT042の正確な組込みならびに配列番号16と17多コピー組込みの場合のみバンドが出現するで示されるプライマーを用いて実施した。ゲノムに組み込まれたプラスミドpPWT042を1コピー有する株は、BIE201Y9と名付けた。[3.2マーカーレスキュー]プラスミドpPWT042の組込みにより導入された選択マーカーを除去するために、以下の手順を実施した。プラスミドpPWT042の設計は、染色体の中にpPWT042が組み込まれる際に、相同配列が互い隣接するようにした。この設計により、選択可能マーカーがこれらの相同領域の自然の分子内組換えにより消失することが可能になる。栄養増殖に際して、低頻度であるが、分子内組換えが起こることになる。この組換えの頻度は、ゲノム中の相同性の長さおよび遺伝子座に依存する未公表結果。培養物の亜分画を新たな培地に逐次的に継代すると、分子内組換え体が時間の経過と共に蓄積することになる。この目的のために、BIE201Y9株を、単一コロニー単離物から開始して、YPD-2グルコースの中で培養した。一晩培養物25μlを使用して、新たなYPD-2グルコース培地に接種した。5回の連続継代の後に、培養物の光学濃度を測定し、1ml当たり約5000個の濃度に細胞を希釈した。30mMKPipH6.8、0.1NH42S04、40mMフルオロアセトアミドAmershamおよび1.8寒天Difcoを含有する酵母カーボンベース培地Difco上に細胞懸濁液を100μl播種した。BIE201Y9株の細胞と同一である、すなわち細胞内組換えがない細胞は、依然としてamdS遺伝子を含有している。それらの細胞にとって、フルオロアセトアミドは有毒である。これらの細胞は、フルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、コロニーを形成することはない。しかしながら、分子内組換えが起こった場合、選択可能マーカーを消失したBIE201Y9変異体は、フルオロアセトアミドを増殖阻害化合物に変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖できるようになる。それらの細胞はこの寒天培地上でコロニーを形成することになる。こうして得られたフルオロアセトアミド抵抗性コロニーを、配列番号15と配列番号16、ならびに配列番号17と配列番号18のプライマーを使用してPCR分析に供した。選択可能マーカーの組換えが意図したように起こった場合、配列番号15と配列番号16のプライマーによりバンドが得られることになる。結果として、xylAおよびXKS1遺伝子がSIT4遺伝子座に組み込まれている。その場合、プライマー17が組換えにより消失する領域にプライミングする以上、配列番号17と配列番号18のプライマーを使用するPCR反応からは、PCR産物が得られるはずがない。これらのプライマーを用いてバンドが得られる場合は、ゲノム中に完全なプラスミドpPWT042が存在することを示すため、組換えは起こっていない。配列番号15と配列番号16のプライマーによりPCR産物が得られない場合は、組換えは起こったが、完全なプラスミドpPWT042のゲノム外への組換えである。選択可能マーカーだけでなく、xylA遺伝子およびXKS1遺伝子も消失した。実際、野生酵母が回収されている。予測されるPCR結果を示した単離物は、サザンブロット分析に供した上記参照。サザンブロット上のバンドが正確なパターンを示した株の1つは、BIE201X9と名付けた株である。[実施例4][BIE252株の構築および選択][4.1xylAカセットの増幅]ゲノムの中にxylA遺伝子の余剰コピーを導入するために、プラスミドpPWT042を鋳型として、また配列番号19と配列番号20のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Phusion登録商標DNAポリメラーゼFinnzymesを使用してPCR反応を実施した。これらのプライマーを用いて、TPI1プロモーター、コドン対最適化xylA遺伝子およびPMA1ターミネーターを含むxylAカセットを増幅する。プライマー設計は、PCR断片の隣接部が酵母トランスポゾンTy-1のデルタ配列のコンセンサス配列に相同になるようにする。これらの配列をNCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/から入手し、例えばCloneManager9ProfessionalEditionScientificEducationalSoftware,Cary,USAのような、アライメントを可能にするソフトウェアパッケージを使用して、アライメントすることができる。xylAカセットは、ゲノムへの組込みに対して選択することができる選択可能マーカーを含有しない。形質転換率を評価するために、kanMX-マーカーを用いる第2の対照形質転換を行った。この目的のために、プラスミドp427TEFDualsystemsBiotech由来のkanMXカセットを、配列番号21と配列番号22に対応するプライマーを使用するPCR反応で増幅した。[4.2BIE201X9の形質転換]BIE201X9を、xylAカセットX18-Ty1と命名30μgまたはkanMXカセット10μgのいずれかを含む断片を用い、上記のエレクトロポレーションプロトコールに従って形質転換した。G418SigmaAldrichを1ml当たり100μg含有するYPD寒天1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/L、寒天20g上にkanMX形質転換混合物を播種した。2~4日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないでは、ブランクのYPD/G418プレートが得られた。形質転換率は、kanMXカセット1μg当たり600個を超えるコロニーであると思われた。X18-Ty1形質転換混合物を使用して、2キシロース添加Verduyn培地100mlを含有する振盪フラスコに接種した。対照として、形質転換の陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないを使用した。旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで振盪フラスコをインキュベートした。600nmの光学濃度を定期的に測定することにより、増殖を追跡した。増殖曲線の結果を図8に示す。観察されるように、20日目と25日目の間で、X18-Ty1振盪フラスコの光学濃度は劇的に増加したが、陰性対照の増殖は依然としてなかった。25日目に、2キシロースを添加した新たなVerduyn培地を含有するフラスコに、0.15の開始光学濃度600nmでX18-Ty1培養物を接種した。再接種すると、培養物がキシロース上で直ちにかつ急速に増殖し始めたことが図8から明らかである。培養物が亜培養物の混合物からなる、したがって、X18-Ty1カセットのコピー数およびキシロース上の増殖速度において差がある細胞からなると思われるため、細胞をmilliQ水の中に希釈し、単一コロニー単離物を得るためにYPD寒天プレート上に播種した。単一コロニー単離物を、異なる炭素源を利用する能力に関して試験した。[4.3BIE252株の選択]他の重要な糖グルコース、アラビノースおよびガラクトースを利用する能力を失うことなく、キシロースを唯一の炭素源とする増殖が改善された株を選択するために、適応進化培養物の単一コロニー単離物10個を、YPD寒天上に再塗布した。続いて、2グルコース添加YPD培地上で前培養した。10個の培養物を30°Cおよび280°Cで一晩インキュベートした。各培養物のアリコートを使用して、2グルコースまたは2キシロースまたは2アラビノースまたは2ガラクトースのいずれかを添加した新たなVerduyn培地に、0.15の開始光学濃度で接種した。対照として、BIE201株、BIE201X9株および混合集団そこから10個の単一コロニー単離物が回収されたが実験に含まれた。旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで細胞を増殖させた。増殖は600nmの光学濃度測定に基づいて評価した。19時間インキュベーション後の600nmにおける光学濃度の結果を図9に示す。図9の結果より、混合培養物および10個の単一コロニー単離物はいずれも、キシロース上で高い最終光学濃度600nmを示す。これらの株は、唯一の炭素源としてのアラビノース上で増殖したが、接種19時間後の600nmにおける最終光学濃度は、親株、BIE201株およびBIE201X9株と比較して低かった。増殖を数日間延長した後、他の単一コロニー単離培養物と比較して、コロニー3が最も高い光学濃度に到達したのでデータを示さず、コロニー3を選択した。試験したすべてのコロニーにおいて、キシロース上の増殖は変わらなかった。コロニー3の培養物を希釈し、YPD寒天上に播種した。2アラビノースまたは2キシロースのいずれかを添加したVerduyn培地上で増殖する能力について、11個の単一コロニー単離物を試験した。この目的のために、Verduyn2グルコース上で前培養を行った。旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩細胞を増殖させた。アリコートを、2アラビノースまたは2キシロースのいずれかを添加したVerduyn培地に、0.15の開始光学濃度で移した。コロニー3の培養物をこの試験の対照として含ませた。旋回シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩細胞を増殖させた。増殖は600nmの光学濃度測定に基づいて評価した。4日間インキュベーション後の600nmにおける光学濃度の結果を図10に示す。この結果から、キシロース上で、コロニー3.7が対照であるコロニー3の培養物と同様な光学濃度に到達したことがわかる。さらに、コロニー3.7が唯一の炭素源としてのアラビノース上で増殖する能力は、コロニー3の培養物と比較して大幅に改善していた。他の単一コロニー単離物も、キシロース上で増殖する能力を明らかに犠牲にして、アラビノース上での増殖が改善されたことを示す。単一コロニー単離物3.7の培養物をBIE252株と名付けた。BIE252におけるSNPおよび増幅は、欧州特許第10160647.3号明細書からの優先権を主張する、2011年4月19日に出願された同時係属中のPCT出願に記載のものと同じ手順に従って判定した。これらの試験から、BIE252が以下のSNP:SSY1遺伝子中のG1363T、YJR154w遺伝子中のA512T、CEP3遺伝子中のA1186GおよびGAL80遺伝子中のA436Cを有することがわかった。これらはBIE201と同じである。さらに、BIE201に存在する染色体VII中の増幅は、BIE252にも存在する。これを図23に示す。[実施例5][BAMにおける性能試験]選択されたBIE252株の性能を試験するために、2グルコース添加Verduyn培地の中にこの株を接種した。対照として、BIE201株およびBIE104P1Y9mc株を含めた。前者はグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを発酵させることができる株上記参照であり、後者はグルコース、ガラクトースおよびキシロースを発酵させることができる株である。回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集し、CO2産生のための培養を、BAMBiologicalActivityMonitorにおいて、5グルコース、5キシロース、3.5アラビノースおよび1ガラクトースを添加したVerduyn培地100mlの中で33°Cにて実施した。バッチ実験である一実験では、糖を添加したVerduyn培地100mlに細胞を加えた。フェドバッチ実験である第2の実験では、糖を添加したVerduyn培地100mlを、毎分3mlの速度で細胞に加えた。CO2産生を一定間隔でモニターし、分析600nmの光学濃度、エタノール、残留糖のために試料を採取した。BAM実験の直前に、BIE201株およびBIE104P1Y9mc株を光学濃度に基づいて1:1の比で混合した。BAM実験の結果を、図11、12、13、14、15および16に示す。フェドバッチ方式における混合株BIE201およびBIE104P1Y9mcの性能から図11、キシロースおよびアラビノースが時間の経過と共にある程度まで蓄積するにもかかわらず、流加の終了約33時間前にすでに、消費速度が流加速度より速くなっていることがわかる。72時間後には、アラビノースはすべて変換されたが、キシロースの消費は完全ではない。グルコースおよびガラクトースは常に検出レベルまたはその近辺にあり、これらの糖がペントースであるアラビノースおよびキシロースよりも好まれることが示される。BAMにおいてフェドバッチ方式で試験された場合図12を参照、BIE252株の性能は、混合株培養物と基本的に同じ特性を示す。しかしながら、キシロースおよびアラビノースはより高い濃度まで蓄積するが、その後のエタノールへの変換は、より高い速度で起こり、それにより、120時間後には同じエタノールタイターおよび同じCO2産生の累積がもたらされる図13。バッチ方式では、バッチ方式における混合株BIE201とBIE104P1Y9mcの性能により、発酵実験の開始後にグルコースが即座に消費されることがわかる図14。続いて、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースが共発酵される。約30時間後、ガラクトースは消費された。約72時間後、アラビノースも完全に消費された。両方とも、CO2およびエタノールの形成に顕著に寄与した。アラビノースの完全消費後に、キシロース消費、したがってエタノールおよびCO2の産生が顕著に減速した。その点で、BIE252株の性能は優れていた図15。10時間以内にグルコースが完全消費された直後に、ガラクトース、アラビノースおよびキシロースが、迅速かつ効率的に共発酵された。ガラクトース完全消費の後でも、ペントースであるアラビノースおよびキシロースは両方とも、完全に共発酵され、CO2産生およびエタノール形成に寄与した。BIE252株の場合には、すべての糖の発酵が約72時間後に完了した。図16に示すように、これにより、混合株培養物BIE201とBIE104P1Y9mcと比較して、BIE252株の高いCO2産生の累積がもたらされた。[実施例6][実際の加水分解物における性能試験]実際の加水分解物における性能試験は、2グルコース添加YEP培地を含有する振盪フラスコの中で一晩培養されたBIE252株を使用して実施した。遠心分離により細胞を収集し、1リットル当たり50グラムの乾燥物質濃度で再懸濁した。試験した供給原料は、コーンファイバー、コーンストーバーおよび麦わらのバッチからなっていた。材料および方法のセクションに記載のように、加水分解および発酵を実施した。結果を、図17コーンファイバー、18コーンストーバーおよび19麦わらに示す。比較的低量のガラクトースおよびアラビノースを含むが、主としてグルコースおよびキシロースからなる供給原料であるコーンストーバーおよび麦わらの場合には、すべての糖が72時間でCO2およびエタノールに変換された。コーンファイバー図17の場合には、アラビノース、ガラクトースおよびキシロースが低量残留する。下記の表では、加水分解の終了時に放出されていた糖および発酵の終了時に産生されていたエタノール量に基づいて、発酵収量を計算した。AntonPaarDMA5000比重計測定により決定される発酵終了時のエタノール産生量および使用した前処理供給原料の量に基づいて、加水分解および発酵の全体収量を二つ組で計算した。これらの数値を表3に示す。[実施例7][BIE252株の安定度試験][7.1BIE252株の安定性]BIE252株の安定性を試験するために、単一コロニー単離物を使用して、YEP2グルコース25mlに接種した。培養物の光学濃度を600nmで測定した。培養物を、回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、光学濃度を測定した。インキュベーション前後のOD600値に基づいて、インキュベーションの間の世代数を計算した。一晩培養物25μlを使用して、新たな培地25mlを含有するフラスコに接種した。上記と同じ条件下で、培養物を再度インキュベートした。細胞が最初の単一コロニー単離物から少なくとも100世代離れた培養物が得られるまで、この手順を繰り返した。アラビノースおよびキシロースの変換に必要となる、BIE252株の導入遺伝子を維持するために、これらの条件下では選択圧が加えられないので、2グルコース添加YEP培地を選択した。少なくとも100世代後に得られた細胞培養物を希釈し、YPD寒天上に播種した。2個の単一コロニー単離物をVerduyn培地2グルコースの中に接種した。対照として、親株BIE252を一緒に採用した。培養物を、回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした。一晩培養物のアリコートを使用して、1グルコース、1キシロース、0.7アラビノース、0.3ガラクトースおよび0.1マンノースを添加したVerduyn培地25mlを含有するフラスコに、0.15の開始光学濃度で接種した。一定間隔で、分析のために、すなわち600nmの光学濃度測定およびNMRによる残留糖の測定のために試料を採取した。図20a安定度試験前のBIE252培養物、20b100世代を超えるBIE252のコロニーからの培養物および20c100世代を超えるBIE252の第2コロニーからの培養物で示すように、これらの結果から3つの株培養物の挙動は、試験条件下で実質上同一であることがわかる。言いかえれば、この増殖培地における性能は変化しなかった。100世代を超える培養の後に、この株は依然として同じ速度で5種の異なる糖を利用することができ、この株が遺伝学的に安定であることが示される。さらに、2グルコース添加YEP培地における100世代培養前後のBIE252のコピー数を評価するために、定量的PCRQ-PCR実験を行った。Q-PCR分析は、Bio-RadBio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA製のBio-RadiCycleriQシステムを用いて実施した。iQSYBRGreenSupermixBio-Radを使用した。供給者のマニュアルの推奨に従って、実験をセットアップした。BIE252株の安定性は、キシロースイソメラーゼをコードするxylA遺伝子のコピー数を決定することにより評価した。参照単一コピー遺伝子として、ACT1遺伝子を選んだ。xylA遺伝子およびACT1遺伝子の検出用プライマーは以下のとおりである。順方向プライマーxylA配列番号23逆方向プライマーxylA配列番号24順方向プライマーACT1配列番号25逆方向プライマーACT1配列番号26結果は、BIE252のコピー数は、ACT1遺伝子に対して、xylA遺伝子が約8コピーであることを示した。コピー数は、2グルコース添加YEP培地上での100世代培養の前後で決定され、定量的PCR分析の限界を考慮すると、基本的に同じであると思われた。2グルコース添加YEP培地における100世代培養の前後で、いくつかのコロニーの染色体DNAを単離した。染色体DNAをXbalにより切断する。サザンブロット分析を、プライマー対配列番号23と配列番号24のPCR産物をプローブとして使用して実施する。得られたオートラジオグラムは、バンドのパターンに変化がないことを示しており、この株が非選択的条件下の100世代増殖の後に、遺伝学的に安定であることが示される。[比較実験A][7.2YEpおよびYCpのベクターを用いて形質転換したBIE201X9の安定性]BIE201X9株を、ベクターpPWT148YCpプラスミドおよびpPWT152YEpプラスミドを用いて形質転換した。プラスミドpPWT148の物理的地図を図21に示す。プラスミドpPWT152の物理的地図を図22に示す。G418SigmaAldrichを1ml当たり100μg含有するYPD寒天1リットル当たり:酵母抽出物10g、ペプトン20g/L、デキストロース20g/L、寒天20g上に形質転換混合物を播種した。2~4日後に、コロニーがプレート上に出現したが、陰性対照すなわち、形質転換実験においてDNAを添加しないでは、ブランクのYPD/G418プレートが得られた。各形質転換の3つのコロニーを、安定性試験のために混合物として使用した。この目的のために、混合コロニーを使用して、2グルコースおよび100μgG418/mlを添加したYEP培地に接種した。細胞を、回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした。光学濃度を600nmで測定した。一晩培養物を使用して、2グルコースを添加した新たなYEP培地および100μgG418/mlを添加した同培地に、600nmで0.02の開始光学濃度になるように接種した。文献上記参照の報告に基づくと、G418の存在下すなわち、選択圧が加えられるで培養された細胞は、その大多数が、細胞内部にプラスミドを保持することになると予測される。しかしながら、G418の非存在下では、細胞はそのプラスミドを急速に消失すると予測される。培養物を、回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした。光学濃度を600nmで測定した。光学濃度測定に基づいて、培養物は、両方の培地すなわち、G418存在および非存在において8世代を経たと計算された。希釈をして、100μgG418/ml含有および非含有YPDプレート上に播種した。コロニーを視覚できかつカウントできるのに必要なように、プレートを30°Cで約2日間以上インキュベートした。さらに、一晩培養物25μlを使用して、2グルコースを添加した新たなYEP培地25mlおよび100μgG418/mlを添加した同培地25mlに接種した。培養物を、回転シェーカーにて30°Cおよび280rpmで一晩インキュベートした。光学濃度を600nmで測定した。光学濃度測定に基づいて、培養物は、両方の培地すなわち、G418存在および非存在において、さらに8世代を経たと計算された。希釈をして、100μgG418/ml含有および非含有YPDプレート上に播種した。コロニーを視覚できかつカウントできるのに必要なように、プレートを30°Cで約2日間以上インキュベートした。G418含有および非含有YDP寒天上でカウントされたコロニーに基づいて、G418の存在下また非存在下での8世代および16世代後の安定性を計算することができた。結果を表4に要約する。この場合では、培地へのG418の添加による選択圧が培養期間中加えられていても、YCpプラスミドおよびYEpプラスミドすなわち、それぞれpPWT148およびpPWT152は両方とも、形質転換酵母細胞の中で安定に維持されないことが表から理解することができる。しかしながら、プラスミド消失は選択圧がない状態ではるかに激しいことに留意しなければならない。この実験と実施例7とを併せると、キシロースイソメラーゼ遺伝子のゲノムへの染色体組込みが安定な酵母形質転換体を得るのに必要であるという洞察が得られる。[実施例8][GAL80の欠失はより良好なアラビノース変換をもたらす]実施例4では、染色体VIIの一部も増幅している場合に、GAL80遺伝子に同定されたSNPが、アラビノース上の増殖に対して正の相加効果を有するが示された。GAL80は、ガラクトースに応答して転写調節に関与する転写リプレッサーをコードするTimsonDJ,etal.2002BiochemJ363Pt3:515-20。プロモーター中にGAL上流活性化部位UAS-GALを含有する遺伝子の発現を、Gal4pおよびGal3pと一緒に、Gal80pは協調的に調節する。これらの遺伝子にはGAL代謝遺伝子であるGAL1、GAL10、GAL2およびGAL7が含まれるLohrD,etal.1995FASEBJ99:777-87に総説がある。gal80がない細胞は、非誘導培地においても、GAL遺伝子を構成的に発現するTorchiaTE,etal.1984MolCellBiol48:1521-7。GAL80遺伝子に同定されたSNPは、Gal80p、Gal3pおよびGal4pの間の相互作用に影響を及ぼすという仮説がある。したがって、ガラクトースパーミアーゼをコードするGAL2を含むガラクトース代謝遺伝子の発現もまた、野生型GAL80対立遺伝子を有する酵母細胞と比較して、変化することになる。Gal2pガラクトースパーミアーゼはアラビノースのための主要な糖トランスポーターであるKouetal1970JBacteriol.1033:671-678;BeckerandBoles2003ApplEnvironMicrobiol.697:4144-4150。明らかに、GAL80遺伝子中のSNPは、L-アラビノースを変換する能力に正の効果がある。アラビノース増殖表現型をさらに改善できるか否かを調査するために、GAL80遺伝子のコード配列全体を、PCRを媒介とした遺伝子置換戦略を使用して削除した。[8.1GAL80遺伝子の破壊]配列番号58および59それぞれ順方向および逆方向プライマーのプライマーを、プラスミドp427-TEFDualsystemsBiotech,Schlieren,Switzerland由来のkanMXマーカーの増幅のために使用した。プライマーの隣接部は、GAL80遺伝子の5’-領域および3’-領域に相同である。相同組換えに際して、WachWachetal1994Yeast10,1793-1808による記載と同様に、GAL80遺伝子のORFはkanMXマーカーにより置換されることになる。得られた断片を、GAL80::kanMX断片と名付ける。BIE252株の酵母形質転換は、GietzandWoods2002,MethodsinEnzymology350:87-96に記載のプロトコールに従い、精製されたGAL80::kanMX断片を用いて行った。BIE252株の構築は欧州特許第10160622.6号明細書に記載されている。BIE252株は、S.セレビシアS.cerevisiaeのキシロースおよびアラビノース発酵株であり、BIE201の誘導株である。BIE252株はまた、GAL80SNPを含有している。選択のために100μg/mlG418含有YEPD寒天上に形質転換細胞を播種した。コロニーが肉眼で見えるまで、プレートを30°Cでインキュベートした。プラスミドp427-TEFを陽性対照として含めた。この場合は、多くのコロニーが得られた。MilliQすなわち、DNAなしを陰性対照として含めた。この場合は、コロニーは得られなかった。GAL80::kanMX断片では、多くのコロニーが得られた。正確な組込みを確認するために、2つの別個のコロニーをサザンブロット法により試験したデータを示さず。GAL80遺伝子の正確な欠失を有するコロニーをBIE252ΔGAL80と名付けた。[8.2BAMにおける性能に対するGAL80遺伝子置換の影響]BAMBiologicalActivityMonitor;HalotecBV,Veenendaal,theNetherlands実験を実施した。BIE252株およびBIE252ΔGAL80株GAL80遺伝子のORFがkanMXマーカーによって正確に置換された形質転換体の単一コロニー単離物を使用して、2グルコース添加Verduyn培地Verduynetal.,Yeast8:501-517,1992に接種した。前培養物を、30°Cおよび280rpmで約24時間インキュベートした。細胞を採取し、合成モデル培地5グルコース、5キシロース、3.5アラビノース、1ガラクトースおよび0.5マンノースを添加したVerduyn培地、pH4.2の中に、培地1kg当たり約1グラムの乾燥重量の細胞密度で接種した。CO2産生を定常的にモニターした。糖変換および産物形成をNMRにより分析した。データは、指定時点での糖の残留量1リットル当たりのグラム数における、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノースおよびキシロースおよび副産物エタノール、グリセロールなどの形成を表わす。増殖は、培養物の光学濃度600nmを追跡することによりモニターした。実験は約72時間行った。グラフを図23BIE252および24BIE252ΔGAL80に示す。実験から、参照株BIE252がグルコースおよびマンノースを迅速に変換したことが明確にわかる。グルコースの枯渇約10時間後、キシロースおよびアラビノースの変換が始まった。ガラクトースの一部は、約10時間の時点ですでに発酵されつつあり、これは、グルコースとガラクトースの一部同時利用を可能にする、この株のGAL80SNPによる可能性がある。実験の終了時である約72時間、ほとんどすべての糖約99が変換された。糖1グラム当たりエタノール0.37グラムのエタノール収量が得られた。BIE252ΔGAL80株は、BIE252株よりも速い糖変換能力を示す。さらに、この株の場合には、マンノースおよびグルコースが発酵の第1の時間帯で変換される。しかしながら、BIE252株とは対照的に、この形質転換体では、グルコース、ガラクトースおよびマンノースがアラビノースおよび特にキシロースと共に、一部同時消費される。一般に、糖消費が速いと、すべての利用可能な糖が一層完全に使用されるようになる。これはまた、時間経過に伴うCO2放出からも明らかである。BIE252の場合には、グルコースおよびマンノースから基本的に形成されるCO2による第1のピークが観察される。10ml/hrを少し超えた最小点に到達した後図20、第2のより平坦なピークが観察される。しかしながら、BIE252ΔGAL80の場合には図21、第2のピークは、NMRによる糖分析から明らかなように、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノースおよびガラクトースの同時使用が強まった結果、第1のピークの尾部として出現する。親株BIE252では、異なる糖の使用はより逐次的である。したがって、BIE252ΔGAL80株の収量は実験の終了時72時間により高く、糖1グラム当たりエタノール0.40グラムである。結論として、BIE252株における試験のように、GAL80遺伝子のORFの欠失はさらに性能の改善をもたらした。"