"微生物の存在を検出するための増殖培地であって、前記増殖培地が、-微生物の少なくとも1つの酵素によって活性化され得る少なくとも1つの蛍光原基質または蛍光原基質の組合せと、-前記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォアと、が均一に溶解している液体栄養支持体から形成され、前記支持体自体の蛍光が好ましくは増殖培地のpH変化、および、増殖培地への前記微生物の導入に感受性でないことを特徴とする増殖培地。4-メチルウンベリフェロンまたはその誘導体から選択される少なくとも1つの蛍光原基質を含むことを特徴とする請求項1に記載の増殖培地。蛍光原基質が4-メチルウンベリフェロン4-MUの誘導体の混合物から構成されることを特徴とする請求項1または2に記載の増殖培地。1種または複数の4-メチルウンベリフェロン誘導体が、個別にまたは混合物として増殖培地に導入される以下の化合物、すなわち、4-MUホスフェート、4-MUブチレート、4-MUアセテート、4-MUアルファ-グルコシド、4-MUベータ-グルコシド、4-MUベータ-ガラクトシド、4-MUN,Nジアセチルシトビオシド、4-MUN,N,Nトリアセチルシトトリオシド、4-MUカプリレート、から選択されることを特徴とする請求項3に記載の増殖培地。蛍光原基質が、以下の4-メチルウンベリフェロン誘導体化合物、すなわち、4-MUホスフェート、4-MUアルファ-グルコシド、4-MUベータ-グルコシドおよび4-MUベータ-ガラクトシドの混合物から構成されることを特徴とする請求項4に記載の増殖培地。以下の化合物:1-2-ベンゾイルフェニル-6-クロロ-1H-インドール-3-イル-ベータ-グルコピラノシド、1-2-ベンゾイルフェニル-6-クロロ-1H-インドール-3-イル-ベータ-ガラクトピラノシド、1-2-ベンゾイルフェニル-6-クロロ-1H-インドール-3-イル-アセテート、または、1-2-ベンゾイルフェニル-6-クロロ-1H-インドール-3-イル-ホスフェートから選択される少なくとも1つの蛍光原基質を含むことを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に記載の増殖培地。増殖培地のpHを標示する蛍光を有する前記フルオロフォアが、8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸HPTS、シアニン化合物もしくはその誘導体のいずれか、または、フルオレセイン化合物もしくはその誘導体、塩もしくはエステルのいずれかから選択されることを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の増殖培地。蛍光が増殖培地のpHに従って変化する前記フルオロフォアがカルボキシフルオレセインまたはその塩もしくはエステルのいずれかであることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の増殖培地。生存微生物によって汚染されているか否かを判定するサンプルを請求項1から8のいずれか一項に記載の増殖培地において培養する段階を含むことを特徴とする微生物の検出無菌性試験方法。被験サンプルがある容量の水または気体の濾過に予め使用されたフィルターまたは膜である請求項9に記載の微生物の検出方法。下記段階を含むことを特徴とする1種または複数の微生物の検出方法:i-微生物の少なくとも1つの酵素によって活性化され得る少なくとも1つの蛍光原基質または蛍光原基質の組合せ、および、-前記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォア、を含む増殖培地に、検出対象微生物が増殖できる条件下でサンプルを配置する段階、ii増殖培地に含有させた蛍光原基質の前記微生物による活性化に関連する蛍光を決定するためおよび増殖培地のpHを標示する蛍光を有するフルオロフォアによって発光された蛍光を決定するために前記増殖培地を蛍光に関して分析する段階、iiipHを標示する蛍光を有するフルオロフォアの決定蛍光測定値および蛍光原基質の決定蛍光測定値を分析し、増殖培地中に検出対象微生物の1つのタイプまたは複数のタイプが存在するか否かを判定する段階。前記増殖培地が請求項1から8のいずれか一項に記載のものであることを特徴とする請求項11に記載の方法。段階iにおいて、培養開始前に前記微生物を予め膜で濾過することを特徴とする請求項11または12に記載の方法。段階iiにおいて、蛍光変化を時間の関数として得るために蛍光を定期的間隔で測定することを特徴とする請求項11から13のいずれか一項に記載の検出方法。段階iiiにおいて、蛍光測定値を参照データベースの標準測定値と比較することを特徴とする請求項11から13のいずれか一項に記載の検出方法。-微生物増殖培地と、-前記増殖培地に可溶性の少なくとも1つの蛍光原基質または蛍光原基質の組合せと、-前記増殖培地に可溶性で前記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォアと、を含むことを特徴とする微生物検出用キット増殖培地が脱水型で包装されていることを特徴とする請求項16に記載の検出用キット。したがって本発明は、特に液体増殖培地中の無菌性試験を実行するために有用な微生物検出方法を含み、方法は、生存微生物で汚染されているか否かの判定を要するサンプルを適当な培地中で培養する段階を含むことを特徴とする。この方法は、特に予め滅菌した増殖培地にサンプルを直接接種することによって濾過可能または濾過不可能ないかなる形態のサンプルにも適用できる。この場合、水のような液体サンプルまたは空気のような気体サンプルは膜を用いて濾過することが可能である。次に、この膜が固体サンプルを形成するかのように液体増殖培地に接種する。本発明によれば、検出方法は以下の段階、すなわちi-微生物の少なくとも1つの酵素によって活性化され得る少なくとも1つの蛍光原基質または蛍光原基質の組合せと、-上記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォアと、を含む増殖培地に、検出対象微生物が増殖可能な条件下で、上記に定義のサンプルを配置する段階、ii増殖培地に含有させた蛍光原基質の微生物による活性化に関連した蛍光を決定するため、および、フルオロフォアによって発光された増殖培地のpHを標示する蛍光を決定するために上記増殖培地を蛍光に関して分析する段階、iiipHを標示する蛍光を有するフルオロフォア由来と決定された蛍光測定値および蛍光原基質由来と決定された蛍光測定値を分析し、増殖培地中の検出対象微生物の1つのタイプまたは複数のタイプが存在するか否かを判定する段階、の1つ以上を含む。蛍光原基質という用語は、光エネルギーを吸収できこのエネルギーの全部または一部を蛍光発光スペクトルの形態で放出できるフルオロフォア基を含み、さらに、該フルオロフォア基の蛍光を遮蔽するクエンチャー基を含む分子を意味する。蛍光原基質は、微生物の特異的酵素に接触したとき異なる形態になりフルオロフォアに蛍光を発光させる。この活性化の結果、基質形成分子のコンホメーションの変化または蛍光残基形成分子の開裂が生じる。様々な蛍光原基質を本発明に考察できる。本発明に好ましい蛍光原基質は酵素活性化後に4-メチルウンベリフェロン化合物になり、その蛍光発光は励起波長約360±10nmで約460±10nmである。本発明に好ましいこのような蛍光原基質はたとえば、メチルウンベリフェリル4-MU誘導体であり、特に以下、から選択される1つ以上の基質である。これらの基質は微生物の部門に比較的特異的なので、すなわち、全微生物中には存在しないある種の酵素によってのみ活性化されるので、検出スペクトルを拡大するために数種類の基質を選択するのが本発明に有利である。発明者らはより特定的に、上記化合物から選択された4種類のメチルウンベリフェリル誘導体の組合せ、特に、4-MUホスフェート、4-MUアルファ-D-グルコピラノシドまたは、アルファ-D-グルコシド、4-MUベータ-D-グルコピラノシドまたは、ベータ-D-グルコシド、および、4-MUベータ-D-ガラピラノクトシドまたはベータ-D-ガラクトシドを含む組合せが有利であると判断した。この組合せによって、特に大腸菌E.coliおよび緑膿菌P.aeruginosaのようなグラム陰性菌、枯草菌B.subtilisおよび黄色ブドウ球菌S.aureusのようなグラム陽性菌ならびに真菌類カンジダアルビカンスC.albicansおよび黒コウジカビA.brasiliensisなどの普通に検出対象となるたいていの微生物を検出することが可能である。しかしながら本発明はこれらの種だけに限定されるものではなく、微生物という用語は自律増殖できるすべての生存細胞を意味すると理解されたい。細胞という用語は膜によって囲まれた細胞質を意味しており遺伝子を含むものとする。Aldol商標BiosynthAG,Rietlisstrasse4,9422Staad,Switzerlandの名称で販売されている化合物、特に化合物Aldol4701-[2-2,4-ジメトキシベンゾイルフェニル]-1H-インドール-3-イルおよびAldol4551-2-ベンゾイルフェニル-6-クロロ-1H-インドール-3-イルならびにそれらの誘導体、特に上記化合物のアセテート、ホスフェート、ベータ-ガラクトシドおよびベータ-グルコシド誘導体は、前述の基質と同様に本発明に好ましい基質である。これらの化合物は欧州特許出願No.09159639に記載されている。これらの化合物は微生物に対していかなる毒性も生じることなく好気性条件中でも嫌気性条件中とまったく同様に活性化できるという利点を有している。本発明において上記増殖培地のpHを標示する蛍光を有するフルオロフォアという表現は、培地中の分子の濃度が実質的に一定に維持されているとき、蛍光発光の強度が増殖培地中のpHの変化に応じて変化するか、または、一定の励起波長に対するその発光波長が同じくpHの変化に応じて変化する分子を意味する。好ましくはこの蛍光変化が、3から10、好ましくは5から9、より好ましくは6から8のpH範囲で観察される。これらの蛍光変化をpHの関数として説明する分子メカニズムはたとえばいくつかのシアニン誘導体について記載されている[BriggsM.S.ら2000Chem.Commun.2323-2324]。蛍光変化という用語は、1単位のpH変化に対して少なくとも10、好ましくは少なくとも20、より好ましくは少なくとも30のRFU相対的蛍光単位の変化を意味するものとする。本発明に好ましい上記増殖培地のpHを標示する蛍光を有するフルオロフォアは、8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸もしくはその塩、シアニン化合物もしくはその誘導体特にペンタメチンシアニン、または、フルオレセインを含む化合物もしくはその誘導体、塩もしくはエステルから選択される。フルオレセインを含む化合物のうちではカルボキシフルオレセイン、特に56-カルボキシフルオレセインCAS72088-94-9が好ましい。本発明の好ましいフルオロフォアはまた8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩HPTSCAS27928-00-3である。CFと4-MUとの組合せが本発明に好ましい。具体的には、これらの化合物の蛍光発光スペクトルの片方ずつに関して行った蛍光測定値を組合せることによって微生物の早期特異的検出が可能になった。4-MU化合物は一般にpH指示物質としては信頼性が低いので、本発明では4-MU化合物がpHを標示する蛍光分子として使用されないのが好ましい。この出願に後出する実験的実施例から明らかになるように、蛍光化合物の一方または他方にそれぞれ関連した蛍光の経時変化は微生物のタイプ毎に異なっており、これが、微生物検出方法の早期段階で検出できる各微生物の固有特徴を形成する。1種以上のAldol化合物とカルボキシフルオレセインとの組合せ、または、HPTSと1種以上のメチルウンベリフェレル誘導体との組合せも微生物の固有特徴を検出および探知するのに適していることが判明した。得られたプロフィルは少なくとも部分的には様々な微生物種間の物質代謝の違いによって説明できる培地のpHに対する影響、増殖速度、蛍光性基質活性化の強度、など。その基本的目的の1つにおいて本発明は、増殖培地中に存在する微生物のタイプを同定するために、同一増殖培地中の蛍光原基質およびpH-感受性フルオロフォアのそれぞれの活性化に起因する蛍光の測定値を組合せることに関する。組合せるという用語は、蛍光原基質の活性化に起因する蛍光の測定値と増殖培地のpH変化に起因する別の蛍光測定値との関係を決定することを意味する。好ましくはこの関係は、計算によってまたはグラフ表示の形態で時変数tに従って提示される。本発明の好ましい特徴によれば、これらのデータを組合せることによってpH、時間および微生物の酵素活性などの変数を統合した微生物の様々なタイプに特有の増殖培地の変化の説明が得られる。したがって、本発明による微生物の検出方法は、上記に記載の段階iiにおいて、蛍光の変化が時間の関数として得られるように蛍光を定期的間隔で測定する作業を含む。好ましくは30秒毎、より好ましくは1分毎、もっと好ましくは2分毎に蛍光を測定する。また、段階iiiにおいては、蛍光測定値がデータベースに参照された標準測定値に比較され、微生物の様々なタイプをよりはっきりと識別できる。その目的の1つにおいて本発明は、本発明の方法をより具体的に実行できる増殖培地に関する。増殖培地は液体または固体の栄養支持体から構成され、その中に、上記にそれぞれ定義したような少なくとも1つの蛍光原基質またはこれらの基質の組合せと、上記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォアとが均等に溶解している。栄養支持体はもっとも普通には、既述のように蛍光剤を含有しない慣用の培地である。さらに、栄養支持体の固有蛍光は、増殖培地のpH変化にも増殖培地への微生物の導入にも感受性でないのが好ましい。言い換えると、増殖培地自体がフルオロフォアによって発光された蛍光と干渉し得る蛍光変化を生じないことを優先的に配慮しなければならない。微生物の培養条件は、慣用の培地に関して文献特に薬局方に記載されている条件と実質的に同じである。最初の計画は液体培地中の培養であるが、本発明を寒天増殖培地で実行することに全く問題はなく、当業者に公知の適当な蛍光測定デバイスたとえば走査型サイトメーターを使用できる。本発明の増殖培地は好ましくは、1種以上の蛍光原基質および1種以上のフルオロフォアとして上記に詳述した化合物またはその組合せを含む。本発明の好ましい特徴によれば、微生物の検出方法が、i1種以上の微生物を培養開始前に予め膜で濾過する段階を含む。本発明の目的はまた微生物検出用キットであり、キットは、本発明の増殖培地を含むか、または、-慣用の微生物増殖培地と、-上記微生物増殖培地に可溶性の少なくとも1つの蛍光原基質または蛍光原基質の組合せと、-上記微生物増殖培地に可溶性で上記増殖培地のpHを標示する蛍光を有する少なくとも1つのフルオロフォアと、を混合目的の個別包装の形態で含むことを特徴とする。保管または利便性の要件に合うように増殖培地が脱水形態で包装されてもよい。このような検出キットはさらに、無菌性試験に先立って濾過段階を実行するための膜を含んでもよい。このようなフィルター膜は単層でもよくまたは多層でもよい。一般的に膜は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデンPVDF、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロースおよびニトロセルロースから選択される1種以上の材料から構成されている。この種の膜の一例が出願人によって商品銘柄HAWGMilliflex,Milliporeで販売されている。本発明のキットはさらに、無菌性試験の実行に使用する増殖培地を収容するための好ましくは滅菌されたフィルターユニット、ボトルまたはバッグを含み得る。以下の実施例は本発明の記載を補足することを意図しており、本発明に何らかの制限を加えるものではない。1/増殖培地の調製100mLの液体TSBBiomerieux培地を準備し製造業者の指示に従って滅菌した。次に、以下に定義の様々な組合せに従ってpH-感受性フルオロフォアおよび蛍光原基質の溶液を無菌条件でTSB培地に添加した。pH-感受性フルオロフォアとしてHTPS:-10mMの8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸の30μLの無菌予製液、または、CF:-100μMの5,6-カルボキシフルオレセインの20μLの無菌予製液。蛍光原基質としてAldol:各誘導体の予製液濃度を25mg/mLにして調製したAldol誘導体Aldol470ホスフェート、Aldol470アセテート、Aldol455ベータ-D-グルコピラノシド、Aldol455ベータ-D-ガラクトピラノシドの200μLの無菌混合液、または、4-MU:各誘導体の予製液濃度を50mg/mLにして調製した4-メチルウンベリフェリル誘導体4-MUホスフェート、4-MUベータ-D-グルコピラノシド、4-MUアルファ-D-グルコピラノシド、4-MUベータ-D-ガラクトピラノシド4MUの200μLの無菌混合液。フルオロフォア溶液および蛍光原基質を、開孔0.22μmのフィルター膜を有するStericupフィルターユニットを使用して予め滅菌し増殖培地に組込んで被験増殖培地を形成した。使用した物質の商品銘柄カタログ参照:TSB:Biomerieux41146HPTS:Fluka563605,6-カルボキシフルオレセイン:Sigma21877Aldol470ホスフェート:BiosynthA-4678Aldol470アセテート:BiosynthA-4680Aldol455ベータ-D-グルコピラノシド:BiosynthA-4689Aldol455ベータ-D-ガラクトピラノシド:BiosynthA-46844-MUホスフェート:Glycosynth440934-MUベータ-D-グルコピラノシド:Glycosynth440594-MUアルファ-D-グルコピラノシド:Glycosynth440514-MUベータ-D-ガラクトピラノシド:Glycosynth440452/微生物の懸濁液の調製以下の微生物について試験を実施した。各微生物の菌株を103から104細胞/mLの範囲の初期濃度黒コウジカビA.brasiliensisの場合は102細胞/mLに達するまで希釈した。3/96ウェルプレート上の培養物の調製参照番号655090を有している96ウェルのGreinerBio-OneμClearPlateをアッセイに使用した。各菌株接種物を各増殖培地シリーズの第一列に導入し、次に1/10oまで系列希釈した。図3は実施した種々の培養アッセイの総括である。このアッセイは以下に示す増殖培地を用いて行われる。4MU-HPTS組合せとして、-TSB-メチルウンベリフェリル誘導体4-MUホスフェート、4-MUベータ-グルコピラノシド、4-MUアルファ-グルコピラノシド、4-MUベータ-ガラクトピラノシドの混合物、および-8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸。4MU-CF組合せとして、-TSB-メチルウンベリフェリル誘導体4-MUホスフェート、4-MUベータ-グルコピラノシド、4-MUアルファ-グルコピラノシド、4-MUベータ-ガラクトピラノシドの混合物、および-5,6-カルボキシフルオレセインCF。Aldol-HPTS組合せとして、-TSB-Aldol誘導体Aldol470ホスフェート、Aldol470アセテート、Aldol455ベータ-グルコピラノシド、Aldol455ベータ-ガラクトピラノシドの混合物、および-8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸HPTS。Aldol-CF組合せとして、-TSB-Aldol誘導体Aldol470ホスフェート、Aldol470アセテート、Aldol455ベータ-グルコピラノシド、Aldol455ベータ-ガラクトピラノシドの混合物、および、-5,6-カルボキシフルオレセインCF。上記の培地のそれぞれについて異なる3つの希釈度で各微生物を試験する。商標Geminiの96-ウェルプレートリーダーは30分毎に1回のデータ収集を72時間にわたって実行するように、すなわち145の測定点を収集するようにプログラムした。蛍光値のデータ収集はウェルの底部から光学リーダーによって行った。各ウェルを10回の測定の対象とし、平均値を記録する。各ウェルに対して4種類の測定を実行する:1-Lm1:励起:355nm発光:555nmカットオフ:530nm2-Lm2:励起:403nm発光:451nmカットオフ:435nm3-Lm3:励起:360nm発光:455nmカットオフ:435nm4-Lm4:励起:485nm発光:525nmカットオフ:595nm。Lm1チャンネルのデータ収集からAldolの蛍光を測定できる。Lm2チャンネルのデータ収集からHPTSの蛍光を測定できる。Lm3チャンネルのデータ収集から4-MUの蛍光を測定できる。Lm4チャンネルのデータ収集からCFの蛍光を測定できる。データ収集キネティクスはsoftmaxProソフトウェアを使用して作成した。4/得られた結果の分析蛍光測定の結果を図4から7にグラフの形態で示す。図4Aから4Gは4-MUHPTSの組合せに関する。図5Aから5Gは4-MUCFの組合せに関する。図6Aから6GはAldolHPTSの組合せに関する。図7Aから7GはAldolCFの組合せに関する。Gで示すグラフは非汚染の陰性対照に対応する。すべての場合に、pH低下HPTSまたはCFを測定できるチャンネルおよび代謝活性4-MUまたはAldolを測定できるチャンネルで微生物に関する特性プロフィルが得られる。特に、緑膿菌P.aeruginosaの場合には極めて異型のプロフィルが観察され、pHが低下しているのにHPTSの使用に関連したシグナルが増加している図4Bおよび6B。黄色ブドウ球菌S.aureusの場合も同様に、4-MUの使用に関連したシグナルがピークを形成し、その後、実質的に直線状に増加している図4Dおよび5D。カルボキシフルオレセインCFの使用に関しては菌株によって異なるpH低下のプロフィルが観察される図5および7。"