"表面にキメラポリペプチドの複数のコピーを提示する組換え型バクテリオファージであって、前記ポリペプチドが少なくとも以下を含む組み換え型バクテリオファージ:a繊維状バクテリオファージのコートタンパク質または前記バクテリオファージの表面発現されることが可能なその機能性断片およびb配列番号2から成る細菌性接着タンパク質FimHの免疫原性ドメイン。前記繊維状バクテリオファージが、M13、fdおよびf1の群に属する、請求項1に記載の組換え型バクテリオファージ。前記コートタンパク質が、コートタンパク質pVIIIである、請求項1または2に記載の組換え型バクテリオファージ。細菌性接着タンパク質FimH質の免疫原性ドメインが、レクチン結合ドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。前記ドメインが、配列番号2の24~179位のアミノ酸断片である、請求項4に記載のバクテリオファージ。前記ドメインが、配列番号2の66~180位のアミノ酸断片である、請求項4に記載のバクテリオファージ。前記キメラポリペプチドが、そのコートタンパク質またはその断片と細菌性接着タンパク質FimH質の免疫原性ドメインとの間にリンカーを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。前記キメラポリペプチドが、アフィニティータグを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。核酸配列が配列番号3から必須に成る、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換え型バクテリオファージ。医薬として使用されるための、請求項1~9のいずれか1項に記載の組換え型バクテリオファージ。尿路感染症UTIに対する免疫原として使用されるための、請求項10に記載の組換え型バクテリオファージ。生理学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせた、請求項1~9のいずれか1項に記載の組換え型バクテリオファージを含む、医薬組成物。体液性および/または細胞性免疫応答を誘発できる、請求項12に記載の医薬組成物。尿路感染症UTIに対するワクチン接種に使用するための、請求項13に記載の医薬組成物。アジュバントをさらに含む、請求項13または14に記載の医薬組成物。前記組換え型バクテリオファージが、ビヒクルと組み合わされる、請求項13から15のいずれか1項に記載の医薬組成物。ヒトまたは動物の尿路感染症UTIの予防および、または治療に使用されるための、請求項12に記載の医薬組成物。従って、本発明の1つの重要な目的は、その表面に複数のキメラポリペプチドのコピーを提示し、前記キメラポリペプチドが少なくとも以下を含む組み換え型バクテリオファージである:a繊維状バクテリオファージのコートタンパク質または前記バクテリオファージの表面発現されることが可能なその機能性断片およびb前記繊維状バクテリオファージが好ましくはM13、fdおよびf1の群に属する、配列番号2から成る細菌接着タンパク質FimHの免疫原性ドメイン。好ましくは、コートタンパク質はコートタンパク質pVIIIである。好ましくは、バリテリア接着タンパク質FimHの免疫原性ドメインは、レクチン結合ドメイン、さらに好ましくは前記ドメインは、配列番号2の24~179位のアミノ酸断片または配列番号2の66~180位のアミノ酸断片である。前記キメラポリペプチドは、好ましくは、コートタンパク質またはその断片と細菌接着タンパク質FimHの免疫原性ドメイン間のリンカーを含む。前記キメラポリペプチドは、好ましくはアフィニティータグを含む。好ましくは、本発明の前記組み換え型バクテリオファージは、配列番号3に必須に存在する核酸配列を有する。従って、本発明の目的は、新規に操作された本発明のバクテリオファージであり、これは外来ポリペプチドを含み:前記ポリペプチドは抗原性、例えば、所望の免疫学的な応答を高めるポリペプチドであり、特に、尿路病原性大腸菌Uropathogenice.coli:UPECとしてのUTI病原体に対して抗原性であるべきである。その長さは、応答を高めるのに充分であるが、バクテリオファージの特性を望ましくないように改変するには不十分であるか、または、その組み込みを妨げるには不十分であるべきである。本発明のバクテリオファージは、免疫原性であり、ワクチンとして、および、通常、治療/診断用製品としての使用に適するのが好ましい。従って、本発明の製品は、いずれかの生理学的に許容可能な適切な希釈剤または担体を用いて処方され、ワクチン組成物を調製し得る。本発明の複合型ファージは、好ましくは各ウイルス粒子上に提示される外因性のポリペプチドのコピーの数を広い範囲内で制御可能にし、非常に高い感受性を付与することができる。周知のように、繊維状バクテリオファージの主要コートタンパク質、好ましくは、M13、fdおよびf1は、遺伝子VIIIによりコードされている。前記タンパク質は、成熟タンパク質のN末端に結合した23アミノ酸のリーダーペプチドを含むプロコートとして合成される。合成後、プロコートタンパク質は、大腸菌の内膜に迅速に挿入され、そこでプロセッシングされて、膜貫通する50アミノ酸の成熟コートタンパク質となる。このタンパク質は、3つのドメイン、すなわち、疎水性の膜貫通のドメイン、細胞の細胞質側に面する正に帯電したC末端ドメイン、および周辺質に伸びる負に帯電したN末端ドメイン、を有する。ウイルス粒子のアッセンブリーの間、コートタンパク質サブユニットは、細胞膜から突き出て、ウイルスDNAの周りでらせん状配列に整列する。ウイルス粒子中では、タンパク質サブユニットのC末端領域は、DNAに向かって内側を向き、それにより、正に帯電した残基は、糖リン酸塩骨格の負の電荷を中和し得る。対称的に、N末端ドメインは、粒子の外表面上にあり、そこで、環境に曝される。核磁気共鳴調査により、この領域は、膜結合型のタンパク質中でも、ファージ粒子の外側に存在する場合でも、柔軟性があることが明らかになった。本発明では、外因性のポリペプチドが主要ファージコートタンパク質のアミノ末端に融合され、ウイルス粒子中に首尾よく組み込まれる伸長コートタンパク質を生成し、顕著な免疫応答を誘発する。この結合は、直接的または一つもしくは複数の適するリンカーを介する。従って、本発明の好ましい実施形態では、選択されたFimHドメインは、SGGGG3S配列番号15フレキシブルリンカーを使用して繊維状バクテリオファージM13pVIIIの主要コートタンパク質のN末端ドメイン中に挿入され、それにより、アッセンブリーされたファージ粒子の外側を修飾decorateする。このファージの調製は、遺伝子VIII中の制限酵素認識部位を使用する組換え型ファージを操作し、所望のポリペプチドをコードする外来DNA断片を直接ファージゲノム中に挿入可能にすることを可能にすることにより、完全にDNAレベルで処理され得る。しかし、制御された手順でこの結果を達成するためには、複合コートタンパク質の合成とファージ粒子のアッセンブリーが別々であり得ることが好ましい。このことは、新規コートタンパク質コンストラクトのクローニングおよび発現、ならびにファージアッセンブリーの膜への挿入およびパッケージング状態が、独立したステップとして実行されることを可能にする。M13コートタンパク質遺伝子の独立した発現を可能とするために、遺伝子VIIIは、制御可能な発現ベクターのファージミド中にサブクローニングされ得る。しかし、野性型遺伝子VIIIは、エピトープをコードするために使用されるオリゴヌクレオチドカセットの挿入に適する制限酵素部位を含んでいない。従って、前記遺伝子のサブクローニングの前に、部位特異的変異誘発によって適切な部位を導入し得る。本発明の複合型バクテリオファージの調製では、中間生成物は、改変をコードするプラスミドである。このようなプラスミドの損失を防ぐために、操作コートタンパク質が、パッケージングシグナルと共に、ファージ、ファージミドまたは他のレプリコン中に移入されることが好ましい。その後、組換え型遺伝子は、パッケージングされ、さらなる複製のために選択することができる。好ましくは、本発明の操作ファージは、繊維状バクテリオファージであり、さらに好ましくは、M13または関連ファージミドである。M13は、約2700コピーの主要コートタンパク質pVIII中に封入され、5コピーの4つの異なる副次的なコートタンパク質pIX、pVII、pVI、pIIIで端をキャッピングされた、6407ヌクレオチド長の環状1本鎖DNAssDNAからなる繊維状バクテリオファージであるGenBankV00604。副次的なコートタンパク質pIIIは、宿主大腸菌のF線毛の先端にある受容体に付着する。繊維状ファージの感染は、致死ではないが、感染により大腸菌中の濁りプラークを引き起こされる。それは非溶解性ウイルスである。しかし、細胞増殖速度の低下が、感染細胞で認められている。M13プラスミドは、多くの組換えDNAプロセスで使用されており、ウイルスもまた、ナノ構造およびナノテクノロジーでの使用のための研究が行われている。ファージコートは、主に、pVIIIまたはP8と呼ばれる50アミノ酸タンパク質から構築されており、これは、ファージゲノム中の遺伝子VIIIまたはg8によりコードされている。野性型M13粒子に対しては、約900nm長のコート外皮を作るのに約2700コピーのpVIIIを要する。コート径は、柔軟性があるが、pVIIIのコピー数を調節して、パッケージングする単鎖ゲノムのサイズに合わせて収容する。例えば、ファージゲノムが変異してDNA塩基の数を減らした場合6.4kbから221bpへ、pVIIIコピーの数を100より少ない数に減らしてpVIIIコートを縮め、それにより、短くなったゲノムに適合させる。ファージは、天然DNA含量の約2倍に制限されているようである。しかし、ファージタンパク質pIIIの欠失が、宿主大腸菌から完全に抜け出すのを防ぎ、ファージゲノムのいくつかのコピーを有する通常の10~20倍の長さのファージが大腸菌宿主から排出されるのが認められる。本発明のさらなる目的は、医薬として使用される、特に、尿路感染に対する免疫原として使用される、本発明の組換え型バクテリオファージである。本発明の他の目的は、生理学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせた、本発明の組換え型バクテリオファージを含む医薬組成物であり、前記医薬組成物は、好ましくは体液性およびまたは細胞性免疫応答を誘発する。本発明のさらなる目的は、尿路感染に対するワクチン接種のために使用される前記医薬組成物である。前記医薬組成物は、さらなるアジュバントを含み得る。前記組換え型バクテリオファージは、好ましくは、前記医薬組成物中のビヒクルと組み合わせる。本発明の他の目的は、ヒトまたは動物において、尿路感染症の予防およびまたは治療のために使用される本発明の医薬組成物である。本発明のさらに重要な態様では、発現でき、生物体の抗原提示細胞の表面上に提示できるポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む、前記したバクテリオファージ粒子を含むワクチン製剤を提供し、それにより、前記ポリペプチドに対する生物体の免疫応答が上昇する。本発明のバクテリオファージは、外来のものであると認識されていると考えられ、そのために、通常の方法で宿主の免疫系により処理される。さらには、外部ポリペプチド/タンパク質、すなわち、選択した哺乳類宿主中には通常存在しないポリペプチド/タンパク質、をコードすることが可能な外因性核酸を含むようにバクテリオファージのゲノムを改変することにより、この外部タンパク質に対する免疫応答が誘発される。免疫応答は、体液性すなわち、抗体および/または細胞性免疫応答であり得ることは正しく理解されよう。用語の外因性は、個々の生物体または生物学的実体例えば、バクテリオファージ中に存在し、活性であるが、内在性因子とは対称的に、元来は、その生物体の外部に由来する材料例えば、ポリペプチドまたは核酸に関する。外因性のポリペプチドまたはタンパク質は、ワクチンが提示される宿主中で免疫応答を誘発するのに充分なレベルで発現する。本発明は、UTI用のワクチンの調製に適用可能であることは正しく理解されよう。バクテリオファージの表面上の前記外因性のポリペプチドは、APC特異的な核酸の直接取込みを可能にする。理論に拘泥することなく、バクテリオファージ粒子は、外来抗原として認識されていることが想定される。通常、用語ポリペプチドは、本明細書では抗原活性を示しているアミノ酸の鎖または配列に関し、その生成物の具体的な長さそれ自体に関しない。必要に応じ、ポリペプチドをインビボでおよび/またはインビトロで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化および/または翻訳後切断により改変でき、従って、その結果、とりわけペプチド、オリゴペプチド、タンパク質および融合タンパク質が包含される。当然、当業者なら、改変ポリペプチドは、生理的機能を保持している、すなわち、免疫応答を誘発できるはずであることを正しく理解するであろう。本発明のバクテリオファージは、好ましくは、適切な転写/翻訳制御因子、例えば、プロモーター、ターミネーター等を含む。便宜的には、プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。しかし、当業者に既知の制御可能プロモーターもまた、使用可能である。例えば、構成的プロモーターおよび制御可能なプロモーターの制御下で、外因性の核酸を含むコンストラクトが設計され得る。この方法では、最初に構成的プロモーターにより、第2の時点で制御可能プロモーター由来の発現により、外因性の核酸の発現をさせることが可能となり得る。この方法は、結果としてより高い免疫原性のファージ粒子の合成をもたらし得る。本発明の好ましい実施形態では、前記ファージは、ファージ粒子の表面上に抗原性のタンパク質を発現するように改変できる。例えば、無傷のバクテリオファージM13粒子をベクタービヒクルとして使用可能である。M13へのインサートの大きさは、比較的小さいが、ファージディスプレイ技術Hawkins、REら、1992年、J.Mol.Biol.226:889の使用は、ファージ粒子が、そのコートタンパク質に融合した外部抗原の一部を保持することを意味する。従って、コンストラクトを、外因性の遺伝子が原核生物のプロモーター例えば、LacZプロモーターの制御下にある状態で作ることができ、大腸菌宿主中で増殖する場合は、原核生物プロモーターは、ワクチン抗原の発現を指示し、融合タンパク質としてM13コート中へのその組み込みを可能とし、これにより、ワクチン接種後の強力な1次応答を誘発することになる。好ましくは、本発明による外因性の核酸は、FimHのマンノース結合レクチンドメインをコードするDNA、さらに好ましくは、成熟FimHタンパク質の44~158位のアミノ酸をコードするドメイン本明細書では、ΔFimHとも命名されるを含むか、もしくは、これから構成される。さらに好ましくは、外因性の核酸は、アフィニティータグをコードする配列を含み得る。このようなアフィニティータグの例は、FLAGタグ、またはFLAGオクタペプチド、ポリヒスチジンタグHisタグ、HAタグもしくはmycタグである。FLAGタグは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して組換え型バクテリオファージを精製するために、または融合タンパク質発現の品質管理のために、組換えDNA技術を使用してタンパク質に付加できるポリペプチドタンパク質タグである。好ましいFLAGタグのペプチド配列は以下の通り、N-DYKDDDDK-C配列番号141012Daである。これは、他のアフィニティータグと連結して使用できる。また、タンパク質のC末端またはN末端に融合できる。さらに、融合タンパク質の構築は、通常、ペプチドリンカーによる2つのタンパク質またはタンパク質のドメインの連結を伴う。リンカー配列の選択は、機能性融合タンパク質の構築には、特に重要である。リンカーの柔軟性および親水性は、通常、ドメイン我々のケースでは、外因性のポリペプチドおよびタンパク質コートpVIIIの機能を妨害しないために重要である。バクテリオファージ上に提示された組換え型抗体を操作するために文献中で首尾よく使用されている好ましいリンカーは、SGGG3S配列番号15である。従って、本発明の具体的な目的は、例えば、図9に示すような、本発明に従って操作されたバクテリオファージの核酸配列、および実質的に同じ全てのヌクレオチド配列である。実質的に同じヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮退のために、所与のアミノ酸配列をコードする全ての他の核酸配列を含む。前記バクテリオファージは、任意の適切な経路、例えば、注射により投与され得て、単位剤形、例えば、アンプル、または複数回投与容器中に調製され得る。前記バクテリオファージは、油性のまたは好ましくは水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態で存在し得る。あるいは、前記バクテリオファージは、適切なビヒクル例えば無菌の発熱性物質を含まない水による、送達時の再構成のために凍結乾燥した形態であり得る。この方法では、ファージ粒子を凍結乾燥する際に、安定化剤、例えば、タンパク質、糖等を添加し得る。液体ならびに再構成される凍結乾燥した形の両方が、注射溶液のpHを適切に調節するのに必要な量の剤、好ましくは緩衝液を含む。任意の非経口の使用、特に製剤を静脈内に投与する場合は、合計溶質濃度を制御して、等張性、低張性または弱高張性の調製物を作らなければならない。糖などの非イオン性材料は、浸透圧を調整するのに好ましく、ショ糖は、特に好ましい。これらの形態のいずれかは、適切な製剤化薬剤、例えば、デンプンまたは糖、グリセリンまたは生理食塩水をさらに含む。単位投与量当たりの組成物は、液体または固体であり得て、バクテリオファージ材料の0.1~99を含み得る。好ましい形態では、ワクチンはアジュバントを含むこともできる。アジュバントは、通常、非特異的な方法で宿主の免疫応答を促進させる物質を含む。いくつかのアジュバントが当技術分野で既知である。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、リポソーム、および例えば、国際公開第WO90/11092号に記載のニオソーム、ミネラルおよび非ミネラルオイルベース油中水型エマルジョンアジュバント、サイトカイン、例えば、CpGジヌクレオチドを含むプラスミドDNA中の短い免疫賦活性ポリヌクレオチド配列、例えば、SatoYら.1996年、Science第273号、第352~354頁;KriegA.M.1996年TrendsinMicrobiol.第4号、第73~77頁、に記載されたものが含まれる。バクテリオファージは、いわゆるビヒクルとも組み合わせ得る。ビヒクルは、これに共有結合しないでバクテリオファージが接着できる化合物、または基質である。典型的ビヒクル化合物には、金粒子、シリカ粒子、例えば、ガラス等が含まれる。従って、本発明のバクテリオファージは、遺伝子銃法、例えば当業界で記載されている、被覆金粒子を使用する高速打ち込み法high-velocitybombardmentmethod、を使用して生物体中に導入され得るWilliamsR.S.ら1991年Proc.Natl.Acad.Sci.USA第88号、第2726~2730頁;FynanE.F.ら1993年Proc.Natl.Acad.Sci.USA第90号第11478-11482頁。さらに、ワクチンは、1つまたは複数の適する表面活性化合物または乳化剤、例えば、SpanまたはTweenを含み得る。本発明のワクチンの投与モードは、免疫防御量の本発明のウイルスを対象に送達する、任意の適する経路によるものであり得る。しかし、ワクチンは、筋肉内または深部皮下経路経由で非経口的に投与されるのが好ましい。他の投与モード、例えば、粘膜経路例えば、直腸、経口、鼻または腟投与経由、または他の非経口の経路経由、すなわち、皮内、鼻腔内、もしくは静脈内も、目的に応じ採用し得る。経鼻投与用の製剤も開発可能で、例えば、アジュバントとしてキトサンを含み得るNat.Medicine54第387-92頁、1999年。しかし、任意の特定のレシピエント生物体に対する具体的な用量レベルは、年齢、総体的な健康、および性別;投与の時間;投与経路;投与される他の薬剤との相乗効果;ならびに求められる防御度合い、等の様々な因子に依存することは理解されよう。もちろん、必要に応じ適切な間隔で投与を繰り返すことができる。通常、毎日投与量のワクチンには、体重1kgあたり0.01~100mgが含まれる。従って、さらなる態様では、本発明は、ヒトおよび/または動物に有効量の本明細書に記載のワクチン製剤を投与することを含む、予防的におよび/または治療的にヒトまたは動物を免役する方法を提供する。有効量は、ヒトおよび/または動物で免疫応答を誘発することができる量であることは理解されよう。本明細書で引用された全ての文献は、引用文献で提示された全てのデータ、表、図、およびテキストを含むその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書で引用された文献の中の引用文献の全含有内容もまた、全体が参照によって組み込まれる。既知の方法のステップ、従来の方法のステップ、既知の方法または従来の方法に対する参照は、関連技術において、本発明のいずれかの態様、説明または実施形態が開示、教示、または示唆されていることを何ら承認するものではない。本出願で開示されている方法および生成物の特徴が理解されると、先行技術、非制限的な以下の図および本発明の基礎的な詳細といくつかの適用を記述した実施例を考察することにより、追加のステップの必要性と性質を容易に導き出すことが可能である。本発明は、以降で、実施例と以下の図を参照しながらさらに詳細に記載する。材料および方法<細菌株>UPECPT27の臨床分離菌を選択し、膀胱炎マウスモデル動物に感染させた。この株は、元々、再発性UTI患者の尿から、LaboratoryofClinicAnalysisDiFiPomeziaRM、Italyで得た。マンノース感受性赤血球凝集反応アッセイおよびマンノースによる赤血球凝集阻害を使用して、PT27株の1型線毛発現を試験した。実験大腸菌株DH5αF’supE44ΔlacU169Φ80lacZΔM15hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1F’[traD36proABlacIqlacZΔM15]をファージ増殖に使用した。<クローニングおよび発現FimHレクチンドメイン>FimHレクチンドメインをコードするDNA断片を、それぞれ、NcoIおよびNotI部位下線を含むプライマーSM124FOR5’-CTGCTGCTGCCATGGTTTGTAAAACCGCCAATGGTACCGCT-3’配列番号9およびSM125REV5’-GTCGTCTGCGGCCGCAGTGGGCACCACCACATCATTATTG-3’配列番号10で、DH5αF’ゲノムから増幅した。結果として得られたPCR生成物をゲル精製し、NcoIおよびNotIで消化し、pKM16プラスミドPavonietal.、2007に連結し、次いで、NcoIおよびNotIでも消化した。結果として得られたプラスミドpSTM21をFimH発現に使用した。<抗FimHポリクローナルウサギ血清の産生>大腸菌DH5αF’中でFimHドメインを発現させ、以下のプロトコルに従って精製した。pSTM21で形質転換した細菌細胞を100μg/mLのApを含有するLB中で一晩ON振盪培養した。翌朝、1mLのON培養液を100mLの新鮮培地中に植菌した。培養液をOD=0.8まで増殖させ、0.1mMのIPTGを添加してFimH発現を誘導した。37°Cで一晩インキュベーション後、細胞を回収し、1mg/mLのリゾチームを含有する10mLのPBS中に再懸濁して、プロテアーゼ阻害剤Rocheの存在下、氷上で30分間インキュベートした。1.5N-ラウリルサルコシンを添加してタンパク質の溶解度を増大させた後、細胞懸濁液を超音波処理によりホモジナイズした。細胞組織片を遠心沈殿し、His-tailを伴って発現したFimHタンパク質を、His-SelectHFNickelAffinityGelSigmaを使用して、メーカーの使用説明書従って精製した。精製タンパク質を12ゲルのSDS-PAGEで分析した後、ニトロセルロース膜に転写し、抗FLAG二次抗体で免疫染色した。精製FimHタンパク質をウサギのワクチン接種に使用し、ポリクローナルウサギ抗FimH血清を得た。<繊維状ファージ上のFimHおよびΔFimHドメインの提示>FimHレクチンドメイン成熟タンパク質の3~158アミノ酸をコードするDNA断片を、それぞれ、EcoRIおよびBamHI制限酵素部位下線を含むプライマーSM126FOR5’-CTGCTGCTGGAATTCTGTAAAACCGCCAATGGTACCGCT-3’配列番号11およびSM127REV5’-CTGCTGCTGGATCCGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGATTTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTCCAGTGGGCACCACCACATCATTATTG-3’配列番号12で、DH5αF’ゲノムから増幅した。リバースプライマーSM127は、FimH配列に提示される組換え型タンパク質のモニタリングを促進するFLAGペプチドおよび、ファージ表面上でのアッセンブリーを向上させるSGGG3Sフレキシブルリンカーを付加した。結果として得られたPCR生成物をゲル精製し、EcoRIおよびBamHIで消化し、プラスミドpc89Feliciら、1991年に連結して、次にEcoRIおよびBamHIでも消化した。結果として得られたプラスミドpSTM23を使ってDH5αF’エレクトロコンピテント細胞を形質転換した。より短いドメインΔFimH成熟タンパク質の44~158位のアミノ酸をコードするDNA断片を、EcoRI部位を含むプライマーSM150FOR5’-CTGCTGCTGGAATTCCATAACGATTATCCGGAAACCATTAC-3’およびプライマーSM127REVで、PCRで増幅した。結果として得られた、ΔFimHドメインをコードするPCR断片、FLAGペプチド、フレキシブルリンカーSGGG3S配列番号15を上述のようにプラスミドpc89中にクローン化し、新規ファージミドpSTM27を得た。pSTM27を使用してDH5αF’エレクトロコンピテント細胞を形質転換した。<ファージELISA>組換え型ファージで、ファージELISAを行い、ファージ表面上のFimHドメインまたはFLAGペプチドの存在を確認した。ファージ上清で以下のようにELISAを行った。マルチウェルプレートImmunoplateMaxisorb、Nunc、Roskilde、Denmarkを、50mMNaHCO3pH9.6中濃度1μg/mLの200μLのpIII57D1Denteら、1994年に対するモノクローナル抗体で、4°Cで一晩コートした。コーティング溶液を廃棄後、前記プレートをブロッキング緩衝液5脱脂粉乳のPBS溶液、0.05Tween-20でブロッキングした。ブロッキング緩衝液で希釈したファージ上清を各ウェルに添加し、37°Cで1時間結合させた。ブロッキング緩衝液で1:50に希釈し、5x1010PFU/mLファージf1を含むウサギ抗FimH血清および100μL/mLのHB101細菌抽出物の混合物を37°Cで30分間、ゆっくり振盪しながらプレインキュベートした。前記ファージ溶液を廃棄し、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、200μLの血清混合物を各ウェルに添加し、37°Cで60分間インキュベートした。前記プレートを洗浄し、1:5000希釈の抗ウサギHRPコンジュゲート二次抗体A1949、Sigma、StLouis、MO、USAと共に30分間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、200μLのTMB液体基質システムSigmaでのインキュベーションにより、ペルオキシダーゼ活性を検出した。15分間発色させた後、25μLの2MH2SO4の添加により反応を停止させた。プレートを自動化ELISAリーダーLabsystemsMultiskanBichromatic、Helsinki、Finlandにより読み取り、結果をA=A450nm-A620nmとして表した。<ファージ増殖およびCsCl勾配による精製>pSTM27ファージに感染したDH5αF’の単一コロニーを、40mLの100μg/mLアンピシリンおよび1グルコースを含むLB中で、OD=0.2になるまでインキュベートした。細菌を遠心処理により集め、アンピシリンを含み、グルコースを含まない40mLのLB中に再懸濁した。約6x109PFUプラーク形成単位mLのヘルパーM13K07を細胞懸濁液に添加し、振盪せずに37°Cで10分間、振盪機でさらに2時間インキュベートした。カナマイシンを添加して20μg/mLの最終濃度とし、細胞を32°Cで、一晩インキュベートした。ファージを標準的PEG/NaCl沈殿により精製しSambrookら、1989年、さらに、1966年のMarvinによる記載のようにCsCl勾配で精製した。<赤血球凝集アッセイ>赤血球凝集アッセイは、以前記載されたClarkおよびBavoil、1994年ように実施した。簡単に説明すると、細菌性培養液をLB中37°Cで48時間、振盪せずに増殖させた。細菌細胞を遠心沈殿し、1xPBSで1回洗浄し、次に、PBSに再懸濁し、密度約1x1010細菌/mLを得た細胞を7~10倍に濃縮した。モルモットを、OhmedaIsotec5BOCHealthcareを使用してイソフルランで麻酔した。モルモットの血液を心臓穿刺により集めた。モルモット血液に1/5の20mMEDTA溶液を添加し、前記血液をPBSまたは1D-マンノースのPBS溶液で1:4に希釈することにより、RBC赤血球懸濁液を得た。1滴の細菌懸濁液40μLとRBC懸濁液40μLをELISAプレート中で混合し、1~2分回転後、プレートを室温で10分間インキュベートした。HAの程度をマンノースの存在または非存在下について推定した。<免疫化>マウス免疫化を2006年にPoggioらによってに記載されたように行った。筋肉内免疫化は、1010PFUファージ形成単位の投与量の組換え型バクテリオファージpSTM27単独で、CFA完全フロイントアジュバントと組み合わせて比率1:1で、CpGオリゴヌクレオチド5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’配列番号16と組み合わせて、または、非CpGオリゴヌクレオチドTCCATGAGCTTCCTGACGTT配列番号17と組み合わせて、6週齢BALB/c雌マウスの群を免疫した。以前に記載されたCpGオリゴヌクレオチドMcCluskieおよびDavis、1998年を、10μg/投与量で使用した。1次免疫後のマウスをワクチン接種後28日目に追加免疫した。抗原を各マウスに100μL/投与量の最終容量で送達した。粘膜i.n鼻腔内免疫化は、組換え型バクテリオファージpSTM27で、マウス群を全身麻酔下で免疫した。ファージ懸濁液の鼻への接触により各マウスに滴下した。マウスを1010PFU/投与量のpSTM27で免疫した。1次免疫化後、ワクチン接種後7、14、および28日目に、マウスを追加免疫した。鼻腔内ワクチン接種の場合には、抗原を各外鼻孔に7μLの容量で送達した。<免疫化マウスへのUPEC株PT27による抗原投与>マウスへの大腸菌株の抗原投与を、基本的に、1995年のHopkinsらによる記載のように行った。1型線毛細菌株大腸菌UPECPT27を静的ブイヨン培地staticbroth中で培養し、1型線毛発現を48時間誘導した。FimHタンパク質の発現をインビトロHA試験により確認した。手術の1~2日前に、腹部の穏やかなマッサージの後で全てのマウスから尿を集め、LAルリアブイヨン寒天培地プレート上で無菌試験した。雌6~8週齢マウスHarlanを0.25mL/マウスの生理的溶液中の2.5の2,2,2-トリブロモエタノール、2.5の2-メチル-2-ブタノールで、麻酔した。各マウスの膀胱を穏やかな腹部マッサージで空にした。10μL中に108CFUを含有するように調節した細菌懸濁液を、外径0.61mmシリコンカテーテルSIL-C20、SolomonScientific、SanAntonio、TXに適合するシリンジを使用して、尿道を通って1cmの深さで膀胱に注入した。細菌感染後5日目に、マウスを屠殺し、膀胱を摘出して洗浄し、1mLの無菌PBS中でホモジナイズした。異なる稀釈度のこのホモジネートを培養し、LAプレート上でカウントした。<試料採取>45日目に、伏在静脈穿刺によりマウスから血液を採取した。腟分泌物を以前記載Parrら、1998年のように集めた。マウス膣を各50μlのPBSで3回洗浄した。収集後ただちに洗浄物を遠心分離し、-20°Cで保存した。腟洗浄物をブロッキング緩衝液で1:1に希釈し、試験した。<ELISA>免疫動物の血清中および腟洗浄物中のFimH特異的IgGおよびIgA抗体の検出を下記のように実施した。重炭酸塩緩衝液中の5μg/mLのFimHで各ウェルを一晩コートし、ブロッキングした。マウス血清の1/200から始まる2倍希釈系列、または1/1希釈した腟洗浄物を各ウェルに添加し、37°Cで1時間結合させた。前記プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、FimH特異的マウスIgGおよびIgAを、HRPコンジュゲート抗マウスIgGA9309、Sigma2次抗体および抗マウスIgAA4789、Sigma2次抗体で検出した。プレートを発色させ、上記のように読み取った。結果<組換え型FimHドメインの発現と精製>scFv配置の可溶性抗体の産生に通常使用されるpKM16プラスミドPavoniら、2007年中で、FimHドメイン成熟タンパク質の3~158位のアミノ酸を、クローン化した。このプラスミドは、lacPプロモーターの制御の下でタンパク質発現を指示し、そのアミノ末端でアルカリフォスファターゼのリーダーペプチドに融合し、カルボキシ末端で6His-tailに融合したクローン化タンパク質の発現を可能にする。結果として得られたプラスミドpSTM21を使用し、DH5αF’細胞を形質転換した。我々は、抗FLAG二次抗体で発色したウェスタンブロットで、凍結-解凍精製した周辺質タンパク質および細胞ペレットを分析した。予想外にも、我々は、FimHが細胞周辺腔に分泌されないことを発見し、また、細胞ペレット中に抗FLAG染色バンドを観察したデータ非公表。細胞質からFimHタンパク質を生成するために、材料および方法の通り、不溶性細胞質タンパク質の精製用プロトコルを使用した。タンパク質の純度を、SDS-PAGEおよび抗FLAG二次抗体で発色したウェスタンブロットにより分析した。多くの追加のバンドが、クマシーブリリアントブルーR250による染色ゲル上で認められた。従って、FLAG標識FimHタンパク質の量は、総タンパク質のわずか約10であった。FimHタンパク質をウサギ免疫化のために使用した。抗体力価約1/70000のポリクローナル抗FimH血清を得た。<pVIIIタンパク質融合体としてのFimHドメインの提示>我々は、主要コートタンパク質pVIIIに融合したFimHレクチンドメイン成熟タンパク質の3~158位のアミノ酸をコードするpSTM23プラスミドを構築し、これを使用してDH5αF’細胞を形質転換した。融合FimH-pVIII遺伝子は、組換え型タンパク質のアッセンブリーを促進し、提示効率をモニタリングするために、フレキシブルリンカーおよびFLAGペプチドもコードするように設計された。材料および方法のところで記載のように、形質転換細胞を培養し、pSTM23ファージを増幅して、精製した。モノクローナル抗FLAG抗体で実施したELISA試験は、組換え型タンパク質がファージ表面上にアッセンブリーされ、抗FLAG抗体が到達可能であることを示した図1。抗FimHポリクローナル血清で実施したELISA試験は、野性型ファージM13K07に比べて、FimH提示ファージの特異的認識を示した図2。FimHドメインのアミノ酸配列分析によって、2つのシステイン残基を含み、マンノースの結合に大きく寄与しないTchesnokovaら、2008年成熟タンパク質の2~43位のアミノ酸断片の欠失が、ファージ粒子生成を向上させる可能性があることが想定できる。我々は、FimHの欠失バリアントである、、成熟タンパク質の44~58位のアミノ酸図3を発現させ提示させた。結果として得られたプラスミドpSTM27この配列は図9に示した配列番号3は、pVIIIに融合したΔFimHタンパク質、FLAGペプチドおよびフレキシブルリンカーをコードした。pSTM27は、DH5αF’細胞を形質転換するのに使用された。形質転換細胞を材料および方法に記載のように増殖し、pSTM27ファージを増幅して、精製した。抗FimHポリクローナル血清で実施したELISA試験は、ファージpSTM27のファージ生成の有意な向上を示した。pSTM27ファージ粒子の収率は、pSTM23に比べて、少なくとも5倍高い。我々は、組換え型ファージpSTM23およびpSTM27長いおよび短い形の両方のFimHドメインを提示しているに対する抗FimH血清の認識の特異性を、精製されたFimHタンパク質との競合により、確かめた。FimHタンパク質の反応混合物への添加により、血清によるファージ認識が完全に遮断され、従って、FimHドメイン結合の特異性が確認された図4。<FimH提示ファージの精製>我々は、PEG/NaClによる標準的な沈殿法Sambrookら、1989年、次に、Marvin1966年による記載の手段に従って、CsCl勾配でファージ粒子を精製した。我々は、CsCl勾配による精製の前後で、pSTM27ファージの抗FimH血清に対する反応性を分析し、ファージ粒子上に提示されたFimHドメインの分解または排出の可能性を推定した図5。この試験は、pSTM27ファージがCsCl勾配による精製手段において安定であり、特異的反応性を何ら失うことなく、ファージ表面上のタンパク質の提示を維持することを示した。<マウスの免疫化>表1は、免疫化、試料採取および細菌性抗原投与の計画を示す。表2は、動物のワクチン接種群を示す。ファージpSTM27単独、またはCFAもしくはCpGオリゴと組み合わせた筋肉内免疫化によってマウスに誘導されたFimHに対するIgGの血清力価は、非免疫化マウスで観察された値よりも有意に高く図6、また、粘膜ワクチン接種により誘導されたIgGレベルよりも高かった。しかし、鼻腔内または筋肉内免疫化により誘導されたマウスの腟洗浄物中の特異的IgAのレベルは、同程度であった図7。特異的IgAのレベルは、UPEC臨床株PT27に対するインビボ保護アッセイと相関した図8。粘膜経路により免疫化されたマウスで認められるとおり、細菌性感染に対し、筋肉内経路による免疫化よりもより良好に保護された。膀胱のコロニー形成は、粘膜ワクチン投与の場合、筋肉内免疫化の1.5~2.5倍と比較すると、UPECの尿道注入後10倍まで低減した。結論として、我々は、UPEC抗原投与後の細菌回復の減少における明確な陽性の効果を観察した。その減少は、FimH接着ドメインに対する特異的IgAの粘膜中レベルと相関したが、血液中IgGレベルとは相関しなかった。参考文献"