以下のa~jの性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞:aOct3/4遺伝子およびNanog遺伝子を発現する、bアルカリホスファターゼ活性陽性である、c胚様体形成能を有する、dSSEA胎児ステージ特異的抗原-1およびSSEA-4を発現する、e正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、f未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、gインビトロで多分化能を有する、h三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、i奇形腫形成能を有する、jキメララット作製能を有する。血清濃度が2以下である培養液を用いた培養条件下で以下のA~Dの工程を含むプロセスを行い、工程B~DにおいてrLIFを含有する培養液を用いることを特徴とする製造方法により得られるラット胚性幹細胞:Aラット胚盤胞をrLIFを含有しない培養液を用いて培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、B解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、C継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代培養する工程、Dさらに継代培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程。培養液が血清代替試薬を含有する、請求項2記載のラット胚性幹細胞。工程Aが物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、請求項2または3記載のラット胚性幹細胞。工程Cが物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、請求項2~4いずれか記載のラット胚性幹細胞。血清代替試薬、rLIF、および請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞を成分として含有するラット胚性幹細胞培養キット。さらにフィーダー細胞を成分として含有する、請求項6記載の培養キット。フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、請求項7記載の培養キット。請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導剤で刺激することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の分化誘導方法。分化誘導剤がレチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイドまたは細胞外基質である、請求項9記載の分化誘導方法。請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞。請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞に由来するcDNAライブラリー、ゲノムライブラリーまたは細胞抽出物。以下のi~iiiの工程を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法:i被験物質を請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、iiラット胚性幹細胞の分化の有無や程度を評価する工程、iii上記iiの評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程。以下のI~IIIの工程を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法:I被験物質を請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、II胚性幹細胞の分化誘導条件下で前記Iのラット胚性幹細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、III上記IIの評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程。請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞の、遺伝子改変ラットの作製における使用。遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、請求項15記載の使用。以下のX~Zの工程を含むプロセスを行うことによる遺伝子改変ラットの製造方法:X請求項1~5いずれか記載のラット胚性幹細胞に所望の遺伝子を導入する工程、Y遺伝子導入されたラット胚性幹細胞を含有する移植用卵を調製する工程、Z移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程。請求項17記載の製造方法により製造された遺伝子改変ラット。遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、請求項18記載のラット。本発明の目的は、従来得ることのできなかったラットES細胞を提供することにある。またラットES細胞の樹立方法、製造方法、ラットES細胞の継代培養方法、ラットES細胞を用いた分化誘導関連物質のスクリーニング方法、および遺伝子改変ラットの作製における前記ラットES細胞の使用などを提供することにある。本発明者らは、種々の系統のラットに由来する胚盤胞からラットES細胞の樹立を試みた結果、マウスES細胞とは全く異なる培養条件継代条件を確立することにより、ラットES細胞株を樹立することに成功した。具体的には、実質的に血清を含有しない培養液を用い、内部細胞塊の単離及びES細胞の継代において物理的手法により樹立を試みるなど種々の工夫をこらすことにより、安定的かつES細胞の条件を全て満たしたラットES細胞を樹立供給することに初めて成功した。本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。すなわち本発明は、下記に掲げるものである:1以下の~の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞:Oct34遺伝子およびNanog遺伝子を発現する、アルカリホスファターゼ活性陽性である、胚様体形成能を有する、SSEA1およびSSEA4を発現する、正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、インビトロで多分化能を有する、三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、奇形腫形成能を有する、キメララット作製能を有する、2さらに20血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記1記載のラット胚性幹細胞、3実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下のA~の工程を含むプロセスを行うことにより得られる、ラット胚性幹細胞:ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代培養する工程、さらに継代培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、4培養液が血清代替試薬を含有する、前記3記載の胚性幹細胞、5工程が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記3または4記載の胚性幹細胞、6工程が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記3~5いずれか記載の胚性幹細胞、7工程においてラット由来白血病阻害因子rLIFを含有しない培養液を用いる、前記3~6いずれか記載の胚性幹細胞、8工程~においてrLIFを含有する培養液を用いる、前記3~7いずれか記載の胚性幹細胞、9培養においてフィーダー細胞を用いる、前記3~8いずれか記載の胚性幹細胞、10フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記9記載の胚性幹細胞、11ウイスターキョウト株、ウイスターハノーバーギャラス株WHG及びブラウンノルウエー株BNのいずれかの系統に由来する、前記1~10いずれか記載の胚性幹細胞、12実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下のA~の工程を含むプロセスを行うことを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の製造方法:ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代培養する工程、さらに継代培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、13マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記12記載の製造方法、14培養液が血清代替試薬を含有する、前記12または13記載の製造方法、15工程が物理的に内部細胞塊を解離する工程を含む、前記12~14いずれか記載の製造方法、16工程が物理的に胚性幹細胞を解離する工程を含む、前記12~15いずれか記載の製造方法、17工程においてrLIFを含有しない培養液を用いる、前記12~16いずれか記載の製造方法、18工程~においてrLIFを含有する培養液を用いる、前記12~17いずれか記載の製造方法、19培養においてフィーダー細胞を用いる、前記12~18いずれか記載の製造方法、20フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記19記載の製造方法、21ラット胚性幹細胞がウイスターキョウト株、ウイスターハノーバーギャラス株WHG及びブラウンノルウエー株BNのいずれかの系統に由来する、前記13~20いずれか記載の製造方法、22細胞集塊を保持した状態で解離し継代することを特徴とする、マウス以外の胚性幹細胞の継代培養方法、23マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記22記載の継代培養方法、24物理的に細胞を解離する工程を含む、前記22または23記載の継代培養方法、25実質的に血清を含有しない培養液を用いて培養することを特徴とする、前記22~24いずれか記載の継代培養方法、26培養液が血清代替試薬を含有するものである、前記25記載の継代培養方法、27培養液がrLIFを含有するものである、前記25または26記載の継代培養方法、28血清代替試薬およびrLIFを含有する、マウス以外の胚性幹細胞用培養液、29マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記28記載の培養液、30血清代替試薬およびrLIFを成分として含有する、マウス以外の胚性幹細胞培養キット、31マウス以外の胚性幹細胞がラット胚性幹細胞である、前記30記載の培養キット、32さらに前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞を成分として含有する、前記31記載の培養キット、33さらにフィーダー細胞を含有する、前記30~32いずれか記載の培養キット、34フィーダー細胞が胎児由来正常繊維芽細胞である、前記33記載の培養キット、35前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導剤で刺激することを特徴とする、ラット胚性幹細胞の分化誘導方法、36分化誘導剤がレチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイドまたは細胞外基質である、前記35記載の分化誘導方法、37前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞を分化誘導して得られた細胞、38前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞に由来するcDNAライブラリー、ゲノムライブラリーまたは細胞抽出物、39以下の~の工程を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法:被験物質を前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、ラット胚性幹細胞の分化の有無や程度を評価する工程、上記の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程、40以下の~の工程を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法:被験物質を前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞に接触させる工程、胚性幹細胞の分化誘導条件下で前記のラット胚性幹細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、上記の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、41前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞の、遺伝子改変ラットの作製における使用、42遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記41記載の使用、43以下のX~の工程を含むプロセスを行うことによる遺伝子改変ラットの製造方法:前記1~11いずれか記載のラット胚性幹細胞に所望の遺伝子を導入する工程、遺伝子導入されたラット胚性幹細胞を含有する移植用卵を調製する工程、移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、44前記43記載の製造方法により製造された遺伝子改変ラット、45遺伝子改変ラットがキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットのいずれかである、前記44記載のラット、46実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下で以下のA~:ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代胚性幹細胞を、継代可能となるまで培養する工程、継代可能となった初代胚性幹細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代培養する工程、さらに継代培養を行うことにより胚性幹細胞を樹立する工程、の工程を含むプロセスを行うことにより得られ、かつ以下の~:Oct34遺伝子およびNanog遺伝子を発現する、アルカリホスファターゼ活性陽性である、胚様体形成能を有する、SSEA1およびSSEA4を発現する、正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、インビトロで多分化能を有する、三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、奇形腫形成能を有する、キメララット作製能を有する、の性質を有することを特徴とするラット胚性幹細胞、47さらに20血清存在下での培養により分化する、という性質を有する、前記46記載のラット胚性幹細胞、ならびに48ウイスターキョウト株、ウイスターハノーバーギャラス株WHG及びブラウンノルウエー株BNのいずれかの系統に由来する、前記46または47記載の胚性幹細胞。本発明は、従来の手法では得ることのできなかったラットES細胞を初めて提供するものである。本発明のラットES細胞は、実質的に血清を含有しない培養液を用いた培養条件下において、以下のA~の工程:ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を、細胞集塊を保持した状態で解離する工程、解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代ES細胞を、継代可能となるまで培養する工程、継代可能となった初代ES細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、継代培養する工程、さらに継代培養を行うことによりES細胞を樹立する工程、を含むプロセスを行うことにより、樹立、製造することができる。本発明のラットES細胞の樹立方法の特徴は、内部細胞塊やES細胞の解離剥離を行うステップにおいて、細胞を単一化することなく、ある程度の細胞集塊を保持した状態で解離、BrownNorway株、GotoKakizaki株、SD株、F344Du株、Wister株WisterHannover株、ACI株などの系統のラットから選択される。2フィーダー細胞本発明のラットES細胞の樹立および樹立後の培養においてはフィーダー細胞を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的にはマウス胎児の正常繊維芽細胞が挙げられる。より具体的には、妊娠12日~16日目のマウス胎児繊維芽細胞の初代培養細胞正常繊維芽細胞が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウスICRの胎児125日目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、市販品マウス繊維芽細胞、旭テクノグラス株式会社等を利用することもできる。当該フィーダー細胞は、マイトマイシンC等で処理して不活性化して用いることが好ましい。3培養液本発明のラットES細胞の製造ラットES細胞樹立用培養液胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液を、ラットES細胞樹立用培養液と称する。組成の具体例ダルベッコ改変イーグル培地F12旭テクノグラス、東京、日本380ml02MLグルタミン5ml血清代替試薬KSRギブコBRL、フナコシ、東京、日本100ml非必須アミノ酸ギブコBRL、フナコシ、東京、日本5ml抗生物質抗菌物質溶液ギブコBRL、フナコシ、東京、日本5ml100mMNaPyruvate5ml01Mβメルカプトエタノール05ml2ラットES細胞用培養液内部細胞塊形成以降の培養樹立ラットES細胞の培養も含むにおいて使用する培養液を、ラットES細胞用培養液と称する。組成の具体例ダルベッコ改変イーグル培地F12旭テクノグラス、東京、日本375ml02MLグルタミン5ml血清代替試薬KSRギブコBRL、フナコシ、東京、日本100ml非必須アミノ酸ギブコBRL、フナコシ、東京、日本5ml100倍ヌクレオシド保存液5mlアデノシン4mg、グアノシン425mg、シチジン365mg、ウリジン365mg、チミジン12mg抗生物質抗菌物質溶液ギブコBRL、フナコシ、東京、日本5ml100mMNaPyruvate5ml01Mβメルカプトエタノール05ml1000Uラット由来白血病阻害因子rLIFこのうちラット由来白血病阻害因子は、要時に添加して混合するのが好ましい。4培養条件本発明のラットES細胞の製造樹立培養における細胞の培養温度は、35°C~375°Cの範囲内であれば良く、好ましくは37°Cである。培養は、通常の培養に用いられる5CO2培養装置中で行われる。5ラットES細胞の樹立方法以下本発明のラットES細胞の樹立方法につき具体例を示す。1卵胚盤胞期胚の採取卵採取用のラットとしては、前記したWistarKyoto株、BrownNorway株、GotoKakizaki株、SD株、F344Du株、Wister株、WisterHannover株、ACI株といった系統のラットから選択される。週齢は8週齢~40週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは10週齢~20週齢のラットが用いられ、より好ましくは10週齢~12週齢のラットが用いられる。卵の採取は当業者に知られた常法により行えば良い。具体的にはラットを自然交配させ、膣栓確認3日目頃に採卵用メスラットをと殺し子宮を摘出する。この子宮を適当な培地で灌流することにより、受精卵胚を回収する。ここで灌流に用いる培養液としては、例えばmw培地NaCl6400mg100mlKCl356mg100mlKH2PO4162mg100mlMgSO47H2O294mg100mlNaHCO31900mg100mlGlucose1000mg100mlNaPyruvate25mg100mlCalactate460mg100mlStreptomycin50mg100mlPenicillin75mg100ml05phenrolred02ml20mMbetaME10μl100mMEDTA2Na10μlBSA3000mg100mlやM2培地などが挙げられる。回収された胚は、mw培地、M2、M16等の培養液中で培養を行う。培養により受精卵胚から桑実胚を経て胚盤胞胚盤胞期胚まで発生を進める。この段階まで発生を進めるためには通常、37°C、5CO2培養装置内にて一晩培養を行う。胚盤胞まで発生が進んだことは、顕微鏡で観察することにより確認することができる。好ましくは、胚盤胞後期段階まで発生を進める。2内部細胞塊の形成分離前記1で得られた胚盤胞を顕微鏡下にて確認した後、透明帯を除去する。透明帯の除去は、酸性タイロイド、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼ等を用いて行う。その後、マイトマイシンC処理を施したフィーダー細胞をゼラチンコート培養皿に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞を5~10個ずつ移し、ラットES細胞樹立用培養液にて培養を開始する。培養から1~4日目にフィーダー細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞後期段階が接着する。接着後5~10日目に胚盤胞から出現した内部細胞塊を200μlのピペットなどを用いて物理的に分離する。この分離した内部細胞塊をラットES細胞樹立用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、5個~20個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。その際、トリプシンEDTAなどの蛋白分解酵素を用いた解離は行わず、ピペット等を用いて物理的に内部細胞塊を解離する。また細胞が単一化されるまで解離を行うことは避け、前記のように5個~20個程度の細胞からなる細胞集塊を保持する程度に解離を行う。ここで細胞集塊を保持した状態であることは顕微鏡下で確認することができる。3ES細胞の樹立フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿において、前記2で解離した内部細胞塊をラットES細胞用培養液で培養する。通常、培養から2~4日目に初代ES細胞コロニーが出現する。初代ES細胞コロニーの出現は顕微鏡下で観察することにより確認することができる出現したES細胞を初代ES細胞と称する。その後5~10日程度培養を続行することにより、初代ES細胞コロニーが継代可能な状態となる。ここで継代可能な状態とは、形成された初代ES細胞コロニーを構成している細胞数が200~600個前後に達し、かつ各細胞間が緊密になった状態を指す。このような形態となったことを顕微鏡下にて確認しながら、200μlのピペット等を用いて当該ES細胞コロニーを分離する。この分離したES細胞コロニーをラットES細胞用培養液を含有する滅菌チューブ等に移し、5個~20個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで解離する。この段階においても細胞が単一化されるまで解離を行うことは避け、前記のように細胞集塊を保持する程度に解離を行う。またこの段階においても、トリプシンEDTA等の蛋白分解酵素を用いた細胞解離は行わず、物理的に解離することが望ましい。解離したES細胞コロニーは、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿においてラットES細胞用培養液で初代培養を行う継代1代目の細胞。培養から2~4日程度でES細胞コロニーが出現し、5~10日程度で継代可能な状態となる。以降の細胞継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち5個~20個程度の細胞からなる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシンEDTA等の蛋白分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。前記において継代可能となったES細胞コロニーから培養液を除去し、室温に戻したPBSにて洗浄し、予め37°Cに保温した25トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては60mmディッシュあたり500μl程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の7割以上のES細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば10ウシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培養液等を加えてトリプシンの濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、5mlピペット等を用いて更に物理的にES細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心室温で1000rpm、3分程度にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。ラットES細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて5~20個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う継代2代目の細胞。その後は、約5~10日毎に継代可能な状態となるため、前記継代1代目の細胞の継代継代2代目の細胞への継代と同様の継代方法により継代培養を続行することができる。細胞集塊の数や細胞集塊を構成する細胞数が安定化した段階をもって、ES細胞が樹立されたと判断する。具体的には、継代3代目以降、望ましくは継代5代目以降の細胞を、樹立したラットES細胞と判断することができる。樹立ラットES細胞を商品として供給する場合は、1系統における安定した供給量を保持するために、継代3代目以降、好ましくは継代5代目以降、より好ましくは継代10代目以降の細胞を商品化の対象とする。6本発明のラットES細胞本発明のラットES細胞は、以下の~の性質:Oct34遺伝子およびNanog遺伝子を発現する、アルカリホスファターゼ活性陽性である、胚様体形成能を有する、SSEA1およびSSEA4を発現する、正常ラット細胞と同じ染色体数を有する、未分化状態を維持したまま継代培養が可能である、インビトロで多分化能を有する、三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有する、奇形腫形成能を有する、キメララット作製能を有する、を含有することを特徴とする。本発明は、前記~に示したES細胞としての性質を全て保持したラットES細胞をはじめて提供するものである。樹立したラットES細胞がES細胞としての性質を保持していること、すなわち未分化状態全能性を維持したES細胞としての性質を保持していることは、以下の手法により解析することができる。1未分化マーカーの発現ES細胞であることを特徴づける決定的な因子として、Oct34OkamotoKetalCell60461472、ScholerHRetalEMBOJ921852195およびNanogMitsuiKetalCell113631642、ChambersIetalCell113643655が知られている。これらの遺伝子の発現は、ラットOct34およびNanog特異的なプライマーを用いたRTPCRを行うことにより確認することができる。ここで用いられるラットOct34およびNanog特異的なプライマーとしては、実施例に記載のプライマーOct34:5ATGGACTACCCAGAACCCCAG3、5TTTGCTGCAACGGCACATAA3を例示することができる。2アルカリホスファターゼ活性未分化ES細胞ではアルカリホスファターゼが大量に発現している。当該アルカリホスファターゼの発現は、市販の種々のアルカリホスファターゼ検出キットを用いることにより容易に測定することができる。当該検出キットとしては、例えばALP組織染色キットやベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットIフナコシなどが挙げられる。3胚様体形成能ES細胞をフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている。胚様体の形成は、ラットES細胞を非コート培養皿にてLIFを除いたラットES細胞用培養液を用いて7日間~14日間程度培養し、顕微鏡下で細胞が凝集して形成される球状体の出現を観察することにより確認することができる。4細胞表面抗原の発現ES細胞をはじめとする多能性幹細胞の分化を同定する指標の一つとして、分化段階特異的に発現量が変化する細胞表面抗原の検出が挙げられる。本発明のラットES細胞はSSEA1およびSSEA4を発現している。当該細胞表面マーカーの発現は、ES細胞キャラクタライゼイションキットフナコシを用いた免疫染色により、評価することができる。5染色体数樹立されたラットES細胞が起源となるラットの染色体数2n42を保持した正常ES細胞であることは、Gバンド法SumnerATCancerGenetCytogenet65987によって染色体数を分析することにより確認することができる。6未分化状態の維持樹立されたES細胞は、未分化状態を維持したまま継代培養を行うことができる。本発明で樹立したラットES細胞は、少なくとも35継代目まで継代培養を行うことができるという優れた特徴を有する。未分化状態の維持は、本発明のラットES細胞の継代培養方法後述の7により継代培養を行い、前記アルカリホスファターゼ活性等を測定することにより確認することができる。7多分化能ES細胞をフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で培養することにより、胚様体を経て種々の細胞へと自発的に分化する。このES細胞の性質は、まず前記3に記載の方法により胚様体を形成させ、その後ゼラチンコート培養皿に胚様体を移し、7日間~14日間程度培養を行うことにより観察することができる。各細胞の特徴的な形態から、神経様細胞、脂肪様細胞、または上皮系細胞などの出現を確認することができる。8三胚葉系列の細胞への分化能ES細胞は三胚葉内胚葉、中胚葉、外胚葉系列の細胞へ分化する能力を有する。このES細胞の性質は、前記3に記載の方法で形成させた胚様体心筋様細胞の出現した胚様体からRNAを抽出し、外胚葉系列の細胞例えば神経細胞、中胚葉系列の細胞、ANF、KvLQT1などが挙げられる。また肝細胞マーカーとしてはALB、TDO、TAT、G6Pなどが挙げられる。9奇形腫テラトーマ形成能ES細胞を同種若しくは先天的に免疫不全である異種動物に移植することにより、奇形腫テラトーマを形成させることができる。ここでテラトーマとは、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉から出来る諸組織を雑然と一腫瘍中に存する混合腫瘍の称である。当該テラトーマの形成は、同種または先天的に免疫不全である異種動物の皮下等にラットES細胞を移植し、数ヶ月後にコブ状の物体の存在を肉眼で観察することにより確認することができる。形成されたテラトーマが三胚葉構造を有していることは、摘出したテラトーマを切片化し、ヘマトキシリンエオジンで染色し、顕微鏡下で組織や細胞の形態を観察することにより、確認することができる。10キメララット作製能ES細胞を同種または異種ラットに導入することによりキメララットを産生することができる。キメララットの作製は、例えば以下の手法により行うことができる。キメララットが作製されたことを容易に確認するために、あらかじめマーカー遺伝子例えばGFP、βgal、ルシフェラーゼ等を本発明のラットES細胞に導入しておくと良い。具体的にはこのようなマーカー遺伝子を含むベクターをエレクトロポレーション法等によってラットES細胞の染色体上に組込み、培養液中に薬剤を添加してセレクションすることにより、ES細胞染色体に前記ベクターが組み込まれた組換えラットES細胞を樹立する。この組換えラットES細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または16細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるかマイクロインジェクション法:GordonJWetalProcNatlAcadSciUSA7773807384、若しくは2個の8細胞期胚の透明帯を取り除き前記組換えラットES細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると1個の胚盤胞となる細胞凝集法:DvorakPetalIntJDevBiol39645652。以上のようにして得られた胚移植用卵を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させることができる。得られたキメララットがES細胞に由来する細胞組織を有していること、すなわち樹立したラットES細胞がキメララット作製能を有していることは、当業者に知られた一般的な手法により確認することができる。例えばキメララットの種々の組織から抽出したゲノムDNAを鋳型として用い、マーカー遺伝子ES細胞に導入したマーカー遺伝子特異的プライマーを用いたゲノムPCRを行うことにより、確認することができる。さらに、ES細胞が各組織系列の細胞へ分化していることは、例えばキメララットの各組織を切片化し、マーカー遺伝子発現産物マーカータンパクの存在を、用いたマーカータンパクの性質に基づき検出することにより、確認することができる。11血清存在下での培養による分化さらに本発明のラットES細胞は、20血清存在下での培養により分化するという性質を有する。好ましくは、本発明のラットES細胞は、10血清存在下での培養により分化するものであり、さらに好ましくは5血清存在下での培養により分化するものである。ラットES細胞の分化は、アルカリホスファターゼ活性の消失や、Oct34やNanog等のES細胞マーカー遺伝子の発現消失により、確認することができる。7ラットES細胞の継代培養方法本発明のラットES細胞は、未分化状態を維持した状態で継代培養を行うことができる。本発明のラットES細胞の継代は、細胞が単一化されない状態、すなわち5個~20個程度の細胞からなる細胞集塊を維持した状態を保てば、当業者の常識の範囲内で継代を行うことができるが、トリプシンEDTA等の蛋白分解酵素による処理は最低限にとどめ、物理的手段により細胞解離を行うことが望ましい。以下に具体例を示す。樹立されたラットES細胞が継代可能な状態となった段階で、培養液を除去し、室温に戻したPBSにて洗浄し、予め37°Cに保温した25トリプシンを全面に塗り広げる。トリプシンの量としては60mmディッシュあたり500μl程度、若しくはそれ以下であることが好ましい。トリプシンを全面に塗り広げた後は、ただちに溶液を除去する。顕微鏡下にて全体の7割以上のES細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、ただちにトリプシン処理を停止させる。ここでトリプシン処理を停止させるためには、例えば10ウシ胎仔血清を含む培養液を添加することが容易であるが、大量の無血清培地等を添加してトリプシン濃度を希釈することにより停止させても良い。その後、5mlピペット等を用いて更に物理的にES細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心室温で1000rpm、3分程度にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。培養液で細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて5~20個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿に移し培養を行う。その後も同様に、約5~10日毎に継代可能な状態となるため、同様の継代培養を行う。継代細胞の培養には、実質的に血清を含有しない培養液を用いる。ここで実質的に血清を含有しないとは、血清の影響によりラットES細胞がES細胞としての性質を示さなくなる例えばアルカリホスファターゼ活性が陰性となる程の血清を含有しないことを意味し、具体的には血清濃度が10以下であること、好ましくは5以下であること、より好ましくは2以下であることを意味する。さらに血清を含有しない無血清培地を用いることがより好ましい。この場合、血清の代わりとなる試薬を添加する必要があり、具体的には、血清代替試薬KSR:ギブコBRLなどを含有する培養液を用いる。当該血清代替試薬は20程度の濃度で使用することが好ましい。また前記継代細胞の培養に用いる培養液は、rLIFを含有していることが望ましい。rLIFの濃度としては培養液1mlあたりrLIFを100単位以上添加することが好ましく、1000単位程度、若しくはそれ以上添加することがより好ましい。以上のように、本発明のラットES細胞の継代培養用の培養液は、血清代替試薬およびrLIFを含有することが好ましく、前記32に記載のラットES細胞用培養液が有効に用いられる。8ラットES細胞培養キット本発明は、本発明のラットES細胞を培養するための培養キットを提供する。具体的には、血清代替試薬およびrLIFを成分として含有する、ラットES細胞培養キットを提供する。血清代替試薬およびrLIFは、混合して1つの容器中に封入されていても良いが、それぞれ別々の容器に封入されていることが好ましい。ここでKSRとしてはギブコBRL社製のものを用いることができ、またrLIFとしてはケミコン社製のものを用いることができる。前記キットは、さらに、本発明のラットES細胞を成分として含有することができる。本発明のラットES細胞を商品として供給する場合は、継代3代目以降、好ましくは継代5代目以降、より好ましくは継代10代目以降の細胞を商品化の対象とする。当該ラットES細胞は、それ単独で商品化されても良いが、前記のように本発明の培養キットの1成分として商品化されても良い。前記キットは、さらにフィーダー細胞を成分として含有することができる。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常繊維芽細胞を用いることが好ましい。具体的には、妊娠12日~16日目のマウス胎児の繊維芽細胞の初代培養細胞正常繊維芽細胞が挙げられ、当該正常繊維芽細胞としては、例えばマウスICRの胎児125日目の正常繊維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、マウス胎児繊維芽細胞旭テクノグラス株式会社等を利用することもできる。以上に述べたES細胞の製造方法樹立方法、継代培養方法、およびES細胞の培養液や培養キットは、ラットES細胞のみならず、他の動物種にも適用可能であるただしマウスは除く。マウスES細胞はコロニーがドーム状に盛り上がり、全体的に隣接する細胞同士の境界が不明瞭である。また光沢を有している。一方、霊長類ES細胞のコロニーは扁平状に広がり、マウスES細胞のような光沢は観察されない。さらに細胞同士の境界がマウスES細胞と比べて明瞭である。本発明において樹立されたラットES細胞は扁平状のコロニーを形成し、マウスES細胞のような強い光沢が観察されず、マウスよりも霊長類ES細胞に近い形態を示すことが明らかとなった。よって、本発明のES細胞の製造方法樹立方法、継代培養方法およびES細胞の培養液や培養キットは、霊長類のES細胞にも適用可能である。9ラットES細胞を分化誘導して得られた細胞本発明は、本発明のラットES細胞の分化誘導方法、および分化誘導して得られた細胞を提供する。マウスやヒトES細胞で知られているように、ES細胞をフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができる。またレチノイン酸、細胞増殖因子、グルココルチコイド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることができる。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。従って本発明のラットES細胞を前記のような条件下で培養することにより、同様に分化誘導することができる。ここでES細胞から分化誘導して得られる細胞としては、例えば神経細胞、血球系細胞、肝細胞、血管内皮細胞、または心筋細胞などが挙げられる。これらES細胞から分化誘導して得られた細胞は、例えば移植治療の実験モデルにおける移植用細胞として有用である。また当該分化細胞は、核酸、タンパク質または発がん物質、環境変異原物質などに細胞を暴露した際の影響を調べるためにも有効に用いられる。具体的には前記物質の添加による細胞のgeneticあるいはepigeneticな変化、細胞のトランスフォーメーション、軟寒天培地中でのコロニー形成能、浸潤能を含むがん化の指標の変化、代謝機能の変化、生理機能の変化、生化学的変化などの生物学的指標に基づき細胞への影響を調べることができる。10ラットES細胞由来の物質本発明においてラットES細胞を樹立したことにより、ラットES細胞のみならず、それに由来する種々の物質例えば樹立ラットES細胞由来のmRNAより調製されたcDNAライブラリーやゲノムライブラリー、あるいはラットES細胞の細胞抽出物などを提供することが可能となった。本発明のES細胞由来の種々の物質は、再生医療における研究や発生学における分子レベルでの発現解析の研究、動物個体に代わる創薬研究や安全性評価試験などにおいて有効に用いることができる。ここでcDNAライブラリーは、本発明のラットES細胞より抽出したRNAを鋳型として用い、市販のcDNAライブラリー作製キット例えばクローンマイナーcDNAライブラリー作製キットやCreatorSMARTcDNAライブラリー作製キット等などを用いて作製することができる。またゲノムライブラリーはMolecularCloningALaboratoryManualTManiatisら編、第2版1989、ColdSpringHarborLaboratory等の基本書を参考にして常法により作製することができる。またES細胞由来の細胞抽出物は、常法により細胞を破砕し、プロテアーゼ阻害剤の存在下にて遠心分離することなどにより調製することができる。11組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法本発明は、以下の~:被験物質を本発明のラットES細胞に接触させる工程、ラットES細胞の分化の有無や程度を評価する工程、上記の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する工程、を含む、組織または細胞の分化誘導剤のスクリーニング方法を提供する。前記工程においてスクリーングに供される被験物質は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、前記スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料被験試料をラットES細胞に接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、細胞抽出液、遺伝子ゲノム、cDNAライブラリー、RNAiライブラリー、アンチセンス核酸、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。これら被験試料又は被験物質は、ラットES細胞への取り込み可能な形態で接触させる。例えば被験試料が核酸の場合は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム、DEAEデキストランや遺伝子導入用リピッドを用いてES細胞に導入する。ラットES細胞と被験物質とを接触させる条件は、該細胞が死滅せず且つ被験物質が取り込まれるのに適した培養条件温度、pH、培養液の組成などであれば特に制限はない。好ましくは分化誘導に適した条件、すなわちフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で培養されたラットES細胞に対して前記被験物質を添加する。続く工程においてはラットES細胞の分化の有無や程度を評価し、においては当該評価結果に基づき被験物質が分化誘導に関連する物質であるか否かを判断する。ラットES細胞から所望の組織または細胞への分化は、例えば、所望の組織または細胞で発現するマーカーを指標として評価することができる。所望の組織又は細胞のマーカーとては、組織または細胞特異的抗原が挙げられる。当該マーカーとして具体的には、例えば神経系細胞のマーカーとしてニューロン特異的エノラーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、ネスチン等が挙げられ、軟骨のマーカーとしてS100タンパク質、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ等が挙げられる。また筋肉のマーカーとしてデスミン、筋特異的アクチン等が挙げられる。このような組織細胞特異的マーカーは、該マーカーに対する抗体を用い、ELISAや免疫染色などにより検出することができる。またこれらのマーカー遺伝子の発現をRTPCR等の手法により検出することもできる。12組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法本発明は、以下の~の工程:被験物質を本発明のラットES細胞に接触させる工程、ES細胞の分化誘導条件下で前記のラットES細胞を培養し、分化の有無や程度を評価する工程、上記の評価結果に基づいて、被験物質が分化誘導に作用する物質であるか否かを判断する工程、を含む、組織または細胞の分化誘導に作用する物質のスクリーニング方法を提供する。ES細胞は、前記のようにフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で培養することにより種々の細胞に分化誘導させることができる。またレチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイド等の作用により種々の細胞に分化誘導させることもできる。さらに細胞外基質により分化誘導させることもできる。この培養系に被験化合物例えば抗癌剤等の医薬品や環境変異物質などを加えて培養することにより、被験物質が正常な分化にどのような影響を及ぼすかを評価することができる。当該スクリーニングは、例えば開発中の医薬品の副作用研究などに応用することができる。工程においてスクリーニングに供される被験物質としては、前記11と同様の物質が挙げられる。被験物質とラットES細胞との接触については、被験物質を本発明のラットES細胞に接触させた後にES細胞の分化誘導条件下で培養しても良く、またラットES細胞を分化誘導条件下で培養開始し、その後被験物質を接触させても良い。分化誘導条件下での培養とは、前記したようなフィーダー細胞やLIFの存在しない培養条件下や、レチノイン酸、増殖因子、グルココルチコイドまたは細胞外基質等を培養液中に添加した培養条件などが挙げられる。分化誘導条件下での培養過程若しくは培養後に、被験物質がラットES細胞の分化に及ぼす影響を評価する。当該評価は、被験物質を作用させない対象細胞における分化の程度との比較に基づき行われることが望ましい。具体的には、例えば肝細胞分化誘導因子特願200459705を培養液に添加することにより機能を有した成熟肝細胞へと分化誘導を行い、肝細胞特異的発現遺伝子アルブミンやトリプトファン23ジオキシゲナーゼ等などを指標として評価することができる。13遺伝子改変ラット本発明のラットES細胞は、遺伝子改変ラットの作製において使用することができる。ラットはマウスに比べて約10倍という実験上適当な大きさの哺乳動物であり、1細胞の血管に容易に薬物投与可能である、2外科移植実験が可能である、3組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。従来から多くのヒト疾患モデルラットが開発発見されてきたが、ラットES細胞が樹立されていなかったがために、遺伝子改変ラット、特にノックアウトラットやノックインラットといったジーンターゲッティングを要する遺伝子改変ラットの作製は事実上不可能であった。本発明のラットES細胞は、そのような遺伝子改変ラットの作製を初めて可能とするものである。本発明のラットES細胞の提供により、当業者に周知の技術にて当該遺伝子改変ラットを作製することができる。ここで遺伝子改変ラットとは、キメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。前記遺伝子改変ラットは、以下の~の工程:本発明のラットES細胞に所望の遺伝子を導入する工程、遺伝子導入されたラットES細胞を含有する移植用卵を調製する工程、移植用卵を偽妊娠させたメスのラットに導入し、仔ラットを産出する工程、を含むプロセスを行うことにより製造することができる。ノックアウトラットとは人為的に標的とする遺伝子を破壊した変異ラットを意味し、遺伝子ターゲッティングラットとも呼ぶことができる。ノックアウトラットの作製は、例えばDonehowerALetalNature356215221等に記載のノックアウトマウスの作製法に準じて行うことができる。簡単に述べると、まず標的とする遺伝子のゲノムDNA配列をもとに、相同組換えのためのベクターターゲッティングベクターを構築する。この時組換えクローンの選別のために、マーカー遺伝子としてG418耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を組み込む。この構築したターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法等によってラットES細胞に導入する。得られた導入細胞の中から相同組換えを起こしたコロニーを選別する。このようにして得られた相同組換えラットES細胞を、例えば、顕微操作でラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または16細胞期に移植して内部細胞塊と一緒にまた内部細胞塊の一部として発生させるかマイクロインジェクション法:GordonJWetalProcNatlAcadSciUSA7773807384、若しくは2個の8細胞期胚の透明帯を取り除き前記相同組換えラットES細胞と共培養して凝集塊を作らせる。この凝集塊を培養すると1個の胚盤胞となる細胞凝集法:DvorakPetalIntJDevBiol39645652。以上のようにして得られた胚移植用卵を、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠させた雌ラットの子宮内に移植し発生させることにより、キメララットを産出させる。当該キメララットを野生型ラットと交配させることにより、ヘテロノックアウトラットを産出させることができ、このヘテロノックアウトラット同士を交配させることによりホモノックアウトラットを産出させることができる。前記ノックアウトラットの範疇には、コンディショナルノックアウトラットも含まれる。ここでコンディショナルノックアウトとは、CreloxPシステムまたはFLPFRTシステムを利用して、部位特異的時期特異的に遺伝子をノックアウトするシステムである。具体的にはターゲッティングしたい遺伝子をloxP配列またはFRT配列で挟んだものに置き換えておき、CreまたはFLPタンパクの供給により前記loxP配列またはFRT配列で挟んだ遺伝子を切り取るシステムである。ノックインラットとは、標的とする遺伝子の位置に、人為的に作製した相同性を有する外来性遺伝子を導入した変異ラットを意味する。標的遺伝子は破壊される場合もあれば破壊されない場合もある。例えば遺伝子の発現をモニターするためにlacZ遺伝子やGFP遺伝子などのマーカー遺伝子を導入したり、遺伝子に変異を導入して入れ替えることも可能である。当該ノックインラットは、例えばPewznerJungYetalJImmunol16146344645等に記載のノックインマウスの作製法に準じて作製することができる。基本的には前記ノックアウトラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。トランスジェニックラットとは、人為的に外来遺伝子を導入したラットを意味する。トランスジェニック動物の作製は従来より顕微操作によって受精卵の雄性前核に所望の遺伝子を注入する方法が一般化されている。そのため前記ノックアウトラットやノックインラットほど本発明のラットES細胞の必要性は高くない。しかしながら導入効率や個体の作製効率を上昇させるためには、本発明のラットES細胞が有効に用いられる。当該トランスジェニックラットは、例えばYamamotoHetalCancerRes6216411647等に記載のトランスジェニックマウスの作製法に準じて作製することができる。すなわち、ES細胞をガラスピペットで吸い付けて固定し、他端から先端2μm以下の鋭く細いガラスピペットを使って核の中に直接外来性標的遺伝子溶液を注入する。溶液を注入したES細胞を培養系に移行し、遺伝子が組み込まれた株を樹立し、マウスの受精卵モルラ胚またはブラスト胚をガラスピペットで吸い付けて固定し、樹立したES細胞をガラスピペットを使って受精卵に注入し、試験管内で培養し、ある程度発生させた後に、偽妊娠雌マウスの卵管または子宮に戻して仔マウスを得る技法である。前記トランスジェニックラットの範疇には、コンディショナルトランスジェニックラットも含まれる。ここでコンディショナルトランスジェニックとは、CreloxPまたはFLPFRTを利用して、部位特異的時期特異的に遺伝子を発現させるシステムである。具体的には薬剤耐性遺伝子などをloxP配列またはFRT配列で挟んでおき、CreまたはFLPタンパクの供給により前記loxP配列またはFRT配列で挟んだ遺伝子を切り取ることにより、目的遺伝子を発現させるシステムである。ノックダウンラットとは、RNAiの中間物質である短い2本鎖RNAsiRNAやアンチセンス核酸を人為的に導入発現させ、当該siRNAやアンチセンス核酸の作用により標的遺伝子の発現を抑制させたラットを意味する。このようなノックダウン動物は、ベクター系によるsiRNAの発現システムが確立したことに基づき、作製可能となったScience296550553、NatureBiotech20500505等。当該ノックダウンラットは、例えばTiscorniaGetalProcNatlAcadSciUSA10018441848等に記載の方法に準じて作製することができる。基本的には前記トランスジェニックラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。本発明は、以上のような操作により製造された遺伝子改変ラットをも提供する。ここで遺伝子改変ラットとは、前記のようにキメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラット若しくはノックダウンラットといった当業者に知られた全ての遺伝子改変ラットを意味する。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。実施例1ラットES細胞の樹立1卵の採取WistarKyoto株であるWKYNのメス日本チャールズリバー、10週齢以上を自然交配し、膣栓確認3日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出した。mw培地NaCl6400mg100mlKCl356mg100mlKH2PO4162mg100mlMgSO47H2O294mg100mlNaHCO31900mg100mlGlucose1000mg100mlNaPyruvate25mg100mlCalactate460mg100mlStreptomycin50mg100mlPenicillin75mg100ml05phenrolred02ml20mMbetaME10μl100mMEDTA2Na10μlBSA3000mg100mlで潅流して胚を回収し、5CO2培養装置にて胚盤胞後期段階まで発生を進めた図1。なおラットES細胞の樹立において、胚盤胞後期段階の卵が最も樹立内部細胞塊形成効率が高かったため、前記のように胚盤胞後期段階の卵を使用することとした。2フィーダー細胞の調製ラットES細胞の樹立および培養の際に使用するフィーダー細胞として、マウスICRの胎児125日目の正常繊維芽細胞をマイトマイシンCで処理したものを使用した図2。使用に際し、凍結保存したフィーダー細胞を使用前日に解凍し、STO培地DMEM450mlFBS50mlAntibioticAntimicroticssolution5mlとゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本を用いて培養した。3ラットES細胞樹立用培養液およびラットES細胞用培養液の検討1LIF添加の検討前記1で調製されたラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させ、この内部細胞塊からES細胞コロニーを形成させ、最終的に安定化したラットES細胞を樹立する。これら一連のステップにおいて用いる培養液の検討を行った。まずラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階における、ラット由来白血病阻害因子の培養液中への添加の必要性につき検討を行った。ラット胚盤胞から内部細胞塊を形成させる段階で、種々の濃度0~5000単位のrLIFラットES細胞の単離方法の検討細胞を単離する際のトリプシン処理の影響を調べた。まず、内部細胞塊を単離してフィーダー細胞上に撒く段階で通常のトリプシンEDTA処理を行った結果、大部分のES細胞が分化してしまった。一方、ピペットを用いて物理的に細胞塊を解離した結果、未分化状態を維持できることが分かった。また、初代ラットES細胞コロニー細胞塊を継代する際にも、トリプシンEDTA処理して継代した場合には細胞は単一化され分化してしまうが、前記と同様に物理的手法により細胞クランプを解離させて継代した場合は未分化状態を維持できることが明らかとなった。次に、2回目以降の継代におけるトリプシンの影響について調べた。すなわち2回目の継代においてトリプシンEDTAを用いて完全に単一細胞化した場合と、トリプシンEDTAによる処理を最小限にとどめ、最終的には物理的操作により5~20個の細胞塊として継代した場合とで未分化状態維持に差があるかどうか検討を行った。その結果、単一細胞状態で継代すると自発的に分化してしまうのに対し、物理的にES細胞コロニーを剥離し、5~20個の細胞塊として継代した場合は、未分化状態を維持できることが明らかとなった図5。以上の結果から、マウスES細胞の場合はトリプシンEDTA溶液で完全に単一細胞化し、継代する事が望ましいが、ラットES細胞の場合、マウスES細胞の方法を適用すると自発的分化が発生するため、物理的にES細胞コロニーを剥離し、5~20個の細胞塊として継代するのが望ましいことが分かった。5ラットES細胞の樹立以上の検討結果に基づきラットES細胞を樹立した。樹立法の概略を図6に示す。ラット胚盤胞後期段階を顕微鏡下にて確認した後、タイロイド酸を用いて透明帯を除去した。マイトマイシンC処理を施した正常マウス胎児繊維芽細胞フィーダー細胞を60mmゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞後期段階を5~10個ずつ移し、ラットES細胞樹立用培養液にて培養を開始した。1~4日目に正常マウス胎児繊維芽細胞上に透明帯を除去したラット胚盤胞後期段階が接着し、接着後5~10日目に内部細胞塊図7のみを200μlのピペットを用いて分離した。200μlのラットES細胞樹立用培養液を15ml滅菌チューブに分注し、分離した内部細胞塊を移し、ビペットを用いて物理的に細胞塊を解離した。使用前日にフィーダー細胞を播種した6穴ゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本において、解離した内部細胞塊をラットES細胞用培養液で培養した。培養から2~4日目にES細胞コロニーが出現し図8、また図6中初代ES細胞、コロニーの出現から5~10日目のES細胞コロニー図9を顕微鏡下にて形態を確認しながら200μlのピペットを用いて分離した。使用前日にフィーダー細胞を播種した6穴ゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本において、物理的に解離したES細胞コロニーをラットES細胞用培養液で培養した図6中継代1代目。培養から2~4日目にES細胞コロニーが出現し、5~10日目に継代可能となった。次に培養液を除去し、室温に戻したPBSにて2回洗浄し、予め37°Cに保温した25トリプシンギブコBRL、フナコシ、東京、日本を60mmディッシュあたり500μl加えて全面に塗り広げ、ただちに溶液を除去した。顕微鏡下にて全体の7割以上のES細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、10ウシ胎仔血清を含む培養液を2ml加えてトリプシン処理を停止させた。5mlピペットを用いて更に物理的にES細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁溶液を遠心1000rpmで3分、室温にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収した。ラットES細胞用培養液で細胞を懸濁し、完全に単離化するのでは無く、顕微鏡下にて5~20個の細胞塊を形成している状態を確認し図5のa、使用前日にフィーダー細胞を播種した60mmゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本に移し培養した図6中継代2代目。その後5~10日目に継代可能な状態へと安定化した細胞を、前記と同様の手法にて継代して得られた継代3代目の細胞以降の細胞を、樹立ラットES細胞とした図10。この樹立したラットES細胞の形態は、これまでに報告されている各種ES細胞と非常に良く似たES細胞の典型的な形態であった図11。なお、樹立以降も前記と同様の手法にて5~10日毎に継代を行い、細胞を維持した。実施例2樹立したラットES細胞の解析継代5代目のラットES細胞を用いて、ES細胞としての特性を有することを確認した。具体的には以下の各性質について検討した。1RTPCR分析による未分化マーカー遺伝子の発現解析樹立したラットES細胞における、代表的な未分化マーカーであるOct34およびNanog遺伝子の発現の有無を検討した。まず樹立したラットES細胞から総RNAをISOGENニッポンジーン、東京、日本を用いて抽出した。一本鎖cDNAは、総RNA2μg、オリゴ18プライマー05μl、dNTPs10pmol、RAV2RTアーゼ5単位、および一本鎖合成緩衝液タカラ、京都、日本を含む全量20μlにおいて合成した。合成は、37°Cで10分間、42°Cで1時間、56°Cで10分間、および99°Cで5分間行った。また、以下のプライマーを合成したオリゴヌクレオチド配列は、センス、アンチセンスプライマーの順に括弧内に記載し、その後にアニーリング温度、PCRに用いたサイクル、および増幅した断片の長さを示す:βアクチン5AGAGCAAGAGAGGTATCCTG3配列番号:1、5AGAGCATAGCCCTCGTAGAT3配列番号:2;55°C;25サイクル;339bp、Oct345ATGGACTACCCAGAACCCCAG3配列番号:3、5TTACAGGAGCTGCAGTTATAC3配列番号:4;56°C;35サイクル;448bp、Nanog、54°C35サイクル617bp。なおラットOct34のプライマーは、マウスOct34遺伝子のCDS配列をGenBankより入手し、さらに、その塩基配列をBLASTにて検索してラットOct34遺伝子配列を得、マウスとラットの相同性を検索し、マウスES細胞は増幅しない領域を選んで、これをラット特異的Oct34プライマーとして設計した。NanogについてもマウスおよびヒトNanog遺伝子のCDS配列をもとにしてプライマーを設計した。増幅は、鋳型cDNA4μl、100μMdNTPs、プライマー10pmol、ExTaq10単位およびExTaq緩衝液タカラ、京都、日本を含む全量50μlにおいて行った。PCR後、少量を30アガロースゲル上で泳動させて、エチジウムブロマイドEtBrによって染色した後、UV照射下で写真を撮影した。結果を図12に示す。図12より明らかなように、ラットES細胞のcDNAでのみ、ラット特異的Oct34およびNanog遺伝子断片の増幅を示すバンドが確認された。2アルカリホスファターゼ活性の分析細胞が未分化能を有していることを証明する代表的な指標の一つであるアルカリホスファターゼ活性の有無を分析した。まずラットES細胞用培養液およびフィーダー細胞存在下にて培養を行った樹立ラットES細胞を直接、4パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定して、その後100EtOHで10分間固定した。H2Oによって30分間洗浄した。アルカリホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットIフナコシ、東京、日本によって検出した。結果を図13に示す。樹立したラットES細胞はアルカリホスファターゼ活性陽性であることが示された。3胚様体形成能の分析ES細胞をフィーダー細胞やLIFの存在しない条件下で非コート培養皿を用いて培養することにより、胚様体が形成されることが知られている。そこで樹立ラットES細胞10×107個を非コート培養皿にてrLIFを除いたラットES細胞用培養液を用いて播種し、37°Cで3日間置きに培養液を交換し、20日間インキュベートした。結果を図14に示す。図14より明らかなように胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた。4ES細胞マーカー染色の分析未分化マーカーの発現の有無につき検討した。ラットES細胞用培養液およびフィーダー細胞存在下にて培養を行った樹立ラットES細胞を直接、4パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定して、その後002トライトンX100で15分間静置し、3過酸化水素水メタノールにて15分間静置した。5血清PBSにて15分間ブロッキングした後、ES細胞の代表的な膜タンパク質であり、未分化マーカーの一種であるSSEA1、SSEA4、TRA160およびTRA181を、説明書に従って、ES細胞キャラクタライゼイションキットフナコシ、東京、日本と二次抗体抗マウスIgG抗体ビオチン標識フナコシ、東京、日本、DAB染色キットコウワ、東京、日本によって検出した。結果を図15に示す。SSEA1およびSSEA4は陽性であり、これら未分化マーカーが発現していることが示された。TRA160およびTRA181については本抗体染色結果では発現は検出できなかった。5染色体数の分析樹立したラットES細胞が正常な染色体数を保持しているかどうか確認した。樹立ラットES細胞をフィーダー細胞非存在下のゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本ラットES細胞用培養液を用いて培養を行い、Gバンド法SumnerATCancerGenetCytogenet65987によって染色体数を分析した。結果を図16に示す。正常ラット細胞の染色体数2n42を保持していることが示された。6継代回数の分析樹立したラットES細胞の継代回数と未分化能維持率について検討した。ラットES細胞をフィーダー細胞存在下のゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本においてラットES細胞用培養液を用いて培養し、継代回数と未分化能力の保持性についてアルカリホスファターゼ活性を指標に検討した。開始は継代回数5代目からで、以後、5代目毎にアルカリホスファターゼ活性染色を行った。アルカリホスファターゼ活性は、説明書に従って、ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットIフナコシ、東京、日本によって検出した。結果を図17に示す。ラットES細胞用培養液を用いることにより少なくとも継代25代目まで安定的に未分化能を維持した状態で培養が可能であることが明らかとなった。なおその後、継代35代目まで安定的に培養できることが明らかとなっている。7インビトロ系における多分化能の分析樹立したラットES細胞の自発的分化能につき検討した。樹立ラットES細胞10×107個を非コート培養皿イワキ、東京、日本において、ラット由来白血病阻害因子を除いたラットES細胞用培養液で培養することにより胚様体形成を開始した。形成開始7日目にゼラチンコート培養皿イワキ、東京、日本に胚様体を移し、さらに7日間培養を行った。結果を図18に示す。図18に示されるように、胚様体から神経様細胞が出現した。この神経様細胞の拡大図bにおいては2細胞間で神経突起を伸ばし、また連結しているような像が確認された。脂肪様細胞は細胞質内に多数の透明顆粒を含んでいるのが特徴であるが、図18cに示すように多数の透明顆粒を含む脂肪様細胞像が確認された。また図18に示すように上皮系細胞も多数確認された。このように樹立したラットES細胞は自発的に様々な細胞へと分化する能力を有していることが確認された。8血清およびLIF添加のラットES細胞への影響樹立したラットES細胞に対するLIFと血清が及ぼす未分化能維持や増殖能への影響について検討した。継代5代目のラットES細胞を以下の4種類の培養条件にて1代継代した。ラットLIF含有、無血清20KSR含有、LIF無添加、無血清20KSR含有、マウスLIFラットLIF含有、20血清含有。未分化能を維持しているか否かは、ES細胞の未分化マーカー遺伝子であるOct34、Nanog、Rex1の各遺伝子の発現の有無を解析することにより調べた。またES細胞の特徴である奇形腫瘍形成に重要なERas遺伝子の発現の有無も解析した。用いたプライマーの配列、アニーリング温度およびPCRに用いたサイクルは以下の通りである:Oct34:5ATGGACTACCCAGAACCCCAG3配列番号:3、5TTACAGGAGCTGCAGTTATAC3配列番号:4、56°C、40サイクル、Nanog:5TAGCCCTGATTCTTCTAGCA3、5TTTGCTGCAACGGCACATAA3、60°C、40サイクル、Rex15AAATCATGACGAGGCAAGGC3、5TGAGTTCGCTCCAACAGTCT3配列番号:8、60°C、40サイクル、ERas:5ACCTGAGCCCCGGCACACAG3、5CAGCTGCAGCGGTGTGGGCG3配列番号:10、64°C、40サイクル。さらに形態学的な観察も行った。結果を図19に示す。rLIFと20KSRでラットES細胞を培養前記すると、形態的に安定であり図19、またES細胞マーカー遺伝子の発現が観察されたことにより、未分化能を維持した状態で増殖出来ることが確認された。一方、残りの3条件前記~で培養すると、特徴的なES細胞マーカー類の発現は消失し、形態的にも分化状態に移行した図19。以上の結果より、ラットES細胞の培養にはラットLIFと血清代替試薬の両者が重要であることが明らかとなった。9奇形腫形成能の分析樹立したラットES細胞をPBSにて10×107個200μlに懸濁調整し、同系雄ラット15週齢の精巣内部および皮下内部に細胞移植を行う。ラットをと殺し、形成された奇形腫を摘出した後、4パラホルムアルデヒドにて固定する。組織切片を作成し、ヘマトキシリンエオジンで染色し、顕微鏡下にて三胚葉内胚葉、中胚葉および外胚葉への分化誘導を確認する。10キメララット作製能の分析pEGFP1ベクタークローンテック社のEGFP遺伝子上流にニワトリのアルブミンプロモーターを組み込み、EGFP遺伝子が安定的に細胞内で発現するベクターとして構築した。本作製したベクターをエレクトロポレーション法を用いてラットES細胞内部に導入し、ラットES細胞内部の染色体遺伝子内に組み込まれた細胞株をG418を用いて薬剤選別を行い、樹立したRESC/EGFP株。一方、ES細胞と同系のラットを用いて自然交配し、膣栓確認3日目に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出し、mw培地で潅流して卵を回収した。その後5CO2培養装置にて40個の採卵を8細胞期胚まで発生を進める。オイルドロップ内でタイロイド酸を用いて透明帯を除去し、フィーダー細胞を除去し、前記で樹立したラットES細胞株の細胞塊1個5から20個を、同系ラットの受精卵にマイクロインジェクション法を用いて導入する。5CO2培養装置内で一晩培養を行う移植用卵。一方、予め輸精管結紮手術を施した雄ラットと採卵用雌ラットを交配させ、翌日に雌ラットの膣栓を確認し、偽妊娠雌ラットを作製する。麻酔を掛けた偽妊娠雌ラットを開腹し、子宮内に移植用卵をそれぞれ10個注入する。自然分娩や、特に必要とされた場合には帝王切開にて仔を摘出し、仔ラットに蛍光を照射して体が蛍光色を呈する事によりキメララットの誕生を確認する。実施例3ES細胞の樹立及び樹立したラットES細胞の解析21ES細胞の樹立実施例1に示したWisterKyotoラットの場合と同様の手法にて、WisterHannoverGALASラットおよびBrownNorwayラットについてもES細胞の樹立を行った。その結果、いずれのラットについてもES細胞を樹立することができた。各ラットの胚盤胞から形成された内部細胞塊の写真を図20に示す。また継代5代目の樹立ES細胞の写真も併せて図20に示す。WHGラットES細胞、BNラットES細胞いずれについてもWKYラットES細胞と同様に未分化能を維持したまま継代できることが確認できた。2RTPCR分析によるES細胞マーカー遺伝子の発現解析樹立したWKYラットES細胞、WHGラットES細胞、BNラットES細胞におけるES細胞マーカー遺伝子の発現の有無を、RTPCR分析により行った。実験は実施例2の1と同様にして行った。ES細胞の未分化マーカー遺伝子であるOct34、Rex1およびNanog遺伝子の発現を解析した。またES細胞の特徴である奇形腫瘍形成に重要なERas遺伝子の発現も解析した。RTPCRのプライマーは実施例2の1及び8に示したものを用いた。WKYラットES細胞の結果を図21に示す。Oct34、Rex1、Nanog、ERasのいずれの因子についても発現が示された。WHGラットES細胞、BNラットES細胞についても同じ結果が得られた。3ES細胞から形成された胚様体の分析樹立ラットES細胞を非コート培養皿にてrLIFを除いたラットES細胞用培養液を用いて播種し、37°Cで3日間置きに培養液を交換し、20日間インキュベートした。その結果胚様体が形成され、心筋様に鼓動する胚様体が多数確認できた。次に、この心筋様細胞の出現した胚様体からRNAを抽出し、神経細胞、心筋細胞および肝細胞の各マーカー遺伝子の発現をRTPCRで解析した。各マーカー遺伝子の名称、プライマー配列、アニーリング温度およびPCRに用いたサイクルを以下に示す。A神経細胞マーカーNestin5GCTCTGACCTATCATCTGAG3、5AGATGCACAGGAGATGCTAC3配列番号:12、58°C、40サイクル、TUJ15GGAACGCATCAGTGTCTACT3配列番号:13、5ACCACGCTGAAGGTGTTCAT3配列番号:14、60°C、40サイクル、MSI15TCTCACTGCTTATGGTCCGA3配列番号:15、5TCAGTGGTACCCATTGGTGA3配列番号:16、60°C、40サイクル、GFAP5GGCTCTGAGAGAGATTCGCA3配列番号:17、5ATGTCCAGGGCTAGCTTAAC3配列番号:18、58°C、40サイクル、B心筋細胞マーカーCCC5TCTGAAGCGGCAGAAGAATC3配列番号:19、5TGACCTCGATGAACTTGGGA3、58°C、40サイクル、ANF5ATACAGTGCGGTGTCCAACA3配列番号:21、5TTATCTTCGGTACCGGAAGC3、58°C、40サイクル、KvLQT15TGCGGATGCTGCATGTTGAT3配列番号:23、5CAAACCCAGAGCCAAGTATG3、58°C、40サイクル、C肝細胞マーカーALB5GCTTGCTGTGATAAGCCAGT3配列番号:25、5TGGCAGACAGATAGTCTTCC3、58°C、40サイクル、TDO5CGATGAGAAGCGTCATGACT3、5AACCAGGTACGATGAGAGGT3、58°C、40サイクル、TAT5AATGAGATTCGAGACGGGCT3配列番号:29、5TTCATCACAGTGGTAGTGCT3、58°C、40サイクル、G6P5GTCAACGTATGGATTCCGGT3、5GTTCTCCTTTGCAGCTCTTG3、58°C、40サイクル。RTPCRの結果を図22に示す。未分化状態レーン1では発現していない遺伝子が、胚葉体では全て陽性に転じていることが明らかとなった。この結果より、樹立したラットES細胞は三胚葉系列の細胞へと分化する能力を有していること、すなわちES細胞としての性質を有していることが明らかとなった。4奇形腫テラトーマ形成能の分析樹立したWKYラットES細胞、WHGラットES細胞、およびBNラットES細胞を、それぞれ免疫不全マウスの皮下に25×107細胞個移植した。その後12ヶ月後にこれら全てのES細胞移植マウスにおいてテラトーマの形成を確認した。WHGラットES細胞の結果を図23に示す。マウスをと殺し、形成されたテラトーマを摘出した後、4パラホルムアルデヒドにて固定した。組織切片を作成し、ヘマトキシリンエオジンで染色した。顕微鏡下での観察により、腺構造中胚葉系列、血管内皮様構造外胚葉系列、腸管様構造内胚葉系列、および骨細胞様構造中胚葉系列の各組織が観察された。以上の結果より、樹立したラットES細胞はテラトーマ形成能を有し、形成されたテラトーマは三胚葉内胚葉、中胚葉および外胚葉構造を有することが明らかとなった。5キメララット作製能の分析pCAGEGFP遺伝子をエレクトロポレーション法を用いてラットES細胞に導入し、pCAGEGFP遺伝子を染色体上に組み込んだWHGラットES細胞株以下、pCAGEGFPWHGrES細胞株と称するを作製した。WHGラットES細胞と同系統の雌ラットを用いて自然交配し、翌日の膣栓陽性確認後、4日目に採卵した。その後5CO2培養装置にて胚盤胞期まで発生を進めた受精卵を採取し、1個の卵につき8~12個のpCAGEGFPWHGrES細胞をマイクロインジェクション法にて移植した卵を作製した以下、ESと称する。一方、精管結紮を施した同系統ラット雄と同系統ラット雌との交配を行い、翌日の膣栓陽性を確認し、偽妊娠雌ラットを作製した。膣栓陽性確認後4日目に、偽妊娠ラット1匹あたり6個~10個のES卵を移植した。その後帝王切開にて仔ラットGFPキメララットを摘出した。このGFPキメララットから種々の組織を分離し、ゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型として、GFP特異的プライマーを用いて常法にてゲノムPCRを行った。結果を図24に示す。結果として、胸腺血管脾臓の3つを除く調べた全ての臓器でpCAGEGFPWHGrES細胞由来であることを示すGFP遺伝子のバンドが確認された。一方、コントロールのゲノムにはGFP遺伝子のバンドが確認されなかった。以上のようにラットES細胞pCAGEGFPWHGrES細胞由来の遺伝子が各組織や細胞中に含まれていたことから、樹立したラットES細胞はキメララット作製能を有していることが明らかとなった。6キメララットの組織解析前記5で得られたGFPキメララット、及び同系統の野生型ラットを用いて、それぞれ各組織を切片化し、GFP抗体とローダミンを用いて蛍光染色したところ、中心静脈近傍にGFP発現細胞であることを示す赤色領域が確認されたデータは示さず。以上の結果より、ラットES細胞由来の遺伝子が各組織中に含まれているだけでなく、形態的に観察した結果、各組織系列の細胞へと分化していることが明らかとなった。