試料に含まれるゲノムDNAまたは転写産物から得られたcDNAを断片化し、且つ指標配列を付与することによってフラグメントDNA混合液を得る段階と、前記フラグメントDNA混合液の第1の一部分を高速DNAシーケンシングすることによって、そこに含まれる全てのフラグメントDNAについてのリード配列データを取得する段階と、前記リード配列データの全てについて、前記指標配列部分の有無を検査し、前記指標配列を有するリード配列データを抽出する段階と、前記抽出されたリード配列データの全てについて、予め決定されたパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理を行うことにより、複数の配列クラスタを形成し、前記配列クラスタのそれぞれについて、当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を取得する段階と、前記配列クラスタのそれぞれに対応付けられた当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を含むデータベースを構築する段階と、を具備し、前記パラメータが、配列の類似性と配列長と指標配列に関するパラメータであることを特徴とするゲノムまたは転写産物の網羅的フラグメント解析のためのデータベース構築方法。前記フラグメントDNA混合液の第2の一部分を電気泳動し、得られた電気泳動結果から各フラグメントに由来するバンド群またはピーク群の強度と電気泳動配列長とをリファレンスプロファイリングの各データとして取得する段階と、前記各配列クラスタの前記コンセンサス配列の配列情報、塩基数および当該配列クラスタを構成する配列数と、前記リファレンスプロファイリングのバンド群またはピーク群に対応付ける段階と、を更に具備する請求項1に記載のデータベース構築方法。前記対応付けが、前記コンセンサス配列の配列情報及び塩基数と前記リファレンスプロファイリングのバンドまたはピークの電気泳動で得られた分子量との関係を第1のパラメータとして用い、及び前記コンセンサス配列の配列クラスタを構成する配列数と前記リファレンスプロファイリングのバンドまたはピークの強度との関係を第2のパラメータとして使用することにより、当該コンセンサス配列と当該リファレンスプロファイリングとを対応付けることを特徴とする請求項2に記載のデータベース構築方法。前記対応付けが、当該配列クラスタを構成する配列数および塩基数と、当該電気泳動で得られたバンドまたはピークの強度および電気泳動配列長とについての一致度をスコア化し、合計スコアが最大になる組み合わせを選択することにより、当該配列クラスタと当該バンドまたはピークとの対応付けが行われることを特徴とする請求項2または3に記載のデータベース構築方法。前記対応付けにおけるずれと配列長および分子量との関係およびまたはずれと内部塩基組成との関係に基づいて、前記対応付を較正することを更に具備する請求項1~4の何れか1項に記載のデータベース構築方法。前記データベースを構築する段階に続いて、当該試料の由来する動物種と同じ動物種の既知遺伝子配列情報を検索し、当該コンセンサス配列と当該同種の既知遺伝子を比較することにより、当該方法おいて得られたコンセンサス配列の信頼性をデータ化する段階を更に具備する請求項1~5の何れか1項に記載のデータベース構築方法。前記データベースを構築する段階に続いて、前記配列クラスタのコンセンサス配列と前記クラスタを構成するリード配列のアライメント情報に基づいて、各配列クラスタのコンセンサス配列についての信頼性をデータ化することを更に具備する請求項1~6の何れか1項に記載のデータベース構築方法。前記データベースを構築する段階に続いて、既知遺伝子配列情報を検索し、当該コンセンサス配列と既知遺伝子配列情報とを比較することにより、当該方法において得られたコンセンサス配列に既知遺伝子配列情報を付与することを更に具備する請求項1~7の何れか1項に記載のデータベース構築方法。対象試料に含まれるゲノムまたは転写産物から得られたDNAを断片化し、更に識別可能な指標配列を付与することによって対象フラグメントDNA混合液を得る段階と、前記対象フラグメントDNA混合液を電気泳動し、得られた電気泳動結果からバンドまたはピークの強度および電気泳動配列長を遺伝子同定対象プロファイリングのデータとして取得する段階と、前記遺伝子同定対象プロファイリングのデータと、当該対象試料の種類に依存して請求項2~8の何れか1項に記載の方法により予め構築されたデータベースの当該コンセンサス配列および当該リファレンスプロファイリングのデータとを対応付けることにより当該対象試料に含まれるゲノムまたは転写産物について遺伝子同定する方法。前記対応付けが、遺伝子同定対象プロファイリングに含まれるバンドまたはピークの強度および電気泳動配列長のデータと、当該リファレンスプロファイリングのバンドまたはピークの強度および電気泳動配列長とを対応付けて、それにより当該対象試料に含まれるゲノムまたは転写産物の遺伝子情報を得ることを特徴とする請求項9に記載の方法。前記対応付けが、遺伝子同定対象プロファイリングに含まれる電気泳動配列長のデータを、当該リファレンスプロファイリングのバンドまたはピークの電気泳動配列長および当該配列クラスタの塩基数とその配列数から作成された疑似プロファイリングとを対応付けて、それにより当該対象試料に含まれる転写産物の遺伝子情報を得ることを特徴とする請求項9に記載の方法。第1~第nの対象試料にそれぞれ含まれるゲノムまたは転写産物から得られたDNAをそれぞれ断片化し、更に指標配列をそれぞれ付与することによって第1~第nのフラグメントDNA混合液をそれぞれ得る段階とここにおいてnは2以上の整数を示す、前記第1~第nのフラグメントDNA混合液を、それぞれ高速DNAシーケンシングすることによって、各フラグメントDNA混合液にそれぞれ含まれる全てのフラグメントDNAについての第1~第nのリード配列データをそれぞれ取得する段階と、前記第1~第nのリード配列データそれぞれの全ての配列データについて、前記指標配列部分の有無をそれぞれ検査し、前記指標配列を有する第1~第nのリード配列データをそれぞれ抽出する段階と、前記抽出された第1~第nのリード配列データそれぞれの全てについて、予め決定されたパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理をそれぞれ行うことにより、第1~第nのクラスタ群をそれぞれ形成し、前記第1~第nのクラスタ群のそれぞれについて、当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報をそれぞれ取得する段階と、前記第1~第nのそれぞれの配列クラスタ群にそれぞれ対応付けられた当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を含む、第1~第nの配列クラスタ群情報を含むデータベースをそれぞれ構築する段階と、前記第1~第nの配列クラスタ群の間で、それぞれの当該コンセンサス配列の類似性によってそれぞれ互いに対応付け、当該それぞれに対応付けられた配列クラスタ間で、それらを構成する配列数をそれぞれ比較することにより、量の変化を伴う配列クラスタ群を検出する段階と、を具備する網羅的フラグメント解析方法。対象試料に含まれるゲノムまたは転写産物から得られたDNAを断片化し、更に指標配列を付与することによってフラグメントDNA混合液を得る段階と、前記フラグメントDNA混合液を、高速DNAシーケンシングすることによって、そこに含まれる全てのフラグメントDNAについてのリード配列データを取得する段階と、前記リード配列データの全ての配列データについて、前記指標配列部分の有無を検査し、前記指標配列を有するリード配列データを抽出する段階と、当該対象試料の種類に依存して請求項2~6の何れか1項に記載の方法により予め構築されたデータベースの当該コンセンサス配列との配列類似性をパラメータとして使用して、当該リード配列データのそれぞれについて配列のクラスタリング処理を行い、前記対象試料の配列クラスタ群をそれぞれ得る段階と、前記対象試料の配列クラスタ群と、前記データベースに含まれる当該配列クラスタ群とを比較して、前記対象試料の配列クラスタ群のみに存在するクラスタおよびまたは前記データベースの配列クラスタ群のみに存在するクラスタを検出する段階と、を具備する網羅的フラグメント解析方法。第1~第nの対象試料にそれぞれ含まれるゲノムまたは転写産物から得られたそれぞれのDNAをそれぞれ断片化し、更に指標配列を付与することによって第1~第nのフラグメントDNA混合液をそれぞれ得る段階とここにおいてnは2以上の整数を示す、前記第1~第nのフラグメントDNA混合液を、それぞれ高速DNAシーケンシングすることによって、それぞれそこに含まれる全てのフラグメントDNAについての第1~第nのリード配列データをそれぞれ取得する段階と、前記第1~第nのリード配列データのそれぞれの全ての配列データについて、前記指標配列部分の有無をそれぞれ検査し、前記指標配列を有する第1~第nのリード配列データをそれぞれ抽出する段階と、当該第1~第nの対象試料それぞれの種類に依存して請求項2~6の何れか1項に記載の方法により予め構築されたデータベースの当該コンセンサス配列との配列類似性をパラメータとして使用して、当該第1~第nのリード配列データのそれぞれについて配列のクラスタリング処理をそれぞれ行い、第1~第nの配列クラスタ群をそれぞれ得る段階と、前記第1~第nの配列クラスタ群にそれぞれ含まれる互いに同じコンセンサス配列毎に、当該クラスタをそれぞれ構成する配列数を比較して、前記第1~第nの配列クラスタ群間で異なる配列数を示す配列クラスタを特定する段階と、を具備する網羅的フラグメント解析方法。目的に応じて、請求項2~6の何れか1項に記載の方法により予めデータベースを構築する段階と、構築されたデータベースに含まれるコンセンサス配列に基づいて設計して準備したプローブ群を基体に固定化することによりマイクロアレイを作成する段階と、対象試料に含まれるゲノムまたは転写産物から得られたDNAを断片化し、更に指標配列を付与することによってフラグメントDNA混合液を得る段階と、前記プローブ群に対して前記フラグメントDNA混合液を接触させ、ハイブリダイズ信号を得る段階と、前記得られたハイブリダイズ信号に基づいて、当該対象試料に含まれる転写産物の存在を検出する段階と、を具備する網羅的フラグメント解析方法。目的に応じて、請求項2~6の何れか1項に記載の方法により予めデータベースを構築する段階と、構築されたデータベースに含まれるコンセンサス配列に基づいて設計して準備したプローブ群を1セットとして、n個の基体に1セットずつそれぞれ固定化することによりn個のマイクロアレイを作成する段階とここにおいてnは2以上の整数を示す、第1~第nの対象試料にそれぞれ含まれるゲノムまたは転写産物から得られたDNAをそれぞれ断片化し、更に指標配列をそれぞれ付与することによってフラグメントDNA混合液をそれぞれ得る段階と、それぞれ前記n個のマイクロアレイにそれぞれ固定された各プローブ群に対して前記第1~第nのフラグメントDNA混合液をそれぞれ接触させ、それぞれのハイブリダイズ信号をそれぞれ得る段階と、前記それぞれ得られたハイブリダイズ信号に基づいて、当該第1~第nの対象試料に含まれる転写産物の存在量を比較する段階と、前記比較により、前記当該第1~第nの対象試料の間で前記存在量に差がある転写産物を検出する段階と、を具備する網羅的フラグメント解析方法。断片化されて指標配列を付与された、試料に含まれるゲノムまたは転写産物からのフラグメントDNA混合液が、高速DNAシーケンシングされることによって取得されたリード配列データの全てについて、前記指標配列部分の有無を検査し、前記指標配列を有するリード配列データを抽出する手順と、前記抽出されたリード配列データの全てについて、予め決定された配列の類似性と配列長と指標配列に関するパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理を行うことにより、複数の配列クラスタを形成し、前記配列クラスタのそれぞれについて、当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を取得する手順と、前記配列クラスタのそれぞれに対応付けられた当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を含むデータベースを構築する手段と、を含む処理をコンピュータに実行させる、前記転写産物の網羅的フラグメント解析のためのデータベース構築用プログラム。上記の状況に鑑み、本願発明の目的は、簡便且つ高い信頼性を保持した遺伝子同定方法および発現解析方法、並びにそこにおいて使用される網羅的フラグメント解析におけるフラグメント配列データベース構築方法を提供することである。本発明の1態様に従うと、試料に含まれる転写産物を断片化し、更に指標配列を付与し、フラグメントDNA混合液を得る段階と、前記フラグメントDNA混合液の第1の一部分を高速DNAシーケンシングすることによって、そこに含まれる全てのフラグメントDNAについてのリード配列データを取得する段階と、前記リード配列データの全てについて、前記指標配列部分の有無を検査し、前記指標配列を有するリード配列データを抽出する段階と、前記抽出されたリード配列データの全てについて、予め決定されたパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理を行うことにより、複数のクラスタを形成し、前記クラスタのそれぞれについて、当該クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を取得する段階と、を具備し、前記パラメータが、配列の類似性と配列長に関するパラメータであることを特徴とするデータベース構築方法が提供される。本発明により、簡便且つ高い信頼性を保持した遺伝子同定方法および発現解析方法、並びにそこにおいて使用される網羅的フラグメント解析におけるフラグメント配列データベース構築方法が提供される。1高速DNAシーケンサを活用した網羅的フラグメント配列データベースの構築以下、図1を用いて高速DNAシーケンサを活用した網羅的フラグメント配列データベースの構築の1例について説明する。まず、データベースを作成するためのフラグメントDNA混合液を調製する。フラグメントDNA混合液は、データベースを作成しようとする試料に含まれるゲノムまたは転写産物を断片化し、指標配列を付与し、調製すればよい。これを網羅的フラグメント解析法のための混合液とする。試料は、細胞、組織および臓器などからそれ自身公知の何れかの手段によりゲノムまたは転写産物を含む混合液に調製されればよい。ゲノムまたは転写産物の断片化に先駆けてそれ自身公知の何れかの手段により行ってもよい。好ましくは転写産物からcDNAを調製し、これを断片化して、標識配列を付与する。ゲノムまたは転写産物から得られたDNAの断片化は、それ自身公知の制限酵素を用いて行ってよい。断片化されたDNAへの識別可能な指標配列の付加は、例えば、アダプタ配列を当該断片に付与することにより行ってよい。アダプタの付与は、各断片の5’末端および/または3’末端であってもよい。また、例えば、メイトペア法において実施されるように、アダプタの付与は、各断片の5’末端および/または3’末端に付与された後に、アダプタを付与された1つの断片の5’末端と3’末端とを結合し、環状核酸を形成した後に当該アダプタに対応する配列以外の部位において切断することにより直鎖状核酸を調製してもよい。アダプタの塩基配列およびその長さは、識別可能な限りで任意に決定してよい。ここで、指標配列とは、指標となるべき配列が識別可能な数の塩基配列を含むことを示す。このようなcDNA断片への識別可能な指標配列の付与は、例えば、HiCEP法、AFLP法、TRFLP法、CAGE法およびDifferentialDisplay法などのフラグメント解析法における指標配列を付与する方法を利用してよく、より好ましくはAFLP法、TRFLP法、CAGE法およびDifferentialDisplay法、最も好ましくはHiCEP法を利用して行ってよい。上述のフラグメント解析法を利用して、cDNA断片への識別可能な指標配列の付与し、更に、それらのフラグメントの混合液についてゲル電気泳動およびまたはキャピラリ電気泳動などの電気泳動によりバンドまたはピークおよび電気泳動配列長ここでは分子量または配列長またはフラグメント長ともいうを得ることにより解析する方法を行うことにより、一般的には網羅的にフラグメントが解析されてもよい。このように調製されたフラグメント混合液を高速DNAシーケンサにかけてリード配列を得る。ここで高速DNAシーケンサとは、長さの異なる複数種類の塩基配列について分離することなくシーケンシングできるシーケンサを示す。例えば、ロシュ社製454FLX、イルミナ社製GAIIシリーズHiSEQシリーズ、LifeTechnology社製SOLiDシリーズイオントレントPMGシリーズ、ヘリコス社製、パシフィックバイオ社製などにより提供されるシーケンサを使用することが可能であるが、これに限定するものではない。また、高速DNAシーケンサは、クローニング不要であってもよい。次に、リード配列の長さと類似性の2つの要素をパラメータとして利用して、コンピュータ処理により、リード配列をクラスタリング処理およびアッセンブリング処理する。それにより、高精度な配列クラスタとコンセンサス配列を作成し、各々の配列クラスタを構成するリード配列数を集計する。コンピュータ処理によるリード配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理について図9Aおよび図9Bを用いて更に詳しく説明する。なお、図9Aと図9Bは、同じ一連の工程を示すものであるが、便宜上、図9Aでは工程1~工程3について詳細に記載し、図9Bでは工程4~6について詳細に記載する。またここで、配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理の両方の処理を行う場合、この処理をクラスタリングアッセンブリングまたはクラスタリングアッセンブリング処理とも記す。ここで配列のクラスタリングは、クラスタリングおよびクラスタ化と交換可能に使用される語であり、予め決定したパラメータ、好ましくは塩基配列の類似性および/または配列長に基づいてグループ分けすることを示す。クラスタリングにより生じたグループをクラスタまたは配列クラスタと呼ぶ。互いに同じ長さの複数の配列からなるクラスタを整列クラスタと呼び、互いに異なる長さの複数の配列からなるクラスタを非整列クラスタと呼ぶ。1つのみの配列からなるクラスタをシングルトンとも称するが、シングルトンもクラスタとして使用されてよい。ここでアッセンブリングは、アッセンブリおよびアッセンブルと交換可能に使用される語であり、少なくとも部分的に共通する配列を有する複数の核酸配列から1つの代表的な配列であるコンセンサス配列を得ることをいい、また、アッセンブリングに供した配列のコンセンサス配列へのアライメント情報を得ることをいう。ここでリード配列とは、シーケンサから出力された配列をいう。ここでコンセンサス配列とはアッセンブリ処理により得られた人工的な配列をいう。工程1配列の分類網羅的フラグメント解析の検出対象となるフラグメントDNA配列の両端に特定の配列が出現する場合、その両端配列の両方または片方を評価し、クラスタリングアッセンブリングに使用する配列を振り分ける。具体的には、即ち、リード配列が指標配列を含むか否かが判断され、両端または片方の末端に指標配列が含まれる場合には、データベース作成のためのリード配列として抽出され、以下の工程において使用される。指標配列を含むか否かの判断は、判断の対象となるリード配列における指標配列の存在を確認すればよい。確認のために使用される指標配列は、アダプタ配列としてDNA断片に対して付与された配列に対応する塩基配列であってよく、アダプタ配列の全体に対応する塩基配列であっても、アダプタ配列の一部分に対応する塩基配列であっても、アダプタ配列に対応する配列に加えて更なる塩基を含む配列であってもよい。更なる配列を含ませる場合には、例えば、任意の数の任意の塩基Nアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンから選択される塩基を含ませてよい。また、任意の塩基Nを含ませる場合には、アダプタ配列に対応する配列の5’末端側または3’末端側に伸長するように含ませることが好ましい。任意の塩基Nを任意の数で含む場合、任意の塩基Nの数は、例えば、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上であってよく、好ましくは、1アダプタに対して2つで、且つ1つの配列の5’末端と3’末端の両側に2つずつ含ませる。しかしながら、当該断片の両末端に付与する場合、5’末端側と3’末端側側とでは互いに異なる数の任意の種類の塩基を含んでもよい。なお、指標配列は、リード配列の内部に存在していてもよいが、両末端に存在するのが好ましい。工程2クラスタリングアッセンブリングクラスタリングアッセンブリングを行ない、配列クラスタとそのコンセンサス配列を得る。前記抽出されたリード配列データの全てについて、予め決定されたパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理を行う。それにより、複数の配列クラスタを形成し、前記配列クラスタのそれぞれについて、当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を取得する。予め決定されたパラメータとして、例えば、配列の類似性、配列長およびまたは指標配列に関するパラメータ、好ましくは、配列の類似性と配列長と指標配列に関するパラメータを用いてよい。工程3クラスタリングエラーの修正得られた配列クラスタについて、コンセンサス配列とクラスタを構成する配列のアライメント情報を使用して、配列クラスタを構成する配列どうしの配列類似性と配列長の同一性を評価し、更に、コンセンサス配列同士の配列類似性と配列長を評価し、クラスタリングアッセンブリングの間違いや矛盾を検出し、作成されたクラスタを修正する。工程4クラスタの信頼性のデータ化工程3で得られた配列クラスタについて、コンセンサス配列とクラスタを構成するリード配列のアライメント情報から、各配列クラスタの代表配列としてのコンセンサス配列の信頼性をデータ化する。クラスタの信頼性を得るためには、例えば、クラスタのコンセンサス配列とそれを構成するリード配列について指標配列に隣接する塩基の評価を行なえばよい。その場合、指標配列に隣接する配列の数は、2以上、好ましくは2塩基であってよい。工程5既知遺伝子情報を利用したコンセンサス配列の信頼性のデータ化前記工程4で得られた配列クラスタのコンセンサス配列について、既知遺伝子情報転写産物、ゲノム、EST情報などが存在する生物種では、公知配列情報を検索し、コンセンサス配列の信頼性データを作成する。工程6コンセンサス配列への遺伝子情報の付与前記工程4で得られた配列クラスタのコンセンサス配列について、公知配列情報を検索し、配列に遺伝子情報を付与する。以上の工程により網羅的フラグメント解析データベース以下、DBとも記すを構築することが可能である。なお、工程4~工程6は、任意の工程であり、目的に応じて、例えば、より高い信頼性を担保したい場合や、具体的な遺伝子情報をデータベースに加えたい場合に行えばよい。また、工程1~工程6により得られるデータベースに含まれる成分の例を図2に示す。上記の工程1~工程6によって、データベースは、コンセンサス配列、配列クラスタの構成配列数、配列クラスタのコンセンサス配列長、アライメント情報、配列クラスタリングの信頼性データおよび配列クラスタの遺伝子情報を含み、これらの情報は関連して記憶部に格納されればよい。2電気泳動で得られるバンドまたはピークと配列の対応付け以下、電気泳動で得られるバンドまたはピークと配列の対応付けの手順の1例について図1を用いて説明する。上記1で得られた高精度なコンセンサス配列の配列情報と塩基数と配列クラスタを構成する配列数を利用して、シーケンス対象としたDNA混合液から得られる網羅的フラグメント解析の電気泳動のバンド群またはピーク群これらのデータを総称してリファレンスプロファリングと称すに対応付ける。コンセンサス配列の配列情報及び塩基数とバンドまたはピークの電気泳動で得られた分子量または電気泳動配列長、及び、コンセンサス配列のクラスタを構成する配列数とバンドまたはピークの強度の2つの要素を使用して、コンセンサス配列とリファレンスプロファイリングとを対応付ける。コンセンサス配列の対応付けには、あらかじめ多量の配列長とその電気泳動で得られた塩基数との対応付け実験を行なったデータを基に得られた配列の分子量および塩基組成による塩基数の較正情報で、較正を行った値を用いてよい。これにより上記1のデータベースに含まれるコンセンサス配列が、リファレンスプロファイリングと対応付けられる。31のデータベース、及び、2の対応付け情報を使用して、網羅的フラグメント解析で得られるバンドまたはピークの遺伝子同定法以下、網羅的フラグメント解析で得られるバンドまたはピークの遺伝子同定法の手順の1例について図3を用いて説明する。[方法1]工程1遺伝子同定対象の試料から得たプロファリング結果と2で使用したリファレンスプロファイリングを対応付けたデータを作成する。工程2遺伝子同定対象の試料から得た遺伝子同定対象バンド群またはピーク群から、上記工程1で作成した対応付けデータを利用して、リファレンスプロファイリングのバンドまたはピークを求め、さらに、2での対応付け情報から、上記1で作成したクラスタを求め、コンセンサス配列と遺伝子情報を求める。これにより、注目のバンド群またはピーク群と遺伝子情報との対応リストを作成する。工程3加えて、上記1の工程6で作成した遺伝子情報により、注目するコンセンサス配列を決定し、上記2で対応付けられたリファレンスプロファイリングのバンドまたはピークを介して、遺伝子同定対象の試料から得たプロファイリングのバンドまたはピークを求める。[方法2]遺伝子同定対象サンプルから得られた電気泳動結果のひとつもしくは複数のバンドまたはピークの電気泳動で得られた塩基数を上記2で使用したリファレンスプロファイリグのバンド、さらに、上記1で作成した配列クラスタとその配列数から作成した擬似プロファイリングおよびその遺伝子情報を並べて提示することで、遺伝子同定対象サンプルから得られた電気泳動結果の注目バンドまたはピークの遺伝子情報を得る。4網羅的フラグメント解析の高速DNAシーケンサによる検出高速DNAシーケンサにより、網羅的にフラグメントを解析し、例えば、目的とする遺伝子を検出することも可能である。このような方法の1例について図6を用いて説明する。測定対象の複数サンプルについて、それぞれ網羅的フラグメント解析法調整された混合液をサンプルごとに同じ種類の高速DNAシーケンサにかけて配列を得る。測定対象のサンプルからそれぞれ得られたリード配列について、1のデータベースをそれぞれ作成し、コンセンサス配列の類似性により、配列クラスタどうしを対応付け、対応付けられた配列クラスタ間で、構成する配列数を比較し、量の変化を伴う配列群を検出し、第1の対象試料と第2の対象試料の間で発現解析を行う方法配列数を比較する際は、全リード配列数もしくはクラスタリングに用いた配列数を使用して標準化を行ない比較してもよい。5データベースをリファレンスにした網羅的フラグメント解析の高速シーケンサによる検出更なる高速シーケンサによる網羅的フラグメント解析の例について図7を用いて説明する。あらかじめ測定対象となるサンプルについて上記1の手順を実施し、データベースを作成しておく。測定対象の複数サンプルについて、それぞれ網羅的フラグメント解析法で調整された混合液をサンプルごとに同じ種類の高速DNAシーケンサにかけて配列を得る。あらかじめ作成したデータベースで使用した高速DNAシーケンサと同じである必要はない。この配列をあらかじめ作成したデータベースのコンセンサス配列をリファレンスとして、これにアライメント処理等を行なうことで測定対象のリード配列をクラスタリングする。同じコンセンサス配列にクラスタリングされた配列の数を、測定サンプル間で比較し、量の変化を伴う配列群を検出し第1の対象試料と第2の対象試料の間で発現解析を行う方法配列数を比較する際は、全リード配列数もしくはクラスタリングに用いた配列数を使用して標準化を行ない比較してもよい。6データベースからプローブを設計して作成したマイクロアレイによる網羅的フラグメント解析方法更にマイクロアレイを利用する網羅的フラグメント解析方法の1例を図8を用いて説明する。あらかじめ測定対象となるサンプルについて1の手順を実施し、データベースを作成しておく。得られたコンセンサス配列をもとにプローブ設計を行い、マイクロアレイを作成する。測定対象の複数サンプルについて、網羅的フラグメント解析法で調整された混合液について、上記で作成したマイクロアレイを用いて量の変化を伴う配列群を検出し、第1の対象試料と第2の対象試料の間で発現解析を行う方法。7指標配列による検査および分類工程以下に、図18を用いて指標配列による検査および分類工程の更なる1例について更に説明する。シーケンスされた全リード配列を読み込み、それらのリード配列に必ず存在するべき既知指標配列との類似性データを算出する。その後、リード配列すべてに対して、一本ずつ、類似性データを参照し、既知の指標配列があるかどうかを確認する。既知の指標配列が確認できたリード配列は、クラスタリングに使用する配列として分類する。8クラスタリングアッセンブリング処理以下に、図19を用いてクラスタリングアッセンブリング処理の更なる1例について更に説明する。図19において各記号は次のことを意味する;M:クラスタのシーズとなるリード配列の番号N:シーズとなるM番目のリード配列の次のリード配列から最後の配列までを読み取るための番号I:生成されたクラスタ番号。クラスタリングに使用するリード配列をすべて読み込み、まず、クラスタのシーズとなるリード配列:M番目の配列を決定し、シーズ配列の次のリード配列から残り全部のリード配列について、順次シーズ配列とN番目の対象リード配列とで類似性と配列長を比較し、同じと判定されたならば、クラスタの記憶域のI番目のクラスタにリード配列を格納する。シーズ配列の検索がすべて終了した時点で、クラスタが確立する。その後、各クラスタでコンセンサス配列を得るために、各クラスタごとにアッセンブリングを行なう。9プログラム本発明の何れの態様に従う方法を行うために、各方法に含まれる工程ここでは段階とも記すを各手順としてコンピュータに実行させるためのプログラムが提供されてもよい。例えば、上述の1、2、3、4、5、6、7および/または8に含まれる段階を各手順として実施するためのプログラムが提供される。例えば、上記1の方法をコンピュータに実行させるためのプログラムが何れかの媒体に格納されて供されてもよい。そのようなプログラムは、例えば、次のようなプログラムである:断片化されて識別可能な指標配列を付与された、試料に含まれる転写産物からのフラグメントDNA混合液が、高速DNAシーケンシングされることによって取得されたリード配列データの全てについて、前記指標配列部分の有無を検査し、前記指標配列を有するリード配列データを抽出する手順と、前記抽出されたリード配列データの全てについて、予め決定された配列の類似性と配列長に関するパラメータを用いて配列のクラスタリング処理とアッセンブリング処理を行うことにより、複数の配列クラスタを形成し、前記配列クラスタのそれぞれについて、当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を取得する手順と、前記配列クラスタのそれぞれに対応付けられた当該配列クラスタの構成配列数、コンセンサス配列およびコンセンサス配列長、並びにアライメント情報を含むデータベースを構築する手段と、を含む処理をコンピュータに実行させる、前記転写産物の網羅的フラグメント解析のためのデータベース構築用プログラム。本発明の態様において使用されるコンピュータは、それ自体公知の何れかのコンピュータであればよい。本発明の態様に従い手続きを行うためのコンピュータの構成の1例を模式的に図44に示す。当該コンピュータは、処理管理部、記憶部、一時記録部、プログラム格納部、クラスタリングアッセンブリング処理部、指標配列検査部、補正データ格納部、類似性判定部および配列長判定部を含む。少なくとも処理管理部に対して、他の全ての構成部、即ち、記憶部、一時記録部、プログラム格納部、クラスタリングアッセンブリング処理部、標識配列検査部、補正データ格納部、類似性判定部および配列長判定部が、信号の授受可能に接続される。また、所望に応じて処理を行うための更なる構成部が含まれてもよく、そのような構成部は、信号の授受可能に処理管理部に接続される。全てのプログラムはプログラム格納部に格納される。処理管理部は、プログラム格納部に格納されたプログラムに従って、全ての処理を管理し実行させる。本発明の態様により構成されたデータベースは、記憶部に格納される。リード配列は、記憶部または一時記録部に格納される。指標配列検査部は、プログラム格納部に格納されたプログラムに従う処理管理部の指示により、格納された構成部から出力され、入力されたリード配列に指標配列が含まれるか否かを検査する。クラスタリングアッセンブリング処理部は、リード配列をクラスタリングおよびアッセンブリング処理する。補正データ格納部は、得られたデータについて補正を行うために使用されるデータを格納する。補正データ格納部に格納されたデータを出力させ、プログラム格納部から補正のためのプログラムを出力させ、それらに基づいて得られたデータについての補正を処理管理部が行う。類似性判定部は、プログラム格納部に格納されたプログラムに従う処理管理部の指示により、比較されるべき対象についての類似性に関する判定を行なう。配列長判定部は、プログラム格納部に格納されたプログラムに従う処理管理部の指示により、比較されるべき対象についての配列長に関する判定を行なう。更にコンピュータは、オペレータや高速DNAシーケンサなどからデータを入力するためにキーボードおよび/またはスキャナーなどの入力部を有してもよい。また更に、得られた結果を出力するためのモニターおよび/またはプリンターなどの出力部を有してもよい。尚、上記では、補正を処理管理部が行う例を示したが、コンピュータが更に補正部を有し、補正部が上述のようにデータの補正を行ってもよい。本発明者らは、従来の技術においては、次のような問題があることを見出している。このような問題も本発明により解決される。HiCEP法に代表されるようなDNA配列を制限酵素で切断し、末端に特定の配列を付与した断片配列を調整して、特定の配列を用いてPCRで増幅後電気泳動する方法、または、DNA配列を特定の配列を用いてPCRで増幅後電気泳動する方法、などで得られた断片DNA配列の電気泳動結果バンド群またはピーク群を、異なるサンプル間で比較し、強度の異なるバンド群またはピーク群を検出する方法がある以下、網羅的フラグメント解析手法と呼ぶ。網羅的フラグメント解析手法の代表的なものは次のような手法である。例えば、そのような手法には、HiCEP、AFLP、TRFLP、SAGE、CAGE、DifferentialDisplayと称される方法が含まれる。これらの網羅的なフラグメント解析法は、既存の配列データがなくとも、網羅的フラグメント解析が可能である。しかしながら、HiCEP法以外の方法は、網羅性が低い、または、フラグメントが短く遺伝子を特定できない、さらに、ひとつの配列から複数のバンドまたはピークが出現し解析が艱難であるという問題がある。HiCEP法は、他の網羅的なフラグメント解析とは異なり、解析対象となる1種類のmRNA配列またはゲノム配列断片スタート配列から、制限酵素で切断して1種類のフラグメントのみが生成されるように調整することを特徴とする方法で、さらに、検出のためのPCR工程で、アダプタ配列より内側に2塩基セレクション配列長いプライマーを使用し256通りのPCRと電気泳動を行うことで、約2万種類以上の断片配列を同時に独立した波形ピークとして得ることでき、その1ピークが元となる配列1種類と対応付くという特徴を持った方法である。よって、HiCEPで得られた電気泳動結果を比較し、サンプル間で強度が変化したピークは、そのフラグメントの元となる配列も同様に量的な差があることを検出できる方法である。さらに、PCRを利用した手法であるため低発現量の転写産物も検出可能であり、再現性も非常に良いため12倍以上の発現量差も検出できる。しかしながら、HiCEP法においても、その他の網羅的なフラグメント解析法同様、量に違いのあるバンドやピークを知ることができても、その配列を決定するには、分取という煩雑な工程を必要とする。これを解決するひとつの方法として、公知の配列情報を持つ生物種については、網羅的フラグメント解析をコンピュータで予測して配列を決定する方法が考えられたが、電気泳動長と配列長のズレや公知配列の情報過多による判別の困難さなどの問題で、バンドやピークの配列の予測ができても、その信頼性は低いというのが実状である。また、HiCEPにおいては、ES細胞を試料として、HiCEPで検出されたピークの約14000についてサンガー法のシーケンサを利用して配列を決定してデータベースを作成したが、このデータベースを作成するのに約3年の期間と大きなコストを必要として、この方法をHiCEP測定対象とするすべての試料で行なうのは現実的ではない。最近では、高速DNAシーケンサが登場し、これを利用してゲノムDNAやmRNAをシーケンスする研究がさかんに行なわれているが、読み取りの長さの制限やシーケンスする配列を作成する段階で配列を同じ長さにそろえる等、網羅的フラグメント解析の試料をシーケンスするには適当ではない方法が使われている。また、配列類似性のみでゲノム配列や転写産物にマッピングをして、遺伝子ごとにクラスタリングする方法を取るため、配列情報がない生物種に適用できないことはもちろんのこと、マッピングエラーなどのバイアスがかかり、メジャーな配列群以外は期待される再現性が得られない。また本発明は、次のような効果を奏することが可能である。1注目バンドまたは注目ピークの配列決定方法の簡易化網羅的フラグメント解析方法で得られた候補のバンド、または、ピークの配列を知るためには、それらのバンドやピークを分取してシーケンシングする必要がある。この注目しているバンド、または、ピークを検出した時点でその配列を知りえないということは、その後の解析を行う上で大きな障害となる。最も重要な欠点は、網羅的フラグメント解析の結果、多くの候補が得られた場合、それらのバンドまたはピークに情報が付与されていないため既知知見を利用して絞り込むことができず、科学的な根拠ではなく、その後の実験の容易さ等で分取対象を決定する必要があり、重要な遺伝子を候補から落としてしまうという問題である。もちろん、注目のバンド、または、ピークを全て分取して配列を決定するという方法も考えられるが、候補が多い場合には大きな費用と時間がかかる。もうひとつの問題点は、分取の手技そのものが煩雑であり、特に、バンドやピークが1ベース単位で蜜な状態では、クローニングを行なってシーケンスしなければならないなど、費用と時間のかかる工程になることである。この分取工程を省くためのひとつの方法として、ゲノム情報や転写産物情報のある生物に対して、HiCEP法をコンピュータによりシミュレーションし、既知の配列から得られる仮想的なフラグメント配列を、電気泳動のバンドもしくはピークの分子数とマッチングを行い、バンドあるいはピークの配列を予測する方法も構築した。しかしながら、電気泳動で得られる配列長電気泳動長と呼ぶと対象のフラグメントの実際の配列長はかならずしも一致しないこと、また、バンドやピークの数に比べて既知の配列の種類が多くなり候補の配列が多くなってしまうこと、これらのことから配列長だけで正確に配列とバンドまたはピークと対応付けられないことがわかった。もうひとつの方法として、対象サンプルについて、すべてのバンドまたはピークについて、あらかじめ配列を決定してデータベースを作成しておくことで分取工程を省くことができると考えた。そこで、ES細胞について、HiCEPを実施し、サンガー法のシーケンサを仕様して、得られたピーク約14000について配列を決定し、データベースを作成した。その結果、ES細胞の解析には有用であったが、このデータベースを作成するには、膨大な時間と期間が必要で、HiCEPを適用する生物種や試料ごとにこの方法でデータベースを作成することは困難であることがわかった。網羅的フラグメント解析法に、高速DNAシーケンサを併用する本法で配列をデータベース化することで、これまでとは比べ物にならないほど、短い期間と低コストで、バンド群またはピーク群の配列を網羅的に同定することができるようになる。さらに、本法では、公知配列を必須としないため、公知配列がない生物種においても本法を適用できる。そのことは、本法を適用することで、網羅的フラグメント解析法のバンド群やピーク群の配列を同定するという効果だけではなく、ゲノムや転写産物の網羅的断片配列を手にいれることができるという効果もある。2網羅的フラグメント解析の新たな検出方法上記1の課題である網羅的フラグメント解析法で得られるバンドやピークの配列を決定することは重要な課題であるが、網羅的フラグメント解析法の差のあるフラグメントの検出方法として、高速DNAシーケンサを利用することも考えられる。しかしながら、高速DNAシーケンサを利用する場合、通常は、シーケンス対象の配列群をランダムに切断し、配列の長さをそろえてシーケンスしなければならない。また、シーケンスした配列をクラスタリングするには、リファレンスとなる既知配列が必要である。よって、網羅的フラグメント解析法で得られるcDNA調製液を高速DNAシーケンサでシーケンシングし解析することは難しいと考えられている。網羅的フラグメント解析法のcDNA調整液を高速DNAシーケンサでシーケンシングし、本法でデータベースを構築することにより、配列クラスタごとのコンセンサス配列と構成配列数を得ることができる。このコンセンサス配列を構成配列を使用して、量に差のある配列クラスタを求めることできる。これは、高速DNAシーケンサの問題はあるものの、バンド群やピーク群をPCRと電気泳動で求めるのではなく、直接、配列クラスタ間のリード配列数を比較することができ、バンド群やピーク群と配列クラスタとの対応付けを必要としないメリットがある。さらに、本法で作成された配列クラスタのコンセンサス配列をリファレンス配列として利用する前提でし、測定対象の試料から網羅的フラグメント解析法で調整されるDNA混合液に対して、既存解析法高速DNAシーケンサのRNAseqやマイクロアレイを適用することで、既存解析法の欠点をおぎないながら網羅的フラグメント解析法の特徴を生かした解析が可能となり、さらに、信頼性データも格納された高精度な配列クラスタの情報を利用できることで、既存解析法を適用するよりもより高精度な解析が可能となる。HiCEP法Highcoverageexpressionprofilingmethodは、網羅的フラグメント解析の方法のひとつで、微量の試料から網羅的高精度に遺伝子発現解析を行う方法である。HiCEP法の最大の特徴は、低発現転写物も再現性良く高精度に解析可能な点である。更に、本法はあらかじめ遺伝子配列情報を必要としないため、ゲノム情報が明らかではない生物種にも適用可能である。しかしながら、プロファイリングピークとして得られる転写産物の塩基配列予測が困難であることも意味する。よって、HiCEP法で得られる網羅的フラグメント解析の発現プロファイルにおける電気泳動ピークの塩基配列同定を本法で実施した。本法の利用イメージは、図20に示す通り、あらかじめ測定対象となる試料をHiCEP法で調製し、本法でシーケンシングしクラスタリングアッセンブリングし配列クラスタのデータベースを作成後、同じ調製試料から得たHiCEPのリファレンスプロファイリングのピークとクラスタの対応付けを行なったデータを保存しておく。その後、データベースを作成した試料と同様の生物種組織ではあるが異なる試料について、HiCEPを実施し、解析対象プロファリングを得、注目する電気泳動ピークをリストアップしたのちに、あらかじめ作成しておいた配列クラスタのデータベース及びクラスタとリファレンスプロファイリングのピークとの対応付けデータを使用して、注目ピークの配列を決定する方法である。HiCEPの具体的な手法は、図10で示すように、生物試料から抽出したRNATotalRNA、もしくは、精製したmRNAの試料をもとに、まず二重鎖のcDNA群を生成し、これを適切な2つの制限酵素によって切断し、それぞれの末端に特徴的なアダプタを付与したcDNA断片群のみの調製液を作成する方法である。このとき、両端に異なるアダプタ配列を付与されたcDNA断片は、スタートのmRNA1種類から1種類しか生成されないのがHiCEPの特徴である。さらにHiCEP法では、図11で示すように、cDNA断片群の調整液を256分割し、両端のアダプタ配列既知の配列より2塩基長いプライマーを16種類作成し、256種類の異なるプライマーの組み合わせでPCRを行って、図12のようにそれぞれのPCR産物をサイズマーカとともにキャピラリー電気泳動装置にかけて、電気泳動の波形パターンとピークの電気泳動配列長及び蛍光強度のデータを、プロファリングデータとして得る手法である。このHiCEPで得られたプロファリングピークの配列同定を、マウスES細胞E14を試料として本法により実施した。1高速DNAシーケンサを活用した網羅的フラグメント配列データベースの構築マウスES細胞E14totalRNA1μgを用いてHiCEP法を実施した。次に、HiCEP法の工程の内、図10で示す工程で得られた鋳型cDNAs両端に指標配列であるHiCEP法で用いるアダプターを有する配列の混合物。長さの分布は約60baseから約800baseについて、シーケンシングに必要なDNA量を得るため、アダプター上のプライマーにて増幅を行った。その後、プライマーダイマーおよびアダプターダイマー画分の除去を目的とし、アクリルアミドゲル電気泳動による精製を行い70baseから100base以下のフラグメントを除去した。その精製物をRoche社製高速DNAシーケンサであるGS454FLXSystemにてシーケンシングを行った。尚、シーケンシングライブラリー作製時、DNAの断片化は行わなかった。シーケンシングにより、1回目2分の1プレートは469318配列、2回目2プレートは1868178配列を得た。これらの配列群について、配列の長さと類似性のふたつの要素を利用して、コンピュータ処理により、クラスタリングアッセンブリングし、高精度な配列クラスタとコンセンサス配列を作成し、それを構成するリード配列数を集計してデータベース化する次のような工程を開発した。工程1:指標配列HiCEP法に用いるアダプタ配列による検査と分類HiCEP法の検出対象となる、図10のcDNA断片の両端には、必ず特定の指標配列であるアダプタ配列が付与される。すべてのリード配列について指標配列を評価し、クラスタリングアッセンブリングに使用する配列を振り分ける。具体的には、図13で示すように、アダプター配列にセレクション塩基NNまでを加えたマスキング配列32種類で、crossmatchワシントン大学プログラムにより、全リード配列を類似性検索し、一定の類似度以上でアダプター配列が両端または片側に確認できる配列をクラスタリングアッセンブリングの対象とする。crossmatchのパラメータcrossmatchプログラムのパラメータは、次の通りである。Aミスマッチギャップのペナルティ値を最小にするpenalty1gapinit1gapext1454のリードエラーの特性モノポリマー1種類の塩基が連続している場合に、リード配列ごとにその連続している領域の塩基数のばらつきが大きくなる特性を考慮して、ギャップのペナルティ値を最小にする。Bワードサイズを小さめにとるminmatch5ペアワイズアライメントを出来るだけ多く検出出力するようにする。C最低スコア値を小さくとるminscore15指標配列MspI側MseI側それぞれのアダプタ配列を指標配列としてcrossmatchへの入力マスク配列とする。実際に使用した配列は、図13のように、アダプタ配列だけではなくNNのセレクション塩基2塩基部分も加えた配列を指標配列とした。これによって、全パターンを網羅するためには、MspIMseI各16種類ずつ計32種類のアダプタ配列を使用した。なお、NNのセレクション塩基を含まないアダプタ配列を指標配列ともできるが、32種類のアダプタを使用したほうが、確認できる指標配列をやや多く確認できるため、32種類のアダプタを採用した。crossmatchによって検出されたアダプタの分類図27で示すようなcrossmatchの出力を使用して、正しいHiCEPフラグメントを得るために、crossmatchによって検出されるアダプタを次の4種類に分けて考える。A高品質アダプタ:アライメントにNNを含む高スコアのアダプタB救済可能な低品質アダプタ:アライメントは短いが置換ギャップがなく、NNを含んでおり、内部配列は高品質であることが期待できるアダプタC低品質アダプタ:低品質かつ救済できないアダプタD偽アダプタ:アダプタに似た内部配列をcrossmatchがアライメントしたと思われるもの実際にはアダプタとして存在しないと思われる部分。D高品質アダプタの判定条件アダプタ配列NN33bpの内、29bp以上が一致する図13を参照。E救済可能な低品質アダプタの判定条件HiCEP法の特徴を生かすためにセレクション塩基NNを含む19bpがすべて一致する図13を参照。F配列の分類確認されたアダプタの種類が、高品質アダプタか救済可能な低品質アダプタである配列をクラスタリングアッセンブリングに使用する配列とする。本実施例では、全リード配列の内、300635配列641が両端にアダプタが確認できた配列であった。また、112365配列239が片側のアダプタのみが確認できた配列であった図13を参照。工程2:クラスタリングアッセンブリングクラスタリングアッセンブリングに使用する配列の内、実施例では両端にアダプタが確認できた配列を対象として、クラスタリングアッセンブリングして、HiCEPフラグメントのコンセンサス配列を生成する。これにより、個々のリード配列のエラーが除かれ、より正確なHiCEPフラグメント配列が得られる。加えて、コンセンサス配列を構成するリード配列の数をHiCEPフラグメントの転写量の参照データとすることができる。A前処理前処理として、クラスタリングアッセンブリングに使用するアダプタ配列が確認できたすべてのリード配列について、確認できたアダプタ配列を含むアダプタ配列の位置から外側を除去し図21参照、さらに、除去した配列の端に本来のアダプタの塩基配列を人工的に付与する。加えて、シーケンサーから出力された各リード配列のクオリティ値の情報についても、確認できたアダプタ配列の位置から外側を除去し、人工的に付与されたアダプタに対応する部分に、クオリティ値の最高点を付与する。上記の前処理を行なった配列群を入力として、クラスタリングアッセンブリングプログラムを実行し、配列クラスタ情報と各配列クラスタの配列アライメント情報、及び、各配列クラスタのコンセンサス配列を得る。Bクラスタリングアッセンブリングソフトウエアクラスタリングアセンブリングには、配列類似性のみでクラスタリングアッセンブリングを行なうTGICLプログラムハーバード大学のウェブサイトhttpcompbiodfciharvardedutgisoftwareで公開を利用する。なお、配列のアッセンブリングはTGICLに付属したアッセンブリングプログラムCAP3を用いる。CTGICLのパラメータパラメータv2はアッセンブリング時に許容するオーバーハング配列の端を無効にして、アッセンブリング結果から除外する部分の塩基数を最小にする設定である。アッセンブリングにおいては、入力配列は両端に共通のHiCEPアダプタ配列が付加された配列なので、オーバーハングのあるアライメントが出力された場合には、そのクラスタが正常にアッセンブリング出来てないことを示すため、エラークラスタが認識可能となる。クラスタリングアッセンブリングに関する以下のパラメータにはデフォルト値を使用した。クラスタリング最小オーバーラップ長40bpオーバーラップの一致率94アッセンブリング最小一致率93Dシングルトン配列の収集通常、ランダムに切断された試料をシーケンシングして得られる配列は、類似性で帰属するゲノム領域や遺伝子を判定し、クラスタを形成し、知見へと結び付けていく。このような場合、シングルトン配列はクラスタを形成していないとして知見を得るためのシグナルとしては扱われない場合もある。しかしながら、本法で得られるシングルトン配列は、指標配列が確認された配列HiCEP法ではアダプタ配列が確認された配列で、信頼性も高く、その配列が1本シーケンシングされたという事実も知見を得るために利用できる。よって、本法では、シングルトン配列についても有効利用できるように、処理対象とするよって、本明細書で、クラスタという場合は、シングルトン配列のみのクラスタも指す場合がある。tgiclの処理において、シングルトン配列は、クラスタリングアッセンブリングの2つの処理段階で別々に発生する。アッセンブリング時に生じたシングルトン配列は、アッセンブリングを実行したスレッド毎に作成されるsingletsファイルに出力されるが、クラスタリング時に除外されたシングルトン配列の情報は出力されない。このため、クラスタリング時に除外された配列を特定して、シングルトン配列として取り出さなければならない。tgiclはクラスタリング終了時にクラスタ化できた配列名のリストをファイルに出力するので、このファイルを利用して、クラスタリング時に除外されたシングルトン配列を取得する。以下にシングルトン配列の収集手順を示す。Aクラスタ化された配列名リストを編集して、1行1配列名の形式でファイルを作成するBFASTA形式の入力ファイルから、全入力配列名の1行1配列名の形式のファイルを作成するC上の2つのファイルを連結ソートして配列名が1行だけの行をとりだすD入力配列の配列データベースを作成し、で取得した配列をFASTA形式で抜き出すEアッセンブリング時のシングルトン配列ファイルとのファイルを連結する工程3:配列長によるクラスタリングエラーの修正tgiclのアッセンブリング結果のアライメント情報はace形式のファイルに出力される。HiCEP法で得られたcDNAから生産される配列クラスタの構成配列すべておよびそこから得られるコンセンサス配列は、配列が類似していることはもちろん、全長にわたり配列がアライメントされている整列クラスタでなければならない。A配列クラスタの検査上記原則に従って、このaceファイルの内容をコンティグ毎に以下の点を検査して、アッセンブリングエラーの判定を行う。Aリードの全長が有効にアッセンブリングされているコンティグを構成する全てのリード配列にクリップされた部分アライメント中でリードの端が無効化され、コンセンサス配列の形成に寄与しない部分が無いことBリードがコンセンサスコンティグ配列の全長にアライメントされているコンセンサス配列にアライメントされたリード配列の両端がコンセンサス配列の両端に一致し、コンセンサス配列の途中からアライメントされることがないこと。上のABの条件を満たさない配列クラスタを非整列クラスタとし、これはエラークラスタであると判定する図14参照。Bエラークラスタの修復上記Aでエラークラスタと判定されたクラスタコンティグの構成配列を取り出して、そのクラスタごとに個別に再度アッセンブリングしてコンセンサス配列を取得することで、エラークラスタを修正する図14参照。A反復アッセンブリング個別アッセンブリングにはCAP3を用い、始めに一致度93でアッセンブリングを試みる。アッセンブリング結果がエラークラスタと判定されなくなるまで、一致度のパラメータを1ずつ上げて反復してアッセンブリングを行っていく。起動パラメータには、オーバーハング長に0を指定するk0を設定する。Bアッセンブリング結果のマージaceファイルの修正エラークラスタ修復前のtgiclが出力したaceファイル対して、修復後に生成されたアライメント情報で修正を行なう。i個別アッセンブリングしたクラスタのリストを作成するiitgiclが出力したaceファイルを先頭から順に読み込み、個別アッセンブリングしたクラスタがあれば、そのクラスタの情報を削除するiii削除した位置に個別アッセンブリングしたクラスタ情報を挿入する。このときに、コンセンサスコンティグ配列名は元ファイルの名前に枝番を付加した名前を付与する。枝番はに続く0埋めした4桁の数字を0001から順に付与する。Dシングルトン配列の収集個別アッセンブリングで発生したシングルトン配列は、個々の入力クラスタ毎のsingletsファイルに出力されている。これらのファイルを連結して、tgiclの結果から作成したシングルトン配列のファイルに追加する。本実施例では、表1で示すように、全リード配列469318の内、両端アダプタが確認できたリード配列300635配列にこれを実施し、15326のクラスタ2本以上の配列が同じものと判定されたグループと284554配列のシングルトン他に同じ配列がないと判定された配列を得ることができた。全リード配列1868178の場合については表1を参照のこと。工程4:クラスタの信頼性のデータ化上記工程3で得られたクラスタ配列に対して、HiCEPのセレクション配列部分がどの程度確からしいかを評価する。具体的には、配列クラスタのコンセンサス配列と構成リード配列について、配列の類似性をスコア化した。これにより、2のプロファイリングの対応付け処理等、作成されたクラスタ情報を使用する際、ここで算出した配列クラスタの信頼性を閾値にした処理を行なうことができるようになる。A前処理クラスタリングアッセンブリング結果から、セレクション評価を行うために下記の前処理を行う。アダプタ配列から配列の向きを確認し、順鎖方向に変換するアダプタ配列をCCGGTTAAに置換する。Bコンセンサス構成配列による評価コンセンサス構成配列による評価では、下記の二種類のスコアを5’端と3’端についてそれぞれ計算する。セレクション塩基の構成配列割合コンセンサス構成配列のセレクション一致率を評価し、ピーク対応付けがうまくいかない場合の修正候補となる。理想な場合のスコアは第一候補が100で、第二および第三候補は0である。ただし、ヘテロのSNPがセレクション部分に入っていた場合、第一候補と第二候補が50ずつとなる図23参照。制限酵素サイトから内側5塩基のコンセンサス配列と構成配列の編集距離平均図24参照理想な場合のスコアは0である。ただし、ヘテロのSNPがセレクション部分に入っていた場合、05となる。セレクション塩基の構成配列割合を計算する際に、セレクション塩基として認識される塩基を図23に示す。Cクラスタの分割256通りのPCR及び電気泳動を行なうHiCEP法の場合、セレクション塩基アダプタ配列から内側の2塩基は、2のプロファイリングの対応付け処理を行なう際に重要なデータとなる。そこで、本実施例では、すべての配列クラスタについて、アダプタ配列の内側2塩基のそれぞれの位置について、コンセンサス配列の塩基と配列クラスタを構成する各リード配列の塩基をデータ化した。これにより、本実施例のHiCEP法の場合、2のプロファイリングの対応付けの処理において、ひとつの配列クラスタの構成リード配列のセレクション塩基位置の塩基が2種類に分かれる場合は、そのセレクション部分にヘテロなSNPが存在すると判定し、クラスタをふたつにわけることができるようになる図15。工程5:既知遺伝子情報を利用したコンセンサス配列の信頼性のデータ化上記工程4で得られた配列クラスタのコンセンサス配列について、既知遺伝子情報転写産物、ゲノム、EST情報などが存在する生物種では、公知配列情報を検索し、コンセンサス配列の信頼性データを作成する。A類似性検索の実行すべての配列クラスタとシングルトンについて、コンセンサス配列またはシングルトンのリード配列を既知公共データベースに類似性検索をかけ、その出力をデータ化する。mRNA:blastndustnotaskmegablastゲノム:blatパラメータなし。Bカテゴリ分類公共データベースへの類似性検索結果を、下記の4つのカテゴリに分ける。ただし、9595は塩基の一致率95以上アライメント長がクエリ長の95以上を表し、9520baseは塩基の一致率が95以上アライメント長が20塩基以上を表す。19595かつCCGGTTAAが存在する29595でCCGGTTAAの両方または片方が1塩基違いで存在する39520baseで末端部分にヒットし、CCGGTTAAが存在する49520baseで末端部分にヒットし、CCGGTTAAが1塩基違いで存在する。また、制限酵素サイトを探す場合は、下記のようにアライメント位置から前後2塩基を加えた中で探す。クエリ配列ccGGXXXXXXサブジェクト配列yyzzZZYYXXXX。大文字がアライメントされた配列で、この例ではクエリ配列の3塩基目からアライメントが始まっている。サブジェクト配列でクエリ配列の制限酵素サイトと同じ座標となる配列に前後2塩基を加えたyyzzZZYYの中でCCGGを探すこととなる。1塩基違いで制限酵素サイトを探した場合、yyzzZZYYの中に複数個所の候補が存在する場合がある。たとえば下記の配列の場合CCNGGXXCCNGGXと考えてGXをセレクションととるか、CNGGXXと考えてXXをセレクションととるかの二通りがある。これらは、配列のみでは判断できないので、候補が複数ある場合は、両方ともデータとして残すこととする。すべての配列クラスタとシングルトンについて、コンセンサス配列またはシングルトンのリード配列と類似性のあった既知転写産物のIDと類似性のあった領域及びスコア、また、類似性のあったゲノム配列の染色体番号と類似性のあった領域及びスコアをデータと格納した。これにより、2のプロファイリングの対応付け処理等、作成されたクラスタ情報を使用する際、ここで算出した配列クラスタの信頼性を閾値にした処理を行なうことができるようになる。加えて、すべての配列クラスタのコンセンサス配列について、アダプタ配列の内側2塩基のそれぞれの位置について、コンセンサス配列の塩基と類似性のあった公知配列の塩基をデータ化した。これにより、本実施例のHiCEP法の場合、3の配列同定処理において、異なる個体の試料の場合、対応する配列クラスタが存在しない場合も、SNPが存在すると仮定して検索処理を行なうことができる。工程6:コンセンサス配列への遺伝子情報の付与上記工程4で得られた配列クラスタのコンセンサス配列について、公知配列情報を検索し、配列に遺伝子情報を付与する。対象生物が既知遺伝子情報転写産物、ゲノム、EST情報などが存在する生物種であれば、工程5において、その情報は付与されている。しかしながら、網羅的フラグメント解析では、未知の転写産物を多く検出することもある。よって、工程6においては、配列クラスタのコンセンサス配列について、すべての生物種、または、特定の複数の生物種の公知配列情報を類似性検索し、それぞれのコンセンサス配列に類似性の高い公知の配列を対応付ける。2電気泳動で得られるバンドまたはピークと配列の対応付け個々の配列クラスタとその配列のシーケンス対象のHiCEP法で得られた鋳型cDNA液からPCRと電気泳動を行って得られたプロファリングである電気泳動のピーク群ES細胞のリファレンスプロファリングの対応付け方法を開発した。対応付けには、1で得られた各配列クラスタのコンセンサス配列の配列と配列長、配列クラスタを構成するリード配列数を使用する。工程1:配列長の補正電気泳動長と電気泳動対象となった配列の配列長は、かならずしも一致しないことが知られている図39参照。本法では、ピークと配列を一致させるためには、電気泳動長と配列長のズレはひとつの課題である。この課題を解決するために、既存のマウスES細胞にHiCEP法を適用したデータベースにおいて、対応付け済みのピーク37675とその配列のデータを利用して、塩基組成や分子量と電気泳動長と配列長のズレとの関係を検討した。その結果、塩基組成や分子量による補正が可能で、ピーク対応付け精度を向上させることができることがわかった。ひとつは、ズレが配列の塩基組成はTGまたはAC含量と相関していることがわかった図42参照。また、分子量によっても、ズレに傾向があることがわかった図41参照。その効果としては、図16のように、既存のマウスES細胞で補正しない場合、ズレが±2bp以内の配列が89であるのに対して、塩基組成と分子量で補正することで、96に増加することがわかった。また、工程2についても、補正を行なわずに工程2を実施した場合の正解率は66であったが、補正を行なうことによって77に増加することがわかった。Aずれと配列長、分子量との関係を用いた較正既知のシーケンスデータより、明らかに不適切なデータを除去した後、既知のシーケンスデータの電気泳動長と対応する配列長とのずれと配列長との関係を検討したところ、図40のように、配列長によりずれに偏りがあることがあることが分かった。また、ずれと分子量との関係を散布図で表すと図41のようになった。分子量は配列長と比べるとより単位が細かいために、細かい較正を行うには分子量を利用した較正が良いので、分子量での較正表を採用する。較正表の作成には、局所回帰平滑化関数であるloess関数を用いた。Bずれとシーケンスの内部塩基組成との関係を用いた較正ずれと配列の内部塩基組成との関係を調べるために、Aで計算したずれと分子量との関係を用いた較正後のずれと配列の内部塩基組成との関係を検討した結果、A、C含量割合とAで較正した後のずれとの間に負の相関関係があること、T、G含量割合とAで較正した後のずれとの間に正の相関関係があることがわかった。較正の結果を大きくするために1で較正した後のずれとAC含量割合との関係、及びTG含量割合との関係を散布図で表すと図42のようになった。A、C、T、G単体よりもはっきりとした相関があるように見えた。上記1で較正した後のずれとAC含量割合との関係、及びTG含量割合との関係より較正表を作成し、較正を行う。較正表の作成には、局所回帰平滑化関数であるloess関数を使用する。C較正表を用いた電気泳動長の予測補間には線形補間を用いた。求めたい点Xの前後に較正表に記載されている点A、Bが存在する場合の求めたい点Xの較正値yxは下式の通りになる図43参照。工程2:配列クラスタとピークとの対応付け処理各配列クラスタのコンセンサス配列の工程1で補正された配列長とHiCEP法で得られたプロファリングである電気泳動のピークの電気泳動長、及び、配列クラスタを構成するリード配列数と電気泳動で得られたピークの強度のふたつの値を使用して、配列クラスタとHiCEPのリファレンスプロファイリングのピークとの対応付けを行なった。具体的には、次の手順で行なう。クラスタリングアッセンブリング処理結果から擬似ピークを生成擬似ピークへピーク長較正を適用同じピーク長の擬似ピークを1つの擬似ピークにまとめるピーク対応付けアルゴリズムによる対応付け。この結果、ES細胞のHiCEP法で得あられたプロファイリングピーク21778に対応付けられたピークの数12551ピーク576で、その内77をコンピュータ処理によって同定することができた。クラスタリングアッセンブリング処理結果から擬似ピークを生成配列クラスタのコンセンサス配列またはシングルトン配列に対し、ピーク長高さを次のように割り当て、擬似ピークを生成する。ピーク長:コンセンサス配列のセレクション塩基を含む塩基数34ピーク高さ:当該配列クラスタのリード数。配列長から電気泳動長への補正値34は次のように決定される。PCR時に使用されるプライマー配列の長さ40塩基とPCRで人工的にチミンが末端に結合された分で41塩基が、HiCEPのセレクション塩基を含みフラグメントDNA配列の外側に付加された配列がPCR産物となる。配列長は、アダプタ配列を除去した塩基数を用いるため、41塩基から、配列長に含まれるセレクション塩基2塩基の両端分の4塩基を引いた37塩基が、配列長を電気泳動長にするための補正値である。しかしながら、アプライドバイオシステムズ社製のキャピラリー電気泳動装置特に3100では、この理論的な補正値より3塩基少ない電気泳動位置に現われることがわかっており、よって、理論的な補正値から3塩基引いた値の34塩基を補正値とした。ピークの高さについては、リード数をそのままピークの高さに適用すると、プロファイルピークよりもかなり低い値になる。本システムのピーク対応付けアルゴリズムでは、高さの絶対値に影響を受けないためこれは問題にならない。一方、擬似ピークを視覚化する場合は、リード数=高さでは高さの関係が見えにくい。そこで、本仕様書での擬似ピークの描画では、リード数に一定の係数をかけて、プロファイルピークと同レベルの高さまで引き上げている図30を参照。擬似ピークへピーク長較正を適用擬似ピークのピーク長を、上記2工程1で生成した較正表により較正する図28参照。同じピーク長の擬似ピークを1つの擬似ピークにまとめる内部配列は異なるが配列長が同じフラグメントが存在した場合、HiCEPの電気泳動結果では、ひとつのピークとして現われ、一方、上記1で作成した配列クラスタは異なる配列クラスタとなる。よって、ピークと配列クラスタの対応付けを行なう場合、擬似ピークの較正後の配列長が同一である場合は、これらの擬似ピークをまとめてひとつの擬似ピークとし、高さは合計してひとつの擬似ピークの高さとする図29参照。なお、配列クラスタのコンセンサス配列の配列長さが同じであっても、配列長較正を施した場合、擬似ピークの電気泳動長が大きく異なる可能性がある。よって、較正後の配列長が-025ベース以内のピーク同士を1つのピークにまとめることとする。ピーク対応付けアルゴリズムによる対応付けシーケンスピーク対応付けアルゴリズムは、DPマッチングを基本的な枠組みとし、各エッジのスコアリングを独自に行うようにしたものである。A擬似ピークの特徴以下に擬似ピークの特徴をまとめる;リード数が発現量を反映していると考えられるが、ばらつきが大きく、同じ電気泳動同士で比較する場合のように一定係数をかけることで全体の高さをそろえることが難しい;リード数が多いコンセンサス配列ほど信頼性が高いと考えられる。リード数が少ないコンセンサス配列ほどセレクション塩基や配列長に誤りが発生する可能性が高くなると考えられる;較正対象となる配列長と電気泳動長のずれは、領域単位で一定のずれがある場合よりも、単独のピークごとにずれ幅が異なる。これらの特徴を前提にピーク対応付けアルゴリズムでる。BDPマッチングによるピークアライメントペアのスコア値を得るための範囲をフレームと呼ぶ。一定のフレーム領域を設定して、そのフレーム内のリファレンスプロファイリングピークと擬似ピークのすべての組み合わせをペア候補としてスコアを付け、スコアの合計が最も高くなるペアの組み合わせをDPマッチング法で求める図17A、図31、図32参照。各ペア候補のスコアの最高値は1.0とし、0以上の場合に最終的なペアとなる可能性が生じる。スコアがマイナス値の場合、そのペア候補が最終的なペアになる可能性はない。DPマッチングの具体的な方法としては、NeedlemanWunsch1970の方法を修正したものを利用した。Cペア候補のスコアペア候補のスコアは、ピークの高さスコアとサイズスコアそれぞれに重みを掛けて合計したものとする。高さスコア、サイズスコアそれぞれの最高値は10であり、それぞれに重み係数を掛けることでペア候補のスコアの最高値も10となるようにする;ペア候補のスコア=実施例では、高さの重み05サイズの重み05を使用した図17B参照。I高さのスコア高さスコアはペア候補ごとに次のように計算する。ピークの高さスコアを計算するにあたって、高さ値の代わりにフレーム内での高さの順序番号を使う図17B参照。高さスコアerrorerror高さ順序番号の許容差porderプロファイルピークの高さ順序番号rorder擬似ピークの高さ順序番号absnの絶対値。II高さ順序番号とフレーム高さ順序番号はフレーム内で最も高いピークから順に123...nと割り振る図33参照。プロファイルピークと擬似ピークそれぞれで別々に割り振る。フレーム及び高さ順序番号は、着目するプロファイルピークごとに計算する1プライマーセットあたりプロファイルピーク数と同じ数のフレームが生成される。なお、高さを順序番号に置き換える図34参照ことにより、高さの関係を考慮しつつ、データの特徴擬似ピークの高さのばらつきの影響を受けないようにできる。また、低いピークほど高さ順序番号の一致精度が悪くなるが、これはデータの特徴による。III高さが同じピークの扱い同じ高さのピークは、擬似ピークの高さが配列数であるため高い頻度で発生する可能性がある。フレーム内で高さの同じピークには同じ順序番号を割り振る図35参照。このときの順序番号は、同じ高さのピーク数を加算したものとする。同じ高さのピーク群は、リード数が少ないかシングルトンである可能性が高い。そのようなピークは、より離れた順序番号をつけておくほうが一致精度が良くなるノイズの影響を少なくできる。IVフレーム幅の決定方法実施例においては、着目プロファイルピーク前後でプロファイルピーク数27以内、かつ80塩基以内の範囲をフレームとする擬似ピークは考慮しない図36。V高さ順序番号の許容差ペア候補の高さ順序差が高さ順序番号の許容差以内であればペナルティにならない。VIサイズスコアサイズスコアはペア候補ごとに次のように計算する図17B参照。サイズスコアerrorerrorサイズ許容差psizeプロファイルピークのサイズrsize擬似ピークのサイズabsnの絶対値。VIIサイズ許容差ペア候補のサイズ差がサイズ許容差以内であればペナルティにならない。サイズ許容差は、2ベースから4ベースの間で可変とする。以下にサイズ許容差を求める手順を示す。着目プロファイルピーク前後両方向それぞれに、隣のピークまでの距離を求める;前後2つの距離のうち、短いほうの距離の12を候補値とする;候補値が2~4ベース以内なら、候補値をそのままサイズ許容差とする;候補値が2ベースより小さければ2、4ベースより大きければ4をサイズ許容差とする図37。サイズが大きくなるにつれて、許容差を大きくしていく方法も考えられるが、本法では、上記方法を採用した。VIII近傍ピークの判定の矯正対応すべきプロファイリングピークと擬似ピークが近傍にある場合、強度の大きい擬似ピークとサイズが近いが強度が低いプロファリングピークのペアは高さ順序番号の差が大きくなることでスコアが低くなり、最終的なペアにはならないことが多い。しかし、低いプロファイリングピークに対応する擬似ピークがなく、本来対応すべき擬似ピークとプロファリングピークが一定のサイズ以上はなれているとペアになってしまうことがある。このような場合への対処として、強度の強いピークとその近傍のピークについてペアを矯正する図38。矯正方法は以下の通り。対応付け対象となるピークの前後075ベース以内に、強度が対象ピークの30以下のピークがあればそれを近傍の低いピークとする左右は区別する;スコア計算において一方が裾野ピークの場合、同じ近傍の強度が低いピーク同士の場合のみスコアを計算する。それ以外の場合、スコアを1ペナルティとする。この矯正は、配列長較正を適用した場合にのみ効果がある配列長較正を行わない場合、擬似ピークは均等に1ベース刻みになる。3上記1データベース、及び上記2の対応付け情報を使用して、HiCEPで得られるピークの遺伝子同定法上記2によって、HiCEP法で調整した同じ鋳型cDNAを使用して作成した配列クラスタとリファレンスプロファリングのピークとを対応付け、リファレンスプロファイリングのピークについて配列を同定できるようになった。次は、同じ細胞で、別の試料にHiCEP法を適用して得られたプロファイリングのピークの配列を上記1のデータベースと上記2の対応付け情報を使用して、同定する方法である図25、図26、図27参照。方法1工程1:遺伝子同定対象のサンプルから得たHiCEPのプロファイリング結果と2で使用したリファレンスプロファイリングを電気泳動長とピークの強度で対応付けたデータを作成する。工程2:遺伝子同定対象のサンプルから得た遺伝子同定対象ピーク群から、上記工程1で作成した対応付けデータを利用して、リファレンスプロファイリングのピークを求め、さらに、2での対応付け情報から、1で作成したクラスタを求め、コンセンサス配列と遺伝子情報を求める。これにより、注目のピーク群と遺伝子情報との対応リストが作成される。工程3:1の工程6で作成した遺伝子情報により、注目するコンセンサス配列を決定し、2で対応付けられたリファレンスプロファイリングのピークを介して、遺伝子同定対象のサンプルから得た電気泳動のピークを求める。方法2遺伝子同定対象サンプルから得られた電気泳動結果のひとつもしくは複数のピークの電気泳動で得られた塩基数を2で使用したリファレンスプロファイリグのバンド、さらに、1で作成した配列クラスタとその配列数から作成した擬似プロファイリングおよびその遺伝子情報を並べて提示することで、遺伝子同定対象サンプルから得られた電気泳動結果の注目ピークの遺伝子情報を得る。