キメラ抗原受容体CARをコードする単離された核酸配列であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:24のアミノ酸配列を含む、単離された核酸配列。前記CARがSEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。SEQIDNO:8の核酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸配列。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1記載の単離された核酸配列。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項4記載の単離された核酸配列。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項1記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項6記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項6記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項6記載の単離された核酸配列。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項1記載の単離された核酸配列。前記CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:18の核酸配列によってコードされる、請求項1記載の単離された核酸配列。抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:24のアミノ酸配列を含む、単離されたキメラ抗原受容体CAR。SEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項12記載の単離されたCAR。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項12記載の単離されたCAR。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項14記載の単離されたCAR。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項12記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項16記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項16記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項16記載の単離されたCAR。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項12記載の単離されたCAR。キメラ抗原受容体CARをコードする核酸配列を含む細胞であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、細胞。前記CARがSEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項21記載の細胞。前記核酸がSEQIDNO:8の核酸配列を含む、請求項21記載の細胞。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項21記載の細胞。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項24記載の細胞。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項21記載の細胞。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項26記載の細胞。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項26記載の細胞。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項26記載の細胞。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項21記載の細胞。前記CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:18の核酸配列によってコードされる、請求項21記載の細胞。T細胞、ナチュラルキラーNK細胞、細胞傷害性Tリンパ球CTLおよび調節性T細胞からなる群より選択される、請求項21記載の細胞。前記抗原結合ドメインがその対応する抗原と結合した場合に抗腫瘍免疫を呈する、請求項21記載の細胞。キメラ抗原受容体CARをコードする核酸配列を含むベクターであって、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:24のアミノ酸配列を含む、ベクター。前記CARがSEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項34記載のベクター。CARをコードする単離された核酸配列がSEQIDNO:8の核酸配列を含む、請求項34記載のベクター。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項34記載のベクター。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項37記載のベクター。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項34記載のベクター。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項39記載のベクター。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項39記載のベクター。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項39記載のベクター。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項34記載のベクター。前記CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:18の核酸配列によってコードされる、請求項34記載のベクター。哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該抗原結合ドメインが該標的細胞集団または組織を特異的に認識するように選択される、方法。哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、それにより、該哺乳動物において抗腫瘍免疫を与える、方法。腫瘍抗原の発現亢進と関連する疾患、障害または病状を有する哺乳動物を治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子改変された細胞の有効量を該哺乳動物に投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、それにより、該哺乳動物を治療する、方法。前記細胞が自己T細胞である、請求項47記載の方法。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項47記載の方法。慢性リンパ性白血病を有するヒトを治療する方法であって、CARを発現するように遺伝子操作されたT細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含む、方法。前記ヒトが少なくとも1つの化学療法薬に対して抵抗性である、請求項50記載の方法。前記慢性リンパ性白血病が治療抵抗性のCD19白血病およびリンパ腫である、請求項50記載の方法。癌と診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたT細胞の存続集団を生じさせる方法であって、CARを発現するように遺伝子操作されたT細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該遺伝子操作されたT細胞の存続集団が投与後少なくとも1カ月間にわたって該ヒトの内部で存続する、方法。前記遺伝子操作されたT細胞の存続集団が、前記ヒトに投与されたT細胞、該ヒトに投与されたT細胞の子孫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの細胞を含む、請求項53記載の方法。前記遺伝子操作されたT細胞の存続集団がメモリーT細胞を含む、請求項53記載の方法。前記癌が慢性リンパ性白血病である、請求項53記載の方法。前記慢性リンパ性白血病が治療抵抗性のCD19白血病およびリンパ腫である、請求項56記載の方法。前記遺伝子操作されたT細胞の存続集団が、投与後少なくとも3カ月間にわたって前記ヒトの内部で存続する、請求項53記載の方法。前記遺伝子操作されたT細胞の存続集団が、投与後少なくとも4カ月間、5カ月間、6カ月間、7カ月間、8カ月間、9カ月間、10カ月間、11カ月間、12カ月間、2年間または3年間にわたって前記ヒトの内部で存続する、請求項53記載の方法。前記慢性リンパ性白血病が治療される、請求項56記載の方法。癌と診断されたヒトにおいて、遺伝子操作されたT細胞の集団を増大expandさせる方法であって、CARを発現するように遺伝子操作されたT細胞を該ヒトに投与する段階を含み、該CARが抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、および、SEQIDNO:24のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、投与された該遺伝子操作されたT細胞が、該ヒトにおいて子孫T細胞の集団を生成する、方法。前記ヒトにおける前記子孫T細胞がメモリーT細胞を含む、請求項61記載の方法。前記T細胞が自己T細胞である、請求項61記載の方法。前記ヒトが少なくとも1つの化学療法薬に対して抵抗性である、請求項61記載の方法。前記癌が慢性リンパ性白血病である、請求項61記載の方法。前記慢性リンパ性白血病が治療抵抗性のCD19白血病およびリンパ腫である、請求項65記載の方法。前記子孫T細胞の集団が、投与後少なくとも3カ月間にわたって前記ヒトの内部で存続する、請求項61記載の方法。前記子孫T細胞の集団が、投与後少なくとも4カ月間、5カ月間、6カ月間、7カ月間、8カ月間、9カ月間、10カ月間、11カ月間、12カ月間、2年間または3年間にわたって前記ヒトの内部で存続する、請求項61記載の方法。前記癌が治療される、請求項61記載の方法。前記キメラ抗原受容体CARをコードする単離された核酸配列であって、該CARが抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、該CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:24のアミノ酸配列を含み、さらに、該単離された核酸配列がSEQIDNO:9の配列を含む、該単離された核酸配列。前記CARがSEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項70記載の単離された核酸配列。前記SEQIDNO:8の核酸配列を含む、請求項70記載の単離された核酸配列。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項70記載の単離された核酸配列。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項73記載の単離された核酸配列。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項70記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項75記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項75記載の単離された核酸配列。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項75記載の単離された核酸配列。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項70記載の単離された核酸配列。前記CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:18の核酸配列によってコードされる、請求項70記載の単離された核酸配列。抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域およびCD3ζシグナル伝達ドメインを含む単離されたキメラ抗原受容体CARであって、該CD3ζシグナル伝達ドメインがSEQIDNO:24のアミノ酸配列を含み、さらに、該単離されたCARが、SEQIDNO:9の配列を含む核酸配列によって発現される、該単離されたCAR。SEQIDNO:12のアミノ酸配列を含む、請求項81記載の単離されたCAR。前記抗原結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項81記載の単離されたCAR。前記抗原結合フラグメントがFabまたはscFvである、請求項83記載の単離されたCAR。前記抗原結合ドメインが腫瘍抗原と結合する、請求項81記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が血液悪性腫瘍と関連する、請求項85記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が固形腫瘍と関連する、請求項85記載の単離されたCAR。前記腫瘍抗原が、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、NYESO1TCR、MAGEA3TCR、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項85記載の単離されたCAR。前記共刺激シグナル伝達領域が、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、CD83と特異的に結合するリガンド、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、請求項81記載の単離されたCAR。詳細な説明本発明は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍を非限定的に含む癌を治療するための組成物および方法に関する。本発明は、キメラ抗原受容体CARを発現するように形質導入されたT細胞の養子細胞移入の戦略に関する。CARとは、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を作製するために、抗体に基づく所望の抗原例えば、腫瘍抗原に対する特異性と、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインとを組み合わせた分子のことである。本発明は、全体として、所望のCARを安定して発現するように遺伝子改変されたT細胞の使用に関する。CARを発現するT細胞を、本明細書では、CART細胞またはCAR改変T細胞と称する。細胞を、抗体結合ドメインをその表面で安定して発現し、MHCに依存しない新規な抗原特異性を付与するように遺伝子改変することが好ましい。場合によっては、T細胞は一般に、特異的抗体の抗原認識ドメインとCD3ζ鎖またはFcγRIタンパク質の細胞内ドメインとを組み合わせて単一のキメラタンパク質としたCARを安定して発現するように遺伝子改変される。1つの態様において、本発明のCARは、抗原認識ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有する細胞外ドメインを含む。1つの態様においては、CARの中のドメインの1つに天然に付随する膜貫通ドメインを用いる。もう1つの態様において、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。好ましくは、膜貫通ドメインはCD8αヒンジドメインである。細胞質ドメインに関して、本発明のCARは、CD28および/または41BBシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のCARに関連して有用な他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように設計することができる。1つの態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ、41BBおよびCD28のシグナル伝達モジュール、ならびにこれらの組み合わせを非限定的に含みうる。したがって、本発明は、CART細胞、および養子療法のためのそれらの使用の方法に関する。1つの態様において、本発明のCART細胞は、所望のCAR、例えば抗CD19、CD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト41BBおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むCARを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することによって作製することができる。本発明のCART細胞は、インビボで複製して、持続的腫瘍制御につながる可能性のある長期存続性をもたらすことができる。1つの態様において、本発明は、CARを発現する遺伝子改変T細胞を、癌を有するかまたは癌を有するリスクのある患者の治療のために、リンパ球輸注を用いて投与することに関する。自己リンパ球輸注を治療に用いることが好ましい。治療を必要とする患者から自己PBMCを収集し、T細胞を活性化した上で、本明細書に記載された当技術分野において公知の方法を用いて増大させ、続いて患者に輸注して戻す。さらにもう1つの態様において、本発明は、全体として、CLLを発症するリスクのある患者の治療に関する。本発明はまた、患者における化学療法および/または免疫療法がその患者における著しい免疫抑制をもたらし、それにより、患者がCLLを発症するリスクが高まるような悪性腫瘍または自己免疫疾患を治療することも含む。本発明は、CD3ζおよび41BBの共刺激ドメインの両方を含む抗CD19CARを発現するT細胞CART19T細胞とも称するを用いることを含む。本発明のCART19T細胞は、頑強なインビボT細胞増大を起こすことができ、血液および骨髄において、より延長した時間にわたって高レベルであり続けることのできるCD19特異的メモリー細胞を樹立することができる。場合によっては、患者に輸注された本発明のCART19T細胞は、進行した化学療法抵抗性CLLの患者において、白血病細胞をインビボで排除することができる。しかし、本発明はCART19T細胞には限定されない。より正確には、本発明は、CD13741BBシグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびこれらの任意の組み合わせの群から選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合した、あらゆる抗原結合モイエティーを含む。定義別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図しないことも理解される必要がある。1つのaおよび1つのanという冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは複数すなわち、少なくとも1つを指して用いられる。一例として、1つの要素は、1つの要素または複数の要素を意味する。量、時間的長さなどの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる約は、特定された値からの±20または±10、より好ましくは±5、さらにより好ましくは±1、いっそうより好ましくは±01のばらつきを範囲に含むものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当なためである。活性化とは、本明細書で用いる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態のことを指す。また、活性化が、サイトカイン産生の誘導および検出可能なエフェクター機能を伴うこともある。活性化されたT細胞という用語は、とりわけ、細胞分裂を行っているT細胞のことを指す。抗体という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫応答部分であってもよい。抗体は典型的には、免疫グロブリン分子のテトラマーである。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF2、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在しうるHarlowetal1999InUsingAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressNY;Harlowetal1989InAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborNewYork;Houstonetal1988ProcNatlAcadSciUSA8558795883;Birdetal1988Science242423426。抗体フラグメントという用語は、無傷の抗体の一部分のことを指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域のことも指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab、F2、およびFvフラグメント、直鎖状抗体、ScFv抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。抗体重鎖とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、大きい方のことを指す。抗体軽鎖とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方のことを指す。κ軽鎖およびλ軽鎖とは、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。本明細書で用いる合成抗体とは、組換えDNA技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現される抗体のことを意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製される抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能であって当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られたような抗体も意味するとみなされるべきである。本明細書で用いる抗原またはAgという用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役を果たしうることを理解するであろう。その上、抗原が組換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書中でその用語が用いられる通りの抗原をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を非限定的に含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するさまざまな組み合わせで並べられていることは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原が遺伝子によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原を合成して作製することもでき、または生物試料から得ることもできることは直ちに明らかである。そのような生物試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が非限定的に含まれうる。本明細書で用いる抗腫瘍効果という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、期待余命の延長、または癌性病状に付随するさまざまな生理的症状の改善によって明らかになる生物学的効果のことを指す。抗腫瘍効果はまた、腫瘍のそもそもの発生を予防する、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになる。自己抗原という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来性であると誤って認識されるあらゆる自己抗原のことを意味する。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が非限定的に含まれる。本明細書で用いる自己免疫疾患は、自己免疫反応に起因する障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例には、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症alopeciagreata、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病1型、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレーGuillainBarr症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が非限定的に含まれる。本明細書で用いる場合、自己という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。同種とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片のことを指す。異種とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。本明細書で用いる癌という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。さまざまな癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが非限定的に含まれる。共刺激リガンドには、この用語が本明細書で用いられる場合、T細胞上のコグネイト共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR/CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを非限定的に含むT細胞応答を媒介するシグナルも与えることのできる、抗原提示細胞例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など上の分子が含まれる。共刺激リガンドには、CD7、B71CD80、B72CD86、PDL1、PDL2、41BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンドICOSL、細胞内接着分子ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLAG、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7H3に特異的に結合するリガンドが非限定的に含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、CD27、CD28、41BB、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3などの、ただしこれらに限定されない、T細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、およびCD83に特異的に結合するリガンドも範囲に含む。共刺激分子とは、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、増殖などの、ただしこれに限定されない、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーのことを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が非限定的に含まれる。共刺激シグナルとは、本明細書で用いる場合、TCR/CD3連結などの一次シグナルとの組み合わせで、T細胞の増殖、および/または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導く分子のことを指す。疾患とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことを指す。対照的に、動物における障害とは、その動物が恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害の非存在下にあるよりもより不都合である健康状態のことである。治療されないままであっても、障害は必ずしもその動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。本明細書で用いる有効量とは、治療的または予防処置的な有益性をもたらす量のことを意味する。コードするとは、所定のヌクレオチド配列すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNAまたは所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物過程において他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性のことを指す。すなわち、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であって通常は配列表として提示されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称することができる。本明細書で用いる場合、内因性とは、生物体、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の材料のことを指す。本明細書で用いる場合、外因性という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系に導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の材料のことを指す。本明細書で用いる発現という用語は、そのプロモーターによって作動する特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。発現ベクターとは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む;発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるものおよびウイルス例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスといった、当技術分野において公知であるすべてのものが含まれる。相同なとは、2つのポリペプチドの間または2つの核酸分子の間の配列類似性または配列同一性のことを指す。比較する2つの配列の両方において、ある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおいて、ある位置がアデニンによって占められている場合には、それらの分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同度percentofhomologyは、2つの配列が共通して持つ一致する位置または相同な位置の数を、比較する位置の数によって除算した上で100を掛けた関数である。例えば、2つの配列中の10個の位置のうち6個が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は60相同である。一例として、DNA配列ATTGCCおよびTATGGCは50の相同性を有する。一般に、比較は、最大の相同性が得られるように2つの配列のアラインメントを行った上で行われる。免疫グロブリンまたはIgという用語は、本明細書で用いる場合、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCRB細胞受容体または抗原受容体と称されることも時にある。このタンパク質のクラスに含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な流血中抗体である。IgMは、ほとんどの哺乳動物で一次免疫応答において産生される主な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時にマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。本明細書で用いる場合、説明材料instructionalmaterialには、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器に添付してもよく、または核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷してもよい。または、説明材料および化合物がレシピエントによって一体として用いられることを意図して、説明材料を容器と別に出荷してもよい。単離されたとは、天然の状態から変更されるかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは単離されていないが、その天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、単離されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもでき、または例えば宿主細胞などの非ネイティブ性環境で存在することもできる。本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略語を用いる。Aはアデノシンのことを指し、Cはシトシンのことを指し、Gはグアノシンのことを指し、Tはチミジンのことを指し、Uはウリジンのことを指す。別に指定する場合を除き、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列には、相互に縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロンを含みうる限り、イントロンも含まれうる。本明細書で用いるレンチウイルスとは、レトロウイルス科Retroviridaeファミリーの属のことを指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させうるという点で、レトロウイルスの中でも独特である;それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボでかなり高いレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。モジュレートするという用語は、本明細書で用いる場合、治療もしくは化合物の非存在下でのその対象における反応のレベルと比較して、および/または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における反応のレベルと比較して、対象における反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、ネイティブ性のシグナルまたは反応を擾乱させるか、および/またはそれに影響を及ぼして、それにより、有益な治療反応を媒介することを範囲に含む。別に指定する場合を除き、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列には、相互に縮重型であって、かつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列が、イントロンを含んでもよい。機能的に連結したという用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結のことを指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、同一のリーディングフレーム内にある。過剰発現された腫瘍抗原または腫瘍抗原の過剰発現という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルに比して異常なレベルであることを指し示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイによって判定することができる。免疫原性組成物の非経口的投与には、例えば、皮下sc、静脈内iv、筋肉内imまたは胸骨内の注射法または輸注法が含まれる。患者、対象、個体などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書に記載の方法を適用しうる、インビトロまたはインサイチューの別を問わない、任意の動物またはその細胞のことを指す。ある非限定的な態様において、患者、対象または個体はヒトである。本明細書で用いるポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチドの連鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらはモノマー性ヌクレオチドに加水分解されうるという一般知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書で用いるポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR商標などを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、および合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる、すべての核酸配列が非限定的に含まれる。本明細書で用いる場合、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と称される長鎖の両方のことを指し、それらには多くの種類がある。ポリペプチドには、いくつか例を挙げると、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。本明細書で用いるプロモーターという用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。本明細書で用いる場合、プロモーター/調節配列という用語は、プロモーター/調節配列と機能的に連結した遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントをも含んでもよい。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。構成性プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。誘導性プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的にはそのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。組織特異的プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的には細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。特異的に結合するという用語は、抗体に関して本明細書で用いる場合、試料中の特異的な抗原を認識するが、他の分子は実質的に認識もせず、それらと結合もしない抗体のことを意味する。例えば、1つの種由来の抗原と特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原と結合してもよい。しかし、そのような種間反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。もう1つの例において、抗原と特異的に結合する抗体が、その抗原の異なるアレル形態と結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。場合によっては、特異的結合または特異的に結合するという用語を、抗体、タンパク質またはペプチドの第2の化学種との相互作用に言及して、その相互作用が、化学種での特定の構造例えば、抗原決定基またはエピトープの存在に依存することを意味して用いることができる;例えば、ある抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識してそれと結合する。抗体がエピトープAに対して特異的であるならば、エピトープAを含有する分子または遊離した非標識Aの存在は、標識Aおよびその抗体を含む反応において、その抗体と結合した標識Aの量を減少させると考えられる。刺激という用語は、刺激分子例えば、TCR/CD3複合体がそのコグネイトリガンドと結合して、それにより、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達などの、ただしこれには限定されないシグナル伝達イベントを媒介することによって誘導される、一次応答のことを意味する。刺激は、TGFβのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再構築などのような、ある種の分子の発現の改変を媒介してもよい。刺激分子とは、この用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドに特異的に結合する、T細胞上の分子のことを意味する。刺激リガンドとは、本明細書で用いる場合、抗原提示細胞例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー本明細書では刺激分子と称すると特異的に結合して、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを非限定的に含む、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドのことを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を範囲に含む。対象という用語は、免疫応答を惹起させることができる、生きている生物例えば、哺乳動物を含むことを意図している。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。本明細書で用いる場合、実質的に精製された細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態に本来付随する他の細胞型から分離された細胞のことも指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団のことを指す。また別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞のことを指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。本明細書で用いる治療的という用語は、治療および/または予防処置のことを意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。治療的有効量という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床専門家が詳しく調べようとしている、組織、系または対象の生物学的または医学的な反応を誘発すると考えられる対象化合物の量のことを指す。治療的有効量という用語には、投与された場合に、治療される障害または疾患の徴候または症状のうち1つもしくは複数の発生を予防するか、またはそれをある程度改善するのに十分な、化合物の量が含まれる。治療的有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なると考えられる。ある疾患を治療するとは、この用語が本明細書で用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。本明細書で用いるトランスフェクトされたまたは形質転換されたまたは形質導入されたという用語は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程のことを指す。トランスフェクトされたまたは形質転換されたまたは形質導入された細胞とは、外因性核酸によってトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入されたもののことである。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。本明細書で用いる転写制御下または機能的に連結したという語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために正しい位置および向きにあることを意味する。ベクターとは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いうる組成物のことである。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを非限定的に含む数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、ベクターという用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが非限定的に含まれる。範囲:本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1~6などの範囲の記載は、1~3、1~4、1~5、2~4、2~6、3~6などの部分的範囲とともに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、27、3、4、5、53および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。説明本発明は、さまざまな疾患の中でもとりわけ、癌を治療するための組成物および方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発性または転移性の腫瘍であってよい。好ましくは、癌は血液悪性腫瘍であり、より好ましくは、癌は慢性リンパ性白血病CLLである。本発明の組成物および方法を用いて治療しうる他の疾患には、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、ならびに自己免疫疾患が含まれる。1つの態様において、本発明は、CARを発現するように操作された細胞例えば、T細胞であって、抗腫瘍性を呈するCART細胞を提供する。本発明のCARは、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖例えば、CD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインと融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作することができる。本発明のCARは、T細胞で発現された場合に、抗原結合特異性に基づく抗原認識を再誘導することができる。例示的な抗原はCD19であるが、これはこの抗原が悪性B細胞上で発現されるためである。しかし、本発明は、CD19のターゲティングには限定されない。より正確には、本発明は、そのコグネイト抗原と結合した場合に腫瘍細胞に影響を及ぼし、その結果、腫瘍細胞が成長できなくなるか、死滅するように促されるか、または患者における腫瘍総量tumorburdenが漸減するかもしくは消失する他の様式で影響を受けるような、あらゆる抗原結合モイエティーを含む。抗原結合モイエティーは、共刺激分子およびζ鎖のうち1つまたは複数からの細胞内ドメインと融合していることが好ましい。抗原結合モイエティーは、CD13741BBシグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD3ζシグナルドメイン、およびこれらの任意の組み合わせの群から選択される1つまたは複数の細胞内ドメインと融合していることが好ましい。1つの態様において、本発明のCARは、CD13741BBシグナル伝達ドメインを含む。これは、本発明が一部には、CARにより媒介されるT細胞応答を、共刺激ドメインの付加によってさらに強化しうるという発見に基づくためである。例えば、CD13741BBシグナル伝達ドメインを含めることにより、CD13741BBを発現するように操作されていないこと以外は同一なCART細胞と比較して、CART細胞の抗腫瘍活性およびインビボ存続性が有意に増加した。組成物本発明は、細胞外および細胞内のドメインを含むキメラ抗原受容体CARを含む。細胞外ドメインは、別の言い方では抗原結合モイエティーとも称される標的特異的結合エレメントを含む。細胞内ドメイン、または別の言い方では細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはCARの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み入れてもよい。本明細書で用いる場合、スペーサードメインという用語は、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをするオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10~100アミノ酸、最も好ましくは25~50アミノ酸で構成されうる。抗原結合モイエティー1つの態様において、本発明のCARは、別の言い方では抗原結合モイエティーとも称される標的特異的結合エレメントを含む。モイエティーの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によって決まる。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾病状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。このように、本発明のCARにおける抗原モイエティードメインとして作用しうる細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびに癌細胞と関連するものが含まれる。1つの態様において、本発明のCARは、腫瘍細胞上の抗原と特異的に結合する所望の抗原結合モイエティーを作製することによって、関心対象の腫瘍抗原を標的とするように操作することができる。本発明に関連して、腫瘍抗原または過剰増殖性hyperporoliferative障害抗原または過剰増殖性障害と関連する抗原とは、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原のことを指す。本明細書で考察する抗原は、単に一例として含めているに過ぎない。リストは排他的であることを意図してはおらず、そのほかの例も当業者には容易に明らかとなるであろう。腫瘍抗原とは、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質のことである。本発明の抗原結合モイエティーの選択は、治療される癌の具体的な種類に依存すると考えられる。腫瘍抗原は当技術分野において周知であり、これには例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原CEA、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテインAFP、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE1、MNCAIX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2AS、腸カルボキシルエステラーゼ、muthsp702、MCSF、プロスターゼ、前立腺特異的抗原PSA、PAP、NYESO1、LAGE1a、p53、プロステイン、PSMA、Her2/neu、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原1PCTA1、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子IGFI、IGFII、IGFI受容体ならびにメソテリンが含まれる。1つの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1つまたは複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原としての役を果たしうる数多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるMART1、チロシナーゼおよびGP100、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼPAPおよび前立腺特異的抗原PSAなどの組織特異的抗原が非限定的に含まれる。他の標的分子には、腫瘍遺伝子HER2/Neu/ErbB2などの形質転換関連分子の群に属するものがある。標的抗原のさらにもう1つの群には、腫瘍胎児性抗原などの癌胎児性抗原CEAがある。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有である、真に腫瘍特異的である免疫グロブリン抗原で構成される。CD19、CD20およびCD37などのB細胞分化抗原は、B細胞リンパ腫における標的抗原の別の候補である。これらの抗原のいくつかCEA、HER2、CD19、CD20、イディオタイプは、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として用いられ、ある程度の成果を上げている。本発明において言及される腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異的抗原TSAまたは腫瘍関連抗原TAAであってもよい。TSAは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上には存在しない。TAA関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で、正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こりうる。TAAは、免疫系が未熟であって応答することができない胎児発生中に正常細胞上で発現される抗原であってよく、またはそれらは、正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現される抗原であってもよい。TSA抗原またはTAA抗原の非限定的な例には、以下のものが含まれる:MART1/MelanAMART1、gp100Pmel17、チロシナーゼ、TRP1、TRP2などの分化抗原、およびMAGE1、MAGE3、BAGE、GAGE1、GAGE2、p15などの腫瘍特異的多系列抗原;過剰発現される胎児抗原、例えばCEAなど;過剰発現される腫瘍遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER2/neuなど;染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原;BCRABL、E2APRL、H4RET、IGHIGK、MYLRARなど;ならびに、ウイルス抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原EBVAならびにヒトパピローマウイルスHPV抗原E6およびE7など。その他の大型のタンパク質ベースの抗原には、TSP180、MAGE4、MAGE5、MAGE6、RAGE、NYESO、p185erbB2、p180erbB3、cmet、nm23H1、PSA、TAG72、CA199、CA724、CAM171、NuMa、Kras、βカテニン、CDK4、Mum1、p15、p16、439F、5T4、791Tgp72、αフェトプロテイン、βHCG、BCA225、BTAA、CA125、CA153\CA2729\BCAA、CA195、CA242、CA50、CAM43、CD68\P1、CO029、FGF5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp175、M344、MA50、MG7Ag、MOV18、NB/70K、NYCO1、RCAS1、SDCCAG16、TA90\Mac2結合タンパク質\シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが含まれる。1つの好ましい態様において、CARの抗原結合モイエティー部分は、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33IL3Ra、cMet、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD2、MYESO1TCR、MAGEA3TCRなどを非限定的に含む抗原を標的とする。標的にすることが望まれる抗原に応じて、本発明のCARを、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合モイエティーを含むように操作することができる。例えば、標的にすることが望まれる抗原がCD19であるならば、CD19に対する抗体を、本発明のCARに組み入れるための抗原結合モイエティーとして用いることができる。1つの態様において、本発明のCARの抗原結合モイエティー部分は、CD19を標的とする。好ましくは、本発明のCARにおける抗原結合モイエティー部分は抗CD19scFVであり、ここで抗CD19scFVの核酸配列はSEQID:14に示された配列を含む。1つの態様において、抗CD19scFVは、SEQIDNO:20のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。もう1つの態様において、本発明のCARの抗CD19scFV部分は、SEQIDNO:20に示されたアミノ酸配列を含む。膜貫通ドメイン膜貫通ドメインに関して、CARは、CARの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様においては、CARの中のドメインの1つに天然に付随する膜貫通ドメインを用いる。場合によっては、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合には、ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明において特に有用性のある膜貫通領域は、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来しうるすなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む。または、膜貫通ドメインが合成性であってもよく、この場合には、それは主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと考えられる。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に認められるであろう。任意で、好ましくは長さが2~10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連鎖を形成してもよい。グリシンセリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。好ましくは、本発明のCARにおける膜貫通ドメインはCD8膜貫通ドメインである。1つの態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQIDNO:16の核酸配列を含む。1つの態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQIDNO:22のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。もう1つの態様において、CD8膜貫通ドメインは、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含む。場合によっては、本発明のCARの膜貫通ドメインは、CD8αヒンジドメインを含む。1つの態様において、CD8ヒンジドメインは、SEQIDNO:15の核酸配列を含む。1つの態様において、CD8ヒンジドメインは、SEQIDNO:21のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。もう1つの態様において、CD8ヒンジドメインはSEQIDNO:21のアミノ酸配列を含む。細胞質ドメイン本発明のCARの細胞質ドメイン、または別の言い方では細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが入れられた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化の原因となる。エフェクター機能という用語は、細胞の特化した機能のことを指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であろう。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達して、細胞が特化した機能を遂行するように導く、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用しうるが、多くの場合には、その鎖全体を用いることは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分truncatedportionが用いられる範囲内において、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、それ故に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。本発明のCARに用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原と受容体との係合後にシグナル伝達を惹起するように協調的に作用するT細胞受容体TCRおよび補助受容体の細胞質配列、ならびに、同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列が含まれる。TCRのみを通じて生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化のためには不十分であること、および二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされることが公知である。このため、T細胞活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができる:TCRを通じての抗原依存的な一次活性化を惹起するもの一次細胞質シグナル伝達配列、および、抗原非依存的な様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすもの二次細胞質シグナル伝達配列。一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式または阻害的な方式で、TCR複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフimmunoreceptortyrosinebasedactivationmotifすなわちITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有しうる。本発明において特に有用性のある、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。本発明のCARにおける細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。1つの好ましい態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、または本発明のCARの文脈において有用な他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように、設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。そのような分子の例には、CD27、CD28、41BBCD137、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1LFA1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。したがって、本発明は、主として41BBを共刺激シグナル伝達エレメントとして用いて例示されるものの、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内にある。本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分の内部の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結させることができる。任意で、好ましくは長さが2~10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが連鎖を形成してもよい。グリシンセリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。もう1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインおよび41BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらにもう1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインならびにCD28および41BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。1つの態様において、本発明のCARにおける細胞質ドメインは、41BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで41BBのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:17に示された核酸配列を含み、CD3ζのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:18に示された核酸配列を含む。1つの態様において、本発明のCARにおける細胞質ドメインは、41BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで41BBのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:23のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、CD3ζのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:24のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。1つの態様において、本発明のCARにおける細胞質ドメインは、41BBのシグナル伝達ドメインおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで41BBのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:23に示されたアミノ酸配列を含み、CD3ζのシグナル伝達ドメインはSEQIDNO:24に示されたアミノ酸配列を含む。ベクター本発明は、CARの配列を含むDNA構築物を範囲に含み、ここでその配列は、細胞内ドメインの核酸配列と機能的に連結された抗原結合モイエティーの核酸配列を含む。本発明のCARにおいて用いうる例示的な細胞内ドメインには、CD3ζ、CD28、41BBなどの細胞内ドメインが非限定的に含まれる。場合によっては、CARは、CD3ζ、CD28、41BBなどの任意の組み合わせを含みうる。1つの態様において、本発明のCARは、抗CD19scFv、ヒトCD8のヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト41BBおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含む。1つの態様において、本発明のCARは、SEQIDNO:8に示された核酸配列を含む。もう1つの態様において、本発明のCARは、SEQIDNO:12のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。もう1つの態様において、本発明のCARは、SEQIDNO:12に示されたアミノ酸配列を含む。所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野において公知の組換え方法、例えば、標準的な手法を用いて、その遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが公知であるベクターから遺伝子を導き出すことによって、またはそれを含有する細胞および組織から直接的に単離することなどによって、入手することができる。または、関心対象の遺伝子を、クローニングするのではなくて、合成によって作製することもできる。本発明はまた、本発明のDNAが挿入されたベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、長期的遺伝子移入を達成するための適したツールであるが、これはそれらが、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込み、および娘細胞におけるその伝播を可能にするためである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターを上回る利点を有するが、これはそれらが、肝細胞などの非増殖性細胞の形質導入も行うことができるためである。また、それらには免疫原性が低いという利点も加わっている。概要を述べると、CARをコードする天然性または合成性の核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチドまたはその部分をコードする核酸をプロモーターと機能的に連結させて、その構築物を発現ベクター中に組み入れることによって達成される。ベクターは、真核生物における複製および組み込みのために適している。典型的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節のために有用なプロモーターを含有する。また、本発明の発現構築物を、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いる核酸免疫処置および遺伝子治療のために用いることもできる。遺伝子送達のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5399346号、第5580859号、第5589466号を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。もう1つの態様において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。核酸は、さまざまな種類のベクター中にクローニングすることができる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを非限定的に含むベクター中にクローニングすることができる。特に関心が持たれるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターが含まれる。さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に与えることもできる。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら2001MolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNewYork、ならびにウイルス学および分子生物学の他のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが非限定的に含まれる。一般に、適したベクターは、少なくとも1つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する例えば、WO01/96584号;WO01/29058号;および米国特許第6326193号を参照。数多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームとなる。当技術分野において公知の手法を用いて、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子の中にパッケージングすることができる。続いて、組換えウイルスを単離して、対象の細胞にインビボまたはエクスビボで送達することができる。数多くのレトロウイルス系が当技術分野において公知である。いくつかの態様においては、アデノウイルスベクターを用いる。数多くのアデノウイルスベクターが当技術分野において公知である。1つの態様においては、レンチウイルスベクターを用いる。そのほかのプロモーターエレメント、例えばエンハンサーなどは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30~110bp上流の領域に位置するが、数多くのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが最近示されている。多くの場合、プロモーターエレメント間の間隔には柔軟性があり、そのため、エレメントが互いに対して逆位になったり移動したりしてもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼtkプロモーターでは、反応性の低下を起こすことなく、プロモーターエレメント間の間隔を50bpまで隔てることができる。プロモーターによっては、個々のエレメントが協調的に、または独立して、転写を活性化しうるように思われる。適したプロモーターの一例は、サイトメガロウイルスCMV最初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと機能的に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を作動させることのできる、強力な構成性プロモーター配列である。適したプロモーターのもう1つの例は、伸長成長因子1αElongationGrowthFactor1αEF1αである。しかし、シミアンウイルス40SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスMMTV、ヒト免疫不全ウイルスHIV長末端反復配列LTRプロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどの、ただしこれらには限定されないヒト遺伝子プロモーターを非限定的に含む、他の構成性プロモーター配列を用いることもできる。さらに、本発明は、構成性プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として想定している。誘導性プロモーターの使用により、それと機能的に連結しているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が所望である場合には有効にし、発現が所望でない場合には発現を無効にすることができる、分子スイッチがもたらされる。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインmetallothionineプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが非限定的に含まれる。CARポリペプチドまたはその部分の発現を評価する目的で、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にするために、細胞に導入される発現ベクターに、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方を含有させることもできる。他の局面において、選択マーカーを別個のDHA小片上に保有させて、同時トランスフェクション手順に用いることもできる。宿主細胞における発現を可能にするために、選択マーカー遺伝子およびレポーター遺伝子をいずれも、適切な調節配列に隣接させることができる。有用な選択マーカーには、例えば、neoなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、および調節配列の機能性を評価するために用いられる。一般に、レポーター遺伝子とは、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現されず、かつ、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子のことである。レポーター遺伝子の発現は、そのDNAがレシピエント細胞に導入された後の適した時点でアッセイされる。適したレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌性アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光性タンパク質の遺伝子が含まれうる例えば、UiTeietal2000FEBSLetters4797982。適した発現系は周知であり、公知の手法を用いて調製すること、または販売されているものを入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高レベルでの発現を示す最小限の5フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結させて、プロモーターにより作動する転写を作用物質がモジュレートする能力を評価するために用いることができる。細胞に遺伝子を導入して発現させる方法は、当技術分野において公知である。発現ベクターに関連して、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、当該技術分野のいずれの方法によっても、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞にベクターを容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrookら2001MolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNewYorkを参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のために好ましい方法の1つは、リン酸カルシウムトランスフェクションである。関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターおよびRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第5350674号および第5585362号を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなど、ならびに、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達媒体として用いるための例示的なコロイド系の1つは、リポソーム例えば、人工膜小胞である。非ウイルス性送達系を利用する場合には、例示的な送達媒体の1つはリポソームである。脂質製剤の使用を、宿主細胞への核酸の導入のために想定しているインビトロ、エクスビボまたはインビボ。もう1つの局面において、核酸を脂質と付随させてもよい。脂質と付随した核酸をリポソームの水性内部の中に封入し、リポソームの脂質二重層の内部に配置させ、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と付随する連結分子を介してリポソームと連結させ、リポソーム内に封じ込め、リポソームと複合体化させ、脂質を含有する溶液中に分散させ、脂質と混合し、脂質と配合し、脂質中に懸濁物として含有させ、ミセル中に含有させるかもしくは複合体化させ、または他の様式で脂質と付随させることができる。脂質、脂質/DNAまたは脂質/発現ベクターが付随する組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二重層構造の中に、ミセルとして、または崩壊した構造として存在しうる。それらはまた、溶液中に単に点在していて、大きさも形状も均一でない凝集物を形成する可能性があってもよい。脂質とは、天然脂質または合成脂質であってよい脂肪性物質のことである。例えば、脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物のクラス、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどが含まれる。使用に適した脂質は、販売元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリンDMPCはSigmaStLouisMOから入手することができ;ジアセチルホスファートDCPはKKLaboratoriesPlainviewNYから入手することができ;コレステロールChoiはCalbiochemBehringから入手することができ;ジミリスチルホスファチジルグリセロールDMPGおよび他の脂質は、AvantiPolarLipidsIncBirminghamALから入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中にある脂質の貯蔵溶液は、約20°Cで保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、それを唯一の溶媒として用いることが好ましい。リポソームとは、閉じた脂質二重層または凝集物の生成によって形成される、種々の単層および多重層の脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜による小胞構造および内部の水性媒質を有するものとして特徴づけることができる。多重層リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水性溶液中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は自己再配列を起こし、その後に閉鎖構造の形成が起こり、水および溶解溶質を脂質二重層の間に封じ込めるGhoshetal1991Glycobiology550510。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も想定している。例えば、脂質がミセル構造をとってもよく、または単に脂質分子の不均一な凝集物として存在してもよい。また、リポフェクタミン核酸複合体も想定している。宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確かめる目的で、宿主細胞に外因性核酸を導入するため、または他の様式で細胞を本発明の阻害因子に曝露させるために用いられる方法にかかわらず、種々のアッセイを用いることができる。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RTPCRおよびPCRなど;生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段ELlSAおよびウエスタンブロットまたは本発明の範囲内にある作用物質を同定するための本明細書に記載のアッセイにによって、特定のペプチドの有無を検出すること、などが含まれる。T細胞の供給源本発明のT細胞の増大および遺伝子改変の前に、T細胞の供給源を対象から入手する。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、数多くの供給源から入手することができる。本発明のある態様において、当技術分野において入手可能な任意のさまざまなT細胞株を用いることができる。本発明のある態様において、T細胞は、フィコール商標分離などの、当業者に公知の任意のさまざまな手法を用いて対象から収集された血液ユニットから得られる。1つの好ましい態様において、個体の流血由来の細胞はアフェレーシスによって入手される。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。1つの態様においては、アフェレーシスによって収集された細胞を、血漿画分を除去するために洗浄した上で、その後の処理段階のために細胞を適切な緩衝液または培地中に配置することができる。本発明の1つの態様においては、これらの細胞をリン酸緩衝食塩水PBSで洗浄する。1つの代替的な態様において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつ、マグネシウムを含まないか、またはすべてではないものの多くの二価カチオンを含まない。この場合にも、驚くべきことに、カルシウム非存在下での最初の活性化段階により、活性化の増強がもたらされる。当業者は容易に理解するであろうが、洗浄段階は、半自動化されたフロースルー遠心分離機例えば、Cobe2991細胞プロセッサー、BaxterCytoMate、またはHaemoneticsCellSaver5などを製造元の指示に従って用いることなどによって、当技術分野において公知の方法によって実現することができる。洗浄の後に、細胞を、例えば、Ca2非含有、Mg2非含有PBS、PlasmaLyteA、または緩衝剤を含むかもしくは含まない他の食塩液といった、種々の生体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。または、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去して、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。もう1つの態様においては、赤血球を溶解させた上で、例えばPERCOLL商標勾配での遠心分離によるか、または向流遠心分離溶出法によって単球を枯渇させることによって、T細胞を末梢血リンパ球から単離する。CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、およびCD45ROT細胞といったT細胞の特定の部分集団を、陽性選択法または陰性選択法によってさらに単離することができる。例えば、1つの好ましい態様において、T細胞は、DYNABEADS登録商標M450CD3/CD28Tなどの抗CD3/抗CD28すなわち、3x28結合ビーズとの、所望のT細胞の陽性選択に十分な期間にわたるインキュベーションによって単離される。1つの態様において、この期間は約30分間である。1つのさらなる態様において、この期間は、30分間~36時間またはそれ以上、およびそれらの間の全ての整数値の範囲にわたる。1つのさらなる態様において、この期間は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間である。さらにもう1つの好ましい態様において、この期間は10~24時間である。1つの好ましい態様において、インキュベーション期間は24時間である。白血病の患者からのT細胞の単離のためには、24時間といった比較的長いインキュベーション時間を用いることにより、細胞収量を増やすことができる。腫瘍組織または免疫機能低下個体から腫瘍内浸潤リンパ球TILを単離する際のように、他の細胞型と比較してT細胞がわずかしか存在しないあらゆる状況で、T細胞を単離するために比較的長いインキュベーション時間を用いることができる。さらに、比較的長いインキュベーション時間の使用により、CD8T細胞の捕捉効率を高めることもできる。したがって、単にこの時間を短縮または延長することによって、T細胞はCD3/CD28ビーズへの結合が可能になるか、および/またはビーズのT細胞に対する比を増加もしくは減少することにより本明細書でさらに説明するように、T細胞の部分集団は、培養開始時もしくはこの過程の他の時点で、これについてもしくはこれに対して優先的に選択されうる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗CD3および/または抗CD28抗体の比を増加または減少することにより、T細胞部分集団は、培養開始時もしくは他の望ましい時点で、これについてまたはこれに対して優先的に選択される。当業者は、本発明の状況において複数回の選択を使用することができることを認めると思われる。ある態様においては、この選択手順を実行し、活性化および増大の過程において選択されない細胞を使用することが望ましいことがある。選択されない細胞に、さらに選択を施すこともできる。陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞への独自の表面マーカーに対する抗体の組合せにより実行することができる。1つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび/または選択である。例えば、陰性選択によってCD4細胞を濃縮するためのモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLADR、およびCD8に対する抗体を含む。ある態様において、典型的にはCD4、CD25、CD62Lhi、GITR、およびFoxP3を発現する調節性T細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましいことがある。または、ある態様においては、抗C25結合ビーズまたは他の類似の選択方法によって、調節性T細胞を枯渇させる。陽性または陰性選択によって望ましい細胞集団を単離するために、細胞および表面例えば、ビーズなどの粒子の濃度を変化させることができる。ある態様においては、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積の著しい減少すなわち、細胞の濃度の増加が望ましいことがある。例えば、1つの態様においては、細胞20億個/mlの濃度を用いる。1つの態様において、細胞10億個/mlの濃度を用いる。さらなる態様においては、細胞10000万個/mlよりも高いものを用いる。さらなる態様においては、1000万個/ml、1500万個/ml、2000万個/ml、2500万個/ml、3000万個/ml、3500万個/ml、4000万個/ml、4500万個/mlまたは5000万個/mlの細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、7500万個/ml、8000万個/ml、8500万個/ml、9000万個/ml、9500万個/ml、または10000万個/mlからの細胞濃度を用いる。さらなる態様においては、12500万個/mlまたは15000万個/mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞増大を生じることができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような、または多くの腫瘍細胞が存在する試料すなわち、白血病血、腫瘍組織などからの、関心のある標的抗原を弱く発現する細胞の捕捉効率を高めることができる。そのような細胞集団は、治療的価値があり、かつ得ることが望ましい。例えば、高い濃度の細胞の使用は、通常弱くCD28を発現するCD8T細胞をより効率的に選択することを可能にする。1つの関連した態様においては、より低い濃度の細胞を用いることが望ましいことがある。T細胞および表面例えばビーズなどの粒子の混合物の高度の希釈により、粒子と細胞間の相互作用は最小化される。これにより、これらの粒子と結合する所望の抗原を大量発現する細胞が選択される。例えば、CD4T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、希釈した濃度でCD8T細胞よりもより効率的に捕捉される。1つの態様において、用いられる細胞濃度は、5×106個/mlである。もう1つの態様において、用いられる濃度は、約1×105個/ml~1×106個/ml、およびその間の任意の整数であることができる。他の態様において、細胞を、回転器にて、さまざまな時間にわたって、さまざまな速度で、2~10°Cまたは室温のいずれかで、インキュベートすることもできる。また、刺激のためのT細胞を、洗浄段階の後に凍結することもできる。理論に拘束されることは望まないが、凍結段階およびそれに続く解凍段階は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球を除去することによって、より均一な製剤を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄段階の後に、これらの細胞を凍結液中に懸濁させてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、かつこの状況において有用であるが、1つの方法は、20DMSOおよび8ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または、10デキストラン40および5デキストロース、20ヒト血清アルブミンおよび75DMSO、または3125PlasmalyteA、3125デキストロース5、045NaCl、10デキストラン40および5デキストロース、20ヒト血清アルブミンおよび75DMSO、または例えばHespanおよびPlasmaLyteAを含有する他の適した細胞凍結培地の使用を伴い、続いてこれらの細胞は、1分間に1°Cの速度で80°Cに凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加え、即時20°Cまたは液体窒素中の制御されない凍結を使用してもよい。ある態様においては、凍結保存細胞を本明細書に記載の通りに解凍および洗浄して、室温で1時間静置した後に、本発明の方法を用いる活性化を行う。また、本発明に関連して、本明細書に記載されたような増大された細胞が必要となる前の期間での、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の収集も想定している。そのために、増大させようとする細胞の供給源を、必要な任意の時点で収集し、T細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載された説明されたもののような、T細胞療法による恩恵を受けると考えられる任意のさまざまな疾患または病状に対するT細胞療法に後に用いるために単離して凍結することができる。1つの態様においては、血液試料またはアフェレーシス物を、全般的に健常な対象から採取する。ある態様においては、血液試料またはアフェレーシス物を、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない全般的に健常な対象から採取し、関心対象の細胞を、後に用いるために単離して凍結する。ある態様においては、T細胞を増大させ、凍結して、後の時点で用いる。ある態様においては、本明細書に記載されたような特定の疾患の診断後間もなく、しかしいかなる治療も行わないうちに、患者から試料を収集する。1つのさらなる態様においては、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス薬、化学療法、放射線療法、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506などの免疫抑制剤、抗体、または他の免疫除去薬、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および照射などの作用因子による治療を非限定的に含む、任意のさまざまな妥当な治療様式の前の対象由来の血液試料またはアフェレーシス物から単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するかシクロスポリンおよびFK506、または増殖因子で誘導されるシグナル伝達にとって重要なp70S6キナーゼを阻害するラパマイシンLiuetalCell668078151991;HendersonetalImmun733163211991;BiereretalCurrOpinImmun57637731993。1つのさらなる態様においては、細胞を患者のために単離して、骨髄移植もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射療法XRT、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法とともに例えば、その前、同時またはその後に、後に用いるために凍結する。もう1つの態様においては、細胞を事前に単離した上で、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどによるB細胞除去療法後の治療のために後で用いるために凍結する。本発明の1つのさらなる態様においては、T細胞を、治療後に患者から直接入手する。これに関して、ある種の癌治療、特に免疫系を障害を及ぼす薬物による治療の後には、患者が通常であれば治療から回復中であると考えられる治療後間もない時点で、得られるT細胞の品質が、それらがエクスビボで増大する能力の点で最適であるか改善されていることが観察されている。同様に、本明細書に記載された方法を用いるエクスビボ操作の後にも、これらの細胞は生着およびインビボ増大の増強のために好ましい状態にある可能性がある。したがって、本発明に関連して、この回復相の間に、T細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することを想定している。さらに、ある態様においては、動員例えば、GMCSFによる動員レジメンおよび条件付けレジメンを用いて、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および/または増大にとって有利に働く状態を、特に治療法の後のある規定された時間枠の間に、対象において作り出すことができる。例示的な細胞型には、T細胞、B細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞が含まれる。T細胞の活性化および増大所望のCARを発現させるためのT細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかにおいて、一般に、例えば、米国特許第6352694号;第6534055号;第6905680号;第6692964号;第5858358号;第6887466号;第6905681号;第7144575号;第7067318号;第7172869号;第7232566号;第7175843号;第5883223号;第6905874号;第6797514号;第6867041号;ならびに米国特許出願公開第20060121005号に記載された方法を用いて、T細胞を活性化して増大させることができる。一般に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する作用物質、およびT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結びつけられた表面との接触によって増大させられる。特に、T細胞集団は、本明細書に記載されたように、例えば、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは抗CD2抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼCアクチベーター例えば、ブリオスタチンとの接触などによって、刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の同時刺激のためには、アクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4T細胞またはCD8T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体および抗CD28抗体。抗CD28抗体の例には、93、BT3、XRCD28DiacloneBesanconFranceが含まれ、当技術分野において一般に公知である他の方法と同様に用いることができるBergetalTransplantProc30397539771998;HaanenetalJExpMed190131913281999;GarlandetalJImmunolMeth22753631999。ある態様において、T細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、さまざまなプロトコールによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える作用物質は、溶液中にあってもよく、または表面と結びつけてもよい。表面と結びつける場合、これらの作用物質を同じ表面に結びつけてもよくすなわち、シスフォーメーション、または別々の表面に結びつけてもよいすなわち、トランスフォーメーション。または、一方の作用物質を溶液中の表面に結びつけ、もう一方の作用物質が溶液中にあってもよい。1つの態様においては、共刺激シグナルを与える作用物質を細胞表面と結合させ、一次活性化シグナルを与える作用物質は溶液中にあるか、または表面と結びつける。ある態様においては、両方の作用物質が溶液中にあってもよい。もう1つの態様において、これらの物質は可溶形態にあり、続いて、Fc受容体を発現する細胞または抗体またはこれらの物質と結合する他の結合物質などの表面と架橋結合することができる。これに関しては、例えば、本発明においてT細胞を活性化および増大させるために用いることを想定している人工抗原提示細胞aAPCについての、米国特許出願公開第20040101519号および第20060034810号を参照されたい。1つの態様においては、2種の作用物質を、同じビーズ上に、すなわちシスか、または別々のビーズ上に、すなわちトランスかのいずれかとして、ビーズ上に固定化する。一例として、一次活性化シグナルを与える作用物質は抗CD3抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを与える作用物質は抗CD28抗体またはその抗原結合フラグメントである;そして、両方の作用物質を等モル量で同じビーズに同時固定化する。1つの態様においては、CD4T細胞の増大およびT細胞増殖のためにビーズと結合させる各抗体を1:1の比で用いる。本発明のある局面においては、ビーズと結合させる抗CD3:CD28抗体の比として、1:1の比を用いて観察される増大と比較してT細胞増大の増加が観察されるようなものを用いる。1つの特定の態様においては、1:1の比を用いて観察される増大と比較して約1~約3倍の増加が観察される。1つの態様においては、ビーズと結合させるCD3:CD28抗体の比は、100:1~1:100、およびそれらの間のすべての整数の範囲にある。本発明の1つの局面においては、抗CD3抗体よりも多くの抗CD28抗体が粒子と結合され、すなわちCD3:CD28の比は1未満である。本発明のある態様において、ビーズと結合させる抗CD28抗体と抗CD3抗体との比は、2:1よりも大きい。1つの特定の態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:100のCD3:CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:75のCD3:CD28比を用いる。さらなる態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:50のCD3:CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:30のCD3:CD28比を用いる。1つの好ましい態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:10のCD3:CD28比を用いる。もう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に1:3のCD3:CD28比を用いる。さらにもう1つの態様においては、ビーズと結合させる抗体に3:1のCD3:CD28比を用いる。T細胞または他の細胞標的を刺激するには、粒子と細胞との比として1:500~500:1およびその間の任意の整数値を用いることができる。当業者が容易に理解するように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存しうる。例えば、小さいサイズのビーズは2、3個の細胞と結合しうるに過ぎないが、一方、より大きいビーズは多くと結合しうると考えられる。ある態様において、細胞と粒子との比は1:100~100:1およびその間の任意の整数値の範囲にあり、さらなる態様において、この比は1:9~9:1およびその間の任意の整数値を含み、これを同じくT細胞を刺激するために用いることができる。T細胞の刺激をもたらす、抗CD3および抗CD28が結びついた粒子とT細胞との比は、上述したようにさまざまでありうるが、いくつかの好ましい値には、1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1および15:1が含まれ、1つの好ましい比は、T細胞1個につき粒子が少なくとも1:1である。1つの態様においては、1:1またはそれ未満である粒子と細胞との比を用いる。1つの特定の態様において、好ましい粒子:細胞比は1:5である。さらなる態様において、粒子と細胞との比は、刺激の日に応じて変化しうる。例えば、1つの態様において、粒子と細胞との比は第1日に1:1~10:1であり、その後最長10日間にわたって毎日または1日おきに追加の粒子を細胞に添加して、最終的な比が1:1~1:10となる添加の日の細胞数に基づく。1つの特定の態様において、粒子と細胞との比は刺激の1日目に1:1であり、刺激の3日目および5日目に1:5に調節される。もう1つの態様において、粒子は毎日または1日おきに添加され、最終的な比は1日目に1:1であり、刺激の3日目および5日目には1:5である。もう1つの態様において、粒子と細胞との比は刺激の1日目に2:1であり、刺激の3日目および5日目に1:10に調節される。もう1つの態様において、粒子は毎日または1日おきに添加され、最終的な比は1日目に1:1であり、刺激の3日目および5日目には1:10である。当業者は、さまざまな他の比が、本発明における使用に適することを理解するであろう。特に、比は粒子サイズならびに細胞のサイズおよび型に応じて多様であると考えられる。本発明のさらなる態様においては、T細胞などの細胞を、作用物質でコーティングされたビーズと一緒にし、その後にビーズと細胞を分離した上で、続いて細胞を培養する。1つの代替的な態様においては、培養の前に、作用物質でコーティングされたビーズと細胞を分離せずに、一緒に培養する。1つのさらなる態様においては、ビーズおよび細胞を磁力などの力の印加によってまず濃縮して、細胞表面マーカーの連結を増加させて、それにより、細胞刺激を誘導する。例として、抗CD3および抗CD28が結びつけられた常磁性ビーズ3x28ビーズをT細胞と接触させることによって、細胞表面タンパク質を連結させることができる。1つの態様においては、細胞例えば、104~109個のT細胞およびビーズ例えば、DYNABEADS登録商標M450CD3CD28T常磁性ビーズ、1:1の比を、緩衝液中、好ましくはPBSカルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない中で一緒にする。この場合も、当業者は、あらゆる細胞濃度を用いうることを容易に理解するであろう。例えば、標的細胞が試料中に非常に稀であって、試料のわずかに001を構成してもよく、または試料の全体すなわち、100が関心対象の標的細胞で構成されてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況の範囲に含まれる。ある態様においては、粒子と細胞を一緒にして混合する容積を著しく減らしてすなわち、細胞の濃度を高めて、細胞と粒子の最大の接触を確実にすることが望ましいと考えられる。例えば、1つの態様においては、細胞約20億個/mlの濃度を用いる。もう1つの態様においては、細胞10000万個/ml超を用いる。1つのさらなる態様においては、1000万個、1500万個、2000万個、2500万個、3000万個、3500万個、4000万個、4500万個、または5000万個/mlの細胞濃度を用いる。さらにもう1つの態様においては、7500万個、8000万個、8500万個、9000万個、9500万個または10000万個/mlの細胞濃度を用いる。さらなる態様において、細胞12500または15000万個/mlの濃度を用いることができる。高濃度を用いることにより、細胞収量、細胞活性化、および細胞増大の増加がもたらされうる。さらに、高い細胞濃度を用いることにより、CD28陰性T細胞のように関心対象の標的抗原を弱く発現する細胞のより効率的な捕捉が可能になる。ある態様においては、そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、入手することが望ましいと考えられる。例えば、高濃度の細胞を用いることにより、通常は比較的弱いCD28発現を有するCD8T細胞のより効率的な選択が可能にある。本発明の1つの態様においては、混合物を、数時間約3時間~約14日間、またはその間の任意の整数値単位の時間にわたって培養しうる。もう1つの態様において、混合物を21日間培養しうる。本発明の1つの態様においては、ビーズとT細胞を約8日間一緒に培養する。もう1つの態様においては、ビーズとT細胞は2~3日間一緒に培養する。数回の刺激サイクルも望ましく、その結果、T細胞の培養時間は60日間またはそれより長くなる。T細胞の培養に適した条件には、血清例えばウシ胎仔血清またはヒト血清、インターロイキン2IL2、インスリン、IFNγ、IL4、IL7、GMCSF、IL10、IL12、IL15、TGFβおよびTNFα、または当業者に公知である細胞増殖のための他の添加物を含む、増殖および生存のために必要な因子を含みうる適切な培地例えば、最小必須培地またはRPMIMedium1640または、Xvivo15Lonzaが含まれる。細胞の増殖のための他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばNアセチルシステインおよび2メルカプトエタノールなどが非限定的に含まれる。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加された、血清非含有であるか、またはT細胞の増殖および増大のために十分な、適量の血清または血漿もしくは規定されたホルモンのセットおよび/もしくは一定量のサイトカインが加えられた、RPMI1640、AIMV、DMEM、MEM、αMEM、F12、XVivo15、およびXVivo20が含まれうる。ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は実験培養物のみに含められ、対象に輸注される細胞の培養物には含められない。標的細胞は、増殖を支えるために必要な条件下、例えば適切な温度例えば、37°Cおよび雰囲気例えば、空気5CO2の下で維持される。多様な刺激時間にわたって曝露されたT細胞は、異なる特性を示しうる。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを受けた末梢血単核細胞産物は、ヘルパーT細胞集団TH、CD4を、細胞傷害性またはサプレッサーT細胞集団TC、CD8よりも多く有する。CD3受容体およびCD28受容体を刺激することによるT細胞のエクスビボ増大では、約8~9日目より前には主としてTH細胞からなるT細胞集団が生じるが、約8~9日目以後、T細胞の集団はTC細胞の集団を次第に多く含むようになる。したがって、治療の目的によっては、主としてTH細胞で構成されるT細胞集団を対象に輸注することが有利な場合がある。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合には、このサブセットをより高度に増大させることが有益な場合がある。さらに、CD4およびCD8マーカーのほかに、他の表現型マーカーも、細胞増大の過程で顕著に、しかし大部分は再現性を伴って変動する。このため、そのような再現性により、活性化T細胞製剤を特定の目的に合わせて作ることが可能になる。治療適用本発明は、レンチウイルスベクターLVによって形質導入された細胞例えば、T細胞を範囲に含む。例えば、LVは、特異的抗体の抗原認識ドメインを、CD3ζ、CD28、41BBの細胞内ドメインまたはこれらの任意の組み合わせと組み合わせたCARをコードする。このため、場合によっては、形質導入されたT細胞は、CARにより媒介されるT細胞応答を誘発することができる。本発明は、一次T細胞の特異性を腫瘍抗原に向けて再誘導するためのCARの使用を提供する。したがって、本発明はまた、哺乳動物において標的細胞集団または組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、CARを発現するT細胞を哺乳動物に投与する段階を含み、該CARが、所定の標的と特異的に相互作用する結合モイエティー、例えばヒトCD3ζの細胞内ドメインを含むζ鎖部分、および共刺激シグナル伝達領域を含む、方法を提供する。1つの態様において、本発明は、CARを発現するようにT細胞を遺伝子改変し、そのCART細胞をそれを必要とするレシピエントに輸注する、一種の細胞療法を含む。輸注された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、CART細胞はインビボで複製して、持続的腫瘍制御につながりうる長期存続性をもたらすことができる。1つの態様において、本発明のCART細胞は、頑強なインビボT細胞増大を起こすことができ、より延長した時間にわたって存続することができる。もう1つの態様において、本発明のCART細胞は、あらゆる追加的な腫瘍形成または増殖を阻害するように再活性化されうる、特異的なメモリーT細胞になることができる。例えば、本発明のCART19細胞が頑強なインビボT細胞増大を起こして、血液および骨髄において延長した時間にわたって高レベルに存続して、かつ特異的なメモリーT細胞を形成しうることは予想外であった。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、CART細胞は、インビボでサロゲート抗原を発現する標的細胞に遭遇するとセントラルメモリー様状態に分化することができ、その後にそれを排除することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、CAR改変T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的な免疫応答でも受動的な免疫応答でもありうる。加えて、CARにより媒介される免疫応答は、CAR改変T細胞がCARにおける抗原結合モイエティーに対して特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部となりうる。例えば、CART19細胞は、CD19を発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。本明細書に開示されたデータは、FMC63マウスモノクローナル抗体に由来する抗CD19scFv、ヒトCD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびにヒト41BBおよびCD3ζのシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを具体的に開示しているが、本発明は、本明細書中の別所に記載されたような構築物の構成要素のそれぞれに関してあらゆるさまざまな変形物を含むとみなされるべきである。すなわち、本発明は、抗原結合モイエティーに対して特異的な、CARにより媒介されるT細胞応答を生じさせるための、CARにおける任意の抗原結合モイエティーの使用を含む。例えば、本発明のCARにおける抗原結合モイエティーは、癌の治療を目的として腫瘍抗原を標的とすることができる。治療しうる可能性のある癌には、血管が発達していないか、またはまだ実質的に血管が発達していない腫瘍、ならびに血管が発達した腫瘍が含まれる。癌は非固形腫瘍血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫を含んでもよく、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のCARを用いて治療される癌の種類には、癌腫、芽細胞腫および肉腫、ある種の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫および黒色腫が非限定的に含まれる。成人腫瘍/癌および小児腫瘍/癌も含められる。血液悪性腫瘍は、血液または骨髄の癌である。血液または造血器悪性腫瘍の例には、白血病、急性白血病急性リンパ性白血病、急性骨髄急性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性の白血病および赤白血病など、慢性白血病慢性骨髄球性顆粒球性白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病など、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫無症候型およびハイグレード型、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛様細胞白血病および骨髄異形成が含まれる。固形腫瘍とは、通常は嚢胞も液体領域も含まない組織の異常腫瘤のことである。固形腫瘍は良性のことも悪性のこともある。さまざまな種類の固形腫瘍が、それを形成する細胞の種類によって名付けられている肉腫、癌腫およびリンパ腫など。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞種皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、ならびにCNS腫瘍神経膠腫脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など、神経膠芽細胞腫多形性神経膠芽細胞腫としても知られる、星状細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫menangioma、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫および脳転移などが含まれる。1つの態様において、本発明のCARのモイエティー部分と結合する抗原は、特定の癌を治療するように設計される。例えば、CD19を標的とするように設計されたCARを、プレBALL小児適応、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどを非限定的に含む癌および障害を治療するために用いることができる。もう1つの態様において、CARを、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を治療するために、CD22を標的とするように設計することができる。1つの態様において、CD19、CD20、CD22およびROR1を標的とするCARの組み合わせを用いて治療しうる癌および障害には、プレBALL小児適応、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、同種骨髄移植後サルベージなどが非限定的に含まれる。1つの態様において、CARを、中皮腫、膵癌、卵巣癌などを治療するために、メソテリンを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、急性骨髄性白血病などを治療するために、標的CD33IL3Raを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、トリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌などを治療するために、cMetを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、前立腺癌などを治療するために、PSMAを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、前立腺癌などを治療するために、糖脂質F77を標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、神経膠芽細胞腫gliobastomaなどを治療するために、EGFRvIIIを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、神経芽細胞腫、黒色腫などを治療するために、GD2を標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するために、NYESO1TCRを標的とするように設計することができる。1つの態様において、CARを、骨髄腫、肉腫、黒色腫などを治療するために、MAGEA3TCRを標的とするように設計することができる。しかし、本発明は、本明細書に開示された抗原標的および疾患のみに限定されるとみなされるべきではない。より正確には、本発明は、疾患を治療するためにCARを用いうる疾患と関連するあらゆる抗原標的を含むとみなされるべきである。本発明のCAR改変T細胞はまた、哺乳動物におけるエクスビボ免疫処置および/またはインビボ治療法のためのワクチンの一種としても役立つことができる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。エクスビボ免疫処置に関しては、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下の少なくとも1つをインビトロで行う:i細胞の増大、iiCARをコードする核酸を細胞に導入すること、および/またはiii細胞の凍結保存。エクスビボ手順は当技術分野において周知であり、以下でより詳細に考察する。手短に述べると、細胞を哺乳動物好ましくはヒトから単離した上で、本明細書で開示されたCARを発現するベクターによって遺伝子改変するすなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトを行う。CAR改変細胞を哺乳動物レシピエントに投与することにより、治療的利益を得ることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、CAR改変細胞はレシピエントに対して自己であることができる。または、細胞がレシピエントに対して同種、同系または異種であることもできる。造血幹細胞および始原細胞のエクスビボ増大のための手順は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5199942号に記載されており、これを本発明の細胞に適用することができる。他の適した方法は当技術分野において公知であり、このため、本発明は、エクスビボ細胞の増大のいかなる特定の方法にも限定されない。手短に述べると、T細胞のエクスビボ培養および増大は以下を含む:1CD34造血幹細胞および始原細胞を哺乳動物から、末梢血採取物または骨髄エクスプラントから収集すること;ならびに2そのような細胞をエクスビボを増大させること。米国特許第5199942号に記載された細胞増殖因子のほかに、flt3L、IL1、IL3およびckitリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および増大のために用いることができる。エクスビボ免疫処置に関して細胞ベースのワクチンを用いることに加えて、本発明はまた、患者における抗原に向けての免疫応答を誘発するためのインビボ免疫処置のための組成物および方法も提供する。一般に、本明細書に記載の通りに活性化および増大された細胞は、免疫機能が低下した個体において生じる疾患の治療および予防に利用することができる。特に、本発明のCAR改変T細胞は、CCLの治療に用いられる。ある態様において、本発明の細胞は、CCLを発症するリスクのある患者の治療に用いられる。したがって、本発明は、CCLの治療または予防のための方法であって、それを必要とする対象に対して、本発明のCAR改変T細胞の治療的有効量を投与する段階を含む方法を提供する。本発明のCAR改変T細胞は、単独で、または希釈剤および/またはIL2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物として投与することができる。手短に述べると、本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載の標的細胞集団を、1つまたは複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせて含みうる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液;ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールのような炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸;酸化防止剤;EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤;アジュバント例えば、水酸化アルミニウム;並びに保存剤を含有してもよい。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤されることが好ましい。本発明の薬学的組成物は、治療または予防される疾患に適した方法で投与することができる。投与量および投与回数は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適量は臨床試験により決定され得る。免疫学的有効量、抗腫瘍的有効量、腫瘍阻害的有効量または治療量が指示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、および患者対象の状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。一般に、本明細書に記載のT細胞を含む薬学的組成物は、細胞104~109個/kg体重、好ましくは細胞105~106個/kg体重であって、これらの範囲内のすべての整数値を含む投与量で投与することができる。また、T細胞組成物をこれらの用量で多回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般的に公知である輸注手法を用いることによって投与することができる例えば、RosenbergetalNewEngJofMed31916761988を参照。特定の患者に関する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の徴候に関して患者をモニタリングして、それに応じて治療を調節することによって、医療の当業者によって容易に決定されうる。ある態様においては、活性化されたT細胞を対象に投与し、続いてその後に血液を再び採取してまたはアフェレーシスを行って、それ由来のT細胞を本発明に従って活性化した上で、これらの活性化および増大されたT細胞を患者に再び輸注することが望まれると考えられる。この過程を2、3週毎に複数回行うことができる。ある態様において、T細胞は10cc~400ccの採取血から活性化させることができる。ある態様において、T細胞は20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90ccまたは100ccの採取血から再活性化される。理論に拘束されるわけではないが、この複数回の採血/複数回の再輸注プロトコールを用いることは、T細胞のある特定の集団を選別するために役立つ可能性がある。本組成物の投与は、エアゾール吸引、注射、経口摂取、輸液、植え付けまたは移植を含む、任意の好都合な様式で実施することができる。本明細書に記載された組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内iv注射により、または腹腔内に投与することができる。1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、患者に対して、皮内注射または皮下注射によって投与される。もう1つの態様において、本発明のT細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。T細胞の組成物を腫瘍内、リンパ節内または感染部位に直接注射してもよい。本発明のある態様においては、本明細書に記載の方法、またはT細胞を治療的レベルまで増大させることが当技術分野において公知である他の方法を用いて活性化および増大された細胞を、MS患者に対する抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン2、シタラビンARACとしても公知もしくはナタリズマブ治療、乾癬患者に対するエファリズマブ治療、またはPML患者に対する他の治療などの薬剤による治療を非限定的に含む、任意のさまざまな妥当な治療様式とともに例えば、前に、同時に、または後に患者に投与する。さらなる態様において、本発明のT細胞を、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびFK506など、抗体、またはCAMPATHなどの他の免疫除去薬、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射と組み合わせて用いてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存型ホスファターゼのカルシニューリンを阻害するかシクロスポリンおよびFK506、または増殖因子が誘導したシグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害するラパマイシンかのいずれかであるLiuetalCell668078151991;HendersonetalImmun733163211991;BiereretalCurrOpinImmun57637731993。1つのさらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法薬、外部ビーム照射XRT、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞除去療法と組み合わせて例えば、その前、同時またはその後に、患者に投与される。もう1つの態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどによるB細胞除去療法の後に投与される。例えば、1つの態様において、対象は、高用量の化学療法薬に続いて末梢血幹細胞移植を行う標準治療を受けることができる。ある態様においては、移植後に、対象は本発明の増大された免疫細胞の輸注を受ける。1つの追加的な態様において、増大された細胞は、手術の前または後に投与される。患者に投与される上記の治療の投与量は、治療される病状および治療のレシピエントの正確な性質に応じて異なると考えられる。ヒトへの投与に関する投与量の増減は、当技術分野において許容される実践に従って行うことができる。例えば、CAMPATHの用量は、一般に成人患者について1~約100mgの範囲であり、通常は1~30日の期間にわたって毎日投与される。好ましい一日量は1~10mg日であるが、場合によっては、最大40mg/日までのより多くの用量を用いることもできる米国特許第6120766号に記載。実験例ここで本発明を、以下の実験例を参照しながら説明する。これらの例は例示のみを目的として提供されるものであり、本発明はこれらの例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も範囲に含むとみなされるべきである。それ以上の説明がなくても、当業者は、前記の説明および以下の例示的な例を用いて、本発明の化合物を作成して利用し、請求される方法を実施することができる。以下の実施例は、このため、本発明の好ましい態様を具体的に指摘しており、本開示の残りを限定するものとは全くみなされるべきでない。実施例1:キメラ受容体を発現するT細胞は、進行した白血病の患者においてメモリー効果および強力な抗腫瘍効果を成立させるキメラ抗原受容体CARを発現するように操作されたリンパ球について、過去の臨床試験では極めてわずかなインビボ増大および抗腫瘍効果しか実証されていない。本明細書で提示された結果は、CD137を含むCART細胞が、進行した慢性リンパ性白血病CLLを有する、治療された患者3人中3人において、輸注後に交差耐性のない強力な臨床活性を有することを実証している。操作されたT細胞はインビボで1000倍を上回って増大し、骨髄に輸送されて、機能的CARを少なくとも6カ月にわたって高レベルで発現し続けた。平均して、輸注された各CART細胞は少なくとも1000個のCLL細胞を根絶させた。血液および骨髄におけるCD19特異的な免疫応答が実証され、これは患者3人中2人における完全寛解を伴った。細胞の一部分はメモリーCART細胞として存続したが、このことは、B細胞悪性腫瘍の有効な治療のためのこのMHC非拘束的アプローチの潜在能力を指し示している。これらの実験に用いた材料および方法について以下に説明する。材料および方法一般的な検査の説明研究試料の処理、凍結および検査分析は、試料の受け取り、処理、凍結および分析のための確立されたSOPおよび/またはプロトコールを用いて優良試験所基準GoodLaboratoryPracticeの規範に則って運用されている、UniversityofPennsylvaniaのTranslationalandCorrelativeStudiesLaboratoryで行った。アッセイ成績およびデータ報告により、MIATA指針が裏づけられているJanetzkietal2009Immunity31527528。プロトコールのデザイン図1に図示したように臨床試験NCT01029366を実施した。少なくとも2回の前治療レジメン後に持続性疾患を有し、かつ同種幹細胞移植には適格でなかったCD19陽性血液悪性腫瘍の患者を、この試験に対して適格とした。腫瘍病期再判定後に、CART19製造のための末梢血T細胞をアフェレーシスによって収集し、対象に対して、輸注の前の週に、図10に明記した通りの単回コースの化学療法を行った。CART19細胞を、図10に表記した用量での3日分割投与レジメン10、30および60を用いる静脈内輸注によって投与し、可能であれば、第10日に2回目の用量を投与した;2回目の輸注のために十分な細胞を有していたのは患者UPN02のみであった。対象を毒性および奏効性に関して、頻回な間隔で少なくとも6カ月間にわたって評価した。プロトコールは、USFoodandDrugAdministrationのRecombinantDNAAdvisoryCommittee、およびUniversityofPennsylvaniaのInstitutionalReviewBoardによる承認を受けた。輸注の最初の日を試験第0日に設定した。対象:臨床的概要臨床的概要を図10に示し、詳細な病歴を本明細書中の他所に提示している。患者UPN01は、55歳の時にステージIIのB細胞CLLと初めて診断された。この患者は無症候性であり、進行性リンパ球増加症、血小板減少症、リンパ節肥大および脾腫に対する治療法が必要となるまで、およそ1~1/2年間の観察を受けた。この時間の経過の間に、患者は数系統の前治療を受けた。最も直近の治療法は、CART19細胞輸注の2カ月前の2サイクルのペントスタチン、シクロホスファミドおよびリツキシマブであったが、奏効性は極めてわずかであった。この患者は続いて、CART19細胞輸注の前にリンパ除去化学療法として1サイクルのベンダムスチンを投与された。患者UPN02は、疲労および白血球増加症を呈した68歳の時に初めてCLLと診断された。この患者は4年間にわたって比較的安定していたが、その時点で患者は、治療を要する進行性白血球増加症195000/μl、貧血および血小板減少症を発症した。核型分析により、CLL細胞に染色体17pの欠失があることが示された。疾患進行のために患者はアレムツズマブによる治療を受けて部分的奏効が得られたが、1年半以内に患者は進行性疾患となった。患者を再びアレムツズマブで18週間治療したところ、部分的奏効および1年間の無増悪期間が得られた。患者は続いて2サイクルのベンダムスチンおよびリツキシマブを投与されたが、有意な奏効性はみられなかった図5A。患者はCART19細胞輸注の前に、リンパ除去化学療法としてベンダムスチン単剤を投与された。患者UPN03は、50歳の時に無症候性のステージICLLを呈し、それから数年間の経過観察を受けた。患者は治療を必要とする進行性白血球増加症白血球数92000/μlおよび進行性リンパ節肥大を起こした。患者は2サイクルのリツキシマブおよびフルダラビンを投与され、その結果、血球数の正常化および有意な改善がもたらされたが、リンパ節肥大の完全な解消には至らなかった。患者はおよそ3年間の無増悪期間を得た。核型検査により、細胞が染色体17pの欠失を含むことが示され、FISHにより、細胞200個のうち170個でTP53欠失が実証された。それから数年を経るうちに、患者は進行性白血球増加症およびリンパ節肥大のために3系統の異なる治療法図10を必要とし、最後にアレムツズマブを投与され、CART19細胞輸注の6カ月前に部分的奏効が得られた。患者はCART19細胞輸注の前に、リンパ除去化学療法としてペントスタチンおよびシクロホスファミドを投与された。ベクターの作製記載の通りにMiloneetal2009MolTher1714531464、CD19BBz導入遺伝子GeMCRIS0607793を設計して構築した。レンチウイルスベクターは、記載の通りにZuffereyetal1997Naturebiotechnol15871875、LentigenCorporationにおいて、3プラスミド作製アプローチを用いる優良製造規範に従って作製された。CART19細胞製剤の調製抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体でコーティングした常磁性ポリスチレンビーズを用いるT細胞調製の方法は記載されているLaportetal2003Blood10220042013。レンチウイルス形質導入は記載の通りに行った5868。35~65歳の成人男性では骨髄は体重全体の50に相当し、16が活性赤色骨髄、34が不活性脂肪骨髄で構成されるBasicanatomicalandphysiologicaldataforuseinradiologicalprotectionTheSkeletoninAnnalsoftheICRPVol255868。骨髄生検標本および吸引液標本に基づき、表1に示したように、ベースラインでの患者3人のCLL細胞の重量を算出した。続いて、総CLL骨髄量のこれらの推定値を、1Kg=細胞1012個を用いて骨髄内の総CLL細胞数に換算し、その結果得られた数を図10に示した。これらの算出は、CLLが骨髄内で均一な分布を有するという仮定に基づく。患者UPN01については、ベンダムスチン化学療法の前に入手した骨髄生検試料、ならびにベンダムスチン後およびCART19輸注の前に入手した吸引液についての算出値を示している。第1日吸引液に関する数字は、第14日生検標本と比較して精度が低いが、これは第1日吸引液の技術的限界に起因する。患者UPN02では、CLLによる骨髄の完全な置き換えを示す単一の治療前生検標本が得られた。この患者ではCART19後の第30日に変化のない標本が得られた。患者UPN03に関する骨髄での総量は、化学療法後およびCART19生検前に基づいて算出した。表1骨髄量血液:CART19輸注前の血液中にかなりのCLL腫瘍総量を有したのは患者UPN02のみであった。フローサイトメトリーにより、細胞は、薄い表面κ拘束CD5CD10CD19CD20薄いCD23可変IgMB細胞集団を伴うクローン集団としての典型的な表現型を示した。CLL細胞のおよそ35はCD38を共発現した。CLL負荷量は3サイクルのベンダムスチン化学療法を行っても消失せず、CART19輸注の時点も存在していた。CART19輸注の時点で、血中CLL数は55000個/μLであった。血液量を50Lと仮定した上で、患者UPN02は第0日に、血中に275×1011個のCLL細胞を有していた。患者UPN01および03における総WBC数が正常であったことを考慮して、これらの患者における流血中疾患負荷量は計算しなかったが、このことは全身負荷量の幾分過小な推定値をもたらしたと考えられる。二次リンパ組織:リンパ節症および脾腫の体積を、横断CTスキャンにて、FDAにより認可されたソフトウエアを用いて定量した。体積は胸部、腹部および骨盤のみについてである。T1椎体から総大腿動脈の分岐レベルまでの腫瘤を全患者で測定し、一部の患者では鼠径部における節も含めた。頭/頸部および四肢における節は分析から除外し、ベースラインのCLL標的細胞数からも除外したが、これは同じく全身負荷量の幾分過小な推定値につながったと考えられる。患者UPN01および03は、6カ月を超えて持続的な完全寛解を有し、このため、式ベースライン体積3カ月目の体積を、腫瘍総量のベースラインからの減少を決定するために用いた;患者UPN02はリンパ節肥大に関して疾患安定であり、このため、ベースライン腫瘍量は、年齢を一致させた健常男性による脾臓体積基準値を差し引くことによって推定したHarrisetal2010EurJRadiol75e97e101。ベースライン腫瘍量を、細胞密度アプローチ1Kg/L密度、および1Kg=細胞1012個または体積アプローチCLL細胞は直径10μMであり、球状と仮定すると600fLであるを用いてCLL細胞に換算し、両方の値を図10に提示している。入手可能なCTスキャンから算出した、患者3人における二次リンパ組織中の腫瘍体積は、以下の表2に示されている。表2腫瘍体積患者UPN01に関するベースラインのCTスキャンを、2サイクルのペントスタチン/シクロホスファミド/リツキシマブの8日後に行ったところ、以前のCTスキャンと比較して、この化学療法レジメンに対する奏効は全く示されなかった。この患者はCART19の前に1サイクルのベンダムスチンを受けており、それ故に、UPN01について第37日から第31日までの腫瘍体積の変化がベンダムスチンならびにCART19の寄与による可能性を否定できない。同様に、UPN03に関する腫瘍体積の変化は、1サイクルのペンタスタチン/シクロホスファミドおよびCART19の併用効果を反映している。患者における有効なインビボE:T比を推定するための方法輸注したCART細胞と、死滅した腫瘍細胞の数とのE:T比を、CART細胞注射の時点で存在した腫瘍細胞の数、および注入したCART細胞の数を用いて算出したCarpenitoetal2009ProcNatlAcadSciUSA10633603365。本発明に関しては、図10に示したCART19T細胞の数を用いたが、これは、インビボに存在するCART19T細胞の絶対数を十分な精度または正確さで決定することができないためである。血液および骨髄におけるCART19増大に関して入手可能であったデータは、図2および図6に描写されているように頑強である。しかし、二次リンパ組織などの他の部位へのCART19の輸送について決定することは不可能であり、このため、腫瘍の最大縮小時点でインビボで達成されたCART19細胞の総数についてはかなり不確実さがある。有効なE:T比の算出には、表3からの算出値を用いた。表3インビボで達成されたCART19E:T比の算出値1=密度体積法の平均2=患者UPN02は骨髄で反応がみられず、脾臓およびリンパ節においてCTによって測定した腫瘍量についてリンパ節肥大の部分的縮小がみられた細胞31E11個。血中での反応については図5Aを参照。試料の処理および凍結ラベンダートップK2EDTAまたはレッドトップ添加物なしのバキュテナーチューブBectonDickinson内に試料末梢血、骨髄を収集し、採取から2時間以内にTCSLに搬送した。確立された検査SOPに従って、試料は受け取って30分以内に処理した。末梢血および骨髄の単核細胞を、FicollPaqueGEHealthcare17144003を用いるFicoll密度勾配遠心分離によって精製し、4ヒト血清アルブミンGeminiBioProducts800120、2ヘタスターチNovaplusNDC0409724849および10DMSOSigmaD2650を加えたRPMIGibco11875135中で、5100Cryo1 ゚凍結容器を用いて凍結した;80°Cで24~72時間おいた後、長期貯蔵のために細胞を液体窒素中に移した。アフェレーシス試料は、HospitaloftheUniversityofPennsylvaniaBloodBankを通じて入手し、Ficoll勾配精製によってCVPF中で処理した上で、上記のように凍結した。解凍直後の生存度は、評価時点で85を上回った。血清単離のためには、試料を室温で15~2時間凝固させ;遠心分離によって血清を単離して、単回使用のための100μlアリコートを80°Cで凍結した。細胞株K562CML、CD19陰性はATCCCCL243から入手した。CarmineCarpenito氏から寄贈いただいたK562/CD19は、CD19分子を発現するように100の頻度でレンチウイルスにより形質導入されたK562である。CD19陽性の非T、非BALL前駆B細胞株でありHurwitzetal1979IntJCancer23174180、CD19抗原を発現することが確かめられたNALM6は、LaurenceCooper氏から寄贈いただいた。上記の細胞株は、10ウシ胎仔血清Hycloneおよび1PenStrepGibco15140122を加えたR10培地RPMI1640Gibco11875中で維持した。健常ドナー由来の末梢単核細胞ND365は、UniversityofPennsylvaniaのHumanImmunologyCoreからアフェレーシスによって入手し、処理して、上記のように凍結した。DNAの単離およびQPCR分析ラベンダートップK3EDTAのBDバキュテナーチューブBectonDickinson内に全血または骨髄試料を収集した。QIAampDNAbloodmidiキットQiagenおよび確立された検査SOPを用いて全血からゲノムDNAを直接単離し、分光光度計によって定量した上で、80°Cで貯蔵した。ゲノムDNA試料に対するQPCR分析は、123~200ngのゲノムDNA/時点、ABITaqman技術、および組み込まれたCD19CAR導入遺伝子配列を検出するための検証済みのアッセイを用いて一括して行った。標準曲線勾配およびr2値、参照基準試料1000コピー/プラスミドスパイクを正確に定量する能力、ならびに健常ドナーDNA試料における増幅がみられないことを含む、合格/不合格のパラメーター範囲を、認定試験および事前に設定した許容範囲を用いて算出した。CD19CAR導入遺伝子用のプライマー/プローブは、記載の通りとしたMiloneetal2009MolTher1714531464。コピー数/単位DNAを決定するために、100ngの非形質導入対照ゲノムDNAにスパイクした1065コピーのレンチウイルスプラスミドからなる8点標準曲線を作成した。各データポイント試料、標準曲線、参照基準試料を3件ずつ評価して、平均値を報告した。患者UPN01の場合、報告された値はすべて、3件中3件の反復試料における正のCt値から導き出され、CVは046未満であった。患者UPN02の場合は、第177日の試料3件中2件の反復試料が正、CV高値を除き、報告された値はすべて、3件中3件の反復試料において正のCt値から導き出され、CVは072未満であった。患者UPN03の場合は、第1日の試料3件中2件の反復試料が正、08CVおよび第3日の試料3件中2件の反復試料が陽性、067CVを除き、報告された値はすべて、3件中3件の反復試料において正のCt値から導き出され、CVは156未満であった。アッセイに関する定量下限LLOQを標準曲線から求めたところ、2コピー/μgDNA10コピー/200ngの投入DNAであった;LLOQよりも少ない平均値すなわち、定量不能と報告は概算値とみなされる。調べるDNAの品質を管理するための並行した増幅反応は、12~20ngの投入ゲノムDNA、CDKN1A遺伝子GENEBANK:Z85996の上流の非転写ゲノム配列に対して特異的なプライマー/プローブの組み合わせセンスプライマー:、アンチセンスプライマー:、プローブ:、および対照ゲノムDNAの希釈によって作成した8点標準曲線を用いて行った;これらの増幅反応により、相関係数CF検出ng/投入ngが得られた。導入遺伝子のコピー数/μgDNAは、以下の式に従って算出した:CD19標準曲線から算出されたコピー数/投入DNAng×CF×1000ng。このアッセイの精度は、輸注した細胞製剤の表示値を、以下の式に従ったQPCRによって定量する能力によって判定した:平均表示値=検出されたコピー数/投入DNA×63pgDNA/male体細胞×CFと、CAR特異的検出試薬を用いるフローサイトメトリー導入遺伝子の陽性度の対比。これらの盲検判定により、UPN01輸注製剤については2268の表示値フローサイトメトリーによれば226、UPN02輸注製剤については3233の表示値フローサイトメトリーによれば23、およびUPN03輸注製剤については43の表示値フローサイトメトリーによれば47の表示が得られた。サイトカイン分析可溶性サイトカイン因子の定量は、Luminexビーズアレイ技術およびLifetechnologiesInvitrogenから購入したキットを用いて行った。アッセイは製造元のプロトコールに従って行い、3倍希釈系列を用いて8点標準曲線を作成した。それぞれの標準点および試料について、1:3希釈で2件ずつ評価した;2件ずつの測定に関する算出CVは15未満であった。データはBioplex200で取得し、BioplexManagerバージョン50ソフトウエアにより、5パラメーターのロジスティック回帰分析を用いて分析した。標準曲線の定量範囲を80~120観測値/期待値の範囲で決定した。個々の分析物の定量範囲は、図の説明文中に報告されている。CARの機能を検出するための細胞アッセイ解凍およびTCM中での一晩の静置の後に、標的細胞に対する反応としてのCD107脱顆粒を測定することによって細胞を機能性に関して評価した。脱顆粒アッセイは、48ウェルプレート中の最終容積500μl中で1×106個のPBMCおよび025×106個の標的細胞を用いて、本質的には記載された通りにBertsetal2003JImmunolMethods2816578、CD49dBectonDickinson、抗CD28、モメンシンeBioscienceおよびCD107aFITC抗体eBiosciencesの存在下において37°Cで2時間かけて行った。抗体試薬以下の抗体を、これらの試験のために用いた:Alexa647結合マウス抗CD19CAR抗体であるMDACARは、BipulenduJena博士およびLaurenceCooper博士MDAndersonCancerCenterから寄贈いただいた。多パラメーター免疫表現型検査用および機能的アッセイ用:抗CD3A700、抗CD8PECy7、抗PD1FITC抗CD25AF488、抗CD28PercPCy55、抗CD57eF450、抗CD27APCeF780、抗CD17APCeF780、抗CD45RAeF605NC、CD107aFITCすべてeBioscienceによる、抗CD4PEテキサスレッドおよびLive/DeadAquaLifeTechnologiesによる、ならびに抗CD14V500、抗CD16V500BectonDickinsonによる。一般的な免疫表現型判定のためのもの:CD3PE、CD14APC、CD14PECy7、CD16FITC、CD16PECy7、CD19PECy7、CD20PE、すべてBectonDickinsonによる。多パラメーターフローサイトメトリーFicollPaque処理後に新鮮なままで、または凍結した場合には一晩静置した後で、細胞を、5ヒトAB血清GemCall100512、1HepesGibco15630080、1PenStrepGibco15140122、1GlutamaxGibco35050061および02NアセチルシステインAmericanRegentNDC0517761003を加えたT細胞培地TCMXvivo15Lonza04418Q中にて2×106個/mlの密度で、フローサイトメトリーによって評価した。多パラメーター免疫表現型検査を、FMO着色料を本文に記載された通りに用いて、合計4×106個の細胞/条件に対して行った。製造元によって推奨される抗体および試薬の濃度を用いて、細胞を1×106個/100μlPBSの密度で氷上にて30分間染色し、洗浄し、05パラホルムアルデヒド中に再懸濁させた上で、上記の抗体の組み合わせの検出用および分離用の青色488nm紫色405nm、緑色532および赤色633nmレーザーならびに適切なフィルターセットを装着した改変LSRIIBDImmunocytometrysystemsを用いて取得した。各着色料について、最低限100000個のCD3細胞を取得した。機能的アッセイのためには、細胞を洗浄し、表面マーカーに関して染色して、05パラホルムアルデヒド中に再懸濁させた上で、上記のように取得した;各染色条件について最低限50000件のCD3イベントを収集した。補正値は個々の抗体着色料およびBD補正ビーズBectonDickinsonを用いて確定し、かつ装置によって自動的に算出および適用された。データはFlowJoソフトウエアバージョン884、Treestar。一般的な免疫表現型検査のためには、青色488および赤色633nmレーザーを装着したAccuriC6細胞計算器を用いて細胞を取得した。補正値は個々の抗体着色料およびBD補正ビーズBectonDickinsonを用いて確定し、手作業で算出した。データはCFlowソフトウエア分析パッケージバージョン102649、Accuri細胞計算器を用いて分析した。患者の既往歴および治療法に対する反応臨床治療の概要を図10に示している。患者UPN01は最初、55歳の時にステージIIのB細胞CLLと診断された。この患者は無症候性であり、進行性リンパ球増加症、血小板減少症、リンパ節肥大および脾腫に対する治療法が必要となるまで、およそ1~1/2年の観察を受けた。4サイクルのフルダラビンの後に、この患者の血球数は完全に正常化し、CTスキャンによれば完全奏効が得られた。進行は5カ月以内に認められ、無症候性リンパ球増加症、血小板減少症、およびリンパ節肥大の増大が見られた。患者はおよそ3年間にわたって症状を伴わずに観察されたが、その後、進行性リンパ球増加症、貧血、および血小板減少症に対して、リツキシマブおよびフルダラビンによる治療が必要となった。患者は4サイクルのリツキシマブおよびフルダラビンによる治療を受け、血球数の部分的改善が得られた。この患者では1年以内に再び、白血球増加症WBC数150000/μlおよび血小板減少症血小板数30000/μlとして顕在化した、治療法を必要とする進行が起こり、アレムツズマブによる治療を受けて、血球数は正常化した。進行は13カ月以内に認められた。患者はそこでリツキシマブ単剤の投与を受けたが、有意な奏効はみられず、続いてリツキシマブ、シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾンRCVPの投与を2サイクル受けたものの、極めてわずかな奏効しかみられず、続いてレナリドミドの投与を受けた。レナリドミドは毒性のために中止された。患者は2サイクルのペントスタチン、シクロホスファミドおよびリツキシマブを投与されたが、奏効は極めてわずかであった。その後、この患者は、CART19細胞輸注の4日前に、リンパ除去化学療法として1サイクルのベンダムスチンを投与された。治療法の前の時点で、WBC14200/μl、ヘモグロビン114gm/dl、血小板数78000/μlであり、ALCは8000/μlであった。CTスキャンによってびまん性リンパ節肥大が示され、骨髄にはCLLが広範に浸潤していた細胞の67。患者は16×107個のCART19/kgを投与されたFACSによる評価では合計113×109個のCART19細胞。輸注毒性はみられなかった。ベンダムスチン投与からおよそ10日後およびCART19細胞輸注から6日後に患者は好中球減少性になり、初回CART19輸注の10日後から、患者は発熱、硬直および一過性低血圧を起こした。同時に、胸部X線およびCTスキャンによって左上葉の肺炎が判明し、抗生物質によって治療された。発熱はおよそ2週間持続し、好中球が回復した時点で解消した。患者はそれ以上は感染症状も体質症状も起こさなかった。図5に描写されているように、この患者では急速かつ完全な奏効が達成された。輸注から1カ月後~6カ月後の間に、体内の流血中CLL細胞はフローサイトメトリーによって検出されなかった。形態学的検査およびフローサイトメトリー検査により、CART19細胞輸注から1カ月後、3カ月後および6カ月後の骨髄で、リンパ性浸潤物の持続的欠如が示されている。輸注から1カ月後および3カ月後のCTスキャンにより、異常リンパ節肥大の完全消散が示されている。この患者は持続性の白血球減少症WBC1000~3900/μlおよび血小板減少症血小板数ほぼ100000/μl、ならびに軽度の低ガンマグロブリン血症IgG525mg/dL、正常値650~2000mg/dLを有しているが、感染性合併症はない。患者UPN02は、77歳の時点でCART19細胞による治療を受けた。この患者は冠動脈疾患の関連病歴があり、疲労および白血球増加症を呈した68歳の時、2000年に初めてCLLと診断された。患者は4年間比較的安定していたが、その時点で患者は、治療を要する進行性白血球増加症195000個/μl、貧血および血小板減少症を発症した。その時の遺伝子検査により、CLL細胞に染色体17pの欠失があることが示された。疾患進行のために、患者はアレムツズマブによる12週間のコースによる治療を受け、部分的奏効および血球数の改善が得られた。1年半以内に、患者は進行性白血球増加症、貧血、血小板減少症および脾腫を生じた。核型分析により、染色体17pの欠失が確かめられたが、この時は染色体13qの欠失も認められた。患者を再びアレムツズマブで18週間治療したところ、白血球増加症の改善、ならびに貧血および脾腫の安定化が得られた。患者は1年以内に、進行性白血球増加症、貧血および血小板減少症の所見を示した。治療には2サイクルのベンダムスチンおよびリツキシマブが含められ、その結果、図5Aに示されているように、疾患の安定がもたらされたが、有意な改善はみられなかった。この患者は、CART19細胞輸注の前に、リンパ除去化学療法としてベンダムスチン単剤の投与を受けた。患者は43×106個のCART19細胞/kg合計41×108個の輸注を3回に分けて受けたが、102 ゚という高い一過性発熱が24時間にわたって併発した。初回輸注後の第11日に、患者は41×108個43×106個/kgのCART19細胞の追加投与を受け、この輸注には発熱、硬直、および低酸素症を伴わない息切れが併発し、24時間の入院が必要となった。心虚血の所見は認められず、症状は解消した。CART19初回輸注後の第15日およびCART19細胞追加輸注後の第4日に、患者は高熱最高104°F、悪寒および硬直のために入院した。血液および尿培養およびCXRによる広範な検査を行ったものの、感染源を同定することはできなかった。患者は息切れを訴えたが、低酸素症はみられなかった。心エコー図検査により、重度の運動低下が示された。駆出率は20であった。患者はプレドニゾン1mg/kgを1日間、03mg/kgをおよそ1週間投与された。これにより、発熱および心機能不全の急速な消失がもたらされた。図5Aに描写されているように、高熱の発生に一致して、この患者では末梢血からのリンパ球の急速な減少がみられた。患者の白血球数は正常化したものの、患者は持続性の流血中CLL、安定した中程度の貧血および血小板減少症を有した。骨髄では、高度の末梢血細胞除去を行ったにもかかわらず、治療の1カ月後にCLLの持続性広範浸潤が示され、CTスキャンからはリンパ節肥大および脾腫の部分的縮小が示された。CART19細胞輸注から5カ月後に、患者は進行性リンパ球増加症を発症した。輸注から9カ月後に、この患者はリンパ球増加症16500/μlを、安定した中程度の貧血および血小板減少症、および安定したリンパ節肥大とともに呈した。患者は依然として無症候性であり、それ以上の治療法は受けなかった。患者UPN03は50歳の時に無症候性のステージICLLと診断され、6年間にわたって経過観察を受けた。その後、患者は、治療を必要とする進行性白血球増加症白血球数92000/μlおよび進行性リンパ節肥大を生じた。患者は2サイクルのリツキシマブおよびフルダラビンを投与され、その結果、血球数の正常化、および、リンパ節肥大の完全消散ではないものの有意な改善がもたらされた。この患者ではおよそ3年間の無増悪期間が得られたが、その後の6カ月で、治療を必要とする急速進行性白血球増加症WBC165000/μlおよび進行性リンパ節肥大が起こった。患者が1サイクルのフルダラビン、ならびに3サイクルのリツキシマブおよびフルダラビンの投与を受けたところ、血球数の正常化、および触知しうるリンパ節肥大の消散が得られた。患者はおよそ20カ月間の無増悪期間を得たが、その後、患者は再び、急速進行性白血球増加症およびリンパ節肥大を発症した。この時点で骨髄はCLLによって広範に浸潤されており、核型検査によって細胞が染色体17pの欠失を含むことが示され、FISHにより、細胞200個のうち170個でTP53欠失が実証された。患者は1サイクルのリツキシマブおよびベンダムスチン、その後に4サイクルのベンダムスチン単独リツキシマブに対する重度のアレルギー反応のための投与を受けた。患者は初期には血球数が正常化したが、治療法を中止すると間もなく、進行性白血球増加症およびリンパ節肥大が起こった。患者UPN3から自己T細胞をアフェレーシスによって収集し、凍結保存した。この患者を続いて、アレムツズマブによって11週間治療したところ、優れた血液学的奏効が得られた。リンパ節肥大は改善したものの、完全消散には至らなかった。この患者ではその後6カ月にわたって活動性ではあるが安定した疾患がみられた。その後に患者は、CART19細胞輸注の前に、リンパ除去化学療法としてペントスタチンおよびシクロホスファミドを投与された。化学療法の3日後であるが細胞輸注の前の時点で、骨髄は過形成性60であり、CLLの関与がおよそ40であった。表3およびBonyhadietal2005JImmunol17423662375に描写されているように、CLL患者からのアフェレーシス収集物に伴う製造上の限界が理由で、患者には、146×105個のCART19細胞/kg合計142×107個のCART19細胞を3日間にわたって輸注した。輸注毒性はみられなかった。初回輸注から14日後に、患者は悪寒、102°Fもの高い発熱、硬直、悪心および下痢を起こすようになり、対症治療を受けた。患者は呼吸器症状も心症状も起こさなかった。輸注後の第22日までに、LDHおよび尿酸の上昇によって顕在化した腫瘍溶解症候群が診断され、腎不全も併発した。患者は入院し、補液蘇生およびラスブリカーゼによる治療を受けたところ、尿酸値および腎機能は急速に正常化した。CXR、血液、尿および便培養による詳細な臨床評価を行ったが、いずれも陰性または正常であった。形態学的検査、フローサイトメトリー、細胞遺伝学検査およびFISH分析によれば、CART19輸注から1カ月以内に患者の流血中CLLは血液および骨髄から消失しており、CTスキャンからは異常リンパ節肥大の消散が示された図5C。患者の寛解は、CART19細胞の初回輸注から8カ月を過ぎても持続していた。実験の結果を以下に記す。臨床プロトコール図1に描写されているように、進行した化学療法抵抗性CLLの患者3人をパイロット臨床試験に組み入れた。図10に示されているように、患者は全員、さまざまな化学療法および生物学的レジメンによる広範な前治療を受けた。患者のうち2人はp53欠損性CLLを有しており、この欠失は従来の治療法に対する奏効不良および急速な進行を予測させるDohneretal1995Blood8515801589。患者はそれぞれ、予備化学療法の後に多くの腫瘍総量を有しており、これには広範な骨髄浸潤40~95およびリンパ節症が含まれた;患者UPN02はまた、顕著な末梢リンパ球増加症も有していた。CART19T細胞は図1Bに描写したように調製され、各患者についての細胞製造および製剤の特性決定の詳細は表4に示されている。患者は全員、CART19T細胞輸注の1~4日前に、リンパ除去化学療法による前治療を受けた。図1Aに描写したような41BB共刺激シグナル伝達ドメインを組み入れたCARの予備試験という理由から、分割投与細胞輸注計画を用いた。表4アフェレーシス産物およびCART19製剤のリリース基準1=2回目の用量2=第12日時点でLOQを下回り、かつ、ベクター世代によるプラスミドDNAの持ち越しと整合するように以前の増大時よりも減少しているアッセイ値。情報補正としてFDAに提出。3=FACSによる表面染色に基づく製剤リリース4=外部DSMCおよびIRBにより、リリース基準に対して許諾された治療上の例外CART19のインビボ増大および存続性ならびに骨髄への輸送CD3/CD28ビーズを用いて増大された、41BBシグナル伝達ドメインを発現するCART細胞は、41BBを持たないCARよりも改良されていると考えられる。血液および骨髄におけるCART19細胞の定量的追跡を可能にするQPCRアッセイを開発した。図2Aおよび2Cに描写されているように、患者は全員、血液中のCART19細胞の増大および存続性を少なくとも6カ月にわたって有していた。注目されることとして、患者UPN01およびUPN03では、輸注後の最初の1カ月の間に、血液中のCART細胞の1000~10000倍への増大が生じた。ピーク増大レベルは、患者UPN01第15日および患者UPN03第23日における輸注後臨床症状の発生と一致した。その上、患者3人全員で、一次速度論を用いてモデル化しうる初期減衰の後、輸注後の第90日から第180日までにCART19T細胞レベルは安定化した。重要なこととして、すべての患者で、CART19T細胞は骨髄にも輸送されたが、図2D~2Fに描写されているように、血液中で観察されたレベルよりも5分の1~10分の1という低いレベルであった。患者UPN01および03では、骨髄において対数線形減衰がみられ、消失T12はほぼ35日であった。CART19輸注後の血液区画および骨髄区画における特異的免疫応答の誘導図3に描写されているように、すべての患者から血清試料を収集して、サイトカインレベルを定量的に決定するためにバッチ分析を行い、CART19細胞の毒性を評価するため、およびその機能に関する所見を得るために、一群のサイトカイン、ケモカインおよび他の可溶性因子を評価した。試験した30種の分析物のうち11種はベースラインから3倍またはそれ以上の変化を生じ、これには4種のサイトカインIL6、1NFγ、IL8およびIL10、5種のケモカインMIP1α、MIP1β、MCP1、CXCL9、CXCL10ならびにIL1RαおよびIL2Rαに対する可溶性受容体が含まれた。これらのうち、インターフェロンγはベースラインからの相対的変化が最も大きかった。興味深いことに、UPN01およびUPN03におけるサイトカイン上昇のピーク時間は、各患者における前述した臨床症状および血液中のCART19細胞のピークレベルと時間的に相関した。患者UPN02では中程度の変化しか認められなかったが、これはおそらくこの患者に与えられたコルチコステロイド治療の結果と考えられる。41BBシグナル伝達ドメインを有するCART細胞を開発することの前臨床段階での根拠の1つは、CD28シグナル伝達ドメインと比較してIL2分泌を誘発する性向が弱いことであったとはいえ、患者の血清中での可溶性IL2の上昇は検出されなかったMiloneetal2009MolTher1714531464。CART細胞が、かなりの量のIL2を分泌するCARによって、または輸注後の外因性IL2の供与によって誘発されうると考えられる細胞である調節性T細胞によって抑制される可能性が以前の研究Leeetal2011CancerRes7128712881で示されていることからみて、これは持続的な臨床活性と関係している可能性がある。さらに、図3Dに描写されているように、UPN03の骨髄吸引液からの上清でサイトカイン分泌の頑強な誘導が観察され、これは腫瘍溶解症候群の発症および完全寛解とも一致した。血液中でのメモリーCART19細胞の集団の長期的発現および樹立CARにより媒介される癌免疫療法における核心的な課題は、最適化された細胞製造および共刺激ドメインが、遺伝子改変されたT細胞の存続性を増強するか否か、および患者におけるCARメモリーT細胞の樹立を可能にするか否かである。以前の研究では、輸注後のT細胞上のCARの頑強な増大、長期にわたる存続性および/または発現は実証されていないKershawetal2006ClinCancerRes1261066115;Lamersetal2006JClinOncol24e20e22;Tilletal2008Blood11222612271;Savoldoetal2011JClinInvestdoi101172JC146110。輸注から169日後の血液および骨髄の両方からの試料のフローサイトメトリー分析により、UPN03図4Aおよび4BにおけるCAR19を発現する細胞の存在、および図4Aに描写されているようにB細胞の欠如が明らかになった。注目されることとして、図2および図6に描写されているように、QPCRアッセイによれば、患者3人の全員が4カ月およびそれ以後の時点で存続CAR細胞を有する。フローサイトメトリーによるCAR細胞のインビボ頻度は、CART19導入遺伝子に関するPCRアッセイから得られた値とよく一致した。重要なこととして、図4Aに描写されているように、患者UPN03では、CD16陽性サブセットまたはCD14陽性サブセットでCAR19細胞が検出不能であったため、CD3細胞のみがCAR19を発現した。図7に描写されているように、患者UPN01の血液中では輸注後の第71日にもCAR発現がT細胞の42の表面上で検出された。次に、多染性フローサイトメトリーを用いることにより、抗CARイディオタイプ抗体MDA647および図8に示されたゲーティング戦略を用いて、UPN03におけるCART19細胞の発現、表現型および機能をさらに特徴づけるための詳細な試験を行った。CAR19発現に基づき、CD8細胞およびCD4細胞の両方においてメモリーおよび活性化のマーカーの発現に著しい差が観察された。図4Cに描写されているように、第56日の時点で、CART19CD8細胞は、抗原への長期的および頑強な曝露に整合するように、主としてエフェクターメモリー表現型CCR7CD27CD28を提示した。対照的に、CAR陰性CD8細胞はエフェクター細胞およびセントラルメモリー細胞の混合物からなり、細胞のあるサブセットはCCR7発現を伴い、CD27/CD28およびCD27/CD28画分にかなりの数があった。CART19細胞集団およびCAR陰性細胞集団は両方ともCD57をかなり発現したものの、CART19細胞ではこの分子はPD1とともに均一に共発現され、このことはこれらの細胞の高度な複製履歴を反映している可能性がある。CAR陰性細胞集団とは対照的に、CART19CD8集団はすべて、CD25およびCD127の両方の発現を欠いていた。第169日までに、CAR陰性細胞集団の表現型は第56日の試料に類似したままであったが、CART19集団は、とりわけCCR7の発現、より高レベルのCD27およびCD28といったセントラルメモリー細胞の特徴を有する少数集団、ならびにPD1陰性、CD57陰性かつCD127陽性であるCAR細胞を含むようになった。CD4区画では、図4Bに描写されているように、第56日の時点で、CART19細胞は、CCR7を一様に欠くこと、ならびにCD57区画およびCD57区画の両方に分布するCD27/CD28/PD1細胞が優位であること、ならびにCD25およびCD127の発現が本質的に存在しないことによって特徴づけられた。対照的に、CAR陰性細胞はこの時点でCCR7、CD27およびPD1の発現に関して異種混交的であり、CD127を発現し、CD25/CD127調節性T細胞の可能性のある集団もかなり含んでいた。第169日までに、CARCD4細胞ではすべて、CD28発現は一様に陽性のままであったが、CART19CD4細胞のある画分は、CCR7の発現を伴い、CD27細胞のパーセンテージがより高く、PD1陰性サブセットが出現し、かつCD127発現を獲得するというセントラルメモリー表現型に向かった。CAR陰性細胞はその第56日の対応物とかなり一致したままであったが、ただし、CD27発現の低下、CD25/CD127細胞のパーセンテージの減少は例外であった。CART19細胞は血液中で6カ月後もエフェクター機能を保ちうるCART細胞を用いた以前の試験の限界には、短い存続性およびインビボ増殖が不十分であることのほかに、輸注したT細胞のインビボでの機能的活性の急速な損失もあった。患者UPN01および03における高レベルのCART19細胞存続性およびCAR19分子の表面発現により、凍結保存した末梢血試料から回収した細胞における抗CD19特異的エフェクター機能を直接検査するという機会がもたらされた。患者UPN03からのPBMCを、CD19発現に関して陽性または陰性のいずれかである標的細胞とともに培養した図4d。表面CD107a発現による評価で、CART19T細胞の頑強なCD19特異的エフェクター機能が、CD19陰性標的細胞とは異なる、CD19陽性標的細胞に対する特異的脱顆粒によって実証された。注目されることとして、標準的なフローサイトメトリー染色での同じエフェクター細胞におけるCAR19の表面発現に関して図8に描写されているように、CD19陽性標的に対するCART19集団の曝露により、表面CAR19の急速な内部移行が誘導された。NALM6株はCD80もCD86も発現しないことからみて、標的細胞上の共刺激分子の存在は、CART19細胞の脱顆粒を誘発するために必要ではなかったBrentjensetal2007ClinCancerRes154265435。エフェクター機能は輸注後の第56日の時点で明らかであり、第169日の時点でも保たれた。CARおよびCART細胞の頑強なエフェクター機能を、薬理刺激によって実証することも可能と考えられる。CART19細胞の臨床的活性いずれの患者においても、輸注後の4日間には、一過性の発熱反応以外に目立った毒性は観察されなかった。しかし、すべての患者で、その後、初回輸注後の第7日~第21日の間に、目立った臨床的毒性および検査値上の毒性が生じた。これらの毒性は短期的かつ可逆的であった。標準的な基準によればHalleketal2008Blood1115446、これまでに治療した3人の患者のうち、CART19輸注後6カ月を上回った時点でのCRは2人であり、PRは1人である。各患者についての既往歴および治療法に対する反応の詳細は、図10に描写されている。手短に述べると、患者UPN01は、輸注の10日後から、硬直および一過性低血圧を伴う発熱症候群を発症した。発熱はおよそ2週間持続してから解消した;この患者ではこれ以上に体質症状を起こさなかった。この患者では、図5に描写されているように、急速かつ完全な奏効が達成された。輸注後1カ月~6カ月の間に、フローサイトメトリーにより、血液中の流血中CLL細胞は全く検出されなかった。図5Bに描写されているように、形態学的検査およびフローサイトメトリー検査により、CART19細胞輸注後1カ月、3カ月および6カ月の骨髄では、リンパ性浸潤物の持続的欠如が示されている。図5Cに描写されているように、輸注後1カ月および3カ月のCTスキャンにより、リンパ節肥大の消散が示されている。完全寛解は、この報告の時点から10カ月超にわたって持続した。患者UPN02は2サイクルのベンダムスチンおよびリツキシマブによって治療され、その結果、図5Aに描写されているように、疾患の安定がもたらされた。この患者は、CART19T細胞輸注の前に、リンパ除去化学療法としてベンダムスチンの3回目の投与を受けた。患者は40°Cに至る発熱、硬直および呼吸困難を発症し、初回輸注後の第11日であってCART19細胞の2回目の追加投与の当日に、24時間の入院が必要となった。発熱および体質症状は持続し、患者は第15日に一過性心機能不全を起こした;コルチコステロイド療法を第18日に開始した後に、症状はすべて消失した。CART19輸注の後に、高熱の発生と同時に、この患者では、図5Aに描写されているように末梢血からのp53欠損性CLL細胞の急速な消失、およびリンパ節肥大の部分的縮小が起こり、骨髄では、高度の末梢血細胞除去を行ったにもかかわらず、治療の1カ月後にはCLLの持続性広範浸潤が示された。患者は無症候性のままであった。患者UPN03は、CART19細胞輸注の前に、ペントスタチンおよびシクロホスファミドをリンパ除去化学療法として投与された。化学療法の3日後であるが細胞輸注の前の時点で、骨髄は過形成性60であり、CLLの関与がおよそ50であった。この患者は低用量のCART19細胞15×105個のCART細胞/kgを3日間に分けての投与を受けた。この場合も急性輸注毒性はみられなかった。しかし、初回輸注から14日後に、患者は硬直、発熱、悪心および下痢を起こし始めた。輸注後の第22日までに、入院を必要とする腫瘍溶解症候群と診断された。患者の体質症状は消散し、CART19輸注から1カ月以内に、形態学的検査、フローサイトメトリー、細胞遺伝学検査およびFISH分析によれば、患者の流血中CLLは血液および骨髄から消失した。図5Bおよび5Cに描写されているように、CTスキャンによって、異常リンパ節肥大の消散が示された。完全寛解はCART19細胞の初回輸注から8カ月を上回って持続した。インビボでのCART19エフェクターとCLL標的細胞との比の検討前臨床試験により、ヒト化マウスで大きな腫瘍を除去することができたこと、および、22×107個のCARの輸注によって、インビボでのE:T比が1:42となる1×109個の細胞で構成される腫瘍を根絶させることができたことが示されているがCarpenitoetal2009ProcNatlAcadSciUSA10633603365、これらの計算は注射後のT細胞の増大を考慮に入れていない。CLL腫瘍総量の経時的な推定により、輸注されたCART細胞の数に基づく、3人の対象においてインビボで達成された腫瘍縮小および推定CART19E:T比の算出が可能になった。骨髄、血液および二次リンパ組織におけるCLL量CLLloadを測定することによって、腫瘍総量を算出した。図10に示されたベースライン腫瘍総量は、各患者がCART19輸注の前に1012個という桁数のCLL細胞すなわち、腫瘍量1kgを有していたことを指し示している。患者UPN03は、第1日すなわち、化学療法の後およびCART19輸注の前の時点で、骨髄内での推定ベースライン腫瘍総量がCLL細胞88×1011個であり、二次リンパ組織における腫瘍量の計測値は、体積分析用CTスキャン分析の方法に応じてCLL細胞33~55×1011個であった。UPN03にはCART19細胞が14×107個しか輸注されなかったことと、初期腫瘍総量の推定値CLL細胞13×1012個を用いた上で、さらに治療後にはCLL細胞が全く検出不能であったことを考慮すると、1:93000という際立ったE:T比が達成された。同様の計算により、UPN01およびUPN02については、表3に示されたように、1:2200および1:1000というインビボでの有効E:T比が算出された。最終的には、CART19T細胞による連続死滅の寄与と、1000倍を上回るインビボでのCART19増大とが相まって、CART19細胞によって媒介される強力な抗白血病効果の原因になっている可能性が高い。キメラ受容体を発現するT細胞は、進行した白血病の患者においてメモリー効果および強力な抗腫瘍効果を成立させるCARのインビボ発現およびエフェクター機能が限定されていることは、第一世代CARを試験する治験において中心的な限界となってきたKershawetal2006ClinCancerRes1261066115;Lamersetal2006JClinOncol24e20e22;Tilletal2008Blood11222612271;Parketal2007MolTher15825833;Puleetal2008NatMed1412641270。41BBシグナル伝達モジュールを含むCARの存続性の強化を実証した前臨床モデリングに基づきMiloneetal2009MolTher1714531464;Carpenitoetal2009ProcNatlAcadSciUSA10633603365、レンチウイルスベクター技術によって操作された第二世代のCARを開発するための実験をデザインした。この第二世代のCARは、慢性HIV感染の状況で安全であることが見いだされたLevineetal2006ProcNatlAcadSciUSA1031737217377。今回の結果は、この第二世代CARをT細胞において発現させ、セントラルメモリーT細胞の生着を促すように設計された条件下で培養した場合にRapoportetal2005NatMed1112301237;Bondanzaetal2006Blood10718281836、以前の報告と比較して輸注後のCART細胞の増大の向上が観察されたことを示している。CART19細胞はCD19特異的なメモリー細胞を樹立させ、これまでに達成されていないインビボでのE:T比で腫瘍細胞を死滅させる。CART19は41BBシグナル伝達ドメインを組み入れた初のCAR治験であり、レンチウイルスベクター技術を用いた初めてのものである。今回の結果は腫瘍部位へのCARの効率的な輸送を実証しており、CD19特異性を呈する腫瘍浸潤リンパ球の事実上の樹立を伴う。顕著なインビボ増大により、患者から直接回収したCARがインビボでエフェクター機能を数カ月にわたって保ちうることの初めての実証が可能となった。以前の研究では、ウイルス特異的T細胞への第一世代CARの導入が一次T細胞にとって好ましいことが示唆されたPuleetal2008NatMed1412641270が、最適な共刺激を受けた一次T細胞に導入された第二世代CARを用いた結果はこの考え方に疑問を投げかける。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、臨床的効果が著明かつ空前無比であり、患者3人のすべてでキログラム規模の腫瘍総量の溶解が起こり、患者のうち2人では危険な恐れのある高レベルのサイトカインの遅延放出が伴うという、警告を促す事項が提起された。古典的なサイトカインストーム効果は観察されなかった。しかし、本研究は、3日という期間をかけたCART19の慎重な輸注によって、この可能性を軽減するように設計した。極めて低用量のCARが強力な臨床的奏効を誘発しうることが見いだされた。これはCART19ベクターのデザインの安全性を実証したパイロット試験であった。以前の試験で検討されたものよりも数桁少ないCART19細胞の用量が臨床的有益性を有しうるという観察所見は、CAR療法のより大きな規模での将来の実施のため、およびCD19以外の標的に向けられたCARを試験する試験のデザインのために重要な意味を有するであろう。本研究はさらに、CART19がセントラルメモリーT細胞およびエフェクターT細胞の両方で発現されることを指し示しており、このことは、以前の報告と比較したそれらの長期生存に寄与している可能性が高い。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、CART細胞は、インビボでサロゲート抗原を発現する標的細胞例えば、CLL腫瘍細胞または正常B細胞に遭遇するとセントラルメモリー様の状態に分化して、その後にそれを排除することができる。事実、41BBのシグナル伝達は、TCRシグナル伝達に関連してメモリーの発達を促進することが報告されているSabbaghetal2007TrendsImmunol28333339。CART19の増殖性および生存性の拡大により、これまで報告されていなかったCART細胞の薬物動態の諸局面が明らかになった。血清および骨髄におけるサイトカイン放出の動態はピークCART19レベルと相関しており、そのため、CD19を発現する細胞標的が限定的になった時点で遅延を開始させることが可能である。CART19の生存性の拡大の機序は、41BBドメインの前記の組み入れ、または天然のTCRおよび/もしくはCARを通じてのシグナル伝達と関係している可能性もある。興味深い可能性は、生存性の拡大が、骨髄標本で同定されたCART19の集団と関係していることであり、これはCD19CARを骨髄内でB細胞始原細胞と遭遇させることによって維持しうるという仮説を生み出す。この問いかけと関係するのは、インビボでCART19細胞の初期増大を作動させるものは何かということである。稀な例外はあるがSavoldoetal2011JClinInvestdoi101172JCI46110;Puleetal2008NatMed1412641270、本研究はIL2輸注を省いた唯一の試験であり、そのため、CART19細胞は、おそらくは恒常性サイトカインに反応するか、またはさらに可能性が高いものとしては白血病標的および/または正常B細胞上に発現されるCD19に反応して増大した可能性が高い。後者の場合には、CART19の自己再生が正常細胞上で起こって、自己ワクチン接種/追加接種を介したCARメモリーの機序をもたらし、それ故に、長期的な腫瘍免疫監視機構をもたらした可能性があるため、これは、正常APC上の標的、例えばCD19およびCD20などに対して向けられたCARの注目される特徴と考えうる可能性がある。CART19恒常性の機序については、細胞の内因性および外因性の存続機構を解明するためにさらに研究が必要であろう。これらの成果の以前には、ほとんどの研究者はCAR療法を免疫療法の一過性形態と捉えていたが、最適化されたシグナル伝達ドメインを備えたCARは、寛解の誘導および強化、ならびに長期的な免疫監視機構のいずれにおいても役割を果たす可能性がある。強力な抗白血病効果が、p53欠損性白血病の患者2人を含む、患者3人のすべてで観察された。CARを用いた以前の研究では、リンパ除去化学療法による抗腫瘍効果を区別することが困難であった。しかし、本研究においてインビボCAR増大と同時に、おそらくはそれに依存して起こった、フルダラビン抵抗性患者における腫瘍溶解の動態を兼ね備えた遅延サイトカイン放出は、CART19が強力な抗腫瘍効果を媒介することを指し示している。今回の結果は、CARの効果を増強する上での化学療法の役割を否定するものではない。インビボでCART細胞の持続的機能を得るために必要な鍵となる特徴について十分な理解を得るためには、ベクター、導入遺伝子および細胞製造手順と、他の施設で進行中の試験による結果との徹底的な比較が必要であろう。抗体療法とは異なり、CAR改変T細胞はインビボで複製する潜在能力を有しており、長期存続性は持続的な腫瘍制御につながりうるであろう。非交差耐性キラーT細胞で構成される汎用的offtheshelf療法が利用可能であれば、B細胞悪性腫瘍の患者の転帰を改善しうる可能性がある。例えばリツキシマブおよびベバシズマブbevicizumabなどの薬剤を用いる抗体療法の限界は、治療法が、不便である上に費用もかかる反復的な抗体輸注を必要とすることにある。CART19細胞の単回輸注後にT細胞上で発現された抗CD19scFvによる長期にわたる抗体療法の送達この場合、現在までに治療した患者3人中3人で少なくとも6カ月にわたってには、便利さおよび費用節約を含む、数多くの実用上の利点がある。実施例2:慢性リンパ性白血病におけるキメラ抗原受容体改変T細胞CD137T細胞における共刺激受容体[41BB]およびCD3ζT細胞抗原受容体のシグナル伝達成分のシグナル伝達ドメインを結びつけた、B細胞抗原CD19に対する特異性を有するキメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスベクターを設計した。治療抵抗性慢性リンパ性白血病CLLの患者に再輸注した、低用量体重1kg当たりおよそ15×105個の自己キメラ抗原受容体改変T細胞は、インビボで初期生着レベルの1000倍を上回る高いレベルまで増大したことが観察された。また、患者が腫瘍溶解症候群の遅延発症を呈して、完全寛解が得られたことも観察された。腫瘍溶解症候群を除いて、キメラ抗原受容体T細胞と関係のある他の唯一のグレード3/4毒性作用は、リンパ球減少症のみであった。組換え細胞は血液および骨髄において少なくとも6カ月にわたって高レベルで存続し、キメラ抗原受容体を発現し続けた。特異的免疫応答が骨髄で検出され、これはCD19を発現する正常B細胞および白血病細胞の喪失を伴った。寛解は治療10カ月後も継続中である。低γグロブリン血症は、予想された慢性毒性作用であった。これらの実験で使用した材料および方法について、以下で説明する。材料および方法試験手順以前に報告したようにMiloneetal2009MolTher17145364、自己不活性化レンチウイルスベクターGeMCRIS0607793を設計して、前臨床安全性試験に供した。T細胞の調製方法も以前に記載されているPorteretal2006Blood107132531。血液および骨髄におけるキメラ抗原受容体T細胞を検出するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応PCR分析を行った。定量下限は標準曲線から求めた;定量下限を下回る平均値すなわち、報告可能ではあるが定量不能であるは概算値とみなす。アッセイの定量下限は、ゲノムDNA1μg当たり25コピーであった。可溶性因子の分析は、単回使用用にアリコートに分けて80°Cで貯蔵した、全血および骨髄由来の血清を用いて行った。可溶性サイトカイン因子の定量は、Luminexbeadarray技術および試薬LifeTechnologiesを用いて行った。1回目のアフェレーシス12~15リットルのアフェレーシス手順をアフェレーシスセンターで実施する。この手順の間に、CART19T細胞作製のために末梢血単核細胞PBMCを入手する。単回の白血球アフェレーシスにより、CART19T細胞を製造するために少なくとも50×109個の白血球を採取する。ベースライン血液の白血球も入手して凍結保存する。細胞減少cytroreductive化学療法化学療法の完了から1~2日後にCART19細胞を投与しうるように、化学療法を輸注のおよそ5~10日前に開始する。化学療法の開始のタイミングは、このため、レジメンの長さに依存する。この化学療法の目的は、CART19細胞の生着および恒常的増大を促進するためにリンパ球減少症を誘導することである。疾患腫瘍総量も減らすように化学療法を選択してもよい。細胞減少化学療法の選択および投与は地域の腫瘍専門医が行う。化学療法の選択は、患者の基礎疾患および過去の治療法に基づく。フルダラビン30mg/m2/日×3日およびシクロホスファミド300mg/m2/日×3日が選択すべき薬剤であるが、これは養子免疫療法を進める上でこれらの薬剤の使用の経験が最も豊富なためである。CHOP、HyperCVAD、EPOCH、DHAP、ICEまたは他のレジメンを含む、FDA認可薬を用いる他のいくつかの許容されるレジメンも適切である。病期再判定評価化学療法の完了時に、ベースライン腫瘍総量測定値を得る目的で、限定的な病期再判定を行う。これには、イメージング、身体的診察および微小残存病変MRD評価が含まれる。対象は以下の輸注前検査を行う:身体的診察、有害事象の文書記録、ならびに血液学検査、生化学検査および妊娠検査のための採血該当する場合。CART19T細胞の調製CD19に対する特異性を有する細胞外単鎖抗体scFvを発現するように自己T細胞を操作する。細胞外scFvは、悪性細胞および正常B細胞の表面に発現が限られる分子であるCD19を発現する細胞に対して、形質導入T細胞の特異性を再誘導することができる。CD19scFvに加えて、TCRζ鎖、または41BBおよびTCRζのシグナル伝達モジュールで構成される縦列シグナル伝達ドメインのいずれかで構成される細胞内シグナル伝達分子も発現するように細胞に形質導入する。scFvはマウスモノクローナル抗体に由来し、それ故にマウス配列を含有しており、シグナル伝達ドメインはすべてがネイティブ性ヒト配列のものである。CART19T細胞は、アフェレーシスによってT細胞を単離して、レンチウイルスベクター技術Dropulicetal2006HumanGeneTherapy1757788;Naldinietal1996Science2722637;Dulletal1998JVirol72846371を用いてscFvTCRζ41BBをCD4およびCD8T細胞に導入することによって製造される。何人かの患者には、競合的再増殖実験のために対照scFvTCRζを細胞の一部分に導入する。これらの受容体は、MHC非依存的な様式で抗原と結合する点で万能的universalであり、このため、単一の受容体構築物を、CD19抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療するために用いることができる。CAR構築物はUniversityofPennsylvaniaで開発され、臨床グレードのベクターはLentigenCorporationで製造された。CART19細胞は、UniversityofPennsylvaniaのClinicalCellandVaccineProductionFacilityで、図11に示された過程に従って製造される。細胞培養が終わったところで、細胞を輸注可能な凍結媒体中で凍結保存する。合計25×109~5×109個の細胞の輸注物を含むCART19形質導入T細胞の単回用量を、1つまたは2つのバッグに入れる。各バッグは、以下の輸注可能グレード試薬v/vを含有する凍結媒体のアリコート容積は用量に依存を含む:3125plasmalyteA、3125デキストロース5、045NaCl、最大750のDMSO、100デキストラン40、500ヒト血清アルブミンと、バッグ当たりおよそ25~5×109個の自己T細胞。安全性を高めるために、初回用量は細胞のほぼ10を第0日に、30を第1日に、60を第2日とする分割用量として第0日、第1日および第2日に投与する。貯蔵CART19形質導入T細胞を含有するバッグ容量10~100mlは監視下にある135°C冷凍庫内で血液銀行の条件下で貯蔵する。輸注バッグは必要時まで冷凍庫で貯蔵する。細胞の解凍治験薬剤部investigationalpharmacyで細胞の記録をとった後に、凍結細胞をドライアイス中にて対象のベッドサイドまで搬送する。36°C~38°Cに維持した水浴を用いて、細胞をベッドサイドで一度に1バッグずつ解凍する。細胞がちょうど解凍するまで、バッグを丁寧にもみほぐす。凍結塊を容器内に残さないようにすべきである。CART19細胞製剤のバッグが損傷もしくは漏出しているように見えるか、または別の形で損なわれているように見える場合には、それを輸注すべきではない。前投薬T細胞輸注後の副作用には、一過性の発熱、悪寒および/または悪心が含まれうる。対象には、CART19細胞の輸注の前に、アセトアミノフェン650mgの内服、および塩酸ジフェンヒドラミン25~50mgの内服または静脈内注射による前投薬を行うことが推奨される。これらの投薬を、必要に応じて6時間毎に繰り返してもよい。患者がアセトアミノフェンによって緩和しない発熱を続けるようであれば、1コースの非ステロイド性抗炎症薬の投薬を処方してもよい。患者には、命に危険のある緊急時を除き、いかなる時もヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロンソルメドロールSoluMedrolまたはデキサメタゾンデカドロンDecadronなどの全身性コルチコステロイドを投与しないことが推奨されるが、これはT細胞に有害作用を及ぼす可能性があるためである。急性輸注反応に対してコルチコステロイドが必要な場合には、初回用量にヒドロコルチゾン100mgが推奨される。投与/輸注輸注は化学療法の完了から1~2日後に開始する。初回輸注の日に、患者には分画を含むCBC、ならびにCD3、CD4およびCD8数の評価を行うが、これは化学療法を一つにはリンパ球減少症を誘導するために行うためである。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、25~5×109個のCART19細胞という初回静脈内用量がこのプロトコールには最適であると考えられている。健常成人には約1×1012個のT細胞が存在するため、提唱される総用量はT細胞の体内総量の約05に相当するRoederer1995NatMed16217;Macallanetal2003EurJImmunol33231626。1回目の用量は分割投与を用いて第0日10、第1日30および第2日60に投与する。対象は隔離された部屋で輸注を受ける。本明細書中の別所に記載したように、細胞は患者のベッドサイドで解凍する。解凍した細胞は忍容しうる限りできるだけ速い輸注速度で投与し、その結果、輸注の持続時間はおよそ10~15分となる。形質導入されたT細胞は、三方活栓付きの18ゲージのラテックス非含有Y型輸血セットによって、毎分およそ10mL~20mLの流速で急速静脈内輸注によって投与する。輸注の持続時間はおよそ15分とする。CART19改変細胞のバッグを1つまたは2つ、氷上にて搬送し、細胞を低温のまま対象に投与する。CART19細胞の混合物を投与される対象では、混合を促す目的で、Yアダプターを用いて細胞を同時に投与する。対象には本明細書中の別所に記載したように輸注および前投薬を行う。対象のバイタルサインの評価およびパルスオキシメトリー検査を、投与の前、輸注の終了時、およびその後は15分毎に1時間、そしてこれらが安定して良好になるまで行う。ベースラインCART19レベルの決定のための血液試料は、輸注前および輸注20分後に入手する。先行して彼らに行った細胞減少化学療法による毒性を来した患者では、これらの毒性が消失するまで輸注スケジュールを遅らせる。T細胞輸注を遅らせる根拠となる具体的な毒性には以下が含まれる:1肺:飽和度を95超に保つために酸素補給が必要、または胸部X線上の進行性である放射線学的異常の存在;2心臓:医学的管理によってコントロールされていない新たな心不整脈。3昇圧サポートを必要とする低血圧。4活動性感染症:T細胞輸注から48時間以内の細菌、真菌またはウイルスに関する血液培養が陽性。カリウムおよび尿酸に関する血清試料を収集し、初回輸注の前ならびに以後の各輸注の2時間後。生着および存続性を評価するための輸注後臨床検査対象は初回CART19細胞輸注後の第4日および第10日に再受診して、血清サイトカインレベルに関する採血、およびCART19細胞の存在を評価するためのCART19PCRを受ける。対象は3週間にわたって週1回ずつ再受診して、以下を受ける:身体的診察、有害事象の文書記録、ならびに血液学検査、生化学検査、CART19細胞の生着および存続性、および臨床検査のための採血。2回目の輸注いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、患者に対するCART19細胞の2回目の用量は、彼らが1回目の用量に対して十分な忍容性を示し、かつ十分なCART19細胞が製造されたならば、第11日に投与しうると考えられている。用量は合計2~5×109個の細胞とする。カリウムおよび尿酸に関する血清試料を輸注2時間後に収集する。2回目のアフェレーシス2リットルのアフェレーシス手順をアフェレーシスセンターで行う。研究調査のためにPBMCを入手して凍結保存する。対象は以下を受ける:身体的診察、有害事象の文書記録、ならびに血液学検査、生化学検査、CART19細胞の生着および存続性、および臨床検査のための採血。加えて、腫瘍総量測定値を得る目的で病期再判定を行う。病期再判定検査は病型別に判定し、イメージング、MRD評価、骨髄吸引および生検、ならびに/またはリンパ節生検を含む。輸注後2~6カ月の毎月の評価対象にCART19細胞輸注後の2~6カ月は月1回再受診させる。これらの試験受診時に対象は以下を受ける:併用薬、身体的診察、有害事象の文書記録、ならびに血液学検査、生化学検査、CART19細胞の生着および存続性、および臨床検査のための採血。CART19細胞輸注後2~6カ月の時点で、検出可能なRCLの存在の可能性を否定するためにHIVDNAアッセイを行う。輸注2年後までの年4回の評価輸注2年後まで、対象を年4回評価する。これらの試験受診時に、対象は以下を受ける:併用薬、身体的診察、有害事象の文書記録、ならびに血液学検査、生化学検査、CART19細胞の生着および存続性、および臨床検査のための採血。CART19細胞輸注後3カ月および6カ月の時点で、検出可能なRCLの存在の可能性を否定するためにHIVDNAアッセイを行う。実験の結果について以下に記す。患者病歴患者は1996年にステージICLLの診断を受けた。この男性はまず、6年間の観察後に、進行性白血球増加症およびリンパ節肥大に対する治療を必要とした。2002年に、彼は2サイクルのリツキシマブフルダラビンによって治療された;この治療の結果、血球数の正常化およびリンパ節肥大の部分的消散がもたらされた。2006年に、彼は疾患進行のために4サイクルのリツキシマブおよびフルダラビンを受け、再び血球数の正常化およびリンパ節肥大の部分的縮退が得られた。この奏効の後に、20カ月間の無増悪期間および2年間の無治療期間があった。2009年2月に、彼は急速進行性白血球増加症および再発性リンパ節肥大を有した。彼の骨髄はCLLにより広範に浸潤されていた。細胞遺伝学的分析により、細胞15個のうち3個が染色体17pの欠失を含むことが示され、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションFISH検査からは、細胞200個のうち170個が染色体17p上のTP53に関わる欠失を有することが示された。彼はリツキシマブおよびベンダムスチンを1サイクル投与され、ベンダムスチンをさらに3サイクル、リツキシマブを伴わずに受けた重度のアレルギー反応のため。この治療の結果、リンパ球増加症の一過性に過ぎない改善が生じた。コンピュータ断層撮影CTにより、治療法の後に進行性リンパ節肥大が実証された。自己T細胞を白血球アフェレーシスによって収集し、凍結保存した。患者は続いてアレムツズマブ抗CD52、成熟リンパ球、細胞表面抗原を11週間投与され、造血の改善およびリンパ節肥大の部分的消散を得た。次の6カ月間は、彼の疾患は安定しており、持続的で広範な骨髄病変および複数の1~3cmリンパ節がみられるびまん性リンパ節肥大を伴った。2010年7月に、この患者はキメラ抗原受容体改変T細胞の第1相臨床試験に組み入れられた。細胞輸注この患者からの自己T細胞を解凍して、CD19特異的キメラ抗原受容体を発現するようにレンチウイルスによる形質導入を行った図12A;レンチウイルスベクターおよび関連配列の配列識別名は表5に描写されている。細胞輸注の4日前に、患者はリンパ球の除去のためにデザインされた、リツキシマブを伴わない化学療法を受けたペントスタチンを体表面積1m2当たり4mgの用量で、およびシクロホスファミドを1m2当たり600mgの用量でLamannaetal2006JClinOncol24157581。化学療法の3日後、しかし細胞輸注の前に、骨髄は過形成性であり、CLLの関与がおよそ40であった。白血病細胞はκ軽鎖ならびにCD5、CD19、CD20およびCD23を発現した。細胞遺伝学的分析により、2種の別個のクローンが示され、これらはいずれも染色体17pおよびTP53座位の喪失をもたらした46XYdel546XYdert546XY14。化学療法の4日後に、患者は、5が形質導入されている合計3×108個のT細胞、すなわち合計142×107個の形質導入細胞146×105個/kgを、3日連続の毎日の静脈内輸注にて分割投与された第1日に10、第2日に30、および第3日に60。輸注後サイトカインは投与しなかった。輸注の毒性作用は認められなかった。表5pELPSCD19BBz移入ベクターの配列識別名臨床的奏効および評価初回輸注の14日後に、患者は悪寒および微熱を有するようになり、グレード2の疲労を伴った。以後の5日間で、悪寒は強まり、彼の体温は392°C1025°Fに上昇し、これに硬直、発汗、無食欲、悪心および下痢が伴った。彼には呼吸器症状も心症状もみられなかった。発熱を理由として、胸部放射線検査ならびに血液、尿および便の培養を行ったところ、いずれも陰性または正常であった。輸注後の第22日に腫瘍溶解症候群が診断された図12B。尿酸レベルは106mg/dl6305μmol/lであり、リンレベルは47mg/dl15mmol/l正常範囲、24~47mg/dl[08~15mmol/l]であり、乳酸デヒドロゲナーゼレベルは1130U/l正常範囲、98~192であった。急性腎障害の所見がみられ、クレアチニンレベル260mg/dl2298μmol/lベースラインレベル、<10mg/dl[<884μmol/l]。患者は入院し、補液蘇生およびラスブリカーゼによる治療を受けた。尿酸レベルは24時間以内、クレアチニンレベルは3日以内に正常範囲に復帰した;彼は入院第4日に退院した。乳酸デヒドロゲナーゼレベルは徐々に低下し、以後1カ月をかけて正常になった。CART19細胞輸注後の第28日までに、リンパ節肥大は触知不能となり、第23日の時点で骨髄内のCLLの所見は認められなかった図12C。核型はその時点で細胞15個中15個とも正常であり46XY、FISH検査は、検査した細胞200個中198個でTP53欠失に関して陰性であった;これは陰性対照における正常範囲内にあると判断される。フローサイトメトリー分析によって残留性CLLは示されず、B細胞は検出不能であったCD5CD10CD19CD23リンパ球ゲート内の細胞の1未満。輸注後の第31日に行ったCTスキャンにより、リンパ節肥大の消散が示された図12D。CART19細胞輸注の3カ月後および6カ月後に、身体的診察で目立った点は依然としてなく、触知可能なリンパ節肥大は認めず、CART19細胞輸注の3カ月後に行ったCTスキャンにより、持続的寛解が示された図12D。3カ月および6カ月の時点での骨髄検査からも、形態学的分析、核型分析46XYまたはフローサイトメトリー分析のいずれによってもCLLの所見は示されず、正常B細胞の継続的な欠如も示された。寛解は少なくとも10カ月間持続した。CART19細胞の毒性細胞輸注には急性毒性作用はなかった。認められた唯一の重篤なグレード3または4の有害事象は、上記のグレード3の腫瘍溶解症候群のみであった。患者にはベースラインでグレード1のリンパ球減少症があり、第1日からはグレード2または3のリンパ球減少症が始まり、治療法後少なくとも10カ月間続いた。リンパ球絶対数140個/m3のグレード4のリンパ球減少症が第19日に記録されたが、第22日から少なくとも10カ月まで、リンパ球絶対数は390~780個/m3の範囲でありグレード2または3のリンパ球減少症、患者は第19日から第26日まで一過性のグレード1血小板減少症血小板数、98000~131000/m3を、第17日から第33日までグレード1または2の好中球減少症好中球絶対数、1090~1630/m3を有した。試験治療とおそらく関係すると考えられた他の徴候および症状には、初回輸注17日後に生じて第33日までに消失したグレード1および2のアミノトランスフェラーゼレベルおよびアルカリホスファターゼレベルの上昇、ならびに発熱、悪寒、発汗、筋肉痛、頭痛および疲労からなるグレード1および2の体質症状が含まれた。グレード2の低γグロブリン血症は静脈内免疫グロブリン輸注によって是正された。血清および骨髄のサイトカインの分析患者の臨床的奏効には、炎症性サイトカインのレベルの遅延上昇が伴い図13Aから図13Dまで、インターフェロンγ、インターフェロンγ応答性ケモカインCXCL9およびCXCL10、ならびにインターロイキン6のレベルは、ベースラインレベルの160倍もの高さとなった。サイトカインレベルの一時的上昇は臨床症状と平行関係にあり、CART19細胞の初回輸注の17~23日後がピークであった。連続的骨髄吸引液からの上清をサイトカインに関して測定したところ、免疫活性化の所見が示された図13E。インターフェロンγ、CXCL9、インターロイキン6および可溶性インターロイキン2受容体の有意な増加が、T細胞輸注前日のベースラインレベルとの比較で認められた;値はCART19細胞の初回輸注後の第23日にピークとなった。骨髄サイトカインの増加は、骨髄からの白血病細胞の排除と一致した。血清および骨髄の腫瘍壊死因子αは変化のないままであった。キメラ抗原受容体T細胞の増大および存続リアルタイムPCRでは、抗CD19キメラ抗原受容体CAR19をコードするDNAが、初回輸注後の第1日から検出された図14A。輸注後の第21日までにインビボでの細胞の3logを上回る増大が認められた。ピークレベルで、血液中のCART19細胞は流血中リンパ球の20超に相当した;これらのピークレベルは体質症状、腫瘍溶解症候群図12Bおよび血清サイトカインレベルの上昇図13Aから図13Dまでの発生と一致した。CART19細胞は輸注6カ月後に高レベルで検出可能なままであったものの、その値はピークレベルから10分の1に減少した。血液中でのキメラ抗原受容体T細胞の倍加時間はおよそ12日であり、消失半減期は31日であった。骨髄におけるキメラ抗原受容体T細胞CART19細胞は骨髄標本において初回輸注23日後から同定され図14B、少なくとも6カ月間持続し、減衰半減期は34日であった。骨髄におけるCART19細胞の最も高いレベルは初回輸注の23日後の初回評価時に同定され、サイトカイン分泌プロファイルによって指し示されるように、免疫応答の誘導と一致した図13E。骨髄吸引液のフローサイトメトリー分析により、ベースラインでCD5CD19細胞のクローン増大が指し示され、これは輸注後1カ月、および輸注後3カ月に入手した試料にはみられなかったデータ非提示。正常B細胞は治療後に検出されなかった図14C。遺伝子改変された自己CART19細胞による治療本明細書に記載されたのは、CD3ζおよびCD13741BBシグナル伝達ドメインを連結させた抗CD19を発現するレンチウイルスベクターによる形質導入を通じてCD19を標的とするように遺伝子改変された自己T細胞による治療から3週間後の、腫瘍溶解症候群の遅延発症および完全奏効である。遺伝子改変された細胞は、輸注後少なくとも6カ月間にわたって骨髄に高レベルで存在した。骨髄におけるCD19特異的免疫応答の生成は、サイトカインの一時的放出および白血病細胞の除去によって明示され、それはキメラ抗原受容体T細胞の浸潤のピークと一致した。細胞免疫療法後の腫瘍溶解症候群の発症は、これまで報告されていないBaeksgaardetal2003CancerChemotherPharacol5118792。特異的腫瘍抗原を標的とするように自己T細胞を遺伝子操作することは、癌療法のための注目される戦略の1つであるSadelainetal2009CurrOpinImmunol2121523;Jenaetal2010Blood116103544。本明細書に記載されたアプローチの重要な特徴は、キメラ抗原受容体T細胞がHLAに拘束されない様式で腫瘍標的を認識することができ、その結果、非常にさまざまな組織学的特徴を有する腫瘍に対して汎用的なキメラ抗原受容体を構築することができることである。HIV由来レンチウイルスベクターを癌療法のために用いたが、これはレトロウイルスベクターの使用を上回るいくつかの利点があるアプローチであるJuneetal2009NatRevImmunol970416。キメラ抗原受容体T細胞の以前の試験では、客観的腫瘍反応は中程度であり、改変された細胞のインビボ増殖は持続的でなかったKershawetal2006ClinCancerRes12610615;Tilletal2008Blood112226171;Puleetal2008NatMed14126470。Brentjensらは、CD28シグナル伝達ドメインを連結させたCD19を標的とするキメラ抗原受容体の臨床試験の予備的結果を報告し、進行したCLLの患者3人中2人で一過性腫瘍反応を見いだしたBrentjensetal2010MolTher186668;しかし、キメラ抗原受容体は流血中から急速に消失した。輸注された極めて低用量のキメラ抗原受容体T細胞が、臨床に明白な抗腫瘍効果をもたらすと考えられることは予想外であった。事実、輸注された用量の15×105個/kgのキメラ抗原受容体T細胞は、キメラ抗原受容体またはトランスジェニックT細胞受容体を発現するように改変されたT細胞の以前の試験で用いられたよりも数桁少なかったKershawetal2006ClinCancerRes12610615;Brentjensetal2010MolTher186668;Morganetal2010MolTher1884351;Johnsonetal2009Blood11453546。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、化学療法はキメラ抗原受容体の効果を増強しうると推測される。患者の血液および骨髄におけるCART19細胞の長期にわたる存続性は、41BBシグナル伝達ドメインを含めたことに起因する。マウス配列を含む単鎖Fv抗体フラグメントを発現するCART19細胞が拒絶されなかったことからみて、CART19細胞により媒介される正常B細胞の排除が、キメラ抗原受容体に対する免疫寛容の誘導を促した可能性が高い。この患者において検出可能なCD19陽性白血病細胞が存在しなかったことを考慮すれば、いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、キメラ抗原受容体T細胞の恒常性は、少なくとも一部には初期B細胞始原細胞により、それらが骨髄内に出現した時点で送達された刺激によって達成された可能性がある。本発明は、メモリーキメラ抗原受容体T細胞を維持させる新たな機序が存在する可能性があるという発見に関する。CD19は注目される腫瘍標的であるものの、その発現が正常細胞および悪性B細胞に限られるため、キメラ抗原受容体T細胞の存続が長期的なB細胞欠乏を媒介する可能性については懸念がある。実際に、この患者において、B細胞は輸注後少なくとも6カ月間にわたって血液および骨髄から失われた。この患者は再発性感染症を有しなかった。リツキシマブを用いるCD20を通じてのB細胞のターゲティングは、B細胞悪性腫瘍の患者に対する有効で比較的安全な戦略であり、長期的なB細胞リンパ球減少症は管理可能であるMolina2008AnnRevMed5923750。リツキシマブによって治療された患者は、治療法の中止から数カ月以内にB細胞が回復することが報告されている。そのような回復が、抗B細胞性のT細胞がインビボに存続する患者で起こるか否かはまだ明らかではない。TP53欠失を伴うCLLを有する患者では、標準療法の後に短期的な寛解が得られるDohneretal1995Blood8515809。同種骨髄移植は、進行CLLの患者における長期寛解を誘導している唯一のアプローチであるGribbenetal2011BiolBloodMarrowTransplant17SupplS63S70。しかし、その結果生じる強力な移植片対腫瘍効果には、慢性移植片対宿主病の頻度が高いことによる高度の病態が伴い、これは高齢患者‐CLLに罹患していることが典型的である‐では多くの場合、特に重症であるGribbenetal2011BiolBloodMarrowTransplant17SupplS63S70;Sorroretal2008Blood11144652。本明細書に提示されたデータは、遺伝子改変された自己T細胞がこの限界を克服しうる可能性を示唆する。腫瘍溶解症候群およびサイトカイン分泌の遅延発現と、それに相まった活発なインビボでのキメラ抗原受容体T細胞の増大および顕著な抗白血病活性は、CART19細胞の実質的および持続的なエフェクター機能を指し示す証拠となるものである。本明細書に記載された実験は、この療法の効力を強く示しており、強力なシグナル伝達ドメインと連結されたキメラ抗原受容体の形質導入を通じてCD19および他の標的を標的とするように遺伝子改変された自己T細胞の詳細な研究の支えともなる。抗体媒介療法とは異なり、キメラ抗原受容体改変T細胞はインビボで複製する潜在能力を有し、長期存続性は持続的な腫瘍制御につながりうると考えられる。進行CLLの他の2人の患者もこのプロトコールに従ってCART19輸注を受け、3人全員で腫瘍の奏効が得られた。これらの知見は、B細胞新生物に対するCD19再誘導T細胞の継続的研究に正当な根拠を与えるものである。本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および等価な変形物を含むことを意図している。規則464に基づく説明書条約第19条に基づく特許請求の範囲に対する補正の結果として、新たな請求の範囲第70項~第89項が追加された。したがって、請求の範囲第1項~第89項が、本出願において出願中である。請求の範囲第1項から第69項までは変更がない。新たな請求の範囲第70項~第89項は、本明細書において開示された特徴を説明している。具体的には、独立請求項である特許請求の範囲第70項および第81項は、SEQIDNO:9を説明している。新たな請求の範囲第70項~第89項の裏づけは、とりわけ、ページ上では、出願時の本明細書の、第87ページの表5における第1行~第31行、および図12に見られる。特許請求の範囲に対するこれらの補正によって、新規事項が追加されることはない。