"多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する工程A;及び前記胚性内胚葉を6ブロモインジルビン3オキシムBIO及びの存在下で培養することにより、前記胚性内胚葉から腸細胞を分化誘導する工程B:を含む、腸細胞の製造方法。EカドヘリンECD及びCXCR4に対する蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーにより、工程Aにおいて得られた細胞培養物から胚性内胚葉細胞を分離し、工程Bにおいて該分離した胚性内胚葉細胞を用いる、請求項1に記載の方法。工程Aにおいて、支持細胞の存在下、かつアクチビン及び/又はbFGFの存在下で前記多能性幹細胞を培養することにより、該多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する、請求項1又は2に記載の方法。支持細胞が、中胚葉に由来する細胞である、請求項3に記載の方法。支持細胞が、M15細胞、MEF細胞又はST2細胞である、請求項3又は4に記載の方法。工程Bにおいて、前記胚性内胚葉をM15細胞又はMEF細胞の存在下で培養する、請求項1~5の何れか1項に記載の方法。前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞である、請求項1~6の何れか1項に記載の方法。前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはマウス胚性幹細胞である、請求項1~7の何れか1項に記載の方法。請求項1から8の何れか1項に記載の方法により得られる、多能性幹細胞から分化誘導された腸細胞。請求項1から8の何れか1項に記載の方法によって多能性幹細胞から腸細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養し、被験物質の非存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度と、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、多能性幹細胞から腸細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。被験物質が成長因子又は低分子化合物である、請求項10に記載のスクリーニング方法。腸細胞で発現するマーカー転写産物の量もしくは蛋白量、またはその両方を指標として、腸細胞へと分化誘導の程度を測定する、請求項10又は11に記載のスクリーニング方法。本発明の課題は、多能性幹細胞を出発材料とした腸細胞を製造する方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、多能性幹細胞である胚性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導した後に、該胚性内胚葉をBIO6ブロモインジルビン3オキシム及びDAPT6ブロモインジルビン3オキシムBIO及びN‐[3,5‐ジフルオロフェニルアセチル]‐L‐Ala‐2‐フェニル‐L‐Gly‐tert‐ブチル‐OHDAPTの存在下で培養することにより、前記胚性内胚葉から腸細胞を分化誘導する工程B:を含む、腸細胞の製造方法。2EカドヘリンECD及びCXCR4に対する蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーにより、工程Aにおいて得られた細胞培養物から胚性内胚葉細胞を分離し、工程Bにおいて該分離した胚性内胚葉細胞を用いる、1に記載の方法。3工程Aにおいて、支持細胞の存在下、かつアクチビン及び/又はbFGFの存在下で前記多能性幹細胞を培養することにより、該多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する、1又は2に記載の方法。4支持細胞が、中胚葉に由来する細胞である、3に記載の方法。5支持細胞が、M15細胞、MEF細胞又はST2細胞である、3又は4に記載の方法。6工程Bにおいて、前記胚性内胚葉をM15細胞又はMEF細胞の存在下で培養する、1~5の何れか1項に記載の方法。7前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞である、1~6の何れか1項に記載の方法。8前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞またはマウス胚性幹細胞である、1~7の何れか1項に記載の方法。91から8の何れか1項に記載の方法により得られる、多能性幹細胞から分化誘導された腸細胞。101から8の何れか1項に記載の方法によって多能性幹細胞から腸細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養し、被験物質の非存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度と、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、多能性幹細胞から腸細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法。11被験物質が成長因子又は低分子化合物である、10に記載のスクリーニング方法。12腸細胞で発現するマーカー転写産物の量もしくは蛋白量、またはその両方を指標として、腸細胞へと分化誘導の程度を測定する、10又は11に記載のスクリーニング方法。本発明の製造方法によれば、多能性幹細胞から、腸の吸収腸細胞、パネート細胞、杯細胞、腸内分泌細胞などの各種成熟型腸細胞を大量かつ効率的に製造することができる。本発明によれば、上記の通り各種成熟型腸細胞を製造することが可能であり、それら腸細胞は再生医療の分野において実践的に用いることができる。本発明の腸細胞の製造方法は、多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する工程A;及び前記胚性内胚葉を6ブロモインジルビン3オキシムBIO及びN‐[3,5‐ジフルオロフェニルアセチル]‐L‐Ala‐2‐フェニル‐L‐Gly‐tert‐ブチル‐OHの存在下で培養することにより、該前記胚性内胚葉から腸細胞を分化誘導する工程Bを含むことを特徴とする。本発明において、多能性幹細胞とは、試験管内などの人工的に構成された条件下invitroで増殖能を持ち、生体の全ての組織の細胞に分化が可能な細胞を言う。本発明では、多能性幹細胞として、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を用いることが好ましく、胚性幹細胞を用いることがより好ましい。胚性幹細胞本発明で用いる胚性ES細胞は、哺乳動物由来のES細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のES細胞などを使用することができる。ES細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Pdx1遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Pdx1座にLacZ遺伝子を組み込んだ129Sv由来ES細胞株又は、Pdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンをもつES細胞SK7株などを使用することができる。あるいは、Hnf3β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のmRFP1レポータートランスジーン及びPdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンを有するES細胞PH3株を使用することもできる。また、本発明では、マウス由来のものであればマウスES細胞株R1、ヒト由来のものであればヒトES細胞株であるKhES1、KhES2、及びKhES3を用いることができ、このうち、マウスES細胞株R1又はヒトES細胞株KhES3を好ましく用いることができる。哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができ、例えば、必要によりフィーダー細胞としてマイトマイシンC処理マウス胚線維芽細胞MEFの存在下において、1000ユニットml白血病抑制因子、15ノックアウト血清リプレースメント、1ウシ胎児血清、100μM非必須アミノ酸、2mMLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、50ユニットmlペニシリンおよび50μgmlストレプトマイシン、及び100μMβメルカプトエタノールを含むグラスゴー最小必須培地中で維持することができる。人工多能性幹細胞本発明で用いる人工多能性幹細胞iPS細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。本発明で言うiPS細胞は、所定の培養条件下例えば、ES細胞を培養する条件下において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本発明における人工多能性幹細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。体細胞からiPS細胞を製造するためには、まず、少なくとも1種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してiPS細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。iOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子iiOct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子iiiOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40largeT遺伝子ivOct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子及びMyc遺伝子にはそれぞれ、複数のファミリー遺伝子が含まれている。それぞれのファミリー遺伝子の具体例としては、国際公開WO2007/069666号公報の明細書の第11頁から第13頁に記載されているものを用いることができる。具体的には、以下の通りである。Oct遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Oct34NM002701、Oct1A、及びOct6などを挙げることができる括弧内は、ヒト遺伝子のNCBIaccession番号を示す。好ましくはOct34である。Oct34はPOUファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして知られており、また多能性維持に関与しているとの報告もある。Klf遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、Klf1、Klf2、Klf4、及びKlf5などを挙げることができる括弧内は、ヒト遺伝子のNCBIaccession番号を示す。好ましくはKlf4である。Klf4Kruppellikefactor4は腫瘍抑制因子として報告されている。Sox遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、例えば、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、及びSox18を挙げることができる括弧内は、ヒト遺伝子のNCBIaccession番号を示す。好ましくはSox2である。Sox2は初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である。Myc遺伝子に属する遺伝子の具体例としては、cMyc、NMyc、及びLMycなどを挙げることができる括弧内は、ヒト遺伝子のNCBIaccession番号を示す。好ましくは、cMycである。cMycは細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり、多能性維持に関与しているとの報告がある。上記した遺伝子は、ヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する遺伝子であり、本発明において任意の哺乳類動物由来例えばヒト、マウス、ラット、サルなどの哺乳類動物由来の遺伝子を用いることができる。また、野生型の遺伝子に対して、数個例えば1~30個、好ましくは1~20、より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個、特に好ましくは1から3個の塩基が置換、挿入及び/又は欠失した変異遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能を有する遺伝子を使用することもできる。本発明では特に好ましくは、初期化遺伝子として、Oct34遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びcMyc遺伝子の組み合わせを用いることができる。初期化遺伝子を体細胞に導入する方法は、導入された初期化遺伝子が発現して体細胞の初期化を達成できる限り特に限定されない。例えば、少なくとも1種類以上の初期化遺伝子を含む発現ベクターを用いて該初期化遺伝子を体細胞に導入することができる。ベクターを用いて2種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する場合には、一つの発現ベクターに2種類以上の初期化遺伝子を組み込んで、該発現ベクターを体細胞に導入してもよいし、1種類の初期化遺伝子を組み込んだ発現ベクターを2種類以上用意して、それらを体細胞に導入してもよい。発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターであり、特に好ましくは導入した初期化遺伝子が体細胞の染色体に組み込まれるようなウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクターレンチウィルスベクターを含む、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。上記の中でも好ましくはレトロウィルスベクターであり、特に好ましくはレンチウィルスベクターである。組み換えウイルスベクターを作製するために用いるパッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であれば任意の細胞を用いることができる。例えばヒト腎臓由来のHEK293細胞、マウス線維芽細胞NIH3T3に基づくパッケージング細胞を用いることができる。組換えウイルスベクタープラスミドをパッケージング細胞に導入することで組換えウイルスベクターを生産することができる。上記パッケージング細胞への上記ウイルスベクタープラスミドの導入法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法などの公知の遺伝子導入法で行うことができる。ES細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地は当業界で公知であり、適当な培地を組み合わせて用いることにより、本発明の人工多能性幹細胞を分離及び培養することができる。即ち、本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地としては、ES培地、ES培地に10ngmlFGF2bFGFを添加後にマウス胚性線維芽細胞を24時間培養した上清であるMEF馴化ES培地以下MEF馴化ES培地などをあげることができる。本発明の人工多能性幹細胞を培養するための培地には、各種の成長因子、サイトカイン、ホルモンなど例えば、FGF2bFGF、TGFb1、アクチビンA、ノギンNoggin、BDNF、NGF、NT1、NT2、NT3等のヒトES細胞の増殖維持に関与する成分を添加してもよい。また、分離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能は、ES細胞について知られている確認手段を利用することにより確認することができる。多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞への分化誘導本発明において、胚性内胚葉細胞definitiveEndodermとは、食道、胃、小腸および大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、および膵臓などの腸管に由来する器官に分化し得る細胞を意味し、具体的には、マーカー遺伝子となるE-カドヘリンEcadherinECD及びCXCR4、あるいはEカドヘリンおよびCD55が陽性である内胚葉細胞を言うShirakiNHaradaSOgakiSKumeKandKumeSIdentificationofDAF1CD55anoveldefinitiveendodermmarkerCellStructFunct3573802010特願2009225758。本発明において、多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する工程Aは、特に限定されるものではなく、各種公知の方法により行うことができる。例えば、特表2007-516728等に記載の方法を用いることが可能であるが、以下に、好ましい方法ついて説明する。本発明の工程Aでは、上記多能性幹細胞を、適切な支持細胞の存在下かつアクチビン及び/又は塩基性線維芽細胞成長増殖因子bFGFの存在下において培養することにより、所望の胚性内胚葉細胞を分化誘導することができる。本発明で用いられる上記支持細胞としては、多能性幹細胞を胚性内胚葉細胞へと分化誘導できる細胞であれば、特に限定されるものではないが、好ましくは、中胚葉に由来する細胞を支持細胞として用いることができる。そのような支持細胞の具体例としては、M15細胞、MEF細胞、ST2細胞などが挙げられる。また、支持細胞は、マイトマイシンC処理又は放射線照射により細胞増殖を失わせたものを用いることができる。本発明で用いるM15細胞は、登録番号ECACC95102517として、細胞バンクCAMRCentreforAppliedMicrobiologyResearchに登録されている。M15細胞は文献LarssonSHCharlieuJPMiyagawaKetalSubnuclearlocalizationofWT1insplicingortranscriptionfactordomainsisregulatedbyalternativesplicingCell81391401の記載に従って入手可能である。M15についてのバンク情報を以下に記載する。Version4200201M15ECACC95102517MorphologyEpithelialMousemesonephricepitheliumpolyomaviruslargeTtransformedDepositorProfVvanHeyningenMRCHumanGeneticsUnitWesternGeneralHospitalEdinburghUKNorestrictionsPatentNoneSpecifiedByDepositorPropertiesProductsWT1ApplicationsGeneexpressionandproteinstudiesconnectedtokidneydevelopmentandWilmstumourigenesisAvailableinthefollowingLABORATORYCAMRCentreforAppliedMicrobiologyResearchDMEM2mMGlutamine10FetalBovineSerumSplitconfluentcultures15to110ieseedingat5x1000to1x10000cellscm2using025trypsinortrypsinEDTA5CO237CcellgrowthimpairedatlowerdensitiesKaryotypeHyperdiploidHazardCZIITheWT1expressingmesonephriccelllineM15wasestablishedfrommousemesonephrostransgenicallyexpressingthelargeTproteinofpolyomavirusunderthecontroloftheearlyviralenhancerAsatumoursuppressergenewithakeyroleinurogenitaldevelopmentWT1isimplicatedaspredispositiongeneinthepathogenesisofWilmstumourFurtherinformationResearchcouncildepositYesPricecodeCBibliographicreferencesCell199581391ByBeatriceTITLEM15DATE200504240032URLhttpwwwbiotechistunigeitcldbcl3312htmlEuropeanCollectionofCellCulturesHealthProtectionAgencyPortonDownSalisburyWiltshireUKJunePoultonEuropeanCollectionofCellCulturesHealthProtectionAgencyPortonDownSP40JGSalisburyWiltshireUKPhone441980612512Fax441980611315EmailecacchpaorgukURLhttpwwwecaccorgukMEF細胞ICRマウスよりは、ATCCにカタログ番号ATCCSCRC-1046として登録されている。また、MEF細胞は、文献NagyAetalManipulatingTheMouseEmbryoALaboratoryManualThirdEditionColdSpringHarborPress2003の記載に従って入手可能である。ST2細胞は、RCB0224として、独立行政法人理化学研究所筑波研究所バイオリソースセンターに登録されている。また、ST2細胞は、文献OgawaMNishikawaSIkutaKYamamuraFNaitoMTkahashiKandNishikawaSEMBOJ1988713371343の記載に従って入手可能である。これらのフィーダー細胞は、血清などを補充した動物細胞用の通常の培地例えば、RPMI培地、DMEM培地を用いて常法に従って培養することができる。本発明の工程Aにおいて、上記支持細胞の存在下で多能性幹細胞を培養する方法は特に限定されないが、例えば、上記支持細胞をフィーダー細胞として使用し、多能性幹細胞を共培養することができる。具体的には、上記フィーダー細胞支持細胞を予め一層に生着させたプレートに、アクチビン及び/又はbFGFを含む適切な培地を用いて、多能性幹細胞を播種し、共培養することができる。数日間、該共培養を行うことにより、多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導することができる。本発明の工程Aにおいて用いられる培地については、DMEM培地、RPMI培地等の通常の動物細胞用培地を用いることが可能であり、培地中にアクチビン及び/又はbFGFを添加して用いられ得る。また、工程Aにおいて用いられる培地は、必要に応じて、ウシ胎児血清などの血清、ノックアウト血清リプレスメントKSR、グルコース等の任意の成分を含んでいても良い。また、アクチビンとしては、アクチビンAを用いることが好ましい。培地中のアクチビンの濃度については、胚性内胚葉細胞が分化誘導され得る限り特に限定されるものではないが、例えば、5~300ng/mL、好ましくは10~200ng/mLとすることができる。培地中のbFGFの濃度についても、胚性内胚葉細胞が分化誘導され得る限り特に限定されるものではないが、例えば、5~300ng/mL、好ましくは10~200ng/mLとすることができる。本発明の工程Aにおいて、多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞が分化誘導されたか否かは、上述のECD及びCXCR4が発現を調べることにより確認することができる。また、必要に応じて、工程Aで得られた培養物から、胚性内胚葉細胞を分離し、分離した胚性内胚葉細胞を本発明の工程Bに供試することもできる。具体的には、ECD及びCXCR4に対する蛍光標識抗体を用いたフローサイトメトリーにより、胚性内胚葉細胞を分離することができる。胚性内胚葉細胞から腸細胞への分化誘導本発明の工程Bでは、6ブロモインジルビン3オキシム6Bromoindirubin3′oximeBIO、及びN‐[3,5‐ジフルオロフェニルアセチル]‐L‐Ala‐2‐フェニル‐L‐Gly‐tert‐ブチル‐OHAlaPhgObuの存在下で、工程Aで得られた胚性内胚葉細胞を培養することにより、胚性内胚葉細胞から腸細胞を分化誘導する。具体的には、BIO及びDAPTの存在下で、胚性内胚葉細胞を、数日間例えば、1~30日間、1~20日間、1~16日間培養すると、Cdx2、Ifabp、Isx、Villin1ビリン1、ラクターゼ、Glut2などの腸細胞マーカー遺伝子の発現が認められる細胞が出現する。すなわち、本発明の工程Bによれば、各種腸細胞マーカー遺伝子の発現が認められる腸細胞の分化誘導が可能となる。培地中のBIO及びDAPTの濃度は、胚性内胚葉細胞から腸細胞が分化誘導できる範囲であればよく、特に限定されるものではない。培地中のBIOの濃度は、例えば1~500μMの範囲、好ましくは1~100μM、より好ましくは1~50μM、さらに好ましくは1~20μM、さらにより好ましくは1~10μMの範囲とすることができる。一方、培地中のDAPTの濃度は、例えば1~500μMの範囲、好ましくは1~100μM、より好ましくは1~50μM、さらに好ましくは1~20μMの範囲とすることができる。また、工程Bにおいて、BIO及びDAPTに加えて、胚性内胚葉細胞から腸細胞への分化誘導を活性化するさらなる物質を培地中に添加することもできる。このような物質の例としては、FGFシグナル伝達を活性化する物質、BMPシグナル伝達を活性化する物質、ヘッジホッグHhシグナル伝達を活性化する物質などが挙げられる。FGFシグナル伝達を活性化する物質の具体例としてはFGF2、BMPシグナル伝達を活性化する物質の具体例としてはBMP4、ヘッジホッグHhシグナル伝達を活性化する物質の具体例としてはSAGSmoothenedAgonist;NMethylN′N′14diaminocyclohexaneSAG13がそれぞれ挙げられる。これらの物質は、マウスES細胞を出発材料とした場合に特に腸細胞への分化誘導を促進できることから、マウスES細胞を出発材料として用いた場合にこれらの物質を用いることが好ましく、その場合それらの物質を単独又は組合せて用いることができる。また、工程Bでは、上記胚性内胚葉細胞を、支持細胞としてM15細胞又はMEF細胞の存在下で培養することが好ましい。上記BIO及びDAPTの存在下で、かつこれらの支持細胞の存在下で胚性内胚葉細胞を培養した場合、上記腸細胞のマーカー遺伝子をより強く発現する各種腸細胞分化種が得られるからである。また、本発明により製造した腸細胞には、Tff3杯細胞マーカー、ムチン2Muc2杯細胞マーカー、DBA杯細胞マーカー、リゾチームパネート細胞マーカー、Sox9パネート細胞マーカー、ソマトスタチン腸内分泌細胞マーカー、クロモグラニンA腸内分泌細胞マーカー、ガストリン腸内分泌細胞マーカー、シナプトフィジン腸内分泌細胞マーカー、Sst腸内分泌細胞マーカー、Sct腸内分泌細胞などの各腸細胞型のマーカーの発現が認められる細胞が含まれる。すなわち、本発明によれば、腸細胞系統の全ての細胞型を製造することが可能である。従って、本発明の方法では、工程Bにより腸細胞を分化誘導させた後に、上述の腸細胞のマーカー遺伝子、及び/又は腸細胞系統の各種細胞型のマーカー遺伝子の発現をmRNA及び/又はタンパク質レベルで検出する工程を設けてもよい。このようなマーカー遺伝子の発現を検出する方法としては、RT-PCR法、ウェスタンブロッティング法などの各種公知の手法を採用することができる。さらに、本発明の方法では、フローサイトメトリーFACS解析などの各種公知の手法を用いて、分化誘導させた腸細胞ないし各種腸細胞をそれぞれ分離する工程をさらに設けてもよい。工程Bに関し、用いられる培地の種類、胚性内胚葉の培養条件、M15細胞又はMEF細胞の培養方法等は、上記工程Aに準じたものを採用することができる。上記の通り、本発明の製造方法によれば、腸細胞系統の全ての細胞型を製造することができるため、それら各種腸細胞は、各種消化器系悪性腫瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病等の疾患に対する再生医療に用いることができる。また、本発明により製造した各種腸細胞は、医薬品の毒性試験安全性試験や薬効薬理試験に用いることもできる。さらに本発明によれば、多能性幹細胞から胚性内胚葉細胞を分化誘導する工程A;及び前記胚性内胚葉をBIO及びDAPTの存在下で培養することにより、該前記胚性内胚葉から腸細胞を分化誘導する工程Bによって腸細胞を製造する際に、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養し、被験物質の非存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度と、被験物質の存在下で多能性幹細胞を培養した場合における腸細胞への分化誘導の程度とを比較することを含む、多能性幹細胞から腸細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。被験物質としては、成長因子又は低分子化合物などを使用することができる。この際、腸細胞で発現するマーカーの転写産物や蛋白量を指標として、腸細胞への分化誘導の程度を測定することが可能である。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。[実施例1]A材料及び方法1細胞株本実施例では、マウスのES細胞として、R1細胞株を使用した。R1細胞株を、白血病抑制因子LIF、10ウシ胎児血清FBS、100μM非必須アミノ酸NEAA、2mMLGln、50単位mLペニシリン及び50μgmlストレプトマイシンPS、ならびに100μMβメルカプトエタノールが添加された2000mgLグルコースDMEM中のマウス胎仔由来線維芽細胞MEFのフィーダー上で維持した。MEFは、胎生期E125~145のマウス胎児から単離した。中腎細胞株M15は、T.Noce博士慶応大学及びMRassoulzadegan博士UniversityofNiceSophiaAntipolisAntipolisFranceから分与されたものである。R1ES細胞は、AndrasNagy博士から分与されたものである。MEF細胞及びM15細胞をマイトマイシンCSigmaで処置し、そして過去に報告されている通りに使用したShirakiNHiguchiYHaradaSUmedaKIsagawaTAburataniHKumeKandKumeSDifferentiationandcharacterizationofembryonicstemcellsintothreegermlayersBiochemBiophysResCommun3816949;ShirakiNUmedaKSakashitaNTakeyaMKumeKandKumeSDifferentiationofmouseandhumanembryonicstemcellsintohepaticlineagesGenesCells1373146;ShirakiNYoshidaTArakiKUmezawaAHiguchiYGotoHKumeKandKumeSGuideddifferentiationofembryonicstemcellsintoPdx1expressingregionalspecificdefinitiveendodermStemCells2687485。2マウスES細胞の腸分化ES細胞を、10ウシ胎児血清及び4500mgmlグルコースを含むDMEM培地中で20ngmlアクチビン及び50ngmlbFGFを加えたM15細胞上で5日間にわたり培養し、胚性内胚葉についてフローサイトメトリーを使用して分析した。腸分化のために、ES細胞を、M15細胞又はMEF細胞上で、BIO及びDAPTの存在で、又はBIO及びDAPTを伴わず、しかし、bFGFを伴い、10KSRを伴う培地中で、グルコース濃度2000mgmlでさらに培養した。3ヒトES細胞の維持ヒトES細胞KhES3PMID:16707099は、中辻博士と末盛博士京都大学から分与されたものであり、日本政府のhES細胞ガイドラインに従って使用した。未分化hES細胞を、MEFのフィーダー層上で、20KSR、LGln、NEAA、及びβMEが添加されたKnockoutDMEMF12Invitrogen中で、3CO2下で維持した。hES細胞を継代するために、hES細胞コロニーを、20KSR及び1mMCaCl2を含むPBS中の025トリプシン及び01mgmlコラーゲナーゼIVを用いて、それらを37°Cで5分間処理し、続いて培養液を加え、穏やかに数回ピペット操作することによりES細胞塊を小片5~20個の細胞に脱凝集させることによりフィーダー層から剥離させた。4ヒトES細胞の腸分化分化誘導では、ヒトES細胞を、Y27632Wakoを用いて24時間にわたり前処理し、予めM15細胞でコーティングされた24ウェルプレートにおいて、1ウェル当たり50000個の細胞をプレーティングした。ES細胞を025トリプシンEDTAInvitrogenを用いて分離し、ES維持培地を含むY27632中で1日間培養した。プレーティングから1日後、細胞をPBSにより洗浄し、培地を分化培地に変えた。細胞を、第1の分化培地[2B27Invitrogen、NEAA、LGln、PS、及びβMEが添加されたRPMI1640Invitrogen]中で0~10日目に培養し、第2の分化培地10KSR、NEAA、LGln、PS、及びβMEが添加されたDMEMに10日目に切り替え、35日目まで培養した。アクチビンA100ngmlを分化の0~10日目に加え、BIO及びDAPTを10~35日目に加えた。培地を、2日ごとに、増殖因子が添加された新鮮培地と交換した。5増殖因子及び阻害剤特記なき場合、以下の濃度を使用した。BIOCalbiochem5μM;DAPTPeptideInst10μM;組換えヒトアクチビンARDSystems、20ngml。ヒトbFGFPeprotech、U0126Sigma、LY294002Calbiochem、SU5402Calbiochem、10μgml;FGF2Peprotech、256ngml;FGF4Peprotech、FGF5Sigma、FGF7RDSystems、FGF8CosmoBio、FGF9Peprotech、FGF10RDSystems、及びFGF18Sigma、50ngml。6フローサイトメトリー分析及び選別された細胞の再培養細胞をCellDissociationBufferInvitrogenを用いて分離し、1×106個細胞50μlに調整し、適切な抗体で染色した。抗体として、ビオチン又はAlexa488抱合抗Eカドヘリンモノクローナル抗体ECCD2、フィコエリトリンPE抱合抗Cxcr4mAb2B11BDPharmingenを使用した。染色された細胞を、FACSAriaBDPharmingenを用いて精製した。データをBDFACSDivaソフトウェアプログラムBDPharmingenを用いて記録し、FlowjoプログラムTreeStarを用いて分析した。7逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RTPCR分析RNAを、TRIReagentSigma又はRNeasyマイクロキットQiagenを使用してES細胞から抽出し、次にDNaseSigmaを用いて処理した。3μgのRNAを、MMLV逆転写酵素Toyobo及びオリゴdTプライマーToyoboを用いて逆転写した。プライマー配列及びサイクル数を表1に示す。各サイクルのPCR条件は、最初は96°Cで1分間の変性、2サイクル目からは、96°Cで30秒間の変性、60°Cで2秒間のアニーリング、そして72°Cで20秒間の伸長とした。最終サイクルでは72°Cで7分間の伸張とした。RTPCR産物を5非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、SYBRGreenIMolecularProbesを用いて染色し、GelLogic200ImagingSystemKodakを使用して可視化した。8抗体使用した抗体は以下の通りである。マウス抗Cdx2BioGenexSanRamonCAラット抗マウスEカドヘリンTaKaRaBIOINCJapanヤギ抗HNF4aSantacruzBiotechnologyIncマウス抗ビリンBDTransductionLaboratoriesウサギ抗リゾチームDiagnosticBiosystemsウサギ抗クロモグラニンAEpitomicsIncビオチン抱合ドリコスマメ凝集素DBAレクチンSIGMAヤギ抗ソマトスタチンSantacruzBiotechnologyIncマウス抗Muc2visionbiosystemsnovocastraウサギ抗Sox9Milliporeウサギ抗クローディン7Abcamウサギ抗Glut2Chemicon9アルカリホスファターゼ活性の測定培養細胞を4パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。01Tween20TBSTを含むリン酸緩衝食塩水で20分間洗浄後、発色反応を、NTMT100mMTrisHCl[pH95]、100mMNaCl、50mMMgCl2、01Tween20、2mMレバミソール中の35μgmlニトロブルーテトラゾリウムNBT、175μgml5ブロモ4クロロ3インドリルリン酸を用いて行った。10PAS染色及びAlucianブルー染色培養細胞を4パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。PAS染色溶液MutoPureChemicalsTokyoJapan又はAlucianブルー8GXSIGMAを製造業者の説明書に従って使用した。B結果1古典的Wntシグナル伝達canonicalWntsignalingの活性化及びNotchシグナル伝達の阻害によって、M15細胞上でのES細胞の腸分化が増強される。本発明者らは、以前に、M15細胞上でES細胞を培養した際、ESが胚性内胚葉運命に、次に胚性内胚葉系統の種々の細胞型Caudal型ホメオボックス2Cdx2発現腸細胞を含むに分化することを示した。Cdx2は、腸特異的転写因子の一種であり、腸細胞のマーカー遺伝子として有用であるSilbergDGSwainGPSuhERandTraberPGCdx1andcdx2expressionduringintestinaldevelopmentGastroenterology11996171。胚性内胚葉が腸細胞系列へ分化するための最適条件を調査するために、胚性内胚葉細胞が誘導された後にES細胞培養に化学物質を添加することにより、いくつかの培養条件を試験した図1A。定量PCRによりアッセイし、6ブロモインジルビン3オキシムBIOGSK3βの阻害剤、あるいは古典的Wntシグナル伝達の活性化因子又はAlaPhgOBuNotchシグナル伝達の阻害剤として機能するガンマ‐セクレターゼ阻害剤が、腸脂肪酸結合タンパク質Ifabp発現を分化の20日目d20に誘導することが見出された図1B。腸脂肪酸結合タンパク質Ifabpは、腸細胞のマーカー遺伝子として有用であるGreenRPCohnSMSacchettiniJCJacksonKEandGordonJIThemouseintestinalfattyacidbindingproteingenenucleotidesequencepatternofdevelopmentalandregionalexpressionandproposedstructureofitsproteinproductDNACellBiol113141。さらに、BIO及びDAPTの同時添加によってCdx2及びIfabpの発現が劇的に増加することが見出された図1B、C。M15細胞上で培養されたES細胞におけるBIO及びDAPTの存在での種々の腸マーカーの時間的発現を検証した図1D。ビリン1VillinMaunouryRRobineSPringaultELeonardNGaillardJAandLouvardDDevelopmentalregulationofvillingeneexpressionintheepithelialcelllineagesofmousedigestiveandurogenitaltractsDevelopment11571728の発現が5日目に誘導され、Cdx2発現が分化の10日目に実質的なレベルで誘導された。さらに、15日目にIfabpの誘導が、20日目でラクターゼLctBosseTFialkovichJJPiaseckyjCMBeulingEBroekmanHGrandRJMontgomeryRKandKrasinskiSDGata4andHnf1alphaarepartiallyrequiredfortheexpressionofspecificintestinalgenesduringdevelopmentAmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol292G130214及び腸特異的ホメオボックスIsxChoiMYRomerAIHuMLepourceletMMechoorAYesilaltayAKriegerMGrayPAandShivdasaniRAAdynamicexpressionsurveyidentifiestranscriptionfactorsrelevantinmousedigestivetractdevelopmentDevelopment133411929の発現が認められた。RTPCR分析と相関して、Cdx2発現の免疫組織化学分析により、BIO及びDAPTの存在で、高い割合のES細胞がCdx2発現細胞に変化することが認められた。2BIO及びDAPTの添加によって、胚性内胚葉が後方化する。誘導された腸細胞が胚性内胚葉に由来するか否かを検証するために、フローサイトメトリーにより、分化の4日目に胚性内胚葉を回収し図2A、これらの細胞を15日目まで再培養した。胚性内胚葉細胞は、さらに、BIO及びDAPTの添加時に、Cdx2又はビリン発現腸細胞に分化した図2B。この結果により、Cdx2及びビリン発現腸細胞が、胚性内胚葉に由来するものであることが明らかとなった。次に、領域特異的な前方後方マーカーを示すマーカーパネルの発現に対する段階的濃度のBIO及びDAPTの効果を試験した。BIO及びDAPTが未添加の場合、或いは低濃度で加えた場合では、甲状腺領域の前方マーカーである、ペアードボックス遺伝子8Pax8MansouriAChowdhuryKandGrussPFollicularcellsofthethyroidglandrequirePax8genefunctionNatGenet198790の発現が認められた。Cdx2及びIfabpは、中程度の濃度のBIO及びDAPTで誘導された。Isx及びホメオボックスC8Hoxc8KawazoeYSekimotoTArakiMTakagiKArakiKandYamamuraKRegionspecificgastrointestinalHoxcodeduringmurineembryonalgutdevelopmentDevGrowthDiffer447784は、高濃度のBIO及びDAPTで誘導された図2C。これらの結果により、腸領域化はBIO及びDAPTの段階的な濃度により特定されることが示唆された。次に、さらに、BIO5μM又はDAPT10μMを用いてES細胞を処理し、Pax8及びHoxc8の発現に対する、もう片方の因子BIO又はDAPTの段階濃度での効果を試験した。BIO5μMの存在下で、高DAPT濃度によって前方マーカーPax8がオフになり、後方マーカーHoxc8が誘導された図2D。一方で、ES細胞をDAPT10μM及び段階濃度のBIOで処理した場合、高BIO濃度によってPax8がオフになり、Hoxc8がオンになった。これらの結果は、Notchシグナル伝達が阻害された場合、BIOによる古典的シグナル伝達の活性化によって、胚性内胚葉の前方分化が阻害され、かつ後方分化が亢進されたことを実証している図2E。3MEF細胞は、BIO及びDAPTの存在下でのES細胞の腸系統への分化を誘導する際に、M15細胞よりも強力である。次に、M15細胞に対して、MEF細胞又はPA6細胞上での胚性内胚葉の培養を比較することにより、それぞれの支持細胞について腸分化の効果を試験した。ES細胞をM15細胞上で、かつアクチビン及びbFGFの存在下で4日間にわたり培養することにより、胚性内胚葉細胞を得て、次いでフローサイトメトリーにより選別した。選別した胚性内胚葉細胞を、BIO及びDAPTの存在下で、M15細胞、MEF細胞、又はPA6細胞上で15日目まで再培養した図3A。Cdx2を発現する分化細胞が、MEF細胞を使用した場合にも観察されたが、PA6細胞では認められなかった図3B。RTPCR分析によって、M15細胞の場合と比較した結果、MEF細胞上で増殖させた場合には、誘導される腸マーカーのさらに強い発現が認められた図3C。Cdx2の発現が、分化の12日目から高レベルで検出された図3D。他のマーカーとして、トレフォイルファクター3Tff3、杯細胞マーカー;リゾチームLyz1、パネート細胞マーカー;ソマトスタチンSst、腸内分泌マーカー;及びLctなども12日目又は15日目から検出された図3EHockerMandWiedenmannBMolecularmechanismsofenteroendocrinedifferentiationAnnNYAcadSci85916074SchonhoffSEGielMoloneyMandLeiterABMinireviewDevelopmentanddifferentiationofgutendocrinecellsEndocrinology145263944。4ES細胞由来の腸細胞の特性次に、ES細胞から分化した腸細胞型について調査した。Cdx2発現腸細胞は、Eカドヘリン上皮マーカーの発現により示される上皮細胞であるLugoMartinezVHPetitCSFouquetSLeBeyecJChambazJPinconRaymondMCardotPandThenetSEpidermalgrowthfactorreceptorisinvolvedinenterocyteanoikisthroughthedismantlingofEcadherinmediatedjunctionsAmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol296G23544。Cdx2発現細胞は、また、肝細胞核因子4アルファHNF4a内胚葉マーカーCattinALLeBeyecJBarreauFSaintJustSHoullierAGonzalezFJRobineSPinconRaymondMCardotPLacasaMetalHepatocytenuclearfactor4alphaakeyfactorforhomeostasiscellarchitectureandbarrierfunctionoftheadultintestinalepitheliumMolCellBiol296294308、及びGlut2吸収腸細胞マーカーGouyonFCaillaudLCarriereVKleinCDaletVCitadelleDKellettGLThorensBLeturqueAandBrotLarocheESimplesugarmealstargetGLUT2atenterocyteapicalmembranestoimprovesugarabsorptionastudyinGLUT2nullmiceJPhysiol55282332、又はクローディン7タイトジャンクションマーカーFujitaHChibaHYokozakiHSakaiNSugimotoKWadaTKojimaTYamashitaTandSawadaNDifferentialexpressionandsubcellularlocalizationofclaudin781213and15alongthemouseintestineJHistochemCytochem5493344を共発現する図4A~C。さらに、他のマーカーについても検証した。パネート細胞リゾチーム発現、及び、クロモグラニンA及びソマトスタチンなどの内分泌マーカーを発現する細胞が誘導された図4D。これらの細胞は、また、ムチン2vanKlinkenBJEinerhandAWDuitsLAMakkinkMKTytgatKMRenesIBVerburgMBullerHAandDekkerJGastrointestinalexpressionandpartialcDNAcloningofmurineMuc2AmJPhysiol276G11524及びレクチンDBAドリコスマメ凝集素杯細胞マーカーKandoriHHirayamaKTakedaMandDoiKHistochemicallectinhistochemicalandmorphometricalcharacteristicsofintestinalgobletcellsofgermfreeandconventionalmiceExpAnim4515560、並びに転写調節因子Sox9パネート細胞マーカーMoriAkiyamaYvandenBornMvanEsJHHamiltonSRAdamsHPZhangJCleversHanddeCrombruggheBSOX9isrequiredforthedifferentiationofpanethcellsintheintestinalepitheliumGastroenterology13353946を発現し、分化したES細胞中でも検出された図5E、F。腸細胞がアルカリホスファターゼ活性により特徴付けられた図5G。杯細胞は、PAS陽性図5H及びAlucianブルー染色図5Iにより特徴付けられた。これらの特徴は全て、本実施例の培養中で生成されたES細胞由来の腸細胞において確認される。これらの結果は、ES細胞が、腸細胞系統の全ての細胞型腸細胞の吸収細胞及びパネート細胞の分泌細胞、杯細胞、ならびに内分泌細胞を含むに分化誘導されることを示している。5ヒトES細胞の腸細胞への分化は、古典的Wntシグナル伝達の活性化及びNotchシグナル伝達の阻害により増強される。次に、ヒトES細胞が、マウスES細胞と同様に、BIO及びDAPTの添加により腸細胞に方向付けることができるか否かを調べた。この試験例では、khES3ヒトES細胞株SuemoriHYasuchikaKHasegawaKFujiokaTTsuneyoshiNandNakatsujiNEfficientestablishmentofhumanembryonicstemcelllinesandlongtermmaintenancewithstablekaryotypebyenzymaticbulkpassageBiochemBiophysResCommun34592632を使用した。アクチビン100μMを用いてKhES3を10日間にわたり培養した後、khES3が胚性内胚葉に分化した。次に、KhES3の培養物にBIO及びDAPTを加え、35日目まで培養を続けた。次いで、免疫組織化学的解析又はRT-PCRによりアッセイした。Cdx2を発現するkhES3が、免疫組織化学的解析図6Aにより25日目に、及びRT-PCR図6Bにより15日目という早期に検出された。RTPCRにより、腸細胞hVillin、hIfabp、hIsx、杯細胞hTff3SuemoriSLynchDevaneyKandPodolskyDKIdentificationandcharacterizationofratintestinaltrefoilfactortissueandcellspecificmemberofthetrefoilproteinfamilyProcNatlAcadSciUSA881101721、パネート細胞hLyzOuelletteAJPanethcellsandinnateimmunityinthecryptmicroenvironmentGastroenterology113177984、内分泌細胞ガストリン、hGast;シナプトフィシン、hSyp;ソマトスタチン、hSstHockerMandWiedenmannBMolecularmechanismsofenteroendocrinedifferentiationAnnNYAcadSci85916074;SchonhoffSEGielMoloneyMandLeiterABMinireviewDevelopmentanddifferentiationofgutendocrinecellsEndocrinology145263944の分子マーカーも検出され、これら分子マーカーの発現が誘導されることも明らかとなった図6B。分化したkhES3細胞はPAS染色陽性であり、機能的な杯細胞が誘導されることが明らかとなった。6腸系列へのES細胞分化がFGFシグナル伝達により増強され、MAPKではなく、PI3Kを通じて媒介される。M15細胞及びMEF細胞の両方が実質的なレベルでFGF2bFGFを発現することは既に公知である。したがって、次に、腸分化に対するFGF2bFGFの効果を試験した。フローサイトメトリーにより回収した胚性内胚葉細胞を、BIO及びDAPTの代わりに、FGF2bFGFの存在下で再培養した。RT-PCRによる分析によって、BIO及びDAPTの存在下で培養した場合には、腸細胞Ifabp、Isx、杯細胞Tff3、パネート細胞Lyz1、及び腸内分泌細胞SctGouyonFCaillaudLCarriereVKleinCDaletVCitadelleDKellettGLThorensBLeturqueAandBrotLarocheESimplesugarmealstargetGLUT2atenterocyteapicalmembranestoimprovesugarabsorptionastudyinGLUT2nullmiceJPhysiol55282332、Syp、Sst、Gastの分子マーカーが発現されることが証明された。しかし、BIO及びDAPTなしに、FGF2bFGFだけの存在下で培養した場合には、これらのマーカーはずっと低いレベルで誘導された。従って、コレシストキニンCckを除く腸細胞の大半の分化マーカーを誘導するために、BIO及びDAPTの同時添加はFGF2bFGFよりも効果がある図7A。次に、分化の4日目から、各種FGFをES細胞培養に添加することにより、各種FGFの効果を試験した。FGF2bFGFの添加によってCdx2を発現する腸細胞が誘導された。FGF4は、Cdx2を発現する細胞を誘導するために、FGF2bFGFより効果的であった。FGF7、9、10、及び18もES細胞の腸分化を誘導したが、その程度はより低いものであった図7B。しかし、これらのFGFの添加は、腸分化において、BIO及びDAPTの添加ほど効果的ではない。この結果は図7Aと矛盾しない。次に、BIO、DAPT、及びFGFシグナル伝達の間における関係を精査した。FGF受容体のアンタゴニストSU5402、及びPI3Kの阻害剤LY294002を使用した。SU5402によるFGFシグナル伝達の遮断、又はLY294002によるPI3Kの遮断によって、BIO及びDAPT媒介性の腸分化が部分的に阻害された図7C及びD。これらの結果により、FGFシグナル伝達が特にPI3Kを通じてWnt及びNotchシグナル伝達と協同的に機能し、腸分化を媒介することが証明された。C考察腸上皮では、腸幹細胞ISC及び陰窩中に存在する前駆細胞が、活発に増殖し、分化細胞を提供する。腸細胞、絨毛中に存在する杯細胞及び腸内分泌細胞、ならびに陰窩基底部に位置するパネート細胞など、4種類の非増殖性の最終分化した上皮細胞が存在するBarkerNvandeWeteringMandCleversHTheintestinalstemcellGenesDev22185664。本実施例において、ES細胞に由来する胚性内胚葉細胞をM15細胞又はMEF細胞上で培養することにより、BIOの添加による古典的Wntシグナル伝達経路の活性化及びDAPTの添加によるNotch経路の阻害によって、同時に、腸管内胚葉での後方マーカーの発現が誘導され、腸分化が亢進されることが確かめられた。M15細胞及びMEF細胞から放出されたFgfは、腸の特徴の確立を助長する図7。従って、本実施例の結果は、FGF、Wnt、及びNotchシグナル伝達が協同的に機能し、腸系列へのES細胞の分化を促進させることも示している。FGFが、用量依存的な様式で、ヒトES細胞由来の胚性内胚葉の異なる前腸系統への特定化に関与していることが知られているAmeriJStahlbergAPedersenJJohanssonJKJohannessonMMArtnerIandSembHFGF2specifieshESCderiveddefinitiveendodermintoforegutmidgutcelllineagesinaconcentrationdependentmannerStemCells284556。高いFGF2bFGFレベルで、中腸内胚葉の小腸前駆細胞への特定化が、Pdx1膵臓前駆細胞の代わりに増加することが知られている上記Ameriらの文献。また、古典的Wnt経路によって、陰窩中での未熟細胞の増殖、及びパネート細胞の成熟が活性化されることが報告されているvandenBornMBegthelHBrabletzTetalWntsignallinginducesmaturationofPanethcellsinintestinalcryptsNatCellBiol73816。また、Notchシグナル伝達の活性化は、腸前駆細胞プールを増幅させ、杯細胞及び腸内分泌細胞の分化を阻害できることが知られているZecchiniVDomaschenzRWintonDandJonesPNotchsignalingregulatesthedifferentiationofpostmitoticintestinalepithelialcellsGenesDev19168691。また、共通するNotch経路の転写調節因子CSLRBPJの条件付き除去後、増殖性陰窩細胞が、有糸分裂後の杯細胞へ迅速かつ大規模に変換されることが観察されているvanEsJHvanGijnMERiccioOvandenBornMVooijsMBegthelHCozijnsenMRobineSWintonDJRadtkeFetalNotchgammasecretaseinhibitionturnsproliferativecellsinintestinalcryptsandadenomasintogobletcellsNature43595963。さらに、類似の表現型が、ガンマセクレターゼ阻害剤を用いてNotchカスケードを遮断することにより得られたことが知られている上記vanEsら文献。このように、陰窩及び腺腫における未分化の増殖性細胞の維持には、Notchカスケード及びWntカスケードの協奏的活性化が必要となる。[実施例2]実施例2は、本発明の方法において、BIO及びDAPTに加えて各種シグナル伝達系の阻害剤又は活性化剤をさらに添加した例を示す。1試験例1:各種阻害剤の添加マウスES細胞を出発材料として用いた場合において、BIO及びDAPTに加えて、さらにどのようなメカニズムにより腸分化が誘導されているのかを明らかにするために、各種シグナル伝達系の阻害剤を添加して、腸マーカーであるCdx2遺伝子の発現が下がる条件について検討を行った。阻害剤としては、BMPシグナル阻害剤であるノギンNoggin500ngml若しくはドルソモルフィン200nM;レチノイン酸シグナルの阻害剤であるLE5401μM;ヘッジホッグシグナルの阻害剤であるKAAD-シクロパミン250nM;又はCxcr4の阻害剤であるAMD310010μMを添加した。実施例1に記載の通り、マウスES細胞をM15細胞上で胚性内胚葉まで分化誘導した後に、フローサイトメトリーを用いて胚性内胚葉を分取しMEF細胞上に再培養した。その後、上記分取した胚性内胚葉を、実施例1に記載の方法に準じて、BIO5μM及びDAPT10μM並びに上記阻害剤の存在下で、8日間培養し、実施例1に記載の方法により細胞からRNAを抽出し、腸マーカーであるCdx2遺伝子の発現についてリアルタイムPCRにより解析した。リアルタイムPCRは、実施例1で用いたプライマーペアー表1参照、ThunderbirdSYBRqPCRmix、及び7500FastRealtimePCRsystemを用いて行った。PCRの反応サイクルは表1に示す通りである。結果を図8Aに示す。その結果、ノギンNoggin、ドルソモルフィンdorsomorphin又はKAAD-シクロパミンを添加することによりCdx2の発現が低下した。すなわち、マウスES細胞を出発材料とした場合には、BMPシグナル伝達系、及びヘッジホッグHhシグナル伝達系が腸分化を促進的に制御していることが示唆された。2試験例2:各種活性化剤の添加上記阻害剤を用いた実験により、FGFシグナル伝達系や、BMPシグナル伝達系ないしHhシグナル伝達系が腸への分化に関与していることが判明した。そこで、次はFGFシグナル伝達系、BMPシグナル伝達系、及びHhシグナル伝達系の活性化実験を行った。マイクロアレイデータにおいてMEF細胞ではFGF2及びBMP4が発現していることを考慮して、FGFシグナル伝達系及びBMPシグナル伝達系の活性化のためにFGF250ngmL、及びBMP425ngmLを用いた。Hhシグナル伝達系の活性化については、SAG300nMを用いた。分化誘導実験のために、以下の通り無フィーダー系で分化誘導を行った。まず、マウスES細胞をゼラチンコートディッシュに6900細胞/cm2で播種した。ES細胞は、NEAA、LGln、PS、βME、インシュリン10μg/mL、トランスフェリン55μg/mL、セレン67pg/mL、025のアルブマックス、及び組換えヒトアクチビンA10ng/mLを添加した、4500mgLのグルコースを含有するDMEM培地InvitrogenGlasgowUKで、7日間培養し、次いで、培地を、グルコース2000mg/mL、BIO5μM及びDAPT10μMを含有し、かつ各活性化剤ないし成長因子を添加した10KSRに置換した。その後、さらに培養を続け、培養10日目と15日目に、実施例1に記載の通り細胞を分離し、フローサイトメトリーを用いてCdx2陽性細胞の割合を評価した。フローサイトメトリーFACS解析は、BDCytofixCytopermTMKitを用い、製造元のマニュアルに従って行った。その結果を図8Bに示す。図8に示される通り、培養10日目においてコントロールについては30程度がCdx2陽性であった。一方、FGF2を添加したものについては40となり有意にCdx2陽性細胞数について上昇がみられた。また、SAGを添加するとCdx2陽性数が低下するが、これはBMP4を添加することにより改善された。培養15日目においてはコントロールでは20程度Cdx2陽性だが、先ほどと同様にFGF2を添加すると60程度がCdx2陽性となりさらに効率よく分化することが示された。また、FGF2に加えてBMP4もしくはSAGを添加することでさらに効率よく分化することが判明した。この結果より、マウスES細胞からの腸への分化についてはFGF2が促進的に働き、さらに培養後期においてBMP4またはSAGによりBMPシグナル伝達系又はHhシグナル伝達系が活性化されて、さらに分化が促進されることが明らかとなった。3試験例3:ヒトES細胞における各種活性化剤の添加ヒトES細胞について、同様に無フィーダー系でFGF2、BMP4及び/又はSAGを添加することによりCDX2陽性細胞への分化効率が改善するかの検討を行った。まず、分化誘導実験のために、ヒトES細胞をゼラチンコートディッシュに69000細胞/cm2で播種した。ES細胞は、NEAA、LGln、PS、βME、インシュリン10μg/mL、組換えヒトアクチビンA100ng/mL、及びB27サプリメントを添加した、RPMI1640培地Invitrogenで、7日間培養した。次いで、培地を、グルコース2000mg/mL、BIO5μM、DAPT10μM、及び試験例2に記載の濃度の各活性化剤ないし成長因子を添加した10KSRに置換した。その後、さらに培養を続け、培養9日目と20日目に、実施例1に記載の通り細胞を分離し、フローサイトメトリーを用いてCdx2陽性細胞の割合を評価した。フローサイトメトリーFACS解析は、BDCytofixCytopermTMKitを用い、製造元のマニュアルに従って行った。その結果を図9に示す。培養9日目においてはどの条件にも差は無かったが、培養20日目において、Fgf2を添加したものについてはCDX2陽性細胞の割合が低下した。この結果よりヒトES細胞においてはFGFシグナルが腸への分化を抑制的に働き、マウスES細胞とは腸への分化メカニズムが異なっていることが示唆された。4試験例4:ヒトES細胞におけるFGF2濃度の影響高濃度のFGF2がヒトES細胞からCDX2陽性細胞への分化に重要であるという過去の報告があることから、同様の結果が得られるかについて試験した。最終濃度250ngmLのFGF2を用いた。試験例3の方法に準じて、ゼラチンコートディッシュ上でヒトES細胞を内胚葉まで分化誘導した後に、BIO5μM及びDAPT10μMに加えて、FGF2を0、50、及び250ngmLでそれぞれ添加し、9日目、あるいは20日目まで培養し、フローサイトメトリーによりCdx2陽性細胞の割合を評価した。フローサイトメトリーFACS解析は、BDCytofixCytopermTMKitを用い、製造元のマニュアルに従って行った。その結果を図10に示す。図10に示される通り、培養9日目においては250ngmLでFGF2を添加したものについてCDX2陽性細胞の割合が低下することを確認した。また、培養20日目においては、Fgf2の濃度依存的にCDX2陽性細胞の割合が低下している。この結果は、図9の結果に相応し、改めてFGF2が分化誘導後期9~20日目の期間において、腸への分化に対して抑制的に働くことを確認した。本実施例の結果によれば、FGF、Wnt、BMP、Hh、及びNotchシグナル伝達の操作によって、腸の機能的な成熟細胞型の分化が可能であることが証明された。これらの知見によれば、本発明が、発生生物学及び再生医療の分野において高い産業上の利用可能性を有することは明らかである。"