"式A:式中:R1およびR2は、独立して、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、HおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルはR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、独立して、ハロゲン、R、OR、SR、CN、CO2RおよびCONR2から選択され;Rは、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;L1およびL2は、独立して、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され;L2が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが1であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが2であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物1;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物2;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物3;2R-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物4;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]デカン-2-アミン化合物5;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ノナン-2-アミン化合物6;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]トリデカン-2-アミン化合物7;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ノナン-2-アミン化合物8;2R-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物9;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物10;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]デカン-2-アミン化合物11;および2S,12Z,15Z-N,N-ジメチル-1-オクチルオキシヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物12;2R,12Z,15Z-1-デシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物13;2R,12Z,15Z-1-ヘキシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物14;2R,12Z,15Z-1-ヘキサデシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物15;2R,12Z,15Z-N,N-ジメチル-1-ウンデシルオキシヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物16;N,N-ジメチル-2-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ウンデカン-1-アミン化合物17;N,N-ジメチル-3-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ドデカン-1-アミン化合物18;ならびに2S-N,N-ジメチル-1-{8-[1R,2R-2-{[1S,2S-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシトリデカン-2-アミン化合物19;から選択されるカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。脂質ナノ粒子の調製のための請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中の一成分としての請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。オリゴヌクレオチドがsiRNAまたはmiRNAである、請求項5に記載の使用。オリゴヌクレオチドがsiRNAである、請求項5に記載の使用。本発明は、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびPEG-脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、siRNAのインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、1つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。本発明の種々の態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にsiRNAおよびmiRNAを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子に有用な新規なカチオン性脂質の実用性に関するものである米国特許出願:米国特許出願公開第2006/0083780号明細書、同第2006/0240554号明細書、同第2008/0020058号明細書、同第2009/0263407号明細書および同第2009/0285881号明細書ならびにPCT特許出願:国際公開第2009/086558号パンフレット、同第2009/127060号パンフレット、同第2009/132131号パンフレット、同第2010/042877号パンフレット、同第2010/054384号パンフレット、同第2010/054401号パンフレット、同第2010/054405号パンフレットおよび同第2010/054406号パンフレット参照。また、SempleS.C.ら,RationaldesignofcationiclipidsforsiRNAdelivery,NatureBiotechnology2010年1月17日オンライン公開;doi:10.1038/nbt.l602も参照のこと。本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。本発明の第1の実施形態において、カチオン性脂質は、式A:式中:R1およびR2は、独立して、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、HおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルはR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、独立して、ハロゲン、R、OR、SR、CN、CO2RおよびCONR2から選択され;Rは、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;L1およびL2は、独立して、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいまたはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。第2の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。第3の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され;L2が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。第4の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが1であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。第5の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが2であり;L1が、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。具体的なカチオン性脂質は、2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物1;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物2;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物3;2R-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物4;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]デカン-2-アミン化合物5Comound;2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ノナン-2-アミン化合物6;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]トリデカン-2-アミン化合物7;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ノナン-2-アミン化合物8;2R-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物9;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ドデカン-2-アミン化合物10;2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]デカン-2-アミン化合物11;および2S,12Z,15Z-N,N-ジメチル-1-オクチルオキシヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物12;2R,12Z,15Z-1-デシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物13;2R,12Z,15Z-1-ヘキシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物14;2R,12Z,15Z-1-ヘキサデシルオキシ-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物15;2R,12Z,15Z-N,N-ジメチル-1-ウンデシルオキシヘニコサ-12,15-ジエン-2-アミン化合物16;N,N-ジメチル-2-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ウンデカン-1-アミン化合物17;N,N-ジメチル-3-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ドデカン-1-アミン化合物18;ならびに2S-N,N-ジメチル-1-{8-[1R,2R-2-{[1S,2S-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシトリデカン-2-アミン化合物19またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は脂質ナノ粒子の調製に有用である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、siRNAおよびmiRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、siRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸およびキラル面E.L.ElielおよびS.H.Wilen,StereochemistryofCarbonCompounds,JohnWileySons,NewYork,1994,第1119~1190頁に記載を有するものであってもよく、ラセミ化合物、ラセミ混合物として、および個々のジアステレオマーとして存在し、可能なすべての異性体およびその混合物例えば、光学異性体は、本発明に含まれる。また、本明細書に開示したカチオン性脂質は互変異性体として存在するものであってもよく、たとえ一方の互変異性体構造しか図示していない場合であっても、両方の互変異性形態が本発明の範囲に包含されることを意図する。本発明のカチオン性脂質における置換基および置換パターンは、当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法ならびに以下に示す方法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように選択され得ることは理解されよう。置換基それ自体が1つより多くの基で置換されている場合、安定な構造がもたらされる限り、このような多数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことは理解されよう。当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように、1個以上のSi原子が本発明のカチオン性脂質に組み込まれることがあり得ることは理解されよう。式Aの化合物において、原子は天然状態の同位体存在度を示すものであってもよく、1個以上の原子において、同じ原子番号を有するが原子量または質量数は自然界に主として見られる原子量または質量数と異なる特定の同位体を人為的に富化したものであってもよい。本発明は、式Aの化合物の適当なあらゆる同位体異型形態を含むことを意図する。例えば、水素Hの異なる同位体形態としては、プロチウム1Hおよびジューテリウム2Hが挙げられる。プロチウムは、自然界に主として見られる水素の同位体である。ジューテリウムの富化により、特定の治療上の利点インビボ半減期の増大もしくは必要投薬量の低減などがもたらされ得るか、または生物学的試料の特性評価のための標準として有用な化合物が得られ得る。式Aに含まれる同位体富化された化合物は、必要以上に実験を行うことなく、当業者によく知られた慣用的な手法によって、または本明細書のスキームおよび実施例に記載のものと同様のプロセスによって、適切な同位体富化試薬および/または中間体を用いて調製され得る。本明細書で用いる場合、アルキルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の飽和脂肪族炭化水素を意図する。本明細書で用いる場合、アルケニルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の不飽和脂肪族炭化水素を意味し、限定されないが、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素が挙げられる。環状アルキルまたはアルケニルの例としては、が挙げられる。本明細書で用いる場合、ヘテロシクリルまたは複素環は、O、NおよびSからなる群より選択される1~4個のヘテロ原子を含む4~10員の芳香族または非芳香族複素環を意味し、二環式基を包含する。したがって、ヘテロシクリルとしては、以下のもの:ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノオキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにそのN-オキシドが挙げられ、これらはすべて、Rから選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。本明細書で用いる場合、ポリアミンは、2つ以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられる。本明細書で用いる場合、ハロゲンはBr、Cl、FおよびIを意味する。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。式Aの一実施形態において、R1およびR2は各々メチルである。式Aの一実施形態において、R3はHおよびメチルから選択される。式Aの一実施形態において、R3はHである。式Aの一実施形態において、R’はRである。式Aの一実施形態において、Rは、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、1つ以上のハロゲンおよびOHで置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、Rは、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。式Aの一実施形態において、nは0、1または2である。式Aの一実施形態において、nは0または1である。式Aの一実施形態において、nは0である。式Aの一実施形態において、L1は、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C3~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C12~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1はC18アルケニルである。式Aの一実施形態において、L1は、である。式Aの一実施形態において、L1はC8アルキルである。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C24アルキルおよびC3~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2はC3~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2はC12~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2はC19アルケニルである。式Aの一実施形態において、L2はである。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2はC3~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC5~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC7~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC9アルキルである。式Aの一実施形態において、ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの一実施形態において、単環式ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの一実施形態において、ポリアミンは、プトレシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。一実施形態において、アルキルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。一実施形態において、アルケニルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。本発明は、遊離形態の式Aのカチオン性脂質、ならびにその薬学的に許容され得る塩および立体異性体を含む。本明細書において例示した具体的な単離されたカチオン性脂質のいくつかは、アミンであるカチオン性脂質のプロトン化された塩である。用語遊離形態は非塩形態のアミンであるカチオン性脂質をいう。包含される薬学的に許容され得る塩には、本明細書に記載した具体的なカチオン性脂質について例示した単離された塩だけでなく、遊離形態の式Aのカチオン性脂質の典型的なあらゆる薬学的に許容され得る塩も包含される。記載した具体的な塩であるカチオン性脂質の遊離形態は、当該技術分野で知られた手法を用いて単離され得る。例えば、遊離形態は、その塩を、希釈した適当な塩基水溶液希釈した水性NaOH、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウムなどで処理することにより再生させたものであり得る。遊離形態は、そのそれぞれの塩形態と特定の物性極性溶媒中への溶解性などが幾分異なり得るが、その酸と塩基の塩は、その他の点では、本発明の解釈上、そのそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性または酸性の部分を含む本発明のカチオン性脂質から、慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般的に、塩基性のカチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィー、または遊離塩基を化学量論量もしくは過剰の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸と適当な溶媒中もしくは種々の溶媒の組合せ中で反応させることのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性の本発明のカチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることにより形成される本発明のカチオン性脂質の慣用的な無毒性の塩を包含する。例えば、慣用的な無毒性の塩としては、無機酸例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などから得られるもの、ならびに有機酸例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ-安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸TFAなどから調製される塩が挙げられる。本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、好適な薬学的に許容され得る塩は、薬学的に許容され得る無毒性の塩基例えば、無機塩基および有機塩基から調製される塩をいう。無機塩基から得られる塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムの塩である。薬学的に許容され得る無毒性の有機塩基から得られる塩としては、第1級、第2級および第3級アミン、置換アミン天然に存在する置換アミンを含む、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチル-モルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。上記の薬学的に許容され得る塩および他の典型的な薬学的に許容され得る塩の調製は、Bergら,PharmaceuticalSalts,J.Pharm.Sci.,1977:66:1-19により充分に記載されている。また、生理学的条件下では本化合物内の脱プロトン化された酸性部分カルボキシル基などがアニオン性となることがあり得、そのため、この電子電荷によって分子内で、プロトン化またはアルキルされた塩基性部分第4級窒素原子などのカチオン電荷に対するバランスが崩れることがあり得るため、本発明のカチオン性脂質は、分子内internal塩または両性イオンとなる可能性があることに注意されたい。ここに示す実施例は、本発明のさらなる理解の補助を意図するものである。具体的な使用材料、種および条件は、さらなる実例を意図するものであって、本発明の妥当な範囲を限定するものではない。カチオン性脂質の合成に使用した試薬は、市販のもの、または当業者によって容易に調製されるもののいずれかである。新規な本カチオン性脂質の合成は、エピクロロヒドリンi一般スキーム1を出発物質とする線形プロセスである。エポキシドの開環、脂質アルコキシドを用いた閉環によりエポキシエーテル中間体iiが得られる。このエポキシドに対するグリニャール付加により第2級アルコール中間体iiiが得られる。アジドを用いた光延反転の後、還元することにより、第1級アミン中間体vが得られる。還元的アミノ化により第3級アミン誘導体viが得られる。一般スキーム1エピクロロヒドリンiを出発物質とする新規な本カチオン性脂質の択一的な合成を一般スキーム2に示す。エポキシドの開環、脂質グリニャールを用いた閉環によりエポキシド中間体viiが得られる。このエポキシドに対するアルコキシド付加により第2級アルコール中間体iiiが得られる。アジドを用いた光延反転の後、還元することにより第1級アミン中間体vが得られる。還元的アミノ化により第3級アミン誘導体viが得られる。一般スキーム2ホモログ化カチオン性脂質x一般スキーム3の合成は、デスマーチンペルヨージナンを用いた中間体iiiのケトンviiへの酸化から始める。このケトンのニトリルviiiへの変換はTOSMICを用いて行われる。このニトリルを水素化アルミニウムリチウムで還元すると第1級アミンixが得られる。還元的アミノ化によりカチオン性脂質xが得られる。一般スキーム3二重doublyホモログ化カチオン性脂質xiiiの合成はケトンviiから始める。ピーターソンオレフィン化により不飽和アミドxiが生成される。L-セレクトリドを用いた共役還元によりアミドxiiが得られる。このアミドを水素化アルミニウムリチウムで還元するとカチオン性脂質xiiiが得られる。一般スキーム42SN,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物1250mL容丸底rbフラスコに、磁気撹拌バー、テトラブチルアンモニウムブロミドTBAB,2.72g,8.4mmol、リノレイルアルコール225g,884mmol、および水酸化ナトリウム50.7g,1.2molを仕込み、次いで、氷浴中で冷却した。S-エピクロロヒドリン156g,1.69molを2時間にわたってゆっくり添加し、次いで周囲温度まで昇温させ、一晩撹拌した。259mLのヘキサンを添加し、15分間撹拌し、次いで混合物を濾過し、有機層を真空濃縮した。生成物を0から10までの酢酸エチル/ヘキサン勾配を用いて330gシルカカラムで精製し、2R-2-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}オキシランを得た。1HNMRCDCl3,300mHzδ0.90-0.86m,3H、1.29s,16H、1.55-1.64m,2H、2.00-2.07m,4H、2.58-2.61m,1H、2.74-2.80m,3H、3.12-3.15m,1H3.34-3.52m,3H、3.67-3.72dd,J=12Hz,1H5.30-5.35m,4H;HRMSm1計算値323.2872,実測値323.2951。エポキシド15g,46.5mmolをTHFに溶解させ、窒素流下で0°Cまで冷却した。オクチルグリニャール25.6mL2M溶液,51.2mmolを滴下し、次いで、マイクロ波で120°Cにて1時間加熱した。析出物を濾別し、溶媒を真空にてエバポレートした。粗製油状物を直接シリカゲルカラムに負荷し、0から10までの勾配ヘキサン-酢酸エチルで溶出し、2R-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-オールを得た。LC/MSm1=437.6。トリフェニルホスフィン14.4g,55mmolをTHFに溶解させ、窒素下で0°Cまで冷却した。ジ-tertブチルアゾジカルボキシレート13.7g,59.5mmolをゆっくり添加し、反応液を30分間撹拌した。次いで、アルコール20g,45.8mmolを滴下し、10分間撹拌し、次いで、ジフェニルホスホリルアジド15.lg,55mmolを添加し、一晩撹拌し、周囲温度まで昇温させた。反応液を真空内でエバポレートして乾固させ、直接シリカゲルカラムに負荷し、0から10までの酢酸エチル/ヘキサン勾配で溶出し、2S-2-アジドウンデシル9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルエーテルを得、これを、特性評価せずに、直接、次の反応に持ち越した。トリフェニルホスフィン4.54g,17.3mmolとアジド8g,17.3mmolをTHFに溶解させた。反応混合物を3μwチューブに分け、各々に120°Cで1時間、放射線照射した。各チューブ内ではかなり圧力が上昇するため、注意を払わなければならない。LCにより、ホスホイミン中間体への100変換が示された。各チューブに約3mLの水を添加し、反応液に120°Cで10分間放射線照射した。反応混合物を合わせ、濃縮して有機溶媒を除去した。ヘキサンを添加してホスフィンオキシドを析出させ、これを、焼結cinteredガラス漏斗に通して濾過した。次いで、溶媒を真空除去した。粗製生成物をHPLCを用いて精製した30分間泳動,60から100までの水/アセトニトリル勾配。合わせたHPLC画分を重炭酸ナトリウムで中和し、真空内でエバポレートした。純粋な生成物を水/ヘキサン間に分配した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、2S-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン2を得た。1HNMRCDCl3,300mHzδ0.88-0.87m,6H、1.25-1.29s,32H、1.54-1.54m,2H、2.03-2.05m,4H、2.23s,2H、2.75-2.76m,2H、2.96m,1H、3.13-3.18m,1H、3.38-3.45m,3H、5.31-5.38m,4H;LC/MSm1=436.7。第1級アミン3.5g,8mmolをTHFに溶解させ、ホルムアルデヒド3.26g,40.2mmolを添加した後、トリアセトキシボロヒドリド5.1g,24.1mmolを添加した。反応液を周囲温度で15分間撹拌した。LC/MSにより生成物への100変換が示された。塩基性になるまで1MNaOHを添加し、ヘキサンで抽出し、水で洗浄した。有機層を保持し、溶媒を真空除去した。60から100までの水/アセトニトリルで30分間の勾配を用いてC8HPLCで精製した。画分を合わせ、重炭酸ナトリウムを添加し、有機部分を真空内でエバポレートした。生成物を水/ヘキサン間に分配し、有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン1を得た。1HNMRCDCl3,300mHzδ0.88-0.87m,6H、1.285s,33H、1.55m,2H、1.80m,1H、2.00-2.05s,4H、2.29-2.312H、2.50m,1H、2.76-1.77m,2H、3.36-3.51m,6H、5.34-5.36m,4H;LC/MSm1=464.9。化合物3~11は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム1に従って調製した。2S-N,N-ジメチル-1-[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]ウンデカン-2-アミン化合物12丸底フラスコに、磁気撹拌バー、シアン化銅1.45g,16.2mmol、エピクロロヒドリン15g,162mmolを仕込み、窒素をパージした。THFを添加し、この溶液を-78°Cまで冷却し、リノレイルグリニャール68.8g,195mmolをゆっくり添加した。グリニャールの添加後、反応液を周囲温度まで昇温させた。反応液を飽和塩化アンモニウム溶液クエンチし、エーテルで抽出した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。中間体のクロロアルコールをフラッシュクロマトグラフィーによって精製したシリカ,0から35までの酢酸エチル/ヘキサン。このアルコールをTHFに溶解させ、固体のNaOHペレットとともに周囲温度で16時間撹拌し、次いでNaOHを濾別し、有機層を水で洗浄した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、2S-2-[10Z,13Z-ノナデカ-10,13-ジエン-1-イル]オキシランを得た。1HNMRCDCl3,300mHzδ0.87-0.90m,3H、1.27-1.52m,22H、2.01-2.19m,4H、2.40-2.46m,1H、2.71-2.76m,3H、2.89-2.91m,1H、5.30-5.36m,4H;LC/MSmHアセトニトリル=349.5。アルコール2.55g,19.6mmolをDCMに溶解させ、0°Cまで冷却した。この溶液に塩化スズ1.63mmol,1.63mLの1M溶液を添加した。エポキシド5g,16.3mmolを反応混合物に滴下し、反応液を0°Cで1時間熟成させた。反応液を真空内でエバポレートし、ヘキサンに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し0から20までの酢酸エチル/ヘキサン、2R,12Z,15Z-1-オクチルオキシヘニコサ-12,15-ジエン-2-オールを得た。LC/MSmH=437.6。このアルコールを、化合物1で記載のようにして最終化合物12へと持ち越した。1HNMRCDCl3,300mHzδ0.85-.091m,6H、1.272s,34H、1.46m,1H、1.57m,1H、1.65s,4H、2.01-2.083H、2.30m,6H、2.52m,1H、2.75-2.79m,2H、3.29-3.4m,2H、3.46-3.51dd,J=9.76Hz,1H、5.30-5.39m,4H;LC/MSmH=464.7。化合物13~16は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム2に従って調製した。N,N-ジメチル-2-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ウンデカン-1-アミン化合物17アルコールiii15g,34.3mmolのジクロロメタン50mL溶液に、デスマーチンペルヨージナン14.6g,34.3mmolを添加し、反応液を周囲温度で16時間撹拌した。固形物を濾過し、濾液を水/DCM間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製しシリカ,0から15までの酢酸エチル/ヘキサン、ケトンviiを得た。LC/MSMH=435.6。ケトンvii10g,23.0mmolのDME40mL溶液に、TOSMIC5.8g,29.9mmolを添加し、溶液を0°Cまで冷却した。この冷却溶液にカリウムtert-ブトキシド46mmol,46mLの1MtBuOH溶液を滴下した。30分後、反応液をヘキサンと水間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製しシリカ,0から10までの酢酸エチル/ヘキサン、ニトリルviiiを得た。LC/MSMH=446.6。ニトリルviii4.6g,10.4mmolのTHF25mL溶液に、水素化アルミニウムリチウム0.8g,20.7mmolを周囲温度で添加した。反応液を硫酸ナトリウム十水和物溶液でクエンチし、固形物を濾過した。濾液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、粗製のアミンixを得、これを、直接、次の反応に持ち越した。LC/MSMH=450.6。アミンix4.7g,10.3mmolとホルムアルデヒド2.5g,31.1mmolを含むTHF25mLの溶液をナトリウムトリアセトキシボロヒドリド6.6g,31.1mmolで周囲温度にて処理した。15分間熟成後、反応液を1M水酸化ナトリウムでクエンチし、水とヘキサン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。分取用逆相クロマトグラフィーによって精製しC8カラム,アセトニトリル/水勾配、化合物17を得た。LC/MSMH=479.6.1HNMRCDCl3,400mHzδ5.36m,4H、3.38m,3H、3.26m,1H、2.75t,J=6.4Hz,2H、2.22m,1H、2.19s,6H、2.04m,5H、1.71m,1H、1.54m,2H、1.28m,32H、0.83m,6H。N,N-ジメチル-3-{[9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエン-1-イルオキシ]メチル}ドデカン-1-アミン化合物18シリルアミド12.4g,78mmolのTHF50mL溶液を-78°Cまで冷却し、nBuLi62.4mmol,25mLの2.5M溶液で処理し、10分間熟成させた。この溶液に、ケトンvii12g,27.6mmolを少量に分けて乾燥THF中移した。反応液を15分間熟成させ、次いで周囲温度まで昇温させ、重炭酸ナトリウム溶液でクエンチし、水とヘキサン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空内でエバポレートし、アミドxiを得た。LC/MSMH=505.6。アミドxi7g,13.9mmolを、マイクロ波バイアル内でL-セレクトリド55.6mmol,55.6mLの1M溶液で処理した。反応液を密封し、マイクロ波反応セット内で70°Cにて16時間、放射線照射した。次いで、反応液をジクロロメタンで希釈し、沸騰発泡が停止するまで注意深く過ホウ酸ナトリウム固体を添加することによってクエンチした。固形物を濾過し、濾液を真空内でエバポレートし、xiiを得た。LC/MSMH=507.6。アミドxii7g,13.8mmolのTHF30mL溶液に、水素化アルミニウムリチウムl.lg,27.7mmolを添加した。反応液を硫酸ナトリウム十水和物溶液でクエンチし、固形物を濾過した。有機部分を真空内でエバポレートし、生成物を分取用逆相クロマトグラフィーによって精製しC8カラム,アセトニトリル/水勾配、化合物18を得た。LC/MSMH=493.6.1HNMRCDCl3,400mHzδ5.38m,4H、3.38m,2H、3.26m,2H、2.78t,J=6.4Hz、2H、2.25m,8H、2.04m,4H、1.56m,4H、1.29m,32H、0.89m,6H。2S-N,N-ジメチル-1-[8-{2-[2-ペンチルシクロプロピルメチル]シクロプロピル}オクチルオキシ]トリデカン-2-アミン化合物19ジエン24g,51.6mmolのジクロロメタンl00mL溶液を-15°Cまで冷却した。この溶液に、ジエチル亜鉛310mmol,310mLの1M溶液を添加した後、ジヨードメタン25mL,310mmolを添加し、反応液を16時間熟成させ、この間、ゆっくり周囲温度まで昇温させた。反応液を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、水とジクロロメタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製しシリカ,0から25までの酢酸エチル/ヘキサン、ビス-シクロプロパン中間体xivを得た。LC/MSMH=493.6。化合物xivを、上記の化合物1で概要を示したようにして最終化合物19へと持ち越した。LC/MSMH=520.8。化合物20は、NatureBiotechnology,2010,28,172-176、国際公開第2010/042877号パンフレット、同第2010/048536号パンフレット、同第2010/088537号パンフレット、および同第2009/127060号パンフレットに記載のDLinKC2DMAである。化合物21は、国際公開第2010/054401号パンフレット、および同第2010/144740号パンフレットに記載のMC3である。LNP組成物以下の本発明の脂質ナノ粒子組成物LNP:カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG56.6/38/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG60/38/2;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG67.3/29/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG49.3/47/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG50.3/44.3/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-C-DMA/DSPC40/48/2/10;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC40/48/2/10;およびカチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC58/30/2/10は、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達に有用である。LNPプロセスの説明:脂質ナノ粒子LipidNano-ParticlesLNPは、衝突噴流プロセスによって調製される。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたsiRNAと混合することにより形成される。siRNAに対する脂質の混合比は、脂質が45~55およびsiRNAが65~45を目標にする。脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質コレステロール、PEG例えば、PEG-C-DMA、PEG-DMG脂質およびDSPCを、アルコール例えば、エタノール中に5~15mg/mL目標9~12mg/mLの濃度で含むものにする。脂質の比率は、カチオン性脂質が25~98目標35~65のモルパーセント範囲を有し、ヘルパー脂質は0~75目標30~50のモルパーセント範囲を有し、PEG脂質は1~15目標1~6のモルパーセント範囲を有し、DSPCは0~15目標0~12のモルパーセント範囲を有するようにする。siRNA溶液は、1種類以上のsiRNA配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液3.5~5の範囲のpHを有する中に0.3~1.0mg/mLの目標0.3~0.9mg/mLの濃度範囲で含むものにする。この2つの溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にLNPが形成される。T字部内径teeIDは0.25~1.0mmの範囲であり、総流速は10~600mL/分にする。流速とチューブ内径の組合せは、LNPの粒径を30~200nmに制御する効果を有する。次いで、この溶液を緩衝溶液と高pHで、1:1~1:3vol:volだが1:2vol:volを目標にするの範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度にする。混合LNPを30分間~2時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行う。インキュベーション中の温度は15~40°C目標30~40°Cの範囲にする。インキュベーション後、この溶液を0.8umフィルターに通して濾過するアニオン交換分離工程を含む。このプロセスでは、1mmID~5mmIDの範囲のチューブ内径および10~2000mL/分の流速が使用される。LNPは濃縮され、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションされ、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液リン酸緩衝生理食塩水などと交換される。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式TFFが使用される。このプロセスでは、30~500KDの公称分子量カットオフ範囲の膜が使用される。膜形式は、中空繊維であってもフラットシートカセットであってもよい。適正な分子量カットオフを用いたTFFプロセスにより、LNPが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール;クエン酸バッファー;および最終バッファー廃物が含有される。TFFプロセスは、初期濃度からsiRNA濃度1~3mg/mLまでの多工程プロセスである。濃縮後、LNP溶液を最終バッファーに対して10~20容量でダイアフィルトレーションしてアルコールを除去し、バッファー交換を行う。次いで、この物質をさらに1~3倍に濃縮する。LNPプロセスの最終工程は、濃縮LNP溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封入である。解析手順:1siRNA濃度siRNA二本鎖の濃度は、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィーSAX-HPLCにより、2996PDA検出器を備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定される。LNPあるいは、RNAi送達媒体RDVとも称するを、0.5TritonX-100で処理して全siRNAを遊離させ、SAX分離により、DionexBioLCDNAPacPA2004×250mmカラムを用いて解析する254nmでUV検出。移動相は、A:25mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0と、B:250mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0を0分から15分までの線形勾配で構成し、流速を1ml/分とする。siRNA量は、siRNA標準曲線との比較によって求められる。2封入速度蛍光試薬SYBRGoldをRNA定量に使用し、RDVの封入速度をモニタリングする。TritonX-100とともに、またはなしでRDVを使用し、遊離siRNAおよび全siRNAの量を調べる。アッセイは、SpectraMaxM5eマイクロプレート分光測光器MolecularDevicesSunnyvale,CA製を用いて行う。試料を485nmで励起し、蛍光放射を530nmで測定した。siRNA量は、siRNA標準曲線との比較によって求められる。封入速度=1-遊離siRNA/全siRNA×1003粒径および多分散性1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1×PBSで最終容量3mlまで希釈する。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NYを用いて測定する。散乱強度は、He-Neレーザーを用いて25°Cにて90°の散乱角で測定する。4ゼータ電位の解析1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1mMのTrisバッファーpH7.4で最終容量2mlまで希釈する。試料の電気泳動移動度をZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NY電極および光源としてHe-Neレーザーを有するを用いて調べる。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定する。5脂質の解析個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCにより、コロナ荷電化粒子検出器CADESABiosciences,Inc,Chelmsford,MAを備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定する。RDV内の個々の脂質を、CADを備えたAgilentZorbaxSB-C1850×4.6mm,1.8μm粒径カラムを用いて60°Cで解析する。移動相は、A:0.1TFAH2O中とB:0.1TFAIPA中で構成する。勾配は、60の移動相Aと40の移動相Bで時間0から1.00分のとき40の移動相Aと60の移動相Bまで;40の移動相Aと60の移動相Bで1.00から5.00分まで;40の移動相Aと60の移動相Bで5.00分から10.00分のとき25の移動相Aと75の移動相Bまで;25の移動相Aと75の移動相Bで10.00分から15.00分のときに5の移動相Aと95の移動相Bまで;および5の移動相Aと95の移動相Bで15.00から20.00分のときに60の移動相Aと40の移動相Bまで変化させ、流速は1ml/分にする。個々の脂質濃度は、RDV内の全脂質成分での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求める。各脂質のモル百分率を、その分子量に基づいて計算する。上記のLNPプロセスを使用し、以下の比率の具体的なLNPを特定した。実施例1マウスでの有効性のインビボ評価化合物1~12を使用したすぐ上に示した公称組成のLNPを、インビボ有効性について評価した。siRNAは、ホタルPhotinuspyralisルシフェラーゼ遺伝子受託番号M15077のmRNA転写物を標的化するものである。ルシフェラーゼsiRNAの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。インビボルシフェラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞内に存在するトランスジェニックマウスを使用する。ROSA26-LoxP-Stop-LoxP-LucLSL-LucトランスジェニックマウスDanaFarberCancerInstituteから実施許諾を得たを、最初に組換えAd-CreウイルスVectorBiolabsを用いてLSL配列を除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子が発現されるように誘導する。該ウイルスの臓器向性の性質のため、尾静脈注射によって送達すると、発現は肝臓に限定される。肝臓内ルシフェラーゼ発現レベルを、ルシフェリン基質CaliperLifeSciencesの投与後にIVIS撮像装置Xenogenを用いて光出力を測定することにより定量する。RDVの投与前に投与前発光レベルを測定する。ルシフェリンPBS中15mg/mLを150μLの容量で腹腔内IP注射する。4分間のインキュベーション期間後、マウスをイソフルランで麻酔し、IVIS撮像装置内に置く。RDVsiRNAを含有PBSビヒクル中を0.2mLの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルを0.1~0.5mg/kgsiRNAの範囲とした。対照としてPBSビヒクル単独を投与した。投与の48時間後、上記の方法を用いてマウスの画像を撮影した。ルシフェリンの光出力の変化は、ルシフェラーゼのmRNAレベルと直接的に相関しており、ルシフェラーゼsiRNA活性の間接的は尺度を表す。インビボ有効性の結果を投与前発光レベルに対する発光阻害として示す。ルシフェラーゼsiRNARDVを全身投与すると、ルシフェラーゼ発現が用量依存的様式で減少した。RDVを内包している化合物1を投与したマウスでは、RDV含有オクチル-CLinDMAOCDカチオン性脂質の場合よりも大きな有効性が観察された図1。OCDは既知であり、国際公開第2010/021865号パンフレットに記載されている。実施例2ラットでの有効性および毒性のインビボ評価該化合物を上記の公称組成で用いたLNPを、インビボ有効性ならびにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増大について、Sprague-DawleyCrl:CDSD雌ラットCharlesRiverLabsにおいて評価した。siRNAは、ApoB遺伝子受託番号NM019287のmRNA転写物を標的化するものである。ApoBsiRNAの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。RDVsiRNAを含有PBSビヒクル中を1~1.5mLの容量で尾静脈注射した。注入速度はおよそ3ml/分にする。各投与群には5匹のラットを使用した。LNP投与後、ラットを、通常の飼料と水を存在させたケージ内に入れる。投与の6時間後、食糧をケージから除く。LNP投与の24時間後、動物の剖検を行う。ラットをイソフルラン下で5分間麻酔し、次いで、イソフルランの送達を継続しながらノーズコーン内に入れることにより、放血が完了するまで麻酔下に維持する。大静脈からの血液を、23ゲージのバタフライ型静脈穿刺セットを用いて収集し、血清化学解析のために血清分離器バキュテイナーにアリコートに分ける。切除した肝臓の尾状葉の円筒形切片punchを作製し、mRNA解析のためにRNALaterAmbion内に入れる。保存した肝臓組織をホモジナイズし、QiagenビーズミルおよびQiagenmiRNA-EasyRNA単離キットを製造業者の使用説明書に従って用いて全RNAを単離した。肝臓ApoBmRNAレベルを定量的RT-PCRによって測定した。メッセージを精製RNAから、ラットApoBの市販のプローブセットAppliedBiosystemsカタログ番号RN01499054_mlを用いて増幅した。PCR反応は、96ウェル高速ブロックを有するABI7500機器で行った。ApoBmRNAレベルをハウスキーピングPPIBNM011149mRNAに対して標準化する。PPIBmRNAレベルは、RT-PCRにより、市販のプローブセットAppliedBiosytemsカタログ番号Mm00478295_mlを用いて測定した。結果をApoBmRNA/PPIBmRNA比として示す。mRNAのデータはすべて、PBS投与対照に相対して示したものである。血清ALTおよびAST解析はSiemensAdvia1800ClinicalChemistryAnalyzerで、Siemensアラニンアミノトランスフェラーゼカタログ番号03039631およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼカタログ番号03039631試薬を用いて行った。RDVを内包している化合物1を投与したラットにおいて、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物20またはMC3化合物21,図2の場合よりも、同様の有効性が観察された。さらに、3mg/kgDLinKC2DMA化合物20で処置した4匹のラットのうち3匹は48時間生存できず、3mg/kgMC3化合物21で処置した4匹のラットのうち2匹は48時間生存できなかった。10mg/kg化合物1で処置した4匹のラットのうち1匹は投与後48時間目に生存していた。実施例3ラット肝臓内カチオン性脂質レベルの測定肝臓組織を20ml容バイアル内に量り入れ、9v/wの水中でGenoGrinder2000OPSDiagnostics,1600ストローク/分,5分間を用いてホモジナイズした。各組織ホモジネートの50μLアリコートを300μLの抽出/タンパク質析出溶媒500nMの内部標準を含有する50/50のアセトニトリル/メタノールと混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。次いで、200μL容量の各上清みを96ウェルプレートの別々のウェルに移し、10μLの試料をLC/MS-MSによって直接解析した。既知量の該化合物ompoundのメタノールストック溶液を未処理のラット肝臓ホモジネート9容量の水/肝臓重量にスパイクすることにより、標準を調製した。各標準/肝臓ホモジネートのアリコート50μLを300μLの抽出/タンパク質析出溶媒500nMの内部標準を含有する50/50のアセトニトリル/メタノールと混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。200μL容量の各上清みを96ウェルプレートの別々のウェルに移し、10μLの各標準をLC/MS-MSによって直接解析した。肝臓ホモジネートから調製および抽出した標準に対する絶対定量を、API4000トリプル四重極質量分析計AppliedBiosystemsに連結したAriaLX-2HPLCシステムThermoScientificを用いて行った。各操作では、総量10μLの試料をBDSHypersilC8HPLCカラムThermo,50×2mm,3μmに周囲温度でインジェクションした。移動相A:95H2O/5メタノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸移動相B:40メタノール/60n-プロパノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸流速は0.5mL/分とし、勾配溶出プロフィールは以下のとおり:80Aで0.25分間保持、100Bまで1.6分間にわたって線形漸増、100Bで2.5分間保持、次いで、80Aに戻して1.75分間保持とした。全操作時間は5.8分間であった。API4000ソースパラメータは、CAD:4、CUR:15、GS1:65、GS2:35、IS:4000、TEM:550、CXP:15、DP:60、EP:10とした。RDVを内包している化合物1を投与したラットでは、肝臓内レベルは、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物20またはMC3化合物21,図3の場合よりも低かった。"