"被験体における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する方法であって、被験体からサンプルを採取する工程と;サンプルから微小胞を単離する工程と;微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する工程とを含む方法。被験体における癌の予後を診断または決定する方法であって、請求項1の方法に従って微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する工程を含み、サンプル中の発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が被験体が癌を有し得ることを示す方法。被験体における癌の進行または抗癌治療の治療有効性をモニターする方法であって、a癌を有する被験体から第1のサンプルを第1のタイムポイントで採取する工程と、第1のサンプルから微小胞を単離する工程と、第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を測定する工程と;b癌を有する被験体から第2のサンプルを第2のタイムポイントで採取する工程であって、第2のタイムポイントが第1のタイムポイント後に起こる工程と、第2のサンプルから微小胞を単離する工程と、第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を測定する工程とを含み;被験体が抗癌治療を受ける前に第1のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第2のタイムポイントが起こる場合、第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量における変化が癌の進行を示すか、または第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量の減少または無変化が抗癌治療の治療有効性を示し;該サンプルが、血液、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄物、精液、腺分泌物、滲出液、嚢胞の内容物および糞便からなる群から選択される体液である方法。前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、EGFRvIII、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、MET、cKit、PDGFR、Wnt、β-カテニン、K-ras、H-ras、N-ras、Raf、N-myc、c-myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、FGFR3、EphB2、ROR1、EphA2、EphA4、ならびにVEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2、TEM-1およびCD276からなる群から選択された癌関連細胞の受容体、ならびに表1~4中でリストされたタンパク質からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法前記発癌タンパク質のリン酸化状態を測定する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、前記第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量の増加が、癌の進行または継続的増殖を示し;前記第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量または微小胞の組成物に比較して、前記第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量の減少または第2のサンプルから得られた微小胞の組成物における変化が、癌の退縮を示し;前記第1のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量に比較して、前記第2のサンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の量の無変化が、癌が進行していないことを示す、請求項3に記載の方法。少なくとも2つの前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が微小胞中で検出される、請求項1に記載の方法。前記微小胞が、超遠心、免疫沈殿、親和性精製または精密濾過によって単離される、請求項1に記載の方法。前記微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が、免疫ブロット、免疫沈殿、ELISA、RIA、フローサイトメトリー、電子顕微鏡または質量分析によって検出または測定される、請求項1に記載の方法。前記微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、アネキシンVでコートしたウェルを用いるELISAによって検出または測定される、請求項1に記載の方法。前記抗癌治療が、外科手術、放射線医学、化学療法、標的化癌治療またはその組み合わせである、請求項3に記載の方法。前記癌が、乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項2、3または11のいずれか一項に記載の方法。被験体からサンプル中の癌を検出するためのキットであって、発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質に対する少なくとも1つの抗体、および該少なくとも1つの抗体を使用してサンプル中の微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出するための説明書を含むキット。前記癌が、乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項13に記載のキット。前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、EGFRvIII、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、MET、cKit、PDGFR、Wnt、β-カテニン、K-ras、H-ras、N-ras、Raf、N-myc、c-myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、FGFR3、EphB2、ROR1、EphA2、EphA4、ならびにVEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2、TEM-1およびCD276からなる群から選択される癌関連細胞の受容体からなる群から選択される、請求項13に記載のキット。前記サンプルが、血液、リンパ液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、洗浄物、精液、腺分泌物、滲出液および糞便からなる群から選択される体液である、請求項13のキット。リン酸化部位特異的抗体をさらに含む請求項13に記載のキット。1つより多い発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が前記微小胞において検出され、該微小胞において検出された該発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の組み合わせが癌型の診断に役立つ、請求項2に記載の方法。前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態が決定される、請求項18に記載の方法。被験体において癌の進行または抗癌治療の治療有効性をモニタリングする方法であって、a癌を有する被験体から第1の血液サンプルを第1のタイムポイントで採取する工程と、微小胞を第1の血液サンプルから単離する工程と、第1の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を測定する工程と;b癌を有する被験体から第2の血液サンプルを第2のタイムポイントで採取する工程であって、第2のタイムポイントが第1のタイムポイント後に起こる工程と、微小胞を第2の血液サンプルから単離する工程と、第2の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を測定する工程とを含み;被験体が抗癌治療を受ける前に第1のタイムポイントが起こり、被験体が抗癌治療を受けた後に第2のタイムポイントが起こる場合、第1の血液サンプルから得られた微小胞に比較して、第2の血液サンプルから得られた微小胞における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態における変化、またはリン酸化もしくは非リン酸化の発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の量における変化が、癌の進行もしくは退縮を示すかまたは抗癌治療の治療有効性もしくは非有効性を示し、;MVにおいて検出されるリン酸化状態またはリン酸化されたタンパク質の量によって決定されるように、癌の退縮または抗癌治療の治療有効性が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の非活性形態の増加によって示され、癌の進行または抗癌治療の非有効性が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の活性化形態の増加によって示される方法。前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が受容体チロシンキナーゼである、請求項20に記載の方法。腫瘍における発癌受容体チロシンキナーゼの活性化をモニタリングする方法であって、腫瘍を有する被験体から血液サンプルを採取する工程と、血液サンプルから微小胞を単離する工程と、微小胞における発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態を測定する工程とを含み、発癌受容体チロシンキナーゼのリン酸化状態が受容体チロシンキナーゼの活性化または非活性化を示す方法。発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および/またはMV関連タンパク質を含む、単離された微小胞。被験体における腫瘍において発現される発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を決定する方法であって、被験体から体液のサンプルを採取する工程と;サンプルから微小胞を単離する工程と;微小胞において存在する発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を決定する工程とを含み、微小胞において存在する発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が腫瘍において発現されることを示す方法。被験体における癌を検出する方法であって、被験体から体液のサンプルを採取する工程と;サンプルから微小胞を単離する工程と;微小胞をアッセイして微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を決定する工程とを含み、微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在が被験体が癌を有することを示す方法。前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が、前記被験体から得られた生検標本において検出されない、請求項25に記載の方法。前記体液が血液である、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。本発明によれば、被験体における発癌タンパク質の存在を検出する方法であり、被験体からサンプルを採取する工程と、サンプルから微小胞MVを単離する工程と、および微小胞における発癌タンパク質の存在を検出する工程とを含む方法が提供される。微小胞における発癌タンパク質の検出によって被験体のサンプル中の癌を診断する方法も本明細書において提供される。一実施形態において、癌はサンプル、例えば体液血液、尿、脳脊髄液、リンパ液、腹水、唾液、洗浄物、精液および腺分泌物に加えて、糞便、滲出液、嚢胞の内容物および他のソース等中の微小胞の分析によって検出される。別の実施形態において、微小胞における発癌タンパク質の検出による癌の予後のための方法が提供される。さらに他の実施形態において、癌の進行および/または治療への応答をモニタリングする方法が提供される。本明細書において癌とは、増殖の非調和による過剰増加および細胞の分化能力の喪失に起因する細胞の増加を示す癌細胞の塊を指す。癌という用語は、乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、白血病、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚メラノーマもしくは眼内メラノーマ、子宮肉腫、卵巣癌、直腸癌もしくは結腸直腸癌、肛門癌、結腸癌一般的には同じ実体が結腸直腸癌および大腸癌として判断される、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、外陰部癌、扁平上皮癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織腫瘍、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性白血病もしくは急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系の腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、多形膠芽腫、原発性中枢神経系のリンパ腫、骨髄腫瘍、脳幹神経神経膠腫、下垂体腺腫、ぶどう膜メラノーマ眼内メラノーマとしても公知、睾丸癌、口腔癌、咽頭癌またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、癌は脳腫瘍例えば神経膠腫である。別の実施形態において、癌は特定の癌タンパク質例えばHER-2、HER-3などを発現する。癌という用語は、小児腫瘍白血病、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋芽細胞腫、肉腫および他の悪性腫瘍を含むを含む小児癌も含む。本発明の方法を使用して検出できる発癌タンパク質の非限定例は以下のとおりである。i癌細胞に由来する膜関連癌タンパク質、例えば神経膠腫におけるEGFRvIII、扁平上皮癌、神経膠腫、肺癌または膀胱癌におけるEGFR、乳癌突然変異体例えばイレッサ感受性型、突然変異体型、または非発現型の腫瘍抑制タンパク質BRCA1および/またはBRCA2、肺癌におけるEGFR、乳癌および卵巣癌におけるHER-2、様々な転移性および侵襲性の癌におけるMet、胃腸間質性腫瘍におけるKit、神経膠腫におけるPDGFR、様々な腫瘍におけるWnt、様々なホスファターゼ;ii形質転換受容体の組み合わせクラスタ、例えば乳癌におけるEGFR/HER-2、様々な腫瘍におけるHER-2/HER-3;iii形質転換特性を備えた膜関連細胞質分子、例えば結腸直腸癌、膵臓癌および肺癌におけるK-ras、神経膠腫および前立腺癌におけるPTEN欠損または不活性化;iv脂質ラフトおよび微小胞において存在するおよび活性のあることができるシグナル伝達複合体、例えばPI3K/Akt、Raf/MEK/MAPK;およびv腫瘍血管新生および抗血管新生に関係する腫瘍に関する内皮受容体、例えばVEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2およびTEM例えばTEM-1、CD276。これらのタンパク質は単独でまたは組み合わせで検出することができる。発癌タンパク質の他の非限定例は、EGFRvIII、EGFR、HER-2、HER-3、HER-4、MET、cKit、PDGFR、Wnt、β-カテニン、K-ras、H-ras、N-ras、Raf、N-myc、c-myc、IGFR、IGFR、PI3K、およびAkt;腫瘍抑制因子タンパク質BRCA1、BRCA2およびPTEN等;癌に関するホスト受容体および微小胞関連分子例えば、VEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2、TEM-1およびCD276等の血管新生に関与するものを含む。発癌タンパク質、腫瘍抑制因子タンパク質、ホスト細胞に関する受容体および微小胞関連分子はすべて、本発明の方法、組成物およびキットにおいて単独でまたは組み合わせで使用できることが意図される。癌について機構的、診断的、予後上または治療法上重要であると判断される任意の発癌タンパク質および発癌タンパク質の任意の組み合わせは、本発明の方法、組成物およびキットにおいて使用できることがさらに意図される。発癌タンパク質が突然変異遺伝子の産物であり、正常細胞の癌性腫瘍細胞への形質転換または悪性度低い癌の悪性度の高い癌への形質転換を引き起こすかまたはそれらに寄与するタンパク質であることは当該技術分野において周知である総説に関しては、VogelsteinandKinzler,Nat.Medicine,108:789-799,2004;Croce,C.M.,N.Engl.J.Med.3585:502-511,2008を参照されたい。腫瘍形成の原因である3つの主なタイプの遺伝子があり、それらは癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および安定性遺伝子である。癌遺伝子は一般的に、遺伝子によりコードされたタンパク質発癌タンパク質が、構成的に活性化、過剰発現、誤発現例えば間違った時間または場所で、または野生型タンパク質が活性化されない条件下で活性化されるように突然変異する。これとは対照的に、腫瘍抑制遺伝子は一般的にそれらの遺伝子活性を減少させるように変異し、それは制御されない細胞増加および腫瘍形成をもたらす。安定性遺伝子も突然変異により一般的に不活性化される。これらの遺伝子は野生型形態において遺伝的突然変異を最小限にするように働くので安定性遺伝子と称される。それらは例えばDNA修復、体細胞組換えおよび染色体分離に関与する。これらの遺伝子の不活性化は全体的な突然変異率の増加を引き起こし、それは癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子において起こる腫瘍形成性突然変異の機会を増加させる。発癌タンパク質に加えて、腫瘍抑制因子および安定性遺伝子における変化も癌と関連し、癌を暗示し得ることはそれゆえ明らかである。腫瘍抑制因子が突然変異を保有する細胞でのアポトーシスの誘導に役立つことも公知である。腫瘍遺伝子突然変異が多くの場合経路またはネットワークにおいて機能することも十分に立証される。例えば、発癌タンパク質は下流のエフェクタータンパク質を調節するように作用することができ、それは今度は他のタンパク質を調節し、癌性形質転換を最終的にもたらすシグナル伝達事象のカスケードを引き起こす。したがって、発癌タンパク質自体における変化に加えて、かかる下流のエフェクタータンパク質またはメディエータータンパク質の変化も癌と関連し、癌を暗示し得ることは理解すべきである。それゆえ、細胞形質転換を引き起こす発癌タンパク質に加えて、他のタンパク質における変化も腫瘍形成と関連し、腫瘍由来微小胞において検出できることは理解すべきである。他のかかるタンパク質は本明細書において腫瘍に関するタンパク質と称される。腫瘍に関するタンパク質の非限定例は以下のものを含む。腫瘍抑制因子タンパク質;安定性タンパク質;ならびに腫瘍に関する細胞受容体、細胞シグナル伝達のメディエーター、転写因子、核内受容体、癌および腫瘍形成と関連するバイオマーカー、ならびに腫瘍の血管新生、遊走または侵入と関連するタンパク質等の発癌タンパク質の下流タンパク質すなわち下流のエフェクタータンパク質。例えば、腫瘍に関するタンパク質という用語は、VEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2およびTEM例えばTEM-1、CD276等の、腫瘍の血管新生および抗血管新生に関する腫瘍に関する内皮受容体を含む。腫瘍形成と関連する腫瘍に関するタンパク質の発現または活性における変化は腫瘍由来微小胞において決定することができる例えば、腫瘍抑制因子タンパク質のダウンレギュレーションが腫瘍由来微小胞において観察できるか、または腫瘍に関する内皮受容体VEGR-2またはVEGFR-1の発現増加または活性化が観察できる。発癌タンパク質に加えて、癌について機構的、診断的に、予後上または治療法上重要であると判断される任意の腫瘍に関するタンパク質は、本発明の方法および組成物およびキットにおいて使用できることが意図される。一実施形態において、MV関連タンパク質という用語は、上で定義されるように、発癌タンパク質および腫瘍に関するタンパク質の両方を含み、それは本明細書において提供された方法に従って、腫瘍に由来する微小胞において検出され、腫瘍の検出、診断、予後、モニタリングなどに有用である。本明細書において記載された本発明は、変異タンパク質を産生する細胞から放出される膜由来微小胞の積載物として存在する活性化受容体の細胞間移行を介して、神経膠腫細胞の間でEGFRvIII癌タンパク質を排出および共有することができるという新規で意外な観察に少なくとも部分的に基づく。実際、EGFRvIIIは脂質ラフトに関する微小胞の形成を刺激し、この微小胞にEGFRvIIIは取り込まれるようになる。EGFRvIII癌タンパク質を含有する微小胞は、癌を有するマウスの馴化培地または血液に放出され、この受容体を欠損する腫瘍細胞の原形質膜と融合することができる。EGFRvIIIのかかる移行は、下流のシグナル経路の活性化MAPKおよびAkt、進行に関する遺伝子発現の変化VEGF、BclxL、p27、および細胞形質転換の悪化の兆候特に形態変化および軟寒天コロニー形成効率の増加を引き起こす。これらの観察は、癌細胞の異なるサブセットの間での形質転換タンパク質の水平伝播における膜微小胞の役割を指摘し、膜関連癌タンパク質の形質転換影響力が対応する突然変異遺伝子を保有する細胞を越えて広がり得ることを示唆する。様々なタイプの活性化細胞は、膜微小胞微粒子、エクトソームまたはアルゴソームとしても公知を細胞周囲中へ産生および脱落させることが公知であり;かかる小胞がリソソーム経路から生じる事例ではそれらは大抵エキソソームと称される。これらの構造の生物学的役割はよく理解されていないが、分泌プロセス、免疫修飾、凝集および細胞間コミュニケーションを含み得るJanowska-Wieczoreketal.,2005,Int.JCancer,20:752-760。微小胞の生成の機構、サイズおよび組成物は変動し得るが、多くの場合特にエクトソーム、機能的膜貫通タンパク質を含む膜脂質ラフトと関連する材料を含有する。例えば、凝固促進組織因子TFはこの様式で炎症性細胞から放出されることができ、重要なことには、その生物学的効果を発揮する血小板、内皮および他の細胞の膜の中へ続いて取り込まれるようになる。本明細書において使用される時、微小胞という用語は、微小胞、微粒子、エクトソーム、アルゴソーム、エキソソーム、腫瘍小胞、および細胞から放出された他のすべての小胞性構造体を含む。p53腫瘍抑制遺伝子を欠損する癌細胞は、いくつかの実例において血液および細胞周囲環境に変化した量のTF含有微小胞Yuetal.,2005,Blood,105:1734-1741、または分泌性微小胞Yuetal.,2006,CancerRes,66:4795-47801を放出することによって、このプロセスを模倣することができる。発癌受容体は多くの場合原形質膜の領域内に存在し、そこから微小胞は癌細胞において生じる例えば脂質ラフト。発癌受容体それ自体が微小胞積載物中に含まれようになり得ることが本明細書において開示される。このことは例えば悪性脳腫瘍神経膠腫において特に興味深く、そこでは膜関連EGFRの活性化が主要な形質転換事象を示し、多形膠芽腫GBMの症例の約30でEGFRvIII発癌突然変異体の発現が容易に検出可能である。この現象をさらに探究するために、培養された活性化EGFR欠損U373神経膠腫細胞、およびEGFRvIIIを発現するように操作したそれらの対応細胞U373vIII細胞による微小胞の産生を検討した。興味深いことには、後者の細胞株におけるEGFRvIII癌遺伝子の存在は細胞表面上に複数の小胞の突出の形成、および培養培地の微小胞画分からのタンパク質の回収の増加が伴う効果をもたらした図1A、Bを参照されたい。この材料は、比例する量のフロチリン-1膜脂質ラフトと関連し、多くの場合様々なソースからのラフトに関する微小胞において見出されるタンパク質を含有していた。まとめて、それは、膜脂質ラフトに由来する微小胞の産生の増加とU373vIII細胞において観察されるEGFRvIIIに関する形質転換が結び付けられることを実証する。特定の実施形態において、微小胞において濃縮されるタンパク質EGFRvIII、HER-2およびMET等は、当該技術分野において公知の様々な技法により検出することができる。例えば、微小胞の溶解物は抗体抗EGFRvIIIまたは抗EGFRを使用する免疫ブロットにより分析できる。遠心分離による微小胞の濃縮は必要なことではあるが、全血漿の分析にわたって多くの定量的および定性的な利点も提供する。これは、微小胞単離が、特定の分子例えばEGFRvIIIの検出の感度を改善微小胞におけるそれらの濃縮に起因して、特異性を増加微小胞は原形質膜分子のランダムな採取でないので、タンパク質分解、脱リン酸化または破壊から積載物を保護微小胞膜に起因して、および分析の範囲を拡大微小胞積載物におけるタンパク質のユニークで診断的に有益な組み合わせの存在に起因してできるからである。これに関しては、微小胞分析の感度は超遠心から精密濾過へ切り替えることによって増加させることができ、精密濾過は微小胞の回収を単純化し改善できる。微小胞タンパク質を検出する他の技法は、例えばアネキシンVMVが多量のホスファチジルセリンを発現するので、またはMVの表面上で発現される発癌タンパク質を結合する抗体抗EGFRvIIIの抗体等によりコートした磁性ビーズからの微小胞に関する材料の免疫沈殿である。さらに、2つの抗体例えば2×抗EGFRvIIIまたは抗EGFRvIII抗EGFRに基づくELISAアッセイ、または2つの抗体例えば2×抗EGFRvIIIまたは抗EGFRvIII抗EGFRに基づく放射性免疫アッセイRIAも使用することができる。加えて、抗EGFRvIII抗体に基づく検出コンポーネントと併用して、アネキシンV例えば市販のTFアッセイでのようにまたはEGFRvIII/EGFR抗体によりコートした表面に対する微小胞の結合に基づくELISAを使用することができる。使用することができる他の技法はフローサイトメトリー微小胞が、例えばアネキシンVもしくは微小胞の表面上に存在する分子タンパク質、炭水化物および他のものに特異的な抗体または非抗体親和性試薬受容体、アプタマー、レクチン、核酸配列などによりコートしたビーズによって捕捉され、例えば抗EGFRvIIIの抗体で染色される、および質量分析EGFRが微小胞調製物のプロテオームにおいて検出されるを含む。親和性精製カラムおよびマルチプレックスプラットフォームを使用して微小胞を単離するために、すべてのかかる試薬および捕捉方法を使用することもできる。微小胞の調製およびタンパク質の検出のために当該技術分野において公知の標準的技法を本明細書において記載された方法において使用できることが意図される。本発明は、EGFRvIIIタンパク質の大量発現がU373vIII細胞自体だけでなくそれらに由来する微小胞の溶解物において検出されるという観察に少なくとも部分的に基づき、完全な形の癌タンパク質がこの様式で循環の中へ放出されることを実証する。親U373細胞は検出可能な量のフロチリン-1含有する微小胞を放出したが、それらは野生型EGFRwtEGFRの微量のみを含有し、EGFRvIIIはない。これらの結果は、EGFR陰性内皮細胞HUVECおよびwtEGFRのみを発現するA431細胞に加えて、それぞれの微小胞調製物に対して確認された図1C。U373細胞はインビボで低悪性度の表現型を示すが、それらのU373vIII対応細胞は、不可逆性低分子pan-Erb阻害剤CI-1033の毎日の用量による阻害を受けやすい様式で、免疫不全SCIDマウスにおいて皮下腫瘍を容易に形成する図1D。U373vIII腫瘍はEGFRvIIIについて強く染色されたが、wtEGFRについては染色されず、興味深いことには、全身循環の中へEGFRvIII含有微小胞が排出された図1E、F。したがって、突然変異体EGFRvIII遺伝子の発現は、完全な形のEGFRvIII癌タンパク質を含有する微小胞の細胞外放出と結び付いた神経膠腫細胞の侵攻性の増加を引き起こす。ヒト神経膠腫における不均一なEGFRvIII発現は、異なる腫瘍細胞サブセットが共通の細胞間隙の中へEGFRvIII含有微小胞を脱落させ得ることを示唆する。微小胞がホスファチジルセリン依存性機構を介して細胞膜と容易に融合することができるので、この様式でより侵攻性の細胞から低悪性度の神経膠腫細胞へ発癌EGFRvIIIを移すことができることは本明細書において実証される。そこで、EGFRvIII-陰性U373細胞を、EGFRvIIIを保有するそれらのU373vIII対応細胞、または緑色蛍光タンパク質GFPタグ付加EGFRvIII癌遺伝子EGFRvIII-GFPを発現するように操作したU373vIII-GFP細胞のいずれかから得られた微小胞の調製物と共にインキュベーションした。興味深いことには、EGFRvIII抗原およびGFP蛍光それぞれのデノボの表面発現によって実証されるように、これは、U373細胞による微小胞含有物の広汎な取り込みをもたらした図2A~D。表向きは完全な形のEGFRvIII受容体の明らかな細胞間微小胞媒介性の移行は、アクセプターU373細胞についてこの事象のシグナル伝達効果もしあればに関する疑問を提起する。この問題に取り組むために、U373細胞を、EGFRvIII含有微小胞への曝露の24時間後に、MAPKおよびAktのカスケード両者ともこの癌遺伝子の形質転換効果を下流に媒介することが公知であるの活性化について検査した。実際、U373原形質膜の中へEGFRvIIIの取り込みはErk1/2リン酸化の一貫した増加をもたらした。この事象はU373由来微小胞として活性のあるEGFRvIIIの移行に依存し、EGFRvIIIを含有しないものは効果がなかった。さらに、pan-ErbB阻害剤CI-1033と共にU373vIII由来微小胞を前インキュベーションすることによって、この受容体の不可逆性遮断剤はErk1/2リン酸化を著しく減少させた図3A。Erk1/2のリン酸化も、アネキシンV微小胞の露出したホスファチジルセリン残基を遮断し、それによってU373細胞による微小胞の取り込みを遮断すると共にこれらの微小胞を前インキュベーションすることによって停止された。これらの結果は、アクセプター細胞におけるMAPK経路の活性化を引き起こすためには、U373細胞の表面とのEGFRvIII含有微小胞の間の単なる接触だけでなく、むしろそれらの実際のホスファチジルセリン依存性の組み込みおよびEGFRvIII移行が必要とされることを実証する図3B。U373vIII由来微小胞の取り込みは、アネキシンVによって阻害できる様式で、U373細胞におけるAktのリン酸化も誘導し図3C、他の複数の事象特にPDK1およびRafのリン酸化を引き起こした。EGFRvIII依存性経路の形質転換効果は、腫瘍増殖、生存および血管新生の原因である複数の遺伝子の脱調節によって最終的に媒介される。後者に関しては、U373vIII由来微小胞に曝露されたU373細胞は、血管内皮成長因子VEGF脳腫瘍血管新生の強力なメディエーターおよび公知のEGFR標的の産生において著しい2~3倍の増加を示すことが指摘された。U373由来微小胞EGFRvIIIを欠く、またはU373vIIIからだがCI-1033によりプレインキュベーションしたものは、VEGFのこの放出を誘導することができなかったので、EGFRvIII活性はこの効果について不可欠であった図4A。これらの設定において、EGFRvIII含有微小胞はVEGFプロモーター活性も強く刺激し、この効果はこの微小胞のアネキシンVによる前処理によって停止された図4B。まとめて、これらの観察は、U373vIII微小胞の取り込みが、MAPKおよびAkt経路の活性化を介して、U373細胞によるVEGF遺伝子発現およびタンパク質産生のEGFRvIII依存性増加を引き起こすことを実証する。多くの場合VEGFアップレギュレーションは発癌経路の活性化を予告するが、EGFRvIIIの下流の細胞形質転換は細胞増殖および生存に直接関与する遺伝子の発現の変化によって媒介される。これに関しては、EGFRvIII含有微小胞により処理したU373細胞は、抗アポトーシス性タンパク質BclxLの発現の増加およびp27/Kip1サイクリン依存性キナーゼ阻害因子のレベルの減少両者とも公知のEGFR標的を示した図4C、D。この場合もやはり、これらの効果は、アクセプターU373細胞による微小胞取り込みをアネキシンVを媒介して遮断することによって阻害された。他のEGFRvIII標的遺伝子例えばp21/Cipの発現における類似のEGFRvIII依存性変化も観察された。この材料に曝露されたU373細胞のより紡錘型の形態によって実証されるように、EGFRvIII含有微小胞の取り込みによって誘発される前述の分子反応のレパートリーの機能的帰結は、より高度の細胞形質転換に引き起こすことができる図2B。U373細胞をEGFRvIII含有微小胞によりプレインキュベーションし、半固形培地における増殖について試験した典型的な形質転換アッセイ。顕著なことには、この様式での癌タンパク質の取り込みは、U373細胞による足場非依存性の軟寒天コロニー形成の2倍の増加を引き起こしたが、EGFRvIII含有を欠く等量の微小胞への曝露は増加させなかった図4D、E。ヒトGBMにおいて、腫瘍全体の増殖は増加するが、腫瘍細胞の少数の亜集団のみがEGFRvIII発現を引き起こす原発性遺伝子突然変異を保有することが十分認識される。これに関しては、EGFRvIII発現が細胞微小胞の形成を誘発し、この膜貫通タンパク質が微小胞に取り込まれるようになり、細胞周囲微小環境図6および7および血液図1Fに脱落されることが本明細書において開示される。本明細書において開示される実験は、脳腫瘍を占める細胞の間での形質転換活性の急速な細胞間移行のためのベヒクルとしてかかる活性のある癌遺伝子を含有する微小胞オンコソームが働き得ることを実証する。これは、それぞれの突然変異を保持する細胞の濃縮なし濃縮前でさえ、増加した増殖能、生存能および血管新生能の水平伝播を引き起こすことができた。この従来は好ましいとされない細胞間相互作用の形態は、今までに提唱された、アポトーシスを起こした癌細胞からの非形質転換性ファゴサイトーシス性の対応細胞への発癌配列含有DNA断片の移行とは根本的に異なる。微小胞交換は腫瘍刺激可溶性リガンドの分泌によって誘導されるパラクリン効果とも異なるが、膜関連およびその結果として不溶性の活性のある受容体の細胞間共有により後者の効果を増幅/修飾することができた。ヒトGBMにおいて、腫瘍細胞の少数の亜集団のみがEGFRvIII発現を引き起こす原発性遺伝子突然変異を保有することが確認されており、GBMに罹患する患者のヒト血漿から採取された微小胞において野生型EGFRおよびEGFRvIIIの両方のバンドは予想されるサイズで検出され、標準的SDS-PAGE手順を使用して分離された図5。類似の微小胞移行は、様々なヒト腫瘍において作動可能な他の形質転換性の、突然変異の、アップレギュレートされた、またはそうでなければ活性化された膜関連発癌チロシンキナーゼ例えばHER-2、wtEGFR、cKitまたはMETおよびタンパク質にも関与できることが包含される。ホスト細胞例えば内皮も癌遺伝子含有微小胞の標的であり得る。一態様において、ホスト細胞の腫瘍促進機能例えば血管新生は、微小胞移行によって悪化させることができた。反対に、腫瘍関連ホスト細胞は、多くの場合非常に変化するか、または顕在的な細胞遺伝学的変化でさえも含有しAkinoetalAm.J.Pathol.2009、それらに由来する微小胞例えば内皮細胞の腫瘍内皮マーカーTEMを含有するは、診断、予後および予測の値を保持することができた。細胞間の微小胞の交換を遮断できる薬剤例えばアネキシンV誘導体が、例えば、細胞と微小胞の融合の阻害によって、癌の広がりおよび増殖を阻害する治療剤として有用であり得ることも本明細書において包含される。一実施形態において、癌を治療する方法は、微小胞の交換を遮断する薬剤例えばアネキシンVおよび/またはその誘導体を、それを必要とする被験体に対して投与することを含んで提供される。微小胞、微粒子、エクトソームまたはエキソソームの移行の遮断のために使用できる任意の薬剤も、本明細書において記載される本発明の方法において使用できることが意図される。かかる薬剤の他の非限定例は、P-セレクチンまたはそのリガンドPSGLを遮断する薬剤を含む。他の態様において、本発明は、微小胞における分析の実行により複数の発癌タンパク質および/またはそれらの内部の複数のリン酸化部位の検出を可能にすることによって癌を診断する方法を提供する。例えば、微小胞のタンパク質組成物の分析によって、微小胞が、単独でまたは組み合わせで、EGFRvIII、HER-2、wtEGFR、cKitまたはMETを保有するかどうかを決定することによって癌を特徴づけることができる。体液中に見出される発癌タンパク質含有微小胞の数も、腫瘍の侵攻性すなわち播種または転移の傾向を決定する方法として使用することができる。本発明の方法はしたがって診断および/または予後を支援することができる。一実施形態において、乳癌の診断および/または予後はEGFRおよび/またはHER-2の存在の検出によって決定することができる。別の実施形態において、腫瘍の診断および/または予後はHER-2および/またはHER-3の存在の検出によって決定される。別の実施形態において、結腸直腸癌の診断および/または予後は、腫瘍抑制因子PTENおよび/またはp53等の腫瘍に関するタンパク質の非存在、ならびにK-rasおよび/またはc-Met侵攻性腫瘍を示す等の発癌タンパク質の存在の検出によって決定される。別の実施形態において、本発明は、癌の進行のモニタリングおよび/または治療または治療法レジメンの有効性のモニタリングの方法を提供する。例えば、発癌タンパク質複数可例えば微小胞中に放出されたEGFRvIII、HER-2、HER-3、cKitまたはMETの量および組成物のモニタリングによって腫瘍のサイズおよび性質を追跡することができる。例えば、より大きな腫瘍がより小さな腫瘍よりもより多くの細胞を含み、それゆえより多くの微小胞を放出するであろうことが期待される。これを使用して、腫瘍のサイズの変化収縮、増殖、または同じ大きさで留まる、のいずれかを測定する手段の提供によって、治療法をモニタリングすることができる。かかる方法は、全体としての患者集団または個々の患者における治療法の有効性の評価に価値があるだろう。癌の進行および/または治療への応答は、微小胞中に見出される発癌タンパク質の組み合わせの測定によってモニタリングできることも意図される。一実施形態において、EGFRおよびHER-2は例えば乳癌において組み合わせて測定することができ、それによって、ある態様において実際の腫瘍サイズに関係ない、遺伝的状態例えば遺伝子型および悪性腫瘍の進行または再発に関する指標を提供する。他の実施形態において、例えばHER-2およびHER-3またはHER-2およびEGFRを組み合わせて測定することができる。さらに別の実施形態において、微小胞は完全な形の癌タンパク質を含有し得るので、癌タンパク質のリン酸化状態を決定して、標的化治療の効率をモニタリングまたは測定することができる。例えば、乳癌に由来する微小胞におけるEGFR/HER-2の組み合わせのリン酸化状態のモニタリングは、Herceptin登録商標等のHER-2-指向性薬物、Tarceva登録商標等のEGFR指向性薬物または類似の抗癌治療の効率を単独でまたは組み合わせで示すことができる。他の態様において、微小胞における発癌タンパク質を取り巻く分子環境例えば他の分子、全体のプロテオームまたはリン酸化プロテオームを使用して癌の進行および/または抗癌治療の効率をモニタリングすることができる。例えば、微小胞におけるPTENのリン酸化状態の存在または非存在は癌の進行および/または抗癌治療の効率を示し得る。さらなる態様において、本発明は、抗癌治療または治療法レジメンの効率をモニタリングするおよび/または癌の進行をモニタリングする方法を提供する。本明細書において記載される方法において当該技術分野において公知の任意の抗癌治療または治療法レジメンを使用できることが意図される。本明細書において包含される治療および治療法レジメンの非限定例は、外科手術、放射線、化学療法、ならびに発癌および腫瘍増殖に関与する特異的機構を妨害する標的化癌療法および治療の投与を含む。標的化癌療法の非限定例は、チロシンキナーゼ関連標的を阻害する治療法Iressa登録商標、CI-1033、Tarceva登録商標およびGleevec登録商標等、ホルモン、サイトカイニンおよび増殖因子についての細胞外受容体結合部位の阻害剤Herceptin登録商標、Erbitux登録商標、プロテアソーム阻害剤Velcade登録商標、ならびにアポトーシスの刺激剤Genasense登録商標を含む。かかる標的化療法は、低分子、単クローン抗体、アンチセンス、siRNA、アプタマーおよび遺伝子治療を介して達成することができる。被験体に治療または治療法レジメンの組み合わせも投与することができる。当該技術分野において公知の他の任意の治療または治療法レジメンは、単独で、または他の治療または治療法レジメンと組み合わせて本明細書において記載される方法において使用することができる。他の態様において、本発明は、微小胞における分析の実行により複数のリン酸化発癌タンパク質および/またはそれらの内部の複数のリン酸化部位の検出を可能にすることによって癌を診断する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、微小胞における発癌タンパク質のリン酸化状態を測定することによる癌の進行のモニタリングおよび/または治療または治療法レジメンの有効性のモニタリングの方法を提供する。EGFR等の受容体チロシンキナーゼRTKは、単一の膜貫通ヘリックスによって細胞質ドメインに連結された細胞外リガンド結合ドメインを含有する。細胞質ドメインは、自己リン酸化および相同でないタンパク質キナーゼによるリン酸化に受ける保存されたタンパク質チロシンキナーゼコアおよび追加の調節配列を含有する。リガンドがRTKの細胞外ドメインに結合する場合、他の隣接するRTKとのRTKの二量体化が誘発される。二量体化はタンパク質の細胞質キナーゼドメインの急速な活性化を引き起こし、これらのドメインについての第1の基質は受容体それ自体である。結果として、活性化受容体は複数の特異的細胞内チロシン残基上で自己リン酸化されるようになる。活性化受容体中の特異的チロシン残基のリン酸化は、Src相同2SH2およびホスホチロシン結合PTBドメイン含有タンパク質についての結合部位を生成する。これらのドメインを含有する特異的タンパク質はSrcおよびホスホリパーゼCγを含み、受容体結合に際してこれらの2つのタンパク質のリン酸化および活性化はシグナル伝達経路の開始を引き起こす。相互作用する他のタンパク質はアダプタータンパク質として活性化受容体と共に作用し、それら自体の固有の酵素活性はない。これらのアダプタータンパク質は、MAPキナーゼシグナル伝達カスケード等の下流のシグナル伝達経路にRTK活性化を結びつける。実質的にはすべてのRTKの活性は、リガンド結合の不在においてでさえ、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤による細胞の処理によって促進することができる。したがって、細胞増加、生存および血管新生に関与する遺伝子の異常な発現を引き起こすRTKまたは発癌受容体の持続的活性化は、活性化ループにおける1つまたは複数のホスホチロシン部位によって正に調節される。RTKのリン酸化は複数の方法を使用して測定することができる。かかる方法の非限定例は、リン酸化特異的抗体、リン酸化の抗体のアレイ、ホスホチロシン残基に対する抗体による染色、およびリン酸化可能な基質による直接キナーゼアッセイを含む。微小胞上の複数の受容体のリン酸化状態を決定する他の方法は、質量分析計MSに関する方法を使用して全リン酸化プロテオームを査定することであり得る。リン酸化されたタンパク質リン酸化タンパク質とも称されるおよびタンパク質のリン酸化状態の測定および検出のための当該技術分野において公知の標準的技法は、本明細書において記載される方法において使用できることが意図される。発癌形質転換は、MV関連タンパク質癌遺伝子の誘発へのそのつながりは機構的に明らかであってもなくてもよいが、バイオマーカーとして使用のための意味があるのより広い範囲の変化を引き起こすという手段で癌細胞に影響を与え得ることを本明細書においてさらに報告する。そこで、皮下のヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの循環MV、またはヒト腫瘍細胞株の培養培地からのMVにおいて存在する癌関連タンパク質の同定を本明細書において報告する。これらのタンパク質は、例えば腫瘍の進行または抗腫瘍療法への応答のモニタリングに使用できるバイオマーカーを表わす。バイオマーカーは被験体における腫瘍の診断および予後のために使用することもできる。悪性腫瘍に関する多くのタンパク質癌遺伝子、腫瘍抑制因子、受容体チロシンキナーゼおよび細胞シグナル伝達のメディエーター等が、複数のタイプのヒト癌細胞に由来するMVにおいて検出されることを本明細書において実証する。バイオマーカーとして使用することができる、腫瘍由来MVにおいて見出されるかかる癌関連タンパク質およびリンタンパク質の例は、表1~4中で以下に与えられる。MVにおいて見出される癌関連タンパク質およびリンタンパク質は、HER-2等の公知の発癌タンパク質、およびVEGFR2またはTie2通常は上皮細胞上で見出される血管新生受容体等の予想外のタンパク質の両方を含むことが指摘される。したがって、本明細書において実証されるような腫瘍由来MVのタンパク質の含有物の分析は、腫瘍の微小環境およびホスト間質の複雑性を含む、腫瘍の特徴づけ、予後および診断を支援するだろう。腫瘍由来MVのタンパク質含有物の決定は可能性のある新規治療標的の同定ももたらし得る。例えば、PANC-1異種移植を保持するマウスからのMVにおいてヒトVEGFR3リンタンパク質が同定され、癌細胞関連VEGFR3リンタンパク質が、少なくとも膵臓癌のサブセットについては、従来は好ましいとされないバイオマーカーおよび/または治療標的であったかもしれないことを示唆する表4を参照されたい。加えて、MVにおいて存在するタンパク質の組み合わせはMVが由来する腫瘍の特徴であり得る例えば、表4を参照されたい。したがって、MVのタンパク質もしくはリンタンパク質プロファイルまたはそのサブセットは、例えば抗腫瘍の療法のモニタリングのためにまたは腫瘍の診断もしくは予後のために本明細書において提供される方法において使用することができる。本明細書において同定されたタンパク質の多くがリン酸化によって活性化または不活性化されることが公知のリンタンパク質であるので、癌関連タンパク質の活性化または機能的状態はそれらのリン酸化状態のモニタリングによる査定することができる。したがって、MV関連タンパク質のリン酸化状態も、単独でまたは組み合わせで、例えば抗腫瘍療法のモニタリングのためにまたは腫瘍の診断もしくは予後のために本明細書において提供される方法において使用することができる。MV関連タンパク質およびリンタンパク質が本明細書において同定され、その組み合わせを本発明の方法およびキットにおいて使用できることを理解すべきである。一態様において、微小胞ベースの血液検査が本明細書において提供され、そこではMVが被験体からの血液のサンプルから単離され、MV関連タンパク質についてアッセイされるか、またはMV関連タンパク質のリン酸化状態を査定するためにアッセイされる。かかる方法は、例えばEGFRvIIIおよび野生型EGFRを発現するMV、ヒト腫瘍細胞株の異種移植を有するマウス、および膠芽腫GBM患者において以下に実証される。多数の癌細胞タイプ乳癌、神経膠腫、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌および結腸直腸癌等におけるこのアプローチの実行可能性を実証した。生検標本ではなく循環MVを使用するという他の潜在的利点は腫瘍不均質性の問題であることが注目される。腫瘍生検サンプルがEGFRvIIIについては陰性であるが、対応する血液MVサンプルが陽性であることが1つの場合で観察された実施例3を参照されたい。したがって、全体的な腫瘍表現型/遺伝子型の代表でない組織生検サンプルを得ることで結果は誤解を招くが、血液サンプルは腫瘍全体の代表であり、したがってより信頼できる。一実施形態において、被験体の腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質の存在を検出する方法であり、MVが被験体からの体液例えば血液のサンプルから単離されて発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質についてアッセイされ、MVにおけるタンパク質の存在が腫瘍におけるタンパク質の存在を示す方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供された方法は、被験体からの生検標本において検出されない発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出することができる。標準的な組織生検方法および組織病理学サンプリングによって発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を見逃し得る場合、これらの方法は特に不均一な腫瘍の分析に有用かもしれない。したがって一態様において、本明細書において提供される方法は、被験体から得られた生検標本の発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質を検出しないリスクを減少または除去する。これらの方法は組織生検に対する非侵襲的な代替物も提供する。別の実施形態において、被験体から採取された体液例えば血液のサンプルから得られた微小胞において発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が検出される、被験体の癌を検出する方法が提供される。一実施形態において、前記発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質は前記被験体から得られた生検標本において検出されない。他の実施形態において、被験体から採取された体液例えば血液のサンプルから得られた微小胞において発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質が検出される、被験体の転移癌を検出する方法が提供される。被験体のすべての転移部から生検標本を得ることが実際的でないかまたは不可能ないくつかの事例において、微小胞の分析を使用して、腫瘍における発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質の存在を決定、および/または発癌タンパク質もしくは腫瘍に関するタンパク質を検出しないリスクを減少もしくは除去することができる。他の態様において、被験体の腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を決定する方法であり、被験体から体液のサンプルを採取する工程と;サンプルから微小胞を単離する工程と;微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を検出する工程とを含む方法であり、微小胞における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態が腫瘍における発癌タンパク質または腫瘍に関するタンパク質のリン酸化状態を示す方法が提供される。一態様において、体液は血液である。さらなる態様において、被験体における癌の予後を診断または決定する方法であり、被験体から体液例えば血液のサンプルを採取する工程と;サンプルから微小胞を単離する工程と;微小胞における発癌タンパク質および/または腫瘍に関するタンパク質を決定する工程とを含む方法が提供される。一態様において、微小胞における発癌タンパク質、腫瘍に関するタンパク質および/またはMV関連タンパク質は、例えば癌型の診断および/または予後に役立つ。本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく説明するために与えられる以下の実施例の参照により容易に理解される。実施例1細胞培養および微小胞MVの単離微小胞を枯渇されたウシ胎仔血清FBSを含有する培地中で、以前に記載されたようにViloria-PetitetalAm.J.Pathology,1997,6:1523-1530;Yuetal.,2005,Blood,105:1734-1741、U373ヒト星状細胞腫細胞、Tet-off調節されるEGFRvIIIまたは緑色蛍光タンパク質pEGFPN1カセットにC末端で融合したEGFRvIIIU373vIII-GFPを発現する安定したバリアントU373vIIIおよびA431が維持される。HUVEC細胞はEGM-2CambrexBioscience、Walkesville、MD、USA中で維持される。以前に記載されたようにYuRak,J.Thromb.Haemost,2004,2:2065-67;Al-Nedawietal.,2005,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,25:1744-1749、微小胞を馴化培地またはマウス血漿から採取する。簡潔には、培地に300gおよび12000gで2つの連続した遠心分離を行ない、細胞および残屑を除去する。微小胞を100000gで2時間の超遠心によってペレットにし、タンパク質含有量を定量し、EGFRまたはEGFRvIIIについて含有物を分析した。走査電子顕微鏡法SEMのために、細胞をカバースリップ上で増殖させ、2.5グルタルアルデヒドで固定し、1OsO4で染色し、金で覆い、JEOL840A装置の使用して可視化する。インビボの分析のために、免疫不全SCIDマウスCharlesRiver、カナダへの1~10×106のU373vIII細胞またはU373細胞の注入によって、腫瘍を生じさせる。いくつかの事例において示されるようにpan-ErbB阻害剤CI-1033により毎日マウスを処理する。血液を、癌を有するマウスまたは対照マウスから心臓穿刺によって採取し、ヘパリン処理注射器の中へ入れる。血小板不含有の血漿を使用して微小胞を調製する。フローサイトメトリーFACSは用いて生存しており透過性ではない細胞の表面上でEGFRvIIIまたはEGFRvIII-GFPを検出し、これらの受容体を内因的に発現した細胞、または微小胞の移行に際してかかる発現を捕捉した細胞で行う。典型的には、U373細胞を、U373vIIIまたはU373vIII-GFP細胞から得られた微小胞MVにより24時間処理する。次いで細胞を2mMEDTAエチレンジアミン四酢酸を使用して剥がして単一細胞懸濁液を得て、その小分け1.5×106/サンプルを1FBSおよび0.1アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝生理食塩水PBS中で洗浄する。次いでU373vIII由来MVにより処理された細胞を例えばEGFRvIIIに対する単クローン抗体Zymedにより4°Cで30分間染色する。洗浄後に、サンプルをAlexaFluor488ヤギ抗マウス二次抗体MolecularProbes、Eugene、ORにより4°Cで30分間インキュベーションし、リン酸緩衝生理食塩水PBSにより洗浄し、分析する。U373vIII-GFP細胞に由来するMVによる処理の事例では、新鮮な細胞懸濁物をGFP蛍光について直接分析する。データーは、FACScaliburフローサイトメーターBDBiosciences、MountainView、CAを使用して捕捉することができる。インビボの実験はすべて、6~8週間齢の重症複合型免疫不全SCIDマウスCharlesRiver、Saint-Coustant、QC、カナダ中で実行される。簡潔には、1~10×106のU373vIII細胞またはU373細胞を0.2mlのPBS中で皮下注射する。血液を心臓穿刺によってマウスから採取し、ヘパリンナトリウム溶液の中へ入れる。血小板不含有血漿を2000gで15分間、2000gで5分間、および16000gで5分間の遠心分離によって調製して、微小胞を単離した。実施例2微小胞移行アッセイU373アクセプター細胞を24時間微小胞により処理し、単一細胞懸濁液をEGFRvIIIまたはGFPの発現についてフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によって分析する。シグナル伝達事象を検出するために、微小胞の添加前にU373を0.5FBSDMEM中で飢餓状態にし、そのまま、または示された濃度のアネキシン-VもしくはCI-1033によりプレインキュベーションする。微小胞関連分子EGFRvIII、TFの発現、ならびに全体のおよび活性化されたMAPKおよびAktの発現に加えて、他の変化は、免疫ブロットBclxL、p27/Kip1、ELISAVEGF、RDSystemsまたはプロモーター活性アッセイVEGFによって、別記されるようにLopez-Ocejoetal.2000,Oncogene,40:4611-4620、アッセイされる。軟寒天コロニー形成アッセイのために、微小胞または対照培地により前処理した等しい数の細胞からの単一細胞懸濁液を0.3アガロース中で調製する。培養を0.5アガロースによりプレコートしたプレート中で樹立し、4を超える細胞を含有するコロニーをすべてカウントする。実施例3多形膠芽腫に罹患した患者における循環EGFRvIIIの検出癌を有するマウスの血漿について以前に記載されたものと類似の様式Al-Nedawietal.,2008,NatureCellBiology,10:619-624で、微小胞をヒト血漿から採取する。簡潔には、保管された血液サンプルに300gで5分間および次いで12000gで20分間の連続した2つの遠心分離を行って、細胞および残屑を除去する。最終的に、100000gで2時間の遠心分離後に微小胞を得て、大量のリン酸緩衝生理食塩水PBSで2回洗浄する。タンパク質溶解物は、10mMTrispH6.8、5mMEDTA、50mMNaF、30mMピロリン酸ナトリウム、2重量/体積SDS、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルPMSFおよび1mMNa3VO4を含有する溶解緩衝液中で、氷上で10分間調製する。特別の指示の無い限り、溶解物をSDS-PAGEによって分離し、例えばマウスもしくはヒツジの抗ヒトEGFRポリクローナル抗体または適切なマウス単クローン抗体による免疫ブロットに行う。適切なHRPコンジュゲート二次抗体および化学発光プラスキットECLキット;AmershamPharmacia、Buckinghamshire、英国を使用して免疫検出を遂行し、その後ブロットをスキャンし、例えばStorm860スキャナGEhealthcareを使用してタンパク質バンドを定量する。野生型EGFRおよびEGFRvIIIバンドの両方はこの様式で予想されるサイズで検出され、標準的なSDS-PAGE手順を使用して分離される。EGFRvIII癌タンパク質は、ウエスタン分析を使用して、TorontoTumorBankからの24名のGBM患者のコホートから採取された循環MVにおいても検出された図8。MVにおける癌タンパク質の検出は、同じ患者からの腫瘍サンプルにおけるEGFRvIII癌遺伝子の検出とよく相関していた図8。これらの結果は、癌患者における循環MVにおける癌タンパク質検出の実行可能性を実証する。特に、患者4については、癌遺伝子は腫瘍サンプルにおいてPCRを使用して検出されなかったが、癌タンパク質はMVにおいて検出された。この結果は、いくつかの事例において、MV分析は、癌関連バイオマーカーEGFRvIIIの検出についてはPCRよりも感度が高いかもしれないことを示す。さらに、MVに関するEGFRシグナルが腫瘍細胞から発散され得る可能性があり、これは除去されず、再発を引き起こすことが予想される。EGFRシグナルは、ELISAアッセイを使用して、ヒト異種移植を有するSCIDマウスの血液から採取したMVにおいて検出された図9。EGFRvIIIと交差反応する抗EGFRの抗体を含有する市販のEGFRELISAキットRDSystems、DYC1854-5を使用して、神経膠腫由来U373vIII細胞の異種移植を保持するマウスからのMVにおけるEGFRvIII、および扁平上皮癌SCC由来A431細胞における野生型EGFRを検出した。これらの結果は、EGFRの両方の形態がELISAアッセイによって容易に検出されることを示し、MVベースのバイオマーカー検出の実行可能性を確認する。実施例4MVにおける複数の癌に関する分子標的の検出ヒト腫瘍細胞株によって培養培地の中へ放出された微小胞を単離し、ウエスタン分析を使用して微小胞の積載物における悪性腫瘍に関する複数のタンパク質癌遺伝子、腫瘍抑制因子および細胞シグナル伝達のメディエーター等を検出した。神経膠腫細胞株U373、U373vIII、U87およびU87vIII、肺癌細胞A549、乳癌細胞MDA-MB-231、前立腺癌細胞PC-3および結腸直腸癌細胞DLD-1、HCT116およびCaCo2を使用した。推定上の癌タンパク質K-ras、c-Met、β-カテニンおよびPDGFRならびに腫瘍抑制遺伝子産物PTEN、TP53およびE-カドヘリンを、微小胞において試験した。結果は図10A中に示され、は着実な反応性を示し、/-は弱い反応性を示し、-検出可能な反応性がないことを示す。ウエスタンブロット分析の例は図10B中に示される。示されるように、培養した細胞株から得られたMV調製物の全細胞溶解物に対してウエスタンブロット分析を実行した。使用した抗体は以下を含んでいた。PanRas:ウサギモノクローナル[Y131]、カタログ番号ab32442、Abcam;K-ras:マウスモノクローナル抗体、カタログ番号AT2650a、BiolynxInc.;C-Met:ウサギモノクローナル[EP145Y]、カタログ番号ab51067、Abcam;PDGFR-b2:マウスモノクローナル、カタログ番号ab10847-100、Abcam;β-カテニン:マウスモノクローナル、カタログ番号MA1-301、ABR;E-カドヘリン:マウスモノクローナル[MB2]、カタログ番号ab8993、Abcam;PTEN:ウサギモノクローナル、カタログ番号9188、CellSignaling;P53:ウサギモノクローナル、カタログ番号2527、CellSignaling。この研究において使用される細胞株は研究室において現在使用され、様々なソースATCC、共同研究者から得られたストックを表わし、それゆえほかの場所で維持された類似した名前の細胞株とは分子的な状態が異なり得ることが指摘される。これらの結果は、MVにおいて存在し検出可能な癌に関連する分子標的の範囲が広いことを実証する。例えば、リン酸化されたMV関連RTKはインビボで検出することができる。この結果は、この様式でヒト腫瘍タイプの多様性を分析できることも実証する。実施例5MVに関連する癌に関するタンパク質の持続的機能的状態リン酸化/活性化の実証42のRTKについてのプローブを含有するリン酸化タンパク質の抗体アレイRDSystemsを使用して、複数のタイプのヒト腫瘍細胞株によって培養培地の中へ放出された微小胞における複数のリン酸化RTKをインビトロで検出した図11。図11Aは、リン酸化RTKの抗体アレイを使用して、相対的リン酸化が単一のサンプルにおいて同時に検出できるRTKの例をリストする。アレイは119のスポットを有し、42の異なるリン酸化されたRTKを検出できる。図11Bは、示された細胞株からのMVにおいて検出された主要なリン酸化RTKを示す。アッセイのアウトプットの例は図11C中に与えられる。この結果は多数のMV関連リン酸化タンパク質を検出できることも示す。主要なMV関連リン酸化タンパク質は、例えば、EGFR、FGFR3、EphB2、ROR1、EphA2およびEphA4を含む。この研究において使用される細胞株は研究室において現在使用され、様々なソースATCC、共同研究者から得られたストックを表わし、それゆえほかの場所で維持された類似した名前の細胞株とは分子的な状態が異なり得る。加えて、得られた結果は、この検出のために使用された特異的抗体およびそれらが標的化するリン酸化エピトープに依存することが指摘される。アレイにおいて使用される抗体はユニークであり、同じRTKに指向性のある他のリン酸化特異的抗体と重複しない反応性を有する可能性がある。これらの結果は、癌細胞の微小胞において含有される受容体チロシンキナーゼRTKが持続的リン酸化を有し、それゆえ持続的活性化および機能的状態を有することを実証する。EGFRvIII駆動性GBM細胞から放出されたMVにおいて含有または濃縮されるリン酸化タンパク質のインビトロプロファイリングを大スケールでも実行した。細胞シグナル伝達タンパク質発現およびリン酸化のプロファイリングのために650を超える異なるリン酸化部位特異的抗体からなるKinex商標抗体マイクロアレイを使用したKinexusInc.。アレイは、調節サブユニットおよび他のタンパク質において、248のユニークなリン酸化特異的抗体リン酸化部位、121のキナーゼリン酸化部位、2つのホスファターゼリン酸化部位および125のリン酸化部位を検出することができる。Kinex商標抗体マイクロアレイを使用して、ヒトGBM細胞によって産生されたMVのリン酸化プロテオームを分析した。MVのリン酸化プロテオームにおけるEGFRvIII依存性変化を同定するために、U373P親U373とも称される細胞非トランスフェクション、非腫瘍形成性細胞およびU373vIII細胞の両方を使用した。各々の事例において、MVから得られた値を細胞から得られた値に対して正規化した。例示的な結果は表1および2において以下に与えられ、そこではリン酸化タンパク質P-タンパク質は左側カラムにおいて与えられ、正規化正味中央値シグナルNNMSは右側カラムにおいて与えられる。MVにおいて最も多量に見出されるタンパク質が表1および2中に示される。表3は、Kinex商標抗体アレイを使用してU373-MVにおいて検出されたリンタンパク質のさらなる例を示す;これらのタンパク質は、検出された200を超えるリンタンパク質のサンプリングを表わす。表3.1は、MVにおける別の部位例えばEGFRのY1068またはY1110のリン酸化をモニタリングできることを示す。この結果は、MVにおいて多数のリン酸化され、それゆえ活性化されたタンパク質があることを示し、その多くは癌における役割および/または予測値を有することが公知である。加えて、Kinex商標抗体アレイおよびRDSystemsからのリン酸化タンパク質の抗体アレイの両方を使用する本明細書において示された結果は、複数の発癌分子、シグナル伝達分子および生物学的活性分子の標的が、癌細胞由来MVにおいて細胞培養馴化培地から回収されたMVおよびヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液から回収されたMVの両方について同時に検出できることを実証する。表1Kinex商標アレイ-最も高い正味正規化中央値シグナルのMV関連リンタンパク質U373P-細胞対U373P-MV表2Kinex商標アレイ-最も高い正味正規化中央値シグナルのMV関連リンタンパク質U373vIII-細胞対U373vIII-MV表3U373-MVにおいて検出されたリンタンパク質の例表3.1Kinex商標-癌細胞U373によって放出されたMVにおける受容体EGFRリン酸化部位の冗長および非冗長検出の例これらの結果は、リン酸化形態でMVにおいて見出すことができる分子のタイプの範囲を示す。これはインビトロアッセイであるが、MVにおける癌遺伝子に関する変化そのいくつかはMV関連変化であり得るが必ずしも発癌変化というわけではないの範囲が、予想外に大きいことが注目される。この結果は、リン酸化-脱リン酸化を決定できるだけでなく、分子の異なる機能異なる標的との相互作用および再利用などに関与する別個のリン酸化部位の状態をモニタリングすることができる例えばEGFRのY1068またはY1110ことも示す。この情報はMVの分析から容易に入手可能であるが、腫瘍サンプルの同等の分析を使用してこの情報を得ることは困難で、恐らく可能ではないだろう。実施例6ヒト腫瘍異種移植を有するマウスにおける循環MVのリンタンパク質プロファイルの決定次いで、ヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液中の循環MVのヒトリンタンパク質プロファイルをインビボで解析した表4;図12。示されたヒト癌細胞株の異種移植を、細胞の皮下接種によってSCIDマウスにおいて行った。腫瘍を形成させた。腫瘍が直径17mmのエンドポイントに到達した時にマウスを屠殺し、腫瘍を有するマウス4~5匹をプールした血漿からMVを単離した。タンパク質溶解物を生成し、RDSystemsからの抗ヒトRTKリンタンパク質抗体アレイをプロービングするために使用した。結果は以下の表4中に与えられ、A431異種移植を持つマウスからの循環MVについてのRTKアッセイの一例は図12中に示される。この結果は、複数のタイプのヒト腫瘍乳房腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍および脳腫瘍等の代表の腫瘍異種移植を保持するマウスにおける循環MVにおいて複数のリン酸化RTKが含有されること、およびこれらのリン酸化RTKはMVにおいて容易に検出できることを実証する。表4ヒト腫瘍異種移植を保持するマウスの血液における循環MVのリンタンパク質プロファイル実施例7MV関連RTKのリン酸化状態が標的化療法に応答性であるという実証バイオマーカーとしてMVを使用して癌遺伝子指向性治療剤への応答をインビボでモニタリングきるかどうかを決定するために、EGFR駆動性の皮下腫瘍を有するマウスをEGFR阻害因子CI-1033により処理した図13。20mg/kgのCI-1033の腹腔内投与による7日間の処理後に、マウスの腫瘍サイズを測定し図13A、抗リン酸化EGFR抗体を使用するウエスタンブロット分析を使用して、マウスの循環MVにおけるEGFRのリン酸化状態を決定した図13B、A431の皮下腫瘍を有するマウスからのMVを上部に示し、U373vIII腫瘍を有するマウスからのMVを下部に示す。A431腫瘍およびU373vIII腫瘍の両方はCI-1033の毎日の用量への曝露に対して応答性であった。さらに、ウエスタン分析によって見られるように、EGFR駆動性の皮下腫瘍を有しEGFR阻害因子CI-1033により処理されたマウスの血液中の循環MVにおけるリン酸化ヒトEGFRの存在は減少した。野生型EGFRA431細胞に比較して、変異受容体EGFRvIIIU373vIIIの事例におけるEGFR阻害の程度はより低く、これは差異的な抗腫瘍効果に反映されている。この結果は、MV関連活性のあるRTKのリン酸化状態それは発癌性であるが、これらの受容体で指向性のある全身性標的療法に対して応答性であり、これらの発癌標的の状態が、MVの単離およびそれらの含有物の分析に基づいた血液検査を使用してモニタリングできることを実証する。これらの結果は、バイオマーカーとして循環MVを使用して癌遺伝子に指向性のある治療剤への応答をインビボでモニタリングできることを示す。本明細書において引用されたすべての文書および参照文献の内容の全体は、参照として本明細書に援用される。本発明はその具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修飾が可能であることが理解され、本出願は一般に本発明の原則に従って本発明のいかなる変形、使用または改造をカバーすることを意図し、本発明が属する当該技術分野で公知または慣習的な実施の範囲内に生ずるような、および上文に記載される本質的特徴に適用され得るような、ならびに添付の請求項の範囲に従うような、本開示からのかかる逸脱を含む。"