スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、S1P受容体アンタゴニスト、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体における神経因性疼痛を治療する方法。前記神経因性疼痛が化学療法誘発性である、請求項1記載の方法。前記化学療法が、タキサン、白金化合物、ビンカアルカロイド、プロテアソーム阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬物の投与を含む、請求項2記載の方法。前記薬物が、パクリタキセル、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3記載の方法。前記S1P受容体アゴニストがS1P1のアゴニストである、請求項1記載の方法。前記S1P受容体アゴニストが、フィンゴリモド、BAF312、ポネシモド、ONO4641、CS0777、KRP203、PF991、W146、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。前記スフィンゴシンキナーゼアンタゴニストが、メチルスフィンゴシン、NNジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、DLスレオジヒドロスフィンゴシン、およびHDLからなる群より選択される、請求項1記載の方法。前記S1Pアンタゴニストが抗S1P抗体である、請求項1記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO1によって同定される配列を有する重鎖を含む、請求項8記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO2によって同定される配列を有する軽鎖を含む、請求項8記載の方法。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、S1P受容体アンタゴニスト、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体における疼痛過敏症を治療する方法。前記疼痛過敏症がオピエート誘発性である、請求項11記載の方法。前記疼痛過敏症がモルヒネによって誘発される、請求項12記載の方法。前記S1P受容体アゴニストがS1P1のアゴニストである、請求項11記載の方法。前記S1P受容体アゴニストが、フィンゴリモド、BAF312、ポネシモド、ONO4641、CS0777、KRP203、PF991、およびW146からなる群より選択される、請求項11記載の方法。前記S1Pアンタゴニストが抗S1P抗体である、請求項11記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO1によって同定される配列を有する重鎖を含む、請求項16記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO2によって同定される配列を有する軽鎖を含む、請求項16記載の方法。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、S1P受容体アンタゴニスト、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体における抗侵害受容性耐性を治療する方法。前記抗侵害受容性耐性がオピエート誘発性である、請求項19記載の方法。前記抗侵害受容性耐性がモルヒネによって誘発される、請求項20記載の方法。前記S1P受容体アゴニストがS1P1のアゴニストである、請求項19記載の方法。前記S1P受容体アゴニストが、フィンゴリモド、BAF312、ACT128800、ONO4641、CS0777、KRP203、PF991、W146、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19記載の方法。前記S1Pアンタゴニストが抗S1P抗体である、請求項19記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO1によって同定される配列を有する重鎖を含む、請求項24記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO2によって同定される配列を有する軽鎖を含む、請求項24記載の方法。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、S1P受容体アンタゴニスト、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される薬物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体における炎症性疼痛を治療する方法。前記個体が炎症性疾患に罹患している、請求項27記載の方法。前記炎症性疾患が関節リウマチである、請求項28記載の方法。前記S1PアゴニストがS1P1のアゴニストである、請求項27記載の方法。前記S1P受容体アゴニストが、フィンゴリモド、BAF312、ポネシモド、ONO4641、CS0777、KRP203、PF991、W146、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項27記載の方法。前記S1Pアンタゴニストが抗S1P抗体である、請求項27記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO1によって同定される配列を有する重鎖を含む、請求項32記載の方法。前記抗体が、SEQIDNO2によって同定される配列を有する軽鎖を含む、請求項32記載の方法。発明の詳細な説明本発明は、脊髄セラミドのオピオイド鎮痛耐性および痛覚過敏への関与が、S1Pを介したシグナル伝達によって起こるのかどうかを判定するために行われた研究に由来する。デノボ経路およびSMase経路における特定段階の薬理学的標的化を通して、脊髄で形成されたS1Pが、少なくとも部分的にグリア細胞機能の調節を介して、神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性に寄与する重要な二次メッセンジャーであることが初めて実証された。神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を防止および治療するために、多くのレベルでセラミド代謝経路を妨害し得る、薬理学的操作の様々なプラットフォームアプローチが提供される。特に、セラミド由来のS1Pが、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生において重要な役割を果たすことが発見され、疼痛管理におけるオピエートの補助としての、セラミドおよびS1Pの阻害剤の開発の新規な機構原理が提供される。グリアにおけるS1Pの役割に加えて、S1Pは、ニューロンに影響を及ぼすことにより、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性の発生に寄与することが示された。この過程のモデルを図6に示すが、この図は、モルヒネの慢性投与が脊髄のグリア細胞におけるセラミド代謝経路を活性化し、スフィンゴシンキナーゼによるS1Pの産生増加をもたらすことを提供している。その細胞外放出に続いて、S1Pは次にグリア細胞上のその受容体に結合し、一連のシグナル伝達経路を開始させ、周知の炎症誘発性および神経興奮性サイトカイン、IL1βTNFα、およびIL6の産生強化に至る。S1Pの阻害はこれらのサイトカインの形成を阻止し、このことから、S1P形成の阻害剤によるモルヒネ誘発性の痛覚過敏および耐性の減弱が、モルヒネ誘発性の脊髄のサイトカイン形成の抑制による二次的なものであることが示唆される。特定の理論によって縛られることはないが、S1P関与の機構は、グリア細胞からの炎症誘発性メディエータの産生を調節することが知られている、酸化還元感受性転写因子、ならびにP38およびERK12を含むいくつかのMAPKの活性化によって示され得ると考えられている。さらに、NFKB、P38キナーゼ、およびERKは、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に関連づけられている。したがって、S1Pは、グリア細胞を活性化して、NFκBおよびMAPK依存的様式で炎症誘発性サイトカインを放出することにより、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に寄与し得る。加えて、特定の理論によって縛られることはないが、S1Pが関与する別のシグナル伝達経路が、ペルオキシ亜硝酸の形成および迅速な反応によって起こるようである。S1Pは、NAPDH酸化酵素および一酸化窒素合成酵素をそれぞれ活性化することにより、スーパーオキシドおよび一酸化窒素の形成を増加させ得る。スーパーオキシドおよび一酸化窒素はいずれも、やはりオピエート誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に関連づけられている、強力な炎症誘発性でかつ侵害受容に親和的な窒素酸化種である、PNの生合成における前駆体である。したがって、S1Pは、PNの産生を支持し、PNが次に、最適な脊髄のグルタミン酸作動性シグナル伝達の維持に関与することが知られている重要なグリア細胞タンパク質をニトロ化することにより、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に寄与する。実際に、DMSによるS1Pの阻害は、PNのマーカーである3ニトロチロシンの形成を阻止した。特にNMDA受容体によって媒介されるようなグルタミン酸神経伝達が、オピオイド耐性の発生において重要であることは、十分に確証されている。細胞外グルタミン酸の恒常性は、ニューロンおよびグリアの両方の形質膜内のナトリウム依存性高親和性グルタミン酸輸送体によって厳密に調節されているが、機能的なグルタミン酸取り込みの大部分は、グリアの輸送体:グルタミン酸アスパラギン酸輸送体およびGLT1によって媒介される。GLASTGLT1機能が影響を受ける場合には、グルタミン酸はCSF内で増加して、シナプス伝達の急速な変化に寄与し得る。細胞外グルタミン酸の恒常性の調節におけるGTの中心的役割とは対照的に、グリア細胞酵素GSは、その細胞内代謝運命において極めて重要な役割を果たす。CNSにおいて、GSは主にアストロサイト内に位置し、これらの細胞の主な役割の1つは、過剰なアンモニアおよびグルタミン酸を取り込み、それらをグルタミンに変換することによって、興奮毒性からニューロンを保護することである。グルタミンは次にニューロンに輸送され、そこでグルタミン酸およびGABAの形成のための前駆体として役立つ。GSの酵素不活性化は、ニューロン興奮を促進する。さらに、フィードバック調節を介して、グルタミン合成酵素の活性の減少はグルタミン酸輸送体の活性を減少させることができ、これら2つの経路間の相互作用が強調される。GS活性の阻害は、炎症性痛覚過敏と関連した中枢性感作を阻止する。GLT1およびGSのニトロ化がDMSによって阻害されることもまた、発見された。したがって、S1Pの阻害剤による痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の阻害は、少なくとも部分的には、PN生成、ならびにそれに続くGLT1およびGSの翻訳後ニトロ化および不活性化の阻害による二次的なものである。いかなる特定の理論によっても縛られることはないが、これらのグリア細胞タンパク質のニトロ化を妨げることにより、DMSはグルタミン酸を基礎レベルまで下げ、そうして最適なグルタミン酸作動性神経伝達を回復させると考えられる。モルヒネの慢性投与、セラミド代謝経路の活性化、ならびに痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生の間の機構的関連性は、依然として不明である。この場合も同様に、特定の理論によって縛られることはないが、オピエート誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生、ならびに神経因性疼痛における、グリア細胞でのToll様受容体4の活性化を意味づける相次ぐデータが最近になって出現した。単球およびマクロファージにおけるLPSによるTLR4の活性化は、デノボ経路およびSM経路における酵素を活性化して、セラミドの産生増加をもたらし、これは次にNFkBおよびMAPKを活性化して、一酸化窒素およびスーパーオキシドの産生、ならびに敗血症および敗血症性ショックの発生に結びつけられているTNFαおよびILβ事象を増加させる。したがって、まとめて解析した場合、最近になって実証されたTLR4アゴニストであるモルヒネによるTLR4由来シグナル伝達経路の活性化は、慢性モルヒネ投与を、セラミド代謝経路の活性化、ならびにひいては痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に関連づけ得る。オピエート媒介性の過敏症と、糖尿病およびその他の感覚性ニューロパチーによる慢性神経因性疼痛と関連した過敏症が、分子的、生化学的、および薬理学的にかなり類似していることを考慮して、セラミドおよびS1Pがそれら両方の状態において実行可能な治療標的となり得るという仮説もまた調べられた。そのような研究により、化学療法誘発性の神経因性疼痛のモデルにおいて特に重要であるものとして、S1P1受容体が同定された。特に、S1P受容体アンタゴニストが、セラミド誘発性の痛覚過敏および化学療法誘発性の神経因性疼痛を逆転させることが実証された。さらに、S1P受容体アゴニスト、特にS1P1、S1P3、およびS1P5受容体サブタイプに対するアゴニストが、化学療法誘発性の神経因性疼痛の発生を阻止することが実証された。いかなる特定の理論によっても縛られることはないが、S1P受容体アゴニストはS1P受容体の内部移行を引き起こし、それらが再循環できないようにそれらを分解すると考えられる。さらなる実験データから、S1P受容体アゴニストが、カラゲナンによって誘発される炎症性疼痛の発生を阻止することが示され、それにより、関節リウマチにおける慢性炎症性疼痛などの、すべての種類の炎症性疼痛の治療のための別の手段が提供される。一般的技法本発明の特定の局面の実行は、他に指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内にある分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、MolecularCloningALaboratoryManualsecondeditionColdSpringHarborPress;OligonucleotideSynthesis;MethodsinMolecularBiologyHumanaPress;CellBiologyALaboratoryNotebookAcademicPress;AnimalCellCulture;IntroductiontoCellandTissueCulturePlenumPress;CellandTissueCultureLaboratoryProceduresJWileyandSons;MethodsinEnzymology;HandbookofExperimentalImmunology;GeneTransferVectorsforMammalianCells;CurrentProtocolsinMolecularBiology;PCRThePolymeraseChainReaction;CurrentProtocolsinImmunology;ShortProtocolsinMolecularBiology;Immunobiology;Antibodies;Antibodiesapracticalapproach;Monoclonalantibodiesapracticalapproach;Usingantibodiesalaboratorymanual;TheAntibodies;およびCancerPrinciplesandPracticeofOncologyなどの文献において十分に説明されている。治療目的のために抗S1P抗体および抗S1P受容体抗体を使用する方法本発明の1つの局面では、S1Pの生物活性を減少させるおよび阻止するために、抗S1P抗体および抗S1P受容体抗体を投与する。このアンタゴニスト活性は、神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性などの、脊髄における内因性S1P産生と関連した病理学的状態の治療において有用であると考えられる。好ましくは、これらの局面において、抗体の有効量を個体に投与する。したがって、1つの局面において、本発明は、本明細書に開示されるアンタゴニストのいずれかを用いて、ヒトS1P生物活性を遮断する方法を提供する。1つの局面において、本方法は、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかとS1Pを接触させる段階を含み、それにより、S1P活性によって媒介される神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性が遮断される、減少する、阻止される、または抑制される。さらに別の局面においては、神経因性疼痛を有する個体を、抗S1P抗体もしくは抗S1P受容体抗体、またはそれらの組み合わせによって治療する。簡単にするため、これらの方法が、本明細書に記載される変種抗体およびポリペプチドのいずれにも当てはまるという理解の下で、一般的に抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体に言及する。抗S1P抗体もしくは抗S1P受容体抗体、または一本鎖などの断片2、Fv、Fe等、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性のS1PS1P受容体認識部位を含む、抗S1P抗体もしくは抗S1P受容体抗体のあらゆる他の改変された立体配置の様々な製剤を、それを必要とする個体への投与に使用することができる。いくつかの局面では、抗S1P抗体およびもしくは抗S1P受容体抗体、またはそれらの様々な製剤を、そのまま投与することができる。他の局面では、抗S1P抗体もしくは抗S1P受容体抗体、またはそれらの様々な製剤、および薬学的に許容される賦形剤を投与することができ、これらは様々な製剤中にあってよい。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において公知である。例えば、賦形剤は形態もしくは稠度を付与し得るか、または希釈剤として働き得る。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変更するための塩、封入剤、緩衝液、および皮膚浸透増進剤が含まれるが、これらに限定されない。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤および製剤は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy20thEdMackPublishingに記載されている。いくつかの局面において、これらの薬剤は注射による投与のために製剤化されるが、他の投与形式を用いることもできる。したがって、抗S1P抗体およびまたは抗S1P受容体抗体、ならびにそれらの同等物は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液等などの、薬学的に許容されるビヒクルと併用することが好ましい。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。一般的に、以下の用量のいずれかを用いることができる:少なくとも約50mgkg体重;少なくとも約10mgkg体重;少なくとも約3mgkg体重;少なくとも約Imgkg体重;少なくとも約750μgkg体重;少なくとも約500μgkg体重;少なくとも約250μgkg体重;少なくとも約100μgkg体重;少なくとも約50μgkg体重;少なくとも約10μgkg体重;少なくとも約1μgkg体重、またはそれよりも少ない用量を投与する。数日またはそれ以上にわたって反復投与するには、状態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療を持続する。例示的な投薬計画は、抗S1P抗体およびまたは抗SIP受容体抗体の約2mgkgの最初の用量、およびその後の約1mgkgの週に1度の維持用量、またはその後の1週間おきの約1mgkgの維持用量の投与を含む。しかしながら、医師が達成を望む薬物動態減衰のパターンに応じて、他の投与計画が有用である場合もある。半減期などの経験的考察が、一般的に投薬量の決定に寄与する。この治療法の進行は、従来の技法およびアッセイ法により容易にモニターされる。個体によっては、2回以上の用量が必要となる場合がある。投与頻度は、治療過程にわたって決定および調整することができる。例えば、投与頻度は、治療される神経因性疼痛の種類および重症度、薬剤を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療法、患者の病歴および薬剤に対する反応、ならびに主治医の裁量に基づいて、決定または調整することができる。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまで、抗S1P抗体および抗S1P受容体抗体を投与する。場合によっては、抗S1P抗体およびまたは抗S1P受容体抗体の持続性連続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤および装置は、当技術分野において公知である。1つの局面において、抗S1P抗体およびまたは抗S1P受容体抗体の投薬量は、1回または複数回の投与を受けた個体において、経験的に決定することができる。個体に、抗S1P抗体およびまたは抗S1P受容体抗体の漸増投薬量を投与する。抗S1P抗体および抗S1P受容体抗体、またはその他の同等の抗体の有効性を評価するために、疾患症状のマーカーをモニターすることができる。本発明の方法に従った抗S1P抗体およびもしくは抗S1P受容体抗体またはポリペプチドの投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的であるかまたは予防的であるか、および医師に公知のその他の要因に応じて、連続的または断続的であってよい。抗体の投与は、あらかじめ選択された期間にわたって本質的に連続的であってよく、または、例えば神経因性疼痛、炎症性疼痛、もしくは痛覚過敏を生じる前、間、もしくは後のいずれかの、間隔を空けた一連の投与であってもよい。その他の製剤には、当技術分野で公知の適切な送達形態が含まれ、これにはリポソームなどの担体が含まれるが、これに限定されない。例えば、MahatoetalPharmRes14853859を参照されたい。リポソーム調製物には、サイトフェクチン、多重膜小胞、および単層小胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの局面においては、2つ以上の抗体またはポリペプチドを投与することができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。そのような組成物は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つの異なる抗体を含み得る。抗体の混合物は、当技術分野でしばしば示されるように、より広範囲の個体集団を治療するのに特に有用であり得る。本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを、所望の細胞における本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかの送達および発現に用いることもできる。発現ベクターを用いて、抗S1P抗体および抗S1P受容体抗体またはポリペプチドの発現を指示することができることは明白である。発現ベクターは、腹腔内、静脈内、筋内内、皮下、髄腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、経皮的、舌下、または吸入によるなど、当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、微粒子銃、またはカテーテル投与、および局所投与を含む、限局投与または全身投与が含まれる。当業者は、インビボで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第6436908号;第6413942号;および第6376471号を参照されたい。本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的化送達を用いることもできる。受容体媒介性DNA送達技法は、例えば、FindeisetalTrendsBiotechnol11202;ChiouetalGeneTherapeuticsMethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer;WuetalJBiolChem263621;WuetalJBiolChem269542;ZenkeetalProcNatlAcadSci873655;WuetalJBiolChem266338に記載されている。遺伝子治療プロトコールでは、限局投与のために、ポリヌクレオチドを含む治療組成物を約100ng~約200mgのDNAの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコールの期間に、約500ng~約50mg、約1mg~約2mg、約5mg~約500mg、および約20mg~約100mgの濃度範囲のDNAを用いることもできる。本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであってよい151;KimuraHumanGeneTherapy5845;ConnellyHumanGeneTherapy1185;およびKaplinNatureGenetics6148を参照されたい。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的または調節性のいずれかであってよい。所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターが、当技術分野で周知である。ウイルスに基づく例示的なビヒクルには、組換えレトロウイルス、アルファウイルスに基づくベクター、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。CurielHumGeneTher3147に記載されているような、死滅アデノウイルスに連結されたDNAの投与も、使用することができる。非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法を使用することもでき、これには、単独の死滅アデノウイルスに連結されたまたは連結されていないポリカチオン性濃縮DNA3147を参照されたい;リガンド結合DNA26416985を参照されたい;真核細胞送達ビヒクル細胞、および核酸電荷中和または細胞膜との融合が含まれるが、これらに限定されない。裸のDNAを使用することもできる。裸のDNAの例示的な導入法は、PCT特許出願公開第WO9011092号および米国特許第5580859号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働き得るリポソームは、米国特許第5422120号;PCT特許出願公開第WO9513796号;第WO9423697号;第WO9114445号;および欧州特許第0524968号に記載されている。さらなるアプローチは、PhilipMolCellBiol142411、およびWoffendinProcNatlAcadSci911581に記載されている。本明細書に記載されるすべての方法に関して、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニストへの言及はまた、これらの薬剤の1つまたは複数を含む組成物を含む。これらの組成物は、緩衝液を含む薬学的に許容される賦形剤などの、適切な賦形剤をさらに含み得、こうした賦形剤は当技術分野で周知である。本発明は、単独で、または治療の他の従来法と併用して用いることができる。神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を治療するためのスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニストいくつかの局面において、本発明は、哺乳動物、ヒトおよび非ヒトの両方を含む個体における、神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を治療するための方法を提供する。したがって、1つの局面において、本発明は、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストの有効量を投与する段階を含む、個体における神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を治療するための方法を提供する。本明細書において意図されるように、治療という用語には、個体における神経因性疼痛、誘発性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を取り除くこと、その発生率を減少させること、寛解させること、抑制すること、緩和すること、およびその開始、発生、または進行を遅延させることが含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの局面では、個体、例えば癌を有する個体または化学療法の対象において疼痛を生じる前または疼痛エピソードの前に、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニストを投与する。神経因性疼痛の緩和および炎症性疼痛の緩和は、緩和の時間経過によって特徴づけることができる。したがって、いくつかの局面において、疼痛の緩和は、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストの投与後、約24時間以内に観察される。他の局面において、疼痛の緩和は、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストの投与後、約36時間、48時間、60時間、72時間、または4日以内に観察され得る。さらなる他の局面において、疼痛の緩和は、神経因性疼痛または炎症性疼痛の改善の徴候が観察される前に、観察される。いくつかの局面では、疼痛の頻度および強度が減少し得、神経因性疼痛を患っている人の生活の質が向上し得る。痛覚過敏および異痛症については、同様の時間枠、および同様に改善された状態において、疼痛に対する感受性低下が観察され得る。化学療法誘発性疼痛を治療する場合には、本発明の方法を任意の化学療法薬と併用して用いることができる。例示的な薬物には、タキサン、白金化合物、ビンカアルカロイド、およびプロテアソーム阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。好ましい化学療法薬には、パクリタキセル、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、およびビンクリスチンが含まれる。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニスト1つの局面において、本発明は、受容体結合およびS1Pに対する細胞応答の誘発などの、S1Pシグナル伝達によって媒介される下流経路を含むS1P生物活性を阻止する、抑制する、または減少させる任意の分子を指す用語である、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを使用する方法を提供する。アンタゴニストという用語は、生物学的作用の特定の機構を意味するのではなく、種々の異なる、化学的に多岐にわたる組成物によって達成され得る、S1Pとのすべての可能な薬理学的、生理学的、および生化学的相互作用、ならびにその結果を明白に含み、包含すると見なされる。いくつかの公知のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼの天然基質を分子的に模倣する薬剤である。このようなアンタゴニストは、場合によっては非可逆的にスフィンゴシンキナーゼに結合し、そうすることによりスフィンゴシンキナーゼの天然基質の結合を妨げ、最終的にこれらの基質のリン酸化を妨げる。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニストの例には、メチルスフィンゴシン、NNジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシン、DLスレオジヒドロスフィンゴシン、および高密度リポタンパク質が含まれる。スフィンゴシンキナーゼ阻害剤として用いることができるその他のスフィンゴシン誘導体は、米国特許第5583160号;第5627171号;第5466716号;第5391800号;第5137919号;第5151360号;第5248824号;第5260288号;および第5331014号に記載されている。DeJongheらは、スフィンゴシンキナーゼの阻害剤として、短鎖スフィンガニン類似体および3フルオロスフィンゴシン類似体を含む、短鎖スフィゴイド塩基の使用を開示している31753180。他のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニストは、最終的に該キナーゼの触媒活性を妨害するという条件で、基質結合部位以外の部位でスフィンゴシンキナーゼに結合し得る。適切なスフィンゴシンキナーゼアンタゴニストは、基質または触媒との相互作用を妨害するもしくは妨げる、または産物の放出を妨害するもしくは妨げる、または酵素による基質の修飾を妨げることによって、スフィンゴシンキナーゼの触媒活性を妨害し得る。マウスのスフィンゴシンキナーゼのクローニングがKohamaらによって報告されており、特異的スフィンゴシンキナーゼ活性の測定を目的とした発現研究および活性研究も報告されている。237228GenBankアクセッション番号NM021972およびXM012589は、クローニングされたヒトスフィンゴシンキナーゼの配列に対応する。上記の薬剤クラスのいずれかのアッセイは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる文献、特にPCT特許出願第PCTAU9800730号に記載されており、これは、スフィンゴシンキナーゼ活性を測定するための方法、ならびにスフィンゴシンキナーゼアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための方法を記載している。例示的なS1PアンタゴニストまたはS1P受容体アンタゴニストには、抗S1P抗体、抗S1P1受容体抗体、S1Pに対するアンチセンス分子、S1P受容体に対するアンチセンス分子、S1P阻害化合物、およびS1P構造類似体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、アンタゴニストという用語は、S1P自体、S1P生物活性、または該生物活性の結果が、実質的に無効にされる、減少する、または任意の程度に中和される、先に特定されたすべての用語、表題、ならびに機能的状態および特徴を包含することが、明確に理解されるであろう。いくつかの局面において、S1PアンタゴニストまたはS1P受容体アンタゴニストは、S1Pと結合し、S1P受容体に結合し、下流のS1P受容体シグナル伝達またはS1P二次メッセンジャー活性を減少させる。他の局面において、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニストは、S1Pの形成を阻害し得る。したがって、いくつかの局面において、S1Pアンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ、S1P、またはS1P受容体と結合する。いくつかの局面において、S1Pアンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ、S1P、またはS1P受容体に結合するポリペプチドである。いくつかの局面において、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストは、抗体もしくは抗体断片を含むペプチド、または改変されたペプチドである。他の局面において、S1PアンタゴニストまたはS1P受容体アゴニストは、下流のS1P受容体シグナル伝達を減少させる。さらなる他の局面において、アンタゴニストは、ヒト化されている抗S1P抗体である。他の局面において、抗S1P抗体は、LT1009の1つまたは複数のCDRを含む。他の局面において、抗S1P抗体は完全にヒトである。さらなる他の局面において、抗S1P抗体は、図29および図30に示される、重鎖可変領域のアミノ酸配列および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。さらなる他の局面において、抗体は、免疫学的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解を誘発しない、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を刺激しない定常領域などの、改変された定常領域を含む。本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片2、Fv、Fc等、キメラ抗体、二重特異性抗体、異種複合体抗体、一本鎖、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化変種、抗体のアミノ酸配列変種、および共有結合により改変された抗体をはじめとする、必要な特異性の抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子のあらゆる他の改変された立体配置を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、またはあらゆる他の起源であってよい。例えば、抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体の、それぞれS1PまたはS1P受容体への結合に関する結合親和性は、約010~約080nM、約015~約075nM、および約018~約072nMであってよい。1つの局面において、結合親和性は約2pM~22pMである。1つの局面において、結合親和性は約23pM~約100pMである。いくつかの局面において、結合親和性は約10nMである。他の局面において、結合親和性は約10nM未満である。他の局面において、結合親和性は約01nMまたは約007nMである。他の局面において、結合親和性は約01nM未満または約007nM未満である。他の局面において、結合親和性は、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、または約50pMのいずれかから、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、または約40pMのいずれかまでである。いくつかの局面において、結合親和性は、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、もしくは約50pM、または約50pM未満のいずれかである。いくつかの局面において、結合親和性は、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、もしくは約50pMのいずれか未満である。さらなる他の局面において、結合親和性は、約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM、または約40pM超である。抗体の結合親和性を決定するための方法は公知である。本発明による、S1PまたはS1P受容体に対する抗体の結合親和性を決定する1つの方法は、該抗体の単機能Fab断片の結合親和性を測定することによる。単機能Fab断片を得るために、抗体をパパインで切断するか、または組換えによって発現させることができる。例えば、抗体の抗S1PFab断片の親和性は、表面プラズモン共鳴表面プラズモン共鳴システム、BIAcoreINC、PiscatawayNJによって決定することができる。供給元の説明書に従って、CM5チップをNエチルNカルボジイミド塩酸塩およびNヒドロキシスクシンイミドで活性化することができる。ヒトS1Pを、10mM酢酸ナトリウムpH40中に希釈し、0005mgmLの濃度で活性化チップ上に通液することができる。個々のチップチャネルにわたって変動する流動時間を用いて、詳細な動力学的研究用の100~200応答単位およびスクリーニングアッセイ用の500~600RUの2通りの抗原濃度範囲を得ることができる。チップは、エタノールアミンでブロッキングすることができる。HB緩衝液を、BIAcoreアッセイ用のランニング緩衝液として用いることができる。精製Fab試料の段階希釈物を100μL分でI分間かけて通液することができ、最長2時間までの解離時間を可能にすることができる。Fabタンパク質の濃度は、標準物質として既知濃度のFabを用いて、ELISAおよびSDSPAGE電気泳動によって決定することができる。動力学的な会合速度および解離速度は、BIAevaluationプログラムを使用して、データを11ラングミュア結合モデルMethodsEnzymology699110に当てはめることによって、同時に得ることができる。平衡解離定数値は、KoffKonとして算出することができる。このプロトコールは、ヒトS1P、別の脊椎動物のS1Pを含む、任意のS1Pに対する抗体の結合親和性の決定における使用に適している。本発明のいくつかの局面において、抗S1P抗体はヒトS1Pと結合し、別の脊椎動物種由来のS1Pとは有意に結合しない。いくつかの局面において、該抗体は、ヒトS1P、ならびに他の脊椎動物種由来の1つまたは複数のS1Pと結合する。いくつかの局面において、該抗体は、ウマまたはイヌなどの哺乳動物種のS1Pには結合するが、別の哺乳動物種由来のS1Pには有意に結合しない。本段落の同じ基準が、抗S1P受容体抗体などの他の抗体にも当てはまり得る。エピトープは、連続的であっても非連続的であってもよい。1つの局面において、該抗体は、米国特許出願第20070148168号;米国特許第6881546号および第6858383号;ならびに米国特許出願第10029372号;米国特許出願第60854971号および第11924890号、ならびに対応するPCT特許出願第PCTUS2007082647号に記載されている抗体と本質的に同じS1Pエピトープと結合する。上記のエピトープはマウスおよびヒトのS1Pに関するものであるが、当業者は、マウスおよびヒトのS1Pの構造を他の種のS1Pと整列させ、これらエピトープに対する可能性のある対応物を同定することができることが理解される。抗S1Pアンタゴニストまたは抗S1P受容体アンタゴニスト抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般的に、本明細書においてさらに記載されているような、抗体の刺激および産生のための確立された従来技法に沿うものである。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的な技法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそれ由来の抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株を生成するための基礎として役立つように操作することができることが意図される。典型的には、宿主動物に、本明細書に記載されるものを含む免疫原の一定量を、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および皮内より接種する。ハイブリドーマは、KohlerBandMilsteinCNature256495497の、またはBuckDWetalInVitro18377381により改良された一般的な体細胞ハイブリッド形成技法を用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。ハイブリッド形成には、X63Ag8653、およびtheSalkInstituteCellDistributionCenter、SanDiegoCaliforniaUSAからの骨髄腫株を含むがこれらに限定されない、入手可能な骨髄腫株を使用することができる。一般的に、この技法は、ポリエチレングリコールなどの融合源を使用するか、または当業者に周知の電気的手段により、骨髄腫細胞とリンパ球細胞を融合する段階を含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地などの選択的増殖培地中で増殖させて、ハイブリッド形成していない親細胞を除去することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養には、血清を補充したまたは補充していない、本明細書に記載される培地のいずれかを使用することができる。細胞融合技法の別の代替手段として、EBVによって不死化したB細胞を用いて、本発明の抗S1Pモノクローナル抗体または抗S1P受容体モノクローナル抗体を生成することができる。必要に応じて、ハイブリドーマを増殖させ、サブクローニングすることができ、上清を、従来の免疫測定手順により、抗免疫原活性についてアッセイすることができる。抗体の供給源として使用することのできるハイブリドーマは、S1P、S1P受容体、またはそれらの一部に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞である派生物をすべて包含する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用して、インビトロまたはインビボで増殖させることができる。そこから産生されたモノクローナル抗体は、必要に応じて、硫安沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地または体液から単離することができる。望ましくない活性が存在する場合には、例えば、固相に結合させた免疫原から作製された吸着剤上に調製物を流し、該免疫原から所望の抗体を溶出するまたは遊離させることによって除去することができる。免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、二官能性薬剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、Nヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCh、またはRとRが異なるアルキル基であるRN=C=NRを用いて結合させたS1Pで宿主動物を免疫化することにより、抗体の集団を得ることができる。必要に応じて、関心対象の抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体を配列決定することができ、このポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためにベクター中にクローニングすることができる。関心対象の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中で維持することができ、次いで将来の使用のために該宿主細胞を増殖させ、凍結することができる。別法では、抗体をヒト化するか、または抗体の親和性もしくは他の特徴を改善するために、該ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用することができる。例えば、抗体をヒトの臨床試験および治療において使用する場合には、適切であれば、免疫応答を回避するために、定常領域をヒト定常領域を模倣するように操作することができる。S1Pに対するより高い親和性、およびS1Pの阻害におけるより高い有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい場合がある。抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体に対して1つまたは複数のポリヌクレオチド変化を加えることができ、それでもなおそれぞれS1PおよびS1P受容体に対するその結合親和性が維持され得ることは、当業者に明白であろう。モノクローナル抗体のヒト化は、以下のようにして達成することができる:出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を決定する、ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化過程においてどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定する、ヒト化方法論技法を適用する、ならびにヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第4816567号;第5807715号;第5866692号;第6331415号;第5530101号;第5693761号;第5693762号;第5585089号;および第6180370号を参照されたい。ヒト定常ドメインに融合させた、齧歯類V領域または改変された齧歯類V領域およびそれに伴う相補性決定領域を有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含む多くのヒト化抗体分子が記載されている。例えば、WinteretalNature349293299、LobuglioetalProcNatAcadSciUSA8642204224、ShawetalJImmunol13845344538、およびBrownetalCancerRes4735773583を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前に、ヒト支持フレームワーク領域に移植された齧歯類CDRについて記載している。例えば、RiechmannetalNature332323327、VerhoeyenetalScience23915341536、およびJonesetalNature321522525を参照されたい。別の参考文献は、組換えよって張り合わせた齧歯類フレームワーク領域によって支持された齧歯類CDRについて記載している。例えば、欧州特許出願公開第0519596号を参照されたい。これらのヒト化分子は、ヒトレシピエントにおける齧歯類抗ヒト抗体分子部分の治療適用の期間および有効性を制限する、これら分子に対する望ましくない免疫応答を最小限に抑えるように設計される。例えば、抗体定常領域は、免疫学的に不活性となるように操作することができる。例えば、PCT特許出願公開第PCTGB9901441号;英国特許出願第98099518号を参照されたい。同様に利用することのできる、抗体をヒト化する他の方法は、DaughertyetalNuclAcidsRes1924712476、ならびに米国特許第6180377号;第6054297号;第5997867号;第5866692号;第6210671号;および第6350861号;ならびにPCT特許出願公開第WO0127160号によって開示されている。LT1O09はヒト化抗体の一例である。さらに別の代替手段では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用して、完全なヒト抗体を得ることができる。より望ましいまたはより強固な免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成に使用することもできる。このような技術の例は、AbgenixIncからのXenomouse、ならびにMedarexIncからのHuMAbMouseおよびTCMouseである。別法では、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、抗体を組換えによって作製し、発現させることができる。例えば、抗体を、ファージディスプレイ技術によって組換えで作製することができる。例えば、米国特許第5565332号;第5580717号;第5733743号;および第6265150号;ならびにWinteretalAnnuRevImmunol12433455を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにおいてヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13またはfdなどの糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面上に提示される。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づく選択によって、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も行われる。したがって、ファージはB細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは様々な形式で行うことができる;総説については、例えば、JohnsonKevinSandChiswellDavidJCurrentOpinioninStructuralBiology3564571を参照されたい。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。ClacksonetalNature352624628は、免疫化したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。MarketalJMolBiol222581597、またはGriffithetalEMBOJ12725734により記載されている技法に本質的に従って、非免疫化ヒトドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。自然の免疫応答では、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する。導入された変化の一部は、より高い親和性を付与することになり、高親和性の表面免疫グロブリンを提示するB細胞は、その後の抗原攻撃の際に優先的に複製され、分化する。この自然の過程は、鎖シャフリングとして知られている技法を使用して模倣することができる。MarksetalBioTechno10779783。この方法では、重鎖および軽鎖V領域遺伝子を、非免疫化ドナーから得られたVドメイン遺伝子の天然変種のレパートリーと順次置換することによって、ファージディスプレイによって得られた一次ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技法により、pM~nM範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能になる。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製するための戦略は、WaterhouseetalNuclAcidsRes2122652266に記載されている。遺伝子シャフリングを使用して、齧歯類抗体から、その出発齧歯類抗体と同様の親和性および特異性を有するヒト抗体を導出することもできる。エピトープ刷り込みとも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法よって得られた齧歯類抗体の重鎖または軽鎖Vドメイン遺伝子が、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーと置換され、齧歯類ヒトキメラが創出される。抗原上での選択により、機能的抗原結合部位を回復させることのできるヒト可変領域が単離される、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する。残りの齧歯類Vドメインを置換するためにこの過程を繰り返すと、CDR移植による齧歯類抗体のヒト抗体ヒト化、この技法は、齧歯類起源のフレームワークもCDR残基も有さない完全なヒト抗体を提供する。上記の論述はヒト化抗体に関係するものであるが、論述された一般原理が、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシで使用するための抗体をカスタマイズするのに適用可能であることは明白である。本明細書に記載される、抗体をヒト化する1つまたは複数の局面を、例えば、CDR移植、フレームワーク突然変異、およびCDR突然変異と併用できることもさらに明白である。抗体は、最初に宿主動物から抗体および抗体産生細胞を単離し、遺伝子配列を取得し、その遺伝子配列を使用して、宿主細胞内で抗体を組み換えによって発現させることにより、組み換えで作製することができる。使用することのできる別の方法は、植物またはトランスジェニック乳汁中で抗体配列を発現させることである。植物または乳汁中で抗体を組換え発現させる方法が開示されている。例えば、PeetersetalVaccine192756;LonbergNandDHuszarIntRevImmunol1365;およびPollocketalJImmunolMethods231147を参照されたい。抗体の派生物、例えば、ヒト化、一本鎖等を作製するための方法は当技術分野で公知である免疫測定法、および蛍光活性化細胞選別などのフローサイトメトリー選別技法を使用して、S1PまたはS1P受容体に特異的な抗体を単離することもできる。本発明による抗体は、必要に応じて、異なる担体に結合させることができる。担体は、活性があっても不活性であってもよい。周知の担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的のために、担体の性質は可溶性または不溶性のいずれかであってよい。当業者は、抗体を結合させるための他の適切な担体を知っているか、または日常的な実験を用いてそのようなものを確認することができる。いくつかの局面において、担体は心筋を標的とする部分を含む。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて、容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離されたならば、このDNAを発現ベクター中にクローニングし、次にこれを、モノクローナル抗体を合成する目的で、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトする。例えば、PCT特許出願公開第WO8704462号を参照されたい。DNAはまた、例えば、相同的なマウス配列に換えてヒト重鎖および軽鎖定常ドメインを置換することにより、MorrisonetalProcNatAcadSci81685J、または免疫グロブリンコード配列に対して、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体もしくは一部を共有結合させることによって、改変することもできる。このようにして、本明細書における抗S1Pモノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラまたはハイブリッド抗体が調製される。抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて特徴づけることができる。例えば、1つの方法は、それが結合するエピトープ同定すること、またはエピトープマッピングである。例えば、Chapter11ofHarlowandLaneUsingAntibodiesaLaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork1999に記載されているような、抗体抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし、特徴づけるための、当技術分野で公知の多くの方法が存在する。さらなる例において、エピトープマッピングを用いて、抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、PepscanSystemsなどのさまざまな供給元より市販されている。エピトープは、線状のエピトープであってよく、すなわち一続きのアミノ酸中に含まれてよく、または必ずしも一続きの中に含まれなくてもよい、アミノ酸の三次元相互作用によって形成される高次構造的エピトープであってもよい。様々な長さのペプチドを単離するか、または合成し、抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体との結合アッセイに使用することができる。抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体を特徴づけるために用いることのできるさらに別の方法は、同じ抗原に結合することがわかっている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定することである。競合アッセイは、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。1つの態様では、発現ベクターを用いて、抗S1P抗体または抗S1P受容体抗体の発現を、それを必要とする患者における治療目的を含め、インビボで指示することができる。当業者は、インビボで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第6436908号;第6413942号;および第6376471号を参照されたい。発現ベクターの投与には、注射、経口投与、微粒子銃、またはカテーテル投与、および局所投与を含む、限局投与または全身投与が含まれる。別の局面では、発現ベクターを、交感神経幹もしくは神経節に直接、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に投与する。発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的化送達を用いることもできる。受容体媒介性DNA送達技法は、例えば、FindeisetalTrendsBiotechnol11202;ChiouetalGeneTherapeuticsMethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer;WuetalJBiolChem263621;WuetalJBiolChem269542;ZenkeetalProcNatlAcadSci873655;WuetalJBiolChem266338に記載されている。遺伝子治療プロトコールでは、限局投与のために、ポリヌクレオチドを含む治療組成物を約100ng~約200mgのDNAの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコールの期間に、約500ng~約50mg、約1μg~約2mg、約5μg~約500μg、および約20μg~約100μgの濃度範囲のDNAを用いることもできる。治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであってよい151;KimuraHumanGeneTherapy5845;ConnellyHumanGeneTherapy1185;およびKaplittNatureGenetics6148を参照されたい。このようなコード配列の発現は、内因性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。コード配列の発現は、構成的または調節性のいずれかであってよい。所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターが、当技術分野で周知である。ウイルスに基づく例示的なビヒクルには、組換えレトロウイルス、アルファウイルスに基づくベクター、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。CurielHumGeneTher3147に記載されているような、死滅アデノウイルスに連結されたDNAの投与も、使用することができる。非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法を使用することもでき、これには、単独の死滅アデノウイルスに連結されたまたは連結されていないポリカチオン性濃縮DNA3147を参照されたい;リガンド結合DNA26416985を参照されたい;真核細胞送達ビヒクル細胞、および核酸電荷中和または細胞膜との融合が含まれるが、これらに限定されない。裸のDNAを使用することもできる。裸のDNAの例示的な導入法は、PCT特許出願公開第WO9011092号および米国特許第5580859号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働き得るリポソームは、米国特許第5422120号;PCT特許出願公開第WO9513796号;第WO9423697号;第WO9114445号;およびEP0524968に記載されている。さらなるアプローチは、PhilipMolCellBiol142411、およびWoffendinProcNatlAcadSet911581に記載されている。非抗体のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニスト本発明の別の局面では、抗S1P抗体または抗S1P受容体以外のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを使用することができる。本発明のいくつかの局面において、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストは、少なくとも1つのS1P活性の発現を阻止し得るかまたは減少させ得る少なくとも1つのアンチセンス分子を含む。スフィンゴシンキナーゼ、およびS1P1を含むS1P受容体のヌクレオチド配列は公知であり、公的に利用可能なデータベースから容易に入手可能である。他のポリヌクレオチドと交差反応することなく、スフィンゴシンキナーゼmRNAまたはS1P受容体mRNAと特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を調製することが通例である。例示的な標的部位には、開始コドン、5調節領域、コード配列、および3非翻訳領域が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの局面において、オリゴヌクレオチドは、約10~100ヌクレオチド長、約15~50ヌクレオチド長、約8~25ヌクレオチド長、またはそれ以上である。オリゴヌクレオチドは、例えば、当技術分野で周知のホスホロチオエート結合および2O糖修飾などの骨格修飾を含み得る。あるいは、S1Pの発現および放出ならびにS1P受容体発現は、当技術分野において周知の方法である遺伝子ノックダウン、モルホリノオリゴヌクレオチド、RNAi、またはリボザイムを用いて減少させることができる。他の局面において、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストは、少なくとも1つのスフィンゴシンキナーゼ、S1P、およびS1P受容体阻害化合物を含む。本明細書において用いられる阻害化合物とは、特定の標的であるスフィンゴシンキナーゼ、S1P、またはS1P受容体の生物活性を直接または間接的に減少させる、阻害する、中和する、または消失させる、抗体以外の化合物を指す。スフィンゴシンキナーゼ、S1P、またはS1P受容体阻害化合物は、以下の特徴のうちのいずれか1つまたは複数を示すべきである:その標的であるスフィンゴシンキナーゼ、S1P、またはS1P受容体のうちの少なくとも1つに結合し、標的生物活性、およびS1P機能によって媒介される下流経路を阻害する;神経因性疼痛、炎症性疼痛、または痛覚過敏の任意の局面を予防する、寛解させる、または治療する;S1P受容体活性化を阻止するまたは減少させる;ならびにS1Pのクリアランスを増加させる。いくつかの局面において、S1P阻害化合物はS1Pと結合する。例示的な標的部位には、S1P受容体に結合するS1Pの部分、および受容体結合領域に隣接し、受容体結合部分の正確な三次元形状に一部関与するS1Pの部分が含まれるが、これらに限定されない。別の局面において、S1P阻害化合物はS1P受容体と結合し、S1P生物活性を阻害する。他の局面において、S1P阻害化合物はスフィンゴシンキナーゼと結合して、S1P生物活性を阻害する。いくつかの局面において、S1P阻害化合物は小分子である。小分子は、100~20000ダルトン、500~15000ダルトン、または1000~10000ダルトンのうちのいずれかのあたりの分子量を有し得る。小分子のライブラリーは市販されている。小分子阻害剤は、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、または経皮的を含む、当技術分野で公知の任意の手段を用いて投与することができる。一般的に、本発明によるスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストが小分子である場合、これは、1~3回またはそれ以上の用量に分割された、01~300mgkg患者体重の用量で投与される。成人患者については、1回用量当たり1mg~5gの範囲の用量を投与することができる。他の局面において、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P1受容体アンタゴニストは、少なくとも1つのS1P構造類似体を含む。本発明におけるS1P構造類似体とは、S1Pの三次元構造の少なくとも一部と類似した三次元構造を有し、インビトロまたはインビボにおいて生理的条件下でスフィンゴシンキナーゼまたはS1P受容体に結合し、該類似体の結合がS1P生物活性またはS1P二次メッセンジャー活性を少なくとも部分的に阻害する化合物を指す。1つの局面において、S1P構造類似体はS1P1受容体に結合する。適切なS1P構造類似体は、例えばPCT特許出願公開第WO9606048号に記載されている方法により、S1P受容体結合の分子モデリングによって設計および合成することができる。本発明に従って、アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的化送達を用いることもできる。受容体媒介性DNA送達技法は、例えば、FindeisetalTrendsBiotechnol11202;ChiouetalGeneTherapeuticsMethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer;WuetalJBiolChem263621;WuetalJBiolChem269542;ZenkeetalProcNatlAcadSci873655;WuetalJBiolChem266338に記載されている。遺伝子治療プロトコールでは、限局投与のために、ポリヌクレオチドを含む治療組成物を約100ng~約200mgのDNAの範囲で投与する。いくつかの局面では、遺伝子治療プロトコールの期間に、約500ng~約50mg、約1μg~約2mg、約5μg~約500μg、および約20μg~約100μgの濃度範囲のDNA、またはそれ以上を用いることもできる。本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであってよい一般的に、JollyCancerGeneTherapy151;KimuraHumanGeneTherapy5845;ConnellyHumanGeneTherapy1185;およびKaplittNatureGenetics6148を参照されたい。このようなコード配列の発現は、構成的または調節性発現を達成するために、内因性の哺乳動物のまたは異種のプロモーターおよびエンハンサーを用いて制御することができる。所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターが、当技術分野で周知である。ウイルスに基づく例示的なビヒクルには、組換えレトロウイルス、アルファウイルスに基づくベクター、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。CurielHumGeneTher3147に記載されているような、死滅アデノウイルスに連結されたDNAの投与も、使用することができる。非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法を使用することもでき、これには、単独の死滅アデノウイルスに連結されたまたは連結されていないポリカチオン性濃縮DNA例えば、CurielHumGeneTher3147を参照されたい;リガンド結合DNA例えば、WuJBiolChem26416985を参照されたい;真核細胞送達ビヒクル細胞例えば、米国特許第5814482号;PCT特許出願公開第WO9507994号;第WO9617072号;第WO9530763号;および第WO9742338号を参照されたい、および核酸電荷中和または細胞膜との融合が含まれるが、これらに限定されない。裸のDNAを使用することもできる。裸のDNAの例示的な導入法は、PCT特許出願公開第WO9011092号および米国特許第5580859号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働き得るリポソームは、米国特許第5422120号;PCT特許出願公開第WO9513796号;第WO9423697号;第WO9114445号;および欧州特許第0524968号に記載されている。さらなるアプローチは、PhilipMolCellBiol142411、およびWoffendinProcNatlAcadSci911581に記載されている。発現ベクターを用いて、本明細書に記載される、タンパク質に基づくスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストのいずれかの発現を指示することができることもまた明白である。S1P受容体アゴニストさらなる局面において、本発明はS1P受容体アゴニストを使用する治療法を提供し、S1P受容体アゴニストとは、受容体結合およびS1Pに対する細胞応答の誘発などの、S1Pシグナル伝達によって媒介される下流経路を含むS1P受容体生物活性を誘導する任意の分子を指す。いかなる特定の理論によっても縛られることはないが、S1P受容体アゴニストは、それらが再循環できないようにS1P受容体の内部移行および分解を引き起こし、神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性の有効な治療をもたらすようである。したがって、この局面において、本発明は、S1P受容体アゴニストの有効量を投与する段階を含む、個体における神経因性疼痛、炎症性疼痛、過敏症、および抗侵害受容性耐性を治療する方法を提供する。アゴニストという用語は、生物学的作用の特定の機構を意味するのではなく、種々の異なる、化学的に多岐にわたる組成物によって達成され得る、S1P受容体とのすべての可能な薬理学的、生理学的、および生化学的相互作用、ならびにその結果を明白に含み、包含すると見なされる。1つの局面において、S1P受容体アゴニストは、インビトロまたはインビボにおいて生理的条件下でS1P受容体に結合し、その結合がS1P受容体に対するアゴニスト作用を発揮するスフィンゴシンおよびS1P構造類似体である。S1P1~5などのすべての種類のS1P受容体のアゴニストが許容可能であるが、S1P1のアゴニストが好ましい。S1P構造類似体は、S1P受容体のS1P結合部位に結合すると考えられる。しかしながら、アゴニストは、そのような結合がアゴニスト作用をもたらすのであれば、S1P結合部位以外の部位に結合してもよい。例示的なアゴニストには、フィンゴリモド、NovartisPharmaAG、NewYork、BAF312、ポネシモド、ONO4641、CS0777、KRP203、PF991、およびW146が含まれるが、これらに限定されないNatRev9Nov2010883897;HlaTetalNeurology201176S3;CusacketalCurrOpinDrDiscandDev13481488;StraderetalJNatProd201174900907。フィンゴリモドが特に好ましい。S1P受容体アゴニストが小分子である局面において、小分子は、100~20000ダルトン、500~15000ダルトン、または1000~10000ダルトンのうちのいずれかのあたりの分子量を有し得る。小分子のライブラリーは市販されている。小分子は、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、または経皮的を含む、当技術分野で公知の任意の手段を用いて投与することができる。一般的に、本発明によるS1P受容体アゴニストが小分子である場合、これは、1~3回またはそれ以上の用量に分割された、01~300mgkg患者体重の割合で投与される。標準体重の成人患者については、1回用量当たり1mg~5gの範囲の用量を投与することができる。本発明の方法において使用するための組成物本発明の方法において使用される組成物は、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストの有効量を含み、いくつかの局面においては、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの局面において、組成物は、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するためのものである。このような組成物の例および製剤化する方法は、前章および以下にも記載されている。1つの局面において、組成物は、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを含む。別の局面において、組成物は、1つまたは複数のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを含む。いくつかの局面において、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストは、有害な免疫応答を伴わない。いくつかの局面において、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P1受容体アンタゴニストは、抗S1P抗体、抗S1P1受容体抗体、S1P1受容体に対するアンチセンス分子、S1P受容体に対するアンチセンス分子、およびS1P阻害化合物、S1P構造類似体からなる群より選択される。別の局面において、S1PアンタゴニストまたはS1P1受容体アンタゴニストは抗S1P抗体である。他の局面において、抗S1P抗体はヒトS1Pを認識する。いくつかの局面において、抗S1P抗体はヒトである。さらなる他の局面において、抗S1P抗体はヒト化されている。さらなる他の局面において、抗S1P抗体は、抗体媒介性溶解またはADCCなどの、不要なまたは望ましくない免疫応答を誘発しない定常領域を含む。他の局面において、抗S1P抗体は、抗体LT1009の1つまたは複数のCDRを含む。本発明による組成物は、2つ以上のスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを含み得る。例えば、組成物は、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストのあるクラスの2つ以上のメンバー、およびS1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストの異なるクラスのメンバーを含み得る。他の例示的な組成物は、同じエピトープを認識する2つ以上の抗S1P抗体、S1P受容体の異なるエピトープに結合する異なる種の抗S1P抗体、または異なるS1P阻害化合物を含む。本発明による組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤LippincottWilliamsandWilkinsEdKEHooverをさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、本明細書においてさらに記載されている。スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニスト、およびそれらの組成物はまた、該アンタゴニストおよびまたはアゴニストの有効性を高めるおよび補完するのに役立つ他の薬剤と併用することができる。例えば、神経因性疼痛、炎症性疼痛、痛覚過敏、および異痛症の治療のために、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストを、1つまたは複数の他の鎮痛薬、NSAID、またはステロイド剤と共に投与することができる。鎮痛薬には、アセトアミノフェン、トラマドール、カプサイシンが含まれるが、これらに限定されない。NSAIDの例は、アスピリンを含むアセチル化サリチル酸;サルサラート、ジフルニサルを含む非アセチル化サリチル酸;エトドラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトンを含む酢酸;フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジンを含むプロピオン酸;メクロフェナム酸、メフェナム酸を含むフェナム酸;フェニルブタゾン、ピロキシカム;セレコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ルミラコキシブを含むCOX2阻害剤である。例示的なステロイド剤には、関節内コルチコステロイドが含まれる。本発明のアゴニストおよびアンタゴニストを含むキット本発明はまた、検出および治療において使用するための、スフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1P受容体アゴニスト、S1P受容体アゴニスト、およびS1P受容体アンタゴニストを含むキットを提供する。キットは、例えば、神経因性疼痛、炎症性疼痛、痛覚過敏、および異痛症を有する個体を治療することをはじめとする、本明細書に記載される方法のいずれかのために使用することができる。キットは任意に、緩衝液などの付加的な成分、および本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、抗体などのS1P受容体アゴニストおよびアンタゴニストを使用するための説明書を提供し得る。いくつかの局面において、キットは、疼痛を治療するための説明書を含む。いくつかの局面において、キットは、本明細書に記載されるS1Pアゴニストおよび抗体、ならびに個体における、癌性疼痛、炎症性疼痛、および痛覚過敏などの疼痛を治療するための説明書を含む。他の局面において、キットは、本明細書に記載されるスフィンゴシンキナーゼアンタゴニスト、S1Pアンタゴニスト、S1Pアゴニスト、またはS1P受容体アンタゴニストのうちの1つまたは複数、および個体における痛覚過敏を治療するための説明書を含む。実験グリアと共局在し、ニューロンとは共局在しない、S1Pの生合成における前駆体であるセラミド7日間にわたって生理食塩水の慢性皮下注入を受けたラットと比較して、同じ時間枠にわたるモルヒネの注入は、1浸透圧ミニポンプの埋め込み前の足逃避潜時と比較した、3日目および6日目における足逃避潜時の有意な減少によって明らかな熱痛覚過敏の発生同じ時間枠にわたる抗侵害受容性耐性の発生をもたらした。後者は、7日間にわたって生理食塩水の注入を受けたラットと比較した場合の、同じ時間枠にわたって慢性モルヒネ注入を受けたラットにおける、3日目および6日目の、腹腔内投与した急性用量のモルヒネによる誘発の30分後の、テールフリック潜時の有意な減少によって示された。6日目に観察されたモルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生は、腰膨大からの脊髄の表層におけるものをはじめとする、免疫蛍光によって検出されたセラミド形成の有意な増加と関連しており、以前の研究が確認された。興味深いことに、セラミドはアストロサイトアストロサイトの細胞マーカーであるGFAP、グリア線維性酸性タンパク質を使用およびミクログリア細胞ミクログリアの細胞マーカーであるIba1、イオン化カルシウム結合アダプター分子1を使用において優先的に上方制御され、共局在したが、ニューロンではそのようなことはなかった。単一の標識を示す個々の写真を、図17~図19に示す。3日目および6日目に観察されたモルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生は、スフィンゴ脂質の抽出後にELISAによって測定された、後角組織におけるS1Pレベルの有意な形成増加と関連していた。セリンパルミトイルトランスフェラーゼの阻害剤であるミリオシン;セラミド合成酵素の競合的かつ可逆的阻害剤であるFB1、またはスフィンゴミエリナーゼの阻害剤であるD609の連日ith注射とのモルヒネの同時投与により、S1Pの産生増加、ならびに痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生が阻止された。これらの用量において、これらの阻害剤が脊髄におけるセラミドの形成を効果的に阻止することは、以前に示されていた。モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生を阻止するS1P生合成の阻害剤脊髄で形成されたS1Pが、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性に寄与する重要な二次メッセンジャーであるということが、スフィンゴシンキナーゼによって触媒されるセラミドのS1Pへの酵素的生物変換の阻害剤を用いた以下の研究において確証された。3日目および6日目に観察されるように、スフィンゴシンキナーゼの、構造的に非関連でかつ一般的に使用される2つの阻害剤、すなわちDMSまたはSKIの連日ith注射とのモルヒネの同時投与により、後角組織におけるS1Pの産生増加、ならびに痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生が阻止された。DMSまたはSKIの完全な用量反応曲線を、最大効果の時点において、図1E、図1Dおよび図15B、ならびに図1Hに示す。これらの結果から、S1Pシグナル伝達経路に対するスフィンゴシンキナーゼの役割が確証される。これらの薬物は、生理食塩水注入を受けたラットに6日間にわたって毎日単独で投与した場合、試験したいずれのパラメータにも影響を及ぼさなかった。7日間にわたり生理食塩水の慢性sc注入を受けたラットと比較して、同じ時間枠にわたるMry、FBI、D609、DMS、またはSKIの注入は、6日目に測定して、足逃避潜時に影響を及ぼさず、急性モルヒネに対する抗侵害受容反応に影響を及ぼさず、また脊髄組織におけるS1Pレベルに影響を及ぼさなかった。表1実験パラメータに及ぼす様々な化合物のインビボでの影響結果は、n=動物5匹についての平均値±SEMとして表してある。急性モルヒネを注射する前の、6日目における全群からのテールフリック潜時のベースライン値は、統計的に有意ではなく、2~3秒の範囲であった。DMSまたはSKIの急性ith注射によるS1Pの阻害は、ひとたび確立された耐性を逆転させることはなく、セラミド由来のS1Pは、耐性の発生をもたらす事象に寄与するが、耐性の発現をもたらす事象には寄与しないことが示される。さらに、セラミドまたはS1Pの阻害によって急性侵害受容は阻害されなかったため、これらのメディエータは正常な疼痛シグナル伝達には関与していないようである。予備研究から、カテーテル処置を受けた動物が未処置の動物と同様のベースライン侵害受容閾値を示すことが明らかに実証されたが、慢性的なithカテーテルが、疼痛処理の変化を引き起こす脊髄環境に影響を及ぼし得るという可能性を排除することはできない。しかしながら、本発明者らが知っている限りでは、この種の懸念事項は検証されていない。同様に、一時的なまたは反復される直接的腰椎注射が、やはり疼痛処理の変化を引き起こし得る脊髄環境に影響を及ぼすという可能性も排除することができない。グリア関連サイトカインの形成を増加させることによって、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に寄与するS1P非耐性動物と比較して、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生は、アストロサイトおよびミクログリア細胞における、それぞれGFAPおよびIba1免疫蛍光の発現の誘導;ならびにウェスタンブロットによるタンパク質発現の誘導、ならびに後角組織におけるTNFα、IL1β、およびIL6の有意な増加と関連していた。DMSのith送達とのモルヒネの同時投与により、DMSによって誘発されるこれらマーカーのグリア細胞発現増加が有意に弱められ、ならびにTNFα、IL1β、およびIL6の産生増加が有意に弱められた。グリア関連GLTIおよびGSのニトロ化を介して、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生に寄与するS1Pペルオキシ亜硝酸は、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生における重要な成分である。データから、後角の表層における3ニトロチロシンの形成が、脊髄のPN産生から生じることが示された。したがって、この設定におけるNTの検出は、PNのマーカーとして信頼して使用することができる。非耐性ラットと比較して、耐性ラットにおけるNT染色の出現が、DMSとのモルヒネの同時投与によって阻止されたことが、今回示されているおよびグルタミン酸合成酵素が、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生中に、脊髄においてPNによってニトロ化されることが見出された。これらのタンパク質のニトロ化は、それらの生物学的機能の不活性化と密接に関連しており、それらの不活性化は、中枢性感作にとって重要であるグルタミン酸作動性神経伝達の増強によって顕在化する重要な派生的影響を有する。図5に見られ得るように、非耐性動物と比較して、抗侵害受容性耐性および痛覚過敏の発生はGLT1およびGSのニトロ化と関連しており、これはDMSのith送達により有意にに弱められ、よってS1P形成を導く慢性モルヒネ投与と、GLT1およびGSのPN媒介性ニトロ化との関連性が確証される。GLT1およびGSの全タンパク質レベルは、様々な群の間で変化しなかった。付加的な実験本教示の局面は、以下の例に照らしてさらに理解され得るが、これらの例は、本教示の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。S1P活性および神経因性疼痛の評価材料および方法実験動物雄のSpragueDawleyラットはHarlanから購入し、ケージ当たり3~4匹を収容し、食糧および水が自由に摂取できるようにした制御された環境で維持した。実験はすべて、実験動物福祉に関する国際疼痛学会および米国立衛生研究所の指針、ならびにSaintLouisUniversity施設内動物実験委員会による推奨に従って行った。UniversityofMagnaGraecia、CatanzaroItalyにおける動物の使用も同様に、実験および他の科学目的に用いられる動物の保護に関するイタリア規制、ならびに欧州連合規制に従った。実験はすべて、処置条件を知らされていない実験者によって行われた。浸透圧ポンプの埋め込み軽いイソフルラン麻酔下のラットの皮下に浸透圧ポンプを埋め込んで、記載されているように、1μl時間の生理食塩水または75μgμl1時間1のモルヒネを7日間にわたって送達した。ミニポンプは、製造業者の仕様書に従って充填した。浸透圧ポンプの使用により、間欠的な休薬期を回避したモルヒネの持続的送達が確実になる。ポンプ送達系の完全性は、脊髄を摘出した各実験の終了時に再点検した。薬物投与被験物質であるフモニシンB1、ミリオシン、D609、DMS、SKI24チアゾール、Calbiochem、SanDiegoCA、またはそれらのビヒクルは、以前に記載されたように、髄腔内カニューレが慢性的に埋め込まれたラットにおいて、ith注射により送達した。被験物質は、全量10μlで、それに続き無菌生理食塩水を10μl流して、1日に1回、6日間にわたってith注射した。行動試験熱痛覚過敏Hargreavesらの方法を用いて、熱侵害受容刺激に対するベースライン侵害受容反応の変化を評価した。動物は、静かな試験室において、透明なガラスプレート上のPlexiglasの囲い内で順応させた。組織損傷を防ぐために、18~20秒というベースライン潜時および20秒という最大カットオフ時間で、放射熱源を後足の足底面に集中させた。足逃避潜時は、足逃避によって作動した動作検出器がタイマーを停止することによって決定される。ミニポンプの埋め込みの前日、ならびにそれに続いて実験期間の1日目、3日目、および6日目に足逃避潜時を得て、モルヒネ耐性動物が熱刺激に対する感受性増加を生じるかどうかを判定した。浸透圧ミニポンプの埋め込み前との経時的な足逃避潜時の有意な減少を、熱痛覚過敏と特徴づける。Hargreaves試験の後、すべての動物において、以下のようにして抗侵害受容性耐性の発生を決定した。急性侵害受容。有害な放射熱源からの尾の逃避潜時を測定するテールフリック試験を用いて、組織傷害を防ぐために、4~5秒というベースライン潜時および10秒というカットオフ時間で、熱侵害受容感受性を測定した。モルヒネの抗侵害受容作用に対する耐性は、この用量で最大抗侵害受容を生じることが以前に実証された時間である、急性用量のモルヒネによる誘発後の、注射時点の30分後の、テールフリック潜時の有意な減少によって示された。得られたデータは、以下のようにして最大可能抗侵害受容作用に対する割合に変換した:×100。被験物質またはビヒクルは、行動試験の完了後、0~6日目に投与した。行動試験後の必要な時点で、脊髄の腰膨大セグメント由来の脊髄組織および後角組織を採取し、免疫組織化学的解析、ウェスタンブロット解析、および生化学的解析のために組織を処理した。実験はすべて、処置条件を知らされていない実験者によって行われた。免疫組織化学的検出および免疫蛍光検出脊髄内のニトロ化タンパク質については、腰椎切片を固定し、十分に特徴づけられたモノクローナル抗ニトロチロシン抗体を用いて、記載されているように免疫組織化学染色用に処理した。処理した試料を、製造業者の説明書に従って二次抗体、NB複合体、およびジアミノベンジジンを用いて、免疫標識について可視化した。脊髄におけるセラミド発現については、ホルマリン固定し、OCT包埋した脊髄腰部から10lmの切片を作製し、使用時まで20°Cで保存した。切片をPBSでリンスし、40mlのDIVAデクローカー中に浸漬し、100°Cの圧力釜中で5分間、抗原回復に供した。スライドを室温まで冷却し、PBSでリンスし、ブロッキング緩衝液、および025TritonXI00中で、RTで加湿しながら2時間インキュベートした。ブロッキングした切片をPBSでリンスし、希釈したブロッキング緩衝液中の、十分に特徴づけられたウサギポリクローナル抗セラミド抗体、ならびにニューロン用のマウスモノクローナル抗NeuN、アストロサイト用のマウスモノクローナル抗GFAP、またはミクログリア用のマウスモノクローナル抗Iba1を用いて、4°Cで加湿しながら16時間かけて二重標識した。切片をPBSでリンスし;希釈したブロッキング緩衝液中のヤギ抗ウサギローダミンおよびヤギ抗マウスAlexafluor488を用いて、RTで加湿しながら2時間かけてタンパク質を検出した。PBSでリンスした後、DAPIを含むVectaShield中に切片を封入し、カバーガラスを乗せ、OlympusFV1000MPE共焦点顕微鏡で写真撮影した。切片を、一次抗体と等しい濃度の標準ウサギIgGまたは標準マウスIgGで処理し、非特異的なバックグラウンド蛍光のみを生じる対照として使用した。免疫沈降および免疫ブロッティング以前に記載されているように、サイトゾル画分およびP2膜を取得し、80°Cで直ちに保存した。免疫沈降解析およびウェスタンブロット解析は、記載されているように行った。電気泳動転写の前に、タンパク質を75、10、または420SDSPAGEで分離した。膜を、TBST、150mMNaCl、001Tween20および01チメロサール中の1BSA中、室温で1時間ブロッキングし;次に、マウスモノクローナル抗グルタミン合成酵素抗体、ポリクローナルウサギ抗GLT1抗体、モノクローナルマウス抗GFAP抗体、またはポリクローナルヤギ抗Iba1抗体でプロービングした。膜をTBSTで洗浄し、RTで時間の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体、および高感度化学発光で可視化した。神経組織によって発現されたタンパク質の大部分を含むラット脳溶解物を、陽性対照として使用した。ブロットを剥がし取り、マウスモノクローナル抗アクチン抗体でプロービングした。ImageQuant52ソフトウェアを用いて、フィルムから関心対象のタンパク質バンドの相対密度を決定し、βアクチンバンドに対して正規化した。データの統計解析データは、統計的有意差をP値<005と定義して使用される分散分析およびその後のダネットの事後検定によって解析した。統計解析はすべて、GraphPadPrismを使用して行った。化学療法誘発性の神経因性疼痛実験動物Harlanからの雄のSpragueDawleyラットまたはマウスは、食糧および水が自由に摂取できるようにした制御された環境において、ケージ当たり3~4匹を収容した。実験はすべて、実験動物福祉に関する国際疼痛学会および米国立衛生研究所の指針、ならびにSaintLouisUniversity施設内動物実験委員会による推奨に従って行った。実験はすべて、処置条件を知らされていない実験者によって行われた。パクリタキセル誘発性:パクリタキセル誘発性疼痛は、Bennettよって開発された、十分に特徴づけられたラットモデルを用いて研究され、このモデルでは、低用量のパクリタキセルの反復腹腔内注射を施すと、全身毒性または運動障害のほとんどない神経因性疼痛が誘発される。行動反応は数週間~数カ月間持続し、そのため患者における有痛性ニューロパチーのモデルとなる。パクリタキセルまたはそのビヒクルは、1日おきに4回、ラットにip注射した。MnTE2PyP5、W146、W140、またはそれらのビヒクルは、以前に記載されており、薬物送達のために一般的に用いられるL5L6腰椎アプローチ;SchoenigerSkinnerBrainBehavImmun21660667;DoyleetalNeurosciLettを用いて、髄腔内カニューレが慢性的に埋め込まれたラットにおいて、ith注射により送達した。薬物は、0日目からその後D15まで毎日、パクリタキセルまたはそのビヒクルの30分前に注射した。別の実験セットでは、フィンゴリモドまたはそのビヒクルを、D0からD15まで腹腔内注射により投与した;D0およびベースラインにおいて、ならびにそれに続きD12、D16、およびD22において、行動試験を行った。オキサリプラチンおよびボルテゾミブ誘発性:オキサリプラチンまたはそのビヒクルは、最終累積用量が10mgkgになるように、5日間連続でラットにip注射した。ボルテゾミブまたはそのビヒクルは、最終累積用量が1mgkgになるように、5日間連続でラットにip注射した。フィンゴリモドまたはそのビヒクルは、D0からD15まで腹腔内注射により投与した;D0およびベースラインにおいて、ならびにそれに続きD12、D16、およびD22において、行動試験を行った。行動試験:0日目のベースラインにおいて、すべてのラットからベースライン値を得た。次に研究中の薬物またはビヒクルを投与し、その30分後に化学療法薬またはビヒクルを投与した。その後、D12、D16、およびD22において行動試験を行った。機械的異痛症および機械的痛覚過敏機械的逃避閾値は、vonFrey試験の自動電子型を用いて評価した。各ラットをPlexiglasチャンバー内に入れ、15分間順応させた。順応後、サーボ制御機械刺激を足底面に加えたが、この刺激は、10秒以内に50gにまで達する、漸増する点状圧力を加える。明らかな自発的な後足逃避反応を誘起する圧力が自動的に記録され、これを機械的閾値指数と見なした。機械的閾値は各時点で3回評価して、平均値を得て、これは平均絶対閾値として報告される。機械的異痛症の発生は、パクリタキセル処置前には逃避反応を誘発することができなかった力での機械的平均絶対足逃避閾値の有意な減少によって証明される。機械的痛覚過敏は、UgoBasile無痛覚計を用いるRandallおよびSellitto足圧試験6により評価したが、この無痛覚計は、ラットの後足の背部に対して直線的に増加する機械力を加える。侵害受容閾値は、ラットがその足を引っ込める際の力と定義した。パクリタキセル処置は、両側性の異痛症および痛覚過敏をもたらす。いずれの群のいずれの時点においても、左と右の後足で閾値は異ならなかったため、さらなる解析およびデータ表示に関して、両足からの値を平均化した。パクリタキセル、または試験した実験的被験物質の存在下でのパクリタキセルの投与を受けた動物は、毒性の徴候を示さなかった;これらの動物は、正常な姿勢、毛づくろい、運動行動を示し、被毛は正常であり、立毛またはポルフィリンの徴候はなく、かつ体重増加は正常であり、ビヒクル処置ラットに匹敵した。スフィンゴミエリナーゼ活性の決定スフィンゴミエリナーゼ活性は、製造業者の説明書に従って、Amplex赤色スフィンゴミエリナーゼアッセイキットを利用して測定した。最初に、ラットの脊髄または末梢神経組織を、以前に記載されているように特定の緩衝液中でホモジナイズした。酸性スフィンゴミエリナーゼ活性の検出には、溶解緩衝液中に酢酸ナトリウムを使用した。加えて、リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を検出するには、溶解緩衝液にEDTAを添加した。中性スフィンゴミエリナーゼ活性アッセイについては、Hepesを含む溶解緩衝液中で組織をホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料をスフィンゴミエリンと共に37°Cで05時間プレインキュベートし、次いでスフィンゴミエリナーゼ活性を蛍光マイクロプレートリーダーにおいて15時間かけて測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、タンパク質濃度により正規化して、mUsとして表した。陽性対照として、過酸化水素および精製スフィンゴミエリナーゼを使用した。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性の決定:SPT活性は、以前に記載された方法に従って、3Hセリンの3ケトスフィンガニンへの取り込みを測定することにより決定した。SPT活性は、カウント数分により測定して、タンパク質濃度により正規化した。免疫蛍光検出脊髄におけるセラミド発現については、ホルマリン固定し、OCT包埋した脊髄腰部から10μmの切片を作製し、使用時まで20°Cで保存した。切片をPBSでリンスし、40mlのDIVAデクローカー中に浸漬し、100°Cの圧力釜中で5分間、抗原回復に供した。スライドを室温まで冷却し、PBSでリンスし、ブロッキング緩衝液、および025TritonX100中で、RTで加湿しながら2時間インキュベートした。ブロッキングした切片をPBSでリンスし、希釈したブロッキング緩衝液中の、十分に特徴づけられたウサギポリクローナル抗セラミド抗体9、およびアストロサイト用のマウスモノクローナル抗GFAPを用いて、4°Cで加湿しながら16時間かけて二重標識した。切片をPBSでリンスし;希釈したブロッキング緩衝液中のヤギ抗ウサギローダミンおよびヤギ抗マウスAlexafluor488を用いて、RTで加湿しながら2時間かけてタンパク質を検出した。PBSでリンスした後、DAPIを含むVectaShield中に切片を封入し、カバーガラスを乗せ、OlympusFV1000MPE共焦点顕微鏡で写真撮影した。一次抗体と等しい濃度の標準ウサギIgGまたは標準マウスIgGで処理した切片を、非特異的なバックグラウンド蛍光のみを生じる対照として使用した。モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性実験動物雄のSpragueDawleyラットはHarlanから購入し、ケージ当たり3~4匹を収容し、食糧および水が自由に摂取できるようにした制御された環境で維持した。実験はすべて、実験動物福祉に関する国際疼痛学会および米国立衛生研究所の指針、ならびにSaintLouisUniversity施設内動物実験委員会による推奨に従って行った。実験はすべて、処置条件を知らされていない実験者によって行われた。浸透圧ポンプの埋め込み雄のSpragueDawleyラットにイソフルランで軽く麻酔し、準備した浸透圧ミニポンプを皮下に埋め込んで、KingetalおよびVeraPortocarreroetalによって記載されているように、1μl時間の生理食塩水または75μgμl1時間1のモルヒネを7日間にわたって送達した。モルヒネ硫酸塩の濃度は、およそ8~9mgkgの1日用量をもたらした。ミニポンプは、製造業者の仕様書に従って充填した。浸透圧ポンプの使用により、間欠的な休薬期を回避したモルヒネの持続的皮下送達が確実になる。ラットが無痛であることを確認するために、ミニポンプの埋め込みの2時間後にラットを無痛について試験したところ、およそ100の無痛が達成されていた。このことはポンプがうまく作動していることを確認するのに役立ち、これは典型的には問題ない。ポンプ送達系の完全性は、脊髄を摘出した各実験の終了時に再点検した。薬物投与:被験物質であるW146もしくはW140またはそれらのビヒクルは、以前に記載されており、薬物送達のために一般的に用いられるL5L6腰椎アプローチ;SchoenigerSkinneretalBrainBehavImmun21660667;DoyleetalNeurosciLettを用いて、髄腔内カニューレが慢性的に埋め込まれたラットにおいて、ith注射により送達した。被験物質は、全量10μlで、それに続き無菌生理食塩水を10μl流して、1日に1回、6日間にわたってith注射した。行動試験熱痛覚過敏熱に対する痛覚過敏反応は、組織損傷を防ぐために20秒というカットオフ潜時を使用して、Basile足底試験12を用いたHargreavesの方法により決定した。動物は、静かな試験室において、透明なガラスプレート上のPlexiglasの囲い内で順応させた。可動式の赤外発生器の位置を合わせて、熱刺激をチャンバーの真下から個々の後足に直接送った。電子クロック回路および熱電対により、注射された足の逃避潜時期を決定した。ミニポンプの埋め込み前の0日目、ならびにそれに続いて実験期間の1日目、3日目、および6日目に足逃避潜時を得て、モルヒネ耐性動物が熱刺激に対する感受性増加を生じるかどうかを判定した。浸透圧ミニポンプの埋め込み前との経時的な足逃避潜時の有意な減少を、熱痛覚過敏と特徴づける。Hargreavesの試験の後、すべての動物において、以下のようにして抗侵害受容性耐性の発生を決定した。急性侵害受容有害な放射熱源からの尾の逃避潜時を測定するテールフリック試験を用いて、組織傷害を防ぐために、2~3秒というベースライン潜時および10秒というカットオフ時間で、熱侵害受容感受性を測定した。モルヒネの抗侵害受容作用に対する耐性は、この用量で最大抗侵害受容を生じることが以前に実証された時間である、急性用量のモルヒネ硫酸塩による誘発後の、注射時点の30分後の、テールフリック潜時の有意な減少によって示された。得られたデータは、以下のようにして最大可能抗侵害受容作用に対する割合に変換した:×100。被験物質またはビヒクルは、行動試験の完了後、0~6日目に投与した。カラゲナン誘発性の熱痛覚過敏軽く麻酔したラットCO2O2に、右後足へのカラゲナンまたはそのビヒクルの足底下注射を行った。フィンゴリモドまたはそれらのビヒクルは、カラゲナンまたはそのビヒクルの90分前に、経管により投与した。熱に対する痛覚過敏反応は、組織損傷を防ぐために20秒というカットオフ潜時を使用して、Basile足底試験を用いたHargreavesの方法により決定した。ラットは個々に、Plexiglasチャンバーに拘束した。可動式の赤外発生器の位置を合わせて、熱刺激をチャンバーの真下から個々の後足に直接送った。電子クロック回路および熱電対により、注射された足の逃避潜時期を決定した。結果を足逃避潜時として表す。統計解析データはすべて、平均値±SEMとして表す。行動データおよびS1P形成データは、パクリタキセルまたはモルヒネ処置動物に対するボンフェローニ事後比較を伴う両側二元配置分散分析によって評価した。セラミド生成酵素の活性は、対応のないスチューデントのt検定によって解析した。有意差はP<005と定義した。結果セラミドおよびS1Pの脊髄でのレベル上昇と関連しているパクリタキセル誘発性の神経因性疼痛の発生低用量のパクリタキセルの反復腹腔内注射により、全身毒性または運動障害のほとんどない神経因性疼痛が誘発される、Bennettのグループによって開発された、十分に特徴づけられたラットモデルを使用した。予備実験から、神経因性疼痛は12日目までに顕著となり、D16までにピークに達することが明らかになった。したがって、D0からD16まで経時的研究を実行して、ピーク痛覚過敏の時点、D16においてすべての生化学的評価を行うことに決定した。薬物またはそれらのビヒクルはすべて、D0からD15まで髄腔内投与した。ビヒクル群と比較して、パクリタキセルの投与は、機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生をもたらし、これはセリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびスフィンゴミエリナーゼの酵素活性増加、ならびに腰膨大からの脊髄の表層におけるものをはじめとする、免疫蛍光によって検出された、S1Pの生合成における前駆体であるセラミドの形成増加と関連していた。さらに、図21Eに見られ得るように、神経因性疼痛の時間依存的発生は、スフィンゴ脂質の抽出後にELISAによって測定された、後角組織におけるS1Pの対応する時間依存的形成と関連していた。加えて、ビヒクル処置動物およびパクリタキセル処置動物からの固定凍結脊髄切片を、セラミド、およびアストロサイトに関するGFAPについて染色した。ビヒクル処置動物由来の脊髄におけるセラミド免疫蛍光と比較して、パクリタキセルはセラミド発現を実質的に増加させた。重ね合わせ像において、パクリタキセル誘発性のセラミドは、GFAPアストロサイトと共局在した。NTに対して標準ウサギ血清、またはGFAPに対して標準マウスIgGを用いた陰性対照は、低レベルのバックグラウンド蛍光しか示さなかった。顕微鏡写真は、異なる日に行った3匹の異なる動物に由来する後角の表層の少なくとも3つの像の代表的なものである。図9も参照されたい。パクリタキセル誘発性の神経因性疼痛の発生に寄与する、S1P1受容体を介したS1P作用ビヒクル群と比較して、パクリタキセルの投与は機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生をもたらし、これは、S1P1アンタゴニストであるW146の連日髄腔内送達によって用量依存的様式で弱められたが、以前の研究;SannaetalNatChemBiol2434441より選択された用量での、その不活性S鏡像異性体であるW140によって弱められなかった。試験した最も高い用量で単独で投与した場合、W146はベースライン逃避閾値に影響を及ぼさなかった。さらなる研究を行って、フィンゴリモドが化学誘発性の末梢神経障害の発生を防ぐことができるかどうかを確認した。フィンゴリモドは、多発性硬化症の治療に関してFDAによって最近承認された新規なS1P1修飾薬であり、かついくつかの前臨床モデル;StraderetalJNatProd74900907。フィンゴリモドは、スフィンゴシンキナーゼ2によるリン酸化後にインビボで活性化して、フィンゴリモドPリン酸塩を形成し、これはリガンドS1Pと類似しており、5種類のS1P受容体のうちの4種類に対する結合についてそれと競合する。フィンゴリモドPはS1P1に対して最も高い結合親和性を有し、わずかにより低い親和性でS1P3およびS1P5に結合し、S1P2に対する親和性は報告されていない。S1P1、S1P3、またはS1P5に対するS1PまたはフィンゴリモドPのいずれかの結合は、受容体の内部移行を引き起こし、S1Pによる結合ではおよそ2時間以内に受容体の細胞表面への再循環が起こるのに対して、フィンゴリモドPによる結合は受容体再循環経路を阻止すると考えられ、よって受容体分解をもたらす。いくつかの研究から、細胞がS1P1、S1P3、S1P5受容体の正常な発現を回復するのには、フィンゴリモドPに対する曝露後、2日~8日を要すると推定された。フィンゴリモドの免疫抑制効果は、S1P1の下方制御に依存しているS1P1受容体内部移行には重要であるが、S1P1受容体シグナル伝達には必要ではないカルボキシ末端セリンリッチS1P1モチーフを変異させたノックインマウスにおける知見によって支持される研究。この突然変異は、該薬物の有益な効果を弱めた。いかなる特定の理論によっても縛られることはないが、その免疫細胞輸送と無関係である種々の前臨床試験において、フィンゴリモドが有益な効果を有することが明らかになりつつある;StraderetalJNatProd74900907;ThangadaetalJExpMed20714751483;ChoietalProcNatlAcadSciUSA108751756;関係する受容体は、おそらくは個々の状況に依存する。フィンゴリモドによって阻止されるパクリタキセル誘発性の神経因性疼痛ビヒクル処置群と比較して、パクリタキセルの投与は、D16までにピークとなり、D22までプラトーである機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生をもたらした。機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生は、フィンゴリモドの連日投与によって弱められた。重要なことには、見られ得るように、D22日に試験した機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生は、D15における薬物終了によって元に戻らなかった。単独で投与した場合、フィンゴリモドはベースライン逃避閾値に影響を及ぼさなかった。フィンゴリモドによって阻止されるオキサリプラチン誘発性の神経因性疼痛ビヒクル処置群と比較して、オキサリプラチンの投与は、D16までにピークとなり、D22までプラトーである機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生をもたらした。機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生は、フィンゴリモドの連日投与によって弱められた。フィンゴリモドの用量は、免疫抑制効果を有さないことが示されたため、以前の研究から同定し、選択した。重要なことには、見られ得るように、D22日に試験した機械的異痛症および機械的痛覚過敏の発生は、D15における薬物終了によって元に戻らなかった。単独で投与した場合、フィンゴリモドはベースライン逃避閾値に影響を及ぼさなかった。この研究の結果から、フィンゴリモドが神経因性疼痛の発生を阻止したことが示される。この効果は持続的であり;特に重要なことは、フィンゴリモドによる処置を15日目に終了しても、CIPNが、観察期間の残りのD22まで元に戻らなかったことが見出されたという知見であった。これらの知見は、これらのことから、ひとたび発生を防ぐと、疼痛は再発しないということが示唆されるため、非常に刺激的である。様々な癌を治療するための化学療法戦略は、観察される多くの副作用によって妨げられる。疼痛は、用量を限定すること、および心理的苦痛を与えることによって、このような戦略の成功を大幅に減少させる。S1P形成の減弱またはその作用の阻害に基づいて化学療法誘発性の慢性神経因性疼痛を妨げる新規方法論は、変革となる。本明細書において報告される知見は、S1Pが、化学療法薬の臨床的有用性を改善するための新規治療標的であることを確認するのに必要である重要な情報を提供する。CIPNを阻止することで、切迫した神経障害のために、現在のところパクリタキセルのような薬物による治療の候補とならない患者が、むしろ最大力の抗腫瘍投薬量から恩恵を受けることが確実になる。これらの知見により、S1P経路の標的化が、化学療法誘発性疼痛の疼痛の発生を防ぐための新規戦略であるという主張が支持される。モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性におけるS1P1サブタイプの役割S1P1サブタイプの潜在的関与を、強力で、競合的で、選択的で、かつ十分に特徴づけられたS1P1サブタイプアンタゴニストであるW146;SannaetalNatChemBiol2434441;ImActaPharmacolSin3112131222;TahaetalBiochimBiophysActa16824855;Takabeetalを用いて試験した。W146は、マウスS1P1サブタイプにおけるのと等しい効力で、ヒト受容体に対して約80nMというKi値を示す。10~20μM程の高い用量で、他の公知のS1P受容体サブタイプに対して、アンタゴニスト活性は観察されていない。文献における大部分の研究は、01~10μM範囲のW146を使用している;SannaetalNatChemBiol2434441;ImActaPharmacolSin3112131222;TahaetalBiochimBiophysActa16824855;Takabeetal。W146は、03、1、および3μMで試験した。W146またはそのビヒクルは、7日間にわたって生理食塩水またはモルヒネのsc注入を受けているラットにおいて、全量10μlで、それに続き無菌生理食塩水を10μl流して、5日間にわたって1日に1回、ith注射した。注射は、行動試験の完了後に行った。図25に見られ得るように、7日間にわたって生理食塩水の慢性sc注入を受けたラットと比較して、同じ時間枠にわたるモルヒネの注入は、浸透圧ミニポンプの埋め込み前の足逃避潜時と比較した、D1ではなくD3およびD6における後足逃避潜時の有意な用量依存的減少によって明らかな、熱痛覚過敏の発生、ならびに同じ時間枠にわたる抗侵害受容性耐性の用量依存的発生をもたらした。後者は、7日間にわたって生理食塩水の注入を受けたラットと比較した場合の、同じ時間枠にわたって慢性モルヒネ注入を受けたラットにおける、D1ではなくD3およびD6で明らかな、急性用量のモルヒネによる誘発の30分後の、テールフリック潜時の有意な減少によって示された。S1P1受容体アンタゴニストW146とのモルヒネの同時投与は、熱痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生を、用量依存的様式で>90阻止したが、その不活性鏡像異性体であるW140ではそのようなことはなかった。観察可能な副作用は見られなかった。ビヒクル群と比較して、W146、またはその不活性鏡像異性体であるW140の連日ith注射は、後足足回避潜時またはテールフリック潜時に影響を及ぼさなかった。モルヒネの急性注射の前にD1、D3、およびD6で測定されたテールフリックベースライン潜時は、ミニポンプ埋め込み前のD0で得られたものと同様であり、経時的研究を通して実験群間で異ならなかった。W146の阻害効果は、W146と急性モルヒネとの間の急性抗侵害受容相互作用に起因しなかった。実際に、図26に示される結果から、W146を、1、3、または6mgkgの急性モルヒネの15分前にith投与した場合、モルヒネに対する用量反応は変化しなかったことが明らかに実証される。テールフリック潜時は、モルヒネの前およびモルヒネの30分後に試験した。これらの知見から、重度の疼痛の管理において、S1P経路の標的化が、モルヒネ誘発性の痛覚過敏および抗侵害受容性耐性の発生を防ぐための効果的な方法であることが示される。フィンゴリモドによって阻止されるカラゲナン誘発性の熱痛覚過敏ラットにおけるカラゲナンの足底内注射は、Hargreaves試験を用いた足逃避潜時の減少によって明らかな熱痛覚過敏の発生をもたらした。カラゲナンの90分前にフィンゴリモドを経口投与すると、時間依存的様式で痛覚過敏が阻止されたが、そのビヒクルではそのようなことはなかった。他の局面上記の詳細な説明は、当業者が本発明を実行するのを援助するために提供するものである。しかしながら、本明細書に開示される特定の局面は、本発明のいくつかの局面の例証として意図されているため、本明細書において記載され、主張される本発明は、これらの局面によって範囲が限定されることはない。いかなる同等の局面も、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、本明細書において示され、記載されるものに加えて、本発明の発見の精神または範囲から逸脱しない本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような変更もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。引用参考文献本明細書において引用される出版物、特許、公開された特許出願、およびその他の参考文献はすべて、個々の出版物、特許、特許出願、またはその他の参考文献が詳細にかつ個別に、すべての目的のために全体として参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における参考文献の引用は、それが本発明の先行技術となることの承認として解釈されるべきではない。その全体が参照により本明細書に組み入れられる出版物には、以下のものが含まれる: