"式IIで示される化合物。式中、R2は、-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R11は、ペプチド、アミノ酸、糖類-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、または共にC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;L’は直接結合またはリンカーであり;nは、0~3であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい;の化合物。式I式中、R2は、-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R2は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、または共にC12アルキルであり;RAはC14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;Lは、リンカーであり;nは、0~3であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。式IIIで示される化合物。式中、R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;L’は直接結合またはリンカーであり;Vは、-S-または-O-であり;およびXは、それぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。式IVで示される化合物。式中、R2は、-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2またはNHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール;L’は、直接結合またはリンカーであり;nは0~3であり;Tは、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;Xは、それぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。式中、R2は、または、C25直鎖アルキルであり;Xは、それぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Zは、-CH-または-N-であり;Yは、-Hまたは-OHであり;Wは、-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;およびRは、C17アルキルである、請求項1,2および4のいずれか一項に記載の化合物。式中、R2は、であり;およびXは、OまたはSである、請求項5に記載の化合物。式中、R2は、C25直鎖アルキルである、請求項5に記載の化合物。式中、R8は、低シクロアルキル、またはHであり、R3およびR4は、共に水素、または共にC12アルキルである、請求項1~7のいずれか一項に記載の化合物。式中、R8は、ベンジルである、請求項1~7のいずれか一項に記載の化合物。Vが、Sである、請求項1~9のいずれか一項に記載の化合物。酵素を含有すると思われるサンプルを、請求項1~10のいずれか一項に記載の化合物と接触させる工程、およびサンプルの発光を検出する工程、を含むことを特徴とする酵素の存在または量の検出方法。発光が、定量化されている、請求項11に記載の方法。サンプルには第2酵素が含有されると疑われ、前記サンプルを、請求項1~10のいずれか一項に記載の、第2酵素のための基質を含有する第2化合物と接触させる工程、および該サンプルの発光を検出する工程、を含む、請求項11に記載の方法。請求項1~10のいずれか一項に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与する工程、および発光を検出する工程、を含む、invivoで酵素の存在を検出する方法。請求項1~10のいずれか一項に記載の化合物を動物に投与する工程、動物からサンプルを得る工程、およびサンプルの発光を検出する工程、を含む、酵素の存在を検出する方法。から成る群から選択される化合物。本発明は、サンプルにおける様々な酵素の存在と活性をアッセイする化合物および方法を提供する。特段の明示的な指定がない限り、comprising含むという用語は、本明細書の中で使用される場合、comprising含むにより羅列された物の他に、別の物が任意選択的に存在し得ることを示している。しかし、本発明の特定の実施形態では、comprising含むという用語は、別の物が存在しない可能性を包含する、すなわち、この実施形態の目的においては、comprising含むは、consistingofから成るの意味を有するとして理解されるべきであることを企図している。本明細書で使用される場合、以下の用語および表現は、指定された意味を有する。本発明の化合物は、非対称的に置換された炭素原子を含有し、光学的活性体またはラセミ体として単離され得ると理解され得ると理解されるであろう。光学的活性体の製造方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ラセミ体の分解により、または光学活性の開始材料からの合成により、製造される。構造の全てのキラル体、ジアステレオ異性体、ラセミ体および全ての幾何異性体は、本発明に含まれる。以下に記載のラジカル、置換基及び範囲に関する具体的な値は、説明のみを目的としている。ラジカルおよび置換基の定められた範囲内にあるその他の定められた値またはその他の値を除外するものではない。定義アルキルという用語は、炭化水素化合物から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。アルキル基には、1~30個の炭素原子、または1~12個の炭素原子、または1~10個の炭素原子、または1~6個の炭素原子、または1~4個の炭素原子が含まれてもよい。アルキル基は、直鎖または分岐でもよく、かつ飽和でも、一部不飽和でも、または完全に不飽和でもよい。アルキル基は、任意選択的に、例えばハロで置換してもよい。直鎖アルキル基の実施例には、エチル、n-プロピル、n-ブチル、およびn-プロピル、n-ヘキシルおよびn-ヘプチルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素-炭素二重結合を有する直鎖不飽和アルキル基の実施例には、エテニルビニル、-CH=CH2,2-プロペニルアリル、-CH-CH=CH2、およびブテニルが含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素-炭素三重結合を含む不飽和アルキルの実施例として、エチニルおよび2-プロピニルプロパルギルが含まれるが、これらに限定されない。分岐アルキル基の実施例には、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、t-ブチルおよびイソ-ペンチルが含まれる。アミノ酸という用語は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方を指している。また、保護天然アミノ酸および保護非天然アミノ酸も含まれる。アリールという用語は、芳香族環から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。アリール基は、6~10個の炭素原子C610アリールを有してもよい。例えば、アリール基は、フェニルまたはナフチルであってもよい。ハロという用語は、Cl、F、BrまたはIなどのハロゲンを指している。ヘテロアリールという用語は、ヘテロ芳香族環から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。ヘテロ芳香族環は、5~10環原子C510ヘテロアリールCの使用は、原子がC、N、OまたはSのいずれかであるに関わらず、環原子の合計数を意味すると理解されたしを有してもよい。環原子は、炭素、窒素、硫黄または酸素であってもよい。複数のヘテロ原子が環に存在してもよい。例えば、ヘテロアリール基は、フリル、チエニル、チアゾリル、ピラゾリル、トリアゾリルまたはテトラゾリルであってもよい。リンカーという用語は、基質部分をセレンテラジン核にリンクする2~50個の原子の鎖を指している。リンカーには、一つまたは複数のヘテロ原子が含まれてもよい。リンカーはまた、オキソ基、アミノ基、アルキル基、ハロゲン基およびニトロ基により置換されてもよい。リンカーはまた、アリール基を含むことが出来る。ふさわしいリンカーとして、p-アミノベンジルリンカーなど、図3に示されるものが含まれる。リンカーは、痕跡の無いtracelessまたは自己分解性self-immolativeリンカーであることがふさわしい。痕跡の無いリンカーまたは自己分解性リンカーとは、リンカーから基質部分が裂けることで、自発的にリンカーがセレンテラジン核から裂けて、セレンテラジンを放つ。自己分解性リンカーの代表例には、図3に示されているものが含まれる。低シクロアルキルという用語は、3~6個の炭素原子を有する炭化水素化合物から水素原子を取り除くことにより得られる一価部分を指している。飽和低シクロアルキル基の実施例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどの基が含まれるが、これらに限定されない。一つまたは複数の炭素-炭素二重結合を有する不飽和低シクロアルキル基の実施例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどの基が含まれるが、これらに限定されない。発光酵素という用語は、特段の指定がない限り、基質としてセレンテラジンを使用する、天然由来、組み換えまたは突然変異の酵素を指している。天然由来の発光酵素の場合、当業者であれば容易に生物から取得可能である。発光酵素が天然由来のもの、または組み換えもしくは突然変異の発光酵素である場合、すなわち、天然由来の発光酵素のルシフェラーゼ-セレンテラジン反応において活性を保持するものであれば、バクテリア、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養から容易に取得可能であり、変換されて発光酵素をエンコードする核酸を発現し得る。さらに、組み換えまたは突然変異の発光酵素は、ルシフェラーゼをエンコードする核酸を用いて、invitro細胞遊離系から引き出すことができる。好適な発光酵素には、生物発光十脚類由来のルシフェラーゼ、例えば、オプロフォルス由来のルシフェラーゼOplophorus-derivedluciferaseなど、ヒオドシエビ上科Oplophoroideaから引き出されるルシフェラーゼ、刺胞動物例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、Aristeidae、Solenoceridae、Luciferidae、サクラエビ科、PasipheidaeおよびThalassocarididae十脚目ファミリーなどの海洋生物から派生するルシフェラーゼ、ならびにエクオリンなどの発光タンパク質が含まれる。発光反応混合物には、発光酵素により光信号、すなわちルミネセンスが生成され得る物質が含有される。混合物にはまた酵素が含有される。必要な物質、ならびに発光信号を生成するのに必要な物質の特定の濃度および/または量は、使用される発光酵素並ならびにアッセイのタイプによって異なる。多くの場合、その他の物質が溶液に加えられる。例えば、その他の物質には、適正なpHでの反応を維持するための緩衝剤、酵素活性の維持に役立つPRIONEXまたはウシ血清アルブミンBSAなどの添加剤、還元剤、洗浄剤などが含まれる。ペプチドという用語は、少なくとも2つのアミノ酸の連続を指している。いくつかの実施形態では、ペプチドには、80個以下のアミノ酸、または35個以下のアミノ酸、または10個以下のアミノ酸が含有され得る。糖類という用語は、糖またはその他の炭化水素、特に単純な糖を指している。α-およびβ-アノマー類の両方が含まれる。糖類は、C6-ポリヒドロキシ化合物、典型的にはC6-ペンタヒドロキシであり得、しばしば、環状グリカールであり得る。既知の単純な糖およびその誘導体、ならびに2つまたはそれ以上の単糖類残渣を有する多糖類が含まれる。糖類には、ヒドロキシル基上の保護基がふくまれ得る。糖類のヒドロキシル基は、一つまたは複数のアセタミド、ハロ、またはアミノ基で置換され得る。さらに、一つまたは複数の炭素原子を酸化して、例えば、ケト基またはカルボニル基にすることもできる。好適な糖類には、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸およびノイラミン酸neurominicacidが含まれる。置換されたという用語は、置換されたという表現で表される基の一つまたは複数例えば、1、2、3、4または5、いくつかの実施形態では、1、2、または3、および他の実施形態では、1またh2の水素が、指定された基複数可から選択した基、または当業者に既知の好適な基で置換されていることを示すことを意図している。但し、指定された原子の正常原子価は超過でなく、置換の結果安定した化合物となる。好適な置換基には、ハロ、ヒドロキシル、フェニル、-NH2、-NHMe、-NMe2、-SH、-CHOMe2、-CF3、-OCH3、-SCH3、C14アルキル、ピペラジニル、およびアリールで置換されたピペラジニルが含まれる。化合物セレンテラジンは、海洋ルシフェラーゼなど、広範な種類の生物発光タンパク質が作用すると発光することが知られている。海洋ルシフェラーゼの実施例として、ウミシイタケルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシアルシフェラーゼ、オプロフォルスルシフェラーゼ、およびウミホタルルシフェラーゼが含まれる。本発明は、非発光酵素の基質であり、また発光タンパク質のpro-基質でもある、セレンテラジン誘導体を提供する。いったん対象の非発光酵素が作用すると、前記誘導体は、発光タンパク質の基質となり、よって、当業者に既知の方法により検出可能となる。いくつかの実施形態では、前記誘導体は、以下に示される式IからIVの化合物であり;1式中、R2は、-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R2は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2、または-NHCOORAから成る群から選択され;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、または置換ヘテロアリール;Lはリンカーであり;nは0~3であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;2式中、R2は、-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R11は、ペプチド、アミノ酸、糖類-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、または共にC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;L’は直接結合またはリンカーであり;nは0~3であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;3式中、R6は、-H、-OH、-NH2、-OCORまたは-OCH2OCORから成る群から選択され;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R12は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCは、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリールであり;L’は直接結合またはリンカーであり;Vは、-S-または-O-であり;Xは、それぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよく;4式中、R2は-CH2n-TまたはC15アルキルであり;R8は、水素または低シクロアルキルから成る群から選択され;R16は、ペプチド、アミノ酸、糖類、-O-RA、-OCOO-RA、-NRB2または-NHCOORAから成る群から選択され;式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルであり;RAは、C14アルキル、置換C14アルキル、-CH2-RCまたは-CH2-V-RCであり;RBは、それぞれ独立して、-Hまたは-RAであり;RCはアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール;L’は直接結合またはリンカーであり;nは0~3であり;Tはアリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリールまたはシクロアルキルであり;Vは、-S-または-O-であり;Xは、それぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Rは、それぞれ独立して、C17アルキルであり;および破線結合手は、選択可能な環の存在を示しており、その環は飽和であっても、不飽和であってもよい。いくつかの実施形態では、R2は、または、C25アルキルであり;Xはそれぞれ独立して、-S-、-O-または-NH-であり;Zは-CH-または-N-であり;Yは-Hまたは-OHであり;Wは-NH2、ハロ、-OH、-NHCOR、-CO2Rであり;およびRはC17アルキルである。いくつかの実施形態では、R2は、であり;およびXはOまたはSである。別の実施形態では、R2はC25直鎖アルキルである。ある実施形態では、R8は、低シクロアルキル、またはHであり、式中、R3およびR4は共に水素、またはC12アルキルである。別の実施形態では、R8はベンジルである。いくつかの実施形態では、VはSである。本発明の化合物には、天然由来の天然のセレンテラジンならびにその類似体がふさわしく、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2003/040100号および米国特許出願第12/056,073号パラグラフ0086に開示されているものに加えて、セレンテラジン-n、セレンテラジン-f、セレンテラジン-h、セレンテラジン-hcp、セレンテラジン-cp、セレンテラジン-c、セレンテラジン-e、セレンテラジン-fcp、bis-デオキシセレンテラジンセレンテラジン-hh、セレンテラジン-i、セレンテラジン-icp、および2-メチルセレンテラジンが含まれる。本発明に従って誘導体化され得る追加の好適なセレンテラジンとして、図4に示されているものが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、グリコシダーゼの基質である。好適な誘導体として、図5に示されているものが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、カスパーゼ2、カスパーゼ3/7、カスパーゼ6、カスパーゼ8、カスパーゼ9、ジペプチジルペプチダーゼ4DPPIV、カルパイン、キモトリプシン様プロテアソーム、トリプシン様プロテアソーム、カスパーゼ様プロテアソーム、グランザイムB、カテプシンB/L/K、トロンビン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、およびSARSプロテアーゼなどのプロテアーゼの基質である。好適なペプチドおよびアミノ酸、およびそれらが基質となる酵素には、図6に羅列されているものが含まれる。好適な追加の誘導体には、図7に羅列されているものが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、チトクロームP450酵素の基質である。いくつかの実施形態では、本発明のセレンテラジン誘導体は、ジアフォラーゼ酵素の基質である。利用方法本発明のセレンテラジン誘導体は、チトクロームP450酵素、プロテアーゼまたはグリコシダーゼなどの非発光酵素の存在または活性を検出するために、アッセイ試薬で使用され得る。発光酵素およびその基質を使用するアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、発光酵素、発光反応混合物および非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を、非発光酵素含有と思われるサンプルに加えてもよい。もし非発光酵素がサンプルに存在するなら、非発光酵素がセレンテラジン誘導体に作用して、発光酵素により認識され、発光信号を産生する。代わりに、非発光酵素が、発光性セレンテラジン誘導体を非発光性形態、すなわち信号アッセイの喪失状態に変換することもできる。いくつかの実施形態では、アッセイにおいて、セレンテラジンの化学発光を利用してもよい。例えば、非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を、非発光酵素を含有すると思われるサンプルに加えてもよい。もし、非発光酵素がサンプルに存在すれば、非発光酵素がセレンテラジン誘導体に作用し、化学発光となり、周知の技術で検出可能となり得る。セレンテラジン誘導体を、発光酵素の前にまたは同時に、サンプルに加えてもよい。ある実施形態では、サンプルは細胞でもよい。細胞は真核細胞でもよく、例えば、酵母、鳥類細胞、植物細胞、昆虫細胞、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギもしくはブタの細胞などを含むがこれに限定されない哺乳動物細胞、または原核細胞、または2つもしくはそれ以上の異なる生物由来の細胞でもよく、または細胞溶液もしくはその上清であってもよい。細胞は、組み換え技術により遺伝子工学的に修飾されたものでもよい。ある態様では、細胞は、トランスジェニックなどの動物のものでもよく、または、血液、血漿、尿、粘液の分泌物などの生理液でもよい。サンプルは、検出され得る複数の非発光酵素を含有してもよい。この場合、複数の発光酵素が使用され得る。さらに、複数の基質も使用され得る。複数の基質および/または発光酵素を使用して、複数の非発光酵素またはその他の対象分子複数可、例えば試験化合物を、例えば多様な反応において、同時に検出してもよい。セレンテラジン誘導体はまた、細胞を分析するinsitu方法において有益である。ルシフェラーゼを利用して細胞のinsitu分析を行う方法は、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第5,998,204号を参照されたし。セレンテラジン誘導体は、非発光酵素ヘの曝露前は、発光酵素の基質ではない。しかし、非発光酵素に曝露すると同時に、前記誘導体は、発光酵素の存在下で、発光反応において容易に検出され得る化合物に変換する。よって、insituイメージングにより、非発光酵素が細胞のどこに位置づけられるかを決定し得る。これは、発光酵素を発現する細胞をセレンテラジン誘導体と接触させることにより行い得る。代わりに、発光酵素の遺伝子を発現するトランスジェニック動物に、対象の特定の非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体と投与することができる。その後、イメージング技術例えば、invivoバイオフォトニックイメージングを用いて、生きたインタクトな動物における発光酵素発現の部位で発光を測定することができる。よって、発光酵素を発現するトランスジェニック動物に、対象の適切な非発光酵素が発現される組織において発光酵素の基質に変換するセレンテラジン誘導体を投与し得る。また、発光酵素が組織で発現される場合、発光信号が産生され、任意の好適な手段により検出され得る。よって、薬剤などの試験化合物は、動物ベースのアッセイで試験され得る。試験化合物は、セレンテラジン誘導体前に動物に投与するべきである。代わりに、トランスジェニック動物由来の組織を、組織ベースのアッセイで使用することもできる。いくつかの実施形態では、非トランスジェニック動物へ、対象の特定の非発光酵素の基質であるセレンテラジン誘導体を投与してもよい。誘導体は、適切な非発光酵素が発現される組織において、発光酵素の基質へと変換する。血液、血清、胆汁、尿、糞便、または組織などの生物サンプルは、動物から取得可能であり、発光酵素と接触させることができる。その結果得られる信号は、任意の好適な手段により検出可能である。よって、薬剤などの試験化合物は、動物ベースのアッセイで試験され得る。試験化合物は、セレンテラジン誘導体の前に動物に投与するべきである。いくつかの実施形態では、候補薬剤などの試験化合物をスクリーニングし、その活性を評価することができる。例えば、1非ルシフェラーゼ酵素の基質、2非ルシフェラーゼ酵素の阻害剤、誘導剤または活性剤などの制御剤、または3細胞状態例えば、生存力、反応性酸素種の増加、または還元可能性の増加の調節剤などが挙げられる。セレンテラジン誘導体はまた、基質と非ルシフェラーゼ酵素との区別のために用いられ得る。スクリーニングは、invitroまたはinvivoのいずれかで行い得る。さらに、本明細書に記載の任意の生物発光アッセイに関しては、その他の試薬を、ルシフェラーゼの不活性化を阻害または防止するものを含むがこれに限定されない反応混合物に加えてもよく、そうでなければ、発光信号を拡張または強化してもよい。キット本発明はまた、一つまたは複数の非ルシフェラーゼ酵素の存在または活性を決定するためのキットを提供する。キットには、以下のうち一つまたは複数が含まれ得る。すなわち、セレンテラジン誘導体複数可、非ルシフェラーゼ酵素複数可、セレンテラジン-依存性発光酵素複数可、および反応緩衝剤複数可である。反応緩衝剤は、非ルシフェラーゼ酵素反応および発光酵素反応のための個々の調剤に存在してもよく、または単独ステップアッセイの単独調剤に存在してもよい。本発明のキットにはまた、非ルシフェラーゼ酵素複数可の阻害剤、活性剤および/または強化剤が含まれ得る。本発明のキットにはまた、アッセイの陽性対照および/または陰性対照が含まれ得る。本発明はさらに、以下の非限定的実施例により記載される。実施例1:z-DEVD-セレンテラジン-h化合物21の合成tert-ブチル3-9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ-4-4-ヒドロキシメチルフェニルアミノ-4-オキソブタノエート13:フラスコにFmoc-AspOtBu-OH6.7g、16.28mmolおよび100mlの乾燥THFを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水N-メチルモルホリン1.9mL、17.28mmolを加え、溶液を-20°Cまで冷却した。無水イソブチルクロロホルメート2.2mL、16.96mmolをシリンジで加え、得られた懸濁液を10分間攪拌した。アミノアルコール2.0g、16.24mmolを一回分加え、反応混合物を10分間攪拌し、その後、冷浴から取り出し、周囲温度で2時間攪拌を継続した。前記反応混合物を300mLの酢酸エチルで希釈し、その混合物を50mLの水で2回、50mLの0.5MのHCl、50mLのブライン溶液で2回と、連続して洗浄した。有機相を乾燥させMgSO4、真空下で濃縮した。残渣を、ヘプタン/酢酸エチルの勾配を用いたシリカクロマトグラフィーにかけた。これにより、白色固体として5.2g10.7mmolの産物を得た。1HNMR300MHz、dmso、d10.02s、1H、7.89d、J=7.5、2H、7.81~7.67m、3H、7.55d、J=8.4、2H、7.47~7.27m、4H、7.24d、J=8.4、2H、5.09t、J=5.7、1H、4.51m、1H、4.43d、J=5.7、2H、4.37~4.16m、3H、2.76~2.51m、2H、1.37s、9H。tert-ブチル3-9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ-4-4-クロロメチルフェニルアミノ-4-オキソブタノエート14:フラスコに、アルコール130.5mg、0.97mmolおよび15mLの乾燥ベンゼンを入れた。この溶液に、周囲温度で、無水トリエチルアミンを加え、2分間攪拌した後、混合物を氷/水浴槽で10分間冷却した。これに、無水塩化チオニル78μL、1.07mmolを加え、2分後に冷浴槽を取り除き、周囲温度で3時間攪拌を継続した。反応混合物を、セライトパッドを通じて濾過し、濾過ケークを30mLの乾燥ベンゼンで濯いだ。濾過液を真空下で濃縮し、塩化メチレンを用いたシリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製した。これにより、粘着性白色固体として、457mg0.85mmolの産物を得た。1HNMR300MHz、dmsoδ10.16s、1H、7.89d、J=7.5、2H、7.79d、J=8.1、1H、7.76~7.68m、2H、7.61d、J=8.5、2H、7.44~7.27m、6H、4.72s、2H、4.58~4.44m、1H、4.33~4.18m、3H、2.63ddd、J=6.0、14.6、21.8、2H、1.37s、9H。化合物17および18:乾燥フラスコに、アルゴン雰囲気下で、セレンテラジン-h7200mg、.37mmolおよび15mLの無水、脱酸素DMFを入れた。この溶液に、周囲温度で、ヨウ化カリウム31mg、0.19mmolおよび炭酸カリウム51mg、0.37mmolを加え、その混合物を約2時間攪拌した。これに、化合物14を加え、その混合物を18時間攪拌した。産物を逆相および順相クロマトグラフィー双方により精製した。化合物19および20:3mLのジクロロメタンに化合物17または18のいずれか365mg、0.4mmolを周囲温度で混ぜた溶液に、7mLのジクロロメタンにピペリジン2mLを混ぜた溶液を加えた。反応混合物を30分間攪拌し、50mLのトルエンで希釈し、真空下で濃縮した。残渣を、0.1TFA/水とアセトニトリルの勾配を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリルにした。位置異性体の混合物133mg、0.19mmolを2mLの乾燥DMFで分解し、HOBt30mg、0.22mmolおよびz-DEVD-CO2H140mg、0.23mmolを加えた。この溶液に、周囲温度で、EDC42mg、0.22mmolを加え、その反応混合物を一晩中攪拌した。前記粗反応混合物を1mLのアセトニトリルで希釈し、20mMの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、54mgの化合物19および69mgの化合物20を得た。化合物21:化合物19および20の粗混合物を、2mLのジクロロメタンで分解し、周囲温度でこの溶液に、4mLのトリフルオロ酢酸、2mLのジクロロメタン、0.4mLのトリイソプロピルシラン、および0.4mLのチオアニソールを含む脱保護カクテルを加えた。反応混合物を3時間攪拌し、30mLのジエチルエーテルで希釈した。この懸濁液を遠心分離し、その固体を10mLのジエチルエーテルで2回すりつぶした。残渣を、2mLのメタノールで分解し、20mMの酢酸アンモニウムとアセトニトリルの勾配を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、オレンジ色の固体として、9mgの化合物21を得た。実施例2:z-DEVD-セレンテラジン-h化合物21の生物試験50mMのHEPES緩衝剤pH7.2、2mMのDTT、および0.5CHAPSの中で、化合物2150μMを、ウミシイタケルシフェラーゼ6.5μg/ml、ウミシイタケ-GST融合と混ぜ合わせ、20分間培養し、ウミシイタケルシフェラーゼの基質となり得る任意の遊離セレンテラジン誘導体を取り除いた。精製されたカスパーゼ-3酵素50U/mlまたは緩衝剤コントロールを、最終濃度がそれぞれ25μMのZ-DEVD-セレンテラジンh誘導体基質、25U/mlのカスパーゼ-3および3.25ug/mlルシフェラーゼを1:1の容積比で加えた。発光は、110分間かけて測定した。経時的に、カスパーゼを含有しない対照サンプルと比べて、100倍の発光増加が観察されたが、これはすなわち、セレンテラジンの酵素放出を示しており、本発明のセレンテラジン化合物が、カスパーゼ酵素図1の検出に用いられ得ることを実証したものである。実施例3:z-DEVD-セレンテラジン-h化合物21の代替的合成R-tert-ブチル3-アミノ-4-4-ヒドロキシメチルフェニル-4-オキソブタノエートC250mLの丸フラスコの中で、b6g、0.011moleをジメチルホルムアミド60mLで分解した。ピペリジン10mLを加えた。4時間後、TLCが反応の完了を示した。溶媒を蒸発させた。残渣を、シーライト250mLのEtOAc中15g上に載せ、MeOHDCM中10に向かって勾配するDCMを用いて、シリカ80g上で溶出することにより精製した。混ぜ合わされた分画を蒸発させた。収率76;Rf=0.250/50Hept/EtOAc、1HNMR300MHz、dmsoδ7.56d、J=8.3、2H、7.22d、J=8.3、2H、5.06t、J=5.4、1H、4.41d、J=4.6、2H、3.61t、J=6.5、1H、2.59dd、J=5.8、15.5、1H、2.41dd、J=7.2、15.6、1H、1.35s、9H;m/z。5S,8S,11R,14R-tert-ブチル5-2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル-8-3-tert-ブトキシ-3-オキソプロピル-14-4-ヒドロキシメチルフェニルカルバモイル-11-イソプロピル-3,6,9,12-テトラオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10,13-テトラアザヘキサデカン-16-オエートd100mLの丸底フラスコに、Z-DtBuEtBuV-OH3.96g、6.5mmol、c1.6g、5.4mmol、HOBt0.915g、5.9mmol、およびDMF25mLを加えた。攪拌する溶液に、EDAC1.15g、5.9mmolを加えた。18時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc200mLで再分解した。溶液をクエン酸30、50mL、重炭酸塩bicarbonatesat50mL、水2×50mLおよびブライン50mLで洗浄した。材料をシーライト15g上で吸着し、ヘプタンからEtOAcへ勾配するシリカ上で精製した。収率74。1HNMR300MHz、dmsoδ9.85s、1H、8.33d、J=7.7、1H、7.95d、J=8.1、1H、7.83d、J=8.3、1H、7.59d、J=8.3、1H、7.53d、J=8.5、2H、7.43~7.26m、5H、7.21d、J=8.6、2H、5.06t、J=5.7、1HD2Oシェーク上で消失、5.02d、J=4.7、2H、4.70q、J=7.7、1H、4.41d、J=5.6、2HD2Oシェーク上でsへコラプス、4.38~4.25m、2H、4.17~4.09m、1H、2.79~2.63m、1H、2.62~2.35m、4H、2.26~2.11m、2H、2.00~1.79m、2H、1.73d、J=6.0、1H、1.34dd、J=4.7、7.4、31H、0.81t、J=6.3、6H。MS:C45H65N5O13の計測値883.5;実測値883.7。5S,8S,11R,14R-tert-ブチル5-2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル-8-3-tert-ブトキシ-3-オキソプロピル-14-4-クロロメチルフェニルカルバモイル-11-イソプロピル-3,6,9,12-テトラオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10,13-テトラアザヘキサデカン-16-オエートe100mLのRBフラスコへ、ベンゼン50mLと共にd3.56g、4mmolを加えた。溶液を蒸発させ、高真空下で、一晩中蓄積した。乾燥ベンゼン70mLをTEA610μL、4.4mmolと共に固体に添加した。溶液を氷浴で氷冷し、SOCl2320μL、4.4mmolをゆっくりと添加した。溶液が室温になるまで放置した。4時間後、追加のTEA241μLおよびSOCl2100μLを加えた。さらに2時間後、反応混合物をシーライト10g上で吸着し、DCMからDCM中5MeOHへと勾配するシリカ上で溶出した。収率33。1HNMR300MHz、dmsoδ10.00s、1H、8.35d、J=7.8、1H、7.95d、J=7.8、1H、7.84d、J=8.3、1H、7.67d、J=8.6、3H、7.41~7.22m、7H、5.11~4.91m、2H、4.77~4.59m、3H、4.43~4.21m、2H、4.19~4.04m、1H、3.30s、水、2.79~2.32m、4HDMSO、2.26~2.07m、2H、2.00~1.79m、2H、1.77~1.60m、1H、1.40~1.24m、27H、0.81t、J=6.4、6H。5S,8S,11R,14R-tert-ブチル5-2-tert-ブトキシ-2-オキソエチル-8-3-tert-ブトキシ-3-オキソプロピル-14-4-2,8-ジベンジル-6-4-ヒドロキシフェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-イルオキシメチルフェニルカルバモイル-11-イソプロピル-3,6,9,12-テトラオキソ-1-フェニル-2-オキサ-4,7,10,13-テトラアザヘキサデカン-16-オエート20。セレンテラジン-h50mg、122μmolおよびK2CO334mg、245μmolを含有する、アルゴンガスで脱気したガラス瓶へ、DMF500μLにe133mg、147μmolを混ぜた脱気溶液を加えた。2時間後、PR-HPLCに直接反応を注入し、0.1TFAaqからアセトニトリルへの勾配で溶出した。主要ピークを単離し、蒸発させた。収率13。UV:ピークは250、300、および420nm。1HNMR300MHz、dmsoδ9.79s、1H、8.27d、J=7.5、1H、7.92d、J=8.0、1H、7.85d、J=10.1、1H、7.58d、J=8.3、1H、7.53d、J=8.7、2H、7.45~7.14m、15H、7.09~6.80m、6H、6.72d、J=8.8、2H、5.13~4.90m、2H、4.73~4.53m、1H、4.22dd、J=5.0、17.7、3H、4.16~4.01m、3HD2Oシェーク後2H、3.25~3.01m、J=10.0、16.5、4H、2.76~2.53m、J=15.6、2H、2.51~2.33m、2HDMSO、2.24~2.04m、2H、1.99~1.77m、2H1.76~1.61m、1H、1.40~1.07m、27H、0.89~0.62m、6H。MS:C71H84N8O14の計算値は1272.6;実測値は1272.8。実施例4:30の合成20mlのメチレンジクロライドの中で、セレンテラジンアセチルエステル0.50g、1.14mmol、キノントリメチルロックC2-ジアミンカルボニルクロリド0.436g、1.14mmol、DMAP0.139g、1.14mmolおよびTEA0.115g、1.14mmolの混合物を一晩中、室温で攪拌した。前記化合物を、ヘプタン/酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、200.184gの収率を得た。1HNMR300MHz、CD2Cl2δ8.47s、1H、8.04d、2H、7.55d、2H、7.0~7.5m、9H、4.57s、2H、CH2、4.16s、2H、CH2、3.2~3.7m、4H、NCH2、2.7~3.2m、8H、2NCH3CH2、2.30s、3H、CH3、1.0~2.2m、15H、CH3。MSm/e:796.5M。実施例5:40の合成30の調製方法実施例4と類似の方法を活用して40を作成した。ヘプタン/酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、600.32gの収率を得た。1HNMR300MHz、CD2Cl2δ8.47s、1H、8.03m、2H、7.57d、2H、7.1~7.5m、7H、6.33s、1H、6.17s、1H、4.58s、2H、CH2、4.19s、2H、CH2、3.3~3.7m、4H、NCH2、2.7~3.2m、8H、2NCH3CH2、1.0~2.2m、15H、CH3。MSm/e:728.5M。HPLC精度:262nmで90実施例6:50の合成PBI4442の調製方法と類似の方法実施例20を活用して50を作成した。ヘプタン/酢酸エチルを溶出剤として用いて、シリカクロマトグラフィで精製し、170.15gの収率を得た。1HNMR300MHz、CD2Cl2δ8.42s、1H、7.99m、2H、7.57d、2H、7.1~7.5m、10H、4.58s、2H、CH2、4.19s、2H、CH2、3.3~3.7m、4H、NCH2、2.7~3.2m、8H、2NCH3CH2、1.0~2.2m、15H、CH3。MSm/e:738.5M。HPLC精度:262nmで95。実施例7:キノン誘導体を用いて代謝活性細胞を測定する本実施例では、代謝活性細胞の量を測定するために、キニーネ含有セレンテラジン誘導体の使用を示す。生細胞は代謝活性状態を維持するが、細胞が損傷すると、その状態が失われれるのは不可避である。生きた細胞に入ると、キノンセレンテラジンは、オプロフォルスルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼなど、セレンテラジンを利用したルシフェラーゼの基質であるセレンテラジン誘導体に還元する。キノンセレンテラジンの変換は、代謝活性細胞の数に比例し、よって、ルシフェラーゼ反応により産生される光をモニタリングすることで量的に測定することが可能である。ジャーカット細胞の2倍の段階希釈をPBSで調製し、ウェル毎に50μlずつ96ウェルプレートのウェルに移した。化合物40および50をPBSで希釈して、それぞれ50μMおよび100μMのストックを作成した。調製した化合物ストック10μlを細胞に加え、その細胞を37°C、5CO2の培養器に置いた。30分の培養後、前記細胞を培養器から取り出し、室温で10分間冷却し、50μlのオプロフォルスルシフェラーゼ検出試薬を直接ウェルに加えた。サンプルを混ぜ合わせ、室温で20分間培養し、発光を測定した。図8に細胞数と発光の線形相関が示したが、これはすなわち、発光と細胞数との間に直接的関係のあることを表している。実施例8:オプロフォルスルスルシフェラーゼと化合物21を用いたカスパーゼ3アッセイオプロフォルスルスルシフェラーゼOgLuc異形、9B8optを、DEVDカスパーゼ-3切断配列を含むpro-セレンテラジン基質を用いた生物発光アッセイに使用した。精製したカスパーゼ-3酵素を、製造者の取扱説明書に従って、HALOLINK商標樹脂Promega社を用いて精製した異形9B8optを発現する大腸菌の溶解物サンプルと混ぜ合わせ、100mMのMESpH6.0、1mMのCDTA,150mMのKCl、35mMのチオ尿素、2mMのDTT、0.25のTERGITOL登録商標NP-9v/v、0.025MAZU登録商標を含有し、100mMのHERPESpH7.5中の23.5μMz-DEVD-セレンテラジン-hを含むかまたは含まない緩衝剤で、10倍に希釈した。カスパーゼ-3酵素を、室温で3時間、溶解物サンプルで培養し、様々な時点において、TurnerMODULUS商標ルミノメーターで発光を検出した。バクテリア溶出物のみを含有するサンプルおよびカスパーゼ-3のみを含有するサンプルを対照として使用した。3つの複製物が使用された。図2および表1は、本発明のpro-セレンテラジン基質を用いることで、対象の酵素が検出可能であることを示している。別のオプロフォルスルスルシフェラーゼ異形L27V02L27Vを、DEVDカスパーゼ-3切断配列を含むpro-セレンテラジン基質を用いた生物発光アッセイに使用した。100mMのMESpH650μL中の精製されたカスパーゼ-3酵素1mg/mLを、50μLアッセイ緩衝剤100mMのMESpH6、35mMのチオ尿素、0.5のTERGITOL登録商標NP-9v/v、1mMのCDTA、2mMのDTTおよび150mMのKCl中の227nMのL27V02異形および47μMのPBI-3741z-DEVD-セレンテラジン-hと混ぜ合わせた。反応物を3時間室温で培養し、上記の通り発光を検出した。L27V02異形によるアッセイを、ホタルルスルシフェラーゼによるアッセイ、カスパーゼ-3/7Gloカスパーゼ-Glo、Promega社と比較した。表2は、本発明の化合物を生物発光アッセイに用いることで、対象の酵素が検出可能であることを表している。予言的実施例9:O-8-ベンジル-2-フラン-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン-イルガラクトシド25典型的なβ糖pro-セレンテラジンの典型的な合成O-8-ベンジル-2-フラン-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン-イル3,4,5,6-テトラアセトキシ-β-ガラクトシド100mLの丸底フラスコに、適切なアセトブロモ-α糖例えば、アセトブロモα-D-ガラクトース1.1EQ、適切なセレンテラジン例えば、8-ベンジル-2-フラン-2-イルメチル-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-37H-オン1.0EQ、100mg、およびトリフルオロメタンスルホン酸67mg、1EQを加え、30分間アルゴンで脱気する。2mLのジクロロメタンおよび70μLのテトラメチル尿素を注入し、室温で3時間攪拌する。4mLのアセトニトリルを加え、固体を濾過する。調製用の250×41mmのC18RP-HPLCカラムに上清を注入することによりサンプルを精製し、水とアセトニトリルまたはその他の適切な溶剤との勾配で溶出することにより、適切な分画を収集する。分画を蒸発させて化合物を得ることができる。上記サンプルに、1mLのメタノールを加え、氷浴で0°Cに冷却する。その後、メタノールまたはTHE中のポタジウムメトキシド5.2EQ溶液を加えることができる。30分後、正確に5.2当量の酢酸を加える。その後、3mLのアセトニトリルを加え、サンプルを濾過することができる。調製用の250×41mmのC18RP-HPLCカラムに上清を注入することによりサンプルを精製し、水とアセトニトリルまたはその他の適切な溶剤との勾配で溶出することにより、適切な分画を収集することができる。分画を蒸発させて化合物25を得ることができる。予言的実施例10:様々なP450基質の合成DMF中でセレンテラジンと1.1当量ポタジウム炭酸塩とを混ぜ合わせた混合物に、アルゴン雰囲気下で、1当量メチルヨウ化物を室温で加えることができる。薄層クロマトグラフィーにより反応進行をモニタリングすることができる。反応が完了すると同時に、混合物を数分間、氷浴で数分間冷却し、反応物容積と当量容積の水を加えることができる。得られた混合物は、好適な有機溶媒例えば、酢酸エチルで抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物1を産生する。前記材料をさらにシリカゲルクロマトグラフィーで精製してもよい。DMF中でセレンテラジンと1.1当量のポタジウム炭酸塩およびポタジウムヨウ化物とを混ぜ合わせた混合物に、アルゴン雰囲気下で、1当量のp-メトキシベンジル臭化物を室温で加えることができる。薄層クロマトグラフィーにより反応進行をモニタリングすることができ、反応が完了すると混合物を数分間、氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加えることができる。得られた混合物は、好適な有機溶媒例えば、酢酸エチルで抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物2を産生する。前記材料をさらにシリカゲルクロマトグラフィーで精製してもよい。THF中で3-ベンジル-5-フェニルピラジン-2-アミン61当量、E-3-4-3,7-ジメチルオクタ-2,6-ジエン-1-イルオキシフェニル-2-オキソプロパン酸51.5当量およびカンファースルホン酸1.5当量とを混ぜ合わせた混合物を、モレキュラシーブの存在下で、開始材料の濃縮が完了するまで環流で加熱する。反応混合物を酢酸エチルで容積の3倍に希釈し、水およびブライン溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、真空下で溶媒を取り除き、化合物7を含有する残渣を乾燥DMFで分解した。得られた溶液を無水酢酸1.5当量およびピリジン1.5当量で、室温で処理する。TLCにより反応の進行をモニタリングすることができ、いったん完了すると、反応混合物を氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加える。得られた混合物は、好適な有機溶媒例えば、酢酸エチルで抽出し、その抽出物を濃縮して粗化合物8を産生する。前記材料をメタノールで分解し、約0°Cに冷却し、産物生成が完了するまで、水素化ホウ素ナトリウム5~10当量を少量ずつ使用して処理する。冷めたまま、反応混合物を、先に添加された水素化物の分子と当量の酢酸で処理することができ、反応混合物を真空下で濃縮することができる。残渣を水で数回すりつぶすと、粗化合物3を得ることができる。この材料をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することもできる。THF中で3-ベンジル-5-4-3,3-ジメトキシプロポキシフェニルピラジン-2-アミン101当量、2-オキソ-3-フェニルプロピオン酸91.5当量およびカンファースルホン酸CSA1.5当量と混ぜ合わせた混合物を、モレキュラシーブの存在下で、開始材料の濃縮が完了するまで環流で加熱する。反応混合物を酢酸エチルで容積の3倍に希釈し、水およびブライン溶液で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、真空下で溶媒を取り除き、11を含有する残渣を乾燥DMFで分解した。得られた溶液を無水酢酸1.5当量およびピリジン1.5当量で、室温で処理する。TLCにより反応の進行をモニタリングすることができ、いったん完了すると、反応混合物を氷浴で数分間冷却し、その後、反応物容積と当量容積の水を加える。得られた混合物は、好適な有機溶媒例えば、酢酸エチルで抽出することができ、その抽出物を濃縮して粗化合物12を産生する。前記材料をメタノールで分解し、約0°Cに冷却し、産物生成が完了するまで、水素化ホウ素ナトリウム5~10当量を少量ずつ使用して処理する。冷めたまま、反応混合物を、先に添加された水素化物の分子と当量の酢酸で処理し、反応混合物を真空下で濃縮する。残渣を水で数回すりつぶすと、粗化合物4が得られる。この材料をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することもできる。実施例11:NADHの測定本発明のジアホラーゼ検出用pro-セレンテラジン基質を使用して、サンプルに存在するNADHの量を測定した。NADH、ジアホラーゼ、pro-セレンテラジン基質、およびエステラーゼを混ぜ合わせて、サンプルに存在するNADHを検出した。ジアホラーゼにより利用されるpro-セレンテラジンをセレンテラジンに変換した。生成されたセレンテラジンの量は、オプロフォルスルスルシフェラーゼ異形により検出され、生成された発光は、サンプルに存在するNADHの量に比例する。アッセイのために、10μLのNADH60μMから0μMへとすりつぶす、PBS中の10μLの12U/mLジアホラーゼ酵素、PBS中の10μLの165Uエステラーゼ、およびPBS中の10μLの60μMPBI-4600を、1時間室温で培養した。培養後、オプロフォルスルスルシフェラーゼ異形L27Vを109希釈で含有するオプロフォルスルスルシフェラーゼ検出試薬100mMのMESpH6、1mMのCDTA、150mMのKCl、35mMのチオ尿素、1mMのDTT、0.5Tergitolおよび0.05Mazuを加えた。5分後と1時間後に発光を測定した図9。データによると、本発明の化合物を用いて、NADHを利用する酵素を検出することによりサンプル中のNADHを測定することができる。全ての刊行物、特許および特許出願書は、参照により本明細書に援用される。前述の明細書では、本発明はそのある実施形態に関連して記載されたが、詳細の多くは説明を目的とするものであって、当業者であれば、本発明が追加の実施形態に対しても実行可能であり、本明細書に記載のある詳細は、本発明の基本的原則が逸脱しない限りにおいて、かなり多様であり得ると理解するであろう。"