"下記式[IV]であるK04-0144D物質。ストレプトミセスエスピーStreptomycessp.に属し、請求項1記載のK04-0144D物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に前記K04-0144D物質を蓄積せしめ、該培養物から前記K04-0144D物質を採取し、前記微生物が、ストレプトミセスエスピーK04-0144Streptomycessp.K04-0144NITEBP-107であることを特徴とするK04-0144D物質の製造法。このような背景のもと、MRSAに対して抗菌活性を示す新しい構造を有する新規な抗生物質を提供することは重要である。また、MRSAに対するβ-ラクタム系抗生物質の活性を増強する薬剤は、β-ラクタム抗生物質の投与量を減量させ、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、作用の異なる2つの薬剤を併用することにより、薬剤耐性を克服することも期待される。本発明の目的は、MRSA感染症やβ-ラクタム系抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の新しい治療薬を提供するものである。本発明者らは、微生物の生産する代謝産物を対象にMRSAに対して抗菌活性を示す化合物あるいはMRSAに対するβ-ラクタム系抗生物質の活性を増強する化合物を探索した結果、新たに土壌から分離した放線菌K04-0144株の培養液中に目的の活性を示す物質が産生されていることを見いだした。次いで、該培養物から目的の活性を示す物質を単離精製したところ、3種の抗MRSA抗生物質と1種のβ-ラクタム系抗生物質の活性を増強する化合物を得た。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、抗MRSA抗生物質をK04-0144A物質、K04-0144B物質およびK04-0144C物質、そしてβ-ラクタム系抗生物質の活性を増強する活性物質をK04-0144D物質と称することにした。またこれらすべてをK04-0144物質と称することとした。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記の式[I]で表されるK04-0144A物質、下記の式[II]で表されるK04-0144B物質、下記の式[III]で表されるK04-0144C物質、および下記の式[IV]で表されるK04-0144D物質のいずれかであるK04-0144物質のうちのK04-0144D物質である。本発明はまた、ストレプトミセス属に属し、K04-0144D物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にK04-0144D物質を蓄積せしめ、該培養物からK04-0144D物質を採取し、前記微生物が、ストレプトミセスエスピーK04-0144Streptomycessp.K04-0144NITEBP-107であるK04-0144D物質の製造法である。本発明の前記の式[I]、[II]、[III]、および[IV]で表される新規K04-0144物質を生産するために使用される菌株としては、一例として、本発明者らによって沖縄県石垣島の土壌から新たに分離されたストレプトミセスエスピーStreptomycessp.K04-0144株があげられる。本菌株の菌学的性状を示すと次のとおりである。I形態的性質栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト麦芽エキス寒天培地やグリセロールアスパラギン寒天培地で豊富に着生し、白色からグレーの色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に20ケ以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は螺旋状で、胞子の大きさは約1.0x1.0μmの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出されない。II各種培地上での性状イービーシャーリングE.B.ShirlingとデーゴットリーブD.Gottliebの方法インターナショナルジャーナルオブシスティマティックバクテリオロジー、16巻、313頁、1966年によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標凖色として、カラーハーモニーマニュアル第4版コンテナーコーポレーションオブアメリカシカゴ、1958年を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、27°C、2週間目の各培地における観察の結果である。培養性状III生理学的諸性質1メラニン色素の生成イチロシン寒天陰性ロペプトンイースト鉄寒天陰性ハトリプトンイースト液陰性ニ単純ゼラチン培地21~23°C陰性2硝酸塩の還元陰性3ゼラチンの液化21~23°C単純ゼラチン培地陰性4スターチの加水分解陽性5脱脂乳の凝固37°C陽性6脱脂乳のペプトン化37°C陽性7生育温度範囲12~42°C8炭素源の利用性プリドハムゴトリーブ寒天培地利用する:D-グルコース、メリビオース、D-マンニトール、L-ラムノースやや利用する:L-アラビノース、D-キシロース、ラフィノース、D-フラクトース、シュークロース9セルロースの分解陰性IV化学分類学的性状細胞壁のジアミノピメリン酸はLL型、主要メナキノンはMK-9H6とMK-9H8である。V結論以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はLL型、主要メナキノンはMK-9H6とMK-9H8である。胞子連鎖の形態は螺旋状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は褐色の色調を呈し、気菌糸は白色からグレー系の色調を呈する。メラニン色素は産生しない。これらの結果から、バージーズマニュアルオブシステマティックバクテリオロジー、4巻、1989年に基づくストレプトミセス属に属する菌種であると考えられる。微生物の国際寄託本菌株は、ストレプトミセスエスピーStreptomycessp.K04-0144として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、郵便番号292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番8号2-5-8KazusakamatariKisarazu-shi,Chiba-ken292-0818Japanに所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターInternationalAdministrativeAgencyNationalInstituteofTechnologyandEvaluationPatentMicroorganismsDepositaryNPMDに寄託した。寄託日は2005年6月30日、受託番号はNITEBP-107である。理化学的性状次に、本発明のK04-0144物質の理化学的性状について説明する。1.K04-0144A物質1性状:白色粉末2分子式:C64H103N4O33PHRNeg.ESI-MSm/z[M-H]-計算値1485.6206、実測値1485.61643分子量:1487Neg.ESI-MSm/zで[M-H]-1485を観測4紫外部吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第1図に示すとおりであり、末端吸収を示す5赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第2図に示すとおりであり、νmax3399、2960、1722、1673、1382、1068cm-1等に特徴的な吸収極大を示す6比旋光度[α]D246.7°c=0.1、メタノール7溶剤に対する溶解性:メタノールや水に可溶、クロロホルムやヘキサンに不溶8プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル:重メタノール中で、バリアン社製、400MHz核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第3図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第4図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフトppmおよび炭素の化学シフトppmは下記に示すとおりである。δH:0.976H,1.263H,1.382H,1.413H,1.603H,1.623H,1.673H,1.783H,1.902H,2.022H,2.043H,2.053H,2.104H,2.131H,2.171H,2.701H,3.241H,3.312H,3.341H,3.461H,3.511H,3.553H,3.603H,3.693H,3.811H,3.902H,4.102H,4.183H,4.293H,4.381H,4.431H,4.451H,4.472H,4.672H,5.061H,5.101H,5.141H,5.281H,5.381H,5.451H,5.931HppmδC:16.1,16.4,17.8,18.0,23.3,23.5,24.0,26.0,27.7,27.9,27.9,32.4,32.7,33.5,35.9,36.5,40.9,42.9,55.7,56.9,62.5,66.9,68.5,69.4,71.6,71.6,72.2,72.6,73.8,73.8,74.0,74.1,74.7,75.0,75.2,75.4,76.4,78.0,78.2,78.3,79.7,82.4,86.1,96.2,103.2,104.3,104.7,105.0,109.3,122.7,123.5,125.4,126.8,132.2,137.4,141.6,142.6,151.1,159.2,173.5,173.8,174.2,174.6,175.1ppm以上のように、K01-0144A物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K01-0144A物質は前述の式[I]で表される化学構造であることが決定された。2.K01-0144B物質1性状:白色粉末2分子式:C58H93N4O28PHRNeg.ESI-MSm/z[M-H]-計算値1323.5656、実測値1323.56363分子量:1325Neg.ESI-MAm/z[M-H]-1323を観測4紫外部吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第5図に示すとおりであり、末端吸収を示す5赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第6図に示すとおりであり、νmax3399、2923、1716、1675、1378、1068cm-1等に特徴的な吸収極大を示す6比旋光度[α]D244.0°c=0.1、メタノール7溶剤に対する溶解性:水、メタノールやジメチルスルフォキシドに可溶、アセトン、クロロホルムやn-ヘキサンに不溶8プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル:重メタノール中で、バリアン社製、400MHz核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第7図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第8図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフトppmおよび炭素の化学シフトppmは下記に示すとおりである。δH:0.976H,1.263H,1.382H,1.423H,1.603H,1.613H,1.673H,1.773H,1.912H,2.025H,2.033H,2.106H,2.702H,3.332H,3.563H,3.581H,3.601H,3.643H,3.843H,4.091H,4.121H,4.151H,4.171H,4.202H,4.281H,4.371H,4.441H,4.452H,4.672H,5.041H,5.102H,5.141H,5.291H,5.381H,5.451H,6.041HppmδC:16.1,16.3,17.8,18.0,23.1,23.3,24.0,26.0,27.7,27.8,27.9,32.4,32.7,33.4,36.0,36.5,40.9,42.9,55.9,56.7,60.8,67.0,67.7,71.6,72.1,72.6,73.7,73.8,73.9,74.0,74.6,75.1,76.0,76.3,77.9,79.9,81.5,86.4,96.5,103.4,104.6,105.2,109.3,122.8,123.5,125.4,126.8,132.2,137.4,141.7,142.4,151.1,159.2,173.2,173.7,174.1,174.7,174.9ppm以上のように、K04-0144B物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K04-0144B物質は前述の式[II]で表される化学構造であることが決定された。3.K04-0144C物質1性状:白色粉末2分子式:C58H94N5O27PHRNef.ESI-MSm/z[M-H]-計算値1322.5809、実測値1322.57953分子量:1324Neg.ESI-MSm/zで[M-H]-1322を観測4紫外部吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第9図に示すとおりであり、末端吸収を示す5赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第10図に示すとおりであり、νmax3400、2925、1677、1648、1400、1066cm-1等に特徴的な吸収極大を示す6比旋光度[α]D243.7°c=0.1、メタノール7溶剤に対する溶解性:水、メタノールやジメチルスルフォキシドに可溶、アセトン、クロロホルムやn-ヘキサンに不溶8プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル:重メタノール中で、バリアン社製、400MHz核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第11図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第12図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフトppm及び炭素の化学シフトppmは下記に示すとおりである。δH:0.976H,1.253H,1.382H,1.423H,1.603H,1.613H,1.673H,1.763H,1.912H,2.016H,2.042H,2.116H,2.702H,3.342H,3.564H,3.644H,3.721H,3.842H,4.061H,4.113H,4.171H,4.212H,4.421H,4.431H,4.451H,4.531H,4.672H,5.081H,5.121H,5.141H,5.311H,5.351H,5.38H,5.991HppmδC:16.1,16.4,17.8,17.9,23.1,23.3,23.9,26.0,27.7,27.9,27.9,32.3,32.6,33.4,36.0,36.5,40.9,42.9,56.5,56.7,61.0,67.2,67.6,70.7,72.3,72.8,73.5,73.7,73.9,74.0,74.4,75.7,76.0,76.0,78.3,79.4,81.6,85.1,96.2,103.5,103.9,104.9,109.3,122.6,123.5,125.4,126.8,132.2,137.3,141.6,142.1,151.1,159.2,173.7,173.7,173.7,174.0,174.7ppm以上のように、K04-0144C物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K04-0144C物質は前述の式[III]で表される化学構造であることが決定された。4.K04-0144D物質1性状:白色粉末2融点:138°C3分子式:C25H41NO5SHRFAB-MSm/z[M-H2Na]計算値512.2423、実測値512.24164分子量:467FAB-MSm/zで[M-H2Na]512を観測5紫外部吸収スペクトル:メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第13図に示すとおりであり、232nmで吸収極大を示す6赤外部吸収スペクトル:臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第14図に示すとおりであり、νmax3427、2927、2864、1641、1604、1398、1124、1078cm-1等に特徴的な吸収極大を示す7比旋光度[α]D2526.8°c=0.1、メタノール8溶剤に対する溶解性:メタノールや水に可溶、クロロホルムやヘキサンに不溶9プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル:重メタノール中で、バリアン社製、400MHz核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第15図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第16図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフトppm及び炭素の化学シフトppmは下記に示すとおりである。δH:0.845H,0.914H,1.003H,1.141H,1.201H,1.352H,1.634H,1.753H,1.983H,2.131H,2.421H,2.631H,2.771H,2.821H,3.021H,3.821H,4.411H,4.861H,5.031H,5.552H,6.351HppmδC:12.0,16.0,19.3,22.3,22.8,24.4,27.8,34.0,34.1,37.7,39.2,39.8,41.1,43.0,53.7,55.2,55.8,72.3,78.8,110.1,133.2,137.6,143.1,172.5,177.4ppm以上のように、K04-0144D物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、K04-0144D物質は前述の式[IV]で表される化学構造であることが決定された。生物学的性状次に、本発明のK04-0144物質の生物学的性状について詳細に述べる。K04-0144A、B及びC物質の抗菌活性最小発育阻止濃度MICの測定は寒天平板希釈法日本化学療法標凖法、CHEMOTHERAPY29巻76-79頁1981年に凖じて行った。試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性Staphylococcusaureus株を含む27種の菌を用いた。それぞれの被験菌はMueller-Hintonbroth2.1w/vDIFCO培地中37度で20時間培養後、同培地で菌数を約106/mL相当に懸濁し、接種用菌液として用いられた。作成した菌液はマイクロプランターを用いて128μg/mlより2倍希釈した各濃度段階のK04-0144A、B及びC物質を含むMHA培地Mueller-Hintonbroth2.1w/v、Agar1.5に塗抹し、37度にて20時間培養後、菌の生育の有無を肉眼で確認することによってMICを算出した。また比較対象としてバンコマイシン、アルベカシン及びリネゾリドを用いた。その結果を下記第2表にまとめた。上記のようにK04-0144A、B及びC物質はMRSAを含むグラム陽性菌に対して、既存薬剤バンコマイシン、アルベカシン及びリネゾリドと同等あるいはそれ以上の強さでその生育を阻害することが明らかとなった。カイコを用いたMRSA感染モデルでの活性評価動物を用いたinvivoMRSA感染モデルの代替法としてカイコを用いた感染系が報告されているKaitoら、MicrobialPathogenesis.32巻,183-190頁,2002年。この方法に従いK04-0144A物質の効果を測定した。試験菌として、臨床分離されたMRSAK24株を用いた。MRSAをLB-10培地DIFCO中で37度で18時間静置培養し、5齢2日目のカイコ約2g、愛媛蚕種社、日本国の背脈管に50μl接種した。K04-0144A物質を1mg/mlに調整し、5頭のMRSA感染カイコの背脈管より注射器を用いて50μl25mg/kg投与した。判定は接種後72時間飼育し、この間観察されるサンプル投与および非投与群との生存率を比較した。何も接種しなかったカイコControl並びに、K04-0144A物質のみを25mg/kg投与したカイコは少なくとも72時間後まですべて生存していたことから、この条件ではK04-0144A物質はカイコに全く毒性を示さないことを確認した。またMRSA菌液50μLを接種したカイコは接種72時間後までにすべて死亡した。このような条件下、K04-0144A物質を25mg/kgで投与したカイコはMRSA接種72時間後でもすべて生存していた。同様にバンコマイシン25mg/kgで投与したカイコもMRSA接種72時間後すべて生存していた。このように、カイコを用いたMRSA感染実験でもK04-0144A物質の有効性が示された。K04-0144D物質によるイミペネム活性増強作用1.ペーパーディスク法によるイミペネム活性増強作用の評価方法試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性StaphylococcusaureusMRSAK24株を用いた。MRSAK-24株は、Mueller-Hintonbroth2.1w/vDIFCO37度、20時間培養後、同培地で0.5McFARAND約108CFU/mL相当に懸濁し、MHA培地Mueller-Hintonbroth2.1w/v、Agar1.5および同組成の培地にイミペネム日本国、萬有製薬社、チエナム筋注用力価0.5を試験菌の生育に影響を与えない濃度、すなわち最終濃度10μg/mLとなるように添加した培地に塗抹した。塗抹は米国臨床検査標準化委員会NationalCommitteeforLaboratoryStandard,NCCLS法に従い、滅菌綿棒日本国、川本産業社を用いて行った。試験菌に対する各培地上での抗菌活性は、ペーパーディスク法薄手、6mm:ADVANTECH社にて、37°Cで20時間後の阻止円径の直径を単位mmで表記した。その結果、第3表に示すように1μgディスク条件下にて、K04-0144D物質それ自身では阻止円が測定されなかったのに対して、イミペネム存在下では、15mmの阻止円が測定され、イミペネム活性増強作用が確認された。2.微量液体希釈法による各種抗菌剤に対する活性増強作用の評価方法ペーパーディスク法による評価で強いイミペネム活性増強作用を示したK04-0144D物質に関しては、微量液体希釈法に従いイミペネムに加えその他抗菌剤を含む活性増強を評価した。その他薬剤としては、バンコマイシン日本国、和光純薬社、ストレプトマイシン日本国、明治製菓社およびシプロフロキサシン日本国、和光純薬社を使用した。評価は、日本化学療法学会標準法CHEMOTHERAPY38巻、103~105頁、1990年を一部改変して行った。96-wellplate米国、Corning社製の各wellに、Mueller-Hintonbroth2.1w/vを85μl添加した後、あらかじめ滅菌水で段階希釈しておいたイミペネムを各wellに最終濃度4.8x10-4から256μg/mlとなるように5μl添加した。さらに、これら各wellに、K04-0144D物質自身では生育に影響を与えない最終濃度16μg/mlとなるように水溶液5μlを添加した。よく混合した後、試験菌MRSAを上記同様に0.5McFARAND約108CFU/mL相当に懸濁し、これを同培地て10倍に希釈した接種菌液を各wellに5μl接種した。37°Cで20時間培養後、wellの中で菌の発育が肉眼的に認められない最小の薬剤濃度をもってMICとした。各種抗菌剤単独時のMICおよび各種抗菌剤とK04-0144D物質併用時のMICは第4表に示すとおりであり、イミペネムでは、32μg/mLから0.03μg/mLまで1024倍の活性増強が確認された。一方、バンコマイシン、ストレプトマイシンおよびシプロフロキサシンにおいては、活性増強作用が確認されないことから、K04-0144D物質の活性増強作用はβ-ラクタム抗生物質に特異的に作用することが明らかとなった。本発明のK04-0144D物質は、β-ラクタム抗生物質と併用することにより抗MRSAメチシリン耐性黄色ブドウ球菌活性を増強することができる。以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。K04-0144物質の製造法1K04-0144A、BおよびC物質の製造法寒天斜面培地スターチ1.0日本国、関東化学社、エヌゼットアミン0.3日本国、和光純薬社、酵母エキス0.02日本国、オリエンタル酵母社、肉エキス0.1日本国、極東製薬工業社、炭酸カルシウシム0.3日本国、関東化学社、寒天1.2日本国、清水食品社pH7.0に調製で培養したK04-0144株を、種培地スターチ2.4日本国、関東化学社、グルコース0.1日本国、和光純薬社、ペプトン0.3日本国、極東製薬工業社、酵母エキス0.5日本国、オリエンタル酵母社、CaCO30.4日本国、関東化学社pH6.0に調製100mLを分注した500mL容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、27°Cで3日間ロータリーシェイカー210rpmで培養した後、生産培地グルコース0.5日本国、和光純薬社、コーンスティプパウダー0.5日本国、マルコー社、オートミール1.0日本国、日本食品製造社、ファーマメディア1.0日本国、イワキ社、K2HPO40.5日本国、関東化学社、MgSO47H2O0.5日本国、和光純薬社、トレース塩溶液0.1FeSO47H2O0.1日本国、関東化学社、MnCl24H2O0.1日本国、関東化学社、ZnSO47H2O0.1日本国、関東化学社、CuSO45H2O0.1日本国、関東化学社、CoCl26H2O0.1日本国、関東化学社、pH7.0に調製50Lを入れた90L容ジャーファーメンターに1植菌し、27°Cで6日間培養した。培養終了後、この培養液50Lをシャープレス遠心機で遠心して上清と菌体に分けた。上清をHP-20カラムΦ10x20cm、三菱化学社、日本国にかけ、水1.5Lで洗浄後、活性成分を100メタノールで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質27gのうち15gを少量の水に溶解してODSカラムΦ5x28cm、センシュー科学、日本国にて精製を行った。40メタノールの溶液でODSカラムを洗浄したのち、メタノール精製水2:3、3:2、4:1、100:0の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、各溶出液4Lを100mLx40本で分画した。活性画分100:0フラクション番号4からフラクション番号9を濃縮乾固することで、褐色粉末物質450mgを得た。これを少量のメタノールに溶解し、分取HPLCカラム:PEGASILODS、20φx250mm、センシュー科学、日本国により精製を行った。50アセトニトリル水溶液10mM酢酸アンモニウ厶pH3、蟻酸により調整を移動相とし、8mL/分の流速において、UV210nmの吸収をモニターした。保持時間21分、23分、及び38分に活性を示すピークを観察し、これらのピークを分取した。分取液はアンモニア水でpHを7とし、減圧濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をODSカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりK04-0144A物質及びK04-0144B物質は部分精製画分として、またK04-0144C物質は活性画分として収量19.4mg単離した。さらに、部分精製画分として得られたK04-0144A物質及びK04-0144B物質を分取HPLCカラム:PEGASILODS、20φx250mm、センシュー科学社、日本国により最終精製を行った。46アセトニトリル水溶液10mMリン酸2水素カリウムpH4.7を移動相とし、8mL/分の流速において、UV210mmの吸収をモニターした。保持時間はK04-0144A物質が20分、K04-0144B物質が26分で観察され、これらのピークを分取した。分取液は10mMのリン酸水素2カリウム水を用いてpH7とし減圧下濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をODSカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりK04-0144A物質及びK04-0144B物質を活性成分としてそれぞれ収量15.7mg及び5.8mg単離した。2K04-0144D物質の製造法K04-0144株をK04-0144A-C物質の製造と同じ生産培地50Lを入れた90L容ジャーファーメンターに1植菌し、27°Cで6日間培養した。培養終了後、この培養液50Lをシャープレス遠心機で遠心して上清と菌体に分けた。上清をHP-20カラムΦ10x20cm、三菱化学社、日本国にかけ、水1.5Lで洗浄後、活性成分を100メタノールで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質27gのうち15gを少量の水に溶解してODSカラムΦ5x28cm、センシュー科学社、日本国にて精製を行った。40メタノールの溶液でODSカラムを洗浄したのち、メタノール精製水2:3、3:2、4:1、100:0の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、各溶出液4Lで分画した。活性画分4:1フラクションを濃縮乾固することで、褐色粉末物質131mgを得た。これを少量のメタノールに溶解し、分取HPLCカラム:PEGASILODS、20φx250mm、センシュー科学社、日本国により精製を行った。60アセトニトリル水溶液0.05リン酸を含むを移動相とし、8mL/分の流速において、UV210nmの吸収をモニターした。保持時間32分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取した。分取液は1N水酸化ナトリウム水を用いてpHを7とし、減圧下濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をODSカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりK04-0144D物質を活性画分として収量17.1mg単離した。"