"以下の式Iで示されるリガンド固定化分子。式I中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Wは以下の式II、式II中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2であるを表す前記kが1、lが2、mが0である請求項1に記載のリガンド固定化分子。以下の式IIIで表される請求項2に記載のリガンド固定化分子。式III中、Xはリガンドを表す請求項1に記載のリガンド固定化分子の製造に使用される式IVで表される化合物。式IV中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Yは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。請求項1に記載のリガンド固定化分子の製造に使用される式Vで表される化合物。式II中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Aは硫黄又は酸素を表し、R1は炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2であるを表す。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。請求項3に記載の化合物のいずれか1つと請求項4に記載の化合物のいずれか1つを用いて請求項1に記載のリガンド固定化分子を製造する方法。請求項3に記載の化合物及び請求項4に記載の化合物を含んでなる請求項1に記載のリガンド固定化分子製造キット。上述のように、特定のリガンドと相互作用する所望の物質を同定するためには、リガンド間の距離などを容易に調節できる必要がある。そのため、リガンドを固相支持体に固定化するための分子リガンド固定化分子は、固相支持体とリガンドまでの距離を自在に調節できるように、該リガンド固定化分子の長さなどを、様々に、かつ、容易に変更し得ることが求められる。そこで、本発明は、リガンド固定化分子のリガンドが結合する部分と固相支持体に結合する部分本発明のリガンド固定化分子においては、ビオチン又はビオチン誘導体が結合部分を別々に調製し、これらを結合させたリガンド固定用分子の提供を目的とする。本出願の発明者らは、リガンド固定化分子のビオチン結合部分に1分子あたり2個のビオチンを保持させて、該リガンド固定化分子が固相支持体ビーズ、プレートなどに対し強固に結合することを可能にした。また、様々な種類の長さのリガンド固定化分子を調製し得るように、リガンド結合部分をビオチン結合部分とは別個に調製した。リガンド固定化分子を固相支持体に結合させる点において、1分子あたりのビオチンの数を2個とすることで、従来の類似分子と比較して、固相支持体への結合安定性が顕著に上昇する。さらに、2個のビオチンを使用することで、より堅固で安定な立体構造をリガンド固定化分子に与えることが可能となる。その結果、リガンド同士の不自然な接触や重なり合いを回避することができ、よりネイティブな状態にリガンドを保ちつつ、結合パートナーの探索ために提示することができる。また、リガンド結合部分をビオチン結合部分と別個に調製することで、リガンド固定化分子自体の長さ、保持するリガンドの数、空間あたりのリガンド密度などを調節することができる。そのため、リガンドと結合する結合パートナー分子の物理的特性が未知であってもパートナー分子を容易に同定し得ることとなる。このようなリガンド固定化分子の各部分の調製おいては、特に、リガンド結合部分については、デンドリマーの調製技術を利用することが可能である。すなわち、本発明は、以下の式Iで示されるリガンド固定化分子である。式I中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Wは以下の式II、式II中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2であるを表すまた、本発明は上記式Iに記載のリガンド固定化分子の製造に使用される式IVで表される化合物である。式IV中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R2は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Aは硫黄又は酸素を表し、Bはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Yは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。さらに、本発明は、上記式Iに記載のリガンド固定用分子の製造に使用される式Vで表される化合物である。式II中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Aは硫黄又は酸素を表し、R1は炭素数1~10の飽和炭化水素鎖を表し、R3は水素又は炭化水素鎖を表し、R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Xはリガンドを表し、kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。本発明のリガンド固定化分子は、1分子あたり2個のビオチン分子を有しているため、任意のリガンドをビオチン-ストレプトアビジン又はアビジン結合を介して、固相支持体に強力に固定させることができる。また、リガンド固定化分子の立体構造を安定に保つことができる。本発明のリガンド固定化分子は、分子あたりのリガンド数を自在に変えたり、あるいは、リガンド固定用分子自体の大きさや形状、さらにリガンド間の長さを適宜調節したりできるため、リガンドパートナー分子レセプター分子の大きさや形に適応させることが可能である。本発明の実施形態の1つは、以下の式Iで示されるリガンド固定化分子である。式I中、R1は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数1~10飽和炭化水素鎖を表し、好ましくは、炭素数1~5の直鎖状飽和炭化水素鎖である。R2は、炭素数1~30で、不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖である。好ましくは、炭素数は5~25の直鎖状炭化水素であって、適宜、アミド結合、エーテル結合を含む。また、Aは硫黄又は酸素を表し、好ましくは、硫黄であり、Bはビオチン又はビオチン誘導体ストレプトアビジン又はアビジンと結合するビオチン誘導体を表す。2個のビオチン間の間隔はつまり、B-R2-CH-R2-Bの長さ、20Å以上が好ましく、例えば、30Å~50Å、より好ましくは、35Å~45Åである。ビオチン間の距離がこの範囲内にあれば、R2の炭化水素鎖は、親水性を有するものであれば、特に限定はされない。式I中、Wは以下の式IIで表される。式II中、Eは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよい。R3は水素又は炭化水素鎖である。R4、R5、R6は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び/又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよい。Xはリガンドを表す。kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。ここでリガンドとは、何らかの物質又は分子と結合する物質のことで、該リガンドの結合パートナーは既知であっても、未知であってもよい。例えば、受容体をリガンドとした場合、該受容体と結合するホルモン、神経伝達物質などが結合パートナーとなり得る。あるいは、ホルモンなどをリガンドとした場合には、受容体が結合パートナーとなり得る。本発明のリガンドは、いかなるものであってもよく、好ましくは、生体内に存在するか、又は人工物であっても生体内で作用すると予想される物質である。本発明のリガンドとしては、例えば、抗体、酵素、ペプチドアプタマー、受容体などのタンパク質性物質、DNA、RNA又はこれらの誘導体などの核酸、抗生物質などのタンパク質性もしくは非タンパク質性生体内活性物質、あるいは、レクチンなどに結合し得る糖例えば、ラクトース、シアリルラクトース、グロボトリオース、ラクト-N-ネオテトラオース、オリゴマンノースなどの他、生体内の特定の組織等に存在するレクチンと結合することが既知の糖鎖などであり、単糖、オリゴ糖などいかなる糖鎖であってもよいなどを挙げることができる。式II中、Eビオチン結合部分に最も近い位置に存在するEとXの距離E-X間の炭化水素鎖を最も伸長させたときの長さは、リガンド結合パートナー分子の大きさ、形状、もしくは、リガンドと結合し得る部位の分子中における存在位置などによって、適宜調節してもよい。例えば、リガンド結合パートナー分子の大きさ又は嵩が大きければ又は大きいと予想される場合には、該E-X間の距離を長めに設定し、リガンド結合パートナー分子の大きさ又は嵩が小さければ又は小さいと予想される場合には、該E-X間の距離を短めに設定してもよい。例えば、リガンド分子が糖鎖等であり、リガンド結合パートナー分子がレクチンなどのタンパク質の場合、E-X間の距離は、例えば、10Å~50Å、15Å~30Å程度としてもよい。当業者であれば、該E-X間の距離は、予備的な実験を行うことで、適宜容易に決定することが可能である。式IIの部分は、k、l、mの組み合わせに応じて種々の構造を取り得るが代表的な化学式は下記のようになる。式IIa及びIIb中、E、R3、R4、R5、R6、Xは上述の通りである。本発明の他の実施形態は、式Iのリガンド固定化分子を製造するのに適した中間化合物であって、以下の式IV及びVで示される。式IV中、R1、R2、A及びBは、上述の式Iと同一の分子、原子、置換基等を表す。Yは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。また、式Iの化合物と同様に、2個のビオチン間の間隔はつまり、B-R2-CH-R2-Bの長さ、20Å以上が好ましく、例えば、30Å~50Å、より好ましくは、35Å~45Åである。また、式V中、R1、R3、R4、R5、R6、A及びXは、上述の式Iと同一の分子、原子、置換基等を表す。kは0又は1の数字、lは0、1又は2の数字、mは0又は1の数字を表し、mが0のときlは2である。Zは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。E-X間の距離については、上述したように適宜決定することができる。式Iの化合物は、式IVのYと式Vの化合物のZを反応させ、式IVの化合物と式Vの化合物を結合することにより、容易に合成することができる。この場合、YとZは、互いに反応して化学結合を構築し得る組合せが好ましい。限定はしないが、例えば、アジド基とアルキニル基の組合せによる環化付加反応によるトリアゾール結合の構築などを挙げることができる。また、本発明の実施形態には、式Iのリガンド固定用分子を製造するためのキットが含まれる。本発明のキットには、式IVの化合物又はその誘導体と式Vの化合物又はその誘導体が含まれており、式IVの化合物と式Vの化合物から式Iの化合物を合成するための試薬類が包含されていてもよい。本発明のキットには、Eビオチン結合部分に最も近い位置に存在するEとXの長さE-X間の炭化水素鎖を最も伸長させたときの長さが異なる式Vの化合物を複数含んでいてもよい。本発明の式IV及び式Vの化合物は、これらの化合物の保存に適した容器中に収納され、使用説明書と共にパッキングされていてもよい。さらに、本発明の実施形態には、検出対象物、例えば、ウィルスや毒素の試験サンプル中における存在の有無を検出するための診断薬も含まれる。本発明の診断薬には、式Iの化合物が有効組成物として含まれており、あるいは、式IVの化合物及び式Vの化合物が個別に含まれていてもよい。この場合、式I及び式IVの化合物中のリガンドXは、検出対象物と特異的に結合するリガンドである。例えば、検出対象物がウィルスや毒素の場合には、これらの表面上に存在するタンパク質等を特異的に認識する糖鎖をリガンドXとして使用することができる。本発明の診断薬は、上述のキットの形態で提供してもよく、この場合、該キットには、リガンド固定化分子を固定化する固相支持体、例えば、プレート例えば、ウェル付きのプレートなどやビーズ例えば、磁気ビーズ等が含まれていてもよい。あるいは、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、分子の大きさが異なる種々の式Iの化合物が、ビオチン-ストレプトアビジン又はアビジン結合を介してマイクロアレイ用のチップ上に予め、各々、固定化されていてもよく、該チップは、ハイスループットの診断に用いられてもよい。以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。1.[GlcNAcOH]2-ビオチン2コンジュゲート19の合成式Iの化合物の1例として、k=1、l=1、m=0の[GlcNAcOH]2-ビオチン2コンジュゲートの製造方法を以下に示す。1-1.GlcNAcOAcダイマーの合成まず、GlcNAcOAcダイマーを以下のスキーム1及び2の過程により合成した。11-アジド-3,6,9-トリオキサ-1-ウンデカノール3テトラエチレングリコール15.00g,25.7mmolをピリジン50mLに溶解させ、窒素雰囲気下0°Cでp-トルエンスルホン酸クロライド5.39g,28.3mmolを加えて攪拌した。反応液は0°Cで攪拌され、2時間後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が多量に残っていたためp-トルエンスルホン酸クロライド0.98g,5.14mmolをさらに加えた。その後1時間攪拌し、綿栓ろ過により析出した塩をろ過した。そのろ液を濃縮し、黄色透明液体Rf048CHCl3EtOAcMeOH541を得た。得られた液体をDMF44mLに溶解させ、次いでアジ化ナトリウム5.01g,77.1mmolを加えた後、窒素雰囲気下80°Cで3時間攪拌した。反応終了後、綿栓ろ過と濃縮を順次行い、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過を行い、濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル1:3v/v,シリカゲル300mL]により精製され、無色透明シラップの目的物32.59g,45.9を得た。Rf034CHCl3EtOAcMeOH541IR3447287221081125cm11HNMRδ37336936736234126313CNMRδ72467060705770487023and6994616350592-メチル-3,4,6-トリ-O-アセチル-1,2-ジデオキシ-α-D-グルコピラノ-[2,1-d]-2-オキサゾリン5N-アセチルグルコサミンα-アセテート44.00g,10.3mmolを塩化メチレン20mLに溶解させ、アルゴン置換をし、氷冷下で撹拌しながらトリフルオロメタンスルホン酸トリシリルメチル2.05mL,11.3mmolを滴下した。その後60°Cで5時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷冷し、過剰のトリエチルアミンを加えて塩基性条件とした。続いて濃縮を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ[トルエン―酢酸エチル―トリエチルアミン100:200:1v/v/v,シリカゲル230mL]により精製し、オレンジ色透明のシラップとして目的物53.08g,91.1を得た。Rf049CHCl3MeOH1011HNMRδ59752749649041941236535611-アジド-3,6,9-トリオキサウンデシル-O-2’-アセトアミド-3’,4’,6’-トリ-O-アセチル-2’-デオキシ-β-D-グルコピラノシド6アジドアルコール35.39g,24.3mmolおよびオキサゾリン体53.08g,9.35mmolを塩化メチレン15mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下でカンファースルホン酸0.217g,0.935mmolを加えた後、90°Cで1時間撹拌した。反応終了後クロロホルムで希釈し、氷水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。続いて無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過した後、濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[1回目;クロロホルム―メタノール20:1v/v,シリカゲル780mL、2回目;クロロホルム―酢酸エチル―メタノール15:14:1v/v/v,シリカゲル630mL]で精製することにより、白色ろう状固体として目的物63.82g,74.5を得た。Rf037CHCl3MeOH151αD33240oIR287821121746166715531242Oester1045cm11HNMRδ664511506479426413413408391360340209201and19813CNMRδ1705417047and1704316914101657322714671287055704470317014696268546846620453655042227420522047and2039MALDITOFMScalcdforC22H36N4O12MNa57122Found57128AnalCalcdforC22H36N4O12C4817H662N1021FoundC4811H657N10121,1-ビスペンタ-2’-オキサ-4’-イン-1’-イルエテン83-クロロ-2-クロロメチル-1-プロペン73.00g,24.0mmolおよびプロパルギルアルコール8.50mL,144mmolをDMF30.0mLに溶解させ、アルゴン置換した後、氷冷した。続いて50水素化ナトリウム7.60g,158mmolを少量ずつ加えていき、1時間かけて全てを加え終えた後、室温に戻してさらに1時間撹拌した。反応終了後、反応液に過剰のメタノールを加え、濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、氷水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過を行った後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル20:1v/v,シリカゲル580mL]によって精製し、無色透明オイル状のジアルキン体83.19g,81.0を得た。Rf041nHexaneEtOAc121IR32932857211614431358and12631086675644cm11HNMRδ52641640924513CNMRδ141071155779507446701257161,1-ビス[4’-{1’-N-[11’’-O-3’’’,4’’’,6’’’-トリi-O-アセチル-2’’’-N-アセトアミド-2’’’-デオキシ-β-D-グルコピラノ-3’’,6’’,9’’-トリオキサウンデシル]-1’,2’,3’-トリアゾール}メトキシメチル]エテン,[GlcNAcOAc]2-C=C9アジ化グリコシド63.57g,6.44mmolとジアルキン体80.440g,2.68mmolをメタノール15mLに溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷下で攪拌しながら、0.1M硫酸銅II五水和物水溶液13.4mL,1.34mmolと1.0Mアスコルビン酸ナトリウム水溶液7.5mL,7.5mmolを順に滴下した。その後室温に戻して4時間攪拌した。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過を行い、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール20:1v/v,シリカゲル480mL]で数回精製することにより、無色透明の高粘性シラップとして目的物93.19g,94.4を得た。Rf036CHCl3MeOH101IR29371746166115591240Oester1045cm11HNMRδ7446675265145074784622456425412404391356390208201200and19313CNMRδ17077×2and1704816932144891419712365115011016673267168712870977066705670477023693068706356621854015017230020742070and2060MALDITOFMScalcdforC54H84N8O26MNa128354Found1283551-クロロ-3-{[2’,2’-ビス4’’-{1’’-N-[11’’’-O-3’’’’,4’’’’,6’’’’-トリ-O-アセチル-2’’’’-N-アセトアミド-2’’’’-デオキシ-β-D-グルコピラノ-3’’’,6’’’,9’’’-トリオキサウンデシル]-1’’,2’’,3’’-トリアゾール}メトキシメチルエチル]スルファニル}プロパン,[GlcNAcOAc]2-S-Cl10N-アセチルグルコサミンアセテート二量体9308mg,244μmolと3-クロロ-1-プロパンチオール357μL,3.66mmolを1,4-ジオキサン1.5mLに溶解させ、続いて室温にてAIBN20.0mg,122μmolを添加し、アルゴン置換を行った。その後反応系を一気に80°Cの油浴に浸たし、80°Cで1時間攪拌した。TLC上で反応が終了したことを確認し、シクロヘキセン371μL,3.66mmolを加えて反応を停止させた。続いて濃縮を行い、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール20:1v/v,シリカゲル60mL]で精製することにより白色泡状~無色透明高粘性シラップとして目的物10269mg,80.3を得た。Rf022CHCl3MeOH151αD28163oIR28721748166715571233Oester1045cm11HNMRδ77065851350747946024554254134053913542CH2ClandH5×2390263260230190208201and19413CNMRδ17066×217040169241447612345101597316715371247055704370377011697469196859×264406207538350064341396831973093294822922066×3MALDITOFMScalcdforC57H91ClN8O26SMNa139354Found139355AnalCalcdforC57H91ClN8O26S2H2OC4863H680N796FoundC4861H650N7671-2.ビオチンダイマーの合成次に、ビオチンダイマーを以下のスキーム3及び4の過程により合成した。2-[2-N-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ]エタノール122-2-アミノエトキシエタノール1110.0g,95.1mmolを蒸留水65mLに溶解させ、さらに水酸化カリウム5.87g,105mmolを加えて攪拌し、窒素置換した後0°Cに氷冷した。次に1,4-ジオキサン35mLに二炭酸ジ-tert-ブチル22.8g,105mmolを溶解させた溶液を全て滴下し、0°Cで1時間攪拌した後、室温に戻してさらに7時間攪拌した。その後反応液をクロロホルムで2回抽出し、その抽出液を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。最後にシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル2:5v/v,シリカゲル790mL]で精製することにより、無色透明の液体として目的物1218.1g,92.8を得た。Rf061CHCl3EtOAcMeOH541IR33582976287216941518cm11HNMRδ52837837136835333330914513CNMRδ1561079383721770276167403428336-N-tert-ブトキシカルボニルアミノヘキサン酸146-アミノヘキサン酸3.00g,22.9mmolを1,4-ジオキサン34mLと蒸留水23mLに溶解させ、0°Cに氷冷した。次に1M水酸化ナトリウム水溶液23mL,23mmolと、二炭酸ジ-tert-ブチル5.50g,22.5mmol―1,4-ジオキサン12mL混合溶液を順に滴下し、室温で一晩攪拌した。TLC上で原料が消失したことを確認した後、反応液を酢酸エチルで洗浄し、水層に1M硫酸水溶液を加えて攪拌した。その酸性水溶液をクロロホルムで3回抽出し、無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させた後、セライトろ過と濃縮を行うことにより、白色固体として目的物145.11g,96.6を得た。Rf023HexaneEtOAc11071CHCl3MeOHH2O65254IR33472976169215301173cm11HNMRδ46831023316315213214613CNMRδ1785815607791334025338529512823260824241,1-ビス{2-[2-N-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ]エトキシメチル}エテン15アルコール1219.7g,96.0mmolと3-クロロ-2-クロロメチル-1-プロペン73.00g,24.0mmolをDMF230mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下かつ室温で50水素化ナトリウムを少量ずつ加えてはTLC上で反応の進行を確認した。TLC上で目的物のスポットが最も濃くなるまで水素化ナトリウムを加えた後、過剰のメタノールを加えて反応を停止させた。続いて反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した後、氷水、飽和食塩水で順に洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[ヘキサン―酢酸エチル1:1→2:3v/v,シリカゲル820,590mL]で2回精製することにより、無色透明液体として目的物154.41g,40.4を得た。Rf049HexaneEtOAc12aD34015oIR29782897170115161172cm11HNMRδ501507404236235333114413CNMRδ15996142331144479153×271767025and694040352841MALDITOFMScalcdforC22H42N2O8MNa48528Found48525AnalCalcdforC22H42N2O805H2OC5603H919N594FoundC5587H902N5841,1-ビス[2-2-{[6-N-tert-ブトキシカルボニルアミノヘキサノイル]アミノ}エトキシエトキシメチル]エテン16ジアミンBoc保護体15100mg,216μmolを塩化メチレン1.0mLに溶解し、アルゴン雰囲気下トリフルオロ酢酸240μL,3.24mmolを滴下した後、室温で2時間攪拌した。TLC上で原料が消失したことを確認した後に反応液を濃縮し、淡黄色透明の液体としてジアミンのトリフルオロ酢酸塩Rf=0.14[CHCl3:MeOH:H2O=65:25:4v/v/v]を得た。得られたアミン塩をDMF1.0mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下0°CでN-メチルモルホリン50μL,0.45mmolを滴下した。滴下後、室温に戻して1時間攪拌した。続いてカルボン酸14100mg,432μmolとN,N-ジメチル-4-アミノピリジン:DMAP63.1mg,518μmol、1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩:EDC124mg,648μmolを加え、60°Cで一晩攪拌した。その後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料がわずかに残っていたためEDC25.2mg,130μmolとDMAP11.2mg,86.4mmolを追加し、反応を完全に進ませた。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈した。希釈液は氷水、飽和食塩水で順に洗浄され、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した後、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール25:1v/v,シリカゲル44mL]で精製することにより、無色透明シラップとして目的物16129mg,86.6を得た。Rf045CHCl3MeOH101αD33004oIR29341701and164715061170cm11HNMRδ629521475404236435735634431021816415214714413713113CNMRδ17299156023142271146578943×271687016698969374036391036382975284126382527MALDITOFMScalcdforC34H64N4O10MNa71145Found71136AnalCalcdforC34H64N4O1003H2OC5882H934N807FoundC5888H943N7911,1-ビス[2-2-{[6-N-シス-テトラヒドロ-2-オキソチエノ[3,4-d]イミダゾリン-4-バレリルアミノヘキサノイル]アミノ}エトキシエトキシメチル]エテン,ビオチン2-C=C17ジアミンBoc保護体162.31g,3.35mmolを塩化メチレン16mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下0°Cでトリフルオロ酢酸4.45mL,60.3mmolを滴下した後、室温で3時間攪拌した。TLC上で原料の消失を確認した後反応液を濃縮し、黄色透明シラップとしてジアミンのトリフルオロ酢酸塩Rf=0.17[CHCl3:MeOH:H2O=65:25:4v/v/v]を得た。得られたアミン塩をDMF15mLに溶解させ、アルゴン雰囲気下0°CでN-メチルモルホリン0.82mL,7.4mmolを滴下した。滴下後、室温に戻して30分攪拌した。続いてビオチン1.80g,7.37mmolとDMAP0.980g,8.04mmol、EDC2.45g,12.7mmolを加え、60°Cで一晩攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[1回目:クロロホルム―メタノール5:1v/v,シリカゲル240mL;2回目:クロロホルム―メタノール―水65:15:2v/v/v,シリカゲル300mL]とゲルろ過クロマトグラフィSephadexLH-20,メタノール,ゲル容量300mLで精製することにより、白色固体として目的物172.14g,67.7を得た。Rf033CHCl3MeOHH2O65254αD30416oIR3306and30922929and28591701and164315531099cm11HNMRδ513441422397235535034632731531130828526321421015912413CNMRδ17615and175931661031442211499726571257068706263396163570241064035402236923683301529802951275826942666MALDITOFMScalcdforC44H76N8O10S2MH94152Found94151AnalCalcdforC44H76N8O10S205H2OC5561H817N1179FoundC5564H813N1154S-2,2-ビス[2-2-{[6-N-シス-テトラヒドロ-2-オキソチエノ[3,4-d]イミダゾリン-4-バレリルアミノヘキサノイル]アミノ}エトキシエトキシメチル]エチルチオアセテート,ビオチン2-SAc18ビスビオチンチオアセチル体17500mg,531μmolを蒸留水―2-メトキシエタール混合溶媒1:1v/v,2.5mLに溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸1.13mL,15.9mmolと2,2’-アゾビスイソブチロニトリル89.7mg,546μmolを加え、80°Cで3時間攪拌した。その後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、反応液をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール―水85:16:2v/v/v,シリカゲル70mL]で3回精製した。続いてゲルろ過クロマトグラフィSephadexLH-20,溶媒:メタノール,ゲル体積:150mLで精製することにより、白色固体として目的物18160mg,29.6を得た。なおこの反応では未反応の原料17をほぼ回収することができた315mg,仕込み量に対して63.0。Rf038CHCl3MeOHH2O65152αD30390oIR3296and30862926and28591697and163915531134cm11HNMRδ441422354348346341232831531130829228526322521421019816812413CNMRδ19733176031759517580and175711658471477106704863216145569041054084403440233680307130623002296829372880274526822653MALDITOFMScalcdforC46H80N8O11S3MH101752Found101751AnalCalcdforC46H80N8O11S3C5431H793N1101FoundC5412H795N10841-3.[GlcNAcOH]2-ビオチン2コンジュゲートの合成化合物10と化合物18から[GlcNAcOH]2-ビオチン2コンジュゲートを以下のスキーム5の過程により合成した。[GlcNAcOH]2-Biotin2conjugate19N-アセチルグルコサミン2量体10188mg,137μmolとビオチン2量体18139mg,137μmolをメタノール―DMF混合溶媒1:1v/v,1.0mLに溶解させ、ナトリウムメトキシド12.5mg,230μmolを加えて室温で1時間攪拌した。反応溶液が濁り始めたため、40°Cの熱をかけ、さらに11時間攪拌した。TLC上で原料の消失を確認し、強酸性陽イオン交換樹脂IR-120BHを適量加えて中和した。その反応液を綿栓ろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール―水65:25:4v/v/v,シリカゲル70mL]で精製し、さらに分取型リサイクルHPLCカラムJAIGEL-W525;溶媒メタノールで精製することにより、白色泡状固体として最終目的物19140mg,49.6を得た。Rf024CHCl3MeOHH2O65254IR3296and30862926and28591694and164715571078cm11HNMRδ795452×2450×2442440423387379383×23633172SCH2CH2×233632831531130928526325424921320019519017416812413CNMRδ1761317591and1737316607145851258810281780476317216717471667162715871507144712570847063703869886503633862846162573757025143412541204108403740233694368432283223318230473016298029512759269426662315MALDITOFMScalcdforC89H156N16O30S4MNa208000Found2080002.式Vの化合物の合成例次に、式Iの化合物を合成するために使用可能な式Vk=1、l=1、m=1の化合物として、GlcNAcテトラマーの合成例を以下に示す。GlcNAcテトラマーは以下のスキーム6の過程により合成した。S-2,2-ビス[4’-{1’-N-[11’’-O-3’’’,4’’’,6’’’-トリ-O-アセチル-2’’’-N-アセトアミド-2’’’-デオキシ-β-D-グルコピラノ-3’’,6’’,9’’-トリオキサウンデシル]-1’,2’,3’-トリアゾール}メトキシメチル]エチルチオアセテート,[GlcNAcOAc]2-SAc20N-アセチルグルコサミンアセテート2量体9509mg,404μmolを1,4-ジオキサン3.0mLに溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸431μL,6.06mmolと2,2’-アゾビスイソブチロニトリル33.4mg,203μmolを加え、80°Cで1時間攪拌した。TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたため2,2’-アゾビスイソブチロニトリル33.0mg,201μmolを追加し、さらに2時間攪拌した。反応終了後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール15:1v/v,シリカゲル67mL]で精製することにより、白色泡状固体として目的物20460mg,85.2を得た。Rf048CHCl3MeOH1011HNMRδ77366451550747945924564254124053903903492andH5×2293233214205208201×2and19413CNMRδ17073×2and17042169281449012356101667324716671297065704670226976692868676453621653950133968305727912299207320682059MALDITOFMScalcdforC56H88N8O27SMNa135954Found1359601,1-ビス[2’,2’-{4’’-[1’’-1’’’-テトラアセチレングリコール-3’’’,4’’’,6’’’-トリ-O-アセチル-2’’’-N-アセトアミド-2’’’-デオキシ-β-D-グルコピラノシド-1’’,2’’,3’’-トリアゾール]メトキシメチル}エチルスルファニルメチル]エテン,[GlcNAcOAc]4-C=C21ビス[N-アセチルグルコサミンアセテート]チオアセチル体20428mg,320μmolと3-クロロ-2-クロロメチル-1-プロペン717.0μL,160μmolをメタノール―DMF混合溶媒1:1v/v,2.2mLに溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷した。続いて、ナトリウムメトキシド14.5mg,268μmolを加えて室温で一晩攪拌した。その後TLC上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたためナトリウムメトキシド25.2mg,466μmolを加え、反応を完全に進行させた。反応終了後、酢酸42.3μL,739μmolを加えて中和し、濃縮を行った。得られた残渣をピリジン3.0mLに溶解させ、無水酢酸3.0mLを加えて室温で一晩攪拌した。TLC上で反応終了を確認後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を1M硫酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順に洗浄し、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過、濃縮を行い、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ[クロロホルム―メタノール15:1v/v,シリカゲル50mL]で精製することにより、白色泡状固体として目的物21297mg,70.2を得た。Rf043CHCl3MeOH1011HNMRδ772670564506493480458CH2O×44564254124053913562×232122462211902×2208201and19313CNMRδ17067×21704116925144791405112354115741015873177158712070597046704170166980692468636442621253915008393235742997229520682064and2055MALDITOFMScalcdforC112H176N16O52S2MNa266410Found266383化合物21は、例えば、スキーム4に示す方法などにより、Zに相当する部分をアセチル基等にし、本発明の式Vの化合物の1つとして使用することができる。3.本発明のリガンド固定化分子を用いたリガンド結合力の検討本発明の実施例で合成した化合物19は、リガンドとして1分子あたり2個のGlcNAcを有している。従って、GlcNAcを1個のみしか有していない分子と比較すると、GlcNAcと結合パートナー分子との結合親和性が上昇していることが予想される。この点について、以下に検討を行った。結合パートナー分子として、WGAレクチンを使用した。また、GlcNAc1個のみを有する対照分子として以下の化合物Aを使用した。WGAレクチンと糖化合物19のGlcNacなどが結合すると蛍光強度の変化が生じる。この蛍光スペクトルの変化から、WGAレクチンとリガンド化合物19又は対照化合物Aとの結合親和性を測定することができる。WGAレクチン溶液0.65μM、pH7.2、5.0±0.1°Cに化合物19657μM、0.15MNaCl含有50mMTris-HClバッファー又は化合物A35.3mM、0.15MNaCl含有50mMTris-HClバッファーを5μLずつ加えた時の蛍光スペクトルEx.295nm変化から、348nmにおける蛍光強度変化を測定し、結合親和性Kaを測定した。その結果、本発明の化合物19の結合親和性は、Ka=5.7×105M-1であったのに対し、化合物Aは、Ka=8.2×103M-1と2桁程度低かった。従って、本発明のリガンド固定化分子は、リガンド数を自在に増加させることが可能であり、所望の結合親和性を有するリガンド固定化分子の調製が可能な優れた分子である。"