"組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、前記組成物から前記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および/または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含む方法。前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項1に記載の方法。前記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび/または空気アレルゲンである、請求項1に記載の方法。前記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、請求項3に記載の方法。前記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、請求項4に記載の方法。前記空気アレルゲンが花粉または胞子である、請求項3に記載の方法。組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、前記組成物から前記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および/または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップ、精製アレルゲンの供給源を提供するステップ、および精製アレルゲンの前記供給源を用いて、紫外線検出および/または質量分析検出を備えた前記液体クロマトグラフィーを実施するために使用する前記機器を較正するステップを含む方法。前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項7に記載の方法。前記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび/または空気アレルゲンである、請求項7に記載の方法。前記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、請求項9に記載の方法。前記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、請求項10に記載の方法。前記空気アレルゲンが花粉または胞子である、請求項9に記載の方法。組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンの複数のアイソフォームまたは変異体を含む組成物を提供するステップ、前記組成物から前記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含む方法。前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップが、前記アレルゲンの1つまたはそれ以上の変異体またはアイソフォームの量を、紫外線検出および質量分析検出により測定するステップを含む、請求項13に記載の方法。前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項13に記載の方法。前記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび/または空気アレルゲンである、請求項13に記載の方法。前記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、請求項16に記載の方法。前記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、請求項17に記載の方法。前記空気アレルゲンが花粉または胞子である、請求項16に記載の方法。本発明の実施形態は、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法を含む。本発明の実施形態は、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含むことができる。本明細書において使用する場合、アレルゲンはアレルギー反応または過敏反応を誘導する任意の物質である。実施形態において、アレルゲンは、公知のアレルゲン、例えば特定の対象においてアレルギー反応または過敏反応を発生させることが公知である物質であってよい。実施形態において、アレルゲンは、公知のアレルゲンであるという理由で、本発明の方法による分析のために選択されてよい。本明細書において使用する場合、アレルギー反応またはアレルギーは、後に曝露したときにアレルゲンに対する反応性が著しく増加するような特定のアレルゲンへの曝露により引き起こされる過敏反応または過敏性である。本発明の実施形態において、液体クロマトグラフィーは、一次元または二次元のいずれであってもよい。本明細書において使用する場合、組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するは、アレルゲンを含む固体組成物の場合、アレルゲンの少なくとも一部を、それを含む固体組成物から液体組成物中に取り出し、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーに適切な抽出液を形成することを意味する。実施形態において、アレルゲンの少なくとも一部を、それを含む固体組成物から液体組成物中に取り出すことは、当業者に利用可能な任意の様式で実施されてよい。タンパク質または他のアレルゲンの固体組成物からの抽出は、当分野において周知であり、単一ステップまたは複数ステップの方法で実施できる。タンパク質または他のアレルゲンの固体組成物からの抽出に使用できる技術の例は、浸出法、液化、溶解、超音波処理、凍結/解凍サイクル、均一化、ろ過、電気泳動、透過化、沈殿、変性、遠心分離、クロマトグラフィー、差次的可溶化およびろ過を含むが、これに限定されない。アレルゲンを含む液体組成物の場合、組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するは、液体クロマトグラフィーステップにより実施できると考えられ、これにより、アレルゲンが液体中の1つまたはそれ以上の他の成分から分離される。特定の実施形態において、アレルゲンは、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび/または空気アレルゲンであり得る。食物アレルゲンの例は、食品穀物、ピーナッツ、豆類、エンドウ、果実、セロリ、ゴマ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンを含むが、これに限定されない。食品穀物アレルゲンの例は、ダイズ、トウモロコシおよびコムギのアレルゲンを含むが、これに限定されない。実施形態において、アレルゲンは、トウモロコシ脂質輸送タンパク質であってよい。本明細書において使用する場合、空気アレルゲンは、アレルギー反応を引き起こし得る任意の空気中物質である。空気アレルゲンの例は、花粉および胞子を含むが、これに限定されない。本発明に従った方法の実施形態は、精製アレルゲンの供給源を提供または単離するステップ、および精製アレルゲンを使用して紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを実施するために使用する機器を較正するステップもまた含むことができる。他の実施形態において、アレルゲンを含む組成物は、アレルゲンの複数のアイソフォームまたは変異体を含むことができる。さらなる実施形態において、本発明に従った方法は、試料中のアレルゲンの複数の異なるアイソフォームまたは変異体の量を測定するために使用され得る。実施形態において、アレルゲンの異なるアイソフォームまたは変異体の量の測定は、紫外線検出ステップおよび/または質量分析検出ステップを備えた単一の液体クロマトグラフィーステップを用いて測定され得る。LC-MS法は、近年、複合マトリックスにおける特異性、感受性および正確性の高さによって、さまざまなバイオマーカーを定量および同定するために首尾よく開発されてきた25、26。LC-MSによるタンパク質の定量は、ペプチドレベルタンパク質分解後の署名ペプチドまたはタンパク質レベル無処理のタンパク質の分析のいずれにおいても実施され得る。同位体で標識された合成類似体を内部標準として使用して、トリプシン署名ペプチドを分析することによるタンパク質定量の方法論が、詳細に記載されている27。しかし、署名ペプチドの取り組みは、a配列が対象となるタンパク質だけに特異的である適切なペプチドが見出されなければならないこと27、b内部標準の挙動が、消化前の無処理のタンパク質の挙動と比較して、有意に異なり得ること、およびcタンパク質のトリプシン消化が完全であることに依存することを含む、いくつかの課題を提起する28。LC-UV/MSによる無処理のタンパク質の定量は、時間のかかる、潜在的に問題のある消化ステップを回避する。さらに、署名ペプチドの取り組みにより取り逃されるさまざまなアイソフォームまたは変異体が、分離され、定量され得る。本明細書において記載する場合、LTPおよびLTP類似体は、トウモロコシ穀粒から精製され、特徴付けられた。LTPの検出のための高い特異性および感受性を得るために、LC-UV/MS法が、迅速な同定および定量用に開発された。この方法は、14のトウモロコシ系統の比較において、アッセイの特異性、感受性および定量の正確性を実証するために開発された。LC-UV/MSの使用は、試料操作の最小化、分析時間の短縮をもたらすことができ、アレルゲンレベルの評価に関する組成物試料の定量を正確にする。本発明を、以下の実施例においてさらに記載するが、これらは例示目的で提示するものであり、いかなる方法においても本発明を限定する意図では決してない。実施例に使用する方法および材料:材料:アンモニウムビカーボネートおよびMESバッファは、SigmaSt.Louis、MOから購入した。HPLCグレードのイソプロピルアルコールIPA、微量金属グレード水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、LC/MSグレードのトリフルオロ酢酸TFA、塩化水素、ジチオエリトリトールDTEおよびβ-メルカプトエタノールは、ThermoFisherScientificPittsburgh、PAから購入した。HPLC-グレードのアセトニトリルACNおよびメタノールは、J.T.BakerPhillipsburg、NJから購入した。0.22μmのメンブレンフィルタを有するSteriflip使い捨て真空ろ過システムは、MilliporeBillerica、MAから購入した。SPSepharose陽イオン交換カラムは、GEHealthcareBioSciencesPiscataway、NJから購入した。ポリプロピレンオートサンプラーバイアルインサートは、AgilentSantaClara、CAから購入した。基準の4~20Tris-HClゲルは、Bio-RadHercules、CAから購入した。Lys-Cおよびトリプシンは、RocheAppliedSciencesIndianapolis、INから入手した。すべての分析に、Milli-QMillipore、Billerica、MA脱イオン水を使用した。参照LTPの調製:非トランスジェニックトウモロコシ種子からのLTPの精製。トウモロコシ由来LTPタンパク質の抽出および単離を、以下のように実施した。既存のトウモロコシ穀粒を、RobotCoupeグラインダーModel:RSI2Y-1、RobotCoupeUSA,Inc.を用いて、等量のドライアイスを含有する微粉に粉砕した。ドライアイスを、-20°Cにおいて一晩抜き、翌日、50グラムの粉末化穀粒を、350mLの125mMアンモニウムビカーボネートバッファに再懸濁した。混合物のpHをNaOHで8.0に調整し、試料を、連続混合しながら、72°Cで2時間加熱した。不溶性粒子を、試料を37000gで5分間、20°Cにおいて遠心分離にかけることによって除去した。得られた上清を、P8グレードのろ紙を通してろ過し、試料を、5mgのトリプシンSigmaCatT7168で一晩、40°Cにおいて消化した。タンパク質分解後、試料のpHを、HClで5.2に下げ、試料を、30000gで15分間、20°Cにおいて遠心分離にかけることによってさらに清澄化した。得られた上清を、0.45μmのフィルタを通してろ過し、試料を、50mMのMESバッファ、pH5.5バッファAであらかじめ平衡化したSPSepharoseカラムに添加した5mL/分、Milli-Q水と50/50で混合。試料の添加後、カラムを、A280がベースラインまで下がるまでバッファAで広範囲に洗浄した。結合したタンパク質を、バッファAからバッファBバッファA0.5MNaClのリニアグラジエントにより溶出させ、回収した分画をSDS-PAGEにより検査した。約9kDaのLTPタンパク質を含有する分画を混ぜ合わせ、タンパク質濃度を、定量的アミノ酸分析により測定した。プールした分画をバイアルにアリコートし、-80°Cにおいて保存した。試料の調製:トウモロコシ穀粒からの、LTPおよびLTP変異体の単離。粉砕トウモロコシ穀粒からのLTPの抽出は、先の報告にいくらかの変更を加えて実施した。21簡潔に言うと、-20°Cに保存した粉砕トウモロコシ穀粒を、Dry-Rite商標を含有するドライボックスにおいて室温で解凍した。およそ100mgの粉砕トウモロコシ穀粒を秤量し、700μLの0.125Mのアンモニウムビカーボネートバッファ、pH8.3を加え、1,100rpmで2時間、22°CにおいてThermoMixer商標を使用して混合した。試料を、16100gで30分間、遠心分離により清澄化し、得られた上清を、1.5mLのマイクロチューブに移した。アリコートをオートサンプラーバイアルに移す前に、抽出液を2分間、16100gで再度遠心分離にかけた。SDS-PAGE分析およびタンパク質消化。LTPの同定および特徴付けを容易にするために、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEを、4~20Tris-HClゲルBio-RadHercules、CAを用いて実施した。簡潔には、試料を、5のβ-メルカプトエタノールを含むLaemmliバッファで希釈した。得られた試料を371gで45秒間遠心分離にかけ、その後、95°Cにおいて1.5分間加熱した。分離されたタンパク質を、CoomassiebrilliantblueR-250を用いて検出した。分離および染色後、対象となるタンパク質バンドを切り取り、トリプシンまたはLys-Cとともに、37°Cにおいて一晩インキュベートした。ペプチドを、25mMのアンモニウムビカーボネートバッファ中50ACNおよび0.5TFAを用いてゲルから抽出した。ゲルに残留するペプチドを、その後、25mMアンモニウムビカーボネートバッファ中70ACNおよび5ギ酸を用いて抽出した。抽出液をプールし、vacufugeにおいて乾燥させた。乾燥ペプチドを、18μLに再構成した。得られたタンパク質分解ペプチドを、質量分析により直接分析した。LTPおよび変異体の特徴付けのための、質量分析条件。すべての質量スペクトルを、Agilent6520Q-TOF質量分析計およびAgilent1200SL液体クロマトグラフィー系において得た。クロマトグラフィーをグラジエント溶出によりAcquityBEH130C18カラムWaters、Milford、MAから50°Cにおいて実施し、カラム寸法は100×2.1mmであり、Agilent1200SLsystemAgilentSantaClara、CAの粒径は1.7μmであった。カラムを、95の移動相A水中0.1v/vFA;MPAおよび5の移動相Bアセトニトリル中0.1v/vFA;MPBを使用して、流速200μL/分で平衡化した。注入体積は、5および20μLの間で変動した。リニアグラジエントを、5MPBから40MPBは17.2分にわたって、40MPBから45MPBは1.7分にわたって用いた。カラムをその後、初期条件まで6分間再平衡化した。UV210~600nmおよびMS200~1800amu、1Hzの両方を得た。UVデータを、Agilent1200SLDiodeArraydetectorAgilentSantaClara、CAを使用して得た。陽イオンエレクトロスプレーイオン化ESIを、6520QTOF質量分析計AgilentSantaClara、CAおよびデュアルESIイオン源において実施した。質量スペクトル獲得のための機器パラメータは、下記の通りである:VCapは3500V、フラグメンターは145V、スキマー1は65V、ガス温度は350oC、ガス流速は8L/分、ネブライザーは310kPaに設定した。タンデムMS実験の間、静的排除範囲を用いた標的化MS/MSを用いた。ピークをタンデムMSのために単離し、9amu幅および3.6V/100Da2Vの衝突エネルギー勾配を適用した。得られたすべてのデータMSおよびMS/MSを手作業で処理した。特徴付けおよび定量のためのクロマトグラフィーおよび質量分析の条件。クロマトグラフィーを、グラジエント溶出によりAcquityBEH300C4カラムWaters、Milford、MAから70°Cにおいて実施し、カラム寸法は100×2.1mmであり、AcquityUPLCsystemWaters、Milford、MAの粒径は1.7μmであった。カラムを、93移動相A水中0.1v/vTFA;MPAおよび7移動相BIPA中0.1v/vTFA;MPBを、流速300μL/分で使用して平衡化した。試料を、パーシャルループフィル注入モードおよび5μLの注入体積を使用して注入した。リニアグラジエントを、7MPBから14.5MPBは15分にわたって用い、その後MPBを、50.5まで7分間線形に傾斜させた。その後、カラムを初期条件まで5分間再平衡化した。試料の注入前、オートサンプラーニードルを、IPA強力洗浄および水弱い洗浄で洗浄し、試料のキャリーオーバーを最小化した。UV215nm、10HzおよびMS700~2300amu、1Hz両方のデータを得た。UVデータを、AcquityTUV検出器WatersMilford、MAを使用して得た。UV獲得のための機器パラメータは以下の通りであった:波長215nm、サンプリング速度10ポイント/秒および時定数0.2秒。陽イオンエレクトロスプレーイオン化ESIを、ロック-スプレーインターフェイスを用いたQ-ToFmicro商標質量分析計Waters、Milford、MAにて実施した。MS注入の前に、7グリセロール/68水/25アセトニトリルの溶液をTeeにより導入し、トリフルオロ酢酸の存在下のイオン化効率を改善した。質量分析スペクトル獲得のための機器パラメータは、以下の通りであった:キャピラリー2850V、試料コーン35V、抽出コーン1.5V、脱溶媒和温度410oC、供給源温度100oC、低および高質量分解能5、脱溶媒和ガス600L/時、コーンガス50L/時、MCP検出器2350V、スキャン時間0.9秒、インタースキャンデレイ0.1秒および衝突エネルギー10。方法の開発ELISAによるLTPの定量は選択法である。29トウモロコシ由来のLTPの場合、特異的抗体の不足のために、LTPを定量するための別の取り組みが考えられた。このことにより、LC-UV/MS分析によるトウモロコシ抽出液の可溶性分画中のトウモロコシLTPの定量的測定に関する方法を開発することになった。トウモロコシLTP中のトリプトファン残基の不在のため、波長215nmを使用するに至った。215nmという波長は、移動相IPAおよびTFAの吸光度を最小化し、被検物質の感受性を最大化し、溶媒のグラジエントを通して一定のベースラインを維持するために慎重に選択した。逆相タンパク質分離のためのIPAおよび高温の使用が、優れた回収および分解能を得るために重要であることがすでに示されている30。特異性の問題に対処するために、MSの反応もまたモニターした。TFAの存在下の質量分析計の反応を改善するために、水/アセトニトリル混合物中グリセロール溶液をMSの前に加えた。シグナル対ノイズ比の増大およびより高い荷電状態への推移を観察した。グリセロール/水/アセトニトリル混合物の存在下で観察された全イオン電流は、移動相の添加剤であるギ酸の存在下で観察されたシグナルと同等であった。グリセロールの添加により、エレクトロスプレーイオン化の間にタンパク質およびタンパク質複合体のイオン化が劇的に増加することが以前に示されている。31方法の開発の間に、参照LTPとガラスバイアルとの結合が観察された。吸着によるこのLTPの損失は、精製された参照LTPの分析時に観察された。オートサンプラーバイアルへの吸着による損失を最小にするために、ポリプロピレンバイアルインサートを、すべての分析に使用した。さらに、参照LTPのLC-UV/MS分析の間、濃度0.3mg/mLのウシ血清アルブミンもまた含まれた。ウシ血清アルブミンの添加およびポリプロピレンバイアルの使用の両方は、低濃度における線形性の維持に必須であった。実施例1:LTPMSによる特徴付け。脂質輸送タンパク質はトウモロコシの主要なアレルゲンであるが、それらの定量化方法は十分確立されていない。LTPの多数の分子形態および異性体が多数の異なる組織において観察されており、結果として、これらのタンパク質のアイソフォームの低濃度および構造類似性のため、分析には高い感受性および選択性が求められる。これは、LTPの精製および特徴付けにつながった。トウモロコシ穀粒中の内因性LTPを、精製後、SDS-PAGEにより分析した。図1に示すように、LTPの単量体型を表す、およそ9kDaのタンパク質バンドが観察された。図2および3は、それぞれ精製タンパク質の全イオンクロマトグラムおよび対応する質量スペクトルを表す。質量スペクトルにより、[MH]イオンをm/z9047.1において発生する主要成分の存在が明らかにされた。この測定された質量は、m/z9046における理論的前駆体質量[MH]イオンの0.01内であった。およそ9kDaのタンパク質バンドの同定を、トリプシンおよびLys-Cプロテアーゼを使用するゲル内消化後、ペプチドマスフィンガープリンティングPMFによりさらに確認した。LTPの完全適用範囲のトウモロコシLTPのアミノ酸配列に基づき、トリプシンペプチドおよびLys-Cペプチドとの比較を達成した図4。N末端トリプシンペプチド、AISCGQVASAIAPCISYARおよびLys-C切断C末端ペプチド、CGVSIPYTISTSTDCSRVNを、LC-MS/MSを使用するMS/MSによる確認のためにさらにシーケンシングした。フルスキャンMSの手作業の解釈および観察されたすべての前駆体電荷状態のMS/MSスペクトルにより配列が明らかになった。各アミノ酸残基を、フラグメントイオンにより生成されるyイオン系列またはbイオン系列のいずれかにより、最小限確認した。実施例2:検証実験LTPを測定するアッセイの正確性を、4.1から147μg/mLの範囲内の11の濃度レベルの参照LTPをスパイクしたトウモロコシ穀粒抽出液の二連の注入を分析することにより評価した。ひとまとめにした一点較正を、参照LTP84.7μg/mLを使用して実施した。非スパイク抽出液中のLTP濃度を測定するために、非スパイク抽出液の5つの注入を実施した。アッセイの正確性相対誤差のパーセント、REを計算し、表1に示すLTP濃度は溶液中の濃度および種子中の対応する濃度の両方の面から報告する。方法の線形性もまた、同じデータを使用して測定した。線形性曲線が、LTPのピーク面積対濃度をプロットすることによって得られた。線形回帰を使用して、4.1~147μg/mLの範囲にわたる線形方程式を得た。線形性曲線の計算に関して、この方程式は原点を通りらなかった。LTPを測定するアッセイの精度を、4日ごとに、挽いた穀粒の3連の調製品各調製品を2連に注入を、3つの濃度レベル低濃度、中濃度および高濃度において分析することによって評価した。日ごとに用意された試料を、一点参照LTP較正標準に85μg/mLひとまとめにした。アッセイの1日のうちの正確性および日ごとの正確性パーセント変動係数、CVを計算し、表2に示す。すべてのトウモロコシ種子試料中の内因性LTPの存在により、アッセイの選択性は、ESI-LC/MSにより無処理の分子の質量測定およびSDS-PAGEによるLCLTP分画の分析により測定した。さらに、被検物質のキャリーオーバーを、もっとも高い標準試料の直後に溶媒ブランクを分析することにより評価した。方法のロバスト性を決定するために、以下のパラメータを調査した:抽出効率、カラム温度、TFA濃度ならびに参照LTP溶液およびトウモロコシ穀粒抽出液の安定性。トウモロコシ穀粒からのLTPの抽出効率を測定した。参照系統3および13からの粉砕トウモロコシ穀粒を、上記の詳細なプロトコルにより、1時間、2時間、5時間または17時間抽出した。これらのさまざまな時点における抽出LTP濃度を、LC-UV/MS分析により測定した。さらに、2時間抽出した試料を、400μLの上清を取り除いた後、500μLのアンモニウムビカーボネートバッファをさらに加えて、もう2時間の2回目の抽出にさらに供した。抽出後、LTP濃度をLC-UV/MS分析により測定し、補正を適用し、1回目の抽出からのLTPの残りを考慮に入れた。クロマトグラフィー分解能およびLTP定量についてのカラム濃度65°C、70°Cおよび75°CおよびTFA濃度0.09、0.1および0.11の効果を、粉砕トウモロコシ穀粒抽出液を使用して評価した。濃度の測定に関して、参照LTPを、同じ実験条件下でさらに分析した。参照LTPおよびトウモロコシ穀粒抽出液の、室温および4°Cにおける安定性を、48時間にわたって評価した。トウモロコシ穀粒抽出液および参照LTPのアリコートを、4°Cおよび室温において48時間保存した。参照LTPおよびトウモロコシ穀粒抽出液の両方の反応を、試料調製直後に測定した。保存後、安定性試料をLC-UV/MSにより分析した。安定性を、保存試料と、新しく調製された参照LTPとを比較することによって評価した。保持時間12.7分および13.1分のLTP変異体を特徴付けるために、20mLのトウモロコシ穀粒抽出液参照系統5を、複数回注入し、分画を手作業で回収した。回収した分画をプールし、Centrivap機で濃縮し、SDS-PAGEに供した。タンパク質バンドを切り取り、Lys-C消化またはトリプシン消化に供し、ペプチドをゲルの外に抽出した。抽出したペプチドを、その後LC-MS/MSにより分析した。トウモロコシの特定の系統の穀粒由来の水性抽出液は、同様の質量のタンパク質変異体を含有し、逆相カラムにおいて特徴的な同様の保持時間を有する。LTPと、同様の逆相保持特徴を有する他のタンパク質とを分離する方法の特異性は、図5から推測できる。図6の保持時間12.3分のピークはトウモロコシLTPに対応するが、12.7分および13.1分のピークは、それぞれLTP変異体AおよびBに対応する。ベースライン分解能は、1.6の測定された分解能を有する、これら2つのタンパク質の分離に関して得られる。LTPピークの純度を、図1レーン2に示されたSDS-PAGEにさらに例示する。LTP変異体AおよびBのさらなる特徴付けは、LC分画を回収し、それらをトリプシンまたはエンドプロテイナーゼLys-Cによる溶液中タンパク質分解に供し、その後LC-MS/MSによりペプチドを分析することによって実施した。ペプチドマスフィンガープリンティングおよびタンデムMSデータにより、LTP変異体Aが、34位に単一アミノ酸多型アルギニンからリジンを有したことが明らかになった。これは、無処理の分子量測定によりLTPおよびLTP変異体Aの間に観察される、28amuの差によりさらに裏付けられた図6BおよびD。部分的ペプチドマスフィンガープリンティングおよび無処理の分子量分析に基づいたLTP変異体Bに関する改変33amuの正確な部位複数可は確認できなかった。これらの結果は、開発されたLC-UV/MS法の特異性をさらに例示する。カラム温度は、これらの2つの成分の分解能を得る重要な要因であった。温度60°Cおよび90°Cにおいて、これらの2対の成分の間の分解能は不適切であった。トウモロコシ穀粒中の内因性LTPの存在により、アッセイの全検証用LTP参照標準試料の調製が複雑となった。結果として、検証研究の開発のために、非スパイクトウモロコシ穀粒抽出液中のLTP濃度を、LTP参照標準を使用することによってまず測定した。線形性および正確な研究のために使用するトウモロコシ穀粒系統中に存在する内因性LTPレベルは、58μg/gであった。アッセイの線形性および正確性を、11の濃度において、トウモロコシ穀粒抽出液を使用して参照LTPをスパイクすること、またはアンモニウムビカーボネートバッファで希釈することによって測定した。アッセイが、4.1~147μg/mLの範囲にわたって、トウモロコシ穀粒抽出液中のLTPに関して線形であることが観察され図5、R2値は0.999であった。この濃度範囲は、トウモロコシ穀粒中のLTPの28.6から1030μg/gに対応する。アッセイの正確性範囲REは0~5.1であり、94.9~103の範囲の回収であった表1。215のノイズ応答に対するシグナルが、LTPの最低測定濃度である4.1μg/mLにおいて観察された。方法の線形性を測定するために、ウシ血清アルブミン中参照LTPの段階希釈を実施した。R2値が0.999の線形応答が得られたが、応答因子面積/濃度の急速な減少が、LTP濃度44.2μg/mL未満において観察された。この減少は、トウモロコシ穀粒抽出液中の内因性LTPがバッファでLTP濃度10.4μg/mLにまで段階的に希釈された場合には観察されなかった。これらの観察は、マトリックス成分の不在下での吸着による、LTPの損失を示唆している可能性がある。その日のうちおよび日ごとの精度に関する検証結果を表2に提示する。精度を、低濃度、中濃度および高濃度のLTPを有することがこれまでに明らかとなっている3つの異なるトウモロコシ穀粒系統を使用して測定した。中間の精度を、2人の分析者、2つのカラムロットおよび2つの異なるLC系を使用してさらに評価した。精度範囲CVは9.1~14.4であり、この4日間中すべての試料にわたってプールされた相対標準偏差は11.6であった。高濃度LTPトウモロコシ穀粒系統の後のブランク試料中に存在する絶対キャリーオーバーは、およそ0.6であることが見出された。これは、トウモロコシ穀粒中6μg/gのLTP濃度に置き換えられる。任意のキャリーオーバー効果をさらに軽減するために、溶媒ブランクを、分析対象となる試料を分離するためのセット全体に配置した。抽出効率を測定するために、抽出LTP濃度を、第1および第2の抽出ステップ後に測定した。補正係数を、第2の抽出ステップ後に抽出されたLTPに適用した。この補正後、第1および第2の抽出ステップにおいて抽出されたLTPの濃度は、それぞれ、参照系統3由来で32.1および1.61μg/mLであり、参照系統13由来で88.2および8.75μg/mLであった。第1ステップにおける抽出効率は、91~95の間である。抽出効率の時間効果もまた、参照系統3および13に関して、1時間、2時間、5時間および17時間において測定した。参照系統3に関して、LTP濃度は、それぞれ204、225、241および220μg/gであった。参照系統13に関して、LTP濃度は、それぞれ526、619、658および648μg/gであった。まとめると、両方の参照系統に関して、2時間における抽出効率は、5時間において観察される効率の94である。カラム温度の変動およびLTP濃度測定に対するその効果を評価した。カラム温度65°C、70°Cおよび75°Cにおいて、LTPの濃度は、それぞれ44.7、48.1および47.2μg/mLであると測定された。移動相AおよびBにおけるTFA濃度の0.09、0.1および0.11の変動に対して、測定されたLTP濃度は、それぞれ46.1、43.8および47.1μg/mLであった。カラム温度およびTFA濃度における変動による、ここで観察された偏差は、方法のRSD内である。溶液中の参照LTPおよび穀粒抽出液中のLTPの被験物質安定性を、4°Cおよび室温において評価した。溶液中の参照LTPに関して、1.91および4.75の損失が、48時間後に、それぞれ4°Cおよび室温において観察された。穀粒抽出液中のLTPに関して、8.3および11.5の損失が、48時間後に、それぞれ4°Cおよび室温において観察された。これらの損失を考慮に入れて、損失はアッセイの精度の範囲内であるが、参照標準LTPを、各試料セットのはじめ、中間および終わりに分析した。実施例3:トウモロコシ系統中のLTPの分析14の異なるトウモロコシ種子系統を、記載のように3連に調製した。各調製品の2連の注入を、LC-UV/MS分析に供した。分析を、一点LTP参照標準を検量体として、ひとまとめにした。検量体もまた、参照系統の分析の間に散在させた。参照LTP由来の応答因子を使用して、LTPおよびそれぞれ保持時間が12.7および13.1分の2つの変異体aおよびbの濃度を測定した。結果を表3に示す。対象となる14のトウモロコシ穀粒系統中に存在するLTPおよびその変異体の濃度を、開発されたアッセイを使用して測定した。14の系統中のLTPおよび変異体AおよびBの濃度は、それぞれ、58~678μg/g、31~528μg/gおよび21~52μg/gの間で変動した表3。LTPの発現量は、分析される組織および組織の発育段階に依存することが、以前に示されている3。この研究は、トウモロコシ穀粒中のLTPのさまざまな濃度が、個別のトウモロコシ系統の遺伝的バックグラウンドまたは成長条件に依存し得ることを示す。14のトウモロコシ系統の分析に関して得られた精度CVは、検証研究の間に測定されたアッセイの精度と一致する。これらの結果は、LTP濃度がこのアッセイ方法を使用して再現可能に測定できることを示す。実施例4:アレルゲン含有組成物の分析食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモ由来のアレルゲンの抽出液ならびに個々のアレルゲンに対する参照標準を得た。各抽出液の2連の注入を、LC-UV/MS分析に供した。分析を、一点参照標準を検量体として、ひとまとめにした。検量体もまた、参照系統の分析の間に散在させた。参照標準由来の応答因子を使用してアレルゲンおよびこれらの変異体の濃度を測定した。異なる抽出液の分析に関して得られた精度CVは、検証研究の間に測定されたアッセイの精度と一致する。これらの結果は、アレルゲン濃度がこのアッセイ方法を使用して再現可能に測定できることを示す。本発明は特定の実施形態において記載されたが、本発明は、この開示の趣旨および範囲内でさらに改良できる。したがって、本出願は、その一般原理を使用する本発明の任意の変形、使用または適合を含むことを意図する。さらに、本出願は、この発明に付随し、添付の特許請求の範囲内に納まる、当分野において公知または習慣的な実践に入るような本開示からの逸脱を含むことを意図する。参考文献KaderJCAnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology199647627654ThomaSLKanekoYSomervilleCPlantJ1993342737SossountzovLRuizAvilaLVignolsFJolliotAArondelVTchangFGrosboisMGuerbetteFMiginiacEDelsenyMPuigdomenechPKaderJCThePlantCell19913923933PyeeJYuHKolattukudyPEArchBiochemBiophys1994311460468CarvalhoAOTeodoroCESDaCunhaMOkorokovaFacanhaALOkorokovLAFernandesKVSGomesVMPhysiolPlant2004122328336TsuboiSOsafuneTTsugekiRNishimuraMYamadaMJBiochem1992111500508KaderJCTrendsPlantSci199726670GaudetDLarocheAFrickMHuelRPuchalskiBPhysiolPlant2003117195205BubierJSchlappiMPlantCellEnviron200427929936DouliezJMichonTElmorjaniKMarionDJCerealSci200032120EklundDMEdqvistJPlantPhysiol200313212491259ParkSYJauhGYMolletJCEckardKJNothnagelEAWallingLLLordEMPlantCell200012151164GarciaOlmedoFMolinaASeguraAMorenoMTrendsMicrobiol199537274vanLoonLvanStrienEPhysiolMolPlantPathol199955514519DiazPeralesAGarciaCasadoGSanchezMongeRGarciaSallesFJBarberDSalcedoGClinExpAll2002328792PastorelloEAFarioliLPravettoniVOrtolaniCIspanoMMonzaMBaroglioCScibolaEAnsaloniRIncorvaiaCContiAJAllergyClinImmunol1999103520526PastorelloEAFarioliLPravettoniVGiuffridaMGOrtolaniCFortunatoDTrambaioliCScibolaECalamariAMRobinoAMContiAJChromBBiomedSciAppl200175695103PastorelloEAFarioliLPravettoniVOrtolaniCFortunatoDGiuffridaMGPeronoGaroffoLCalamariAMBrennaOContiAJAllergyClinImmunol2003111350359DiazPeralesATabarAISanchezMongeRGarciaBEGomezBBarberDSalcedoGJAllergyClinImmunol2002110790796PalacinACumplidoJFigueroaJAhrazemOSanchezMongeRCarrilloTSalcedoGBlancoCJAllergyClinImmunol200611714231429PastorelloEAFarioliLPravettoniVIspanoMScibolaETrambaioliCGiuffridaMGAnsaloniRGodovacZimmermannJContiAFortunatoDOrtolaniCJAllergyClinImmunol2000106744751PastorelloEAPompeiCPravettoniVFarioliLCalamariAMScibiliaJRobinoAMContiAIamettiSFortunatoDBonomiSOrtolaniCJAllergyClinImmunol2003112775783MalekiSJCurrOpinAllergyClinImmunol20044241245NakajimaOTeshimaRTakagiKOkunukiHSawadaJRegulToxicolPharmacol2007479095JiQCRodilaRGageEMElShourbagyTAAnalChem20037570087014CzerwenkaCMaierIPotocnikNPittnerFLindnerWAnalChem20077951655172KirkpatrickDSGerberSAGygiSPMethods200535265273BarnidgeDRHallGDStockerJLMuddimanDCProteomeRes20043658661BorgesJPJauneauABruleCCulerrierRBarreADidierARougePPlantPhysiologyandBiochemistry200644535542DillonTMBondarenkoPVRehderDSPipesGDKleemannGRRicciMSJChromA20061120112120IavaroneATJurchenJCWilliamsERAnalChem20017314551460SossountzovLRuizAvilaLVignolsFJolliotATchangVAFGrosboisMGuerbetteFMiginiacEDelsenyMPuigdomenechPKaderJCThePlantCell19913923933"