レシオメトリックに基づくCEST画像化法における、CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体の使用。レシオメトリックに基づくCEST画像化法における、CEST剤がペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を含むランタニド錯体化合物である請求項1に記載の使用。ランタニド錯体のランタニド金属イオンが、プラセオジム、ネオジム、ジスプロシウム、エルビウム、テルビウム、ホルミウム、ツリウム、イッテルビウムおよびユーロピウムここで、およびイッテルビウムから選ばれる請求項2に記載の使用。ランタニドイオンが、イッテルビウムまたはユーロピウムである請求項3に記載の使用。錯体の大環状キレート配位子が、式:式中、Rは、CHCOOHである;R1は、H、またはO、N、CO、NHCO、CONH基から選ばれる基によって任意に中断され、1つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシル基、フェニルもしくは置換フェニル基によって、またはCOOH、NHR3もしくはNR4R5から選ばれる基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1C5アルキル鎖である;R2は、H、または1つ以上のC1C3アルコキシによって任意に置換されるC1C5アルキル鎖、あるいはヒドロキシアルコキシ基であるで示される化合物であるか、またはその二量体もしくは多量体誘導体である請求項2~4のいずれか1つに記載の使用。式の化合物において、R2がHであり、R1がH、CH3、CH2CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2、CH2CHCH2OH、CH2OCH2C6H5、CH2OCH2、CH2OCH2から選ばれる基である請求項5に記載のランタニド錯体化合物の使用。式の化合物において、R2がH、R1がCH3であり、ランタニド金属イオンがイッテルビウムまたはユーロピウムから選ばれる請求項5または6のいずれか1つに記載の使用。CEST剤が、1134トリヒドロキシブタン2イル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のランタニドキレート錯体である請求項1~4のいずれか1つに記載の使用。濃度非依存性CEST造影剤としての、請求項5または6のいずれか1つに定義する式のランタニド錯体化合物、またはその二量体もしくは多量体誘導体、あるいは請求項8に記載のランタニドキレート錯体の使用。診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存性マップを得るための、CEST応答剤としての請求項9に記載のランタニド錯体化合物の使用。CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体に属する磁気的に非等価な交換可能なプロトンを利用することを含むレシオメトリックに基づくCEST画像化法。CEST剤が、請求項2~8のいずれか1つに定義するLn錯体化合物を含む請求項11に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。濃度非依存性インビボCEST画像化を提供するための請求項11または12に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。ヒトまたは動物の体器官、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存性インビボマップを得るための、請求項11または12に記載のレシオメトリックに基づくCEST画像化法。i必要に応じて、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること;ii前投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する2つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲において、Zスペクトルを集め、そして、これらの2つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動効果からレシオメトリック値を計算すること;iii計算されたST値から、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップを得、必要に応じて、該マップを形態画像上に重ね合わせること;を含む、CESTMRI技術を用いることによる、式のLnキレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体を前投与されたヒトまたは動物患者における診断対象の物理的または化学的パラメーターの測定方法。HPDO3A四量体、その塩およびその常磁性金属イオンとのキレート錯体。4HPDO3A四量体および適当な生理的に許容しうる添加剤および/または担体を含む診断用組成物。しかしながら、主として、濃度非依存応答性を示すCESTシステムの数が限られているという理由から、応答性CEST剤の開発は依然として不十分である。発明の概要上記課題にしたがって、本発明は、設定されたCESTに基づく濃度非依存応答手順ならびに別の濃度非依存応答性を示すCESTシステムを承諾する、磁気的に非等価な可動プロトンの代替源の同定に関する。本発明の解決手段は、磁気的に非等価な交換可能なプロトンの代替源として、常磁性CEST剤のNMRで区別可能な立体異性体を用いることに関する。さらに詳しくは、本発明は、レシオメトリックに基づくCEST画像化法を設定するための、磁気的に非等価な可動プロトンの源としての常磁性CEST剤のNMRで区別可能な異性体の使用に関する。さらなる実施態様において、本発明は、常磁性CEST剤のNMRで区別可能な少なくとも2つの異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用することを含むレシオメトリックに基づくCESTMRI法に関する。別の実施態様において、本発明は、溶液中で少なくとも2つのNMRで区別可能な立体異性体を示す、キレート形成配位子のペンダントアーム上の交換基を付与されているランタニド錯体化合物、ならびに濃度非依存CESTコントラストを提供するための濃度非依存CESTコントラスト剤としてのレシオメトリックに基づくCEST画像化法におけるこれらの錯体の使用に関する。さらに別の実施態様において、本発明は、濃度非依存応答性CEST剤としての該同定されたランタニド錯体化合物の使用、ならびにヒトまたは動物の体器官、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの濃度非依存マップを提供するためのその使用を含むレシオメトリックに基づくCEST画像化法に関する。発明の詳細な記載本明細書で開示する、濃度非依存性CESTMRI法を可能にする磁気的に非等価な可動プロトンの源は、常磁性CEST剤の少なくとも2つのNMRで区別可能な異性体に属する可動プロトンで表される。この点に関して、他に特記しない限り、CEST剤のNMRで区別可能な異性体という表現は、分離され、NMRスペクトルにおいて区別可能な可動プロトンシグナル、あるいは言い方を変えれば、交換可能なプロトンに対する別個の共鳴を示す可動プロトンシグナル、を提供するCEST剤の立体異性体を意味し、各共鳴はNMRで区別可能な立体異性体の1つに対応する。この点で、この種の磁気的に非等価なプロトンを提供する適当なCEST剤は、溶液中で少なくとも2つのNMRで区別可能な立体異性体を示す、キレート配位子ペンダントアーム上にプロトン交換基を含むランタニド錯体化合物が好ましい。実際のところ、興味深いことに、これらの錯体化合物のNMRスペクトルは、レシオメトリックに基づくCEST画像化法において選択的に照射される交換可能なプロトンに対する少なくとも2つの、各共鳴がNMRで区別可能な異性体の1つに対応する、分離された共鳴を示す。レシオメトリックに基づくCEST画像化法において利用できる磁気的に非等価な可動プロトンの源として適当なランタニド錯体化合物のNMRで区別可能な異性体の使用は、本発明の1つの実施態様を構成する。インビボCESTに基づく方法における非等価な可動プロトンの、この別の源を適切に利用するために、CESTプローブとして用いるランタニド錯体が、生理的条件下で複数のNMRで区別可能な立体異性体を示すことが必要であるか、あるいは言い方を変えれば、Ln錯体が示す異なる立体異性体の交換可能なプロトンの共鳴が、水溶液中、室温および生理的pHにて、依然として適当にシフトされ、良好に検出可能であることが必要であることが今では明らかである。複数のNMRで区別可能な異性体の混合物として溶液中に存在する、ペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を含む、特定の種類のLn錯体化合物を本明細書において同定する。これらの錯体化合物のNMRスペクトルが、水溶液中ならびに生理的pHおよび温度下で依然として存在し、良好に分離される異なる立体異性体に対応する、交換可能なOHプロトンに対する少なくとも2つの共鳴を示すのが有利である。レシオメトリックに基づくCEST画像化法における特定の種類のランタニド錯体化合物の使用は、本発明の好ましい実施態様を表す。したがって、本発明の1つの実施態様は、対象となるランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体によってそれぞれ提供される磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCEST画像化法における、ペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されているキレート配位子を含むランタニド錯体化合物の使用に関する。適当なランタニド金属イオンは、プラセオジム、ネオジム、ジスプロシウム、エルビウム、テルビウム、ホルミウム、ツリウム、イッテルビウムおよびユーロピウムから選ばれ、ユーロピウムおよびイッテルビウムが好ましく、イッテルビウムが特に好ましい。一方、本発明の適当なキレート配位子は、単一のペンダントアーム上にヒドロキシルプロトン交換基を付与されている大環状キレート配位子を包含する。式:式中、Rは、CHCOOHである;R1は、H、またはO、N、CO、NHCO、CONH基から選ばれる基によって任意に中断され、1つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシル基、フェニルもしくは置換フェニル基によって、またはCOOH、NHR3もしくはNR4R5から選ばれる基によって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1C5アルキル鎖である;R2は、H、または1つ以上のC1C3アルコキシによって任意に置換されるC1C5アルキル鎖、あるいはヒドロキシアルコキシ基であるで示されるキレート配位子が好ましい。この点で、式のキレート配位子が三価の正に架電したランタニド金属イオンと錯形成する場合、R部分のカルボキシル基は、対応する脱プロトン化形態COOであることは当業者には明らかである。本明細書において、他に特記しない限り、用語直鎖もしくは分枝鎖のC1C3アルキル基は、炭素原子数1~5個の直線状もしくは分枝状のアルキル鎖を意味する。アルキル基の適当な例は、メチル、エチル、nプロピル、イソプロピル、nブチル、イソブチル、secブチル、tertブチル、nペンチルなどを含む。上記アルキル基は、1つ以上の上述のハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシアルコキシ、フェニルまたは置換フェニル基によってさらに置換および/または中断されてもよい。ハロゲンまたはハロゲン原子は、ヨウ素、塩素、臭素またはフッ素原子を意味し、これらの後者が特に好ましい。用語置換フェニルは、1つ以上のハロゲン原子、ヒドロキシルまたはC1C3アルコキシ基;あるいはnCOOH、NO2、NHR3またはNR4R5基から選ばれる基によって置換されたフェニル基を意味する。用語C1C3アルコキシは、アルキル部分が3個以下の炭素原子を含む、いずれかのアルキルオキシ基を意味する。ヒドロキシアルコキシ基は、アルキル部分がヒドロキシル基によってさらに置換されている上記C1C3アルコキシ基のいずれかを意味する。本発明のアルコキシまたはヒドロキシアルコキシ基の適当な例は、たとえば、メトキシ、エトキシ、nプロポキシ、ヒドロキシメチルオキシ、2ヒドロキシエトキシ、23ジヒドロキシプロポキシなどを含む。式の化合物において、R2がHであり、R1がH、または酸素原子によって任意に中断されるか、またはOH、NH2またはフェニルによって任意に置換される直鎖もしくは分枝鎖のC1C4アルキル鎖であるのが好ましい。式の化合物において、R2がHであり、R1がH、CH3、CH2CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2、CH2CHCH2OH、CH2OCH2C6H5、CH2OCH2、CH2OCH2から選ばれる基であるのがより好ましい。キレートされるLnイオンが、YbまたはEuから選ばれ、R2がHであり、R1がCH3である式の配位子を有するLn錯体が本発明において特に好ましい。適切な場合に官能化されてもよいそれらのR1基を介して任意に連結された、少なくとも2つの式のキレート配位子を含む二量体または多量体誘導体は、本発明に含まれ、一般に感度が増大される。したがって、異なる実施態様において、本発明は、キレート配位子が、式の化合物の二量体または多量体誘導体であるLn錯体化合物に関する。このタイプの化合物の一例は、たとえば、後述の実施例1ならびにその製造用反応工程式に開示される。4つの常磁性金属イオンを有する、本明細書において互換的に用いられる実施例1の四量体キレート配位子またはHPDO3A四量体もしくはその塩およびそのキレート化錯体は、新規であり、本発明のさらなる目的を較正する。この点で、適当な常磁性金属イオンは、以下から選ばれる:Fe、Fe、Cu、Ni、Rh、Co、Cr、Gd、Eu、Dy、Tb、Pm、Nd、Tm、Ce、Y、Ho、Er、La、Yb、Mn、Mn。常磁性金属イオンが、Gd、またはYb、EuもしくはDyから選ばれるランタニド金属であるのがより好ましい。本発明のさらなる目的は、MR画像化における使用のための適当な添加剤および/または担体とともに、式のキレート配位子の二量体または多量体誘導体の常磁性または特にLnビスもしくはポリキレート錯体あるいはその生理的に許容しうる塩を含む診断用組成物である。好ましい実施態様において、該診断用組成物は、図9に示す構造を有する4HPDO3A四量体を含む。大環状骨格上に少なくとも3つのカルボン酸基を含む式のキレート配位子は、生理的に許容しうる塩の形態であるのが都合がよい。本発明の配位子を塩化するのに用いる無機塩基のカチオンの適当な例は、カリウム、ナトリウム、カルシウムまたはマグネシウムなどのアルカリまたはアルカリ土類金属のイオンを含む。好ましい有機塩基のカチオンは、特に、エタノールアミン、ジエタノールアミン、モルホリン、グルカミン、Nメチルグルカミン、NNジメチルグルカミンなどの第一級、第二級および第三級アミンのカチオンを含む。この目的のために適当に用いることができる好ましい無機酸のアニオンは、クロリド、ブロミド、ヨージドなどのハロ酸のイオンまたはスルフェートなどのその他のイオンを含む。好ましい有機酸のアニオンは、製薬技術において、たとえばアセテート、スクシネート、シトレート、フマレート、マレエートまたはオキサレートなどの、塩基性物質の塩化のために通常用いられる酸のアニオンを含む。好ましいアミノ酸のカチオンおよびアニオンは、たとえば、タウリン、グリシン、リシン、アルギニン、オルニチンあるいはアスパラギン酸およびグルタミン酸などのカチオンおよびアニオンを含む。一方、大環状配位子の3つのカルボン酸基はすべて、3に荷電したランタニドイオンのキレート化に関与する。結果として、式のLn錯体化合物は、中性であり、したがって、さらなる中和あるいは塩化を行うことなく、インビボ適用に適している。むしろ、キレート配位子がさらなる酸性基を含む場合、たとえば上述のものから選ばれる製薬技術において通常用いられるカチオンによるその中和は、その生理的に許容しうる塩を提供することが必要である。R1がHとは異なる式のLnキレート錯体およびその二量体または多量体は、ペンダントアーム上のヒドロキシル化炭素によって表される不斉中心を含む。したがって、溶液中で、それらは、時計回りまたは反時計回りのアセテートアームの配置において、大環状環の2つの配座において、および不斉中心の配座において本質的に異なる複数の立体異性体を示す。この点で、当業者は、R1がHである場合、該炭素はそのキラリティーを失うが、アセテートアームの配置または環の配座において異なる異性体は存在することを認識している。本発明は、好ましい種類の錯体化合物によって室温にて水溶液中で示されるジアステレオ異性体が、NMRスペクトルにおいて区別可能であるという観察に基づく。さらに詳しくは、我々は、本発明によって説明される式のLn錯体化合物が、生理的温度およびpHにおいて溶液中で、それぞれ錯体のNMRで区別可能な異なるジアステレオ異性体に対応する交換可能なOHプロトンに対する少なくとも2つの適当にシフトされた共鳴を示すことを見出した。有利なことに、同じ錯体の異なる立体異性体が、同じインビボ生体内分布および同じ経時的相対濃度比を有することが判明した。したがって、複数の適当にシフトしたOHプロトン共鳴において、溶液中で示される式のLn錯体化合物のNMRで区別可能な立体異性体は、対象の錯体の局所的濃度によって影響されないインビボCEST画像を提供するためにインビボ条件で利用できるレシオメトリックに基づくCESTMRI法を設定するために有効に利用することができる。さらに、興味深いことに、本発明のLn錯体化合物のOHの交換可能なプロトンの選択的飽和によって得られる飽和移動STの量は、それらが分散する微小環境の物理的または化学的パラメーターに対して著しく感度が高い、あるいは言い方を変えれば、応答性が高い。結果として、本発明の特定の種類のLn錯体化合物は、CEST画像化法において利用されて濃度非依存性CESTコントラストを提供できることに加えて、特に、CEST剤自体の局所的濃度に影響されない、診断対象のインビボ測定および物理的または化学的パラメーターのマップを提供することができるレシオメトリックに基づくCEST画像化法において反応性CEST剤としても有効に利用されうる。したがって、さらなる実施態様において、本発明は、特に、診断対象の物理的または化学的パラメーターのインビボ決定のためのレシオメトリックに基づくCEST画像化法における、濃度非依存性CEST応答剤としての式のLn錯体化合物の使用に関する。本発明において、他に特記しない限り、診断対象の物理的または化学的パラメーターは、温度、pH、酸素または二酸化炭素の分圧、特定のイオンもしくは代謝物濃度、または特定の酵素活性から選ばれるパラメーターを意味する。この点で、医師が、調査対象の体器官または領域における物理的または化学的パラメーターの値またはマップを知ることによって、評価パラメーターに厳密に依存する診断対象の生理的または代謝的過程の診断評価を提供することができることが今では明らかである。さらなる実施態様において、本発明は、適当な高周波パルスを利用、すなわち、照射し、適当なCESTプローブの2つ以上のNMRで区別可能な立体異性体によって提供される少なくとも2つの磁気的に非等価な可動プロトンのバルク水シグナルへの飽和移動を誘発することを含む、レシオメトリックに基づくCESTMRI法、に関する。この点で、いずれかの適当なCESTプローブのNMRで区別可能な異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCESTMRI法が、本発明に含まれるであることは当業者には明らかである。特に好ましい実施態様において、CESTプローブは、HPDO3Aキレート配位子のLn錯体、またはその二量体または多量体誘導体であるビスもしくはポリキレート錯体、あるいはその生理的に許容しうる塩である。したがって、本発明の好ましい実施態様において、本発明は、式のLn錯体化合物、またはその二量体もしくは多量体誘導体を用いて、濃度非依存性インビボCEST画像化を提供することを含む、レシオメトリックに基づくCESTMRI法に関する。該レシオメトリックに基づくCESTMRI法が、CEST剤の局所的濃度に影響されない、ヒトまたは動物の体器官、体液、組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターのインビボ定量のために用いられるのがさらに好ましい。さらに詳しくは、好ましい実施態様において、本発明は、a式のLnキレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体をヒトまたは動物患者に投与し、必要に応じて、好ましくはT2加重シーケンスを用いることによって、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること;b投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する2つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲のZスペクトルを集め、そして、これらの2つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動効果からレシオメトリック値を計算すること;c該ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の濃度非依存性画像を得ること;ここで、方法のステップCが、方法のステップbにおいて測定されたST効果から得られたレシオメトリック値マップを、あらかじめ記録された対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の形態画像上に重ね合わせることを含むのが好ましい;を含む、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織の画像を得るための濃度非依存性CEST画像化法に関する。この点で、ステップbにおいて、2つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数は、既知でない場合、CEST画像化前に適当に記録されうる該錯体のNMRスペクトルから得られる。ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のインビボ画像を得るために、上記CEST画像化法をインビトロ、あるいは好ましくはインビボで実施することができる。もう1つの好ましい実施態様において、本発明は、i式のLnキレート錯体またはその二量体もしくは多量体誘導体をヒトまたは動物患者に投与し、必要に応じて、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のMRI形態画像を記録すること;ii投与されたランタニド錯体のNMRで区別可能な立体異性体に属する2つの磁気的に非等価な可動プロトンの共鳴周波数に精密に調整された周波数の範囲において、Zスペクトルを集め、そして、これらの2つの可動プロトンプールについて測定された飽和移動効果からレシオメトリック値を計算すること;iii計算されたSTから、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップを得、必要に応じて、該マップを形態画像上に重ね合わせること;該測定は、インビトロ、あるいは好ましくはヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織においてインビボで行う;を含む、CESTMRI技術を用いることによる、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における診断対象の物理的または化学的パラメーターの測定方法に関する。特に好ましい実施態様において、本発明は、HPDO3Aキレート配位子、またはその二量体もしくは多量体誘導体、またはその生理的に許容しうる塩のLnキレート錯体の、NMRで区別可能な異性体に属する磁気的に非等価な可動プロトンを利用することを含む、対象のヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織におけるpHのインビボマップを得るための濃度非依存性CEST画像化法に関する。この点で、可動プロトン周波数を照射し、Zスペクトルを集め、レシオメトリックST効果を計算し、較正曲線を用いることによって体器官または領域における所望の物理的または化学的パラメーターのマップを得ることを含む、先に詳述した画像化ステップが、一度正しく設定されると、現在の診断実務において用いられる手順にしたがって、断層撮影法によって、そして、たとえば、実験セクションおよび参照することにより本発明に援用される引用文献において提供される画像化プロトコルなどに開示されているデータ処理手順を用いることによって、自動的に行われることは当業者には明らかである。本発明方法において、本発明のCEST剤として働く、式のLn錯体化合物は、適当な医薬製剤の形態で投与される。この点で、特に好ましい実施態様によれば、上記のCESTに基づく方法の両方は、適当な量の本発明のランタニド錯体化合物を含む医薬製剤を適当に前投与されたヒトまたは動物の身体において行われる。言い換えれば、特に好ましい実施態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織のインビボ画像化方法、あるいは適当な量の本発明のランタニド錯体化合物を含む医薬製剤を適当に前投与されたヒトまたは動物の身体において行われるCEST磁気共鳴画像化技術の使用による、ヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における物理的または化学的パラメーターの、CESTMRI技術の使用による、インビボ評価もしくはマッピング方法に関する。本明細書で用いる適当な量は、その意図する診断目的:すなわち、たとえば、濃度非依存性対照画像を獲得すること、またはCESTに基づくMRI画像化技術の使用による、関心のあるヒトまたは動物の体器官、領域、体液または組織における対象のパラメーターの濃度非依存性マップを提供すること;を実現させるのに十分な本発明の造影剤またはその医薬組成物の量を意味する。この点において、該投与または前投与は、たとえば、血管内注射たとえば、静脈内、動脈内、脳室内注射用などによって、または髄腔内、腹腔内、リンパ管内、腔内、経口または経腸で行うことができる。式のランタニド錯体化合物の注射可能な医薬製剤は、典型的に、有効成分、すなわち、ランタニド錯体またはその医薬的に許容しうる塩、ならびに医薬的に許容しうる賦形剤を、薬理学的観点から適当な純度の水に溶解することによって製造される。得られる製剤は、適当に滅菌されて用いることができ、あるいは、別法として、凍結乾燥され、使用前に再構成されることもできる。これらの製剤は、001~05mmol体重kgの範囲の用量で、診断要求に応じた濃度で投与することができる。先に述べたように、本発明の特に好ましい実施態様は、R2がHであり、R1がCH3であり、キレート化LnイオンがYbまたはEuから選ばれる、式のLn錯体である。したがって、この配位子のランタニド錯体化合物は、本発明の非限定的代表例として用いられている。この配位子は、当業界で、HPDO3Aという名称で知られており、そのGd3とのキレート化錯体は、従来のMRI画像化において用いられる公知の造影剤であり、ProHanceとして長く販売されている。この造影剤が示す非常に低い毒性および優れた耐容性は、当業界で長い間知られており、CEST画像化法におけるその使用を、この技術が要求する、従来のMRIにおいて典型的に用いられる10倍の用量までの用量でさえも特に有利で安全にする。HPDO3AのGdおよびYb錯体の構造は、x線によって決定されている。該引用文献において、ラセミ溶液から出発したとしても、キラル2ヒドロキシプロピル基を含む非対称ユニットの存在は、2つの別の錯体のすべての配位アームが、同じ配向を有する、すなわち、同じ様式でねじれている、大環の相対的配置が異なるジアステレオマー配置を有する2つの独立した錯体をもたらすことが報告されている。溶液において、以下の構造:を有するHPDO3AのLn錯体は、典型的に、8つの異性体、さらに詳しくは、以下のスキーム1にて図式化される4つのジアステレオマーと4つのエナンチオンマーを示す。スキーム1それぞれRおよびS体に帰属する可能性が最も高い2つのジアステレオ異性体は、NMRスペクトルにおいて、特に、2つの主要なジアステレオ異性体に合理的に帰属する飽和移動の2つの領域を明確に示すYbHPDO3AのZスペクトルにおいて検出可能である。代わって、他の2つのジアステレオ異性体の証拠は、異なる温度で記録された錯体のNMRスペクトルの比較によって誘導される。上記のすべてと完全に一致して、錯体の2つのNMRで区別可能なジアステレオ異性体のヒドロキシル基は、図2aで示すように、20°Cにおいてそれぞれ72および99ppmという化学シフトの十分な相違ならびに交換速度の相違を示し、レシオメトリックに基づく本発明方法を設立するために利用することができるpHに対するこの錯体によって示される応答性もまた、実験セクションにおいて詳細に報告するインビトロMRI実験によって実証されている。得られた結果は、YbHPDO3Aジアステレオ異性体のOH可動プロトンのそれぞれによって示されるpHにおける飽和移動の従属が異なることを確認する。このことから、間葉系幹細胞を用いて行う試験における細胞内pHの濃度非依存性評価を可能にするレシオメトリックアプローチの利用ができるようになる。興味深いことに、それぞれ図5のパネルbおよびcに示す、この試験から得られたSTマップは、ST効果が、YbHPDO3Aとともにインキュベートされたか、電気穿孔された細胞についてのみ見られ、いずれかの飽和が、錯体が無い場合に記録されたことを確認する。観察されたST効果は、測定されたpH700±02に対応する電気穿孔された細胞についてはより高く、細胞2のペレットで測定されたpHは、68±03であった。特に、図8に示すように、YbHPDO3Aが示すpHに対する高感度は、腫瘍領域の環境pHの測定における、その有効な使用を可能にする。我々の知る限り、この結果は、CEST剤以前には達成されていなかった。YbHPDO3Aが示す環境温度に対する応答性もまた試験されている。得られた結果は、特に、2つのNMRで区別可能なジアステレオマーの2つのヒドロキシルプロトンの化学シフトによって示される温度に対する関連感度を強調表示した。したがって、化学シフトは、濃度に依存しないので、環境の温度は、錯体のZスペクトルにおいて観察される化学シフトの値によって簡単に正確に得ることができる。予想どおり、感度、特に、温度に対する感度の大幅な増加が、区別できる立体異性体のそれぞれについて4個以下のOH可動プロトンを含む、YbHPDO3Aの四量体誘導体で観察されている。YbHPDO3Aが示すpHに対する同じ応答性もまた、対応するEu錯体化合物について証明された。図12に示す、この錯体のNMRスペクトルは、2つの主要な異性体をはっきりと示す。これらの異性体のヒドロキシルプロトンに属するシグナルは、それぞれ水およびD2O中にEuHPDO3Aを含む2つの異なる溶液のNMRスペクトルを比較することによって評価されている。したがって、2つの化学シフトは、pH2および37°Cにおいて、それぞれ205ppmおよび167ppmにて付与されている。しかしながら、図13に示すように、生理的pH値に対して溶液pHを増加させることによって、プロトン交換速度は増加し、これらの2つのシグナル間の化学シフトにおける分離は減少して、生理的条件下での選択的照射が困難になる。しかしながら、STプロフィールを、異なる照射パルスを用いることによって記録したことから、6μTで行うことによって、2つの別の共鳴の両方を観察し、次いで、レシオメトリック測定を行うことが可能であることが示され、飽和移動は、中間値の共鳴周波数、すなわち約18ppmを用いることによって、どんな場合でも依然として観察される。上述したすべてから、YbHPDO3AおよびEuHPDO3Aが、pHおよび温度のインビボ評価のための応答性CEST剤として効果的に用いることができるということが結論づけられる。この点で、YbおよびEuHPDO3Aの両方が、対応するガドリニウム錯体であるProHanceが示すような生体内分布、排出および耐容性に関して同じ特性をもつと見てよく、したがって、それらは、従来の解剖学的画像化と同種の画像化を促進する。しかしながら、有利なことに、YbおよびEu錯体の使用は、CESTに基づく解剖学的画像の獲得を可能にし、該剤が分配された増強された解剖学的領域のpHおよび/または温度に関するさらなる情報が、従来のMRIにおいてProHanceによってすでに可能になっている解剖学的情報をさらに補完し、統合する。原理のさらなる証拠として、以下の式:化合物2で示される、42ヒドロキシ34710トリスカルボキシメチル214710テトラアザシクロドデシ1イルプロポキシ安息香酸のYb錯体が示すpHへの応答性も評価した。化合物2のZスペクトルは、溶液内の錯体の2つの主要なジアステレオ異性体に起因する飽和移動の2つの領域を示す。2つの別のジアステレオ異性体の存在は、2つの適当にシフトされたOHプロトン共鳴、それぞれ50および94ppmを提供する。図15および図16から明らかなように、この錯体で行う応答性試験は、YbHPDO3Aの可動プロトンに見られる、この錯体のジアステレオ異性体のヒドロキシルプロトンによって示されるより高い交換速度ゆえの、より酸性のpH、好ましくは55~62の範囲のpHにおける、そのpHに対するより高い感度を確認した。本発明のpH応答性剤のさらなる例は、以下の式:化合物3で示される、114710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のYb3錯体によって表される。図17に示す、この化合物のNMRスペクトルは、化合物のSAPおよびTSAP体に対応する2つの主要な異性体の存在に起因する2セットのシグナルを示す。実際、アセテートアームの配置または大環の配座のいずれかにおいて異なる4つの異性体が、溶液中に存在する。これらの異性体は、エナンチオマーのカップルなのでエナンチオマーが1つのNMR観測点から区別可能であるような2セットのシグナルがNMRスペクトルにおいて実際に期待される。上記と完全に一致して、化合物3のZスペクトルは、共鳴がそれぞれ78および99ppmにてシフトされる、この化合物によって提供される2つの異なる正反四角柱またはねじれ正反四角柱異性体のヒドロキシエチルアーム上のOH基に起因する2つの飽和領域の存在を示す。図18に示す、この化合物を用いて64~8のpH範囲で行った応答性試験の結果は、pHに対するその感度を確認する。本発明のLn錯体化合物のもう1つの例は、以下の式:化合物4で示される123ジヒドロキシ3アミンプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のYb錯体である。この場合、2つの別のジアステレオ異性体の存在は、それぞれ2つの異なるSAPおよびTSAP異性体上の2つの異なるヒドロキシルOH基に属する4つの非等価な可動プロトンを提供すべきである。実際、化合物4のZスペクトルおよび飽和移動STプロフィールは、それぞれ10、75および100ppmにおける3つの安定にシフトしたプロトン共鳴の存在を確認する。それらのうち、大きくシフトした共鳴は、溶液中の化合物の2つの異なる異性体によって提供される金属中心の配位圏に最も近いOH基の交換プロトンに合理的に起因し、一方、より小さくシフトした共鳴は、金属中心からより離れた残りのOH基の交換プロトンに起因する。第4の交換プールは、おそらく、NMRの時間スケールでは交換速度が速すぎるという理由から、スペクトルにおいて検出されない。この錯体化合物を用いてインビトロで行われた応答性試験は、図19および図20からわかるように、そのpHに対する感度を確認する。特に、得られた結果は、それぞれ75ppmおよび100ppmにて2つのジアステレオ異性体のOH可動プロトンによって示される飽和移動のpHへの依存性が、異なることを確認する。このことは、pH値68で、この錯体化合物で標識したマウスマクロファージ細胞を用いて行った試験において、細胞内pHの濃度非依存性評価を可能にするレシオメトリックアプローチを利用できるようにする。さらなる例として、以下の構造式:化合物5で示される1134トリヒドロキシブタン2イル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のYb錯体を調査した。この点において、この同じキレート配位子のGd3錯体が、従来のMRI画像化における使用について臨床的に承認され、GADOVISTとして市販されている周知の造影剤であるということは注目すべきである。その製造は、EP0448191に記載されている。この化合物の構造は、たとえば、YbHPDO3Aに関し、潜在的立体異性体の数を有意に増加させる2つの不斉中心を包含する。図21に示すこの化合物のZスペクトルは、許可される複数のうち2つの最も豊富な立体異性体によるものである、それぞれ50および75ppmにて区別可能な少なくとも2つのピークを示す。この化合物の可動プロトンを特徴付ける高い交換速度は、最も豊富なNMRで区別可能な異性体が、55前後のより低いpH値のみで検出可能であることをもたらす。代わって、より高いpH値においては、化合物構造の変化に起因する可能性が高い、スペクトル中75におけるピークが現れる。本発明の好ましい式のランタニド錯体に包含されないが、上記化合物5は、本発明の濃度非依存性CEST画像化法を設定するのを可能にする、溶液中の作用剤のNMRで区別可能な立体異性体のヒドロキシル基に属する非等価な可動プロトンを提供する。したがって、本発明のレシオメトリックに基づくCEST画像化法における1134トリヒドロキシブタン2イル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のランタニド錯体の使用、ならびに該Ln錯体の2つのNMRで区別可能な異性体によって提供される2つの磁気的に非等価な可動プロトンを利用するレシオメトリックに基づくCESTMRI法は、本発明に包含され、そのさらなる実施態様を構成する。実験セクション式のキレート配位子は当業界で周知であるか、あるいは周知の手順または当業者に公知の合成経路にしたがって容易に製造することができる。さらに、合成手順の非限定的例として、たとえば、レシオメトリックに基づくCEST画像化法における本発明のランタニド錯体化合物の使用に関する詳細を記載する以下の実施例1~3などが挙げられる。CEST画像化法および条件Micro25マイクロイメージングプローブを備えたBrukerAvance300分光計で、7Tにて取得した画像において、CESTMRコントラスト増強を測定した。代表的なRAREスピンエコー系列、エコー時間33msおよびTR値5を用いた。10mmの正方視野をもつ64x64の収集マトリックスを用いた。全シーケンスに先行して、連続波パルス2秒およびRF強度24、12、6μTからなる飽和スキームを行った。DevelopmentandvalidationofasmoothingsplinesbasedcorrectionmethodforimprovingtheanalysisofCESTMRimages、StancanelloJTerrenoE、DelliCastelliD、CabellaC、UggeriF1、AimeS;CONTRASTMEDIAMOLECULARIMAGINGVolume:3、Issue:4、Pages:136149、2008;およびMethodsforanimproveddetectionoftheMRICESTeffectTerrenoE、StancanelloJ、LongoD、DelliCastelliD、MiloneL、SandersHMHF、KokMB、UggeriF、AimeS;CONTRASTMEDIAMOLECULAR画像化;Volume:4;Issue:5;Pages:237247、2009に開示されたように、広範に作動するMATLABプラットホームにコンパイルされたソフトウェアを用いることによってレシオメトリック値を決定するために、Zスペクトルを連続的に分析した。BrukerAvance600分光計で溶液の磁化率の測定を介して、溶液の全常磁性濃度を決定した。4HPDO3A四量体の製造以下に主なステップを詳述するスキーム2に図式化された合成手順を用いることによって、四量体キレート錯体であるYbHPDO3A四量体を製造した。スキーム236ジオキサ8ノネン酸THF中の2アリルオキシエタノールの溶液を、THF中の水素化ナトリウムの懸濁液に機械攪拌しながら滴下した。室温にて20時間後、THF中のブロモ酢酸の溶液を滴下し、溶媒の自発還流を引き起こした。溶液を還流下で2時間維持し、次いで、エタノールで希釈し、30分後、懸濁液を濃縮した。残渣を水に溶解し、溶液をエチルエーテル、ジクロロメタンで洗浄した;水性相を37塩酸でpH1に酸性化し、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機相を水、食塩水で洗浄し、液体残留物に蒸発させ、67Paで減圧蒸留して、36ジオキサ8ノネン酸を無色液体で得た。収率75。peb67Pa98100°C。標記935。1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ11ウンデカニル113ジエン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサン36ジオキサ8ノネン酸、ジイソプロピルエチルアミンおよびONNN’N’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートHBTUを、ジメチルホルムアミド中の22’ビスアミノメチレン13ジアミノプロパンの懸濁液に加えた。5日後、溶液を蒸発させ、残渣をエチルエーテルで処理し;エーテル溶液を5NaHCO3溶液、塩水で洗浄し、蒸発させて、残渣を水で処理し、次いで、高真空下で乾燥して、1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ11ウンデカニル113ジエン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサンを固体残渣で得た。1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ1011オキシランウンデシルジオキシラン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサンクロロホルム中のmクロロ過安息香酸の溶液を水から分離し、クロロホルム中の1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ11ウンデカニル113ジエン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサンの溶液に攪拌しながら滴下した。室温にて2日後、mクロロ過安息香酸およびmクロロ安息香酸の両方が完全に除去されるまで、溶液を5NaHCO3溶液で洗浄し、次いで、水および塩水で洗浄した。有機溶液を蒸発させ、残渣1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ1011オキシランウンデシルジオキソラン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサンをワックス状固体で得た。123ビス4710トリアセティック14710テトラアザシクロドデカンイル1212’ビス114710トリアセティック14710テトラアザシクロドデカンイル2アザ3オキソ58ジオキシ10ヒドロキシウンデカニル222ジヒドロキシ471720テトラオキシ915ジオキソ1014ジアザトリコサンアセトニトリル中の1212’ビス2アザ3オキソ58ジオキサ1011オキシランウンデシルジオキシラン471720トリオキサ915ジオキソ1014ジアザトリコサン、14710テトラアザシクロドデカン147三酢酸の11ジメチルエチルトリスエステルおよびジイソプロピルエチルアミンの溶液を50°Cにて10日間加熱した。溶液を蒸発させて、123ビス4710トリス14710テトラアザシクロデカンイル1212’ビス114710トリス14710テトラアザシクロデカンイル2アザ3オキソ58ジオキシ10ヒドロキシウンデカニル222ジヒドロキシ471720テトラオキシ915ジオキソ1014ジアザトリコサンを得た。粗残渣を氷浴で冷却した;攪拌しながら、トリフルオロ酢酸を加えた;ついで、トリスイソプロピルシランの溶液を加えた。5日後、エチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。固体を水に溶解し、溶離液としてメタノール/水を用いるAmberchromeCG161上のクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を凍結乾燥して、所望生成物を白色固体で得た。錯適定による標記化合物=74、主要不純物は、トリフルオロ酢酸によって表される。得られた生成物のNMRスペクトルは、キレート配位子の構造と一致する。123ビス4710トリアセテート14710テトラアザシクロドデカンイル1212’ビス114710トリアセテート14710テトラアザシクロドデカンイル2アザ3オキソ58ジオキシ10ヒドロキシウンデカニル222ジヒドロキシ471720テトラオキシ915ジオキソ1014ジアザトリコサンテトライッテルビウム錯体水中の塩化イッテルビウム六水和物の溶液を、攪拌している水中の配位子の溶液に加え、2N水酸化ナトリウムで、pH7まで溶液を非常にゆっくりと中和した。過剰の配位子が、<02であり、pHが一定である場合、溶液をSephadexG10カラムによって脱塩し、溶液を凍結乾燥した後、所望の錯体、123ビス4710トリアセテート14710テトラアザシクロドデカンイル1212’ビス114710トリアセテート14710テトラアザシクロドデカンイル2アザ3オキソ58ジオキシ10ヒドロキシウンデカニル222ジヒドロキシ471720テトラオキシ915ジオキソ1014ジアザトリコサンイッテルビウム錯体を得た。114710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のイッテルビウムキレート錯体の製造以下に主なステップを詳述するスキーム3に図式化された一般的合成手順を用いることによって、化合物3に対応するイッテルビウムキレート錯体を製造した。スキーム312テトラヒドロピランオキソエチル14710テトラアザシクロドデカン4710トリアセティックJOrgChem1986、51、752755に記載の手順にしたがって、テトラヒドロピランを合成した。この基質を50mlのアセトニトリルに溶解し、アセトニトリル中のK2CO3およびたとえば、W09628433などの開示にしたがって製造したDO3Aトリスtertブチルエステルブロモハイドレートの懸濁液に滴下した。一夜室温に置いた後、混合物をろ過し、蒸発させた。次いで、残渣を酢酸エチルに溶解し、水および塩水で洗浄した。有機溶液を減圧濃縮し、酢酸エチル/エタノール勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって、粗生成物を精製した。生成物含有画分を合せて蒸発させて、黄色油状物を得た。1HNMRand13CNMRは、所望の構造と一致した。MSMH計算値:64246実測値:64364。114710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸THP部分を除去するために、中間体VIIIを水、THFおよび酢酸に溶解し、室温にて24時間攪拌した。次いで、混合物を濃縮し、トリイソプロピルシランおよびTFAを0°Cにて滴下した。室温にて3日後、ジエチルエーテルで粗生成物を沈殿させ、ろ過し、AmberchromCG161樹脂および02TFA水溶液を用いる液体クロマトグラフィーによって精製した。次いで、所望生成物含有画分をあわせ、凍結乾燥し、1NHClで酸性化し、再度凍結乾燥した。1HNMRおよび13CNMRは、所望の構造と一致した。MSMH計算値:39021実測値:39153。114710テトラアザシクロドデカン4710トリアセテートメタレート配位子付加法により、水溶液中のMeCl3を用いて、pH65にて錯体形成反応を行った。IXの水溶液に、01NNaOHでpHを65に維持しながら、等モル量の水性MeCl3溶液をゆっくりと加えた。pHが一定になるまで、混合物を室温にて攪拌した。キシレノールオレンジアッセイを用いてモニターし、金属がわずかに過剰に達したとき、少し過剰の配位子を加えた。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーにより錯体を脱塩し、凍結乾燥した。エバンス試験、723726によって測定sれた標記錯体は、98であった。123ジヒドロキシプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸のイッテルビウムキレート錯体の製造以下に主なステップを詳述するスキーム4に図式化された合成手順を用いることによって、化合物4に対応するイッテルビウムキレート錯体を製造した。スキーム4123ジヒドロキシプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸アセトニトリル中の23エポキシプロパノール、14710テトラアザシクロドデカン147三酢酸の11ジメチルエチルトリスエステルおよびジイソプロピルエチルアミンの溶液を、50°Cにて3日間加熱した。溶液を蒸発させて、123ジヒドロキシプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710トリスを得た。粗生成物をジクロロメタンに溶解し、氷浴で冷却し、次いで、攪拌しながらトリフルオロ酢酸を加えた;ジクロロメタンを蒸発させ、トリフルオロ酢酸およびトリイソプロピルシランを加えた。1日後、エチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。固体を水に溶解し、水を溶離液として用い、アンバーライトXAD1600で精製した。純粋な画分を凍結乾燥した後、所望の配位子を白色固体で得た。NMRスペクトルは、キレート配位子の構造と一致する。次いで、回収した配位子の錯適定を行って、その完全な錯形成に必要な酸化ランタニドの量を評価した。得られた標記化合物は、配位子の錯形成後に除去される溶媒およびトリフルオロ酢酸の残留する存在が確認される。123ジヒドロキシ3アミンプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710トリアセテートメタレート;水中の123ジヒドロキシプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710三酢酸の溶液に、攪拌しながら酸化金属を加え、溶液を90°Cに加熱した。酸化物が溶解したら、溶液を冷却し、ミリポア045μmでろ過し、pH7になるまでリライト3ASFBをゆっくりと加えた;樹脂をろ過し、溶液を凍結乾燥して、23ジヒドロキシプロピル14710テトラアザシクロドデカン4710トリアセテートメタレートを得た。pH58の指示薬としてキシレノールオレンジを用いる0001Mの金属塩化物による錯適定によって過剰の配位子を測定した。標記錯体は、エバンス試験によって測定した。インビトロ試験pHに対するYbHPDO3Aの応答性14個のキャピラリーを含むファントムを用いて、pHに対するYbHPDO3Aの応答性をインビトロで調査した。キャピラリーのうち、11個は、519~875の範囲で異なるpHを有する濃度24mMのYbHPDO3Aの溶液を含み、3個は、pH731にて、3~24mMの範囲のYbHPDO3Aの溶液を含むものである。20°Cおよび37°CにてCESTMRI実験を行った。それぞれ72および99ppmで照射されたファントムのMR画像を記録し、図3に示した。さらに詳しくは、図3cは、72ppmでのヒドロキシルプロトンの照射により得られたSTマップを示し、図3dは、99ppmでのヒドロキシルプロトンの照射により得られたSTマップを示す。得られた結果から、溶媒中の2つのYbHPDO3Aジアステレオマーの各OHプロトンによって示される飽和移動のpH依存性が異なることが確認でき、レシオメトリックアプローチの利用が可能であることがわかる。次いで、それぞれ72および99ppmでの2つの異性体のヒドロキシルプロトンの照射から得られたpHの変動に伴うST効果の変動を測定することによって、図3eに示す較正曲線を行い、図3fのレシオメトリック曲線が得られた。細胞内pHを評価するためのYbHPDO3Aの使用試験のための細胞株として、間葉系幹細胞を選択した。実験に用いる細胞をマウス骨髄細胞から抽出し、次いで、20FBSを加えたαMEM培地中で培養した。初代培養にて、細胞にプリモシンprimocinを加える。集密が約70になったとき、025トリプシン-EDTAで細胞をはがし、PBSで洗浄し、次いで、015MYbHPDO3Aの溶液に再懸濁した。細胞の一部を37°Cにて3時間インキュベートし、一部を電気穿孔した。細胞をPBSで洗浄し、MRI実験用に調製した。さらに詳しくは:1PBS中、37°C、pH74にて、015MのYbHPDO3Aを含む溶液とともに3時間インキュベートされたMSH細胞のペレット;2PBS中、pH74にて、015MのYbHPDO3Aの溶液とともに電気穿孔されたMSH細胞のペレット;3PBSのみとともにインキュベートされ、参照として用いられたMSH細胞のペレット、および空のキャピラリーを含むファントムについてのCESTマップを得た。それぞれ、72および99ppmにてファントムを照射して、ST効果を測定した。それぞれ図5のパネルbおよびcに記載の得られたSTマップから、錯体の不在下でも何らかの飽和は記録されたが、ST効果は、YbHPDO3Aとともにインキュベートされたか、または電気穿孔された細胞についてのみ見られたことが示される。キャピラリー2のインキュベートされた細胞のペレットにおいて測定されたpHは、68±03であったが、観察されたST効果は、700±02という測定されたpHに対応する、電気穿孔された細胞について、より高かった。インビボ試験黒色腫の動物モデルにおけるpHの評価のためのYbHPDO3Aの使用黒色腫の動物モデルにおいて、12mmolKgのYbHPDO3Aの静脈内注射で、インビボ測定を行った。6~10週齢の雌性C57Bl6マウスの左わき腹に、ATCCから入手し、10FBS、2mMグルタミン、100Umlペニシリンおよび100μgmlストレプトマイシンを補足したDMEM培地中で培養した約1×106個のB16マウス黒色腫細胞を含む単独懸濁液02mlの皮下接種を行った。Micro25マイクロ画像化プローブを備えたBrukerAvance300分光計を用い、7Tにて、CEST造影MR画像を得た。細胞接種の7日後、すなわち、腫瘍体積が平均直径約4mmに達したとき、マウスにYbHPDO3Aの溶液の臨床的承認用量の3倍に対応する、200μLの150mMYbHPDO3A溶液を注射した。方形連続波、次いで、RAREシーケンスを用いることによって、CEST剤の静脈内注射の前および直後に、Zスペクトルを得た。膀胱、腎臓および腫瘍においてCESTコントラストを測定した。膀胱で集めたZスペクトルは、予測された37°Cより低い生理的Tに対応する交換プールについてのシフトを明らかにした。次いで、この温度で、pHからのST依存性の較正を繰り返し、次いで、前記実施例2で記載した手順を行った。得られたレシオメトリック曲線を図7に示す。次いで、レシオメトリック法の適用によって、膀胱、腎臓および腫瘍においてST効果を測定したところ、膀胱において606±02、腎臓髄質において624±02、腫瘍において66±02のpHが得られた。図8において、腫瘍領域において計算されたSTマップを、対応する解剖学的画像に重ね合わせたが、実際に断層表示上に現れる画像においては鮮赤色である明るい領域として現れるインビトロ試験温度に対するYbHPDO3Aの応答特性pH731のYbHPDO3Aの溶液を用いて試験した。それぞれ20および37°Cで記録した溶液のZスペクトルは、溶液中のNMRで区別可能なYbHPDO3Aジアステレオ異性体のヒドロキシルプロトンの化学シフトは、温度に対して非常に感度が高いことを示した。事実、図4の、パネルbに示すように、20°Cから37°Cに変わると、錯体の2つの異なる立体異性体に対応する共鳴周波数は、それぞれ99から88ppmに、72から643ppmに変わる。プロトン化学シフトは、CEST剤の濃度に依存しないので、Zスペクトルを集めるだけで、環境の温度を正確に決定すること、そして、適切なインビトロ較正を用いてpHを決定することが可能になる。温度に対するYbHPDO3A四量体の応答特性026~84mMの範囲の異なる濃度、pH74および298Kにて、血清中のYbHPDO3A四量体の溶液を含むファントムを用いて試験を行った。単量体について前述したように操作することにより、温度におけるOH可動プロトンの化学シフトの依存性を試験した。図10に示す、得られたレシオメトリック曲線から、実施例7において単量体で得られた結果が実質的に確認される。しかしながら、予想通り、そして図10のパネルbから明らかなように、四量体錯体の分子当たりの感度は大きく増加した。細胞内pHを評価するための化合物4の使用試験用細胞株として、マウスマクロファージ細胞を選択した。この化合物を用いて得られたレシオメトリック曲線の感度の範囲を、まず、細胞内pHの範囲で適切に調節した。さらに詳しくは、それぞれ75ppmおよび100ppmにて2つのシフトされた可動プロトンプールを照射することによってpHに関して計算されたST曲線に対してレシオメトリックアプローチを適用することによって、55~7の範囲のpHにおけるレシオメトリックSTの変動を表す図20に示すレシオメトリック曲線が得られた。化合物4をマウスマクロファージ細胞に入れた。J774は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。細胞を、10ウシ胎児血清、100Umlペニシリンおよび100mgmlストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地培地中で培養した。細胞を、約2x104細胞cm2の密度で75cm2フラスコに播種し、湿度の高い5CO2インキュベーター中、37°Cにて培養した。J774を70mMの化合物4とともに一夜インキュベートした。細胞を洗浄し、その生育培地とともに3時間再度インキュベートした。次いで、025トリプシン-EDTAで細胞をはがし、MRICEST実験用に調製した。化合物4または生育培地とともに一夜インキュベートされた細胞のペレットを含むファントムのZスペクトルを得ることによって、飽和移動のレシオメトリック値を計算した。インキュベートされた細胞について観察されたST効果から、pH値68を得た。インビトロ試験pHに対する化合物4の応答性濃度20mMおよび508~74の範囲の異なるpHを有するイッテルビウム錯体の溶液を含む6個のキャピラリーを含むファントムを用いることにより、pHに対する化合物4の応答性をインビトロで審査した。CESTMRI実験を20°Cにて行った。それぞれ75および100ppmにて照射されたファントムから集めたZスペクトルを図19に示す。pHの関数として得られたレシオメトリックST曲線を図20に示す。