"酵母細胞由来でない1つ以上のペントース代謝経路の1つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞であって、前記酵母細胞由来のhxk1、hxk2glk1およびgal1の破壊を有する酵母細胞。ペントース発酵酵母細胞を調製する方法であって、ペントース代謝経路の1つ以上の外因性遺伝子を含む酵母細胞を、前記酵母細胞由来の遺伝子hxk2の破壊に供し、得られた破壊体株を、前記酵母細胞が単独の炭素源としてのペントース上で0.05h-1以上の生育速度を有するまで進化工学に供してペントース消費を改善し、得られたペントース発酵酵母細胞を単離する方法。破壊体株は請求項1に記載の酵母細胞である、請求項2に記載の方法。得られた酵母において、hxk1、hxk2、glk1およびgal1遺伝子の1つ以上を導入してそのグルコース消費能を回復させる、請求項2または3に記載の方法。請求項2~4のいずれか一項に記載の方法により得られる、嫌気的同時ペントースおよびグルコース消費をし得る、ペントースおよびグルコース発酵サッカロマイセスSaccharomyces細胞。請求項5に記載のペントースおよびグルコース発酵酵母細胞をペントースおよびグルコース含有材料中で、好適な発酵条件下でペントースおよびグルコースの発酵生成物への発酵を可能とするために十分な期間培養する工程を含む、ペントースの発酵から発酵生成物を生成する方法であって、前記酵母細胞は、ペントースを発酵して発酵生成物を対応する野性型酵母と比べて高いレベルにおいて生成する方法。発酵時間は、対応する野性型酵母の発酵と比べて低減される、請求項7に記載の方法。発酵時間は、40以上低減される、請求項8に記載の方法。ペントースおよびグルコースを同時に発酵する、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。全体エタノール生成速度は、対応する野生型酵母を用いる方法のそれよりも少なくとも約20、少なくとも約50または約100高い、請求項9に記載の方法。前記ペントース含有材料は、リグノセルロース材料の加水分解物を含む、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。前記加水分解物は、リグノセルロース材料の酵素加水分解物である、請求項6~11のいずれか一項に記載の方法。[実施例][株および維持]本試験において使用される株表1の貯蔵のため、振とうフラスコ培養を10gl-1の酵母抽出物BDDifcoおよび20gl-1のペプトンBDDifcoからなり、2のグルコースYPD、2のエタノール1.5のグリセロールYP-EtOH/Glycまたは2のアラビノースYP-Araのいずれかを補給した複合培地YP中で実施した。培養物を、静止生育期までオービタルシェーカー200rpm中で30°Cにおいてインキュベートした。30v/vのグリセロールの添加後、振とうフラスコ培養物からの試料を2mlのアリコートで-80°Cにおいて貯蔵した。[振とうフラスコ培養]振とうフラスコ中での培養を、2.3gl-1の尿素、6.6gl-1のK2SO4、3gl-1のKH2PO4、0.5gl-1のMgSO4.7H2O、および微量元素を含有する合成培地MY尿素[7]中で30°Cにおいて実施した。振とうフラスコ培養のため、培地pHを滅菌前に2MのKOHにより4.7に調整した。加熱滅菌121°C、20分後、フィルター滅菌ビタミン溶液[7]および糖を添加した。振とうフラスコ培養物は、500mlの振とうフラスコ中の適切な糖を含有する100mlの培地に凍結ストック培養物を植菌することにより調製し、オービタルシェーカー200rpm中で30°Cにおいてインキュベートした。[嫌気的バッチ培養]嫌気的バッチ培養は、1lの作業容積を有する2リットルの発酵槽Applikon,Schiedam,theNetherlands中で30°Cにおいて実施した。培養は、5gl-1のNH42SO4、3gl-1のKH2PO4、0.5gl-1のMgSO4.7H2Oおよび微量元素を含有する合成培地[7]中で実施した。加熱滅菌121°C、20分後、培地にエタノール中に溶解した0.01g-1のエルゴステロールおよび0.42g-1のTween80[1,2]、ケイ素消泡剤、微量元素、フィルター滅菌ビタミン溶液[7]、ならびに適切な炭素源を補給した。培養物を800rpmにおいて撹拌し、0.5lmin-1の窒素ガス<10ppmの酸素によりスパージし、2MのKOHの自動添加によりpH5.0において維持した。酸素拡散を最小化するため、発酵槽にNorpreneチューブColePalmerInstrumentCompany,VernonHills,USAを備えた。酸素の不存在は、酸素電極Applisens,Schiedam,theNetherlandsにより確認した。バッチ培養は、100mlのグルコースにより生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により開始した。[生育速度決定]振とうフラスコ培養物について、660nmにおける光学密度OD660を経時的に計測することにより生育プロファイルを作製した。発酵槽中の嫌気的培養について、比生育速度を排ガス中のCO2濃度に基づき決定した。比生育速度は、データ点を指数曲線にフィットすることにより決定した。[二酸化炭素および細胞外代謝産物分析]嫌気的発酵槽からの排ガスを、凝縮器2°C中で冷却し、Permapure乾燥器型MD-110-48P-4Permapure,TomsRiver,USAにより乾燥させた。二酸化炭素濃度は、NGA2000分析器RosemountAnalytical,Orrville,USAにより測定した。排ガス流速および比二酸化炭素生成速度は、上記のとおり測定した[6,8]。グルコース、アラビノース、酢酸、乳酸、コハク酸、グリセロールおよびエタノールを、BioRadHPX87HカラムBioRad,Hercules,USA、Waters2410屈折率検出器およびWaters2487UV検出器を搭載したWatersAlliance2690HPLCWaters,Milford,USAを使用するHPLCにより分析した。カラムは、60°Cにおいて0.5gl-1の硫酸により0.6mlmin-1の流速において溶出させた。[ヘキソキナーゼ活性測定]本試験において使用された株の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、グルコースのグルコース-6-リン酸反応1への変換率を、形成されたグルコース-6-リン酸を酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼにより6-ホスホグルコン酸に変換する連結酵素反応反応2を使用して計測することにより測定した。この連結反応において形成されるNADPHの速度は、ヘキソキナーゼ活性と等しく、340nmにおける吸光度を計測することにより測定する。[実施例1][遺伝子欠失]本実施例において、遺伝子欠失は、標的遺伝子を置き換えるG418耐性カセットの統合により達成した。HXK2、HXK1およびGLK1の欠失のため、pUG6からのKanMXカセットを、表2に示されるオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した[4]。PCR生成物の精製後GenElutePCRClean-upKit,Sigma,Steinheim,Germany、一晩培養物を遺伝子破壊カセットにより形質転換[3]した。形質転換細胞は、100μgml-のG418InvivoGen,SanDiego,USAを含有するYPD寒天上で選択した。KanMXカセットの正確な統合は、KanMXカセットならびに標的遺伝子の上流および下流領域に結合する診断オリゴヌクレオチドを使用して単一コロニーに対するPCRにより確認した表1。複数の遺伝子欠失のため、隣接遺伝子の欠失前にKanMXマーカーをレスキューした。この目的のため、細胞を、誘導性Creリコンビナーゼを発現し、フレオマイシン耐性遺伝子blerを有するpSH65により形質転換した[5]。形質転換細胞を、フレオマイシンを含有するYPDプレート上にスプレッドし、コロニーが現れるまで30°Cにおいてインキュベートした。7.5μg/mlのフレオマイシンを含有する液体YP-ガラクトースInvivoGen,SanDiego,USAに、いくつかのフレオマイシン耐性コロニーを植菌し、Creリコンビナーゼの誘導のために30°Cにおいて一晩インキュベートし、フレオマイシンを有する固体YPDに植継ぎした。CreリコンビナーゼによるKanMXカセットの除去は、YPDおよびYPD-G418上のフレオマイシン耐性酵母コロニーのレプリカプレーティングにより、およびG418耐性を失った単一コロニーに対する診断PCRにより確認した。続いて、pSH65の損失を、細胞をフレオマイシンを有さないYPD中で非選択的に5~10世代生育させることにより達成し、その後、フレオマイシン耐性の損失を、フレオマイシンを有し、または有さない固体YPD上の単一コロニーのレプリカプレーティングにより確認した。HXK2、HXK1およびGLK1の後続の欠失、ならびにそれぞれの欠失後のKanMX遺伝子の除去は、株IMK306、IMK307、IMK311、IMK312およびIMK318をもたらした表3。グルコースおよびアラビノース消費に対するhxk2およびhxk2hxk1欠失の効果。グルコースおよびアラビノース消費に対するHXK2およびHXK1欠失の効果を決定するため、株DS62504、IMK307hxk2ΔおよびIMK311/IMK312hxk2Δhxk1Δを振とうフラスコ図1および嫌気的発酵槽図2の両方の中で30°Cにおいて2のアラビノースおよび2のグルコースの混合物を補給したMY中で培養した。振とうフラスコ培養は、MY-glc中で生育させた振とうフラスコ培養物の植菌により約0.05の初期OD660において開始した。株DS62504図1は、グルコースを21時間内に消費し、グルコース枯渇時、アラビノース消費が開始した。両方の糖は、50時間超の合計時間内に消費された。株IMK307図1の培養物において、グルコースは、25時間で全部消費され、アラビノースはその後15時間未満で枯渇した。全IMK307は、DS62504と比較して合計発酵時間の少なくとも20の低減を実証した。株IMK311図1は、2のグルコースを約30時間内で消費した。培養物中に依然として約10mMのグルコースが残り、アラビノース消費が観察された。アラビノースは、48時間内に消費が完了した。IMK307よりも緩慢であったが、IMK311の全発酵時間はDS62504のそれよりも依然として短かった。嫌気的培養図2は、MY-glc中で生育させた振とうフラスコ培養物による植菌により約1の初期OD660において開始した。CO2生成プロファイルに基づき、株DS64205がグルコースを15時間未満内で完全に消費したことが推定することができた。グルコース消費の間の比生育速度は、0.29h-1であった。しかしながら、アラビノースは、かなり低い速度において消費された。80時間後、アラビノースの約90が発酵ブロス中に依然として存在する。株IMK307hxk2Δについてのグルコース消費はより緩慢であった。CO2生成プロファイルおよびグルコース計測の両方は、全てのグルコースが20時間内に消費されることを示した。グルコース消費の間の比生育速度は、0.20h-1であった。アラビノース消費はグルコース枯渇時に開始し、アラビノースの92が66時間内に消費され、それは株DS62504と比較した場合に明白な改善である。HXK2に加えてHXK1の欠失株IMK312は、グルコース上での比生育速度に対して甚大な効果を有した。株IMK312についての生育速度0.05h-1は、株IMK307のそれよりも75低かった。グルコースは46時間内に枯渇した。これらの46時間内で、132mMのアラビノースの合計の約10が消費された。アラビノースは、112時間未満内で完全に消費された。[実施例2][グルコースの存在下でアラビノース上で生育するIMK318の選択]グルコース上での振とうフラスコ中の450時間の培養により、ヘキソキナーゼ/グルコキナーゼ欠失株IMK318hxk1Δhxk2Δglk1Δがグルコース単独上で生育し得ないことを確認した。したがって、この株をYP-EtOH/Glyc中で培養し、続いてグリセロールの添加後に-80°Cにおいて貯蔵した。続いてIMK318を、2のアラビノースを含有する100mlのMY中で培養した。3日後、約1のOD660において、2mlの培養物を、2のアラビノースを含有する100mlの新たなMYに植継ぎした。約12日後、培養物のOD660は>5であり、試料を-80°Cにおいてグリセロールストックとして貯蔵した。株IMK318は、30°CにおいてMY-ara中で数日間培養した。約5のOD660において、2mlの培養物を、2のアラビノースを補給し、グルコース濃度が0、0.11、0.23、0.65、1.3および2.5w/vで変動する100mlのMY尿素を含有する6つの別個の振とうフラスコに植継ぎした。これら6つの並行培養物の生育を、OD660計測により記録した図3。グルコースの存在下、生育が遅延することが観察された。グルコースの量の増加は、アラビノース上での次第に遅延する生育をもたらした。これらの並行培養物の2つ系統A、0.65w/vのグルコースにおいて開始;系統B、2.5w/vのグルコースにおいて開始を、表4に示される植継ぎスキームに従ってアラビノースおよびグルコースを補給した100mlのMYに継代した。培養物を、増加濃度のグルコースを有する培地に植継ぎした系列Aにおいて表3、アラビノースは完全に消費された一方、グルコースの10未満が消費された図4。SF7から、試料を、100μgml-1のG418を補給した固体YP-ara上にスプレッドし、コロニーが現れるまで30°Cにおいてインキュベートした。別々のコロニーを固体YP-araに植継ぎした。単一コロニー単離物をYP-ara中で培養し、-80°Cにおいて貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の2つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の1つを株IMW018と命名した。系列B表3において、振とうフラスコ培養物を、2のアラビノースおよび2のグルコースの固定濃度を有するMY培地中に植継ぎした図5。驚くべきことに、アラビノースおよびグルコースの同時消費は、第1の植継ぎSF1→SF2後に観察された。SF3から、試料を、100μgml-1のG418を補給した固体YP-ara上にスプレッドし、コロニーが現れるまで30°Cにおいてインキュベートした。別々のコロニーを固体YP-araに植継ぎした。単一コロニー単離物をYP-ara中で培養し、グリセロールストックとして-80°Cにおいて貯蔵した。継代された振とうフラスコのこの系列の2つの単一コロニー単離物を試験し、混合培養物と質的に類似することが見出された。これらの単離物の1つを株IMW017と命名した。単一コロニー単離物株IMW017およびIMW018の両方のグルコースおよびアラビノース消費を、振とうフラスコ培養物中で試験した図4および5。単一コロニー単離物は、それらが由来する継代された振とうフラスコ培養物に類似するグルコースおよびアラビノース濃度プロファイルを示した。興味深いことに、ヘキソキナーゼ/グルコキナーゼ欠失株IMK318hxk1Δhxk2Δglk1Δに基づくこの進化工学戦略において適用されたグルコース濃度レジームは、2つの異なる表現型をもたらした:i株IMW018によるグルコース非感受性アラビノース消費、およびii株IMW017によるアラビノースおよびグルコースの同時消費。[実施例3][アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵]株IMW017を、連続バッチ発酵槽設定を使用してグルコースおよびアラビノースの混合物中で嫌気的に培養した。グルコース/アラビノース混合物中の3つの連続バッチを実施した図6。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された。CO2生成プロファイルから推定すると、グルコース/アラビノース混合物上での比生育速度が、第1のバッチにおける0.05h-1から第3のバッチにおける0.07h-1に増加することが観察された。さらなる連続バッチ発酵の間、生育速度はいっそうさらに増加する。最終バッチから採取された単一コロニー単離物株は、グルコースおよびアラビノース同時消費をIMW017と比較して増加した比消費速度において示す。[実施例4][ヘキソキナーゼ活性]株DS62504、IMK307、IMK312、IMK318、IMW017およびIMW018の細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性を測定する。IMK307hxk2Δの細胞抽出物中のヘキソキナーゼ活性は、株DS62504のそれよりも低い。IMK312hxk2Δhxk1Δのヘキソキナーゼ活性はIMK307のそれよりも低い一方、IMK318hxk2Δhxk1Δglk1Δは、ヘキソキナーゼ活性を示さず/最低のヘキソキナーゼ活性を示す。株IMW018中のヘキソキナーゼ活性はIMK318について観察されるヘキソキナーゼ活性と類似する一方、IMW017はIMK318よりも高いヘキソキナーゼ活性を有する。[実施例5][IMW017における未知ヘキソキナーゼの同定]進化させたhxklhxk2glkl株における計測されたヘキソキナーゼ活性に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期される。この活性をコードする遺伝子をゲノム分析により同定する。この遺伝子の付加的欠失は、ヘキソキナーゼ活性の減少をもたらす。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。[実施例6][IMK318におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]グルコース上での生育を回復させるため、HXK1、HXK2またはGLK1のいずれかをIMK318中に再導入する。活性計測は、IMK318におけるこれらの遺伝子の1つの再導入がヘキソ/グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。[実施例7][IMW018におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]活性計測は、IMW018におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入が株IMW018と比較してヘキソ/グルコキナーゼ活性の増加をもたらすことを示す。単独の炭素源としてのグルコース上での生育が回復される。HXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入は、単独の炭素源としてのグルコースおよびアラビノースの両方の上での生育をもたらす。得られた株は、グルコースおよびアラビノースの混合物中で生育し、グルコースおよびアラビノースの同時消費を示す。[実施例8][IMW017およびIMW018のグルコース非感受性表現型の基礎をなす突然変異の同定]株IMW017およびIMW018のグルコース非感受性表現型は、グルコースおよびアラビノースを含有する培地中の株IMK318の選択的生育の間に蓄積した突然変異により説明することができることが予測される。これらの突然変異を同定するため、株IMK318、IMW017およびIMW018のゲノムをシーケンシングする。IMW017とIMK318およびIMW018とIMK318のゲノム配列を比較することにより、例えば単一ヌクレオチド多型などのゲノム改変を同定する。DS62504におけるこれらの単一ヌクレオチド多型の導入は、アラビノース上での生育がグルコースに対して非感受性である表現型をもたらす。[実施例9][GAL1の欠失]ヘキソキナーゼ活性の維持を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1hxk2glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、GAL1遺伝子をhxk1hxk2glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1hxk2glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1hxk2glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。[実施例10][YDR516cの欠失]ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1hxk2glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、YDR516c遺伝子をhxk1hxk2glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1hxk2glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1hxk2glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。[実施例11][YLR446wの欠失]ヘキソキナーゼ活性の残留を担うタンパク質を決定するための別のアプローチは、hxk1hxk2glk1株においてヘキソキナーゼ活性を潜在的にコードする遺伝子を欠失させることである。この目的のため、YLR446w遺伝子をhxk1hxk2glk1株において欠失させる。得られた株は、親hxk1hxk2glk1株よりも低いヘキソキナーゼ活性を示し、または親hxk1hxk2glk1株と比較して単独の炭素源としてのグルコース上で生育する能力の減少を示す。この四重ノックアウト株は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の進化工学についてかなり強いプラットフォームを提供する。[実施例12][アラビノースおよびグルコースの嫌気的同時発酵]株IMW017のグルコースおよびアラビノースの同時消費を改善するため、株IMW017を、20g/リットルのグルコースおよび20g/リットルのアラビノースの混合物を補給したMY中で、連続バッチ発酵槽設定を使用して嫌気的に培養した。最初に、グルコース/アラビノース混合物中の4つの連続バッチを実施した。それぞれのバッチにおいて、グルコースおよびアラビノースは同時に消費され、エタノールに発酵された図6、実施例3。CO2生成プロファイルから推定すると、グルコース/アラビノース混合物上の比生育速度が、第1のバッチにおける0.05h-1から第4のバッチにおける0.06h-1に増加することが観察された。第4のバッチ後、連続バッチ培養をグルコースおよびアラビノースの混合物バッチ番号6、7、9、11、13、15、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37および39またはアラビノース単独バッチ番号5、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38および40の中で実施した。MY-アラビノースおよびMY-グルコース/アラビノースそれぞれにおける19および21のバッチ後、嫌気的生育速度は単独の炭素源としてのアラビノース上で0.09h-1に増加し、グルコース/アラビノース混合物上で0.10h-1に増加した図7。個々のバッチ培養のCO2生成プロファイルの比較は、反復バッチレジームがアラビノース単独またはグルコース/アラビノース混合物のいずれについても約120時間から約80時間に発酵時間の減少をもたらしたことを示し、それぞれのバッチについて等しい初期植菌材料サイズが想定される図8。グルコース/アラビノース混合物中のバッチ培養について観察されたCO2生成の単一ピークは、グルコースおよびアラビノースが連続的にではなく同時に消費されることを示す図8および9。[実施例13][ヘキソキナーゼ活性]株DS62504、IMK307、IMK312、IMK318、IMW017およびIMW018のヘキソキナーゼ活性を、アラビノースを補給したYP中で生育させた振とうフラスコ培養物の細胞抽出物において測定した。ヘキソキナーゼ反応混合物は、50mMのイミダゾール-HCl、pH7.6、1mMのNADP、10mMのMgCl2、2Uのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、10mmのD-グルコースおよび細胞抽出物からなるものであった。反応は1mMのATPの添加により開始し、NADPHの形成は340nmにおける反応混合物の吸光度を計測することにより測定した。株DS62504およびIMK307hxk2Δの細胞抽出物におけるヘキソキナーゼ活性は、それぞれ1.2および1.3μmol.min-1.mg-1タンパク質であった図10。IMK312hxk2Δhxk1Δの細胞抽出物における0.4μmol.min-1.mg-1タンパク質のヘキソキナーゼ活性は、IMK307のそれよりも低かった。株IMK318およびIMW018hxk2Δhxk1Δglk1Δは、0.2μmol.min-1.mg-1タンパク質未満のヘキソキナーゼ活性を示した。三重のhxk2hxk1およびglk1の欠失にかかわらずグルコースを消費し得る株IMW017は、両方ともグルコースを消費し得ない株IMK318およびIMW018と比較してより高いヘキソキナーゼ活性を有することが予期された。株IMW017についてのヘキソキナーゼ活性は、アッセイ条件下で0.02μmol.min-1.mg-1タンパク質未満でもあった。[実施例14][IMW017におけるヘキソキナーゼとしてのGAL1の同定]グルコースおよびアラビノースの混合物上での進化させたhxk1Δhxk2Δglk1Δ株IMW017の生育実験に基づくと、ゲノム中に存在する糖キナーゼをコードする潜在性を有する別の遺伝子が活性になり、またはグルコースに対するその基質特異性を変えたことが予期された。未知のヘキソキナーゼ活性がGAL1によりコードされるか調査するため、GAL1遺伝子をIMW017において欠失させた。pSH65実施例1参照を使用してglk1遺伝子座からKanMXカセットを除去した後、GAL1欠失を、オリゴヌクレオチドGAL1-DisAおよびGAL1-DisB表5を使用するPCRにより増幅させたG418耐性カセットの統合により達成した。形質転換細胞は、100μgml-のG418InvivoGen,SanDiego,USAならびに炭素源としての1.5w/vのエタノールおよび1.5w/vのグリセロールを含有するYP寒天上で選択した。KanMXカセットの正確な統合は、診断オリゴヌクレオチドGAL1-FW2/KanAおよびGAL1-RV2/KanB表4の組合せを使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。得られた株IMW023におけるGAL1の欠失は、単独の炭素源としてのガラクトース上での生育不能により確認した。興味深いことに、IMW023は、グルコースを炭素源として使用し得ず、それは、GAL1がその親hxk1Δhxk2Δglk1Δ株IMW017における未知のヘキソキナーゼ活性を担ったことを示す。グルコースおよびアラビノースの混合物中での振とうフラスコ培養の間、IMW023はグルコースを消費しなかった一方、アラビノースは消費された図11。[実施例15][グルコースの存在下でのアラビノースの嫌気的発酵について]IMW017におけるGAL1pもヘキソキナーゼ活性を示すことが見出されたため、hxk1Δhxk2Δglk1Δgal1Δ株IMW023は、進化工学によりグルコースを消費させずにグルコースの存在下でのアラビノース消費を改善するためのより堅実なプラットフォームを提供する。培地中のグルコースの存在下での改善されたアラビノース消費を選択するため、株IMW023を、振とうフラスコ培養物中で、2のアラビノースおよび2のグルコースを補給したMY培地中での継代により培養した。生育はOD660計測によりモニタリングし、比生育速度は培養物当たり2または3つのいずれかのOD660計測から推定した。グルコースおよびアラビノース濃度は、HPLC分析により測定した。63日間におけるアラビノース/グルコース混合物上での24代の継代後、株IMW023の植継ぎされた培養物は、依然としてグルコースを消費せずに2のグルコースの存在下でアラビノース上で生育し得た図12。アラビノース上での比生育速度は、約0.06h-1から約0.11h-1に増加した図13。嫌気的条件下でグルコースの存在下でアラビノースを消費し得る細胞を選択するため、およびグルコースの存在下でアラビノース消費をさらに改善するため、2のアラビノースおよび2のグルコースを補給したMY培地中での株IMW023の連続的植継ぎを嫌気的連続バッチ発酵設定中で継続した。このため、株IMW023の継代された培養物の最終振とうフラスコ培養物SF24を植菌材料として使用した。培養の最初の1000時間において、発酵槽のヘッドスペースに窒素に代えて空気を補給した場合にCO2生成の増加が観察されるにすぎなかった図14。第4のバッチの間の培養の約1000時間後、排ガス中のCO2濃度の増加が観察された。CO2生成プロファイルから推定すると、嫌気的生育のこの第1のバッチは、約0.03h-1の比生育速度を示した。さらなる10代の植継ぎ後、比生育速度は約0.06h-1に増加した図14。連続的に植継ぎされたバッチ培養の間、アラビノースは消費された一方、グルコースは消費されなかった図15。個々のバッチ培養のCO2生成プロファイルは、CO2生成の速度、ひいてはアラビノース消費速度が連続的植継ぎの間に増加し、それはアラビノースを完全に消費するために必要とされる発酵時間の減少をもたらしたことを示す図16。最終バッチから採取された単一コロニー単離物は、株IMW058と命名し、IMW023と比較してグルコースの存在下でアラビノース消費速度の増加を示した。[実施例16][IMW018におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]株IMW018におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、HXK2、HXK1およびGLK1を、オリゴヌクレオチド組合せHXK2FW/HXK2RV、HXK1FW/HXK1RVおよびGLK1FW/GLK1RVを使用し、S.セレビシエS.cerevisiaeCENPK113-7DのゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRにより増幅した。PCR生成物の精製後GenElutePCRClean-upKit,Sigma,Steinheim,Germany、IMW018の一晩培養物をこのPCR生成物により形質転換したGietzandWoods2002。形質転換細胞は、2のグルコースを含有するMY寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるHXK2、HXK1およびGLK1のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断プライマーペア表6を使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。得られた株IMW024HXK2、IMW025HXK1およびIMW047GLK1を、振とうフラスコ中で30°Cにおいて2のグルコースおよび2のアラビノースを補給したMY-尿素培地pH4.7中で0.05±0.01の初期OD660で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。比較のため、株DS62504、IMK307およびIMK311を同一条件下で培養した。生育および糖消費は、69時間モニタリングした。株IMW024、IMW025およびIMW047は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た図17。IMW018におけるGLK1の再導入IMW047は、迅速なグルコースおよびアラビノース消費をもたらした。アラビノースおよびグルコースは、培養の43時間内に消費が完了し、それはIMK307hxk2ΔおよびIMK311hxk1Δhxk2Δについて観察されたものと類似する。IMW024HXK2およびIMW025HXK1について観察されたアラビノース消費は、両方ともIMK307およびIMK311について観察されたものよりも緩慢であるが、いかなるHXK/GLK欠失も有さない親株DS62504について観察されたものよりも迅速であった図17a。アラビノースおよびグルコースの同時消費は、株IMW047についてのみ観察された図18。グルコースが22時間において枯渇される前、アラビノースの約7が消費された。25時間において、グルコースが完全に消費されたとき、アラビノースの19が利用された。[実施例17][IMW058におけるヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼ活性の再導入]株IMW058におけるHXK1、HXK2またはGLK1のいずれかの再導入を、グルコース上での生育を回復させるために実施した。このため、HXK2、HXK1およびGLK1を、オリゴヌクレオチド組合せXK2FW/HXK2RV、HXK1FW/HXK1RVおよびGLK1FW/GLK1RVを使用し、S.セレビシエS.cerevisiaeのCENPK113-7DのゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRにより増幅させた。PCR生成物の精製後GenElutePCRClean-upKit,Sigma,Steinheim,Germany、IMW058の一晩培養物をこのPCR生成物により形質転換したGietzandWoods2002。形質転換細胞は、2のグルコースを含有するMY寒天上のグルコース上での生育について選択した。相同性組換えによるHXK2、HXK1およびGLK1のそれらの元の遺伝子座における正確な統合は、診断オリゴヌクレオチド表5を使用する単一コロニーに対するPCRにより確認した。得られた株IMW059HXK2、IMW060HXK1およびIMW061GLK1を、振とうフラスコ中で30°Cにおいて2のグルコースおよび2のアラビノースを補給したMY-尿素培地pH4.7中で0.05±0.01の初期OD660で、グルコース上で生育させた予備培養物を使用して培養した。生育および糖消費は、72時間モニタリングした。株IMW059、IMW060およびIMW061は、全てグルコースおよびアラビノースの両方を利用し得た図17。IMW058におけるHXK2の再導入は、アラビノースおよびグルコースの迅速な連続的消費をもたらした。参照株DS62504は69時間内にアラビノースを完全に消費しなかった一方図17a、株IMW059はアラビノースの99超を約46時間内に消費した図17j。株IMW060HXK1およびIMW061GLK1について、グルコースおよびアラビノースの同時消費が観察された図17kおよびl。培養の最初の22時間において、アラビノースの約18がグルコースの約48と一緒に同時消費された。培養の50時間内に、アラビノースの99が消費された。[実施例18][株IMK318、IMW017およびIMW018の比較全ゲノムシーケンシング]株IMK318、IMW017およびIMW018についての全ゲノムDNAシーケンシングは、IlluminaGAIIx技術75bpのリード、ペアエンドを使用して実施した。シーケンスリードは、CLCGenomicsWorkbenchバージョン4.5を使用してS.セレビシエS.cerevisiaeCEN.PK113-7Dの参照ゲノム配列にアラインした。SNP分析は、CLCGenomicsWorkbenchバージョン4.5を使用して実施した。全体で、SNP分析は、IMK318、IMW017およびIMW018をCEN.PK113-7Dの参照配列と比較した場合にアミノ酸変化をもたらすコード領域中の4つの突然変異を生じた。ガラクトキナーゼをコードするGAL1中のAsp376Valアミノ酸変化をもたらす1つの突然変異。この突然変異は、参照配列と比較した場合にIMK318、IMW017およびIMW018に見出された図19。驚くべきことに、IMW017について2つの特有の突然変異のみが見出された。それらの一方は、GAL1中のTyr274Phe突然変異であり、Thodenetal.2005により記載されたガラクトキナーゼのガラクトース結合部位中に局在する。IMW017におけるGAL1の欠失がグルコース上での生育を排除する観察と組み合わせると、この突然変異はIMW017におけるグルコース消費を可能とするGAL1のヘキソキナーゼ活性を担った可能性が高いと考えられる。第2の突然変異は、S.セレビシエS.cerevisiaeにおけるガラクトースパーミアーゼをコードするGAL2の膜貫通モチーフ5に見出されたThr219Asn。GAL2pは、アラビノースを輸送し得ることが公知であるKouet.al1970;Beckeretal.2003。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるGAL2における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。驚くべきことに、1つの特有の突然変異のみがIMW018のコード領域に見出された。この突然変異は、S.セレビシエS.cerevisiaeにおけるガラクトースパーミアーゼをコードするGAL2の膜貫通モチーフ8中に局在したAsn376Ser。GAL2pは、アラビノースを輸送し得ることが公知であるKouet.al1970;Beckeretal.2003。アラビノースについての親和性を増加させ、またはグルコースについての親和性を減少させるGAL2における突然変異は、グルコースの存在下でのアラビノース消費の改善をもたらす。[実施例19][IMW059によるグルコースおよびアラビノースの迅速な嫌気的発酵]株IMW059を、20gl-1のグルコースおよび20gl-1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。19時間内に、グルコースは枯渇した。CO2生成プロファイルおよびアラビノース濃度図21に基づくと、アラビノース消費はグルコースが完全に消費された後に開始した。グルコースおよびアラビノースの同時消費は観察されなかった。嫌気的培養の74時間後、アラビノースの99が消費された。エタノールは、全糖1グラム当たり0.43gの全体収率で生成された。このCO2生成プロファイルとDS62504株のそれとの比較図24は、グルコース/アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第1のCO2生成ピークに基づき、グルコース消費が株IMW059について緩慢であることを示す。しかしながら、アラビノースは、IMW059によりかなり迅速に消費され、それは第2のCO2生成ピークの間のより高いCO2生成レベルおよびより短い合計発酵時間により反映される。[実施例20][IMW060によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費]株IMW060を、20gl-1のグルコースおよび20gl-1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。CO2生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度図22に基づくと、アラビノースは最初の約40時間内にグルコースと同時に消費された。最初の43時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの41が消費された。嫌気的培養の74時間後、アラビノースの89が消費された。嫌気的培養の140時間後、アラビノースの98が消費された。エタノールは、全糖1グラム当たり0.43gの全体収率で生成された。このCO2生成プロファイルとDS62504株のそれとの比較図24は、グルコース/アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第1のCO2生成ピークに基づき、グルコース消費が株IMW060について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース/アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、DS62504のそれよりも短い。[実施例21][IMW061によるグルコースおよびアラビノースの嫌気的同時消費]株IMW061を、20gl-1のグルコースおよび20gl-1のアラビノースを有するMY培地中で嫌気的に培養した。糖消費は、HPLC計測によりモニタリングした。酵母の生育は、乾燥重量計測およびOD660のモニタリングにより測定した。CO2生成は、排ガス中のCO2濃度の計測により測定した。エタノール生成は、CO2生成に基づき算出した。エタノール蒸発を補正するため、生成されたエタノールの量は、CO2の計測された累積生成から、バイオマス合成に起因して生じたCO2生成1グラムのバイオマス当たり5.85mmolのCO2および酢酸形成に伴うCO2を差し引いたものに等しいと想定した。CO2生成プロファイルならびにグルコースおよびアラビノース濃度図23に基づくと、アラビノースは最初の43時間内にグルコースと同時に消費された。最初の49時間内に、グルコースは完全に消費される一方、アラビノースの73が消費された。嫌気的培養の74時間後、アラビノースの95が消費された。嫌気的培養の140時間後、アラビノースの99が消費された。エタノールは、全糖1グラム当たり0.44gの全体収率で生成された。このCO2生成プロファイルとDS62504株のそれとの比較図24は、グルコース/アラビノース混合物の嫌気的発酵の間の第1のCO2生成ピークに基づき、グルコース消費が株IMW061について緩慢であることを示す。しかしながら、グルコース/アラビノース混合物を発酵させるための合計時間は、DS62504のそれよりも短い。[実施例22][BAMにおける性能試験]株IMW060およびIMW061の性能を試験するため、株を、2のグルコースを補給したVerduyn培地において植菌した。対照として、株DS62504を含めた。ロータリーシェーカー中で30°Cおよび280rpmにおいて一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により収集し、CO2生成のための培養をBAMBiologicalActivityMonitor中で33°Cにおいて、表7に示される糖を補給した100mlのVerduyn培地中で実施した。細胞を、糖ならびに阻害剤の酢酸、クマル酸、フェルラ酸、フルフラール、HMFおよびギ酸を示された濃度において補給した100mlのVerduyn培地に添加した。第2の実験において、糖を補給したが阻害剤を使用しない100mlのVerduyn培地を使用した。CO2生成は常にモニタリングし、試料は分析600nmにおける光学密度、エタノール、および残留糖のために周期的に採取した。BAM実験の結果を、阻害剤を有する培地については図25、26、および27に示し、阻害剤を有さない培地については図28、29および30に示す。IMW060およびIMW061は両方とも、糖グルコースおよびアラビノースを迅速に同時にエタノールに変換し得る一方、株DS62504は変換し得ず、すなわちDS62504は、グルコースが培地から排出された後にアラビノースを消費すると結論づけることができる。同一の結果、すなわちアラビノースおよびグルコースの同時消費は、阻害剤の存在下で得られるが、文献から公知のとおり全ての糖を消費させるためにかかる時間が阻害剤の存在下においてより緩慢である。[1]A.A.Andreasen,T.J.Stier,AnaerobicnutritionofSaccharomycescerevisiae.I.Ergosterolrequirementforgrowthinadefinedmedium,J.CellPhysiol.41195323-36.[2]A.A.Andreasen,T.J.Stier,AnaerobicnutritionofSaccharomycescerevisiae.II.Unsaturatedfattyacidrequirementforgrowthinadefinedmedium,J.CellPhysiol.431954271-281.[3]R.D.Gietz,R.A.Woods,Transformationofyeastbylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolmethod,MethodsEnzymol.350200287-96.[4]U.Gueldener,S.Heck,T.Fiedler,J.Beinhauer,J.H.Hegemann,Anewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeast,NucleicAcidsRes.2419962519-2524.[5]U.Gueldener,J.Heinisch,G.J.Koehler,D.Voss,J.H.Hegemann,AsecondsetofloxPmarkercassettesforCre-mediatedmultiplegeneknockoutsinbuddingyeast,NucleicAcidsResearch3062002e23.[6]H.VanUrk,P.R.Mak,W.A.Scheffers,J.P.VanDijken,MetabolicresponsesofSaccharomycescerevisiaeCBS8066andCandidautilisCBS621upontransitionfromglucoselimitationtoglucoseexcess,Yeast41988283-291.[7]C.Verduyn,E.Postma,W.A.Scheffers,J.P.VanDijken,Effectofbenzoicacidonmetabolicfluxesinyeasts:acontinuous-culturestudyontheregulationofrespirationandalcoholicfermentation,Yeast81992501-517.[8]R.A.Weusthuis,W.Visser,J.T.Pronk,W.A.Scheffers,J.P.VanDijken,Effectsofoxygenlimitationonsugarmetabolisminyeasts-acontinuous-culturestudyoftheKluyvereffect,Microbiology1401994703-715.[9]S.C.Kou,etal.1970.J.Bact.102,671-678.[10]J.Beckeretal.2003.Appl.Environ.Microbiol.69,4144-4150.[11]J.B.Thodenetal.2005.J.Biol.Chem.280,36905-36911"