a配列番号1、配列番号2、配列番号72、配列番号106の配列、またはこれらの配列の1つの少なくとも15個の連続するヌクレオチドの配列、b配列番号1、配列番号2、配列番号72、もしくは配列番号106の配列の相同体または変異体である核酸配列、およびcaおよびbで定義される配列に対応する相補配列またはRNA配列、からなる群から選択される配列を含んでなることを特徴とする、精製または単離されたSPG4遺伝子の核酸。受託番号AB029006としてGenBankデータバンクで確認される核酸を除く、請求項1に記載の精製または単離された核酸。配列番号2の配列、それに対して相補的な配列、またはその対応するRNAの配列についての、nt714~809末端を含む断片の少なくとも15個の連続するヌクレオチドの配列を少なくとも1つ含んでなる、請求項1または2に記載の精製または単離された核酸。ヒトの本来の多形性に対応する突然変異を含んでなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の精製または単離された核酸。請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸配列を含んでなる、プローブまたはプライマー。該配列が配列番号4~配列番号71の配列から選択される、請求項5に記載のプローブまたはプライマー。配列番号74~配列番号105の配列から選択される請求項1に記載の核酸配列を含んでなる、スプライス受容部位または供与部位。cDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするか、またはスパスチンをコードしている単離されたゲノムまたはcDNAをクローニングする方法であって、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸配列を用いる方法。哺乳類、特にマウスのSPG4遺伝子のゲノムまたはcDNA配列を同定する、請求項8に記載の方法。ヒトSPG4遺伝子が有する突然変異を同定する方法であって、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸配列を用いる方法。常染色体性優性遺伝性痙性対麻痺の原因である突然変異を同定する、請求項10に記載の方法。SPG4遺伝子の発現を促進および/または調節する核酸配列を同定する方法であって、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸配列を用いる方法。請求項9~12のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された核酸。請求項1~4および13のいずれか一項に記載の核酸によりコードされているポリペプチド。好ましくはその配列が受託番号AB029006としてGenBankデータバンクで確認される584アミノ酸ペプチドを除く、請求項14に記載のポリペプチド。a配列番号3、配列番号73、配列番号107の配列、またはこれらの配列の1つの少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列、およびb配列番号3、配列番号73、または配列番号107の配列の相同体または変異体である配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項14または15に記載のポリペプチド。配列番号3の配列のaa197~228末端を含む断片の少なくとも8個の連続するアミノ酸の配列を含んでなる、請求項14または15に記載のポリペプチド。ヒトの本来の多形性に対応する少なくとも1つの突然変異を有する、配列番号3、配列番号73、配列番号107の配列、および少なくとも10個の連続するアミノ酸のその断片の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項14または15に記載のポリペプチド。請求項1~4および13のいずれか一項に記載の核酸配列を含む、クローニングおよび/または発現ベクター。宿主細胞におけるその発現に必要なエレメントを含む、請求項19に記載のベクター。請求項19または20に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。請求項21に記載の細胞を含んでなる、ヒトを除く哺乳類。形質転換細胞を含んでなり、SPG4遺伝子の2つの対立遺伝子の少なくとも一方の配列がヒトの本来の多形性に対応するか、または請求項10または11に記載の方法を用いて同定される少なくとも1つの突然変異を含む、請求項22に記載のヒトを除く哺乳類。核酸配列を検出および/または増幅するためのプローブまたはプライマーとしての、請求項5、6および13のいずれか一項に記載の核酸配列の使用。ゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングするための、請求項1~7および13のいずれか一項に記載の核酸配列の使用。組換えまたは合成ポリペプチドを生産するための、請求項1~4および13のいずれか一項に記載の核酸配列の使用。組換えポリペプチドを発現させる条件下で請求項21に記載の形質転換細胞を培養してその組換えポリペプチドを回収する、組換えポリペプチドの生産方法。請求項27に記載の方法を用いて得られるポリペプチド。請求項14~18および28のいずれか一項に記載のポリペプチドを特異的に認識し得る、モノもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片、キメラ抗体もしくは免疫複合体。請求項14~18および28のいずれか一項に記載のポリペプチドを検出および/または精製する方法であって、請求項29に記載の抗体を用いる方法。SPG4遺伝子に関連するAD-HSPの遺伝子型診断法であって、請求項1~7および13のいずれか一項に記載の核酸配列を用いる方法。患者由来の生物学的サンプルを用いる、SPG4遺伝子配列の少なくとも1つの突然変異の存在に関連するAD-HSPの遺伝子型診断法であって、以下の工程:a必要に応じて、解析される生物学的サンプル由来のゲノムDNAを単離し、または生物学的サンプルのRNAからのcDNAを作製し、b請求項5および6のいずれか一項に記載のプライマーまたは請求項13に記載の核酸を用いて、突然変異を含むと考えられるSPG4遺伝子の前記DNA配列を特異的増幅させ、c得られた増幅産物の解析し、それらの配列とその対応する正常なSPG4遺伝子配列との比較する、ことを含んでなる方法。SPG4遺伝子によりコードされているポリペプチドの異常な発現に関連するAD-HSPを診断する方法であって、そのポリペプチドとその抗体との特異的な免疫学的複合体の形成を可能にする条件下で請求項29に記載の1以上の抗体と、試験される生物学的材料とを接触させて、形成される可能性のある免疫学的複合体を検出および/または定量する、方法。請求項14~18および28のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項1~7および13のいずれか一項に記載の核酸と、直接的または間接的に相互作用でき、かつ/またはこれらのポリペプチドの発現または活性を調整することを可能にする、化学的もしくは生化学的化合物を選択する方法であって、請求項1~7および13のいずれか一項に記載の核酸、請求項14~18および28のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項19および20のいずれか一項に記載のベクター、請求項21に記載の細胞、請求項22および23のいずれか一項に記載の哺乳類、または請求項29に記載の抗体と、候補化合物とを接触させて、そのポリペプチドの活性の改変を検出する、方法。SPG4遺伝子の発現または活性を調べるための、請求項1~7および13のいずれか一項に記載の核酸配列、請求項14~18および28のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項19および20のいずれか一項に記載のベクター、請求項21に記載の細胞、請求項22および23のいずれか一項に記載の哺乳類または請求項29に記載の抗体の使用。以下の化合物の群から選択される少なくとも一種の化合物を含んでなる、診断キットまたはパック。a請求項5および6のいずれか一項に記載の核酸、およびb請求項29に記載の抗体。例1:材料および方法1候補領域のサブクローニングおよび配列決定2種のヒトゲノムライブラリー、CITB_978_SKBResearchGeneticsgが販売およびRPCI-11を起源とし、SPG4範囲を包含する12のBACを選択し、配列決定した309191999。各BACの40μgのDNAをCviJI制限酵素で部分的に消化し、0.4LMPアガロースゲルでの電気泳動により分離した。そのサイズが3.5および10kbの領域で変化するDNA画分をβ-アガラーゼで溶出し、予め、Smalで消化して脱リン酸化したプラスミドベクターpBAM3と5×ベクターにつき1×挿入物の割合で連結した。エレクトロコンピテント大腸菌DH10B菌をエレクトロポレーションにより種々の連結物で形質転換した。各BACより、20が10kbの挿入物を有するクローン、40が5kbの挿入物を有するクローンおよび40が3kbの挿入物を有するクローンからなる、約1000~1500のサブクローン8~10当量のゲノムを単離した。これらのクローンの挿入物の末端をLICOR4200自動シーケンサーで配列決定した。各BACの配列をPhredおよびPhrapプログラムを用いていくつかのコンティグからなる主鎖に構成した。各コンティグ間のホールを標識したジデオキシヌクレオチドを用いてABI377シーケンサーで配列決定した。これらの配列コンティグに含まれるエキソンをGRAILII、GENSCAN、FGENEHおよびGenieコンピュータプログラムを用いて推定した。またその配列をBLASTNおよびBLASTXプログラムを用いてEMBLおよびGenBank核酸およびタンパク質データベースにおいて比較した。プロモーター配列の決定はTSSGおよびTSSWコンピュータプログラムを用いて行った。これら総ての配列解析の結果をGenotator配列注解プログラムを用いて視覚化した。2cDNAクローニングSPG4遺伝子のcDNAをMarathoncDNA増幅キットを用いて製造業者の教示に従い、胎児脳、成人脳および成人肝臓のポリARNAにおける5’および3’RACE-PCR試験により単離した。種々のプライマー対を用い、第1のPCRに次ぎに内部PCRを行った。そのプライマーの配列を以下の表1に示す。RACE-PCR産物をTA-クローニングキットを用いてクローニングし、その対応するクローンをABI377で配列決定した。SPG4転写物の配列は6人の健康な個体のリンパ芽球由来のcDNA集団から増幅したPCR産物の配列決定により確認した。3突然変異の検出調査される家系の1患者と6人の対照個体のリンパ芽球株からRNAPLUSRキットを用いて全RNAを抽出した。cDNA合成を標準条件下で、ランダム6量体プライマー100pmolおよびSuperscriptII逆転写酵素200単位を用いて、RNA500ng~1μgにおいて行った。親および対照のcDNAにおいてSPG4オープンリーディングフレームの総てを包含する重複断片を生ずる4種のPCR増幅を行った。断片IをSPA_Db/SPA_Dmプライマーを用い、次いでSPA_Dc/SPA_Dnプライマーを用いて、内部PCRにより増幅した。断片II、IIIおよびIVを各々、SPA_Ad/SPA_Am、SPA_Ba/SPA_BmおよびSPA_Ca/SPA_Cmプライマー表1にあるこれらのプライマーの配列を参照を用いて増幅した。各々の増幅をcDNA4μl-1/7番目の調製物、各プライマー20pmol、dNTP200μM、KCl50mM、Tris10mM、pH9、1.5mMMgCl2、tritonX-1000.1、ゼラチン0.01およびTaqポリメラーゼCetus-PE2.5単位を含有する全量50μlで行った。PCR反応はホットスタートプロセスに従い行った:94°Cで5分間の最初の変性工程後にTaqポリメラーゼを92°Cで加える。次ぎにサンプルを変性94°Cで40秒間、ハイブリダイゼーション55°Cで50秒間、断片Iを除く:58°Cで50秒間および伸長72°Cで1分間、次ぎに最終伸長工程72°Cで5分間35サイクルに付す。PCR産物を断片I、II、IIIおよびIV各々に対して、SPA_Dc/SPA_Dn、SPA_Ac/SPA_An、SPA_Bb/SPA_BnおよびSPA_Cb/SPA_Cmプライマーを用いてABI377自動シーケンサーで配列決定した。また親および対照のSPG4遺伝子の17の推定エキソンを配列決定することにより突然変異を探し、または確認した。各エキソンをエキソン1gSPAex1c/gSPAex1m、およびgSPAex10a/gSPAex12mおよびgSPAex11a/gSPAex12mプライマー対を用いて同時増幅されるエキソン10、11および12を除く、対応するamプライマー対以下の表2参照を用いて増幅した。アドバンテージGCゲノムPCRキットを用いて製造業者の教示に従い増幅されるエキソン1以外には、4種のわずかに異なるPCRプログラム1、2、3および4を用いてSPG4エキソン表2参照を増幅した。増幅は総て、ゲノムDNA100ng、各プライマー50pmol、dNTP250μM、1×TakaraバッファーおよびTakaraLaTaqTaqポリメラーゼ1単位を含有する容量50μlで行った。PCR反応はホットスタートプロセスに従い行った:96°Cで5分間の最初の変性工程後にTaqポリメラーゼを94°Cで加える。次ぎにサンプルを変性94°Cで40秒間、ハイブリダイゼーションプログラム1:60°Cで50秒間、プログラム2:58°Cで50秒間、プログラム3および4:55°Cで50秒間および伸長プログラム1および4:72°Cで1分間、プログラム2および3:72°Cで40秒間、次ぎに最終伸長工程72°Cで10分間30サイクルに付す。これらのPCR産物の配列決定をPCRプライマーまたはbおよびnと呼ばれる内部プライマー表2参照のいずれかを用いてABI377シーケンサーで行った。4SPG4の同定ネズミオルトログSPG4に対応するマウス胚盤胞およびE8胚cDNAライブラリー由来のcDNAクローン977312ESTAA560327および568234ESTAA107866をIMAGEコンソーシアムを用いて単離し、ABI377シーケンサーで実験室で配列決定した。SPG4およびそのネズミオルトログSPG4の発現プロフィールを調べるために、種々の胎児ならびに成人ヒト組織、およびまたマウス組織由来のcDNAコレクションを、ヒトcDNAについてはSPA_Ca/SPA_Cmプライマー対を用いた、およびマウスcDNAについてはSPA_Ca/spamspam:5’-ACCGAAGTCAAGAGCCTATC-3’対を用いたPCRにより製造業者のプロトコールに従って調べた。PCR条件は、サンプルを成人ヒト組織ならびにマウス組織由来のcDNAについては32サイクル、および胎児組織由来のcDNAについては28サイクルに付したことを除き、リンパ芽球株cDNA由来のSPG4の増幅に用いるもの§突然変異の検出参照である。増幅産物を2LMPアガロースゲルでの電気泳動により泳動させた。5患者由来の筋肉生検の組織学的解析Casarietal1998に記載された標準的な方法によりSPG4遺伝子座に関する家系の患者由来の筋肉生検において組織学的かつ組織酵素解析を行った。6公開データベースにおける受託番号SPG4またはSPASTcDNAおよび推定タンパク質配列、GenBank/EMBLAJ246001;不完全Spg4cDNAクローン、GenBank/EMBLAJ246002;SPG4またはSPAST遺伝子、GenBank/EMBLAJ246003。例2:SPG4遺伝子範囲の配列解析組換え結果の解析によりSPG4候補領域をD2S352およびD2S2347マーカー19、20間0cMの遺伝子範囲に限定することが可能になる。37BACからなるSPG4範囲の予備配列決定マップを作製した;候補領域は約1.5Mbの物理的距離に及んでいる。クローンAおよびE間の4kbの単一ホールを除く、SPG4領域にわたって伸びている12の重複BACを選択し、配列決定した図1A。注目される領域の約70に及んでいるこれらの7のBACA、B、C、D、E、FおよびGはすでに配列決定されている。これらの7のBAC配列を核酸およびタンパク質データベースのものと比較し、4種のエキソン推定プログラムを用いて解析した。これらの予備的配列解析により、キサンチンデヒドロゲナーゼ、ステロイドSα-レダクターゼ2およびTGFβ結合タンパク質をコードする遺伝子に対応する3つを含む、14の可能性ある転写単位を示すことが可能になる。配列解析により検出された14の遺伝子のうち9つのものはすでにESTExpressedSequenceTaqデータベースにおいて確認されており、SPG4範囲に位置していた:残る5つの遺伝子は候補領域の配列決定により同定のみできる。これら5つの新規遺伝子の1つはそのコード領域の3’においてAAAタンパク質系をコードする遺伝子と相同性を示した。より完全な配列解析により、SPG4またはSPASTと呼ばれるこの遺伝子が17のエキソンからなり、かつ2つの隣接するBACクローン、DおよびGに包含される約90kbの領域にわたっていることが示された図1B参照。この遺伝子の最初の3つの推定エキソンは用いられる4種の推定プログラムのうちの2種、GRAILIIおよびGENSCANそれらはマウス胚盤胞EST、AA560327と強い相同性を示すによりBACDにおいて同定された。最後の14のエキソンはBACGにおいて見出せる。エキソン7~17から推定されるタンパク質配列はYta6p、TBP6およびEnd13酵母タンパク質、またSKD1マウスタンパク質も含む、AAA系サブクラスと有意に相同である。4種のエキソン推定プログラムのうちFGENEHが最も信頼性がありかつ最も能力が優れており、2p21~22のこの染色体領域の大部分の遺伝子の検出を可能にすると思われる。この所見はまたSPG4遺伝子にも当てはまる。この15のエキソンはこのプログラムを用いて示されるが、4、9または11のエキソンだけは各々、Genie、GRAILIIおよびGENSCANプログラムを用いて位置決定する。次ぎにこの遺伝子のゲノム構成図1BをSPG4cDNAの配列を決定することにより確認する。イントロン/エキソン連結については以下の表3に示す:エキソンサイズは41bpエキソン16~1.410kbエキソン17の範囲にわたっており、イントロンサイズは140bpイントロン11~23.247kbイントロン1の範囲にわたっている。例3:SPG4cDNAの同定成人肝臓ならびに脳および胎児脳cDNAのコレクションにおいて5’および3’RACE-PCRにより数度の連続増幅を行い、SPG4転写物の同定を行った。転写物の5’領域がGC高含量であることから90のGCはnt263位の前に置かれた60bpにある、総ての5’RACE-PCRによりSPG4cDNAのnt263位で終結する図2増幅産物を得た。コード領域の総てを包含する4つの重複PCR産物を6人の対照個体のリンパ芽球由来のcDNAから増幅し、SPG4転写物の配列を確かめる補助手段により完全に配列決定した。PCRおよびRACE-PCR産物総ての配列を調節することにより125bpの非翻訳5’領域5’非翻訳領域の代わりに5’UTRを前に置いた1848bpのオープンリーディングフレーム、さらに後に続くポリAテール上流~35bpのnt3227-3232位間のポリアデニル化部位を含む図21290bpの3’UTR領域を含んでなる、3263bpの配列を再構築することができる。SPG4cDNAとESTデータバンクとの比較により、第2のポリアデニル化部位を含んでなるさらに延長された3’非コード領域180bpを含むESTN47973をはじめとする6人のヒトESTとの有意な相同性を検出することができる。翻訳開始部位を、プリンがイニシエーターATGの3nt上流に配置され、それ自身が停止コドンを前に置かれることとなる翻訳開始に好適な関係として定義されるコサック共通配列CTGTGAatgAの存在により同定した。3263bpのcDNA配列はSPG4遺伝子の17のエキソンから推定される転写配列と同一である。TSSGおよびTSSWコンピュータプログラムを用いる5’領域の配列解析によりエキソン1のnt1位の43bp上流に配置されたTATAボックス型のプロモーター配列の存在が示される。例4:SPG4遺伝子における突然変異SPG4遺伝子座が関連した家系の14人の患者各家系から1人の患者のリンパ芽球由来のSPG4cDNAにおいてヘテロ接合突然変異を調べた。14人の患者と、また6人の健康な対照個体においてSPG4cDNAのオープンリーディングフレームを包含する4つの重複PCR断片I、II、IIIおよびIVを増幅し、配列決定した。PCR断片IVのアガロースゲル電気泳動により、スイスの同じ地域に源を発する家系2992、5226および5330の3人の患者ではスプライス部位の微量欠失または突然変異を示す同じ強度の3つのバンドが示された;家系2992および5330の2人の健康な個体には2つの付加的なバンドは存在しなかった図3A。これらの3家系の患者ではエキソン16のゲノム配列によりイントロン15のスプライス受容部位AGのヘテロ接合A→G突然変異が示された図3B;この突然変異はエキソン16の欠失の後、異常転写物におけるリーディングフレームシフトを引き起こすものである。夫および妻をはじめとする健康な構成員のうち、スプライス部位のこの突然変異を有するものはいない。これらのスイスの3家系の総ての患者における同一突然変異の同定により、おそらくはハプロタイプの研究により示された共通の祖先の存在が立証される。アミノ酸置換をタンパク質配列S362C、C448YおよびR499Cに導入する3つの点突然変異、1210C→G、1468G→Aおよび1620C→Tが、各々家系624、4014および618の患者におけるPCR断片IIIおよびIVを配列決定することにより示された。これらの3つの置換総てにはタンパク質配列におけるシステインの欠失または挿入を誘導するシステイン残基が含まれる。465個のアミノ酸aaからなる末端切断型タンパク質を誘導する停止コドンを出現させる1bpの欠失、1520delTをA家系の患者において検出した。以下の表4に概略を示す5つの突然変異はいずれも、彼らが本明細書において調べた7家系の健康な兄弟姉妹または配偶者のいずれであろうと、調べた対照個体では見られなかった。これらの5つの突然変異はAAA系の総ての構成員においてATPアーゼ活性を担うと推定されるいくつかのタンパク質モチーフからなる非常に保存されたドメイン、またはAAAカセットのタンパク質配列に重大な影響を与える。上記のこれらの5つの突然変異に加え、その他の36の家系のAD-HSP患者においてヘテロ接合突然変異の研究を行い、SPG4遺伝子の発現産物を改変するまたは改変すると思われるその他の34の突然変異を示すことができた。これらその他の34の突然変異の特徴を、上記の最初の5つの変異も加えて以下の表5に概略を示している。例5:スパスチンのタンパク質配列の解析SPG4のオープンリーディングフレームはスパスチンと呼ばれ、その分子量が約67.2キロダルトンkDである616aaタンパク質をコードする。タンパク質データベースのこのアミノ酸配列をBLASTプログラムを用いて比較することにより、スパスチンのC末端においてAAA系のいくつかの構成員と著しく相同である領域を示すことができた。AAAカセットに含まれるAAA系の典型的モチーフはProDomおよびPrositeタンパク質ドメインデータベースにおける配列比較により342位と599位との間に確認される図2参照。WalkerAならびにBモチーフおよびまたAAAタンパク質の最小共通モチーフを含む3つの保存された典型的ドメインはそれぞれ、aa382~389、437~442および480~498位のAAAカセットにおいて確認される図2。ATP結合ドメインに対応し、p-ループとも呼ばれるWalkerAモチーフ、GPPGNGKTおよびBモチーフ、IIFIDEはスパスチンをはじめとしてAAA系の総ての構成員の間で非常に保存される。進化上極めて遠い生物由来のこのATPアーゼ系の150のタンパク質に存在するAAAカセットを比較することにより、この群のタンパク質を確認されたAAAカセット数1または2およびこれらの種々のカセット間の配列相同性に関して、いくつかの部分群に分類することができる。AAA系の総てのタンパク質のうち、スパスチンはAAAの特定のサブクラスと、より詳しくは問題の生物体のゲノムの完全な配列決定によりその大部分が同定された次のタンパク質:シーノラブディチスエレガンスの2つのタンパク質、O16299およびQ18128;サッカロミセスセレビシエの26Sプロテアソーム2つのサブユニット、Yta6pQ02845およびTBP6P40326;シゾサッカロミセスポンベのプロテアソームのサブユニットO43078;S.セレビシエのSAP1P39955およびEND13P52917タンパク質およびネズミSKD1タンパク質P46467とより著しい相同性を示している。スパスチンとこれら8種のタンパク質との多数のアライメントを図4Aに示している。AAAカセットを含む257個のアミノ酸aa342~599位のうち、スパスチンはYta6pQ02845酵母タンパク質、O16299線虫類タンパク質およびTBP6P40326酵母タンパク質とそれぞれ、52、51および50の配列同一性を示している。ProDomデータベースにおいてスパスチンのタンパク質配列を解析することにより同様の結果が得られた。ここでは酵母の26Sプロテアソームの推定サブユニットで見られる相同な3つのドメインの存在92、179および6226と呼ばれ、aa342~409位、411~509位および512~599位に対応しているが示された。さらにこのAAA部分群の構成員は共通してロイシンジッパー型モチーフを含んでおり、このうち2つがPrositeデータベースにおいて配列を解析することにより、aa50~78位および508~529位のスパスチンのタンパク質配列において検出できた図2参照。またこの解析によりaa478~486位間に確認されるヘリックスループの二量体化モチーフ-ヘリックス型の存在も推定できた。スパスチンのタンパク質配列とAFG3、RCA1およびYME1酵母タンパク質などのミトコンドリアメタロプロテアーゼ、およびさらに稀少型AR-HSPに関連するパラプレギンのものとを比較することにより、AAA系のこれら5つの構成員間の相同性がAAAカセットを含む257aa領域に限定されることがわかる図4B。この領域においてスパスチンとパラプレギンとの配列同一性はわずか29であるが、タンパク質配列のこの同一部分でパラプレギンとAFG3酵母タンパク質とは57同一である。この配列比較によりスパスチンがパラプレギンおよび他のミトコンドリアメタロプロテアーゼのように、同じAAA部分群に属していないことが示される。さらに、タンパク質の細胞下分布が推定できるPSORTIIプログラムを用いるスパスチン配列のコンピュータ解析によりスパスチンが核タンパク質であることが示されることは明らかである。可能性ある核分布シグナルNLS、RGKKKはaa7~11位間に示されたが、パラプレギンでの観察とは異なり、ミトコンドリアへの引き入れの特徴であるシグナルペプチドは検出されなかった。例6:SPG4およびそのネズミ類似遺伝子Spg4の発現プロフィールESTデータバンクにおいてSPG4の核酸配列を比較することにより、SPG4と著しい相同性を示す数種類のヒト、ネズミおよびラットESTが検出できた。2つのネズミEST、AA560327およびAA107866に対応するマウス胚盤胞およびE8胚cDNAクローンをIMAGEコンソーシアムから得て、完全に配列決定した。これらのcDNAクローンの配列を構成することにより、1514bpの不完全オープンリーディングフレームを含む1689bpの一致配列が再構築できた。ヒトSPG4cDNAとこのマウスcDNAとを比較することにより、ネズミ転写物が翻訳開始コドンを含む5’末端において約460bpを欠失していることがわかった。マウスオープンリーディングフレームの後にポリAテール~20bp上流にあるポリアデニル化部位を含む175bpの3’非コード領域3’UTRが続いている図5。SPG4の核酸配列およびヒトスパスチンのタンパク質配列はマウスcDNAおよび推定タンパク質配列とそれぞれ、89nt460~1982位間および96aa113~616位間の同一性を示す。このようにかなりの相同性であることから、マウス転写物がSPG4のネズミ類似遺伝子に対応していることが確認でき、従ってSpg4と呼ばれている。種々のヒトおよびネズミ組織のmRNAを含んでなるノーザンブロットのSPG4およびSpq4cDNAクローンとのハイブリダイゼーションでは10日間の暴露後、マウス精巣の2.5kb転写物に対応する極めて弱いバンド以外、いずれの納得のゆく結果も得られなかった。この遺伝子の発現レベルが低いため、SPG4およびSpq4の発現プロフィールを種々の成人および胎児組織由来の標準cDNAコレクションにおけるPCR試験により求めた図6A~6C参照。ネズミSpq4遺伝子はマウス成人組織、さらにマウス胚E7~E17期においても至る所で発現される図6A。Spq4のより高い発現は肝臓、骨格筋および精巣、さらに胚E15期においても検出された。胚発生期のSpq4の初期発現は公開ESTデータバンクの胚盤胞、E8胚および胚癌腫cDNAライブラリー由来のESTの存在により確認された。ヒトSPG4遺伝子はそれ自体、成人図6Bおよび胎児図6C組織の至る所で発現されるが、胎児脳で顕著に発現されるであろう。例7:SPG4遺伝子座が関連したAD-HSPにおける酸化的リン酸化障害の否定スパスチン突然変異がパラプレギンの場合と同様にミトコンドリアにおける酸化的リン酸化OXPHOS障害を誘発するか否かを確認するため、SPG4遺伝子座が関連した1AD-HSP家系の患者において筋生検を行った。筋生検の形態学的かつ組織酵素解析ではミトコンドリアにおけるOXPHOS障害に特徴的なRRF破れた赤色線維型筋繊維は全く示されなかった。総ての筋繊維が正常であろうという事実、さらにはスパスチンの核分布の推定によっても、SPG4遺伝子座が関連したAD-HSPが、SPG7遺伝子座が関連したAR-HSPとは異なり、OXPHOS型のミトコンドリア疾患ではないことが示されているようである。1.5Mb領域の配列決定に基づく位置的クローニングアプローチを用いて、発明者らは染色体バンド2p21~p22にすでに確認されている最も一般的な型のAD-HSPの原因となるSPG4またはSPAST遺伝子を同定した。SPG4遺伝子座との関連を示すAD-HSPを有する41家系の患者においてスパスチンと呼ばれる発現産物を改変するまたは改変すると思われる39の突然変異が検出できた。スパスチンは核分布すると考えられ、かつ酵母の26Sプロテアソームのサブユニットと著しい相同性を示すAAAタンパク質系の新規構成員である。AAAカセットとよばれる230~250aaのドメインに限定された高い相同性にもかかわらず、このタンパク質系の多くの構成員は液胞内のタンパク質の輸送、細胞周期制御、細胞小器官の発生、すなわち転写制御などといった極めて多様な細胞機構に関係し得る。しかしながら、これら総ての細胞機構はタンパク質複合体の構成、機能または分解に関係しており、このことによりAAA系の構成員がいわゆるシャペロンchaperonタンパク質であることが示唆される。参考文献