下記工程:a細菌糖と、0001~07、0005~05、001~05、01~12、01~05、01~02、05~08、01~08、03~10もしくは04~09モル当量のペリオダートとを反応させて、活性化された細菌糖を形成させる工程;b活性化された細菌糖と、担体タンパク質とを混合する工程;c活性化された細菌糖および担体タンパク質と、還元剤とを反応させて、コンジュゲートを形成させる工程;またはa細菌糖と、0001~07、0005~05、001~05、01~12、01~05、01~02、05~08、01~08、03~10もしくは04~09モル当量のペリオダートとを反応させて、活性化された細菌糖を形成させる工程;b活性化された細菌糖と、リンカーとを混合する工程;c還元剤を用いて活性化された細菌糖とリンカーとを反応させて、細菌糖リンカーを形成させる工程;d細菌糖リンカーと、担体タンパク質とを反応させて、コンジュゲートを形成させる工程;を含み、工程aが、アミン基を含まないバッファー中で起こり、該バッファーが1~100mMの濃度を有する、細菌糖をコンジュゲートさせる方法。バッファーがリン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酢酸バッファー、炭酸バッファーおよびクエン酸バッファーからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。バッファーが無機バッファーである、請求項1~2のいずれか1項に記載の方法。バッファーがリン酸バッファーである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。バッファーが1~50mM、1~25mM、1~10mM、5~15mM、8~12mM、もしくは10~50mMまたは約10mMの濃度を有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。工程aにおけるpHが、pH35~80、50~70、もしくはpH55~65または約pH60である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が、細菌莢膜糖を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌、サルモネラ菌Vi、または表皮ブドウ球菌に由来する、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる群より選択される肺炎連鎖球菌莢膜糖である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が、5、6B、6A、7F、9V、14、19Fまたは23Fからなる群より選択される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が肺炎連鎖球菌莢膜糖23Fである、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が肺炎連鎖球菌莢膜糖6Bである、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が肺炎連鎖球菌莢膜糖6Aである、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。細菌糖がインフルエンザ菌b多糖またはオリゴ糖である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が隣接ジオールを含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。細菌糖が天然多糖であるか、または20倍以下の倍数によりサイズが低下したものである例えば、マイクロ流体化による、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。細菌糖を、工程aの前にマイクロ流体化する、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。天然多糖の平均分子量が20kDa~2000kDaまたは30kDa~1000kDaである、請求項16~17のいずれか1項に記載の方法。天然多糖の平均分子量が750~1500kDaである、請求項18に記載の方法。天然多糖の平均分子量が100~250kDaである、請求項18に記載の方法。細菌糖の平均分子量が、工程a後に1~1100kDa、100~470kDa、200~300kDa、600~1100kDaまたは800~1000kDaである、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。23F糖の平均分子量が、工程a後に100~470kDaまたは200~300kDaである、請求項11に記載の方法。Hib細菌糖の平均分子量が、工程a後に1~50kDaまたは5~10kDaである、請求項14に記載の方法。担体タンパク質が、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD、PhtD、PhtDEおよびN19からなる群より選択される、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法。工程aを暗室中で実行する、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。細菌糖の隣接ジオールの0001、001、01、05、1、2、または5未満が、工程aの間に酸化されるようになる、請求項15に記載の方法。工程cの間に、カルボニル基が担体タンパク質上のアミン基と反応する、請求項26に記載の方法。細菌糖が、工程aにおいて02gl~14gl、8gl~12gl、10gl~12gl、1gl~4gl、02gl~1glまたは04gl~06glの濃度で存在する、請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。工程bにおける担体タンパク質の初期濃度が、05gl~35gl、25gl~35gl、または05gl~5glである、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。工程bにおける活性化された細菌糖の初期濃度が、02gl~20gl、10gl~28gl、または02gl~4glである、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。工程bにおける活性化された細菌糖と担体タンパク質の初期比が、20:1~01:1、18:1~04:1、1:1~14:1、18:1~16:1、14:1~16:1、08:1~04:1、07:1~05:1、または07:1~06:1である、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。工程cまたはc後の担体タンパク質と細菌糖の最終比が、05:1~4:1、08:1~32:1、05:1~18:1、14:1~18:1、1:1~12:1、2:1~24:1、または25:1~35:1である、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。工程aにおける反応の温度を、4~40°C、10~32°C、17~30°Cまたは22~27°Cで維持する、請求項1~32のいずれか1項に記載の方法。工程cにおける反応の温度を、4~40°C、10~32°C、17~30°Cまたは22~27°Cで維持する、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。工程aが30時間未満もしくは15~25時間、または10~20時間、30分~25時間、1時間~35時間の期間を有する、請求項1~34のいずれか1項に記載の方法。工程cが10~60、または20~60時間の期間を有する、請求項1~35のいずれか1項に記載の方法。活性化された細菌糖を担体タンパク質に直接コンジュゲートする、請求項1~36のいずれか1項に記載の方法。活性化された細菌糖を、担体タンパク質にリンカーを介してコンジュゲートする、請求項1~36のいずれか1項に記載の方法。リンカーが1~20Åの長さである、請求項38に記載の方法。リンカーがADHリンカーを含む、請求項38または39のいずれか1項に記載の方法。還元剤がナトリウムシアノボロヒドリドを含む、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。還元剤がナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを含む、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。工程cにおいて05~2または08~12モル当量の還元剤が用いられる、請求項42に記載の方法。工程cにおいて2~10モル当量の還元剤が用いられる、請求項43に記載の方法。任意の未反応のカルボニル基をナトリウムボロヒドリドとの反応によりキャップさせる、請求項1~44のいずれか1項に記載の方法。約2M当量のナトリウムボロヒドリドが用いられる、請求項45に記載の方法。工程cの生成物を、15min~15h、15min~45min、2~10h、または3~5h、ナトリウムボロヒドリドと反応させる、請求項45または46のいずれか1項に記載の方法。活性化された細菌糖および担体タンパク質を工程bの前に凍結乾燥させる、請求項1~47のいずれか1項に記載の方法。活性化された細菌糖および担体タンパク質を工程cの前に凍結乾燥させる、請求項1~48のいずれか1項に記載の方法。活性化された細菌糖および担体タンパク質を非還元糖の存在下で凍結乾燥させる、請求項48~49のいずれか1項に記載の方法。非還元糖が、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットからなる群より選択される、請求項48~50のいずれか1項に記載の方法。工程bおよび/またはcをDMSO溶媒中で実行する、請求項1~51のいずれか1項に記載の方法。工程bおよび/またはcをDMF溶媒中で実行する、請求項1~51のいずれか1項に記載の方法。コンジュゲートを精製するさらなる工程eを含む、請求項1~53のいずれか1項に記載の方法。工程eが透析濾過を用いてコンジュゲートを精製することを含む、請求項54に記載の方法。工程eがイオン交換クロマトグラフィーを用いてコンジュゲートを精製することを含む、請求項54~55のいずれか1項に記載の方法。工程eがサイズ排除クロマトグラフィーを用いてコンジュゲートを精製することを含む、請求項56に記載の方法。コンジュゲートを滅菌濾過するさらなる工程fを含む、請求項1~57のいずれか1項に記載の方法。コンジュゲートをさらなる抗原と混合するさらなる工程を含む、請求項1~58のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる群より選択される少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20種の肺炎連鎖球菌糖を含む、請求項59に記載の方法。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖4、9V、14、18Cおよび19Fを含む、請求項59~60のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖19Aを含む、請求項59~61のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖6Aを含む、請求項59~62のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖1を含む、請求項50~63のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖5を含む、請求項59~64のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖7Fを含む、請求項59~65のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖3を含む、請求項59~66のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖23Fを含む、請求項59~67のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖6Bを含む、請求項59~68のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が肺炎連鎖球菌糖6Bを含む、請求項59~70のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、ポリヒスチジントライアドファミリー、コリン結合タンパク質ファミリー、CbpXトランケート、LytXファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケートLytXトランケートキメラタンパク質、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125およびSp133からなる群より選択される1種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質を含む、請求項59~70のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および殺傷された全細胞ボルデテラペルツシスまたは2種以上の無細胞性百日咳成分を含む、請求項60~71のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、B型肝炎表面抗原を含む、請求項60~72のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、インフルエンザ菌b多糖またはオリゴ糖を含む、請求項60~73のいずれか1項に記載の方法。さらなる抗原が、担体タンパク質と、A型髄膜炎菌、C型髄膜炎菌、W型髄膜炎菌およびY型髄膜炎菌からなる群より選択される細菌の莢膜多糖との1つ以上のコンジュゲートを含む、請求項60~74のいずれか1項に記載の方法。コンジュゲートをアジュバントと混合する、請求項1~75のいずれか1項に記載の方法。アジュバントがアルミニウム塩である、請求項76に記載の方法。コンジュゲートを製薬上許容し得る賦形剤と混合する、請求項1~77のいずれか1項に記載の方法。請求項1~78のいずれか1項に記載の方法により得られるコンジュゲート。請求項1~78のいずれか1項に記載の方法により得られたコンジュゲート。請求項79~80のいずれか1項に記載のコンジュゲートおよび製薬上許容し得る賦形剤を含む免疫原性組成物。製薬上の賦形剤が塩化物塩を含まない、請求項81に記載の免疫原性組成物。製薬上の賦形剤がバッファーを含む、請求項81~82のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。バッファーがマレイン酸バッファーである、請求項83に記載の免疫原性組成物。少なくとも1種のさらなる抗原を含む、請求項84に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる群より選択される肺炎連鎖球菌糖を含む、請求項86に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖4、9V、14、18Cおよび19Fを含む、請求項85~86のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖19Aを含む、請求項85~87のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖6Aを含む、請求項85~88のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖1を含む、請求項85~89のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖5を含む、請求項85~90のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖7Fを含む、請求項85~91のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖3を含む、請求項85~92のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖23Fを含む、請求項85~93のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖6Bを含む、請求項85~94のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、肺炎連鎖球菌糖6Cを含む、請求項85~95のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、ポリヒスチジントライアドファミリー、コリン結合タンパク質ファミリー、CbpXトランケート、LytXファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケートLytXトランケートキメラタンパク質、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125およびSp133からなる群より選択される1種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質を含む、請求項85~96のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および殺傷された全細胞ボルデテラペルツシスまたは2種以上の無細胞性百日咳成分を含む、請求項85~97のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、インフルエンザ菌b多糖またはオリゴ糖を含む、請求項85~98のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、B型肝炎表面抗原を含む、請求項85~99のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。さらなる抗原が、担体タンパク質と、A型髄膜炎菌、C型髄膜炎菌、W型髄膜炎菌およびY型髄膜炎菌からなる群より選択される細菌の莢膜多糖との1つ以上のコンジュゲートを含む、請求項85~100のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。アジュバントをさらに含む、請求項85~101のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。アジュバントがアルミニウム塩である、請求項102に記載の免疫原性組成物。請求項81~103のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。細菌疾患の予防または治療における請求項81~103のいずれか1項に記載の免疫原性組成物または請求項104に記載のワクチンの使用。細菌疾患の予防または治療のための医薬の調製における請求項81~103のいずれか1項に記載の免疫原性組成物または請求項104に記載のワクチンの使用。請求項81~103のいずれか1項に記載の免疫原性組成物または請求項104に記載のワクチンを患者に投与することを含む、細菌感染を予防または治療する方法。式:式中、活性化された細菌糖はn個の反復単位を含み、nは2~2400、500~2000、750~1500、1000~2000または1500~2300であり、S1の少なくとも0001であるが、50未満は、であり、その残りは、であり、S2は、であり、ならびに、S3は、であるの反復単位を含む、活性化された細菌糖。S2の0001、01、05、1、2、3、5、10、30または50未満が、である、請求項108に記載の化合物。S3の01、05、1、2、3、5、10、30または50未満が、である、請求項108または109に記載の化合物。本発明は、抗原を担体タンパク質にコンジュゲートさせるための改良されたプロセスに関する。特に、本発明は、a細菌糖と、0001~07、0005~05、001~05、01~12、01~05、01~02、05~08、01~08、03~10もしくは04~09モル当量のペリオダートとを反応させて、活性化された細菌糖を形成させる工程;b活性化された細菌糖と担体タンパク質とを混合する工程;c活性化された細菌糖および担体タンパク質と、還元剤とを反応させて、コンジュゲートを形成させる工程;またはa細菌糖と、0001~07、0005~05、001~05、01~12、01~05、01~02、05~08、01~08、03~10もしくは04~09モル当量のペリオダートとを反応させて、活性化された細菌糖を形成させる工程;b活性化された細菌糖と、リンカーとを混合する工程;c活性化された細菌糖と、リンカーとを還元剤を用いて反応させて、細菌糖リンカーを形成させる工程;d細菌糖リンカーと、担体タンパク質とを反応させて、コンジュゲートを形成させる工程;を含み、工程aがアミン基を含まないバッファー中で起こり、バッファーが1~100mMの濃度を有する、細菌糖をコンジュゲートさせるためのプロセスを提供する。用語ペリオダートは、ペリオダートおよび過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタペリオダートおよびオルトペリオダートの両方を含むが、1つの特定の実施形態においては、本発明の方法において用いられるペリオダートはメタペリオダートである。用語ペリオダートはまた、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムなどのペリオダートの種々の塩も含む。一実施形態においては、用いられるペリオダートは、メタペリオダートナトリウムである。抗原がペリオダートと反応する場合、ペリオダートは隣接するヒドロキシル基を酸化して、カルボニルまたはアルデヒド基を形成し、CC結合の切断を引き起こす。この理由から、用語抗原とペリオダートとを反応させることは、ペリオダートによる隣接するヒドロキシル基の酸化を含む。本発明の目的のために、活性化された細菌糖は、本発明のプロセスの工程aにより活性化された細菌糖である。本発明の目的のために、用語コンジュゲートは、担体タンパク質に共有連結された細菌糖を示す。一実施形態においては、細菌糖は担体タンパク質に直接連結される。第2の実施形態においては、細菌糖はスペーサー/リンカーを介してタンパク質に連結される。工程aにおいて用いられるバッファーは、アミン基を含まないバッファーである。一実施形態においては、バッファーは、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酢酸バッファー、炭酸バッファー、マレイン酸バッファーおよびクエン酸バッファーからなる一覧より選択される。第2の実施形態においては、バッファーは無機バッファーである。用語無機バッファーは、緩衝能力が炭素を含まない化合物の存在に起因する任意のバッファー溶液を含む。本発明の無機バッファーは、リン酸バッファーおよびホウ酸バッファーを含む。一実施形態においては、バッファーはリン酸バッファーである。一実施形態においては、バッファーは、1~100mM、5~80mM、1~50mM、1~25mM、10~40mM、1~10mM、5~15mM、8~12mM、10~20mM、5~20mM、10~50mM、約10mMまたは約20mMの濃度を有する。さらなる実施形態においては、工程aにおけるpHは、pH25~80、pH50~70、pH55~65、pH58~63、または約pH60である。本明細書を通じて、用語糖は、多糖、テイコ酸またはオリゴ糖を示してもよく、3つ全部を含む。それは、リポ多糖またはリポオリゴ糖を示してもよい。使用前に、多糖を起源株から単離するか、または起源株から単離し、公知の方法例えば、EP497524およびEP497525;ShousunChenSzuら、CarbohydrateResearchVol152p720を参照により、例えば、マイクロ流体化により、ある程度まで切断することができる。オリゴ糖は少数の反復単位典型的には、5~30個の反復単位を有し、典型的には、加水分解された多糖である。一実施形態においては、細菌糖は、細菌莢膜糖である。本発明の一実施形態においては、細菌糖は、B群連鎖球菌、コレラ菌ビブリオコレラ、肺炎連鎖球菌ストレプトコッカスニューモニア、インフルエンザ菌ヘモフィルスインフルエンザ、髄膜炎菌ナイセリアメニンギティディス、黄色ブドウ球菌スタフィロコッカスアウレウス、腸球菌、サルモネラ菌Vi、または表皮ブドウ球菌スタフィロコッカスエピデルミディスに由来する。さらなる実施形態においては、細菌糖は、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌、サルモネラ菌Vi、または表皮ブドウ球菌に由来する。さらなる実施形態においては、細菌糖は、髄膜炎菌血清群A、B、C、W135もしくはY、B群連鎖球菌群Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、もしくはVII、5型黄色ブドウ球菌、8型黄色ブドウ球菌、腸チフス菌サルモネラティフィ多糖またはオリゴ糖である。一実施形態においては、細菌糖は隣接抗ジオールを含む。細菌糖は、天然多糖であってもよく、または2倍、4倍、6倍、8倍、10倍もしくは20倍以下の倍率でそのサイズを低下させたものであってよい例えば、マイクロ流体化例えば、EmulsiflexC50装置によるもしくは他の公知の技術例えば、熱、化学、酸化、音波方法による。一実施形態においては、細菌糖は、工程aの前にマイクロ流体化される。オリゴ糖は、そのサイズを実質的にさらに低下させたものであってよい例えば、公知の熱、化学、または酸化方法による。本発明の目的のために、天然多糖とは、糖のサイズを低下させることを目的とするプロセスにかけられていない細菌糖を指す。多糖は、通常の精製手順の間にそのサイズがわずかに低下するようになってもよい。そのような糖は依然として天然である。多糖がそのサイズを低下させる技術にかけられた場合にのみ、多糖は天然ではないと考えられる。本発明のプロセスによるコンジュゲーションにとって好適な細菌糖の重量平均分子量は、20kDa~2000kDa、30kDa~1000kDa、40kDa~500kDa、50kDa~400kDa、75kDa~300kDaまたは1000kDa~2000kDaであってよい。肺炎連鎖球菌に由来する天然の23F莢膜糖の場合、天然多糖の平均分子量は、750~1500kDaまたは1200~1300kDaである。天然のHib糖の場合、天然多糖の平均分子量は、100~250kDaである。本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、コンジュゲーションの前に測定された細菌糖の重量平均分子量を指し、MALLSにより測定される。MALLS技術は、当業界でよく知られている。糖のMALLS分析のために、2種のカラムTSKG6000および5000PWxlを組合わせて用いることができ、糖は水中に溶出される。光散乱検出器例えば、488nmの10mWアルゴンレーザーを備えたWyattDawnDSPおよび干渉屈折計を用いて、糖を検出する。MALLS分析を、TSKGMPwxlおよびRIDAWNEOS検出器を用いて溶出バッファーとして50mMNaKPO4、200mMNaClpH70を075mlminで用いて実行することができる。一実施形態においては、糖の多分散性は1~15、1~13、1~12、1~11または1~105であり、担体タンパク質へのコンジュゲーション後に、コンジュゲートの多分散性は10~25、10~20、10~15、10~12、15~25、17~22または15~20である。全ての多分散性の測定値はMALLSにより生成される。ペリオダートを用いる処理は、細菌糖のサイズの低下を誘導し得るサイジング効果。一実施形態においては、本発明のプロセスは、このサイジング効果を減少させる。これは、肺炎連鎖球菌由来23F細菌糖について認められる実施例1に記載の通り。この理由から、一実施形態においては、本発明の細菌糖の平均分子量は、工程a後に1~1100kDa、100~470kDa、200~300kDa、600~1100kDaまたは800~1000kDaである上記のMALLSにより測定される。一実施形態においては、23F糖の平均分子量は、工程a後に100~470kDaまたは200~300kDaである。一実施形態においては、Hib細菌糖の平均分子量は、工程a後に1~50kDaまたは5~10kDaである。用語担体タンパク質は、小さいペプチドおよび大きいポリペプチド10kDaを超えるの両方を包含することが意図される。担体タンパク質は、任意のペプチドまたはタンパク質であってよい。それは、1個以上のTヘルパーエピトープを含んでもよい。担体タンパク質は、破傷風トキソイド、破傷風トキソイド断片C、破傷風毒素の非毒性突然変異体TTのそのような変異体は全て、本発明の目的にとっては同じ型の担体タンパク質であると考えられることに留意されたい、N19などの破傷風毒素T細胞エピトープを含むポリペプチド、ジフテリアトキソイド、CRM197、ジフテリア毒素の他の非毒性突然変異体CRM176、CRM197、CRM228、CRM45;CRM9、CRM45、CRM102、CRM103およびCRM107ならびにNichollsおよびYoule、GeneticallyEngineeredToxins、FrankelInfectImmun63270613、OMPC、合成ペプチド、熱ショックタンパク質、百日咳タンパク質、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子もしくはホルモン、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトCD4T細胞エピトープを含む人工タンパク質EurJImmunol3138163824、例えば、N19タンパク質InfectImmun7248847、肺炎球菌表面タンパク質PspA、鉄取込みタンパク質、Cdifficileの毒素AもしくはB、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌PhtA、破傷風トキソイドの断片C、ジフテリアトキソイド、CRM197、ニューモリシン、プロテインD、PhtD、PhtDEおよびN19からなる群より選択される。さらなる実施形態においては、担体タンパク質はCRM197である。さらなる実施形態においては、担体タンパク質は破傷風トキソイドである。一実施形態においては、工程aは、暗室中で行われる。抗原がペリオダートと反応する場合、ペリオダートは隣接ヒドロキシル基を酸化してカルボニル基またはアルデヒド基を形成し、CC結合の切断を引き起こす。酸化工程工程aは、以下に記載のように起こってもよい。低濃度のバッファー、特に、リン酸バッファーおよび少量のペリオダートを用いる場合、これは上記のサイジング効果を減少させ得る。肺炎連鎖球菌莢膜糖は、以下に示される反復領域の構造から認められるように、ペリオダートにより酸化され得る隣接ヒドロキシル基を含む。一実施形態においては、細菌糖の隣接ジオールの0001、001、01、05、1、2、5、10、30または50未満が、工程aの間に酸化されるようになる。一実施形態においては、工程aで産生されたカルボニル基は、工程cにおいて担体タンパク質上のアミン基と反応する。これは、以下の反応スキームに従って起こってもよい。一実施形態においては、細菌糖は、工程aにおいて、02gl~14gl、8gl~12gl、10gl~12gl、1gl~4gl、02gl~1glまたは04gl~06glまたは約11glまたは約05glの濃度で存在する。一実施形態においては、工程bにおける担体タンパク質の初期濃度は、05gl~35gl、25gl~35gl、05gl~5glもしくは08gl~2glまたは約32glもしくは1glである。さらなる実施形態においては、工程bにおける活性化された細菌糖の初期濃度は、02gl~20gl、10gl~28glもしくは02gl~4glもしくは1gl~2glまたは約15glもしくは16glである。さらなる実施形態においては、工程bにおける活性化された細菌糖と担体タンパク質との初期比率は、20:1~01:1、18:1~04:1、14:1~16:1、1:1~14:1、18:1~16:1、08:1~04:1、07:1~05:1、または07:1~06:1である。さらなる実施形態においては、工程cまたはc後の担体タンパク質と細菌糖との最終比率は、05:1~4:1、08:1~32:1、05:1~18:1、14:1~18:1、1:1~12:1または25:1~35:1である。一実施形態においては、工程aにおける反応の温度は、4~40°C、10~32°C、17~30°Cまたは22~27°Cである。典型的には、この温度は、工程aを通じて維持される。工程cの間の反応温度は、4~40°C、10~32°C、17~30°Cまたは22~27°Cである。典型的には、この温度は、工程cを通じて維持される。一実施形態においては、本発明のプロセスの工程aは、30時間未満、5~25時間、15~25時間、30分~25時間、1時間~35時間、10~20時間、または15~20時間、約18時間または約1時間行われる。一実施形態においては、本発明のプロセスの工程cは、10~60時間、10~20時間、20~60時間、30~50時間、または35~45時間行われる。コンジュゲーションはまた、本発明の化学を用いるヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介して起こってもよい。このリンカーの一方の末端は、還元的アミノ化により活性化された抗原と反応するが、リンカーの他方の末端は任意の型の化学を用いて担体タンパク質と反応してもよい。この理由から、リンカーは少なくとも1個の反応性アミノ基を含み、リンカーがホモ二官能性である場合、それは2個の反応性アミノ基を含み、リンカーがヘテロ二官能性である場合、それは1個の反応性アミノ基および異なる反応性基を含み、一実施形態においては、この第2の反応性基は反応性カルボニル基である。一実施形態においては、リンカーは1~20Åの長さである。さらなる実施形態においては、リンカーは、4~20、4~12、または5~10個の炭素原子を有する。可能なリンカーは、アジピン酸ジヒドラジドである。他のリンカーとしては、Bプロピオンアミド、ニトロフェニルエチルアミンMedMicrobiolImmunol165;171288、ハロゲン化ハロアルキル、グリコシド結合、ヘキサンジアミンおよび6アミノカプロン酸が挙げられる。一般的には、担体タンパク質上の以下の型の化学基を、第2の反応性基としてカップリング/コンジュゲーションに用いることができる。Aカルボキシル例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を介する。一実施形態においては、この基は、カルボジイミド化学、例えば、EDACカルボジイミドを用いてリンカー上のアミノ基に連結される。注記:上記のEDACの代わりに、任意の好適なカルボジイミドを用いてもよい。Bアミノ基例えば、リジンを介する。一実施形態においては、この基は、カルボジイミド化学、例えば、EDACを用いてリンカー上のカルボキシル基に連結される。別の実施形態においては、この基は、リンカー上のCDAPもしくはCNBrで活性化されたヒドロキシル基;アルデヒド基を有するリンカー;スクシンイミドエステル基を有するリンカーに連結される。Cスルフヒドリル例えば、システインを介する。一実施形態においては、この基は、マレイミド化学を用いてブロモまたはクロロアセチル化リンカーに連結される。一実施形態においては、この基は、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化/改変される。Dアルキニル基またはアジド基を含むようにタンパク質を改変することができ、これをクリック化学Tetrahedronlettersの前に、活性化された細菌糖および担体タンパク質を凍結乾燥してもよい。一実施形態においては、活性化された細菌糖および担体タンパク質を一緒に凍結乾燥する。これは工程bの前、または工程bの後に行ってもよい。一実施形態においては、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、可能な非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。さらなる実施形態においては、非還元糖は、スクロース、トレハロースまたはマンニトールからなる群より選択される。一実施形態においては、工程bおよび/またはcを、DMSOジメチルスルホキシド溶媒中で実行する。さらなる実施形態においては、工程bおよび/またはcを、DMFジメチルホルムアミド溶媒中で実行する。DMSOまたはDMF溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された細菌糖および担体タンパク質を再構成させることができる。工程cの終わりに、コンジュゲート中に残存している未反応のカルボニル基が存在してもよく、これらのものを好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤はナトリウムボロヒドリドであり、例えば、工程cの生成物を、15min~15h、15min~45min、2~10hもしくは3~5h、約30minまたは約4h、ナトリウムボロヒドリドと反応させることができる。さらなる実施形態においては、工程cの生成物と、約2モル当量または15~10モル当量のNaBH4とを混合することにより、キャッピングを達成する。本発明はまた、コンジュゲートを精製するさらなる工程eも提供し、工程eは、透析濾過、例えば、100kDaのカットオフを用いる透析濾過を含んでもよい。さらに、またはあるいは、工程eは、イオン交換クロマトグラフィーを含んでもよい。さらなる実施形態においては、工程eは、サイズ排除クロマトグラフィーを含んでもよい。一実施形態においては、請求項1~51に記載のプロセスは、さらなる工程fを含み、そこでコンジュゲートは滅菌濾過される。また、コンジュゲートを、さらなる抗原と混合してもよい。一実施形態においては、さらなる抗原は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fからなる群より選択される少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20種の肺炎連鎖球菌糖を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖4、6B、9V、14、18Cおよび19Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖4、9V、14、18C、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、6B、7F、9V、14、18Cおよび19Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19Aおよび19Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19Aおよび19Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌糖1、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19Fおよび23Fを含む。さらなる抗原として列挙された糖のいずれかを、必要に応じて、本発明のプロセスまたは異なるプロセスにより担体タンパク質にコンジュゲートする。必要に応じて、これらのさらなる抗原を、上記に列挙された担体タンパク質にコンジュゲートする。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖1を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインD、CRM197、ニューモリシンもしくはPhtDまたはその断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖3を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖4を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖5を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖6Bを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖7Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖9Vを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖14を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、プロテインDまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖23Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、破傷風トキソイドまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖18Cを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、ニューモリシンまたはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖19Aを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、CRM197もしくはPhtDまたはその断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖22Fを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、ニューモリシンまたはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じて、プロテインDもしくはPhtDまたはその融合タンパク質またはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖6Aを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、ニューモリシンまたはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じて、プロテインDもしくはPhtDまたはその融合タンパク質またはCRM197にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖6Cを含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌莢膜糖19Fを含む。また、さらなる抗原は、肺炎連鎖球菌タンパク質を含んでもよい。一実施形態においては、さらなる抗原は、ポリヒスチジントライアドファミリー、コリン結合タンパク質ファミリー、CbpXトランケート、LytXファミリー、LytXトランケート、CbpXトランケートLytXトランケートキメラタンパク質または融合物、ニューモリシン、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125およびSp133からなる群より選択される少なくとも1種のタンパク質を含む。さらなる抗原はまた、さらなる細菌種に由来する抗原を含んでもよい。一実施形態においては、ワクチンまたは免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、大腸菌、モラクセラ菌、破傷風、ジフテリア、百日咳、表皮ブドウ球菌、腸球菌、シュードモナス菌または黄色ブドウ球菌に由来する抗原を含む。一実施形態においては、さらなる抗原は、モラクセラ菌抗原を含み、好ましいモラクセラ菌抗原は、OMP106WO9741731およびWO9634960OMP21LbpAおよびLbpBWO9855606TbpAおよびTbpBWO9713785およびWO9732980CopBHelminenMEらInfectImmun6120032010UspA12WO9303761ならびにOmpCDである。組合せワクチン特に、中耳炎の予防のために含有させることができる非典型的なインフルエンザ菌抗原の例としては、フィンブリンタンパク質およびそれに由来するペプチドを含む融合物例えば、LB1ペプチド融合物;US5843464またはWO9964067OMP26WO9701638P6EP281673TbpAおよびTbpBHiaHmw12HapならびにD15が挙げられる。さらなる実施形態においては、さらなる抗原は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、および百日咳成分典型的には、解毒された百日咳トキソイドおよび任意のペルタクチンを含む線維状ヘマグルチニンおよび/もしくはアグルチニン12、例えば、DT、TT、PT、FHAおよびPRN抗原を含む市販のワクチンINFANRIXDTPaTM、または例えば、TritanrixTMとしてSmithKlineBeechamBiologicals社により市販された全細胞百日咳成分を含む。さらなる実施形態においては、さらなる抗原は、B型肝炎表面抗原を含む。さらなる実施形態においては、さらなる抗原は、インフルエンザ菌のPRP莢膜糖を含む。さらなる実施形態においては、さらなる抗原は、髄膜炎菌A、C、WまたはYに由来する少なくとも1種の莢膜糖を含む。さらなる実施形態においては、さらなる抗原は、髄膜炎菌A、C、WまたはYに由来する莢膜糖の少なくとも1種のコンジュゲートを含む。また、コンジュゲートを、アジュバントと混合してもよい。好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、アルミニウム塩リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドA例えば、3DMPL、サポニン例えば、QS21、水中油乳濁液、グラム陰性細菌株に由来するブレブもしくは外膜ベシクル調製物WO0209746に教示されたものなど、リピドAもしくはその誘導体、アルキルグルコサミドリン酸またはこれらのアジュバントの2種以上の組合せが挙げられる。さらなる実施形態においては、本発明のコンジュゲートを製薬上許容し得る賦形剤と混合する。本発明のさらなる態様において、本発明のプロセスにより得られるコンジュゲートが提供される。本発明のさらなる態様において、本発明のプロセスにより得られたコンジュゲートが提供される。本発明はまた、本発明のコンジュゲートおよび製薬上許容し得る賦形剤を含む免疫原性組成物も提供する。一実施形態においては、製薬上許容し得る賦形剤は、塩化物塩を含まず、さらなる実施形態においては、製薬上の賦形剤は塩化ナトリウムを含まない。一実施形態においては、製薬上の賦形剤は、マレイン酸、トリスまたはクエン酸からなる群より選択されるバッファーを含む。さらなる実施形態においては、バッファーはマレイン酸バッファーである。本発明の免疫原性組成物は、さらなる抗原、特に、上記にさらなる抗原として記載されたものを含んでもよい。免疫原性組成物は、アジュバント、特に、上記のものを含んでもよい。本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンも提供する。本発明の免疫原性組成物を含有するワクチン調製物を用いて、全身または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することにより、感染の疑いのある哺乳動物を保護または治療することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射;または口腔/消化管、呼吸器、尿生殖路への粘膜投与を含んでもよい。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻内投与が可能である肺炎球菌の鼻咽頭運搬をより効果的に防止することができるため、その最も早い段階で感染を弱めることができる。本発明のワクチンを単回用量として投与することができるが、その成分を同時に、または異なる時間に一緒に同時投与することもできる例えば、肺炎球菌糖コンジュゲートを、互いに関して免疫応答の最適な協調のためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与と別々に、同時に、または1~2週間後に投与することができる。単一経路の投与に加えて、2つの異なる経路の投与を用いてもよい。例えば、糖または糖コンジュゲートをIMまたはIDで投与し、細菌タンパク質をINまたはIDで投与してもよい。さらに、本発明のワクチンを、初回用量のためにIMで、追加用量のためにINで投与してもよい。ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には、1~100μg、必要に応じて、5~50μg、最も典型的には、5~25μgの範囲にある。初回ワクチン接種の後、被験体は十分に間隔を空けた1回または数回の追加免疫を受けてもよい。ワクチン調製物は、VaccineDesignPlenumPressNewYorkに一般的に記載されている。リポソーム内への封入は、Fullerton、米国特許第4235877号に記載されている。本発明のワクチンを任意の経路により投与することができるが、皮膚への記載のワクチンの投与が本発明の一実施形態を形成する。ヒトの皮膚は、表皮を覆う角質層と呼ばれる外側の角質キューティクルを含む。この表皮の下は、真皮と呼ばれる層であり、同様に皮下組織を覆う。研究者は、皮膚、特に、真皮へのワクチンの注射が免疫応答を刺激し、これがいくつかのさらなる利点とも関連し得ることを示した。本明細書に記載のワクチンを用いる皮内ワクチン接種は、本発明の任意選択の特徴を形成する。皮内注射の従来技術であるマントー手順は、皮膚を清浄化した後、一方の手を伸ばし、狭いゲージの針26~31ゲージの先端面取り部を上に向けて針を10~15°の角度で挿入する工程を含む。針の先端面取り部を挿入したら、針の胴部を下げ、それを皮膚の下で上昇させるわずかな圧力を加えながらさらに進める。次いで、液体を非常にゆっくりと注入し、それによって、皮膚表面上にブレブまたは隆起を形成させた後、針をゆっくりと引き抜く。より最近では、液体薬剤を皮膚の中または皮膚を横切って投与するために特異的に設計されたデバイス、例えば、WO9934850およびEP1092444に記載されたデバイス、また、例えば、WO0113977US5480381、US5599302、US5334144、US5993412、US5649912、US5569189、US5704911、US5383851、US5893397、US5466220、US5339163、US5312335、US5503627、US5064413、US5520639、US4596556、US4790824、US4941880、US4940460、WO9737705およびWO9713537に記載のジェット注入デバイスが記載されている。ワクチン調製物の皮内投与の代替方法は、従来の注射筒および針、または固体ワクチンの弾道送達のために設計されたデバイス、または経皮パッチ;または皮膚表面への適用経皮もしくは経皮送達、WO9820734;WO9828037を含んでもよい。本発明のワクチンを皮膚に、またはより具体的には、真皮中に投与しようとする場合、ワクチンは少ない液体容量、特に、約005ml~02mlの容量にある。本発明の皮膚または皮内ワクチン中の抗原の含量は、筋肉内ワクチン上記を参照されたい中に認められる従来の用量と類似するものであってよい。しかしながら、製剤が低用量であり得ることが皮膚または皮内ワクチンの特徴である。従って、低用量ワクチン中のタンパク質抗原は、必要に応じて、用量あたり01~10μgまたは01~5μgの少なさで存在する;および糖必要に応じて、コンジュゲートされた抗原は、用量あたり001~1μg、または001~05μgの糖の範囲で存在してもよい。本明細書で用いられる用語皮内送達は、皮膚中の真皮の領域へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮中にのみ位置しなくてもよい。真皮は、ヒトの皮膚中の表面から約10~約20mmに位置する皮膚中の層であるが、個体間で、および身体の異なる部分において特定の量の変化が存在する。一般的に、皮膚の表面の下に15mm行くことにより真皮に到達すると予想される。真皮は表面の角質層および表皮と、下の皮下層との間に位置する。送達の様式に応じて、究極的にはワクチンを専らもしくは主に真皮内に位置させるか、または究極的には表皮および真皮の中に分布させることができる。本発明の一態様においては、必要に応じて、凍結乾燥形態の本発明の免疫原性組成物を含有するバイアルを含み、およびさらに本明細書に記載のアジュバントを含有するバイアルを含むワクチンキットが提供される。本発明のこの態様において、アジュバントを用いて凍結乾燥された免疫原性組成物を再構成させることが想定される。本発明のさらなる態様は、免疫保護用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットをヒト宿主に投与することを含む、細菌疾患感染に対して該宿主を免疫する方法である。本発明のさらなる態様は、免疫保護用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットをヒト宿主に投与することを含む、肺炎連鎖球菌および/またはインフルエンザ菌により引き起こされる感染に対して該宿主を免疫する方法である。本発明のさらなる態様は、細菌疾患の治療または予防における使用のための本発明の免疫原性組成物である。本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および/またはインフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防における使用のための本発明の免疫原性組成物である。本発明のさらなる態様は、細菌疾患の治療または予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用である。本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および/またはインフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用である。本発明はまた、活性化された細菌糖が、式:式中、活性化された細菌糖はn個の反復単位を含み、nは2~2400、20~2000、50~1500、1000~2000、1000~2500または1500~2300であり、S1の少なくとも0001、001、01、05、1、2、5、10もしくは30であるが0001、001、01、05、1、2、5、10、30もしくは50未満は、であり、その残りは、であり、S2は、であり、ならびにS3は、であるの反復単位を含む、活性化された細菌糖も提供する。一実施形態においては、S2の0001、01、05、1、2、3、5、10、30または50未満は、である。一実施形態においては、S3の01、05、1、2、3、5、10、30または50未満は、である。約またはおよそは、本発明の目的のために所与の数値の10以上または以下以内と定義される。本明細書に記載の用語含む、含むおよび含むは、必要に応じて、それぞれ、例ごとに用語からなる、からなるおよびからなると置換可能であると本発明者らにより意図される。本発明のワクチン組成物に関する本明細書に記載の実施形態はまた、本発明の免疫原性組成物に関する実施形態にも適用可能であり、その逆も可能である。本特許明細書内に引用された全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組入れられるものとする。本発明をより良好に理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、例示のためだけのものであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。ペリオダートを用いる23Fおよび6Bの酸化23Fまたは6B多糖を、100mMKH2PO4、10mMKH2PO4またはWFIに溶解して、2mgPSmlの溶液を形成させた。この溶液を室温で撹拌下で2時間インキュベートした。この時間の後、1NHClを用いてpHをpH60に調整した。様々な量のペリオダートを粉末として、または液体形態WFI中の10mgmlで添加して、一定範囲のモル比を達成した表1。溶液を室温20~25°Cで17時間インキュベートし、この時間の後、サンプルをWFIに対して透析または透析濾過した。屈折率と組合せた高性能ゲル濾過クロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱検出器を用いて、分子量を測定した。サイズ排除媒体を用いて、多糖の分子サイズ分布をプロファイルしたNaCl02M~NaN3002中、05mlminで溶出。表1および図1は、これらの実験の結果を記載する。これらのものは、23F糖について、100mMリン酸バッファー中の高いモル当量のペリオダートを用いる酸化の際に実質的なサイジングが起こることを示している。リン酸バッファーの濃度または用いるペリオダートのモル当量を減少させることにより、このサイジング効果を低下させることができる。還元的アミノ化およびCDAP化学を用いるCRM197への23Fのコンジュゲーション還元的アミノ化1gのPS23Fを、500mlの10mMKH2PO4、pH715に溶解した。この溶液を室温で2時間インキュベートした。pHを、1MHClを用いて60Nに調整した。111mgのペリオダート:0625。900mgの凍結乾燥されたPS23FCRM197混合物を、350mlのDMSO溶媒を添加し、室温で2時間インキュベートすることにより可溶化した。PS23FCMR197混合物を還元するために、1モル当量のNaBH3CNを添加したWFI中の100mgmlの溶液の735μl。この溶液を撹拌下、室温15°C~25°Cでさらに40時間インキュベートした。この時間の後、2モル当量のNaBH4WFI中の100mgmlを添加し、溶液を室温で4時間インキュベートした。2200mlの150mMNaClを添加した後、透析濾過カットオフ100kDaし、DEAEにより精製した。目的の画分をプールし、022μmフィルターを通して濾過した。CDAP200mgのマイクロ流体化されたPS23Fを、10mgmlの濃度が得られるまで水中に溶解した。NaClをこの溶液に2Mの最終濃度で添加した。十分なCDAP溶液550vvのアセトニトリル/WFI中で新鮮に調製された100mgmlを添加して、075mgmgPSのCDAP:PS比を達成した。90秒後、01NNaOHの添加によりpHをpH95に上昇させた。3分後、十分なCRM197015MNaCl中の10mgmlを添加して、15の比CRM197:PSを達成し、pHをpH95に維持した。この溶液をpH95で1時間インキュベートした。このカップリング工程の後、10mlの2Mグリシン溶液を混合物に添加し、pHをpH90クエンチングpHに調整した。溶液を室温で30分間撹拌した。5μmフィルター、次いで、小分子ならびにコンジュゲートされていない多糖およびタンパク質を除去するSephacrylS400HRを用いて、コンジュゲートを精製した。流速を150mlhに固定した。溶出を、150mMNaClを用いて達成した。目的の画分をプールし、Millipack20を用いて濾過した。得られたコンジュゲートは135wの最終CRM197PS比を有していた。還元的アミノ化およびCDAP化学により作製された23FCRM197コンジュゲートの免疫原性実施例2に記載の方法を用いて、コンジュゲートを作製した。メスのモルモットを、025μgのPS23FCRM197コンジュゲートを用いて3回0、14および28日目、筋肉内的に免疫した。動物を42日目に出血させ、PS23Fに対する抗体応答をELISAおよびOPAにより測定した。ELISAマイクロプレートを、PBSバッファー中の精製された肺炎球菌多糖で被覆した。プレートを、09NaClおよび005Tween20を用いて4回洗浄した。PBS005Tween20中でCPSと共に37°Cで1時間、血清をインキュベートした。血清をマイクロウェルに添加し、PBS005Tween中に連続希釈2倍希釈段階した。プレートを撹拌下、室温で30分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、抗モルモットIgG抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した後、RTで30分間プレートをインキュベートした。洗浄後、基質10mlのクエン酸01MpH45および5μlのH2O2中の4mgのOPDAを各ウェルに15分間添加した。HCl1Nの添加により反応を停止させた。分光光度計を用いて490~620nmで吸光度を読み取った。現像された色は、血清中に存在する抗体の量に直接比例する。血清中に存在する抗PSIgGのレベルを、各プレートに添加された参照曲線血清との比較により決定し、μgmlで表す。分散の均一性CochranのC検定により調べるおよび正規性ShapiroWilk検定を用いて調べるを推測した後、結果を統計的に分析した。全ての統計を、対数変換濃度IgG上でAnovaを用いて実行した。オプソニン食作用血清サンプルを56°Cで45min加熱して、任意の残存する内因性成分を不活化した。各12希釈された血清サンプルの25μlアリコートを、96穴丸底マイクロタイタープレートのウェルあたり25μlのOPAバッファーHBSS144不活化FBS中で連続希釈2倍した。続いて、例えば、421の比率の不活化HL60細胞1x107細胞/ml、新鮮に解凍された肺炎球菌ワーキングシードおよび新鮮に解凍された子ウサギ補体の25μlを希釈した血清に添加して、50μlの最終容量を得た。軌道振とうしながら37°Cで2h、アッセイプレートをインキュベートして、食作用プロセスを促進させた。マイクロプレートを氷上に少なくとも1min置くことにより反応を停止させた。次いで、プレートの各ウェルの20μlアリコートを、96穴平底マイクロプレートの対応するウェル中に移し、50μlのToddHewittBroth09寒天を各ウェルに添加した。37°Cおよび5CO2で一晩インキュベートした後、寒天中に出現する肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システムを用いて計数した。血清サンプルを含まない8個のウェルを細菌対照として用いて、ウェルあたりの肺炎球菌の数を決定した。対照ウェルのCFUの平均数を決定し、各血清サンプルに関する殺傷活性の算出のために用いた。血清サンプルのOPA力価を、肺炎球菌の50の殺傷を容易にすることができる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン食作用力価を、4パラメーター曲線適合分析を用いることにより算出した。分散の均一性CochranのC検定により調べるおよび正規性ShapiroWilk検定を用いて調べるを推測した後、結果を統計的に分析した。全ての統計を、ELISAについては対数変換濃度IgG上でのAnovaにより、およびOPAについては対数希釈率上でのKruskalWallisにより実施した。図2に見られるように、CDAP化学によりコンジュゲートされたPS23FCRM197よりも、還元的アミノ化によりコンジュゲートされたPS23FCRM197を用いる免疫後に、モルモットにおいて有意により高い抗体応答が誘導された。23Fの還元的アミノ化のさらなる例23FCRMRA116150mgの天然PS23Fを、10mMリン酸バッファー中に2mgmlの濃度で4時間溶解させた。溶解後、1NHClを用いてpHをpH60に調整した。次いで、04モル当量のペリオダートをPS溶液に添加し、暗室中、25°Cで17hインキュベートした。次いで、溶液をWFIに対して透析濾過カットオフ30kDaし、酸化されたPSを022μm膜上で濾過した。50mgの酸化されたPSおよび75mgのCRM197を、安定剤の存在下で一緒に凍結乾燥したCRMPS比:151。凍結乾燥されたPSCRM197を、室温で2h、20mlのDMSOを用いて可溶化させた。次いで、1モル当量のTABナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを添加し、撹拌下で17h後、2モル当量のNaBH4を添加した後、室温で30分間インキュベートした。溶液をWFIの添加により5倍希釈した後、10mMリン酸バッファー、150mMNaClpH72に対して透析濾過カットオフ30kDaした。次いで、コンジュゲートをDEAE樹脂上にロードし、10mMリン酸バッファー、500mMNaClpH72中に溶出させた。最後にコンジュゲートを022μm上で濾過した。得られたコンジュゲートは、231の最終CRMPS比を有する。さらなるコンジュゲートのために、2回目の透析濾過工程をDEAEカラム後に加えて、バッファーを交換した最終バッファーとして150mMNaCl。還元的アミノ化異なるタンパク質:糖比および異なるサイズのマイクロ流体化6B糖を用いるおよびCDAP化学を用いるCRM197への6Bのコンジュゲーション6BCRMRA122200mgのマイクロ流体化PS6Bを、10mMリン酸バッファー中に2mgmlで希釈した。1NHClを用いてpHをpH60に調整した。次いで、01モル当量のペリオダートをPS溶液に添加し、暗室中、室温で17hインキュベートした。次いで、溶液をWFIに対して透析濾過したカットオフ30kDa。50mgのPSおよび30mgのCRM197を、安定剤の存在下で一緒に凍結乾燥させた:061。凍結乾燥されたPSCRM197を、室温で3h、20mlのDMSOを用いて可溶化させた。次いで、25モル当量のTABナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを添加しを添加した後、室温で30分間インキュベートした。溶液をWFIの添加により4倍希釈した後、透析濾過したカットオフ100kDa。次いで、コンジュゲートを022μm上で濾過した。得られたコンジュゲートは、111の最終CRMPS比を有していた。6BCRMRA123凍結乾燥工程を21の初期CRM197PS比を用いて実行し、DMSO工程における溶解のために30mlのDMSOを用いた以外は、6BCRMRA122について記載されたように、マイクロ流体化されたPS6BをCRM197にコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートは、301の最終CRMPS比を有していた。6BCRMRA124350kDaの分子量を有する200mgのマイクロ流体化PS6Bを、10mMリン酸バッファー中で2mgmlに希釈した。1NHClを用いてpHをpH60に調整した。次いで、01モル当量のペリオダートをPS溶液に添加し、暗室中、室温で17hインキュベートした。次いで、溶液をWFIに対して透析濾過したカットオフ100kDa。50mgのPSおよび60mgのCRM197を、安定剤の存在下で一緒に凍結乾燥させた:121。凍結乾燥されたPSCRM197を、室温で5h、20mlのDMSOを用いて可溶化させた。次いで、25モル当量のTABナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを添加しを添加した後、室温で30分間インキュベートした。溶液をWFIの添加により4倍希釈した後、透析濾過したカットオフ100kDa。次いで、コンジュゲートを022μm上で濾過した。得られたコンジュゲートは、161の最終CRMPS比を有する。6BCRMRA125凍結乾燥工程を21の初期CRM197PS比を用いて実行し、DMSO中への溶解を33mlを用いて実行した以外は、6BCRMRA124について記載された通りに、マイクロ流体化PS6BをCRM197にコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートは、291の最終CRMPS比を有していた。6BCRM00350mgのマイクロ流体化PS6Bを、水中に10mgmlで希釈した。固体形態のNaClを添加して、2Mの最終濃度を達成した。CDAP溶液を添加して、好適なCDAPPS比を達成した。15分後、01NNaOHの添加によりpHを活性化pH95に上昇させ、CRM197を添加するまでこのpHで安定させた。3分後、CRM197を添加して、2のCRM197PS比を達成した;pHを、カップリングpH95で維持した。溶液をpH調節下で2h静置した。カップリング工程の後、25mlの2Mグリシン溶液を混合物に添加した。pHを、クエンチングpHに調整した。溶液を室温で30min撹拌した。次いで、コンジュゲートを5μmフィルターを用いて濾過し、SephacrylS400HRカラム上に注入して、小分子DMAPなどおよびコンジュゲートされていないPSおよびタンパク質を除去した。流速を30mlhに固定した。150mMNaCl中で溶出を実行した。目的の画分をプールし、Millipack20上で濾過した。得られたコンジュゲートは、151の最終CRM197PS比を有していた。6BCRMRA1441gのマイクロ流体化PS6Bを、10mMリン酸バッファー中で2mgmlに希釈した。1NHClを用いてpHをpH60に調整した。次いで、01モル当量のペリオダートをPS溶液に添加し、暗室中、室温で18hインキュベートした。次いで、溶液をWFIに対して透析濾過したSartoconSlice200Hydrosart100kDa。200mgの酸化されたPSおよび240mgのCRM197を、安定剤の存在下で一緒に凍結乾燥させた:121。凍結乾燥されたPSCRM197を、25°Cで6h、80mlのDMSOを用いて可溶化させた。次いで、25モル当量のTABナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを添加しを添加し、室温で30minインキュベートした。溶液をWFI中で5倍希釈し、30min後、150mMNaClを用いて10倍、次いで、PO410mMpH72150mMNaClを用いて5倍に透析濾過した。次いで、保持物をDEAEカラム上にロードした。カラムを、PO410mMpH72NaCl150mMバッファーを用いて洗浄した。コンジュゲートを、PO410mMpH72NaCl500mMバッファーを用いて溶出させた。溶出液を濃縮し、5倍量の150mMNaClを用いて透析濾過した後、022μmフィルター上で濾過した。得られたコンジュゲートは、161の最終CRMPS比を有する。還元的アミノ化およびCDAP化学により作製された6BCRM197コンジュゲートの免疫原性40匹のメスのBalbcマウスの群を、AlPO4上で製剤化された還元的アミノ化またはCDAP化学により製造された01μgのPS6Bコンジュゲートを用いて0、14および28日目に3回、筋肉内的に免疫した。PS6BPDを基準として用いた。42日目にマウスを出血させ、各抗原に対する抗体応答をELISAおよびOPAにより測定した。20匹のメスのモルモットの群を、AlPO4と共にアジュバント化された還元的アミノ化またはCDAP化学により製造された025μgのPS6Bコンジュゲートを用いて0、14および28日目に3回、筋肉内的に免疫した。PS6BPDを基準として用いた。42日目にモルモットを出血させ、各抗原に対する抗体応答をELISAおよびOPAにより測定した。マウスおよびモルモットのOPA血清サンプルを56°Cで45min加熱して、任意の残存する内因性補体を不活化した。それぞれ12希釈された血清サンプルの25μlのアリコートを、96穴丸底マイクロタイタープレートのウェルあたり25μlのOPAバッファー中に連続希釈した。続いて、例えば、421の比の活性化されたHL60細胞、新鮮に解凍された肺炎球菌ワーキングシードおよび新鮮に解凍された子ウサギ補体の25μlの混合物を希釈した血清に添加して、50μlの最終容量を得た。アッセイプレートを、軌道振とうしながら37°Cで2hインキュベートして、食作用プロセスを促進させた。マイクロプレートを氷上に少なくとも1min置くことにより反応を停止させた。次いで、プレートの各ウェルの20μlアリコートを、96穴平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、50μlのToddHewittBroth09寒天を各ウェルに添加した。37°Cおよび5CO2で一晩インキュベートした後、寒天中に出現する肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システムを用いて計数した。血清サンプルを含まない8個のウェルを細菌対照として用いて、ウェルあたりの肺炎球菌の数を決定した。対照ウェルのCFUの平均数を決定し、それぞれの血清サンプルの殺傷活性の算出に用いた。血清サンプルのOPA力価を、肺炎球菌の50の殺傷を容易にすることができる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン食作用力価を、4パラメーター曲線適合分析を用いることにより算出した。表3は、実施例4の方法を用いて作製されたコンジュゲートを用いるbalbcマウスの免疫により得られたGMCレベルを記載する。balbcマウスにおけるこれらのコンジュゲートの免疫原性を、図3に記載する。図3と一緒になって、表3は、マウスモデルにおいて、還元的アミノ化により製造されたコンジュゲートがCDAP化学を用いて製造されたものと同程度であったことを示している。特に、図3は、還元的アミノ化を用いて製造されたコンジュゲートの免疫原性が、CDAP化学を用いて作製されたコンジュゲートの免疫原性よりも高かったことを示している。表4は、実施例4の方法を用いて作製されたコンジュゲートを用いるモルモットの免疫により得られたGMCレベルを記載する。モルモットにおけるこれらのコンジュゲートの免疫原性を、図4に記載する。マウスモデルにおいて実行された実験と同様、表4および図4中の結果は、還元的アミノ化により製造されたコンジュゲートが、CDAP化学を用いて製造されたものと同程度であり、特に、PS06BCRM125は、CDAPを用いて製造されたコンジュゲートよりも有意により高いGMCレベルおよび免疫原性を示したことを示している。還元的アミノ化を用いる破傷風トキソイドへのHibのコンジュゲーションHibIO4LS08029gのPSを、室温で4h30min、次いで、4°Cで一晩、260mlの10mMリン酸バッファーpH62中に溶解させた。溶解の間に粘度の追跡を行った。4hの溶解の後、粘度は安定しているように見えた。PSをリン酸バッファーを用いて10mgmlで希釈した後、60分間、007モル当量のNaIO4を用いて暗室中で酸化させた。酸化されたPSを、35倍量のリン酸バッファーに対して透析濾過した後、022μmフィルター上で濾過した。酸化後に得られた反復単位の数を、1HNMRにより見積もったところ、約21であることがわかった。HibTTLS210、212および213200mgの酸化されたPSを、300mgのTT151と混合し、3664mlの10mMリン酸バッファーpH62を用いて4mgmlに希釈した。溶液を安定剤の存在下で凍結乾燥させた。凍結乾燥されたPSTTを、25°Cで6h、20mlのDMSOを用いて可溶化させた。次いで、10MeqのTABナトリウムトリアセトキシボロヒドリドを添加し、撹拌下で16h後、2モル当量のNaBH4を添加した後、室温で30minインキュベートした。溶液をWFIの添加により3倍希釈した後、透析濾過工程を行った5倍量のWFI、次いで、5倍量の10mM酢酸バッファー、150mMNaClpH62、100kDaMWCO。次いで、サンプルをSephacrylS300HR樹脂上にロードした。150mMNaClを用いて10mM酢酸バッファー中で溶出を実行した。目的の画分をプールし、022μmフィルター上で濾過した。得られたコンジュゲートは、211の最終TTPS比を有していた。