"ピリピロペン生合成遺伝子群と、マーカー遺伝子とを含む、核酸構築物。前記ピリピロペン生合成遺伝子群が、下記の~に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも1個のヌクレオチド配列の全長もしくはその一部を含んでなる、請求項1に記載の核酸構築物:配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列、配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつ配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつ配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも90以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつ配列番号266における2911番から27797番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。前記ピリピロペン生合成遺伝子群が、目的遺伝子と、発現調節領域とを含んでなる、請求項1または2に記載の核酸構築物。前記目的遺伝子が、配列番号267~275から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の核酸構築物。前記目的遺伝子が、下記の~に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも1個のヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の核酸構築物:1下記に記載されたヌクレオチド配列配列番号266で示されるヌクレオチド配列の3342番から5158番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の5382番から12777番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の13266番から15144番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の16220番から18018番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の18506番から19296番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の19779番から21389番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の21793番から22877番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の23205番から24773番までのヌクレオチド配列、および配列番号266で示されるヌクレオチド配列の25824番から27178番までのヌクレオチド配列、1において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、31において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、41において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも90以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。前記発現調節領域が、下記の~に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも1個ヌクレオチド配列を含む、請求項3~5のいずれか一項に記載の核酸構築物:1下記に記載されたヌクレオチド配列の全長もしくはその一部配列番号266で示されるヌクレオチド配列の2911番から3341番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の5159番から5381番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の12778番から13265番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の15145番から16219番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の18019番から18505番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の19297番から19778番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の21390番から21792番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の22878番から23204番までのヌクレオチド配列、配列番号266で示されるヌクレオチド配列の24774番から25823番までのヌクレオチド配列、および配列番号266で示されるヌクレオチド配列の27179番から27797番までのヌクレオチド配列、1において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、31において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、1もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列、41において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも90以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列と実質的に同等な機能を有するヌクレオチド配列。前記マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子または栄養要求性遺伝子である、請求項1~6に記載の核酸構築物。前記マーカー遺伝子が、デストマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子である、請求項1~6に記載の核酸構築物。請求項1~8のいずれか一項に記載の核酸構築物を、宿主に導入することにより得られる、形質転換体。ピリピロペン生合成遺伝子群を含む核酸構築物と、マーカー遺伝子を含む核酸構築物とを、同時にまたは別々に、宿主に導入することにより得られる、形質転換体。プラスミドpPYRI02またはコスミドpPYRI07を宿主に導入することにより得られる、請求項9に記載の形質転換体。前記宿主がピロピロペンを生産する糸状菌である、請求項9~11のいずれか一項に記載の形質転換体。前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウム属、ユーペニシリウム属、またはアスペルギルス属である、請求項12に記載の形質転換体。前記ピリピロペンを生産する糸状菌が、ペニシリウムコピロビウム、ペニシリウムグリセオフルバム、ユーペニシリウムレティキュロスポラム、アスペルギルスフミガタスである、請求項12に記載の形質転換体。前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウムコピロビウムである、請求項12に記載の形質転換体。前記ピリピロペンを生産する糸状菌がペニシリウムコピロビウムPF1169株またはペニシリウムコピロビウムATCC58615株である、請求項12に記載の形質転換体。請求項9~16のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養物からピリピロペンを採取することを含んでなる、ピリピロペンの製造法。以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例1:ペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムDNAの調製三角フラスコ1Lに滅菌したNB培地500mlを入れ、12CMMY寒天培地において、28°Cで、4日間前培養していたペニシリウムコピロビウムPF1169株公開技報2008500997号特許文献4を上記の培地に加え、28°Cで、4日間液体培養した。ミラクロスで濾過により、菌体5gを得た。この菌体よりゲノムDNA精製キットGenomictip100Gキアゲン株式会社製を、添付のマニュアルに従い、30μgのゲノムDNAを取得した。実施例2:ポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーとその増幅断片種々の糸状菌ポリケチド合成酵素に保存されているアミノ酸配列より増幅用縮重プライマーとして下記プライマーをデザインし、合成した:LC1:GAYCCIMGITTYTTYAAYATG配列番号1LC2c:GTICCIGTICCRTGCATYTC配列番号2ただし、RAG、YCT、MAC、Iイノシン。この縮重プライマーを使用して、実施例1において調製したゲノムDNAと、ExTaqポリメラーゼタカラバイオ株式会社製とを、添付のマニュアルに従い反応させ、約700bpの増幅断片を検出した図1。そして、前記増幅断片を解析し、その内部500bpの配列を特定した配列番号3。実施例3:ゲノムDNAの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索実施例1において得られたペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムDNAを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムDNA50μgの一部を前処理の後、Roche社454FLXDNAシークエンサーに供し、約250bp、103万本のフラグメント配列総計49Mbの配列を取得した。この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列ポリケチド合成酵素:AspergillusfumigatusPKS2146aaおよびPenicilliumgriseofluvum6methylsalycilicacidsynthase1744aa、プレニルトランスフェラーゼ:AspergillusfumigatusPrenyltransferase、AspergillusfumigatusPrenyltransferase4hydroxybezoateoctaprenyltransferase、およびPenicilliummarneffeiPrenyltransferase由来の配列を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ89本、86本、2本、1本、および3本の相同配列を取得した表2参照。さらに、AfumigatusPKS2146aaおよびPgriseofluvum6methylsalycilicacidsynthase1744aaの相同配列から、それぞれ19本、23本のコンティグ配列を取得したAfumigatusPKS2146aaのコンティグ配列:配列番号179~197、Pgriseofluvum6methylsalycilicacidsynthase1744aaのコンティグ配列:配列番号198~220表2参照。実施例4:ゲノムDNAからのPCR増幅実施例3において取得したblastxの検索結果より、ポリケチド合成酵素に対して、配列番号227~252に示す13種のプライマー対を合成した。同様に、プレニルトランスフェラーゼに対して、配列番号253~262に示す5種のプライマー対を合成した。これらのプライマーを用いて、ゲノムDNAに対するPCRを行ったところ、全プライマー対について期待される大きさの増幅断片を認めた図1および図2参照。実施例5:ファージゲノムライブラリーの作製ペニシリウムコピロビウムPF1169株のλファージゲノムライブラリーを、λBlueSTARXhoIHalfsiteArmsKitを用いて、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、ゲノムDNAを、制限酵素Sau3A1を用いて部分分解し、約20kbのDNA断片05μgをキットに添付されたλBlueSTARDNA05μgに連結した。このライゲーション溶液をLambdaINNPackagingkitを用い、キットに添付のマニュアルに基づいてinvitroパッケージングを行い、1mlの溶液を取得した。このパッケージングされたファージ溶液10μlを大腸菌ER1647株100μlに感染させ、プラーク形成培地において、37°Cで、一晩培養後、約500クローンのプラークを得た。このように感染により10~20kbのペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムDNAが導入されたファージ約50000クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。実施例6:ファージライブラリーからのスクリーニング実施例5において調製したファージライブラリー10000クローンに対して、上記で調製したLC1-LC2cプライマー対により増幅させたPCR産物をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによる1次スクリーニングを行った。プローブの標識と検出にはAlkPhosDirectLabellingandDetectionSystemwithCDPStarGEヘルスケア株式会社製CatNoRPN3690を用いた。前記ハイブリダイゼーションは、添付のマニュアルに従い、実施した。1次スクリーニングにより、6クローンが候補として残った。さらに、プラークハイブリダイゼーションによる2次スクリーニングの結果、4クローンを取得した。これらの陽性クローンは大腸菌BM258株に感染させ、添付のマニュアルに従いファージをプラスミドに変換させ、目的領域を含む4種のプラスミドを取得した。実施例7:フォスミドゲノムライブラリーの作製ペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムライブラリーは、CopyControlFosmidLibraryProductionKitEPICENTRE社製、CatNoCCFOS110を、添付のマニュアルに従い、構築した。すなわち、約40kbのゲノムDNA025μgのDNA断片を末端の平滑化を行った後、フォスミドベクターpCCFOSEpicentre社製に組み込んだ。このライゲーション溶液を同キット添付のMaxPlaxLambdaPackagingExtractを用い、キットに添付のマニュアルに基づいて、invitroパッケージングを行った。このパッケージングされたウィルス溶液10μlを大腸菌EPI300TMT1R株100μlに感染させ、クロラムフェニコール含有培地において、37°Cで、一晩培養し選抜したところ、300クローンのコロニーを得た。このように感染により40kbのペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムDNAが導入されたフォスミド約30000クローンを取得した。1wellあたり約50クローンとなるように96wellプレートに分注し、つまり、96のプール、約4800クローンからなるゲノムライブラリーを作製した。実施例8:フォスミドライブラリースクリーニングフォスミド添付のマニュアルに従い、実施例7において作成したライブラリーの96プールより各プラスミドDNAを調製した。実施例2で合成したポリケチド合成酵素増幅用縮重プライマーを用いて、この96プールのプラスミドDNAサンプルに対して、PCRを行った。その結果、約700bpのDNA断片が、9プールより増幅した。さらにこのポジティブプールから、約300クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、LC1LC2cプライマー対を用いて、約4800クローンより9種のフォスミドを取得した。実施例9:ゲノムDNAの大量シークエンスとアミノ酸配列相同性検索実施例1において得られたペニシリウムコピロビウムPF1169株のゲノムDNAを大量シークエンスと、アミノ酸配列の相同性検索とに供した。具体的にはゲノムDNA50μgの一部を前処理の後、Roche社454FLXDNAシークエンサーに供し、平均コンティグ長19621kb、1405本のフラグメント配列総塩基長27568160Mbの配列を取得した。この配列に対し、ポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼで既知である配列として、下記の五種の配列ポリケチド合成酵素:Penicilliumgriseofluvum6methylsalycilicacidsynthase1744aaおよびAspergillusfumigatusPKS2146aa、プレニルトランスフェラーゼ:PenicilliummarneffeiPrenyltransferase、AspergillusfumigatusPrenyltransferase、およびAspergillusfumigatusPrenyltransferase4hydroxybezoateoctaprenyltransferase由来の配列を選定し、相同配列検索ソフトblastxによる検索を実施した。それぞれ22本、21本、2本、3本、および3本の相同配列を取得した。実施例10:フォスミドライブラリースクリーニングおよびクラスター遺伝子の配列解析フォスミドキットEPICENTRE社製CopyControlFosmidLibraryProductionKitに添付されているマニュアルに従い、実施例7において作成したライブラリーの96プールより各プラスミドDNAを調製した。Roche社454FLXDNAシークエンサーにより決定された塩基配列に基づいてアミノ酸配列の相同性検索を行い、ポリケチド合成酵素とプレニルトランスフェラーゼが近接する領域を検索した。得られた領域のプレニルトランスフェラーゼ塩基配列より400bpのDNA断片を増幅しうるプライマー対No27を合成した。このプライマーを用いて、この48プールのプラスミドDNAサンプルに対して、PCRを行った。その結果期待される約400bpのDNA断片配列番号263が、11プールより増幅した図3参照。さらに、このポジティブプールのうち6プールから、約300クローン以上のコロニーを含むシャーレを作製し、コロニーハイブリダイゼーションにより再スクリーニングした。その結果、27F27Rのプライマー対27Fプライマー:配列番号264、27Rプライマー:配列番号265を用いて、約4800クローンより4種のフォスミドを取得した。この内の一つをpCC1PP1と命名し、挿入断片の全配列を決定した配列番号266。得られたpCC1PP1により大腸菌EscherichiacoliEPI300TMT1R株フォスミドキットに付属を形質転換することにより大腸菌EscherichiacoliEPI300TMT1R株/pCC1PP1受託番号FERMBP-11133を得た。なお、前記配列番号266の配列とCoAligase、LovBlikepolyketidesynthase、水酸化酵素であるCytochromeP450monooxygenase、Cyclase、FADdependentmonooxygenase、UbiAlikeprenyltransferase、アセチル化酵素であるAcetyltransferase、Acetyltransferase2、およびCationtransportingATPase上記酵素は、いずれもAspergillusfumigatusAf293株由来との、相同性検索をそれぞれ行ったところ、いずれも70以上の高い相同性を示した。配列番号266のヌクレオチド3342-5158は、CoAligaseをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号267に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド5382-12777は、LovBlikepolyketidesynthaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号268に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド13266-15144以下、このポリヌクレオチド配列P4501によりコードされるタンパク質をCytochromeP450monooxygenase1とするおよび16220-18018以下、このポリヌクレオチド配列P4502によりコードされるタンパク質をCytochromeP450monooxygenase2とするは、CytochromeP450monooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号269、270に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド18506-19296は、Cyclaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号271に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド19779-21389は、FADdependentmonooxygenaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号272に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド21793-22877は、UbiAlikeprenyltransferaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号273に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド23205-24773は、Acetyltransferaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号274に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド25824-27178は、Acetyltransferase2をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号275に記載したアミノ酸配列で示され、配列番号266のヌクレオチド27798-31855は、CationtransportingATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号276に記載したアミノ酸配列で示された。実施例11:ゲノムDNAライブラリーの作成カビの形質転換が可能なコスミドベクターpMFCOS1を以下のようにして構築した。プラスミドpMKD01特許第3593134号公報よりカビの形質転換用マーカー遺伝子であるデストマイシン耐性遺伝子を含む約30kbのXbaI断片を調製し、T4ポリメラーゼを使用して末端を平滑化した。この断片を制限酵素SmaIおよびStuIで二重消化した市販のコスミドベクターSuperCos1ストラタジーン社と連結してコスミドベクターpMFCOS1を構築した。次に、ピリピロペンA生産菌であるペニシリウムコピロビウムPF1169株公開技報2008500997号特許文献4を液体培地3グリセリン、0.8ニュートリエントブロス、0.3麦芽エキス、0.2酵母エキス、0.1グルタミン酸ナトリウム、pH7.0に植菌し、26°C、48時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より染色体DNAを調製した。染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、DNA末端を脱リン酸化した。このDNA断片を、予め制限酵素XbaIで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素BamHIで消化したコスミドベクターpMFCOS1に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、エピセンター社製のMAXPLAXラムダパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌XLI-BlueMRAに感染させることによりゲノムDNAライブラリーを作製した。実施例12:ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング実施例1で作製したゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ピリピロペンA生合成遺伝子の一つであるcytochromeP450遺伝子を使用することとし、以下に示すようにPCRによって調製した。実施例1に示したゲノムDNAを鋳型とし、5’ATGATCGAGCTCAAAGATGC3’配列番号277と5’CTTCTTTCCAGTCAATACCT3’配列番号278のオリゴDNAをプライマーとしてPCRを行った。PCRは、DNAポリメラーゼとしてPrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ株式会社を使用し、PERKINELMERGeneAmpPCRSystem9700を用いて行った。反応液は、ゲノムDNAを0.5μl0.5μg相当量、酵素に添付の2倍濃度反応用緩衝液を25μl、2.5mMdNTP溶液を4μl、100pmol/μlの濃度に調整した上記プライマーを各0.5μlずつ、酵素を0.5μl、滅菌水を19μl加えて50μlとした。反応は、94°C、5分間の前処理後、98°Cで10秒間、50°Cで5秒間、72°Cで2分間のインキュベーションを25サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約1.8kbpのDNA断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約1.8kbpのバンドを定法に従って切り出してDNA断片を回収した。上記DNA断片をプローブにし、ECLダイレクトDNA/RNAラベリング検出システムアマシャムファルマシアバイオテク社製を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約5000個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの1クローンよりプラスミドpPYRI02を単離した。また、このプラスミドpPYRI02の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号266の1~25000およびその上流域を含むことが確認された。実施例13:形質転換体の造出ピリピロペン生産菌であるペニシリウムコピロビウムPF1169株を液体培地3グリセリン、0.8ニュートリエントブロス、0.3麦芽エキス、0.2酵母エキス、0.1グルタミン酸ナトリウム、2.0グリシン、pH7.0に植菌し、26°C、24時間培養した後、遠心により菌体を集めた。得られた菌体を1.0MKClで洗浄し、0.45μmのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液3mg/mLβ-glucuronidase、1mg/mLChitinase、3mg/mLLysingenzyme、1.0MKCl10mLに懸濁した。30°Cで60~90分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、遠心してプロトプラストを回収し、SUTC緩衝液0.5mol/Lシュークロース、10mM塩化カルシウム、10mMトリス塩酸[pH7.5]で洗浄した。調製したプロトプラストを1mLのSUTC緩衝液に懸濁し、この100μLに対し10μgのpPYRI02DNA溶液20μLを加え、氷中に5分間静置した。次に、400μLのPEG溶液60PEG4000、10mM塩化カルシウム、10mMトリス塩酸pH7.5を加え混合し、氷中に20分間静置した後、10mLのSUTC緩衝液を加え、遠心しプロトプラスト化した菌体を回収した。得られた菌体を1mLのSUTC緩衝液に懸濁した後、4000rpmで5分間遠心して、最終的に100μLのSUTC緩衝液に懸濁した。以上の処理を加えた菌体を、200μg/mLハイグロマイシンB、1.0Mシュークロース含ポテトデキストロースアガー上に、軟1.0Mシュークロース含ポテトデキストロースアガー培地とともに重層し、26°C、4日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。実施例14:形質転換体の培養、および培養液中のピリピロペンの定量形質転換体の培養には、種培地として2.0でんぷんスターチ、1.0ぶどう糖グルコース、0.5ポリペプトン、0.6小麦胚芽、0.3酵母エキス、0.2大豆粕および炭酸カルシウム0.2の組成からなる培地を用いた。また、生産培地としては、10.0グルコース、1.3脱脂大豆、0.3グルタミン酸ナトリウム、0.8小麦胚芽、0.125塩化ナトリウム、0.15炭酸カルシウム、0.2ニコチンアミドの組成からなる培地殺菌前pH7.0を用いた。前記の種培地40mlを分注した250ml容三角フラスコを122°Cで20分間殺菌し、これに実施例13に記載した形質転換体を1白金耳の菌を植菌後、26°Cで3日間振盪培養した。次いで、生産培地20mlを分注した250ml容三角フラスコを122°Cで20分間殺菌し、これに上記種培養液0.5mlを無菌的に移植し、26°Cで8日間振盪培養した。得られた培養液0.5mlにメタノール95mlを添加しピリピロペンを抽出、濾過すると抽出液が得られた。このうち10μlをHPLC分析に供した。HPLC分析は、HPLCシステムLC-2010C島津製作所を用いて分析した。分析条件は、カラム:InertsilODS-34.6X250mm、移動相:アセトニトリル:水=60:40、流速:1.0ml/min、カラム温度:40°C、UV波長:320nmとした。得られたパターンをピリピロペン標準品と比較し、ピリピロペンに由来するピークを特定し、その面積からピリピロペンの定量を行った。尚、定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンA、E、Oとした。同時に形質転換体の親株であるペニシリウムコピロビウムPF1169株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。その結果、下表3に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の約2.6倍に向上し、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含まないpPYRI02により形質転換させた形質転換体であっても、ピリピロペン生産性が向上することが明らかとなった。実施例15:アグロバクテリウムツメファシエンスを用いたペニシリウムコピロビウムの形質転換12CMMY寒天培地でペニシリウムコピロビウムPF1169株を28°Cで3日間培養し、分生糸をかきとり回収した。滅菌ミラクロスCarbiochem社製、CatNo475855で濾過して胞子を取得し、IM液体培地2SO2、18gLグルコース、853gLMES、5mLLグリセリン、pH53で103mlに希釈し、これをペニシリウムコピロビウム胞子懸濁液とした。図4に示すpBIAnGPDEGFPを導入したアグロバクテリウムツメファシエンスEHA105株を50ppmのカナマイシンを含むIM液体培地に植菌し、28°Cで1晩培養した。これを660nmの透過光の吸収が03~045になるように50ppmのKmを含むIM液体培地で希釈し、終濃度が500μMとなるようにアセトシリンゴンを添加し、さらに28°Cで6時間培養し、これをアグロバクテリウム培養液とした。50ppmのKmおよび500μMのASを含むcocultivation寒天培地2SO2、09gLグルコース、853gLMES、5mLLグリセリン、15gLAgar、pH53にhybondNを敷き、上記の方法で得られた100μLのペニシリウムコピロビウム胞子懸濁液と、100μLのアグロバクテリウム培養液とを混合し、hybondN上に均一に広げた。これを、25°Cで2日間共存培養した後、50ppmのハイグロマイシンおよび25ppmのメロペネムを含むMM寒天培地2SO2、18gLグルコース、15gLAgarに移し4日間選択培養した。得られたコロニーを25ppmのハイグロマイシンおよび25ppmのメロペネムを含む12CMMY寒天培地に移し、生育した形質転換体を取得した。取得したハイグロマイシン耐性コロニーとGFP蛍光観察結果を図5Aに示したとおり、得られたハイグロマイシン耐性コロニーのほとんどから蛍光を検出した。一方、図5Bに示したとおり、対照としたアグロバクテリウムを感染させていないペニシリウムコピロビウムPF1169株からは蛍光を検出しなかった。また、ハイグロマイシン耐性コロニーのゲノムPCR実験により、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびGFP遺伝子の導入も確認した。実施例16:ゲノムDNAライブラリーのスクリーニング2実施例12で得たpPYRI02の挿入断片末端の塩基配列は、配列番号266の1~25000およびその上流域を含む配列である。さらにピリピロペン生合成遺伝子クラスターの下流部分を加えた全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを得るために、別途クローニングした生合成遺伝子クラスターの下流部分と、上記pPYRI02の挿入断片と連結させることにより、全長の生合成遺伝子クラスターを構築することとした。全長の生合成遺伝子クラスターの構築方法としては、実施例11で作製したゲノムDNAライブラリーより、pPYRI02には含まれていないピリピロペンA生合成遺伝子であるOacetyltransferase遺伝子をプローブとして、本クラスターの下流部分をクローニングした。実施例11に示したゲノムDNAを鋳型とし、プローブとして使用するDNA断片を増幅する際のプライマーとして5ATGGATTCCCTATTGACGAG3’配列番号279及び5’TTAAATCTCCCCACCAACCG3’配列番号280を用いた以外は、実施例12の場合と同様の条件で実施した。本DNA断片をプローブとして、ECLダイレクトDNA/RNAラベリング検出システムを使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約5000個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの1クローンよりプラスミドpPYRI03を単離した。本クローンに対するPCR解析の結果、生合成遺伝子クラスターの下流域は充分有しており、上流部については、CytochromeP450monooxygenaseまでは有していること、またAdenylateformingenzymeは含まれていないことを確認した。実施例12で得たpPYRI02の挿入断片と、前記pPYRI03の挿入断片を用い、生合成遺伝子クラスター全長を有するコスミドを構築することとした。それぞれのコスミドの塩基配列の解析よりクラスター上に有する制限酵素部位が明らかにでき、生合成遺伝子クラスターの上流領域としてpPYRI02のBsiWI断片約202kbを、下流領域としてpPYRI03のBsiWI~AflII断片約49kbを連結することにより、全長の生合成遺伝子クラスーが構築できることが明らかとなった。そこでまず、放線菌の接合伝達用プラスミドpSET152[ビアマンBierman,M.ら著,ジーンGene,蘭国,1992年,第116巻,p.43-49]をSphI消化し、T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、HindIIIリンカー5’CCCAAGCTTGGG3’配列番号281、宝酒造株式会社製を連結してプラスミドpSET153を構築した。pSET153のマルチクローニングサイトをHindIII-NotI-BsiWIAflII-NotI-EcoRIに変更するため、合成オリゴヌクレオチドHinNotBsiAflNotEco15’AGCTTGCGGCCGCGTACGCTTAAGGCGGCCGCG3’配列番号282およびHinNotBsiAflNotEco25’AATTCGCGGCCGCCTTAAGCGTACGCGGCCGCA3’配列番号283をアニールした後、HindIII及びEcoRIで二重消化したpSET153と連結してプラスミドpSET201を構築した。pSET201のBsiWI-AflII部位に、pPYRI03由来の約49kbのBsiWI-AflII断片を挿入してプラスミドpPYRI05を得た。pPYRI05のBsiWI部位に、pPYRI02由来の約202kbのBsiWI断片を挿入し、BsiWI断片が天然の生合成遺伝子クラスターと同向きに挿入されたクローンを選抜し、プラスミドpPYRI06を得た。pPYRI06は生合成遺伝子クラスター全長を含むプラスミドであるが、カビの形質転換マーカーを有していないことから、挿入断片のコスミドベクターpMFCOS1への繋ぎ換えを行った。即ち、pPYRI02由来の約85kbのコスミドベクター部分のNotI断片と、pPYRI06由来の約251kbのNotI断片を連結してコスミドpPYRI07翻訳領域:配列番号284、非翻訳領域:配列番号285を得た。pPYRI07は生合成遺伝子クラスター全長を含むとともにカビの形質転換マーカー遺伝子も有するコスミドである。pPYRI07の挿入断片末端の塩基配列を解析した結果、配列番号266の2446~27505およびその上流にベクター部分の塩基配列を含んでおり、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを含むことが確認された。実施例17:pPYRI07を用いた形質転換体の造出実施例16で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例13の場合と同様の条件で形質転換体の造出を行った。実施例18:形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量実施例17で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、実施例14で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンA、E、Oとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウムコピロビウムPF1169株についても、同様に培養及び培養液中のピリピロペンの定量を行った。その結果、下表4に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の3.6倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、ペニシリウムコピロビウムPF1169株の生産性が向上することが示された。実施例19:ペニシリウムコピロビウムを用いた形質転換体の造出ペニシリウムコピロビウムPF1169株以外のペニシリウムコピロビウムにおいても全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターを導入により、その生産性が向上することを確認するために、ペニシリウムコピロビウムATCC58615株StudiesinMycology49p8485参照について形質転換を行った。方法は、実施例16で得たpPYRI07を用いた以外は、実施例13に示した方法と同様の方法にて形質転換体の造出を行った。実施例20:形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量実施例19で得られ形質転換体の培養および培養液中のピリピロペンの定量方法は、培養時間が4日間であることを除き、実施例14で示した方法にて行った。定量を行ったピリピロペン類縁体は、本菌において産生されているピリピロペンA、E、Oとした。また同時に形質転換体の親株であるペニシリウムコピロビウムATCC58615株についても、同様に培養および培養液中のピリピロペンの定量を行った。その結果、下表5に示したとおり、形質転換体のピリピロペン生産性は、親株の2.5倍に向上していた。以上の結果から、全長のピリピロペン生合成遺伝子クラスターの導入により、PF1169株以外のペニシリウムコピロビウムについても、その生産性が向上することが示された。また、ペニシリウムコピロビウムPF1169株の方が、ペニシリウムコピロビウムATCC58615株に比べ、生産性がより向上するが明らかとなった。"