核酸の送達のための下記式の化合物の使用式中、Yは、3またはCNpCH2CH2より選択されるリンカー基でありR1は、アルキルナフチルあるいはフェニルが非置換であるか、または以下より独立して選択される置換基で最大4回置換されているmフェニルでありNO2、CN、ハロゲン、Oフェニル、OアルキルもしくはCNH2R2は、水素フェニル環が非置換であるかまたはOアルキルで独立して置換されているkNC3kCNH2kフェニル非置換であるかまたはSCH3で1回置換されているアルキルでありR3は、フェニル基が以下より独立して選択される置換基でさらに置換されているNHフェニルでありOHもしくはOCOkは1、2、3、4、5または6でありmは1、2、3または4でありnは0または1でありかつpは1~20の整数である。式の化合物が、式に示す立体配座を有する、請求項1記載の使用。式またはの化合物のYが、3である、請求項1または2記載の使用。式またはの化合物の置換基Yが、3でありR2が、フェニル環が非置換であるかまたはOアルキルで独立して置換されているkNC3でありR3が、フェニル基がOCOでさらに置換されているNHフェニルでありnが0でありかつR1およびkが上記に示す意味を有する、請求項3記載の使用。式またはの化合物の置換基Yが、CNpCH2CH2である、請求項1または2記載の使用。式またはの化合物の置換基Yが、CNpCH2CH2でありR2が、フェニル環が非置換であるかまたはOアルキルで独立して置換されているkNC3でありR3が、フェニル基がOCOでさらに置換されているNHフェニルでありnが0でありかつR1、kおよびpが上記に示す意味を有する、請求項5記載の使用。前記化合物が核酸に共有結合している、請求項1~6のいずれか記載の使用。下記式の化合物式中、Raは、kNH2でありR1およびkは、式について上記に示す意味を有する。式に示す立体配座を有する、請求項8記載の化合物式中、Raは、kNH2でありR1およびkは、式について上記に示す意味を有する。前記核酸が、修飾パターン5na3を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5ns3を有するセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、wが独立して5リン酸もしくは5ホスホチオエートまたはHであり、Z1が独立して2修飾ヌクレオチドであり、Z2が独立して2デオキシヌクレオチドまたは2フルオロ修飾ヌクレオチドであり、Z3が独立して2修飾ヌクレオチドであり、naが8~23であり、かつnsが8~25である、請求項8または9記載の化合物。前記核酸がsiRNAである、請求項8~10のいずれか記載の化合物。前記核酸が送達用ポリマーによって投与される、請求項8~10のいずれか記載の化合物。請求項8~12のいずれか記載の化合物を含む、薬学的組成物。修飾パターン5na3を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5ns3を有するセンス鎖とを含むオリゴヌクレオチドであって、ここで、wが独立して5リン酸もしくは5ホスホチオエートまたはHであり、Z1が独立して2修飾ヌクレオチドであり、Z2が独立して2デオキシヌクレオチドまたは2フルオロ修飾ヌクレオチドであり、Z3が独立して2修飾ヌクレオチドであり、naが8~23であり、かつnsが8~25である、オリゴヌクレオチド。Z1が2フルオロ修飾ヌクレオチドまたは2デオキシヌクレオチドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、請求項14記載のオリゴヌクレオチド。Z3が2Oメチル修飾ヌクレオチド、2フルオロ修飾ヌクレオチドまたは2デオキシヌクレオチドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、請求項14または15記載のオリゴヌクレオチド。送達用ポリマーに共有結合している、請求項14~16のいずれか記載のオリゴヌクレオチド。請求項14~17のいずれか記載のオリゴヌクレオチドとコレステロールとを含む、複合体。請求項14~17のいずれか記載のオリゴヌクレオチドと下記式の化合物とを含む、複合体。小分子と請求項14~17のいずれか記載のオリゴヌクレオチドとの複合体であって、前記小分子が、1~10個の2OHヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーを含み、かつ前記オリゴヌクレオチドが、前記小分子の前記ヌクレオチドリンカーに共有結合している、複合体。前記小分子がコレステロールまたは下記式の化合物である、請求項20記載の複合体式中、Rは、1~10個の2OHヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーである。請求項14~17のいずれか記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項18~21のいずれか記載の複合体を含む、薬学的組成物。本質的に上記の通りである、化合物、使用および方法。以下の実施例は、核酸の送達に使用される化合物の合成を例示するための参考例としてのみ意図される。それらは本発明の一部を形成するようには意図されていない。実施例1工程131715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミン標記アミンをそのニトリル前駆体から文献のプロトコールLolloetalWO2001070415に従って調製した。工程2N31715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルスクシナミン酸2L丸底フラスコ中で31013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロパン1アミンおよびヒューニッヒ塩基とAcOEtとを組み合わせて無色溶液を得た。THF中ジヒドロフラン25ジオンを加え、反応混合物を周囲温度で終夜攪拌して白色懸濁液を得た。すべての揮発物を減圧除去し、残渣をCH2Cl2に溶解させ、有機層をNH4Clおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をCH3CNH2Oに溶解させ、凍結乾燥させて標記化合物298gを綿毛状粉末として得た。MS5425。工程3N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ6ジフェニルメチルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ31オキソプロパン2イルスクシンアミド10mL丸底フラスコ中で、上記で調製した41013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタン酸、22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミド、HOAtおよびEDC塩酸塩をCH2Cl2中で一緒に混合して黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基を加え、反応液を周囲温度で終夜攪拌した。TLCは出発原料の消費を示した。すべての揮発物を減圧除去し、粗生成物をCH2Cl2中SiO27MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物128mgを明黄色固体として生成した。MS予測質量12407552、実測質量12407518。工程410mL丸底フラスコ中で、上記で調製したN11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ6ジフェニルメチルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ31オキソプロパン2イルスクシンアミドおよびヒューニッヒ塩基とCH2Cl2およびDMFとを組み合わせて黄色懸濁液を得て、ビスカーボネートを加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。ジエチルエーテル約10mlによるトリチュレーション後、標記生成物99mgをオフホワイトの固体として得た。MS予測質量14057614、実測質量14057518。工程3に必要なジペプチドビルディングブロックを以下のように調製した。工程a223プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸25mL丸底フラスコ中で、2アミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸をCH2Cl2に溶解させて明黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基およびトリメチルクロロシランを加え、反応混合物を15分間攪拌した。第2の50mL丸底フラスコ中で、2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸をDMFに溶解させて無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基およびTPTU125700712を加え、反応混合物を20分間攪拌した。対応するシリルエステルモノシリルアミンを含有する第1のフラスコからの溶液を加え、反応液をさらに3時間攪拌した。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO210MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物138gを褐色泡状物として得た。MS83358554。工程b115ジフェニルメチルアミノペンチルカルバモイル2エチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステル250mLナシ型フラスコ中で、上記で合成した22メトキシカルボニルアミノ3プロパンアミド6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸、メタノール、HOAtおよびEDC塩酸塩をCH2Cl2に溶解させて黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基を加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をジエチルエーテルでトリチュレートし、得られた固体を濾去し、乾燥させて標記化合物1214gを明褐色固体として得た。MS9387。工程c22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミド50mL丸底フラスコ中で、上記で調製した115ジフェニルメチルアミノペンチルカルバモイル2エチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステルとTHFとを組み合わせて褐色溶液を得た。0°Cでジエチルアミンを加えた。反応液を周囲温度で3時間攪拌し、その時点でMSは出発原料の消失を示した。すべての揮発物を減圧蒸発させた後、CH2Cl2中SiO201NEt3→CH2Cl2中10MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィー、続いてCH2Cl2中SiO25MeOH01NEt3の第2のフラッシュクロマトグラフィーを行って標記化合物502mgを明褐色泡状物として得た。MS予測質量715337、実測質量7153362。実施例2OベンジルN4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLチロシルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3フェニルプロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量14668182、実測質量14668136。実施例3N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイル4シアノLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13857716、実測質量13857696。実施例434ジクロロN4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量14286984、実測質量1428695。実施例54クロロN4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13947373、実測質量13947342。実施例64221013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルアミノ3プロパノイルアミノ6メチルアミノヘキサノイルアミノベンジル4ニトロフェニルカーボネート実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3ナフタレン1イルプロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量1410792、実測質量14107918。実施例7N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイル4フルオロLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13787669、実測質量13787609。実施例8N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイル2フルオロLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13787669、実測質量13787689。実施例9N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイル3フルオロLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13787669、実測質量13787659。実施例10工程1N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN4141フェニルアミノ6ジフェニルメチルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ4オキソブタン2イルスクシンアミド10mL丸底フラスコ中で、上記で調製した41013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタン酸、23アミノ4ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミド、HOAtおよびEDC塩酸塩をCH2Cl2中で一緒に混合して黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基を加え、反応液を周囲温度で終夜攪拌した。TLCは出発原料の消費を示した。すべての揮発物を減圧除去し、粗生成物をCH2Cl2中SiO25MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物197mgをオフホワイトの固体として生成した。MS予測質量12277763、実測質量12277714。工程24231013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミド4ブタンアミド6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドベンジル4ニトロフェニルカーボネート10mL丸底フラスコ中で、上記で調製したN11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN4141フェニルアミノ6ジフェニルメチルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ4オキソブタン2イルスクシンアミドおよびヒューニッヒ塩基とCH2Cl2およびDMFとを組み合わせて黄色懸濁液を得て、ビスカーボネートを加え、反応を周囲温度で終夜進行させた。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。AcOEtヘプタンでのトリチュレーション後、標記化合物123mgを明黄色固体として得た。MS予測質量13927825、実測質量13927819。工程1に必要なジペプチドビルディングブロックを以下のように調製した。工程a234ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸25mL丸底フラスコ中で、2アミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸をCH2Cl2に溶解させて淡黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基およびトリメチルクロロシランを加え、反応混合物を周囲温度で20分間攪拌した。第2の50mL丸底フラスコ中で、3メトキシカルボニルアミノ4ブタン酸をDMFに溶解させて無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基およびTPTU125700712を加え、反応混合物を15分間攪拌した。対応するシリルエステルモノシリルアミンを含有する第1のフラスコからの溶液を加え、反応液を周囲温度でさらに3時間攪拌した。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO25MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物210gを黄色泡状物として得た。MS8206。工程b2115ジフェニルメチルアミノペンチルカルバモイルメチルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステル250mLナシ型フラスコ中で、上記で合成した2115ジフェニルメチルアミノペンチルカルバモイルメチルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステル、メタノール、HOAtおよびEDC塩酸塩をCH2Cl2に溶解させた。ヒューニッヒ塩基を加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をジエチルエーテルでトリチュレートし、得られた固体を濾去し、乾燥させて標記化合物0796gを明褐色固体として得た。MS9256。工程c23アミノ4ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミド50mL丸底フラスコ中で、上記で調製した2115ジフェニルメチルアミノペンチルカルバモイルメチルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステルとTHFとを組み合わせて褐色溶液を得た。0°Cでジエチルアミンを加えた。反応液を周囲温度で終夜攪拌した。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO210MeOH01NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物500mgをオフホワイトの固体として得た。MS予測質量7023581、実測質量7023578。実施例114231013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミド4フェニルブタンアミド6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドベンジル4ニトロフェニルカーボネート実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして23アミノ4フェニルブタンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを23アミノ4ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドの代わりに使用して調製した。前者は3メトキシカルボニルアミノ4フェニルブタン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量1374792、実測質量13747877。実施例124434コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルアミノブタノイルN6メチルLリジルアミノベンジル4ニトロフェニルカーボネート実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして23アミノ4ブタンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを23アミノ4ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドの代わりに使用して調製した。前者は3メトキシカルボニルアミノ4ブタン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS14099。実施例13N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルOメチルLチロシルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は2メトキシカルボニルアミノ3プロパン酸から実施例1の上記工程a~cに記載のように調製した。MS13919。実施例14N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルDフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルDリジンアミド実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして22アミノ3フェニルプロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを22アミノ3プロパンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。このビルディングブロックは2メトキシカルボニルアミノ6アミノヘキサン酸および2アミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸から上記工程a~cに記載のように合成した。MS予測質量13607763、実測質量13607774。実施例15434コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルアミノ4ブタノイルN6メチルLリジルアミノベンジル4ニトロフェニルカーボネート実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして23アミノ4ブタンアミドNフェニル6ジフェニルメチルアミノヘキサンアミドを23アミノ4ブチリルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドの代わりに使用して調製した。前者は3メトキシカルボニルアミノ4ブタン酸から上記工程a~cに記載のように調製した。MS予測質量13997872、実測質量13997857。実施例16N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド工程122アミノ3フェニルプロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドビルディングブロック22アミノ3フェニルプロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドはBioconjugateChemVol13No42002855869に記載の手順に類似して調製した。MS6715工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ6ジフェニルメチルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルスクシンアミドN31715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルスクシナミン酸およびヒューニッヒ塩基のDMF溶液にTPTU125700712を加えた。3分後、22アミノ3フェニルプロピオニルアミノ6ジフェニルメチルアミノヘキサン酸アミドを加えた。t1時間でのTLCは、反応が完了したことを示した。溶媒を減圧除去した。残りの残渣を酢酸エチル中に取り込み、NaHCO3半飽和溶液、フタル酸水素カリウム溶液005M、水およびブラインで抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、減圧濃縮した。粗材料をフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記生成物を明褐色固体として得た。MS11968工程3上記アルコールおよびビスカーボネートのTHF溶液にヒューニッヒ塩基を加えた。黄色溶液を室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧除去した。残りの残基をジエチルエーテルでトリチュレートした。固体を濾取し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて標記化合物を明褐色固体として得た。MS13619実施例17工程1223フェニルプロピオニルアミノヘキサン酸市販のLFmocPheOSuを12ジメトキシエタンと水との11vv混合物に懸濁させ、0°CでLノルロイシンおよびNaHCO3で処理した。冷却浴を取り外し、反応を周囲温度で14時間進行させた。混合物を砕氷クエン酸上に注ぎ、酢酸エチルで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。SiO2AcOEtのフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物0870mgを白色固体として得た。MS5012。工程211ペンチルカルバモイル2フェニルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステルナシ型フラスコ中で、上記で合成した223フェニルプロピオニルアミノヘキサン酸、メタノールおよび2エトキシ1エトキシカルボニル12ジヒドロキノリンをCH2Cl2に溶解させ、Arバルーン下で終夜攪拌した。混合物を砕氷NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、体積を約300mlに減少させた。析出物を濾去し、乾燥させて標記化合物525gを明褐色固体として得た。MS6063。工程322アミノ3フェニルプロピオニルアミノヘキサン酸アミド丸底フラスコ中で、上記で調製した11ペンチルカルバモイル2フェニルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステルをCH2Cl2に溶解させた。0°Cでジエチルアミンを加え、反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。すべての揮発物を減圧蒸発させた後、SiO2CH2Cl210MeOHのフラッシュクロマトグラフィー、続いてAcOEtからの結晶化により標記化合物2116gを明褐色結晶として得た。MS3842。工程4N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ1オキソヘキサン2イルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルスクシンアミド実施例16、工程2に類似して調製した。MS90979318。工程5N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN4カルボニルオキシメチルフェニルLノルロイシンアミド実施例16、工程3に類似して調製した。MS予測質量10736453、実測質量1073642実施例18N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLアラニルN4カルボニルオキシメチルフェニルグリシンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加2クロロトリチルクロリド樹脂、1DVBをDCMDMF11中で10分間膨潤させた。樹脂を排水し、FMOC4アミノベンジルアルコールおよびピリジンのDCMDMF11溶液を加えた。混合物を終夜振盪した。樹脂を排水し、10ヒューニッヒ塩基のメタノール溶液で封鎖した。樹脂をDMFおよびDCMで洗浄し、HVで終夜乾燥させて樹脂217gを得た。負荷を決定した結果、041mmoLgであった。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN41フェニルアミノ2オキソエチルアミノ1オキソプロパン2イルスクシンアミド工程1の樹脂をDMFで予め洗浄し、ピペリジンDMF14で5分間および10分間処理した。樹脂をDMFおよびIPAで交互に洗浄した。FmocGlyOH、TPTUおよびヒューニッヒ塩基のDMF溶液を5分間攪拌した後、樹脂と共に1時間振盪した。樹脂をDMFおよびイソプロピルアルコールで交互に洗浄した。以下のFmoc開裂および引き続くFmocAlaOHとN31715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルスクシナミン酸とのカップリングを適宜行った。乾燥ペプチド樹脂をTFA1DCM中で約2X30分間攪拌した。反応混合物を濾過し、樹脂をDCMで洗浄した。濾液をプールし、溶媒を減圧蒸発させた。粗材料をジエチルエーテルでトリチュレートした。フラッシュクロマトグラフィーで精製後、生成物を白色固体として得た。MS予測質量7765452、実測質量7765455工程3上記で調製したアルコールN11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN41フェニルアミノ2オキソエチルアミノ1オキソプロパン2イルスクシンアミドRO5545270およびビスカーボネートをアルゴン下、室温でDMFに溶解させ、ヒューニッヒ塩基で処理し、混合物を終夜反応させた。溶媒を減圧除去した。得られた固体をジエチルエーテルでトリチュレートした。固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した。生成物を減圧乾燥させて標記化合物を明褐色固体として得た。MS予測質量9415514、実測質量9415518実施例19N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLロイシルN4カルボニルオキシメチルフェニルLメチオニンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して調製した。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ41オキソブタン2イルアミノ4メチル1オキソペンタン2イルスクシンアミドFmocMetOHおよびFmocLeuOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS8936183工程3は実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、標記化合物を明褐色固体として得た。MS予測質量10576174、実測質量10576184実施例20N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLロイシルN14カルボニルオキシメチルフェニルLアスパルトアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2221013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミド4メチルペンタンアミドN1フェニルスクシンアミドFmocAsnOHおよびFmocLeuOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS予測質量8756136、実測質量8756133工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、標記化合物を明褐色固体として得た。MS予測質量10406198、実測質量10406188実施例21N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLアラニルN14カルボニルオキシメチルフェニルLアスパルトアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2221013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミドプロパンアミドN1フェニルスクシンアミドFmocAsnOHおよびFmocAlaOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS83488567工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを明褐色固体として得た。MS予測質量9985729、実測質量9985739実施例22N24コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLアスパラギニルN4カルボニルオキシメチルフェニルグリシンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程221013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミドN1フェニルアミノ2オキソエチルスクシンアミドFmocGlyOHおよびFmocAsnOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を白色固体として得た。MS予測質量819551、実測質量8195503工程3実施例18、工程3に類似して標記化合物を明褐色固体として得た。MS予測質量9845572、実測質量9845489実施例23N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN4カルボニルオキシメチルフェニルグリシンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN41フェニルアミノ2オキソエチルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルスクシンアミドFmocGlyOHおよびFmocPheOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を白色固体として得た。MS予測質量8525765、実測質量8525754工程3実施例18、工程3に類似して標記化合物を明褐色固体として得た。MS予測質量10175827、実測質量10175775実施例24N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLロイシルN4カルボニルオキシメチルフェニルグリシンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN41フェニルアミノ2オキソエチルアミノ4メチル1オキソペンタン2イルスクシンアミドFmocGlyOHおよびFmocLeuOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS予測質量8185921、実測質量8185921工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを明黄色固体として得た。MS予測質量9835983実測質量9836004実施例25N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLロイシルN4カルボニルオキシメチルフェニルLフェニルアラニンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルアミノ4メチル1オキソペンタン2イルスクシンアミドFmocPheOHおよびFmocLeuOHをアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS予測質量9086391実測質量908637工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体として得た。MS予測質量10736453実測質量1073646実施例26N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN4カルボニルオキシメチルフェニルLフェニルアラニンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルアミノ1オキソ3フェニルプロパン2イルスクシンアミドFmocPheOHをアミノ酸として用いて実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を明黄色固体として得た。MS予測質量9426234実測質量9426218工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体として得た。MS予測質量11076296実測質量11076287実施例27N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLロイシルN4カルボニルオキシメチルフェニルLロイシンアミド工程12クロロトリチル樹脂へのFMOC4アミノベンジルアルコールの添加実施例18、工程1に類似して行った。工程2N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ4メチル1オキソペンタン2イルアミノ4メチル1オキソペンタン2イルスクシンアミドFmocLeuOHをアミノ酸として用いて実施例18、工程2に類似して調製した。生成物を白色固体として得た。MS予測質量8746547実測質量8746527工程3標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体として得た。MS予測質量10396609実測質量10396588実施例28N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLアラニルN4カルボニルオキシメチルフェニルLアラニンアミド工程111エチルカルバモイルエチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステルFmocAlaAlaOHおよびメタノールのTHF溶液をEEDQで処理した。溶液を室温で終夜攪拌した。混合物を102プロパノール酢酸エチルで希釈し、溶液をKHSO45K2SO410、水およびブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中で数分間超音波処理し、固体を濾取して生成物を明褐色固体として得た。MS4883工程22アミノN1エチルプロピオンアミド化合物を実施例1、工程cに類似して調製して生成物を明黄色固体として得た。MS266328825313工程3N11013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルN411フェニルアミノ1オキソプロパン2イルアミノ1オキソプロパン2イルスクシンアミド実施例16、工程2に類似して化合物を明褐色固体として調製した。MS予測質量7905608、実測質量7905587工程4標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体として得た。MS予測質量955567、実測質量9555651実施例29N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLイソロイシルN14カルボニルオキシメチルフェニルLアスパルトアミド工程1223メチルペンタノイルアミノスクシナミン酸2クロロトリチルクロリド樹脂をDCM中で膨潤させた後、FmocAsnOHおよびヒューニッヒ塩基のDCM溶液で終夜処理した。樹脂をDCMで洗浄し、10ヒューニッヒ塩基のメタノール溶液で封鎖した。標準的固相ペプチド合成に従ってFmocIleOHとTPTUおよびヒューニッヒ塩基とをカップリングした。樹脂から生成物をTFA水トリイソプロピルシランのカクテルによって室温で2時間かけて開裂させた。樹脂を濾過し、濾液を少量に減圧濃縮した。ジエチルエーテルでのトリチュレーション後、生成物を濾過し、減圧乾燥させて生成物を白色固体として得た。MS予測質量4672056、実測質量4672056工程212カルバモイル14ヒドロキシメチルフェニルカルバモイルエチルカルバモイル2メチルブチルカルバミン酸9Hフルオレン9イルメチルエステル実施例28、工程1に類似して化合物を明黄色固体として調製した。工程322アミノ3メチルペンタノイルアミノN1スクシンアミド実施例1、工程cに類似して化合物を明黄色固体として調製した。工程4221013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタンアミド3メチルペンタンアミドN1フェニルスクシンアミド実施例16、工程2に類似して化合物を明黄色固体として調製した。工程5実施例18、工程3に類似して上記工程の化合物を反応させて標記化合物を得た。シリカゲル上での精製後、それを明褐色固体として得た。MS予測質量10406198、実測質量10406177実施例30N4コレスタ5エン3イルオキシプロピルアミノ4オキソブタノイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルDリジンアミドFmocDLysOHで出発して実施例16、工程1に類似して化合物を明褐色固体として調製した。MS1362813838実施例31N15コレスタ5エン3イルオキシ415ジオキソ811ジオキサ514ジアザペンタデカン1オイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド合成の工程2においてコレステロールオリゴPEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。MS14798工程2に必要なコレステロールPEG中間体N21715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシエチルスクシナミン酸を以下のように調製した。工程a22エトキシエチルカルバミン酸1715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルエステル22ビスのジクロロメタン75mL溶液にコレステリルクロロホルメートのジクロロメタン25mL溶液を攪拌下で滴下した。反応液を室温で終夜攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、水で抽出した。有機抽出物を無水MgSO4二水和物で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。アミノ改質シリカゲル上での精製後、生成物を白色ワックス状固体として得た。MS5615工程bN21715ジメチルヘキシル1013ジメチル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシエチルスクシナミン酸工程aのアミンおよびトリエチルアミンをジクロロメタン5mLに溶解させた。無水コハク酸を加えた後、溶液を室温で終夜攪拌した。TLCチェックは何らかの出発原料を依然として示した。さらに無水コハク酸を加えた。反応液を室温でさらに3時間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、5KHSO410K2SO4混合物で洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4二水和物で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させて所望の酸を得た。MS6615実施例32N30コレスタ5エン3イルオキシ430ジオキソ8111417202326ヘプタオキサ529ジアザトリアコンタン1オイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド合成の工程2においてコレステロールPEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。MS16999工程2に必要なコレステロールPEG中間体1コレスタ5エン3イルオキシ127ジオキソ581114172023ヘプタオキサ226ジアザトリアコンタン30酸を以下のように調製した。工程atertブチル251013ジメチル176メチルヘプタン2イル2347891011121314151617テトラデカヒドロ1Hシクロペンタaフェナントレン3イルオキシ25オキソ36912151821ヘプタオキサ24アザペンタコサ1イルカルバメートコレステリルクロロホルメートおよびトリエチルアミンをジクロロメタン5mLに溶解させた。次に、ジクロロメタン1mLに溶解したαアミノωbocアミノオクタの溶液を加えた。溶液を室温で終夜攪拌し、ジクロロメタンで希釈し、KHSO45K2SO410水性混合物で希釈した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。シリカゲル上で精製後、生成物を無色油状物として得た。MS8987工程b1コレスタ5エン3イルオキシ127ジオキソ581114172023ヘプタオキサ226ジアザトリアコンタン30酸上記Boc誘導体をジオキサン中HCl4Mに溶解させた。溶液を室温で40分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残りの白色固体をジクロロメタン5mLに溶解させ、トリエチルアミンおよび無水コハク酸で終夜処理した。さらに無水コハク酸を加え、60分後に反応液をジクロロメタンで希釈し、KHSO45K2SO410緩衝液で洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて所望の生成物390mgを得た。MS8817実施例33N66コレスタ5エン3イルオキシ466ジオキソ8111417202326293235384144475053565962ノナデカオキサ565ジアザヘキサヘキサコンタン1オイルLフェニルアラニルN6メチルN4カルボニルオキシメチルフェニルLリジンアミド合成の工程2においてコレステロールPEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。MS22281工程2に必要なコレステロールPEG中間体1コレスタ5エン3イルオキシ163ジオキソ581114172023262932353841444750535659ノナデカオキサ262ジアザヘキサヘキサコンタン66酸を以下のように調製した。工程aコレスタ5エン3イルカルバメートαωビスアミノ20およびトリエチルアミンを乾燥ジクロロメタン15mLに溶解させた。コレステリルクロロホルメートの乾燥ジクロロメタン2mL溶液を室温で滴下した。溶液を終夜攪拌した後、少量に減圧濃縮し、シリカゲル上で直接精製して生成物をワックス状固体として得た。MS13099工程b1コレスタ5エン3イルオキシ163ジオキソ581114172023262932353841444750535659ノナデカオキサ262ジアザヘキサヘキサコンタン66酸工程aのアミン、無水コハク酸およびトリエチルアミンを乾燥ジクロロメタン5mLに溶解させた。さらにトリエチルアミンを加えた後、溶液を室温で終夜攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、KHSO45K2SO410水性混合物で2回洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて生成物を無色ワックス状固体として得た。MS14089以下の実施例は本発明を例示する。実施例34RNA複合体の調製のための一般的手順材料ジメチルスルホキシド、NNジイソプロピルエチルアミンおよび酢酸ナトリウム溶液をSigmaAldrichChemieGmbHから購入した。RPHPLC用の酢酸トリエチルアンモニウムおよびアセトニトリルをBiosolveから購入した。エタノールをMerckから購入した。OptilabHFシステムからの精製水を使用した。ResourceRPC3mLカラムをGEHealthcareから購入した。HPLC精製はAKTAExplorer100システムを使用して実現した。アミノ修飾RNAの合成センス鎖の5末端においてヘキシルアミノリンカーを備えたRNAを、1215μmolスケールでの固相上でAKTAOligopilot100および固体支持体としての細孔制御ガラスを使用して標準的ホスホラミダイト化学作用によって生成した。2Oメチルヌクレオチドを含有するRNAを、対応するホスホラミダイトである2OメチルホスホラミダイトおよびTFAヘキシルアミノリンカーアミダイトを使用して作成した。開裂および脱保護ならびに精製を、当技術分野で公知の方法によって実現した。アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCによって特性決定し、独自性をESIMSによって確認した。配列u、c対応するRNAヌクレオチドの2Oメチルヌクレオチド、sホスホロチオエート。一般的な実験的結合手順実施例1~33の標記化合物を以下の手順に従ってアミノ修飾RNA経由でカップリングした。5末端においてC6アミノリンカーを備えたRNAをDMSO500μLおよび水150μLに溶解させる。DMSO1mLに溶解したpニトロフェニルカーボネート誘導体、続いてDIPEA8μLを加える。反応混合物を暗室中35°Cで振盪し、RPHPLCを使用してモニタリングする。反応が完了に至る時点で、EtOH中酢酸ナトリウムを使用してRNA複合体を20°Cで析出させる。ジペプチドモチーフ中にMMT保護基を欠く例では、先に記載の条件を使用して対応する複合体を精製する。純粋な画分をプールし、材料を酢酸ナトリウムEtOHによって析出させて所望のRNA複合体を得る。ジペプチド配列中にMMT保護基を含有するRNA複合体を、以下に示す手順に従ってさらに処理する。MMT開裂の一般的手順粗RNA複合体ペレットを水500μLおよび酢酸ナトリウム緩衝液15mLに溶解させる。溶液を30°Cで2日間振盪する。反応混合物をRPHPLCを使用してモニタリングする。MMT保護基の開裂完了後、すぐ上で言及した条件を使用してRNA複合体を直接精製する。純粋な画分をプールし、所望の複合体を酢酸ナトリウムEtOHによって析出させる。対照として、ジペプチドモチーフを欠くRNA複合体を合成した。この目的でコレステロールを文献記載のリンカー経由で5末端に結合させた。この複合体を非開裂性と呼ぶ。すべてのRNA複合体を純度についてRPHPLCで分析し、独自性をESIMSで確認した。簡潔に言えば、XBridgeC18カラムを備えたDionexUltimateシステム上にてカラム温度65°CでRPHPLCを行った。1メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノールおよび16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95メタノール中のそれらを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った。UV検出を260nmで記録した。質量分析では、マイクロスプレー源およびイオントラップ検出器を備えたThermoFinniganLCQDecaXPESIMSシステムをHPLCシステムにオンラインで組み合わせた。式の特定の化合物の例を表1に開示する。得られた化合物をジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体と呼び、特定のジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体をさらに標記化合物実施例Xおよび実施例Xの標記化合物を有するsiRNAと呼ぶ。siRNA調製アンチセンス配列u、c対応するRNAヌクレオチドの2Oメチルヌクレオチド、sホスホロチオエート。アポリポタンパク質BmRNAに対して指向するジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を、アニーリング緩衝液中の相補鎖の等モル溶液を混合することで作成し、水浴中、80~85°Cで3分間加熱し、3~4時間かけて室温に冷却した。二本鎖形成を天然ゲル電気泳動によって確認した。すべての調製したジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を表2に列挙する。表1ジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体および分析データキー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。表2ジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体最後の項目は、ジペプチドモチーフを欠くsiRNA複合体を表す。キー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。実施例35インビボ実験ジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与6~8週齢マウスをHarlanSpragueDawleyから得た。マウスを注射前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlanTekladげっ歯類用食餌によって自由に行った。マウスに送達用ポリマーの02mL溶液とジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体02mlとの混合物を注射した。別途明記しない限り、注射量は送達用ポリマー15mgkg、ジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体01mgkgとした。溶液を尾静脈への注入により注射した。注射48時間後の血清ApoBレベルを等張グルコース処理動物に対して以下の手順に従って測定した。血清ApoBレベル決定マウスを顎下出血による血清採取前に4時間絶食させた。血清ApoBタンパク質レベルを標準的サンドイッチELISA法で決定した。簡潔に言えば、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体をそれぞれ捕捉抗体および検出抗体として使用した。その後、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体をApoB抗体複合体に結合するように適用した。次にテトラメチルベンジジン比色展開の吸光度をTecanSafire2マイクロプレートリーダーによって450nmで測定した。図1において、各種のジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を、コレステロールに結合されているが本節で先に詳述した開裂性モチーフを欠く同一のsiRNAに対して評価した。このsiRNA複合体の血清ApoBレベルに対する効果を1に設定することで、ジペプチド含有複合体の影響を非開裂性対照に対して評価した。最初に使用したPheLysモチーフを対応するDアミノ酸で置換するか、または単にLysを非天然鏡像異性体で置き換えることで、非開裂性対照siRNA以下のApoB減少が生じた。LysをGlyで置き換えるかまたはPheをpメトキシフェニルアラニンで置き換えることで、実施例16の標記化合物を有するsiRNAに比べて効力が減少した。他のジペプチドモチーフ含有siRNA複合体は、当初のPheLys含有複合体と同程度に有効であることが示された。図2は、PheLysモチーフからなる実施例16の標記化合物を有するsiRNAに比べて同程度に有効であったかまたは向上した有効性を示したジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体をまとめて示す。これらすべての複合体は非開裂性コレステロールsiRNA複合体SEQIDNO対266154に比べて著しく活性が高かった。最も高能力のジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体は、フッ素修飾フェニル環をPhyLysモチーフ中に有していたか、またはβフェニルアラニンで置換されたフェニルアラニンを有していたかもしくはその誘導体で置換されたフェニルアラニンを有していた。Dアミノ酸からなるジペプチドモチーフを有するジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体が非開裂性対照複合体と同等に機能することから、他のジペプチド配列がプロテアーゼ活性によってインビボで実際に開裂すると考えられる。しかし、異なるアミノ酸およびその誘導体の広範な受容を考慮すれば、文献に示唆されるように、2つ以上の酵素が開裂反応に関与している可能性が高い。図3に示すように、siRNAと小分子リガンドコレステロールとの間にカテプシン開裂性ジペプチドモチーフを組み込むことで、ストレートなコレステロールsiRNA複合体に比べてsiRNA複合体の効力が増強される。さらに、PEGに基づくリンカーによってコレステロールリガンドをジペプチドモチーフから間隔を空けて配置することで、PEGリンカーの長さに比例して効力が減弱される。図4ではポリマー用量を15mgkgで一定に保持した。siRNA用量を滴定し、血清ApoB含有量に対する効果を測定した。PheLysモチーフを含有するジペプチド含有コレステロールsiRNA複合体は、ジペプチド配列を欠く対照複合体に比べて著しく強力であった。実施例362修飾オリゴリボヌクレオチド合成オリゴリボヌクレオチドを固相上でホスホラミダイト技術に従って合成した。スケールに応じてABI394シンセサイザーまたはAKTAoligopilot100のいずれかを使用した。細孔制御ガラスでできた固体支持体上で合成を行った。すべての2修飾RNAホスホラミダイトおよび補助試薬をSAFCから購入した。具体的には、以下の2Oメチルホスホラミダイトを使用した2Oメチルアデノシン3Oホスホラミダイト、5OジメトキシトリチルN42Oメチルシチジン3Oホスホラミダイト、2Oメチルグアノシン3Oホスホラミダイトおよび5Oジメトキシトリチル2Oメチルウリジン3Oホスホラミダイト。2デオキシ2フルオロホスホラミダイトは2OメチルRNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリルに溶解させ、モレキュラーシーブを加えた。5リン酸を作成するために、GlenResearchからの22エチルスルホニルエチルホスホラミダイトを使用した。オリゴマーの5末端においてC6アミノリンカーを導入するために、ThermoFisherScientificからの6ヘキシルホスホラミダイトを使用した。5修飾を合成サイクルの改変なしに導入した。5エチルチオテトラゾールをアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3アミノ3H124ジチアゾール3チオンの無水アセトニトリルピリジン中50mM溶液を使用した。実施例37支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、濃アンモニア水によって40°Cで18時間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな管に移し、CPGをアンモニア水で洗浄した。一緒にした溶液を蒸発させ、固体残渣を緩衝液A中で再構成した。実施例38オリゴリボヌクレオチドの精製粗オリゴマーを、SourceQ15で充填したカラムおよびAKTAExplorerシステムを使用してアニオン交換HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM過塩素酸ナトリウム、20mMTris、1mMEDTAであり、20アセトニトリルを含有し、緩衝液Bは500mM過塩素酸ナトリウムを除けば緩衝液Aと同一であった。32個のカラム体積内の22B~42Bの勾配を使用した。280nmでのUVトレースを記録した。適切な画分をプールし、3MNaOAcおよび70エタノールで析出させた。最後にペレットを70エタノールで洗浄した。実施例39siRNAを発生させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング等モルRNA溶液を組み合わせることで相補鎖を混合した。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を85°Cの水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。実施例402OH残基を欠くsiRNAのインビトロ活性2OH残基を欠くsiRNAが強力なインビトロノックダウン活性を示すか否かを調査するために、本発明者らは、異なる2修飾化学構造を有するEGFPmRNA標的化siRNAのパネルを検査した。siRNAをセンス活性およびアンチセンス活性についてDualGloルシフェラーゼアッセイシステムによってCOS7細胞中でpsiCHECK2ベクターを使用してスクリーニングした。センス鎖およびアンチセンス鎖が与えるサイレンシング活性を扱うために、本発明者らは、別々のpsiCHECK2構築物としての対応する各19mer標的部位配列を、合成ウミシイタケルシフェラーゼの翻訳終止コドンに対して3に位置する多重クローニング領域内にクローニングした。Lipofectamine2000を使用することで、COS7細胞をベクター構築物、およびクローニング標的部位に相補的な対応するsiRNA3nMと同時形質移入した。siRNA媒介サイレンシングの成功は、形質移入の24時間後、ホタルルシフェラーゼレベルに対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼの活性を介して、形質移入効率を考慮するように決定した。表32修飾に依存するインビトロノックダウン活性の決定に使用される例示的siRNA配列および化学修飾本研究において使用される基準二本鎖、および対応する修飾変異体の選択例。XfはヌクレオチドXの2フルオロ修飾を示し、小文字は2Oメチル修飾を示し、強調文字はDNAヌクレオチドを示し、すべての他の大文字はリボヌクレオチドを示す。文字pは5リン酸を示す。5つの最も強力な修飾siRNAが2フルオロ2Oメチルの交互パターンで設計されていることがわかった。検査したすべての2F2OMe変異体においてウミシイタケルシフェラーゼ活性が欠けているかまたは最小限であることが示すように、この化学構造は、アンチセンス活性を与えたが、対応するセンス鎖の活性を完全に除去した。本発明者らは、そのような2F2OMeパターンがsiRNAの所期のアンチセンス鎖活性を促進する一方、センス鎖に由来する望まれない非特異的な効果が完全に抑制されると結論づけた。実施例41インビトロアッセイによるDNAseII感受性部位の検出イオン対逆相高速液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化質量分析との組み合わせ、またはアニオン交換HPLCに基づく方法を確立することで、選択される一本鎖および二本鎖RNAのインビトロ安定性を検査した。方法の説明安定性分析のために、一本鎖または二本鎖RNAの10μM溶液を、DNaseII08または8単位を含有する5mM酢酸ナトリウム緩衝液中にて37°Cでインキュベートした。100mM酢酸トリエチルアンモニウム塩溶液を加えて、pHを7に変化させて、DNaseII酵素を不活性化することで、インキュベーション反応を停止させた。LCMSとUV検出との組み合わせ、またはAEXHPLCとUV検出との組み合わせのいずれかで分析を行った。260nmでのUV検出トレースを定量分析に使用し、MSデータをRNA配列内の開裂部位同定に役立てた。AWatersXBridgeC18カラムをカラム温度65°Cで使用してIPRPHPLCを行った。1メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノールおよび16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95メタノール中の組成Aを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った。1B→18Bの30分での勾配を使用した。BDionexDNAPac200カラム上にて50°Cで、10ACNを含有するpH11の20mMリン酸緩衝液を使用してAEXHPLCを行った。溶離液Bは、溶離液A中に1MNaBrを含有した。25→62Bの18分での勾配を使用した。表4二本鎖および残りの無傷鎖をDNaseIIに対するそれらの安定性について評価したキー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、fが続く大文字A、C、G、Uは2フルオロヌクレオチドを示す。小文字pは5リン酸を示す。は逆位デオキシチミジンを表す。ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。dTはデオキシチミジンとする。は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。結語A少なくとも1個の2OHヌクレオチドを含有するRNA鎖が環状五価中間体を介して速やかに分解することで、5開裂生成物において23環状リン酸が生じる。五価中間体の形成は、例えば2デオキシ、2OMeまたは2Fのような2OH基を欠くヌクレオチドを使用して阻害することができる。Bさらに、RNAは、5末端ヌクレオチドに対する2修飾とは無関係の5エキソヌクレアーゼ経路を介して分解する。この分解経路は、例えばC6アミノリンカーまたは第1のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエートのような5末端非ヌクレオチド部分を使用して阻害することができる。C5リン酸基は、エキソヌクレアーゼ開裂動態を減速させるが、この末端において出発する分解を完全に遮断することはできない。これはほぼ間違いなく、ホスファターゼ、またはDNaseII酵素の固有のホスファターゼ活性のいずれかによる、5リン酸の開裂が理由である。DRNA鎖の最善の保護は、2OHヌクレオチドを含有しないオリゴヌクレオチドであって、ホスホロチオエート結合により第2のヌクレオチドに接続される5末端の2OMeヌクレオチドで出発するオリゴヌクレオチドによって実現された。他の末端非2OHヌクレオチドも5エキソ分解に対して保護するが、2OMe修飾に比べてその程度は低い。実施例422OH残基を欠くsiRNAのインビボノックダウン活性DPCGalNacと同時投与される因子VII標的化siRNAを注射したマウスを用いてインビボ実験を行った。表5aインビボ実験用のsiRNAの配列キー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、fが続く大文字A、C、G、Uは2フルオロヌクレオチドを示す。小文字pは5リン酸を示す。は逆位デオキシチミジンを表す。ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。dTはデオキシチミジンとする。は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。GalNAcは式の構造を意味する。センス鎖およびアンチセンス鎖上に2OMe2Fの交互パターンを有するFVIIsiRNAを、アンチセンス上に5末端2OMeヌクレオチドとし、センス鎖上に5末端2F鎖として作成した。両方の鎖を3末端オーバーハングにおけるinvで保護する。アンチセンス鎖は、siRNAの活性を維持するための5リン酸基を有していた。センス鎖の5末端にGalNAcパルミトイルリガンドを結合させることで、これらの細胞上で発現するアシアロ糖タンパク質受容体による肝細胞に対する標的化を可能にした。マウスにおいてsiRNAをGalNAc標的化PBAVE送達用ポリマーと同時投与した。肝ホモジネートからQuantiGene10分岐DNAアッセイキットを使用してFVIImRNA測定を行った。剖検において肝組織1~2gを液体窒素中でスナップ凍結させた。凍結組織をドライアイス上で乳鉢および乳棒によって粉末化した。組織15~25mgを冷却15mL反応管に移し、MilliQ水中に予め希釈した13溶解混合物1mLおよびプロテイナーゼK33μLを加え、組織を出力30~50で数秒間の超音波処理によって溶解させた。溶解液を分析まで80°Cで保存した。mRNA分析のために、溶解液を解凍し、プロテイナーゼKと共に65°Cでのサーモミキサー中、1000rpmで15分間消化した。FVIIおよびGAPDHmRNAレベルを、QuantiGene10bDNAアッセイキット試薬を製造者の推奨に従って使用して決定した。FVIImRNA発現を溶解液20μLおよびマウスFVIIプローブセットによって分析した。GAPDHmRNA発現を溶解液40μL、およびマウスと交差反応することがわかったドブネズミプローブセットによって分析した。アッセイ読み取りとして、アッセイの終わりの化学発光シグナルをVictor2Lightルミネセンスカウンター中で相対光単位として測定した。FVIImRNAのシグナルを同一の溶解液からのGAPDHmRNAのシグナルで割った。値は、GAPDHに対して正規化されたFVIImRNA発現として報告する。結果は、SEQIDNO対179166の投与の48時間後において79のFVIImRNAノックダウンを示す。対照的に、表5に示すように、2OHヌクレオチドを有するsiRNASEQIDNO対180168は著しいノックダウンを示さなかった。表5bインビボノックダウン研究の結果実施例432OH残基を欠くsiRNAの組織分布肝組織試料中のsiRNA濃度を、国際公開公報第2010043512号に記載の特許保護されたオリゴヌクレオチド検出方法を使用して決定した。簡潔に言えば、siRNA定量化は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な蛍光標識PNAプローブのハイブリッド形成とそれに続くAEXHPLCに基づく分離とに基づく。定量化は、インビボ実験において使用した2つのFVIIsiRNAの希釈系列から作成した外部検量線に対する蛍光検出によって行った。血漿試料では02~2μL、組織では約1mgのアリコートをHPLCシステムに注入した。2OHヌクレオチドを欠く安定化siRNAの肝組織分析は、ugg範囲での肝臓中の無傷アンチセンス鎖の高濃度を示したが、約95が5脱リン酸化不活性型で存在した。末端2OMeヌクレオチドを有する得られたRNAは、ホスホキナーゼhClp1によって細胞質内で再リン酸化される傾向がない。対照的に、2OH含有siRNAのアンチセンス鎖は投薬後の最初の6時間以内に組織中で完全に分解した。表62OHヌクレオチドを含有しない安定化siRNAの肝組織分析BDL=検出限界未満実施例44最適化された5末端を有するsiRNAのインビトロノックダウン活性アンチセンスの5末端において細胞内でリン酸化されることでRNAiコンピテント種を生じさせることが可能なsiRNAを同定するために、FVIIsiRNAのさらなるインビトロスクリーンを行った。このスクリーンからのすべてのsiRNAを表7に示す。2OMe2Fの交互修飾パターンは、アンチセンス鎖の5末端における最初2個のヌクレオチドにおける各種修飾を除けば、第一世代設計と同一であった。アンチセンス鎖の2個の5末端ヌクレオチドは、さらなる5リン酸または5ホスホチオエートありまたはなしの各種組み合わせにおける2Fまたは2デオキシ修飾ヌクレオチドとして作成された。すべてのsiRNAを、ノックダウン活性についてマウス初代培養肝細胞の形質移入後にLipofectamine2000を製造者の説明書に従って使用して用量反応でスクリーニングした。2つのsiRNAはIC50値に関して親二本鎖と同程度に活性であり、1つは5末端2Fおよびリン酸基を有し、1つは2個の5末端2デオキシヌクレオチドおよび5ホスホロチオエートを有していた。これらはいずれも、第1の動物実験において使用した末端2OMeヌクレオチドを有するsiRNAに比べて約5~6倍活性が高い。実施例45最適化された5末端を有するsiRNAのインビトロ5リン酸化表7に列挙した5リン酸または5ホスホロチオエートを有さないすべてのsiRNAを、リン酸化についてHeLaS100細胞抽出物中でhClp1によって評価した。WeitzerおよびMartinez213321372007に記載のようにS100HeLa抽出物から5リン酸化を分析した。5mMATPを含有するS100HeLa抽出物中での1μMsiRNAのインキュベーションの直後に、溶液をIPRPHPLCまたはAEXHPLCのいずれかによって試料溶液5μLの注入による変性条件下で分析した。AWatersXBridgeC18カラムをカラム温度65°Cで使用してIPRPHPLCを行った。1メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノールおよび16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95メタノール中の組成Aを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った。1B→18Bの30分での勾配を使用した。BDionexDNAPac200カラム上にて50°Cで、10ACNを含有するpH11の20mMリン酸緩衝液を使用してAEXHPLCを行った。溶離液Bは、溶離液A中に1MNaBrを含有した。25→62Bの18分での勾配を使用した。表7IC50値5リン酸化比をsiRNAの各鎖について260nmでのUVトレースから以下の等式を使用して計算する。=100PA5リン酸化鎖表8は、2OMeヌクレオチドが5末端に位置しない場合、siRNAのアンチセンス鎖を5リン酸化することができないことを示す。対照的に、2F、2デオキシまたは2OHヌクレオチドが5末端において組み込まれている場合、アンチセンス鎖は5リン酸化されやすい。インビトロアッセイにおいて親SEQIDNO対182168と同程度に活性であった2つのsiRNAは、合成的に導入された5リン酸5PTO基がインビボで例えばホスファターゼによって開裂する時点で5リン酸化されやすい。表8S100HeLa細胞抽出物中での4時間のインキュベーション後の5リン酸化鎖の割合キー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、fが続く大文字A、C、G、Uは2フルオロヌクレオチドを示す。は逆位デオキシチミジンを表す。ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。dTはデオキシチミジンとする。実施例46最適化された5末端を有するsiRNAのインビトロDNAseII安定性すべてのアンチセンス鎖を実施例41に記載のようにDNAseII安定性についてスクリーニングした。親二本鎖と同程度に活性であったsiRNAに存在する2つのアンチセンス鎖は、DNAseII開裂IIに対して安定である。表920時間のインキュベーション後のDNaseIIに対するsiRNAのインビトロ安定性実施例47最適化された5末端を有するsiRNAのインビボノックダウン活性最適化された5末端によるインビトロでの向上がインビボ状況に移転されるか否かを評価するために、本発明者らは、選択されたsiRNAのGalNAcパルミトイル複合体によるさらなるマウス実験を行った。第1のマウス実験について記載の理想的条件下でSiRNAを投与した。FVIIレベルの測定のために、マウスからの血漿試料を、標準的手順に従って顎下出血によって0109molLクエン酸ナトリウム抗凝固剤を収容する微量遠心管中に血液を採取することで調製した。血漿中のFVII活性を発色合成基質法によってBIOPHENVIIキットを製造者の推奨に従って使用して測定した。比色展開の吸光度を、405nmでTecanSafire2マイクロプレートリーダーを使用して測定した。調査されたsiRNAは、インビトロスクリーニング結果と完全に一致して、インビボ活性の向上を示した。血清中のFVII活性の減少は、投薬48時間後の両siRNAでは80超であり、これに比べて第一世代siRNA設計を使用した場合では49であった。この結果は、合成的に作成された5リン酸または5ホスホチオエート基をホスファターゼがインビボで開裂させる場合の、有効にリン酸化可能なアンチセンス鎖上の5末端ヌクレオチドの重要性を明らかに強調する。初期設計において使用されている、または古典的なsiRNAとのインビトロ比較に基づいてより強力なsiRNA設計として文献に記載されている5末端2OMeヌクレオチドの場合、インビボでの合成リン酸の開裂は対応するsiRNAの効力の強力な減少を導く。表10最適化された5末端を有するsiRNAのインビボノックダウン活性キー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、fが続く大文字A、C、G、Uは2フルオロヌクレオチドを示す。小文字pは5リン酸を示す。は逆位デオキシチミジンを表す。ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。GalNAcは式の構造を意味する。実施例48最適化された3末端を有するsiRNAのインビトロノックダウン活性DNaseIIに対して安定なsiRNAの活性をさらに増大させるために、3オーバーハングのSAR研究を行った。センス鎖またはアンチセンス鎖3オーバーセンス上のinvdT、dTinvdTまたはdTsdTの各種組み合わせをAha1およびEGFP標的化siRNAに適用し、最も強力なsiRNAにおける両3末端の組成について対で比較した。すべてのsiRNAを、ノックダウン活性についてマウス初代培養肝細胞の形質移入後にLipofectamine2000を製造者の説明書に従って使用して用量反応でスクリーニングした。表11異なる3末端を有するEGFP標的化siRNAのインビトロノックダウン活性表12異なる3末端を有するAha1標的化siRNAのインビトロノックダウン活性アンチセンス鎖上に2個のヌクレオチドdTsdTオーバーハングを有するsiRNAが、アンチセンスの3末端において単一のinvdTオーバーハングを有するsiRNAよりも常に優れて機能することがわかった。3オーバーハングとしての単一のinvdTオーバーハングで修飾されたセンス鎖を有する組み合わせがさらに有益であった。実施例49非ヒト霊長類におけるsiRNAのインビボノックダウン活性DPCの調製および投薬ポリマー149RAFTをジスルフィド結合を通じて指示されたsiRNA標的化凝固因子VIIに41重量重量比で共有結合させた後、ポリマーsiRNA複合体をCDMPEGCDMNAGの21重量重量混合物によって7x重量重量比で修飾することで、DPCを調製した。カニクイザルにDPC1mgkgおよび指示されたsiRNA025mgkgを投薬した。1匹の動物は、siF7SEQIDNO対151152を含有するDPCを受け取り、2匹の動物は、siF7SEQIDNO対253254を含有するDPC、1および2を受け取り、2匹の動物は、SEQIDNO対251255を含有するDPC、1および2を受け取った。F7値を2つの投薬前値の平均に正規化した。SEQIDNO対253254またはSEQIDNO対251255を含有するDPCを受け取った動物は、SEQIDNO対251252を受け取った動物よりも大きなF7ノックダウンレベルおよび長いPTを有した。DPC注射手順各注射手順において、ケタミンとデクスメデトミジンとの組み合わせを含有する筋肉内注射液を動物に投与し、手術室に移動させた。手術室において、動物を水ジャケット付きの加熱パッド上に置き、注射部位を剪毛し、消毒薬で準備した。静脈内カテーテルを体静脈に挿入し、DPC溶液を1~2分かけてゆっくりと注入した。パルスオキシメーターを使用して注射手順の途中および直後の心拍数および酸素飽和度をモニタリングした。各注射手順を行うには約20分を要した。注射後、カテーテルを除去し、静脈穿刺部位に緩やかな圧力を加えた。動物をケージに戻し、逆転薬アチパメゾールの筋肉内注射液を投与した。正常な活動を回復するまで動物をモニタリングした。採血手順遺伝子阻害、血液化学値、および肝損傷マーカーの測定用に血液試料を得た。これらの採血手順において、ケタミンとデクスメデトミジンとの組み合わせを含有する筋肉内注射液を動物に投与した。鎮静させた時点で、動物を携帯式手術台に移動させ、22ゲージ針およびシリンジを使用して大腿静脈から血液を採取した。採血直後に、圧力を静脈穿刺部位に加え、血液を分割して各血液検査に適した試料管に入れた。次に動物に逆転薬アチパメゾールの筋肉内注射液を投与し、ケージに戻した。任意の30日の期間において全血液量の20以下を抜き取った。各採血手順を行うには約10分を要した。因子VII活性測定非ヒト霊長類からの血液試料を、血清分離管を全血で満たして血液を室温で少なくとも20分間凝固させることで調製した。凝固後、血液管を9000rpmで3分間遠心分離し、アリコートしてエッペンドルフ管に入れ、アッセイするまで20°Cで保管した。血清中のF7活性を発色合成基質法によってBIOPHENVIIキットを製造者の推奨に従って使用して測定した。比色展開の吸光度を、405nmでTecanSafire2マイクロプレートリーダーを使用して測定した。凝固検査非ヒト霊長類からの血液試料を、クエン酸ナトリウム管を全血で完全に満たし、緩やかに混合して血餅形成を防ぐことで調製した。管を1時間以内に臨床試験室に運び、凝固アッセイを採取時間から4時間以内に行った。表13NHP実験に使用されるFVIIdsRNAキー小文字a、c、g、uは2Oメチルヌクレオチドとし、fが続く大文字A、C、G、Uは2フルオロヌクレオチドを示す。小文字pは5リン酸を示す。は逆位デオキシチミジンを表す。ホスホロチオエート結合は小文字sで記号化する。dTはデオキシチミジンとする。NH2C6は、センス鎖の5末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。両鎖上の単一のヌクレオチド3オーバーハングをセンス鎖上の3オーバーハングおよびアンチセンス鎖上のdTsdTオーバーハングを有する非対称siRNA設計に変化させるが、それ以外は修飾パターンを一定にすることは、非ヒト霊長類におけるより顕著な血清FVII減少、およびこの効果の著しく長い持続時間を導く。この観察は、予測される生物学的結果、すなわち、因子7減少の程度に対応するプロトロンビン時間に対するより顕著な効果によって裏付けられる。実施例50開裂性RNAリンカーを有するsiRNAのインビボノックダウン活性表14では、血清中のFVIIタンパク質阻害に基づくインビボ有効性を、マウスにおける同一の配列構成内でコレステロールまたはGalNAcパルミトイルsiRNA複合体を使用して比較した。インビボ実験を実施例42に記載のように行った。FVII阻害は、2OHヌクレオチドを含有しないコレステロール結合siRNAでは、GalNAcパルミトイル結合対応物に比べて強力に減少していた。対照的に、2OH含有siRNAでは、コレステロール複合体はGalNAcパルミトイル誘導体に比べて高いFVII阻害を導いた。記載されるインビボ実験に使用される小分子リガンドGalNAcパルミトイルおよびコレステロールは、センス鎖の5末端への非開裂性リンカーを介してsiRNAに接続される。センス鎖が2OHヌクレオチドを示す場合、リガンドはヌクレアーゼによって依然として開裂可能である。開裂反応は遊離siRNAを放出し、次に遊離siRNAは送達用ポリマーのエンドソーム攪乱活性によって細胞質中に放出される。センス鎖中に2OHヌクレオチドを欠くsiRNAでは、リガンドの開裂の引き金を引く酵素機構または化学機構がないことから、リガンドは二本鎖に安定して接続される。したがって、完全に安定なコレステロール結合siRNAは、親油性コレステロールリガンドの膜相互作用が理由で、細胞膜に捕捉されうる。細胞質中へのsiRNAの有効な放出には、組織中の高濃度のsiRNAであっても十分ではない。対照的に、比較的親油性が低いGalNAcパルミトイル結合siRNAは、細胞膜との比較的顕著ではない相互作用が理由で、細胞質中に放出されうる。このため、安定な非開裂性のGalNAcパルミトイルsiRNA複合体が、同一のsiRNAに結合されるコレステロールに比べて有効である。開裂性リンカー構築物を開発することは、安定コレステロール結合siRNAの膜捕捉に関する問題を回避するために役立つであろう。ジスルフィドリンカー化学構造の使用は、規定の開裂部位を導入するための魅力的な可能性として記載されている。しかし、開裂は細胞内の小器官を減少させることに限定されている。エンドソームリソソーム区画において開裂が遅いことが予測されることから、コレステロールジスルフィド結合siRNAの大部分は、非開裂性コレステロール複合体について記載のように、依然として膜に捕捉されうる。表14十分に確立されたジスルフィド開裂性リンカー化学構造以外の別の可能性としては、特定の位置で2OHヌクレオチドを使用することによる規定の開裂部位の発生がある。選択的位置での2OHヌクレオチドの導入は、RNA鎖からの複合体の開裂を実現するための新たなアプローチである。2OHヌクレオチドは、少なくとも1個の2OHヌクレオチドをRNA鎖の3または5末端において有する一本鎖オーバーハングを加えること、またはsiRNAの二本鎖領域内で2OHヌクレオチドを使用することによって実現することができる。エンドソームリソソームに存在するヌクレアーゼの酵素活性は、この位置において選択的に開裂を行う。第1の設計では、コレステロールを、3個の2OHヌクレオチドを含有する一本鎖オーバーハングを介して5末端においてセンス鎖に接続した。各種の開裂性リンカー化学構造を比較するコレステロール結合siRNAを表15に示す。すべてのsiRNAは同一の配列構成を有しており、リンカー化学構造のみが改変された。コレステロールを、3個の2OHヌクレオチドで構成される一本鎖オーバーハングを介して5末端においてセンス鎖に接続した。送達用ポリマーと同時投与した際に、このsiRNAは、マウスにおける血清中のFVIIの77下方制御を導いたが、これに比べて、安定結合コレステロールを有する同一のsiRNAを使用した場合、下方制御はわずか60であった。式Iaのリンカーを介してセンス鎖5末端に結合されたコレステロールを有する同一のsiRNAは、血清中のFVII活性の93減少を導いた。すべての結果は、マウスにおける送達用ポリマー15mgkgとコレステロール結合siRNA25mgkgとの同時投与によって実現された。これらの結果は、開裂性リンカーの使用が、2OHヌクレオチドを含有しないsiRNAのインビボでの効力を向上させることを示す。開裂性リンカーは、2OH含有ヌクレオチド、ジペプチド開裂モチーフ、またはジスルフィドリンカー化学構造のいずれかで構成されうる。すべての開裂性リンカー構築物は、コレステロール結合siRNAと緩徐エンドソーム放出送達用ポリマーとの同時投与設定においてインビボでの効力を向上させる。表15コレステロール結合siRNAの各種のリンカー化学構造のインビボ比較実施例51開裂性リンカーを有するsiRNAのインビトロ血清安定性開裂性リンカーの安定性をインビトロ安定性アッセイにおいて評価した。コレステロール結合センス鎖を90マウス血清中、37°Cにて様々な時点でインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリウム含有緩衝液中にプロテイナーゼKを加えることでインキュベーション反応を停止させた。処理は、RNA鎖の完全性に干渉することなくすべてのタンパク質および酵素を分解した。この溶液25μLを、260nmでのUV検出器に接続されたAEXHPLCシステム上に直接注入した。AEXHPLCを、DionexDNAPac200カラム上で75°Cにて、50ACNを含有するpH=8の20mMTris緩衝液を使用して行った。溶離液B中の800mMNaBrが溶離液塩として役立つ。25→62Bの18分での勾配を使用した。コレステロール含有一本鎖RNAは、260nmでブロードなピークとしてHPLCカラムから溶離する。コレステロールの開裂後、鋭い対称ピークがより短い保持時間で観察される。コレステロールの開裂速度を下記等式によって決定した。=100PA遊離RNAインビトロでは、3ntヌクレオチドオーバーハングが90マウス血清中にて1時間未満で定量的に開裂することが示された。オーバーハング中の2個のピリミジンヌクレオチドに対して3側で開裂が生じることで、2つの別々の開裂代謝物が得られる。対照的に、式1aのジペプチド含有リンカー、ジスルフィド結合コレステロールおよび安定結合コレステロールは、マウス血清中で完全に安定である。実施例52開裂性リンカーを有するsiRNAの組織分布これらの結果は、開裂性リンカーの使用が、2OHヌクレオチドを含有しないsiRNAのインビボでの効力を向上させることを示す。開裂性リンカーは、2OH含有ヌクレオチド、ジペプチド開裂モチーフ、またはジスルフィドリンカー化学構造のいずれかで構成されうる。すべての開裂性リンカー構築物は、コレステロール結合siRNAと緩徐エンドソーム放出送達用ポリマーとの同時投与設定においてインビボでの効力を向上させる。簡潔に言えば、siRNA定量化は、siRNA二本鎖のセンス鎖に相補的な蛍光標識PNAプローブのハイブリッド形成とそれに続くAEXHPLCに基づく分離とに基づく。定量化は、インビボ実験において使用した2つのFVIIsiRNAの希釈系列から作成した外部検量線に対する蛍光検出によって行った。血漿試料では02~2μL、組織では約1mgのアリコートをHPLCシステムに注入した。肝組織分析からの結果を表16に示す。siRNA含有量を分析した際に、肝組織中に存在するセンス鎖が、ジペプチドリンカーモチーフ、または無修飾リンカー配列AUCを有する3nt5オーバーハングのいずれかを使用する場合にコレステロールから定量的に開裂することがわかった。対照的に、肝臓中に存在するジスルフィド結合siRNAのわずか15が投薬後の最初の48時間以内にコレステロールから開裂し、安定結合コレステロールは全くsiRNAから開裂しない。肝組織中の無コレステロールsiRNAの絶対量を比較した際に、ジスルフィドリンカーとRNAAUCリンカーとで同様の量が観察され、これは投薬48時間後の同等のFVII血清活性とよく相関していた。ジペプチド結合コレステロールsiRNAによって達成される比較的低いFVII活性は、開裂無コレステロールsiRNAの比較的大きな絶対量と完全に相関している。肝臓内に送達される、センス鎖上にリンカーを備えたコレステロールsiRNA複合体の全量は、安定結合またはジスルフィド結合コレステロールに比べて約6倍少なく、ジペプチド結合コレステロールsiRNAに比べて約3倍少ない。組織中での存在の減少は、マウス血清とのインビトロインキュベーションにおいて示されるように、AUCリンカーが細胞内ヌクレアーゼの基質であるだけでなく、循環中に存在するヌクレアーゼの基質でもあるという事実に起因しうる。既に循環中にあるsiRNAからコレステロールリガンドが開裂する場合、得られたsiRNAは腎クリアランスを起こしやすく、組織中への送達なしに尿中に速やかに排出される。表16実施例53開裂性RNAリンカーを有するsiRNAのインビボノックダウン活性コレステロールsiRNA複合体を使用して、マウスにおいて実施例50に記載のようにインビボ実験を行った。実施例50では、コレステロールを、3個の2OHヌクレオチドを含有する実施例51に記載のように低い血清安定性を示した一本鎖オーバーハングを介して5末端においてセンス鎖に接続した。これは、実施例52に記載のように、血清安定性のあるリンカー化学構造に比べて明らかに減少した組織中濃度を導く。リンカー内での1個または2個のみの選択された2OHヌクレオチドと2OMeヌクレオチドとの組み合わせは、血清安定性の上昇を導くが、エンドソームリソソームに存在するヌクレアーゼに対する感受性を維持する。エンドソームリソソームに存在するヌクレアーゼの酵素活性は、2OHヌクレオチドの位置において選択的に開裂を行う。各種の開裂性ヌクレオチドリンカーモチーフを比較するコレステロール結合siRNAを表17にまとめて示す。すべてのsiRNAは同一の配列構成を有しており、リンカー化学構造のみが改変された。コレステロールを、変動しうる数の2OHおよび2OMeヌクレオチドを伴う3個または4個のヌクレオチドで構成される一本鎖オーバーハングを介してセンス鎖の5末端に接続した。すべてのsiRNAは、送達用ポリマーと同時投与した際に、マウスにおける血清のFVII下方制御を導いた。siRNAは、投薬後48時間で87、投薬後168時間で95の血清中FVII活性の減少を導いた。siRNAは、投薬後48時間で79、投薬後168時間で97の血清中FVII活性の減少を導いた。すべての結果は、マウスにおける送達用ポリマー15mgkgとコレステロール結合siRNA25mgkgとの同時投与によって実現された。表17コレステロール結合siRNAの各種のヌクレオチドリンカーモチーフのインビボ比較これらの結果は、血清中で安定でありかつエンドソームリソソーム中で開裂可能なヌクレオチドリンカーの使用が、血清に対して不安定なリンカーを有するsiRNAに比べてsiRNAのインビボ効力をさらに向上させることを示している。すべての開裂性リンカー構築物は、コレステロール結合siRNAと緩徐エンドソーム放出送達用ポリマーとの同時投与設定においてインビボでの効力を向上させる。以下の表では、実施例において使用されるsiRNAをまとめて示す。表18コア配列表19コア配列および修飾配列のマッピング