"式A:式中:R1およびR2は、独立して、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、独立して、ハロゲン、R、OR、SR、CN、CO2RまたはCONR2から選択され;Rは、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;L1はC4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが2であり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン化合物1;17Z,20Z-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-9-アミン化合物2;16Z,19Z-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-8-アミン化合物3;13Z,16Z-N,N-ジメチルドコサ-13,16-ジエン-5-アミン化合物4;12Z,15Z-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-4-アミン化合物5;14Z,17Z-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-6-アミン化合物6;15Z,18Z-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-7-アミン化合物7;18Z,21Z-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-10-アミン化合物8;15Ζ,18Ζ-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-5-アミン化合物9;14Z,17Z-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-4-アミン化合物10;19Z,22Z-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-9-アミン化合物11;18Z,21Z-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-8-アミン化合物12;17Z,20Z-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-7-アミン化合物13;16Z,19Z-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-6-アミン化合物14;22Z,25Z-N,N-ジメチルヘントリアコンタ-22,25-ジエン-10-アミン化合物15;21Z,24Z-N,N-ジメチルトリアコンタ-21,24-ジエン-9-アミン化合物16;18Z-N,N-ジメチルヘプタコス-18-エン-10-アミン化合物17;17Z-N,N-ジメチルヘキサコス-17-エン-9-アミン化合物18;19Z,22Z-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-7-アミン化合物19;およびN,N-ジメチルヘプタコサン-10-アミン化合物20;20Z,23Z-N-エチル-N-メチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン化合物21;1-[11Z,14Z-1-ノニリコサ-11,14-ジエン-1-イル]ピロリジン化合物22;20Z-N,N-ジメチルヘプタコス-20-エン-10-アミン化合物23;15Z-N,N-ジメチルヘプタコス-15-エン-10-アミン化合物24;14Z-N,N-ジメチルノナコス-14-エン-10-アミン化合物25;17Z-N,N-ジメチルノナコス-17-エン-10-アミン化合物26;24Z-N,N-ジメチルトリトリアコント-24-エン-10-アミン化合物27;20Z-N,N-ジメチルノナコス-20-エン-10-アミン化合物28;22Z-N,N-ジメチルヘントリアコント-22-エン-10-アミン化合物29;16Z-N,N-ジメチルペンタコス-16-エン-8-アミン化合物30;12Z,15Z-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン化合物31;13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘプタデカン-8-アミン化合物33;1-[1S,2R-2-ヘキシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルノナデカン-10-アミン化合物34;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ノナデカン-10-アミン化合物35;N,N-ジメチル-21-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘニコサン-10-アミン化合物36;N,N-ジメチル-1-[1S,2S-2-{[1R,2R-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン-10-アミン化合物37;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン-8-アミン化合物38;N,N-ジメチル-1-[1R,2S-2-ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン-5-アミン化合物39;N,N-ジメチル-3-{7-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン-1-アミン化合物401-[1R,2S-2-ヘプチルシクロプロピル]-N,N-ジメチルオクタデカン-9-アミン化合物41;1-[1S,2R-2-デシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルペンタデカン-6-アミン化合物42;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ペンタデカン-8-アミン化合物43;ならびに11E,20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,23-トリエン-10-アミン化合物44から選択されるカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32;であるカチオン性脂質またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体。請求項1に記載の式Aのカチオン性脂質、コレステロール、DSPCおよびPEG-DMGを含むLNP組成物。カチオン性脂質13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32、コレステロール、DSPCおよびPEG-DMGを含むLNP組成物。脂質ナノ粒子の調製のための請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子中の一成分としての請求項1に記載のカチオン性脂質の使用。オリゴヌクレオチドがsiRNAである、請求項9に記載の使用。本発明は、オリゴヌクレオチドを有する脂質ナノ粒子を形成するためのコレステロールおよびPEG-脂質などの他の脂質成分と組み合わせて使用され得る新規なカチオン性脂質を提供する。本発明の目的は、肝臓内低脂質レベルの結果、向上した有効性とともに低肝臓毒性を示すカチオン性脂質骨格を提供することである。本発明では、siRNAのインビボ送達の効率および耐容性を向上させるために、1つの短い脂質鎖を有する低分子量カチオン性脂質を使用する。本発明の種々の態様および実施形態は、オリゴヌクレオチド、特にsiRNAおよびmiRNAを任意の標的遺伝子に送達するための脂質ナノ粒子に有用な新規なカチオン性脂質の実用性に関するものである米国特許出願:米国特許出願公開第2006/0083780号明細書、同第2006/0240554号明細書、同第2008/0020058号明細書、同第2009/0263407号明細書および同第2009/0285881号明細書ならびにPCT特許出願:国際公開第2009/086558号パンフレット、同第2009/127060号パンフレット、同第2009/132131号パンフレット、同第2010/042877号パンフレット、同第2010/054384号パンフレット、同第2010/054401号パンフレット、同第2010/054405号パンフレットおよび同第2010/054406号パンフレット参照。また、SempleS.C.ら,RationaldesignofcationiclipidsforsiRNAdelivery,NatureBiotechnology,2010,28,172-176も参照のこと。本発明のカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。本発明の第1の実施形態において、カチオン性脂質は、式A:式中:R1およびR2は、独立して、H、C1~C6アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンから選択され、ここで、前記アルキル、ヘテロシクリルおよびポリアミンは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環は、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R3は、独立してHおよびC1~C6アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく;R’は、独立して、ハロゲン、R、OR、SR、CN、CO2RまたはCONR2から選択され;Rは、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはハロゲンおよびOHで置換されていてもよく;nは、0、1、2、3、4または5であり;L1はC4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよいで示されるもの、またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。第2の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが0であり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。第3の実施形態において、本発明は、R1およびR2が各々メチルであり;R3がHであり;nが2であり;L1が、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され;L2が、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される、式Aを有する化合物またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体を特色とする。具体的なカチオン性脂質は、20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン化合物1;17Z,20Z-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-9-アミン化合物2;16Z,19Z-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-8-アミン化合物3;13Z,16Z-N,N-ジメチルドコサ-13,16-ジエン-5-アミン化合物4;12Z,15Z-N,N-ジメチルヘニコサ-12,15-ジエン-4-アミン化合物5;14Z,17Z-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-6-アミン化合物6;15Z,18Z-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-7-アミン化合物7;18Z,21Z-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-10-アミン化合物8;15Ζ,18Ζ-N,N-ジメチルテトラコサ-15,18-ジエン-5-アミン化合物9;14Z,17Z-N,N-ジメチルトリコサ-14,17-ジエン-4-アミン化合物10;19Z,22Z-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-9-アミン化合物11;18Z,21Z-N,N-ジメチルヘプタコサ-18,21-ジエン-8-アミン化合物12;17Z,20Z-N,N-ジメチルヘキサコサ-17,20-ジエン-7-アミン化合物13;16Z,19Z-N,N-ジメチルペンタコサ-16,19-ジエン-6-アミン化合物14;22Z,25Z-N,N-ジメチルヘントリアコンタ-22,25-ジエン-10-アミン化合物15;21Z,24Z-N,N-ジメチルトリアコンタ-21,24-ジエン-9-アミン化合物16;18Z-N,N-ジメチルヘプタコス-18-エン-10-アミン化合物17;17Z-N,N-ジメチルヘキサコス-17-エン-9-アミン化合物18;19Z,22Z-N,N-ジメチルオクタコサ-19,22-ジエン-7-アミン化合物19;およびN,N-ジメチルヘプタコサン-10-アミン化合物20;20Z,23Z-N-エチル-N-メチルノナコサ-20,23-ジエン-10-アミン化合物21;1-[11Z,14Z-1-ノニリコサ-11,14-ジエン-1-イル]ピロリジン化合物22;20Z-N,N-ジメチルヘプタコス-20-エン-10-アミン化合物23;15Z-N,N-ジメチルヘプタコス-15-エン-10-アミン化合物24;14Z-N,N-ジメチルノナコス-14-エン-10-アミン化合物25;17Z-N,N-ジメチルノナコス-17-エン-10-アミン化合物26;24Z-N,N-ジメチルトリトリアコント-24-エン-10-アミン化合物27;20Z-N,N-ジメチルノナコス-20-エン-10-アミン化合物28;22Z-N,N-ジメチルヘントリアコント-22-エン-10-アミン化合物29;16Z-N,N-ジメチルペンタコス-16-エン-8-アミン化合物30;12Z,15Z-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン化合物31;13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘプタデカン-8-アミン化合物33;1-[1S,2R-2-ヘキシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルノナデカン-10-アミン化合物34;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ノナデカン-10-アミン化合物35;N,N-ジメチル-21-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘニコサン-10-アミン化合物36;N,N-ジメチル-1-[1S,2S-2-{[1R,2R-2-ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン-10-アミン化合物37;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン-8-アミン化合物38;N,N-ジメチル-1-[1R,2S-2-ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン-5-アミン化合物39;N,N-ジメチル-3-{7-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン-1-アミン化合物401-[1R,2S-2-ヘプチルシクロプロピル]-N,N-ジメチルオクタデカン-9-アミン化合物41;1-[1S,2R-2-デシルシクロプロピル]-N,N-ジメチルペンタデカン-6-アミン化合物42;N,N-ジメチル-1-[1S,2R-2-オクチルシクロプロピル]ペンタデカン-8-アミン化合物43;ならびに11E,20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,23-トリエン-10-アミン化合物44またはその任意の薬学的に許容され得る塩もしくは立体異性体である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は脂質ナノ粒子の調製に有用である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、siRNAおよびmiRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。別の実施形態において、開示したカチオン性脂質は、siRNAの送達のための脂質ナノ粒子に有用な成分である。本発明のカチオン性脂質は、不斉中心、キラル軸およびキラル面E.L.ElielおよびS.H.Wilen,StereochemistryofCarbonCompounds,JohnWileySons,NewYork,1994,第1119~1190頁に記載を有するものであってもよく、ラセミ化合物、ラセミ混合物として、および個々のジアステレオマーとして存在し、可能なすべての異性体およびその混合物例えば、光学異性体は、本発明に含まれる。また、本明細書に開示したカチオン性脂質は互変異性体として存在するものであってもよく、たとえ一方の互変異性体構造しか図示していない場合であっても、両方の互変異性形態が本発明の範囲に包含されることを意図する。本発明のカチオン性脂質における置換基および置換パターンは、当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法ならびに以下に示す方法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように選択され得ることは理解されよう。置換基それ自体が1つより多くの基で置換されている場合、安定な構造がもたらされる限り、このような多数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことは理解されよう。当業者により、容易に入手可能な出発物質から当該技術分野で知られた手法によって容易に合成され得る化学的に安定なカチオン性脂質が得られるように、1個以上のSi原子が本発明のカチオン性脂質に組み込まれることがあり得ることは理解されよう。式Aの化合物において、原子は天然状態の同位体存在度を示すものであってもよく、1個以上の原子において、同じ原子番号を有するが原子量または質量数は自然界に主として見られる原子量または質量数と異なる特定の同位体を人為的に富化したものであってもよい。本発明は、式Aの化合物の適当なあらゆる同位体異型形態を含むことを意図する。例えば、水素Hの異なる同位体形態としては、プロチウム1Hおよびジューテリウム2Hが挙げられる。プロチウムは、自然界に主として見られる水素の同位体である。ジューテリウムの富化により、特定の治療上の利点インビボ半減期の増大もしくは必要投薬量の低減などがもたらされ得るか、または生物学的試料の特性評価のための標準として有用な化合物が得られ得る。式Aに含まれる同位体富化された化合物は、必要以上に実験を行うことなく、当業者によく知られた慣用的な手法によって、または本明細書のスキームおよび実施例に記載のものと同様のプロセスによって、適切な同位体富化試薬および/または中間体を用いて調製され得る。本明細書で用いる場合、アルキルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の飽和脂肪族炭化水素を意図する。本明細書で用いる場合、アルケニルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖、環状または分枝型の不飽和脂肪族炭化水素を意味し、限定されないが、ジエン、トリエンおよびテトラエン不飽和脂肪族炭化水素が挙げられる。環状アルキルまたはアルケニルの例としては、が挙げられる。本明細書で用いる場合、ヘテロシクリルまたは複素環は、O、NおよびSからなる群より選択される1~4個のヘテロ原子を含む4~10員の芳香族または非芳香族複素環を意味し、二環式基を包含する。したがって、ヘテロシクリルとしては、以下のもの:ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノオキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにそのN-オキシドが挙げられ、これらはすべて、Rから選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。本明細書で用いる場合、ポリアミンは、2つ以上のアミノ基を有する化合物を意味する。例としては、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、およびスペルミンが挙げられる。本明細書で用いる場合、ハロゲンはBr、Cl、FおよびIを意味する。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、HおよびC1~C6アルキルから選択され、ここで、前記アルキルはR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、R’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1およびR2は、これらが結合している窒素と一体となって、該窒素に加えてN、OおよびSから選択される1個または2個のさらなるヘテロ原子を含むものであってもよい4~7員の単環式複素環を形成していてもよく、前記単環式複素環はR’から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。式Aの一実施形態において、R1およびR2は各々、メチルである。式Aの一実施形態において、R3は、独立して、Hおよびメチルから選択される。式Aの一実施形態において、R3はHである。式Aの一実施形態において、R’はRである。式Aの一実施形態において、Rは、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択され、ここで、前記メチル、エチルおよびプロピルは、1つ以上のハロゲンおよびOHで置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、Rは、独立して、H、メチル、エチルおよびプロピルから選択される。式Aの一実施形態において、nは0、1、2または3である。式Aの一実施形態において、nは0、1または2である。式Aの一実施形態において、nは0、1または2である。式Aの一実施形態において、nは0である。式Aの一実施形態において、nは2である。式Aの一実施形態において、L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C4~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1は、C12~C24アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L1はC19アルケニルである。式Aの一実施形態において、L1は:である。式Aの一実施形態において、L1は:である。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルこれらはハロゲンおよびOHで置換されていてもよいから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C5~C9アルキルおよびC5~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2は、C7~C9アルキルおよびC7~C9アルケニルから選択される。式Aの一実施形態において、L2はC3~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC5~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC7~C9アルキルである。式Aの一実施形態において、L2はC9アルキルである。式Aの一実施形態において、L1は、C4~C24アルキルおよびC4~C24アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2は、C3~C9アルキルおよびC3~C9アルケニルから選択され、前記アルキルおよびアルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、L1はC12~C24アルケニルから選択され、前記アルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2はC5~C9アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、L1はC19アルケニルから選択され、前記アルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2はC7~C9アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、L1はC19アルケニルから選択され、前記アルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2はC9アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、L1は直鎖C19アルケニルから選択され、前記アルケニルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよく;L2は直鎖C9アルキルから選択され、前記アルキルは、R’から選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。式Aの一実施形態において、ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの一実施形態において、単環式ヘテロシクリルは、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、イミダゾールまたはピペラジンである。式Aの一実施形態において、ポリアミンは、プトレシン、カダベリン、スペルミジンまたはスペルミンである。一実施形態において、アルキルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖飽和脂肪族炭化水素である。一実施形態において、アルケニルは、指定された数の炭素原子を有する直鎖不飽和脂肪族炭化水素である。本発明は、遊離形態の式Aのカチオン性脂質、ならびにその薬学的に許容され得る塩および立体異性体を含む。本明細書において例示した具体的な単離されたカチオン性脂質のいくつかは、アミンであるカチオン性脂質のプロトン化された塩である。用語遊離形態は非塩形態のアミンであるカチオン性脂質をいう。包含される薬学的に許容され得る塩には、本明細書に記載した具体的なカチオン性脂質について例示した単離された塩だけでなく、遊離形態の式Aのカチオン性脂質の典型的なあらゆる薬学的に許容され得る塩も包含される。記載した具体的な塩であるカチオン性脂質の遊離形態は、当該技術分野で知られた手法を用いて単離され得る。例えば、遊離形態は、その塩を、希釈した適当な塩基水溶液希釈した水性NaOH、炭酸カリウム、アンモニアおよび重炭酸ナトリウムなどで処理することにより再生させたものであり得る。遊離形態は、そのそれぞれの塩形態と特定の物性極性溶媒中への溶解性などが幾分異なり得るが、その酸と塩基の塩は、その他の点では、本発明の解釈上、そのそれぞれの遊離形態と薬学的に等価である。本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性または酸性の部分を含む本発明のカチオン性脂質から、慣用的な化学的方法によって合成され得る。一般的に、塩基性のカチオン性脂質の塩は、イオン交換クロマトグラフィー、または遊離塩基を化学量論量もしくは過剰の所望の塩形成無機酸もしくは有機酸と適当な溶媒中もしくは種々の溶媒の組合せ中で反応させることのいずれかによって調製される。同様に、酸性化合物の塩は、適切な無機塩基または有機塩基との反応によって形成される。したがって、本発明のカチオン性脂質の薬学的に許容され得る塩は、塩基性の本発明のカチオン性脂質を無機酸または有機酸と反応させることにより形成される本発明のカチオン性脂質の慣用的な無毒性の塩を包含する。例えば、慣用的な無毒性の塩としては、無機酸例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などから得られるもの、ならびに有機酸例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ-安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸TFAなどから調製される塩が挙げられる。本発明のカチオン性脂質が酸性である場合、好適な薬学的に許容され得る塩は、薬学的に許容され得る無毒性の塩基例えば、無機塩基および有機塩基からform調製される塩をいう。無機塩基から得られる塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などが挙げられる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウムの塩である。薬学的に許容され得る無毒性の有機塩基から得られる塩としては、第1級、第2級および第3級アミン、置換アミン天然に存在する置換アミンを含む、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタインカフェイン、コリン、N,N1-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミントリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。上記の薬学的に許容され得る塩および他の典型的な薬学的に許容され得る塩の調製は、Bergら,PharmaceuticalSalts,J.Pharm.Sci.,1977:66:1-19により充分に記載されている。また、生理学的条件下では本化合物内の脱プロトン化された酸性部分カルボキシル基などがアニオン性となることがあり得、そのため、この電子電荷によって分子内で、プロトン化またはアルキルされた塩基性部分第4級窒素原子などのカチオン電荷に対するバランスが崩れることがあり得るため、本発明のカチオン性脂質は、分子内internal塩または両性イオンとなる可能性があることに注意されたい。ここに示す実施例は、本発明のさらなる理解の補助を意図するものである。具体的な使用材料、種および条件は、さらなる実例を意図するものであって、本発明の妥当な範囲を限定するものではない。カチオン性脂質の合成に使用した試薬は、市販のもの、または当業者によって容易に調製されるもののいずれかである。新規な本カチオン性脂質の合成は、脂質酸Iを出発物質とする線形プロセスである。N,O-ジメチルヒドロキシルアミンにカップリングさせると、ワインレブアミドIIが得られる。グリニャール付加によりケトンIIIが生成される。チタン媒介性還元的アミノ化によりIVの型の最終生成物が得られる。一般スキーム1単一炭素ホモログ化カチオン性脂質Vの合成は、脂質ケトンIIIを出発物質とする線形プロセスである。該ケトンのニトリルVへの変換は、TOSMICおよびカリウムtert-ブトキシドでの処理によって行われる。該ニトリルを第1級アミンに還元した後、還元的アミノ化を行うと最終のカチオン性脂質VIが得られる。一般スキーム2二炭素ホモログ化カチオン性脂質IXの合成は、脂質ケトンIIIを出発物質とする線形プロセスである。該ケトンのα,β-不飽和アミドVIIへの変換は、ピーターソン条件下で行われる。該α,β-不飽和の共役還元は、LS-セレクトリドを用いて行われ、アミドVIIIが得られる。該アミドを水素化アルミニウムリチウムで還元すると、最終のカチオン性脂質IXが得られる。一般スキーム3シクロプロピル含有脂質は一般スキーム4に従って調製される。不飽和ワインレブアミドIIをシモンズスミスシクロプロパン化条件に供すると、シクロプロピル含有ワインレブアミドXが得られる。これを、一般スキーム1~3に概略を示したようにして最終生成物にする。一般スキーム4アリル型アミンカチオン性脂質XVIの合成は、アルデヒドXIを出発物質とする線形プロセスである。酢酸t-ブチルを付加すると、β-ヒドロキシエステルXIIが生成される。該ヒドロキシル官能部をフルオロ基に変換させた後、酸処理を行うと、β-フルオロ酸XIIIが生成される。この酸をワインレブアミドに変換させた後、グリニャール付加を行うと、β-フルオロケトンXVが得られる。還元的アミノ化によって同時に脱離がもたらされ、所望のアリル型アミンXVIが生成される。一般スキーム520,23-ノナコサジエン-10-アミン,N,N-ジメチル-,20Z,23Z化合物111,14-エイコサジエン酸,11Z,14Z-50g,162mmol、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩31.6g,324mmol、HOAt44.1g,324mmol、Et3N45.2mL,324mmol、およびEDC62.1g,324mmolをDCM810mL中で混合し、周囲温度で一晩撹拌した。次いで、反応液を5×700mLの水で洗浄し、次いで1×600mLの1MNaOH洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライトに通して濾過し、エバポレートし、53.06g93の11,14-エイコサジエンアミド,N-メトキシ-N-メチル-,11Z,14Zを透明な金色の油状物として得た。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.35m,4H、3.68s,3H、3.18s,3H、2.77m,2H、2.41t,J=7Hz,2H、2.05m,4H、1.63m,2H、1.40-1.26m,18H、0.89t,J=7Hz,3H。11,14-エイコサジエンアミド,N-メトキシ-N-メチル-,11Z,14Z-14g,11.38mmolを、250mL容フラスコ内の乾燥THF50.0mlに溶解させ、次いで、1Mのノニルマグネシウムブロミド22.76ml,22.76mmolを窒素下、周囲温度で添加した。10分後、過剰の飽和水性NH4Clで反応液をゆっくりクエンチした。反応液を分液漏斗内でヘキサンと水にて洗浄し、振り、下側の水層を廃棄し、上側の層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートし、粗製ケトンを金色の油状物として得た。上記の粗製ケトンに、ジメチルアミンTHF中2M14.22ml,28.4mmolを添加した後、TiO-i-Pr46.67ml,22.76mmolを添加し、一晩撹拌状態にした。翌日、EtOH50mlを添加した後、NaBH40.646g,17.07mmolを添加した。5分間の撹拌後、全反応液を、330gシリカカラムとインラインの40gシリカカラムに直接注入した。10分間は100DCMで、次の30分間は0から15のMeOH/DCMで溶出させると、20,23-ノナコサジエン-10-アミン,N,N-ジメチル-,20Z,23Z12.45g,5.47mmol,48.1収率がかすかに金色の油状物として収集された。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.35m,4H、2.78m,2H、2.23m,1H、2.21s,6H、2.05m,4H、1.45-1.16m,38H、0.89m,6H.HRMSC31H61Nの計算値448.4877,実測値448.4872。化合物2~30は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム1に従って調製した。12Z,15Z-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミン化合物31ケトンiii4.0g,9.55mmol、TOSMIC2.4g,12.4mmolを含むジメトキシエタン45mLの溶液を0°Cまで冷却し、カリウムtert-ブトキシド19.1mmol,19.1mLの1MのtBuOH溶液で処理した。90分後、反応液をヘキサンと水間に分配した。有機部分を水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。この物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し0から5までのEtOAc/ヘキサン、所望の生成物を得た約20の出発物質s.m.を含有。この混合物を、そのままの状態で次の工程に持ち越した。LC/MSMH=430.6。水素化アルミニウムリチウム23.9mmol,23.9mLの1MのTHF溶液をニトリルv3.42g,8mmolに直接、周囲温度で添加し、反応液を20分間撹拌した。反応液を100mLのTHFで希釈し、0°Cまで冷却し、硫酸ナトリウム十水和物溶液を用いて注意深くクエンチした。固形物を濾別し、THFで洗浄した。濾液を真空にてエバポレートし、直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。LC/MSMH=434.6。第1級アミン3.45g,6.2mmolのジクロロエタン100mL溶液をホルムアルデヒド1.6mL,21.7mmolで処理した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム6.6g,31mmolで処理した。5分後、反応液をジクロロメタンと1NNaOH間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。粗製混合物を分取用逆相クロマトグラフィーC8カラムによって精製し、12Z,15Z-N,N-ジメチル-2-ノニルヘニコサ-12,15-ジエン-1-アミンを得た。HRMS計算値462.5033,実測値462.5026。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.35m,4H、2.782H,t,J=5.6Hz、2.18s,6H、2.05m,6H、1.3m,39H、0.89m,6H。13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32シリルアミドのピーターソン試薬3.1g,16.7mmolをTHF35mLに溶解させ、-63°Cまで冷却した。この溶液にnBuLi16.7mmol,6.7mLの2.5M溶液を添加した。反応液を周囲温度まで30分間昇温させた。ケトン5.0g,11.9mmolを第2のフラスコ内のTHF25mLに溶解させた。このケトン溶液をピーターソン試薬に、温度を-60°C~-40°Cに維持しながら30分間にわたって移した。反応液を-40°Cまで1時間昇温させ、次いで、0°Cまで30分間昇温させた。重炭酸ナトリウムを用いて反応液をクエンチし、さらに水で希釈し、水/ヘキサン間に分配した。有機部分をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュクロマトグラフィーによって精製し0から40までのMTBE/ヘキサン、α,β-不飽和アミドviiを得た。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.75s,1H、5.36m,4H、3.01s,3H、2.99s,3H、2.78t,2H、2.28t,2H、2.05m,6H、1.35m,34H、0.89m,6H。α,β-不飽和アミドvii1g,2.1mmolとLS-セレクトリド4.1mmol,4.1mLの1M溶液を密封チューブ内で合わせ、60°Cまで24時間加熱した。反応液を周囲温度まで冷却し、塩化アンモニウム溶液とヘプタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートし、アミドviiiを得た。この中間体を直接、次の反応に粗製状態で持ち越した。α,β-不飽和アミドviiの択一的な共役還元は、水素化銅での還元の使用を伴うものである。5L容RB内で、銅触媒9.77g,17.13mmolを窒素下でトルエン1713mlに溶解させた。これに、PMHSAldrich製304ml,1371mmolを一気に添加した。反応液を5分間熟成させた。この溶液に、α,β-不飽和アミドvii167.16g、343mmolを添加した。次いで、この混合物にt-アミルアルコール113ml,1028mmolをシリンジポンプによって3時間にわたって添加した。添加終了後、この溶液に約1700mLの20NH40Hを少量に分けて添加して反応rxnさせた。注意:クエンチの初めに激しい発泡および起泡が見られ、これは、しっかりとモニタリングしなければならず、水酸化アンモニウムは少量に分けてゆっくり添加しなければならない。反応液を水とヘキサン間に分配した。有機部分をセライトに通して濾過し、真空にてエバポレートした。得られたゴム状固形物質を、機械的撹拌器を用いてヘキサン中で粉砕し、小さな粒状物を得、次いで、これを濾過し、ヘキサンで洗浄した。次いで、有機部分を真空にてエバポレートし、フラッシュクロマトグラフィーによって精製しシリカ,0から15までの酢酸エチル/ヘキサン、所望のアミドviiiを得た。LC/MSMH=490.7。アミドviii2.85g,5.8mmolの溶液に、水素化アルミニウムリチウム8.7mmol,8.7mLの1M溶液を添加した。反応液を周囲温度で10分間撹拌し、次いで、硫酸ナトリウム十水和物溶液をゆっくり添加することによってクエンチした。固形物を濾過し、THFで洗浄し、濾液を真空にてエバポレートした。粗製混合物を分取用逆相クロマトグラフィーC8カラムによって精製し、13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32を油状物として得た。HRMSMH計算値476.5190,実測値476.5189。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.37m,4H、2.78t,2H、2.42m,8H、2.05q,4H、1.28m,41H、0.89m,6H。N,N-ジメチル-1-2-オクチルシクロプロピルヘプタデカン-8-アミン化合物330°Cまで冷却したオレイン酸1g,3.5mmolのDCM500mL溶液に、CDI0.63g,3.9mmolを添加した。反応液を周囲温度まで30分間昇温させた後、0°Cまで冷却し、まずトリエチルアミン0.39g,3.9mmolで、次いでジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩0.38g,3.9mmolで処理した。1時間後、反応液を水とヘプタン間に分配した。有機部分を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートし、粗製ワインレブアミドiiを得、これを直接、次の反応に持ち越した。ジエチル亜鉛70.3mmol,70.3mLの1M溶液のジクロロメタン130mL溶液を-1°Cまで冷却し、TFA8.0g,70.3mmolの滴下にて処理した。30分後、ジヨードメタン18.8g,70.3mmolを添加し、これを氷浴内で30分間熟成させた。この溶液に、ワインレブアミドii7.6g,23.4mmolを添加した。反応液を周囲温度まで昇温させ、1時間撹拌した。塩化アンモニウム溶液100mLを用いて反応液をクエンチし、有機層を分配して取り出し、10チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。精製はフラッシュクロマトグラフィーとし0から30までのMTBE/ヘプタン、所望の生成物xを得た。1HNMR400MHz,CDCl3δ3.72s,3H、3.22s,3H、2.48t,2H、1.65m,2H、1.39m,22H、1.18m,2H、0.91t,3H、0.68m,2H、0.59m,1H、-0.32m,1H。ワインレブアミドxの化合物33への変換は、上記の化合物1について記載のものと同様の様式で行ったノニルグリニャール付加の後、還元的アミノ化。LC/MSMH=436.6.1HNMR400MHz,CDCl3δ2.25s,6H、1.30m,45H、0.91m,6H、0.68m,2H、0.59m,1H、-0.31m,1H。化合物34~43は新規なカチオン性脂質であり、上記の一般スキーム1~4に従って調製した。11E,20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,23-トリエン-10-アミン化合物44-78°Cまで冷却したLDA95mmol,47.5mLの2M溶液のTHF127mL溶液に、酢酸t-ブチルを添加した。反応液を15分間撹拌した後、アルデヒドxiを添加した。直ちに塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、周囲温度まで昇温させ、水/ペンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。LC/MSMH-tBu=325.4。ヒドロキシケトンxii7g,18.4mmolをジクロロメタン150mLに溶解させ、0°Cまで冷却し、デオキソフルオル7.3g,33.1mmolで処理した。反応液を撹拌しながら16時間、周囲温度まで昇温させた後、重炭酸ナトリウム溶液を用いてクエンチした。反応液を分配し、有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。フラッシュカラムクロマトグラフィーchromotagraphy0から5までの酢酸エチル/ヘキサンにより、β-フルオロエステルを得た。フルオロエステル中間体6g,15.6mmolジクロロメタン中を塩化水素157mmol,39.2mLの4Mのジオキサン溶液で処理し、反応液を周囲温度で16時間撹拌した。反応液を真空にてエバポレートし、所望のβ-フルオロ酸xiiiを得た。LC/MSMH=327.3。フルオロカルボン酸xiii5.1g,15.7mmol、EDC6.0g,31.4mmol、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩3.1g,31.4mmol、トリメチルアミン4.0g,39.2mmol、およびHOAt4.3g,31.4mmolをDCM78mL中で合わせ、周囲温度で16時間撹拌した。反応液を水/DCM間に分配し、有機部分を水3×とNaOH溶液1×で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。粗製物質を分取用逆相クロマトグラフィーによって精製し、所望のワインレブアミドxivを得た。LC/MSMH=370.4。ワインレブアミドxiv4.3g,11.7mmolのTHF50mL溶液を、ノニルマグネシウムブロミド23.4mmol,23.4mLの1M溶液で周囲温度にて処理した。1時間後に塩化アンモニウム溶液を用いて反応液をクエンチし、水とペンタン間に分配した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空にてエバポレートした。この物質を次の工程に粗製状態で持ち越した。ケトンxv5.1g,11.7mmolをジメチルアミン29.3mmol,14.7mLの2MのTHF溶液とチタンIVイソプロポキシド6.7g,23.5mmolで処理し、反応液を周囲温度で16時間撹拌した。反応混合物にエタノール50mLを添加した後、水素化ホウ素ナトリウム0.67g,17.6mmolを添加した。反応液を直接シリカカラムに負荷し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した0から15までのMeOH/DCM。この物質は、11E,20Z,23Z-N,N-ジメチルノナコサ-11,20,23-トリエン-10-アミンを得るために分取用逆相クロマトグラフィーによる2回目の精製が必要であった。HRMS計算値446.4720,実測値446.4724。1HNMR400MHz,CDCl3δ5.48m,1H、5.37m,4H、5.23m,1H、2.78t,2H、2.58m,1H、2.22s,6H、2.04m,6H、1.56m,1H、1.30m,31H、0.89m,6H。化合物45は、NatureBiotechnology,2010,28,172-176、国際公開第2010/042877号パンフレット、同第2010/048536号パンフレット、同第2010/088537号パンフレット、および同第2009/127060号パンフレットに記載のDLinKC2DMAである。化合物46は、国際公開第2010/054401号パンフレット、および同第2010/144740号パンフレットに記載のMC3である。LNP組成物以下の本発明の脂質ナノ粒子組成物LNP:カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG56.6/38/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG60/38/2;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG67.3/29/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG49.3/47/3.7;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG50.3/44.3/5.4;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-C-DMA/DSPC40/48/2/10;カチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC40/48/2/10;およびカチオン性脂質/コレステロール/PEG-DMG/DSPC58/30/2/10は、オリゴヌクレオチド、具体的にはsiRNAおよびmiRNAの送達に有用である。LNPプロセスの説明:脂質ナノ粒子LipidNano-ParticlesLNPは、衝突噴流プロセスによって調製される。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたsiRNAと混合することにより形成される。siRNAに対する脂質の混合比は、脂質が45~55およびsiRNAが65~45を目標にする。脂質溶液は、本発明の新規なカチオン性脂質、ヘルパー脂質コレステロール、PEG例えば、PEG-C-DMA、PEG-DMG脂質およびDSPCを、アルコール例えば、エタノール中に5~15mg/mL目標9~12mg/mLの濃度で含むものにする。脂質の比率は、カチオン性脂質が25~98目標35~65のモルパーセント範囲を有し、ヘルパー脂質は0~75目標30~50のモルパーセント範囲を有し、PEG脂質は1~15目標1~6のモルパーセント範囲を有し、DSPCは0~15目標0~12のモルパーセント範囲を有するようにする。siRNA溶液は、1種類以上のsiRNA配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液3.5~5の範囲のpHを有する中に0.3~1.0mg/mLの目標0.3~0.9mg/mLの濃度範囲で含むものにする。この2つの溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にLNPが形成される。T字部内径teeIDは0.25~1.0mmの範囲であり、総流速は10~600mL/分にする。流速とチューブ内径の組合せは、LNPの粒径を30~200nmに制御する効果を有する。次いで、この溶液を緩衝溶液と高pHで、1:1~1:3vol:volだが1:2vol:volを目標にするの範囲の混合比で混合する。この緩衝溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度にする。混合LNPを30分間~2時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行う。インキュベーション中の温度は15~40°C目標30~40°Cの範囲にする。インキュベーション後、この溶液を0.8umフィルターに通して濾過するアニオン交換分離工程を含む。このプロセスでは、1mmID~5mmIDの範囲のチューブ内径および10~2000mL/分の流速が使用される。LNPは濃縮され、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションされ、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液リン酸緩衝生理食塩水などと交換される。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式TFFが使用される。このプロセスでは、30~500KDの公称分子量カットオフ範囲の膜が使用される。膜形式は、中空繊維であってもフラットシートカセットであってもよい。適正な分子量カットオフを用いたTFFプロセスにより、LNPが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール;クエン酸バッファー;および最終バッファー廃物が含有される。TFFプロセスは、初期濃度からsiRNA濃度1~3mg/mLまでの多工程プロセスである。濃縮後、LNP溶液を最終バッファーに対して10~20容量でダイアフィルトレーションしてアルコールを除去し、バッファー交換を行う。次いで、この物質をさらに1~3倍に濃縮する。LNPプロセスの最終工程は、濃縮LNP溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封入である。解析手順:1siRNA濃度siRNA二本鎖の濃度は、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィーSAX-HPLCにより、2996PDA検出器を備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定される。LNPあるいは、RNAi送達媒体RDVとも称するを、0.5TritonX-100で処理して全siRNAを遊離させ、SAX分離により、DionexBioLCDNAPacPA2004×250mmカラムを用いて解析する254nmでUV検出。移動相は、A:25mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0と、B:250mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0を0分から15分までの線形勾配で構成し、流速を1ml/分とする。siRNA量は、siRNA標準曲線との比較によって求められる。2封入速度蛍光試薬SYBRGoldをRNA定量に使用し、RDVの封入速度をモニタリングする。TritonX-100とともに、またはなしでRDVを使用し、遊離siRNAおよび全siRNAの量を調べる。アッセイは、SpectraMaxM5eマイクロプレート分光測光器MolecularDevicesSunnyvale,CA製を用いて行う。試料を485nmで励起し、蛍光放射を530nmで測定した。siRNA量は、siRNA標準曲線との比較によって求められる。封入速度=1-遊離siRNA/全siRNA×1003粒径および多分散性1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1×PBSで最終容量3mlまで希釈する。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NYを用いて測定する。散乱強度は、He-Neレーザーを用いて25°Cにて90°の散乱角で測定する。4ゼータ電位の解析1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1mMのTrisバッファーpH7.4で最終容量2mlまで希釈する。試料の電気泳動移動度をZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NY電極および光源としてHe-Neレーザーを有するを用いて調べる。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定する。5脂質の解析個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCにより、コロナ荷電化粒子検出器CADESABiosciences,Inc,Chelmsford,MAを備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定する。RDV内の個々の脂質を、CADを備えたAgilentZorbaxSB-C1850×4.6mm,1.8μm粒径カラムを用いて60°Cで解析する。移動相は、A:0.1TFAH2O中とB:0.1TFAIPA中で構成する。勾配は、60の移動相Aと40の移動相Bで時間0から1.00分のとき40の移動相Aと60の移動相Bまで;40の移動相Aと60の移動相Bで1.00から5.00分まで;40の移動相Aと60の移動相Bで5.00分から10.00分のとき25の移動相Aと75の移動相Bまで;25の移動相Aと75の移動相Bで10.00分から15.00分のときに5の移動相Aと95の移動相Bまで;および5の移動相Aと95の移動相Bで15.00から20.00分のときに60の移動相Aと40の移動相Bまで変化させ、流速は1ml/分にする。個々の脂質濃度は、RDV内の全脂質成分での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求める。各脂質のモル百分率を、その分子量に基づいて計算する。化合物32の配合物の一般的なLNPプロセスの説明:脂質ナノ粒子を衝突噴流プロセスによって調製した。この粒子は、アルコールに溶解させた脂質を、クエン酸バッファーに溶解させたsiRNAと混合することにより形成した。脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質コレステロール、PEG例えば、PEG-C-DMA、PEG-DMG脂質およびDSPCを、アルコール例えば、エタノール中に5~15mg/mL目標9~12mg/mLの濃度で含むものとした。脂質の比率は、カチオン性脂質が25~98目標35~65のモルパーセント範囲を有し、ヘルパー脂質は0~75目標30~50のモルパーセント範囲を有し、PEG脂質は1~15目標1~6のモルパーセント範囲を有し、DSPCは0~15目標0~12のモルパーセント範囲を有するようにした。siRNA溶液は、1種類以上のsiRNA配列を、クエン酸ナトリウム緩衝塩溶液3.5~5の範囲のpHを有する中に0.3~0.6mg/mLの目標0.3~0.9mg/mLの濃度範囲で含むものとした。この2つの溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度まで加熱し、次いで、衝突噴流混合機内で混合すると、即座にLNPが形成された。T字部内径teeIDは0.25~1.0mmの範囲とし、総流速は10~600mL/分とした。流速とチューブ内径の組合せは、LNPの粒径を30~200nmに制御する効果を有した。次いで、LNP懸濁液を緩衝溶液と高pHで、1:1~1:3vol:volだが1:2vol:volを目標にするの範囲の混合比で混合した。この緩衝溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度にした。さらに、このLNP懸濁液を緩衝溶液と高pHで、1:1~1:3vol:volだが1:2vol:volを目標にするの範囲の混合比で混合した。この緩衝溶液を15~40°C目標30~40°Cの範囲の温度にした。混合LNPを30分間~2時間保持した後、アニオン交換濾過工程を行った。インキュベーション中の温度は15~40°C目標30~40°Cの範囲にした。インキュベーション後、LNP懸濁液を0.8umフィルターに通して濾過したアニオン交換分離工程を含む。このプロセスでは、1mmID~5mmIDの範囲のチューブ内径および10~2000mL/分の流速を使用した。LNPを濃縮し、限外濾過プロセスによってダイアフィルトレーションし、このとき、アルコールが除去され、クエン酸バッファーが最終バッファー溶液リン酸緩衝生理食塩水などと交換された。限外濾過プロセスには、タンジェンシャルフロー濾過形式TFFを使用した。このプロセスでは、30~500KDの公称分子量カットオフ範囲の膜を使用した。膜形式は、中空繊維またはフラットシートカセットとした。適正な分子量カットオフを用いたTFFプロセスにより、LNPが保持液中に保持され、濾液または透過液中にアルコール;クエン酸バッファー;および最終バッファー廃物が含有された。TFFプロセスは、初期濃度からsiRNA濃度1~3mg/mLまでの多工程プロセスである。濃縮後、LNP懸濁液を最終バッファーに対して10~20容量でダイアフィルトレーションしてアルコールを除去し、バッファー交換を行った。次いで、この物質をさらに1~3倍に濃縮した。LNPプロセスの最終工程は、濃縮LNP溶液の滅菌濾過および生成物のバイアル封入とした。解析手順:siRNA濃度siRNA二本鎖の濃度を、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィーSAX-HPLCにより、2996PDA検出器を備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定した。LNPあるいは、RNAi送達媒体RDVとも称するを、0.5TritonX-100で処理して全siRNAを遊離させ、SAX分離により、DionexBioLCDNAPacPA2004×250mmカラムを用いて解析した254nmでUV検出。移動相は、A:25mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0と、B:250mMNaClO4,10mMTris,20EtOH,pH7.0を0分から15分までの線形勾配で構成し、流速を1ml/分とした。siRNA量を、siRNA標準曲線との比較によって求めた。封入速度蛍光試薬SYBRGoldをRNA定量に使用し、RDVの封入速度をモニタリングした。TritonX-100とともに、またはなしでRDVを使用し、遊離siRNAおよび全siRNAの量を調べた。アッセイは、SpectraMaxM5eマイクロプレート分光測光器MolecularDevicesSunnyvale,CA製を用いて行う。試料を485nmで励起し、蛍光放射を530nmで測定した。siRNA量は、siNA標準曲線との比較によって求められる。封入速度=1-遊離siNA/全siNA×100粒径および多分散性1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1×PBSで最終容量3mlまで希釈した。試料の粒径および多分散性を、動的光散乱法によりZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NYを用いて測定した。散乱強度は、He-Neレーザーを用いて25°Cにて90°の散乱角で測定した。ゼータ電位の解析1μgのsiRNAを内包しているRDVを、1mMのTrisバッファーpH7.4で最終容量2mlまで希釈した。試料の電気泳動移動度をZetaPALS機器BrookhavenInstrumentsCorporation,Holtsville,NY電極および光源としてHe-Neレーザーを有するを用いて調べた。ゼータ電位の計算には、スモルコフスキー限界を想定した。脂質の解析個々の脂質濃度を、逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCにより、コロナ荷電化粒子検出器CADESABiosciences,Inc,Chelmsford,MAを備えたWaters2695AllianceシステムWaterCorporation,MilfordMAを用いて測定した。RDV内の個々の脂質を、CADを備えたAgilentZorbaxSB-C1850×4.6mm,1.8μm粒径カラムを用いて60°Cで解析した。移動相は、A:0.1TFAH2O中とB:0.1TFAIPA中で構成した。勾配は、60の移動相Aと40の移動相Bで時間0から1.00分のとき40の移動相Aと60の移動相Bまで;40の移動相Aと60の移動相Bで1.00から5.00分まで;40の移動相Aと60の移動相Bで5.00分から10.00分のとき25の移動相Aと75の移動相Bまで;25の移動相Aと75の移動相Bで10.00分から15.00分のときに5の移動相Aと95の移動相Bまで;および5の移動相Aと95の移動相Bで15.00から20.00分のときに60の移動相Aと40の移動相Bまで変化させ、流速は1ml/分とした。個々の脂質濃度は、RDV内の全脂質成分での標準曲線と比較して二次曲線フィットにより求めた。各脂質のモル百分率を、その分子量に基づいて計算した。表1の種々の配合物のための一般的なLNP調製物表1のsiRNAナノ粒子懸濁液は、siRNAおよび/または担体分子を20mMクエン酸ナトリウムバッファーpH5.0に約0.40mg/mLの濃度で溶解させることにより調製される。脂質溶液は、カチオン性脂質例えば、32,表2の構造参照、DSPC、コレステロールおよびPEG-DMG表1に示した比率の混合物を無水エタノールに、約8mg/mLの濃度で溶解させることにより調製される。リン酸部に対する窒素の比率は6:1と概算される。ほぼ等容量のsiRNA/担体溶液と脂質溶液を、2つのFPLCポンプを同じ流速で用いて混合T字コネクタに送達する。背圧弁を使用し、所望の粒径に調整する。得られた乳状混合物を滅菌ガラスビン内に収集する。次いで、この混合物を等容量のクエン酸バッファーで、続いて等容量のPBSpH7.4で希釈し、イオン交換膜に通して濾過し、混合物中の遊離siRNA/担体あればを除去する。PBS7.4に対する限外濾過を使用し、エタノールを除去してバッファーを交換する。所望の容量まで濃縮し、0.2μmフィルターに通して滅菌濾過することにより最終LNPを得る。得られたLNPを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に関して特性評価する。LNP製造プロセス非限定的な例において、LNPは、バルクで以下のようにして調製される。このプロセスは、1脂質溶液の調製;2siRNA/担体溶液の調製;3混合/粒子の形成;4インキュベーション;5希釈;6限外濾過および濃縮からなる。脂質溶液の調製2L容のガラス試薬ビンとメスシリンダーを脱パイロジェン処理する。脂質を室温まで昇温させる。このガラス試薬ビン内に、8.0gの化合物32をピペットで移し、1.2gのDSPC、3.5gのコレステロール、0.9gのPEG-DMGを添加する。この混合物に1Lのエタノールを添加する。試薬ビンを、加熱した水浴50°Cを超えない温度中に入れる。脂質懸濁液を撹拌バーで撹拌する。この懸濁液中に、丸底フラスコの口の1つから密封アダプターを付けて熱電対プローブを入れる。懸濁液を透明になるまで30~40°Cで加熱する。この溶液を室温まで放冷する。siRNA/担体溶液の調製滅菌容器内Corning保存ビンなどに、水補正率およそ1.2の0.4倍のg数のsiRNA-1粉末を量り入れる。このsiRNAを、脱パイロジェン処理した2L容ガラス試薬ビンに移す。この秤量容器をクエン酸バッファー20mM,pH5.0で3回すすぎ洗浄し、すすぎ液をこの2L容ガラスビンに入れ、1Lになるまでクエン酸バッファーで分量供給QSする。siRNA溶液の濃度は、UV分光計により以下の手順を用いて測定される。該溶液から20μLを取り出し、50倍に希釈して1000μLにし、クエン酸バッファーでのブランク測定後にUV読み値をA260nmで記録する。これを繰り返す。2つの試料の読み値が整合している場合は、平均をとり、siRNAの消散係数に基づいて濃度を計算する。最終濃度が0.40±0.01mg/mLの範囲外である場合、さらにsiRNA/担体粉末を添加すること、またはさらにクエン酸バッファーを添加することにより濃度を調整する。適用可能な場合は、このプロセスを第2のsiRNAで反復する。あるいはまた、siRNA/担体溶液を、2種類以上のsiRNA二本鎖および/または担体のカクテルではなく1種類のsiRNA二本鎖および/または担体で構成した場合、siRNA/担体を20mMクエン酸バッファーpH5.0に溶解させ、終濃度を0.4mg/mLにする。次いで、脂質溶液とエタノール溶液をPallAcropak200.8/0.2μm滅菌フィルターPN12203に通して滅菌濾過し、MasterFlexPeristalticPumpModel7520-40を用いて脱パイロジェン処理済ガラス槽内に入れ、封入プロセスのための滅菌出発物質を得る。濾過プロセスは、20cm2の膜面積で80mL規模にて実施する。流速は280mL/分とする。このプロセスは、チューブ直径と濾過面積を増大させることによりスケールアップ可能である。粒子の形成-混合工程ツーバレルシリンジ駆動型ポンプHarvard33TwinSyringeを使用し、滅菌脂質/エタノール溶液と、滅菌siRNA/担体またはsiRNA/担体カクテル/クエン酸バッファー20mMクエン酸バッファー,pH5.0溶液を、0.5mmIDT-混合機混合ステージI内で、等しいまたはほぼ等しい流速で混合する。得られた排出LNP懸濁液には、40~50volのエタノールが含まれていた。45volエタノール排出懸濁液が所望される場合、滅菌脂質/エタノールと、滅菌siRNA/担体またはsiRNA/担体カクテル/クエン酸バッファー溶液を、それぞれ、54mL/分および66mL/分の流速で、排出混合物の総流速が120mL/分となるように混合する。希釈混合ステージIの排出流は直接、4mmIDT-混合機混合ステージII内に供給され、ここで、高pHの緩衝溶液20mMクエン酸ナトリウム,300mM塩化ナトリウム,pH6.0により1:1vol:volの比率で希釈される。この緩衝溶液は30~40°Cの範囲の温度であり、4mmT-混合機に蠕動ポンプColeParmerMasterFlexL/S600RPMによって120mL/分の流速で送達される。混合ステージIIの排出流は直接、6mmIDT-混合機混合ステージIII内に供給され、ここで、高pH緩衝溶液PBS,pH7.4により1:1vol:volの比率で希釈される。この緩衝溶液は15~25°Cの範囲の温度であり、6mmT-混合機に蠕動ポンプColeParmerMasterFlexL/S600RPMによって240mL/分の流速で送達される。インキュベーションおよび遊離siRNAの除去混合ステージIIIの排出流は、30分間のインキュベーションのための混合後、保持される。インキュベーションは35~40°Cの温度で行われ、プロセス内懸濁液を光から保護した。インキュベーション後、遊離の封入されていないsiRNAを、MustangQクロマトグラフィーフィルターカプセルでのアニオン交換によって除去する。使用前、クロマトグラフィーフィルターを、逐次、1NNaOH、1MNaCl、および最後に12.5volエタノール溶液PBS中のフラッシュ液で前処理する。最後のフラッシュ液のpHは、pH<8が確実であることを確認する。次いで、インキュベーションしたLNP流を、MustangQフィルターによって蠕動ポンプColeParmerMasterFlexL/S600RPMによっておよそ100mL/分の流速で濾過する。濾過流を、以下の限外濾過および濃縮のために滅菌ガラス容器内に受容する。限外濾過、濃縮および滅菌濾過限外濾過プロセスは時限的プロセスであり、流速は注意深くモニタリングしなければならない。これは2工程プロセスであり;最初は、希釈物質を採取し、siRNAをおよそ0.3~0.6mg/mLの濃度までおよそ8倍に濃縮する濃縮工程である。第1の工程では、限外濾過膜100kDaPESSpectrumLabsを備えたリングスタンドを蠕動ポンプSpectrumKrosFloIISystemに装着する。9.2Lの滅菌蒸留水をレザーバに添加し;3Lをドレイン排出して廃棄し、残りを透過液中にドレイン排出して廃棄する。5.3Lの0.25N水酸化ナトリウムをレザーバに添加し、1.5Lをドレイン排出して廃棄し、3.1Lを透過液中にドレイン排出して廃棄する。残りの水酸化ナトリウムを、消毒のために系内に保持し少なくとも10分間、次いでポンプをドレイン排出する。9.2Lの70v/vイソプロピルアルコールをレザーバに添加し、1.5Lをドレイン排出して廃棄し、残りを透過液中にドレイン排出して廃棄する。6Lのコンディショニングバッファーリン酸緩衝生理食塩水中12.5エタノールを添加し、1.5Lをドレイン排出して廃棄し、残りを、廃液が中性pH7~8になるまで透過液中にドレイン排出する。膜の流出値を記録し、次いでポンプをドレイン排出する。希釈LNP溶液をレザーバ内に1.1Lの印まで入れる。ポンプを2.3L/分で作動させる。5分間の再循環後、透過液ポンプを62.5mL/分で作動させ、液レベルをレザーバ内で、およそ950mLに一定にする。希釈LNP溶液を9.8Lから1.1Lまで140分間で濃縮し、希釈LNP溶液がすべてレザーバに移されたらポンプを一時停止する。第2工程は、エタノール/水性バッファーをリン酸緩衝生理食塩水に交換するダイアフィルトレーション工程である。この工程中、およそ10~20ダイアフィルトレーション容量のリン酸緩衝生理食塩水を使用する。ダイアフィルトレーション後、2回目の濃縮を行い、LNP懸濁液を、siRNAがおよそ1~1.5mg/mLになるまで3倍に濃縮する。濃縮された懸濁液は、滅菌プラスチックPETGビン内に収集する。次いで、最終懸濁液を、逐次、Pall0.45umPESフィルターおよびPall0.2umPESフィルターによって最終滅菌のために濾過した後、バイアル充填する。一実施形態において、本発明のLNP組成物は、式Aのカチオン性脂質、コレステロール、DSPCおよびPEG-DMGを含むものである。別の実施形態において、本発明のLNP組成物は、さらに抗凍結剤を含むものである。別の実施形態において、抗凍結剤は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、ベルバスコース、マンニトール、グルコース、ラクトース、マルトース、マルトリオース-ヘプタオース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、インスリン、ソルビトール、グリセロール、アルギニン、ヒスチジン、リシン、プロリン、ジメチルスルホキシドまたはその任意の組合せである。別の実施形態において、抗凍結剤はスクロースである。別の実施形態において、抗凍結剤はトレハロースである。別の実施形態において、抗凍結剤はスクロースとトレハロースの組合せである。別の実施形態において、LNP組成物は、カチオン性脂質13Z,16Z-N,N-ジメチル-3-ノニルドコサ-13,16-ジエン-1-アミン化合物32、コレステロール、DSPCおよびPEG-DMGを含むものである。得られたLNPを、粒径、ゼータ電位、アルコール含量、総脂質含量、封入核酸および総核酸濃度に関して特性評価する。当業者には、本発明が、課題を遂行するため、ならびに記載の目的および利点ならびに本発明に固有の目的および利点を得るのに充分適合したものであることが容易に認識されよう。現時点で代表的な好ましい実施形態である本明細書に記載の方法および組成物は例示的であり、本発明の範囲に対する限定を意図しない。当業者には、本発明の精神に包含され、特許請求の範囲によって規定される本発明の変形例および他の使用が思いつくであろう。上記のLNPプロセスを使用し、以下の比率の具体的なLNPを特定した。オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野でよく知られている米国特許出願:米国特許出願公開第同第2006/0083780号明細書、同第2006/0240554号明細書、同第2008/0020058号明細書、同第2009/0263407号明細書および同第2009/0285881号明細書ならびにPCT特許出願:国際公開第2009/086558号パンフレット、同第2009/127060号パンフレット、同第2009/132131号パンフレット、同第2010/042877号パンフレット、同第2010/054384号パンフレット、同第2010/054401号パンフレット、同第2010/054405号パンフレットおよび同第2010/054406号パンフレット参照。本実施例において開示し、使用したsiRNAは標準的な固相手順によって合成した。実施例1マウスでの有効性のインビボ評価化合物1~44を使用したすぐ上に示した公称組成のLNPを、インビボ有効性について評価した。siRNAは、ホタルPhotinuspyralisルシフェラーゼ遺伝子受託番号M15077のmRNA転写物を標的化するものである。ルシフェラーゼsiRNAの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。インビボルシフェラーゼモデルには、ホタルルシフェラーゼコード配列がすべての細胞内に存在するトランスジェニックマウスを使用する。ROSA26-LoxP-Stop-LoxP-LucLSL-LucトランスジェニックマウスDanaFarberCancerInstituteから実施許諾を得たを、最初に組換えAd-CreウイルスVectorBiolabsを用いてLSL配列を除去することにより、ルシフェラーゼ遺伝子が発現されるように誘導する。該ウイルスの臓器向性の性質のため、尾静脈注射によって送達すると、発現は肝臓に限定される。肝臓内ルシフェラーゼ発現レベルを、ルシフェリン基質CaliperLifeSciencesの投与後にIVIS撮像装置Xenogenを用いて光出力を測定することにより定量する。RDVの投与前に投与前発光レベルを測定する。ルシフェリンPBS中15mg/mLを150μLの容量で腹腔内IP注射する。4分間のインキュベーション期間後、マウスをイソフルランで麻酔し、IVIS撮像装置内に置く。RDVsiRNAを含有PBSビヒクル中を0.2mLの容量で尾静脈注射した。最終用量レベルを0.1~0.5mg/kgsiRNAの範囲とした。対照としてPBSビヒクル単独を投与した。投与の48時間後、上記の方法を用いてマウスの画像を撮影した。ルシフェリンの光出力の変化は、ルシフェラーゼのmRNAレベルと直接的に相関しており、ルシフェラーゼsiRNA活性の間接的は尺度を表す。インビボ有効性の結果を投与前発光レベルに対する発光阻害として示す。ルシフェラーゼsiRNARDVを全身投与すると、ルシフェラーゼ発現が用量依存的様式で減少した。RDVを内包している化合物1を投与したマウスでは、RDV含有オクチル-CLinDMAOCDカチオン性脂質の場合よりも大きな有効性が観察された図1。OCDは既知であり、国際公開第2010/021865号パンフレットに記載されている。RDVを内包している化合物32および33を投与したマウスでも、MC3化合物46カチオン性脂質を含有するRDVと比べて同様の有効性が観察された図11。実施例2インビトロApoE結合アッセイLNPを、90アカゲザル血清中、4ug/mLの最終LNP濃度で37°Cにてインキュベートする。インキュベーションは、軌道回転により20分間とする。インキュベーション後、試料をPBS中で1:20に希釈し、100uLの各希釈試料を、抗PEG抗体コート96ウェルプレートLifeDiagnosticsカタログ番号P-0001PLのウェルにアリコートに分ける。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを300uLのPBSで5回洗浄する。洗浄後、50uLの0.2TritonX-100を各ウェルに添加し、プレートを37°Cで10分間インキュベートした後、プレート振盪機で750rpmにて1分間振盪する。試料のApoEELISAおよびステムループPCR解析を行う前に、試料を凍結させる。ApoEELISAアッセイを行い、インキュベーション後、LNPに結合しているアカゲザル血清中のApoEを定量する。抗ApoE抗体Milipore,カタログ番号AB947をPBS中で1:1000に希釈し、100uLの希釈抗体を、ポリスチレン製の高結合プレートの各ウェルに添加する。抗体を有するこのプレートを4°Cで一晩インキュベートした後、プレートを200uLのPBSで2回洗浄する。次に、1BSAおよび0.05Tween-20をPBS中に含む200uLのバッファーインキュベーションバッファーを各ウェルに添加した後、室温で1時間インキュベーションする。プレートを0.05Tween-20含有PBSで5回洗浄する。凍結Triton溶解試験試料を解凍し、インキュベーションバッファーで1:6に希釈し、100uLの試験試料を、ApoE抗体プレートのウェルにアリコートに分ける。インキュベーションを室温で1時間した後、0.05Tween-20含有PBSで5回洗浄する。洗浄後、100uLのビオチン化抗ApoE抗体Mabtech,カタログA番号E887-ビオチンインキュベーションバッファー中で1:500に希釈を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした後、0.05Tween-20含有PBSで5回洗浄する。次いで、100uL/ウェルのストレプトアビジン-HPRThermo,カタログ番号TS-125-HRを添加し、室温で1時間インキュベートする。0.05Tween-20含有PBSで5回洗浄後、100uLのTMB基質Thermo,カタログ番号34028を各ウェルに添加した後、暗所で室温にて20分間インキュベーションする。100uLのTMB停止溶液KPL,カタログ番号50-85-04で比色定量反応を停止させ、450nmにおける吸光度を測定する。アカゲザル組換えApoEを、0.03TritonX-100100ng/mL~0.78ng/mLの範囲の濃度を有するインキュベーションバッファーで希釈することによりApoE標準曲線を作成する。ApoE標準を、ELISAにおいて試験試料とパラレルで評価する。ELISAにおける非LNP依存性ApoEシグナルのバックグラウンド減算を得るため、アカゲザル血清のみLNPなし対照を使用する。ステムループRT-PCRプロトコル抗PEG抗体プレートに結合させた量のLNPに結合しているApoEに対して標準化するため、抗PEG抗体ウェル内に保持されたsiRNAの量をステムループPCRによって定量し、LNP1つあたりに封入されたsiRNA数と関連付け、ウェル1つあたりの結合LNP粒子の総数の概算測定値を得る。スパイク標準曲線試料の調製:標準曲線は、siRNAの分子量ApoB17063は13693g/molを用いてコピー数を計算して作成する。高度標準は1011コピー/3μlを含むものとするのがよい。一連のアッセイプレートにおいて、最低標準が102コピー/3μ1を含むまで10倍連続希釈を行う。0.2TritonX-100を水中で1:80に希釈し、20uLの希釈TritonX-100を96ウェルプレートの10個のウェル内にピペッティングする。30uLの連続希釈標準曲線およびミックスをプレートの各ウェルに添加する。10uLのスパイク標準曲線を逆転写反応に使用する。ステムループRT-PCR-試験試料および標準曲線:PEG抗体プレート捕捉によるTritonライセートをヌクレアーゼ無含有水中で1対2000に希釈する。10μLの‘RT-PrimerMix’AppliedBiosystem’sTaqManMicroRNAReverseTranscriptionKitカタログ番号4366596を96ウェルMicro-AmpQPCRプレートABIカタログ番号N801-0560の各ウェルに添加する。10uLの各試験試料1対2000に希釈またはスパイク標準曲線上記を96ウェルプレート内にアリコートに分ける。プレートをマットABIカタログ番号N801-0550で覆い、蒸発を最小限にする。プレートを800rpmで1分間、手短に遠心分離する。次に、このプレートに対して、サーモサイクラーにおいて以下のサイクルパラメータを用いて操作する。次に、10uLの‘RTMix’を各ウェルAppliedBiosystem’sTaqManMicroRNAReverseTranscriptionKitカタログ番号4366596に添加する。RTサイクル反応液は、10uLの試験試料、10uLのRTプライマーミックスおよび10uLのRTミックス成分で総容量30uLで構成する。総量30uLの総RTミックス中のRT-プライマーの終濃度は200nMとする。次いで、プレートを同じプレートマットで封止し、800rpmで1分間、手短に遠心分離し、次いで、サーモサイクラーで以下のサイクルパラメータを用いて実施する。次に、15uLの高速酵素/プライマー-プローブミックスを、新たな高速96ウェルプレートAppliedBiosystem’sTaqManFastUniversalPCRMasterMix,カタログ番号4352042の各ウェルに添加する。5uLの各RT反応液を高速酵素ミックスプレートに添加する。プレートを1000rpmで1分間遠心分離し、高速ブロックFastBlockを有するABI7900でQPCR解析を行う。サイクルパラメータは:1サイクル-95°Cで20秒間、続いて40サイクル-95°Cで1秒間、60°Cで20秒間とする。QPCRの結果を使用し、PEG抗体捕捉プレートのTritonライセート中のsiRNA濃度を計算する。LNP粒子1個あたりsiRNAは500個という推定に基づき、抗PEG抗体プレートの各ウェル内に保持されたLNPの数が算出され得る。ウェル1つあたりのApoE濃度ApoEELISAおよびウェル1つあたりのLNP粒子数によって測定を使用し、LNP粒子1つあたりに結合しているApoE分子の個数の概算値が算出され得る。LNP1つあたりに結合しているApoE分子の数実施例3ヘパリンセファロースHI-TRAPTM結合アッセイ中性表面電荷を有する脂質ナノ粒子LNPは、ヘパリンセファロース泳動バッファーとして1×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水DPBSを含むへの注入後、保持されずにカラム空隙容積内に溶出される。血清アポリポタンパク質EApoEは、ヘパリン硫酸との高親和性結合を示し、LNPは、精製および/または組換えヒトApoEまたは血清試料とのインキュベーション後、ヘパリンセファロースに、ApoEに結合するその固有の能力脂質ナノ粒子の組成とApoEの濃度の両方に依存に依存する程度に結合することが示された。表面にApoEが結合している脂質ナノ粒子は、ヘパリンセファロースに高親和性で結合し、高塩度1MNaClでのみ溶出される。ヘパリンセファロース結合アッセイは、ApoE-LNP複合体がヘパリンセファロースに対して示す高親和性相互作用に基づいて、脂質ナノ粒子に対する血清ApoE結合を評価するために開発された。インキュベーション脂質ナノ粒子を、37°Cで20分間、50μg/mLの最終siRNA濃度で、種々の濃度の精製もしくは組換えヒトアポリポタンパク質Eまたは0.1~50のラット/マウス/アカゲザル/ヒト血清1×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水DPBS中のいずれかとともにインキュベートした。ApoEまたは血清とのインキュベーション後、LNP試料を1×DPBSを用いて10倍に希釈し、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーによって解析した。保持されたLNPのピーク面積適切なブランクシグナルの減算後をApoEおよび/または血清とのインキュベーションなしのLNP対照の総ピーク面積と比較し、ApoE/血清とのインキュベーション後に高親和性ヘパリン相互作用へのシフトが起こったLNPのパーセンテージを求める。ヘパリンセファロースHI-TRAPTMクロマトグラフィー条件ヘパリンセファロースHI-TRAPTMクロマトグラフィーカラムGEHealthcare;1mLの床容量を1倍または2倍いずれかのダルベッコPBSで平衡化する;高い方の2倍塩濃度を、ヘパリンセファロース上への固有保持力が高い方おそらく、プラスの表面電荷が高いためのLNPに使用する。移動相A:1×または2×DPBS移動相B:1MNaCl含有10mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0100のAを定組成的に10分間送達後、100のBまでの段階的勾配;さらに10分間保持;段階的勾配で100のAに戻し、さらに10分間再平衡化した後、次の試料のインジェクション流速:1mL/分試料のインジェクション容量:50μL検出:UV260nmアカゲザル血清とのインキュベーション2×DPBS条件でのHI-TRAPTM結合の結果実施例4ラットでの有効性および毒性のインビボ評価該化合物を上記の公称組成で用いたLNPを、インビボ有効性ならびにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増大について、Sprague-DawleyCrl:CDSD雌ラットCharlesRiverLabsにおいて評価した。siRNAは、ApoB遺伝子受託番号NM019287のmRNA転写物を標的化するものである。ApoBsiRNAの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。RDVsiRNAを含有PBSビヒクル中を1~1.5mLの容量で尾静脈注射した。注入速度はおよそ3ml/分にする。各投与群には5匹のラットを使用した。LNP投与後、ラットを、通常の飼料と水を存在させたケージ内に入れる。投与の6時間後、食糧をケージから除く。LNP投与の24時間後、動物の剖検を行う。ラットをイソフルラン下で5分間麻酔し、次いで、イソフルランの送達を継続しながらノーズコーン内に入れることにより、放血が完了するまで麻酔下に維持する。大静脈からの血液を、23ゲージのバタフライ型静脈穿刺セットを用いて収集し、血清化学解析のために血清分離器バキュテイナーにアリコートに分ける。切除した肝臓の尾状葉の円筒形切片punchを作製し、mRNA解析のためにRNALaterAmbion内に入れる。保存した肝臓組織をホモジナイズし、QiagenビーズミルおよびQiagenmiRNA-EasyRNA単離キットを製造業者の使用説明書に従って用いて全RNAを単離した。肝臓ApoBmRNAレベルを定量的RT-PCRによって測定した。メッセージを精製RNAから、ラットApoBの市販のプローブセットAppliedBiosystemsカタログ番号RN01499054_mlを用いて増幅した。PCR反応は、96ウェル高速ブロックを有するABI7500機器で行った。ApoBmRNAレベルをハウスキーピングPPIBNM011149mRNAに対して標準化する。PPIBmRNAレベルは、RT-PCRにより、市販のプローブセットAppliedBiosytemsカタログ番号Mm00478295_mlを用いて測定した。結果をApoBmRNA/PPIBmRNA比として示す。mRNAのデータはすべて、PBS投与対照に相対して示したものである。血清ALTおよびAST解析はSiemensAdvia1800ClinicalChemistryAnalyzerで、Siemensアラニンアミノトランスフェラーゼカタログ番号03039631およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼカタログ番号03039631試薬を用いて行った。RDVを内包している化合物32または33を投与したラットにおいて、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物45またはMC3化合物46,図2の場合よりも、同様の有効性および耐容性の改善が観察された。実施例5ラット/サルの肝臓内カチオン性脂質レベルの測定肝臓組織を20ml容バイアル内に量り入れ、9v/wの水中でGenoGrinder2000OPSDiagnostics,1600ストローク/分,5分間を用いてホモジナイズした。各組織ホモジネートの50μLアリコートを300μLの抽出/タンパク質析出溶媒500nMの内部標準を含有する50/50のアセトニトリル/メタノールと混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。次いで、200μL容量の各上清みを96ウェルプレートの別々のウェルに移し、10μLの試料をLC/MS-MSによって直接解析した。既知量の該化合物のメタノールストック溶液を未処理のラット肝臓ホモジネート9容量の水/肝臓重量にスパイクすることにより、標準を調製した。各標準/肝臓ホモジネートのアリコート50μLを300μLの抽出/タンパク質析出溶媒500nMの内部標準を含有する50/50のアセトニトリル/メタノールと混合し、プレートを遠心分離して析出し、タンパク質を沈降させた。200μL容量の各上清みを96ウェルプレートの別々のウェルに移し、10μLの各標準をLC/MS-MSによって直接解析した。肝臓ホモジネートから調製および抽出した標準に対する絶対定量を、API4000トリプル四重極質量分析計AppliedBiosystemsに連結したAriaLX-2HPLCシステムThermoScientificを用いて行った。各操作では、総量10μLの試料をBDSHypersilC8HPLCカラムThermo,50×2mm,3μmに周囲温度でインジェクションした。移動相A:95H2O/5メタノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸移動相B:40メタノール/60n-プロパノール/10mMギ酸アンモニウム/0.1ギ酸流速は0.5mL/分とし、勾配溶出プロフィールは以下のとおり:80Aで0.25分間保持、100Bまで1.6分間にわたって線形漸増、100Bで2.5分間保持、次いで、80Aに戻して1.75分間保持とした。全操作時間は5.8分間であった。API4000ソースパラメータは、CAD:4、CUR:15、GS1:65、GS2:35、IS:4000、TEM:550、CXP:15、DP:60、EP:10とした。RDVを内包している化合物32または33を投与したラットでは、肝臓内レベルは、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物45またはMC3化合物46,図3と同様であるか、またはより低いかのいずれかであった。RDVを内包している化合物32または33を投与したサルでは、肝臓内レベルは、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物45またはMC3化合物46,図7よりも低かった。実施例6アカゲザルでのApoB有効性のインビボ評価化合物を上記の公称組成で用いたLNPを、インビボ有効性について、雄または雌のアカゲザルMacacamulattarhesusmonkeyにおいて評価した。siRNAは、ApoB遺伝子受託番号XM001097404のmRNA転写物を標的化するものである。ApoBsiRNAの一次配列と化学修飾パターンは上記に示している。RDVsiRNAを含有PBSビヒクル中を静脈内注射によって伏在静脈に、20mL/分の注入速度で0.25mg/キログラムsiRNAの用量レベルまで投与した。注射容量は1.9~2.1mL/キログラムとし、サルの体重は2.5~4.5キログラムの範囲であった。RDVまたはPBS対照を3匹のサルに投与した。投与後、複数の日に、血清化学検査用解析のために1mLの血液試料を大腿動脈から採取した。サルは、血液採取の前に一晩絶食させた。有効性の尺度として、LDL-Cを、ApoBmRNA減少の下流サロゲートマーカーとしてモニタリングした。RDVを内包している化合物32および330.25mg/kgの全身投与の4日後、LDL-Cの血清レベルは、投与前レベルの30未満まで低減された図4。実施例7アカゲザルでのβ-カテニンの有効性のインビボ評価試験の-7日目、投与前肝臓生検試料約0.5~lグラム/試料を雄アカゲザルから、腹腔鏡下での外科的切除によって収集したサル1匹あたり、無作為に選択した肝葉の1つの外縁から1例の生検試料を切除。各投与前生検からの約50mgの3つの非隣接試料の標本抽出には、5mmの組織円筒形切片を使用した。試料は、後のCTNNB1mRNA解析のためにRNAlaterTMAmbion中に保存した。試験の0日目、サルに、脂質ナノ粒子LNP試験品のリン酸緩衝生理食塩水懸濁液0.05~0.1mgsiRNA/mLを、単回用量静脈内ボーラス注射によって目標用量0.67、1.34または3.34mgsiRNA/m2で投与した。投与目的のため、体表面積m2を体重から、以下に示す確立されたアロメトリックスケーリングの関係1:BSAm2=0.11BW単位:kg0.65にしたがって推定した。試験の2日目と7日目LNP投与後、48時間目と168時間目、肝臓生検試料約0.5~1グラム/試料をサルから、腹腔鏡下での外科的切除によって収集したサル1匹あたり、無作為に選択した2つの別々の肝葉を切除した。48時間目と168時間目の各外科的生検試料について、約50mgの3つの非隣接試料の標本抽出には、5mmの組織円筒形切片を使用した。試料は、後のCTNNB1mRNA解析のためにRNAlaterTMAmbion中に保存した。CTNNB1mRNAレベルを相対的定量的RT-PCRによって、CTNNB1に対して検証済のプライマー/プローブセットを用いて測定し、ペプチジルプロリルイソメラーゼBPPIBまたはシクロフィリンBとしても知られているのmRNAレベル、および18SリボソームRNA18SrRNAのRNAレベルに対して標準化した。CTNNB1mRNA肝臓発現の変化を、投与後試料と対応する各投与前サル肝臓試料とのPCRのサイクル数閾値の差ΔΔCtとして測定した。CTNNB1mRNAノックダウン処置前レベルに対しての計算値は、ΔΔCtから以下の関係:mRNAノックダウン=100-100/2-ΔΔCtを用いて算出した。RDVを内包している化合物32および33ならびにβ-カテニンsiRNAを投与したサルでは、0.67~3.34mg/m2の範囲の用量でロバストなKDが示された図5。1FDA指針書:GuidanceforIndustry:EstimatingtheMaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers2005年7月,米保健社会福祉省,食品医薬品局-医薬品評価センターCenterforDrugEvaluationandResearchCDER実施例8アカゲザルでのALT増加のインビボ評価アラニンアミノトランスフェラーゼALTを、サル全血の血餅から遠心分離後に収集した血清において測定する。RocheModularSystem自動化学検査用解析装置により、該血清中のALTの酵素活性を、国際臨床化学連合InternationalFederationofClinicalChemistryの標準化された手順および試薬を使用することにより測定する。解析者のコンピュータで吸光度の測定値を用いて、標準曲線と比較したときの試料中のALT活性を算出する。ALT活性を1リットルあたりの国際単位IU/Lで報告する。RDVを内包している化合物32および33を投与したサルでは、RDVを内包しているカチオン性脂質DLinKC2DMA化合物45またはMC3化合物46,図6を投与したサルよりもピークALTの上昇が低かった。実施例9肝細胞癌マウスモデルにおける評価肝細胞癌へのβ-カテニンsiRNAsiRNAβ-catの送達におけるLNP活性を、TRE-METと命名されたマウス肝細胞癌HCCモデルにおいて評価した。TRE-METマウスは、ヒトMET導入遺伝子が、七量体化上流tet-オペレータを有するhCMVプロモーター下で発現されるFVB/N遺伝的背景のトランスジェニックマウスである。TRE-METマウスをLAP-tTA系統と交配すると、ダブルトランスジェニックTRE-MET/LAP-tTAマウスは、METを肝臓特異的様式で発現し、これはドキシサイクリンの投与によって抑制され得る。このマウスは、約3ヶ月齢のときにHCCを発症し、肝臓表面上に目視で確認可能な腫瘍小結節があり、腫瘍は、HCCに典型的な散在性で小柱状の増殖パターンを示し、HCC腫瘍マーカーであるα-フェトプロテインAFPを発現する。また、TRE-METマウスの腫瘍における変異解析によっても、腫瘍のおよそ95においてβ-カテニン遺伝子の変異の活性化が確認されている。このような特徴のため、TRE-METHCCマウスモデルは、β-カテニンsiRNAのLNP媒介性送達およびその結果もたらされる腫瘍増殖に対する有効性の評価に適している。肝臓および腫瘍組織の両方でのβ-カテニンmRNAのサイレンシングにおけるβ-カテニン含有LNPの効果を、まず、腫瘍を有するTRE-METマウスでの薬力学的PD試験において評価した。種々の用量のLNPまたは高用量のLNP対照siRNAを静脈内投与し、72時間後、剖検を行い、Taqmanによるβ-カテニンmRNAレベルの測定のために肝臓と腫瘍組織を収集した。図8と9に示されるように、化合物33では、ロバストで用量依存性のβ-カテニンmRNAのノックダウンが肝臓と腫瘍組織の両方において誘導されたが、対照siRNAまたはPBSを受けた動物ではβ-カテニンノックダウンは観察されなかった。0.1mpkおよび0.05mpkのLNPでは、それぞれ、正常肝臓において88および69のKDが誘導された。腫瘍内でのKDは702mpk~約400.1または0.05mpkの範囲である。図12と13に示されるように、化合物32では、ロバストで用量依存性のβ-カテニンmRNAのノックダウンが肝臓と腫瘍組織の両方において誘導されたが、対照siRNAまたはPBSを受けた動物ではβ-カテニンノックダウンは観察されなかった。0.1mpkおよび0.05mpkのLNPでは、それぞれ、正常肝臓において76および78のKDが誘導された。腫瘍内でのKDは470.25mpk~約20ないし300.1または0.05mpkの範囲である。腫瘍増殖に対するLNPの効果を反復用量有効性試験において評価した。TRE-METHCCマウスに化合物33/siRNAβ-cat、化合物32/siRNAb-cat、対照siRNAまたはPBSを毎週、3週間投与し3回投与、各動物の腫瘍体積を、1回目の投与の7日前と最終投与の3日後に、マイクロCTスキャンによって測定した図10および14。また、最終投与の7日後に、β-カテニンmRNAレベルの評価のために肝臓および腫瘍組織を収集した。PBSまたは対照siRNAを受けたマウスでは、全身腫瘍組織量において360~470の増殖が示されたが、化合物33/siRNAβ-catで処置したマウスでは、用量依存的様式での著しい腫瘍の増殖阻害または退縮が示された図10。2mpkおよび0.5mpkの化合物33/siRNAβ-catでは、それぞれ、60および40の腫瘍退縮が誘導され、0.05mpkでは腫瘍の安定stasisが引き起こされた。PBSまたは対照siRNAを受けたマウスでは、全身腫瘍組織量において約350の増殖が示された、化合物32/siRNAβ-catで処置したマウスでは、用量依存的様式での著しい腫瘍の増殖阻害または退縮が示された図14。0.5、0.25および0.1mg/kgの化合物32/siRNAβ-catでは、それぞれ、37、58および37の腫瘍退縮が誘導され、0.05mpkでは腫瘍の安定が引き起こされた。"