"ワクチン組成物であって、少なくとも1種のノロウイルスVLP抗原及び少なくとも1種のロタウイルスVP6抗原を含むことを特徴とするワクチン組成物。抗原性カプシドペプチド及び抗原性カプシドタンパク質から成る群から選択されるノロウイルス抗原を更に含む、請求項1に記載のワクチン組成物。前記ノロウイルス抗原が、GI及びGIIノロウイルス並びにこれらの遺伝子型から成る群由来である、請求項1に記載のワクチン組成物。前記ノロウイルス抗原がGII-4VLPである、請求項1~3のいずれか一項に記載のワクチン組成物。前記GII-4VLPが一価である、請求項4に記載のワクチン組成物。前記ノロウイルス抗原が2種以上のVLPタイプを含む、請求項1に記載のワクチン組成物。前記ロタウイルスVP6抗原が、rVP6タンパク質、2層VP2/VP6VLP及びVP6タンパク質を含むVLP並びにこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載のワクチン組成物。前記rVP6が、細管、球体、シート及びこれらの組み合わせから成る群から選択される多量体の形態である、請求項7に記載のワクチン組成物。無菌で非毒性の薬学的に許容可能な生理学的担体を更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のワクチン組成物。ノロウイルス及びロタウイルスへの感染、ウイルスを原因とする下痢及び嘔吐を伴う疾患並びに胃腸炎から成る群から選択される疾患の予防に使用するための、請求項1~9のいずれか一項に記載のワクチン組成物。請求項1~8のいずれか一項に記載のワクチン組成物の製造方法であって、単一の宿主において少なくとも1種のノロウイルスVLP抗原及び少なくとも1種のロタウイルスVP6抗原を同時発現させること、あるいはa少なくとも1種のノロウイルスVLP抗原を作製、単離及び精製し、b少なくとも1種のロタウイルスVP6抗原を作製、単離及び精製し、c前記ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原を混合するステップを含むことを特徴とする製造方法。前記抗原を、組み換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞宿主において作製する、請求項11に記載の方法。本発明は、少なくとも1種のノロウイルスNV抗原及び少なくとも1種のロタウイルスRV抗原を含む混合ワクチン製剤に関する。驚くべきことに、多くの他の混合ワクチンと同様に、ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原が互いの免疫原性を阻害しないことが判明した。本ワクチンにおいて、混合ワクチン中の個々の抗原間での干渉はないため、本発明の混合ワクチンは、ワクチン中に存在する抗原のそれぞれに対する免疫を引き出すことができる。適切には、組み合わせの一方の成分に対する免疫応答は、個別に測定した場合のその成分の免疫応答の少なくとも50であり、好ましくは100又は実質的に100である。免疫応答は適切には、本明細書の実施例において説明するように、例えば抗体応答により測定し得る。本ワクチン製剤は個々の抗原間での負の干渉を起こさないだけでなく、相乗効果ももたらす。本発明での使用に適したノロウイルス抗原には、以下に限定するものではないが、抗原性カプシドタンパク質、ペプチド、単量体、二量体、VLP又はこれらの組み合わせが含まれる。ノロウイルス抗原は、GI又はGII遺伝子群に属し且つ所望の遺伝子型を有するノロウイルス由来となり得る。一部の実施形態において、ノロウイルス抗原は、GII-4、GII-12及びGI-3VLPから成る群から選択される。遺伝子型GII-4が世界中での急性ノロウイルス胃腸炎の主な原因であることから、本ワクチンでの使用に好ましいノロウイルス抗原はGII-4VLPである。好ましくは、VLPは一価である。ロタウイルスVP6は、交差反応性の抗ロタウイルス応答を誘導する最も豊富にあり且つ免疫原性のロタウイルスタンパク質であるサブグループ特異的抗原である。本ワクチン製剤で免疫化したマウスのロタウイルス特異的血清抗体は、ヒトに感染するロタウイルス血清型の大多数の場合と同様に、サブグループ1及び2に属する様々なヒト、ウシ及びサルロタウイルス株に対して交差反応性であった図12。多量体若しくは他の形態のロタウイルスVP6、組み換えVP6rVP6又はVP6を含むロタウイルスVLPを本ワクチン製剤においてロタウイルス抗原として使用し得る。組み換えバキュロウイルス中でのVP2及びVP6の同時発現により、2層のウイルス様粒子dlVP2/VP6VLPが形成される。このようなVLPは、本ワクチン製剤における使用に適したロタウイルス抗原に含まれる。ロタウイルス抗原はいずれのロタウイルス株由来にもなり得るが、好ましくはヒトロタウイルス由来である。上記のノロウイルス及びロタウイルス抗原は、本ワクチン製剤においていずれの所望の組み合わせでも使用し得る。一部の実施形態において、ワクチン製剤は1価のGII-4ノロウイルスVLP及びロタウイルスrVP6タンパク質を好ましくは多量体の形態で含む。幾つかの他の実施形態において、ワクチン製剤は、1価のGII-4ノロウイルスVLP及びロタウイルス2層VP2/VP6VLPを含む。ノロウイルス抗原及びロタウイルス抗原は、天然源から単離及び精製し得る。他の実施形態において、これらの抗原は、適切な発現系における組み換え技術により作製し得て、適切な発現系には、以下に限定するものではないが、酵母細胞例えば、SセレビシエS.cerevisiae、S.ポンベS.pombe、ピキアパストリスPichiapastori、細菌細胞例えば、大腸菌E.coli、昆虫細胞例えば、Sf9細胞及び哺乳動物の細胞例えば、CHO細胞が含まれる。各発現系に適した発現ベクターは、当業者に周知である。本ワクチンは、単独ノロウイルス及びロタウイルスワクチンの組み合わせをいずれの比でも含み得るが、好ましくは等量1:1である。混合ワクチンは、少なくとも2つのやり方で処方し得る。第1のやり方においては、ノロウイルスワクチン及びロタウイルスワクチンを組み換えタンパク質として別々に製造しVLP、単量体、二量体、三量体、球体、細管、シート又はこれらのいずれの組み合わせの形態で、インビトロにて特定の比で混合するとカクテルワクチンと称される液体製剤が得られる。第2のやり方においては、ノロウイルスカプシド及びロタウイルスVP6のキメラタンパク質は、所望の宿主例えば、Sf9昆虫細胞に適切な発現系例えば、ノロウイルスカプシド遺伝子及びロタウイルスVP6遺伝子を発現する組み換えバキュロウイルスを同時感染させることで得られる。このようなワクチン製剤を本明細書ではキメラワクチンと称する。遺伝子型特異的同型免疫応答に加えて、交差反応性異型免疫応答の誘導が、ノロウイルス、ロタウイルス等のウイルスが問題となる場合に極めて重要である。これらのウイルスには多数の様々な遺伝子型/血清型及び株がある。理想的なワクチンは、ワクチン中のウイルスと同種及び異種の多種多様な株に対する応答を誘導する。一部の実施形態において、GI-3ノロウイルス遺伝子群Iに属する及びGII-12ノロウイルス遺伝子群IIに属するVLPは、ワクチン製剤中に存在するGII-4VLPに対する異種抗原として特定された。GII-4特異的単独又は混合ワクチンで免疫化したマウスは、遺伝子群を越えて及びその間で異種抗原の両方に対して反応性の抗体を産生した。ロタウイルスVP6単独ワクチンと比較しての、混合ワクチンで免疫化したマウスの血清におけるGI-3に対する交差反応性免疫応答における約50の上昇は、ワクチン製剤中に存在しているロタウイルスVP6タンパク質のアジュバント効果を示している。言い換えると、本混合ワクチンの抗原性成分は相乗効果をもたらす。実施例において、RVVP6タンパク質が、ワクチン抗原によって誘導される免疫応答を広げ、また血清のブロッキング活性を上昇させる観点からアジュバントとして作用する能力を有することが実証される。交差反応性応答に加えて、本混合ワクチン製剤は、全身にわたって強く長期間続くメモリーブロッキングIgG抗体応答並びにノロウイルス及びロタウイルスに特異的な細胞性免疫をいかなる免疫経路であっても誘導する好ましくは皮内及び筋肉内経路。これらの応答は、感染後に生まれる短期間の遺伝子型特異的な自然な免疫応答と対照的である。このため、局所的な粘膜免疫応答とは対照的な全身性の免疫応答が、長期間にわたる防御には必要と考えられる。血清IgG抗体の腸管内腔内への移動が、腸管感染からの重要な防御メカニズムとなりそうである。本明細書に記載のもののような非経口ID/IMで投与するワクチンによって引き出される全身的な免疫応答が高ければ高いほど、移動する抗体のレベルは高くなり、また防御はより良好なものになると予想することができる。更に、本ワクチン製剤は、バランスのとれた混合型の免疫応答、すなわちTヘルパーTh細胞タイプ1及びTh2タイプ応答を誘導する。この両方のタイプの免疫応答がノロウイルス及び/又はロタウイルスへの感染に対する防御を仲介しているらしいことを考えると、このことは重要な観察結果である。加えて、本ワクチン製剤は、実施例において実証されるように、高アビディティ抗体の強力な誘導物質である。高アビディティ抗体は、ワクチンの防御効力と大きく相関することが示された。更に、本発明は、本明細書で使用のワクチン製剤で遺伝子群間での交差防御が達成可能であることを示す。本明細書に記載のGII-4VLPいわゆる一価ワクチンとしての特定の株/遺伝子型のノロウイルスからのVLPでの免疫化は、ワクチン製剤本明細書で使用のGI-3及びGII-12に含まれていない他の遺伝子型に対する交差反応性又は異型免疫応答を誘導するだけでなく、本明細書において記載するように異種のウイルスの結合もブロックし、またウイルスを中和する。免疫刺激を引き出す有効成分、すなわちノロイルス及びロタウイルス抗原に加えて、本製剤は、無菌で非毒性の薬学的に許容可能な生理学的担体を含み得る。一部の実施形態において、ワクチン製剤は更に、細菌又は真菌による汚染を防止するためにフェノール、2-フェノキシエタノール又はチメロサール等の保存料を含み得る及び/又は悪条件下でワクチンを安定させ、また免疫原がバイアルの壁面に付着するのを防止するためにスクロース、ラクトース、アミノ酸、ゼラチン等の安定剤を含み得る。一部の実施形態において、本ワクチン製剤は、有効量の1種以上のアジュバントを含み得る。これらのアジュバント物質の主な特徴の1つは一般にワクチン抗原によって誘導される免疫応答の範囲を広げることである。用語有効量のアジュバントには、投与した抗原に対する免疫応答を刺激することができるある量のアジュバント、すなわち、例えば本明細書の実施例において説明するような血清における交差反応性及びブロッキング抗体活性に関して測定する、投与した抗原組成物の免疫応答を上昇させる量が含まれる。適切で効果的な上昇には、アジュバントを加えていない同じ抗原組成物と比較して5を越えて、好ましくは25を越えて、特には50を越えての上昇が含まれる。ワクチン製剤での使用に適したアジュバントは当業者に公知である。本ワクチン製剤は様々な形態で提供し得て、以下に限定するものではないが、水溶液、乾燥粉末凍結乾燥製剤が含まれる。例えば、水溶液を、注射、鼻からの送達例えば、スプレー、点鼻薬及び口からの送達による投与に適した形態で提供し得る。ワクチン製剤は、当業者にはすぐにわかるように、様々な経路で投与し得る。好ましくは、本発明のワクチン製剤を非経口の注射により投与し、これには以下に限定するものではないが筋肉内IM、皮内ID又は皮下SC注射が含まれる。様々な投与レジメンを本ワクチン製剤に適用し得る。重篤な急性ロタウイルス胃腸炎及びノロウイルス胃腸炎は生後6か月~3歳に同様のピーク発生率を有しているため、混合ノロウイルス/ロタウイルスワクチンのターゲットは、以下の2つの非限定的なやり方で、この年齢層の子供になり得る。aノロウイルスロタウイルス注射用ワクチンを、乳幼児の定期予防接種スケジュールの一部にし得る。乳幼児には2回のワクチンで十分と考えられ、後から追加量を投与する場合もある。フィンランドでは、定期予防接種のスケジュールは、生後3、5、12か月である。本ノロウイルスロタウイルスワクチンは、そのようなスケジュールに合う。他国の予防接種スケジュールは若干異なるものの、提案するワクチンは、生後2、4及び12か月、4、6及び12か月等の異なるプログラムでも容易に採用し得る。bノロウイルスロタウイルス注射用ワクチンを、生後12~15か月でのロタウイルスの追加ワクチン接種及びノロウイルスの一次ワクチン接種として使用し得る。投与は2回行われ得る。この選択肢は、生後2~6カ月の時点でロタウイルスに対する一次免疫化に経口生ロタウイルスワクチンを使用し続ける場合に採用し得る。ロタウイルスに対する免疫は2歳及び3歳で衰えることが知られていて、追加のワクチン接種が多くの場合において望ましい。しかしながら、経口生ワクチンは追加のワクチン接種には使用することができない。より高い年齢、すなわち通常の追加ワクチン接種時期では腸重積症のリスクが高くなるからである。生後12~15か月の間で2回にわたって投与されるノロウイルスロタウイルス注射用ワクチンは、ロタウイルスの追加ワクチン接種及びノロウイルスの一次ワクチン接種としての役割を果たし得る。生後12か月未満の乳幼児でもノロウイルス胃腸炎に罹患することは少ないながらあるものの、多くの場合、この年齢を越えてから発症し、ワクチンは依然として小児におけるノロウイルス胃腸炎の症例の大半を予防する可能性を有し得る。本ワクチンは、薬学的な有効量の本ワクチン製剤を患者にワクチン接種することによって、ノロウイルス及びロタウイルスへの感染、ノロウイルス及びロタウイルスによって誘発される下痢、嘔吐を伴う疾患norovirusandrotavirusinduceddiarrhealandvomitingdiseases及び胃腸炎を予防し又は減少させ、またそれを必要とする患者においてノロウイルス及びロタウイルスに対する免疫応答を誘導するのに使用し得る。ワクチンの薬学的な有効量とは、ノロウイルス及びロタウイルスからワクチン被接種者を防御する免疫応答を引き出すことが可能な量のことである。当業者には、テクノロジーが進歩するにつれて本発明の概念を様々なやり方で実施可能なことが明白である。本発明及びその実施形態は下記の実施例に限定されず、請求項の範囲内で変化し得る。実施例1:ノロウイルスVLPの作製及び精製ノロウイルスGII-4カプシド遺伝子の抽出及びクローニングノロウイルスGII-4を1999年、フィンランドにおいて患者の便から単離した。便からのRNAを、QiaAmpRNAウイルスミニキットQiagen社、ドイツを使用して抽出した。ノロウイルスVP1カプシド遺伝子1620bpの完全遺伝子を含有するDNA断片を、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法RT-PCRにより以下のプライマー:JV24順方向5’-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3’;SEQIDNO:1Buesaetal.,2002及び逆方向5’-TTATAATGCACGTCTACGCCC-3’;SEQIDNO:2を使用して増幅した。VP1カプシド配列の完全長DNAコピーを、ABIPRISM商標310ジェネティックアナライザAppliedBiosystems社、米国でシーケンシングすることによって得た。問題のノロウイルス株を、EMBL/GenBank及びEuropeanFood-borneVirusesinnetworkFBVEに基づいて遺伝子クラスタに分類したGenBank配列データベース受入番号AF080551。完全VP1カプシド遺伝子を、以下のプライマー:GII-4-順方向5’CACAGGATCCATGAAGATGGCGTCGAATGAC-3’;SEQIDNO:3及びGII-4-逆方向5’CTCTGAATTCTTATAATGCACGTCTACGCCCCGCTCCA-3’;SEQIDNO:4を使用してPTC-200DNAエンジンMJResearch社で増幅した。増幅した断片をpCR2.1-TOPOベクターInvitrogen社、米国にクローニングし、更にバキュロウイルスpFastBac1トランスファーベクターInvitrogen社にサブクローニングした。化学的にコンピテントなTOP10大腸菌細胞への形質転換後、VP1を、ABIPRISM商標310ジェネティックアナライザAppliedBiosystems社でシーケンシングすることによって検証した。ノロウイルスGII-12及びGI-3カプシド遺伝子の抽出及びクローニングフィンランドにおいて、ノロウイルスに感染した患者から便検体を回収した。RNAを上述したように抽出したQiagen社。ノロウイルスGII-12VP1カプシド遺伝子及びGI-3VP1カプシド遺伝子を、RT-PCRにより以下のプライマー:GII-12-順方向5’-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3’;SEQIDNO:5、GII-12逆方向5’TTACTGTACTCTTCTGCGCCC-3’;SEQIDNO:6、GI-3順方向5’-GTAAATGATGATGGCGTCTAA-3’;SEQIDNO:7及びGI-3逆方向5’-TGGGCCATTATGATCTCCTAAT-3’;SEQIDNO:8を使用して増幅した。アンプリコン1.6Kbをシーケンシングし、株を、EMBL/GenBank及びFBVEに基づいて分類したGenBank配列データベース受入番号:GII-12AJ277618、GI-3AF414403。ノロウイルスVP1カプシド遺伝子GII-12、GI-3はコドン最適化された。GII-12をpFastBacDualトランスファーベクターInvitrogen社にクローニングし、GI-3をpFastBac1トランスファーベクターInvitrogen社にクローニングした。ノロウイルスカプシド組み換えバキュロウイルスBVストックの調製組み換えバクミドを作りだすために、pFastBacコンストラクトを、製造業者の指示通りにBac-to-Bacバキュロウイルス発現系Invitrogen社によりDH10BacTMコンピテント大腸菌に形質転換した。バクミドDNAを2mlのオーバーナイトLB培養物からPureLinkHiPurePlasmidDNAミニプレップキットInvitrogen社により精製した。組み換えバクミドDNAをPCRにより分析してバクミド中の遺伝子の存在を検証した。pUC/M13を分析するために、順方向及び逆方向プライマーInvitrogen社を使用した。VLPが、Bac-to-Bac発現系に従った組み換えバキュロウイルスを感染させたスポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperdaSf9昆虫細胞で作製された。より明確に説明すると、Sf9細胞を、マルチディッシュ6ウェルNunc、ThermoFisher社、デンマークに1x106細胞/ml無血清培地Sf900SFMIII、Invitrogen社で播種し、セルフェクチンInvitrogen社を使用してバクミドDNA1μgによりトランスフェクションを行った。細胞を26°Cで成長させ、トランスフェクションから72時間後に収穫した。細胞懸濁液を500xgで5分間にわたって遠心分離にかけ、上清P1バキュロウイルスストックをアリコートし、4°Cで保存した。Sf9細胞にバキュロウイルスP1ストックで感染させ、感染から6日後dpiに細胞懸濁液を500xgで5分間にわたって遠心分離し、アリコートした上清P2バキュロウイルスストックを4°Cで保存した。P2ストックの感染多重度MOIとして表わされるバキュロウイルス力価プラーク形成単位:pfuを、BacPakラピッドタイターキットClontechlaboratories社、米国で求めた。組み換えrノロウイルスカプシドの発現並びにVLPの作製及び精製ノロウイルスVLPの作製のために、200mlのSf9細胞培養物を密度1x106細胞/mlで準備し、細胞に感染多重度1のP2ストックで感染させた。6日目に、感染させた細胞培養物を3000xgでの30分間にわたる4°Cでの遠心分離により清澄化した。上清中のVLPを、100,000xgでの2時間にわたる4°Cでの超遠心分離L8-60Mウルトラセントリフュージ、ベックマンSW-32.1Tiロータにより濃縮し、ペレットを3mlの0.2MのTris-HClpH7.3に再懸濁させた。VLPを10~60の不連続スクロース勾配にロードし、100,000xgでの1時間にわたる4°Cでの超遠心分離に供した。画分を、底部に孔を開けて回収した。約25個の画分が回収され、各画分を、カプシドタンパク質の発現についてSDS-PAGEで分析した。第1のスクロース勾配画分の指示した画分の分析により、35スクロースに遊走したカプシドタンパク質のはっきりとしたピークが示され、これらの画分をプールした。更に、GII-4VLPを追加の不連続スクロース勾配35~60で精製した。VLPを含有する画分を回収し、プールした。スクロースを一晩にわたる1Lのリン酸緩衝食塩水PBSに対する透析により除去した。VLPを限外濾過により濃縮した。簡単に説明すると、最高15mlの透析済みの生成物を、製造業者の指示通りにAmiconUltra30kDa遠心分離フィルタ装置Millipore社、ドイツを使用して濃縮した。VLPをPBS中で4°Cで保存した。全体のタンパク質濃度を、Pierce登録商標BCAプロテインアッセイThermoScientific社、米国を使用して数量化した。純度及び完全性を、12SDS-PAGEとそれに続く濃度分析、EMにより検証した。実施例2:ロタウイルス抗原A.ロタウイルスrVP6の作製及び精製ロタウイルスVP6の抽出及びクローニングVP6遺伝子セグメントの完全ヌクレオチド配列を得るために、G1[P8]RT-PCR強陽性の急性胃腸炎患者から得た10便懸濁液のRNAを、製造業者の指示に従って、QIAampRNAウイルスミニキットQiagen社により抽出した。抽出したdsRNAを、1362bpのVP6を作りだすアンプリコンの特異的プライマー対Matthijnssensetal.,2006とのRT-PCR反応に供した。アンプリコンを、QIAquickゲル抽出キットQiagen社により精製し、ABIPRISMTM310ジェネティックアナライザAppliedBiosystems社によりシーケンシングした。VP6アンプリコンの配列はコドン最適化され、pFastBac1ベクターInvitrogen社にクローニングされた。ロタウイルスVP6組み換えバキュロウイルスBVストックの調製ストックの調製は、本質的に、ノロウイルスに関して上述した通りに行われた。ロタウイルスrVP6の作製及び精製組み換えVP6の作製については、200mlのSf9昆虫細胞に、感染多重度5pfu/細胞、細胞濃度1x106細胞/mlでVP6の遺伝子を含有している組み換えバキュロウイルスを感染させた。培養物の上清を6dpiで回収し、1000rpmで20分間にわたって4°Cで清澄化した。組み換えタンパク質を、100000xgでの1.5時間にわたる4°Cでの超遠心分離により濃縮し、ペレットを0.2MのTris-HClpH7.3に再懸濁させ、連続スクロース勾配10~60で、100000xg、16時間、4°Cで精製した。追加のスクロース勾配精製も適用し得る。VP6タンパク質を含有するスクロースの画分をプールし、一晩にわたってPBSに対して透析し、AmiconUltra50遠心分離フィルタユニットMillipore社での遠心分離により濃縮した。タンパク質をPBS中で4°Cで保存した。全体のタンパク質濃度を、Pierce登録商標BCAプロテインアッセイを使用して数量化した。純度及び完全性を、12SDS-PAGEとそれに続く濃度分析、EMにより検証した。B.2層dlロタウイルスVP2/VP6VLPの作製及び精製ロタウイルスVP2の抽出及びクローニングVP2遺伝子セグメントの完全ヌクレオチド配列を得るために、同じG1[P8]RT-PCR陽性急性胃腸炎患者のRNAをQIAampRNAウイルスミニキットQiagen社により、ロタウイルスrVP6の作製及び精製に関して説明したように抽出した。RT-PCR反応を、VP2の特異的プライマー対Matthijnssensetal.,2006を使用して行うことによって2662bpのアンプリコンを作製した。このアンプリコンを、VP6に関して用いたやり方と同様のやり方で精製及びシーケンシングした。VP2アンプリコンの配列はコドン最適化され、またpFastBacDualベクターInvitrogen社にクローニングされた。ロタウイルスVP2組み換えバキュロウイルスBVストックの調製ストックの調製は、本質的に、ノロウイルスに関して上述した通りに行われた。ロタウイルスdlVP2/VP6VLPの作製及び精製ロタウイルス2層dlVP2/VP6VLPを作製するために、Sf9昆虫細胞に、同感染多重度/細胞、細胞濃度1x106細胞/mlでVP2及びVP6の遺伝子を含有する組み換えBVを同時感染させた。培養物の上清を7dpiで回収し、1000rpmで20分間にわたって4°Cで清澄化した。組み換えVP2/6-VLPを、組み換えノロウイルスVLPと同様に濃縮し、連続スクロース勾配で精製した。VP2及びVP6を含有するスクロースの画分をプールし、PBSに対して透析し、AmiconUltra-100遠心分離フィルタユニットMillipore社での遠心分離により濃縮した。VLPをPBS中で4°Cで保存した。全タンパク質を、Pierce登録商標BCAプロテインアッセイThermoScientific社を使用して数量化した。VP2/6の純度及び完全性を、12SDS-PAGE及びEMで検証した。VP2/VP6サンプル中のVP6の割合を、濃度分析により数量化した。実施例3:キメラタンパク質GII-4カプシドVP6の作製及び精製キメラタンパク質調製物を、Sf9昆虫細胞に、感染多重度5のノロウイルスGII-4rBV及び感染多重度5のロタウイルスVP6rBVを同時感染させることによって作製した。同時感染させた昆虫細胞の上清を、6dpiで収穫した。細胞培養物を、3000xgでの30分間にわたる4°Cでの遠心分離により清澄化し、上清を100000xgで2時間にわたって4°Cで超遠心分離した。ペレットを0.2MのTris-HClpH7.3に再懸濁させ、キメラタンパク質を、連続スクロース勾配10~60により100000xgで3時間にわたって4°Cで同時精製した。両方の組み換えタンパク質それぞれNVカプシド及びRVVP6を含有する画分を、底部に孔を開けて回収し、SDS-PAGEにより分析した。キメラタンパク質を含有する40スクロースからの画分をプールし、スクロースをPBSに対する透析により除去した。透析済みの生成物を、AmiconUltra30kDa遠心分離フィルタ装置で濃縮した。生成物をPBS中で4°Cで保存した。全体のタンパク質濃度を、Pierce登録商標BCAプロテインアッセイThermoScientific社を使用して数量化した。各タンパク質の純度及び完全性を、12SDS-PAGEとそれに続く濃度分析、EMにより検証した。実施例4:ノロウイルス及びロタウイルスVLPのキャラクタリゼーションSDS-PAGE及び濃度数量化サンプルを、アクリルアミド12の分離ゲルとアクリルアミド5の濃縮ゲルのポリアクリルアミドゲルBioradLaboratories社、米国を使用したSDS-PAGEドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。サンプルを5分間にわたって、2SDS、5β-メルカプトエタノール、62.0mMTris-HClpH6.8、25グリセロール及び0.01ブロモフェノールブルーBiorad社を含有するレムリサンプルバッファ中で沸騰させた。ゲルをPageBlueTMタンパク質染色溶液Fermentas社、リトアニアで染色した。SDS-PAGEゲル上のタンパク質の帯を、AlphaEase登録商標FCソフトウェアAlphaInnotech社、米国で製造業者の指示に従って数量化した。図1Aは、矢印で印をつけた、期待される分子量の特定されたタンパク質ののったページブルー染色ゲルの写真である。GII-4カプシド及びロタウイルスVP6のキメラタンパク質が、スクロース勾配の同じ画分で検出された。図1Aは、SDS-PAGE上の精製されたタンパク質を示す。電子顕微鏡法EM調製物を、3酢酸ウラニルUApH4.6で陰性染色した。3μlのタンパク質サンプルをカーボンコートグリッドに30秒間にわたって適用した。グリッドを乾燥させ、3μlのUAをグリッドに更に30秒間にわたって適用した。過剰な液体を除去し、グリッドを、FEITecnaiF12電子顕微鏡PhillipsElectronOptics社、オランダ120kVで動作で観察した。各タンパク質を、EM下でモルホロジーについて観察し図1B、GII-4VLP、rVP6細管及びdlVP2/VP6VLPを含めた高次構造体が確認された。rVP6の細管を示すが、いずれの形態のrVP6タンパク質も構築され得て、以下に限定するものではないが、三量体並びに球体及びシートを含めた高次多量体構造体が含まれる。GII-4VLP及びrVP6を比1:1でカクテルに混合しても、タンパク質の完全性又はカクテル中のいずれの成分のモルホロジーも損なわれなかった。同様の形態学的特徴がカクテルワクチン及びキメラワクチンでも認められ、GII-4VLPで充填されたrVP6細管を特定している。NVカプシド及びRVVP6の他の構造体も形成され得る。実施例5:マウスの免疫化生後7~9週間の雌のBALB/cマウス4~5匹のマウス/グループを、0週目及び3週目の2回にわたる異なるワクチンの皮内ID又は筋肉内IM投与により免疫化した。一部の例において、マウスはワクチンで1度しか免疫化されなかった。免疫化に使用したワクチンは以下の通りであった:GII-4VLP、rVP6タンパク質、dlVP2/VP6VLP、カクテルGII-4VLPとrVP6との混合物、キメラワクチン及びカクテルVLPGII-4VLPとdlVP2/VP6VLPとの混合物。採用したワクチン用量は、50μg、10μg、1μg及び0.1μgであった。殆どの場合、マウスを、10μgの単独ワクチン製剤又は20μgの混合ワクチンカクテル又はキメラで免疫化した。10μgの各単独ワクチン成分をカクテルワクチンは含有している。例えば、カクテルワクチンを得るために、PBS中の10μgのGII-4VLPを10μgのPBS中のrVP6とインビトロで混合し、4°Cで保存した。血液血清サンプル及び便を0採血前、免疫のない血清、2、3及び4週目に回収した。マウスを、最後の免疫化から2週間後に安楽死させ、便、全血及びリンパ組織を回収した。ワクチン製剤を投与していないナイーブなマウスをコントロールとして使用した。実施例6:ワクチンによって誘導される免疫応答の用量反応、動力学及び期間マウスのグループ5匹のマウス/グループを、0日目及び21日目にIM及びID経路で10、1又は0.1μgのGII-4VLPで免疫化した。血清を0、2、3及び4週目に回収し、マウスを5週目に殺した。回収した各血清を1:200の希釈でNV特異的IgGについて試験した。用量10及び1μgで同様の応答レベルが誘発されたが、用量0.1μgでは若干低い応答が観察された図2。加えて、上記のマウスグループからのプールした血清のエンドポイント力価は同様であった図3。コントロールであるナイーブなマウスはNVに応答しなかった。図4は、毎週回収した血清で測定された免疫応答の動力学を示す。免疫化の時点を矢印で示す。結果は、1回の免疫化が極めて強力な免疫応答を、特には用量10μg及び1μgで誘導することを示す。用量50μgは、用量10μgと同様の応答を誘導し、これは用量10μgで応答がプラトーに達することを示す。つまり、これらの結果から用量10及び1μgが最適な用量であることがわかる。ただし、その他の用量のワクチン製剤も使用し得る。加えて、用量10μgでは、25週目まで衰えることのない長期間にわたって持続する免疫応答が誘導された図5。実施例7:便の分析血清から腸管内腔内へのIgGの移動は、NV、RV等の腸内病原菌からの防御と関連づけられている。RV感染からの防御を仲介する又は疾患から回復させる、腸管内でのIgGの能力は、小児における受動免疫グロブリン処置から明らかになっている。単独ワクチン製剤又は混合ワクチンのIgGの考えられ得る移動への影響を試験するために、新鮮なマウスの便を、100mMのNaCl、1mMのCaCl2、0.05Tween、1アプロチニン及び10μMのロイペプチン全てSigma-Aldrich社製を含有する10mMのTrisバッファに懸濁させ、ボルテックスにより均質化した10の便懸濁液を再構成した。均質化した懸濁液を氷上で20分間にわたって維持し、15分間にわたって18000xg、4°Cで遠心分離に供した。上清を抽出し、-80°Cで保存した。便サンプルを、血清抗体ELISAについて説明したように、若干の変更を加えてノロウイルスGII-4及びロタウイルスVP6特異的IgGについてELISAで試験した。コーティング及びブロッキング後、便サンプル10便懸濁液を1:2から連続的に1:32まで2倍希釈し、プレートに加えた。ヤギ抗マウスIgG-HRPSigma-Aldrich社を1:3000に希釈し、プレートを展開し、上述したように吸光度を測定した。図8は、極めて高いレベルのNV特異的IgGが免疫化マウスの便で検出されたが、コントロールのマウスの便では検出されなかったことを示す。実施例8:血清分析マウスのグループを、上述したように各単独ワクチン製剤又は混合ワクチンで免疫化した。IgGサブタイプIgG1及びIgG2aを、免疫化マウスの血清から測定することによってワクチン製剤によって誘導される免疫応答のタイプを求められるようにした。TヘルパーTh1/Th2ダイコトミーと優勢な免疫グロブリンアイソタイプとの関係を求めた。IgG1はTh2タイプ応答、IgG2aはTh1タイプ応答と分類された。Th1タイプは細胞性免疫を促進し、Th2タイプは体液性免疫を促進する。ノロウイルス血清IgG及びIgGサブタイプELISA免疫化マウス及びコントロールのマウスからの血清を、酵素結合免疫吸着測定法ELISAにより免疫グロブリンGIgG、IgG1及びIgG2aについて試験した。ノロウイルスGII-4、GII-12及びGI-3VLPを、10mMのPBS中、それぞれ濃度0.2μg/ml、0.4μg/ml及び1μg/ml100μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートNuncImmunoMaxisorp、ThermoFisherScientific社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国のコーティング4°C、一晩に使用した。0.05のTween20を含有するPBSPBS-Tで3回洗浄した後、プレートを室温RTで1時間にわたって5のスキムミルクSigma-Aldrich社を含有するPBSでブロックした。次にウェルを3回、PBS-Tで洗浄し、1時間にわたって37°Cで、1のスキムミルクを含有するPBS-T中で1:200に希釈した100μlの血清又は2倍希釈系列と共にインキュベートした。全ての血清サンプルを2重のウェルで試験した。6回洗浄した後、PBS-T中の1ミルク中で1:4000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼHRP抱合抗マウスIgGSigma-Aldrich社をウェルに加えた。抗GII-4IgGサブタイプ応答を、PBS-T中の1ミルク中で1:6000に希釈したヤギ抗マウスIgG1又はIgG2aHRP抱合体Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州を使用して調べた。インキュベーション後1時間、37°C、プレートを洗浄し、o-フェニレンジアミンジヒドロクロリドSIGMAFASTOPD、Sigma-Aldrich社基質を濃度0.4mg/mlで添加した。プレートを暗所において室温で30分間にわたってインキュベートし、反応を2Mの硫酸H2SO4で止めた。波長490nmでの吸光度光学密度、ODを、マイクロプレートリーダーVictor21420、PerkinElmer社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国で測定した。ナイーブなマウスからの1つの既知の陽性血清サンプル及び1つの陰性血清サンプルをコントロールとして全てのプレートに加えた。ブランクのウェル血清を入れていないウェルからのバックグラウンドシグナルを、プレートでのOD測定値の全てから引いた。正味の吸光度値が設定したカットオフ値より高い場合はサンプルを陽性とみなし、計算は以下の通りに行われた:平均ODナイーブなマウス3xSD及び少なくとも0.100OD。ロタウイルス血清IgG及びIgGサブタイプELISAVP6タンパク質を、バイカーボネート/カーボ―ネートバッファ0.1mMのNa2CO3、0.8mMのNaHCO3、pH9.55中、濃度1μg/ml100μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートのコーティングに使用した。上記のステップ後、ELISAを、ノロウイルスの場合のELISAと同様にして行った。交差反応性ロタウイルス特異的血清抗体の検出に関して、ポリクローナルウサギ抗ロタウイルスヒトDAKOをバイカーボネート/カーボネートバッファで1:200に希釈し、100μl/ウェルをマイクロタイタープレートのコーティングに使用した4°C、一晩。PBS-Tで4回洗浄した後、プレートを、上述したようにして調製した100μl/ウェルのロタウイルス抗原4°C、一晩でコーティングした。PBS-Tで4回洗浄した後、プレートを37°Cで1時間にわたって5のスキムミルクを含有するPBSでブロックした。このステップの後、ELISAを、ノロウイルスの場合の血清ELISAと同様にして行った。血清IgGの強度及びサブタイプ図6、7はそれぞれノロウイルス及びロタウイルス特異的血清IgG滴定を示す。コントロールのマウスを除いて、免疫化したマウスのどのグループについてもエンドポイント力価はかなり高かった逆数力価>4~5log10。これらの結果は、混合ワクチン中の成分による特異的免疫応答の相互阻害又は抑制がないことを示している。図9、10は、本発明のワクチン製剤の全てが、バランスのとれた混合型、すなわちTh1タイプ及びTh2タイプの免疫応答を誘導することを示している。この両方のタイプの免疫応答がノロウイルス及び/又はロタウイルスへの感染からの防御を仲介しているらしいことを考えると、このことは重要な観察結果である。Th細胞はB細胞を支援し細胞間の接触又は可溶性サイトカインにより、特にはワクチン全般が誘導しようとする長期間にわたるメモリー応答に必要なメモリーB細胞への分化を支援する。RVVP6特異的Th細胞はマウスロタウイルス感染からの防御を誘導し、またRVの異型のVP4又はVP7分子上の中和エピトープに特異的なB細胞に同種の支援を行うEsquivelFR,Arch.Virology2000;Peraltaetal.,VirologyJournal,2009。従って、Th細胞は、異型の免疫応答の誘導に重要である。実施例9:免疫応答のアビディティ抗体アビディティは、機能的抗体の成熟又は親和性の成熟の尺度である。高アビディティの抗体は、ワクチンの防御効力と大きく相関することが示されているMakidonetal.,2008。発明者は、血液中に高アビディティのNV特異的IgG抗体を有するより年齢の高い子供は、抗体が低アビディティの2歳未満の子供よりNVへの感染が少ないことを以前に示しているNurminenetal.,2010。NV及びRV抗体のアビディティを求めるために、尿素溶出により低アビディティの抗体を除去した[KannoandKazuyama,2002]。ELISAアッセイを、追加の尿素インキュベーションステップを除いて上述のように行った。抗原ノロウイルスGII-4VLP又はロタウイルスVP6タンパク質をコーティングしたプレート上での血清のインキュベーション後、血清をプレートから吸引し、PBS-T中の8Mの尿素Sigma-Aldrich社を添加した。5分間のインキュベーション後、処理を繰り返した。プレートを4回洗浄し、それからHRP抱合抗マウスIgGを添加し、プレートを上述したようにして展開した。アビディティインデックスを、[尿素がある場合のOD/尿素がない場合のOD]x100として計算し、インデックスの値が50を超える場合を高アビディティとみなした。単独又は混合ワクチンでの免疫化は、高アビディティのNV-及びRV特異的IgG抗体を誘導したアビディティインデックスはそれぞれ50を超える。結果は、本ワクチン製剤が、防御特性を有する高アビディティ抗体の強力な誘導物質であることを示す図11。実施例10:交差反応性免疫応答異なる血清型G1P8、G2P6、G4P6、G8P10、G12P4、BRV、RRVのロタウイルスを胎児アカゲザル腎臓MA104細胞MA104中で培養し、交差反応性研究のためのELISAにおける抗原として使用するために用意した。免疫化したマウス及びコントロールのマウスからの血清を、実施例8で説明したようにELISAでノロウイルス及びロタウイルス抗体について試験した。ノロウイルスGII-4誘導血清抗体は、異種GI-3及びGII-12抗原に対して交差反応性であった図12、上のパネル。更に、ワクチン製剤で免疫化したマウスのロタウイルス特異的血清抗体は、サブグループ1及び2に属する様々なヒト、ウシ及びサルロタウイルス株に対して交差反応性であった図12、下のパネル。驚くべきことに、ロタウイルスVP6抗原では、ロタウイルスVP6単独ワクチンと比較して、混合ワクチンで免疫化したマウスの血清におけるGI-3に対する交差反応性免疫応答は約50上昇した図12、上のパネル。この結果は、本混合ワクチンの抗原性成分により相乗効果がもたらされることを示している。実施例11:ブロッキングアッセイブロッキングアッセイは、NVについての代替中和アッセイである。NVは、インビトロの培地では成長しないため、古典的な意味でのウイルスが結合して許容細胞に感染するのをブロックする抗体での中和アッセイを行うことができない。近年、ヒト組織/血液型抗原HBGAが、とりわけ粘膜表面の細胞例えば、腸細胞上で発現するNVの受容体として発見された。例えば、糖Hタイプ3がNVGII-4の推定上の受容体として特定されているため、GII-4VLPは上記の糖に結合するLHuhtietal.,2010。受容体へのNVVLPの結合は、中和特性を有する抗体でブロックされると予測される。実際、GII-4VLPのHタイプ3への結合は、飲用水媒介の急性胃腸炎の大流行中にNVに感染しなかった子供からの血清でブロックすることができたKNurminenetal.,2010。NVへの感染からの防御は、血清の強力なブロッキング活性と相関関係にあった。従って、抗体のブロッキング活性は、様々なワクチンアプローチを考慮にいれる場合、NV防御の関連する代替マーカーになり得る。NVVLPのHBGAHタイプ3への結合をブロックするためのアッセイを、免疫化したマウス及びコントロールのマウスの血清で行った。マイクロタイタープレートを、濃度2μg/mlでPBS中のGII-4又はGI-3VLPpH7.2でコーティングし、4時間にわたって室温でインキュベートした。洗浄後、プレートをPBS中の5のミルクと共に一晩、4°Cでインキュベートした。1:200~1:6400まで連続的に希釈した血清をウェルに加え、プレートを1時間にわたって37°Cでインキュベートした。血清を吸引後、100μlのビオチン化Hタイプ3又はLewisBLeubLectinityHoldings社、モスクワ、ロシアコントロールを、1のミルクを含有するPBS-T中の濃度20μg/ml又は40μg/mlで添加した。37°Cでの4時間後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン抱合HRPThermoFisherScientific社の1:2000希釈物を添加し、1時間にわたって37°Cでインキュベートした。呈色反応の進行及び波長490nmでの吸光度の測定を上述した通りに行った。血清なしでインキュベートしたウェルのOD測定値を、Hタイプ3のGII-4VLPへの結合についての最大シグナルとみなした。ブロッキングインデックスは以下のようにして計算した:100-OD[血清あり]/OD[血清なし]x100。VLPの陰性コントロールLeubHBGAへの結合は検出されなかった。ブランクのウェルHBGAが入っていないウェルからのバックグラウンドシグナルを、試験したサンプルのOD値の全てから引いた。図13A及び13Bはそれぞれ、GII-4及びGI-3のその推定上の受容体Hタイプ3への結合のブロッキングを示している。混合ワクチンと比較すると、単独ワクチンで免疫化したマウスのHタイプ3へのGII-4VLPの結合を最大限ブロックするには2倍大きい力価が必要であった図13C。この結果は、混合ワクチン中のrVP6タンパク質が、GII-4特異的血清のブロッキング活性を抑制又は阻害していないことを示す。それどころか、混合ワクチン製剤で免疫化したマウスの血清の注目に値するブロッキング活性は、これまでの実験で検出されたものと同様のrVP6タンパク質のアジュバント効果を示す。更に、発明者のデータは、遺伝子群間の交差防御が、発明者の研究で使用したワクチン製剤で容易に検出可能であることを示す。この種の観察結果は、ノロウイルスワクチン研究の分野において極めて稀である。また、この結果は、ウイルスの1つの株/遺伝子型いわゆる一価ワクチンでの免疫化は、上述したようにワクチン製剤に含まれていない他の株に対する交差反応性又は異型免疫応答を誘導するだけではなく、異種ウイルスの結合もブロックし、それを中和することを示す。実施例12:抗体分泌細胞ASCELISPOT抗体分泌細胞ASCは、プラズマB細胞及び病原体からの長期間にわたる防御を担い、ワクチン接種で誘導しようとするメモリー応答の特徴である病原体への再曝露と同時に迅速に病原体に反応するメモリーB細胞メモリー応答に分割される。ELISPOTアッセイを用いて、免疫化したマウスの脾臓におけるIgG抗体分泌プラズマ細胞及びメモリーB細胞の頻度を検出した。安楽死させたマウスの脾臓をハンクス平衡塩類溶液HBSSSigma-Aldrich社に回収した。脾臓の構造体をメスで切断し、70μmセルストレーナBecton、DickinsonandCompany社、米国で単細胞懸濁液に解離させた。懸濁液を300xgで10分間にわたって遠心分離し、細胞をHBSSに再懸濁させた。赤血球を1:10に希釈したHBSSで溶解させ、その後、懸濁液のモル濃度を2xHBSSで回復させた。脾細胞懸濁液を3回洗浄し、凍結培地40FBS、10DMSOを補充したRPMI、Sigma-Aldrich社で凍結させ、後に使用するために液体窒素中で保存した。96ウェルPVDFプレートMillipore社を一晩、4°CでノロウイルスGII-4VLP又はロタウイルスVP6タンパク質で、濃度40μg/ml100μl/ウェル中でコーティングした。脾細胞を液体窒素から解凍し、洗浄し、培地10FBS、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノール及び2mMのL-グルタミンを補充したRPMI-1640に懸濁させた。プレートを洗浄、ブロックした後、脾細胞を濃度4x105細胞/ウェルで添加し、一晩、37°C、5CO2でインキュベートした。プレートを6回、PBS-Tで洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-HRPSigma-Aldrich社をウェルに希釈1:1000で添加した。3時間の室温でのインキュベーション後、プレートをしっかりと洗浄し、DAB基質SigmaFASTDAB、Sigma-Aldrich社で展開し、スポットを数えた。コントロールであるナイーブな動物のウェルに現れるスポットを実験グループから引いた。データを、GII-4VLP又はVP6特異的抗体分泌細胞ACSとして表わし、1x106細胞ごとに正規化した。一部の例では、細胞をインビトロで4日間にわたってGII-4VLP又はrVP6と共にインキュベートし、洗浄し、メモリーB細胞の数量化との関連で説明したようにプレーティングした。インビトロでの刺激を受けていない細胞で行ったELISPOTアッセイから得られたスポットを、活発に分泌するプラズマ細胞とみなした。4日間にわたって培養した細胞で得られたスポットは、プラズマ細胞でできたスポットを引いた後、メモリーB細胞活性を表す。図14は、本ワクチン製剤がNV及びRV特異的IgG抗体を産生するプラズマB細胞を誘導することを示す。また、特異的IgG抗体を分泌するメモリーB細胞が高頻度で単独及び混合ワクチンで同様の量で誘導され、誘導される応答がメモリー応答であることを示す。参考文献"