"aPDZドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、bPDZ結合ペプチドに融合した、抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドとを含む、宿主細胞。前記PDZ結合ペプチドが5~20アミノ酸長である、請求項1に記載の宿主細胞。真核細胞および原核細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の宿主細胞。前記真核細胞が酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項3に記載の宿主細胞。前記酵母細胞が、出芽酵母S.cerevisiae、ピキアパストリスP.pastoris、カンジダアルビカンスC.albicans、ハンゼヌラポリモルファH.polymorpha、ヤロウイアリポリティカY.lipolitica、および分裂酵母S.pombeからなる群から選択される、請求項4に記載の宿主細胞。前記原核細胞が、大腸菌E.coli、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、枯草菌Bacillussubtilis、緑膿菌Pseudomonasaeruginosa、および霊菌Serratiamarcescansからなる群から選択される、請求項3に記載の宿主細胞。前記細胞表面タンパク質が細胞壁タンパク質である、請求項4または5に記載の宿主細胞。前記細胞壁タンパク質が、Aga1、Aga2、Agα1、Cwp1、Cwp2、Gas1p、Yap3p、Flo1p、Crh2p、Pir1、Pir2、Pir3、およびPir4からなる群から選択される、請求項7に記載の宿主細胞。前記PDZドメインおよび前記PDZ結合ペプチドのそれぞれがCys残基を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記パートaのポリヌクレオチドが、エンハンサードメインをさらにコードする、請求項1~9のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記エンハンサードメインが、ヒトフィブロネクチンの10番目のフィブロネクチンIII型ドメインFN3の変異体である、請求項10に記載の宿主細胞。前記PDZドメインが、InaDPDZドメインSEQIDNO:2、ディシブルド1様DVL1LPDZSEQIDNO:3、proTGF-α細胞質ドメイン-相互作用タンパク質18TACIP18PDZ1SEQIDNO:4、TACIP18類似体SITACPDZ1SEQIDNO:5、PSD-95/SAP90PDZ3ドメインSEQIDNO:6、およびErbinPDZドメインSEQIDNO:7からなる群から選択される、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記PDZ結合ペプチドが、NorpASEQIDNO:1のC末端配列または少なくとも90同一であるその断片を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。Cys残基が-1位に位置している、請求項13に記載の宿主細胞。前記PDZ結合ペプチド配列がGKTEFCASEQIDNO:16である、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記PDZ結合ペプチドが、前記抗体またはその抗原結合性断片のC末端に融合している、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記パートaのポリヌクレオチド、および/または前記パートbのポリヌクレオチドが、蛍光マーカータンパク質をさらにコードする、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記パートaのポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノムに組み込まれている、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記パートaおよびパートbのポリヌクレオチドが、別個のベクター中に存在するか、または場合によって同じベクター中に存在する、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記抗体が、2つの重鎖と2つの軽鎖とを含む四量体IgG免疫グロブリンである、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記抗体の前記抗原結合性断片が、少なくとも前記重鎖の可変領域および/または前記軽鎖の可変領域を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記抗体の前記抗原結合性断片がFabを含む、請求項21に記載の宿主細胞。前記抗体の前記抗原結合性断片がscFvを含む、請求項21に記載の宿主細胞。前記パートaのポリヌクレオチドが、前記細胞表面タンパク質を細胞表面に導くシグナル配列をさらに含む、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。宿主細胞が酵母細胞である場合に、前記シグナル配列がAga2シグナル配列である、請求項24に記載の宿主細胞。前記PDZ結合ペプチドが15アミノ酸長未満である、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記PDZドメインが約80~100アミノ酸長である、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。前記PDZドメイン-PDZ結合ペプチド相互作用が、約100nM以下のKdを有する、前記請求項のいずれか1項に記載の宿主細胞。それぞれがその表面に異なる抗体またはその抗原結合性断片を発現する、前記請求項のいずれか1項に記載の少なくとも10^3種の異なる真核宿主細胞を含む、複数の細胞。前記真核宿主細胞が酵母細胞である、請求項29に記載の複数の細胞。前記真核宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項29に記載の複数の細胞。請求項29~31のいずれか1項に記載の複数の細胞を培養することを含む、少なくとも10^3種の異なる抗体またはその抗原結合性断片を細胞表面に提示させる方法。前記PDZドメインおよび前記PDZ結合ペプチドが少なくとも1つのジスルフィド結合で連結している、請求項32に記載の方法。前記複数の細胞を抗原と接触させることと、場合によって該抗原に結合する細胞を選択することとをさらに含む、請求項32~33のいずれか1項に記載の方法。前記抗原に結合する細胞を選択することをさらに含む、請求項34に記載の方法。前記選択することが、蛍光活性化細胞選別FACS、ビーズに基づく選別、または固相パニングによる、請求項35に記載の方法。前記ビーズに基づく選別が、磁気活性化細胞選別MACSである、請求項36に記載の方法。抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、a抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択することと、b請求項30に記載の複数の酵母細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法。抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、a抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択することと、b請求項31に記載の複数の哺乳動物細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法。抗体またはその抗原結合性断片を選択する方法であって、a請求項30に記載の複数の酵母細胞を抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することと、b請求項31に記載の複数の哺乳動物細胞を該抗原と接触させ、かつ該抗原に結合する細胞を選択することとを含む前記方法。抗体または抗原結合性断片を提示する複数のファージを抗原と接触させ、かつ該抗原に結合するファージを選択するステップをさらに含む、請求項40に記載の方法。詳細な説明本発明は、抗体を含む対象タンパク質を細胞表面に提示させるのに有用な材料および方法に関する。細胞表面にタンパク質を提示することができる原核細胞および真核細胞の両者が提供される。本開示において提供される方法および材料は、対象タンパク質を細胞表面に提示するための、対象タンパク質とPDZ結合ペプチドの融合体とPDZドメインと細胞表面タンパク質の融合体との相互作用に関する。本発明の有利な一態様は、特に対象タンパク質が多量体であり、複数の異なるポリペプチド鎖を含み得る場合に、PDZ結合ペプチドの小さいサイズが、対象タンパク質の折り畳みおよび溶解性への干渉の可能性を低くするということである。例えば、抗体の組み立ておよび抗原との結合への干渉が低下し、抗体またはその抗原結合性断片をPDZ結合ペプチドとともに含む融合タンパク質が容易に単離または精製され、別々に宿主細胞と会合していない状態で抗原との結合について試験される。本明細書における例は、本開示の材料および方法が、2つの重鎖と2つの軽鎖とを含む四量体免疫グロブリンを細胞表面に発現させることを可能にすることを示す。別の潜在的利点は、蛍光活性化細胞選別技術に依存して強い結合特性を示す細胞を濃縮し、分離することができることであり、これは10-6未満の頻度で出現する候補などの対象の候補タンパク質、例えば抗体を発現する、より希少なクローンを特定することを可能にする。別の潜在的利点は、同じ細胞上に異なる対象タンパク質を提示する能力である。例えば、それぞれNorpAテザーを含む異なる対象タンパク質をクローニングし、InaDPDZ1ドメイン/Aga1融合体の単一コピーで発現してもよい。細胞表面タンパク質との結合に基づく他の技術と比較したときの本発明のまた別の潜在的利点は、多様性が向上した比較的大きいライブラリーを調製することができることである。A.定義本明細書において使用する際、特異的に結合する、抗原特異的である、抗原に対して特異的である、または抗原と免疫反応する抗体は、無関係ないし類似する配列の他の抗原よりも高い親和性、好ましくは少なくとも103、104、105、または106高い親和性で抗原に結合する、本発明の抗体またはポリペプチド結合剤を指す。一態様において、本発明の抗体またはポリペプチド結合剤、あるいはその断片、変異体、もしくは誘導体は、他の種、すなわち非ヒト種の類似する抗原に対するその結合親和性と比較して、より高い親和性でヒト抗原に結合するが、標的の相同分子種を認識し、それに結合するポリペプチド結合剤も想定されている。例えば、その同種抗原に対して特異的な抗体またはその断片であるポリペプチド結合剤とは、その抗体の可変領域が、検出可能な優先性で所望の抗原を認識し、それに結合することを示す例えば、所望の抗原がポリペプチドである場合、抗体の可変領域は、結合親和性の測定可能な差によって、ファミリーメンバー間に局所的な配列同一性、相同性、または類似性が存在する可能性があるにもかかわらず、抗原ポリペプチドを同じファミリーの他の既知のポリペプチドと区別することができる。特異抗体が、抗体の可変領域外、特に分子の定常領域の配列との相互作用によって、他のタンパク質例えば、黄色ブドウ球菌S.aureusタンパク質AまたはELISA技術における他の抗体とも相互作用し得ることは理解されるであろう。本発明の方法で使用するためのポリペプチド結合剤、例えば抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当分野で周知であり、日常的に行われている。そのようなアッセイの包括的な考察に関しては、Harlowetal.Eds,Antibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY1988,Chapter6を参照されたい。本発明において使用するための抗体は、当分野で既知の本明細書においてより詳細に説明されるいかなる方法を用いて作製してもよい。用語エピトープは、抗原結合領域の1つまたは複数において、選択的結合剤が認識し、結合することができるあらゆる分子の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは、本明細書において使用する際、隣接または非隣接であってよい。誘導体という用語は、ポリペプチド例えば、対象タンパク質、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片に関連して用いる場合、ユビキチン化、グリコシル化、脱グリコシル化、治療薬または診断薬とのコンジュゲート化、標識例えば、放射性核種または様々な酵素、PEG化ポリエチレングリコールによる誘導体化などのポリマー共有結合、およびヒトタンパク質に通常存在しない、オルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドを指す。誘導体は、本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。検出可能部分または標識とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識には、32P、35S、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素例えば、ELISAにおいて一般的に用いられているもの、ビオチン-ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、それに対する抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なハプテンおよびタンパク質例えば、c-myc、HA、または別の標識された核酸分子と相補的な配列を有する核酸分子が含まれる。検出可能部分は、しばしば、試料中の結合した検出可能部分の量を定量化するために使用可能な放射性、発色性、または蛍光性のシグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。宿主細胞という用語は、特定の1つまたは複数の対象細胞だけではなく、それらの子孫も指すと理解される。また、培養において、後世代で自然突然変異または偶発的突然変異が生じることがあり、そのためかかる子孫が親細胞と完全に同一でない可能性があるが、本明細書において使用するこの用語の範囲に依然として含まれることも理解される。作用可能に結合したという用語は、2つ以上のポリヌクレオチド例えば、DNAセグメント間の機能的関係を指す。典型的には、この用語は、転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、シス作用性転写制御因子のあらゆる組み合わせを含む、本発明のプロモーター/エンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作用可能に結合している。一般に、転写配列に作用可能に結合したプロモーター転写調節配列は、その転写配列に物理的に隣接している、すなわちそれらの配列はシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、その配列が転写を増強するコード配列と物理的に隣接するか、または接近している必要はない。ポリリンカーは、コード配列を挿入するのに便利な位置を提供するため、遺伝子はプロモーターに作用可能に結合される。ポリリンカーは、一連の3個以上の狭い間隔の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むポリヌクレオチド配列である。シグナル配列という用語は、普通は細胞によって非細胞質の位置に排出例えば、分泌されるか、または膜成分となる特定のタンパク質のNH2末端に存在する短いアミノ酸配列すなわち、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。シグナルペプチドは、細胞質から非細胞質の位置へのタンパク質輸送を導く。本明細書で使用する際、結合することは、水素結合、ファンデルワールス、イオン双極子、および疎水性相互作用を含む弱い力、ならびに強い力であるイオン結合のうちの1つまたは複数からなる非共有相互作用の特定のネットワークによって生じる2つ以上の異なる分子実体間の物理的会合である。結合のレベルまたは程度は、親和性に関して測定することができる。親和性または結合親和性は、2つ以上の異なる分子実体間の結合相互作用の強度の尺度であり、平衡結合定数または動的結合速度パラメータによって定義することができる。好適な定数またはパラメータおよびそれらの測定単位の例は、当分野で周知であり、これには平衡会合定数KA、例えば約105M-1以上、約106M-1以上、約107M-1以上、約108M-1以上、約109M-1以上、約1010M-1以上、約1011M-1以上、または約1012M-1以上;平衡解離定数KD、例えば、約10-5M以下、または約10-6M以下、または約10-7M以下、または約10-8M以下、または約10-9M以下、または約10-10M以下、または約10-11M以下、または約10-12M以下;オン速度例えば、秒-1、モル-1およびオフ速度例えば、秒-1が含まれるが、これらに限定されない。KAの場合、より高い値が、より強いまたは強化されたまたはより大きい結合親和性を意味するが、KDの場合は、より低い値が、より強いまたは強化されたまたはより大きい結合親和性を意味する。本明細書において使用する際、強化された結合速度パラメータとは、増加した滞在時間、より速い会合、またはより遅い解離を意味する。本明細書において使用する際、低下した結合速度パラメータとは、減少した滞在時間、より遅い会合、またはより速い解離を意味する。2つの要素間、例えば抗体と抗原との間の親和性は、直接的または間接的に測定することができる。親和性の間接的測定は、親和性を示すおよび/または親和性に比例する代理特性を用いて実施することができる。かかる代理特性には、第1の成分の第2の成分との結合の量もしくはレベル、または第1の成分の第2の成分に対する見かけの結合親和性を予測するもしくはこれと相関する、第1の成分または第2の成分の生物物理学的特徴がある。具体的な例には、第1の成分または第2の成分のいずれかの飽和濃度以下での第1の成分の第2の成分との結合の量またはレベルの測定がある。測定可能な他の生物物理学的特徴には、第1の成分および第2の成分のうちの一方または両方の正味分子電荷、回転活性、拡散速度、融点、静電ステアリングまたは配置が含まれるが、これらに限定されない。また他の測定可能な生物物理学的特徴には、温度、pH、またはイオン強度の変化の影響に対する結合相互作用の安定性の特定が含まれる。測定された親和性は、測定に用いた正確な条件に依存し、これらの条件には、他にも多数ある要素の中でも特に、結合要素の濃度、アッセイの設定、結合要素の価数、緩衝液組成、pH、イオン強度、および温度、ならびに結合反応に加えられる追加要素、例えばアロステリック調節因子および制御因子が含まれる。定量的および定性的方法を用いて、結合相互作用の絶対強度および相対強度の双方を測定してもよい。B.PDZドメインおよびPDZ結合ペプチド1.PDZドメイン本発明は、PDZドメインに融合した細胞表面タンパク質を含む融合タンパク質を用いて、抗体および抗体断片を含むタンパク質を細胞表面に提示させるのに有用な方法および細胞を提供する。PDZドメインは、当初は、95kDaのシナプス後肥厚部タンパク質PSD-95、ショウジョウバエ腫瘍抑制discs-largedlg、およびタイトジャンクションタンパク質閉鎖帯-1ZO-1の間で保存された構造要素を含むとされていた。これらのドメインは、多くの多様なタンパク質に認められる。これらは、一般に、相互作用タンパク質のカルボキシ末端に位置する短いカルボキシ末端ペプチド配列に結合するが、内部配列に結合することもある。PDZドメインは、一般に、一個の5~6本鎖逆平行βバレルおよび2~3個のαヘリックスからなる。ヘリックスα2および鎖β2は、PDZドメインの折り畳み内の保存されたペプチド結合クレフトのいずれかの側を形成する。β1鎖とβ2鎖との間のループは、C末端カルボキシレート結合ループを形成する。C末端ペプチド例えば、PDZ結合ペプチドは、ヘリックスα2および鎖β2によって形成される溝中の逆平行β鎖として結合する。PDZドメインの保存されたGly-Leu-Gly-PheGLGF配列は、β1とβ2とを連結するループ内に認められ、これはC末端カルボキシレート基の水素結合配位に重要である。PDZドメインのN末端およびC末端は、PDZドメインのペプチド結合部位の反対側で互いの近くに位置する。HungおよびShengJ.Biol.Chem.,277:8,5699-57022002は、PDZドメインをそのペプチドリガンドの結合特異性に基づいて3つのクラスに分類した。PDZドメインの結合特異性は、一般に、ヘリックスα2の最初の残基とC末端PDZ結合リガンドの-2位の残基の側鎖との相互作用によって決定される番号付けは0位のC末端アミノ酸に基づく。クラスIPDZ相互作用、例えばPSD-95の相互作用において、セリンまたはトレオニン残基がPDZ結合リガンドの-2位を占める。側鎖ヒドロキシル基は、α2-1位第2のαヘリックスであるα2の最初の残基のヒスチジン残基のN-3窒素とともに水素結合を形成し、これはクラスIPDZドメインの間で高度に保存される。対照的に、クラスIIPDZ相互作用は、PDZ結合ペプチドリガンドの-2位およびPDZドメインのα2-1位の双方にある疎水性残基を特徴とする。神経細胞-酸化窒素シンターゼnNOSなどにあるPDZドメインの第3のクラスは、PDZ結合リガンドの-2位における負荷電アミノ酸を優先する。この特異性は、PDZ結合リガンドの-2位残基の側鎖カルボキシレートと、α2-1位置のチロシン残基のヒドロキシル基の配位によって決定される。PDZドメインは、一般に、遊離カルボキシレート基を含む、それらのタンパク質標的のC末端の3~4個のアミノ酸と相互作用するHillieretal.,1999Science284:812-815。I型PDZドメインは、共通配列S/T-X-V/L式中、Xは任意の残基であるに結合しDoyleetal.,1996Cell85:1067-1076、Songyangetal.,1997Science275:73-77、一方II型PDZドメインは、より一般的な配列Φ-X-Φ式中、Φは、通常は大きい疎水性残基であるに結合するDanielsetal.,1998Nat.Struct.Biol.5:317-325。PDZドメインの分類は、配列または構造に基づく情報を用いて、上述の3つのクラスを超えて拡大され、改善されたPDZドメイン特異性の予測および新規のPDZドメイン/ペプチド相互作用の設計を可能にしているTonikianetal.,2008PLosBiol6:e239、Kaufmannetal.,J.Mol.Model.201117:315-324。PDZドメインの大部分とは対照的に、一部のPDZドメインは、内部ペプチド配列と相互作用する。例えば、PSD-95のPDZドメインは、nNOSの内部領域と相互作用する。nNOS-PSD-95PDZ複合体の結晶構造において、nNOSの標準PDZドメインと近接するアミノ酸残基は、PSD-95PDZドメインのペプチド結合溝中に入る二本鎖βヘアピンフィンガーを形成する。βフィンガーの鋭角のβターンは、ペプチドリガンドの末端カルボキシレート基と同じ部位に結合する。内部ペプチドすなわち、C末端にあるのではないペプチドに結合するPDZドメインは、本発明の範囲に含まれるとみなされる。本明細書において使用する際、PDZドメインという用語は、PDZドメインに特徴的な上述の保存された構造要素のうちの1つまたは複数、例えば保存されたペプチド結合クレフトを形成するヘリックスα2および鎖β2、C末端カルボキシレート結合ループを形成するβ1鎖とβ2鎖との間のループ、GLGF反復、クラスIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位のN-3含有ヒスチジン残基または好適な窒素を含むその保存的置換、クラスIIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位の疎水性残基、および/またはクラスIIIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位のヒドロキシル含有チロシン残基またはヒドロキシルを含むその保存的置換、ならびにそれらの断片、伸長部、または変異体を含む、タンパク質のドメインを指す。例となる実施形態において、断片は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上のアミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、約20、約25、または約30アミノ酸長である。例となる実施形態において、伸長部は、SEQIDNO:6の残基394~399を含む。例となる実施形態において、変異体は、かかるドメインの少なくとも50個のアミノ酸と少なくとも80、85、90、または95同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記で特定した保存要素のうちの1つまたは複数が保持される。例えば、保存されたペプチド結合クレフトを形成するヘリックスα2および鎖β2が保持され、場合によっては、GLGF反復、クラスIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位のN-3含有ヒスチジン残基または好適な窒素を含むその保存的置換、クラスIIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位の疎水性残基、および/またはクラスIIIPDZドメインの間で高度に保存された、ヘリックスα2の1位のヒドロキシル含有チロシン残基またはヒドロキシルを含むその保存的置換もまた保持される。PDZドメインという用語は、シナプス後肥厚部タンパク質95PSD-95SEQIDNO:10、腫瘍抑制discs-largedlgSEQIDNO:11、タイトジャンクションタンパク質閉鎖帯ZO-1SEQIDNO:12、InaDSEQIDNO:2、ディシブルド1様DVL1LSEQIDNO:3、proTGF-α細胞質ドメイン-相互作用タンパク質18TACIP18SEQIDNO:4、TACIP18類似体SITACSEQIDNO:5、PDZ様ドメイン、PDZダイマー、タンデムPDZドメインLeeZheng、CellCommunicationandSignaling20108:8、PSD-95/SAP90PDZ3ドメインSEQIDNO:6、およびErbinSEQIDNO:7のPDZドメイン、または本明細書に記載されるPDZ結合ペプチドと結合することができるその断片、伸長部Petitetal.,PNAS106:18249-542009およびWangetal.,ProteinCell1:737-512010、もしくは変異体を含むが、これらに限定されない。これらの実施形態のいずれにおいても、天然にCysを含むPDZドメイン例えば、InaDまたはTACIP18またはSITACのPDZ1が想定される。また、PDZドメインという用語は、PDZ1ファミリーメンバーの脊椎動物ホモログも含み、これには哺乳動物ホモログおよび鳥類ホモログが含まれるが、これらに限定されない。PDZドメインファミリーメンバーの代表的な哺乳動物ホモログには、マウスホモログおよびヒトホモログ、または無脊椎動物タンパク質、例えばキイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster由来のものが含まれるが、これらに限定されない。例となる実施形態において、PDZドメインという用語に含まれるPDZドメインの断片は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上のアミノ酸長である。例となる実施形態において、PDZドメインという用語に含まれる変異体は、かかるPDZドメインの少なくとも50個のアミノ酸と少なくとも80、85、90、または95同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、上記で特定した保存要素のうちの1つまたは複数が保持される。一般PDZドメイントポロジーを共有するInactivationnoafter-potentialDInaD由来のPDZ1ドメインは、SEQIDNO:2のアミノ酸11~107として記載される。InaDは、十分に特徴付けられたGタンパク質共役ホスホリパーゼC媒介シグナル伝達カスケードであるショウジョウバエの光伝達経路において重要なタンパク質であるScottZuker,1998Nature395:805-808、Xuetal.,1998J.CellBiol.142:545-555、Scottetal.,1995Neuron15:919-927。InaDは、ほぼ完全に5つのPDZドメインからなるためvanHuizenetal.,1998EMBOJ.17:2285-2297、Tsunodaetal.,1997Nature388:243-249、Shiehetal.,1997Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12682-12687、このドメインが特徴付けられた最初の3つのタンパク質にその名前が由来する:シナプス後肥厚部タンパク質95、Discs-large、および閉鎖帯Kennedy,1995TrendsBiochemSci20:350、MoraisCabraletal.,1996Nature382:649-652、Doyleetal.,1996Cell85:1067-1076。InaDの各PDZドメインは、光伝達に関与するタンパク質のうちの1つまたは複数を結合させ、その複合体を効果的シグナル伝達のための正しい細胞位置に集めることに関わっているとされているTsunodaetal.,1997Nature388:243-249、Wesetal.,1999NatNeurosci2:447-453、Montell,1999AnnuRevCellDevBiol15:231-268、FanningAnderson,1999Curr.Opin.CellBiol.11:432-439。ショウジョウバエのInaDタンパク質は、674個のアミノ酸SEQIDNO:2を含み、分子量74,332ダルトンを有し、5つのPDZドメインを含む。これらの5つのPDZドメインは、このタンパク質構造の大部分を形成する。このドメインは、PDZ1からPDZ5まで番号付けされる。InaDのN末端ドメインであるPDZ1は、InaDタンパク質の残基11~107を含む。本明細書で提示される開示において、PDZ1は、一部の実施形態で具体的に言及されるが、実施形態、方法、および技術の開示および考察は、PDZ2、PDZ3、PDZ4、およびPDZ5などの別のPDZドメインにも適用可能である。InaDのPDZ1ドメインは、NorpASEQIDNO:1のC末端に結合することが知られている。この相互作用は、これら2つのタンパク質間に形成されるジスルフィド結合によって仲介される。ジスルフィド結合は、NorpAのCys-1C末端アミノ酸を0位とすることに基づく付番とInaDPDZ1のCys31との間に形成される。一実施形態において、本発明によって有用なPDZドメイン例えば、PDZ1ドメインは、ショウジョウバエに認められるInaDタンパク質に由来する、すなわちInaDPDZ1ドメインであり、細胞表面タンパク質に融合している。InaDPDZ1ドメインには、少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上のアミノ酸長のInaDPDZ1ドメインアミノ酸11~107の断片、およびInaDPDZ1ドメインの少なくとも50個のアミノ酸と少なくとも80、85、90、または95同一のアミノ酸配列を含むその変異体が含まれる。一部の実施形態において、上記で特定した保存要素のうちの1つまたは複数が維持される。本発明のPDZドメイン例えば、PDZ1ドメインは、いかなる種にも由来すると考えられ、これにはキイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster、シノラブディスエレガンスCaenorhabditiselegans、ホホアカクロバエCalliphoravicina、ヒトHomosapiens、ハツカネズミMusmusculus、およびPDZドメインを有する任意の他の種が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、PDZドメインは、ペプチド結合クレフト中にCys残基を含む。一実施形態において、Cys残基を含むPDZドメインは、ディシブルド1様DVL1LPDZである。別の実施形態において、Cys残基を含むPDZドメインは、proTGF-α細胞質ドメイン-相互作用タンパク質18TACIP18PDZ1である。別の実施形態において、Cys残基を含むPDZドメインは、TACIP18類似体SITACPDZ1である。種々の実施形態において、PDZドメインは、約80~約100アミノ酸長である。類似する実施形態において、PDZドメインは、80、81、81、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、または120アミノ酸長、あるいはこれらの端点のいずれかの間の任意の範囲である。一実施形態において、PDZドメインは、エンハンサードメインをさらに含む。Huangetal.Proc.NatlAcad.Sci.USA,105:18,6578-832008、参照により全体が援用されるは、天然PDZ結合ペプチドに対する結合親和性が著しく改善された結合部位を作成するようにPDZドメインを操作することができる系を記載している。著者らは、ヒトフィブロネクチンの91アミノ酸残基10番目のフィブロネクチンIII型ドメインFN3を96アミノ酸残基ErbinPDZドメインに融合させた。著者らは、次に、FN3の3つの表面ループが多様化されたファージ提示ライブラリーを構築した。ARVCFペプチドに対する増強された親和性を示すいくつかのクローンを特定した。PDZ結合ペプチドに対する増強された親和性でPDZ融合体を作成するこのようなFN3ドメインをエンハンサードメインと名付けた。PDZ-FN3融合体を親和性クランプと名付けた。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZドメインは、エンハンサードメイン、例えば、FN3の少なくとも50個のアミノ酸と少なくとも80、85、90、または95同一のアミノ酸配列に融合される。かかる親和性クランプおよびエンハンサードメインは、本発明における使用が想定されている。種々の実施形態において、PDZドメインは、タンデムPDZドメインである。LeeおよびZhengCellComm.Signaling,8:82010、参照により全体が本明細書に援用されるは、各PDZドメインが正しい折り畳みのために他方の存在を必要とする、GRIP-1タンパク質由来のPDZドメイン1および2のタンデム配列を記載している。同様に、GRIP-1由来の4番目および5番目のPDZドメインのタンデム配列は、GluR2/3との相互作用に必要であった。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZドメインは、タンデムPDZドメイン、例えばGRIP-1アクセッション番号NP083012由来のPDZ1およびPDZ2、またはGRIP-1由来のPDZ4およびPDZ5である。かかるタンデムPDZドメインは、同じまたは異なる配列の少なくとも2個、3個、4個、またはそれ以上のPDZドメインを含んでもよい。種々の実施形態において、PDZドメインは、非共有結合または共有結合していてもよく、PDZ結合ペプチドに結合する能力を保持する、同じまたは異なる配列の2つのPDZドメインを含むPDZダイマーである。種々の実施形態において、PDZドメインは、PDZ様ドメインである。LeeおよびZhengCellComm.Signaling,8:82010は、2つのヘリックスでキャッピングされた5つのβ鎖からなるPDZ様折り畳みを採用する種々のタンパク質を記載している。PDZ様ドメインを有するタンパク質は、HtrAまたはDegP、DegS、およびDegQを含む。したがって、本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZドメインは、PDZ様ドメイン、HtrA、DegS、またはDegQ由来のPDZ様ドメインである。2.PDZ結合ペプチド本発明により有用なPDZ結合ペプチドは、いかなる長さの配列であってもよいが、一般に、PDZドメインと相互作用する部分は、PDZ結合タンパク質のC末端の3~4個のアミノ酸である。本明細書において使用する際、PDZ結合ペプチドは、PDZ結合タンパク質のC末端または内部PDZ結合領域を取り囲むおよそ15~20アミノ酸領域、あるいは少なくとも5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のアミノ酸長のその断片、あるいはPDZドメインとのジスルフィド結合を可能にするCys残基が保持されるという条件で、天然配列に1、2、3、4、5、6、7、8、または9個の置換、好ましくは保存的置換が行われたかかる断片の変異体を指す。本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZ結合ペプチドはNorpAタンパク質SEQIDNO:1由来でありすなわち、NorpAPDZ結合ペプチド、これは例えば、NorpAタンパク質SEQIDNO:1C末端の20個のアミノ酸に由来する。一部の例では、NorpAPDZ結合ペプチドは、1つまたは複数の置換例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個、好ましくは保存的置換を含んでもよく、-1位にCysを保持する、少なくとも4~20、5~15、または5~20アミノ酸長のC末端断片である。一部または任意の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列X1-X2-X3-C-X4を含み、式中、Cは不変システインであり、X1、X2、X3、およびX4は、任意の残基であってよいSEQIDNO:13。代替的実施形態において、これらの可変アミノ酸は以下の通りである:X1は、トレオニン、セリン、またはチロシンであり、X2は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、X3は、フェニルアラニン、またはチロシンであり、X4は、アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、またはバリンであるSEQIDNO:14。一部または任意の実施形態において、例えば、PDZ結合ペプチドと相互作用するPDZドメインがI型PDZドメインである場合、PDZ結合ペプチドは、共通配列S/T-X-V/Lを含み、式中、Xは任意の残基である。一部または任意の実施形態において、例えば、PDZ結合ペプチドと相互作用するPDZドメインがII型PDZドメインである場合、PDZ結合ペプチドは、共通配列Φ-X-Φを含み、式中、Φは大きい疎水性残基である。本発明のPDZ結合ペプチドは、NorpAポリペプチドSEQIDNO:1に記載される代表的なNorpAポリペプチドの任意のセグメントもしくは断片、または本明細書で定義されるようなその機能的同等物を、そのセグメント、断片、またはその機能的同等物が、本明細書で定義されるようなPDZ1ドメインポリペプチドを結合する機能的特徴を示す限り含んでもよい。具体的な実施形態において、PDZ結合ペプチド配列は、TEFCASEQIDNO:15、またはCys残基が好ましくは-1位に保持される条件で、1個、2個、3個、もしくは4個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。別の実施形態において、PDZ結合ペプチド配列は、GKTEFCASEQIDNO:16、またはCys残基が好ましくは-1位に保持される条件で、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。別の実施形態において、PDZ結合ペプチド配列は、KTEFCASEQIDNO:17、またはCys残基が好ましくは-1位に保持される条件で、1個、2個、3個、4個、もしくは5個の保存的置換が行われた改変ペプチドである。前述のように、InaDPDZ1ドメインは、NorpAの-1位すなわち、SEQIDNO:1の最後から2番目の残基にCys残基を有する、NorpAのC末端に結合する。InaD-NorpA相互作用と類似する形で同種PDZドメインと相互作用することが期待される、天然に存在するCys残基を例えば-1位に有するタンパク質のさらなる例には、ショウジョウバエウィングレスDrosophilaWinglessSwissProtアクセッション番号P13217;C-末端配列TCL、KnirpsP10734;VCV、ネトリンAQ24567;TCA;ヒトZFP3617209;C-末端配列SCV、ZAP70P43403;ACA、Ulk-1O75385;ICA、アデニロスクシナーゼP30566;LCL、P53誘導タンパク質10O14682;FCL、NAG-2O14817;YCA、c-MycP01106;SCA、インスリン様ペプチド4Q14641;LCT、グルタチオンペルオキシダーゼP07203;SCA、5-HT-2AP28223;SCV、T-カドヘリン受容体P55290;ACL、CD86前駆体P42081;TCF、エストラジオール17BヒドロゲナーゼP56937;SCL、EGR-3Q06889;TCA、ガラクトキナーゼIP51570;LCL、およびFrizzled10trEMBLQ9ULW2;TCVに由来するPDZ結合ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、PDZ結合ペプチドは、ラットIII型ヘキソキナーゼP27296;C末端配列ACV、Olif.Rec.様protI15P27296;FCL、Olif.Rec.様protF3P23265;FCY、およびD3ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼO08651;FCFに由来する。これらの実施形態のいずれにおいても、PDZ結合ペプチドは、少なくとも4~20、または5~15、または5~20アミノ酸長の任意の前述のタンパク質のC末端断片であり、これは1つまたは複数の置換例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個、好ましくは保存的置換を含んでもよく、-1位にCysを保持する。本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZ結合ペプチドは、5~20アミノ酸長または4~20アミノ酸長である。他の実施形態において、PDZ結合ペプチドは、15アミノ酸長未満、例えば、3~15アミノ酸長である。種々の実施形態において、PDZ結合ペプチドは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40アミノ酸長、あるいはこれらの端点のいずれかの間の任意の範囲である。一実施形態において、PDZ結合ペプチドは、対象タンパク質、例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片のC末端に融合している。本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZドメインとPDZ結合ペプチドとの対は、表1から選択される。例示的PDZドメインおよびそのそれぞれのリガンドすなわち、PDZ結合ペプチドは、PDZBaseから得られBeumingetal.,Bioinformatics,216:827-8282005、表1に記載される。表1PDZドメイン/PDZ結合ペプチド対本明細書における一部または任意の実施形態において、PDZドメインとPDZ結合ペプチドとの対は、表2から選択される。表2に、3つの例示的PDZドメインおよびそれぞれのPDZ結合ペプチドを記載する。表2に記載される3つのPDZドメインに対するPDZ結合ペプチドは、Tonikianetal.,PLosBiol6:9e2392008により報告されるように、ファージ提示によって推定PDZ結合ペプチドのランダムライブラリーをスクリーニングすることにより単離された。表2PDZドメインおよびスクリーニングにより特定されたPDZ結合ペプチドXは、20個の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表す。当業者は、Tonikianらにより開示される方法が、本明細書に開示される材料および方法に有用な新規のPDZドメイン/PDZ結合ペプチド対を作成するのに有用であることを理解するであろう。Tonikianらは、0位にシステインを含むPDZ結合ペプチドを認識する4つのPDZドメインを記載しており、これにはAPBA3-1ヒトアミロイドβA4前駆体タンパク質結合ファミリーAメンバー3、アクセッション番号NP_004877、T21G5.4-1線虫C.elegans仮説タンパク質、アクセッション番号AAB2899、C25G4.6-2線虫C.elegans仮説タンパク質、アクセッション番号NP_502380、およびC53B4.4線虫C.elegans仮説タンパク質、アクセッション番号NP_001122764が含まれる。APBA3-1、T21G5.4-1、C25G4.6-2、およびC53B4.4PDZドメインは、共通配列FDΩΩCSEQIDNO:534式中、Ωは、芳香族アミノ酸F、W、またはYであると結合する。当業者は、0位にシステイン残基を含むPDZ結合ペプチドと優先的に結合することが示されるPDZドメインが、前述のPDZ結合ペプチドシステインとジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むように操作可能であることを理解するであろう。さらに、当業者は、構造情報を用いて、上述の天然に存在するInaDPDZ1ドメイン/NorpA対と類似する、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むPDZドメイン/PDZ結合ペプチド対を操作可能であることを理解するであろう。一部の実施形態において、PDZドメインを操作して、天然アミノ酸残基をPDZドメインのペプチド結合溝中、またはペプチド結合溝外の領域のシステインで置換する。他の実施形態において、PDZ結合ペプチドを操作して、天然アミノ酸残基をPDZ結合ペプチドのC末端、またはC末端領域外の領域のシステイン残基で置換する。また、一部の実施形態において、PDZ結合ドメインおよびPDZ結合ペプチドを操作して、天然残基をシステイン残基で置換することにより、ジスルフィド結合によって結合したPDZドメイン/PDZ結合ペプチドを作成することも想定されている。ジスルフィド結合が可能なPDZドメイン/PDZ結合ペプチド対は、PDZドメイン/PDZ結合ペプチド相互作用が共有結合性であるという理由でより好適であるという点で有利である。C.宿主細胞および細胞表面タンパク質本明細書において使用する際、細胞表面タンパク質は、細胞表面に提示される天然に存在するタンパク質またはその部分、または細胞表面に提示される能力を保持するその断片もしくは変異体である。1.酵母一部または任意の実施形態において、酵母株は、サッカロミセス属Saccharomyces、ピチア属Pichia、ハンゼヌラ属Hansenula、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、クリベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、およびカンジダ属Candidaからなる群から選択される属に由来する。一部または任意の実施形態において、酵母種は、出芽酵母S.cerevisiae、ピキアパストリスP.pastoris、ゼヌラポリモルファH.polymorpha、分裂酵母S.pombe、K.lactis、Y.lipolytica、およびカンジダアルビカンスC.albicansからなる群から選択される。一部または任意の実施形態において、酵母株は、ヒト細胞で実施される種類のグリコシル化反応を実行するように操作されている。酵母の糖操作のための例示的方法は、NatRevMicrobiol32:119-282005に概説されている。本発明の方法および細胞は、細胞表面でのタンパク質提示を可能にするために、細胞壁タンパク質に融合したPDZドメインを提供する。宿主細胞が酵母細胞である場合、任意の好適な細胞壁タンパク質をPDZドメインに融合させてもよい。宿主細胞が出芽酵母S.cerevisiaeである場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、Aga1、Aga2、Agα1、Cwp1、Cwp2、Gas1p、Yap3p、Flo1p、Crh2p、Pir1、Pir2、Pir3、またはPir4、またはそれらの断片もしくは変異体がある。宿主細胞がハンゼヌラポリモルファH.polymorphaである場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、HpSED1、HpGAS1、HpTIP1、またはHPWP1がある。宿主細胞がカンジダアルビカンスC.albicansである場合、好適な細胞壁タンパク質の例には、Hwp1p、Als3p、またはRbt5pがある。例となる実施形態において、かかる細胞壁タンパク質の断片は、少なくとも約20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長である。例となる実施形態において、その変異体は、かかるドメインの少なくとも100個のアミノ酸と少なくとも80、85、90、または95同一のアミノ酸配列を含む。2.哺乳動物細胞また、本明細書に開示される方法は、哺乳動物宿主細胞を用いて実施することも想定されている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばCHOK1細胞ATCCCCL61、DXB-11、DG-44、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO、Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980、および制御されたフコシル化を生じるように操作されたCHO細胞MAbs.13:230-362009;SV40COS-7、ATCCCRL1651で形質転換したサル腎臓CV1系;ヒト胎児腎臓細胞系懸濁培養での成長用にサブクローニングされた293細胞または293細胞Grahametal.,J.GenVirol.36:59,1977;ベビーハムスター腎細胞BHK、ATCCCCL10;マウスセルトリ細胞TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243-251,1980;サル腎細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頸癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞HepG2、HB8065;マウス乳癌MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matheretal.,AnnalsN.YAcad.Sci.383:44-681982;MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝癌系HepG2である。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、細胞表面にタンパク質を提示する能力を保持する細胞表面タンパク質の部分の例には、任意の既知の細胞膜タンパク質の好適な膜貫通ドメイン、あるいはGPIアンカー配列または切断不可能なII型シグナルアンカー配列を含むポリペプチドが含まれる。哺乳動物細胞における細胞提示に使用する膜アンカー配列の例には、PDGFR膜貫通ドメインChesnutetal.,JImmunolMethods1931:17-27,1996、Hoetal.,ProcNatlAcadSciUSA10325:9637-42,2006、参照により全体が援用される、ヒト崩壊促進因子由来のGPIアンカーAkamatsuetal.,JImmunolMethods,3271-2:40-522007、参照により全体が援用される、およびT細胞受容体TCRζ鎖Alonso-Caminoetal.,PLoSOne49:e71742009、参照により全体が援用されるがある。別の例は、II型シグナルアンカー配列の使用である米国特許第7,125,973号、参照により全体が援用されるである。あるいは、捕捉分子、例えば抗体またはタンパク質を膜アンカー配列に融合し、細胞表面に提示して、対象タンパク質を捕捉することもできる米国特許第6,919,183号、参照により全体が援用される。一部の実施形態では、人為的な細胞表面アンカー配列を哺乳動物細胞の細胞膜内に組み込む、またはかかる細胞膜に結合させる。3.原核生物また、本明細書に開示される方法は、原核宿主細胞を用いて実施することも想定されている。したがって、一部または任意の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。この目的で好適な原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科Enterobacteriaceae、例えばエシャリキア属Escherichia、例えば、大腸菌E.coli、エンテロバクター属Enterobacter、エルウィニア属Erwinia、クレブシエラ属Klebsiella、プロテウス属Proteus、サルモネラ属Salmonella、例えば、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、セラチア属Serratia、例えば、霊菌Serratiamarcescans、および赤痢菌属Shigella、ならびに桿菌属Bacilli、例えば枯草菌B.subtilisおよびリケニホルミス菌B.licheniformis例えば、1989年4月12日出版のDD266,710に開示されているリケニホルミス菌41PB.licheniformis41P、シュードモナス属Pseudomonas、例えば緑膿菌P.aeruginosa、ならびにストレプトミセス属Streptomycesがある。好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌294ATCC31,446であるが、他の株、例えば大腸菌B、大腸菌X1776ATCC31,537、および大腸菌W3110ATCC27,325は好適である。これらの例は、説明のためであり、限定するものではない。宿主細胞が原核細胞である場合、好適な細胞表面タンパク質の例には、好適な細菌外膜タンパク質がある。かかる外膜タンパク質には、線毛および鞭毛、リポタンパク質、氷核形成タンパク質、およびオートトランスポーターがある。異種タンパク質提示に使用する例示的細菌タンパク質には、LamBCharbitetal.,EMBOJ,511:3029-371986、参照により全体が援用される、OmpAFreudl,Gene,822:229-361989、参照により全体が援用される、およびインチミンWentzeletal.,JBiolChem,27430:21037-43,1999、参照により全体が援用されるがある。さらなる例示的外膜タンパク質には、FliC、プルラナーゼ、OprF、OprI、PhoE、MisL、および細胞溶解素があるが、これらに限定されない。表面提示に使用され、本発明における使用が想定される細菌膜タンパク質の広範なリストは、Leeetal.,TrendsBiotechnol,211:45-522003、Jose,ApplMicrobiolBiotechnol,696:607-142006、およびDaugherty,CurrOpinStructBiol,174:474-802007に詳述されており、これらは全て参照により全体が援用される。一部の実施形態において、アンカータンパク質は、細菌細胞の外面に組み込まれるか、またはかかる外面に結合される、人為的配列である。D.ポリペプチド結合剤一部または任意の実施形態において、対象タンパク質はポリペプチド結合剤である。ポリペプチド結合剤という用語は、本明細書において使用する際、別の分子実体例えば、抗原に特異的に結合することができるか、または測定可能な結合親和性で別の分子実体に結合することができるポリペプチドを指す。ポリペプチド結合剤の例には、場合により他のペプチド部分または非ペプチド部分とコンジュゲートした、抗体、ペプチボディpeptibody、プロテアーゼ、スキャフォールドタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドがある。ポリペプチド結合剤が結合してもよい分子実体には、抗体応答を引き出すことができるか、または非特異的結合よりも高い検出可能な結合親和性でポリペプチド結合剤に結合することができる、任意のタンパク質性分子または非タンパク質性分子がある。例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤は抗体である。抗体という用語は、広義で使用され、完全に組み立てられた抗体、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体例えば、二重特異性抗体、mAb2抗体、抗原に結合することが可能な抗体断片例えば、Fab、Fab2、Fv、一本鎖抗体、二特異性抗体、dAb、および所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組み換えペプチドを含む。免疫グロブリンまたは四量体抗体という用語は、それぞれが可変領域および定常領域を含む2つの重鎖と2つの軽鎖からなる四量体糖タンパク質を指す。抗原結合部分は、組み換えDNA技術によって、あるいは無傷の抗体の酵素的切断または化学的切断によって作製することができる。抗体断片または抗原結合部分には、とりわけ、Fab、Fab、Fab2、Fv、ドメイン抗体dAb、Fcab商標、相補性決定領域CDR断片、一本鎖抗体scFv、一本鎖抗体断片、フレームワーク領域によって結合した2つのみのCDRを含む抗体分子、例えば、VHCDR1-VHFR2-VLCDR3融合ペプチド、キメラ抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、直鎖状抗体;キレート性組み換え抗体、トリボディまたはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬SMIP、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、VHH含有抗体、またはそれらの変異体もしくは誘導体、および抗体が所望の生物活性を保持する限り、1個、2個、3個、4個、5個、または6個のCDR配列など、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが含まれる。天然に存在する免疫グロブリンでは、それぞれの四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対は、1つの軽鎖約25kDaと1つの重鎖約50~70kDaを有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に主に関与する、約100~110個、またはそれ以上のアミノ酸を有する可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパκおよびラムダλ軽鎖に分類される。重鎖は、ミューμ、デルタΔ、ガンマγ、アルファα、およびエプシロンεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEと定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約12個以上のアミノ酸を有するJ領域によって連結し、このとき重鎖は、約10個以上のアミノ酸を有するD領域も含む。概して、FundamentalImmunology,Ch.7Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.1989参照によりあらゆる目的で全体が援用されるを参照されたい。それぞれの軽鎖/重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが2つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。各重鎖は、一端VHに1つの可変ドメイン、続いて複数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端VLに可変ドメイン、その他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられているChothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901-917,1987。免疫グロブリン可変ドメインは、同じ一般的構造の3つの超可変領域またはCDRによって連結した比較的保存されたフレームワーク領域FRを示す。N末端からC末端にかけて、軽鎖および重鎖はいずれもドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1987and1991、またはChothiaLeskJ.Mol.Biol.196:901-917,1987、Chothiaetal.,Nature342:878-883,1989の定義に従う。抗体の超可変領域とは、抗原結合に関与する抗体のCDRアミノ酸残基を指す。超可変領域は、CDRからのアミノ酸残基Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991に記載されるように、軽鎖可変ドメインの残基24~34L1、50~56L2、および89~97L3、および重鎖可変ドメインの残基31~35H1、50-65H2、および95~102H3、および/または超可変ループからの残基Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901-9171987に記載されるような、軽鎖可変ドメインの残基26~32L1、50~52L2、および91~96L3、ならびに重鎖可変ドメインの残基26~32H1、53~55H2、および96~101H3を含む。フレームワークすなわちFR残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。重鎖可変領域とは、本明細書において使用する際、前記抗体重鎖可変ドメインの少なくとも1つの相補性決定領域CDRを含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、前記抗体重鎖の1個、2個、または3個のCDRを含み得る。軽鎖可変領域とは、本明細書において使用する際、前記抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも1つの相補性決定領域CDRを含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、前記抗体軽鎖の1個、2個、または3個のCDRを含み得、これは抗体によってカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかであり得る。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに割り当てることができ、これらはサブクラスまたはアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類してもよい。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、IgG1アイソタイプおよびIgG3アイソタイプはADCC活性を有する。本発明の抗体は、定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのいずれか、またはそれらの変異体もしくは共通配列、あるいは異なるアイソタイプのハイブリッド例えば、IgG1/IgG2ハイブリッドあってもよい。例示的実施形態において、本発明の抗体は、ヒトカッパκもしくはヒトラムダλ軽鎖、またはそれに由来するアミノ酸配列、またはそれらのハイブリッドを、場合によっては、ヒト重鎖またはそれに由来する配列とともに、あるいは一本鎖、二量体、四量体例えば、2つの重鎖と2つの軽鎖、または他の形態で重鎖および軽鎖を一緒に含んでもよい。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然発生突然変異以外は同一である。抗体変異体とは、本明細書において使用する際、天然の抗体可変領域ドメインの可変領域に少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む抗体ポリペプチド配列を指す。変異体は、改変していない抗体と実質的に相同または実質的に同一であってよい。キメラ抗体とは、本明細書において使用する際、典型的には異なる種を起源とする、2つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体例えば、米国特許4,816,567号を参照を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよび齧歯動物の抗体断片、一般的にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。中和抗体は、それが結合する抗原の生物学的機能を排除するか、または著しく減少させることが可能な抗体分子である。したがって、中和抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を排除する、または著しく減少させることができる。単離抗体は、その自然環境の成分から特定、分離、および回収された抗体である。その自然環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げるであろう物質であり、これには酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。一部の実施形態において、例えば、1ローリー法で測定したときに抗体の95重量を上回るまで、好ましくは99重量を上回るまで、2スピニングカップシークエネーターの使用によってN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または3クマシーブルーもしくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でSDS-PAGEにより均質となるまで、抗体を精製する。単離抗体には、組み換え細胞内でのinsitu抗体が含まれるが、これはこの抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しなしなくなるためである。しかし、通常、単離抗体は少なくとも一つの精製ステップによって調製されるであろう。他の例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤はプロテアーゼである。プロテアーゼという用語は、本明細書において使用する際、ペプチド結合の加水分解を触媒する任意のタンパク質分子を指す。これには、天然に存在するタンパク質分解酵素、ならびにプロテアーゼ変異体が含まれる。また、これはタンパク質分解酵素の任意の断片、または前述のタンパク質のうちの1つを含む分子複合体もしくは融合タンパク質も含む。プロテアーゼには、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、トロンビン、プラスミン、Xa因子、uPA、tPA、MTSP-1、グランザイムA、グランザイムB、グランザイムM、エラスターゼ、キマーゼ、パパイン、好中球エラスターゼ、血漿カリクレイン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、補体因子のセリンプロテアーゼ、ADAMTS13、中性エンドペプチダーゼ/ネプリライシン、フューリン、およびクルザインが含まれるが、これらに限定されない。さらなる例となる実施形態において、ポリペプチド結合剤はスキャフォールドである。タンパク質スキャフォールドには、AdNectin、Affibody、Anticalin、DARPin、操作されたKunitz-type阻害剤、テトラネクチン、Aドメインタンパク質、リポカリン、反復タンパク質、例えばアンキリン反復タンパク質、免疫タンパク質、α2p8ペプチド、昆虫デフェンシンA、PDZドメイン、カリブドトキシン、PHDフィンガー、TEM-1β-ラクタマーゼ、フィブロネクチンIII型ドメイン、CTLA-4、T-細胞受容体、ノッチン、ネオカルチノスタチン、炭水化物結合モジュール4-2、緑色蛍光タンパク質、チオレドキシンが含まれるが、これらに限定されないGebauerSkerra,Curr.Opin.Chem.Biol.13:245-552009、GillDamle,Curr.Opin.Biotech17:653-582006、Hosseetal,ProteinSci.15:14-272006、Skerra,Curr.Opin.Biotech18:295-3-42007。E.ベクター本発明のベクターは、一般に、外因性ポリペプチドを発現するのに必要な転写または翻訳制御配列を含む。好適な転写または翻訳制御配列は、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、ならびに転写および翻訳の終結部位を含むが、これらに限定されない。一部または任意の実施形態において、PDZドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、PDZ結合ペプチドに融合した対象タンパク質例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドとは、同じベクター上に存在する。一部または任意の実施形態において、PDZドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、PDZ結合ペプチドに融合した対象タンパク質例えば、ポリペプチド結合剤、または抗体もしくはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドとは、異なるベクター上に存在する。当業者に理解されるであろうように、融合体をコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、宿主細胞の適切な発現を可能にするための好適な転写および翻訳制御配列ならびにシグナル配列を有することになる。一部または任意の実施形態において、PDZドメインに融合した細胞表面タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。宿主細胞が酵母細胞である場合、酵母組み込み型プラスミドYIpを使用して、ポリヌクレオチドを酵母細胞のゲノムに組み込むことができる。組み込み部位は、制限エンドヌクレアーゼによってYIpプラスミド中の酵母セグメントを切断し、その線状化プラスミドで酵母株を形質転換することによって標的化することができる。線端部は組み換え型であり、これらの端部と相同なゲノム内の部位への組み込みを導く。さらに、線状化は、組み込み形質転換の効率を10倍~50倍向上させる。YIpプラスミドで形質転換した株は、選択圧の不在下であっても、極めて安定である。本発明の一部または任意の実施形態において、発現ベクターは、少なくとも2つの非関連発現系において複製が可能なシャトルベクターである。かかる複製を容易にするために、ベクターは、一般に、各発現系において有効な少なくとも2つの複製起点を含む。シャトルベクターは、真核細胞発現系および原核細胞発現系において複製可能であってよい。あるいは、シャトルベクターは、2つの異なる真核細胞系、例えば酵母系および哺乳動物系において、あるいは2つの異なる原核細胞系において複製可能であってもよい。このことは、真核細胞宿主におけるタンパク質発現および原核細胞宿主におけるベクターの増幅の検出を可能にする。一実施形態において、1つの複製起点はCENoriであり、1つはpUC由来であるが、ベクターの複製を導くという条件で、当分野で既知の任意の好適な起点を用いてもよい。ベクターがシャトルベクターである場合、ベクターは、少なくとも2つの選択可能なマーカー例えば、真核細胞用に1つと原核細胞用に1つを含む。使用する発現系で機能するという条件で、当分野で既知または本明細書に記載の任意の選択可能なマーカーを使用することができる。1.複製起点複製起点一般に、ori配列と称するは、好適な宿主細胞におけるベクターの複製を可能にする。oriの選択は、使用する宿主細胞の種類に依存することになる。宿主細胞が原核生物である場合、発現ベクターは、典型的には、原核細胞内でのベクターの自律複製を導くoriを含む。この種のoriの非限定的例には、pMB1、pUC、および他の細菌起点がある。高等真核生物は、複数のDNA複製起点推定104~106ori/哺乳動物ゲノムを含むが、ori配列はそれほど明確に定義されていない。哺乳動物ベクターの好適な起点は、通常は真核生物ウイルスに由来する。例示的真核生物ori配列には、SV40ori、EBVori、およびHSVoriがあるが、これらに限定されない。酵母細胞の例示的ori配列には、2μmori配列およびCENori配列があるが、これらに限定されない。2.シグナル配列原核生物および真核生物の双方に由来するシグナル配列は、いくつかの共通の特徴を共有する。これらは約15~30アミノ酸長であり、正荷電N末端領域、中央疎水性領域、およびより極性の高いC末端領域の3つの領域からなる。宿主細胞が酵母細胞である場合、タンパク質が分泌するよう、および/または細胞壁に向かうよう導くことが可能な、当分野で既知の任意のシグナル配列を使用することができる。例えば、このシグナル配列は、接合因子α1MFα1Bitteretal.,ProcNatlAcadSciUSA8117:5330-41984、インベルターゼSUC2TaussigandCarlson,NucleicAcidsRes116:1943-541983、酸ホスファターゼPHO5Arimaetal.,NucleicAcidsRes116:1657-721983、βグルカナーゼBGL2Achstetteretal.,Gene1101:25-311992、およびイヌリナーゼINU1AChungetal.,BiotechnolBioeng494:473-91996から得ることができる。細胞壁に共有結合し、細胞表面タンパク質提示に適合する、AGA2、AGA1、AGα1、FLO1、GAS1、CWP1、およびCWP2などの酵母GPIタンパク質のシグナル配列もまた、本発明の範囲に含まれるDeGrootetal.,Yeast209:781-961992。宿主細胞が原核細胞である場合、融合ポリペプチドのペリプラズム分泌を導くシグナル配列には、spA、phoA、リボース結合タンパク質、pelB、ompA、ompT、dsbA、torA、torT、およびtolTに由来するものが含まれるdeMarco,MicrobialCellFactories,8:262009。米国特許第5,846,818号および第5,576,195号に開示されるpelBシグナル配列は、参照により全体が援用される。また、本発明の範囲には、原核宿主細胞例えば、大腸菌においてもシグナル配列として機能する、真核細胞に由来するシグナル配列も含まれる。かかる配列は、米国特許第7,094,579号に開示され、その内容は参照により全体が援用される。WatsonNucleicAcidsResearch12:5145-51641984は、シグナル配列の集積を開示している。米国特許第4,963,495号は、宿主生物のペリプラズム空間における、3末端で成熟タンパク質をコードするDNAの5末端に連結した原核生物の分泌シグナル配列DNAを用いた、成熟真核生物タンパク質の発現および分泌を開示している。ChangらGene55:189-1961987は、大腸菌においてhGHを分泌するためのSTIIシグナル配列の使用を開示している。GrayらGene39:247-2451985は、ヒト成長ホルモンの天然シグナル配列の使用、ならびに大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーターおよび大腸菌におけるヒト成長ホルモンの分泌のためのシグナル配列の使用を開示している。WongらGene68:193-2031988は、大腸菌におけるLamBおよびOmpF分泌リーダー配列と融合したインスリン様成長因子1IGF-1の分泌、ならびにprlA4突然変異の存在下でのこれらのシグナル配列の処理効率の向上を開示している。FujimotoらJ.Biotech.8:77-861988は、大腸菌におけるヒト上皮成長因子hEGFの分泌のための4つの異なる大腸菌エンテロトキシンシグナル配列、STI、STII、LT-A、およびLT-Bの使用を開示している。DenefleらGene85:499-5101989は、成熟ヒトインターロイキン1βの分泌のためのOmpAおよびPhoAシグナルペプチドの使用を開示している。上記の全ての文献の内容は、参照により全体が援用される。3.プロモーター真核細胞の好適なプロモーター配列には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。成長条件によって制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。哺乳動物細胞の好適なプロモーターは、SV40プロモーター、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、およびそれらのハイブリッドである。酵母細胞に好適なプロモーターには、出芽酵母S.cerevisiaeのGAL10、GAL1、TEF1、CUP1、ADH2、GPD、およびピキアパストリスP.pastorisのGAP、AOX1が含まれるが、これらに限定されない。様々な強力な原核細胞プロモーターが当分野で既知である。好適なプロモーターは、ラックプロモーター、Trcプロモーター、T7プロモーター、およびpBADプロモーターである。4.ターミネーターターミネーター配列は、好ましくは、1つまたは複数の転写終結配列ポリアデニル化配列などを含み、転写のリードスルーをさらに中断するために付加的DNA配列を含めることによって長くなってもよい。本発明の好適なターミネーター配列または終結部位は、遺伝子と、それに続くその遺伝子自体の終結配列または異種終結配列のいずれかの転写終結配列とを有する。かかる終結配列の例には、当分野で既知であり、広く入手可能な、種々の酵母転写終結配列または哺乳動物ポリアデニル化配列に結合した終止コドンがある。5.選択可能なマーカー上述の要素の他に、ベクターは、選択可能なマーカー例えば、そのベクターで形質転換した宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよいが、かかるマーカー遺伝子は、宿主細胞に共導入された別のポリヌクレオチド配列上にあってもよい。選択可能な遺伝子が導入されている宿主細胞のみが、選択条件下で生存および/または成長することになる。典型的な選択遺伝子は、a抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、G418、メトトレキサートなどに対する耐性を付与する、b栄養要求性欠損を補完する、またはc複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。正しいマーカー遺伝子の選択は、宿主細胞に依存し、様々な宿主に適切な遺伝子は当分野で既知である。本発明に包含されるベクターは、組み換えクローニング法を用いて、および/または化学合成によって得ることができる。PCR、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびライゲーションなどの莫大な数の組み換えクローニング技術が、当分野で周知である。また、当業者は、本明細書において提供される配列データ、または公共または独自のデータベース内の配列データを使用して、当分野で利用可能な任意の合成手段によって所望のベクターを得ることができる。さらに、周知の制限およびライゲーション技術を用いて、種々のDNA源から適切な配列を切り取って、外因性配列と作用可能な関係で組み込んで、本発明に従って発現させることが可能である。F.ライブラリーを調製およびスクリーニングする方法一部または任意の実施形態において、少なくとも10^3種、少なくとも10^4種、少なくとも10^5種、少なくとも10^6種、少なくとも10^7種、少なくとも10^8種、少なくとも10^9種、または少なくとも10^10種の異なる宿主細胞、例えば酵母細胞を含み、それぞれのかかる宿主細胞がその表面に異なる対象タンパク質例えば、ポリペプチド結合剤、抗体、またはその抗原結合性断片を提示する、細胞のライブラリーが想定されている。対象タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の提示は、本明細書に記載されるような、PDZドメインとPDZ結合ペプチドとの間の相互作用を利用した融合タンパク質の発現によって達成される。抗体またはその抗原結合性断片のライブラリーを含む宿主細胞を生成する方法は、当分野で既知であり、また本明細書に記載される。かかる細胞ライブラリーを当分野で既知であり、本明細書に記載される方法FACSまたはMACSなどを用いてスクリーニングして、標的タンパク質/抗原に結合する抗体またはその抗原結合性断片を特定する。本発明は、細胞表面に提示される抗体または抗原結合性断片のライブラリーを作成することを含む、標的特異的抗体またはその抗原結合部分を生成する方法を想定している。抗体または抗原結合性断片のライブラリーは、免疫化源または非免疫化源から調製することができ、また天然、半合成、または合成であってよいHoogenboom,Nat.Biotech.239:1105-11162005において概説される。また、本発明は、ライブラリーを標的タンパク質またはその一部に接触させることと、標的に結合する細胞を選択または単離または選別することと、その細胞から抗体またはその抗原結合性断片を得ることとを含む、標的特異的抗体またはその抗原結合部分を特定する方法も想定している。選択のための方法の例は、下記の細胞選別に記載する。一例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するための抗体または抗原結合性断片のライブラリーを調製するための方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を標的抗原またはその抗原部分で免疫して、免疫応答を引き起こすステップと、その免疫した動物から抗体産生細胞を抽出するステップと、その抽出した細胞からRNAを単離するステップと、そのRNAを逆転写してcDNAを生成するステップと、そのcDNAを増幅するステップと、そのcDNAを本明細書で開示される提示ベクターに挿入して、抗体を宿主細胞の細胞表面に発現させるステップと、を含む。抗体ライブラリーを構築およびスクリーニングするための方法は、WinterらPCT国際公開第WO90/05144号、および米国特許第6,057,098号参照により本明細書に援用されるに記載されている。別の例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するための抗体または抗原結合性断片のライブラリーを調製するための方法は、動物、例えばヒトの脾臓細胞、または末梢血リンパ球からmRNAを単離するステップと、そのRNAを逆転写してcDNAを生成するステップと、そのcDNAを増幅するステップと、そのcDNAを本明細書で開示される提示ベクターに挿入して、抗体を宿主細胞の細胞表面に発現させるステップと、を含む。あるいは、異なるヌクレオチド配列のライブラリーは、既存の抗体コード配列のinvitro突然変異誘発によって得ることができる。さらなる例として、本明細書で開示される細胞表面提示方法で使用するためのプロテアーゼ変異体のライブラリーは、国際公開第WO/04031733および国際公開第WO/06125827号参照により本明細書に援用されるに記載される方法によって調製してもよい。コード配列に変更を導入する様々な戦略には、単点もしくは多点突然変異、単一もしくは複数のヌクレオチドトリプレットの交換、1つもしくは複数のコドンの挿入もしくは欠失、異なる遺伝子間の相同もしくは非相同組み換え、そのコード配列の一端における付加的コード配列の融合、または付加的コード配列の挿入、あるいはこれらの方法の任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。一部または任意の実施形態では、対象タンパク質のライブラリーが既存の提示ライブラリーからサブクローニングされ、これは例えば、抗原に対する1ラウンドまたは複数ラウンドのパニングによって作成されたファージ提示サブライブラリーである。例えば、国際公開第WO/9847343号は、濃縮ライブラリーの提示されたポリペプチドをコードする核酸を提示ベクターから発現ベクターにサブクローニングして、抗体および他のポリペプチドのポリクローナルライブラリーを生成する方法を記載している。さらなる例として、Jostocketal,J.Immunol.Methods289,65-802004は、ファージベクター中のFab断片の哺乳動物ベクター中のIgGへのバッチ再編成を記載している。ライブラリーをスクリーニングする方法は、実施例に記載する。抗体提示ライブラリーを生成およびスクリーニングする際に使用できるさらなる方法および試薬は、当分野で利用可能である例えば、Ladneretal.米国特許第5,223,409号、Kangetal.PCT国際公開第WO92/18619号、Doweretal.PCT国際公開第WO91/17271号、Winteretal.PCT国際公開第WO92/20791号、Marklandetal.PCT国際公開第WO92/15679号、Breitlingetal.PCT国際公開第WO93/01288号、McCaffertyetal.PCT国際公開第WO92/01047号、Garrardetal.PCT国際公開第WO92/09690号、Fuchsetal.1991Bio/Technology9:1370-1372、Hayetal.1992Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85、Huseetal.1989Science246:1275-1281、McCaffertyetal.,Nature1990348:552-554、Griffithsetal.1993EMBOJ12:725-734、Hawkinsetal.1992J.Mol.Biol.226:889-896、Clacksonetal.1991Nature352:624-628、Grametal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-3580、Garrardetal.1991Bio/Technology9:1373-1377、Hoogenboometal.1991NucAcidRes19:4133-4137、およびBarbasetal.1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7978-7982を参照されたい。G.細胞選別フローサイトメトリーは、合成コンビナトリアルライブラリーからの生物活性分子の単離、微生物中の病原性遺伝子の特定、およびタンパク質機能の研究および操作を含む数多くの用途を有する、強力なハイスループットのライブラリースクリーニング手段である。フローサイトメトリーを用いて、リガンド結合、触媒作用、発現レベル、および安定性を含む所望の機能について、微生物において発現させたタンパク質突然変異体の巨大なライブラリーを定量的にスクリーニングすることができる。10-6未満の頻度で出現する希少な標的細胞を検出し、細胞選別と成長による増幅の1サイクルまたは複数サイクルを用いて、不均一ライブラリー集団から単離することができる。フローサイトメトリーが特に強力であるのは、スクリーニング過程を観察し、定量的に最適化するまたとない機会を提供するためである。しかしながら、集団内でそのような低い頻度で出現する細胞を単離する能力には、スクリーニングパラメータの検討および最適化が必要とされる。表面に抗体断片を提示する細胞のライブラリーを、磁気活性化細胞選別MACSまたは蛍光活性化細胞選別FACSのいずれかによって、抗原結合についてスクリーニングする。FACSは、他にもあるより高度なレベルの検出の中でも特に、複数のカラーチャネル、低角および鈍角の光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを用いて、細胞を分離または選別する。所望の細胞の生存能力に悪影響がない限り、いかなるFACS技術を用いてもよい。FACSの例示的方法については、米国特許第5,061,620号を参照。サイズが108を上回るライブラリーについては、典型的にはMACSを用いてライブラリーのサイズを減少させることで、その後のFACSによるスクリーニングを実現可能な時間で実施できるようにする。MACSにおいて、ビオチン標識抗原に結合するライブラリーのメンバーをストレプトアビジン被覆磁気ビーズおよび磁気分離を用いて単離した後、さらなるスクリーニングのために増殖させる。FACSにおいて、二色検出法を用いた抗原結合および抗体発現の同時評価により、高親和性クローンの集団が特定でき、これらのクローンをその後のスクリーニングラウンドのために増殖させる。分離手順には、抗原被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、および固体マトリクスに付着した抗原を使用するパニングを含み得る。磁気ビーズおよび他の固体マトリクス、例えばアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜、およびプラスチック製ペトリ皿に付着した抗体は、直接分離を可能にする。抗原が結合した細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を単に物理的に分離することによって、細胞懸濁液から除去することができる。細胞の固相結合抗原とのインキュベーションの正確な条件および時間は、使用するシステム特有のいくつかの要因によって異なることになる。しかしながら、適切な条件の選択は、当分野の技能の範囲内である。一部の実施形態において、抗原をビオチンとコンジュゲートした後、これを支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって除去する。他の実施形態において、抗原を蛍光色素とコンジュゲートして、これを蛍光活性化細胞選別装置で使用して、細胞分離を可能にすることができる。H.親和性成熟対象タンパク質の細胞表面提示を含む本発明の方法は、親和性成熟に特に有用である。本発明によると、多数の置換変異体を生成し、複数の細胞の細胞表面に提示し、その細胞を標的タンパク質と接触させることによって、所望の標的結合特性のために選択することができる。親和性成熟は、一般に、親ポリペプチドのCDR内に置換を有するポリペプチド変異体、例えば抗体変異体を調製およびスクリーニングすることと、親ポリペプチドと比較して、改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体を選択することとを含む。かかる置換変異体を生成するのに都合のよい方法は、親和性成熟である。簡潔に述べると、一部の方法では、いくつかの超可変領域部位例えば6~7部位を突然変異させて、各部位にアミノ置換を生成する。そのようにして生成した抗体変異体を細胞表面に一価の状態で提示させる。次に、細胞表面提示変異体をその生物活性例えば結合親和性についてスクリーニングする。親和性成熟のファージ提示法の例については、例えば、国際出願第WO92/01047号、第WO93/112366号、第WO95/15388号、および第WO93/19172号を参照されたい。現在の抗体親和性成熟方法は、確率論的および非確率論的の2つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローンPCR、ミューテーター細菌株Lowetal.,J.Mol.Biol.260,359-681996、および飽和突然変異誘発Nishimiyaetal.,J.Biol.Chem.275:12813-202000、Chowdhury,P.S.MethodsMol.Biol.178,269-852002は、確率論的な突然変異誘発法の典型的な例であるRajpaletal.,ProcNatlAcadSciUSA.102:8466-712005。非確率論的な技術は、しばしばアラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発を使用して、特定の変異体の限定された集合を生成する。一部の方法をさらに詳細に後述する。1.パニング法による親和性成熟組み換え抗体の親和性成熟は、一般的に、漸減量の抗原の存在下での候補抗体の数ラウンドのパニングによって実施する。ラウンドごとに抗原の量を減らすことにより、その抗原に対して最も高い親和性を有する抗体を選択し、それによって巨大な出発材料のプールから高親和性の抗体が得られる。パニングによる親和性成熟は、当分野で周知であり、例えば、HulsらCancerImmunolImmunother.50:163-712001に記載されている。この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。2.ルックスルー突然変異誘発ルックスルー突然変異誘発LTMRajpaletal.,ProcNatlAcadSciUSA.102:8466-712005は、抗体結合部位を迅速にマッピングするための方法を提供する。LTMでは、20個の天然のアミノ酸によって提供される主要な側鎖化学を代表する9つのアミノ酸を選択して、抗体の6つ全てのCDR中のあらゆる位置における結合への官能性側鎖の寄与を分析する。LTMは、CDR内に一連の位置的な単一突然変異を生じ、それぞれの野生型残基が、9個の選択されたアミノ酸のうちの1つで系統的に置換される。突然変異CDRを組み合わせて、全ての変異体の定量的提示を妨げることなく複雑性およびサイズが増加する、コンビナトリアル一本鎖可変断片scFvライブラリーを生成する。正の選択後、結合が改善されたクローンを配列決定し、有益な突然変異をマッピングする。同様に、この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。3.エラープローンPCRエラープローンPCRは、異なる選択ラウンド間の核酸のランダム化を含む。このランダム化は、使用するポリメラーゼの固有エラー率によって低い率で生じるが、転写時の高い固有エラー率を有するポリメラーゼHawkinsetal.,JMolBiol.226:889-961992を用いたエラープローンPCRによって増進することができるZaccoloetal.,.J.Mol.Biol.285:775-7831999。突然変異サイクル後、本発明の方法および材料を使用して、抗原に対する親和性が改善されたクローンを選択する。4.遺伝子部位飽和突然変異誘発GSSMGSSMは、所定のコドン位置における全ての可能な塩基トリプレットの導入を含み、それによって標的位置に20個全てのアミノ酸交換を含むライブラリーの形成をもたらすKretzetal,Meth.Enz.388:3-112004。これは、縮重突然変異誘発プライマーを用いて遺伝子レベルで実現される。続いてinvitroPCR増幅を用いて、元の遺伝子の完全な飽和に必要な全てのコドン変異を有する遺伝子のライブラリーを生成する。5.TargetedAffinityMaturation商標TAE、標的化親和性成熟TAEは、終止コドンを含み、システインおよびメチオニンを含まない18個のアミノ酸残基と等しい提示をコードする縮重コドンの使用を含む。縮重コドンは、それぞれ集合的に18個のアミノ酸残基をコードし、1つまたは複数のアミノ酸残基の過剰提示をもたらし得るいかなる冗長性も排除する。結果として、この方法は、対象位置に18個のアミノ酸置換を含む、より小さい、集中的なライブラリーの生成を可能にする国際公開第WO09/088933号。この一般的概念は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。6.DNAシャフリング核酸シャフリングは、より短いまたは小さいポリヌクレオチドのプールをinvitroまたはinvivoで相同組み換えして、変異体ポリヌクレオチドを生成するための方法である。DNAシャフリングは、米国特許第6,605,449号、米国特許第6,489,145号、国際公開第WO02/092780号、およびStemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-511994に記載されている。一般に、DNAシャフリングは、3つのステップ:1DNaseIによるシャッフルすべき遺伝子の断片化、2断片のランダムハイブリダイゼーション、およびDNAポリメラーゼの存在下でのPCRセクシャルPCRによる断片化された遺伝子の再組み立てまたはフィリング、ならびに、3再組み立てされた産物の従来のPCRによる増幅、からなる。DNAシャフリングは、逆の連鎖反応であるという点でエラープローンPCRとは異なる。エラープローンPCRでは、ポリメラーゼ開始部位の数および分子の数が、指数関数的に増加する。対照的に、ランダムポリヌクレオチドの核酸再組み立てまたはシャフリングでは、開始部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数サイズではないは、経時的に減少する。抗体の場合、DNAシャフリングは、例えば、全てのCDR1と全てのCDR2と全てのCDR3との自由な組み合わせ関係を可能にする。複数の配列ファミリーを、同じ反応でシャッフルできることが想定される。さらに、シャフリングは、例えば、CDR2の位置にCDR1が見られなくなるように、一般に相対的順序を保存する。シャフラントshufflantは、まれに多数の最良の例えば、最高の親和性のCDRを含み、これらの希少なシャフラントをその優れた親和性に基づいて選択することができる。DNAシャフリングで使用可能な鋳型ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAであってよい。それらは、組み換えまたは再組み立てを行う遺伝子またはより短いもしくは小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて、様々な長さであってもよい。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、50bp~50kbである。鋳型ポリヌクレオチドは、多くの場合二本鎖であるべきである。遺伝子選択の最初のステップにおいて、鋳型ポリヌクレオチドと同一の領域および鋳型ポリヌクレオチドと異種の領域を有する一本鎖または二本鎖の核酸ポリヌクレオチドを、鋳型ポリヌクレオチドに付加してもよいことが想定される。また、2つの異なるが関連するポリヌクレオチド鋳型を最初のステップにおいて混合してよいことも想定される。これらの技術は、本発明の方法および材料に容易に適合可能である。I.変更されたグリコシル化本発明により有用な抗体変異体には、親抗体と比較して改変されたグリコシル化パターン、例えば、この抗体中に認められる1つまたは複数の炭水化物部分の欠失、および/またはこの抗体中に存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位の付加を有する抗体が含まれる。抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖との炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニン式中、Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であるは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。したがって、N結合型グリコシル化部位は、これらのトリペプチド配列のうちの1つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、抗体に付加することができる。O結合型グリコシル化とは、糖類であるN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1つと、ヒドロキシアミノ酸最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用可能であるとの結合を指す。O結合型グリコシル化部位は、元の抗体の配列に、1つまたは複数のセリンもしくはトレオニン残基を挿入または置換することによって、抗体に付加することができる。また、改善されたADCC活性を示す、フコシル化が不在または減少した抗体分子も本発明により想定される。これを達成するための様々な方法が、当分野で既知である。例えば、ADCCエフェクター活性は、抗体分子のFcγRIII受容体との結合によって媒介され、これはCH2ドメインのAsn-297におけるN結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、向上した親和性でこの受容体に結合し、天然のフコシル化抗体よりも効果的にFcγRIII媒介エフェクター機能を誘発する。例えば、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠損させたCHO細胞における非フコシル化抗体の組み換え産生は、ADCC活性が100倍に増加した抗体を生じるYamane-Ohnukietal.,BiotechnolBioeng.87:614-222004。同様の効果は、例えばsiRNAまたはアンチセンスRNA処理によってこの酵素またはフコシル化経路の他の酵素の活性を減少させることによって、細胞系を操作して酵素を欠損させることによって、または選択的グリコシル化阻害剤とともに培養することによっても達成することができるRothmanetal.,MolImmunol.26:1113-231989。一部の宿主細胞株、例えばLec13またはハイブリドーマYB2/0細胞系は、より低いフコシル化レベルの抗体を自然に生成するShieldsetal.,JBiolChem.277:26733-402002、Shinkawaetal.,JBiolChem.278:3466-732003。GnTIII酵素を過剰発現する細胞中で組み換えによって抗体を産生することによる分岐炭水化物のレベルの上昇も、ADCC活性を増加させることが確認されているUmanaetal.,NatBiotechnol.17:176-801999。2つのフコース残基のうちの1つのみの不在が、ADCC活性を増加させるのに十分であり得ると予測されているFerraraetal.,BiotechnolBioeng.93:851-612006。J.標識一部の実施形態において、細胞および/またはポリペプチド結合剤は、それらの検出を容易にするために標識する。標識または検出可能部分は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に好適な標識には、放射性標識例えば、32P、フルオロフォア例えば、フルオレセイン、電子密度の高い試薬、酵素例えば、ELISAで一般的に使用されるようなもの、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えばハプテンまたはペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができるか、またはそのハプテンまたはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用可能なタンパク質がある。本発明における使用に好適な標識の例には、蛍光色素例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど、放射性標識例えば、3H、125I、35S、14C、または32P、酵素例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびELISAで一般的に使用される他の酵素、および比色標識、例えばコロイド金、着色ガラス、またはプラスチックビーズ例えば、ポリスチチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどが含まれるが、これらに限定されない。標識は、当分野で周知の方法によるアッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合させてよい。好ましくは、一実施形態における標識は、本発明による作用物質のコンジュゲート化のためのイソシアネート試薬を用いてバイオポリマーに共有結合させてもよい。本発明の一態様では、本発明の二官能性イソシアネート試薬を使用して、標識をバイオポリマーとコンジュゲートして、作用物質をそれに結合させずに、標識バイオポリマーコンジュゲートを形成することができる。標識バイオポリマーコンジュゲートは、本発明による標識されたコンジュゲートの合成のための中間体として使用してもよく、あるいはバイオポリマーコンジュゲートを検出するのに使用してもよい。前述のように、多種多様な標識を使用することができ、この標識の選択は、要求される感度、アッセイの所望の成分とのコンジュゲート化の容易性、安定性要件、利用可能な器具、および処理規定に依存する。非放射性標識は、間接的手段によって結合されることが多い。一般に、リガンド分子例えば、ビオチンが、その分子に共有結合される。次にそのリガンドを本質的に検出可能であるか、または例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合した別の分子例えば、ストレプトアビジン分子に結合する。また、本発明により有用なポリペプチド結合剤は、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲート化によって、シグナル生成化合物と直接コンジュゲートしてもよい。標識としての使用に好適な酵素には、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼoxidotase、特にペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわち、フルオロフォアには、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれるが、これらに限定されない。好適なフルオロフォアのさらなる例には、エオシン、TRITC-アミン、キニーネ、フルオレセインW、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Bスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウムトリス、ビピリジニウム、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限定されない。標識としての使用に好適な化学発光化合物には、ルシフェリン、および2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法で使用可能な種々の標識系およびシグナル生成系の概説については、米国特許第4,391,904号を参照されたい。標識を検出するための手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーで使用する写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起し、その結果生じた蛍光を検出することによって、この標識を検出することができる。蛍光は、視覚的に、あるいは電子検出装置、例えば電荷結合素子CCDまたは光電子増倍管などの使用などによって検出することができる。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供し、その結果生じた反応生成物を検出することによって検出することができる。比色標識または化学発光標識は、単に標識に関連する色を観察することによって検出することができる。本発明の方法における使用に好適な他の標識および検出系は、当業者に容易に認識されるであろう。このような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断に使用することができる。前述の発明は理解を明確にする目的で詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更を行ってもよいことは明らかであろう。本明細書で引用する全ての刊行物および特許文献は、それぞれが個別に参照により援用されることが示されているのと同様に、参照により全体があらゆる目的で援用される。以下の実施例は、説明の目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。実施例1一般的な材料および方法酵素、抗体、および組み換えタンパク質制限エンドヌクレアーゼおよびT4DNAリガーゼをNewEnglandBiolabsIpswich,MAから購入した。KODHotStartポリメラーゼEMD4Biosciences,Gibbstown,NJを用いてPCRを実施した。フローサイトメトリー用の抗体をInvitrogenCorp.Carlsbad,CAから入手した。組み換えヒトIL-1βをPeproTechRockyHill,NJから購入し、EZ-LinkSulfo-NHSビオチン標識キットThermoScientific,Rockford,ILを用い、製造業者の使用説明に従ってビオチンで標識した。酵母クローンおよび株酵母クローンYNR044WAGA1およびYGL032CAGA2は、OpenBiosystemsHuntsville,ALから購入し、出芽酵母Saccharomycescerevisiae株BJ5465は、ATCCから入手した。出芽酵母Saccharomycescerevisiae株EBY100は、BoderandWittrup,Nat.Biotech.15,553-5571997に記載されている。培地および緩衝液SDCAA培地:38mMNa2HPO4、71mMNaH2PO4、2w/vD-デキストロース、0.67w/v酵母窒素ベース、0.5w/vカザミノ酸、pH7.5。SGCAA培地:SDCAAと同様であるが、D-デキストロースの代わりにガラクトースを使用。SDCAAおよびSGCAAの両培地、トリプトファン、ウラシル、およびリン酸緩衝食塩水PBSは、TEKnovaHollister,CAから購入した。フローサイトメトリー用の洗浄緩衝液は、0.1w/vBSASigma-Aldrich,St.Louis,MOを含むフィルター滅菌したPBSからなる。トランスフェクション培地:4mML-グルタミンを補充したHyCloneSFMTransfx-293Media。成長培地:HyCloneSFMTransfx-293Media、10w/vHyCloneFBS、4mML-グルタミン、および250μg/mLジェネテシン。HyCloneSFMTransfx-293培地およびFBSは、ともにThermoScientificRockford,ILから購入し、L-グルタミンおよびジェネテシンは、InvitrogenCorpCarlsbad,CAから購入した。酵母形質転換および成長Frozen-EZTransformationII商標キットZymoResearch,Orange,CAを用いて、化学的にコンピテントな酵母細胞を調製した。形質転換した細胞をデキストロース培地プレート上で、30°Cで72時間成長させた。次に、単離したコロニーを振盪250rpmしながら30°Cで16時間、培養物として成長させた。デキストロース培地をガラクトース培地に交換し、細胞を20時間成長させて抗体発現を誘導した。哺乳動物細胞トランスフェクションおよび成長20マイクログラムのプラスミドDNAを1mLのトランスフェクション培地中の20μgのLipofectamine商標2000試薬InvitrogenCorp,Carlsbad,CAとともに、室温で25分間インキュベートした。次に、この混合物を20mLのトランスフェクション培地中の1.6×107のヒト胎児腎臓HEK293E細胞に滴下添加した。次に、細胞を5CO2および振盪95rpm下、37°Cで成長させた。4日後にフローサイトメトリー分析用に、7日後にタンパク質発現および精製用に細胞を収集した。可溶性IgGを精製するために、トランスフェクト細胞を遠心分離し3200rpm、10分間、4°C、馴化培地を除去し、200μLのタンパク質AセファロースCL-4BGEHealthcare,Waukesha,WIとともに、室温で2時間または4°Cで16時間インキュベートした。この樹脂をPBSで洗浄し、700μLの溶出緩衝液0.2Mグリシン/HCl、pH2.5とともにインキュベートした後、中和緩衝液1MTris-HCl、pH9.0を添加した。次いで、精製したIgGを4°Cで16時間PBSに透析し、HPLCおよびSDS-PAGEによって純度を分析した。フローサイトメトリー200万個の酵母細胞または5×104のHEK293細胞を洗浄緩衝剤で洗浄した後、ビオチン標識IL-1β100nMおよびニワトリ抗c-Myc4μg/mLとともに室温で1時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン-フィコエリトリンPE10μg/mL、抗ニワトリAlexaFluor登録商標647コンジュゲート20μg/mL、および抗血球凝集素HAAlexaFluor登録商標488コンジュゲート10μg/mLとともに、氷上、遮光下で30分間インキュベートした。次いで、C6フローサイトメーターAccuriCytometersInc.,AnnArbor,MIまたはFACScan機器BD,FranklinLakes,NJのいずれかで分析する前に、細胞を最後にもう1度洗浄した。典型的には、1試料当たり10,000事象を採取した。その後の分析は、FlowJoソフトウェアTreeStarInc.,Ashland,ORを用いて実施した。実施例2ベンチマークとしてのAga2融合体提示ベクターの構築GAL1プロモーター、Aga2シグナルペプチドをコードするDNA1~18、クローニングのためのBamHI制限部位、c-MycエピトープタグをコードするDNA、成熟Aga2タンパク質をコードするDNA19~87、MATα転写ターミネーター、TRP1遺伝子、CEN6/ARSH4起点、AMP耐性遺伝子、およびpUC細菌起点を含むベクターpTam14をGenScriptPiscataway,NJによって合成した。ビオチン標識IL-1βに対する抗体ファージ提示ライブラリーの可溶性パニングを3ラウンド行った後、そのクローンであるXPA28scFvを特定した。配列決定により、XPA28scFvが、VH3およびVL1ファミリーに相当する重鎖およびラムダ軽鎖を有することが明らかになった。XPA28scFvをベクターpXHMVにサブクローニングしRondonらのPCT国際公開第WO2010/040073号、このときscFvをエピトープタグ6xHis、c-Myc、V5、およびバクテリオファージ由来のpIIIとインフレームで融合する。ベクターpTam15を、まず、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、プラスミドpXHMV/XPA28scFvからXPA28scFvをPCR増幅することによって構築し、NheIおよびBamHIを用いて消化し、アクセプターベクターpTam14も同様に消化した。その断片とベクターを連結し、その結果ベクターpTam15図1を生じた。実施例3NorpAテザー提示系のためのベクター構築ベクターpTam16を、まずInaDのPDZ1ドメイン11~107を合成し、次にその断片をを用いてPCR増幅することによって構築した。増幅した断片およびpTam14の双方をNheIおよびBamHIで消化し、これらを連結して、その結果ベクターpTam16図2を生じた。ベクターpTam21を以下のように構築した。pXHMV/XPA28scFv中のV5タグGKPIPNPLLGLDSTSEQIDNO:22をコードするDNAを、NorpAのC末端7残基GKTEFCASEQIDNO:16からなるNorpAテザーをコードするDNA1089~1095で置換した。これは、変異プライマーであるを用いて、QuikChange商標部位特異的突然変異誘発Stratagene,LaJolla,CAによって実施した。His6、c-mycタグ、およびNorpAを含むXPA28scFvに対応するDNAを、プライマーを用いて増幅し、NheIおよびPmeIで消化し、NheI/PmeI消化pTam14中に連結した。変異プライマーであるを用い、プラスミドpTam16のQuikChange商標突然変異誘発によって、ベクターpTam27を構築した。これによりサイレント突然変異を導入し、Aga2シグナルペプチド内のNheI制限部位を削除した。ベクターpTam28を以下のように構築した。鋳型としてのpTam21、プライマーを用いて、Aga2シグナルペプチド、XPA28scFv、His6タグ、c-Mycタグ、NorpAテザー、およびMATαターミネーターに対応するDNAをPCR増幅した。鋳型としてのpTam27、プライマーを用いて、Gal1プロモーター、Aga2シグナルペプチド、InaDPDZ1、およびc-Mycタグに対応するDNAをPCR増幅した。これら2つのPCR断片は、相同な30塩基対を含み、オーバーラップPCR伸長を用いて結合した。簡潔に述べると、これらの2つの断片それぞれ100ngの混合物に、最終伸長ステップで休止する前に6サイクルにわたる加熱サイクルを実施した70°C。続いて、最も外側のプライマーTam89およびTam92を最終濃度300nMまで添加し、さらに26サイクルにわたり反応を継続させた。結合した断片2127塩基対に対応するDNAバンドをゲル精製し、NheIおよびHindIIIを用いて消化し、アクセプターベクターpTam14も同様にした。続いてその断片とベクターを連結し、その結果ベクターpTam28図3を生じた。実施例4NorpAテザー提示系の構築および検証EBY100細胞をpTam15、16、および28で形質転換し、SDCAA培地で成長させた。単一コロニーを成長させ、SGCAA培地で誘導した。フローサイトメトリー分析のために、実施例1に記載のように細胞を洗浄し、標識した。図4Aに示すように、NorpAテザー系を用いたXPA28scFvpTam28を提示する細胞は、IL-1βに結合し、PE蛍光およびAlexaFluor647蛍光によって観察されるc-Myc染色が陽性である。しかしながら、抗原結合およびscFv発現は、c-MycエピトープタグがXPA28scFvとInaDPDZ1との双方のカルボキシル末端に存在することから、直接的相関ではない。Aga2融合体としてXPA28scFvpTam15、図4Bを提示する細胞と比較すると、NorpAテザー系によるIL-1β結合の量はより低い。対照として、InaDPDZ1のみpTam16を発現する細胞は、IL-1βに結合しない図4C。次に、pTam15および28を発現する細胞を漸増濃度のビオチン標識IL-1β16.9pM~1μMとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。各試料の平均PE蛍光を測定し、全体に占める割合として算出した。次に、これをIL-1β濃度に対してプロットし、最大半量EC50における濃度として解離定数KDを決定した。図5に示すように、2つの提示系を用いたXPA28scFvによるIL-1β結合のKDは類似しており、これはNorpAテザー系pTam28で9.2nM、Aga2融合体提示pTam15で20.5nMであり、この種の分析の誤差の範囲内であったChao,Lauetal.2006。これらの結果は、IL-1βに対するXPA28の親和性が、NorpAテザー系において損なわれていないことを示唆している。むしろ、Aga2融合体提示図4Bと比較して、NorpAテザー系を用いて観察されたより低いレベルの抗原結合図4Aは、細胞表面に見られるscFvの総レベルの減少に起因する可能性がある。最後に、Biacoreによって測定した場合、NorpAテザー系を用いて測定されたKDは、IgG1として再編成された可溶性XPA28のKDと十分一致している15.1±4.5nM。ベクターpTam18を以下のように構築した。Aga2シグナルペプチドをコードするDNA1~18、XPA28scFv、c-Mycタグ、グリシンセリンリンカー、およびAga219~87からなるDNA断片を4つのより小さい断片を用いてオーバーラップ伸長PCRにより生成した。まず、Aga2シグナルペプチドに対応するオリゴを合成し、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ、を用いてPCR増幅した。プライマーを用いたPCR増幅の鋳型として、ベクターpXHMV/XPA28scFvを使用した。c-Mycエピトープタグおよびグリシンセリンリンカーに対応するオリゴを合成し、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ、を用いてPCR増幅した。プライマーを用いて、YGL032COpenBiosystems,Huntsville,ALから成熟Aga2タンパク質19~87を増幅した。これら4つの断片を別個にゲル精製し、プライマーRbsAga2SS2およびAga22を用いて、実施例1に記載のようにオーバーラップ伸長PCRにより結合した。4つ全ての断片のサイズに相当する単一断片1209塩基対をゲル精製し、In-Fusion登録商標クローニングClontech,MountainView,CAを用いて、SacI/PmeI消化pYC2/CTInvitrogenCorp,Carlsbad,CAにクローニングした。ベクターpTam32を以下のように構築した。2つの断片を用いたオーバーラップ伸長PCRにより、c-Mycタグ、グリシンセリンリンカー、および成熟Aga1タンパク質23~726をコードするDNA断片を生成した。c-Mycタグおよびグリシンセリンリンカーに対応するオリゴを合成し、PCR増幅をプライマーを用いて行った。プライマーを用いて、クローンYNR044WOpenBiosystems,Huntsville,ALからAga1p23~176を増幅した。これらの2つの断片をゲル精製し、増幅のためのプライマーTam159およびTam122を用いて、オーバーラップ伸長PCRにより結合した。この結合断片およびpTam18の両者をHindIIIおよびPmeIで消化し、連結して、その結果ベクターpTam32図6を生じた。EBY100細胞およびBJ5465細胞をそれぞれpTam15および32で形質転換した。SDCAAEBY100、pTam15または40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAABJ5465、pTam32のいずれかで成長させた後、形質転換体を特定した。次に液体培地で単一コロニーを成長させ、対応するガラクトース培地SGCAAまたは40μg/mLのトリプトファンを含むSGCAAで誘導した。フローサイトメトリー分析のために、実施例1に記載のように、細胞を洗浄し、標識し、分析した。図7に示すように、PE蛍光およびAlexaFluor647蛍光により観察されるpTam15AおよびpTam32B形質転換細胞の抗原結合およびc-Myc染色特性は、極めて類似しており、Aga1が、XPA28scFvの細胞壁アンカーとしてのAga2の好適な代替物であることを示している。QuikChange商標突然変異誘発、ならびにプライマーを用いて、まずpTam32中のURA3遺伝子とCEN6/ARSH4複製起点との間のNheI制限部位を排除することにより、pTam34を構築した。得られたプラスミドpTam32bをNheIおよびHindIIIで消化し、以下のインサートに対するアクセプターベクターとした。XPA28scFv、His6、c-Mycタグ、NorpAテザー、MATαターミネーター、GAL1プロモーター、InaDPDZ1、およびc-Mycタグに対応するDNA断片をNheIおよびHindIIIを用いてpTam28から切り取った。このインサートとアクセプターベクターとを連結させ、その結果ベクターpTam34図8を生じた。EBY100細胞およびBJ5465細胞をそれぞれpTam28および34で形質転換し、SDCAAEBY100、pTam28または40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAABJ5465、pTam34のいずれかで成長させた。フローサイトメトリー分析のための標識前に、細胞を対応するガラクトース培地SGCAAまたは40μg/mLのトリプトファンを含むSGCAAで誘導した。図9に示すように、PE蛍光およびAlexaFluor647蛍光により観察されるpTam28AおよびpTam34B形質転換細胞の抗原結合およびc-Myc染色特性は、極めて類似していた。これは、Aga1が、InaDPDZ1を酵母細胞壁に固定するという点で、Aga2の好適な代替物となったことを示している。pTam35を以下のように構築した。血球凝集素HAエピトープに相当するDNA配列を合成し、プライマーを用いてPCR増幅した。増幅したインサートは、InaDPDZ1のカルボキシル末端で、c-Mycタグの5側および3側に隣接する配列と相同な領域を含む。プラスミドpTam34をHindIIIで消化し、インサートをIn-Fusion登録商標クローニングを用いてクローニングした。pTam35のベクターマップに示すように、InaDPDZ1に融合されたc-Mycエピトープタグは、ここではHAタグに置換されている図10。BJ5465細胞をpTam35で形質転換し、40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAAで成長させ、40μg/mLのトリプトファンを含むSGCAAで誘導してから標識した。非誘導細胞および誘導細胞の両者をフローサイトメトリーで分析した図11。図11に示すように、PE蛍光およびAlexaFluor488蛍光により評価したとき、誘導細胞白抜きは、非誘導細胞グレー塗りつぶしと比較して、IL-1βに結合しA、InaDPDZ1を発現するC。しかしながら、AlexaFluor647蛍光により観察したとき、scFvは検出されなかったB。細胞がIL-1βに結合したため、このことは、AlexaFluor647蛍光の欠如が、c-Myc抗体がこのエピトープタグに結合できないことによるものであり、scFv発現の欠如によるものではないことを示している。発明者らは、NorpAテザーとInaDPDZ1との複合体形成が、c-Myc抗体とタグとの結合を妨げ得るとさらに仮定した。この問題に取り組むために、c-Mycエピトープタグが一次配列においてNorpAテザーからさらに離れた、ベクターpTam37を構築した。まず、プライマーを用いて、ベクターバックボーンのpTam35を増幅することにより、ベクターpTam37を構築した。c-Myc、His6、およびNorpAテザーに、この特定の順序で対応するDNA断片を合成し、プライマーを用いてPCR増幅した。増幅した断片は、増幅したバックボーンと相同な18塩基対を含み、これはIn-Fusion登録商標を用いたクローニングを可能にした。図12に示すように、pTam37は、ここではc-MycタグがHis6タグに先行するという点でpTam35と異なる。BJ5465細胞をpTam37で形質転換し、40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAAで成長させ、40μg/mLのトリプトファンを含むSGCAAで誘導してから標識した。非誘導細胞および誘導細胞の両者をフローサイトメトリーで分析した。図13に示すように、誘導細胞白抜きは、IL-1βに結合しA、InaDPDZ1を発現するBが、非誘導細胞グレー塗りつぶしはそうではない。pTam37図13BとpTam35図11BとのAlexaFluor647蛍光の比較は、おそらく2つのベクター間のタグアクセス性の差によると思われる、c-Mycエピトープタグの検出における著しい差を示している。これらの結果を考慮して、小さい非免疫scFvライブラリーを構築するためのベクターとして、プラスミドpTam37を選択した。実施例5哺乳動物細胞上のIgGのNorpAテザー提示ベクター構築過程におけるタンパク質発現を評価するためのモデル抗体として、IgG1抗体である抗KLH8を使用した。抗KLH8の重鎖全体に対応するDNAをKLH8-HC-Xba1順方向プライマーおよびKLH8-HC-Not1逆方向プライマーを用いてPCR増幅し、XbaIおよびNotIを用いた制限部位クローニングにより、pIRESベクターClontech,MountainView,CA中に連結した。次にこのプラスミドをEcoRIおよびXbaIで消化し、IRES1の代わりに合成IRES2配列BlueHeron,Bothell,WAをクローニングした。次に、IRES2配列および抗KLH8HCをIRES2Xho1順方向プライマーおよびXho1-KLH8HC逆方向プライマーを用いてPCR増幅した。増幅した断片をXhoIで消化し、単一XhoI部位に定常ラムダCλ軽鎖XOMA,Berkeley,CA;国際出願第WO06/060769号および抗KLH8VLを含む一過性発現ベクターであるアクセプターベクターpMXT13/抗KLH8VLにクローニングした。抗KLH8LCおよびHCがそれぞれCMVプロモーターおよびIRES2によって調節される得られたベクターpXIBM-IRES2は、これで単一ベクターからの完全なIgGの発現を可能にする。次に、抗KLH8LCに先行するIgGリーダーペプチドをUS2シグナルペプチド米国特許第7,094,579号に置き換えた。US2シグナルペプチド、抗KLH8LC、およびIRES2からなるDNA断片を2ステップPCR反応により生成した。一次PCR反応は、US2配列US2-KLH8LC順方向プライマー:および逆方向プライマーIRES2-PmlI逆方向プライマー:を含む伸長した順方向プライマーを用いた、抗KLH8LCおよびIRES2の増幅からなった。上記の逆方向プライマーおよび第2の順方向プライマーSal1-US2順方向プライマー:を用いた二次PCR反応を実施して、US2シグナル配列を完成し、クローニングのためのSalI部位を付加した。次に、PCR断片をSalIおよびPmlI部位を用いた制限部位クローニングによりpXIBM-IRES2にクローニングし、その結果ベクターpXIBM-US2-IRES2を生じた。最後に、抗KLH8LCおよびHCを対応するXPA28の可変領域に置き換えた。Sfi1-VL順方向プライマー、VLAvrII逆方向プライマー、Nco1-VH順方向プライマー、およびVHNhe1逆方向プライマーを用いて、鋳型pXHMV/XPA28scFvからXPA28LCおよびHCを増幅した。XPA28のLCおよびHCをそれぞれSfiI/AvrIIおよびNcoI/NheI制限酵素対を用いた制限部位クローニングにより、pXIBM-US2-IRES2に挿入した。得られたベクターpXIBM14図14Aは、IgG1のCλ領域およびCH1-3領域とそれぞれインフレームで融合したXPA28のVLおよびVHを特徴とする。pXIBM14で一過性にトランスフェクトした細胞は、可溶性XPA28IgGを発現し、これをタンパク質Aセファロースで精製した。HCおよびLCの電気泳動移動度は、XPA28scFvが全長抗体XPA28IgG図14Bとして正しく再構成されたことを予想通り示していた。細胞表面にXPA28IgGを提示するために、重鎖のカルボキシル末端にNorpAテザーを融合した。順方向プライマーNhe1-HCFwdと、3つの逆方向プライマーXho1-PDZ-NoAARev:、3アミノ酸スペーサーXho1-PDZ-3AARev:、および5アミノ酸結合スペーサーXho1-PDZ-5AARev:のうちの1つとを用いて、pTam37からNorpAテザーをPCR増幅して、スペーサーが結合していないテザーを生成した。これら3つの異なるNorpAテザーPCR断片をpXIBM14のNhe1制限部位およびXho1制限部位にクローニングして、結果としての3つのベクター:CH3とNorpAテザーとの間にスペーサーを含まないpXIBM32;3アミノ酸スペーサーGAAを含むpXIBM34;および5アミノ酸スペーサーGGGGSを含むpXIBM36SEQIDNO:74を生成し、これらを図15に示す。ベクターpTam29を以下のように構築した。IgGリーダーペプチド、InaDPDZ1、c-Mycエピトープ、グリシンセリンリンカー、および血小板由来成長因子受容体βPDGFR-βの膜貫通ドメインをコードするDNA断片を2つの断片を用いたオーバーラップ伸長PCRにより生成した。プライマーを用いて、InaDPDZ1に対応するDNAをPCR増幅した。プライマーを用いて、プラスミドであるpDisplayInvitrogen,Carlsbad,CAから、PDGFR-βの49アミノ酸膜貫通ドメイン513~561をPCR増幅した。これら2つの断片をゲル精製し、プライマーのTam99およびTam100を用いて、オーバーラップ伸長PCRにより結合した。結合した断片およびアクセプターベクターpMXT32XOMA,Berkeley,CA;国際公開第WO06/060769号の双方をBsmIおよびXhoIで消化し、これらを連結して、その結果ベクターpTam29図15Bを生じた。HEK293E細胞を実施例1に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの96時間後、フローサイトメトリーにより、IL-1β結合およびInaDPDZ1発現について細胞を分析した図16。対照として、pXIBM14でトランスフェクトした細胞は、IL-1βおよびc-Myc染色の双方について陰性であったA。予想通り、pTam29でトランスフェクトした細胞は、c-Mycのみについて陽性であったB。対照的に、pXIBM32およびpTam29C、pXIBM34およびpTam29D、ならびにpXIBM36およびpTam29Eで共トランスフェクトした細胞は、PE蛍光およびAlexa647蛍光で測定したときに、IL-1β結合およびPDZ発現の双方について陽性であった。さらに、XPA28IgGのC末端とNorpAテザーとの間の間隔が違いをもたらすとは思われなかった。これらの結果は、NorpAテザー提示系が酵母と同様に哺乳動物抗体提示に適用できることの立証に成功した。InaDPDZ1発現の不在下で、3つ全てのXPA28IgG/NorpAテザータンパク質が馴化培地に分泌され、またタンパク質Aセファロースを用いて十分に精製することができ、NorpAテザー中の不対システインがXPA28IgGの発現および折り畳みに影響を与えなかったことを示している。また、3つの融合タンパク質の精製収率は、NorpAテザーを含まずに、XPA28IgGに匹敵した。NorpAテザーおよびGGGGSスペーサーを含むXPA28IgG、ならびにこれらを含まないXPA28IgGの還元SDS-PAGE分析により、単離タンパクの純度および重鎖に融合したNorpAテザーの存在を確認した図17。実施例6抗体結合にとってのInaDPDZ1/NorpAジスルフィド結合の重要性の試験NorpAのC末端7残基1089~1095と複合したInaDPDZ1ドメイン11~107の結晶構造は、InaDPDZ1およびNorpAのそれぞれC31とC1094の間のジスルフィド結合を示すKimpleetal.2001EMBOJ.20:4414-4422。テザー提示系におけるこのジスルフィド結合の重要性を調査するために、鋳型プラスミドとしてのpTam37および以下に概説する変異プライマーを用いたQuikChange商標突然変異誘発により、ベクターpTam49~52を構築した。pTam49~Tam190pTam50~Tam192pTam51~Tam220pTam52~Tam222pTam49において、NorpAテザーの最後から2番目のシステイン残基C1094をセリンに変異させ、対応する突然変異C31SをInaDPDZ1ドメインに作成し、その結果pTam50図18を生じた。pTam51および52の双方は、InaDPDZ1およびXPA28scFvそれぞれの最初のコドンの直前に挿入された2つの終止コドンを含む図18。BJ5465細胞をpTam37、49、50、51、および52で形質転換し、40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAAで成長させた後、ガラクトース誘導を行った。次に、フローサイトメトリーを用いて、IL-1β結合、ならびにc-MycおよびHAエピトープタグの存在について細胞を分析した。図19Aに示すように、pTam37で形質転換した細胞はIL-1βに結合するが、NorpAC1094S突然変異体pTam49で形質転換した細胞はIL-1βに結合しない図19B。興味深いことに、InaDPDZ1C31S突然変異体pTam50は、pTam37よりも低いレベルではあるが、IL-1β結合を保持する図19C。したがって、データは、InaDPDZ1およびNorpAのそれぞれC31とC1094の間のジスルフィド結合の重要性を立証する。3個全てのベクターにおいて、細胞表面上のPDZの存在が、AlexaFlour登録商標488蛍光により観察された。最後に、IL-1β結合は、InaDPDZ1pTam51またはXPA28scFvpTam52を含まない細胞には存在せず図19DおよびE、IL-1βとInaDPDZ1または細胞表面との間に非特異的相互作用が存在しないことが示された。実施例7抗体テザー提示ライブラリーの構築pTam37中のXPA28を1.5キロベースのスタッファーDNA断片で置換して、アクセプターベクターpTam48を作成した。次に、このベクターをNheIおよびSfiIで消化してスタッファーDNAを除去し、ゲル精製した。scFvライブラリーに対応するインサートDNAを以下のように生成した。V-Baseから設計したプライマーを用いて、健康なドナー30名の骨髄、PBMC、または脾臓から単離したcDNAから、VH領域およびVλ領域をPCR増幅した。Vセグメントにアニーリングする順方向プライマーと、VHおよびVLそれぞれのためのVJおよびCH1領域でアニーリングする逆方向プライマーとを使用して、VH1~7およびVL1~10の各ファミリーを別個に増幅した。次に、PCR反応を実施して、VHの5末端にNheI制限部位を、VL領域の3末端にSfiI制限部位付加した。さらに、VH用の逆方向二次プライマーおよびVL用の順方向二次プライマーは相補的であり、グリシン-セリンリンカーをコードする。VHのPCR産物をサブファミリーVH1~7に基づいてプールし、VLの単一プールを作成したVL全体。VH1~7およびVL全体からのDNAを5:1の比率で混合し、アセンブリプライマーを用いたオーバーラップ伸長PCRにより、scFvに対応する単一の混合断片を生成した。両アセンブリプライマーは、線状化アクセプターベクターpTam48と相同な48の相補的塩基対を含む。7個のアセンブリPCR産物VH1~7/VLプールをV-Baseに記載される天然分布MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UKに従って混合し、単一のプールにした。ベクターおよびインサートDNAを相同的組み換えによって混合した。線状化ベクター8μgおよびscFvDNA24μgをBJ5465細胞に電気穿孔で導入し、その結果ライブラリーサイズ1.74×108の形質転換体を生じた。実施例8抗トランスフェリンscFvsの抗体テザー提示ライブラリーからの単離第1ラウンドのパニングのために、実施例7に記載のライブラリーからの1×1010の細胞を1μMのビオチン標識トランスフェリンとともにFACS緩衝液0.1BSA含有PBS中、室温で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン磁気マイクロビーズMiltenyiBiotec,Cologne,Germanyとともに、氷上で10分間インキュベートした。次に、この細胞懸濁液をLSカラムMiltenyiBiotecに添加し、FACS緩衝液で洗浄し、40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAA培地中に溶出し、16~24時間成長させた。続いて、細胞を継代し、さらに24時間成長させた。FACSに備えて、細胞を次いで40μg/mLのトリプトファンを含むSGCAA培地に移し、20~24時間成長させた。第2ラウンドのパニングのために、細胞を抗c-Myc4μg/mLおよびビオチン化トランスフェリンともに、室温で1時間インキュベートした。次に、細胞を冷たいFACS緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン-フィコエリトリンPE10μg/mL、抗ニワトリAlexaFluor登録商標647コンジュゲート20μg/mL、および抗血球凝集素HAAlexaFluor登録商標488コンジュゲート10μg/mLとともに、4°C、遮光下で30分間インキュベートした。FACSAria商標機器BD,FranklinLakes,NJを用いて、標識された細胞を選別した。図20Aに示すように、集団の4.0に対応する選別ゲートを使用して、PE蛍光およびAlexaFluor登録商標488蛍光の双方について陽性のクローンを選別した。選別した細胞を40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAA中に採取し、パニングの次のラウンドの間30°Cで成長させた。その後のパニングラウンドにおいて、より蛍光性が高いクローンを単離するために選別ゲートの位置を変更した図20B~D。FACSによる4ラウンドの濃縮後、プレーティングにより単一クローンを単離し、単一の96ウェルプレートの培地に接種するために使用した。個々のscFvクローンによるトランスフェリン結合をフローサイトメトリーにより評価した。続いて、18個の固有配列を特定し、抗原滴定曲線を用いてさらに特徴付けた。次に、細胞を漸増濃度のビオチン標識トランスフェリン1nM~2μMとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。平均PE蛍光全体に占める割合を抗原濃度に対してプロットし、最大半量EC50における濃度として解離定数KDを決定した。3つの例示的クローンの推定親和性を図21に示す。実施例9IgGおよびFabの酵母細胞表面提示抗体XPA28IgGを酵母細胞の表面に提示するために、プライマーであるTam147を用いて、ベクターpTam48実施例7を参照をまずQuikChange商標突然変異誘発によって改変して、第2のPmeI部位図22を不活性化した。得られたベクターをNheIおよびPmeIで消化してスタッファー配列、cMycおよびHis6エピトープタグ、ならびにNorpAテザーを除去した。次に、得られた8kb断片をNheI-HFおよびPmeIで消化した3kbのオーバーラップ伸長PCR断片に連結した。この後者の断片は、以下の3つのPCR増幅から構成された:1プライマーを用いて増幅した、ベクターpXIBM36由来の軽鎖図15Aを参照;2プライマーを用いて増幅した、ベクターpTam48由来のMATαターミネーター、Gal1プロモーター、およびAga2シグナル配列;3プライマーを用いて増幅した、ベクターpXIBM36由来のVHおよびCH1-3領域。クローニングの目的で、URA3遺伝子中のNcoI部位をQuikChange商標突然変異誘発、ならびにプライマーによって不活性化した。最終的ベクターであるpVV42を図23に示す。プライマーおよびoVV82PCR逆方向下線部分の配列の逆方向成分は、NorpAテザーアミノ酸GKTEFCASEQIDNO:16をコードするを用いて、ベクターpVV42からVHおよびCH1ドメインを増幅することによって、IgGベクターpVV42図24のFc領域をコードする配列を除去した。次に、PCR断片をNcoIおよびPmeIで消化し、NcoIおよびPmeIですでに消化しておいたpVV42中に連結して、その結果新しいベクターであるpVV47図24を生じた。BJ5465酵母細胞をベクター:pTam37XPA28scFv、pVV47XPA28Fab、およびpVV42XPA28IgG1で形質転換し、40μg/mLのトリプトファンを含むSDCAAで成長させ、ガラクトースで誘導した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を洗浄緩衝剤で洗浄した後、ビオチン標識IL-1β100nMとともに、室温で1時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、ストレプトアビジン-フィコエリトリンPE10μg/mLおよび抗血球凝集素HAAlexaFluor登録商標488コンジュゲート10μg/mLとともに、氷上、遮光下で30分間インキュベートした。次に、分析前に最後に1回細胞を洗浄した。図25に示すのは、PE蛍光およびAlexaFluor488蛍光の2変数グラフであり、酵母細胞表面上のビオチン-IL-1βおよびInaDPDZ1/Aga1融合体それぞれの存在を示している。これらの結果は、生成された3つ全ての構築物が、IL-1βに結合したタンパク質を提示したことを示す。scFv形式を提示する細胞は、これら3つの形式の中で最も高いレベルの抗原結合を示し、その次にFab、次にIgGが続いた図25。PDZ/Aga1提示のレベルは、抗体サイズとは無関係と思われ、3つ全ての構築物に関して類似していた。この実験は、開示されるPDZテザー提示系を用いて、複数の抗体タイプを酵母細胞表面に提示することができることを立証した。実施例10組み込みファージ、酵母、哺乳動物提示を用いた、Tie2結合抗体の特定および特徴付けXFab1ライブラリーの構築XFab1ファージライブラリーを以下のように調製した。標準的方法Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress1989を用いて、RT-PCRにより30名のドナーからcDNAを調製したAllCells,Emeryville,USA。VBASEMRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UKからの生殖系列配列に基づくプライマーを用いて、VL領域およびVH領域をPCR増幅した。次に、増幅したVH断片およびVL断片をpXHMV-US2-L-FabベクターまたはpXHMV-US2-K-Fabベクター中に順次連結させた。連結したDNAをエレクトロコンピテントTG1細胞Lucigen,Middleton,USAに電気穿孔で導入した。得られたXFab1ライブラリーのサイズは、2.5×1011形質転換体であった。Tie2抗原に対するファージパニングファージパニングに備えて、ストレプトアビジン結合Dynabeads登録商標LifeTechnologies,Carlsbad,CAを、5ミルクを含むPBSで3回洗浄した。次に、このビーズおよびファージ100×ライブラリー当量を、5ミルクを含むPBSで、室温で1時間ブロックした。ブロックしたファージをブロックしたビーズ100μLとともに室温で30分間インキュベートすることにより、除外ステップを実施した。このステップをもう1回繰り返した。抗原Tie2RDSystem,Minneapolis,MNをSulfo-NHS-LCBiotinThermoScientific,Rockford,ILで標識した。第1ラウンドのパニングのために、抗原100ピコモルをブロックしたビーズ100μLとともに30分間インキュベートした。洗浄後、Tie2結合ビーズを除外されたライブラリーファージとともに、室温で1時間インキュベートした。次に、0.05Tween登録商標20および5ミルクを含むPBSを用いてビーズを3回洗浄した。洗浄したビーズを500μLの100mMTEAEMDChemicals,Gibbstown,N.Jに20分間懸濁させてから、等容積の1MTrispH7.4Teknova,Hollister,CAで中和することにより、結合したファージを溶出した。次に、このファージ/ビーズ溶液を用いて対数期TG1大腸菌10mL細胞を100rpm振盪下、37°Cで1時間感染させた。感染細胞を2YTCG培地100g/mLカルベニシリンおよび2グルコースを含む2YTに蒔き、30°Cで一晩インキュベートした。翌日、細胞を掻き取って採取し、新鮮な液体2YTCG培地に接種するために使用した。前のラウンドからの回収ファージの100倍の数の細胞を用いて、600nmOD600における最終光学密度が0.05になるように、2YTCG細胞の培養物に接種した。次に、この培養物を振盪下250rpm、37°Cで、OD600が0.5に達するまで成長させた。M13K07ヘルパーファージNewEnglandBiolabs,Ipswich,MAを感染多重度MOI20でこの培養物に添加した。この培養物を振盪下100rpm、37°Cで1時間、さらにインキュベートした。次に、感染細胞をペレット化し、100μg/mLのカルベニシリンおよび50μg/mLのカナマイシンを含む2YT培地に再懸濁させ、振盪下250rpm、30°Cで一晩成長させた。翌日、細胞をペレット化し、ファージ上澄みは取っておいた。第2ラウンドのパニングのために、1mLのファージ上澄みおよび50ピコモルのビオチン標識Tie2を使用した。第3ラウンドでは、100μLのファージ上澄みを用いたが、抗原の量には変化はなかった50ピコモル。他の全てのパニング条件は、第1ラウンドと同様であった。濃縮ファージクローンの哺乳動物提示ベクターへの移入第3ラウンドのパニングからの感染細胞を2YTCG培地で前述の通り30°Cで一晩成長させた。翌日、細胞を掻き取り、PlasmidMegaキットQiagen,Valencia,CAを用いてプラスミドDNAを単離した。プラスミドDNA30μgをSfiIおよびNheIで消化して、VL領域、CL領域、およびVH領域を含む単一インサートを切り取った。アクセプターベクターであるpXIBM36も同じ制限酵素で消化した。QIAquick登録商標ゲル抽出キットQiagen,Valencia,CAを用いて、インサートおよび切断したベクターの両者をゲル精製した。ベクター対インサートの比率2:1からなる合計1マイクログラムのDNAをT4DNAリガーゼとともに、16°Cで一晩インキュベートした。1マイクロリットルのライゲーション反応物を使用して、TOP10大腸菌LifeTechnologies,Carlsbad,CAに電気穿孔した。プレーティングおよび一晩の成長後、第3ラウンドのファージ収量の10倍に相当するコロニーを掻き取り、プラスミドDNAを前述の通り単離した。次に、DNAをAvrIIおよいbNcoIで消化して、大腸菌に最適化されたCL、およびVH領域に先行するpelBシグナル配列含む断片を除去した。これをライゲーションによりヒトCL、IRES2、およびIgGリーダー配列を含む断片で置換し、前述の通りTOP10細胞に電気穿孔した。再び、プレーティングおよび一晩の成長後、第3ラウンドのファージ収量の10倍に相当するコロニーを掻き取り、DNAを得るために処理した。精製したプラスミドDNAはこのとき、IgG1バックボーンに移入されたファージ由来VL領域およびVH領域を含んだ。哺乳動物提示を用いた抗Tie2IgGの特定1:1の比率のIgGおよびpTam29をコードするプラスミドDNA合計20μgを用いて、HEK293E細胞を実施例1に記載のようにトランスフェクトした。24時間のトランスフェクション後、細胞を最終濃度5μg/mLのビオチン-Tie2およびニワトリ抗c-Myc4μg/mLLifeTechnologies,Carlsbad,CAとともに、4°Cで1時間インキュベートした。その後の標識フローサイトメトリー分析は、実施例1に記載のように実施した。図26Aに示すように、分析した細胞の大部分は、Tie2結合およびPDZ提示の双方について陽性であり、ファージベクター由来のVLおよびVHの哺乳動物提示ベクターへのトランスフェクションおよび2ステップクローニングの双方が成功したことを裏付けた。次に、トランスフェクト細胞に、もう1ラウンドの磁気細胞分離MACSを用いた濃縮を実施した。端的に述べると、細胞2×107を0.5FBSおよび2mMEDTAを含むPBSで洗浄し、10ピコモルのビオチン標識Tie2とともに、4°Cで30分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、40μLの抗ビオチンマイクロビーズMiltenyiBiotec,Auburn,CAとともに、4°Cで15分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、最終容積500μLになるように、0.5FBSおよび2mMEDTAを含むPBSに再懸濁させた。次に、70μmナイロンメッシュを用いて細胞懸濁液を濾過してから、LSカラムMiltenyiBiotech,Auburn,CAに装填した。MidiMacs商標分離装置MiltenyiBiotech,Auburn,CAを用いて、製造業者の使用説明に従ってTie2結合細胞を単離した。フローサイトメトリーによる溶出した細胞の分析は、MACSによる追加ラウンドのパニングが、集団中のTie2結合細胞の割合を前のパニングラウンド図26Aと比較して20さらに高めた図26Bことを明らかにした。Mini-prepキットQiagen,Valencia,CAを用いて溶出した細胞からプラスミドDNAを単離し、TOP10大腸菌細胞に電気穿孔で導入し、100μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地で、37°Cで一晩成長させた。翌日、配列分析のためにコロニーを収集し、そのうち34個が固有コロニーであった。さらなる特徴付けのための可溶性IgGを精製するために、実施例1に記載のトランスフェクション手順に以下の変更を加えた。10マイクロリットルのIgGミニプレップDNAを1μgのLipofectamine商標とともに、室温で20分間インキュベートした。次に、この混合物を96ウェル培養プレートに播種した100μLのHEK293E細胞に添加した。37°C、5CO2で48時間成長させた後、細胞培地を採取した。次に、CHOK1細胞上に発現したTie2に対する結合についてIgGクローンをスクリーニングした。これを達成するために、分泌されたIgGの上澄みを含む25μLの細胞培地を25μLのCHOK1-Tie2細胞2×106細胞/mLとともに、4°Cで30分間インキュベートした。この前に、CHOK1-Tie2細胞をCSFE色素LifeTechnologies,Carlsbad,CAで事前標識して、フローサイトメトリーによって識別できるようにしておいた。次に、細胞をFACS緩衝液0.5BSAおよび0.01アジ化ナトリウムを含むPBSで洗浄し、FACS緩衝液中の25μLのマウス抗c-Myc400ng/mLRocheAppliedScience,Indianapolis,INとともに30分間インキュベートした。細胞ペレットを再び洗浄し、FACS緩衝液中のアロフィコシアニンAPCコンジュゲート化ヤギ抗マウスIgGJacksonImmunoLabs,WestGrove,PAの1:200希釈物25μLとともに、4°Cで15分間インキュベートした。標識後、細胞をFACS緩衝液と4パラホルムアルデヒドSigmaAldrich,St.Louis,MOの1:1混合物50μLに再懸濁させてから、フローサイトメトリー分析を行った。抗Tie2IgGの親和性測定および機能的特徴付けCHO-Tie2結合スクリーニングに基づき、上位10個のIgGクローンを24ウェル培養プレート内に増殖させ、親和性測定用のIgGを生成するためにさらに3日間成長させた。分泌したIgGを含む培地をまずアッセイ緩衝液10mMHEPES、150mMNaCl、3mMEDTA、0.05SurfactantP20、1mg/mLBSA、pH7.4で約2μg/mL総タンパク質まで希釈し、BiacoreA100GEHealthcare,Waukesha,WIを用いた抗ヒトIgGJacksonImmunoResearch,WestGrove,PA結合バイオセンサーに注入した。次に、連続3倍希釈物10nM~0.04nM中の6つの濃度のTie2を捕捉したIgG上に注入し、これを2回繰り返した。Tie2の注入は30μL/分で4分であり、解離時間は10分であった。BiacoreA100評価ソフトウェアGEHealthcare,Waukesha,WIを用いて、収集したデータを1:1ラングミュア相互作用モデルに当てはめた。10個のIgGクローンのうち6個について解離定数を算出した図27。素晴らしいことに、6個のIgGが、可溶性Tie2に対して1桁または2桁のナノモル親和性を示した。Biacoreに加え、結合スクリーニングからの上位10個のクローンにも機能アッセイを実施した。血清飢餓CHOK1-Tie2細胞をTie2リガンド、Ang110μg/mL、または抗Tie2IgG10および50μg/mLとともに、37°Cで10分間インキュベートした。次に、Phospho-AktキットMesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MDを用いて、セリン473における細胞Aktリン酸化を特定した。図27に示すように、Tie2に結合するクローン10個のうち9個が、Tie2シグナル伝達を活性化することが認められた。Phospho-Aktレベルは、Ang1で見られるレベルの40~60であることが観察された。ごくわずかなリン酸化は、陰性対照である抗KLH処理細胞および未処理細胞で観察された。濃縮ファージクローンの酵母提示ベクターへの移入105~106cfuからなる、ラムダFabファージ提示ライブラリーXFab1からのTie2第3ラウンド産出物を酵母提示ベクターpVV42図23にクローニングした。第1のステップにおいて、ライゲーションによりベクター:インサートのモル比1:2、この回収物由来のSfiI/NheI断片を同様に消化したpVV42にバルク移入した。3uLのライゲーション165ngのベクターを40uLのXL1-Blue大腸菌細胞Agilent,SantaClara,CAに電気穿孔で導入することにより、約4×109形質転換体を生じた。クローニングの第2ステップにおいて、可変ドメイン間で細菌配列を酵母配列で置き換えた。具体的には、pVV42CL-MATalphaターミネーター-Gal1プロモーター-US2シグナル配列からなる由来のAvrII/NcoI断片を第1ステップで構築し、同様に消化したライブラリー中に、1:6のベクター:インサート比で連結した。22の形質転換それぞれにおいて2.5uLのライゲーション91ngのベクターを50uLのTOP10大腸菌細胞Invitrogen,Carlsbad,CAに電気穿孔で導入することにより、約4000コロニーを生じた。酵母にこれらの細菌コロニーから単離したDNAを電気穿孔した。酵母株BJ5465をエレクトロコンピテントにし、Benatuiletal,ProteinEngineering,DesignSelection23,155-92010に記載されているように形質転換した。DNAをPelletPaint登録商標共沈物EMDChemicals,Darmstadt,Germanyで濃縮し、2.5μgを約3.2×109の酵母細胞に電気穿孔して、約2×105酵母コロニー形成単位を生じた。酵母FACS、スクリーニング、および配列決定:ライブラリーで形質転換した酵母からの発現をSDCAA40μg/mLのトリプトファン中で48時間後SGCAA40μg/mLのトリプトファンガラクトース中で26時間インキュベートすることにより誘導した。酵母を約400ng/mLのビオチン化Tie2-Fcとともに1時間、次いで蛍光PEタグ化ストレプトアビジン、ならびに検出抗体である10μg/mLの蛍光APCタグ化抗ラムダIgGBrookwoodBiomedical,Birmingham,ALとともにインキュベートすることにより、抗原との結合を検出した。標識した細胞をFACSAria商標機器BD,FranklinLakes,NJを用いて選別した。図28に示すように、Tie2結合および抗体提示の二重陽性細胞の3つの集団が回収された。次いで誘導された94コロニーの全てが、フローサイトメトリーにより、Tie2と結合していることが検証された。配列決定された58個のクローン中、20個が固有であり、重鎖および軽鎖相補性決定領域のファミリーの多様性を示している。組み込み提示プラットフォームを用いて発見された固有クローンの分析酵母提示のみを用いて発見された固有Fabクローンの配列を酵母または哺乳動物提示を用いて回収された固有Fabクローンと比較した。各提示プラットフォームについて、クローンの大部分は、それ以外の提示技術を用いて回収されなかった表3他の選択方法を用いても認められた各選択からのクローンの割合は、網掛けなしの欄に示し、1つの選択方法に固有のクローンの割合は網掛け欄に示す。したがって、組み込み提示方法の使用は、1つのプラットフォームを用いては到達できなかったさらなる多様なクローンの発見を可能にした。表3"