"候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方法は、以下:i第1の候補遺伝子を選択する工程;ii該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合する第1のジンクフィンガータンパク質、および第2の遺伝子の標的部位に結合する第2のジンクフィンガータンパク質を提供する工程;iii該第1のジンクフィンガータンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第1の細胞を培養し、そして該第2のジンクフィンガータンパク質が該第2の候補遺伝子と接触する条件下で第2の細胞を培養する工程であって、ここで、該第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、該第1および該第2の候補遺伝子の発現を調節する、工程;ならびにvi選択された表現型についてアッセイする工程であって、これにより該第1の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する、工程、を包含する、方法。前記第1の候補遺伝子の第2の標的部位に結合する第3のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。複数の候補遺伝子を選択する工程、および各候補遺伝子の標的部位に結合する複数のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。前記第2の遺伝子が、制御遺伝子である、請求項1に記載の方法。前記第1の候補遺伝子が、少なくとも約200ヌクレオチド長のESTによって部分的にコードされる、請求項1に記載の方法。前記第1の候補遺伝子および前記第2の遺伝子の両方が、前記選択された表現型と関連する、請求項1に記載の方法。前記第1および第2の細胞が同一の細胞であり、ここで該細胞が、前記第1および第2の候補遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。前記第1および第2の候補遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項1に記載の方法。前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約50だけ抑制される、請求項1に記載の方法。前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約150だけ活性化される、請求項1に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質の発現が、外因性薬剤の投与によって誘導される、請求項1に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項11に記載の方法。前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項14に記載の方法。前記細胞が、ヒト細胞である、請求項15に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現の活性化である、請求項1に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑制である、請求項1に記載の方法。前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトランスフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。請求項1に記載の方法であって、前記第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発現ベクターを前記細胞に投与する第1の工程をさらに包含する、方法。前記ジンクフィンタータンパク質の発現が、低分子の制御下にある、請求項20に記載の方法。請求項21に記載の方法であって、前記第1のジンクフィンガータンパク質の発現、および前記第2のジンクフィンガータンパク質の発現が、異なる低分子の制御下にあり、該第1および第2のジンクフィンガータンパク質の両方は、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、そして該第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、同じ細胞において発現される、方法。前記第1および第2のジンクフィンガータンパク質の両方が、遺伝子発現を抑制する調節ドメインを含む、請求項22に記載の方法。前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項20に記載の方法。前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、請求項24に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項20に記載の方法。前記細胞が、約1.5×106個未満の各ジンクフィンガータンパク質のコピーを含む、請求項1に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の上流にある、請求項1に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位に隣接している、請求項1に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項1に記載の方法。候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方法は、以下:i複数の候補遺伝子を同定する工程;ii第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合する第1のジンクフィンガータンパク質を提供する工程;iii該第1のジンクフィンガータンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第1の細胞を培養する工程であって、ここで、該第1のジンクフィンガータンパク質が、該第1の候補遺伝子の発現を調節する、工程;iv該候補遺伝子の発現パターンを決定し、そして該第1の候補遺伝子が選択された表現型と関連するか否かを決定する、工程;ならびにv各候補遺伝子について、工程ii~ivを繰り返す工程、を包含する、方法。前記第1の候補遺伝子の第2の標的部位に結合する第2のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項31に記載の方法。前記候補遺伝子の少なくとも1つが、少なくとも約200ヌクレオチド長のESTである、請求項31に記載の方法。少なくとも2つの候補遺伝子が、選択された表現型を引き起こすために必要とされる、請求項31に記載の方法。前記候補遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項31に記載の方法。前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約50だけ抑制される、請求項31に記載の方法。前記候補遺伝子の発現が、少なくとも約150まで活性化される、請求項31に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項31に記載の方法。前記調節ドメインが、低分子の制御下にある、請求項38に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項38に記載の方法。前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項41に記載の方法。前記細胞が、ヒト細胞である、請求項42に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現の活性化である、請求項31に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑制である、請求項31に記載の方法。前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトランスフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。請求項31に記載の方法であって、前記ジンクフィンガータンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発現ベクターを前記細胞に投与する第1の工程をさらに包含する、方法。前記ジンクフィンタータンパク質の発現が、低分子の制御下にある、請求項47に記載の方法。前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項47に記載の方法。前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、請求項49に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項47に記載の方法。前記細胞が、約1.5×106個未満の前記ジンクフィンガータンパク質を含む、請求項31に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の上流にある、請求項31に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位に隣接している、請求項31に記載の方法。前記標的部位が、前記候補遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項31に記載の方法。候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方法は、以下:i第1の候補遺伝子を選択する工程;ii該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合する第1のジンクフィンガー、および該第1の候補遺伝子の第2の標的部位に結合する第2のジンクフィンガーを提供する工程;iii該第1のジンクフィンガータンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第1の細胞を培養し、該第2のジンクフィンガータンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第2の細胞を培養する工程であって、ここで、該第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、該第1の候補遺伝子の発現を調節する、工程;ならびにiv選択された表現型についてアッセイする工程であって、これにより該第1の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する工程、を包含する、方法。前記第2の候補遺伝子の標的部位に結合する第3のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項56に記載の方法。複数の候補遺伝子を選択する工程、および各候補遺伝子の標的部位に結合する複数のジンクフィンガータンパク質を提供する工程をさらに包含する、請求項56に記載の方法。前記第2の候補遺伝子が、制御遺伝子である、請求項57に記載の方法。前記第1の候補遺伝子が、少なくとも200ヌクレオチド長のESTである、請求項56に記載の方法。前記第1の候補遺伝子および前記第2の候補遺伝子の両方が、前記選択された表現型を引き起こすために必要とされる、請求項57に記載の方法。前記第1および第2の細胞が同一の細胞である、請求項56に記載の方法。前記第1の候補遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項56に記載の方法。前記第1の候補遺伝子の発現が、少なくとも約50だけ抑制される、請求項56に記載の方法。前記第1の候補遺伝子の発現が、少なくとも約150まで活性化される、請求項56に記載の方法。前記第1のジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項56に記載の方法。前記調節ドメインが、低分子の制御下にある、請求項66に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも2つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項66に記載の方法。前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞、または真菌細胞からなる群から選択される、請求項56に記載の方法。前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項69に記載の方法。前記細胞が、ヒト細胞である、請求項71に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子発現の抑制を妨げる遺伝子発現の活性化である、請求項56に記載の方法。前記発現の調節が、遺伝子活性化を妨げる遺伝子発現の抑制である、請求項56に記載の方法。前記調節ドメインが、転写調節レプレッサ、メチルトランスフェラーゼ、転写調節活性化剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、請求項66に記載の方法。請求項56に記載の方法であって、前記第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによってコードされ、該方法が、該発現ベクターを前記細胞に投与する第1の工程をさらに包含する、方法。前記ジンクフィンガータンパク質の発現が、低分子の制御下にある、請求項75に記載の方法。請求項76に記載の方法であって、前記第1のジンクフィンガータンパク質の発現、および前記第2のジンクフィンガータンパク質の発現が、異なる低分子の制御下にあり、ここで、該第1および第2のジンクフィンガータンパク質の両方が、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、そしてここで、該第1および第2のジンクフィンガータンパク質が、同一の細胞において発現される、方法。請求項77に記載の方法であって、前記第1のジンクフィンガータンパク質が、遺伝子発現を抑制する調節ドメインを含み、そして前記第2のジンクフィンガータンパク質が、遺伝子発現を活性化する調節ドメインを含む、方法。前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項75に記載の方法。前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはAAV発現ベクターである、請求項79に記載の方法。前記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされる、請求項75に記載の方法。前記細胞が、約1.5×106個未満の各ジンクフィンガータンパク質のコピーを含む、請求項56に記載の方法。前記第1または第2の標的部位が、前記第1の候補遺伝子の転写開始部位の上流にある、請求項56に記載の方法。前記第1または第2の標的部位が、前記第1の候補遺伝子の転写開始部位に隣接している、請求項56に記載の方法。前記第1または第2の標的部位が、前記第1の候補遺伝子の転写開始部位の下流のRNAポリメラーゼ停止部位に隣接している、請求項56に記載の方法。候補遺伝子の生物学的機能を同定する方法であって、該方法は、以下:i第1の候補遺伝子を選択する工程;ii該第1の候補遺伝子の第1の標的部位に結合する第1のジンクフィンガータンパク質を提供する工程;iii該第1の候補ジンクフィンガータンパク質が該第1の候補遺伝子と接触する条件下で第1の細胞を培養する工程であって、ここで、該第1のジンクフィンガータンパク質は、該第1の候補遺伝子の発現を調節する、工程;ならびにiv選択された表現型についてアッセイする工程であって、それにより該第1の候補遺伝子が該選択された表現型と関連するか否かを同定する、工程、を包含する、方法。実施例以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、限定する目的ではない。当業者は、変更または改変されて基本的に類似した結果を生じ得る種々の決定的ではないパラメーターを容易に認識する。実施例I:標的確認のための、ジンクフィンガータンパク質を用いるヒトVEGF遺伝子の標的化標的確認における重要な考慮は、標的遺伝子と得られる表現型との間の相関関係を十分に決定しかつ実際に評価することである。本実施例は、ジンクフィンガータンパク質技術の使用を実証して、例えば、遺伝子の発現または遺伝子産物の機能を調節し得る、治療用化合物の開発のための標的として遺伝子を確認することを実証する。このプロセスは、以下の単純な仮説に基づく図1。遺伝子XがZFP-A1これはX1部位を特異的に標的にするにより上方制御される場合、表現型Qが観察される。遺伝子XがZFP-A2これは異なるX2部位を特異的に標的にするにより上方制御される場合、同じ表現型Qが観察される。遺伝子XがZFP-B1これはX3部位X3はX1またはX2であり得るを標的にするにより下方制御される場合、異なる表現型Zが観察される。ZFP-A1、ZFP-A2、またはZFP-B1を用いて、表現型Qに関与しない遺伝子を標的にする場合、この遺伝子に関する表現型の変化は観察されない。ヒトおよびマウスの血管内皮増殖因子VEGF遺伝子を、本実施例における標的確認のために選択した。VEGFは、低酸素により誘導される内皮細胞特異的分裂促進因子である、約46kDaの糖タンパク質である。VEGFは、チロシンキナーゼレセプターFlt-1VEGFR-1およびFlk-1/KDRVEGFR-2との相互作用を介して内皮細胞に結合する。VEGFは、新脈管形成において非常に重要な役割を果たすので、治療薬の開発のためのこの遺伝子の標的化は、多大な興味を引いている。VEGF遺伝子の阻害下方制御は、癌および糖尿病性網膜炎の処置に用いられ得るが、遺伝子の活性化上方制御は、虚血心臓および組織疾患のために用いられ得る。これらの2つの所望の表現型変化は、VEGF遺伝子をジンクフィンガータンパク質技術を用いる標的確認に理想的にする。インビトロでの生化学的アフィニティーおよび特異性についてのジンクフィンガータンパク質の試験ジンクフィンガータンパク質についてのDNA標的部位を、標的遺伝子の転写部位の周囲の領域において選択した。主な標的を、転写開始部位の約1kb上流の領域内で選択した。ここで、エンハンサーエレメントの大部分が配置される。各3-フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、9bpのDNA配列を認識する。DNA結合特異性を増加させるために、近接する2つの3-フィンガーのジンクフィンガータンパク質を9bp配列Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:5525~55301997を標的にするように共に融合した。ヒトSP-1またはマウスZif268転写因子を設計したジンクフィンガータンパク質の構築のための前駆体分子として用いた。アミノ酸配列フィンガーこれは標的DNA配列を認識するを、本明細書中に記載される認識規則に基づいて設計した。設計したジンクフィンガータンパク質遺伝子を6つの重複するオリゴヌクレオチドを利用するPCRベースの手順を用いて構築した。VEGFを標的にするジンクフィンガータンパク質遺伝子を設計およびアセンブルする方法は、USSN09/229037に詳述される。設計したジンクフィンガータンパク質遺伝子を、始めに、KpnIおよびBamHIを用いて消化した後、pMAL-KNBベクターにクローン化した図2。このpMAL-KNBベクターを、pMAL-c2ベクターNEWEnglandBiolabs,MAから改変する。ジンクフィンガータンパク質を細菌から精製し、そして生化学的アフィニティーアッセイおよび特異性アッセイに供した。これらのインビトロアッセイについての方法を、本明細書中および同時係属出願であるUSSN09/229037に記載する。一過性トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼプロモーターの活性化または抑制高い生化学的アフィニティーおよび特異性を有するジンクフィンガータンパク質を、pcDNA-NVFまたはpcDNA-NKF中のKpnI部位およびBamHI部位にサブクローニングした図2。pcDNA-NVF構築物は、核局在シグナル、単純ヘルペスウイルスVP16活性化ドメイン、およびFlagペプチドをコードするCMVプロモーター制御配列を含む。この構築物を、哺乳動物細胞に導入した場合に、標的化遺伝子を上方制御するように設計した。pcDNA-NKF構築物は、VP16ドメインに代わってKruppel関連ボックスKRAB抑制ドメインを含み、そしてこれを標的化遺伝子の下方制御に用いた。これらの構築物を、同時係属出願であるUSSN09/229037に詳細に記載する。レポータープラスミド系は、pGL3-プロモーターおよびpGL3-コントロールベクターPromega,WIに基づく。ジンクフィンガータンパク質標的部位の3つの直列型反復配列を、SV40プロモーターの上流に挿入した図3。pGLPレポーターを用いて、遺伝子発現の上方制御について、操作したジンクフィンガータンパク質の活性を評価した。pGLCレポーターを用いて、ZFP-KRAB活性遺伝子発現の阻害の効果を測定した。これらの構築物を、同時係属出願であるUSSN09/229037に詳細に記載する。本実施例に用いられるコントロールプラスミドを、図2に示す。pcDNA-NVFまたはpcDNA-NKFは、ZFPを欠くエフェクターである。pcV-RANまたはpcK-RANは、操作したジンクフィンガータンパク質が公知でないDNA結合能力を有すること以外、全ての成分を発現する図2。pcV-RANまたはpcK-RAN構築物におけるジンクフィンガータンパク質配列は、以下:であり、ここで、フィンガーに下線を付す。これらのコントロール構築物を用いて、DNA結合ドメインの非存在下での調節ドメインVP16またはKRABの効果を確認した。pc-ZFP-catプラスミドは、特定の設計したジンクフィンガータンパク質を発現するが、機能的ドメインVP16またはKRABを、pcDNA3.1/CATベクターnt1442~1677Invitrogen,CA中のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT遺伝子から単離される234bpフラグメントと交換した図2。このコントロールプラスミドを用いて、DNA結合ドメインが単独で遺伝子発現に対する任意の効果を有するか否かを試験する。他のコントロールは、異なるDNA配列および非特異的ジンクフィンガータンパク質標的配列を含むレポーターを認識するジンクフィンガータンパク質を発現するエフェクターを含む。以下の実施例は、設計したジンクフィンガータンパク質の効果を実証する。これは293細胞中のルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化する。標的化配列GGGGTTGAGをM6-1892Sと名付け、そしてこれはヒトVEGF遺伝子のプロモーター領域中に存在する。この9-bpDNA配列を認識するジンクフィンガータンパク質を、本明細書中およびUSSN09/229037に記載されるように設計およびアセンブルした。ジンクフィンガータンパク質のDNA配列およびアミノ酸配列を以下に示す:アセンブルされたジンクフィンガータンパク質のKpnI-BamHIDNAフラグメントを、pMAL-KNBベクターのKpnI-BamHI部位にクローン化した。設計されたジンクフィンガータンパク質が、その標的部位に結合する能力を、E.coliから組換えタンパク質を発現および精製すること、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイEMSAを実施することによって、確認した。上記に示したタンパク質の結合親和性Kdは、EMSAによって決定された場合、20nMであった。次いで、このKpnI-BamHIZFPフラグメントを、pcDNA-NVFベクターのKpnI-BamHI部位にサブクローン化し、そしてpcV-VF471Aと命名した。M6-1892S部位の3つの縦列反復配列を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを作製し、そしてpGLP-VF471x3と命名した。すべてのプラスミドDNAを、Qiagenプラスミド精製キットを使用して調製した。ヒト胚性腎293細胞を、翌日に約70コンフルエンスに到達する密度で、6ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を、LipofectamineGIBCO-BRL、MDまたはGenePORTERGeneTherapySystemsInc,CAトランスフェクション試薬を用いて、50ngエフェクターDNAZFP発現プラスミド、900ngレポーターDNA、および100ngpCMV-LacZDNAと共に、同時トランスフェクトした。同時発現されたβ-ガラクトシダーゼ活性をコントロールに使用して、ルシフェラーゼ活性を正規化した。細胞溶解産物を、トランスフェクションの40~48時間後に収集した。ルシフェラーゼアッセイを、Dual-LightLuciferaseandβ-galactosidaseReporterAssaySystemTropix、MAを使用して実施した。代表的なルシフェラーゼアッセイの結果を、図4に示す。この実施例は、この設計されたZFP発現プラスミドpcV-VF471Aが、コントロールプラスミドpcV-RANこれは、既知のDNA結合能力を有さないと比較した場合に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を8倍刺激し得ることを示した。VP16ドメインをペプチドこれは、転写調節活性を有さないと置換した場合に、このジンクフィンガータンパク質pcV-VF471A-catは、ルシフェラーゼ遺伝子をトランス活性化するその能力を欠損した。設計されたジンクフィンガータンパク質pcV-VF471Aは、異なるジンクフィンガータンパク質結合部位を含むレポーターからのルシフェラーゼ発現を活性化できず、このことは、このトランス活性化効果が配列特異的であることを示す。従って、この実施例において調節ドメインVP16と組み合わせられたDNA結合ドメインVF471AZFPは、適切な標的部位で遺伝子をオンにし得た。一過的にトランスフェクトされた細胞における標的遺伝子のネイティブなプロモーターを含むリポーターの試験単純レポーター系とネイティブなレポーター系との間の差異は、ネイティブなレポータープラスミド構築物が、標的遺伝子のプロモーターを含むということである。ネイティブなレポーター系に固有の利点は、単一のネイティブなレポータープラスミド構築物を使用して、そのプロモーターの状況下で、複数のジンクフィンガータンパク質の効果を分析し得るということである。pGLP-ネイティブレポーターを、プロモーターを含むDNAフラグメントとpGL3-プロモーター中のSV40プロモーターとを置換すること、そして標的遺伝子の配列を隣接させることによって構築した図3。この実施例では、ヒトVEGF遺伝子のネイティブなレポーター構築物は、ヒトゲノムDNAから3319bpのフラグメントをPCR増幅することによって生成された。このフラグメントは、VEGFプロモーターおよびその隣接領域を含む。VEGFATGコドンを、ルシフェラーゼコード領域に融合した。ネストNest-PCRを、増幅のために実施した。外部プライマーは、hVEGFU15’-GAATTCTGTGCCCTCACTCCCCTGG;nt1~25は、GenBank配列M63971に基づいたおよびVEGFD25’-ACCGCTTACCTTGGCATGGTGGAGG;nt3475~3451であった。内部プライマー対は、hVEHFU25’-ACACACCTTGCTGGGTACCACCATG;nt71~95、KpnI部位に下線を付したおよびVEGFD15’-GCAGAAAGTcCATGGTTTCGGAGGCC;nt3413~3388、下線を付したNcoI部位を生成するために、TからCへの置換を作製するである。ネスティッドnestedPCR産物を、KpnIおよびNcoIで消化し、そしてpGL3プロモータープラスミドのKpnI-NcoIベクターフラグメントと連結した図3。ヒトVEGFネイティブレポータープラスミドを、pGLPVFHと命名した。類似のストラテジーを使用して、マウスゲノムDNAから2070bpフラグメントを増幅した。外部プライマーは、mVEGFU25’-TGTTTTAGAAGATGAACCGTAAGCCT;nt1~25は、GenBank配列U41383に基づいたおよびVEGFD25’-ACCGCTTACCTTGGCATGGTGGAGG;nt3475~3451は、M63971に基づいたであった。内部プライマーは、mVEGF5’-GCCCCCATTGGtACCCTGGCTTCAGTTCCCTGGCAACA;nt155~192;下線を付したKpnI部位を生成するために、CからTへの置換を作製するおよびVEGFD5’-GCAGAAAGTcCATGGTTTCGGAGGCC;nt3413~3388はM63971に基づいた、下線を付したNcoI部位を生成するために、TからCへの置換を作製するであった。VEGFD2およびVEGFD1プライマーを使用して、ヒトおよびマウスのゲノムDNAの両方を増幅した。なぜなら、これらの配列は、この領域で非常に相同であるからであるShimaら、J.Biol.Chem.271:38771996。マウスVEGFのネイティブなレポータープラスミドを、pGLPmVFと命名した。以下の実施例は、2つの設計されたジンクフィンガータンパク質が、293細胞中でヒトVEGFネイティブプロモーター遺伝子を上方制御し得たことを示す。1つのジンクフィンガータンパク質pcV-M6-2009Aを、転写開始部位の362bp上流に位置付けられた近位部位GAAGGGGGCを標的化するように設計し、そして他の1つpcV-M6-111Sを、転写開始部位の2240nt上流に位置付けられた遠位部位ATGGGGGTGを標的化するように設計した。上記のルシフェラーゼレポーターアッセイと同様に、50~100ngのエフェクターDNAを、900ngのネイティブなレポーターDNAおよび100ngのpCMVlacZDNAと共に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの約40時間後に測定し、そして図5に活性化倍数として示した。細胞培養物において内因性のヒトおよびマウスのVEGF遺伝子を活性化または抑制するための第1ジンクフィンガータンパク質これらの操作されたジンクフィンガータンパク質が、細胞培養物において内因性のヒトおよびマウスのVEGF遺伝子を活性化または抑制し得るか否かを試験するために、一過的なトランスフェクション実験を実施した。ヒト293細胞およびマウス乳房上皮細胞C127IShimaら、JBC271:38771996は、低レベルの内因性VEGFタンパク質を発現し、これを使用して、VEGF活性化に対するジンクフィンガータンパク質の効果を評価した。ヒト膠芽腫U87MG細胞、マウス神経芽腫NB41細胞Levyら、GrowthFactors2:91989およびラット神経膠腫GS-9L細胞Connら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:13231990は、高レベルの内因性VEGFタンパク質を発現し、これを、ジンクフィンガータンパク質の抑制効果を試験するために使用する。これらの細胞を、翌日に約70コンフルエンスに到達する密度で、6ウェルプレートの各ウェルに播種する。0.1~1gのエフェクターDNAを、通常、細胞型に依存してLipofectamineまたはGenePORTERトランスフェクション試薬のいずれかを用いて、細胞をトランスフェクトするために使用する。トランスフェクションの約14時間後、細胞に、新鮮培地を給餌し、そしてさらに24時間培養する。次いで、この培地を収集し、そして内因性VEGFレベルを、VEGFELISAアッセイキットRDSystems、MNを使用して測定する。VEGFM6-111SおよびM6-2009SZFPを、第1ジンクフィンガータンパク質として設計して、ヒトVEGF遺伝子調節におけるそれらの活性を試験した。表1における結果は、両方の第1ジンクフィンガータンパク質が、293細胞中において内因性VEGF遺伝子発現を有意に活性化することを示した。標的遺伝子を発現させるために、設計されたジンクフィンガータンパク質ドメインを、pcDNA-NKFベクター中にクローン化した。適切な細胞中へのDNAのトランスフェクション後、ZFP-KRAB融合タンパク質は、同時トランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター遺伝子と同様に、内因性遺伝子を阻害し得る。本明細書中で使用された実施例は、pcK-M6-11Sである。表1に示されるように、M6-111SZFPは、標的配列ATGGGGGTGを認識する。M6-111SZFPが、KRAB抑制ドメインに融合される場合、同時トランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター遺伝子発現における約80の抑制および内因性VEGF遺伝子発現における約40の抑制が達成された。細胞培養物における内因性のヒトおよびマウスのVEGF遺伝子を活性化または抑制するための第2ジンクフィンガータンパク質第1ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が、VEGF遺伝子に対する効果に起因し、そして他の副作用例えば、代替的な遺伝子標的の調節に起因しないことを確認するために、第1ジンクフィンガータンパク質の部位とは異なる部位でVEGF遺伝子を標的化する第2ジンクフィンガータンパク質を操作した。表1に示されるように、2つの第2ジンクフィンガータンパク質はまた、培養細胞中で内因性VEGF遺伝子発現を活性化する。これらの結果は、ジンクフィンガータンパク質技術を使用して、遺伝子発現を調節し得、そして治療のための標的として遺伝子を確認し得ることを示す。VEGF生理に関与しない遺伝子を標的化するための第3ジンクフィンガータンパク質第1および第2ジンクフィンガータンパク質を用いて観察された生理的効果が、VEGF遺伝子に対する特異的効果に起因し、そしていかなる非特異的DNA結合または鎮圧squelching効果にも起因しないことを確認するために、VEGF生理に関与しない遺伝子を標的化する第3ジンクフィンガータンパク質を、ネガティブコントロールとして使用する。例えば、ヒトEPO遺伝子発現を調節するために設計されたジンクフィンガータンパク質を、特異性コントロール実施例IIを参照のこととして使用する。EPOはまた、低酸素によって影響を及ぼされ、従って、低酸素アッセイを使用するVEGF標的確証のためのコントロールとして有用である。VEGF阻害は、特異的に、糖尿病性網膜症を覆す。この結果は、薬物の発見および開発のための分子標的としてのVEGFを確証する。げっ歯類における糖尿病性網膜症モデルに対するVEGF阻害効果の試験糖尿病性網膜症は、労働者年齢の個体間における失明の最も一般的な原因である。VEGF発現の増加は、糖尿病性網膜症の病理の主要な誘因である。この疾患を処置するためのストラテジーの1つは、治療的化合物を使用して、内因性VEGF遺伝子発現を阻害することである。上記のように、ジンクフィンガータンパク質は、治療剤としてVEGFを確証するための手段を提供する。アデノ随伴ウイルスAAVおよび/またはレトロウイルスに基づいたウイルスベクターを、上記のように構築する。これらのウイルスベクターは、上記のようなKRAB抑制ドメインと融合されたジンクフィンガータンパク質を発現する。これらのウイルスを産生し、精製し、そして動物中に注射する。操作されたジンクフィンガータンパク質の効力を、以前に記載されたAdmaisら、Arch.Ophthalmol.114:661996;Pierceら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9051995;Aielloら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:104571995;Smithら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.35:101、1994ような網膜新生血管形成の抑制によって、評価する。すべての必要なコントロール第2および第3のジンクフィンガータンパク質を発現するウイルスベクターを含むもまた、使用される。げっ歯類における末梢動脈疾患モデルに対するVEGF活性化効果の試験側副動脈の発達を増強するための、VEGFによる末梢新脈管形成の刺激は、虚血性脈管疾患を有する患者のための潜在的に新規な治療形態である。上記と同じストラテジーを使用し、マウス末梢動脈疾患モデルを用いて、標的としてのVEGFを確証する。VP16活性化ドメインに融合されたジンクフィンガータンパク質を発現するAAVまたはレトロウイルスベクターを、上記のように構築する。ジンクフィンガータンパク質の効力を、以前に記載された手順Couffinhalら、Am.J.Pathol.152:16671998;Takashitaら、Lab.Invst.75:4871996;Isnerら、HumanGeneTherapy7:9591996と同様に評価する。すべての必要なコントロール第2および第3のジンクフィンガータンパク質を発現するウイルスベクターを含むもまた、使用される。VEGFの過剰発現は、側副動脈成長を誘発する。この結果は、薬物の発見および開発のための標的としてのVEGFを確証する。実施例II:赤血球生成の標的の発見哺乳動物の赤血球生成を、増殖および分化シグナルを与える特定の因子による赤血球前駆体の刺激を介して調節する。低酸素は、多くの生理学的に関連したプロセスを制御する遺伝子の発現を誘導する強力なシグナルであるRatcliffeら、J.Exp.Biol.201:11531998。このプロセスの1つは、特定の組織が、さらなる赤血球の生成のための因子を放出することを要求することである。この現象は、低酸素条件を用いて異なる細胞株および/または組織を刺激すること、培養物上清をサンプリングすること、そしてマウス骨髄培養物由来の赤血球コロニー形成単位の刺激について試験することによって検出され得る。この様式において、低酸素に応答することが見出された細胞株または組織は、低酸素誘導可能様式で、赤血球生成増殖因子を発現する可能性がある。低酸素処理に際してこのような細胞または組織において示差的に発現される遺伝子の分析は、赤血球生成増殖因子発現遺伝子の同定へと導く。ジンクフィンガータンパク質技術は、このような示差的な遺伝子発現実験のための分析ツールとして、そして仮定上の赤血球生成増殖因子遺伝子を確証するために使用され得る。細胞型ヒトヘパトーム細胞株Hep3Bを含むの収集物を、適切な培地において培養し、そして加湿5CO2-95空気のインキュベーター内で37°Cにて維持する。低酸素条件を、18時間にわたって1O2-5CO2-94N2を流すことによって達成するGoldbergら、Blood77:2711991。培養物上清を収集し、そしてコロニー形成アッセイにおいて試験するMullerら、Exp.Hematol.21:13531993;EavesEaves、Blood52:11961978。ヒトヘパトームHep3B細胞株は、低酸素誘導に際して赤血球生成増殖因子を生成することが見出されGoldbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:79721987、そしてこの細胞株を、さらなる特徴付けのために用いる。1つの作業仮説は、赤血球生成の刺激を担う1つのまたは、それより多い細胞性遺伝子が、低酸素に際して活性化されるということである。この遺伝子は、示差的遺伝子発現実験例えば、ディファレンシャルディスプレイGeneHunter、TN、PCR選択cDNAサブトラクションPCR-SelectcDNASubtractionClontech,CA、またはマイクロアレイAffymetrix、CAを実施することによって同定され得る。正常な条件および低酸素条件の下で、Hep3B細胞増殖物から抽出されたRNAの遺伝子発現パターンを比較する。複数の遺伝子が、低酸素症を呈した細胞において上方制御される可能性が非常に高い。約18個の遺伝子が、低酸素によって上方制御されるとして同定されたRatcliffeら、J.Exp.Biol.201:11531998。広範に研究されている、エリスロポエチンEPO遺伝子および血管内皮増殖因子VEGF遺伝子を、この実施例において使用して、赤血球生成増殖因子をコードする遺伝子の機能的ゲノム学genomicsおよび同定へのジンクフィンガータンパク質技術の適用を実証する。上記の実験から同定された候補遺伝子のDNA配列に基づいて、第1ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに近接して位置付けられたDNA配列を標的化するように設計される。ジンクフィンガータンパク質の構築および特徴付けのプロセスは、実施例Iに記載されたプロセスと同一である。高いDNA結合親和性および特異性を有するジンクフィンガータンパク質3フィンガーのもの、または6フィンガーのタンパク質を、HSVVP-16活性化ドメインまたはKRAB抑制ドメインのいずれかと融合して、リスト上の個々の遺伝子の発現を活性化またはブロックする。これらの設計されたZFP-VP16構築物は、非低酸素条件下でGenePORTERトランスフェクション試薬GeneTherapySystemsInc,CAを使用して、個々に一過的にHep3B細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの48時間後、上清を収集し、そしてコロニー形成アッセイを実施する。ジンクフィンガータンパク質のアップレギュレーションに際して赤血球生成を誘導する遺伝子は、赤血球生成増殖因子をコードする遺伝子であるとみなされる。この結果は、エリスロポエチンEPO遺伝子が、赤血球生成の調節を担うが、他のすべての試験された遺伝子VEGFを含むは、赤血球生成の調節を担わないことを示す。実施例Iに記載された、すべての必要なジンクフィンガータンパク質コントロール構築物をまた、この実施例において使用する。遺伝子を同定および確証する別の方法は、これらのジンクフィンガータンパク質をKRABドメインと融合すること、そしてHep3B細胞を、トランスフェクションの14時間後に低酸素によって刺激することを除いて、上記と同様の実験を実施することである。EPO遺伝子発現を抑制するように設計されたジンクフィンガータンパク質を、Hep3B細胞中にトランスフェクトする場合、コロニー形成アッセイに基づいて、全く活性は観察されないか、または活性の減少が観察される。EPO遺伝子以外の遺伝子を標的化するすべてのジンクフィンガータンパク質は、低酸素誘導下で、赤血球生成に影響を及ぼさない。遺伝子の機能をさらに確証するために、EPO遺伝子の異なる部位で標的化する第2ジンクフィンガータンパク質を構築する。これらの第2ジンクフィンガータンパク質は、VP16活性化ドメインと融合された場合に、EPO遺伝子発現を活性化し、そして赤血球生成を刺激する。逆に、KRAB抑制ドメインと融合された場合、これらのジンクフィンガータンパク質は、低酸素条件下でEPO遺伝子発現を阻害し、そして赤血球生成を刺激できない。実施例III:乳癌標的遺伝子の発見いくつかの乳房腫瘍の増殖は、ホルモンエストロゲンの持続的存在に依存する。エストロゲンは、トランスフォームされた表現型の維持に必要とされる遺伝子のアップレギュレーションに関与する可能性がある。これらの組織由来の細胞株例えば、MCF-7、BT20、およびT47Dは、培養における増殖についての、このエストロゲン依存性を保持する。従って、エストロゲンは、依存的細胞株において必須の遺伝子の発現を刺激するようである。これらのエストロゲン誘導性遺伝子の発見は、乳癌を処置するための新たな薬物の開発のために有用な分子標的である。エストロゲン依存性細胞増殖に必要とされるエストロゲン誘導性遺伝子を同定するためのジンクフィンガータンパク質の使用が、本明細書中に記載される。さらに、新たに発見された標的を、ジンクフィンガータンパク質および適切なコントロールを使用して確証する。ER応答性遺伝子の同定MCF-7細胞を、エストロゲンエストラジオールの非存在下で、短期間1週間および長期間28週間増殖させ、基底レベルに達するまでエストラジオール誘導性遺伝子の転写を可能にする。フェノールレッドを欠きかつ10チャコール除去strippedウシ胎仔血清FCSHyclone、10μg/mlのインスリンおよび0.5nMのエストラジオールを補充したダルベッコ改変イーグル培地DMEMを含む162mlフラスコ中で、細胞を増殖させる。80コンフルエンシーを達成したらすぐ、細胞をトリプシン処理し、そしてエストラジオールを欠く新鮮培地に移す。このフラスコを5のCO2の加湿雰囲気下で37°Cにてインキュベートする。エストロゲン応答性遺伝子発現を、この細胞にエストラジオールを添加することにより刺激する。エストラジオールの非存在下で増殖した細胞を、エストラジオールを欠く新鮮培地へ分配する。1つのフラスコに10nMのエストラジオールエタノールに溶解させたを添加し、一方、他方のフラスコにエストラジオールを含まない等量のエタノールを添加する。刺激した細胞および刺激してない細胞の両方を、6時間後に収集する。RNAを、標準的なRNA単離キットを使用して、示差的に発現された遺伝子を同定するために細胞から単離する。エストロゲン応答性遺伝子を以下の方法の1つまたはそれらの組み合わせを使用して同定する:差引きハイブリダイゼーション例えば、Clontech製のPCR-Select、ディファレンシャルディスプレイ法例えば、Genelogicにより提供されるREADS技術もしくPerkin-ElmerのGenScope、cDNAアレイ例えば、Incyte製のGEM技術またはAffymetrixから提供される高密度オリゴヌクレオチドマトリックス技術。多くの示差的に発現されたエストラジオール活性化遺伝子が同定される。これらの遺伝子に関するcDNAが配列決定され、そして候補遺伝子のリストにまとめられる。多くの遺伝子が同定され、これらが、エストロゲンレセプターを含むことが予想される。エストロゲン応答性遺伝子の最初の確認上記のように、そして同時係属中の出願USSN09/229037に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリストの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に標的化可能な9bpの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配列を得るためおよび上記で生成されたcDNA配列の精度を確実にするために、以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索することを含む。これらの設計されたジンクフィンガータンパク質は、上記のように機能ドメインに融合され、候補遺伝子の発現の上方制御およびノックダウンの両方を可能にする。使用される機能的ドメインは、Kruppel関連ボックスKRAB抑制ドメインおよび単純ヘルペスウイルスHSV-1VP16活性化ドメインである。候補遺伝子の抑制リプレッサー研究のために、個々のジンクフィンガータンパク質を保有する細胞を、エストロゲン依存性機能をブロックすることに起因する増殖の欠損についてアッセイする。エストロゲンレセプターが、MCF-7における増殖に必須であることが証明され、従って、これらの細胞は、ER遺伝子または他のエストロゲン依存性機能が下方制御について標的化される場合、増殖に失敗する。細胞を、エストラジオールを有するかまたは有さない、上記の培地中で培養する。ジンクフィンガータンパク質をSV40NLSおよびKRABに融合して構築された真核生物発現ベクターは、上に記載される。トランスフェクションは、LipofectamineGIBCO-BRL製の市販されるリポソーム調製物を使用して行われる。全てのプラスミドDNAは、QiagenMidiDNA精製システムを使用して調製される。10gのエフェクタープラスミドを全量1600μlのOpti-MEM中の100ngのLipofectamine50μlと混合する。pCMVβ-galプラスミドPromegaをまた、トランスフェクション効率のための内部コントロールとしてDNA混合物中に含ませた。30分間のインキュベーション後、6.4mlのDMEMを添加し、そしてこの混合物を細胞上で層状に重ねた。5時間後、DNA-Lipofectamine混合物を除去し、そして10のチャコール除去FCS、10μg/mlのインスリンおよび10nMのエストラジオールを含む新鮮培養培地をその細胞上で層状に重ねた。生存能力を、トリパンブルー排除および増殖のモニタリングによりアッセイする。細胞を、トリプシン処理し、遠心分離により濃縮し、そして約106細胞/mlで再懸濁する。トリパンブルーの0.4溶液を、血球計スライド上の等量の細胞に添加する。全細胞および染色した細胞を顕微鏡下で計数する。増殖を、DNA合成を測定することによりモニターする。放射活性[3H]チミジン30Ci/mmolで0.5μCi;Ammershamを添加し、そして細胞をさらに17時間増殖させる。培地を除去し、そして細胞を1SDSを用いてインサイチュで溶解する。細胞溶解産物を、15トリクロロ酢酸TCAで沈殿させ、そしてWhatman3Mフィルターディスクを用いて濾過することにより収集し、そして5TCA、次いでエタノールで洗浄する。濾紙を乾燥させ、そしてチミジンの取り込みを液体シンチレーション計数により定量する。候補遺伝子の活性化リストの各メンバーの活性化をまた行い、MCF-7細胞のエストロゲン依存性増殖についてアッセイする。真核生物発現ベクターを上記のように構築する。LipofectamineGIBCO-BRL製の市販されるリポソーム調製物を用いてトランスフェクションを行う。全てのプラスミドDNAを、QiagenMidiDNA精製システムを使用して調製する。上記のようにトランスフェクションを行う。生存能力を、トリパンブルー排除および増殖のモニタリングによりアッセイする。細胞を、トリプシン処理し、遠心分離により濃縮し、そして約106細胞/mlで再懸濁する。トリパンブルーの0.4溶液を、血球計スライド上の等量の細胞に添加する。全細胞および染色した細胞を顕微鏡下で計数する。増殖を、DNA合成を測定することによりモニターする。放射活性[3H]チミジン30Ci/mmolで0.5μCi;Ammershamを添加し、そして細胞をさらに17時間増殖させる。培地を除去し、そして細胞を1SDSを用いてインサイチュで溶解する。細胞溶解産物を、15トリクロロ酢酸TCAで沈殿させ、そしてWhatman3Mフィルターディスクを用いて濾過することにより収集し、そして5TCA、次いでエタノールで洗浄する。濾紙を乾燥させ、そしてチミジンの取り込みを液体シンチレーション計数により定量する。二次的な確認さらなる試験によって、この1回目のリプレッサーおよびアクチベーター研究の間に同定された候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク質を、候補遺伝子における異なりかつ別々の2つの標的部位を標的化するように設計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、18bpを認識する6フィンガー分子を形成するために、2つの3フィンガージンクフィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。3フィンガージンクフィンガータンパク質を上記のように設計し、生成しそしてEMSAによりアッセイする。適切な配列これらについて、ジンクフィンガータンパク質が容易にかつ信頼して設計され得るを位置付けるために、候補遺伝子のさらなる配列決定が必要とされ得る。さらに、さらなる配列を、ヌクレオチド配列データベースに見出し得る。2つの9bpの配列が互いの5bp以内に存在し;従ってジンクフィンガータンパク質対の連結を可能にするように、標的配列を選択する。受容可能な親和性および特異性で結合する3フィンガージンクフィンガータンパク質の対を同定した後、このドメインをPCRによって連結し、6フィンガー分子のフィンガー4~6を構成するドメインを増幅する。非組織的かつ可撓性であると推定されるペプチド配列をコードする短いDNA配列を、増幅の間に、このドメインのN末端に付加する。各構築物を、培養物中の増殖しているMCF-7細胞へ一過的にトランスフェクトし、そして各構築物を、上記のように、増殖の失敗抑制またはエストロゲン非依存性増殖活性化についてスコア付けする。異種移植片を使用する標的確認腫瘍増殖に対する変更された標的遺伝子発現の効果を、ヌードマウスにおける異種移植片により評価する。ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子を、上記のようにアデノ随伴ウイルスAAVまたはレトロウイルスベースのウイルスベクターにクローン化する。このジンクフィンガータンパク質をKRABまたはVP16ドメインのいずれかに融合する。得られた組換えウイスルを生成し、精製しそしてMCF-7細胞を感染するために使用する。これらのトランスジェニック細胞を、皮下的にヌードマウスへ導入するBisseryら、Semin.Oncol.22:3~161995。腫瘍を、腫瘍重量を見積もるために1週間に2度測定するBisseryら、Semin.Oncol.22:3~161995;Kubotaら,J.Surg.Oncol.64:155~1211997。この実験を、腫瘍が100~300mgの重量を得るかまたは動物が死亡するまで進められる。終点アッセイは、あり得る死亡原因を決定するための胸腔および腹腔の肉眼的実験を含む。さらなるアッセイは、組織サンプルの組織学的分析および秤量のための腫瘍の切り出しを含む。実施例IV:植物における脂肪酸飽和標的の発見植物油の質を、成分の脂肪酸側鎖の飽和程度により部分的に決定する。過剰な不飽和1または2個の二重結合より多いは、酸化および酸敗する傾向がより高い粗悪な油を生じる。油生産種子における生合成機構の構成要素は、不飽和の程度を決定する。産物が脂肪酸不飽和に関与する遺伝子の発現を阻害することによって、高品質の油を生じ得る。ジンクフィンガータンパク質を、脂肪酸飽和のレベルを設定する際に役割を果たす遺伝子を同定するための、示差的遺伝子発現実験のためのプローブとして使用する。第1、第2および第3のジンクフィンガータンパク質を使用して、新たに発見された遺伝子機能を確認する。最終的に、高品質の油を生成するトランスジェニック植物を作製する。ランダム変異誘発を介する候補遺伝子の作製出発材料は、ダイズGlycinemax種子または植物のいずれかである。変異誘発を、化学的処理またはランダムDNA挿入のいずれかにより行うKatavicら,Plant.Physiol.108:399~4091995;Martienssen,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:2021~20261998;HohnPuchta,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:8321~83231999;Facciottiら,NatureBiotech.17:593~5971999。種子の化学的変異誘発を、0.3v/vのエチルメタンスルホネートEMS中に16時間浸漬することにより行うHaughnSomerville,Mol.Gen.Genet.204:430~4341986。M1種子を繁殖し、そして自家受粉させ、次いでM2種子を無作為に収集し、そして繁殖させて、引き続きもう1回の自家受粉してM3種子を形成する。これらの種子の脂肪酸組成および得られた植物を以下に記載のように分析する。あるいは、ランダムDNA挿入を、植物において開発された多くの系を使用する転位により行い得るMartienssen,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:2021~20261998。脂肪酸および脂質分析による潜在的な候補遺伝子の同定脂肪酸および脂質組成物を、KatavicPlantPhysiol.108:399~4091995の方法に従って、約20~30個のM3種子について決定する。成熟植物組織もまた、同様に分析する。種子を、脂肪酸飽和の程度に従ってカテゴリーに分類する。発現プロフィールを、実施例IIIに記載される方法の1つを使用することにより、不飽和の上昇した程度または減少した程度のいずれかを発現する種子について作成する注記:ω-6-デサチュラーゼをコードするFAD2-1は、種子における低レベルのポリ不飽和長鎖脂肪酸である、過少発現遺伝子であることが予想される。一旦、特定の遺伝子を、変更された表現型に関与すると同定すると、このcDNAを配列決定のために選択する。第1ジンクフィンガータンパク質を用いる最初の標的確認上記のように、そして同時係属中の出願USSN09/229037に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質を操作して、候補遺伝子のリストの個々のメンバーの各々を標的化する。候補遺伝子の配列を、独特かつ容易に標的化可能な9bpの配列についてスキャンする。このプロセスは、さらなる配列を得るためおよび上記で生成されたcDNA配列の精度を確実にするために、以前に配列決定された遺伝子に対する一致についてデータベースを検索することを含む。これらの設計されたジンクフィンガータンパク質は、上記のように機能的ドメインに融合され、候補遺伝子の発現の上方制御およびノックダウンの両方を可能にする。使用される機能的ドメインは、Kruppel関連ボックスKRAB抑制ドメインおよび単純ヘルペスウイルスHSV-1VP16活性化ドメインである。ZFP-機能ドメイン融合物をコードする遺伝子を植物発現ベクター例えば、pCAMBIA1301へクローン化する。このベクターは、以下の特性を有する:1選択可能マーカー例えば、ハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子;2Agrobacterium媒介形質転換のための左側または右側のT-DNA境界border;3所望のプロモーター例えば、CaMV35S、ナピンnapinプロモーターまたはファゼオリンプロモーターの下流のジンクフィンガータンパク質遺伝子の挿入を可能にする都合のよい制限部位;4Nosのような植物ポリアデニル化シグナル;5GUSレポーター遺伝子。設計されたジンクフィンガータンパク質を、レポーター遺伝子の活性化または抑制をアッセイすることにより、所望の標的に対する活性について試験する。ジンクフィンガータンパク質およびレポーターを独立して発現する単一のプラスミドを使用する。標的配列を、GUS遺伝子の転写の開始部位付近のDNA中に挿入する。タバコカルスへのレポーター構築物の形質転換を、標準の同時培養手順により行うGrayburnら,Biotechnol.10:675~6781992。GUSアッセイを、蛍光アッセイを使用して行うJefferson,PlantMol.Biol.Rep.5:387~4051987。EMSAにより評価する場合には受容可能な親和性を示し、そしてレポーターアッセイにより評価する場合にはインビボ機能を示すジンクフィンガータンパク質を、未成熟種子の子葉に由来する増殖性の胚形成培養物の粒子ボンバードメントを用いてダイズ体細胞胚へ形質転換するLiuら,PlantCellTiss.Org.Cult.46:33~421996。各ZFP保有プラスミドについての10~20の別々の形質転換事象由来の組織および種子を単離し、脂肪酸および脂質プロフィールを評価する。上記のジンクフィンガータンパク質で形質転換した場合に変更された脂肪酸または脂質プロフィールを生じる候補遺伝子を、より特異的なジンクフィンガータンパク質を生成する第2の設計または第3の設計のために選択する。不飽和経路における標的をさらに確認するための第2または第3のジンクフィンガータンパク質さらなる試験を使用して、1回目のこのリプレッサーおよびアクチベーター研究の間に同定される候補遺伝子を確認する。これらのジンクフィンガータンパク質を、候補遺伝子における異なりかつ別々の2つの標的部位を標的化するように設計する。さらに、ジンクフィンガータンパク質の特異性および親和性を、18bpを認識する6フィンガー分子を形成するために、2つの3フィンガージンクフィンガータンパク質ドメインを融合することにより改良する。3フィンガージンクフィンガータンパク質を本明細書中に記載のように、設計し、生成しそしてEMSAによりアッセイする。適切な配列これらについて、ジンクフィンガータンパク質が容易にかつ信頼して設計され得るを位置付けるために、候補遺伝子のさらなる配列決定が必要とされ得る。さらに、さらなる配列を、ヌクレオチド配列データベースに見出し得る。2つの9bpの配列が互いの5bp以内に存在し;従ってジンクフィンガータンパク質対の連結を可能にするように、標的配列を選択する。受容可能な親和性および特異性で結合する3ジンクフィンガータンパク質の対を同定した後、ドメインをPCRによって連結し、6フィンガー分子のフィンガー4~6を構成するドメインを増幅する。非組織的かつ可撓性であると推定されるペプチド配列をコードする短いDNA配列を、増幅の間に、このドメインのN末端に付加する。6フィンガージンクフィンガータンパク質を本明細書中に記載のように抑制ドメインまたは活性化ドメインのいずれかに融合し、そして初めにタバコカルスレポーター研究において、次いでダイズ植物においてアッセイする。上記の第2のジンクフィンガータンパク質により標的化する場合、変更された脂肪酸または脂質プロフィールを生じる候補遺伝子を、第3のジンクフィンガータンパク質の設計のために選択する。第2のジンクフィンガータンパク質で標的化される遺伝子とは異なる遺伝子の第2の領域を選択する。再度、本明細書中に記載のように、18bpを結合するように設計されたジンクフィンガータンパクを設計し、そして試験する。これらのジンクフィンガータンパク質をダイズに導入し、そして生じた脂肪酸および脂質プロフィールにおける変更を、再度試験する。図1は、遺伝子発現を調節するジンクフィンガータンパク質を使用する標的確認の略図を示す。図2は、ジンクフィンガータンパク質発現構築物を示す。図3は、遺伝子発現のジンクフィンガータンパク質の調節のためのルシフェラーゼレポーター構築物を示す。図4は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性化に対する、ジンクフィンガータンパク質の効果を示す。図5は、ジンクフィンガータンパク質による、ヒトVEGFネイティブレポーターの活性化を示す。"