"共有結合された第1および第2のドメインを含む分離した組み換え型MHCポリペプチド、およびジスルフィド結合によって組み換え型MHCポリペプチドの第1ドメインに共有結合された抗原決定基、を含む組成物であって、ここで、第1ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIβ1ドメインであり、第2ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIα1ドメインであり、第2ドメインのアミノ末端は、第1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、MHCクラスII分子は、α2またはβ2のドメインを含まず、あるいは、第1ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、第2ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα2ドメインであり、第2ドメインのアミノ末端は、第1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、MHCクラスI分子は、α3ドメインを含まないことを特徴とする組成物。前記ジスルフィド結合は、前記抗原決定基におけるシステイン残基と、前記組み換え型MHCポリペプチドの前記第1ドメインにおけるシステイン残基との間のジスルフィド結合を含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。前記組み換え型MHCポリペプチドの前記第1ドメインは、β1ドメインを含み、前記システイン残基は、システイン17、システイン79、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。前記組み換え型MHCポリペプチドの前記第1ドメインと前記第2ドメインとの間の前記共有結合は、ペプチドリンカーを含むことを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の組成物。前記ペプチドリンカーは、長さが少なくとも6のアミノ酸であることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。前記抗原決定基は、ペプチド抗原を含むことを特徴とする、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の組成物。前記抗原決定基は、8乃至35のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項6に記載の組成物。前記抗原決定基は、MOG35-55、インスリンB:9-23、またはPLP139-151を含むことを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の組成物。前記抗原決定基におけるシステイン残基は、非自然発生のシステインを含み、前記組み換え型MHCポリペプチドの前記第1ドメインにおける前記システイン残基は、非自然発生のシステイン、またはその組み合わせを含むことを特徴とする、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の組成物。前記組み換え型MHCポリペプチドは、溶液中の凝集を減少させる可能性を有することを特徴とする、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の組成物。前記組み換え型MHCポリペプチドは、1つ以上の疎水性の残基の、極性または荷電の残基との置換を含む、DR2MHCβ1α1ポリペプチドを含み、ここで、1つ以上の残基は、配列番号11の、V102、I104、A106、F108、およびL110から選択され、それによって、修飾されていない組み換え型MHCポリペプチドと比較して、溶液中の凝集が減少することを特徴とする、請求項10に記載の組成物。薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の組成物。被験体の、自己免疫性疾患、網膜疾患、ブドウ膜炎、卒中、および認知障害から成る群から選択される障害、または物質依存によって誘発された神経精神障害を処置または阻害する方法であって、該方法は、請求項1乃至12のいずれかに記載の有効な量の組成物を被験体に投与し、それによって疾患を処置または阻害する工程を含むことを特徴とする方法。前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、悪性貧血、重症筋無力症、視神経炎、およびアジソン病から成る群から選択されることを特徴とする、請求項13に記載の方法。被験体のI型糖尿病を処置または阻害する方法であって、該方法は、共有結合された第1および第2のドメインを含む分離した組み換え型MHCポリペプチド、およびジスルフィド結合によって組み換え型MHCポリペプチドの第1ドメインに共有結合された抗原決定基、を含む有効な量の組成物を、被験体に投与する工程、それにより、被験体のI型糖尿病を処置または阻害する工程を含み、ここで、前記第1ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIβ1ドメインであり、前記第2ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、前記第2ドメインのアミノ末端は、前記第1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、前記MHCクラスII分子は、α2またはβ2のドメインを含まないことを特徴とする方法。前記抗原決定基は、インスリンを含むことを特徴とする、請求項15に記載の方法。前記抗原決定基は、インスリンB:9-23またはインスリンB:16-23を含むことを特徴とする、請求項15または請求項16に記載の方法。前記インスリンB:9-23は、配列番号1、3、および7乃至9のいずれか1つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項17に記載の方法。組成物を生成する方法であって、該方法は、ジスルフィド結合が抗原決定基と組み換え型MHCポリペプチドとの間で形成されるのに十分な条件下で、抗原決定基と、共有結合された第1および第2のドメイン含む分離した組み換え型MHCポリペプチドとを接触させる工程、それにより、組成物をもたらす工程を含み、ここで、前記第1ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIβ1ドメインであり、前記第2ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、前記第2ドメインのアミノ末端は、前記第1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、前記MHCクラスII分子は、α2またはβ2のドメインを含まず、あるいは、前記第1ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、前記第2ドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIα2ドメインであり、前記第2ドメインのアミノ末端は、前記第1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、前記MHCクラスI分子は、α3ドメインを含まないことを特徴とする方法。ジスルフィド結合が形成されるのに十分な条件は、100mMのNaPO4、pH6.5、150mMのNaCl、0.05のSDS、および0.01のNaN3において37°Cで60時間、抗原決定基と組み換え型MHCポリペプチドとを接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項19に記載の方法。請求項1に記載の組成物を生成するためのキットであって、該キットは、組み換え型MHCポリペプチドまたは組み換え型MHCポリペプチドをコード化する核酸、および組み換え型MHCポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合の形成に十分な条件を提供するための1つ以上の成分を含む溶液、を含むことを特徴とするキット。前記溶液は、100mMのNaPO4、pH6.5、150mMのNaCl、0.05のSDS、および0.01のNaN3を含むことを特徴とする、請求項21に記載のキット。抗原決定基をさらに含むことを特徴とする、請求項21または請求項22に記載のキット。請求項19に記載の方法によって生成された組成物。治療上および診断上の適用において分離したMHC/抗原複合体を使用する概念がかなり有望ではあるが、現在まで報告された様々な方法の主な欠点は、複合体が大きく、結果的に生成し作用させるのが難しいということである。組み換え型の2つのドメインMHCクラスIまたはMHCクラスIIのポリペプチドなどの組み換え型MHCポリペプチドが、安定した複合体を生成するために、ペプチド抗原に共有結合され得ることが、本明細書に示される。本明細書には、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合された、MHCクラスIまたはMHCクラスIIの組み換え型T細胞受容体リガンドRTLポリペプチドを含む安定した複合体が開示される。本明細書にはまた、例えば、自己免疫疾患を処置または阻害するための、そのような組成物を作る方法および使用の方法が開示される。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、共有結合した第1および第2のドメインを含む、組み換え型MHCポリペプチドを含み、ここで、第1ドメインは哺乳動物のMHCクラスIIβ1ドメインであり、第2ドメインは哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、α1ドメインのアミノ末端は、β1ドメインのカルボキシ末端に共有結合され、およびMHCクラスIIポリペプチドは、α2またはβ2のドメインを含まず、開示される組成物はさらに、ジスルフィド結合によって組み換え型MHCポリペプチドに共有結合された抗原決定基ペプチド抗原などを含む。他の実施形態において、開示される組成物は、共有結合した第1および第2のドメインを含む組み換え型MHCポリペプチドを含み、ここで、第1ドメインは哺乳動物のMHCクラスIα1ドメインであり、第2ドメインは哺乳動物のMHCクラスIα2ドメインであり、α2ドメインのアミノ末端は、α1ドメインのカルボキシ末端に共有結合され、およびMHCクラスIポリペプチドはα3ドメインを含まず、開示される組成物はさらに、ジスルフィド結合によって組み換え型MHCポリペプチドに共有結合された抗原決定基ペプチド抗原などを含む。いくつかの例において、組み換え型MHCポリペプチドは、溶液中の凝集の可能性を減少し、例えば、組み換え型MHCポリペプチドは、MHCポリペプチドのβシートプラットフォームにおける1つ以上の疎水性アミノ酸の、極性または荷電のアミノ酸との置換を含む。いくつかの例において、ジスルフィド結合は、MHCクラスIIβ1ドメイン中のシステイン残基またはMHCクラスIαドメイン中のシステイン残基などのMHCポリペプチド中の自然発生のシステイン残基を活用して形成される。他の例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってMHCポリペプチドにおいて導入されたシステイン残基などの、MHCポリペプチドにおける非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。さらなる例において、ジスルフィド結合は、抗原決定基中の自然発生のシステイン残基を活用して形成される。またさらなる例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によって抗原決定基において導入されたシステイン残基などの、ペプチド抗原における非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。本明細書にはまた、開示される組成物を作る方法および開示される組成物を生成するためのキットが開示される。いくつかの例において、方法は、組み換え型MHCポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合の形成を促進するための例えば、そのための十分な条件を提供するための、1つ以上の成分を含む、緩衝液または溶液の使用を含む。開示される組成物を使用する方法はまた、本明細書で提供される。幾つかの実施形態において、方法は、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合された、本明細書に開示される組み換え型MHCポリペプチドを含む、有効な量の組成物を投与する工程を含む、被験体の自己免疫疾患を処置または阻害する工程を含む。特定の例において、自己免疫疾患は、限定されないが、多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、または乾癬を含む。本開示の前述および他の特徴は、付随の図に関連して進められる、以下の詳細な記載からより明らかになるであろう。治療上および診断上の適用において分離されたMHC/抗原複合体を使用する概念がかなり有望ではあるが、現在まで報告された様々な方法の主な欠点は、複合体が大きく、結果的に生成し作用させるのが難しいということである。この点に関する主な突破口は、組み換え型T細胞リガンド、またはRTLの開発であった。RTLは、クラスIまたはクラスIIのMHC分子のペプチド結合ドメインに相同性のある可溶性の1本鎖ポリペプチドを含む。ペプチドは、免疫反応を調節する多くの方法のいずれかに使用される、抗原結合の間隙およびRTLペプチド複合体に充填され得る。RTLの欠点は、ペプチドが、単に非共有結合の相互作用によって抗原の間隙に結合され、それ故複合体が比較的不安定であるということである。RTLも、組み換え型MHCポリペプチドの遺伝的にコード化されたアミノ末端の伸張extensionとして含まれる抗原決定基によって構成された。これらの複合体は、安定しているが、個々に設計されなければならず、生成するのに時間がかかる。本明細書には、抗原決定基が、ジスルフィド結合によってRTLポリペプチド例えば、β1α1MHCクラスIIRTLポリペプチドまたはα1α2MHCクラスIRTLポリペプチドに共有結合される組成物が開示される。β1α1ポリペプチドの場合には、RTLポリペプチドと抗原決定基との間のジスルフィド結合は、β1サブユニットにおける内部のジスルフィド結合を妨害する。驚いたことに、RTLは、この内部のジスルフィド結合が分裂するときでさえ、その構造および機能を維持する。さらに、ジスルフィド結合は、抗原決定基とMHCポリペプチドとの間の安定した結合を提供する。この安定した相互作用は、被験体への投与を意図した医薬組成物において、効能と有効性の両方を維持する点に加え、このような組成物に関する十分な規制基準を満たす点でも特に重要である。さらに、開示される組成物は、単純にRTLに選択された抗原決定基を充填し、このような組成物の生成および試験を促進することによって、急速に且つ好都合に生成され得る。これらの組成物はまた、自己免疫障害などの、被験体における疾患または障害を処置または阻害するための増加した有効性を示す。いくつかのペプチド抗原は、翻訳後修飾グリコシル化またはシトルリン化などを含む。ヒト関節リウマチにおいて、異常な免疫反応の重要な標的は、シトルリン化を受けたタンパク質である。同様に、MBPのシトルリン化は、多発性硬化症の病理に重要な役割を果たすと示され、ヒトMBP上の6つの部位が病理学的な設定においてシトルリン化される。これらの修飾されたペプチド抗原は、以前に記載されたRTLのアミノ末端で遺伝的にコード化され得ないが例えば、米国特許第6,270,772号;米国特許公開番号2005/0142142、本明細書に記載される化学作用は、この問題に対する現実的解決案を提供する。抗原決定基とMHCポリペプチドとの間のジスルフィド結合のさらなる利点は、複合体が深部のエンドソームに達するまで、この結合が内在化に続いて維持されることであり、ここで、抗原決定基は、ガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素GILTによって開裂される。その後、抗原決定基は、細胞表面での提示のために全長の天然のMHCクラスII分子上に再び充填されることが可能であり、免疫寛容反応をもたらし得る。<I.略語および用語>APC抗原提示細胞EAE実験的自己免疫性脳脊髄炎FACS蛍光活性化細胞分類GADグルタミン酸脱炭酸酵素GILTガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素HELニワトリ卵白リゾチームHLAヒト白血球抗原IAAヨードアセトアミドIRBP光受容体間レチノイド結合タンパク質MBPミエリン塩基性タンパク質MHC組織適合性主複合体MOGミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質NOD非肥満糖尿病マウスPLPプロテオリピッドタンパク質RTL組み換え型T細胞受容体リガンドSDS硫酸ドデシルナトリウム特に明記のない限り、技術用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、OxfordUniversityPress,1994ISBN0-19-854287-9によって公開された、BenjaminLewin,GenesV;BlackwellScienceLtd.,1994ISBN0-632-02182-9によって公開された、Kendrewetal.eds.,TheEncyclopediaofMolecularBiology;およびVCHPublishers,Inc.,1995ISBN1-56081-569-8によって公開された、RobertA.Meyersed.,MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReferenceに見出され得る。様々な実施形態の検討を促進するために、以下の特定の用語の説明が提供される:β1α1ポリペプチド:共有結合においてMHCクラスII分子のα1およびβ1のドメインを含む組み換え型ポリペプチド。適切な配座を保証するために、このようなポリペプチドの配向は、β1ドメインのカルボキシル末端が、α1ドメインのアミノ末端に共有結合されるような配向である。1つの限定しない実施形態において、ポリペプチドは、ヒトβ1α1ポリペプチドであり、ヒトMHCクラスII分子に関してはα1およびβ1のドメインを含む。ヒトβ1α1ポリペプチドの、1つの具体的な、限定しない例は、β1ドメインのカルボキシル末端が、HLA-DR分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合される分子である。ヒトβ1α1ポリペプチドのさらなる具体的な限定しない例は、β1ドメインのカルボキシル末端が、HLA-DRAまたはBのいずれか、HLA-DPAおよびB、またはHLA-DQAおよびBの分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合される分子である。1つの実施形態において、β1α1ポリペプチドは、β2ドメインを含まない。別の実施形態において、β1α1ポリペプチドは、α2ドメインを含まない。また別の実施形態において、β1α1ポリペプチドは、α2またはβ2のドメインをどちらも含まない。典型的なβ1α1ポリペプチドは、米国特許第6,270,772号;米国特許公開番号2005/0142142に記載され、本明細書で提供される例えば、配列番号4、11、14、19、20および55-58。β1α1遺伝子:β1α1ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組み換え型核酸分子。幾つかの実施形態において、β1α1遺伝子は、β1α1ポリペプチドをコード化する核酸に操作可能に結合されたプロモーター領域を含む。1つの実施形態において、コード化されたβ1α1ポリペプチドは、ヒトβ1α1ポリペプチドである。α1α2ポリペプチド:共有結合においてMHCクラスI分子のα1およびα2のドメインを含むポリペプチド。このようなポリペプチドの配向は、α1ドメインのカルボキシル末端が、α2ドメインのアミノ末端に共有結合されるような配向である。α1α2ポリペプチドは、クラスIα鎖を全体よりも少なく含み、α鎖のα3ドメインのほとんど又はすべてを省く。α1α2ポリペプチドの具体的な限定しない例は、α1ドメインのカルボキシル末端が、HLA-A、HLA-BまたはHLA-Cの分子のα2ドメインのアミノ末端に共有結合されるポリペプチドである。1つの実施形態において、α3ドメインは、α1α2ポリペプチドから省かれ、したがって、α1α2ポリペプチドはα3ドメインを含まない。α1α2遺伝子:α1α2ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む組み換え型核酸分子。幾つかの実施形態において、α1α2遺伝子は、α1α2ポリペプチドをコード化する核酸に操作可能に結合されたプロモーター領域を含む。1つの実施形態において、コード化されたα1α2ポリペプチドは、ヒトα1α2ポリペプチドである。抗原:動物へと注入または吸収される組成物を含む、動物において抗体の生成またはT細胞反応を刺激し得る化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘発されたものを含む、特異的な体液免疫または細胞免疫の生成物と反応する。用語抗原は、本明細書に開示される組み換え型MHC分子に関連して提示される抗原ペプチドなどの、すべての関連する抗原エピトープおよび抗原決定基を含む。自己免疫障害:免疫系が、内因性の抗原に対抗して免疫反応例えば、B細胞またはT細胞の反応をもたらし、結果として組織に対する傷害につながる障害。典型的な自己免疫障害は、限定されないが、多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、悪性貧血、重症筋無力症、およびアディソン病を含む。同類置換または変異体:アミノ酸残基の、類似した生化学的特性を有する別のアミノ酸残基との置換。ペプチドは、1つ以上のアミノ酸置換、例えば、1、2、5または10の同類置換などの、1-10の同類置換、2-5の同類置換、4-9の同類置換を含むことができる。同類置換の具体的な、限定しない例は、以下の例を含む:ドメイン:ポリペプチドまたはタンパク質のドメインは、特定の機能と同一視することができるアミノ酸配列の別々の部分である。例えば、MHCクラスII分子を構成するαおよびβのポリペプチドは、それぞれ、2つのドメイン、α1、α2、およびβ1、β2を有していると認識されている。同様に、MHCクラスI分子のα鎖は、3つのドメイン、α1、α2、およびα3を有していると認識されている。これらの分子の各々における様々なドメインは、典型的に、アミノ酸配列を結合することによって連結される。1つの実施形態において、組み換え型分子に包含するための特定のドメインの配列を選択するときに、全体のドメインが含まれ、これを確実に行うために、ドメイン配列は、リンカーの一部分、または隣接ドメインの一部分さえ含むために伸張され得る。様々なMHC分子ドメインのアミノ酸の正確な数は、哺乳動物の種に依存して、また種内の遺伝子のクラス間で変化する。アミノ酸の数に基づいた正確な構造の定義よりもむしろ、重要なのは、特定のドメインのアミノ酸配列を選択するときのドメイン機能の維持である。その上、選択されるドメインの全体より幾分少ないアミノ酸配列が活用されると、ドメイン機能も維持され得ることを当業者は認識するであろう。例えば、α1ドメインのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかでの多くのアミノ酸が、ドメイン機能に影響を与えることなく省かれ得る。しかしながら、典型的には、ドメイン配列のどちらかの末端から省かれたアミノ酸の数は、10未満であり、より典型的には、5未満である。特定の選択されたドメインの機能活性は、抗原特異性のT細胞増殖アッセイを使用する本開示によって提供される2つのドメインMHCポリペプチド例えば、組み換え型クラスIIβ1α1またはクラスIα1α2のポリペプチドに関連して評価され得る。例えば、特定のβ1ドメインを試験するために、それは、β1α1分子を生成するように、機能的なα1ドメインに結合され、その後、T細胞増殖アッセイで試験される。生物学的に活性なβ1α1またはα1α2のポリペプチドは、抗原特異性のT細胞増殖を、少なくとも約50阻害し、故に、成分ドメインcomponentdomainsが機能的であることを示す。典型的に、このようなポリペプチドは、このアッセイ系におけるT細胞増殖を、少なくとも75および時には約90より多く阻害する。有効な量:単独でまたは薬学的に許容可能な担体または1以上の追加の薬剤と一緒に、所望の反応を誘発する、組成物または医薬調製物の量。薬剤の有効な量は、被験体の生理的状態の改善、疾患によって引き起こされた症状の緩和、あるいは疾患または疾病の進行の阻害などの、多くの様々な方法で決定され得る。有効な量はまた、様々なインビトロinvitro、インビボinvivo、またはインサイツinsituのアッセイを介して決定され得る。エピトープ:抗原決定基。これらは、抗原性である、例えば、特異的な免疫反応を引き起こす、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、特定の抗原エピトープを結合する。T細胞の場合において、T細胞エピトープは、T細胞受容体によって認識されるMHC分子に関連して提示される特定の抗原ペプチドである。特に強いT細胞反応をもたらすT細胞エピトープは、優性のT細胞エピトープと指定され得る。同等物:実験上または治療上の設定などの与えられた状況において同じ又は類似した結果をもたらす1つ以上の配列変化を有するRTLまたは抗原決定基などのポリペプチドは、同等なまたは機能的に同等なポリペプチドと考えられる。このような配列変化は、限定されないが、同類置換、欠失、変異、フレームシフト、および挿入を含むことができる。免疫反応:抗原攻撃antigenchallengeなどの、免疫原の刺激に対する免疫系の反応。1つの実施形態において、反応は、特定の抗原に特異的である抗原特異性の反応。抗原攻撃のタイプ例えば、病原体、アレルゲン、または毒素によって、異なるタイプの免疫反応が生じ得る。いくつかの例において、免疫反応は、Th1反応、Th2反応、Th3反応、Th17反応、抑制T細胞反応、遅延型過敏反応、即時型過敏症反応、炎症反応、細胞媒介性免疫反応、特異的な免疫反応、非特異的な免疫反応、先天性の免疫反応、補体系の1つ以上の成分を含む反応、または任意の他の免疫反応を含む。疾患の阻害または処置:疾患を阻害することは、例えば、自己免疫障害などの疾患を有するか、または自己免疫障害などの疾患にかかりやすいと知られている人において、疾患の完全な進行を阻害することを指す。疾患の阻害は、疾患の部分阻害から略完全な阻害予防までのスペクトルに及び得る。いくつかの例において、用語阻害することは、疾患の開始または進行を減少させるか又は遅らせることを指す。疾患または障害を阻害または処置するために有効な量の医薬品化合物を投与される被験体は、そのような障害に対する標準診断技術、例えば、症状の基準、病歴、家族歴、あるいは疾患または障害を進行させる危険因子によって確認され得る。処置は、進行し始めた後の、疾患の徴候または症状あるいは病理学的状態を改善する治療上の介入を指す。分離した:分離した核酸は、例えば、核酸が生じる有機体の細胞中の他の核酸、例えば、他の染色体および細胞質のDNAおよびRNAから離されて略分離されたか又は精製された。したがって、用語分離したは、標準の核酸精製法によって精製された核酸を包含する。該用語はまた、宿主細胞中の組み換えの発現によって調製された核酸の他に、化学的に合成された核酸も包含する。分離したポリペプチドは、例えば、核酸が生じる有機体の細胞中の他のポリペプチド、例えば、他のポリペプチドから離されて略分離されたか又は精製された。したがって、用語分離したは、標準のタンパク質精製法によって精製されたポリペプチドを包含する。該用語はまた、宿主細胞中の組み換えの発現によって調製されたポリペプチドの他に、化学的に合成されたポリペプチドも包含する。リンカー:リンカーは、2つのポリペプチドドメインを共有結合するアミノ酸配列である。リンカーは、本開示の組み換えMHCポリペプチドに含まれ得ることで、結合したポリペプチドドメインに循環の自由rotationalfreedomを与え、それによって、適切なドメインの折畳み及びドメイン間ならびにドメイン内の結合を促進する。一例として、β1α1を含む組み換えポリペプチドにおいて、リンカーは、β1ドメインとα1ドメインとの間で提供され得る。当該技術分野に周知のリンカー配列は、限定されないが、Chaudharyetal.Nature339:394-367,1989に記載される、グリシン4-セリンスペーサーを含む。本開示による組み換え型MHCクラスIα1α2ポリペプチドは、α1ドメインのカルボキシル末端をα2ドメインのアミノ末端に連結する共有結合を含む。天然のMHCクラスIα鎖のα1およびα2のドメインは、典型的には、アミノ酸リンカー配列によってこの配向で共有結合される。この天然のリンカーは、組み換え型の構成物において維持され得るか、あるいは、組み換え型リンカーは、天然のリンカー配列の代わり又はそれに加えてα1ドメインとα2ドメインとの間で導入され得る。核酸分子:限定されないが、cDNA、mRNA、ゲノムDNA、および合成の例えば化学的に合成したDNAを含む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマー。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。医薬品または薬物:被験体に適切に投与されたときに所望の治療上または予防的な効果を誘発することができる化学化合物または組成物。薬学的に許容可能な担体:本明細書に記載されるポリペプチドおよび核酸を用いることで有用な薬学的に許容可能な担体は従来のものである。Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,TheUniversityoftheSciencesinPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,Wilkins,Philadelphia,PA,21stEdition2005は、本明細書に開示される融合タンパク質の薬剤送達に適した、組成物および製剤を記載する。一般に、担体の性質は、使用されている投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性のデキストロース、グリセロールなどの、薬学的且つ生理学的に許容可能な液体を含む注射可能な液体を含む。固形組成物例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態に関して、従来の無毒な固形担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤などの小量の無毒な補助剤、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステルを含むことができる。ポリペプチドまたはタンパク質:モノマーがアミド結合によって一緒に連結されるアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファアミノ酸であるときに、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかが使用され得る。本明細書に使用されるような、用語ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むように意図される。用語ポリペプチドまたはタンパク質は、自然発生のタンパク質に加え、組み換えで又は合成的に生成されるものも包含するように特に意図される。精製した:用語精製したは、絶対的な純度を必要とせず、むしろ、相対語として意図される。したがって、例えば、精製したMHCポリペプチド調製物は、組み換え型MHCポリペプチドが、細胞または調製物内のその元の環境においてポリペプチドよりも純粋である調製物である。組み換え型MHCポリペプチド調製物は、典型的には、組み換え型MHCポリペプチドが、調製物の総タンパク含量の少なくとも50を示すように精製される。しかしながら、より高度に精製された調製物は、特定の適用に必要とされ得る。例えば、このような適用のために、MHCポリペプチドが、総タンパク含量の少なくとも75、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98、少なくとも99、またはそれ以上を含む調製物が利用され得る。組み換え型:組み換え型の核酸またはポリペプチドは、自然発生でない配列を有するか、または2つ以上のその他の分離した画分の配列の人為的な組み合わせによって作られる配列を有するものである。この人為的な組み合わせは、化学合成、またはより一般には、核酸の分離した画分の人為的操作、例えば、遺伝子工学手法によってしばしば達成される。配列同一性:アミノ酸配列間の類似点は、配列間の類似点の観点から表され、そうでなければ、配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、割合の同一性あるいは類似性または相同性の観点から頻繁に測定され、割合が高いほど、2つの配列はより類似している。MHCドメインポリペプチドの変異体は、標準分析法を使用して並べられるalignedときに、比較的高度な配列同一性を持つ。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野に周知である。Altschuletal.1994は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察を提示する。NCBIBasicLocalAlignmentSearchToolBLASTAltschuletal.1990は、配列分析プログラム、blastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxに関連して使用するための、NationalCenterforBiotechnologyInformationncbi.nlm.nih.govを含む、いくつかのソースから利用可能である。このプログラムを使用して、配列同一性を測定する方法の記載は、デフォルトパラメーターと同様に、NCBIのウェブサイトで入手可能である。MHCドメインポリペプチドの変異体は、典型的には、デフォルトパラメーターに対するギャップのあるgappedblastpセットである、NCBIBlast2.0を使用して、天然のMHCドメインポリペプチドのアミノ酸配列を有する全長アラインメントにわたって計算された、少なくとも50の配列同一性を有することを特徴とする。参照配列へのさらなる大きな類似点を有するタンパク質は、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95の配列同一性などの、この方法によって評価されるときの増加する割合の同一性を示す。全体より少ない配列が配列同一性のために比較されているとき、変異体は、典型的には、10-20のアミノ酸の短いウィンドウshortwindows上の少なくとも75の配列同一性を有し、参照配列への類似点に依存して、少なくとも85または少なくとも90または95の配列同一性を有し得る。このような短いウィンドウ上で配列同一性を測定するための方法は、NCBIのウェブサイトで記載されている。MHCドメインポリペプチドの変異体はまた、天然のポリペプチドの生物学的活性を保持する。本開示の目的のために、その活性は、変異体ドメインを適切なβ1α1またはα1α2のポリペプチドに組み込み、結果として生じるポリペプチドの、インビトロinvitroで抗原特異性のT細胞増殖を阻害するか、あるいはT抑制細胞またはIL-10の発現を誘発する能力を決定することによって好都合に評価される。被験体:ヒトおよびヒト以外の哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、多細胞の脊椎生物。被験体は、ウシおよび羊などの家畜、齧歯類マウスおよびラットなど、およびヒト以外の霊長類を含む、獣医の被験体を含む。耐性:抗原に対する特異的な免疫反応を作り出す縮小されたか又は不在の能力。耐性は、本明細書に記載されるように、2つのドメインMHC分子がある状態での抗原との接触の結果としてしばしばもたらされる。1つの実施形態において、B細胞反応は、減少するか又は生じない。別の実施形態において、T細胞反応は、減少するか又は生じない。あるいは、T細胞およびB細胞の反応の両方は、減少し得るか又は生じ得ない。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書に開示される主題が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語a、an、およびtheは、文脈が他に明確に明示していない限り、複数の指示物を含む。同様に、語またはは、文脈が他に明確に明示していない限り、およびを含むように意図される。本明細書に記載される方法および物質に類似したまたは同等の方法および物質は、本開示の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。本明細書で言及される、すべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体が引用によって組み込まれる。コンフリクトconflictの場合においては、用語の説明を含む本明細書が管理するcontrol。さらに、物質、方法、および例は、単に例示的であり、限定するようには意図されない。<II.共有結合した組み換え型MHCポリペプチドおよび抗原決定基>本明細書には、ジスルフィド結合によって精製された抗原決定基などの抗原決定基に共有結合した、精製された組み換え型MHCポリペプチドなどの組み換え型MHCポリペプチドを含む組成物が開示される。MHCポリペプチドは、共有結合した第1および第2のドメインを含む。幾つかの実施形態において、第1ドメインは哺乳動物のMHCクラスIIβ1ドメインであり、第2ドメインは哺乳動物のMHCクラスIIα1ドメインであり、ここで、α1ドメインのアミノ末端は、β1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、MHCクラスII分子は、α2またはβ2のドメインを含まない。他の実施形態において、第1ドメインは哺乳動物のMHCクラスIα1ドメインであり、第2ドメインは哺乳動物のMHCクラスIα2ドメインであり、ここで、α2ドメインのアミノ末端は、α1ドメインのカルボキシル末端に共有結合され、MHCクラスI分子は、α3ドメインを含まない。いくつかの例において、MHCドメインはヒトMHCドメインである。2つのドメインMHCポリペプチドは、以下に及び米国特許第6,270,772号;第6,815,171号;および第7,265,218号および米国特許公開番号2008/0267987および2005/0142142;により詳細に記載され、これら各々は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。組み換え型MHCポリペプチドは、ジスルフィド結合を介して、ペプチド抗原などの抗原決定基に共有結合される。組み換え型MHCポリペプチドとペプチド抗原との間の共有結合は、例えば、ジスルフィド結合の形成のための適切な条件下で、組み換え型MHCポリペプチドとペプチド抗原とを接触させることによって形成される。このような条件は、慣例的な方法を活用する当業者によって決定され得る。典型的な方法は、以下にさらに詳細に議論されるセクションV。本開示の組み換え型MHCポリペプチドは、原核細胞または真核細胞においてβ1α1ポリペプチドまたはα1α2ポリペプチドなどのMHCポリペプチドをコード化する核酸の発現によって容易に生成され得、大量に精製され得る。幾つかの実施形態において、開示される組成物は、抗原決定基と組み換え型MHCポリペプチドとの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、β1α1ポリペプチドまたはα1α2ポリペプチドなどの精製された組み換え型MHCポリペプチドと、ペプチド抗原などの抗原決定基とを接触させることによって生成される。いくつかの例において、ジスルフィド結合は、MHCクラスIIβ1ドメインにおけるシステイン残基またはMHCクラスIα1またはα2のドメインにおけるシステイン残基などのMHCポリペプチドにおける自然発生のシステイン残基を活用して形成される。いくつかの例において、ジスルフィド結合は、組み換え型MHCクラスIIβ1α1ポリペプチドのCys17を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型MHCクラスIIβ1α1ポリペプチドのCys79を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型MHCクラスIIβ1α1ポリペプチドのCys15及び/又はCys79を含む。特定の例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型MHCクラスIIDRβ1α1ポリペプチドのCys17及び/又はCys79例えば、配列番号4などの、DR2MHCポリペプチドのCys17及び/又はCys79を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型MHCクラスIIDPβ1α1ポリペプチドのCys16及び/又はCys78例えば、配列番号19などの、DP2MHCポリペプチドのCys16及び/又はCys78を含む。またさらなる例において、ジスルフィド結合は、開示される組み換え型MHCクラスIIDQβ1α1ポリペプチドのCys16及び/又はCys80例えば、DQ2MHCポリペプチドのCys16及び/又はCys80、例えば配列番号20を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、β1α1ポリペプチドの、Cys15、Cys16、Cys17、Cys18、Cys19、Cys20、Cys21、Cys76、Cys77、Cys78、Cys79、Cys80、Cys81、及び/又はCys82を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型MHCクラスIα1α2ポリペプチドのCys101を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、組み換え型MHCクラスIα1α2ポリペプチドのCys164を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、α1α2ポリペプチドの、Cys98、Cys99、Cys100、Cys102、Cys103、Cys104、Cys161、Cys162、Cys163、Cys165、Cys166、及び/又はCys167を含む。さらなる例において、ジスルフィド結合はまた、ペプチド抗原における自然発生のシステイン残基を活用して形成される。自然発生のシステイン残基は、組み換え型MHCポリペプチドまたはドメインまたはペプチド抗原などのポリペプチドの天然型配列または野生型配列に生じるシステイン残基を含む。他の例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってMHCポリペプチドにおいて導入されたシステイン残基などの、組み換え型MHCポリペプチドにおける非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。さらなる例において、ジスルフィド結合は、突然変異誘発によってペプチド抗原において導入されたシステイン残基などの、ペプチド抗原における非自然発生のシステイン残基を活用して形成される。非自然発生のシステイン残基は、天然型ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドに生じない、組み換え型MHCポリペプチドまたはドメインまたはペプチド抗原などのポリペプチドにおいてシステイン残基を含む。いくつかの例において、非自然発生のシステイン残基は、ポリペプチドにおいて任意の他の自然発生のアミノ酸と取って代わるシステイン残基を含む。他の例において、非自然発生のシステイン残基は、ポリペプチドに加えられるか又は挿入される例えば、ポリペプチドの5’または3’の末端で加えられるか又はポリペプチド中の2つの自然発生の残基間で挿入されるシステイン残基を含む。自然発生および非自然発生のシステイン残基の任意の組み合わせは、ジスルフィド結合の形成のために活用することができる。1つの例において、非自然発生のシステインは、MHCIIα1ドメイン、例えば、天然のα1鎖のアミノ酸の位置62または72DR、DP、またはDQβ1α1のポリペプチドのアミノ酸の位置158または168など、例えば配列番号11、19、または20においてアミノ酸残基と取って代わることによって導入される。ポリペプチドにおいて非自然発生の残基を導入する方法は、当業者に既知であって、ポリペプチドをコード化する核酸分子の部位特異的変異誘発を含む。例えば、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989;Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborPress,2001;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,1992andSupplementsto2000;Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,4thed.,WileySons,1999を参照。当業者は、例えば以下の実施例に記載される方法を活用することによって例えば、分子モデリングを活用する及び/又は複合体の形成のための構成物を構成し且つ試験することで、組み換え型MHCポリペプチドまたはペプチド抗原においてシステイン残基に変異させるための適切な残基を識別することができる。<A.組み換え型MHCクラスIIβ1α1分子>哺乳動物のMHCクラスIIαおよびβ鎖のタンパク質のアミノ酸配列に加え、これらのタンパク質をコード化する核酸も同様に、当該技術分野に周知であり、GenBankncbi.nlm.nih.govを含む多数のソースから入手可能である。典型的な配列は、Auffrayetal.,Nature308:327-333,1984ヒトHLADQα;Larhammaretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:7313-7317,1983ヒトHLADQβ;Dasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3543-3547,1983ヒトHLADRα;Tonnelletal.,EMBOJ.4:2839-2847,1985ヒトHLADRβ;Lawrenceetal.,Nucl.AcidsRes.13:7515-7528,1985ヒトHLADPα;Kellyetal.,Nucl.AcidsRes.13:1607-1621,1985ヒトHLADPβ;Syhaetal.,Nucl.AcidsRes.17:3985,1989ラットRT1.Bα;Syha-Jedelhauseretal.,Biochim.Biophys.Acta1089:414-416,1991ラットRT1.Bβ;Benoistetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:534-538,1983マウスI-Aα;Estessetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:3594-3598,1986マウスI-Aβにおいて提供され、それらすべては、引用によって本明細書に組み込まれる。1つの実施形態において、MHCクラスIIタンパク質は、ヒトMHCクラスIIタンパク質である。本開示の組み換え型MHCクラスII分子は、MHCクラスIIα鎖のα1ドメインに共有結合されたMHCクラスIIβ鎖のβ1ドメインを含む。α1およびβ1のドメインは、哺乳動物のMHCクラスIIタンパク質においてよく定義されている。典型的には、α1ドメインは、成熟鎖maturechainの約1-90の残基を含むと見なされる。MHCクラスIIタンパク質のα1ドメインとα2ドメインとの間の天然のペプチドリンカー領域は、考察の下、特定のα鎖によって、約76のアミノ酸から約93のアミノ酸まで及ぶ。したがって、α1ドメインは、α鎖の約1-90のアミノ酸残基を含み得るが、当業者は、このドメインのC末端切断が、必ずしも正確に定義されない、例えば、α鎖の70-100のアミノ酸残基間のどの時点でも生じ得ることを認識するであろう。限定しない例において、α1ドメインは、α鎖の、1-80、1-81、1-82、1-83、1-84、1-85、1-86、1-87、1-88、1-89、1-90、1-91、1-92、または1-93のアミノ酸残基を含む。α1ドメインの組成物はまた、哺乳動物の種および問題の特定のα鎖に依存して、これらのパラメーターの外側で変更し得る。当業者は、アミノ酸配列の正確な数値パラメーターが、ドメイン機能の維持ほど重要ではないことを認識するであろう。同様に、β1ドメインは、典型的には、成熟β鎖の約1-90の残基を含むと見なされる。MHCクラスIIタンパク質のβ1ドメインとβ2ドメインとの間のリンカー領域は、考察の下、特定のβ鎖によって、β鎖の約85のアミノ酸から約100のアミノ酸まで及ぶ。したがって、β1タンパク質は、約1-100のアミノ酸残基を含み得るが、当業者は、このドメインのC末端切断が、必ずしも正確に定義されない、例えば、β鎖の75-105のアミノ酸残基間のどの時点でも生じ得ることを認識するであろう。限定しない例において、β1ドメインは、β鎖の、1-75、1-76、1-77、1-78、1-79、1-80、1-81、1-82、1-83、1-84、1-85、1-86、1-87、1-88、1-89、1-90、1-91、1-92、1-93、1-94、1-95、1-96、1-97、1-98、1-99、または1-100のアミノ酸残基を含む。β1ドメインの組成物はまた、哺乳動物の種および問題の特定のβ鎖に依存して、これらのパラメーターの外側で変更し得る。また、当業者は、アミノ酸配列の正確な数値パラメーターが、ドメイン機能の維持ほど重要ではないことを認識するであろう。1つの実施形態において、β1α1分子は、β2ドメインを含まない。別の実施形態において、β1α1分子は、α2ドメインを含まない。またさらなる実施形態において、β1α1分子は、α2またはβ2のドメインをどちらも含まない。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、β1ドメインとα1ドメインとの間で提供される。典型的には、このリンカーは、長さが少なくとも6のアミノ酸例えば少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、またはそれ以上のアミノ酸であり、各ドメインが天然立体配座へと自由に折畳まるように、ドメイン間で柔軟性を提供する機能を果たす。特定の例において、リンカーは、長さが約2乃至25のアミノ酸例えば、6乃至25または15乃至20のアミノ酸である。当業者は、もし組み換え型MHCポリペプチドに含まれるのであれば、適切なリンカーを選択することができる。リンカー配列は、リンカー配列をコード化するようにPCRプライマーを設計することによって、好都合に提供され得る。B.組み換え型MHCクラスIα1α2分子哺乳動物のMHCクラスIα鎖タンパク質のアミノ酸配列、同様にこれらのタンパク質をコード化する核酸は、当該技術分野において周知であり、GenBankncbi.nlm.nih.govを含む多数のソースから利用可能である。典型的な配列は、Browningetal.,TissueAntigens45:177-187,1995ヒトHLA-A;Katoetal.,Immunogenet.37:212-216,1993ヒトHLA-B;Steinleetal.,TissueAntigens39:134-134,1992ヒトHLA-C;Walteretal.,Immunogenetics41:232,1995ラットIa;Walteretal.,Immunogenetics39:351-354,1994ラットIb;Kressetal.,Nature306:602-604,1983マウスH-2-K;Schepartetal.,J.Immunol.136:3489-3495,1986マウスH-2-D;及びMooreetal.,Science215:679-682,1982マウスH-2-lにおいて提供され、これらは、引用により本明細書に組み込まれる。1つの実施形態において、MHCのクラスIタンパク質は、ヒトMHCのクラスIタンパク質である。本開示の組み換え型MHCクラスI分子は、MHCクラスI鎖のα2ドメインに共有結合する、MHCクラスIα鎖のα1ドメインを含む。これらの2つのドメインは、哺乳動物のMHCクラスIタンパク質において十分に定義されている。典型的に、α1ドメインは、成熟鎖の約1-90の残基を含むと見なされ、α2ドメインは、約90-180のアミノ酸残基を含むと見なされるが、切断点は正確に定義されず、異なるMHCクラスI分子の間で変わる。限定しない例において、α1ドメインは、α鎖の1-80、1-81、1-82、1-83、1-84、1-85、1-86、1-87、1-88、1-89、1-90、1-91、1-92、又は1-93のアミノ酸残基を含む。MHCクラスIαタンパク質のα2とα3のドメイン間の境界は、典型的に、成熟鎖の179-183のアミノ酸の領域において生じる。限定しない例において、α2ドメインは、α鎖の85-180、86-180、87-180、88-180、89-180、90-180、90-179、90-181、90-182、又は90-183のアミノ酸残基を含む。α1及びα2のドメインの組成物はまた、哺乳動物の種、及び特に問題のα鎖に依存する、これらのパラメーターの外側で変化し得る。当業者は、アミノ酸配列の正確な数のパラメーターが、ドメイン機能の維持ほどあまり重要ではないことを認識するであろう。1つの実施形態において、α1α2分子は、α3ドメインを含まない。α1α2構成物は、アミノ酸番号1と179-183のアミノ酸との間の二重ドメインα1及びα2の領域をコード化する読み枠を増幅することにより、最も好都合に構成され得るが、当業者は、これらエンドポイントにおける幾つかの変化が可能であることを認識するであろう。そのような分子は、α1とα2の間に天然のリンカー領域を含むが、所望されると、リンカー領域は除去され、合成リンカーペプチド上述のリンカーなどと交換され得る。C.修飾されたMHC分子前述の考察は、MHCクラスI及びクラスIIの分子、並びにこれら分子の様々なドメインを事前に発生させる例を使用する一方で、当業者は、これらの分子とドメインの変化が、記載されるものと同じ方法で作られ且つ利用され得ることを認識するであろう。したがって、MHCポリペプチド又は分子のドメイン例えば、MHCクラスIIβ1ドメインに対する、本明細書における言及は、参照された分子の自然発生の形態、同様に、自然発生の形態のアミノ酸配列に基づくが、1つ以上のアミノ酸配列の変化を含む分子を含む。そのような変異体ポリペプチドはまた、それらが自然発生の分子と共有するアミノ酸配列同一性の程度において、定義され得る。典型的に、MHCドメイン変異体は、自然発生のMHCドメインの配列と、少なくとも80の配列同一性を共有する。より高度に保存された変異体は、自然発生の配列と、少なくとも90又は少なくとも95の配列同一性を共有する。MHCドメインポリペプチドの変異体はまた、自然発生のポリペプチドの生物学的活性を保持する。本開示の目的のため、その活性は、適切なβ1α1又はα1α2のポリペプチドにおける変異体ドメインを組み込むことにより、及びインビトロinvitroでの抗原特異性のT細胞増殖を阻害する、結果として生じるポリペプチドの能力を測定することにより、都合よく評価される。抗原特異性のT細胞増殖の測定方法は、当業者に周知である例えば、Huanetal.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005を参照。変異体MHCドメインポリペプチドは、アミノ酸配列において自然発生のMHCポリペプチド配列と異なるが、具体化された生物学的活性を保持するタンパク質を含む。前記タンパク質は、例えば、特定部位の突然変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応によってドメインをコード化する分子のヌクレオチド配列の操作により、生成され得る。最も単純な修飾は、1つ以上のアミノ酸の、類似の生化学的特性を有するアミノ酸との置換に関与する。これらいわゆる同類置換は、結果として生ずるタンパク質の活性に最小の影響を及ぼすかもしれない。幾つかの実施形態において、開示された組み換え型MHCポリペプチドは、天然のMHCポリペプチド、或いはβ1α1又はα1α2のMHCポリペプチドの自己凝集を減少させる1以上のアミノ酸変化を含む、修飾されたMHCポリペプチドを含む。例えば、米国特許公開番号2005/0142142、及びHuanetal.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005を参照し、その両方は、引用により本明細書に組み込まれる。本開示の修飾されたMHCポリペプチドは、天然のMHCポリペプチドにおいて見出される自己結合界面内に位置する、又はそれを定義する溶媒を暴露した標的部位での1以上のアミノ酸変化を導入するために、合理的に設計され、構成される。修飾されたMHCポリペプチドにおいて変更される自己結合界面は、典型的に、天然のMHCポリペプチドの、又は天然のMHCポリペプチドを組み込む修飾されないβ1α1或いはα1α2のMHCポリペプチドの自己凝集を媒介する、1以上のアミノ酸残基を含む。自己結合界面は、天然のMHCポリペプチドの一次構造と相互に関連付けられるが、この界面は、天然のポリペプチドがインタクトなMHC複合体から分離し、修飾されないβ1α1又はα1α2のMHC分子に関連して組み込まれる時に、凝集を促進する表面特徴として現われるだけである。本明細書に記載の典型的なMHCクラスII分子例えば、結合したβ1とα1のドメインを含むの場合において、天然のβ1α1構造は、インタクトなMHCII複合体において見出される免疫グロブリンフォールド様のβ2とα2のドメインの除去の後に、特定の溶媒に曝露された、自己結合残基又はモチーフを示すだけである。修飾されていないβ1α1MHC分子の凝集を媒介する、これら同じ残基又はモチーフは、溶媒のアクセス不能な構成に仮定的に埋め込まれburied、又は他に、天然又は前駆体のMHCII複合体おそらく免疫グロブリンフォールド様のβ2とα2のドメインとの関連性を通じてにおいてマスクされるmasked例えば、自己凝集の媒介を妨げる。幾つかの実施例において、非常に少ない凝集プローンフォームaggregationproneformをもたらすためのMHCクラスII成分を含むMHC分子の表面修飾は、例えば、非疎水性の残基例えば、極性の残基又は荷電された残基と、MHC成分のβ-シートプラットフォームにおいて同定される、1つ以上の疎水性の残基を交換することによって達成することができる。図13A-Cは、典型的なHLA-DR2ポリペプチド、典型的なβ1α1分子、及び疎水性のβ-シートプラットフォーム残基を表し、それぞれ、修飾のために標的とされ得る。幾つかの例において、β-シートプラットフォームの中心コア部分の1以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトDR2のMHCクラスIIβ1α1RTL例えば、配列番号11のV102、I104、A106、F108、及びL110の1つ以上が、修飾される。他の例において、β-シートプラットフォームの中心コア部分の1以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトDR2のMHCクラスIIβ1α1RTL例えば、配列番号19のV98、A102、及びF104の1つ以上が、修飾される。更なる例において、β-シートプラットフォームの中心コア部分の1以上の疎水性アミノ酸、例えば、ヒトDQ2のMHCクラスIIβ1α1RTL例えば、配列番号20のV104、及びG108の1以上が、修飾される。当業者は、他のMHCクラスII分子又はβ1α1分子において対応するアミノ酸を識別することができる。例えば、図14で提供される、ヒト、マウス、又はラットのRTLのアラインメントを参照する。特定の実施例において、同定された疎水性のβ-シートプラットフォームアミノ酸の1以上は、極性の残基例えばセリン又は荷電された残基例えばアスパラギン酸のいずれかへと変更される。幾つかの例において、配列番号11の:又は別のβ1α1ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸V102、I104、A106、F108、及びL110の5つすべては、極性の残基又は荷電された残基へと変更される。1つの例において、配列番号11の又は他のβ1α1ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸V102、I104、A106、F108、及びL110の各々は、アスパラギン酸残基に変更される。他の例において、追加の疎水性の標的残基は、MHC分子に組み込まれるクラスIIMHC分子のβ-シートプラットフォーム部分の自己結合の特徴を変更するための修飾に利用可能である。図13Cを参照すると、図解されたβ-シートプラットフォームの左アームleftarmは、非疎水性の例えば、極性又は荷電された残基に修飾され得る、配列番号11或いは他のβ1α1ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸の3つの記された疎水性の残基頂部乃至底部、L141、V138、及びA133の別々のモチーフを含む。幾つかの例において、配列番号11のL141、V138、及びA133は、配列番号19のL139、V136、及びD131、或いは、配列番号20のV141、K138、及びV133に対応する。また、図13Cを参照すると、様々な標的の疎水性の残基は、配列番号11或いは他のβ1α1ポリペプチドにおいて対応するアミノ酸のL9、F19、L28、F32、V45、及びV51を含む、コアβ-シートモチーフの右側に印づけられ、それらは、MHC分子修飾のための1以上の追加の、自己結合の、又は自己関連させる標的モチーフと見なされ得る。幾つかの例において、配列番号11のL9、F19、L28、F32、V45、及びV51は、配列番号19のL9、F19、L26、I30、V43、及びV49、或いは、配列番号20のV9、T19、V28、I32、V45、及びV51に対応する。当業者は、他のMHCクラスII分子又はβ1α1分子において対応するアミノ酸を識別することができる。3つの残基のいずれか1つ又はそれらの組み合わせは、非疎水性の残基に対する修飾に向けられ得、モノマーのMHC分子を増加させ得る。本明細書に開示の修飾されたMHC分子は、対応する修飾されないMHC分子例えば、天然のMHCポリペプチドを含んでおり、修飾されない、自己結合界面を持つと比較して、溶液中の単分散のモノマー分子の割合の増加をもたらす。特定の実施形態において、水溶液中の単分散の種として存在する修飾されないMHC分子の割合は、合計のMHCタンパク質の1もの低さ、典型的には5-10以下の低さであり、修飾されないMHC分子のバランスは、高次凝集の形態において見出される。対照的に、本明細書に開示の修飾されたMHC分子は、溶液に少なくとも10-20の単分散の種をもたらす。他の実施形態において、溶液中のモノマーの種の割合は、合計のMHCタンパク質の25-40、しばしば50-75から、80、90、95、又はそれ以上までの範囲に及び、凝集されたMHC種の割合の比例した減少は、比較可能な条件下で、対応する修飾されないMHC分子について観察された分量と比較される。D.抗原決定基開示された組成物は、上述のものなどの、組み換え型MHCポリペプチドに共有結合される抗原決定基ペプチド抗原などを含む。クラスI又はクラスIIのMHC分子に慣習的に関連し、T細胞によって認識される、任意の抗原のペプチドは、この目的に使用することができる。多くのソースから抗原のペプチドは詳細に特徴づけられ、ミツバチ毒液アレルゲン、チリダニアレルゲン、細菌によって作られる毒素破傷風毒素など、及び自己免疫性疾患に関与するヒト組織抗原から抗原のペプチドを含む。前記ペプチドの詳細な考察は、米国特許第5,595,881号;第5,468,481号;及び第5,284,935号で提供され;これらの各々は、引用により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で周知のように例えば米国特許第5,468,481号を参照、APCの表面上のMHC複合体における抗原の提示は、一般に全体の抗原のペプチドに関与しない。むしろ、β1ドメインとα1ドメインのMHCの場合、又はα1ドメインとα2ドメインのMHCIの場合間の溝に位置づけられるペプチドは、典型的に、全体の抗原のペプチドの小断片である。JanewayTraversImmunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease,CurrentBiologyLtd.,NewYork,1997で考察されるように、MHCクラスI分子のペプチド溝に位置づけられるペプチドは、結合ポケットの大きさにより抑圧され、典型的には長さが8-15のアミノ酸であり、より典型的には長さが8-10のアミノ酸であるしかし、可能な例外に関して、Collinsetal.,Nature371:626-629,1994を参照。対照的に、MHCクラスII分子のペプチド溝に位置するペプチドは、このように抑圧されず、しばしばかなり大きく、典型的には少なくとも長さが11のアミノ酸約13-25のアミノ酸などである。MHC分子へ充填するためのペプチド断片は、合成ペプチド合成機械syntheticpeptideaynthesismachineの使用など、標準の手段によって調製することができる。典型的な抗原決定基は、自己免疫性疾患の病因において識別されたペプチドを含む。幾つかの例において、抗原決定基は、関節リウマチ例えば、II型コラーゲン、重症筋無力症アセチルコリン受容体、多発性硬化症MBP、PLP、又はMOG、ブドウ膜炎又は他の網膜の疾患光受容体間レチノイド結合タンパク質IRBP、アレスチン、レコベリン、及びフォスデューシン、及び糖尿病インスリンの病因において識別されたペプチドである。特定の抗原決定基は、限定されないが、MOG35-55配列番号5、MOG1-25GQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCR;配列番号21、MOG94-116GGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVE;配列番号22、MOG145-160VFLCLQYRLRGKLRAE;配列番号23、又はMOG194-208LVALIICYNWLHRRL;配列番号24などのMOGペプチド;MBP10-30RHGSKYLATASTMDHARHGFL;配列番号25、MBP35-45DTGILDSIGRF;配列番号26、MBP77-91SHGRTQDENPVVHF;配列番号27、MBP85-99ENPVVHFFKNIVTPR;配列番号28、MBP95-112IVTPRTPPPSQGKGRGLS;配列番号29、又はMBP145-164VDAQGTLSKIFKLGGRDSRS;配列番号30などのMBPペプチド;及び、PLP139-151CHCLGKWLGHPDKFVG;配列番号16、又はPLP95-116GAVRQIFGDYKTTICGKGLSAT;配列番号31などのPLPペプチドを含む。追加の典型的な抗原決定基は、限定されないが、II型コラーゲン261-274AGFKGEQGPKGEPG;配列番号32、II型コラーゲン259-273GIAGFKGEQGPKGEP;配列番号33、II型コラーゲン257-270EPGIAGFKGEQGPK;配列番号34、又は修飾されたII型コラーゲン257-270APGIAGFKAEQAAK;配列番号35などのII型コラーゲンペプチドを含む。更に典型的な抗原決定基は、IRBP1177-1191ADGSSWEGVGVVPDV;配列番号36などのIRBPペプチド;アレスチン291-310NRERRGIALDGKIKHEDTNL;配列番号37などのアレスチンペプチド;フォスデューシン65-96KERMSRKMSIQEYELIHQDKEDEGCLRKYRRQ;配列番号38などのフォスデューシンペプチド;又は、レコベリン48-52QFQSI;配列番号39、レコベリン64-70KAYAQHV;配列番号40、レコベリン62-81PKAYAQHVFRSFDANSDGTL;配列番号41、レコベリン149-162EKRAEKIWASFGKK;配列番号42などのレコベリンペプチドを含む。追加の典型的な抗原決定基は、フィブリノゲン-α40-59VERHQSACKDSDWPFCSDED;配列番号43、フィブリノゲン-α616-625THSTKRGHAKSRPVRGIHTS;配列番号44、フィブリノゲン-α79-91QDFTNRINKLKNS;配列番号45、又はフィブリノゲン-α121-140NNRDNTYNRVSEDLRSRIEV;配列番号46などのフィブリノゲン-αペプチド;ビメンチン59-79GVYATRSSAVRLRSSVPGVRL;配列番号47、ビメンチン26-44SSRSYVTTSTRTYSLGSAL;配列番号48、ビメンチン256-275IDVDVSKPDLTAALRDVRQQ;配列番号49、又はビメンチン415-433LPNFSSLNLRETNLDSLPL;配列番号50などのビメンチンペプチド;α-エノラーゼ5-21KIHAREIFDSRGNPTVE;配列番号51などのα-エノラーゼペプチド;或いは、ヒト軟骨糖タンパク質39259-271PTFGRSFTLASSE;配列番号52などのヒト軟骨糖タンパク質39ペプチドを含む。他の例において、抗原決定基は、α2-グリアジン61-71FPQPELPYPQP;配列番号53又はα2-グリアジン58-77LQPFPQPQLPYPQPQLPYPQ;配列番号54などのα2-グリアジンペプチドを含む。幾つかの例において、抗原決定基はまた、グリコシル化又はシトルリン化などの修飾を含む。他の例において、抗原決定基は、1つ以上の追加のアミノ酸置換を含む。幾つかの実施形態において、抗原決定基ペプチド抗原などは、p4位置にシステイン残基を含む。幾つかの実施形態において、抗原決定基は、MHCポリペプチドMHCクラスIIβ1α1ポリペプチドなどのP4ポケットを占めることができるシステイン残基を含む。システイン残基は、抗原決定基中の自然発生の天然のシステイン残基であり、又は、非自然発生のシステイン残基例えば、突然変異又はペプチド合成により誘発されるであり得る。当業者は、抗原決定基のp4位置を識別することができる例えば、Corperetal.,Science288:505-511,2000;Lateketal.,Immunity12:699-710,2000を参照。例えば、MHCクラスII対立遺伝子は、ペプチドのためのコア結合モチーフによって特徴付けられたペプチド結合プリファランスpeptidebindingpreferencesを有し、ペプチドのアンカー残基は、各々の対立遺伝子の特徴的なポケットに結合する。ポケットに結合するペプチド残基はアンカー残基と考えられる。P4ポケットは、MHCクラスII分子内の天然のジスルフィド結合の近くに位置している。それ故、P4ポケットを占めるシステインを有するペプチド抗原は、天然のジスルフィド結合を分裂させて、MHCポリペプチドを有するジスルフィド結合を形成することができる。すべてのMHC分子のモチーフを識別するための資源が利用可能である例えば、syfpeithi.deの世界的なウェブ上にて。また、以下の実施例6を参照する。システイン残基は、例えば突然変異誘発によって、抗原決定基へ導入され、本明細書に開示の方法を利用して組み換え型MHCポリペプチドを有するジスルフィド結合を形成するそれらの能力に関して試験され得る。幾つかの例において、自然発生の抗原決定基は、システイン残基を含まず、抗原決定基は、非自然発生のシステイン残基を導入するために修飾される。幾つかの例において、抗原決定基は、例えば、突然変異誘発又はペプチド合成によって、1つ以上のシステイン残基を含むため例えば、p4位置に非自然発生のシステイン残基を導入するため、又は1つ以上のシステイン残基を取り除くために修飾される。幾つかの例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のアミノ末端又はカルボキシ末端に存在する。他の例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のアミノ末端の半分、抗原決定基のアミノ末端の3分の1、又は抗原決定基のアミノ末端の4分の1に存在する。更なる例において、非自然発生のシステインは、抗原決定基のカルボキシ末端の半分、抗原決定基のカルボキシ末端の3分の1、又は抗原決定基のカルボキシ末端の4分の1に存在する。幾つかの例において、ペプチド抗原は、インスリンB:9-23などのインスリンペプチド例えば、配列番号3を含む。このペプチドは、位置19配列番号3の位置11に自然発生のシステイン残基を含み、それは、幾つかの実施例においてMHCポリペプチドのシステインを有するジスルフィド結合を形成することができる。別の例において、ペプチド抗原は、MOG35-55例えば、配列番号5又は6などのMOGペプチドを含む。このペプチドは、自然発生のシステイン残基を含まない。幾つかの例において、MOG35-55の1つの残基は、MHCポリペプチドのシステインを有するジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基例えば、配列番号12、13、及び15のいずれか1つに変異させられる。更なる例において、ペプチドは、PLP139-151例えば、配列番号16などのPLPペプチドである。III.医薬製剤、及び自己免疫疾患を処置又は阻害する方法ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む、開示された組成物は、抗原特異性のT細胞によって媒介される疾病を処置又は阻害するために使用することができる。前記疾病は、アレルギー、移植拒絶反応及び自己免疫疾患限定されないが、多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、自己免疫疾患、ブドウ膜炎、視神経炎、悪性貧血、重症筋無力症、及びアディソン病を含むを含む。開示された組成物はまた、認知障害及び/又は精神神経の機能障害物質依存によって誘導されるものなど、網膜障害網膜変性、黄斑症、網膜症、網膜剥離、又は緑内障などを含む他の疾病を処置又は阻害するために使用することができる。これら疾病を処置するために使用され得るMHCポリペプチドの様々な形態は、以前に記載されており、それらのシステムの中で使用される方法は、本開示の組成物に等しく有用である。典型的な方法論は、米国特許第5,130,297号、第5,284,935号、第5,468,481号、第5,734,023号、及び5,194,425号引用により本明細書に組み込まれるに記載される。また、2011年1月28日出願の、米国仮特許出願第61/437,316号;2011年1月31日出願の、米国仮特許出願第61/438,004号;及び2011年4月7日出願の、米国仮特許出願第61/516,918号;2010年3月8日出願の、米国特許出願第12/661,038号;米国特許公開番号2011/000832;及びHuanetal.,MucosalImmunolを参照し、そのすべては、引用により本明細書に組み込まれる。一例として、ペプチド抗原に共有結合される有効な量のMHCポリペプチドを含む組成物は、自己反応性T細胞個体群中のアネルギーを誘発するために被験体に投与され得、又は、これらT細胞個体群は、毒性の部分により共役されるMHC/ペプチド複合体の投与により処置され得る。或いは、MHC/ペプチド複合体は、T抑制細胞を誘導するため、又はサイトカイン発現特性を修飾するために、被験体に投与され得る。被験体ヒト又は非ヒトの哺乳動物などへの投与のため、本明細書に開示のペプチド抗原に共有結合される組み換え型MHCポリペプチドは、一般に薬学的に許容可能な担体と組み合わせる。一般に、担体の性質は、使用されている投与の特定の形態に依存する。本開示に役立つ薬学的に許容可能な担体及び賦形剤は、従来のものである。例えば、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,TheUniversityoftheSciencesinPhiladelphia,Editor,Lippincott,Williams,Wilkins,Philadelphia,PA,21stEdition2005を参照。例えば、非経口の製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水溶性のデキストロース、グリセロールなどの薬学的及び生理学的に許容可能な流体を含む、注射可能な流体を含む。固形組成物例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態のため、従来の無毒な固形の担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、又はステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、pH緩衝剤などの小量の無毒な補助的な物質、例えば、酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタンを含むことができる。当該技術分野で既知なように、タンパク質ベースの医薬品は、食物摂取によって単に非能率的に送達され得る。しかしながら、特に、遅延放出の組成物において処方されれば、製薬のタンパク質の丸剤ベースの形態はまた、代わりに皮下に投与され得る。遅延放出製剤は、コレステロールなど生物学的適合のマトリックスと標的タンパク質を組み合わせることにより生成され得る。タンパク質医薬品を投与する別の方法は、小型の浸透圧のポンプの使用による。上述のように、生物学的適合の担体も、この送達方法と併用して使用されるであろう。追加の起こり得る送達方法は、吸入Edwardsetal.,Science276:1868-1871,1997及び経皮送達Mitragotrietal.,Pharm.Res.13:411-420,1996による、深い肺送達を含む。本開示の医薬組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段によって投与され得る。幾つかの実施形態において、抗原決定基に共有結合する組み換え型MHCポリペプチドを含む、有効な量の開示された組成物は、自己免疫障害を処置又は阻害するために自己免疫障害の被験体に投与される。ペプチド抗原に共有結合される選択されたMHCポリペプチドを含む組成物の投与のための量及びレジメンは、担当の臨床医によって決定され得る。治療適用に有効な量は、処置される疾病の性質及び重症度、選択された特定のMHCポリペプチド及びペプチド抗原、患者及び他の臨床的な因子の年齢並びに状態に依存して、変化する。典型的に、用量範囲は、約0.1μg/kgの体重から約100mg/kgの体重である。他の適切な範囲は、約100μg/kgから10mg/kgの体重、又は、約500μg/kgから約5mg/kgの体重の用量を含む。服薬スケジュールは、被験体のタンパク質に対する感受性など、多くの臨床的な因子に依存して、毎週1回から毎日1回まで変わり得る。服薬スケジュールの例は、毎週2回、毎週3回又は毎日の3μg/kgの用量の投与;毎週2回、毎週3回又は毎日の7μg/kgの用量の投与;毎週2回、毎週3回又は毎日の10μg/kgの用量の投与;又は、毎週2回、毎週3回又は毎日の30μg/kgの用量の投与である。服薬スケジュールの追加の例は、毎週2回、毎週3回又は毎日の約1mg/kgの用量の投与;毎週2回、毎週3回又は毎日の約5mg/kgの用量の投与;又は、毎週2回、毎週3回又は毎日の約10mg/kgの用量の投与である。抗原決定基に共有結合される、開示されたMHC分子の1以上を含む医薬組成物は、正確な投与量の個々の投与に適した、単位剤形に処方することができる。1つの具体的な限定しない例において、単位投与量は、抗原決定基に共有結合される、約1ngから約1000mgまでのMHCポリペプチドを含み得る約10ng乃至700mg、約1mg乃至500mg、約5mg乃至250mg、又は約10mg乃至100mg例えば約70mgなど。投与される活性組成物の量は、処置されている被験体、苦痛の重症度、及び投与の方法に依存し、処方する臨床医の判断に依存するのが最も良い。これらの境界内で、投与される製剤は、処置されている被験体において所望される効果を達成するのに有効な量の活性な組成物の量を含む。幾つかの例において、MHC分子は、毎日、毎週、毎週2回、又は毎月投与される。本開示の化合物は、局所、経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、鞘内、皮下、眼内、吸入、又は坐薬などの様々な方法で、被験体自己免疫障害を有する、又は自己免疫障害を進行する危険性のある被験体などに投与することができる。1つの例において、化合物は被験体に皮下投与される。別の例において、化合物は被験体に静脈内投与される。投与の特定の形態及び投与レジメンは、担当臨床医によって選択され、その場合の詳細例えば、被験体、疾患、関与する疾患の状態、処置が予防的であるかどうかを考慮に入れる。処置は、数日乃至数カ月、又は更に数年の期間にわたり、毎月、隔月、毎週、毎日、又は毎日複数の量の組成物を含み得る。幾つかの例において、抗原決定基に共有結合される、有効な量治療上有効な量などの開示された組み換え型MHCポリペプチドは、被験体の自己免疫障害多発性硬化症、I型糖尿病、関節リウマチ、セリアック病、乾癬、全身性紅斑性狼瘡、又は視神経炎などを処置又は阻害するのに必要な抗原に共有結合される、MHCポリペプチドMHCクラスIIβ1α1ポリペプチド、又はMHCクラスIα1α2ポリペプチドなどの量でもよい。IV.共有結合されたMHCポリペプチド及びペプチド抗原の更なる使用ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む本開示の組成物は、インビトロinvitro及びインビボinvivoの適用に役立つ。実際は、これらのポリペプチドの生物学的活性の結果として、それらは、MHC分子を発現する、インタクトな精製されたMHC分子、又はAPCのいずれかの代わりに、多数の適用において使用され得る。セクションIII上記で考察されるように、本開示の組成物は、自己免疫障害を有する、又は当該障害の危険性のある被検体の自己免疫障害を処置又は阻害するのに役立つ。追加の適用が以下に記載される。開示された組成物のインビトロinvitroの適用は、抗原特異性のT細胞の検出、定量化、及び精製を含む。MHC由来の複合体の様々な形態をこれらの目的に使用する方法は、周知であり、例えば米国特許第5,635,363号、第5,595,881号、及び第6,815,171号に記載される。そのような適用のため、ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む、開示された組成物は、溶液中で遊離し、又はプラスチックディッシュ、マイクロタイタープレート、膜、又はビーズの表面などの固形の支持物に付けられ得る。典型的に、そのような表面は、プラスチック、ナイロン又はニトロセルロースである。遊離した溶液中のペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む組成物は、蛍光の活性化された細胞分類FACSなどの適用に役立つ。抗原特異性のT細胞の検出及び定量化のため、ポリペプチドは、好ましくは、放射性核種例えば、インジウム-111などのガンマ線を放射するソース、常磁性の同位体、蛍光のマーカー例えば、フルオレセイン、酵素アルカリフォスファターゼなど、補助因子、化学発光の化合物、及び生物発光の化合物などの、検知可能なマーカーにより標識化される。MHCポリペプチドへのそのようなラベルの結合は、標準分析法例えば、米国特許第5,734,023号;引用により本明細書に組み込まれるを使用して達成され得る。検出され、定量化され、又はそうでなければ操作されるべきT細胞は、一般的に、被験体から除去された生体サンプルの中に存在する。生体サンプルは、典型的に血液又はリンパ液であるが、リンパ節、腫瘍、関節などの組織サンプルも含み得る。サンプル中のT細胞を操作するために使用される方法の正確な詳細は、行われる操作のタイプ、及び生体サンプルとMHC分子の両方の物理的形態に依存することが認識される。一般的には、ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む組成物は、生体サンプルに加えられ、混合物は、結合を可能にする十分な時間例えば約5分から数時間まででインキュベートされる。ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む組成物に結合されたT細胞の検出及び定量化は、蛍光顕微鏡法及びFACSMHC/ペプチドは蛍光のラベルを含むを含む、多くの方法によって行われ得る。ELISA及び放射免疫定量法などの標準の免疫測定も、MHC/ペプチド複合体が固形の支持物に結合される、T細胞-MHC/ペプチド複合体を定量化するために使用され得る。幾つかの例において、抗原特異性のT細胞個体群の定量化は、疾患の経過を監視するのに役立つ。例えば、多発性硬化症の被験体において、抗原反応的なT細胞の数を減らすために施される治療の効果は、被験体に存在する前記T細胞の数を定量化するために、抗原MBPなどに共有結合されるMHCを使用して監視され得る。FACSはまた、抗原特異性のT細胞が、濃縮の目的などのためにサンプルから除去されるべき場合に特に役立ち得る、生体サンプルからT細胞-MHC/ペプチド複合体を分離するために使用され得る。MHC/ペプチド複合体が磁気ビーズに結合される場合、MMiltenyietal.,Cytometry11:231-238,1990に記載されるように、結合T細胞個体群が精製され得る。生体サンプル中の具体的な抗原特異性のT細胞個体群は、標的とされたT細胞によって認識されるペプチドを含むペプチド抗原に共有結合される、MHCポリペプチドを含む組成物によるサンプルのインキュベーションによって、アネルギー化され得る。したがって、これら組成物が、他の共同刺激的な分子の欠如下でT細胞受容体に結合するとき、アネルギーの状態はT細胞中で誘発される。そのような手法は、標的とされたT細胞個体群が、様々な自己免疫性疾患などの、自己抗原を認識するという状況に役立つ。或いは、標的とされたT細胞個体群は、毒性の部分と共役されるMHC/ペプチド複合体による、生体サンプルのインキュベーションによって、直接死滅させられ得る。T細胞はまた、本開示のポリペプチドによって抗原特異性の方法で活性化され得る。例えば、ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む、開示された組成物は、プラスチックディッシュ又は磁気ビーズなどの、固体表面に対して高密度で接着され得る。固体表面上のポリペプチドへのT細胞の暴露は、共同刺激的な分子の欠如にもかかわらず、抗原特異性の方法でT細胞を刺激し、活性化することができる。これはおそらく、共同刺激が活性化に不要であるMHC/ペプチド複合体に結合するT細胞上のT細胞受容体の十分な数に起因する。1つの実施形態において、T抑制細胞が誘発される。したがって、ペプチド抗原に共有結合されるMHCポリペプチドを含む組成物が、適切なコンテキスト中のT細胞受容体に結合するとき、T抑制細胞はインビトロinvitroで誘発される。1つの実施形態において、エフェクター機能は修飾され、サイトカイン特性は、MHC/ペプチド複合体でのインキュベーションによって変更される。V.ペプチド抗原に共有結合される組み換え型MHCポリペプチドを作るための方法及びキット幾つかの実施形態において、開示された組成物は、抗原決定基とMHCポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型MHCポリペプチドβ1α1ポリペプチド、或いはα1α2ポリペプチドと、抗原決定基ペプチド抗原などを接触させることにより調製される。幾つかの実施形態において、1つ以上1、2、3、4、5、又はそれ以上などの抗原決定基は、抗原決定基とMHCポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型MHCポリペプチドβ1α1ポリペプチド、或いはα1α2ポリペプチドによりインキュベートされ、それにより、各々が異なる抗原決定基に結合されるMHCポリペプチドの混合された個体群を生成する。他の実施例において、異なる抗原決定基に結合されるMHCポリペプチドの混合された個体群は、ジスルフィド結合の形成に十分な条件下で、組み換え型MHCポリペプチドにより各々の抗原決定基をインキュベートし、次に、抗原決定基に共有結合される、結果として生じるMHCポリペプチドを一緒に混合することにより、生成される。幾つかの例において、MHCポリペプチドは各々の反応において同じである。他の実施例において、MHCポリペプチドは、各反応において異なり、MHCポリペプチド及び/又は抗原決定基の混合された個体群を生成する。幾つかの実施形態において、組み換え型MHCポリペプチドと抗原決定基の間のジスルフィド結合の形成に十分な条件は、1つ以上の抗原決定基のモル過剰を含む。幾つかの実施例において、組み換え型MHCポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、少なくとも1.1:1少なくとも、1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、50:1、100:1、又はそれ以上などである。他の例において、組み換え型MHCポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、約1:1乃至約500:1約2:1乃至100:1、約5:1乃至50:1、又は約10:1乃至20:1などである。1つの限定しない実施例において、組み換え型MHCポリペプチドに対する抗原決定基の比率は、約10:1である。当業者は、開示された組成物がまた、例えば、インキュベーションの時間及び/又は温度等の他の反応パラメーターを調整することによって、MHCポリペプチドのモル過剰を抗原決定基に接触させることにより、生成され得ることを認識するであろう。幾つかの実施形態において、抗原決定基と組み換え型MHCポリペプチドの間のジスルフィド結合の形成に十分な条件は、ジスルフィド結合を形成するのに十分な温度及び期間で、抗原決定基のレドックス捕捉redoxcaptureを促進する、緩衝液又は溶液中でのインキュベーションを含む。レドックス捕捉のための典型的な溶液は、約5乃至約8.5例えば、約5.5乃至8.0、約6乃至7.5、又は約6.5乃至8.5等のpHを有する溶液を含む。幾つかの例において、溶液のpHは、約6.0乃至7.0約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6.6.7、6.8、6.9、又は7.0などである。1つの限定しない例において、溶液は、約6.5のpHを有する。幾つかの例において、より低いpH例えば、約6乃至7を利用することで、MHCポリペプチドと抗原決定基の間のジスルフィド結合の形成を促進し、抗原決定基によってホモダイマーの形成を減少させる。MHCポリペプチドが、ジスルフィド結合形成例えば、約2-5Åなど、約1-10Åの範囲内に関与する、システイン残基に近い酸性アミノ酸残基例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含むとき、これは特に有利であり得る。幾つかの例において、溶液は、随意に、軽度の還元剤グルタチオン、β-メルカプトエタノール、又はジチオトレイトールなどを含み、それはまた、抗原決定基によってホモダイマー形成を減少させることができる。その溶液はまた、洗浄剤例えば、イオン性洗浄剤、両性イオン洗浄剤、又は非イオン洗浄剤を含む。適切な洗浄剤は、当業者により選択され、硫酸ドデシルナトリウムSDS、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物CTAB、3-[3-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルフォナートCHAPS、[3-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルフォナートCHAPSO、Tween登録商標洗浄剤Tween登録商標-20など、Triton登録商標洗浄剤Triton登録商標X100など、又はBrij登録商標洗浄剤Brij登録商標35などを含む。幾つかの例において、溶液は、約0.025-0.075、又は約0.05などの、約0.01-0.1の洗浄剤例えば、約0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、又は0.1の洗浄剤を含む。1つの非限定的な例において、溶液は、約0.05のSDSを含む。幾つかの実施形態において、溶液は、1つ以上の塩例えばNaCl及び/又は保存剤例えばNaN3などの、追加の成分を含む。特定の例において、溶液は、100mMのNaPO4、pH6.5、150mMのNaCl、0.05のSDS、及び0.01のNaN3を含む。幾つかの実施形態において、抗原決定基及び組み換え型MHCポリペプチドは、およそ室温例えば、22乃至25°C乃至75°Cで、約1乃至72時間インキュベートされる。幾つかの例において、抗原決定基及び組み換え型MHCポリペプチドは、約37°C乃至約75°C、例えば、約37°C乃至約75°C、約45°C乃至約65°C、又は約50°C乃至約60°Cで接触される。幾つかの例において、反応温度は、約37°C乃至約60°C約37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、又は60°Cなどである。幾つかの例において、反応時間は、約2時間乃至約72時間、約24時間乃至約60時間、又は約36時間乃至50時間など、約1時間乃至84時間である。他の実施例において、抗原決定基及び組み換え型MHCポリペプチドは、約1時間、2時間、3時間、6時間、12時間乃至約72時間、又はそれ以上約12時間、16時間、18時間、24時間、36時間、48時間、50時間、55時間、60時間、72時間、又はそれ以上などで接触される。1つの限定しない例において、抗原決定基及び組み換え型MHCポリペプチドは、約60時間、約37°Cで接触される。本明細書にはまた、ジスルフィド結合によって抗原決定基に共有結合される組み換え型MHCポリペプチドβ1α1ポリペプチド、或いはα1α2ポリペプチドなどを含む、開示された組成物を生成するためのキットが開示される。幾つかの実施形態において、キットは、組み換え型MHCポリペプチドをコード化する組み換え型MHCポリペプチド又は核酸例えば、発現ベクトル中の組み換え型MHCポリペプチドをコード化する核酸、及びジスルフィド結合の形成用の1以上の成分を含む溶液上述の溶液などを含む。1つの例において、溶液は、約0.05のSDSを含み、約6.5のpHを有する。特定の例において、溶液は、100mMのNaPO4、pH6.5、150mMのNaCl、0.05のSDS、及び0.01のNaN3を含む。追加の実施形態において、キットはまた、1つ以上の抗原決定基1つ以上の抗原のペプチドなどを含む。抗原のペプチドは、当業者によって選択され得るが、限定されないが、上記セクションIIDで開示されたものである。キットは、核酸例えば、細菌又は真核細胞、追加の緩衝液例えば、透折緩衝液、及び/又は、組み換え型MHCポリペプチドと、ジスルフィド結合によって共有結合される抗原決定基を含む組成物を生成する方法を実行するための説明書のための細胞など、追加の成分を含むことができる。以下の実施例は、特定の特異的な特徴及び/又は実施形態を示すために提供される。これら実施例は、記載される特異的な特徴又は実施形態に対して本開示を限定するためには解釈されるべきでない。実施例1材料及び方法rIAg7の設計、発現、生成及び精製組み換え型T細胞受容体リガンドRTLの設計、クローニング、及び発現の一般的な方法は、以前に記載されているBurrowsetal.,ProteinEng.12:771-778,1999;Changetal.,J.Biol.Chem.276:24170-24176,2001;Huanetal.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005;Fontenot,etal.,J.Immunol.177:3874-3883,2006;その全ては引用により本明細書に組み込まれる。ネズミI-As-由来のRTL400Offneretal.,J.Immunol.175:4103-4111,2005を、組み換え型IAg7RTL450シリーズ遺伝子の構成のためにテンプレートとして使用した。テンプレートを修飾するために具体的に設計される対となるオリゴプライマーを合成し、rIAg7RTL450;配列番号4を生じさせるために使用した。遺伝子を、NcoIとXhoIの制限酵素Novagen,Gibbstown,NJを使用してpET21dベクターへ方向性にdirectionally結紮し、陽性のコロニー選択のため、Novablueの大腸菌の宿主Novagenに形質転換した。構成物の一次配列を、DNA配列によって確認した。その後、確認された配列を有するプラスミド構成物を、発現のために大腸菌株BL21DE3Novagenに形質転換した。これらのタンパク質の発現、精製及びリフォールディングは、以前に記載された手順に従ったHausmannetal.,J.Exp.Med.189:1723-1734,1999。簡潔に、対象のプラスミド構成物を含んでいるBL21DE3細胞を、37°Cでカルベニシリン50mg/mlを含んでいるルリア=ベルターニLBブロス中の対数中期mid-logarithmicphaseOD600=0.6-0.8に対して1リットルの培養物中で成長させた。組み換え型タンパク質生成を、0.5mMのイソプロピルβ-D-チオガラクトシドの追加によって誘発した。3時間のインキュベーションの後、細胞を、遠心分離によって採取し、処理の前に-80°Cで保存した。細胞のすべての後の操作を4°Cで行った。細胞ペレットを、氷冷のPBS、pH7.4中で再懸濁し、塩/氷/水浴で冷却された細胞懸濁液により4×20秒で超音波処理した。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、上清の断片を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、PBSで3時間洗浄し、その後、20mMのエタノールアミン/6Mの尿素、pH10を4時間再懸濁した。遠心分離後、可溶化されたrIAg7を含む上清を集め、精製まで4°Cで保存した。XK26/20カラムPharmaciaBiotechの中でソース30Q陰イオン交換培地PharmaciaBiotech/GELifesciences,Piscataway,NJを使用する高速タンパク質液体クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィーによる、rIAg7に関与する濃度の精製を、緩衝液B20mMのエタノールアミン、pH10.0、6Mの尿素、2MのNaClで負荷し、次に、緩衝液ANaClを引いた緩衝液Bにより平衡に保った。およそ100mlの溶解物サンプルを1.5-2.0ml/分で充填した。タンパク質を、工程勾配105mlの1のB、75mlの2のB、120mlの3のB、70mlの4のBを使用して、その後直線勾配130mlの4乃至100のBにより溶出し、次に、5ml/分の流量で、23mlの100のBにより取り除いた。rIAg7を含む断片を、SDS-PAGEによる断片の分析に基づいて収集し、貯蔵し、緩衝液C6Mの尿素、20mMのエタノールアミン、pH10、200mMのNaClに対して広範囲に透析した。均質性に対する精製のため、緩衝液C中のHR16/50カラムPharmaciaBiotechにおけるSuperdex75培地PharmaciaBiotech上でサイズ排除クロマトグラフィーを使用する完了工程を使用した。精製されたrIAg7を含む断片を貯蔵し、0.1mg/mlまで希釈し、rIAg7を、20mMのトリス、pH8.5に対して0.1mg/mlでの広範囲な透析により、リフォールディングした。その後、タンパク質を短期貯蔵4°Cのため1mg/mlにまで濃縮し、又は-80°Cでの長期貯蔵のため液体N2中でスナップ凍結したsnap-frozen。精製されたrIAg7の最終的な収量SDS-PAGEによって推測されるように、約90純粋は、15及び30mg/Lの細菌培養間で異なる。レドックス捕捉条件200μg/mlでの10:1のペプチド:rIAg7、100mMのNaPO4、pH6.5;150mMのNaCl;0.05のSD;及び0.01のNaN3の混合物を、生成した。任意の沈澱のため混合物を検査した後に、反応を37°Cで60時間インキュベートした。レドックス捕捉条件がMHCによってペプチド捕捉を促進する能力の分析を、以下のように行った:様々な時点の20μlのアリコートを、2倍の電気泳動サンプル緩衝液1のグリセロール、500mMのトリス、0.2のSDS、及びpH8.0でのブロモフェノールブルーの等量と混合した。その後、サンプルを30分間氷の上に置き、β-メルカプトエタノールにより、又はβ-メルカプトエタノールなしで、90°Cで6分間加熱して、10-20のSDS-PAGEによって分離し、その後クマシーブルー染色を行い、タンパク質を視覚化した。タンパク質を、MolecularImagerFX5及びQuantityOnesoftwareBio-Rad,Hercules,CAを使用するデンシトメトリー走査によって定量化した。動物生後7-8週のC57BL/6のオスのマウスを、JacksonLaboratoriesBarHarbor,MEから得た。C57BL/6バックグラウンド上のガンマインターフェロン誘発性のリソソームのチオール還元酵素GILTのノックアウトマウスも、得たMaricetal.,Science294:1361-1365,2001。マウスを、制度上のガイドラインに従って、PortlandVeteransAffairsMedicalCenterPortland,OR,USAにある動物資源設備に収容した。研究を、実験動物の使用のための国立衛生研究所のガイドラインに従って行い、プロトコルは、InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeにより承認された。抗原ヒト組み換え型MOGrhMOGを、BettadapuraetalJ.Neurochem.70:1593-1599,1998に記載する。合成のヒトhMOG-35-55MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK;配列番号5、マウスMOGmMOGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK;配列番号6、インスリンB:9-23SHLVEALYLVCGERG;配列番号3、同様に、短くされ、システインにより置換された変異体を、GenscriptInc.Piscataway,NJにより合成した。活性EAEの誘発及びRTL551による処置マウスを、2mg/mlの熱により死滅した結核菌MyobacteriumtuberculosisMTbを含む完全フロインドアジュバントの等量における、100μgのrhMOGペプチド又は100μgのmMOG-35-55ペプチドにより免疫化した。全てのマウスにまた、免疫化に関連して、0日目及び2日目に、75及び200ngの百日咳毒素を腹腔内に注入した。マウスを、以下のスケールに従い、実験的自己免疫性脳脊髄炎EAEの徴候のために評価した:0、正常;1、尾の引きずり又は軽度の後肢の虚弱;2、中程度の後肢の虚弱又は軽度の運動失調症;3、中程度に深刻な後肢の虚弱;4、深刻な後肢の虚弱又は軽度の前肢の虚弱、或いは、中程度の運動失調症;5、単なる中程度の前肢の虚弱による対麻痺;及び6、深刻な前肢の虚弱又は深刻な運動失調症による対麻痺或いは瀕死状態。EAEの臨床症状の発症時臨床的なスコアが2以上であった時、10-13日目に、マウスを2つのグループに分け、8日間、抗ヒスタミン剤に加えて、対照として100μlの20mMのトリス-HClにより、又は、1mg/mlのI-Ab-由来のrIAbRTL550;空、RTL551遺伝的にコード化したMOG-35-55アミノ末端拡張を有するrIAb、又はRTL550-Cys-MOGrIAb/MOGにより、静脈内で処置する。抗ヒスタミン剤の効果は、SJL/JHuanetal.J.Immunol.172:4556-4566,2004又はC57BL/6のマウスにおけるEAE誘発及び進行時には観察されなかった。遊離ペプチド、SJL/Jに対するPLP-139-151、及び抗ヒスタミン剤でのC57BL/6のマウスに対するMOG-35-55のモル当量の投与は、未処置のマウスと比較して、EAEを有するマウスに対して著しい臨床的な利点を有していなかった。マウスを疾患スコアの変化のために監視し、エキソビボexvivo分析のために安楽死させられるまで、示されるような処置により追加免疫した。実施例2抗原ペプチドのジスルフィド捕捉ヒトDR-、DP-及びDQ-、ネズミのI-Ab、I-As、及びルイスラットのRT1.Bに由来する単一の鎖の構成物の設計及び特徴付け、名付けられた組み換え型T細胞受容体リガンドRTLは、以前に記載されている。RTLの構成物は、T細胞行動を調節する能力を有しBurrowsetal.,J.Immunol.167:4386-4395,2001、EAEヒト多発性硬化症のための動物モデル、慢性のベリリウム疾患、ブドウ膜炎Adamusetal.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47:2555-2561,2006及び卒中Subramanianetal.,Stroke40:2539-2545,2009を含む様々な自己免疫障害における、インビトロinvitro及びインビボinvivoでの有効性を有する。単一のポリペプチドrIAg7;RTL450シリーズとして発現された、MHCクラスII分子のβ1とα1のドメインを含むIAg7の組み換え型形態rIAg7を、設計した。IAg7由来の構成物は、大腸菌で容易に生成され、水溶性の緩衝液において正常に動作し、抗原のペプチドを結合する。MHCクラスIIβ1ドメインはすべて、システイン17とシステイン79の間のジスルフィド結合を含む。インスリンB:9-23は、IAg7を結合し、位置19にシステイン残基を含む、抗原のペプチドである。実施例1に記載のインスリンB:9-23の存在下でrIAg7をジスルフィド捕捉状態にさらし、その後、非還元条件下でサンプルを電気泳動にさらすと、より高度に明らかな分子量の多くのバンドが現われた。より高度な分子量バンドは、サンプルが還元条件下で電気泳動にさらされた時には現われなかった図1。より高度な分子量バンドは、インスリンB:9-23がジスルフィド捕捉条件下でrIAg7に加えられた時にのみ存在し、B:C17-C79ジスルフィド結合の破壊によって、rIAg7に共有結合的に繋ぎとめられている9-23のペプチドのシステイン19が原因であった。IAg7/ペプチド複合体WTは、空のrIAg7分子より高い分子量の種29及び31kDの種として遊走した。アミノ末端FITCに結合したB:9-23誘導体を生成し、ペプチド結合、及び、現れた様々なより高度な分子量バンドが特徴づけられる速度を測定するために使用した。最も効率的なジスルフィド補足インスリンB:9-23のペプチドは、位置19でCysを有する野生型の配列であった図2。システインが位置18SHLVEALYLCAGERG;配列番号7又は20SHLVEALYLVACERG;配列番号8に移動したインスリンB:9-23の変異体は、補足されるジスルフィドであったが、効果は著しく少ない図2。実施例3rIAg7によるジスルフィド捕捉の時間経過クマシーによって染色したバンド示されるように。29kD及び31kDを、捕捉の初速度を測定するために定量化した図3。インスリンB:16-23のペプチドFITC-YLVCGERG;配列番号1及びrIAg7を、100mMのNaPO4、pH6.5、150mMのNaCl、0.05のSDS、及び0.01のNaN3中で混合し10:1、ペプチド:rIAg7、示された時間の間のインキュベートを可能にした。デンシトメトリー結果を図4に示す。B:9-23のシステインがアラニンSHLVEALYLVAGERG;配列番号9に修飾されたペプチドは、補足されるジスルフィドでなかった。更に、アミノ末端を切断したB:9-23のペプチド変異体を、ジスルフィドを補足する能力に関して試験した。効率的に補足され得る最短のペプチドは、B:9-23のC-末端8アミノ酸を含む、FITCにより標識化された8-merのインスリンB:16-23であった。このペプチドは、約1時間の最大の捕捉率の半分を有した。実施例4質量分析を使用するジスルフィド捕捉の分析タンパク質消化と質量分析の質量分析の組合せを、インスリンB:9-23のペプチドがどのように捕捉されるか、同様に捕捉の化学作用をより明確に測定するために使用した。一次配列を、ペプチド、及び、rIAg7のトリプシン消化後に得られるペプチドのジスルフィドと架橋結合した種を予測するために使用した。予測されたペプチドの質量電荷比m/zを計算した。完全なトリプシンの消化を、特有のm/z値を有する対象のペプチドをもたらすために予想し表1、質量分析法がジスルフィド捕捉の性質を明らかにし得ることを示唆する。表1は、rIAg7とインスリンB:9-23の予測されたトリプシンの断片を示し、rIAg7、インスリンB:9-23、及び潜在的なジスルフィドと架橋結合した種の対象のトリプシン消化断片のモノアイソトピック質量monoisotopicmassesm、トリプシンの可能な荷電状態z、及びm/z比率を含む。遊離したシステイン残基のヨードアセトアミドIAAによるカルボキシイミドメチル化carboxyimidomethylationの際、利用可能ならば、質量を57単位増加する。モノアイソトピック質量を、ウェブブラウザインタフェース計算機prospector.ucsf.edu/を使用して計算した。カルボキシ末端のグリシンが、インスリンB:9-23のペプチドから開裂されないことに注意する。全体の質量測定は、rIAg7がインタクトな内部ジスルフィド結合を含有することを確認した図5。インスリンB:9-23を、レドックス捕捉条件下でrIAg7によりインキュベートし、更なるジスルフィド交換反応をIAAの追加によってクエンチした。その後、サンプルを沸騰させ、10-20のSDS-PAGEによる非還元条件下で分離した。電気泳動による分離後、rIAg7約26kDに対応するゲル切片、及び29kD並びに31kDのより高度な分子量バンドを、インスリンB:9-23のペプチドにより充填されるrIAg7を含むレーンから切除した。ゲル切片をトリプシンにより消化し、MSにより分析した。プロセスと結果の概要を図6に示す。インタクトなC17-C79ジスルフィド結合を含有する、ジスルフィドに結合したトリプシンの断片と一致する質量対電荷m/z比率を有するペプチド断片を、非還元のrIAg7サンプルで容易に観察した表2。還元された及びアルキル化されたrIAg7のトリプシン消化は、15-25GECYFTNGTQR;配列番号10及び73-80AELDTACR;配列番号2のシステインによりアルキル化されたペプチド断片に対応した、m/z比率を有するペプチド断片を含んでいた図6。非還元の29kD及び31kDの結合は、両方とも、m/zのインスリンBに結合したrIAg7ジスルフィドから73-80のペプチドに対応するm/z比率を有するペプチドを含んでいた図6。Cys-17での結合に一致するm/z値を有するペプチドも観察した。データは、優先的なジスルフィド捕捉、及び、インスリンB:9-23のペプチドのCys-19の、少なくとも平衡時間点約50時間の捕捉のCys-79のrIAg7への挿入を示唆する。インスリンB:9-23に結合されるrIAg7のアミノ酸73-80のトリプシンペプチドを容易に検出した。様々なサンプルからのトリプシンの断片を、rIAg7によるインスリンB:9-23のペプチドのインキュベーション後に検出された対象の混合されたジスルフィド種を測定する目的で、Xcalibur登録商標ソフトウェアThermo-Scientific,Waltham,MAを使用して分析した。rIAg773-80に関連する、還元し、アルキル化した2イオンを、容易に観察した。実施例5他のクラスIIMHC分子に由来するRTLによるペプチドのジスルフィド捕捉P4ポケット位置に単一のシステイン置換基を有するペプチド、及び、異なるMHC対立遺伝子を結合するのに適切なアンカー残基を生成し、組み換え型DR2図7、組み換え型I-Ab図8、及び組み換え型DR4RTLによるそのような抗原のペプチドのジスルフィド捕捉の結果をもたらした。ジスルフィド捕捉の効果は、補足されるペプチド中のシステイン置換の位置、使用されるMHC対立遺伝子の結合モチーフに対していかに十分にペプチドが適合するか、及びペプチドの酸化還元反応の状態に依存した。組み換え型ヒトDR2配列番号11を、システイン残基配列番号5を含まない野生型MOG35-55ペプチド;位置42でセリンの代わりにシステインを含むために設計されたMOG35-55S42C変異体MEVGWYRCPFSRVVHLYRNGK;配列番号12;或いは、位置43でプロリンの代わりにシステインを含むために設計されたMOG35-55P43C変異体MEVGWYRSCFSRVVHLYRNGK;配列番号13で、充填する。変異させられていないMOG35-55WTで充填されたrDR2は、より高い明らかな分子量の種を形成せず、S42C変異体は、より効率的に、P43C変異体より高い明らかな分子量の種を形成した図7。これは、rIAg7に類似している、rDR2に対するペプチド結合の記録が、捕捉の効果に影響を与える因子であることを示す。組み換え型ネズミI-Ab配列番号14を、S45Cで変異したマウスMOG35-55MEVGWYRPPFCRVVHLYRNGK;配列番号15で充填した。より高い明らかな分子量の種を、還元条件下で形成した図8。PLP-139-151HCLGKWLGHPDKF;配列番号16などの幾つかのペプチドは、MHCクラスIIのβ1ドメインのC17-C79ジスルフィド結合により妨害する代わりに、システインに結合した連結するホモ二量体のペプチドを形成した。これは、PLPペプチド配列によるものであり、又は、特定のペプチド調製の人為的結果であったかもしれない。実施例6ジスルフィドにより補足されたペプチドによるRTLの設計ネズミH2-IAg7及びヒトHLA-DQ8から自然に処理されたペプチドを、保存された化学的な特徴を有する9-merのコア配列モチーフを定義するために使用したWingetal.,Immunol.106:190-199,2002;Levisettietal.,Int.Immunol.15:1473-1483,2003;Surietal.,J.Clin.Invest.115:2268-2276,2005。9-mer量体のコア配列が、IAg7とDQ8の糖尿病誘発性のクラスIIMHC分子に関する複雑な結合モチーフを示した一方で、IAg7とDQ8の結晶学的な構造分析により支持された、自然に処理されたペプチドを配列する1つの明確な結果は、両方のMHCクラスII対立遺伝子が、カルボキシ末端の方に酸性のアミノ酸を含有するペプチドを好みfavor、多くのペプチドが、C末端の方に2倍又は3倍の酸性の残基の移動runsを含む両方の対立遺伝子から分離されたことであるWingetal.,Immunol.106:190-199,2002;Surietal.,J.Clin.Invest.115:2268-2276,2005。IAg7とDQ8の構造の特徴付けは、P9ポケットの特有の特徴を明らかに文書化し、酸性のp9残基は、IAg7のα鎖のArg76によるイオン対の形成を可能にし、ペプチド:MHCの複合体を安定させるように思われるCorperetal.,Science288:505-511,2000;Lateketal.,Immunity12:699-710,2000;Leeetal.,Nat.Immunol.2:501-507,2001;Yoshidaetal.,J.Clin.Invest.120:1578-1590,2010。IAg7とDQ8の構造間の重要な違いは、P4ポケットであり、それにおいて、DQ8は大きな残基を好むように思われるLeeetal.,Nat.Immunol.2:501-507,2001。従来の結合記録におけるインスリンB:9-23のペプチドのアラインメントは、HLA-DQ8構造に対する結合が3Å分割を決定したとき、インスリンB:9-23のための場合であるようにTyr16がIAg7のP4ポケットを占めることを示唆するPDBaccession1JK8Leeetal.,Nat.Immunol.2:501-507,2001。しかしながら、研究のモデル化は、代替の従来のものでない結合モチーフがまた、妥当性があるもの、特に、インスリンB:9-23のTyr-16が、IAg7のP1ポケットを占め、P9ポケット中の酸性の接触に寄与するペプチドのカルボキシル末端を占めるものであることを、強く示唆する。この非従来型結合記録は、すべてのMHCクラスIIβ鎖全長のMHCクラスIIにおけるC15-C79に保存される、C17-C19の鎖内のジスルフィド結合から適切な距離で、P4ポケット中にC19を置き、その結果、この高度に保存されたジスルフィド結合への挿入によってジスルフィド捕捉が起こり得る図9この非従来型の結合記録を支持する詳細の多くについて、結合ペプチド{1ESO、IAg7GAD-207-220YEIAPVFVLLEYVT;配列番号17Corperetal.,Science288:505-511,2000;1F3J、IAg7HEL-11-25AMKRHGLDNYRGYSL;配列番号18Lateketal.,Immunity12:699-710,2000を有する、IAg7の結晶構造により説明することができる。3点を注目する。最初に、IAg7のP1ポケットは最大のポケットであり、GAD-207-220ペプチドを含んでいる1ESO構造における、疎水性のイソロイシン及び3つの埋没された水分子によって、単に部分的に占めるCorperetal.,Science288:505-511,2000。親水性及び疎水性の残基の両方は、P1ポケットの表面を形成する。これらは、親水性のα鎖His24、及び、β鎖Asn82、Thr86、及びGlu87、並びに、疎水性のα鎖残基Tyr8、Leu31、Phe32、Trp43、Ile52、及びPhe54を含む。この多様なセットの残基は、インスリンBTyr-16の収容を含む、P1残基のタイプ及び大きさにおける広範囲の特異性を許容する。次に、P4ポケットは、小さい一方で、特性が疎水性であり、バリン残基によって単に部分的に占められる。追加の空間は、インスリンB:9-23のCys-19、同様に、ロイシン又はイソロイシンなどのわずかに大きな疎水性の残基を収容することができる。第3に、2つの配向は、IAg7中のP9側鎖に関して起こり得るように思われる。一方は、適切なペプチド溝へと下方を指し、もう一方は横向きを指す。P9ポケットの浅さは、カルボキシル基を提供するカルボキシル末端でp8に終わる、小さな側鎖グリシン、アラニン、及びおそらくセリン又は短いペプチドのみが、下方の配向に収容することができることを示唆する。陽性に負荷された環境は、陰性に負荷された残基を好むが、IAg7構造で観察された特有の横向きの配向Corperetal.,Science288:505-511,2000は、大きな側鎖に培地を収容させることができる。したがって、構造のデータは、本明細書に開示のデータによって示唆された非従来型の記録を支持し、IAg7が、P4ポケットを占めるTyr-16を有するインスリンB:9-23のペプチドを収容することを可能にする。実施例7ジスルフィドにより補足されたペプチドを有する組み換え型IAg7が、NODマウスを処置する非肥満糖尿病NODマウスを、ジスルフィドにより補足されたB:9-23のペプチドを有する組み換え型IAg7、RTL450空のrIAg7、又はビヒクルにより処置した。その後、生存を測定した。ジスルフィドにより補足されたB:9-23による処置を受けたマウスは、他の両方のグループよりもより良い生存を示した図10。実施例8ジスルフィドにより補足されたペプチドを有する組み換え型DR2がEAEマウスを処置するEAEをマウスに誘発し、マウスをその後、ジスルフィドにより補足されたMOG35-55のペプチドを有するRTL550、RTL551遺伝的にコード化されたMOG-35-55アミノ末端拡張を有するrIAb、又はビヒクルにより処置した。その後、臨床的なEAEスコアを測定した。ジスルフィドにより補足されたMOG35-55を有するRTL550RTL-Cys-MOGにより処置されたマウスは、RTL551により処置されたマウスと比較して、類似の疾患経過及び累積疾患指数を有していた図11A及びB;表3。実施例9ジスルフィドにより補足されたペプチドによる、GILTノックアウトマウスの処置EAEを、C57BL/6GILT-/―マウスに誘発した。マウスを、ビヒクル、又は、ジスルフィドにより補足されたMOG35-55ペプチドRTL550-Cys-MOGを有するRTL550により処置し、EAEスコアを測定した。ジスルフィドにより補足されたMOG35-55ペプチドを有するRTL550による処置は、ビヒクルで処置したマウスと比較して、EAEスコアを有意に改善しなかった図12A及び12B。処置された及び処置されていないマウスの疾患経過を、表4に示す。本開示の原則が適用され得る、多くの起こり得る実施形態を考慮して、示された実施形態が実施例のみであり、本発明の範囲を限定するものとして捉えられるべきでないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。それ故、我々は、本発明として、これらの請求項の範囲及び精神の中に生ずるものすべてを請求する。"