"腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞を含む3次元スフェロイド又は凝集体を抗体とともにインキュベートすることを含む、抗体のエフェクター機能のインビトロ検出のための方法。aナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、bマルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、cマルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、dマルチウェルプレートのウェルに抗体を添加し、e約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、f蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。ナチュラルキラー細胞がヒトのナチュラルキラー細胞であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞が10:1から1:10の比率で混合されることを特徴とする、先行する請求項の何れか一項に記載の方法。比率が1:2から1:4であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。インキュベーションが約20時間から約28時間であることを特徴とする、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。遠心分離が1000rpmで10分間であることを特徴とする、請求項2から6の何れか一項に記載の方法。腫瘍細胞がリンパ腫細胞であることを特徴とする、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。リンパ腫細胞が、Raji細胞、又はSU-DHL4細胞、又はZ138細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。抗体が15μg/mlから0.1μg/mlの濃度で添加されることを特徴とする、請求項2から9の何れか一項に記載の方法。抗体が8μg/mlから12μg/mlの濃度で添加されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。多数の抗体と多数の腫瘍細胞との組合わせのエフェクター機能の決定のための、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む3次元スフェロイド又は凝集体の使用。aナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、bマルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、cマルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、dマルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を添加し、e約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、及びfエフェクター機能を有する抗体として、死細胞の生細胞に対する1を超える比率を有する抗体を決定することを含むエフェクター機能を持つ抗体をインビトロで決定するための方法。a蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞、b単離されたナチュラルキラー細胞、c96ウェルマルチウェルプレート、及びdヨウ化プロピジウムを含むキット。実施例1材料と方法細胞株:Raji細胞、SU-DHL4細胞及びZ138細胞株は、ATCCマナッサス、バージニア州、米国、DSMZブラウンシュヴァイク、ドイツ、及びM.Dyer教授レスター大学、英国からそれぞれ入手した。加湿インキュベーター中37°Cで、10FCSGibco社、カタログ番号10500-064とペニシリン/ストレプトマイシンRoche社、カタログ番号11074440001を補充されて、Raji細胞およびSU-DHL4細胞は、RPMI1640培地PANBiotech,カタログ番号P04-18500中で、Z138はDMEM培地PANBiotech,カタログ番号P04-02500中で培養された。90以上の細胞生存率を有する対数増殖期細胞が、NK細胞の共培養実験に使用された。NK細胞の生成:通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれたBectonDickinson,カタログ番号368484。PBMCはフィコールの調製によって得られたPANBiotechカタログ番号P04-60125。NK細胞を触れずに残すために、NK細胞は、NK細胞と負の選択キットを用いて精製したMiltenyi,カタログ番号130-092-657。短く言えば、フィコールで単離されたPBMCが、1x107細胞/40μlでMACSバッファーに再懸濁された。10μlのNK細胞ビオチン抗体カクテルが細胞に添加され、4°Cで10分間インキュベートされ、その後30μlのMACSバッファーが添加された。その後、20μlのNK細胞マイクロビーズカクテルが細胞に添加され、4°Cで15分間インキュベートされ、2mlのMACSバッファーが添加され、細胞は10分間300gで遠心分離された。ペレットは500μlのMACSバッファーに再懸濁され、500μlのMACSバッファーで先に平衡化された分離カラム上にロードされた。カラムは続いて500μlのMACSバッファーで3回洗浄され、CASY細胞カウンターSchaerfeSystemを使用して全溶出中で決定された。NK細胞調製物の純度は、一定分量のMACS溶出液を染色することによって決定した。短く言えば、約2x105細胞が100μlのRPMI1640/10FCSに再懸濁され、抗CD56PE抗体及び抗CD3FTIC抗体の各々10μlで各々はBectonDickinson,カタログ番号555516及び5553394°Cで15分間染色された。その後、2mlのRPMI1640/10FCSが細胞に添加され、400gで5分間遠心分離された。ペレットは0.5mlのRPMI1640/10FCSに再懸濁され、リンパ球散乱ゲート内のCD56陽性だがCD3陰性である細胞画分の割合が、FACSスキャン又はFACSCantoII測定器を用いて分析されたBectonDickinson。単球の精製:通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれたBectonDickinson,カタログ番号368484。PBMCはフィコールの調製によって得られたPANBiotechカタログ番号P04-60125。単球を触れずに残すために、単球は、負の選択、単球濃縮キットStemCellTechnologies,カタログ番号19059を用いて精製された。リンパ腫細胞のCMFDA染色:CMFDA凍結乾燥物インビトロジェン、カタログ番号C7025がDMSOに再懸濁され、10mMストック溶液を得た。1×106リンパ腫細胞が、1μMのCMFDAを補った1mlの完全培地中、30分間、37°Cでインキュベートされた。その後、細胞は、ペレット化され、完全培地で一回洗浄し、最終的に1×106細胞/mlで完全培地中に再懸濁した。実施例2リンパ腫細胞株からの3Dスフェロイド/凝集体の生成リンパ腫細胞数がCASY測定器Schaerfe-Systems,Reutlingenを用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に2.5×104細胞/mlスフェロイド/凝集体あたり5000細胞及び5×104細胞/mlスフェロイド/凝集体あたり10000細胞に希釈された。細胞懸濁液の容積200μlが、丸底コーニング社、ニューヨーク、米国または円錐形底Nunc,Roskilde,オランダの96ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは95エタノールv/v中の0.5polyHEMAPolysciences社、Eppelheim、ドイツ50μlでプレコーティングされ、3日間37°Cで空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機5810エッペンドルフAG、ハンブルグ、ドイツを用いて、10分間1,000gでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、37°C、7CO2で、標準的な細胞培養条件下で培養した。実施例3固形腫細胞株からの3Dスフェロイド/凝集体の生成単層細胞は単一の細胞懸濁液を生成するためにAccutasePAAラボラトリーズ社、インスブルック、オーストリアで分離された。細胞数がCASY測定器Schaerfe-Systems,Reutlingenを用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に2.5×104細胞/mlスフェロイド/凝集体あたり5000細胞及び5×104細胞/mlスフェロイド/凝集体あたり10000細胞に希釈された。rBMは一晩氷上で解凍され、細胞懸濁液に氷冷ピペットチップで2.5の最終濃度v/vで添加した。細胞懸濁液の容積200μlが、丸底コーニング社、ニューヨーク、米国または円錐形底Nunc,Roskilde,オランダの96ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは95エタノール中の0.5polyHEMAPolysciences社、Eppelheim、ドイツ50μlでプレコーティングされ、3日間37°Cで空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機5810エッペンドルフAG、ハンブルグ、ドイツを用いて、10分間1,000gでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、37°C、7CO2で、標準的な細胞培養条件下で培養した。実施例4凝集体/スフェロイドリンパ腫/NKの共培養および抗体とのインキュベーション細胞の共培養と抗体添加の順序は変えることができる。典型的な共培養実験では、リンパ腫細胞CMFDAで標識およびNK細胞が、6穴プレートで示されるような比率で混合された。例えば、E:Tリンパ腫細胞に対するNK細胞の比率が3:1は31の混合例えば、75NK細胞と25のリンパ腫細胞に対応する。200μlの細胞懸濁液がpolyHEMAで被覆された96ウェルV字プレートの単一ウェルに添加されたNunc,カタログ番号249662。PolyHEMAコーティング:95エタノール中の0.5ポリHEMAがウェルあたり50μl;37°Cで72時間乾燥Polysciences,カタログ番号18894。プレートを1,000gで10分間遠心分離した。その後抗体は上記の濃度で添加され、細胞凝集体/スフェロイドは、加湿インキュベーターで37°C、7CO2でインキュベートした。NK細胞以外の免疫細胞との腫瘍細胞の3D共培養を説明するために、Raji細胞のみと精製NK細胞と共培養されたRaji細胞の顕微鏡画像、並びに共培養されたRaji細胞と単球細胞の画像が図7に示されている。実施例5生存細胞と細胞死の解析実施例2及び3で説明したように、スフェロイド/凝集体は10,000細胞を用いて生成され、抗体と共にインキュベートした。生存リンパ腫腫瘍細胞の同定は以下の通りであった:同一の実験条件を表す個々のウェルからの個々の凝集体がプールされ、ピペッティングにより解離され、10分間、300gで遠心分離した。個々のスフェロイドがプールされ、リン酸緩衝生理食塩水PBSで1回洗浄され、Accutase溶液に再懸濁され、37°Cでインキュベートされた。5分おきに、スフェロイド/凝集体がピペッティングして再懸濁され、解離は5分から15分以内に完了した。細胞は完全培地を用いて洗浄され、遠心分離され、細胞ペレットは完全培地中に再懸濁し、ヨウ化プロピジウムが1μg/mlの濃度で添加されたシグマ社、カタログ番号P4170。蛍光分析は、FACS分析ベクトンディッキンソン、CantoII測定器によって行われた。図1bに示すように、生存リンパ腫細胞を同定した。PI及びCMFDA陽性細胞の右上の象限は死滅リンパ腫細胞を表し、PI陰性だがCMFDA陽性細胞の右下の象限は生存リンパ腫の腫瘍標的細胞画分を表す。左下の象限は生存NK細胞であり、一方死滅NK細胞は左上の象限に位置している。代替設定では、アポトーシスアッセイを行うことができる。実施例2及び3で説明したように、スフェロイド/凝集体は10,000細胞を用いて生成され、抗体と共にインキュベートした。アポトーシスの解析では、スフェロイド/凝集体は、96ウェル円錐底プレートに移され、リン酸緩衝生理食塩水PBSで1回洗浄し、Accutase溶液に再懸濁され、37°Cでインキュベートされた。5分おきに、スフェロイド/凝集体はピペッティングして再懸濁され、解離は、5分から15分以内で完了した。8つのスフェロイド/凝集体からの単一細胞懸濁液がプールされ、補充した2mMのCaCl2アネキシンV-fluos染色キット、ロシュダイアグノスティックス社、マンハイム、ドイツの存在下で、アネキシンV-fluos及びヨウ化プロピジウムで染色された。10,000個の細胞の蛍光が、フローサイトメーターFACSスキャン測定器、ベクトンディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州、米国を用いて取得された。象限の統計に、左下の象限に位置する生存細胞の数が、ドットプロット上に適用された。死滅細胞と生存細胞の絶対数を得るために、スフェロイド/凝集体からの総細胞数は、フックスローゼンタール細胞計数チャンバーを用いて計数し、アネキシンV-fluos/PI染色から決定され、同一のスフェロイド/凝集体の生存細胞又は死滅細胞の割合が乗じられた。"