"非ヒト脊椎動物宿主において導入された免疫グロブリン領域を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳類であって、前記導入された領域がヒト免疫グロブリン可変領域コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳類。非ヒト脊椎動物宿主の免疫グロブリン可変領域遺伝子座における内在性可変遺伝子の一部または全部が除去される、請求項1に記載のトランスジェニック動物。導入される免疫グロブリン領域遺伝子座がヒトVHコード配列を含む、請求項1または2に記載のトランスジェニック動物。トランスジェニック動物が、ヒトD配列およびJコード配列ならびに前記非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD配列およびJ配列をさらに含む、請求項3に記載のトランスジェニック動物。内在性VH配列、D配列およびJ配列の一部または全部が脊椎動物宿主ゲノムから欠失している、請求項4に記載のトランスジェニック動物。前記非ヒト脊椎動物宿主が齧歯類である、請求項1~5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。前記非ヒト脊椎動物宿主がマウスである、請求項1~6のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。前記非ヒト脊椎動物宿主がニワトリである、請求項1~5のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む、非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、a2以上のリコンビナーゼ標的部位を非ヒト脊椎動物細胞内に導入し、前記細胞のゲノム上流における少なくとも1つの部位と、内在性免疫グロブリン可変遺伝子を含むゲノム領域の下流の少なくとも1つの部位とを統合するステップ;およびbヒトコード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を、リコンビナーゼ仲介交換により前記非ヒト脊椎動物宿主の細胞に導入するステップ;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が単一の核酸領域として導入される、請求項9に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、非ヒト宿主に導入される前に単一の核酸として合成される、請求項10に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が2以上の隣接核酸領域として導入される、請求項9に記載の方法。可変遺伝子領域がVH遺伝子領域である、請求項9~12のいずれか1項に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、iヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列、およびii非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列をさらに含む、請求項13に記載の方法。リコンビナーゼ標的部位が、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流ならびに内在性D遺伝子配列およびJ遺伝子配列の下流に導入される、請求項9~14のいずれか1項に記載の方法。リコンビナーゼ部位が1つまたは複数の選択マーカーと共に導入される、請求項9~15のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、前記ステップbに先立ち、2つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、請求項9~16のいずれか1項に記載の方法。前記非ヒト脊椎動物細胞が哺乳類胚性幹ES細胞である、請求項9~17のいずれか1項に記載の方法。前記非ヒト脊椎動物細胞が鳥類始原生殖細胞である、請求項9~17のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項9~19のいずれか1項に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップであって、少なくとも1つの組換え部位が内在性VH免疫グロブリン領域の上流に導入され、少なくとも1つの組換え部位が前記内在性VH免疫グロブリン領域の下流に導入されるステップ;biヒトVHコード配列と、ii内在性VH領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを、宿主細胞に提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップaの宿主細胞の前記内在性VH免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ステップbの前記ベクター、および2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ;およびd前記ステップaの前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性VH免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ;を含む、方法。第1のリコンビナーゼ部位が内在性VH免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の上流に導入され、第2のリコンビナーゼ部位が内在性VH免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の下流に導入される、請求項21に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、iヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、ii非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とをさらに含む、請求項21または22に記載の方法。前記方法が、前記ステップcに先立ち、2つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が胚性幹ES細胞である、請求項21~24のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および、前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項21~25のいずれか1項に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって:a互いに組換わることができない2つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップであって、少なくとも1つの組換え部位が内在性VL免疫グロブリン領域の上流に導入され、少なくとも1つの組換え部位が前記内在性VL免疫グロブリン領域の下流に導入されるステップ;biヒトVLコード配列と、ii内在性VL領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを、宿主細胞に提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップaの宿主細胞の内在性VL免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ステップbの前記ベクターおよび2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ;およびd前記ステップaの前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性VL免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ;を含む、方法。第1のリコンビナーゼ部位が内在性VL免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の上流に導入され、第2のリコンビナーゼ部位が内在性VL免疫グロブリン遺伝子を含むゲノム領域の下流に導入される、請求項27に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、iヒトJL遺伝子コード配列、およびii非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードJL遺伝子配列をさらに含む、請求項27または28に記載の方法。前記方法が、前記ステップcに先立ち、2つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、請求項27~29のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が哺乳類胚性幹ES細胞である、請求項27~30のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、請求項27~30のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項27~31のいずれか1項に記載の方法。トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップであって、前記2組の部位特異的組換え部位は、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の一部の両側に位置するステップ;b第1組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、前記ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の前記一部を欠失させるステップであって、前記ゲノムにおける前記欠失は、第2組の部位特異的組換え部位を保持するステップ;cヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含むベクターを提供するステップであって、前記ヒトコード配列および非コード配列は、前記第2組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;d前記ステップcの前記ベクターと、第2組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ;およびe前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との置換を生じさせるステップ;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域がVHコード領域を含み、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とをさらに含む、請求項34に記載の方法。前記方法が、前記ステップcに先立ち、2つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、請求項34または35に記載の方法。前記細胞が哺乳類胚性幹ES細胞である、請求項34~36のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、請求項34~36のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項34~37のいずれか1項に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2つの部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ;biヒトVHコード配列と、ii内在性VH領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、部分的ヒト領域は、前記ステップaの宿主細胞の前記ゲノムにおけるものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ステップbの前記ベクター、および2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを、前記細胞に導入するステップ;d前記ステップaの前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性VH免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、iヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、ii非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とをさらに含む、請求項40の方法。前記方法が、前記ステップcに先立ち、2つの導入されたリコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域を欠失させるステップをさらに提供する、請求項40または41に記載の方法。前記細胞が哺乳類胚性幹ES細胞である、請求項40~42のいずれか1項に記載の方法。前記細胞が鳥類始原生殖細胞である、請求項40~42のいずれか1項に記載の方法。前記方法が、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項40~43のいずれか1項に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト哺乳類細胞を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹ES細胞を提供するステップであって、前記2つの部位特異的組換え部位は、前記免疫グロブリン領域の一部の両側にあるステップ;bヒトVHコード配列と、内在性VH領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ES細胞における免疫グロブリン領域の前記一部の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ES細胞において、前記免疫グロブリン領域の内在性部分を部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、前記ES細胞および前記ベクターを、2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ;を含む、方法。前記部分的ヒト免疫グロブリン領域が、iヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、ii非ヒト宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とをさらに含む、請求項46に記載の方法。前記方法が、前記部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ、および前記細胞を単離するステップをさらに提供する、請求項46または47に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法であって、a互いに組換わることができない1つまたは複数の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ;biヒトVHコード配列と、ii内在性VH領域に基づいた非コード配列とを有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ステップaの宿主細胞の前記ゲノムに導入されるものと同じ部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ステップbの前記ベクター、および1組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ;d前記ステップaの前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性VH免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ;e部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ;およびf前記細胞を利用して、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すこと;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とをさらに含む、請求項49に記載の方法。部位特異的組換え部位が内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流、および内在性D遺伝子配列およびJ遺伝子配列の下流に導入される、請求項49または50に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹ES細胞を提供するステップであって、前記2つの部位特異的組換え部位は、免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置するステップ;bヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、前記部分的ヒト領域は、前記ES細胞において内在性免疫グロブリン領域の前記一部の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c前記ES細胞において、前記免疫グロブリン領域の内在性部分を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、前記ES細胞および前記ベクターを、2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ;d核酸の置換された部分を含むES細胞を選択し、前記胚性幹細胞を使用するステップ;およびe部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために前記細胞を利用して、ヘテロ接合の部分的ヒト哺乳類を産生すること;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトVHコード配列、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、非ヒト哺乳類宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とを含む、請求項52に記載の方法。部位特異的組換え部位が、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性D遺伝子配列およびJ遺伝子配列の下流に導入される、請求項52または53に記載の方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を産生する方法であって、a互いに組換わることができない2組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップであって、2組の部位特異的組換え部位は、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置するステップ;b第1組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の前記一部を欠失させるステップであって、前記ゲノムにおける前記欠失は、第2組の部位特異的組換え部位を保持するステップ;cヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップであって、前記コード配列および非コード配列は、前記第2組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;d前記ステップcの前記ベクター、および第2の部位特異的組換え部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを前記細胞に導入するステップ;e前記細胞の前記ゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と部分的ヒト免疫グロブリン領域との置換を生じさせるステップ;f部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ;およびg前記細胞を利用して、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すステップ;を含む、方法。部分的ヒト免疫グロブリン領域が、ヒトVHコード領域、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列とを含む、請求項55に記載の方法。部位特異的組換え部位が、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性D遺伝子配列およびJ遺伝子配列の下流に導入される、請求項55または56に記載の方法。完全にヒト化された免疫グロブリンマウスの多くは、低効率VDJ組換えのため、通常の率より抗体産生が低く、また部分的遺伝子補体が原因で抗体産生が制限される。マウスコード配列がヒト配列と交換されている他のマウスの産生は、シンテニーのヒト対応物と個々のマウスエクソンとを置換するその手法のため、非常に時間がかかり且つ高価である。前述により、ヒト抗体を効率よく産生する能率的且つ対費用効果の高い方法が必要なことは明白である。より具体的には、ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物、および抗原に適切に応答する能力を有するトランスジェニック動物が当該技術分野で必要である。前述の目的に従って、ヒトV領域を有する抗体を生産できるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。この概要は、下記発明の詳細な説明でさらに後述する概念の一部を簡略化された形で紹介するために提供する。この概要は、請求する主題の重要な特徴または必須の特徴を確認することを意図するものではなく、また請求された主題の範囲を制限するために用いられることを意図するものでもない。請求する主題の他の特徴、詳細、有用性、および利点は、添付図面に図示されたり、別記の特許請求の範囲に明記されたりしている態様を含む、発明の詳細な説明から明白になるであろう。本発明は、非ヒト脊椎動物細胞、および導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物を含み、導入された領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座コード配列、および非ヒト脊椎動物の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む。好ましくは、本発明のトランスジェニック細胞およびトランスジェニック動物は、内在性免疫グロブリン領域の一部または全部が除去されているゲノムを有する。最低でも、非ヒト脊椎動物におけるヒトモノクローナル抗体の産生には、宿主が、ヒト重鎖免疫グロブリン蛋白質を発現する少なくとも1つの遺伝子座およびヒト軽鎖免疫グロブリン蛋白質を発現する1つの遺伝子座を有することが必要である。幾つかの態様で、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトVHコード配列および非ヒト脊椎動物の内在性VH領域に基づいた非コードVH配列を含む。これらの態様で、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列ならびに非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子配列およびJ遺伝子配列をさらに含む。他の態様で、免疫グロブリン領域は、ヒトVLコード配列および非ヒト脊椎動物の内在性VL領域に基づいた非コードVL配列を含む導入領域を含む。より好ましくは、導入されたヒトVLコード配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトJ遺伝子コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードJ遺伝子配列をさらに含む。ある特定の態様で、脊椎動物は哺乳類であり、好ましくは哺乳類は、齧歯類、たとえば、マウスまたはラットである。他の態様で、脊椎動物は鳥類、たとえば、ニワトリである。具体的な一態様で、本発明は部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法を提供し、該方法は:a非ヒト脊椎動物細胞内に2以上のリコンビナーゼ標的部位を導入し、細胞のゲノム上流における少なくとも1つの部位と、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むゲノム領域の下流の少なくとも1つの部位を統合するステップ;およびbヒト免疫グロブリン可変領域コード配列と、非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を、リコンビナーゼ仲介交換によって、非ヒト脊椎動物宿主細胞内に導入するステップを含む。この方法の具体的な態様で、導入される部分的ヒト免疫グロブリン領域はヒトVH遺伝子コード領域を含み、iヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列ならびにii非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列をさらに含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、好ましくは、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性D遺伝子領域およびJ遺伝子領域の下流に導入されるリコンビナーゼ標的部位を使用して宿主細胞内に導入される。他の態様で、VH遺伝子コード領域は、少なくとも部分的に他のソースに由来する-たとえば、それらは合理的に設計されたまたは別の方法で設計された配列、ヒト配列と他の設計された配列の組合せである配列、あるいは非ヒト霊長類等の、他種由来の配列であってもよい。さらに別の具体的な態様で、導入される部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトVL遺伝子コード領域を含み、iヒトJ遺伝子コード配列およびii非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードJ遺伝子配列を、さらに含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、好ましくは、内在性VL免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性J領域の下流に導入されるリコンビナーゼ標的部位を使用して宿主細胞内に導入される。好ましくは、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、単一の核酸として合成され、単一の核酸領域として非ヒト脊椎動物宿主細胞内に導入される。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、2つ以上の連続したセグメントで合成することも可能であり、これらの不連続のセグメントで脊椎動物宿主細胞に導入してもよい。部分的ヒト核酸は、組換え方法を使用して産生することもでき、非ヒト脊椎動物宿主細胞への導入前に単離することもできる。別の好ましい態様で、本方法は、ステップbの前に、2つの導入されたリコンビナーゼ部位に挟まれたゲノム領域の欠失をさらに提供する。別の態様で、本発明は部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト脊椎動物細胞を産生する方法を提供し、該方法は:a少なくとも1つの組換え部位が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上流に導入され、且つ少なくとも1つの組換え部位が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の下流に導入される、互いに組換えができない2つ以上の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ;biヒト免疫グロブリン可変領域コード配列とii内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列を有する部分的ヒト免疫グロブリン領域とを含むベクターを、宿主細胞に提供するステップあって、上記部分的ヒト免疫グロブリン領域は、aの宿主細胞の内在性可変免疫グロブリン領域の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位に挟まれているステップ;cステップbのベクター、および2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ;daの細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、部分的ヒト免疫グロブリン領域遺伝子座で置換されるステップ;を含む。この方法の具体的な態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、VH免疫グロブリン遺伝子コード配列を含み、またiヒト遺伝子コード配列DおよびJ遺伝子コード配列ならびにii非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列をさらに含む。リコンビナーゼ標的部位は、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流ならびに内在性D遺伝子配列およびJ遺伝子配列の下流に導入される。この方法の別の具体的な態様で、本方法は、ステップcの前に、2つの導入リコンビナーゼ部位で挟まれたゲノム領域の欠失をさらに提供する。本発明は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞を産生するためのまた別の方法を提供し、該方法は:a互いに組換えができず、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する、2組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップ;b第1組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により、そのゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上記一部を欠失させるステップであって、ゲノムにおけるそのような欠失が、第2組の部位特異的組換え部位を保持するステップ;cヒトコード配列と、第2組の部位特異的組換え部位に挟まれた内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップ;dステップcのベクターおよび第2組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ;およびe細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座で置換されるステップ;を含む。好ましくは、上記各方法で使用するための非ヒト哺乳類細胞は哺乳類細胞であり、より好ましくは哺乳類胚性幹ES細胞である。他の態様で、細胞は鳥類細胞、好ましくは鳥類始原生殖細胞であってもよい。いったん、細胞が内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の置換を受けると、導入された部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含む細胞が選択され、好ましくは単離される。本発明の好ましい態様で、細胞は非ヒト哺乳類胚性幹ES細胞であり、単離されたES細胞は、次に、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類を作り出すために利用される。他の態様で、細胞は始原生殖細胞であり、この単離された生殖細胞は、次に、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を発現するトランスジェニック非ヒト鳥を作り出すために利用される。具体的な態様で、本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む非ヒト哺乳類細胞を産生する方法を提供し、該方法は:a互いに組換えができず、免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する2つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹ES細胞を提供するステップ;bヒト免疫グロブリン可変領域コード配列、および内在性免疫グロブリン可変領域に基づいた非コード配列を含む、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、ES細胞において免疫グロブリン領域の上記一部の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;c免疫グロブリン領域の内在性部分を、ES細胞における部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、ES細胞およびベクターを、2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ;を含む。別の態様で、本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を産生する方法を提供し、該方法は:a互いに組換えができない1つまたは複数の部位特異的組換え部位を、非ヒト脊椎動物宿主の細胞のゲノムに導入するステップ;biヒト可変コード配列およびii内在性可変領域に基づいた非コード配列を有する部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、aの宿主細胞のゲノムに導入されるものと同じ部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;cステップbのベクター、および1組のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを、細胞に導入するステップ;daの細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン可変領域が部分的ヒト免疫グロブリン領域で置換されるステップ;e部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ;およびfその細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用するステップ;を含む。具体的な態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、ヒトVHコード領域、ヒトD遺伝子コード配列およびJ遺伝子コード配列、および非ヒト脊椎動物宿主の内在性ゲノムに基づいた非コードD遺伝子およびJ遺伝子およびpre-DJ配列を含む。また、部位特異的組換え部位を、内在性VH免疫グロブリン遺伝子の上流および内在性D遺伝子領域およびJ遺伝子領域の下流に導入する。本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト動物を産生する別の方法を提供し、該方法は:a互いに組換えができず、宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の一部の両側に位置する、2組の部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞を提供するステップ;b第1組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入によって宿主ゲノムの内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上記一部を欠失させるステップであって、ゲノムにおけるそのような欠失が、第2組の部位特異的組換え部位を保持するステップ;cヒトコード配列、および内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むベクターを提供するステップであって、これらのコード配列および非コード配列が第2組の部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;dステップcのベクター、および第2組の部位特異的組換え部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを細胞に導入するステップ;e細胞のゲノムと部分的ヒト免疫グロブリン可変領域との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に内在性免疫グロブリン領域と部分的ヒト免疫グロブリン可変領域との置換を生じさせるステップ;f部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含む細胞を選択するステップ;およびgその細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用するステップ;を含む。本発明は、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生するまた別の方法を提供し、該方法はa互いに組換えることができず、免疫グロブリン領域の一部の両側に位置する、2つの部位特異的組換え部位を含むゲノムを有する非ヒト哺乳類胚性幹ES細胞を提供するステップ;bヒト可変コード配列、および内在性可変遺伝子領域に基づいた非コード配列を含む、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むベクターを提供するステップであって、上記部分的ヒト領域は、ES細胞における免疫グロブリン領域のその部分の両側に位置するものと同一の2つの部位特異的組換え部位で挟まれているステップ;cES細胞において、免疫グロブリン領域の内在性部分を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する結果となる組換え事象を促進する適切な条件下で、上記ES細胞および上記ベクターを、2つのリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させるステップ;d核酸の置換された部分を含むES細胞を選択し、上記胚性幹細胞を使用するステップ;およびeその細胞を、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むトランスジェニック動物を作り出すために利用して、ヘテロ接合部分的ヒト動物を産生するステップ;を含む。本発明の具体的な態様で、トランスジェニック非ヒト脊椎動物は哺乳類であり、好ましくは哺乳類は、齧歯類、たとえば、マウスまたはラットである。他の態様で、トランスジェニック非ヒト脊椎動物は鳥類、たとえば、ニワトリである。本発明の目的は、ヒト可変領域コード配列、および内在性宿主ゲノムに基づいた非コード配列を有する、導入された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を発現する非ヒト脊椎動物細胞および非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供することである。さらに、本発明の目的は、ヒトVH配列を有する部分的ヒト抗体を発現できるトランスジェニック動物由来のB細胞そのようなB細胞は、特定の抗原に特異的なモノクローナル抗体のソースを提供するために不死化されているを提供することである。また別の目的は、診断的使用および治療的使用のための抗体の産生および/または最適化で使用するために、B細胞からクローン化されたヒト可変領域を提供することである。本発明のさらなる目的は、ヒト可変領域配列を有する部分的ヒトモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞を提供することである。これらの態様および他の態様、目的および特徴を、さらに詳細に後述する。定義本明細書で使用される用語は、当業者により理解される平易で通常の意味を有することを意図する。以下の定義は、読者が本発明を理解するのに役立つことを意図するが、特に指示がない限り、そのような用語の意味を変更したり制限したりすることを意図しない。本明細書で使用される部分的ヒトは、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両者由来の配列を有する核酸、またはヒトおよび非ヒト哺乳類の両者由来の配列を有する核酸を含む動物を指す。本発明の部分的ヒト配列との関連で、部分的ヒト核酸は、ヒト免疫グロブリンコード領域の配列および非ヒト哺乳類の内在性免疫グロブリン領域の非コード配列に基づいた配列を有する。用語基づいたは、非ヒト哺乳類由来の内在性非コード配列に関連して使用されるとき、非コード配列に対応する配列を指し、宿主哺乳類、たとえば、ES細胞に由来する哺乳類の、内在性遺伝子座の非コード配列と比較的高度の相同性を共有する。好ましくは、非コード配列は、非コード配列を含む部分的ヒト分子が導入されようとしている非ヒト脊椎動物宿主細胞の内在性遺伝子座に存在する対応する非コード配列と少なくとも80、より好ましくは90相同性を共有する。用語相同ターゲティングベクターは、ターゲティング配列、部位特異的組換え部位、および任意選択的に選択可能なマーカー遺伝子をコード化する核酸を含み、宿主細胞において、相同性仲介組換えを使用して免疫グロブリン領域を改変するために使用される、ベクターを指す。たとえば、本発明で相同ターゲティングベクターを使用して、部位特異的組換え部位を宿主細胞ゲノムの特定の領域に導入することができる。本明細書で使用される用語免疫グロブリン可変領域は、抗体分子の可変領域の全部または一部あるいは抗体分子の発現を制御する制御ヌクレオチド配列の全部または一部をコード化するヌクレオチド配列を指す。重鎖に関する免疫グロブリン領域は、イントロンを含む、V領域,D領域,J領域,およびスイッチ領域の全部または一部を含んでもよいが、それらに限定されない。軽鎖に関する免疫グロブリン領域は、軽鎖定常領域遺伝子に付随するまたは隣接する、V領域およびJ領域、それらの上流フランキング配列、イントロン、を含むがそれらに限定されない。部位特異的組換えは、以下の3事象のいずれかを含む2つの互換性のある組換え部位間の組換えプロセスを指す:a組換え部位で挟まれた、予め選択された核酸の欠失;b組換え部位に挟まれた、予め選択された核酸のヌクレオチド配列の反転、およびc異なる核酸分子上に位置する組換え部位に最も近い核酸領域の相互交換。核酸分子の一方または両方が環状であれば、この核酸セグメントの相互交換は、結果的に組み込み事象を生じることを理解すべきである。用語ターゲティング配列は、細胞のゲノムにおいて改変すべき免疫グロブリン領域である領域の側方に位置するかまたは隣接して存在するDNA配列に相同な配列を指す。フランキング配列または隣接配列は、その遺伝子座自身の中であってもよく、あるいは宿主細胞のゲノムにおけるコード配列の上流または下流であってもよい。細胞ゲノムに挿入される配列組換え部位の配列等がベクターのターゲティング配列に挟まれるように、形質移入するために使用される組換えDNAベクターに該ターゲティング配列が挿入される。本明細書で使用される用語部位特異的ターゲティングベクターは、部位特異的組換え部位、部分的ヒト核酸、および任意選択的に選択可能なマーカー遺伝子をコード化している核酸を含み、リコンビナーゼ仲介部位特異的組換えを使用して、宿主における内在性免疫グロブリン領域を改変するために使用されるベクターを指す。ターゲティングベクターの組換え部位は、宿主細胞のゲノム配列に挿入されたたとえば、相同ターゲティングベクターによりもう1つの対応する組換え部位との部位特異的組換えに適する。当該組換え部位は、改変すべき免疫グロブリン領域に隣接して挿入される。免疫グロブリン領域における組換え部位への部分的ヒト配列の組み込みは、導入された部分的ヒト領域によって内在性領域の置換を生じさせる結果となる。用語導入遺伝子は、細胞、特に脊椎動物宿主動物の細胞の、ゲノム内に人工的に挿入された、または挿入されようとしている遺伝物質を記述するために、本明細書では使用される。本明細書で使用される用語導入遺伝子は、部分的ヒト核酸、たとえば、発現構築物および/またはターゲティングベクターの形の、部分的ヒト核酸を指す。トランスジェニック動物により、染色体外要素として存在する外因性核酸配列を細胞の一部に有するか、または生殖細胞系DNAに安定的にすなわち、その細胞の大部分または全部のゲノム配列に組み込まれた、非ヒト動物、通常は哺乳類を意味する。本発明では、当該技術分野で周知の方法に従って、遺伝子操作により、そうしたトランスジェニック動物の生殖細胞系に部分的ヒト核酸が導入される。当該生殖細胞系としては、たとえば、宿主動物の胚または胚性幹細胞がある。ベクターは、プラスミド、ウイルス、および、あらゆるDNA分子またはRNA分子を含み、自己複製してもしなくてもよく、細胞を形質転換または形質移入することができる。発明の詳細な説明本明細書に記載の技法の実行は、他に指示がない限り、当該技術分野で実行する者の技術の範囲内である、有機化学,高分子技術,分子生物学組換え技法を含む、細胞生物学,生化学、およびシーケンシング技術の、従来の技法および記述を使用することが可能である。このような従来の技法は、ポリマーアレイ合成,ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ならびに標識を使用したハイブリダイゼーションの検出を含む。好適な技法の具体的な実例は、本明細書の実施例を参照することによって得ることができる。しかし、他の同等の従来の手順も、もちろん、使用することができる。そのような従来の技法および記述は、グリーンGreenら編1999,GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeriesVols.I-IV;ワイナーWeiner,ガブリエルGabriel,ステファンズStephens編2007,GeneticVariation:ALaboratoryManual;ディーフェンバハDieffenbach,ドヴェクスラーDveksler編2003,PCRPrimer:ALaboratoryManual;バウテルBowtellおよびサムブルックSambrook2003,DNAMicroarrays:AMolecularCloningManual;マウントMount2004,Bioinformatics:SequenceandGenomeAnalysis;サムブルックSambrookおよびラッセルRussell2006,CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratoryManual;および、サムブルックSambrookおよびラッセルRussell2002,MolecularCloning:ALaboratoryManual全てコールドスプリングハーバー研究所ColdSpringHarborLaboratoryPress刊;ストライラーStryer,L.1995Biochemistry第4版W.H.フリーマンFreeman社,ニューヨーク,ニューヨーク州;ゲイトGait,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach1984,IRLプレスPress,ロンドン;ネルソンNelsonおよびコックスCox2000,レーニンジャーLehninger,PrinciplesofBiochemistry第3版,W.H.フリーマンFreeman社,ニューヨーク,ニューヨーク州;およびバーグBergら2002Biochemistry,第5版,W.H.フリーマンFreeman社,ニューヨーク,ニューヨーク州等の標準的な実験マニュアルで見ることができ、その全てを、全目的のために、参照により全体として本明細書に援用する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形a、an、およびtheは、前後関係が他に明らかに指示しない限り、複数形指示対象を含むことに留意されたい。したがって、たとえば、alocus遺伝子座への言及は、1つまたは複数の遺伝子座を指し、またthemethod方法への言及は、当業者に周知の同等の諸ステップおよび諸方法等々への言及を含む。他に規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の全ての出版物は、今記述した発明に関連して使用される可能性がある装置、製剤および方法論を記述および開示するために、参照により組み込まれる。値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間に入る各値、および何か他の規定値または規定範囲内に入る値は、本発明の中に包含されると理解される。こうしたより小さい範囲の上限および下限は、そのより小さい範囲に独立に含まれ、またその規定された範囲で明確に除外されたあらゆる制限を受けて、本発明の中にも包含される。規定された範囲が限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の両方ともを除外する範囲も本発明に含まれる。以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細を述べる。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細の1つまたは複数がなくても実行可能なことは、当業者に明白になるであろう。他の場合には、本発明を分かりにくくすることを避けるために、周知の特徴および当業者に周知の手順は記述されていない。発明全般体液性免疫系において、多様な抗体レパートリーは、VDJ組み換えと呼ばれるプロセスで、IgH鎖IghとIgL鎖Igl遺伝子座の組合せ多様性および結合多様性によって生み出される。B細胞の発生において、生じる最初の組換え事象は、重鎖遺伝子座のD遺伝子セグメント1つとJ遺伝子セグメント1つとの間であり、これらの2つの遺伝子の間のDNAが欠失する。このD-J組換えに続いて、新たに形成されたDJ複合体の上流の領域由来のV遺伝子1つを結合し、再構成されたVDJ遺伝子を形成する。つぎに、新しいVDJ遺伝子のVセグメントとDセグメントの間の他の遺伝子全てを、個々のB細胞ゲノムから欠失させる。この再構成された遺伝子は、最終的にB細胞表面上にIgHポリペプチドとして発現し、これがIgLと結合してB細胞受容体を形成する。ネズミおよびヒトのIg遺伝子座は、極めて複雑であり、ほぼ2Mbの領域に及び、幾つかの定常領域遺伝子セグメント、J遺伝子セグメント、D遺伝子セグメントおよびより多数の可変遺伝子を含む。本発明は、ヒト可変領域のコード領域、および脊椎動物宿主ゲノム由来の非コード配列、たとえば、宿主哺乳類がマウスであるときにはマウスゲノムの非コード配列を含む、導入された部分的ヒト核酸を含む非ヒト脊椎動物細胞を提供する。この部分的ヒト核酸は、トランスジェニック動物が、制御配列ならびに効率的な抗体産生および抗原認識を促進するのに役立つある特定の宿主ゲノムにおける介在配列内で見られる他の要素を保持しながら、ヒトVH領域を含む重鎖レパートリーを産生することを可能にする。本発明は、VH遺伝子座由来のヒトコード配列と非ヒト非コード配列の両者を含む、合成または組換えで産生される部分的ヒト領域の使用を含む。本発明の方法は、操作されたゲノム内の2組以上の部位特異的組換え部位を利用できるため、本組換えステップは、部分的ヒト遺伝子座に多数の挿入を行うことが可能である。本発明の好ましい態様で、宿主脊椎動物細胞に挿入されるこの部分的ヒト領域は、既知のヒトVH遺伝子の全部または相当数を含む。しかし、場合によっては、そのようなVH遺伝子のサブセットを使用することが望ましいこともあり、特殊な場合には、僅か1つのヒトVHコード配列が本発明の細胞および動物で使用されることさえある。本発明の好ましい態様は、非ヒト哺乳類および哺乳類細胞を含み、この非ヒト哺乳類および哺乳類細胞は、ヒトVH遺伝子を含み、D遺伝子ヒトコード領域およびJ遺伝子ヒトコード領域ならびに非ヒト哺乳類宿主の内在性ゲノムに基づいたpre-DJ配列をさらに含む、部分的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む。ある態様で、導入される部分的ヒト領域は、1つ以上の完全に組換えられたVDJセグメントを含むことができる。本発明の具体的な態様で、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、非ヒト哺乳類宿主遺伝子座における介在配列に基づいた介在配列が付いた多数のヒトVH遺伝子、およびヒトD遺伝子およびJ遺伝子のヒトコード領域を含む導入された核酸を含む。特に好ましい態様で、部分的ヒト核酸は、ヒトVH遺伝子、非ヒト哺乳類宿主のゲノムたとえば、マウスゲノムに基づいたpre-D領域、ならびにヒトDエクソンおよびJエクソンを含む。実施例の部分でさらに詳述する、代表的な実施態様では、マウスの内在性VH免疫グロブリン遺伝子座全体J558遺伝子座を含むを欠失させ、マウスのJ558VH領域遺伝子座のVHエクソンを、44のヒトVH遺伝子を含む核酸と置換し、その結果として、マウスの非コード配列に対応する非コード領域と入り混ざっている。完全な、導入された免疫グロブリンVH領域は、VH遺伝子の他にもヒトDエクソンおよびJエクソンをさらに含む。この態様で、10Kbのpre-D領域はマウス配列を含むが、D領域およびJ領域はヒトコード配列を含む。好ましくは、D領域およびJ領域は、ヒトD遺伝子およびヒトJ遺伝子を含むヒトDJコード領域として提供される。本発明の方法は、相同的組換えと部位特異的組換えとの組合せを利用して、本発明の細胞および動物を作り出す。相同ターゲティングベクターを先ず使用して、部位特異的組換え部位を、宿主哺乳類ゲノムの、内在性免疫グロブリン遺伝子座における所望の位置に導入する。インビボでの、関連ターゲティング配列とゲノムDNAとの相同的組換えによるゲノム配列への部位特異的組換え部位の挿入は、好ましくは形質移入細胞により発現される抗体分子のアミノ酸配列を改変しない。この手法は、組換え部位、および任意選択的に、選択可能なマーカー遺伝子等の追加的配列の挿入後に、所望の抗体を産生する免疫グロブリン遺伝子の適切な転写および翻訳を維持する。しかし、場合によっては、挿入によって抗体分子のアミノ酸配列が変更されるが、抗体は依然として所望の目的のために十分な機能性を保持するように、リコンビナーゼ部位および他の配列を、免疫グロブリン遺伝子座配列に挿入できることもあり、本発明は、そのような挿入も含むことを想定する。相同的組換えの代表的な方法論は、米国特許第6,689,610号明細書;米国特許第6,204,061号明細書;米国特許第5,631,153号明細書;米国特許第5,627,059号明細書;米国特許第5,487,992号明細書;および米国特許第5,464,764号明細書に記述されており、それぞれを参照により全体として援用する。本発明の具体的な態様で、相同ターゲティングベクターを利用して、部位特異的組換え部位および選択マーカーを導入する他に、内在性ゲノム内のある特定の配列を置換することができる。たとえば、VH遺伝子領域の3’要素を導入するために使用される相同ターゲティングを使用して、マウスpre-D配列およびDJ配列を、ヒトの同等物と置換することが可能である。部位特異的組換え部位特異的組換えは、リコンビナーゼ認識に必要な、短い特異的なDNA配列だけが組換えの起こる部位である点で、一般的な相同的組換えと異なる。部位特異的組換えは、部位を認識して、このような部位における組換えを触媒するための専用のリコンビナーゼを必要とする。多数のバクテリオファージおよび酵母由来の部位特異的組換えシステムそれぞれ、リコンビナーゼおよび特異的な同種部位を含むは、真核細胞でDNA組み込みのために働くため、本発明での使用に適しており、これらの中にはバクテリオファージP1Cre/lox、酵母FLP-FRTシステム、および部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのDreシステムなどが含まれる。そのようなシステムおよび使用方法は、たとえば、米国特許第7,422,889号明細書;米国特許第7,112,715明細書;米国特許第6,956,146明細書;米国特許第6,774,279明細書;米国特許第5,677,177明細書;米国特許第5,885,836明細書;米国特許第5,654,182明細書;および米国特許第4,959,317号明細書に記述されており、そのようなリコンビナーゼの使用方法を教示するために、参照により本明細書に援用する。リコンビナーゼ仲介カセット交換RMCE手順は、野生型と変異型loxPまたはFRT等部位の組合せを負の選択と一緒に使用することによって容易になる。しかし、非変異部位のみを使用するときおよび/または上記選択を欠く場合も生じる。しかし、挿入反応よりむしろ削除が好ましく、また正の選択を組み入れなければ適切に変異した細胞のリッチ化がないため、効率は非常に低い。チロシンファミリーの他のシステム、たとえばバクテリオファージλIntインテグラーゼ、HK2022インテグラーゼ等、およびさらに別のセリンファミリーのリコンビナーゼに属するシステム、たとえばバクテリオファージphiC31、R4Tp901インテグラーゼ等は、それぞれの組換え部位を使用して、哺乳類細胞で働くことが知られておりトルンシュTronche,F.ら.2002、また本発明での使用にも適する。本発明の方法は、好ましくは、同一リコンビナーゼであるが、部位間の組換えを促進しない部位特異的組換え部位を利用する。たとえば、LoxP部位および変異型LoxP部位を宿主のゲノムに組み入れることができるが、宿主へのCreの導入によって、それら2部位が容易に組換わることはなく、むしろ、LoxP部位は、別のLoxP部位と組換わり、変異型部位は、別の同様の変異型LoxP部位と組み換わる。そのような変異型組換え部位の例としては、逆方向反復の組合せを含むもの、または変異体スペーサ配列を有する組換え部位を含むものなどがある。たとえば、2クラスの変異型リコンビナーゼ部位を、安定したCre-loxP組込み組換えの操作に利用できる。両者とも、8bpスペーサ領域内または13-bp逆方向反復内で、Cre認識配列における配列変異体を利用する。lox511ホエスHoessRHら,NucleicAcidsRes1986,14:2287-2300、lox5171およびlox2272リーLeeGおよびサイトーSaitoI,Gene1998,216:55-65、m2、m3、m7、およびm11ランガーLangerSJら,NucleicAcidsRes2002,30:3067-3077等のスペーサ変異体は、それら自身とは容易に組換わるが、野生型部位との組換え率は著しく減る。このクラスの変異体は、非相互作用型Cre-Lox組換え部位および非相互作用型FLP組換え部位を使用するリコンビナーゼ仲介カセット交換RMCEによるDNA挿入に利用されてきたバエルBaerAおよびボーデBodeJ,CurrOpinBiotechnol2001,12:473-480;アルベルトAlbertHら,PlantJ1995,7:649-659;セイブラーSeiblerJおよびボーデBodeJ,Biochemistry1997,36:1740-1747;シュレークSchlakeTおよびボーデBodeJ,Biochemistry1994,33:12746-12751。逆方向反復変異体は、第2クラスの変異型リコンビナーゼ部位を表す。たとえば、LoxP部位は、変更された塩基を、左逆方向反復LE変異体または右逆方向反復RE変異体で含むことができる。LE変異体であるlox71は、左逆方向反復の5’末端に、野生型配列からTACCGに変化している5bpを有するアラキArakiKら,NucleicAcidsRes1997,25:868-872。同様に、RE変異体であるlox66は、CGGTAに変化した5つの3’末端塩基を有する。逆方向反復変異体は、プラスミド挿入物を染色体DNAに組み込むために使用される。ターゲット染色体loxP部位として設計されたLE変異体を含む上記染色体DNAに、ドナーRE変異体が組換わる。組換え後、loxP部位は、挿入されたセグメントを挟んで、シスcisに配置される。組換えのメカニズムは、組換え後、一方のloxP部位は二重変異体LE逆方向反復変異およびRE逆方向反復変異の両者を含むであり、他方は野生型であるというものであるリーLeeLおよびサドースキーSadowskiPD,ProgNucleicAcidResMolBiol2005,80:1-42;リーLeeLおよびサドースキーSadowskiPD,JMolBiol2003,326:397-412。二重変異体は、野生型部位と十分に異なるため、Creリコンビナーゼにより認識されず、また挿入されたセグメントは削除されない。ある態様では、コード核酸領域または制御配列と対照的に、部位特異的組換え部位をイントロンに導入することができる。これによって、部位特異的組換え部位を動物細胞のゲノムに挿入する際に、適当な抗体発現に必要な制御配列またはコード領域を不注意に破壊することを回避することが可能である。部位特異的組換え部位の導入は、従来の相同的組換え技法によって達成することが可能である。そのような技法は、たとえば、サムブルックSambrookおよびラッセルRussell2001Molecularcloning:alaboratorymanual第3版コールドスプリングハーバー研究所ColdSpringHarbor,N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPressおよびナギーNagy,A.2003.Manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual,第3版コールドスプリングハーバーColdSpringHarbor,ニューヨーク州:コールドスプリングハーバー研究所ColdSpringHarborLaboratoryPress等の参考文献に記述されている。GeneticRecombination:Nucleicacid,Homologybiology,Homologousrecombination,Non-homologousendjoining,DNArepair,Bacteria,Eukaryote,Meiosis,Adaptiveimmunesystem,VDJrecombination、フレドリックFredericP.ミラーMiller,アグネスAgnesF.バンドームVandome,およびジョンマクブリュースターJohnMcBrewsterペーバーバック-2009年12月23日。ゲノムへの特異的組換えは、当該技術分野で周知の通り、正の選択または負の選択用に設計されたベクターを使用して容易にすることができる。置換反応を受けた細胞の同定を容易にするために、好適な遺伝子マーカーシステムを使用することが可能であり、また、たとえば選択培地の使用によって、細胞を選択することが可能である。しかし、ゲノム配列が、置換区間の2つの終点にまたは隣接して外来核酸配列を実質的に含まないことを確実にするために、置換された核酸を含む細胞の選択後にマーカーシステム/遺伝子を除去できることが望ましい。本発明の方法の好ましい一態様では、内在性免疫グロブリンの全部または一部の置換が起こった細胞を、毒素または薬物に暴露して、負の選択をする。たとえば、ガンシクロビル等のヌクレオシド類縁体の好適な使用により、HSV-TKの発現を保持する細胞を選択することができる。本発明の別の態様では、組換え事象の後で、または組換え事象の結果として、細胞から任意選択的に除去され得るマーカー遺伝子を使用して、内在性免疫グロブリン領域の欠失を含む細胞について、正の選択をすることが可能である。使用可能な正の選択システムは、HPRT等の、組換え事象によって接合されるマーカー遺伝子の2つの非機能部分の使用に基づく。これらの2つの部分は、置換反応がうまく実行されたとき、機能的会合をもたらし、機能的に再構成されたマーカー遺伝子は、さらなる部位特異的組換え部位置換反応に使用された部位特異的組換え部位と異なるにより両側が挟まれている。これにより、好適な部位特異的リコンビナーゼを使用してマーカー遺伝子がゲノムから削除されることができる。リコンビナーゼは、精製蛋白質、または、リコンビナーゼ活性を提供するために細胞内で一時的に発現される構築物として提供することが可能である。あるいは、マーカー遺伝子および関連した組換え部位を欠く子孫を生み出すために、その細胞を使用して、前記リコンビナーゼを発現する動物と交配することが可能な、トランスジェニック動物を産生することが可能である。トランスジェニック動物の産生具体的な態様で、本発明は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すための方法を提供する。一態様で、内在性免疫グロブリン遺伝子の置換のために利用される宿主細胞は、胚性幹ES細胞であり、次にこれを利用して、トランスジェニック哺乳類を作り出すことができる。したがって、一態様によれば、本発明の方法は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む胚性幹細胞を単離すること、および前記ES細胞を使用して部分的に置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を産生することをさらに含む。別の実施例で、トランスジェニック動物は鳥類であり、動物は始原生殖細胞を使用して生み出される。したがって、別の態様によれば、本発明の方法は、導入された部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む始原生殖細胞を単離することおよび部分的に置換された免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック動物を産生するために前記生殖細胞を使用することをさらに含む。そのようなトランスジェニック鳥類を生み出す方法は、たとえば、米国特許第7,323,618号明細書および米国特許第7,145,057号明細書参照により本明細書に援用するに開示されている。以下の実施例は、本発明をどのように作製して使用するかについて完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するものであって、発明者が自身の発明と考えるものの範囲を制限する意図もなく、また以下の実験が、実施した実験の全てである、または実施した実験のみであることを表したり暗に示したりする意図もない。概括的に説明された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様に示された本発明に多くの変形および/または改変を行えることは、当業者に十分理解されるであろう。したがって、本実施態様は、あらゆる点で例証として考えるべきであり、制限として考えるべきではない。使用される用語および数たとえば、ベクター、量、温度、等々に関して正確さを確実にするために努力がなされてきたが、幾らかの実験誤差および偏差が占める。他に指定のない限り、部は重量基準による部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。実施例は、組換部位の両側に位置する5’ベクターおよび3’ベクターの両者によるターゲティングおよび合成DNAの導入を例示する。5’ベクターターゲティングが最初に起こった後に3’が続いてもよく、または3’ベクターターゲティングが最初に起こった後に5’ベクターが続いてもよいことは、明細書を読んだときに当業者に明白になるであろう。場合によっては、二重検出メカニズムを用いて、ターゲティングを同時に実行することもできる。実施例1:マウスゲノムのVH遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する代表的な方法を、図1~6に図示する。図1は、本発明の方法のこの代表的な態様の様々なステップを図示するフローチャートを示す。この方法は、哺乳類ゲノムの内在性VH領域の5’または3’のいずれにも導入することが可能な、第1の部位特異的組換え部位の、哺乳類ゲノムへの導入を提供する。次いで、哺乳類ゲノムへの第2の部位特異的組換え部位の導入102が続き、これが、第1の部位特異的組換え部位と共同して、内在性免疫グロブリン領域を挟む。挟まれた内在性領域が欠失され104、ヒト配列と非ヒト配列との両者を含む合成核酸が、リコンビナーゼ仲介交換によって導入される106。マウスES細胞のゲノム遺伝子座への、部分的なヒトのマウス-ヒト免疫グロブリン領域の導入を説明する代表的な方法を、図2~6により詳細に図示する。図2では、ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ-チミジンキナーゼ融合蛋白質puroΔTK203を含む、相同ターゲティングベクター201が提供される。上記puroΔTK203は、2つの異なるリコンビナーゼ認識部位、たとえば、FlpおよびCre用の、FRT207およびloxP205と、たとえばFRT209およびloxP211の改変部位それぞれ、未改変部位207および205と組換えができないで挟まれている。ターゲティングベクターは、以後のステップで、導入された構築物を発現する細胞の負の選択で使用するための、ヒトジフテリア毒素受容体hDTRcDNA217を含む。ターゲティングベクターは、緑色蛍光蛋白質GFP非表示等の視覚的マーカーも、任意選択的に含む。領域213および215は、隣接領域223の、5’部分および3’部分と、それぞれ相同である。この隣接領域223は、マウス内在性VH遺伝子を含むゲノム領域219の5’である。免疫グロブリン領域の内在性VH遺伝子219、pre-D領域221、J遺伝子領域225および定常遺伝子領域227を含む免疫グロブリン領域229を有するマウスES細胞に、相同ターゲティングベクター201を導入する202。相同ターゲティングベクター201の部位特異的組換え部位およびhDTRcDNA217は、マウス内在性VH遺伝子領域のマウスゲノム5’に組込まれる204。図3は、追加的な1組の部位特異的組換え部位、たとえば、Dreリコンビナーゼと共に使用するためのRox部位331および改変されたRox部位333を加えること以外は、図2と同じ手法を効果的に図示する。図3では、ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ-チミジンキナーゼ融合蛋白質303を含む、相同ターゲティングベクター301が提供される。ピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ-チミジンキナーゼ融合蛋白質303は、リコンビナーゼ認識部位FRT307、loxP305、およびRox331、ならびに、その改変部位FRT309、loxP311およびRox333それぞれ、未改変部位部位、およびと組換えができないで挟まれている。ターゲティングベクターは、ヒトジフテリア毒素受容体hDTRcDNA317も含む。領域313および315は、隣接領域323の5’部分および3’部分と、それぞれ相同である。この隣接領域323は、マウス内在性VH遺伝子を含むゲノム領域319の5’である。相同ターゲティングベクター301を、免疫グロブリン領域の内在性VH遺伝子319、pre-D領域321、J遺伝子領域325および定常遺伝子領域327を含む、マウス免疫グロブリン領域329に導入する302。相同ターゲティングベクター301の部位特異的組換え部位およびhDTRcDNA317は、マウス内在性VH遺伝子領域のマウスゲノム5’に組み込まれる304。図4に図示する通り、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTミニ遺伝子435およびネオマイシン耐性遺伝子437ならびにFlpおよびCreのリコンビナーゼ認識部位FRT407およびloxP405第1の相同ターゲティングベクターから組込まれたFRT407部位およびloxP405部位と組換えができるを含む、第2の相同ターゲティングベクター401が提供される。領域431および領域433は、内在性マウス遺伝子座における隣接領域441の、5’部分および3’部分と、それぞれ相同である。上記隣接領域441は、マウス内在性VH、D遺伝子およびJ遺伝子を含むゲノム領域の3’であるとともに、定常遺伝子領域の5’である。相同ターゲティングベクター401を、内在性VH遺伝子419、pre-D領域421、J遺伝子領域425および定常遺伝子領域427を含む、改変されたマウス免疫グロブリン領域に導入する402。相同ターゲティングベクター401の部位特異的組換え部位およびHPRTミニ遺伝子435およびネオマイシン耐性遺伝子437は、マウス内在性VH遺伝子領域のマウスゲノム5’に組込まれる404。いったん、組換え部位が宿主哺乳類のゲノムに導入されると、次に、免疫グロブリンドメインの内在性領域は、ゲノムにおける部位特異的組換え部位に対応するリコンビナーゼの1つこの実施例ではFLPまたはCreのいずれかをの導入により組換えを受ける。図5に図示する通り、FLPが導入される502と、部位特異的組換え部位509,511,507および505を含む領域とpuroΔTK遺伝子503とが保持されるとともに、他の2つの組換え部位507および505の3’には、追加的FLP組換え部位507が存在する。組換え部位の3’領域であって、hDTR、内在性免疫グロブリンドメイン519,521,525、第2の相同ターゲティングベクターを使用して導入されたHPRT527を含むおよびNeo529遺伝子を含む3’領域は欠失する。リコンビナーゼ-仲介欠失504にCreが使用されると、欠失の区域は同じであるが、唯一の部位特異的組換え部位507が、puroΔTK遺伝子の3’に直接に残る。本手順は、その相同性よりも同一染色体上に起こった第2のターゲティングに依存するすなわち、トランスtransよりもシスcis。ターゲティングがトランスに起こる場合、細胞は、Cre組換え後、負の選択に感受性がない。内在性免疫グロブリン領域の欠失に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび/またはロスオブネイティブアレルloss-of-native-alleleqPCRスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次ポリメラーゼ連鎖反応PCRスクリーンを用いて、実行され得る。HPRTは、HPRT-欠損ES細胞において6-チオグアニン依存性の負の選択を可能にする。欠失した免疫グロブリン領域を含むES細胞は、hDTR遺伝子を使用した負の選択で選択され得る。図6は、改変されたマウスゲノムへの部分的ヒト配列の導入を図示する。哺乳類宿主ゲノムに導入すべき部分的ヒト免疫グロブリン領域610を含む部位特異的ターゲティングベクター629を、内在性免疫グロブリン領域が欠失したゲノム領域601に導入する602。上記ゲノム領域601は、部位特異的組換え部位609,611,607および605およびpuroΔTK遺伝子603を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、i44のヒトVHコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むVH領域619と、iiマウス配列を含む10kbのpre-DJ領域621と、iiiヒトD遺伝子コード領域およびJ遺伝子コード領域ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むDJ領域625とを含んでいた。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする組換え部位609,611,605および607で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入される604と同時に、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺伝子領域627のゲノム上流に組込まれる。部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび/またはロスオブネイティブアレルloss-of-native-alleleqPCRスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次PCRスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてHPRT遺伝子605が欠失することにより、6-チオグアニン-依存性の負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能になる。実施例2:マウスゲノムへの部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入ある特定の態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、実施例1に記載の要素を含むが、追加的配列を含む。こうした追加的配列は、たとえば、追加的制御配列を導入するため、導入された免疫グロブリン領域内に所望の間隔を確保するため、置換された免疫グロブリン領域に隣接した他の配列と、あるコード配列が適正な近位であることを確実にするため、その他の理由のために、戦略的に加えられる配列である。図7は、図2~5で産生されるとともに実施例1で上述された、改変されたマウスゲノムへの第2の代表的な部分的ヒト配列の導入を図示する。哺乳類宿主ゲノムに導入されるべき部分的ヒト免疫グロブリン領域710を含む部位特異的ターゲティングベクター729が、欠失した内在性免疫グロブリン領域を含むゲノム領域701に導入される702。ゲノム領域701は、部位特異的組換え部位709,711,707および705およびpuroΔTK遺伝子703を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、i1~43のヒトVHコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むVH領域719と、iiマウス配列を含む10kbのpre-DJ領域721と、iiiヒトDコード領域およびJコード領域、ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むDJ領域725と、ivマウス非機能性JH遺伝子領域とを含んでいた。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする組換え部位709,711,705および707で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入される704と同時に、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺伝子領域727のゲノム上流に組込まれる。実施例1に記載の通り、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび/またはロスオブネイティブアレルloss-of-native-alleleqPCRスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次PCRスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてHPRT遺伝子705が欠失することにより、6-チオグアニン-依存性の負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能になる。実施例3:マウスゲノムの免疫グロブリン重鎖遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する方法が、図8に図示される。この方法は、哺乳類ゲノムへの第1の部位特異的組換え部位の導入に続いて、哺乳類ゲノムへの第2の部位特異的組換え部位の導入を使用した。2つの部位は、VH領域遺伝子セグメント、DH領域遺伝子セグメントおよびJH領域遺伝子セグメントの集団全体を挟んでいた。本明細書に記載の、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、挟まれた内在性領域を欠失させた。野生型マウス免疫グロブリン領域801における、VH、DHおよびJH領域遺伝子セグメント集団の両側に部位特異的リコンビナーゼ部位を導入するために使用されたターゲティングベクター803,805は、リコンビナーゼにより効率よく認識されるままであるが、未改変部位と組換わらないように改変された追加的部位特異的リコンビナーゼ部位を含んでいた。この部位は、VH、DHおよびJH領域遺伝子セグメント集団の欠失後、第2の部位特異的組換え事象に使用できるように、ターゲティングベクター中に配置された。第2の部位特異的組換え事象とは、非天然のDNA片が、改変されたVH遺伝子座に移動するものである。部位特異的リコンビナーゼを使用してDNAを遺伝子座に移動させる方法は、リコンビナーゼ-仲介カセット交換と呼ばれる。この実施例で、非天然DNAは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸であった。略述したプロセスを達成するために、2つの遺伝子ターゲティングベクターが構築された。ベクターの一方803は、最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流の遺伝子座の5’末端から取ったマウスゲノムDNAを含んでいた。他方のベクター805は、J領域遺伝子セグメント近傍の遺伝子座内から取ったマウスゲノムDNAを含んでいた。5’ベクター803の重要な特徴は、5’から3’の順で、以下の通りであった:ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子;重鎖遺伝子座における最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流に位置する4.5KbのマウスゲノムDNA;J領域遺伝子セグメント無能化;Flpリコンビナーゼ用のFRT認識配列;マウスPolr2a遺伝子プロモータを含むゲノムDNA片;翻訳開始配列Kozakコンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン;Creリコンビナーゼ用の、変異型LoxP認識配列lox5171部位として知られる;転写終結/ポリアデニル化配列;Creリコンビナーゼ用のloxP認識配列;ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子;該ベクター中の上記4.5Kb配列に近接して位置する3KbのマウスゲノムDNAであって、天然の相対配向で配置された3KbのマウスゲノムDNA。上記ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の2つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。また、上記ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子由来のプロモータの転写制御下にあり、チミジンキナーゼpu-TKの切断型に融合している。3’ベクター805の重要な特徴は、5’から3’の順で、以下の通りであった:ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子;マウスJ領域遺伝子セグメントを含む3.7KbのマウスゲノムDNAであって、重鎖可変領域遺伝子セグメントの最も近くに位置する当該領域の末端が、該ベクター中の上記DTA遺伝子に最も近いように配置された3.7KbのマウスゲノムDNA;マウスPolr2a遺伝子プロモータの転写制御下にあるヒトヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTをコード化しているミニ遺伝子;マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子プロモータの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子;Creリコンビナーゼ用のloxP認識配列;および、ゲノムにおいて上記3.7Kbフラグメントの直下に位置する2.1KbのマウスゲノムDNAであって、両フラグメントが、マウスゲノムにおけるのと等しい相対的配置で配置された2.1KbのマウスゲノムDNA。広く使用される手順に従い、3’ベクター805を用いて、エレクトロポレーションにより、マウス胚性幹ES細胞C57Bl/6NTacマウスに由来するに形質移入した。エレクトロポレーションの前に、NotI制限酵素を用いて、ベクターDNAを直線化した。形質移入細胞をプレーティングし、≧24時間後に、ネオマイシン類縁体G418を使用した薬物選択にかけた。1週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ES細胞のコロニーをプレートから物理的に採取した。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養した。その後、細胞の一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でDNAの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割した。広く使用される遺伝子-ターゲティングアッセイデザインを使用して、PCRによりES細胞クローン由来のDNAをスクリーニングした。4つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、PCRオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、3’ベクター805とゲノムDNAとの間で共有される同一性の領域外に位置していたが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の2つのアーム間の新規なDNA内すなわち、HPRTまたはneo遺伝子要素に位置していた。3’重鎖ターゲティングベクターとゲノムとの間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうDNA片を検出するために、標準デザインに従って、これらのアッセイを設計した。3’ベクター805を用いて、2つの別々の形質移入を実施した。先ず第一に、4つのPCRアッセイを使用してスクリーニングしたほぼ300クローンから、計2個の陽性クローンが得られた。第二に、スクリーニングしたやはりほぼ300クローンから、計6個の陽性クローンが得られた。2つの形質移入による計6個のPCR陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析した。広く使用される手順に従って、選択された3つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたゲノムDNAを使用して、サザンブロットアッセイを実施する。3つのプローブおよび複数の制限酵素は、クローンにおける標的遺伝子座の構造が相同的組換えにより適切に改変されたと確認できるように選択される。プローブの1つは、3’重鎖ターゲティングベクターとゲノムDNAとの間で共有される同一性の領域の片側に位置するDNA配列に位置し;第2のプローブは、同一性の領域外であるがその反対側に位置し;第3のプローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の2つのアームの間の新規なDNA内すなわち、HPRTまたはneo遺伝子要素に位置する。マウスES細胞で生じる、最も一般的に生じる染色体異常を識別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ES細胞のPCR-陽性クローン6個を、核型分析する。そのような異常のあるクローンは、さらなる使用から除外される。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断され、また核型分析に基づいて、検出可能な染色体異常を持たないと判断される、ES細胞クローンをさらなる使用のために選択する。G418/ネオマイシン選択の代わりにピューロマイシン選択が使用されること以外は、3’ベクター805に使用されるものと本質的にデザインが同じである手順およびスクリーニングアッセイを使用し、5’ベクター803を用いて、許容できるクローンを改変する。PCRアッセイ、プローブおよび消化物は、5’ベクター805により改変しようとしているゲノム領域に適合するように調整される。3’重鎖ベクターおよび5’重鎖ベクターの両者により予想される方法で変異されたES細胞のクローン、すなわち、両方の操作された変異を担持する二重標的細胞を、ベクターターゲティング後に単離する。クローンは、相同染色体ではなく、同一染色体上で遺伝子ターゲティングを受けていなければならないすなわち、ターゲティングベクターによって作り出された操作された変異は、別の相同のDNA鎖上でのトランスではなく、同一DNA鎖上のシスである必要がある。変異のシス配列を有するクローンは、ゲノム同一性のアーム間の2つの遺伝子ターゲティングベクターに存在する新規なDNAにハイブリダイズするプローブを使用した、中期スプレッドspreadの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション等の分析手順によって、トランス配列を有するものと区別される。二種類のクローンを、次の方法により互いに区別することもできる。すなわち、Creリコンビナーゼを発現するベクターを用いて形質移入し、次いで5’ベクター803によって導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生き残ったコロニー数を比較し、そしてクローン由来の細胞の幾つかを、ピューロマイシンまたはG418/ネオマイシンに対する抵抗性についてテストする同胞選択siblingselectionスクリーニング手順による。この種の実験で、変異のシス配列を有する細胞は、トランス配列を有する細胞よりもほぼ103倍多いガンシクロビル耐性クローンが生じると予想される。結果として生じるシス由来のガンシクロビル耐性クローンの大部分は、G418/ネオマイシンの両薬物に感受性があることも予想される。これとは対照的に、トランス由来のガンシクロビル耐性クローンは、ピューロマイシンおよびG418/ネオマイシンの両者に対する抵抗性を保持する。操作された変異のシス配列を重鎖遺伝子座に有する細胞の二重標的クローンを、さらなる使用のために選択する。上でまとめた分析実験と同様、Creリコンビナーゼを発現するベクターを用いて細胞の二重標的クローンを形質移入し、その後、形質移入細胞をガンシクロビル選択にかける。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、5’重鎖ターゲティングベクターおよび3’重鎖ターゲティングベクターにより作り出された2つの操作された変異間の予想される欠失の存在について、PCRおよびサザンブロットで分析した。これらのクローンにおいて、Creリコンビナーゼは、2つのベクターにより重鎖遺伝子座に導入されたloxP部位間に組換え802を生じさせて、807に示す構築物を作り出す。loxP部位は、同じ相対配向で2つのベクターに配置されているため、組換えは、2つのloxP部位の間のゲノム区間全体を含むDNAの輪が削除される結果となる。この輪は複製開始点を含まず、したがって、有糸分裂中に複製されず、したがってクローン増殖を経るにつれて、細胞のクローンから失われる。結果として生じるクローンでは、元は2つのloxP部位の間にあったDNAが欠失されている。ES細胞クローンであって、それらの免疫グロブリン重鎖遺伝子座の2つの相同コピーの一方における配列が欠失されたES細胞クローンに、V、DおよびJ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むDNA片809と、Creリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する804。このDNA片809の重要な特徴は以下の通りである:lox5171部位;ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームイニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありlox5171部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している;転写終結/ポリアデニル化配列;FRT部位;44のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る;マウス重鎖遺伝子座におけるD領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の7.5KbのゲノムDNA片;ヒトDおよびJ領域遺伝子セグメントを含む58KbのDNA片;lox5171部位と逆相対配向のloxP部位。形質移入クローンをG418選択にかけ、リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法を受けた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーDNA809配列番号1が全体として、loxP部位とlox5171部位との間の欠失された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組込まれて、811に図示されたDNA領域が作り出される。5’ベクター803由来の残りの要素が、FLP-仲介組換え806で除去されて、結果的に、813に示す最終的なヒト化遺伝子座が生じる。G418耐性ES細胞クローンをPCRおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ-仲介カセット交換方法を受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。マウス重鎖遺伝子座に部分的ヒト免疫グロブリン重鎖DNA813を担持するES細胞クローンを、DBA/2系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ES細胞由来のキメラマウスを作り出す。外皮へのES細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。本明細書で最適な雌マウスは、C57Bl/6NTac系統のものであり、その生殖細胞系で発現されるFlpリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子をやはり担持している。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ-仲介カセット交換ステップで作り出されたFRTに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。実施例4:マウスゲノムの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座への部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入哺乳類ゲノムの一部を部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する別の方法を図9に図示する。この方法は、哺乳類ゲノムへの、第1の部位特異的組換え部位の導入を提供し、続いて第2の部位特異的組換え部位を哺乳類ゲノムに導入する。上記第1の部位特異的組換え部位の導入は、哺乳類ゲノムのVK領域遺伝子セグメントおよびJK領域遺伝子セグメントの主集団の5’または3’のいずれにも導入することが可能である。また、上記第2の部位特異的組換え部位は、第1の部位特異的組換え部位と共同して、VKおよびJK領域遺伝子セグメントの集団全体を挟むことが可能である。次いで、挟まれた内在性領域を欠失させ、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して置換することができる。VKおよびJK領域遺伝子セグメント集団901の両側の部位特異的リコンビナーゼ部位を導入するために使用されるターゲティングベクターは、追加的部位特異的リコンビナーゼ部位も含む。この追加的部位特異的リコンビナーゼ部位は、リコンビナーゼにより効率よく認識されるままであるが、未改変部位とは組換わらないように改変されている。この部位は、VKおよびJK領域遺伝子セグメント集団の欠失後、第2の部位特異的組換え事象に使用できるように、ターゲティングベクター中に配置されている。これにより、第2の部位特異的組換え事象では、非天然のDNA片が、リコンビナーゼ-仲介カセット交換によって、改変されたVK遺伝子座に移動される。この実施例で、非天然のDNAは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸である。略述した方法を達成するために、2つの遺伝子ターゲティングベクターを構築した。ベクターの一方903は、最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流の、遺伝子座の5’末端から取ったマウスゲノムDNAから成っていた。他方のベクター905は、J領域遺伝子セグメント近傍の遺伝子座内から取ったマウスゲノムDNAから成っていた。5’ベクター903の重要な特徴は、以下の通りであった:ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子;κ鎖遺伝子座における最遠位可変領域遺伝子セグメントの上流に位置する6KbのマウスゲノムDNA;Flpリコンビナーゼ用のFRT認識配列;マウスPolr2a遺伝子プロモータを含むゲノムDNA片;翻訳開始配列Kozakコンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン;Creリコンビナーゼ用の変異loxP認識配列lox5171部位として知られる;転写終結/ポリアデニル化配列;Creリコンビナーゼ用のloxP認識配列;ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子;該ベクター中の上記6Kb配列の近傍に位置する2.5KbのマウスゲノムDNAであって、天然の相対配向で配置された2.5KbのマウスゲノムDNA。上記ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の2つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。また、上記ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質から成る融合蛋白質をコード化している遺伝子は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子由来のプロモータの転写制御下にある切断型チミジンキナーゼpu-TKに融合している。3’ベクター905の重要な特徴は、以下の通りであった:ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子;κ遺伝子座J領域遺伝子セグメント付近から取られた6KbのマウスゲノムDNAであって、κ可変領域遺伝子セグメントに最も近くに位置する当該フラグメントの末端が、該ベクター中の上記DTA遺伝子に最も近いように配置された6KbのマウスゲノムDNA;マウスPolr2a遺伝子プロモータの転写制御下にあるヒトヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTをコード化しているミニ遺伝子;マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子プロモータの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子;Creリコンビナーゼ用のloxP認識配列;ゲノムにおいて上記6Kbフラグメントの直下流に位置する3.6KbのマウスゲノムDNAであって、これら2つのフラグメントが、マウスゲノムと同じ相対的配向で配置されていた3.6KbのマウスゲノムDNA。上記ジフテリア毒素ADTAサブユニットをコード化している遺伝子は、ポリオーマウイルス由来の2つの変異体転写エンハンサーに結合した改変された単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ遺伝子プロモータの転写制御下にある。広く使用される手順に従い、3’ベクター905を用いて、エレクトロポレーションにより、C57Bl/6NTacマウス由来のマウス胚性幹ES細胞に形質移入した。エレクトロポレーションの前に、NotI制限酵素を用いて、ベクターDNAを直線化した。形質移入細胞をプレーティングし、≧24時間後に、ネオマイシン類縁体G418を使用した薬物選択にかけた。1週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ES細胞のコロニーをプレートから物理的に採取した。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養した。その後、細胞の一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でDNAの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割した。広く使用される遺伝子-ターゲティングアッセイデザインを使用して、PCRで、ES細胞クローン由来のDNAをスクリーニングした。4つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、PCRオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、3’ベクター905とゲノムDNA901との間で共有される同一性の領域外に位置していたが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の2つのアームの間の新規なDNA内すなわち、HPRTまたはneo遺伝子要素に位置していた。3’ベクター905とゲノムとの間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうDNA片を検出するために、標準デザインに従って、これらのアッセイを設計した。3’ベクター905を用いて1つの形質移入を実施し、4つのPCRアッセイを使用してスクリーニングしたほぼ300クローンから、計17の陽性クローンが得られた。形質移入による計6個のPCR陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析した。広く使用される手順に従って、サザンブロットアッセイを実施した;その中には、3つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたゲノムDNAが含まれていた。3つのプローブおよび複数の制限酵素は、プローブと消化物との組合せによって、クローン中の標的遺伝子座の構造についての結論と、相同的組換えにより適切に改変されたかどうかの結論とを導くことが可能になるように選択された。プローブの1つは、3’κターゲティングベクターとゲノムDNAとの間で共有される同一性の領域の片側に位置するDNA配列に位置し;第2のプローブも、その反対側であるが同一性の領域外に位置し;第3のプローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の2つのアームの間の新規なDNA内すなわち、neo遺伝子要素に位置していた。外部プローブの1つおよびネオマイシンプローブによって検出するとき、κ遺伝子座の、正確に変異した3’κターゲティングベクターとの相同的組換えによる部分に対応する、DNAの予想されるEco911-生成フラグメントの存在が、サザンブロットで確認されたデータ非表示。外部プローブは、変異体フラグメントを検出するとともに、相同染色体上に、免疫グロブリンκ遺伝子座の非変異体コピー由来の野生型フラグメントも検出した。マウスES細胞で生じる、最も一般な染色体異常を識別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ES細胞のPCR-陽性クローン6個について、核型分析も行った。そのような異常のあるクローン1個を、さらなる使用から除外した。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断された、核型的に正常なクローン2個をさらなる使用のために選択した。G418/ネオマイシン選択の代わりにピューロマイシン選択が使用されること以外は、3’ベクター905に使用されるものとデザインが本質的に同じである手順およびスクリーニングアッセイを使用し、5’ベクター903を用いて、2つのクローンを改変する。上記プロトコールは、5’ベクター903により改変されるゲノム領域に適合するように調整される。5’ベクター903形質移入実験の目的は、3’ベクター905および5’ベクター903の両者により予想される方法で変異されたES細胞のクローン、すなわち、両方の操作された変異を担持する二重標的細胞を単離することである。これらのクローンで、Creリコンビナーゼは、2つのベクターによりκ遺伝子座に導入されたloxP部位間に組換え902を生じさせ、907に示す構築物を作り出す。さらに、クローンは、相同染色体ではなく、同一染色体上で遺伝子ターゲティングを受けていなければならない、すなわち、ターゲティングベクターによって作り出された操作された変異は、別の相同なDNA鎖上でのトランスではなく、同一DNA鎖上でのシスでなければならない。変異のシス配列を有するクローンは、ゲノム同一性のアーム間の2つの遺伝子ターゲティングベクターに存在する新規なDNAにハイブリダイズするプローブを使用した、中期スプレッドspreadの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション等の分析手順によって、トランス配列を有するのものと区別される。二種類のクローンを、次の方法によって互いに区別することもできる。すなわち、Creリコンビナーゼを発現するベクターを用いて形質移入し、5’ベクター903によって導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生き残ったコロニー数を比較し、そしてクローン由来の細胞の幾つかを、ピューロマイシンまたはG418/ネオマイシンに対する抵抗性についてテストする同胞選択siblingselectionスクリーニング手順による。この種の実験で、変異のシス配列を有する細胞は、トランス配列を有する細胞よりもほぼ103倍多いガンシクロビル耐性クローンが生じると予想される。結果として生じるシス由来のガンシクロビル耐性クローンの大部分はまた、G418/ネオマイシンの両薬物に感受性があると予想される。これとは対照的に、トランス由来のガンシクロビル耐性クローンとは、ピューロマイシンおよびG418/ネオマイシンの両者に対する抵抗性を保持するはずである。操作された変異のシス配列をκ鎖遺伝子座に有する細胞を、さらなる使用のために選択する。上でまとめた分析実験と同様、Creリコンビナーゼを発現するベクターを用いて細胞の二重標的クローンを形質移入し、その後、形質移入細胞をガンシクロビル選択にかける。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、5’ベクター903および3’ベクター905により作り出された2つの操作された変異間の予想される欠失の存在について、PCRおよびサザンブロットで分析する。これらのクローンにおいて、Creリコンビナーゼは、2つのベクターによりκ遺伝子座に導入されたloxP部位間に組換えを生じさせた。loxP部位は、同じ相対配向で2つのベクターに配置されているため、組換えは、2つのloxP部位の間のゲノム区間全体を含むDNAの輪が削除される結果となる。この輪は複製開始点を含まず、したがって、有糸分裂中に複製されず、したがってクローン増殖を経るにつれて、細胞のクローンから失われる。結果として生じるクローンでは、元は2つのloxP部位の間にあったDNAが欠失されている。予想される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。ES細胞クローンであって、それらの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の2つの相同コピーの一方における配列が欠失されたES細胞クローンに、V、DおよびJ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座を含むDNA片909と、Creリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する904。このDNA片K-Kと呼ばれる配列番号2の重要な特徴は以下の通りである:lox5171部位;ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームイニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありlox5171部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している;転写終結/ポリアデニル化配列;FRT部位;39のヒトκ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。;マウスκ鎖遺伝子座におけるJκ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の13.5KbのゲノムDNA片;マウス非コードDNAに組込まれた5つのヒトJ領域遺伝子セグメントを含む2KbのDNA片;lox5171部位と逆相対配向のloxP部位。第2の独立した実験では、K-KDNAの代わりに部分的ヒトDNAの代替片909を使用する。このDNAL-Kと呼ばれる配列番号3の重要な特徴は以下の通りである:lox5171部位;ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームイニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありlox5171部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している;転写終結/ポリアデニル化配列;FRT部位;38のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。;マウスκ鎖遺伝子座におけるJ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の13.5KbのゲノムDNA片;マウス非コードDNAに組込まれた5つのヒトJλ領域遺伝子セグメントを含む2KbのDNA片;lox5171部位と逆相対配向のloxP部位。K-K配列番号2およびL-K配列番号3形質移入実験からの形質移入クローンをG418選択にかけ、リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法を受けていた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーDNAが全体として、loxP部位とlox5171部位それぞれ3’ベクター905および5’ベクター903によって配置されたとの間の、欠失された免疫グロブリンκ鎖遺伝子座に組込まれる。K-K配列を使用して作り出されたDNA領域を図9の911に図示する。5’ベクター903由来の残りの要素を、FLP-仲介組換え906で除去し、結果的に、913に示す最終的なヒト化遺伝子座を生じる。G418耐性ES細胞クローンをPCRおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ-仲介カセット交換プロセスを受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するK-KクローンとL-Kクローンとの両者をさらなる使用のために選択する。K-KES細胞クローンおよびL-KES細胞クローンを、DBA/2系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ES細胞由来キメラマウスを作り出す。これらK-KES細胞クローンおよびL-KES細胞クローンは、マウスκ鎖遺伝子座に部分的ヒト免疫グロブリンDNAをそれぞれ担持する。外皮へのES細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。交尾で使用するのに最適な雌マウスは、C57Bl/6NTac系統のものであり、生殖細胞系で発現されるFlpリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子をやはり担持している。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ-仲介カセット交換ステップで作り出されたFRTに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスは、K-KマウスおよびL-Kマウスのコロニーを確立するために使用される。実施例3に記載の通りに産生された、部分的にヒトのすなわち、ヒト化された重鎖遺伝子座を担持するマウスを、ヒト化κ鎖遺伝子座を担持するマウスと交配させることができる。次に、それらの子孫を、両方ともヒト化された遺伝子座すなわち重鎖およびκについてヒト化されたについてホモ接合であるマウスを最終的に産生する計画で、一緒に育てることができる。そのようなマウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインから成る部分的ヒト重鎖を産生する。そのようなマウスはまた、そのκ遺伝子座由来のヒトκ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトκ蛋白質も産生する。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、ヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。繁殖計画に対する変動バリエーションは、ヒト化重鎖遺伝子座についてはホモ接合であるが、κ遺伝子座では、一方の染色体上にK-Kヒト化遺伝子座を有し、他方の染色体上にL-Kヒト化遺伝子座を有するというようにヘテロ接合である、マウスを生み出すことを含む。そのようなマウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインから成る部分的ヒト重鎖を産生する。それらはまた、そのκ遺伝子座の一方に由来するヒトκ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトκ蛋白質も産生する。それらは、他方のκ遺伝子座から、ヒトλ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインから成る部分的ヒトλ蛋白質を産生する。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、場合によってはヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成り、また他の場合ではヒトλ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。実施例5:マウスゲノムの免疫グロブリンλ鎖遺伝子座への、部分的ヒト免疫グロブリン領域の導入哺乳類ゲノムの一部を、部分的ヒト免疫グロブリン領域と置換する方法を、図10に図示する。この方法は、J3、C3、J1およびC1遺伝子セグメントのすぐ近くの、V2遺伝子セグメントの上流とV1遺伝子セグメントの下流の両方の遺伝子座と同一性を共有するターゲティングベクター1003を含む相同的組換え方法により、野生型マウス免疫グロブリンλ遺伝子座1001からDNAのほぼ194Kbを欠失させる。本ベクターは、DNAの194Kbを、後続の部位特異的組換えを可能にするように設計された要素と置換する。後続の部分特異的組換えでは、リコンビナーゼ-仲介カセット交換1002により、非天然のDNA片が、改変されたVL遺伝子座に移動される。この実施例で、非天然DNAは、ヒト配列と非ヒト配列との両方を含む合成核酸である。194Kb欠失を達成するための遺伝子ターゲティングベクター1003の重要な特徴は以下の通りである:ジフテリア毒素のAサブユニットをコード化している遺伝子または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の、負の選択遺伝子;λ遺伝子座におけるマウスV2可変領域遺伝子セグメントの5’由来の4KbのゲノムDNA;FRT部位;マウスPolr2a遺伝子プロモータを含むゲノムDNA片;翻訳開始配列Kozakコンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドン;Creリコンビナーゼ用の、変異型LoxP認識配列lox5171部位として知られる;転写終結/ポリアデニル化配列;ピューロマイシンに対する抵抗性を与える蛋白質をコード化しているオープンリーディングフレーム;このオープンリーディングフレームは、Polr2aプロモータおよびその隣の翻訳開始配列に関してアンチセンス鎖上にある;このオープンリーディングフレームの後に、それ自身の転写終結/ポリアデニル化配列も続く;Creリコンビナーゼ用のloxP認識配列;翻訳開始配列Kozakコンセンサス配列に組込まれたメチオニンコドンであって、上記ピューロマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームと同じアンチセンス鎖上にある;ニワトリβアクチンプロモータおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサー要素であって、上記ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレームの転写を指令するように配置され、翻訳は、loxP部位の下流の開始コドンで開始し、loxP部位を遡ってピューロマイシンオープンリーディングフレームに続くPolr2aプロモータおよびその隣の翻訳開始配列に関して全てアンチセンス鎖上にある;F3部位として知られるFlpリコンビナーゼ用の変異した認識部位;J3、C3、J1およびC1遺伝子セグメントおよび周囲の配列を含む7.3KbのゲノムDNA;ジフテリア毒素のAサブユニットをコード化している遺伝子または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の、第2の負の選択遺伝子。広く使用される手順に従ってターゲティングベクター1003を用いて、エレクトロポレーションにより、マウス胚性幹ES細胞C57Bl/6NTacマウスに由来するに形質移入する。結果として生じる構築物1005は、天然のDNAを、196Kb領域におけるターゲティングベクター1003由来の配列と置換する。エレクトロポレーションの前に、原核生物プラスミド配列または原核生物プラスミド配列と結合したポリリンカーのみで切断する希有切断制限酵素を用いて、ベクターDNAを直線化する。形質移入細胞をプレーティングし、≧24時間後に、ピューロマイシンを使用した薬物選択にかける。1週間以上後、肉眼で見えるようになった後で、薬物耐性ES細胞のコロニーをプレートから物理的に採取する。採取したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレート上に再プレーティングして、数日間培養する。その後、細胞の一部を保存記録として冷凍し、残りを分析目的でDNAの単離に使用できるように、細胞の各クローンを分割する。広く使用される遺伝子-ターゲティングアッセイデザインを使用して、PCRによりES細胞クローン由来のDNAをスクリーニングする。4つのアッセイを使用し、いずれの場合にも、PCRオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、ターゲティングベクターとゲノムDNAとの間で共有される同一性の領域外に位置するが、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の2つのアームの間の新規なDNA内たとえば、ピューロ遺伝子内に位置する。標準デザインに従えば、これらのアッセイは、ターゲティングベクター1003と天然のDNA1001との間で完全に論理的な相同的組換えを受けた形質移入細胞に由来する細胞のクローンに存在するだけであろうDNA片を検出する。形質移入1002からのほぼ6個のPCR-陽性クローンを増殖のために選択し、続いてサザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。サザンブロットは、3つのプローブおよび複数の制限酵素で消化されたクローンに由来するゲノムDNAを含む。3つのプローブおよび複数の制限酵素は、DNAが相同的組換えによって適切に改変されていたかどうかを確認することが、プローブと消化物の組合せによって可能になるように選択される。マウスES細胞で生じる、最も一般な染色体異常を識別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション手順を使用して、ES細胞のPCR-陽性クローン6個を、核型分析する。異常の証拠を示すクローンは、さらなる使用から除外される。サザンブロットデータに基づいて予想される正しいゲノム構造を有すると判断された、核型的に正常なクローンをさらなる使用のために選択する。免疫グロブリンλ鎖遺伝子座の2つの相同コピーの一方に欠失を有するES細胞クローンに、V、JおよびC領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンλ鎖遺伝子座を含むDNA片1007配列番号:4と、Creリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する1004。このDNA片1007の重要な特徴は以下の通りである:lox5171部位;ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームイニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありlox5171部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している;転写終結/ポリアデニル化配列;FRT部位;38のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウスλ非コード配列に組込まれたヒトλコード配列から成る;J~Cユニットのアレイであって、マウスλ遺伝子座由来の非コード配列内に組込まれたヒトJλ領域遺伝子セグメントおよびマウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントから成るヒトJ領域遺伝子セグメントは、J1、J2、J6およびJ7をコード化するものであるが、マウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントは、C1および/またはC2および/またはC3である;F3部位として知られるFlpリコンビナーゼ用の変異型認識部位;ハイグロマイシン耐性を与えるオープンリーディングフレーム;そのオープンリーディングフレームは、構築物において、情報をコードしている免疫グロブリン遺伝子セグメントに関してアンチセンス鎖上に位置する;lox5171部位と逆相対配向のloxP部位。形質移入クローンをG418および/またはハイグロマイシン選択にかけ、リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法を受けていた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ-仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーDNAが全体として、loxP部位とlox5171部位遺伝子ターゲティングベクターによって配置されたとの間の欠失させた免疫グロブリンλ鎖遺伝子座に組込まれる。ターゲティングベクター1003由来の残りの要素をFLP-仲介組換え1006で除去し、結果的に、1011に示す最終的なヒト化遺伝子座が生じる。G418/ハイグロマイシン耐性ES細胞クローンをPCRおよびサザンブロットで分析して、不必要な再構成または欠失がなく、予想されるリコンビナーゼ-仲介カセット交換方法を受けていたかどうかを決定する。予想されるゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。部分的ヒト免疫グロブリンDNA1011をマウスλ鎖遺伝子座に担持するES細胞クローンを、DBA/2系統由来のマウス胚盤胞に微量注入し、標準手順に従って部分的ES細胞由来キメラマウスを作り出す。外皮へのES細胞由来分布が最高レベルである雄キメラマウスを、雌マウスと交尾させるために選択する。本明細書で最適な雌マウスは、C57Bl/6NTac系統のものであり、その生殖細胞系で発現されるFlpリコンビナーゼをコード化している導入遺伝子を担持する。これらの交尾による子孫を、部分的ヒト免疫グロブリンλ鎖遺伝子座の存在、およびリコンビナーゼ-仲介カセット交換ステップで作り出されたFRTに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子およびF3-に挟まれたハイグロマイシン耐性遺伝子の喪失について、分析した。部分的ヒト遺伝子座を担持するマウスを使用して、マウスのコロニーを確立する。幾つかの態様で、ヒト化された重鎖およびκ遺伝子座を含むマウス実施例3および実施例4に記載されているは、ヒト化λ遺伝子座を担持するマウスに育てられる。この種の育種計画から生み出されるマウスは、ヒト化重鎖遺伝子座についてホモ接合であり、K-Kヒト化遺伝子座またはL-Kヒト化遺伝子座についてホモ接合であってもよい。あるいは、κ遺伝子座において、一方の染色体上にK-K遺伝子座を担持し、他方の染色体上にL-K遺伝子座を担持するヘテロ接合であってもよい。これらの各マウスは、ヒト化λ遺伝子座についてホモ接合になる。これらのマウスから回収されるモノクローナル抗体は、場合によってはヒトκ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成り、また場合によってはヒトλ可変ドメインと対をなすヒト可変ドメインから成る。λ可変ドメインは、ヒト化L-K遺伝子座またはヒト化λ遺伝子座のいずれかに由来する。実施例6:マウスゲノムへの部分的ヒト免疫グロブリンミニ遺伝子への導入ある特定の他の態様で、部分的ヒト免疫グロブリン領域は、図11に図示するもの等の、ヒト可変ドメインミニ遺伝子を含む。ここで、ヒトVH遺伝子の全部または実質的に全部を含む部分的ヒト免疫グロブリン領域の代わりに、マウス免疫グロブリン領域が、より少ないヒトVH遺伝子たとえば1~43のヒトVH遺伝子を含むミニ遺伝子1119と置換される。哺乳類宿主ゲノムに導入すべき部分的ヒト免疫グロブリン領域1110を含む部位特異的ターゲティングベクター1129を、欠失された内在性免疫グロブリン領域を有するゲノム領域1101に導入する1102。ゲノム領域1101は、部位特異的組換え部位1109,1111,1107および1105およびpuroΔTK遺伝子1103を含む。部位特異的ターゲティングベクターは、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含んでおり、この部分的ヒト免疫グロブリン領域は、i全44のヒトVHコード領域およびマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むVH領域1119と、iiマウス配列を含む10kbのpre-DJ領域721と、iiiヒトDコード領域およびJコード領域ならびにマウスゲノム内在性配列に基づいた介在配列を含むDJ領域1125と、ivマウス非機能性JH遺伝子領域とを含む。部分的ヒト免疫グロブリン領域は、改変された内在性遺伝子座との組換えを可能にする、組換え部位1109,1111,1105および1107で挟まれている。好適なリコンビナーゼが導入されると同時に1104、部分的ヒト免疫グロブリン領域が、定常遺伝子領域1127のゲノム上流に組込まれる。実施例1に記載の通り、部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座の導入に関する一次スクリーニングは、サザンブロットにより実行され、またはサザンおよび/またはロスオブネイティブアレルloss-of-native-alleleqPCRスクリーンを用いた二次スクリーンで支持される一次PCRスクリーンを用いて、実行され得る。組換え事象の一部としてHPRT遺伝子1105が欠失することにより、6-チオグアニン-依存性の負の選択を使用して、組換え事象を受けなかった細胞の同定が可能となる。前述は本発明の原理を説明するに過ぎない。本明細書に明確に記述されたり示されたりしていないが、本発明の原理を具現する様々なアレンジを当業者が考案できるであろうことは十分に理解でされるであろうし、またその精神および範囲内に含まれる。さらに、本明細書に列挙した全ての実施例および条件付きの用語は、主として読者が本発明の原理および技術を促進するために発明者が貢献する概念を理解するのに役立つことを意図するものであって、具体的に列挙された実施例および条件等に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および、実施態様ならびにその具体例を列挙する、本明細書の全ての論述は、その構造的同等物および機能的同等物の両者を含むことを意図する。加えて、このような同等物は、現在知られている同等物および将来開発される同等物の両者、すなわち、構造に関わらず、同一機能を実施する、開発されるあらゆる要素を含むものとする。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記述されている代表的な実施態様に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具現される。後続する特許請求の範囲において、用語手段meansが使用されていない限り、そこに列挙されている特徴または要素はいずれも、米国特許法35.U.S.C.第112条の第6パラグラフに従って、手段機能限定と解釈すべきではない。"