"少なくとも下記で構成されるインフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスワクチンaパンデミックインフルエンザのH1/N1亜型インフルエンザウイルスのウイルス1の分離株から派生したアミノ酸配列SEQIDNO:34を持つヘマグルチニンHA遺伝子分節、及びbパンデミックインフルエンザのH1/N1亜型インフルエンザウイルスのウイルス1の分離株から派生したアミノ酸配列SEQIDNO:39を持つノイラミニダーゼNA遺伝子分節。HA遺伝子分節が、ウイルス1の4分節SEQIDNO:4のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項1に記載のワクチン。HA遺伝子分節が、パンデミックインフルエンザのH1/N1亜型インフルエンザウイルスクレード7のHA特定配列を持つ請求項1に記載のワクチン。HA遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのH1/N1亜型インフルエンザウイルスD222残基の突然変異体を持つ請求項1に記載のワクチン。HA遺伝子分節が、D222E突然変異体を持つ請求項4に記載のワクチン。HA遺伝子分節が、野生型パンデミックインフルエンザのH1/N1亜型インフルエンザウイルスに関連するS203T突然変異体を持つ請求項4に記載のワクチン。HA遺伝子分節が、その他、P83SとI321Vの突然変異体を一つ以上持つ請求項4に記載のワクチン。NA遺伝子分節が、ウイルス1の分節6SEQIDNO:6のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項1に記載のワクチン。NA遺伝子分節が、パンデミックインフルエンザH1/N1亜型インフルエンザウイルスの野生型に関連するY275H突然変異体を持つ請求項1に記載のワクチン。NA遺伝子分節が、その他、I106VとD248Nの突然変異体を一つ以上持つ請求項9に記載のワクチン。さらに、cパンデミックインフルエンザH1N1亜型インフルエンザウイルスの分離株から派生したSEQIDNO:50のアミノ酸配列を持つペプチドM1をコード化する基質遺伝子MAを持つ請求項1に記載のワクチン。MA遺伝子分節が、ウイルス1の分節7SEQIDNO:7のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を持つ請求項11に記載のワクチン。基質遺伝子MA分節が、パンデミックインフルエンザH1N1亜型インフルエンザウイルスの分離株から派生したSEQIDNO:51のアミノ酸配列を持つペプチドM2をコードする請求項11に記載のワクチン。ペプチドM1が、A198P突然変異体を持つ請求項11に記載のワクチン。請求項1から14のいずれかに応じて、手段の一つとして患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含むインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。請求項1から14のいずれかに応じて、一つの手段として患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含む超強毒なインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。請求項1から14のいずれかに応じて、一つの手段として患者へのインフルエンザワクチンを投与することを含むオセルタミビルに抵抗力のあるインフルエンザウイルスに対して患者に免疫を持たせる方法。請求項1から14のいずれかに応じて、再構成ワクチンであるワクチン。請求項18に応じて、インフルエンザの再構成ウイルスが従来の再構成によって得られるワクチン。請求項1から14のいずれかに応じて、弱毒化生ワクチン又は不活化ワクチンであるワクチン。請求項20に記載の、経口又は経鼻投与できるように生成されるワクチン。請求項1から14のいずれかに応じて、一つの手段として、ウイルスキャリアと再構成インフルエンザウイルスの混合物、及び任意でアジュバントを含む超強毒インフルエンザウイルス株に対して患者に免疫を持たせるためのワクチンの調製方法。本明細書に使用されている用語は、当分野内、本発明の文脈内、及び各用語が使用される特定文脈内では、一般用語である。本発明を記述するために使われる用語のいくつかは、後ほど、又は、本発明の記述に関して実施者への追加手引きを提供するため本明細書の他の文節で論じる。都合上、用語のいくつかはイタリック体及び/又は引用符などを使い、強調されている。用語に付された強調文字の利用は、その文字の視点や意味に影響するものではなく、その文脈において、強調に関わらず、用語の視点や意味は同じである。1つ以上の方法で同じものを表現している。従って、ここで論じる用語は、言い換えたり、同義語を使用したりしているが、ここで特別に扱う必要性はない。特定の用語に対して同義語が使用されている。同義語を使用してもその他の同義語の使用を排除するものではない。ここで論じる用語例は、本明細書のいずれの箇所に使用する目的として、本発明をより理解しやすくするためである。同様に、本明細書に記載される複数の実施例は、本発明を限定するものではない。特に定義がない限り、ここで使われる技術用語及び科学用語は、本発明に属する技術分野で理解されるものと同じ意味を持つ。対立がある場合、定義を含む本文書は、有効な参照文書となる。以下の参照文書は、技術に基づき、本発明で使われる用語の一般的な定義を提供する。Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2ndEd.1993;TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnologyWalkered.,CambridgeUniversityPress.1990;TheGlossaryofGenetics,5thed.,R.Riegeretal.eds.,SpringerVerlag1991;andHaleMargham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology1991。一般的に、細胞及び繊維培養、分子生物学及びプロテイン、化学及びポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド交配、及びここに記述されるそれらの技術に関して使われる名称はよく知られており、技術分野で共通して使用されている。標準的技術は組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び組織変成向けに使用される例:エレクトロポレーション及びリポフェクション。製造者の仕様にもとづいて、或いは最新式で共通して得られたり、ここで記述されるように酵素反応や精製法が行われる。特に反する記載がない限り、本発明の実施には、技術分野内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組み換えDNA技術の従来の方法が使われ、これらの多くが説明のために本文書に記載される。このような技術は、以下のような文献で詳しく説明されている。Sambrook,etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEdition,1989;Maniatisetal.MolecularCloning:ALaboratoryManual1982;DNACloning:APracticalApproach,vol.IIID.Glover,ed.;OligonucleotideSynthesisN.Gait,ed.,1984;NucleicAcidHybridizationB.HamesS.Higgins,eds.,1985;TranscriptionandTranslationB.HamesS.Higgins,eds.,1984;AnimalCellCultureR.Freshney,ed.,1986;Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning1984。亜型インフルエンザウイルスは、以下の表1に示すように8つの分節に分かれたマイナス鎖RNAから構成されるゲノムを有する。SteinhauerDA,SkehelJJ.,Geneticsofinfluenzaviruses.AnnRevGenet.200236:305-332。循環ヒト株は、年々突然変異体を蓄積する傾向があり、流行パンデミックを繰り返すことで知られている。しかし、ゲノムの分節性質も異なるウイルス株間で全遺伝子の交換ができる。インフルエンザウイルスの遺伝的可変性も、ワクチン設計、病原性、及び自然宿主から出現し世界的パンデミックを起こす新ウイルスの能力に対する潜在的で深刻な影響を有している。合計950個のウイルスが細胞培養により分離され、そこから毛細管シークエンシングにより部分配列が得られた、すなわち、193個のノイラミニダーゼNAと197個のヘマグルチニンHAである。従って、NAとHAはH1N1亜型において最もよく変化する配列であるため、コンピューターによる解析系統発生解析及びBLASTでは、386個すべてHAとNAシーケンスが20グループに分かれていることが示された。従って、各グループ代表メンバーの完全ゲノムは、パイロシークエンシング装置454チタニウムロシュROCHEでパイロシークエンスされた。H1N1亜型の合計20個の完全ゲノムが得られ、各H1N1亜型は8個の遺伝子で構成されている。シークエンシングデータは異なる3つの突然変異体を有する4つのウイルス分離体を示した。iNAオセルタミビル登録商標、HA超強毒性及びマトリックス分節に突然変異体を有するH1N1亜型パンデミックウイルスウイルス1、iiNA及びマトリックス分節に突然変異体を有するH1N1亜型パンデミックウイルスウイルス2、iiiマトリックス分節MAに突然変異体を有するH1N1亜型パンデミックウイルスウイルス3、及びivノイラミニダーゼNA分節に突然変異体を有するH1N1亜型パンデミックウイルスウイルス4である。アスパラギン酸DからグリシンGに変わる222位ナンバリングH3では225に相当するアミノ酸においてヘマグルチニンHA1遺伝子配列の変化は、重大な臨床結果と関連している。2009年4月から9月の間の異なる時間的測定点において、突然変異体D222GがH1N1pdm分離株としてジェンバンクに登録された。ChenGW,ShihSR2009GenomicsignaturesofinfluenzaApandemicH1N12009virus.EmergInfectDis。シアル酸-α2,3-ガラクトース受容体α2,3又はシアル酸-α2,6-ガラクトース受容体α2,6へのインフルエンザウイルスの選択的結合が親和性を決定し、受容体α2,3及びα2,6がそれぞれ下部気道細胞及び上部気道細胞において優勢である。ShinyaK,EbinaM.YamadaS,OnoM,KasaiN,KawaokaY.Avianflu:influenzavirusreceptorsinthehumanairway.Nature.2006;4407083:435-6。最近のマイクロアレイ解析では、ヘマグルチニンHAD222Gの置換により受容体α2,6を混合受容体α2,3/α2,6の特異性に変化させる可能性を示唆しており、これにより受容体α2,3への結合が増加し、病気を重篤化している。StevensJ,BlixtO,GlaserL,TaubenbergerJK,PaleseP,PaulsonJC,etal.Glycanmicroarrayanalysisofthehemagglutininsfrommodernandpandemicinfluenzavirusesrevealsdifferentreceptorspecificities.JMolBiol.006;3555:1143-55。この順位は、受容体の結合特異性に影響を与え、ウイルス1918Id.の2つの変異ウイルスとの間のDからGの差は、混合α2-3/α2-6の特異性と結びついたシアル酸α2-6の優先変化と相関関係にある。すなわち、受容体α2-3発現細胞が多くある気道においてウイルスがより感染しやすくなる可能性があり、これにより超強毒性が生じる。しかし、D222G置換を伴う重篤な症例と異なる系統発生グループは観察されなかったMakGCetal.,AssociationofD222Gsubstitutioninhemagglutininof2009pandemicinfluenzaAH1N1withseveredisease.Eurosurveillance,Volume15,Issue1,08April2010。222位HA1において変異を有していることが観察されたウイルスはすべて、HA1クレード7の特徴においてS203T置換を特徴とするパンデミックH1N1ウイルスサブクレードに属する。これも、超強毒株及び他のH1N1亜型株に対して特有な抗原性領域をさらすアミノ酸の嚢で囲まれている。このサブクレードは、ヨーロッパ及び他の北半球地域でパンデミックウイルスの大部分を形成している。南半球に関しては、このサブクレードもかなり散らばった状態にある。現在、WHOで閲覧可能な共有データを基にすると、D222G置換の有病率は1.8以下であるHAシーケンスの2755以上の内52件を検出。確認された致死例364件の内、26件7.1のウイルスがD222G置換を有していた。これらの症例において基本的医療潜在条件に関する臨床情報は限られている。D222G置換を有する2009年のパンデミックウイルスH1N1は、WHOの推奨するワクチンウイルスである、A/California/7/2009H1N1ウイルスに抗原的に類似している。前述H1N12009年の亜型ウイルスの中に、iヘマグルチニンHA内にGly222突然変異体、及びiiオセルタミビルへの耐性に関連したノイラミニダーゼNA内にTyr275突然変異体が確認されたMcKimm-BreschkinJL.Resistanceofinfluenzavirusestoneuraminidaseinhibitors-areview.AntiviralRes2000;47:1-17;CollinsPJetal.Structuralbasisforoseltamivirresistanceofinfluenzaviruses.Vaccine2720096317-6323。従って、両方の突然変異体は重要な表現型超強毒性及びオセルタミビルへの耐性と関連しており、抗原性領域がこれらの突然変異体と関係している。本候補ワクチンは、両方の変異株とH1N1亜型野生型を効率的に認識できる。D222Gウイルスの3変種は、オセルタミビルへの耐性に関係したノイラミニダーゼNA内にH275Y置換を有している。WHO報告書。2009年H1N1亜型インフルエンザパンデミックウイルスのヘマグルチニン内のD222Gのアミノ酸置換の予備検査。2009年12月28日www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/cp165_2009_2812_review_d222g_amino_acid_substitution_in_ha_h1n1_viruses.pdf。現在も使用されるパンデミックワクチンは超強毒性突然変異体、及びオセルタミビルへの抵抗力のある突然変異体を識別するが、突然変異体が受容体の結合くぼみに位置し、ヘマグルチニンH1の抗原部位になくても、スウェーデン感染症研究所及び当研究所で実施された事前抗原的特徴では、野生型H1N1の亜型パンデミック株と比較して現在のパンデミックワクチンに対する抗血清を含む変異ウイルスの顕著な減少反応が見られた。従って、現在のワクチンは、世界中に急速に拡大した新変異株を識別するために候補となっているワクチンほど効果的ではない。ウイルスゲノムの分節7マトリックス分節の3’末端にある突然変異体は、インフルエンザ分節BMと相似60していることを示す。この突然変異体は人において特異的免疫反応を増やし、B型インフルエンザから保護することもできることが以前に報告されていた。しかし、特にウイルスマトリックス及び核タンパク質抗原に対する細胞性免疫は感染を防ぐことはできないが、ウイルス除去や治癒には重要である。4つのウイルス分離のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の特定により推察された。ウイルス1はHA、NA及びMAタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス2は、NA及びMAタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス3はNAタンパク質に関連する突然変異体を有していた。ウイルス4はMAタンパク質に関連する突然変異体を有していた。HA配列はH1N1亜型パンデミックインフルエンザ配列の野生型に関連する突然変異体を求めて解析された。分離株4株は、H1N1亜型パンデミック株のクレード7で優勢にあると思われるP83SとI321Vの突然変異体を有していた。ウイルス1も、i特異的変異体S203Tのあるクレード7を持ち、iiHA配列の222位に突然変異体D222Eを持っている。222~223位において、ウイルス1は野生型D-Qの代わりにE-Rアミノ酸を持っている。ウイルス1のHA配列の完全な一致は亜型インフルエンザウイルスのHAタンパク質にあるA/Novgorod/01/2009H1N1。ウイルス1、2及び4は、野生型A/California/07/2009の配列に関するNA6分節のI106V、D248N、Y275H残基に突然変異体を有している。突然変異体Y275Hはオセルタミビルに抵抗力がある。これら3つの分離株に見られるNA配列の完全な一致は他の分離株で見られる。現在の野生型ワクチンは、これら特異領域にあるHAとNA両方の突然変異体を有するウイルス1に対して効果が低いPuzellietal.,TransmissionofHemagglutininD222GmutantstrainofpandemicH1N12009virus.EmergingInfectiousDiseases165:863-8652010。超強毒性HA領域においてD222G/Eとオセルタミビルに抵抗力NA領域においてY275Hのあるウイルス1のようなウイルスから生まれたワクチンは、野生型H1N1のパンデミックワクチンの非効率性を克服でき、超強毒性ウイルスから守ることもオセルタミビルへの抵抗力のあるウイルスからも保護できる。ウイルス1、2及び3は、野生型A/California/07/2009の配列に関係するM1領域分節7に突然変異体A198Pを有している。さらに、これら分離株3株にはM2領域でD34相当の残基がない。この突然変異体が細胞性免疫を増やしているしかし感染を防いでいないことが報告されている。突然変異を起こした領域は、MA領域ではB型インフルエンザウイルスとの配列において60相似しており、この突然変異体を有するウイルス分離株に対して生成されたワクチンは、B型インフルエンザに対する免疫を生成することができる。また、突然変異体M1は、ウイルス除去及び回復のための治療対象として使用することもできる。本発明の方法は、インフルエンザウイルス感染に対して免疫を与えるためにここで説明したインフルエンザウイルスの抗原を使用している。抗原が派生する特異的ウイルスは、保護を与える特異的ウイルスと同じ又は異なることがあり、その理由として、特に同じウイルスのサブタイプ内で様々なインフルエンザウイルス分離株同士で干渉効果がおこることが知られている。現在使用中のインフルエンザワクチンは、全粒子ワクチンWV又はスプリットワクチンSV分割又は精製された表面抗原とも呼ばれると呼ばれる。SVワクチンは、残存ウイルスの化学的不活性化に続いて、脂質を含むウイルスエンベロープを可溶化した洗剤により破壊された精製ウイルスを含んでいるのに対し、WVワクチンはそのまま不活化ウイルスを含んでいる。またインフルエンザに対する弱毒ウイルスワクチンも開発中である。従来のワクチンを調合する方法については、Wright,P.F.Webster,R.G.,FIELDSVIROLOGY,4dEd.Knipe,D.M.etal.Ed.,1464-652001を参照することもできる。ワクチンがひとつ以上のインフルエンザ株を含む一方、異なる株は典型的に別々に培養され、ウイルスが採取され、抗原が調合された後に混合される。或いは、インフルエンザウイルスの異なる分離株の異なる分節は、多能性ワクチンを作るために組み合わされることもできる。本発明のプロセスで使われるインフルエンザウイルス複数は再集合体菌株であるか、逆遺伝学技術で得られたものでもよい。ウイルスは、弱毒化していたり、温度に敏感又は低温適応であってもよい。病原性株と非病原性株の残りの6又は7分節からHA及びNAウイルス分節を含む再集合体ウイルス株を使用することができる。本発明による免疫原性組成物に使われるインフルエンザウイルス抗原は、生ウイルス状態であっても、又は好ましくは不活化ウイルス状態であってもよい。ウイルスの不活化は、通常、ホルマリン又はβ‐プロピオラクトンなどの化学処理を伴う。不活化ウイルスが使用される場合、抗原は全ウイルス、スプリットウイルス又はサブユニットウイルスであってもよい。スプリットウイルスは、サブビリオン調剤を製造するために界面活性剤例えば、エチルエーテル、ポリソルベート80、デオキシコール酸、トリ-n-ブチルホスフェート、トリトンX-100、トリトンN101、臭化セチルトリメチルアンモニウム等でビリオン処理することによって得られる。サブユニットワクチンは、インフルエンザ表面抗原、すなわちヘマグルチニン及びノイラミニダーゼのいずれか、又は両方を含む。インフルエンザ抗原は、またビロソームの形態で表すこともできる。抗原がインフルエンザウイルスむしろインフルエンザウイルスの培養を伴わない組換え又は合成系で生成される代わりにから生成される場合、ウイルスは卵又は細胞培養のいずれかで成長させることができる。病原体のない孵化卵の培養は、ワクチン作成のために培養されたインフルエンザウイルスの既存のルートであるが、細胞培養は最近の開発である。細胞培養が使われる場合、ウイルスワクチンは、通常、MDCK細胞、ベロ細胞又はPER.C6細胞などの哺乳動物細胞内で培養される。これらの細胞株は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション英語の頭文字からATCC又はCoriellCellRepositoriesで広く入手可能となっている。例えば、ATCCは、カタログ番号CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586及びCRL-1587で様々な異なるベロ細胞を提供しており、また、カタログ番号CCL-34でMDCK細胞を提供している。ニワトリ胚線維芽細胞などニワトリ由来細胞株を含む鳥類細胞株の培養も可能であるCEF。本発明の免疫原性組成物及び薬剤は患者への投与に適している。これにより、皮内注射、経皮投与及び局所投与などに限らず様々な方法で投与できる。これらの投与は皮膚剥削術と組み合わせてエメリー研磨紙やマイクロアブレシブを使用することもできる。本発明の免疫原性組成物及び薬剤は好ましくはワクチンとして提示する。本発明の組成物にはアジュバントを含むことができる。インフルエンザワクチンに使用されるアジュバントは、アルミニウム塩、キトサン、CpG7909などのオリゴデオキシヌクレオチドCpG、MF59などの水中油型エマルション、水中油型又は油中水型エマルション、大腸菌の易熱性毒素及びその無毒化変異体、モノホスホリルリピッドA及びその派生3-O-脱アシル化、百日咳毒素の突然変異体、ムラミールジペプチドなどを含んでいる。ヘマグルチニンHAは、不活化インフルエンザワクチンの主要な免疫原であり、ワクチンの用量は通常、一元放射免疫拡散法SRIDテストで測定されるのでHAレベルに関して標準化されている。低用量を使用しても子ども、又はパンデミック状況等のため、1/2すなわち1株当たり7.5μgのHA、1/4及び1/8の分数投与で使用されることがあるが、筋肉注射ワクチンには通常、1株当たりHA約15μgを含めて使用されている。本発明の組成物には通常、インフルエンザ1株当たりHA0.1~8μgが含まれているが、好ましくは、例えば、約7.5μg、約5μg、約3μg、約2.5μg、約2μg、約1.5μg、約1μg、約0.75μg、約0.5μg、約0.4μg、約0.2μgなどである。筋肉注射ワクチンは用量0.5mlが通常である。組成物には、チオマーサル又は2-フェノキシエタノールなどの保存剤を含むことができる。しかし、組成物は水銀物質すなわち、1μg/ml未満を実質的に含まないことが好ましい、例えば、チオマーサルフリー。水銀を含有しないワクチンが好ましい。インフルエンザウイルスが培養細胞によって増殖される時、微量の宿主細胞DNAがあっても良いが、本発明の組成物は好ましくは、用量あたり宿主細胞DNAの残存が100pg未満である。汚染DNAは、クロマトグラフィーなど標準的精製手順を使用してワクチン生成の際に除去することができる。宿主細胞DNAの残存除去は、Benzonase登録商標Dnaseなどを使用して、ヌクレアーゼ処理で高めることができる。ヘマグルチニン10μg当たり宿主細胞DNAを100pg未満含むワクチンが好ましく、同様に、用量0.25ml当たり宿主細胞DNAを100pg未満含むワクチンが好ましい。ヘマグルチニン50μg当たり宿主細胞DNAを100pg未満含むワクチンが好ましく、同様に用量ml当たり宿主細胞DNAを100pg未満含むワクチンが好ましい。本発明のワクチンは、単回投与免疫療法として提供することができる。また、それらは、プライムブースト法初回免疫は、数週間又は数カ月以内に、類似抗原性の第2回目の接種が続くという意味の主要要素として提供しても良い。インフルエンザワクチンの免疫原性を試す方法は、当技術分野では周知されている。一つの方法は、以下の手順を含む。a予防接種の直前に、血中抗体HA抗体の基準滴定用に患者の腕から静脈の血液10mlのサンプルを採取し、bその後すぐ、患者は、腕に投与される場合、採血した反対の腕にワクチンを1回接種し、c予防接種の約3週間後、前述患者から10mlの採血を行う。血清を血液サンプルから分離し、必要な場合-20度で保管する。この血清は、血球凝集抑制HI又は一元放射溶血反応SRHにより関連株に対する抗ヘマグルチニン抗体試験にかける。陽性及び陰性血清は、基準調剤と同じく、公共の試験所で入手できる。抗体力価測定は2連で行われ、前後のワクチン接種の血清を同時に滴定する。各サンプルに割当てられた力価は、2つの独立した測定の幾何平均であるしかし、計算の目的として、HI<10=検出不可のいずれの結果も5として表記し、SRHのマイナス結果のいずれも標準条件で4mm2と表記される。HI試験では、セロコンバージョンは予防接種前後の免疫力価≧40の比率に相当し、さらに、抗体力価が顕著な増加例:少なくとも4倍に対応する。SRH試験では、セロコンバージョンは、≧25mm2の予防接種後のエリアに相当し、予防接種前のエリアに対して少なくとも50対応する。本発明の実施形態では、例示的な機器、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に示すが、本発明の範囲を限定する意図はない。タイトル又はサブタイトルは読者の都合に合わせて実施例に使用しても良いが、決して本発明の範囲を制限するものではないことに留意されたい。さらに、本発明で特定の理論が提案され、示されるが、正しくても又は間違っていても、本発明がその特定の理論又は構想のいずれにも関係なく実施される場合、決して本発明の範囲を制限しない。実施例1:細胞株ベロ細胞は、微生物学、細胞生物学及びウイルス学において非常に良く研究され、アフリカミドリザルCercopithecusaethiopsの腎臓から最初に分離し、広く使われている細胞株である。ウイルスワクチンロタウイルスとポリオウイルス生成のために米国で承認され、さらに、狂犬病、レオウイルス及び日本脳炎ワクチン生成用に試され、また、いくつかの症例で認められた。我々は、重感染への感受性、及びワクチン生成にあたり望ましい特徴である発酵槽及び生物反応器の工業規模における増殖能力を理由に、この細胞株を選択した。使用されるベロ細胞株は、ATCCから購入し、ジメチルスルホキシドDMSOを用いて-70度で保存した。細胞はCORNINGの指示に従って解凍した。実施例2:殺菌条件バイオセキュリティーIIIレベルで全ての設備は慎重に処理され、感染を避けるために監視されている。定期的に、部屋、材料、試薬及び機器に無菌試験を行う。細胞培養エリアは定期的に洗浄し、毎月消毒しており、エタノール70と塩素5のベンザルを使って24、48及び72時間ごとに消毒巡回を行なっている。これらの巡回の終了時に無菌試験を行い、液状チオグリコレート培地でアリコートを培養してすべての試薬を感染試験にかける。実施例3:細胞増殖ベロ細胞の増殖は、ポリスチレン細胞培養フラスコ25cm2,50cm2及び75cm2で保存するなど物理的及び化学的条件に合わせて行われた。これらのフラスコも疎水性を減らすためガンマ線を通した。このような容器は効果的な細胞粘着と単分子層形成を可能にする。細胞を増殖させるため、ダルベッコ変法イーグル培地DMEMのM199成長培地を用い、ウシ胎仔血清BFSSIGMA-Aldrich10を添加した。生理的pHの維持はフェノールレッドを用いて監視した。抗菌剤混合物ペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンBを加え、真菌汚染を抑制するために抗PPLOも加えた。細胞培養は35度、CO25、湿度5で行った。細胞質及び増殖を位相差顕微鏡でモニタリングし、これにより、細菌汚染又は真菌汚染を示した培養を廃棄することができる。完全コンフルエンスを示すフラスコの細胞継代培養は以下の方法で行われる。1.培地を取り除き、廃棄する。2.トリプシン阻害剤を含む血清すべての残りを取り除くため0.25w/vのトリプシン0.53mMEDTAの溶液で細胞株を軽くすすぐ。3.フラスコにトリプシン-EDTA液を2.0から3.0ml加えて、細胞層が通常は5~15分以内分散するまで倒立顕微鏡で細胞を観察する。4.6.0から8.0mlの完全増殖培地を加え、慎重にピペッティングにより細胞の吸引を行う。5.新しい培養容器に細胞懸濁液の適切なアリコートを加える。6.37度で培養する。80のコンフルエンスが得られた時、細胞を、1×106のHN1亜型パンデミックウイルスで接種した。このコンフルエンスレベルは、H1N1亜型インフルエンザウイルスにより生じる細胞変性効果の観察に最適だった。実施例4:ウイルス分離ウイルス分離は、ベロ細胞80コンフルエンスを接種した25cm2のフラスコで行われた。ウイルス分離のために、培地が取り除かれ、細胞を遠心分離し、そして細胞残屑を廃棄するため3回再懸濁した。臨床的にH1N1亜型インフルエンザと診断され、リアルタイムでPCRにより確認された患者から得た綿棒サンプルから、細胞培養に50μlを接種し、そして、細胞表面にウイルスを付着させるために30分間培養した。その後、M199を1のBFSで添加し、40度40分間培養した。接種された培養は、位相差顕微鏡で細胞変性効果の有無を検出するためモニタリングされた。同時にウイルス負荷をリアルタイムPCRによって測定した。1×106に達した時、培養は-80度DMSO10に凍結し、さらなる研究のために保管された。実施例5:リアルタイムRT-PCRによるウイルス感染の確認と定量化ウイルスRNAは、前述のように、市販の装置ROCHEを使用して、ベロ細胞培養から抽出し、その後、RNAは、NanoDrop装置を用いて分光光度法により定量化した。定量化プラスミド内でクローン化したH1遺伝子の101~106のコピーを目的にインフルエンザ用基準を含み、リアルタイムPCRによりH1N1亜型の検出のためサーモサイクラーLightCycler480ROCHEでCDCプロトコールを行った。ウイルス負荷の判定は、各サンプルに対して交差点形式で計算することによって行われた。図1は、ウイルス負荷の定量化の実施例を示す。実施例6:サンプル選出臨床及び疫学データに基づいて、シークエンシング用H1N1亜型パンデミックの陽性サンプル3760個のうち計193個のサンプル。抽出のための臨床基準は、感染症の重症度、薬剤耐性及び臨床的異型性のシナリオ。そして、疫学基準は、場所、性別及び年齢に基づいた。選出されたサンプルは2009年3月から11月までに報告された最も集中した病巣4か所で採取された。サンプルは、ウイルス輸送培地の2.5mlで再懸濁、及び調合され、均質500μl、-70度下で保存した。実施例7:核酸の抽出臨床サンプルの全核酸は、MagNAPureLCRoche器具にMagNAPureLCTotalNucleicAcidIsolationRocheキットを用いてExternalLysisプロトコールにより製造者の指示に従って分離し、脱イオン水100μで再懸濁した。すなわ、MagnaPure核酸カートリッジにサンプル500μlを置き、溶解バッファーを加えてから、全てのパラメータを設置し、開始した。RNAを抽出して後の解析のために-70度下に置いた。実施例8:リアルタイムPCRによるH1N1亜型パンデミックインフルエンザの検出H1N1亜型パンデミックインフルエンザの検出は2つの方法によって行われた。Real-timereadyRNAVirusMaster53Rocheキットを用いて、Real-timereadyInfluenzaA/H1N1検出セットRoche。LightCyclerRoche器具を使用して、熱サイクル法によって次の条件を行った:50度下で30分;95度下で15分;94度下で15秒45サイクル;及び60度下で30秒。第二の方法は、亜型インフルエンザH1N1用のRTプロトコールの方法をリアルタイムPCRで、前記プロトコールに記載されるプライマーとプローブ、及びonestepRT-PCRInvitrogenSuperScript商標IIIPlatinum登録商標One-StepQuantitativeキットを用いた。熱サイクル法は、LightCycler2.0Roche器具によって次の条件で行った:50度下で50分;95度下で2分;95度下で15秒45サイクル;及び55度下で30秒。両方法の反応はすべて、製造者の指示に基づいて、全RNA5μlを用いて20μlの反応量で行われた。検出の両方法には内的コントロールが含まれたRoche法向けにはミオスタチンのヒト遺伝子、CDCプロトコールにはRNA分解酵素P。各サンプルは、テストされ、リアルタイムPCRは次のプローブを用いながら別に行われた。亜型インフルエンザInfA、一般の豚インフルエンザSwFluA、豚のヘマグルチニンSwH1及びRNA分解酵素PRPヒト核酸用の内的コントロール。ポジティブ及びネガティブコントロールを加えた。反応混合には、各プライマー0.8μΜ、各プローブ0.2μΜ、PCR1X溶解バッファー、及びSuperScriptIII/PlatinumTaqMixInvitrogen0.5Uが含まれていた。図2は、サンプルの配列を示す。増幅条件は以下となった。逆転写:50度/30分不活性化:15度/2分エクステンション:95度/15サイクル、及び55度/30サイクル実施例9:データ解析結果は、以下の要領によってWHO基準に基づいて解析した。1.ネガティブコントロールには蛍光はあってはならない。2.試験用サンプルは、RPプローブに対して蛍光発光を示さなければならない。3.ヒト核酸コントロールは、プローブInfA、SwFluA及びSwH1に対して蛍光発光してはならない。4.ポジティブコントロールH1N1亜型核酸は、全てのプライマー及びプローブに対して蛍光発光しなければならない。5.基準がすべてクリアされたら、サンプルはポジティブとみなす。図3A及び図3Bは、LightCycler2.0リアルタイムで蛍光カーブを示しながら、熱サイクラーのグラフィカルインターフェースを示す。図3A:臨床サンプル。図3B:RNA分解酵素PRP検出。実施例10:シークエンシング細胞培養によって計950個のウイルスを分離し、そのうち、ABI3100AppliedBiosystemsシークエンシング器で毛細管シークエンシングを介して、ノイラミニダーゼNA193個の部分遺伝配列、及びヘマグルチニンHA197個の部分遺伝配列を得た。H1N1亜型ではHA及びNAがより変動する配列であるため、コンピューターによる解析系統発生解析及びBLASTは386個の配列HA及びNA配列が20個に分類できることを示したため、各分類グループの代表メンバーの完全ゲノムに対して454TitaniumRochePyrosequencingROCHE装置でパイロシークエンスが行われた。実施例11:ニワトリ胚におけるインフルエンザウイルスの増殖ベロ細胞においてインフルエンザワクチン向けの候補を増殖させる試みを何度も行った。しかし、それらの試みは、回収したウイルス量が少なかったため、最初の3代継代でも失敗した。これを考慮して、SPF特定病原体未感染ニワトリ胚において1~2代継代を行った。各候補となる0.1mlの羊水で接種を行った。パンデミックインフルエンザ時期で事前に分離されていた他の40ウイルスも加えて、その接種は、各ウイルスに対して卵を2個使って行った。35度下で3日してから、各感染各胚から羊水を抽出し、回収された液体は細胞残屑を取り除くために3000xgで遠心分離し、そして浮遊物はqRT-PCRによって解析し-80度下で保存した。全ての手順は、バイオセキュリティーリスクを防ぐためにバイオセキュリティーレベルIIIで要請される基準に従って行った。胚内の継代後、ウイルス負荷は株3つに対して多く、そのうち1株は候補ウイルスであった。RT-PCRテストでさらに分離株10株を検出したが、ウイルス負荷が低いことを示した。従って、他のSPFニワトリ胚に対して再度接種を行ったが、この場合、接種は尿膜腔液で行った。培養の72時間後に、前記の同条件に従って、尿膜腔液のみを回収しながら、ウイルスを抽出した。より少ない量をRT-PCR法を用いて解析し、その残りは-80度下で保管した。結果は、分離株10株のうち6株は高いウイルス負荷を示しながら、効率的に増殖できることを示した。カロリンスカ研究所の配列証明ニワトリ胚の流行以前に、cDNAウイルス株が、パイロシークエンス454ROCHEシステムによって配列の検証をするためにカロリンスカ研究所へ送られた。バイオインフォマティクス解析は、我々の研究所が事前に特定した配列の確認を行った。一次ウイルスの同定インフルエンザワクチン用の候補ウイルスは、HZFLUJALと命名された。ベロ細胞株で培養するためのインフルエンザウイルスの順応候補ウイルスHZFLUJALや胚から抽出した他の2つのウイルスをベロ細胞株で接種した。順応を得るために、培養の浮遊物を感染後7~10日で回収しながら数回継代を行った。各浮遊物は、ベロ細胞の新たな継代を感染させるために用いた。各継代のウイルス負荷を数量化した。図4Aは、胚のウイルス負荷と同ウイルスの各継代培養の差を示す。前述図は、この組織細胞株に対するウイルス順応が4代目継代まで得られること明確に示している。MDCK細胞株において増殖するためのインフルエンザウイルスの順応ベロ細胞株だけがインフルエンザウイルスの基質として評価されたのではなく、MDCK細胞株もウイルス増殖のために用いられた。ベロ細胞の順応に適用した同じ手順でMDCK細胞にも実施した。予備結果はニワトリ胚のウイルス負荷より高いウイルス負荷を得るため外見から判断して3継代だけを必要としなかったから前述細胞株に対してより良い順応を示した図4B。HZFLUJAL一次ウイルスを取得するためのウイルス増殖事前にベロ細胞株にて培養するためにならしたウイルスを増殖する目的で、ベロ細胞で4代継代の1クライオバイアルを解凍してから、175cm2のフラスコでベロ細胞を感染させるために用いた。CO2培養器に33度下において10日後、一次ウイルス120mlを得た。そのウイルスは107ウイルス粒子/mlより多いウイルス負荷だった約107.7。1mlの一次ウイルスを含むクライオバイアル120個を得た。一次ウイルスの品質管理一次ウイルスに対して無菌テスト及び血球凝集テストを行った。前者のテストでは、一次ウイルスのクライオバイアル4個を解凍し、そのうちのクライオバイアル2個を、NHチオグリコール酸培地100mlを含む2本のフラスコに接種するために用い、残りのクライオバイアル2個は、抗生物質のないDMEM培地の接種に使った。両培地は、35度下で8~15日間接種した。接種機関後、培地に増殖も変化も見られなかったので、無菌バクテリア、カビ及び原虫が無いとみなした。血球凝集テストは、一次ウイルスのヘマグルチニン価を測定するために実施した。このテストでは、U型96穴マイクロプレートに、1:2~1:1024の一次ウイルスをPBSph=7.4で連続希釈した。各希釈溶液をPBSに、O型ヒト赤血球0.5v/vの懸濁液と同じ量を加えた。前記マイクロプレートを4度下で2時間培養し、結果は1:8の赤血球凝集価を示した。実施例12:HZFLUJALワクチンを使用した前臨床予備テスト前臨床予備テストウイルス不活化前臨床予備テストの実施にあたり、一次ウイルスのクライオバイアル1個を解凍し、CO2培養器において33度下で7日後、80cm2のフラスコでベロ培養に感染させるために使用した。前記培養は、ホルマリン最終濃度0.02v/vによって35度下で18時間をかけて不活化した。ホルマリンは、48時間以内にDMEMダルベッコ変法イーグル培地に対する4回の透析で除去した。その後、赤血球凝集価は、定量化し、再度1:8となった。不活化ウイルス懸濁液は25μl当たり106のウイルス粒子に調整され、下記のグループにワクチンとして使用された。前臨床予備テスト用の動物モデル前臨床予備テスト用に7~8週齢のBALB/cメスマウスを用いた。各グループは、Hepaフィルターで覆われたラックに置いた。全ての動物は不要な苦痛を回避するよう取り扱った。プロトコールが完了した時点で全てのマウスを安楽死させた。前臨床予備テストでセロコンバージョン試験各試験にマウス5匹の9グールプに対してセロコンバージョン試験を実施した。グループ1:106ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与グループ2:106ウイルス粒子トランスファーファクター筋内投与グループ3:106ウイルス粒子舌下投与グループ4:106ウイルス粒子筋内投与グループ5:市販ワクチン舌下投与グループ6:市販ワクチン筋内投与グループ7:非ウシ胎仔血清DMEM舌下投与グループ8:非ウシ胎仔血清DMEM筋内投与グループ9:無治療前臨床予備テストにおける用量反応試験用量反応試験は、各試験にマウス3匹の5グールプに対して実施した。グループA:107ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与グループB:105ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与グループC:104ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与グループD:103ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与グループE:102ウイルス粒子トランスファーファクター舌下投与免疫化プロトコールの初めから、全てのマウスを4日間、免疫試験を行うためのバイオセキュリティー要件が揃っている動物実験室に置いた。順応時間後、体重、外見等の臨床データを記録し、免疫前に各マウスから抗凝固剤を使わずサンプル用の採血を行った。その後、各グループは、それぞれの薬の投与ルートによって接種された。各マウスの免疫後7日、14日、21日及び28日目の血液を4サンプル取得した。血清が、血液サンプルの遠心分離によって得られ、H1N1亜型インフルエンザウイルスに対するIgG2抗体を検出するために使用された。さらに、免疫グロブリンAIgAの分泌物を検出するために各マウスの分泌サンプルを採取した。実施例13:CIATEJ/OPKOワクチンによって生成されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対する抗体の検出ベロ細胞においてCIATEJ/OPKOワクチンとしてここで記載する例示的ワクチンを開発し、H1N1亜型パンデミックインフルエンザに対する抗体を生成する能力を知るために試験を実施した。ベロ細胞においてCIATEJ/OPKOによって開発された抗原は、マウスにワクチンとして使用される抗体生成を誘発することができた。CIATEJ/OPKO抗原に誘発された抗体価は、市販ワクチンよりも大きかった。図5は、ELISAによって検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対する合計抗体を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした。図6Aは、ELISA法により血清中で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgM抗体を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、筋肉投与とした。トランスファーファクターが、CIATEJ/OPKOワクチンに添加されたとき、IgG抗体価を5倍増加させ、同様に、トランスファーファクターは、免疫付与第1週中にIgM抗体価を3倍増加させた。図6Bは、ELISA法により血清中で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgG抗体を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、筋肉投与とした。CIATEJ/OPKOワクチンの筋内投与は、舌下投与よりIgG2A抗体の誘発が大きかったことを示した。図7Aは、ELISA法により血清中で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgG2A抗体を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした。図7Bは、ELISA法より血清中で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgG2Aの用量反応を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、舌下投与とした。CIATEJ/OPKOワクチンの筋内投与は、舌下投与に匹敵するIgA抗体の誘発を示した。図8Aは、ELISA法により呼吸粘膜で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgA抗体を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした免疫付与21日後。図8Bは、ELISA法より呼吸粘膜で検出されたH1N1亜型パンデミックインフルエンザに対するIgAの用量反応を示す。CIATEJ/OPKOワクチンは、ベロ細胞、TF=トランスファーファクターにおいて開発された。免疫付与は、7~8週齢のBALB/cメスマウスに行った。免疫付与は、舌下または筋肉投与とした免疫付与21日後。参考文献MagnaPureLCTotalNucleicAcidIsolationKit.VersionDecember2008.Kitforisolationoftotalviralnucleicacidsfrommammalianserum,plasmaandwholeblood.Cat.No.03038505001.SuperScriptIIIPlatinumOneStepQuantitativeRT-PCRSystem.Cat.No.11738-088.WorldHealthOrganization.CDCprotocolofRealtimeforInfluenzaAH1N1.April292009.CENAVECE-InDRE.LineamientosparalaredNacionaldelaboratoriosdesaludpublicaeinstitutosnacionalesdesaludparavigilanciadeinfluenzaenMexico2009.AmmermanN.,BeierM.,andAzadF.2008GrowthandMaintenanceofVeroCellLines.CurrProtocMicrobiol.Pp.1-10.ErlichH.,MullerM.,HelenM.,TambyahP.,JoukhadarM.,MontomoliM.,FisherD.,BerezukD.,FritschM.,Low-BaselliA.,VartianN.,BobrovskyR.,BorislavaG.,Pavlova,PollabauerE.,KistnerO.,andBarrettN.2008AClinicalTrialofaWhole-VirusH5N1VaccineDerivedfromCellCulturefortheBaxterH5N1PandemicInfluenzaVaccineClinicalStudyTeam.N.Engl.J.Med.358;24.Pp.2573-2584.InstitutodeMedicinaTropicalPedroKouri.2003.Manualdeprocedimientosparaeldiagnosticodelaboratoriodelainfeccionesrespiratyoriasagudasdeetiologiaviral.Organizacionpanamericanadelasalud.Organizacionmundialdelasalud.KistnerO.,HowardK.,SpruthM.,WodalW.,BruhlP.,GerencerM.,CroweB.,SavidisH.,LiveyI.,ReiterM.,MayerhoferI.,TauerC,GrillbergerL,MundtG.,FalknerF.,andP.Noel.2007CellcultureVeroderivedwholevirusH5N1vaccinebasedonwild-typevirusstraininducescross-protectiveimmuneresponses.BaxterAG,BiomedicalResearchCenter,Uferstrasse,Austria.Vaccine.200710;532.P.6028-6036.ReinaJ.,FernandezV.,BlancoI.yMunarM.1997.ComparisonofMadin-DarbyCanineKidneyCellsMDCKwithaGreenMonkeyContinuousCellLineVeroandHumanLungEmbryonatedCellsMRC-5intheIsolationofInfluenzaAVirusfromNasopharyngealAspiratesbyShellVialCulture.AmericanSocietyforMicrobiologyVol.35,No.7.P.1900-1901.RyanJohn.Ph.D.Introductiontoanimalcellculture.CorningIncorporatedLifeSciences900ChelmsfordSt.Lowell,BulletinTechnical.MA01851.P.1-24.RyanJohn.Ph.D.SubculturingMonolayercellculturesProiocolCorningIncorporatedLifeSciences900ChelmsfordSt.Lowell,MA01851.P.1-5.SheetsR.2000HistoryandCharacterizationoftheVeroCellLine.VaccinesandRelatedBiologicalProductsAdvisoryCommitteeMeetingtobeheld.刊行物及び特許出願が個別に参照されるように、引用された全ての刊行物及び特許出願は本願明細書に援用される。本発明を、図面あるいは例示的な実施形態において説明したが、当業者は、以上の詳細な説明および図面並びに特許請求の範囲から、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を逸脱することなく、本発明の好適な実施例に変形および変更を施せることを理解するであろう。"