"単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSであって、ORF1aによってコードされるそのタンパク質が:アミノ酸配列AMANVYD配列番号:9内のアミノ酸N;アミノ酸配列IGHNAVM配列番号:12内のアミノ酸N;アミノ酸配列TVPDGNC配列番号:15内のアミノ酸D;アミノ酸配列CWWYLFD配列番号:18内のアミノ酸Y;アミノ酸配列HGVHGKY配列番号:21内のアミノ酸H;アミノ酸配列AAKVDQY配列番号:24内のアミノ酸V;アミノ酸配列PSATDTS配列番号:27内のアミノ酸T;アミノ酸配列LNSLLSK配列番号:30内のアミノ酸L.アミノ酸配列APMCQDE配列番号:33内のアミノ酸C;アミノ酸配列CAPTGMD配列番号:36内のアミノ酸T;アミノ酸配列PKVAKVS配列番号:39内のアミノ酸A;アミノ酸配列AGEIVGV配列番号:42内のアミノ酸I;アミノ酸配列ADFNPEK配列番号:45内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列QTPILGR配列番号:48内のアミノ酸I;のいずれかを含有するアミノ酸配列からなる群から選択される、前記PRRSウイルス。単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSであって、ORF1aによってコードされるそのタンパク質が:アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D;アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H;アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C;アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A;アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I;のいずれかを含有するアミノ酸配列からなる群から選択される、前記PRRSウイルス。単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSであって、ORF1aによってコードされるそのタンパク質が、変種a、b、c及びdの一つ又はそれより多くを独立に含有するアミノ酸配列を有し、それぞれの前記変種は、以下:変種a、アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D,アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H;又は変種aのいずれかのサブセット;変種bアミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C;又は変種bのいずれかのサブセット;変種cアミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A;又は変種cのいずれかのサブセット;変種dアミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I;又は変種dのいずれかのサブセット;のとおり定義される、前記PRRSウイルス。請求項3、変種aに記載の五つのアミノ酸配列の二つ又はそれより多くを含有する、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRS。請求項3、変種bに記載の四つのアミノ酸配列の二つ又はそれより多くを含有する、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRS。請求項3、変種cに記載の二つのアミノ酸配列を含有する、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRS。請求項3、変種dに記載の三つのアミノ酸配列の二つ又はそれより多くを含有する、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRS。適した宿主細胞に直接遺伝子導入し、そしてこのように遺伝子導入された適した宿主細胞からブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSを発現することが可能なプラスミドであって、このプラスミドは:aPRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列、及びb前記感染性RNA分子を転写することが可能なプロモーターを含んでなり、前記ウイルスのORF1aによってコードされるタンパク質が:1アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D,アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H;又はこれらのいずれかのサブセット;及び/又は2アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C;又はこれらのいずれかのサブセット;及び/又は3アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A;又はこれらのいずれかのサブセット;及び/又は4アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I;又はこれらのいずれかのサブセット;を含有するアミノ酸配列を有する、前記プラスミド。前記プロモーターが、標的真核細胞中のDNAの起動を許容することが可能な真核生物プロモーターである、請求項8に記載のプラスミド。前記プロモーターが、前記プラスミドのinvitroの転写を指示することが可能な原核生物又はファージプロモータである、請求項8に記載のプラスミド。PRRSウイルスを産生する方法であって、適した宿主細胞を請求項8に記載のプラスミドで遺伝子導入し、そして遺伝子導入された細胞によって産生されたPRRSウイルスを得ることを含んでなる、前記方法。PRRSウイルスを産生する方法であって、請求項10に記載のプラスミドを転写することを含んでなる、前記方法。北米型PRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記DNA配列が以下のaからc:a配列番号:6;b前記aのDNA配列と少なくとも85の同一性を有する配列であって、そのORF1aによってコードされるタンパク質が:1アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D,アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H、又はこれらのいずれかのサブセット;或いは2アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C、又はこれらのいずれかのサブセットから;或いは3アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A、又はこれらのいずれかのサブセットから;或いは4アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I、又はこれらのいずれかのサブセットからのもの;を含有するアミノ酸配列を有する、配列;並びにc65度Cにおける0.5MのNaHPo4、7のSDS、1mMのEDTA中のフィルターに結合したDNAへのハイブリダイゼーション、及び68度Cにおける0.1SSC/0/1SDS中の洗浄を含んでなる、高度に厳密な条件下でa又はbのDNA配列の相補体にハイブリダイズするDNA配列;からなるグループから選択される、前記単離されたポリヌクレオチド分子。請求項13に記載のポリヌクレオチド分子で形質移入された宿主細胞。PRRSウイルスによる感染に対してブタ動物を保護するためのワクチンであって、a請求項6に記載のポリヌクレオチド分子によってコードされた遺伝子的に改変された北米型PRRSウイルス、b前記感染性分子、cプラスミドの形態の前記ポリヌクレオチド分子、又はd前記ポリヌクレオチド分子を含んでなるウイルスベクター、及び獣医学的使用のために適した担体を含んでなり、ここにおいて、PRRSウイルスは、感染に対して免疫保護を産生するために有効な量において、PRRSウイルスによる感染に対して有効な免疫保護的反応を誘発することが可能である、前記ワクチン。PRRSウイルスをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が:a配列番号:6のDNA配列;b前記aのDNA配列と少なくとも85の同一性を有するDNA配列であって、そのORF1aによってコードされるタンパク質が:1アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D,アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H、又はこれらのいずれかのサブセット;或いは2アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C、又はこれらのいずれかのサブセット;或いは3アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A、又はこれらのいずれかのサブセット;或いは4アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I、又はこれらのいずれかのサブセット;を含有するアミノ酸配列を有する、DNA配列;或いはc65度Cにおける0.5MのNaHPo4、7のSDS、1mMのEDTA中のフィルターに結合したDNAへのハイブリダイゼーション、及び68度Cにおける0.1SSC/0/1SDS中の洗浄を含んでなる、高度に厳密な条件下でa又はbのDNA配列の相補体にハイブリダイズするDNA配列;に対応するRNA配列である、前記単離されたポリヌクレオチド分子。PRRSウイルスの野生株で天然に感染されたブタ動物及び請求項15に記載のワクチンでワクチン接種されたブタ動物間を識別するポリヌクレオチド分子を含んでなる、診断キット。前記ワクチンが、野生型P129ウイルスと比較して減少したインターフェロン-α阻害効果を有する、請求項15に記載のワクチン。a配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、及び配列番号:6、baのいずれかの配列の相補体;c65°Cにおいて0.5MのNaHPO4、7のSDS、1mMのEDTA中でフィルターに結合されたDNAにハイブリダイズし、そして68°Cにおいて0.1×SSC/0.1SDS中で洗浄することと定義される、高度に厳密な条件下でa又はbの配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド;da、b又はcのポリヌクレオチドと少なくとも70同一であるポリヌクレオチド;ea、b又はcのポリヌクレオチドと少なくとも80同一であるポリヌクレオチド;fa、b又はcのポリヌクレオチドと少なくとも90同一であるポリヌクレオチド;ga、b又はcのポリヌクレオチドと少なくとも95同一であるポリヌクレオチド;ha、b又はcのポリヌクレオチドと少なくとも99同一であるポリヌクレオチド;からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、そして、aからhのそれぞれの場合:アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D;アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H;アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C;アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A;アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I;からなる群から選択される、ORF1a発現タンパク質中のアミノ酸を、前記配列がコードするか、又はその相補体がコードする、単離されたポリヌクレオチド。請求項19に記載のいずれかのDNAポリヌクレオチド配列の相補体である、RNAポリヌクレオチド分子。本明細書及び付属する特許請求の範囲中で使用する場合、単数の形態一つ、一つの、及びそのは、文脈が明白に他を指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、その方法に対する言及は、本開示を読むことによって当業者にとって明白となるものである本明細書中に記載される種類の、一つ又はそれより多い方法、及び/又は工程等を含む。他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料は、ここに記載される。本発明の実施は、具体的に反対に示されない限り、当技術の技能内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組換えDNA技術の慣用的な方法を使用するものであり、これらの多くは、例示の目的のために以下に記載される。このような技術は、文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook,etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEdition,1989;Maniatisetal.MolecularCloning:ALaboratoryManual1982;DNACloning:APracticalApproach,vol.IIID.Glover,ed.;OligonucleotideSynthesisN.Gait,ed.,1984;NucleicAcidHybridizationB.HamesS.Higgins,eds.,1985;TranscriptionandTranslationB.HamesS.Higgins,eds.,1984;AnimalCellCultureR.Freshney,ed.,1986;Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning1984を参照されたい。北米型PRRSウイルスは、制約されるものではないが、1990年代初め頃、米国で最初に単離されたPRRSウイルス例えば、Collins,J.E.,etal.,1992,J.Vet.Diagn.Invest.4:117-126を参照されたい;北米型PRRSウイルス分離株MN-1bKwang,J.etal.,1994,J.Vet.Diagn.Invest.6:293-296;PRRSのケベックLAF-exp91株Mardassi,H.etal.,1995,Arch.Virol.140:1405-1418;及び北米型PRRSウイルス分離株VR2385Meng,X.-Jetal.,1994,J.Gen.Virol.75:1795-1801のような、北米型PRRSウイルス分離株に伴う遺伝子的特徴を有するいずれものPRRSウイルスを意味する。遺伝子的特徴は、北米型PRRSウイルス株によって共有される、ゲノムヌクレオチド配列の類似性及びアミノ酸配列の類似性を指す。中国型PRRSウイルス株は、一般的に北米型株と約80-93のヌクレオチド配列類似性を示す。欧州型PRRSウイルスは、1991年頃、欧州で最初に単離されたPRRSウイルス例えば、Wensvoort,G.,etal.,1991,Vet.Q.13:121-130を参照されたいに伴う遺伝子的特徴を有するPRRSウイルスのいずれもの株を指す。欧州型PRRSウイルスは、更に当技術において時にレリスタッドウイルスとも呼ばれる。有効な免疫保護反応、免疫保護、等の用語は、本発明の目的のために、ワクチン接種された動物において病原体による感染に対して保護するために、病原体の一つ又はそれより多い抗原エピトープに対して向けられる免疫反応を意味する。本発明の目的のために、病原体による感染に対する保護は、感染の絶対的予防だけでなく、更に病原体による感染の程度又は速さの減少のいずれもの検出可能な減少、或いはワクチン接種されていない感染された動物と比較した、ワクチン接種された動物における病原体による感染から得られる疾病、又は任意の徴候若しくは症状の重篤度のいずれもの検出可能な減少を含む。有効な免疫保護反応は、以前に病原体で感染されていない及び/又はワクチン接種の時点に病原体で感染されていない動物に誘発することができる。有効な免疫保護反応は、更にワクチン接種の時点で病原体に既に感染している動物においても誘発することができる。遺伝的に改変されたPRRSウイルスは、これが改変されていない親株より少なく病原性である場合、弱毒化されている。ある株は、これが疾病の重篤度を決定する一つ又はそれより多いパラメーターにおいて、統計的に有意な減少を示す場合、より少なく病原性lessvirulentである。このようなパラメーターは、ウイルス血症のレベル、発熱、呼吸困難の重篤度、生殖性徴候の重篤度、或いは肺の病変の数又は重篤度、等を含むことができる。PRRSウイルスの複製を支持することが可能な宿主細胞は、本発明のウイルスで感染された場合、感染性PRRSを発生することが可能な細胞を意味する。このような細胞は、ブタ肺胞マクロファージ細胞及び誘導体のような単球/マクロファージ系列のブタ細胞、MA-104サル腎臓細胞及びMARC-145細胞のような誘導体、並びにPRRSウイルスに対する受容体で遺伝子導入された細胞を含む。用語PRRSウイルスの複製を支持することが可能な宿主細胞は、更に生きたブタ内の細胞も含む。オープンリーディングフレーム、又はORFは、本明細書中で使用する場合、特定のPRRSウイルスタンパク質をコードするために必要な、介在するストップコドンを伴わない、最小のヌクレオチド配列を意味する。ブタの及びブタは、本明細書中で互換的に使用され、そして例えば家畜のブタのようなSuidae科のメンバーであるいずれもの動物を指す。用語PRRSウイルスは、本明細書中で使用する場合、他に示さない限り、北米型又は欧州型PRRSウイルスのいずれかの全ての株を意味する。PRRSは、PRRSウイルス感染によって起こされるブタの病的徴候を包含する。このような徴候の例は、制約されるものではないが、発熱、妊娠したメスの流産、呼吸困難、肺の病変、食欲減退、及び若年のブタの死亡を含む。本明細書中で使用する場合、PRRSを産生することが不可能であるPRRSウイルスは、ブタに感染することができるが、しかしブタのPRRS感染に通常伴う全ての病的徴候を産生しないウイルスを指す。PRRSVのNタンパク質又はORF7は、本明細書中で使用する場合、PRRSウイルスの欧州型及び北米型遺伝子型の両方のORF7によってコードされるポリペプチドとして定義される。現時点で既知であるNタンパク質の特異的なアイソタイプの例は、寄託番号PRU87392によってジェンバンクに報告されている北米型PRRSプロトタイプ分離株VR2322の123アミノ酸のポリペプチド、及びジェンバンク寄託番号A26843で報告されている欧州型プロトタイプPRRS分離株レリスタッドの128残基のNタンパク質である。PRRSVのNタンパク質のNLS-1領域又はPRRSVORF7NLS-1領域は、熟成したNタンパク質の最初の約15のN末端残基内に位置する、四つの連続した塩基性アミノ酸リシン又はアルギニン、又は三つの塩基性残基及びヒスチジン又はプロリンを含有するpat4又はnuc1核局在化シグナルNakaiKanehisa,1992;RowlandYoo,2003を指す。例として、VR2332のNLS-1領域の配列は、KRKKであり、そして残基9-12に位置し、一方レリスタッド分離株配列は、KKKKであり、そしてNタンパク質の残基10-13に位置している。PRRSVのNタンパク質のNLS-2領域又はPRRSVORF7NLS-2領域は、一つ又は二つの形態をとることができるNタンパク質内の二番目の核局在化シグナルを指す。北米型PRRSウイルスにおいて、NLS-2は、本出願人等がpat8モチーフと命名したパターンを有し、これは、五つのうち少なくとも三つの塩基性残基K又はRを含有する五つの残基の配列によって三つの残基内に続くプロリンから始まるNakaiKanehisa,1992;RowlandYoo,2003によって記載されているpat7又はnuc2モチーフの僅かな改変。例として、このような配列は、北米型PRRSVの分離株VR2332のNタンパク質残基41-47に位置し、そして配列P...Kによって表される欧州型PRRSウイルスにおいて、NLS-2は、pat4又はnuc1モチーフを有し、これは、四つの塩基性アミノ酸又はヒスチジン又はプロリンを伴う三つの塩基性残基の連続した伸長であるNakaiKanehisa,1992;RowlandYoo,2003。欧州型PRRSVの分離株レリスタッドのNLS-2は、残基47-50に位置し、そして配列K..Kによって表される。PRRSVのNタンパク質のNoLS領域又はPRRSVORF7NoLS領域は、約32アミノ酸の全長を有し、そしてそのアミノ末端近辺のNLS-2領域を組込む核局在化シグナルを指す。例として、VR2332のNoLS領域の配列は、残基41-72に位置し、そして配列P...Rによって表されRowlandYoo,2003、そして対応するレリスタッド分離株配列は、残基42-73に位置し、そして配列P..Rによって表される。遺伝子導入された宿主細胞は、米国特許第5,600,662号に記載されているような実際的に任意の宿主細胞を意味し、PRRSウイルスで遺伝子導入された場合、RNAは、PRRSビリオンの少なくとも最初の一巡を産生することができる。感染性DNA分子は、本発明の目的のために、適した宿主細胞からの機能的ビリオンに複製、転写、及び翻訳を支持するために必要な要素をコードするDNA分子である。同様に、単離されたポリヌクレオチド分子は、存在する場合、その天然に存在する状態からいずれもの検出可能な程度に精製された本発明のポリヌクレオチド分子を含んでなる物質の成分を指す。本発明の目的のために、二番目のポリヌクレオチド分子RNA又はDNAのいずれかのヌクレオチド配列は、第1のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同であるか、又は前記第1のポリヌクレオチド分子に同一性を有し、ここにおいて、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重の基づくように、第1のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列として同じポリアミノ酸をコードするか、又はこれがポリアミノ酸をコードする場合、これは、第1のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸に十分に類似であり、従って本発明の実施において有用である。相同なポリヌクレオチド配列は、更にセンス及びアンチセンス鎖と、そして全ての場合、いずれものこのような鎖の相補体と呼ばれる。本発明の目的のために、ポリヌクレオチド分子は、本発明を実施において有用であり、そして従って相同であるか又は同一性を有し、ここでこれは、感染されたブタの体液或いは組織試料中のPRRSウイルス又はウイルスのポリヌクレオチドの存在を検出するための診断プローブとして、例えば標準的なハイブリダイゼーション又は増幅技術によって使用することができる。一般的に、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、これが、BLASTNアルゴリズム他にNCBIとしても知られるNationalCenterforBiotechnologyInformation,Bethesda,Maryland,USAoftheUnitedStatesNationalInstituteofHealthに基づく第1のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約70のヌクレオチド配列の同一性を有する場合、第1のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に相同である。本発明の実施による計算のための具体的な例において、BLASTP2.2.6[TatusovaTAandTLMadden,BLAST2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences.1999FEMSMicrobiolLett.174:247-250.]に対して言及がなされる。簡単には、10のギャップ開始ペナルティー、0.1のギャップ伸長ペナルティー、並びにHenikoff及びHenikoffProc.Nat.Acad.Sci.USA89:10915-10919.1992のblosum62スコアリングマトリックスを使用するアラインメントスコアを最適化するために、二つのアミノ酸配列を整列させる。次いで同一性のパーセントを:同一の対応の全数×100/長い配列の長さによって割る二つの配列を整列するために長い配列に導入されたギャップの数、のように計算する。好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも約75のヌクレオチド配列同一性を、なお更に好ましくは少なくとも約80、85、90、95、96、97、98及び99のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝子コードが縮重されているために、相同なヌクレオチド配列は、任意の数のサイレントな塩基変化、即ち、それでも同じアミノ酸をコードするヌクレオチド置換を含むことができる。相同なヌクレオチド配列は、更に非サイレント変異、即ち、配列が、第1のヌクレオチド配列によってコードされたポリアミノ酸と少なくとも約70同一のままである限りは、コードされたポリアミノ酸にアミノ酸の差をもたらす塩基置換、欠失、又は付加を含有することができ、或いは他に、本発明の実施のために有用である。これに関して、一般的に:正に荷電したアミノ酸そして逆も又真である、リシン、アルギニン及びヒスチジンに関する;負に荷電したアミノ酸そして逆も又真である、アスパルギン酸及びグルタミン酸に関する;そして中性に荷電したアミノ酸そして全ての場合、更に逆も又真であるのある種のグループ、1アラニン及びセリン、2アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、3システイン及びセリン、4グリシン及びプロリン5イソロイシン、ロイシン及びバリン、6メチオニン、ロイシン及びイソロイシン、7フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン及びチロシン、8セリン及びトレオニン、9トリプトファン及びチロシン、10並びに例えば、チロシン、トリプトファンtyrptophan及びフェニルアラニンに関するような、全体のタンパク質の機能を不活化しないことが認識されている、ある種の保存性アミノ酸置換を行うことができる。アミノ酸は、物理的特性並びに二次及び三次タンパク質構造に対する寄与によって分類することができる。保存的置換は、当技術において一つのアミノ酸の、類似の特性を有するもう一つのアミノ酸との置換として認識される。例示的な保存的置換は、1996年9月6日に出願され、1997年3月13日に公開されたWO97/09433PCT/GB96/02197の10ページに見出すことができる。別の方法として、保存的アミノ酸は、LehningerBiochemistry,SecondEdition;WorthPublishers,Inc.NY:NY1975,pp.71-77中に記載されているように分類することができる。更なる適した保存的変化及びその適用は、以下に記載される。相同なヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の比較によって、例えば上記のBLASTNを使用することによって決定することができる。別の方法として、相同なヌクレオチド配列は、選択された条件下のハイブリダイゼーションによって決定することができる。例えば、二番目のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、これが配列番号:1の相補体に、中程度に厳密な条件下で、例えば、65°Cにおける0.5MのNaHPO4、7のドデシル硫酸ナトリウムSDS、1mMのEDTA中のフィルターに結合されたDNAとのハイブリダイゼーション、及び42°Cにおける0.2×SSC/0.1SDSの洗浄Ausubeletaleditors,ProtocolsinMolecularBiology,WileyandSons,1994,pp.6.0.3to6.4.10を参照されたい、或いは他の以下に定義されるとおりのPRRSウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションをもたらすものである条件でハイブリダイズされた場合、配列番号:1又は任意の他の特定のポリヌクレオイド配列に相同である。ハイブリダイゼーションの条件の改変は、経験的に決定されるか、又はプローブのグアノシン/シトシンGC塩基ペア形成の長さ及びパーセントに基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、Sambrooketal.,Eds.のMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork1989pp.9.47to9.51ページ中に記載されているように計算することができる。もう一つの態様において、二番目のヌクレオチド配列は、これが、配列番号:1の相補体に、高度に厳密な条件下で、例えば、65°Cにおける0.5MのNaHPO4、7のSDS、1mMのEDTA中のフィルターに結合されたDNAへのハイブリダイゼーション、及び68°Cにおける0.1×SSC/0.1SDS中の洗浄で、当技術において知られたようにAusebeletal.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork,1989ハイブリダイズした場合、配列番号:1又は本発明のいずれもの他の配列に相同である。本発明の単離されたポリヌクレオチド分子及び単離されたRNA分子が、合成分子及びinvitroのクローニング及び転写によるような組換え技術によって得られた分子の両方を含むことは更に理解されることである。ポリヌクレオチド分子は、当技術において既知のような部位特異的変異誘発、又は化学的変異原又は放射線への暴露によるようなランダム変異誘発によることを含む、当業者にとって既知の組換え技術を使用して遺伝子的に変異することができる。変異は、当技術において既知の標準的な方法、例えば記載されている例えば、Meulenbergetal.,Adv.Exp.Med.Biol.,1998,440:199-206ような、感染性コピーの部位特異的変異誘発例えば、Sambrooketal.1989MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.を参照されたいによって行うことができる。従って、本発明は、更に、遺伝子的に改変された北米型PRRSウイルスを製造するための方法を提供し、この方法は、先に記載したようにPRRSウイルスをコードする感染性RNA分子をコードするDNA配列を変異し、そして遺伝子的に改変されたPRRSウイルスを、適した発現系を使用して発現することを含んでなる。遺伝子的に改変されたPRRSウイルスは、単離されたポリヌクレオチド分子から、一般的に当技術において既知の、その例が本出願中に記載される適した発現系を使用して発現することができる。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、invitroで、適した宿主細胞中でコードされたウイルスを発現することが可能な、以下に更に詳細に記載されるようなプラスミドの形態であることができる。北米型PRRSVのNタンパク質配列は、高度に保存され、そして報告された配列は、互いに約93-100の同一性を有する。北米型及び欧州型PRRSVのNタンパク質は、約57-59同一であり、そして共通の構造的モチーフを共有する。一般的に、PRRSをコードする配列及び分離株を比較した場合、これらは、特異的ヌクレオチド又はコードされたアミノ酸に関して異なって番号付けされることができ、固有の領域の確認は、対象のPRRS株中の保存された特徴的アミノ酸を確認し、そしてこれを参照株と整列することによって容易に達成される。組換えDNA技術は、核酸をDNAレベルで改変することを目標とする極めて多様な、そして強力な分子生物学技術を含んでなり、そしてゲノムを分子レベルで分析し、そして改変することを可能にする。これに関して、PRRSウイルスのようなウイルスは、そのゲノムの中程度の大きさのために、このような操作に特に受け入れられる。然しながら、組換えDNA技術は、非レトロウイルス型RNAウイルスに対しては、これらのウイルスがその複製中にDNA中間体工程を包含していないために、直ちに適用可能ではない。このようなウイルスのために、組換えDNA技術を改変されたウイルスを発生するそのゲノムに適用することができる前に、感染性cDNAクローンを開発しなければならない。感染性クローンは、研究中のウイルスのcDNAここではRNAのDNAコピーの広い意味で使用され、そしてmRNAのDNAコピーの厳密な意味のみではないの全長ゲノムの長さの構築によって誘導することができ、その後、感染性の転写物が全長のcDNAにより遺伝子導入された細胞中でinvivoで合成されるが、しかし感染性転写物は、更に転写混合物の存在中の原核プロモーターを有するプラスミド中で、全長のcDNAからのinvitroの転写によって、或いは全ウイルスゲノムを含んでなる連結された全長の一部のcDNA断片を使用して、再びinvivoで得ることができる。全ての場合、転写されたRNAは、cDNAに導入された全ての改変を保有し、そしてこのように改変されたウイルスの更なる継代のために使用することができる。欧州型PRRSウイルスの分離株又はレリスタッドウイルスの感染性クローンの調製は、米国特許第6,268,199号中に記載され、これは、本明細書中に全てが参考文献として援用される。P129と命名された北米型PRRSウイルスの分離株Leeetal.,2005;Yooetal.,2004の感染性cDNAクローンの調製は、米国特許第6,500,662号中に記載され、これは、本明細書中に全てが参考文献として援用される。P129のcDNAの配列は、ジェンバンク寄託番号AF494042及び米国特許第6,500,662号中に開示されている。以下の本出願人等の仕事は、このような感染性クローンを活用し、これは、プラスミドの状況において、前初期プロモーターCMVによって発現され、そしてpCMV-S-P129と命名され、そして更に米国特許第6,500,662号中に開示されている。米国特許第6,500,662号中に記載されているように、本明細書の使用のために適した他のプラスミド及びプロモーターが存在する。対象の任意のオープンリーディングフレームの完全な配列及び対象のアミノ酸残基の位置を考慮すると、当業者は、所望の特定の位置における変化を設計するために、コドン表のみを参考にする必要がある。コドンは、mRNA中のヌクレオチド及びその対応するcDNA分子の三塩基配列を構成する。コドンは、mRNA分子中に存在する場合、塩基ウラシルUによって特徴づけられるが、しかしDNA中に存在する場合、塩基チミジンTによって特徴づけられる。ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基に対するコドン中の簡単な変化は、コードされたポリペプチドの配列又は構造を変化しないものである。表現が、特定の三つのヌクレオチド配列が、任意の特定のアミノ酸をコードすることを記述する場合、当業者は、上記の表が問題の特定のヌクレオチドを確認する手段を提供することを認識するものであることは明白である。例として、特定の三つのヌクレオチド配列がリシンをコードする場合、上記の表は、二つの可能な三塩基配列が、AAA及びAAGであることを開示する。グリシンは、GGA、GGC、GGTRNA中の場合GGU及びGGGによってコードされる。コードされたタンパク質中のリシンをグリシン残基に変化するために、AAA又はAAG三塩基を、コードする核酸中のGGA及びGGC、GGT又はGGGのいずれかによって置換することができる。前述のように、本発明は、PRRSのワクチン株の提供に関し、ここで、他の反応の中でも、インターフェロン経路によって仲介される宿主のウイルスに対する反応は、下方制御されない。以下に詳細に記載するように、この点において有効な、ウイルスゲノムに対する各種の改変があり、特に本明細書中に開示されるようなORF1a中に見出される改変、及びこれらの組合せである改変が存在する。更に本明細書表9を参照されたい中で開示されるように、類似した複数の改変部位を、PRRSゲノムの更なるオープンリーディングフレーム中に見出すことができることは注目すべきである。PRRSポリヌクレオチドの改変に対するある種の他の従来の方法が、得られた弱毒化の正確な原因は一般的に知られていないが、恐らくワクチン使用のための適合性を提供し、PRRSウイルスを弱毒化するために成功していることは注目すべきである。例えば、オープンリーディングフレーム7ORF7中に欠失を含むために、ウイルスのヌクレオカプシド或いはNタンパク質ORF7によってコードされた中のNSL-2領域、NoLS領域、又はNES領域を変異或いは欠失することによって病原性PRRSウイルスを弱毒化することが開示されている。もう一つの側面において、ORF7欠失は、カプシドタンパク質の核局在化シグナルNLSをコードする配列内にある。NLSをコードする配列内のORF7欠失は、43-48位の一つ又はそれより多いアミノ酸の欠失、或いは43及び44位のいずれか又は両方のアミノ酸の欠失を含む。例えば、本明細書中に参考文献として援用される米国特許第7,544,362号の全ての開示を参照されたい。ORF7によってコードされるPRRSVのヌクレオカプシドタンパク質Nは、リン酸化された小さい塩基性のタンパク質でありWootton,Rowland,andYoo,2002、そしてホモダイマーを形成するWoottonandYoo,2003。結晶構造は、最近決定されているDoanandDokland,2003。Nタンパク質は、感染された細胞中で多数の機能を有するように見受けられる。細胞質中で行われる過程として、その中にゲノムRNAが包装された球形のカプシド構造を形成することに加えて、Nタンパク質の一部は、核中に、そして特異的に感染された細胞の核小体に運搬される。Nタンパク質のアミノ酸配列は、核及び核小体への運搬、及び核からの移行をそれぞれ容易にする二つの核局在化シグナルNLS、核小体局在化シグナルNoLS、及び核外移行シグナルを含有するRowlandetal.,1999;Rowlandetal.,2003;RowlandandYoo,2003。一方、核小体において、Nタンパク質は、小さい核小体のRNA付随性タンパク質フィブリラリンと相互作用し、そして好ましいウイルスの複製のために感染された細胞中のrRNA加工及びリボソーム生合成を制御することができるYooetal.,2003。この種類のウイルス変異は、新規なPRRSワクチンを設計するために、単独で又は他の弱毒化変異との組合せのいずれかで、有用である。弱毒化されたPRRSウイルスのもう一つの例において、ORF1aに改変されたものが使用された。ORF1aの非構造的タンパク質2をコードする領域中の高頻度可変領域中のアミノ酸616ないし752間の抗原性エピトープをコードするDNA配列の欠失が使用される。その全てが参考文献として援用される、米国特許第7,618,797号を参照されたい。PRRSウイルスの免疫生物学に対する研究は、PRRSウイルスのPDCとの相互作用が、試験に値することを示唆する。この細胞型は、ヒト、マウス、ラット、ブタ及びサルの末梢血単核細胞の0.2-0.8である。その希少性に関わらず、この細胞は、自然免疫系の重要な成分であり、そしてウイルスの刺激に続いて大量のIFN-αを分泌することが可能である。PDCが、これらがナチュラルキラー細胞、B細胞、及びT細胞の機能を促進するために、抗ウイルス性の自然及び獲得免疫を制御することにおいて主要な役割を演じるのは、IFN-αの分泌による。更に、ブタ単球由来の樹状細胞MoDCの変異は、PDCによって分泌されるIFN-αによって援助され、抗原を提示し、そしてT細胞を活性化するMoDCの向上された能力をもたらす。ウイルス感染の後期において、PDCは、成熟した樹状細胞の独特の形に分化し、これは、T細胞の機能を直接制御し、そしてPRRSウイルスを含むウイルスに対する抗ウイルス性免疫の主要な媒介物であるIFN-γを分泌することが可能な細胞への、T細胞の分化を指示する。驚くべきことではないが、呼吸器多核体ウイルス及び麻疹ウイルスのようなヒトのウイルスが存在し、これらは、IFN-αを分泌するPDCの能力を抑制することが知られている。この阻害効果は、体液性免疫反応の優勢、及びこれらのウイルスによる感染の結果として観察される付随する免疫病理学、並びに二次的細菌及びウイルス感染に対する宿主の増加した感受性において役割を演じると考えられる。対照的に、野生型PRRSV分離株、並びにインゲルバックPRRSワクチン株以下の実施例5以降を参照されたいの両方は、IFN-αを産生するブタのPDCの精製された集団の能力を阻害し、一方、新規なP129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルス原料下記を参照されたいは、このPDC機能に対して最小の阻害効果しか示さないか又は全く示さなかった。これらの観察の有意性は、部分的に、ウイルスに対する獲得免疫反応の発生を制御することにおけるIFN-αの重要性にある。従って、IFN-αの抑制が最低限であるウイルスから誘導された弱毒化されたウイルスのワクチンが、強力な抗ウイルス性保護免疫反応を誘発するものである可能性が非常に高い。インゲルバックPRRSMLVワクチンに対するIFN-αのアジュバント効果が、ウイルス特異的T細胞仲介IFN-γ反応を誘発し、そしてワクチンによって誘発されるウイルス特異的T細胞仲介IFN-γ反応の強度が、現場及び研究所の条件下でウイルスに対する保護免疫と正の相関を有することが従来証明されている。従って、理論に制約されるものではないが、細胞介在免疫反応及び非IFN-α阻害性PRRSVによって誘発される保護免疫のレベルが、野生型IFN-α阻害性の表現型を示すPRRSV分離株のものより有意に大きいものであることを予測することは妥当なものである。本発明に関して、P129-PK-FLウイルス、並びにpCMV-S-P129-PK感染性cDNAクローンから誘導された全ての五つの欠失変異体が、IFN-α産生を阻害する能力を喪失したことは注目に値する。従って、この異常な表現型は、単に欠失のためにすることにはできないが、しかし少なくとも部分的に感染性クローンの構築中に固定されることとなった遺伝子的変化のためのものである筈である。興味あることに、PK-9細胞上で63回の連続継代された非クローン化P129ウイルスは、IFN誘発を阻害する能力を保持した表1。全ての感染性クローン由来のウイルスにおいて見られる普通のIFN表現型に対する最も可能性のある説明は、感染性クローンの発生中の一つ又はそれより多い変異の組込みである。これらの変異は、感染性クローンを構築するために使用されたウイルスのRNA中に、恐らく低いレベルで存在したものである。最終的に、変異は、ブタの本来継代0のウイルス中に存在することができたか、又はこれらは、16代の継代間、PK-9細胞上で増殖するためにウイルスを適合する過程中に発生され、そして富化されることができた。変異が、PCR誘発の間違いの結果又はクローン化の人為的結果である可能性を除外することはできない。いずれにせよ、IFN-α阻害機能の喪失の原因である変異類は、感染性クローンの構築中に固定され、そしてこの特定の感染性クローンから誘導された全てのウイルス中に存在することが予測される。変化したIFN-α阻害表現型の原因である変異が、cDNAクローンを構築するために使用したウイルスRNA中に前から存在していた可能性は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによる間違いの結果として、PRRSVがランダムな遺伝子の多様性を容易に発生することが知られていることを考慮すれば、可能性がある。ウイルスの多種性quasispeciesは、invivoのウイルス複製中に天然に出現する密接に関連する遺伝子的変種の不均一な混合で構成される。なお更に関連するものは、感染性cDNAクローンから誘導されたPRRSVの多数代のinvitroの継代後のウイルスの多種性の観察である。これは、従来行われた研究中のウイルスゲノムの出発集団が、遺伝子的に不均一な集団からなり、そして配列の多様性が細胞培養の継代中に急速に発生したために、注目に値する。本研究において、感染性クローンの構築に至るまでの16代のPK-9の継代よりも前に、オリジナルのP129ウイルスがクローン化生物学的に又は分子的にされていなかったために、ゲノムの不均一性のレベルはより高かったであろう。従って、IFN-α阻害機能の喪失の原因であるPRRSVのRNA変種の類似的な種quasispeciesからの確率選択、及びpCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNAクローンへの組込みは、真実味のあることであるように見受けられる。有効な次世代のPRRSワクチンの開発のための重要性を証明することができるこの特徴的な生物学的表現型を、全ての誘導体のウイルスが共有する筈であったことを考慮すれば、感染性クローンへのこれらの変異の組込みは、幾つかの状況下で幸運であったと考えることができる。野生型のPRRSウイルス株P129は、このウイルスの他の株のように、末梢血単核細胞PBMC及び形質細胞様樹状細胞PDCのインターフェロIFN-αを産生する能力に対して強力な阻害効果を示す。他方、P129の感染性cDNAクローンcCMV-S-P129-PK17-FLから誘導されたウイルスは、IFN-α阻害表現型の有意な減少を示す。この感染性クローンは、CD163を発現するブタ腎臓細胞系PK-9上で、16代の連続継代の経過にわたって増殖するために以前に適合されたウイルスから構築されたその全てが参考文献として援用される米国特許第7,754,464号を参照されたい。P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44のIFN-α阻害性表現型は、低から無視可能までの範囲にあり、そしてその両方が高度に阻害性である二つのインゲルバックPRRS改変生ウイルスワクチン株のいずれかによって示されるものと顕著な対比にあった。これらの結果は、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスが、親の低い継代のP129分離株、他の野生型PRRSウイルス、及び両方のインゲルバックPRRSワクチンと、生物学的に別個であることを示す。減少したIFN-α阻害性表現型の潜在的な意味、並びに表現型の変化に対する可能な理由が考察される。本発明のアミノ酸改変本発明の実施によれば、新規なPRRSの分離株は、北米型又は中国型遺伝子型に関わらず、ORF1からコードされたタンパク質中の特異的位置に特異的なアミノ酸を含有するものとしてフィールドで同定することができ、そしてこれらのウイルスに対して所望の表現型を与える。あるいは、前述のように、標準的な遺伝子的方法を使用して、コードされたORF1タンパク質の遺伝子配列そして従ってアミノ酸配列を改変することができ、再び改変された北米型及び中国型PRRSウイルス、及び感染性クローン、並びにこれらからワクチンを産生することができ、これらの全てはこのような表現型をもたらす。好ましい例において、表現型は、制約されるものではないが、野生型PRRSウイルスと比較して減少したインターフェロン-α阻害効果、及び所望により、頑強な免疫反応を誘発するが、しかし僅かな検出可能な病態を伴って宿主動物ブタ中で再生又は持続する能力を含む。従って、本発明の実施において、有用な出発点として役立つことができる北米型PRRS株又は分離株は、開示されたもの、例えば米国特許第6,500,662号;7,618,797号;7,691,389号;7,132,106号;6,773,908号;7,264,957号;5,695,766号;5,476,778号;5,846,805号;6,042,830号;6,982,160号;6,241,990号;及び6,110,468中のものを含む。有用な出発点として役立つ中国型PRRS株及び分離株に関しては、例えば、TJM-92に関する中国出願CN201633909からの公開された中国出願CN200910091233.6を参照されたい。以下の考察に関連して、国際的に認識された一文字又は三文字記号を、DNAによってコードされる最も普通のアミノ酸:アラニンAla、A;アルギニンArg、R;アスパラギンAsn、N;アスパラギン酸Asp、D;システインCys、C;グルタミン酸Glu、E;グルタミンGln、Q;グリシンGly、G;ヒスチジンHis、H;イソロイシンIle、I;ロイシンLeu、L;リシンLys、K;メチオニンMet、M;フェニルアラニンPhe、F;プロリンPro、P;セリンser、S;トレオニンThr、T;トリプトファンTrp、W;チロシンTyr、Y及びバリンVal、Vに対して使用する。表9及び10は、インターフェロンアルファ活性の減少された阻害と相関し、これによってワクチンに対する安全及び頑強な免疫反応を可能にする、北米型及び中国型PRRSの病原性の弱毒化の原因である観察されたアミノ酸変化を同定する。表10は、これに関連するORF1内の非常に好ましいアミノ酸改変を同定し、そして他のP129培養物からの継代培養に関して如何にこれらの変異が起こったかを示すこの経緯の点検が、必要に応じて、本発明のアミノ酸変化のいずれかを有するコードするDNAを再構築するための遺伝子変異戦略の設計をも容易にすることは注目すべきである。これに関連して、ORF1aに対するP129の継代52によって示されるような最も好ましいアミノ酸の改良は:182位におけるアスパラギン、189位におけるアスパラギン、273位におけるチロシン、302位におけるヒスチジン、665位におけるトレオニン、943位におけるシステイン、1429位におけるトレオニン、1505位におけるアラニン、2410位におけるアスパラギンを含み、これは、更に多くのグルコシル化の機会を潜在的に加え、そしてこれは、更にタンパク質の機能を変更することができる。従って、本発明は、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSを提供し、ORF1aによってコードされるそのタンパク質は:アミノ酸配列AMANVYD配列番号:9内のアミノ酸N;アミノ酸配列IGHNAVM配列番号:12内のアミノ酸N;アミノ酸配列TVPDGNC配列番号:15内のアミノ酸D;アミノ酸配列CWWYLFD配列番号:18内のアミノ酸Y;アミノ酸配列HGVHGKY配列番号:21内のアミノ酸H;アミノ酸配列AAKVDQY配列番号:24内のアミノ酸V;アミノ酸配列PSATDTS配列番号:27内のアミノ酸T;アミノ酸配列LNSLLSK配列番号:30内のアミノ酸L.アミノ酸配列APMCQDE配列番号:33内のアミノ酸C;アミノ酸配列CAPTGMD配列番号:36内のアミノ酸T;アミノ酸配列PKVAKVS配列番号:39内のアミノ酸A;アミノ酸配列AGEIVGV配列番号:42内のアミノ酸I;アミノ酸配列ADFNPEK配列番号:45内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列QTPILGR配列番号:48内のアミノ酸I;のいずれかを含有するアミノ酸配列からなるグループから選択される。更に具体的には、本発明は、単離されたブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスPRRSを提供し、ここにおいて、ORF1aによってコードされるそのタンパク質は:アミノ酸配列ANV配列番号:9参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列HNA配列番号:12参照内のアミノ酸N;アミノ酸配列PDG配列番号:15参照内のアミノ酸D;アミノ酸配列WYL配列番号:18参照内のアミノ酸Y;アミノ酸配列VHG配列番号:21参照内のアミノ酸H;アミノ酸配列KVD配列番号:24参照内のアミノ酸V;アミノ酸配列ATD配列番号:27参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列SLL配列番号:30参照内のアミノ酸L.アミノ酸配列MCQ配列番号:33参照内のアミノ酸C;アミノ酸配列PTG配列番号:36参照内のアミノ酸T;アミノ酸配列VAK配列番号:39参照内のアミノ酸A;アミノ酸配列EIV配列番号:42参照内のアミノ酸I;アミノ酸配列FNP配列番号:45参照内のアミノ酸N;及びアミノ酸配列PIL配列番号:48参照内のアミノ酸I;のいずれかを含有するアミノ酸配列からなるグループから選択される。上述のように、北米型及び中国型PRRSの多くの既知の株及び分離株が存在し、そして新規な株は、進化し、又は単離され続けている。全てのこれらの株間において、高いレベルのアミノ酸配列の相同性が存在するが、幾つかの変種が実際存在し、そして実際に利益をこれらの差及び類似性から得て、全てのワクチン株の表現型の特性を更に改良することができることを当業者は直ちに認識するものである。先ず、すぐ上英文明細書2728ページで特定した配列番号によって定義される全てのアミノ酸のモチーフに関して、下線を引かれ、そして好ましいアミノ酸はP129の継代52から得られるように、隣接するアミノ酸が規定された配列番号の配列から他に変化させられたとしても、一般的に完全に有益なままである。従って、具体的な、そして代表的な例として、AMANVYD配列番号:9に関して、対応するアミノ酸モチーフを見出すために、いずれもの北米型又は中国型PRRSからの対応するORF1により発現されたタンパク質配列を詳細に調べることは、進化の結果として、置換及び/又は欠失又は付加を起こす更なる変化がこのような他の株に起こったとしても、一般的に可能である。当業者によって認識されるものであるように、P129の継代52によって示される好ましいアミノ酸の変化は、従って、更に継代52の規定されたアミノ酸に対して直接的に5’又は3’である全体のアミノ酸配列における他の変化にも関わらず操作可能なままである筈である。これは、対比できるアミノ酸変化が保存性であると考えられる場合、特別なものである。従って、AMANVYD配列番号:9及びその部分配列ANVに関して、例えば、その中のバリンがイソロイシン又はロイシンで、或いはいずれもの他の残基によって置換された場合、又は残基が、単純に欠失したか或いは更なる残基が加えられた場合、もう一つのPRRS株中の対比可能なモチーフを確認することは容易に可能である筈である。整列を確認し、そして従ってポリペプチド配列のモチーフが対応するか否かを決定するための多くのコンピュータープログラム、例えばいわゆるBlosum表同一性のパーセントの所定のレベルに基づくが存在し、S.Henikoffetal.AminoAcidSubstitutionmatricesfromproteinblocks,ProcNatlAcadSci,USA,8922,pp.10915-10919,Nov15,1992を参照されたく、そして、更にA.L.Lehningeretal.PrinciplesofBiochemistry,2005,MacMillanandCompany,4theditionも参照されたい。保存的アミノ酸変化は、更に五つの全体的グループ:スルフヒドリルsulfydrylCys;芳香族Phe、Tyr、及びTrp;塩基性Lys、Arg、His;脂肪族Val、Ileu、Leu、Met及び親水性Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser及びThrへの分類に基づいても更に認識される。従って、いずれもの北米型又は中国型PRRSをコードするヌクレオチド配列を、適当な、そして対応する位置にP129の継代52のために規定されたアミノ酸変化のいずれかを組込むために、指定された位置に隣接する一つ又はそれより多い他のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたとしても、改変することは、本発明の実施の範囲内である。更に、類似の原理に基づけば、好ましいアミノ酸が、本発明の実施によりORF1aのために確認された特異的な継代52の変化から確認された場合、いずれものこのような継代52のアミノ酸に対する保存的置換が、次いで更にP129変種のいずれかにおいて、又はいずれもの他の北米型又は中国型株に関して、意図する継代52の表現型の実質的保存を伴って使用することができることを当業者は認識するものである。従って、いずれものこのような置換アミノ酸が、本来確認された独特の継代52のアミノ酸変化と同様に、規定された位置で働くことが、本発明の要求ではないことは容易に認識されるものであるが、代表的な例として:SLL配列番号:30内に関して、指定されたロイシン残基は、イソロイシン、バリン又はメチオニンで更に置換することができる;FNP配列番号:45内に関して、指定されたアスパラギンは、Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser及びThrのいずれかで置換することができる;そしてVAK配列番号:39内に関して、指定されたアラニンは、Asn、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Ser及びThrのいずれかで置換することができる;全て等である。勿論、いずれもの他の認識されたモデルによる標準的な保存的アミノ酸変化の使用も、更に本発明において実施される。例えば、そして全ての場合その逆を含み、Gluに対してAsp及びその逆、Glnに対してAsn、Lysに対してArg、Cys又はThrに対してSer、Tyrに対してPhe、Leu又はIleuに対してVal、Glyに対してAla、等である。更に、本発明の実施の範囲内において、個々の継代52のアミノ酸変化上記でORF1aに対して確認されたようにのいずれかは、所望の表現型効果を伴っていずれもの中国型PRRSの北米型中に有用に入れることができるが、可能な限り多くの表9又は表10のアミノ酸選択物を、コードするポリヌクレオチド配列の適当な改変によって典型的に提供されるように、最終構築物中に含むことが更に好ましい。従って、本発明の実施は、2、3、4、5、6、7、8、9個の、そして概略17までのいずれかの確認された52継代の、全て最終ウイルス配列内のORF1a変化表9を、任意の特異的ペア、トリプレット、又は全ての完全に確認された継代52アミノ酸変化の他のより高い組合せを含めるために提供する、中国型又は北米型PRRSウイルス及び対応するコードするポリヌクレオチドの提供を含む。このようなアミノ酸変化は、勿論、ウイルスの対応するコードするヌクレオチド配列に、部位特異的変異誘発、PCR、及び当技術において公知の他の技術によって導入することができる。特定の遺伝子的に改変された株が弱毒化されることを示すために、以下に記載されるような実験を使用することができる。グループ当たり少なくとも10匹の雌ブタが、それぞれの試行に含まれ、これらはPRRSVを持たない農場から得る。ブタを、PRRSウイルス特異的血清抗体を持たず、そしてPRRSVに対して陰性であることを試験する。試行に含めた全てのブタは、同じ供給源及び品種である。ブタのグループへの割当てはランダムである。誘発は、鼻腔当たり105TCID50を伴う1mlのPRRSVの鼻腔内適用で、妊娠の90日目に行う。それぞれの試験の設定に対し少なくとも三つのグループ:P129誘発のための一つのグループ;恐らく弱毒化されたウイルスによる誘発のための一つの試験グループ;及び一つの厳密な対照グループがある。研究は、厳密な対照が、研究の時間経過にわたってPRRSV陰性のままであり、そして厳密な対照と比較して、P129誘発グループにおいて、少なくとも25少ない生きた健康な子ブタが生まれた場合、有効であると見做される。弱毒化、言い換えればより低い病原性は、繁殖性能又は他の総体症状symptomologyを決定する一つ又はそれより多いパラメーターの統計的に有意な変化として定義され:改変されない親株で感染されたグループと比較した、試験グループ恐らく弱毒化されたウイルスに対する以下のパラメータの少なくとも一つにおける有意な減少は、弱毒化の表示であり:a死産の頻度b妊娠112日目又はその前の流産cミイラ化した子ブタの数d元気がなく、そして弱い子ブタe離乳前死亡率更に、改変されない親株で感染されたグループと比較した、試験グループに対する以下のパラメーターの少なくとも一つにおける有意な増加が好ましい:f雌ブタ当たりの離乳した子ブタの数g雌ブタ当たりの生まれた生きて健康な子ブタの数。あるいは、呼吸障害の徴候及びPRRSV感染の他の徴候を、弱毒化を確立するために試験することができる。弱毒化された株は、ワクチンの処方のために有用である。本発明のワクチンは、これがPRRSウイルスによる感染に対してブタを保護する場合に有効である。ワクチンは、一匹又はそれより多い未感染のブタへのワクチンの投与後、生物学的に純粋なウイルスの分離株例えば、VR2385、VR2386、P129等によるその後の誘発が、低められた重篤度のいずれもの全体的又は組織病理学的変化例えば、肺の病変及び/又は疾病の徴候を、保護されていない同様なブタにおける分離株によって典型的に起こされたこれらの変化又は徴候と比較して即ち、適当な対照に関してもたらす場合、PRRSウイルスによる感染に対してブタを保護する。更に特に、本発明のワクチンは、ワクチンを、それを必要とする一匹又はそれより多い適したブタに投与し、次いで適当な長さの時間後例えば、4週間、生物学的に純粋なPRRSV分離株の大量の試料103-7TCID50により誘発することによって、有効であることを示すことができる。次いで血液試料を誘発されたブタから約1週間後に抜出し、そして次いで血液試料からウイルスを単離する試みが行われる。大量のウイルスの単離は、ワクチンが有効であることができなかった表示であり、一方、減少された量のウイルスの単離又はウイルスが無いは、ワクチンが有効であることができた表示である。従って、本発明のワクチンの有効性は、定量的に即ち、適当な対照グループと比較した固定された肺組織のパーセントの減少又は定性的に例えば、血液からのPRRSVの単離、免疫アッセイによる肺、扁桃腺又はリンパ節組織試料中のPRRSV抗原の検出評価することができる。ブタの繁殖及び呼吸器疾患の徴候は、定量的に例えば、温度/発熱、又は半定量的に例えば、チアノーゼ、肺炎、肺病変等のような一つ又はそれより多い徴候の存在又は非存在、或いは一つ又はそれより多い徴候の重篤度の減少評価することができる。未感染のブタは、ブタ繁殖及び呼吸器疾病感染性病原体に暴露されていないか、又はブタ繁殖及び呼吸器疾病感染性病原体に暴露されたが、しかし疾病の徴候を示していないかのいずれかのブタである。感染されたブタは、PRRSの徴候を示すか、又はそれからPRRSVを単離することができたものである。本発明のワクチンは、標準的な緩衝液、安定剤、希釈剤、保存剤、及び/又は可溶化剤のような、ヒトを含む適用可能な場合動物に対して受容可能な担体を含むために受容された習慣に従って処方し、そして更に継続放出を容易にするために処方することができる。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、等を含む。等張性のための添加剤は、特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含む。安定剤は、特にアルブミンを含む。改変された生ワクチンを処方することにおいて特に有用であるものを含む他の適したワクチンベヒクル及び添加剤は、当業者にとって既知であるか、又は明白であるものである。例えば、Remington’sPharmaceuticalScience,18thed.,1990,MackPublishingを参照されたく、これは、本明細書中に参考文献として援用される。本発明のワクチンは、更に、一つ又はそれより多い、例えば、特にアジュバント又はサイトカインのような更なる免疫調節性成分を含んでなることができる。本発明のワクチン中に使用することができるアジュバントの非制約的例は、RIBIアジュバント系RibiInc.,Hamilton,Mont.、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルのような無機ゲル、水中油乳液、例えばフロイント完全又は不完全アジュバントのような油中水乳液、ブロックコポリマーCytRx,Atlanta,Ga.、QS-21CambridgeBiotechInc.,CambridgeMass.、SAF-MChiron,EmeryvilleCalif.、AMPHIGEN.RTM.アジュバント、サポニン、QuilA又は他のサポニン画分、モノホスホリル脂質A、及びアブリジン脂質-アミンアジュバントを含む。本発明のワクチンにおいて有用である水中油乳液の非制約的例は、改変されたSEAM62及びSEAM1/2製剤を含む。改変されたSEAM62は、5容量/容量のスクアレンSigma、1容量/容量のSPAN.RTM.85合成洗剤ICISurfactants、0.7容量/容量のTWEEN.RTM.80合成洗剤ICISurfactants、2.5容量/容量のエタノール、200pg/mlのQuilA、100[mgr]g/mlのコレステロール、及び0.5容量/容量のレシチンを含有する水中油乳液である。改変されたSEAM1/2は、5容量/容量のスクアラン、1容量/容量のSPAN.RTM.85合成洗剤、0.7容量/容量のTween80合成洗剤、2.5容量/容量のエタノール、100.mu.g/mlのQuilA、及び50.mu.g/mlのコレステロールを含んでなる水中油乳液である。ワクチン中に含むことができる他の免疫調節性薬剤は、例えば、一つ又はそれより多いインターロイキン、インターフェロン、又は他の既知のサイトカインを含む。本発明のワクチンは、所望により本発明のウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターの継続放出のために処方することができる。このような継続放出製剤の例は、ウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターを、例えば、ポリ乳酸、ポリ乳酸-共-グリコール酸、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等のような生体適合性ポリマーの複合体と組合せて含む。薬物供給ベヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、A.Dombetal.,1992,PolymersforAdvancedTechnologies3:279-292を含む幾つかの刊行物中で総括され、これは、本明細書中に参考文献として援用される。医薬製剤中のポリマーの選択及び使用における更なる指導は、当技術において既知の教科書、例えば、M.ChasinandR.Langereds,1990,BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystemsin:DrugsandthePharmaceuticalSciences,Vol.45,M.Dekker,N.Y.中に見出すことができ、これも、更に本明細書中に参考文献として援用される。別に、又は更に、ウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターは、投与及び効力の改良のために、マイクロカプセル化することができる。抗原をマイクロカプセル化する方法は、当技術において公知であり、そして例えば、米国特許第3,137,631号;米国特許第3,959,457号;米国特許第4,205,060号;米国特許第4,606,940号;米国特許第4,744,933号;米国特許第5,132,117号;及び国際特許出願公開WO95/28227中に記載されている技術を含み、これらの全ては本明細書中に参考文献として援用される。リポソームも、更にウイルス、プラスミド、又はウイルスベクターの継続放出を提供するために使用することができる。如何にリポソーム製剤を製造し、そして使用するかに関する詳細は、特に、米国特許第4,016,100号;米国特許第4,452,747号;米国特許第4,921,706号;米国特許第4,927,637号;米国特許第4,944,948号;米国特許第5,008,050号;及び米国特許第5,009,956号中に見出すことができ、これらの全ては、本明細書中に参考文献として援用される。いずれもの上記のワクチンの有効な量は、低い投与量のウイルス、ウイルスタンパク質、プラスミド又はウイルスベクターから出発し、そして次いで効果をモニターしながら投与量を増加する、慣用的な手段によって決定することができる。有効な量は、ワクチンの一回の投与後、又はワクチンの多数回の投与後に得ることができる。動物当たりの最適な投与量を決定する場合、既知の因子を考慮することができる。これらは、動物の種、大きさ、年齢及び一般的状態、動物中の他の薬物の存在、等を含む。実際の投与量は、好ましくは、他の動物の研究からの結果の考慮後に選択される例えば、以下の実施例2及び3を参照されたい。十分な免疫反応が達成されたか否かを検知する一つの方法は、ワクチン接種後の動物中の抗体陽転及び抗体力価を決定することである。ワクチン接種のタイミング及び若しあれば、追加免疫の回数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて、医師又は獣医師によって決定されるものであり、その幾つかは上述されている。本発明のウイルス、タンパク質、感染性DNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターの有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体重のような、当業者によって決定することができる因子を考慮して、既知の技術を使用して決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの投与量は、好ましくは約101から約109pfuプラーク形成単位まで、更に好ましくは約102から約108pfuまで、そして最も好ましくは約103から約107pfuまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの投与量は、好ましくは約0.1mgから約100mgまで、更に好ましくは約1mgから約10mgまで、なお更に好ましくは約10mgから約1mgまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明の感染性DNA分子の投与量は、好ましくは約0.1mgから約100mgまで、更に好ましくは約1mgから約10mgまで、なお更に好ましくは約10mgから約1mgまでの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの投与量は、好ましくは約101から約109pfuまで、更に好ましくは約102pfuから約108pfuまで、そしてなお更に好ましくは約103から約107pfuまでの範囲である。適した投与量の大きさは、約0.5mlから約10mlまで、そして更に好ましくは1mlから約5mlまでの範囲である。本発明の実施によるウイルスタンパク質又はペプチドワクチンに対する適した投与量は、一般的に投与当たり1から50マイクログラムまで、又は標準的な方法によって決定することができるようなものより高い量の範囲であり、それぞれのこのような物質に関して認識された方法によって決定される量のアジュバントを伴う。ブタのワクチン接種に関する本発明の好ましい例において、ブタのための最適年齢の目標は、離乳前pre-weeningである約1ないし21日の間であり、更にMycoplasmahyopneumoniae又はPCVに対するもののような他の計画されたワクチン接種に対応することもできる。更に、飼育中の雌ブタの好ましいワクチン接種の計画は、年間のワクチン再接種計画と同様な投与を含むものである。いずれもの上記のワクチンの有効な量は、低投与量のウイルス、プラスミド又はウイルスベクターから出発し、そして次いで効果をモニターしながら投与量を増加する、慣用的な手段によって決定することができる。有効な量は、ワクチンの一回投与後、又はワクチンの多数回投与後に得ることができる。動物当たりの最適投与量を決定する場合、既知の因子を考慮することができる。これらは、動物の種、大きさ、年齢及び一般的状態、動物中の他の薬剤の存在、等を含む。実際の投与量は、好ましくは他の動物研究からの結果の考慮後に選択される。十分な免疫反応が達成されたか否かを検知する一つの方法は、ワクチン接種後の動物中の抗体陽転及び抗体力価を決定することである。ワクチン接種の時期及び若しあれば、追加免疫の回数は、好ましくは、全ての関連する因子の分析に基づいて、医師又は獣医師によって決定されるものであり、その幾つかは先に記載されている。本発明のウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターの有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体重のような当業者によって決定することができる因子を考慮して、既知の技術を使用して決定することができる。例として、ワクチンは、経口、非経口、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内又は静脈内に供給することができる。経口供給は、例えば、組成物を動物の食餌又は飲料に加えることを包含することができる。ワクチンの投与量に関連する因子は、例えば、ブタの体重及び年齢を含む。本発明は、更に、本明細書中に記載されるPRRSウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターを含んでなるワクチンを調製する方法を提供し、この方法は、有効な量の本発明のPRRSウイルス、感染性RNA分子、プラスミド、又はウイルスベクターの一つを、医薬又は獣医学的な使用のために受容可能な担体と混合することを含んでなる。更に、本発明の生弱毒化ワクチンは、既知の組換え技術を使用してPRRSウイルスゲノム中に挿入される異種抗原エピトープをコードするために、米国特許第6,500,662号に記載されているように改変することができる。更に米国特許第7,132,106号を参照されたく、これは、その全ては参考文献として援用される。本発明のための異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープは、PRRSウイルス以外のブタ病原体からの抗原エピトープを含み、これは、制約されるものではないが、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、トルクテノウイルス、Actinobacilluspleuropneumoniae、Actinobacillussuis、Bacillusanthraci、Bordetellabronchiseptica、Clostridiumhaemolyticum、Clostridiumperfringens、Clostridiumtetani、Escherichiacoli、Erysipelothrixrhusiopathiae、Haemophilusparasuis、Leptospiraspp.、Mycoplasmahyopneumoniae、Mycoplasmahyorhinis、Mycoplasmahyosynovia、Pasteurellamultocida、Salmonellacholeraesuis、Salmonellatyphimurium、Streptococcusequismilis、及びStreptococcussuisからなる群から選択されるブタ病原体からの抗原エピトープを含む。前述のブタ病原体からの抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術において既知であり、そしてNationalCenterforBiotechnologyInformationUSAからのジェンバンクGenBankのようなワールドワイドウェブ上の公開された遺伝子データベースから得ることができる。本発明の更なる特徴及び変更は、詳細な説明を含む本出願の全体から当業者にとって明白であるものであり、そして全てのこのような特徴は、本発明の側面として意図されている。同様に、本明細書中に記載される本発明の特徴は、更なる態様に組換えることができ、これらも、更に、特徴の組合せが具体的に側面として先に記述されているか否かに関わらず、本発明の側面又は態様として意図されている。更に、本発明にとって重要であるとして本明細書中に記載されているような制約のみを、本明細書中に重要であるとして記載されていない制約を欠く本発明の変更が本発明の側面として意図されている、として見做されるべきである。本発明が、前記の説明及び実施例中に特別に記載される以外の他の方法で実施することができることは明白であるものである。本発明の多くの改変及び変更は、上記の教示に照らして可能であり、そして従って、本発明の範囲内である。以下の実施例は、本発明を例示するが、しかし制約するものではない。実施例1PRRSV分離株P129のPK-9細胞への適合及び弱毒化病原性PRRS分離株P129を、インディアナの病気のブタから、1995年にPurdue大学の動物疾病診断研究所で単離した。このブタからの血清試料を、高い健康状態のブタ中で一代継代して、血清及び肺ホモジネート原料を増加した。ウイルスRNAを血清及び肺ホモジネートから抽出し、そしてP129の継代0のウイルスの完全なゲノムコンセンサス配列を決定するために使用した。先ずRNAをランダム六量体で予備刺激し、そしてcDNAを合成するために使用した。ゲノムを高忠実度プルーフリーディングPCRを使用して三つの重複ピース中で増幅した。三つの別個のPCR反応ゲノムセグメント当たりからのPCR産物を、T/Aクローン化し、そして全長のゲノムコンセンサス配列を発生するためのDNA配列決定のために使用した配列番号:1を参照されたい。P129の継代0を含有する、DNAの配列決定するために使用したものと同じブタの血清のアリコートを、一次ブタ肺胞マクロファージPAM細胞に感染するために使用した。PAM感染からの後代ウイルス継代1を、0.1マイクロメートルのシリンジフィルターを通して濾過し、そしてPK-9細胞を感染するために使用した。PK-9細胞は、PK0809ブタ腎臓細胞系を、ブタCD163遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子の欠失バージョンをコードするプラスミドで、安定して遺伝子導入することによって誘導された遺伝子導入細胞系である。PK-9細胞系の構築及び特徴付けの詳細は、先に記載されている。PAM細胞からの継代1ウイルスのPK-9細胞上で増殖への適合は、困難であり、そして多重の並行した系列による幾つかの試みが必要であった。感染は、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に対して特異的なFITC複合モノクローナル抗体SDOW17RuralTechnologiesInc,BrookingsSouthDakotaを使用して、二重のウェルの免疫蛍光法によってモニターした。初期の継代は、僅かな小さい病巣をもたらしたが、しかし新鮮な単層の感染を開始するために十分な、細胞を含まないウイルス粒子を発生しなかった。これらの継代は、感染された単層をアキュターゼトリプシン代替品で処理し、そして多重ウェル中の細胞を、未感染PK-9細胞の添加を伴って又は伴わずに、新鮮な培地で再接種することによって達成した。数代のこのような継代後、幾つかの系列は、蛍光性病巣の発生頻度及び大きさの明白な増加を示した。これらの幾つかは、細胞を含まないウイルス流体を使用して継代される能力を獲得した。継代17PAM細胞上で1代、PK-9において16代までに、一つの系列は、前の継代からの、細胞を含まない流体の希釈物を使用して、確実に持続され、そして数日内に全部の単層の感染をもたらすことができた。ウイルスは、全ての継代レベルでPK-9に対する細胞変性効果を起こさなかった。RNAを、ウイルス継代17で感染されたPK-9細胞から抽出し、そして感染性cDNAクローンを構築するために使用した。実施例2P129-PKの継代17の感染性cDNAクローンの構築P129-PKの継代17ウイルスの感染性cDNAクローンを、先に記載したとおり土台バックボーンプラスミドを使用して構築した。ウイルスのゲノムを、逆転写及び三つの重複セグメント中のPCRによって、重複の領域中の天然に存在する独特な制限エンドヌクレアーゼ部位で増幅した。三つの別個のPCR反応からの産物を、クローン化し、そして配列決定し、そしてそれぞれのゲノムセグメントのためのコンセンサス配列を発生するために整列させた。所定のセグメントの三つのクローン化された産物の一つも、そのセグメントに対するコンセンサスの予測アミノ酸配列に合致しない場合、クローンの一つは、これが当該コンセンサスの予測アミノ酸配列に合致するまでサブクローニング及び/又は部位特異的変異誘発によって改変された。三つのゲノムセグメント及びプラスミドバックボーンを、標準的なクローニング技術及び制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して結合した。pCMV-S-P129-PK17-FLと命名された得られた全長のクローンは、PK-9細胞中に遺伝子導入した場合、感染性であった。この感染性cDNAクローンの配列を、配列番号:2に与える。ゲノムは、本質的に、これが構築された継代17のウイルスと同一であり、真正な終端を持ち、そして継代17のコンセンサス配列に関するいずれもの挿入又は欠失を欠いていた。この感染性cDNAクローンのウイルスゲノム内の操作された制限部位又は他の標的化された変化は存在しなかった。P129の継代0の完全なゲノムコンセンサス配列及び感染性クローンpCMV-S-P129-PK17-FLのゲノム配列間のヌクレオチド並びにアミノ酸の差は、個々に表6に記載している。表6は、ゲノム位置による全てのヌクレオチドの差、及び結果として生じるアミノ酸の差を含む。これらの変異のサブセットは、IFN阻害性継代0からIFN非阻害性継代17の感染性cDNAクローンから誘導された全てのウイルスへの表現型の変化の原因である。表7は、PRRSVオープンリーディングフレームORF又は非構造性タンパク質nspによる、ヌクレオチド、アミノ酸、及び非保存的アミノ酸の差を要約する。表7の目的のために、特に次のグループ:[K、R]、[D、E]、[L、I、V、A]、及び[S、T]のアミノ酸が保存的と考えられる。実施例3P129-PKの継代17における欠失変異体ゲノムの二つの領域における欠失を、感染性cDNAクローンのpCMV-S-P129-PK17-FLに操作して、五つの遺伝子的に改変した感染性クローンを発生した。改変を受けるゲノムの一つの領域は、ヌクレオカプシドタンパク質の41-47のアミノ酸位置に位置する核局在化配列NLSであったPRRSVのORF7によってコードされる。二つの種類の欠失が行われた。これらの欠失は、もう一つのPRRSV感染性クローンの文脈において先に記載されている。アミノ酸残基41-49の野生型配列は、PG...KNである。更にPG--KSとしても知られる変異体d43/44において、リシン残基43及び44は欠失され、そしてアスパラギン残基49はセリンに変化されている。更にPG--S-KSとしても知られる変異体d43/44/46において、リシン残基43、44、及び46は欠失され、そしてアスパラギン残基49はセリンに変化されている。これらの欠失を組込むpCMV-S-P129-PK17-FLから誘導された感染性クローンは、それぞれpCMV-S-P129-PK17-d43/44及びpCMV-S-P129-PK17-d43/44/46である。米国特許第7,544,362号を参照されたい。改変を受けるゲノムの二番目の領域は、ORF1a内のnsp2の高頻度可変領域にあった。131アミノ酸393ヌクレオチドの欠失は、もう一つのPRRSV感染性クローンの文脈において先に記載されている。この欠失を組込むpCMV-S-P129-PK17-FLから誘導される感染性クローンは、pCMV-S-P129-PK17-nsp2である。NLS及びnsp2欠失を組合せた感染性クローンは、更にpCMV-S-P129-PK17-FLバックボーン内に発生され、そしてこれらは、pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44及びpCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44/46と命名された。実施例4PK-9細胞上のウイルスの発生及び増殖実施例3に記載された六つの感染性クローンを、PK-9細胞に遺伝子導入して、六つのウイルスを表1に示すように発生した。ウイルスを、これらの感染性クローンから、リポフェクタミン2000を使用してPK-9細胞中への環状プラスミドの直接遺伝子導入によって発生させた。遺伝子導入後、回収されたウイルスを、力価を更に増加し、そして病原性を減衰するために、再びPK-9細胞上で連続継代した。原料を、invitroの試験及びinvivoの評価のためにワクチン候補として製造した。非改変pCMV-S-P129-PK17-FL感染性クローンから誘導されたP129-PK17-FLウイルスの場合、ウイルスは、ブタから合計52継代に達するまで培養された。このウイルスの完全なゲノムは、継代24配列番号:3及び52配列番号:6において配列決定された。実施例5P129-PKの継代17感染性CDNAクローンから誘導されたウイルスによるIFN-アルファ誘導を阻害する能力の減少ウイルス及び細胞。MARC-145及びST細胞を、5の胎児ウシ血清FBS及び抗生物質50μg/mlのゲンタマイシン、100UIのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンで補充された改良イーグル培地MEM中で増殖させた。ブタ肺胞マクロファージZMAC-1細胞を、10のFBSで補充されたRPMI-1640中で増殖させた。TGEウイルスのPurdue株を、改良イーグル培地中で0.01の多重度において密集ST細胞単層の感染によって調製した。ウイルス接種材料を1時間後に除去し、そして細胞を、2.5のFBSで補充されたMEM中で、37°Cで5のCO2雰囲気中でインキュベートした。ウイルスを80の細胞変性効果が観察された後、細胞単層の冷凍及び解凍によって放出した。TGEウイルス原料を3,500rpmで4°Cで15分間遠心し、そして-80°Cで使用するまで保存した。ウイルス原料PK-9細胞からは、次の通りであり:P129-PK-FL及びP129-PK-dnsp2-d43/44/46は、継代8/25感染性クローンから8代、ブタから25代であった。他の四つのウイルスP129-PK-d43/44、P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2、及びP129-PK-dnsp2-d43/44は、継代21/38であった。各種のPRRSウイルスの作業原料は、商業的なワクチンのインゲルバックPRRSMLV及びインゲルバックPRRSATPを製造業者の説明書によって再構成し、そして感染のために直接使用したことを除き、ZMAC-1細胞上の一代継代を製造することによって調製した。ブタPBMCの単離。新鮮なヘパリン処理された静脈血を、ハンクス液で希釈し、そしてPBMCを、Ficoll-Hypaque1077Sigma勾配による密度遠心によって単離した。ハンクス液で二回洗浄した後、細胞を5の胎児ウシ血清Gibco、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、1mMのピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸Mediatech100U/mlのゲンタマイシン及び250mMの2-メルカプトエタノールSigmaで補充されたL-グルタミンMediatechを伴うRPMI培地中に懸濁した。ブタ形質細胞様樹状細胞の精製。ブタ形質細胞様樹状細胞の精製を、先に記載されているCalzada-Nova、提示済ように行い、そしてこれらの細胞によるCD4及びCD172の特徴的発現に基づいたSummerfieldetal.,2003簡単には、新鮮なブタPBMCを、0.5のBSAを伴うPBS中に懸濁し、そして最適な量のmAb認識性ブタCD17274-22-15,VMRDで標識した。一回の洗浄後、次いで細胞をPEに結合した二次ヤギ抗マウス抗体SouthernBiotechと共に、そして洗浄後、FITCで標識された抗-CD474-12-4,VMRDと共にインキュベートした。PDCを、反射式セルソーターiCytで選別し、選別ゲートは、CD4/CD172low集団に設定した。選別後、細胞の純度を再分析によって確認した。全ての場合、純度は、>95であった。サイトカイン分泌測定のためのアッセイ。PBMC又はPDCを、異なった刺激物質で16時間37°C、5CO2刺激するか、又は模擬刺激した。インキュベーション後、刺激された細胞を覆う培地を、IFN-αの存在に対して、商業的に入手可能なモノクローナル抗体抗ブタIFN-αmAbsK9及びF17と共に調製したサンドイッチELISAを使用して分析した。簡単には、ImmulonIIプレートDynatechInc.を、抗ブタIFN-αmAbF17PBLLaboratoriesで、一晩の4°Cのインキュベーション、その後の5胎児ウシ血清で補充したRPMI培地による遮断によって被覆した。1時間後、培地を廃棄し、そして50マイクロリットルの試験される上清を、アッセイウェルに二重で加えた。1時間のインキュベーション後、アッセイウェルを4回洗浄し、そして次いで、ビオチン標識された抗ブタIFN-αmAbsK9PBLLaboratories、HRPと結合したストレプトアビジンZymedLaboratories、及びTMB基質KPLと連続してインキュベートした。光学濃度を、ELISAプレートリーダーで決定した。P129-PKの継代17の感染性cDNAクローンから誘導されたウイルスは、IFN-アルファ誘導を阻害する能力を欠く。作業ウイルス原料を、四つの異なったPRRS野生型ウイルス分離株P3412、P129、IND5、NADC20のグループから、ブタ肺胞マクロファージ細胞系ZMAC-1を使用して調製した。更なる原料を、PK-9、FK.D4又はMARC-145細胞中の繰返し継代によって細胞培養物中で増殖するように適合された最初の二つの野生型ウイルスの誘導体からも更に調製した。四つの野生型分離株の三つP129、IND5、NADC20は、容易に、そして効率よくZMAC-1細胞中で約107TCID50/mlの力価まで増殖し、一方、P3412野生型分離株は、105TCID50/mlの力価に達したのみであった。注目すべきことは、ZMAC-1細胞系中で調製されたP129ウイルスの原料は、ウイルスが適合されたPK-9又はMARC-145細胞において得られたものより、10倍高い力価に達した。PBMCによってIFN-αの分泌を刺激するこれらのウイルスの能力の試験は、一つ分離株P3412クローンCを除いて、試験されたPRRSウイルス原料のいずれかに対するこれらへの暴露に反応して、非常に少量の<50pgIFN-αがこれらの細胞によって分泌され、これは、ブタコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルスTGEvへのこれらの暴露の結果として、同じ細胞によって産生されるIFN-αの豊富な分泌17,540pgとの比較によって、無視可能であることを明らかにした。PRRSVは、ブタPBMCによるIFN-α産生を刺激することが不可能であるだけでなく、その産生を活発に阻害する。PRRSV原料の阻害効果は、PRRSVの存在又は非存在におけるTGEvに対する暴露に反応してPBMCによって分泌されるIFN-αの量を測定することによって決定された。表2に示すように、試験された全ての四つの野生型PRRSウイルス分離株、並びに全ての細胞培養物に適合された誘導体は、TGEvに対するPBMCのIFN-α反応に対して強力な阻害効果>80を示した。全長のP129-PK-FLウイルスを含む感染性cDNAクローンpCMV-S-P129-PK17-FLから誘導されたウイルス原料のグループ、及び幾つかの遺伝子操作された欠失変異体の分析を行った。表3に示すように、親の野生型分離株P129継代1の強力な阻害効果>95と比較した場合、P129-PK-FLウイルス及び全ての欠失変異体は、PBMC中のTGEvによるIFN-の誘導を阻害する有意に減少した能力を示した。これらのウイルスのIFN-α表現型を更に評価するために、その後の実験は、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルス、親のP129野生型株、及び/又はBoehringerIngelheimによって製造された二つの商業的に入手可能な改変された生PRRSVワクチンインゲルバックPRRSMLV及びインゲルバックPRRSATP間の直接比較を行うことに焦点を当てた。更なる低継代の参照分離株、NVSL-14も更に試験した。表4に示すように、四つの独立の実験において、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44は、親のP129ウイルス、二つのインゲルバック弱毒化株、又は参照株より有意に少ないIFN-α阻害効果を示した。一つの事例において、P129-PK-FL又はP129-PK-d43/44ウイルスによる同時感染は、TGEvに対するIFN-α反応の明白な向上をもたらした。表2に示す結果は、野生型PRRSウイルス及び細胞培養物中で増殖するために適合された誘導体のインターフェロン-α阻害効果を示している。示したPRRSウイルス原料は、ZMAC-1細胞中で増殖され、そしてこれらの新しく発生された原料の力価は、ZMAC-1細胞を使用して決定した。TGEウイルスの存在又は非存在中の、示されたPRRSウイルス原料に18時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞の培養上清中に存在するIFN-αの量は、ELISAによって決定された。単独のTGEvに対する反応。表3に示した結果は、野生型PRRSウイルスP129、及びCD163を発現しているPK-9細胞中で増殖するために適合されたその遺伝子操作された誘導体のインターフェロン-α阻害効果を示す。TGEウイルスの存在又は非存在中の、示されたPRRSウイルス原料に対して18時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞PBMCの培養上清中に存在するIFN-αの量は、ELISAによって決定された。na=適用せず;単独のTGEvに対する反応。表4は、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスの、野生型P129ウイルス及びPRRSインゲルバックワクチンと比較して減少したインターフェロン-α阻害効果を示す。TGEウイルスの存在又は非存在中の、示されたPRRSウイルス原料に対して18時間暴露されたブタ末梢血単核球細胞PBMCの培養上清中に存在するIFN-αの量は、ELISAによって決定された。na=適用せず;単独のTGEVに対する反応。TGEVへのその暴露に反応してPBMCによって分泌される豊富な量のIFN-αは、主として、PBMCの0.3より少ない集団を含んでなる細胞のサブセットから誘導される。この稀な、しかし重要な細胞のサブセットは、形質細胞様樹状細胞PDCで構成され、これは、特徴的な形質細胞様な形態のためにこの名前を授与された。P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスのIFN-α表現型を更に試験するために、PBMCから>95の純度で新しく単離されたPDCを使用したことを除き、先に記載したものと同様に、一連の実験を行った。図1に示すように、この一連の実験は、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスが、TGEVによるIFN-α誘導の無視可能な阻害を起こすことを確認した。更に、一つの実験において、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスに反応したPDCによる、TGEV媒介のIFN-α誘導に対する明白な向上効果が観察された。対照的に、インゲルバックPRRSMLVウイルスは、図1に示すようにIFN-α反応に対する強力な阻害効果を示した。実験の項に記載した結果は、P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44のPRRSウイルス、並びにpCMV-S-P129-PK-FL感染性cDNAクローンの他の誘導体が、感染されたPBMC又はPDC細胞中のTGEVによるIFN-αの誘導を阻害する大幅に減少した能力を有することを明らかにした。これは、野生型低継代のPRRSウイルス及び二つの商業的に入手可能な改変された生ウイルスワクチンインゲルバックPRRSMLV及びインゲルバックPRRSATPで観察されたIFN抑制効果に対する顕著な対比である。P129-PK-FL及びP129-PK-d43/44ウイルスが、PDCのこの重要な機能に対して最小に抑制性であったことの観察は、これらの細胞が、ウイルス感染に対する自然免疫を仲介することにおいて演じる主要な役割を考慮すれば、潜在的に有意である。本発明が、CD163受容体を組換え的に発現する許容的細胞上で増殖するために適合された臨床的に有効な商業的なワクチンウイルスを提供し、そしてこのようなウイルス及びワクチンが、歴史的なサル細胞の培養技術に依存せず、又はいずれの点もそれにより開発されたものではないことは更に注目されるべきである。具体的には、米国特許第7,754,464号を参照されたい。実施例6ワクチン候補物質の安全性及び効力PRRSに対するワクチンとしてのその安全性及び効力を評価するために、pCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNAクローン、P129-PK-FL継代7/24、P129-PK-d43/44継代17/34及びP129-PK-d43/44/46継代17/34から誘導された三つのウイルスを、若年のブタの呼吸器疾病モデルで評価した。これらのウイルスの起源を図8に示し、そして実験の設計処置グループを、表5に記載する。低継代の病原性PRRSV分離株NAD20を、異種誘発のために、生後7週目ワクチン接種後4週経過に使用した。対照処置グループは、模擬ワクチン及び商業的PRRSワクチンインゲルバックMLVを含んでいた。非処置NTグループは、次のとおりであった:NT1ブタは、元のブタの健康状態をモニターするための標識であった。これらは、別個に収容され、そしてPRRSV誘発の前に剖検された。NT2ブタは、ワクチン接種されたブタの二つの檻の間の檻に別個に収容された、それぞれのT02ないしT05の処置グループ当たり合計二匹の接触対照であった。NT3ブタは、ワクチン接種されたブタと共に檻当たり一匹収容された、処置グループT01ないしT05当たり合計二匹の接触対照であった。NT3ブタのみがT01グループに割当てられた。ワクチン接種されたブタの直腸温度を、ワクチン接種後測定し、そしてT01模擬ワクチン処置グループと比較した。結果を図1に示す。ワクチンのどれも発熱を誘導しなかった。全てのグループは、ワクチン接種後の観察期間を通して104°Cより低い平均であった。ブタの直腸温度を誘発後測定した。結果を図2に示す。ワクチン接種されていないT01ブタは、104°Cより大きい継続した発熱を示した。対照的に、三つのワクチンは誘発後の発熱を有意に減少した。P129-PK-FLは、発熱を減少することに最も有効であった。ブタの体重をワクチン接種前及び後に記録した。結果を図3に示す。体重を、研究の1ワクチン接種前、10、24、27誘発前、及び37日目に記録した。ワクチン接種されないブタにおいて、病原性NAD20ウイルスによる誘発は、10日間の観察期間中に体重増加を殆ど完全に除去した。ワクチンは、この影響を各種の程度で無効にした。誘発されたブタの肺を誘発後の剖検で試験した。病変に関係したそれぞれの肺のパーセントを図4に示す。T01模擬ワクチングループは、平均25.1の肺の病変への関与であった。ワクチンは、肺の病変を各種の程度に減少した。P129-PK-FLは、最も有効であり、肺病変の関与を1.1に減少した。肺病変の重篤度を、図5に示すように肺評価得点LASを使用して評価した。三つのワクチンはLASを減少した。P129-PK-FLは、平均LASを、模擬ワクチン接種グループの1.63から0.14に減少した。PRRSVに対する血清抗体を、ワクチン接種及び誘発の両方によって誘導した。IDEXXELISAのS/P比を、研究の27及び37日目に測定した。結果を図6に示す。P129-PK-FLによるワクチン接種は、最高のレベルの抗PRRS抗体を誘導した。誘発されたブタの血清中のウイルス血症を、PAM細胞上で滴定した。結果TCLD50/mLを図7に与える。P129-PK-FLは、誘発後のウイルス血症を減少することに最も有効であった。本発明は、上記の実施例、及びそのそれぞれの全部の内容が参考としてその全てが援用される添付書類を参照して記載されてきたが、改変及び変更が、本発明の思想及び範囲内に包含されることは理解されるものである。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制約される。実施例7感染性CDNAクローンPCMV-S-P129からの感染性CDNAクローンPCMV-S-P129-PK17-FLの誘導本発明のpCMV-S-P129-PK17-FLのPRRSV感染性cDNAクローンは、先に記載したPRRSV感染性cDNAクローンpCMV-S-P129から、当業者によって、部位特異的変異誘発の技術を使用して容易に誘導することができる。PRRSV感染性cDNAクローンpCMV-S-P129は、米国特許第6,500,662号に記載され、そして寄託番号203489下でATCCに寄託されている。このクローン中のPRRSVゲノムのDNA配列は、更に寄託番号AF494042としてジェンバンクNCBIデータベース中で入手可能である。部位特異的変異誘発キットは、多くの供給者から商業的に入手可能であり、そして大きいプラスミド中の多数の部位における多くの刺激性ヌクレオチド変化を製造することが可能である。このようなキットは、制約されるものではないが、Change-ITTM多重変異部位特異的変異誘発キットAffymetrix/USB、QuikChangeLightning多重部位特異的変異誘発キットAgilentTechnologies-StratageneProducts、及びAMAP多重部位特異的変異誘発キットMBLInternationalを含む。PRRSV感染性cDNAクローンpCMV-S-P129ATCCから入手可能及び本発明のpCMV-S-P129-PK17-FLのPRRSV感染性cDNAクローン間のヌクレオチドの差のリストを、表8に与える。全ての変化は、ゲノムのタンパク質コード領域中にある。74の変異原性プライマー及び商業的な部位特異的変異誘発キットによる多重逐次反応を使用してpCMV-S-P129感染性クローンに誘導して、本明細書中に記載されるpCMV-S-P129-PK17-FLと配列が同一であるプラスミド分子を得ることができる、合計74のヌクレオチド変化が存在する。実際に、互いに約50-60のヌクレオチド内の変異のクラスターは、一つの変異原性プライマーを使用して変化することができるために、74より少ない変異原性プライマーで同じ結果を得ることができる。例えば、ヌクレオチド735、750、及び756は、ヌクレオチド965、992、及び1009ができるように、一つの変異原性プライマーを使用して変化することができる。従って、プライマーの数は、約60まで減少することができる。74のヌクレオチド変化のうち、大部分42は、同義又はサイレントであり、これらが同一アミノ酸をコードすることを意味する。これらのヌクレオチド変化は、インターフェロン誘導又はウイルスの阻害表現型に対するいずれもの測定可能な効果を持たない可能性がある。残りの32のヌクレオチド変化は、非同義又は非サイレントであり、そしてウイルスタンパク質中のアミノ酸変化をもたらす。これらの32のヌクレオチド変化は、ウイルスのインターフェロン誘導/阻害表現型の直接の原因であることが予測され、そして感染性クローンpCMV-S-P129によってコードされたウイルスを、感染性クローンpCMV-S-P129-PK17-FLによってコードされたウイルスによって示されるものと同じインターフェロン表現型に転換するために変化されなければならない。このような変化は、多くとも32の、関連するヌクレオチドの幾つかのクラスター形成を考慮した場合はより少ない、変異原性プライマーを必要とするものである。実施例8感染性CDNAクローンPCMV-S-P129-PK17-FLの新規な合成部位特異的変異誘発に対する別の方法として、本発明のPRRSウイルスゲノムは、適当な5’及び3’アダプター配列により、そしてPRRS感染性cDNAクローンpCMV-S-P129寄託番号203489としてATCCから入手可能のために使用されるプラスミドバックボーン、又は類似のプラスミドバックボーンにクローン化して、新規に化学的に合成することができる。長さ50kbより大きい遺伝子PRRSVゲノムは約15.5kbであるの受託合成は:GenScript,DNA2.0、及びBioBasicInc.制約されるものではないを含む多くの業者から商業サービスとして利用可能である。合成ウイルスゲノムは、感染性クローンpCMV-S-P129中のウイルスゲノムを、ゲノムに隣接する5’PacI及び3’SpeI制限酵素部位を使用して置換することによって、pCMV-Sベクター中に方向性クローン化される。合成ゲノムを切断するために、24のヌクレオチド伸長5’-GCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTC-ゲノム-3’、これは、下線を引かれたPacI部位を含むが合成ゲノムの5’終端に構築され、そして83のヌクレオチドの伸長5’-ゲノム-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCATATTTAAATCCCAAGCCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGAGCGGCCGC-3’、これは下線を引かれたSpeIを含むが、合成ゲノムの3’終端に構築される。プラスミド並びにPacI及びSpeIを伴う合成ゲノムを切断した後、適当な断片を精製し、DNAリガーゼを使用して結合し、そしてEscherichiacoliに、当業者にとって公知の標準的なクローン化技術を使用して、スクリーニング及び繁殖のために形質転換される。生物学的材料の寄託以下の生物学的材料米国特許第6,500,662号を参照されたいを、1998年11月19日に、10801UniversityBlvd.,Manassas,Virginia,20110-2209,USAのアメリカ培養細胞系統保存機関ATCCに寄託し、そして以下の寄託番号が指定された。プラスミドpT7P129A、寄託番号203488プラスミドpCMV-S-P129、寄託番号203489。次の米国特許の完全な文章及び開示は、完全に明記されているかのように、本明細書中に参考文献として援用される:米国特許第6,500,662号、及び米国特許第7,618,797号。"