0~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なり、かつSEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシンSEQIDNO18に関して37位のプロリンSEQIDNO18に関して39位のロイシンおよびSEQIDNO18に関して74位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、配列を含む組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して37位のプロリンおよびまたはSEQIDNO18に関して39位のロイシンを含む、請求項1記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して37位のプロリンおよびSEQIDNO18に関して39位のロイシンを含む、請求項2記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンを含む、請求項1記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して34位のチロシンを含む、請求項1記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシンSEQIDNO18に関して37位のプロリンSEQIDNO18に関して39位のロイシンおよびSEQIDNO18に関して74位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、請求項1記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンSEQIDNO18に関して37位のプロリンSEQIDNO18に関して39位のロイシンおよびSEQIDNO18に関して74位のアルギニンを含む、請求項1記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して32位のロイシンをさらに含む、請求項1~7のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して38位のロイシンをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、SEQIDNO18に関して79位のセリンをさらに含む、請求項1~9のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、0~5個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なる、請求項1~10のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記配列が、0~3個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なる、請求項1~10のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチド。実施例10のアッセイ法においてヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも少なくとも4倍大きいヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。1より大きいVLA4LPAM1結合親和性比率を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。SEQIDNO18の配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。変異体が、実施例21のアッセイ法において不活性VLA4と比べて活性化VLA4に対してより強い結合を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。変異体が、実施例21のアッセイ法において、活性化VLA4に対するQ38L2DVCAM1変異体の結合と比べて活性化VLA4に対してより強い結合を示す、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。実施例19のアッセイ法を用いて未処置の対照哺乳動物と比べると、哺乳動物に投与された場合に末梢血中のCD49dB細胞およびCD29B細胞ならびにCD49dT細胞およびCD29T細胞の百分率における減少を誘導しない、前記請求項のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。前記請求項のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、該2DVCAM1変異体のN末端またはC末端に融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドとを含む、タンパク質融合物。請求項1~18のいずれか一項記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドと該ポリペプチドに共有結合している少なくとも1つの結合成分とを含む2DVCAM1変異体結合体であって、該結合成分が、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、および非ポリペプチド親油性成分より選択される、2DVCAM1変異体結合体。前記少なくとも1つの結合成分が非ポリペプチドポリマー成分である、請求項20記載の2DVCAM1変異体結合体。前記非ポリペプチドポリマー成分がポリエチレングリコールである、請求項21記載の結合体。前記PEGが分子量約20~80kdalの分枝PEGである、請求項22記載の結合体。前記PEGが前記ポリペプチドのリジンまたはN末端に共有結合している、請求項23記載の結合体。前記PEGが前記ポリペプチドのN末端に共有結合している、請求項24記載の結合体。1つの二官能性PEGに共有結合している2つの請求項1~18のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む、請求項21~25のいずれか一項記載の結合体。請求項1~19のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項20~26のいずれか一項記載の結合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物。請求項1~10のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えポリヌクレオチド。プロモーターに機能的に連結された請求項28記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。請求項29記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項29記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階および培地からまたは該宿主細胞から、該ポリペプチドを回収する段階を含む、該組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを作製する方法。封入体としての組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項29記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階該ポリペプチドを含む該封入体を回収する段階該封入体を可溶化して、可溶化されたポリペプチドを得る段階該可溶化されたポリペプチドがリフォールディングするのに適した条件下で尿素および還元型酸化型グルタチオンの溶液中において該可溶化されたポリペプチドをインキュベートして、リフォールディングされたポリペプチドを得る段階該リフォールディングされたポリペプチドを精製する段階ならびに段階に由来する該ポリペプチドを回収する段階を含む、該組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを作製する方法。段階が、前記リフォールディングされたポリペプチドを精製することを含む、請求項32記載の方法。請求項1~18のいずれか一項記載の2DVCAM1変異体ポリペプチドを提供する段階および回収された該ポリペプチドに少なくとも1つのポリエチレングリコール成分を共有結合させる段階を含む、2DVCAM1変異体結合体を作製する方法。前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる前記段階が、該ポリペプチドのN末端アミノ基にPEGアルデヒドを結合させるのに有効な条件下で分子量20~80kdalの分枝PEGアルデヒドと共に該ポリペプチドをインキュベートし、それによって、該ポリペプチドのN末端に共有結合している分枝PEG成分を含む2DVCAM1結合体を作製することを含む、請求項34記載の方法。請求項27記載の薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、該対象の炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置のための方法。前記炎症性疾患が多発性硬化症である、請求項36記載の方法。炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置用の医薬を製造するための、請求項1~19のいずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項20~26のいずれか一項記載の結合体の使用。詳細な説明定義本明細書または明細書の残りの部分において他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、ヒト2DVCAM1という用語は、6ドメイン型または7ドメイン型の天然ヒトVCAM1の最初の2つのドメインからなる人工構築物を意味する。この2ドメイン型のVCAM1は、実際には自然に発生しない。SEQIDNO1およびSEQIDNO2は、ヒト2DVCAM1の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ提供する。SEQIDNO2のアミノ酸残基1~88および96~199は、ヒト2DVCAM1のドメイン1およびドメイン2の配列にそれぞれ相当し、SEQIDNO2のアミノ酸残基89~95は、ドメイン1およびドメイン2を連結するリンカーペプチドの配列に相当する。ヒト2DVCAM1配列は、成熟した6ドメイン型のヒトVCAM1のアミノ酸残基1~199ならびに成熟した7ドメイン型のヒトVCAM1の残基1~199に相当し、これらは両方とも自然に発生する。本明細書において使用される場合、2DVCAM1変異体ポリペプチドという用語は、ヒト2DVCAM1のドメイン1配列およびドメイン2配列を含む配列を含み、かつVLA4結合活性を示すポリペプチドを意味し、その際、変異体配列は、1つまたは複数のアミノ酸位置において、ヒト2DVCAM1のドメイン1配列およびまたはドメイン2配列と異なる。ポリペプチドとは、文脈によって、天然のアミノ酸もしくは人工のアミノ酸類似体を含むアミノ酸ポリマー、またはアミノ酸ポリマーを表す文字列である。遺伝コードの縮重を前提として、特定のポリペプチド配列をコードする1つもしくは複数の核酸、またはその相補的核酸を、そのポリペプチド配列から決定することができる。ポリヌクレオチドは、文脈によって、ヌクレオチドA、C、T、U、Gもしくは他の天然のヌクレオチドまたは人工のヌクレオチド類似体を含むヌクレオチドポリマー、または核酸を表す文字列である。任意の指定されたポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的核酸のいずれかを決定することができる。任意の所与のポリマー構成要素の位置が、所与のポリマーにおけるその構成要素の実際の数値的位置に基づくのではなく、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーにおける同じ位置または等価な位置を参照することにより呼ばれる場合、所与のアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けは、選択されたアミノ酸ポリマーまたは核酸ポリマーの番号付けに対応するか、またはに関する。したがって、例えば、所与のポリペプチド配列における所与のアミノ酸位置の番号付けは、参照配列として使用される選択されたポリペプチド配列における同じまたは等価なアミノ酸位置に対応する。等価な位置とは、本明細書において説明するアライメントアルゴリズムを用いて最適に整列させられた場合、参照ポリペプチド配列の対応する位置と並ぶ、試験ポリペプチド配列の位置であると本明細書において定義される。試験ポリペプチドの等価なアミノ酸位置は、参照ポリペプチドの対応する位置と同じ数値的位置番号を有さなくてもよい同様に、試験ポリヌクレオチドの等価な核酸位置は、参照ポリヌクレオチドの対応する位置と同じ数値的位置番号を有さなくてもよい。2つのポリペプチド配列は、その配列ペアにとって可能な最大の類似性スコアに達するように、所定のパラメーター、すなわち、所定のアミノ酸置換マトリクス、ギャップ存在ペナルティ、およびギャップ伸長ペナルティを用いてそれらを整列させた場合、最適に整列される。BLOSUM62マトリックスProcNatlAcadSciUSA891091510919は、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズムにおいて、初期設定のスコアリング置換マトリクスとしてしばしば使用される。ギャップ存在ペナルティは、整列された配列の内の1つに単一のアミノ酸ギャップを導入するために課され、ギャップ伸長ペナルティは、ギャップ中の各残基位置に課される。別段の定めが無い限り、本明細書において使用されるアライメントパラメーターは、BLOSUM62スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ11、およびギャップ伸長ペナルティ1である。アライメントスコアは、アライメントが開始および終了する各配列のアミノ酸位置によって、任意で、可能な最大の類似性スコアに達するように一方または両方の配列中に1つのギャップまたは複数のギャップを挿入することによって定められる。アミノ酸位置およびアミノ酸置換を特定するのに使用される用語は、次のように示される。T37は、SEQIDNO2などの参照アミノ酸配列において、位置番号37がトレオニン残基によって占められていることを示す。T37Pは、37位のトレオニン残基がプロリン残基で置換されていることを示す。二者択一の置換は、を用いて示され、例えば、T37MPは、37位のトレオニン残基がメチオニン残基またはプロリン残基で置換されているアミノ酸配列を意味する。複数の置換は、を用いて示される場合が時々あり、例えば、T37MPI39Lは、メチオニン残基またはプロリン残基による37位のトレオニン残基の置換、およびロイシン残基による39位のイソロイシン残基の置換を含むアミノ酸配列を示す。欠失は、アスタリスクによって示される。例えば、S100は、100位のセリン残基が欠失していることを示す。2個またはそれ以上の連続したアミノ酸の欠失は、次のように示される場合がある。例えば、P95S100は、残基P95~S100の欠失を示す。挿入は、次のように示される。95位に位置するプロリン残基の後ろへの付加的なセリン残基の挿入は、P95PSと示される。置換および挿入の組合せは、次のように示される。セリン残基による95位のプロリン残基の置換および95位のアミノ酸残基の後ろへのアラニン残基の挿入は、P95SAと示される。別段の定めが無い限り、本明細書において説明する2DVCAM1変異体ポリペプチドのアミノ酸残基の位置番号付けは、アミノ酸配列SEQIDNO2、すなわちヒト2DVCAM1の配列に関する。親ポリペプチドの例および親ポリペプチドに対する改変は、配列SEQIDNO2に関して本明細書において提供され得るものの、これらの例は本発明の他のポリペプチドに関係し、本明細書において説明する改変は、本明細書において説明する他のポリペプチドのいずれかの等価なアミノ酸位置に加えられ得ることを理解すべきである。したがって、例として、SEQIDNO2に関する置換Q38Lは、SEQIDNO18におけるアミノ酸位置L38に対応すると理解される。別の例として、SEQIDNO2に関する置換F32Lは、SEQIDNO20に関する置換S32Lに対応し、かつSEQIDNO18におけるアミノ酸位置L32に対応する。VLA4は、インテグリンサブユニットα4およびβ1の非共有結合性ヘテロダイマーとして自然界に存在する。本明細書において定義される場合、VLA4タンパク質は、天然の形態および非天然の形態のインテグリンα4β1を含むと意図される。本明細書の実施例3において、1種のこのようなVLA4タンパク質である、Fcドメインにそれぞれ融合されたヒトインテグリンα4サブユニットおよびβ1サブユニットを含む可溶性融合タンパク質の組換え発現および精製を説明する。この可溶性融合タンパク質を、例えば実施例10のアッセイ法において使用して、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドのVLA4結合活性を測定することができる。同様に、LPAM1も、インテグリンサブユニットα4およびβ7の非共有結合性ヘテロダイマーとして自然界に存在する。本明細書において定義される場合、LPAM1タンパク質は、例えば、実施例4および実施例11で説明する通り、Fcドメインにそれぞれ融合されたヒトインテグリンα4サブユニットおよびβ7サブユニットを含む可溶性融合タンパク質などの天然の形態および非天然の形態のインテグリンα4β7を含むと意図される。VLA4結合活性を示している、有している、もしくは有するという用語は、本発明のポリペプチドまたは結合体がVLA4タンパク質に対して測定可能な結合活性を有することを示すと意図される。VLA4タンパク質は、例えば、ヒトU937細胞などの細胞の表面で発現される場合があり、その場合、細胞表面のVLA4タンパク質への結合は、本明細書の実施例13で説明する細胞接着アッセイ法などの細胞接着アッセイ法を用いて測定することができる。あるいは、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4Fc融合タンパク質などの融合タンパク質として、可溶型のVLA4タンパク質を作製してもよく、例えば、実施例10で説明する通りのELISAアッセイ法または実施例12で説明する通りの表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて、VLA4Fcへの結合を測定してもよい。非ヒトVLA4タンパク質に対する本発明のポリペプチドおよび結合体の結合活性を含むVLA4結合活性を測定する他のアッセイ法は、当技術分野において公知であり、かつまたは実施例において説明する。当業者は、測定可能な結合活性を構成するものは、行われるアッセイ法の性質にある程度依存することを認識しているが、一般的指針として、測定可能な活性とは、試験化合物の存在下で生じるアッセイシグナルが、試験化合物の非存在下で生じるアッセイシグナルと異なり、その差が定量可能であるものである。場合によって、本発明のポリペプチドまたは結合体によって示される活性は、参照2DVCAM1ポリペプチドによって示される特定の活性のものとほぼ等しいか、それより小さいか、またはそれより大きくてよい。変異体とは、親ポリペプチド配列のものと1つまたは複数のアミノ酸位置において異なる配列を含むポリペプチドである。変異体は、残基の最大8など親ポリペプチド配列の総残基数の最大10において、例えば、親ポリペプチド配列の総残基数の最大6、5、4、3、2、または1において親ポリペプチド配列と異なる配列を含んでよい。例えば、アミノ酸199個のポリペプチド配列SEQIDNO2の変異体は、親ポリペプチド配列の総残基数の最大10において、すなわち、アミノ酸199個のポリペプチド配列SEQIDNO2内の最高19個のアミノ酸位置において、例えば、SEQIDNO2内の1~19個のアミノ酸位置において、1~18個のアミノ酸位置において、1~17個のアミノ酸位置において、1~16個のアミノ酸位置において、1~15個のアミノ酸位置において、1~14個のアミノ酸位置において、1~13個のアミノ酸位置において、1~12個のアミノ酸位置において、1~11個のアミノ酸位置において、1~10個のアミノ酸位置において、1~9個のアミノ酸位置において、1~8個のアミノ酸位置において、1~7個のアミノ酸位置において、1~6個のアミノ酸位置において、1~5個のアミノ酸位置において、1~4個のアミノ酸位置において、1~3個のアミノ酸位置において、または1~2個のアミノ酸位置において異なる配列を含む。親ポリペプチドという用語は、本発明に従って改変するためのポリペプチド配列を示すと意図される。例えば、親ポリペプチド配列は、本明細書においてSEQIDNO2として特定するヒト2DVCAM1ポリペプチドまたは本明細書においてSEQIDNO10として特定するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの配列でよい。あるいは、親ポリペプチド配列は、例えば、SEQIDNO12、14、16、18、20、22、または24の内の1つなどの本明細書において開示する2DVCAM1変異体の配列でもよい。物体に対して使用される場合、天然のとは、その物体が、人によって人工的に作製されるのとは違って、自然界で見出すことができることを意味する。例えば、生物中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、かつ研究室で人によって意図的に改変されていないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然である。物体に対して使用される場合、非天然のとは、その物体が天然に存在しないこと、すなわち、その物体が、人によって人工的に作製されるのとは違って自然界で見出すことができないことを意味する。断片または部分配列とは、配列全体までだが配列全体を含まない、配列全体の任意の部分である。したがって、断片または部分配列とは、アミノ酸の長い配列または核酸の長い配列の一部分を含む、アミノ酸または核酸の配列を意味する。2つの分子間、例えば、リガンドおよび受容体の特異的結合親和性とは、分子の混合物における一方の分子の別の分子に対する優先的結合を意味する。典型的には、結合親和性が、約1×104M1~約1×109M1またはそれ以上である場合、それらの分子の結合は特異的とみなされる。リガンドおよび受容体の結合親和性は、当業者に公知の標準的技術によって測定することができる。結合親和性を測定するための周知の技術の非限定的な例には、Biacore技術、等温滴定マイクロカロリメトリー、ELISA、およびフローサイトメトリーが含まれる。例えば、フローサイトメトリー法を用いて、関連する結合対メンバーに特異的に結合する分子集団を選択することができる。リガンド受容体複合体は、、蛍光に基づいて検出し選別することができる。関連する結合対メンバーに結合する関心対象の分子を集め、低濃度の受容体の存在下で再選別する。漸減濃度の受容体から1ナノモル濃度またはそれ以下までの存在下で細胞選別を複数回実施することによって、その受容体に対して特異的結合親和性を示す分子が濃縮された集団を得ることができる。ポリペプチド、核酸、または他の構成要素は、通常それが伴っている構成要素、核酸、細胞、合成試薬、細胞混入物、細胞構成要素などから、例えば、もともとの由来元である細胞において通常伴っている他の構成要素から、部分的にまたは完全に分離されている場合、単離されている。ポリペプチド、核酸、または他の構成要素は、その自然環境の他の構成要素から部分的または完全に回収または分離され、その結果、それが、構成要素の組成物、混合物、または集合物中に存在する優勢な種である場合、単離されている。場合によっては、調製物は、約60超、70超、もしくは75超、典型的には約80超、または好ましくは約90超の単離された種からなる。実質的に純粋なまたは単離された核酸、ポリペプチド、タンパク質、または組成物はまた、対象の種が、存在する全高分子種の少なくとも約50重量、60重量、または70重量を構成する場合も意味する。実質的に純粋な組成物または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全高分子種の少なくとも約80重量、90重量、または95重量を構成してもよい。また、単離された対象の種は、組成物が単一の高分子種の誘導体から本質的になる、本質的に均質な状態に精製することもできる。精製されたという用語は、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを一般に意味する。これは、典型的には、核酸、ポリペプチド、またはタンパク質が、少なくとも約50純粋、60純粋、70純粋、75純粋、より好ましくは少なくとも約85純粋、および最も好ましくは少なくとも約99純粋であることを意味する。単離された核酸という用語は、本発明の核酸の由来元である生物の天然のゲノムにおいてはそれのすぐ横に連続しているコード配列の両方のすぐ横に連続していない核酸を意味することができる。したがって、この用語は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片を含み、このようなcDNAまたはゲノムDNA断片が、ベクター中に組み入れられているか、そのもともとの由来元である生物と同じ種もしくは異なる種のゲノム中に組み込まれているか、キメラポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を形成させるための付加的なコード配列に連結されているか、または他の任意のDNA配列から独立しているかを問わない。DNAは、二本鎖でも一本鎖でもよく、センスでもアンチセンスでもよい。組換えポリヌクレオチドまたは組換えポリペプチドは、複数の供給源ポリヌクレオチドまたは供給源ポリペプチドにそれぞれ由来する核酸配列またはアミノ酸配列を含んでよい非天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、この供給源ポリヌクレオチドまたは供給源ポリペプチドは、天然のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドでもよく、またはそれ自体が変異誘発もしくは他のタイプの改変に供されたものでもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが合成もしくは人工もしくは操作されているか、または合成もしくは人工もしくは操作されているポリペプチドもしくは核酸に由来する場合、組換えとみなしてよい。組換えポリヌクレオチドは、典型的には一緒に含まれてないか、典型的には互いに結合していないか、またはさもなければ、典型的には互いから分離されている、配列の少なくとも2個のセグメントの組合せによって作製することができる。組換えポリヌクレオチドは、異なる供給源に由来するポリヌクレオチドセグメントを一緒にして結合するかもしくは組み合わせることによって形成させた、かつまたは人工的に合成した核酸分子を含んでよい。組換えポリペプチドは、クローニングされたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの結果として生じるポリペプチドをしばしば意味する。組換えという用語は、例えば、細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、またはポリペプチドに関して使用される場合、典型的には、その細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくはポリペプチドが、異種核酸の導入もしくは天然核酸の変更によって改変されていること、またはタンパク質もしくはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって改変されていること、またはそのように改変された細胞に細胞が由来することを示す。組換え細胞は、その細胞の天然形態には存在しない核酸配列を発現するか、または別の状況では異常に発現されるか、過少発現されるか、もしくは全く発現されないであろう天然核酸配列を発現する。組換えという用語は、細胞に関して使用される場合、その細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸にコードされたポリペプチドを発現することを示す。組換え細胞は、天然形態の細胞の内部には存在しないコード配列を含むことができる。また、組換え細胞は、人工的手段によって改変され細胞に再導入される、天然形態の細胞中に存在するコード配列を含んでもよい。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された、細胞に内在する核酸を含む細胞も包含する。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、組換え、および関連した技術によって得られるものが含まれる。ベクターとは、選択された核酸による細胞への形質導入もしくはトランスフェクション、または細胞におけるその核酸の発現を容易にする構成要素または構成物である。ベクターには、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、YACなどが含まれる。発現ベクターとは、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを含む、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物または核酸配列である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部分でよい。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された、転写されるべき核酸を含む。転写されるべき核酸は、典型的には、プロモーターの指示下または制御下にある。イムノアッセイ法という用語は、抗原に結合または特異的に結合させるために抗体または免疫原を使用するアッセイ法を含む。典型的には、イムノアッセイ法は、抗原を単離し、標的とし、かつまたは定量するために特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とする。本明細書において使用される場合、対象という用語は、生物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ネコ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジを含む哺乳動物または他の非ヒト哺乳動物例えば、トリまたは魚など哺乳動物ではない脊椎動物および哺乳動物ではない無脊椎動物を含む非哺乳動物を含むが、それらに限定されるわけではない。薬学的組成物という用語は、動物またはヒトを含む対象における薬学的使用に適している組成物を意味する。薬学的組成物は、一般に、有効量の活性作用物質と、例えば薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、賦形剤または担体とを含む。有効量という用語は、所望の結果をもたらすのに十分な投薬量または量を意味する。所望の結果は、その投薬量または量の受容者における客観的改善または主観的改善を含んでよい。予防的処置とは、疾患、病状、もしくは医学的障害の徴候も症状も示していないか、または疾患、病状、もしくは障害の初期の徴候もしくは症状を示しているにすぎない対象に対して施される処置であり、その際、処置は、疾患、病状、または医学的障害を発生するリスクを減少、防止、または低下させる目的で施される。予防的処置は、疾患または障害に対する防止的な処置として機能する。予防的活性とは、病状、疾患、もしくは障害の徴候も症状も示していないか、または病状、疾患、もしくは障害の初期の徴候もしくは症状を示しているにすぎない対象に投与された場合に、病状、疾患、または障害を対象が持つようになるリスクを減少、防止、または低下させる、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組成物などの作用物質の活性である。予防的に有用な作用物質または化合物とは、病状、疾患、または障害の発生を減少、防止、処置、または低下させる際に有用である作用物質または化合物を意味する。治療的処置とは、病状、疾患、または障害の症状または徴候を示している対象に対して施される処置であり、その際、処置は、病状、疾患、または障害の徴候または症状を減少または消失させる目的で対象に施される。治療的活性とは、病状、疾患、または障害の徴候または症状を、そのような徴候または症状に苦しんでいる対象に投与された場合に消失または減少させる、核酸、ベクター、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質、物質、またはそれらの組成物などの作用物質の活性である。治療的に有用な作用物質または化合物とは、作用物質または化合物が、病状、疾患、または障害のそのような徴候または症状を減少、治療、または消失させる際に有用であることを示す。一般に、以下で使用する学名および下記に説明する細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、およびタンパク質化学における実験手順は、当業者に周知であり、一般に使用されるものである。標準的技術、例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualVols13ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork2001およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyFMAusubeletaledsCurrentProtocolsJohnWileySonsIncで説明されているものが、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養法、および導入遺伝子組込み、例えば、エレクトロポレーション、インジェクション、遺伝子銃、皮膚を介した導入、およびリポフェクションのために使用される。一般に、オリゴヌクレオチドの合成工程および精製工程は規格に従って実施される。一般に、それらの技術および手順は、当技術分野および本文書の全体を通して提供される様々な一般的参考文献における従来の方法に従って実施される。その中の手順は、当業者に周知であると考えられており、読者の利便性のために提供される。一般に、スクリーニングという用語は、本発明の最適な分子、例えば、本発明のポリペプチドなど、およびそのような分子をコードする核酸を同定するプロセスを説明する。これらの各分子のいくつかの特性を、スクリーニングにおいて使用することができる。例えば、試験システムまたはインビトロ適用、エクスビボ適用、もしくはインビボ適用において、分子がリガンドまたは受容体に結合する能力、細胞増殖を阻害する能力、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製を阻害する能力、細胞サイトカイン産生を誘導または阻害する能力、免疫応答を変化させる能力である。抗原の場合、抗原の発現、フォールディング、安定性、免疫原性、およびいくつかの関連抗原に由来するエピトープの存在を含む、抗原のいくつかの特性を選択およびスクリーニングにおいて使用することができる。選択とは、同定および物理的分離が同時に実現される、スクリーニングの一形態である。選択の1つの様式は、遺伝的選択であり、これは、例えば、選択マーカーの発現によって遂行することができる。選択マーカーにより、一部の状況において、他の細胞は死滅するが、そのマーカーを発現する細胞が生き残ることが可能になる。選択マーカーには、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子などが含まれる。スクリーニングマーカーには、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、および緑色蛍光タンパク質などが含まれる。別の様式の選択は、受容体へのリガンドの結合、基質と酵素の反応、または直接的にもしくは間接的に検出可能なシグナルを生じることができる他の任意の物理的プロセスなど、検出可能な事象に基づいた物理的選別を伴う。物理的選別による選択は、例えば、全細胞形式または微小滴形式のフローサイトメトリーなどの様々な方法によって遂行することができる。例えば、ライブラリーを表面提示ベクター中にサブクローニングして、細胞表面でのポリペプチドの発現を可能にすることができる。次いで、表面で発現されたポリペプチドのライブラリーから、フローサイトメトリーを用いて、受容体に結合するポリペプチドを予め濃縮することができる。例えば、受容体に結合した場合に受容体と表面に提示されたポリペプチドとの相互作用の寄与により細胞を間接的に標識する、蛍光標識された抗受容体抗体を用いて、受容体に結合するポリペプチドを提示する細胞を検出することができる。次いで、受容体に結合する発現されフォールディングされたポリペプチドをコードするメンバーをライブラリーから予め濃縮するフローサイトメトリーによって、この様式で蛍光標識された細胞を選別することができる。次いで、受容体結合物を予め濃縮したライブラリーを、参照ポリペプチドと比べて受容体に強固に結合し、かつまたは受容体からの解離速度が遅いポリペプチドをコードするメンバーをさらに濃縮するための競合アッセイ法を用いた選択に供することができる。このアプローチにおいて、受容体は、細胞表面でポリペプチドを発現する細胞集団に添加される。これらの細胞は洗浄され、次いで、参照ポリペプチドが添加される。参照ポリペプチドの存在下で、徐々に長くなる期間に渡って受容体に結合したままである表面提示ポリペプチドを選択するために、様々な期間の後にフローサイトメトリーによって細胞集団を選別する。この様式で選択される細胞集団は、同族受容体への結合がより強固であるポリペプチドをコードするライブラリーメンバーが濃縮されていることが予想され、強固な受容体結合に関連した活性を有するポリペプチドの単離および同定が可能になる。本明細書および特許請求の範囲において、例えば、非ポリペプチド成分、アミノ酸残基、置換、緩衝液などの文脈において、1つの構成要素への任意の言及は、別段の記載が無い限り、またはそうではないことが特定の文脈から明らかである場合を除いて、1つまたは複数のそのような構成要素に言及すると意図される。例えば、A、B、およびCより選択される構成要素という表現は、A、B、およびCのあらゆる組合せ、例えば、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCを含むと意図される。その他の様々な用語は、本明細書において定義されるか、またはそうでなければ特徴決定される。本発明の分子および方法本発明は、VLA4結合活性を示す組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体を提供する。このような2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体は、VLA4への天然VCAM1の結合を阻害する際に有用であり得る。本発明は、特定の理論の根本的メカニズムによって限定されるものではないが、本明細書においてより詳細に説明するものなどの代理アッセイシステムにおけるVLA4結合活性は、例えば、対象において天然VCAM1への天然VLA4の結合を阻害する際の、2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにその融合タンパク質および結合体の有効性の予測に役立ち得ることが提唱されている。本発明の分子はVCAM1VLA4相互作用に拮抗する能力を有するため、VCAM1へのVLA4の結合に関連した障害、疾患、または症状を予防または治療する際に有用となっている。このようなアンタゴニストは、細胞の活性化、遊走、増殖、および分化を含む細胞接着プロセスを阻害し得る。2DVCAM1変異体ポリペプチド本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、例えば、実施例13の細胞ベースのアッセイ法において実証される通り、VLA4およびVCAM1の結合を阻害する。VLA4は、炎症応答の鍵となる介在物質として関係付けられているため、VLA4VCAM1結合相互作用の阻害剤は、炎症の治療ならびに炎症性の疾患および障害に関連した病態の治療に有用な可能性がある。1つの態様において、本発明は、0~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なり、かつSEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンまたはチロシンSEQIDNO18に関して37位のプロリンSEQIDNO18に関して39位のロイシンおよびSEQIDNO18に関して74位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも2個のアミノ酸残基を含む配列を含む組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを提供する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO18に関する番号付けを用いて前述したアミノ酸残基の内の任意の2個、3個、または4個の組合せを有してよい。例示的な組合せには、P37L39P37R74F34P37F34R74P37L39R74F34L39R74F34P37L39S34P37R74S34L39R74Y34P37L39ならびに前述したアミノ酸残基の内の4個の組合せ、すなわち、F34P37L39R74およびY34P37L39R74が含まれ、アミノ酸位置の番号付けは、SEQIDNO18に関する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドのポリペプチド配列は、SEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンまたはSEQIDNO18に関して34位のチロシンをしばしば含み、通常、SEQIDNO18に関して34位のフェニルアラニンを含む。前述の配列特徴に加えて、2DVCAM1変異体ポリペプチドはまた、SEQIDNO18に関して32位のロイシンおよびもしくはSEQIDNO18に関して38位のロイシンならびにまたはSEQIDNO18に関して79位のセリンもしばしば含む。前述の態様において、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO18に関して0~7個、0~6個、0~5個、0~4個、0~3個、0~2個、または0~1個の位置において異なるアミノ酸配列を含んでよい。適切な置換には、L32F、F34S、L38Q、S41A、R74AILMFWYV、S79KR、L141F、D145A、およびR146Wが含まれる。特定の態様において、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドは、0~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なり、かつSEQIDNO18に関して37位のアミノ酸プロリンおよびまたは39位のアミノ酸ロイシンを含む配列を含む。典型的には、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、P37およびL39の両方を含む。一部のこのような2DVCAM1変異体ポリペプチドはまた、SEQIDNO18に関して38位のロイシンも含む。本発明のこの局面によるいくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO18に関してL32FS、F34SY、L38Q、S41A、R74TA、S79KR、L141FW、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、0~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO12と異なり、かつSEQIDNO12に関して37位のアミノ酸プロリンおよび39位のアミノ酸ロイシンを含む配列を含む、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む。この態様において、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO12に関して0~7個、0~6個、0~5個、0~4個、0~3個、0~2個、または0~1個の位置において異なるアミノ酸配列を含んでよい。一部のこのような2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO12に関して41位のアラニンも含む。本発明のこの局面によるいくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO12に関してF32LS、S34FY、Q38L、A41S、T74RA、K79SR、L141FW、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む。SEQIDNO12およびSEQIDNO18に関して列挙した前述の具体的な置換に加えて、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、保存的置換をさらに含んでもよい。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、ならびに小型アミノ酸のグループ内のものである。最も一般的に起こる交換は、AlaSer、ValIle、AspGlu、ThrSer、AlaGly、AlaThr、AlaVal、SerGly、TyrPhe、AlaPro、LysArg、AspAsn、LeuIle、およびLeuVal、ならびにこれらの逆である。別の局面において、本発明は、ペプチド結合によって直接的に、またはリンカーを介して間接的に連結されている第1のドメイン配列および第2のドメイン配列を有する組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む。ドメイン1配列は、ヒト2DVCAM1のドメイン1アミノ酸配列と2~8個のアミノ酸位置において異なり、SEQIDNO2に関して置換T37PおよびI39Lを含む。変異体のドメイン1配列は、SEQIDNO2に関してF32LS、S34FY、Q38L、S41A、T74RA、およびK79SRより選択される、1つまたは複数のドメイン1置換をさらに含んでもよい。変異体のドメイン2配列は、ヒト2DVCAM1のドメイン2アミノ酸配列と0~3個のアミノ酸位置において異なり、SEQIDNO2に関してL141F、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数のドメイン2置換を任意で含む。本発明のこの局面によるいくつかのこのような2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ドメイン1配列およびドメイン2配列を間接的に連結する、SEQIDNO2のアミノ酸89~95に対応するリンカーペプチドなどのリンカーペプチドを含む。前述の1つまたは複数のドメイン1置換に加えて、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒト2DVCAM1に関して、次の1つまたは複数のアミノ酸残基を含んでよい。36位のアルギニン、40位のアスパラギン酸、および42位のプロリン。一部のこのような本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、40位に少なくともアミノ酸残基アスパラギン酸を含む。例えば、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、D40ならびにR36およびP42の一方または両方と組み合わせて、上記に特定したドメイン1置換の内の任意の1つまたは複数を含んでよい。例えば、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、SEQIDNO2に関して残基R36、D40、およびP42ならびに置換T37PおよびI39Lを含み、かつSEQIDNO2に関してドメイン1置換F32LS、S34FY、Q38L、S41A、T74RA、およびK79SRの内の1つまたは複数をさらに含んでよい。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4Fc融合物などのヒトVLA4タンパク質に結合する。言い換えると、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4結合活性を示す。場合によっては、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質に対するヒト2DVCAM1の結合親和性よりも大きい、ヒトVLA4タンパク質、例えば、本明細書の実施例3で説明するヒトVLA4Fc融合物などのVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかのこのような本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい、VLA4タンパク質に対する結合親和性を有する。いくつかの本発明の2DVCAM1変異体配列は、次のモチーフの内の1つを含んでよいRPQLDAPまたはRPLLDSP。一般に、これらのモチーフ配列は、ヒト2DVCAM1配列に関して、アミノ酸位置36~42に、またはその付近に位置する。したがって、本発明はまた、最大10個のアミノ酸位置においてSEQIDNO2と異なり、かつRPQLDAPおよびRPLLDSPより選択されるモチーフを含む変異体配列を有する組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドも提供する。典型的には、上記のモチーフの内の1つを含むこのような2DVCAM1変異体ポリペプチド配列は、最大8個、最大6個、または最大4個のアミノ酸位置においてSEQIDNO2と異なり、VLA4タンパク質に対するその結合親和性は、VLA4タンパク質に対するヒト2DVCAM1の結合親和性よりも大きいか、または場合によっては、VLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい。例示的な本発明の2DVCAM1変異体は、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO101、SEQIDNO103、SEQIDNO105、SEQIDNO107、SEQIDNO109、SEQIDNO111、SEQIDNO113、SEQIDNO115、SEQIDNO117、SEQIDNO119、SEQIDNO121、SEQIDNO123、SEQIDNO125、SEQNO127、SEQIDNO129、SEQIDNO131、SEQIDNO133、SEQIDNO135、SEQIDNO137、SEQIDNO139、SEQIDNO141、SEQIDNO143、SEQIDNO145、SEQIDNO147、SEQIDNO149、SEQIDNO151、SEQIDNO153、SEQIDNO155、SEQIDNO157、SEQIDNO159、SEQIDNO161、およびSEQIDNO163として本明細書において提供される。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチド配列、例えば、SEQIDNO2または本明細書において提供される例示的な2DVCAM1変異体配列の内の1つ、例えばSEQIDNO12もしくはSEQIDNO18に関して、アミノ酸残基のさらなるアミノ酸置換、欠失、およびまたは挿入を含んでよい。このような2DVCAM1変異体ポリペプチドは、例えば、VLA4への結合を測定するための実施例10のELISAアッセイ法およびまたは実施例12のBIACOREアッセイ法と共に、変異誘発法および変異体ライブラリーを作製するための当技術分野において公知の他の方法を用いて、容易に同定することができる。置換、欠失、およびまたは挿入に適した他の位置は、2DVCAMのドメイン1およびドメイン2の間の天然リンカー中に位置する場合がある。SEQIDNO2のアミノ酸残基89~95は、ヒト2DVCAM1のドメイン1およびドメイン2の間の天然リンカーペプチドを形成する。いくつかの本発明の2DVCAM1変異体は、変異体ポリペプチドのドメイン1配列およびドメイン2配列を間接的に連結するこのリンカーを含む。本発明はまた、ドメイン1およびドメイン2を結合させるため、ならびに2DVCAM1変異体Fc融合ポリペプチドにおいて2DVCAM1変異体ポリペプチドをFc領域と結合させるための、このリンカーおよび他の適切なリンカーの使用も企図する。他の適切なリンカーには、20種の天然のアミノ酸のいずれか、または当技術分野において公知の非天然のアミノ酸、ならびにそれらの組合せから構成されるリンカーが含まれる。ポリペプチドを連結して新規の融合ポリペプチドにするための、天然のアミノ酸残基または非天然のアミノ酸残基のいずれかから構成されたリンカーの使用は、当技術分野において周知であり、参照によりそれぞれ本明細書に組み入れられる次の参考文献において報告されているHallewelletalJBiolChem26452605268AlfthanetalProteinEng8725731RobinsonandSuerBiochemistry35109116KhandekaretalJBiolChem2723219032197FaresetalEndocrinology13924592464SmallshawetalProteinEng12623630および米国特許第5856456号。また、リンカーペプチドの使用は、軽鎖および重鎖の可変領域がリンカーペプチドを介して連結されている単鎖抗体の作製においても実証されている。広く使用されているリンカーペプチドは、GlyGlyGlyGlySerアミノ酸配列の繰り返し3回からなる15量体である3SEQIDNO25。適切なリンカー配列を多様化し選択するために、ファージ提示技術が使用されているJBiolChem2711568215686HenneckeetalProteinEng11405410。いくつかの態様において、ドメイン1配列およびドメイン2配列を間接的に連結するリンカーペプチドは、少なくとも50のグリシン残基、場合によっては、少なくとも75のグリシン残基を含んでよい。リンカーペプチドはまた、グリシン残基のみから構成されてもよい。例えば、リンカーは、1~20個のグリシン残基、2~16個のグリシン残基、3~15個のグリシン残基、4~12個のグリシン残基、または5~10個のグリシン残基を含んでよい。グリシン残基のほかに、リンカーは、他の残基、特にSer、Ala、およびThrからなる群より選択される残基を含んでもよい。本発明の2DVCAM1変異体において使用されるリンカーペプチドは、その配列中にグリシン残基およびセリン残基のみを含んでもよい。例えば、リンカーペプチドは、nの形態または1~3であるであってよい。グリシン残基およびセリン残基のみを有する他の適切なリンカーペプチドは、nの形態または1~3であるであってよい。他の適切なリンカーペプチドには、アミノ酸配列GlyxXaaGlyyXaaGlyzの整数であるを有するものが含まれる。いくつかの態様において、各Xaaは、Ser、Ala、およびThrからなる群より独立に選択される。より具体的には、リンカーペプチドは、アミノ酸配列GlyGlyXaaGlyGlyGlyXaaGlyGlyGlyを有し、各Xaaは、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Asp、およびGluからなる群より独立に選択される。いくつかの態様において、各Xaaは、Ser、Ala、およびThrからなる群より独立に選択される。典型的には、XaaはSerである。適切なリンカーペプチドには、リンカーペプチドのアミノ酸配列中に少なくとも1つのプロリン残基を含むものが含まれる。本発明の2DVCAM1変異体において使用するためのリンカーペプチドはまた、少なくとも1つのシステイン残基およびまたは少なくとも1つのリジン残基も含んでよい。したがって、本発明のいくつかの態様において、リンカーペプチドは、Gly、Ser、Ala、Thr、Cys、Lys、およびProからなる群より選択されるアミノ酸残基を含む。インビボで投与された場合の2DVCAM1変異体に特徴的な血清半減期を変化させるために、他の配列改変を加えてもよい。例えば、グリコシル化部位またはPEG化部位を導入または除去するための配列改変を、本発明の2DVCAM1変異体に加えることができる。以下に、より詳細にこれを説明する。1つの態様において、本発明はまた、非ポリペプチド結合成分が共有結合し得るアミノ酸の置換、挿入、または欠失を伴う2DVCAM1変異体ポリペプチド配列も提供する。除去または導入するための具体的なアミノ酸は、除去または導入するための非ポリペプチド結合成分の性質に基づいて選択される。例えば、非ポリペプチド結合成分が、非ポリペプチドポリマー、例えば、適切な反応性官能基を用いて活性化されたポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキシド誘導体である場合、結合基は、システイン、リジン、N末端アミノ酸残基、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、もしくはアルギニン、またはそれらの2種もしくはそれ以上の任意の組合せでよい。リジンおよびシステインは、非ポリペプチド結合成分に結合させるための結合部位を付加または除去するという状況において導入または除去される典型的な結合基である。本明細書において使用される場合、非ポリペプチド結合成分という用語は、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、または非ポリマー親油性成分を意味する。例示的な非ポリペプチド結合成分を、下記により詳細に説明する。非ポリペプチド結合成分が共有結合するアミノ酸残基は、本明細書において結合基と呼ばれる。非ポリペプチド結合成分は、結合基上の特定の結合部位と反応する。結合部位という用語は、結合反応に関与する特定の官能基を意味する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの配列中にリジン反応性結合部位を導入するための例示的な置換には、R10K、R36K、R78K、R123K、R146K、R172K、R187K、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチド配列からリジン反応性結合部位を除去するための例示的な置換には、K2RQ、K46RQ、K79RQ、K82RQ、K93RQ、K107RQ、K112RQ、K130RQ、K136RQ、K147RQ、K152RQ、K167RQ、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。例示的な非ポリペプチド結合成分を、下記により詳細に説明する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、典型的には、長さが約190~約230アミノ酸残基、より典型的には、長さが約185~約210アミノ酸残基、例えば、長さが約190~約205アミノ酸残基、一般に、長さが約195~約200アミノ酸残基、しばしば、長さが約199アミノ酸残基である。別の態様において、本発明は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、2DVCAM変異体ポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドである第1のポリペプチドと、該2DVCAM変異体ポリペプチドのN末端に融合されている第2のポリペプチドまたはペプチドと、該2DVCAM変異体ポリペプチドのC末端に融合されている第3のポリペプチドまたはペプチドとを含む融合タンパク質であって、該第2のポリペプチドまたはペプチドおよび該第3のポリペプチドまたはペプチドが同一であるかまたは異なっていてよい、融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質において使用するのに適したポリペプチドおよびペプチドには、例えば、延長された半減期およびターゲティングまたは精製のために望ましい場合があるVLA4以外の分子実体への結合などの望ましい特徴を2DVCAM1変異体ポリペプチドに与えるものが含まれる。例示的な第2のポリペプチドペプチドおよび第3のポリペプチドペプチドには、例えば、ポリヒスチジンタグおよびその変異体、免疫グロブリンのFc領域の全体または一部分、ならびにヒト血清アルブミンなどが含まれる。例えば、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、例えば、1~5個もしくは1~10個または1~20個もしくは1~30個のアミノ酸残基からなるタグペプチドまたはリンカーペプチドを含む融合タンパク質として発現されてよい。タグペプチドまたはリンカーペプチドは、2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端またはC末端に結合されてよい。タグペプチドまたはリンカーペプチドは、例えば、ポリペプチドの精製を容易にするように設計することができ、または非ポリペプチドポリマー成分への結合を容易にすることができる。いくつかの適切なタグが、例えば、UnizymeLaboratoriesから市販されている。例示的なタグには、以下が含まれる。参照により本明細書に組み入れられるEvanGIetalMolCellBiol5361016によって説明されているC末端タグ。その他の適切なリンカーペプチドは、ランダム変異誘発などの周知の変異誘発技術を用いて、本明細書または文献において説明されるリンカーペプチドを最適化することによって得ることができる。別の例において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのFc領域の一部分または全体に直接的にまたはリンカーを介して間接的に連結されている本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む、2DVCAM1変異体Fc融合ポリペプチドでもよい。本発明の実践において使用するのに適したFc領域には、抗体アイソタイプIgG、IgA、もしくはIgDの重鎖の第2定常ドメインおよび第3定常ドメイン、またはIgMもしくはIgEの重鎖の第2、第3、およびもしくは第4定常ドメインの一部分もしくは全部が含まれる。適切なリンカーには、下記により詳細に説明するものが含まれる。実施例22は、本発明の2DVCAM1変異体Fc融合ポリペプチドの構築を例示する。2DVCAM1変異体の特性いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例10のELISAアッセイ法によって測定されるように、VLA4タンパク質に対するヒト2DVCAM1の結合親和性と比べて、VLA4タンパク質に対する結合親和性が大きい。実施例10のアッセイ法において、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒトVLA4Fcに対するヒト2DVCAM1の親和性と比べて、少なくとも5倍、例えば、少なくとも10倍大きい親和性をヒトVLA4Fcに対して示す。いくつかのこのような本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例10のアッセイ法において、ヒトVLA4Fcに対するヒト2DVCAM1の親和性と比べて、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、最高で500倍大きい親和性をヒトVLA4Fcに対して示す。いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドはまた、実施例10のELISAアッセイ法およびまたは実施例12のBIACOREアッセイ法のいずれかによって測定されるように、VLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べて、VLA4タンパク質に対する結合親和性が少なくとも同等であるか、または典型的には大きい。実施例10のアッセイ法において、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒトVLA4Fcに対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの親和性と比べて、少なくとも2倍大きい親和性をヒトVLA4Fcに対して示す。より典型的には、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例10のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの親和性と比べて、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、最高で50倍大きい親和性をヒトVLA4Fcに対して示す。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、より大きいまたはより小さい結合親和性をLPAM1タンパク質に対して示す。すなわち、VLA4LPAM1結合親和性比率が、それぞれ1より大きいか、または1未満である。本発明のある種の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例11のELISAアッセイ法で測定されるように、ヒト2DVCAM1の結合親和性またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べて、より大きいまたはより小さい結合親和性をLPAM1タンパク質に対して示す。組換えモノクローナル抗体ナタリズマブおよび野生型ヒトVCAM1と同様に、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒトVLA4およびLPAM1の両方に対して結合活性を示す。したがって、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、Q38L2DVCAM1ポリペプチドと比べて、より大きい結合親和性をLPAM1タンパク質に対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例11のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの親和性と比べて、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、最高で50倍大きい親和性をLPAM1タンパク質に対して示す。さらに、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒト2DVCAM1ポリペプチドまたはQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べて、同等または小さい結合親和性をLPAM1タンパク質に対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例11のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合改善と比べて、2倍未満の結合改善をLPAM1Fcに対して示す。より典型的には、このような2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例11のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合改善と比べて、15倍未満、1倍未満、05倍未満、02倍未満、01倍までの結合改善をLPAM1Fcに対して示す。いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドのVLA4タンパク質に対する平衡解離定数は、ヒト2DVCAM1の平衡解離定数よりも小さい。言い換えると、いくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、例えば、実施例12の動態学的結合アッセイ法によって測定されるように、ヒト2DVCAM1の結合親和性よりも大きい、VLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、。実施例12のアッセイ法において、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、典型的には、ヒト2DVCAM1より少なくとも5倍大きい親和性をVLA4Fcに対して示す。より典型的には、それらは、実施例12のアッセイ法において、ヒト2DVCAM1の結合親和性と比べて、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、最高で500倍大きい結合親和性をVLA4Fcに対して示す。いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4タンパク質、例えばVLA4Fcに対する結合親和性が、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性とほぼ等しいか、または典型的にはそれより大きい。いくつかのこのような本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例12のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性より、少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも8倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍、少なくとも40倍、最高で50倍大きい結合親和性をVLA4Fcに対して示す。本発明のある種の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、野生型2DVCAM1の結合親和性よりも大きい結合親和性をLPAM1タンパク質、例えばLPAM1Fcに対して示す。このような変異体は、典型的には、実施例12のアッセイ法において、ヒト2DVCAM1よりも、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、最高で500倍大きい結合親和性をLPAM1Fcに対して示す。本発明の他の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、野生型2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1の結合親和性と比べて、ほぼ等しい結合親和性または小さい結合親和性をLPAM1タンパク質、例えばLPAM1Fcに対して示す。典型的には、このような変異体は、実施例12のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べて2倍未満の大きさの結合親和性をLPAM1Fcに対して示す。より典型的には、このような2DVCAM1変異体ポリペプチドは、実施例12のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べて、約15倍未満、約1倍未満、約05倍未満、約02倍未満、約01倍までの大きさの結合親和性をLPAM1Fcに対して示す。さらに、実施例12で示した通り、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1によって示されるVLA4LPAM1結合親和性比率のものよりも大きい、VLA4LPAM1結合親和性比率を示す。言い換えると、いくつかの本発明の変異体は、ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1のいずれかのVLA4対LPAM1の相対的結合親和性と比べた場合、LPAM1タンパク質に対する結合親和性よりもVLA4タンパク質に対する結合親和性においてより大きい改善を示す。ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1の結合親和性比率と比べて高いVLA4LPAM1結合親和性比率を有する2DVCAM1変異体ポリペプチドは、LPAM1結合が望ましくない場合、例えば、LPAM1結合が、進行性多巣性白質脳症などの有害な副作用と相関している場合、特に有利であり得る。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、図14および図15に示す通り、不活性VLA4と比べた場合、活性化VLA4に対して優先的な結合を示すことが実証されている。対応する実験は、下記の実施例21で説明する。背景技術のセクションで説明した通り、他のインテグリン受容体と同様に、VLA4は、低親和性の立体構造状態および高親和性の立体構造状態の両方で存在する。低親和性状態から高親和性状態への移行は、リガンドに対するVLA4およびLPAM1の親和性を増大させる、マグネシウムおよびマンガンなどの二価陽イオンの結合に次いで起こるインテグリン受容体の立体構造変化に起因する。図14に示す通り、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、不活性VLA4と比べた場合、活性化VLA4に対してより強い結合を示す。また、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、野生型2DVCAM1およびまたはQ38L2DVCAM1変異体と比べて、活性化VLA4に対してより強い結合を示す。図15は、VLA4活性化状態がクローン146の結合に与える影響を示す。この図から、2DVCAM1変異体ポリペプチドは活性化VLA4に結合するが、活性化されていないVLA4には強固に結合しないことが裏付けられる。このように2DVCAM1ポリペプチドが活性化VLA4を優先するため、疾患に関連する活性化受容体を選択的にブロックすることができ、無関係なインテグリン受容体に結合する潜在的なポリペプチドプールを減少させることができる。また、関連するVLA4受容体を選択的にターゲティングすることによって、免疫を過剰に抑制することなく疾患を予防することを可能にする2DVCAM1変異体ポリペプチド最適用量レベルを与えることができる。したがって、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、活性化VLA4および非活性化VLA4に同様に良く結合するナタリズマブなどの他のα4β1アンタゴニストと比べて、例えばJCウイルスによる日和見性感染症およびそのような感染症によって引き起こされる疾患、例えばPMLのリスク低減を実現する際に有益であり得る。実施例19Aおよび19Bで実証される通り、哺乳動物に投与される場合、本発明の変異体ポリペプチドは、末梢血リンパ球上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現を下方調節しないと思われる。実施例19Aにおいて、ペグ化型のクローン146、ラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS2、またはリン酸緩衝液溶液のいずれかを雌Balbcマウスに皮下注射した。マウスから採取した全血を、B220細胞上のα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルについて解析した。これらの結果を図10に示す。PS2処置マウスにおいてa4インテグリンの細胞表面レベルの上昇が観察されたのとは対照的に、PEG50146処置マウスにおいては□4インテグリンの細胞表面レベルは、不変のようであった。同様の結果が、b1インテグリンレベルに関しても得られた。実施例19Bにおいて、PEG50146またはヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブのいずれかを雄カニクイザルに皮下注射した。サルから採取した全血を、CD20末梢B細胞およびCD3末梢T細胞上のα4インテグリン細胞表面レベルおよびβ1インテグリン細胞表面レベルについて解析した。図11Aに示す通り、PEG50146変異体と比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD49dB細胞の百分率が有意に減少していた。図11Bに示す通り、PEG50146変異体で処置したサルと比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD49dであるT細胞の同様の減少が観察された。図12Aおよび図12Bに示す通り、PEG50146変異体と比べて、ナタリズマブで処置したサルにおいて、CD29B細胞およびCD29T細胞の百分率もまた、それぞれ有意に減少していた。したがって、さらなる態様において、本発明は、実施例19におけるアッセイ法を用いて未処置の対照哺乳動物と比べると、哺乳動物に投与された場合に末梢血中のCD49dB細胞およびCD29B細胞ならびにCD49dT細胞およびCD29T細胞の百分率における減少を誘導しない2DVCAM1変異体ポリペプチドを提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、インビボで投与された場合に末梢血リンパ球上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現の減少を誘導しない変異体の特性は、これらの接着分子に依存した免疫学的活性に対して強い影響を示し得ると考えられている。これらの活性には、免疫監視および炎症部位への免疫細胞の遊走が含まれる。このように接着細胞の表面発現に対する影響力を欠く結果、免疫監視、免疫細胞トラフィッキング、免疫ホメオスタシス、およびJCウイルスによって引き起こされる感染症などの日和見性感染症のリスクに対する影響が小さくなって、細胞接着分子の細胞表面発現に影響を及ぼす他のVLA4アンタゴニストと比べてPMLの全体的リスクが低くなり得る。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含むタンパク質融合物および結合体もまた、2DVCAM1変異体ポリペプチドに対して前述の特性を示すと考えられている。上記および下記の実施例で説明する本発明の分子に関して観察される特性を考慮して、本発明の分子は、他のVLA4アンタゴニストに関連付けられているPMLのリスクの低下を伴う、炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置として有益であり得ると考えられている。具体的には説明しない、本明細書において説明する特性を有する2DVCAM1変異体ポリペプチドは、下記の本発明のポリペプチドという題のセクションおよび実施例において説明するアッセイ法において説明される通り、変異誘発を加味した本明細書において先に提供された鍵となるアミノ酸残基の情報に基づいて容易に同定することができる。本発明のポリヌクレオチド本発明は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび前述のそのタンパク質融合物をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明の例示的なポリヌクレオチドには、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO100、SEQIDNO102、SEQIDNO104、SEQIDNO106、SEQIDNO108、SEQIDNO110、SEQIDNO112、SEQIDNO114、SEQIDNO116、SEQIDNO118、SEQIDNO120、SEQIDNO122、SEQIDNO124、SEQIDNO126、SEQIDNO128、SEQIDNO130、SEQIDNO132、SEQIDNO134、SEQIDNO136、SEQIDNO138、SEQIDNO140、SEQIDNO142、SEQIDNO144、SEQIDNO146、SEQIDNO148、SEQIDNO150、SEQIDNO152、SEQIDNO154、SEQIDNO156、SEQIDNO158、SEQIDNO160、およびSEQIDNO162が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO101、SEQIDNO103、SEQIDNO105、SEQIDNO107、SEQIDNO109、SEQIDNO111、SEQIDNO113、SEQIDNO115、SEQIDNO117、SEQIDNO119、SEQIDNO121、SEQIDNO123、SEQIDNO125、SEQIDNO127、SEQIDNO129、SEQIDNO131、SEQIDNO133、SEQIDNO135、SEQIDNO137、SEQIDNO139、SEQIDNO141、SEQIDNO143、SEQIDNO145、SEQIDNO147、SEQIDNO149、SEQIDNO151、SEQIDNO153、SEQIDNO155、SEQIDNO157、SEQIDNO159、SEQIDNO161、およびSEQIDNO163にそれぞれ対応する本発明の例示的なポリペプチドをコードする。当業者は、遺伝コードの縮重のために、本発明の2DVCAM1変異体をコードする多数のポリヌクレオチド配列が存在することを容易に理解するであろう。表1は、各アミノ酸の同義コドンを提供するコドン表である。例えば、コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、およびCGUはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されている本発明のポリヌクレオチド中のすべての位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、前述の対応するコドンのいずれかに変更することができる。RNA配列中のUはDNA配列中のTに対応することが理解される。表1コドン表このようなサイレント変種は、保存的変種の一種である。当業者は、ポリヌクレオチド配列中の各コドンを、標準的な技術によって、機能的に同一なポリペプチドをコードするように改変できることを認識するであろう。したがって、あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各サイレント変種は、説明した任意の配列に潜在的に含まれる。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製できる、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在し得る各変種およびすべての変種を企図し、提供する。これらの組合せは、本発明のポリヌクレオチド配列に適用される際、標準的なトリプレット遺伝コードに従って作られる。同じ環境で翻訳された場合に同じアミノ酸をいずれもコードする2種またはそれ以上の異なるコドンのグループは、本明細書において同義コドンと呼ばれる。本発明の2DVCAM1変異体は、所望の宿主生物の最適コドン使用に従うようにポリヌクレオチドを改変することによって、特定の宿主生物における発現のためにコドン最適化することができる。当業者は、多様な生物についての優先情報を提供する表および他の参考文献が容易に入手可能であることを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、HenautandDanchinEscherichiacoliandSalmonellaNeidhardtetalEdsASMPressWashingtonDCpp20472066を参照されたい。特定の宿主生物による発現用に最適化されたポリヌクレオチドの例はSEQIDNO55であり、これは、大腸菌用に最適化したヒト2DVCAM1ポリヌクレオチド配列である。ヒト2DVCAM1ポリヌクレオチド配列は、SEQIDNO1として提供される。保存的に改変された変種および保存的変種という用語は本明細書において同義的に使用され、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを意味するか、またはポリヌクレオチドがコード配列でない状況において、この用語は、同一であるポリヌクレオチドを意味する。コードされる配列中の単一のアミノ酸またはわずかな百分率のアミノ酸を変化させるか、付加するか、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加は、その変化が次の内の1つまたは複数をもたらす場合、保存的に改変された変種とみなされることを当業者は認識するアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換。複数のアミノ酸が影響を受ける場合、その百分率は、典型的には、コードされる配列の長さ全体のアミノ酸残基の5未満、およびより典型的には2未満である。互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸を提供する参考文献は、当技術分野において周知である。本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法を用いて調製することができる。典型的には、最長約50~120塩基のオリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで、連結して、本質的に任意の所望の連続的配列を形成させる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、BeaucageetalTetrahedronLetters22185969によって説明されている古典的なホスホラミダイト法、またはMatthesetalEMBOJ380105によって説明されている方法を用いて化学合成によって調製することができる。ホスホラミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドは合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクター中にクローニングされる。さらに、本質的に任意のオリゴヌクレオチドは、例えば、TheMidlandCertifiedReagentCompany、TheGreatAmericanGeneCompany、ExpressGenInc、および他社など様々な商業的供給業者のいずれかによって受注製作され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば、両方とも参照により本明細書に組み入れられるCarruthersetalColdSpringHarborSympQuantBiol47411418およびAdamsetalJAmChemSoc105661において説明されている周知の技術によっても合成され得る。その場合、相補鎖を合成し、適切な条件下でそれらの鎖を一緒にアニールすることによるか、または適切なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応において相補鎖を作製することによって、二本鎖DNA断片を得ることができる。本明細書において具体的に説明しない2DVCAM1変異体ポリペプチドは、変異体ライブラリーを作製するための公知の方法を用い、続いて、例えば、実施例6または実施例7のアッセイ方法を用いてVLA4結合活性を検出するためのスクリーニングを行うことによって、容易に同定することができる。変異体ライブラリーを作製するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、変異誘発法および定向進化法をポリヌクレオチドまたは本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかなどに容易に適用して、本明細書において説明する方法を用いて発現させ、スクリーニングし、かつ分析できる変異体ライブラリーを作製することができる。変異誘発法および定向進化法は、当技術分野において周知である。例えば、LingetalApproachestoDNAmutagenesisanoverviewAnalBiochem25415778DaleetalOligonucleotidedirectedrandommutagenesisusingthephosphorothioatemethodMethodsMolBiol5736974SmithInvitromutagenesisAnnRevGenet19423462BotsteinetalStrategiesandapplicationsofinvitromutagenesisScience22911931201CarterSitedirectedmutagenesisBiochemJ23717KrameretalPointMismatchRepairCell38879887WellsetalCassettemutagenesisanefficientmethodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsitesGene34315323MinshulletalProteinevolutionbymolecularbreedingCurrentOpinioninChemicalBiology3284290ChristiansetalDirectedevolutionofthymidinekinaseforAZTphosphorylationusingDNAfamilyshufflingNatureBiotechnology17259264CramerietalDNAshufflingofafamilyofgenesfromdiversespeciesacceleratesdirectedevolutionNature391288291CramerietalMolecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybyDNAshufflingNatureBiotechnology15436438ZhangetalDirectedevolutionofaneffectivefucosidasefromagalactosidasebyDNAshufflingandscreeningProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA944544509CramerietalImprovedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingDNAshufflingNatureBiotechnology14315319StemmerRapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshufflingNature370389391StemmerDNAshufflingbyrandomfragmentationandreassemblyInvitrorecombinationformolecularevolutionProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA911074710751WO9522625WO970078WO9735966WO9827230WO0042651およびWO0175767を参照されたい。これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。ベクターの使用、プロモーター、および他の多くの関連する題目を含む、本明細書において有用な分子生物学的技術を説明する一般的教科書には、BergerandKimmelGuidetoMolecularCloningTechniquesMethodsinEnzymologyvol152AcademicPressIncSanDiegoCASambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualVol13ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork2001、およびCurrentProtocolsinMolecularBiologyFMAusubeletalEdsCurrentProtocolsJohnWileySonsIncが含まれ、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Qβレプリカーゼ増幅、およびRNAポリメラーゼを介した他の技術を含むインビトロの増幅法を通じて当業者に指導するのに十分なプロトコールの例は、Berger、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullisetal米国特許第4683202号PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressIncSanDiegoCAArnheimandLevinsonCEN3647TheJournalofNIHResearch38194KwohetalProcNatlAcadSciUSA861173GuatellietalProcNatlAcadSciUSA871874LomelletalJClinChem351826LandegrenetalScience24110771080VanBrunti8291294WuandWallaceGene4560BarringeretalGene89117、およびSooknananandMalekBiotechnology13563564において見出され、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、参照により本明細書に組み入れられるWallaceetal米国特許第5426039号において説明されている。PCRによって大型核酸を増幅するための改良された方法は、参照により本明細書に組み入れられるChengetalNature369684685において要約されている。当業者は、参照により本明細書に組み入れられるAusubel、Sambrook、およびBergerの前記文献において説明されている通りに逆転写酵素およびポリメラーゼを用いることにより、本質的に任意のRNAを、制限消化、PCR伸張、および配列決定に適した二重鎖DNAに変換できることを容易に理解するであろう。ベクター、プロモーター、および発現システム本発明はまた、前述の本発明の2DVCAM1変異体をコードするポリヌクレオチドの内の1つまたは複数を含む組換え構築物も含む。構築物または核酸構築物という用語は、本明細書において、天然の遺伝子から単離されているか、または改変しなければ自然には存在しないと思われる様式で核酸のセグメントを含むように改変された、一重鎖または二重鎖いずれかの核酸を意味する。核酸構築物という用語は、核酸構築物が、本発明のポリヌクレオチド配列の発現に必要とされる制御配列を含む場合、発現カセットという用語と同義である。特定の態様において、本発明はまた、プロモーターに機能的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。発現ベクターという用語は、本明細書において、転写を実現する付加的なセグメントに機能的に連結された本発明のポリペプチドをコードするセグメントを含む、直線状または環状のDNA分子を意味する。本明細書において使用される場合、発現という用語は、限定されるわけではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。本発明の核酸構築物は、典型的には、プロモーターなどの制御配列を含む。制御配列という用語は、本明細書において、本発明の2DVCAM1変異体の発現のために必要または有利である構成要素すべてを意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に固有のものまたは外来のものでよい。このような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。最低でも、制御配列には、プロモーターならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード配列との連結を容易にする、特異的制限部位を導入する付加的な配列と共に提供されてよい。機能的に連結されるという用語は、本明細書において、制御配列がポリペプチドの発現を指示するように、制御配列がDNA配列のコード配列に関連する位置に適切に配置されている立体配置を意味する。本明細書において使用される場合、コード配列という用語は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に指定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、ATG開始コドンで通常始まるオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、典型的には、DNA配列、cDNA配列、およびまたは組換えポリヌクレオチド配列を含む。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において周知である様々な発現ベクターのいずれか1つに組み込むことができる。当技術分野において公知である原核細胞発現ベクターなどの、原核宿主細胞に適合する発現ベクターが使用され得る。これらには、例えば、BLUESCRIPTベクター、T7発現ベクター、pETベクター、ならびにクローニングおよび発現用の多機能性大腸菌ベクターなどが含まれる。あるいは、当技術分野において公知である真核生物発現ベクターなどの、真核宿主細胞に適合する発現ベクターが使用され得る。これらには、例えば、pCMVベクター、pIRESベクター、pSG5ベクター、pCDNA31、pCDNA3、および遍在性クロマチンオープニングエレメント発現ベクターなどが含まれる。適切なベクターには、染色体配列、非染色体配列、および合成DNA配列が含まれる。例示的なベクターには、細菌人工染色体、酵母人工染色体、例えば細菌プラスミドまたは酵母プラスミドなどのプラスミド、コスミド、ファージ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスDNA由来のベクター、ならびにプラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクターが含まれる。遺伝物質を細胞中に伝達し、かつ複製が望ましい場合には、関連する宿主において複製可能かつ生存可能である任意のベクターを使用することができる。発現ベクター中に組み込まれる場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えばT5プロモーターなどの、mRNA合成を指示するための適切な転写制御配列に機能的に連結される。原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが公知であり、かつ本発明のいくつかの態様において使用できる他のプロモーターには、SV40プロモーター、大腸菌lacプロモーターまたはtrpプロモーター、ファージλPLプロモーター、tacプロモーター、およびT7プロモーターなどが含まれる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位およびPinIIなどの転写ターミネーターを任意で含む。また、ベクターは、例えばエンハンサーなどの発現を増幅するための適切な配列も任意で含む。さらに、本発明の発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供するために1種または複数種の選択マーカー遺伝子を任意で含む。適切なマーカー遺伝子には、抗生物質スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する耐性をコードするもの、ストレプトマイシン耐性をコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン耐性またはジェネテシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシン耐性をコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。その他の選択マーカー遺伝子には、真核細胞培養の場合のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌の場合のテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性が含まれる。本発明のベクターを使用して、適切な宿主を形質転換して、本明細書において説明する2DVCAM1変異体を宿主が発現するのを可能にすることができる。適切な発現宿主の例には、発現宿主という題のセクションにおいて下記に説明するものが含まれる。本発明の2DVCAM1変異体をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、細胞の所望の細胞区画、膜、もしくは細胞小器官にポリペプチド発現を導くため、またはポリペプチド分泌を細胞周辺腔もしくは細胞培養培地中へと方向付けるために、分泌配列局在化配列をコードする核酸にインフレームで融合させることもできる。このような配列は当業者に公知であり、分泌リーダーペプチド、細胞小器官標的配列保留シグナル、ミトコンドリア移行配列、葉緑体移行配列、および膜局在化アンカー配列などが含まれる。発現宿主本発明はまた、本発明のベクターまたは構築物を用いて形質導入される操作された宿主細胞、ならびに組換え技術によって本発明のポリペプチドを作製する方法も提供する。本明細書において使用される場合、宿主細胞という用語は、本発明の核酸構築物による形質転換を受け入れることができる任意の細胞型を意味する。したがって、本発明は、本明細書において前述した本発明の任意のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞を含む。典型的には、ポリヌクレオチドは、宿主細胞のポリヌクレオチドの発現を実現する1つまたは複数のプロモーターおよびまたはエンハンサーに機能的に連結されている。単離された宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、もしくは植物細胞などの真核細胞でよく、または宿主細胞は、細菌細胞、およびストレプトマイセス属などなどの原核細胞でもよい。宿主細胞中への核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストランを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃もしくはワクチン銃、インジェクション、または他の一般的な技術によって実施することができるBasicMethodsinMolecularBiologyを参照されたい。宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力について任意で選択される。タンパク質のこのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるわけではない。タンパク質のプレ型またはプレプロ型を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディング、およびまたは機能のために重要である場合がある。大腸菌細胞、バチルス属種細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞など異なる宿主細胞、例えば、CHO、HeLa、BHK、MDCK、HEK293、およびWI38などは、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。組換えタンパク質の長期的な高収率の作製のために、安定な発現を使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質導入される。ベクターの導入後、細胞は、選択培地に移す前に、強化培地中で1~2日間、増殖させてよい。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を成功裡に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。例えば、安定に形質転換された細胞の耐性集団を、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からコードされるタンパク質を発現および回収するのに適した条件下で任意で培養される。組換え細胞によって産生されたポリペプチドは、使用される配列およびまたはベクターに応じて、分泌されるか、膜に結合するか、または細胞内に含まれ得る。当業者には理解される通り、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜もしくは真核細胞膜を通って成熟ポリペプチドが分泌されるように指示するシグナル配列を含むように設計することができる。2DVCAM1変異体の作製および回収別の態様において、本発明は、本発明の2DVCAM1変異体を作製する方法を提供し、この方法は、コードされるポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を培養する段階および培地から、または形質転換され培養された宿主細胞から、ポリペプチドを回収する段階を含む。2DVCAM1変異体の作製および回収に使用される宿主細胞は、典型的には、植物または動物などの高等生物と比べて、単離された宿主細胞である。適切な宿主株に形質導入し、適切な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、選択されたプロモーターを、例えば温度変化または化学的誘導などの適切な手段によって誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。典型的には、細胞は遠心分離によって採取され、物理的手段または化学的手段によって破壊され、得られた粗製の抽出物が、さらなる精製のために確保される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または当業者に周知である他の方法を含む任意の簡便な方法によって破壊することができる。上述した通り、細菌、植物、動物、および古細菌由来の細胞を含む多種類の細胞の培養および作製について、多くの参考文献が入手可能である。これらの参考文献には、Sambrook、Ausubel、およびBerger、ならびにFreshneyCultureofAnimalCellsaManualofBasicTechniquethirdeditionWileyLissNewYorkDoyleandGriffithsMammalianCellCultureEssentialTechniquesJohnWileyandSonsNYHumasonAnimalTissueTechniquesfourtheditionWHFreemanandCompanyおよびRicciardellietalInvitroCellDevBiol2510161024が含まれ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。植物細胞の培養および再生を説明する参考文献には、PayneetalPlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWileySonsIncNewYorkNYGamborgandPhillipsPlantCellTissueandOrganCultureFundamentalMethodsSpringerLabManualSpringerVerlagJonesEdPlantGeneTransferandExpressionProtocolsHumanaPressTotowaNewJersey、およびPlantMolecularBiologyRRDCroyEdBiosScientificPublishersOxfordUKISBN0121983706が含まれ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。一般的な細胞培養用培地は、参照により本明細書に組み入れられるAtlasandParksTheHandbookofMicrobiologicalMediaCRCPressBocaRatonFLにおいて説明されている。細胞培養についてのその他の情報は、両方とも参照により本明細書に組み入れられる、SigmaAdrichIncによるLifeScienceResearchCellCultureCatalogueならびにSigmaAldrichIncによるThePlantCultureCatalogueおよび補遺などの入手可能な商用文献において見出される。本発明の2DVCAM1変異体は、例えば、硫安沈殿または溶媒沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって、組換え細胞培養物から回収単離し、任意で精製してよい。適切なタンパク質精製方法は、SandanaBioseparationofProteinsAcademicPressIncBollagetalProteinMethods2ndEditionWileyLissNYWalkerTheProteinProtocolsHandbookHumanaPressNJHarrisandAngalProteinPurificationApplicationsAPracticalApproachIRLPressatOxfordOxfordEnglandHarrisandAngalProteinPurificationMethodsAPracticalApproachIRLPressatOxfordOxfordEnglandScopesProteinPurificationPrinciplesandPractice3rdEditionSpringerVerlagNYJansonandRydenProteinPurificationPrinciplesHighResolutionMethodsandApplicationsSecondEditionWileyVCHNYおよびWalkerProteinProtocolsonCDROMHumanaPressNJにおいて説明されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、精製段階は、アルギニンを含む溶離液混合物を用いたクロマトグラフィー法による精製を含む。細菌に産生させた2DVCAM1変異体は、封入体を形成する場合があり、これは活性ポリペプチドを生成するためにさらなる加工段階を必要とする。このさらなる加工は、封入体の単離および可溶化、ポリペプチドのアンフォールディング、次いで、生物学的に活性である正しい三次構造へのポリペプチドのリフォールディングを伴う場合がある。本発明は、本発明のポリペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、封入体としてのポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を培養する段階形質転換され培養された宿主細胞から、コードされるポリペプチドを含む封入体を回収する段階ポリペプチドを含む回収された封入体を、可溶化剤を用いて可溶化する段階可溶化されたポリペプチドを精製する段階ポリペプチドをリフォールディングさせる段階およびリフォールディングされたポリペプチドを精製する段階を含む。封入体は、典型的には、尿素などの溶媒中で可溶化される。リフォールディングは、例えば、希釈した尿素およびグルタチオンの溶液中で、可溶化されたポリペプチドをインキュベートすることによって達成することができる。ポリペプチド変異体結合体本発明は、少なくとも1つの非ポリペプチド結合成分に共有結合している本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む、ポリペプチド変異体結合体を提供する。典型的には、ポリペプチド変異体結合体は、1つまたは複数の非ポリペプチド結合成分に共有結合している本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む。本明細書において使用される場合、非ポリペプチド結合成分という用語は、非ポリペプチドポリマー、糖成分、または非ポリマー親油性成分を意味する。非ポリペプチドポリマーという用語は、本明細書において、ペプチドでもポリペプチドでもタンパク質でもない、天然ポリマーまたは合成ポリマーでよい水溶性ポリマーを意味する。本明細書において使用される場合、糖成分という用語は、Nグリコシル化プロセスまたはOグリコシル化プロセスなどのインビボまたはインビトロのグリコシル化プロセスによって結合される炭水化物分子を意味する。典型的には、非ポリペプチド結合成分は、例えば、インビボでの血清半減期またはインビボでの機能的半減期、安定性、および免疫原性など2DVCAM1変異体ポリペプチドの固有の特性を変化させるために選択される。本明細書において使用される場合、インビボでの血清半減期という用語は、関心対象の化合物の50が、ラット、マウス、ウサギ、またはサルなどの非ヒト哺乳動物の血流中を循環するようになるまでの時間を意味する。血清という用語は、本明細書において、通常の意味、すなわち、フィブリノーゲンおよび他の凝固因子を含まない血漿を意味するために使用される。インビボでの機能的半減期という用語は、本明細書において、関心対象の化合物の生物活性の50が体内もしくは標的器官において依然として存在する時間、または関心対象の化合物の活性が初期値の50となるまでの時間を意味する。インビボでの機能的半減期は、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、またはサルなどの非ヒト哺乳動物において測定してもよい。インビボでの血清半減期およびインビボでの機能的半減期の両方を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体を非ヒト哺乳動物に投与し、既定の時間間隔で血液試料を採取してよい。例えば、抗VCAM1抗体を用いたELISAアッセイ法によって、または可溶性VLA4タンパク質もしくは不溶性VLA4タンパク質の調製物を用いて分析することによって、血液試料を2DVCAM1変異体レベルについて解析することができる。半減期は、時間に対する2DVCAM1変異体濃度のプロットから決定することができる。典型的には、本発明の2DVCAM1変異体結合体は、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドと比べて、より長いインビボでの機能的半減期およびまたはより長い血清半減期を示す。これらの2DVCAM1変異体結合体は、2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合された非ポリペプチドポリマーまたは糖成分を通常有する。例えば、各非ポリペプチドポリマーおよびまたは糖成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合されてよい。典型的には、非ポリペプチド結合成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に2DVCAM1変異体ポリペプチド中の結合基に結合されている。より長いという用語は、インビボでの機能的半減期または血清半減期に関連して使用される場合、2DVCAM1変異体結合体の関連する半減期が、類似条件下で測定された場合に、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその構成要素などの参照分子と比べて統計学的に有意に長いことを示すために本明細書において使用される。したがって、2DVCAM1変異体結合体には、インビボでの機能的半減期または血清半減期が、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドの半減期よりも長いものが含まれる。2DVCAM1変異体結合体には、結合体のインビボでの機能的半減期と対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドの半減期との比が、少なくとも125、少なくとも15、少なくとも175、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8であるものが含まれる。さらなる局面において、2DVCAM1変異体結合体は、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドよりも大きい生物学的利用能を示す場合がある。生物学的利用能の指標は、皮下投与された場合の曲線下面積パラメーターまたはAUCscによって提供される。AUCscまたは皮下投与された場合の曲線下面積という用語は、通常の意味で使用されて、2DVCAM1変異体が実験動物に皮下投与された場合、血清中活性対時間曲線下の面積を意味する。実験の活性時点を決定した後、AUCscは、GraphPadPrism301などのコンピュータープログラムによって簡便に計算することができる。AUCscに関連して使用される場合のより大きいという用語は、皮下投与された場合の2DVCAM1変異体結合体の曲線下面積が、類似条件下で測定された場合に、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドと比べて統計学的に有意に大きいことを示すために使用される。異なる分子を直接比較するために、典型的には、AUCsc値は正規化されるべきであり、例えば、AUCsc投与用量として表される。例示的な2DVCAM1変異体結合体には、結合体のAUCscと対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドのAUCscの比が、同じ種の実験動物に類似条件下で投与された場合、少なくとも125、少なくとも、15、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、または少なくとも20であるものが含まれる。本発明のある種の2DVCAM1変異体結合体は、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドよりも、投与後のより長い期間後に、より大きい活性を示す。これらの2DVCAM1変異体結合体は、対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドのTmaxよりも大きいTmaxを示す。本明細書において使用される場合、Tmaxという用語は、血清中活性対時間曲線において、最も高い血清中活性が観察される時点を意味する。このような2DVCAM1変異体結合体のTmaxと対応する非結合型2DVCAM1変異体ポリペプチドのTmaxとの比は、皮下投与された場合、特に、ラットまたはサルなどの実験動物において皮下投与された場合、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、少なくとも2、少なくとも25、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10である。結合成分は、直接的にまたはリンカーを介して間接的にポリペプチドに共有結合されてよい。適切なリンカー成分には、ペプチド、非ペプチド性の非ポリマー脂肪族成分、およびオリゴヌクレオチドなどが含まれる。適切なリンカーには、2DVCAM1変異体ポリペプチドという題のセクションで本明細書において前述したものが含まれる。いくつかの態様において、リンカーペプチドが、2DVCAM1変異体のN末端に共有結合され、非ポリペプチド結合成分が、結合されたリンカーペプチドのN末端に共有結合される。いくつかの態様において、リンカーペプチドが、2DVCAM1変異体のN末端またはC末端に結合され、非ポリペプチド結合成分が、リンカーペプチド中の結合基に共有結合される。より詳細に下記でも考察するグリコシル化部位もまた、リンカーペプチド配列中に組み入れられてよい。非ポリペプチド結合成分を結合するための例示的な結合基を表2に後述する。表2有用な結合基および対応する非ポリペプチド結合成分の例各刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の実践において使用するのに適したポリマーは、分枝状または直鎖状でよく、典型的には、約300~約100000ダルトンの範囲、典型的には、約1000ダルトン~約80000ダルトン、または約2000~約60000もしくは50000もしくは40000もしくは30000もしくは20000、もしくは10000ダルトン、およびいくつかの態様において、約1000ダルトン~約5000ダルトンの平均分子量を有する。より具体的には、ポリマー分子は、約2000ダルトン、5000ダルトン、10000ダルトン、12000ダルトン、15000ダルトン、20000ダルトン、30000ダルトン、40000ダルトン、50000ダルトン、60000ダルトン、または80000ダルトンの平均分子量を典型的に有する。ポリマーの分子量を説明する文脈において使用される場合、約という用語は、概算の平均分子量を示し、所与のポリマー調製物にはある程度の分子量分布が通常あると考えられることを示す。本発明の結合体で使用するのに適した例示的なポリマーには、ポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、リンカー基によって相互に連結された2つまたはそれ以上のポリエチレングリコール鎖を有する分枝状ポリエチレングリコールなどでよいポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシラート、ポリ、ポリエチレンcoマレイン酸無水物、デキストラン、および他の同様のポリマーが含まれる。ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは、一般に生体適合性、非毒性、非抗原性、非免疫原性、水溶性であり、生物から容易に排泄されるため、本発明の結合体において典型的に使用される。特にポリエチレングリコールは、多糖類などの他の化合物に架橋できる反応性基がごく小数であるため、好都合である。例えばモノメトキシポリエチレングリコールなどの単官能性PEGは、本発明の結合体において使用するための適切なポリマーの一例である。ポリエチレングリコールなどのヒドロキシル化ポリマーの2DVCAM1変異体ポリペプチドへの共有結合をもたらすために、ポリマー分子の少なくとも1つの末端ヒドロキシル基は、典型的には、活性化型で提供される、すなわち、2DVCAM1変異体ポリペプチド中の標的結合基と反応する官能基で誘導体化されている。例示的な反応性官能基には、第一級アミノ基、ヒドラジド、チオール、スクシナート、スクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルスクシンアミド、スクシンイミジルプロプリオナート、スクシンイミジルカルボキシメチラート、ベンゾトリアゾールカルボナート、Nヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ニトロフェニルカルボナート、マレイミド、およびトレシラートが含まれる。本発明の2DVCAM1結合体は、1つの二官能性PEGに共有結合している2つの本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含んでよい。本明細書において使用される場合、二官能性pegという用語は、2DVCAM1変異体ポリペプチド中の標的結合基と反応する官能基2つで誘導体化されているポリエチレングリコール成分を意味する。適切に活性化されたポリマー分子が、例えば、NektarTherapeuticsIncSanFranciscoCA、NOFCorporationJapan、およびDowPharmaMidlandMIから市販されている。あるいは、参照により本明細書に組み入れられるWO9013540において開示されているものなどの当技術分野において公知である従来の方法によって、ポリマー分子を活性化することもできる。本発明の2DVCAM1変異体結合体において使用するのに適している、活性化された直線状および分枝状の単官能性および二官能性のポリマー分子の具体的な例は、Nektar20052006AdvancedPegylationCatalogueおよびNOFDDSCatalogueVer12において説明されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み入れられる。これらの活性化ポリエチレングリコールポリマーの具体的な例には、Nektar20052006AdvancedPegylationCatalogueにおいて開示されている、次の直線状PEGNHSPEG、およびNORPEG、BTCPEG、EPOXPEG、NCOPEG、NPCPEG、CDIPEG、ALDPEG、TRESPEG、VSPEG、IODOPEG、およびMALPEG、二官能性PEG、例えば、MALPEGMAL、NHSPEGNHS、およびSSPEGSSなど、ならびにmPEG2NHSなどの分枝PEG、ならびにNOFDDSCatalogueVer12、米国特許第5932462号および同第5643575号において開示されているものが含まれる。本発明の2DVCAM1変異体結合体において使用するのに適している、活性化された直線状および分枝状のポリマー分子の他の例は、NOFCorp2005CataloguePEGDerivativesPhospholipidsandDrugDeliveryMaterialsforPharmaceuticalProductsandFormulationsおよびNOFCorpCatalogueVer12DDSにおいて説明されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み入れられる。活性化ポリエチレングリコールポリマーのその他の例には、NOFCorp2005CataloguePEGDerivativesPhospholipidsandDrugDeliveryMaterialsforPharmaceuticalProductsandFormulationsにおいてすべて開示されている、次のPEGNHSPEGCSnCOCH2CH2COONHSSUNBRIGHTMEGC20HSおよびSUNBRIGHTMEGC10TSnCOCH2CH2CH2COONHSSUNBRIGHTME020ASnCH2COONHSSUNBRIGHTME050HSn5COONHSアルデヒドPEGALnCH2CH2CHOマレイミドPEGMAn3NHCO2分枝PEGマレイミドMA分枝PEGNHSグルタリルGS2分枝PEGNHSカルボキシメチルHS分枝PEGアルデヒドAL2、ならびにNOFCorpCatalogueVer12DDS、米国特許第6875841号ならびに米国特許出願公開第20050058620号および同第20050288490号において開示されているものが含まれる。以下の公報は、本発明の2DVCAM1変異体結合体に関連して使用するのに適しているその他の有用なポリマーおよびまたはPEG化化学的部分を開示している米国特許第5824778号、米国特許第5476653号、米国特許第6875841号、米国特許第5872191号、米国特許第5767284号、EP0839850、WO9732607、EP229108、EP402378、米国特許第4902502号、米国特許第5281698号、米国特許第5122614号、米国特許第5219564号、WO9216555、WO9404193、WO9414758、WO9417039、WO9418247、WO9428024、WO9500162、WO9511924、WO9513090、WO9533490、WO9600080、WO9718832、WO9841562、WO9848837、WO9932134、WO9932139、WO9932140、WO9640791、WO9832466、WO9506058、EP439508、WO9703106、WO9621469、WO9513312、EP921131、米国特許第5736625号、WO9805363、EP809996、米国特許第5629384号、WO9641813、WO9607670、米国特許第5473034号、米国特許第5516673号、EP605963、US5382657、EP510356、EP400472、EP183503、およびEP154316。システイン残基への結合のために特に好ましい活性化PEGポリマーの具体的な例には、次の直線状PEGビニルスルホンPEG、好ましくはビニルスルホンmPEG9VSmPEGマレイミドPEG、好ましくはマレイミドmPEG、およびオルトピリジルジスルフィドPEG、好ましくはオルトピリジルジスルフィドmPEGが含まれる。2DVCAM1変異体ポリペプチドと活性化ポリマー分子の結合は、例えば、次の参考文献において説明されている任意の従来の方法に従って行われるHarrisandZalipskyedsPolyChemistryandBiologicalApplicationsAZCWashingtonRFTaylorProteinImmobilisationFundamentalsandApplicationsMarcelDekkerNYSSWongChemistryofProteinConjugationandCrosslinkingCRCPressBocaRatonGTHermansonetalImmobilizedAffinityLigandTechniquesAcademicPressNY。活性化ポリエチレングリコールを2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合するプロセスは、本明細書においてPEG化と呼ばれる。2DVCAM1変異体ポリペプチドへのポリエチレングリコール成分の共有結合は、適切な活性化ポリエチレングリコールおよび反応条件を選択することによって、特定の結合部位を標的とすることができる。これらは当技術分野において周知であり、下記により詳細に説明する。さらに、結合は、参照により本明細書に組み入れられるWO9955377において説明されているものなどの公知の方法を用いて、一段階で、または段階的様式で達成することができる。システイン残基のPEG化の場合、ポリペプチドは通常、PEG化の前にジチオトレイトールなどの還元剤で処理される。その後、還元剤は、脱塩などの任意の従来の方法によって除去される。典型的には、システイン残基へのPEGの結合は、最長で約16時間の期間中に、4°C~25°Cの様々な温度で、pH6~9の適切な緩衝液中で起こる。リジンのPEG化は、活性エステルで活性化されたPEG成分エステルおよびPEGスクシンイミジルプロピオナートまたはPEGスクシンイミジルブタノアートなどのエステルなどをしばしば使用する。ほぼ等モル量のPEGおよびタンパク質が混合された場合、室温、pH8~95において、1つまたは複数のPEG成分が30分以内にタンパク質に結合され得る。通常、PEGとタンパク質アミノ基のモル比は11~51で十分である。pHを上昇させると反応速度が速くなるのに対し、pHを低下させると反応速度が遅くなる。これらの反応性が高い活性エステルは、生理学的pHで結合することができるが、反応性が劣る誘導体は、より高いpHを典型的には必要とする。また、不安定なタンパク質が使用されている場合、低温を使用してもよい。低温条件下では、より長い反応時間が使用され得る。2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端アミノ基へのPEG成分の共有結合は、本明細書においてN末端PEG化と呼ばれる。N末端PEG化は、N末端アミノ酸のαアミノ基のpKa値とリジンのεアミノ基のpKa値の差によって促進される。N末端アミノ基のPEG化は、アミンに対する選択性がより高く、したがって、ヒスチジンのイミダゾール基と反応する可能性がより低いPEGアルデヒドをしばしば使用しさらに、リジン結合のために使用されるPEG試薬もまた、N末端アミンの結合のために使用され得る。N末端アミノ基へのPEGアルデヒドの結合は、典型的には、約4°C~25°Cの様々な温度で、一晩の間に、pH約50の適切な緩衝液中で起こる。有用なN末端PEG化の方法および化学的性質は、両方とも参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5985265号および米国特許第6077939号でも説明されている。場合によっては、N末端をPEG化された本発明の2DVCAM1変異体結合体は、2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端アミノ酸のαアミノ基に直接結合されたPEGを有する。場合によっては、PEGは、ポリペプチドのN末端にリンカーペプチドを介して間接的に結合される。すなわち、リンカーペプチドが2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端に結合され、次いで、PEGが、リンカーペプチドのN末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合される。適切なリンカーペプチドは、前述の通りである。PEGは、直鎖状または分枝状でよく、典型的には、約20kdal~約80kdal、例えば約30kdal~約60kdal、例えば約50kdalの平均分子量を有する。2DVCAM1変異体結合体は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチド中のリジン残基に結合された1つまたは複数のポリエチレングリコール成分を有してよい。場合によっては、少なくとも1つまたは複数のPEG成分が、次のリジン結合基の内の1つまたは複数の位置で2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合されるK2、K46、K79、K82、K93、K107、K112、K130、K136、K147、K152、K167、2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端アミノ酸残基のαアミノ基、およびそれらの2つまたはそれ以上の任意の組合せ。また、PEG成分は、置換によって導入される次の結合基の内の1つまたは複数の位置で2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合されてもよいR10K、R36K、R78K、R123K、R146K、R172K、R187K、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の任意の組合せ。システインペグ化方法が利用される場合、本発明の2DVCAM1変異体結合体は、例えば、C23、C28、C71、C75、C113、C171およびそれらの2種またはそれ以上の任意の組合せなどのシステイン結合基の位置において2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合されたPEG成分を含んでよい。PEG成分は、前述の結合基の任意の組合せ、ならびに本明細書において説明する任意の導入された結合基に結合されてよい。場合によっては、利用可能なポリマー結合基の内のできるだけ多数をポリマーと結合させることが望ましい場合がある。これは、2DVCAM1変異体ポリペプチドに対してモル過剰のポリマーを使用することによって実現することができる。このようなモル過剰は、約1001または2001~約10001までの活性化ポリマー対2DVCAM1変異体ポリペプチドのモル比を用いることによって実現することができる。場合によっては、モル比は、約501、101、または51までなど、いくらか低くてもよい。等モル比の活性化ポリマーおよび2DVCAM1変異体ポリペプチドもまた、使用してよい。前述した通り、本発明の2DVCAM1変異体結合体には、2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合された1つまたは複数の糖成分を有する結合体も含まれる。これらの結合体は、本明細書においてグリコシル化2DVCAM1変異体ポリペプチドとも呼ばれる。2DVCAM1変異体ポリペプチド上のグリコシル化部位は、典型的には、Nグリコシル化部位またはOグリコシル化部位のいずれかである。本明細書において使用される場合、Nグリコシル化部位という用語は、配列NXSTCを意味し、式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、STCは、セリン、トレオニン、またはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニン、および最も好ましくはトレオニンである。Oグリコシル化部位は、本明細書において、セリン残基またはトレオニン残基のOH基を意味する。2DVCAM1変異体ポリペプチドは、インビトロのプロセスまたはインビボのプロセスのいずれかによってグリコシル化されてよい。使用される結合方法に応じて、炭水化物は、次の結合基に結合され得る参照により本明細書に組み入れられるLundbladandNoyesChemicalReagentsforProteinModificationCRCPressIncBocaRatonFLにおいて説明されている通り、アルギニンおよびヒスチジン、遊離カルボキシル基、システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、セリン、トレオニン、チロシン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、フェニルアラニンもしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、またはグルタミンのアミド基。このような基は、本発明のポリペプチドにおいて導入およびまたは除去され得る。インビトロ結合の適切な方法は、いずれも参照により本明細書に組み入れられるWO8705330およびAplinetalCRCCritRevBiochempp2593061981において説明されている。また、タンパク質が結合したGln残基およびペプチドが結合したGln残基への糖成分のインビトロ結合は、例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるSatoetal1996Biochemistry351307213080およびEP725145によって説明されている通り、グルタミン転移酵素を用いて実施することもできる。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、1つまたは複数のNグリコシル化部位またはOグリコシル化部位を有する2DVCAM1変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをグリコシル化用真核性発現宿主細胞中に導入することによって、インビボでグリコシル化することができる。グリコシル化用真核性発現宿主細胞は、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または当技術分野において公知である他の任意のグリコシル化用真核性発現宿主細胞より選択することができる。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドへの結合のために適した非ポリペプチド親油性成分には、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはステロイド、リン脂質などの天然化合物、あるいは、直鎖状または分枝状の脂肪族、アリール、アルカリル酸、アルコール、およびアミンなどの合成化合物が含まれる。非ポリペプチド親油性成分への結合は、次の例示的な結合部位のいずれか1つの位置で起こり得る2DVCAM1変異体ポリペプチドのN末端もしくはC末端、アミノ酸残基Ser、Thr、もしくはTyrのヒドロキシル基、Lysのεアミノ基、CysのSH基、またはAspおよびGluのカルボキシル基。2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび非ポリペプチド親油性成分は、いずれも参照により本明細書に組み入れられるBodanszkyPeptideSynthesisJohnWileyNewYorkおよびWO9612505において説明されているものなどの当技術分野において公知の方法に従って、直接的にまたはリンカーを介して間接的に互いに結合させることができる。非ポリペプチド結合成分は、直接的にまたはリンカー成分を介して間接的に本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合され得る。例えば、非ポリペプチドポリマーは、いずれも参照により本明細書に組み入れられるAbuchowskietalJBiolChem25235783581およびUS4179337において説明されている通りに塩化シアヌルリンカーを介して2DVCAM1変異体ポリペプチドに結合され得る。他の適切なリンカーは当技術分野において周知である。薬学的組成物本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤などの担体または賦形剤と共に、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたは本明細書において前述したそのタンパク質融合物もしくは結合体を含む組成物を提供する。薬学的に許容される適切な賦形剤には、加工剤ならびに薬物送達の調整剤および促進剤、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、デキストロース、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せが含まれる。薬学的に許容される他の適切な賦形剤は、RemingtonsPharmaceuticalSciences18theditionARGennaroEdMackPubCoNewJersey、PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteinsSFrokjaerandLHovgaardEdsTaylorandFrancis、およびHandbookofPharmaceuticalExcipients3rdeditionAKibbeEdPharmaceuticalPressにおいて説明されており、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはそのタンパク質融合物もしくは結合体を含む薬学的組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、または乳剤を含む、意図された投与方法に適した任意の形態で存在してよい。本発明の実践において使用するために企図される液体担体には、例えば、水、生理食塩水、薬学的に許容される有機溶媒、ならびに薬学的に許容される油および脂肪など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の混合物が含まれる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、栄養素、緩衝剤、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、粘度調節剤、および安定化剤など薬学的に許容される他の適切な添加剤を含んでよい。適切な有機溶媒には、例えば、エタノールなどの一価アルコール、およびグリコールなどの多価アルコールが含まれる。適切な油には、例えば、ダイズ油、ヤシ油、オリーブ油、サフラワー油、および綿実油などが含まれる。非経口投与の場合、担体は、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルでもよい。本発明の組成物はまた、微粒子、マイクロカプセル、およびリポソーム封入物など、ならびにそれらの任意の2種またはそれ以上の組合せの形態で存在してよい。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにそのタンパク質融合物および結合体は、従来の薬学的に許容される無毒性の担体、補助剤、およびビヒクルを所望に応じて含む単位用量製剤として、経口的に、非経口的に、舌下に、吸入スプレーによって、直腸に、または局所的に投与され得る。また、局所的投与は、経皮貼付剤またはイオン導入装置などの経皮投与の使用を伴ってもよい。非経口という用語は、本明細書において使用される場合、皮下注射、静脈内投与、筋肉内投与、胸骨内注射、経皮もしくは経粘膜投与、または輸注技術を含む。注射可能な製剤は、標準的な方法および当技術分野において公知の材料、例えば、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁化剤などを用いて調製することができる。また、無菌注射製剤は、溶媒、例えば、13プロパンジオールに溶かした液剤として存在してもよい。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の例は、水、リンガー溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油も、溶媒または懸濁媒体として従来使用される。この目的には、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も注射製剤中で使用される。経口投与用の固形剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれ得る。このような固形剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなど少なくとも1種の不活性な希釈剤と混合されてよい。このような剤形はまた、不活性な希釈剤以外のその他の物質、例えば、滑沢剤なども含んでよい。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、これらの剤形はまた、緩衝剤も含んでよい。錠剤および丸剤は、さらに腸溶コーティングを用いて調製することができる。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはそのタンパク質融合物もしくは結合体はまた、リポソームの形態で投与されてもよい。当技術分野において公知である通り、リポソームは一般に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体中に分散されている一重膜または多重膜の水和された液晶によって形成されている。リポソームを形成できる任意の非毒性で生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質を使用することができる。脂質型の本発明の組成物は、本発明の化合物のほかに、安定化剤、保存剤、および賦形剤などを含んでよい。典型的な脂質は、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリンである。リポソームを形成させる方法は当技術分野において公知であり、参照により本明細書に組み入れられるPrescottEdMethodsinCellBiologyVolumeXIVAcademicPressNewYorkNWp33etseqにおいて説明されている。2DVCAM1変異体ポリペプチド、その結合体および組成物を使用する方法本発明は、炎症のメカニズムに関係があるとされているVLA4とVCAM1の相互作用を阻害するために、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにその結合体および薬学的組成物を使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体もしくは薬学的組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象の炎症性疾患を治療する方法を提供する。治療は、本明細書において説明するものを含む炎症性疾患の治療的処置または予防的処置のいずれかでよい。別の態様において、本発明は、炎症性疾患の治療用の医薬を製造するための、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは結合体の使用を提供する。α4インテグリンに対するアンタゴニストは、炎症部位へのリンパ球および単球の動員を阻害するため、炎症性疾患および自己免疫の多種多様の実験モデルを抑制する際に有効であることが報告されている715723RansohoffRMetalNatRevImmunol3569581SmolenJSetalNatRevDrugDiscov2473488JamesWGetalJImmunol170520527vonAndrianUHetalNEnglJMed3486872を参照されたい。本明細書において使用される場合、炎症性疾患という用語は、例えば、自己免疫疾患または自己免疫障害を含む、炎症が重要な病理学的役割を果たす疾患または障害を意味する。これらには、アルツハイマー病、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性皮膚炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、痛風、橋本甲状腺炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、変形性関節症、天疱瘡、周期熱症候群、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病、潰瘍性大腸炎、脈管炎、および異種移植拒絶、細菌性赤痢、シャーガス病、嚢胞性線維症、間質性肺炎、ビラリアシス、ヘリコバクターピロリ胃炎、C型肝炎、インフルエンザウイルス性肺炎、ハンセン病、ナイセリア髄膜炎または肺炎球菌髄膜炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、敗血症症候群、および結核などの疾患が含まれる。NathanNature420846。特に、本発明は、VLA4経路よって媒介される疾患または障害を治療、予防、軽減、または抑制するための方法を提供する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにそのタンパク質融合物および結合体は、炎症性疾患または炎症性障害の治療的または予防的な処置用の医薬を製造するために使用され得る。このような疾患および障害には、例えば、喘息、多発性硬化症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、炎症性肺疾患、関節リウマチ、敗血症性関節炎、I型糖尿病、臓器移植拒絶、炎症性腸疾患、および接着分子によって媒介される他の疾患、例えば、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、エイズ認知症、および腫瘍転移が含まれる。急性炎症の特徴は、内皮への白血球粘着の増加である5130525。本発明は、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体もしくは組成物の治療的有効量をヒト対象または非ヒト哺乳動物対象に投与する段階を含む、内皮細胞への白血球の接着を阻害する方法を提供する。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、下記の実施例19に示す通り、VLA4の定常状態発現または接着分子を含む4インテグリンもしくはβ1インテグリンの細胞表面レベルにほとんど影響を与えないことが示されている。したがって、1つの態様において、本発明は、α4β1、α4β7、α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、およびα9β1などのα4またはβ1を含む細胞接着分子の細胞表面発現に最小限の影響しか与えずに、内皮細胞への白血球の接着を阻害する方法を提供する。本明細書のこれまでの部分および実施例において説明する2DVCAM1分子の特性を考慮して、本発明の分子は、他のVLA4アンタゴニストに関連付けられているPMLリスクを低下させるにあたって、治療的および予防的な利点を提供し得ると考えられている。任意の特定の対象または患者に対する具体的な用量レベルは、使用される個々の化合物の活性、年齢、体重、全体的健康状態、投与経路、障害の重症度、および排泄速度などを含む様々な因子に依存し得ることを当業者は理解するであろう。所与の状況に対する治療的有効量は、常用的な実験法によって容易に決定することができ、通常の臨床家の技能および判断の範囲内である。本発明の目的において、治療的有効用量は、一般に、約01μgkg日~約100mgkg日の本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドまたは結合体、時には、約10μgkg日~約500μgkg日、および時には、約10μgkg日~約100μgkd日であり、1つの用量でまたは複数用量で投与されてよい。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにその結合体および薬学的組成物は、推奨される最大臨床投薬量またはそれよりも少ない投薬量で投与することができる。本発明の組成物中の活性化合物および活性結合体の投薬量レベルは、投与経路、疾患の重症度、および患者の応答などに応じて、所望の治療応答が得られるように変更してよい。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび結合体は、単独の活性な薬学的作用物質として投与することができるが、1種または複数種の他の作用物質と組み合わせて使用してもよい。組合せは、個別の組成物として、または両方の作用物質を含む単一の剤形として投与することができる。組合せとして投与される場合、治療作用物質は、同時もしくは異なる時点に与えられる個別の組成物として調製されてよく、または治療作用物質は単一の組成物として与えられてもよい。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび結合体はまた、VLA4を有する細胞の存在を検出するのに有用である。脳中にこのような細胞が存在する場合、治療的処置を開始する必要性が指摘される可能性がある。2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体は、蛍光性標識、放射性同位体、および常磁性同位体などの検出可能な標識で標識されてよい。標識された2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体は、インビトロまたはインビボで細胞と接触させられる。対象細胞に結合する標識された2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体が検出および定量される。対象におけるVLA4レベルの変化は、望ましくない炎症応答の証拠となり得る。したがって、本発明は、2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体をヒト対象または非ヒト哺乳動物対象に由来する組織試料と接触させる段階および該2DVCAM1変異体ポリペプチドまたはその結合体と組織試料中のVLA4との特異的結合によって形成される複合体を検出する段階を含む、該VLA4を検出するための方法を提供する。本発明の態様には、以下が含まれる。10~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO12と異なり、かつSEQIDNO12に関して37位のプロリンおよび39位のロイシンを含む、配列を含む組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。2前記配列が、SEQIDNO12に関して41位のアラニンを含む、態様1の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。3前記配列が、SEQIDNO12に関してF32LS、S34FY、Q38L、A41S、T74RA、K79SR、L141FW、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む、態様1の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。4前記配列が、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、およびSEQIDNO24より選択される、態様1の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。5前記配列が、0~5個のアミノ酸位置においてSEQIDNO12と異なる、態様1の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。6前記配列が、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO22、およびSEQIDNO24より選択される、請求項5記載の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。7前記配列が、SEQIDNO12に関して38位のロイシンを含む、態様1の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。80~8個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なり、かつSEQIDNO18に関して37位のプロリンおよび39位のロイシンを含む、配列を含む組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドであって、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きい該ヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。9前記配列が、SEQIDNO18、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO20、SEQIDNO22、およびSEQIDNO24より選択される、態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。10前記変異体配列が、SEQIDNO18に関してL32FS、F34SY、L38Q、S41A、R74TA、S79KR、L141FW、D145A、およびR146Wより選択される1つまたは複数の置換を含む、態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。11前記配列が、0~5個のアミノ酸位置においてSEQIDNO18と異なる、態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。12前記配列が、SEQIDNO18、SEQIDNO14、SEQIDNO20、およびSEQIDNO22より選択される、態様11の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。13前記配列が、SEQIDNO12またはSEQIDNO18のアミノ酸96~199に対応する天然ヒトVCAM1ドメイン2配列を含む、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。14前記配列が191~199アミノ酸長である、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。15前記配列が、RPQLDAPおよびRPLLDSPより選択されるモチーフを含む、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。16実施例10のアッセイ法において、ヒトVLA4タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも少なくとも4倍大きいヒトVLA4タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。17実施例11のアッセイ法において、ヒトLPAM1タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも小さいヒトLPAM1タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。18実施例11のアッセイ法において、ヒトLPAM1タンパク質に対するQ38L2DVCAM1の結合親和性よりも大きいヒトLPAM1タンパク質に対する結合親和性を有する、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。19実施例12のアッセイ法において、Q38L2DVCAM1のVLA4LPAM1結合親和性比率と比べて、少なくとも2のVLA4LPAM1結合親和性比率を示す、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。20前記配列が、SEQIDNO12またはSEQIDNO18のアミノ酸89~95に対応するヒト2DVCAM1リンカー配列を含む、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。21N末端またはC末端に融合されたタグペプチドをさらに含む、態様1または態様8の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチド。22前記タグペプチドが、配列SEQIDNO25を有するポリヒスチジンタグである、態様21の組換えVLA4結合ポリペプチド。23態様1または態様9の組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドと該ポリペプチドに共有結合している少なくとも1つの結合成分とを含む2DVCAM1変異体結合体であって、該結合成分が、非ポリペプチドポリマー成分、糖成分、および非ポリペプチド親油性成分より選択される、2DVCAM1変異体結合体。24前記非ポリペプチドポリマー成分がポリエチレングリコールである、態様23の結合体。25前記PEGが分子量約20~80kdalの分枝PEGである、態様24の結合体。26前記PEGが前記ポリペプチドのリジンまたはN末端に共有結合している、態様24の結合体。27前記ポリペプチドに共有結合している2つまたはそれ以上のPEGを含む、態様24の結合体。28前記PEGが、直接的にまたはリンカーペプチドもしくはタグペプチドを介して間接的に、前記ポリペプチドのN末端に結合している、態様24の結合体。29前記PEGが分枝PEGである、態様24の結合体。30配列SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、またはSEQIDNO18を含む、態様24の結合体。31態様1もしくは態様8のポリペプチドまたは態様23の結合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、組成物。32.態様1または態様8の2DVCAM1変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えポリヌクレオチド。33プロモーターに機能的に連結された態様32のポリヌクレオチドを含む、ベクター。34態様33のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。35組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、態様33のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階および培地からまたは該宿主細胞から、該ポリペプチドを回収する段階を含む、該組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを作製する方法。36封入体としての組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で、態様33のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階該ポリペプチドを含む封入体を回収する段階該封入体を可溶化して、可溶化されたポリペプチドを得る段階該可溶化されたポリペプチドがリフォールディングするのに適した条件下で尿素および還元型酸化型グルタチオンの溶液中において該可溶化されたポリペプチドをインキュベートして、リフォールディングされたポリペプチドを得る段階該リフォールディングされたポリペプチドを精製する段階ならびに段階に由来するポリペプチドを回収する段階を含む、該組換え2DVCAM1変異体ポリペプチドを作製する方法。37段階が、セラミックヒドロキシアパタイトカラムに通すクロマトグラフィーによって、前記リフォールディングされたポリペプチドを精製することを含む、態様36の方法。38回収された前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる段階をさらに含む、態様35、36、または37の方法。39前記ポリペプチドに少なくとも1つの結合成分を共有結合させる段階が、該ポリペプチドのN末端アミノ基にPEGアルデヒドを結合させるのに有効な条件下で分子量20~80kdalの分枝PEGアルデヒドと共に該ポリペプチドをインキュベートし、それによって、該ポリペプチドのN末端に共有結合している分枝PEG成分を含む2DVCAM1結合体を作製する段階を含む、態様38の方法。40態様1もしくは態様8のポリペプチド、態様23の結合体、または態様31の組成物を、ヒトまたは非ヒト哺乳動物対象においてVCAM1およびVLA4の結合を阻害するのに有効な量で、該対象に投与する段階を含む、該対象においてVCAM1およびVLA4の結合を阻害する方法。本発明の前述の局面および他の局面は、以下の非限定的な実施例と併せると、より良く理解することができる。実施例12DVCAM1プラスミドの構築、2DVCAM1をCHOの細胞表面に提示するための細胞トランスフェクション、および細胞表面に提示された2DVCAM1の検出CHOK1細胞の細胞表面に2DVCAM1を提示するために、ヒトVCAM1の最初の2つのドメインおよびその変異体をコードするポリヌクレオチドを、ヒトIgGκ軽鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド、パラミクソウイルスSV5に由来するV5エピトープをコードするポリヌクレオチドSEQIDNO34アミノ酸配列はSEQIDNO35として提供されるおよびグリコシルホスファチジルイノシトール膜アンカーをコードするポリヌクレオチドに翻訳によって融合させた。Cκとの融合物を使用する論理的根拠は、適切なフォールディングを促進し、2DVCAM1変異体を分泌経路に導くことであった。V5エピトープは、細胞表面に提示された組換えタンパク質の発現レベルをモニターするために好都合なエピトープタグを提供するために使用した。ヒト2DVCAM1プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチドTBO380およびTBO381を用いるPCRによって、鋳型としての白血球cDNAライブラリーから、シグナルペプチドおよびヒトVCAM1の最初の2つのドメインを増幅した。得られた680塩基対のアンプリコンを精製し、以下のようにその後のクローニングのための制限部位を導入することおよび内在するBamHI制限部位を破壊することを狙いとする2回のPCR反応のための鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO383を用いて、PCR産物TBO380TBO381を再増幅して、その後のクローニングのためのBamHI制限部位、シグナルペプチド、およびVCAM1由来の303塩基、ならびにヒトVCAM1遺伝子中に存在する元の内在するBamHI制限部位を破壊するためのVCAM1のAsp94におけるサイレント変異を含む、394bpアンプリコンを生じさせた。オリゴヌクレオチドTBO382およびTBO385を用いてPCR産物TBO380TBO381を再増幅して、PCR産物TBO388TBO383のものと一致し、かつその後のクローニングのためのBsrGI制限部位を作り出すためのVCAM1のVal195におけるサイレント変異を含む、46bpのオーバーラップした5末端を作製した。これらの2つのPCR産物を精製し、続いて、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO385を用いたPCR反応によって組み立てた。得られた688bpアンプリコンを、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO392を用いる新たなPCR反応において鋳型として使用して、Cκに由来する最初の17個のヌクレオチドを含む705bpアンプリコンを生じさせた。オリゴヌクレオチドTBO389およびTBO390を用いて、鋳型としての白血球cDNAライブラリーから、PCRによりヒトCκ配列を増幅した。得られた271bpアンプリコンを精製し、オリゴヌクレオチドTBO391およびTBO393を用いた新たなPCR反応において鋳型として使用して、PCR産物TBO388TBO392のものと一致する36ヌクレオチドのオーバーラップした5末端、ヒトCκ配列、UGA停止コドン、およびSbfI制限部位を含む354bpアンプリコンを生じさせた。これらの2つのPCR産物TBO388TBO392およびTBO391TBO393を精製し、オリゴヌクレオチドTBO388およびTBO393を用いたPCRによって組み立てた。得られた1023bpアンプリコンを制限酵素BamHIおよびSbfIで消化し、ベクターpB183中の対応する部位にサブクローニングしてpVM009を得た。pVM009プラスミドは、ヒト2DVCAM1とCκとの翻訳融合物の発現を可能にする2DVCAM1CκUGAV5GPI構築物を含み、この翻訳融合物の細胞内局在は、調節リードスルー技術によって制御される。調節リードスルーベクターにより、高発現体トランスフェクタントを得るために活用され得る同じベクターから、膜結合型組換えタンパク質および可溶型組換えタンパク質を選択的に作製することが可能になる。高い表面発現を示す個々のトランスフェクタント細胞を選択し、増幅して、高レベルの可溶性タンパク質の作製のために次いで使用できるクローン細胞株を得る。調節リードスルーベクターを作製および使用するための方法は、参照により本明細書に組み入れられる国際出願公開WO2005073375およびBouquinTetalJBiotechnol125516528において説明されている。プラスミドpVM009を鋳型として用いてプラスミドpVM025を作製した。プラスミドpVM025は、Cκ配列とV5配列の間にUGA停止コドンを含まないことを除いては、pVM009と同一であった。オリゴヌクレオチドTBO394およびTBO014を用いたPCR反応においてプラスミドpVM009を鋳型として使用して、得られた274bpアンプリコンを制限酵素BstEIIおよびPmeIで消化し、pVM009中の対応する部位にサブクローニングして、pVM025を得た。プラスミドpVM025は、2DVCAM1、Cκ、およびV5エピトープの翻訳融合物をCHOK1細胞の形質膜にターゲティングするのを可能にする。レトロウイルス型のプラスミドpVM009およびpVM025を次のようにして構築した。レトロウイルス型のpVM009を生じさせるために、プラスミドを制限酵素BamHIおよびPmeIで消化して2DVCAM1CκUGAV5GPIカセットを遊離させ、このカセットを精製し、続いて、レンチウイルスベクターpC100中の対応する部位にサブクローニングした。得られたpVM010プラスミドにより、調節リードスルー技術を用いてレトロウイルス哺乳動物細胞株において2DVCAM1Cκタンパク質融合物を選択的に分泌または膜固定することが可能になった。レトロウイルス型のプラスミドpVM025を生じさせるために、PCR産物TBO394TBO014を制限酵素BstEIIおよびPmeIで消化し、pVM010の対応する部位にサブクローニングした。得られたpVM011プラスミドを用いて、2DVCAM1、Cκ、およびV5エピトープの翻訳融合物を細胞表面に提示するレトロウイルスCHOK1細胞株を生じさせた。本発明者らはまた、2DVCAM1配列が大腸菌発現用に最適化されている、pVM011由来の派生プラスミドも構築した。部位特異的変異誘発を用いて、次の残基の位置のコドンを大腸菌発現にとってより有利であるもので置換した成熟ヒトVCAM1中のArg10、Arg36、Ile39、Arg78、Arg123、Arg126、Arg146、Arg172、Pro184、Arg187、Ile197、およびCys199。大腸菌用に最適化されたヒト2DVCAM1核酸配列は、SEQIDNO55として提供される。大腸菌用に最適化された2DVCAM1構築物および元の構築物は、CHOK1細胞において同程度の発現を示したことから、コドン最適化はCHOK1細胞における発現に悪影響を与えないことが示された。5CO2の37°Cインキュベーターにおいて、100UmLペニシリンおよび100μgmLストレプトマイシンおよび10熱失活ウシ胎児血清を添加したDMEMNutMixF12培地中で、CHOK1ベースの粘着性細胞株すべてを増殖させた。製造業者の推奨に従って細胞解離溶液を用いて、細胞を回収した。レトロウイルスベースのベクターまたはレトロウイルスをベースとしないベクターを以下のように用いて、トランスジェニック細胞株を生じさせた。関心対象のプラスミドをトランスフェクション剤LIPOFECTAMINE2000の存在下で用い、製造業者の推奨に従ってトランスフェクションを行うことによって、非レトロウイルスベクターを内部に持つトランスジェニック細胞を作製した。トランスフェクション後、2日間または3日間細胞を増殖させてから、選択用の抗生物質ハイグロマイシンまたはブラストサイジンをそれぞれ添加した。安定な細胞プールが生じるまで、2~3日毎に選択培地を補充した。pLenti6V5DTOPOに由来するレトロウイルスベクターの場合、VIRAPOWERレンチウイルスキットに含まれる推奨に従って、293FT細胞中でレトロウイルスを作製した。簡単に説明すると、pLenti6V5DTOPOベースのベクターおよびパッケージングプラスミドレンチウイルスキットに含まれるを293FT細胞に同時トランスフェクトして、レトロウイルス粒子を作製した。48時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収し、フィルター滅菌して細胞片を除去し、続いて、CHOK1細胞を感染させるために使用した。CHOK1細胞をウイルス希釈系列に感染させ、製造業者の推奨に従うことによって、レトロウイルス力価を評価した。5mgLブラストサイジンを用いた選択を感染後3日目に開始し、安定な細胞プールが生じるまで、2~3日毎に選択培地を補充した。二重生物発現用にコドン最適化されたヒト2DVCAM1核酸配列を、CHOK1細胞における膜提示を介したタンパク質発現について、天然ヒト2DVCAM1核酸配列と比較した。pVM011レトロウイルスベクターおよびpVM036レトロウイルスベクターの両方を、VIRAPOWERレンチウイルスキットを用いて293FT細胞においてレトロウイルスを作製するのに使用した。pVM011R0およびpVM036R0とそれぞれ名付けられるCHOK1安定細胞株が生じた後、488mnのアルゴンレーザーを装備しているFACSCaliburFlowCytometerを用いた蛍光活性化細胞選別解析およびCellQuestProソフトウェア、ver511を用いたデータ解析によって、組換えタンパク質の膜提示について細胞を分析した。膜に提示された組換えタンパク質は、ヒト2DVCAM1、ヒトIgGκ鎖、V5エピトープ、およびGPIアンカーの翻訳融合物であるため、組換えタンパク質の異なるエピトープを標的とする複合抗体を用いて二重染色を実施することが可能であった。この目的のために、FITC結合抗V5mAbおよびPECy5結合抗ヒトVCAM1mABを用いて、pVM011R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036R0トランスジェニック細胞プールを染色した。2つの細胞株の蛍光プロファイルは、極めて類似していた。より具体的には、V5染色および2DVCAM1染色の両方が陽性である細胞の百分率は、pVM011R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036R0トランスジェニック細胞プールのそれぞれ84および72であった。P1チャネルの平均蛍光シグナルは、p011R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036R0トランスジェニック細胞プールにおいて、それぞれ113および112であった。同様に、P3チャネルの平均蛍光シグナルは、pVM011R0トランスジェニック細胞プールおよびpVM036R0トランスジェニック細胞プールにおいて、それぞれ590および503であった。この結果から、コドン最適化された2DVCAM1を含む組換えmRNAは、CHOK1細胞において元のヒト2DVCAM1を含む組換えmRNAと同じくらい効率的に翻訳されることが示される。さらに、この結果から、コドン最適化された2DVCAM1に基づく変異体を提示するCHOK1細胞における機能的ライブラリースクリーニングと、それに続く、大腸菌におけるその後のサブクローニングおよび2DVCAM1変異体の作製を実施することが可能であることが示される。実施例22DVCAM1ファージミドの構築、2DVCAM1を提示するファージの作製、およびファージに提示された2DVCAM1の検出一価ファージ提示ベクタープラスミドpS0124を用いて、糸状ファージの表面に2DVCAM1を提示させた。プラスミドpS0124は、大腸菌における複製のためのcolE1起点、M13起点およびパッケージングシグナル、大腸菌におけるアンピシリン耐性選択のためのβラクタマーゼ遺伝子、ならびにSTII分泌シグナル、提示されるべきポリペプチド、6Hisタグ、抑制可能なアンバー停止コドン、およびM13遺伝子IIIC末端ドメインの翻訳融合物の発現を推進するアラビノースオペロンを含むファージミド大腸菌ベクターである。ヒト2DVCAM1との例示的な翻訳融合の核酸配列は、SEQIDNO56として提供される。STII分泌シグナル配列とHisタグの間の独特なSfiI部位およびNotI部位によって、提示されるべきポリペプチドをコードするDNA配列をクローニングしてインフレーム融合物を生じさせることが可能になる。araBADプロモーターは、遺伝子が同じくプラスミド中に含まれるaraC活性化タンパク質と相互作用するアラビノースによって活性化され得る。プラスミドが、TG1またはTOP10などのアンバーサプレッサー株中に形質転換される場合、araBADプロモーターからの基底発現が、提示されるべきポリペプチド、Hisタグ、およびM13タンパク質IIIのC末端ドメインからなる成熟融合タンパク質の発現およびプロセシングを推進する。2DVCAM1をコードするDNAをプライマーを用いて増幅して、隣接するSfiI部位およびNotI部位を導入し、続いてこれらの部位を用いてpS0124中にサブクローニングして、プラスミドpS01242DVCAM1を作製した。このプラスミドを大腸菌TG1細胞中に形質転換し、後述する通りにこの形質転換体をファージ作製のために使用した。2DVCAM1またはその変異体を提示するファージを調製するために、ファージミドクローンを2×YTCarb503ml中に播種し、続いて、対数増殖期中期になるまで2×YTCarb5050ml中で継代培養し、対数増殖期中期になった時点でM13K07ヘルパーファージ1mLを添加し、37°C、250rpmで一晩、培養物を増殖させた。一晩培養物を6000rpmで20分間遠心分離し、上清を採取し、4分の1の体積量の5×PEGNaCl溶液と混合し、氷上で30分間インキュベートした。4°C、10000rpmで30分間の遠心分離によってファージDNAを回収し、トリス緩衝生理食塩水1ウシ血清アルブミン1~2ml中に再懸濁した。微量遠心管に入れ、最大速度で5分間の遠心分離によって再懸濁物を清澄化し、上清を4°Cで最長1週間保存した。TBS1BSAに溶かしたファージの10倍段階希釈系列を作製し、各希釈物1ulを対数期TG1培養物100ulに添加し、37°Cで20分間、TG1細胞をファージに感染させることによって、ファージの力価を測定した。次いで、感染した培養物を、50ugmlカルベニシリンを含むLB寒天プレート上に塗り広げた。37°Cで一晩インキュベートした後に得られたファージミドトランスフェクタントコロニーを計数し、ファージ力価を算出するのに使用した。典型的には、力価は、1012~1013cfumlの範囲であった。ファージELISAを用いて、ファージに提示された2DVCAM1の機能を試験した。TBSMに溶かした濃度5ugmlのVLA4Fcをウェル1つ当たり50ul加えて、NUNCMaxiSorpプレートを4°Cで一晩コーティングした。TBSMTで洗浄した後、3ミルクを含むTBSMでプレートをブロッキングした。このブロックを洗浄し、コーティングされたプレートにファージ希釈物を添加し、室温でインキュベートした。2時間のインキュベーション後、TBSMTでプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗M13抗体結合体と共に30分間インキュベートし、TBSMTで洗浄し、固定されたHRPをTMBH2O2試薬によって検出することによって、結合されたファージを検出した。2MH2SO4を用いて発色させた後に反応を停止させ、分光光度計およびSoftMaxProソフトウェアを用いて、プレートの450nMにおける吸光度を読み取った。ファージ希釈物に対して吸光度をプロットして、様々な変異体の結合を比較するための結合曲線を得た。実施例3VLA4Fcのクローニング、発現、精製、および特徴決定Aヒトα4Fcプラスミドの構築ヒトα4インテグリンcDNAを、白血球cDNAライブラリーから3つの断片としてPCR増幅した。第1の断片は、成熟ヒトα4インテグリンの最初の317個のヌクレオチドを含み、プライマーTBO358およびTBO357を使用した。第2の断片は、プライマーTBO365およびTBO367を用いて作製した。プライマーTBO366およびTBO352を用いた第3のPCR反応の結果、ヒトα4インテグリンの配列を含む1155bpのアンプリコンが得られた。標準手順を用いてこれら3種のPCR産物を精製し、次の変更を伴う完全なヒトα4インテグリン細胞外ドメインをコードするDNAの作製を目標とするPCR反応のための鋳型とした内因性シグナルの代わりにマウスκIgG軽鎖シグナルペプチド、内在するBamHI制限部位の除去、変異R558Lの導入、およびその後のサブクローニングのための制限部位の導入。プライマーTBO359およびTBO355を用いて、第1のPCR断片を再増幅させた。プライマーTBO359は、BamHI制限部位、続いて、マウスIgGκシグナルペプチドをコードするコザックコンセンサス翻訳開始シグナル配列、および第1の断片の5にハイブリダイズする配列を含んだ。TBO355は、第1の断片の3末端の近くのBamHI部位を破壊するサイレント変異を含んだ。得られた産物は長さが412bpであり、BamHI部位、続いてコザック配列、および成熟ヒトα4インテグリン遺伝子へのマウスIgGκシグナルの融合物をコードするDNAを含んだ。プライマーTBO354およびTBO369を用いて第2のPCR産物を増幅して、第1のPCR断片のものと一致し、かつヒトα4インテグリンにおける変異R558Lを含む、33bpのオーバーラップした5末端を作製した。オリゴヌクレオチドTBO368およびTBO353を用いて第3のPCR産物を増幅して、第2のPCR産物のものと一致し、かつその後のサブクローニングのための制限部位SalIを含む、36bpのオーバーラップした5末端を作製した。標準手順を用いてこれら3種のPCR産物を精製し、続いて、隣接プライマーTBO359およびTBO353を用いたPCRによって組み立て、増幅した。最終的なPCR断片は、マウスIgGκシグナルペプチドと変異R558Lを含むヒトα4インテグリンとの翻訳融合物をコードした。TOPOTAクローニングキットのpCR4TOPOベクター中に2907bpアンプリコンをクローニングして、プラスミドpVM017を作り出した。ヒトα4インテグリン細胞外ドメインは、ヒトIgG1Fcと融合させた。オリゴヌクレオチドTBO351およびTBO305を用いたPCRによって、ヒト白血球cDNAライブラリーから、ヒトIgG1Fc核酸配列を増幅した。SOE戦略52835を参照されたいによって、IgG1CH3ドメインの最初の部分に独特なXhoI制限部位を導入した。オリゴヌクレオチドの組合せTBO351およびTBO377ならびにTBO376およびTBO305を用いた2回の独立したPCR反応において、IgG1Fc鋳型を増幅した。オリゴヌクレオチドTBO351およびTBO305を用いたPCRによって、これらの2種のPCR断片を組み立て、増幅した。得られたIgG1Fc産物は、IgG1Fcタンパク質のコード配列に変異Y407Tを導入するための鋳型として働いた。626bp断片を作製するためのオリゴヌクレオチドの組合せTBO361およびTBO365ならびに159bp断片を作製するためのオリゴヌクレオチドの組合せTBO364およびTBO360を用いて、2回のPCR反応を実施した。オリゴヌクレオチドTBO361およびTBO360を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO361TBO365およびTBO364TBO360を組み立てて、Y407T変異を有するヒトIgG1Fc配列ならびにサブクローニング目的で導入されたBamHI、SalI、XhoI、およびPmeI制限部位を含む753bpアンプリコンを生じさせた。TOPOTAクローニングキットのpCR4TOPOベクター中にTBO361TBO360PCR産物をクローニングして、プラスミドpVM001を作製した。muIgG1κシグナルおよびα4インテグリンR558L配列を含むBamHISalI断片をpVM017から切り出し、pVM001の対応する部位にサブクローニングして、muIgG1κシグナル配列、α4インテグリンR558L変異体ECD配列、およびFcY407T配列の機能的融合物を含むプラスミドpVM003を作製した。BamHI酵素およびPmeI酵素を用いてこの融合物をpCDNA31Hyg中にサブクローニングして、ハイグロマイシン耐性マーカーおよび可溶性ヒトα4インテグリンFcY407Tの発現を推進するCMVプロモーターを含むプラスミドpVM004を得た。実現し得る最高レベルの可溶性α4Fcを産生する細胞株を作製するために、プラスミドpVM004においてα4Fc翻訳融合物の下流にUGA停止コドン、V5エピトープ、およびGPIアンカーを導入することによって、調節リードスルー技術に基づくプラスミドベクターpVM007を構築した。次のようにしてUGAV5GPIカセットを作製した。プラスミドpVM001が、オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO379を用いたPCR反応において鋳型として働いて、FcY407TのCH3領域、UGA停止コドン、およびV5エピトープの上流部分を含む347bpアンプリコンをもたらした。鋳型としてのプラスミドpB183ならびにオリゴヌクレオチドTBO378およびTBO104を用いる第2のPCR反応を実施して、PCR産物TBO376TBO379の3末端との37bpオーバーラップ、残りのV5エピトープ、GPI配列、およびサブクローニングのための制限部位PmeIを含む235bpのアンプリコンを作製した。オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO104を用いたPCRによって、2種のPCR産物TBO376TBO379およびTBO378TBO104を組み立て、増幅し、得られた545bpアンプリコンをXhoIおよびPmeIで消化し、pVM004中のXhoIPmeI断片を置換するのに用いて、pVM007を作製した。プラスミドpVM007により、参照により本明細書に組み入れられるWO2005073375において説明されている調節リ―ドスルーアプローチによる可溶性α4Fcまたは膜結合型α4Fcの選択的作製が可能になった。遍在性クロマチンオープニングエレメント技術を用いて、α4Fc発現プラスミドおよびβ1Fc発現プラスミドの第2のセットを作製した。CET1019ASpuroベクターおよびCET1019AShygroベクターは、ゲノムDNAにおけるプラスミド組込み後の発現を改善するために局所的クロマチン巻き戻しを誘導するDNAエレメントを含む。両方のベクターとも、プロモーターAおよびSV40polyAターミネーターを有する。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pVM007由来のα4Fcを切り出し、NheI制限酵素およびSnaBI制限酵素で消化したCET1019ASpuro中にクローニングして、プラスミドpVM162を得た。NheI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、pVM008由来のα1FcORFを切り出し、同じ酵素で消化したCET1019AShygro中にクローニングして、プラスミドpVM168を得た。Bヒトβ1Fcプラスミドの構築鋳型としての白血球cDNAライブラリーならびにオリゴヌクレオチドTBO370およびTBO371を用いたPCRによって、ヒトα1インテグリンをクローニングして、分泌シグナル配列および細胞外ドメインを含むヒトβ1インテグリン遺伝子の最初の2187個のヌクレオチドを含むPCR産物を得た。オリゴヌクレオチドTBO372およびTBO373を用いてPCR産物を再増幅して、隣接するBamHI制限部位およびPmeI制限部位を導入した。TOPOTAクローニングキットのpCR4TOPOベクター中にこの断片をクローニングして、プラスミドpVM016を得た。次いで、ヒトβ1シグナル配列およびβ1インテグリンをヒトIgG1Fc配列に融合した。第1に、PCR産物TBO351TBO305中で得られるヒトIgG1Fc配列を、2回のPCR反応によってT366Y変異を含むように変異させた505bp断片を与える、オリゴヌクレオチドTBO361およびTBO363を用いた第1の反応ならびに277bp断片を与える、TBO362およびTBO360を用いた第2の反応。オリゴヌクレオチドTBO361およびTBO360を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO361TBO363およびTBO362TBO360を組み立て、増幅して、T366Y変異を有するヒトIgG1Fc配列ならびにBamHI、SalI、XhoI、およびPmeI制限部位を含む753bpアンプリコンを生じさせた。次いで、組み立てられた産物をTOPOTAクローニングキットのpCR4TOPOベクター中にクローニングして、プラスミドpVM002を得た。酵素BamHIおよびSalIを用いて、プラスミドpVM016からヒトβ1インテグリン配列を切り出し、プラスミドpVM002の対応する部位にサブクローニングして、ヒトβ1インテグリンおよびヒトIgG1FcT366Yの翻訳融合物を含むpVM005を得た。β1Fc融合物を、pCDNA6mycHisAに由来する発現ベクター中にサブクローニングした。オリゴヌクレオチドTBO374およびTBO375を用いて、プラスミドpCDNA31Hygから5非翻訳領域およびβグロビンイントロン配列をPCR増幅して、HindIII制限部位およびBamHI制限部位にはさまれた406bpアンプリコンを作製し、HindIIIおよびBamHIを用いてこれをpCDNA6mycHisA中にクローニングして、プラスミドpCDNA6mycHisAイントロンを得た。酵素BamHIおよびPmeIを用いて、プラスミドpVM005からβ1Fcカセットを切り出し、プラスミドpCDNA6mycHisAイントロン中にサブクローニングして、プラスミドpVM006を得た。プラスミドpVM006は、ブラストサイジン耐性マーカー、および可溶性β1Fcの発現を推進するCMVプロモーターを含んだ。実現し得る最高レベルの可溶性β1Fcを産生する細胞株を作製するために、pVM006プラスミドのβ1Fc翻訳融合物の下流にUGA停止コドン、V5エピトープ、およびGPIアンカーを導入することによって、調節リードスルー技術に基づくプラスミドベクターpVM008を構築した。プラスミドpVM002は、オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO379を用いたPCR反応において鋳型として働いて、Fcドメインの3末端、UGA停止コドン、およびV5エピトープの上流部分を含む347bpアンプリコンを生じた。鋳型としてプラスミドpB183を用い、かつオリゴヌクレオチドTBO378およびTBO104を用いて、第2のPCR反応を実施した。得られた235bpアンプリコンは、PCR産物TBO376TBO379の3末端との37bpオーバーラップ、残りのV5エピトープ、GPI配列、およびサブクローニングのためのPmeI制限部位を含んだ。オリゴヌクレオチドTBO376およびTBO104を用いたPCRによって、これらの2種のPCR産物TBO376TBO379およびTBO378TBO104を組み立て、増幅して、545bpアンプリコンを得、これをXhoI制限酵素およびPmeI制限酵素で消化し、ベクターpVM006の対応する部位にクローニングして、プラスミドpVM008を作製した。プラスミドpVM008により、参照により本明細書に組み入れられるWO2005073375において説明されている調節リードスルーアプローチによる可溶性β1Fcまたは膜結合型β1Fcの選択的作製が可能になった。遍在性クロマチンオープニングエレメント技術を用いて、α4Fc発現プラスミドおよびβ1Fc発現プラスミドの第2のセットを作製した。CET1019ASpuroベクターおよびCET1019AShygroベクターは、ゲノムDNAにおけるプラスミド組込み後の発現を改善するために局所的クロマチン巻き戻しを誘導するDNAエレメントを含む。両方のベクターとも、プロモーターAおよびSV40polyAターミネーターを有する。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pVM007由来のαfFcを切り出し、NheI酵素およびSnaBI酵素で消化したCET1019ASpuro中にクローニングして、プラスミドpVM162を得た。NheI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、pVM008由来のβ1FcORFを切り出し、同じ酵素で消化したCET1019AShygro中にクローニングして、プラスミドpVM168を得た。Cα4Fcβ1Fcを産生する細胞株の構築調節リードスルー法によってα4Fcβ1Fc細胞株を作製するために、本発明者らは、最初にα4FcベースのプラスミドをCHOK1にトランスフェクトし、高レベルのα4Fcを提示するクローンを作製および選択する逐次的アプローチを用いた。続いて、これらのクローンを、β1Fcベースのプラスミドによるトランスフェクションのための受容細胞として使用した。サンドイッチELISAを用いて、得られたトランスジェニック細胞株をヘテロダイマー分泌についてスクリーニングした。製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン2000を用いて、pVM007プラスミドでCHOK1細胞をトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性について選択した。安定な細胞プールが生じた後、GPI固定を介してヒトα4Fcを提示するためにFACSに基づいた2回の濃縮にこれらの細胞を供した。各回の濃縮において、選別された細胞の百分率は、それぞれ08および07であった。FACSに基づいた異なる濃縮ラウンドの出来を評価するために、元のトランスジェニック細胞に対応する細胞プールの上清または1回のFACSに供した細胞もしくは2回のFACSに供した細胞を、α4Fc産生について分析した。異なる濃縮ラウンド間でα4Fc分泌に著しい改善が認められたことから、FACS工程は高発現体細胞を濃縮する上で大きい成功を収めたことが示された。実際、2回のFACSに供された細胞プール中のα4Fc分泌レベルは、元のトランスジェニック細胞プールの分泌レベルの87倍であった。続いて、pVM007R2細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、約300個のクローンを目で見て確認し、ELISAを用いてα4Fc産生について順位付けした。最も多いα4Fc組換えタンパク質産生を示しているクローン24個を集め、増幅し、製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン2000を用いてプラスミドpVM008でトランスフェクトした。抗生物質ブラストサイジンの存在下で約2週間増殖させた後、トランスジェニック細胞株を得た。pVM007およびpVM008を同時トランスフェクトされた細胞を、CHOK1007008と呼んだ。各細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、サンドイッチELISAを用いてα4Fc産生およびβ1Fc産生についてCHOK1007008クローンを順位付けした。8個のCHOK1007008クローンを選択し、さらに増殖させるためにTフラスコに移し、1週間後に、サンドイッチELISAを用いて、分泌されたヘテロダイマーのレベルを評価した。ローラーボトルにおいてさらに組換えタンパク質を産生させるために、1つのクローンを選択した。前述したものに類似した逐次的トランスフェクション工程により、プラスミドpVM162およびpVM168を用いて、第2のVLA4Fc細胞株をCHOS細胞から作製した。DVLA4Fcの発現および精製選択した細胞株をローラーボトルに移し、無血清培地に順応させた。上清を毎日採取し、80°Cで凍結した。一連の行動の最後に、上清を解凍し、まとめ、溶出緩衝液としてグリシンpH32を用いるrプロテインAセファロースカラムを用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。溶出された画分を集め、還元条件下のSDSPAGEゲル上で解析した。PVDF膜にエレクトロブロッティングした後、2つの主要バンドの配列を決定した。Mrが最も低いバンドの配列は得られなかった。別々に、かつ機能的細胞結合アッセイ法によって、画分を試験した。等価な活性を示している画分を集め、中和した溶出緩衝液中で80°Cで保存した。続いて、機能的ELISAアッセイ法用の標準物質としてこれを使用した。また、BIACOREを用いて、活性な画分を同定し、集めることもできる。EVLA4Fcの特徴決定1MALDITOF質量分析VLA4Fc融合タンパク質に対してMALDITOF質量分析を実施した。結果から、融合タンパク質が約280kDaの不均一な質量を有することが示された。この不均質性は、α鎖およびβ鎖の両方の多数のNグリコシル化部位にNグリカンが結合することに起因する可能性が高かった。結合した炭水化物の質量は、約45kDaと推定された。2N末端配列決定上記のDの部分で説明したゲル解析において観察された2つの主要バンドのN末端アミノ酸配列決定を実施した。Mrが最も高いバンドについては、N末端アミノ酸配列TyrAsnValAspThrGluSerAlaLeuLeuTyrGlnGlyProが見出された。このアミノ酸配列は、α4鎖の予想されるN末端アミノ酸配列と同一である。Mrが最も低いバンドについては、N末端アミノ酸配列は見出されなかった。β1鎖中の予想されるN末端アミノ酸残基は、環化してN末端のアミノ酸配列決定をし難くする可能性が高いGln残基であるため、この結果は以外ではない。3機能的細胞結合アッセイ法精製された可溶性VLA4Fc受容体の機能性を評価するために、2DVCAM1CκV5を提示するトランスジェニックCHOK1細胞をVLA4Fc希釈系列と共にインキュベートした。これらの細胞をPE結合抗ヒトIgGFc鎖抗体と共にインキュベートすることによって、2DVCAM1への可溶性VLA4Fc受容体の結合を検出した。これらの結果から、可溶性VLA4Fcが、CHOK1細胞表面に提示された2DVCAM1タンパク質に結合したことが示される。4機能的ELISAアッセイ法後期のVLA4Fc精製バッチの機能性を標準バッチと比べるために、本発明者らは、実施例10において説明するELISAアッセイ法を使用した。TBSMに溶かした2ugmlのVLA4Fcタンパク質画分および標準VLA4Fc調製物で同じELISAプレートをコーティングし、2種の異なる2DVCAM1変異体を用いてELISAを実施した。両方の2DVCAM1変異体について標準バッチと同一である画分のみを許容範囲とみなし、集めて、VLA4Fcタンパク質の新しいバッチを作製した。実施例4LPAM1Fcのクローニング、発現、精製、および特徴決定Aヒトβ7Fcプラスミドの構築鋳型としての白血球cDNAライブラリーならびにオリゴヌクレオチドTBO395およびTBO396を用いたPCRによって、ヒトβ7インテグリンをクローニングして、分泌シグナル配列および細胞外ドメインを含む、ヒトβ7インテグリン遺伝子の最初の2169個のヌクレオチドを含むPCR産物を得た。オリゴヌクレオチドTBO397およびTBO398を用いて、このPCR産物を再増幅して、隣接するBamHI制限部位およびSalI制限部位を導入した。BamHI部位およびSalI部位を用いて、β1断片の代わりにβ7断片をプラスミドpVM006にサブクローニングして、IgG1FcT366Y配列に融合されたβ7シグナル配列および細胞外ドメインを含むプラスミドpVM012を得た。続いて、BamHI制限酵素およびPmeI制限酵素を用いて、この融合物をコードする配列を切り出し、プラスミドpCDNA6mycHisAの対応する部位の間にクローニングして、プラスミドpVM013を得た。プラスミドpVM013は、ブラストサイジン耐性マーカーおよび可溶性ヒトβ7インテグリンFcT366Yの発現を推進するCMVプロモーターを含んだ。またpVM013由来のNheIPmeI断片を、同じ酵素で消化したCET1019AShygro中にサブクローニングすることによって、UCOE技術に基づいたβ7Fcプラスミドを作製した。得られたプラスミドをpVM172と名付けた。Bα4Fcβ7FcCHO細胞株の構築本質的にはα4Fcβ1Fc細胞株の作製について前述した通りの逐次的アプローチを用いて、α4Fcβ7Fcを発現する細胞株を作製した。前述した通り、最も多いα4Fc組換えタンパク質産生を示しているクローン24個を集め、増幅し、製造業者の推奨に従ってリポフェクタミン2000を用いてプラスミドpVM013でトランスフェクトした。抗生物質ブラストサイジンの存在下で約2週間増殖させた後、トランスジェニック細胞株を得た。pVM007およびpVM013を同時トランスフェクトされた細胞を、CHOK1007013と呼んだ。各細胞プールを、5個の96ウェル培養プレートにおける限界希釈クローニングに供した。2週間増殖させた後、実施例9で説明するサンドイッチELISAを用いてα4Fc産生およびβ7Fc産生についてCHOK1007013クローンを順位付けした。8個のCHOK1007013クローンを選択し、さらに増殖させるためにTフラスコに移し、1週間後に、サンドイッチELISAを用いて、分泌されたヘテロダイマーのレベルを評価した。ローラーボトルにおいてさらに組換えタンパク質を産生させるために、1つのクローンを選択した。前述したものに類似した逐次的トランスフェクション工程により、プラスミドpVM162およびpVM172を用いて、第2のLPAM1Fc発現細胞株をCHOS細胞から作製した。CLPAM1Fcの発現および精製選択した細胞株をローラーボトルに移し、無血清培地に順応させた。上清を毎日採取し、80°Cで凍結した。一連の行動の最後に、上清を解凍し、まとめ、溶出緩衝液としてグリシンpH32を用いるrプロテインAセファロースカラムを用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって精製した。これらの画分を別々に試験し、機能的画分を集め、中和した溶出緩衝液中で80°Cで保存した。DLPAM1Fcの特徴決定機能的ELISAアッセイ法後期のLPAM1Fc精製バッチの機能性を標準バッチと比べるために、本発明者らは、実施例11において説明するELISAアッセイ法を使用した。TBSMに溶かした2ugmlのLPAM1Fcタンパク質画分および標準LPAM1Fc調製物で同じELISAプレートをコーティングし、2種の異なる2DVCAM1変異体を用いてELISAを実施した。両方の2DVCAM1変異体について標準バッチと同一である画分のみを許容範囲とみなし、集めて、LPAM1Fcタンパク質の新しいバッチを作製した。実施例5CHO細胞表面提示ライブラリーおよびファージ提示ライブラリーの調製入手可能なVCAM1構造体をVLA4と相同なインテグリンの構造体に手動でドッキングすることに基づいて、VLA4への結合を担っている2DVCAM1中の領域を特定したJBiolChem2721942919440JinMetalProcNatlAcadSciUSA10357585763SongGetalJBiolChem28150425049。VLA4結合に直接関与していると予測されるこれらの領域の表面の残基をライブラリーに含めた。次の残基を変異誘発の標的としたR36、T37、Q38、I39、S41、P42F32、S34、T72、T74、K79、L80、E81R123、L141、E142、D143、D145、R146、およびK147。ドープされたまたはスパイクされたオリゴヌクレオチドとして公知の特別設計されたゆらぎの使用に基づくライブラリー設計戦略を使用した。これらのゆらぎは、変異体1個当たり変異2~3個という平均変異頻度を与えるように最適化した。停止コドンの量を最小限に抑え、同時に、オリゴヌクレオチド合成のための異なるゆらぎの数を最小限に抑えつつ、システイン以外のアミノ酸すべてに備えるために、設計戦略を最適化した。CHO細胞表面提示ライブラリー1および3については、ベクターpVM036中の2DVCAM1をPCR変異誘発のための鋳型として使用した。標的とされる領域において変異誘発プライマーを用いて鋳型を増幅し、隣接領域は非変異誘発性プライマーを用いて増幅した。PCR断片を組み立て、BamHIクローニング部位およびPstIクローニング部位も導入する隣接プライマーを用いた最終PCR反応において増幅した。得られた変異体配列ライブラリーをBamHI酵素およびPstI酵素で消化し、ベクターpVM036中のヒト2DVCAM1挿入配列を置換するのに使用した。この連結を用いて、下記の実施例6で説明するレトロウイルスライブラリーを作製した。ライブラリー2の場合、ヒト野生型2DVCAM1を鋳型として使用した。VLA4結合に直接関与していると予測される2DVCAM1のドメイン1の表面の残基にまたがる変異誘発性プライマーを用いて、様々な位置に変異を組み入れた。これらのプライマーを用いていくつかのオーバーラップ断片を増幅し、PCRによって組み立てた。得られた2DVCAM1変異体配列ライブラリーを、挿入物の5末端および3末端にSfiIクローニング部位およびNotIクローニング部位をそれぞれ挿入するプライマーを用いて増幅した。ライブラリー産物をSfiI制限酵素およびNotI制限酵素で消化し、アガロースゲルを用いて精製し、pS0124ベクターの対応する部位に連結し、エレクトロポレーションによって大腸菌TOP10細胞に形質転換した。1時間回復させた後、50ugmLカルベニシリンを含む2×YT培地中、37°Cで一晩、形質転換体を増殖させた。大量調製キットを用いてライブラリーDNAを作製するために、得られたライブラリー培養物を使用した。典型的なライブラリーは、約9×108個の独立した形質転換体を含んだ。実施例6CHO細胞表面提示を用いた、2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現およびスクリーニングpLenti6V5DTOPOに由来するレトロウイルスライブラリーを、ViraPowerレンチウイルスキットに含まれる推奨に従って、293FT細胞中で作製した。簡単に説明すると、pLenti6V5DTOPOベースのライブラリーおよびパッケージングプラスミドレンチウイルスキットに含まれるを293FT細胞に同時トランスフェクトして、レトロウイルス粒子を作製した。48時間後、レトロウイルス粒子を含む上清を回収し、フィルター滅菌して細胞片を除去し、続いて、CHOK1細胞を感染させるために使用した。CHOK1細胞をウイルス希釈系列に感染させ、製造業者の推奨に従うことによって、レトロウイルス力価を評価した。ブラストサイジン選択を感染後3日目に開始し、安定な細胞プールが生じるまで、2~3日毎に選択培地を補充した。CHO細胞表面に提示された2DVCAM1変異体ライブラリーを、FACSに基づいた数回の濃縮に供した。第1のラウンドは、抗V5FITCmAbで標識される検出可能レベルの2DVCAM1CκV5組換えタンパク質を提示する細胞を濃縮することを狙いとした。抗V5FITCmAbが陽性である細胞を集め、細胞培養によって増幅した。濃縮したライブラリー細胞を、可溶性VLA4Fcに結合する2DVCAM1変異体を提示する細胞を選別することを狙いとする後続のFACSラウンドに供した。21°Cで1時間、200nMVLA4Fcと共に細胞をインキュベートし、抗IgG1PEモノクローナル抗体を用いて、結合したVLA4Fcを定量した。抗V5FITCモノクローナル抗体で細胞を同時染色することによって、組換えタンパク質提示レベルを評価した。ヒト2DVCAM1を提示する細胞と比べて強いVLA4FcV5染色を示す細胞を選別し、細胞培養で増幅した。選別された集団は、後続のラウンドにおける全細胞の6および145に相当した。最後に、FACS解析の間に、解離速度に基づく2回の連続した競合にライブラリーを供した。抗IgGPEモノクローナル抗体による染色の前に、5μMQ38L2DVCAM1ポリペプチドの存在下で、2DVCAM1変異体ライブラリーを提示する細胞をVLA4Fcに結合させた。したがって、Q38L2DVCAM1変異体よりもVLA4Fcに良く結合する2DVCAM1変異体を提示する細胞のみが、実質的なPEシグナルを保持すると予想された。2回の連続した解離速度競合において、細胞の約5および14が選別された。ラウンド4およびラウンド5の濃縮から得られた細胞を、限界希釈クローニングを用いて96ウェル培養プレートに単一細胞として播種し、増幅して、クローン細胞株を得た。これらの細胞株をVLA4Fc結合およびV5結合についてのFACS染色に供し、ヒト2DVCAM1ポリペプチドまたはQ38L2DVCAM1ポリペプチドのいずれかを発現する対照細胞と比較した。並行して、2DVCAM1挿入DNAをPCRによって細胞株から増幅し、配列決定に供した。配列データとFACS結合データの相互関係を明らかにして、VLA4Fc結合が改善している2DVCAM1変異体を同定した。実施例7ファージ提示を用いた2DVCAM1変異体ポリペプチドの発現、パンニングおよびスクリーニングエレクトロポレーションによってライブラリーDNAを大腸菌TG1細胞に形質転換した。2DVCAM1変異体のライブラリーを提示するファージ粒子の産生を援助するためのM13K07ヘルパーファージを追加して、ライブラリー培養物を一晩増殖させた。一晩培養物を6000rpmで10分間遠心分離し、4分の1の体積量の5×PEGNaCl8000、25MNaClと共に氷上で30分間インキュベーションし、10000rpmで40分間遠心分離することによって、上清中のライブラリーファージ粒子を沈降させた。ファージ沈殿物を1~2mlのTBS1BSAに再懸濁し、微量遠心管に入れて最大速度で5分間遠心分離することによって清澄化し、使用するまで氷上で保存した。TBSMに溶かした2ugmLのVLA4Fcタンパク質1mLで、NUNCMaxisorbイムノチューブを4°Cで一晩コーティングした。別のチューブを対照としてBSA1mLでコーティングした。イムノチューブをTBSMT中で洗浄し、TBSMT中3ミルクによって室温で1時間ブロッキングした。上記のライブラリーファージ調製物をイムノチューブに添加し、2時間結合させた。チューブをTBSTで入念に洗浄し、結合したファージ粒子を110体積量の1MTrispH90で中和した1BSA中02Mグリシン、pH22を用いて溶出させた。この溶出物を用いて、ナイーブなTG1細胞を感染させた。VLA4でコーティングしたチューブおよびBSAでコーティングしたチューブの両方に由来する試料感染培養物を選択培地上に播種して、ファージ粒子の数を推定し、個別のコロニーを得た。VLA4でコーティングしたチューブに由来する残存培養物を用いて、前述のようにしてファージを調製した。パンニング工程を5回繰り返した。各ラウンドの濃縮後に得られた個々のファージミドクローンの試料を、ファージELISA形式を用いてVLA4Fc結合についてスクリーニングした。2×YTCarb50を含む96ウェルプレートに個々のファージミドクローンを播種し、以下のようにハイスループットなファージ調製物を作製するために使用した。最初に、96ウェルのディープウェルブロックに入れたウェル1個当たり1mlの2×YTCarb50にこれらのクローンを播種し、M13KO7ヘルパーファージの存在下で一晩増殖させた。これらのブロックを遠心分離し、上清を回収し、VLA4Fcへの結合についてELISAアッセイ法によってスクリーニングした。TBSM中5ugmlVLA4Fcで、NUNCMAXISORPプレートを4°Cで一晩コーティングした。TBSMTで洗浄した後、ファージ上清を1時間インキュベートし、洗浄し、抗M13HRP抗体結合体の15000希釈物と共にインキュベートすることによって、結合されたファージを検出した。TBSMTで洗浄した後、TMBH2O2とのインキュベーションによって、結合された抗体シグナルを推定し、発色後に2MH2SO4で反応を停止させた。プレートの450nmでの吸光度を読み取った。また、ファージミドクローンを、QIAGENミニプレップキットを用いてファージミドDNAを調製するのにも使用し、配列決定した。配列データをELISAデータと合わせて、最も高頻度で出現し、かつまたは良好なVLA4Fc結合を示すクローンを同定し、これらを実施例8で説明する通りにして精製した。実施例82DVCAM1変異体ポリペプチドの発現、リフォールディングおよび精製A大腸菌における発現のための2DVCAM1配列のサブクローニング発現させようとする2DVCAM1配列を細菌発現ベクターpVMEcVec中にサブクローニングした。プラスミドpVMEcVecは、プラスミドpQE81に由来し、大腸菌における増殖および選択のためのcolE1起点およびカナマイシン耐性マーカー、lacオペレーターおよびT5プロモーター配列からなり、標的遺伝子の発現を推進するIPTG誘導性プロモーター、ならびにその産生物が誘導性プロモーターを制御するlacIリプレッサー遺伝子を含む。2DVCAM1配列の5末端にHisタグ配列および3末端にHindIII制限部位を加えるプライマーを用いて、サブクローニングしようとする2DVCAM1遺伝子を供給源ベクターからPCR増幅した。このPCR産物を再増幅して、2DVCAM1配列の5末端にEcoRI制限部位、リボソーム結合部位、および開始ATGコドンを付加した。PCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、同じ酵素で消化したpVMEcVec中にサブクローニングした。得られたプラスミドを配列決定して2DVCAM1配列を確認し、次いで、2DVCAM1ポリペプチドの発現および精製のためにW3110大腸菌株に形質転換した。タグ無し型の2DVCAM1変異体を発現させるためのプラスミドを次のようにして構築した。Hisタグ付き型の2DVCAM1変異体を含むプラスミドを、2DVCAM1変異体ORFの5のすぐ近くにEcoRI制限部位、リボソーム結合部位、および開始ATGコドンを導入するフォワードプライマーならびに2DVCAM1ORFの終止コドンの後ろにHindIII制限部位を導入するリバースプライマーを用いるPCR増幅のための鋳型として使用した。前述した通りにEcoRI制限酵素およびHindIII制限酵素を用いて、PCR産物をpVMEcVec中にサブクローニングし、次いで、発現および精製のためにW3110大腸菌に形質転換した。B細菌培養物の調製2DVCAM1変異体ポリペプチドおよびHisタグペプチドの翻訳融合物を発現するトランスジェニック大腸菌株を、50μgmLカナマイシンを添加した2×YT液体培地3ml中、37°Cで4~6時間、振盪インキュベーターにおいて増殖させた。4~6時間後、50μgmLカナマイシンおよび05グルコースを添加した2×YT培地100mlを入れた500ml容振盪フラスコに培養物を移した。振盪インキュベーターにおいて37°Cで一晩、培養物を増殖させた。翌日、50μgmLカナマイシンを添加した2×YT液体培地250mlを入れた1L容振盪フラスコに培養物を移した。組換えタンパク質の発現を促進するために、培養フラスコに15mMになるまでIPTGを添加した。振盪インキュベーターにおいて37°Cで4時間、培養物を誘導した。C大腸菌からの封入体の単離細菌培養物をIPTG処理した後、5000gで15分間の遠心分離によって大腸菌細胞を単離した。上清を廃棄した。さらに使用するまで、細菌沈殿物を20°Cで保存した。抽出する前に、細菌沈殿物を1時間解凍した。解凍した沈殿物を再懸濁し、製造業者の取扱い説明書に従ってBPERを用いて溶解した。氷上に20分間置いた後、15000gで15分間の遠心分離によって封入体を回収した。上清を廃棄した。次いで、沈殿物を精製のために処理した。D精製1Hisタグ付き2DVCAM変異体の捕捉工程IMAC精製のために、大腸菌から単離された封入体を平衡緩衝液30ml中に溶解した。15000gで15分間の遠心分離によって、大型の砕片を除去した。上清をデカントし、上清の総体積を40mlにするのに十分な量の平衡緩衝液を添加した。溶解物を022μmフィルターに通してろ過し、続いて、Niセファロースカラムに添加した。Niセファロースカラムを10カラム容量の50mMTRIS、200mMNaCl、6M尿素、5mMDTTpH80で平衡化した。溶解物を添加した後に、20カラム容量の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。50mMTRIS、300mMイミダゾール、6M尿素、2mMDTTpH80中にタンパク質を溶出させた。2Hisタグ付き2DVCAM1変異体のリフォールディング1mM還元型グルタチオンおよび1mM酸化型グルタチオンを含む50mMTRIS、200mMNaClpH8に加えて希釈することによって、リフォールディングを遂行した。リフォールディングされたものにおけるタンパク質濃度は01mgmlまたはそれ以下に保った。尿素およびDTTの影響を打ち消すために、最小希釈率140を用いた。リフォールディングは、4°Cで一晩実現した。3SEC精製Superdex200カラムによって変異体をさらに精製するために、まず、CentriconPlus70遠心ろ過装置を用いて、リフォールディングされたタンパク質を約1mlになるまで濃縮した。濃縮されたタンパク質のおよそ半分をSuperdex200サイズ排除カラムに添加した。50mMTRIS、200mMNaClpH80でカラムを溶出させた。濃縮されたタンパク質の残り半分を用いて精製を繰り返した。タンパク質をSDSPAGEによって解析した。実施例9α4Fc、VLA4FcおよびLPAM1Fcの発現についてのELISAアッセイ法Aα4FcについてのELISAアッセイ法2μgmLmAbを添加したPBS100μLを用いて、Fcドメインに特異的なマウス抗ヒトIgG1mAbを黒色のMaxySorb96ウェルプレートに吸着させた。4°Cで約16時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄緩衝液200μLで2回洗浄し、続いて、25mgmLカゼインを含む洗浄緩衝液200μLによって21°Cで90分間、ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、培地試料と共に2時間インキュベートし、洗浄緩衝液で3回洗浄した。25mgmLカゼインおよび04μgmLビオチン標識抗ヒトインテグリンα4を添加した100μLウェルのPBSと共にプレートをインキュベートすることによって、α4Fc組換えタンパク質の検出を実施した。21°Cで90分間インキュベーションした後、プレートを3回洗浄し、25mgmLカゼインを添加した洗浄緩衝液中で200倍希釈した100μLウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンと共に30分間インキュベートした。オービタルシェーカー上で100μLウェルのSuperSignal化学発光基質と共にプレートを20分間インキュベートすることによって、HRPを検出した。発光シグナルをマイクロプレートシンチレーションおよび発光カウンターLiquidScintillationCounterLSCによって測定した。BVLA4Fcを推定するためのサンドイッチELISAPBS中2ugml抗CD49d抗体で、NUNCMAXISORPプレートを4°Cで一晩コーティングした。これらのプレートをPBSTで4回洗浄し、室温で1時間、PBS中3ミルクでブロッキングした。洗浄後、上清試料を2倍希釈して滴定した。また、各プレートは、10ugmlから始まる標準物質VLA4Fcの2倍タイトレーション系列も含んだ。PBST中1ミルクの存在下で結合を行った。室温で1時間インキュベーションした後、これらのプレートをPBSTで4回洗浄し、室温で1時間、1ミルクを含むPBSTに溶かした04ugmlのビオチン標識抗CD29抗体をウェル1個当たり50ul加えて、インキュベートした。これらのプレートをPBSTで4回洗浄し、PBST中で12000希釈したストレプトアビジンHRPと共にインキュベートし、もう一度、PBSTで4回洗浄した。50ulウェルのTMBPlus基質を添加し、発色するまで室温でインキュベートし、その後、2MH2SO4を用いて反応を停止させ、SoftMaxPlusソフトウェアを用いてプレートリーダーによってプレートを読み取ることによって、HRPを検出した。GraphPadPrismによってデータを解析して検量線を得、これを用いて、上清試料中のヘテロダイマーの濃度を算出した。CLPAM1Fcを推定するためのサンドイッチELISA上清中のα4Fcβ7Fcヘテロダイマーを推定するために使用したサンドイッチELISAは、上記で使用した手順と同様であり、以下の変更点を伴った。2ugmlのPBS中抗β7抗体でプレートをコーティングし、04ugmlのビオチン標識抗α4抗体を用いてヘテロダイマーを検出した。検量線をプロットするために、標準LPAM1Fcタイトレーションを各プレートに含めた。実施例102DVCAM1VLA4Fc結合についてのELISAアッセイ法対照タンパク質と比べた、固定されたVLA4Fcヘテロダイマーに対する様々な2DVCAM1変異体の相対的結合親和性を固相ELISAアッセイ法によって測定した。4°Cで一晩、TBSM中2ugmlのVLA4Fcヘテロダイマー50ulでMAXISORPELISAプレートをコーティングし、TBSTで洗浄し、室温で1時間、TBSM中3ミルク200ulでブロッキングし、TBSTで再び洗浄した。分析しようとする精製2DVCAM変異体の4倍希釈系列を、COSTARU底プレートにおいてTBSTMC中に開始濃度82uMで溶かして作製した。希釈系列をELISAプレートに移し、このプレートを室温で2時間インキュベートし、続いてTBSTで洗浄した。TBSTMC中05ugmlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体と共に室温で1時間インキュベーションし、次いで、TBSMTで洗浄し、その後、TBSTMC中ストレプトアビジンHRPの12000希釈物と共に室温で30分間インキュベーションすることによって、結合された2DVCAMタンパク質を検出した。TBSMTで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にしたTMBPlus基質50ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、5~15分の範囲であった。2MH2SO450ulを添加することによって発色を停止させた。SpectraMaxSoftmaxPro分光光度計を用いて、450nMにおける吸光度を迅速に測定し、GraphPadPrismソフトウェアを用いて、タンパク質濃度に対して吸光度をプロットすることによってEC50値を算出した。同じプレートで分析した対照タンパク質を基準とした結合の改善倍率を算出した。表3Aは、Q38L2DVCAM1またはヒト2DVCAM1のいずれかを基準とした、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドによって示されるVLA4への結合の改善倍率を示す。表3AELISAアッセイ法におけるVLA4Fcへの結合の改善倍率表3Bは配列置換の表を提供する。表3B実施例112DVCAM1LPAM1Fc結合についてのELISAアッセイ法対照タンパク質と比べた、固定されたLPAM1Fcヘテロダイマーに対する様々な2DVCAM変異体タンパク質の相対的結合親和性を固相ELISAアッセイ法によって測定した。4°Cで一晩、LPAM1Fcヘテロダイマー中2ugml50ulでMAXISORPELISAプレートをコーティングし、TBSTで洗浄し、室温で1時間、TBSM中3ミルク200ulでブロッキングし、TBSTで再び洗浄した。分析しようとする精製2DVCAM1変異体の4倍希釈系列を、COSTARU底プレートにおいてTBSTMC中に開始濃度82uMで溶かして作製した。希釈系列をELISAプレートに移し、このプレートを室温で2時間インキュベートし、続いてTBSTで洗浄した。TBSTMC中05ugmlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体と共に室温で1時間インキュベーションし、次いで、TBSTで洗浄し、その後、TBSTMC中ストレプトアビジンHRPの12000希釈物と共に室温で30分間インキュベーションすることによって、結合された2DVCAM1タンパク質を検出した。TBSTで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にしたTMBPlus基質50ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、5~15分の範囲であった。2MH2SO450ulを添加することによって発色を停止させた。SpectraMaxSoftmaxPro分光光度計を用いて、450nMにおける吸光度を迅速に測定し、GraphPadPrismソフトウェアを用いて、タンパク質濃度に対して吸光度をプロットすることによってEC50値を算出した。同じプレートで分析した対照タンパク質を基準とした結合の改善倍率を算出した。表4は、Q38L2DVCAM1を基準とした、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドによって示されるLPAM1への結合の改善倍率を示す。表4ELISAアッセイ法におけるLPAM1Fcへの結合の改善倍率実施例12表面プラズモン共鳴を用いた、VLA4Fc融合タンパク質およびLPAM1Fc融合タンパク質に対する2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性の測定本実施例では、Biacore相互作用解析を用いて、VLA4FcリガンドおよびまたはLPAM1Fcリガンドに対する結合親和性の改善に基づいて2DVCAM1変異体ポリペプチドをスクリーニングするための手順を説明する。このタイプの解析を説明するのに使用される学術用語では、固定された結合相手がリガンドと呼ばれ、移動相中の結合相手が分析物と呼ばれる。典型的には、結合親和性の強さは、利用可能なリガンドの50が平衡状態で結合される分析物のモル濃度を示す平衡解離定数の観点から説明される。このスクリーニング方法では、Biacoreセンサーチップを抗ヒトIgGで誘導体化した。これらの表面にVLA4FcリガンドまたはLPAM1Fcリガンドを捕捉した後、緩衝液に溶かした2DVCAM1変異体ポリペプチドに、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上を流れさせた。2DVCAM変異体ポリペプチドが特異的結合相手に結合する能力を評価した。また、対照タンパク質またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドにも、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上を流れさせ、これらの分子がVLA4FcまたはLPAM1Fcに結合する能力を比較用に同様に評価した。Biacoreシステムを用いて、VLA4FcリガンドまたはLPAM1Fcリガンドに結合する関心対象のタンパク質の結合速度定数および解離速度定数を評価し、平衡解離定数KDを算出するために使用することができる。ヒト2DVCAM1およびまたはQ38L2DVCAM1と比べてVLA4FcおよびまたはLPAM1Fcに対する結合親和性が高い変異2DVCAM1ポリペプチドを同定した。BIACORE解析はすべて、BIACORE2000システムまたはBIACORE3000システムを用いて室温で実施した。特に指定した場合を除いて、1mMMnCl2を添加したHBSP緩衝液、150mMNaCl、0005サーファクタントP20をすべての実験用のフローバッファーとして使用した。A動態学的2DVCAM1結合アッセイ法動態学的2DVCAM1アッセイ法では、センサーチップに塗られた二量体リガンドおよび単量体分析物の移動相における結合動態を測定する。製造業者のプロトコールに従って、ヤギ抗ヒトIgG抗体をCM5センサーチップに固定した。固定化緩衝液中で抗体を30μgmlになるまで希釈した。流速5μl分で、EDCNHS混合物35μlを注入し、続いて希釈抗体35μlを注入して、センサーチップCM5を活性化した。1MエタノールアミンHCl、pH8535μlによって未反応部位の反応を停止させた。この手順により、典型的には15000応答単位の結合抗体が得られた。実施例3および実施例4でそれぞれ説明した通りにして調製したVLA4FcまたはLPAM1Fcを、リガンド溶液20μlを注入することによって、抗体でコーティングしたセンサーチップに結合させた。リガンド捕捉レベルは典型的には200~300RUであった。2DVCAM1変異体ポリペプチドをHBSPMn中で希釈し、リガンドでコーティングしたセンサーチップの上に30μl分で2分間流し、続いて、タンパク質を含まないHBSPMnと共に同じ流速で5分間インキュベーションした。VLA4FcまたはLPAM1Fcからの解離速度が非常に遅い2DVCAM1変異体ポリペプチドの場合、より長い解離時間も用いて動態学的アッセイ法を行った。2DVCAM1変異体ポリペプチドのRmaxシグナルレベルは、約5~25RUの範囲であった。50μl分で10mMグリシン緩衝液と共に200秒間インキュベーションすることによって、サイクル間の再生を実施した。実際の実験での使用に先立って、新しいチップを4~5サイクルの捕捉結合再生に供した。ヤギ抗ヒトIgG捕捉抗体のみを含む参照セルからのデータを、補足されたVLA4FcまたはLPAM1Fcを含むフローセルから得られたデータから差し引いた。典型的には、2DVCAM1変異体ポリペプチドの150nM~0069nMの範囲の希釈物8種をブランク参照に対して解析した。各単量体融合タンパク質は、そのC末端がヒスチジンタグに共有結合的に融合されている、成熟2DVCAM1ポリペプチドまたは成熟した本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを含む。典型的なBiacore解析のセンサーグラムトレースを図3に示す。この図は、VLA4Fc融合タンパク質に対する次の2DVCAM1タンパク質の結合によって生じた応答の経時変化を示すヒト2DVCAM1Q38L2DVCAM1およびクローン146と呼ばれる例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチド。結合相は、関心対象の分析物と関心対象のリガンドとの結合を反映する。図3において、各分析物の結合相は、矢印を付けた時点より前の時点の曲線によって表され、VLA4Fcリガンドへの分析物、Q38L2DVCAM1、または2DVCAM1クローン146の結合を特徴とする。分析物がVLA4Fcリガンドと結合する速度は、曲線に反映されている。例えば、約620秒の時点で始まる応答単位の急激な上昇率を参照されたい。解析の解離相は、図3で矢印を付けた時点に始まる。解離相の間、分析物およびリガンドは、それらが結合した立体構造から解離する。図3において、分析物がVLA4Fcリガンドから解離する速度は、応答単位の減少によって表される。これらのデータに基づいて、相対的な解離速度定数および結合速度定数を決定することができる。相互作用の親和性の合計は、KD、すなわちによって説明することができる。結合親和性の増大は、より遅い解離速度によってしばしば顕在化する。このより遅い解離速度が、等しいか、より速いか、またはわずかに遅い結合速度を伴い、その結果、計算される平衡解離定数KDが小さくなる場合には、親和性がより大きいと考えられる。この場合、VLA4Fcリガンドに対する結合親和性が、同じリガンドに対する野生型2DVCAM1の結合親和性よりも大きい2DVCAM1変異体ポリペプチドは、野生型2DVCAM1よりもリガンドからの解離速度も遅いと考えられる。VLA4Fcリガンドに対する結合親和性が、同じリガンドに対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性よりも大きい2DVCAM1変異体ポリペプチドはまた、Q38L2DVCAM1ポリペプチドよりも遅いリガンドからの解離速度を有する場合がある。図3は、VLA4FcリガンドからのQ38L2DVCAM1ポリペプチドの解離速度が、同じリガンドからの野生型2DVCAM1ポリペプチドの解離速度より有意に遅いことを示す。また、Q38L2DVCAM1ポリペプチドがVLA4Fcリガンドに結合するための結合速度は、野生型2DVCAM1において観察されるものに似ている。したがって、野生型2DVCAM1と比べて、Q38L2DVCAM1ポリペプチドの方がVLA4Fcリガンドに対する親和性が高い。図3はまた、例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの方が、野生型2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドのいずれかよりもVLA4Fcリガンドからの解離速度が遅いことも示す。また、例示的な2DVCAM1変異体ポリペプチドは、VLA4Fcリガンドに対する野生型2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドのいずれかの結合速度と比べて、VLA4Fcリガンドに結合するための結合速度が同様である。したがって、例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの方が、野生型2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドのいずれかよりも、VLA4Fcリガンドに対して高い結合親和性を示す。したがって、例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒトなどの哺乳動物のローリング白血球においてインビボで発現される、例えば活性化VLA4を含む天然VLA4に、より高い結合親和性で結合すると予想される。この結論は、下記の実施例で考察する機能的な細胞ベースのアッセイ法によってさらに裏付けられる。本発明の他の2DVCAM1変異体ポリペプチドを用いて、前述した通りにしてBiacore解析を実施した。さらに、LPAM1Fcでコーティングしたセンサーチップおよび本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドを用いて、Biacore解析を実施した。図4は、LPAM1Fc融合タンパク質に対する次の2DVCAM1タンパク質の結合によって生じたある期間に渡るのセンサーグラムトレースを示すヒト2DVCAM1Q38L2DVCAM1およびクローン146と呼ばれる例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチド。これらの2DVCAM1変異体ポリペプチドの解離速度および結合親和性を測定し、野生型2DVCAM1およびQ38L2DVCAM1ポリペプチドの解離速度および結合親和性と比較した。代表的な結果を下記の表5および表6に示す。B標準的なBIACOREデータ解析センサーグラムの再生部分および捕捉部分を削除した後、試料注入の約10秒前のすべての曲線の5秒間の平均に曲線の0の位置を合わせた。各試験曲線からブランク曲線を差し引いた。フィットカイネティクス、同時kakd機能を用いて、BIAevaluationソフトウェアによってデータを解析した。注入開始時期は、すべての曲線が0に近い、結合相の前の時点と定義した。結合相についてのデータ選択は、注入開始時点から約10秒後に開始し、注入停止時点より約10秒前に終了した。注入停止時点は、解離相に関連する任意のシグナルスパイクが出現する前の時点と定義した。解離相は、注入停止時点から10秒後に開始するように選択し、5分の解離相の内の280~295秒を含んだ。11ラングミュアモデルは、反応ABABを説明する。このモデルは、関心対象の単一のタンパク質に対する単一のリガンド結合を表す。BIAevaluationソフトウェアの11ラングミュアモデルを用いて、結合速度定数および解離速度定数を決定し、平衡解離定数KDを算出した。KDkdka。KDAB。平衡解離定数KDは、平衡結合定数KAの逆数に等しい。KD1KA。反応の速度式は、次の通りであるdBdtおよびdABdtkaABkdAB。ABを所与の時点のBiacore応答単位Rで、BをRmaxRで、およびAをCで置き換えることにより、Biacore単位の正味の速度式は、dRdtkaCkdRとなり、総応答ABRIとなる。バルクシフトを0に設定し、全曲線に対してRmax、ka、およびkdを全体的にフィットさせた。前述の標準的な動態学的アッセイ法およびデータ解析を、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドならびにQ38L2DVCAM1ポリペプチドおよびヒト2DVCAM1ポリペプチドの調製物に対して実施した。表5および表6は、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドについての結合データを要約する。表5A表5Aは、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した、VLA4Fcに対する代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。具体的には、表5Aは、本発明の各2DVCAM1変異体ポリペプチドの呼称2DVCAM1ポリペプチドまたはポリペプチド変異体のポリペプチド配列に対応する配列識別番号VLA4Fcに対する2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合に基づいて決定された平衡解離定数およびVLA4Fcに対する野生型2DVCAM1の結合親和性と比べた、VLA4Fcに対する各2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。この相対的結合親和性は、VLA4Fcに対する野生型2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と比べた、VLA4Fcに対する2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性の改善倍率として示す。さらに、ヒト2DVCAMのVLA4Fc結合親和性と比べた、Q38L2DVCAM1ポリペプチドのVLA4Fc結合親和性の改善倍率も示す。表5Aに示した通り、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドのVLA4Fc結合親和性は、VLA4Fcリガンドに対する野生型2DVCAM1の結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きいかつまたはVLA4Fcリガンドに対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きい。VLA4Fcに対する野生型2DVCAM1の結合親和性を基準としたVLA4Fcリガンドに対する結合親和性の改善倍率を、代表的な各2DVCAM1変異体について示す。本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの多くが、VLA4Fcからの野生型2DVCAM1の解離速度よりも遅い、VLA4Fc融合タンパク質からの解離速度を有することが判明した。表5Aに示す代表的な2DVCAM1変異体ポリペプチドはすべて、野生型2DVCAM1のVLA4Fc平衡解離定数より小さいVLA4Fc平衡解離定数を有していた。さらに、表5Aに示す2DVCAM1変異体ポリペプチドの大半が、Q38L2DVCAM1ポリペプチドのVLA4Fc平衡定数より小さいVLA4Fc平衡解離定数を有していた。表5Aに示す代表的な2DVCAM1変異体ポリペプチドはすべて、ヒト野生型2DVCAM1のVLA4Fc結合親和性より大きいVLA4Fc結合親和性を有していた。さらに、表5Aに示す2DVCAM1変異体ポリペプチドの多くは、Q38L2DVCAM1ポリペプチドのVLA4Fc結合親和性より大きいVLA4Fc結合親和性を有していた。ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドのVLA4Fc結合親和性と比べてVLA4Fcリガンドに対する結合親和性が大きい本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドとそれぞれ比べて、インビボで炎症を抑制する際の有効性が高くなっている可能性が高い。このような本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、炎症部位へのリンパ球および単球の動員を阻害する上で極めて有効であり、したがって、様々な炎症性疾患および自己免疫に関連した障害の有効な治療薬である可能性がある。表5Bは、新しいポリペプチド調製物および新しいVLAFcリガンドを用いて再試験し、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した場合の、VLA4Fcに対する代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。対照のヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドは再分析しなかった。表5B表6Aは、標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した、LPAM1Fcに対する代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。表6A具体的には、表6Aは、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドそれぞれについて、LPAM1Fcリガンド結合に関する平衡解離定数および同じリガンドに対する野生型2DVCAM1融合タンパク質の結合親和性と比べた、LPAM1Fcに対する結合親和性を提供する。各2DVCAM1変異体ポリペプチドについて、LPAM1Fcリガンドに対する野生型2DVCAM1融合タンパク質の結合親和性と比べた、LPAM1Fcリガンドに対する結合親和性の改善倍率を示す。野生型ヒト2DVCAM1は基準となる。すなわち、LPAM1Fcへのその結合親和性を1に設定する。表6Aに示した通り、代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドのLPAM1Fcリガンドに対する結合親和性は、LPAM1Fcリガンドに対する野生型2DVCAM1の結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きいかかつまたはLPAM1Fcリガンドに対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性と少なくともほぼ等しいか、もしくはそれより大きい。いくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドが、同じリガンドからの野生型2DVCAM1の解離速度とほぼ等しいか、またはそれより大きい、LPAM1Fcリガンドからの解離速度を有することが判明した。いくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、同じリガンドへの野生型2DVCAM1融合タンパク質の結合速度とほぼ等しいか、またはそれより大きい、LPAM1Fcへの結合速度を有することが判明した。表6に示す多くの代表的な2DVCAM1変異体ポリペプチドは、野生型2DVCAM1のLPAM1Fc平衡解離定数より小さいLPAM1Fc平衡解離定数を有していた。さらに、表6Aに示すいくつかの代表的な2DVCAM1変異体ポリペプチドが、Q38L2DVCAM1ポリペプチドのLPAM1Fc平衡定数と少なくともほぼ等しいLPAM1Fc平衡解離定数を有していた。表6Aに示す多くの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、同じリガンドに対するヒト野生型2DVCAM1の結合親和性より大きいLPAM1Fc結合親和性を有していた。さらに、表6Aに示すいくつかの2DVCAM1変異体ポリペプチドは、同じリガンドに対するQ38L2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性とほぼ等しいLPAM1Fc結合親和性を有していた。表6Bは、新しいポリペプチド調製物および新しいLPAM1Fcリガンドを用いて再試験し、前述の標準的なBIACOREアッセイ法によって測定した場合の、LPAM1Fcに対する代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの結合親和性を示す。対照のヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1ポリペプチドは再分析しなかった。表6BVLA4に対する結合親和性とLPAM1に対する結合親和性を比較すると、例示的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの多くが、ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1のいずれかによって示されるVLA4LPAM1結合親和性の比率よりも大きい、VLA4LPAM1結合親和性の比率を示すことが明らかである。言い換えると、いくつかの本発明の2DVCAM1変異体は、VLA4およびLPAM1に対するヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1のいずれかの相対的親和性と比べると、LPAM1に対する結合親和性よりもVLA4に対する結合親和性においてより大きい改善を示す。表7は、ヒト2DVCAM1の値を基準として、Q38L2DVCAM1ポリペプチドおよび代表的な本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドに対するVLA4FcおよびLPAM1Fcの結合親和性比率を提供する。これらの比率は、対照および変異体の両方を分析した実験に基づく、表5Aおよび表6Aに示す実験データから導き出した。表7ヒト2DVCAM1またはQ38L2DVCAM1の結合親和性比率と比べて高いVLA4LPAM1結合親和性比率を有する2DVCAM1変異体ポリペプチドは、LPAM1結合が望ましくない場合、例えば、LPAM1結合が、進行性多巣性白質脳症などの有害な副作用と相関している場合、特に有利であり得る。実施例13α4インテグリン妨害についての静的細胞接着アッセイ法2DVCAM1変異体が細胞表面ヒトVLA4に結合するために、固定されたVCAM1タンパク質と競合する能力を、U937VCAM1細胞接着アッセイ法を用いて定量した。細胞表面にVLA4を有するU937細胞を蛍光色素カルセインAMで標識し、2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび対照の存在下または非存在下で7DVCAM1に結合させた。粘着性細胞に関連した蛍光強度の低下は、VLA4を媒介とした細胞接着が2DVCAM1変異体ポリペプチドおよび対照によって競合的に阻害されていることを反映していた。最初に、これは、コーティング用緩衝液100μlに溶かした5μgmlの組換えヒト7DVCAM1で96ウェルプレートをコーティングすること、各プレートを密閉すること、およびプレートを37°Cで2時間インキュベートさせることを伴った。逆さまにしてコーティング溶液をデカントし、ブロッキング緩衝液200μlを添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。分析する直前に、VCAM1でコーティングしたプレートを、手作業でまたは96ウェルプレート自動洗浄装置を用いることによってPBS中005TWEEN20で3回洗浄し、次いで、プレートを逆にし、ブロットした。10FBS、1PenStrepを含むRPMI1640培地中でU937細胞を維持した。分析する前に、標識用緩衝液中にU937細胞を再懸濁し、次いで、ローテーターにおいて37°Cで30分間、05μgmlカルセインAMで標識した。続いて、標識用緩衝液で細胞を3回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液中に5×106細胞mlとなるように再懸濁した。試験化合物を希釈緩衝液中に希釈し、VCAM1でコーティングしたプレートに添加した。希釈緩衝液100μlで満たしたVCAM1でコーティングしたウェルを、固定されたVCAM1に対する最大量の細胞粘着を示すための対照として使用した。10μgml抗VLA4抗体100μlを、細胞粘着の最大限の阻害を示す陽性対照として使用した。VCAMではないタンパク質でコーティングされたウェルをブランクとして使用した。カルセインAMで標識した細胞100μlを各ウェルに添加した。室温で20分間、プレートをインキュベートし、静置式細胞接着洗浄チャンバーにおいてアッセイ緩衝液で洗浄した。LJLAnalystHT96384を用いて蛍光強度を測定する前に、280×gで5分間、プレートを遠心沈殿させ、逆さまにしてアッセイ緩衝液をデカントした。図5は、抗VLA4抗体、希釈緩衝液のみ、2DVCAM1変異体クローン46、Q38L2DVCAM1ポリペプチド、およびヒト2DVCAM1の細胞接着指数を示すグラフである。細胞接着指数は、として算出した。VCAM1でコーティングされていないウェルに細胞接着指数1を与える。図5は、100μgmlの2DVCAM1変異体クローン46が、抗VLA4抗体とほぼ同じくらいU937細胞接着を阻害したことを示す。これに対して、100μgmlのQ38L2DVCAM1は、U937細胞接着の部分的な阻害しか示さず、100μgmlのヒト2DVCAM1はU937細胞接着の阻害を本質的に全く示さなかった。図6は、様々な濃度の可溶性2DVCAM1ポリペプチドの存在下での、固定されたVCAM1に対するU937細胞接着の滴定曲線を示す。これらの曲線から、変異体クローン46および変異体クローン146のIC50はそれぞれ64nMおよび08nMであると推定された。Q38L2DVCAM1ポリペプチドは全面的な阻害を示さず、IC50は推定されなかった。図6に示す細胞結合の阻害曲線は、GraphpadPrismソフトウェアにおいて非線形回帰モデル最大値および最小値、Y最小値×ヒル勾配を用いて作成して、IC50値を推定した。実施例142DVCAM1変異体ポリペプチドは実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおいて有効である以下の実施例から、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが、ヒト多発性硬化症の認識された動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスモデルにおいて麻痺の発生を遅らせ、疾患症状の重症度を緩和するにあたって、インビボで有効であることが実証される。EAEは、急性又は慢性の、再発性、後天性、炎症性、かつ脱髄性の自己免疫疾患である。一般に、EAEは、神経細胞を取り囲む絶縁性の鞘であるミエリン中に存在するタンパク質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質またはプロテオリピドタンパク質を動物に注射することによって誘導される。あるいは、これらのタンパク質の公知のエピトープに対応する配列を有する合成ペプチドが注射される。注射されたタンパク質または免疫原性ペプチドは、動物において自己免疫応答を誘導し、その結果、動物の免疫系がそれ自身のミエリンに対して攻撃を開始する。動物は、ヒトのMSによく似ている疾患過程を経験する。6~7週齢の雌SJLマウスを計量し、不完全フロイントアジュバントに溶かした1000ugmlPLP、Anaspecおよび2mgml結核菌H37Raの乳濁液合計100ulを側腹部に皮下注射した。1群当たり7~8匹の動物からなる4群にマウスを分けた。7日目から開始して15日目まで、マウスを未処置で放置するか、またはラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS2を1日おき、2DVCAM1変異体クローン59を毎日、もしくは2DVCAM1変異体クローン146を毎日、100ugを静脈内に注射するかした。免疫化後、マウスを毎日観察し、膿瘍などの注射部位の合併症を検査した。注射後10日目から開始して、1日おきに体重を測定し、動物を毎日視診し、疾患の進行をグレード分けした。以下の通りに、疾患進行の標準的なグレード分け方式を使用した。表840またはそれより高いスコアが動物に与えられた場合、人道的に安楽死させた。15日目を過ぎると、対照群の観察を中止した。図7に示した通り、2DVCAM変異体ポリペプチドで処置した動物では、未処置動物と比べて、EAE症状の発生は遅れ、疾患の全般的重症度は低下した。2DVCAM1変異体クローン146は、クローン2DVCAM1変異体クローン59よりも有効であると思われた。これは、これら2種の分子のVLA4インテグリン結合親和性の差と相関がある可能性がある。未処置群、クローン59処置群、およびクローン146処置群における疾患発症までの平均日数は、それぞれ96±08日、111±14日、および128±11日であった。これらは、統計学的に有意な改善である。マウスEAEモデルにおいて動物を疾患から保護する際のさらなる改善は、2DVCAM1変異体の投薬量レベルおよび投薬頻度を最適化し、PEG試薬で改変したものなどの半減期を長くした2DVCAM1変異体を用いることによって、実現することができる。これらの結果から、VLA4インテグリン結合親和性を示す本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドがげっ歯動物EAEモデルにおいて有効であることが示され、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが多発性硬化症および関連障害の治療において有効であることが示唆される。実施例15タグ無し2DVCAM1変異体ポリペプチドのリフォールディング、PEG化および精製以下の実施例は、ポリペプチドのN末端に融合されるヒスチジンタグを伴わずに発現される本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドをリフォールディング、PEG化、および精製するための例示的手順を提供する。この手順を用いて、タグ無しのクローン146および本発明の他の変異体をリフォールディング、PEG化、および精製した。1捕捉段階大腸菌由来の封入体を25mM酢酸ナトリウム、25mMNaH2PO4、8M尿素、pH4に調整した。この材料を室温で一晩インキュベートし、次いで、20000RPMで1時間遠心分離して、不溶性構成要素を除去した。022μmフィルターを用いて上清をろ過し、次いで、素通りモードのSartobindQMiniフィルターに添加して、DNAを除去した。可溶性タンパク質を添加する前に、25mM酢酸ナトリウム、25mMNaH2PO4、8M尿素、pH4でSartobindフィルターを平衡にした。25mM酢酸ナトリウム、25mMNaH2PO4、8M尿素、pH4で平衡にしたSPセファロースFFカラムに添加する前に、05MHClでSarobindQ素通り材料をpH4に再び調整した。平衡緩衝液で洗浄した後、25mM酢酸ナトリウム、25mMNaH2PO4、300mMNaCl、8M尿素、pH4中にタンパク質を溶出させた。2タグ無し2DVCAM1変異体のリフォールディング最終濃度が03Mになるまで尿素を補充した50mMTris、2mM酸化型グルタチオン、1mM還元型グルタチオン、pH8に加えて希釈することによって、リフォールディングを遂行した。最小希釈率1267を用いてリフォールディング物のタンパク質濃度を02mgmlで維持して、尿素濃度が03Mを超えるのを防いだ。最低40時間かけて、4°Cでリフォールディングを実現した。3QセファロースHP精製25mMTris、pH6で平衡にしたQHPカラムにリフォールディング物を添加することによって、リフォールディングされた材料の精製を実現した。平衡緩衝液で洗浄した後、勾配を用いて、25mMTris、100mMNaCl、pH6中にタンパク質を溶出させた。4PEG化のための予備処理下記の2つの方法の内の1つを用いて、PEG化のために2DVCAM1変異体を予備処理した。分子量カットオフ値35Kの透析カセットを用いて、100mMNaH2PO4にタンパク質を加えて透析し、次いで、3KMWCOの遠心濃縮装置を用いて1~5mgmlの間の濃度に濃縮した。または、50mMKH2PO4、001Tween80、pH48で平衡にしたSPセファロースFFカラムにタンパク質を添加した。平衡緩衝液でカラムを洗浄し、次いで、50mMKH2PO4、200mMKCl、001Tween80、pH5を用いて溶出させた。05MHClを用いて、溶出液をpH4に調整した。5タグ無し2DVCAM1変異体のN末端PEG化1~4mgmlのタンパク質を、タンパク質に対して2~1倍モル過剰の50K分枝PEGアルデヒドおよび063mgmlNaCNBH3と反応させた。反応物を室温で3時間インキュベートした。6SPセファロースHPによるモノPEG化2DVCAM1変異体の単離PEG化された材料を、導電率が8mScm未満になるように水で希釈し、各20mMのリンゴ酸、クエン酸、コハク酸、NaH2PO4、およびHEPES、001Tween80、pH4で平衡にしたSPセファロースHPカラムに添加した。平衡緩衝液で洗浄した後、勾配を用いて、各20mMのMCSPH、100mMNaCl、001Tween80、pH55中にタンパク質を溶出させた。モノPEG化画分を集め、3KMWCOの遠心濃縮装置を用いて濃縮し、35KMWCO透析カセットを用いてバッファーをPBSに交換した。SDSPAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析した。あるいは、上記の段階3および4を下記の段階3で置き換えてもよい。3セラミックヒドロキシアパタイトI型精製リフォールディングされたタンパク質を1mMNaH2PO4、50mMMES、pH6に調整し、1mMNaH2PO4、50mMMES、150mMNaCl、pH6で平衡にしたCHTカラムに添加した。平衡緩衝液、次いで、5mMNaH2PO4、150mMNaCl、pH6でカラムを洗浄した。次いで、19mMNaH2PO4、243mMNaCl、pH65でタンパク質を溶出させた。05MHClを用いて、溶出液をpH4に調整した。段階3はまた、Capto混合モードクロマトグラフィーで置き換えてもよい。実施例16N末端がPEG化された2DVCAM1変異体の延長された半減期およびインビボでの活性有効性前述した通りにして、例示的な2DVCAM1変異体クローン146を大腸菌中で作製し、50K分枝PEGアルデヒド試薬を用いてN末端をPEG化した。PEG化されたクローン146分子は、PEG化されていないクローン146ポリペプチドよりも有意に長い半減期をマウス血清において示した。表9マウスにおいて、抗α4インテグリン抗体PS2は、未成熟リンパ球上で発現されたVLA4と骨髄細胞上で発現されたVCAM1との相互作用を阻害し、したがって、末梢血白血球増加症と呼ばれるプロセスにおいて未成熟リンパ球が骨髄から末梢血へと出て行く原因となる。同様に、PEG50146分子は、マウスおよびカニクイザルにおいて末梢血白血球の増加を誘導し、その結果、2DVCAM1変異体結合体がインビボでVLA4とVCAM1の相互作用を阻害することが示唆された。また、PEG50146分子は、PLP投与後6日目、8日目、10日目、および13日目に3mgkgの量で投与された場合、未処置の対照と比べて、雌SJLマウスにおけるEAE症状の発生を遅らせることにより、インビボの活性を示した。表10実施例17N末端をPEG化された2DVCAM1変異体ポリペプチドは実験的自己免疫性脳脊髄炎モルモットモデルにおいて有効である以下の実施例から、N末端をPEG化された本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが、ヒト多発性硬化症の認識された動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎モルモットモデルにおいて麻痺の発生を遅らせるにあたって、インビボで有効であることが実証される。完全フロイントアジュバントに溶かしたモルモット脳全体のホモジネートおよび結核菌を0日目に注射することによって、雌ハートレイ系モルモットを免疫化した。1群当たり9匹の動物からなる群にモルモットを分けた。13日目から、モルモットを未処置で放置するか、または50Kの分枝PEGアルデヒド試薬でN末端をPEG化した2DVCAM1変異体クローン146もしくは80Kの分枝PEGアルデヒド試薬でN末端をPEG化した2DVCAM1変異体クローン146を13日目、15日目、および17日目にモルモットに皮下注射した。ヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブ3mgkgを13日目に投与した。免疫化後、モルモットを毎日観察し、疾患の進行をグレード分けした。以下のように、疾患進行の標準的なグレード分け方式を使用した。表11図8に示した通り、未処置の対照と比べて、PEG50146ポリペプチドおよびPEG80146ポリペプチドで処置した動物においてEAE症状の発生が遅れた。PEG50146およびPEG80146で処置した動物は、免疫化後約19日目および21日目まで、またはポリペプチドの最終投与後2日目および4日目まで、モルモットを疾患から保護した。ナタリズマブで処置した動物もまた、疾患から保護され、24日目または薬物の最終投与後11日目に疾患の症状を示し始めた。薬物の最終投与後に動物が疾患を発症するのにかかる時間の長さがこのように異なるのは、PEG化2DVCAM1変異体ポリペプチドと対照抗体とでVLA4受容体占有の薬物動態およびまたは持続期間が異なることを反映している可能性がある。これらの結果から、N末端をPEG化された本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドがVLA4インテグリン結合親和性を示し、EAEげっ歯動物モデルにおいて有効であることが示される。また、データから、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが多発性硬化症および関連障害の治療において有効であることが示唆される。実施例18カニクイザルにおいてPEG50146の血清中濃度を検出するためのELISAアッセイ法カニクイザルへのPEG50146ポリペプチド皮下投与後の様々な時点における動物血清中の機能的PEG50146の量を、固相ELISAアッセイ法を用いて測定した。4°Cで一晩、TBSKCl中1ugmlのVLA4Fcヘテロダイマー50ulでMAXISORPELISAプレートをコーティングし、TBSTで洗浄し、室温で1時間、TBSKCl中1ウシ血清アルブミン200ulでブロッキングした。5ugmlから始まるPEG50146の5倍希釈物からなる検量線を、カニクイザル血清を含む1BSA含有TBSKClにおいて調製した。1BSAおよび20サル血清を含むTBSKCL中で2倍系列希釈を調製することによって、実験的な未知試料を調製した。PEG50146および実験的な未知試料の両方をELISAプレートに移し、このプレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートし、続いてTBSTで洗浄した。1BSA含有TBSKCl中025ugmlビオチン標識抗ヒトVCAM抗体と共に振盪しながら室温で1時間インキュベーションし、次いで、洗浄し、その後、1BSA含有TBSKCl中ストレプトアビジンHRPの1100000希釈物と共に室温で1時間インキュベーションすることによって、結合されたPEG50146タンパク質を検出した。TBSTで最終的な洗浄を行った後、暗所で室温と同等の温度にしたTMBPlus基質緩衝液100ulを各ウェルに添加し、発色を目で見て追跡した。典型的な顕色時間は、15分±2分の範囲であった。停止溶液50ulを添加することによって発色を停止させた。450nMでの吸光度をSpectraMaxSoftmaxPro分光光度計を用いて迅速に測定した。50Kの分枝PEGアルデヒド試薬でN末端をPEG化した2DVCAM1変異体クローン146またはPEG50146を、0日目にカニクイザルに皮下注射した。投与後8時間目、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、および144時間目に血清試料を採取した。1群当たりの動物は4匹であった。前述のELISA法によって、機能的PEG50146ポリペプチドの量について血清試料を解析した。図9Aに示した通り、03mgkgおよび3mgkgのPEG50146を皮下投与した後の血清中PEG50146の量は、24時間目の時点でそれぞれ約300ngmlおよび1300ngmlである。次いで、血清中PEG50146ポリペプチドの量は、20~60時間の範囲のおおよその半減期で減少する。VLA4Fcに結合できるPEG50146の量は、低用量群において投与後144時間目の時点でアッセイ法の限界値を下回っている。実施例192DVCAM1変異体ポリペプチドは末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現を減少させない蛍光活性化細胞選別アッセイ法を用いて、末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの表面発現に対する2DVCAM1ポリペプチド結合の影響をマウスおよびカニクイザルの両方において検査した。Aマウス末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの細胞表面発現の評価EDTA中に採取したマウス全血を1×溶解用緩衝液で110希釈し、穏やかにボルテックスし、室温で5分間インキュベートし、1熱失活ウシ胎児血清を加えたPBS中で洗浄した。次いで、細胞懸濁液をマウスFcBlockと共に5分間インキュベートした。次いで、FITCに結合させたラット抗マウスB220抗体およびPEに結合させたノンブロッキングラット抗マウスCD49dモノクローナル抗体またはノンブロッキングハムスター抗マウスCD29ビオチン標識抗体を用いて、末梢B細胞上のα4インテグリンまたはβ1インテグリンの細胞表面レベルに関して細胞を二重染色した。1200希釈したストレプトアビジンPEを用いて、ビオチン標識抗マウスCD29を検出した。アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。2FBSを加えたPBS中に、染色された細胞を再懸濁し、FACSCaliburによって分析した。フローサイトグラムを作成して、各細胞表面マーカーについて陽性である細胞の割合を明らかにした。ヨウ化プロピジウムの排除に基づいて、生存リンパ球を選択した。抗体陽性細胞の比率を算出するための分母として使用するリンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲートをかけた。0日目、2日目、および4日目に、04mgkgのPEG50146または3mgkgのラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体PS2またはPBSを雌Balbcマウスに皮下注射した。1群当たり5匹の動物からなる3群にマウスを分けた。1日目、2日目、4日目、5日目、6日目、7日目、および8日目に各群から全血を採取し、集め、前述のアッセイ法を用いてフローサイトメトリーによってB220末梢B細胞上のα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルを解析した。3日目には試料を採取しなかった。図10に示す通り、PBSで処置した対照と比べて、PEG50146で処置したマウスでは、CD49dである末梢B細胞の百分率に変化はなかった。一方、PS2の場合、処置後早くも1日目にCD49B細胞の百分率が減少した。PS2処置によるCD49B細胞の百分率のこの減少は、7日目まで約55で維持された。8日目に、CD49B細胞の百分率は正常化し始め、PS2抗体の最終投与後4日目に90陽性に達した。β1インテグリンの細胞表面レベルもまた、PEG50146処置マウスにおいて不変であったのに対し、PS2処置マウスでは1回の皮下投与後にβ1インテグリン陽性B細胞の減少が観察可能であった。表12表13に示す通り、ラット抗マウスα4インテグリンモノクローナル抗体R12によってマウスを処置した場合も、3mgkgのR12で処置したBalbcマウスの脾臓中のCD49dB細胞およびCD29B細胞の数が減少した。R12は、PS2のエピトープと比べて異なるα4インテグリン上のエピトープに結合する。表13これらの結果から、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドは、抗α4モノクローナル抗体PS2およびR12とは違って、末梢B細胞におけるα4インテグリンまたはβ1インテグリンの細胞表面発現を低減させないことが示される。また、これらの結果から、B細胞上のα4インテグリンおよびβ1インテグリンの減少が、細胞表面のα4インテグリンに二価で結合し架橋するモノクローナル抗体の一般的特性であり得ることが示唆される。Aカニクイザル末梢血リンパ球におけるα4インテグリンおよびβ1インテグリンの細胞表面発現の評価K3EDTAで処理したチューブ中に、フローサイトメトリー解析用の全血試料を集めた。溶解洗浄方法を用いて、単離された白血球を、CD3に対する抗体APCCy、BDBiosciences、カタログ番号557757、CD20に対する抗体、CD29に対する抗体、およびCD49dに対する抗体で染色した。FACSCantoIIおよびFACSDiva解析ソフトウェアを用いて、フローサイトメトリーのデータを捕獲した。FACSDiva解析ソフトウェアを用いて、取得データを解析した。フローサイトグラムを作成して、各細胞表面マーカーについて陽性である細胞の割合を明らかにした。抗体陽性細胞の比率を算出するための分母として使用するリンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲートをかけた。個々のリンパ球部分集団の絶対計数は、リンパ球ゲートおよびAdvia120HematologyAnalyzerによるリンパ球絶対計数から次の式に従って導き出された相対比率から算出されるリンパ球絶対計数×全リンパ球絶対計数100。1日目に、03mgkgのPEG50146もしくは3mgkgのPEG50146または3mgkgのヒト化抗α4インテグリンモノクローナル抗体ナタリズマブを雄カニクイザルに皮下注射した。これらの動物を、それぞれ4匹の動物からなる3群に分けた。投与の4日前、投与後2、34、および5日目に全血試料を採取し、前述のアッセイ法を用いてフローサイトメトリーによってCD20末梢B細胞およびCD3末梢T細胞上のα4インテグリン細胞表面レベルおよびβ1インテグリン細胞表面レベルを解析した。図11Aに示した通り、カニクイザルすべての末梢血中のCD49dB細胞のベースラインの百分率は、4日前の3群の動物すべてにおいて約70~80であった。薬物投与後2~5日目において、PEG50146で処置したサルの末梢血中のCD49dB細胞の百分率は96~97であった。PEG50146群において投与前から投与後2日目までにCD49dB細胞の百分率が増加したのは、実施例16において説明する通りにVCAM1とVLA4の相互作用の妨害の結果として生じる、血液中の末梢リンパ球の全体的増加を反映している可能性が最も高い。ナタリズマブで処置した動物における白血球増加は、PEG50146を単回投与した場合に観察された白血球増加と同程度~上回る程度であったにもかかわらず、末梢におけるCD49dB細胞の百分率は、2日目および3日目の間、約68のままであり、その後、93~94陽性まで増加した。2日目および3日目における、PEG50146群と比べたナタリズマブで処置した動物におけるCD49dB細胞の百分率の差は、統計学的に有意であった。また、ナタリズマブで処置されたサルにおいてはCD49dT細胞百分率の同様の減少も観察されたが、どちらのPEG50146処置群もCD49dT細胞百分率に影響を及ぼさなかった。表14図12Aに示す通り、処置前試料と比べて、いずれかの用量のPEG50146で処置したサルにおいて、CD29末梢B細胞の百分率に有意な変化はなかった。一方、ナタリズマブで処置されたサルにおけるCD29B細胞の百分率は、4日前と2日目とで約2分の1に減少した。ナタリズマブで処置されたサルにおけるCD29B細胞の百分率の減少は、2日目、3日目、4日目、および5日目のPEG50146投与群での比率と比べて統計学的に有意であった。ナタリズマブで処置されたサルにおいてはCD29T細胞百分率の同様の減少が観察されたが、どちらのPEG50146処置群もCD29T細胞百分率に影響を及ぼさなかった。図11および図12の結果から、PEG50146は、試験したいずれの用量によっても、カニクイザルの末梢B細胞または末梢T細胞におけるα4ヘテロダイマーインテグリン接着分子またはβ1ヘテロダイマーインテグリン接着分子の細胞表面発現を減少させないことが示される。これらの結果は、末梢リンパ球表面においてα4インテグリンレベルおよびβ1インテグリンレベルの両方が低下したナタリズマブ処置サルにおいて観察された結果とは対照的である。2日目~3日目に認められた、ナタリズマブ処置によるα4レベルの一時的な下方調節は、内因性サルIgG4抗体との鎖交換が原因で、これらの動物の血清中に存在する二価のインタクトなナタリズマブ抗体が、VLA4結合について本質的に一価であるナタリズマブに変換することを反映している可能性が最も高い。これは、二価の機能的ナタリズマブの大多数が薬物投与後3日目と4日目の間にサルから消失したことを示すELISAデータによって裏付けられた。サル血清中の機能的ナタリズマブの濃度は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヒトIgG4に対するマウスモノクローナル二次抗体を用いて結合されたタイサブリを検出したことを除いては実施例18において説明したものと同様のELISAアッセイ法におけるヒトVLA4Fcの結合に基づいて決定した。ナタリズマブと内因性ヒトIgG4とのIgG4鎖交換が、患者および動物において観察されている767771ShapiroRIetalJPHarmBiomedAnal55168175。マウスおよびヒトにおいて抗4モノクローナル抗体について観察された通り、サルへのナタリズマブの複数回投与が、動物において定常状態レベルの二価ナタリズマブを維持し、末梢リンパ球上の細胞表面VLA4の下方調節を維持した可能性が最も高いWipfleretalMultSchler171623HarreretalJNeuroimmunolNatalizumabtherapydecreasessurfaceexpressionofbothVLAheterodimersubunitsonperipheralbloodmononuclearcellsEpub。ナタリズマブの単回投与は、β1を含むインテグリン受容体に持続的な影響を与え、サルにおいて5日目まで受容体下方調節が観察された。β1は少なくとも9個の異なる鎖と非共有結合的に結合するため、これは、VLA4およびLPAM1以外の細胞接着分子に対するナタリズマブのより幅広い影響を反映している可能性がある。β1を含む接着分子に対するナタリズマブのこの影響は、免疫監視および炎症部位への免疫細胞の遊走などこれらの接着分子に依存する免疫学的活性に対する多大な影響を有する可能性がある。PEG50146は接着分子の細胞表面発現に影響を与えないため、α4モノクローナル抗体と比べて、免疫監視、免疫細胞トラフィッキング、免疫ホメオスタシス、およびJCウイルスなどの日和見性の感染症のリスクに対する影響が小さい可能性がある。実施例20クローン146の配列最適化2DVCAM1変異体クローン146の配列最適化された変異体12種からなる第1のセットをGeneArtによって設計および合成した。配列最適化された変異体は、2DVCAM1変異体クローン146中に存在する7種の変異の様々な組合せを含んだが、変異荷重の合計が少ないものも含んだ。各合成遺伝子は、5NheI部位、コザック配列、変異体ORFからなる、および終止コドンとそれに続く3PmeI部位を含んだ。適切なコドン使用によって、独特な制限部位をORFの様々な位置に人工的に作り出すことにより、第1のセットのクローン間で断片を交換することによって本発明者らが新しいクローンを作製することが可能になった。NheI制限部位およびPmeI制限部位を用いて、pCDNA31哺乳動物発現ベクター中に合成遺伝子をサブクローニングし、CHOS細胞にプラスミドを一過的にトランスフェクトした。細胞培養上清を濃縮し、ろ過し、VLA4Fcへの結合をBIACOREによって分析した。また、2DVCAM1変異体クローン146発現のためのプラスミドもこの様式で作製し、トランスフェクトし、分析して、対照データを得た。単一復帰変異体クローンの最初のセットから、wt2DVCAM1と比べて、クローン146の活性改善に対するF32LおよびK79Sの貢献はたとえあるとしても少しであり、クローン146の活性改善に対するT37PおよびI39Lの貢献はあまり大きくなく、クローン146の活性改善に対するS34F、Q38L、およびT74Rの貢献が最も大きいことが示唆された。146R1~146R12から得られた最初の結果に基づいて、配列最適化されたクローンの第2のセットを、ORF中の独特な制限部位を用いたサブクローニングによって、またはSOE技術によって、第1のセットから誘導した。前述した通りにして、プラスミドをトランスフェクトし、粗製の上清を分析した。表15は、配列最適化された各変異体中に存在する7種の変異の様々な組合せ、変異体中の変異の合計数、およびBIACOREによって測定された、2DVCAM1変異体クローン146を基準とした結合親和性の低下KDを示す。表152DVCAM1変異体クローン146の配列最適化された変異体粗製上清アッセイ法の結果に基づいて、配列最適化された変異体13種をさらなる研究のために精製タンパク質として選択した。これらの変異体は、SOE技術によるスプライシングの技法を用いて適切な変異を復帰させることにより、元のプラスミドpVM146から誘導した。これらの変異体の配列情報を表16に提供する。プラスミドを作製用のW3110大腸菌株に形質転換し、精製し、実施例8および実施例12において前述した通りにVLA4親和性およびLPAM1親和性について分析した。表16大腸菌発現システムにクローニングした、2DVCAM1変異体クローン146の配列最適化された変異体Biacore測定の結果を図13に示す。またこの結果から、5個未満または5個の変異を有する二重復帰変異体の大半がVLA4結合およびLPAM1結合の低下を示すことが示唆される。配列最適化された変異体を大腸菌発現システムから発現させ、精製し、VLA4結合およびLPAM1結合についてBIACOREによって分析した。VLA4のKDおよびLPAM1のKDを示している。実施例212DVCAM1変異体ポリペプチドは高い親和性状態のインテグリンに優先的に結合する以下の実施例から、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが、高い親和性または活性化状態のインテグリン受容体に優先的に結合することが実証される。この実験において、1mMMnCl2をアッセイ緩衝液に添加することによって、活性化型へのVLA4の変換を誘導した。Aフローサイトメトリーアッセイ法を用いた活性化モルモットVLA4への2DVCAM1ポリペプチドの結合モルモット脾細胞をTBS中に再懸濁し、最終濃度50ugmlの精製2DVCAM1ポリペプチドと共に氷上で15分間インキュベートした。次いで、2ウシ胎児血清を加えたTBSでこれらの細胞を洗浄した。2通りの試料セットを調製し、ここで1mMMnCl2を含むTBS中にモルモット脾細胞を再懸濁した後、氷上で15分間の2DVCAM1ポリペプチド添加および2FBSを含むTBSMによる洗浄を行った。氷上で10分間、1正常ヒツジ血清を含むTBS中で両方の試料セットをブロッキングした。次いで、1正常ヒツジ血清を含むTBSに溶かした1ugmlのビオチン標識ヒツジポリクローナル抗ヒトVCAM1CD106抗体を用いて、氷上で15分間、結合された2DVCAM1ポリペプチドを検出した。次いで、細胞を洗浄し、1200希釈したストレプトアビジンPEと共に氷上で15分間インキュベートした。染色された細胞を洗浄し、2FBSを加えたTBS中に再懸濁し、FACSCaliburによって分析した。リンパ球を含めるために、前方散乱対側方散乱サイトグラム内に電気的ゲートをかけた。染色されなかった細胞およびSAPEのみで処理された細胞をアッセイ法の対照として使用した。SAPEのみのバックグラウンド対照試料を引いて、2DVCAM1ポリペプチドに加えてビオチン標識抗VCAMおよびSAPEと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度の変化としてデータをプロットした。図14に示す通り、活性化VLA4状態に相当する1mMMnCl2を含む緩衝液中の細胞と共にポリペプチドをインキュベートした場合、Q38L、クローン046、クローン047、クローン059、およびクローン1462DVCAM1ポリペプチドの場合にモルモット脾細胞への結合が検出された。また、MnCl2の存在下で2量体のクローン046融合タンパク質に対する結合も検出された。これらのポリペプチドすべてにおいて、モルモット脾細胞上の細胞表面インテグリンへの結合は、1mMMnCl2が存在しない場合よりも存在する場合の方が強かったことから、これらのタンパク質が高親和性または活性状態のインテグリンに優先的に結合することが示唆された。Mn2の非存在下では、Q38Lの結合もクローン046Fcの結合も観察されなかった。Mn2無し試料には、アッセイ緩衝液中に導入された任意の二価陽イオンを除去するためにEDTAなどのキレート剤が添加されなかったため、Mn2無し試料中のインテグリン受容体の一部分が活性化状態であった可能性があり、Mn2無し試料中のポリペプチドの結合量が少なかったのは、残存する高親和性受容体に結合し、低親和性受容体には結合しないことに起因した可能性がある。Q38Lまたは2DVCAM1変異体と比較すると、1mMMnCl2の存在下でも非存在下でも、野生型2DVCAM1の有意な結合はこのアッセイ法において検出されなかった。これは、BIACOREによって実証されたように、精製VLA4に対する野生型2DVCAM1の結合親和性が低いことに起因する可能性がある。このアッセイ法におけるモルモット脾細胞への野生型2DVCAM1ポリペプチドおよび変異体2DVCAM1ポリペプチドの結合は、ヒトVCAM1に対するポリクローナル抗体を用いて間接的に検出したため、モルモット脾細胞への変異体ポリペプチドの様々な結合量は、精製VLA4に対する相対的親和性を反映しない可能性があり、むしろ、抗VCAMポリクローナル抗体に対する親和性を反映している可能性がある。抗VCAMポリクローナル抗体に対する野生型2DVCAM1ポリペプチドおよび変異体2DVCAM1ポリペプチドの結合親和性は測定しなかった。BBIACOREアッセイ法における活性化ヒトVLA4Fcへの2DVCAM1クローン146の結合VLA4の活性化状態がクローン146結合に与える影響を、いくつかの例外以外は実施例12で前述したのと同じ方法を用いてBIACOREによって測定した。ヤギ抗ヒトIgG抗体をCM5チップに固定し、実施例12で説明した通りにしてHBSP中のヒトVLA4Fcを捕捉した。各結合サイクルにおいて、常に150nMのクローン146を1回注入した。クローン146は、HBSP緩衝液、1mMMn2を添加したHBSP緩衝液、または15mMEDTAを添加したHBSP緩衝液中で希釈した。流速30ul分で90秒間、クローン146を注入した。解離を5分間モニターした。各緩衝液条件で2回試験した。クローン146の各注入後に、グリシン、pH17を3分注入してチップを再生した。Mn2含有緩衝液中のクローン146がヒトVLA4Fcに結合したことから、2DVCAM1ポリペプチドが活性化VLA4に結合することを示す以前のデータが裏付けられた。EDTA含有緩衝液中のクローン146はVLA4に結合しなかったことから、クローン146は非活性化VLA4には強固に結合しないことが示された。EDTAもMn2も添加されていないHBSP中のクローン146の場合に観察される小さい結合シグナルは、HBSP中のVLA4は活性化状態と非活性化状態の混合物であることを示す可能性が高い。有意な解離は観察されなかった。まとめると、図14および図15に示されるデ―タから、細胞ベースのフローサイトメトリーおよびインビトロのBIACOREアッセイ法の両方によって、本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドが、不活性状態または低親和性状態のVLA4よりも、活性化状態または高親和性状態のVLA4に対して高い結合親和性を示すことが実証される。したがって、2DVCAM1変異体ポリペプチドは、ヒトなどの哺乳動物のローリング白血球上で発現されるものなどのインビボの活性化VLA4に、不活性状態のVLA4に対してよりも高い結合親和性で、優先的に結合すると予想される。このように2DVCAMポリペプチドが活性化VLA4を優先するため、疾患に関連する活性化受容体が選択的にブロックされ得、無関係なインテグリン受容体に結合する潜在的なポリペプチドプールが減少され得る。また、関連するVLA4受容体を選択的にターゲティングすることによって、免疫の過剰抑制を伴わない疾患予防を可能にする2DVCAM1変異体ポリペプチド最適用量レベルを与え、それによって、JCウイルスによって引き起こされるものなどの日和見性感染症のリスクを低減させることができる。実施例22N末端をPEG化された2DVCAM1変異体の薬物動態はインビボでのリンパ球放出に密接に関係している以下の実施例によって、N末端をPEG化された本発明の2DVCAM1変異体ポリペプチドの動物における薬物動態または血清中濃度が、リンパ球増加と呼ばれるプロセスである末梢血リンパ球の増加に密接に関係していることが実証される。リンパ球増加は、VCAM1と末梢血リンパ球上のVLA4との相互作用の阻害およびまたはVCAM1と骨髄中の未成熟リンパ球上のVLA4との相互作用の阻害に起因する。どちらの場合も、ポリペプチドで処置した動物におけるリンパ球増加は、実施例16で説明した通りに2DVCAM1変異体結合体がインビボでVLA4とVCAM1の相互作用を阻害するという証拠である。第2の実験において、50Kの分枝PEGアルデヒド試薬でN末端をPEG化した2DVCAM1変異体クローン146を、0日目および8日目にカニクイザル4匹に皮下注射した。96時間前、1時間前、8時間目、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、144時間目、192時間目、240時間目、および336時間目に血清試料を採取し、実施例18で説明したELISAアッセイ法を用いて、血清試料中のPEG50146の量を測定した。96時間前、1時間前、24時間目、48時間目、72時間目、96時間目、120時間目、144時間目、192時間目、240時間目、および336時間目に全血試料を採取し、BayerAdvia120自動分析装置を用いて、リンパ球絶対計数を得た。図16Bに示す通り、PEG50146でカニクイザルを処置すると、末梢血リンパ球増加が誘導された。リンパ球増加は、最初の薬物投与後24時間目までに誘導され、投与後約24~72時間の間、増加したままであり、投与後72~144時間目に、ベースラインのリンパ球レベルに戻り始めた。168時間目の2回目のPEG50146投与後、末梢血中のリンパ球計数は再び上昇し、240時間目にピークに達し、その後、336時間目にベースラインレベルに戻り始めた。図16Bで認められる通り、PEG50146で処置したサルで観察されたリンパ球増加のパターンは、動物中のPEG50146の血清中レベルを反映していた。言い換えると、薬物投与後にPEG50146血清レベルが上昇するにつれ、リンパ球計数が増加し、薬物投与後にPEG50146血清レベルが低下するにつれ、リンパ球計数が減少した。まとめると、PEG50146で処置したモルモットおよびカニクイザルについてそれぞれ図16Aおよび図16Bに示す結果から、末梢血中のリンパ球計数の変化がインビボでのPEG50146の薬物血清中濃度に関係していることが示唆される。リンパ球放出は、VLA4とVCAM1の相互作用のインビボでの阻害についての薬力学的マーカーであるため、この実施例で示す結果から、カニクイザルとモルモットの両方においてPEG50146のPKPDの関連性が密であることが示唆される。PEG50146の密なPKPD関連性は、薬物血清レベルとインビボ活性との直接的関係、ならびにポリペプチドが自然にクリアランスされる際に患者において正常リンパ球機能が迅速に回復する潜在的可能性を与えるという点で、自己免疫疾患を治療するにあたって有益である可能性がある。この結果として、薬物動態が長く、PKとPDが不調和である他のVLA4アンタゴニストには必要とされる可能性がある、JCウイルスによって引き起こされるものなどの日和見性感染症の場合の患者におけるPLEXまたは免疫吸収の必要が回避され得る。実施例232DVCAM1変異体ポリペプチドFc融合タンパク質の発現、精製、および活性の確認A哺乳動物細胞において発現させるための2DVCAM1Fc融合配列のサブクローニングSOEPCR技術を用いて、2DVCAM1クローン046ポリペプチドおよびクローン146ポリペプチドを、4つのシステインの内の3つがセリンに変異させられたヒトIgG2Fcドメインまたはエフェクター機能を失うように変異させられたヒトIgG1Fcドメインに融合させて、046および146のPIg17、PIg18、およびZIgをそれぞれ作製した。2DVCAM1クローン046遺伝子および2DVCAM1クローン146遺伝子は、ドメイン1領域と相補的な5プライマーおよび改変されたIgG2FcドメインまたはIgG1Fcドメインとオーバーラップする伸長部分を含みドメイン2領域と相補的な3プライマーを用いて、供給源ベクターpVM046およびCet10192DVCAM146からそれぞれPCR増幅した。改変されたIgG2FcPIg17断片およびIgG2FcPIg18断片は、VCAMクローンとオーバーラップする伸長部分を含む5プライマーおよび内部3プライマーを用いて、これらのFcドメインを含む供給源ベクターからPCR増幅した。改変されたIgG1断片は、VCAMクローンとオーバーラップする伸長部分を含む5プライマーおよびIgG1Fcドメインの下流のポリA配列に相補的な3プライマーを用いて、このFcドメインを含む供給源ベクターからPCR増幅した。内因性VCAMシグナルペプチド配列は、AgeI部位を含む伸長部分を含むシグナル配列と相補的な5プライマーおよびVCAMドメイン1領域と相補的な3プライマーを用いて、供給源ベクターpcDNA2DVCAM146IgG2FcSSからPCR増幅した。増幅されたシグナル配列、VCAM、およびPIg17Fc産物、PIg18Fc産物、またはZIgFc産物をSOEing反応のために混合し、シグナル配列5プライマーおよび各IgGFc3プライマーを用いて増幅して、シグナル配列VCAMFc産物を生じさせた。クローン046Fc融合構築物の場合、PCR産物をAgeIおよびPmlIで消化またはAgeIおよびSalIで消化し、同じ酵素で消化したCETベクター中に挿入した。クローン046PIg17構築物およびクローン046PIg18構築物の場合、ベクターはPmlI部位の3側にIgG2配列を含んだ。ZIg構築物の場合、空ベクターを使用した。クローン146Fc融合構築物の場合、PCR産物をAgeIおよびSal1で消化し、同じ酵素で消化したCETベクター中に挿入した。得られたプラスミドを配列決定して、シグナルペプチド配列、2DVCAM1配列、およびIgGFc配列を確認した。B2DVCAM1Fc融合タンパク質の精製GenePulserを用いたエレクトロポレーションによって、046Fc融合タンパク質および146Fc融合タンパク質をコードするDNAプラスミドを懸濁OptiCHOK1細胞中にトランスフェクトした。細胞を48時間増殖させた後、9ugmLのピューロマイシンを含む培地中でピューロマイシン耐性カセットを発現させるために細胞を選択した。選択後7~8日間ぐらい、安定なプールを発達させた。これらのプールをT25フラスコから125mL容振盪フラスコに移して増殖させた。プロテインAアフィニティー高速液体クロマトグラフィーを実施して、安定なプール中でのFc融合タンパク質の発現レベルをチェックした。発現力価に基づいて、細胞培養物を増殖させ、精製のために上清を回収した。GEHealthcareから購入したMabSelectSureカラムを用い、溶出緩衝液として100mMグリシンpH37を用いた標準的なプロテインAクロマトグラフィーによって、タンパク質を精製した。溶出されたタンパク質をPBSに対して一晩透析した。これらのタンパク質を非還元条件下および還元条件下のSDSPAGEゲル上で解析し、単量体内容物に対してはSEC解析によって解析した。C2DVCAM1Fc融合タンパク質のBIACORE結合次の例外はあるものの本質的には実施例12において説明した通りにして、ヒトVLA4Fcに2DVCAM1Fc融合物を結合させた。製造業者のプロトコールに従って、クローン146Fcおよびクローン046FcをセンサーCM3チップに固定した。EDCNHS混合物35μlを流速5μl分で注入して、センサーチップCM3を活性化した。活性化された表面を、固定用緩衝液に溶かして30ugmlに希釈したクローン146Fcまたはクローン046Fcに3~5分間曝露した。1MエタノールアミンHClpH8535μlで未反応部位の反応を停止させた。約1900RUのクローン146Fcおよび2500RUのクローン046Fcを固定した。1mMMn2を加えたHBSP緩衝液中で、濃度039nM、156nM、625nM、25nM、および100nMにVLA4Fcを希釈した。30ul分で4分間、これらをクローン146Fcおよびクローン046Fcの上に注入した。解離を30分間モニターした。各VLA4Fc注入後、10mMグリシン、pH17を30秒間2回注入することによって、チップを再生した。クローン146Fcおよびクローン046Fcの解離を、Fcを含まないそれらの単量体親ポリペプチドのヒトVLA4Fc結合の過去の解離曲線と定性的に比較した。その際、実施例12で説明した通りにしてヤギ抗ヒトIgGを用いてVLA4Fcを固定し、1回のサイクルにおいて016nM、08nM、40nM、20nM、および100nMの2DVCAMポリペプチドを注入した。過去のアッセイ法においてFcを含まないタンパク質をチップに固定するために使用された抗ヒトIgGは2DVCAMFcタンパク質およびVLA4Fcタンパク質の両方のFc領域と交差反応すると思われるため、ヒトVLA4Fcに対する2DVCAMFc融合タンパク質の結合親和性を評価するために異なるアッセイ形式を使用することが必要であった。VLA4に対する2DVCAMの結合を測定するための2種の異なるアッセイ形式によって与えられるRU尺度は異なるが、解離曲線および対応するKDは、両方のアッセイ形式について比較可能である。図17Aに示す通り、クローン146FcはヒトVLA4Fcに強固に結合した。試験した5種類の濃度のヒトVLA4Fcすべてに対して、形状が類似した解離曲線が得られ、100nMの場合に最も高いRUが認められた。このアッセイ法におけるヒトVLA4Fcへのクローン146Fc結合の解離曲線は、Fcを含まないタイプのクローン146のものと質的に類似していた。同様に、図17Bのデータから、100nMVLA4Fcの場合に最も高いRUが得られた、ヒトVLAFcへのクローン046Fcの結合が実証される。ヒトVLA4Fcに対する046Fcの解離曲線は、Fcを含まないタイプのクローン046に対して得られたものと質的に類似していた。まとめると、図17Aおよび図17Bのデータから、Fc融合物が、2DVCAM1ポリペプチドの機能的な薬物形態であることが実証される。このアッセイ法は、ヒトVLA4に対する2DVCAM1Fc融合タンパク質の1つのアームの単量体結合親和性を測定するために設計されたものであり、このアッセイ法は、結合活性の効果によって強化されたFc融合物の抗原結合を測定する。インビボにおいて、2DVCAM1Fc融合物は、VLA4インテグリン受容体に対する結合活性の強化のため、結合親和性に関して単量体2DVCAM1ポリペプチドに勝る優位性を有し得る。実施例24二官能的にPEG化された2DVCAM1変異体ポリペプチドのPEG化、単離、および活性の確認A二官能的にPEG化された2DVCAM1クローン146のPEG化二官能性PEGを用いたタグ無し2DVCAM1変異体のN末端PEG化5mgmlタンパク質を、タンパク質に対して025~1倍モル過剰の60K二官能性PEGアルデヒドおよび126mgmlNaCNBH3と反応させた。反応物を室温で3時間インキュベートした。BSPセファロースHPにおける60Kの二官能的にPEG化された2DVCAM1変異体の単離PEG化された材料を、導電率が6mScm未満になるように1部の水および2部の平衡緩衝液で希釈した。この材料を、30mMアルギニン、20mMリンゴ酸、500mMグリシン、001Tween80、pH4で平衡化したSPセファロースHPカラムに添加した。平衡緩衝液で洗浄した後、250mMアルギニン、20mMリンゴ酸、500mMグリシン、001Tween80、pH4への勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。二官能的にPEG化された画分を集め、3KMWCO遠心濃縮装置を用いて濃縮し、35KMWCO透析カセットを用いてバッファーをPBSに交換した。SDSPAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を解析した。C二官能的にPEG化された2DVCAM1クローン146のBIACORE結合クローン146と同様に、二価のPEG60クローン146が、捕捉されたヒトVLA4Fcに結合することを示した。実施例12で前述した通りにして、ヤギ抗ヒトIgG抗体をCM5センサーチップ上に固定した。ヒトVLA4FcをHBSP中で20ugmlに希釈し、15ul分で3分間捕捉した。典型的には、捕捉は約600RUであった。1mMMn2を加えたHBSP中でクローン146を6nM、30nM、および150nMに希釈した。最も薄いものから始めて、各濃度について30ul分で3分間、これらの濃度を順次注入した。二価PEG60クローン146を同じ緩衝液中で16nM、80nM、および400nMに希釈し、同様に注入した。解離を30分間モニターした。結合サイクル間に、10mMグリシン、pH17を10ul分で用いて、チップを3分間再生した。クローン146の結合を2回測定して、アッセイ法の再現性を確認した。図18に示すデータから、二価PEG60クローン146がヒトVLA4Fcに結合したことが示される。PEG化されていないクローン146ポリペプチドと比べて、チップ上のヒトVLA4Fcを飽和させるのにいくらか高い濃度が必要であった。これは、PEG50146およびPEG80146などのすべてのPEG化2DVCAM1クローンの特徴を示している。実験中、解離は観察されなかったことから、クローン146および二価PEG60クローン146の両方による非常に強固な結合が示唆された。二価PEG60クローン146の方が、VLA4インテグリン受容体に対する結合活性の強化のため、単量体PEG化クローン146よりもインビボでヒトVLA4に対して高い結合親和性を有することが予想される。このデータから、2つの同一の2DVCAM1ポリペプチドを単一のPEG成分と連結して二価分子を形成させることは、2DVCAM1ポリペプチドの機能的な薬物形態であることが実証される。本発明の好ましい態様を例示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それらの態様において様々な変更がなされてもよいことが容易に理解されるであろう。