"相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法であって、前記方法は、ioポジティブ選択遺伝子、o制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、を含むベクター、ならびに前記ベクターの相同組み換えサイトに相同組み換えによる挿入する注目の核酸フラグメント、相同組み換えサイトの5’位および3’位の組み換え領域と実質的に同一の領域に隣接する前記核酸フラグメント、とを酵母細胞と接触させる工程、ならびにii前記酵母細胞を前記ベクターおよび前記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、iii前記ポジティブ選択遺伝子を伴う前記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程であって、ネガティブ選択遺伝子はさらに前記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中に、前記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下で存在し、前記プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に前記ベクター中で作動可能に連結されていることを特徴とし、iv前記方法が注目のDNAフラグメントを含む酵母細胞を前記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む方法。ポジティブ選択遺伝子、およびプロモーター、を含むベクターに、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに前記相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子を含む、カセットの統合により本発明のベクターを得る事前工程をさらに含み、前記カセットの相同組み換えサイトの下流にある前記ネガティブ選択遺伝子を、前記ベクター中に存在する前記プロモーターの制御下に配置し、前記プロモーターおよび前記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている、請求項1に記載の方法。注目する核酸フラグメントを合成するさらなる事前工程を含み、前記フラグメントは、工程iのベクター上の相同組み換えサイトの5’位および3’位の領域の実質な同一性を有する配列により隣接される、研究または製造するための核酸の配列を含む、請求項1または2に記載の方法。前記ネガティブ選択遺伝子がURA3遺伝子である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。ネガティブ選択遺伝子発現を制御する前記プロモーターがGAL1である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。ネガティブ選択遺伝子のURA3が、誘導性プロモーター非誘導性の培地中に漏れる、好ましくはGAL-1プロモーターの制御下にあり、および、本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入が、少なくとも120塩基対により、最も好ましくは少なくとも188塩基対により誘導性プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する、請求項4および5に記載の方法。ネガティブ選択遺伝子発現を制御する前記プロモーターがADH1である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。ネガティブ選択遺伝子URA3がADH-1プロモーターの制御下にあり、および、本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入が、少なくとも100塩基対、最も好ましくは少なくとも169塩基対により誘導性プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する、請求項4および7に記載の方法。選択工程iiiおよびivが同時に実施される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに前記相同組み換えサイトの下流に存在するネガティブ選択遺伝子、を含む、カセット。前記ネガティブ選択遺伝子がURA3遺伝子である、請求項10に記載のカセット。複製起点、前記ポジティブ選択がプロモーターの制御下にある、ポジティブ選択遺伝子、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに前記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中かつ前記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下、前記プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に前記ベクター中で作動可能に連結され、かつターミネータの制御下に存在するネガティブ選択遺伝子、を含む、ベクター。請求項10~11のいずれか1項に記載のカセットを、ポジティブ選択遺伝子、およびプロモーター、を含むベクターに請求項10~11のいずれか1項に記載のカセットを統合することを含み、前記カセットの相同組み換えサイトの下流にある前記ネガティブ選択遺伝子を、前記ベクター中に存在する前記プロモーターの制御下に配置し、前記プロモーターおよび前記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている、請求項12で定義されるベクターを得る方法。請求項10~11のいずれかに記載のカセット、少なくとも一つの酵母細胞培地、を含む、キット。本発明のベクター中に存在する前記ネガティブ選択遺伝子および/またはポジティブ選択遺伝子による選択を可能とする選択培地または化合物、および/または5’位および3’位の相同組み換え領域と同一または実質的に同一の核酸フラグメント配列、をさらに含む、請求項14に記載のキット。したがって、相同組み換えにより得られる注目の酵母形質転換体を容易に選択する新しいツールおよび方法の需要がある。本発明者らは、発現ベクターにおいて相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を容易に選択する新しい方法およびカセットを開発した。方法およびカセットは、お金と時間の節約を可能とし、したがって、その方法およびカセットは予測される酵母を選択するためのDNAの精製の工程を避け、一工程で予測される形質転換酵母細胞の選択を可能とする。本発明は、相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、その方法は、ioポジティブ選択遺伝子、o制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、を含むベクター、ならびにベクターの相同組み換えサイトに相同組み換えによる挿入において注目の核酸フラグメント、相同組み換えサイトの5’位および3’位の組み換え領域と実質的に同一の領域に隣接する核酸フラグメント、とを酵母細胞と接触させる工程、ならびにii上記酵母細胞を上記ベクターおよび上記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、iii上記ポジティブ選択遺伝子を伴う上記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程であって、ネガティブ選択遺伝子はさらに上記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中に、上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下で存在し、当該プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結されていることを特徴とする工程を含み、ならびにiv上記方法は注目のDNAフラグメントを含む酵母細胞を上記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む。本発明は、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイトと相同組み換えサイトの下流にあるネガティブ選択遺伝子と、を含むカセット、ならびに複製起点、ポジティブ選択がプロモーターの制御下にある、ポジティブ選択遺伝子、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに相同組み換えサイトの下流にあるベクター中かつ上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下に存在し、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結され、かつターミネータの制御下にあるネガティブ選択遺伝子、を含むベクターに関する。本発明は、本発明のベクターを得るための方法にも関し、その方法は本発明に係るカセットを、ベクター、好ましくは、ポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含むプラスミドに統合することを含み、当該カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている方法、に関する。本発明は、最終的に、本発明に係るカセット、および少なくとも一つの酵母細胞培地、を含むキットを提供する。本発明の方法本発明の第一の目的は、相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、当該方法は、ioポジティブ選択遺伝子、o制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、を含むベクター、ならびに当該ベクターの相同組み換えサイトに相同組み換えによる挿入において注目の核酸フラグメント、相同組み換えサイトの5’位および3’位の組み換え領域と実質的に同一の領域に隣接する上記核酸フラグメント、とを酵母細胞と接触させる工程、ならびにii上記酵母細胞を上記ベクターおよび上記注目の核酸フラグメントと共に形質転換する工程、iii上記ポジティブ選択遺伝子を伴う上記ベクターを含む酵母細胞を選択する工程、を含み、ネガティブ選択遺伝子はさらに上記相同組み換えサイトの下流にあるベクター中に、上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下で存在し、当該プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結されている、ならびにiv上記方法は注目のDNAフラグメントを含む酵母細胞を上記ネガティブ選択遺伝子を用いて選択する工程をさらに含む。ベクター中の注目のDNAフラグメントを統合しない形質転換酵母細胞は、上記プロモーターと未だ作動可能に連結されたネガティブ選択遺伝子の発現のせいで、工程ivで死に、ベクター中の統合された注目のDNAフラグメントを有する形質転換酵母細胞は、注目する核酸フラグメントが、上記ネガティブ選択遺伝子および上記プロモーターの間に挿入されるとき、そのプロモーターとさらには作動可能に連結しないネガティブ選択遺伝子の発現がないので、工程ivの後で生きている、ことが、本発明の方法を用いてわかるはずである。用語形質転換transformationまたは形質転換transformingは、宿主生物に、DNAフラグメント、プラスミドまたはベクターを転移することを言及する。DNAフラグメント、プラスミドまたはベクターなどを含有する宿主生物は、組み換えrecombinant生物または形質転換transformed生物と呼ばれる。本発明の方法において、形質転換生物は、Saccharomycescerevisiae、CandidaalbicansカンジダアルビカンスおよびC.maltosaカンジダマルトーサ、Hansenulapolymorphaハンゼヌラポリモルファ、KluyveromycesfragilisクルイベロマイセスフラギリスおよびK.lactisクルイベロマイセスラクチス、PichiaguillerimondiiピキアギリエルモンティーおよびP.pastorisピキアパストリス、Schizosaccharomycespombeシゾサッカロマイセスポムベ、およびYarrowialipolyticaヤローウィアリポリティカである。好ましくは、形質転換酵母細胞は、Saccharomycescerevisiaeなどの酵母である。用語ベクターまたはプラスミドは、細胞の中央代謝の部分でない遺伝子および、通常環状二本鎖DNA分子の形態にある遺伝子をよく含む外因染色体を言及する。そのような成分は、任意の源由来の、自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状もしくは環状の一本鎖DNAまたは二本鎖DNAまたはRNAであってよく、いくつかのヌクレオチド配列は、適切な3’位の非翻訳配列に沿って、選択された遺伝子産物のプロモーターフラグメントおよびDNA配列を細胞に導入することができる独特の構造に、結合または再結合されている。したがって、本発明のベクターおよびプラスミドは、酵母中に機能的な複製起点を含む。用語酵母中に機能的な複製起点は、染色体から独立にベクターまたはプラスミドの複製を可能とする任意の核酸配列を言及する。一般的に、複製起点は以下の少なくとも一つ以上において機能的である:Saccharomycescerevisiae、CandidaalbicansおよびC.maltosa、Hansenulapolymorpha、KluyveromycesfragilisおよびK.lactis、PichiaguillerimondiiおよびP.pastoris、Schizosaccharomycespombe、およびYarrowialipolytica。好適な複製起点は、例えば、ars1、セントロメア指向ori、および2μ指向を包含する。一実施形態において、本発明の方法は、ポジティブ選択遺伝子、およびプロモーター、を含むベクターに、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに当該相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子、を含む、カセットの統合により本発明のベクターを得る事前工程をさらに含み、上記カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は、得られたベクター中に作動可能に連結されている。本発明において、用語カセットは、任意の手段により、例えば、酵素消化およびDNAライゲーションにより、組み換え領域により、より具体的にはプラスミドへの相同組み換えにより統合する具体的な核酸配列を含む要素として考えられるべきである。本願明細書で使用する場合、用語プロモーターは、当該プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子またはコード配列の直接転写したがって、発現することができるDNA配列を言及する。一般的に、用語作動可能に連結されたは、転写調節核酸が、転写が開始される態様のように任意のコード配列に関連して位置する、ことを意味する。本願明細書で使用する場合、これは、当該コード領域の発現を可能とする距離で、コード領域の5’位に、プロモーターは位置することを意味するだろう。プロモーターは、未変性の遺伝子から全体で得られ、または天然に見つかる異なるプロモーター由来の異なる要因から構成され、またはさらに合成DNAセグメントを含みさえするかもしれない。異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発展の段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現に向かわせるかもしれない。異なる種類のプロモーターがある。本願明細書で使用する場合、プロモーターは誘導性プロモーターもしくは管理されたプロモーターその活性は、生物的ファクターもしくは非生物的ファクターの存在または不存在により上昇制御または下方制御されるまたは構成的プロモーターほとんどの細胞型において、ほとんどの時間に遺伝子発現をもたらすであるかもしれない。本発明において用いられるプロモーターは、強力プロモーター高い遺伝子発現をもたらすまたは弱いプロモーター低い遺伝子発現をもたらすであってよいMaya,D,Quintero,MJ,Munoz-Centeno,M,Chavez,S,SystemsforappliedgenecontrolinSaccharomycescerevisiaeサッカロマイセスセレビシエにおける用いられる遺伝子の制御のためのシステム、BiotechnolLett、2008年、第30巻:979-987頁。本発明において用いられるプロモーターは、酵母細胞において機能的である。本発明において用いられうる酵母において機能的なプロモーターの例は、これらに限定されないが、GAL1プロモーター配列番号1、ADH1プロモーター配列番号2および強力GPDグリセルアルデヒド3PDHプロモーター配列番号3、を含むMayaら、Biotechnol.Lett、2008年、第30巻:979-987頁。選択遺伝子またはレポーター遺伝子、選択可能な遺伝子が、宿主細胞中に存在すること、すなわち発現において、遺伝子を意味することにより、選択可能な遺伝子を含有しない細胞から宿主は区別されることを可能としうる。選択可能な遺伝子は、ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子を包含している種々の異なる型に区別され得る。ある条件において特定の効果の原因となるのは、核酸またはタンパク質発現生成物であるかもしれない。基質、リガンドなどの追加成分は、選択可能な遺伝子に基づく選択または分類を可能とするためにさらに添加されてもよい。本願明細書で使用する場合、本発明の選択遺伝子は開始コドンにより始まり、終止コドンにより停止し、プロモーター遺伝子発現を可能とし、かつ制御するにより進行され、ターミネータにしたがって、機能化される。ポジティブ選択遺伝子は、当該遺伝子を欠乏する細胞を殺しまたは成長を妨げる増殖条件下、ポジティブ選択遺伝子を発現する細胞の生存を可能とする核酸配列である。ポジティブ選択遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子ネオマイシン耐性遺伝子またはカナマイシン抵抗性遺伝子などの発現を促進する核酸配列である。ネオマイシン耐性遺伝子を含有しない細胞はG418の適用により、選ばれ、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞はG418により危害を加えられないポジティブ選択。酵母中機能的な好ましいポジティブ選択遺伝子は、ADE2、HIS3、LEU2、またはTRP1を包含する生存遺伝子である。ALG7はツニカマイシンに対して増加した耐性を与え、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、銅イオン存在下で酵母を増殖できるようにするG418およびCUP1遺伝子に対する耐性を与える。本発明において、ベクター中に存在するポジティブ選択遺伝子は、機能的な酵母プロモーターの制御下におかれている酵母中で機能的で古典的なポジティブ遺伝子の選択である。好ましくは、当該ポジティブ選択遺伝子は、HIS3遺伝子配列番号4である。酵母細胞を選択し、ゲノム中の機能的なHIS3遺伝子を欠乏し、本発明の方法の工程iiiにおいて、ベクターを避難させるために、培養された酵母細胞はヒスチジンを欠乏する培地に置かれる。His3遺伝子を発現する酵母細胞だけ、この培地において増殖しうる。ネガティブ選択遺伝子は、通常適切な外因性試薬の利用において、当該ネガティブ選択遺伝子を発現する細胞を殺し、増殖を抑制またはさもなければ選択する核酸配列である。ネガティブ選択遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルスHSV-TKのチミジンキナーゼ遺伝子の発現を促進する核酸配列である。HSV-TKを発現する細胞は、ガンシクロビルネガティブ選択の利用によって、それに対して選択され、それに対して遺伝子を発現しない細胞はガンシクロビルにより比較的危害を加えられない。用語はさらに定義され、そして、米国特許第5,464,764号参照により本願明細書に援用したものとするによってさらに説明される。ネガティブ選択遺伝子の別の実施例は、URAオロチジン5’リン酸脱炭酸酵素遺伝子である。URA3は、出芽酵母S.CerevisiaeサッカロマイセスセレビシエおよびK.lactisクルイベロマイセスラクチスのURA遺伝子であり、URA4は、S.pombeシゾサッカロマイセスポムベのURA遺伝子である。本願明細書で使用する場合、用語URA3遺伝子は、ピリミジンリボヌクレオチドの合成およびウラシルまたはウリジンを欠いている培地中の細胞増殖の必要性に関する酵素をコードする遺伝子に関する。当該酵素は、5-フルオロオロチン酸5-FOAの、細胞死の原因となる毒性化合物5-フルオロウラシルへと変換もする。URA3遺伝子は、DNA形質転換、特に酵母DNA形質転換のポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝として用いられうる。本願明細書で使用する場合、URA3遺伝子は、任意の酵母、好ましくはSaccharomycescerevisiaeまたはKluyveromyceslactis由来のURA3遺伝子と、変異体を含み、そして上述で引用したURA3活性を維持するURA3の機能の保存的異型などを包含する。SaccharomycescerevisiaeのURA3遺伝子の配列の例は、配列番号5に与えられる。本願明細書で使用する場合、異型または機能の保存的異型は、一つまたは種々のヌクレオチドの変更された核酸配列およびBLASTまたはFASTAアルゴリズムで測定して少なくとも80、好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95、さらにより好ましくは少なくとも99ヌクレオチドの同一性を有する核酸配列、ならびに比較される遺伝子の未変性または親遺伝子と同一の特性もしくは機能または実質的に同一の特性もしくは機能を有する核酸配列を包含する。好ましくは、上記ネガティブ選択遺伝子はURA3遺伝子である。本発明の方法の工程ivにおいて注目する核酸フラグメントを含む酵母細胞を選択するために、酵母細胞は、5-FOAを含有する培地におかれる。上記フラグメントを含まない細胞中、URA3遺伝子および本発明のベクターにおいてURA3遺伝子発現を制御するプロモーターは作動可能に連結され、そしてURA3は発現される。URA3遺伝子が発現されるとき、5-FOAは毒性の化合物に変換され、当該フラグメントを含まない酵母細胞は死ぬ。上記フラグメントを含む細胞において、URA3遺伝子および上記プロモーターは当該フラグメントにより分離され、もはや本発明において作動可能に連結されない。したがって、URA3遺伝子は発現されず、そして5-FOAはこれらの細胞に毒性ではなく、生き続け成長し続ける。実際、本発明に係るネガティブ選択遺伝子は、酵母中の機能的なプロモーターの制御下に置かれる。本発明のベクターにおいて、ネガティブ選択遺伝子は相同組み換えサイトにより当該プロモーターから分離され、当該プロモーターに作動可能に連結される例えば、当該プロモーターに十分近くに存在し、当該プロモーターがネガティブ選択遺伝子の発現を制御することを可能とする。相同組み換えが起こったとき、注目する核酸フラグメントは、相同組み換えサイト、ここでは、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子との間に挿入される。その場合、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は作動可能に連結されないそれらの同士の距離が重要すぎるせいで。発明者らは、作動可能に連結されたの考えがプロモーターの種類に存在することを示した。特定の実施形態において、本発明は、相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を選択する方法に関し、ネガティブ選択遺伝子は、強力プロモーター、好ましくはGPDプロモーター、の制御下にあり、本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、少なくとも2000pb、特に少なくとも3000pb、より具体的には少なくとも4000pb、好ましくは少なくとも5000pbによりプロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する。特定の実施形態において、本発明は、当該相同組み換えによるベクターにおいて注目の核酸フラグメントをすでに統合している形質転換酵母細胞の選択方法に関し、ネガティブ選択遺伝子は、誘導性プロモーター非誘導性の媒体中に漏れる、好ましくはGAL-1プロモーターの制御下にあり、および本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、そのプロモーターから、少なくとも120pb、特に少なくとも150pb、より具体的には少なくとも188pb、ネガティブ選択遺伝子を分離する。特定の実施形態において、本発明は、相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを統合する形質転換酵母細胞を選択する方法に関し、ネガティブ選択遺伝子は、中間体プロモーター、好ましくはADH1プロモーターの制御下にあり、および本発明の注目する核酸フラグメントの相同組み換えによる挿入は、少なくとも120pb、特に少なくとも150pb、より具体的には少なくとも169pbにより中間体プロモーターからネガティブ選択遺伝子を分離する。本発明の一実施形態において、工程iiiおよびivの両方の選択は同時または分離して、好ましくは同時に実現されるかもしれない。用語相同組み換えサイトは、相同組み換えにより、ベクターまたはシャトルベクターに注目する核酸フラグメントの導入を可能とするサイトを言及する。相同組み換えは、要するに、相同配列すなわち、相補鎖のセットの調製を自然発生的に生じうる鎖交換のプロセスである。技術分野で公知であるように、酵母は、相同組み換えで効果的である。Orr-Weaverら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1981年、第78巻:6345-6358頁;Ma,ら、Gene、1987年、第58巻:201-216;Petermann、NucleicAcidsRes.、1998年、第26巻9:2252-2253頁それぞれ、参照により本願明細書に援用したものとする。相同組み換えを可能とする方法および条件は、技術分野で周知である。したがって、一般に、相同組み換えサイトは、2つの異なった、一般的に連続的な領域を含有している。第一の領域本願明細書において5’領域と称されるは、一般的に、注目する核酸フラグメントの側面に位置する5’領域と全く一致しており、ベクターに挿入される。第二の領域本願明細書において3’領域と称されるは、一般的に、注目する核酸フラグメントの側面に位置する3’領域と全く一致しており、ベクターに挿入される。好ましくは、5’位および3’位の領域は、それぞれ12個または15個の核酸長さである。より好ましくは、5’位および3’位の領域は、それぞれ約20個または30個の核酸長さであり、より好ましくは少なくとも約50個の核酸長さ、および最も好ましくは約60個の核酸長さである。本発明において、相同組み換えサイトの配列は、ベクターが相同組み換えサイトの配列に対応する別の配列を含まないベクターに独特である任意の核酸配列および注目する核酸フラグメントを挿入する側面の領域と一致する核酸配列を言及する。5’位および3’位の両方の相同組み換え領域の例は、実施例に示されているそれぞれ配列番号6および配列番号7または、それぞれ配列番号16および配列番号17。本願明細書で使用する場合、用語注目する核酸フラグメントは、相同組み換えサイトでベクターに挿入する任意の核酸を言及する。本発明において、注目する核酸フラグメントは、本願明細書に提示されるベクターの相同組み換えサイトの5’位および3’位の領域と一致しているまたは実質的に一致している。5’位および3’位の領域と隣接している。したがって、注目する核酸フラグメントがベクターに挿入されたとき、注目する核酸フラグメントを側面にする5’位および3’位の領域は、相同組み換えの間、相同組み換えサイトの5’位および3’位の領域を置換する。本願明細書で使用する場合、実質的な同一性は、挿入するDNAフラグメントのベースと組み換え領域の約80、特に90、好ましくは95、より好ましくは99の同一性であるだろう。本発明において、上記注目する核酸フラグメントは、タンパク質を製造するためにコードするまたはしない任意のDNA配列であってよい。例えば、当該フラグメントは、任意の外部または酵母タンパク質をコードする遺伝子でありまたは非コード核酸配列であってよい、好ましくは当該フラグメントは、HIV-1またはHIV-2逆転写酵素遺伝子配列、HIV-1またはHIV-2プロテアーゼ遺伝子配列、HIV-1またはHIV-2インテグラーゼ遺伝子配列、HIV-1またはHIV-2gag-pol前駆体遺伝子の全体または部分配列を含む群から選択される。本発明の一実施形態において、相同組み換えによる注目する核酸フラグメントをすでに統合した形質転換酵母細胞において、方法は、注目する核酸フラグメントの合成のさらなる事前工程を含み、フラグメントは、ステップiのベクター上の相同組み換えサイトの5’位および3’位の領域と実質的に同一である配列に隣接するものを研究または製造する核酸配列を含む。本願明細書で使用する場合、用語制限部位、または制限認識部位は、制限酵素により認識されているヌクレオチドの特定の配列を含有するDNA分子状に位置している。特定の制限酵素は、その認識部位または近くの部位の2つのヌクレオチド間の配列を切断するかもしれない。本発明において、制限部位は、本発明のベクターについて独特であり、ベクターは当該制限部位に対応する別の配列を含まない。任意の制限部位は、用いられるかもしれず、制限部位の例は、これらに限定されないが、NotI、BamHI、XhoI、EcoRI、NcoI、Sacl、Sail、SmaI、PvuII、ScaIを含む。本発明の制限部位は、本発明のベクターを相同組み換えのために線形化を可能とする。実際、相同組み換えは、シングルカットされた脱リン酸ベクターによって行われる。カセットおよび本発明のベクター本発明の第二の目的は、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに当該相同組み換えサイトの下流に存在するネガティブ選択遺伝子を含むカセット、に関する。本発明において、上記カセットは、ベクター、好ましくはプラスミドに挿入されるために用いられ、カセットのネガティブ選択遺伝子当該カセットの上記相同組み換えサイトの下流にあるを、ベクター、上記プロモーター、得られたベクター中に作動可能に連結された上記ネガティブ選択遺伝子のプロモーターの制御下に置くため、ポジティブ遺伝子の選択性およびプロモーターを含む。得られたベクター例えば、上記カセットが正確に挿入されているプラスミドは、本発明の方法を行うために用いられる。本発明において、ベクターは、複製起点を含み、ポジティブ選択遺伝子は、プロモーターの制御下にある。本発明の選択遺伝子のそれぞれは、ターミネータの制御下にもある。本願明細書で使用する場合、用語ターミネータまたは転写ターミネータは、遺伝子の末端、または転写用のゲノムDNA上のオペロンをマークする核酸配列の領域である。ADH1ターミネータ、STE2ターミネータ、CycE1のような酵母細胞において機能的であるターミネータは技術分野で周知である。本発明の第3の目的は、複製起点、ポジティブ選択がプロモーターの制御下にある、ポジティブ選択遺伝子、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイト、ならびに相同組み換えサイトの下流にあるベクター中かつ上記相同組み換えサイトの上流に位置するプロモーターの制御下に存在し、プロモーターおよびネガティブ選択遺伝子は、注目のDNAフラグメントの挿入前に上記ベクター中で作動可能に連結され、かつターミネータの制御下にあるネガティブ選択遺伝子、を含むベクターに関する。本発明において、ポジティブ選択遺伝子およびネガティブ選択遺伝子は、それぞれプロモーターとターミネータとの制御下にある。本発明の一実施形態において、上記ベクターは、シャトルベクター例えば、酵母および細菌細胞例えば、Escherichiaエシェリキア大腸菌の両方において増殖しうるように構成されているベクターである。したがって、本発明の特定の実施形態において、上記ベクターは、細菌性複製起点および細菌性ポジティブ遺伝子の選択例えば、アンピシリン耐性遺伝子をさらに含む。本発明において、上記ベクターは、上記細胞に相同組み換えにより注目する核酸フラグメントを挿入するため、そして上記の選択方法により、発現ベクターの上記注目する核酸フラグメントを実際にかくまう形質転換酵母細胞を選択するために酵母細胞を形質転換するために用いられてもよい。一実施形態において、本発明は、本発明のベクターを得るための方法に関し、当該方法は、制限部位を構成する5’位および3’位の組み換え領域を含む相同組み換えサイトと、当該相同組み換えサイトの下流のネガティブ選択遺伝子と、を含むカセットをポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含むベクターに統合し、当該カセットの相同組み換えサイトの下流にある上記ネガティブ選択遺伝子を、上記ベクター中に存在する上記プロモーターの制御下に配置し、上記プロモーターおよび上記ネガティブ選択遺伝子は得られたベクター中に作動可能に連結されている。カセットおよび本発明のベクターは、より詳細に上記されている。本発明のキット本発明の第4の目的は、本発明の方法を行うためのキットに関する一実施形態において、本発明は、本発明のカセット、少なくとも一つの酵母細胞培地、を含むキットに関する。本発明において、上記キットは、上記カセットをベクターに挿入するためおよび酵母細胞を上記ベクターと注目する核酸フラグメントとを本発明の方法を行うために形質転換するために用いられる。上記ベクターは、ポジティブ選択遺伝子およびプロモーターを含む任意の機能的なベクターであってよい。特定の実施形態において、上記キットは、本発明のベクター中に存在するネガティブ選択遺伝子および/またはポジティブ選択遺伝子による選択を可能とする選択的な媒体または化合物をさらに含んでもよい。別の特定の実施形態において、上記キットは、5’位および3’位の相同組み換え領域と同一または実質的に同一の核酸フラグメント配列、をさらに含んでもよい。一実施形態において、本発明は、上で定義されたとおりの本発明に係るベクター、および少なくとも一つの酵母細胞培地、を含むキットに関する。特定の実施形態において、上記キットは、本発明のベクター中に存在するネガティブ選択遺伝子および/またはポジティブ選択遺伝子による選択を可能とする選択的な媒体または化合物、をさらに含んでもよい。別の特定の実施形態において、上記キットは、5’位および3’位の相同組み換え領域と同一または実質的に同一の核酸フラグメント配列、をさらに含んでもよい。別の実施形態において、本発明のキットは、酵母細胞、好ましくはSaccharomycescerevisiae酵母細胞をさらに含む。本願明細書で使用する場合、用語キットは、物質を含むための任意の送達システムを言及する。反応分析との関連で、送達システムなどは、反応試薬例えば、適当な容器におけるオリゴヌクレオチド、酵素などの貯蔵、輸送、または配達を可能とするシステム、および/または、別の一つの場所からの支持材例えば、バッファー、分析を行うための記載されている装置を包含する。例えば、キットは、対応する反応試薬および/または支持材を含有する1以上の封入物例えば、箱を包含する。本願明細書で使用する場合、用語断片化されたキットは、全キットの補助成分をそれぞれ含有する2以上の独立した容器を含む送達システムを言及する。容器は、意図する受容体に共にまたは独立に含まれてよい。例えば、第一容器は、分析において使用するための酵素を含有してよく、第二容器はオリゴヌクレオチドを含有する。用語断片化されたキットは、限定されないが、連邦食品医薬品化粧品法のセクション520eで定義されている分析物特異的試薬ASR’sを含有するキットを包含することを意図する。実際、各容器がそれぞれ全キットの補助成分を含有する2以上の独立した容器を含む任意の送達システムは、用語断片化されキットに包含される。対照的に、結合キットは、単一の容器における反応分析の全成分を含有する送達システムを言及する。用語キットは、断片化されたキットと結合キットとの両方を包含する。現在のキットも、現在の方法を直ちに容易に実施するため、試薬、緩衝液、ハイブリダイゼーション培地、核酸、プライマー、ヌクレオチド、プローブ、分子量マーカー、酵素、固体支持体、データベース、分散様式を計算するためのコンピュータープログラムおよび/または使い捨て実験室装置マルチウェルプレートなどを1以上包含しうる。現在のキットに包含されうる酵素は、ヌクレオチドポリメラーゼなどを包含する。固体支持体は、ビーズなどを包含しうるが、分子量マーカーはコンジュゲーブルconjugableマーカー例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンなどを包含しうる。一実施形態において、キットは、本願明細書に記載される方法を行う装置から生成される。装置は、有形的表現媒体紙上に印刷された、コンピューター可読媒体などを通して理解できる形態に提供されうる。以下の実施例は、本発明を成しおよび実施するいくつかの好ましい形態を開示する。しかしながら、実施例は、例示目的だけであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例1:変性pRS発現ベクターの下流のGALプロモーター領域への自滅的なカセットの挿入プライマー5SacUra配列番号8および3UraSac配列番号9を用いるPCRにより増幅されたURA3のためのコード領域は、37°Cで1時間SacIにより消費され、SacIによっても消費されるpRSベクターの変性バージョンにGAL1プロモータの制御下クローンされる。新しく作製されたカセット、GAL1プロモーターの下流に位置し、以下の配列を含有する。RHl5’配列番号6固有のXhoI制限酵素サイトRHl3’配列番号7URA3ORFこの構造において、URA3遺伝子の開始コドンは、GAL1プロモーターの下流末端に配置された88bpである。この新しく作製された発現ベクターのvs3gal-RHにおいて、GAL1プロモーターとURA3ORFの開始コドンとの距離は、pRS骨格のHIS3バージョンにおけるこのプロモーターのリークしやすい特徴に起因して、グルコース培地においてさえ、URA3発現をもたらす表1。この新しく製造されるベクターは、XhoIを伴ったシングルカットであり、精製され、RHl-5’配列およびRHl-3’配列の5’位および3’位の末端で存在するHIV-Iプロテアーゼの配列を増幅させた配列PCRと混合され、W303酵母株を形質転換するために用いられる。形質転換体は、ヒスチジンおよび5-FOAを欠乏する最少培地において24時間30°Cで1mg/mLの最終濃度に増殖し、その後ヒスチジンを欠乏する最少培地中48時間残される。細胞は、滅菌水中3回洗浄され、そして、培地を含有するガラクトース中、HIV-1プロテアーゼの発現を試験した。S.cerevisiaeサッカロマイセスセレビシエ中のHIV-1プロテアーゼの発現が細胞死を誘導することは以前報告されている。図2は、PCR増幅されたウイルスプロテアーゼ遺伝子を伴ったまたは伴っていない線形のvs3gal-RHベクターを用いて形質転換されたW303の細胞増殖を示す。示された結果の分析は、作製されたDNAカセットは実際選択において、5-FOAインキュベーションを通して、DNAフラグメントがベクターに挿入されているクローンのみ選択するのに実際効率的である図2ことを明確に示す。URA3開始コドンがGAL1プロモーター任意のDNAフラグメントの不存在下での88bpの長さプラス挿入されたフラグメントの存在下での100bpの長さの下流末端に約188bp以下の距離で配置されたとき、作製されたカセットの自殺特性suicidecharacterは、効果的であることを、vs3gal-RHベクターでなされた実験は示している。100bp長さのDNAフラグメントの挿入は、vs3gal-RHベクターの5-FOA致死率を抑制する。W303酵母株は、線形化され、かつ脱リン酸化されたvs3gal-RHベクターおよびベクターの相同組み換えサイトの5’および3’組み換え領域に同一の領域に隣接するDNAフラグメントを用いて形質転換された。得られた形質転換体は、二日間5-FOAの存在下または不存在下の異なる選択的な媒体における増殖のため試験された。少なくとも100pb長さのDNAフラグメントを含むプラスミドは5-FOA耐性を与える。実施例2:p415ADH1発現ベクターのADH1プロモーター領域の下流への自滅的なカセットの挿入p415ADHベクターMumberg,D.,Muller,R,Funk,M.Gene.1995年、第156巻:119-122頁.Yeastvectorsforthecontrolledexpressionofheterologousproteinsindifferentgeneticbackgrounds異なる遺伝的背景において異種のタンパク質の制御された発現用の酵母ベクターを、そのマルチクローニングサイトに配置されている制限酵素XhoIを用いて切断し、そしてURA3遺伝子のORF領域をその位置に挿入した。本発明の目的のカセットは、以下の配列:5’位の相同組み換え領域RH5p4xx配列番号16,独特の制限酵素サイト,3’位の相同組み換え領域RH3p4xx配列番号17,URA3ORFを包含する。このカセットにおいて、URA3遺伝子の開始コドンは、ADH1プロモーターの末端の69bpの下流に位置している。URA-酵母細胞はこのベクターvs5ADH-RHを用いて形質転換され、URA3遺伝子はウラシルを欠乏する最少合成培地で増殖した形質転換体として発現する。我々は、約670bpのTRP1遺伝子のORF領域をサブクローニングすることにより、得られた発現ベクターの自殺特性を試験した。下流のADH1プロモーターおよび上流のURA3遺伝子は以下のとおりである:栄養要求性マーカーTRP1のためのコード領域は、プライマー配列番号10および配列番号l1を用いるPCRにより増殖された。新たな選択性マーカーを含むフラグメントは、その後、CB018またはW303酵母株における相同組み換えによりvs5ADH-RHベクター制限酵素HindIIIヒンディースリーにより線形化したに組み込まれている。URA-、TRP-酵母細胞がこのプラスミドを用いて形質転換されるとき、URA3遺伝子は、その形質転換体はウラシルを欠乏している最少合成培地において増殖しないので発現されなかったが、TRP1遺伝子は発現し、その形質転換体は、トリプトファンを欠乏している最少合成培地において増殖した。URA3遺伝子ではなく、新たなプラスミドの発現されたTRP1を含み、ADH1プロモーターの3’位の末端から675bpの距離はURA3遺伝子は発現されないようにすることを暗に示す表3。URA3開始コドンがADH1プロモーターの末端の約169bp下流のより小さい距離にあるとき、vs5ADH-RHベクター上で行われる実験は作製された新しいカセットの自殺特性は効果的であることを示している。表3.100bp長さのDNAフラグメントの挿入はvs5ADH-RHベクターの5-FOA致死率を抑制する。W303酵母株を、直線化し、かつ脱リン酸化したvsSADH-RHベクターと形質転換し、DNAフラグメントはベクターの相同組み換えサイトの5’位および3’位の組み換え領域に一致している領域に隣接する。DNAフラグメントはTRP1遺伝子の全長ORFであり、またはそのORFのより小さいフラグメントであった。得られた形質転換体を、2日間、5-FOAの存在下または不存在下で、異なる選択媒体中での増殖を試験し。少なくとも100pb長さのDNAフラグメントを含むプラスミドは5-FOA耐性を与えた。実施例3:p424GPD発現ベクターのGPDプロモーター領域の下流に実施例2で作製された自滅的なカセットの挿入実施例2で作製された自滅的なカセットは、制限酵素SaclおよびKpnlを用いて、vs5ADH-RHベクターから切除された。純粋なSacl-Kpnlカセットは、同じ酵素で前もって切断してvs4GPD-RHベクターになるp424GPDベクターに挿入されたMumberg,D.,Muller,R,Funk,M.、Gene.、1995年、第156巻:119-122頁.Yeastvectorsforthecontrolledexpressionofheterologousproteinsindifferentgeneticbackgrounds異なる遺伝的背景にある異種タンパク質の制御される発現のための酵母ベクター。URA-酵母細胞は、このベクターvs4GPD-RHと形質転換されるとき、形質転換体はウラシルを欠乏する最少合成培地上で増殖するので、URA3遺伝子が発現される。我々は、下流のGPDプロモーターおよび上流のURA3遺伝子の約660bpのHIS3遺伝子のORF領域を、以下のとおりにサブクローニングすることにより得られる発現ベクターの自殺特性を試験した:栄養要求性のマーカーHIS3のコード領域はプライマー配列番号12および配列番号13用いてPCRにより増幅された。新たな選択可能なマーカーを含むフラグメントは、その後、W303酵母株中の相同組み換えにより、制限酵素EcoRIにより線形化したvs4GPD-RHベクターに組み込まれた。URA-、HIS-酵母細胞がこのプラスミドで形質転換されたとき、形質転換体がウラシルおよびヒスチジンを欠乏する最少合成培地において増殖するので、URA3およびHIS3遺伝子は発現する。その後、我々は、下流のGPDプロモーターおよび上流のURA3遺伝子の約1095bpのLEU2遺伝子のORF領域を、以下のとおりにサブクローニングすることにより、得られる発現ベクターの自殺特性を試験した:栄養要求性のマーカーLEU2のコード領域をプライマー配列番号14および配列番号15を用いるPCRにより増幅した。新たな選択可能なマーカーを含むフラグメントは、その後、CB018またはW303酵母株における相同組み換えによりvs4GPD-RHベクター制限酵素EcoRIにより線形化されているに組み込んだ。URA-、LEU-酵母細胞を、このプラスミドを用いて形質転換したとき、URA3およびLEU2遺伝子の形質転換体は、ウラシルおよびロイシンを欠乏する最少合成培地上で増殖するので、URA3およびLEU2遺伝子は発現する。"