"a第一の標的に結合するための結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、b第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、i該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又はii該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、を含む、融合タンパク質。前記ノッチンポリペプチドが、EETI-II、AgRP又はアガトキシンのいずれか1つである、請求項1に記載の融合タンパク質。前記ノッチンポリペプチドがω-コノトキシンである、請求項1に記載の融合タンパク質。前記ノッチンポリペプチドが、その結合ループ中に非天然配列を含有する、請求項1、2又は3に記載の融合タンパク質。前記非天然配列が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する、請求項4に記載の融合タンパク質。前記ノッチンポリペプチドが、aαvβ3インテグリン、bαvβ5インテグリン、及びcα5β1インテグリンのうちの1又は2以上との結合を媒介する配列を含有する、請求項5に記載の融合タンパク質。前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである、請求項1に記載の融合タンパク質。前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのIg1ドメインである、請求項7に記載の融合タンパク質。前記Ig1ドメインが、Axl受容体、MuSK受容体、又はFGF受容体に由来する、請求項7に記載の融合タンパク質。前記受容体型チロシンキナーゼがAxl受容体である、請求項8に記載の融合タンパク質。前記ノッチンポリペプチドが、EETI-II、AgRP及びアガトキシンからなる群より選択される、請求項9に記載の融合タンパク質。前記結合ループが、aαvβ3インテグリン、bαvβ5インテグリン、及びcα5β1インテグリンのうちの1又は2以上と結合するように操作されている、請求項11に記載の融合タンパク質。aインテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、EETI-II又はAgRPノッチンポリペプチドと、biAxl細胞外ドメイン、及びii肝細胞増殖因子のNK1断片からなる群より選択されるポリペプチドと、を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。aDNA構築物内に前記融合タンパク質と多数のランダム化DNA配列とをコードする多数のDNA構築物を有するライブラリーを調製する工程と、b該ライブラリーの該DNA構築物を酵母で発現させ、発現したDNA構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、cクローンを標的と接触させることによって、該発現したDNA構築物と第一の標的又は第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、d該標的と高い親和性で結合する翻訳DNA構築物を発現するクローンを選択する工程と、e該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、を具える、請求項1に記載の融合タンパク質を調製する方法。前記ノッチンが、EETI-II、AgRP、アガトキシン又はコノトキシンのうちの1つである、請求項14に記載の方法。前記第二ポリペプチドが、リガンド結合部位を含む受容体断片と、リガンドの受容体に結合する部位を含むリガンド断片とからなる群より選択される、請求項14又は15に記載の方法。前記第二ポリペプチドが、チロシンキナーゼ受容体断片である、請求項14又は15に記載の方法。前記第二ポリペプチドが、増殖因子断片である、請求項16に記載の方法。前記第二ポリペプチドが、Axl、c-Met、HGF、VEGF、VEGF受容体、及びGas6からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項16に記載の方法。前記ノッチンポリペプチドがEETI-IIである、請求項16に記載の方法。前記ノッチンが、インテグリンに結合するように操作されている、請求項15に記載の方法。前記インテグリンが、aαvβ3インテグリン、bαvβ5インテグリン、及びcα5β1インテグリンのうちの少なくとも1つである、請求項21に記載の方法、前記ノッチンが、ループ1及びループ3が操作されたEETI-IIである、請求項15に記載の方法。i阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、ii阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法。前記細胞表面受容体がインテグリンである、請求項22に記載の方法。前記阻害される受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項21又は22に記載の方法。前記チロシンキナーゼがTAM受容体型チロシンキナーゼである、請求項25に記載の方法。下記概要は、本発明の特徴及び態様を全て包含することを意図するものでなく、本発明が本概要で論じる特徴及び態様を全て包含しなければならないことを暗示するものでもない。簡潔にするため、選択的な組み合わせ又は部分組み合わせが明確に列挙されていなくとも、様々な実施形態の特定の特徴を組み合わせ得ることを理解できる。従って、特定の態様において、本発明は、a第一の標的に結合するための結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、b第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、i該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又はii該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、を含む。ノッチンについて知られるように、結合ループは、典型的に、束縛されたシステイン残基間に存在する。これらループは、ランダム化配列のライブラリーを調製することによって改変することができる。本態様において、ノッチンポリペプチドは、その結合ループ内に非天然配列を含有する。つまり、前記配列は、ノッチンに天然に存在しない;好ましくは、前記配列は、高度な結合に対するスクリーニング手法によって選択される。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する非天然配列を含有するであろう。本発明の特定の態様では、ノッチンポリペプチドが、aαvβ3インテグリン、bαvβ5インテグリン、及びcα5β1インテグリンのうちの1又は2以上との結合を媒介する配列を含有する。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインである第二ポリペプチドを含む。本発明の特定の態様では、前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのIg1ドメインである。本発明の特定の態様では、前記Ig1ドメインが、Axl受容体、MuSK受容体、又はFGF受容体に由来する。本発明の特定の態様では、前記受容体型チロシンキナーゼがAxl受容体である。本発明の特定の態様では、前記ノッチンポリペプチドが、EETI-II、AgRP及びアガトキシンからなる群より選択される。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、aαvβ3インテグリン、bαvβ5インテグリン、及びcα5β1インテグリンのうちの1又は2以上と結合するように操作されている結合ループドメインを有する。本発明の特定の態様では、融合タンパク質が、aインテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、EETI-II又はAgRPノッチンポリペプチドと、biAxl細胞外ドメイン、及びii肝細胞増殖因子のNK1断片からなる群より選択されるポリペプチドと、を含む。本発明の特定の態様は、aDNA構築物内に前記融合タンパク質及び多数のランダム化DNA配列をコードする多数のDNA構築物を有するライブラリーを調製する工程と、b該ライブラリーの該DNA構築物を酵母で発現させ、発現したDNA構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、cクローンを標的と接触させることによって、該発現したDNA構築物と第一の標的又は第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、d該標的と高い親和性で結合する翻訳されたDNA構築物を発現するクローンを選択する工程と、e該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、を具える、融合タンパク質を調製する方法を含む。本発明の特定の態様は、i阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、ii阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法を含む。様々な前記方法の特定の態様では、前記チロシンキナーゼがTAM受容体型チロシンキナーゼである。特定の態様において、本発明は、改変ノッチン部分と、好ましくは受容体、受容体リガンド又は該天然分子の結合特性を有するそれらの断片である別の結合部分とを含有する、二重特異性又は多重特異性の融合タンパク質を調製する方法を含む。このように調製される融合タンパク質は、2個の異なる結合部分と2個の異なるリガンドとを有する。ノッチン部分は、そのC末端で、結合部分のN末端と融合する。あるいは、ノッチン部分は、そのN末端で結合部分のC末端と融合してもよい。特定の態様において、本発明は、a前記融合タンパク質及び多数のランダム化ループドメインをコードする多数のDNA構築物を有し、一定の結合多様性とライブラリーから選択される多数の強力な結合体とを提供するライブラリーを調製する工程、bライブラリー中のDNA構築物をタンパク質変異型として発現させる工程と、c第二結合パートナーに対するタンパク質変異型の結合についてライブラリーをスクリーニングする工程と、d第二結合パートナーに高い親和性で結合するDNA構築物を発現するクローンを選択する工程と、e選択したクローンのコード配列を得る工程とを具え、これによって融合タンパク質を調製することができる、第二結合パートナーに対して高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有する第二ポリペプチド例えば、ノッチンに融合する第一結合パートナー例えば、受容体又は受容体リガンドに結合する第一ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製する方法を含む。選択される第二結合パートナーは、完全に異なる分子タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質、細胞構造体、ウイルスエピトープ等であっても、又は第一結合パートナー受容体若しくは受容体リガンドに対する結合部位上の異なるエピトープであってもよい。特定の態様において、本発明は、受容体断片である第一ポリペプチドを利用する。例えば、様々なドメインを有する細胞表面受容体を、細胞外リガンド結合ドメインをコードする断片の形態で用いる。細胞表面受容体は、受容体型チロシンキナーゼでもよい。本発明の特定の態様では、第一ポリペプチドが、受容体リガンドであっても、又は受容体に結合する該リガンドの断片であってもよい。リガンドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。第一ポリペプチドは、Axl、c-Met、HGF、VEGF、VEGF受容体及びGas6からなる群より選択される配列の少なくとも一部分である配列を有し得る。本発明の特定の態様では、第二ポリペプチドが、ノッチン足場であり、EETI-II、AgRP及びアガトキシンからなる群より選択され得る。ノッチン足場がω-コノトキシンであり得ることも考えられる。本発明の特定の態様では、ノッチンループドメインがインテグリンに結合するように操作されている。本発明の特定の態様では、前記方法が、対象の標的との結合について選択されたループ部分を有するランダム酵母ディスプレイライブラリーをクローン化する工程を具える。特定の態様において、本発明は、受容体リガンドポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記受容体リガンドは、特異的受容体結合部位で受容体と結合し、受容体リガンドに対する特異的受容体結合部位でない結合パートナーに高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドに融合されている。本発明の特定の態様では、前記受容体リガンドポリペプチドが天然リガンドの断片である。本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、第一クリングルドメインでHGFアミノ末端を構成する、肝細胞増殖因子のNK1断片のような増殖因子断片である断片を含む。本発明の特定の態様は、受容体ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、前記受容体は、特異的リガンド結合部位でリガンドに結合し、特異的リガンド結合部位でない結合パートナーに高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドに融合されている。受容体型チロシンキナーゼは、固形腫瘍進行に関与する受容体型チロシンキナーゼであるAxl及び肝細胞増殖因子受容体であるMETからなる群より選択され得る。受容体型チロシンキナーゼは、Tyro-3及びMerのような、Axlの近縁種である近縁な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、EETI-II、AgRP及びアガトキシンからなる群より選択されるノッチンポリペプチドを含む。本発明の特定の態様では、前記融合タンパク質が、α5β1インテグリン、αvβ3インテグリン又はαvβ5インテグリンのうちの少なくとも1つに結合するように操作されたループドメインを含む。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがβ3インテグリンに結合するように操作されている。本発明の特定の態様では、前記ループドメインがαvインテグリンサブユニット又はβ3インテグリンサブユニットに結合するように操作されている。[要約]本発明は、異なる結合機能を提供する第二の異なるペプチド又はタンパク質と融合した操作したノッチンペプチドを含む新規な融合タンパク質の創出を含む。第二ポリペプチドは、受容体又は受容体リガンドである。好ましくは、ノッチンペプチドの一部分が、インテグリンに結合するように作成された配列で置き換えられている。加えて、融合タンパク質は、ノッチンの適切な発現及び折り畳みを促す別のタンパク質に融合したノッチンペプチドを含み得る。本発明は、受容体リガンド結合を増強するのに用い得る。リガンド-受容体相互作用に関与する天然タンパク質は、治療薬候補の操作の有望な出発点である。タンパク質-タンパク質相互作用の操作に関する従来のアプローチは、既存の相互作用を最適化することに焦点を合わせてきた。しかしながら、本来、タンパク質-タンパク質相互作用は、しばしば、複数のドメインの接合部で起こり、遺伝子組み換えは、タンパク質機能の進化に強力な役割を果たす。これらの知見を用いて、我々は、我々がドメインの付加及び進化と呼び、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張することによって増強を達成する、既存のタンパク質-タンパク質相互作用の操作に関する遺伝的アプローチを開発した。図1は、本発明の融合が、受容体-リガンド結合に対し別のエピトープを実際に付加することを示す。図1Aは、Axl細胞外ドメインが、2個の免疫グロブリン様ドメインIg1及びIg2、そして2個のフィブロネクチンIII型様Fnドメインを含むことを示す。図1Bは、EETI-II結晶構造PDB番号2ETIを示す。ドメインの付加及び進化ライブラリー用にランダム化したループ1及び3は、黒色で示す。システインI~VIを記す。図1Cは、ドメイン付加ストラテジーを示す概略図である。EETI-II変異体ライブラリーは、AxlIg1のN末端構造の左下へ向かう黒色リボンに結合され、Gas6リガンド上の隣接エピトープに結合するEETI-II変異体をスクリーニングする。Axl-Gas6構造は、PDB番号2C5Dから出典されている。図1Dは、ランダム化したEETI-IIのループI領域及びループ3領域並びにAxlIg1ドメインへの融合を示すアミノ酸配列のリストを示す。図は、PyMolを用いて作成した。図2A及び2Bは、酵母提示構築物及びAxlに連結した出発E-AxlライブラリーEETI-II変異体ランダム化ループの評価を示す。2A酵母提示E-Axl構築物。対象のタンパク質は、酵母Aga1タンパク質にジスルフィド結合した酵母Aga2タンパク質に対する遺伝的融合体として発現される。Aga1タンパク質が酵母細胞壁に共有結合することによって、提示構築物全体を酵母細胞表面に連結する。酵母ディスプレイにおけるAga1タンパク質及びAga2タンパク質の使用は、抗体の表面提示と関連して既に報告されている。例えば、K.DaneWittrupらによるタンパク質の酵母細胞表面ディスプレイ及びその使用と題された米国特許第6423538号明細書を参照されたい。対照のタンパク質に隣接するHAエピトープタグ及びc-mycエピトープタグは、市販の抗体を用いて相対的酵母表面発現レベルについて染色することができる参考のために示すc-myc染色。可溶性Gas6は、酵母提示タンパク質に対する結合を検査するのに用いることができる;Gas6結合は、Gas6上のヘキサヒスチジンタグ配列番号77に対する蛍光標識抗体で装飾される。図2Bは、野生型AxlIg1による結合と出発E-Axlライブラリーによる結合との比較を示す散布図を表す。[I二重特異性又は多重特異性結合を有するノッチン融合体]特定の態様において、本発明は、治療効果の増加のために2個以上の受容体若しくは受容体リガンドに結合する及び/又はそれらを阻害することができるという点で二重特異的又は多重特異的である融合タンパク質を含む。これら融合体は、一例として、インテグリン結合部分を含有するように操作されたN末端又はC末端ノッチンを含み得る。インテグリン結合ノッチンは、Cochranらによる改変インテグリン結合ペプチドと題された米国出願公開第2009/0257952号明細書に記載されている。フィブロネクチンα5β1インテグリン又はビトロネクチンαvβ3インテグリン及びαvβ5インテグリンに高い親和性低い平衡解離常数で結合する改変ペプチドが開示される。新規な結合特性を有するノッチンは、融合して、ヘテロオリゴマー二重特異性タンパク質を生成することができる。この手法は、最終段落に記載されている通り、参照により本明細書に含まれるものとし、インテグリン結合ノッチンの説明のため更に閲覧され得る。ここで用いる具体的なインテグリン結合パートナーは、αインテグリン鎖とβインテグリン鎖の両方に特異的であっても、又はβ鎖のみに特異的であってもよい。後者の場合、様々なα-βインテグリンの組み合わせが存在するであろうことから、インテグリン結合は多重特異的であろう。例えば、インテグリン結合ノッチン-リガンド融合体は、増殖因子NK1の断片を用いて創出されている。インテグリン結合ノッチンは、α5β1、αvβ3及びαvβ5、特にαvβ3インテグリンのような選択したインテグリンに特異的に結合するように操作されているループを含有する。NK1は、MET受容体のアゴニストとして働くポリペプチド増殖因子HGF/SFの断片である。これは、Gherardiによる肝細胞増殖因子/散乱係数hgf/sfのNK1断片及びその変異型、並びにそれらの使用と題された米国出願公開第2004号/0236073号により詳細に記載されている。簡単に述べると、HGF/SFは、血液プロテイナーゼ前駆体プラスミノーゲンのものに似て、6個のドメイン:プラスミノーゲン活性化ペプチドと相同なN末端Nドメインと、クリングルKドメインの4個のコピーと、触媒的に不活性なセリンプロテイナーゼドメインとからなるユニークなドメイン構造を有する。一次HGF/SF転写物の選択的スプライシングの2種の生成物は、Nドメインと第一KドメインであるK1とを含有する断片であるNK1と、NとK1と第二クリングルドメインであるK2とを含有する断片であるNK2とをコードする。その配列は、MolCellBiolMarch1998p1275-1283Vol18No3に見ることができる。別の例として、Axlを用いて、インテグリン結合ノッチン-受容体融合体を調製した。Axl受容体は、Liuの米国特許第5468634号明細書に記載されている。簡単に述べると、Axlは、IgL及びFNIIIリピートを並べた細胞外領域の構造を有する受容体型チロシンキナーゼである。これは、細胞増殖の刺激に関与する。これは、ビタミンK依存性タンパク質Gas6に結合することができ、よって細胞質へ信号を伝達する。Axlの細胞外ドメインは切断することができ、65kDaの可溶性細胞外ドメインを遊離することができる。切断は、受容体のターンオーバーを増強し、部分的に活性化されたキナーゼを生成するO’BryanJPFridellYWKoskiRVarnumBLiuETJBiolChem270:551-557。しかしながら、切断されたドメインの機能は未知である。Axl受容体は、2個のGas6結合部位:Ig1ドメインに位置する主要な高親和性部位と、Ig2ドメインに位置する弱い副次的な部位とを有する図1A。Gas6が、その高親和性部位を介してAxlと結び付くと、その後の弱い結合部位を介した結合が受容体の二量体化及び活性化をもたらし、活性な2:2シグナル伝達複合体が形成される。Axl過剰発現が様々な範囲の癌細胞株において浸潤及び転移をもたらし、Azlシグナル伝達の阻害が腫瘍細胞の移動及び転移を阻害するため、これは、治療上関連するリガンド-受容体システムである。生成した二重特異性タンパク質は、高い親和性でインテグリン及びAxlリガンドGas6と結合する。図1は、配列がドメインの付加及び進化ライブラリー生成及びスクリーニングの概要を表すことを示し;第一行は、システイン結合及びシステイン間のループを有する野生型EETI-II配列を示し;第二行は、x残基が加えられたループ1及び3を示し;EETI-IIのループ1及び3は、ランダム化されてループライブラリーを生成し、Ax1Ig1のN末端に融合される;第三行は、EETI-II-axl融合変異体であるEA7.01、EA7.06及びEA8.04の配列を示す;最下行は、PGMモチーフ又はP-G/T-M/Kモチーフの同定に由来する配列を列挙する。Axlアミノ酸配列は、NCBIUniGene26362及びGenbankアクセッション番号P30530で見ることができる。本発明の別の態様において、ノッチンに融合した受容体又は他の融合タンパク質は、結合目的で変異させられたノッチンに融合することに加えて、結合目的で修飾及び変異もさせられる。これは、実施例6に示される。この実施例において、デコイとして用いられるべき受容体は、最初に細胞外ドメインへ短縮される。Axlの場合、シグナルペプチドの部分及び細胞ガイドメインの小部分約426アミノ酸の細胞外ドメインから約110アミノ酸を用いた。変異性DNA増幅を用いて、受容体断片をコードするDNA配列に変異を導入する。得られたクローンを天然リガンドAxlの場合はGas6に対する結合性に対してスクリーニングして、より強力な結合体を、例えばセルソーティングによって選択する。様々な受容体構築物を用いることができた。このノッチン-Axl融合体は、インテグリン結合と天然Gas6/Axl相互作用の両方に同時に拮抗できる二重特異性又は多重特異性分子として機能することができる。Gas6は可溶性リガンドである一方、インテグリンは細胞表面受容体であり、両方の標的は同時に結合することができる。Gas6の結合は該可溶性リガンドを捕捉し、その結合を妨げ、続いて内在性Axl受容体の活性化を妨げる。インテグリン受容体に対する結合は、インテグリン受容体が細胞外基質タンパク質に結合するのを妨げるであろう。受容体型チロシンキナーゼのような増殖因子受容体又はシグナル伝達受容体に対するインテグリン結合ペプチドの融合は、インテグリンと増殖因子受容体経路との間に有意なクロストークが存在するため、有利である。例えば、インテグリンとMet受容体との間に強いクロストークが存在する。両方の受容体を標的とする薬物は、血管新生及び転移の阻害に一層優れるであろう。治療的タンパク質とインテグリン結合性ノッチンとの融合によるインテグリン標的化は、第二の治療薬を腫瘍細胞に局在化させて、結合活性効果により効力を増加させることもできる。更に、2個の腫瘍受容体を標的とすることができるイメージング剤は、増加したシグナルを発生させ、早期発見のため、より小さな腫瘍を検出することができる。[ノッチン-Fc融合体]本明細書に記載する融合タンパク質の別の例実施例12を参照は、インテグリン結合性ノッチンとマウス抗体のFc部分との間の融合体である。抗体のFc部分は、免疫グロブリン分子を作り上げている2個の重鎖の2個のカルボキシ末端ドメインによって形成される。IgG分子は、2個の重鎖それぞれ約50kDa及び2個の軽鎖それぞれ約25kDaを含有する。全ての抗体の全体構造は非常に類似しており、タンパク質の先端の小さな領域が極めて可変性であり、僅かに異なる先端構造を有する何百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は超可変領域Fabとして知られている。他の断片は、抗原結合活性を持たないが、元々は容易に結晶化することが観察され、この理由のため、結晶可能な断片にちなんで、Fc断片と名付けられた。この断片は、対になったCH2及びCH3ドメインに相当し、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプ間の機能的相違は、主にFc断片にある。抗体分子のFc部分とFab部分とを結合するヒンジ領域は、堅固な蝶番ではなく、実際には、2個のFabアームの独立な動きを可能にする柔軟なつなぎなわである。このことは、ハプテンに結合した抗体の電子顕微鏡検査によって実証されている。従って、本発明の融合タンパク質は、抗体断片の各アーム上に1個が存在する2個のノッチンペプチドを含有するように作成することができる。Fc部分は、抗体のクラス及びサブクラス間で変動するが、そのクラスの範囲内では同一である。重鎖のC末端端部がFc領域を形成する。Fc領域は、受容体結合部分として重要な役割を果たす。抗体のFc部分は、2つの異なる方法でFc受容体に結合する。例えば、IgG及びIgMがそれらのFab部分によって病原体に結合した後に、それらのFc部分がマクロファージのような食細胞上の受容体に結合して食作用を誘導することができる。本発明のノッチン-Fc融合体は、Fc部分を用いて二重の結合能力、及び/又は半減期の延長、発現レベルの向上等を提供するように実施することができる。[IIリガンド受容体結合の改善に用いるノッチン融合体]本発明の本態様において、ランダム化ループを有し受容体に融合したノッチンのライブラリーをスクリーニングして、改善されたリガンド結合を創出するプラットフォームとして用いる。一例として、EETIライブラリーをAxlに融合させて、このライブラリーをスクリーニングして、Gas6リガンドに対する増加した親和性を有するEETI-Axl結合体を単離した。このように、ノッチンは、リガンド-受容体相互作用の親和性を増加させるための一般的なプラットフォームとして既存のリガンド又は受容体と融合させることができる。ここで、我々は、合成ノッチン結合ドメインの付加及びそれに続く最適化によってタンパク質を操作する可能性を示す。このアプローチの能力を実証するため、我々は、1ラウンドのみの指向進化を用いて天然の高親和性1桁台のナノモルタンパク質-タンパク質相互作用をナノモル以下のレベルまで増強する。この研究を通じて、我々は、エクバリウムエラテリウムEcballiumelateriumのトリプシン阻害剤IIEETI-IIノッチンの表面上の2個の構造的に隣接したループを同時に操作して、外因性標的に向けた結合面を形成することができることも実証する。つまり、受容体及びリガンドは、融合したノッチン上のループを操作することによって、及び又は、受容体若しくはリガンド自体のループを操作することによって、付加的な表面で結合するか又は結合させることができる。この研究は、実験室進化研究に遺伝子の複製及び組み合わせの自然進化の過程を利用する可能性を実証し、タンパク質機能の調査及び最適化に広く応用できるはずである。ドメインの付加及び進化のストラテジーは、既存のタンパク質-タンパク質相互作用の親和性を増大するための広範なストラテジーである。合成結合ドメインを、結合タンパク質のN末端又はC末端に融合させて、続いて、隣接エピトープに結合することによって結合パートナーに対する親和性を増大させるように進化させることができる。我々は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定における応用も想定する。我々は、ナイーブという用語により、標的に対して天然の結合を有さないタンパク質に基づくライブラリーを意味し、例えば、EETI-IIノッチンがGas6に対して天然の結合親和性を示さないことである。このアプローチの更なる応用は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定を含む。腫瘍標的に結合するように操作したEETI-IIペプチドは、生体内分子イメージング手法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分な程度に高くなければならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表面提示結合において一桁台のμMの範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親和性を有する合成結合ドメインの同定を可能にするアンカーリングストラテジーとして用いることができる。下記の実施例では、ノッチン変異体をAxlの不存在下で発現させた場合、本発明で開発したEETI-II変異体が、Gas6に対し検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することができる。[III折り畳まれた機能性ノッチンタンパク質の発現を増強するノッチン融合体]ノッチンペプチドは、適切に折り畳まれた形態で得ることが困難な場合がある。ペプチドの化学合成及び再折り畳みを行うことはできるが、広範囲にわたる最適化を必要とする、この問題は、ノッチンをタンパク質に融合することによって軽減され得る。例えば、EETI-II2.5D下記で説明するは酵母で可溶型として発現できなかった。しかしながら、Axlに融合した場合、高収率の折り畳まれた機能性ノッチン-Axl融合体が得られた。融合パートナーを切り離すためにプロテアーゼ切断部位をEETI-II2.5DとAxlとの間に導入した。これは、いずれかの融合パートナーを発現のために用いる場合の一般的なストラテジーであり得るか、又は、上述のような二重特異性タンパク質の作成の一環とし得る。これは、Fc、ヒト血清アルブミン等のような修飾ドメインの融合にも影響を与え、治療的用途のために半減期を増加させるであろう。発現が困難なノッチンを適切に発現したタンパク質に融合することによって、収率を向上させることができる。プロテアーゼ認識配列をノッチンと融合パートナーとの間に挿入する。これは、下記実施例7で例示されている。[定義]特に定義のない限り、本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと類似する又は同等な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。一般に、細胞及び分子生物学及び化学に関連して用いられる学術用語並びに細胞及び分子生物学及び化学の技術は、本技術分野で周知であり、通常用いられるものである。具体的に規定しないが、ある種の実験手法は、一般に、本技術分野で周知の通常の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され論じられる様々な一般的及びより詳細な参考文献に記載されたように、行われる。明確さの目的で、次の用語を下記で定義する。有効量という用語は、改変ペプチドの同族結合パートナーとの結合を調節することができる本発明の融合タンパク質の量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の病状に左右されるであろう。医薬として許容されるは、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、投与された宿主にとって毒性でない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与のため、上記有効成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液のようなビヒクルで注射用の単位剤形に調剤することができる。ノッチンタンパク質という用語は、タンパク質類、糖類及び脂質類のような様々な分子標的に結合する、典型的には24~40アミノ酸の小型タンパク質の構造ファミリーを意味する。これらの三次元構造は、3~5個のジスルフィド結合の特有の配置によって本質的に規定される。2個の他の鎖内ジスルフィド結合によって制限される大環状分子を横断する1個のジスルフィド架橋を有する特徴的な結び目構造を持つトポロジーが、このクラスの生体分子に名前を貸した、同じシステインネットワークを有する幾つかの異なる微小タンパク質において見出された。その二次構造含量は低いが、ノッチンは、ジスルフィド結合骨格によって安定化した小型の三重鎖逆平行βシートを共有する。システインノットタンパク質とも呼ばれるノッチンファミリーの生化学的によく定義されたメンバーとしては、エクバリウムエラテリウム種子由来のトリプシン阻害剤EETI-II、捕食性イモガイであるアンボイナイガイConusgeographus由来の神経細胞N型Ca2チャネル遮断剤であるω-コノトキシン、アグーチ関連タンパク質AgRP、Millhauserら、AnnNYAcadSciJune12003;9941:27-35を参照のこと、オメガアガトキシンファミリー等が挙げられる。適切なアガトキシン配列は、米国特許出願公開第2009/0257952号で与えられており、通常の発明者は本願と共に利用できる。別のアガトキシン配列は、GenBankアクセッション番号P37045のオメガ-アガトキシン-Aa4b;P81744のオメガ-アガトキシン-Aa3b等で与えられる。その他のノッチン配列は、GenBankアクセッション番号FJ601218.1,knottin[ベミシアタバシ];GenBankアクセッション番号P85079,オメガ-リコトキシン;及びGenBankアクセッション番号AAB34917,ミュー-OコノトキシンMrVIA=電位作動型ナトリウムチャネル遮断剤で見出すことができる。コノトキシン類は、一般に、長さが10~30残基のペプチドからなる。具体的な例は、食魚性のイモガイであるヤキイモConusmagusで見出された天然に存在するコノペプチドの合成等価体ジコノチドであるPRIALTである。ジコノチドは、2639ダルトンの分子量及びC102H172N36O32S7の分子式を有し3個のジスルフィド架橋を含有する25アミノ酸の多塩基性ペプチドである。ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド結合構造を有する。この構造は、Gellyら、TheKNOTTINwebsiteanddatabase:anewinformationsystemdedicatedtotheknottinscaffoldNucleicAcidsResearch2004Vol32DatabaseissueD156-D159にも説明されている。多数のノッチンに三重鎖βシートが存在する。この結び目構造に関与するシステインは、Cys残基が互いに結合していることを指し示す図1Dの線で結ばれて、示される。Cys残基間の空間は、本発明で重要であり、それは改変ループの分子トポロジー及び高次構造のためである。改変ループは、RGDを含み、インテグリン結合ループを提供することができる。これらの属性は、高親和性インテグリン結合にとって重要である。RGD擬似ループをノッチンCys残基間に挿入するが、このループの長さは、それらCys残基間の三次元空間に依存する最適なインテグリン結合に応じて調節されなければならない。例えば、フランキングCys残基が互いに結合している場合、最適なループは、フランキングCys残基が一次配列において離れたCys残基と結合している場合よりも短くなり得る。そうでなければ、高親和性インテグリン結合のために、より長いRGD含有ループを抑制する特定のアミノ酸置換を最適な高次構造へ導入することができる。本発明のノッチンタンパク質は、作られたある種の修飾を含み、ノッチンを短縮しても又はループ若しくは不要なシステイン残基若しくはジスルフィド結合を除去してもよい。アミノ酸という用語は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を包含し、アミノ酸のD体とL体の両方及びラセミ体を包含する。より具体的には、アミノ酸は、最大10個の炭素原子を含む。それらは、付加的なカルボキシル基並びに窒素及び硫黄のようなヘテロ原子を含み得る。好ましくは、アミノ酸がαアミノ酸及びβアミノ酸である。αアミノ酸という用語は、カルボキシル基に直接結合した炭素であるα炭素にアミノ基が結合したアミノ酸を指す。βアミノ酸という用語は、カルボキシル基から1個離れた炭素であるβ炭素にアミノ基が結合したアミノ酸を指す。本明細書中で記載するアミノ酸は、Xがいずれかのアミノ酸を意味する標準IUPAC1文字命名法で呼ぶ。EETIという用語は、プロテインデータバンクエントリーPDB2ETIを意味する。ノッチンデータベースにおけるこのエントリーはEETI-IIである。これは、下記配列を有する。全長EETI-IIは、最終プロリンが位置30に位置する30アミノ酸配列を有する:ループ1及びループ3は太字で下線を引いた。これらループは、下記で実証されるように、変化させることができ、結合効率にも影響を与え得る。他のループは結合効率に影響せずに変化させ得る。AgRPという用語は、PDBエントリー1HYKを意味する。ノッチンデータベースにおけるこのエントリーは、SwissProtAGRP_HUMANであり、129アミノ酸の全長配列を見出すことができる。これは、87番目のアミノ酸で開始する配列を含む。追加のGをこの構築物に加える。これは、Jacksonらの論文2002年、Biochemistry、41巻、7565頁に記載されているC105A変異も含む。破線を引いた部分は、下記の小型の異形において除外した断片を示す。ループ4由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するRGD配列によって置き換えられる。ループ1及びループ3は、下の括弧の間に示す。AgRPに関する小型のという用語は、PDBエントリー1MROを意味する。これはSwissProtAGRP_HUMANでもある。これは、上で与えられたものと類似する下記配列を有する。配列中、下線を引いたAは、予想される二量体形成シスチンを排除するアミノ酸置換を表す。本明細書で、シスチンは1個のアミノ酸を指し;システインは二量体を指す。ループ4由来の太字で下線を引いた部分は、下に記載するRGD配列によって置き換えられる。アガトキシンという用語は、オメガアガトキシンPDB:1OMB及びノッチンデータベースにおけるSwissProtエントリーTOG4B_AGEAPを意味する。これは、下記配列を有する。破線は、小型のアガトキシンについて除外されたペプチド部分を示す。追加のグリシンが小型構築物のN末端に加えられる。太字で下線を引いた部分は、下記で記載するRGD配列によって置き換えられる。ループドメインという用語は、規則正しい二次構造を有さないペプチド鎖内にあり、一般にそのペプチドの表面上に存在するアミノ酸配列を指す。ループという用語は、αヘリックス、βシート等の形態にあるような規則正しい形態でない二次構造を指すものと本技術分野で理解される。ペプチドに関連して、実質的に同一という用語は、ペプチドが、特定の比較ウインドウによって参照配列に対して少なくとも70の配列同一性、好ましくは80、より好ましくは85、最も好ましくは少なくとも90又は少なくとも95の配列同一性を有する配列を含むことを示し、この場合、ペプチドは、ペプチド全体、分子足場部分、又は結合ループ部分約9~11残基のいずれかである。好ましくは、Needleman及びWunschの相同性アラインメントアルゴリズムJMolBiol48:443453を用いて最適なアラインメントが行われる。2個のペプチド配列が実質的に同一であることのしるしは、一方のペプチドが、第二のペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に反応性であることである。本発明の目的について、配列が明確に例示した特定配列と実質的に同一であることの別のしるしは、問題の配列が少なくとも参照配列と同じように高いインテグリン結合親和性を有することである。従って、例えば、2個のぺプチドが保存的置換によってのみ相違する場合、ペプチドは、第二のぺプチドと実質的に同一である。保存的置換は周知であり、例えば、PAM250スコアリング行列によって例示される。実質的に類似するペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化によって相違し得ることを除き、上述した配列を共有する。本明細書中で使用するように、2個の核酸又はポリペプチド配列に関連して、配列同一性又は同一性は、2個の配列の残基が特定の比較ウインドウによって最大一致を目指して整列させた場合に同一であることを指す。タンパク質に関して配列同一性の比率を用いる場合、同一でない残基位置は、しばしば、保存的アミノ酸置換によって相違し、この場合、アミノ酸残基は類似の化学特性例えば、電荷又は疎水性を有する他のアミノ酸残基と置換され、よって分子の機能的特性を変えないことが認められる。配列が保存的置換で相違する場合、配列同一性率は、置換の保存的性質を修正するように上方修正され得る。そのような保存的置換により相違する配列は、配列類似性又は類似性を有するといえる。この修正を行う手法は、当業者に周知である。これは、典型的には、保存的置換を全体的でなく部分的なミスマッチとしてスコアリングすることを含み、これにより配列同一性の比率が増加する。従って、例えば、同一アミノ酸が1のスコアを与えられ、非保存的置換が0のスコアを与えられる場合、保存的置換は0と1の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、NIH多重アラインメントワークショップhttphelixwebnihgovmultialignで実行されるように計算される。三次元ツールを配列比較に用いてもよい。本明細書中で用いるように、配列同一性の比率は、比較ウインドウによって最適に整列させた2個の配列を比較することによって決定される値を意味し、2個の配列の最適アラインメントについて、比較ウインドウにおけるポリペプチド配列の部分は、付加又は欠失を含まない参照配列と比較して付加又は欠失すなわち、ギャップを含み得る。その比率は、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を測定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、結果に100をかけて配列同一性の比率を得ることによって計算される。受容体型チロシンキナーゼという用語は、その通常の意味で用いられる;具体例は下記で与えられる。TAM受容体型チロシンキナーゼという用語は、tyro3、Axl及びMerTKを含む受容体キナーゼのTAMファミリーを指す。これらは、キナーゼドメイン内の保存配列及び接着分子様細胞外ドメインによって特徴付けられ、Lingerらの論文TAMreceptortyrosinekinases:biologicfunctionssignalingandpotentialtherapeutictargetinginhumancancerAdvCancerRes2008;100:35-83によって更に説明される。全体説明[ノッチンペプチドの操作]本発明の融合タンパク質の重要な特徴は、所定のリガンドへの特異的結合にノッチン部分を用いることである。ノッチン結合は、好ましくは、天然の溶媒露出ループを所定のリガンドへの結合用に選択した短い例えば、5~12アミノ酸配列で置き換えることによって操作される。溶媒露出すなわち、表面上のループは、一般に、ジスルフィド結合したシステイン残基によって固定されている。新しい、すなわち置換アミノ酸配列は、好ましくは、ループ部分のコドンをランダム化し、改変ペプチドを発現させ、所定のリガンドに対して最大の結合を有する変異体を選択することによって得られる。先の工程から最も強力な結合性タンパク質を採用し、ループを再ランダム化して、この選択工程を複数回繰り返してもよい。EETI-IIノッチンペプチドは、ジスルフィド結び目構造トポロジーを含み、突然変異誘発を行うことができる複数の溶媒露出ループを有する。Gas6との境界面を進化させるため、我々は構造的に隣接するループ1及びループ3をランダム化した。このEETI-IIループライブラリーの直接的なAC1Ig1のN末端への融合図1Dに図示は、天然のGas6-Axl相互作用を乱さず、これにより、数千万の一桁台のナノモル結合体のバックグラウンドをもたらした。このようなバックグラウンドから増強されたクローンを単離する能力は、タンパク質工学の酵素表面ディスプレイ及び定量蛍光活性化セルソーティングの力を語る。更に、機能喪失をこうむっていない出発ライブラリーは、結合パートナーの一方に対する無作為変異がしばしば初期ライブラリーの大部分について機能の低下をもたらす従来の指向進化ストラテジーのものと異なる。ドメイン付加ナイーブライブラリーにおける野生型特性の保持は自然進化の展望に光を当て、これによって、ドメインの付加及び進化は事実上、活性低下の代償なく、配列空間を探索しながら、タンパク質機能の進化を可能にすることができる。多種多様なノッチンペプチドを本発明の融合タンパク質に用いることができる。例えば、酵母細胞表面上に提示される場合、下記変異体は、フィブロネクチン由来のRGD配列を有する変異体よりも約2~3倍良好にαvβ3インテグリンと結合する。2009年4月3日に出願された同時継続出願第12/418376号に記載されるように、上記改変ノッチンは、RGD結合ループを含み、インテグリンと特異的に結合する。そこに記載する通り、これらループは、非RGD残基において、結合特異性及び力価に影響することなく、ある程度まで変化させることができる。例えば、11残基のうちの3個を変化させた場合、25Dに対して約70の同一性を有するであろう。上記改変ノッチンは、αvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン及びα5β1インテグリンに特異的に結合することが示されている。インテグリンに結合するように操作したノッチンペプチドの別の例は、AgRPである。下の表2は、フローサイトメトリーによって単離し、太字の残基によって表示されるように、ループ4中にRGD配列及びフランキング残基を有するAgRP変異体の配列を示す。付加的AgRP改変ノッチンは、上で参照したCochranらの米国出願公開第2009/0257952号明細書に記載されているように創出することができる。AgRPノッチン融合体は、AgRPのループ1、2及び3に加えて上で例示するループ4を用いて調製することができる。[改変ノッチン結合パートナー]改変ノッチンを別のタンパク質に融合させる。このタンパク質は、本明細書の記載に従って改変ノッチンの設計にある程度入るであろう。つまり、融合パートナー及びノッチン結合パートナーは、それらが同じ生物学的経路に存在する点で論理的関係を有し、これらは、結合されて治療結果等を改善する標的を対象とする。改変ノッチン-チロシンキナーゼ受容体融合体によって下記で例示されるように、融合体は、チロシンキナーゼに対するリガンドと結合するように操作してもよい。融合体は投与されてリガンドと結合され、それにより、デコイとして働き、天然リガンドがチロシンキナーゼ受容体と結合するのを妨げる。下記で更に例示するように、チロシンキナーゼ受容体全体を使用しない;天然リガンド、好ましくはアゴニストと結合する部分のみを使用する。Axlの場合、Gas6リガンドと結合するAxl受容体のIg1部分及びIg2部分を使用する。増殖停止特異的6であるGas6は、血漿ビタミンK依存性タンパク質ファミリーに属する。Gas6は、抗凝固タンパク質と高い構造相同性を共有し合うが、TAMファミリーの受容体型チロシンキナーゼであるtyro3、Axl及びMerTKとの相互作用を通じて増殖因子様特性を有する。改変ノッチン-タンパク質融合体の別の例は、融合パートナーが増殖因子又は増殖因子の活性断片である融合体であり、ノッチンは、血管系中又は腫瘍に存在し得るような内皮細胞と結合するように操作される。これは、αvβ3インテグリンと、Met受容体に結合する増殖因子又は増殖因子断片とを結びつけるように操作したノッチンAgRPによって例示される。αvβ3インテグリンと細胞外基質との相互作用は、毛細血管から出芽する内皮細胞及び血管新生にとって極めて重要である。更に、インテグリン媒介性アウトサイドインシグナルは、増殖因子受容体と協同して、細胞の増殖及び運動性を促進する。別の例として、Soldiらの論文Roleofalphavbeta3integrinintheactivationofvascularendothelialgrowthfactorreceptor-2TheEMBOJournal199918882-892は、インテグリン系によって血管新生誘導因子受容体の調節の可能性を見極めることを報告しており、ヒト内皮細胞においてαvβ3インテグリンとチロシンキナーゼ血管内皮増殖因子受容体-2VEGFR-2との間の相互作用を調べた。VEGF受容体とMet受容体肝細胞増殖因子受容体としても知られるの両方とも受容体型チロシンキナーゼである。結合パートナー選択の別の例は、αvβ3インテグリンに結合する改変ノッチンと、MET受容体のアゴニストとして働くポリペプチド増殖因子HGF/SFの断片であるNK1との融合である。下に記載するように、NK1を修飾して、高度に安定でより効果的なアゴニスト性リガンドを創出するか、又は高度に安定でより効果的なアンタゴニストを創出した。[ドメイン付加により合成結合ドメインを有するEETI-Axl融合体]下記の実施例で、エクバリウムエラテリウムのトリプシン阻害剤IIEETI-IIは合成結合ドメインとして働き、その融合パートナーの結合を増大させる。EETI-IIは、優れた安定性特性を提供する特徴的な織り合わされたジスルフィド結合骨格を含むノッチンペプチドファミリーのメンバーである図1B。EETI-IIの溶媒露出ループは、突然変異誘発に対して寛容性であり、新規な認識特性について既に個別に操作されてきた。しかしながら、本研究では、EETI-II中の構造的に隣接する2個のループを同時にランダム化して、生じたEETI-II変異体のライブラリーを野生型AxlIg1に融合させた。Axl配列は、EntrezGeneのGeneID558で与えられる。次に、このライブラリーをスクリーニングして、増大したGas6結合親和性を有する新規なEETI-Axl融合体を同定した。つまり、結合は、Axl受容体を介して、また改変ループを介して起こるであろう。1ラウンドのみの指向進化に続いてナノモル以下の親和性を有する変異体を同定し、その変異体では、EETI-II変異体の改変ループの両方とも、新規な結合面の創出によってGas6に対する親和性の増大に貢献した。この研究は、ドメインの付加及び進化がタンパク質機能を増強することを裏付け、足場としてのEETI-IIノッチンが新規な認識特性を操作することも裏付ける。[ドメイン付加ライブラリーの設計及び合成]AxlのIg1ドメインはGas6に対する優位な結合部位を含むことから、Gas6/Axl相互作用の親和性を増大させるために、EETI-IIノッチンペプチドのループライブラリーをAxlIg1に融合させた。Gas6/Axl複合体ではAxlIg1のN末端がそのC末端よりもGas6の近くにあり、従って、EETI-II変異体のGas6との相互作用をより可能にしやすそうであるため図1C、AxlのN末端への融合を選択した。EETI-II及びAxlの構造の解析は、AxlのN末端へのEETI-IIの融合が2個のタンパク質の三次構造の間におよそ11アミノ酸の間隔を与えるであろうことを示す。従って、更なるリンカー残基を含めることなく、EETI-IIループライブラリーをAxlのN末端に直接融合させることを選択した。EETI-II中の最終Pro30残基及びAxlIg1のPro20を排除して、結合の柔軟性を向上させ、EETI-IIのSer29をAxlのArg21に直接融合させた。構造的に隣接しており図1B、EETI-IIノッチン状に連続的な結合面の形成を可能にするであろうことから、ランダム化についてRRTI-IIループ1及びループ3を選択した。野生型のループ1及びループ3を、NNSコドンを用いて、それぞれ7~10アミノ酸及び6~8アミノ酸のランダム化配列で同時に置き換えた図1D。NNSコドンストラテジーは、1個の停止コドンのみをコードすることによって停止コドンの頻度を制限しながら、20個のアミノ酸全てを改変ループに含めることを可能にする。他の縮重ライブライリーストラテジーを用いてもよい。他の例示的ストラテジーについては、Kleebらの論文MetabolicengineeringofageneticselectionsystemwithtunablestringencyProcNatAcadSci104:1390713912を参照されたい。直接融合は、酵母提示pCTプラスミドにおいてAxlIg1アミノ酸Gly22の前にプロリン-アルギニンジペプチドをコードするAvrIIC‘CTAG,G部位を含めることによって達成した。EETI-IIループライブラリーは、制限消化したAxrII部位の最初の塩基対を‘T’で置き換えて、EETI-IIのSer29とAxlIg1のArg21との所望のSer-Arg結合をコードするTCTAGG配列番号40を与えるように設計した。EETI-IIループライブラリー用cDNAは、標準的なPCRアセンブリ技術を用いて合成し、酵母提示E-Axlライブラリーは、pCT-Avr-Axlアクセプタープラスミドに対する相同組み換えによって生成させた実施例を参照。このライブラリーは、本明細書でE-Axlライブラリーと呼ぶ;これは、希釈物プレーティング及びコロニー計数によって測定したように、1.2×108個の形質転換体を含んでいた。無作為に選択した個々のクローンの配列解析は、意図した融合ストラテジー、ループ長分布、及びAxl配列への変異の欠如を確認した。先の複数のランダム化ループを含むライブラリーの報告と一致して、およそ30のクローンは、停止コドン又は変異を含まない全ループ配列を含んでいた。ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分なほど高くなければならないという要求のため、努力を必要とする。例えば、酵母表面ディスプレイにおいて、一桁台のμM範囲の結合親和性は検出限界を下回り、このようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は単離において検出限界を下回る親和性を有し得る合成結合ドメインの同定を可能にするアンカーリングストラテジーとして用いることができる。この裏付けとして、本発明で開発したEETI-II変異体は、ノッチン変異体がAxlの不存在下で発現される場合にはGas6に対して検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する完全合成結合薬を生成させることができる。[ライブラリースクリーニング及び配列解析]E-Axlライブラリーの発現及びそのGas6に対する結合を、それぞれ、酵母提示構築物上のcmycエピトープタグ及び可溶性Gas6上のヘキサヒスチジンタグ配列番号77図2Aの免疫蛍光標識によって評価した。図2Aは、酵母表面ディスプレイにおいて知られているように、アガトキシン構成要素Aga1p及びAga2pがこの順番で酵母細胞壁から伸びていることを示す。Hylite44822でタグを付けた抗his抗体をGas6上のhisタグ32に結合させる;mycタグ26をチキン抗myc抗体28に結合させ、今度はAlexa555,30で標識した抗チキン抗体により結合される。融合体にヘマグルチニンタグも含める。これにAxl-Ig1を融合させて、Gas6リガンドのAxlに対する結合が実行される。酵母細胞表面上に発現した出発ライブラリーの全メンバーは、野生型AxlIg1と同じレベルでGas6に結合した図2B。これは、AxlのN末端へのEETI-IIループライブラリーの直接結合が天然のGas6-Axl相互作用を乱さないことを実証する。結果的に、これは、稀な改良クローンを分離しなければならない数千万の野生型の一桁台のナノモルの結合体のバックグラウンドも生じる。酵母表面ディスプレイを用いたライブラリースクリーニングのために、しばしば結合クローンの上位1を収集する;しかしながら、この極めて高いバックグラウンドレベルの結合のため、結合クローンの上位6を収集して増強された特性を有する稀なクローンを失う可能性を低減する保存的分取ストラテジーを最初に用いた図3。図3は、ライブラリーを分取するときに、可溶性Gas6への結合についてスクリーニングすることによって最初の分取を行ったことを示す。その後の分取は、Gas6への結合の後に解離速度の増大に対して選択圧を付与する過剰な競合相手の存在下でのインキュベーションが続く‘解離速度’分取を用いた。第6ラウンド目の分取で、ネガティブソーティングを行って、二次抗His抗体に結合している変異体を取り除いた。第6分取の産物下記は、1ラウンドのみの分取でこれらが完全に排除されたことを示す。最終分取の産物は、46時間の非結合‘解離’工程の後に結合を保持した。後期の分取ラウンドにおけるストリンジェンシーを増加させるため、2nMのGas6と共にインキュベーションした後に、競合相手として働く1Mの過剰のGas6の存在下で非結合工程を続ける‘解離’分取を行った。過剰な競合相手は、可溶性Axl受容体と複合した遊離Gas6を隔離することによって酵母提示E-AxlからのGas6の解離を付加逆性のものとし、これによって、より遅い解離速度を有するクローンに対する選択圧を増加させる。[インテグリン及び増殖因子受容体を標的とする二重特異性タンパク質]実施例8に、αvβ3インテグリンに結合するように操作したノッチンAgRPと、HGFのN末端及び第1クリングルドメインを含む断片NK1と呼ばれるとの間の融合体の調製を記載する。HGF肝細胞増殖因子のこの部分は、Met受容体に結合する。c-MetMET又はMNNGHOS形質転換遺伝子は、肝細胞増殖因子受容体HGFRとして知られるタンパク質をコードするがん原遺伝子である。この肝細胞増殖因子受容体タンパク質は、チロシンキナーゼ活性を持つ。一次一本鎖前駆体タンパク質は、翻訳後切断されて、ジスルフィド結合されて成熟受容体を形成するαサブユニット及びβサブユニットを生成する。αvβ3インテグリン受容体は、数多くの固形腫瘍細胞上で過剰発現され、癌の重要な標的とされる。シスチン-ノットペプチドであるアグーチ関連タンパク質AgRPは、4個のジスルフィド結合及び4個の溶媒露出ループを含む。これを、pM結合親和性でαvβ3インテグリン受容体を標的とするように操作した。AgRP変異体である7Aは、強力な結合親和性を有することが示された。7A変異体のU87MG細胞及びK562-αvβ3細胞に対するKD値は、それぞれ0.78nM及び0.89nMである。Met受容体型チロシンキナーゼ及びそのリガンドである肝細胞増殖因子HGFは、腫瘍進行と組織再生の両方を媒介することに重要な役割を果たす。HGFのN末端及び第一クリングルドメインNK1は、Met受容体を活性化する能力を保持する天然に存在するスプライスバリアントである。しかしながら、NK1は、弱いアゴニストであり、比較的不安定で、その治療上の可能性は限られている。Met受容体アゴニスト及びアンタゴニストとして機能して増強された生化学的及び生物物理学的特性を持つNK1変異体を設計した。下に記載するように、最初に、酵母表面ディスプレイを用いて、安定性及び組み換え発現収率の増大のためにNK1を進化させた。我々のライブラリー選別から単離したNK1変異体は、NK1ホモ二量体化を媒介する残基の変異のため、弱いMet受容体アンタゴニストとして機能した。このNK1ホモ二量体化境界面を復元してアゴニスト性リガンドを創出するか、又は更にこれらの相互作用を破壊してより効果的なアンタゴニストを創出する点変異を導入した。最も良いアンタゴニストは、野生型由来のアンタゴニストに対して15°Cの改良である最高約64°Cの融点を示し、発現収量に最大40倍の改良を示した。インテグリンとc-Metシグナル伝達経路との間のクロストークを研究して、有意な関係性を示した。Met受容体の天然リガンドであるHGF/SFのシグナル伝達は、上皮細胞及び内皮細胞における機能的に不活性なαvβ3インテグリンにおいてリガンド結合活性を導入することができる。従って、αvβ3インテグリンとMet受容体の両方を標的として阻害する二重特異性タンパク質は、特に単受容体標的薬と比較して、効果的な癌治療薬として有望である。[融合体で有用な受容体型チロシンキナーゼRTK断片]本発明の融合タンパク質は、様々な受容体型チロシンキナーゼを含み得る。これらタンパク質は、それらの細胞外及びリガンド結合モチーフに関して良く特徴付けられている。これらは、RTKクラスIEGF受容体ファミリーFrbBファミリー;RTKクラスIIインスリン受容体ファミリー;RTKクラスIIIRDGF受容体ファミリー;RTKクラスIVFGF受容体ファミリー;RTKクラスVVEGE受容体ファミリー;RTKクラスVIHGF受容体ファミリー;RTKクラスVIITrk受容体ファミリー;RTKクラスVIIIEph受容体ファミリー;RTKクラスIXAXL受容体ファミリー;RTKクラスXLTK受容体ファミリー;RTKクラスXITIE受容体ファミリー;RTKクラスXIIROR受容体ファミリー;RTKクラスXIIIDDR受容体ファミリー;RTKクラスXIVRET受容体ファミリー;RTKクラスXVKLG受容体ファミリー;RTKクラスXVIRYK受容体ファミリー;及びRTKクラスXVIIMuSK受容体ファミリーを含む。好ましくは、これら受容体を有する融合タンパク質の調製において、受容体の一部のみを含む、すなわち、細胞外N末端領域を含み、免疫グロブリンIg様又は上皮増殖因子EGF様ドメイン、フィブロネクチンII型リピート、又はRTKの各サブファミリーに特徴的な高システイン領域を含む様々な保存要素を示すポリペプチドを調製する;これらドメインは、主として、細胞外リガンド、例えば特定の増殖因子又はホルモンに結合するリガンド結合部位を含む。細胞内C末端領域は、最も高い保存レベルを示し、これら受容体のキナーゼ活性を担当する触媒ドメインを含み、RTK基質の受容体自己リン酸化及びチロシンリン酸化を触媒する。受容体型チロシンキナーゼ配列は、Genbankを含む様々な情報源から入手可能である。本発明に従って断片及び融合タンパク質を創出するのに用いることができる例示的配列は、例えばRandらの論文SequencesurveyofreceptortyrosinekinasesrevealsmutationsinglioblastomasProcNatAcadSciOctober42005vol102no4014344-14349で与えられる。下記のリストは、その刊行物から抜粋される。Leeらの論文Vascularendothelialgrowthfactor-relatedprotein:aligandandspecificactivatorofthetyrosinekinasereceptorFlt4PNASMarch51996vol93no51988-1992も参照されたい。本発明で使用する受容体の正確な断片は、本教示及び既存の受容体構造の知識を考慮して決定することができる。リガンド結合ポケットのみをコードする正確な配列を用いることが必要ではない。追加のアミノ酸を含むある程度の柔軟性が認容される。例えば、米国出願公開第2004/132634号で開示されるように、全てのEphファミリーメンバーのN末端細胞外領域がリガンド結合に必要なドメインを含み、具体的には、高システインドメイン及び2個のフィブロネクチンII型リピートが後に続く。一般に、N末端部分の約400、500又は600アミノ酸を、受容体型チロシンキナーゼのリガンド結合断片として用い得る。上記リストは、アミノ酸及びヌクレオチド配列を提供する。他のヌクレオチド配列は、Genbankからペプチド又はタンパク質の名称について検索することによって得ることができる。ノッチンDNA配列は、与えられたアミノ酸配列から、いずれかのコドンアサインメントを用いて得ることができる;コドンアサインメントは、酵母のような、用いる発現ベクターに基づき選択することができる。EETIヌクレオチド配列は、国際公開第02/34906号、GenBankのAX497055で与えられており;AGRPヌクレオチド配列はNG_011501で見ることができ;アガトキシンのヌクレオチド配列はGenbankのM95540.1で見ることができる。別のノッチンのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、ノッチンであるプサコテアシンPsacotheasinに関する論文JMicrobiolBiotechnol2010204708711で見ることができる。[融合体に有用な受容体リガンド断片]ここで、特定の受容体リガンドである肝細胞増殖因子及び抗体Fc断片を例示する。肝細胞増殖因子c-metとも呼ばれるを断片化して、met受容体に結合することが知られている部分を得た。このHGF断片はNK1断片としても知られている。例示配列を配列番号66で与える。この配列は、PAN_Appleスーパーファミリーの配列の一部及びKRスーパーファミリーの配列の一部を含む。従って、本教示で与えられる本明細書で例示する組成は、肝細胞増殖因子様タンパク質;プラスミノーゲンドメイン含有タンパク質;マクロファージ刺激因子1;及び、RONrecepteurd’origineNantaisのような他のプラスミノーゲン関連増殖因子を含むように拡張することができる。Maestriniらの論文AfamilyoftransmembraneproteinswithhomologytotheMET-hepatocytegrowthfactorreceptorPNASJanuary231996vol93no2674-678を参照されたい。哺乳動物においても、肝細胞増殖因子はセリンプロテアーゼの相同体であるが、そのタンパク質分解活性を失っていた。[二重特異性タンパク質の投与]本発明の融合タンパク質は、細胞培養研究におけるような試験管内で、すなわち、移植用の細胞に投与してもよいが、生体内に投与してもよい。治療用タンパク質について使用される様々な処方及び投与計画を用いることができる。医薬組成物は、CFPに加えて、動物への投与に適し例えば、生理食塩水ひいては活性な融合タンパク質の医薬上使用することが出来る調剤薬への加工を促す助剤賦形剤、安定剤又は希釈剤のようなを含む、適切な、医薬として許容される担体、生物学的に適合性のビヒクル及び添加剤を含むことができる。このような組成物は、最終的に、本発明のキメラタンパク質と相乗的に又は協調的に作用する別の治療用組成物と併用することができる。あるいは、他の医薬組成物は、特定の疾患に対して治療効果があることが知られている融合タンパク質例えば、乳癌に対するハーセプチンを用いて基礎とすることができる。あるいは、可溶性のものを含む医薬組成物を組み合わせて、様々な治療計画で使用するためのカクテルとすることができる。医薬組成物は、投与方法の要求を満たすいずれか許容されるやり方で調剤することができる。例えば、生体材料及び他の薬物送達用ポリマーの使用、更に、特定の投与方法を有効にする様々な技術及びモデルは、文献に開示されているLuoBandPrestwichGD2001;ClelandJLetal2001。当業者は、一般に受け入れられたあらゆる投与方法を用いて測定して、そのときの融合タンパク質の所望の血中レベルを定めることができる。例えば、投与は、皮下、静脈内、硬膜外、局所、皮内、髄腔内、直接脳室内、腹腔内、経皮例えば、徐放製剤で、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、肺内吸入、眼内のような様々な非経口経路、経口経路、又は口腔経路によることができる。他の特に好ましい投与経路は、エアゾール製剤及びデボー製剤である。発明した薬剤の持続放出製剤、特にデボー製剤が明確に意図される。非経口投与は、ボーラス注射によるもの又は時間をかけた段階的な灌流によるものとすることができる。非経口投与用製剤は、本技術分野で既知の助剤若しくは賦形剤を含み得る滅菌水又は非水性溶液、懸濁液及びエマルションを包含し、常法に従って調製することができる。更に、活性な融合タンパク質の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として投与してもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよく、その物質としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び/又はデキストランが挙げられる。任意により、懸濁液は、安定剤を含んでもよい。医薬組成物は、注射による投与に適する溶液を含み、約0.01~99、好ましくは約20~75の活性な融合タンパク質を賦形剤と一緒に含む。直腸投与することができる組成物としては、坐剤が挙げられる。非経口例えば、静脈内、皮下、筋肉内投与用に、活性なタンパク質を、医薬として許容される非経口用ビヒクル例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液及び浸透圧を維持する例えば、マンニトール又は化学的安定性を維持する例えば、保存剤及び緩衝剤添加剤と併せて、液剤、懸濁剤、エマルション又は凍結乾燥粉末として調剤することができる。製剤は、通常用いられる技術によって滅菌される。経粘膜投与用に、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。このような浸透剤は、本技術分野で一般に知られている。経口的に服用することができる医薬として又は生理学上許容される製剤としては、ゼラチンで作られた押し込み式カプセル、及びゼラチンとグリセロール又はソルビトールのような可塑剤とから作られた封止ソフトカプセルが挙げられる。押し込み式カプセルは、活性成分を、乳糖のような充填剤、デンプンのような結合剤、及び/又はタルク若しくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と、また任意により安定剤との混合物として含むことができる。ソフトカプセルでは、活性な融合タンパク質を、脂肪油、流動パラフィン、又は液状ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解又は懸濁させてもよい。更に、安定剤を加えてもよい。全ての経口投与用製剤は、かかる投与に適する用量とすべきである。融合タンパク質を注射、例えば、ボーラス注射又は連続的灌流による非経口投与用に調剤することができる。注射用製剤は、添加された保存剤と共に、単位用量形態で、例えば、アンプルで又は多回投与容器で存在することができる。医薬組成物は、水性ビヒクル中に懸濁剤、液剤又はエマルションのような形態とすることができ、懸濁剤、安定剤及び/又は分散剤のような製剤化剤を含むことができる。あるいは、活性成分を、使用前にパイロジェンフリーの滅菌水のような適切なビヒクルでの構成用の粉末形態又は凍結乾燥形態とすることができる。先に説明した製剤に加えて、融合タンパク質は、デポー製剤として調剤することもできる。そのような長期作用性剤は、埋め込み例えば、皮下若しくは筋肉内によって又は筋肉内注射によって投与することができる。よって、例えば、融合タンパク質を、適切な高分子若しくは疎水性材料例えば、許容される油中のエマルションとして若しくはイオン交換樹脂を用いて製剤化してもよく、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として調剤してもよい。更に、融合タンパク質は、治療薬を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような持続放出システムを用いて送達してもよい。様々な持続放出材料が本技術分野で確立されており、周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に依存して、融合タンパク質を数週間から最長100日又は1年を超えて放出することができる。投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態及び体重、もしあれば、併用療法、処置の頻度、並びに所望される効果の性質によって左右されるであろうことが理解される。用量は、当業者によって理解され、また決定することができるように、個々の患者に合わせて調整されるであろう。各治療に必要な総用量は、多段階投与によって又は単回投与で投与することができる。本発明の医薬組成物は、単独で、又はその病状若しくはその病状の他の症状を対象とする他の治療薬と併用して投与することができる。大抵、活性なタンパク質の1日用量は、体重1キログラム当たり0.01~100ミリグラムからなる。望む結果を得るためには、通常、分割投与で又は持続放出形態で1日当たり1キログラム当たり1~40ミリグラム与えられることが有効である。二回目の又は後続の投与は、個体に最初に若しくは前回投与された用量と同じ、それより少な又はそれより多い用量で行うことができる。本発明によると、本発明の物質は、治療上有効量で、他の治療計画又は薬物の前に、同時に又はその後に例えば、多剤併用療法、予防的に又は治療的に個体に投与することができる。他の治療薬と同時に投与される活性薬剤は、同一組成物で又は異なる組成物で投与することができる。本発明の方法で用いるあらゆるタンパク質について、治療上有効量を最初に細胞培養試験から見積もることができる。例えば、試験管内の系でサイトカイン発現を低減することが示された濃度点又は濃度範囲を含む又は包含する循環濃度範囲を達成する用量を動物モデルで処方することができる。このような情報を用いて、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。治療上有効量は、患者の症状の改善をもたらす融合タンパク質量を指す。このような融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準製薬手順により、例えば、LD50被験集団のうちの50の致死量及びED50被験集団のうちの50に治療効果のある用量を測定することによって、決定することができる。毒性と治療効果の用量比は、治療指数であり、LD50とED50の比として表現することができる。高い治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。これら細胞培養試験及び動物研究から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の調剤に用いることができる。このような融合タンパク質の用量は、好ましくは、毒性が殆ど又は全くなくED50を含む循環濃度範囲内である。その用量は、この範囲内で、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。的確な製剤、投与経路及び用量は、個別の医師が患者の健康状態を考慮して選択することができる。実施例1~5で説明するように、我々がドメインの付加及び進化と呼ぶ、既存のタンパク質-タンパク質相互作用を操作する包括的な方法を開発し、その方法では、増強が、合成結合ドメインの付加及びそれに続く試験管内進化を通じて結合境界面を拡張することによって達成される。合成ノッチン結合ドメインの付加及び進化を通じてGas6とAxl受容体との間の天然の高親和性リガンド-受容体相互作用を増強する能力を示すことによって、この方法を検証した。我々は、EETI-II-axl融合変異体が、最大4倍に増大したGasに対する親和性を有することを特定した。重要なことは、AxlIg1が突然変異誘導及びスクリーニング過程の間に変異を累積しなかったことであり、これは、親和性の増大が改変EETI-II変異体によるものであり得ることを示している。改変ループの野生型EETI-II配列への個々の復帰は、幾つかのEA変異体が親和性増大のために両方の改変ループを必要とすることを確かめた。我々の知る限り、これは、ノッチンの2個のループを外因性の標的に向けた結合面へと操作した最初の例である。また、3個のEA変異体の各々は、およそ45の非天然EETI-IIアミノ酸配列を含む。合わせて、これは更に、新規な結合試薬の生成に対するノッチンの折り畳みの頑強性を立証する。また、この研究は、癌の転移におけるAxlの役割を伝えることにも関連する。ドミナントネガティブなAxl受容体は、腫瘍細胞の移動及び転移を抑制しVajkoczyetal2006;Rankinetal2010、親和性が増大したEA変異体は、有用な治療薬候補であり得る。この方法の更なる応用は、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定を含む。腫瘍標的に結合するように操作したEETI-IIペプチドは、生体内分子イメージング法にとってかなり有望である。しかしながら、ナイーブライブラリーからの結合タンパク質の同定は、一つには、同定したタンパク質の親和性が検出に充分な程度に高くなければならないという要求のため、難しい。例えば、酵母表面提示結合において一桁台のμMの範囲の親和性は検出限界を下回り、そのようなタンパク質は一般にライブラリーソーティングの間に濃縮されないであろう。ドメインの付加及び進化は、既存の相互作用を増強するが、それ自体は分離した状態で検出限界を下回る親和性を有する合成結合ドメインの同定を可能にするアンカーリングストラテジーとして用いることができる。この裏付けとして、ノッチン変異体をAxlの不存在下で発現させた場合、本発明で開発したEETI-II変異体は、Gas6に対し検出限界を下回る弱い結合親和性を示す。それに続く従来のストラテジー又は更なるドメインの付加及び進化による親和性成熟を用いて、高い親和性を有する合成結合薬物を充分に生成することができる。下記で説明するように、αvβ3/αvβ5インテグリンに結合する改変EETIノッチン変異型2.5Dを、野生型AxlのIg1のN末端に直接融合させた。この多重特異性融合タンパク質の構想を、酵母表面ディスプレイを用いて、EETI2.5D-Axlが単一特異性のタンパク質であるEETI2.5及びAxlそれぞれに匹敵するレベルでαvβ3インテグリン及びGas6に結合したことを示すことによって、立証した。更に、αvβ3インテグリン又はGas6の結合は、飽和濃度の他の標的の存在によって影響を受けなかった。このことは、EETI2.5D-Axlがαvβ3インテグリンとGas6の両方と同時に相互作用できることを示唆する。EETI2.5D-Axl融合タンパク質は、微生物宿主で35mg/Lの規模で組み換え的に生産することができた。生成したタンパク質は、細胞表面上に発現したαvβ3インテグリンに対して高い親和性約2nMのKDを提示した。[例1:試薬及び培地]SD-CAA培地は、20g/Lのグルコース、6.7g/Lの酵母窒素原基礎培地アミノ酸を含まない、5.4g/LのNa2HPO4、8.6g/LのNaH2PO4H2O、及び5g/Lのバクトカザミノ酸を含有した;SG-CAA培地は、グルコースを20g/Lのガラクトースで置き換えたことを除いて、同一であった。pH4.5のSD-CAA培地は、リン酸塩を13.7g/Lのクエン酸ナトリウム二水和物及び8.4g/Lのクエン酸無水物で置き換えて、pH4.5に調整したことを除いて、SD-CAAと同一であった。Gas6タンパク質及びAxl-Fcタンパク質は、RDシステムズ社から購入し、チキン抗cmyc抗体及びヤギ抗チキンAlexa555抗体はインビトロジェン社から購入し、マウス抗HisHilyteFluor488モノクローナル抗体は、Anaspec社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水PBSは、11.9mMのリン酸ナトリウムpH7.4、137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウムからなる。PBS/BSAは、1mg/mLのウシ血清アルブミンを含むPBSからなった。[例2;酵母表面提示ライブラリー生成:EETI/Axl融合体]EETI-IIループ1を置き換える、7、8、9又は10個の縮重NNSコドンを有する4種のフォワードアッセンブリープライマーと、EETI-IIループ3を置き換える、6、7又は8この縮重NNSコドンを有する3種のリバースアッセンブリープライマーとを用いて、EETI-IIループライブラリーを構築した。EETI-IIアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号P12071であり;DBNA配列は、2009年4月3日に出願された同時係属米国出願第12/418376号で与えられ、参照により本明細書にも含まれる。DNA配列は、与えられたアミノ酸配列の逆翻訳によって所望の通りに設計できる。プライマー配列は、ループに隣接する領域に相補性であった。EETI-II、ランダム化ループ1及びループ3並びにAxl中のランダム化ループのアミノ酸配列を、図1Dに示す。1×KODポリメラーゼバッファー、0.2mMのdNTP,1.5mMのMgCl2、1Mのベタイン、及び2.5ユニットのKODポリメラーゼNovagen社と共に、4種のフォワードプライマーをプールしてそれぞれ1μMで用い、3種のリバースプライマーのそれぞれをプールして、それぞれ1.33μMで用いた。熱サイクルパラメーターは次の通りであった。ステップ1:95°Cで2分;ステップ2:95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分30サイクル;ステップ3:72°Cで10分。構築したDNA0.6μLを、2μMのフォワード及びリバース増幅プライマー、1×Pfx50バッファー、0.2mMのdNTP及び5ユニットのPFx50DNAポリメラーゼインビトロジェン社を用いて増幅させた。フォワード増幅プライマーはpCT骨格に対して50bpの相同性を有し、一方、リバース増幅プライマーはAxlIg1のN末端に対して50bpの相同性を持ち、EETI-IIのC末端Ser29とAxlIg1のN末端Arg21との適切なSer-Arg結合を確実にするように設計した。プラスミド骨格の調製について、NheI制限部位及びBamHI制限部位を用いて、Ig1ドメインを含むAxlアミノ酸22~132;Genbankアクセッション番号P30530を、酵母提示pCTプラスミドBoder及びWittrup,1997にクローン化した。Axl配列の5’に直接AvrII制限部位を含めた。これを、NheI部位の下流に、制限消化を促す14bpのジャンクDNAのスペーサーとともに配置した。このプラスミドをpCTAvr-Axlと名付けた。ライブラリー合成用のプラスミド骨格は、pCTAvr-AxlをNheI制限酵素及びAvrII制限酵素で消化することによって作成した。合計で約50μgのcDNA挿入物と約25μgの制限消化pCTAvr-Axl骨格とを電気穿孔法によってEBY100に形質転換し、相同組み換えによって生体内で構築を行った。連続希釈プレーティング及びコロニー計数によって見積もったように、1.2×108個の形質転換体のライブラリーが得られた。無作為に選択したクローンの配列解析で、EETI-II変異体においてEETI-IIとAxlIg1との適切な融合及び所望のループ長分布を確かめた。酵母表面ディスプレイは、米国特許第6423538号で更に説明される。一般に、少なくとも104個の形質転換体が得られるであろう。プライマーは、下記のように設計した。[EETI-Axlライブラリー合成/アッセンブリー及び増幅用DNAオリゴヌクレオチドプライマー]下記配列において、プラスミド骨格に対する相同性のために用いるヌクレオチドを5’末端から最初の斜線までで示す。プライマーの最初の斜線から二重斜線までの部分及びプライマーの三重斜線から3’末端までの部分は、EETI-IIの残基と一致する。Nはいずれかのヌクレオチドを表わし、SはG及びCの入り交りである。プライマーの二重斜線から三重斜線までの部分は、EETI-IIループ1又はループ3のランダム化残基を生成するために用いるヌクレオチドである。L17XfwdGgttctgctagcggttgtnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnstgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgttL18XfwdGgttctgctagcggttgtnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnstgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgttL19XfwdGgttctgctagcggttgtnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnstgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgttL110XfwdGgttctgctagcggttgtnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnstgtaaacaagattctgattgtttggctggttgtgtt下記のリバースプライマーの場合は、5’末端から最初の斜線までが、アクセプタープラスミド骨格部分でもあるAxl受容体構築物のN末端をコードするヌクレオチドと相同である。上のように、最初の斜線から二重斜線までの領域及び三重斜線から3’末端までの領域は、EETI-IIの残基と一致する。Nはいずれかのヌクレオチドを表わし、SはG及びCの入り交りである。L36XrevCgtgcccctgagaccacasnnsnnsnnsnnsnnsnnacaaacacaaccagccaaacaatcagL37XrevCgtgcccctgagaccacasnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnacaaacacaaccagccaaacaatcagL38XrevCgtgcccctgagaccacasnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnsnnacaaacacaaccagccaaacaatcagPCRアッセンブリーによるライブラリー合成の後に、そのライブラリーを、プラスミド骨格に対して約50塩基対の相同性下線部、リバース増幅プライマーの場合についてはAxl配列に対する相同性を含むを含む下記の増幅プライマーを用いて増幅した。約50塩基対の相同性は、RaymondCKPownderTASexsonSL1999GeneralmethodforplasmidconstructionusinghomologousrecombinationBiotechniques26:134-138140-131に記載されるように、ライブラリー挿入物とプラスミド骨格とのアッセンブリーを可能にする。LibraryamplificationreverseTtccctgggttgcccacgaagggactttcttcagcctgcgtgcccctgctaccacaLibraryamplificationforwardGgtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctagcggttgt[例3:Gas6を用いたライブラリースクリーニング]様々な濃度のGas6を酵母提示ライブラリーとともにPBS/BSA中で室温にて約2~3時間インキュベートした。最後の1時間は、チキン抗cmyc抗体を1:250の最終希釈物に加えた。遠心分離によって細胞をペレット化して、1mLの氷冷PBS/BSAで洗滌し、ヤギ抗チキンA555の1:100希釈物及びマウス抗His488抗体の1:100希釈物を含有するPBS/BSA中に再懸濁させ、2分間氷冷した。細胞をペレット化し、1mLの氷冷PBS/BSAで洗滌して、VantageSEフローサイトメータースタンフォードFACSで蛍光活性化セルソーティングFACSにより分取した。収集した細胞をpH4.5のSD-CAA培地中で増幅し、FACSの更なるラウンドのためにSG-CAA培地中で30°Cにて発現を誘導して、変異体に富むプールを得た。FACSによる分取の最初のラウンドは、合計およそ8×107個の分取細胞に対する3つの別個の分取からなり、その後の分取ラウンドは、先のラウンドで収集した酵母の数の少なくとも10×で解析して、残りのライブラリー変種の充分な試料採取を確実にした。Gas6の濃度を低減することにより、分取のストリンジェンシーを増加させた。後の分取ラウンドでは、Gas6とのインキュベーションに続いて、細胞をペレット化し、洗滌し、解離速度分取のために発現競合者Axl-Fcの約50倍のモル過剰の存在下でインキュベートした。非結合段階の最後の1時間では、チキン抗cmycを1:250の最終希釈物に加えた。細胞をペレット化し、洗滌し、上述のように二次抗体で染色した。ZymoprepキットZymoResearch社を用いて酵母培養物からプラスミドDNAを回収し、プラスミドミニプレップのためにXL-1BluesupercompetentE.coli細胞ストラタジーン社へ形質転換させた。MCLabSouthSanFrancisco社、カリフォルニアによってDNA配列決定を行った。5ラウンドの分取の後、ライブラリーは、野生型AxlIg1よりも強い結合を持つクローンを濃縮し始めた図3。ランダム化配列を含むライブラリーのスクリーニングにおける一般的な問題は、人為的結合体をスクリーニングする可能性である。例えば、抗ヘキサヒスチジン二次抗体ヘキサヒスチジンは配列番号77として開示されるを用いてGas6結合を照らすことから、幾つかの増強されたクローンは実際に二次抗体に結合した。これに対するコントロールのため、0nMのGas6及び従来通りの二次抗体標識を用いたネガティブソーティングを行って、収集プールから二次結合体を除去した図3、分取6。二次結合体をモニターし続けたが、この1回のみのネガティブソーティングはその後の分取産物全体から人為的結合体を排除するのに充分であった。最後に、Gas6に対して野生型AxlIg1を上回る増強された結合を有する変異体の濃縮プールを得た。比較のため、46時間の‘解離’段階を用いた最後の分取は、4時間の‘解離’段階のみを用いた第4分取よりも高く持続的な結合を示し、動力学的解離速度の有意な改善を実証した。[例4:改変変異体の特徴付け]リガンド枯渇を回避して結合平衡に達するように実験的に決定した容積、細胞数及びインキュベーション時間を用いて、Gas0.05~400nMを、室温でPBS/BSA中で対象のタンパク質を提示している5×104個の酵母細胞に加えた。細胞をペレット化して、氷冷PBS/BSAで洗滌し、チキン抗cmycの1:250希釈物を含有するPBS/BSA中に再懸濁させ、氷上で40分間インキュベートした。細胞をペレット化して、洗滌し、ヤギ抗チキン及びマウス抗His二次抗体の1:100希釈物を含有するPBS/BSA中に氷上で20分間再懸濁させた。細胞を洗滌し、FACSCaliburフローサイトメーターベクトンディッキンソン社及びFlowJoソフトウエアTreestar社を用いて解析した。結合滴定を、カレイダグラフソフトウエアを用いて4パラメータシグモイド曲線にあてはめて、平衡結合常数KDを決定した。動力学的非結合試験のため、細胞を結合平衡が達成されるまで2nMのGas6と共にインキュベートし、ついで洗滌し、ペレット化して、解離速度分取のために0、1、4、9.25、23又は46時間、上述のように50倍モル過剰のAxl-Fcの存在下でインキュベートした。フローサイトメトリーによって持続結合を解析し、カレイドグラフソフトウエアを用いて、未結合のものを単一又は二重指数関数デコイ曲線に適切にあてはめた。野生型EAループ変異型への復帰のための持続的結合を、非結合段階を0~9.25時間行ったことを除いて、動力学的結合試験と同じく行った。第7、第8及び第9ラウンドの分取の産物から無作為に選択した合計31個のクローンの配列決定は、20個のユニークなクローンを明らかにし、第10ラウンドの分取では、第9ラウンドの分取段物由来のクローンのうちの2個を濃縮した下記の表3。全てのクローンは、最初のライブラリー設計に沿ったループ長を示し、どのクローンもAxl配列に変異を含まなかった。これは、EAクローンの親和性の増大がEETI-II変異体に特異的であることを示す。共通P-G/T-M/Kモチーフについて、20個のクローンのうち3個がループ3にPGMモチーフを含み、2個の更なるクローンがPTM又はPGKを含んだ。P-G/T-M/Kモチーフに先行するL又はL-X及び後続するR-Sも発生率がさらに少なかった図1D。興味深いことに、20個のEA変異体のうちの4個であるEA7.01、EA7.05、EA7.06及びEA8.04のみが改変ループにシステインを含まなかったが、これらのうちの1個であるEA7.05は、ループ1に先行する保存システイン残基にcysからargへの変異を含んだ。ループ3にP-G/T-M/Kモチーフを含む幾つかの変異体も改変ループにシステインを含み、これは、追加のシステインがEETI-IIループ構造を完全には乱さない場合があることを示唆する表3。しかしながら、対になっていないシステインの潜在的影響を最小限にするため、EA7.01、EA7.06及びEA8.04を更なる調査のために選択した。簡略化のため、Axl融合体の配列全体をここでは示さないが、配列番号41、46及び50について添付した配列表で示す。AxlIg1配列は、天然形態と変異形態の両方で下記に示され、下記のEA配列において、注記される場合以外は天然形態で用いられることが理解される。例えば、表3に列挙するEA7.01は、図1D及び配列番号41に示すように、AxlIg1のN末端に融合してAxlIg1配列のN末端配列を続ける。表3に列挙する他のEA類は、RGT...で始まるAxl配列と同様に融合する。全長配列を配列番号41、46及び50で与え、図1Dで最長QAE...部分まで図示する。繰り返すが、下記表3のポリペプチドにおいて、末端GSは、下記で配列番号84に示すようにAxlIg1ドメインに融合する。[例5:Gas6に対するAxl変異型の特徴付け]酵母ディスプレイを用いてGasと改変EA変異体との間の結合相互作用を特徴付ける目的で、最初に、酵母ディスプレイがGas6-Axl相互作用の正確な親和性測定を可能にすることを確かめることを試みた。酵母提示されたAxlを用いて、既に報告されている表面プラズモン共鳴及び固相結合により測定されたAxl変異体の結合親和性を再現することができた表4。これは、酵母提示されたAxlが受容体の組み換え異形と同様であることを立証する。EETI-II変異体のみの親和性は弱すぎて検出されなかったが、AxlIg1と融合した場合、EA変異体は、野生型AxlIg1より最大で約4倍強いナノモル以下の親和性を示した。AxlのN末端に融合した野生型EETI-IIは、野生型Axlと同じ親和性を示した。これは、融合構築体が天然のAxl-Gas6相互作用を妨げず、親和性の向上が単純にAxlのN末端へのEETI-IIノッチンの融合に起因するというよりもEETI-IIループ変異体のためであることを更に実証する図4及び表4。増強された結合の性質を調査するため、結合研究を行って、解離速度をモニターした。野生型AxlIg1又はEA変異体を発現している酵母を2nMのGas6と共にインキュベーションした後で、上述した‘解離速度’分取と同様なやり方で盛る過剰の競合者と共にインキュベーションした。野生型AxlIg1は単一指数関数デコイモデルによってよく説明される動力学的解離を示し、一方、EA変異体は、より複雑な動態を示し、二重指数関数デコイモデルを用いてあてはめられなければならない図5及び表5。コントロールとしての野生型EETI-Axlは、野生型AxlIg1と識別不能な解離速度を示し、単一指数関数デコイモデルによってよくあてはめられたデータは図示せず。各々の改変ループの親和性増大への寄与を調べるため、EA変異体のループ1又は3を個別に野生型EETI-II配列に復帰させてGas6に対する結合を試験した図6。これら研究で、野生型EETI-Axlを、両ループの野生型への復帰に対するコントロールとして用いた。EA7.06の持続的結合の評価は、ループ1の野生型EETI-II配列への復帰EA7.06wtL1は親のEA7.06変異体と同一の持続的結合を示すことから、ループ3のみがGas6との相互作用に貢献することを明らかにした図6B。EA7.01及びEA8.04について、ループ1の野生型EETI-II配列への復帰EA7.01wtL1及びEA8.04wtL1は、それぞれの親変異体よりも弱いが、野生型EETI-Axlよりも強い持続的結合を示す。ループ3の野生型への復帰EA7.01wtL3及びEA8.04wtL3は、野生型EETI-Axlを上回る改良を完全に消失させた図6A及びC。それと共に、これは、EA7.01及びEA8.04について、ループ3が主たる寄与因子であるが、結合の最大の増強には両改変ループが必要であり、EA7.06についてはループ3が単独の寄与因子であることを実証する。[例6:変異受容体断片EETI-II-AxlIg1を有するノッチン融合体]下記の実施例は、インテグリンに結合するように操作した変異EETI-IIノッチンに融合させたAxlIg1受容体断片、つまりノッチン2.5D及び2.5Fの調製を開示する。2.5D及び2.5Fは、両方ともエクバリウムエラテリウムのトリプシン阻害剤IIEETI-IIノッチンの変異型である。これらはノッチンをそれぞれ、αvβ3インテグリン及びαvβ5インテグリン、並びにαvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン、α5β1インテグリンに特異的に結合するように操作した。これを達成するため、EETI-IIのループ1を、インテグリン認識トリペプチドモチーフであるRGDを含むランダム化配列と置き換えた。ついで、酵母表面提示及び蛍光活性化セルソーティングFACSを用いて、所望の結合特性を有するクローンを選択した。これらインテグリンは臨床上重要な癌標的であり、Axlは同様に癌の治療用の新興の標的である受容体型チロシンキナーゼである。Axlの過剰発現は様々な癌の侵襲性及び転移性表現型と関連付けられており、Axlとその天然のリン癌度であるGas6との間の相互作用に拮抗することは治療上価値があり得ることが示唆される。AxlのS6-1及びS6-2は、Axlの天然リガンドであるGas6に野生型よりも高い親和性で結合する改変型のAxlIg1である。エラープローンPCRを用いて、変異体を野生型AxlIg1遺伝子に導入し、生じた変異体DNAライブラリー酵母の表面上で発現させた。FACSを用いて、Gas6に対する結合が向上したクローンを単離した。クローンS6-1及びS-2は、野生型をそれぞれ20倍及び12倍上回る平衡結合の向上を示し、向上は主として解離速度の改善に由来する。Gas6を強力に結合することに加えて、S6-1は、安定性の有意な増大を表す、野生型を13°C上回る融解温度の改良を有する。下記表7は、用いた様々なペプチドEETI-II及びAxl変異体を示す。[アミノ酸配列]野生型EETI-II、2.5D及び2.5Fのアミノ酸配列を下に示す。下に示すように1アミノ酸変異及び欠失をAxlIg1受容体断片に導入した。角括弧付きAPは、表3で示すEA融合体で除外した。融合構築物:標準的なクローニング技術を用いて、EETI-II変異体をコードする遺伝子とAxlIg1をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする1個の遺伝子構築物へと組み立てた。EETI-IIドメインをAxlIg1のN末端に融合させ、N末端ノッチンドメインに続くAxlIg1ドメインからなる融合タンパク質を得た。融合体の全体の柔軟性を改善するため、EETI-IIの最後のプロリンとAxlの最初のアラニン及びプロリンとを除去した。次いで融合タンパク質をコードするDNAを発現プラスミドと選択プラスミドの両方に連結した。この融合タンパク質を酵母の表面上で発現させて、可溶性に産生されることに加えて、結合研究を可能にしている。データ:簡単に言うと、2.5D-Axlを提示した酵母を用いて、この融合体が機能的であるかを試験した。融合体の可溶性αvβ3インテグリン及びGas6に結合する能力を測定して、2.4単独及びAxl単独で示される結合レベルと比較した。融合体は、2.5のもとの一致したαvβ3結合親和性を示し、同時に野生型AxlのGas6に対する親和性を維持し、融合構築物を有効であると確認した。加えて、各可溶性標的の結合を飽和量の第二標的の存在下で試験して、融合体のαvβ3インテグリンとGas6の両方に同時に結合する能力を試験した。これら結合レベルは、それらを個別に測定した場合と同じであり、融合体が実際にその標的両方に同時に結合できることを示唆した。最後に、融合体が安定であることを確認するため、融合体を酵母ピキアパストリスPichiapastoris中で可溶性に生産させた。精製組み換え体の収量は1リットルあたり50~75mg程度であった。これらタンパク質を、αvβ3インテグリンを過剰発現するように形質転換した細胞に対して結合する能力について試験した。それらは、2.5Dについて先に測定したのと一致する平衡結合を示し、更に、2個のタンパク質ドメインを融合させることは結合特性に負の影響を及ぼさなかったことを立証した。融合体の機能:このノッチン-Axl融合体は、インテグリン結合と天然のGas6/Axl相互作用の両方に同時に拮抗することができる多重特異性分子として機能するであろう。Gas6が可溶性リガンドである一方でインテグリン類は細胞表面受容体であり、両方の標的は同時に結合されることを可能にする。Gas6の結合は、可溶性リガンドを捕捉し、可溶性リガンドが細胞外Axl受容体に結合して活性化するのを妨げるであろう。インテグリン受容体に対する結合は、細胞外基質タンパク質と結合するのを妨げるであろう。[例7:改変ノッチンの収量を向上させるノッチン融合体]上述のように、ノッチン類は、組み換え的に産生することが困難であり得る。それらをよく発現しているタンパク質に融合させることによって、それらを高収率で発現させることができる。ノッチンの切断は、タンパク質ドメイン間にプロテアーゼ部位を挿入することにより達成することができる。融合構築物:標準的なクローニング技術を用いて、EETI-II変異体をコードする遺伝子とAxlIg1をコードする遺伝子とを、融合タンパク質をコードする1個の遺伝子構築物へと組み立てた。ノッチン融合体のN末端とC末端の両方を、タバコエッチ病ウイルスTEV認識部位であるENLYFQG配列番号80を有し、タンパク質ドメイン間に挿入されるように作成した。次いで、遺伝子を酵母発現プラスミドに連結し、酵母ピキアパストリスを形質転換した。N末端融合体とC末端融合体の双方を1リットル当たり約50mgの精製収量で産生させた。次いで、精製した融合体にTEVによるタンパク質分解切断を行って、ノッチンドメインを遊離させた。次いで、ノッチンを、FPLCによって更に精製し、その融合パートナーから分離した。注目すべきは、フォールドした機能性EETI変異体2.5Dが、この融合タンパク質の助けなしに酵母で発現できなかったことである。N末端融合体は、太字で示す連結配列を含むことが分かる。加えて、直接融合は、連結配列なしに行うことができた、すなわち、2.5DEETI/インテグリンペプチドのカルボキシ末端セリンをAxlIg1ドメインのアルギニンに直接融合させる。EETI2.5DをAxlIg1に融合させることによってαvβ3/αvβ5インテグリン及びGas6を結合することができる多重特異性分子を形成した。Axlの結晶構造の解析は、N末端が二次構造構成要素から充分に遠く離れており、実施例9で記載する直接融合を用いて、ノッチンに対する直接融合が適切に生じたことを示唆した。[例8:Met受容体を結合する改変HGF断片NK1に融合したαvβ3に対するAgRPノッチン]Aras4と名付けられた最も強力な結合性NK1断片の1つでAgRP変異体7Aを連結することによって、二重特異性融合タンパク質を構築した。Aras4はAgRP7AのC末端で連結され、2つのドメイン間にアミノ酸リンカーは存在しない。酵母表面ディスプレイを用いて、可溶性αvβ3インテグリン及びMet受容体に対する結合を測定した。0.5nM及び5nMのαvβ3インテグリン及びMetに対する結合を測定してAgRP7A及びAras4単独と比較した図7。図7は、融合タンパク質が、αvβ3インテグリン及びMet受容体それぞれに対してAgRP及びNK1変異体に匹敵する結合親和性を有することを示す。これは、融合タンパク質を発現でき、その個々の構成部分がそれぞれの標的に立体障害なしに結合することを示す。融合タンパク質AgRP7A-Aras4のオープンリーディングフレームをpPICK9Kプラスミドに組み込み、ピキアパストリスを形質転換させた。メーカーの使用説明書インビトロジェン社に従って、融合タンパク質を酵母培養物で発現させ、次いで、ヒスチジンタグ配列番号77による金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。この融合タンパク質の遺伝子の概略図を下の四角形に示す。油号タンパク質AgRP7A-Aras4のタンパク質配列を表8に列挙し、下に列挙する。上記は、pPCI9Kプラスミド中の融合タンパク質の遺伝子の模式図である。SnaBI、AvrII及びMluIは制限酵素部位である。NK1断片の変異型配列を用いることができ、これは、例えば、Hartmanら、Afunctionaldomainintheheavychainofscatterfactorhepatocytegrowthfactorbindsthec-MetreceptorandinducescelldissociationbutnotmitogenesisProcNatAcadSciUSAVol89pp11574-115781992年12月に記載されている。上記タンパク質配列番号66の詳細を下に示す。C末端でHisタグに下線を引いてある。AgRP7A-Aras4融合タンパク質の結合親和性を、αvβ3インテグリンとMet受容体の双方を発現するK562-αvβ3細胞で測定した図8。K562白血病細胞は予めαvβ3インテグリンで形質転換したBlystoneSD1994JCellBiol12711291137。フローサイトメトリーにより、これら細胞株がMet受容体も天然に発現することも示したデータは図示せず。ノッチンEETI2.5F及びAgRp7A並びにNK融合タンパク質を作成して、生物学的特徴の試験管内での研究のために精製した。これら様々なNK変異型を、M2.2、M2.2D127A及びAras4を含む2個の別個のノッチンタンパク質のC末端に融合させた。従って、次のバリエーションで構成される6個のタンパク質:AgRp7A-Aras4、EETI2.5F-Aras4、AgRp7A-M2.2、EETI2.5F-M2.2、AgRp7A-M2.2D127A及びEETI2.5F-M2.2D127Aを構築して、試験管内アッセイに用いた。M2.2は指向進化の第2ラウンドに由来し、Aras4は、我々の先のNK1出願の指向進化の第3ラウンドに由来する。D127Aは、アンタゴニスト活性を調節することが既に示されている点変異である。K562-αvβ3細胞結合アッセイでは、形質転換されてαvβ3インテグリンを発現するK562細胞におけるαvβ3インテグリンに対するAgRp7A-M2.2D127A及びEETI2.5F-M2.2D127Aの結合親和性KD値が2.1±1.1nM及び4.6±1.6nMである。HUVEC細胞結合アッセイでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECに対するAgRp7A-M2.2D127A及びEETI2.5F-M2.2D127Aの結合親和性KD値が9.4±1.0nM及び4.7±0.6nMである。HUVECは、中間レベルのαvβ3インテグリン、αvβ5インテグリン及びMet受容体並びに高レベルのαvβ3インテグリンを発現する。加えて、デュアル受容体直接結合アッセイは、多重特異性タンパク質がMet及びインテグリンに同時に結合することを示した。この実験では、可溶性Alexa-488標識ヒトMet-Fc220nMと単一特異性タンパク質及び多重特異性タンパク質との混合物をK562-αvβ3細胞に加えた。結合はフローサイトメトリーによって検出した。AgRp7A-M2.2、EETI2.5F-M2.2、AgRp7A-M2.2D127A及びEETI2.5F-M2.2D127Aは可溶性Met-Fcに結合でき、またK562-αvβ3細胞上のαvβ3インテグリンと結合した。これらの結果は、ノッチン融合体がαvβ3インテグリン及びMet受容体と同時に結合できることを実証する。タンパク質を40ヒト血清とともに37°Cで数日間にわたりインキュベートしたときに、AgRp7A-M2.2D127A及びEETI2.5F-M2.2D127Aの血清安定性が示された。試料をウエスタンブロットにより分析し、FLAGエピトープタグに対する抗体を用いて検出した。7日間にわたり無傷の融合タンパク質の量に有意な低減は観察されず、血清プロテアーゼ及び温度上昇に対するノッチン融合タンパク質の安定性が示された。細胞を0.5nMのHGFで刺激するHUVEC増殖アッセイを行った。AgRp7A、EETI2.5F、AgRp7A-M2.2D127A又はEETI2.5F-M2.2D127Aタンパク質を加えて、HUVEC増殖の阻害に対する効果を観察した。AgRp7Aは、HUVEC増殖に対してほとんど阻害効果を持たなかった。EETI2.5F単独では、良好な阻害を示した1μMで70阻害、細胞単独の場合=90阻害。ノッチン融合タンパク質AgRp7A-M2.2D127A又はEETI2.5F-M2.2D127Aは、陰性コントロールのものと等しい阻害レベルに近づくAgRp7A及びEETI2.5Fと比較して、細胞増殖に対してより高い阻害効果を示した。Met受容体リン酸化アッセイをPC3前立腺癌細胞で行った。Met受容体リン酸化は、0.3nMのHGFで刺激した後にウエスタンブロットによりアッセイした。AgRp7A、Aras4及びAgRp7A-Aras4タンパク質を加えて、Metリン酸化の阻害に対する効果を観察した。AgRp7AはMetリン酸化の阻害を示さなかった。Aras4及びAgRp7A-Aras4の添加に対しては、Met受容体リン酸化の用量依存的な低減が観察され、AgRp7A-Aras4ノッチン融合タンパク質でそれよりわずかに高い阻害効果が観察された。注:PC3細胞は中間レベルのαvβ3インテグリン及びMet並びに低レベルのα5β1インテグリンを発現するマイクロタイタープレートのウェル上にヒトビトロネクチンをコーティングし、様々な濃度のAras4、AgRp7A、EETI2.5F、AgRp7A-Aras4又はEETI2.5F-Aras4の存在下で細胞を播種することによって、ビトロネクチンに対するPC3細胞接着の阻害を行った。予想通り、PC3細胞接着を阻害しなかったAras4を除き、全ての構築物についての最大半量濃度の値は類似し、低nM範囲約20~40nMであった。[例9:野生型Axl受容体断片に直接融合したノッチン融合体]例6で記載したように、EETIノッチン/インテグリン結合ペプチドのAxl膜結合型キナーゼ受容体との直接結合体を調製した。AxlIg1ドメインのアミノ酸21~132を用いた。EETI2.5DをAxlIg1に融合させることによって、αvβ3/αvβ5インテグリン及びGas6を結合できる多重特異性分子を形成した。配列を下に示し、ノッチンタンパク質2.5Dに下線を引き、Axl部分は配列RGT...で始まる。融合タンパク質がαvβ3インテグリンとGas6の一方に結合する能力を、EETI2.5D-Axl融合タンパク質を酵母提示構築物にクローン化して細胞表面上に提示させる酵母提示プラットフォームを用いて試験した。EETI2.5D、AxlIg1又はEETI2.5-Axl融合タンパク質のいずれかを発現している酵母を様々な濃度の可溶性αvβ3インテグリン又はGas6とともにインキュベートした。結合反応は平衡となり、その時点で過剰なリガンドを洗滌によって除去した。適切なリガンドインテグリン又はGas6に対する蛍光標識抗体を含有する溶液中に、酵母を懸濁させた。フローサイトメトリーを用いて、二次抗体の検出によって、結合したインテグリン又はGas6を定量した。これらの実験は、EETI2.5D及びAxlIg1がそれぞれαvβ3インテグリン及びGas6に結合するのみであり、一方でEETI2.5D-Axl融合体は両タンパク質にそれら単一特異性構成部分と等しいレベルで結合することを示した。このデータは、EETI2.5DとAxlIg1との融合がどちらの標的タンパク質に対する結合も破壊しないことを実証する。EETI2.5D、野生型AxlIg1又はEETI2.5D-Axl融合体を発現している酵母を20nM、50nM又は100nMのαvβ3インテグリンとともにインキュベートした。予想されるように、EETI2.5D及びEETI2.5D-Axlのみがインテグリンに結合し、野生型Axlはこの受容体に対する天然親和性を有さない。同一の組の酵母試料を0.2nM、2nM又は20nMのGas6とともにインキュベートした。野生型Axl及びEETI2.5D-AxlはGas6に対する親和性を示すが、EETI2.5Dのみ結合を検出しない。両方の場合において、EETI2.5D-Axl融合タンパク質は、その単一特異性構成部分と同様の親和性でインテグリン又はGas6に結合する。次に、EETI2.5D-Axlを発現している酵母を、飽和濃度のGas6の存在下でαvβ3インテグリンとともにインキュベートすることによって、又は飽和濃度のαvβ3インテグリンの存在下でGas6とともにインキュベートすることによって、融合体が両標的に同時に結合する能力を調べた。これらの結果の概要を図9で示す。両方の場合において、過剰な可溶性第二リガンドの存在は、第一リガンドに対する結合を実質的に減少させない。これらの結果は、1つの標的のEETI2.5D-Axl融合体タンパク質への結合が第二の結合を妨げずGas6とαvβ3インテグリンの双方との同時相互作用を容認することを示す。図9の酵母表面提示結合データを参照する。図9Aでは、酵母を、200nMのαvβ3インテグリンの存在下で20nM又は100nMのGas6とともにインキュベートした。二重特異性タンパク質は、過剰なインテグリンが存在する場合もGas6に対する親和性を維持する。図9Bでは、酵母を、100nMのGas6の存在下で100nM又は200nMのαvβ3インテグリンとともにインキュベートした。Gas6が存在する場合も、αvβ3インテグリンに対する親和性は失われない。それとともに、これら実験は、EETI2.5D-Axlが両標的に同時に結合できることを示唆する。[例10:組み換え酵母で生産したノッチン融合体]次いで、EETI2.5D-Axl融合タンパク質をpPic9K酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーのマニュアルインビトロジェン社に従って酵母株P.パストリスで可溶性タンパク質を組み換え的に生産した。ニッケル親和性クロマトグラフィーを用いて培養上清からタンパク質を精製し、タンパク質をエンドグリコシダーゼendoHで処理することによって、異種酵母糖鎖付加を切断した。単量体のEETI2.5D-Axlタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて更に精製した。最終産物の純度をSDS-PAGE及び分析的サイズ排除クロマトグラf-を用いて分析した。高度に純粋な単量体EETI2.5D-Axl融合タンパク質を1リットル当たりおよそ35ミリグラムの収率で得た。組み換え的に生産したEETI2.5D-Axlを、細胞表面αvβ3インテグリンを結合する能力について試験した、αvβ3インテグリンを過剰発現するように形質転換されているK562白血病細胞K562-αvβ3細胞を様々な濃度のEETI2.5D-Axlとともにインキュベートした。反応が平衡に達した時点で、過剰なEETI2.5D-Axlを洗滌によって除去し、組み換え多重特異性タンパク質上のFLAGエピトープタグに対する蛍光標識抗体を含有する溶液に細胞を再懸濁させた。次いで、フローサイトメトリーを用い、蛍光抗FLAG抗体を検出することによって、結合したEETI2.5D-Axlの量を定量した。EETI2.5D-Axl融合タンパク質のK562-αvβ3細胞に対する親和性Kdを1.72nMであると測定した。加えて、円二色性分光法を用いて、野生型Axlと比較して、EETI2.5D-Axl融合タンパク質の熱安定性を分析した。野生型AxlIg1は41°Cの融解温度Tmを有することが分かった。EETI2.5DをAxlのn末端に融合させることによって、11°Cの安定性の改善が観察されたTm約52°C。これらの結合研究及びCD実験の結果を下記の表にまとめた。K562-αvβ3細胞上に発現したαvβ3インテグリンに対する観察された結合の特異性を、この細胞をEETI2.5D-Axl及び環状RGDcRGDとともにインキュベートすることによって試験した。EETI2.5Dはインテグリン上でcRGDと同じエピトープに結合するため、タンパク質がインテグリンに特異的に結合している場合、モル過剰のcRGDはEETI2.5D-Axlに競合して解離させる。cRGDは、K562-αvβ3細胞へのEETI2.5D-Axlの結合を阻害し、タンパク質が実際に細胞表面上のαvβ3インテグリンに特異的に結合していることを示唆する。[例11:自己切断TEV-ノッチン融合体]幾つかのノッチンは、適切に折り畳まれたモノマーよりも高次オリゴマーを生成するため、組み換え的に生産することが困難である。例えば、我々は、固相ペプチド合成を用いたEETI2.5Dの化学合成及び試験管内折り畳みの確固たる方法を立証しているが、このノッチンを酵母に基づく発現系で組み換え的に発現させることはできていない。適切に折り畳まれたEETI2.5D-Axl融合体を高い組み換え体収率で生産できるという知見は、ノッチンを組み換え的に生産する手法としての自己切断TEV-2.5D構築物の開発につながった。この融合体では、タバコエッチ病ウイルスTEVプロテアーゼをEETIノッチン変異型2.5Dに融合させた。TEVは、アミノ酸配列中グリシンGがセリンSで置き換えられてもよいSENLYFQS又はGENLYFQG配列番号82のどちらかであり得る8個のアミノ酸配列を認識する。次いで、TEVは最後のG/Sの直前で切断する。この切断部位は、TEVプロテアーゼのC末端に位置し、EETI2.5Dが続いた。EETI2.5Dの最初のアミノ酸はグリシンGであり、切断後に残ったものから余分な残基を除外するため、そのグリシンを取り除く。翻訳の際、融合タンパク質のプロテアーゼ部分は、別の融合体の切断部位と相互作用して、それを切断し、そのため遊離のEETI2.5Dノッチンが生成することができる。この自己切断融合タンパク質をN末端及びC末端にそれぞれFLAG及び6×HISタグを伴ってpPic9K酵母分泌ベクターにクローン化し、メーカーの指示に従ってインビトロジェン社酵母株P.パストリスに形質転換させた。発現培養物の上清に対するウエスタンブロットはFLAG又はHISタグのどちらかについて探索した。ウエスタンブロットは、N末端FLAGタグについての探索がTEVプロテアーゼに相当する高分子量種を示すことを明らかにした。C末端の6×HISタグについて染色したブロットは、切断されたノッチンに相当する約8kDaの種を示す。これら発現試験に基づき、この自己切断構築物が、標準的な微生物系での生産が困難であるノッチンを組み換え的に発現させる実行可能な方法である。自己切断構築物は、微生物系で生産することができない他のノッチンの組み換え生産を容認する。このストラテジーはノッチン以外のタンパク質を生産することにも使用できる。あるいは、Axlのような融合パートナーを用いて、ノッチンとAxlタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を導入して、ノッチンの組み換え発現を促すことができる。[例12:ノッチン-Fc融合体]この例では、マウス抗体のFc部分をインテグリン結合ノッチンであるEETIに上述するように融合させる。ノッチン-Fc融合体を分子クローニング及び哺乳動物細胞発現によって創出した。これら修飾したノッチンタンパク質は、数分程度の半減期を有する未修飾ノッチンと比較して、長い循環時間数日を有するであろう。この系を用いて、EETIをベースとするノッチンペプチド2.5D及び2.5F並びに野生型EETI-IIをマウスIg2aのFcドメイン配列番号83に融合させて哺乳動物ヒト胎児腎臓HEK細胞でノッチン-Fc融合タンパク質を発現できることを示した。Fcドメインは既知の配列であり、mRNA配列については例えばアクセッション番号NM_010184.2を参照されたい。ノッチンペプチドを生成してNuPAGE4~12ビス-トリスゲル上で泳動させた。結果は、予期したサイズの非還元型NR及び還元型Rノッチン22.5D-Fcを示した。次いで、これらノッチンタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーによって分析して、純粋なノッチン-Fc2は凝集の傾向を示さなかった。次いで、ノッチン-Fcタンパク質の腫瘍細胞株への結合を測定した。ノッチン2.5F-Fcペプチドは、野生型EETII-Fcに対して測定した場合のノッチン2.5D-Fcペプチドと比較して、より高い親和性でsk0v3細胞に結合することを見出した。対照的に、ノッチン2.5-Fc及び2.5D-Fcは、αvβ3インテグリンで形質転換させたK562白血病細胞に同様な親和性で結合した。別の腫瘍モデルでは、ノッチン-Fcタンパク質が細胞外基質ECMタンパク質であるビトロネクチンに対するPC3細胞接着を阻害する能力を分析した。両ノッチン-Fcタンパク質は腫瘍細胞接着を強く阻害し、一方、陰性コントロールは阻害しなかった。結果を図10に示す。インテグリン-ECM接着の阻害はカスパーゼ媒介性アポトーシスを誘導するため、この生物学的メカニズムは、将来の研究で調査されるであろう。本研究は、受容体結合親和性を乱すことなく抗体Fcドメインをノッチンタンパク質に融合させることができることの最初の実証である。このストラテジーは、インテグリン以外の様々な生物医学的標的に対する改変ノッチンタンパク質の半減期を増加させるための一般的なプラットフォームであろう。また、一価のノッチンを上回る増加した結合親和性と増加又は変化した生物学的効力を有し得る二量体タンパク質Fc融合体は二価であるためを作成する潜在的なプラットフォームでもある。更に、Fc融合体を骨組みとして用いて、抗体に基づく薬物を用いて行われているものと同様な、より高次のオリゴマー又は多価/多重特異性タンパク質を構築することができる。[結論]上記具体的な記載は、発明を例示する及び説明することを意図しており、添付された請求の文字通りの等価な範囲によって定義される発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。本明細書中で言及するあらゆる特許又は刊行物も、明確に提示されていないことがあり得るがこの分野の研究者によって理解されるであろう本発明の特定の態様を実施するのに有用な方法及び材料の詳細を伝えることを意図する。このような特許又は刊行物は、必要に応じ、参照される方法又は材料を説明する及び使用可能にする目的で、各々が具体的及び個別に参照により援用された及び本明細書に含まれた場合と同じ程度まで、参照により本明細書に含まれるものとする。"