"明細書に記載の発明。発明の要旨本明細書中に記載されるものは、新規のHIV配列、これらの新規配列によってコードされるポリペプチド、ならびにこれらおよび他のHIV配列から生成される合成発現カセットである。1つの局面において、本発明は、改良されたHIV発現カセットに関する。第2の局面において、本発明は、本発明の発現カセットを用いた被験体における免疫応答の発生に関する。さらなる局面において、本発明は、本発明の発現カセットおよび本発明の発現カセットによってコードされるポリペプチドを用いた被験体における免疫応答の発生に関する。別の局面において、本発明は、被験体におけるHIVに対する抗体および/または細胞性免疫応答を強力な中和を誘導するための増強されたワクチン技術に関する。特定の実施形態において、本発明は、HIVポリペプチドEnv、Gag、Pol、Prot、RT、Int、Vpr、Vpu、Vif、Nef、Tat、Revならびに/またはそれらの組み合わせおよびフラグメントが挙げられるが、これらに限定されないをコードする、単離された野生型のポリヌクレオチドおよび/または発現カセットに関する。いくつかの遺伝子の変異は、免疫応答を発生する遺伝子産物の能力に有害な影響を与えることなく、遺伝子産物の活性を減少させるか、または排除することが記載される。例示的なポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:他の実施形態において、本発明は、HIVポリペプチドEnv、Gag、Pol、Prot、Int、Vpr、Vpu、Vif、Nef、Tat、Revならびに/またはそれらの組み合わせおよびフラグメントが挙げられるが、これらに限定されないをコードする合成のポリヌクレオチドおよび/または発現カセットに関する。さらに、本発明また、HIVポリペプチドの発現の改善、およびウイルス様粒子の産生に関する。HIVポリペプチド例えば、Gag-,pol-,プロテアーゼprot-、逆転写酵素、インテグラーゼ、RNAseH、Tat、Rev、Nef、Vpr、Vpu、Vifおよび/またはEnvを含有するポリペプチドをコードする合成発現カセットが記載され、この発現カセットの使用も記載される。いくつかの遺伝子の変異は、免疫応答を発生する遺伝子産物の能力に有害な影響を与えることなく、遺伝子産物の活性を減少させるか、または排除することが記載される。例示的な合成ポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:従って、本発明の1つの局面は、発現カセットおよびこの中に含まれるポリヌクレオチドに関する。この発現カセットは、代表的には、発現ベクター骨格に挿入されたHIVポリペプチドコード配列を含む。1つの実施形態において、発現カセットは、1以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約85~100の間、およびこの間の任意の整数値例えば、少なくとも約85、好ましくは約90、より好ましくは約95、およびより好ましくは約98の配列同一性を有する配列を含む。本発明のHIVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、さらなるポリペプチドをコードする配列を含み得る。ポリペプチドをコードするこのようなさらなるポリヌクレオチドは、例えば、他のウイルスタンパク質例えば、B型肝炎またはC型肝炎あるいは他のHIVのタンパク質についてのコード配列例えば、HIVGagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、HIVEnvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および/またはvif、vpr、tat、rev、vpuおよびnefのうちの1以上をコードするポリヌクレオチド;サイトカインまたは他の導入遺伝子を含み得る。1つの実施形態において、HIVPolポリペプチドをコードする配列は、逆転写酵素およびインテグラ-ゼに対応するコード領域の欠失によって改変され得る。このポリメラーゼポリペプチドにおけるこのような欠失はまた、作製され得、その結果、このポリヌクレオチド配列は、ヘルパーT細胞およびCTLのエピトープを保存する。目的の他の抗原は、同様にポリメラーゼに挿入され得る。別の実施形態において、発現カセットは、例えば、以下:のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中で教示される配列に対して、約85~100の間、およびこの間の任意の整数値例えば、少なくとも約85、好ましくは約90、より好ましくは約95、そしてより好ましくは約98の配列同一性を有する配列を含む。本発明のHIVポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列および合成ポリヌクレオチド配列は、代表的には、本明細書中に教示される配列と、約85~100の間、およびこの間の任意の整数値例えば、少なくとも約85、好ましくは、約90、より好ましくは、約95、そしてより好ましくは、約98の配列同一性を有する。さらに、特定の実施形態において、本発明のHIVポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書中に教示される配列と、100の配列同一性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術またはそれらの組み合わせによって生成され得る。本発明は、さらに、選択した宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含し、ここで、この組換え発現系は、本発明の1つ以上のポリヌクレオチドおよび発現カセットを用いる。このような系において、ポリヌクレオチド配列は、選択した宿主細胞における発現と適合性のコントロールエレメントに作動可能に連結される。多数の発現コントロールエレメントが、当該分野で公知であり、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を最適化するための配列、および翻訳終止配列。例示的な転写プロモーターとしては、CMV、CMVイントロンA、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltrおよびメタロチオネインから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の別の局面は、本発明の1つ以上の発現カセットを含む細胞を含み、ここで、ポリヌクレオチド配列は、選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。1つの実施形態において、このような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、BHK細胞、VERO細胞、HT1080細胞、293細胞、RD細胞、COS-7細胞およびCHO細胞が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下から得られるものが挙げられるがこれらに限定されない:昆虫例えば、TrichoplusianiTn5およびSf9、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞、一次細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。さらなる局面において、本発明は、免疫学的応答を発生するための組成物を包含し、ここで、この組成物は、代表的には、本発明の少なくとも1つの発現カセットを含有し、そして例えば、発現カセット例えば、Pol誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する1つ以上の発現カセット、Gag誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する1つ以上の発現カセット、付随ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド例えば、ネイティブもしくは合成の、vpu、vpr、nef、vif、tat、revを有する1つ以上の発現カセット、および/またはEnv誘導体化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する1つ以上の発現カセットの組み合わせを含有し得る。このような組成物は、さらに、アジュバント単数または複数を含有し得る。これらの組成物はまた、1つ以上のHIVポリペプチドを含有し得る。このHIVポリペプチドは、組成物中の発現カセットによってコードされるポリペプチドに対応し得るか、または発現カセットによってコードされるポリペプチドとは異なり得る。発現カセットまたは、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方を含有する組成物において、本発明の種々の発現カセットが混合され得、そして/または本明細書中に記載される種々のHIVポリペプチドと適合され得る。別の局面において、本発明は、被験体の免疫化の方法を包含する。本方法において、上記の組成物のいずれかは、被験体中の発現カセットの発現に適合性である条件下で、被験体中にある。1つの実施形態において、発現カセットまたは、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子送達ベクターを使用して導入され得る。この遺伝子送達ベクターは、例えば、非ウイルスベクター、またはウイルスベクターであり得る。例示的なウイルスベクターとしては、真核層状開始系eucaryoticlayeredvectorinitiationsystem、Sindbisウイルスまたは他のαウイルス由来ベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。他の例示的なベクターとしては、pCMVKm2、pCMV6a、pCMV-link、およびpCMVPLEdhfrが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的応答を生じるために有用な組成物はまた、特定のキャリア例えば、PLG微粒子またはCTAB-PLG微粒子を使用して送達され得る。さらに、このような組成物は、例えば、金粒子またはタングステン粒子、および例えば、遺伝子銃を使用して被験体に送達されるコーティングされた粒子上にコーティングされ得る。これらの組成物はまた、リポソームとして処方され得る。この方法の1つの実施形態において、被験体は、哺乳動物であり、そして例えば、ヒトであり得る。さらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生じる方法を包含する。本明細書中に記載される任意の発現カセットは、適切な細胞において発現されて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるHIVポリペプチドの発現を提供し得る。次いで、ポリペプチドは単離例えば、続いて精製され、免疫応答を誘発するのに十分な量で被験体に投与される。特定の実施形態において、本方法は、本明細書中に記載される遺伝子送達技術のいずれかを使用して、本発明の1つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドを投与する工程を包含する。他の実施形態において、本方法は、本発明の1つ以上の発現カセットまたはポリヌクレオチドおよび1つ以上のポリペプチドを同時投与する工程を包含し、ここで、これらのポリペプチドは、これらのポリヌクレオチドから発現され得るか、または他のHIVポリペプチドであり得る。他の実施形態において、本方法は、本発明の複数の発現カセットまたはポリヌクレオチドを同時投与する工程を包含し得る。なおさらなる実施形態において、本方法は、複数のポリペプチド、例えば、本発明のポリヌクレオチドから発現されるポリペプチドおよび/または他のHIVポリペプチドを同時投与する工程を包含する。本発明はさらに、被験体において免疫応答を生じる方法を包含し、ここで、被験体の細胞は、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチド例えば、本発明の任意の発現カセットによってコードされるの産生が可能な条件下で、上記の発現カセットまたは本発明のポリヌクレオチドのいずれかを用いてトランスフェクトされる。この方法によって、ポリペプチドに対する免疫応答が、被験体で誘発される。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、細胞は被験体においてインビボでトランスフェクトされ得る。免疫応答は、体液性および/または細胞媒介性細胞性であり得る。さらなる実施形態において、この方法はまた、被験体への発現カセットの導入前、導入時および/または導入後に、HIVポリペプチドを投与する工程を包含し得る。本発明のポリヌクレオチドは、単独または組み合わせて使用され得る。HIV誘導体化ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは、種々の方法において発現され得る。これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:プロモーターから発現される単一の遺伝子産物またはそれらの一部分をコードするポリヌクレオチド;1つより多い遺伝子産物またはそれらの一部分をコードする複数のポリヌクレオチド例えば、ポリシストロニックコード配列;単一のポリタンパク質を産生するための複数のポリヌクレオチドインフレーム;およびポリタンパク質がポリタンパク質を含む1つ以上のポリペプチドの間にタンパク質切断部位を有する、単一のポリタンパク質を産生するための複数のポリヌクレオチドインフレーム。本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示の点から、当業者に容易に思い浮かぶことである。したがって、本発明は、以下を提供する。1HIVGagポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Gagポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18および配列番号19からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。2HIVGagポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Gagポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号12または配列番号20の少なくとも500個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。3HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Envポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29および配列番号30に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。4HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Envポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37および配列番号38に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。5HIVIntポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Intポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号39に対して少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。6HIVIntポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Intポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号40に対して少なくとも98の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。7HIVNefポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Nefポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号41または配列番号203に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。8HIVp15RNaseHポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該p15RNaseHポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号42に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。9HIVPolポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Polポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号43、配列番号44および配列番号45からなる群より選択される配列に対して少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。10HIVTatポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Tatポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号46、配列番号47および配列番号48からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。11HIVProtポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Protポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号49または配列番号50に対して少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。12HIVProtポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Protポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号51に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。13HIVRevポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Revポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号52に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。14HIVTatポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Tatポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、および配列番号60からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。15HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、該Envポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチド配列が、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190および配列番号191からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。16項目1~15のいずれかに記載の発現カセットを含む、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系であって、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現と適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、組換え発現系。17項目16に記載の組換え発現系であって、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からなる群より選択される、組換え発現系。18項目16に記載の組換え発現系であって、前記転写プロモーターが、CMV、CMVおよびイントロンA、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr、ならびにメタロチオネインからなる群より選択される、組換え発現系。19項目1~15のいずれか1項に記載の発現カセットを含む細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発現に適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞。20前記細胞が哺乳動物細胞である、項目19に記載の細胞。21前記細胞が、BHK細胞、VERO細胞、HT1080細胞、293細胞、RD細胞、COS-7細胞、およびCHO細胞からなる群より選択される、項目20に記載の細胞。22前記細胞が、CHO細胞である、項目21に記載の細胞。23前記細胞が、昆虫細胞である、項目19に記載の細胞。24前記細胞が、TrichoplusianiTn5昆虫細胞またはSf9昆虫細胞のいずれかである、項目23に記載の細胞。25前記細胞が、細菌細胞である、項目19に記載の細胞。26前記細胞が、酵母細胞である、項目19に記載の細胞。27前記細胞が、植物細胞である、項目19に記載の細胞。28前記細胞が、抗原提示細胞である、項目19に記載の細胞。29項目28に記載の細胞であって、前記抗原提示細胞が、リンパ細胞であり、該リンパ細胞が、そのマクロファージ、単球、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞、および始原細胞からなる群より選択される、細胞。30項目19に記載の細胞であって、前記細胞が、始原細胞である、細胞。31項目19に記載の細胞であって、前記細胞が、不死化細胞である、細胞。32項目19に記載の細胞であって、前記細胞が、腫瘍由来細胞である、細胞。33HIVGagポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、以下:項目19に記載の細胞を、該ポリペプチドを産生するための条件下でインキュベートする工程、を包含する、方法。34哺乳動物被験体における使用のための遺伝子送達ベクターであって、該被験体における使用のための適切な遺伝子送達ベクターを含み、該ベクターが、項目1~15のいずれかに記載の発現カセットを含み、そして前記ポリヌクレオチド配列が、該被験体における発現と適合する制御エレメントに作動可能に連結されている、遺伝子送達ベクター。35被験体のDNA免疫化の方法であって、以下:該被験体における前記発現カセットの発現と適合する条件下で、項目34に記載の遺伝子送達ベクターを該被験体に導入する工程、を包含する、方法。36前記遺伝子送達ベクターが、非ウイルスベクターである、項目35に記載の方法。37前記ベクターが特定のキャリアーを使用して送達される、項目35に記載の方法。38項目37に記載の方法であって、前記ベクターが、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そして該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記被験体に送達される、方法。39前記ベクターが、リポソーム調製物にカプセル化されている、項目35に記載の方法。40前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目35に記載の方法。41前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目40に記載の方法。42前記ウイルスベクターが、アルファウイルスベクターである、項目40に記載の方法。43前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目40に記載の方法。44前記被験体が、哺乳動物である、項目35に記載の方法。45前記哺乳動物が、ヒトである、項目44に記載の方法。46被験体において免疫応答を生じさせる方法であって、以下:該被験体の細胞に、項目34に記載の遺伝子送達ベクターを、前記ポリヌクレオチドの発現および該ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、トランスフェクトし、それによって、該ポリペプチドに免疫学的応答を誘発する工程、を包含する、方法。47前記ベクターが非ウイルスベクターである、項目46に記載の方法。48前記ベクターが特定のキャリアーを使用して送達される、項目46に記載の方法。49項目46に記載の方法であって、前記ベクターが、金またはタングステンの粒子上にコーティングされ、そして該コーティングされた粒子が、遺伝子銃を使用して前記脊椎動物に送達される、方法。50前記ベクターが、リポソーム調製物にカプセル化されている、項目46に記載の方法。51前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目46に記載の方法。52前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、項目51に記載の方法。53前記ウイルスベクターが、アルファウイルスベクターである、項目51に記載の方法。54前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、項目51に記載の方法。55前記被験体が、哺乳動物である、項目46に記載の方法。56前記哺乳動物が、ヒトである、項目55に記載の方法。57前記トランスフェクションが、エキソビボで行われ、そして前記トランスフェクトされた細胞が、前記被験体に再導入される、項目46に記載の方法。58前記トランスフェクションが、前記被験体においてインビボで行われる、項目46に記載の方法。59前記免疫応答が、体液性免疫応答である、項目46に記載の方法。60前記免疫応答が、細胞性免疫応答である、項目46に記載の方法。61項目46に記載の方法であって、前記遺伝子送達ベクターが、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮、膣内、直腸内、経口、または静脈内で投与される、方法。発明の詳細な説明本発明の実行において、他に示されない限り、当該分野における従来の化学法、生物化学法、分子生物学法、免疫学法および薬理学法を使用する。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、第18版Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990;MethodsInEnzymologyS.ColowickおよびN.Kaplan編、AcademicPress、Inc.;およびHandbookofExperimentalImmunology、第I~IV巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986,BlackwellScientificPublications;Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版、1989;ShortProtocolsinMolecularBiology、第4版Ausubelら編、1999,JohnWileySons;MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourseReamら編、1998,AcademicPress;PCRIntroductiontoBiotechniquesSeries第2版NewtonGraham編、1997,SpringerVerlagを参照のこと。本明細書中で使用される場合、単数型a、anおよびtheは、明確にそうではないことを指示しない限り、複数を含む。したがって、例えば、抗原anantigenは、2種以上のこのような抗原の混合物を含む。1.定義本発明の記載において、以下の用語が使用され、以下に示されるとおりに規定されることが意図される。本明細書中で使用される場合には、合成配列とは、その発現が本明細書中で記載されているように、例えば、阻害配列のコドンの置換、改変された活性および/または不活化によって改変されている、HIVポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをいう。野生型配列または天然の配列とは、本明細書中で使用される場合には、本質的にはそれらが天然において見出される通りのポリペプチドコード配列をいう。例えば、HIV単離株にて見出されるようなGag、Pol、Vif、Vpr、Tat、Rev、Vpu、Envおよび/またはNefのコード配列例えば、SF162、SF2、AF110965、AF110967、AF110968、AF110975、8_5_TV1_C.ZA、8_2_TV1_C.ZAまたは12-5_1_TV2_C.ZAである。HIVゲノムの種々の領域は、8_5_TV1_C.ZAに対する番号付けと共に表Aに示される図1A~1D。従って、用語Polは、以下のポリペプチドのうちの1つ以上をいう:ポリメラーゼp6Pol;プロテアーゼprot;逆転写酵素p66RTまたはRT;RNAseHp15RNAseH;および/またはインテグラーゼp31IntまたはInt。任意の選択されたHIV単離株についての遺伝子領域の同定は、本明細書中に示される教示および当該分野で公知の情報に基づいて当業者によって実行され得る例えば、8_5_TV1_C.ZAに対するアライメント図1A~1Dまたは他の既知のHIV単離株例えば、遺伝子領域例えば、SF2、GenBank登録番号K02007;SF162、GenBank登録番号M38428を有するサブタイプB単離株、および遺伝子領域例えば、GenBank登録番号AF110965およびGenBank登録番号AF110975を有するサブタイプC単離株に対するアライメントを実行することによる。本明細書中で使用される場合は、用語ウイルス様粒子またはVLPは、以下にさらに議論されるいくつかのウイルスのうちのいずれかに由来する、複製しないウイルス外皮をいう。VLPは、一般的には、キャプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および/またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドこれらに限定されないのような、1つ以上のウイルスタンパク質から構成される。VLPは、適切な発現系中でタンパク質の組換え発現の際に自発的に形成し得る。粒子状のVLPを産生するための方法が、当該分野で公知であり、そして以下により完全に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現後のVLPの存在は、当該分野で公知の従来技術例えば、電子顕微鏡分析、X線結晶解析などを使用して検出され得る。例えば、Bakerら、Biophys.J.199160:1445-1456;Hagenseeら、J.Virol.199468:4503-4505を参照のこと。例えば、VLPは、密度勾配遠心分離によって単離され得、そして/または特徴的な密度のバンド形成によって同定され得る。あるいは、低温電子顕微鏡分析が、対象のVLP調製物のガラス状にされた水性サンプル対して行われ得、そして適切な露出条件下で画像が記録され得る。特定のウイルスタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドによって、VLP形成に好ましい条件下でVLPを形成する能力を有する全長またはほぼ全長のウイルスタンパク質、ならびにそれらのフラグメント、または内部欠失を有するウイルスタンパク質が意味される。従って、そのポリペプチドは、全長の配列、フラグメント、短縮された配列および部分的な配列、ならびに参照分子のアナログおよび前駆体の形態を含み得る。従って、この用語は、ポリペプチドがVLPを形成する能力を維持している限りは、その配列に対する欠失、付加,および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然のバリエーションを含む。なぜなら、コートタンパク質におけるバリエーションがしばしば、ウイルスの単離物間で存在するからである。この用語はまた、タンパク質がVLPを形成する能力を維持している限りは、参照のタンパク質中では天然には生じない欠失、付加、および置換を含む。好ましい置換は、天然で保存されている置換すなわち、側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。詳細には、アミノ酸は、一般的に、4つのファミリーに分けられる:1酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸;2塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;3非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;ならびに4非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。用語HIVポリペプチドとは、ネイティブHIVポリペプチド例えば、Gag、Env、Prot、Pol、RT、Int、vif、vpr、vpu、tat、rev、nefおよび/またはその組み合わせに対して配列相同性を示す任意のアミノ酸配列および/または機能的な任意のアミノ酸配列をいう。HIVポリペプチドによって示され得る機能の非制限的な例としては、免疫原としての使用例えば、体液性および/または細胞性の免疫応答を生成すること、診断剤における使用例えば、ELISAまたは他の免疫アッセイにおける使用のために適切な抗体により結合しているおよび/または野生型もしくは合成のHIVポリペプチドと関連する1つ以上の生物学的活性を示すポリペプチドが挙げられる。例えば、本明細書中で使用される場合、用語Gagポリペプチドは、1つ以上の抗Gag抗体によって結合されており;体液性および/または細胞性の免疫応答を惹起し;そして/または粒子を形成する能力を示す、ポリペプチドをいい得る。抗原とは、体液性および/または細胞性の抗原特異的応答を生じるように宿主免疫系を刺激する、1以上のエピトープを含む分子線状、立体構造conformationalのいずれか、またはその両方をいう。この用語は、用語免疫原と交換可能に使用される。通常、B細胞エピトープは、少なくとも約5個のアミノ酸を含むが、3~4アミノ酸程度の少なさであり得る。T細胞エピトープ例えば、CTLエピトープは、少なくとも約7~9個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーT細胞エピトープは、少なくとも約12~20個のアミノ酸を含む。通常、エピトープは、約7と15との間のアミノ酸例えば、9、10、12、または15個のアミノ酸を含む。用語抗原は、サブユニット抗原すなわち、天然で付随している生物全体から分離されそして別個である、抗原、ならびに殺傷されたか、弱毒化されたか、または不活性化された、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、または他の微生物の両方を示す。抗体例えば、抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメントおよび合成ペプチドミモトープこれは、抗原または抗原決定基を模倣し得るもまた、本明細書中で使用される抗原の定義の下に捕捉される。同様に、例えば、遺伝子治療およびDNA免疫適用において、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義内に含まれる。本発明の目的のために、抗原は、以下により十分に記載されるように、いくつかの既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれかに由来し得る。この用語はまた、種々の腫瘍抗原のいずれかを意図する。さらに、本発明の目的のために、抗原は、タンパク質が本明細書中に定義されるような免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブな配列に対する改変例えば、欠失、付加および置換一般に天然で保存されるを含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を通してのように故意であってもよく、または抗原を産生する宿主の変異を通してのように偶然であってもよい。抗原または組成物に対する免疫学的応答は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性および/または細胞性の免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、体液性免疫応答とは、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方、細胞性免疫応答は、Tリンパ球および/または他の白血球により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の1つの重要な局面は、細胞傷害性T細胞CTLによる抗原特異的応答に関する。CTLは、主要組織適合遺伝子複合体MHCによりコードされるタンパク質と結合して存在しそして細胞表面上に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答に関する。ヘルパーT細胞は、それらの表面上にMHCと結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、そしてこの細胞に対する活性に焦点を当てることを補助するように作用する。細胞性免疫応答はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化T細胞および/または他の白血球CD4およびCD8T細胞に由来するものを含むにより産生される他のこのような分子の産生をいう。細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でMHC分子と結合している抗原の提示により、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。この細胞媒介性免疫応答は、その細胞の表面に抗原を提示する細胞に、またはその付近に指向される。さらに、抗原特異的Tリンパ球は、免疫された宿主の将来的な防御を可能にするように生成され得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイによって例えば、リンパ増殖lymphoproliferationリンパ球活性化アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイによってか、または感作された被験体における抗原に特異的なTリンパ球についてアッセイをすることによって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ericksonら、J.Immunol.1993151:4189~4199;Doeら、Eur.J.Immunol.199424:2369~2376を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内サイトカインまたはT細胞集団によるサイトカイン分泌の測定、またはエピトープ特異的T細胞の測定例えば、テトラマー技術によるを含むMcMichael,A.J.、およびO’Callaghan,C.A.、J.Exp.Med.18791367~1371、1998;Mcheyzer-Williams,M.G.ら、Immunol.Rev.150:5~21、1996;Lalvani,A.ら、J.Exp.Med.186:859~865、1997により総説される。従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、CTLの産生、および/またはヘルパーT細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの1以上を含み得る:B細胞による抗体の産生;ならびに/あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に対して特異的なサプレッサーT細胞および/またはγδT細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして/あるいは抗体-補体、または抗体依存性細胞傷害性ADCCを媒介して、免疫された宿主に対する防御を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野において周知である、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。免疫原性組成物は、被験体への組成物の投与が、目的の抗原性分子に対する被験体における体液性免疫応答/細胞性免疫応答の発生を生じる、抗原性分子を含む組成物である。免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、鼻腔内、および粘膜例えば、直腸内または膣内投与によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。サブユニットワクチンとは、目的の病原体由来例えば、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌由来の抗原に由来するかまたはそれに相同である、1以上の選択された抗原しかし、全ての抗原ではないを含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原体細胞もしくは病原性粒子、またはこのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、サブユニットワクチンは、病原体から少なくとも部分的に精製された好ましくは、実質的に精製された免疫原性ポリペプチドまたはそのアナログから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成産生を含み得る。実質的に精製されるたとは、一般に、物質化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物が、存在するサンプルの主要な割合を含むように、その物質を単離することをいう。代表的には、サンプル中に、実質的に精製された成分は、このサンプルの50、好ましくは80~85、より好ましくは90~95を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度に従う沈降が挙げられる。コード配列または選択されたポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列または制御エレメントの制御下に置かれた場合、インビボで転写されDNAの場合、そしてポリペプチドに翻訳されるmRNAの場合核酸分子である。コード配列の境界は、5’アミノ末端の開始コドンおよび3’カルボキシ末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス由来のcDNA、原核生物または真核生物のmRNA、ウイルスまたは原核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含まれ得るが、これらに限定されない。終止コドンのような転写終結配列は、コード配列に対して3’に位置され得る。代表的な制御エレメントには、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列翻訳終止コドンに対して3’に位置する、翻訳の開始の最適化のための配列コード配列に対して5’に位置する、および翻訳終結配列が含まれるが、これらに限定されない。例えば、本明細書中に記載される配列および/またはベクターはまた、転写および/または終結を最適化し得る1つ以上のさらなる配列を含み得、これらとしては、コドン最適化野生型リーダーののATGの前5’に位置するKozak配列例えば、GCCACC、配列番号191のヌクレオチド1~6、または任意の他の適切なリーダー配列例えば、tpa1、tpa2、wtLnatネイティブ野生型リーダーまたはコード配列の後3’に位置する終結配列例えば、TAA、または好ましくはTAAA、配列番号191のヌクレオチド1978~1981が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドコード配列または選択されたポリペプチドをコードする配列は、核酸分子であり、これは、適切な調節配列または制御エレメントの制御下で配置される場合、インビトロでDNAの場合に転写され、そしてmRNAの場合にポリペプチドに翻訳される。コード配列の境界は、開始コドン例えば、5’末端またはその付近および翻訳終止コドン例えば、3’末端またはその付近によって決定される。例示的なコード配列は、本発明の改変されたウイルスのポリペプチドコード配列である。本発明のポリヌクレオチド配列のコード領域は、当業者によって同定可能であり、そして例えば、ポリヌクレオチドの3つ全てのフレームの翻訳を実行すること、およびコードされたポリペプチド例えば、nef由来のポリペプチドをコードする本発明の合成nefポリヌクレオチドに対応するフレームを同定することによって、容易に同定され得る。転写終結配列は、コード配列の3’に位置され得る。代表的な制御エレメントとしては、転写レギュレーター例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、およびポリアデニル化配列;および転写レギュレーター例えば、翻訳の開始を最適化するための配列例えば、Shine-Dalgarnoリボソーム結合部位配列、Kozak配列すなわち、翻訳、配置の最適化のための配列例えば、コード配列の5’、リーダー配列、翻訳開始コドン例えば、ATG、および翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、1つ以上の翻訳調節配列または翻訳開始配列例えば、リーダー配列が、野生型翻訳開始配列すなわち、そのネイティブ状態におけるコード領域の翻訳を調節する配列に由来する。本明細書中に記載される方法を用いて改変されている野生型リーダー配列もまた、本発明における使用が見出される。プロモーターは、誘導性プロモーターここで、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される、抑制プロモーターここで、プロモーダーに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される、および構築プロモーターを含み得る。核酸分子には、原核生物配列、真核生物mRNA、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物例えば、哺乳動物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含まれ得るが、これらに限定されない。その用語はまた、DNAおよびRNAの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を捕捉する。作動可能に連結したは、エレメントの配置をいい、ここで、そのように記載された成分は、それらの機能を行うように構成されている。従って、コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、その適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。そのプロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写はされるが翻訳はされない介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に作動可能に連結していると考えられ得る。本明細書において、核酸分子を記載するために使用される組換えは、その起源または操作により、1天然において結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない;および/または2天然において結合している以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、cDNA、半合成または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される用語組換えは、組換えポリヌクレオチドの発現によって生成されるポリペプチドを意味する。組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養物、および単細胞部分として培養された原核生物微生物または真核生物細胞株を示すそのような他の用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターまたはその他の移入DNAのためのレシピエントとして使用され得るか、または使用されている細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的な変異または意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学上、または元の親に相補的なゲノムもしくは全DNAにおいて完全に同一でなくてもよいことが理解される。関連する特性例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在によって特徴づけられるべき親に充分に類似している親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。アミノ酸配列類似性を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、類似性は、アミノ酸が同一であるか、または類似の化学的および/または物理的特性例えば、電荷または疎水性を有する適切な部位での2つ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。次いで、いわゆるパーセント同一性は、比較したポリペプチド配列間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するmRNAのヌクレオチド配列を決定する通常、cDNA中間体を介してこと、およびそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第2のアミノ酸配列と比較することを包含する。一般に、同一性は、2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれの、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。2つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較され得る。2つ以上のアミノ酸配列は、同様に、パーセント同一性を決定することによって比較され得る。2つの配列のパーセント同一性核酸またはペプチド配列が一般に記載されているか否かは、一般に、より短い配列の長さによって除算され、そして100を積算された2つの整列された配列間の正確な整合の数として記載される。核酸配列についてのおよその整列は、SmithおよびWaterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-4891981の局所的な相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff,AtlasofProteinSequencesandStructure,M.O.Dayhoff編、5補遺、3:353-358、NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USAによって開発され、そしてGriskov、Nucl.Acids.Res.146:6745-67631986によって正規化された、スコア付けマトリックスを使用して、ペプチド配列を用いて使用するために拡張され得る。核酸配列およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実行は、それらのBestFitユーティリティーアプリケーションにおいてGeneticsComputerGroupMadison,WIによって提供される。この方法についてのデフォルトパラメーターは、WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual,Version81995GeneticsComputerGroup、Madison,WIより入手可能に記載される。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の等しく適切なプログラムは、当該分野で一般に公知である。例えば、特定のヌクレオチド配列の、参照配列に対するパーセント同一性は、SmithおよびWatermanの相同性アルゴリズムを、デフォルトスコア付け表および6ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いて使用して決定され得る。本発明の状況においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、JohnF.CollinsおよびShaneS.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics,Inc.MountainView、CAによって頒布されているUniversityofEdinburghに著作権の帰属するプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。このパッケージソフトから、Smith-Watermanアルゴリズムが、スコア付表例えば、12のギャップオープンペナルティ、1のギャップ拡張ペナルティ、および6のギャップについて使用されるデフォルトパラメータが使用される場合に、利用され得る。作成されたデータから、マッチ値は、配列同一性を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適切なプログラム例えば、整列プログラムBLASTこれはデフォルトパラメータでも使用され得るは、一般に、当該分野で公知である。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータでも使用され得る:遺伝子コード=標準;フィルター=なし;鎖=両方;カットオフ=60;予想=10;マトリックス=BLOSUM62;記載=50配列;選別=高スコア;データベース=非縮重、GenbankEMBLDDBJPDBGenbankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る:http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。当業者は、所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを容易に決定し得、例示的な好ましいSmithWatermanベースのパラメータが上記される。例えば、検索パラメータは、問題の配列のサイズに基づいて変化し得る。従って、本発明のポリヌクレオチド配列について、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列の長さは、選択されたデータベースに対して検索され、そして本質的に同じ長さの配列と比較されて同一性を決定する。例えば、本発明の代表的な実施形態は、X個の連続するヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、iX個の連続するヌクレオチドは、本明細書中に記載される配列表Cの1つ以上のY個の連続したヌクレオチドまたはそのフラグメントに関して、少なくともほぼ選択されたレベルの同一性を有し、そしてiiX=Yの検索目的について、Yは、規定された長さ例えば、15ヌクレオチドの長さから、選択された全長配列に存在するヌクレオチドの数までの選択された参照のポリヌクレオチドである。本発明の配列は、例えば、約15ヌクレオチドから本明細書中に記載される全長配列例えば、図を参照のことに存在するヌクレオチドの数まで上記範囲内の全ての整数値を含むの配列フラグメントを含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のフラグメントは、30~60ヌクレオチド、60~120ヌクレオチド、120~240ヌクレオチド、240~480ヌクレオチド、480~1000ヌクレオチド、およびこれらの間の全ての整数値であり得る。本発明の合成の発現カセットおよび精製したポリヌクレオチドには、本明細書に開示される合成の発現カセット配列および/またはポリヌクレオチド配列に対して例えば、本発明の配列、本発明の配列が、例えば、配列のデータベースに対する問い合わせ配列として使用された場合に、約80~100の、80~85より大きい、好ましくは、90~92より大きい、より好ましくは、95より大きい、そして最も好ましくは、98より大きい100までの配列同一性これらの記載の範囲に入る全ての整数値を含む有する関連するポリヌクレオチド配列が含まれる。2つの核酸フラグメントは、本明細書に記載される場合、選択的にハイブリダイズすると考えられる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、少なくとも部分的に、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrookら、前出、またはAusubelら、前出を参照を使用して評価され得る。このようなアッセイは、例えば、低ストリンジェントから高ストリンジェントまでの種々の条件を使用して、種々の程度の選択性を使用して行われ得る。低ストリンジェンシー条件が利用される場合、非特異的結合の不在は、非特異的な結合事象の非存在下で、二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性を欠損する二次プローブ例えば、標的分子と約30よりも少ない配列同一性を有するプローブを使用することによって評価され得る。ハイブリダイゼーションに基づく検出システムが利用される場合、標的核酸配列に対して相補的な核酸プローブが選択され、次いで適切な条件の選択により、そのプローブおよび標的配列が、互いに、選択的にハイブリダイズするか、結合して、ハイブリッド分子を形成する。中程度のストリンジェントな条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約70の配列同一性を有する少なくとも約10~14個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約90~95より大きな配列同一性を有する少なくとも約10~14個のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的が特定の程度の配列同一性を有するプローブ/標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知なように決定され得る例えば、NucleicAcidHybridization:APracticalApproach、B.D.HamesおよびS.J.Higggins編、1985Oxford;Washigton,DC;IRLPress。ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多くの等価な条件を利用して、特定のストリンジェンシーを、例えば、以下の因子を変えることで確立し得ることは、当該分野で周知である:プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液組成物の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキング因子例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコールが存在するかしないか、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野の標準的方法に従って選択される例えば、Sambrookら、前出、またはAusubelら、前出を参照のこと。第1のポリヌクレオチドが、第2のポリヌクレオチド、そのcDNA、それらの相補体の領域と同じかもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、または第1のポリヌクレオチドが、上記のような配列同一性を示す場合に、第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチドに由来する。第1のポリペプチドが、i第2のポリヌクレオチドに由来する第1のポリヌクレオチドによってコードされる場合、またはii第1のポリペプチドが、上記のような配列同一性を第2のポリペプチドに対して示す場合に、第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドに由来する。ウイルスポリペプチドが、iウイルスのポリヌクレオチドウイルス性ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームによってコードされる場合、またはiiウイルスのポリペプチドが、上記のような配列同一性をウイルスのポリペプチドに対し示す場合に、一般に、ウイルスポリペプチドは、ウイルスの特定のポリペプチドウイルス性ポリペプチドに由来する。コードされるとは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列に関連し、ここでこのポリペプチド配列またはその一部は、この核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する、少なくとも3~5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも8~10個のアミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも15~20個のアミノ酸からなる配列を含む。免疫学的にこの配列によってコードされるポリペプチドと同一視され得るポリペプチド配列もまた含まれる。さらに、ポリタンパク質は、ポリペプチドまたはペプチド産物をコードする、2つ以上のポリヌクレオチド配列をインフレーム融合することによって構築され得る。さらに、ポリシストロンpolycistronicコード配列は、互いに隣接するポリペプチド産物をコードする2つ以上のポリヌクレオチド配列を、典型的には1つのプロモーターの制御下に、配置することで産生され得、ここで各ポリペプチドコード配列は、内部リボソーム結合部位に対する配列を含むよう改変され得る。精製されたポリヌクレオチドとは、基本的に、目的のポリヌクレオチドと自然の状態で関連するタンパク質が除かれた例えば、そのタンパク質の約50未満、好ましくは約70未満、そしてより好ましくは約90未満を含む、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに関する。目的のポリヌクレオチドを精製する技術は、当該分野で周知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含む細胞を、カオトロピック剤で破壊し、そしてポリヌクレオチドおよびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度に依存した沈殿法により分離する工程を含む。核酸免疫化とは、1つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子を、宿主細胞に、抗原またはエピトープのインビボ発現のため導入することを意味する。核酸分子は、レシピエント被験体中に直接導入例えば、注射、吸入、経口投与、鼻腔内投与および粘膜投与などされ得るか、または宿主から取り出された細胞中にエキソビボ導入され得る。後者の場合に、形質転換された細胞は、被験体中に再導入され、免疫応答が、この核酸分子によってコードされる抗原に対して生じ得る。遺伝子移入または遺伝子送達とは、目的のDNAを宿主細胞に正確に挿入する方法またはシステムをいう。このような方法は、組みこまれていない移入DNAの一過性の発現、染色体外複製および移入レプリコン例えば、エピソームの発現、または移入遺伝子物質の宿主細胞ゲノムDNA中への組みこみを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫化に用いる場合、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと呼ばれ得る。Tリンパ球またはT細胞は、抗体を産生しないリンパ球であり、免疫系の細胞性媒介アームの一部を構成する。T細胞は、骨髄から胸腺に遊走した未成熟なリンパ球から生じ、これらは、胸腺ホルモンの指令のもとで成熟過程を経ていく。ここで成熟リンパ球は、急速に分裂して、非常に多数に増加する。成熟T細胞は、特定の抗原を認識および結合する能力に基づいて、免疫応答性になる。抗原がリンパ球表面レセプター結合した場合、免疫応答性T細胞の活性化は、誘発される。用語トランスフェクションは、外来DNAの、細胞による取り込みを示すために使用される。外因性DNAが細胞膜内に導入された場合、細胞は、トランスフェクトされている。多くのトランスフェクション技術は、当該分野で一般に公知である。例えば、Grahamら1973Virology,52:456,Sambrookら1989MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davisら1986BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier、およびChuら1981Gene13:197を参照のこと。このような技術を用いて、1つ以上の外来DNA部分を、適切な宿主細胞中に導入し得る。この用語は、遺伝子物質の安定な取り込みおよび一過性の取り込みの両方を意味し、そしてペプチド結合DNAまたは抗体結合DNAの取り込みを含む。ベクターは、遺伝子配列を、標的細胞へ移入し得る例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子性キャリアおよびリポソーム。典型的には、ベクター構築物、発現ベクターおよび遺伝子移入ベクターは、目的の遺伝子発現を指向し得る任意の核酸構築物をいい、これらは、遺伝子配列を、標的細胞に移入し得る。従って、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。自殺遺伝子例えば、薬物感受性遺伝子の標的細胞への移入は、正常細胞に対して比較的無毒である化合物または組成物に対して、細胞を感受性にする。Moolten,F.L.1994CancerGeneTher.1:279-287。自殺遺伝子の例は、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼHSV-tk、シトクロムP450Manomeら1996GeneTherapy3:513-520、ヒトデオキシシチジンキナーゼManomeら1996NatureMedicine25:567-573および細菌性酵素シトシンデアミナーゼDongら1996HumanGeneTherapy7:713-720である。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的無毒のプロドラッグであるガンシクロビルHSV-tk、シクロホスファミドシトクロムP4502B1、シトシンアラビノシドヒトデオキシシチジンキナーゼまたは5-フルオロシトシン細菌性シトシンデアミナーゼの影響に対し、感受性にされる。Culverら1992Science256:1550-1552,Huberら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8302-8306。選択マーカーまたはレポーターマーカーとは、遺伝子移入ベクターに含まれるヌクレオチド配列をいい、これらは治療的活性を持たないが、むしろ遺伝子移入ベクターのより単純な調製、製造、特徴づけまたは試験を可能にするために含まれる。特異的結合因子とは、分子の特定の結合対のメンバーをいい、ここでこれらの分子の1つは、第2の分子に対し、化学的および/または物理的手段を介して、特異的に結合する。特異的結合因子の1つの例は、選択された抗原に対して指向される抗体である。被験体とは、脊椎動物の亜門のいずれかのメンバーヒトおよび他の霊長類非ヒト霊長類例えば、アカゲザル、マカク、チンパンジーおよび他の類人猿、ならびに猿種などを含む;家畜例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ;家庭向けの哺乳動物例えば、イヌおよびネコ;実験動物マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む;鳥家庭向けの鳥、野生の鳥および狩猟鳥を含む例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥、アヒル、ダチョウなどを含むが、これらに限定されないを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体および新生仔の個体が意図され、含まれる。これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に機能するので、上記のシステムは、上記脊椎動物種のいずれかにおける使用が意図される。薬学的に受容可能または薬理学的に受容可能は、生物学的でない物質またはさもなくば所望されない物質に関する。すなわち、この物質は、処方物または組成物で個体に投与され得て、任意の所望されない生物学的影響を引き起こすことも、有害な様式で、含まれる組成物成分のいずれかと相互作用することない。生理学的pHまたは生理学的範囲にあるpHとは、約7.0~8.0に含まれる範囲にあるpHを意味し、より典型的には、約7.2~7.6に含まれる範囲にある。本明細書で使用される場合、処置とは、以下のいずれかをいう:i従来のワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、ii症状の軽減または除去、およびiii該当する病原体の実質的除去または完全な除去。処置は、予防的に感染前にまたは治療的に感染後に影響され得る。同時投与とは、1つ以上の組成物または分子を投与することをいう。従って、同時投与は、同じ投与経路または異なる投与経路を介して、同時に投与する工程または連続して投与する任意の順番で工程を含む。同時投与レジームの非限定的な例としては、核酸およびペプチドの同時投与;異なる核酸の同時投与例えば、本明細書に記載されるような異なる発現カセットおよび/または異なる遺伝子送達ベクター;および異なるポリペプチドの同時投与例えば、異なるHIVポリペプチドおよび/または異なるアジュバントが挙げられる。この用語はまた、同時投与される分子または組成物のうちいずれか1つを複数回投与する工程を含む例えば、本明細書に記載される1つ以上の発現カセットの複数回投与後の、ポリペプチド含有組成物の1回以上の投与。分子または組成物が連続して送達される場合に、各投与間の時間は、本明細書の教示を考慮することで、当業者により容易に決定され得る。レンチウイルスベクターおよび組換えレンチウイルスベクターとは、目的の核酸分子を運ぶ核酸構築物をいい、そして特定の実施形態において、目的の核酸分子の発現を指向し得る。レンチウイルスベクターは、少なくとも1つの転写プロモーター/エンハンサーもしくは遺伝子座規定エレメント、または遺伝子発現を他の手段例えば、選択的スプライシング、核RNA輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾またはタンパク質の転写後修飾により制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復配列LTRSまたはその一部、ならびに使用するレトロウイルスに適した正および負のプライマー鎖結合部位を含まなければならないこれらがまだ、レトロウイルスベクターに存在していない場合。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー例えば、Neo、TK、ハイグロマイシン、プレオマイシン、ヒスチジノールまたはDHFR、ならびに1つ以上の制限酵素認識部位および翻訳終結配列を含み得る。例として、このようなベクターは、典型的に、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第2鎖DNA合成の起点および3’LTRまたはその一部を含む。レンチウイルスベクター粒子とは、本発明の範囲内で使用される場合、少なくとも1つの目的の遺伝子を保持するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。この組換えレンチウイルスは、その遺伝物質RNAをDNAに逆転写し得、そして感染の際にこの遺伝物質を宿主細胞のDNAに組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ例えば、両性amphoエンベロープまたはVSV-Gエンベロープまたはキメラエンベロープを有し得る。核酸発現ベクターまたは発現カセットとは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る構築物をいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。他の制御エレメントも同様に存在し得る。本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、細菌複製起点、1以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖DNAとして存在することを可能にするシグナル例えば、M13複製起点、マルチクローニング部位および哺乳動物複製起点例えば、SV40またはアデノウイルスの複製起点を含み得る。パッケージング細胞とは、組換えレトロウイルスベクターを欠く感染性組換えレトロウイルスの産生のために必要なエレメントを含む細胞をいう。代表的には、このようなパッケージング細胞は、Gag、polおよびenvタンパク質をコードする、タンパク質を発現し得る1以上の発現カセットを含む。プロデューサー細胞またはベクター産生細胞とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。2.本発明を実行する様式本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方またはプロセスパラメーターに限定されず、このようなものは、当然異なり得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。本明細書中に記載の方法および材料に類似するかまたは等価である多くの方法および材料が、本発明の実行において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書中に記載される。2.1.0.HIVゲノムHIVゲノムおよび種々のポリペプチドコード領域を、表Aに示す。ヌクレオチド位置は、8_5_TV1_C.ZA図1;HIVC型単離株に対して与えられる。しかし、本発明の開示の技術の観点から、例えば、配列比較プログラム例えば、本明細書中に記載されるBLASTなどまたは構造的特徴の同定およびアラインメント例えば、種々の領域を同定し得る、本明細書中に記載されるALBプログラムのようなプログラムを使用して、他のHIV株または改変体例えば、単離株HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4、種々のサブタイプ由来の他のHIV-1株例えば、サブタイプA~G、およびO、HIV-2株および種々のサブタイプ例えば、HIV-2UC1およびHIV-2UC2、ならびにサル免疫不全ウイルスSIVこれらおよび他の関連のウイルスの記載について、例えば、Virology、第三版W.K.Joklik編、1988;FundamentalVirology、第二版B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編、1991;Virology、第三版Fields,BN、DMKnipe、PMHowley、編者、1996、Lippincott-Raven、Philadelphia,PAを参照のこと中の対応する領域を決定する方法は、当業者に容易に明らかである。表A:8_5_TV1_C.ZAに関するHIVゲノム領域当業者が、表Aに示される任意の配列を整列させて、任意の特定のHIV遺伝子の相対的な位置を容易に決定し得ることは、容易に明らかである。例えば、本明細書中に記載されるアラインメントプログラムの1つ例えば、BLASTを使用して、他のHIVゲノム配列を、8_5_TV1_C.ZAと共に整列させて表A、遺伝子の位置を決定し得る。ポリペプチド配列も同様に整列し得る。例えば、図2A~2Cは、種々の株由来のEnvポリペプチド配列の、SF-162に対するアラインメントを示す。共有に係るWO/39303に詳細に記載されるように、Envポリペプチド例えば、gp120、gp140およびgp160は、βシートを形成する4つのアンチパラレルβ鎖β-2、β-3、β-20およびβ-21からなる架橋bridgingシートを含む。1つの対のβ鎖β-2およびβ-3からの突出は、2つのループV1およびV2である。SF-162に対して、このβ-2シートは、ほぼアミノ酸残基113Cys~アミノ酸残基117Thrを占めるが、β-3は、ほぼアミノ酸残基192Ser~アミノ酸残基194Ileを占める。このV1/V2領域は、SF-162に対して、ほぼアミノ酸残基120Cys~アミノ酸残基189Cysを占める。β鎖の第二の対β-20およびβ-21からの突出は、小ループ構造であり、本明細書中で架橋シート小ループとも称される。小ループおよび架橋シート小ループの両方の位置は、本明細書中およびWO/39303の技術に従って、HXB-2に対して決定され得る。図2A~2Cにおいて、矢印によって、βシート領域からの欠失配列のおおよその部位もまた示される。は、本明細書の技術に従って変異され得るNグリコシル化部位を示す。2.1.1.野生型HIV配列種々の新規サブタイプC新規単離物のの単離されたヌクレオチド配列を、以下の図A1に示す。配列を、Engelbrechtら2001ADISRes.Hum.Retoroviruses1716:1533-1547に記載されるように得、そして分析した例えば、系統樹分析GneBankもまた参照のこと。付属のタンパク質配列およびこれらのタンパク質の分析は、Scribaら2001AIDSRes.Hum.Retoroviruses178775-781に記載される。表A1:野生型配列2.2.0合成発現カセット本発明の1つの局面は、例えば、対応する野生型配列と比較して改善された発現を有する、HIV-1コード配列ならびに関連の配列の作製である。2.2.1HIV-1核酸コード配列の改変第1に、得られる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用法に匹敵するように、HIV-1コドン使用法パターンを改変した。HIVコドン使用法は、コドントリプレットのヌクレオチドAまたはTの高い含量を反映する。HIV-1コドン使用法の効果は、DNA配列における高いAT含量であり、減少した翻訳能力およびmRNAの不安定性をもたらす。比較すると、高度に発現されるヒトコドンは、ヌクレオチドGまたはCを好む。HIVコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用法に匹敵するように改変された。第2に、例えば、Gagコード配列のコード配列内に位置する、阻害性または不安定性エレメントINSが存在する。RREは、HIVコードRev-タンパク質と相互作用して、INSの発現下方調節の影響を克服する二次RNA構造である。RREおよびRevの転写後活性化機構を克服するために、不安定性エレメントは、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって不活化され得る。第3に、いくつかの遺伝子に関して、このコード配列は、ポリヌクレオチドコード配列が不活性または非機能的である遺伝子産物例えば、不活性化ポリメラーゼ遺伝子産物、不活性化プロテアーゼ遺伝子産物v、不活性化tat遺伝子産物、不活性化rev遺伝子産物、不活性化nef遺伝子産物、不活性化vif遺伝子産物、不活性化vpr遺伝子産物、および/または不活性化vpu遺伝子産物をコードするように変更される。実施例1は、いくつかの例示的な変異を記載する。実施例8は、変異Tat抗原、変異Rev抗原および変異Nef抗原の機能的な分析に関する情報を示す。合成コード配列は、例えば、MidlandCertifiedReagentCompanyMidland,Texasのような企業による、当該分野で公知の方法によって構築される。Gagポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されないの野生型コード配列に対して改善された発現を生じる。Gag含有ポリペプチドをコードするいくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、以下:である。同様に、本発明はまた、合成Envコードポリヌクレオチドおよび改変Envタンパク質であって、例えば、以下が挙げられる:得られた核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵されるように、Envのコドン使用法パターンを、Gagに関して上述したように改変した。本発明の支持において実施された実施例は、合成Env配列が、天然のEnv配列と比較して高いレベルのタンパク質を産生し得ることを示す。Envポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されないの野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。類似のPolポリペプチドコード配列Gagについて上述したものを含むが、種々の単離物からの改善された発現について得られ、改変され、そして試験され得る。Envのさらなる改変としては、その中に変異および/または欠失を有するEnvポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成することが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、超可変領域V1および/またはV2は、本明細書中に記載されるように欠失され得る。さらに、例えば、Env内の架橋シート領域および/またはN-グリコシル化部位に対する他の改変はまた、本明細書の教示に従って実施され得る。図2A~C、ならびにWO00/39303、WO00/39302、WO00/39304、WO02/04493を参照のこと。これらの改変の種々の組み合わせを使用して、本明細書中に記載されるような合成発現カセットを作製し得る。本発明はまた、合成Pol配列を含む発現カセットを含む。上記のように、Polは、ポリメラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素および/またはインテグラーゼを含有する配列を含むタンパク質-コード領域が挙げられるが、これらに限定されないWanら1996Biochem.J.316:569~573;Kohlら1988PNASUSA85:4686~4690;Krausslichら1988J.Virol.62:4393~4397;Coffin,RetroviridaeandtheirReplicationVirology,第1437~1500Raven,NewYork,1990;Patelら1995Biochemistry34:5351~5363。従って、本明細書中に例示される合成発現カセットは、1以上のこれらの領域、および生じるアミノ酸配列に対する1以上の変化を含む。Pol誘導体化ポリペプチドをコードする、いくつかの例示的なポリヌクレオチド配列は、表Cに示される。生じる核酸コード配列が、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵するように、Polのコドン使用法パターンを、GagおよびEnvに関して上述したように改変した。構築物は、種々の方法で改変され得る。例えば、この発現構築物は、インテグラーゼポリペプチドの最初の6アミノ酸をコードする配列を含み得る。この6アミノ酸領域は、HIVプロテアーゼによって認識される切断認識部位を提供すると考えられる例えば、McCornackら1997FEBSLetts414:84~88を参照のこと。構築物は、1つ以上の導入遺伝子の挿入のための、マルチクローニングサイトMCSを、代表的にはこの構築物の3’末端に含み得る。さらに、RTにおいて触媒中心から誘導された触媒中心エピトープをコードするカセットは、代表的に、インテグラーゼの6アミノ酸をコードする配列を3’末端に含んだ。このカセットは、RTのIle178~セリン191をコードし、そしてこの十分に保存された領域を、可能なCTLエピトープとして維持するために添加され得る。さらに、これらの構築物は、リーディングフレームを保存する挿入変位を含む例えば、Parkら1991J.Virol.65:5111を参照のこと。特定の実施形態において、RTの触媒中心および/またはプライマーグリップ領域が、改変される。RTの触媒中心およびプライマーグリップ領域は、例えば、Patelら1995Biochem.34:5351およびPalaniappanら1997J.Biol.Chem.27217:11157に記載されている。例えば、p66RTの183位~185位AF110975に対して番号付けられたにおいてアミノ酸YMDDをコードする野生型配列は、アミノ酸APをコードする配列と置換され得る。さらに、プライマーグリップ領域アミノ酸WMGY、p66RTの残基229~232AF110975に対して番号付けられたが、アミノ酸PIをコードする配列で置換され得る。Pol配列に対して、コドン使用法の変化は、代表的に、-1までのフレームシフトの領域に制限されており、そして再度、Gagリーディングフレームの末端において開始する;しかし、フレームシフト翻訳領域内の領域も同様に改変され得る。最後に、プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に位置する阻害すなわち、不安定性エレメントINSも同様に、変更され得る。本発明の支持によって実験を実施して、合成Pol配列がネイティブPol配列と比較してより高レベルのタンパク質を産生し得たことを示し得る。Polポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株および他の型の細胞であって、昆虫細胞が挙げられるがこれらに限定されないにおいて、野生型コード配列と比較して、改善された発現を生じる。類似のPolポリペプチドコード配列GagおよびEnvに関して上記したものを含むが、種々の単離物からの改善された発現について得られ、改変され、そして試験され得る。本発明はまた、Gag、EnvおよびPol以外のHIV遺伝子由来の合成配列を含有する、発現カセットを含み、これらには、Gag、Env、Pol内の領域、ならびに以下が挙げられるが、これらに限定されない:他の株から得られる配列は、本明細書の教示に従って同様の様式で製造され得る。上記のように、生じる核酸コード配列が、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されたコドン使用法に匹敵するように、Gag、EnvおよびPolに関して上述したように、コドン使用法パターンを改変した。代表的に、これらの合成配列は、ネイティブ配列と比較してより高度のレベルのタンパク質を産生し得、そして野生型ポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株および他の型の細胞株であって、昆虫細胞が挙げられるが、これに限定されないの野生型コード配列と比較して改善された発現を生じる。さらに、核酸配列もまた改変されて、遺伝子の1つ以上の領域に変異を導入し得、例えば、遺伝子産物の機能を変更し得例えば、その遺伝子産物を非機能的にし得る、そして/または改変部位例えば、Nefにおけるミリストイル化部位を排除し得る。本明細書中に例示される、HIVC型コード配列由来の合成発現カセットは、以下の合成ポリヌクレオチドの1以上を含む配列が挙げられるが、これらに限定されない:Gag-完全Gag-completeは、例えば、Gagおよびpolを含むインフレームポリタンパク質をいい、ここで、Gagのp6位が存在する。本発明のいくつかの局面において使用され得る、さらなる配列は、WO00/39302、WO00/39303、WO00/39304、WO02/04493に記載されている。2.2.2HIV核酸コード配列を含む配列のさらなる改変本明細書中に記載される、HIVポリペプチドコード発現カセットはまた、例えば、1つ以上の導入遺伝子をコードする、1つ以上のさらなる配列を含み得る。本発明の実施において有用なさらなる配列例えば、導入遺伝子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:さらなるウイルスエピトープ/抗原{HCV抗原例えば、E1、E2;Houghton,M..ら、米国特許第5,714,596号1998年2月3日発行;Houghton,M..ら、米国特許第5,712,088号1998年1月27日発行;Houghton,M..ら、米国特許第5,683,864号1997年11月4日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,728,520号1998年3月17日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,766,845号1998年6月16日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,670,152号1997年9月23日発行、HIV抗原例えば、1以上のHIV単離物由来のものを含むがこれらに限定されない}をコードするさらなる配列;および腫瘍抗原/エピトープをコードする配列。さらなる配列はまた、非ウイルス供給源に由来し得る例えば、インターロイキン-2IL-2、幹細胞因子SCF、インターロイキン3IL-3、インターロイキン6IL-6、インターロイキン12IL-12、G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、インターロイキン-1αIL-1I、インターロイキン-11IL-11、MIP-1I、腫瘍壊死因子TNF、白血病抑制因子LIF、c-kitリガンド、トロンボポエチンTPOおよびflt3リガンドのようなサイトカイン例えば、GenzymeFramingham,MA、GenentechSouthSanFrancisco,CA、AmgenThousandOaks,CA、RDSystemsandImmunexSeattle,WAのようないくつかの販売元から市販されているをコードする配列。さらなる配列は、以下に記載されている。また、Gagおよび他のコード配列の、互いに対する向きのバリエーションは、以下に記載されている。HIVポリペプチドコード配列は、他のHIV単離物から得られ得る。例えば、Myersら、LosAlamosDatabase,LosAlamosNationalLaboratory,LosAlamos,NewMexico1992;Myersら、HumanRetrovirusesandAids,1997,LosAlamos,NewMexico:LosAlamosNationalLaboratoryを参照のこと。合成発現カセットは、このようなコード配列を出発物質として使用して、本明細書の教示に従って、作製され得る。さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書中に開示される合成発現カセット配列によってコードされるポリペプチドに対して、85より大きい配列同一性、好ましくは90より大きい配列同一性、より好ましくは95より大きい配列同一性、そして最も好ましくは98より大きい配列同一性を有する、関連するポリペプチド配列を含む。例示の発現カセットおよび改変体は、実施例1に記載される。2.2.3HIV-1ポリペプチドおよび関連するポリペプチドをコードする、合成配列の発現本発明の合成HIVコード配列発現カセットは、発現のレベルを評価するため、およびGag含有構築物の場合には、VLPの産生を評価するために、多数の異なる発現ベクターにクローニングされ得る。HIVポリペプチドに対する合成DNAフラグメントは、真核生物発現ベクター一過性発現ベクター、CMVプロモーターに基づく哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系において使用するためのシャトルベクターが挙げられるにクローニングされ得る。対応する野生型配列もまた、同じベクターにクローニングされ得る。次いで、これらのベクターは、いくつかの異なる細胞型種々の哺乳動物細胞株293、RD、COS-7、およびCHO、例えば、A.T.C.C.から入手可能な細胞株が挙げられるにトランスフェクトされ得る。次いで、細胞株は、適切な条件下で培養され、そして任意の適切なポリペプチド産物のレベルが、上清中で評価され得る表Aを参照のこと。例えば、p24は、Gag発現を評価するために使用され得る;gp160、gp140またはgp120は、Env発現を評価するために使用され得る;p6polは、Pol発現を評価するために使用され得る;protは、プロテアーゼを評価するために使用され得る;p15は、RNAseHを評価するために使用され得る;p31は、インテグラーゼを評価するために使用され得る;そして他の適切なポリペプチドは、Vif、Vpr、Tat、Rev、VpuおよびNefを評価するために使用され得る。さらに、改変されたポリペプチドがまた使用され得、例えば、他のEnvポリペプチドとしては、例えば、ネイティブgp160、オリゴマーgp140、モノマーgp120、ならびにこれらのポリペプチドの改変配列および/または合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成HIVポリペプチドコード配列の発現が、対応する野生型配列より有意に高いことを実証する。さらに、ウエスタンブロット分析を使用して、合成発現カセットを含む細胞が、ネイティブ発現カセットを含む細胞より高い細胞あたりの濃度で、予測されたタンパク質を産生することを示し得る。HIVタンパク質は、細胞溶解物と上清との両方において見られ得る。本発明の合成発現カセットでトランスフェクトされた細胞については、産生のレベルは、細胞上清において有意により高い。合成発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清画分を使用して、これらのカセットが、野生型配列と比較して、HIVタンパク質の優れた産生そしてGagの場合には、VLPの産生を提供することを示し得る。これらのHIV含有ポリペプチドの、哺乳動物細胞株における効率的な発現は、以下の利点を提供する:ポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない;FDAによって認可された、確立された方法による産生;増加した純度;より高い収率ネイティブコード配列と比較して;およびCHO細胞におけるSubHIV含有ポリペプチドの産生これは、本発明の構築物を使用して得られる増加した発現の非存在下では実行不可能であるの新規方法。例示的な哺乳動物細胞株としては、BHK、VERO、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/クローン8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、およびCEMX174このような細胞株は、例えば、A.T.C.C.から入手可能であるが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の合成Gag発現カセットはまた、昆虫細胞にトランスフェクトされる場合に、高レベルの発現およびVLP産生を示す。本明細書中に記載される合成発現カセットはまた、昆虫細胞において高レベルの発現を示す。さらに、より高い全タンパク質収率に加えて、合成ポリペプチドからの最終生成物は、一貫して、ネイティブの配列からの最終生成物より低い量の夾雑バキュロウイルスタンパク質を含む。さらに、本発明の合成発現カセットはまた、酵母ベクターに導入され得、このベクターは次に、酵母細胞Saccharomycescerevisea;Rosenberg,S.およびTekamp-Olson,P.,米国再発行特許発明第35,749号1998年3月17日発行に記載されるようなベクターを使用するに形質転換され得、そして酵母細胞によって効率的に発現され得る。哺乳動物ベクターおよび昆虫ベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、選択された発現制御エレメントを使用して、種々の発現ベクターに組み込まれ得る。任意の所定の細胞型に適切なベクターおよび制御エレメントは、本明細書の教示、および発現ベクターについて当該分野において公知の情報を考慮して、当業者によって選択され得る。例えば、合成発現カセットは、所望のコード配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクターに挿入され得、これによって、選択された細胞型における遺伝子の発現が可能となる。例えば、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター例えば、CMV前初期プロモーターCMVプロモーターはイントロンAを含み得る、RSV、HIV-Ltr、マウス乳腺癌ウイルスLTRプロモーターMMLV-1tr、アデノウイルスの主要後期プロモーターAdMLP、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターもまた、哺乳動物発現のために用途を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終止コドンに対して3’に位置する。好ましくは、翻訳の開始の最適化のための配列もまた存在し、コード配列に対して5’に位置する。転写終結シグナル/ポリアデニル化シグナルの例としては、Sambrookら、前出に記載されるようなSV40由来のシグナル、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むイントロンもまた、本発明と共に使用するための構築物中に設計され得るChapmanら,Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986。エンハンサーエレメントもまた、本明細書中において使用されて、哺乳動物構築物の発現レベルを増加させ得る。例としては、Dijkemaら,EMBOJ.19854:761に記載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、Gormanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1982b79:6777に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復LTR由来のエンハンサー/プロモーター、およびBoshartら,Cell198541:521に記載されるようなヒトCMV由来のエレメント例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントChapmanら,Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986が挙げられる。所望の合成ポリペプチドをコードする配列は、多数の市販のベクターにクローニングされて、このポリペプチドの、適切な宿主系における発現を生じさせ得る。これらの系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:バキュロウイルス発現{Reilly,P.R.ら,BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTORS:ALABORATORYMANUAL1992;Beamesら,Biotechniques11:3781991;Pharmingen;Clontech,PaloAlto,CA}、ワクシニア発現{Earl,P.L.ら,ExpressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaCurrentProtocolsinMolecularBiology.F.M.Ausubelら編,GreenePublishingAssociatesWileyInterscience,NewYork1991;Moss,B.ら,米国特許第5,135,855号1992年8月4日発行}、細菌における発現{Ausubel,F.M.ら,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWileyandSons,Inc.,MediaPA;Clontech}、酵母における発現{Rosenberg,S.およびTekamp-Olson,P.,米国再発行特許発明第35,749号1998年3月17日発行;Shuster,J.R.,米国特許第5,629,203号1997年5月13日発行;Gellissen,G.ら,AntonieVanLeeuwenhoek,621-2:79-931992;Romanos,M.A.ら,Yeast86:423-4881992;Goeddel,D.V.,MethodsinEnzymology1851990;Guthrie,C.,およびG.R.Fink,MethodsinEnzymology1941991}、哺乳動物細胞における発現{Clontech;Gibco-BRL,GroundIsland,NY;例えば、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株Haynes,J.ら,Nuc.Acid.Res.11:687-7061983;1983,Lau,Y.F.ら,Mol.Cell.Biol.4:1469-14751984;Kaufman,R.J.,Selectionandcoamplificationofheterologousgenesinmammaliancells、MethodsinEnzymology,第185巻,537-566頁、AcademicPress,Inc.,SanDiegoCA1991}、および植物細胞における発現{植物クローニングベクター、ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,CA、およびPharmaciaLKBBiotechnology,Inc.,Pistcataway,NJ;Hood,E.ら,JBacteriol.168:1291-13011986;Nagel,R.ら,FEMSMicrobiol.Lett.67:3251990;Anら,BinaryVectors、およびPlantMolecularBiologyManualA3:1-191988;Miki,B.L.A.ら,249-265頁における他のもの、ならびにPlantDNAInfectiousAgentsHohn,T.ら編Springer-Verlag,Wien,Austria,1987;PlantMolecularBiology:EssentialTechniques,P.G.JonesおよびJ.M.Sutton,NewYork,J.Wiley,1997;Miglani,GurbachanDictionaryofPlantGeneticsandMolecularBiology,NewYork,FoodProductsPress,1998;Henry,R.J.,PracticalApplicationsofPlantMolecularBiology,NewYork,ChapmanHall,1997における他のもの}。本発明にはまた、コード配列、および適切な宿主におけるコード領域の発現を可能にする発現制御エレメントを含む発現ベクターが含まれる。これらの制御エレメントは、一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終止配列および転写終止配列、ならびにベクターに挿入物を導入するための挿入部位を含む。転写制御エレメントは、M.Kozakによって概説されている例えば、Kozak,M.,Mamm.Genome78:563-574,1996;Kozak,M.,Biochimie769:815-821,1994;Kozak,M.,JCellBiol1082:229-241,1989;Kozak,M.,およびShatkin,A.J.,MethodsEnzymol60:360-375,1979。酵母系における発現は、工業的生産の利点を有する。ワクシニアおよびCHO細胞株による組換えタンパク質の産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルスの発現は、以下を含むいくつかの利点を有する:iその広範な宿主範囲;ii組換えタンパク質の正確な転写後修飾、プロセシング、折り畳み、輸送、分泌および構築;iii比較的可溶性の組換えタンパク質の高レベルな発現;ならびにiv外来DNAに適合する大きな能力。合成HIVポリペプチドコード発現カセットから組換え的に発現されたポリペプチドは、典型的に、溶解された細胞および培養培地から単離される。精製は、当該分野で公知の方法塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分画およびアフィニティークロマトグラフィーを含むによって、実施され得る。免疫親和性クロマトグラフィーは、例えば、HIV抗原に基づいて作製された抗体を使用して、用いられ得る。哺乳動物細胞を使用して本発明のタンパク質を発現させる利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:産生のスケールアップのための十分に確立されたプロトコル;VLPを生成する能力;細胞株が優良製造プロセスGMP基準を満たすように適合されること;哺乳動物細胞の培養条件が当該分野で公知であること。合成HIV1ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されており、例えば、図を参照のこと。本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の様々な形態は、組み合わされてもよい。例示的な発現アッセイが実施例2に記載される。ウエスタンブロット分析についての例示的な条件は、実施例3に示される。2.3.0ウイルス様粒子の生成およびパッケージング細胞株を作製するための本発明の構築物の使用ヒト免疫不全ウイルス1型HIV-1の群特異的抗原Gagは、発芽によって種々の真核生物細胞から放出される非感染性ウイルス様粒子VLPに自己構築するFreed,E.O.,Virology251:1-15,1998による総説。本発明のGag含有合成発現カセットは、種々の異なる細胞型哺乳動物細胞が挙げられるが、これに限定されないを使用するHIV-Gagウイルス様粒子VLPの生成を提供する。ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対する、この粒子に捕捉または結合された抗原の適切な提示のためのマトリクスとして、使用され得る。2.3.1本発明の合成発現カセットを使用するVLP生成本発明のGag含有合成発現カセットは、ネイティブのGagコード配列と比較して、Gagタンパク質およびVLPの両方の優れた生成を提供し得る。さらに、VLP生成の電子顕微鏡評価を使用して、推定サイズの遊離の発芽している未成熟ウイルス粒子は、この合成発現カセットを含む細胞によって生成されることが示され得る。ウイルス様粒子の生成のために、ネイティブのGagコード配列ではなく、本発明の合成発現カセットを使用することは、いくつかの利点を提供する。第1に、VLPは、増大した量で生成され得、これによりこのVLPの単離および精製がより容易になり得る。第2に、VLPは、この合成発現カセットを使用して種々の細胞型で生成され得、特に、哺乳動物細胞株例えば、CHO細胞は、VLP生成のために使用され得る。CHO細胞を使用する生成は、以下を提供する:iVLP形成;ii正確なミリストイル化および発芽;iii非哺乳動物細胞混入物例えば、昆虫ウイルスおよび/または細胞の非存在;およびiv精製の容易さ。本発明の合成発現カセットはまた、哺乳動物細胞株以外の細胞型における発現を増大するために有用である。例えば、この合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターで昆虫細胞を感染することにより、高レベルのGagタンパク質の全収率およびより高いレベルのVLP生成が生じる野生型コード配列と比較して。さらに、バキュロウイルスGag合成発現カセットに感染した昆虫由来の最終産物は、野生型コード配列を使用した場合の最終産物より少ない量の混入昆虫タンパク質を一貫して含む。VLPは、目的の粒子形成ポリペプチドが適切な宿主細胞において組換え発現される場合に、自然に形成され得る。従って、本発明の合成発現カセットを使用して生成されるVLPは、組換え技術を使用して簡便に調製される。下記のように、本発明のGagポリペプチドコード合成発現カセットは、目的の他のポリペプチドコード配列例えば、HIVプロテアーゼ、HIVポリメラーゼ、Env;合成Envを含み得る。このような合成発現カセットの発現は、Gagポリペプチドを含むVLPならびに目的のポリペプチドを生じる。一旦、所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が単離または合成されると、これらのコード配列は、発現に適切な任意のベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが、当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択が可能である。一般的には、Sambrookら前出を参照のこと。次いで、このベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な組換え発現系としては、細菌発現系、哺乳動物発現系、バキュロウイルス/昆虫発現系、ワクシニア発現系、セムリキ森林熱ウイルスSFV発現系、アルファウイルス例えば、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎VEEウイルス発現系、哺乳動物発現系、酵母発現系およびゼノプス発現系が挙げられるが、これらに限定されず、これらは当該分野で周知である。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株系、ワクシニア系、シンドビス系、真核生物に移植したlayeredベクター開始系。他の市販の脂質としては、DDAB/DOPEおよびDOTAP/DOPEBoerhingerが挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:4194-4198;DOTAP1,2-ビスオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンリポソームの合成の記載については、PCT公開第WO90/11092号を参照のこと。同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、AvantiPolarLipidsBirmingham,ALから容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルコリンDOPC、ジオレイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンDOPEが挙げられる。これらの材料はまた、DOTMA出発材料およびDOTAP出発材料と適切な比で混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。リポソームは、多層小胞MLV、小さな単層小胞SUV、または大きな単層小胞LUVを含み得る。種々のリポソーム-核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODSOFIMMUNOLOGY1983,第101巻,512頁~527頁;Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:4194-4198;Papahadjopoulosら、Biochim.Biophys.Acta1975394:483;Wilsonら、Cell197917:77;DeamerおよびBangham,Biochim.Biophys.Acta1976443:629;Ostroら、Biochem.Biophys.Res.Commun.197776:836;Fraleyら、Proc.Natl.Acad,Sci.USA197976:3348;EnochおよびStrittmatter,Proc.Natl.Acad.Sci.USA197976:145;Fraleyら、J.Biol.Chem.1980255:10431;SzokaおよびPapahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:145;ならびにSchaefer-Ridderら、Science1982215:166を参照のこと。DNAおよび/またはタンパク質抗原はまた、Papahadjopoulosら、Biochem.Biophys.Acta.1975394:483-491によって記載されるものに類似する渦巻型脂質組成物で送達され得る。米国特許第4,663,161号および同第4,871,488号もまた参照のこと。目的の合成発現カセットはまた、粒子状キャリアに被包され得るか、それに吸着され得るか、またはそれと結合され得る。このようなキャリアは、複数コピーの選択された抗原を免疫系に示し、局所的なリンパ節中で、抗原の捕捉および保持を促進する。粒子は、マクロファージによって食作用され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を強化し得る。粒子状キャリアの例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマーに由来するキャリアならびにポリラクチドおよびポリラクチド-コ-グリコリドPLGとして公知に由来する微粒子が挙げられる。例えば、Jefferyら、Pharm.Res.199310:362-368;McGeeJPら、JMicroencapsul.142:197-210,1997;O’HaganDTら、Vaccine112:149-54,1993を参照のこと。適切な微粒子はまた、荷電界面活性剤例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤の存在下で製造され、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する巨大粒子を得ることができる。例えば、アニオン性界面活性剤例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドCTABを用いて製造された巨大粒子すなわち、CTAB-PLG巨大粒子は、例えばDNAのような負に荷電した巨大粒子を吸着する。例えば、国際出願番号PCT/US99/17308を参照のこと。さらに、他の粒子状系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボでの送達のために使用され得る。例えば、ポリマー例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、およびこれらの分子の結合体は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、他の不溶性無機酸塩例えば、リン酸ストロンチウム、ケイ酸アルミニウムベントナイトおよびカオリンを含む、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどを使用する沈殿は、本方法に関する用途を見出す。遺伝子移入に有用な送達系の概説については、例えば、Felgner,P.L.,AdvancedDrugDeliveryReviews19905:163-187を参照のこと。ペプトイド1998年11月3日に発行された、Zuckerman,R.N.ら、米国特許第5,831,005号もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。さらに、粒子状キャリア例えば、金およびタングステンを使用する遺伝子銃を使用するbiolistic送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。粒子は、送達されるべき合成発現カセットでコーティングされ、遺伝子銃からのガンパワー放電を使用して、一般的に還元雰囲気下で高速度まで加速される。従って、このような技術の記載および有用な装置については、例えば、米国特許第4,945,050号;同第5,036,006号;同第5,100,792号;同第5,179,022号;同第5,371,015号;および同第5,478,744号を参照のこと。また、針無し注射系も使用され得るDavis,H.L.ら、Vaccine12:1503-1509,1994;Bioject,Inc.,Portland,OR。本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のための組成物中に処方される。これらの組成物は、予防的感染を予防するためまたは治療的感染後に疾患を治療するためのいずれかであり得る。この組成物は、治療有効量の目的の遺伝子を含み、それによって、ある量の抗原がインビボで産生され、その結果、免疫応答が抗原が投与される個体中で惹起される。正確な必要量は、他の因子の中でも、処置される被験体;処置される被験体の年齢および一般的状態;抗体を合成する被験体の能力;所望される保護の程度;処置される状態の重篤度;選択された特定の抗原およびその投与様式、に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、治療有効量は、慣用的な試行によって決定され得る、比較的広い範囲に入る。組成物は、一般的に、1つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル例えば、水、生理的食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどを含む。さらに、補助物質例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などは、このようなビヒクル中に存在し得る。核酸の取り込みおよび/または発現の特定の促進剤例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースが挙げられるがこれらに限定されないはまた、組成物中に含まれ得るかまたは同時投与され得る。一旦処方されると、本発明の処方物は、例えば、上記されるように被験体に直接投与され得るか、あるいは、例えば、上記される方法を使用して、被験体に由来する細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換された細胞を被験体に再移植するための方法は、当該分野で公知であり、そしてこれには、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクタミン媒介性トランスフェクションおよびLT-1媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド対応する抗原を含むかまたは含まないのリポソーム中での被包化、ならびにDNAの核への直接的微量注入が挙げられ得る。合成発現カセット組成物のインビボでの直接の送達は、一般的に、上記されるように、ウイルスベクターを使用してかまたは使用せずに、従来のシリンジまたは遺伝子銃例えば、Accell登録商標遺伝子送達系PowderJectTechnologies,Inc.,Oxford,Englandのいずれかを使用する注射によって達成される。この構築物は、皮下的、表皮的、皮内的、粘膜内的例えば、鼻内的、直腸的および膣的、腹腔内的、静脈内的、経口的または筋内的のいずれかで注射され得る。DNAの表皮細胞への送達は、特に好ましい。なぜならこの投与様式は、皮膚関連リンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエントにおけるDNAの一過性の存在を提供するからである。投与の他の様式としては、経口投与および肺投与、坐剤、針無し注射、経皮的transcutaneous適用および経皮的transdermal適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。核酸の投与は、ペプチドまたは他の物質の投与ともまた組み合わされ得る。例示的な免疫原性研究は、実施例4、5、6、9、10、11、および12において示される。2.4.2本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達1つの実施形態において、T細胞および関連する細胞型抗原提示細胞例えば、マクロファージ、単球、リンパ球、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞、およびこれらの前駆細胞を含むがこれらに限定されないは、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達に使用され得る。T細胞は、当業者に公知の種々の手順によって、末梢血リンパ球PBLから単離され得る。例えば、T細胞集団は、PBLの集団からアクセサリー細胞およびB細胞を除去することによって富化され得る。特に、T細胞富化は、抗MHCクラスIIモノクローナル抗体を使用する非T細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非T細胞の特定の集団を枯渇させるために使用され得る。例えば、抗Ig抗体分子は、B細胞を枯渇させるために使用され得、そして抗MacI抗体分子は、マクロファージを枯渇させるために使用され得る。T細胞は、当業者に公知の技術によって多くの異なる部分集団にさらに分画され得る。2つの主要な部分集団は、これらの細胞表面マーカーCD4およびCD8の差示的な発現に基づいて、単離され得る。例えば、上記のようなT細胞の富化の後、CD4細胞は、CD4に特異的な抗体を使用して富化され得るColiganら上述を参照のこと。抗体は、磁気ビーズのような固体支持体と結合され得る。逆に、CD8細胞は、CD4に特異的な抗体CD4細胞を除去するための使用によって濃縮され得るか、または固体支持体に結合されたCD8抗体の使用によって単離され得る。HIV-1感染患者由来のCD4リンパ球は、Wilsonら、1995J.Infect.Dis.172:88によって記載される形質導入の前または後に、エキソビボで増殖され得る。T細胞の精製の後、当業者に公知の種々の遺伝的改変の方法は、本明細書中に記載されるように構築された、非ウイルスベースの遺伝子移送ベクターまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクターを使用して実施され得る。例えば、1つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞に由来する培養物のベクター含有上清を用いて精製されたT細胞の導入を包含する。第2のアプローチは、精製されたT細胞との、照射された単層のベクター産生細胞の同時培養を包含する。第3のアプローチは、類似する同時培養アプローチを含むが、精製されたT細胞は、種々のサイトカインで前刺激され、そして照射されたベクター産生細胞との同時培養の前に48時間培養される。このような導入の前の前刺激は、効率的な遺伝子移入を増大させるNoltaら、1992Exp.Hematol.20:1065。増殖のためのこれらの培養物の刺激はまた、患者への再注入のための細胞集団の増加を提供する。同時培養の後、T細胞は、ベクター産生細胞単層から回収され、増殖され、そして液体窒素で凍結される。遺伝子移入ベクター本発明の1つ以上の合成発現カセット単離されたT細胞への送達のための適切な制御エレメントを伴うを含むは、公知の方法を使用して、そして本明細書の指針に従って、構築され得る。選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築において使用され得る。例えば、遺伝子移入ベクターで形質導入された哺乳動物細胞に、細胞傷害性剤に対する耐性を与えるマーカーが、使用され得る。細胞傷害性剤は、ネオマイシン、アミノ配糖体、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシン、ジスタマイシンA、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るが、これらに限定されない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIは、ネオマイシンアナログであるゲネチシンG418に対する耐性を付与する。T細胞はまた、少なくとも1種類の増殖因子を含有する培地において維持され得、その後選択される。種々の増殖因子は、当該分野で公知であり、これらは特定の細胞型の増殖を維持する。このような増殖因子の例は、サイトカインマイトジェン例えば、rIL-2、IL-10、IL-12、およびIL-15であり、これらは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の細胞型は、ホルモンヒト絨毛性ゴナドトロピンhCGおよびヒト成長ホルモンを含むのような他の増殖因子によって刺激される。特定の細胞集団に対する適切な増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。例えば、白血球例えば、分化した前駆細胞および幹細胞は、種々の増殖因子によって刺激される。より具体的には、活性化THおよび活性化マクロファージによって産生される、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、GM-CSF、M-CSF、およびG-CSFは、骨髄性幹細胞を刺激し、この骨髄性幹細胞は、次いで、多能性幹細胞、顆粒球-単球前駆細胞、好酸球前駆細胞、好塩基球前駆細胞、骨髄巨核球、および赤血球前駆細胞に分化する。分化は、GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-11、およびEPOのような増殖因子によって調節される。多能性幹細胞は、次いで、リンパ球幹細胞、骨髄間質細胞、T細胞前駆細胞、B細胞前駆細胞、胸腺細胞、TH細胞、TC細胞、およびB細胞に分化する。この分化は、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2、およびIL-5のような増殖因子によって調節される。顆粒球-単球前駆細胞は、単球、マクロファージ、および好中球に分化する。このような分化は、増殖因子であるGM-CSF、M-CSF、およびIL-8によって調節される。好酸球前駆細胞は、好酸球に分化する。このプロセスは、GM-CSFおよびIL-5によって調節される。好塩基球前駆細胞の肥満細胞および好塩基球への分化は、GM-CSF、IL-4、およびIL-9によって調節される。骨髄巨核球は、GM-CSF、EPO、およびIL-6に応答して、血小板を産生する。赤血球前駆細胞は、EPOに応答して赤血球に分化する。従って、CD-3結合因子による活性化の間、T細胞はまた、マイトジェン例えば、IL-2のようなサイトカインと接触され得る。特に好ましい実施形態において、IL-2は、約50~100μg/mlの濃度でT細胞の集団に添加される。CD-3結合因子を用いる活性化を、2~4日間実施し得る。いったん適切に活性化されると、T細胞へのベクターのトランスフェクションを可能にする条件下で、T細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって、T細胞は遺伝的に改変される。T細胞集団の細胞密度が約0.1×106と5×106との間、好ましくは約0.5×106と2×106との間である場合、遺伝的改変が実施される。多くの適切なウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入ベクターが、本明細書中で使用について記載されている。形質導入後に公知の技術を用いて、形質導入細胞を、非形質導入細胞から選択する。例えば、形質導入に用いられる遺伝子移入ベクターが細胞傷害性剤に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、細胞は適切な細胞傷害性剤に接触され得、これにより非形質導入細胞は、形質導入細胞から陰性に選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は特定の細胞表面マーカーに特異的な結合因子と接触され得、これにより、形質導入された細胞は、この集団から陽性に選択され得る。この選択工程はまた、蛍光活性化細胞分類FACS技術を包含し得例えば、FACSが使用され、特定の細胞表面マーカーを含む集団から細胞を選択する場合、またはこの選択工程は、標的細胞捕捉および/またはバックグラウンド除去のための回収可能な支持体としての、磁気的に応答性の粒子の使用を包含し得る。より好ましくは、形質導入細胞の陽性選択を、FACSセルソーター例えば、FACSVantageTMCellSorter、BectonDickinsonImmunocytometrySystems、SanJose、CAを用いて実施して、選択可能な細胞表面マーカーを発現する形質導入された細胞を分類および回収し得る。形質導入に続いて、細胞を、特定の細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体分子で染色する。それぞれの細胞に結合した抗体の量を、細胞を含有する液滴にセルソーターを通過させることによって測定し得る。染色された細胞を含む液滴に電磁気的電荷を与えることによって、形質導入細胞を他の細胞から分離し得る。次いで、陽性に選択された細胞を、滅菌回収容器内に回収する。これらの細胞分類手順を、例えば、FACSVantageTMTrainingManual項3-11~3-28および10-1~10-17を特に参照するに詳細に記載する。形質導入細胞の陽性選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁気的分離を用いて実施され得る。このような分離技術において、陽性に選択される細胞は、まず特異的結合因子例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬と接触される。次いで、細胞は、回収可能な粒子例えば、磁気的に応答性の粒子と接触される。この粒子は、陽性細胞に結合した特異的結合因子と結合する試薬と結合されている。次いで、細胞結合因子-粒子複合体を、非標識細胞と物理的に分離し得る例えば、磁場を用いて。磁気的に応答性の粒子を用いる場合、標識細胞は、磁場を用いて容器内に保持され得る一方、陰性細胞は除去される。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。選択された形質導入細胞におけるベクターの発現を、当業者に公知の多くのアッセイによって評価し得る。例えば、ウエスタンブロット分析またはノーザン分析を、目的の挿入ヌクレオチド配列の特性に依存して使用し得る。いったん発現が確立され、そして形質導入されたT細胞が選択された合成発現カセットの存在について試験されると、末梢血流を介した患者への注入の準備ができる。本発明は、初代哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変のためのキットを含む。このキットは代表的に、1以上の容器に含まれる少なくとも1つの選択マーカーおよび少なくとも1つの合成発現カセットをコードする遺伝子移入ベクター、付属の試薬またはハードウェア、およびキットの使用についての取扱説明書を含む。2.4.3.さらなる送達レジメン本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド例えば、発現カセットまたはポリペプチド上記のいずれかの方法によって送達されるはまた、他のDNA送達系および/またはタンパク質送達系と組み合わせて使用され得る。非限定的な例としては、これらの分子の同時投与例えば、1以上の分子がプライム工程で送達され、その後1以上の分子がブースト工程によって送達される、プライム-ブースト法が挙げられる。特定の実施形態において、1以上の核酸含有組成物の送達の後に、1以上の核酸含有組成物および/または1以上のポリペプチド含有組成物例えば、HIV抗原を含むポリペプチドが送達される。他の実施形態において、同じかまたは異なる核酸分子の複数の核酸プライマーの後に、同じかまたは異なるポリペプチドの複数のポリペプチドブーストが送達され得る。他の例としては、複数の核酸投与および複数のポリペプチド投与が挙げられる。同時投与を含む任意の方法において、種々の組成物は、任意の順序で送達され得る。従って、複数の異なる組成物または分子の送達を含む実施形態において、これらの核酸は、ポリペプチドよりも前に全てが送達される必要はない。例えば、プライミング工程は、1つ以上のポリペプチドの送達を含み得、そしてブースト工程は、1つ以上の核酸および/または1つ以上のポリペプチドの送達を含む。複数のポリペプチドが投与され、その後、複数の核酸が投与され得るか、またはポリペプチドおよび核酸の投与が任意の順序で実施され得る。本明細書中に記載される任意の実施形態において、核酸分子は、ポリペプチドの全てまたはいくつかをコードし得るか、あるいは全くコードしなくてもよい。従って、本明細書中に記載される1つ以上の核酸分子例えば、発現カセットおよび/または本明細書中に記載される1つ以上のポリペプチドは、任意の順序で、かつ任意の投与経路で同時投与され得る。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの任意の組み合わせが、免疫反応を誘発するために使用され得る。3.0改善されたHIV-1Gag発現カセットおよびPol発現カセットいずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。世界保健機構WHOは、HIV-1に感染した世界中の人の数が、3610万人を超えると概算した。従って、安全かつ有効なHIVワクチンの開発が、現時点で不可欠である。最近の研究により、感染患者においてHIV-1複製を制御することにおけるCTLの重要性が実証された。さらに、複数のHIV抗原とのCTL反応性は、ウイルス複製の有効な制御に必要である。本発明を支持して実施された実験は、中和抗体の誘導のためのEnvに加えて、HIV-1GagおよびPolをワクチンに含めることが有用であることを示唆する。HIV-1ワクチン候補の効力を増大させるため、Gag単独またはGagPolのいずれかについて、コドン改変されたGag発現カセットおよびPol発現カセットを設計した。発現および効力における潜在的な差異を評価するために、これらの構築物の発現を分析し、そして免疫原性研究をマウスにおいて実施した。GagおよびPolをコードするいくつかの発現カセットを設計した。このカセットとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:Gagプロテアーゼ、フレームシフトしたGagPolΔインテグラーゼgagFSpolおよびインフレームのGagPolΔインテグラーゼgagpol。減弱Attまたは非機能的プロテアーゼInaを有する、インフレームのGagPolΔインテグラーゼのバージョンもまた設計した。これらの核酸配列を、高度に発現されるヒト遺伝子のコドン用法に対応するようにコドン改変した。マウスを滴定したDNA用量で免疫し、そして体液性免疫応答および細胞性免疫応答をELISAおよび細胞内サイトカイン染色によって評価した実施例10。マウスにおける免疫応答は、インビトロでの相対的発現レベルと相関することが観察されている。アカゲザルにおけるワクチン研究は、インビボでの免疫応答および発現レベルをさらに扱う。4.0HIVに対する強力な中和抗体および細胞性免疫応答の誘導のための増強されたワクチン技術いずれの特定のモデルにも理論にも仮説にも拘束されることを望まないが、以下の情報は、本発明のより完全な理解を提供するために示される。HIV感染に対する保護は、おそらく、ウイルスチャレンジに曝露された、ワクチン接種された個体中に予め存在する、強力かつ広く反応性の中和抗体を必要とする。細胞性免疫応答は、感染した個体におけるウイルス血症を制御するために所望されるが、感染に対する保護は、これらの応答の誘導に排他的に依存するワクチンアプローチについては実証されていない。この理由のために、本発明を支持して実施された実験は、初代HIV単離体例えば、R5サブタイプBHIV-1SF162株およびサブタイプCHIV-1TVI株由来の新規V欠失エンベロープ抗原を使用する、プライム-ブーストアプローチを使用する。これらの抗原を、増強されたDNA[ポリアクチドpolyactideco-グリコリドPLG微粒子処方物もしくはエレクトロポレーション]またはアルファウイルスレプリコン粒子ベースのワクチンアプローチ、その後のMF59アジュバント中のEnvタンパク質でのブースター免疫によって送達した。電気的透過化による、プラスミドにコードされた遺伝子のインビボの効果的な発現が記載されている例えば、Zucchelliら2000J.Virol.74:11598-11607;Bangaら1998TrendsBiotechnol.10:408-412;Hellerら1996FebsLett.389:225-228;Mathiesenら、1999GeneTher.4:508-514;Mirら1999Proc.Nat’lAcadSci.USA8:4262-4267;Nishiら1996CancerRes.5:1050-1055を参照のこと。SF126株由来のネイティブおよびV欠失の両方のモノマー性形態gp120およびオリゴマー性形態o-gp140のタンパク質を、ブースターとして試験した。全てのタンパク質調製物を高度に精製し、そして生物物理学的方法論および免疫化学的方法論によって広範に特徴付けた。ウサギおよび霊長類の免疫原性研究の結果は、中和抗体応答は、親の非V2欠失SF162ウイルスに対して構成的に誘導され得るが、異種HIV株に対する応答の誘導は、この免疫原のV2ループの欠失によって改善されたことを示した。さらに、これらのプライム-ブーストワクチンレジメンを使用して、強力なHIV抗原特異的CD4T細胞応答およびCD8T細胞応答もまた実証した。これらの知見に基づいて、V2欠失エンベロープDNAおよびタンパク質のワクチンを、臨床的評価に進めるために選択した。免疫と類似のアプローチを、例えば、対応するHIV由来ポリペプチドブーストまたは異種のHIV由来ポリペプチドブーストと組み合わせて本発明の合成HIVポリヌクレオチドを使用する核酸免疫を用いて、使用し得る。本発明のこの局面の1実施形態を、以下に一般的に記載し得る。抗原を、ワクチン組成物のために選択する。Envポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第一の抗原性組成物において使用する。さらに、Gagポリペプチドを、代表的に、免疫応答を誘導するために使用される第二の抗原性組成物において使用する。この第二の抗原性組成物は、HIV由来のポリペプチド配列Pol配列、Tat配列、Rev配列、Nef配列、Vif配列、Vpr配列および/またはVpu配列を含むが、これらに限定されないをさらに含み得る。DNAプライムワクチン接種を、代表的に、第一および第二の抗原性組成物を用いて実施する。1以上の抗原性組成物を用いるさらなるDNAワクチン接種もまた、選択された時間間隔で含まれ得る。このプライムの後に、代表的に、少なくとも1回のブーストが行われる。このブーストとしては、例えば、アジュバント化adjuvantしたHIV由来のポリペプチド例えば、DNAワクチン接種のために使用されるDNAに対応する、ウイルスベクターによってコードされる、HIV由来ポリペプチド例えば、DNAワクチン接種のために使用されるDNAに対応するのコード配列、さらなるワクチン接種および/または上記の組み合わせが挙げられ得る。1実施形態において、DNAプライムは、第一の抗原性組成物例えば、エンベロープポリペプチドをコードするDNA構築物および第二の抗原性組成物例えば、Gagポリペプチド、Polポリペプチド、Tatポリペプチド、NefポリペプチドおよびRevポリペプチドをコードするDNA構築物と共に投与される。プライムにおいて使用するためのDNA構築物は、例えば、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み得る。このDNAプライムの後に、ブースト例えば、アジュバント化したエンベロープポリペプチドブーストおよびウイルスベクターブーストここで、このウイルスベクターは、例えば、Gagポリペプチド、Polポリペプチド、Tatポリペプチド、NefポリペプチドおよびRevポリペプチドをコードするが行われる。あるいはまたはさらに、このブーストは、アジュバント化したGagポリペプチド、Polポリペプチド、Tatポリペプチド、NefポリペプチドおよびRevポリペプチドのブースト、ならびにウイルスベクターブーストここで、ウイルスベクターは、例えば、エンベロープポリペプチドをコードするであり得る。このブーストは、DNAプライムにコードされた全てのポリペプチド抗原を含み得るが;これは必須でない。さらに、異なるポリペプチド抗原を、最初のワクチン接種に対してブーストにおいて使用し得るが、逆もまた行われ得る。さらに、最初のワクチン接種は、DNA構築物ではなくウイルスベクターであり得る。HIVエンベロープワクチン設計において考慮され得るいくつかの因子は、以下のとおりである。エンベロープベースのワクチンは、非ヒト霊長類モデルにおいて、感染に対する保護を実証している。受動的抗体研究は、ウイルスチャレンジストックに対して、中和抗体の存在下でHIV感染に対する保護を実証している。Envを排除するワクチンは、一般に、より低い保護効力を付与する。本発明を支持して実施された実験は、SF2lab株由来のモノマー性gp120タンパク質が、HIV-1lab株の中和および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供したことを実証している。ThaiEフィールド株由来の初代gp120タンパク質は、サブタイプ交差的なcross-subtypelab株の中和を提供した。初代サブタイプBオリゴマー性o-gp140タンパク質は、サブタイプB初代フィールド単離体の部分的中和を提供した。初代サブタイプBのo-gp140ΔV2DNAプライムタンパク質ブーストは、多様なサブタイプB初代単離体の強力な中和、および霊長類モデルにおけるウイルスチャレンジに対する保護を提供した。初代サブタイプCのo-gp140およびo-gp140ΔV2は、おそらく、サブタイプBについて記載された結果と類似の結果を提供する。強力で広範に反応性である中和抗体の誘導のためのワクチンストラテジーは、保存された中和エピトープを露出するエンベロープポリペプチド構造例えば、可変領域の欠失および脱グリコシル化、エンベロープタンパク質-レセプター複合体、結晶構造に基づく合理的設計例えば、β-シート欠失ならびにgp-41融合ドメインベースの免疫原の構築によって補助され得る。エンベロープタンパク質産生のための安定なCHO細胞株が、最適化したエンベロープポリペプチドコード配列gp120、o-gp140、gp120ΔV2、o-gp140ΔV2、gp120ΔV1V2、o-gp140ΔV1V2が挙げられるが、これらに限定されないを使用して開発されている。さらに、以下のプライム-ブーストレジメン例えば、上記のレジメンは、感染した被験体におけるウイルス負荷を低減すること、そしておそらくHIV関連疾患の進行を未処置の被験体と比較して遅延または予防することを助けるために有利なようである。例示的な抗原性組成物および免疫原性研究を、実施例9、10、11および12に示す。実験本発明を実施するための特定の実施形態の例を以下に示す。これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。使用される数値例えば、量、温度などに関する正確性を確証するための努力が成されているが、ある程度の実験的誤差および偏差が、当然、許容されるべきである。実施例1合成発現カセットの作製A.合成ポリヌクレオチドの作製本発明のポリヌクレオチド配列を、その遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。以下の工程の順序は、変化し得る。第1に、HIV-1のコドン用法パターンを、得られる核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。HIVコドン用法は、高含有量のヌクレオチドAまたはTのコドントリプレットを反映する。HIV-1コドン用法の効果は、DNA配列における高いAT含有量であり、これにより、RNAのAU含有量が高くなり、mRNAの翻訳能力が減少し、不安定になる。対照的に、高度に発現するヒトコドンは、ヌクレオチドGまたはCを好む。野生型配列を、高度に発現するヒト遺伝子において見出されるコドン用法に適合するように改変した。第二に、いくつかの遺伝子についての非機能的改変体を作製した。以下の表表Bにおいて、いくつかのHIV遺伝子の活性に影響を与える変異を開示する。これらの変異のいくつかを含む構築物が、本明細書中に記載される。Vif、vprおよびvpuの合成構築物が記載される。関連する遺伝子産物の機能を低減または排除することは、本明細書の教示を考慮して、上記の表に示される教示を使用して達成され得る。本発明の1実施形態において、Gagポリメラーゼ配列の全長コード領域は、合成の最適化されたGag発現カセットによって発現されるウイルス様粒子についてのエピトープの数を増加させるために、合成Gag配列に含まれる。合成HIV-1Gagポリメラーゼは、構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて部分的に欠失した機能的酵素である逆転写酵素RTおよびインテグラーゼINTを発現するので、RT機能およびINT機能を不活化することが重要である。RTおよびINTのリーディングフレームにおけるいくつかのインフレーム欠失は、RT活性およびINT活性に関して、触媒的に非機能的な酵素を達成するために作製され得る。さらに選択されたB細胞エピトープおよび/またはT細胞エピトープが、RTコード配列またはINTコード配列の欠失の内側のGag-ポリメラーゼ構造に付加され、RTおよびINTの機能的改変により欠失される任意のエピトープと置き換えられ、そして増強され得る。代替的に、選択された、RTおよびINT由来のB細胞エピトープおよびT細胞エピトープCTLエピトープを含むは、上記で記載した合成Gagカセットまたは合成GagProtカセットの発現により形成される最小のVLP中に含まれ得る既知のHIVB細胞エピトープおよびT細胞エピトープについての記載については、HIVMolecularImmunologyDatabaseCTLSearchInterface;LosAlamosSequenceCompendia,1987~1997;Internetaddress:http://hiv-web.lanl.gov/immunology/index.html.を参照のこと。別の局面において、本発明はEnvコード配列を含み、このEnvコード配列は以下のHIV-コードポリペプチド:gp160、gp140、およびgp120例えば、HIV-1SF2SF2Envポリペプチドの記載については米国特許第5,792,459号を参照のことをコードするポリヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。これらのポリペプチド間の関連を、図3図中で:ポリペプチドは線で表わし、アミノ末端およびカルボキシ末端はgp160ライン上に示され;白丸はオリゴマー形成ドメインを表わし;白四角は膜貫通型架橋ドメインTMを表わし;そしてcは切断部位を表わし、gp140.mutにおいて、Xは、切断部位がすでに切断部位として機能しないよいうに改変されていることを示すに概略的に示す。このポリペプチドgp160は、gp120およびgp41のコード配列含む。このポリペプチドgp41は、オリゴマー形成ドメインODおよび膜貫通型架橋ドメインTMを含む、いくつかのドメインから構成される。天然のエンベロープにおいて、オリゴマー形成ドメインは、gp41トリマーおよびそれ自体との共有的な相互作用を介して、3つのgp41ポリペプチドがトリマー構造を形成するための非共有結合に必要とされ、gp120ポリペプチドはまた、トリマー構造内で組織化される。1つの切断部位は、およそgp120のポリペプチド配列とgp41に対応する配列ポリペプチド配列との間に存在する。この切断部位は、改変されて、その部位での切断を妨害し得る。生じたgp140配列ポリペプチドは、gp41の膜貫通型架橋ドメインが欠失している、gp160の短縮形態に一致する。このgp140ポリペプチドは、gp41内のオリゴマー形成ドメインの存在の利点により、単量体およびオリゴマー例えば、トリマーの両形態で存在し得る。切断部位が改変されて切断を防止し、そしてgp41の膜貫通部分が欠失している状況において、生じたポリペプチド生成物は、所望の変異gp140たとえば、gp140.mutである。当業者に明らかであるように、切断部位は、様々な方法で改変され得る。WO00/39302も参照のこと。野生型HIVコード配列例えば、Gag、Env、Pol、tat、rev、nef、vpr、vpu、vifなどをコードするは、既知のあらゆるHIV単離物から選択され得、そしてこれらの配列を操作して、本発明の教示に従うそれらの遺伝子産物の発現を最大にする。野生型コード領域は、おそらく以下の一つ以上の方法で改変される。1つの実施形態において、Env、特にV1および/またはV2の超可変領域をコードする配列が欠失された。他の実施形態において、改変は、例えば、Env内の切断部位をコードする配列中に誘導され、オリゴマーgp140が酵素的に切断されてgp120となるのを抑制する例えば、Earlら、1990PNASUSA87:648~652;Earlら、1991J.Virol.65:31~41を参照のこと。さらに他の実施形態において、超可変領域が欠失され、N-グリコシル化部位は除去され、そして/または切断部位が改変された。上記で記載したように、異なる改変が、異なる遺伝子のコード配列内に誘導され得る例えば、表Bを参照のこと。例えば、Tatコード配列は、本明細書の教示に従って改変され、例えば、遺伝子産物のトランス活性化ドメイン例えば、22位のグリシン残基とシステイン残基との置き換え、Caputoら、1996GeneTherapy3:235に影響を及ぼした。本発明の合成コード配列を作製するために、遺伝子カセットは目的の全コード配列を含むように設計される。合成遺伝子カセットは、オリゴヌクレオチド合成およびPCR増幅によって構築され、遺伝子フラグメントを生成する。プライマーは、サブクローニングに便利な制限部位を提供するように選択される。次いで、生じたフラグメントをライゲーションし、次いで、適切なベクターにクローニングされる所望の全配列を作製する。最終的な合成配列は、i制限エンドヌクレアーゼ消化および分析によってスクリーニングされ、ii所望の配列が得られることを確かめるためにDNA配列決定に供され、そしてiiiSDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより、発現タンパク質の同定および整合性を確認した。合成コード配列は、ChironCorp.Emeryville,CAでか、またはMidlandCertifiedReagentCompanyMidland,Texasにより構築される。本発明の合成配列に対する同一は、例えば、Smith-Waterman検索アルゴリズムTimeLogic,InclineVillage,NVを用いて、以下の模範的なパラメータ:重量マトリックス=nuc4×4hb;ギャップオープニングペナルティgapopeningpenalty=20、ギャップエクステンションペナルティgapextentionpenalty=5、報告義務のある閾値reportingthreshold=1;アライメント閾値alignmentthreshold=20で決定され得る。本発明の異なる実施形態例えば、構成の、様々な形態が合わせられ得る。本発明の合成ポリヌクレオチドの例示的な実施形態は、表Cに表される配列を含むが、これらに限定されない。B.本発明の合成ポリヌクレオチドを含む発現カセットの作製本発明の合成DNAフラグメントは、以下の発現ベクターにクローニングされる:一時的な発現アッセイおよびDNA免疫研究のためのpCMVKm2pCMVKm2は、pCMV6aChapmanら、Nuc.AcidsRes.199119:3979~3986から誘導され、そしてカナマイシン選択マーカー、ColE1複製起点、CMVプロモーターエンハンサーおよびイントロンA、次いで、下記に記載される合成配列のための挿入部位、次いで、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルを含む--pCMVKm2ベクターは、pCMV-linkを生成するためにポリリンカー部位がpCMVKm2に挿入されたという点においてのみ、pCMV-linkベクターとは異なる;チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞における発現のためのpESN2dhfrおよびpCMVPLEdhfrpCMVIIIとしても公知である;およびバキュロウイルス発現系において用いるためのpAcC13シャトルベクターpAcC13は、MunemitsuS.ら、MolCellBiol.1011:5977~5982、1990に記載されるpAcC12由来であった。これらのベクターの説明については、共有に係るWO00/39303、WO00/39302、WO00/39304、WO02/04493も参照のこと。簡単に、pCMVPLEdhfrpCMVIIIの構築を下記に示した。DHFRカセットを構築するために、EMCVIRES内部リボソーム侵入部位internalribosomeentrysiteリーダーを、pCite-4aNovagen、Inc.、Milwaukee、WIからPCR増幅し、そしてXba-NcoフラグメントとしてpET-23dNovagenInc.、Milwaukee、WIに挿入し、pET-EMCVを得た。dhfr遺伝子を、pESN2dhfrから増幅し、翻訳終止コドンに代わってGly-Gly-Gly-Serスペーサーを有する産物を得、そしてNco-BamH1フラグメントとして挿入され、pET-E-DHFRを得た。次に、弱められたneo遺伝子を、pSV2NeoClontech、PaloAlto、CA誘導体からPCR増幅し、そしてpET-E-DHFRの独自のBamH1部位に挿入し、pET-E-DHFR/Neom2を得た。次いで、pCDNA3Invitrogen、Inc.、Carlsbad、CA由来のウシ成長ホルモンターミネーターを、neo遺伝子の下流に挿入し、pET-E-DHFR/Neom2BGHtを得た。EMCV-dhfr/neo選択マーカーカセットフラグメントを、pET-E-DHFR/Neom2BGHtの切断により調製した。CMVエンハンサー/プロモーターイントロンAを、HindIII-SalIフラグメントとして、pCMV6aChapmanら、Nuc.AcidsRes199119:3979~3986からpUC19NewEnglandBiolabs、Inc.、Beverly、MAに移した。Nde1部位からSap1部位までを、pUC19のベクター骨格から欠失させた。上記に記載したDHFRカセットを、EMCVIRESがCMVプロモーターの次に来て最終構築体を作製るように、この構築物に加えた。このベクターはまた、ampr遺伝子およびSV40複製開始起点を含んだ。本発明の発現ベクターは、本明細書中に開示される例えば、図で示される一つより多いの合成コード配列を含む。発現カセットが1つ以上のコード配列を含む場合、コード配列はすべてインフレームであって、1つのポリタンパク質を生成し得るか;あるいは、1つより多いポリペプチドコード配列は、ポリシストロンのメッセージを含み得、ここで例えば、IRESは、それぞれのポリペプチドコード配列に対して、5’に位置する。実施例2合成コード配列についての発現アッセイ野生型配列は、合成HIV由来の配列がクローニングされるベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローニングされる。野生型任意の公知の単離体および対応する合成配列を有する様々なベクターについての発現効率を、以下のように評価する。いくつかの哺乳動物細胞株293、RD、COS-7、およびCHO;全てAmericanTypeCultureCollection、10801UniversityBoulevard、Manassas、VA20110-2209から入手される由来の細胞を、トランスフェクション試薬LT1PanVeraCorporation、545ScienceDr.、Madison、WI中の2μgのDNAを用いてトランスフェクトする。これらの細胞を、縮小reduced血清培地Opti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD中で5時間インキューベートする。次いで、培地を以下のように標準培地と入れ換える;293細胞IMDM10ウシ胎仔血清、2グルタミンBioWhittaker,Walkersvill,MD;RD細胞およびCOS-7細胞D-MEM、10ウシ胎仔血清、2グルタミンOpti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD;ならびにCHO細胞、Ham‘sF-12、10ウシ胎仔血清、2グルタミンOpti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD。これらの細胞を、48時間か60時間のいずれかの時間にわたりインキュベートする。上清を収集して、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過し、そして必要に応じて-20°Cで保存する。上清を、HIV抗原に対する適切なモノクローナル抗体例えば、HIVコア抗原に対するマウスモノクローナルでコーティングした96ウェルプレートを用いたCoulterp24-アッセイCoulterCorporation、Hialeah、FL、USを用いて評価する。最適なHIV抗原は、コーティングされたウェルに結合し、HIVに対するビオチン化抗体は、この結合した抗原を認識する。結合体化ストレプトアビジンstrepavidin-セイヨウワサビペルオキシダーゼはビオチンと反応する。ペルオキシダーゼとTMB基質との反応により、発色する。反応を、4NH2SO4の添加により停止させる。色の強度は、サンプル中のHIV抗原の量に、直接的に比例する。チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞をまた、製造業者の指導書に従って、MirusTransIT-LT1ポリアミントランスフェクション試薬PanVeraを用いて、本明細書中に記載される合成HIVポリペプチドをコードするプラスミドDNA例えば、pESN2dhfrまたはpCMVIIIベクター骨格でトランスフェクトし、そして96時間インキュベートする。96時間後、培地を選択培地250μg/mlのG418を含む特別なF12に換え、細胞を1:5に分け、さらに48時間インキュベートする。コロニーが形成されるときにコロニーの形成が開始するまで培地を5~7日ごとに入れ換え、96ウェルにプレートにプレートし、そしてCaptureELISAによりスクリーニングする。ポジティブクローンを24ウェルプレートに広げ、上に記載のように、CaptureELISAによってHIVタンパク質産生について数回スクリーニングする。24ウェルプレート内がコンフルーエンシーに達した後、ポジティブクローンをT25フラスコCorning、Corning、NYに広げる。コンフルーエンシー後、これらを数回スクリーニングし、ポジティブクローンをT75フラスコに広げる。ポジティブT75クローンをLN2中で凍結し、最も発現の高いクローンを、様々な濃度の0~5μMメトトレキセートMTXで増幅させ、100mm培養皿中にプレートする。プレートをコロニー形成についてスクリーニングし、そして全てのポジティブクローズドclosedを、上記に記載のように再び広げる。クローンを広げ、捕捉ELISAによって各工程で増幅およびスクリーニングする。ポジティブクローンを、各メトトレキセートレベルで凍結する。最も多く生成されるクローンを、より大きなバイオリアクターにスケールアップするように低血清懸濁培地条件に広げ、そして適応させるように、灌流バイオリアクター3L、100L中で増殖させる。本発明を支持して実施された実施例からのデータは、多様な細胞株において発現する場合、合成HIV発現カセットが、ネイティブの野生型配列に関連して、それらのタンパク質産物の生成の劇的な増加を提供し、そして、所望のHIVポリペプチドを発現する、安定ひトランスフェクトされたCHO細胞株が生成され得ることを示す。CHO細胞を用いたHIVポリペプチドの生成は、i正しいグリコシル化形パターンおよびタンパク質高次構造MAbのパネルへの結合により決定される場合;iiCD4レセプター分子への正しい結合;iii非哺乳動物細胞混入の非存在例えば、昆虫ウイルスおよび/または昆虫細胞;およびiv容易な精製を提供する。実施例3発現のウエスタンブロット分析本明細書中に記載されるHIV発現カセットをトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析を、共有に係るWO00/39302に記載されるように本質的に実施する。ヒト293細胞を、実施例2に記載されるように、ネイティブまたは合成のHIV発現カセットを含む、pCMV6のベースのベクターでトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクション後、60時間培養する。上澄みを記載したように調製する。細胞溶解物を、以下のように調製する。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、界面活性剤[0.1MTris-HClpH7.5中の1NP40SigmaChemicalCo.St.Louis、MO]で溶解し、そして溶解物を新しいチューブに移す。SDS-ポリアクリルアミドゲル前もって調製したpre-cast8~16;Novex、SanDiego、CAに、20μlの上清または12.5μlの細胞溶解液を充填する。タンパク質スタンダードもまた、充填する5μl、広いサイズ範囲のスタンダード;BioRadLaboratories、Hercules、CA。電気泳動を行い、BioRadTransferChamberBioRadLaboratories、Hercules、CAを用いて、製造業者Milliporeによって推奨される転写緩衝液を用いて、100ボルトで90分間、転写を実施し、タンパク質をImmobilonP膜MilliporeCorp.、Bedford、MAに転写させる。この膜を、HIV-1-ポジティブヒト患者血清にさらし、そしてo-フェニレンジアミンジヒドロクロリドOPD;Sigmaを用いて免疫染色する。イムノブロッティング分析の結果を用いて、合成HIV発現カセットを含む細胞が、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、1細胞当り高い濃度で、期待されるHIV-ポリペプチドを生成することを示す。実施例4合成HIV発現カセットのインビボ免疫原性A.免疫合成HIV発現カセットの免疫原性を評価するために、マウス研究を実施し得る。プラスミドDNA例えば、本発明の合成配列を含む発現カセットを有するpCMVKM2を、100μlの総注射容量において以下の最終濃度まで希釈する:20μg、2μg、0.2μgおよび0.02μg。希釈DNAの起こり得るネガティブな希釈効果を克服するために、各サンプル中の総DNA濃度を、ベクターpCMVKM2単独を使用して、20μgまで上昇させる。コントロールとして、ネイティブな対応するポリペプチドをコードする発現カセットを含むプラスミドDNAを、同様に扱う。4匹のBalb/cマウスCharlesRiver,Boston,MAの12群に、種々の投薬量を使用して筋肉内免疫する50μl/肢、前脛骨筋中に筋肉内注射。B.体液性免疫応答体液性免疫応答を、マウス血清の適切な抗HIV抗体ELISA酵素結合免疫吸着アッセイを用いて、免疫後0および4週目群5~12、そしてさらにそれぞれ免疫後6および8週目、2回目の免役後2および4週目群1~4に検査する。血清の抗体価を抗HIV抗体ELISAにより決定する。簡潔には、免役マウス由来の血清を、適切なHIVタンパク質例えば、GagについてはHIVp55に対する抗体についてスクリーニングした。ELISAマイクロタイタープレートを、1ウェルあたり0.2μgのHIVタンパク質で一晩コートし、4回洗浄する;続いて、ブロッキングを、PBS-0.2TweenSigmaで2時間行う。ブロッキング溶液の除去後、100μlの希釈マウス血清を加える。血清を1/25希釈で試験し、その後3倍系列希釈で試験する。マイクロタイタープレートを4回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG二次抗体Pierce,Rockford,ILとともにインキュベートする。ELISAプレートを洗浄し、そして100μlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;Pierceを1ウェルあたりに加えた。各ウェルの光学密度を15分後に測定する。報告した力価は、最大半値光学密度O.D.を与えた血清の希釈率の逆数である。プラスミド-DNAでのマウス免役の結果を使用して、合成発現カセットが、ネイティブな発現カセットと比較して、免疫原性の向上を提供することを示す。また、2回目のブースト免役は、2週間後に二次免役応答を誘導するグループ1~3。C.細胞性免役応答特異的細胞傷害性Tリンパ球CTLの頻度を、ペプチドをパルスしたBalb/cマウスCD4細胞の標準的なクロム放出アッセイにより評価する。HIVタンパク質発現ワクシニアウイルスに感染したCD-8細胞を、ポジティブコントロールとして使用するvv-タンパク質。簡潔には、脾臓細胞エフェクター細胞、Eを、上記のように免役したBALB/cマウスから得る。細胞を培養し、再刺激し、そして例えばDoe,B.およびWalker,C.M.,AIDA107:793-794,1996に記載されたGagペプチドでパルスした標的細胞に対するCTL活性についてアッセイする。細胞傷害活性を、標準的な51Cr放出アッセイにおいて測定する。標的T細胞をエフェクターE細胞とともに種々のE:T比で4時間培養し、そして複製ウェルからの平均cpmを使用して特異的51Cr放出を算出する。細胞傷害性T細胞CTL活性を、本明細書中で記載したHIVDNA構築物で免役したマウスから回収した脾細胞において測定する。DNA免役動物由来のエフェクター細胞は、CTL応答を示す、HIVペプチドでパルスしたSV-BALBMHCが一致した標的細胞の特異的溶解を示す。ペプチドでパルスされ、そしてMHCが一致しないマウス系統MC57に由来する標的細胞は、溶解されない。CTLアッセイの結果を使用して、DNA免役による、細胞傷害性Tリンパ球CTL応答の誘導についての合成HIV発現カセットの増加した効力を示す。実施例5合成HIV発現カセットのインビボ免疫原性A.一般的な免疫方法合成HIV発現カセットの免疫原性を評価するために、モルモット、ウサギ、マウス、マカクアカゲサル、およびヒヒを使用する研究を行う。研究を代表的には以下のように構築する:DNA免役単独単回または複数回;DNA免役に続いてタンパク質免役ブースト;DNA免役に続いてシンドビス粒子免役;シンドビス粒子単独による免役。B.モルモット実験を、以下のように、モルモットを使用して実施し得る。各6匹のモルモットを含む群を、0、4および12週目に、本明細書中に記載される1以上の配列を含む発現カセットをコードするプラスミドDNAで、筋肉内または粘膜にて免疫する。続いて、約18週目に、単一用量の、プラスミドブーストの配列によってコードされるHIVタンパク質および/または他のHIVタンパク質で、動物をブーストする筋肉内、皮内または粘膜。抗体力価相乗平均力価を、3回目のDNA免役の2週間後およびタンパク質ブーストの2週間後に測定する。これらの結果を使用して、免役応答の生成のための合成構築物の有用性、およびDNA免役後の免役応答を増強するためにタンパク質ブーストを提供することの利点を証明する。C.ウサギ実験を、以下のように、ウサギを使用して実施し得る。ウサギを、本明細書中に記載されるHIVタンパク質をコードするプラスミドDNAで、筋肉内、粘膜、または皮内にてBiojectニードルレスシリンジを使用して免疫する。核酸免役に、初回免役後のタンパク質ブーストが続く。代表的には、本発明の合成HIVポリペプチドコードポリヌクレオチドを含む構築物は、ウサギにおいて、高度に免疫原性であり、そしてわずか2回の免役後に実質的な抗原結合抗体応答を生成する。D.体液性免役応答任意の免役動物モデルにおいて、体液性免役応答を、免役動物由来の血清標本において、免役後の種々の時間で、抗HIV抗体ELISA酵素結合免役吸着アッセイを用いて検査する。血清の抗体力価を、上記のように抗HIV抗体ELISAによって決定する。簡潔には、免役動物由来の血清を、その動物を免疫するために使用したDNAおよび/またはポリペプチドによってコードされるHIVポリペプチド/タンパク質に対する抗体についてスクリーニングする。ELISAマイクロタイタープレートのウェルを、選択したHIVポリペプチド/タンパク質で一晩コートし、4回洗浄する;その後、ブロッキングを、PBS-0.2TweenSigmaで2時間行う。ブロッキング溶液の除去後、100μlの希釈マウス血清を加える。血清を、1/25希釈率で試験し、そしてその後3倍系列希釈により試験する。マイクロタイタープレートを4回洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG二次抗体Pierce,Rockford,ILとともにインキュベートする。ELISAプレートを洗浄し、そして100μlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;Pierceを1ウェルあたりに加えた。各ウェルの光学密度を15分後に測定する。力価を、最大半値光学密度O.D.を与えた血清希釈率の逆数として代表的に報告した細胞性免疫応答もまた評価し得る。実施例6本発明の合成HIVポリヌクレオチドを含む発現カセットを使用する、ヒヒおよびマカクアカゲサルのDNA免役A.ヒヒ4匹のヒヒを、本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクルを使用して、3回0、4および8週目、四頭筋への筋肉内にて両側性に、または粘膜にて免役する。各免役の2週間後に動物から採血し、そしてHIV抗体ELISAを単離した血漿で実施する。ELISAを、二次抗体結合体が、1:500の希釈率で使用される抗ヒトIgG、g-鎖特異的ペルオキシダーゼ結合体SigmaChemicalCo.,St.Louis,MD63178であることを除き、本質的には上記のように実施する。50μg/mlの酵母抽出物を、ヒヒの既存の酵母抗体に起因する非特異的バックグランドを低減させるために、血漿サンプルおよび抗体結合体の希釈物に加え得る。4回目の免役の2週間後14週目に、ヒヒにおいて、リンパ球増殖応答が観察され、そしてHIVポリペプチドでのブースト後44週目および76週目に実質的に増強される。このような増殖結果はT-ヘルパー細胞機能の誘導を示す。B.マカクアカゲサル本発明の合成コドン改変HIVポリペプチドコードポリヌクレオチドの向上した効力は、発現プラスミド中に構築される場合、マカクアカゲサルにおいて確証され得る。代表的には、マカクは、2または3回の1mg用量の改変HIVポリヌクレオチドの後、検出可能なHIV特異的CTLを有する。まとめると、これらの結果は、合成HIVDNAが非ヒト霊長類において免疫原性であることを証明する。中和抗体もまた検出され得る。実施例7モノシストロン性およびマルチシストロン性構築物の同時トランスフェクション本発明は、マルチ、モノシストロン性発現カセットでの同時トランスフェクション、ならびに1以上のマルチシストロン性発現カセットでの同時トランスフェクション、またはその組合せを包含する。このような構築物は、種々の組合せで、一過性トランスフェクション研究のために293T細胞中にトランスフェクトされ得る。例えば、二シストロン性bicistronic構築物が作製され得る。この構築物では、異なるHIVポリペプチドのためのコード配列が単一CMVプロモーターの制御下にあり、そして2つのコード配列の間に、IRESinternalribosomeentrysiteEMCVIRES;Kozak,M.,CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology2745:385-402,1992;Witherell,G.W.らVirology214:660-663,1995配列が、第1のHIVコード配列の後で第2のHIVコード配列の前に導入される。細胞培養物から集めた上清を、HIVタンパク質の存在について試験し、そして上清は、適切なタンパク質がトランスフェクト細胞において発現されることを示す例えば、Envコード配列が存在した場合、対応するEnvタンパク質が検出された;Gagコード配列が存在した場合、対応するGagタンパク質が検出された、など。これらの細胞株によるキメラVLPの産生は、電子顕微鏡分析を使用して決定され得る例えば、共有に係るWO00/39302を参照。実施例8HIV-1ワクチンの付属遺伝子成分:変異型Tat、RevおよびNefのC型抗原の機能分析HIV-1調節および付属遺伝子は、ウイルスの病原性における役割、高度に保存されたCTLエピトープの高い割合、およびウイルスのライフサイクルにおける早期の発現に起因して、HIVワクチンの成分として大きな注目を受けた。これらの遺伝子の様々な所望されない特性に起因して、ワクチン成分としてのそれらの安全性および安定性に関する疑問が生じる。本発明に支持して実行された実験は、効率的な発現および潜在的な有害な機能の不活性化について、候補HIV-1サブタイプCtat変異体、rev変異体およびnef変異体を分析した。他のHIVサブタイプの付属遺伝子は、同様に評価され得る。南アフリカHIV-1サブタイプCのコンセンサスなTatタンパク質、Revタンパク質およびNefタンパク質をコードする、配列改変された変異体tat遺伝子、rev遺伝子およびnef遺伝子は、重複合成オリゴヌクレオチドおよびPCRベースの部位特異的変異誘発を使用して構築された。それぞれのコンセンサス配列とよく似ている単離体の野生型遺伝子の構築物もまた、PCRによって作製した。構築物のインビトロ発現を、ウェスタンブロットによって分析した。Tat変異体のトランス活性化の活性およびRev変異体の核RNA輸送活性を、レポーター遺伝子ベースの機能的アッセイを使用した様々な細胞株のトランスフェクションの後に研究した。全ての構築物のインビトロでの発現を、Tat、RevまたはNef発現プラスミドを用いたマウスのDNAワクチン接種によって生成された抗原特異的マウス血清を使用して、ウェスタンブロットによって実証した。配列改変遺伝子の発現レベルは、野生型遺伝子よりも有意に高かった。サブタイプBTatcDNAおよびサブタイプCTatcDNAを、TatC22、TatC37およびTatC22/37を得るために変異させた。Tat活性は、3つの細胞株RD、HeLaおよび293においてアッセイする。サブタイプCコンセンサスなTatの背景において、C22での単一変異は、LTR依存CAT発現を不活性化するために不十分であった。対照的に、この活性は、単一変異C37または二重変異C22C37を使用して、RD細胞、293細胞およびHeLa細胞において有意に損なわれた表Bを参照のこと。一致する結果を、サブタイプB株由来のTat変異体から得た。例示的な結果を、293細胞中のLTR-CATプラスミドでのTat変異体のトランス活性化について図4に示す。3つの独立したアッセイを、各構築物で行った図4、説明文1、2、3。サブタイプCの構築物TatC22ProtRTTatRevNefおよびProtRTTatC22RevNefは、TatC22単独と比較した場合、減少したTat活性を示した。これは、おそらく融合タンパク質によって生じた構造の変化に起因する。Rev構築物について、機能の損失について試験するために、ネイティブなRevまたは変異したRevを含むレポータープラスミドを用いたCATアッセイを、使用した。図5に示されるように、野生型Revと比較すると、二重変異M5M10を有するサブタイプCRevのmRNA輸送機能は、有意に低かった表Bを参照のこと。バックグラウンドレベルは、偽mockデータおよびRevを含まないpDM128レポータープラスミドデータにおいて示される。2つの独立したアッセイを、各構築物について行った図5、説明文1、2。Nef特異的機能を測定するためのアッセイもまた行ったNef変異体は、表Bにおいて記載される。例えば、FACs分析を使用して、細胞表面上のMHC1およびCD4の存在を探す。細胞を、Nef発現の存在および不在コントロールため下で、ならびにネイティブなnefタンパク質および変異したnefタンパク質をコードする本発明の合成ポリヌクレオチドを使用してアッセイした。MHC1発現およびCD4発現の下方制御は、nef遺伝子産物が、機能的でないことを示すすなわち、nefが非機能的である場合、これらは下方制御でない。これらのデータは、tatDNA免疫原およびrevDNA免疫原の損なわれた機能が多成分HIV-1サブタイプCワクチンの一部を形成し得ることを実証する。他のグループによって以前に公開されたデータと対照的に、C22変異は、Tatのトランス活性化機能を有意に不活性化しなかった。C37変異は、サブタイプCTatタンパク質およびサブタイプBTatタンパク質の不活性化に必要であるようである。実施例9プラスミドをコードする様々なHIVポリペプチドの免疫原性の評価上記のように、本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチドまたは発現カセットの免疫原性を、容易に評価する。以下の表表Dは、ウサギ中で、エレクトロポレーションを使用して、独立して、そして混合サブタイプmixed-subtypeワクチンとしての両方でサブタイプBエンベローププラスミドおよびサブタイプCエンベローププラスミドの免疫原性の比較に関する例示的手順である。このような方法は、任意の他のHIVポリペプチドに等しく適用可能であることが明らかである。表DMF59Cアジュバントは、5スクアレン、0.5Tween80、0.5スパン85を含有する10mMクエン酸pH6のマイクロフルイダイズされたエマルションであり、10mLアリコート中で4°Cにて貯蔵される。免疫原を、様々なグループにおいて動物に投与するために、以下の表表Eに記載されるように調製する。濃度は、例えば、使用される配列および/またはタンパク質に起因して、表に記載される濃度から変化し得る。免疫化表Fおよび採血bleeding表Gスケジュールは、以下の通りである:実施例10GagおよびPol構築物でのマウス免疫化研究マウスにおいて、以下の構築物:Gag、GagプロテアーゼFSGP1、プロテアーゼ、コドン至適化およびINSの不活性化;GP2、プロテアーゼ、INSの不活性化のみ、フレームシフトを有するGagPolΔインテグラーゼgagFSpol、およびGagPolΔインテグラーゼインフレームGagPol図118を参照のことについて、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を評価した実施例4に実質的に記載される。弱力化プロテアーゼGagPolAttまたは非機能性プロテアーゼGagPolInaを有するGagPolΔインテグラーゼインフレームの変形もまた、設計した。インビトロ発現データは、Gag単独、GagプロテアーゼFS、GagFSpol、およびGagPolInaを使用した、p55Gagおよびp66RTの同等の発現を示した。完全に機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼGagPolまたはGagPolAttを備える構築物は、p55Gagおよびp66RTの発現において、おそらくプロテアーゼの細胞毒性効果に起因して有効性がより小さかった。pCMVベクター中のGag対GP1およびGag対GP2を使用したマウスのDNA免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時0週および4週間後に、マウスを免疫した。0週、4週、6週において、採血を実施した。使用したDNA用量は、以下のとおりであった:20μg、2μg、0.2μg、および0.02μg。pCMVベクター中のGag対gagFSpolを使用したマウスのDNA免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時0週に、マウスを免疫し、そして4週間後に、GagrVVgagをコードする組換えワクシニアウイルスでチャレンジした。0週および4週において、採血を実施した。使用したDNA用量は、以下のとおりであった:20μg、2μg、0.2μg、および0.02μg。pCMVベクター中のGag対gagFSpolおよびGag対gagpolを使用したマウスのDNA免疫化を、前脛骨筋において筋肉内に実施した。研究の開始時0週に、マウスを免疫し、そして4週間後に、GagrVVgagをコードする組換えワクシニアウイルスでチャレンジした。0週および4週において、採血を実施した。使用したDNA用量は、以下のとおりであった:2μg、0.2μg、0.02μgおよび0.002μg。Gagに対する細胞性免疫反応は、試験した全ての改変体について同等であった例えば、Gag、Gagプロテアーゼ、gagFSpolおよびGagPolInaはすべて、同等の有効性を有した。Gagに対する体液性免疫反応もまた、GP1および特にGP2を除いて同等であった。体液性免疫反応は、機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼを含む構築物において、より弱かった。このことは、過剰に活性なoveractiveプロテアーゼによって引き起こされるp55Gagのあまり有効でない分泌に起因し得る。インビトロ実験およびインビボ実験本発明の支持で実施したは、Gagの発現および免疫原性が全ての構築物で同等であることを示唆した。例外は、機能的なプロテアーゼまたは弱力化プロテアーゼを有するGagPolインフレームである。これは、プロテアーゼの細胞毒性の影響の結果であり得る。マウスにおける免疫反応は、インビボ発現の相対的レベルと相関した。実施例11C型由来エンベロープポリペプチドを使用したタンパク質発現、免疫原性、および中和抗体の産生南アフリカ人の個体から回収されたC亜型初代単離体、TV1に由来するエンベロープEnvワクチンを、以下のようにウサギで試験した。遺伝子カセットを、可変ループ領域、V2およびV1V2の欠失があるHIV-1エンベロープおよび欠失がないHIV-1エンベロープのポリタンパク質のgp120形態表面抗原、gp140形態表面抗原膜貫通タンパク質、gp41のエクトドメイン、および全長gp120gp41gp160形態を発現するように設計した。全ての遺伝子を配列改変して、Rev非依存様式での、コードされるEnv糖タンパク質の発現を増強し、そしてそれらを、続いて上記のDNAワクチンおよびタンパク質産生適用のためのpCMVベースのプラスミドベクターにクローニングした。この配列を、本明細書中に記載されるようにコドン至適化した。簡潔には、すべての改変エンベロープ遺伝子を、ChironpCMVlinkプラスミドベクターに好ましくは、EcoRI/XhoI部位にクローニングした。A.タンパク質発現TV1Env抗原の全長gp160、短縮gp140Envエクトドメインのみおよびgp120のネイティブ型を、本明細書中に記載される発現カセットから産生した。gp140をコードする配列を、293T細胞に一過性にトランスフェクトした。遺伝子産物の発現レベルを、組織内in-house抗原捕捉ELISAによって評価した。TV001c8.2、TV001c8.5およびTV002c12.1のネイティブ配列から構築したエンベロープ遺伝子は、インビトロで正確なタンパク質を発現した。gp140TV001c8.2が、最高レベルの発現を示した。さらに、TV1由来クローン8.2から発現されたEnvタンパク質が、CD4レセプタータンパク質に結合することこのことは、発現されたタンパク質のこの特性が、機能的配置で維持されていることを示すを見出した。発現されたTV1gp160タンパク質果のレセプター結合特性/機能性の結果もまた、細胞融合アッセイによって確認した。全発現は、合成gp140構築物について、ネイティブgp140遺伝子カセットと比較しておおよそ10倍に増加した。改変gp120改変体および改変gp140改変体の両方とも上清中に大量のタンパク質を分泌した。さらに、gp140のV2欠失型およびV1V2欠失型は、インタクトのgp140よりも、おおよそ2倍多いタンパク質を分泌した。概して、合成gp140遺伝子改変体の発現レベルは、ネイティブ配列を有するgp140遺伝子よりも10~26倍増加した。つまり、試験した各合成構築物は、ネイティブのコード配列を使用した構築物と比べて10倍より高い発現の増大したレベルを示した。さらに、全ての発現されたタンパク質は、推定された分子量のタンパク質であり、CD4に結合することが示された。安定なCHO細胞株を得、そして小規模タンパク質精製方法を使用して、ワクチン研究のためにこれらのタンパク質の少量の各非欠失オリゴマー形態およびV-欠失オリゴマー形態o-gp140を産生した。B.TV001ウイルス単離体およびTV002ウイルス単離体の中和特性一過性発現実験は、TV001ウイルス単離体およびTV002ウイルス単離体由来のエンベロープ遺伝子が所望のタンパク質産物を発現することを示した。これらの2つのウイルス株の、18人の感染した南アフリカ人B亜型およびC亜型からの血清を使用した相対的中和感度は、以下のとおりである。TV2株は、1:10血清希釈において、18血清中18血清で;1:50血清希釈において、18血清中16血清で;1:250血清希釈において、18血清中15血清で中和された。それに比べて、TV1単離体は、1:10血清希釈において、18血清中15血清で;1:50血清希釈において、18血清中6血清のみで中和され;そして1:250血清希釈において、いずれの試料によっても中和されなかった。さらに、TV001患者血清は、試験したすべての希釈で、TV002単離体に対する中和活性を示した。対照的に、TV002は、1:10血清希釈においてのみ、TV001の中和を示した。これらの結果は、TV001単離体が、感染した宿主において、TV002よりもより広範かつより強力な中和抗体反応を誘導し得ることを示唆する。C.ウサギ研究における改変TV1EnvDNAおよびタンパク質抗原の免疫原性TV1EnvDNA合成発現カセットを含むおよびタンパク質ワクチンを、下の表Hに示すように投与した。一群あたり4匹の、7群のウサギを、示したプラスミドDNAおよびオリゴマーのEnvタンパク質抗原で免疫した。3つの用量のDNA1免疫で1動物あたり1mgのDNAを、0週目、4週目、および20週目において針注射、続いてエレクトロポレーションにより筋肉内に投与した。20週目に、別の部位にMF59アジュバント中の単回用量のEnvタンパク質100μgを、筋肉内に与えた。DNA免疫には、C亜型配列改変遺伝子TV1--gp160、gp160dV2、gp160dV1V2、gp140、gp140dV2およびgp140dV1V2--ならびにB亜型SF162配列改変gp140dV2を使用した。DNA免疫を、0週目、4週目および20週目に針注射により、筋細胞および常在の抗原提示細胞のトランスフェクションを促進するためにエレクトロポレーションを使用して筋肉内経路によって実施した。20週目に、離れた部位に単回のEnvタンパク質追加免疫MF59アジュバント中でを、筋肉内注射により施した。各連続した免疫化に次いで、ELISAにより抗体価を評価した。0週目、4週目、6週目、8週目、12週目、22週目および24週目に、血清試料を回収した。血清抗体価を、ELISAで測定した。96ウエルプレートを、1μg/mlの濃度のタンパク質でコーティングした。血清サンプルを、連続的に3倍に希釈した。ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ結合体1:20,000を、検出に使用した。基質としてTMBを使用し、そして0.6OD450nmにおいて抗体価を、読み取った。PBMC-増殖R5HIV-1株に対する中和抗体反応を、2つの異なる研究所における2つの異なるアッセイChironにおける5.25レポーター細胞株ベースのアッセイおよびDuke大学におけるDavidMontefioriのPBMCベースのアッセイを使用して、免疫したマウスから回収した血清においてモニターした。結果を、図121、図122、および図123に示す。Chironアッセイを、基本的に以下のように実施した。PBMC-増殖C亜型TV001株およびPBMC-増殖C亜型TV002株に対する中和抗体反応を、5.25細胞株を用いる組織内レポーター細胞株アッセイを使用して測定した。この細胞は、その細胞膜上にCD4、CCR5、CXCR4およびBONZOレセプター/コレセプターを有する。親のparentalCEM細胞株は、急性リンパ芽球性白血病に罹患した4歳の白人のCaucasian女性に由来し、この細胞をヒトB細胞株721.174と融合して、CEMx174を作製した。CCR遺伝子約1.1kbを、pBABEpuroレトロウイルスベクターのBamH-I5’およびSal-I3’にクローニングし、それに次いでCEMx174に導入した後、LTR-GFPをこの細胞にトランスフェクトした。この細胞の緑色蛍光タンパク質GFPを、フローサイトメータFACScanによって検出した。ウイルス中和アッセイについて、50ulの力価決定したtitrateウイルスおよび50ulの希釈免疫血清または免疫前血清を、室温で1時間インキュベートした。24ウエルプレートにプレートした、104細胞/ml細胞を有するウエルに、この混合物を添加し、そして37°Cで5~7日間インキュベートした。次いで、この細胞を、PBSで洗浄した後、2ホルムアルデヒドで固定した。Cellquestソフトウエアを使用して、BectonDickinsonFACScanで各サンプルについて15,000事象細胞を収集した。示したデータは、3連のウエルの平均であった。以下の式:ウイルス阻害=ウイルスコントロール-実験/ウイルスコントロール-細胞コントロール×100、を使用して、ウイルスコントロールと比較して、中和を算出した。採血前に観察された任意のウイルス阻害を、各個々の動物について差し引いている。>50の値を陽性と見なし、グレーで強調する。図122において、は、動物が採血前血清において高いレベルのウイルス阻害>20ウイルス阻害観察した阻害の大きさ、およびいくつかの場合、有意な中和抗体活性<50阻害の存在について、血清が陽性であるか、または陰性であるかスコアする本発明者らの能力に影響するを有することを示す。図123に示すデータについて、単回のタンパク質の追加免疫の後3回目の後post-third回収した血清サンプルを、ウイルスで1:8希釈細胞添加後1:24において3連でスクリーニングした。示した値は、対応する採血前コントロールサンプルにおけるp24合成に対する、p24合成の減少である。0値は、陰性の値が測定されたか、または値が測定されなかったことを示す。NV、有効でないnotvalidは、免疫前血清におけるウイルス阻害に起因する。p24が、少なくとも80低減された場合、中和を陽性と見なす;これらのサンプルを、ダークグレーで強調する。より明るいグレーの陰影付けのサンプルは、p24の合成において少なくとも50の減少を示した。図119は、プレートをモノマーのgp120.TV1タンパク質でコートした際のELISAデータを示す。このタンパク質は、免疫に使用したC亜型遺伝子に相同である。全ての免疫群が、2回目のDNA免疫の後、高い抗体価を産生した。gp140形態のDNAで免疫した群は、1回目のDNA免疫および2回目のDNA免疫の両方の後、gp160形態を使用した群と比べて、相対的により高い幾何平均抗体価を有する。gp140.TV1およびgp140dV1V2.TV1遺伝子の両方は、2回目のDNAの2週後において高い抗体価約104を産生した;gp140dV2.TV1プラスミドは、この時点および他のすべての時点で抗体の最高の力価>104を得た。gp120.TV1タンパク質に対する結合抗体価は、相同のgp140dV2.TV1遺伝子で免疫した群において、約103の力価を示す、異種のgp140dV2.SF162遺伝子で免疫した群よりも高かった。2回目のDNA免疫の後、全ての群が、8週目までに抗体価におけるいくらかの下落を示した。20週でのDNAタンパク質追加免疫の後、全ての群が、2回目のDNA免疫の後に以前に観察した力価より高い力価に到達した0.5~1.0対数増加を観察した。タンパク質追加免疫の後、gp140dV2.TV1DNAまたはgp160dV2.TV1DNAのいずれかのよって初回抗原刺激された、o-gp140dV2.TV1タンパク質を受けた全ての動物は、最高の抗体価を示した。結合抗体価をまた、C亜型o-gp140dV2.TV1タンパク質またはB亜型o-gp140dV2.SF162タンパク質のいずれかでコートしたELISAプレートを使用して測定した図120。全てのTV1Env免疫化群について、オリゴマータンパク質、o-gp140dV2.TV1を使用して測定した抗体価は、モノマー非V2欠損失タンパク質、gp120.TV1を使用して測定した抗体価より高かった。実際、これらの群について、異種のB亜型o-gp140dV2.SF162タンパク質で観察した力価は、C亜型TV1gp120で測定された力価と同等であるか、またはそれよりも高かった。それにもかかわらず、C亜型抗原で免疫した全ての群は、B亜型gp140dV2.SF162に結合する力価よりも高い、C亜型gp140dV2.TV1タンパク質に結合する力価を示した。逆に、gp140dV2.SF162免疫原で免疫した群は、オリゴマーB亜型タンパク質での、そのC亜型対応物より高い抗体価を示した。概して、3つのアッセイすべては、高い抗体交差反応抗体が、C亜型TV1ベースのDNA免疫原およびタンパク質抗原によって産生されることを示した。これらの結果は、C亜型TV1由来のEnvDNA抗原およびタンパク質抗原が、免疫されたウサギにおいて高い力価の抗体を誘導する免疫原であること、ならびにB亜型R5ウイルス株およびC亜型R5ウイルス株の両方に対する中和抗体の実質的な証拠であることを示す。特に、gp140dV2.TV1抗原は、B亜型SF162EnvDV2株およびC亜型TV2に株対する一貫した中和反応を誘導している。従って、TV1ベースのEnvDNAおよびタンパク質ベースの抗原は、免疫原性であり、そしてC亜型HIV-1Env抗原およびB亜型HIV-1Env抗原の両方に反応性の高力価抗体反応を誘導する。2回のみのDNA免疫後、いくつかの群で中和感受性B亜型R5HIV-1SF162DV2に対する中和抗体反応を観察した。Envタンパク質での単回の追加免疫に次いで、TV1EnvのV2欠失形態を受けた群のウサギの大多数が、密接に関連するC亜型TV2初代株に対する中和活性を示した。実施例12RhesusMacaquesにおける免疫学的応答表Iに示すように構成された免疫化研究において、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を、3群のrhesusmacaques各群は、4匹の動物で構成されたで評価した。免疫化組成物についての投与経路は、いずれの場合においてもエレクトロポレーションであった。抗体価を、2回目の免疫の2週間後について表Iに示す。1回目の免疫の前0週において、免疫前血清を得た。0週において、1回目の免疫を実施した。4週目において2回目の免疫を実施した。1回目の採血を、2回目の免疫の2週後すなわち、6週目に実施した。3回目の免疫を8週目に、そして4回目の免疫を、16週目に実施する。動物2A、動物3A、動物3Bおよび動物3Dは、以前おおよそ4年以上に、gagプラスミドDNAまたはgagVLP亜型Bでワクチン接種されている。バルクCTL、51Cr-放出アッセイ、およびフローセル細胞計測方法を使用して、表Jおよび表K中のデータを得た。gag特異的T細胞およびpol特異的T細胞を検出するために使用した試薬は、以下であった:igagCpol抗原n=377に及ぶ合成重複ペプチドであって、代表的には、このペプチドは、11マーまでの重複を有する15マーのプールであり、このプールは、以下:プール1、n=1~82、プール2、n=83~164、プール3、n=165~271、プール4、n=272~377であり、従ってプール1およびプール2は、gag特異的であり、そしてプール3およびプール4は、pol特異的である、合成重複ペプチドならびにii組換えワクシニアウイルスrVV例えば、rVVgag965、rVVp2Pol975p2p7gag975を含む、およびVVwr親ウイルス。2回目の免疫の後に、血液中のGag特異的IFNγCD8T細胞、Gag特異的IFNγCD4T細胞、Pol特異的IFNγCD8T細胞、およびPol特異的IFNγCD4T細胞を、上の表Iに記載の各動物について決定した。結果を、表Jおよび表Kに示した。表Kに示すpol特異的活性のうちいくつかは、p2p7gagに対して惹起された可能性がある。これらの結果は、本発明の構築物が、選択されたHIVポリペプチド抗原に対する特異的細胞応答および体液性応答を生成し得ることを支持する。本発明の好ましい実施形態はいくらか詳細に記載されているが、明らかな改変が添付の請求項により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなしになされ得ることが理解される。"