"ai.宿主細胞中での膜透過処理剤の発現を制御する第一の制御配列の機能的制御下の該剤をコードする第一の核酸配列;およびii.誘導可能なプロモーターを含む第二の制御配列の機能的制御下の巨大分子をコードする第二の核酸配列であって、該制御配列が宿主細胞中での該巨大分子の発現を制御する、該核酸配列を含んでなる宿主細胞を、該巨大分子の所望の産生レベルを満たすのに十分な選択された細胞密度まで培養する工程;b細胞膜の完全な溶解を伴わずに細胞膜の完全性を破壊するように該剤を誘導する環境条件に宿主細胞を曝露して、それにより小分子量化合物の該膜を通る輸送を可能にする工程;ならびにc破壊された細胞膜を通り輸送し得る成分を含んでなる栄養素カクテルの存在下で該宿主細胞を培養する工程であって、該成分が、第二の制御配列のプロモーターを誘導する誘導剤および膜が破壊された宿主細胞中での該巨大分子の発現を可能にする代謝要件を含む、工程;を含んでなり、かつ、該巨大分子が宿主細胞中で発現される、宿主細胞中での巨大分子の組換え発現方法。a膜の完全な溶解を伴わずに細胞膜の完全性を破壊しそして小分子量化合物の該膜を通る輸送を可能にする膜透過処理剤と宿主細胞を接触させる工程であって、該宿主細胞が誘導可能なプロモーターを含んでなる制御配列の機能的制御下に巨大分子をコードする核酸配列を含有し、該制御配列が該宿主細胞中での該巨大分子の発現を制御する、工程;b破壊された細胞膜を通って輸送し得る成分を含んでなる栄養素カクテルの存在下で該宿主細胞を培養する工程であって、該成分が膜を破壊された宿主細胞中での該巨大分子の高められた発現を可能にする代謝要件を含む、工程;を含んでなる、宿主細胞中での巨大分子の組換え発現を高める方法。宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞よりなる群から選択される、請求項1若しくは2に記載の方法。膜透過処理剤が、細菌タンパク質毒素、そのフラグメントおよびそのバリアントよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。細菌タンパク質毒素が、ジフテリア毒素、炭疽菌保護抗原、緑膿菌Pseudomonasaeruginosa外毒素A、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、黄色ブドウ球菌S.aureusα毒素、β-バレル膜孔形成毒素、大腸菌E.coli溶血素、ウェルシュ菌Clostridiumperfringensι毒素、リステリオリシンOおよび細胞溶解素よりなる群から選択される、請求項4に記載の方法。膜透過処理剤が植物タンパク質毒素、そのフラグメントおよびそのバリアントよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。植物毒素がリシン、アブリンおよびモデシンよりなる群から選択される、請求項6に記載の方法。膜透過処理剤がチャンネルタンパク質である、請求項1に記載の方法。チャンネルタンパク質が、イオンチャンネルタンパク質、電位制御チャンネルタンパク質、化学制御チャンネルタンパク質および非制御チャンネルタンパク質よりなる群から選択される、請求項8に記載の方法。膜透過処理剤が、受動輸送タンパク質、酵素、ギャップ結合タンパク質、核孔複合体、膜孔形成タンパク質、ホリン、コリシン、プロテグリン、補体および補体関連タンパク質、膜融合ウイルスタンパク質、それらのフラグメントならびにそれらのバリアントよりなる群から選択される、請求項1に記載の方法。膜孔形成タンパク質がナイスタチン、アムホテリシンB、グラミシジンA、アラメシシンおよびポリンよりなる群から選択される、請求項10に記載の方法。酵素がリパーゼである、請求項10に記載の方法。コリシンがコリシンE1、コリシンE3、コリシンA、コリシンIaおよびコリシンYである、請求項10に記載の方法。補体がパーフォリンである、請求項10に記載の方法。膜透過処理剤がヘマグルチニンである、請求項10に記載の方法。膜透過処理剤が界面活性剤、イオノフォア、若しくは浸透圧ストレスを誘導する剤である、請求項2に記載の方法。巨大分子がタンパク質、DNA若しくはRNAである、請求項1若しくは2に記載の方法。核酸配列、第一の核酸配列若しくは第二の核酸配列が、プラスミド、バクテリオファージ若しくはウイルスである輸送ベクター中に独立して存在する、請求項1若しくは2に記載の方法。第一の制御配列が構成的プロモーターを含んでなる、請求項1に記載の方法。第一の制御配列が誘導可能なプロモーターを含んでなる、請求項1に記載の方法。第二の制御配列が第一の制御配列のものと異なるプロモーターを含んでなる、請求項1に記載の方法。誘導可能なプロモーターがきっちり合うように調節されるプロモーターである、請求項1若しくは2に記載の方法。第二の制御配列が、第一の制御配列のものと異なる誘導可能なプロモーターを含んでなる、請求項22に記載の方法。工程bの環境条件が、pHを変えること、塩濃度を変えること、浸透圧を変えること、温度を変えること、宿主細胞を光に曝露すること、および宿主細胞を作用剤、生体分子、化学物質若しくはリガンドに曝露することの最低1種を含んでなる、請求項1に記載の方法。pHを変えることがpHを約4ないし6.5に低下させることを含んでなる、請求項24に記載の方法。作用剤、生体分子、化学物質若しくはリガンドが、還元剤、酸化剤、酸、塩基、塩、カオトロープ、界面活性剤、および第一の制御配列の誘導可能なプロモーターを誘導する作用剤よりなる群から選択される、請求項24に記載の方法。小分子量化合物が、大きさが約50ないし約2000ダルトンの間の範囲にある、請求項1若しくは2に記載の方法。栄養素カクテルが、巨大分子の発現を制御するプロモーターを誘導するための誘導剤、アデノシン三リン酸ATP、アミノ酸、リボヌクレオチド、補助因子、デオキシリボヌクレオチド、非天然のアミノ酸、安定化剤、浸透圧調節物質、酸化還元を変える剤、および巨大分子を産生するのに必要な環境因子よりなる群から選択される1種若しくはそれ以上の成分を含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。発現された巨大分子を宿主細胞から回収することをさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。栄養素カクテルの存在下で細胞を培養する前に宿主細胞を濃縮若しくは収集することをさらに含んでなる、請求項1若しくは2に記載の方法。ai.宿主細胞中での膜透過処理剤の発現を制御する第一の制御配列の機能的制御下の該剤をコードする第一の核酸配列;およびii.誘導可能なプロモーターを含んでなる第二の制御配列の機能的制御下の巨大分子をコードする第二の核酸配列であって、該制御配列が該宿主細胞中での該巨大分子の発現を制御する、該核酸配列を含有する宿主細胞を、ミニウェルプレートの各ウェル中で;該巨大分子の所望の産生レベルを満たすのに十分な選択された細胞密度まで培養する工程であって;ここで各ウェルの宿主細胞中の該第二の核酸配列が異なる巨大分子をコードする、工程;b細胞膜の完全な溶解を伴わずに該膜の完全性を破壊するように該処理剤を誘導するのに適する環境条件に該宿主細胞を曝露しそれにより小分子量化合物の該膜を通る輸送を可能にする工程;c破壊された細胞膜を通って輸送し得る成分該成分は各ウェル中の細胞の第二の制御配列のプロモーターを誘導する誘導剤を含んでなり;および各ウェルの膜を破壊された宿主細胞中での該巨大分子の発現を可能にする代謝要件ここで該巨大分子は各ウェルの宿主細胞中で発現されるを含んでなる栄養素カクテルの存在下で該宿主細胞を培養する工程;d各ウェルの宿主細胞を試験試薬で処理する工程;ならびにe試験試薬に応答した巨大分子の正体を決定する工程を含んでなる、インシトウinsitu薬物スクリーニング方法。ai.宿主細胞中での膜透過処理剤の発現を制御する第一の制御配列の機能的制御下の該剤をコードする第一の核酸配列;およびii.誘導可能なプロモーターを含んでなる第二の制御配列の機能的制御下の巨大分子をコードする第二の核酸配列であって、該制御配列が宿主細胞中での該巨大分子の発現を制御する、該核酸配列;を含有する宿主細胞をミニウェルプレートの各ウェル中で、該処理剤の蓄積を可能にする選択された細胞密度まで培養する工程;b細胞膜の完全な溶解を伴わずに該膜の完全性を破壊するように該剤を誘導するのに適する環境条件に該宿主細胞を曝露し、それにより小分子量化合物の該膜を通る輸送を可能にする工程;c破壊された細胞膜を通って輸送し得る成分を含んでなる栄養素カクテル該成分は各ウェル中の該細胞の第二の制御配列のプロモーターを誘導する誘導剤を含んでなりおよび各ウェルの膜を破壊された宿主細胞中での該巨大分子の発現を可能にする代謝要件の存在下で、該宿主細胞を培養する工程であって;ここで該巨大分子が各ウェルの宿主細胞中で発現される、工程;d各ウェルの宿主細胞を異なる試験試薬で処理する工程;ならびにe巨大分子での応答を誘導した試験試薬の本質を決定する工程、を含んでなる、インシトウinsitu薬物スクリーニング方法。試験試薬に対する細胞の応答が結合若しくはシグナル事象の誘発である、請求項31若しくは32に記載の方法。試験試薬で細胞を処理する前に細胞を溶解する工程をさらに含んでなる、請求項31若しくは32に記載の方法。試験試薬が破壊された細胞膜を通り輸送する小分子である、請求項31若しくは32に記載の方法。IV.実施例以下の実施例は本発明の組成物および方法の使用を示す。酸性線維芽細胞増殖因子aFGFの製造方法A.膜透過処理剤および巨大分子の共発現のための2種の核酸分子を含有する宿主細胞の構築活性部位残基に3塩基対突然変異を含有するE148S無傷のジフテリア毒素DT遺伝子を膜透過処理剤としてコードしてDT-E148Sと呼ばれるDTの低毒性の弱毒化バージョンをもたらすDNA配列。本核酸配列を、慣習的技術を使用しかつO’KeefeとCollier、PNAS、86:343-61989に記述されるとおり集成する。本配列を、pFIKT7-FlexiTMプラスミドベクターPromegaに誘導可能なT7プロモーターの後にクローン化する。T7プロモーターはイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドIPTGで誘導可能であるが、しかしIPTGの非存在下で基礎レベルの発現漏出発現を表す。pFIKT7-FlexiTMベクターは、成功裏にトランスフェクトされた大腸菌E.coli宿主の同定を見込む選択可能なマーカーkanrカナマイシン耐性のためを含有する。DT-E148Sを含有するこの第一のプラスミドpDT-E148Sをコンピテントな大腸菌E.coli宿主細胞に形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンを含有するLB寒天上で画線しかつ37°Cで一夜増殖させる。単一コロニーを選択し、そしてカナマイシンを含有する15mLのLB培地中37°Cで15時間増殖させる。細胞をペレットにしかつ次の段階のため使用する。第二のプラスミドすなわちpRHAプラスミドはGiacaloneら、2006、Biotechniques、403:355-63に記述されたとおり構築する。pRHAプラスミドは、成功裏にトランスフェクトされた大腸菌E.coli宿主の同定を見込む選択可能なマーカーamprアンピシリン耐性のためを含有する。巨大分子すなわちタンパク質aFGFをコードするDNA配列をpRHAプラスミドにrhaTプロモーターの後にクローン化する。場合によっては該タンパク質を宿主細胞からの後の精製のためGST若しくはヒスチジンタグでタグをつける。rhaTプロモーターは、L-ラムノースの添加により誘導可能かつD-グルコースの存在により抑制される厳しく調節されるプロモーターである。標的巨大分子をコードする核酸配列を含んでなるこの第二のプラスミドを、膜透過処理剤DT-E148Sをコードする第一のプラスミドを含有する大腸菌E.coli細胞に形質転換する。共形質転換された大腸菌E.coli宿主細胞をアンピシリンおよびカナマイシンを含有するLB寒天上で画線しかつ37°Cで一夜増殖させて、双方のプラスミドを含有する細胞について選択する。単一コロニーを選択しかつアンピシリンおよびカナマイシンを含有する15mLのLB培地中37°Cで15時間増殖させる。B.選択された密度までの宿主細胞の培養大腸菌E.coliを、巨大分子の発現を抑制するがしかしDT-E148Sの発現を可能にするように0.2D-グルコースを補充されているLB培地中で培養する。この時間の間に大腸菌E.coli宿主細胞はその漏出プロモーターのためDT-E148Sを発現しておりかつそのリーダー配列によりそれを該細胞の細胞膜周辺腔に局在化している。宿主細胞が、該巨大分子の産生を最大にするために一般に選択される細胞密度である1.0のOD595という選択された細胞密度に達する場合に、大腸菌E.coli宿主細胞を収集しかつ培地を捨てる。C.宿主細胞の透過処理細胞をその後、透過処理剤が細胞膜の完全な溶解を伴わずに細胞膜の完全性を破壊することを誘導する環境条件に曝露する。本実験において、細胞を酸性緩衝液コハク酸ナトリウムに再懸濁してpHを約5.0に約5分間低下させる。理論により拘束されることを願わず、酸性培地が、宿主細胞を完全に溶解することを伴わずに細胞膜にそれが挿入しかつその完全性を破壊することを可能にする、周辺質のDT-E148S分子中のコンホメーション変化を誘導する。細胞膜のこの破壊がそれにより、小分子量化合物例えば約50ないし2000ダルトンの小分子の膜を通る輸送を可能にする。D.巨大分子の製造透過処理が生じた後に、酸性緩衝液をLB、ならびに、rhaTプロモーターを誘導するL-ラムノースならびに透過処理された細胞の代謝および膜を破壊された細胞中のタンパク質aFGFの産生に必要とされる他の小分子化合物を包含する栄養素カクテルと交換する。これらの分子は破壊された細胞膜を通り輸送し得る大きさのものである。この場合のこうした成分はATP、アミノ酸およびリボヌクレオチドを包含する。各成分を約1mMの濃度まで添加する。誘導される細胞を37°Cで一夜保つ。細胞をペレットにしかつ溶解し、そして巨大分子タンパク質aFGFを慣習的クロマトグラフィー法を使用して精製する。線維芽細胞増殖因子20FGF-20の製造方法A.巨大分子の発現のための核酸分子を含有する宿主細胞の構築Giacaloneら、2006、Biotechniques、403:355-63に記述されるとおり構築されたpRHAプラスミドは、成功裏にトランスフェクトされた大腸菌E.coli宿主の同定を見込む選択可能なマーカーamprアンピシリン耐性のためを含有する。巨大分子すなわちタンパク質FGF-20をコードするDNA配列をpRHAプラスミドにrhaTプロモーターの後にクローン化する。場合によっては、該タンパク質を宿主細胞からの後の精製のためGST若しくはヒスチジンタグでタグをつける。rhaTプロモーターは、L-ラムノースの添加により誘導可能かつD-グルコースの存在により抑制される厳しく調節されるプロモーターである。標的巨大分子をコードする核酸配列を含んでなるこのプラスミドをコンピテントな大腸菌E.coli細胞に形質転換する。形質転換された大腸菌E.coli宿主細胞を50μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天上で画線し、そして該プラスミドを含有する細胞について選択するため37°Cで一夜増殖させる。単一コロニーを選択しかつアンピシリンを含有する15mLのLB培地中37°Cで15時間増殖させる。細胞をペレットにしかつ次の段階のため使用する。B.選択された密度までの宿主細胞の培養該大腸菌E.coliを、巨大分子の発現を抑制するため0.2D-グルコースを補充されているLB培地中で培養する。宿主細胞が、巨大分子の産生を最大化するために一般に選択される細胞密度である1.0のOD595という選択された細胞密度に達する場合に、大腸菌E.coli宿主細胞を収集しかつ培地を捨てる。C.宿主細胞の透過処理細胞をその後、細胞膜の完全な溶解を伴わずに細胞膜の完全性を破壊するのに十分な環境条件下で外的に添加された透過処理剤コリシンYに曝露する。本実験において、収集された大腸菌E.coliをその後中性緩衝液に再懸濁し、そして2μg/mLの透過処理剤コリシンYで約5分間処理する。この処理が、宿主細胞を完全に溶解することを伴わずに細胞膜の完全性を破壊する。細胞膜のこの破壊がそれにより小分子量化合物例えば約50ないし2000ダルトンの小分子の膜を通る輸送を可能にする。D.巨大分子の製造透過処理が生じた後に、中性緩衝液を、LB、ならびにrhaTプロモーターを誘導するL-ラムノースならびに透過処理された細胞の代謝および膜を破壊された細胞中のタンパク質FGF-20の産生に必要とされる他の小分子化合物を包含する栄養素カクテルと交換する。これらの分子は破壊された細胞膜を通り輸送し得る大きさのものである。この場合のこうした成分は約1mMの濃度で添加されるATP、アミノ酸およびリボヌクレオチドを包含する。誘導された細胞を37°Cに一夜保つ。細胞をペレットにしかつ溶解し、そして巨大分子タンパク質FGF-20を慣習的クロマトグラフィー法を使用して精製する。insitu薬物スクリーニングA.膜透過処理剤および巨大分子の共発現のための2種の核酸分子を含有する宿主細胞の構築コンピテントな大腸菌E.coli宿主細胞を実施例1に記述されたところのプラスミドpDT-E148Sでトランスフェクトする。タンパク質5-α還元酵素のバリアントを得かつ実施例1に記述されたとおりpRHAプラスミドにrhaTプロモーターの後に個別にクローン化して、それによりコードされるタンパク質5-α還元酵素バリアント中でのみ異なるpRHAプラスミドのライブラリーを提供する。タンパク質バリアントコーディング配列を含有する各プラスミドを、pDT-E148Sを含有する大腸菌E.coli細胞に形質転換する。形質転換された細胞を、双方のプラスミドを含有する細胞について選択するためアンピシリンおよびカナマイシンを含有するLB寒天上で画線しかつ37°Cで一夜増殖させる。各バリアントを運搬する宿主細胞の単一コロニーを選択しかつアンピシリンおよびカナマイシンを含有する15mLのLB培地中37°Cで15時間増殖させる。B.選択された密度までの宿主細胞の培養バリアント大腸菌E.coli宿主細胞を96ウェルプレートに蒔き、各プレートは異なるバリアントを含有する。ウェル中の各大腸菌E.coliを、巨大分子バリアントの発現を抑制するがしかし宿主細胞の周辺質に蓄積するDT-E148Sの発現を許容するため0.2D-グルコースを補充されているLB培地中で培養する。宿主細胞が1.0のOD595という選択された細胞密度に達する場合に、大腸菌E.coli宿主細胞を収集しかつ培地を捨てる。C.宿主細胞の透過処理各ウェル中の細胞を酸性緩衝液コハク酸ナトリウムに再懸濁してpHを約5.0に約5分間低下させる。理論により拘束されることを願わず、酸性培地が、宿主細胞を完全に溶解することを伴わずに細胞膜にそれが挿入しかつその完全性を破壊することを可能にする周辺質のDT-E148S分子中のコンホメーション変化を誘導する。細胞膜のこの破壊がそれにより、小分子量化合物例えば約50ないし2000ダルトンの小分子の膜を通る輸送を可能にする。D.巨大分子の製造透過処理が生じた後に、各ウェル中の酸性緩衝液をLB、ならびに、rhaTプロモーターを誘導するL-ラムノースならびに透過処理された細胞の代謝および膜を破壊された細胞中でのタンパク質5-α還元酵素の産生に必要とされる他の小分子化合物を包含する栄養素カクテルと交換する。これらの分子は破壊された細胞膜を通り輸送し得る大きさのものである。この場合のこうした成分はATP、アミノ酸およびリボヌクレオチドを包含し、これを約1mMの濃度で添加する。また破壊された細胞膜を通り輸送し得る、約0.01マイクロモル濃度ないし1mMの試験試薬すなわち小分子量化合物例えばフィナステリドもまた各ウェルに添加する。誘導された細胞を37°Cで一夜保つ。細胞をペレットにしかつ溶解し、そして巨大分子タンパク質5-α還元酵素をクロマトグラフィータグを使用して精製する。試験試薬がタンパク質5-α還元酵素のバリアントを結合することが可能であった場合、該試験試薬は質量分析により検出されることができる。質量分析は結合バリアントを同定するのにもまた使用することができる。本薬物スクリーニング方法は、当業者が、試験試薬に応答したバリアント巨大分子の正体を決定することを可能にする。本実験の別の態様において、同一巨大分子を各ウェル中で発現させるが、しかし、各ウェルは、どの試験試薬が該巨大分子を結合するかを同定するために異なる試験試薬と接触させる。細胞透過性の測定上の実施例のいずれについても、以下の既知かつ公表されている手順は、細胞透過処理剤の適用若しくは発現後に細胞膜の透過性の程度を試験するのに使用しうる一方法の一例である。これらの手順はとりわけO’KeefeとCollier、PNAS、86:343-61989により詳細に記述されている。当業者は本明細書に記述される方法の最適化においてこれら若しくは同様の手順を使用しうる。細胞を顕微鏡で見て細胞が溶解されていないことを確認する。A.膜電位。形質転換された大腸菌E.coli細胞を1.0のOD595までL培地中で増殖させる。細胞を遠心沈降しかつ1mlあたり3×109細胞の濃度まで2mMトリスHCl/50mMNaCl、pH7.0に再懸濁する。各実験点について、細胞を50mMNaClを含有する多様なpH値の5mM緩衝液に1:10希釈する。この点から細胞を温度調節された磁気的に攪拌されるキュベット中で37°Cに保つ。以下の緩衝液すなわちPipespH7.0および6.5、MespH6.0ならびにクエン酸ナトリウム/コハク酸ナトリウムpH5.5および5.0を個々のキュベットに添加する。細胞pH特異的緩衝液を含有するを1minインキュベートし、そしてその後100mMトリス-HClpH7.5にもたらす。1分後にヨウ化3,3’-ジプロピルチアジカルボシアニンMolecularProbes、オレゴン州ユージーンを1μg/mlの最終濃度まで添加する。シグナルが安定化した場合に測定される蛍光をpH7.0での蛍光により除算して相対蛍光を得る。蛍光は645nmでの励起および668nmでの測定を用いSLMAMINCOイリノイ州アーバナSPF-500C蛍光分光計で測定する。双方のスリットを5mmに設定する。B.プロリン輸送。無カリウムM9培地リン酸ナトリウムをリン酸カリウムの代わりに用いる中で一夜増殖させた細胞を同一培地で1:100希釈する。5hr増殖させた後に該細胞を1.0のOD595まで増殖培地に再懸濁する。0.1mLの細胞を、4.8μCi1Ci=37GBqのL-[2,3,4,5-3H]プロリンを含有する多様なpH値上と同一の1.9mlの20mM緩衝液に添加する。37°Cで10min後に該細胞をMilliporeHAフィルターで濾過し、そして5mlの無カリウムM9塩で洗浄する。フィルターを乾燥しかつOCSAmershamに溶解し、そして放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。C.86Rb流出。細胞を輸送アッセイについてのとおり増殖させる。1.0のOD595まで再懸濁した後に該細胞を86RbCl20μCi/mlの存在下37°Cで1hrインキュベートする。0.1mlの細胞をその後多様なpH値の1.9mlの20mM緩衝液上と同一に添加しそして37°Cで10minインキュベートする。該細胞をその後、洗浄緩衝液に前浸漬されたMilliporeHAフィルターで濾過する。フィルターを10mMRbClを補充された5mlのM9塩で洗浄しかつ乾燥し、そして放射活性をガンマカウンターで測定する。D.膜透過の測定上のアッセイのいずれかでの95超の活性の低下は、本明細書に記述される方法により、細胞膜が、該膜の完全な溶解を伴わずに小分子量化合物の輸送に十分に透過処理されたことを示す。上の明細で引用された全部の文書は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の態様および実施例に関して記述された一方、改変が本発明の技術思想から離れることなくなされ得ることが評価される。例えば、当業者は、とりわけ、所望の特性をもつ試験試薬を同定するために本発明の宿主細胞および方法を使用する、他のinsitu薬物スクリーニングプロトコル、他の巨大分子、他の栄養素カクテルおよび検出アッセイを容易に選択しうる。こうした改変は付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。"