明細書に記載の発明。従って、当該分野において、rAAVビリオン産生のために必要とされる補助機能のみを含むアデノウイルスゲノムのサブセット、またはアデノウイルスゲノムの機能的なホモログを同定する必要性は残存する。従って、サブセットは、適切な宿主細胞に導入された場合に、アデノウイルス感染を使用して産生される量に実質的に等価またはそれより多くの量でrAAVビリオンの産生を支持する、補助機能ベクターまたは補助機能系に含まれ得る。さらに、有意のレベルの感染性アデノウイルスビリオン、または他の混入する副産物をも産生することなく、商業的に有意のレベルのrAAVビリオン粒子を産生し得る補助機能系を提供する必要性は残存する。項目1適切な宿主細胞において組換えAAVrAAVビリオン産生を支持するための、1つ以上の補助機能を提供し、少なくとも1つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する、核酸分子であって、該分子が、iアデノウイルスVARNAを提供する配列、iiアデノウイルスE4ORF6コード領域、iiiアデノウイルスE2aの72kDコード領域、ならびにi、ii、およびiiiの任意の組合せ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。項目2適切な宿主細胞において効率的な組換えAAVrAAVビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供し、そして少なくとも1つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子。項目3項目2に記載の核酸分子であって、該分子がアデノウイルス初期遺伝子領域2bおよび3を欠失することを特徴とする、核酸分子。項目4ヒト293宿主細胞において効率的にrAAVビリオン産生を支持するに十分な補助機能を提供する、項目2または3に記載の核酸分子。項目5項目4に記載の核酸分子であって、以下:アデノウイルスVARNAを提供する第1のヌクレオチド配列;ORF6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第2のヌクレオチド配列;およびアデノウイルスE2aコード領域を含む第3のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。項目6項目2に記載の核酸分子であって、該分子はアデノウイルスによって感染し得ないか、またはアデノウイルスの複製を支持し得ない適切な宿主細胞において、効率的な組換えAAVrAAVビリオン産生を支持するための補助機能を提供することを特徴とする、核酸分子。項目7項目6に記載の核酸分子であって、以下:アデノウイルスVARNAを提供する第1のヌクレオチド配列;ORF6を含むアデノウイルスE4コード領域を含む第2のヌクレオチド配列;アデノウイルスE2aコード領域を含む第3のヌクレオチド配列;およびアデノウイルスE1aおよびE1bコード領域を含む第4のヌクレオチド配列、を含む、核酸分子。項目82型または5型アデノウイルスゲノム由来の1つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目4または6に記載の核酸分子。項目9項目1、2、または6のいずれかに記載の核酸分子を含む、補助機能ベクター。項目10前記ベクターがプラスミドであることを特徴とする、項目9に記載の補助機能ベクター。項目11選択遺伝子マーカーをさらに含む、項目10に記載の補助機能ベクター。項目12前記選択遺伝子マーカーが抗生物質耐性遺伝子を含むことを特徴とする、項目11に記載の補助機能ベクター。項目13少なくとも1つの異種プロモーター領域をさらに含む、項目10に記載の補助機能ベクター。項目14前記の少なくとも1つの異種プロモーター領域が、サイトメガロウイルスCMV即時初期プロモーター領域に対して実質的に相同であるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、項目13に記載の補助機能ベクター。項目15第1、第2、および第3の補助機能ベクターを含む、組換えAAVrAAVビリオン産生のための補助機能系であって、ここで;a該第1補助機能ベクターは、アデノウイルスVARNAを提供するヌクレオチド配列を含み;b該第2補助機能ベクターは、アデノウイルスE4ORF6コード領域を含み;そしてc該第3補助機能ベクターは、アデノウイルスE2aの72kDコード領域を含む、補助機能系。項目16前記第1補助機能ベクターが、プラスミドpBSIIVARNAATCC受託番号第98233号であり、前記第2補助機能ベクターが、p33cE4ORF6ATCC受託番号第98234号であり、そして前記第3補助機能ベクターが、p33cE2AATCC受託番号第98235号であることを特徴とする、項目15に記載の補助機能系。項目17項目9に記載の補助機能ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。項目18AAVベクターでトランスフェクトされた場合、組換えAAVrAAVビリオンを産生し得る細胞であって、該細胞は、該細胞において発現され、AAVヘルパー機能を提供し得るAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた、項目17に記載の宿主細胞を含む、細胞。項目19組換えAAVrAAVビリオンを産生する方法であって、以下;a適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程;bAAVヘルパー構築物を宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程;c項目15に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための補助機能を提供する、工程;およびd該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、を包含する、方法。項目20組換えAAVrAAVビリオンを産生する方法であって、以下;a適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程;bAAVヘルパー構築物を該宿主細胞に導入する工程であって、該ヘルパー構築物は、該AAVベクターから欠失したAAVヘルパー機能を補完するために該宿主細胞において発現されるAAVコード領域を含む、工程;c項目9に記載の補助機能系を該宿主細胞に導入する工程であって、該補助機能系は、該宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持するための該補助機能を提供する、工程;およびd該宿主細胞を培養してrAAVビリオンを産生する工程、を包含する、方法。項目21項目19または20に記載の方法によって産生される、組換えAAVビリオン。発明の要旨本発明は、適切な宿主細胞において効率的なAAV複製を支持するために必要とされる補助機能の同定に基づく。本発明は、このような機能を含み、そしてヘルパーウイルスの使用なしにrAAVビリオンの産生を可能にする系を提供する。特定の実施態様において、本発明は、補助機能をコードし、そして少なくとも1つのアデノウイルス後期遺伝子領域を欠失する核酸分子に関する。その分子は、2型もしくは5型ゲノムアデノウイルス、またはその機能的なホモログ由来のヌクレオチド配列を含む1つ以上のベクターにおいて提供され得る。従って、1つの局面において、本発明は、アデノウイルスのVARNAを提供する配列、アデノウイルスE4ORF6のコード領域、アデノウイルスのE2aの72kDコード領域E2aの72kDのDNA結合タンパク質をコードする、およびヌクレオチド配列、、の任意の組み合わせ、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むベクターに関する。別の実施態様において、本発明は、適切な宿主細胞において効率的な組換えAAVrAAVビリオン産生を支持し得る補助機能を提供し、そして少なくも1つのアデノウイルスの後期遺伝子領域を欠く核酸分子、ならびにその核酸分子を含むベクターに関する。別の局面において、本発明は、多数のヌクレオチド配列アデノウイルスVARNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、およびアデノウイルスのE2aのコード領域を含む配列を含むを含むベクターに関する。本発明のさらに別の局面において、アデノウイルスVARNAを提供する配列、アデノウイルスE4コード領域を含む配列、アデノウイルスE2aコード領域を含む配列、ならびにアデノウイルスのE1aおよびE1bコード領域を含む配列を含むベクターが提供される。本発明の別の実施態様において、rAAVビリオン産生のための補助機能系が提供され、ここでこの系は適切な宿主細胞において効率的なAAVビリオン産生を支持するために適切な補助機能成分を提供する、多数の補助機能ベクターを含む。本発明のなお別の実施態様において、rAAVビリオンを産生するための方法が提供される。この方法は、一般に、1適切な宿主細胞にAAVベクターを導入する工程;2この細胞にAAVヘルパー構築物を導入する工程であって、ここでこのヘルパー構築物が、AAVベクターから欠失しているAAVヘルパー機能を補完するために宿主細胞において発現され得る工程;3宿主細胞に1つ以上の補助機能ベクターを導入する工程であって、ここで1つ以上の補助機能ベクターは宿主細胞において効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る補助機能を提供する工程;および4rAAVビリオンを産生する細胞を培養する工程、を包含する。さらなる実施態様において、本発明の方法によって産生される組換えAAVビリオンもまた提供される。本発明のこれらの、および他の実施態様は、本明細書中における開示を考慮して当業者に容易に理解される。発明の詳細な説明本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内のウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技法の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual;DNACloningAPracticalApproach第I巻および第II巻;NucleicAcidHybridization;TranscriptionandTranslation;CRCHandbookofParvoviruses第I巻および第II巻;FundamentalVirology、第2版第I巻および第II巻を参照のこと。本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形のa、an、およびtheは、その内容が明らかに他を指図しない限り、複数の言及を含む。A.定義本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義されることが意図される。遺伝子移入または遺伝子送達は、宿主細胞中に外来DNAを確実に挿入するための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入されたDNAの一過性発現、移入されたレプリコン例えば、エピソームの染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムDNA中への移入された遺伝物質の組込みを生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置のための独特のアプローチを提供する。多数の系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、米国特許第5399346号を参照のこと。ベクターにより、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝子エレメントが意味され、これは、適正な制御エレメントに伴われる場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝子配列を移行させ得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列またはAAVITRにより、AAVゲノムの各末端で見出される当該分野で認識される領域が意味され、これは、一緒にシスで、DNAの複製起点としておよびウイルスのためのパッケージングシグナルとして機能する。AAVITRは、AAVrepコード領域と一緒に、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切り出しおよびレスキュー、ならびに2つの隣接するITR間にはさまれたヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノムへの組込みを提供する。AAVITR領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、AAV2配列については、KotinRMHumanGeneTherapy5793801;BernsKIパルボウイルス科およびその複製FundamentalVirology、第2版、を参照のこと。本明細書中で使用される場合、AAVITRは、示される野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。さらに、AAVITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAVX7などを含むがそれらに限定されない、任意のいくつかのAAV血清型に由来し得る。さらに、AAVベクターにおいて、選択されたヌクレオチド配列に隣接する5および3ITRは、それらが意図するように、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にするように、ならびにAAVRep遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノム中への異種配列の組込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同じAAV血清型もしくは単離株と同一であるかまたはそれに由来する必要はない。AAVrepコード領域により、ウイルスゲノムを複製させるために、および潜在的感染の間の宿主ゲノムへのウイルスゲノムの挿入のために集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質をコードする、当該分野で認識される、AAVゲノムの領域、またはその機能的ホモログ例えば、AAV2DNA複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイルス6HHV6rep遺伝子ThomsonらVirology204304311が意味される。従って、repコード領域は、AAVRep78およびRep68長形態のRep、ならびにRep52およびRep40短形態のRep、またはその機能的ホモログをコードする遺伝子を少なくとも含む。AAVrepコード領域のさらなる記載については、例えば、MuzyczkaNCurrentTopicsinMicrobiolandImmunol15897129;およびKotinRMHumanGeneTherapy5793801を参照のこと。本明細書中で使用する場合、repコード領域は、上記のAAV血清型のような任意のウイルス血清型に由来し得る。この領域は野生型遺伝子のすべてを含む必要はなく、適切なレシピエント細胞中で発現される場合に、存在するrep遺伝子が十分な組み込み機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。AAVcapコード領域により、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされる、ウイルスのコートタンパク質をコードする、AAVゲノムの当該分野で認識される領域が意味される。従って、capコード領域は、コートタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする遺伝子を少なくとも含む。capコード領域のさらなる記載については、例えば、MuzyczkaNCurrentTopicsinMicrobiolandImmunol15897129;およびKotinRMHumanGeneTherapy5793801を参照のこと。本明細書中で使用される場合、AAVcapコード領域は、上記のように、任意のAAV血清型に由来し得る。この領域は野生型cap遺伝子のすべてを含む必要はなく、AAVベクターとともに宿主細胞中に存在する場合に遺伝子が十分なパッケージング機能を提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変され得る。AAVベクターにより、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAVX7などを含むがそれらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターが意味される。AAVベクターは、全体または一部が欠失した1つ以上のAAV野生型遺伝子、好ましくはrepおよび/またはcap遺伝子を有し得るが、機能的な隣接するITR配列を保持し得る。機能的ITR配列は、AAVビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングのために必要である。従って、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされるこれらの配列例えば、機能的ITRを少なくとも含むことが、本明細書中で定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、そして、配列が機能的なレスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。AAVヘルパー機能は、発現されて、次に増殖性AAV複製のためにトランスで機能するAAV遺伝子産物を提供し得るAAV由来コード配列をいう。従って、AAVヘルパー機能は、主要なAAVオープンリーディングフレームORFrepおよびcapの両方を含む。Rep発現産物は、とりわけ:AAVのDNA複製起点の認識、結合、およびニッキング;DNAヘリカーゼ活性;ならびにAAVまたは他の異種のプロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を有することが示されている。Cap発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。AAVヘルパー機能は、本明細書中では、AAVベクターから失われているAAV機能を、トランスで相補することに使用される。用語AAVヘルパー構築物は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを産生するために使用される、AAVベクターから欠失したAAV機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。AAVヘルパー構築物は、一般に、溶菌性AAV複製に必要である、失われているAAV機能を相補するためにAAVrepおよび/またはcap遺伝子の一過性発現を提供するために使用される;しかし、ヘルパー構築物は、AAVITRを欠き、そしてそれ自体複製もパッケージングもし得ない。AAVヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。多くのAAVヘルパー構築物が記載されている例えば、RepおよびCap発現産物の両方をコードする一般に使用されるプラスミドpAAVAdおよびpIM2945。例えば、SamulskiらJVirol6338223828;およびMcCartyらJVirol6529362945を参照のこと。Repおよび/またはCap発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第5139941号を参照のこと。用語補助機能accessoryfunctionは、AAVがその複製のために依存する、非AAV由来ウイルス性および/または細胞性機能をいう。従って、この用語は、AAV複製のために必要とされるタンパク質およびRNAAAV遺伝子転写の活性化、時期特異的AAVmRNAスプライシング、AAVDNA複製、Cap発現産物の合成およびAAVキャプシドアセンブリに関与する部分を含むを捕らえる。ウイルスに基づく補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス1型単純ヘルペスウイルス以外およびワクシニアウイルスのような任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。例えば、アデノウイルス由来補助機能は広く研究されており、そして補助機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、そして部分的に特徴付けられている。例えば、CarterBJアデノ随伴ウイルスヘルパー機能CRCHandbookofParvoviruses、第I巻PTijssen編、およびMuzyczkaNCurrTopicsMicrobiolandImmun15897129を参照のこと。詳細には、初期アデノウイルス遺伝子領域E1a、E2a、E4、VAIRNAおよびおそらくE1bは、補助プロセスに関与すると考えられている。Janikら、ProcNatlAcadSciUSA7819251929。ヘルペスウイルス由来補助機能は、記載されている。例えば、Youngら、ProgMedVirol25113を参照のこと。ワクシニアウイルス由来補助機能もまた記載されている。例えば、CarterBJ、前出、Schlehoferら、Virology152110117を参照のこと。用語補助機能ベクターは、一般に、補助機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。補助機能ベクターは、適切な宿主細胞中にトランスフェクトされ得、ここで次いでベクターは、宿主細胞におけるAAVビリオン産生を支持し得る。天然に存在するままの感染性ウイルス粒子例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス粒子は、明白にこの用語から排除される。従って、補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。効率的なrAAVビリオン産生を支持し得るにより、宿主細胞のアデノウイルスヘルパーウイルスでの感染に際して得られ得るレベルと実質的に等価なまたはそれより高いレベルで、特定の宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を相補するに十分である補助機能を提供する、補助機能ベクターまたは系の能力をいう。従って、効率的なrAAVビリオン産生を支持する、補助機能ベクターまたは系の能力は、補助ベクターまたは系を使用して得られるrAAVビリオン力価を、感染性アデノウイルスでの感染を使用して得られる力価と比較することにより決定され得る。より特定すると、等価な数の宿主細胞から得られるビリオンの量が、アデノウイルス感染を使用して得られる量の約200分の1以上、より好ましくは約100分の1以上、そして最も好ましくはアデノウイルス感染を使用して得られる量に等しいかまたはそれより多い場合、補助機能ベクターまたは系は、感染性アデノウイルスを使用して得られると実質的に同一またはそれより多い効率的なrAAVビリオン産生を支持する。組換えウイルスにより、例えば、粒子中への異種核酸構築物の付加または挿入によって、遺伝子的に改変されているウイルスが意味される。AAVビリオンにより、野生型wtAAVウイルス粒子AAVキャプシドタンパク質コートと結合した直鎖状、一本鎖AAV核酸ゲノムを含むのような完全なウイルス粒子が意味される。これに関して、いずれかの相補的センスsenseの一本鎖AAV核酸分子例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖は、任意の1つのAAVビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は等しく感染性である。組換えAAVビリオンまたはrAAVビリオンは、本明細書中では、両側においてAAVITRにより隣接される、目的の異種ヌクレオチド配列を包膜するAAVタンパク質外皮から構成される感染性、複製欠損性ウイルスとして定義される。rAAVビリオンは、その中に導入されたAAVベクター、AAVヘルパー機能および補助機能を有している適切な宿主細胞において産生される。この方法において、宿主細胞は、AAVベクター目的の組換えヌクレオチド配列を含むをその後の遺伝子送達のための感染性組換えビリオン粒子中にパッケージングするために必要とされるAAVポリペプチドをコードし得るようにされる。用語トランスフェクションは、細胞による外来DNAの取り込みをいうように使用され、そして外因性DNAが細胞膜の内側に導入されている場合に、細胞はトランスフェクトされている。多くのトランスフェクション技術が当該分野で一般に公知である。例えば、GrahamらVirology52456、SambrookらMolecularCloningalaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoriesNewYork、DavisらBasicMethodsinMolecularBiologyElsevier、およびChuらGene13197を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞中に、1つ以上の外因性DNA部分例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよびその他の核酸分子を導入するために使用され得る。用語宿主細胞は、AAVヘルパー構築物、AAVベクタープラスミド、補助機能ベクター、または他の移入DNAのレシピエントとして使用され得る、または使用されている、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される場合、宿主細胞は、一般に、外因性DNA配列でトランスフェクトされている細胞をいう。単一の親細胞の子孫が、自然の変異、偶発的な変異、または故意の変異によって、元の親と形態においてまたはゲノムDNA相補complementもしくは全DNA相補において必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。本明細書で使用される場合、用語細胞株は、インビトロにおける連続的または延長された増殖および分裂が可能である細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一の始原細胞に由来するクローン性集団である。自発的な変化または誘導された変化が、このようなクローン性集団の貯蔵または移入の間に、核型において生じ得ることは、当該分野でさらに公知である。それゆえ、言及される細胞株に由来する細胞は、先祖細胞または先祖培養物と正確に同一でなくてもよく、そして言及される細胞株はこのような変異体を含む。用語異種は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、通常は一緒には連結されていない、および/または通常は特定の細胞に伴われていない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの異種領域は、天然では他の分子に結合して見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列に結合して見出されない配列により隣接されるコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然では見出されない構築物である例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列。同様に、細胞中に通常には存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると考えられる。対立遺伝子変異または天然に生じる変異事象は、本明細書で使用される場合、異種DNAを生じない。コード配列または特定のタンパク質をコードする配列は、適切な調節配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボにおいて転写されDNAの場合そしてポリペプチドに翻訳されるmRNAの場合核酸配列である。コード配列の境界は、5アミノ末端における開始コドンおよび3カルボキシ末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列さえも含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の3側に位置する。核酸配列は、DNAまたはRNA配列をいう。この用語は、以下のような、しかしそれらに限定されない任意の公知のDNAおよびRNAの塩基アナログを含む配列を捕らえる:4アセチルシトシン、8ヒドロキシN6メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5ウラシル、5フルオロウラシル、5ブロモウラシル、5カルボキシメチルアミノメチル2チオウラシル、5カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6イソペンテニルアデニン、1メチルアデニン、1メチルシュードウラシル、1メチルグアニン、1メチルイノシン、22ジメチルグアニン、2メチルアデニン、2メチルグアニン、3メチルシトシン、5メチルシトシン、N6メチルアデニン、7メチルグアニン、5メチルアミノメチルウラシル、5メトキシアミノメチル2チオウラシル、βDマンノシルキューオシン、5メトキシカルボニルメチルウラシル、5メトキシウラシル、2メチルチオN6イソペンテニルアデニン、ウラシル5オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル5オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2チオシトシン、5メチル2チオウラシル、2チオウラシル、4チオウラシル、5メチルウラシル、Nウラシル5オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル5オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、2チオシトシン、および26ジアミノプリン。用語DNA制御配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位IRES、エンハンサーなどを集合的にいい、これらはレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。用語プロモーター領域は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域をいうためのその普通の意味で本明細書において使用され、ここで、調節配列は、RNAポリメラーゼを結合し得、そして下流3方向のコード配列の転写を開始し得る遺伝子に由来する。作動可能に連結は、そのように記載される成分がそれらの通常の機能を実行するように配置されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る。制御配列は、それがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なお、コード配列に作動可能に連結されていると考えられ得る。ヌクレオチド配列に言及する場合、単離されたにより、示される分子が、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下で存在することが意味される。従って、特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう;しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を与えないいくらかのさらなる塩基または部分を含み得る。本出願を通して特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して上流、下流、3、または5に位置すると記載される場合、これは、当該分野において慣習的であるようにいわれる、DNA分子のセンス鎖またはコード鎖における配列の位置であると理解されるべきである。相同性は、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド部分間の同一性の割合をいう。1つの部分由来の配列と別の部分由来の配列との間の対応は、当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインさせ、そして容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによって、2つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同性は、相同性領域間での安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼ単数または複数での消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。上記の方法を使用して決定したところ、少なくとも約80、好ましくは少なくとも約90、および最も好ましくは少なくとも約95のヌクレオチドまたはアミノ酸が、規定された長さの分子にわたってマッチする場合、2つのDNAまたは2つのポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。所定のポリペプチドの機能的ホモログまたは機能的等価物は、天然のポリペプチド配列に由来する分子、および、所望の結果を達成するように参照分子と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリペプチドを含む。従って、AAVRep68またはRep78の機能的ホモログは、組み込み活性が残存する限り、これらのポリペプチドの誘導体およびアナログその内部でまたはアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる、任意の単一のまたは複数のアミノ酸の付加、置換、および/または欠失を含むを含む。所定のアデノウイルスヌクレオチド領域の機能的ホモログまたは機能的等価物は、異種アデノウイルス血清型に由来する類似の領域、別のウイルスまたは細胞性供給源に由来するヌクレオチド領域、ならびに、所望の結果を達成するように参照ヌクレオチド領域と同様の様式で機能する、組換えで産生される、または化学的に合成されるポリヌクレオチドを含む。従って、アデノウイルスVARNA遺伝子領域またはアデノウイルスE2a遺伝子領域の機能的ホモログは、ホモログが、バックグランドより上の検出可能なレベルでAAVビリオン産生を支持するためにその固有の補助機能を提供する能力を保持する限り、このような遺伝子領域の誘導体およびアナログ領域内で生じる、任意の単一のまたは複数のヌクレオチド塩基の付加、置換、および/または欠失を含むを含む。B一般的方法本発明の中心は、ヘルパーウイルスによる感染なしに効率的にrAAVビリオンを産生させる補助機能系の開発である。従来の産生方法と異なり、補助機能は、rAAVビリオン産生を補うために必要な遺伝子を含む一つ以上のベクター例えば、プラスミドを宿主細胞へ導入することにより提供される。この様式で、本補助機能系は、有意なレベルのヘルパーウイルス粒子または他のウイルス産生物例えば、アデノウイルス繊維タンパク質に汚染されずに産業的に有意なレベルのrAAVビリオンの産生を支持し得る。rAAVビリオンの効率的な産生は、rAAVビリオンの収量が、補助機能を提供するための2型アデノウイルス感染を用いたときに得られるレベルより、約200倍より低くないレベルで得られる場合に達成される。補助機能は、一つ以上のベクター上で提供される。ベクターは、rAAVビリオンの産生のために必要なアデノウイルス由来のヌクレオチド配列を含む。以下にさらに記載されるように、補助機能構築物上に存在する配列は、使用される宿主細胞によって決定され、そしてE1a、E1b、E2a、E4、およびVARNA領域を含み得る。任意の特定の理論に拘束されることなく、アデノウイルスE1b、E2a、およびE4初期遺伝子によって提供される補助機能は、AAVのDNA複製において必要とされると考えられる。アデノウイルスE1b、E4、およびVARNA遺伝子領域によって提供される補助機能は、AAVの生活環において転写後事象または翻訳事象に関与するようである。E4によって提供される補助機能に関しては、E4コード領域のオープンリーディングフレーム6によってコードされるE434kDタンパク質のみが、明らかにAAV複製に必要とされる。アデノウイルス遺伝子領域E1aによって提供される補助機能は、他のアデノウイルス遺伝子領域E1b、E2a、E4およびVARNAを含むの転写または発現を活性化する調節因子として必要であると考えられる。あるいは、本発明の補助機能ベクターは、それぞれのホモログが、置換されたアデノウイルス遺伝子の補助機能を提供する能力を保有する限り、アデノウイルス遺伝子配列を置換する一つ以上のポリヌクレオチドホモログを含み得る。従って、相同なヌクレオチド配列は、別のアデノウイルス血清型例えば、2型アデノウイルス、別のヘルパーウイルス部分例えば、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスに由来し得、または任意の他の好適な供給源に由来し得る。さらに、本発明に従って構築された補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。あるいは、ベクターは、適切な制御エレメントおよび酵素と結合される場合、宿主細胞において補助機能を提供するために転写または発現され得る一つ以上の線状化されたDNAまたはRNAフラグメントの形態であり得る。上記のベクターの全ては、当該分野に公知のトランスフェクション技術を使用して、好適な宿主細胞に容易に導入され得る。このようなトランスフェクション方法は、カルシウムリン酸供沈Virol52456467、培養細胞への直接マイクロインジェクションCell22479488、エレクトロポレーションBioTechniques6742751、リポソーム媒介遺伝子導入BioTechniques6682690、脂質媒介トランスフェクションProcNatlAcadSciUSA8474137417および、高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達Nature3277073を含み、これら文献に記載されている。補助機能ベクターは従来の組換え技術を使用して操作され得る。詳細には、核酸分子は、例えば、ポリリンカーオリゴヌクレオチドなどを使用してクローニングベクターに制限酵素フラグメントを連結することによって、一つ以上の補助機能ヌクレオチド配列を構築物に挿入することにより、任意の所望される順序で容易にアセンブリされ得る。次いで、新たに形成された核酸分子は、ベクターから切り出され得、そして制限酵素または当該分野に周知の他の技術を使用して適切な発現構築物中に配置され得る。より詳細には、選択されたアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域例えば、E1a、E1b、E2a、E4、およびVARNA、あるいはそれらの機能的ホモログは、ウイルスゲノムから、または同じものを含むベクターから切り出され得、そして標準の連結技術例えば、Sambrookら、前出、に記載を使用して、好適なベクターに個々に、または共に連結されて挿入されて補助機能構築物を提供し得る。図2に関連して、そのような構築物の一つは、5型アデノウイルスゲノム由来の4つの核酸分子VARNAを含む領域;E2aを含む領域;E4を含む領域、およびE1a、E1bを含む領域を含むように操作され得る。詳細には、図2は以下を示す:1724bpのSalIHinDIIIフラグメントであるVARNAを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約9831から約11555の位置にわたるヌクレオチドに対応する;5962bpのSrfIBamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約21606から約27568の位置にわたるヌクレオチドに対応する;3669bpのHphIHinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約32172から約36841の位置にわたるヌクレオチドに対応する;および4102bpのBsrGIEco47IIIフラグメントであるE1a、E1bを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約192から約4294の位置にわたるヌクレオチドに対応する、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の完全な相補を提供する。連結は、20mMTrisClpH75、10mMMgCl2、10mMDTT、33μgmlBSA、10mM~50mMNaCl、および40μMATP、0°Cで001~002ユニットのT4DNAリガーゼ付着末端連結のため、または1mMATP、14°Cで03~06ユニットのT4DNAリガーゼ平滑末端連結のためのいずれか中で達成され得る。分子内付着末端連結は、通常、30~100μgmlの総DNA濃度で実施される5~100nMの最終濃度。次いで、アセンブリされた分子は、補助機能構築物を細胞間で転移し得る発現ベクターに容易に挿入され得る。あるいは、一つ以上の補助機能を含む核酸分子は、当該分野の従来の固相直接オリゴヌクレオチド合成化学および酵素連結方法の組合せを使用して、合成的に得られ得る。合成配列は、制限酵素部位のような特徴を有するように構築され得、そして市販のオリゴヌクレオチド合成装置例えば、AppliedBiosystemsIncから入手可能の装置でホスホルアミダイト方法を使用して調製され得る。例えば、Beaucageら、TetrahedronLett2218591862を参照のこと。2型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、一般的に公知であり、そして公的に入手可能である例えば、GeneBank参照名:ADRCG、アクセス番号:J01917;およびNCBI同定番号:209811。5型アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列は、2型アデノウイルスゲノムと99相同であると考えられている。哺乳動物細胞における合成分子の発現に好ましいコドンもまた、容易に合成され得る。次いで、完全な核酸分子が、上記の方法によって調製された重複したオリゴヌクレオチドからアセンブリされる。例えば、EdgeNature292756Nambairら、Science2231299Jayら、JBiolChem2596311を参照のこと。アデノウイルス遺伝子領域が、補助機能を提供するために本発明のベクターにおいて使用される場合、これらの領域は、これらの転写または発現を指向する制御配列に作動可能に連結される。このような制御配列は、通常、野生型アデノウイルスゲノム中の遺伝子領域と結合されたこれらのアデノウイルス制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が所望される場合、使用され得る。有用な異種プロモーター配列は、哺乳動物遺伝子またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するプロモーター配列を含む。例として、相同なアデノウイルスプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳ガンウイルスLTRプロモーター;アデノウイルス主要後期プロモーター;単純ヘルペスウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター例えば、CMV即時初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに制限されない。さらにマウスメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス遺伝子由来の配列もまた、本明細書中において使用が見出される。このようなプロモーター配列は、例えば、Stratageneから市販されている。さらに、本発明のベクターはまた、選択マーカーを含むように構築され得る。好適なマーカーは、核酸構築物でトランスフェクトされた細胞が適切な選択培地で増殖される場合に、抗生物質耐性、または感受性を与える遺伝子、または色を与える遺伝子、または抗原的特徴を変化する遺伝子を含む。本発明の実施において有用な特定の選択マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンB耐性遺伝子アミノグリコシドリン酸転移酵素をコードするを含み、これはG418に対する耐性を与えることにより哺乳動物細胞における選択を可能にするSigmaStLouisMOから入手可能。他の好適なマーカーは当業者に公知である。アデノウイルスの補助機能遺伝子または遺伝子領域例えば、E1a、E1b、E2a、E4、VARNA、および/またはそれらの機能的ホモログの完全な相補物を含む補助機能ベクターは、ヘルパーウイルスに寛容でない宿主細胞例えば、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染可能でない、またはヘルパーウイルスの複製を支持し得ないを含む宿主細胞に補助機能を提供するために使用され得る。この様式で、rAAVビリオン産生は、以前はそのような産生の支持に対しては屈折していた宿主細胞を含む広範な宿主細胞において実施され得る。あるいは、補助機能ベクターは、補助機能の完全相補を下回るものを含むように構築され得る。このようなベクターは、すでに一つ以上の補助機能を与え得る細胞、例えば、一つ以上の補助機能を遺伝的に例えば、細胞が補助機能のホモログを発現する場合、または形質転換事象によって与えられる細胞において使用され得る。補助機能の完全相補を下回るものを含む補助機能ベクターはまた、他の補助的な補助機能構築物と組み合わせて使用され得る。詳細には、好適な宿主細胞は、通常の組換え技術を使用して操作されて、一つ以上の補助機能を提供する細胞を産生し得る。例えば、ヒト細胞株293は、5型アデノウイルスDNAフラグメントで形質転換されたヒト胚腎臓細胞株JGenVirol3659であり、そしてアデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子を発現するVirology94460。293細胞株は、容易にトランスフェクトされ、そしてrAAVビリオンの産生のための特に便利なプラットフォームを提供する。従って、本発明の特に好ましい一つの実施態様において、アデノウイルスE2a、E4およびVARNA遺伝子領域、またはそれらの機能的ホモログのみを有する補助機能ベクターが提供される。図1に関連して、一つのそのような構築物が、5型アデノウイルスゲノム由来の3つの核酸分子:1724bpのSalIHinDIIIフラグメントであるVARNAを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約9831から約11555の位置にわたるヌクレオチドに対応する5962bpのSrfIBamHIフラグメントであるE2aを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約21606から約27568の位置にわたるヌクレオチドに対応する;および3669bpのHphIHinDIIIフラグメントであるE4を含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約32172から約36841の位置にわたるヌクレオチドに対応するを含むように操作され得、ここで核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能の切形の相補を提供する。図3に関連して、別の構築物が、2型アデノウイルスゲノム由来の3つの核酸分子:732bpのEcoRVSacIIフラグメントであるVARNAを含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約10423から約11155の位置にわたるヌクレオチドに対応する;5962bpのSrfIKpnIフラグメントであるE2を含むフラグメント2型アデノウイルスゲノムの約21606から約27568の位置にわたるヌクレオチドに対応する;および3192bpのSrfISpeI改変フラグメントであるE4ORF6を含む改変フラグメント2型アデノウイルスゲノムの約32644から約34120の位置にわたるヌクレオチドに対応するを含むように操作され得る。核酸分子は共に連結されて、一つの補助機能構築物における補助機能のなおさらなる切形の相補を提供する。これらのベクターは組換えおよび/または合成技術を使用して上記のように構築され得、そして異種プロモーター領域、選択マーカーなどのような種々の補助構成成分を含み得る。293宿主細胞へのトランスフェクションに際して、ベクターは、rAAVビリオンの効率的な産生を支持し得る補助機能を提供する。一旦操作されると、本発明の補助機能ベクターは、rAAVビリオン産生のための種々の系に使用され得る。例えば、AAVヘルパー機能を提供するために、細胞において発現され得るAAVベクターおよびAAVヘルパー構築物で同時トランスフェクトされた場合、一つ以上の補助機能ベクターでトランスフェクトされた好適な宿主細胞は、これらによってrAAVビリオンを産生し得る。AAVベクター、AAVヘルパー構築物、および補助機能ベクターは、同時に、または連続的のいずれかで、上記のトランスフェクション技術を使用して宿主細胞に導入され得るようになる。目的のヌクレオチド配列を送達するためのrAAVビリオンを産生するために使用されるAAVベクターは、両方の末端5’末端および3’末端で機能的AAVITRと連結した、一つ以上の異種ヌクレオチド配列を含むように構築され得る。本発明の実施において、AAVベクターは、一般に、少なくとも一つのAAVITRおよび異種ヌクレオチド配列に関して好適に位置された適切なプロモーター配列、ならびに異種配列の下流に位置された少なくとも一つのAAVITRを含む。5’および3’ITRは、これらが意図されたように機能する限り、同じAAV単離物と必ずしも同一である、またはこれに由来する必要はない。AAVベクターにおいて使用するための好適な異種ヌクレオチド配列は、任意の機能的に関連したヌクレオチド配列を含む。従って、本発明の実施において使用するためのAAVベクターは、受容細胞のゲノムから欠損または欠失するタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子、または所望の生物学的もしくは治療効果例えば、抗ウイルス機能を有する非天然のタンパク質をコードする任意の所望の遺伝子のいずれか、あるいはアンチセンスまたはリボザイム機能を有する分子に対応し得る配列を含み得る。好適な遺伝子は、以下の処置のために使用され得る遺伝子を含むが、これらに限定されない:AIDS、ガン、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症のような疾患を含む炎症性疾患、自己免疫、慢性および感染性疾患;種々の貧血、サラセミア、および血友病を含む種々の血液疾患;嚢包性線維症、ゴーシェ病、アデノシンジアミナーゼ欠損、気腫などのような遺伝的欠損。ガン、心血管疾患、およびウイルス性疾患のアンチセンス治療において有用である多くのアンチセンスオリゴヌクレオチド例えば、mRNAの翻訳開始部位の周囲の配列に相補的な短いオリゴヌクレオチドが、当該分野において記載されている。例えば、Hanら、ProcNatlAcadSciUSA8843134317Uhlmannら、ChemRev90543584Heleneら、BiochimBiophysActa104999125Agarwalら、ProcNatlAcadSciUSA8570797083およびHeikkilaら、Nature328445449を参照のこと。好適なリボザイムの論議については、例えば、Cechら、JBiolChem2671747917482、およびGoldbergらの米国特許第5225347号を参照のこと。AAVベクターはまた、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御配列、ならびに選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能にする他の制御エレメントを含み得る。このようなAAVベクターは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、米国特許第5173414号;国際公開番号第WO9201070号1992年1月23日に公開されたおよび同第WO9303769号1993年3月4日に公開された;Lebkowskiら、MolecCellBiol839883996;Vincentら、Vaccines90;Carter、BJCurrentOpinioninBiotechnology3533539;MuzyczkaNCurrentTopicsinMicrobiolandImmunol15897129;KotinRMHumanGeneTherapy5793801;ShellingおよびSmithGeneTherapy1165169;ならびにZhouら1994JExpMed17918671875を参照のこと。本発明の方法において、AAVヘルパー構築物を使用して、AAVベクターから欠失されたAAV機能を相補する。以下を含む多くの適切なAAVヘルパー構築物が記載されている:例えば、repおよびcap発現産物の両方をコードするプラスミドpAAVAdおよびpIM2945例えば、Samulskiら1989JVirol6338223828およびMcCartyら1991JVirol6529362945を参照のこと。この様式においてrAAVビリオン産生を支持する相補性AAVヘルパー機能は、当該分野で容認された技術である。しかし、AAVベクター中に存在するAAVITR配列と、ヘルパー構築物中に存在するAAVヘルパー機能配列との間での相同組換え事象によって、このような技術はまた、rAAVビリオンストック中に野生型AAVビリオンの混入を生じる。AAVに基づくベクター系中の野生型AAV粒子の存在は、組換えAAVビリオンの意図されない拡大を潜在的に導き得、そして外来遺伝子の効率的な発現を妨げ得る。C.実験以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図しない。使用された数字例えば、量、温度などに関する精度を確実にする努力が行われたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。プラスミド構築プラスミドJM17McGroryら1988Virology1636146175型アデノウイルスの環状単離物を、アデノウイルスE1a遺伝子の末端の唯一のXbaI部位に挿入されたプラスミドベクターpBR322Xとともに含むを、アデノウイルス遺伝子の供給源として使用した。5型アデノウイルスおよびpJM17の両方とも完全には配列決定されていない。従って、以下に記載される5型アデノウイルスのフラグメントのサイズはほぼ正確である。2型アデノウイルスが完全に配列決定されており、そして2型および5型アデノウイルスが約99相同であると考えられているので、5型アデノウイルスのフラグメントのサイズは、対応する2型アデノウイルスのフラグメントに基づいて近似される。プラスミドpBSIIVARNAATCCアクセス番号98233を以下のように構築した。約5324bpのHinDIIIHinDIIIフラグメント5型アデノウイルスVARNAIおよびIIコード領域を含むをプラスミドpJM17から得た。5324bpのフラグメントを、プラスミドベクターpBIIskStratageneから入手したのHinDIII部位に挿入した。5324bpのフラグメントは、2型アデノウイルスゲノム例えば、GeneBank参照名称:ADRCG、アクセス番号:J01917;およびNCBI同定番号:209811として公に入手可能の6231位から11555位HinDIII部位に伸びるヌクレオチドに対応する。プラスミドpBSIIE2aE4を以下のように構築した。約15667bpのBamHIXbaIフラグメント5型アデノウイルスE2a、E3、およびE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、ならびに5型アデノウイルスE1aコード領域の一部を含むをプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIskを、BamHIおよびXbaIで切断し、そして15667bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。15667bpのフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの21606位BamHI部位から35937位3末端の遠位末端に伸びるヌクレオチド、および1位5末端の最初から1336位XbaI部位に伸びるヌクレオチドに対応する。プラスミドpBSIIE2aを以下のように構築した。約5935bpのBamHIEcoRIフラグメント5型アデノウイルスE2aコード領域を含むをプラスミドpJM17から得た。プラスミドベクターpBSIIskをBamHIおよびEcoRIで切断し、そして5935bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5935bpのフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの15403位BamHI部位から21338位EcoRI部位に伸びるヌクレオチドに対応する。プラスミドpBSIIE4を以下のように構築した。約5111bpのXhoIXbaIフラグメント5型アデノウイルスE4コード領域、頭と頭で連結されたアデノウイルス末端反復、および5型アデノウイルスE1コード領域の一部を含むをプラスミドpJA17から得た。プラスミドベクターpBSIIskを、XhoIおよびXbaIで切断し、そして5111bpのフラグメントを目的のベクターにクローン化した。5111bpのフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの29788位XhoI部位から35937位3末端の遠位末端に伸びるヌクレオチド、および1位5末端の最初から1336位XbaI部位に伸びるヌクレオチドに対応する。プラスミドpWadhlacZを以下のように構築した。プラスミドpUC119GeneBank参照番号:U07649、GeneBankアクセス番号:U07649を、AflIIIおよびBspHIで部分的に消化し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、次いで連結して、細菌の起点およびamp遺伝子のみを含むポリリンカーおよびF1起点を取り除いたを含む環状の1732bpのプラスミドを形成した。平滑末端化し、そして連結したAflIIIおよびBspHIの連結部は唯一のNspI部位を形成する。1732bpのプラスミドをNspIで切断し、T4ポリメラーゼを用いて平滑末端に改変し、そしてpUC119ポリリンカーから得た20bpのHinDIIIーHinCIIフラグメントクレノウ酵素を用いて平滑末端に改変したを、プラスミドの平滑化したNspI部位に連結した。平滑化したポリリンカー由来のHinDIII部位を再度作製し、次いで細菌の複製起点に隣接して配置した。次いで、得られたプラスミドを唯一のPstISse8387I部位で切断し、そしてSse8387IPvuIISse8387Iオリゴヌクレオチド5GGCAGCTGCCTGCA3配列番号1をそこに連結した。残っている唯一のBspHI部位を切断し、クレノウ酵素を用いて平滑末端に改変し、そしてAscIリンカーを含むオリゴヌクレオチド5GAAGGCGCGCCTTC3配列番号2をそこに連結し、BspHI部位を排除した。得られたプラスミドをpWeeと称した。pWadhlacZ構築物を作製するために、CMVlacZ発現カセットAAVITRによって5および3が隣接されたヌクレオチド配列を含み、ここでヌクレオチド配列は以下のエレメントを含む:CMVプロモーター、hGHの第1のイントロン、adhlacZフラグメント、およびSV40初期ポリアデニル化部位を含むを、複数の工程を用いてpWeeの唯一のPvuII部位に挿入し、その結果CMVプロモーターは、pWeeの細菌のamp遺伝子に隣接して配置された。より詳細には、CMVlacZ発現カセットは、プラスミドpsub201CMVから誘導され、以下のように構築された。制限酵素部位:NotIMluISnaBIAgeIBstBIBssHIINcoIHpaIBspEIPmlIRsrIINotIをコードし、そして以下のヌクレオチド配列:5GCGGCCGCACGCGTACGTACCGGTTCGAAGCGCGCACGGCCGACCATGGTTAACTCCGGACACGTGCGGACCGCGGCCGC3配列番号3を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてpUC119の平滑末端に改変したKasIEarI部位部分的にクローン化して、2757bpのベクターフラグメントを得た。CMV即時初期プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む653bpのSpeISacIIフラグメントを、2757bpのベクターフラグメントのSnaBI部位にクローン化した。さらに、hGHの第1のイントロンをコードするヌクレオチド配列を含む、269bpのPCRで作製したBstBIBstBIフラグメントこれは以下のプライマーを用いて得られた:5AAAATTCGAACCTGGGGAGAAACCAGAG3配列番号4および3aaaattcgaacaggtaagcgcccctTTG5配列番号5を、2757bpのベクターフラグメントのBstBI部位にクローン化し、そしてpCMVβプラスミドClonetechから入手した由来のSV40初期ポリアデニル化部位を含む、135bpのHpaIBamHI平滑末端に改変したフラグメントを、目的のベクターフラグメントのHpaI部位にクローン化して、p11cと称されるプラスミドを得た。次いで、p11cプラスミドをNotIで切断して、第1のCMV発現カセットを得た。プラスミドpsub201Samulskiら、1987JVirol6130963101をXbaIで切断し、平滑末端に改変し、そしてNotIリンカー5TTGCGGCCGCAA3配列番号6をその末端に連結して、細菌の複製起点およびamp遺伝子を含むベクターフラグメントを得た。ここで、ベクターフラグメントはNotI部位に両側で隣接されている。NotIで切断した後、第1のCMV発現カセットをpsub201ベクターフラグメントにクローン化して、psub201CMVを作製した。このプラスミド由来のITRに結合された発現カセットを、PvuIIでの切断によって単離し、そしてpWeeをPvuIIで切断した後、このプラスミドに連結して、pWCMVを作製した。次いで、pWCMVをBssHIIで切断し部分的、そしてadhlacZ遺伝子を含む3246bpのフラグメントプラスミドpCMVβから得たSmaIDraIヌクレオチドフラグメントの末端にAscIリンカー5GAAGGCGCGCCTTC3配列番号7を連結して3246bpのフラグメントを得たを、pWCMVのBssHII部位に連結して、pWadhlacZ構築物を得た。プラスミドpW1909adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4723bpのSpeIEcoRVフラグメントを、プラスミドpGN1909ATCCアクセス番号69871から得た。pGN1909プラスミドは、repコード領域についてその通常の位置野生型AAVゲノムにおける位置から下流になるような構築物に配置されるAAVp5プロモーター領域とともに、AAVrepおよびcap遺伝子を有する高効率AAVヘルパープラスミドである。4723bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー5GAAGGCGCGCCTTC3配列番号8を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。プラスミドpW620adhlacZを以下のように構築した。AAVrepおよびcapコード領域を含む4439bpのMscIフラグメントを、プラスミドpSM620Samulskiら1982ProcNatlAcadSciUSA7920772081から得た。4439bpのフラグメントを平滑末端に改変し、そしてAscIリンカー5GAAGGCGCGCCTTC3配列番号9を平滑末端に連結した。次いで、得られたフラグメントをpWadhlacZの唯一のAscI部位に連結し、そしてAAVコード配列が構築物中の細菌の複製開始点に隣接して配置されるように方向付けした。プラスミドpW1909を以下のように構築した。pW1909adhlacZプラスミドをSse8387で切断し、そして6506bpのSse8387ISse8387Iフラグメントアンピシリン耐性遺伝子、coli1複製起点、およびAAVヘルパー配列を含むを、分子内連結により再環化して、pW1909構築物を得た。pVlacZベクタープラスミドは、pUC119プラスミド中にクローン化されたpW1909adhlacZから得られるSse8387ISse8371Iフラグメントの改変バージョンである。pVlacZのSse8387ISse8371Iは、AAV逆方向末端反復ITR由来ではない全てのAAV配列が排除されている点で、pW1909のSse8387ISse8371Iフラグメントとは異なる。プラスミドpVlacZを以下のように構築した。AAV血清型2の塩基対122~145を下流のNotI適合性末端と組み合わせることによって形成されたDNAの合成断片を構築し、全てのDループを含むAAVITR配列を含むMscINotIフラグメントを得た。合成DNAを、pW1909adhlacZプラスミド由来の4384bpのNotIフラグメントの両末端に連結した。4384bpのフラグメントはCMVlacZ配列を含む。次いで、得られたフラグメントをpW1909adhlacZの6732bpのMscIフラグメントに連結して組立てassembly構築物を得た。組立て構築物をSse8387Iで切断して4666bpのSse8387ISse8371IフラグメントCMVlacZ配列を含むを得、そして4666bpのフラグメントをpUC119中にSse8387I部位で連結してpVlacZベクタープラスミドを得た。実施例1補助機能を供給するためのトランスフェクトされたアデノウイルス遺伝子を用いるrAAVビリオンの産生トランスフェクションによって適切な宿主細胞中に導入されたアデノウイルス遺伝子が、AAV複製の状況におけるアデニウイルス感染によって提供される補助機能に類似の補助機能を提供し得るかどうかを決定するために、以下の実験を行った。安定なヒト細胞株由来の細胞である293例えば、アクセス番号CRL1573のもとでATCCを通じて容易に入手可能を、10cmの組織培養ディッシュに1×106細胞/ディッシュでプレートし、4回の二連の実験群を提供した。次いで、細胞を37°Cで増殖させ、トランスフェクションの前の約24~48時間にわたって90のコンフルエントに到達させた。各群において、プラスミドpW1909adhlacZを、レスキュー可能なAAVlacZベクター、ならびにAAVrepおよびcapコード領域の供給源として使用した。トランスフェクションを、改変されたリン酸カルシウム法を用いて、計20μgのDNAで5時間行った。より詳細には、トランスフェクションの1~4時間前に組織培養プレート中の培地を、10のFCS、1のpenstrep、および1のグルタミンを含有する新鮮なDMEF12培養培地で置き換えた。1以上のベクターを含む計20μgのDNAを、1mLの滅菌した300mMのCaCl2に添加し、次いでこれを1mLの滅菌した2×HBS溶液280mMのNaCl、50mMのHEPES緩衝液、15mMのNa2HPO4を混合し、そして10MのNaOHでpH71に調製することによって形成されるに添加し、そして穏やかに逆さにすることによってすぐに混合した。得られた混合物をすぐに10cmプレートの90のコンフルエント細胞10mLの上記の培養培地中にピペッティングし、そして回転させて均質な溶液を作製した。プレートを5のCO2インキュベーターに移し、そして撹拌せずに約5時間37°Cで培養した。トランスフェクション後、培地をプレートから取り除き、細胞を滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水PBSで1回洗浄した。アデノウイルス作用workingストックを、2型アデノウイルスのマスターストックを、10のFCS、1のpenstrep、1のグルタミン、および25mMの滅菌したHEPES緩衝液pH74を加えたDMEF12中で106pfumlの濃度に希釈することによって調製した。第1群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpBSIIskでトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、1感染多重度moiで2型アデノウイルスを含有する10mLの培地を添加し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。第2群由来の細胞培養物を、各10μgのプラスミドpW1909adhlacZおよびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。第3群由来の細胞培養物を、各10μgのpBSIIskおよびpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。第4群由来の細胞培養物を、各10μgのpW1909adhlacZおよびpBSIIskでトランスフェクトした。トランスフェクション期間の後、培地を置換し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。各実験群由来の細胞を回集し、培地を遠心分離1000×g、10分間によって取り除き、そして1mLの溶解物を、3回の凍結/解凍サイクルドライアイス-エタノールと37°Cとの湯浴の交替を用いて得た。溶解物を遠心分離10000×g、10分間によって破片を含まないようにした。rAAVlacZビリオン産物を、293細胞について凍結/解凍抽出物を力価測定すること、およびlacZについてアッセイすることによって評価した。詳細には、293細胞を12ウェルプレートにウェルあたり1×105細胞でプレートし、そして上記の凍結/解凍溶解物の容量範囲10~001μLで接種し、そして37°Cで24時間インキュベートした。次いで、培地の除去、2のホルムアルデヒドおよび02のグルタルアルデヒドを含有するPBS中での5分間の細胞のインキュベーション、PBSで1回の洗浄、次いで5mMのフェロシアン化カリウム、5mMのフェリシアン化カリウム、2mMの塩化マグネシウム、および1mgmlのXGalを含有するPBS中での一晩の細胞のインキュベーションによって、細胞を固定し、そして染色したSanesら、膜BioRadRichmondCAをサイズにカットし、そしてドットプロット装置にアセンブリした。DNA試料を、200λの2×アルカリ性溶液08MNaOH、20mMEDTAを用いて変性させ、そして、5分後に、膜を2×SSC溶液中で1分間リンスし、濾紙上で乾燥させ、次いで、80°Cで約30分間真空下でベーキングした。ハイブリダイゼーション緩衝液1mMEDTA、40mMNa2HPO4pH72、7SDS中で65°C30分間ハイブリダイゼーションを行った。次いで、フィルターを洗浄し、そして約20時間オートラジオグラフし、放射活性をシンチレーションカウンティングを用いて決定した。実験の結果を、以下の表2に示す。表2に示される結果から見られ得るように、単離されたアデノウイルス遺伝子領域は、首尾良く宿主細胞にトランスフェクトされて、rAAVビリオン複製にとって必要かつ十分な補助機能を提供し得る。さらに、第3群および第5群で得られた結果は、アデノウイルスVARNA領域はrAAVビリオンの複製にとって必須ではないことを示している。しかし、この領域は、アデノウイルス感染を用いて得られるrAAV力価に匹敵するrAAV力価を得るために必要である。実施例3rAAVビリオン産生に対するアデノウイルスVARNA投薬量の相関宿主細胞に供したトランスフェクトされたアデノウイルスVARNA遺伝子領域の量と、宿主細胞中の補体rAAV複製へ提供された補助機能のレベルとの間に相関が存在するか否かを調査する目的で、以下の実験を行った。293細胞を、10cmの組織培養皿に1×106細胞/皿でプレートし、そしてトランスフェクション前に約24~48時間の期間にわたって、37°Cで約90のコンフルエンシーに達するまで培養した。トランスフェクションを、上記実施例1に記載のように行った。詳細には、293細胞を、5μgのプラスミドpW1909adhlacZ、10μgのプラスミドpBSIIE2aE4および0~25μgのプラスミドpBSIIVARNAでトランスフェクトして、プラスミドを有するVARNAの他のプラスミドに対するモル比を0~5の範囲にわたって変動した。トランスフェクション期間の後、培地を交換し、そして細胞を37°Cで約72時間インキュベートした。次いで各実験群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離1000×g、10分間によって除去し、そして1mLの溶解物を、3回の冷凍/解凍サイクルドライアイス-エタノール浴と37°C浴との交替を用いて産生した。遠心分離10000×g、10分間によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでAAVlacZベクターの産生を、実施例1に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表3に示す。表3から見られ得るように、アデノウイルスVARNAは、アデノウイルス感染で得られるレベルと実質的に等価なレベルでrAAVビリオン産生を得るのに必要とされるにもかかわらず、調製された範囲におけるVARNA/他のアデノウイルス遺伝子領域の比の変動はrAAVビリオンの産生に著しく影響を及ぼさない。実施例4補助機能におけるアデノウイルスE2a、E4およびVARNA遺伝子領域に対する要求の実証rAAVビリオン産生についての補助機能の提供におけるアデノウイルスE2a、E4およびVARNA遺伝子領域の相対的寄与を確率する目的で、以下の実験を行った。293細胞を、10cmの組織培養皿に1×106細胞/皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24~48時間の期間にわたって、37°Cで約90のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例1に記載のように行った。293細胞培養物を、5μgのプラスミドpW1909adhlacZ、および15μg全体の以下のプラスミドの全ての組み合わせまたはその一対の組み合わせのいずれかで同時トランスフェクトして、E2a、E4およびVARNAをコードする各アデノウイルス遺伝子領域を同時トランスフェクションから排除する培養物を提供した:pBSIIE2a;pBSIIE4;およびpBSIIVARNA。トランスフェクション期間後に、培地を交換し、そして細胞を37°Cで約72時間インキュベートした。次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離1000×g、10分間によって除去し、そして1mLの溶解物を、3回の冷凍/解凍サイクルドライアイス-エタノール浴と37°C浴との交替を用いて産生した。遠心分離10000×g、10分間によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例1に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表4に示す。表4に示された結果から見られ得るように、各アデノウイルス遺伝子領域E2a、E4およびVARNAは、rAAVビリオン産生を支持するのに必要な補助機能を提供する必要は全くない。しかし、全ての遺伝子領域は、アデノウイルス感染で得られるレベルに匹敵するrAAVビリオンのレベルを産生するために必要である。より詳細には、プラスミド含有VARNAを同時トランスフェクションから省略することにより、rAAVビリオン産生の7倍の低下7×108機能的単位/10cm皿をもたらした。rAAVビリオンの産生は、E4およびE2a含有プラスミドの同時トランスフェクションからの省略によって、さらに著しく影響された。E4構築物の省略により、産生の83倍の低下6×107機能的単位/10cm皿になり、そしてE2構築物の省略により、rAAVビリオン産生の10000倍の低下5×105機能的単位/10cm皿になった。実施例5pW1909adhlacZまたはpW620adhlacZに基づくAAVヘルプを用いたrAAVビリオン産生の比較野生型または改変型AAVヘルプ機能AAVrepおよびcapコーディング領域のいずれかを含むAAVヘルパー構築物とともに非ウイルス補助機能系を用いて、宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率を比較する目的で、以下の実験を行った。293細胞を、10cmの組織培養皿に1×106細胞/皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24~48時間の期間にわたって、37°Cで約90のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例1に記載のように行った。第一セットの293細胞培養物を、5μgのプラスミドpW620adhlacZ野生型AAVヘルプ機能を含む、10μgのプラスミドpBSIIE2aE4および5μgのプラスミドpBSIIVARNAで同時トランスフェクトした。第2セットの293培養物を、5μgのプラスミドpW1909adhlacZ改変型AAVヘルプ機能を含む、10μgのプラスミドpBSIIE2aE4および5μgのプラスミドpBSIIVARNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。次いで各同時トランスフェクション群由来の細胞を回収し、培地を遠心分離1000×g、10分間によって除去し、そして1mLの溶解物を、3回の冷凍/解凍サイクルドライアイス/エタノール浴と37°C浴との交替を用いて産生した。遠心分離10000×g、10分間によって破片を含まない溶解物を作製した。次いでrAAVlacZビリオンの産生を、実施例1に記載の技法を用いて評価した。実験の結果を以下の表5に示す。表5に示された結果から見られ得るように、AAVヘルプの野生型と改変型の両方はrAAVビリオンの産生をほぼ同レベルで支持した。実施例6プラスミドに基づく補助機能のrAAVビリオンの産生効率の比較プラスミドに基づく単離された補助機能、それらの組み合わせ、ならびにアデノウイルスVARNA、E4およびE2a遺伝子領域上記のpladeno1プラスミドを含有する単一の構築物を用いて宿主細胞中のrAAVビリオン産生の効率と、2型アデノウイルスad2感染を用いて得られるrAAVビリオン産生の効率とを比較する目的で、以下の実験を行った。1.pladeno1およびpladeno1E1の構築:pladeno1プラスミドアデノウイルスVARNA、E4およびE2a遺伝子領域を含むを、5型アデノウイルス遺伝子をpBSIIskのPvuII部位の間に挿入された慣例のポリリンカーにクローニングすることによってアセンブリした。pladeno1構築物の地図は、図1に示される。より詳細には、制限酵素部位SalIXbaIEcoRVSrfIBamHI5GTCGACAAATCTAGATATCGCCCGGGCGGATCC3:配列番号10をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドポリリンカーを、pBSIIskの2513bpのPvuIIベクターフラグメントに連結して、アセンブリプラスミドを提供した。次いで、5型アデノウイルス遺伝子または遺伝子領域を含む以下のフラグメントを、pJM17プラスミドから得た:1724bpのSalIHinDIIIVARNA含有フラグメント2型アデノウイルスゲノムの約9831~約11555位にわたるヌクレオチドに対応する;5962bpのSrfIBamHIE2a含有フラグメント2型アデノウイルスゲノムの約21606~約27568位にわたるヌクレオチドに対応する;および3669bpのHphIHinDIIIE4含有フラグメント2型アデノウイルスゲノムの約32172~約36841位にわたるヌクレオチドに対応する。XbaI部位を、E4を含むフラグメントのHphI末端に、クローニングベクターのHpaI部位に3669bpのHphIHinDIIIフラグメントをクローニングし、次いでそのフラグメントをXbaIおよびHinDIIIで切除する部分切断ことによって加えた。5962E2aを含むフラグメントを、アセンブリプラスミドのSrfI部位とBamHI部位の間にクローン化し、そして1724bpのVARNA含有フラグメントおよび改変型3669bpのE4含有ラグメントを、それらの共通HinDIII末端によって結合させ、そしてアセンブリプラスミドのSalIとXbaI部位との間に連結して、pladeno1構築物を得た。図2に参照されるように、pladeno1E1プラスミドを以下のようにアセンブリした。4102bpのBsrGIEco47IIIフラグメント5型アデノウイルスのElaおよびElbコード領域を含むを、pJK17プラスミドから得た。被験体フラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの約192~約4294位にわたるヌクレオチドに対応する。4102bpのフラグメントを、平滑末端改変し、そして次いで、pladeno1プラスミドのVARNAフラグメント中のHpaI部位に挿入して、pladeno1E1プラスミドを得た。2.rAAVビリオン産生のアッセイ:293細胞を、10cmの組織培養皿に1×106細胞/皿でプレートし、そして同時トランスフェクション前に約24~48時間の期間にわたって、37°Cで約90のコンフルエンシーに達するまで培養した。全てのトランスフェクションを、上記の実施例1に記載のように行った。全ての293細胞培養物を、5μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトした。また、培養物の実験群を、補助機能含有プラスミドまたはコントロールプラスミドpBSIIskのそれぞれの5μgの種々の組み合わせで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの後、培地を交換し、そして培養物を37°Cで約72時間インキュベートした。比較として、2型アデノウイルスmoi=1を含む10mLの培地を、5μgのプラスミドpW1909adhlacZでトランスフェクトされた293細胞に加え、そして37°Cで約72時間インキュベートした。次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離1000×g10分間により培地を除去した。そして、3回の凍結/融解サイクルドライアイス-エタノール浴および37°C浴を交互にするを使用して1mLの溶解産物を生成した。遠心分離10000×g10分間により、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例1に記載される技術を使用して、rAAVlacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表6に示す。表6の結果が示し得るように、pladeno1構築物は、効率的なrAAVビリオン産生を支持し得る2型アデノウイルス感染を使用して得られるレベルと実質的に同じレベル。補助機能構築物pBSIIE2a、pBSIIE4、およびpBSIIVARNAの組み合わせはまた、ad2感染と実質的に等価なレベルの効率的なrAAVビリオン産生を支持し得た。補助機能構築物pBSIIE2aE4およびpBSIIVARNAの組み合わせは、rAAV産生を支持し得たad2感染レベルより10倍下回る;そして、E2aを含む構築物pBSIIE2aは、ad2感染を使用して得られるレベルより約200倍下回るレベルのrAAV産生を支持した。実施例7アデノウイルスに基づくかまたはプラスミドに基づく補助機能を使用して得られる大規模rAAVビリオン産生の比較2型アデノウイルスad2に基づくか、またはpladeno1に基づく補助機能のいずれかを使用して産生されるrAAVビリオンの大規模調製を比較するために、次の実験を行った。実施例1に記載のトランスフェクション方法を使用して、ヒトエリスロポエチン遺伝子を含むAAVベクターで約109個の293細胞をトランスフェクトした。補助機能の供給源として、一方の調製物はpladeno1構築物で同時トランスフェクトし、他方の調製物は2型アデノウイルスで感染させた。適切なインキュベーション期間の後に、次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離1000×g10分間により増殖培地を除去した。そして、3回の凍結/融解サイクルドライアイス-エタノール浴および37°C浴を交互にするを使用して溶解産物を生成した。遠心分離10000×g10分間により溶解産物から破片を無くして、粗溶解産物を得た。精製した試料を得るために、粗溶解産物を密度勾配遠心分離に供した。各調製により産生されるrAAVゲノムの量を、実施例2に記載のドットブロットアッセイにより定量した。実験の結果を以下の表7に示す。表7の結果が示し得るように、pladeno1に基づく補助機能を使用した調製は、2型アデノウイルスに基づく補助機能を使用した調製から得られた収率より24倍大きなrAAVビリオン収率を提供した。実施例8rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与の決定rAAVビリオン産生における個々のアデノウイルス補助機能の相対的な寄与を決定するために、以下の実験を行った。個々のアデノウイルス補助機能単独または組み合わせのいずれかを使用して、宿主細胞におけるrAAVビリオン産生を補助した。さらに、E2aおよびE4ORF6領域全体を含み、そして相同プロモーターにより駆動される構築物pBSIIE2aおよびpBSIIE4構築物を、CMVで駆動されるE2aまたはE4ORF6構築物p33cE2Aおよびp33cE4ORF6構築物、下記に置換した効果を評価した。1.p33cE2Aおよびp33cE4ORF6の構築:5型アデノウイルスE2a72kDDNA結合タンパク質および5型アデノウイルスE4オープンリーディングフレーム6ORF6タンパク質をコードする構造遺伝子を、それぞれ、CMVで駆動される発現構築物p33cにクローニングし、それぞれ、p33cE2Aプラスミド構築物およびp33E4ORF6プラスミド構築物を提供した。プラスミドp33cを以下のように構築した。pUC119ベクター配列を含む、p11c由来2732bpNotIフラグメントを、以下の制限部位を含む合成DNAフラグメントに連結した:NotIMluIEcl136IISacIIBstBIBssHIISrfIBssHIIBglIISnaBIBstEIIPmlIRsrIIおよびNotI。合成DNAフラグメントの配列は:5GCGGCCGCACGCGTGAGCTCCGCGGTTCGAAGCGCGCAAAGCCCGGGCAAAGCGCGCAGATCTACGTAGGTAACCACGTGCGGACCGGCGGCCGC3配列番号:11である。サイトメガロウイルス前初期CMVIEプロモーターを含む653bpSpeISacIIフラグメント;以下のプライマー5AAAATTCGAACAGGTAAGCGCCCCTTTG3配列番号:12および3AAAATTCGAATCCTGGGGAGAAACCAGAG5配列番号:13を使用して得られた、hGH第一イントロンをコードする、269bpのPCR産生BstBIBstBIフラグメント;ならびにpCMVβClonetechより入手由来SV40後期ポリアデニル化部位を含む213bpBamHIBamHI平滑化フラグメントを、それぞれ、合成リンカーのEcl136II、BstBI、およびSnaBI部位にクローニングし、p33c発現構築物を生じた。プラスミドp33cE4ORF6ATCC受託番号98234を、以下のように調製した。5型アデノウイルスE4ORF6をコードする配列を含む、pBSIIE4由来の1024bpBglIISmaIフラグメントを入手し、そして平滑末端に改変した。このフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの33309位SmaI部位から34115位BglII部位に相当する。次いで、改変したフラグメントをp33cのSrfI部位にクローニングし、p33cE4ORF6プラスミドを提供した。プラスミドp33cE2AATCC受託番号98235を、以下のように調製した。pBSIIE2a由来の2467bpMscI部分的BamHIフラグメントを入手した。このフラグメントは、5型アデノウイルスE2aコード配列を含み、そして2型アデノウイルスゲノムの24073位MscI部位から21606位BamHI部位に相当する。2467bpフラグメントをpCITE2ANovageneより入手のMscI部位とBamHI部位との間にサブクローニングし、pCITE2AE2A構築物を提供した。次いで、1636bpNcoI部分的BsrGIフラグメントをpCITE2AE2Aから切り出した。このフラグメントは、E2a72kDタンパク質をコードする配列を含み、そして2型アデノウイルスゲノムの24076位MscINcoI部位から22440位BsrGI部位に相当する。1636bpフラグメントを平滑末端に改変し、そしてp33cにクローニングし、p33cE2Aプラスミドを提供した。2.rAAVビリオン産生アッセイ:293細胞を10cm組織培養ディッシュに2×106細胞/ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクションの前に約48時間の期間にわたって、約90コンフルエンシーに達するまで37°Cで培養した。全てのトランスフェクションは、以下のDNAの組み合わせで、CaPO4法を使用して行った。全ての293細胞培養物を、5μgのプラスミドpW620adhlacZを用いてトランスフェクトした。5μgの種々の補助機能構築物以下の表8に示す通りを使用して、1ディッシュあたり総量20μgのDNAを提供した。4個未満の構築物を入れる試料については、pBSIIDNAを使用してトランスフェクトされるDNAの総量を20μgにした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして補助機能のためにアデノウイルスを使用する培養物は、5のMOIで2型アデノウイルスを受けた。次いで、全ての培養物を、収集前に約72時間、37°Cでインキュベートした。次いで、各ディッシュから細胞を回収し、遠心分離1000×g10分間により培地を除去した。そして、3回の凍結/融解サイクルドライアイス-エタノール浴および37°C浴を交互にするを使用して1mLの溶解産物を生成した。遠心分離10000×g10分間により、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例1に記載の技術を使用して、rAAVlacZビリオン産生を評価した。lacZの力価測定titeringを、アデノウイルスの存在下で行った。全ての試料は、2連でアッセイした。実験の結果を、以下の表8に示す。表8に示す結果が示し得るように、アデノウイルスのE2a、E4、およびVARNA領域は、効率的なrAAVビリオン産生補助機能を提供するためにアデノウイルス感染を使用して得たレベルと実質的に等価なレベルを提供するために全て必要である。しかし、これらの領域の一つが、rAAVビリオン産生のために絶対的に必要であるというわけではない。pBSIIE2aおよびpBSIIE4構築物中にサブクローニングされたE2aおよびE4領域は、いくつかのオープンリーディングフレームORFを、72kDE2aDNA結合タンパク質およびE4ORF6タンパク質のためのORFに加えて含む。上記の研究において、pBSIIE2aおよびpBSIIE4構築物を、CMVで駆動されるp33cE2Aおよびp33cE4ORF6構築物で置換することにより、E2a72kDDNA結合タンパク質およびE4ORF6タンパク質は、他の全てのオープンリーディングフレームがそれらのそれぞれのコード領域に存在しないときに、完全なE2aまたはE4補助機能を提供し得ることが確証された。実施例9pladeno1プラスミドの再構築およびrAAVビリオン産生効率の比較pladeno1の構築に使用したpJM17由来アデノウイルス遺伝子の代わりに、アデノウイルス遺伝子の供給源として精製された2型アデノウイルスDNAを使用して、pladeno1プラスミドを再構築した。再構築したプラスミドはpladeno5と名付けられ、以下に詳細に記載される。この再構築を、プラスミドのサイズ全体を減少させるために行った。さらに、再構築したプラスミドpladeno5はアデノウイルスプロテアーゼをコードしないが、pladeno1はアデノウイルスプロテアーゼをコードする。1.pladeno5の構築:pladeno5プラスミドを以下のように構築した。精製された2型アデノウイルスDNAGibcoBRLより入手より単離した、E2a、E4、およびVARNA領域をコードするDNAフラグメントを、pAmpscriptと呼ばれるプラスミド中に連結した。pAmpscriptプラスミドを、以下のように組立てた:オリゴヌクレオチド指定変異誘発oligonucleotidedirectedmutagenesisを使用して、pBSIIskStratageneより入手からポリリンカーおよびα相補発現カセットcomplementationexpressioncassetteを含む623bp領域を除去し、そしてこれをEcoRV部位で置換した。オリゴヌクレオチド指定変異誘発に使用した変異誘発性オリゴoligoの配列は、5CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTCACTCAA3配列番号:14であった。ポリリンカー以下の制限部位を含む:BamHIKpnISrfIXbaIClaIBst1107ISalIPmeIおよびNdeIを合成し、そして上記で作製したEcoRV部位へ挿入し、その結果、リンカーのBamHI部位を、改変されたプラスミドにおいてf1開始点の近位にして、pAmpscriptプラスミドを提供した。ポリリンカーの配列は、5GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATACGTCGACGTTTAAACCATATG3配列番号15であった。2型アデノウイルスE2aおよびVARNA配列を含むDNAフラグメントを、pAmpscriptに直接的にクローニングした。特に、E2a領域を含む5962bpSrfIKpnI部分的フラグメントを、pAmpscriptのSrfI部位とKpnI部位との間にクローニングした。5962bpフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの21606~27568塩基対を含む。VARNAを含む732bpEcoRVSacII平滑化フラグメントを、pAmpscriptのBst1107I部位にクローニングした。732bpフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの10423~11155塩基対と等価である。pAmpscriptポリリンカーに挿入し得る前に、2型アデノウイルスE4配列を含むDNAを改変しなければならなかった。特に、PCR変異誘発を使用してE4の近位のアデノウイルス末端反復をSrfI部位で置換した。このSrfI部位の位置は、2型アデノウイルスゲノムの35836~35844塩基対と等価である。変異誘発において使用したオリゴヌクレオチドの配列は:5AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC3配列番号16;および5ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC3配列番号:17であった。上記の改変されたE4遺伝子をSrfIおよびSpeIを用いて切断することにより生成した3192bpE4フラグメントを、既にE2aおよびVARNA配列を含むpAmpscriptのSrfI部位とXbaI部位との間に連結し、pladeno5プラスミドを生じた。3192bpのフラグメントは、2型アデノウイルスゲノムの32644~35836塩基対と等価である。2.rAAVビリオン産生アッセイ:293細胞を10cm組織培養ディッシュに1×106細胞/ディッシュでプレートし、そして、同時トランスフェクション前に約24~48時間の期間にわたって、約90コンフルエンシーに達するまで37°Cで培養した。全てのトランスフェクションを、上記実施例1に記載のように行った。293細胞培養物を、5μgのpVlacZベクタープラスミド、5μgのプラスミドpW1909、および5μgのpladeno1またはpladeno5のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を取り替え、そして、培養物を収集前に約72時間、37°Cでインキュベートした。次いで、各実験群から細胞を回収し、遠心分離1000×g10分間により培地を除去した。そして、3回の凍結/融解サイクルドライアイス-エタノール浴および37°C浴を交互にするを使用して1mLの溶解産物を生成した。遠心分離10000×g10分間により、溶解産物から破片を無くした。次いで、実施例1に記載の技術を使用して、rAAVlacZビリオン産生を評価した。実験の結果を、以下の表9に示す。表9に報告された結果が示し得るように、pladeno5を使用した場合に、より大きなrAAVビリオン産生効率が見られたpladeno5の産生は、pladeno1の産生より25倍多いrAAVビリオンを生じた。従って、効率的な組換えAAVビリオン産生を支持し得る、新規な補助機能を記載した。本発明の好ましい実施態様をいくぶん詳細に記載したが、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな変形がなされ得ることが理解される。本発明の実施において有用な株の寄託以下の株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、ブダペスト条約の規定の下に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301ParklawnDriveRockvilleMarylandで行った。示された受託番号は、好結果の生存試験後に交付され、そして必要な手数料を払った。この培養物へのアクセスは、米国特許法施行規則114および米国特許法122条に基づいて権利を与えられる特許庁長官によって決定されたものに対して、特許出願の係属中は利用可能である。本出願に特許が許可された際は、寄託された生物学的物質の公衆への利用可能性について寄託者により課される全ての制限は、米国特許法施行規則§1808に明記されるように、以下の一つの例外はあるが、変更不能に取り除かれる。その例外は、発行された特許の存続期間の間は、試料の請求が以下の3つの条件のいずれか一つまたは全てを満たす場合のみ、寄託物の試料が分譲されることを要求することを寄託機関との間に契約する権利を寄託者が留保することである:1請求は、書面または具体的な形式であり、日付がある;および/または2請求は、請求する当事者の名称およびあて名ならびに寄託物の受託番号を含む;および/または3請求は、寄託機関から寄託者に、試料を分譲した日付ならびに試料の分譲を受けた当事者の名称およびあて名とともに書面で通知される。さらに、示された寄託物は、寄託の日から30年間、もしくは当該寄託物の最終請求の後5年間;または米国特許の実施可能期間のいずれがより長期であっても、維持される。培養物が生存不可能になるか、もしくは不注意に破壊されるか、またはプラスミド含有株の場合にそのプラスミドが失われた際には、培養物は、同一の分類学的記載の生存能力のある培養物単数または複数で置き換えられる。これらの寄託物は、当業者への便宜のためにのみ提供され、そして寄託が必要とされることを認めるわけではない。これらのプラスミドの核酸配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の記載と何らかの矛盾がある場合をコントロールしている。寄託物を製造、使用、または販売するためにライセンスが必要とされ得、そしてこのようなライセンスはこれによって承諾されるわけではない。配列表