"未修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸置換を含む修飾FIXポリペプチドであって、アミノ酸置換が、配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおけるアミノ酸残基R318でのチロシンYへの置換R318Y、R318E、R318F、R318W、R318D、R318I、R318K、R318L、R318M、R318S、R318V、S61A、S61C、S61D、S61E、S61F、S61G、S61I、S61K、S61L、S61P、S61R、S61V、S61W、S61Y、D64A、D64C、D64F、D64H、D64I、D64L、D64M、D64P、D64R、D64S、D64T、D64W、Y155F、Y155L、N157D、N157E、N157F、N157I、N157K、N157L、N157M、N157R、N157V、N157W、N157Y、S158A、S158D、S158E、S158F、S158G、S158I、S158K、S158L、S158M、S158R、S158V、S158W、S158Y、N167D、N167Q、N167E、N167F、N167G、N167H、N167I、N167K、N167L、N167M、N167P、N167R、N167V、N167W、N167Y、T169A、T169D、T169E、T169F、T169G、T169I、T169K、T169L、T169M、T169P、T169R、T169S、T169V、T169W、T169Y、T172A、T172D、T172E、T172F、T172G、T172I、T172K、T172L、T172M、T172P、T172R、T172S、T172V、T172W、T172Y、D203M、D203Y、D203F、D203H、D203I、D203K、D203L、D203R、D203V、D203W、A204M、A204Y、A204F、A204I、A204W、E239S、E239R、E239K、E239D、E239F、E239I、E239L、E239M、E239T、E239V、E239W、E239Y、H257F、H257E、H257D、H257I、H257K、H257L、H257M、H257Q、H257R、H257V、H257W、R312Y、R312L、R312C、R312D、R312E、R312F、R312I、R312K、R312M、R312P、R312S、R312T、R312V、R312W、K316M、K316D、K316F、K316H、K316I、K316L、K316R、K316V、K316W、K316Y、F342I、F342D、F342E、F342K、F342L、F342M、F342S、F342T、F342V、F342W、F342Y、T343R、T343E、T343D、T343F、T343I、T343K、T343L、T343M、T343S、T343V、T343W、T343Y、N346Y、N346E、N346F、N346H、N346I、N346K、N346L、N346M、N346Q、N346R、N346V、N346W、K400E、K400C、K400D、K400F、K400G、K400L、K400M、K400P、K400S、K400T、K400V、K400Y、R403D、R403F、R403I、R403K、R403L、R403M、R403S、R403V、R403Y、E410D、E410S、E410A、E410F、E410G、E410I、E410K、E410L、E410M、E410P、E410R、E410T、E410V、E410W、E410Y、T412A、T412V、T412C、T412D、T412E、T412F、T412G、T412I、T412M、T412P、T412WおよびT412Y、または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換の中から選択され、対応するアミノ酸残基が、配列番号3のポリペプチドとの未修飾FIXポリペプチドのアライメントによって同定され、ただし、修飾FIXポリペプチドが修飾F342I/T343R/Y345Tを含有しない、修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Y、R318E、R318F、R318W、S61A、D64A、Y155F、Y155L、N157D、S158A、S158D、S158E、N167D、N167Q、T169A、T172A、D203M、D203Y、A204M、A204Y、E239S、E239R、E239K、H257F、H257E、R312Y、R312L、K316M、F342I、T343R、T343E、T343D、N346Y、K400E、R403D、E410D、E410S、E410A、T412AおよびT412Vの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1に記載の修飾FIXポリペプチド。R318または318に対応する残基でのアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換が、Y、E、F、およびWの中から選択される、請求項1または請求項2に記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Yを含む、請求項3に記載の修飾FIXポリペプチド。R338でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける338に対応する残基でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項3または請求項4に記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R338DもしくはR338Eまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項3~5のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R338Eを含む、請求項3~6のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。残基R318およびR338でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸残基R318およびR338に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項3~6のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Y/R338Eまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項3~8のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。T343でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸残基T343に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項3または請求項4に記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換T343R、T343E、もしくはT343Dまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~10のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換T343Rを含む、請求項1~11のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。残基R318およびT343でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸残基R318およびT343に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項3~12のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Y/T343Rまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項3~13のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。E410でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸残基E410に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項3~14のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。NもしくはSである、残基E410でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける410に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項3~15のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Y/E410Nまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項3~16のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Yならびに配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドの残基338、343、403、および410の中から選択されるアミノ酸残基でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける残基338、343、403、もしくは410に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項1~17のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおけるR338E、T343R、R403E、およびE410Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~18のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。置換R318YR338ER403EE410N、R318YR338ET343RR403EE410N、R318YR338ET343RE410N、Y155FR318YR338ET343RR403E、Y155FK228NK247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YR338ET343RR403E、K247NN249SR318YR338ET343RR403E、R318YR338ET343R、Y155FK247NN249SR318YR338ET343R、K228NR318YR338ET343RR403EE410N、K228NK247NN249SR318YR338ET343RR403E、R318YR338ET343RR403EE410S、Y155FK247NN249SR318YR338E、K247NN249SR318YR338ET343R、R318YT343RE410N、Y155FR318YR338ER403E、R318YR338ER403E、R318YR338EE410N、K228NR318YE410N、R318YR403EE410N、D203NF205TR318YE410N、A103NN105SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SR318YR338ER403EE410N、K228NR318YR338ER403EE410N、I251SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SI251SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SR318YR338EE410N、I251SR318YE410NR338E、D104NK106SI251SR318YR338EE410N、A103NN105SK247NN249SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SK247NN249SR318YR338ER403EE410N、K228NK247NN249SR318YR338ER403EE410N、A103NN105SY155FR318YR338ER403EE410N、D104NK106SY155FR318YR338ER403EE410N、Y155FK228NR318YR338ER403EE410N、Y155FI251SR318YR338ER403EE410N、K247NN249SR318YR338ER403EE410N、Y155FR318YR338ER403EE410N、K247NN249SR318YR338EE410N、Y155FR318YR338EE410N、Y155FK247NN249SR318YR338EE410N、R318YR338ER403EE410S、R318YR338ER403EE410NT412V、R318YR338ER403EE410NT412A、R318YR338ER403ET412A、R318YR338EE410S、R318YR338ET412A、R318YR338EE410NT412V、D85NK228NR318YR338ER403EE410N、N260SR318YR338ER403EE410N、R318YR338EN346DR403EE410N、Y155FR318YR338EN346DR403EE410N、K247NN249SN260SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SN260SR318YR338ER403EE410N、Y155FN260SR318YR338ER403EE410N、Y155FR318YR338ET343RR403EE410N、D104NK106SY155FK247NN249SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SK228NK247NN249SR318YR338ER403EE410N、Y155FK228NK247NN249SR318YR338ER403EE410N、Y155FK247NN249SN260SR318YR338ER403EE410N、D104NK106SR318YR338ET343RR403EE410N、R318YR338EN346YR403EE410N、R318YR338ET343RN346YR403EE410N、R318YR338ET343RN346DR403EE410N、R318YR338EY345AR403EE410N、K228NI251SR318YR338ER403EE410N、R318YR338EY345AN346DR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YR338ER403E、K247NN249SR318YR338ER403E、Y155FK247NN249SR318YR403EE410N、K247NN249SR318YR403EE410N、R318YR338ET343RR403E、Y155FR318YR338ET343RE410N、R318YT343RR403EE410N、Y155FR318YT343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、K247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、Y155FK228NI251SR318YR338ER403EE410N、N260SR318YR338ET343RR403EE410N、Y155FN260SR318YR338ET343RR403EE410N、K228NK247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YR403E、Y155FK247NN249SR318YE410N、K247NN249SR318YR338ET343RE410N、Y155FK247NN249SR318YR338ET343RE410N、Y155FK247NN249SR318YT343RR403EE410N、K247NN249SR318YT343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YT343RR403E、K247NN249SR318YT343RR403E、Y155FK247NN249SR318YT343RE410N、K247NN249SR318YT343RE410N、Y155FR318YR338ET343R、Y155FR318YT343RR403E、Y155FR318YT343RE410N、K228NK247NN249SR318YR338ET343RE410N、Y155FK247NN249SR318YT343R、Y155FK247NN249SR318YR338ER403EE410N、K228NK247NN249SR318YT343RR403EE410NおよびY155FR318YR403EE410Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~19のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318YR338ER403EE410N、R318YR338ET343RR403EE410N、R318YR338ET343RE410N、Y155FR318YR338ET343RR403E、Y155FK228NK247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR318YR338ET343RR403E、K247NN249SR318YR338ET343RR403E、R318YR338ET343R、Y155FK247NN249SR318YR338ET343R、K228NR318YR338ET343RR403EE410N、K228NK247NN249SR318YR338ET343RR403E、R318YR338ET343RR403EE410S、Y155FK247NN249SR318YR338E、K247NN249SR318YR338ET343R、R318YT343RE410NまたはY155FR318YR338ER403Eを含む、請求項1~20のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R318Y/R338E/R403E/E410N、R318Y/R338E/T343R/R403E/E410N、またはR318Y/R338E/T343R/E410Nを含む、請求項1~21のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドにおけるD203、F205、およびK228の中から選択されるアミノ酸残基でのまたはアミノ酸残基D203、F205、もしくはK228に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項3または4に記載の修飾FIXポリペプチド。D203N、F205T、およびK228Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じアミノ酸置換を含む、請求項1~23のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換D203N/F205T/R318YもしくはK228N/R318Yまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~24のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。FまたはLから選択される、アミノ酸位置Y155でのまたは155に対応する残基でのアミノ酸置換を含む、請求項1~25のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換Y155Fまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~26のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドの残基103、104、105、106、228、251、260、もしくは346でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける103、104、105、106、228、251、260、もしくは346に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項26または請求項27に記載の修飾FIXポリペプチド。A103N、D104N、N105S、K106S、K228N、I251S、N260S、およびN346Dの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~28のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。Y155FK228N、Y155FI251S、D104NK106SY155FK228N、Y155FN346D、Y155FN260S、Y155FN260SN346D、D104NK106SY155FN260S、D104NK106SY155FK228N、A103NN105SY155FおよびD104NK106SY155Fの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~29のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドの338、403、および410の中から選択される残基でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける338、403、もしくは410に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換をさらに含む、請求項26または請求項27に記載の修飾FIXポリペプチド。R338E、R403E、およびE410Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~31のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。Y155FR338ET343RR403EE410N、Y155FR338ET343RR403E、Y155FR338ET343RR403EE410S、Y155FN260SR338ET343RR403E、Y155FT343RR403EE410N、Y155FR338ET343RE410NおよびY155FR338ER403EE410Nの中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項1~32のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換Y155Fならびに配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置247および/または249でのアミノ酸置換を含む、請求項1~33のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換Y155F/K247N/N249Sを含む、請求項1~34のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換Y155FK247NN249SR338ER403EE410N、D104NK106SY155FK228NK247NN249S、D104NK106SY155FK247NN249S、Y155FK228NK247NN249S、Y155FK247NN249SN260S、D104NK106SY155FK247NN249SN260S、D104NK106SY155FK247NN249S、Y155FK247NN249ST343RR403E、Y155FK247NN249SR338ET343RR403EE410N、Y155FK247NN249SR338ER403E、Y155FK247NN249SR338ET343R、Y155FK247NN249SR338EE410N、Y155FK247NN249SR338ET343RR403E、Y155FK247NN249SR338ET343RE410N、Y155FK247NN249ST343RR403EE410N、Y155FK247NN249ST343RE410NおよびY155FK247NN249SR403EE410Nまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~35のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換Y155F/K247N/N249S/R338E/R403E/E410Nを含む、請求項1~36のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。R、E、およびDの中から選択される、T343でのまたは343に対応する残基でのアミノ酸置換を含む、請求項1~37のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換T343Rまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項38に記載の修飾FIXポリペプチド。R338、Y345、およびN346の中から選択されるアミノ酸残基でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項38または請求項39に記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換R338E、Y345T、N346Y、もしくはN346Dまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~40のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換T343R/Y345T、T343R/N346D、T343R/N346Y、もしくはR338E/T343Rまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~41のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換K247NN249SR338ET343RR403EE410N、R338ET343RE410N、Y155FI251SR338ET343RR403E、R338ET343RR403EE410N、R338ET343RR403E、K247NN249SR338ET343RR403EまたはK247NN249SR338ET343RE410Nを含む、請求項1~42のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換K247N/N249S/R338E/T343R/R403E/E410N、R338E/T343R/E410N、またはY155F/I251S/R338E/T343R/R403Eを含む、請求項1~43のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドにおけるK247、N249、R403、およびE410の中から選択されるアミノ酸残基でのまたはアミノ酸残基K247、N249、R403、もしくはE410に対応するアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、請求項38または請求項39に記載の修飾FIXポリペプチド。K247N、N249S、R403E、およびE410Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~45のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換K247N/N249S/T343R/R403E/E410Nを含む、請求項1~46のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドの1、5、53、61、64、85、103、104、105、106、108、148、155、157、158、159、167、169、172、179、202、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、320、321、333、338、343、345、346、392、394、400、403、410、412および413または未修飾FIXポリペプチドにおける対応する位置に対応する、1つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む、請求項1~47のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。Y1N、K5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、N105T、K106N、K106S、K106T、V108S、V108T、T148A、Y155F、Y155H、N157D、N157Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、D203N、A204M、A204Y、F205S、F205T、K228N、E239N、E239S、E239A、E239R、E239K、T241N、H243S、H243T、K247N、N249S、N249T、I251S、H257F、H257Y、H257E、H257S、N260S、A262S、A262T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316T、K316M、G317N、R318E、R318Y、R318N、R318A、S319N、A320S、L321N、L321S、L321T、R333A、R333E、R338A、R338E、F342I、T343R、T343E、T343Q、Y345A、Y345T、N346D、N346T、K392N、K394S、K394T、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410S、E410N、E410A、E410D、T412V、T412AおよびK413Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~48のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。置換R318E/R403E、E410N/T412A、もしくはE410N/T412Vから選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項1~49のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドにおける2つのアミノ酸置換を含む修飾第IX因子FIXポリペプチドであって、第1のアミノ酸置換が、配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおける53、61、64、85、103、104、105、106、108、155、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、321、333、338、343、345、346、392、394、400、403、410、412および413の中から選択されるアミノ酸残基または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基にあり、対応するアミノ酸残基が、配列番号3のポリペプチドとの未修飾FIXポリペプチドのアライメントによって同定され、第2のアミノ酸置換が、配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおける5、53、61、64、85、155、158、159、167、239、260、284、293、312、318、333、338、346、400、403、410、412、および413の中から選択されるアミノ酸残基または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基にあり、対応するアミノ酸残基が、配列番号3のポリペプチドとの未修飾FIXポリペプチドのアライメントによって同定される、修飾第IX因子FIXポリペプチド。第1のアミノ酸置換が、アラニンAla、A;アルギニンArg、R;アスパラギンAsn、N;アスパラギン酸Asp、D;システインCys、C;グルタミン酸Glu、E;グルタミンGln、Q;グリシンGly、G;ヒスチジンHis、H;イソロイシンIle、I;ロイシンLeu、L;リシンLys、K;メチオニンMet、M;フェニルアラニンPhe、F;プロリンPro、P;セリンSer、S;トレオニンThr、T;トリプトファンTrp、W;チロシンTyr、Y;および、バリンVal、Vの中から選択されるアミノ酸残基による置換であり、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸と同じではない、請求項51に記載の修飾FIXポリペプチド。第1のアミノ酸置換が、アラニンAla、A;アスパラギンAsn、N;アスパラギン酸Asp、D、グルタミン酸Glu、E;グルタミンGln、Q;ヒスチジンHis、H;イソロイシンIle、I;ロイシンLeu、L;リシンLys、K;メチオニンMet、M;フェニルアラニンPhe、F;セリンSer、S;トレオニンThr、T;チロシンTyr、Y;およびバリンVal、Vの中から選択されるアミノ酸残基による置換または保存的アミノ酸置換である、請求項51または請求項52に記載の修飾FIXポリペプチド。第1のアミノ酸置換が、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、K106S、K106N、V108S、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、A204M、A204Y、K228N、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、T241N、H243S、K247N、N249S、I251S、H257F、H257E、H257F、H257Y、H257S、Y259S、N260S、A262S、K265T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316N、K316A、K316E、K316S、K316M、G317N、R318A、R318E、R318Y、R318N、S319N、A320S、L321S、K321N、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、F342I、T343R、T343E、T343Q、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、K392N、K394S、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VおよびK413Nまたは保存的アミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換の中から選択される、請求項51~53のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第2のアミノ酸置換が、アラニンAla、A;アルギニンArg、R;アスパラギンAsn、N;アスパラギン酸Asp、D;システインCys、C;グルタミン酸Glu、E;グルタミンGln、Q;グリシンGly、G;ヒスチジンHis、H;イソロイシンIle、I;ロイシンLeu、L;リシンLys、K;メチオニンMet、M;フェニルアラニンPhe、F;プロリンPro、P;セリンSer、S;トレオニンThr、T;トリプトファンTrp、W;チロシンTyr、Y;および、バリンVal、Vの中から選択されるアミノ酸残基による置換であり、置換するアミノ酸は、置換されるアミノ酸と同じではない、請求項51~52のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第2のアミノ酸置換が、アラニンAla、A;アルギニンArg、R;アスパラギンAsn、N;アスパラギン酸Asp、D;グルタミン酸Glu、E;グルタミンGln、Q;ヒスチジンHis、H;ロイシンLeu、L;リシンLys、K;フェニルアラニンPhe、F;セリンSer、S;トレオニンThr、T;チロシンTyr、Y;およびバリンVal、Vの中から選択されるアミノ酸残基による置換または保存的アミノ酸置換である、請求項51~55のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第2のアミノ酸置換が、K5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、N260S、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、R318A、R318E、R318Y、R318N、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、N346D、N346Y、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VおよびK413Nまたは保存的アミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換の中から選択される、請求項51~56のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第1のアミノ酸置換が、318、155、247、249、338、403、および410の中から選択される位置でのまたは未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での置換である、請求項51~57のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第1のアミノ酸置換が、R318Y、Y155F、K247N、N249S、R338E、R403E、およびE410Nの中から選択される、または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じアミノ酸置換である、請求項51~58のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第2のアミノ酸置換が、338、155、247、249、318、403、および410の中から選択される位置にある、または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基にある、請求項51~59のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。第2のアミノ酸置換が、R338E、Y155F、K247N、N249S、R318Y、R403E、およびE410Nの中から選択される、または対応するアミノ酸残基での同じ置換である、請求項51~60のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。アミノ酸置換K400ER403E、D85NK228N、D85NI251S、K400AR403A、R338AR403A、R338ER403E、K293AR403A、K293ER403E、R318AR403A、R338EE410N、K228NE410N、K228NR338E、K228NR338AおよびR403EE410Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換を含む、請求項51~61のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおける53、61、64、85、103、104、105、106、108、155、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、265、284、293、312、314、315、316、317、318、319、321、333、338、343、346、345、392、394、400、403、410、412および413の中から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む、請求項51~62のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。さらなるアミノ酸置換が、Y1N、Y5A、S53A、S61A、D64A、D64N、D85N、A103N、D104N、N105S、K106S、K106N、V108S、Y155F、Y155H、Y155Q、S158A、S158D、S158E、T159A、N167D、N167Q、T169A、T172A、T179A、V202M、V202Y、D203M、D203Y、A204M、A204Y、K228N、E239A、E239N、E239S、E239R、E239K、T241N、H243S、K247N、N249S、I251S、H257F、H257E、H257Y、H257S、Y259S、N260S、A262S、K265T、Y284N、K293E、K293A、R312Q、R312A、R312Y、R312L、F314N、H315S、K316S、K316N、K316A、K316E、K316S、K316M、G317N、R318A、R318E、R318Y、R318N、S319N、A320S、L321S、R333A、R333E、R333S、R338A、R338E、R338L、F342I、T343R、T343E、T343Q、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、K392N、K394S、K400A、K400E、R403A、R403E、E410Q、E410N、E410D、E410S、E410A、T412A、T412VおよびK413Nの中から選択されるアミノ酸置換または未修飾FIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基での同じ置換に対応する、請求項62または請求項63に記載の修飾FIXポリペプチド。置換D85ND203NF205T、D85ND104NK106SI251S、K293AR338AR403A、K293ER338ER403E、R338ER403EE410N、D203NF205TK228N、D203NF205TE410N、D203NF205TR338E、D203NF205TR338A、D203NF205TR338ER403E、K228NR338ER403E、K247NN249SN260S、D104NK106SN260S、D104NK106SK228NK247NN249S、A103NN105SK228N、D104NK106SK228N、A103NN105SI251S、D104NK106SI251S、A103NN105SK247NN249S、D104NK106SK247NN249S、K228NK247NN249S、D104NK106SN260S、Y259FK265TY345T、D104NK106SK247NN249SN260SおよびK247NN249SR338ER403EE410Nに対応するアミノ酸置換の中から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項51~64のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドと比較して、1つまたは複数のグリコシル化部位を導入および/または排除する、1つまたは複数の修飾を含む、請求項1~65のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。グリコシル化部位が、N-、O-、およびS-グリコシル化部位の中から選択される、請求項66に記載の修飾FIXポリペプチド。1、2、3、4、5、6、7、8、またはそれ以上のグリコシル化部位が導入されている、請求項66または請求項67に記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドと比較して、アンチトロンビンIIIおよび/またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す、請求項1~66のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上の、アンチトロンビンIIIおよび/またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す、請求項69に記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドと比較して、触媒活性の増加を示す、請求項1~70のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。触媒活性の増加が、FVIIIaの存在下におけるものである、請求項71に記載の修飾FIXポリペプチド。触媒活性の増加が、FVIIIaの非存在におけるものである、請求項72に記載の修飾FIXポリペプチド。修飾FIXポリペプチドの触媒活性が、未修飾FIXポリペプチドの触媒よりも少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、もしくはそれ以上または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、もしくはそれ以上大きい、請求項69~73のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。未修飾FIXポリペプチドと比較して、薬物動態学的特性の改善を示す、請求項1~74のいずれかに記載の修飾FIXポリペプチド。薬物動態学的特性の改善が、未修飾FIXポリペプチドと比較した、1つまたは複数のクリアランスの減少、分布容積の改変、インビボにおける回収率の増加、インビボにおける総修飾FIXポリペプチド暴露の増加、血清半減期の増加、および平均共鳴時間MRTの増加の中から選択される、請求項75に記載の修飾FIXポリペプチド。薬物動態学的特性の改善が、血清半減期の増加であり、概要A.定義B.止血およびそれにおける第IX因子の役割1.血小板の粘着および凝集2.凝固カスケードa.開始b.増幅c.伝播3.凝固の調節C.第IX因子FIX構造および機能1.FIX構造2.FIX翻訳後修飾3.FIX活性化4.FIX機能5.生物製剤としてのFIXD.修飾FIXポリペプチド1.例示的なアミノ酸置換a.グリコシル化の改変i.グリコシル化の利点ii.グリコシル化が改変された、例示的な修飾FIXポリペプチドa.非天然グリコシル化部位複数可の導入b.天然グリコシル化部位の排除b.AT-IIIおよびヘパリンに対する抵抗性の増加i.AT-IIIii.ヘパリンiii.AT-IIIおよびヘパリンに対する抵抗性が増加した、例示的なFIXポリペプチドc.触媒活性を増加させるための突然変異d.LRP結合を減少させるための突然変異e.翻訳後修飾を改変するための他の突然変異2.組合せの修飾a.活性を増加させるための修飾b.リン脂質に対する親和性を増加させるまたはコラーゲンへの結合を低下させる修飾c.阻害因子に対する抵抗性を増加させるためのさらなる修飾d.グリコシル化を改変するためのさらなる修飾e.プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるための修飾f.免疫原性を低下させるための修飾g.例示的な組合せの修飾3.コンジュゲートおよび融合タンパク質E.FIXポリペプチドの産生1.ベクターおよび細胞2.発現系a.原核生物発現b.酵母c.昆虫および昆虫細胞d.哺乳動物細胞e.植物2.精製3.融合タンパク質4.ポリペプチド修飾5.ヌクレオチド配列F.修飾FIXポリペプチド活性の評価1.インビトロアッセイa.グリコシル化b.他の翻訳後修飾c.タンパク質分解活性d.凝固活性e.他のタンパク質および分子への結合および/またはそれによる阻害e.リン脂質親和性2.非ヒト動物モデル3.臨床アッセイG.製剤および投与1.製剤a.投薬量b.剤形2.修飾FIXポリペプチドの投与3.修飾FIXポリペプチドをコードする核酸の投与遺伝子療法H.治療上の使用血友病a.血友病Bb.血友病AJ.併用療法K.製品およびキットL.実施例A.定義他に特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、発明複数可が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書における全開示を通して言及される全ての特許、特許出願、公開出願、および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイト、ならびに他の出版物は、他に特に述べられない限り、それらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書における用語について、複数の定義がある場合、本部における定義が優先される。URLまたは他のそのような識別子もしくはアドレスが参照される場合、そのような識別子は、変化し得、また、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、等価な情報は、インターネットを検索することによって見出すことができることが理解されたい。それに対する参照は、そのような情報の有用性および公的な普及を証明する。本明細書において使用されるように、凝固経路または凝固カスケードは、不溶性フィブリン血餅の形成に至る、一連の活性化事象を指す。凝固カスケードまたは凝固経路において、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質チモーゲンとも呼ばれるは、1つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働く。カスケードの最終タンパク質分解工程において、フィブリノーゲンは、トロンビンによってフィブリンにタンパク質分解によって切断され、次いで、これは、傷害の部位で架橋して、血餅を形成する。本明細書において使用されるように、止血は、器官または身体部分における出血または血流の停止を指す。止血という用語は、血管傷害の後の失血を予防するための血液凝血~続く組織修復の後の血餅の溶解の全プロセスを包含することができる。本明細書において使用されるように、凝血または凝固は、不溶性フィブリン血餅の形成を指すまたは血液の凝固因子が、凝固カスケードにおいて相互作用し、不溶性フィブリン血餅の形成を最終的にもたらすプロセスを指す。本明細書において使用されるように、プロテアーゼは、共有結合性のペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの名称は、チモーゲン形態ならびにその活性化単鎖形態、活性化二重鎖形態、および活性化多重鎖形態を含む。明確にするために、プロテアーゼに対する言及は、全ての形態を指す。プロテアーゼは、たとえば、それらの活性部位の触媒活性および標的基質のペプチド結合を切断するメカニズムに依存して、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含む。本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼまたはセリンエンドペプチダーゼは、酵素の活性部位におけるセリン残基の存在によって特徴づけられるペプチダーゼのクラスを指す。セリンプロテアーゼは、原核生物および真核生物における消化酵素として機能するだけではなく、血液凝血および炎症を含む体内における広範囲の機能に参加する。セリンプロテアーゼによる切断のメカニズムは、セリンによる、標的ペプチド結合の求核攻撃に基づく。システイン、トレオニン、もしくはアスパラギン酸と結合した水分子または金属もまた、この役割を果たすことができる。セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸の一列に並んだ側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通の触媒3残基catalytictriadを形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合するくぼみとして形づくられる。本明細書において使用されるように、第IX因子またはFIXポリペプチドは、組換えで産生されるポリペプチド、合成によって産生されるポリペプチド、ならびに肝臓および血液を含むが、これらに限定されない細胞または組織から抽出されたまたは単離された第IX因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない、任意の第IX因子ポリペプチドを指す。第IX因子について区別なく使用される代替の名称は、第9因子Factor9、クリスマス因子、血漿トロンボプラスチン成分PTC、凝固因子IX、および血清因子IXを含む。第IX因子についての略語は、FIXおよびF9を含む。第IX因子は、ヒトおよび非ヒト起源の動物を含むが、これらに限定されない異なる種由来の関連ポリペプチドを含む。ヒト第IX因子hFIXは、第IX因子、対立遺伝子変異アイソフォーム[T148A配列番号20もしくは325またはT412P突然変異を有する対立遺伝子変異体など]、核酸からの合成分子、ヒト組織および細胞から単離されたタンパク質、ならびにその修飾形態を含む。例示的な未修飾成熟ヒト第IX因子ポリペプチドは、未修飾および野生型天然第IX因子ポリペプチド配列番号3において記載される配列を含有するポリペプチドなどならびにプロペプチドおよび/またはシグナルペプチドを含む未修飾および野生型前駆体第IX因子ポリペプチド配列番号2において記載される配列を有する前駆体FIXポリペプチドなどを含むが、これらに限定されない。当業者は、成熟第IX因子ポリペプチド配列番号3の参照位置が、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列を含有する第IX因子ポリペプチドである前駆体FIXポリペプチド配列番号2と比較した場合、46アミノ酸残基ずつ異なることを認識するであろう。したがって、配列番号3の第1のアミノ酸残基は、配列番号2の47番目の第47アミノ酸残基に対応する。用語第IX因子はまた、残基132Cおよび289Cの間でジスルフィド結合によって連結されるFIX軽鎖配列番号2のアミノ酸47~191および配列番号3のアミノ酸1~145に対応するならびにFIX重鎖配列番号2のアミノ酸227~461および配列番号3のアミノ酸181~415に対応するを含有する、第IXa因子FIXaと呼ばれる第IX因子ポリペプチドの活性化形態を包含する配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応する。FIXaは、アミノ酸残基R145およびR180の後のタンパク質分解性の切断によって成熟FIXポリペプチドたとえば、配列番号3において記載されるものから産生される。タンパク質分解性の切断は、たとえば、活性化第XI因子FXIaまたは組織因子/活性化第VII因子TF/FVIIa複合体によって、実行することができる。本明細書において提供されるFIXポリペプチドは、化学修飾または翻訳後修飾などによって、さらに修飾することができる。そのような修飾は、グリコシル化、ペグ化、アルブミン化albumination、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。第IX因子は、ヒトおよび非ヒト種を含む、任意の種由来の第IX因子を含む。非ヒト起源のFIXポリペプチドは、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、また他の霊長動物の第IX因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。非ヒト起源の例示的なFIXポリペプチドは、たとえばチンパンジーパントログロディテス、配列番号4、アカゲザルマカクムラッタ、配列番号5、マウスムスムスクルス、配列番号6、ラットラッタスノルベジクス、配列番号7、モルモットテンジクネズミ、配列番号8、ブタサススクロファ、配列番号9、イヌカニスファミリアリス、配列番号10、ネコイエネコ、配列番号11、ウサギオリクトラガスクニクラス、配列番号12、ニワトリ[ガルスガルスGallusgallus、配列番号13]、雌ウシ[ボースタウルスBostaurus、配列番号14]、ヒツジ[オービスアリエスOvisaries、配列番号15]、カエルゼノパストロピカリス、配列番号16、ゼブラフィッシュダニオレリオDaniorerio、配列番号17、日本フグトラフグ、配列番号18を含む。FIXポリペプチドに対する言及はまた、単鎖形態または二重鎖形態、活性を有するその切断形態をした前駆体ポリペプチドおよび成熟FIXポリペプチドをも含み、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、ならびに配列番号2において記載される前駆体ポリペプチドまたはその成熟形態配列番号3に対して、少なくとも40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、他の変異体を含む。配列番号75~272および326~417の修飾FIXポリペプチドならびにその変異体などのような修飾FIXポリペプチドが含まれる。FIXポリペプチドのFVIIIa結合、第X因子結合、リン脂質結合、および/または血液凝固活性などのような、FIXの少なくとも1つの活性を保持するものもまた含まれる。活性を保持することによって、活性は、保持される活性のレベルが、検出可能な効果を得るのに十分である限り、野生型FIXと比較して、低下させるまたは増加させるなどのように、改変することができる。FIXポリペプチドは、組織特異的アイソフォームおよびその対立遺伝子変異体、核酸の翻訳によって調製される合成分子、組換え法を通しての、より短いポリペプチドのライゲーションを含む合成などのような化学合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒトの組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラFIXポリペプチドおよびその修飾形態を含むが、これらに限定されない。FIXポリペプチドはまた、十分な長さであるまたは完全長成熟ポリペプチドの少なくとも1つの活性必要に応じて、活性化に際してを保持するのに適切な領域を含む、FIXの断片または部分をも含む。FIXポリペプチドはまた、化学修飾または翻訳後修飾を含有するものおよび化学修飾または翻訳後修飾を含有しないものをも含む。そのような修飾は、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られている他のポリペプチド修飾を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用されるように、対応する残基は、アライメントされた場所に存在する残基を指す。関連ポリペプチドまたは変異ポリペプチドは、当業者らに知られている任意の方法によってアライメントされる。そのような方法は、典型的に、マッチを最大限にし、マニュアルアライメントを使用するならびに入手可能な多数のアライメントプログラムたとえばBLASTPおよび当業者らに知られている他のものを使用することによるなどのような方法を含む。ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存された同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、第IX因子ポリペプチドの配列をアライメントすることによって、当業者は、指標として、保存された同一のアミノ酸残基を使用して、対応する残基を同定することができる。たとえば、配列番号3成熟第IX因子のアミノ酸位置1におけるチロシンY1は、配列番号2のアミノ酸位置47におけるチロシンY47に対応する。他の場合では、対応する領域を、同定することができる。たとえば、Glaドメインは、配列番号3のアミノ酸位置Y1からV46に、また、配列番号2のアミノ酸位置Y47からV92に対応する。当業者はまた、ヒト配列および非ヒト配列の間のならびにそれらの中の対応するアミノ酸残基を見出すために、指標として保存アミノ酸残基を利用することができる。たとえば、配列番号3ヒトのアミノ酸残基Q11およびP74は、配列番号14ウシのR11およびQ74に対応する。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューターシミュレーションアラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。他の場合では、対応する領域を、同定することができる。本明細書において使用されるように、アミノ酸置換に関する同じ置換は、他の第IX因子ポリペプチドにおける対応する位置における、配列番号3における参照アミノ酸位置での同様の置換を指す。たとえば、配列番号3におけるアミノ酸残基R318でのチロシンの置換に関しての同じ置換は、配列番号14におけるアミノ酸残基R319でのチロシンの置換であるたとえば図3を参照されたい。たとえば、配列番号3におけるアミノ酸残基E410でのアスパラギンの置換に関する同じ置換は、配列番号366におけるアミノ酸残基S410でのアスパラギンの置換である。同じアミノ酸の置換に対する言及は、対応する位置での、置換される残基と異なるアミノ酸残基の置換を指すことが理解される。本明細書において使用されるように、プロ領域、プロペプチド、またはプロ配列は、切断されて、成熟タンパク質を産生する領域またはセグメントを指す。これは、触媒機構を遮蔽し、したがって、触媒中間体の形成を予防することによってつまり基質結合部位を立体的に閉鎖することによって、タンパク質分解活性を抑制するように機能するセグメントを含むことができる。プロ領域は、成熟した生物学的活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であり、少数のアミノ酸ほどの小さなものとすることができるまたは多重ドメイン構造とすることができる。本明細書において使用されるように、成熟第IX因子は、シグナル配列およびプロペプチド配列を欠くFIXポリペプチドを指す。典型的に、シグナル配列は、翻訳の間に、タンパク質を、小胞体ER-ゴルジ経路を介しての分泌に導き、ERへの挿入の後に切断される。プロペプチド配列は、典型的に、タンパク質の翻訳後修飾において機能し、細胞からのタンパク質の分泌前に切断される。したがって、成熟FIXポリペプチドは、典型的に、分泌タンパク質である。一例では、成熟ヒトFIXポリペプチドが、配列番号3において記載される。配列番号3において記載されるアミノ酸配列は、配列番号3が、配列番号2のアミノ酸残基1~28に対応するシグナル配列を欠き、また、配列番号2のアミノ酸残基29~46に対応するプロペプチド配列を欠くという点で、配列番号2において記載される前駆体ポリペプチドと異なる。成熟FIXポリペプチドに対する言及は、単鎖チモーゲン形態および二重鎖形態を包含する。したがって、成熟FIXポリペプチドに対する言及はまた、ジスルフィド結合によって結合される重鎖および軽鎖を含有する二重鎖形態配列番号2のアミノ酸192~226に対応する活性化ペプチドを有していないをも指す。本明細書において使用されるように、FIXに関する野生型および天然は、自然界においてヒトおよび他の動物を含む生物において存在する対立遺伝子変異体を含む天然FIX遺伝子または天然に存在するFIX遺伝子によってコードされるFIXポリペプチドを指す。種に無関係の野生型第IX因子に対する言及は、任意の種の野生型第IX因子を包含するように意図される。コード前駆体ポリペプチド、その断片、ならびにシグナルペプチドを欠く成熟形態およびその任意の翻訳前または翻訳後処理形態または修飾形態などのようなその処理形態が、野生型FIXポリペプチドの中に含まれる。グリコシル化、カルボキシル化、およびヒドロキシル化による修飾を含むが、これらに限定されない、翻訳後修飾されるものもまた、天然FIXポリペプチドの中に含まれる。天然FIXポリペプチドはまた、単鎖形態および二重鎖形態をも含む。たとえば、ヒトは、天然FIXを発現する。例示的な野生型ヒトFIXのアミノ酸配列は、配列番号2および3ならびにその対立遺伝子変異体において記載される。他の動物はチンパンジーパントログロディテス、配列番号4、アカゲザルマカクムラッタ、配列番号5、マウスムスムスクルス、配列番号6、ラットラッタスノルベジクス、配列番号7、モルモットテンジクネズミ、配列番号8、ブタサススクロファ、配列番号9、イヌカニスファミリアリス、配列番号10、ネコイエネコ、配列番号11、ウサギオリクトラガスクニクラス、配列番号12、ニワトリガルスガルス、配列番号13、雌ウシボースタウルス、配列番号14、ヒツジオービスアリエス、配列番号15、カエルゼノパストロピカリス、配列番号16、ゼブラフィッシュダニオレリオ、配列番号17、日本フグトラフグ、配列番号18を含むが、これらに限定されない天然FIXを産生する。本明細書において使用されるように、種変異体は、マウスおよびヒトなどのような異なる哺乳動物種を含む様々な種の中のポリペプチドにおける変異体を指す。本明細書において使用されるように、対立遺伝子変異体は、同じ種のメンバーの中のタンパク質における変異を指す。本明細書において使用されるように、スプライス変異体は、2つ以上の種類のmRNAをもたらす、ゲノムDNAの転写一次産物のディファレンシャルプロセシングdifferentialprocessingによって産生される変異体を指す。本明細書において使用されるように、チモーゲンは、活性化切断などのような成熟切断を含むタンパク質分解性の切断ならびに/または他のタンパク質複数可および/もしくは補因子複数可との複合体形成によって活性化されるプロテアーゼを指す。チモーゲンは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。そのような前駆体は、必ずしも大きいというわけではないが、活性形態よりも一般に大きい。セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンは、触媒切断および自己触媒切断を含む特異的な切断によってまたは活性酵素を生成する活性化補因子の結合によって活性酵素に変換される。たとえば、一般に、チモーゲンは、単鎖形態で存在する。チモーゲンは、一般に、不活性であり、1つまたは複数のタンパク質分解部位での触媒切断または自己触媒切断によって成熟活性ポリペプチドに変換されて、二重鎖などのような多重鎖ポリペプチドを生成することができる。したがって、チモーゲンは、活性化因子の作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。切断は、自己活性化によって達成することができる。多くの凝固タンパク質は、チモーゲンであり、それらは不活性であるが、血管損傷の後の凝固系の開始に際して切断され、活性化されるようになる。FIXに関して、FIXポリペプチドは、FIXの二重鎖形態FIXaを産生するために、たとえば活性化FXIFXIaまたはFVIIaTFと結合したなどのようなプロテアーゼによる切断まで、チモーゲンとして血漿中に存在する。本明細書において使用されるように、活性化配列は、活性プロテアーゼを形成するために、活性化切断または成熟切断に必要とされる部位である、チモーゲンにおけるアミノ酸の配列を指す。活性化配列の切断は、自己触媒によってまたは活性化パートナーによって触媒することができる。本明細書において使用されるように、活性化切断は、一種の成熟切断であり、これは、完全な酵素活性の発達に必要とされるコンホメーション変化を誘発する。これは、たとえば、切断により、キモトリプシンにおけるAsp194などのようなプロテアーゼの保存領域と相互作用して、活性に必要とされるコンホメーション変化を誘発する新しいN-末端を生成する、セリンプロテアーゼについての古典活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの多重鎖形態の産生をもたらすことができる。いくつかの場合では、プロテアーゼの単鎖形態は、タンパク質分解活性を示すことができる。本明細書において使用されるように、活性化第IX因子またはFIXaは、FIXaポリペプチドの任意の二重鎖形態を指す。二重鎖形態は典型的にタンパク質分解性の切断に起因するが、合成によって産生することができる。活性化第IX因子は、したがって、血液凝固活性が低い、チモーゲン様の二重鎖形態、FVIIIaおよびFXへの結合に際して起こる、完全に活性化された形態、ならびに完全に活性化された二重鎖形態で存在するまたは完全に活性化された形態へのコンホメーション変化を起こす突然変異形態を含む。たとえば、FIXポリペプチドの単鎖形態たとえば配列番号3を参照されたいは、成熟FIXポリペプチドのアミノ酸残基R145およびR180の後のタンパク質分解によって切断される。切断産物、FIX重鎖およびFIX軽鎖は、ジスルフィド結合配列番号3のFIXにおけるアミノ酸残基132Cおよび289Cの間のによって共に保持され、二重鎖活性化FIX酵素を形成する。タンパク質分解性の切断は、たとえば活性化第XIa因子FXIaおよびTFと複合体の活性化第VIIa因子FVIIaによって実行することができる。本明細書において使用されるように、FIXポリペプチドの特性は、物理的または構造的特性、そのような三次元構造、pI、半減期、コンホメーション、および他のそのような物理的特徴を指す。本明細書において使用されるように、FIXポリペプチドの活性は、第IX因子ポリペプチドによって示される任意の活性を指す。そのような活性は、インビトロおよび/またはインビボにおいて試験することができ、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性、第X因子FX活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性;抗原性抗FIX抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力;第VIIIa因子もしくは第X因子に結合する能力;および/またはリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない。活性は、たとえば、インビトロにおいてまたはインビボにおいて凝固を測定することによって、承認されるアッセイを使用して、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができる。そのようなアッセイの結果は、ポリペプチドが、インビボにおけるポリペプチドの活性に相互に関連し得る活性を示すことを示し、インビボ活性は、生物学的活性と呼ぶことができる。FIXの修飾形態の機能性または活性を決定するためのアッセイは、当業者らに知られている。FIXポリペプチドの活性を評価するための例示的なアッセイは、血液凝固活性を評価するためのプロトロンボプラスチン時間PTアッセイもしくは活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイまたは触媒活性もしくはタンパク質分解活性を評価するための、合成基質を使用する発色アッセイを含む。本明細書において使用されるように、少なくとも1つの活性を示すまたは少なくとも1つの活性を保持するは、同じ条件下で同じ形態の未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドによって示される活性を指す。たとえば、二重鎖形態の修飾FIXポリペプチドは、同じ実験条件下で、二重鎖形態の未修飾FIXポリペプチドと比較され、2つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究中の修飾である。他の例では、単鎖形態の修飾FIXポリペプチドは、同じ実験条件下で、単鎖形態の未修飾FIXポリペプチドと比較され、2つのポリペプチドの間の唯一の差異は、研究中の修飾である。典型的に、同じ形態の未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持するまたは示す修飾FIXポリペプチドは、インビボにおいて投与された場合、修飾FIXポリペプチドが、凝血促進治療薬として治療的に有効となるのに十分な量の活性を保持する。一般に、凝血促進薬としての治療的効能を保持するための修飾FIXポリペプチドについて、保持される活性の量は、凝血促進薬としての治療的効能を示す同じ形態の未修飾FIXポリペプチドの活性の0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、もしくはそれ以上またはその前後である。必要であれば、凝血促進薬としての治療的効能を維持するために必要とされる活性の量は、経験的に決定することができる。典型的に、活性の0.5~20、0.5~10、0.5~5の保持は、インビボにおいて凝血促進薬としての治療的効能を保持するのに十分である。修飾FIXポリペプチドによって示されるまたは保持される活性は、凝固活性もしくは血液凝固活性、凝血促進活性;第X因子FX活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性;抗原性抗FIX抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力;第VIIIa因子もしくは第X因子に結合する能力;および/またはリン脂質に結合する能力を含むが、これらに限定されない任意の活性とすることができることが理解される。いくつかの場合では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、増加した活性を保持することができる。いくつかの場合では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、減少した活性を保持することができる。修飾FIXポリペプチドの活性は、問題の修飾を含有していないポリペプチドと比較して、1の活性、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上の活性を含むが、これらに限定されない、未修飾ポリペプチドの活性のうちの任意のレベルの百分率とすることができ、両方のポリペプチドは、同じ形態をしている。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、同じ形態をした未修飾FIXポリペプチドと比較して、増加したまたは減少した活性を示すことができる。たとえば、それは、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、または少なくとも99の活性を保持することができる。他の実施形態では、活性における変化が、未修飾FIXよりも、少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、またはそれ以上大きい。保持されることとなる特定のレベルは、ポリペプチドの意図される使用についての関数であり、経験的に決定することができる。活性は、たとえば、本明細書において記載されるものなどのようなインビトロアッセイまたはインビボアッセイを使用して、測定することができる。本明細書において使用されるように、凝固活性または血液凝固活性または凝血促進活性は、ポリペプチドが凝固を達成する能力を指す。血液凝固活性を評価するためのアッセイは、当業者らに知られており、プロトロンビン時間PTアッセイまたは活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイを含む。本明細書において使用されるように、FIXに関する触媒活性またはタンパク質分解活性は、FIXタンパク質が、基質のタンパク質分解性の切断を触媒する能力を指し、区別なく使用される。そのような活性を評価するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、FIXのタンパク質分解活性は、Mes-D-CHD-Gly-Arg-AMCなどのような発色基質を使用して測定することができ、基質の切断は、線形回帰によって決定される吸光度および基質加水分解の速度によってモニターされる。本明細書において使用されるように、ドメイン典型的に、3またはそれ以上、一般に、5または7またはそれ以上のアミノ酸の配列は、構造的におよび/または機能的に分子の他の部分と異なり、同定可能である、タンパク質またはコード核酸などのような分子の部分を指す。たとえば、ドメインは、1つもしくは複数の構造モチーフから構成されるタンパク質内で、独立して折り畳まれた構造を形成することができるおよび/またはタンパク質分解活性などのような機能的活性により認識される、ポリペプチド鎖のそれらの部分を含む。タンパク質は、1つまたは2つ以上の異なるドメインを有することができる。たとえば、ドメインは、プロテアーゼドメインまたはglaドメインを定めるモチーフに対する相同性などのような、関連するファミリーメンバーに対する、その中の配列の相同性によって、同定する、定める、または区別することができる。他の例において、ドメインが、タンパク質分解活性など、その機能によってまたはDNA結合、リガンド結合、および二量体化などのような、生体分子と相互作用する能力によって区別することができる。ドメインは、ドメインが、独立してまたは他の分子に融合して、たとえばタンパク質分解活性またはリガンド結合などのような活性を実行することができるように、独立して、生物学的機能または生物学的活性を示すことができる。ドメインは、アミノ酸の線状配列またはアミノ酸の非線状配列とすることができる。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。そのようなドメインは、知られており、当業者らによって同定することができる。本明細書における例証のために、定義は、提供されるが、名称によって特定のドメインを認識することは、当技術分野における技術の範囲内に十分にあることが理解されたい。必要に応じて、適切なソフトウェアを、ドメインを同定するために利用することができる。本明細書において使用されるように、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインに対する言及は、これらのタンパク質のいずれかの単鎖形態、二重鎖形態、および多重鎖形態を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、たとえば触媒中心などのような、そのタンパク質分解活性に必要とされる、そのタンパク質の必須の特性を全て含有する。FIXに関して、プロテアーゼドメインは、触媒3残基を含めて、キモトリプシン/トリプシンファミリープロテアーゼドメインと、相同性および構造的特徴を共有する。たとえば、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドにおいて、プロテアーゼドメインは、アミノ酸位置181~412に対応する。本明細書において使用されるように、ガンマ-カルボキシグルタミン酸Glaドメインは、タンパク質、たとえば、Glaを形成するためのビタミンK依存性カルボキシル化による、グルタミン酸残基、一般に、全てではないが、ほとんどのグルタミン酸残基の翻訳後修飾を含有するビタミンK依存性タンパク質の部分を指す。Glaドメインは、カルシウムイオンの高親和性結合および負電荷リン脂質への結合を担う。典型的に、Glaドメインは、ビタミンK依存性タンパク質の成熟形態のN-末端で始まり、保存芳香族残基で終わる。成熟FIXポリペプチドにおいて、Glaドメインは、配列番号3において記載される例示的なポリペプチドのアミノ酸位置1~46に対応する。Glaドメインは、十分に知られており、それらの場所は、特定のポリペプチドにおいて同定することができる。様々なビタミンK依存性タンパク質のGlaドメインは、N-末端の疎水性残基の、細胞表面膜上の負電荷リン脂質との相互作用を媒介する疎水性パッチへのクラスタリングを含めて、配列相同性、構造的相同性、および機能的相同性を共有する。例示的な他のGla含有ポリペプチドは、FVII、FX、プロトロンビン、プロテインC、プロテインS、オステオカルシン、マトリックスGlaタンパク質、成長停止特異的タンパク質6Gas6、およびプロテインZを含むが、これらに限定されない。本明細書において使用されるように、上皮成長因子EGFドメインEGF-1またはEGF-2は、上皮成長因子EGF配列の特異的な30~40のアミノ酸部分に対して配列相同性を共有する、タンパク質の部分を指す。EGFドメインは、ジスルフィド結合に関与することが示されたEGFにおいて、6つのシステイン残基を含む。EGFドメインの主な構造は、C-末端の短い二本鎖シートへのループが後続する二本鎖ベータシートである。FIXは、2つのEGFドメイン:EGF-1およびEGF-2を含有する。これらのドメインは、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドの、アミノ酸位置47~83および84~125にそれぞれ対応する。本明細書において使用されるように、未修飾ポリペプチドまたは未修飾FIXおよびその文法的な変化形は、本明細書において提供される修飾のために選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型形態とすることができる。さらに、出発ポリペプチドは、それが、天然野生型アイソフォームと異なるように、改変するまたは変異させることができるが、それにもかかわらず、本明細書において産生される、引き続いて修飾されるポリペプチドと比較して、出発未修飾ポリペプチドと本明細書において呼ばれる。したがって、未修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性における望ましい増加または減少を有するように修飾された、当技術分野において知られている既存のタンパク質は、出発未修飾ポリペプチドとして選択し、使用することができる。たとえば、グリコシル化を改変するための1つまたは複数のアミノ酸残基における変化などのように、1つまたは複数の単一アミノ酸変化によってその天然形態から修飾され、望ましい特性における増加または減少のいずれかを有するタンパク質は、同じまたは異なる特性のさらなる修飾のための、本明細書において未修飾と呼ばれる、標的タンパク質とすることができる。当技術分野において知られている例示的な修飾FIXポリペプチドは、たとえばSchuettrumpfetalBlood105231623MeltonetalBloodCoagulFibrinolysis1223743CheungetalJBiolChem2672052920531CheungetalProcNatlAcadSciUSA931106811073HopfneretalEMBOJ1666266635SichleretalJBiolChem27841214126BegbieetalThrombHaemost94113847ChangJetalJBiolChem2731208994YangLetalJBiolChem2775075660YangLetalJBiolChem278250328;米国特許第5969040号、第5621039号、第6423826号、第7125841号、第6017882号、第6531298号;米国特許出願公開第20030211094号、第20070254840号、第20080188414号、第2008000422号、第20080050772号、第20080146494号、第20080050772号、第20080187955号、第20040254106号、第20050147618号、第20080280818号、第20080102115号、第20080167219号、および第20080214461号;ならびに国際特許出願公開WO2007112005、WO2007135182、WO2008082613、WO2008119815、WO2008119815、WO2007149406、WO2007112005、およびWO2004101740において記載される任意のFIXポリペプチドを含む。本明細書において使用されるように、修飾第IX因子ポリペプチドおよび修飾第IX因子は、未修飾第IX因子ポリペプチドと比較して、1つまたは複数のアミノ酸差異を有するFIXポリペプチドを指す。1つまたは複数のアミノ酸差異は、1つもしくは複数のアミノ酸置換交換、アミノ酸挿入、もしくはアミノ酸欠失などのようなアミノ酸突然変異とすることができるまたは全ドメインの挿入もしくは欠失およびその任意の組合せとすることができる。典型的に、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、一次配列における1つまたは複数の修飾を有する。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、またはそれ以上のアミノ酸差異を有することができる。任意の修飾は、結果として生じるポリペプチドが、たとえば触媒活性、タンパク質分解活性、FVIIIaに結合する能力、またはリン脂質に結合する能力などのような、天然FIXポリペプチドと関連する、少なくとも1つのFIX活性を示す限り、企図される。本明細書において使用されるように、アンチトロンビンIIIまたはAT-IIIは、セリンプロテアーゼ阻害因子セルピンである。AT-IIIは、分泌の間に切断されて、432アミノ酸の成熟アンチトロンビン配列番号22を放出する、464のアミノ酸残基配列番号21を含有する前駆体タンパク質として合成される。本明細書において使用されるように、ヘパリンは、抗凝固特性を有する、直鎖で、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンのうちの、異成分からなるグループを指す。ヘパリンは、AT-IIIに結合して、AT-III/ヘパリン複合体を形成することができる。本明細書において使用されるように、AT-IIIおよび/またはヘパリンに対する抵抗性の増加は、未修飾FIXポリペプチドなどのような参照ポリペプチドと比較した、AT-IIIのみ、ヘパリンのみ、および/またはAT-III/ヘパリン複合体の阻害効果に対する、修飾FIXポリペプチドなどのようなポリペプチドの感受性の減少についての任意の量を指す。AT-III、ヘパリン、および/またはAT-III/ヘパリン複合体に対する抵抗性の増加は、AT-III、ヘパリン、および/またはAT-III複合体に対する修飾FIXポリペプチドの結合を評価することによって、アッセイすることができる。抵抗性の増加はまた、AT-III、ヘパリン、またはAT-III/ヘパリン複合体の存在下において、FIXポリペプチドの触媒または血液凝固活性の阻害を測定することによって、アッセイすることができる。阻害因子へのポリペプチドの結合または阻害因子によるポリペプチドの酵素活性の阻害を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえばAT-IIIまたはAT-III/ヘパリン複合体などのような、共有結合性の阻害因子について、阻害についての二次速度定数を測定することができる。たとえばヘパリンなどのような、非共有結合性の阻害因子について、kiを測定することができる。さらに、BIAcoreバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴もまた、1つまたは複数の定められる条件を使用して、AT-III、ヘパリン、および/またはAT-III/ヘパリン複合体へのFIXポリペプチドの結合を測定するために使用することができる。しかしながら、AT-IIIまたはAT-III/ヘパリン複合体などのような共有結合性の阻害因子については、結合速度on-rateのみをBIAcoreを使用して測定することができ、ヘパリンなどのような非共有結合性の阻害因子については、結合速度on-rateおよび解離速度off-rateの両方を測定することができる。FIX血液凝固活性に対するたとえばAT-III/ヘパリンの阻害効果を決定するためのアッセイもまた、当技術分野において知られている。たとえば、修飾FIXポリペプチドが、AT-III/ヘパリンの存在下または非存在下においてその基質FXを切断する能力を測定することができ、AT-III/ヘパリンが反応を阻害する程度を決定することができる。これは、AT-IIIの存在下または非存在下において、未修飾FIXポリペプチドがその基質FXを切断する能力と比較することができる。その代わりに、FIXポリペプチドの阻害についての二次速度定数を測定し、未修飾FIXポリペプチドの阻害についての二次速度定数と比較することができる。阻害についての二次速度定数を比較する場合、阻害に対する抵抗性の増加は、阻害の二次速度定数の減少を意味する。AT-IIIおよび/またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドと比較して、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上の、それぞれAT-III、ヘパリン、および/またはAT-III/ヘパリン複合体の効果に対する抵抗性の増加を示す。本明細書において使用されるように、補因子は、他の特異的なタンパク質または分子に結合して、活性複合体を形成するタンパク質または分子を指す。いくつかの例では、補因子への結合が、最適なタンパク質分解活性に必要とされる。たとえば、FVIIIaは、FIXaの補因子である。FIXaへのFVIIIaの結合は、その基質FXに対するFIXaのタンパク質分解活性の増加をもたらすコンホメーション変化を誘発する。本明細書において使用されるように、グリコシル化部位は、炭水化物部分を付加することができる、ポリペプチドにおけるアミノ位置を指す。典型的に、グリコシル化タンパク質は、炭水化物部分の付加のために、アスパラギンまたはセリンなどのような1つまたは複数のアミノ酸残基を含有する。本明細書において使用されるように、天然グリコシル化部位は、炭水化物部分が野生型ポリペプチドにおいて付加されるアミノ酸の位置を指す。FIXにおいて6つの天然グリコシル化部位;配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応するN157およびN167での2つのN-グリコシル化部位ならびにS53、S61、T159、T169、T172、およびT179での6つのO-グリコシル化部位がある。本明細書において使用されるように、非天然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチドにおいて存在しない、修飾ポリペプチドにおいて炭水化物部分が付加されるアミノ酸の位置を指す。非天然グリコシル化部位は、アミノ酸置換によってFIXポリペプチドの中に導入することができる。O-グリコシル化部位は、たとえば、天然残基のセリンまたはトレオニンとのアミノ酸置換によって、生成することができる。N-グリコシル化部位は、たとえば、モチーフAsn-Xaa-Ser/Thr/Cysを確立することによって、生成することができ、ここで、Xaaは、プロリンではない。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の生成は、たとえば、天然アミノ酸残基のアスパラギンとの単一アミノ酸置換、天然アミノ酸残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの単一アミノ酸置換、または天然残基のアスパラギンとの第1のアミノ酸置換および天然残基のセリン、トレオニン、もしくはシステインとの第2のアミノ酸置換を含む二重アミノ酸置換を含むことができる。本明細書において使用されるように、グリコシル化のレベルの増加およびその任意の文法的な変化形は、参照ポリペプチドまたはタンパク質と比較した、ポリペプチドに連結された炭水化物の量の増加を指す。炭水化物は、N結合型、O結合型、C結合型とすることができるまたは任意の他の連結によって付加することができる。グリコシル化のレベルは、未修飾ポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上、増加させることができる。ポリペプチドのグリコシル化のレベルつまり炭水化物の量を決定するためのアッセイは、当技術分野において知られている。たとえば、炭水化物含有量またはグリコシル化のレベルは、高pHアニオン交換クロマトグラフィー、蛍光体支援炭水化物電気泳動fluorophoreassistedcarbohydrateelectrophoresisFACE、連続的なエキソグリコシダーゼ消化、質量分析、NMR、ゲル電気泳動、または本明細書において記載されるもしくは当技術分野において知られている任意の他の方法によって評価することができる。本明細書において使用されるように、生物学的活性は、化合物、組成物、または他の混合物のインビボ投与に際して結果として生じる、化合物のインビボ活性または生理学的応答を指す。したがって、生物学的活性は、そのような化合物、組成物、および混合物の治療上の効果および医薬活性を包含する。生物学的活性は、そのような活性を試験するまたは使用するために設計されるインビトロ系において観察することができる。したがって、本明細書における目的上、FIXポリペプチドの生物学的活性は、血液凝固活性を包含する。本明細書において使用されるように、薬物動態学的特性は、身体における、FIXポリペプチドなどのような薬剤または作用物質の作用に関連する特性、特に、薬剤が身体に吸収され、分布し、代謝され、排除される速度を指す。薬物動態は、様々なパラメーターによって評価することができる。これらは、クリアランス、分布容積、インビボ回収率、インビボにおける総修飾FIXポリペプチド暴露、血清半減期、および平均共鳴時間MRTを含むが、これらに限定されない。ポリペプチドの薬物動態学的特性は、たとえば、ヒトまたは動物モデルへのポリペプチドの投与および様々な時点での身体におけるFIXの量の評価などのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。クリアランス、分布容積、インビボ回収率、インビボにおける総修飾FIXポリペプチド暴露、血清半減期、および平均共鳴時間MRTなどのような様々なパラメーターは、当技術分野においてよく知られており、本明細書において記載される計算を使用して評価される。本明細書において使用されるように、薬物動態学的特性の改善は、たとえば未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドなどのようなポリペプチドの薬物動態学的特性における望ましい変化を指す。変化は、増加または減少とすることができる。本明細書において使用されるように、クリアランスは、投与の後の、対象の身体からの、ポリペプチドなどのような作用物質の除去を指す。クリアランスは、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、身体からのポリペプチドのクリアランスは、様々な時点で血漿中のFIXの量を測定し、用量/AUC0-infとしてクリアランスを計算することによって、評価することができる。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのクリアランスの改善は、未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのクリアランスにおける減少を指す。修飾FIXポリペプチドのクリアランスは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99まで減少し得る。本明細書において使用されるように、平均共鳴時間MRTは、FIXポリペプチドが投与の後に身体において存在する時間を指す。MRTは、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドのMRTは、様々な時点で血漿中のFIXの量を測定し、AUMC0-last/AUC0-lastとしてMRTを計算することによって評価することができ、AUC0-lastは、曲線下面積の合計であり、AUMC0-lastは、1次モーメント曲線下面積の合計である。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのMRTの改善は、未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのMRTにおける増加を指す。修飾FIXポリペプチドのMRTは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加することができる。本明細書において使用されるように、インビボ回収率は、投与されるFIXポリペプチドの総量に関して、投与の後のある期間の後に循環において検出可能なFIXポリペプチドの百分率を指す。インビボ回収率は、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、評価されるポリペプチドのインビボ回収率は、Cmaxでの血漿中のFIXの量を測定し、それを、投与されたFIXの量と比較するによって評価することができる。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのインビボ回収率の改善は、未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのインビボ回収率における増加を指す。修飾FIXポリペプチドのインビボ回収率は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加することができる。本明細書において使用されるように、血漿半減期t1/2は、FIXポリペプチドの排除半減期またはFIXポリペプチドの血漿濃度がその最初のまたは投与の後の最大の濃度の2分の1に達した時間を指す。血漿半減期への言及は、α-、β-、および/またはγ-相の間の血漿半減期を含む。血漿半減期は、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドの血漿半減期は、様々な時点で血漿中のFIXの量を測定することによって評価することができる。T1/2βは、たとえば、血漿FIX濃度対時間曲線の対数線形プロットの終末相terminalphaseの間の、負の傾きによって割った-ln2として計算される。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドの血漿半減期の改善は、未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドの血漿半減期における増加を指す。修飾FIXポリペプチドの血漿半減期は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加することができる。本明細書において使用されるように、インビボにおける暴露は、投与されたFIXポリペプチドの濃度時間曲線下の血漿面積またはAUCに関しての、投与の後の循環におけるFIXポリペプチドの量を指す。インビボにおける暴露は、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイを実行することができ、ポリペプチドのインビボ回収率は、様々な時点で血漿中のFIXの量つまりAUCを測定し、それを、投与されたFIXの量と比較するによって評価することができる。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのインビボにおける暴露の改善は、未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドのインビボにおける暴露における増加を指す。修飾FIXポリペプチドのインビボにおける暴露は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加することができる。本明細書において使用されるように、分布容積は、投与の後の、血漿および身体の残りの間のFIXポリペプチドの分布を指す。それは、血漿においてポリペプチドの観察される濃度をもたらすように、ポリペプチドの量が均一に分布する必要がある容積として定義される。分布容積は、実施例6において記載されるものなどのような、当技術分野においてよく知られている方法を使用して評価することができる。たとえば、定常状態分布容積MRTClとして計算されるであるVssおよび終末消失定数βに基づく分布容積[Cl/ln2/T1/2βとして計算]であるVzは、FIXポリペプチドをマウスに投与するアッセイにおいて評価することができ、血漿におけるFIXの濃度は、様々な時点で決定される。未修飾FIXポリペプチドと比較した、修飾FIXポリペプチドの分布容積の改善は、クリアランスについてのタンパク質のメカニズムおよび安全性プロファイルに依存して、修飾FIXポリペプチドの分布容積における増加または減少のいずれかを指すことができる。たとえば、ポリペプチドが複数のコンパートメントの中で分布する場合、修飾FIXポリペプチドの分布容積の減少は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、対象のコンパートメントにおける薬剤暴露および活性の有意な増加をもたらすことができるたとえば血管コンパートメント対血管外コンパートメント。他の場合では、たとえば、薬剤安全性がCmaxによって制限される場合、他のコンパートメントへの再分布たとえば内皮細胞の表面への結合は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、対象のコンパートメント内のより長い終末半減期および/または作用持続時間ならびに優れた安全性プロファイルをもたらし得る。修飾FIXポリペプチドの分布容積は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99減少し得る。他の例では、修飾FIXポリペプチドの分布容積が、未修飾FIXポリペプチドの分布容積の少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加する。本明細書において使用されるように、用語評価するおよびその文法的な変化形は、ポリペプチドの活性についての絶対値を得るという意味でおよびまた活性のレベルを示す指数、比、百分率、視覚的値、または他の値を得るという意味でも、定量的決定および定質的決定を含むように意図される。評価は、直接的または間接的なものであってもよい。たとえば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、産物の直接的な測定によるものとすることができるまたは切断された基質の結果として生じる活性を決定することによって間接的に測定することができる。本明細書において使用されるように、キモトリプシンナンバリングは、配列番号19の成熟ウシキモトリプシンポリペプチドのアミノ酸ナンバリングを指す。たとえば第IX因子のプロテアーゼドメインなどのような他のプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンを用いてなすことができる。そのような場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応する、第IX因子のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸のナンバリングが与えられる。対応する位置は、マニュアルアライメントを使用してまたは入手可能な多数のアライメントプログラムを使用することによってたとえばBLASTP、当業者によって、そのようなアライメントによって決定することができる。対応する位置はまた、たとえばタンパク質構造のコンピューターシミュレーションアラインメントを使用することによる構造のアラインメントに基づくものとすることができる。ポリペプチドのアミノ酸が開示される配列におけるアミノ酸に対応するという記載は、GAPアルゴリズムなどのような標準的なアライメントアルゴリズムを使用して、同一性または相同性を最大にするための、開示される配列とのポリペプチドのアライメント保存アミノ酸がアライメントされるに際して同定されるアミノ酸を指す。配列番号3において記載されるFIXポリペプチドのアミノ酸位置181~415の対応するキモトリプシンナンバーは、表1において提供される。配列番号3において記載される配列と比較したアミノ酸位置は、標準のフォントとし、それらの位置のアミノ酸残基は、太字とし、対応するキモトリプシンナンバーは、イタリック体とする。たとえば、成熟キモトリプシン配列番号19との成熟第IX因子配列番号3のアライメントに際して、第IX因子におけるアミノ酸位置181のバリンVは、V16のキモトリプシンナンバリングが与えられる。続くアミノ酸は、それに応じてナンバリングされる。一例では、成熟第IX因子配列番号3のアミノ酸位置213のグルタミン酸Eは、キモトリプシンナンバリングに基づいてアミノ酸位置E49に対応する。残基が、プロテアーゼにおいて存在するが、キモトリプシンにおいて存在しない場合、アミノ酸残基は文字表記が与えられる。たとえば、キモトリプシンナンバリングによるA95aおよびA95bは、成熟第IX因子配列配列番号3に関するナンバリングによるA261およびA262にそれぞれ対応する。表1第IX因子のキモトリプシンナンバリング本明細書において使用されるように、核酸は、DNA、RNA、ならびにペプチド核酸PNAおよびその混合物を含むその類似体を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖とすることができる。蛍光または放射ラベルなどの検出可能なラベルなどを用いて所望によりラベルされるプローブまたはプライマーを指す場合、一本鎖分子が、企図される。そのような分子は、典型的に、それらの標的が、統計的にユニークとなるような長さであるまたはライブラリーのプロービングもしくはプライミングのために低コピー数典型的に5未満、一般に3未満のものとする。一般に、プローブまたはプライマーは、対象の遺伝子と相補的なまたは同一の配列の少なくとも14、16、または30の連続ヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100、またはそれ以上の核酸長とすることができる。本明細書において使用されるように、ペプチドは、2~40のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるアミノ酸の様々な配列において生じるアミノ酸は、それらの知られている3文字または1文字の略語に従って同定される表2。様々な核酸断片において生じるヌクレオチドは、当技術分野においてルーチン的に使用される標準的な単一の文字の名称を用いて命名される。本明細書において使用されるように、アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、2つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書における目的上、アミノ酸は、20の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体つまりα-炭素が側鎖を有するアミノ酸を含む。JBiolChem24335573559、および適合する米国特許法施行規則§§1.821~1.822に記載される標準的なポリペプチド命名法に合わせて、アミノ酸残基についての略語を表2Aに示す。表2A対応の表本明細書における式によって表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向に、左から右への配向を有することに留意されたい。さらに、語句アミノ酸残基は、対応の表表2において列挙されるアミノ酸ならびに米国特許法施行規則§§1.821~1.822において言及されるものおよび参照によって本明細書において組み込まれるものなどのような修飾アミノ酸および例外的なアミノ酸を含むように、広く定義される。アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりのダッシュは、1つまたは複数のアミノ酸残基のさらなる配列に対する、NH2などのようなアミノ末端基に対する、またはCOOHなどのようなカルボキシル末端基に対するペプチド結合を示すことに留意されたい。本明細書において使用されるように、天然に存在するアミノ酸は、ポリペプチドにおいて生じる20種のL-アミノ酸を指す。本明細書において使用されるように、非天然アミノ酸は、表2において列挙される天然に存在するアミノ酸のうちの1つではない、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、たとえば、20種の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を含み、アミノ酸のD-立体異性体を含むが、これらに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は、当業者らに知られており、修飾第IX因子ポリペプチド中に含むことができる。本明細書における目的上、保存的アミノ酸交換は、ポリペプチドおよびそのドメインにおいてなされてもよい。ただし、結果として生じるタンパク質がFIXの活性を示す。表2Bにおいて記載されるものなどのような保存的アミノ酸交換は、タンパク質分解活性を排除しないものである。アミノ酸の適した保存的交換は、当業者に知られており、結果として生じる分子の生物学的活性を改変することなく、一般になされ得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須の領域における単一アミノ酸の交換が生物学的活性を実質的に改変しないことを認識するたとえば、WatsonetalMolecularBiologyoftheGene4thEdition1987TheBenjaminCummingsPubcop224を参照されたい。MTSPの触媒活性断片、特に単鎖プロテアーゼ部分もまた定義内に含まれる。保存的なアミノ酸交換は、以下の表2Bに記載される交換に従ってなされる。表2B他の交換もまた許容可能であり、経験的にまたは知られている保存的交換に従って決定されてもよい。本明細書において使用されるように、DNAコンストラクトは、自然界において見出されない様式で組み合わせられ、並べられたDNAのセグメントを含有する一本鎖もしくは二本鎖、線状、または環状のDNA分子である。DNAコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。本明細書において使用されるように、DNAセグメントは、特定の性状を有する、より大きなDNA分子の部分である。たとえば、特定のポリペプチドをコードするDNAセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのような、より長いDNA分子の部分であり、5’から3’方向に読み取られる場合、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。本明細書において使用されるように、ポリヌクレオチドという用語は、5’端から3’端に読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドベースの一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを含み、天然源から単離する、インビトロにおいて合成する、または天然分子および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチドntと省略または塩基対bpと省略により本明細書において示される。ヌクレオチドという用語は、状況が可能にする場合、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が、二本鎖分子に適用される場合、用語は、全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二重鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はわずかに長さが異なることがあり得、そしてその端がずれることがあり得、したがって、二重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対になることができるとは限らないことが当業者らによって認識されるであろう。そのような対でない端は、一般に、20ヌクレオチド長を超えないであろう。本明細書において使用されるように、一次配列は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列を指す。本明細書において使用されるように、2つのタンパク質または核酸の間の類似性は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列の間の関連性を指す。類似性は、残基の配列の同一性および/または相同性の程度ならびにそこに含有される残基に基づくものとすることができる。タンパク質または核酸の間の類似性の程度を評価するための方法は、当業者らに知られている。たとえば、配列類似性を評価するためのある方法において、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、配列の間で最大のレベルの同一性が得られるようにアライメントされる。同一性は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が一様である程度を指す。アミノ酸配列のアライメントおよびある程度のヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸またはヌクレオチドにおける保存的な差異および/または頻繁な交換を考慮することができる。保存的な差異は、含まれる残基の物理化学的特性を保存する差異である。アラインメントは、全体的配列の全体の長さにわたるおよび全ての残基を含む、比較される配列のアラインメントまたは局所的最も類似する1つまたは複数の領域のみを含む配列の部分のアラインメントなものとすることができる。本明細書において使用されるように、用語相同性および同一性は、区別なく使用されるが、タンパク質についての相同性は、保存的アミノ酸変化を含むことができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最も高度な程度のマッチが得られるように、アライメントされる[たとえばComputationalMolecularBiologyLeskAMedOxfordUniversityPressNewYork1988BiocomputingInformaticsandGenomeProjectsSmithDWedAcademicPressNewYork1993ComputerAnalysisofSequenceDataPartIGriffinAMandGriffinHGedsHumanaPressNewJersey1994SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinjeGAcademicPress1987andSequenceAnalysisPrimerGribskovMandDevereuxJedsMStocktonPressNewYork1991CarilloetalSIAMJAppliedMath481073を参照されたい]。本明細書において使用されるように、配列同一性は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較における、同一のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。相同性ポリペプチドは、所定の数の同一アミノ酸残基または相同性アミノ酸残基を指す。相同性は、同一残基と同様に、保存的なアミノ酸交換を含む。配列同一性は、それぞれのサプライヤーによって確立されるデフォルトギャップペナルティーを用いて使用される標準的なアライメントアルゴリズムプログラムによって決定することができる。相同性核酸分子は、所定の数の同一ヌクレオチドまたは相同性ヌクレオチドを指す。相同性は、同一残基と同様に、コードアミノ酸を変化させない交換つまりサイレント交換を含む。実質的に相同性の核酸分子は、典型的に、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーで、核酸の全長に沿ってまたは対象の完全長核酸分子の少なくとも約70、80、もしくは90に沿ってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子におけるコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子もまた、企図される。タンパク質の相同性の決定のために、保存的アミノ酸は、同一のアミノ酸と同様にアライメントすることができ、この場合、同一性の百分率および相同性百分率は、変わる。任意の2つの核酸分子が、少なくとも80、85、90、95、96、97、98、または99同一のヌクレオチド配列を有するまたは任意の2つのポリペプチドが、そのようなアミノ酸配列を有するかどうかは、FASTAプログラムなどのような、知られているコンピューターアルゴリズムを使用して、たとえば、PearsonetalProcNatlAcadSciUSA852444におけるデフォルトパラメーターを使用して、決定することができる[他のプログラムは、GCGプログラムパッケージ[DevereuxJetalNucleicAcidsResearch12387]、BLASTP、BLASTN、FASTA[AtschulSFetalJMolecBiol215403GuidetoHugeComputersMartinJBishopedAcademicPressSanDiegoandCarilloetalSIAMJAppliedMath481073を含む]。たとえば、NationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースのBLAST機能は、同一性を決定するために使用することができる。他の市販で入手可能なまたは公的に入手可能なプログラムは、DNAStarMegAlignプログラムMadison、WIおよびUniversityofWisconsinGeneticsComputerGroupUWGGapプログラムMadisonWIを含む。タンパク質および/または核酸分子の相同性または同一性のパーセントは、たとえば、GAPコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる[たとえば、SmithandWatermanによって改訂されたNeedlemanetalJMolBiol48443]。手短かに言えば、GAPのプログラムは、2つの配列のうちの短い方のシンボルの総数によって割った、類似する、アライメントされたシンボルつまりヌクレオチドまたはアミノ酸の数として類似性を定義する。GAPプログラムのためのデフォルトパラメーターは、1単項比較マトリックス同一の場合には1および同一でない場合には0という値を含有するならびにSchwartzandDayhoffedsAtlasofProteinSequenceandStructureNationalBiomedicalResearchFoundationpp353358によって記載されるGribskovetalNuclAcidsRes146745の加重比較マトリックス;2それぞれのギャップに対する3.0のペナルティーおよびそれぞれのギャップにおけるそれぞれのシンボルに対するさらなる0.10のペナルティー;ならびに3エンドギャップに対するペナルティーなし、を含むことができる。そのため、本明細書において使用されるように、用語同一性は、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。1つの非限定的な例では、~に少なくとも90同一のは、参照ポリペプチドと比較した、90~100の同一性パーセントを指す。90またはそれ以上のレベルでの同一性は、例証目的と仮定して、100アミノ酸の試験および参照ポリヌクレオチド長が比較され、試験ポリペプチドにおけるアミノ酸の多くとも10つまり100のうち10が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。類似する比較は、試験ポリヌクレオチドおよび参照ポリヌクレオチドの間でなすことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として表され得る、またはそれらは最大に許容できる、たとえば10/100のアミノ酸差異約90の同一性まで、様々な長さの1つまたは複数の場所にクラスター形成し得る。差異は、核酸またはアミノ酸の交換、挿入、または欠失として定義される。約85~90以上の相同性または同一性のレベルでは、結果は、プログラムおよびギャップパラメーターセットに非依存性であるはずであり、そのような高度なレベルの同一性は、ソフトウェアに頼ることなく容易に評価できることが多い。本明細書において使用されるように、用語実質的に同一のまたは類似するは、当業者らによって理解されるように、状況により変わるが、当業者らは、そのようなものを評価することができることもまた理解されたい。本明細書において使用されるように、配列のアライメントは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における対応する位置をアライメントするための相同性類似性および/または同一性の使用を指す。典型的に、50またはそれ以上の同一性によって関係する2つまたはそれ以上の配列が、アライメントされる。配列のアライメントセットは、対応する位置でアライメントされる2つまたはそれ以上の配列を指し、ゲノムDNA配列とアライメントされる、ESTおよび他のcDNAなどのような、RNAに由来するアライメント配列を含むことができる。本明細書において使用されるように、特異的にハイブリダイズするは、標的核酸分子への核酸分子たとえばオリゴヌクレオチドの相補的塩基対合によるアニーリングを指す。当業者らは、特定の分子の長さおよび組成などのような、特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロパラメーターおよびインビボパラメーターに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは、アニーリング温度および洗浄温度、緩衝液組成、ならびに塩濃度をさらに含む。非特異的結合核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは0.1×SSPE、0.1SDS、65°C、中ストリンジェンシーでは0.2×SSPE、0.1SDS、50°Cである。等価なストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている。当業者は、特定の適用に適切な標的核酸分子への核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するために、これらのパラメーターを容易に調整することができる。本明細書において使用されるように、単離もしくは精製ポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する組織の細胞に由来する細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないまたは化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない。調製物は、そのような純度を評価するために当業者らによって使用される薄層クロマトグラフィーTLC、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィーHPLCなどのような標準的な分析方法によって決定されるように、容易に検出可能な不純物がそれらにないまたは十分に純粋であり、さらなる精製が、物質のタンパク質分解活性および生物学的活性などのような物理的特性および化学的特性を検出可能に変化させないであろうと思われる場合、実質的に不純物がないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製のための方法は、当業者らに知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物となり得る。そのような場合、さらなる精製は、化合物の特異的活性を増加させ得る。細胞性物質が実質的にないという用語は、タンパク質が単離されるまたは組換えで産生される細胞の細胞性構成成分からタンパク質が分離されている、タンパク質の調製物を含む。一実施形態では、細胞性物質が実質的にないという用語が、約30未満乾燥重量によるの非プロテアーゼタンパク質本明細書において混入タンパク質とも呼ばれる、一般に、約20未満の非プロテアーゼタンパク質または10の非プロテアーゼタンパク質または約5未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換えで産生される場合、それもまた、実質的に培地がない、すなわち、培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の20、10、または5未満、その前後、またはそれと等しい。本明細書において使用されるように、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている、プロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約30乾燥重量による、20、10、5以下、またはそれ未満の化学的前駆体または非プロテアーゼ化学物質もしくは構成成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。本明細書において使用されるように、組換えDNA法を使用することによる組換え法による産生は、クローニングDNAによりコードされるタンパク質を発現させるための、分子生物学のよく知られている方法の使用を指す。本明細書において使用されるように、ベクターまたはプラスミドは、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種核酸を導入するために使用される別個のエレメントを指す。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体の中への遺伝子またはその部分の統合を達成するように設計することができる。細菌人工染色体、酵母人工染色体、および哺乳動物人工染色体などのような人工染色体であるベクターもまた企図される。そのような媒体の選択および使用は、当業者らによく知られている。本明細書において使用されるように、発現は、核酸がmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムDNAに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または真核生物宿主生物が選択される場合、mRNAのスプライシングなどのようなプロセシングを含むことができる。本明細書において使用されるように、発現ベクターは、そのようなDNA断片の発現を達成することができる、プロモーター領域などのような調節配列と作動可能に連結されるDNAを発現することができるベクターを含む。そのようなさらなるセグメントは、プロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、所望により、1つまたは複数の複製開始点、1つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他同種のもの含むことができる。発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスDNAに一般に由来するまたは両方のエレメントを含有することができる。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞の中への導入に際してクローニングDNAの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または他のベクターなどのような組換えDNAコンストラクトまたは組換えRNAコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは、当業者らによく知られており、真核細胞および/または原核細胞において複製可能なベクターならびにエピソームのままのベクターまたは宿主細胞ゲノムの中に統合するベクターを含む。本明細書において使用されるように、ベクターはまた、ウイルスベクターまたはウイルス性ベクターを含む。ウイルス性ベクターは、細胞の中に外因性遺伝子を移入する媒体またはシャトルとしてように外因性遺伝子に作動可能に連結される、操作されたウイルスである。本明細書において使用されるように、アデノウイルスは、ヒトにおいて結膜炎および上気道感染症を引き起こすDNA含有ウイルスのグループのいずれかを指す。本明細書において使用されるように、裸のDNAは、ワクチンおよび遺伝子療法に使用することができるヒストンなしのDNAを指す。裸のDNAは、形質転換またはトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移入プロセスの間に細胞から細胞に移される遺伝物質である。形質転換またはトランスフェクションにおいて、レシピエント細胞によって取り込まれる精製DNAまたは裸のDNAは、レシピエント細胞に、新しい特徴または表現型を与えるであろう。本明細書において使用されるように、操作可能にまたは作用可能に連結されたは、DNAセグメントを指す場合、セグメントが、意図される目的に一致して機能するように、たとえば、転写がプロモーターにおいて開始し、コードセグメントを通ってターミネーターに進むように配置されることを意味する。本明細書において使用されるように、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調整する作用物質は、タンパク質の活性を減少させるもしくは増加させるまたは他の場合には改変するまたはいくつかの様式において、細胞における核酸の発現をアップレギュレートするもしくはダウンレギュレートするまたは改変する。本明細書において使用されるように、キメラタンパク質または融合タンパク質は、異なるポリペプチドに作動可能に連結されたポリペプチドを指す。本明細書において提供されるキメラタンパク質または融合タンパク質は、1つもしくは複数のFIXポリペプチドもしくはその部分ならびに任意の1つもしくは複数の転写/翻訳制御シグナルについての1つもしくは複数の他のポリペプチド、シグナル配列、局在化のためのタグ、精製のためのタグ、免疫グロブリンGのドメインの一部、および/または標的作用物質を含むことができる。キメラFIXポリペプチドはまた、他のポリペプチドと交換されるポリペプチドのそれらの内因性ドメインまたは内因性領域を有するものをも含む。これらのキメラタンパク質または融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え手段によって産生されるもの、たとえばスルフヒドリル基へのカップリングを通した化学的カップリングなどのように、化学的手段によって産生されるもの、ならびに少なくとも1つのポリペプチドつまりFIXまたはその部分が、リンカー複数可を介して直接的または間接的に他のポリペプチドに連結される任意の他の方法により産生されるものを含む。本明細書において使用されるように、作動可能に連結されたは、融合タンパク質を指す場合、インフレームで互いに融合されるプロテアーゼポリペプチドおよび非プロテアーゼポリペプチドを指す。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのN-末端またはC-末端に融合することができる。本明細書において使用されるように、標的作用物質は、細胞表面受容体などのような細胞表面分子への特異的な結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分などのような任意の部分であり、受容体は、いくつかの場合では、結合したコンジュゲートまたはその部分を内部移行することができる。標的作用物質はまた、たとえば、コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、表面へのコンジュゲートの付加、またはコンジュゲートもしくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するもしくは容易にする作用物質とすることもできる。本明細書において使用されるように、分子の誘導体または類似体は、分子から誘導される部分または分子の修飾バーションを指す。本明細書において使用されるように、疾患または障害は、感染症、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状により特徴づけられる、生物における病的状態を指す。本明細書における対象の疾患および障害は、凝固タンパク質によって媒介されるものおよび凝固タンパク質が病因または病状において役割を果たすものを含む、凝固を伴うものを含む。疾患および障害はまた、血友病などにおいて、タンパク質の欠如によって引き起こされるものを含み、本明細書において特に関心があるのは、凝固タンパク質における欠損の欠乏症により凝固が生じないそれらの障害である。本明細書において使用されるように、凝血促進薬は、血液凝固を促進する任意の物質を指す。本明細書において使用されるように、抗凝固薬は、血液凝固を阻害する任意の物質を指す。本明細書において使用されるように、血友病は、血液凝血因子における欠乏症によって引き起こされる出血障害を指す。血友病は、たとえば、凝血因子の欠如、発現の低下、または機能の低下の結果となり得る。最も一般的な型の血友病は、血友病Aであり、これは、第VIII因子における欠乏症に起因する。第2の一般的な型の血友病は、血友病Bであり、これは、第IX因子における欠乏症に起因する。FXI欠乏症と呼ばれる血友病Cは、より軽度な、それほど一般的でない形態の血友病である。本明細書において使用されるように、先天性血友病は、遺伝する血友病の型を指す。先天性血友病は、凝血因子遺伝子の突然変異、欠失、挿入、または他の修飾に起因し、凝血因子の産生は、欠如している、低下している、または機能しない。たとえば、第VIII因子および第IX因子などのような凝血因子遺伝子における遺伝性の突然変異は、先天性血友病、血友病AおよびBをそれぞれもたらす。本明細書において使用されるように、後天性血友病は、FVIIIを不活性化する自己抗体の産生に由来する、成人期において発症する血友病の型を指す。本明細書において使用されるように、出血障害は、対象が、出血を制御する能力が減少している状態を指す。出血障害は、遺伝し得または獲得され得、また、たとえば、凝固経路における欠損もしくは欠乏症、血小板活性における欠損もしくは欠乏症、または血管の欠損に起因し得る。本明細書において使用されるように、後天性出血障害は、肝臓疾患、ビタミンK欠乏症、またはクマジンワルファリンもしくは他の抗凝固薬による療法などのような状態によって引き起こされる凝血欠乏症に起因する出血障害を指す。本明細書において使用されるように、疾患または状態を有する対象を処置するは、本明細書において提供されるポリペプチド、組成物、または他の産物が、対象に投与されることを意味する。本明細書において使用されるように、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤、または化学療法剤は、ワクチンを含む従来の薬剤および薬剤療法を意味し、これらは、当業者らに知られている。放射線治療剤は、当技術分野においてよく知られている。本明細書において使用されるように、処置は、状態、障害、または疾患の症状が回復するまたは有益に改変される任意の様式を意味する。したがって、処置は、予防法、療法、および/または治療法を包含する。処置はまた、本明細書における組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。処置はまた、本明細書において提供される修飾FIXおよび組成物の任意の、医薬としての使用をも包含する。本明細書において使用されるように、医薬組成物または他の治療薬の投与によるなどのような処置による特定の疾患または障害の症状の回復は、永久的なものまたは一時的なもの、永続的なものまたは一過性のものにかかわらず、組成物または治療薬の投与に帰し得るまたは関連し得る、症状の任意の緩和を指す。本明細書において使用されるように、予防または予防法は、疾患または状態を発症する危険性を低下させる方法を指す。予防法は、疾患もしくは状態を発症する危険性の減少および/または症状の悪化もしくは疾患の進行の予防または症状の悪化もしくは疾患の進行の危険性の低下を含む。本明細書において使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物または組成物の有効量は、疾患と関連する症状を回復させるまたはいくつかの様式では低下させるのに十分な量である。上記量は、単一投与量として投与することができまたはレジメンに従って投与することができ、それによって、それは、有効となる。その量は、疾患を治癒することができるが、典型的に、疾患の症状を回復させるために投与される。典型的に、反復投与が、症状の所望の回復を達成するために必要とされる。本明細書において使用されるように、治療有効量または治療有効用量は、治療上の効果をもたらすのに少なくとも十分な化合物を含有する作用物質、化合物、物質、または組成物を指す。有効量は、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、回復させる、阻止する、または部分的に阻止するために必要な治療剤の含量である。本明細書において使用されるように、処置されることとなる患者または対象は、ヒトまたは哺乳動物を含む非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、およびサルなどのような霊長動物;イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、雌ウシなどのような家畜化された動物;ならびにマウス、ラット、ハムスター、およびアレチネズミなどのようなげっ歯動物を含む。本明細書において使用されるように、組合せは、2つのアイテムの間のまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連を指す。関連は、空間的なものとすることができるまたは共通の目的のための2つもしくはそれ以上のアイテムの使用を指すことができる。本明細書において使用されるように、組成物は、2つまたはそれ以上の産物または化合物たとえば作用物質、修飾因子、調節因子などの任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性製剤もしくは非水性製剤、またはそれらの任意の組合せとすることができる。本明細書において使用されるように、製品は、作製され、販売される産物である。本出願の全体にわたって使用されるように、この用語は、包装製品に含有される修飾プロテアーゼポリペプチドおよび核酸を包含するように意図される。本明細書において使用されるように、流体は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形態をしている組成物を包含する。本明細書において使用されるように、キットは、包装された組合せを指し、所望により、組合せのエレメントを使用する方法を実施するための試薬および他の産物および/または成分を含む。たとえば、本明細書において提供される修飾プロテアーゼポリペプチドまたは核酸分子ならびに投与、診断、および生物学的活性または生物学的特性の評価を含むが、これらに限定されない目的のための他のアイテムを含有するキットが提供される。キットは、所望により、使用のための説明書を含む。本明細書において使用されるように、抗体は、軽鎖および重鎖の可変領域から構成される、Fab断片などのような抗体断片を含む。本明細書において使用されるように、受容体は、特定のリガンドに対する親和性を有する分子を指す。受容体は、天然に存在する分子または合成分子とすることができる。受容体はまた、当技術分野において抗リガンドと呼ぶこともできる。本明細書において使用されるように、動物は、これらに限定されないが、ヒト、ゴリラ、およびサルを含む霊長動物;マウスおよびラットなどのようなげっ歯動物;ニワトリなどのような家禽;ヤギ、雌ウシ、シカ、ヒツジなどのような反芻動物;ブタなどのようなヒツジに近い動物ならびに他の動物などのような任意の動物を含む。非ヒト動物は、企図される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるプロテアーゼは、任意の源、動物、植物、原核生物、および菌類に由来するものである。本明細書において使用されるように、遺伝子療法は、そのような療法が求められる障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの標的細胞である、ある種の細胞の中へのDNAなどのような異種核酸の移入を伴う。DNAなどのような核酸は、直接的またはベクターもしくは他のデリバリービヒクルなどにおいてDNAなどの異種核酸が発現し、それによって、コードされる治療産物が産生される様式で、選択される標的細胞の中に導入される。その代わりに、DNAなどのような異種核酸は、いくつかの様式において、治療産物をコードするDNAの発現を媒介することができるまたはそれは、いくつかの様式において、直接的または間接的に治療産物の発現を媒介する、ペプチドまたはRNAなどのような産物をコードすることができる。遺伝的療法はまた、欠陥遺伝子を置換するまたは核酸が導入される哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳動物宿主において通常産生されないまたは治療有効量でもしくは治療的に有用な時に産生されない、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼなどのような治療化合物をコードすることができる。治療産物をコードする、DNAなどのような異種核酸は、産物またはその発現を増強するまたはその他の場合には改変するために、罹患した宿主の細胞の中への導入の前に、修飾することができる。遺伝的療法はまた、遺伝子発現の阻害因子またはリプレッサーまたは他の修飾因子のデリバリーを伴い得る。本明細書において使用されるように、異種核酸は、核酸が発現する細胞によってインビボにおいて通常産生されないまたは細胞によって産生されるが、異なる座にあるもしくは異なって発現されるまたは転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって、DNAなどのような内因性核酸の発現を改変する媒介物を媒介するもしくはコードする核酸である。異種核酸は、一般に、核酸が導入される細胞にとって内因性ではないが、他の細胞から得られたまたは合成的に調製されたものである。異種核酸は、内因性のものとすることができるが、異なる座から発現するまたはその発現が改変された核酸である。一般に、必ずではないが、そのような核酸は、細胞によってまたは核酸が発現される細胞と同じ方法で通常産生されないRNAおよびタンパク質をコードする。DNAなどのような異種核酸はまた、DNAなどのような外来性核酸と呼ぶこともできる。したがって、異種核酸または外来性核酸は、DNAなどのような核酸分子対応物がゲノムにおいて見出されるように、全く同じ配向または位置に存在しない核酸分子を含む。それはまた、他の生物または種に由来する核酸分子を指すこともできるつまり外因性。核酸が発現される細胞に対して異種または外来性であるとして当業者が認識するまたは考えるであろう、DNAなどのような任意の核酸は、本明細書において異種核酸によって包含され、異種核酸は、内因的にも発現する、外因的に追加される核酸を含む。異種核酸の例は、薬剤抵抗性を付与するタンパク質などのような追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素、およびホルモンなどのような治療的に有効な物質をコードする核酸、ならびに抗体などのような他の種類のタンパク質をコードする、DNAなどのような核酸を含むが、これらに限定されない。異種核酸によってコードされる抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面上に分泌され得るまたは発現され得る。本明細書において使用されるように、遺伝子療法のための治療的に有効な産物は、異種核酸、典型的にDNAによってコードされ、宿主の中への核酸の導入に際して、遺伝性疾患もしくは後天性疾患の症状、徴候を回復させるもしくは排除するまたは疾患を治癒する産物が発現される、産物である。RNAiおよびアンチセンスなどのような生物学的活性核酸分子もまた含まれる。本明細書において使用されるように、ポリペプチドが、アミノ酸の記載される配列から本質的になるという説明は、完全長ポリペプチドの記載される部分またはその断片のみが存在することを意味する。ポリペプチドは、他の源からのさらなるアミノ酸を所望により含むことができ、一般にそれらを含み、またはそれを他のポリペプチドの中に挿入することができる。本明細書において使用されるように、単数形1つのa1つのan、およびそのtheは、文脈が他に特に明らかに指示しない限り、複数の指示物を含む。したがって、たとえば、細胞外ドメインを含む化合物への言及は、1つまたは複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。本明細書において使用されるように、範囲および量は、約、その特定の値または範囲として表現することができる。約はまた、まさにその量をも含む。したがって、約5塩基は、約5塩基およびまた5塩基をも意味する。本明細書において使用されるように、所望によるまたは所望によりは、引き続いて記載される事象または状況が、生じるまたは生じないことおよび説明が、前記事象または状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含むことを意味する。たとえば、所望により交換される基は、基が交換されないまたは交換されることを意味する。本明細書において使用されるように、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略語は、他に示されない限り、それらの共通の使用法、認識される略語、またはIUPACIUBCommissiononBiochemicalNomenclature[Biochem111726を参照されたい]に従うものとする。B.止血およびそれにおける第IX因子の役割修飾FIXaポリペプチドを含む修飾第IX因子FIXポリペプチドおよびその触媒活性断片が、本明細書において提供される。第IX因子ポリペプチドは、止血の調節およびプロセスにおいて役割を果たし、したがって、治療剤として使用することができる。臨床的使用のためのFIXなどのような治療タンパク質の有効なデリバリーは、薬学に対する主な課題である。一度血流に入ると、これらのタンパク質は、腎臓における糸球体濾過または血液におけるタンパク質分解などのようなタンパク質排除のための通常の経路を使用する代謝およびクリアランスを含む様々な生理学的プロセスによって、短時間内に、循環から絶えず排除される。一度胃腸管内腔に入ると、これらのタンパク質は、内腔のプロテアーゼによって絶えず消化される。後者は、静脈内注射において治療剤として使用されるタンパク質の半減期に影響を及ぼす、制限的なプロセスになり得る。さらに、血液中の阻害因子は、治療タンパク質の活性を特異的に阻害し得る。たとえば、アンチトロンビンAT-III、ヘパリン、およびAT-III/ヘパリン複合体は、FIXの血液凝固活性を阻害し得る。薬物動態学的および薬力学的特性の改善、触媒活性の増加、ならびに/または阻害因子に対する抵抗性の増加を含む、特性の改善を有するFIXのより効果的な変異体が、必要とされる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、血清半減期の増加などのような薬物動態学的特性の改善;アンチトロンビンIIIAT-III、ヘパリン、およびAT-III/ヘパリン複合体などのような阻害因子に対する抵抗性の増加;触媒活性の増加;またはその任意の組合せを含む、特性の改善を示す。したがって、血液凝固活性が増加した修飾FIXポリペプチドが提供される。したがって、これらのポリペプチドは、たとえば、止血を調整するための治療薬として、様々な使用および適用を有する。以下の議論は、第IX因子およびその修飾の議論の前に、凝固プロセスおよびこのプロセスにおける第IX因子の役割の概説を提供する。止血は、血管系に対する傷害に起因する出血を止める生理学的メカニズムである。正常な止血は、細胞性構成成分および可溶性血漿タンパク質に依存し、血餅の形成に最終的に至る一連のシグナリング事象を伴う。傷害が血管に対して生じ、内皮細胞が損害を与えられた後に、凝固は、素速く開始される。凝固の一次フェーズにおいて、血小板は、活性化されて、傷害の部位で止血性の血栓を形成する。二次止血が続き、血漿凝固因子が伴い、これは、タンパク質分解カスケードにおいて作用し、血小板血栓を強化するフィブリン鎖の形成をもたらす。血管傷害に際して、傷害を与えられた直後のエリアへの血流は、血管の収縮によって制限され、内皮下の結合組織上に新しく露出した線維状コラーゲンに血小板が粘着することを可能にする。この粘着は、フォンビルブランド因子vWFに依存性であり、これは、傷害の3秒以内に内皮に結合し、それによって、血小板の粘着および凝集を容易にする。凝集した血小板の活性化は、ADP、ATP、トロンボキサン、およびセロトニンを含む様々な因子の分泌をもたらす。粘着分子、フィブリノーゲン、vWF、トロンボスポンジン、およびフィブロネクチンもまた、放出される。そのような分泌は、血小板のさらなる粘着および凝集、血小板活性化および血管収縮の増加、ならびに血液凝固酵素複合体のアセンブリーのためのプラットホームとして働く、血小板表面上の陰イオン性リン脂質の暴露を促進する。血小板は、形状を変化させ、仮足形成に至り、これは、他の血小板への凝集をさらに容易にし、緩い血小板血栓をもたらす。ペプチダーゼの凝血カスケード凝固カスケードは、同時に開始される。凝固カスケードは、タンパク質分解性の切断を伴う一連の活性化事象を含む。そのようなカスケードにおいて、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質チモーゲンとも呼ばれるは、1つまたは複数のペプチド結合の切断によって活性プロテアーゼに変換され、次いで、これは、カスケードにおける次のチモーゲン分子のための活性化プロテアーゼとして働き、最終的に、フィブリンの架橋によって血餅形成をもたらす。たとえば、カスケードは、トロンビンなどのような活性化分子プロトロンビンの切断に由来するを生成し、これは、血小板をさらに活性化し、また、フィブリノーゲンの切断に由来するフィブリンを生成する。次いで、フィブリンは、血餅を安定化するために血小板血栓のまわりに架橋ポリマーを形成する。傷害の修復に際して、フィブリンは、主要な構成成分がプラスミノーゲンおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子tPAである線溶系によって消化される。これらのタンパク質の両方は、重合フィブリンの中に組み込まれ、それらは、相互作用して、プラスミンを生成し、これは、順番に、フィブリンに作用して、前に形成された血餅を溶解する。血餅形成の間に、凝固因子阻害因子はまた、傷害部位を除く血餅形成を予防するために血液中を循環する。傷害から血餅形成および続く線溶までの系の相互作用は、下記に記載される。1.血小板の粘着および凝集血液の凝血は、正常な条件下で能動的に回避される。血管内皮は、血管拡張を支持し、血小板の粘着および活性化を阻害し、凝固を抑制し、フィブリン切断を増強し、かつ抗炎症性の特徴をしている。血管内皮細胞は、亜酸化窒素NOおよびプロスタサイクリンなどのような分子を分泌し、これは、血小板の凝集を阻害し、血管を拡張する。これらの分子の放出は、可溶性グアニル酸シクラーゼsGCおよびcGMP依存性プロテインキナーゼIcGKIを活性化し、環状グアノシン一リン酸cGMPレベルを増加させ、これは、血管壁における平滑筋の弛緩を引き起こす。さらに、内皮細胞は、CD39などのような細胞表面ADPアーゼを発現し、これは、血小板から放出されたADPをアデニンヌクレオチド血小板阻害因子に変換することによって、血小板の活性化および凝集を制御する。内皮はまた、線溶カスケードにおける酵素の調節において重要な役割を果たす。内皮細胞は、プラスミノーゲンアネキシンIIおよびウロキナーゼの受容体の発現ならびに組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の分泌を通してプラスミンの生成を直接的に促進し、これらの全ては、血餅クリアランスを促進する。血栓形成促進性の調節の最終層において、内皮細胞は、ヘパラン硫酸を産生することによって、凝固カスケードを阻害する際に能動的な役割を果たし、これは、トロンビンおよび他の凝固因子のアンチトロンビンIII阻害の反応速度を増加させる。しかしながら、急性血管外傷下で、血管収縮性のメカニズムが、優勢であり、内皮は、自然に、血栓形成促進性、凝固促進性procoagulatory、および炎症促進性になる。これは、内皮拡張剤:アデノシン、NO、およびプロスタサイクリンの低下;ならびにそれらの収縮を誘発するための、血管平滑筋細胞に対する、ADP、セロトニン、およびトロンボキサンの直接的な作用によって達成されるBeckerHeindletal2000。止血性の血栓の形成に至る内皮の機能における変化に対する主なトリガーは、血液および細胞外マトリックスECM構成成分の間の内皮細胞壁の損失である[RuggeriNatMed812271234]。循環する血小板は、内皮の病変のエリアを同定し、識別し、暴露した内皮下層に接着する。様々な血栓形成性の基質および局所的に生成されたアゴニストまたは放出されたアゴニストとのそれらの相互作用は、血小板活性化をもたらす。このプロセスは、2つのステージ、1粘着:表面への初期の連結および2凝集:血小板-血小板接着を有するとして記載されている[SavageetalCurrOpinHematol8270276]。血小板粘着は、循環する血小板が、細胞表面上のコラーゲン結合タンパク質との相互作用を通しておよびこれもまた内皮上に存在するvWFとの相互作用を通して暴露したコラーゲンに結合する場合、開始される。vWFタンパク質は、内皮によって2つの方向に;基底面にbasolaterallyおよび血流の中に分泌される可変サイズの多量体構造である。vWFはまた、第VIII因子に結合し、これは、第VIII因子の安定化および循環におけるその存続において重要である。血小板粘着および続く活性化は、vWFが、GPIb血小板糖タンパク質受容体複合体GPIb-IX-Vの一部にそのA1ドメインを介して結合する場合、達成される。vWFおよびGPIbの間の相互作用は、ずり応力における増加が、GPIbに対するvWFの親和性の対応する増加をもたらすように、剪断力によって調節される。白血球上のVLA-2としても知られているインテグリンα1β2は、血小板上の主要なコラーゲン受容体であり、この受容体を通した結合は、血小板活性化に寄与する細胞内シグナルを生成する。α1β2を通した結合は、低親和性コラーゲン受容体、GPVIの結合を容易にする。これは、免疫グロブリンスーパーファミリーの一部であり、血小板活性化のための最も強力な細胞内シグナルを生成する受容体である。血小板活性化は、アデノシン二リン酸ADPの放出をもたらし、これは、トロンボキサンA2に変換される。血小板活性化はまた、血小板インテグリンαIIbβ3としても知られている血小板糖タンパク質IIb-IIIaGPIIb-IIIa受容体の表面発現をもたらす。GPIIb-IIIa受容体は、これらの受容体を通して血小板を連結するフィブリノーゲン分子により互いの血小板の粘着つまり凝集を可能にする。これは、傷害の部位での血小板血栓の形成をもたらして、さらなる失血を予防するのを助けるが、損害を与えられた血管組織は、凝固カスケードおよび血小板血栓のまわりで安定化フィブリン網の形成を開始する因子を放出する。2.凝固カスケード凝固経路は、それぞれの酵素が、チモーゲンまたは不活性形態として血漿中に存在する、タンパク質分解経路である。チモーゲンの切断は、前駆体分子から活性形態を放出するために調節される。経路は、活性化プロセスを制御する、一連のポジティブフィードバックループおよびネガティブフィードバックループとして機能し、最終目標は、トロンビンを産生することであり、次いで、これは、可溶性フィブリノーゲンをフィブリンに変換して、血餅を形成することができる。凝固因子および他のタンパク質は、1つまたは複数の、凝固の内在性経路、外因性経路、または共通経路を通して、血液凝固に参加する。下記に議論されるように、これらの経路は、相互に連絡し、血液凝固は、活性化の細胞ベースのモデルを通しておそらく起こる。トロンビンの生成は、歴史的に、3つの経路、活性化第X因子FXaの生成のための代替経路を提供する内在性経路経路の全ての構成成分が、血漿に対して内在性であることを示唆するおよび外因性経路経路の1つまたは複数の構成成分が、血漿に対して外因性であることを示唆するならびにトロンビン形成をもたらす最終共通経路に分けられてきた図1。これらの経路は、凝固を達成するために、相互に連絡した、相互依存性のプロセスに共に参加する。これらの経路を説明する凝固の細胞ベースのモデルが、開発された図2[HoffmanetalThrombHaemost85958965]。このモデルにおいて、外因性経路および内在性経路は、それぞれ、異なる細胞表面、組織因子TFを有する細胞、および血小板上で達成される。凝固のプロセスは、異なるフェーズ、開始、増幅、および伝播に分類され、この間に、外因性経路および内在性経路は、様々なステージで機能して、血餅形成のための、十分な量のフィブリノーゲンをフィブリンに変換するために必要とされるトロンビンの大量の著しい増加をもたらす。a.開始FVIIは、凝固カスケードの開始を担う凝固因子であると考えられ、この開始は、TFとのその相互作用に依存性である。TFは、平滑筋細胞、線維芽細胞、単球、リンパ球、顆粒球、血小板、および内皮細胞などのような様々な細胞によって発現される膜貫通糖タンパク質である。骨髄性細胞および内皮細胞は、それらが、炎症促進性サイトカインなどによって刺激される場合のみ、TFを発現する。しかしながら、平滑筋細胞および線維芽細胞は、TFを恒常的に発現する。したがって、一度、これらの細胞が、組織傷害の後に血流に接すると、凝固カスケードは、血漿中の第VII因子またはFVIIaとのTFの結合によって速やかに開始される。TF/FVIIa複合体は、FVIIaのTFへの直接的な結合によってまたはFVIIのTFへの結合および次いで、FXa、FIXa、FXIIa、もしくはFVIIaそれ自体などのような血漿プロテアーゼによるFVIIのFVIIaへの続く活性化によって形成することができる。TF/FVIIa複合体は、TFを有する細胞に固定されたままであり、それは、少量のFXをFXaに活性化し、これは、凝固の外因性経路として知られている。TF/FVIIa複合体はまた、少量のFIXをFIXaに切断する。FXaは、その補因子FVaと結合して、これもまた、TFを有する細胞上で、プロトロンビンをトロンビンに次いで変換することができる複合体を形成する。しかしながら、産生された少量のトロンビンは、完全な凝血に必要とされるフィブリン形成を支持するのに不十分である。さらに、あらゆる活性FXaおよび活性FIXaは、アンチトロンビンIIIAT-IIIおよび他のセルピンによって循環において阻害され、これについては、下記により詳細に議論される。これは、通常、循環において血餅形成を予防するであろう。しかしながら、傷害の存在下において、血管系への損害は、血小板凝集およびトロンビン形成のこの部位での活性化をもたらし、それによって、凝固シグナルの増幅を可能にする。b.増幅増幅は、トロンビンが血小板に結合し、血小板を活性化する場合、起こる。活性化血小板は、それらのアルファ顆粒からFVを放出し、これは、トロンビンによって活性化されて、FVaになる。トロンビンはまた、血小板膜上でFVIII/vWF複合体からFVIIIを放出し、活性化し、FXIを切断して、FXIaにする。これらの反応は、それらの表面上にFVa、FVIIIa、およびFIXaを有する活性化血小板を生成し、これは、伝播ステージの間のトロンビン生成の大量の著しい増加のためのステージを準備するものである。c.伝播凝固の伝播は、傷害の部位の多くの血小板の表面で生じる。上記に記載されるように、活性化血小板は、それらの表面上に、FXIa、FVIIIa、およびFVaを有する。外因性経路が達成されるのは、ここにおいてである。FXIaは、FIXを活性化して、FIXaにし、これは、次いで、FVIIIaと結合することができる。このプロセスは、TFを有する細胞上のTF/FVIIa複合体によるFIXの切断によって生成される少量のFIXaに加えて、その補因子、FVIIIa、カルシウム、および適したリン脂質表面と複合体を形成した大量のFIXaを生成する。この複合体は、テナーゼまたは第X因子活性化複合体複合体と呼ばれ、それは、第X因子FXを切断して、活性化し、第Xa因子FXaにする。FXa分子は、FVaに結合して、プロトロンビンを活性化してトロンビンにするプロトロンビナーゼ複合体を生成する。トロンビンは、より多くの血小板を活性化するためにポジティブフィードバックループにおいて作用し、増幅フェーズについて記載されるプロセスを再度開始する。直後に、フィブリノーゲンから十分な量のフィブリンを生成して、止血性のフィブリン血餅を形成するのに十分に多い、著しく増加したトロンビンを生成するための、適切な複合体を有する、十分な数の活性化血小板がある。フィブリノーゲンは、トロンビンによって切断された場合、フィブリノペプチドAおよびフィブリノペプチドBを放出する、血漿において可溶性の二量体である。次いで、フィブリノペプチドBは、トロンビンによって切断され、この第2のタンパク質分解性の切断によって自発的に形成されたフィブリン単量体は、不溶性ゲルを形成する。重合したフィブリンは、非共有結合性の力および静電力によって共に保持され、トロンビンによるFXIIIの切断によって産生されるトランスアミド化transamidating酵素因子XIIIaFXIIIaによって安定化される。トロンビンはまた、TAFIをも活性化し、これは、血餅表面でプラスミン生成を低下させることによって線溶を阻害する。さらに、トロンビンは、それ自体、さらなる安定化のために血餅の構造の中に組み込まれる。これらの不溶性フィブリン凝集体血餅は、凝集した血小板血栓と共に、損害を与えられた血管をブロックし、さらなる出血を予防する。3.凝固の調節凝固の間、カスケードは、さらなる血餅形成を阻害するために、恒常的な刺激プロセスによって調節される。調節は、aフィブリン血餅形成による組織の虚血を制限するのに、およびb組織傷害の部位にのみ血餅形成を局在化することによって、広範囲の血栓症を予防するのに重要である。調節は、いくつかの阻害分子の作用によって達成される。たとえば、アンチトロンビンIIIAT-IIIおよび組織因子経路阻害因子TFPIは、凝固カスケードにおける因子を阻害するために恒常的に働く。TFPIは、主に、FXaおよびFVIIa/TF複合体を阻害する。対照的に、セリンプロテアーゼ阻害因子セルピンであるAT-IIIは、主に、トロンビン、FXa、およびFIXaを阻害する。AT-IIIによるこれらの凝固因子の阻害は、ヘパリンによって非常に増強され、これは、AT-IIIに結合して、阻害反応を加速する活性化コンホメーション変化を誘発する。ヘパリンはまた、AT-III非依存性の様式においてFIXa/FVIIIa複合体の活性を阻害することができるYuanetalBiochemistry4436153625。血小板活性化を介して刺激されるさらなる因子、プロテインCは、FVaおよびFVIIIaのタンパク質分解性の切断および不活性化によって凝固を調節する。プロテインSは、プロテインCの活性を増強する。さらに、凝固阻害に寄与する他の因子は、必須の膜タンパク質、トロンボモジュリンであり、これは、血管内皮細胞によって産生され、トロンビンに対する受容体として働く。トロンビンのトロンボモジュリンへの結合は、トロンビン凝血促進活性を阻害し、またプロテインC活性化にも寄与する。線溶、フィブリン血餅の崩壊もまた、凝固を調節するためのメカニズムを提供する。血餅における架橋フィブリン多量体は、セリンプロテアーゼであるプラスミンによって可溶性ポリペプチドに分解される。プラスミンは、その不活性前駆体プラスミノーゲンから生成することができ、2つの方法において:フィブリン血餅の表面の組織プラスミノーゲン活性化因子tPAとの相互作用によっておよび細胞表面のウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子uPAとの相互作用によってフィブリン血餅の部位に動員される。第1のメカニズムは、血管内の血餅の溶解を担う主要なメカニズムであると思われる。第2のものは、血餅融解を媒介することができるが、組織リモデリング、細胞移動、および炎症において主要な役割を果たすことができる。血餅融解もまた、2つの方法において調節される。第一に、効率的なプラスミン活性化および線溶は、血餅表面でまたは細胞膜上で形成される複合体においてのみ生じるが、血液中に遊離しているタンパク質は、非効率的な触媒であり、速やかに不活性化される。第二に、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミンは、プラスミノーゲン活性化因子に作用するプラスミノーゲン活性化因子阻害因子1型PAI-1およびPAI-2ならびにプラスミンを不活性化するα2-抗プラスミンおよびα2-マクログロブリンなどのような分子によって不活性化される。正常な状況下で、凝固および線溶の間の適時のバランスは、血管傷害の後の、血餅の効率的な形成および除去をもたらすが、望まれない血栓症エピソードまたは出血エピソードを同時に予防する。C.第IX因子FIX構造および機能活性または機能の改善を有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。FIXは、凝固カスケードに関与するポリペプチドである。凝固カスケードにおけるFIXの役割は、その構造および活性化のメカニズムに関連する。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドによる凝固の修飾もまた、その構造および活性化のメカニズムに関連づけられることが理解される。これらの特徴は、未修飾FIXポリペプチドと同じとなり得る。他の場合では、これらの特徴は、本明細書において提供されるFIXポリペプチドにおいて修飾され、したがって、活性または特性が改変されたまたは改善されたポリペプチドをもたらすことができる。たとえば、FIXポリペプチドの修飾は、FIXポリペプチドの1つまたは複数の活性を改変することができる。たとえば、野生型FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの増加を示す修飾FIXポリペプチドが提供される。修飾FIXポリペプチドは、したがって、インビボアッセイを使用して試験される場合に、野生型FIXポリペプチドと比較して、クリアランスの低下および血清半減期の増加などのような、薬物動態学的特性の改善を示すことができる。AT-III、ヘパリン、およびAT-III/ヘパリン複合体などのような阻害因子に対する抵抗性の増加ならびに/または触媒活性の増加を示す修飾FIXポリペプチドもまた、提供される。したがって、未修飾FIXポリペプチドと比較して、改善された治療特性を示す修飾FIXポリペプチドが、提供される。FIXポリペプチドおよび修飾FIXポリペプチドの構造的および機能的特徴の要約を下記に記載する。第IX因子は、ビタミンK依存性セリンプロテアーゼであり、止血における重要な凝固因子である。それは、肝臓において単鎖チモーゲンとして合成され、凝固カスケードの一部として活性化されるまでこの不活性化状態で血液中を循環する。FXIaまたはTF/FVIIa複合体によるFIXチモーゲンから活性化FIXFIXaへの活性化の後に、FIXaは、その補因子、FVIIIaに結合する。結果として生じるFIXa/FVIIIa複合体は、FXに結合して、FXaに活性化し、したがって、止血を確立するために上記に記載される凝固カスケードを継続する。血液中のFIXの濃度は、約4~5μg/mlであり、それは、約18~24時間の半減期を有する。クリスマス病または第IX因子欠乏症としても知られている血友病Bは、FIX遺伝子における任意の1つまたは複数の様々な突然変異に起因するFIXの欠乏症または機能障害によって引き起こされる。血友病Aほど一般的ではないが、血友病Bは、再発性の関節の出血が、滑膜肥大、滑膜、軟骨、および骨の破壊を伴う慢性滑膜炎に至り、進行性で重症の関節損傷のために、慢性痛、関節の硬直、および運動制限に至り得る、深刻な疾患のままである。再発性の筋肉出血もまた、急性痛、腫脹、および運動制限をもたらすが、他の部位の出血が、罹患および死亡の一因となり得る。処置は、典型的に、組換えFIXrFIXを用いる置換療法によるものである。血友病Bなどのような第IX因子療法に適用可能な疾患および状態を処置するために、改善された治療薬として働くことができる、活性化に際して凝固活性の増加を有するように設計される修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。1.FIX構造ヒトFIX遺伝子は、X染色体上に位置し、約34kb長であり、8つのエクソンを有する。ヒトFIX転写物は、2803ヌクレオチドであり、短い5’非翻訳領域、1383ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム終止コドンを含む、および3’非翻訳領域を含有する。1383ヌクレオチドオープンリーディングフレームまたはFIXmRNA;配列番号1は、細胞性分泌経路に第IX因子ポリペプチドを導く28アミノ酸N末端シグナルペプチド配列番号2のアミノ酸1~28を含有する461アミノ酸前駆体ポリペプチドSwiss-Prot受託番号P00740;配列番号2をコードする。疎水性シグナルペプチドに加えて、FIX前駆体ポリペプチドはまた、切断された場合に、FIXaへの活性化までチモーゲンとして血液中を循環する415アミノ酸成熟ポリペプチド配列番号3を放出する18アミノ酸プロペプチド配列番号2のアミノ酸29~46をも含有する。シグナルペプチドおよびプロペプチドに加えて、FIX前駆体はまた、以下のセグメントおよびドメインを含有する:Glaドメイン配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸1~46に対応する配列番号2のアミノ酸47~92、上皮成長因子EGF様ドメイン1EGF1;配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸47~83に対応する配列番号2のアミノ酸93~129、EGF2配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸84~125に対応する配列番号2のアミノ酸130~171、軽鎖配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸1~145に対応する配列番号2のアミノ酸47~191、活性化ペプチド配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸146~180に対応する配列番号2のアミノ酸192~226、重鎖配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸181~415に対応する配列番号2のアミノ酸227~461、およびセリンプロテアーゼドメイン配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸181~413に対応する配列番号2のアミノ酸227~459。プロトロンビン、凝固因子VIIおよびX、ならびにプロテインC、S、およびZなどのような他のビタミンK依存性タンパク質のように、FIXのGlaドメインは、カルシウムイオンの存在下において、細胞のリン脂質膜と相互作用する膜結合モチーフである。ビタミンK依存性タンパク質は、これらのタンパク質のGlaドメインにおいてクラスター形成されるアミノ酸であるγ-カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンKを必要とする。FIXGlaドメインは、12のグルタミン酸残基を有し、これらは、それぞれ、潜在的なカルボキシル化部位となる。そのため、それらの多くは、γ-カルボキシグルタミン酸残基を生成するために、カルボキシル化によって修飾される。カルシウムイオンによって占められた場合に、膜への結合を達成するために脂質二重層の中に挿入される、FIXポリペプチド中の疎水性残基を暴露するようにGlaドメインの正確な折り畳みを促進する、高および低親和性両方の、FIXGlaドメイン中の、合計8つのCa2結合部位がある。Glaドメインに加えて、FIXポリペプチドはまた、2つのEGF様ドメインをも含有する。EGF様ドメインはそれぞれ、EGFタンパク質において観察される同じパターンをした各ドメインにおいて、3つのジスルフィド結合を形成する6つの高度に保存されたシステイン残基を含有する。第1のEGF様ドメインEGF1は、カルシウムイオンによって占められた場合に、分子の正確な折り畳みに寄与し、生物学的活性を促す、高親和性Ca2結合部位を含有するカルシウム結合EGFドメインである[RaoetalCell82131141]。第2のEGFドメインEGF2は、カルシウム結合部位を含有していない。FIXのセリンプロテアーゼドメインまたは触媒ドメインは、FIXaのタンパク質分解活性を担うドメインである。他のセリンプロテアーゼのように、FIXは、H221、D269、およびS365キモトリプシンナンバリングによるH57、D102、およびS195に対応するからなるセリンプロテアーゼ触媒3残基を含有する。FIXaへの成熟FIXの活性化は、R145-A146結合およびR180-V181結合配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに関するナンバリングのタンパク質分解性の切断によって達成され、配列番号3において記載される成熟FIXタンパク質のアミノ酸146~180に対応する活性化ペプチドを放出する。したがって、活性化の後に、FIXaは、2つの鎖;軽鎖および重鎖からなる。軽鎖は、Glaドメイン、EGF1、およびEGF2ドメインを含有し、重鎖は、プロテアーゼドメインを含有する。2つの鎖は、C132およびC289の間の単一のジスルフィド結合によって共に保持される。2.FIX翻訳後修飾第IX因子前駆体ポリペプチドは、血液の中に分泌される成熟チモーゲンになるように広範囲な翻訳後修飾を受ける。そのような翻訳後修飾は、γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、シグナルペプチドおよびプロペプチドの切断、OおよびN結合型グリコシル化、硫酸化、ならびにリン酸化を含む。N末端シグナルペプチドは、小胞体ERにポリペプチドを導き、その後にそれは切断される。細胞からの分泌の直前に、プロペプチドは、切断部位の前の4つのアミノ酸内の少なくとも2つのアルギニン残基を認識する、たとえばPACE/フューリンなどのようなプロセシングプロテアーゼによって切断される。単一酵素、ビタミンK依存性ガンマカルボキシラーゼは、ER中のγ-カルボキシル化FIXを触媒する[BerknerJNutr130187780]。カルボキシル化反応において、γ-カルボキシラーゼは、FIXプロペプチドに結合し、ポリペプチドのGlaドメインにおけるグルタミン酸残基のγ-炭素上の第2のカルボキシル化を触媒するつまり、Gluからγ-カルボキシグルタミルまたはGlaに。グルタミン酸残基が全てγ-カルボキシル化されることを仮定すると、FIXは、12のGla残基を含有し、最初の10個は、他のビタミンK依存性タンパク質と相同性の位置にある。次いで、FIXのGlaドメインは、基質を放出する前に、クラスター中のグルタミン酸を全て前進的にprocessivelyカルボキシル化する[Morrisetal1995Berkner2000Steninaetal2001]。FIXもまた、部分的にβ-ヒドロキシル化される。この修飾は、EGF1におけるD64配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するのβ-炭素をヒドロキシル化するジオキシゲナーゼによって実行される。ヒトFIXポリペプチドのおよそ3分の1が、β-ヒドロキシル化される。D64は、FIXのEGF1ドメインにおける高親和性Ca2結合部位に寄与するが、この残基のヒドロキシル化は、Ca2結合にも生物学的活性にも必要であるように思われない[DerianetalJBiolChem26466156618SunnerhagenetalJBiolChem2682333923344]。さらなる翻訳後修飾は、位置155のチロシンでのスルホン化および位置158のセリン残基でのリン酸化を含む。第IX因子のこれらの翻訳後修飾は、FIXのインビボ回収率の寄与に関係した[KaufmanThrombHaemost7910681079、米国特許第7,575,897号]。FIXは、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのN157およびN167に対応する活性化ペプチドにおけるアスパラギン残基でN結合型グリコシル化される。翻訳後修飾はまた、O結合型二糖および三糖を有する位置53配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するにセリン残基をももたらすが、位置61のセリン残基は、O結合型四糖を含有する[NishimuraetalJBiolChem2642032020325HarrisetalBiochemistry3265396547]。さらに、アミノ酸位置159および169配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するのトレオニン残基は、O-グリコシル化される[AgarwalaetalBiochemistry3351675171]。アミノ酸位置172および179のトレオニン残基もまた、O-グリコシル化され得る。3.FIX活性化第IX因子は、タンパク質分解性の切断によって活性化されるまで、最小のタンパク質分解活性を有するチモーゲンとして主に循環する。活性化は、TF/FVIIa複合体または第XIa因子によって達成することができる。TF/FVIIaによる活性化は、内在性経路を通してのものであるが、FXIaによる活性化は、上記に記載される外因性経路を通してのものである。活性化のプロセスは、連続的なものであるように思われ、Arg145-Ala146結合が最初に切断され、Arg180-Val181結合の切断がその後に続く[SchmidtetalTrendsCardioMed133945]。タンパク質分解性の切断は、活性化ペプチドを放出し、アミノ酸位置132および289配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するナンバリングの2つのシステインの間のジスルフィド結合によって共に保持される、軽鎖配列番号3のアミノ酸位置1~145に対応するおよび重鎖配列番号3のアミノ酸位置181~415に対応するを含有する二重鎖FIXa分子を形成する。FX中の少なくとも2つのエキソサイトは、FIX/TF/FVIIa三元複合体を形成するために、TF/FVIIa複合体中のTFへの結合に関与するように思われる[ChenetalThrombHaemost887482]。研究は、FIXのEGF1ドメインが、TF/FVIIa複合体によるFIX活性化に必要とされることを示唆する。たとえば、FIXのEGF1ドメインにおけるG48配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに関するの突然変異は、TF/FVIIaによるその活性化を低下させる[WuetalThrombHaemost84626634]。さらに、FIXのEGF1ドメインは、TF/FVIIa複合体におけるTFと相互作用することが示された[ZhongetalJBiolChem2773622]。対照的に、しかしながら、EGF1ドメインは、FXIaによるFIX活性化に必要とされるように思われない。Glaドメインもまた、TF/FVIIa複合体への結合およびそのため活性化に関与する。FIXのGlaドメインは、TFにおける、FXと同じ領域と相互作用し、これもまた、TF/FVIIa複合体によって活性化される[KirchhoferetalBiochem3973807387]。活性化ペプチドの切断および放出の後に、V181配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応する;キモトリプシンナンバリングによるV16の新しいアミノ末端が生成される。活性化ペプチドの放出は、コンホメーション変化を促進し、それによって、V181のアミノ基が活性部位の中に入り、D364の側鎖カルボキシレートと塩ブリッジを形成する。そのような変化は、その変化によりS365のヒドロキシル側鎖がその基質、FXの切断部位を加水分解することができる反応性の種に変換するので、チモーゲン状態の活性状態への変換に必要とされる。さらなるコンホメーション変化がFVIIIaとの結合などによって誘発され、最大の触媒活性を有するFIXaポリペプチドを生成するまで、活性化FIXaポリペプチドは、チモーゲン様のコンホメーションのままである。4.FIX機能FIXは、凝固経路において重要な役割を果たし、欠乏症またはFIX活性の欠如は、血友病Bに至る。一度、FIXからFIXaに活性化されたら、FIXaは、順番に、大量のFXを、凝固に必要とされるFXaに活性化するように機能する。そうするために、FIXaは、活性化血小板のリン脂質表面上で、内在性テナーゼ複合体とも呼ばれるFIXa/FVIIIa複合体を形成するためにその補因子、第VIIIa因子に最初に結合しなければならない。FIXのGlaドメインおよびEGF2ドメインの両方は、リン脂質への安定した結合にとって重要である。次いで、FIXa/FVIIIa複合体は、FXに結合してこの凝固因子を切断し、FIXaを形成する。FIXaは、その補因子、FVIIIaおよび生理学的基質、FXの非存在下において事実上不活性である。実験的研究は、これが主に99ループに起因することを示す。FIXaにその補因子が結合していない場合、Y177は、Y99およびK98キモトリプシンナンバリングによる、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのY266およびK265に対応するの側鎖が基質結合を妨げる不活性コンホメーションにおいて99ループを固定する。FIXaへのFVIIIaの結合は、このチモーゲン様のコンホメーションを解き放ち、放出し、FXは、次いで、FIXa/FVIIIa複合体と結合し、解き放たれた99ループを再配列し、引き続いて活性部位のくぼみに結合することができる[SichleretalJBiolChem27841214126]。リン脂質へのFIXaの結合およびCa2の存在は、反応をさらに増強する。FIXa/FVIIIa相互作用のいくつかのモデルが、提唱されてきた[たとえばAutinetalJThrombHaemost320442056StoilovaMcPhieetalBlood9912151223BajajetalJBiolChem2761630216309SchmidtetalTrendsCardiovascMed133945を参照されたい]。FIXaは、FIXaポリペプチドの2つ以上のドメインを伴う相互作用においてFVIIIaに結合する。FVIIIaは、3つの非共有結合鎖:A1、A2、およびA3-C1-C2からなるヘテロ二量体である。A3-C1-C2はまた、軽鎖とも呼ばれる。FIXaのプロテアーゼドメインは、FVIIIaのA2サブユニットと相互作用するように思われる。研究は、FIXaの293ヘリックスキモトリプシンナンバリングによる126ヘリックス、330ヘリックスキモトリプシンナンバリングによる162ヘリックス、およびN346キモトリプシンナンバリングによるN178が、FVIIIaのA2サブユニットとの相互作用に関与することを示唆する。FIXaのEGF1/EGF2ドメインは、FVIIIaのA3サブユニットと相互作用する。さらに、FIXaのGlaドメインは、FVIIIaのC2ドメインと相互作用することが仮定される。カルシウムイオンおよびリン脂質もまた、FIXaおよびFVIIIaの結合に寄与する。たとえば、リン脂質の存在は、約2000倍まで、FVIIIaへのFIXaの結合を増加させる[MathuretalJBiolChem272]。FIXa/FVIIIa複合体によるFXの結合の後に、FIXaのプロテアーゼドメインまたは触媒ドメインは、FXaを形成するためのR194-I195でのFXの切断を担う。FIXaの活性は、上記に議論されるように、AT-III/ヘパリン複合体などのような阻害分子および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質LRPなどのような他のクリアランスのメカニズムによって調節される。LRPは、肝臓、脳、胎盤、および肺を含む様々な組織上に発現される膜糖タンパク質である。LRPは、FIXaに加えて、アポリポタンパク質、リパーゼ、プロテイナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤複合体、およびマトリックスタンパク質を含むが、これらに限定されない広範囲のタンパク質および複合体に結合する。FIXのチモーゲン形態または不活性形態は、LRPに結合しない。もっと正確に言えば、活性化に際して、LRP結合部位が暴露される[NeelsetalBlood9634593465]。この結合部位は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドの残基342~346にわたるプロテアーゼドメインにおけるループに位置する[RohlenaetalJBiolChem27893949401]。5.生物製剤としてのFIX第IX因子は、完全に、血液凝固プロセスに関与し、その活性化形態FIXaにおいて、それは、FVIIIaとテナーゼ複合体を形成し、FXをFXaに活性化する。FXaは、リン脂質、カルシウム、およびFVaと共に、プロトロンビンをトロンビンに変換し、これは、順番に、フィブリノーゲンをフィブリン単量体に切断し、したがって、強固で網目の血餅の形成を促進する。多くの研究は、外因性FIXが、血友病を有する患者において血液凝血を促す能力を実証した。たとえば、FIXが欠損している血友病B患者は、外因性FIXを用いる置換療法によって処置することができる。初期の置換療法は、MonoNine登録商標第IX因子およびAlpha-nine-SD登録商標第IX因子として販売される治療薬などのような血漿精製FIXを利用した。Bebulin登録商標VH、FXおよび低量のFVIIとのFIXの精製濃縮物;Konyne登録商標80Bayer、FII、FX、および低レベルのFVIIとのFIXの精製濃縮物;PROPLEX登録商標TBaxterInternational、FII、FVII、およびFXと共にFIXを含有する、プールされた正常ヒト血漿からの調製された熱処理産物;ならびにProfilnineSD登録商標AlphaTherapeuticCorporationを含む、血漿精製FIX複合体治療薬もまた、使用されてきた。より最近では、しかしながら、ヒト組換え第IX因子BeneFIX登録商標凝固因子IX組換え体、Wyethが、手術背景における出血の制御および予防を含む、血友病B患者における出血エピソードの制御および予防における使用のために承認されてきた。BeneFIX登録商標凝固因子IX組換え体は、配列番号20において記載されるアミノ酸配列を有し、血漿由来第IX因子のAla148対立形質と同一である。したがって、配列番号3において記載される野生型FIXポリペプチドと比較して、BeneFIX登録商標、凝固因子IX組換え体は、T148A突然変異を含有する。凝血促進薬としてのその使用に加えて、FIXの不活性形態または触媒活性が低下した形態は、血栓症の疾患および状態の処置などにおいて、抗凝血薬として使用することができる。典型的に、FIXは、静脈内に投与されるだけでなく、経口的に、全身性に、頬側に、経皮に、筋肉内に、および皮下に投与することもできる。FIXは、一度または複数回、投与することができる。一般的に、複数回の投与は、凝固を達成するために、FIXを用いる処置レジメンにおいて使用される。本明細書において下記に議論されるように、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、未修飾または野生型または他の治療的に活性なFIXポリペプチドが使用されることが知られている、任意の処置あるいは製薬の方法において使用することもできる。そのような使用、方法、およびプロセスにおいて、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、野生型または未修飾FIXポリペプチドと比較して、改善された特性を示す。D.修飾FIXポリペプチド修飾第IX因子ポリペプチドが、本明細書において提供される。FIXポリペプチドは、野生型または未修飾FIXポリペプチドの一次配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換交換によって修飾することができる。結果として生じる修飾ポリペプチドは、未修飾または野生型FIXポリペプチドと比較した、改善された特性または活性を示す。たとえば、修飾第IX因子および第IXa因子ポリペプチドの修飾FIXaポリペプチドおよび断片を含む修飾第IX因子ポリペプチドは、高グリコシル化を含む、改変されたグリコシル化などのような改変された翻訳後修飾および/またはリン酸化もしくは硫酸化の減少などのような改変されたリン酸化もしくは硫酸化;AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性の増加;LRPへの結合の減少;触媒活性の増加;クリアランスの減少およびインビボにおける血清半減期の増加を含む、改善された薬物動態学的特性;血液凝固活性の増加;またはその任意の組合せを有することができる。典型的に、修飾FIXポリペプチドは、凝血促進活性を示す。したがって、それらの単鎖チモーゲン形態からの活性化および補因子、FVIIIaへの続く結合に際して増加した血液凝固活性を示す修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。そのような修飾FIXポリペプチドは、たとえば血友病Bなどのような不十分な凝固によって特徴づけられる疾患または状態を有する患者に投与することができる。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、AT-III、ヘパリン、およびAT-III/ヘパリン複合体を含む阻害因子に対する抵抗性の増加を示す。そのような修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示すことができる。さらなる例では、本明細書において提供される修飾第IX因子ポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化レベルおよび/またはグリコシル化の種類の改変などのような、改変された翻訳後修飾を示す。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。したがって、高グリコシル化FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾FIXポリペプチドは、炭水化物成分が連結される、少なくとも1つの非天然グリコシル化部位つまり未修飾または野生型FIXポリペプチドにおいて見出されないグリコシル化部位の組み込みにより、グリコシル化の増加を示すことができる。そのような修飾FIXポリペプチドは、クリアランスの減少および血清半減期の増加を含む、インビボにおける改善された薬物動態学的特性を示すことができる。非天然グリコシル化部位および続く炭水化物成分の導入は、1つまたは複数の他のタンパク質とのFIXポリペプチドの相互作用を立体的に妨げることによって、修飾FIXポリペプチドの活性をさらに改善することができる。たとえば、グリコシル化部位は、炭水化物成分がこの部位に付加される場合に、それがAT-III/ヘパリン複合体との修飾FIXポリペプチドの相互作用を立体的に妨げ、AT-III/ヘパリンに対する抵抗性が増加したポリペプチドをもたらすように、導入することができる。これは、さらに、循環からのポリペプチドのクリアランスを低下させることができる。したがって、新しいグリコシル化部位の導入の効果は、炭水化物成分がまた、AT-III/ヘパリン複合体などのような他のタンパク質との相互作用をも立体的に妨げる場合、数倍になり得る。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、1つまたは複数の修飾を含有することができる。たとえば、1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の非天然グリコシル化部位を導入することができる。導入することができるグリコシル化部位は、N-グリコシル化部位、O-グリコシル化部位、またはその組合せを含むが、これらに限定されない。したがって、グリコシル化を促進する細胞においてまたはインビトログリコシル化の後に産生される場合、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、天然グリコシル化部位たとえば、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのS53、S61、N157、N167、T159、T169、T172、およびT179に対応する天然グリコシル化部位に連結される炭水化物成分に加えて、それぞれ異なる非天然グリコシル化部位に連結される1、2、3、4、5、6、またはそれ以上の炭水化物成分を含有することができる。特定の例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、1つまたは複数の非天然N-グリコシル化部位を含有する。したがって、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、N-グリコシル化のレベルの増加を示すことができる。たとえば、グリコシル化が増加した修飾FIXポリペプチドはまた、未修飾FIXポリペプチドと比較して、溶解性の増加、AT-III/ヘパリン抵抗性の増加、血清半減期の増加、免疫原性の減少、および/または血液凝固活性の増加をも示すことができる。そのような修飾FIXポリペプチドは、血友病または傷害などのような、出血障害または出血事象の処置において使用することができ、FIXポリペプチドは、血液凝固を促進するために機能することができる。いくつかの場合では、グリコシル化の増加を示す、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、タンパク質を不活性またはほとんど不活性にする、1つまたは複数の修飾をも含有することができる。そのようなポリペプチドは、そのため、抗凝固薬活性の増加を示すことができ、血栓症の事象、状態、または疾患の処置において使用することができる。典型的に、しかしながら、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、凝血促進薬である。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、他の活性および/または特性をも示すことができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドのいくつかは、触媒活性を増加させる1つまたは複数の修飾を含有する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、リン酸化、硫酸化、ヒドロキシル化、および/またはグリコシル化を減少させる、1つまたは複数の修飾を含有する。さらなる例では、修飾FIXポリペプチドが、FIXおよびLRPの間の相互作用に干渉する修飾を含有する。LRPへのFIXの結合を妨害することによって、循環からのFIXのクリアランスを減少させることができる。したがって、LRPへのFIXの結合を低下させる修飾は、インビボにおけるFIXの薬物動態学的特性を改善することができる。1つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を導入するまたは阻害因子に対する抵抗性を増加させる修飾などのような、本明細書において記載されるアミノ酸置換などのような修飾は、配列番号2において記載される配列を有する前駆体FIXポリペプチドを含む任意のFIXポリペプチドたとえば未修飾もしくは野生型FIXポリペプチド、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドにおいて、または配列番号2もしくは配列番号3において記載されるFIXポリペプチドに対して少なくとも40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するFIXポリペプチドにおいて、なすことができる。アミノ酸残基に対する本明細書における言及は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのナンバリングに関するものであることが理解される。配列番号3と他のFIXポリペプチドの配列のアライメントによって、前駆体、成熟、または他の活性形態などのような任意の形態の他のFIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を同定することは、当業者のレベルの範囲内にあるたとえば図3を参照されたい。本明細書において提供される任意のアミノ酸置換は、異なるまたは置換アミノ酸残基と同じでない、対応するアミノ酸残基でなすことができる。本明細書において記載される活性または特性について、任意の結果として生じる修飾FIXポリペプチドを試験することは、当業者のレベルの範囲内にある。たとえば、アミノ酸置換などのような修飾は、当技術分野において記載されるものなどのような、任意の種、対立遺伝子、または修飾変異体においてなすことができる。FIXの対立遺伝子変異体は、T148AおよびT412Pを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供されるアミノ酸置換のいずれも、突然変異T148AまたはT412Pを含有する第IX因子とすることができる。たとえば、任意のアミノ酸置換などのような修飾は、配列番号325または配列番号20において記載されるFIXポリペプチドにおいてなすことができる。本明細書における修飾のための例示的な種変異体は、それらの配列が配列番号4~18においてそれぞれ記載されるチンパンジー、アカゲザル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、雌ウシ、ヒツジ、カエル、ゼブラフィッシュ、および日本フグFIXポリペプチド由来のFIXポリペプチドを含む、ヒトおよび非ヒトポリペプチドを含むが、これらに限定されない。FIXポリペプチドにおける修飾は、一次配列の修飾およびポリペプチドの一次配列におけるものではない修飾を含む、当技術分野において記載されるものなどのような、他の修飾をも含有するFIXポリペプチドに対してなすことができるたとえば、本明細書において記載されるアミノ修飾をなすことができる、例示的な修飾FIXポリペプチドを記載するD.6部を参照されたい。他の例では、アミノ酸置換などのような修飾が、配列番号2もしくは配列番号3の活性断片などのようなFIXポリペプチドの任意の活性断片または当技術分野において記載されるものなどのような種、対立遺伝子、もしくは修飾変異体の活性断片においてなすことができる。活性断片は、ポリペプチドの触媒活性ドメインまたは本明細書において記載されるアミノ酸置換などのようなアミノ酸修飾を含有する触媒活性部分を含有するアミノ酸の連続配列を含有する。活性断片は、配列番号3において記載されるFIXポリペプチドなどのようなポリペプチドの成熟形態の活性の少なくとも30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上を示す。FIXポリペプチドの修飾はまた、異なるFIXポリペプチドのハイブリッドであるポリペプチドおよび知られているポリペプチドの配列に基づいて、組換えで調製されたまたは当技術分野において知られている他の方法によって合成されたもしくは構築された合成FIXポリペプチドの修飾をも含む。たとえば、第FVII因子FVIIおよび第X因子FXを含むが、これらに限定されない他の凝固因子ファミリーメンバーとのFIXのアライメントに基づいて、ファミリーメンバーの間の相同性ドメインは、容易に同定される。FIXポリペプチドのキメラ変異体は、構築することができ、1つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインは、対応するファミリーメンバーのアミノ酸配列を使用して、FIXアミノ酸配列において置換される。さらに、キメラFIXポリペプチドは、1つもしくは複数のアミノ酸または全ドメインが、異なる種のアミノ酸配列を使用して、ヒトFIXアミノ酸配列において置換されるものを含む。そのようなキメラタンパク質は、出発未修飾FIXポリペプチドとして本明細書において使用することができる。出発未修飾参照ポリペプチドの本明細書において提供される修飾は、アミノ酸置換もしくは交換、アミノ酸の追加もしくは欠失、またはその任意の組合せを含む。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、またはそれ以上の修飾位置を有するものを含む。いくつかの例では、FIXのある活性または特性を改変するためになされる修飾はまた、またはその代わりに、もう1つの他の活性または特性に影響を及ぼすことができる。たとえば、阻害因子に対する抵抗性を増加させるためになされる修飾はまた、またはその代わりに、触媒活性を増加させることができる。他の例では、新しいグリコシル化部位を導入するためになされる修飾がまた、阻害因子に対する抵抗性の増加および/または触媒活性の増加をもたらすことができる。さらなる例では、LRPへの結合の減少のためになされる修飾はまた、またはその代わりに、AT-III/ヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる。したがって、本明細書において記載される修飾は、典型的に、FIX活性または特性に対するそれらの意図される影響に関して記載されるが、本明細書において記載される修飾のいずれも、単独でまたは1つもしくは複数の他の修飾と共に、他の予測されない活性または特性における変化をもたらし得ることが理解される。本明細書において提供される任意の修飾は、当業者に知られている任意の他の修飾と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、それがその二重鎖形態をしている場合、凝固活性の増加を示す。修飾の結果として改変することができる活性または特性は、凝固もしくは血液凝固活性;凝血促進活性;第X因子FX活性化を達成するためのなどのようなタンパク質分解活性もしくは触媒活性;抗原性抗FIX抗体に結合する能力もしくはそれへの結合についてあるポリペプチドと競合する能力;FVIIIa、アンチトロンビンIII、ヘパリン、および/もしくは第X因子に結合するための能力;リン脂質に結合するための能力;3次元構造;pI;および/またはコンホメーションを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの中で、アンチトロンビンIIIAT-IIIに対する抵抗性の増加、ヘパリンに対する抵抗性の増加、グリコシル化の増加などのような、改変されたグリコシル化、触媒活性の増加、ならびにiクリアランスの減少、ii分布容積の改変、iiiインビボにおける回収率の増強、ivインビボにおける総タンパク質暴露の増強つまりAUC、v血清半減期α-、β-、および/もしくはγ-相の増加、ならびに/またはvi平均共鳴時間MRTの増加などのような改善された薬物動態学的特性を有するものが本明細書において提供される。いくつかの例では、修飾は、FIXポリペプチドの2つまたはそれ以上の特性または活性に影響を及ぼすことができる。たとえば、修飾は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、修飾FIXポリペプチドのAT-III抵抗性の増加および触媒活性の増加をもたらすことができる。他の例では、非天然N-グリコシル化部位を導入し、したがって、哺乳動物細胞などのような適切な細胞において発現される場合に、ポリペプチドのグリコシル化レベルを増加させることができる修飾もまた、未修飾FIXポリペプチドと比較して、修飾FIXポリペプチドの触媒活性の増加をもたらすことができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、修飾の効果の範囲を同定するために、それぞれの特性および活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、下記に記載される。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの特性および/または活性に対する変化は、FVIIIaに対する結合ならびに/またはFXの結合および活性化などのような、しかし限定されない、他のFIX活性または特性を保持しながら、なされる。したがって、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、FIXポリペプチドの野生型形態または出発形態と比較して、FVIIIa結合および/またはFX結合ならびに活性化を保持する。典型的に、そのような活性は、野生型タンパク質または出発タンパク質と比較して、実質的に不変である1、5、または10未満変化する。他の例では、修飾FIXポリペプチドの活性が、野生型ポリペプチドまたは出発FIXポリペプチドと比較して、増加するまたは減少する。活性は、インビトロにおいてまたはインビボにおいて評価することができ、たとえば成熟野生型天然FIXポリペプチド配列番号3、野生型前駆体FIXポリペプチド配列番号2、または出発物質として使用される当業者に知られている任意の他のFIXポリペプチドなどのような未修飾FIXポリペプチドと比較することができる。本明細書において提供される修飾は、当業者にとってルーチン的なものなどのような標準的な組換えDNA技術によってなすことができる。標的タンパク質における任意の1つまたは複数のアミノ酸の突然変異を達成するための、当技術分野において知られている任意の方法を利用することができる。方法は、コード核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法によるものを含む。炭水化物部分の追加、ポリエチレングリコールPEG部分の追加、Fcドメイン、血清アルブミン、および/または他のタンパク質の追加を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの一次配列にあるまたはない他の修飾は、修飾FIXポリペプチドまたはそのコンジュゲートにおいて含むことができる。たとえば、そのようなさらなる修飾は、タンパク質の安定性または半減期を増加させるためになすことができる。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、単鎖チモーゲンポリペプチドであるものおよび二重鎖チモーゲン様のポリペプチドであるものつまり、補因子、FVIIIaに結合していないFIXaポリペプチドを含む。単鎖ポリペプチドである、本明細書において提供される任意の修飾FIXポリペプチドは、修飾FIXaつまり二重鎖形態を生成するために活性化することができる。修飾FIXポリペプチドの活性は、その二重鎖形態において典型的に示される。1.例示的なアミノ酸置換配列番号3のナンバリングに関する残基のナンバリングと共に本明細書において下記に記載される1つまたは複数のアミノ酸置換を含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。同じアミノ酸置換は、他のFIXポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基においてなすことができるたとえば、対応するアミノ酸残基の同定の例証のために図3を参照されたい。アミノ酸置換は、改変されたグリコシル化たとえば非天然グリコシル化部位の導入もしくは天然グリコシル化部位の排除によって、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンに対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、LRP結合の減少、ならびに/または翻訳後修飾の改変を付与する。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、たとえば、改善された薬力学的または薬物動態学的活性による、改善された治療上の効能を示す。特に、本明細書において下記に提供される修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸置換の非限定的な例は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに関するナンバリングにより、任意の1つまたは複数のアミノ酸残基155、318、338、343、403、および/または410でのものであるキモトリプシンナンバリングによって、それぞれ、アミノ酸残基[155]、150、170、175、233、および/または240に対応する。他のFIXポリペプチドにおける155、318、338、343、403、および/または410のいずれかに対応する残基は、配列番号3との配列アライメントによって決定することができるたとえば図3を参照されたい。配列番号3に関するナンバリングによるアミノ酸残基155、318、338、343、403、および/または410のいずれかでの本明細書において提供されるアミノ酸置換は、本明細書において別記されるように、他のFIXポリペプチドにおいてなすことができることが理解される。本明細書において提供される他のアミノ酸置換のいずれかに対応する残基はまた、本明細書において例示されるように、他のFIXポリペプチドにおいて同定することもできることもまた、理解されるたとえば図3。特に、アミノ酸残基Y155、Y155L、Y155H、R318A、R318Y、R318E、R318F、R318W、R318D、R318I、R318K、R318L、R318M、R318N、R318S、R318V、R318Y、R338A、R338E、T343R、T343E、T343D、T343F、T343I、T343K、T343L、T343M、T343Q、T343S、T343V、T343W、T343Y、R403A、R403E、E410Q、E410S、E410N、E410A、E410Dでのチロシンのアミノ酸置換または保存的アミノ酸置換たとえば表2Bを参照されたいが、本明細書において提供される。いくつかの例では、アミノ酸置換が、Y155F、R318Y、R318E、R338E、T343R、R403E、および/もしくはE410Nまたはその保存的アミノ酸置換である。たとえば、本明細書においてデータによって示されるように、配列番号3に関する位置R318キモトリプシンナンバリングによる150でのアミノ酸置換は、AT-III/ヘパリン複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。位置R338キモトリプシンナンバリングによるR170でのアミノ酸置換もまた、AT-III/ヘパリン複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。この点において、アミノ酸位置R338は、インビトロ凝血アッセイにおいて5~10倍増強した凝血活性を示すことが報告されている自然突然変異の部位R170Lである国際特許出願公開WO2010029178。記載されるアッセイは、精製タンパク質ではなく、条件培地を用いて実行され、タンパク質濃度は、ELISAアッセイを使用して測定された。その結果として、これらのデータは、野生型コンパレーター調製物と比較して、R338LR170L調製物における活性物質のより高度な画分または凝血アッセイにおいて活性な、より高度なレベルの混入物を反映することができた。しかしながら、本明細書において示されるように、位置338170にA、E、およびLを含有する変異体は、FX活性化に対する効率が3.5~4倍増加する。本明細書において見出されるように、R338E突然変異は、さらに、ヘパリン/AT-III複合体による阻害に対して約88倍の抵抗性および補因子FVIIIaへの結合の2倍の増強を示した。位置342~345キモトリプシンナンバリングによる174~177からの、FIXへの4アミノ酸トロンビンループswap突然変異は、sLRPへのFIXaの結合を低下させることが報告されている[RohlenaetalJBiolChem93949401を参照されたい]。位置T343キモトリプシンナンバリングによるT175での残基の突然変異は、FIXの薬物動態学的PK特性に有意な影響を付与しなかった。しかしながら、突然変異T343RキモトリプシンナンバリングによるT175Rは、約3.1の倍数までFXの活性化のための触媒効能を増加させ、ヘパリン/AT-III複合体に対する約5.6倍の抵抗性をもたらし、約1.6倍の倍数までFVIIIaに対する親和性を増加させることが本明細書において見出される。また、本明細書において示されるように、位置R403キモトリプシンナンバリングによるR233での突然変異は、ヘパリン/AT-III複合体による阻害に対する抵抗性を付与する。E410Nなどのような位置E410キモトリプシンナンバリングによるE240での突然変異は、FXの活性化のための触媒効能において、有意な、これまでに観察されていない1.3~2.8倍の増加をもたらす。また、その点で示されるように、補因子FVIIIへの結合の増強では、R338およびT343キモトリプシンナンバリングによるR170およびT175での突然変異、特にR338EおよびT343Rにおいて相乗効果がある。相乗効果はまた、位置R338およびE410での突然変異キモトリプシンナンバリングによるR170およびE240、特にR338EおよびE410Nの間で観察された。本明細書において例示される2つの二重突然変異体、R338E/T343RおよびR338E/E410Nは、24~28倍改善された、FVIIIaへの結合を示すが、それぞれの単一突然変異は、単独で、1.6~2.2倍まで結合を増強する。下記に記載されるように改変された特性または活性を付与することが見出された、本明細書において提供されるFIXポリペプチドにおける他の例示的なアミノ酸置換は、配列番号3に関する1、5、53、61、64、85、103、104、105、106、108、148、157、158、159、167、169、172、179、202、203、204、205、228、239、241、243、247、249、251、257、259、260、262、284、293、312、314、315、316、317、319、320、321、333、342、345、346、392、394、400、412、または413の中からの任意のアミノ酸残基または対応するアミノ酸残基でのものとすることができる。たとえば、本明細書において提供されるFIXポリペプチドにおける例示的なアミノ酸置換はまた、配列番号3において記載される配列を有する成熟FIXポリペプチドにおけるY1N、K5A、S53A、S61A、S61C、S61D、S61E、S61F、S61G、S61I、S61K、S61L、S61P、S61R、S61V、S61W、S61Y、D64A、D64C、D64F、D64H、D64I、D64L、D64M、D64N、D64P、D64R、D64S、D64T、D64W、D85N、A103N、D104N、N105S、N105T、K106N、K106S、K106T、V108S、V108T、T148A、N157D、N157E、N157F、N157I、N157K、N157L、N157M、N157Q、N157R、N157V、N157W、N157Y、S158A、S158D、S158E、S158F、S158G、S158I、S158K、S158L、S158M、S158R、S158V、S158W、S158Y、T159A、N167D、N167Q、N167E、N167F、N167G、N167H、N167I、N167K、N167L、N167M、N167P、N167R、N167V、N167W、N167Y、T169A、T169D、T169E、T169F、T169G、T169I、T169K、T169L、T169M、T169P、T169R、T169S、T169V、T169W、T169Y、T172A、T172D、T172E、T172F、T172G、T172I、T172K、T172L、T172M、T172P、T172R、T172S、T172V、T172W、T172Y、T179A、V202M、V202Y、D203N、D203M、D203Y、D203F、D203H、D203I、D203K、D203L、D203R、D203V、D203W、A204M、A204Y、A204F、A204I、A204W、F205S、F205T、K228N、E239A、E239S、E239R、E239K、E239D、E239F、E239I、E239L、E239M、E239N、E239T、E239V、E239W、E239Y、T241N、H243S、H243T、K247N、N249S、N249T、I251S、H257F、H257E、H257D、H257I、H257K、H257L、H257M、H257Q、H257R、H257S、H257V、H257W、H257Y、N260S、A262S、A262T、Y284N、K293E、K293A、R312A、R312Y、R312L、R312C、R312D、R312E、R312F、R312I、R312K、R312L、R312M、R312P、R312Q、R312S、R312T、R312V、R312W、R312Y、F314N、H315S、K316M、K316D、K316F、K316H、K316I、K316L、K316M、K316R、K316S、K316T、K316V、K316W、K316Y、G317N、S319N、A320S、L321N、L321S、L321T、R333A、R333E、F342I、F342D、F342E、F342K、F342L、F342M、F342S、F342T、F342V、F342W、F342Y、Y345A、Y345T、N346D、N346Y、N346E、N346F、N346H、N346I、N346K、N346L、N346M、N346Q、N346R、N346T、N346V、N346W、K392N、K394S、K394T、K400A、K400E、K400C、K400D、K400F、K400G、K400L、K400M、K400P、K400S、K400T、K400V、K400Y、T412A、T412V、T412C、T412D、T412E、T412F、T412G、T412I、T412M、T412P、T412W、T412Y、K413Nまたは対応するアミノ酸残基位置における同じ置換をも含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾たとえばアミノ酸置換によって改変される、例示的な特性および活性は、以下のように記載される。a.グリコシル化の改変本明細書において提供される修飾第IX因子ポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化レベルおよび/または改変されたグリコシル化の種類を示すことができる。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。したがって、修飾FIXポリペプチドの中で、本明細書において記載されるのは、高度にグリコシル化されたFIXポリペプチドである。i.グリコシル化の利点多くの哺乳動物タンパク質は、多様な数の炭水化物鎖を用いてグリコシル化され、これらのそれぞれが、異なる炭水化物構造を有することができる。そのような炭水化物は、タンパク質の安定性、溶解性、活性、血清半減期、および免疫原性において重要な役割を有することができる。したがって、タンパク質の特性および活性は、グリコシル化の量および/または種類を調整することによって改変することができる。たとえば、グリコシル化は、安定性、溶解性を増加させることによっておよびタンパク質の免疫原性を低下させることによって、ポリペプチドの血清半減期を増加させることができる。これは、治療用ポリペプチドについて特定に興味深く、治療用ポリペプチドの溶解性、血清半減期、および安定性の増加は、治療上の効能の増加をもたらすことができる。オリゴ糖は、認識、シグナル伝達、および粘着などのような細胞内および細胞間事象において重要である。炭水化物はまた、分泌タンパク質の折り畳みを支援する。ポリペプチドが、たとえばグリコシル化が可能な真核細胞において産生される場合、それが、グリコシル化されるように、グリコシル化部位は、グリコシド結合を介しての単糖およびオリゴ糖のポリペプチドへの付加のための部位を提供する。いくつかの種類のタンパク質グリコシル化がある。N結合型およびO結合型グリコシル化は、主なクラスであり、アスパラギン残基またはセリンもしくはトレオニン残基が、それぞれ、修飾される。他の種類のグリカンは、グリコサミノグリカンおよびグリコシルホスファチジルイノシトールGPI-アンカーを含む。グリコサミノグリカンは、セリンのヒドロキシ酸素に付加されるが、GPIアンカーは、グリカン鎖を介して、疎水性脂質アンカーにタンパク質を付加する。C-グリコシル化はまた、コンセンサス配列Trp-X-X-Trpで起こり得、配列における第1のトリプトファン残基のインドール側鎖は、α-マンノピラノシル基を用いて修飾される[FurmaneketalActaBiochimPol47781789]。しかしながら、潜在的なグリコシル化部位の存在は、その部位が、ERにおける翻訳後プロセシングの間にグリコシル化されるであろうということを保証するものではない。さらに、グリコシル化のレベルは、グリカン構造でのように、任意の所定の部位で変わり得る。特定の部位でのグリコシル化のレベルおよび種類における差異は、潜在的なグリコシル化部位のあたりの配列構成および二次構造に、少なくとも部分的に起因し得る。O結合型グリコシル化は、セリン、トレオニン、ヒドロキシリシン、またはヒドロキシプロリン残基のヒドロキシル基を介しての、N-アセチルガラクトサミンなどのような糖単位の付加を含む。それは、1つの単糖の付加によって開始され、この後に、他のものが追加され、成熟O-グリカン構造が形成される。O-グリコシル化は、高度な割合のセリン残基、トレオニン残基、およびプロリン残基を有する配列において、より可能性が高くなるが、O-グリコシル化について知られているモチーフはない。さらに、広がったβターンなどのような二次構造エレメントもまた、O-グリコシル化を促し得る。O-グリコシル化は、共通のコア構造を欠く。その代わりに、いくつかの種類のグリカンは、O-N-アセチルガラクトサミンO-GalNAc、O-N-アセチルグルコサミンO-GlcNAc、O-フコース、およびO-グルコースを含めて、選択されるO-グリコシル化部位に付加することができる。O-グリコシル化とは対照的に、N結合型グリコシル化コンセンサス配列モチーフは、十分に特徴づけられている。N結合型グリコシル化の間に、14残基オリゴ糖は、Asn-X-Ser/Thr/Cysコンセンサスモチーフ中のアスパラギン残基に移され、ここで、Xは、Pro以外の任意のアミノ酸である。次いで、グリコシルトランスフェラーゼは、酵素的にサッカライドを切り、マンノース残基にさらなる糖単位を付加する。コンセンサスモチーフに近接する配列もまた、グリコシル化がコンセンサス配列で起こるかどうかに影響を及ぼし得る。したがって、Asn-X-Ser/Thr/Cysコンセンサス配列の存在は、N結合型グリコシル化が起こるのに必要とされるが、必ずしも十分でない。いくつかの場合では、近接配列に対する変化が、それまで1つもなかった、コンセンサスモチーフでのグリコシル化をもたらす[ElliotetalJBiolChem2791685416862]。N結合型オリゴ糖は、GlcNAc2Man3の共通のコア構造を共有する。哺乳動物において3つの主な種類のN結合型サッカライドがある:高マンノースオリゴ糖、複雑なオリゴ糖、およびハイブリッドオリゴ糖。高マンノースオリゴ糖は、本質的に、いくつかのマンノース残基を有する2つのN-アセチルグルコサミンを含有する。いくつかの場合では、最終のN結合型高マンノースオリゴ糖は、それがタンパク質に付加される前の前駆体オリゴ糖と同数のマンノース残基を含有する。複雑なオリゴ糖は、たいてい、コア構造において2つを超えるN-アセチルグルコサミン含めて、任意の数のマンノース、N-アセチルグルコサミン、およびフコースサッカライドを含有することができる。グリコシル化は、タンパク質のタンパク質分解を低下させることによって、タンパク質の安定性を増加させることができ、熱分解、変性剤に対する暴露、酸素フリーラジカルによる損害、およびpHの変化からタンパク質を保護することができる。グリコシル化はまた、標的タンパク質が、細胞表面受容体を含む他のタンパク質への結合を伴うクリアランスメカニズムを回避することを可能にすることができる。炭水化物のシアル酸構成成分は、特に、タンパク質の血清半減期を増強することができる。シアル酸部分は高度に親水性であり、標的タンパク質の疎水性残基を遮蔽することができる。これは、溶解性を増加させ、タンパク質の凝集および沈殿を減少させる。凝集の減少は、タンパク質に対して産生されている免疫応答の可能性を減少させる。さらに、炭水化物は、免疫系から、免疫原性の配列を遮蔽することができ、炭水化物部分によって占められる空間の容量は、免疫系によって調査される、利用可能な表面積を減少させることができる。これらの特性は、標的タンパク質の免疫原性における低下に至り得る。治療用ポリペプチドのグリコシル化のレベルおよび/または種類の修飾は、ポリペプチドのインビボにおける活性に影響を及ぼし得る。グリコシル化のレベルを増加させることによって、組換えポリペプチドは、血清半減期の増加、血清クリアランスの低下、および免疫原性の低下により、より安定させることができる。これは、ポリペプチドのインビボにおける活性を増加させ、同等の治療効果を達成するために、投薬の用量および/または頻度の低下をもたらすことができる。たとえば、ダルベポエチンアルファDAと呼ばれるリコンビナントヒトエリスロポエチンrHuEPOの高グリコシル化形態は、インビボにおける活性が増加しており、作用持続時間が長い。高グリコシル化DAポリペプチドの炭水化物およびシアル酸含有量の増加は、未修飾rHuEPOよりも3倍の血清半減期をもたらす。この血清半減期の増加は、生物学的利用率の増加およびクリアランスの低下をもたらし、これは、投薬をそれほど頻繁でないものにするおよび/または用量をより低くすることができ、患者にとっての、関連する利便性が増加し、副作用の危険性が低下し、患者コンプライアンスが改善される。ii.グリコシル化が改変された、例示的な修飾FIXポリペプチド未修飾FIXポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化を示すように修飾される修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾FIXポリペプチドは、それぞれ、非天然グリコシル化部位の組み込みまたは天然グリコシル化部位の欠失などによって、グリコシル化の増加または減少を示すことができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、1、2、3、4、またはそれ以上の非天然N-グリコシル化部位を含有することができる。非天然N-グリコシル化部位は、アミノ酸置換複数可[もしくは交換複数可]、挿入複数可、または欠失複数可またはその任意の組合せによって導入することができ、アミノ酸置換複数可、挿入複数可、および/または欠失複数可は、グリコシル化モチーフAsn-Xaa-Ser/Thr/Cysの確立をもたらし、ここで、Xaaは、プロリンではない。他の例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化部位の数を減少させることができ、典型的に、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの低下をもたらす。さらなる例では、修飾FIXポリペプチドが、野生型FIXと同じレベルのグリコシル化を示すが、異なる種類のグリコシル化を示す。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと同数のグリコシル化部位および同じレベルのグリコシル化を示すことができるが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、たとえばN-およびO-グリコシル化の異なる相対量などのような、異なる種類のグリコシル化を有することができる。a.非天然グリコシル化部位複数可の導入特定の例では、非天然N-グリコシル化部位が、アミノ酸置換によって導入される。いくつかの場合では、アミノ酸置換による非天然N-グリコシル化部位の生成が、たった1つのアミノ酸置換を必要とする。たとえば、未修飾FIXポリペプチドがGly-Ala-Ser配列を含有する場合、N-グリコシル化部位は、アスパラギンとのグリシンの単一のアミノ酸交換によって生成され、Asn-Ala-SerN-グリコシル化モチーフを生成することができる。他の例では、未修飾FIXポリペプチドがAsn-Trp-Met配列を含有する場合、N-グリコシル化部位は、システインまたはトレオニンまたはセリンとのメチオニンの単一アミノ酸交換によって生成することができる。他の場合では、アミノ酸置換による非天然N-グリコシル化部位の生成が、1つ以上アミノ酸置換を必要とする。たとえば、未修飾FIXポリペプチドがGly-Arg-Phe配列を含有する場合、N-グリコシル化部位は、2つのアミノ酸置換:アスパラギンとのグリシンのアミノ酸交換およびシステインまたはトレオニンまたはセリンとのフェニルアラニンのアミノ酸交換によって生成され、Asn-Arg-Ser/Thr/CysN-グリコシル化モチーフを生成することができる。したがって、当業者は、FIXポリペプチドにおける任意の位置に1つまたは複数の非天然N-グリコシル化部位を導入することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドを生成するために、非天然グリコシル化部位がFIXポリペプチドの中に導入される位置は、典型的に、その部位で連結される任意の炭水化物成分が、FIXポリペプチドの構造、機能、および/もしくは凝血促進活性に不利に干渉しないようにまたは非天然グリコシル化部位を導入するためにポリペプチドに対してなされるアミノ酸修飾複数可が、FIXポリペプチドの構造、機能、もしくは活性に不利に干渉しないように選択される。したがって、非天然グリコシル化部位は、FIXポリペプチドにおける任意の位置の中に導入することができる、ただし、結果として生じる修飾FIXポリペプチドが、野生型または未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。反対に、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位は、阻害分子とのFIXの相互作用に関与し得る部位で、修飾FIXポリペプチドの中に導入することができる。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、阻害分子および修飾FIXの間の相互作用を立体的に妨げることができる。そのような立体障害は、血液凝固活性が増加した修飾FIXポリペプチドをもたらすことができる。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドにおいて含有される非天然グリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、AT-III/ヘパリン複合体との修飾FIXの相互作用を立体的に妨げることができる。これは、AT-III/ヘパリンの阻害効果に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。したがって、非天然グリコシル化部位は、Glaドメイン、EGF1ドメイン、EGF2ドメイン、活性化ペプチド、および/またはプロテアーゼドメインの中に導入することができる、ただし、結果として生じる修飾FIXポリペプチドが、野生型または未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。他の例では、非天然グリコシル化部位が、EGF2ドメインまたはプロテアーゼドメインの中に導入される。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のFXに対する結合活性を保持する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のFVIIIaに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび/またはいくつかの条件下において、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXタンパク質と比較して、活性の増加を示すことができるたとえば、インビボにおける薬力学的活性および/またはATIII/ヘパリンもしくは血漿の存在下における触媒活性。表3は、非天然N-グリコシル化部位を導入することによってグリコシル化レベルを増加させるために、修飾FIXポリペプチド中に含まれる、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第1のアミノ酸1文字略語は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号3に関する成熟FIXポリペプチド配列における位置に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまた、必要に応じて、キモトリプシンナンバリングスキームによっても参照されるつまり突然変異がFIXプロテアーゼドメイン内に位置する場合。修飾アミノ酸位置が対応するキモトリプシン番号を有していないつまり、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するアミノ酸位置181~415内になく、上記の表1において記載されていない場合、位置は、成熟FIXナンバリングを使用して、括弧中に表される。たとえば、キモトリプシンナンバリングを指す場合、A103Nは、対応するキモトリプシン番号を有しておらず、A[103]Nとして記載される。下記の表3において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。修飾によって生成される非天然グリコシル化部位の位置もまた、表3において同定される。いくつかの場合では、1つのアミノ酸置換だけが、非天然N-グリコシル化部位を生成するために必要とされる。たとえば、位置85配列番号3において記載された成熟FIXポリペプチドに対応するでのアスパラギン酸Asp、Dは、結果として生じる修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸位置85で、EGF2ドメインにおける非天然グリコシル化部位を生成するためにアスパラギンAsn、Nと置換することができる。他の例では、位置251配列番号3において記載された成熟FIXポリペプチドに対応するでのイソロイシンIle、Iが、結果として生じる修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸位置249で、プロテアーゼドメインにおける非天然N-グリコシル化部位を生成するためにセリンSer、Sと置換することができる。他の場合では、2つのアミノ酸置換が、新しいグリコシル化部位を生成するために必要とされる。たとえば、結果として生じる修飾FIXポリペプチドにおけるアミノ酸位置103で、EGF2ドメインにおいて非天然N-グリコシル化部位を生成するために、位置103配列番号3において記載される成熟FIXのナンバリングに基づくでのアラニンAla、Aは、アスパラギンAsn、Nと置換することができ、位置105でのアスパラギンは、セリンSer、Sと置換することができる。他の例では、アミノ酸位置243でプロテアーゼドメインにおいて非天然N-グリコシル化部位を生成するために、位置241でのトレオニンThr、Tが、アスパラギンと置換され、位置243でのヒスチジンHis、Hが、セリンと置換される。表3本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、2つまたはそれ以上の非天然N-グリコシル化部位の導入をもたらす修飾を含有することができる。たとえば、表3において記載される修飾は、組み合わせられ、2、3、4、5、6、またはそれ以上の非天然N-グリコシル化部位を含有する修飾FIXポリペプチドをもたらすことができる。任意の2つまたはそれ以上の、表3において記載される修飾は、組み合わせることができる。たとえば、アミノ酸交換D104N/K106S/K228Nを含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの中に含まれ、それぞれ、アミノ酸位置104および228配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するナンバリングに2つの非天然グリコシル化部位を有するFIXポリペプチドがもたらされる。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、アミノ酸交換D85N/K247N/N249S/K392N/K394Sを含有することができ、それぞれアミノ酸位置85、247、および392配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するナンバリングに3つの非天然グリコシル化部位を有するFIXポリペプチドがもたらされる。表4は、2つまたはそれ以上の非天然N-グリコシル化部位を有する例示的なFIXポリペプチドを記載する。表4本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、1つまたは複数の非天然N-グリコシル化部位などのような、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有することができる。したがって、グリコシル化を促進する細胞において発現される場合または当技術分野においてよく知られているインビトロにおける技術を使用してグリコシル化される場合、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの増加を示すことができる。グリコシル化のレベルは、未修飾または野生型FIXポリペプチドのグリコシル化のレベルと比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加させることができる。1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、1つまたは複数の修飾は、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、LRPへの結合を減少させる、ならびに/または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有し、グリコシル化のレベルの増加などのような改変されたグリコシル化を有し、たとえばその基質FXに対する触媒活性などのような、FIXの少なくとも1つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90。95、またはそれ以上を保持する。グリコシル化のレベルの増加は、未修飾FIXと比較して、1つまたは複数の以下の特性を変異体に与えることによって、修飾FIXポリペプチドの薬物動態学的特性を改善することができる:iクリアランスの減少、ii分布容積の改変、iiiインビボにおける回収率の増強、ivインビボにおける総タンパク質暴露の増強つまりAUC、v血清半減期α、β、および/もしくはγ相の増加、ならびに/またはvi平均共鳴時間MRTの増加。改変されたグリコシル化を有する修飾FVIIポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、未修飾FIXポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで、増加させることができる。b.天然グリコシル化部位の排除本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化部位の数を減少させることができる。典型的に、グリコシル化部位の数の低下は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化のレベルの低下をもたらす。除去することができる天然グリコシル化部位は、たとえば、配列番号3において記載される成熟FIXの位置157および167に対応するアミノ酸位置の天然N-グリコシル化部位ならびに配列番号3において記載される成熟FIXの位置53、61、159、169、172、および179に対応するアミノ酸位置の天然O-グリコシル化部位を含む。任意の1つまたは複数の天然グリコシル化部位は、アミノ酸置換複数可、挿入複数可、もしくは欠失複数可またはその任意の組合せによって除去することができる。たとえば、アミノ酸置換、欠失、および/または挿入は、Asn/Xaa/Ser/Thr/CysモチーフここでXaaはプロリンではないを破壊するためになされ、それによって、位置157または167のN-グリコシル化部位を除去することができる。他の例では、O-グリコシル化部位が、位置53もしくは61でのセリン残基のアミノ酸置換もしくは欠失または位置159もしくは169でのトレオニン残基のアミノ酸置換もしくは欠失などによって、除去される。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のFXに対する結合活性を保持する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のFVIIIaに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび/またはいくつかの条件下において、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXと比較して、特性の増強を示すことができるたとえば、インビボにおける回収率の増加、インビボにおけるAUCの増加、および/またはインビボにおけるクリアランスの減少を含むが、これらに限定されない。表5は、天然N-グリコシル化部位を除去するまたは排除することによってグリコシル化レベルを減少させるために、修飾FIXポリペプチド中に含まれる、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。下記の表5において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表51つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、1つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除する、1つまたは複数の修飾は、非天然グリコシル化部位を導入する、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。1つまたは複数の天然グリコシル化部位を排除する本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、たとえばその基質FXに対する触媒活性などのような、FIXの少なくとも1つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90。95、またはそれ以上を保持する。いくつかの場合では、改変されたグリコシル化を有する修飾FVIIポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、未修飾FIXポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで、増加させることができる。b.AT-IIIおよびヘパリンに対する抵抗性の増加FIXの活性は、凝固プロセスの調節の一部として、血液中の因子によって阻害され得る。したがって、AT-IIIおよびヘパリンを含む阻害因子の阻害効果に対する抵抗性の増加を示す修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。いくつかの例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、ヘパリンに対する結合親和性の低下ならびに/またはAT-IIIのみおよび/もしくはAT-III/ヘパリン複合体による阻害に対する二次速度定数の減少を示す。さらなる例では、修飾FIXポリペプチドが、AT-IIIのみまたはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を示す。したがって、AT-III、AT-III/ヘパリン複合体、および/またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。i.AT-IIIアンチトロンビンIIIアンチトロンビンまたはAT-IIIとしても知られているは、重要な抗凝固セルピンセリンプロテアーゼ阻害因子である。AT-IIIは、464アミノ酸残基を含有する前駆体タンパク質として合成される配列番号21。分泌の過程において、32残基シグナルペプチドは、切断されて、432アミノ酸成熟ヒトアンチトロンビン配列番号22を生成する。58kDaAT-III糖タンパク質は、血液中に循環し、セリンプロテアーゼ阻害因子セルピンとして機能して、凝固系の多くのセリンプロテアーゼを阻害する。AT-IIIはまた、FXIa、FXIIa、および程度はより少ないが、FVIIaの活性をも阻害することが示されたが、AT-IIIの主要な標的は、トロンビン、第Xa因子、および第IXa因子である。AT-IIIの作用は、診療において抗凝固薬として広く使用される、天然に存在するヘパラン硫酸または様々な組織由来ヘパリンなどのようなグリコサミノグリカンによって非常に増強される。二次分子に結合することなく典型的に有効である他のセルピンと異なり、標的凝固因子との、ヘパリンの非存在下における、AT-IIIの反応は、非常にゆっくりとしている。ヘパリンの非存在下において、AT-IIIの反応性ループ配列は、ゆっくりとした反応性の決定因子を提供する。AT-IIIの反応性ループ中心における保存P2-P1’残基の突然変異誘発は、たとえば、ヘパリンの存在下ではなく非存在下において、プロテアーゼとのAT-IIIの相互作用に影響を及ぼす。AT-IIIは、反応性中心ループにおけるコンホメーションの変化を誘発する、ヘパリンにおける特有の五糖配列に対して高度に特異的な様式で結合する。そのようなコンホメーションにおいて、AT-IIIの反応性中心ループは、より効率的に、セリンプロテアーゼの反応部位と相互作用することができ、阻害を達成することができる。証拠は、AT-IIIへのヘパリンの結合が、AT-IIIとのFIXa、トロンビン、およびFXaの相互作用を促す、新しいエキソサイトを生成することを示唆する。位置253のチロシンおよび位置255のグルタミン酸は、たとえば、ヘパリン結合によって生成され、AT-IIIのみにより観察される阻害と比較してAT-IIIによるFIXaの急速な阻害の増加を促す、AT-III上のエキソサイトの重要な決定因子であることが示されてきた[IzaguirreetalJBioChem2811342413432]。突然変異の研究もまた、第IXa因子におけるどの残基がAT-III/ヘパリンとの相互作用に関与するかをいくらか示した。たとえば、成熟FIXポリペプチドの位置318キモトリプシンナンバリングによる位置150に対応するでのアルギニンの修飾は、33倍~70倍まで、AT-III/ヘパリンとのこの突然変異体の反応性を低下させる[YangLetalJBiolChem278250328]。FIXa突然変異体およびAT-IIIの間の反応性の低下は、AT-IIIがヘパリンに結合していない場合ほど顕著ではないが、成熟FIXaポリペプチドの位置318のアルギニンおよびAT-IIIの間の相互作用が、AT-IIIがヘパリン活性化コンホメーションをしている場合に達成されることを示す。ii.ヘパリンヘパリンは、上記に議論されるAT-III依存性の様式およびAT-III非依存性の様式の両方で、内在性テナーゼ複合体において、FIXaの活性を阻害することができる。研究は、ヘパリンによるFIXa活性のAT-III非依存性の阻害が、FVIIIa-FIXa相互作用を破壊する、FIXa上のエキソサイトへのオリゴ糖結合の結果であることを示す[YuanetalBiochem4436153625MisenheimeretalBiochem4678867895MisenheimeretalBiochem49997710005]。ヘパリンに結合するエキソサイトは、位置338キモトリプシンナンバリングによる位置170に対応するのアルギニンから少なくとも位置403キモトリプシンナンバリングによる位置233に対応するのアルギニンにわたる電気陽性領域における第IXa因子プロテアーゼドメイン中にある。このエキソサイトは、その補因子、FVIIIaとのFIXaの相互作用に重大なFIXaの領域と重複する。したがって、FIXaへのヘパリンの結合は、FVIIIaとのFIXaの相互作用を阻害し、したがって、内在性テナーゼ活性を低下させる。iii.AT-IIIおよびヘパリンに対する抵抗性が増加した、例示的なFIXポリペプチドAT-III、ヘパリン、および/またはAT-III/ヘパリン複合体に対するその抵抗性を増加させる修飾を、FIXポリペプチドに対してなすことができる。一般的に、そのような修飾FIXポリペプチドは、FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。典型的に、そのような修飾は、AT-III、ヘパリン、および/またはAT-III/ヘパリン複合体とのFIXaの相互作用に関与する、FIXポリペプチドの任意の位置の1つまたは複数のアミノ酸交換を含む。そのような修飾は、たとえば、AT-IIIのみとの修飾FIXaポリペプチドの相互作用の速度の低下、AT-III/ヘパリン複合体に対する修飾FIXaポリペプチドの相互作用の速度の低下、および/またはヘパリンのみに対する修飾FIXaポリペプチドの結合親和性の低下をもたらすことができる。いくつかの例では、修飾複数可が、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、AT-III/ヘパリン複合体との修飾FIXの相互作用を立体的に妨げ、AT-III/ヘパリンの阻害効果に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。そのため、修飾FIXaポリペプチドは、内在性テナーゼ活性に関して、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンの天然阻害効果に対する抵抗性の増加を示す。凝血促進治療薬としての対象への投与の後などに、適切なインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて評価した場合、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示すことができる。本明細書において下記に記載されるように、当業者は、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対して増加した抵抗性を示す修飾FIXaポリペプチドを経験的にまたは合理的に設計することができる。そのような修飾FIXポリペプチドは、修飾FIXポリペプチドがAT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対して抵抗性の増加を示すかどうかを決定するための、当業者に知られているアッセイにおいて試験することができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンへの結合について試験することができる。一般的に、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対する抵抗性を増加させた修飾FIXポリペプチドは、ヘパリンへの結合の減少および/もしくは親和性の減少ならびに/またはAT-IIIおよび/もしくはAT-III/ヘパリンとの相互作用の速度の減少を示すであろう。典型的に、そのようなアッセイは、FIXFIXaの活性化形態を用いてならびに補因子、FVIIIaおよびリン脂質の非存在下または存在下において実行される。AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対する抵抗性の増加を示す修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるFIXポリペプチド変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置202、203、204、205、228、239、257、260、293、312、316、318、319、321、333、338、342、346、400、403、または410で修飾されるキモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置38、39、40、41、63、74、92、95、126、143、145、148、150、151、153、165、170、174、178、230、233、および240にそれぞれ対応する。これらのアミノ酸残基は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸交換によってなどのような修飾であってもよい。同定される残基は、任意の他のアミノ酸と置換または交換することができる。その代わりに、アミノ酸挿入は、標的アミノ酸残基の近傍における標的アミノ酸残基またはタンパク質構造のコンホメーションを改変するために使用することができる。任意のアミノ酸残基はまた、同定される位置の内因性アミノ酸残基と交換することができる。典型的に、置換アミノ酸は、それが、FIXおよびAT-IIIまたはヘパリンの間の相互作用に干渉するように選ばれる。たとえば、修飾は、ヘパリンとのFIXポリペプチドの相互作用に干渉するように、アミノ酸位置260、293、333、338、346、400、および410でなすことができるキモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置95、126、165、170、178、230、233、および240にそれぞれ対応する。他の例では、修飾が、AT-IIIとのFIXポリペプチドの相互作用に干渉するように、アミノ酸位置203、204、205、228、239、312、314、316、318、319、321、および342でなされるキモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置39、40、41、63、74、143、145、148、150、151、153、および174にそれぞれ対応する。いくつかの例では、新しいグリコシル化部位が、アミノ酸置換によって導入される。新しいグリコシル化部位に連結される炭水化物成分は、AT-III/ヘパリン複合体との修飾FIXの相互作用を立体的に妨げ、AT-III/ヘパリンの阻害効果に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる。たとえば、位置410キモトリプシンナンバリングによる240位に対応するのグルタミン酸Glu、Eは、位置410に新しいグリコシル化部位を導入するために、アスパラギンAsn、Nと置換することができる。他の例では、位置239キモトリプシンナンバリングによる位置74に対応するのグルタミン酸Glu、Eが、位置239に新しいグリコシル化部位を導入するために、アスパラギンAsn、Nと置換される。AT-III/ヘパリンに対する抵抗性を増加させるために新しいグリコシル化部位を導入する他の突然変異は、たとえばD203N/F205T、R318N/A320S、N260S、およびF314N/K316SキモトリプシンナンバリングによるD39N/F41T、R150N/A152S、N95S、およびF145N/K148Sに対応するを含む。AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対する抵抗性を増加させるために、修飾がなされる他の例では、位置202キモトリプシンナンバリングによる位置38に対応するのバリン残基が、メチオニンMet、MもしくはチロシンTyr、Yと置換される;位置203キモトリプシンナンバリングによる位置39に対応するのアスパラギン酸Asp、Dが、メチオニンMet、MもしくはチロシンTyr、Yと置換される;位置204キモトリプシンナンバリングによる位置40に対応するのアラニンAla、Aが、メチオニンMet、MもしくはチロシンTyr、Yと置換される;位置239キモトリプシンナンバリングによる74位に対応するのグルタミン酸が、セリンSer、S、アラニンAla、A、アルギニンArg、R、もしくはリシンLys、Kと置換される;位置257キモトリプシンナンバリングによる位置92に対応するのヒスチジンが、フェニルアラニンPhe、F、チロシンTyr、Y、グルタミン酸Glu、E、もしくはセリンSer、Sと置換される;位置293キモトリプシンナンバリングによる位置143に対応するのリシンLys、Kが、アラニンAla、AもしくはグルタミンGln、Qと置換される;位置312キモトリプシンナンバリングによる位置143に対応するのアルギニンArg、Rが、アラニンAla、AもしくはグルタミンGln、Qと置換される;位置316キモトリプシンナンバリングによる148に対応するのリシンが、アスパラギンAsn、N、アラニンAla、A、グルタミン酸Glu、E、セリンSer、S、もしくはメチオニンMet、Mと置換される;位置318キモトリプシンナンバリングによる位置150に対応するのアルギニンArg、Rが、アラニンAla、A、グルタミン酸Glu、E、チロシンTyr、Y、フェニルアラニンPhe、F、もしくはトリプトファンTrp、Wと置換される;位置333キモトリプシンナンバリングによる位置165に対応するのアルギニンArg、Rが、アラニンAla、Aもしくはグルタミン酸Glu、Eと置換される;位置338キモトリプシンナンバリングによる位置170に対応するのアルギニンArg、Rが、アラニンAla、Aもしくはグルタミン酸Glu、Eと置換される;位置400キモトリプシンナンバリングによる位置230に対応するのリシンLys、Kが、アラニンAla、Aもしくはグルタミン酸Glu、Eと置換される;ならびに/または位置403キモトリプシンナンバリングによる位置233に対応するのアルギニンArg、Rが、アラニンAla、A、グルタミン酸Glu、E、もしくはアスパラギン酸Asp、Dと置換される。チロシンである、残基R318もしくは318に対応するFIXポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばR318Yまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、チロシンについての保存的アミノ酸残基は、フェニルアラニンFまたはトリプトファンWを含むが、これらに限定されない。グルタミン酸である、残基R403もしくは403に対応するFIXポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばR403Eまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾FIXポリペプチドもまた、提供される。たとえば、グルタミン酸についての保存的アミノ酸残基はアスパラギン酸Dを含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、組合せ突然変異体を生成することができる。アミノ酸位置202、203、204、257、239、293、312、316、318、333、338、400、403、および410キモトリプシンナンバリングによるアミノ酸位置38、39、40、74、92、126、143、148、150、165、170、230、233、および240にそれぞれ対応するに2つ以上の突然変異を有するものが、そのような組合せ突然変異体の中に含まれる。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、2、3、4、5、またはそれ以上の同定される位置にアミノ酸交換を有することができる。したがって、修飾ポリペプチドは、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンの阻害効果に対する修飾FIVポリペプチドの抵抗性の増加をもたらすことができる1、2、3、4、5、またはそれ以上の突然変異を示すことができる。AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンの阻害効果に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性を増加させるために本明細書において記載される、任意の1つまたは複数の突然変異は、組み合わせることができる。表6は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。これらの中に、例示的な組合せ突然変異が含まれる。述べられるように、そのようなFIXポリペプチドは、AT-III、AT-III/ヘパリン、および/またはヘパリンに対する抵抗性を増加させるように設計され、そのため、ATIII、ヘパリン/ATIII、ヘパリン、血漿、血清、または血液を含むインビボ、エクスビボ、またはインビトロアッセイにおいて血液凝固活性が増加している。そのような突然変異に関して、第1のアミノ酸1文字略語は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号3に関する成熟FIXポリペプチド配列における位置に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表6において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表6AT-IIIおよび/またはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させるための、本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、AT-IIIおよび/またはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、1つまたは複数の修飾は、非天然グリコシル化部位を導入する、1つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、1つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、典型的に、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。AT-IIIのみ、AT-III/ヘパリン複合体、および/またはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を有する修飾FIXポリペプチドは、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾または野生型FIXポリペプチドの親和性、阻害の程度、または阻害についての二次速度定数と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、またはそれ以上のヘパリンに対する親和性、特定の条件下での阻害の程度、またはATIIIもしくはヘパリン/ATIIIによる阻害に対する二次速度定数の低下を示すことができる。したがって、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドによって示される抵抗性の少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上のAT-IIIのみ、AT-III/ヘパリン複合体、および/またはヘパリンのみに対する抵抗性の増加を示すことができる。そのような修飾FIXポリペプチドによるAT-III、AT-III/ヘパリン複合体、および/またはヘパリンに対する抵抗性の増加はまた、AT-III、AT-III/ヘパリン複合体、ヘパリン、血液、血漿、または血清の存在下において、インビボまたはインビトロにおいて、凝固活性の増加または凝固活性の持続時間の改善として明らかにすることもできる。修飾FIXポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾FVIIポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加させることができる。AT-III、ヘパリン/AT-III複合体、および/またはヘパリンに対する抵抗性を増加させる修飾を含有する修飾FIXポリペプチドはまた、未修飾FIXaと比較して、治療指数の増強を示すこともできる。c.触媒活性を増加させるための突然変異本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXと比較して、ポリペプチドの触媒活性を増加させるために1つまたは複数の修飾を含有することができる。たとえば、修飾は、結果として生じる修飾FIXポリペプチドが、FVIIIaに対する親和性の増加を有するように、その補因子、FVIIIaとのFIXの相互作用に関与するアミノ酸に対してなすことができ、それによって、FVIIIaが飽和濃度で存在しない条件下でFXに対する活性の増加を示す。修飾はまた、補因子FVIIIaの存在下および/または非存在下におけるFXの活性化に対する修飾FIXポリペプチドの活性または触媒効率が未修飾ポリペプチドの活性または触媒効率と比較して増加するように、FIXポリペプチドのプロテアーゼドメインに対してなすこともできる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、位置259、265、345、410、および412キモトリプシンナンバリングによる94、98、177、240、および242に対応するでのアミノ酸置換を含む。これらの位置でのアミノ酸は、任意の他のアミノ酸残基と置換することができる。いくつかの例では、位置259のチロシンが、フェニルアラニンと置換される;位置265のリシンが、トレオニンと置換される;および/または位置345のチロシンが、トレオニンと置換される。さらなる例では、位置410のグルタミン酸が、グルタミン、セリン、アラニン、またはアスパラギン酸と置換される。一例では、位置412のトレオニンが、バリンまたはアラニンと置換される。上記挙げられる修飾は、単に例示的なものにすぎない。本明細書において記載される他の多くの修飾はまた、触媒活性の増加をももたらす。たとえば、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、1つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、1つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、LRPへの結合を減少させる、ならびに/または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善するためにFIXポリペプチドの中に導入される修飾はまた、活性の増加を示す修飾FIXポリペプチドをももたらすこともできる。表7は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第1のアミノ酸1文字略語は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号3に関する成熟FIXポリペプチド配列における位置に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表7において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表7触媒活性を増加させるために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、触媒活性を増加させる1つまたは複数の修飾は、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、1つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、1つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、典型的に、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。触媒活性の増加を有する修飾FIXポリペプチドは、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾または野生型FIXポリペプチドの触媒活性と比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、またはそれ以上の活性を示すことができる。そのような修飾FIXポリペプチドの触媒活性の増加はまた、凝固活性、凝固活性の持続時間の増加、および/または治療指数の増強として明らかにすることができる。修飾FIXポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾FVIIポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加させることができる。d.LRP結合を減少させるための突然変異FIXaは、肝臓、脳、胎盤、および肺を含む様々な組織上に発現される膜糖タンパク質である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質LRPへの結合によって体循環から取り除かれ得る。したがって、LRPへの結合の減少を示す修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。これは、たとえば、iクリアランスの減少、ii分布容積の改変、iiiインビボにおける回収率の増強、ivインビボにおける総タンパク質暴露の増強つまりAUC、v血清半減期α、β、および/もしくはγ相の増加、ならびに/またはvi平均共鳴時間MRTの増加を含む、修飾FIXポリペプチドの改善された薬物動態学的特性をもたらすことができる。そのような修飾FIXポリペプチドは、血液凝固活性の増加を示すことができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、LRP結合部位において1つまたは複数の修飾を含有することができる。この結合部位は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドの残基342~346にわたるプロテアーゼドメインにおけるループに位置することが想定される。アミノ酸置換、挿入、または欠失によってなどのような位置342~346キモトリプシンナンバリングによる位置174~178に対応するでの1つまたは複数の修飾は、修飾FIXポリペプチドおよびLRPの間の相互作用に干渉し、結合親和性の減少をもたらすことができる。LRPへの修飾FIXポリペプチドの結合は、当業者に知られているアッセイを使用して試験することができる[たとえばRohlenaetalJBiolChem27893949401を参照されたい]。結果として生じる改善された薬物動態学的特性はまた、下記に記載されるものを含む、よく知られているインビボアッセイを使用して試験することもできる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、位置343、344、345、および346キモトリプシンナンバリングによる175、176、177、および178に対応するでのアミノ酸置換を含む。これらの位置でのアミノ酸は、任意の他のアミノ酸残基と置換することができる。いくつかの例では、位置343のトレオニンが、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニンと置換される;位置344のフェニルアラニンが、イソロイシンと置換される;位置345のチロシンが、トレオニン、アラニン、もしくはアラニンと置換される;および/または位置346のアスパラギンが、アスパラギン酸もしくはチロシンと置換される。任意の1つまたは複数のこれらの例示的なアミノ酸置換は、互いにまたは本明細書において記載される他の修飾と組み合わせることができる。アルギニンである、残基T343もしくは343に対応するFIXポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばT343Rまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、アルギニンについての保存的アミノ酸残基は、リシンKを含むが、これらに限定されない。表8は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定される残基での例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。そのような突然変異に関して、第1のアミノ酸1文字略語は、置換されるアミノ酸に対応し、番号は、配列番号3に関する成熟FIXポリペプチド配列における位置に対応し、第2のアミノ酸1文字略語は、その位置の第1のアミノ酸と置換する、選択されるアミノ酸に対応する。突然変異のためのアミノ酸位置はまたキモトリプシンナンバリングスキームによっても参照される。下記の表8において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表8LRPへの結合を減少させるために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、LRPへの結合を減少させる1つまたは複数の修飾は、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、触媒活性を増加させる、非天然グリコシル化部位を導入する、1つもしくは複数の天然グリコシル化部位を排除する、1つもしくは複数の天然硫酸化、リン酸化、もしくはヒドロキシル化部位を排除する、FVIIIaの存在下および/もしくは非存在下において活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、典型的に、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。LRPへの結合が減少した修飾FIXポリペプチドは、インビトロにおいて、LRPへの未修飾または野生型FIXポリペプチドの結合と比較して、少なくともまたは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、またはそれ以上の減少を示すことができる。そのような修飾FIXポリペプチドによるLRPへの結合の減少は、iクリアランスの減少、ii分布容積の改変、iiiインビボにおける回収率の増強、ivインビボにおける総タンパク質暴露の増強つまりAUC、v血清半減期αγ、β、および/もしくはγ相の増加、ならびに/またはvi平均共鳴時間MRTの増加などのような、改善された薬物動態学的特性をもたらすことができる。さらに、そのような改変は、血液凝固活性、凝固活性の持続時間の増加、および/または治療指数の増強をもたらすことができる。修飾FIXポリペプチドの凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾FVIIポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加させることができる。e.翻訳後修飾を改変するための他の突然変異野生型FIXは、哺乳動物細胞における発現に際して翻訳後に修飾される。第IX因子前駆体ポリペプチドは、血液の中に分泌される成熟チモーゲンになるように広範囲な翻訳後修飾を受ける。そのような翻訳後修飾は、γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、O-およびN結合型グリコシル化、硫酸化、ならびにリン酸化を含む。上記に議論されるように、グリコシル化のレベルは、たとえば、新しい非天然グリコシル化部位を導入するおよび/または天然グリコシル化部位を排除することによって改変することができる。同様に、他の翻訳後修飾は、γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を導入するおよび/または排除することなどによって改変することができる。任意の1つまたは複数の天然のγ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、硫酸化、またはリン酸化部位は、アミノ酸置換または欠失などによって排除することができる。たとえば、未修飾FIXポリペプチドは、Glaドメイン中の任意の1つまたは複数の12のグルタミン酸残基配列番号3において記載される成熟FIXの位置7、8、15、17、20、21、26、27、30、33、36、および40に対応するのアミノ酸置換によって修飾することができる。これらの残基は、典型的に、野生型FIXにおいて、γ-カルボキシグルタミルまたはGlaにγ-カルボキシル化される。したがって、アミノ酸交換または欠失によってなどのようなグルタミン酸残基の除去は、未修飾FIXポリペプチドと比較して、修飾FIXポリペプチドにおけるγ-カルボキシル化のレベルを低下させることができる。同様に、野生型FIXにおいて通常β-ヒドロキシル化されている位置64のアスパラギン酸残基は、アミノ酸交換または欠失などによって除去することができる。排除することができるさらなる翻訳後修飾部位は、たとえば、野生型FIXにおいて典型的に硫酸化されている位置155のチロシンおよび野生型FIXにおいて典型的にリン酸化されている位置158のセリン残基を含む。他の例では、非天然翻訳後修飾部位が、アミノ酸置換または挿入などによって導入することができる。たとえば、さらなるグルタミン酸残基は、Glaドメインの中に導入することができる。そのようなグルタミン酸残基は、たとえば哺乳動物細胞における発現に際して、修飾FIXポリペプチドにおいてγ-カルボキシグルタミルまたはGlaにγ-カルボキシル化され得る。同様に、1つまたは複数の非天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、またはリン酸化部位は、導入することができる。1つまたは複数の天然翻訳後修飾部位が排除された、修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を含む、1つまたは複数の翻訳後修飾部位を排除するために修飾された修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくともまたは少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上の触媒活性を保持する。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドの少なくともまたは少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、またはそれ以上のFVIIIaに対する結合活性を保持する。いくつかのアッセイにおいておよび/またはいくつかの条件下において、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXタンパク質と比較して、活性の増加を示すことができるたとえば、インビボにおける薬力学的活性および/またはAT-III/ヘパリンもしくは血漿の存在下における活性の増加。フェニルアラニンである、残基Y155もしくは155に対応するFIXポリペプチドにおける残基でのアミノ酸置換、たとえばY155Fまたはその保存的アミノ酸置換を含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。たとえば、フェニルアラニンについての保存的アミノ酸残基は、メチオニンM、ロイシンL、またはチロシンYを含むが、これらに限定されない。表9は、それぞれ位置64、155、および158の天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を排除するために、修飾FIXポリペプチド中に含まれる、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、例示的なアミノ酸置換の非限定的な例を提供する。下記の表9において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表9β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を排除するために本明細書において記載される修飾は、本明細書において記載されるまたは当技術分野において知られている任意の他の突然変異と組み合わせることができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加を示す。たとえば、1つまたは複数の天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を排除する1つまたは複数の修飾は、AT-IIIおよび/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性を増加させる、グリコシル化の増加などのようなグリコシル化を改変する、触媒活性を増加させる、内因活性を増加させる、リン脂質への結合を増加させる、または薬物動態学的および/もしくは薬力学的特性を改善する修飾複数可と組み合わせることができる。1つまたは複数の天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を排除する、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、たとえばその基質FXに対する触媒活性または補因子FVIIIaへの結合などのような、FIXの少なくとも1つの活性を保持する。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドによって示される触媒活性の少なくともまたは少なくとも約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90。95、またはそれ以上を保持する。いくつかの場合では、修飾FIXポリペプチドの血液凝固活性は、インビボまたはインビトロにおいて、未修飾FVIIポリペプチドまたは野生型FIXポリペプチドの凝固活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加する。2.組合せの修飾野生型FIXポリペプチドと比較して、1つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を含有する、1つもしくは複数の天然グリコシル化部位が排除されている、1つもしくは複数の天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/もしくはリン酸化部位が排除されている、またはAT-III、AT-III/ヘパリン、および/もしくはヘパリンなどのような阻害因子に対する抵抗性の増加をもたらすことができる修飾を有する、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドもまた、他の修飾を含有することができる。いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する修飾を含有し、また、FIXならびにAT-III、AT-III/ヘパリン複合体、および/またはヘパリンなどのような阻害因子の間の相互作用に干渉する修飾をも含有する。他の例では、1つまたは複数の天然β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/またはリン酸化部位を排除する修飾が、阻害因子に対する抵抗性を増加させる修飾および/または1つもしくは複数のグリコシル化部位を導入する修飾と組み合わせることができる。したがって、上記表3~9において記載される1つまたは複数の突然変異は、上記表3~9において記載される他の突然変異のいずれかと組み合わせることができる。したがって、未修飾FIXポリペプチドと比較して、N-グリコシル化などのようなグリコシル化の増加;AT-III、AT-III/ヘパリン、および/もしくはヘパリンに対する抵抗性の増加;β-ヒドロキシル化、硫酸化、および/もしくはリン酸化の減少;ならびに/または触媒活性の増加を示すものが、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの中に含まれる。さらに、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドのいずれも、任意の1つまたは複数のさらなる修飾を含有することができる。いくつかの例では、さらなる修飾が、未修飾FIXポリペプチドと比較して、改変された特性および/または活性をもたらす。典型的に、そのようなさらなる修飾は、それら自体、修飾ポリペプチドの血液凝固活性の増加および/またはポリペプチドの安定性の増加をもたらすものである。したがって、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、典型的に、血液凝固活性の増加を示す。さらなる修飾は、たとえば、当技術分野において知られている任意のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入、典型的に、FIXポリペプチドの血液凝固活性および/または安定性を増加させる任意のものを含むことができる。本明細書において提供される任意の修飾FIXポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上のさらなるアミノ酸修飾を含有することができる。典型的に、結果として生じる修飾FIXポリペプチドは、たとえば触媒活性または補因子FVIIIaへの結合などのような、野生型または未修飾ポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。一次配列におけるさらなる修飾は、翻訳後修飾を達成するためにFIXポリペプチドになすことができる。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、米国特許出願公開20080280818号において記載される非天然O結合型もしくはS結合型グリコシル化部位または国際特許出願公開WO20091300198およびWO2009137254において記載される非天然グリコシル化部位を含む、当技術分野において記載されるもののいずれかなどのような、上記に記載されるものを含むおよびそれ以外の非天然グリコシル化部位を含有することができる。他の例では、さらなる修飾が、他の因子、分子、およびタンパク質とのその相互作用が改変されるように、FIXポリペプチド配列に対してなすことができる。たとえば、第X因子との相互作用に関与するアミノ酸残基は、FXへの修飾FIXポリペプチドの親和性および/または結合が増加するように修飾することができる。他の修飾は、FVIIIa、ヘパリン、アンチトロンビンIII、およびリン脂質との相互作用に関与するアミノ酸の修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドのコンホメーションまたは折り畳みを改変するさらなる修飾もまた、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドに対してなすことができる。これらは、たとえば、新しいジスルフィド結合が形成されるような、システインとの1つもしくは複数のアミノ酸の置換またはα-ヘリックスコンホメーションを安定化する修飾を含み、それによって、修飾FIXポリペプチドに対して活性の増加を与える。修飾はまた、修飾FIXポリペプチドの安定性を増加させるように作用するものなどのような部分に引き続いて連結することができるアミノ酸残基を導入するためになすことができる。たとえば、システイン残基は、ポリマー、そのようなポリエチレングリコールPEGへのコンジュゲーションを促進するために導入することができる国際特許出願公開WO2009140015。FIXポリペプチドの安定性はまた、潜在的なタンパク質分解部位を除去するなど、潜在的なタンパク質分解部位を修飾することによって改変し、それによって、プロテアーゼに対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性を増加させることができるたとえば米国特許出願公開第20080102115号を参照されたい。さらに、アミノ酸交換、アミノ酸欠失、またはアミノ酸挿入は、修飾FIXポリペプチドが、リン脂質膜に対する結合性および/または親和性の増加を示すように、内因性Glaドメインにおいてなすことができる。そのような修飾は、単一のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、および/もしくはアミノ酸挿入を含むことができるまたは複数のアミノ酸のアミノ酸交換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸挿入を含むことができる。たとえば、内因性Glaドメインの全てまたは一部分は、異種Glaドメインの全てまたは一部分と置換することができる。他の例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、内因性Glaドメインにおける欠失または通常γ-カルボキシル化される位置における交換を示すことができる。その代わりに、アミノ酸交換は、さらなる潜在的なガンマカルボキシル化部位を導入するようになすことができる。以下の部は、FIXポリペプチドの安定性および/または血液凝固活性の増加を達成するための、当技術分野において記載される例示的な修飾の非限定的な例を記載する。上記に議論されるように、そのような修飾はまた、本明細書において提供される任意の修飾FIXポリペプチドにおいてさらに含むことができる。下記に言及されるアミノ酸位置は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応する。対応する突然変異は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、またはスプライス変異体などのような他のFIXポリペプチドにおいてなすことができる。a.活性を増加させるための修飾一例では、第X因子に対する触媒活性の増加をもたらすさらなる修飾が、本明細書において提供される修飾第IX因子ポリペプチドに対してなすことができる。たとえば、修飾は、結果として生じる修飾FIXポリペプチドが、FVIIIaが飽和していない条件下で、FVIIIaに対する親和性を増加させ、それによってFXに対する増加した活性を示すように、その補因子、FVIIIaとの相互作用に関与するアミノ酸に対してなすことができる。基質FXの活性化について、未修飾FIXaポリペプチドまたはFIXa/FVIIIa複合体の活性と比較して、FIXaポリペプチドおよび/またはFIXa/FVIIIa複合体の触媒効率を増加させる修飾もまた、FIXにおいてなすことができる。修飾FIXポリペプチドの内因活性を増加させるための、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドにおいて含むことができるさらなる修飾の例は、HopfneretalEMBOJ1666266635KolkmanetalBiochem3973987405SichleretalJBiolChem27841214126BegbieetalThrombHaemost94113847米国特許第6531298号、ならびに米国特許出願公開第20080167219号および第20080214461号において記載されるものを含むが、これらに限定されない。修飾FIXポリペプチドの内因活性の増加をもたらすことができる、当技術分野において記載される例示的なアミノ酸修飾の非限定的な例は、1つまたは複数のV86A、V86N、V86D、V86E、V86Q、V86G、V86H、V86I、V86L、V86M、V86F、V86S、V86T、V86W、V86Y、Y259F、A261K、K265T、E277V、E277A、E277N、E277D、E277Q、E277G、E277H、E277I、E277L、E277M、E277F、E277S、E277T、E277W、E277Y、R338A、R338V、R338I、R338F、R338W、R338S、R338T、Y345F、I383V、E388Gを含む。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、アミノ酸交換Y259FK265T、Y259FK265TY345F、Y259FA261KK265TY345F、Y259FK265TY345FI383VE388GまたはY259FA261KK265TY345FI383VE388Gを含有することができる。他の例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、活性化ペプチドを除去する修飾Δ155~177を含有することができ[たとえばBegbieetalThrombHaemost94113847を参照されたい]、これは、インビボにおいて活性を増加させることができるのみならず、クリアランスを減少させることもできる。b.リン脂質に対する親和性を増加させるまたはコラーゲンへの結合を低下させる修飾本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、リン脂質に対する親和性を増加させるための1つまたは複数のさらなる修飾を含有することができる。FIXの血液凝固活性は、活性化血小板の表面上に発現されるものなどのようなリン脂質に対するポリペプチドの結合性および/または親和性を増加させることによって増強することができる。これは、たとえば、内因性FIXGlaドメインを修飾することによって、達成することができる。修飾は、ホスファチジルセリンおよび他の負電荷リン脂質に結合するための能力が増加した修飾FIXポリペプチドをもたらす、FIXポリペプチドのGlaドメインにおける1つまたは複数の位置のアミノ酸交換によって達成することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドに対してなすことができる、リン脂質結合および/または親和性を増加させるためのさらなる修飾の例は、米国特許第6,017,882号において記載されるものを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、アミノ酸位置11、12、29、33、および/または34配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するに1つまたは複数の修飾を含有することができる。例示的なそのような修飾は、アミノ酸交換K5I、K5L、K5F、K5E、Q11E、Q11D、R16E、R29F、ならびに/またはN34E、N34D、N34F、N34I、N34L、T35D、およびT35Eである。他の態様では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、コラーゲンに対する親和性を低下させるための1つまたは複数のさらなる修飾を含有することもできる。FIXの血液凝固活性は、内皮細胞上の細胞外マトリックスの表面上に存在するコラーゲンIVに対するポリペプチドの結合および/または親和性を低下させることによって増強させることができる。コラーゲンIVへの結合の低下は、修飾FIXポリペプチドの循環の増加、したがって、インビボにおける血液凝固活性の増加をもたらすことができる。これは、たとえば、コラーゲンIVとの相互作用を担う、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸残基3~11のFIXGlaドメインを修飾することによって達成することができる[CheungetalJBiolChem2672052920531CheungetalProcNatlAcadSciUSA931106811073]。修飾は、コラーゲンIVに結合する能力が減少した修飾FIXポリペプチドをもたらす、FIXポリペプチドのGlaドメインにおける1つまたは複数の位置でのアミノ酸交換によって達成することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドに対してなすことができる、リン脂質結合および/または親和性を増加させるためのさらなる修飾の例は、SchuettrumpfetalBlood105231623MeltonetalBloodCoagulFibrinolysis1223743およびCheungetalProcNatlAcadSciUSA931106811073において記載されるものを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、アミノ酸交換K5Aおよび/またはV10Kを含有することができる。c.阻害因子に対する抵抗性を増加させるためのさらなる修飾たとえば、アンチトロンビンIIIAT-III/ヘパリンによる阻害などのような、阻害因子に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性を増加させることによって、FIXポリペプチドの活性を増加させる、さらなる修飾を含むことができる。典型的に、これは、AT-III、ヘパリン、またはAT-III/ヘパリン複合体との相互作用に関与する、1つまたは複数の残基の修飾によって達成することができる。例示的なそのような修飾は、たとえば米国特許第7,125,841号;米国特許出願公開第20040110675号;国際特許出願公開WO2002040544;ChangJetalJBiolChem2731208994YangLetalJBiolChem2775075660YangLetalJBiolChem278250328RohlenaetalJBiolChem2789394401SheehanetalBlood107387682BuyueetalBlood11232343241において記載されるものを含む。AT-IIIおよび/またはヘパリンによる阻害を減少させるために含むことができる修飾の非限定的な例は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドのアミノ酸位置R252、H256、H257、K265、H268、K293、R318、R333、R338、K400、R403、K409、またはK411に対応するアミノ酸位置での修飾を含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供されるFIXポリペプチドは、アミノ酸交換R252A、H257A、H268A、K293A、R318A、R333A、R338A、K400A、R403A、R403E、および/またはK411Aを含有することができる。d.グリコシル化を改変するためのさらなる修飾修飾は、上記に記載されるものに加えて、未修飾FIXポリペプチドと比較して、修飾FIXポリペプチドのグリコシル化を改変するために、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの中に組み込むことができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドは、修飾FIXポリペプチドの中に1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を導入する、1つまたは複数の修飾を含有することができる。したがって、適切な系において発現される場合、修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較して、改変されたグリコシル化パターンを示すことができる。いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、N-グリコシル化の増加またはO-グリコシル化の増加などのような、未修飾FIXポリペプチドと比較して、グリコシル化の増加を示す。FIXポリペプチドのグリコシル化プロファイルを改変するために、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチド中に含むことができるさらなる修飾の例は、国際特許出願公開WO2009130198、WO2009051717、およびWO2009137254において記載されるものを含むが、これらに限定されない。グリコシル化を増加させるために、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、Y1N、Y1NS3T、S3NK5ST、G4T、G4NL6ST、K5NE7T、L6NE8T、E7NF9T、F9NQ11ST、V10NG12ST、Q11NN13T、G12NL14ST、L14NR16T、E15T、E15NE17TR16NC18ST、M19NE21TE20NK22T、K22N、S24NE26TF25NE27TE26NA28TE27NR29TA28NE30TR29NV31ST、E30NF32TV31NE33TF32NN34T、E33N、T35NR37ST、E36TE36NR37N、T39NF41ST、E40NW42T、F41NK43ST、W42NQ44ST、K43NY45TQ44NV46ST、Y45ND47T、V46NG48ST、D47ND49ST、G48NQ50ST、D49NC51ST、Q50NE52ST、E52NN54T、S53NP55ST、C56ST、L57NG59ST、G59NS61TG60ST、S61NK63ST、K63ND65ST、D65NN67ST、I66NS68ST、Y69ST、Y69NC71ST、S68NE70ST、E70NW72ST、W72NP74ST、P74NG76ST、F75N、G76NE78T、E78NK80T、F77T、F77NG79ST、G79NN81ST、K80NC82ST、E83ST、E83ND85ST、L84NV86ST、D85N、V86A、V86NC88ST、T87NN89ST、I90NN92ST、K91ST、I90NN92ST、K91NG93ST、R94ST、R94NE96ST、K100N、A103ST、S102ND104ST、A103NN105ST、D104NK106ST、V107ST、K106NV108ST、V108NV110ST、S111N、E113NY115ST、G114NR116ST、R116NA118ST、E119NQ121ST、K122ST、Q121NS123ST、K122NC124STS123NE125ST、E125NA125ST、P126NV128ST、A127NP129T、V128NF130ST、P129NP131ST、F130NC132ST、R134N、V135NV137ST、S136N、S138N、V137NQ139TQ139N、T140NL142ST、S141NL143ST、K142N、A146NA148ST、E147NV149ST、T148NF150ST、V149NP151ST、F150ND152ST、P151NV153ST、D152ND154ST、V153NY155ST、D154NV156ST、Y155NN157ST、V156N、S158NE160ST、T159NA161ST、E160NE162ST、A161N、E162NI164ST、T163NL165ST、I164ND166ST、L165NN167ST、D166NI168ST、I168NQ170ST、T169N、Q170N、S171NQ173ST、T172N、Q173NF175ST、S174NN176ST、F175ND177ST、F178ST、D177N、D177E、F178NR180ST、T179NV181ST、R180NV182ST、G183E185ST、G184ND186T、E185NA187ST、D186NK188ST、A187NP189T、K188NG190ST、P189NQ181ST、G200NV202T、K201ND203ST、K201T、V202NA204ST、D203NF205ST、E213NW215ST、K214T、V223T、E224NG226ST、T225NV227ST、G226NK228ST、V227NI229T、K228N、H236NI238TI238NE240TE239N、E240NE242ST、E242N、T241NH243ST、H243NE245ST、K247NN249ST、V250NR252T、I251ST、I251NI253ST、R252NI254ST、I253NP255ST、P255NH257ST、H257NY259ST、N260ST、A262ST、A261NI263ST、A262NN264ST、I263NK265ST、K265NN267ST、A266NH268ST、D276NP278ST、P278NV280ST、E277NL279ST、V280NN282ST、Y284ST、S283NV285ST、Y284N、D292NK294ST、K293NY295ST、E294N、F299ST、I298NL300ST、K301NG303ST、F302N、G303NG305ST、S304NY306ST、Y306NS308ST、R312NF314ST、V313NH315T、F314NK316ST、H315NG317ST、K316NR138ST、G317N、R318NA320ST、S319NL321ST、A320NV322T、L321NL323ST、V322NQ324ST、Y325NR327ST、R327NP329ST、P329NV331ST、L330ND332ST、D332NA334ST、R333N、A334NC336ST、T335NL337ST、L337N、R338N、S339NK341T、T340NF342TK341N、F342NI344ST、T343NY345ST、Y345NN347ST、M348ST、G352NH354T、F353N、F353NE355T、H354NG356ST、H354V、H354I、E355T、E355NG357ST、G356NR358T、G357ND359ST、R358N、Q362ND364ST、V370NT371VT371IE372T、E372NE374ST、E374N、G375N、W385NE387TG386NE388T、E388NA390ST、A390NK392T、M391NG393ST、K392NK394ST、K392V、G393T、G393NY395ST、K394NG396ST、R403NV405ST、I408ST、K409NK411ST、E410N、K411NK413ST、およびK413Nを含むが、これらに限定されない。e.プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるための修飾本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、プロテアーゼに対するポリペプチドの抵抗性の増加をもたらす、さらなる修飾を含有することができる。たとえば、1つまたは複数の潜在的なタンパク質分解性切断部位を除去するアミノ酸交換は、なすことができる。修飾FIXポリペプチドは、したがって、プロテアーゼに対してより抵抗性になり、それによって、修飾ポリペプチドの安定性および半減期を増加させることができる。プロテアーゼに対する抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドにおいて含むことができるさらなる修飾の例は、米国特許出願公開第20080102115号および国際特許出願公開WO2007149406において記載されるものを含むが、これらに限定されない。プロテアーゼ抵抗性を増加させるために、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチド中に含むことができる例示的な修飾は、Y1H、Y1I、S3Q、S3H、S3N、G4Q、G4H、G4N、K5N、K5Q、L6I、L6V、E7Q、E7H、E7N、E8Q、E8H、E8N、F9I、F9V、V10Q、V10H、V10N、G12Q、G12H、G12N、L14I、L14V、E15Q、E15H、E15N、R16H、R16Q、E17Q、E17H、E17N、M19I、M19V、E20Q、E20H、E20N、E21Q、E21H、E21N、K22N、K22Q、S24Q、S24H、S24N、F25I、F25V、E26Q、E26H、E26N、E27Q、E27H、E27N、A28Q、A28H、A28N、R29H、R29Q、E30Q、E30H、E30N、V31Q、V31H、V31N、F32I、F32V、E33Q、E33H、E33N、T35Q、T35H、T35N、E36Q、E36H、E36N、R37H、R37Q、T38Q、T38H、T38N、T39Q、T39H、T39N、E40Q、E40H、E40N、F41I、F41V、W42S、W42H、K43N、K43Q、Y45H、Y45I、V46Q、V46H、V46N、D47N、D47Q、G48Q、G48H、G48N、D49N、D49Q、E52Q、E52H、E52N、S53Q、S53H、S53N、P55A、P55S、L57I、L57V、N58Q、N58S、G59Q、G59H、G59N、G60Q、G60H、G60N、S61Q、S61H、S61N、K63N、K63Q、D64N、D64Q、D65N、D65Q、I66Q、I66H、I66N、S68Q、S68H、S68N、Y69H、Y69I、E70Q、E70H、E70N、W72S、W72H、P74A、P74S、F75I、F75V、G76Q、G76H、G76N、F77I、F77V、E78Q、E78H、E78N、G79Q、G79H、G79N、K80N、K80Q、E83Q、E83H、E83N、L84I、L84V、D85N、D85Q、V86Q、V86H、V86N、T87Q、T87H、T87N、I90Q、I90H、I90N、K91N、K91Q、N92Q、N92S、G93Q、G93H、G93N、R94H、R94Q、E96Q、E96H、E96N、F98I、F98V、K100N、K100Q、S102Q、S102H、S102N、A103Q、A103H、A103N、D104N、D104Q、K106N、K106Q、V107Q、V107H、V107N、V108Q、V108H、V108N、S110Q、S110H、S110N、T112Q、T112H、T112N、E113Q、E113H、E113N、G114Q、G114H、G114N、Y115H、Y115I、R116H、R116Q、L117I、L117V、A118Q、A118H、A118N、E119Q、E119H、E119N、K122N、K122Q、S123Q、S123H、S123N、E125Q、E125H、E125N、P126A、P126S、A127Q、A127H、A127N、V128Q、V128H、V128N、P129A、P129S、P131A、P131S、G133Q、G133H、G133N、R134H、R134Q、V135Q、V135H、V135N、S136Q、S136H、S136N、V137Q、V137H、V137N、S138Q、S138H、S138N、T140Q、T140H、T140N、S141Q、S141H、S141N、K142N、K142Q、L143I、L143V、T144Q、T144H、T144N、R145H、R145Q、A146Q、A146H、A146N、E147Q、E147H、E147N、T148Q、T148H、T148N、V149Q、V149H、V149N、P151A、P151S、D152N、D152Q、V153Q、V153H、V153N、D154N、D154Q、Y155H、Y155I、V156Q、V156H、V156N、S158Q、S158H、S158N、T159Q、T159H、T159N、E160Q、E160H、E160N、A161Q、A161H、A161N、E162Q、E162H、E162N、T163Q、T163H、T163N、I164Q、I164H、I164N、L165I、L165V、L165Q、L165H、D166N、D166Q、I168Q、I168H、I168N、T169Q、T169H、T169N、S171Q、S171H、S171N、T172Q、T172H、T172N、S174Q、S174H、S174N、F175I、F175V、F175H、D177N、D177Q、F178I、F178V、F178H、T179Q、T179H、T179N、R180H、R180Q、V181Q、V181H、V181N、V182Q、V182H、V182N、G183Q、G183H、G183N、G184Q、G184H、G184N、E185Q、E185H、E185N、D186N、D186Q、A187Q、A187H、A187N、K188N、K188Q、P189A、P189S、G190Q、G190H、G190N、F192I、F192V、F192IH、P193A、P193S、W194S、W194H、W194I、V196Q、V196H、V196N、V197Q、V197H、V197N、L198I、L198V、L198Q、L198H、N199Q、N199S、G200Q、G200H、G200N、K201N、K201Q、V202Q、V202H、V202N、D203N、D203Q、A204Q、A204H、A204N、F205I、F205V、G207Q、G207H、G207N、G208Q、G208H、G208N、S209Q、S209H、S209N、I210Q、I210H、I210N、V211Q、V211H、V211N、E213Q、E213H、E213N、K214N、K214Q、W215S、W215H、I216Q、I216H、I216N、V217Q、V217H、V217N、T218Q、T218H、T218N、A219Q、A219H、A219N、A220Q、A220H、A220N、V223Q、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0H、A320K、A320N、A320P、A320Q、A320R、A320S、A320T、L321A、L321C、L321D、L321E、L321G、L321H、L321K、L321N、L321P、L321Q、L321R、L321S、L321T、V322A、V322C、V322D、V322E、V322G、V322H、V322K、V322N、V322P、V322Q、V322R、V322S、V322T、V322W、V322Y、L323A、L323C、L323D、L323E、L323G、L323H、L323K、L323N、L323P、L323Q、L323R、L323S、L323T、L323F、L323I、L323M、L323V、L323W、L323Y、Q324A、Q324C、Q324G、Q324P、Y325A、Y325C、Y325D、Y325E、Y325G、Y325H、Y325K、Y325N、Y325P、Y325Q、Y325R、Y325S、Y325T、Y325W、L326A、L326C、L326D、L326E、L326G、L326H、L326K、L326N、L326P、L326Q、L326R、L326S、L326T、L326F、L326I、L326M、L326V、L326W、L326Y、R327A、R327C、R327G、R327H、R327P、V328A、V328C、V328D、V328E、V328G、V328H、V328K、V328N、V328P、V328Q、V328R、V328S、V328T、V328F、V328I、V328M、V328W、V328Y、L330A、L330C、L330D、L330E、L330G、L330H、L330K、L330N、L330P、L330Q、L330R、L330S、L330T、L330F、L330I、L330V、L330W、L330Y、V331A、V331C、V331D、V331E、V331G、V331H、V331K、V331N、V331P、V331Q、V331R、V331S、V331T、V331F、V331I、V331M、V331W、V331Y、D332A、D332C、D332G、D332P、R333A、R333C、R333D、R333E、R333G、R333H、R333N、R333P、R333Q、R333R、R333S、R333T、A334C、A334D、A334E、A334G、A334H、A334K、A334N、A334P、A334Q、A334R、A334S、A334T、T335A、T335C、T335G、T335P、C336D、C336E、C336H、C336K、C336N、C336P、C336Q、C336R、C336S、C336T、L337A、L337C、L337D、L337E、L337G、L337H、L337K、L337N、L337P、L337Q、L337R、L337S、L337T、R338A、R338C、R338G、R338P、S339P、S339T、K341A、K341C、K341G、K341P、F342A、F342C、F342D、F342E、F342G、F342H、F342K、F342N、F342P、F342Q、F342R、F342S、F342T、F342M、F342W、T343A、T343C、T343G、T343P、I344A、I344C、I344D、I344E、I344G、I344H、I344K、I344N、I344P、I344Q、I344R、I344S、I344T、Y345A、Y345C、Y345D、Y345E、Y345G、Y345H、Y345K、Y345N、Y345P、Y345Q、Y345R、Y345S、Y345T、Y345M、Y345W、N346A、N346C、N346G、N346P、N347H、N347P、M348A、M348C、M348D、M348E、M348G、M348H、M348K、M348N、M348P、M348Q、M348R、M348S、M348T、F349A、F349C、F349D、F349E、F349G、F349H、F349K、F349N、F349P、F349Q、F349R、F349S、F349T、F349I、F349M、F349W、F349Y、C350D、C350H、C350P、C350T、A351E、A351H、A351N、A351P、A351Q、A351R、A351S、A351T、G352A、G352C、G352P、F353A、F353C、F353D、F353E、F353G、F353H、F353K、F353N、F353P、F353Q、F353R、F353S、F353T、F353I、F353M、F353W、H354A、H354C、H354G、H354P、E355A、E355C、E355D、E355G、E355H、E355K、E355N、E355P、E355Q、E355S、E355T、G356D、G356E、G356H、G356K、G356N、G356P、G356Q、G356R、G356S、G356T、G357D、G357E、G357H、G357K、G357N、G357P、G357Q、G357R、G357S、G357T、R358D、R358E、R358H、R358K、R358N、R358P、R358Q、R358R、R358S、R358T、D359A、D359C、D359G、D359P、D359Q、D359S、D359T、S360A、S360C、S360G、S360P、C361D、C361E、C361H、C361K、C361N、C361P、C361Q、C361R、C361S、C361T、V370A、V370C、V370D、V370E、V370G、V370H、V370K、V370N、V370P、V370Q、V370R、V370S、V370T、V370W、V370Y、V373A、V373C、V373D、V373E、V373G、V373H、V373K、V373N、V373P、V373Q、V373R、V373S、V373T、V373F、V373I、V373M、V373W、E374A、E374C、E374G、E374P、G375H、S377A、S377C、S377G、S377P、F378A、F378C、F378D、F378E、F378G、F378H、F378K、F378N、F378P、F378Q、F378R、F378S、F378T、F378W、L379A、L379C、L379D、L379E、L379G、L379H、L379K、L379N、L379P、L379Q、L379R、L379S、L379T、L379I、L379M、L379W、L379Y、T380A、T380C、T380G、T380P、G381D、G381E、G381H、G381K、G381N、G381P、G381Q、G381R、G381S、G381T、I382A、I382C、I382D、I382E、I382G、I382H、I382K、I382N、I382P、I382Q、I382R、I382S、I382T、I382M、I382W、I382Y、I383A、I383C、I383D、I383E、I383G、I383H、I383K、I383N、I383P、I383Q、I383R、I383S、I383T、S384A、S384C、S384G、S384P、W385A、W385C、W385D、W385E、W385G、W385H、W385K、W385N、W385P、W385Q、W385R、W385S、W385T、W385M、E387A、E387C、E387G、E387H、E387P、E387T、E388H、E388N、E388P、E388Q、E388T、A390C、A390D、A390E、A390G、A390H、A390K、A390N、A390P、A390Q、A390R、A390S、M391A、M391C、M391D、M391E、M391G、M391H、M391K、M391N、M391P、M391Q、M391R、M391S、M391T、M391F、M391I、M391W、M391Y、K392A、K392C、K392G、K392P、G393C、G393D、G393E、G393H、G393K、G393N、G393P、G393Q、G393R、G393S、G393T、Y395A、Y395C、Y395D、Y395E、Y395G、Y395H、Y395K、Y395N、Y395P、Y395Q、Y395R、Y395S、Y395T、Y398A、Y398C、Y398D、Y398E、Y398G、Y398H、Y398K、Y398N、Y398P、Y398Q、Y398R、Y398S、Y398T、K400H、V401A、V401C、V401D、V401E、V401G、V401H、V401K、V401N、V401P、V401Q、V401R、V401S、V401T、V401F、V401I、V401M、V401W、V401Y、S402A、S402C、S402G、S402P、R403A、R403C、R403G、R403P、R403T、Y404A、Y404C、Y404D、Y404E、Y404G、Y404H、Y404K、Y404N、Y404P、Y404Q、Y404R、Y404S、Y404T、V405A、V405C、V405D、V405E、V405G、V405H、V405K、V405N、V405P、V405Q、V405R、V405S、V405T、V405W、V405Y、N406F、N406H、N406I、N406L、N406P、N406W、N406Y、W407D、W407E、W407F、W407H、W407I、W407K、W407N、W407P、W407Q、W407R、W407S、W407T、W407Y、I408D、I408E、I408H、I408K、I408N、I408P、I408Q、I408R、I408S、I408T、K409F、K409H、K409I、K409P、K409T、K409V、K409W、K409Y、E410H、K411A、K411C、K411G、K411I、K411P、K411T、K411V、K411W、K411YまたはK413Tに対応する任意の1つまたは複数のアミノ酸修飾を含む。g.例示的な組合せの修飾未修飾FIXポリペプチドの1つまたは複数の特性または活性に影響を及ぼすように設計される2つ以上の修飾を有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。いくつかの例では、2つまたはそれ以上の修飾が、FIXポリペプチドの2つまたはそれ以上の特性または活性を改変する。修飾は、1つまたは複数のグリコシル化、AT-IIIに対する抵抗性、AT-III/ヘパリンに対する抵抗性、ヘパリンに対する抵抗性、触媒活性、LRPへの結合、内因活性、リン脂質結合および/または親和性、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、ならびにFVIIIaおよびFXなどのような他の因子または分子との相互作用が改変されるように、FIXポリペプチドに対してなすことができる。典型的に、2つまたはそれ以上の修飾は、結果として生じる修飾FIXポリペプチドが、未修飾FIXポリペプチドと比較して、血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および/または治療指数の増強を有するように、組み合わせられる。修飾は、アミノ酸交換、アミノ酸挿入、またはアミノ酸欠失を含むことができる。2つまたはそれ以上の修飾を含有する修飾FIXポリペプチドの血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および/または治療指数の増強は、出発FIXaポリペプチドまたは未修飾FIXaポリペプチドの活性と比較して、少なくともまたは少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、またはそれ以上まで増加させることができる。1つ、2つ、またはそれ以上の活性または特性を改変するために未修飾FIXポリペプチドの中に導入される、2つまたはそれ以上の修飾を含有する修飾FIXポリペプチドが、本明細書において提供される。修飾FIXポリペプチドは、2、3、4、5、6、またはそれ以上の修飾を含有することができる。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、位置203に非天然グリコシル化部位を導入するための、アミノ酸交換D203NおよびF205Tなどのような、一次配列の中に非天然グリコシル化部位を組み込むことによる、グリコシル化を増加させるための修飾ならびにR338Eなどのような、AT-III/ヘパリンに対する抵抗性を増加させるための修飾を含有することができる残基は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応する。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、もっぱら表3~9において記載されるものから選択される2つ以上の修飾を有することができる。他の例では、修飾FIXポリペプチドが、2つ以上の修飾を含有し、1つまたは複数の修飾が、表3~9において記載されるものから選択され、1つまたは複数の修飾が、たとえば当技術分野において記載される修飾などのような、表3~9において記載されていないさらなる修飾である。いくつかの例では、1つまたは複数のさらなる修飾が、触媒活性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、血小板およびリン脂質に対する親和性および/または結合の増加、プロテアーゼ抵抗性の増加、免疫原性の減少、ならびにPEG成分などのような成分へのコンジュゲーションを促進するものをもたらすものなどのような、上記、部D.3.a~fにおいて記載されるものから選択することができる。非限定的な例示的な組合せの修飾は、表10において提供される。これらの例示的な組合せの修飾は、AT-IIIに対する抵抗性の増加、AT-III/ヘパリンに対する抵抗性の増加、ヘパリンに対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および改変されたグリコシル化を含むが、これらに限定されない、FIXポリペプチドの2つ以上の活性または特性を改変するように設計される、2つ以上の修飾を含む。そのような組合せの修飾を含有する修飾FIXポリペプチドは、血液凝固活性の増加、血液凝固活性の持続時間の増加、および/または治療指数の増強を有することができる。下記の表10において、修飾FIXポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が記載される配列識別子配列番号が同定される。表103.コンジュゲートおよび融合タンパク質本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、ポリマーなどのような、他のポリペプチドまたは他の成分に対してコンジュゲートするまたは融合することができる。いくつかの実例では、コンジュゲーションまたは融合は、血清半減期を増加させるために達成される。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドを融合することができる例示的なポリペプチドは、血清アルブミン、Fc、FcRn、およびトランスフェリンを含むが、これらに限定されない[たとえばSheffieldWPetalBrJHaematol12656573;米国特許出願公開第20050147618号;国際特許出願公開WO2007112005、およびWO2004101740を参照されたい]。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、デキストラン、ポリエチレングリコールペグ化PEG、もしくはシアリル成分または天然ポリマーもしくは糖ポリマーなどのような他のそのようなポリマーなどのようなポリマーに対してコンジュゲートすることができる。一例では、ポリペプチドが、別記されるように、デキストランに対してコンジュゲートされる[ZambauxetalJProteinChem1727984]。PEGまたはPEG誘導体を共有結合するコンジュゲートすることつまりペグ化によって、ポリペプチドを修飾する様々な方法は、当技術分野において知られているたとえばUS20060104968、US5672662、US6737505、およびUS20040235734を参照されたい。ペグ化のための技術は、特殊なリンカーおよびカップリング化学作用たとえばHarrisAdvDrugDelivRev544594762002を参照されたい、単一のコンジュゲーション部位への複数のPEG成分の付加分岐PEGの使用を介してなど;たとえばVeroneseetalBioorgMedChemLett121771802002を参照されたい、部位特異的ペグ化および/またはモノペグ化たとえばChapmanetalNatureBiotech177807831999を参照されたい、部位特異的酵素的ペグ化たとえばSatoAdvDrugDelivRev544875042002を参照されたい、ならびに糖PEG化米国特許出願公開第20080050772号、第20080146494号、第20080050772号、第20080187955号、および第20080206808号を含むが、これらに限定されない。当技術分野において記載される方法および技術は、単一のタンパク質分子に付加された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のPEGまたはPEG誘導体を有するタンパク質を産生することができるたとえばU.S.2006/0104968を参照されたい。したがって、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、米国特許第5,969,040号、第5,621,039号、第6,423,826号、米国特許出願公開第20030211094号、第20070254840号、第20080188414号、第2008000422号、第20080050772号、第20080146494号、第20080050772号、第20080187955号、および第20080206808号、国際特許出願公開WO2007112005、WO2007135182、WO2008082613、WO2008119815、WO2008119815において記載されるいずれかなどのような、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、糖ペグ化glycopegylateを含めて、ペグ化することができる。いくつかの実例では、修飾FIXポリペプチドが、他の成分へのコンジュゲーションを促進するためのアミノ酸置換を含む。たとえば、システイン残基は、ポリマーへのコンジュゲーションを促進するためにFIXポリペプチドの中に組み込むことができる。この目的のための例示的なアミノ酸置換修飾は、D47C、Q50C、S53C、L57C、I66C、N67C、S68C、E70C、W72C、P74C、K80C、L84C、V86C、N89C、I90C、K91C、R94C、K100C、N101C、S102C、A103C、D104C、N105C、K106C、V108C、E114C、R116C、E119C、N120C、Q121C、S123C、E125C、P129C、S138C、T140C、S141C、K142C、A146C、E147C、E162C、T163C、I164C、L165C、D166C、N167C、I168C、T169C、Q170C、S171C、T172C、Q173C、S174C、F175C、N176C、D177C、F178C、T179C、R180C、E185C、D186C、K188C、P189C、K201C、V202C、D203C、E224C、T225C、K228C、E239C、E240C、T241C、H243C、K247C、N249C、R252C、H257C、N260C、A261C、A262C、I263C、K265C、E277C、F314C、R318C、L321C、K341C、E372C、E374C、M391C、K392C、N406C、K413CおよびT415C配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドに対応するを含むが、これらに限定されない。E.FIXポリペプチドの産生FIXのその修飾FIXポリペプチドまたはドメインを含むFIXポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための、当技術分野においてよく知られている方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸の同定のための、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。当技術分野において利用可能な任意の方法は、細胞源または組織源などから、たとえば肝臓などからFIXポリペプチドまたは他のビタミンKポリペプチドをコードする完全長つまり全コード領域を包含するcDNAまたはゲノムDNAクローンを得るために使用することができる。本明細書において記載される修飾FIXポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発などによって操作することができる。FIXは、核酸分子のクローニングおよび単離について、当技術分野において知られている任意の利用可能な方法を使用してクローニングするまたは単離することができる。そのような方法は、核酸のPCR増幅ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング、および活性ベースのスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。たとえばポリメラーゼ連鎖反応PCR法を含む、核酸の増幅のための方法は、FIXポリペプチドをコードする核酸分子を単離するために使用することができる。核酸含有物質は、FIXコード核酸分子を単離することができる出発物質として使用することができる。たとえば、DNA調製物およびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物たとえば、肝臓から、流体試料たとえば血液、血清、唾液、健常および/または病気の対象に由来する試料は、増幅法において使用することができる。核酸ライブラリーもまた、出発物質の源として使用することができる。プライマーは、FIXコード分子を増幅するために設計することができる。たとえば、プライマーは、FIXが生成される発現配列に基づいて設計することができる。プライマーは、FIXアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成される核酸分子は、配列を決定し、FIXポリペプチドをコードすることを確認することができる。ベクター、たとえばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードDNA配列の増幅のために設計されたベクターの中に合成遺伝子をクローニングする目的で制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む、さらなるヌクレオチド配列を、FIXコード核酸分子に結合することができる。さらに、機能的DNAエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列は、FVIIコード核酸分子に作動可能に連結することができる。そのような配列の例は、細胞内タンパク質発現を容易にするよう設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を容易にするよう設計された分泌配列を含むが、これらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列などのようなさらなるヌクレオチド配列もまた、FIXコード核酸分子に連結することができる。そのような領域は、特異的標的細胞の中へのFIXの取り込みを容易にするまたは他の場合には合成遺伝子の薬物動態を増強させる配列を含むが、これらに限定されない。次いで、同定され、単離された核酸は、適切なクローニングベクターの中に挿入することができる。当技術分野において知られている多くのベクター宿主系を使用することができる。可能性として考えられるベクターは、プラスミドまたは修飾ウイルスを含むが、これらに限定されない、しかしベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターは、ラムダ誘導体などのようなバクテリオファージまたはpBR322プラスミド誘導体もしくはpUCプラスミド誘導体などのようなプラスミドまたはBluescriptベクターStratagene、LaJolla、CAを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターの中への挿入は、たとえば、相補的付着末端を有するクローニングベクターの中にDNA断片をライゲーションすることによって達成することができる。挿入は、TOPOクローニングベクターを使用して達成することができるInvitrogen、Carlsbad、CA。DNAを断片化するために使用される相補的制限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、DNA分子の端は、酵素的に修飾することができる。その代わりに、所望される任意の部位は、DNA末端上にヌクレオチド配列リンカーをライゲーションすることによって産生することができる;これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。代替方法では、切断されたベクターおよびFIXタンパク質遺伝子は、ホモポリマーテーリングによって修飾することができる。組換え分子は、たとえば形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、および超音波穿孔sonoporationを介して宿主細胞の中に導入することができ、遺伝子配列の多くのコピーが、生成される。特定の実施形態では、単離FIXタンパク質遺伝子、cDNA、または合成DNA配列を組み込む組換えDNA分子を用いる宿主細胞の形質転換が、遺伝子の複数のコピーの生成を可能にする。したがって、遺伝子は、形質転換体を成長させ、形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要な場合には単離組換えDNAから、挿入された遺伝子を回収することによって、多量に得ることができる。1.ベクターおよび細胞1つまたは複数のFIXタンパク質の組換え発現のために、FIXタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部分を含有する核酸は、適切な発現ベクター、つまり、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、たとえばpCMVなどのような任意の哺乳動物発現ベクターである。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、FIX遺伝子についての天然プロモーターおよび/またはそれらのフランキング領域によって供給することもできる。FIXまたは修飾FIXをコードする核酸を含有するベクターもまた、提供される。ベクターを含有する細胞もまた、提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、ベクターは、その中での使用に適した任意のベクターである。ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞が、提供される。そのような細胞は、細菌細胞、酵母細胞、菌類細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞を含む。細胞は、コードFIXタンパク質が細胞によって発現される条件下で上記細胞を成長させ、かつ発現FIXタンパク質を回収することによって、FIXポリペプチドまたはその修飾FIXポリペプチドを産生するために使用される。本明細書における目的上、FIXは、培地の中に分泌させることができる。一実施形態では、FIX活性を有し、FIXポリペプチドの全てもしくは一部分を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列またはその複数のコピーを含有するベクターが、提供される。ベクターは、細胞におけるFIXポリペプチドもしくは修飾FIXポリペプチドの発現について選択することができるまたはFIXタンパク質が、分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。FIXが発現される場合、核酸は、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeα-接合因子シグナル配列もしくはその部分などのような分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸に連結される。様々な宿主-ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために使用することができる。これらは、ウイルスたとえばワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルスを用いて感染させた哺乳動物細胞株;ウイルスたとえばバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞株;酵母ベクターを含有する酵母などのような微生物;またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAを用いて形質転換された細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において変わる。使用される宿主-ベクター系に依存して、多くの適した転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか1つを使用することができる。ベクターの中へのDNA断片の挿入について当業者らに知られている任意の方法が、適切な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えDNAおよび合成技術ならびにインビボ組換え体遺伝的組換えを含むことができる。FIXポリペプチドもしくは修飾FIXポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、断片、もしくは相同体のタンパク質をコードする核酸配列の発現は、遺伝子またはその断片が、1つまたは複数の組換えDNA分子を用いて形質転換された宿主において発現するように、第2の核酸配列によって調節することができる。たとえば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター/エンハンサーによって制御することができる。特定の実施形態では、プロモーターが、FIXタンパク質についての遺伝子に対して天然のものではない。使用することができるプロモーターは、SV40初期プロモーター[BernoistandChambonNature290304310]、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列において含有されるプロモーター[YamamotoetalCell22787797]、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター[WagneretalProcNatlAcadSciUSA7814411445]、メタロチオネイン遺伝子の調節配列[BrinsteretalNature2963942];β-ラクタマーゼプロモーター[JayetalProcNatlAcadSciUSA785543]またはtacプロモーター[DeBoeretalProcNatlAcadSciUSA802125]などのような原核生物発現ベクター;UsefulProteinsfromRecombinantBacteriaScientificAmerican2427994もまた参照されたい;ノパリン合成酵素プロモーター[HerraraEstrellaetalNature303209213]またはカリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター[GarderetalNucleicAcidsRes92871]を含有する植物発現ベクターならびに光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター[HerreraEstrellaetalNature310115120];Gal4プロモーターなどのような酵母および他の菌類に由来するプロモーターエレメント、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた以下の動物転写制御領域:膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域[SwiftetalCell38639646OrnitzetalColdSpringHarborSympQuantBiol50399409MacDonaldHepatology7425515];膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域[HanahanetalNature315115122]、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域[GrosschedletalCell38647658AdamsetalNature318533538AlexanderetalMolCellBiol714361444]、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域[LederetalCell45485495]、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域[PinckertetalGenesandDevel1268276]、肝臓において活性なアルファ-フェトプロテイン遺伝子制御領域[KrumlaufetalMolCellBiol516391648HammeretalScience23553581987]、肝臓中で活性なアルファ-1抗トリプシン遺伝子制御領域[KelseyetalGenesandDevel1161171]、骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域[MagrametalNature315338340KolliasetalCell468994]、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域[ReadheadetalCell48703712]、骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域[ShaniNature314283286]および視床下部の性腺刺激細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域[MasonetalScience23413721378]を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、FIXポリペプチドもしくは修飾FIXポリペプチドまたはそのドメイン、断片、誘導体、もしくは相同体をコードする核酸に作用可能に連結されるプロモーター、1つまたは複数の複製開始点、および所望により、1つまたは複数の選択マーカーたとえば抗生物質抵抗性遺伝子を含有するベクターが、使用される。FIXポリペプチドの発現のためのベクターおよび系は、よく知られているピキアベクターたとえばInvitrogen、SanDiego、CAから入手可能、特にコードタンパク質の分泌のために設計されるベクターを含む。哺乳動物細胞における発現のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、pCMVを含む。イーコリE.coli細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターは、たとえば、pQE発現ベクターを含むQiagen、Valencia、CAから入手可能;系について記載する、Qiagenによって出版さる文献もまた参照されたい。pQEベクターは、イーコリにおける組換えタンパク質の、厳重に調節された、高度なレベルの発現を提供するためのファージT5プロモーターイーコリRNAポリメラーゼにより認識されるおよび二重のlacオペレーター抑圧モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位RBSII、6XHisタグコード配列、t0およびT1転写ターミネーター、ColE1複製開始点、ならびにアンピシリン抵抗性を付与するためのベータ-ラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターは、組換えタンパク質のN-またはC-末端のいずれかに6xHisタグを置くことを可能にする。上記プラスミドは、3つの全てのリーディングフレームのためのマルチクローニングサイトを提供し、N-末端6×Hisタグ付きタンパク質の発現を提供するpQE32、pQE30、およびpQE31を含む。イーコリ細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターは、たとえば、pET発現ベクターを含む米国特許第4,952,496号を参照されたい;NOVAGEN、Madison、WIから入手可能;系を記載する、Novagenによって出版されている、文献もまた参照されたい。そのようなプラスミドは、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘発性イーコリlacオペレーター、およびlacリプレッサー遺伝子を含有するpET11a;T7プロモーター、T7ターミネーター、およびイーコリompT分泌シグナルを含有するpET12a-c;ならびにHisカラムを用いる精製において使用されるHis-Tag商標リーダー配列およびカラムでの精製の後での切断を可能にするトロンビン切断部位、T7-lacプロモーター領域、およびT7ターミネーターを含有するpET15bおよびpET19bNOVAGEN、Madison、WIを含む。2.発現系FIXポリペプチド修飾および未修飾は、たとえば、宿主細胞、宿主動物の中への、FIXをコードする核酸分子の導入およびインビトロにおける、FIXをコードする核酸分子からの発現などのような、インビトロおよびインビボにおける方法を含む、タンパク質産生のための、当技術分野において知られている任意の方法によって産生することができる。FIXおよび修飾FIXポリペプチドは、投与および処置に必要な、必要とされる量および形態のFIXポリペプチドを産生するのに適した任意の生物において発現することができる。発現宿主は、イーコリ、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞などのような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルおよび発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類において異なり得る。発現宿主の選定は、これらの因子ならびに調節および安全性の考慮、産生コスト、ならびに精製の必要性および方法などのような他の因子に基づいてなすことができる。真核生物宿主における発現は、サッカロマイセスセレビシエおよびピキアパストリスPichiapastorisなどのような酵母、ショウジョウバエの細胞および鱗翅目の昆虫の細胞などのような昆虫細胞、タバコ、トウモロコシ、イネ、藻類、およびアオウキクサ属などのような植物および植物細胞における発現を含むことができる。発現のための真核細胞はまた、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞またはベビーハムスター腎臓BHK細胞などのような哺乳動物細胞株をも含む。真核生物の発現宿主はまた、たとえば、血清、乳、および卵における産生を含む、トランスジェニック動物における産生を含む。野生型FIXポリペプチドの産生のためのトランスジェニック動物は、当技術分野において知られており米国特許出願公開第2002-0166130号および第2004-0133930号、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドの産生に適合し得る。FIXの発現のための、多くの発現ベクターが、入手可能であり、当業者に知られている。発現ベクターの選定は、宿主発現系の選定により影響を及ぼされる。そのような選択は、十分に、当業者の技術のレベルの範囲内にある。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターならびに所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写終結シグナルおよび翻訳終結シグナルを含むことができる。安定した形質転換に使用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを典型的に有する。いくつかの場合において、複製開始点は、細胞におけるベクターのコピー数を増幅させるために使用することができる。FIXまたは修飾FIXポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用するまたは発現することができる。たとえば、融合物は、ポリペプチドに対してさらなる機能性を追加するために生成することができる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のためなどのようなタグ、たとえばhis6タグもしくはmycタグまたは精製のためのタグ、たとえばGST融合物、ならびにタンパク質分泌および/または膜結合を指示するための配列の融合物を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、FIXポリペプチドまたは修飾FIXポリペプチドが、活性形態で発現することができ、それによって、活性化は、分泌の後に、ポリペプチド活性化第XI因子FXIaのインキュベーションによって達成される。他の実施形態では、プロテアーゼは、不活性なチモーゲン形態で発現させることができる。FIXポリペプチドの産生の方法は、FIXポリペプチドの生成を助けることができる1つまたは複数のさらなる異種ポリペプチドの同時発現を含むことができる。たとえば、そのようなポリペプチドは、FIXポリペプチドの翻訳後プロセシングに寄与することができる。例示的なポリペプチドは、プロペプチド配列などのようなFIX前駆体配列の切断を助けるペプチダーゼ、たとえばグリコシル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、またはリン酸化によってなどのような、FIXポリペプチドの修飾に参加する酵素を含むが、これらに限定されない。FIXと同時発現することができる例示的なペプチダーゼは、PACE/フューリンまたはPACE-SOLであり、これは、FIXプロペプチド配列の切断を助ける。FIXポリペプチドのカルボキシル化を助ける例示的なタンパク質は、ワルファリン感受性酵素ビタミンK2,3-エポキシドレダクターゼVKORであり、これは、ビタミンK依存性γ-カルボキシラーゼによる補因子としての利用のための還元ビタミンKを産生する[Wajihetal.J.Biol.Chem.2803631603-31607]。この酵素のサブユニット、VKORC1は、γカルボキシル化を増加させるために、修飾FIXポリペプチドと同時発現させることができる。1つまたは複数のさらなるポリペプチドは、FIXポリペプチドと同じ発現ベクターまたは異なるベクターから発現させることができる。a.原核生物発現原核生物とりわけイーコリは、大量のFIXを産生するための系を提供する[たとえばPlatisetalProteinExpPurif3122230およびKhalilzadehetalJIndMicrobiolBiotechnol316369を参照されたい]。イーコリの形質転換は、当業者らによく知られている単純で速い技術である。イーコリE.coliについての発現ベクターは、高度なレベルのタンパク質発現を誘発するのにおよび宿主細胞に対していくらかの毒性を示すタンパク質を発現するのに有用である誘発性プロモーターを含有することができる。誘発性プロモーターの例は、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7RNAプロモーターおよびSP6RNAプロモーター、ならびに温度調節性λPLプロモーターを含む。FIXは、イーコリの細胞質内環境において発現させることができる。細胞質は、還元環境であり、いくつかの分子については、これは、不溶性封入体の形成をもたらし得る。ジチオトレイトールおよびβ-メルカプトエタノールなどのような還元剤ならびに変性剤たとえばグアニジン-HClおよび尿素などは、タンパク質を再可溶化するために使用することができる。代替アプローチは、酸化環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生に至る、細菌の細胞膜周辺腔におけるFIXの発現である。典型的に、タンパク質を周辺質に向けるリーダー配列は、発現されることとなるタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、周辺質の内部で、シグナルペプチターゼによって除去される。周辺質標的リーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子に由来するpelBリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーを含む。いくつかの場合において、周辺質の発現は、培地の中への発現タンパク質の漏出を可能にする。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで単純な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、周辺質から浸透圧溶解により得ることができる。細胞質内発現に類似して、いくつかの場合において、タンパク質は、不溶性になり得、変性剤および還元剤は、可溶化および再折り畳みを容易にするために使用することができる。誘発および成長の温度もまた、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼし得る。典型的に、25°Cおよび37°Cの間の温度が、使用される。突然変異もまた、発現タンパク質の溶解性を増加させるために使用することができる。典型的に、細菌は、非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、本明細書において提供される、高度にグリコシル化されたFIXポリペプチドの産生のために、グリコシル化は、宿主細胞からの精製の後にインビトロにおいて追加することができる。b.酵母サッカロマイセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe、ヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、およびピキアパストリスなどのような酵母は、FIXのための有用な発現宿主である[たとえばSkokoetalBiotechnolApplBiochem3825765を参照されたい]。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いてまたは相同組換えによる、安定した染色体の統合によって形質転換することができる。典型的に、誘発性プロモーターは、遺伝子発現を調節するために使用される。そのようなプロモーターの例は、GAL1、GAL7、およびGAL5ならびにCUP1などのようなメタロチオネインプロモーターを含む。発現ベクターは、形質転換DNAの選択および維持のために、LEU2、TRP1、HIS3、およびURA3などのような選択マーカーを含むことが多い。酵母において発現されるタンパク質は、可溶性であることが多く、Bipなどのようなシャペロニンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現は、発現レベルおよび溶解性を改善することができる。さらに、酵母において発現されるタンパク質は、サッカロマイセスセレビシエに由来する酵母接合型アルファ-因子分泌シグナルなどのような分泌シグナルペプチド融合物およびAga2p接合接着受容体またはアークスラアデニニボランスArxulaadeninivoransグルコアミラーゼなどのような酵母細胞表面タンパク質との融合物を使用して、分泌のために指示され得る。プロテアーゼ切断部位たとえばKex-2プロテアーゼは、ポリペプチドが分泌経路を出る場合に、融合配列をポリペプチドから除去するよう操作することができる。酵母はまた、Asn-X-Ser/Thrモチーフでのグリコシル化も可能である。c.昆虫および昆虫細胞特にバキュロウイルス発現系を使用する昆虫および昆虫細胞は、FIXまたはその修飾形態などのようなポリペプチドを発現するのに有用である[たとえばMunetaetalJVetMedSci6521923を参照されたい]。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞および昆虫幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物によって使用されるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を改善し、真核生物の発現の調節性の問題を低下させる制限的な宿主範囲を有する。典型的に、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのようなプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルスAcNPVおよびカイコ核多角体病ウイルスBmNPVなどのようなバキュロウイルスならびにヨトウガに由来するSf9、シューダレティアユニプンクタPseudaletiaunipunctaA7SおよびオオカバマダラDpN1などのような昆虫細胞株を含む。高度な発現のために、発現されることとなる分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞において厳密に処理され、発現タンパク質を培地の中に分泌するために使用することができる。さらに、細胞株シューダレティアユニプンクタA7SおよびオオカバマダラDpN1は、哺乳動物細胞株に類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。昆虫細胞における代替発現系は、安定して形質転換された細胞の使用である。Schnieder2S2およびKc細胞キイロショウジョウバエおよびC7細胞ヒトスジシマカなどのような細胞株は、発現に使用することができる。ショウジョウバエメタロチオネインプロモーターは、カドミウムまたは銅を用いる重金属誘発の存在下で高度なレベルの発現を誘発するために使用することができる。発現ベクターは、ネオマイシンおよびヒグロマイシンなどのような選択マーカーの使用によって典型的に維持される。d.哺乳動物細胞哺乳動物発現系は、FIXポリペプチドを発現するために使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのようなウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランなどのような直接的DNA移入によってならびに電気穿孔および微量注射などのような物理的手段によって、哺乳動物細胞に移入することができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列Kozakコンセンサス配列、およびポリアデニル化エレメントを典型的に含む。そのようなベクターは、高度なレベルの発現のための転写プロモーター-エンハンサー、たとえばSV40プロモーター-エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルスCMVプロモーター、およびラウス肉腫ウイルスRSVの長末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター-エンハンサーは、多くの細胞型において活性である。組織プロモーターおよび細胞型プロモーターならびにエンハンサー領域もまた、発現に使用することができる。例示的なプロモーター/エンハンサー領域は、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、アルファフェトプロテイン、アルファ1抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などのような遺伝子に由来するものを含むが、これらに限定されない。選択マーカーは、発現コンストラクトを有する細胞を選択し、維持するために使用することができる。選択マーカー遺伝子の例は、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、およびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。TCR-ζおよびFcεRI-γなどのような細胞表面シグナリング分子を有する融合物は、活性状態にあるタンパク質の、細胞表面上での発現を指示することができる。多くの細胞株は、哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、およびニワトリならびにハムスターの細胞を含む。例示的な細胞株は、BHKつまりBHK-21細胞、293-F、CHO、CHOExpressCHOX;Excellgene、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0非分泌および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株およびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8、およびHKBの細胞を含むが、これらに限定されない。細胞株はまた、分泌タンパク質の細胞培養液からの精製を容易にする無血清培地に適合させて利用可能である。1つのそのような例は、無血清EBNA-1細胞株である[PhametalBiotechnolBioeng8433242]。血漿由来FIXと類似する構造および翻訳後修飾を示す組換えFIXポリペプチドの発現は、当技術分野において知られている。ビタミンK依存性タンパク質発現を最適化するための方法は、知られている。たとえば、培養液におけるビタミンKの補足またはビタミンK依存性γ-カルボキシラーゼの同時発現[WajihetalJBiolChem2803160331607]は、FIXポリペプチドなどのようなビタミンK依存性タンパク質の翻訳後修飾を助けることができる。e.植物トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物は、FIXの発現に使用することができる。発現コンストラクトは、微粒子銃などのような直接的DNA移入およびプロトプラストの中へのPEG媒介性移入を使用してならびにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に典型的に移入される。発現ベクターは、プロモーター配列およびエンハンサー配列、転写終結エレメント、ならびに翻訳制御エレメントを含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技術は、シロイヌナズナおよびタバコなどのような双子葉植物宿主ならびにトウモロコシおよびイネなどのような単子葉植物宿主の間で通常分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびUBQ3プロモーターを含む。ヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどのような選択マーカーは、形質転換細胞の選択および維持を容易にするために使用されることが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体カルス組織として培養において維持することができる、または完全な植物に再生成させることができる。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてFIXを産生するための選定に影響を及ぼし得る。トランスジェニック植物細胞はまた、タンパク質を産生するよう操作された藻類を含むこともできる[たとえばMayfieldetalProcNatlAcadSciUSA100438442を参照されたい]。植物は、哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主においてFIXを産生するための選定に影響を及ぼし得る。2.精製宿主細胞に由来するFIXポリペプチドの精製のための方法は、選定される宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子については、タンパク質は、細胞を除去した後に培養液から一般に精製される。細胞内発現については、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などのようなトランスジェニック生物が、発現に使用される場合、組織または器官は、溶解した細胞抽出物を作製するために出発物質として使用することができる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵におけるポリペプチドの産生を含むことができ、これは、収集することができ、必要であれば、さらに、タンパク質を抽出し、さらに、当技術分野における標準的な方法を使用して精製することができる。FIXは、SDS-PAGE、サイズ分画クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析、キレートクロマトグラフィー、ならびにイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。たとえば、FIXポリペプチドは、下記実施例1において記載されるようなアニオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。FIXポリペプチドを精製するための例示的な方法は、機能的Glaドメインを有する任意のポリペプチドの結合を可能にするイオン置換カラムの使用、その後に続く、カルシウムの存在下における溶出によるものである。アフィニティー精製技術もまた、調製の効率および純度を改善するために使用することができる。たとえば、FIXに結合する抗体、受容体、および他の分子を、アフィニティー精製において使用することができる。発現コンストラクトはまた、mycエピトープ、GST融合物、またはHis6などのようなアフィニティータグを追加するように操作し、タンパク質に対して、それぞれ、myc抗体、グルタチオン樹脂、およびNi-樹脂を用いてアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動技術および染色技術ならびに分光光度計技術を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。FIXポリペプチドは、発現させ、精製して、不活性形態チモーゲン形態とすることができるまたは、代わりに、発現プロテアーゼは、自己触媒などによって活性形態に精製することができる。たとえば、R145およびR180の後のタンパク質分解性の切断を介して活性化されたFIXポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができるつまFIXa;二重鎖形態。FIXポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。FIXポリペプチドの、活性プロテアーゼ形態、FIXaへの切断は、第XIa因子とのインキュベーションによって達成することができる。いくつかの例では、これが、カルシウムおよびリン脂質の存在下において実行される。3.融合タンパク質修飾FIXポリペプチドおよび1つまたは複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質もまた、提供される。適した経路による投与のために製剤されるそのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が、提供される。融合タンパク質は、任意の順番で、修飾FIXポリペプチドならびに抗体またはその断片、成長因子、受容体、リガンド、および他のそのような作用物質などのような作用物質を連結することによって、FIXポリペプチドの精製を容易にする、FIXポリペプチドの薬力学的特性を、たとえば、標的細胞もしくは標的組織にポリペプチドを向けることによって改変する、および/またはFIXポリペプチドの発現もしくは分泌を増加させる目的で、形成される。典型的に、任意のFIX融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較して、96、97、98、99、またはそれ以上の血液凝固活性を含む、非融合FIXポリペプチドと比較して、少なくとも約30、40、50、60、70、80、90、または95の血液凝固活性を保持する。FIXポリペプチドの、他のポリペプチドとの連結は、直接的にまたはリンカーを介して間接的に達成することができる。一例では、連結が、ヘテロ二官能性剤を介するなどのような化学的連結またはチオール連結または他のそのような連結によるものとすることができる。融合はまた、組換え手段によって達成することもできる。他のポリペプチドに対するFIXポリペプチドの融合は、FIXポリペプチドのN-末端またはC-末端に対するものとすることができる。本明細書中で提供されるFIXポリペプチドを有する融合タンパク質において使用することができるポリペプチドの非限定的な例は、たとえば、GSTグルタチオンS-トランスフェラーゼポリペプチド、免疫グロブリンGに由来するFcドメイン、アルブミン、または異種シグナル配列を含む。融合タンパク質は、イーコリマルトース結合タンパク質MBPなどのような、細胞によるタンパク質の取り込みを助ける、さらなる成分を含有することができる国際PCT出願WO01/32711を参照されたい。融合タンパク質は、標準的な組換え技術によって産生することができる。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするDNA断片は、従来の技術に従って、インフレームで、たとえば、ライゲーションのための平滑端または付着端の末端、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適宜、粘着端の補充、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素的ライゲーションを利用することによって、共にライゲーションすることができる。他の実施形態では、融合遺伝子が、自動DNA合成機を含む従来の技術によって合成することができる。代わりに、遺伝子断片のPCR増幅は、2つの連続した遺伝子断片の間の相補的オーバーハングを起こすアンカープライマーを使用して実行することができ、引き続いて、遺伝子断片をアニールし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる[たとえばAusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons1992を参照されたい]。そのうえ、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが、市販で入手可能であるたとえばGSTポリペプチド。FIXコード核酸は、融合部分がインフレームでプロテアーゼタンパク質に連結されるように、そのような発現ベクターの中にクローニングすることができる。4.ポリペプチド修飾修飾FIXポリペプチドは、未修飾もしくは裸のポリペプチド鎖または翻訳後修飾ポリペプチドとして調製することができる。いくつかの適用のために、翻訳後修飾または他の化学的修飾を有していない裸の形態で修飾FIXを調製することは望ましいものとなり得る。裸のポリペプチド鎖は、翻訳後にFIXを修飾しない適した宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、インビトロ系において、化学的ポリペプチド合成を使用して調製することができる。他の適用のために、特定の修飾は、所望されるものとなり得る。特に、本明細書における目的のために、高度にグリコシル化されたFIXポリペプチドを産生するための修飾FIXポリペプチドのグリコシル化は、好ましい。そのようなグリコシル化は、哺乳動物発現系などのような適切な発現系を使用してインビボにおいて、インビトロにおいて[たとえばMikamietalJBiotechnol1276578を参照されたい]、またはたとえば、FIXポリペプチドが原核細胞において発現され、酵素的グリコシル転移を使用してインビトロにおいてさらに修飾されるインビボおよびインビトロ方法の組合せで[たとえばSchwarzetalNatureChemBiol6264266を参照されたい]実行することができる。さらに、ペグ化、アルブミン化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、または他の知られている修飾が、所望され得る。修飾は、インビトロにおいてまたはたとえば、そのような修飾をもたらす、適した宿主において修飾FIXを産生することによってなすことができる。5.ヌクレオチド配列FIXまたは修飾FIXポリペプチドをコードする核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、任意のコードFIXポリペプチドの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体を含む。本明細書において提供される例示的な核酸分子は、配列番号75~272のいずれかにおいて記載されるポリペプチドをコードするいずれかのものなど、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドをコードするいずれかのものである。一実施形態では、本明細書において提供される核酸分子が、少なくとも50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、または99の配列同一性を有するまたは中もしくは高ストリンジェンシーの条件下で、本明細書において提供されるFIXポリペプチドをコードする完全長の任意の核酸の少なくとも70に沿ってハイブリダイズする。たとえば、本明細書において提供される核酸分子は、配列番号1において記載される核酸配列に対して、少なくともまたは少なくとも約50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、または99の配列同一性を有する。他の実施形態では、核酸分子が、本明細書において提供されるFIXポリペプチドのいずれかをコードする縮重コドン配列を有するものを含むことができる。F.修飾FIXポリペプチド活性の評価FIXポリペプチドの活性および特性は、インビトロにおいておよび/またはインビボにおいて評価することができる。そのような評価のためのアッセイは、当業者らに知られており、試験された活性および結果を、治療活性およびインビボ活性と相互に関連されることが知られている。一例では、FIX変異体が、未修飾FIXおよび/または野生型FIXと比較して、評価することができる。そのようなアッセイは、FVIIIa、リン脂質、および/またはカルシウムの存在下または非存在下において実行することができる。インビトロアッセイは、たとえば、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、および分子生物学アッセイを含む、細胞ベースのアッセイなどのような、当業者に知られている任意の検査アッセイを含む。インビボアッセイは、動物モデルにおけるFIXアッセイおよびヒトに対する投与を含む。いくつかの場合において、FIXポリペプチドの活性は、アッセイ決定因子に対して、血液、血清、または他の体液を評価することによってインビボにおいて決定することができる。本明細書において提供されるものなどのようなFIX変異体もまた、治療効果などのような活性または特性を評価するためにインビボにおいて試験することができる。典型的に、本明細書において記載されるアッセイは、FIXの二重鎖活性化形態、つまりFIXaに関してのものである。R145およびR180の後のタンパク質分解性の切断を介して活性化されたFIXポリペプチドは、インビトロにおいて調製することができる。FIXポリペプチドは、最初に、哺乳動物細胞における産生、その後に続く精製を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される産生の方法のいずれかによって調製することができる。FIXポリペプチドの、FIXの活性プロテアーゼ形態への切断は、活性化第XI因子FXIaとのインキュベーションによって達成することができる。活性化ポリペプチドは、本明細書において記載される、FIX活性を測定するためのアッセイのいずれかにおいて使用することができる。そのようなアッセイはまた、単鎖チモーゲン形態を用いる実行することもできる。たとえば、単鎖チモーゲンFIXポリペプチドは、そのような形態が、典型的に、FIXの血液凝固活性に必要とされるタンパク質分解活性または触媒活性を示さないので、陰性対照を提供することができる。さらに、そのようなアッセイはまた、FIXの活性を増大することができる、FVIIIaなどのような補因子ならびにリン脂質および/またはカルシウムなどのような他の分子の存在下において実行することができる。1.インビトロアッセイ例示的なインビトロアッセイは、ポリペプチド修飾および活性を評価するためのアッセイを含む。修飾は、当技術分野において知られている、グリコシル化、γ-カルボキシル化、および他の翻訳後修飾を評価するインビトロアッセイ、タンパク質アッセイ、ならびにコンホメーションアッセイを使用して評価することができる。活性についてのアッセイは、FVIIIaおよび第X因子などのような他の凝固因子とのFIX相互作用の測定、FIXポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリンおよび他のリン脂質に対するFIXポリペプチドの結合性および/または親和性を決定するためのアッセイ、ならびに凝固に対するFIXポリペプチドの効果を決定するための細胞ベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。修飾FIXポリペプチドの濃度は、酵素連結免疫吸着アッセイELISA、SDS-PAGE;Bradford法、Lowry法、BCA法;UV吸光度、ならびにこれらに限定されないが、免疫学的方法、放射性の方法、蛍光性の方法、および関連する方法などのような他の定量化可能なタンパク質ラベル法を含むが、これらに限定されない、当技術分野においてよく知られている方法によって評価することができる。FIXポリペプチドの切断またはFIXプロテアーゼ活性によって産生される産物を含む、タンパク質分解反応の切断産物の評価は、発色基質切断、HPLC、SDS-PAGE分析、ELISA、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的検査、免疫沈降、NH2-末端配列決定、蛍光、およびタンパク質ラベル化を含むが、これらに限定されない方法を使用して実行することができる。修飾FIXポリペプチドの構造的特性もまた、評価することができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドのX線結晶解析、核磁気共鳴NMR、および低温電子顕微鏡cryo-EMは、FIXポリペプチドの3次元構造および/またはCa2結合性もしくは補因子結合性などのようなFIXポリペプチドの他の特性を評価するために実行することができる。さらに、FIX分解の存在および程度は、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEおよび電気泳動にかけられたFIX含有試料のウェスタンブロッティングなどのような標準的な技術によって測定することができる。プロテアーゼに暴露されたFIXポリペプチドはまた、修飾FIXポリペプチドの切断部位の場所または変化を決定するためにN-末端配列決定にかけることもできる。a.グリコシル化FIXポリペプチドは、当技術分野においてよく知られている方法を使用して、グリコシル化の存在について評価することができる。ポリペプチドのグリコシル化は、高pHアニオン交換クロマトグラフィー[TownsendetalGlycobiology1139147]または蛍光体支援炭水化物電気泳動FACE[KumaretalBiotechnolApplBiochem24207214]、連続的なエキソグリコシダーゼ消化[WatzlawicketalBiochemistry311219812203TyagarajanetalGlycobiology68393]、質量分析[GilleceCastroetalMethEnzymol193689712DuffinetalAnalChem6414401448PapacetalinTechniquesinGlycobiologyMarcelDeckerIncNewYorkpp3352FuetalCarbohydrRes261173186]、およびNMR[FuetalCarbohydrRes261173186]などのような種々様々の方法を使用して、その酵素的にまたは化学的に放出された炭水化物プールから特徴づけることができる。たとえば、化学的放出は、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって、糖タンパク質からN結合型グリカンおよびO結合型グリカンを放出するヒドラジン分解によって達成することができる。酵素的放出は、エンドグリコシダーゼであるペプチドN-グリコシダーゼFPNGaseFによって達成することができ、これは、もともとグリコシル化されているAsn残基をAspに加水分解しながら、ポリペプチドから、もとのままのほとんどの共通のN結合型炭水化物を取り出す。FIXポリペプチドのヒドラジン分解処置またはエンドグリコシダーゼ処置は、蛍光体ラベルまたは発色団ラベルを用いてタグを付けることができる還元末端を生成する。ラベルFIXポリペプチドは、蛍光体支援炭水化物電気泳動FACEによって分析することができる。グリカンに対する蛍光性タグはまた、HPLCによる単糖分析、複雑なグリコシル化パターンのプロファイリングまたはフィンガープリンティングに使用することもできる。例示的なHPLC方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む。例示的なグリカンプローブは、3-アセチルアミノ-6-アミノアクリジンAA-Acおよび2-アミノ安息香酸2-AAを含むが、これらに限定されない。炭水化物部分はまた、グリコシル化FIXポリペプチドを認識する特異的な抗体の使用を通して検出することができる。ある方法では、質量分析は、部位特異的な炭水化物異質性を評価するために使用される。これは、収集されたHPLC画分のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法質量分析[SuttonetalAnalBiochem2183446PlougetalJBiolChem2731393313943]またはエレクトロスプレーイオン化質量分析と直接的に接続された逆相HPLCLC/ESIMS[たとえばHuddlestonetalAnalChem65877884MedzihradskyetalMethodsMolBiol446293316を参照されたい]を含むことができる。一例では、Asn-X-Ser/Thr/Cysモチーフ内のアスパラギン残基などのような潜在的なN-グリコシル化部位でのグリコシル化が、LC/ESIMSによって評価される。FIXポリペプチドにおける潜在的なN-グリコシル化部位は、同定することができ、個々のペプチド上のこれらの部位を分離するタンパク質分解酵素を、選択することができる。次いで、消化混合物は、衝突活性化によって診断上の炭水化物イオンを生成する方法であるLC/ESIMSによって分析される33。たとえば、診断上の炭水化物イオンは、m/z204、274、および292、366、ならびに657に特徴的な非還元末端オキソニウムイオンを含み、これらは、それぞれ、N-アセチルヘキソサミン、ノイラミンシアル酸、ヘキソシル-N-アセチルヘキソサミン、およびシアリル-ヘキソシル-Nアセチルヘキソサミンの存在を示す。選択的なイオンモニタリングSIMによるこれらのイオンの存在の同定に加えて、LC/ESIMS方法はまた、分子量をも評価するためにペプチドを分析し、これは、どのペプチド、そのため、どの潜在的N-グリコシル化部位が炭水化物を含有するかを示すために使用することができる。b.他の翻訳後修飾FIXポリペプチドは、グリコシル化以外の翻訳後修飾の存在について評価することができる。そのようなアッセイは、当技術分野において知られており、ヒドロキシル化、硫酸化、リン酸化、およびカルボキシル化を測定するためのアッセイを含む。β-ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ性加水分解にかけられたFIXポリペプチドの逆相HPLC分析を含む[PrzysieckietalPNAS8478567860]。FIXポリペプチドのカルボキシル化およびγ-カルボキシル化は、他のビタミンK依存性ポリペプチドについて記載されるように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型MALDI-TOF分析を用いるマススペクトロメトリーを使用して評価することができる[たとえばHarveyetalJBiolChem27883638369MaunetalProtSci1411711180を参照されたい]。プロペプチドプロFIXを含有するFIXポリペプチドの、翻訳後γ-カルボキシレート修飾を担うカルボキシラーゼとの相互作用もまた、評価することができる。カルボキシラーゼの、フルオレセインラベルプロFIXポリペプチドとのインキュベーションの後の解離定数Kdは、異方性によって結合カルボキシラーゼの量を決定することによって測定することができる[LinetalJBiolChem27965606566]。カルボキシル化を測定するための他の例示的なアッセイは、アルカリ性加水分解にかけられたFIXポリペプチドの逆相HPLC分析を含む[PrzysieckietalPNAS8478567860]。リン酸化を測定するための例示的なアッセイは、ホスホセリンおよび/もしくはホスホチロシンアミノ酸残基に対するまたはセリンリン酸化FIXポリペプチドに対するリン酸化部位特異的抗体の使用を含む。FIXポリペプチドを産生する細胞の32Pの代謝ラベル化もまた、リン酸化を評価するために使用することができ、ラベルFIXポリペプチドは、精製し、放射性ホスフェートの組み込みについて分析することができる。チロシン硫酸化のための例示的なアッセイは、FIXポリペプチドを産生する細胞の35Sラベル化を含む。そのような方法において、細胞は、35S-S2SO4または35Sメチオニンとインキュベートされ、35Sの組み込みは、35Sメチオニン試料に対する標準化によって決定される。c.タンパク質分解活性修飾FIXポリペプチドは、合成基質およびその天然基質、第X因子の両方に対するタンパク質分解活性について試験することができる。修飾FIXポリペプチドFIXaの活性化形態は、アッセイにおいて典型的に使用される。CH3SO2-LGR-pNAペプチドなどのような合成基質を使用するアッセイは、FIXaポリペプチドの酵素的切断活性を測定するために用いることができる。FIXaの存在下におけるCH3SO2-LGR-pNAの加水分解は、切断反応試料からのp-ニトロアニリンpNAの産生を評価することによって測定することができる。試料におけるpNAの量は、405nmでの試料の吸光度に比例し、したがって、FIXa試料におけるタンパク質分解活性の程度を示す。FIXa切断活性を評価するために使用することができるさらなる例示的な蛍光発生基質は、Mes-D-CHD-Gly-Arg-AMCPefafluorFIXa10148およびH-D-Leu-PHG-Arg-AMCPefafluorFIXa3688を含むが、これらに限定されず、切断は、AMCおよび蛍光発生エステル基質、4-メチルウンベリフェリルp’-グアニジノベンゾエートMUGBの放出によって評価され、切断は、4-メチルウンベリフェロン蛍光体4-MUの放出によって評価されるたとえば実施例3を参照されたい。エチレングリコールなどのようなFIXa触媒活性を増強する分子は、そのようなアッセイにおいて用いることができる[SturzebecheretalFEBSLett295300]。FIXaのタンパク質分解活性はまた、下記実施例4において記載されるように、活性化第X因子FXaへの第X因子FXの変換を測定することによって評価することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドを含むFIXaポリペプチドは、FVIIIa、リン脂質小胞ホスファチジルセリンおよび/またはホスファチジルコリン、ならびにCa2の存在下において、FXポリペプチドとインキュベートすることができ、FXaを産生するためのFXの切断は、SpectrafluorFXaCH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMCなどのような蛍光発生基質またはS2222もしくはS2765ChromogenicsAB、Molndal、Swedenなどのような発色基質を使用してアッセイすることができ、これらは、FXaによって特異的に切断される。d.凝固活性FIXポリペプチドは、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用することによって凝固活性について試験することができる。たとえば、アッセイのいくつかは、2ステージ凝血アッセイ[LiebmanetalPNAS8238793883];プロトロンビン時間アッセイPT、これは、外因性経路におけるFIXaのTF依存性活性を測定することができる;PT試験の改良であるアッセイ;活性化部分トロンボプラスチン時間aPTT、これは、FIXaのTF非依存性活性を測定することができる;活性化凝血時間ACT;再石灰化活性化凝血時間;リー-ホワイト凝血時間;またはトロンボエラストグラフィーTEG[PusaterietalCriticalCare9S15S24]を含むが、これらに限定されない。たとえば、修飾FIXポリペプチドの凝固活性は、PTベースのアッセイによって決定することができ、FIXは、FIX欠損血漿において希釈され、DadeBehringからのInnovin商標として入手可能なものなどのようなプロトロンビン時間試薬リン脂質およびカルシウムを有する組換えTFと混合される。血餅形成は、光学的に検出され、血餅までの時間は、決定され、FIX欠損血漿のみに対して比較される。下記に記載されるものなどのような動物モデルにおけるインビボ凝固アッセイもまた、FIXポリペプチドの凝固活性を評価するために実行することができる。e.他のタンパク質および分子への結合および/またはそれによる阻害阻害アッセイは、たとえばアンチトロンビンIIIAT-III、ヘパリン、AT-III/ヘパリン複合体、p-アミノベンズアミジン、セリンプロテアーゼ阻害因子、およびFIX特異的抗体などのようなFIX阻害因子に対する修飾FIXポリペプチドの抵抗性を測定するために使用することができる。他の阻害因子についての阻害の評価もまた、試験することができ、他のセリンプロテアーゼ阻害因子を含むが、これらに限定されない。阻害は、FVIIIaありおよび/またはなしでプレインキュベートされたFIXポリペプチドとの阻害因子のインキュベーションによって評価することができる。次いで、FIXの活性は、上記に記載される、任意の1つまたは複数の活性アッセイまたは凝固アッセイを使用して測定することができ、阻害因子による阻害は、阻害因子とインキュベートされなかったFIXポリペプチドの活性との、阻害因子とインキュベートされたFIXポリペプチドの活性の比較によって評価することができる。たとえば、AT-III/ヘパリンによる修飾FIXポリペプチドの阻害は、実施例5において記載されるように評価することができる。AT-III/ヘパリン複合体による野生型FIXaまたはFIXa変異体の阻害は、FIXaとAT-III/ヘパリンをインキュベートし、小分子基質、メシル-D-CHG-Gly-Arg-AMCPefafluorFIXa;Pentapharmに対するFIXaの触媒活性を測定することによって評価される。そのようなアッセイは、FVIIIaの存在下または非存在下において実行することができる。FIXポリペプチドは、他の凝固因子および阻害因子に対する結合について試験することができる。たとえば、FVIIIaなどのような補因子、FXおよびFIXなどのような基質、ならびにアンチトロンビンIIIおよびヘパリンなどのような阻害因子とのFIXの直接的なおよび間接的な相互作用は、免疫沈降、カラム精製、非還元SDS-PAGE、BIAcore登録商標アッセイ、表面プラズモン共鳴SPR、蛍光共鳴エネルギー転移FRET、蛍光偏光FP、等温滴定熱量測定ITC、円二色性CD、タンパク質断片補足性アッセイPCA、核磁気共鳴NMR分光法、光散乱、沈降平衡、小ゾーンゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル遅延、ファーウェスタンブロッティング、蛍光偏光、ヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリント、ファージディスプレー、および様々な2-ハイブリッド系を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている任意の結合アッセイを使用して評価することができる。e.リン脂質親和性ホスファチジルセリンPSおよび他のリン脂質に対する修飾FIXポリペプチドの結合性および/または親和性は、当技術分野においてよく知られているアッセイを使用して決定することができる。高度に純粋なリン脂質たとえば既知濃度のウシPSおよび卵ホスファチジルコリンPCこれは、Sigmaなどから入手可能であるは、有機溶媒において、小さな単層リン脂質小胞を調製するために使用することができる。これらのPS/PC小胞へのFIXポリペプチドの結合は、入射光に対する90°での相対的な光散乱によって決定することができる。PS/PC単独でのおよびPS/PC/FIXでの光散乱の強度は、解離定数を決定するために測定される[HarveyetalJBiolChem27883638369]。BIAcoreバイオセンサー機器でなどのような表面プラズマ共鳴もまた、リン脂質膜に対するFIXポリペプチドの親和性を測定するために使用することができる[SunetalBlood10122772284]。2.非ヒト動物モデル非ヒト動物モデルは、修飾FIXポリペプチドの活性および安定性を評価するために使用することができる。たとえば、非ヒト動物は、疾患または状態についてのモデルとして使用することができる。非ヒト動物は、疾患進行に対する効果をモニターするために、FIX変異体の投与の前に、疾患および/または表現型誘導物質を注射することができる。遺伝モデルもまた、有用である。1つまたは複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、またはノックアウトによって疾患または状態を模倣するマウスなどのような動物は、生成することができる。そのような動物は、当技術分野においてよく知られているトランスジェニック動物産生技術または天然に存在する突然変異株もしくは誘発突然変異株を使用することによって生成することができる。FIXと関連する疾患の有用な非ヒト動物モデルの例は、出血障害、特に血友病のモデルを含むが、これらに限定されない。これらの非ヒト動物モデルは、野生型FIXポリペプチドと比較して、FIX変異体の活性をモニターするために使用することができる。動物モデルはまた、修飾FIXポリペプチドの安定性、半減期、クリアランス、ならびに他の薬物動態学的および薬力学的特性をモニターするために使用することもできる。そのようなアッセイは、修飾FIXポリペプチドを比較するのにならびにさらなる非ヒト動物試験およびヒト試験のための用量および用量レジメンを計算するのに有用である。たとえば修飾FIXポリペプチドは、マウスの尾部静脈の中に注射することができる。次いで、血液試料は、注射の後の時点で採取され数分、数時間、および数日後など、次いで、修飾FIXポリペプチドの薬物動態学的および薬力学的特性は、ELISAまたはラジオイムノアッセイによって、FIXa活性およびタンパク質濃度について特定の時点で血清または血漿をモニターすることなどによって評価されるたとえば実施例6を参照されたい。血液試料はまた、aPTTアッセイなどのような方法において凝固活性について試験することができるたとえば実施例6を参照されたい。修飾FIXポリペプチドは、血友病のための動物モデルを使用して、治療有効性について試験することができる。非限定的な一例では、マウスなどのような動物モデルを、使用することができる。血友病のマウスモデルは、当技術分野において入手可能であり、FIX欠損マウス実施例7において利用されるものなどおよび突然変異体FIXポリペプチドを発現するマウスを含み、修飾FIXポリペプチドを試験するために用いることができる[WangetalPNAS941156311566LinetalBlood9039623966KunduetalBlood92168174SabatinoetalBlood10427672774およびJinetalBlood10417331739;実施例7もまた、参照されたい]。FIX欠乏症の他のモデルは、欠陥FIXを発現するまたは肝臓が切除された血友病のイヌを含む[EvansetalPNAS8610095MauseretalBlood883451andKayetalPNAS9123532357]。3.臨床アッセイ多くのアッセイは、臨床的使用のためのFIXの活性を評価するのに利用可能である。そのようなアッセイは、インビボにおける凝固、タンパク質安定性、および半減期の評価ならびに表現型アッセイを含むことができる。表現型アッセイおよびFIX処置の治療効果を評価するためのアッセイは、FIXの血中レベルの評価[たとえば、肥満度指数BMIについて修正するための、投与前のならびに第1の投与の後、最後の投与直後、および中間の時点を含む投与の後の時点の血清FIXの測定]、未修飾FIXおよび/もしくは野生型FIXまたは偽薬を用いて処置される対象と比較した、長い間にわたる症状の回復を含む、FVII処置に対する表現型の応答を含む。FIX活性を評価するための臨床アッセイの例は、FranchinietalThrombHaemost9310271035ShapiroetalBlood105518525およびWhiteetalThrombHaemost78261265などにおいて見出すことができる。患者は、ルーチン的な投与もしくは反復投与のためのある期間にわたりまたは出血、外傷、もしくは手術手技などのような急性事象に応じた投与の後に定期的にモニターすることができる。G.製剤および投与出血障害の処置における使用のための組成物は、本明細書において提供される。そのような組成物は、治療有効量の本明細書において記載される第IX因子ポリペプチドを含有する。有効濃度のFIXポリペプチドまたは薬学的に許容可能なその誘導体は、全身投与、局所投与、または局所的投与のための適した医薬担体または医薬媒体と混合される。化合物は、選択される障害の処置に有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排泄率、投薬スケジュール、および投与される量ならびに当業者に知られている他の因子に依存するであろう。本明細書において提供される化合物の投与に適した医薬担体または医薬媒体は、当業者らに知られている任意のそのような担体を含み、投与の特定のモードに適したものとなる。治療有効量の本明細書において記載されるFIXポリペプチドを含む医薬組成物は、投与の直前に、滅菌水などを用いて再構成される凍結乾燥粉末として提供することができる。1.製剤修飾FIXを含有する医薬組成物は、選択される量のポリペプチドを、1つまたは複数の生理学的に許容可能な担体または賦形剤と混合することによって、任意の従来の様式において製剤することができる。担体または賦形剤の選択は、投与する医者の技術の範囲内にあり、多くのパラメーターに依存し得る。これらは、たとえば、投与のモードすなわち、全身、経口、経鼻、経肺、局所的、局所、または任意の他のモードおよび処置される障害を含む。本明細書において提供される医薬組成物は、単一投薬量直接的投与のためにまたは希釈もしくは他の修飾のために製剤することができる。製剤における化合物の濃度は、意図される処置に有効な、投与の際の量のデリバリーに有効である。典型的に、組成物は、単一投薬量の投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物またはその混合物の重量分率は、処置される状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の場合には混合される。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、二重鎖FIXaタンパク質として対象に対する投与のために製剤することができる。修飾FIXポリペプチドは、製剤前に、当技術分野において知られている任意の方法によって活性化することができる。たとえば、FIXは、ビーズ上に固定されたFXIaなどのようなFXIaとのインキュベーションによって活性化することができる。カルシウムは、修飾FIXaタンパク質の完全な活性化および正確な折り畳みを保証するためにこれらのプロセス中に含むことができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、単鎖タンパク質として投与のために製剤することもできる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、単鎖形態および二重鎖形態が、自己活性化を排除するまたは制御するために、培地の適切な選択によって、任意の比において医薬組成物において含有されるように、製剤することができる。化合物は、微粒子化された形態もしくは他の適した形態で懸濁させることができるまたはより可溶性の活性産物を産生するために誘導体化することができる。結果として生じる混合物の形態は、投与の意図されるモードおよび選択される担体または媒体における化合物の溶解性を含む、多くの因子に依存する。結果として生じる混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液、および他のそのような混合物であり、非水性または水性の混合物、クリーム、ゲル、軟膏剤、乳剤、液剤、エリキシル剤、ローション、懸濁剤、チンキ剤、ペースト、泡、エアロゾル、灌注剤、スプレー剤、坐剤、包帯、または全身投与、局所投与、もしくは局所的投与に適している任意の他の製剤として製剤することができる。筋肉内投与、非経口投与、または関節内投与などのような局所的内部投与については、ポリペプチドは、等張緩衝生理食塩水などのような水性ベースの培地において溶液懸濁剤として製剤することができるまたは内部投与のために意図される生体適合性支持体もしくは生体接着性のものと組み合わせられる。有効濃度は、標的とされる状態を回復させるのに十分であり、経験的に決定することができる。組成物を製剤するために、化合物の重量分率は、標的とされる状態が軽減するまたは回復するような有効濃度で、選択される媒体において溶解される、懸濁される、分散される、または他の場合には混合される。一般に、薬学的に許容可能な組成物は、規制当局に対する承認を考慮して調製され、他のものは、動物およびヒトにおける使用のための、一般に承認される薬局方に従って調製される。医薬組成物は、アイソフォームが共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体などのような担体を含むことができる。そのような医薬担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などのような、石油起源、動物起源、野菜起源、または合成起源のものを含む、水および油などのような、滅菌した液体とすることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水は、典型的な担体となる。食塩水ならびに水性デキストロース溶液および水性グリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体として利用することができる。組成物は、有効成分と共に、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどのような希釈剤;ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および滑石などのような滑沢剤;ならびにデンプン、アラビアゴムなどのような天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者らに知られている他のそのような結合剤などのような結合剤を含有することができる。適した医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールを含む。組成物はまた、望ましい場合、少数の量の湿潤剤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤、たとえばアセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレアート、および他のそのような作用物質を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤の形態をとることができる。治療化合物およびラクトースまたはデンプンなどのような、適した粉末ベースの粉末ミックスを含有する、たとえば、吸入器または注入器における使用のためのゼラチンのカプセル剤およびカートリッジは、製剤することができる。組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどのような担体と共に坐剤として製剤することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他のそのような作用物質などのような、標準的な担体を含むことができる。経口投与のための調製物もまた、ボーマン-バーク阻害因子、コンジュゲーションボーマン-バーク阻害因子、アプロチニン、およびカモスタットなどのようなプロテアーゼ阻害因子と共に適切に製剤することができる。適した医薬担体の例は、EWMartinによるRemington’sPharmaceuticalSciencesにおいて記載される。そのような組成物は、対象または患者への適切な投与のための形態を提供するために、適した量の担体と共に、一般に精製形態において、治療有効量の化合物を含有するであろう。製剤は、投与のモードに適するはずである。たとえば、修飾FIXは、注射によるたとえばボーラス注射または継続注入による非経口投与のために製剤することができる。注射可能な組成物は、油性媒体または水性媒体において、懸濁剤、液剤、または乳剤としてそのような形態をとることができる。滅菌した注射可能な調製物はまた、たとえば1,4-ブタンジオールにおける液剤として、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶剤における、滅菌した注射可能な液剤または懸濁剤とすることができる。滅菌した不揮発性油は、溶剤または懸濁媒として慣習的に利用される。この目的のために、合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリド、脂肪酸オレイン酸を含む、ゴマ油、やし油、落花生油、綿実油、および他の油のような天然に存在する植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪性媒体を含むが、これらに限定されない任意の無刺激の不揮発性油を、利用することができる。緩衝液、保存剤、酸化防止剤、および適した成分は、必要に応じて組み込むことができるまたはその代わりに、製剤を含むことができる。ポリペプチドは、組成物におけるただ一つの薬学的に活性な成分として製剤することができる、または他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体などのような標的作用物質へのコンジュゲーションなどによって、デリバリーのために標的にすることができる。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容可能な担体として適し得る。これらは、当業者らに知られている方法に従って調製することができる。たとえば、リポソーム製剤は、米国特許第4,522,811号において記載されるように調製することができる。リポソームデリバリーはまた、徐放性製剤を含むこともでき、フィブロネクチンを用いて修飾される、コラーゲンゲルおよびリポソームなどのような医薬マトリックスを含む[たとえばWeineretalJPharmSci749225を参照されたい]。本明細書において提供される組成物は、これらに限定されないが、不活性担体またはコロイド分散系などのような、デリバリーを容易にする1つまたは複数のアジュバントをさらに含有することができる。そのような不活性担体の代表的で非限定的な例は、水、イソプロピルアルコール、ガス状フルオロカーボン、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル産生物質、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、ソルビタンモノオレアート、メチルセルロース、およびその2つまたはそれ以上の適した組合せから選択することができる。活性化合物は、処置される対象に対して望ましくない副作用の非存在下において、薬学的に許容可能な担体において、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。治療有効濃度は、本明細書において提供されるアッセイなどのような知られているインビトロ系およびインビボ系において化合物を試験することによって経験的に決定することができる。a.投薬量投与される治療剤の正確な量または用量は、特定のFIXポリペプチド、投与の経路、ならびにその疾患の重症度ならびに対象の体重および全身状態などのような他の考慮に依存する。治療剤の局所的濃度が、いくつかの場合において、全身投与に際して安全性を伴って達成することができるものよりも、局所的投与の後に、高いものとなり得るが、治療剤の局所的投与は、典型的に、全身投与のあらゆるモードよりも低い用量を必要とするであろう。必要であれば、特定の投薬量および持続時間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、組換えFIXポリペプチドおよび天然FIXポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。たとえば、rFIXaに活性化された組換えFIXrFIXaポリペプチド、BeneFIX登録商標第IX因子は、様々な用量で、出血の処置のためにならびに予防的および手術背景において、血友病Bを有する患者に投与されてきた。組換えFIXを用いる処置の投薬量および持続時間は、第IX因子欠乏症の重症度、出血の位置および程度、ならびに患者の臨床状態、年齢、および第IX因子の回収率に依存する。たとえば重症の血友病Bを有する患者<1IU/dLのFIX活性;正常活性の11IUは、1mLの正常なプールされた血漿における第IX因子の活性に相当するは、中程度の1~5IU/dLのFIX活性;正常活性の1~5または軽度の>5~<40IU/mLのFIX活性;正常活性の>5~<40血友病Bを有する患者よりも、FIXの注入をより必要とするであろう。BeneFIX登録商標第IX因子の初回推定用量は、以下の式を使用して決定することができる:必要とされる単位=体重kg×所望される第IX因子の増加正常のIU/dLまたは×観察される回収率の逆数IU/dL当たりのIU/kg。成人および小児<15歳患者による臨床研究において、1キログラムの体重当たりのBeneFIXの1IUは、第IX因子の循環活性を以下のように増加させた:成人:0.8±0.2IU/dL[範囲0.4~1.2IU/dL];小児:0.7±0.3IU/dL[範囲0.2~2.1IU/dL]。したがって、成人患者については:必要とされる第IX因子IUの数IU=体重kg×所望される第IX因子の増加またはIU/dL×1.3IU/dL当たりのIU/kgおよび小児患者については:必要とされる第IX因子IUの数IU=体重kg×所望される第IX因子の増加またはIU/dL×1.4IU/dL当たりのIU/kg。表11は、様々な出血エピソードのために使用される典型的な投薬を記載する。表11本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、天然組換えFIXと比較して、低下した投薬量および/または低下した頻度で有効となり得る。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、24時間、36時間、48時間、60時間、またはそれ以上などのような、それほど頻繁でない投薬間隔で投与することができる。他の例では、より少ない用量の修飾FIXポリペプチドを投与することができる。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、凝固を達成するために一度だけ投与することができる。いくつかの実施形態では、修飾FIXの投薬量が、天然FIXと比較して低下する。たとえば、投薬量は、1IU/kg、2IU/kg、3IU/kg、4IU/kg、5IU/kg、6IU/kg、7IU/kg、8IU/kg、9IU/kg、10IU/kg、20IU/kg、30IU/kg、40IU/kgもしくは50IU/kg、60IU/kg、70IU/kg、80IU/kg、90IU/kg、または100IU/kg未満またはそれくらいとすることができる。処置の用量、持続時間、および注射の間の間隔は、出血の重症度および処置に対する患者の応答に応じて変わるであろう、また、適宜、調整することができる。未修飾FIXと比較した、修飾FIXの活性のレベルおよび半減期などのような因子は、投薬量の決定をなす場合、考慮に入れることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。たとえば、未修飾FIXポリペプチドよりも長い半減期を示す修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドよりも低い用量および/または低い頻度で投与することができる。同様に、未修飾FIXポリペプチドと比較して、増加した血液凝固活性を示す修飾FIXポリペプチドを使用する、治療効果に必要とされる投薬量は、頻度および量を低下させることができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に当業者によって決定することができる。b.剤形医薬品の治療的に活性な化合物およびその誘導体は、典型的に、単位剤形または複数回の剤形で製剤され、投与される。製剤は、適した量の化合物または薬学的に許容可能なその誘導体を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒、滅菌した非経口液剤または非経口懸濁剤、経口液剤または懸濁剤、および油水乳剤を含むが、これらに限定されない剤形で、ヒトおよび動物に対する投与のために提供することができる。それぞれの単位用量は、必要とされる医薬担体、医薬媒体、または医薬希釈剤と関連して、望ましい治療効果をもたらすのに十分な所定の量の治療的に活性な化合物を含有する。単位用量形態の例は、アンプルおよびシリンジならびに個々に包装される錠剤またはカプセル剤を含む。いくつかの例では、単位用量が、投与前に再構成される凍結乾燥散剤として提供される。たとえば、FIXポリペプチドは、注射のための単一用量液剤を生成するために、適した液剤を用いて再構成される凍結乾燥散剤として提供することができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥散剤が、滅菌蒸留水を用いる再構成によって、緩衝液または食塩水におけるFIXポリペプチドをもたらすように、FIXポリペプチドおよび塩などのような、さらなる構成成分を含有することができる。単位用量形態は、分割してまたはそれを複数にして投与することができる。複数用量形態は、分離した単位用量形態で投与されるように、単一の容器中に包装される複数の同一単位剤形である。複数用量形態の例は、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数用量形態は、包装において分離されない複数の単位用量である。2.修飾FIXポリペプチドの投与本明細書において提供されるFIXポリペプチドつまり活性化合物は、体液または他の組織試料などのような混合物をFIXポリペプチドと接触させることによって、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて投与することができる。たとえば、エクスビボにおいて化合物を投与する場合、対象からの体液または組織試料は、たとえばバイパス機械におけるチューブまたはフィルターなどのようなチューブまたはフィルター上にコーティングされているFIXポリペプチドと接触させることができる。インビボにおいて投与される場合、活性化合物は、液体形態、半液体形態、または固体形態において、任意の適切な経路によって、たとえば経口的に、経鼻的に、経肺で、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下に、関節内に、槽内に眼内に、脳室内に、鞘内に、筋肉内に、腹腔内に、気管内に、または局所におよびその任意の2つまたはそれ以上の任意の組合せによって、投与することができ、投与のそれぞれの経路に適した様式において製剤される。修飾FIXポリペプチドは、1回または2回、3回、4回、もしくは治療効果を達成するために必要とされる任意の回数などのように、1回よりも多く投与することができる。複数回の投与は、任意の経路または経路の組合せを介して達成することができ、1時間ごと、2時間ごと、3時間ごと、4時間ごとに、またはそれ以上で投与することができる。投与に最も適した経路は、処置されることとなる疾患状態、たとえば出血障害の場所に依存して変わるであろう。一般に、FIXポリペプチドは、約2~5分間の投与注入時間と共に、静脈内ボーラス注射によって投与されるであろう。他の例では、FIXの望ましい血液レベルが、血漿レベルによって確かめられるように、活性剤の継続注入によって維持することができる。主治医は、毒性または骨髄、肝臓、もしくは腎臓の機能障害により、投薬量を下げるために、どのようにかついつ療法を終了させる、中断する、調整するかを知っているであろうということに留意されたい。反対に、主治医はまた、臨床応答が適当でない場合に、どのようにかついつ処置をより高度なレベルに調整するかをも知っているであろう有毒な副作用防止する。他の例では、出血障害の場所が、FIX製剤が代替経路を介して投与されることを示してもよい。たとえば、脳の中へのたとえば脳室内投与を含む局所的投与は、患者がこの領域における出血を経験している場合、実行されてもよい。同様に、関節における出血の処置のために、関節への治療剤の注射による局所的投与つまり関節内手段、静脈内手段、または皮下手段を利用することができる。他の例では、たとえば、クリーム、ゲル、もしくは軟膏剤として製剤された、皮膚への治療剤の局所投与または吸入によるまたは気管内の肺への投与が、出血がこれらのエリアに局在化している場合、適切であってもよい。修飾FIXポリペプチドが、デポー調製物として製剤される場合、長時間作用性製剤は、植え込みたとえば皮下にもしくは筋肉内にまたは筋肉内注射によって投与することができる。したがって、たとえば、治療化合物は、適したポリマー物質もしくは疎水性物質たとえば許容可能な油中の乳剤としてまたはイオン置換樹脂と共にまたはわずかに可溶性の誘導体として、たとえばわずかに可溶性の塩として製剤することができる。組成物は、所望の場合、活性成分を含有する1つまたは複数の単位剤形を含有することができる包装、キット、またはディスペンサーデバイスにおいて提供することができる。包装は、たとえば、ブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付することができる。活性剤を含有する組成物は、包装材料、本明細書において提供される作用物質、および作用物質が提供される障害を示すラベルを含有する製品として包装することができる。3.修飾FIXポリペプチドをコードする核酸の投与遺伝子療法修飾FIXポリペプチドをコードする核酸分子および遺伝子療法に適したそれらをコードする発現ベクターの組成物もまた、提供される。タンパク質を送達するのではなく、全身的にもしくは他の経路などによりインビボにおいてまたはリンパ球を含む細胞の除去、その中への核酸の導入、および宿主もしくは適合性のあるレシピエントへの再導入などによりエクスビボにおいて核酸を投与することができる。修飾FIXポリペプチドは、核酸分子の発現によって細胞および組織に送達することができる。修飾FIXポリペプチドは、修飾FIXポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができ、エクスビボ技術および直接的インビボ発現を含む。核酸は、当業者らに知られている任意の方法によって細胞および組織に送達することができる。単離核酸配列は、さらなる操作のためにベクターの中に組み込むことができる。本明細書において使用されるように、ベクターまたはプラスミドは、その発現または複製のいずれかのために細胞の中に異種DNAを導入するために使用される別個のエレメントを指す。そのような媒体の選択および使用は、当業者の技術の範囲内に十分にある。コード核酸分子の発現による修飾FIXポリペプチドの投与のための方法は、組換えベクターの投与を含む。ベクターは、複製の起点の包含などによりエピソームのままとなるように設計することができるまたは細胞における染色体の中に統合するよう設計することができる。修飾FIXポリペプチドはまた、非ウイルス性ベクターを使用して、エクスビボ遺伝子発現療法において使用することができる。たとえば、細胞は、修飾FIXポリペプチドコード核酸をゲノムの場所の中に統合し、調節配列に作動可能に連結されるまたは結果として、それが、ゲノムの場所における調節配列に作動可能に連結されて配置されることなどによって、修飾FIXポリペプチドを発現するように操作することができる。次いで、そのような細胞は、処置を必要とする患者などのような対象に局所的にまたは全身的に投与することができる。ウイルス性ベクターは、たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスAAV、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、および遺伝子療法のために設計される他のものを含み、利用することができる。ベクターは、エピソームのままとすることができるまたは処置される対象の染色体の中に統合することができる。修飾FIXポリペプチドは、ウイルスによって発現させることができ、修飾FIXゼポリペプチドは、処置を必要とする対象に投与される。遺伝子療法に適したウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスAAV、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、および上記に述べられている他のものを含む。たとえば、アデノウイルス発現技術は、当技術分野においてよく知られており、アデノウイルス産生および投与方法もまた、よく知られている。アデノウイルス血清型は、たとえばAmericanTypeCultureCollectionATCC、Rockville、MDから利用可能である。アデノウイルスは、エクスビボにおいて使用することができる、たとえば、細胞は、処置を必要とする患者から単離され、修飾FIXポリペプチド発現アデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適した培養期間の後、形質導入された細胞は、対象に局所的および/または全身的に投与される。代わりに、修飾FIXポリペプチド発現アデノウイルス粒子は、単離され、対象の疾患または状態を予防する、処置する、または回復させるために、治療有効量のデリバリーのために、薬学的に許容可能な担体において製剤される。典型的に、アデノウイルス粒子は、対象体重1キログラム当たり1個の粒子から1014個の粒子の範囲、一般に、対象体重1キログラム当たり106個または108個の粒子から1012個の粒子の間の用量で送達される。いくつかの場面において、細胞表面膜タンパク質もしくは標的細胞に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどのような、細胞を標的にする作用物質と共に核酸源を提供することが望ましい。FIXはまた、デリバリーのために、特定の細胞型の中に向けることもできる。たとえば、FIXポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターは、肝細胞などのような非分裂細胞における安定した発現に使用することができる[MargaritisetalJClinInvest11310251031]。他の例では、FIXポリペプチドをコードするウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターが、続くデリバリーのために、単離細胞の中に形質導入することができる。FIXの発現およびデリバリーのためのさらなる細胞型は、線維芽細胞および内皮細胞を含むが、これらに限定されない。核酸分子は、人工染色体および他の非ウイルス性ベクターの中に導入することができる。ACESなどのような人工染色体[LindenbaumetalNucleicAcidsRes32e172を参照されたい]は、アイソフォームをコードし、発現するように操作することができる。手短かに言えば、哺乳動物人工染色体MACは、細胞の中に大きなペイロードの遺伝子情報を自律複製非統合方式において導入するための手段を提供する。MACの中で特有に、哺乳動物サテライトDNAベースの人工染色体発現ACEは、異なる種の細胞株において再現性よくデノボ生成され、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。次いで、精製された哺乳動物ACEは、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、ACEは、長期間、選択圧の非存在下においてACE系を使用して安定して維持される。このアプローチを使用して、1つまたは2つの遺伝子標的を特異的に積むことがLMTK-およびCHO細胞中で達成された。修飾FIXポリペプチドをコードする核酸を導入する他の方法は、酵母における2工程遺伝子置換技術であり、酵母人工染色体YACにおいてクローニングされる完全アデノウイルスゲノム[Ad2;KetneretalPNAS9161866190]ならびにYACクローンにおける特異的な領域を標的とするためのアデノウイルス配列、関心のある遺伝子のための発現カセット、ならびにポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含有するプラスミドを用いて始まる。YACは、より大きな遺伝子の組み込みを可能にするので、特に関心がある。このアプローチは、哺乳動物細胞または全動物に対する遺伝子移入のための、記載される修飾FIXポリペプチドのいずれかをコードする核酸を運ぶ、アデノウイルスベースのベクターの構築に使用することができる。核酸は、リポソームなどのような媒体にカプセル化するまたは細菌細胞、特に弱毒化された細菌などのような細胞の中に導入するまたはウイルス性ベクターの中に導入することができる。たとえば、リポソームが利用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、たとえば、特定の細胞型に対して向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいて内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、および細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強させるタンパク質が、ターゲティングのためにおよび/または取り込みを容易にするために使用することができる。エクスビボおよびインビボにおける方法については、修飾FIXポリペプチドをコードする核酸分子は、処置されることとなる、適したドナーまたは対象からの細胞の中に導入される。療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は、たとえば、処置されることとなる疾患または状態に適切な任意の所望の利用可能な細胞型を含み、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞;Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などのような血球;様々な幹細胞または前駆細胞、特にたとえば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、およびそれらの他の源から得られる幹細胞などのような造血幹細胞または造血前駆細胞を含むが、これらに限定されない。エクスビボ処置については、処置されることとなる対象と適合性のあるドナーに由来する細胞または処置されることとなる対象からの細胞は、除去され、核酸は、これらの単離細胞の中に導入され、修飾細胞は、対象に投与される。処置は、たとえば患者の中に植え込まれる多孔質膜内にカプセル化されるものなどのように、直接的投与を含むたとえば、それぞれ、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第4,892,538号および第5,283,187号を参照されたい。インビトロにおける哺乳動物細胞の中への核酸の移入に適した技術は、リポソームならびにカチオン脂質たとえばDOTMA、DOPE、およびDC-Cholの使用、電気穿孔法、微量注射法、細胞融合法、DEAE-デキストラン法、ならびにリン酸カルシウム沈降法を含む。DNAデリバリーの方法は、インビボにおいて修飾FIXポリペプチドを発現させるために使用することができる。そのような方法は、電気穿孔、超音波、およびリン酸カルシウムデリバリーの使用などのように、局所的および全身的なデリバリーを含む、核酸のリポソームデリバリーおよび裸のDNAのデリバリーを含む。他の技術は、微量注射、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、ミクロセル媒介性遺伝子移入、およびスフェロプラスト融合を含む。修飾FIXポリペプチドのインビボ発現は、さらなる分子の発現に連結させることができる。たとえば、修飾FIXポリペプチドの発現は、操作されたウイルスなどにおいて、細胞毒性産物の発現と連結することができるまたは細胞毒性ウイルスにおいて発現させることができる。そのようなウイルスは、治療的効果のために標的とされる特定の細胞型を標的にすることができる。発現修飾FIXポリペプチドは、ウイルスの細胞毒性を増強させるように使用することができる。修飾FIXポリペプチドのインビボ発現は、細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどのような特異的な調節配列に、修飾FIXポリペプチドコード核酸分子を作動可能に連結することを含むことができる。修飾FIXポリペプチドはまた、とりわけ標的細胞型および/または標的組織において感染するおよび/または複製するベクターから発現することができる。誘発性プロモーターは、修飾FIXポリペプチド発現を選択的に調節するために使用することができる。例示的な調節可能な発現系は、ドキシサイクリン誘発性遺伝子発現系であり、これは、組換えFIX発現を調節するために使用されてきた[SrouretalThrombHaemost90398405]。核酸分子は、裸の核酸としてまたはベクター、人工染色体、リポソーム、および他の媒体において、全身投与、局所経路、局所的経路、および投与の他の経路によって対象に投与することができる。全身およびインビボにおけるものである場合、核酸分子または核酸分子を含有する媒体は、細胞を標的にすることができる。投与はまた、細胞または組織を典型的に標的にするベクターまたは細胞の投与などによって直接的なものとすることができる。たとえば、腫瘍細胞および増殖は、修飾FIXポリペプチドのインビボ発現についての標的細胞となり得る。修飾FIXポリペプチドのインビボ発現に使用される細胞はまた、患者にとって自己となる細胞をも含む。そのような細胞は、患者から取り出され、修飾FIXポリペプチドの発現のための核酸を、導入し、次いで、注射または植え付けなどによって患者に投与することができる。H.治療上の使用本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドおよび核酸分子は、未修飾FIXが利用される任意の状態の処置に使用することができる。したがって、たとえば、修飾FIXポリペプチドは、血友病などのような、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害の処置のために凝血促進薬として使用することができる。典型的に、そのため、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、出血障害の処置において使用される凝血促進薬である。他の特定の例では、しかしながら、修飾FIXポリペプチドを、抗凝血薬として使用することができる。たとえば、その基質、FXに対する触媒活性の欠乏をもたらす、1つまたは複数の修飾をも含有する、高度にグリコシル化された修飾FIXポリペプチドは、血栓症の障害を処置するために抗凝血薬として使用することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、単独でまたは他の作用物質と組み合わせて治療活性を有する。本明細書において提供される修飾ポリペプチドは、治療活性を保持するが、改善された薬物動態学的および薬力学的特性、阻害因子に対する抵抗性の増加、ならびに/または改善された触媒活性などのような修飾された特性を示すように設計される。そのような修飾された特性および活性は、たとえば、ポリペプチドの治療有効性を改善することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドおよびコード核酸分子は、未修飾FIXが利用される任意の状態の処置に使用することができる。この部は、例示的な使用および投与方法を提供する。これらの記載される療法は、単に例示的なものであり、修飾FIXポリペプチドの適用を限定しない。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、様々な治療薬およびFIXが利用される診断法において使用することができる。そのような方法は、記載されるおよび以下に挙げられる生理学的状態および医学的状態の処置の方法を含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、野生型FIXと比較して、同じ効果を達成するためのより低い用量を含む、インビボ活性および治療効果の改善、より持続される治療効果、ならびに投与および処置における他の改善を示す。本明細書において記載される修飾FIXポリペプチドは、未修飾FIXポリペプチドと比較した、薬物動態学的および薬力学的特性の改善、触媒活性の増加、阻害因子に対する抵抗性の増加、および/または血液凝固活性の増加を示すことができる。そのようなポリペプチドは、たとえば、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害の処置のために凝血促進薬として使用することができる。いくつかの例では、非天然グリコシル化部位を有する、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドはまた、修飾FIXポリペプチドが抗凝固薬となり、たとえば、血栓症の疾患および障害を処置するために使用することができる、凝固を阻害する修飾FIXポリペプチドをもたらす修飾をも含有する。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、より長く続く、より安定した療法を送達するために使用することができる。修飾FIXポリペプチドを使用する治療的改善の例は、より低い投薬量、より少ないおよび/またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、凝血促進薬であり、先天性および後天性の出血障害を含む出血障害を処置するために使用することができる。特定の例では、修飾FIXポリペプチドが、他の修飾および未修飾FIXポリペプチドが処置のために使用されている治療方法における使用について意図される。単独でまたは他の凝血促進薬を含む他の作用物質と組み合わせて、修飾FIXポリペプチドを用いて処置することができる例示的な疾患および障害は、血液凝固障害、血液疾患、出血性障害、血友病、特に血友病B、外傷および手術と関連する出血を含む後天性の血液障害を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、FIXポリペプチドによって処置されることとなる出血が、脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管などのような器官において生じる。他の実施形態では、出血が、出血性胃炎および大量の子宮出血などにおいてびまん性である。血友病などのような出血障害を有する患者は、抜歯を含む手術または外傷の間に、出血および過度の出血のために危険にさらされることが多い。そのような患者は、修飾FIXポリペプチドを用いて処置することができる急性出血性関節症関節における出血、慢性血友病性関節症、血腫筋肉、腹膜後、舌下、および咽頭後方など、他の組織における出血、血尿腎管からの出血、脳出血、ならびに消化管出血UGI出血などを有することが多い。したがって、いくつかの例では、修飾FIXポリペプチドが、対象における、外傷または手術による出血エピソードまたは血小板の数もしくは活性の低下を処置するために使用される。手術を受ける患者のための例示的な方法は、出血を予防するための処置および手術の前、その間、またはその後の処置を含む。典型的に、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、修飾FIXポリペプチドと比較して、改善された血液凝固活性を示すが、いくつかの例では、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドが、1つまたは複数の非天然グリコシル化部位を含有することができ、また、機能的なペプチダーゼ活性を欠く。そのような修飾FIXポリペプチドは、血液凝固を阻害するための治療方法において使用することができるたとえば米国特許第6,315,995号を参照されたい。血液凝固を阻害する修飾FIXポリペプチドは、虚血性および血栓症の障害のための処置の抗凝固方法において使用することができる。深部静脈血栓症DVTまたは浅静脈血栓症SVTを有する患者などのような、過度の凝血の危険性が増加している外科患者において、抗凝血薬である本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、手術における過度の凝血を予防するために投与することができる。いくつかの場合において、処置は、FIX単独で実行される。いくつかの場合において、FIXは、処置されることとなる状態または疾患によって必要とされるように、さらなる抗凝固因子と共に投与される。修飾FIXポリペプチドを用いる疾患および状態の処置は、注射、経肺、経口、および経皮投与を含むが、これらに限定されない、本明細書において記載される適した製剤を使用する、投与の任意の適したルートによって達成することができる。必要であれば、特定の投薬量および持続時間ならびに処置プロトコールは、経験的に決定するまたは推定することができる。たとえば、上記に記載されるBeneFIX登録商標凝固因子IX組換え体の推奨される投薬量などのような、組換えFIXポリペプチドおよび天然FIXポリペプチドの例示的な用量は、適切な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。高度にグリコシル化され、インビボにおける半減期が増加したまたは阻害因子に対する抵抗性が増加したもしくは触媒活性が増加した修飾FIXポリペプチドは、投薬量および/または頻度の低下に有効になり得る。未修飾FIXポリペプチドについての投薬量および投薬量レジメンは、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドについての投薬量を決定するためのガイダンスとして使用することができる。未修飾FIXと比較した、修飾FIXの半減期および活性のレベルなどのような因子は、そのような決定をなす際に使用することができる。特定の投薬量およびレジメンは、経験的に決定することができる。投薬量レベルおよびレジメンは、知られている投薬量およびレジメンに基づいて決定することができ、必要ならば、修飾ポリペプチドの特性の変化に基づいて推定することができるおよび/または様々な因子に基づいて経験的に決定することができる。そのような因子は、個人の体重、健康状態、年齢、利用される特異的な化合物の活性、性別、食事、投与の時間、排泄の速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度および過程、ならびに疾患に対する患者の素因および処置する医師の判断を含む。有効成分、ポリペプチドは、典型的に、薬学的に有効な担体と組み合わせられる。単一剤形または多剤形を産生するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される宿主および投与の特定のモードに依存して変わり得る。血液の凝血時間に対するFIXポリペプチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間PTT、活性化部分トロンボプラスチン時間aPTT、活性化凝血時間ACT、再石灰化活性化凝血時間、またはリー-ホワイト凝血時間を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている凝血試験のいずれかを使用してモニターすることができる。患者の状態の改善に際して、必要であれば、維持用量の化合物または組成物を投与することができ、投与量、剤形、もしくは投与の回数またはそれらの組合せを修正することができる。いくつかの場合において、対象は、疾患症状のあらゆる再発に際してまたはスケジューリングされた投薬量に基づいて、長期ベースでの断続的な処置を必要とし得る。他の場合において、さらなる投与は、出血、外傷、または手術手技などのような急性事象に応じて必要とされ得る。血友病血友病は、1つまたは複数の血液凝固因子における欠乏症によって引き起こされる出血障害である。それは、組織損傷の部位に血餅を形成する能力の減少によって特徴づけられる。先天性のX連鎖血友病は、血友病Aおよび血友病Bまたはクリスマス病を含み、これらは、それぞれ、FVIIIおよびFIXにおける欠乏症によって引き起こされる。血友病Aは、10,0000人の男性のうち1人の割合で起こるが、血友病Bは、50,000人の男性のうち1人に起こる。血友病を有する患者は、再発性の関節および筋肉出血に罹患し、これは、特発性のものまたは外傷に応じてのものとすることができる。出血は、重症の急性の痛みを引き起こし、移動を制限し、滑膜肥大を含む二次的合併症に至り得る。さらに、関節において再発する出血は、慢性滑膜炎を引き起こし得、これは、関節の損害を引き起こし、滑膜、軟骨、および硬骨を破壊し得る。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドおよび本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドをコードする核酸は、血友病と関連する出血状態の処置を含めて、血友病のための療法において使用することができる。本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、たとえば、特発性出血エピソードを制御するもしくは予防するためにまたは外傷もしくは手術手技に応じての出血を制御するもしくは予防するために使用することができる。本明細書における修飾FIXポリペプチドは、改善された血清半減期、阻害因子に対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および/または血液凝固活性の増加などのような、薬物動態学的および薬力学的特性の改善を示すことができる。したがって、修飾FIXポリペプチドは、血友病のための、より長く続くまたは他の場合には改善された療法を送達するために使用することができる。修飾FIXポリペプチドを使用する治療的改善の例は、たとえば、より低い投薬量、より少ないおよび/またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。修飾FIXポリペプチドは、たとえば、動物モデルを使用することによって、治療有効性について試験することができる。たとえば、FIX欠損マウスまたは血友病についての任意の他の知られている疾患モデルは、修飾FIXポリペプチドを用いて処置することができる。疾患症状の進行および表現型は、修飾FIXポリペプチドの効果を評価するためにモニターされる。修飾FIXポリペプチドはまた、偽薬対照および/または未修飾FVIIを使用する対照と比較した、インビボにおける有効性を評価するために、臨床試験などにおいて動物モデルおよび対象に投与することもできる。a血友病B血友病Bは、FIX治療薬の投与により有効に管理することができる。重症の血友病Bを有する患者は、<1IU/dLのFIX活性正常活性の1を有し、中程度の血友病Bを有する患者は、1~5IU/dLのFIX活性正常活性の1~5を有し、軽度の血友病Bを有する患者は、>5~<40IU/mLのFIX活性正常活性の>5~<40を有する。適切な量のFIXを用いる、特定の出血エピソードの適した予防的な代理の療法および/または処置を用いると、患者は、標準の寿命に達することができる。FIXの投与は、手術、外傷の間の、抜歯の間の、または関節血症、血尿、鼻出血もしくは胃腸管出血などのような粘膜皮膚の出血、骨膜下骨もしくは軟部組織における嚢胞性の病変、または頭蓋出血、脊柱管出血などのような神経学的合併症を引き起こす血腫と関連する出血を軽減するように、出血を制御するのを支援することができる。血友病を有する患者における死亡は、中枢神経系における出血の結果であることが多い。血友病患者における他の深刻な合併症は、凝固因子治療薬および疾患に対する阻害因子の発生を含む。血友病B患者におけるFIX遺伝子における最も頻繁な改変は、点突然変異、特にミスセンス突然変異である。同定されたFIX突然変異のほとんどは、FIX遺伝子のコード領域におけるアミノ酸残基において起こり、進化的に保存されたアミノ酸に影響を及ぼすことが多い。血友病の重症度は、突然変異の性質に依存する。コード領域における突然変異は、プロテアーゼ活性、補因子結合、シグナルペプチド、またはプロペプチド切断の改変、翻訳後修飾、およびその活性化形態へのFIXの切断の阻害を含む、FIXポリペプチドの多くの異なる特性または活性に影響を及ぼすことができる。他の種類の点突然変異は、不安定な切断FIXポリペプチドを産生するナンセンス突然変異ならびに最終的に異常なFIX分子をもたらすフレームシフト突然変異小さな欠失および挿入を含む。さらに、FIX点突然変異は、プロモーター領域中に見出すことができ、これは、いくつかの特定の遺伝子調節タンパク質についての認識配列を破壊し、凝固因子IXの転写の低下をもたらし得る。転写異常の結果としてのFIXの減少は、血友病Bライデンと呼ばれる。プロモーター領域における例示的な突然変異は、HNF-4結合部位の崩壊を含み、これは、アンドロゲン受容体によるFIX転写の調節に影響を及ぼす。この種の血友病の重症度は、血液中のアンドロゲンのレベルによって決定され、これは、思春期の間に増加し、FIX転写欠乏症を部分的に軽減する[Kurachietal]。他のミスセンスヌクレオチド変化は、第IX因子一次RNA転写産物のプロセシングに影響を及ぼす。たとえば、いくつかの突然変異は、進化的に保存されたドナースプライスGTおよびアクセプタースプライスAGコンセンサス配列に起こり、これは、潜在性のスプライスジャンクションを生成し、スプライソソームのアセンブリーを破壊し得る。血友病のいくつかの重症の症例約10は、FIX遺伝子における大きな欠失の症状を示す。FIX欠乏症、したがって血友病Bの処置は、ほとんどの場合、FIXの組換え形態、精製血漿FIX調製物、または精製血漿濃縮物を含むFIXの投与を伴う。したがって、同様に、本明細書における修飾FIXポリペプチドおよび修飾FIXポリペプチドをコードする核酸は、血友病Bの処置のために使用することができる。本明細書における修飾FIXポリペプチドは、改善された血清半減期、阻害因子に対する抵抗性の増加、触媒活性の増加、および/または血液凝固活性の増加などのような、薬物動態学的および薬力学的特性の改善を示すことができる。したがって、修飾FIXポリペプチドは、血友病のための、改善された療法を送達するために使用することができる。修飾FIXポリペプチドを使用する治療的改善の例は、たとえば、より低い投薬量、より少ないおよび/またはより頻度が低い投与、副作用の減少、ならびに治療効果の増加を含むが、これらに限定されない。b.血友病A血友病Aは、血友病の全ての症例の約85を占めるが、X染色体上の第VIII因子遺伝子における1つまたは複数の突然変異に起因し、FVIIIタンパク質の欠乏症または機能障害に至る。BeneFIX登録商標凝固因子IX組換え体などのような組換えFIXポリペプチドまたは血漿精製FIXポリペプチドを含む天然FIXポリペプチドを用いる血友病Aの処置は、典型的に、天然FIXポリペプチドが凝固を達成するための触媒活性のためにFVIIIaを必要とするので、推奨されない。しかしながら、FIX内因活性を増加させるための1つまたは複数の修飾を含有する、本明細書において記載されるものなどのような修飾FIXポリペプチドは、血友病Bの処置において使用することができる。そのようなポリペプチドは、FVIII非依存性活性を有し、したがって、血友病A患者における凝固薬として機能することができる。たとえば、1つもしくは複数の非天然グリコシル化部位を導入するもしくは排除するための1つもしくは複数の修飾ならびに/またはAT-IIIおよび/もしくはヘパリンに対する抵抗性を増加させるための1つもしくは複数の修飾を含有するならびにFVIIIaの非存在下において修飾FIXポリペプチドの活性を増加させるための1つもしくは複数の修飾をも含有するものなどのような上記に記載される修飾FIXポリペプチドは、血友病Aを有する患者における出血エピソードを処置するために使用することができる。FIXポリペプチドがFVIIIa非依存性の様式において作用することができるような、FIXポリペプチドの内因活性を増加させるための修飾は、上記および他のところに記載されており[たとえばHopfneretalEMBOJ1666266635KolkmanetalBiochem3973987405SichleretalJBiolChem27841214126BegbieetalThrombHaemost94113847、米国特許第6,531,298号ならびに米国特許出願公開第20080167219号および第20080214461号を参照されたい]、アミノ酸置換V86A、V86N、V86D、V86E、V86Q、V86G、V86H、V86I、V86L、V86M、V86F、V86S、V86T、V86W、V86Y、Y259F、A261K、K265T、E277V、E277A、E277N、E277D、E277Q、E277G、E277H、E277I、E277L、E277M、E277F、E277S、E277T、E277W、E277Y、R338A、R338V、R338I、R338F、R338W、R338S、R338T、Y345F、I383VおよびE388Gを含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、アミノ酸交換Y259FK265T、Y259FK265TY345F、Y259FA261KK265TY345F、Y259FK265TY345FI383VE388GまたはY259FA261KK265TY345FI383VE388Gを含み、内因活性の増加を示すことができる。そのため、そのような修飾FIXポリペプチドは、血友病Aの処置において使用することができる。J.併用療法修飾FIXポリペプチドおよび本明細書において記載される修飾FIXポリペプチドをコードする核酸分子のいずれも、他の生物学的製剤、小分子化合物、および手術を含むが、これらに限定されない他の治療剤または手技と組み合わせて、その前に、それと断続的に、またはそれに続いて、投与することができる。FIXが指示されるまたは使用されてきたならびに他の作用物質および処置が利用可能である、上記に例証されるものを全て含む任意の疾患または状態について、FIXは、それと組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドは、同様に使用することができる。処置されることとなる疾患または状態に依存して、例示的な組合せは、他の血漿精製凝固因子または組換え凝固因子、凝血促進薬、抗凝血薬、抗凝固抗体、グリコサミノグリカン、ヘパリン、ヘパリノイド、ヘパリン誘導体、ヘパリン様の薬剤、ワルファリンおよびクマリン誘導体などのようなクマリンとの組合せを含むが、これらに限定されない。凝血促進特性を有する、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドとの併用療法において使用することができるさらなる凝血促進薬は、ビタミンK、ビタミンK誘導体、他の凝固因子、およびプロテインC阻害因子を含むが、これらに限定されない。抗凝固特性を有する、本明細書において提供される修飾FIXポリペプチドとの併用療法において使用することができるさらなる抗凝血薬は、β2アドレナリン受容体アンタゴニスト、神経ペプチドV2アンタゴニスト、プロスタサイクリン類似体、トロンボキサンシンターゼ阻害因子、カルシウムアゴニスト、エラスターゼ阻害因子、非ステロイド系抗炎症性分子、トロンビン阻害因子、リポキシゲナーゼ阻害因子、FVIIa阻害因子、FXa阻害因子、ホスホジエステラーゼIII阻害因子、フィブリノゲン、ビタミンKアンタゴニスト、糖タンパク質IIb/IIIaアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。K.製品およびキット修飾FIXポリペプチドをコードする核酸についての修飾FIXポリペプチドまたはその誘導体もしくは生物学的活性部分の医薬化合物は、包装材料、FIX媒介性の疾患または障害の処置に有効な医薬組成物、および修飾FIXポリペプチドまたは核酸分子が、FIX媒介性の疾患または障害の処置について使用されることになっていることを示すラベルを含有する製品として包装することができる。本明細書において提供される製品は、包装材料を含有する。医薬製品の包装における使用のための包装材料は、当業者らによく知られている。たとえば、それぞれ、その全体が本明細書において組み込まれる米国特許第5,323,907号、第5,033,252号、および第5,052,558号を参照されたい。医薬包装材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択される製剤ならびに投与および処置の意図されるモードに適した任意の包装材料を含むが、これらに限定されない。任意のFIX媒介性の疾患または障害に対する様々な処置のように、本明細書において提供される化合物および組成物の多くの製剤が、企図される。修飾FIXポリペプチドおよび核酸分子はまた、キットとして提供することもできる。キットは、本明細書におけて記載される医薬組成物および投与のためのアイテムを含むことができる。たとえば、修飾FIXは、シリンジ、吸入器、投薬カップ、ドロッパー、またはアプリケーターなどのような投与のためのデバイスと共に提供することができる。キットは、所望により、投薬量、投薬レジメン、および投与のモードのための説明書を含む、適用のための説明書を含むことができる。キットはまた、本明細書において記載される医薬組成物および診断のためのアイテムを含むことができる。たとえば、そのようなキットは、FIXの濃度、量、もしくは活性を測定するためのアイテムまたは対象のFIX調節システムを含むことができる。以下の実施例は、説明の目的のみのために含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。第IX因子ポリペプチドのクローニングおよび発現A.FIX遺伝子のクローニング461アミノ酸ヒトFIX前駆体ポリペプチドP00740;配列番号1において記載をコードする核酸を、伸長因子-1αEF-1αコアプロモーターならびにヒトT細胞白血病ウイルスHTLV1型末端反復配列のRセグメントおよびU5配列の部分R-U5’を含む複合プロモーターhEF1-HTLVを含有する哺乳動物発現ベクター、pFUSE-hIgG1-Fc2本明細書においてpFUSEと略すInvivoGen;配列番号23にクローン化した。In-FusionCFDry-DownPCRCloningKitClontechを供給者によって指定された条件に従って用いた。インフュージョンプロセスのためにヒト免疫グロブリン1hIgG1Fc部分を含まないプラスミドpFUSEを、pFUSE-Acc-F1フォワードプライマー:GTGCTAGCTGGCCAGACATGATAAG配列番号24およびpFUSE-Acc-R3リバースプライマー:CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC配列番号25でのポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いて直線化し、アクセプターDNAとして用いた。FIXの全長コード配列を、FIX-wtsp-Invivo-F1フォワードプライマー:CGAAGGAGGGCCACCATGCAGCGCGTGAACATGATC配列番号26およびFIX-Invivo-R1リバースプライマー:TGTCTGGCCAGCTAGCACTTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCC配列番号27と共にヒトFIXcDNAOrigeneを鋳型として用いてPCRによって増幅した。上に記載の2つのFIXドナー増幅プライマー配列に関して、フォワードおよびリバースプライマー配列それぞれにおけるFIXATG開始およびTAA終止コドンの相補配列の両方に下線をつけた。18nt長相同性領域、InFusionのための非アニーリング5’プライマー末端を太字で示す。標準的PCR反応およびサーモサイクリング条件をPhusionHigh-FidelityMasterMixKitNewEnglandBiolabsと共に製造者によって推奨されるとおり用いた。アクセプターおよびドナーPCR産物の両方を、次いでイーコリ由来damメチル化PCR鋳型バックグラウンドを除去するためにDpnI制限酵素で消化した。次いでそれらを混合し、In-Fusion反応を供給者によって指定された条件を用いて実施した。反応混合物をイーコリXL1BluesupercompetentcellsStratageneに形質転換した。コロニーを25ppmZeocinInvivoGenを添加した2xYTアガープレート上で選択した。プラスミドDNAを選択されたクローンから単離し、正確なクローニングを検証するために配列決定した。B.FIX変異体の生成FIX変異体を、新たに合成するDNAに設計された突然変異を組み込むためのプライマーとして働く特異的に設計したオリゴヌクレオチドと共にQuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKitStratageneを製造者の説明書に従って用いて生成した。望まれる突然変異を含む相補的プライマーを、クローン化FIXcDNA配列を鋳型として含有する精製した二重鎖スーパーコイルpFUSEプラスミドDNAを用いるサイクルにおいて伸長した。プライマーの伸長は、新たに合成される鎖への対象の突然変異の組み込みをもたらし、ねじれ型ニックstaggerednicksを含む突然変異プラスミドを生じた。増幅に続いて、イーコリ由来pFUSEDNAのdamメチル化親鎖を除去するために突然変異導入産物をDpnI制限酵素で消化した。次いでDNAをイーコリXL1BluesupercompetentcellsStratageneに形質転換し、25ppmZeocinInvivoGenを添加した2xYTアガープレート上での選択が続いた。プラスミドDNAを選択されたクローンから単離し、FIX遺伝子上の望まれる位置複数可での突然変異複数可の組み込みを検証するために配列決定した。FIX変異体を生成するために用いた各相補的プライマー対由来のオリゴヌクレオチドの内の1つのヌクレオチド配列を表12に提供する。置換されたアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレット配列を大文字で示す。たとえば置換A103N/N105SキモトリプシンナンバリングによるA[103]N/N[105]S;配列番号77を含有するFIX変異体を生成するために、A103N/N105SフォワードプライマーおよびA103N/N105Sフォワードに相補的であるプライマーを9-bpGCTgatAAC野生型配列を9-bpAATgatAGC突然変異配列で置き換えるために用いた変更したヌクレオチドトリプレットを大文字で記す。下の表12は、FIX突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドプライマーを記載する。突然変異体トリプレットを大文字で示し、プライマー名は、プライマーを用いた突然変異誘発の結果として産生されたキモトリプシンナンバリングによる、突然変異体に対応する。表12下の表13は、配列番号3において記載される成熟FIXポリペプチドと比較したナンバリングおよびキモトリプシンナンバリングを用いて示す突然変異を有する生成されたFIX変異体を記載する。表13FIX変異体C.FIXポリペプチドの発現および精製野生型および変異体のFIXポリペプチドをCHO発現CHOX細胞Excellgeneにおいて発現した。CHO発現CHOX細胞をDM204BCompletemediumIrvineScientificにおいて維持し、産生種培地に接種するために用いた。種培地を同じ培地で生存細胞vc1mL当たりおよそ1.4x107個まで増殖させ、およそ100mLをDM204BCompletemediaおよそ1.0Lに接種するために用い、したがって接種密度は1.2x106vc/mLであった。この培養物をトランスフェクションの日に13~16x106vc/mLに達するように3日間増殖させた。FIXプラスミドDNA3.2mgをポリエチレンイミンMAX[PEI-20.5mgPolyscience]と混合し、serum-freeTfMAX2transfectionmediumMediatechで1.0Lに希釈することによってトランスフェクション複合体を形成した。次いでこの混合物を産生培地1.0Lに添加した。細胞にトランスフェクション混合物を加えたもの1.0Lアリコートを2個の3Lバッフル付きフェルンバッハフラスコに分割し、粗FIXを回収する前に4日間発現させた。次いで培養上清を濾過によって回収し、FIXを精製した。10L以上の大規模培養物をWAVEbioreactorGEHealthcareにおいて産生した。DM204BCompletemedia4.6Lで接種密度1.2x106vc/mLまで上に記載のとおり増殖させた種培養物およそ400mLを20Lwavebagに接種した。細胞が3日後に細胞密度13~16x106vc/mLに達するようにWAVEbioreactorを揺動角度6度、揺動速度24rpm、37.1°Cに設定した。FIXプラスミドDNA16mgおよびPEI102.5mgをトランスフェクション複合体を形成するように合わせ、最初の接種の3日後にWAVEbioreactor内の培養物に添加する前にTfMAX25.0L中に希釈した。トランスフェクション複合体にTfMAX培地を加えたものをwavebagに添加し、WAVEBioreactorの揺動角度を8°Cに、温度を33°Cに他の設定は同じままで設定した。培養物を粗FIXを回収する前に4日間発現させた。wavebagの内容物をCUNOデプスフィルターを通じて培養上清を回収する前に3時間、4°Cで静置し、次いでFIXを精製した。機能的Glaドメインを有するFIXポリペプチドが吸着し、カルシウム溶出工程が続くCaptoQcolumnGEHealthcareを用いてFIXポリペプチドを精製した。典型的にはEDTA10mM、Tris25mM、pH8.0およびTween-800.001をトランスフェクトした細胞由来の培養上清に添加した。試料を、緩衝液B25mMTrispH8、1MNaCl、0.001Tween-80で予め平衡化したCaptoQcolumnにロードし、緩衝液A25mMTrispH8、0.15MNaCl、0.001Tween-80での平衡化が続いた。試料のロードの完了直後にカラムを14緩衝液B86緩衝液Aで20カラム容量洗浄した。次いで緩衝液C25mMTrispH8、0.2MNaCl、0.001Tween-80、10mMCaCl2をプールとして採取するFIXポリペプチドを溶出するためにカラムに添加した。溶出プールをQSepharoseHPcolumnGEHealthcareを用いてさらに精製した。試料を緩衝液D25mMTrispH8、0.001Tween-802容量で希釈することによって添加のために調製した。希釈試料を緩衝液F25mMTrispH8、1MNaCl、2.5mMCaCl2、0.001Tween-80に続いて緩衝液E25mMTrispH8、2.5mMCaCl2、0.001Tween-80で予め平衡化したQSepharoseHPcolumnにロードした。4緩衝液F96緩衝液Eでの洗浄後、4~40緩衝液Fの勾配をカラムに適用し、画分を採取した。次いでFIXポリペプチドを含有する画分をプールした。D.グリコシル化ポリペプチドを濃縮するための精製修飾FIXポリペプチドのグリコシル化の程度をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて推定した。過剰グリコシル化を修飾FIXポリペプチドの移動パターンの野生型FIX、Benefix登録商標CoagulationFIXとの比較によって評価した。酵素の過剰グリコシル化形態は遅く移動し、野生型ポリペプチドよりも高い見かけの分子量を示す。E240N突然変異240位に非天然N-グリコシル化部位を導入するを含有するポリペプチドは部分的にしかグリコシル化されていないことおよそ20グリコシル化が認められた。過剰グリコシル化形態を濃縮するために、上に記載の精製プロセスの変更を実施した。精製の最初の工程は、上に記載のとおりCaptoQcolumnを用いて実施した。このカラムからの溶出プールを緩衝液D上に記載のとおり2容量で希釈し、試料を緩衝液F上に記載のとおりに続いて緩衝液E上に記載のとおりで予め平衡化したHeparinSepharoseカラムにロードした。次いでカラムを0から70緩衝液Fの勾配で展開し、画分を採取した。E410N変異体の過剰グリコシル化形態はカラムからおよそ35緩衝液F中に溶出し、非グリコシル化形態はおよそ50緩衝液F中に溶出した。採取した各プールをQSepharoseHPcolumn上で上に記載のとおりさらに精製した。この方法によりE410N変異体のおよそ80過剰グリコシル化形態を含有するプールを得た。過剰グリコシル化の程度をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法の目視検査によって推定した。FXの活性化および活性部位滴定剤ActiveSiteTitrantフルオレセイン-モノ-p’-グアニジノベンゾエートFMGBを用いる触媒的に活性なプロテアーゼFXa濃度の決定第X因子FXの保存物中で触媒的に活性になり得るFXの濃度を決定した。次いでFXのこの保存物をFXに対するFIX変異体の触媒活性を算出するための次の研究で用いた。FXのFXaへの活性化に続いて、活性部位滴定アッセイを本質的にBocketal273375388によって記載のとおり、蛍光発生エステル基質フルオレセイン-モノ-p’グアニジノベンゾエートFMGBを用いて、いくつかの若干の変更を伴って実行した。FMGBはFXaと直ちに反応ししかしFXまたは不活性プロテアーゼとは反応せず、FMGB濃度が飽和しており、脱アシル化が特に遅く、触媒作用の律速である条件下で事実上安定なアシル-酵素中間体を形成する。これらの条件下で、FXaプロテアーゼは、一回の触媒代謝回転を受け、フルオレセインフルオロフォアを放出する。蛍光の最初のバーストをフルオレセイン蛍光の外部濃度標準曲線で較正すると、活性部位の濃度を算出できる。A.FXaへのFXの活性化触媒的に活性になり得るFXの保存液中の濃度をラッセルクサリヘビ毒Russell’sViperVenomでのFX試料の活性化によって決定し、FMGBでの活性FXFXaの滴定を続けた。FX酵素前駆体保存物はバックグラウンドFXa活性を減少させるために供給者によってDFPジイソプピルフルオロホスフェートおよびEGR-cmkで最初に予備処理された。FXa活性化反応物は、最終濃度10μMFXA280吸光度および吸光係数1.16に基づくで、100mMTris、50mMNaCl、5mMCaCl2、0.1PEG8000を含有する反応緩衝液pH8.1中、最終容量50~100μLに調製した。活性化は、Russell’sViperVenomRVV-Xase;HeamatologicTechnologies、Inc.の最終濃度5μg/mL反応物100μL当たり98μg/mL希釈物を5μL、または反応物50μL当たり2.5μLの37°C、45~60分間の活性化時間での添加によって開始した15分ごとに試料を採取することおよびSpectrafluorFXa蛍光発生基質の切断における増加を検査することによって完全な活性化を表すことが既に決定されている。反応を100mMTris、50mMNaCl、5mM、100mMEDTA、0.1PEG8000を含有する1/10容量のクエンチ緩衝液pH8.1でクエンチした。B.活性部位滴定活性部位滴定アッセイを、0.4cmx1cmの石英キュベット中の反応容量1mLで継続的に撹拌しながら実施した。反応物は、30mMHepes、135mMNaCl、1mMEDTAおよび0.1PEG8000を含有するアッセイ緩衝液pH7.4中に100~400nMの新鮮活性化FXaおよび5μMFMGBを含有した。FMGBを乾燥重量に基づいて保存濃度0.01MでDMF中に調製し、濃度をリン酸緩衝生理食塩水PBSにおける吸光係数19,498M-1cm-1を用いて452nmでの吸光分光法によって確認した。アッセイは1mMFMGB最終濃度5μM5μLを1×アッセイ緩衝液1mLに添加することによって開始し、FXaの最終濃度約100~400nMでの添加の前にFMGBのバックグラウンド加水分解を約150~200秒間最初に測定した。反応のバースト相におけるフルオレセイン蛍光の放出をさらに3600秒間追跡した。FXaによるFMGBの触媒作用に続いて放出されるフルオレセインの量は、遊離フルオレセインの標準曲線を用いて決定した。フルオレセイン標準溶液は保存濃度約70~150mMでDMF中に新鮮調製し、正確な濃度を0.1NNaOHにおける吸光係数89,125M-1cm-1を用いる496nmでの標準条件下の吸光分光法によって確認した。次いで遊離フルオレセインの標準曲線を吸光度較正済フルオレセイン標準物の1×アッセイ緩衝液への20nMから最終濃度260~300nMへの滴定によって作成した。データ分析のために、反応トレースをGraphpadPrismsoftwarepackageに導入し、自発的FMGB加水分解の初期測定速度の外挿によってバックグラウンド加水分解の寄与を曲線から減算した典型的には総蛍光バーストの5未満。補正曲線を、Δ蛍光=Amp1-e-KtBt[式中Amp=上に概説した飽和アッセイ条件下でのバースト相の振幅、Kはアシル酵素形成に関して観察された一次速度定数、およびBはFMGBの完全代謝回転に関するバルク速度定数bulkrateconstantである]の形の線形成分脱アシル化の低速を表すためを有する単一指数方程式singleexponentialequationにフィットさせた。活性FXaプロテアーゼの濃度を振幅に関するフィットパラメーターのフルオレセイン標準曲線との比較によって算出した。複数のアッセイから値を測定し、平均をとり、標準偏差を決定した。調製物中の活性FXaの量は、FIXaによって活性化され得る保存調製物中のFXの濃度を直接表す。この活性部位滴定値を下の実施例4において記載する補因子依存アッセイcofactor-dependentassayなどの間接アッセイにおいて用いるFXの濃度を算出する場合に使用した。FIXの活性化および活性部位滴定剤4-メチルウンベリフェリル-p’-グアニジノベンゾエートMUGBを用いる触媒的に活性なプロテアーゼFIXa濃度の決定第IX因子FIX酵素前駆体の保存溶液中で触媒的に活性になり得るFIXの濃度を、FIX変異体を含むFIX試料の第XIa因子FXIa;HeamatologicTechnologies、Inc.での活性化に続く、活性第IX因子FIXaの4-メチルウンベリフェリル-p’グアニジノベンゾエートMUGBでの滴定によって決定した。A.FIXのFIXaへの活性化FIXポリペプチド調製物中の総タンパク質濃度を各変異体に固有の吸光係数すなわち、ε280=Try残基数×1490Trp残基数×5500Cys残基数×125を用いてA280吸光度によって決定した。FIXのFIXaへの活性化反応物を、100mMTris、50mMNaCl、5mMCaCl2、0.1PEG8000を含有する反応緩衝液pH8.1中の最終容量200~500μLに最終濃度10μMFIXで調製した。活性化は、37°C、60分間の活性化時間でのFIXaまたはビオチン化FXIaの最終濃度20nMへの添加によって開始した。60分間の活性化時間は、15分ごとに試料を採取することおよびSDS-PAGEによって総切断をアッセイすることによって完全な活性化を表すことが予め決定されていた。次いで活性化反応において用いた遊離FXIaまたはビオチン化FXIaを、同じ結果をもたらす2つの方法それぞれ95~97を超える触媒FXIaを除去するの内の1つを用いて試料から除去した。遊離FXIaを除去するために用いた第一の方法では、FXIaで開始した活性化反応物を最終濃度50nMの抗FXIaモノクローナル抗体Abcam20377と60分間、37°Cで混合した。遊離FXIaの抗体捕捉には、追加的120分間、室温での洗浄済proteinGDynalBeads30mg/mL、Invitrogenの最終濃度25容量:容量への添加が続いた。DynalBeadsを製造者の説明書に従って溶液から除去した。ビオチン化FXIaを除去するために用いた第二の方法では、ビオチン化FXIaを用いた活性化反応物を、最終濃度10容量:容量のStreptavidineDynalBeads10mg/mL;Invitrogenと60分間、室温で混合した。次いでDynalBeadsを製造者の説明書に従って除去した。FXIaの除去に続いて、活性化FIXa試料の総タンパク質濃度を各変異体に固有の吸光係数上に記載のとおりを用いてA280吸光度によって決定した。B.FIXaの活性部位滴定活性化保存溶液中の触媒的に活性なFIXaの濃度を、FIXa試料を蛍光発生エステル基質、4-メチルウンベリフェリル-p’-グアニジノベンゾエートMUGBでの滴定によって決定した。原則的な滴定アッセイは、MUGBのFIXaとの緩徐な反応性を考慮するためのいくつかの若干の変更を伴って本質的にPayneetalBiochemistry3571007106によって記載のとおり実施した。MUGBはFIXaと直ちに反応ししかしFIXまたは不活性プロテアーゼとは反応せず、MUGB濃度が飽和しており、脱アシル化が特に遅く、触媒作用の律速である条件下で事実上安定なアシル-酵素中間体を形成する。これらの条件下でFIXaプロテアーゼは、一回の触媒代謝回転を受け、4-メチルウンベリフェロンフルオロフォア4-MUを放出する。蛍光の最初のバーストを4-MU蛍光の外部濃度標準曲線で較正すると、活性部位の濃度を算出できる。アッセイを、0.4cmx1cmの石英キュベット中の反応容量1mLで継続的に撹拌しながら50mMHepes、100mMNaCl、5mMCaCl2および0.1PEG8000を含有するアッセイ緩衝液pH7.6で実施した。MUGBを乾燥重量に基づいて保存濃度0.04MでDMSO中に調製し、DMSO中2mMの実施濃度に希釈した。滴定アッセイを1×アッセイ緩衝液に2mMMUGB4μLを最終濃度8μMで添加することによって開始し、FIXaまたはFIXa変異体の最終濃度約100~200nMFXIa除去後に活性化反応物について決定した総タンパク質濃度に基づくでの添加の前にMUGBのバックグラウンド加水分解を最初に約200~300秒間測定した。反応のバースト相における4-MU蛍光の放出を初期バーストおよび続く定常状態相から十分なデータを得るために合計2時間追跡した。FIXaによるMUGBの触媒作用に続いて放出される4-MUの量を4-MUの標準曲線を用いて決定した。4-MU標準溶液はDMSO中に0.5Mの保存濃度で調製し、濃度を50mMTris緩衝液pH9.0における吸光係数19,000M-1cm-1を用いる360nmでの吸光分光法によって確認した。遊離4-MUの標準曲線を吸光度較正済4-MUの1×アッセイ緩衝液への20nMから最終濃度260~300nM4-MUへの滴定によって作成した。データ分析のために、反応トレースをGraphpadPrismsoftwarepackageに導入し、自発的MUGB加水分解の初期測定速度の外挿によってバックグラウンド加水分解の寄与を曲線から減算した典型的には総蛍光バーストの5未満。補正された曲線を、Δ蛍光=Amp1-e-KtBt式中Amp=上に概説した飽和アッセイ条件下でのバースト相の振幅、Kはアシル酵素形成に関して観察された一次速度定数、およびBはMUGBの完全代謝回転に関するバルク速度定数であるの形の線形成分定常状態相における脱アシル化の低速を表すためを有する単一指数方程式にフィットさせた。活性FIXaプロテアーゼの濃度を振幅に関するフィットパラメーターの4-MU標準曲線との比較によって算出した。複数のアッセイから値を測定し、平均をとり、標準偏差を決定した。次いで活性化され得る保存溶液中のFIX酵素前駆体の濃度を、FIX酵素前駆体のA280決定総濃度に、完全に活性化された試料に関して実験的に決定された活性割合値fractionactivevalue活性FIXaの濃度/FIXaの総濃度を掛けることによって決定した。基質、第X因子に対するFIXaの触媒活性の決定基質、第X因子FXに対するFIXa変異体の触媒活性を、合成基質SpectrafluorFXaについて、FIXaによる活性化において生成されるFXaの活性をアッセイすることによる蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。活性化プロテアーゼFIXaの濃度より基質プロテアーゼFXが少なくとも1000倍を超えて過剰であった場合の動力学的速度定数を算出するために様々なFX濃度を用いた。簡潔には活性化され、活性部位滴定されたFIXaを組換えFVIII、リン脂質小胞およびアルファ-トロンビンFVIIIをFVIIIaに活性化するを含むカルシウム含有緩衝液中でインキュベートし、テナーゼXase複合体を形成させた。次にアッセイ開始前にアルファ-トロンビンの活性を高度に特異的なトロンビン阻害物質、ヒルジンの添加によってクエンチした。FIXa変異体Xase複合体の部分としてを次にアッセイを開始するために様々な濃度のFXおよび蛍光基質SpectrafluorFXaCH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMCと混合した。FXaによるSpectrafluorFXaの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、AMC7-アミノ-4-メチルクマリンの放出を次に一定期間連続的に評価し、FIXa変異体の動力学的速度定数を決定した。A.アッセイプロトコールFVIIIaおよびリン脂質の存在下でのFIXaによるFX活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、最初に組換えFVIIIKogenateFS登録商標;Bayerhealthcareを製造者の説明書に従って添付の希釈剤5mL中に懸濁した。次いでFVIIIのモル濃度を吸光係数1.567mg-1mLcm-1および分子量163.6kDaを用いて280nmでの吸光度によって決定した。FIX変異体を上の実施例1~3において記載されるとおり発現、精製、活性化および活性部位滴定した。次いでFIXa変異体を1×緩衝液A20mMHepes/150mMNaCl/5mMCaCl2/0.1BSA/0.1PEG-8000、pH7.4200μL容量中へ16pMの濃度に系列希釈した。FIXaおよびリン脂質の存在下でのFVIIIのFVIIIaへの活性化のための調製物において、アルファ-トロンビンHeamatologicTechnologies、Inc.およびヒルジンAmericanDiagnosticaをそれぞれ1×緩衝液A1.0mL容量中へ64nMおよび640nMにそれぞれ希釈した。再構成FVIIIを、267μMの新鮮再懸濁リン脂質75ホスファチジルコリンPC/25ホスファチジルセリンPS;PS/PC小胞直径約120nm;AvantiPolarLipidsを含有する1×緩衝液A10mL容量中へ濃度267nMにさらに希釈した。上のFVIII/PC/PS溶液600μLと16pM野生型FIXaまたはFIXa変異体希釈物100μLおよび64nMアルファ-トロンビン溶液50μLとを混合し、続いて15分間、25°CでのインキュベーションによってFVIIIをFVIIIaに活性化した。次にFX活性化についての動力学的アッセイを開始する前に活性化反応を上の640nMヒルジン溶液50μLの5分間、25°Cでの添加によってクエンチした。Xase複合体溶液800μL中の試薬の最終濃度は、以下のとおりであった:2pMFIXa変異体、200nMFVIIIa、200μMPC/PS小胞、4nMアルファ-トロンビン阻害済および40nMヒルジン。各Xase複合体溶液FIXa/FVIIIa/リン脂質/Ca2合計25μLを予め定義したプレートマップFIXa変異体4種/プレートに従って96ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートに分注した。活性部位滴定し、DFP/EGR-cmk処理したFX上の実施例2を参照されたいの900nM溶液を1.0mMSpectrafluorXa基質を含有する1×緩衝液A5.6ml中に調製した。これは、検査したFXの最高濃度および4種のアッセイのための十分な容量を表した。次いでFX/SpectrafluorXa溶液を1.0mMSpectrafluorXaを含有する1×緩衝液A最終容量2.5mlで8チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に1.8倍系列希釈し、900nM、500nM、277.8nM、154.3nM、85.7nM、47.6nM、25.6nMおよび0nMFXの最終希釈物を得た。代替的にいくつかのアッセイにおいては、FX/SpectrafluorXa溶液を1.0mMSpectrafluorXaを含有する1×緩衝液A最終容量2.5mlで12チャネルディープウエルポリプロピレンプレート中に1.5倍系列希釈し、900nM、600nM、400nM、266.7nM、177.8nM、118.5nM、79.0nM、52.7nM、35.1nM、23.4nM、15.6nMおよび0nMFXの最終希釈物を得た。典型的にはアッセイ反応は、FX/SpectrafluorXa希釈物25μLを、各FIXa変異体Xase複合体25μLを含む4つのアッセイプレートに分配するようにプログラムしたBioMekFXliquidhandlingsystemを用いて開始した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった:1pMFIXa、100nMFVIIIa、100μMPC/PS小胞、0.5mMSpectrafluorXa、2nMアルファ-トロンビン阻害済、20nMヒルジンおよび0nMから450nMのFX希釈物。反応をSpectraMaxfluorescenceplatereaderにおいて30分間、37°Cでモニターした。遊離AMCの標準曲線を0μMから100μMAMCに及ぶ用量範囲を用いる続くデータ分析計算においてRFUからμMへの変換係数として利用した。B.データ分析FIXaによるFXの触媒作用の定常状態動力学を決定するために用いる全ての方程式は、参考文献PetersenetalBiochemJ225149158のZymogenActivationKineticsModulatoryeffectsoftrans4cyclohexane1carboxylicacidandpolyDlysineonplasminogenactivationに記載されたものに基づく。スキームA下を参照されたいに記載した系の定常状態動力学に関する理論は、産物の放物型蓄積parabolicaccumulationを表す方程式1の表現によって記載される。スキームAの機序により、a0は活性化プロテアーゼFIXaの濃度であり、z0は酵素前駆体FXの濃度であり、KaおよびKzは酵素前駆体の活性酵素FXaへの活性化因子触媒転換に関するKcatおよびKMを示し、KeおよびKSは所与の時間tにわたるFXaによる基質から産物への転換に関するKcatおよびKMを示す:方程式1プログレス曲線の分析のために方程式1を、蛍光発生基質のFxa加水分解の定常状態動力学を非依存的に決定し、化合物定数K2に置き換えた方程式2の形に再計算した。方程式21×緩衝液A中のSpectrofluorFXaでのFXa活性が313.0μMのKMおよび146.4s-1のKcat値を有すると非依存的に決定した。これらの値の方程式3への代入は、90s-1のK2補正係数を与えた。方程式3FIXa触媒活性の程度を決定するために、SoftMaxProapplicationMolecularDevicesで集めた生データを.XMLファイルまたは.TXTファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を自動化曲線フィッテイングおよびMicrosoftExcelspreadsheetenvironmentIDBSSoftwareでの統計分析のためのソフトウェアパッケージXLfit4で実施、またはXERunnerdataanalysismoduleIDBSSoftwareを用いるActivityBasesoftwarepackageで直接実施した。集計表テンプレートを、各FX濃度で検査したFIXa変異体の放物型反応速度parabolicreactionvelocitiesμM/秒2を方程式4に示す標準直角双曲線の関数すなわちミカエリスメンテン方程式に自動的にフィットするように設定し、VmaxおよびKMについてのフィット値を得た。方程式4次いで検査したFIXa変異体についてのKcat値を方程式5によるVmaxμM/秒2に対するフィット値から算出した。方程式5特異的定数Kcat/KMをKMのフィット値および上の方程式5の計算から生じる算出されたKcatから直接算出した。表14~19は、アッセイしたFIXa変異体それぞれについての触媒活性を記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型FIXaCatalystBiosciencesWTと称する;上の実施例1に記載のとおり生成した、血漿精製FIXaHaematologicTechnologies、Inc.およびBeneFIX登録商標[CoagulationFactorIXRecombinant、Wyeth]であった。表14~15は、触媒活性についての動力学的定数Kcat/KMM-1s-1としておよび野生型FIXaの活性の百分率として[活性は各FIXa変異体のその基質、FXに対する触媒活性、Kcat/KMM-1s-1である]表した結果を示す。個々の速度定数KcatおよびKMを表16~17および表18~19にそれぞれ示す。表15、17および19は追加的FIXa変異体についてのデータを示し、表14、16および18におけるFIXa変異体についての追加的反復実験nを含んで算出された新たな総平均を提供する。FIXa変異体の活性を野生型FIXaと比較する場合は、活性におけるいかなる差異も突然変異複数可の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体FIXaポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型FIXaポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型FIXaポリペプチドは、配列番号1において記載されるFIX遺伝子のクローニングから生成され、CHOX細胞から配列番号3において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例1において記載される組換え野生型FIXaすなわちCatalystBiosciencesWTFIXpolypeptideであった。標準偏差S.D.、変動係数百分率として;CVおよび実施アッセイ数nも各動力学的パラメーターについて提供する。FIXa変異体の観察された触媒活性は、いくつかの変異体たとえば、FIXa-F314N/H315S、FIXa-G317N、FIXa-R318N/A320SおよびFIXa-K400E/R403Eでの検出不可能なXase活性から、野生型FIXaと比較してFXの活性化についてのKcat/KMにおける10倍を超える増加までの範囲であった。触媒活性における最も大きな増加のいくつかを示したFIXa-R338E、FIXa-R338A、FIXa-T343R、FIXa-E410Nならびに、これらの組合せFIXa-R318Y/R338E/E410N、FIXa-R318Y/R338E/R402E/E410N、FIXa-R318Y/R338E/T343R/R402E/E410N、FIXa-R318Y/R338E/T343R/E410NおよびFIXa-R338E/T343Rなどを含むいくつかの変異体は、野生型FIXaと比較して顕著に増加した触媒活性を示した。単一または複数の追加的グリコシル化部位を有するいくつかのFIXa変異体は野生型活性に近いものたとえばFIXa-I251S、FIXa-D85N/I251S、FIXa-K63N、FIXa-K247N/N249SおよびFIXa-K63N/K247N/N249Sまたは、他の突然変異と組み合わされた場合に改善された活性たとえばFIXa-K247N/N249S/R338E/T343R/R403EおよびFIXa-K247N/N249S/R318Y/R338E/T343R/R403E/E410Nを示したが、他は低下した触媒活性を示した。増加した触媒活性は、KcatもしくはKMまたはより頻繁には両方のパラメーターにおける改善のためであった。表14FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態表15FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態表16FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態表17FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態表18FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態表19FIXa変異体の触媒活性†BHK21細胞において産生;E410Nの80グリコシル化形態アンチトロンビン/ヘパリン複合体によるFIXaの阻害の決定アンチトロンビン/ヘパリン複合体AT-III/へパリンによる野生型FIXaまたはFIXa変異体の阻害を、小分子基質、メシル-D-CHG-Gly-Arg-AMCPefafluorFIXa;Pentapharmに対するFIXaの触媒活性についての種々の濃度のAT-III/へパリンによる阻害のレベルを測定することによって評価した。予め定義されたアッセイ条件下でFIXa変異体の触媒活性の50阻害IC50のために必要であったAT-IIIのモル濃度に相当するK0.5値を検査した各FIXa変異体について決定する。阻害反応を低分子量ヘパリンLMWH;Calbiochemまたは全長未分画ヘパリンUFH;Calbiochemの存在下で実施した、後者は阻害速度の増加を考慮して変更したプロトコール条件を必要とする。AT-III/UFH複合体による野生型FIXaまたはFIXa変異体の阻害についての見かけの二次速度定数Kappも変更したプロトコールAT-III/UFH複合体とのインキュベーション時間を変更したを用いて直接評価した。A.アンチトロンビン/LMWH複合体によるFIXaの阻害LMWH存在下での阻害反応のために、1×緩衝液A50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.41.2mL容量中の2μMLMWHの溶液中への血漿精製ヒトAT-IIIMolecularInnovationsの20μM保存物の希釈によってAT-III/LMWH最終2μMLMWHの200nM溶液を調製した。AT-III/LMWHのこの溶液をアッセイにおける最高濃度として用いた。AT-III/LMWH溶液を少なくとも30分間、室温でインキュベートし、次いで2μMLMWHを含有する1×緩衝液Aの最終容量400μLで96ディープウエルポリプロピレンプレート中に1.5倍系列希釈し、200nM、133.3nM、88.9nM、59.3nM、39.5nM、26.3nM、17.6nMおよび0nMすなわちA-H列の希釈物を得た。合計25μLを96ウエルV底保存プレートのそれらそれぞれの列に分注し、全ての行すなわち1~12を満たした。FIXa変異体を最初に1×緩衝液A中に100nMへ希釈した。次に各100nMFIXa変異体36μLを1×緩衝液A2mL中、1.8nMの濃度へ希釈し、次いで予め定義したプレートマッププレート1枚当たりFIXa変異体4種に従ってこの溶液60μLを96ウエルV底保存プレートに分注した。アッセイ反応は、各FIXa変異体に対して計2枚の重複アッセイプレートにおいて1ウエル当たりAT-III/LMWHの各希釈物25μLを含有するプレートにFIXa溶液25μLを分配するようにプログラムしたBioMekFXliquidhandlingsystemを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は:0.9nMFIXaおよび、1μMLMWH中の0から100nMまでの範囲のAT-III希釈物であった。反応物25μLアリコートを、アッセイ緩衝液B50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4、60エチレングリコール中に1.6mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMCを1ウエル当たり25μL含有する96ウエル黒色ハーフエリアプレートにBioMekFXによって移す前に、阻害反応物を1分間、室温約25°Cでさらにインキュベートした。最終濃度5mg/mLのポリブレンヘキサジメトリンブロミドをAT-III/LMWH反応をクエンチするために緩衝液Bに添加した。FIXaの残存活性を25°Cに設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を60分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4中の0.45nMFIXa変異体、0.8mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMC、30エチレングリコールおよび5mg/mLポリブレンである。AT-III/LMWHによるFIXaまたはFIXa変異体に対する阻害の程度を決定するために、SoftMaxProapplicationMolecularDevicesで集めた生データを.XMLファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、自動化曲線フィッテイングおよびMicrosoftExcelspreadsheetenvironmentIDBSSoftwareでの統計分析のためのソフトウェアパッケージXLfit4で実施した、またはXERunnerdataanalysismoduleIDBSSoftwareを用いるActivityBasesoftwarepackageで直接実施した。テンプレートを、各実験AT-III濃度で各FIXa反復についてのAT-III希釈系列、AT-IIIのFIXaに対する比およびVi/Vo比を算出するために用いた。集計表テンプレートを、各実験AT-III濃度で各FIXa反復についてのAT-III希釈系列、AT-IIIのFIXaに対する比およびVi/Vo比を算出するために用いた。残存FIXa活性Vi/Voとして表す対AT-III濃度の非線形回帰分析をXLfit4ならびに、CAmp1-X/K0.5X;式中C=オフセットアッセイの経過において100阻害に達しないデータセットの外挿を可能にするために0に固定、Amp=フィットおよびK0.5の振幅アッセイ条件下で最大半量の阻害のために必要なAT-IIIの濃度に相当する、の形の双曲線阻害方程式を用いて処理した。いくつかのFIXa変異体について、AT-III/LMWHはAT-IIIの検査した最高濃度で総プロテアーゼ活性の10~15未満を阻害し、標準スクリーニング条件下でのアッセイについて検出の上限を表している。したがって10未満の最大阻害を有する変異体は、999nMの下限K0.5値に帰され、ほとんどの場合は報告された値より大きなAT-III抵抗性を有すると予測される。表20は、AT-III/LMWHを用いて実施したアッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたK0.5パラメーターとしておよび、野生型FIXaと比較した各変異体についてのAT-III抵抗性の程度をフィットされたK0.5値の比K0.5変異体/K0.5野生型として表す表現としての両方で表す。FIXa変異体のK0.5パラメーターを野生型FIXaと比較する場合、活性におけるいかなる差異も突然変異複数可の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体FIXaポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型FIXaポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型FIXaポリペプチドは、配列番号1において記載されるFIX遺伝子のクローニングから生成され、配列番号3において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとしてCHOX細胞から発現された実施例1において記載される組換え野生型FIXaすなわちCatalystBiosciencesWTFIXpolypeptideであった。いくつかのFIXa変異体は、野生型FIXaCatalystBiosciencesWTFIXaと比較して20倍を超えて増加したAT-IIIに対する抵抗性を示した。たとえばFIXa-R318A/R403A、FIXa-R318E/R340E、FIXa-R318A、FIXa-R318E、FIXa-K400E、FIXa-R338E/R403EおよびFIXa-K400A/R403Aは、AT-IIIに顕著な抵抗性を示す群に含まれる。表20ATIIILMWHによるFIXa変異体の阻害A999nMのK05値は、アッセイ条件下で10未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。B.アンチトロンビン/UFH複合体によるFIXaの阻害AT-III/UFH複合体未分画全長ヘパリンによるFIXa変異体の阻害を評価するために上に記載したのと同じアッセイを若干の変更を伴って用いて追加的実験を実施した。全長、未分画ヘパリンCalbiochemを、長いヘパリン鎖によって提供される鋳型効果によるFIXa変異体突然変異の阻害反応の速度増加への影響を観察するために低分子量ヘパリンLMWHの代わりに用いたたとえばOlsonetalThrombHaemost92929939を参照されたい。UFHの存在下での阻害反応のために、AT-III/UFH最終1μMUFHの70nM、600nM、2000nM、6000または10000nM溶液を、1×緩衝液A50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.41.4mL中の過剰量UFH2から20μM溶液中への血漿精製ヒトAT-IIIMolecularInnovations20μM保存物の希釈によって調製した。AT-III/UFH溶液も、1μMUFHを含有する1×緩衝液Aの最終容量460μLで96ウエルディープウエルポリプロピレンプレートにおいて1.5倍系列希釈する前に30分間、室温でインキュベートした。変更したアッセイのためのAT-IIIの最終希釈は、AT-IIIの開始濃度に依存して、70nM~0nM、600nM~0nM、100nM~0nMまたは5000nM~0nMすなわち列A~Hの範囲であった。標準条件下でAT-III阻害への増加した抵抗性を示したこれらの変異体を、さらに高い濃度のAT-IIIを用いてさらに検査した。各AT-III希釈物の合計35μLを96ウエルV底保存プレートのそれらそれぞれの列に全ての行を満たすようにすなわち1~12分注した。FIXa変異体を1×緩衝液A中に100nMに最初に希釈した。次に各100nMFIXa変異体の15μLを1×緩衝液A2.0mL中で濃度0.6nMへ希釈し、次いで同様に予め定義したプレートマッププレート1枚当たりFIXa変異体4種に従ってこの溶液70μLを96ウエルV底保存プレートに分注した。アッセイ反応は、各FIXa変異体に対して計2枚の重複アッセイプレートにおいて1ウエル当たりAT-III/LMWHの各希釈物35μLを含有するプレートにFIXa溶液35μLを分配するようにプログラムしたBioMekFXliquidhandlingsystemを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は:0.3nMFIXaおよび、1μMから10μMの範囲のUFH中に最も高いAT-III濃度に依存して35nMから0nM、300nMから0nM、1000nMから0nM、3000nMから0nMまたは5000nMから0nMの範囲のAT-III希釈物であり、ヘパリンは過剰のままであった。反応物40μLアリコートを、アッセイ緩衝液C50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4、82エチレングリコールおよび5mg/mLポリブレン中に2.5mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMCを1ウエル当たり20μL含有する96ウエル黒色ハーフエリアプレートにBioMekFXによって移す前に、阻害反応物を10秒間、室温約25°Cでさらにインキュベートした。最終濃度5mg/mLのポリブレンヘキサジメトリンブロミドをAT-III/UFH反応をクエンチするために緩衝液Cに添加した。FIXaの残存活性を25°Cに設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を60分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4中の0.2nMFIXa変異体、0.83mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMC、30エチレングリコールおよび5mg/mLポリブレンであった。データ分析をAT-III/LMWH阻害アッセイについて上に記載したとおりに実施した。LMWHで見出されたとおりAT-III/UFHは、検査した最高濃度のAT-IIIで多数のFIXa変異体について総プロテアーゼ活性の10~15未満を阻害し、それにより標準スクリーニング条件下でのアッセイについて検出の上限を表している。したがって10未満の最大阻害を有するこれらの変異体は、999nMの下限K0.5値に帰され、ほとんどの場合は報告された値より大きなAT-III抵抗性を有すると予測される。999nMのK0.5値を最初に示したいくつかのFIXa変異体を、より高いAT-III濃度で再検査し、アッセイの感度を拡げ、AT-III抵抗性の明確なレベルを提供した。これらの変異体が、最も高い検査AT-III濃度1000nMから5000nMで10未満の最大阻害をまだ維持した場合、9999nMの下限K0.5値に帰され、これらの変異体は報告された値よりも大きなAT-III抵抗性を有することが予測される。表21~22は、AT-III/UFHを用いて実施したアッセイの結果を提供する。表22は、追加的FIXa変異体についてのデータを表し、表21中のFIXa変異体についての追加的反復実験nを含んで算出した新たな総平均を提供する。結果は、フィトされたK0.5パラメーターとしておよび、野生型FIXaと比較した各変異体についてのAT-III抵抗性の程度をフィットされたK0.5値の比K0.5変異体/K0.5野生型として表す表現としての両方で表される。いくつかのFIXa変異体は、野生型FIXaと比較して100から500倍を超えて増加したAT-IIIに対する抵抗性を示した。たとえばFIXaR318AR403A、FIXaR318A、FIXaR318Y、FIXaR338AR403AFIXaD203NF205TR318Y、FIXaR318YR338ER403E、FIXaR318YR338ER403E、FIXaR318YR338EE410N、R318YR338ET343RN346YR403EE410NおよびFIXaR318YR403EE410Nは、AT-IIIに顕著な抵抗性を示すこの群に含まれる。表21ATIIIUFHによるFIXa変異体の阻害999nMのK05値は、標準アッセイ条件下で10未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。50超のWTKcatKMおよび初めに999nMのK05値を付された変異体はアッセイの感度を拡げるより高いATIII濃度で再検査された。9999nMのK05値は感度を拡げたアッセイ条件下で10未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。表22ATIIIUFHによるFIXa変異体の阻害999nMのK05値は、標準アッセイ条件下で10未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。50超のWTKcatKMおよび初めに999nMのK05値を付された変異体はアッセイの感度を拡げるより高いATIII濃度で再検査された。10000nMのK05値は感度を拡げたアッセイ条件下で10未満の阻害を有するこれらの変異体についての下限値を示す。C.アンチトロンビン/UFH複合体によるFIXaの阻害についての二次速度定数Kappの決定上の実施例5Bにおける記載と同じアッセイを若干の変更を伴って用いてAT-III/UFHによるFIXa変異体の阻害についての二次速度定数Kappを測定するために追加的実験を実施した。この方法は、伝統的である競合的な動力学的方法または不連続な方法よりも複数の変異体について同時に二次速度定数を評価するためにより適している[たとえばOlsonetalThrombHaemost92929939を参照されたい]。UFH存在下での阻害反応のために、1×緩衝液A50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.41.0mL容量中の過剰量UFH溶液2μM中への血漿精製ヒトAT-IIIMolecularInnovationsの20μM保存物の希釈によってAT-III/UFHの1000nM溶液を調製した。AT-III/UFH溶液を、2μMUFHを含有する1×緩衝液Aの最終容量500μLで96ディープウエルポリプロピレンプレートにおいて2.0倍系列希釈する前に30分間、室温でインキュベートした。変更したKappアッセイのためのAT-IIIの最終希釈物は500mM~0mMすなわち列A~Hの範囲であった。各AT-III希釈物の合計35μLを96ウエルV底保存プレートのそれらそれぞれの列に全ての行を満たすようにすなわち1~12分注した。FIXa変異体を最初に1×緩衝液A中に100nMへ希釈した。次に各100nMFIXa変異体の50μLを1×緩衝液A2.5mL中に濃度2.0nMへ希釈し、次いで上記と同様に予め定義したプレートマッププレート1枚当たりFIXa変異体4種に従ってこの溶液70μLを96ウエルV底保存プレートに分注した。アッセイ反応は、各FIXa変異体に対して計2枚の重複アッセイプレートにおいて1ウエル当たりAT-III/UFHの各希釈物35μLを含有するプレートにFIXa溶液35μLを分配するようにプログラムしたBioMekFXliquidhandlingsystemを用いて開始した。最終阻害アッセイ条件は:1.0nMFIXaおよび、1μMUFH中の500nMから0nMまでの範囲のAT-III希釈物であり、ヘパリンは過剰のままであった。阻害反応物を、予測される阻害速度定数に応じて室温約25°Cで種々の時間さらにインキュベートし、アッセイにおけるAT-IIIの最高濃度500nMで90超阻害が達成され得るように調節した。典型的なインキュベーション時間を各変異体または変異体の種類について特異的に決定したが、全般的には表23に概説したインキュベーション時間に従った。表23予測されるKapp値に基づくアッセイインキュベーション時間望まれるインキュベーション時間後、アッセイ緩衝液C50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4、82エチレングリコールおよび5mg/mLポリブレン中に2.5mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMCを1ウエル当たり20μL含む96ウエル黒色ハーフエリアプレートに反応物の40μLアリコートをBioMekFXによって移した。最終濃度5mg/mLのポリブレンヘキサジメトリンブロミドをAT-III/UFH反応をクエンチするために緩衝液Cに添加した。FIXaの残存活性を25°Cに設定した蛍光読み取り装置において基質切断の初速度を60分間追跡することによって評価した。残存活性の決定のための最終アッセイ条件は、50mMTris、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01Tween-20、pH7.4中の0.67nMFIXa変異体、0.83mMメシル-D-CHG-Gly-Arg-AMC、30エチレングリコールおよび5mg/mLポリブレンであった。ActivityBasesoftwarepackageおよびXERunnerdataanalysismoduleIDBSSoftwareを用いた実施例BにおいてAT-III/UFH阻害アッセイについて上に記載したのと類似するやり方でK0.5値を算出するためのデータ分析を実施した。実施例5Bに概説した擬一次条件下でのアッセイ設定を用いて、種々のインキュベーション時間を検査することにより、次の方程式:方程式1方程式2を用いてAT-IIIによる阻害についての見かけの二次速度定数kappを算出することが可能である。t1/2アッセイの時間によって定義されるでのK0.5=[AT-III]についてのフィット値を仮定すると、AT-IIIによる所与のFIXa変異体の阻害についてのKobsおよびそれによりKappを算出するために必要な全ての値が入手可能になる。算出されたKapp値は、文献において典型的に報告される値を示すことから本算出において1.2の一定値をもたらす阻害の化学量論S.I.における変化のいかなる潜在的影響も考慮していない[たとえばOlsonetalThrombHaemost92929939を参照されたい]。表24は、AT-III/UFHを用いて実施した二次速度アッセイの結果を提供する。結果は、フィトされたKappパラメーターとしておよび、野生型FIXaと比較した各変異体についてのAT-III抵抗性の程度をそれらのフィットされたKapp値の比Kapp野生型/Kapp変異体として表す表現としての両方で表す。いくつかのFIXa変異体は、野生型FIXaと比較して10,000~20,000倍を超えて増加したAT-IIIに対する抵抗性を示した。たとえば、FIXaR318A、FIXaR318Y、FIXaR338AR403A、FIXaR318YR338ER403E、FIXaR318YR338ER403E、FIXaK247NN249SR318YR338ER403E、FIXaR318YR338ER403E、FIXaK228NI251SR318YR338ER403EE410N、FIXaR318YR338EE410NおよびFIXaR318YR338ER403EE410Nは、AT-IIIに顕著な抵抗性を示すこの群に含まれる。表24ATIIIUFHによる阻害についての二次速度定数FIXaポリペプチドの薬物動態学的および薬力学的分析FIXa変異体ポリペプチドの薬物動態学的PKおよび薬力学的PD特性を静脈内投与後の種々の時点でのマウス血漿中の変異体FIXの量を測定することによって評価した。2種のアッセイを血漿中のFIXaを定量するために用いた。薬物動態学的特性を評価するためにELISAをマウス血漿中の総FIXタンパク質を定量するために用い、FIX依存凝固アッセイFIX欠失血漿を用いる活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイを血漿中のFIXポリペプチドの血液凝固活性を定量するために用い、薬力学的特性を評価した。動物。CharlesRiverLaboratoriesHollister、CAによって供給されたオスCD-1マウス30~40gmを処理前の少なくとも3日間隔離した。系列PK研究のために、オスCD-1マウス30~37gmに留置頸動脈血管カニューレを装着した。PDまたはPK実験に用いる前は、濾過水道水および食餌を自由摂取させた。A.投与および血液採取マウス1時点当たりN=3にFIXポリペプチドを尾静脈を介して静脈内投与PK研究用に約1.4mg/kgおよびPD研究用に約400IU/kg、用量容量2ml/kgした。投与後の適切な時点で動物を麻酔し、最終的な心穿刺を用いてクエン酸を含むシリンジに血液を抜いた0.5~1mL。十分な量のタンパク質が得られなかったいくつかの実験では、ずらして配置した時点での系列採血のために合計4~6匹だけの動物を用い、過剰な血液量を除去することなく全ての時点で採取するために全過程のそれぞれについてマウス2匹を用いた。血液は、0.9生理食塩水を含む0.1mLシリンジに少量の血液を最初に除去することによって覚醒動物を拘束して試料採取した。次いで0.1Mクエン酸ナトリウム4.5μLを含むシリンジを取り付け、血液0.05mLをシリンジに抜き、血液を1.5mLチューブに移した。最初のシリンジを再び取り付け、生理食塩水0.07mLをカニューレを通じて戻した。プロセスを繰り返す場合カニューレは次の時点まで蓋をしておいた。全ての研究に関して血液試料を採取15分間以内に遠心分離し9000rpm、8分間、4°C、血漿を除去し、直ちに液体窒素中で新鮮凍結し、分析まで凍結保存-70°Cした。A.PK評価クエン酸処理血液試料を投与後1440分までの種々の時点すなわち、投与前、2、4、10、30、60、120、240、360、480、960および1440分で最終実験のために心穿刺によってまたは系列実験のために留置カテーテルによって採取した。rFIXの血漿濃度を、検出および捕捉の抗体FIX-EIA、AffinityBiologicals、Ancaster、ONの対応する対を利用する第X因子特異的ELISAを用いて決定した。簡潔には、FIXに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体をプレートのウエルにコートする。プレートを洗浄し、FIXを含有する血漿試料を添加する。血漿試料をプレート上で1:750および1:1500に希釈する。未結合物質を除去するためにプレートを洗浄後、FIXに対するペルオキシダーゼコンジュゲート検出抗体を捕捉されたFIXに結合させるためにプレートに添加する。未結合コンジュゲート抗体を除去するためにプレートを洗浄後、化学発光基質とのインキュベーションによってペルオキシダーゼ活性が発現され、EnVisionplatereader上、425nMで読み取る。標準曲線は、濃度範囲全体にわたって直線的であり、濃度0.82pg/mlから30ng/mlに及ぶ。抗体親和性における差異を排除するためにFIX変異体それ自体を標準曲線のために用いる。各試料を2枚の別々のアッセイプレートで測定し、標準曲線の範囲内の測定値を血漿試料中のFIX変異体の濃度を算出するために用いる。PD評価。rFIXの血漿薬力学的活性を活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイおよびFIX欠乏ヒト血漿STACLOTC.K.PRESTkit、DiagnosticaStago、Asnieres、Franceを製造者の説明書に従って用いて定量した。簡潔には、aPTTアッセイには、セファリン血小板代替物および活性化因子[コアリンkoalin]存在下での血漿のカルシウム再加recalcificationが関与する。FIX欠乏ヒト血漿を用いる場合、aPTTアッセイはFIXに対して特異的である。aPTTアッセイを製造者の製品挿入物に記載のとおり実施した。簡潔にはクエン酸処理血液試料をPK評価について記載したのと同じ時点で採取した。血漿試料を、0.1ウシ血清アルブミンProbumin、Millipore、Billerica、MAを含有するTris緩衝生理食塩水中に1:100で希釈した。希釈血漿または標準物をFIX欠乏ヒト血漿およびセファリンカオリン試薬と合わせ、180秒間インキュベートした。血液凝固をカルシウムCaCl2の添加によって開始させた。秒数での血液凝固時間をSTArt4instrumentDiagnosticaStago、Asnieres、Franceを用いて測定した。既知の濃度のrFIXから作成した標準曲線を用いて血漿FIX濃度を対数濃度対対数時間標準曲線プロットから内挿し、次いでバックグラウンドFIX活性投与前動物からを減算した。第IX因子活性についての定量の下限は約10ng/mLであった。PDおよびPKデータ分析。rFIX変異体でのマウス研究からのPDaPTTおよびPKELISAパラメーターをWinNonLinv5.1、PharsightCorp.、MountainView、CAでの非コンパートメント解析を用いて算出した。rFIX変異体のPDおよびPKの両方は、見かけの双指数関数的血漿減衰biexponentialplasmadecayに従った。検査した各変異体について選択されたパラメーターをPDaPTTアッセイを用いたに関しては表25に、PKELISAアッセイを用いたに関しては表26~27に提供する。表26は、追加的FIXa変異体に関するデータを示し、表26のFIXa変異体についての追加的実験反復nを含んで算出された新たな総平均を提供する。PDパラメーターは、ハーフタイム終末、分、MRTMRT0-inf、分、曲線下面積AUC0~最終分μg/mL/用量mg/kg;最大濃度Cmax;μg/mL/用量μg/kg、VdmL/kgおよびクリアランスCl、mL/min/kgを含んだ。薬物動態学的パラメーターを算出するために用いた定義および式血漿半減時間血漿FIX濃度対時間プロファイルの終末相でのFIXポリペプチドの半減期;T1/2β血漿FIX濃度対時間曲線の対数直線プロットの終末相における負勾配で割った-ln2として算出;MRT0-lastは身体に存在するFIXポリペプチドの平均時間であり;AUMC0-last/AUC0-lastとして算出される式中AUMC0-lastは初期モーメント対時間曲線の下の総面積であり、以下でAUCと記載される;AUC0-last/用量は[AUC0-t]として算出され、式中tはIV用量mg/kgで割ったFIXポリペプチドの測定可能な血漿濃度での最終時点であり;AUC0-inf/用量は[AUC0-tCt/ln2/T1/2β]として算出され、式中tはIV用量mg/kgで割ったFIXポリペプチドの測定可能な血漿濃度を有する最終時点であり;Cmax/用量mg/kg当たりug/mL、Cmaxは最大に測定された血漿FIX濃度に対応する投与後時間であり;Clは用量/AUC0-infとして算出される全身クリアランスであり;Vssは定常状態分布容積であり;MRTClとして算出され;VZは終末排出定数terminaleliminationconstantβに基づく分布容積であり;Cl/ln2/T1/2βとして算出される。表25aPTTアッセイによって評価したFIX変異体のPD特性表26ELISAによって評価したFIX変異体のPK特性E410Nの80グリコシル化形態表27ELISAによって評価したFIX変異体のPK特性FIXポリペプチドの凝血促進活性のインビボ評価FIX欠損マウスFIX-/-マウスを用いる血友病BのマウスモデルをFIXポリペプチドの凝血促進活性を評価するために確立した。マウスをFIXポリペプチドで処理し、20分間に失われた血液量をFIXポリペプチドの凝血促進活性を決定するために測定した。A.野生型FIX凝血促進活性のインビボ評価オスFIX-/-マウスをケタミン/キシラジンカクテル生理食塩水中45mg/mlおよび3.6mg/mlの腹腔内投与によって麻酔し、体温降下が生じないことを確実にするために温めたプラットホーム39°C上に置いた。処置室を温度82Fに維持した。尾部切断の10分前に尾部を予め温めたPBS、10mLに浸漬した15mL遠心管;39°C。7から15匹のマウスに組換えヒトFIX[Benefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinant、Wyeth]またはBenefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantと同じである緩衝液0.234塩化ナトリウム、8mML-ヒスチジン、0.8ショ糖、208mMグリシン、0.004polysorbate80に希釈した修飾FIXポリペプチドを一回注射で尾静脈を介して注射した。マウスの陰性対照群は緩衝液だけを受けた。注射し損ねた場合は、動物を研究から排除した。FIXポリペプチドまたは緩衝液の注射は、尾部切断の5分前に行った。尾部切断はカミソリ刃を用いて尾部末端から5mmで行い、血液をPBS中に20分間採取した。採取期の最後に総失血を評価した。採取チューブを混合し、各試料の1mLアリコートを取り、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Triton-Xを滅菌水中、1対4に希釈し、100μLを1mL試料に添加して溶血させた。次いで試料の吸光度を546nmの波長で測定した。失血量を算出するために、PBS中に希釈し、Triton-X100で上のとおり溶血させた既知の容量のマウス血液の546nmでの吸光度を測定することによって作成した標準曲線に対して吸光度を読み取った。値を平均値±SEMとして表す。1.野生型FIX血液凝固活性を評価する用量反応研究FIX-/-マウスにおいてBenefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantの0.03、0.1、0.3および1mg/kgでの血液凝固活性を評価するための用量反応研究を実施した。この実験において、緩衝液のみの群における失血は835.42±24.55μlであり、0.1、0.3および1mg/kgでのBenefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinant処理によって顕著に減少した[558.59±56.63μL、415.81±66.72μLおよび270.75±57.48μLへ;クラスカル-ワリスに続くダンポストテストDunn’sposttestを用いてp<0.05]。0.03mg/kgの検査した最低用量では値は731.66±59.16μLであった。非線形回帰を用いて算出したED50値を下の表28に示す。2.FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N、FIXa-R318Y/R338E/E410NおよびFIXa-Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410Nの血液凝固活性を評価する用量反応FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410NキモトリプシンナンバリングによるR150Y/R170E/R233E/E240N、FIXa-R318Y/R338E/E410NキモトリプシンナンバリングによるR150Y/R170E/E240NおよびFIXa-Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410NキモトリプシンナンバリングによるY[155]F/K82N/N84S/R150Y/R170E/R233E/E240Nの血液凝固活性を様々な用量で評価した用量反応研究を実施した。FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410Nでの処理は、失血の顕著な抑制を0.01、0.03、0.1、0.3および1mg/kgそれぞれ434.65±73.75μL、497.28±50.92μL、230.81±39.67μL、261.94±58.79μLおよび251.56±41.81μLにおいて緩衝液のみの対照と比較して811.45±26.63μL;クラスカル-ワリスに続くダンポストテストを用いてp<0.05もたらした。0.003mg/kgに用量を減少させると、失血値は対照レベルに近い786.83±44.39μLになった。FIXa-R318Y/R338E/E410Nでの処理も失血の顕著な抑制を0.03、0.1、0.3および1mg/kgそれぞれ571.67±50.45μL、425.42±43.65μL、263.47±42.66μLおよび78.19±13.42μLにおいて緩衝液のみの対照と比較して845.14±23.63μL;クラスカル-ワリスに続くダンポストテストを用いてp<0.05もたらした。0.001mg/kgに用量を減少させると、失血値は対照レベルに近い777.16±53.72μLになった。FIXa-Y155F/K247N/N249S/R318Y/R338E/R403E/E410Nでの処理は、検査した突然変異体での失血の最も顕著な抑制:0.01、0.03および0.1mg/kgにおいてそれぞれ460.03±74.60μL、393.48±75.16μLおよび157.28±28.89μLを、緩衝液のみの対照と比較して851.44±44.25μL;クラスカル-ワリスに続くダンポストテストを用いてp<0.05もたらした。非線形回帰を用いて算出したED50値を下の表28に示す。表283.野生型FIX血液凝固活性を評価する反応持続時間Benefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantの0.5mg/kgでの効果の持続時間を評価する研究をFIXー/-マウスで実施した。尾部切断の48時間、24時間、16時間、8時間、2時間、30分および5分前にマウスに静脈投与した。この実験において対照群を0抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は5分、30分、2、4、8、16、24および48時間においてそれぞれ、媒体対照から59.7±11.9、48.25±12.84、57.74±9.10、56.04±8.46、32.09±7.92、12.94±7.33、38.75±11.47および0.64±11.3であった平均値およびSEM、n=マウス8~33匹、実験3回から。4.FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N血液凝固活性を評価する反応持続時間FIXa-R318Y/R338E/R403E/E410Nの0.5mg/kgでの効果の持続時間を評価する研究をFIX-/-マウスで実施した。尾部切断の96時間、72時間、48時間、32時間、24時間、16時間、8時間、4時間、2時間、30分および5分前にマウスにi.v.投与した。この実験において対照群を0抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、5分、30分、2、4、8、16、24、32、48、72および96時間においてそれぞれ媒体対照から93.26±2.04、96.30±3.70、85.86±6.52、69.4±9.92、89.05±3.69、78.48±8.71、63.33±6.70、47.97±10.07、3.1±8.22、-13.52±10.59および-12.82±7.31であった平均値およびSEM、n=マウス8~45匹、実験4回から。FIX-/-マウスについての注:マウスのFIXノックアウト群体はオスFIXノックアウトマウス由来の凍結保存精子を用いたインビトロ受精によって作製した。FIXノックアウト対立遺伝子を有する動物を選択するためにPCRに基づくプロトコールを用いて全ての子孫を遺伝子型同定した。これらの動物のさらなる交配およびそれらの子孫PCRに基づく遺伝子型同定後は、PCRによって確認されたとおりFIXノックアウト動物すなわち、FIX遺伝子がX染色体上にあることからヘミ接合性のオスおよびホモ接合性のメスを産生した。この初期FIX群体の全てのメンバーの遺伝子型のPCR確認後、真のノックアウト動物はノックアウト子孫だけを産生できることから、全群体の子孫のPCR確認を終了した。しかし群体から引退した種畜を何度か遺伝子型同定した。全ての群体の子孫の遺伝子型同定を終了したおよそ7カ月後、引退した種畜の遺伝子型同定は、群体における非ノックアウトまたは野生型動物の存在を明確に示した。この結果に基づいて、ノックアウト群体の全てのメンバーを遺伝子型同定し、全ての非ノックアウト動物を同定し、群体から排除した。群体遺伝子型同定の結果は、不十分なDNA調製のためにオスマウスの19が野生型であり、オスマ動物の4が不明確であることを示した。野生型および不明確なオスおよびメスの両方を群体から排除した。したがってFIXノックアウト群体にはある時点で1匹または複数匹の非ノックアウト動物が混入し、したがって群体のオスの19~23の間まで時間と共に増加した野生型FIX遺伝子を含有するわずかな非ノックアウト動物が含まれていたインビボ実験はオスマウスだけを用いる。この応用において作成および報告されたFIXデータに関して、全てのインビトロデータは影響を受けない。インビボデータに関しては、混入が全ての化合物に同様に影響し、したがって変異体の序列またはそれらのBeneFIXとの比較のいずれにも影響しないことが推定および予測される。混入した動物が内在性FIXを既に有したことから、有効性および持続時間実験においてそれらは、真の血友病動物よりも少ない血液を失い、外来性FIXの投与からより少ない利益を得ており、したがって全ての化合物に関するデータの拡散または可変性を増加させた。混入は、全ての化合物を実際よりもわずかに低い強度に見せた場合もあったが、BeneFIXに対するそれらの比は変更されないすなわち本発明者らのリード分子の強度および持続時間の利点は影響されない。B.野生型FIX凝血促進活性のインビボ評価-新規群体データ下に記載するデータは、上に記載の確認済FIX-/-マウスから再構築した新規群体由来である。マウスを種畜として用いる前に遺伝子型同定によって二重に確認した。下に記載する全てのデータは、両親が二重に確認された繁殖単位から生まれたマウス由来である。全ての交替用種畜も新たな繁殖単位の開始前にFIX-/-として二重確認される。オスFIX-/-マウスをケタミン/キシラジンカクテル生理食塩水中45mg/mlおよび3.6mg/mlの腹腔内投与によって麻酔し、体温降下が生じないことを確実にするために温めたプラットホーム39°C上に置いた。処置室を温度82Fに維持した。尾部切断の10分前に尾部を予め温めたPBS、10mLに浸漬した15mL遠心管;39°C。7から15匹のマウスに、組換えヒトFIX[Benefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinant、Wyeth]またはBenefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantと同じである緩衝液0.234塩化ナトリウム、8mML-ヒスチジン、0.8ショ糖、208mMグリシン、0.004polysorbate80に希釈した修飾FIXポリペプチドを一回注射で尾静脈を介して注射した。マウスの陰性対照群は緩衝液だけを受けた。注射し損ねた場合は、動物を研究から排除した。FIXポリペプチドまたは緩衝液の注射は、尾部切断の5分前に行った。尾部切断はカミソリ刃を用いて尾部末端から5mmで行い、血液をPBS中に20分間採取した。採取期の最後に総失血を評価した。採取チューブを混合し、各試料の1mLアリコートを取り、ヘモグロビン含有量についてアッセイした。Triton-Xを滅菌水中、1対4に希釈し、100μLを1mL試料に添加して溶血させた。次いで試料の吸光度を546nmの波長で測定した。失血量を算出するために、PBS中に希釈し、Triton-X100で上のとおり溶血させた既知の容量のマウス血液の546nmでの吸光度を測定することによって作成した標準曲線に対して吸光度を読み取った。値を平均値±SEMとして表す。1.FIX血液凝固活性を評価する用量反応研究Benefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantおよびFIXポリペプチドの血液凝固活性をFIX-/-マウスにおいて用量を変化させて評価するための用量反応研究を実施した。これらの実験におけるED50値を非線形回帰を用いて算出し、下の表29に示す。表29用量反応ED50値2.野生型FIX血液凝固活性を評価する反応持続時間Benefix登録商標CoagulationFactorIXRecombinantの0.5mg/kgでの効果の持続時間を評価するための研究をFIXー/ーマウスで実施した。尾部切断の48時間、32時間、24時間、16時間、8時間、4時間、2時間および5分前にマウスに静脈投与した。この実験において対照群を0抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、5分、2、4、8、16、24、32および48時間においてそれぞれ媒体対照から68.6±5.8、64±6.98、54.7±6.13、43.4±6.86、13.7±5.53、24.9±6.11、11.7±4.88および5.6±4.17であった平均値およびSEM、n=マウス10~35匹、実験3回から。3.FIXポリペプチド凝血促進活性を評価する反応持続時間FIXポリペプチドの0.5mg/kgでの効果の持続時間を評価するための研究をFIXー/ーマウスで実施した。尾部切断の72時間、48時間、32時間、24時間、8時間および5分前にまたは尾部切断の72時間、48時間、および1時間前にマウスにi.v.投与した。これらの実験において対照群を0抑制と設定して対照群からの抑制を決定した。失血の抑制は、抑制平均値およびSEMとして表30に示す。表30失血の抑制FIXaのその補因子第VIIIa因子への機能性補因子結合KD-appの決定基質第X因子FXの存在下またはその飽和での補因子第VIIIa因子FVIIIaに対するFIXa変異体の機能性補因子結合KD-appを、FIXaによる活性化で生じるFXaの合成基質SpectrafluorFXaでの活性をアッセイすることによる蛍光発生アッセイにおいて間接的に評価した。補因子FVIIIaが活性化プロテアーゼFIXaの濃度より少なくとも1000倍過剰であるFVIIIa濃度の範囲を見かけの動力学的速度定数KD-appを算出するために用いた。実験は、基質FXの飽和レベルで触媒活性を評価する前に、テナーゼXase複合体を形成するリン脂質小胞の存在下でFIXaと補因子FVIIIaを種々の濃度で予めインキュベートする実施例4基質、第X因子に対するFIXaの触媒活性の決定に記載したアッセイの変形であるように設計した。簡潔には、活性化および活性部位滴定されたFIXaをカルシウム含有緩衝液中でリン脂質小胞とインキュベートし、別に組換えFVIIIをアルファ-トロンビンで活性化するFVIIIaに。次いでアッセイ開始前に、アルファ-トロンビンの活性を高度に特異的なトロンビン阻害物質、ヒルジンの添加によってクエンチした。次いでFIXa変異体をXase複合体を形成するように様々な濃度のFVIIIaと混合し、次にアッセイを開始するために飽和濃度のFXおよび蛍光基質SpectrafluorFXaCH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMCと混合した。FXaによるSpectrafluorFXaの触媒作用に続く遊離フルオロフォア、AMC7-アミノ-4-メチルクマリンの放出を次いで連続的経時的に評価し、FIXa変異体の動力学的速度定数を決定した。A.アッセイプロトコール種々のFVIIIa濃度およびリン脂質の存在下でFIXaによるFX活性化の動力学的速度を評価するアッセイのために、最初に組換えFVIIIKogenateFS登録商標;Bayerhealthcareを添付の希釈剤1mL中に再懸濁した。次いでFVIIIのモル濃度を吸光係数1.567mg-1mLcm-1および分子量163.6kDaを用いて280nmでの吸光度によって決定した。FIX変異体を上の実施例1~3において記載したとおり発現、精製、活性化および活性部位滴定した。次いでFIXa変異体を1×緩衝液A20mMHepes/150mMNaCl/5mMCaCl2/0.1BSA/0.1PEG-8000、pH7.41mL容量中に8pM4×の濃度に系列希釈した。リン脂質の存在下でのFVIIIのFVIIIaへの活性化のための調製物において、アルファ-トロンビンHeamatologicTechnologies、Inc.およびヒルジンAmericanDiagnosticaを製造者の保存濃度から1:100に1×緩衝液A中へそれぞれ希釈した。再構成したFVIIIを、400μMの新鮮再懸濁リン脂質[75ホスファチジルコリンPC/25ホスファチジルセリンPS;PS/PC小胞直径約120nm;AvantiPolarLipids]を含有する1×緩衝液A1.6mL容量中に濃度1600nM最高用量の4×へさらに希釈した。上のFVIII/PC/PS溶液を最終濃度15nMのアルファ-トロンビン溶液と混合し、続く15分間、25°CでのインキュベーションによってFVIIIをFVIIIaに活性化した。次に、400μMPC/PS小胞を含有する1×緩衝液A中への活性化FVIIIa最終用量0.5mLの12チャネルディープウエルポリプロピレンプレートにおける1.5倍系列希釈を開始する前に活性化反応を最終濃度150nMへのヒルジンの5分間、25°Cでの添加によってクエンチした。FVIIIa×4の最終濃度は、12点アッセイについて1600nM、1066.7nM、711.1nM、474.1nM、316.1nM、210.7nM、140.5nM、93.6nM、62.43nM、41.6nM.27.8nMおよび0nMであり、代替的な2倍希釈系列での8点アッセイについて;1600nM、600nM、400nM、200nM、100nM、50nM、25nMおよび0nMであった。FVIIIaの希釈系列を、次に4×FIXa希釈物各12.5μLと1:1で96ウエルハーフエリア黒色アッセイプレートにおいて、予め定義したプレートマップFIXa変異体4種/プレートに従って混合し、種々の濃度のFVIIIaとXase複合体を形成するように15分間、25°Cで予めインキュベートした。最終2×溶液25μLは次のとおり:4pMFIXa変異体、1600~0nMFVIIIa、200μMPC/PS小胞、7.5nMアルファ-トロンビン阻害済および75nMヒルジン。活性部位滴定し、DFP/EGR-cmk処理したFX上の実施例2を参照されたいの1000nM×2の溶液を1.0mMSpectrafluorXa基質を含有する1×緩衝液A20mL中に調製し、4種のアッセイのために十分な容量を提供した。これは実施例4、表16に報告したKM値より少なくとも5~20倍高いFXの2×飽和濃度を示した。典型的にはアッセイ反応は、FX/SpectrafluorXa希釈物25μLを、各FIXa変異体およびFVIIIa希釈物Xase複合体25μLを含む4枚のアッセイプレートに分配するようにプログラムしたBioMekFXliquidhandlingsystemを用いて開始した。アッセイにおける試薬の最終濃度は、次のとおりであった:2pMFIXa、400~0nMFVIIIa、100μMPC/PS小胞、0.5mMSpectrafluorXa、3.8nMアルファ-トロンビン阻害済、38nMヒルジンおよび500nMのFX。反応を、SpectraMaxfluorescenceplatereaderにおいて30分間、37°Cでモニターした。遊離AMCの標準曲線を0μMから100μMAMCに及ぶ用量範囲を用いる続くデータ分析計算においてRFUからμMへの変換係数として利用した。B.データ分析FIXa変異体のFVIIIaに対する機能的親和性をそれらの触媒活性に基づいて決定するために、SoftMaxProapplicationMolecularDevicesで集めた生データを.TXTファイルとして出力した。さらなる非線形データ分析を、XERunnerdataanalysismoduleIDBSSoftwareを用いるActivityBasesoftwarepackageで直接実施した。データ分析は、若干の変更を伴って本質的に実施例4Bにおいて記載のとおりであった。Aベーステンプレートを、各FVIIIaX濃度で検査したFIXa変異体の放物型反応速度μM/秒2を方程式1に示す標準直角双曲線の関数すなわちミカエリスメンテン方程式に自動的にフィットするように設定し、VmaxおよびKD-appのフィット値を得た。方程式1表31は、アッセイしたFIXa変異体それぞれについての機能的親和性KD-appを記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型FIXaCatalystBiosciencesWTと称する;上の実施例1に記載のとおり生成した、血漿精製FIXaHaematologicTechnologies、Inc.およびBeneFIX登録商標[CoagulationFactorIXRecombinant、Wyeth]であった。表XXは、親和性に関する動力学的定数KD-appnMとして、およFIXa変異体と比較した野生型FIXaの機能的親和性の比として各FIXa変異体の機能的親和性は、基質FXの活性化についてのKD-appnMによって定義される表した結果を示す。FIXa変異体の活性を野生型FIXaと比較する場合は、活性におけるいかなる差異も突然変異複数可の結果であり、たとえば異なる発現系に関連する翻訳後修飾における差異の結果ではないことを確実にするために変異体FIXaポリペプチドについて用いたのと同じ条件を用いて発現および精製した組換え野生型FIXaポリペプチドと比較した。したがって比較に用いた野生型FIXaポリペプチドは、配列番号1において記載されるFIX遺伝子のクローニングから生成され、CHOX細胞から配列番号3において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例1において記載される組換え野生型FIXaすなわちCatalystBiosciencesWTFIXpolypeptideであった。標準偏差S.D.、変動係数百分率として;CVおよび実施アッセイ数nも提供する。いくつかの変異体は、野生型と類似の親和性またはKD-appにおける名目上の増加を示したがたとえば、FIXa-R318Y/R338EおよびFIXa-R318Y/R338E/R403E/E410N、いくつかの変異体は、KD-appにおける6~10倍を超える増加を有する機能的親和性における顕著な増加を表した。突然変異R338E、T343RおよびE410Nの組合せを有する変異体は、機能的親和性において最も大きな改善を示した。たとえば、FIXaR338ET343R、FIXaR318YR338ET343RE410N、FIXaR318YR338EE410N、FIXaY155FK247NN249SR318YR338ET343RR403EE410N、FIXaR338EE410NおよびFIXaK228N247NN249SR318YR338ET343RE410Nはこの群に含まれる。表31FIXa変異体の機能的補因子親和性血友病B血漿中のFIX変異体の凝固活性の決定FIX変異体についての凝固活性を、製造者の説明書に従って、1未満凝固活性を有する単一のドナー由来のヒト血友病B血漿GeorgeKingBio-Medical,Inc.、OverlandPark、Kansasにおける活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTアッセイによって決定した。簡潔には、aPTTアッセイには、精製リン脂質血小板代替物ならびに活性化因子[カオリンおよびスルファチドsulphatide]の混合物の存在下での血漿のカルシウム再加が関与する。最終濃度100nM、10nMまたは1nMでFIX変異体を血友病B血漿に添加したFIX変異体と共にDapttin登録商標TCaPTTreagentTechnocloneGmbH、Vienna、Austriaを本質的に製造者の製品挿入物に記載のとおり用いてaPTTアッセイを実施した。簡潔には、FIX変異体を活性部位滴定した酵素前駆体濃度実施例2に基づいて1×緩衝液A20mMHepes/150mMNaCl/0.5BSA、pH7.4中に1μMへ希釈した。次にFIX変異体をクエン酸処理ヒト血友病B血漿GeorgeKingBio-Medical中へ100nM、10nMおよび1nMに直接系列希釈した。血漿中の各FIX希釈物の100μL容量をDapttin登録商標TCaPTTreagent100μLと混合し、37°C、180秒間インキュベートした。血液凝固を25mMカルシウムDiagnosticaStago、Asnieres、France100μLの添加によって開始した。秒数での血液凝固時間をSTArt4instrumentDiagnosticaStago、Asnieres、Franceを用いて測定した。各実験は、典型的には5CV未満を示す2種の独立した凝固時間測定値の平均を示す。表32は、アッセイした各FIX変異体についての凝固活性を記載する。同様にアッセイしたのは組換え野生型FIXaCatalystBiosciencesWTと称する;上の実施例1に記載のとおり生成したおよびBeneFIX登録商標[CoagulationFactorIXRecombinant、Wyeth]であった。表XXは、検査した3種のFIX濃度;100nM、10nMおよび1nM[各FIX濃度はプールされた正常血漿PNPにおけるFIXの正常濃度の約100、約10および約1を表す]それぞれにおいて凝固するまでの時間として表す結果を示す。同一のアッセイ条件下で、100PNPは、31.3±2.0秒の凝固時間を示し、血友病B血漿中のPNPの10および1希釈物についての凝固時間は、それぞれ42.7±1.7および55.0±4.7秒であるn=4。これらの分析において用いられた血友病B血漿について凝固までの時間は、83.2±9.2秒と評価されたn=5。検査した変異体の多くは、野生型FIXaと比較して類似のまたはわずかに延長した凝固時間を実証し、ここで比較のために用いられた野生型FIXaポリペプチドは、CHOX細胞から配列番号3において記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして発現された実施例1において記載される組換え野生型FIXaすなわちCatalystBiosciencesWTFIXpolypeptideであった。一方いくつかの変異体は、顕著に短縮された凝固時間を示した。この群に含まれる変異体は、FIXaR318YR338ET343R、FIXaR318YR338EE410N、FIXaR338ET343RE410N、FIXaR318YR338ET343RE410N、FIXaK247NN249SR338ET343RE410NおよびFIXaK228N247NN249SR318YR338ET343RE410Nである。表32血友病B血漿におけるFIX変異体の凝固活性変更が当業者に明らかであることから、本発明が添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。"