以下の工程を含む、T細胞集団を検出、弁別及び定量する方法:a個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程であって、前記体液が抗原提示細胞APC及びT細胞を含む、前記工程;b前記第一のアリコートを前記少なくとも1つの抗原と一定の時間インキュベートする工程;c前記個体の体液の第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない第二のアリコートにおいて、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RTqPCRを用いて、特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程;及びd検出されたAPCのマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによってT細胞集団を検出及び定量する工程。工程cでさらに別に、少なくとも1つの第二のマーカーが前記第一及び第二のアリコートで検出され、ここで前記第二のマーカーはT細胞自体の誘導マーカーであり、さらに工程dが、APCの第一の検出マーカー及びT細胞の第二のマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程を含む、請求項1に記載の方法。第二のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる、さらに別の工程a’を工程aに含み、さらに前記第二のアリコートを一定の時間インキュベートする、さらに別の工程b’を工程bに含み、ここで工程b’の一定の時間は工程bの時間とは異なり、さらにRTqPCRによって第一及び第二のアリコートで第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程c’を工程cの代わりに含み、工程dを含む、請求項1又は2に記載の方法。工程c’が第一及び第二のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程を含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。体液のアリコートが、APCのみを含むアリコートA及びT細胞を含むアリコートBに分けられ、さらに工程aが、アリコートAを少なくとも1つの抗原と接触させる工程a1及び、少なくとも1つの抗原と接触させたアリコートAをアリコートBと接触させる、後続工程a2を含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。T細胞集団がナイーブT細胞、活性化T細胞又はメモリーT細胞を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。T細胞集団のT細胞が、CD4T細胞、Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞、CD4CD25調節性T細胞、Th3細胞、CD8T細胞、CD4CD8細胞傷害性T細胞、CD4CD8T細胞、CD161NKT細胞及び/又は多様なT細胞の混合物である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。体液が、血液、脳脊髄液、リンパ、心膜液、気管支洗浄液、骨髄吸引物、リンパ組織懸濁物又は精製PBMC集団である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。抗原がペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、RNA又はDNAである、請求項1から8のいずれかに記載の方法。抗原が、細菌、ウイルス、植物、動物、真菌又は寄生虫の抗原である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。抗原が、PSA、HER2neu、ムチン1、MAGE、CEA、ミエリン塩基性タンパク質MBP、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質MOG、ミエリンプロテオリピドタンパク質PLP、ミエリン、インスリンB、プレプロインスリン、IA2、GAD65、Hsp60、ESAT6、CFP10、TB77、TB376、MPT63、ツベルクリンPPD、VlsE、p58BBQ03、p14、p2124OspC、p3738FlaA、p41、p19OspE、p18、Crasp3、BB0323、p26OspF、p28OspD、p30、p39BmpA、p6065共通抗原、Hsp60、p83100、p17Osp17、p3132OspA、p34OspB、ボレリア脂質、ボレリア株の溶解物、Pr55gag、p24、p17、POL、RT、nef、pp65、IE1、IE2、BZLF1、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、ORF1、ORF4、PRF62、ORF68、HBsAg、HBcAg及びAdV5から成る群から選択される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。工程aの接触及び工程bのインキュベーションの時間が0から72時間、好ましくは4、6又は8時間である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。APCの第一のマーカー及びT細胞の第二のマーカーが、それぞれ核酸又はタンパク質、特にRNA、DNA、核酸フラグメント、ペプチド又はペプチドフラグメントであり、さらに少なくとも1つの抗原との前記接触及びインキュベーションによって誘導される、請求項1から12のいずれかに記載の方法。APCのマーカーが、41BBリガンド41BBL、OX40リガンドOX40L、TNFSFCD70、B71CD80、B72CD86、FcγRIIICD16、FcγRIICD32、FcγRICD64又はTNFTNFレセプター若しくは免疫グロブリンスーパーファミリーのさらに別の代表例である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。T細胞のマーカーが、INFβ、INFγ、TNFα、IL2、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、GMCSF、TGFβ、MIP1a、MIP1b、41BB、CD25、パーフォリン及び/又はグランザイムである、請求項1から14のいずれかに記載の方法。工程c及びdの検出及び定量が、さらにPCR、定量PCRqPCR、マイクロアレイ、FACS、ELISpot又はELISAを用いることによって実施される、請求項1から15のいずれかに記載の方法。抗原及びマーカー増幅用プライマー対を含む、請求項1から16のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。本発明の関係では、T細胞集団は特定の表現型を有する一定のT細胞グループであると理解される。本発明のT細胞集団は、特にナイーブT細胞、活性化T細胞及びメモリーT細胞である。本発明の関係では、T細胞という用語は、Tリンパ球、例えばCD4T細胞若しくはCD8T細胞又はCD4T細胞及びCD8T細胞のようなそれぞれのT細胞を指すと理解される。本明細書では、CD4T細胞のグループは、Tヘルパー細胞、例えばTヘルパー1Th1細胞、Tヘルパー2Th2細胞、Tヘルパー17Th17細胞、CD4CD25調節性T細胞Treg、Tr1細胞及びTヘルパー3Th3細胞を包含する。CD8T細胞のグループは、CD4CD8細胞傷害性T細胞、及びCD4CD8表現型CD4CD8dim、CD4dimCD8bright又はCD4hiCD8hiを示すT細胞を含む。本発明の関係では、ナイーブT細胞は、一定の抗原特異性を示すが、未だその抗原と最初の接触をもたないT細胞であると理解される。ナイーブT細胞、例えばナイーブCD4T細胞はそれらの表面のマーカーとして例えばCD45RAを示す。本発明の関係では、活性化T細胞は、T細胞レセプターの最初の抗原接触によって刺激される最初の抗原チャレンジの前のナイーブ状態と共通基盤上にあるT細胞であると理解される。MHC分子上で提示されるペプチドのT細胞レセプターによる認識は、いわゆるT細胞レセプターの架橋を生じる。T細胞活性化のためのさらに別の前提条件は第二のシグナルである。このシグナルは、T細胞と同様にAPCにもある共刺激分子及びそれらのリガンドの相互作用によって媒介される。この活性化は、T細胞内におけるシグナルカスケード及び最終的には増殖及び多様なエフェクター機能の発達を生じる。加えて、活性化T細胞は、特徴的な表面分子例えばCD40リガンド、41BB、CD69及び/又はCD25の一過性発現を特徴とする。専門的抗原提示細胞の表面における最初の抗原接触の後にナイーブT細胞から活性化T細胞へと向かう活性化はまたプライミングと称される。活性化T細胞という用語はエフェクターT細胞という用語と同義であり、その抗原との復活接触によって特異的に再活性化されたメモリーT細胞もまた含む。本発明の関係では、メモリーT細胞は、既に特異的抗原と接触したT細胞であると理解される。メモリーT細胞は特別な表面マーカー例えばCD45RO、CD44及びLセレクチンを特徴とする。本発明の関係では、抗原提示細胞APCは、ポリペプチドを取り込み、それらをプロセッシングし、さらに前記ポリペプチドのフラグメントいわゆるエピトープをMHCI及びMHCIIと一緒に免疫系に提示することができる細胞を指すと理解される。抗原提示細胞という用語は、特にいわゆる専門的抗原提示細胞例えば樹状細胞DC、単球及びマクロファージ、非専門的APC例えばB細胞以外にもまた、血管内皮細胞、皮膚の線維芽細胞、胸腺又は甲状腺の上皮細胞、脳のグリア細胞、膵臓のベータ細胞とともに血管の内皮の細胞も含む。非専門的APCは、T細胞との相互作用のために必要とされるクラスI及びIIのMHC分子を、サイトカイン例えばIFNγによる活性化の後でのみ発現する。加えるに、T細胞はまたAPCとして機能できる。これらのAPCT細胞は、APC特に樹状細胞DCと接触することによって、共刺激分子例えばCD80、CD40リガンドCD40L、OX40リガンドOX40L及び41BBリガンド41BBL、TNFSF9と同様にMHCクラスI及びクラスII分子の細胞内移転によって作出される。本発明の関係では、APCのマーカー及びT細胞のマーカーは、それぞれ核酸特にRNA又はDNA又は核酸フラグメントであると理解される。さらにまた、APCのマーカー及びT細胞のマーカーはまた、それぞれペプチド、オリゴペプチド又はタンパク質でもあると理解される。本発明によれば、APC上でMHC分子と複合体を形成した抗原の活性化T細胞による特異的認識の後で、マーカーの発現の増加又は低下が検出できることが予想される。本発明によれば、したがって、APCのマーカーは活性化T細胞とAPCとの抗原特異的相互作用によって誘導され、それによって検出及び定量できるようになると予想される。本発明の関係では、マーカーが誘導される又はマーカーの誘導は、それぞれマーカーの発現の変化であると理解される。マーカーが核酸である事例では、本発明によれば、誘導は例えば遺伝子のmRNAの生成の増加又は低下であると理解される。さらにまた本発明によれば、誘導は、遺伝子の、例えばメチル化の手段による調節であると理解される。さらにまた本発明の関係では、誘導されるは、タンパク質の発現が増加又は低下することを指すと理解される。この結果として、タンパク質の発現は細胞上及び細胞においてすなわち細胞内で生じ得る。本発明の関係では、抗原は特にタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであると理解される。抗原は特にポリペプチド配列であり、APCによって取り込まれ、プロセッシングされ、さらにそのフラグメントいわゆるエピトープはMHC分子上でT細胞に提示される。抗原はまた特にペプチドであり、MHC分子と一緒にT細胞に提示される。加えるに、抗原は、ポリペプチドをコードするRNA、DNA又は発現プラスミドであると理解される。本明細書で用いられる発現プラスミド又は発現ベクターという用語は、細胞に核酸を導入し発現させるために人工的に作出された構築物を指す。発現ベクターは、例えば細菌プラスミド及びMIDGES、ウイルス誘導プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、又は人工的に作製された核酸、例えば人工染色体である。ベクターはさらにまた1つ以上の選別マーカーを含むことができる。本発明の関係では、ポリペプチドという用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーであると理解される。ポリペプチドという語はまた、標的エピトープ、エピトープ、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、ポリプロテイン及びポリペプチドの凝集物という用語を含む。さらにまた、ポリペプチドという表現はまた、翻訳後改変例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、カルバモイル化及び類似の改変を示すポリペプチドを包含する。加えるに、ポリペプチドという表現はまた、1つ以上のアミノ酸アナローグ、例えば非天然アミノ酸を示すポリペプチド、置換結合とともに従来技術で公知の他の改変それらが天然に存在するか又は非天然起源であるかにかかわらずを有するポリペプチドを指すと理解される。本明細書で用いられるエピトープという用語はポリペプチドの部分であって、抗原特性を示し、例えばT細胞又は免疫グロブリンの認識部位として機能するものをいう。本発明によれば、エピトープは例えば、免疫細胞例えばCD4Tヘルパー細胞、CD8細胞傷害性T細胞、CD4CD8dim細胞傷害性T細胞、CD56CD8とともにCD56CD57CD8NKT細胞又はCD4CD25調節性T細胞によって認識されるポリペプチドの部分である。エピトープは3つ以上のアミノ酸を含むことができる。通常は、エピトープは少なくとも5から7アミノ酸から成り、より頻繁には8から11アミノ酸、又は11を超えるアミノ酸、又は20を超えるアミノ酸、より稀には30すら超えるアミノ酸から成る。本発明の関係では、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、RTqPCRは、通常のポリメラーゼ連鎖反応PCRに基づく方法であると理解される。加えるに、RTqPCRは、増幅に加えてさらにまた標的mRNAの定量を可能にする。この目的のために、全RNAを試験のために材料から単離して抗原とインキュベートし、さらに比較として非刺激材料又は無関係の抗原とインキュベートした材料から全RNAを単離し、続いてその後の逆転写反応でcDNAに転写する。特異的プライマーを用いることによって、続いてqPCRで標的配列を増幅させる。標的配列の定量のためには、いくつかの方法を利用することができる。定量のもっとも簡単な方法は、インターカレート蛍光色素例えばSYBRグリーン又はEVAグリーンを用いることである。これらの色素はそれら自身を二本鎖DNA分子に適合させ、前記適合は特異的生成物の伸長時に生じる。検出は、常に伸長の終わりに蛍光色素の励起後の発光を検出することによって実施される。PCR生成物の量の増加とともに、より多くの色素が取り込まれ、したがって蛍光シグナルが増加する。定量のさらに別の可能性は配列特異的プローブの使用である。加水分解Taqman又はハイブリダイゼーションLightCyclerプローブが存在する。加水分解プローブは蛍光色素で5’末端を、さらにいわゆるクェンチャーで3’末端を標識される。レポーター色素と空間的に近接するために、クェンチャーは蛍光シグナルの消光に応答でき、伸長期の相補性DNAの合成中に切断される。蛍光色素が伸長終了時に光源で励起されると直ちに特異的な波長の光が放出され、前記発光が検出される。ハイブリダイゼーションプローブ系は2つのプローブから成り、これらのプローブは互いに隣り合って標的配列と結合する。両プローブは蛍光色素で標識される。第一のプローブの5末端の第一の蛍光色素が光源で励起される。前記発光は続いて蛍光共鳴エネルギー転移FRETにより第二のプローブの3’末端の蛍光色素に移される。したがって前記色素は励起され、それによって特異的波長の光が放出され、前記が検出される。標的配列の相補鎖の伸長過程で、第一のプローブがポリメラーゼによって分解されるならば、FRETはもはや発生せず、その後蛍光シグナルは減少する。前述の方法とは対照的に、ここでは定量は常に伸長プロセスの開始時に生じる。しばしば用いられる蛍光色素は、例えばフルオロフォア1、フルオロフォア2、アミノクマリン、フルオレセイン、Cy3、Cy5、ユーロピウム、テルビウム、ボディピー、ダンシル、ナフタレン、ルテニウム、テトラメチルローダミン、6カルボキシフルオレセイン6FAM、VIC、YAK、ローダミン及びテキサスレッドである。しばしば用いられるクェンチャーは、例えばTAMRATM、6カルボキシテトラメチルローダミン、メチルレッド又はダーククェンチャーである。リアルタイムという用語は、PCRの各サイクル内のそれぞれ別個のすなわちリアルタイム即時の測定を指す。いわゆる標的配列の増加はサイクルからサイクルへと蛍光の増加と相関する。作業が終了したとき通常数サイクルから成る、続いて得られた蛍光シグナルを基準にしてPCRの指数期に定量を実施する。したがって、増幅の測定は通常Cq定量サイクルの値サイクルを説明するにより実施され、定量サイクルで蛍光が初めてバックグラウンドの蛍光を超えて顕著に上昇する。Cqの値が、一方で標的核酸について、他方で参照核酸について決定される。このようにして、標的配列の絶対的又は相対的コピー数を決定できる。本発明の関係では、発現参照遺伝子は、ゲノムDNAレベル上およびmRNAレベル上の配列であると理解できる。これらはまた本発明の刺激条件下で転写的に活性でなくてもよく、またそれらはゲノムの非コードDNA領域に一致してもよい。本発明によれば、参照遺伝子はまた標的遺伝子サンプルに添加されたDNA又はRNAでもよい。参照遺伝子のもっとも厳しい基準は、参照遺伝子は刺激進行中に及び本発明の方法の条件によって変化しないということである。実験結果はしたがって、種々のサンプルで用いられる鋳型の量に関して正規化することができる。したがって、参照遺伝子は標的遺伝子の相対的発現の決定を可能にする。参照遺伝子の例は、グリセロアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼGAPDH、hu0ヒト酸性タンパク質0、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼPBGD、βアクチン又はチューブリンである。本発明の第一の目的では、T細胞集団の検出、弁別及び定量のための方法を提供することが意図される。前記方法は以下の工程を含む:a個体の体液の第一のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる工程ここで、前記体液は抗原提示細胞APC及びT細胞を含む;b前記第一のアリコートを前記少なくとも1つの抗原と一定の時間インキュベートする工程;c前記個体の体液の第一のアリコート及び前記少なくとも1つの抗原とインキュベートされていない第二のアリコートで、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RTqPCRによって、特異的T細胞集団のT細胞によって誘導されたAPCの少なくとも1つの第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程;及びdAPCの検出マーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによってT細胞集団を検出及び定量する工程。本発明によれば、したがって、特異的T細胞集団のT細胞の検出、弁別及び定量は、非刺激及び/又は非特異的及び特異的刺激細胞の培養サンプルで、APCの少なくとも1つのマーカーをRTqPCRを用いて検出及び相対的に定量することによって実施されることが意図される。本発明は、特に活性化されたT細胞はフィードバックメカニズムにより抗原提示細胞APCの成熟に寄与するという事実を根拠にして検出及び定量が可能であると考える。本発明の関係では、このフィードバックメカニズムはまた逆T細胞技術RTTと称される。したがって、抗原特異的活性化T細胞特にTヘルパー細胞は、TCRを介する抗原装荷MHC分子の認識及び同時に発生するT細胞とAPCとの更なる相互作用によって媒介されて、とりわけ例えばAPCのマーカーとしての多様な遺伝子のプロモーターの活性化、mRNA分子の生成の増加、及びこれらマーカータンパク質の発現の増加を誘導する。これらの成熟プロセスにより、APCは、病原体又は疾患特異的細胞傷害性T細胞及び低親和性Tヘルパー細胞を刺激する能力の増加を獲得する。本発明によれば、したがって、特異的T細胞集団のT細胞、例えば活性化T細胞の検出は、APCのマーカーを介する間接検出によって達成できると考えられる。いかなる理論にも拘束されないが、本発明によれば、抗原フラグメントとのインキュベーションにより、APCはそれらの表面でMHCクラスII又はI分子と協力して活性化T細胞にこの抗原を提示すると考えられる。それによって、活性化T細胞と抗原提示細胞との特異的結合が生じる。この特異的なT細胞APC相互作用により、APCは特異的に刺激される。この特異的刺激の結果として、APCにおけるマーカー誘導が生じる。逆転写定量PCRRTqPCRによる特異的刺激APC及び非刺激APCにおけるマーカーの決定は、特異的T細胞集団の形式の活性化T細胞の検出、弁別及び定量を可能にする。本方法は、特異的T細胞集団のT細胞例えばナイーブ、活性化又はメモリーT細胞の鋭敏で信頼できる検出を可能にする。本方法の鋭敏性は、特にT細胞がAPCでマーカーのとりわけ多数のmRNAコピーの形式の刺激を誘引するという事実による。さらにまた、おそらく多数のAPCが1つのT細胞いわば1つのAPCから別のAPCにジャンプするT細胞によって刺激されると考えられ、全般的にシグナルの強化に、したがって本発明の鋭敏性の増加につながる。本方法は、したがってT細胞集団の検出及び弁別を可能にし、それによって特に活性化T細胞をメモリー細胞から区別することを可能にする。本発明の好ましい実施態様では、正確な遺伝子発現の定量を達成するために、集めたリアルタイムPCRデータリアルタイムPCRデータの正規化が、固定参照値実験の条件によって影響を受けないを用いることによって実施される。この目的のために、参照遺伝子の発現もまた量の相対的比較を実施するために測定される。本発明によれば、APCのマーカーの決定のために、個体の体液の第一及び第二のアリコートが提供される。本発明の関係では、提供するは、体液のアリコートが既に容器に存在することを示唆すると理解される。本発明によれば、提供するはまた、体液のアリコートが、例えば血液サンプルを採取することによって患者から直接提供されることを意味することができる。本発明は、第一のアリコートは少なくとも1つの抗原で刺激され、一方、第二のアリコートは刺激されないままであることを意図する。全般的に、第一のアリコートと第二のアリコートは抗原と接触するという点を除いて同一であることがしたがって意図される。したがって、第二の非刺激アリコートは一種のカリブレーターとして機能する。定量はしたがってカリブレーターに対応して実施される。マーカーの決定又は定量のために、第一の刺激アリコート中のマーカーの量を第二の非刺激アリコート中のマーカーの量で割ることが意図される。したがって、カリブレーターすなわち第二の非刺激アリコートに対して第一の刺激アリコートのマーカーの量にn倍の相違が検出される。本方法はもっぱらexvivoで実施される方法である。本方法は、公知の利用可能な方法よりも有利な態様で、実験プロセスの鋭敏性、速度及び信頼性が高められてある活性化Tヘルパー細胞の検出を可能にする。加えるに、本方法は特にメモリーT細胞に対する活性化T細胞の区別とともに弁別的決定を可能にする。活動性微生物感染時並びに特に自己免疫疾患及び腫瘍疾患における活性化T細胞の確定的検出が顕著に困難であるのは、循環中に存在する疾患及び病原体特異的活性化T細胞の数が非常に少ないことに起因する。T細胞はリンパ系器官で抗原装荷APCとの接触によって活性化され、増殖し、続いて血液及びリンパを介して感染部位又は疾患部位前記部位にそれらはしばしば留まりそれらのエフェクター機能を発揮するに遊走する。本方法は、APCにおける生成が活性化T細胞との抗原特異的接触後に測定可能な程度で調節されるすなわち増加、低下又は改変されるT細胞誘導性成分、例えばRNA分子又はタンパク質の検出を根幹とする。APC又はAPC含有培養物のT細胞に誘導される成熟プロセスの決定は、タンパク質の形式のマーカーを発現ベクターで特異的に刺激した細胞培養で、多様なタンパク質検出方法例えばFACS、EliSpot又はELISAを用いて検出することによって以前から公知の方法で実施される。しかしながらこれらの方法は、診断的応用における活性化T細胞の信頼に値する検出では適切性が限定的であるか、又は不適切であることが判明した。T細胞誘導性マーカー分子は、多数の種々の疾患及び微生物感染において試験されるべき種々の細胞集団、対象者又は患者で生成され、したがって各個体でこれらのマーカータンパク質は時に強く変動し、部分的には既に非常に高い基礎的発現レベルを示すことが知られている。さらにまた、APCは、しばしばすでに大量の前形成マーカー分子すなわち既に発現されたマーカー分子を含み、それらは活性化Tヘルパー細胞による抗原特異的刺激とは別個に存在する。さらにまた、活性化Tヘルパー細胞は通常ただ1つ又はほんのいくつかのAPCのみをそれぞれ刺激し、ほんの限定的な感度の増加が細胞レベルで達成され得るだけである。これら公知の状況のために、前記活性化T細胞によって刺激されたAPCのタンパク質レベルで特異的マーカーを検出することにより信頼できる活性化T細胞を決定することは、診断として信頼可能な基準としては不可能であろうとこれまでのところ考えられてきた。驚くべきことには、本方法は、APCのマーカーとして例えばmRNAのT細胞誘導生成を決定することによって実施できることを示すことができた。ある種のマーカー分子の変動的発現に関する上述の問題のために、本発明のRNAレベルにおけるAPCのマーカー検出は、抗原特異的活性化T細胞の信頼できる鋭敏な決定を可能にするということは予想に反すると考えられるはずである。例えば、活性化T細胞とAPCとの接触は、非常に大量のmRNA分子の生成を誘導し、前記分子はマーカーの強力な増幅をもたらし、したがって本発明の方法の感度を顕著に高める。しかしながら、活動性疾患の存在のマーカーとして、活性化された抗原特異的T細胞を検出するためにAPCのT細胞誘導性マーカー例えばmRNA分子の生成を使用することに対してはこれまで基本的な技術的不利益があった。これらの技術的不利益は、特にAPCの特異的マーカーは個々に非常に不規則に変動する基礎発現を示すという事実に基づく。しかしながら、有意義な試験結果のために信頼できる閾値レベルの規定のために、これらの変動性の補整が必然的に要求される。これらの技術的不利益は、本発明の方法では特に、少なくとも1つの抗原で刺激した個体体液の第一のアリコート及び刺激しなかった第二のアリコートのAPCのマーカーを検出して第一のアリコート対第二のアリコートの比を決定することによって、マーカー発現の相対的増加を決定することによって克服された。本発明の好ましい実施態様では、工程cでさらに別に少なくとも1つの第二のマーカーが第一のアリコート及び第二のアリコートで検出され、前記第二のマーカーはT細胞自体の誘導マーカーであり、さらに工程dが、検出されたAPCの第一の検出マーカー及びT細胞の第二のマーカーの第一のアリコート対第二のアリコート比を決定することによって、T細胞集団を検出及び定量する工程を含む方法が意図される。本発明によれば、個体のT細胞集団としてナイーブT細胞、活性化T細胞及びメモリーT細胞の弁別が可能になるということが本方法のために意図される。本発明の方法は、一定の疾患で弁別的診断の可能性を提供する。例えば、とりわけ結核症についてそのような弁別的診断の手段によって、活動性疾患を有し同時治療を必要とする患者を、潜伏性感染を有し具体的治療を必要としない患者及び健常な個体と区別することを可能にする。この弁別的診断は、第一及び第二のマーカーの検出によって可能になる。第一のマーカーはこれによってAPCのT細胞誘導マーカーを表す。このマーカーは活動性疾患現出時にのみ誘導される。第二のマーカーはT細胞自体のマーカーである。この第二のマーカーは、本方法のサンプルで活性化T細胞及びメモリーT細胞の存在下で形成される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、第二のアリコートを少なくとも1つの抗原と接触させる、さらに別の工程a’を工程aに含み、さらに前記第二のアリコートを前記抗原と一定の時間インキュベートする、さらに別の工程b’を工程bに含み、ここで工程b’の時間は工程bの時間とは異なり、さらにRTqPCRによって第一及び第二のアリコートで第一のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程c’を工程cの代わりに含み、さらに工程dを含む方法が意図される。本発明の特に好ましい実施態様では、工程b’のインキュベーションの時間が0分であることが意図される。さらに別の特に好ましい本発明の実施態様では、当該時間は0から60分、より好ましくは0から45分、より好ましくは0から30分、より好ましくは0から20分、より好ましくは0から15分、より好ましくは0から10分、特に好ましくは0から5分である。本発明によれば、第二のアリコートは、第一のアリコートのインキュベーションの時間と比較して顕著に短いいわゆるゼロサンプルすなわち0分の間までの時間抗原と接触させることが意図される。したがって、第二のアリコートのインキュベーション時間内にはマーカーは未だ形成されていないか又は非常に低量のマーカーがその時までに存在しているだけである。本発明によれば特に、工程b’の時間は工程bの時間より顕著に短いことが意図される。本発明によれば、工程b’における第二のアリコートの抗原とのインキュベーションは、したがって数秒から0分のままである範囲でのみ生じるか、または少なくとも継続的時間で生じることはない。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、第二のアリコートは、無関係の抗原と工程a’で接触され、さらに工程b’でインキュベートされる。本発明によれば、無関係の抗原は、それに対して当該個体又はメモリー細胞が活性化しなかった抗原であると理解される。そのような無関係の抗原は例えばアルブミン又はHIV血清陰性者におけるHIVタンパク質であり得る。本発明の好ましい実施態様では、工程c’が、第一及び第二のマーカーを検出することによってT細胞集団を検出及び弁別する工程を含む方法が意図される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、体液のアリコートがAPCのみを含むアリコートA及びT細胞を含むアリコートBに分けられ、さらに工程aが、アリコートAを少なくとも1つの抗原と接触させる工程a1及び、少なくとも1つの抗原と接触させたアリコートAをアリコートBと接触させる後続工程a2を含む方法が意図される。本発明によれば、T細胞を添加する前に、APCは最初に抗原を装荷される。本発明によればより好ましくは、T細胞含有アリコートBはまた非装荷APCすなわちその前に抗原と接触させられていないAPCを含むことが意図される。本発明によれば、T細胞集団はナイーブT細胞、活性化T細胞又はメモリーT細胞を含むことが意図される。本発明の好ましい実施態様では、T細胞集団のT細胞は、CD4T細胞、特にTh1細胞、Th2細胞、Th17細胞、CD4CD25調節性T細胞、Th3細胞、CD8T細胞、特にCD4CD8細胞傷害性T細胞、CD4CD8T細胞、CD161NKT細胞及び/又は多様なT細胞の混合物であることが意図される。本発明にしたがえば、さらに好ましくは、体液は、血液、脳脊髄液、リンパ、心膜液、気管支洗浄液、骨髄吸引物、リンパ組織懸濁物又は精製PBMC集団であることが意図される。本発明の関係では、リンパ組織は、リンパ節、脾臓、扁桃腺とともに胃腸管粘膜のリンパ組織例えばペイヤープラーク、呼吸器のリンパ組織及び尿道のリンパ組織であると理解される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、体液はさらに別に分離されたAPC集団を含むことが意図される。さらにまた本発明によれば、いわゆるバッフィーコートが体液として好ましい。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原はペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、RNA又はDNAであることが意図される。さらに別の好ましい実施態様では、抗原は発現プラスミドである。本発明にしたがえば、さらに好ましくは、抗原は、オリゴペプチドの、ポリペプチドの、タンパク質の、RNAの、又はDNAのフラグメント、切断成分又は断片である。本発明にしたがえば、好ましくは、抗原は、細菌、ウイルス、植物、動物、真菌又は寄生虫に由来する抗原であることが意図される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は、サイトメガロウイルスCMV、エプスタインバールウイルスEBV、肝炎BウイルスHBV、肝炎CウイルスHCV、ヒト免疫不全ウイルスHIV、パルボウイルスB19、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、JC及びBKウイルス、A、B、C型インフルエンザウイルス、ヒト型結核菌マイコバクテリウムツベルクローシスMycobacteriumtuberculosis、ボレリア、トキソプラズマゴンディーToxoplasmagondii若しくはアスペルギルスのポリペプチド、又は腫瘍若しくは自己抗原であることが意図される。本発明によれば、抗原は好ましくはヒトに病原性を有するウイルスの抗原である。以下の例では本発明にしたがってそのようなウイルスが提示される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、オルトミクソウイルス特にインフルエンザウイルスA、B、C型、パラミクソウイルス特にパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体形成ウイルスRSウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス特に黄熱、デング、日本脳炎B、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、肝炎CウイルスHCV、トガウイルス特にアルファ及びルビウイルス、ブンヤウイルス特にブンヤ、ハンタ、ナイロ、フレボ、及びトスポウイルス、ジェネラウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、アレナウイルス特にリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスLCMV及びラッサ熱ウイルス、胃腸炎ウイルス特にロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス特にレトロウイルスA、B、C及びD型、レンチウイルス特にヒト免疫不全ウイルス1型HIV1及び2型HIV2、サル免疫不全ウイルスSIV、ネコ免疫不全ウイルスFIV、ウシ免疫不全ウイルスBIV、スプマウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス1型HTLV1及び2型HTLV2、パルボウイルス特にパルボウイルスB19及びアデノ関連ウイルスAAV、パポーバウイルス特にパピローマウイルス、進行性多病巣性白質脳障害PMLのウイルス、BKウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス特に単純疱疹ウイルス1型HSV1及び2型HSV2、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、サイトメガロウイルスCMV及びエプスタインバールウイルスEBV、ヒトヘルペスウイルス6、7及び8HIV6、7及び8、肝炎ウイルス特に肝炎AウイルスHAV、肝炎BウイルスHBV、肝炎CウイルスHCV、肝炎DウイルスHDV、肝炎EウイルスHEV及び肝炎GウイルスHGVとともに輸血伝播ウイルスTTV、並びにポックスウイルス特にオルトポックスウイルス、例えばヒトポックスウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、及びパラポックスウイルス。さらにまた、ポリペプチドは、稀な亜急性又は慢性疾患のウイルス病原体特にマールブルグ及びエボラウイルスとともにボルナウイルスから誘導できる。本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはヒト免疫不全ウイルスHIV、例えばgp120、gp160、p17、p24、Pr55gag、ポリメラーゼPol、逆転写酵素RT及びnefである。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはエプスタインバールウイルスEBVのポリペプチド、例えばEVNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3BEBNA4、EBNA3CEBNA6BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1、BARF0、BRLF1、BI’LF4、gp85、gp110、gp220350、VCAp150、EBNALB、LMP1及びLMP2である例えば以下にまとめられている:KhannaetalAnnuRevMicrobiol541948。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはサイトメガロウイルスCMVのポリペプチド、例えばUL123IE1、UL122IE2、UL83pp65、UL82、HL99、UL28、UL33、UL37、US3、UL94、UL16、UL55gB、UL85、UL25、US18、UL45及びUL32pp150である例えば以下にまとめられている:CroughetalClinMicrobiolRev227698。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくは水痘帯状疱疹ウイルスVZVのポリペプチド、例えばORF1、ORF4、ORF10、ORF14、ORF29、ORF62及びORF68gEである。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくは肝炎Bウイルスのポリペプチド、例えばHBsAg及びHBcAgである。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は、特に好ましくはアデノウイルスのポリペプチド、例えばAdV5である。さらにまた本発明にしたがえば、抗原は好ましくは動物に病原性のウイルスの抗原であり、以下に列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、むしろ単なる代表例である。ウマモルビリウイルスEMP、ピコルナウイルス、特にエンテロウイルス、口蹄疫FMDの病原体を含むアフトウイルス、水疱性口内炎ウイルス、パラミクソウイルス、特にモルビリウイルス、トリパラミクソウイルス、ポックスウイルス、特にカプリポックスウイルス、ブンヤウイルス、レオウイルス、特にオルビウイルス、フラビウイルス、特にペスチウイルス、オルトミクソウイルス、特にインフルエンザAウイルス、ヘルペスウイルス、特にアルファヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、レトロウイルス、特にレンチウイルス及びC型レトロウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、ビルナウイルス、コロナウイルス及びカリシウイルス。これまで記載したウイルスの包括的リストは例えば以下にまとめられてありInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses、インターネットを介してアクセスできるhttpwwwncbinlmnihgovTaxonomyBrowserwwwtaxcgimodeUndefnameViruseslfl3srchmode1keep1unlock。さらにまた本発明によれば、抗原は好ましくは細菌の抗原である。本発明によればヒトの病原性細菌の抗原が特に好ましい。以下の例でそのような細菌が列挙される。このリストは本発明の関係で限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、エンテロコッカス、ナイセリア、腸内細菌科、特に大腸菌EscherichiacoliEcoli乳児に病原性を有する大腸菌EPEC、腸内凝集性大腸菌株EAggECを含む、クレブシーラ、エンテロバクター、セラチア、プロテウス、シトロバクター及びチフス様サルモネラ、腸炎サルモネラ、シゲラ、エルシニア、ビブリオ、特にコレラ菌ビブリオコレラエVibriocholerae及びビブリオエルトールVibrioElTor、シュードモナス、ブルクホルデリア、ステノトロホマス。アシネトバクター、カンピロバクター、ヘリコバクター、特にピロリ菌ヘリコバクターピロリHelicobacterpylori、ヘモフィルス、ボルデテーラ、レジオネラ、リステリア、ブルセラ、フランシセラ、エリシペロトリクス、コリネバクテリア、バチルス、クロストリジア、バクテロイデス、プレボテラ、ポリフィロモナス、フゾバクテリア、アネロビオスピリルム、アネロビブリオ、ブチビブリオ、セントリペジア、デスルフォモナス、ジケロバクター、フィブロバクター、レプロトリキア、メガモナス、ミツオケラ、リケネラ、セバルデラ、セレモナス、スクシノビブリオ、スクシノモナス、チセレラ、マイコバクテリア、特にヒト型結核菌MツベルクローシスMtuberculosis、非定形マイコバクテリアMOTT、らい菌MレプラエMleprae、ノカルジア、トレポネーマ、特にTパリダムTpallidum及びTカラテウムTcarateum、ボレリア、特にBブルグドルフェリセンスラトBburgdorferisensulato、BガリニーBgarinii、BアフゼリーBafzelii、BバレイシアナBvalaisiana、BルシタニアエBlusitaniae及びBスピエルマニBspielmaniA14S及びBレクレンチスBrecurrentis、レプトスピラ、リケッチア、コクシエラ、エルリキア、バルトネラ、マイコプラズマ、特に肺炎マイコプラズマMプニューモニアエMpneumoniae及びMホミニスMhominis、ウレアプラズマ、アクチノミセタ、クラミジア。さらにまた本発明によれば、抗原は好ましくはさらに別の医学的に関連する細菌、例えばトレフェリマ、パスツレラ、ブランハメラ、ストレプトバチルス、スピリルム及びガルドネレラから誘導できる。さらにまた本発明によれば、抗原は、より好ましくはヒト型結核菌のポリペプチド、例えばCFP10、ESAT6、TB77、TB376及びMPT63、又はポリペプチド混合物、例えばツベルクリンPPDである。さらにまた本発明によれば、抗原は、特に好ましくはボレリアスペクBorreliaspecのポリペプチド、例えばVlsE、p58OppA2、BBK32、p14、p20BBQ03、p2124OspC、p3738FlaA、p41フラゲリン、FlaB、p19OspE、p18、Crasp3、BBA36、BB0323、p26OspF、p28OspD、p30、p39、BmpA、p6065共通抗原、Hsp60、p83100、p17Osp17、p3132OspA及びp34OspB、又はボレリア脂質又はボレリア株の溶解物である。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は動物に病原性の細菌の抗原である。本発明にしたがえば以下の例でそのような細菌が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。マイコプラズマ、バチルス、特に炭疽菌バチルスアントラシスBacillusanthracis、ブルセラ、マイコバクテリア、特にヒト型結核菌及びウシ型結核菌MボビスMbovis、カンピロバクター、トリトリコモナス、レプトスピラ、リケッチア、サルモネラ、クロストリジア、アクチノバチルス、クラミジア、エキノコッカス、リステリア、エルシニア、コリネバクテリア及びフランシセラ。これまで記載した細菌の包括的リストはインターネットによりアクセスできる:httpwwwncbinlmnihgovTaxonomyBrowserwwwtaxcgimodeRoot。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は真菌の抗原である。本発明の特に好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の真菌から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような真菌が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。酵母、特にカンジダ、クリプトコッカス、マラセチア、糸状不完全菌類、特にアスペルギルス、トリコフィトン、ミクロスポルム及びエピデルモフィトン、二形性菌類、特にヒストプラズマ、ブラストミセス、コクシジオイデス、パラコクシジオイデス、シポロトリクス、及びニューモシスチス。本発明のさらに別の実施態様では、抗原は寄生虫の抗原である。本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の寄生虫から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような寄生虫が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。原生動物、例えばトリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルジア、アメーバ、プラスモジア、トキソプラズマ、クリプトスポリジア、ミクロスポリジア、吸虫類、例えばシストソーマとともに多節条虫、例えばサナダムシ及びエキノコッカスとともに線虫類、例えばトリクリス、トリキネラ、ストロンギロイデス、鉤虫属、アメリカ鉤虫属、エンテロビウス、回虫属及びフィラリア上科。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は動物に病原性の寄生虫のポリペプチドである。本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒトに病原性の寄生虫から誘導される。本発明にしたがえば以下の例でそのような動物に病原性の寄生虫が列挙される。このリストは本発明の関係では限定的なものと考えられるべきではなく、単に代表例である。原生動物、特にプロトモナス、ジプロモナス、ポリマスチギジア、アメーバ、トキソプラズマ及びコクシシジア、ミクロスポラ、ヘルミンテス、トレマトーラ、多節条虫及び線虫。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、抗原は腫瘍抗原又は自己抗原であることが意図される。本発明の関係では、自己抗原は、ペプチドフラグメントの形態の構造を示し、身体自身の構造物である抗原と理解される。T細胞そのような自己抗原に対して反応性を示すが存在する事例では、自己免疫疾患の出現があり得る。自己抗原はまたセルフ抗原又は自己免疫抗原とも称される。本発明の関係では、活性化T細胞それぞれ腫瘍疾患又は自己免疫疾患を示すは、腫瘍関連抗原又は自己免疫抗原とのインキュベーションによって検出され得る。本発明の好ましい実施態様では、抗原はヒト腫瘍抗原である。本発明にしたがえば、特に好ましいものは、前立腺特異的抗原PSA、HER2neu、ムチン1、過剰発現野生型p53とともに点変異を示すp53、MAGE抗原及びCEA癌胎児抗原、CarcinoEmbryonicAntigenである。さらに別の好ましい実施態様では、抗原は自己抗原である。本発明にしたがえば、好ましくは多発性硬化症MSに対する自己免疫抗原、例えば以下である:ミエリン塩基性タンパク質MBP、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質MOG、ミエリンプロテオリピドタンパク質PLP、ミエリン、MBPPLP融合タンパク質MP4、オリゴデンドロサイトのミエリン関連塩基性タンパク質MOBP、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質OSP、ミエリン関連糖タンパク質MAG、とともに糖タンパク質P0、末梢ミエリンタンパク質22PMP22PASII、p170kSAGシュワン細胞膜糖タンパク質、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質OMgp、シュワン細胞ミエリンタンパク質SMP、トランスアルドラーゼ、S100β、アルファBクリスタリン、2’3’サイクリックヌクレオチド3’ホスホジエステラーゼCNP、線毛神経栄養因子CNF及びグリア線維性酸性タンパク質GFAP。さらにまた本発明にしたがえば、1型糖尿病若年性真性糖尿病に対する自己免疫抗原、例えばインスリンB、プレプロインスリンPPI、チロシンホスファターゼIA2、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65GAD65、熱ショックタンパク質Hsp60、島細胞タンパク質ICA69、IGRP、cd4、クロモグラニンAChgA以下をまた参照されたい:VelthuisetalDiabetesが好ましい。本発明の特に好ましい実施態様では、抗原は以下から成る群から選択される:PSA、HER2neu、ムチン1、MAGE、CEA、ミエリン塩基性タンパク質MBP、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質MGO、ミエリンプロテオリピドタンパク質PLP、ミエリン、インスリンB、プレプロインスリン、IA2、GAD65、Hsp60、ESAT6、CFP10、TB77、TB376、MPT63、ツベルクリンPPD、p14、OspC、p3738FlaA、p41、OspE、OspF、OspD、p39、Osp17、OspA、OSPB、Pr55gag、p24、p17、POL、RT、nef、pp65、IE1、IE2、BZLF1、EBNA3、EBNA2、EBNA6、BMLF1、EBNA1、ORF1、ORF4、PRF62、ORF68、HBsAg、HBcAg及びAdV5。本発明のさらに好ましい実施態様では、抗原はTヘルパー細胞のエピトープを含むポリペプチドから選択される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程aの接触及び工程bのインキュベーションの時間は0から72時間、好ましくは4、6又は8時間であることが意図される。さらにまた、好ましいこととして、工程a及び/又は工程bの時間は0から72時間、好ましくは4、6又は8時間であることが意図される。さらにまた本発明にしたがえば、好ましくは、工程a及び/又は工程bの時間は、0から48時間、より好ましくは0から36時間、より好ましくは0から34時間、より好ましくは0から32時間、より好ましくは0から30時間、より好ましくは0から28時間、より好ましくは0から26時間、より好ましくは0から24時間、より好ましくは0から22時間、より好ましくは0から20時間、より好ましくは0から18時間、より好ましくは0から16時間、より好ましくは0から15時間、より好ましくは0から14時間、より好ましくは0から12時間、より好ましくは0から10時間、より好ましくは0から9時間、より好ましくは0から8時間、より好ましくは0から7時間、より好ましくは0から6時間、より好ましくは0から5時間、より好ましくは0から4時間、より好ましくは0から3時間、より好ましくは0から2時間、より好ましくは0から1時間である。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程a及び/又は工程bの時間は0から60分、より好ましくは0から50分、より好ましくは0から40分、より好ましくは0から30分、より好ましくは0から20分、より好ましくは0から15分、より好ましくは0から10分及びより好ましくは0から5分である。本発明にしたがえば好ましくは、APCの第一のマーカー及びT細胞の第二のマーカーは核酸又はタンパク質、特にRNA、DNA、核酸フラグメント、ペプチド又はペプチドフラグメントであること、及びこれらは少なくとも1つの抗原との接触及びインキュベーションによって誘導されることがさらにまた意図される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、APCのマーカーは、41BBリガンド41BBL、OX40リガンドOX40L、TNFSFCD70、B71CD80、B72CD86、FcγRIIICD16、FcγRIICD32、FcγRICD64、又はTNFTNFレセプター及び/又は免疫グロブリンスーパーファミリーのさらに別の代表例、又はCXCLファミリーのメンバー、例えばCXCL9、CXCL10、CXCL11、又はケモカインCCモチーフリガンドファミリーのメンバー、例えばCCL2、CCL7、CCL8、CCL10又はIL1RNであることが意図される。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、T細胞のマーカーは、IFNβ、INFγ、TNFα、IL2、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、GMCSF、TGFβ、MIP1a、MIP1b、41BB、CD25、パーフォリン及び/又はグランザイムであることが意図される。さらにまた本発明にしたがえば、T細胞のマーカーは、活性化T細胞又は活性化メモリーT細胞によって生成されるさらに別のサイトカイン又はケモカインである。本発明の好ましいマーカーは特に核酸であり、T細胞によるAPCのエピトープ特異的認識の後で、APCでの生成が通常的に検出できるほどに増加する。APCの本発明のマーカーであるそのような核酸の例は、41BBリガンド41BBL及びOX40リガンドOX40LのmRNA分子であるOshimaetal1997JImmunol15938383848;denHaanandBevan2000PNAS971295012952。さらにまた本発明にしたがえば、共刺激タンパク質B71CD80、B72CD86及びFasリガンドFasLのmRNA分子とともにTNFTNFリセプタータンパク質ファミリー及び免疫グロブリンスーパーファミリーの他のタンパク質のmRNA及び多様なFcレセプターのmRNA、並びにサイトカイン及びケモカインのmRNA分子が好ましい。加えるに、本発明にしたがえば、任意のポリペプチドの核酸であって、その生成が、APCの表面のMHCタンパク質と一緒に存在するポリペプチドの、活性化T細胞による特異的認識のために同じAPCでのその生成が検出できるほどに増加又は低下する前記核酸が好ましい。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、工程c及びdの検出及び定量は、また別にPCR定量PCRqPCRマイクロアレイ、FACS、ELISpot及び/又はELISAによって実施されることが意図される。本発明のさらに別の主題は、少なくとも1つの抗原及び第一のマーカーの増幅用プライマー対を含む、本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、キットはさらにまた第二のマーカーの増幅のための1対のプライマーを含む。さらに別の好ましい実施態様では、キットはさらにまた参照遺伝子の増幅のための1対のプライマーを含む。さらにまた本発明にしたがえば、好ましくは、キットはまた別にプローブとともに細胞培養液を含む。本発明のさらに別の好ましい実施態様では、キットはさらに別にRNA安定化試薬、RTマスターミックス、qPCRマスターミックス、陽性コントロール、及び陽性試薬を含む。本発明にしたがえば、陽性コントロールは、増幅されるべきマーカーDNAの規定量であると理解される。本発明にしたがえば、陽性試薬は、非特異的にたとえ活性化T細胞が存在しなくてもAPCのマーカーを刺激する試薬であると理解される。陽性試薬の本発明の例は、PMAイオノマイシン又はプロスタグランジンE2PGE2と協力して活性を示す抗CD40抗体である。本発明の好ましい実施態様では、キットはさらにまた、PCR、qPCR又はマイクロアレイによるAPCのマーカーの検出を可能にするプライマーを含むことが意図される。以下で本発明を後続の実施例により例示する。これらの実施例は本発明の具体的な実施態様と考えられるべきであり、限定的であると考えてはならない。特異的T細胞集団、例えば活性化T細胞を検出、弁別及び定量するために、抗原提示細胞APCのT細胞誘導成熟プロセスを分析した。この目的のために、細胞培養モデルを開発した。前記培養モデルは、抗原装荷APCとexvivoでエクスパンドさせた活性化抗原特異的Tヘルパー細胞との共培養を基準にしている。このモデル系では、i非装荷APC又は無関係の抗原を装荷したAPCと前活性化抗原特異的Tヘルパー細胞との共培養、及びii抗原装荷APCと非特異的活性化T細胞又は無関係抗原特異性を有する活性化Tヘルパー細胞の共培養陰性コントロールが提供される。この系では抗原特異的Tヘルパー細胞Th細胞の検出は、逆転写定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RTqPCRによって、特異的刺激及び非刺激培養サンプルでマーカーmRNAの比較定量により実施される。a抗原特異的T細胞のexvivoエクスパンションESAT6CFP10特異的活性化Th細胞を作製するために、潜伏性ヒト型結核菌感染ドナーのCD4T細胞を3-4週間invitroでエクスパンドさせた。この目的のために、ドナーの血液をヘパリン化注射筒に抜き取り、PBSwithout二価イオンを含まないリン酸緩衝食塩水:Lonzaで希釈し、続いてパンコールPancoll:PanBiotechを用いて密度勾配遠心分離800xg、30分、20°Cにより、血球をそれらの密度にしたがって分離した。その後、PBMCを前記勾配から単離し、PBSwithoutで2回300xg、10分洗浄した。続いて、MACS技術CD4T細胞単離キットII、Miltenyiを用いてCD4T細胞を単離し、ESAT6CFP10融合タンパク質AGLindnerInstituteformedicalMicrobiologyandHygieneUniversityHospitalRegensburgを装荷した自己APC成熟樹状細胞、PBMCにより、完全R5培養液中にて1:3の割合Th細胞:APCで毎週刺激することによって培養した完全R5培養液:RPMI1640PanBiotech、5ヒトAB血清血液型ABのドナーの血液から調製、1ペニシリンストレプトマイシンPANBiotech。この目的のために、完全R5培養液中の1x107細胞mLの濃度のAPCに10μgmLのESAT6CFP10融合タンパク質を3時間、37°Cで、5CO2含有湿潤雰囲気で装荷し、さらに単離Th細胞と培養する前に30Gyのγ照射に付した。Th細胞の最適増殖のために、50UmLの組換えIL2ProleukinSNovartisを培養に添加した。Th細胞の増殖は、血球計算版を用いて生細胞の全細胞数を検出することによって毎週決定した。同様に培養の特異性は、ESAT6CFP10を装荷した照射PBMCで刺激した後でIFNγ及びCD40L陽性細胞の数を検出することによって毎週決定した。この目的のために、エクスパンション培養のTh細胞を10μgmLのESAT6CFP10の存在下で新しく単離した自家PBMCと1:1の割合で6時間、5CO2、37°Cでインキュベートした。2時間のインキュベーション後に、ブレフェルジンAを添加して細胞のサイトカインの放出を停止させた。各事例で1μgmLのPMAイオノマイシンで刺激したサンプル及び非刺激サンプルをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして供した。1μgmLの共刺激用モノクローナル抗CD49d及び抗CD28抗体を各刺激サンプルに添加した。インキュベーションの後で、1回の洗浄工程が続いた。この目的のために、9mLのPBSwithoutを細胞に添加し、この細胞を300xgにて8分間4°Cで遠心分離した。上清を廃棄し、リフラックスして細胞を再懸濁させた。続いて表面分子を各事例で5μLの以下の発蛍光団結合抗体で標識した:抗CD3アロフィコシアニンH7BD、抗CD4アロフィコシアニンBD、抗CD8ペリジニンクロロフィルタンパク質BD。表面染色は室温で暗所にて20分実施した。続いて、細胞を洗浄し、500μLのPBSwithout中の2パラホルムアルデヒドPFASigmaAldrichで室温にて暗所で10分固定した。更なる洗浄工程の後、細胞の透過性のために10μLのPBSwithout中の2サポニンCarlRothの存在下で、1μLの抗IFNγフルオレセインイソチオシアネートBD及び10μLの抗CD40LRフィコエリトリンBDを用いて細胞内IFNγとともに細胞内CD40Lの染色を室温にて暗所で30分実施した。続いて細胞を01のPBSwithout中のサポニンで2回洗浄し、300μLのPBSwithout中の1PFAに再懸濁させた。染色細胞は、FACSCANTOIIフローサイトメーターBDで分析した。この目的のために、まず初めに細胞集団をフォワードスキャター光及びサイドスキャター光にしたがって分離させた。続いてリンパ球集団をそれらのCD3の発現に関して分析した。続いて全てのCD3細胞をCD4及びCD8タンパク質の発現に関して分析した。続いてCD4T細胞をIFNγ及びCD40Lの発現に関して分析した。この目的のために、特異的Tヘルパー細胞として活性化ESAT6CFP10のパーセンテージをIFNγ及びCD40Lの発現を基準にして決定したデータは示されていない。発現培養では、Tヘルパー細胞の持続的増殖が観察され、ESAT6CFP10特異的Th細胞の増加を伴った。このようにして、3-4週間後に5から18の特異的Th細胞がエクスパンション培養で作出できた。EBVBZLF1及びCMVpp65特異的Th細胞の作製及び性状の決定は、それぞれEBV及びCMV血清陽性ドナーの血液サンプルを用いることによって前述の実験手順と同様に実施した。bexvivo前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞とESAT6CFP10融合タンパク質を装荷した新鮮調製自家PBMCとの共培養潜伏性結核症のドナーの新しく調製したPBMCを、exvivo前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞のエクスパンジョン培養と1:1の割合で1x106細胞mLの全細胞数を用い、10μgmLのESAT6CFP10融合タンパク質の存在下及び非存在下でB細胞培養液にて共培養したB細胞培養液:イスコフIscoveの改変ダルベッコー培養液IMDM:Lonza、10ヒトAB血清、6ngmLのIL4MiltenyiBiotech、50ngmLトランスフェリンRoche、5μgmLインスリンRoche。細胞を37°C、5CO2下で10時間インキュベートし、各事例で2x105細胞のサンプルを種々の時点例えば0、05、1、2、3、4、6、8及び10時間後で取り出した。これらのサンプルを迅速に遠心分離し、上清を廃棄して直ちにペレットを液体窒素で凍結した。更なるプロセッシングまでサンプルは80°Cで保存した。新しく調製したPBMCと自己exvivo前活性化Th細胞との共培養におけるTh細胞の表面の活性化マーカーCD40Lの存在は、ESAT6CFP10による刺激後の時間経過にしたがって予め分析した。これらの分析で、invitroで特異的に再刺激したTh細胞はそれらの表面に一過性のCD40Lの発現を提示することが示され、CD40L発現細胞の最高数は抗原装荷APCとの共培養の6時間後に観察されたデータは示されていない。c抗原特異的活性化Th細胞の間接検出としてのRTqPCRによるPBMCの41BBLmRNAの定量peqLabpeqGOLD全RNAキットpeqLabを用いて、全RNAを細胞サンプルから単離した。DNAの夾雑は、peqGOLDDNaseIダイジェストキットpeqLabを用いて除去した。全RNAは60μLのDEPC水で溶出させたDEPC水:1Lの蒸留水1mLのジエチルピロカーボネートSigma;1時間37°Cでインキュベーション、続いて121°Cで15分のオートクレーブ。cDNAへの逆転写RTPCRのために、10μLの溶出RNAを10μLのRTPCRマスターミックスと混合した。RTPCRマスターミックスは、DEPC水に50mMの緩衝液A緩衝液A中のTaqMan1000RXNGoldAppliedBiosystems、5mMMgCl2緩衝液A中のTaqMan1000RXNGoldAppliedBiosystems、25mMランダム化ヘキサマーMWGOperonsEurofins、5mMdNTP、25UμLのMuLV逆転写酵素AppliedBiosystems、1UμLのRNase阻害剤AppliedBiosystemsを含んでいる。逆転写は、23°Cで15分、95°Cで5分及び42°Cで30分実施し、PTC200ペルティヤーPeltierサーモサイクラーMJResearchを用いた。続いて以下を含む24μLのqPCRマスターミックスを6μLの前記作製cDNAと混合した:DEPC水中の50mM緩衝液A、6875mMMgCl2、0308μM41BBLフォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCGbiomers配列番号:1で示す、0308μM41BBLリバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAACbiomers配列番号:2で示す、02525μM41BBLプローブFAMCCACCAGCTGCGCAAACATGCTMR、TIBMolbiol、0308μMGAPDHフォワードプライマーGAAGGTGAAGGTCGGAGTCbiomers配列番号:4で示す、0308μMGAPDHリバースプライマーGTAAACCATGTAGTTGAGGTCbiomers配列番号:5で示す、02525μMGAPDHプローブYAKTCATTGATGGCAACAATATCCACTTMRTIBMolbiol配列番号:6に示す、0003125UμLのTaqGoldポリメラーゼ。qPCRの温度プロフィールは、95°Cで10分の工程とその後に続く95°Cで15秒及び60°Cで1分から成る50サイクルを含み、StepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsを用いて実施した。THP1細胞構成的に41BBLmRNAを発現するを陽性コントロール及び参照として供した。前記をこの試験でサンプルと同じ態様で処理した。その後、以前に増幅させた同様なグリセロアルデヒド3ホスフェートデヒドロゲナーゼGAPDHを参照遺伝子として用い、41BBLmRNAの相対的定量を以下の式にしたがって実施した:R=2ΔΔCqΔΔCq=-CqGAPDH--CqGAPDH結果は、マーカーmRNA生成の刺激サンプル対対応する陰性コントロールの比として提供され、既にGAPDHで正規化されている。分析は各サンプルについてトリプリケートで実施した。これらの分析により、ESAT6CFP10タンパク質装荷自家PBMCと共培養したESAT6CFP10特異的前活性化Th細胞は、非装荷PBMCと共培養したものと比較して、測定可能な41BBLmRNA生成の増加を誘導することが示された図3。ESAT6CFP10タンパク質装荷PBMCの共培養における41BBリガンドmRNA生成誘導とexvivoエクスパンドESAT6CFP10タンパク質特異的Th細胞数との相関性ヒト型結核菌潜伏感染対象者のESAT6CFP10特異的Th細胞を、実施例1の項aに記載したようにexvivoでエクスパンドし、続いて新しく調製した自家PBMCと実施例1の項bに記載したように共培養した。このプロセスで、1x106のPBMCと共培養したESAT6CFP10特異的Th細胞の数は、一続きの半対数的濃度で定量された濃度段階:1x106のPBMCにつき0、117、370、1170、3700、11700、37000、117000の前活性化Th細胞。インキュベーションから0、05、1、2、3、4、6、8及び10時間後に2x105の細胞を取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。全RNAを実施例1のcのプロトコルにしたがって単離し、41BBLmRNAの生成に関してRTqPCRで分析した。これらの分析では、前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞の数とマーカーのシグナル強度41BBLmRNAの生成の増加との間に明瞭な相関性が観察された図4。非刺激及びESAT6CFP10刺激PBMCと自己のexvivo前活性化ヒト型結核菌ESAT6CFP10特異的Th細胞との共培養における41BBL及びIFNγmRNA生成の誘導ヒト型結核菌潜伏感染患者のESAT6CFP10特異的Th細胞を、実施例1のaに記載したようにexvivoでエクスパンドし、続いて新しく調製した自家PBMCと実施例1のbに記載したように共培養した。このプロセスで、50000のexvivo前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞を1x106のPBMCと共培養した。0から32時間にわたって2時間の間隔で、各事例において2x105の細胞を培養サンプルから取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。全RNAを実施例1のcのプロトコルにしたがって単離し、41BBLmRNAの生成に関してRTqPCRで分析した。加えて、サイトカインIFNγのmRNAも実施例1のcに記載したように分析したIFNγはAPCの特異的T細胞との抗原特異的接触後にT細胞によって放出される。この目的のために、以下のプライマープローブ系を用い、ここでも同様にGAPDHを参照遺伝子として用いた:IFNγフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACATbiomers配列番号:7で示す;IFNγリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCAbiomers配列番号:8で示す;IFNγプローブFAMTTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAATMR配列番号:9で示す。ヒト型結核菌潜伏感染者では、ヒト型結核菌特異的Th細胞がPBMC混合物に存在し、この細胞はまた部分的にESAT6CFP10に対して特異性を示す。対照的に、活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞は、急性病期に一過性に出現し、そのときだけPBMC混合物で見出される。力価測定によれば、PBMCへのexvivo前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞の添加は急性結核症感染を模倣する。これらの分析は、41BBLmRNAの生成増加とは別に、IFNγmRNAの相対的増加が、exvivo前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞と潜伏性結核症のドナーの自家PBMCとの共培養で検出できることを示している図5A及び5B。ESAT6CFP10装荷PBMCとESAT6CFP10特異的活性化Th細胞又は非特異的前活性化Th細胞との共培養における41BBLmRNA生成の誘導RTT方法の抗原特異性を証明するために、ESAT6CFP10タンパク質の存在下及び非存在下で潜伏性結核症ドナーのPBMCを、前活性化ESAT6CFP10特異的活性化Th細胞又はESAT6CFP10非特異的活性化Th細胞で刺激し、ESAT6CFP10刺激培養の41BBL生成の相対的増加を、RTqPCR技術を用いて種々の時点で非刺激細胞培養と比較して決定した。この目的のために、Th細胞を実施例1のaに記載したように単離し、そのようにして入手したTh細胞を市場で入手できるT細胞エクスパンダービーズDynabeadsInvitrogenと2:1の割合で14日間R5培養液にて37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気で培養した。T細胞の活性化は、CD40Lの発現をモニターすることによってフローサイトメトリーで決定した。この分析で、エクスパンダービーズによる刺激から14日後に40を超えるTh細胞がCD40をそれらの表面に提示することが証明されたデータは示されていない。続いて、10μgmLのESAT6CFP10の存在下及び非存在下で、1x106mLの新しく調製した自家PBMCを、各事例で0、210、6636又は66360のexvivo前刺激ESAT6CFP10特異的Th細胞実施例1のaの記載にしたがって作製又は非特異的活性化Th細胞実施例1のbにしたがって作製と共培養した。0、05、1、2、3、4、6及び8時間後に、各事例で2x105の細胞を共培養から取り出し、実施例1のcに記載したようにRTqPCRで41BBLmRNAの生成に関して分析した。これらの実験で、特異的刺激共培養サンプルと非刺激共培養サンプルと比較したとき、前活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞の数と41BBL発現の相対的増加との間で正の相関性が示された。対照的に、非特異的前活性化Th細胞との共培養サンプルでは、41BBLのmRNA生成の相対的増加の顕著な低下が観察された図6。ESAT6CFP10、BZLF1又はpp65の存在下及び非存在下の、ヒト型結核、EBV及びCMV陽性ドナーから選択したPBMCとexvivo前活性化ヒト型結核菌ESAT6CFP10、EBVBZLF1又はCMVpp65特異的Th細胞との共培養における41BBLmRNA生成誘導の特異性さらに別の実験で、iヒト型結核菌ESAT6CFP10、EBVBZLF1及びCMVpp65タンパク質のPBMCへの装荷自体が41BBLmRNAの非特異的活性化を誘導するか否か、及びiiRTTマーカーの誘導は、APCと活性化Th細胞との抗原特異的態様における相互作用により生じるか否か、が分析された。この目的のために、ヒト型結核菌に潜伏感染したEBV及びCMV血清陽性ドナーのTh細胞を単離し、実施例1のaに記載されたようにexvivoでエクスパンドし前活性化させた。続いて、Exvivoでエクスパンドした70000のTヘルパー細胞を10μgmLのESAT6CFP10、BZLF1又はpp65の存在下及び非存在下で、各事例で1x106PBMmlの実施例1のbに記載されたように新たに調製した自家PBMCと共培養した。0、05、1、2、3、4、6、8及び10時間後に、各事例で2x105の細胞を共培養から取り出し、5分間300gでペレットにし、前記ペレットを直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。全RNAを実施例1のcのプロトコルにしたがって単離し、41BBLmRNAの生成についてRTqPCRで分析した。これらの分析によって、APC含有PBMCの多様な刺激抗原による刺激は、41BBLmRNAの非特異的活性化を誘引しないことが証明された。加えて、これらの分析は、APCの41BBLmRNAの生成増加はもっぱら活性化Th細胞とAPCとの抗原特異的接触の後で生じることを立証した。ヒト型結核菌特異的Th細胞を自家PBMCと共培養した場合、それらは、ESAT6CFP10の存在下でのみ41BBLmRNAの生成を誘引したが、BZLF1若しくはpp65の存在下又は抗原の非存在下では誘引しなかった図7及び8a。加えて、invitro前活性化BZLF1及びpp65特異的Th細胞は、それぞれ自家PBMC対応する活性化T細胞の対応する標的抗原構造物を既に装荷されていたの培養においてのみ41BBLmRNA生成の増加を誘導した図8b及び8c。さらにまた、実行した分析は、41BBLmRNAの誘導効率とPBMCに存在する抗原特異的CTLの数は逆比例することを示している。TB患者の血中には、ESAT6CFP10特異的CTLは通常非常にわずかしか見出すことができないが、CMV及び特にEBV血清陽性対象者では、それぞれ既存のメモリーT細胞の顕著な割合又は支配的割合が細胞傷害性T細胞CTLの亜集団に帰属する。ESAT6CFP10特異的前活性化Th細胞とESAT6CFP10装荷PBMCとの共培養では、最強の41BBL活性化が観察され、BZLF1特異的前活性化Th細胞とBZLF1装荷PBMCとの共培養ではもっとも低い41BBLの活性化が観察された。この発見は、シグナル提供APCの特異的CTLによる溶解と説明できよう。BZLF1装荷PBMCとexvivo活性化BZLF1特異的Th細胞との共培養における41BBリガンドmRNA生成誘導のブロッキング抗MHCクラス1抗体の添加による調節ヒト型結核菌感染はもっぱらTh細胞によって制御される。加えて、細胞傷害性T細胞CTLもまた、病原体感染細胞の認識及び破壊によってこの病原体との戦いに役割を果たす。ある種の感染すなわちエプスタインバールウイルスEBV感染では、CTLは支配的なTリンパ球集団である。本発明の方法の場合、いわゆる逆T細胞技術RTTにより、CTLもまた病原体特異的標的構造物を装荷されたAPCをこれらがAPCのマーカーRTTマーカーを発現する前であっても認識しこれを破壊することが可能である。それによって可能なシグナル提供APCの数、したがって試験の感度が低下する。RTT方法の感度に対する細胞傷害性T細胞の影響を精査するために、invitro前活性化BZLF1特異的Th細胞実施例1のaにしたがって作製とBZLF1装荷自家PBMCとの共培養を用いた実験を、MHC1ブロッキング抗体10μgmLHLAABCantibodyCatNoMCA81EL;クローンW632AbDSerotecの存在下及び非存在下で実施例1のbに記載したように実施した。抗原提示細胞上のMHC1分子と抗体との結合のために、CTLによるそれらの認識は妨げられ、結果としてタンパク質装荷APCの殺滅は発生しない。1x106細胞mLをBZMで共培養した1x106のPBMCにつき70000のBZLF1特異的前活性化Th細胞を用いた。0、1、2、3、4、6、8及び10時間の時点で、各事例で2x105サンプルの細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。続いて、実施例1のcに記載したように、41BBLmRNAの含有量をRTqPCRで分析した。MHCクラス1ブロッキング抗体を用いることによって、これらの実験で、BZLF1特異的Th細胞とBZLF1装荷PBMCとの共培養で41BBLmRNAの生成を顕著に増加させることができた図9。活性化Th細胞の間接的検出のための、活動性及び潜伏性結核症患者並びに健常ドナーのPBMCにおける41BBリガンドmRNA生成の特異的誘導の分析本方法RTT方法が、活動性結核症の患者の同定並びに潜伏性結核症の患者及び健常ドナーとの区別のために有用であるか否かを究明するために、ヘパリン化注射筒で以下の各事例において3人から血液を取り出してiヒト型結核菌に感染していない健常ドナーp012、p010、p008、ii潜伏性結核症の健常ドナーp009、p006、p005、iii活動性結核症のために本分析前の6カ月間に医薬で治療されたドナーp013、p014、p003、及びiv原因療法の開始前又は開始後間もない活動性結核症のドナーp001、p004、p007、それらからPBMCを新しく単離した。続いて各事例で、1x106細胞mLを10μgmLのESAT6CFP10と37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気でインキュベートした。加えて、選択したドナーのPBMCをコントロール抗原、HIVp24キャプシド抗原健常:p008、潜伏性:p005及びp006、治療:p003、活動性:p007及びp001と一緒に又はウシ血清アルブミンp001と一緒に、又はさらに別の陰性コントロールとして一切の抗原の非存在下でインキュベートした。インキュベーションから05、1、2、3、4、6、8及び10時間後に、各事例で2x105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。続いて、実施例1のcに記載したように、41BBLmRNAの含有量をRTqPCRで分析した。健常ドナーのPBMCではESAT6CFP10による刺激は41BBLmRNAの誘導を生じないことが示された図10a。同様に、ヒト型結核菌潜伏感染対象者図10b又は活動性結核症のために分析前の6カ月間に治療を受けた対象者図10cのPBMCでも、41BBLmRNAの誘導は測定できなかった。原因療法の開始前又は開始後間もない急性期症状を有する対象者のPBMCの場合だけ、ESAT6CFP10による刺激後に、非刺激細胞培養と比較して特異的に刺激した細胞培養で41BBLmRNAの顕著な誘導を観察することができた図10d。無関係の抗原BSA及びp24によるPBMCの刺激は41BBLmRNAの誘導増加をもたらさなかった図10e。ツベルクリンPPDによる、急性及び潜伏性結核症ドナー並びに健常対象者のPBMCにおける41BBLmRNA生成の誘導急性結核症患者のPBMCの41BBLmRNA誘導がより広い抗原域を用いることによって増加し得るか否かを究明するために、活動性及び潜伏性結核症患者並びに健常ドナーの各事例においてヘパリン化注射筒で血液を取り出し、それらからPBMCを新しく単離した。続いて、1x106細胞mLを10μgmLのESAT6CFP10又はツベルクリンPPDStatensSerumInstitutDenmarkと37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気でインキュベートした。加えて、PBMCのアリコートを、陰性コントロールとして抗原の非存在下で、さらに41BBLmRNA生成の誘導能力についての陽性コントロールとして各々の事例で1μgmLのホルボル12ミリステート13アセテートPMASigmaAldrich及びイオノマイシンSigmaAldrichと一緒にインキュベートした。インキュベーションから0、2、4、6、8及び10時間後に、2x105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。続いて、実施例1のcに記載したように、41BBLmRNAの含有量をRTqPCRで分析した。ツベルクリンPPDによる刺激は、ESAT6CFP10よりも何倍も高い41BBLmRNAの誘導を急性結核症の患者のPBMCで誘引することを示すことができた図11a、上図。対比して、潜伏感染及び健常対象者のPBMCでは、ツベルクリンPPDとともにESAT6CFP10による刺激後に41BBLmRNA生成誘導の顕著な増加は観察されなかった図11b及び11c上図。加えて、3通りのドナーの全てのPMAイオノマイシン刺激PBMCアリコートで、非刺激PBMCアリコートと比較して、41BBLmRNA生成の顕著な増加が観察され、したがって、このRTTマーカーの生成についてPBMCの機能性が立証された図11a-c、下図。PMAイオノマイシン又はPGE2抗CD40の組合せによる刺激後の健常ドナーのPBMCにおける41BBリガンド発現誘導のタイムコース活性化T細胞を検出する本発明のRTT方法のための陽性コントトールを同定するために、PMAイオノマイシン又はPEG2抗CD40の組合せが、41BBLmRNA発現の非特異的誘導を誘引するか否か又はどの程度誘引するかを究明した。この目的のために、健常ドナーの1x106PBMCmLを、各事例で1μgmLのPMA及びイオノマイシン又は5μgmLのPEG2AlexisBiochemicals及び2μgmLのCD40抗体LEAF抗CD40Biozolの組合せとともにインキュベートした。陰性コントロールとして非刺激PBMCを供した。インキュベーションから0、2、4、6及び8時間後に、5x105の細胞を取り出し、ペレットにし、直ちに液体窒素で凍結した。更なる使用まで細胞を80°Cで保存した。続いて、実施例1のcに記載したように、41BBLmRNAの含有量をRTqPCRで分析した。これらの分析で、PMA及びイオノマイシン図12aは、PGE2及びCD40抗体の組合せ図12bよりも顕著に強い非特異的誘導物質であることが示された。invitro前活性化ヒト型結核菌特異的Th細胞と自家PBMCとの、非刺激及びESAT6CFP10刺激共培養における、41BBLmRNA生成の相対的誘導の種々の参照遺伝子を用いた比較測定本発明のRTT方法に適切な参照遺伝子を同定するために、参照遺伝子GAPDH、huP0及びPGBDを41BBLmRNA量の正規化のために実施例3に記載したcDNAサンプルで対応するプライマープローブ系を用いて増幅させた。この目的のために、遺伝子増幅のためのプライマープローブ系を実施例1のcに記載のRTqPCR条件にしたがって用いた。この目的のために以下のプライマープローブ系を用いた:huP0フォワードプライマーGTGGTGCTGATGGGCAAGAbiomers配列番号:10で示す;huP0リバースプライマーGCAGCAGTTTCTCCAGAGCTGbiomers配列番号:11で示す;huP0プローブFAMACCATGATGCGCAAGGCCATCCTMRTIBMolbiol、配列番号:12で示す;PBGDフォワードプライマーCCAGCTCCCTGCGAAGAG配列番号:13で示す;PBGDリバースプライマーCACTGAACTCCTGCTGCTCGbiomers配列番号:14で示す;PBGDプローブFAMCCCAGCTGCAGAGAAAGTTCCCGCTMRTIBMolbiol配列番号:15で示す;分析は、GAPDH、huP0及びPBGDを参照遺伝子として、さらに非刺激コントロールをカリブレーターとして用い、2ΔΔCq方法にしたがって実施した。これらの分析は、41BBLmRNAの含有量は、3つの参照遺伝子のいずれを用いても最終結果に顕著な影響を与えることなく正規化できることを示した図13。3つの参照遺伝子で正規化すると41BBLmRNAの誘導の強さの違いが観察されたが、傾向は比較可能であった。ESAT6CFP10装荷PBMCとexvivoエクスパンドESAT6CFP10特異的Th細胞の共培養における41BBリガンド発現のフローサイトメトリーによる決定invitroエクスパンド活性化ESAT6CFP10特異的Th細胞実施例1のaにしたがって作製を自家PBMCと1:1で混合し、組換えESAT6CFP10の存在下及び非存在下でR5中の1x106細胞mLの濃度で28時間共培養した。最後の26時間に、タンパク質分泌をブレフェルジンAによって阻害した。続いて、B細胞の41BBLのタンパク質発現を実施例1のaのプロトコルにしたがって細胞内標識し、続いてフローサイトメトリーによって決定した。表面染色のためには抗CD19Rピコエリトリンシアニン7PerCy7BDの5μLを、41BBLの細胞内染色のためには20μLの抗41BBLPEを用いた。これらの分析によって、非刺激B細胞は非常に高い含有量の細胞内既存41BBLを既に示し、したがってESAT6CFP10による刺激後のタンパク質レベルでの41BBL発現の更なる誘導が検出できないことが示された図2。これらの分析により、タンパク質レベルでのT細胞誘導成熟プロセスの検出は、変動性で部分的に非常に高い含有量のRTTマーカーのせいで、制限付きではあるがフローサイトメトリー又はELISA及びELISpot技術を用いることによってのみ可能であることが明らかにされた。RTT方法のためのRTqPCR正規化用参照遺伝子の同定。細胞内発現が生物学的変化によって引き起こされない、多様な反応混合物における発現レベルの変動はしたがって修正されるであろう。臨床サンプル分析のためにRTT方法において適切な参照遺伝子を同定するために、多様な対象者のグループ由来のPBMCサンプルを異なる3つの条件下で刺激し、参照遺伝子に対するRTqPCRの結果を対応する非刺激サンプルの結果と比較した。2人の活動性TB感染患者、1人の潜伏性TB感染者並びに1人の健常対象者及び1人の健常BCGワクチン接種対象者のヘパリンナトリウム血液サンプルを処理した。この目的のために、PBMCを実施例1のaに記載したように単離した。続いて6mLにつき1x106のPBMCをB細胞培養液中で刺激した。刺激は、ESAT6CFP1010μgmL、ツベルクリンPPD10μgmL、非特異的にPMAイオノマイシン各事例1μgmLにより、37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気で6時間にわたって実施した。インキュベーション後、細胞を10分間300gでペレットにし、上清を廃棄し、ペレットを1のβメルカプトエタノールを含むRLT緩衝液QIAGENに溶解し、直ちに液体窒素で凍結させた。RNAは、DNase消化を含むRNeasyミニキットQIAGENを製造業者の指示にしたがって用いてカラムで単離した。cDNA合成は、QuantiTect逆転写キットQIAGENを用いて実施した。qPCRは、CustomTaqMan遺伝子発現アレイ96ウェルファストプレートAppliedBiosystems及びTaqManファストユニバーサルマスターミックスAppliedBiosystemsを用いABIStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsで製造業者の指示にしたがって実施した。RTqPCR用に良好に適合させた参照遺伝子の遺伝子発現は、全ての適用実験条件下及びそこで意図される刺激下で一定に維持されるべきである。加えて、参照遺伝子の発現レベルは標的遺伝子の発現レベルと対応するべきである。同様に、qPCR効率は標的遺伝子の1つと同様であるべきである。5つのサンプル全てについて、結果を比較し分析した。結果を図14に示す。種々の刺激条件に対するRTTマーカー遺伝子TNFSF9及びIFNGの発現はCq23からCq30の間で検出された。遺伝子TAF1A及びHMBSは、41BBLTNFSF9とも称される及びIFNγIFNGとも称されるのRTTマーカーRNAのための参照遺伝子として適切であり、それは、全ての刺激条件についての定常的発現のため並びにCq28-Cq29における発現レベルのため及び標的遺伝子の1つと比較して同様なRTqPCR効率のためであるデータは示されていない。より高い発現レベルを有するまた別のマーカーとしては、HPRT1又はRPLP0が適切な参照遺伝子と考えることができる。総合すればこのようにして、発現レベルが全実験条件下で一定に維持されるいくつかの適切な参照遺伝子がこれらの分析で同定できた。RTTマーカー遺伝子の発現レベルに応じて、TAF1A、HMBSは低発現のために、HPRT1は中間的発現のために、またRPLP0は高い発現のために参照遺伝子として用いることができる。マーカーTNFSF9及びIFNGのためには、TAF1Aが参照遺伝子として適切である。RTTマーカーのバックグラウンド発現並びに活動性TB感染者及び健常者間の識別のための閾値の決定のための、非刺激サンプルと比較した、種々の患者に由来するツベルクリンPPD刺激PBMCにおける41BBLTNFSF9とも称される発現の測定健常対象者及び潜伏性TB患者におけるRTTマーカー41BBLTNFSF9とも称されるの平均的バックグラウンド発現についての情報を得るために、21人の対象者の血液で本発明のRTT方法を実施した。この目的のために、PBMCを実施例1のaに記載したように単離した。サンプルにつき、5x106のPBMCをB細胞培養液中で、10μgmLのツベルクリンPPDの存在下及び非存在下で37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気で6時間インキュベートした。刺激はデュープリケートで実施し、それぞれ別個に処理した。インキュベーション後に、細胞をペレットにし、40mMのDTTを含むRLT緩衝液QIAGENGmbHHildenGermany中で溶解させ、溶解物を直ちに液体窒素で凍結した。RNAは、DNase消化を含むRNeasyミニキットQIAGENを製造業者の指示にしたがって用いてカラムで単離した。cDNA合成は、製造業者の指示にしたがいQuantiTect逆転写キットQIAGENにより各事例で1μgのRNAを用いて実施した。qPCRは、10μLの全反応体積中に1μLのcDNAを用い、TaqManファストユニバーサルマスターミックスAppliedBiosystemsを用いることによって実施した。マスターミックスは以下の組成を有していた:300nMのNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCG配列番号:1で示す;300nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAAC配列番号:2で示す;200nMのTNFSF9プローブFAMCCACCAGCTGCGCAAACATGCTMR配列番号:3で示す;1xTaqManファストユニバーサルPCRマスターミックス、1xTaqMan遺伝子発現アッセイTAF1AVIC色素標識MGBプローブプライマー限定AppliedBiosystems。qPCRの温度プロフィールは、95°Cで20秒の変性、続いて95°Cで3秒及び60°Cで30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsを用いて実施した。21サンプルについて比較Cq分析2ΔΔCqの各事例で2つの別個の刺激から得られた結果の平均値は図15に示されている。これらの分析は、刺激後のRTTマーカーTNFSF9発現の相対的増加は、潜伏性TB対象者、健常個体及びBCGワクチン接種健常個体では2倍未満又はせいぜい2倍として認められたが、一方、活動性TB感染患者は2倍を超える発現増加を有することを示した。したがって、2ΔΔCq=20の予備的閾値を決定することができた。それぞれ活動性感染TB患者と健常個体又は潜伏性TB対象者との間の弁別はしたがってRTT方法を用いれば可能である。代替の部分合成無血清培養液によるIFNγIFNGとも称される発現の改善IFNγIFNGとも称されるシグナルが、代替細胞培養液を用いることによって増加させ得るか否かを調査するために、いくつかの部分合成培養液を試験した。通常的に用いられるB細胞培養液はIL4を含むIL4はIFGNシグナルの阻害をもたらし得る。加えて、前記培養液は自家製AB血清を含み、それは標準的条件すなわち品質が変動しない一定の条件が場合によって伴われ得ないことを意味する。潜伏性TBの3人の対象者及び3人の健常個体の血液サンブルを用いて、本発明のRTT方法を実施した。この目的のために、PBMCを実施例1のaに記載したように単離した。サンプルにつき、5x106のPBMCを2.5mLの種々の細胞培養液で、それぞれ10μgmLのツベルクリンPPDの存在下及び非存在下で37°C及び5CO2下の湿潤雰囲気で6時間インキュベートした。以下の培養液を試験した:B細胞培養液BZM、IL4を含まないB細胞培養液BZM、LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液Ultra及びInvitrogenのAIMV培養液AIMV。細胞溶解、RNA抽出、cDNA合成及びqPCRは実施例13に記載したように実施した。発現の増加はIFGN及び41BBLTNFSF9とも称されるについて判定した図16及び図17を参照されたい。IFNGのマスターミックスは以下の組成を有していた:300nMのIFNGフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACATbiomers配列番号:7で示す;300nMのIFNGリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCAbiomers配列番号:8で示す;200nMのIFNGプローブFAMTTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAATMRTIBMOLBIOL配列番号:でに示す;1xTaqManファストユニバーサルPCRマスターミックス、1xTaqMan遺伝子発現アッセイTAF1AVIC色素標識MGBプローブプライマー限定AppliedBiosystems。TNFSF9のためのマスターミックスは以下の組成を有していた:300nMのTNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCGbiomers配列番号:1で示す;300nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAACbiomers配列番号:2で示す;200nMのTNFSF9プローブFAMCCACCAGCTGCGCAAACATGCTMRTIBMOLBIOL配列番号:3で示す;1xTaqManファストユニバーサルPCRマスターミックス、1xTaqMan遺伝子発現アッセイTAF1AVIC色素標識MGBプローブプライマー限定AppliedBiosystems。qPCRの温度プロフィールは、95°Cで20秒の変性、続いて95°Cで3秒及び60°Cで30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsで実施した。IFNG発現の相対的増加2ΔΔCqは、刺激後に通常のBZMよりもUltraCULTURETM及びAIMV培養液で顕著に強くなった。B細胞培養液からIL4を除去BZMしてもシグナル増強は生じなかった図16。UltraCULTURETMでの刺激では、TNFSF9発現の相対的増加は、潜伏性TB患者及び健常対象者のサンプルでは検出できなかった。対照的に、AIMV培養液の刺激は、B細胞培養液及びUltraCULTURETM培養液と比較したとき、TNFSF9RNA発現の強い非特異的誘導をそれぞれもたらした図17。これらの分析は、培養液の選択が、RTTマーカー遺伝子の相対的発現に対して強い影響を有し得ることを示している。LONZAの無血清UltraCULTURETM培養液の使用は、潜伏性TB対象者のサンプルでIFNGシグナルの顕著な強化をもたらし、RTTマーカー遺伝子TNFSF9のバックグラウンド発現は一定であった。三重qPCRを用い参照遺伝子に対し同時正規化することによる2つのRTTマーカー遺伝子の同時検出本発明のRTT方法の簡易化及び実用性の改善とともに適用範囲の拡大のために、三重RTqPCRを開発した。三重RTqPCRは、1つの反応サンプルで、RTTマーカー41BBLTNFSF9とも称される及び潜伏性TB感染検出のためのマーカーIFNγIFNGとも称されるの同時検出を可能にし、さらにまた別に参照遺伝子を用いることによりシグナルの正規化を可能にする。潜伏性TB対象者のサンプルを実施例12に記載したように本発明の方法にしたがって処理した、qPCRは、10μLの全反応体積中に1μLのcDNAによりTaqManファストユニバーサルPCRマスターミックスAppliedBiosystemsを用いて実施した。前記マスターミックスは以下の組成を有していた:150nMのTNFSF9フォワードプライマーGAGGGTCCCGAGCTTTCGbiomers配列番号:1で示す;150nMのTNFSF9リバースプライマーGCCCATCGATCAGCAGAACbiomers配列番号:2で示す;200nMのTNFSF9プローブFAMCCACCAGCTGCGCAAACATGCBBQTIBMOLBIOL配列番号:3で示す;300nMのIFNGフォワードプライマーGTGGAGACCATCAAGGAAGACATbiomers配列番号:7で示す;300nMのIFNGリバースプライマーGGCGACAGTTCAGCCATCAbiomers配列番号:8で示す;200nMのIFNGSondeBoTMRTTCATGTATTGCTTTGCGTTGGACATTCAABBQTIBMOLBIOL配列番号:9で示す;1xTaqManファストユニバーサルPCRマスターミックス、1xTaqMan遺伝子発現アッセイTAF1AVIC色素標識MGBプローブプライマー限定AppliedBiosystems。qPCRの温度プロフィールは、95°Cで20秒の変性、続いて95°Cで3秒及び60°Cで30秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsで実施した。図18は、潜伏性TB対象者の1つのサンプルの比較Cq分析2ΔΔCqの結果を示す。三重qPCRの結果左及び比較として対応する二重qPCRの結果右が提供される。二重qPCRのサンプルは実施例14に記載したように調製した。これらの比較分析は、RTTマーカーの検出は原理的に参照遺伝子による複数の値の同時正規化により多重反応が可能であることを示している。非刺激サンプルと比較した2人の対象者のツベルクリンPPD刺激PBMCにおける本発明のRTTのためのさらに別のマーカー遺伝子の発現決定本発明のRTT方法のより高い感度を達成するために、SYBRグリーンシステムを用いさらに別のマーカーをRTqPCRで試験した。この目的のために、各事例で1人の潜伏性TB患者及び1人の健常対象者のサンプルを実施例12に記載したように本発明の方法にしたがって処理した、qPCRは、20μLの全反応体積中に1μLのcDNAを用いブリリアントIIIウルトラファストSYBRグリーンQPCRマスターミックスBrilliantIIIUltraFastSYBRGreenQPCRMasterMixAppliedBiosystemsで実施した。前記マスターミックスは以下の組成を有していた:300nMのフォワードプライマー、300nMのリバースプライマー、1xのブリリアントIIIウルトラファストSYBRグリーンQPCRマスターミックス、300nMの参照色素。以下のプライマーを用いた:FCGR1ABCフォワードプライマーGAAGGGGTGCACCGGAATIBMOLBIOL配列番号16で示す;FCGR1ABCリバースプライマーCTCACGGGGAGCAAGTGGTIBMOLBIOL配列番号17で示す;CXCL9フォワードプライマーGAGTGCAAGGAACCCCAGTAGT配列番号18で示す;CXCL9リバースプライマーGGTGGATAGTCCCTTGGTTGGT配列番号19で示す;CXCL10フォワードプライマーTCCACGTGTTGAGATCATTGC配列番号20で示す;CXCL10リバースプライマーTCTTGATGGCCTTCGATTCTG配列番号21で示す;CXCL11フォワードプライマーCAAGGCTTCCCCATGTTCA配列番号22に示す;CXCL11リバースプライマーCCCAGGGCGTATGCAAAGA配列番号23で示す全てのCXCLプライマーは以下の学位論文に由来する:TheresaKnoblach2010DasCytomegalievirusIE1ProteinalsRegulatordeshumanenTranskriptomsundZielstrukturRNAibasierterTherapiestrategienUniversityofRegensburg。qPCRの温度プロフィールは、95°Cで3分の変性、続いて95°Cで5秒及び60°Cで10秒から成る40サイクルを含んでいた。qPCRはStepOnePlusリアルタイムPCRシステムAppliedBiosystemsで実施した。比較Cq分析2ΔCqの結果は図19において両サンプルについて提供される。潜伏感染TB患者及び健常個体の刺激及び非刺激サンプルにおけるこの比較分析はそれぞれ、これらの遺伝子が潜伏性TBの検出のためのマーカーとして適切であり得ることを示している。