PD1分子と特異的に結合する少なくとも1つの結合部位、およびTIM3分子と特異的に結合する少なくとも1つの結合部位を含む、多重特異性ポリペプチド剤。PD1分子と特異的に結合する1つの結合部位、およびTIM3分子と特異的に結合する1つの結合部位を含む、二重特異性ポリペプチド剤。多重特異性抗体またはその多重特異性抗体断片である、請求項1記載のポリペプチド剤。二重特異性抗体またはその二重特異性抗体断片である、請求項2記載のポリペプチド剤。PD1分子が、SEQIDNO1に示された配列を有するか、またはSEQIDNO1の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド剤。TIM3分子が、SEQIDNO2に示された配列を有するか、またはSEQIDNO2の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド剤。PD1分子と特異的に結合する結合部位が、PD1のリガンド相互作用部位に指向する、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド剤。TIM3分子と特異的に結合する結合部位が、TIM3のリガンド相互作用部位に指向する、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド剤。PD1のリガンド相互作用部位との特異的結合が、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートする、請求項7記載のポリペプチド剤。PD1のリガンド相互作用部位との特異的結合が、PD1とPDL2との相互作用をモジュレートする、請求項7記載のポリペプチド剤。PD1のリガンド相互作用部位との特異的結合が、PD1とPDL1およびPDL2との相互作用をモジュレートする、請求項7記載のポリペプチド剤。PD1のリガンド相互作用部位が、SEQIDNO1のアミノ酸残基41~136を含む、請求項7または請求項9~11のいずれか一項記載のポリペプチド剤。PD1におけるリガンド相互作用部位が、SEQIDNO1のアミノ酸64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む、請求項7または請求項9~12のいずれか一項記載のポリペプチド剤。PD1におけるリガンド相互作用部位が、SEQIDNO1のアミノ酸78、126、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む、請求項7または請求項9~13のいずれか一項記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位との特異的結合が、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートする、請求項8記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位との特異的結合が、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートする、請求項8記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位との特異的結合が、TIM3とガレクチン9およびホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートする、請求項8記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位が、SEQIDNO2のアミノ酸残基24~131を含む、請求項8または請求項15~17のいずれか一項記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位が、SEQIDNO2のアミノ酸50、62、69、112、および121からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む、請求項8または請求項15~18のいずれか一項記載のポリペプチド剤。TIM3のリガンド相互作用部位が、SEQIDNO2のアミノ酸44、74、および100からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む、請求項8または請求項15~19のいずれか一項記載のポリペプチド剤。請求項1~20のいずれか一項記載のポリペプチド剤の有効量を、慢性免疫病を有する対象へ投与する工程を含む、慢性免疫病を有する対象を処置する方法。請求項1~20のいずれか一項記載のポリペプチド剤の有効量を、慢性免疫病を有する対象へ投与する工程を含む、慢性免疫病を有する対象において免疫応答を活性化する方法。慢性免疫病が持続感染である、請求項21または22記載の方法。慢性免疫病が癌または腫瘍である、請求項21または22記載の方法。慢性免疫病が、機能的に疲弊したT細胞の集団を含む、請求項21~24のいずれか一項記載の方法。機能的に疲弊したT細胞の集団が、CD8T細胞集団を含む、請求項25記載の方法。詳細な説明阻害性受容体PD1およびTim3の両方を同時発現している細胞を標的化するための組成物および方法が、本明細書に記載される。これらの組成物および方法は、Tim3経路およびPD1経路の阻害の組み合わせが、疲弊したまたは非応答性のT細胞のような免疫細胞の免疫学的な活性および機能を回復させること、そしてこれらの2種の経路のそのような阻害の組み合わせが、癌または持続感染のような、特異的な免疫応答の不足または阻害を特徴とする慢性免疫病のコントロールおよび処置において、いずれかの経路のみの標的化より有効であることの新規の発見に、一部、基づく。従って、PD1およびTIM3が細胞の表面において同時発現されている時、これらの分子と特異的に結合する二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤を含む新規の組成物、ならびに慢性免疫病においてこれらの阻害性受容体を同時発現している機能的に疲弊したまたは非応答性の免疫細胞のような細胞を標的化する方法が、本明細書に記載される。例えば、1つまたは複数のリガンド相互作用部位と特異的に結合することにより、これらの阻害性受容体のそのリガンドとの相互作用を遮断するかまたは阻害することによって、これらの二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、PD1およびTIM3の阻害性シグナルを妨害しかつ/または阻害し、従って、これらの受容体を発現している細胞の免疫応答の回復または増加を可能にする。これらの二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、PD1およびTIM3を同時発現している細胞と選択的に結合するため、本明細書に記載されたポリペプチド剤を使用すれば、シングルポジティブ細胞への治療剤の送達に起因し得る望ましくない効果を回避することができる。例えば、本明細書に記載された組成物および方法における二重特異性ポリペプチドおよび多重特異性ポリペプチドの使用は、Tim3のみまたはPD1のみを発現している、疲弊していないT細胞、または病原性の、例えば、自己特異的なT細胞の活性化を妨害し、生産的な免疫応答を開始しているTim3のみまたはPD1のみを発現しているエフェクター細胞の不要な標的化を妨害することができる。PD1およびPD1リガンドPD1またはCD279は、免疫グロブリンIgスーパーファミリードメイン、20アミノ酸スターク、膜貫通ドメイン、およびITIMimmunoreceptortyrosinebasedinhibitorymotifとITSMimmunoreceptortyrosinebasedswitchmotifとを含有しているおよそ95残基の細胞内ドメインから構成される、288アミノ酸のI型膜貫通型タンパク質である。PD1は、マウスにおいては第一染色体上のPdcd1遺伝子、ヒトにおいては第二染色体上のPDCD1遺伝子によりコードされる。両方の種において、Pdcd1は5つのエキソンからなる。エキソン1は、短いシグナル配列をコードし、エキソン2はIgドメインをコードする。スタークおよび膜貫通ドメインがエキソン3を構成し、エキソン4は、細胞質ドメインの始めを特徴付ける短い12アミノ酸配列をコードする。エキソン5は、C末端細胞内残基および長い3UTRを含有しているKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。PD1は受容体のB7ファミリーのメンバーである。PD1のスプライスバリアントが、活性化されたヒトT細胞からクローニングされている。これらの転写物は、エキソン2、エキソン3、エキソン2および3、またはエキソン2~4を欠く。休止末梢血単核細胞PBMCにおいて、エキソン3のみを欠くスプライスバリアントPD1Δex3を除き、これらのバリアントは、全て、全長PD1と類似のレベルで発現されている。全てのバリアントが、抗CD3および抗CD28によるヒトT細胞の活性化により、有意に誘導されるKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。従って、PD1という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、NP005009により記載される、のアミノ酸配列を有する288アミノ酸ポリペプチドをさし、さらに、天然に存在するその対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、およびプロセシングされた型もさす。典型的には、PD1とは、ヒトPD1をさす。PD1という用語は、PD1ポリペプチドの短縮型または断片をさすためにも使用される。PD1のそのような型の言及は、本願において、例えば、PD1により同定され得る。例えば、成熟PD1ペプチドは、本明細書において、PD1と呼ばれ、PD1IgVドメインはPD1と呼ばれる。PD1の特定の残基は、例えば、PD1と呼ばれ得る。PD1は、T細胞、B細胞、ナチュラルキラーT細胞、活性化された単球、および樹状細胞DCにおいて発現されることが示されている。PD1は、休止T細胞においては発現されないが、活性化の後に誘導可能に発現される。T細胞受容体またはB細胞受容体のライゲーションは、Tリンパ球およびBリンパ球におけるPD1をアップレギュレートすることができる。正常なヒト反応性リンパ組織において、PD1は、胚中心関連T細胞において発現されている。細胞内貯蔵庫におけるPD1区画化は、調節性T細胞集団において記載されている。PD1は、ヒトにおいて骨髄CD11cDC上のAPCおよび単球において誘導可能に発現されるKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。PD1は、2種の公知のリガンドPDL1およびPDL2を有し、それらもB7ファミリーのメンバーである。PD1のPDL1との結合界面は、IgV様ドメイン即ち、PD1を介している。PD1のそのリガンドとの結合にとって重要な残基には、残基64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136が含まれる。PDL1CD274は、マウスのT細胞およびB細胞、DC、マクロファージ、間葉系幹細胞、ならびに骨髄由来肥満細胞において構成的に発現されていることが示されている。CD274PDL1発現は、広範囲の非造血系細胞にも見出され、活性化の後に多数の細胞型においてアップレギュレートされる。PDL1は、IFNγによる処理により、PA1骨髄腫、P815マスト細胞腫、およびB16黒色腫を含むほぼ全てのマウス腫瘍細胞株において発現される。癌においては、ホスファチジルイノシトール3キナーゼPI3KおよびAktのシグナル伝達を修飾する細胞ホスファターゼであるホスファターゼテンシンホモログPTENの損失または阻害が、転写後PDL1発現を増加させるKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。PD1との結合にとって重要なPDL1の残基には、PDL1、PDL1、PDL1、PDL1、PDL1、PDL1、およびPDL1が含まれる。PDL2発現は、PDL1発現より制限されている。PDL2は、DC、マクロファージ、および骨髄由来マスト細胞において誘導可能に発現される。PDL2は、休止腹膜B1細胞の50~70においても発現されているが、普通のB2B細胞においては発現されない。PDL2は、GMCSF、IL4、およびIFNγによって、単球およびマクロファージにおいても誘導され得る。PDL2発現は、腫瘍株においても観察されている。PD1およびそのリガンドは、急性感染および慢性感染を引き起こす微生物に対する免疫防御の調節において重要な役割を有することが示されている。PD1PDL経路は、感染の転帰、および有効な抗微生物免疫防御と免疫により媒介される組織傷害との間の微妙なバランスの調節において、重要な役割を果たしているようである。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1のそのリガンドとの結合を阻害するかまたは遮断する。慢性感染を引き起こす多数の微生物が、免疫応答を逃れ、持続感染を確立するため、PD1PDL経路を活用しているようである。慢性ウイルス感染のリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスLCMVモデルにおける研究は、慢性感染におけるPD1PDL経路の役割を最初に示したBarberDLetal2006Nature43968287。慢性感染を引き起こすウイルスは、ウイルス特異的なT細胞を非機能性にし、それにより、抗ウイルスT細胞応答をサイレンシングすることができるWherryEJandAhmedR2004JVirol78553545。CD8T細胞の、本明細書において疲弊とも呼ばれる機能調節障害は、慢性感染における無効なウイルスコントロールの重要な理由であり、マウスにおける慢性LCMV感染に特徴的であり、ヒトにおけるHIV感染、HBV感染、HCV感染、およびHTLV感染、ならびに霊長類におけるSIV感染にも特徴的である。ヒトにおける慢性ウイルス感染において、HIV特異的なT細胞PetrovasCetal2006JExpMed203228192;DayCLetal2006Nature44335054;TrautmannLetal2006NatMed121198202、HBV特異的なT細胞BoettlerTetal2006JVirol80353240;BoniCetal2007JVirol81421525、およびHCV特異的なT細胞BengschBetal2010PLoSPathog6;UrbaniSetal2006JVirol8011398403において、PD1発現が高いことを、いくつかのグループが示している。インビトロのPD1PDL相互作用の遮断は、HIV、HBVBoniCetal2007JVirol81421525、HCV、およびSIVVeluVetal2007JVirol81581928に特異的なCD8T細胞およびCD4T細胞の疲弊を逆転させ、増殖およびサイトカイン産生を回復させることが示されているPetrovasCetal2006JExpMed203228192;DayCLetal2006Nature44335054;TrautmannLetal2006NatMed121198202;UrbaniSetal2006JVirol8011398403。最近の研究は、ヌクレオカプシドタンパク質であるHCVコアが、健康なドナーT細胞におけるPD1およびPDL1の発現をアップレギュレートし得ること、そしてPD1のアップレギュレーションが、HCVコアの補体受容体C1QBPとの相互作用により媒介されることを示しているYaoZQetal2007ViralImmunol2027687。PD1PDL経路は、細菌感染の慢性においても重大な役割を果たすことができる。ヘリコバクターピロリHelicobacterpyloriは、慢性胃炎および胃十二指腸潰瘍を引き起こし、胃癌の発症のリスクファクターである。Hピロリ感染においては、T細胞応答が、感染を除去するためには不十分であり、そのことが持続感染をもたらす。胃上皮細胞は、MHCクラスII分子を発現しており、Hピロリ感染において重要なAPC抗原提示細胞機能を有すると考えられている。抗PDL1遮断抗体は、Hピロリに曝された胃上皮細胞およびCD4T細胞の培養物におけるT細胞増殖およびIL2産生を増強し、このことから、PD1PDL1経路が、Hピロリ感染におけるT細胞応答の阻害において重要な役割を果たしていることが示唆されるDasSetal2006JImmunol17630009。寄生虫も、強力な抑制機能を有するマクロファージを誘導するためにPD1PDL経路を活用している。マウスにおけるテニアクラッシセプスTaeniacrassiceps感染においては、CD4T細胞の高い割合が、PD1を発現しており、活性化されたマクロファージにおいて、PDL1およびPDL2がアップレギュレートされている。PDL1、PDL2、またはPD1の遮断は、テニア感染マウス由来のマクロファージによるインビトロT細胞増殖の抑制を有意に減少させたTerrazasLIetal2005IntJParasitol35134958。同様に、マウスにおけるマンソン住血吸虫Schistosomamansoni感染においては、マクロファージが、高レベルのPDL1および比較的低レベルのPDL2を発現している。抗PDL1は、これらのマクロファージの、インビトロでT細胞増殖を抑制する能力を完全に排除したが、抗PDL2には効果がなかったKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。PD1PDL経路は、寄生原虫メキシコリーシュマニアLeishmaniamexicanaに対する免疫応答においても明瞭な役割を有することが示されているKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。腫瘍は、宿主T細胞が認識することができる抗原を発現しているが、腫瘍の免疫学的除去は稀少である。この不全の一部は、腫瘍微小環境による免疫抑制のためである。最近の研究は、PD1PDL経路が、抗癌/腫瘍免疫応答の抑制に関与していることを示した。腫瘍浸潤リンパ球においては、PD1発現がアップレギュレートされ、これが腫瘍免疫抑制に寄与することができる。PDL1発現は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上皮、頭部、および頸部を含む多様な固形腫瘍においてインサイチューで示されている。さらに、卵巣癌において、PDL1発現は、上皮内浸潤CD8T細胞と逆相関しているが、間質浸潤CD8T細胞とは逆相関しておらず、このことから、PDL1がCD8T細胞の腫瘍内遊走を阻害することが示唆される。また、腫瘍におけるPDL1発現を疾患転帰と関係付ける研究は、PDL1発現が、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、および膵臓癌における予後不良と強く相関しているが、小細胞肺癌とは相関していないことを示しているKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。PD1経路は、血液悪性疾患においても役割を果たし得る。PD1が、血管免疫芽球性リンパ腫のT細胞において高度に発現されており、PDL1が、関連濾胞樹状細胞ネットワークにおいて発現されている。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫においては、リンパ球および/または組織球LH細胞に関連したT細胞が、PD1を発現している。PD1およびPDL1は、HTLV1により媒介される成人T細胞白血病およびリンパ腫においてCD4T細胞において発現されている。PDL2は、マントル細胞リンパ腫において高度に発現されていることが同定されている。PDL1は、多発性骨髄腫細胞において発現されているが、正常な形質細胞においては発現されておらず、骨髄腫細胞に応答して起こるT細胞増大は、PDL1遮断によりインビトロで増強される。PDL1は、いくつかの原発性T細胞リンパ腫、具体的には、未分化大細胞Tリンパ腫において発現されているKeirMEetal2008AnnuRevImmunol26677704。従って、本明細書に記載された組成物および方法のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1の、そのリガンドのうちの1種または複数種との結合を阻害するかまたは遮断する。TIM3およびTIM3リガンドTIM3は、N末端免疫グロブリンIg様ドメイン、O結合型グリコシル化を有し、膜付近にN結合型グリコシル化を有するムチンドメイン、単一の膜貫通ドメイン、およびチロシンリン酸化モチーフを有する細胞質領域を含むI型細胞表面糖タンパク質である。TIM3は、TIMTcelltransmembraneimmunoglobulinandmucin遺伝子ファミリーのメンバーである。従って、TIM3という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、AAL65157により記載されるのアミノ酸配列を有する301アミノ酸ポリペプチドをさし、さらに、天然に存在するその対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、およびプロセシングされた型もさす。典型的には、TIM3とは、ヒトTIM3をさす。TIM3という用語は、TIM3ポリペプチドの短縮型または断片をさすためにも使用される。TIM3のそのような型または断片に対する言及は、本願において、例えば、TIM3により同定され得る。TIM3の特定の残基は、例えば、TIM3と呼ばれ得る。TIM3は、数回のインビトロTh1分化の後に発現されるマウスTh1特異的細胞表面タンパク質として最初に同定され、その後、Th17細胞においても発現されることが示された。ヒトにおいて、TIM3は、活性化されたCD4T細胞のサブセット、分化したTh1細胞、いくつかのCD8T細胞において発現され、Th17細胞においてはより低いレベルで発現されるHastingsWDetal2009EurJImmunol3924922501。TIM3は、マウスのマスト細胞、マクロファージおよび樹状細胞DCの亜集団、NK細胞、およびNKT細胞、ならびにヒト単球を含む自然免疫系の細胞、ならびにマウス初代気管支上皮細胞株においても発現される。TIM3発現は、転写因子Tbetにより調節される。TIM3は、Th1細胞およびTc1細胞のアポトーシスをもたらす阻害シグナルを生成することができ、アポトーシス細胞の食作用および抗原の交差提示を媒介することができる。TIM1およびTIM3の多形は、T細胞応答の方向を相反的に調節することができるFreemanGJetalImmunolRev2010Can23517289。TIM3は、2種の公知のリガンド、ガレクチン9およびフォスファチジルセリンを有する。ガレクチン9は、長いフレキシブルリンカーにより接合された2つの別個の炭水化物認識ドメインを含むS型レクチンであり、より大きなポリNアセチルラクトサミン含有構造に対する増強された親和性を有する。ガレクチン9は、シグナル配列を有しておらず、細胞質に局在している。しかしながら、それは、分泌される場合もあり、炭水化物鎖を介して標的細胞表面上の糖タンパク質と結合することにより、その機能を発揮するFreemanGJetalImmunolRev2010Can23517289。ガレクチン9は、免疫細胞および胃腸管上皮において広く発現されている。ガレクチン9発現は、マスト細胞において特に高く、T細胞、B細胞、マクロファージ、内皮細胞、および繊維芽細胞にも見出される。ガレクチン9産生は、IFNγによりアップレギュレートされ得る。ガレクチン9は、CD44およびIgEとの相互作用を介して、様々な生物学的機能を発揮することも報告されている。ガレクチン9のTIM3への会合は、Th1細胞の細胞死およびその結果としてのIFNγ産生の低下をもたらす。インビボで与えられた時、ガレクチン9は、EAEモデル、マウス関節炎モデル、心臓および皮膚の同種移植モデル、ならびに接触過敏症および乾癬のモデルを含むいくつかのマウス疾患モデルにおいて、有益な効果を有したFreemanGJetalImmunolRev2010Can23517289。TIM3のガレクチン9との結合にとって重要な残基には、Nグリコシル化および/またはOグリコシル化を受けるTIM3、TIM3、およびTIM3が含まれる。ヒトおよびマウスのTIM3は、いずれも、結合研究、変異誘発、および共結晶構造に基づき、フォスファチジルセリンPtdSerの受容体であることが示されており、TIM3発現細胞は、PtdSerを発現しているアポトーシス細胞に結合しかつ/またはそれを貪食することが示されている。結合部位がIgVドメインの反対側にあることが見出されているため、TIM3のPtdSerとの相互作用は、ガレクチン9との相互作用を排除しない。TIM3のPtdSerとの結合にとって重要な残基には、TIM3、TIM3、TIM3、TIM3、およびTIM3が含まれる。最近の研究は、慢性ウイルス感染に関連したT細胞機能障害の媒介にTIM3が関与していることを示したGoldenMasonLetal2009JVirol8391229130;JonesRBetal2008JExpMed20527632779。進行性HIV感染において、TIM3がCD8T細胞の約50において発現され、ウイルス特異的CD8T細胞において発現されることが見出された。エクスビボのTIM3経路の遮断は、HIV1特異的なT細胞応答を増加させることが見出された。注目すべきことに、TIM3T細胞サブセットは、PD1T細胞サブセットとは本来別個であることが見出されたGoldenMasonLetal2009JVirol8391229130。慢性HCV感染において、TIM3発現は、CD4T細胞およびCD8T細胞、特に、HCV特異的CD8細胞傷害性T細胞CTLにおいて増加していた。ウイルス特異的CTLの過半数が、PD1を単独で発現しているか、またはTim3と共に同時発現していることが見出された。TIM3に対する遮断モノクローナル抗体による処理は、HCV特異的なT細胞疲弊を逆転させたJonesRBetal2008JExpMed20527632779。従って、本明細書に記載された組成物および方法のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、TIM3の、そのリガンドのうちの1種または複数種との結合を阻害するかまたは遮断する。PD1およびTIM3を標的化するための二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤機能的に疲弊した免疫細胞のような細胞の表面においてPD1およびTIM3が同時発現されている時、これらの分子と特異的に結合する二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤が、本明細書に記載される。ポリペプチド剤は、PD1標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する少なくとも1つのポリペプチドドメインと、TIM3標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する少なくとも1つのポリペプチドドメインとを含み得る。本明細書に記載されるように、そのようなポリペプチド剤は、PD1およびTIM3の両方を同時発現しているダブルポジティブ細胞と選択的に結合することができる。従って、抗体およびその抗原結合断片のような、細胞表面抗原と特異的に結合するポリペプチドは、PD1およびTIM3を同時発現している細胞と選択的に結合することができる剤を提供するため、本明細書に記載されるポリペプチド剤へとフォーマットされ得る。これらの二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、PD1およびTIM3を同時発現している細胞と選択的に結合するため、本明細書に記載されたポリペプチド剤を使用すれば、シングルポジティブ細胞への治療剤の送達に起因し得る望ましくない効果例えば、疲弊していないまたは病原性の例えば、自己特異的なT細胞の活性化を回避することができる。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、ポリペプチド剤は、本明細書ならびに米国特許第20100081796号および米国特許第20100021473号これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに記載されるようにして、二重特異性ポリペプチド剤としてフォーマットされ得る。本明細書に記載された局面のその他の態様において、ポリペプチド剤は、例えば、WO03002609これの教示全体が参照により本明細書に組み入れられるに記載されるようにして、多重特異性ポリペプチド剤としてフォーマットされ得る。二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、異なる結合特異性を有する免疫グロブリン可変ドメインを含み得る。そのような二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの組み合わせを含み得る。例えば、二重特異性ポリペプチド剤は、1種の標的、即ち、PD1またはTim3のいずれかと結合する、例えば、Gly4Serのような適当なリンカーを使用してscFvの形態へと連結されていてもよいVHドメインおよびVLドメインを含み得る。例えば、TIM3と結合するscFvと、PD1と結合するscFvとを含む構築物は、PD1およびTIM3に対して二重特異性であると言われる。類似の配置が、例えば、二重特異性F2構築物に関して適用され得る。単一ドメイン抗体構築物も、二重特異性試薬の開発のために企図される。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、普通の二本鎖抗体に見出されるような、単一の抗原またはエピトープと協調的に結合する抗原結合部位を形成する相補的なVHVL対を含まなくてもよい。その代りに、いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、2種の異なるエピトープまたは抗原が特異的に結合されるよう、Vドメインが、各々、異なる結合特異性を有するようなVHVL相補対を含むことができる。さらに、いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、1つまたは複数のCHドメインまたはCLドメインを含む。ヒンジ領域ドメインも、いくつかの態様において、含まれ得る。そのようなドメインの組み合わせは、例えば、IgGもしくはIgMのような天然抗体、またはFv分子、scFv分子、Fab分子、もしくはF2分子のようなそれらの断片を模倣し得る。VHドメイン、VLドメイン、CH1ドメイン、およびCLドメインを含むIgG分子の単一のアームのようなその他の構造も、本明細書に記載された態様に包含される。あるいは、別の態様において、複数の二重特異性ポリペプチド剤は、多量体を形成するよう組み合わせられる。例えば、2種の異なる二重特異性ポリペプチド剤を、四特異性分子を作出するため、組み合わせることができる。本明細書に記載された方法に従い作製された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の軽鎖および重鎖の可変領域は、同一ポリペプチド鎖上にあってもよいし、あるいは異なるポリペプチド鎖上にあってもよいことが、当業者により認識されるであろう。可変領域が異なるポリペプチド鎖上にある場合、それらは、リンカー、一般に、ポリペプチド鎖のようなフレキシブルリンカー、化学結合基、または当技術分野において公知のその他の方法を介して連結されていてよい。本明細書に記載された局面の異なる態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、二重特異性もしくは多重特異性の抗体またはそれらの抗原結合断片としてフォーマットされてもよいし、または二重特異性もしくは多重特異性の非抗体構造へとフォーマットされてもよい。適当なフォーマットには、例えば、抗原に対する結合特異性を構造に付与するため、抗体可変ドメインまたはそのCDRのうちの1つまたは複数が組み込まれた適当なポリペプチド構造が含まれる。二重特異性IgG様フォーマット例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、抗体の重鎖および/または軽鎖のヘテロ二量体、上記のいずれかの抗原結合断片例えば、Fv断片例えば、一本鎖FvscFv、ジスルフィド結合Fv、Fab断片、Fab断片、F2断片、単一可変ドメイン例えば、VH、VL、VHH、dAb、ならびに上記のいずれかの修飾されたバージョン例えば、ポリアルキレングリコール例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールまたはその他の適当なポリマーの共有結合性の付着により修飾されたもののような、多様な適当な抗体フォーマットが、当技術分野において公知である。二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、n[n=1~8、例えば、2、3、4、5、6、または7]のような適当なリンカーを使用して、フォーマットされてもよい。所望により、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、CH2ドメインおよびCH3ドメインのいずれかまたは両方を含み、任意で、ヒンジ領域を含む、抗体Fc領域と連結されてもよい。例えば、単一のヌクレオチド配列としてFc領域と連結された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤をコードするベクターを、そのようなポリペプチドを調製するために使用することができる。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、抗体の抗原結合断片は、同一のエピトープを有する標的分子と結合する多価複合体を形成し、それにより、優れたアビディティを提供するため、非抗体多重特異性ポリペプチド構造へと組み合わせられかつ/またはフォーマットされてもよい。例えば、SpAのような天然の細菌受容体が、1つまたは複数のエピトープと特異的に結合するリガンドを生成するため、CDRのグラフティングのための足場として使用され得る。この手法の詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第5831012号に記載されている。その他の適当な足場には、フィブロネクチンおよびアフィボディaffibodiesに基づくものが含まれる。適当な手法の詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO9858965に記載されている。その他の適当な足場には、vandenBeukenetalJMolBiol310591601に記載されたようなリポカリンおよびCTLA4、ならびに、例えば、細菌GroELまたはその他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO0069907MedicalResearchCouncilに記載されたもののような足場が含まれる。いくつかの態様において、タンパク質足場が組み合わせられてもよい。例えば、PD1およびTIM3に特異的なCDRを、CTLA4足場へとグラフティングし、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤を形成するため、免疫グロブリンのVHドメインまたはVLドメインと共に使用することができる。同様に、その他の態様において、フィブロネクチン、リポカリン、およびその他の足場を組み合わせることができる。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤を、第二の抗原結合ドメインと直接融合された第一の抗原結合ドメインを含有している融合タンパク質としてフォーマットすることができる。所望により、いくつかの態様において、そのようなフォーマットは、半減期延長モエティをさらに含んでいてもよい。例えば、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、血清アルブミンと結合する抗原結合ドメインと直接融合された、TIM3に特異的な第二の抗原結合ドメインと直接融合された、PD1に特異的な第一の抗原結合ドメインを含むことができる。一般に、標的に対する結合特異性を有する結合部位を有するポリペプチドドメインの方向、および二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤がリンカーを含むか否かは、設計選択の問題である。しかしながら、いくつかの方向は、リンカーを含んでいてもまたは含んでいなくても、その他の方向より良好な結合特徴を提供することができる。全ての方向が、本明細書に記載された局面および態様に包含され、所望の結合特徴を提供する方向を含有している二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、スクリーニングにより容易に同定され得る。従って、一つの局面において、PD1分子と特異的に結合する少なくとも1つの結合部位と、TIM3分子と特異的に結合する少なくとも1つの結合部位とを含む多重特異性剤が、本明細書に記載される。この局面の一つの態様において、多重特異性剤が結合するPD1分子は、SEQIDNO1に示された配列を有するか、またはSEQIDNO1の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。この局面の一つの態様において、多重特異性剤が結合するTIM3分子は、SEQIDNO2に示された配列を有するか、またはSEQIDNO2の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。一つの局面において、PD1分子と特異的に結合する第一の結合部位と、TIM3分子と特異的に結合する第二の結合部位とを有する二重特異性剤が、本明細書に記載される。この局面の一つの態様において、二重特異性剤が結合するPD1分子は、SEQIDNO1に示された配列を有するか、またはSEQIDNO1の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。この局面の一つの態様において、二重特異性剤が結合するTIM3分子は、SEQIDNO2に示された配列を有するか、またはSEQIDNO2の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、一般に、PD1標的および/もしくはTIM3標的の天然に存在するかもしくは合成の類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、および断片;または、少なくとも、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤もしくは多重特異性ポリペプチド剤が結合するPD1標的上およびTIM3標的上の抗原決定基もしくはエピトープと本質的に同一である1つもしくは複数の抗原決定基もしくはエピトープを含有しているPD1標的および/もしくはTIM3標的の類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、および断片と結合するであろうことが、理解されるべきである。いくつかの態様において、本明細書に記載されたアミノ酸配列およびポリペプチドは、PD1標的および/またはTIM3標的のいくつかの類似体、バリアント、変異体、対立遺伝子、部分、および断片と結合し、かつその他とは結合しない。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性抗体のような二重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、標的とリガンドとの相互作用部位に指向する。本明細書に記載された局面のその他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、標的と、その受容体またはリガンドとの相互作用に対する立体障害を提供するため、該標的におけるリガンド相互作用部位の近傍の部位に指向する。好ましくは、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤が指向する部位は、標的のその受容体またはリガンドとの結合をモジュレートする、具体的には、阻害または妨害するような部位である。本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1のリガンド相互作用部位と結合することにより、PD1の活性または発現を低下させるかまたは阻害することができる。本明細書において使用されるように、PD1と特異的に結合する二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、細胞例えば、CD8T細胞のようなT細胞におけるPD1の活性または発現を、未処理の対照レベルと比べて、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または100まで、低下させる能力を有する。本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、TIM3のリガンド相互作用部位と結合することにより、TIM3の活性または発現を低下させるかまたは阻害することができる。本明細書において使用されるように、TIM3と特異的に結合する二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、細胞例えば、CD8T細胞のようなT細胞におけるTIM3の活性または発現を、未処理の対照レベルと比べて、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、または100まで、低下させる能力を有する。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害するかまたは妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL2との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害するかまたは妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害するかまたは妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位、およびPD1とPDL2との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害するかまたは妨害するような、リガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、PD1とPDL2との相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1とPDL2との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、PD1とPDL1との相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、PD1のリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸残基41~136を含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸78、126、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位、およびTIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、リガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、TIM3とガレクチン9との相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、TIM3のリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸残基24~131を含む。いくつかの態様において、TIM3におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸50、62、69、112、および121からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸44、74、および100からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。本明細書に記載された方法の実施のために適当な抗体は、好ましくは、モノクローナルかつ多重特異性であり、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体を含み、一本鎖抗体、Fab断片、F断片、Fab発現ライブラリーにより産生された断片、および/または上記のいずれかの結合断片を含み得るが、これらに限定されない。抗体とは、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち、PD1およびTIM3と特異的に結合する少なくとも2種の抗原結合部位または標的結合部位を含有している分子もさす。当業者により理解されるように、本明細書に記載された免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成されてもよいし、または組換えDNA法例えば、米国特許第4816567号を参照のことにより作成されてもよい。モノクローナル抗体は、例えば、ClacksonetalNature352624628またはMarksetalJMolBiol222581597に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。抗体断片という用語は、本明細書において使用されるように、一般に、完全抗体の抗原結合部位を含んでおり、従って、抗原と結合する能力を保持している、完全抗体の一部分のみを含むタンパク質断片をさす。本定義に包含される抗体断片の例には、以下のものが含まれる:iVLドメイン、CLドメイン、VHドメイン、およびCH1ドメインを有するFab断片;iiCH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFab断片であるFab断片;iiiVHドメインおよびCH1ドメインを有するFd断片;ivVHドメインおよびCH1ドメインを有し、CH1ドメインのC末端に1つまたは複数のシステイン残基を有するFd断片;v抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインを有するFv断片;viVHドメインからなるdAb断片WardetalNature341544546;vii単離されたCDR領域;viiiヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価の断片であるF2断片;ix一本鎖抗体分子例えば、一本鎖Fv;scFvBirdetalScience242423426;およびHustonetalPNAS8558795883;x同一ポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメインVLと接続された重鎖可変ドメインVHを含む2つの抗原結合部位を有するダイアボディ例えば、EP404097;WO9311161;およびHollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448を参照のこと;xi相補的な軽鎖ポリペプチドと共に、1対の抗原結合領域を形成する1対のタンデムFdセグメントVHCH1VHCH1を含む直鎖抗体ZapataetalProteinEng810571062;および米国特許第5641870号。別の局面において、IgG様フォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。そのようなフォーマットは、IgG分子の普通の四本鎖構造二本の重鎖および二本の軽鎖を有し、一方のVHドメインおよびVLドメインから構成された抗原結合領域が、PD1と特異的に結合し、他方のやはりVHドメインおよびVLドメインから構成された抗原結合領域が、TIM3と特異的に結合する。いくつかの態様において、可変領域2つのVH領域および2つのVL領域の各々は、dAbまたは単一可変ドメインに交換される。IgG様フォーマットに含まれるdAbまたは単一可変ドメインは、同一の特異性を有していてもよいしまたは異なる特異性を有していてもよい。いくつかの態様において、IgG様フォーマットは四価であり、2種、3種、または4種の特異性を有することができる。例えば、IgG様フォーマットは、二重特異性であって、同一の特異性を有する3つのdAb、および異なる特異性を有するもう1つのdAbを含んでいてもよいし;二重特異性であって、同一の特異性を有する2つのdAb、および共通であるが異なる特異性を有する2つのdAbを含んでいてもよいし;三重特異性であって、同一の特異性を有する第一のdAbおよび第二のdAb、異なる特異性を有する第三のdAb、ならびに第一、第二、および第三のdAbとは異なる特異性を有する第四のdAbを含んでいてもよいし;または四重特異性であって、各々異なる特異性を有する4つのdAbを含んでいてもよい。IgG様フォーマットの抗原結合断片例えば、Fab、F2、Fab、Fv、scFvは、当業者に公知であるように、そして本明細書に記載されるように調製され得る。二重特異性抗体を作成する方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、異なる特異性を有する二本の免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づくMillsteinetalNature305537539。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせのため、これらのハイブリドーマクアドローマは、10種の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、そのうち1種のみが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製は、一般的に、アフィニティクロマトグラフィ工程により行われるが、生成物収率は低い。類似の手法が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、WO9308829およびTrauneckeretalEMBOJ1036553659に開示されている。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO9627011に記載された別のアプローチに従い、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大にするため、1対の抗体分子の間の界面を操作することができる。そのような界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含み得る。この方法においては、第一の抗体分子の界面に由来する1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンに交換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの例えばアラニンまたはトレオニンに交換することにより、大きい側鎖と同一または類似のサイズの代償的な空隙が、第二の抗体分子の界面に作出される。これは、ホモ二量体のような他の不要な最終生成物と比べて、ヘテロ二量体の収量を増加させるための機序を提供する。一つの局面において、本明細書に記載された二重特異性抗体には、架橋された抗体またはヘテロコンジュゲートheteroconjugate抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンとカップリングし、他方をビオチンとカップリングすることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞へとターゲティングするため米国特許第4676980号、そしてHIV感染の処置のためWO9100360、WO92200373、およびEP03089提唱された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便利な架橋法を使用して作成され得る。適当な架橋剤は、当技術分野において周知であり、多数の架橋技術と共に、米国特許第4676980号に開示されている。一つの態様において、二重特異性抗体はヘテロコンジュゲートを含まない。抗体断片から二重特異性抗体を生成する技術も、文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して、二重特異性抗体を調製することができる。例えば、BrennanetalScience22981は、F2断片を生成するため、完全抗体をタンパク質分解的に切断する手法を記載している。近接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨害するため、これらの断片を、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元する。次いで、生成されたFab断片を、チオニトロベンゾエートTNB誘導体へ変換する。次いで、FabTNB誘導体のうちの一つを、メルカプトエチルアミンによる還元によりFabチオールへ再変換し、二重特異性抗体を形成するため、等モル量の他のFabTNB誘導体と混合する。この方法を使用して作製されたPD1およびTIM3に特異的な二重特異性抗体は、本明細書に記載された組成物および方法のいずれかにおいて使用され得る。いくつかの態様において、米国特許出願第20100233173号;米国特許出願第20100105873号;米国特許出願第20090155275号;米国特許出願第20080071063号;および米国特許出願第20060121042号これらの内容は、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに記載された方法のいずれかを使用して、PD1およびTIM3に特異的な二重特異性抗体を作製することができる。いくつかの態様において、米国特許出願第20090175867号および米国特許出願第20110033483号これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに記載された方法のいずれかを使用して、PD1およびTIM3に特異的な二重特異性抗体を作製することができる。いくつかの態様において、例えば、大腸菌Ecoliにおいて、組換え発現されたFabSH断片を直接回収し、二重特異性抗体が形成されるよう、化学的にカップリングすることにより、二重特異性抗体を作成することができる。例えば、ShalabyetalJExpMed175217225は、完全ヒト化二重特異性抗体F2分子の作製を記載している。各Fab断片を、大腸菌から別々に分泌させ、二重特異性抗体が形成されるよう、インビトロの特異的化学的カップリングに供した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現している細胞および正常ヒトT細胞と結合することができ、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。従って、この方法は、細胞傷害性T細胞のような免疫細胞において応答性を回復させるための、PD1およびTIM3に対する二重特異性抗体を生成するため、使用され得る。組換え細胞培養物から直接、二重特異性抗体断片を作成し単離するための様々な技術も、記載されており、PD1およびTIM3と特異的に結合する二重特異性抗体の生成において使用され得る。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されているKostelnyetalJImmunol14815471553。Fosタンパク質およびJunタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、2種の異なる抗体のFab部分と連結した。モノマーが形成されるよう、抗体ホモ二量体をヒンジ領域において還元し、次いで、抗体ヘテロ二量体が形成されるよう再酸化した。この方法は、抗体ホモ二量体の作製のためにも利用され得る。HollingeretalProcNatlAcadSciUSA9064446448により記載されたダイアボディ技術は、二重特異性抗体断片を作成するための別の機序を提供した。断片は、同一鎖上での2つのドメイン間の対形成を可能にしない短かいリンカーにより、軽鎖可変ドメインVLに接続された重鎖可変ドメインVHを含む。従って、ある断片のVHドメインおよびVLドメインは、別の断片のVHドメインおよびVLドメインと対形成することを強いられ、それにより、2つの抗原結合部位を作出する。一本鎖FvsFv二量体の使用により、二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も、報告されている。GruberetalJImmunol1525368を参照のこと。あるいは、抗体は、ZapataetalProteinEng810571062に記載されたような直鎖抗体であってもよい。簡単に説明すると、これらの抗体は、1対の抗原結合領域を形成する、1対のタンデムFdセグメントVHCH1VHCH1を含む。直鎖抗体は、二重特異性または多重特異性であり得る。本発明の方法において有用な抗体は、それらが含む特定のCDRに関して記載されるかまたは特定され得る。本明細書に記載された組成物および方法は、PD1およびTIM3と特異的に結合する、抗体、またはa3つのCDRのセットおよびb4つのフレームワーク領域のセットを含む重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含むその誘導体の使用を包含する。二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤のキメラ抗体誘導体、即ち、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、その鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である抗体分子、ならびにそのような抗体の断片も、それらが所望の生物学的活性を示す限り、本明細書に提供される米国特許第4816567号;およびMorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168516855。キメラ抗体分子は、例えば、ヒト定常領域と共に、マウス、ラット、またはその他の種の抗体に由来する1つまたは複数の抗原結合ドメインを含むことができる。キメラ抗体を作成するための多様なアプローチが記載されており、分化細胞または腫瘍特異的細胞の表面上の、選択された抗原、即ち、PD1およびTIM3を認識する免疫グロブリン可変領域を含有しているキメラ抗体を作成するために使用され得る。例えば、Takedaetal1985Nature314452;Cabillyら、米国特許第4816567号;Bossら;Tanaguchiら、欧州特許公開EP171496;欧州特許公開0173494、英国特許GB2177096Bを参照のこと。本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤は、ヒト化抗体誘導体であってもよい。非ヒト例えば、マウス抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限に含有しているキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種ドナー抗体の超可変領域に由来する残基に交換されているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域FR残基が、対応する非ヒト残基に交換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出さない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために施される。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域Fcの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細に関しては、JonesetalNature321522525;RiechmannetalNature332323329;およびPrestaCurrOpStructBiol2593596を参照のこと。化学的コンジュゲーションが、本明細書に記載された二重特異性抗体または多重特異性抗体を生成するために使用されてもよく、同種二官能性試薬および異種二官能性試薬と、Eアミノ基またはヒンジ領域チオール基との使用に基づく。55ジチオビスDNTBのような同種二官能性試薬は、2つのFabの間にジスルフィド結合を生成し、OフェニレンジマレイミドプロピオネートSPDPのような異種二官能性試薬は、クラスまたはアイソタイプに関わらず、抗体およびFab断片の露出アミノ基を化合させるVanDijketal1989。いくつかの態様において、本明細書に記載された抗体、即ち、慢性免疫病を処置するのために有用であり、かつPD1およびTIM3に特異的な抗体には、修飾された誘導体、即ち、抗体のPD1またはTIM3との結合を妨害しないような、任意の型の分子の抗体への共有結合性の付着により修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定ではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質との連結等により修飾された抗体が含まれる。特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツリカマイシンturicamycinの代謝的合成等を含むが、これらに限定されない、多数の化学的修飾のいずれかが、公知の技術により実施され得る。さらに、誘導体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。従って、慢性免疫病の処置において使用するための、本明細書に記載された二重特異性抗体または多重特異性抗体は、当技術分野において公知の適当な方法によって生成され得る。PD1およびTIM3の両方に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、当技術分野において公知である。例えば、特定の特徴またはエピトープ特異性を有する抗体を生成するために必要な程度に、当業者は、下記のように、または当技術分野において公知であるように、新たなモノクローナルまたはポリクローナルの抗PD1抗体および抗TIM3抗体を生成することができる。他の態様において、本明細書に記載された二重特異性抗体および多重特異性抗体ならびにその抗原結合断片は、MDX1106ONO4538、完全ヒトIgG4抗PD1遮断抗体JournalofClinicalOncology2008Vol26No15S;CT011CureTechLTD、以前はCTAcTibodyまたはBAT、ヒト化モノクローナルIgG1抗体BensonDMetalBlood2010May11、またはクローンNATAbcam、クローンEH122H7Biolegend、クローンJ116eBioscience、クローンMIH4eBioscience、クローンJ105eBioscience、もしくはクローン192106RDsystemsから入手されるもののような、ヒトPD1に対するモノクローナル抗体に由来するPD1結合部位配列を利用することができる。同様に、本明細書に記載された二重特異性抗体および多重特異性抗体ならびにその抗原結合断片は、クローンF382E2Biolegendまたはクローン344823RDSystemsから入手されるもののような、ヒトTIM3に対するモノクローナル抗体に由来するTIM3結合部位配列を利用することができる。例えば、MDX1106のCDR領域のアミノ酸配列を有するPD1に対する抗原結合部位、およびクローン344823により産生される抗体のCDR領域のアミノ酸配列を有するTIM3に対する抗原結合部位を、本明細書に記載される二重特異性抗体構築物を生成するため、ヒトIgG1骨格のような適切なフレームワークにグラフティングすることができる。当技術分野において周知の様々な手法によって、PD1またはTIM3に特異的なポリクローナル抗体を作製することができる。例えば、PD1ポリペプチドもしくはTIM3ポリペプチド、またはSEQIDNO1のアミノ酸残基42~136を含む断片もしくはSEQIDNO2のアミノ酸残基24~131を含む断片のような、それらの断片を、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を含有している血清の作製を誘導するため、ウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに限定されない、様々な宿主動物へ投与することができる。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原、例えば、PD1断片およびアジュバントの複数回の皮下sc注射または腹腔内ip注射により動物において産生される。例えば、二官能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を通したコンジュゲーション、Nヒドロキシスクシンイミドリジン残基を通したもの、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1NCNR[RおよびR1は異なるアルキル基である]を使用して、免疫感作される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターと、抗原をコンジュゲートさせることが有用であり得る。例えば、それぞれウサギまたはマウスのため100μgまたは5μgのタンパク質またはコンジュゲートを、3倍容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、その溶液を複数の部位において皮内注射することにより、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して動物を免疫感作することができる。1ヶ月後、複数の部位における皮下注射により、最初の量の15~110のペプチドまたはコンジュゲートを含むフロイント完全アジュバントにより、動物を追加刺激する。7~14日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで、動物を追加刺激する。好ましくは、同一抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質と、かつ/または異なる架橋試薬を通してコンジュゲートしたものによって、動物を追加刺激する。コンジュゲートは、タンパク質融合体として組換え細胞培養物において作成されてもよい。ミョウバンのような凝集剤も、免疫応答を増強するために適切に使用される。様々なその他のアジュバントが、宿主種に依って、免疫学的応答を増加させるために使用され得、フロイント完全および不完全、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCGカルメットゲラン桿菌およびコリネバクテリウムパルバムcorynebacteriumparvumのような有用である可能性のあるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。適当なアジュバントも、当業者に周知である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマテクノロジー、組換えテクノロジー、およびファージディスプレイテクノロジー、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において公知の極めて多様な技術を使用して調製され得る。本明細書に記載されたモノクローナル抗体を作成するための様々な方法が、当技術分野において利用可能である。例えば、モノクローナル抗体は、KohleretalNature256495により最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、または組換えDNA法米国特許第4816567号により作成され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において公知のもの、および、例えば、HarlowetalAntibodiesALaboratoryManual;HammerlingetalinMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas563681。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、適当な培養培地、好ましくは、非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する1種または複数種の物質を含有している培養培地に播種し成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨害する物質、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろうHAT培地。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支持し、かつHAT培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、SalkInstituteCellDistributionCenterSanDiegoCalifUSAから入手可能なマウス腫瘍MOPC21およびMPC11に由来するもの、ならびにAmericanTypeCultureCollectionRockvilleMdUSAから入手可能なSP2細胞またはX63Ag8653細胞のようなマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロミエローマheteromyelomaの細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の作製のために記載されているKozborJImmunol1333001;BrodeuretalMonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplicationspp5163。ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイRIAもしくは酵素結合免疫吸着アッセイELISAのようなインビトロ結合アッセイにより決定する。所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法により成長させることができるGodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticepp59103。この目的のために適当な培養培地には、例えば、DMEM培地またはRPMI1640培地が含まれる。さらに、動物において腹水腫瘍としてインビボでハイブリドーマ細胞を成長させることもできる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインAセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィのような従来の免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、または血清から適当に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手法を使用して例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより容易に単離され配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい起源として機能する。単離後、DNAを発現ベクターに置き、次いで、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るため、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞へそれをトランスフェクトすることができる。抗体の組換え作製は、以下に、より詳細に記載される。別の例において、本明細書に記載された方法および組成物において有用な抗体は、McCaffertyetalNature348552554に記載された技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーからの単離のような、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成され得る。ClacksonetalNature352624628およびMarksetalJMolBiol222581597は、ファージライブラリーを使用した、マウス抗体およびヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。その後の刊行物は、チェーンシャフリングによる高親和性nM範囲ヒト抗体の作製MarksetalBioTechnology10779783、ならびに極めて大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えWaterhouseetalNucAcidsRes2122652266を記載している。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替法である。ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードする核酸配列を保持しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特定の態様において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー例えば、ヒトまたはマウスから発現された抗原結合ドメインをディスプレイするために利用され得る。ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードする核酸配列を保持しているファージ粒子の表面上にディスプレイされる。具体的には、VHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー例えば、ヒトまたはマウスのリンパ組織のcDNAライブラリーから増幅する。VHドメインおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによりscFvリンカーと組換え、ファージミドベクター例えば、pCANTAB6またはpComb3HSSへクローニングする。ベクターを大腸菌へ電気穿孔し、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ファージの遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのタンパク質のいずれかと組換えにより融合した、Fab、Fv、またはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現されたfdおよびM13結合ドメインを含む繊維状ファージである。PD1もしくはTIM3またはそれらの一部と結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズと結合したもしくはそれらに捕獲された抗原を使用して、選択または同定され得る。本明細書に記載された抗体を作成するために使用され得るファージディスプレイ法の例には、Brinkmanetal1995JImmunolMethods1824150;Amesetal1995JImmunolMethods184177186;Kettleboroughetal1994EurJImmunol24952958;Persicetal1997Gene187918;Burtonetal1994AdvancesinImmunology191280;PCT出願第PCTGB9101134号;PCT公開WO9002809;WO9110737;WO9201047;WO9218619;WO9311236;WO9515982;WO9520401;ならびに米国特許第5698426号;第5223409号;第5403484号;第5580717号;第5427908号;第5750753号;第5821047号;第5571698号;第5427908号;第5516637号;第5780225号;第5658727号;第5733743号、および第5969108号これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに開示されたものが含まれる。上記参照に記載されるように、ファージ選択の後、ファージから抗体コーディング領域を単離し、ヒト抗体を含む完全抗体、またはその他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、例えば、以下に詳細に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む所望の宿主において発現させることができる。例えば、Fab断片、Fab断片、およびF2断片を組換え作製するための技術も、PCT公開WO9222324;MullinaxetalBioTechniques199212864869;およびSawaietal1995AJRI342634;およびBetteretal1988Science24010411043これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに開示されたもののような、当技術分野において公知の方法を使用して、利用することができる。本明細書において使用されるように、キメラ抗体とは、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体のような、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子をさす。キメラ抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、MorrisonScience19852291202;Oietal1986BioTechniques4214;Gilliesetal1989JImmunolMethods125191202;米国特許第5807715号;第4816567号;および第4816397号それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるを参照のこと。ヒト化抗体という用語は、本明細書において使用されるように、非ヒト種由来の1つまたは複数のCDRと、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワークおよび定常領域とを有する、所望の抗原、即ち、PD1またはTIM3と結合する、非ヒト種由来の抗体分子をさす。しばしば、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変するため、好ましくは、改善するため、CDRドナー抗体由来の対応する残基に置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法により、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するため、CDR残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化し、特定の位置における稀なフレームワーク残基を同定するため、配列を比較することにより同定される例えば、Queenら、米国特許第5585089号;Riechmannetal1988Nature332323を参照のこと。抗体は、例えば、CDRグラフティングEP239400;PCT公開WO9109967;米国特許第5225539号;第5530101号;および第5585089号、ベニアリングveneeringまたはリサーフェシングresurfacingEP592106;EP519596;PadlanMolecularImmunology199128489498;Studnickaetal1994ProteinEngineering7805814;Roguskaetal1994PNAS91969973、およびチェーンシャフリング米国特許第5565332号これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるを含む、当技術分野において公知の多様な技術を使用して、ヒト化され得る。従って、ヒト化抗体は、非ヒトである起源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基と呼ばれ、典型的には、インポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯動物のCDRまたはCDR配列に置換することにより、WinterらJonesetalNature321522525;RiechmannetalNature332323327;VerhoeyenetalScience23915341536これらの内容は、参照によりそれらの全体に本明細書に組み入れられるの方法に従って実施され得る。従って、そのようなヒト化抗体は、完全ヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列に置換されたキメラ抗体である米国特許第4816567号この内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。実際、ヒト化抗体は、典型的には、数つのCDR残基が、げっ歯動物抗体における類似の部位に由来する残基に置換されており、数つのFR残基も置換されているかもしれない、ヒト抗体である。ヒト化抗体の作成において使用されるヒト可変ドメイン軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性を低下させるために極めて重要である。いわゆるベストフィット法に従って、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワークFRとして受け入れるSimsetalJImmunol1512296;ChothiaetalJMolBiol196901。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同一のフレームワークを、数種の異なるヒト化抗体のために使用することができるCarteretalProcNatlAcadSciUSA894285;PrestaetalJImmunol1512623。抗原、即ち、PD1およびTIM3に対する高い親和性、ならびにその他の有利な生物学的特性を保持しつつ、抗体をヒト化することが、さらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列および様々な概念的ヒト化生成物の分析の過程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元コンフォメーション構造を図示し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を観察することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンの抗原結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能である。このようにして、標的抗原に対する親和性の増加のような所望の抗体特徴が達成されるよう、レシピエント配列およびインポート配列からFR残基を選択し組み合わることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に、直接、最も実質的に、関与している。VEgf抗原に対するヒト化抗体およびその親和性成熟バリアントは、例えば、2005年2月26日発行の米国特許第6884879号この内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるに記載されている。完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記ファージディスプレイ法を含む、当技術分野において公知の多様な方法により作成され得る。米国特許第4444887号および第4716111号;ならびにPCT公開WO9846645、WO9850433、WO9824893、WO9816654、WO9634096、WO9633735、およびWO9110741これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるも参照のこと。ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しており、免疫感作により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニックマウスを使用して、ヒト抗体を作製することもできる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域JH遺伝子のホモ接合性の欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジにより、ヒト抗体の産生をもたらすであろう。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、PD1およびTIM3の全部または一部により、通常の様式で免疫感作する。従来のハイブリドーマテクノロジーを使用して、免疫感作されたトランスジェニックマウスから、抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスが保有しているヒト免疫グロブリントランスジーンは、B細胞分化の間に再編成され、後に、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術を使用して、治療的に有用なIgG抗体、IgA抗体、IgM抗体、およびIgE抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこのテクノロジーの概要に関しては、LonbergandHuszar1995IntRevImmunol13:6593を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこのテクノロジー、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、PCT公開WO9824893;WO9201047;WO9634096;WO9633735;欧州特許第0598877号;米国特許第5413923号;第5625126号;第5633425号;第5569825号;第5661016号;第5545806号;第5814318号;第5885793号;第5916771号;および第5939598号これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるを参照のこと。さらに、AbgenixIncFreemontCalifおよびMedarexPrincetonNJのような会社は、上記のものと類似したテクノロジーを使用して、選択された抗原に対するヒト抗体の提供に従事し得る。例えば、JakobovitsetalProcNatlAcadSciUSA902551;JakobovitsetalNature362255258;BruggermannetalYearinImmuno733;およびDuchosaletalNature355258これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるも参照のこと。あるいは、免疫感作されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変Vドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を作製するため、ファージディスプレイテクノロジーMcCaffertyetalNature348552553を使用することができる。この技術によると、抗体Vドメイン遺伝子を、M13またはfdのような繊維状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子へインフレームでクローニングし、機能的な抗体断片としてファージ粒子の表面上にディスプレイさせる。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有しているため、抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ももたらす。従って、ファージは、B細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、多様なフォーマットで実施され得;それらの概説については、例えば、JohnsonKevinSandChiswellDavidJCurrentOpinioninStructuralBiology3564571を参照のこと。V遺伝子セグメントの数種の起源が、ファージディスプレイのために使用され得る。ClacksonetalNature352624628は、免疫感作されたマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。MarksetalJMolBiol222581597またはGriffithetalEMBOJ12725734に記載された技術に本質的に従い、免疫感作されていないヒトドナーに由来するV遺伝子のレパートリーを構築し、自己抗原を含む多様な抗原に対する抗体を単離してもよい。米国特許第5565332号および第5573905号も参照のこと。インビトロで活性化されたB細胞により、ヒト抗体を生成することもできる米国特許第5567610号および第5229275号これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるを参照のこと。ガイドセレクションguidedselectionと呼ばれる技術を使用して、選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を生成することができる。このアプローチにおいては、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするために使用するJespersetal1994Biotechnology12899903。さらに、本明細書に記載されたPD1またはTIM3に対する二重特異性抗体および多重特異性抗体を、次に、当業者に周知の技術を使用して、本明細書に記載されたタンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を生成するために利用することができる例えば、GreenspanBona1989FASEBJ7437444;およびNissinoff1991JImmunol1472429243Sを参照のこと。そのような抗イディオタイプのFab断片は、活性化されたリンパ球に存在するPD1またはTIM3に対する個体の自己の免疫応答を誘発するため、治療計画において使用され得る。抗体断片の作製のための様々な技術が開発されている。本明細書に記載された抗体を、従来の技術を使用して断片化し、上記の完全抗体と同様に、それらの断片を利用可能性についてスクリーニングすることができる。伝統的には、これらの断片は、完全抗体のタンパク質分解的消化を介して導出された例えば、MorimotoetalJournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24107117およびBrennanetalScience22981を参照のこと。例えば、本明細書に記載された二重特異性抗体および多重特異性抗体のFab断片およびF2断片は、Fab断片を作製するためのパパインまたはF2断片を作製するためのペプシンのような酵素を使用した、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により作製され得る。F2断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のCH1ドメインを含有している。しかしながら、現在では、組換え宿主細胞により、直接、これらの断片を作製することができる。例えば、抗体断片を、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、FabSH断片を、大腸菌から直接回収し、F2断片が形成されるよう、化学的にカップリングすることができるCarteretalBioTechnology10163167。別のアプローチによると、組換え宿主細胞培養物から直接、F2断片を単離することができる。抗体断片の作製のためのその他の技術は、当業者に明らかであろう。他の態様において、選択される抗体は一本鎖Fv断片に記載されるようにアラニンスキャニング変異誘発と呼ばれる。ここでは、標的残基の残基または群を同定し例えば、arg、asp、his、lys、およびgluのような電荷を有する残基、そのアミノ酸の抗原との相互作用に影響を与えるため、中性アミノ酸または負の電荷を有するアミノ酸最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニンに交換する。次いで、置換の部位に、またはその代わりに、さらなるバリアントまたは他のバリアントを導入することにより、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置を正確にする。従って、アミノ酸配列変動を導入するための部位は予め決定されるが、変異自体の性質を予め決定する必要はない。例えば、所定の部位における変異の性能を分析するため、標的のコドンまたは領域においてalaスキャニング変異誘発またはランダム変異誘発を実施し、発現された抗体バリアントを所望の活性についてスクリーニングする。アミノ酸配列挿入には、1残基から100残基以上を含有しているポリペプチドまでの範囲の長さの、アミノ末端および/またはカルボキシル末端における融合が含まれ、1つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。抗体分子のその他の挿入バリアントには、酵素例えば、ADEPTのためまたは抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドの、抗体のN末端またはC末端への融合が含まれる。バリアントの別の型は、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異なる残基に交換された抗体分子内の少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発のために最も重要である部位には、超可変領域が含まれるが、FR改変も企図される。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片の生物学的特性の実質的な修飾は、a置換の区域のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはヘリックスコンフォメーションとしての構造、b標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、またはc側鎖のかさ、の維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、側鎖の特性の類似性によって分類され得るALLehningerinBiochemistrysecondedpp7375WorthPublishersNewYork:1無極性:AlaA、ValV、LeuL、IleI、ProP、PheF、TrpW、MetM;2電荷を有しない極性:GlyG、SerS、ThrT、CysC、TyrY、AsnN、GlnQ;3酸性:AspD、GluE;4塩基性:LysK、ArgR、HisH。あるいは、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づく群に分割され得る:1疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;2中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;3酸性:Asp、Glu;4塩基性:His、Lys、Arg;5鎖方向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;6芳香族:Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらのクラスのうちの一つのメンバーを、別のクラスに交換することを要するであろう。特に好ましい保存的置換は以下の通りである:Ala→GlyもしくはSer;Arg→Lys;Asn→GlnもしくはHis;Asp→Glu;Cys→Ser;Gln→Asn;Glu→Asp;Gly→AlaもしくはPro;His→AsnもしくはGln;Ile→LeuもしくはVal;Leu→IleもしくはVal;Lys→Arg、Gln、もしくはGlu;Met→Leu、Tyr、もしくはIle;Phe→Met、Leu、もしくはTyr;Ser→Thr;Thr→Ser;Trp→Tyr;Tyr→Trp;および/またはPhe→Val、Ile、もしくはLeu。抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しないシステイン残基も、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止するため、置換することができ、一般に、セリンに置換することができる。反対に、安定性を改善するため、システイン結合を抗体に付加することもできる特に、抗体がFv断片のような抗体断片である場合。置換バリアントの特に好ましい型には、本明細書に記載された親抗体またはその抗体断片の1つまたは複数の超可変領域残基の置換例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれる。一般に、さらなる開発のために選択される得られたバリアントは、それらが生成された親抗体に比べて改善された生物学的特性を有するであろう。そのような置換バリアントを生成するための便利な方式には、ファージディスプレイを使用した親和性成熟が含まれる。簡単に説明すると、数箇所の超可変領域部位例えば、6~7の部位を、各部位における全ての可能なアミノ置換を生成するために変異させる。このように生成された抗体バリアントを、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価でディスプレイさせる。次いで、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるようにして、生物学的活性例えば、結合親和性についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するため、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するため、アラニンスキャニング変異誘発を実施することができる。代替的に、または、付加的に、抗体とヒトのDEspRとの間の接触点を同定するため、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述された技術による置換の候補である。そのようなバリアントが生成された後は、バリアントのパネルを、本明細書に記載されるスクリーニングに供し、1種または複数種の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片のアミノ酸バリアントの別の型は、抗体の最初のグリコシル化パターンを改変する。改変とは、抗体に見出される1つもしくは複数の糖モエティの欠失、および/または抗体に存在しない1つもしくは複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物モエティの付着をさす。トリペプチド配列アスパラギンXセリンおよびアスパラギンXトレオニンXはプロリン以外の任意のアミノ酸であるは、アスパラギン側鎖への炭水化物モエティの酵素的付着のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、可能性のあるグリコシル化部位を作出する。O結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンへの、糖Nアセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの1種の付着をさすが、5ヒドロキシプロリンまたは5ヒドロキシリジンも使用され得る。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片へのグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列のうちの1つまたは複数を含有するよう、アミノ酸配列を改変することにより、便利に達成されるN結合型グリコシル化部位の場合。改変は、最初の抗体の配列への、1つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換によってもなされ得るO結合型グリコシル化部位の場合。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片がFc領域を含む場合には、それに接着している炭水化物を改変することができる。例えば、抗体のFc領域に付着しているフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、米国特許出願第US20030157108A1号PrestaLに記載されている。US20040093621A1KyowaHakkoKogyoCoLtdも参照のこと。抗体のFc領域に付着した炭水化物の中に二分bisectingNアセチルグルコサミンGlcNAcを有する抗体は、WO03011878JeanMairetらおよび米国特許第6602684号Umanaらに参照されている。抗体のFc領域に付着したオリゴ糖の中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体は、WO9730087Patelらに報告されている。Fc領域に付着した改変された炭水化物を有する抗体に関しては、WO9858964RajuSおよびWO9922764RajuSを参照のこと。例えば、抗体の抗原依存性細胞傷害ADCCおよび/または補体依存性細胞傷害CDCを増強するため、エフェクター機能に関して、本明細書に記載された抗体またはその抗体断片を修飾することが望ましい場合がある。これは、抗体またはその抗体断片のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより達成され得る。代替的に、または、付加的に、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にしてもよい。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力ならびに/または増加した補体媒介細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害ADCCを有し得る。CaronetalJExpMed17611911195およびShopesBJImmunol14829182922を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、WolffetalCancerResearch5325602565に記載されるような異種二官能性クロスリンカーを使用しても調製され得る。あるいは、二つのFc領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびADCC能力を有することができるよう抗体を操作してもよい。StevensonetalAntiCancerDrugDesign3219230を参照のこと。例えば、WO0042072PrestaLは、Fc領域にアミノ酸置換を含む、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたADCC機能を有する抗体を記載している。好ましくは、改善されたADCCを有する抗体は、Fc領域の298位、333位、および/または334位Eu残基番号付けにおける置換を含む。好ましくは、改変されたFc領域は、これらの位置のうちの1つ、2つ、または3つにおける置換を含むかまたはそれらからなるヒトIgG1Fc領域である。そのような置換は、任意で、C1q結合および/またはCDCを増加させる置換と組み合わせられてもよい。改変されたC1q結合および/または補体依存性細胞傷害CDCを有する抗体は、WO9951642、米国特許第6194551B1号、米国特許第6242195B1号、米国特許第6528624B1号、および米国特許第6538124号Idusogieらに記載されている。それらの抗体は、Fc領域のアミノ酸位置270位、322位、326位、327位、329位、313位、333位、および/または334位Eu残基番号付けのうちの1つまたは複数におけるアミノ酸置換を含む。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片の血清半減期を増加させるため、例えば、米国特許第5739277号に記載されるように、抗体特に、抗体断片にサルベージsalvage受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書において使用されるように、サルベージ受容体結合エピトープという用語は、IgG分子のインビボ血清半減期の増加を担う、IgG分子例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域のエピトープをさす。新生児型Fc受容体FcRnとの改善された結合および増加した半減期を有する抗体が、WO0042072PrestaLおよびUS20050014934A1Hintonらに記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnとの結合を改善する1つまたは複数の置換をその中に有するFc領域を含む。例えば、Fc領域は、238位、250位、256位、265位、272位、286位、303位、305位、307位、311位、312位、314位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、413位、424位、428位、または434位Eu残基番号付けのうちの1つまたは複数における置換を有し得る。改善されたFcRn結合を有する、Fc領域を含む好ましい抗体バリアントは、そのFc領域の307位、380位、および434位Eu残基番号付けのうちの1つ、2つ、または3つにおけるアミノ酸置換を含む。一つの態様において、抗体は307434変異を有する。本明細書に記載された抗体またはその抗体断片のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野において公知の多様な方法によって調製される。これらの方法には、天然起源からの単離天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合、または先に調製された抗体のバリアントもしくは非バリアントバージョンのオリゴヌクレオチド媒介もしくは部位特異的変異誘発、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。PD1およびTIM3を標的化する二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤を使用した慢性免疫病の処置の方法本明細書に記載されたある種の局面は、腫瘍部位に浸潤していることが見出されたもののような、機能的疲弊の状態にあるCD8T細胞が、阻害性受容体PD1およびTIM3を同時発現していることの、本発明者らによる発見に、一部、基づく。本発明者らは、TIM3発現免疫細胞を、TIM3低発現細胞およびTIM3高発現細胞にさらに細分し得ることを見出した。本発明者らは、CD8T細胞のような免疫細胞におけるPD1およびTIM3の同時発現が、その他のリンパ組織コンパートメントに比べて、腫瘍微小環境のような特異的な微小環境に制限されているか、またはそのような微小環境において増加している可能性があることも見出した。さらに、本発明者らは、ダブルポジティブPD1TIM3細胞が、PD1のみまたはTIM3のみのいずれかを発現しているシングルポジティブCD8T細胞と比較した時、最も高度の機能障害、即ち、最小の増殖およびサイトカイン産生を有することを見出した。実際、腫瘍部位に浸潤しているPD1シングルポジティブ即ち、PD1TIM3CD8細胞が、IFNγを産生する機能的に疲弊していない真のエフェクターT細胞を含んでおり、PD1TIM3TILよりはるかに高い、最も高頻度のIFNγ産生細胞を含有していることが見出されたため、本明細書に記載されたデータは、PD1が単独では免疫細胞機能的疲弊の不完全なマーカーであることを証明している。本発明者らは、インビボで、例えば、PD1およびTIM3に特異的な抗体を使用した阻害性受容体PD1およびTIM3の標的化の組み合わせが、これらの分子を同時発現している疲弊したCD8T細胞の機能を救済し回復させ、従って、抗腫瘍免疫を回復させることをさらに発見した。実際、最初の腫瘍チャレンジにおいてTIM3経路およびPD1経路の両方が標的化されたマウスは、その後の腫瘍再チャレンジの後ですら無腫瘍のままであることが見出された。これらの所見は、機能的に非応答性であるかまたは疲弊した表現型を有する免疫細胞のみを特異的に標的し、従って、全般的な免疫活性化を回避するための、新規のかつ特異的な、細胞表面のPD1およびTIM3の両方の標的化を提供する。従って、PD1およびTIM3の両方を発現している細胞の同時標的化のために使用され得る、二重特異性抗体および多重特異性抗体ならびにそれらの抗体断片のような、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤、ならびにこれらの剤を使用した方法は、機能的に疲弊した細胞を特徴とする慢性免疫病において、免疫応答を回復させかつ/または開始させるための新規の手段を提供する。従って、その必要のある対象における、癌および持続感染のような慢性免疫病の処置の方法が、本明細書に提供される。これらの方法のいくつかは、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤のうちの1種を、治療的に有効な量、対象へ投与することを含む。これらの方法は、具体的には、CD8T細胞集団またはCD4T細胞集団のような1種または複数種の免疫細胞集団が機能的に疲弊している状態を有するヒト対象の治療的処置を目標としている。一つの局面において、PD1分子と特異的に結合する結合部位を含む少なくとも1つのポリペプチドドメインと、TIM3分子と特異的に結合する結合部位を含む少なくとも1つのポリペプチドドメインとを含む多重特異性ポリペプチド剤の有効量を対象へ投与することを含む、その必要のある対象における慢性免疫病の処置の方法が、提供される。一つの態様において、多重特異性ポリペプチド剤は、多重特異性抗体またはその多重特異性抗体断片である。一つの局面において、PD1分子と特異的に結合する結合部位を含む1つのポリペプチドドメインと、TIM3分子と特異的に結合する結合部位を含む1つのポリペプチドドメインとを含む二重特異性ポリペプチド剤の有効量を対象へ投与することを含む、その必要のある対象における慢性免疫病の処置の方法が、提供される。一つの態様において、二重特異性ポリペプチド剤は、二重特異性抗体またはその二重特異性抗体断片である。これらの局面のいくつかの態様において、PD1分子は、SEQIDNO1に示された配列を有するか、またはSEQIDNO1の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。これらの局面の他の態様において、TIM3分子は、SEQIDNO2に示された配列を有するか、またはSEQIDNO2の対立遺伝子バリアントもしくはスプライスバリアントである。本明細書に記載された方法のいくつかの態様において、多重特異性ポリペプチド剤および二重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、リガンド相互作用部位に指向する。本明細書に記載された局面の他の態様において、多重特異性ポリペプチド剤および二重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、剤がPD1標的またはTIM3標的のリガンドとの相互作用を立体的に妨げるよう、リガンド相互作用部位の近傍の部位に指向する。従って、本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される、対象に投与される二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL2との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位、およびPD1とPDL2との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、PD1におけるリガンド相互作用部位の両方に指向する。他の態様において、対象へ投与される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1とPDL1との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、PD1とPDL2との相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、PD1とPDL2との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、PD1とPDL1との相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、PD1におけるリガンド相互作用部位に指向する。従って、本明細書に記載された方法および組成物のいくつかの態様において、PD1のリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸残基41~136を含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸64、66、68、73、74、75、76、78、90、122、124、126、128、130、131、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸78、126、および136からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO1のアミノ酸78、126、および136からなる群を含む。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される、対象へ投与される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、かつTIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートするような、具体的には、阻害または妨害するような、TIM3におけるリガンド相互作用部位の両方に指向する。他の態様において、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用はモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。他の態様において、二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤の結合部位は、TIM3とホスファチジルセリンとの相互作用をモジュレートし、具体的には、阻害または妨害し、TIM3とガレクチン9との相互作用をモジュレートせず、阻害せず、または妨害しないような、TIM3におけるリガンド相互作用部位に指向する。本明細書に記載された方法および組成物のいくつかの態様において、TIM3のリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸残基24~131を含む。いくつかの態様において、TIM3におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸50、62、69、112、および121からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。いくつかの態様において、PD1におけるリガンド相互作用部位は、SEQIDNO2のアミノ酸44、74、および100からなる群より選択されるアミノ酸残基のいずれかを含む。対象および個体という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤のレシピエントである動物、例えば、ヒトをさす。ヒト対象のような特定の動物に特異的な疾患状態の処置について、対象という用語は、その特定の動物をさす。非ヒト動物および非ヒト哺乳動物という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類のような哺乳動物を含む。対象という用語には、哺乳動物、爬虫類、両生類、および魚を含むが、これらに限定されない任意の脊椎動物も包含される。しかしながら、有利には、対象は、ヒトのような哺乳動物であるか、または家畜化された哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ等、もしくは生産哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ等のようなその他の哺乳動物も、対象という用語に包含される。投与様式本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、対象における有効な処置をもたらす適切な経路により、その必要のある対象へ投与され得る。本明細書において使用されるように、投与および導入という用語は、交換可能に使用され、所望の効果が生じるよう、炎症の部位のような所望の部位におけるそのような剤の少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路により、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤を対象へ配置することをさす。いくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、注射、注入、点滴注入、および吸入投与を含むが、これらに限定されない、剤を全身的に送達するか、または所望の表面もしくは標的へと送達する投与モードにより、慢性免疫病を有する対象へ投与される。ポリペプチド剤が消化管における不活化から防御され得る程度に、経口投与型も企図される。注射には、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本明細書に記載された方法において使用するための二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、静脈内への注入または注射により投与される。非経口投与および非経口投与されるという語句は、本明細書において使用されるように、経口投与および局所投与以外の投与モード、一般的には、注射による投与モードをさす。全身投与、全身投与される、末梢投与、および末梢投与されるという語句は、本明細書において使用されるように、腫瘍部位のような標的部位、標的組織、または標的器官への直接投与以外の、剤が対象の循環系に入り、従って、代謝等の過程を受けるような、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の投与をさす。本明細書に記載された方法の臨床的な使用のため、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の投与は、非経口投与、例えば、静脈内投与;粘膜投与、例えば、鼻腔内投与;眼投与、またはその他の投与モードのための薬学的組成物または薬学的製剤への製剤化を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、対象における有効な処置をもたらす薬学的に許容される担体化合物、材料、または組成物と共に投与され得る。従って、本明細書に記載された方法において使用するための薬学的製剤は、1種または複数種の薬学的に許容される成分と組み合わせて、本明細書に記載される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤を含有していてもよい。薬学的に許容されるという語句は、正当な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比と相応の、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症がなく、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適当な、化合物、材料、組成物、および/または剤形をさす。薬学的に許容される担体という語句は、本明細書において使用されるように、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の安定性、可溶性、または活性の維持に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、媒質、封入材料、製造助剤例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、もしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸、または溶媒封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であって、かつ患者にとって有害でないという意味で、許容されるものでなければばらない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる:1乳糖、グルコース、およびショ糖のような糖;2コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン;3セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微晶質セルロース、および酢酸セルロースのようなその誘導体;4トラガカント末;5麦芽;6ゼラチン;7カカオ脂および坐剤用ロウのような賦形剤;8落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油のような油;9プロピレングリコールのようなグリコール;10グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールPEGのようなポリオール;11オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル;12寒天;13酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤;14アルギン酸;15発熱性物質不含水;16等張生理食塩水;17リンゲル液;19pH緩衝溶液;20ポリエステル、ポリカーボネート、および/またはポリ無水物;21ポリペプチドおよびアミノ酸のような増量剤、22血清アルブミン、HDL、およびLDLのような血清成分;23エタノールのようなC2C12アルコール;ならびに24薬学的製剤において利用されるその他の非毒性の適合性の物質。放出剤、コーティング剤、保存剤、および抗酸化剤が、製剤中に存在してもよい。賦形剤、担体、薬学的に許容される担体等のような用語は、本明細書において交換可能に使用される。本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、具体的には、以下に適合したものを含む、固体、液体、またはゲルの形態で、対象への化合物の投与のために製剤化され得る:1例えば、無菌の溶液もしくは懸濁物、もしくは徐放性製剤としての、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、もしくは硬膜外注射による非経口投与;2例えば、皮膚へ適用されるクリーム、軟膏、もしくは放出制御型パッチ、もしくはスプレーとしての局所適用;3例えば、ペッサリー、クリーム、もしくはフォームとしての、膣内投与もしくは直腸内投与;4眼投与;5経皮投与;6経粘膜投与;または79経鼻投与。さらに、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、患者へ移植されてもよいし、または薬物送達系を使用して注射されてもよい。例えば、UrquhartetalAnnRevPharmacolToxicol24199236;LewisedControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals;米国特許第3773919号;および米国特許第353270960号を参照のこと。本明細書に記載された方法において使用され得る二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の製剤化および投与モードのさらなる態様を、以下に例示する。非経口剤形。二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の非経口剤形は、皮下、静脈内ボーラス注射を含む、筋肉内、および動脈内を含むが、これらに限定されない、様々な経路により、慢性免疫病を有する対象へ投与されてもよい。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するため、非経口剤形は、好ましくは、無菌であるか、または患者への投与の前に滅菌可能である。非経口剤形の例には、注射用の既製の溶液、注射用の薬学的に許容される媒体に溶解または懸濁させるための既製の乾燥生成物、注射用の既製の懸濁物、放出制御型非経口剤形、および乳濁液が含まれる。本開示の非経口剤形を提供するために使用され得る適当な媒体は、当業者に周知である。例には、滅菌水;注射用水USP;生理食塩水溶液;グルコース溶液;塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖塩化ナトリウム注射液、および乳酸リンゲル注射液のようなこれらに限定されない水性媒体;エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールのようなこれらに限定されない水混和性媒体;ならびにトウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルのようなこれらに限定されない非水性媒体が含まれるが、これらに限定されない。エアロゾル製剤。二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、従来の佐剤を含む、適当な噴霧剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴霧剤と共に、加圧されたエアロゾル容器にパッケージングされてもよい。二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、ネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧形態で投与されてもよい。二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、例えば、吸入器の使用により、乾燥粉末の形態で、気道へ直接投与されてもよい。適当な粉末組成物には、例として、乳糖または気管支内投与のために許容されるその他の不活性粉末と完全に混合された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の粉末調製物が含まれる。粉末組成物は、エアロゾルディスペンサーを介して投与されてもよいし、または、カプセルに穴をあけ、吸入のために適当な一定流で粉末を噴出する装置に、対象によって挿入され得る、破壊可能なカプセルに包まれていてもよい。組成物は、噴霧剤、界面活性剤、および共溶媒を含むことができ、適当な計量弁により閉鎖された従来のエアロゾル容器に充填され得る。気道への送達のためのエアロゾルは、当技術分野において公知であり例えば、AdjeiAandGarrenJPharmRes1565569;ZanenPandLammJWJIntJPharm114111115;GondaIAerosolsfordeliveryoftherapeuticandiagnosticagentstotherespiratorytractinCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems6273313;AndersonetalAmRevRespirDis14013171324を参照のこと、ペプチドおよびタンパク質の全身送達の可能性も有するPattonandPlatzAdvancedDrugDeliveryReviews8179196;TimsinaetalIntJPharm101113;およびTanseyIPSprayTechnolMarket42629;FrenchDLEdwardsDAandNivenRWAerosolSci27769783;VisserJPowderTechnology58110;RudtSandRHMullerJControlledRelease22263272;TabataYandYIkadaBiomedMaterRes22837858;WallDADrugDelivery2101201995;PattonJandPlatzRAdvDrugDelRev8179196;BryonPAdvDrugDelRev5107132;PattonJSetalControlledRelease28157985;DammsBandBainsWNatureBiotechnology;NivenRWetalPharmRes1213431349;およびKobayashiSetalPharmRes138083これら全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。水はいくつかの化合物の分解を助長し得るため、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の製剤は、開示された化合物を活性成分として含む、無水の薬学的組成物および剤形をさらに包含する。例えば、水例えば、5の添加は、貯蔵寿命または経時的な製剤の安定性のような特徴を決定するための、長期保管をシミュレートする手段として、薬学分野において広く認められている。例えば、JensTCarstensenDrugStabilityPrinciplesPractice37980を参照のこと。本開示の無水の薬学的組成物および剤形は、無水の成分または低水分含有成分、および低水分または低湿度の条件を使用して、調製され得る。乳糖および一級アミンまたは二級アミンを含む少なくとも1種の活性成分を含む薬学的組成物および剤形は、製造、パッケージング、および/または貯蔵の間の水分および/または湿気との実質的な接触が予想される場合、好ましくは、無水である。無水の組成物は、好ましくは、適当な処方キットに含まれ得るよう、水への曝露を防止することが既知の材料を使用してパッケージングされる。適当なパッケージングの例には、密閉ホイル、プラスチック、乾燥剤を含むかまたは含まない単位用量容器例えば、バイアル、ブリスターパック、およびストリップパックが含まれるが、これらに限定されない。放出制御型剤形および徐放型剤形。本明細書に記載された局面のいくつかの態様において、二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、放出制御手段および徐放手段により対象へ投与され得る。理想的には、医学的処置における最適に設計された放出制御型調製物の使用は、最小限の薬物物質が、最少限の時間で、状態の治癒またはコントロールのために利用されることを特徴とする。放出制御型製剤の利点には、以下のものが含まれる:1薬物の活性の拡張;2投薬頻度の低下;3患者コンプライアンスの増加;4より少ない全薬物の使用;5局所または全身の副作用の低下;6薬物蓄積の最小化;7血中レベル変動の低下;8処置の効力の改善;9薬物活性の増強または損失の低下;および10疾患または状態のコントロールのスピードの改善KimCherngjuControlledReleaseDosageFormDesign2。放出制御型製剤は、式Iの化合物の作用の開始、作用の継続時間、治療ウィンドウ内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御するために使用され得る。特に、放出制御型または長期放出型の剤形または製剤は、薬物の過小投薬即ち、最小治療レベル未満からも、薬物の毒性レベルを超えることからも起こる可能性のある有害効果および安全性懸念を最小化しつつ、式Iの化合物の最大の有効性が達成されることを確実にするために使用され得る。多様な公知の放出制御型または長期放出型の剤形、製剤、および装置が、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤と共に使用するために適合し得る。例には、各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第3845770号;第3916899号;第3536809号;第3598123号;第4008719号;第5674533号;第5059595号;第5591767号;第5120548号;第5073543号;第5639476号;第5354556号;第5733566号;および第6365185B1号に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。これらの剤形は、変動する割合で、所望の放出プロファイルを提供するため、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、OROS登録商標AlzaCorporationMountainViewCalifUSAのような浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはそれらの組み合わせを使用して、1種または複数種の活性成分の徐放または放出制御を提供するために使用され得る。さらに、開示された化合物の固定化された吸着された塩型を調製し、従って、薬物の制御された送達をもたらすため、イオン交換材料が使用されてもよい。具体的なアニオン交換樹脂の例には、Duolite登録商標A568およびDuolite登録商標AP143RohmHaasSpringHousePaUSAが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載された方法において使用するための二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤は、徐放またはパルスで対象へ投与される。パルス治療は、経時的な同一量の組成物の不連続投与の型ではなく、低下した頻度での同一用量の組成物の投与、または低下した用量の投与を含む。障害が対象に継続的に存在する時、例えば、対象がウイルス感染の継続的なまたは慢性の症状を有する場合、徐放またはパルス投与が特に好ましい。各パルス用量を低下させることができ、処置の課程を通して患者へ投与される二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤の総量が、最小化される。パルス間の間隔は、必要である時、当業者によって決定され得る。しばしば、パルス間の間隔は、組成物または組成物の活性成分が、次のパルスの送達前に対象においてもはや検出可能でない時、組成物をもう一回投与することにより計算され得る。間隔は、組成物のインビボ半減期からも計算され得る。間隔は、インビボ半減期より長く、または組成物半減期の2倍、3倍、4倍、5倍、さらには10倍として計算され得る。注入またはその他の型の送達により組成物を患者へパルス投与するための様々な方法および装置は、米国特許第4747825号;第4723958号;第4948592号;第4965251号、および第5403590号に開示されている。慢性免疫病本明細書に記載された方法のある種の局面は、腫瘍部位に浸潤していることが見出されたもののような、機能的疲弊の状態にあるCD8T細胞により同時発現されている阻害性受容体PD1およびTIM3の同時標的化が、機能的疲弊の状態を逆転させ、有効な免疫応答をもたらし得るという本発明者らによる発見に、一部、基づく。従って、本明細書に記載された二重特異性ポリペプチド剤および多重特異性ポリペプチド剤を使用する方法は、CD8T細胞のような免疫細胞の集団の機能的疲弊により、免疫応答が抑制されているか、不十分であるか、阻害されているか、または排除されている、持続感染または癌のような慢性免疫病を有する対象の処置において有用である。これらの方法は、活性化すべき細胞、即ち、TIM3およびPD1の両方を同時発現している細胞のみの特異的な標的化を提供し、シングルポジティブ細胞、機能的に疲弊していない細胞、および活性化により病原性となる細胞、例えば、自己反応性細胞の不要なまたは望まれない活性化を妨害する。宿主免疫応答の免疫抑制は、持続感染および腫瘍免疫抑制のような多様な慢性免疫病において役割を果たしている。最近の証拠は、この免疫抑制が、免疫細胞の表面において発現された免疫阻害性受容体、およびそれらのリガンドとの相互作用により媒介され得ることを示している。例えば、細胞傷害性CD8T細胞は、機能的疲弊または非応答性の状態になる場合があり、その際、それらは、増殖およびサイトカイン産生のような抗原特異的な応答を妨害する阻害性受容体を発現している。従って、そのような阻害性受容体の活性および/または発現を阻害することにより、抑制されているか、阻害されているか、または非応答性である、持続感染または癌もしくは腫瘍に対する免疫応答を、増強するかまたは阻害されないようにすることができる。本明細書において使用されるように、免疫応答とは、B細胞、T細胞CD4もしくはCD8、調節性T細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、NKT細胞、NK細胞、好塩基球、好酸球、または好中球のような免疫系の細胞による、刺激に対する応答をさす。いくつかの態様において、応答は、特定の抗原に特異的であり抗原特異的な応答、抗原特異的な受容体を介したCD4T細胞、CD8T細胞、またはB細胞による応答をさす。いくつかの態様において、免疫応答は、CD4応答またはCD8応答のようなT細胞応答である。これらの細胞によるそのような応答は、例えば、細胞傷害、増殖、サイトカインもしくはケモカインの産生、輸送、または食作用を含むことができ、応答を起こしている免疫細胞の性質に依存し得る。本明細書において使用されるように、免疫細胞に関する非応答性または機能的疲弊には、活性化受容体またはサイトカインを介した刺激のような刺激に対する免疫細胞の抵抗性が含まれる。非応答性は、例えば、免疫抑制薬への曝露、高用量もしくは一定用量の抗原への曝露のため、またはPD1もしくはTIM3のような阻害性受容体の活性を通して起こり得る。本明細書において使用されるように、非応答性という用語には、活性化受容体により媒介される刺激に対する抵抗性が含まれる。そのような抵抗性は、一般に、抗原特異的であり、抗原曝露が終わった後、持続する。非応答性免疫細胞は、同一の型の対応する対照免疫細胞に比べて、細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、輸送、食作用活性、またはそれらの任意の組み合わせの、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、または100もの低下を有し得る。本明細書に記載された方法のいくつかの態様において、PD1およびTIM3に特異的な二重特異性ポリペプチド剤または多重特異性ポリペプチド剤を投与される対象は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫による持続感染を有する。持続感染とは、急性感染とは対照的に、宿主免疫応答の誘導により効果的に除去されない感染をさす。そのような持続感染においては、感染性病原体と免疫応答とが平衡に達するため、感染対象は、必ずしも症状を発現することなく、長期にわたり感染したままとなる。持続感染は、しばしば、宿主細胞を急速に死滅させず、過度の傷害を与えることすらない、無症候性感染および増殖性感染の両方の期を含む。持続感染には、例えば、潜伏感染、慢性感染、および遅発性感染が含まれる。持続感染は、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、パポーバウイルス、プリオン、肝炎ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、およびパピローマウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスにより起こる。慢性感染において、感染性病原体は、対象において常に検出され得る。しかしながら、疾患の兆候および症状は、存在するかもしれないしまたは長期間存在しないかもしれない。慢性感染の非限定的な例には、を参照のこと;ダイネミシンdynemicinAを含むダイネミシン;クロドロネートのようなビスホスホネート;エスペラミシン;ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗菌性発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシンcactinomycin、カラビシンcarabicin、カミノマイシンンcaminomycin、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシンdetorubicin、6ジアゾ5オキソLノルロイシン、ADRIAMYCIN登録商標ドキソルビシンモルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、2ピロリノドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む、エピルビシン、エソルビシンesorubicin、イダルビシン、マルセロマイシンmarcellomycin、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシンpotfiromycin、ピューロマイシン、ケラマイシンquelamycin、ロドルビシンrodorubicin、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;メトトレキサートおよび5フルオロウラシル5FUのような代謝拮抗薬;デノプテリンdenopterin、メトトレキサート、プテロプテリンpteropterin、トリメトレキサートtrimetrexateのような葉酸類似体;フルダラビン、6メルカプトプリン、チアミプリンthiamiprine、チオグアニンのようなプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体;カルステロンcalusterone、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎薬antiadrenals;ホリニン酸のような葉酸補充薬;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシルbestrabucil;ビサントレン;エダトラキサートedatraxate;デホファミンdefofamine;デメコルチン;ジアジコンdiaziquone;エルホルミチンelformithine;エリプチニウムelliptinium酢酸塩;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニンlonidainine;マイタンシンおよびアンサミトシンansamitocinsのようなマイタンシノイド;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモールmopidanmol;ニトラエリンnitraerine;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK登録商標多糖複合体JHSNaturalProductsEugeneOreg;ラゾキサン;リゾキシンrhizoxin;シゾフランsizofuran;スピロゲルマニウムspirogermanium;テヌアゾン酸;トリアジコン;222トリクロロトリエチルアミン;トリコテシン特に、T2毒素、ベラクリンverracurinA、ロリジンroridinA、およびアングイジンanguidine;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシンgacytosine;アラビノシド;RobertSPorteretalTheEncyclopediaofMolecularBiologypublishedbyBlackwellScienceLtd1994;およびRobertAMeyersMolecularBiologyandBiotechnologyaComprehensiveDeskReferencepublishedbyVCHPublishersInc1995;ImmunologybyWernerLuttmannpublishedbyElsevier2006に見出され得る。分子生物学における一般的な用語の定義は、全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、BenjaminLewinGenesIXpublishedbyJonesBartlettPublishing2007;KendrewetalTheEncyclopediaofMolecularBiologypublishedbyBlackwellScienceLtd1994;およびRobertAMeyersManiatisetalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYUSA;SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYUSA;DavisetalBasicMethodsinMolecularBiologyElsevierSciencePublishingIncNewYorkUSA;またはMethodsinEnzymologyGuidetoMolecularCloningTechniquesVol152SLBergerandARKimmerlEdsAcademicPressIncSanDiegoUSA;CurrentProtocolsinMolecularBiology、CurrentProtocolsinProteinScience、およびCurrentProtocolsinImmunologyJohnEColiganetaledJohnWileyandSonsIncに見出される。本明細書において使用されるように、含むという用語は、提示された定義された要素に加えて、その他の要素も存在し得ることを意味する。含むの使用は、限定ではなく包含を示す。本明細書において使用されるように、から本質的になるという用語は、所定の態様のために必要とされる要素をさす。この用語は、本発明のその態様の基本的な、新規の、または機能的な特徴に物質的に影響を与えない付加的な要素の存在を可能にする。からなるという用語は、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分をさし、態様の説明において言及されない要素は除外される。さらに、前後関係によりそうでないことが必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は単数を含むであろう。作業実施例を除き、または他に示された場合、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す用語は、全て、常に約という用語により修飾されるものと理解されるべきである。百分率に関して使用された時、約という用語は、±1を意味し得る。本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、試薬等に限定されず、従って、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、特定の態様を記載するためのものに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を制限するためのものではない。同定された全ての特許およびその他の刊行物は、例えば、本発明に関して使用され得るそのような刊行物に記載された方法論を記載し開示する目的のため、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。この点に関して、先願発明のため、またはその他の理由のため、本発明者らがそのような開示に先行している資格を有しないことの承認として解釈されるべきものは存在しない。これらの文書の日付に関する記述または内容に関する表示は、全て、出願人にとって入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する承認を構成するものではない。限定として解釈されるべきではない以下の実施例により、本発明をさらに例示する。免疫応答は、癌の抑止において重要な役割を果たす;しかしながら、免疫抑制の機序が、生産的な抗腫瘍免疫を妨げる。腫瘍を保持している宿主におけるT細胞の機能障害または疲弊は、一つのそのような機序である。PD1は、慢性疾患状態における疲弊したT細胞のマーカーとして同定されており、PD1PD1L相互作用の遮断は、T細胞機能を部分的に回復させることが示されている。本発明者らは、固形腫瘍を保持しているマウスにおいて、Tim3が、CD8腫瘍浸潤リンパ球TILにおいて発現されていることを発見した。全てのTim3TILが、PD1を同時発現しており、Tim3PD1TILは、腫瘍浸潤T細胞の優勢な画分を表す。Tim3PD1TILは、増殖能の欠如、またはIL2、TNFα、およびIFNγの産生能の欠如により定義されるような、最も重度の疲弊表現型を示す。本発明者らは、Tim3経路およびPD1経路の標的化の組み合わせが、いずれかの経路の単独の標的化より、腫瘍成長の制御において有効であることをさらに見出す。癌からの防御における免疫系の重要性は、癌免疫監視の理論において最初に提唱された。この理論は、免疫系は、癌細胞が発生した時、それらの癌細胞を認識することができ、それらを排除するため、自然免疫応答および適応免疫応答の両方を開始することができると主張するものである。癌免疫監視を支持して、免疫不全または免疫抑制の患者、および実験動物の両方が、腫瘍発症に対してより感受性であるという事実があるDunnetal2004;Zitvogeletal2006;SwannandSmyth2007に概説されている。癌の抑止における免疫系の役割に対立するのが、免疫抑制の状態を発生させることにより、免疫系を免れる腫瘍の能力であるZitvogeletal2006。腫瘍を保持している宿主に存在する免疫抑制の機序の一例が、T細胞の機能障害または疲弊の促進である。T細胞疲弊とは、マウスにおける慢性リンパ球脈絡髄膜炎ウイルスLCMV感染において最初に観察されたT細胞機能障害の状態を表すものであるZajacetal1998。疲弊したT細胞は、抗原刺激に応答して、増殖することができず、細胞傷害およびサイトカイン分泌のようなエフェクター機能を発揮することができない。さらなる研究は、疲弊したT細胞が、阻害性分子プログラム細胞死1PD1の持続的な発現を特徴としており、PD1とPD1リガンドPDL1との相互作用の遮断が、LCMV感染マウスにおいて、T細胞疲弊を逆転させ、抗原特異的なT細胞応答を回復させ得ることを同定したBarberetal2006。T細胞疲弊は、ヒトにおいても慢性感染時に起こりKlenermanandHill2005に概説されている、HIVDayetal2006;Petrovasetal2006Trautmannetal2006、B型肝炎ウイルスHBVBoettleretal2006、およびC型肝炎ウイルスHCVUrbanietal2006による慢性感染を有するヒトにおけるCD8T細胞は、高レベルのPD1を発現している。これらの細胞におけるPD1PDL相互作用の遮断は、インビトロでT細胞機能を回復させることができる。いくつかの証拠系列も、癌におけるT細胞疲弊にPD1PDL経路を関係付けている。第一に、PD1発現は、複数の固形腫瘍における腫瘍浸潤CD8T細胞Blanketal2006;Ahmadzadehetal2009;Gehringetal2009および非固形腫瘍を有する宿主における抗原特異的CD8T細胞Yamamotoetal2008;Mumprechtetal2009に見出される。第二に、これらのPD1T細胞は機能障害を有する。第三に、PDL1は、いくつかの異なる癌において高レベルに発現されておりLatchmanetal2001;Dongetal2002;Brownetal2003、腫瘍におけるPDL1の高発現は、予後不良と強く関連しているThompsonetal2006。最後に、抗体による遮断またはPD1欠損のいずれかを通してPD1PDLシグナル伝達に干渉することにより、いくつかの癌において、臨床転帰が改善され、機能的なT細胞応答が回復することが示されているBlanketal2006;Yamamotoetal2008;Mumprechtetal2009;Zhangetal2009。しかしながら、PD1PDL1経路の標的化は、T細胞疲弊の逆転を必ずしももたらさずBlackburnetal2008;Gehringetal2009、PD1発現は、疲弊表現型と必ずしも関連しておらずPetrovasetal2006;Fourcadeetal2009、このことは、他の分子がT細胞疲弊に関与している可能性が高いことを示している。HIVを有する患者における最近の研究は、免疫調節因子であるT細胞免疫グロブリン3TIM3が、疲弊したCD8T細胞においてアップレギュレートされていることを示したJonesetal2008。Tim3は、IFNγを分泌するTh1細胞およびTc1細胞において選択的に発現されているとして最初に同定された分子であるMonneyetal2002。Tim3の、そのリガンド、ガレクチン9との相互作用は、Tim3T細胞における細胞死を誘発する。従って、Tim3およびPD1の両方が、T細胞応答の負の調節因子として機能することができる。HIV患者において、TIM3およびPD1は、疲弊した細胞の別個の集団を特徴付けており、PD1およびTIM3の両方について陽性の細胞は、CD8T細胞の最も小さな画分Jonesetal2008を構成している。同様に、別のグループは、HCVを有する患者において、TIM3が、疲弊したT細胞においてアップレギュレートされていることを示したGoldenMasonetal2009。この場合、TIM3およびPD1を同時発現している細胞は、HCV特異的CD8T細胞の中で最も豊富な画分である。両方の研究において、TIM3の遮断は、T細胞増殖を回復させ、サイトカイン産生を増強した。PD1PDL経路の単独の標的化は、T細胞機能の完全な回復をもたらさずBlackburnetal2008、PD1PDL経路の標的化がT細胞機能を全く回復させない癌もあるためGehringetal2009、T細胞疲弊に関与しているその他の分子および阻害経路を同定する必要が存在する。実際、ある研究は、LAG3が、疲弊したT細胞において発現されていることを同定し、抗LAG3による処置は、単独では、LCMV感染マウスにおいてT細胞機能を回復させなかったが、PD1遮断と協同作用して、T細胞応答を改善し、ウイルス負荷を低下させたBlackburnetal2009。残念ながら、この研究は、LAG3およびPD1が、疲弊したT細胞の別個の集団おいて発現されているのか、それともオーバーラップする集団において発現されているのかを同定しなかった。本発明者らは、固形腫瘍を保持しているマウスにおける腫瘍浸潤リンパ球TILの大きな画分におけるTim3およびPD1の同時発現を、本明細書において報告する。Tim3およびPD1を同時発現しているTILは、CD8TILの中で優勢であり、T細胞エフェクター機能の最も顕著な欠陥を示す。本発明者らは、Tim3経路およびPD1経路の標的化の組み合わせが、腫瘍成長の制御において高度に有効であることをさらに示す。癌におけるT細胞におけるTim3およびPD1の同時発現癌におけるT細胞疲弊におけるTim3の可能性のある役割を調査するため、固形腫瘍CT26結腸を保持しているマウスに由来するT細胞におけるTim3およびPD1の発現を、最初に調査した。CD8癌腫瘍浸潤リンパ球TILの中で、Tim3およびPD1を同時発現している細胞は、主要な集団およそ50を構成し、PD1のみを発現している細胞、またはTim3もPD1も発現していない細胞は、より小さな集団それぞれおよそ30およびおよそ20を構成することが観察された図1Aおよび1B。その他の癌にこれらの観察を拡張するため、その他の固形腫瘍:4T1乳腺癌およびB16F10黒色腫を保持しているマウスにおいて、CD8TILを調査した。CT26を保持しているマウスにおける観察と一致して、Tim3およびPD1を同時発現している細胞は、4T1腫瘍を保持しているマウスにおいても、CD8TILのおよそ50を構成し、PD1のみを発現している細胞、またはTim3もPD1も発現していない細胞は、より小さな集団それぞれおよそ25およびおよそ15を構成する図1B。B16F10黒色腫を保持しているマウスにおいては、CD8TILの3種の集団Tim3PD1、Tim3PD1、およびTim3PD1が、全て、ほぼ等しい頻度で存在する。興味深いことに、調査された3種の腫瘍モデルの全てにおいて、Tim3PD1TILは観察されなかった図1A。CD4TILも調査した;しかしながら、これらはより少量であり、これらのうちの過半数がTim3PD1であり、Tim3PD1集団およびTim3PD1集団がほぼ等しいことが見出された図1A。総合すると、これらのデータは、Tim3およびPD1を同時発現しているCD8TILが、異なる固形腫瘍に浸潤しているTILに存在するT細胞の主要な集団を構成することを示している。Tim3およびPD1の発現を、腫瘍保持マウスの脾臓においても調査した。ここでは、ナイーブマウスと比較して、CD8Tim3細胞の頻度の増加の傾向が観察された;しかしながら、この増加の程度は、異なる固形腫瘍を保持しているマウスの間で可変であった図1C。CD8TILとは対照的に、腫瘍保持マウスにおける脾臓CD8T細胞においては、PD1とTim3との同時発現の証拠が、あったとしてもほとんど見出されず図6、このことから、CD8Tim3細胞におけるPD1のアップレギュレーションは、環境的な合図に応答して、腫瘍環境において特異的に起こることが示唆された。しかしながら、腫瘍保持マウスの末梢リンパ組織において、Tim3細胞の2種の別個の集団、Tim3高およびTim3低が区別された。同様に、腫瘍保持マウスの脾臓CD4T細胞の中で、Tim3高集団およびTim3低集団が観察された。興味深いことに、Tim3低集団は、PD1の同時発現を特徴としており、このことから、これらの細胞が、Tim3PD1TILの前駆細胞であって、Tim3高細胞とは異なる機能的状態にあるT細胞を表すことが示唆された図6。Tim3およびPD1を発現しているTILにおけるT細胞機能障害CD8TILの異なるサブセットをさらに特徴決定するため、CD44およびCD62Lの発現を最初に調査した。CD62LおよびCD44の発現パターンは、Tim3PD1TIL、Tim3PD1TIL、およびTim3PD1TILの間で極めて異なっていることが見出された。TILの3種の集団は、全て、高レベルのCD44を発現していた図2Aおよび2B。しかしながら、Tim3PD1TILおよびTim3PD1TILのみが、ナイーブCD44低CD62L高T細胞を含有しており、Tim3PD1TILが、最も高い割合でナイーブT細胞を含有していたおよそ35。Tim3PD1TILのうち過半数がCD62L低であり、この集団においてはセントラルメモリーCD44高CD62L高細胞の画分が最低であった。これらのデータは、Tim3およびPD1のディファレンシャルな発現を特徴とするTILの3種の集団が、異なる機能的状態にある細胞を含有していることを初めて示すものであった。慢性ウイルス感染において、PD1は、機能障害のまたは疲弊したCD8T細胞のマーカーとして同定されているBarberetal2006。さらに、CTL機能およびIL2の産生が最初に損なわれ、続いて、TNFの損失、次いでIFNの損失が起こる、T細胞疲弊の階層が存在することが観察されているWherryetal2003。従って、Tim3およびPD1を発現しているTILのいくらかが、疲弊表現型を示すか否かを決定するため、CD8TILを単離し、IL2、TNFα、およびIFNγの産生をエクスビボで直接調査した。Tim3PD1TILおよびTim3PD1TILと比較した時、Tim3PD1TILは、IL2、TNFα、およびIFNγの産生の最も顕著な障害を示すことが見出された図3A。驚くべきことに、Tim3PD1TILは、TILの3種の集団の中で最も多くIFNγを産生し、IL2およびTNFαの産生の障害を、Tim3PD1TILより有意に少なく示した。これらのデータは、Tim3PD1TILが、最も疲弊したTILを表し、Tim3PD1TILが、疲弊したT細胞およびエフェクターT細胞の混合物を含有していることを示唆する。これらの観察をさらに確認するため、サイトカイン産生TILおよび非産生TILにおいて、Tim3PD1細胞およびTim3PD1細胞の存在量を決定した図3B。Tim3PD1細胞が、サイトカイン非産生TILの中で最も豊富な55~60集団であり、Tim3PD1細胞より3~4倍多いことが見出された。サイトカイン産生TILの調査は、IL2産生TILの中で、Tim3PD1細胞がTim3PD1より少量であることを明らかにした。類似の傾向がTNFαでも観察されたが、これは統計的有意性には達しなかった。IFNγ産生TILの中では、両方の集団が等しく表された。興味深いことに、サイトカイン産生TILの中のTim3PD1細胞の存在量のこの段階的な損失は、T細胞疲弊の階層に従っているようであり、このことから、疲弊はインビボの動的な過程である可能性が高いこと、そして最初に疲弊表現型を発症するのがTim3PD1細胞であることが示唆される。上述のように、TCR刺激に応答して増殖する能力の損失は、疲弊したT細胞において失われる最初のエフェクター機能のうちの一つである。従って、細胞周期に入っている細胞により発現される核タンパク質Ki67の発現を決定することにより、エクスビボで直接TILの増殖能を調査した。しかしながら、HIVによる慢性感染を有する個体においては、G1において停止している細胞が、Ki67を発現し得ることが認められているCombadereetal2000。TOPRO3ヨウ化物による同時染色により、DNA含量も調査した。そのことにより、G1において停止している細胞を、S期、G2期、およびM期に進行した細胞から区別することができる。TILを単離しエクスビボで直接刺激した後、Ki67発現およびDNA含量を調査した。次いで、細胞周期のGO期、G1期、およびSM期にあるTim3PD1細胞およびTim3PD1細胞の存在量を決定した図4A。Tim3PD1細胞が、GOにおいて静止している最も豊富な集団であり、Tim3PD1細胞より5倍多いことが見出された図4B。興味深いことに、G1期およびSM期に進行した細胞を調査すると、細胞周期進行に伴いTim3PD1細胞の数が着実に減少し、Tim3PD1細胞が着実に増加することが見出された。総合すると、データは、増殖することができず、IL2、TNFα、およびIFNγを産生することができないTILの最も疲弊した集団を、Tim3およびPD1の同時発現が特徴付けることを、強く支持している。癌におけるTim3シグナル伝達経路およびPD1シグナル伝達経路の標的化の効果PD1またはTim3のいずれかのシグナル伝達経路の遮断Jonesetal2008;GoldenMasonetal2009が、慢性感染の情況においてT細胞機能を改善し得るという以前の観察と共に、これらの証明は、これらの2種の経路の標的化の組み合わせが、インビボの抗腫瘍免疫を回復させるための最も効果的な手段であると判明する可能性を与えた。インビボ処理を始める前に、CT26腫瘍におけるPD1およびTim3のリガンドそれぞれPDL1およびガレクチン9の発現図7を最初に確認した。次いで、インビボで遮断機能を有することが以前に記載されたMonneyetal2002抗Tim3抗体、抗PDL1抗体、抗Tim3抗体抗PDL1抗体、または対照免疫グロブリンにより、CT26腫瘍保持マウスを処理した。抗Tim3単独による処理には、ほとんどまたは全く効果がなく、抗PDL1単独による処理は、腫瘍成長の遅延の傾向を示すことが見出された;しかしながら、これは実験間で変動し、統計的有意性には達しなかった図5。しかしながら、抗Tim3および抗PDL1による処理の組み合わせは、腫瘍成長の劇的な低下をもたらし、マウスの50が完全な腫瘍退縮を示した。CT26腫瘍はPDL1を発現しているがTim3は発現していないため図7、抗PDL1抗体が腫瘍成長に対する直接の阻害効果を有する可能性を考慮した。CT26腫瘍を、抗PDL1または対照免疫グロブリンの存在下で培養したところ、腫瘍増殖は影響を受けないことが見出された図8。B16黒色腫を保持しているマウスにおいても抗Tim3抗PDL1処理の効果を試験したところ、対照免疫グロブリン、抗Tim3、または抗PDL1により処理されたマウスに比べて、処理の組み合わせを受容したマウスは、増強された生存を示すことが見出された。抗Tim3抗PDL1による処理が実際にTIL機能を回復させるか否かを直接解明するため、CT26腫瘍を保持しているマウスからTILを単離し、抗Tim3抗体、抗PDL1抗体、抗Tim3抗体抗PDL1抗体、または対照免疫グロブリンの存在下で培養した図9。抗Tim3単独および抗PDL1単独の両方が、TILからのIFNγ産生を強化し得るが、この効果は、可変であり、抗Tim3抗体および抗PDL1抗体の両方により処理されたTILにおいて観察されたIFNγ産生の増加と比較して、しばしば弱いことが見出された。実際、これらのデータは、インビボ処理実験において観察されたものと密接に平行しており、抗Tim3単独または抗PDL1単独は、腫瘍成長に対して限られたかつ/または可変の効果を有する図5。腫瘍保持マウスからの末梢T細胞応答に対する抗Tim3抗PDL1処理の効果も調査したところ、TILにおいて観察された効果に類似して、抗Tim3単独および抗PDL1単独の両方が、可変であり、かつ抗Tim3抗PDL1の効果に比べてしばしば弱い、IFNγ産生に対する効果を有することが見出された図10。さらに、図11は、Tim3経路およびPD1経路の標的化の組み合わせが、B16黒色腫モデルの生存を劇的に増加させることを証明する。雌C57BL6マウスにB16F10を移植し、対照免疫グロブリン、抗Tim3抗体クローン5D12、抗PDL1抗体クローン10F9G2、または両抗体のいずれかにより処理した。マウスを腫瘍成長および生存についてモニタリングした。各群n=5。さらに、図12は、抗Tim3および抗PDL1により処理されたマウスにおける腫瘍特異的T細胞応答の回復を証明する。CT26結腸癌を移植されたBalbcマウスの流入領域リンパ節に由来する細胞を、対照免疫グロブリン、抗Tim3抗体クローン2C12、抗PDL1抗体クローン10F9G2、または両抗体のいずれかにより処理した。処理されたマウスの腫瘍流入領域リンパ節に由来する細胞を、腫瘍抗原AH130μgmlと共に培養した。48時間目に収集された上清の中のIFNγの産生が示される。p>001、p>005、一元配置のANOVA、チューキーの多重比較検定。示されたデータは、2つの独立の試料の平均値である。2回の付加的な独立の実験において、類似の結果が得られた。やはり、処理の組み合わせは、いずれかの剤単独による分泌と比べて、IFNγI分泌を劇的に増加させる。さらなる証拠を提供して、図13は、確立された腫瘍に対するTim3経路およびPD1経路の標的化の効果を証明する。BALBcマウスにCT26結腸癌を移植した。腫瘍が30~50mm2に達した後、マウスを、対照免疫グロブリンまたは抗Tim3抗体クローン2C12抗PDL1抗体クローン10F9G2のいずれかにより処理した。各群n=5。組み合わせは、未処理の対照と比べて腫瘍サイズを低下させるために有効であり、重要なことに、抗Tim3抗PDL1群の動物5匹のうち2匹が、確立された腫瘍モデルにおいて完全な腫瘍退縮を示した。総合すると、本明細書に記載されたデータは、Tim3およびPD1のシグナル伝達経路の標的化の組み合わせが、抗腫瘍免疫の回復において高度に有効であることを証明している。疾患の慢性の他に、T細胞における疲弊の誘導および/または維持に関与している因子に関してはほとんど未知である。PD1は疲弊したT細胞についての主要なマーカーであった。しかしながら、PD1シングルポジティブTILは、PD1Tim3TILよりはるかに高い、最も高頻度のIFNγ産生細胞を含有しているため、この集団は、IFNγを産生する真のエフェクターT細胞を含んでいる可能性が高いことを、本明細書に記載されたデータは示している図3A。これらのデータは、PD1が、疲弊の不完全なマーカーであり、Tim3の同時発現が、最も疲弊した表現型を有するT細胞を明白に特徴付けることを示す。しかしながら、いくつかの問題が残る。Tim3の誘発は、細胞死シグナルをT細胞へ伝達し得ることが公知である。では、疲弊したTim3PD1T細胞は、いかにして慢性状態を持続するのか。理論により拘束または限定されることは望まないが、一つの可能性は、Tim3発現のディファレンシャルなレベルが、異なる機能的転帰を駆動する、即ち、高レベルのTim3はT細胞の細胞死を促進し、低レベルのTim3は、細胞が細胞死を免れ機能障害状態を持続することを可能にする阻害シグナルを伝達するというものである。これに関して、腫瘍保持マウスの末梢におけるCD4コンパートメントおよびCD8コンパートメントの両方において、Tim3低細胞の存在が観察された図6。これらのT細胞が、Tim3高細胞と比較して、エフェクター機能の異なる状態にあるか否かを決定することは興味深いであろう。理論により拘束または限定されることは望まないが、第二の、相互に排他的ではない可能性は、PD1および/またはLAG3のようなその他の阻害性分子の同時発現が、疲弊表現型を有する細胞を担うかまたは保存しているというものである。理論により拘束または限定されることは望まないが、第三の、相互に排他的ではない可能性は、疲弊と細胞死との間の決定が、Tim3リガンドであるガレクチン9の利用可能性のレベルで調節されるというものである。これに関して、TILにおける疲弊の発症が、腫瘍自体におけるガレクチン9発現に依存するのか、それともそれが末梢において開始し、腫瘍におけるTim3:ガレクチン9の相互作用により疲弊表現型がさらに増幅されるのかは、未だ証明されていない。慢性LCMV感染におけるCD8T細胞における疲弊表現型の促進に、転写因子Blimp1が関与していることが最近示されたことを除きShinetal2009、疲弊表現型の誘導および/または維持を担う下流シグナルに関してはほとんど未知である。Tim3PD1細胞が慢性状態における真の疲弊したT細胞として同定された、本明細書に記載された新規の発見は、疲弊表現型を駆動/維持する遺伝子プログラムの調査を容易にし、癌および感染性疾患のような慢性免疫病における免疫活性の刺激のための治療アプローチを提供する。材料および方法腫瘍浸潤リンパ球の単離。20分間、コラゲナーゼD25mgmlの存在下で腫瘍組織を解離させた後、不連続パーコール勾配GEHealthcare上で遠心分離することにより、腫瘍浸潤リンパ球を単離した。次いで、単離された細胞を、T細胞機能の様々なアッセイにおいて使用した。フローサイトメトリー。単一細胞懸濁物を、CD4RM45、CD85367、PD1RMP130、CD44IM7、CD62LMEL14Biolegend、およびTim38B2C12Ebioscienceに対する抗体により染色した。死細胞を排除するために7AADを使用した。細胞質内サイトカイン染色のため、ゴルジプラグBDBiosciencesの存在下で、3時間、PMA50ngmlおよびイオノマイシン1μgmlによりインビトロで細胞を刺激した。次いで、細胞を採集し、CD8、Tim3、およびPD1について染色した後、固定および透過性化を行った。次いで、透過性化された細胞を、IL2JES65H4、TNFαMP6XT22、およびIFNγXMG12について染色した。全てのデータを、BDLsrIIBDBiosciencesに収集し、FlowJoソフトウェアTreeStarにより分析した。Ki67およびTOPRO3染色。TILを採集し、48時間、抗CD31μgmlの存在下でインビトロで培養した。次いで、細胞を、CD8、PD1、Tim38B2C12に対する抗体で染色した後、透過性化し、Ki67に対する抗体BiolegendおよびTOPRO3ヨウ化物Invitrogenで染色した。全てのデータを、BDLsrIIBDBiosciencesに収集し、FlowJoソフトウェアTreeStarにより分析した。腫瘍実験。5×105個のCT26を、野生型Balbcマウスの右側腹部へ移植した。マウスを、0日目、2日目、および4日目に100μgの抗Tim3クローン8B2C12によりip処理するか、0日目、3日目、6日目、9日目、および12日目に200μgの抗PDL1クローン10F9G2により処理するか、またはアイソタイプ対照免疫グロブリンラットIgG1およびラットIgG2bにより処理した。腫瘍表面を、ノギスを使用して、二次元に測定した。インビトロ実験。腫瘍浸潤リンパ球を上記のように採集し、可溶性抗CD35μgml、および10μgmlの抗Tim3クローン8B2C12、抗PDL1クローン10F9G2、抗Tim3抗PDL1の両方、または対照免疫グロブリンラットIgG1およびラットIgG2bのいずれかの存在下で培養した1~3×105個ウェル。96時間後、培養上清を収集し、サイトメトリックビーズアレイCBABDBiosciencesによりIFNγを測定した。参照