"表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、糖側鎖を有するポリマーを、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。前記ポリマーの主鎖がポリスチレンであり、糖側鎖がラクトースまたはガラクトースである請求項1記載の細胞培養基材。前記糖側鎖を有するポリマーが、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミドである請求項1または2記載の細胞培養基材。前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、E-カドヘリン、または、E-カドヘリンと相同性を有するタンパク質であって、EC1ドメイン、EC2ドメイン、EC3ドメイン、EC4ドメインおよびEC5ドメインのうち1つ以上を含み、かつE-カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である請求項1~3のいずれか一項記載の細胞培養基材。前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、E-カドヘリンと、免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質である請求項1~3のいずれか一項記載の細胞培養基材。前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質と、糖側鎖を有するポリマーとが海島構造を形成している請求項1~5のいずれか一項記載の細胞培養基材。請求項1~6のいずれか一項記載の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。請求項1~6のいずれか一項記載の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる請求項8記載の多能性幹細胞の分化誘導方法。請求項1~6のいずれか一項記載の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とする細胞培養方法。前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミドである請求項10記載の細胞培養方法。上記のようなES細胞、iPS細胞といった分化万能性細胞を、拒絶反応のない移植材料として用いるためには、特定の細胞に分化させる必要がある。分化万能性細胞を任意の細胞に分化させるに当たっては、分化誘導の効率はもとより、分化誘導後の細胞の均一性が求められる。即ち、分化誘導後に、目的外のものに分化した細胞や未分化の細胞など目的の細胞以外の細胞が混入していることは、移植後の癌化の危険性を避けるためにも好ましくない。例えば、胚様体Embryoidbodyの形成や、フィーダー細胞の使用を含む従来の分化誘導方法では、細胞塊cellcolonyが形成され、その中において3種すべての胚葉系統の細胞が誘導されてしまい、目的の細胞のみを高い純度で得ることができないといった問題があった。そこで本発明の目的は、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることが可能であり、分化後の細胞の選抜にも用いることができる細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。本発明者等は鋭意検討した結果、表面に、特定のタンパク質とポリマーを、固定またはコーティングした細胞培養基材とすることにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する、以下の[1]~[11]である。[1]表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、糖側鎖を有するポリマーを、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。[2]前記糖側鎖が、ラクトースまたはガラクトースである[1]の細胞培養基材。[3]前記糖側鎖を有するポリマーが、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミドである[1]または[2]の細胞培養基材。[4]前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、E-カドヘリン、または、E-カドヘリンと相同性を有するタンパク質であって、EC1ドメイン、EC2ドメイン、EC3ドメイン、EC4ドメインおよびEC5ドメインのうち1つ以上を含み、かつE-カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である[1]~[3]のいずれかの細胞培養基材。[5]前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、E-カドヘリンと、免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質である[1]~[3]のいずれかの細胞培養基材。[6]前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質と、糖側鎖を有するポリマーとが海島構造を形成している[1]~[5]のいずれかの細胞培養基材。[7][1]~[6]のいずれかの細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。[8][1]~[6]のいずれかの細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。[9]多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる[8]の多能性幹細胞の分化誘導方法。[10][1]~[6]のいずれかの細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とする細胞培養方法。[11]前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミドである[10]の細胞培養方法。本発明により、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることの可能であり、分化後の細胞の選抜にも用いることができる細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することが可能となる。[定義]本明細書中に使用するとき、用語多能性幹細胞とは、invitro培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核染色体型を呈し、適当な条件下において三胚葉外胚葉、中胚葉、および内胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞をいう。多能性幹細胞は、初期胚より単離されるES細胞、iPS細胞及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離されるEG細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中、ES細胞と表記した場合はEG細胞も含むこともある。本明細書中に使用するとき、用語未分化性とは、多能性幹細胞において、少なくとも1つ以上の未分化マーカー、例えばALP活性やOct-3/4遺伝子産物の発現、または種々の抗原分子の発現により確認することができる未分化な状態を呈する性質を意味する。多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核染色体型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。本明細書中に使用するとき、用語分化多能性とは、様々な種類の細胞に分化する能力をいう。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。本明細書中に使用するとき、用語液体培地とは、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができる液体培地をすべて含む。本発明の培養基材としては、培養皿ディッシュ、96穴、48穴などのマイクロプレート、プレートやフラスコ等、従来から細胞培養に用いられているもののいずれをも使用できる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料、またはポリスチレンやポリプロピレン等の有機材料のいずれかからなることができるが、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるものが好ましい。カドヘリンファミリーに属するタンパク質を、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、カドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間~一昼夜、より好ましくは1時間~12時間、接触させることで達成できる。また、前もって接着性分子に人為的に抗原性分子を付加融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。上述の様に作製した培養基材は、多能性幹細胞の通常の培養法にそのまま使用することができる。すなわち、適当数の多能性幹細胞を、通常用いられる液体培地又は細胞培養液に懸濁し、それを当該培養基材に添加すればよい。その後の液体培地の交換や継代も、従来法と同様に行なうことができる。本明細書中に使用するとき、用語同種親和性の結合とは、細胞接着において、細胞-細胞又は細胞-基材間の接着性分子を介した結合において、同じ種類の接着性分子同士が結合又は会合することによりなされているものを意味する。本明細書中に使用するとき、用語フィーダー細胞とは、支持細胞とも称され、単独では生存培養できない細胞を培養する際に、あらかじめ培養され、培地中に不足する栄養分や増殖因子の補給などの役割を担う別の細胞をいう。フィーダー細胞には、MEF細胞や、STO細胞等の間質系細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中に使用するとき、用語分散状態とは、細胞が培養基材表面に接着した状態で生育している場合において、明確なコロニーを形成せず、個々の細胞が他の細胞と接触していない、または、一部接触していても、その接触領域がごく小さい状態を意味する。本明細書中に使用するとき、用語遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位を含む核酸を言う。遺伝子はRNAであってもDNAであってもよく、天然由来又は人為的に設計された配列であり得る。また、遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムやsiRNAshort/smallintereferingRNA等の機能的RNAをコードするものであってもよい。糖側鎖を有するポリマーとは、好ましくはエチレン性不飽和結合を重合させて得られる主鎖と、糖側鎖とを有するポリマーである。糖側鎖としては、グルコース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられるが、ラクトースまたはガラクトースが好ましい。ラクトース中のβ-ガラクトース、β-ガラクトース側鎖が、アシアロ糖タンパク質レセプターにより特異的に認識され、細胞の結着に寄与しうるからである。糖側鎖を有するポリマーは、スチレン誘導体ポリマーであることが好ましく、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミド以下、PVLAとも称するが最も好ましい。糖側鎖を有するポリマーを、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、糖側鎖を有するポリマーを含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間~一昼夜、より好ましくは1時間~12時間、接触させることで達成できる。また、前もって糖側鎖を有するポリマーに人為的に抗原性分子を付加融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。本発明の上記効果や他の利点および特徴を、以下の好適な実施態様の詳細な説明において詳述する。[細胞培養基材]本発明の細胞培養基材は、表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、糖側鎖を有するポリマーを、固定またはコーティングしたことを特徴とするものである。カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンスジャンクションadherensjunctionと呼ばれるCa2依存性の細胞間接着結合に関与する接着分子であり、E上皮型、N神経型、P胎盤型の3種が代表例として知られている。これらのカドヘリン分子は、700~750アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約110アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるExtracellularCadherinECドメインと呼ばれる領域が5個存在する。例えば、ヒトE-カドヘリンそのアミノ酸配列を配列番号1に示すの場合、EC1、EC2、EC3、EC4、EC5の各ドメインは、それぞれ157~262、265~375、378~486、487~595、596~700に相当する数値は配列番号1に示すアミノ酸配列内の残基の番号である。また、マウスE-カドヘリンそのアミノ酸配列を配列番号2に示すの場合、EC1、EC2、EC3、EC4、EC5の各ドメインは、それぞれ159~264、267~377、380~488、489~597、598~702に相当する数値は配列番号2に示すアミノ酸配列内の残基の番号である。これらのECドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にN末端側に位置するドメインEC1、EC2の相同性が高い。この様な類似の構造を呈するカドヘリン分子としては、現在、50種類以上のものが知られており、これらの分子を総称してカドヘリンファミリーと呼ぶ。以上、カドヘリンに関する総説としては、Takeichi、Curr.Opin.CellBiol.7:619,1995;MarrsNelson、Int.Rev.Cytol.165:159,1996;Yapetal.,Annu.Rev.CellDev.Biol.13:119,1997;YagiTakeichi、GenesDev.14:1169,2000;Gumbiner、J.CellBiol.148:399,2000、等を参照のこと。E-カドヘリン別名、カドヘリン-1は、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている総説として、Mareeletal.,Int.J.Dev.Biol.37:227,1993;Maysetal.,CordSpringHarb.Symp.Quant.Biol.60:763,1995;El-BahrawyPignatelli、Microsc.Res.Tech.43:224,1998;Nolletetal.,Mol.Cell.Biol.Res.Commun.2:77,1999。また、E-カドヘリンは、未分化なマウスES細胞にも強く発現しており、E-カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたES細胞は、細胞間接着が著しく阻害されることが知られているLarueetal.,Development122:3185,1996。また、米国NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIの公的な遺伝子発現データベースに登録されている情報から、E-カドヘリン遺伝子がヒトES細胞株でも発現していることが確認できる。カドヘリンファミリーに属するタンパク質を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナントタンパク質を作製精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞のカドヘリンファミリーに属するタンパク質を、生体組織細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。カドヘリンファミリーに属するタンパク質に関し、そのリコンビナントタンパク質を作製するための方法、及び当該分子をコードする遺伝子を取得する方法は、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、上記で挙げた参考書籍を参照することができるが、特にこれを限定しない。E-カドヘリンを例とした場合、E-カドヘリン遺伝子は、既にヒト配列番号1、マウス配列番号2、ラット等の動物で単離同定され、その塩基配列が、NCBI等の公的なDNAデータベースにおいて利用可能であるアクセス番号:ヒトNM_004360;マウスNM_009864;ラットNM_031334。そのため、当業者であれば、E-カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、E-カドヘリン遺伝子のcDNAを取得使用することが可能である。また、E-カドヘリン遺伝子のcDNAは、理化学研究所ジーンバンク日本筑波やAmericanTypeCultureCollectionATCC、Invitrogen社/ResGen等からも購入することができる。使用するカドヘリンファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、多能性幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましく、例えば、マウスES細胞を用いて本発明を実施する場合、マウスのE-カドヘリンcDNAの使用が望ましい。しかし、異種動物由来のもの、即ち、ヒトやサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、又は鳥類例えば、ニワトリ等、又は両生類例えば、アフリカツメガエル等由来のE-カドヘリンcDNAも使用することができる。カドヘリンファミリーに属するタンパク質のリコンビナントタンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、COS細胞や293細胞、CHO細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写発現が可能になる様な形で連結される。また、転写発現させる遺伝子は、さらにポリA付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、SVSimianVirus40ウイルスやサイトメガロウイルスCytomegaroVirus;CMV、ラウス肉腫ウイルスRoussarcomavirus等のウイルスに由来するプロモーターや、β-アクチンプロモーター、EFElongationFactor1αプロモーター等が挙げられる。上記のリコンビナントタンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、本発明の好適な事例に用いられるE-カドヘリンの場合、細胞外領域をコードする、N末端側から690~710アミノ酸残基を含む部分配列から作製されるリコンビナントタンパク質、すなわちEC1~EC5ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もN末端側に位置するドメインEC1が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定しているNoseetal.,Cell61:147,1990ため、少なくともEC1を含み、それ以外のドメインの1個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。さらには、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで80以上、好ましくは85以上、さらに好ましくは90以上、最も好ましくは95以上の相同性を示し、かつ、接着活性を有するタンパク質も使用することができる。また、上記のリコンビナントタンパク質は、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として作製することも可能である。例えば、イムノグロブリンのFc領域やGSTGlutathione-S-Transferaseタンパク質、MBPMannnose-BindingProteinタンパク質、アビジンタンパク質、Hisオリゴヒスチジンタグ、HAHemAgglutininタグ、Mycタグ、VSV-GVesicularStromatitisVirusGlycoproteinタグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインA/Gカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナントタンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にFc融合タンパク質は、ポリスチレン等を材料とした培養基材に吸着する能力が高まるため、本発明の実施において好適である。イムノグロブリンのFc領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4のFc領域を含む塩基配列の配列情報は、NCBI等の公的なDNAデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号:AJ294730、AJ294731、AJ294732、及びAJ294733として登録されている。したがって、当業者であれば、Fc領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Fc領域部分をコードするcDNAを取得使用することが可能である。この場合、使用するFc領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインA/Gとの結合性が強いヒトIgG1やIgG2、又はマウスIgG2aやIgG2b等のFc領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Fc領域に変異を導入することによりプロテインAとの結合性を高める方法も知られておりNagaokaetal.,ProteinEng.16:243,2003非特許文献7参照、当該法により遺伝子改変を加えたFcタンパク質も使用することもできる。なお、本発明を実施するための好適に用いられるE-カドヘリンの場合、当該リコンビナントタンパク質の作製法の一例として、発明者らの既報告論文を挙げることができるNagaokaetal.,Biotechnol.Lett.24:1857,2002非特許文献6;ProteinEng.16:243,2003非特許文献7参照。また、マウス又はヒトのE-カドヘリンの細胞外領域をコードするcDNAに、ヒトIgGのFc領域部分をコードする配列及びHisタグ配列のcDNAを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナントタンパク質RecombinantHuman/MouseE-cadherin-FcChimera;RDsystems社、GenzymeTechne社が市販されており、マウス又はヒト由来のE-カドヘリンタンパク質として使用することもできるE-cad-Fcタンパク質。糖側鎖を有するポリマーとは、好ましくはエチレン性不飽和結合を重合させて得られる主鎖と、糖側鎖とを有するポリマーである。糖側鎖としては、グルコース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられるが、ラクトースまたはガラクトースが好ましい。ラクトース中のβ-ガラクトース、β-ガラクトースが、アシアロ糖タンパク質レセプターにより特異的に認識され、細胞の結着に寄与しうるからである。糖側鎖を有するポリマーは、ポリスチレン主鎖を有するスチレン誘導体ポリマーであることが好ましく、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミド以下、PVLAとも称するが最も好ましい。細胞培養用の培養基材としては、例えば、ディッシュ培養皿とも称する、シャーレやプレート6穴、24穴、48穴、96穴、384穴、9600穴などのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、蛋白質やペプチド等に対する吸着性が高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な基材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び/又はプレート以下、無処理ポリスチレン製プレートと称するを挙げることができ、当該培養基材は一般に市販されている。本発明で開示される方法の実施において、カドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を、上記の培養基材固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。接着性分子がタンパク質性やペプチド性の分子、又は糖鎖を含む高分子化合物等である場合、プレート等の培養基材固相表面に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やPBS等を溶媒とする接着性分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、数時間から一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた細胞培養用基材が得られる。好ましくは、蒸留水やPBS等で数回洗浄し、PBS等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。また、接着性分子に前もって人為的に抗原性分子が付加融合させている場合は、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもでき、接着性分子を効率的に基材表面に修飾することができるため、より好ましい。この場合、特異抗体を前もって培養基材表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、接着性分子にIgGのFc領域タンパク質を融合させたリコンビナントタンパク質の場合、培養基材に前もって修飾しておく抗体としては、IgGのFc領域を特異的に認識するものを使用することができる。接着性分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナントタンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、培養基材に前もって修飾することにより、使用することができる。本発明の実施において、細胞培養基材の固相表面に固定又はコーティングされるカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質は少なくとも1種であるが、2種以上のカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々のタンパク質の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基き、修飾すればよい。上記のカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質溶液の濃度は、当該タンパク質の吸着量及び/又は親和性、さらには当該タンパク質の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、E-カドヘリンの細胞外領域にFc領域を融合させたリコンビナントタンパク質の場合、0.01~1000μg/mL程度までの濃度範囲とし、好ましくは、0.1~200μg/mL程度、さらに好ましくは1~50μg/mL、そして最も好ましくは5~10μg/mLである。糖側鎖を有するポリマーを、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、上記カドヘリンファミリーに属するタンパク質の場合と同様に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、糖側鎖を有するポリマーを含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間~一昼夜、より好ましくは1時間~12時間、接触させることで達成できる。また、前もって糖側鎖を有するポリマーに人為的に抗原性分子を付加融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。上記培養基材の表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質、糖側鎖を有するポリマーを固定またはコーティングする過程の一態様として、E-cad-Fcタンパク質とPVLAを用いた場合の模式図を図1Bに示す。図1Bは、E-cad-Fcタンパク質、PVLAの順でコーティングしている。この順でコーティングすると、E-cad-Fcタンパク質によるコーティングの隙間に、PVLAがコーティングされ、E-cad-Fcタンパク質が海、PVLAが島となるような海島構造を形成することと考えられる。本発明の細胞培養基材は、後述するように、種々の多能性幹細胞の未分化性を維持したままの培養や、分化誘導因子を加えて、多能性幹細胞を分化させる培養や、多能性幹細胞を分化させた細胞群から、所望の細胞を選抜、濃縮する培養方法に好適に用いることができる。[細胞培養方法]本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。本発明の実施において、分子生物学や組換えDNA技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、MolecularCloning:ALaboratoryManual第3版SambrookRussell、ColdSpringHarborLaboratoryPress、2001;CurrentProtocolsinMolecularbiologyAusubeletal.編、JohnWileySons、1987;MethodsinEnzymologyシリーズAcademicPress;PCRProtocols:MethodsinMolecularBiologyBartlettStriling編、HumanaPress、2003;AnimalCellCulture:APracticalApproach第3版Masters編、OxfordUniversityPress、2000;Antiboides:ALaboratoryManualHarlowetal.Lane編、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1987等を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社等の市販業者から入手可能である。また、多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、GuidetoTechniquesinMouseDevelopmentWassermanetal.編、AcademicPress,1993;EmbryonicStemCellDifferentiationinvitroM.V.Wiles、Meth.Enzymol.225:900,1993;ManipulatingtheMouseEmbryo:AlaboratorymanualHoganetal.編、ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994;EmbryonicStemCellsTurksen編、HumanaPress,2002が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生細胞生物学実験のための試薬及びキット類はInvitrogen/GIBCO社やSigma社等の市販業者から入手可能である。マウス及びヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献Matsuietal.,Cell70:841,1992;Thomsonetal.,米国特許第5,843,780号;Thomsonetal.,Science282:114,1998;Shamblottetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998;Shamblottetal.,米国特許第6,090,622号;Reubinoffetal.,Nat.Biotech.18:399,2000;国際公開番号第00/27995号等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。また、その他の動物種に関しても、例えばサルThomsonetal.,米国特許第5,843,780号;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,7844,1996やラットIannacconeetal.,Dev.Biol.163:288,1994;Loringetal.,国際公開番号第99/27076号、ニワトリPainetal.,Development122:2339,1996;米国特許第5,340,740号;米国特許第5,656,479号、ブタWheeleretal.,Reprod.Fertil.Dev.6:563,1994;Shimetal.,Biol.Reprod.57:1089,1997等に関してES細胞又はES細胞様細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いられるES細胞を作製することができる。ES細胞とは、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊innercellmassと呼ばれる細胞集塊をinvitro培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。マウス由来ES細胞としては、E14、D3、CCE、R1、J1、EB3等、様々なものが知られており、一部はAmericanTypeCultureCollection社やCellMolecularTechnologies社、Thromb-X社等から購入することも可能である。ヒト由来ES細胞は、現在、全世界で50種以上が樹立されており、米国国立衛生研究所NIHのリストhttp://stemcells.nih.gov/registry/index.aspには20種以上の株が登録されている。その一部はESCellInternational社やWisconsinAlumniResearchFoundationから購入することが可能である。ES細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもES細胞を作製することが可能であるMunsieetal.,Curr.Biol.10:989,2000;Wakayamaetal.,Science292:740,2001;Hwangetal.,Science303:1669,2004。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞cytoplastsやooplastoidsと称されるに、所望する動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にES細胞を作製する方法も考案されている国際公開番号第99/45100号;第01/46401号;01/96532号;米国特許公開第02/90722号;02/194637号。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからES細胞を作製する試み米国特許公開第02/168763号;VranaKetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:11911-6や、ES細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したES細胞を作る方法も報告されている国際公開番号第00/49137号;Tadaetal.,Curr.Biol.11:1553,2001。本発明で使用されるES細胞は、この様な方法により作製されたES細胞又はES細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。EG細胞は、始原生殖細胞と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ES細胞の場合と同様、MEF細胞やSTO細胞、Sl/Sl4-m220細胞等のフィーダー上で、LIF及びbFGF/FGF-2、又はフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製されたものでありMatsuietal.,Cell70:841,1992;Koshimizuetal.,Development122:1235,1996、ES細胞ときわめて類似した性質を有しているThomsonOdorico、TrendsBiotechnol.18:53,2000。ES細胞の場合と同様、EG細胞と体細胞を融合させて作製したEG細胞Tadaetal.,EMBOJ.16:6510,1997;AndrewらやEG細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも、本発明の方法に使用することができる。iPS細胞人工多能性幹細胞:inducedpluripotentstemcellとは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。上記特許文献3,4,5に記載された方法により作製することができる。また、iPS細胞は、上記特許文献記載の方法以外にも多数の変法による作製方法が知られている。国際公開WO2007/069666号公報には、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子及びMycファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。この他に、上記初期化因子の一つないし複数を使用せずに、他の因子を用いたり、初期化因子に変えて、または、加えて、別の物質や遺伝子を使用する方法が知られているが、iPS細胞の定義に入るものであればいずれの方法により作製されたものであっても使用することができる。本発明で用いるiPS細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。体細胞は、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。また、多能性幹細胞は、ES細胞やEG細胞、iPS細胞のみに限らず、哺乳動物の胚や胎児、臍帯血、又は成体臓器や骨髄等の成体組織、血液等に由来する、ES/EG細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞が含まれる。例えば生殖細胞を特殊な培養条件下で培養することにより得られるES様細胞は、ES/EG細胞ときわめて良く似た形質を呈しておりKanatsu-Shinoharaetal.,Cell119:1001,2004、多能性幹細胞として使用することができる。その他の例としては、骨髄細胞から単離され、三胚葉すべての系譜の細胞に分化能を有する多能性成体幹細胞multipotentadultprogenitor/stemcells:MAPCを挙げることができる。また、毛根鞘細胞やケラチノサイト国際公開番号第02/51980号、腸管上皮細胞国際公開番号第02/57430号、内耳細胞Lietal.,NatureMed.9:1293,2003等を特別な培養条件下で培養することにより得られた多能性幹細胞や、血液中の単核球細胞又はその細胞核分に含まれる幹細胞をM-CSFMacrophage-ColonyStimulatingFactor;マクロファージコロニー刺激因子PMAphorbol12-myristate13-acetate処理Zhaoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:2426,2003、又はCR3/43抗体処理Abuljadayel、Curr.Med.Res.Opinion19:355,2003することにより作製される多能性幹細胞等に関しても、ES/EG細胞と類似の形質を有する幹細胞であればすべて含まれる。この場合、ES/EG細胞と類似の形質とは、当該細胞に特異的な表面抗原マーカーの存在や当該細胞特異的な遺伝子の発現、さらにはテラトーマ形成能やキメラマウス形成能といった、ES/EG細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。本発明の実施において、多能性幹細胞は、上記本発明の細胞培養基材に播種される。多能性幹細胞の培養方法や培養条件は、当該培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件は、上記の参考書籍、すなわち、GuidetoTechniquesinMouseDevelopmentWassermanetal.編、AcademicPress,1993;EmbryonicStemCellDifferentiationinvitroM.V.Wiles、Meth.Enzymol.225:900,1993;ManipulatingtheMouseEmbryo:AlaboratorymanualHoganetal.編、ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994;EmbryonicStemCellsTurksen編、HumanaPress,2002や、参考文献Matsuietal.,Cell70:841,1992;Thomsonら、米国特許第5,843,780号;Thomsonetal.,Science282:114,1998;Shamblottetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998;Shamblottetal.米国特許第6,090,622号;Reubinoffetal.,Nat.Biotech.18:399,2000;国際公開番号第00/27995号等を参照することができるが、特にこれらに限定されない。多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば、すべて使用可能である。その具体例としては、Dulbecco’sModifiedEagle’sMediumDMEM、GlasgowMinimumEssentialMediumGMEM、RPMI1640培地等が挙げられ、通常、2mM程度のグルタミン及び/又は100μM程度の2-メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ES細胞培養用培地として市販されているKnockOutDMEMInvitrogen社や、EScell-qualifiedDMEMCellMolecularTechnologies社、TX-WESThromb-X社等も用いることができる。これらの培地にはFBSを5~25程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、15~20のKnockOutSerumReplacementInvitrogen社を代用することができる。また、MEF細胞の培養上清やbFGF/FGF-2、SCF等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知であるXuetal.,NatureBiotech.19:971,2001;国際公開番号第01/51616号;国際公開番号第03/020920号;Amitetal.,Biol.Reprod.,70:837,2004。上記の多能性幹細胞を培養するための液体培地には、多能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有する物質因子を添加することが望ましい。具体的な物質因子としては、特にこれを限定しないが、マウスES/EG細胞の場合、LIFが好適である。LIFは既報告論文SmithHooper、Dev.Biol.121:1,1987;Smithetal.,Nature336:688,1988;Rathjenetal.,GenesDev.4:2308,1990や、NCBIの公的なDNAデータベースにアクセス番号X13967ヒトLIF、X06381マウスLIF、NM_022196ラットLIF等で公知のタンパク質性因子であり、そのリコンビナントタンパク質は、例えばESGROChemicon社の商品名で購入することができる。また、GSK-3阻害剤を培養液に添加することにより、特に他の成長因子生理活性因子等の添加をしなくても、マウス及びヒトES細胞の未分化性を効率的に維持することができるSatoetal.,NatureMed.10:55,2004。この場合、GSK-3の活性を阻害できる作用を有した物質であれば、すべて使用可能であり、例えばWntファミリー分子ManoukianWoodgett、Adv.CancerRes.84:203,2002;DobleWoodgett、J.CellSci.116:1175,2003等を挙げることができる。本発明の実施において、従来の方法に基づき継代維持した多能性幹細胞を、上記の方法により作製された培養基材に播種し、かつ、上記の培養条件方法に基いて培養することにより、当該細胞を分散した状態で、しかも当該細胞が本来有する未分化な状態を保持したまま継代培養することが可能である。この様な状態で培養した多能性幹細胞は、細胞分裂の際に物理的な抑制がかからないため、及び/又は細胞間接触に起因する細胞増殖抑制機構が作用しないため、及び/又は細胞の生存性が高まり、死細胞数が減少するため、細胞の著しい増加や増殖が認められる。一つの事例として、本発明の方法によりマウスES細胞を培養した場合、従来の方法で培養した場合と比較して、少なくとも1.25倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上の増殖能を呈することが可能である。また、当該条件で4代ほど継代すると、従来法と比べて少なくとも3倍、好ましくは10倍以上の細胞を回収することが可能である。増殖能は、単位時間における細胞数の増加率や倍化速度等の指標で表すことができ、その計測算出方法としては、一般の細胞を用いた実験で使用され、公知となっている方法であれば、いずれも用いることができる。上述のように、多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核染色体型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。また、好ましくは、多能性幹細胞のその他の特性、例えば、テロメアーゼ活性の維持やテラトーマ形成能、又はキメラ形成能等の性質のうち、少なくとも1つを有していることが望ましい。これらの性質特性を調べる方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、上記の参考書籍、即ち、GuidetoTechniquesinMouseDevelopmentWassermanら編、AcademicPress,1993;EmbryonicStemCellDifferentiationinvitroM.V.Wiles、Meth.Enzymol.225:900,1993;ManipulatingtheMouseEmbryo:AlaboratorymanualHoganetal.編、ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994;EmbryonicStemCellsTurksen編、HumanaPress,2002等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれらに記載の方法には限定されない。また、未分化状態の多能性幹細胞は、以下に記載する少なくとも1つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも1つ、好ましくは複数のマーカー分子の存在が確認できる細胞と定義することもできる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、未分化状態の多能性幹細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカーとしては、例えばALP活性や、Oct-3/4またはRex-1/Zfp42等の遺伝子産物の発現が利用できる。また、各種抗原分子も用いることができ、マウスES細胞ではSSEA-1、ヒトES細胞ではSSEA-3やSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM-2等が未分化マーカーとして挙げられる。これらの未分化マーカーの発現は、ES細胞が分化することにより低減、消失する。あるいは、未分化状態の多能性幹細胞マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRやハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカータンパク質をコードするmRNAを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカータンパク質例えば、Oct-3/4やRex-1/Zfp42、Nanog等をコードする遺伝子の核酸配列は既知であり、NCBIの公共データベース等において利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。[分化誘導方法]本発明の多能性幹細胞の分化誘導方法は、上記本発明の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする。多能性幹細胞の分化誘導のための培養方法や培養条件は、上記本発明の細胞培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の分化誘導培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。また、液体培地については上記したものと同様のものを使用することができる。分化誘導因子GrowthFactorとも称されるは、多能性幹細胞の分化を誘導する為に、培地に添加されるペプチド、ホルモン、サイトカイン、タンパク質、糖タンパク質などの化合物であり、分化させたい細胞のタイプや、分化のステージに応じて様々な種類の分化誘導因子が用いられる。本発明においては、既知の方法やプロトコルに従い、目的の細胞に応じて公知の分化誘導因子を液体培地に添加することができる。例えば、肝細胞への分化を例にとると、肝細胞は、ES細胞をMesendoderm内胚葉系中胚葉系細胞、DefinitiveEndoderm内胚葉系細胞、HepaticProgenitorCells肝前駆細胞、Hepatocytes肝細胞という順で分化させて得ることができる。肝細胞への分化には、ActivinA、Nodal、bFGFbasicfibroblastgrowthfactor、塩基性繊維芽細胞増殖因子、HGFhepatocytegrowthfactor、肝細胞増殖因子、OSMOncostatinM、DEXdexamthasone、EGFepidermalgrowthfactor、TGF-αtransforminggrowthfactor-αtransforminggrowthfactor-αといった分化誘導因子が用いられるが、公知の文献等記載の技術に従い、これら以外の因子を用いてもよい。肝細胞以外の細胞についても、それぞれの細胞への分化に必要な分化誘導因子を用いることにより、分化を誘導することができる。[他の細胞培養方法]本発明の他の細胞培養方法は、上記の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とするものである。前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリp-N-ビニルベンジル-D-ラクトンアミドであることが好ましい。特定の細胞培養基材を用いること以外の培養方法については上記と同様に、公知の細胞培養方法によることができる。本発明の細胞培養基材を用いて多能性幹細胞を肝細胞に分化させると、高い純度で肝細胞が得られる。分化誘導後、細胞培養基材から、肝細胞を引き剥がし、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することにより、肝細胞の純度をさらに高めることができる。これは、肝細胞の細胞表面に発現するASGPRアシアロ糖タンパク質レセプターが、ガラクトース側鎖を認識するため、肝細胞のみがガラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に接着するためである。カドヘリンファミリーに属するタンパク質による細胞接着と、ガラクトース側鎖を含むポリマーによる細胞接着は、ともにCa2依存性であるため、分化誘導後、細胞培養基材から、肝細胞を引き剥がす方法として、キレート剤を用いることが好ましい。キレート剤は公知のものをいずれも使用することができ、細胞に悪影響を与えないものが好ましい。多能性幹細胞への遺伝子導入法としての利用本発明の別の態様として、本発明記載の方法は、所望する外来遺伝子を、多能性幹細胞の細胞内に効率的に導入する方法として使用することができる。導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、例えば増殖因子や受容体、酵素、転写因子等の天然の蛋白質や、例えば、遺伝子工学的手法を用いて改変、作製した、人工的な蛋白質である。また、導入遺伝子としては、リボザイムやsiRNA等の機能的RNAでも良い。更には、外来遺伝子として、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子、例えば、GFPGreenFluorescentProteinやβ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子も利用可能である。好適な実施態様の1つとして、導入する外来遺伝子は、遺伝子の転写及び発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写発現が可能になる様な形で連結される。又、この場合、当該遺伝子は、更にポリA付加シグナルと連結されることが望ましい。多能性幹細胞において外来遺伝子の転写および発現を可能にするプロモーターとしては、SV40ウイルスやCMV、ラウス肉腫ウイルス等のウイルスに由来するプロモーターや、β-アクチンプロモーター、EF1αプロモーター等が挙げられる。また、目的の如何によっては、ある種の細胞/組織又はある分化段階の細胞で特異的に遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆる細胞/組織特異的プロモーター配列や分化段階特異的プロモーター、或いはRNAの発現に適したPol.IIIプロモーター等も使用できる。これらプロモーターの塩基配列は、NCBI等の公共のDNAデータベースにおいて利用可能であり、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、所望の遺伝子配列を利用した遺伝子ベクターを作製することが可能である。また、これらのプロモーターを利用可能なベクターが、Invitrogen社や、Promega社、Ambion社等から購入可能である。上記の遺伝子ベクターの導入のための方法としては、特にこれを制限せず、例えばリン酸カルシウムやDEAE-デキストランを用いたトランスフェクション法を挙げることができる。また、遺伝子導入対象の細胞が細胞内に取りこむことが可能であり、かつ、細胞毒性の低い脂質製剤、例えばLipofectoamineInvitrogen社やSuperfectQiagen社、DOTMARoche社等を用いて、目的とする遺伝子とリポソーム-核酸複合体を形成させた上でトランスフェクションする方法も好適である。更には、レトロウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターに目的の遺伝子を組み込み、その組み換えウイルスを細胞に感染させる方法等も使用可能である。この場合、ウイルスベクターとは、ウイルスDNAまたはRNAの全長若しくは一部を欠損変異させた核酸配列に、目的とする遺伝子を組み込み、発現することができる様にした構築物である。本発明の方法により増殖させた多能性幹細胞の利用本発明に係る培養方法増殖方法により増殖させた多能性幹細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収法を用いることにより、未分化な状態を維持した多能性幹細胞を、効率的かつ多量に得ることができる。また、本発明に係る遺伝子導入法により、所望する遺伝子を導入発現させた多能性幹細胞を効率的かる多量に得ることができる。この様にして得られた多能性幹細胞を、以下、本発明により調製された多能性幹細胞と呼ぶ。多能性幹細胞の回収法としては、多能性幹細胞の一般的な継代培養法において用いられる、公知の酵素消化による方法が挙げられる。その具体例としては、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、PBSを用いて数回、好ましくは2~3回洗浄し、適当なタンパク質分解酵素を含む溶液例えば、トリプシンやディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を含む溶液を加え、37°Cで適当時間、好ましくは1~20分間、より好ましくは3~10分間程度培養した後、上記のES細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、酵素を用いない方法も使用することができ、例えば、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、PBSを用いて数回、好ましくは2~3回洗浄した後、エチレンジアミン四酢酸EDTA溶液を終濃度0.01~100mM、好ましくは0.1~50mM、より好ましくは1~10mMになる様に添加し、37°Cで適当時間、好ましくは1~60分間、好ましくは10~30分間程度処理して細胞を剥離させ、更にES細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、EDTAの代わりにエチレングリコールビス2-アミノエチルエーテル四酢酸EGTA溶液を、同様の方法で用いることもできる。また、本発明は、本発明により調製された多能性幹細胞から適当な分化誘導処理により作製した分化細胞をも提供する。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。外胚葉由来の細胞とは、神経組織、松果体、副腎髄質、色素体および表皮組織といった組織器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。中胚葉由来の細胞とは、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、心臓組織、血管組織、血液組織、真皮組織、泌尿器および生殖器といった組織器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。内胚葉由来の細胞とは、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および膵臓といった組織器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。本発明により調製された多能性幹細胞、及び/又は当該細胞から作製した分化細胞は、各種生理活性物質例えば、薬物や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価や活性評価に有用である。例えば、多能性幹細胞や種々の分化細胞の機能調節に関する物質や薬剤、及び/又は多能性幹細胞や種々の分化細胞に対して毒性や障害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ヒト細胞を用いたスクリーニング法はほとんど確立しておらず、本発明により調製された多能性幹細胞に由来する各種分化細胞は、当該スクリーニング法を実施するための有用な細胞ソースとなる。さらに、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞を用いてキメラ胚またはキメラ動物を作製する方法、及び作製したキメラ胚またはキメラ動物をも提供する。キメラ胚またはキメラ動物を作製する方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、ManipulatingtheMouseEmbryo:AlaboratorymanualHoganetal.編、ColdSpringHarborLaboratoryPress,1994等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれを限定しない。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。本発明の実施例において行った実験方法は以下の通りである。<PVLAの合成>PVLA図1AをKobayashiA,KobayashiK,AkaikeT.J.Biomater.Sci.Polym.Ed.1992;3:499-508記載の方法に準拠して合成した。p-vinylbenzylamineをガブリエル合成により合成し、オリゴサッカライドを酸化してグルコアミドを得た。N-p-vinylbenzyl-O-β-D-galactopyranosyl-1→4-D-glucoamideVLAを水に溶解し、窒素雰囲気下で、2時間、60°Cで、開始剤として1K2S2O8w/vを用いて重合した。沈殿したポリマーを抽出し、フリーズドライを行って、ポリマー粉末を得た。<E-cad-Fcの合成>E-cad-Fc融合タンパク質の発現と精製を、NagaokaM,AkaikeT.,ProteinEng.2003;16:243-245.に準拠して行った。本実施例において、マウスのE-カドヘリン全長理研BRCDNAバンク、コード1184から得た細胞外ドメインcDNAと、変異導入IgG1-FcドメインcDNAT252M/T254Sをライゲーションし、E-cad-Fc融合タンパク質を発現させた。<水晶発振子マイクロバランス測定法QCM>AFFINIXQ4装置InitiumCo.Ltd製を温度調節装置に設置した。QCMセルの電極を純水、クロロホルムで洗浄し、硫酸/過酸化水素体積比3/1で処理し、その後、2SDS溶液ナカライテスクで処理した。高速回転法によりポリスチレンの薄膜フィルムで電極をコーティングした。QCM装置にセルをセットし、2時間安定化させた後、サンプル溶液500μlを加えた。表面は少なくとも30分間安定化し、PBSで3回リンスして、不安定な吸着物を除去した。吸着曲線を作成するために、PVLA溶液の濃度を、2、4、6、8、10、50、100および200μg/mLと変え、E-cad-Fc溶液の濃度を1、2、4、6、8、10、15μg/mLと変えた。単分子層の形成に必要な濃度を確かめた後、PVLAとE-cad-Fcの共被覆co-coatingをテストした。E-cad-Fc溶液7.5μg/mLをQCMセルに加え、安定化と3回の洗浄処理を施した後、PVLA溶液100μg/mLを加えて、同様に安定化、洗浄処理を行った。単位面積当たりの質量変化を、Sauerbrey方程式により計算した。即ち、1cm2の領域において、1Hzの振動数の変化が0.606ng/cm2の質量変化に値する。濃度依存的な吸着は、データの2重逆数をLineweaber-Burk方程式を用いた直線回帰を行った後、Langmuir方程式を用いて記述した。<PVLAコートされた培養皿の作製>Millipore製の0.22μmフィルターを用いた滅菌の後、1.5mLのPVLA水溶液100μg/mLを未処理のポリスチレン培養皿35mm、Iwaki製に加え、37°Cで2時間インキュベートした。その後、上記培養皿をリン酸塩バッファーPBSで洗浄し、1BSAで1時間ブロッキングした。その後、PVLAコートされた培養皿をPBSでリンスした。上記と同様の方法により、ゼラチンコートしたポリスチレン培養皿をゼラチン水溶液1mg/mLを用いて作製した。また、コラーゲンコートした培養皿をコラーゲン水溶液タイプI、0.1mg/mL,pH3.0を用いて作製した。<E-cad-FcとPVLAを共固定化した培養皿の作製>図1Bに記載の共固定化基層を作製する為に、精製したE-cad-Fc溶液7.5μg/mLを未処理のポリスチレン培養皿に加えた。37°C、2時間のインキュベーションの後、培養皿をPBSで洗浄し、PVLA溶液100μg/mLで処理し、37°Cで2時間インキュベーションした。共固定化培養皿を1BSAでブロッキングし、PBSで洗浄し、用いた。<肝細胞の単離と培養>SeglenPO.,Exp.CellRes.1973;82:391-398、および、IseH,SugiharaN,NegishiN,NikaidoT,AkaikeT.,Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2001;285:172-182記載の方法に準拠して、2段階insituコラゲナーゼ灌流法により、初代培養肝細胞を、雄のICRマウス6~8週、SLCの肝組織から単離した。マウスをペントバルビタールにより麻酔し、門脈にカニューレ挿入し、肝臓を、EGTAを含有するCa2フリープレ灌流溶液pH7.4で灌流し、その後、トリプシンインヒビター0.05mg/mL、Wako製とコラゲナーゼ0.15mg/mL、Wako製を含有するコラゲナーゼ溶液pH7.4で灌流した。灌流した組織は、Hank溶液で分離し、100μmナイロンセルストレイナーBDFalcon製で集めた。肝細胞は、10パーコール溶液GEHealthcareBioscienceを用いた密度勾配遠心分離50xg、10分間、4°Cにより精製した。トリパンブルー法を用いて細胞の生存を確認した。生存初代培養肝細胞を、50ng/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシンナカライテスク製を含有するWilliamsE培地Invitrogenに懸濁し、3×104細胞/cm2の密度でゼラチン、コラーゲン、E-cad-Fc、PVLA、共固定化培養皿上に播種した。培地は、4時間後に除き、結着しなかった細胞や死細胞を除去した。<未分化ES細胞の維持>フィーダーフリーのマウスES細胞系統EB3を、10FBS、2mML-グルタミン、1非必須アミノ酸NEAA、ナカライテスク製、1mMピルビン酸塩、0.1mMβ-メルカプトエタノール、1000units/mLLIF組み換え白血病抑制因子、Chemicon製、抗生物質50ng/mLペニシリンおよび50μg/mLストレプトマイシンを添加したGrasgow最小培地GMEM、Sigma-Aldrich製を含む、ゼラチンコートされた培養皿において維持した。mES細胞は、AccutaseMillipore製により分離し、毎日培地を交換しながら、3日ごとに継代し、少なくとも3回継代培養した9日間。<mES細胞の肝細胞への分化>分化のプロセスは、図1Cに記載の通りで、4つのステップに分けて行った。内胚葉系中胚葉への分化、胚体内胚葉への分化、肝前駆細胞への分化、肝細胞への分化である。従って、分化誘導用培地は3種類用いた。10ノックアウト血清代替物KSR、Invitrogen製、1FBS、2mML-グルタミン、1NEAA、1mMピルビン酸塩、0.1mMβ-メルカプトエタノールおよび抗生物質を含有するGMEMを基本培地とした。まず、上記基本培地に10ng/mLのアクチビンARDsystem製を加えたものを培地Aとし、内胚葉系中胚葉分化に用いた。ゼラチン上で維持されていた未分化ES細胞0日後を、Accutaseにより分離し、5000細胞/mLの濃度35mm培養皿全体では、10000細胞となるように、培地Aを加えた共固定化培養皿に播き、3日間培養した。その後、内胚葉への分化の為に、基本培地に、アクチビンA10ng/mLとbFGF50ng/mL、Promega製を加えたものを培地Bとし、用いた。上記で分化させた細胞3日後をさらに、培地B中で2日間培養した。自発的な分化が起きるようなコントロールとして、上記と並行して基本培地で5日間培養した5日間。HGF10ng/mL、Sigma製、オンコスタチンM10ng/mL、OSM、Sigma製および、デキサメタゾン1mM、DEX、Sigma製を基本培地に加えて、培地Cとし、肝細胞への分化に用いた。6日目に、細胞をエンザイムフリーの細胞分離バッファーCDB、Gibco製を用いて分離し、培地Cを含むE-cad-FcとPVLAの共固定化培養皿に、5000細胞/mLの密度で播いた。14日後、分化した細胞をCDBを用いて分離し、培地Cを含むE-cad-FcとPVLAの共固定化培養皿に、5000細胞/mLの密度で播いた。E-cad-Fc単独コートされた培養皿についても、mES細胞を上記と同様に培養した。ゼラチンコートされた培養皿については、未分化ES細胞をゼラチンコートされた培養皿で2日間維持した後、同様に培養し、安定なコロニーを形成させた。分化誘導開始後18日、20日、22日、24日後において、分化した細胞をCDBにより分離し、培地Cを含む35mmPVLAコートされた培養皿に、10000細胞/mLの密度培養皿全体では20000細胞で播いた。PVLAに結着した細胞の割合を、ASGPRポジティブ細胞の数と、再播種の最適なタイミングの評価に用いた。<結着アッセイ>96ウェルプレート上で、細胞を4時間培養した後、培地と結着しなかった細胞を除いた。結着した細胞は、PBSにより3回洗浄し、Midlform20N4ホルムアルデヒド、pH7.4、和光純薬製により15分間固定した。その後、0.1クリスタルバイオレットで10分間染色した。最後に、リンスの後、2SDSを加えて30分間インキュベートし、570nmの波長に対する吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。<半定量的RT-PCR>TRIzolエージェントInvitrogen製により細胞破砕液からRNAを抽出し、蒸留水に懸濁し、dNTPとオリゴ-dTプライマー、Moloneyマウス白血病ウィルス逆転写酵素Invitrogen製を用いてcDNAに逆転写した。PCRは、dNTPミックスTakara製、TopTaqポリメラーゼQiagen製、MgCl2を含むPCRバッファーを用いて行った。PCR産物は、2アガロースゲル電気泳動にかけ、MolecularDynamicsTyphoon8600imagerによりスキャンした。ハウスキーピング遺伝子マーカーと比較したバンド強度を、ImageQuantソフトウェアを用いて計算したver5.2、MolecularDynamics製。<免疫蛍光アッセイ>細胞をMildform20N8ホルムアルデヒド、pH7.4で20分間固定し、PBSで洗浄した。固定した細胞を、0.2TritonX-100により5分間処理し、PBSで洗浄した。Image-iTsignalenhancerInvitrogen製の存在下で30分間インキュベーションし、BlockingOneソリューションナカライテスク製を用いて1時間ブロッキングした。その後、細胞を室温下で2時間、一次抗体でインキュベートし、PBSで慎重に洗浄した後に、2次抗体で、2時間室温下でインキュベートした。その後、細胞をDAPIで核染色した。染色した細胞をPBSに懸濁し、倒立型蛍光顕微鏡オリンパス製により観察した。Oct3/4、Sox17、AFP、ALBをそれぞれ発現する細胞の数を算定するために、3つの独立の培養皿中の、異なる5箇所から採取した50~100細胞を観察した。<ウェスタンブロット>細胞のタンパク質を、1PMSF、1プロテアーゼインヒビターカクテルを含むlysisバッファー20mMTris-HCl,、pH8.0、150mMNaCl、1NP-40、1TritonX-100により抽出した。細胞破砕液を15000xg、4°Cで15分間遠心分離し、タンパク質サンプル溶液を得た。サンプルバッファーで処理したタンパク質をSDS-PAGEにかけ7.5、10アクリルアミドゲル、PVDFメンブレンImmobilon-P、Millipore製にトランスファーした。PVDFメンブレンを、マウスの抗β-アクチン抗体と、ゴートの抗マウスアルブミン抗体Abcamで2時間室温下においてインキュベートした。その後、HRP結合2次抗体1/10000希釈、JacksonImmunoResearchLaboratoriesで2時間、室温でインキュベートした。HRP活性をImmobilonWestern検出エージェントMillipore製により検出した。<アルブミンELISAアッセイ>培地中に分泌されたアルブミンを、マウスアルブミンELISAキットShibayaki製を用いて検出した。培地を、24時間ごとに回収し、8000xg、5分間遠心し、希釈してサンプル溶液とした。その後、抗アルブミン抗体処理したマイクロプレートを250μlの洗浄バッファーでリンスしたものに、50μlのサンプル溶液10倍希釈もしくはスタンダードソリューションで、1時間インキュベートした。マイクロプレートをリンスし、HRP結合抗体溶液で室温下1時間インキュベートした。洗浄バッファーでリンスした後、発色基質溶液3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、TMBで20分間処理し、50μlの1M硫酸で処理した。450nmの波長に対する吸光度を、マイクロプレートリーダーにより測定した。標準曲線を作成してアルブミン濃度を計算し、細胞数で標準化した。<グリコーゲン蓄積PAS反応>初代培養肝細胞と、分化した細胞をそれぞれMildform20N8ホルムアルデヒド、pH7.4で10分間固定した。PBSで2回洗浄し、細胞を1過ヨウ素酸和光純薬製で5分間酸化し、再び洗浄した。細胞をSchiff反応液和光純薬製で10分間処理し、PBSで洗浄した。2SDS溶液で30分間処理した後、550nmの波長に対する吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、細胞数で標準化した。未分化ES細胞をコントロールとして用いた。<尿素アッセイ>培地中における尿素レベルをUreaassayキットBioassaySystems製を用いて測定した。培地を毎日回収し、8000xg、5分間遠心し、上清をサンプルとして用いた。水ブランク、希釈スタンダードソリューション2mg/dL、およびサンプル液を96穴プレートに導入した。200μLの反応試薬溶液を加え、室温で50分間インキュベートした。492nmにおけるODopticaldensityを測定した。最後に、105細胞ごとの単位量を標準曲線を用いて算出し、細胞数で標準化した。結果<PVLAとE-cad-Fcの共吸着>まず、ポリスチレン表面に対する、PVLAとE-cad-Fcの結合能をQCMを用いて調べた。サンプル溶液の添加により、水晶の振動波長は斬減し、ある時点以降安定化した。振動数周波数の変化は、飽和点に達するまでは、コーティング濃度の増加にともなって減少した。細胞外マトリックス分子による表面の完全飽和は、ポリスチレン表面上における単分子層吸着とみることができる。QCMの結果から、PVLAの単分子層濃度が100μg/mLであることが分かった。また、E-cad-Fcの単分子層濃度が、ELISAアッセイにより明らかにされた数値と同様の、10μg/mLであることが分かった。その後、吸着分の質量変化を、Sauerbrey方程式により計算し、直線回帰によりノーマライズした。GFI値GoodnessofFit、適合度指標は、決定係数coefficientofdetermination,R2値として記載されている。統計値の回帰直線は、実測値によく近似した。一方、最大吸着量ΔmmaxとLangmuirの吸着式における定数Kαも得た。吸着等温線の理論によれば、E-cad-Fcタンパク質の吸着エネルギーは、PVLAよりも大きい。即ち、E-cad-Fcの方が、PVLAよりも早く吸着する。PVLAとE-cad-Fcの吸着曲線を、Langmuirの吸着式により示す図2A、B。加えて、固定化基層を形成する為のPVLAとE-cad-Fcの共吸着についてもQCMにより評価した図2C。まず、単分子層濃度10μg/mLよりも低い7.5μg/mLのE-cad-Fc溶液をQCMのセルに導入した。安定化とリンスの後、PVLA溶液100μg/mlを加えたところ、吸着値が上昇した。結果、PVLAはE-cad-Fcの固定後に残ったスペースを占めることが明らかになり、ポリスチレンに対する吸着能は、PVLAよりもE-cad-Fcの方が高いという推論が裏付けられた。<初代培養肝細胞の機能および吸着への、PVLAとE-cad-Fc共固定化基層の影響>E-カドヘリンは、PVLAに結合した肝細胞のスフェロイド形成に重要な機能を果たす。凝集塊中の細胞は、単細胞層のカルチャー中の細胞よりも、生存期間が長く、分化機能発現能も高い。これらの現象を考慮し、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層への、初代培養肝細胞の結合および機能を調べた。様々なマトリックス上での初代培養肝細胞の形態とアルブミン発現を、蛍光染色により調べた図3A。初代培養肝細胞は、ゼラチン、コラーゲン、E-cad-Fc単独、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層、のそれぞれの表面上で、単一細胞層を形成した。一方、PVLA単独をコーティングしたディッシュの上では、いくつかに分かれて球状spheroidの構造を形成した。全てのマトリックスにおいて、細胞の殆どが高いアルブミン発現レベルを示した。培養3日後、PVLA上の肝細胞は、安定な多層の球状構造を形成した。PVLAとE-cad-Fc共固定化基層上の細胞は、単一細胞層の凝集塊となるように集合しだし、ゼラチン、コラーゲン、E-cad-Fc上の細胞は特に形態に変化は見られなかった。凝集塊中の細胞のアルブミン発現は高いレベルで維持されていた。一方、ゼラチン、コラーゲン、E-cad-Fc上の細胞では、アルブミンの発現が著しく下がった。既存の培養システム上では、細胞は広がって存在していたのに対し、PVLAとE-cad-Fc共固定化基層上の凝集塊中の細胞は、アルブミン発現レベルが長期間に渡って高く維持されていた図3A、B。これは、肝細胞の凝集塊の形成及び機能維持において、PVLAが基層として重要な役割を果たすことを示唆している。それぞれのマトリックス上の細胞を用いて、アルブミンALB、肝細胞核因子4αHNF-4α、アシアログリコプロテイン受容体ASGPR、マウストリプトファンオキシゲナーゼmTO、グルコース6-ホスファターゼG6PについてRT-PCRを行った。その結果、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層、PVLA単独コーティング上の細胞は、ゼラチン、E-cad-Fc単独固定化表面上の細胞よりも、肝細胞特異的な遺伝子の発現レベルが高かった図3C。さらに、それぞれのマトリックス上で培養した肝細胞の機能を評価するために、肝細胞特異的に生成されるアルブミンの産生量をモニターした。初代培養肝細胞を、ゼラチン、E-cad-Fc単独、PVLA単独、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層のそれぞれにおいて、10FBS存在下で、1週間培養した。図3Dに示すように、PVLA単独、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層とは対照的に、ゼラチン、E-cad-Fc単独のマトリックス上の肝細胞によるアルブミン産生量は、速やかに減少し、脱分化が示唆された。また、新たに培養された肝細胞においては、貯蔵されたグリコーゲンの量は、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層と、ゼラチンやE-cad-Fc単独マトリックスとではほぼ同様のレベルであったが、共固定化基層では長時間の培養を通じて高いレベルに保たれていたのに対し、ゼラチンやE-cad-Fc単独マトリックスでは長時間の培養を通じて明らかに減少した。これにより、肝細胞の機能維持において、PVLAが重要な役割を果たすことが示唆された。PVLAが肝細胞機能維持に寄与し、E-カドヘリンが初代培養肝細胞およびES細胞の結着と分化を促進するという知見を考慮し、invitroでの、活性の高い肝細胞を高い純度で集めるために、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層マトリックスを用いることにした。<共固定化基層上における未分化のマウスES細胞>融合タンパク質であるE-cad-Fcは、ES細胞を分散状態および分化全能性を維持するための、フィーダー細胞フリーの細胞外マトリックスとして開発された。本実施例において、PVLAとE-cad-Fcの共固定化基層マトリックスシステムの使用適合性を確認する為に、上記共固定化基層マトリックス上での、マウスES細胞mES細胞の挙動を調べた。まず初めに、2日間培養後の、未分化mES細胞EB3の形態から、E-cad-Fcマトリックスと同様に、共固定化基層マトリックスにおいても、単一細胞レベルでの分散状態を維持できることがわかった図4A。一方、PVLA単独コーティングマトリックスには未分化mES細胞は結着しなかった。その後、種々のマトリックス上における未分化mES細胞の増殖を評価し、それぞれのマトリックス上での結着細胞数により標準化した図4B。その結果、共固定化基層マトリックスは、ゼラチンマトリックスよりも細胞増殖能が高く、E-cad-Fc単独マトリックスよりも低かった。これは、PVLAの存在が一部の細胞の増殖にわずかに影響を与えたことを示唆している。未分化マーカーOct3/4を用いて転写を調べることにより、それぞれのマトリックス上でのmES細胞が未分化であることを確認した図5A。共固定化基層マトリックス上でのES細胞は、E-cad-Fc単独マトリックス上におけるものと同様のレベルの未分化マーカーを発現した。<mES細胞の肝細胞への分化>ES細胞由来の肝細胞を得る為に、mES細胞EB3を、共固定化基層マトリックス上に播種し、均一な細胞群を形成させた。共固定化基層マトリックス上に分散させた細胞を、アクチビンAおよびbFGF存在下で培養し、内胚葉細胞に分化させた。その後さらに、HGF、オンコスタチンMおよびデキサメタゾンを含む低血清培地で培養した。E-カドヘリンとゼラチンマトリックスを用いた分化誘導は常に並行しておこなった。経時的に採取した細胞を用いてRT-PCRを行い、細胞の均一性と肝細胞様の形質への分化の程度を調べた。RT-PCRは、内胚葉特異的な遺伝子Gata6およびSox17、肝前駆細胞特異的な遺伝子AFP、アルブミン、サイトケラチン18およびHNF4α、肝細胞特異的な遺伝子ASGPR、アルブミン、トリプトファンオキシゲナーゼ、および、未分化mES細胞マーカーOct3/4、中胚葉マーカーbrachyury、外胚葉マーカーPax6、チロシンヒドロキシラーゼについて行った。図5AおよびB示すように、内胚葉特異的な遺伝子発現は、早い段階で増加するとともに、Oct3/4の発現量は緩やかに減少した。結果、E-カドヘリン単独マトリックス、および、共固定化基層マトリックスを用いた場合に、効率的で、均一性を保った分化が見られた。一方、ゼラチンコーティングマトリックス上の細胞は、Sox17の発現量が少量であった。ゼラチンコーティングマトリックス上の細胞は、外胚葉マーカーも発現していた。共固定化基層マトリックス上の細胞は、外胚葉マーカーの発現は見られなかった。この結果より、内胚葉への分化におけるE-カドヘリンの重要な役割が示唆された。内胚葉形質の細胞へ分化した細胞の割合を調べる為、Sox17、E-カドヘリンおよびOct3/4の免疫染色を行った。共固定化基層マトリックス上の細胞は、分散状態を保ち、多くがSox17とE-カドヘリンを発現していた。分化誘導後5日以内に、分化したES細胞は核が肥大し、共固定化基層マトリックス上の細胞のうち95.3±3.7がSox17を発現した一方、Oct3/4を発現していたものは41.4±15.8に過ぎなかった図5C、D。対照的に、ゼラチン上の細胞は、8.6±5.9がSox17を発現し、85.3±9.6がOct3/4を発現した。E-カドヘリンの安定した発現により、E-カドヘリンマトリックスが、内胚葉分化へ適していることが示唆される。これらの結果は、E-cad-Fcの利点を維持している共固定化基層マトリックスが、内胚葉分化において、好適な基層であることを示唆している。さらに、肝前駆細胞や肝細胞への分化におけるPVLAの存在の影響についても調べた。肝細胞分化早期および中期の特異的分化マーカーを決定する為に、AFP、ALB、サイトケラチン18、HNF4αおよびE-カドヘリンの発現をRT-PCRにより調べた図6A。AFPを除いた肝細胞特異的遺伝子は全て、分化誘導時間経過に伴って漸増した。AFPは発現レベルの最大値が分化誘導10日後に記録された図6B。ALB、サイトケラチン18、HNF4αの発現量についても、4日ごとに半定量的に調べた図6C、D、E。共固定化基層マトリックス上の細胞において、誘導開始8日後からアルブミンの発現が見られ、サイトケラチン18は、4日後から発現が見られた。その後、分化した細胞は、12日後からHNF4αを発現しだした。3つのマーカー全てについて、共固定化基層上の細胞の方が、ゼラチン上のものよりも転写レベルが高かった。肝細胞へ分化した細胞の割合を調べる為、AFP、ALBについて免疫染色を行った図6F、G。図6Fが示すように、93.8±6.0という高い割合で、共固定化基層上の単一細胞レベルに分散した細胞は、AFPを強く発現した一方、ゼラチン上のコロニーは、僅かな割合の細胞がAFPを発現した15.6±7.1。分化誘導16日後では、共固定化基層上の細胞は、90.0±9.6という高い割合でALBポジティブであった。一方、ゼラチン上の細胞は20.5±5.3がALBを発現しているに過ぎなかった図6G、H。共固定化基層は、E-cad-Fc単独マトリックスと同様の結果であり、ゼラチンと比較して優れた細胞濃縮性能を有することが裏付けられた。共固定化基層上、および、E-cad-Fc単独マトリックス上の細胞のアルブミンの発現は、ウェスタンブロットにより確認した図6I。図7Aが示すように、ASGPRおよびmTOを含む成熟肝細胞特異的遺伝子マーカーの発現が、分化の後半段階において増加した。分化の進行に伴い、24日後に、ASGPRの発現量がピークになった図7B。興味深いことに、ASGPRの発現は、共固定化基層上の細胞では10日後から始まったのに対し、E-cad-Fc単独マトリックス上の細胞では12日後から、ゼラチンマトリックス上の細胞では16日後から始まった。共固定化基層上の細胞は、ASGPRの発現量がほかの2つのマトリックスよりも常に高かった。これは、PVLAがASGPRの発現促進に寄与している可能性を示唆している。これらの結果と一致するように、共固定化基層上の細胞は、E-cad-Fc単独マトリックスやゼラチンと比較して、mTOの発現レベルも高かった。特に、22日以降において差が顕著であった図7C。一方、分化誘導24日後に行った免疫染色の結果から、ALBおよびASGPRの発現量は、共固定化基層、およびE-cad-Fc単独マトリックスでは、ゼラチンと比較して明らかに高かった図7D。肝細胞は、様々な代謝機能を有する成熟細胞である。分化最終ステージのmES細胞誘導後20日、24日の機能レベルを評価し、共固定化基層マトリックスの分化誘導効率への影響を確認した。共固定化基層上の細胞のアルブミン分泌図7E、グリコーゲン蓄積図7F、および尿素生成レベル図7Gは、ゼラチンやE-cad-Fc単独マトリックスよりも高かった。<マウスES細胞由来の肝細胞のASGPR発現に基づいた濃縮>本発明により、ES細胞由来の肝細胞を単離し、未分化の細胞や他の系列に分化する可能性のある細胞を除去する、マトリックス依存的選択的細胞濃縮方法が提供される。E-cad-Fcは、PVLAによるASGPR選択的な結合をサポートしうる。E-カドヘリンによる結合と、PVLA-ASGPRの結合の両方が、Ca2依存的であることから、分化誘導18日、20日、22日、24日後において、キレート剤CDBを用いて分化細胞を分離し、PVLAコーティングしたディッシュ上に播種した。結着した細胞数を計算し図8A、細胞膜上に発現したASGPRの存在を評価した。ASGPRポジティブの細胞の割合は、それぞれのマトリックスにおいて、分化誘導開始から経時的に増加した。共固定化基層上の細胞は、E-cad-Fc単独や、ゼラチンコートされたディッシュよりもASGPRポジティブの細胞の割合が高かった。24日後において、共固定化基層由来の細胞の結着率は59.7±11.6であり、E-cad-Fc単独マトリックス由来の細胞の結着率は45.0±2.5であり、ゼラチンコートされたディッシュ由来の細胞の結着率は、23.2±3.3であった。結着細胞の割合の変化は、22日後と24日後の間では小さかった。よって、再播種のタイミングは、分化誘導後22日後が最適であるといえる。共固定化基層においては、最終ステージにある分化細胞であっても、単一細胞層を維持していたが、凝集への傾向が見られた図8B。しかしながら、PVLAコートされたディッシュへの再播種から3日培養した場合、分化細胞は、一部が凝集し、多層の凝集塊を形成していた。この様子は、初代培養肝細胞の培養3日後に形成される組織様のスフェロイドに類似していた。<ASGPRにより濃縮したES細胞由来の肝細胞の特徴>ゼラチン、E-cad-Fc単独マトリックス、共固定化基層それぞれにおいて分化誘導してから24日後の細胞について、各種マーカーの転写量を、再播種した細胞上記と同様にPVLAコートしたディッシュ上に再播種し3日間培養した細胞と比較した図8C。brachyury中胚葉特異的遺伝子、Pdx1膵臓マーカーのRT-PCRから、キレート剤による細胞分離と再播種による細胞選択プロセスにより、肝細胞以外のマーカーを発現しない細胞が濃縮されたことが分かる。また、Gata6およびSox17内胚葉および肝前駆細胞の転写が見られなくなったことから、分化の早期ステージにある細胞が除去されたことが分かる。成熟した肝細胞のマーカーASGPR、mTO、G6Pの転写量は維持ないしは増加したことからも、成熟肝細胞選択的な結着が起こった事が分かる。これらの結果より、肝細胞の選択的濃縮が達成できたことが分かる。分化したES細胞が、初代培養肝細胞として機能しうるかについて調べるために、アルブミン分泌、グリコーゲン蓄積、および尿素生成について測定した。PVLAコートしたディッシュに再播種した肝細胞は、それぞれの代謝機能を維持していた。"