ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、iポリメラーゼ酵素を標識されていない標的ポリヌクレオチドに接触させて複合体を形成する工程;iiポリメラーゼ活性を誘導するのに十分な条件下で、dATP、dTTP、dGTPおよびdCTPからなる群より選択される1つ以上の標識されていないヌクレオシド三リン酸に該複合体を接触させれう工程;およびiii該酵素が該標的ポリヌクレオチドに沿って進行する時にpHが変化することを検出することによって、該標的ポリヌクレオチドの配列を決定する工程、を包含し、該pHの変化は、該標的ポリヌクレオチドに対して相補的な未完成のヌクレオチド鎖へのヌクレオシド三リン酸の取り込みから生じる、方法。前記酵素は、該酵素に対する緑色蛍光タンパク質の融合物を含む、請求項1に記載の方法。前記工程iiおよびiiiは、同じ複合体を1回以上利用される、請求項1に記載の方法。前記未完成の鎖は、プライマー配列である、請求項1に記載の方法。前記検出工程は、フローセルで行われる、請求項1に記載の方法。前記酵素および/または前記複合体は、固体支持体上で固定される、請求項1に記載の方法。前記pHの変化における変化は、局所的なpHの変化である、請求項1に記載の方法。本発明の要約本発明は、標的ポリヌクレオチドの配列を、標的ポリヌクレオチドに結合し、標的ポリヌクレオチドに沿って進行する酵素における立体配座の変化を測定することによって、決定し得るということに基づいている。立体配座の変化が起こる程度は、標的上のどの個々のヌクレオチドが該酵素と接触しているかによって異なる。本発明の一つの態様によれば、ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法は、以下を包含する:酵素活性を誘導するのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドと相互作用し、かつポリヌクレオチドに沿って進行し得る酵素と、反応せしめ、酵素がポリヌクレオチドに沿って進行する時に、酵素における立体配座の変化を検出すること。好ましい実施態様において、酵素は相補鎖を伸長する過程で標的と相互作用するポリメラーゼ酵素である。酵素は、規定領域内に反応を局在化させるために固体支持体上に固定化する。本発明の第2の実施態様によれば、酵素は最初に結合された検出し得る標識を包含し、酵素が立体配座の変化を進行するにつれて、その特徴を変化させる。また、酵素は、最初の標識と相互作用し得る2番目に結合した検出し得る標識を包含する。ここで、相互作用の程度は酵素における立体配座の変化に依存する。通常、最初の標識はエネルギー受容体であり、2番目の標識はエネルギー供与体であり、立体配座の変化を検出することは、2つの標識間のエネルギー遷移を測定することにより行う。本発明のさらなる実施態様によれば、蛍光共鳴エネルギー遷移を用いて、標的ポリメラーゼと相互作用し、標的ポリメラーゼに沿って進行する酵素における立体配座の変化を検出する。それによりポリヌクレオチドの配列を決定する。蛍光共鳴エネルギー遷移は、酵素にそれぞれ結合しているFRET供与体および受容体標識との間で行い得る。あるいは、標識の1つは酵素に結合し、もう一方の標識はポリヌクレオチドに結合してもよい。さらなる実施態様によれば、ポリヌクレオチド配列を決定するために、標的ポリヌクレオチドと相互作用し、標的ポリヌクレオチドに沿って進行し得る検出可能な標識酵素を使用する。ここで、該標識は、酵素がポリヌクレオチドに沿って進行するにつれて、その検出し得る特性を変化させる。さらなる態様によれば、固体支持体は、標的ポリヌクレオチドと相互作用し、標的ポリヌクレオチドに沿って進行し得る少なくとも1つの固定化酵素を包含する。酵素は1以上の検出し得る標識物によって標識されている。さらなる態様によれば、ポリヌクレオチドの配列を決定するためのシステムは、上記のような固体支持体を包含し、標識を検出するための装置を包含する。本発明は、従来の配列決定技術を超えるいくつかの利点を提供する。ポリメラーゼ酵素は、一旦ポリヌクレオチドの伸長ラウンドを始めると、鎖から脱落する前までに数千のヌクレオチドを重合する。さらに、ある特定のポリメラーゼシステムは、鋳型分子を囲むスライディングクランプを介して、または部分的に囲む分子フックを介して、鋳型ポリヌクレオチドにシステム自身を固着し、係留することができる。本発明は、1回の試行で、1秒あたり数百もの塩基対の速度で数十キロベースまたはそれ以上の配列決定をし得る。これは、DNAの1本鎖フラグメントに関する配列決定の結果である。DNAの1本鎖フラグメントの配列決定に関する利点は、配列決定速度が利用された酵素システムによって決定され、間接的総合的反応により決定されるのではないので相当速いことである。速い速度と同じくらい重要なことは、DNAの大きなフラグメントを配列決定することができる能力である。これは、配列決定情報のメガベースセグメントを集めるのに必要とされるサブクローニングの量および重複配列の数を顕著に低下させる。1本鎖フラグメントアプローチのさらなる利点は、現在配列決定の努力を阻害するアクリルアミドのような有害不用物の廃棄に関する問題を排除することである。例えば、本願発明は以下の項目を提供する。項目1下記の過程:酵素活性を誘導するのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドと相互作用し、かつポリヌクレオチドに沿って進行し得る酵素と、反応せしめ、酵素が該ポリヌクレオチドに沿って進行する時に、酵素における立体配座の変化を検出すること、を含むポリヌクレオチドの配列を決定するための方法。項目2酵素がポリメラーゼ酵素である、項目1記載の方法。項目3酵素がヘリカーゼ酵素またはプライマーゼ酵素である、請求項1記載の方法。項目4酵素が固体支持上で固定化された、項目1~3記載の方法。項目5固体支持上で固定化された複数の酵素を含む、項目4記載の方法。項目6酵素が、最初に結合した検出し得る標識を含み、酵素が立体配座の変化を進行させるにつれて、その特徴が変化する、項目1~5記載の方法。項目7酵素が、最初の標識と相互作用し得る2番目に結合した検出し得る標識を包含し、相互作用の程度は酵素における立体配座の変化に依存する、項目6記載の方法。項目82番目の検出し得る標識が、酵素と接触することになるヌクレオチドに結合している、項目6記載の方法。項目9最初の標識がエネルギー受容体であり、2番目の標識がエネルギー供与体であり、もしくは逆で、過程iiは2つの標識間のエネルギー遷移の変化を測定することにより行い得る、項目7または項目8記載の方法。項目10過程iiは共焦顕微鏡を用いて実施する、項目1~9記載の方法。項目11過程iiは蛍光画像化によって実施する、項目10記載の方法。項目12過程iiは最初の標識の変化した特性に対する分極効果の結果を測定することによって実施する、項目10記載の方法。項目13過程iiは蛍光分極異方性によって実施する、項目10記載の方法。項目14標的ポリメラーゼと相互作用し、標的ポリメラーゼに沿って進行する酵素における立体配座の変化を検出して、それによってポリヌクレオチドの配列を決定するための蛍光共鳴エネルギー遷移の使用。項目15酵素がポリメラーゼ酵素である、項目14記載の使用。項目16酵素が固体支持体上に固定化される、項目14または15記載の使用。項目17ポリヌクレオチド配列を決定するために、標的ポリヌクレオチドと相互作用し、標的ポリヌクレオチドに沿って進行し得る検出可能な標識酵素の使用であって、酵素がポリヌクレオチドに沿って進行する時に、標識がその検出し得る特性を変化させる検出可能な標識酵素の使用。項目18標的ポリヌクレオチドと相互作用し、標的ポリヌクレオチドに沿って進行し得る少なくとも1つの固定酵素を包含し、酵素が1以上の検出し得る標識物によって標識される固体支持体。項目19酵素がポリメラーゼである、項目18記載の固体支持体。項目20標識が蛍光団である、項目18または19記載の固体支持体。項目21項目18~21記載の固体支持体および標識を検出するための装置を含むポリヌクレオチドの配列を決定するためのシステム。本発明の説明ポリヌクレオチドを配列決定するための本方法は、酵素と標的ポリヌクレオチドとの間の立体配座の変化に関する分析を包含する。本明細書中で使用するポリヌクレオチドなる用語は、広義に解釈されるべきであり、DNAおよびRNAならびに修飾DNAおよび修飾RNAを含み、さらに別のハイブリダイズする核酸様分子、例えばペプチドヌクレオチド核酸も含む。酵素は、ポリメラーゼ酵素であってもよく、立体配座の変化は、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドに対し相補的な未完成鎖中にヌクレオチドを導入する場合にもたらされる。立体配座の変化は、各々異なるヌクレオチド、A、T、GまたはCに対して異なり、そのため、該変化を測定することによりどのヌクレオチドが組み込まれたかを同定するのである。あるいは、酵素は、ポリヌクレオチド、例えば、ヘリカーゼ酵素、プライマーゼおよびホロ酵素との相互作用に関与するものどれでもよい。酵素がポリヌクレオチドに沿って進行すると、その立体配座は、標的上のどのヌクレオチドに接触するかに依存して変化する。酵素における立体配座の変化を検出する1つの方法は、適切なエネルギー供与体標識と適切なエネルギー受容体標識との共鳴エネルギー遷移を測定することである。一つの例において、供与体および受容体は酵素に各々結合し、標的ポリヌクレオチドとの相互作用によりもたらされる酵素における立体配座の変化が標識の相対的位置を変える。位置付けにおける差異は、得られるエネルギー遷移を反映しており、酵素と接触する特定のヌクレオチドの特徴となる。あるいは、1つの標識を酵素上に位置付け、もう一方の酵素を標的のヌクレオチド上または標的に相補的な鎖上に導入されたヌクレオチド上に位置付けられ得る。蛍光共鳴エネルギー遷移の使用は、本発明の好ましい実施態様である。この技術は、2から8nmの距離を測定することができ、供与体蛍光団と受容体蛍光団との距離依存性エネルギー遷移による。該技術は、優秀な静的共局在化の能力を持つだけでなく、分子内および分子間FRETに対する2つの蛍光団の距離または配向性における動的変化に対する情報も提供する。1つの供与体と1つの受容体との間のエネルギー遷移についての最初の測定以来、該方法はリガンド受容体の共局在性を研究するため、触媒中の平衡タンパク質構造性変動および酵素-基質相互作用を調べるため、そして立体配座状態および溶液中の個々の拡散分子の副固体数を同定するために使用されてきた。これらの変法の全ては、本発明において適用し得るものと考えられる。本発明は、1つの標識のみを必要とする測定技術を使用しても実施し得る。1分子レベルで酵素の局所環境における変化を測定することができる全てのシステムは、本発明の許容される態様である。ポリヌクレオチドプロセシング酵素およびまたはその基質類と結合した1つの蛍光プローブの多様な特性は、本発明の中で活用することができ、ヌクレオチドの合同事象に特異的である酵素システム分子環境中において、またはその非常に近接した環境において変動するものに対するデータを提供する。そのような変動するものは、限定はしないが、分子相互作用、酵素活性、反応速度論、立体配座動力学、運動の分子自由度、活性および化学的静電的環境の変化を包含する。例えば、1つの蛍光団の吸収および放射遷移双極子を、分極化励起光を用いて、または放出分極を分析することによって、または両方を用いて測定し得る。強固に結合または回転拡散した係留標識の双極子配向性における一過性のバリエーションが、マクロ分子システムの角度運動またはサブユニットの1つについて報告されている。これを本発明で適用し得る。本発明中で使用される標識は、当業者に既知である。好ましくは、標識は、XueetalNature1995373681に記載の蛍光標識である。または、蛍光酵素、例えば緑色蛍光タンパク質を用い得る。本発明の好ましい実施態様は、ポリヌクレオチドプロセシング酵素、例えばテトラメチルローダミンに共有結合および部位特異的結合した小さな蛍光分子の使用を包含する。蛍光標識を本発明で使用する場合、その検出は、励起波長への反復暴露によって生じる光漂白に影響される。この問題を回避するための1つの可能な方法は、多くの連鎖反応を実施するが、一度にただ少数のものについて蛍光シグナルを検出することである。この反復過程を用いて、シグナルの正しい配列を測定し、ポリヌクレオチド配列を測定できる。例えば、固体支持体上に複数の酵素を固定化し、それらを標的ポリヌクレオチドと接触させることによって、連続配列決定反応はほぼ同時に開始するはずである。蛍光の励起および検出は、光漂白が明らかとなるまでのしばらくの間は、全体の反応の一部に局在することがある。この時、励起および検出を反応の異なる部分に移し、配列決定を継続することができる。全ての反応が同時性である場合、この正しい配列は、最小の配列の再構築によって得られるはずである。標識は、共有結合または他の結合によって酵素と結合してもよい。多くのストラテジーを、該標識を該酵素に結合するのに使用し得る。ストラテジーは、特定のおよび直交染料標識化タンパク質のためのシステインおよびケトンハンドルを導入するために、部位指向性突然変異誘発および非天然アミノ酸突然変異誘発の使用を包含する。ポリヌクレオチドプロセシング酵素を標識するのに使用される別の予測される実施態様は、当業者に既知の分子クローニング技術を介するプロセシング酵素との緑色蛍光タンパク質の融合である。この技術は、立体配座の変化および局所pH変化を測定するのに適用し得ることが分かっている。固定化酵素における使用に適切な支持体は当業者に公知である。シリコン、ガラスおよびセラミクッス材を用い得る。支持体は通常平らな表面である。酵素固定は共有結合または別の手段によって実施し得る。例えば、共有結合リンカー分子を使用して、適切に調製された酵素に結合する。結合方法は当業者に既知である。固体支持体に固定化された酵素は1またはそれ以上であってよい。好ましい実施態様において、複数の酵素を結合する。これは、多くの別々の反応をモニタリングすることを可能にし、上述の光漂白問題を克服するのに有用である。種々の技術を用いて、酵素における立体配座の変化を測定することも可能である。共鳴エネルギー遷移は、表面プラスモン共鳴または蛍光表面プラスモン共鳴技術によって測定し得る。しかし、標識との相互作用を介する放射変化を側定する別の技術またはエネルギー変換器を考えてもよい。例えば、全内部反射率蛍光、漸先全反射、拡散全反射、Brewster角度反射率、散乱全内部反射、蛍光存在期間画像化顕微鏡および分光法、蛍光分極異方性、蛍光分光法またはエバネッセント波楕円偏向法による分光法である。本発明は、下記実施例で図面と併せて詳細に説明する。実施例この実施例では、図1に示したような共焦蛍光配置を使用した。図1に関して、その配置は、X、YおよびZ次元において高い解像度でスキャンすることができる走査テーブル、プライマー-鋳型ポリヌクレオチド複合体およびヌクレオチド緩衝液内の固定化されたポリメラーゼ分子上に導入する入口を持つ微螢光測定フローセルシステムの一部であるクラスカバースリップ、および排出物のための出口からなる。供与体励起のためのレーザー光源からの入射光は、油浸漬対物レンズを介して伝達させる。タンパク質接合本実験において、テトラメチルローダミンおよびCy5は一組のFRETとして使用する。これは、それらの十分に分離した放出波長および大きなFoester半径を理由とする。NewEnglandBiolabsから入手したT7DNAポリメラーゼを用いた。T7を、Vivaspin500中で、T7DNAポリメラーゼが入った貯蔵用緩衝液からDTTを除去するために、200mM酢酸ナトリウム緩衝液を4x500μlに対して緩衝液交換した。次いで、緩衝液を交換したT7DNAポリメラーゼを、酢酸ナトリウム緩衝液と飽和22ジピリジルジスルフィド水性溶液に添加した。次いで、該反応を110分間放置し、343nmでの吸収を記載した。最後に、該試料を前記のような200mMTrisに緩衝液交換を行った。染料の結合を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を変性することで確認した。Cy5スクシンイミジルエステルを、同じ標識化条件下でTMRT7DNAポリメラーゼに接合し、精製し、上記のように特性分析した。ポリメラーゼ固定化ガラスカバースリップを、Nプロピルエチレンジアミン三酢酸塩によって修飾した。次いで、カバースリップを、修飾されたガラス表面上に連続的に緩衝液が流れるようにしたフローセル配置中へ接着した。次いで、標識ポリメラーゼを緩衝液に添加し、タンパク質をガラス表面上で固定するようにカバーガラス上に流した。次いで、タンパク質を、いずれかの一時でもレーザー励起体積下に1分子のみがあるように、ガラス水界面上に低密度に固定した。レーザー光を、スキャンステージにおける共焦顕微鏡のエピ照明配置中に油浸漬対物レンズを用いて、04μmスポットに集束した。蛍光放出を同対物レンズによって集め、二色性ビーム分割によって2つに分割し、2つのAvalanchePhotoDiode計測装置によって同時に検出した。585nmのバンドパスフィルターを供与体検出器の前に置き、650nmロングパスフィルターを受容体検出器の前に置いた。蛍光検出中スペクトル範囲を二色性ビーム分割のカットオフ波長から十分除去するので、供与体および受容体シグナルの両方の検出効率に関する分極依存性は無視できる。高度に近いフィールド開口対物レンズによるこの分極混合は、大目にみてよいことが知られている。供与体および受容体放射時間を得るために、受容体シグナルに対する探査条件を、概説したように用い得る。この方法は、二重標識したタンパク質のスクリーニングに役立つ:受容体の直接的な励起はせずに、FRETを受けるタンパク質のみが受容体シグナルを示し得る。タンパク質をレーザースポット下でスクリーンし、位置し、配置すると、供与体および受容体の時間トレースを得た。捕捉時間は、光漂白された標的タンパク質上で全て蛍光標識されるまで続いた。反応の開始2種のオリゴヌクレオチドを、標準的なホスホラミダイト化学を用いて合成した。配列番号1として定義されるオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドとして用い、配列番号2として定義されるオリゴヌクレオチドはプライマーとして用いた。2つのオリゴヌクレオチドをハイブダイズ条件下で反応し、標的-プライマー複合体を形成した。配列番号1CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG配列番号2CTCTCCCTTCTCTCGTC次いで、反応を、04mMの濃度で存在する4つのヌクレオチドを有するフローセル中にプライム化DNAを注入して開始した。該フローセルを、25°Cで修飾ペルレィエ装置で維持した。また、酸素排除系50μgmlグルコースオキシダーゼ10μgmlカタラーゼ18グルコース1βメルカプトエタノールを用い、蛍光存在時間を長くした。FRETデータ分析最初の試験は、点滅の起源、光漂白および三重項振幅を測定し、それら全ては、立体配座の変化の結果として蛍光団間で変化する距離により、FRET効率の基本的な変化を干渉し得る。Haetal1999に記載のような供与体および受容体時間トレースからのバックグラウンドシグナルの控除後、3重項振幅を除くために5点を平均した中央値フィルタを適用した。次いで、供与体点滅結果による両検出器上の同時性ダークカウントを示したデータ値は、時間トレースから無視した。受容体光漂白に対する供与体シグナル回復の量は、分子の量子収率およびその全体的な検出効率に関する。次いで、エネルギー遷移効率時間トレースを得た。標的鎖配列番号1のポリメライゼーション中の該FRET効率時間トレースを図2に示した。図2によると、この配列は配列番号1の配列の相補物に対応する。