皮膚を賦活化させる薬剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を血管内皮細胞に作用させ、前記細胞のPDGFBBの発現を亢進させる薬剤を皮膚賦活剤として選定することを特徴とする方法。前記測定が、細胞中のPDGFBに由来するmRNAをリアルタイムポリメラーゼ連鎖方法により測定することにより実施される、請求項1に記載の方法。皮膚の血管部位でPDGFBB活性又はレベルを増加させることにより、間葉系幹細胞を賦活化し、それ故皮膚を賦活化し、皮膚の老化を抑制する方法。本発明は、皮膚を賦活化させる薬剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を血管内皮細胞に作用させ、前記細胞のPDGFBBの発現を亢進させる薬剤を皮膚賦活剤として選定することを特徴とする方法に関する。血小板由来成長因子は線維芽細胞、平滑筋細胞、グリア細胞等といった間葉系細胞の遊走および増殖などの調節に関与する増殖因子であり、上皮細胞や内皮細胞など様々な細胞によって産生される。PDGFにはPDGFA、B、CおよびDの少なくとも4種類が存在するが、A鎖およびB鎖はジスルフィド結合を形成することによりホモあるいはヘテロ2量体構造をとり3種類のアイソフォームPDGFAA、AB、BBを有している。PDGFはチロシンキナーゼ関連型であるPDGF受容体PDGFRを介してその生理作用を発現することが知られている。PDGFBの遺伝子は公知であり、遺伝子クローニングされている非特許文献10。本発明において使用する間葉系細胞は、あらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモットなどの真皮に由来し得る。本発明でいう皮膚の賦活とは、特に限定されるわけではないが、一般に皮膚組織の新陳代謝が活発となり、ターンオーバー期間が比較的短く、組織疲労や萎縮、酸化の進行などが低い状態となることをいう。皮膚の賦活により、肌のハリが保たれ、小ジワの形成、シミの形成などを防いだり、それらを改善することができる。血管内皮細胞中のPDGFBB遺伝子の発現は、例えばPDGFBBの量を測定することにより決定してよい。好ましくは、この測定は、PDGFBBに特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばELISA法、RIA法等、様々な方法により実施できる。また、例えば、血管内皮細胞中のtotalRNAを抽出し、PDGFBをコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応PCR法、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RTPCRにより行われる。RTPCRに適切なプライマーの選定は、当業者周知に方法により実施することができる。本発明者は、また、レチノイン酸がPDGFBBの発明を亢進させることを見出した。したがって、皮膚賦活剤の選定は、例えばレチノイン酸といったPDGFBBの発現促進効果を有する薬剤などを用いたポジティブコントロールや、PDGFBB発現阻害効果を有する薬剤、例えばPDGFB遺伝子のsiRNAなどを用いたネガティブコントロールとの対比において、候補薬剤がPDGFBBの発現を亢進させるかどうかを例えば統計学的手法を介して調べ、行うことができる。本発明はさらに、候補薬剤を血管内皮細胞中のPDGFB配列番号1をコードするポリヌクレオチドに対し高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドの発現を亢進する能力について評価し、当該亢進能力を有する候補薬剤を皮膚賦活剤として選定することを特徴とする方法を提供する。ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJSambrookらMolecularCloning2ndColdSpringHarborLabPress1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばナトリウム濃度が約10~40mM、好ましくは約20mM、温度が約50~70°C、好ましくは約60~65°Cであることを含む条件をいう。本発明はさらに、皮膚の血管部位でPDGFBB活性又はレベルを増加させることにより、活性が亢進又は発現レベルの増加したPDGFBBが間葉系幹細胞に作用し、その結果該間葉系幹細胞が賦活化し、皮膚が賦活し、それ故皮膚老化を抑制する美容学的方法に関する。上記のとおり、本発明者はレチノイン酸、特にトレチノイン酸がPDGFBBの発明を亢進させることを見出した。したがってこの方法は、例えば老化の抑制を所望する皮膚にレチノイン酸を適用することにより実施される。また、被験体におけるPDGFBをコードする遺伝子が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がPDGFB欠損又は欠陥状態にあるときは、PDGFB遺伝子自体を細胞内に導入するために、PDGFBB遺伝子を組み込んだベクターを使用し、PDGFBBの活性又はレベルを増加させることができる。該ベクターにおいては、PDGFB遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーを、PDGFB遺伝子に対し作動可能な位置に配置することが好ましい。PDGFB遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法日経サイエンス、1994年4月号、2045頁、実験医学増刊、12、実験医学別冊遺伝子治療の基礎技術、羊土社1996のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス、又はRNAウイルスに、PDGFBをコードするDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法DNAワクチン法、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、DNAを直接体内に導入するinvivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でDNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すexvivo法がある日経サイエンス、1994年4月号、2045頁、月刊薬事、3623481994、実験医学増刊、12。invivo法がより好ましい。invivo法により投与される場合は、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。invivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソームセンダイウイルスHVJ-リポソーム等の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。実験方法ヒト皮膚構成細胞におけるPDGFB遺伝子発現量の測定ヒト皮膚の構成細胞におけるPDGFB遺伝子発現量を定量PCR法で調べた。表皮角化細胞KCおよび毛包上皮細胞である外毛根鞘細胞ORSCはEpilifeKG2培地クラボウ、皮膚線維芽細胞FBは10FBS添加のDMEM培地、ヒト血管内皮細胞HUVECはEGM2培地三光純薬を用いて増殖培養を行った。各細胞をIsogenに回収して、提供されたプロトコールに従いtotalRNAを抽出した。精製したtotalRNAの濃度は核酸定量装置Nanodropにより測定した。各サンプルについて同量のtotalRNAを用いて、ランダムプライマーと逆転写酵素SuperscriptIIIにより、Invitrogen社のマニュアルに従いcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型に反応試薬LightCyclerFastStartDNAMasterPLUSSYBRGreen、反応装置LightCyclerを用いて定量PCRを行った。組成条件はRocheのプロトコールに従った。また、PCRの条件は、初期変性95°Cで10分、変性95°Cで10秒、アニール60°Cで10秒、伸長72°Cで10秒とした。使用したプライマーの配列は以下の通であり、LightCyclerの附属のソフトウェアを用いて、PDGF遺伝子の発現量を測定した。PDGFA:フォワードプライマー:5‘ATACCTCGCCCATGTTCTG3‘配列番号1リバースプライマー:5‘GATGCTTCTCTTCCTCCGAA3‘配列番号2PDGFB:フォワードプライマー:5‘CTTTAAGAAGGCCACGGTGA3‘配列番号3リバースプライマー:5‘CTTCAGTGCCGTCTTGTCAT3‘配列番号4PDGFC:フォワードプライマー:5‘TATATTAGGGCGCTGGTGTG3‘配列番号5リバースプライマー:5‘ATTAAGCAGGTCCAGTGGCA3‘配列番号6PDGFD:フォワードプライマー:5‘TGGGAATCTGTCACAAGCTC3‘配列番号7リバースプライマー:5‘CTTTTGACTTCCGGTCATGG3‘配列番号8G3PDH:フォワードプライマー:5‘GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3‘配列番号9リバースプライマー:5‘ATGGTGGTGAAGACGCCAGT3‘配列番号10なお、G3PDHは内部標準として用い、各遺伝子それぞれの定量時において、これを用いて対照群のcDNA量を補正した。遊走能の評価市販の脂肪由来の間葉系幹細胞MSCを購入して間葉系幹細胞用培地MesenProで継代培養を行った。次に、24穴培養プレートに無血清のMSC用培地StemPro培地にPDGFAA、PDGFABあるいはPDGFBBRDSystemsを5~30ngmlの濃度で加え、その上にファイブロネクチンコートセルインサートBDbioscienceをセットし、StemPro培地に懸濁したMSC50000個を播種した。CO2インキュベーターで一晩培養を行った後、培養液を吸引除去した。続いて、セルインサーをHoechist33258PBS溶液に10分間浸漬してセルインサート上に接着している細胞の核を染色した。PBSで洗浄した後、セルインサートの裏側を蛍光顕微鏡下で観察して画像の撮影を行った。各セルインサートについてランダムに5枚の画像を撮影、移動した細胞の数をカウントした。ヒト皮膚組織におけるPDFGBBの局在部位ヒト皮膚組織を凍結組織包埋剤OTCコンパウンドサクラファインテックジャパンに包埋し、凍結切片作製装置クライオスタットLeicaにて50μmの凍結切片を作製した。室温で風乾した凍結切片を、20°Cで15分間冷却した冷アセトンを用いて室温で15分間固定した。次に、TBSで洗浄後に無血清ブロッキング試薬DAKOで30分間ブロッキング処理を行い、3BSA含有のTBSTで100倍に希釈したウサギAntiヒトPDGFBB抗体AbcamとヒツジAntiヒトCD31抗体RDsystemsと4°Cで一晩反応させた。TBSTで40分間を2回、TBSで40分間を1回の計3回の洗浄を行った後、3BSA含有のTBSTで200倍希釈したAlexa488標識antisheepIgGとAlexa594標識antirabbitIgG標識の二次抗体Invitrogenと1時間反応させた。反応後の切片をTBSTで40分間を2回、TBSで40分間を1回の計3回洗浄した後、Hoechist33258で核染色を行ってから、共焦点蛍光顕微鏡LSM5PASCALZeissを用いて観察および画像取り込みを行った。血管内皮細胞チューブ形成アッセイInVitroAngiogenesisAssayKitを用いてコーティングした8穴のチャンバースライドに、赤色の蛍光色素PKH26REDFLUORESCENTSigmaで標識したHUVEC、緑色の蛍光色素PKH67GREENFLUORESCENTSigmaで標識したMSCを播種した後、5CO2存在下、37°Cで12時間インキュベートした。共焦点蛍光顕微鏡LSM5PASCALZeissを用いて、形成されたチューブの状態を観察、画像の撮影を行った。また、マウス抗PDGFレセプター中和抗体RDSystemsまたはアイソタイプの一致するマウスIgGは5μgmlの濃度で使用した。定量PCR法によるヒト皮膚におけるPDGF遺伝子発現量の測定ヒト皮膚組織を液体窒素で凍結、クライオプレスマイクロテックニチオンを用いて液体窒素の冷却下において組織の破砕処理を行った。サンプルをIsogenに回収して、提供されたプロトコールを用いて皮膚のtotalRNAを抽出した。PDGFB遺伝この発現量は、以下のプライマーを用いて前述と同様の方法で行った。PDGFB:フォワードプライマー:5‘CCTGGCATGCAAGTGTGA3‘配列番号11リバースプライマー:5‘CCAATGGTCACCCGATTT3‘配列番号12皮膚におけるヒト間葉系幹細胞の染色ヒト皮膚組織をホルマリンリン酸緩衝液で1週間まで固定した後、自動包埋機サクラファインテックジャパンを用いてパラフィンに包埋した。得られたヒト皮膚パラフィンブロックからミクロトームLeicaにて6μmの組織切片を作製、APSコートスライドガラスに貼り付けて伸展機サクラファインテックジャパンの上で伸展乾燥させた。作製した皮膚組織スライドについて、キシレンによる脱パラフィンとエタノール水系列での親水処理を行いさらにTBS緩衝液でリンスしてから、20μgmlのProteinaseKRocheと37°Cで15分間の酵素反応処理を行ってCD34抗原を賦活化させた。次に、TBSTで十分に洗浄した後、無血清ブロッキング試薬DAKOで15分間ブロッキング処理を行い、3BSA含有のTBSTで500倍に希釈したマウスAntiヒトCD34抗体クローンQBEND10、Abcamと室温で1時間反応させた。TBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回の洗浄を行った後に、抗マウス抗体用染色試薬ヒストファインマウスステインキット、ニチレイと15分間反応させた。次に、反応後の切片をTBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回洗浄した後、ペルオキシダゼ標識ストレプトアビジンニチレイと15分間の反応を行った。反応後の切片をTBSTで15分間を2回、TBSで15分間を1回の計3回洗浄した後、シンプルステインDAB溶液ニチレイを用いて発色反応を行った。対比染色は行わずに蒸留水でリンスした後、エタノール水系列による脱水とキシレンによる透徹処理を行い、さらにマウントクイック大道産業とカバーガラスを用いて封入した。微分干渉顕微鏡OlympusBX51で対物20倍のレンズにて画像取り込みを行い、それぞれの切片に対して10枚の画像についてCD34陽性細胞の数をカウントした。血管内皮細胞におけるPDGFBの産生亢進作用の評価ヒト血管内皮細胞HUVECをEGM2培地三光純薬で継代培養を行い、継代4代目の細胞をVEGFAを含まないHumediaEG2培地クラボウに懸濁してコラーゲンコート24穴マルチプレート旭硝子に20000個の割合で播種、5CO2存在下、37°Cで細胞が集密に達するままで3~5日間の培養を行った。レチノイン酸1μM、10μMあるいは溶媒コントロールDMSOを添加したHumediaEG2培地クラボウに交換した後、さらに2日間培養を行った。培養終了時に培養上清を回収、ヒトPDGFBBQuantikineELISAキットRDSystemsを用いて、提供されたプロトコールに従いPDGFBBの定量を行った。また、培養後の細胞からRNA抽出試薬MagNAPureLCmRNAHSキットと自動核酸抽出装置MagNAPureLC10インスツルメントを用いて、提供されたプロトコールに従ってmRNAの抽出精製を行った。各サンプルについて同容量のmRNAを鋳型に、配列番号9と10のプライマーペアー、反応試薬QuantiFastSYBRGreenRTPCRKitQiagenと反応装置LightCyclerを用いて、PDGFB遺伝子のワンステップ定量RTPCRを行った。組成条件はQiagenのプロトコールに従った。また、RTPCRの条件は、RT反応50°Cで20分、初期変性95°Cで15分、変性94°Cで15秒、アニール60°Cで20秒、伸長72°Cで30秒とした。なお、G3PDHは内部標準として用い、これを用いて対照群のmRNA量を補正した。結果ヒト皮膚において間葉系幹細胞が血管部位に局在していることが明らかになっている特願2009213291。線維芽細胞の遊走因子として知られるPDGFファミリーについて、血管部位で発現が高い分子種を調べる目的で、4つの遺伝子PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFDの皮膚構成細胞での発現を比較した結果、PDGFBはHUVECにおいて非常に発現が高く、一方でFBではほとんど発現していないことが明らかになった図1。その他、PDGFAはKC、ORSC、HUVECで同等かつFBの4倍程度、PDGFCとPDGFDはFBでの発現が顕著に高い結果であった図1。HUVECでPDGFAとPDGFBの発現が認められたことから、これらの遺伝子から生じるPDGFタンパク質のPDGFAA、PDGFAB、PDGFBBの間葉系幹細胞の遊走能への影響を調べた。その結果、PDGFBBがPDGFAAやPDGFABと比較して有意に、幹細胞の遊走能を亢進することが明らかになった図2。次に、真皮や皮下脂肪におけるPDGFBBの局在を調べたところ、太い血管部位において血管マーカーCD31と一致して分布していた図3。太い血管部位での分布状態を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、PDGFBBは血管内皮細胞の外側かつ周皮細胞真皮幹細胞の間に存在していることが分かった図4。さらに、血管内皮細胞チューブ形成アッセイに間葉系幹細胞を加えるとそのほとんどが分岐部に集積するのに対して、PDGFBBのレセプターPDGFRβの中和抗体存在下では分岐部への集積が阻害され図5、血管部位への間葉系幹細胞の集積にPDGFBBが働いていると考えられた。ヒト皮膚における間葉系幹細胞およびPDGFBBの加齢変化を調べたところ、老化に伴い間葉系幹細胞の数が減少していること図6、PDGFB遺伝子の発現も同様に老化で減少することが分かった図7。これらのことから、PDGFBBを維持亢進することにより間葉系幹細胞を多くすることで、皮膚を賦活化できる可能性が考えられる。そこで、PDGFBBの発現を亢進する薬剤についてELISA法および定量PCR法で調べた結果、トレチノインalltransretinoicacidに濃度依存的な活性を見出した図8。