"伝播欠損性であるベータヘルペスウイルス、好ましくは組換えベータヘルペスウイルス。内皮向性であり、かつ/または野生型様ビリオン表面を有する、請求項1に記載のベータヘルペスウイルス。内皮向性であり、野生型様ビリオン表面を有する、請求項1から2のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、免疫応答の誘導に適切であるかまたは免疫応答を誘導でき、好ましくは、前記免疫応答が、ベータヘルペスウイルスに対する中和抗体ならびにベータヘルペスウイルスのエピトープに対してのCD4およびCD8T細胞を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記免疫応答が、中和抗体を含み、ベータヘルペスウイルスが、前記中和抗体により内皮細胞および/または上皮細胞に感染することを妨げられる、請求項4に記載のベータヘルペスウイルス。前記中和抗体により内皮細胞および/または上皮細胞に感染することを妨げられるベータヘルペスウイルスが、病原体、好ましくはヒト病原体である、請求項5に記載のベータヘルペスウイルス。ヒトベータヘルペスウイルスである、請求項1から6のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。サイトメガロウイルスである、請求項1から7のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。ヒトサイトメガロウイルスである、請求項7および8のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。1次および/または2次エンベロープ化に関与する少なくとも1つの遺伝子生成物を欠損している、請求項1から9のいずれか1項、好ましくは請求項9に記載のベータヘルペスウイルス。前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、1次エンベロープ化に関与する、請求項10に記載のベータヘルペスウイルス。前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、UL50およびUL53ならびにそのそれぞれの相同体を含む群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項11に記載のベータヘルペスウイルス。前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、2次エンベロープ化に関与する、請求項10に記載のベータヘルペスウイルス。前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、UL94およびUL99ならびにそのそれぞれの相同体を含む群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項13に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号34によるヌクレオチド配列を含む第4ヌクレオチド配列とを含む、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド252が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項16に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~130670により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243~181652により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第4ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド130670が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~130670により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243~181652により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第4ヌクレオチド配列と、配列番号34によるヌクレオチド配列を含む第5ヌクレオチド配列と、配列番号35によるヌクレオチド配列を含む第6ヌクレオチド配列とを含む、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド252が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド130670が、配列番号35によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号35によるヌクレオチド配列のヌクレオチド67が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項19に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号32によるヌクレオチド配列を含む第4ヌクレオチド配列とを含む、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド179が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項22に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~62129により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~62129により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~181652により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号33によるヌクレオチド配列を含む第4ヌクレオチド配列とを含む、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド38が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項25に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~62129により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド632161~181652により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第4ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ベータヘルペスウイルスが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~62129により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~181652により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192~233681により表される第4ヌクレオチド配列と、配列番号32によるヌクレオチド配列を含む第5ヌクレオチド配列と、配列番号33によるヌクレオチド配列を含む第6ヌクレオチド配列とを含む、請求項1から14のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド179が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド38が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド181652が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド189192と共有結合している、請求項28に記載のベータヘルペスウイルス。UL133、UL134、UL135、UL136、UL137、UL138、UL139、UL140、UL141、UL142、UL143、UL144およびUL145を含む群から選択される1または複数の遺伝子を含む、請求項1から29のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。配列番号23によるヌクレオチド配列を含む、請求項1から30のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。免疫回避遺伝子によりコードされる少なくとも1つの遺伝子生成物を欠損している、請求項1から31のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。免疫回避遺伝子によりコードされる前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、MHCクラスI提示を調節する遺伝子生成物およびNK細胞応答を調節する遺伝子生成物を含む群から選択される、請求項32に記載のベータヘルペスウイルス。免疫回避遺伝子によりコードされる前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、MHCクラスI提示を調節する遺伝子生成物である、請求項33に記載のベータヘルペスウイルス。MHCクラスI提示を調節する前記遺伝子生成物が、US6、US3、US2、UL18、US11、UL83およびUL40を含む群から選択される、請求項34に記載のベータヘルペスウイルス。免疫回避遺伝子によりコードされる前記少なくとも1つの遺伝子生成物が、NK細胞応答を調節する遺伝子生成物である、請求項33に記載のベータヘルペスウイルス。NK細胞応答を調節する前記遺伝子生成物が、遺伝子UL40、UL16およびUL18によりコードされる遺伝子生成物を含む群から選択される、請求項36に記載のベータヘルペスウイルス。異種核酸をコードする、請求項1から37のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記異種核酸が、機能的核酸であり、好ましくは、アンチセンス分子、リボザイムおよびRNA干渉媒介核酸を含む群から選択される、請求項41に記載のベータヘルペスウイルス。前記核酸が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸である、請求項38に記載のベータヘルペスウイルス。前記ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、少なくとも1つの抗原を含む、請求項40に記載のベータヘルペスウイルス。前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生体抗原を含む群から選択される抗原である、請求項41に記載のベータヘルペスウイルス。対象の治療のための方法における使用および/もしくは対象のワクチン接種のための方法における使用のためのまたは使用に適切な、請求項1から42のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記対象が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項43に記載のベータヘルペスウイルス。ヒトサイトメガロウイルスである、請求項43または44に記載のベータヘルペスウイルス。前記対象が、疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性がある、請求項43から45のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記ワクチン接種が、疾患に対するワクチン接種である、請求項43から46のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記疾患が、ベータヘルペスウイルス感染、好ましくはヒトサイトメガロウイルス感染に伴う疾患または状態である、請求項46および47のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記疾患または状態が、先天性封入体病を含む群から選択される、請求項48に記載のベータヘルペスウイルス。前記対象が、妊娠している雌または生殖可能年齢の雌、好ましくは、妊娠している女性または生殖可能年齢の女性である、請求項43から49のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス。前記治療が、雌から前記雌が有しているかまたは将来有する胎児および/または胚へのベータヘルペスウイルス、好ましくはヒトサイトメガロウイルスの移動を妨げるかまたは妨げるのに適するかまたは妨げることができる、請求項50に記載のベータヘルペスウイルス。前記治療が、雌の体内での免疫応答または雌の体内での免疫応答を生じさせるためであるかまたは生じさせるのに適するかまたは生じさせることができ、好ましくはそのような免疫応答が、前記雌が有しているかまたは将来有する胎児および/または胚に、ベータヘルペスウイルス、好ましくはヒトサイトメガロウイルスおよび/またはベータヘルペスウイルス感染、好ましくはヒトサイトメガロウイルス感染に伴う疾患もしくは状態に対する防御を授ける、請求項50に記載のベータヘルペスウイルス。医薬品の製造のための、請求項1から47のいずれかに記載のベータヘルペスウイルスの使用。前記医薬品が、ベータヘルペスウイルス感染の治療および/または予防用である、請求項53に記載の使用。前記医薬品が、ベータヘルペスウイルス感染、好ましくはヒトサイトメガロウイルス感染に伴う疾患もしくは状態の治療および/または予防用である、請求項53に記載の使用。ワクチンの製造のための、請求項1から47のいずれかに記載のベータヘルペスウイルスの使用。前記ワクチンが、ベータヘルペスウイルス感染の治療および/または予防用である、請求項56に記載の使用。前記ワクチンが、ベータヘルペスウイルス感染、好ましくはヒトサイトメガロウイルス感染に伴う疾患もしくは状態の治療および/または予防用である、請求項57に記載の使用。前記ワクチンが、対象への投与のためであるかまたは投与に適し、前記対象が、妊娠している雌、生殖可能年齢の雌、移植片のドナー、移植片のレシピエントおよびHIVに感染しているかもしくはHIVに感染する危険性がある対象を含む群から選択される、請求項56から58のいずれか1項に記載の使用。前記ドナーが、潜在的ドナーであり、かつ/または前記レシピエントが、潜在的レシピエントである、請求項59に記載の使用。前記請求項のいずれかに記載のベータヘルペスウイルスをコードする核酸。請求項61に記載の核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~233681により表される第2ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123688と共有結合している、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~233681により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号34によるヌクレオチド配列を含む第3ヌクレオチド配列とを含む、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド252が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合している、請求項64に記載のベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~130670により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243~233681により表される第3ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド130670が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243と共有結合している、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~122630により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668~130670により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243~233681により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号34によるヌクレオチド配列を含む第3ヌクレオチド配列と、配列番号35によるヌクレオチド配列を含む第4ヌクレオチド配列とを含む、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド122630が、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号34によるヌクレオチド配列のヌクレオチド252が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド123668と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド130670が、配列番号35によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号35によるヌクレオチド配列のヌクレオチド67が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド131243と共有結合している、請求項67に記載のベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~233681により表される第2ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合している、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~233681により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号32によるヌクレオチド配列を含む第3ヌクレオチド配列とを含む、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド179が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合している、請求項70に記載のベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~62129により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~233681により表される第2ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合している、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~62129により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~233681により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号33によるヌクレオチド配列を含む第3ヌクレオチド配列とを含む、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド38が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合している、請求項73に記載のベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~62129により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~233681により表される第3ヌクレオチド配列とを含み、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261と共有結合している、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。前記ベクターが、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1~58442により表される第1核酸配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623~62129により表される第2ヌクレオチド配列と、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド63261~233681により表される第3ヌクレオチド配列と、配列番号32によるヌクレオチド配列を含む第4ヌクレオチド配列と、配列番号33によるヌクレオチド配列を含む第5ヌクレオチド配列とを含む、請求項62に記載の前記核酸を含むベクター。配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド58442が、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号32によるヌクレオチド配列のヌクレオチド179が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド59623と共有結合し、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド62129が、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド1と共有結合し、配列番号33によるヌクレオチド配列のヌクレオチド38が、配列番号20によるヌクレオチド配列のヌクレオチド632161と共有結合している、請求項76に記載のベクター。請求項61に記載の核酸または請求項62から77のいずれか1項に記載のベクターを含む宿主細胞。前記請求項のいずれか1項に記載のベータヘルペスウイルス、請求項61に記載の核酸および/または前記請求項のいずれか1項に記載のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。[伝播アッセイ]本明細書に記載する伝播アッセイは、ベータヘルペスウイルスおよびヒトサイトメガロウイルスの特徴決定の関係において、このようなウイルスが伝播欠損性であるかを決定するために用いることができる。ヒトCMVについての初代線維芽細胞の株化細胞MRC5およびマウスCMVについてのNIH/3T3ならびに補完性細胞株TCL94/99-BPおよびNTM94-7をそれぞれ播き、約0.25のMOIで1時間感染させ、D-PBSで2回洗浄する。細胞を6時間インキュベートし、その後、D-PBSで4回洗浄する。同数の非感染細胞を、5μMのCFSEで8分間染色し、2FCS/D-PBSでブロックし、次いで、2FCS/D-PBSで2回洗浄し、その後、未染色であるが感染した細胞の上に播種した。感染の48時間マウスCMVおよび72時間ヒトCMV後に、4パラホルムアルデヒドPFAを用いてD-PBS中で10分間、37°Cにて共培養物を固定し、洗浄し、0.1TritonX100を10分間用いて透過にした。3回の洗浄後、細胞を、3BSA/D-PBSで1時間ブロックした。最初期染色を、CMVの最初期遺伝子生成物に対する1次抗体、より具体的にはモノクローナル抗体Croma101IgG1アイソタイプKeilらKeilら1987JVirol.612:526~533頁において抗体6/20/1と称されるマウスCMVの最初期タンパク質1に特異的、およびヒトCMV最初期1に特異的なPlachterらにおいてCH160と称されるモノクローナル抗体Plachterら1993Virology193、642~652頁VirusysCo.から市販で入手可能と固定細胞を3BSA/D-PBS中でインキュベートすることにより行った。3回のD-PBS洗浄の後に、細胞を、MCMVの場合に1次抗体Croma101およびヒトCMVの場合にCH160に対してのAlexaFluor555結合2次抗体と、3BSA/D-PBS中でインキュベートした。最後に、細胞を3回洗浄し、LSM510MetaZeissを用いて共焦顕微鏡により画像化した。CMV株または変異体が伝播欠損性であるかを決定するために、野生型CMVに感染した細胞を陽性対照として用いる。伝播欠損性ウイルス伝達は、最初期陽性細胞およびCFSE陽性細胞を、ImageJCellCounterプラグインRasband,WS.ImageJ2009.Bethesda、Maryland、USA、U.S.NationalInstitutesofHealth.このプログラムは、NCBIにて自由にアクセスできる標準でありhttp://rsbweb.nih.gov/ij/、科学出版物において参考として受け入れられているを用いて計数することにより決定する。CFSE染色細胞、最初期陽性細胞および両方のシグナルを示す細胞を計数した。ウイルス伝達は、最初期陽性/CFSE染色細胞と最初期陰性/CFSE染色細胞の間の比率を算出することにより決定した。[ウイルスが内皮向性であるかを決定するためのアッセイ]ここに記載するアッセイは、ウイルスが内皮向性であるかを決定するために用いる。ヒトCMVが内皮向性であるかを決定することについて、初代ヒト線維芽細胞の株化細胞、本発明のHCMVが欠損している関係の遺伝子の生成物を補完する補完株化細胞、およびヒト内皮株化細胞を播き、約0.1のMOIでHCMV野生型または本発明のウイルスに感染させる。感染の24時間後に、最初期染色を、本発明のベータヘルペスウイルスの最初期遺伝子生成物に対するモノクローナル抗体、より具体的にはVirusysCo.から市販で入手可能なCMVIE1/2モノクローナル抗体CH160Plachterら、既出と固定細胞を3BSA/D-PBS中でインキュベートすることにより行う。3回のD-PBS洗浄の後に、細胞を、HCMVのヒト最初期1に対するモノクローナル抗体に対してのAlexaFluor555結合2次抗体と、3BSA/D-PBS中でインキュベートする。最後に、細胞を3回洗浄し、UV顕微鏡により画像化する。野生型HCMVに感染した細胞を陽性対照として用い、最初期1陽性細胞およびCFSE陽性細胞を、ImageJCellCounterプラグインRasband、既出を用いて計数する。マウスCMVが内皮向性であるかを決定することについて、初代マウス線維芽細胞の株化細胞、本発明のMCMVが欠損している関係の遺伝子の生成物を補完する補完性細胞株、およびマウス内皮株化細胞を播き、約0.1のMOIでMCMV野生型または本発明のウイルスに感染させる。感染の24時間後に、最初期染色を、本発明のベータヘルペスウイルスの最初期遺伝子生成物に対するモノクローナル抗体、より具体的にはKeilらKeilら、既出において抗体6/20/1と称されるCroma101と固定細胞を3BSA/D-PBS中でインキュベートすることにより行う。3回のD-PBS洗浄の後に、細胞を、マウスCMVの最初期1に対するマウスモノクローナル抗体に対してのAlexaFluor555結合2次抗体と、3BSA/D-PBS中でインキュベートする。最後に、細胞を3回洗浄し、UV顕微鏡により画像化する。野生型マウスCMVに感染した細胞を陽性対照として用い、最初期1陽性細胞を、ImageJCellCounterプラグインRasband、既出を用いて計数する。[材料および方法][細胞およびマウス]マウス胚性線維芽細胞MEFに由来する線維芽細胞の株化細胞NIH/3T3およびBALB/cは、Cicin-SainらCicin-Sainら2005JVirol79:9492~9502頁に記載されるようにして培養した。C57BL/6B6マウス、B6.SJL-PtprcPtprcマウスおよび129.IFNαβR-/-マウスは、ElevageJanvierLeGenestSaintIsle、France、JacksonLaboratoriesBarHarbor、Maine、USAおよびBKUniversalLimitedGrimston、Englandからそれぞれ購入した。129.IFNαβR-/-マウスMullerら1994Science264:1918~1921頁は、B6バックグラウンドと戻し交配したB6.IFNαβR-/-。T細胞受容体トランスジェニックマウスOT-IHogquistら1994Cell76:17~27頁およびOT-IIBarndenら1998ImmunolCellBiol76:34~40頁は、PtprcCD45.1またはThy1.1CD90.1コンジェニックマウスとそれぞれ戻し交配した。Alb-crePosticら1999JBiolChem274:305~315頁およびTie2-creConstienら2001Genesis30:36~44頁は、B6バックグラウンドで維持した。マウスは、特定の病原体フリーの条件で保持した。動物実験は、Bavaria州の管轄機関承認番号第55.2-1-54-2531-111-07号またはUniversityofRijekaの倫理委員会により承認された。[トランス補完性細胞株NT/M94-7の作製]条件的トランス補完性細胞株NT/M94-7を、Lotzerichら、既出に従って作製した。簡単に述べると、M94ORFをpSM3frSacherら2008CellHostMicrobe3:263~272頁から、プライマーHAM94for配列番号1およびM94rev配列番号2を用いて増幅することにより、N末端にHAタグを導入した。PCR生成物をBamHIおよびXbaIで消化し、BamHI-およびNheI-切断pTRE2HygベクターBDBiosciencesClontech、Heidelberg、Germanyに挿入して、HAM94発現HAM94タンパク質は配列番号31に示すをテトラサイクリンtet誘導性プロモーターの制御下に行うpTRE-HAM94配列番号22を得た。pTRE-HAM94を有する安定なNIH/3T3トランスフェクタントを、50μg/mlハイグロマイシンBを用いて選択した。欠失ウイルスMCMV-ΔM94を、異なるNT/M94細胞クローンにそれぞれのBACをトランスフェクトすることにより再構築した。最も生産性がよく感染されたトランス補完性細胞株NT/M94-7を、限界希釈を用いてサブクローニングした。トランス補完性細胞株を、ブダペスト条約に従って、DSZM、Germanyに、2010年5月5日に寄託した。[組換えウイルスの作製]組換えマウスCMVMCMV変異体は、MCMV細菌人工染色体BACクローンpSM3frSmith株Messerleら1997ProcNatlAcadSciUSA94:14759~14763頁を起源とするに由来した。ヌクレオチドの位置は、RawlinsonらRawlinsonら、既出に従って示す。FRTに挟まれたカナマイシン耐性遺伝子Kanrを有するpCP15の1.4キロ塩基対bpのSmaI断片を、pCR3Invitrogen、Basel、SwitzerlandのBssHII部位に導入して、pCR3-FRT-Kanr-FRTを得た。ATG開始コドンおよびloxP部位を含有する断片を、オリゴヌクレオチドATGlox1配列番号3とATGlox2配列番号4とをアニールすることにより作製した。この断片を、pCR3-FRT-Kanr-FRTのHCMVのメジャー最初期プロモーターIEPとウシ増殖ホルモンのポリAシグナルとの間に位置するEcoRIおよびXhoI部位に挿入して、pCR3-FRT-Kanr-FRT-ATG-loxPを得た。オボアルブミン遺伝子ovaを、pBSK-OVA配列番号21に含まれるのと同様に、GGAAをnt9位の後に導入して合成して、さらなるクローニングのためのBspEI制限部位を得た。Ovaを、pCR3-FRT-Kanr-FRT-ATG-loxPのBspEIおよびNotIを用いてインフレームで挿入して、IEPの制御下で開始ATGの後にloxP部位が挿入された全長ovaを得て、pCR3-FRT-Kanr-FRT-ATG-loxP-ovaと命名した。Cre誘導性オボアルブミンOVA発現を有する構築物配列番号24を得るために、floxstopカセットSacherら、既出を、pCR3-ATG-loxP-ovaのEcoRIおよびBspEI部位に挿入して、pCR3-ATG-flox-stop-ovaを得た。これらの構築物を鋳型として、オリゴヌクレオチド5’-Δm157-pCR3-FRT-Kanr-FRT配列番号5nt216243位~216290位および3’-Δm157-flox-egfp配列番号6nt216885位~216930位をプライマーとして用いて、IEP-ovaカセット、FRTに挟まれたKanrおよびMCMVゲノム標的部位m157に対するウイルス相同配列を含む直鎖状DNA断片を作製した。同様の手順で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子lucを、IEPの制御下に、FRTに挟まれたKanrを有するpCP15中にクローニングした。これらの断片を、記載されるようにしてSacherら、既出pSM3frのm157中に導入して、pSM3fr-Δm157-ova、pSM3fr-Δm157-flox-ovaおよびpSM3fr-Δm157-lucを得た。FRTに挟まれたKanrの切り出しのために、FLPリコンビナーゼを、プラスミドpCP20から一過的に発現させた。[伝播欠損性ウイルス変異体の作製]図1に示すように、大腸菌において、BACpSM3fr-ΔM94を、tTAトランスアクチベーターカセットをpSM3frに挿入して、そのことによりM94を欠失することにより作製した。トランス補完性細胞株NT/M94-7は、pM94を、Tet誘導性プロモーターの制御下に発現する。pSM3fr-ΔM94のトランスフェクションにより、ウイルスゲノムによるtTAの発現が、細胞によるpM94の発現を誘導し、トランス補完MCMV-ΔM94の生成を導く。このウイルスは、非補完性の最初の標的細胞に感染できる。必須遺伝子M94を欠くので、感染性ウイルス粒子の放出は不可能であるが、最初期IE、初期Eおよび後期Lウイルス遺伝子発現ならびにDNA複製DNArepは生じる。M94配列を欠く組換えMCMVを作製するために、親のMCMVBACであるpSM3frMCMV-wt、pSM3fr-Δm157-ovaMCMV-ovaおよびpSM3fr-Δm157-rec-egfpMCMV-Δm157-rec-egfpSacherら、既出を、第2突然変異誘発ステップに用いた。よって、pO6ie-F5からの変異体34bpFRT部位で両側を挟まれたKanrをpO6-tTALotzerichら、既出に挿入することによりプラスミドpO6-tTA-mFRT-Kanr-mFRTを得て、tTAトランス活性化遺伝子を、pM94配列番号30のトランス補完に必要なIEPの制御下に発現させた。tTAカセット、KanrおよびMCMVゲノム標的部位に対するウイルス相同配列MCMV上流相同性:nt136189位~136234位およびMCMV下流相同性:nt137256位~137309位を含む直鎖状DNA断片を、プライマー5’ΔM94-pO6-tTA配列番号7、プライマー3’-ΔM94-pO6-tTA配列番号8ならびにプラスミドpO6-tTA-mFRT-Kanr-mFRTを鋳型として用いて作製した。このPCR断片を、異なる親のpSM3frクローンに挿入して、そのことによりM94遺伝子を欠失した。M94およびM93のORFはオーバーラップするので、47bpの相同性を、M94の5’端に残してM93ORFをインタクトにしなければならず、17bpの相同性がM94の以前の3’端にまだ存在する。ここでもまたFLPリコンビナーゼを、Kanrの切り出しのために発現させた。pSM3fr-ΔM94、pSM3fr-ova-ΔM94、pSM3fr-flox-ova-ΔM94およびpSM3fr-Δm157-rec-egfp-ΔM94の構築を、制限消化分析および配列決定により確認した。ウイルスを、BACDNAから再構築し、NT/M94-7補完細胞上で繁殖させ、以前に記載されたようにしてSacherら、既出、スクロースクッション上で精製した。ウイルス複製の分析のために、感染細胞からの上清を24時間ごとに採取した。感染性ウイルスの定量を、NIH/3T3または補完NT/M94-7細胞に対してTCID50中央組織培養感染量法を用いて行った。invivoウイルス複製の決定のために、ウイルス量を、標準的プラークアッセイにより、器官1グラムあたりのプラーク形成単位PFUとして、記載されたようにしてSacherら、既出決定した。M94欠損変異体MCMV-ΔM94、MCMV-ova-ΔM94、MCMV-flox-ova-ΔM94およびMCMV-Δm157-rec-egfp-ΔM94の各ウイルスストックの伝播欠損性は、非補完MEFの感染後にプラーク形成がないことにより確認したが、個別の感染細胞のCPEは検出可能であった。伝播欠損性MCMV-ΔM94のpSM3fr-ΔM94BACを含有する大腸菌を、ブダペスト条約の下でDSZMに2010年4月28日にDSM23561として寄託した。[ウイルスのUV不活性化]invivoで用いるために、免疫のために用いたMCMV-wtウイルス調製物の画分を、UVクロスリンカーStratagene、Amsterdam、Netherlands中で5cmの距離で4°Cにて、1.5kJ/cm2のUV光に曝露することにより不活性化した。ウイルス感染性は、2.4×107の係数で減少した。同じ処理は、MCMV-Δm157-rec-egfpを異なる線量0.5、1.0および1.5kJ/cm2のUV光に供し、その後、MEF上で力価決定した場合に、ウイルス遺伝子発現を消失させるのに十分であった。感染後p.i.4日後に、ウイルスに低線量0.5kJ/cm2のUVを照射した場合、単回感染細胞においてEGFP発現をモニタリングし、EGFP発現は、強い照射1.5kJ/cm2の後に観察されなかった。未処理MCMV-Δm157-rec-egfpは、EGFPプラークを形成した。[マウスの免疫および攻撃]8~10週齢の雌B6マウスを、MCMV-wtまたは変異体MCMVのいずれかの腹腔内i.p.または皮下s.c.注射により免疫した。各マウスは、100μlのウイルス懸濁物をs.c.で、または300μlをi.p.で受容した。C57BL/6マウスを、1×105TCID50のMCMV-wtもしくはMCMV-deltaM94で、129.IFNαβR-/-を、2.5×105TCID50のMCMV-deltaM94もしくはUV照射MCMV-wtで、そしてB6.IFNαβR-/-を、3×105TCID50のMCMV-ΔM94もしくはMCMV-wtで免疫した。模擬処置マウスは、同じ容量のPBSを受容した。マウスを追加免疫するために、この手順を14日p.i.にて反復した。12週p.i.のマウスから回収した血清を用いて、ウイルス特異的抗体の量を、以下に記載するウイルス中和アッセイにより決定した。初回抗原刺激の28日または20週間後に、マウスを、106PFUの組織培養由来MCMV-wtの静脈内i.v.注射により攻撃した。攻撃の5日後に、肺、肝臓および脾臓を滅菌条件下で回収し、-80°Cに貯蔵した。器官のホモジネートを、感染性ウイルス量について、MEF細胞上での標準的なプラークアッセイにより分析した。唾液腺由来MCMVsgMCMV-wtを、組織培養由来MCMV-wtに感染したマウスからの唾液腺のホモジネートとして、TrgovcichらTrgovcichら2000ArchVirol145:2601~2618頁に記載されるようにして作製した。単離sgMCMV-wtは、組織培養由来MCMV-wtに比較してビルレンスがより高いPilgrimら2007ExpMolPathol.82:269~279頁。ワクチン接種したB6.IFNαβR-/-マウスを、2×105PFUのsgMCMV-wtで攻撃し、129.IFNαβR-/-マウスを、2.5×105TCID50組織培養由来MCMV-wtで攻撃した。[ウイルス中和アッセイ]5匹の免疫化マウス12週p.i.からの熱不活性化血清56°C、30分間をプールし、1:2で、10最終濃度モルモット補体を含有するDMEM中で系列希釈した。各希釈物に、50PFUのMCMV-lucを混合し、90分間、37°Cにてインキュベートし、その後、NIH/3T3細胞に96ウェルフォーマットで加えた。37°Cにて1時間後に、ウイルス接種物を取り出し、NIH/3T3培養物を加えた。培養物を24時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、細胞抽出物において、ルシフェラーゼアッセイPromega、Mannheim、GermanyをルミノメータBerthold、BadWildbad、Germany中で供給業者および製造業者の使用説明にそれぞれ従って用いて決定した。[Invivo細胞傷害性アッセイ]CD8T細胞エフェクター機能をinvivoで評価するために、コンジェニックCD45.1Ptprcマウスの脾細胞を、2μMの記載するペプチドとインキュベートし、2μM、0.7μMまたは0.1μMのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルCFSEおよびPKH26赤色蛍光細胞リンカーミニキットを製造業者の使用説明Sigma-Aldrichに従って用いて染色した。第6日p.i.にて、標識CD45.1細胞を、B6CD45.2レシピエントに移入した。16時間後に、レシピエントマウスの脾臓を取り出し、標的細胞のフローサイトメトリー分析を行った。標的細胞の特異的細胞傷害性を、等式:spec溶解=1-初回攻撃なし比率/初回攻撃あり比率100;比率=CFSElow/CFSEhighを用いて算出したLauterbachら2005JGenVirol86:2401~2410頁。OVA由来クラスIペプチド配列番号9ならびにm139配列番号10、ie3配列番号11、M57配列番号12およびM45配列番号13に由来するMCMV特異的ペプチドSnyderら、2008既出をMetabion、Germanyから購入し、製造業者のデバイスに従って溶解して貯蔵した。[養子導入およびフローサイトメトリー分析]OVA特異的CD8T細胞を、コンジェニックCD45.1マウスと戻し交配したOT-ITCRトランスジェニックマウスの脾臓ならびに頸部、腋窩、上腕および鼠径リンパ節から単離した。OT-I細胞を、CD8αT細胞単離キットMiltenyiBiotec、BergischGladbach、Germanyによるネガティブ選択により精製した。3×105のトランスジェニックT細胞を、レシピエントB6マウスに、105TCID50のMCMVでのi.p.感染の1日前にi.v.注射した。移入されたOT-IT細胞の増殖を追跡するために、100μlの血液を3、6および8日p.i.に採集し、赤血球を溶解しPharmLyse、BDBiosciences、Heidelberg、Germany、残りの細胞を、PE-TexasRed結合α-CD8α5H10;Caltag、Sacramento、CA、USAおよびPE結合α-CD45.1抗体A20;BDBiosciencesPharmingenとインキュベートした。フローサイトメトリーによる取得を、EpicsXL-MCLBeckman-Coulterを用いて行い、データを、FlowJoソフトウェアTristar、Ashland、OR、USAを用いて分析した。OVA特異的CD4T細胞を、コンジェニックCD90.1マウスと戻し交配したOT-IITCRトランスジェニックマウスの脾臓ならびに頸部、腋窩、上腕および鼠径リンパ節から単離した。赤血球の溶解の後に、3×105トランスジェニックT細胞を、レシピエントマウスに、105TCID50のMCMVでの感染の1日前にi.v.注射した。脾臓を取り出し、脾細胞を、Fcブロック2.4G2;BDBiosciencesとインキュベートし、その後、PEコンジュゲートα-CD90.1HIS51;eBioscienceおよびPE-Cy5.5結合α-CD4RM4-5;eBioscienceで染色した。フローサイトメトリーによる取得を、FACSCaliburBDBiosciencesを用いて行い、データを、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。[器官ホモジネート中のウイルスゲノムの定量]肺を、感染の12カ月後にマウスから取り出した。器官をホモジネートし、DNAを、QiagenHilden、GermanyからのDNeasy血液および組織キットを用いて抽出した。溶出を、100μlの供給される溶出緩衝液を用いて行い、各試料のゲノムDNA濃度を、2重で、NanoDropND-1000UV-Vis分光光度計を用いて定量した。ウイルスDNAを定量するために、MCMVM54遺伝子に特異的な定量リアルタイムPCRCicin-Sainら、2005既出を、特異的Taqmanプローブ配列番号14およびTaqman1000RXNPCRコア試薬キットをABIPRISM7700配列検出器AppliedBiosystems、Carlsbad、CA、USAで用いて行った。ウイルスゲノムコピー数を算出するために、M54遺伝子を含有するBACプラスミドpSM3frの標準曲線を含めた。[統計分析]統計分析は、GraphPadPrism4GraphPadSoftwareLaJolla、CA、USAを用いて行った。ウイルスのinvitro増殖比較、中和抗体アッセイ、リアルタイムPCRおよびT細胞増殖のために、平均を、標準偏差SDを用いて算出した。器官におけるウイルス量およびinvivo細胞傷害性を示す全ての図において、中央値を示す。MCMV-wtまたはMCMV-ΔM94をワクチン接種したマウスにおける中和抗体応答の比較を、2元ANOVA検定を用いて行った。器官またはウイルスゲノムにおけるT細胞増殖のパーセンテージおよびウイルスの定量の比較は、ウェブサイトhttp://elegans.swmed.edu/~leon/stats/utest.cgiを用いる両側Wilcoxon順位和検定を用いて行った。アスタリスクは、統計学的な差を示す、P<0.05;、P<0.01;、P<0.001。[MCMV-ΔM94は、伝播欠損性である]HCMVビリオンタンパク質pUL94は、ウイルス複製にとって必須でありDunnら、既出、後期速度論で発現されるWingら、既出。MCMV相同体であるpM94も必須であり、ウイルス成熟の後核ステップにおいて重要な役割を演じることが見出されている。必須のM94遺伝子生成物をトランス補完し、M94欠失変異体を再構築するために、M94遺伝子をTREプロモーターの制御下に有するNIH/3T3由来補完性細胞株NT/M94-7を作製した。TREプロモーターは、TetトランスアクチベーターtTAの存在下でのみ活性である。tTAをpM94のトランス補完のために提供するために、tTA発現カセットを、pSM3frMesserleら、既出に、M94を破壊して導入してpSM3fr-ΔM94を作製した。MCMV-ΔM94ウイルスを、NT/M94-7細胞をトランスフェクトすることにより再構築した図1。次に、NT/M94-7細胞および親のNIH/3T3線維芽細胞にMCMV-ΔM94またはMCMV-wtを感染させる多重ステップ成長分析を行った。本実施例の結果を図2に示す。図2Aにおいて、親のNIH/3T3丸およびNT/M94-7線維芽細胞箱に、0.1TCID50/細胞にてMCMV-wtwt;塗りつぶした記号またはMCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない記号を感染させた。記載する日数にて、上清中の感染性ウイルスを、NT/M94-7細胞上でTCID50終点力価決定により定量した。2重の力価決定の平均/-SDを示す。第5日p.i.にて、上清をMEF上でさらに力価決定した。MCMV-ΔM94に感染したNT/M94-7の1ml上清中でPFUは見出されなかった。p.i.=感染後;DL=検出限界。図2Bに示すように、親のNIH/3T3下のパネルおよびNT/M94-7上のパネル線維芽細胞に、MCMV-Δm157-rec-egfp-ΔM94を感染させた。記載する時点にて、EGFP発現細胞をモニタリングした。hpi=感染後の時間。図2Cに示すように、129.IFNαβR-/-マウスMCMV-ΔM94についてn=15、塗りつぶしていない記号;MCMV-wtについてn=8、塗りつぶした記号に、2.5×105TCID50i.p.を感染させ、生存を30日p.i.にわたって追跡した。MCMV-ΔM94はMCMV-wt様力価をNT/M94-7細胞上で再現したが、感染性ウイルスは、NIH/3T3細胞の上清中で検出できなかった図2A。MCMV-ΔM94が上清中に感染性ウイルス粒子を放出できないことは、細胞に付随するウイルスの伝播を排除しないので、増強緑色蛍光タンパク質EGFPを発現するΔM94変異体MCMV-Δm157-rec-egfp-ΔM94が構築された。MCMV-Δm157-rec-egfp-ΔM94はNT/M94-7細胞上でMCMV-wtに匹敵する速度論で伝播するが、MCMV-Δm157-rec-egfp-ΔM94は、最初に感染したNIH/3T3細胞に厳密に限定されたままであった図2B。この結果は、内皮細胞においても確認された図8。まとめると、M94は必須であり、欠失は、ウイルス放出および細胞間伝播を抑止する。さらに、MCMV-ΔM94は、トランス補完により効果的に生成できる。補完NT/M94-7、親のNIH/3T3線維芽細胞および心筋由来内皮細胞MHEC5-Tに、0.1TCID50/細胞のMCMV-ΔM94-Δm157-rec-egfpMCMV-ΔM94またはMCMV-Δm157-rec-egfpwtを感染させた。記載する時点にてEGFP発現細胞をモニタリングした。尺度バーは100μmを表す。[MCMV-ΔM94は、複製能のあるウイルスに復帰しない]主な安全性の懸念は、調製中Roizmanら1982DevBiolStand.52:287~304頁またはワクチン接種した患者においてIyerら2009Ann.Emerg.Med53:792~795頁ワクチン株が複製能のあるウイルスに復帰することである。MCMV-ΔM94と補完性細胞株との間で相同配列の組換えによりM94遺伝子を獲得することを排除するために、ウイルス構築中に相同性を注意深く回避した。欠失ウイルスとNT/M94-7が発現するM94遺伝子との間の組換えを示す複製能のあるウイルスは、全く観察されなかった。感受性が高いマウス株におけるワクチン接種研究についてMCMV-ΔM94の安全性を調査するために、129.IFNαβR-/-マウスに、MCMV-wtまたはMCMV-ΔM94を感染させた。全てのIFNαβR-/-マウスはMCMV-wtに感染して14日以内に死亡したが、MCMV-ΔM94への感染の後に、全てのマウスは、全く体重減少しないかまたは最小限の体重減少を有して生存した図2C。結論として、MCMV-ΔM94を安全に生成でき、免疫欠損マウスでさえMCMV-ΔM94感染に耐容性であった。[MCMV-ΔM94は、中和抗体およびT細胞応答を誘導する]ウイルス侵入を妨げる中和抗体の誘導が乏しいことは、HCMV感染における問題点であるLandiniら1991CompImmunolMicrobiolInfectDis14:97~105頁。よって、MCMV-wtおよびMCMV-ΔM94に対する中和抗体応答を、免疫後12週に比較した。血清の系列希釈物を、ルシフェラーゼ発現MCMVMCMV-lucと混合した後にNIH/3T3に感染させた。ルシフェラーゼシグナルの低減は、抗血清の中和能力を反映した。MCMV-ΔM94での免疫は、MCMV-wtを用いるよりもわずかに低い量の中和抗体を誘導したが図3A、p<0.05、UV照射MCMV-wtでの免疫は、中和抗体の誘導を消失させ、発表された観察結果が確認されたGillら、既出。本実施例の結果を、図3に示す。図3Aにおいて、B6マウスを、i.p.にて105TCID50のMCMV-wtwt;塗りつぶした丸、MCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない丸で免疫したかまたは模擬感染させたPBS;灰色の四角。12週p.i.にて血液を回収し、血清のウイルス中和能力を、MCMV-lucを用いて決定した。MCMV-ΔM94で免疫したマウスの中和抗体レベルは、2元ANOVA検定を用いて、MCMV-wtで免疫したマウスの抗体レベルよりも有意に低かったP=0.04。値は、測定した血清プールの平均SDを表す。RLU=相対ルシフェラーゼ単位、BG=バックグラウンド。図3Bにおいて、3×105のOT-ICD8T細胞の養子導入の後に上のパネル、B6マウスn=5に、i.p.にて105TCID50のMCMV-ovawt-ova;塗りつぶしたバー、MCMV-ova-ΔM94ΔM94-ova;塗りつぶしていないバーまたはPBS灰色のバーを感染させた。第3、6および8日p.i.にて、コンジェニックマーカーCD45.1およびCD8についてのフローサイトメトリー分析を血液に対して行った。3×105のOT-IICD4T細胞の養子導入の後に下のパネル、B6マウスn=5に、i.p.にて上記のように感染させた。第3、6および8日p.i.にて、CD90.1およびCD4についてのフローサイトメトリー分析を脾細胞に対して行った。各バーは、記載する群の平均SDを表す、P<0.01。図3Cにおいて、B6マウスn=5に、i.p.にて105TCID50のMCMV-wtwt;塗りつぶした記号、MCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない記号またはUV照射MCMV-wtwtUV;灰色の記号を感染させた。第6日p.i.にて、invivo細胞傷害性アッセイを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルCFSEで標識した脾細胞および記載するウイルスペプチドを用いて行った。記号は、個別の動物における記載するペプチドに対する特異的溶解活性を表す。横棒は、分析した群の中央値を示す。右のパネルは、フローサイトメトリーデータの例示的なセットを示す。CD4およびCD8T細胞はともに、CMVに対する宿主防御において重要な役割を演じる。抗ウイルスCD8T細胞は、急性感染中のMCMV制御において効果的であり、免疫の後の防御を媒介するReddehaseら、既出。さらに、CD4Tヘルパー細胞は、唾液腺におけるウイルスクリアランスのために必要であるJonjicら1989JExpMed169:1199~1212頁。MCMV-wtとMCMV-ΔM94により誘導されるCD4およびCD8T細胞応答のレベルを比較するために、ワクチンが発現するモデル抗原としてOVAを選択した。B6マウスにMCMV-ovaおよびMCMV-ova-ΔM94を、OVA特異的CD4またはCD8T細胞の養子導入の1日後に感染させた。MCMV-ovaについて、OVA特異的CD4およびCD8T細胞の発現は、第6日p.i.にてピークになり、発表されたデータと一致したKarrerら、2004JVirol78:2255~2264頁。顕著なことには、MCMV-ova-ΔM94もOVA特異的CD8およびCD4図3BT細胞の増殖応答を、伝播能のあるMCMV-ovaに匹敵する程度まで刺激した。CD8T細胞の量は、MCMV-wtを用いてわずかにより高くさえあったP<0.01。この観察結果を、天然MCMV抗原について確認した。B6マウスに、MCMV-ΔM94またはMCMV-wtを感染させた。6日p.i.にて、m139、ie3、M57またはM45のいずれかに由来するウイルスペプチドを負荷した標的細胞Snyderら、2008既出に注射し、それらの細胞溶解をinvivoにて分析した図3C。MCMV-ΔM94により誘導される細胞溶解性CD8T細胞応答は、MCMV-wtに匹敵することがわかった。これとは対照的に、UV照射MCMVを注射したB6マウスは、標的を全く溶解しないかまたは標的の乏しい溶解だけを生じた。MCMV-ΔM94またはMCMV-wtのUV不活性化も、血清のOVA特異的T細胞増殖およびウイルス中和能力を消失させた。つまり、ウイルス遺伝子発現は、適応免疫応答の誘導に重要であるとみられた。まとめると、伝播欠損性MCMVは、MCMV-wtに匹敵する免疫応答を誘導した。[CD8T細胞活性化におけるウイルス標的細胞型の役割]MCMV-ΔM94に対する強い適応免疫応答は、驚くべきことであった。なぜなら、MCMV-ΔM94遺伝子発現は、最初の標的細胞に限定されるからである。特異的T細胞応答の誘導は、感染細胞および専門の抗原提示細胞による抗原提示に依存するVilladangosら2008Immunity.29:352~361頁。効果的なCD8T細胞応答の発生における異なる細胞型の感染の貢献度を評価するために、複製欠損MCMVを、マーカー遺伝子の条件的活性化と組み合わせたSacherら、既出。Cre媒介組換えの後にのみOVAを発現するMCMV-flox-ova-ΔM94を構築した。105TCID50のMCMV-flox-ova-ΔM94ΔM94-flox-ova、MCMV-ova-ΔM94ΔM94-ova、MCMV-wtwtまたはPBSのi.p.注射の1日前に、3×105のコンジェニックOT-ICD8T細胞を、i.v.にてB6、Alb-creおよびTie2-creマウスに移入した。第6日p.i.にて、コンジェニックマーカーCD45.1およびCD8についてのフローサイトメトリー分析を、PBLに対して行った。箱は、3回の独立した実験のプールとしてのCD8細胞あたりのOT-I細胞の比率を表し、25百分位数から75百分位数までの範囲である。直線は、中央値を示す。ひげは、極度の値を示す範囲に広がる。P値は、両側Wilcoxon順位和検定を用いて得た、P<0.01;、P<0.001。結果を図4に示す。内皮細胞ECおよび肝細胞Hcは、MCMVがinvivoにおいて感染する最初の標的細胞に含まれるSacherら、既出。これらの細胞型がCD8T細胞活性化に貢献するかについて、血管ECTie2-creまたはHcAlb-creにおいてCreリコンビナーゼを選択的に発現するマウスに感染させることにより取り組んだ。OVA特異的CD8T細胞の養子導入の1日後に、マウスに、105TCID50の伝播欠損性MCMV-flox-ova-ΔM94を感染させた。Hcは、感染の最初の数日間、感染性ウイルスを主に生成し、Creリコンビナーゼによる条件的マーカー遺伝子の活性化において非常に効果的であるSacherら、既出。しかし、MCMV感染HcにおけるOVA発現の選択的誘導は、OVA特異的CD8T細胞の弱い増殖だけをもたらした図4。これとは対照的に、OVA特異的CD8T細胞の有意にP<0.001より高い増殖応答が、ECにおけるOVA発現の際に観察された。よって、ECの感染は、Hcの感染よりも、抗ウイルスCD8T細胞応答の誘導により強く貢献する。全ての感染した細胞におけるOVAの発現を導くMCMV-ΔM94-ovaへのC57BL/6マウスの感染は、ECでの選択的な発現MCMV-ΔM94-flox-ovaに感染したTie2-creマウス;P<0.01よりも高い割合のOVA特異的CD8T細胞を誘導するので、さらなる細胞型が、抗原発現およびT細胞刺激に関与するとみられる。さらに、細胞型特異的invivo組換えの後の著しく異なるT細胞応答は、MCMV-ΔM94が細胞から細胞へと伝播できないことを証明する。本実施例に関連する実験の詳細は、実施例3に概説したものに加えて、以下のとおりであり、本実施例の結果は、図5に示す。B6マウスn=5を、第1回s.c.またはi.p.にて105TCID50のMCMV-wtwt;塗りつぶした記号、MCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない記号、Δm01-17m144-158-MCMVΔΔ;灰色の記号またはPBS薄い灰色の記号で免疫した。ウイルス調製物に、記載するように、免疫前にUV照射したUV。場合によって、マウスに、第2回2週間後に同じ用量、経路およびウイルスを追加免疫した。攻撃感染は、i.v.にて、初回の20Aまたは4週間B後に106PFUのMCMV-wtを用いて行った。攻撃の5日後に、プラークアッセイを行った。水平のバーは、各群の中央値を示す。各記号は、1匹の個体マウスを表す。DL=検出限界。[MCMV-ΔM94は、MCMV-wtでの攻撃に対して防御する]致死攻撃に対するMCMV-ΔM94の防御を試験するために、B6マウスに、伝播欠損性MCMV-ΔM94、弱毒化株Δm01-17m144-158-MCMVCicin-Sainら2007JVirol81:13825~13834またはMCMV-wtのいずれかを感染させた。追加感染を、4週間後に同じ用量で行った。初回の20週間後に、マウスを、i.v.にて106TCID50組織培養由来MCMV-wtで攻撃した。最も顕著なことには、単回免疫用量のMCMV-ΔM94が、MCMV-wt複製を肺において10,000倍、肝臓において1,000倍および脾臓において少なくとも100倍、強く抑制するためにすでに十分であったが、非免疫対照は、試験した全ての器官において高いウイルス量を有した全てP<0.01;図5A。概して、MCMV-ΔM94ワクチン接種により媒介される防御は、MCMV-wtまたはΔm01-17m144-158-MCMVワクチン接種に匹敵した全てP>0.05。1回の投与の後にすでに強い防御が達成されたので、追加の効果は検出できなかった。しかし、UV不活性化MCMV-wtまたはUV不活性化MCMV-ΔM94ウイルスを投与した場合に、単回用量の後に弱い防御効果が存在した。UV不活性化ウイルスを追加攻撃した後にのみ、効果はわずかに改善されたが、単回用量のMCMV-ΔM94のものよりも低いままであったP<0.05。短期間のワクチン接種プロトコールにおいてMCMV-ΔM94の単回投与の後にも強い防御を実現できるかが疑問であった。さらに、2つの異なる投与経路の影響も試験した。B6マウスに、i.p.またはs.c.のいずれかにて注射し、その後、たった4週間後に、MCMV-wtを用いて攻撃感染させた。ここで、MCMV-ΔM94を用いるワクチン接種は、Δm01-17m144-158-MCMVでの免疫に匹敵するために、約100倍の攻撃ウイルス量の低減を肝臓P<0.05、肺P<0.01および脾臓P<0.01;図5Bにおいてもたらした。MCMV-wtワクチン接種は、1,000倍の攻撃ウイルス量の低減をもたらしたP<0.01。全般的に、i.p.またはs.c.ワクチン接種経路の間に有意な差はなかったが、s.c.注射は、脾臓P>0.05、図5Bおよび心臓においてわずかによりよい防御を誘導するとみられた。まとめると、伝播欠損性MCMV-ΔM94でのワクチン接種は、免疫能のあるマウスを、MCMV-wtでの攻撃に対して、単回用量のワクチン接種の後に効果的に防御できた。顕著なことには、MCMV-ΔM94でのワクチン接種は、長期間のワクチン接種に関してMCMV-wtでのワクチン接種と同様に効果があったが、UV不活性化ウイルスの使用は、2回目の投与の後にさえ競争できなかった。[重度に免疫低下したレシピエントの防御]I型インターフェロンは、CMVに対する免疫応答における鍵となるサイトカインであり、それらの受容体の欠失は、重度に免疫低下し、MCMV感染に対して親のマウス株よりも少なくとも1,000倍感受性が高いマウスIFNαβR-/-をもたらすPrestiら1998JExpMed188:577~588頁。伝播欠損性MCMV-ΔM94は、IFNαβR-/-マウスにおいて耐容性がよいことが証明されたので図2C、MCMV-ΔM94が、IFNαβR-/-マウスでさえ、致死MCMV-wt攻撃に対して防御できるかを試験した図6Aを参照されたい。B6.IFNαβR-/-マウスを、MCMV-ΔM94または致死用量以下のMCMV-wtで免疫した。両方の群は生存し、MCMV-ΔM94で免疫したマウスは、著しい体重減少を示さなかったが、MCMV-wt感染マウスは、およそ15体重が低下した。4週間後に、マウスを、致死用量のよりビルレントな唾液腺由来MCMVへの感染により攻撃した実施例3に記載されるようにして。最も著しいことに、MCMV-ΔM94およびMCMV-wtでのワクチン接種はともに防御的であり、全ての動物は生存した図6A。本実施例の結果を図6に示す。図6Aにおいて、B6.IFNαβR-/-n=6マウスを、i.p.にて3×105TCID50のMCMV-wtwt;黒色の丸またはMCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない丸で免疫した。B6.IFNαβR-/-灰色の丸またはB6灰色の三角の対照群は、PBSで処理した。4週間後に、攻撃感染を、2×105PFUの唾液腺由来MCMVsgMCMV-wtマウスのi.p.注射により行い、生存をモニタリングした。図6Bにおいて、2.5×105TCID50のMCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない丸、n=8またはUV照射MCMV-wtwtUV;塗りつぶした下向きの三角、n=8で4週間前に免疫した129.IFNαβR-/-マウスを、致死用量のMCMV-wtで攻撃し図2Cを参照されたい、生存をモニタリングした。10倍高い用量のMCMV-wtを、MCMV-ΔM94で免疫したマウスn=7に投与した塗りつぶしていない三角。B6マウスは、ナチュラルキラー細胞のLy49H依存性活性化により利益を受け、m157によりコードされるMCMVタンパク質により刺激される強い自然免疫応答が得られるSunら2008.J.Exp.Med.205:1819~1828頁。129.IFNαβR-/-マウスは、Ly49Hを発現せず、B6.IFNαβR-/-マウスよりもMCMV感染に対してさらに感受性が高い。129.IFNαβR-/-マウスに、MCMV-ΔM94をワクチン接種し、2.5×105TCID50の用量の組織培養由来MCMV-wtで4週間後に攻撃した図6B。以前のデータと一致してCicin-Sainら2007既出、UV不活性化ウイルスでのワクチン接種は、部分的防御だけを媒介し、死亡を短期間遅らせることができた。MCMV-ΔM94をワクチン接種したマウスは、2.5×106TCID50の用量の致死攻撃でも生存した。まとめると、MCMV-ΔM94でのワクチン接種は、感受性が高い免疫低下マウスでさえ、致死MCMV攻撃に対して防御できる。[MCMV-ΔM94ゲノムのinvivoでの維持]弱毒化生ワクチンの使用に対するある議論は、再活性化の危険性を有する潜伏感染を確立するそれらの能力であるIyerら、既出。他方、非増殖性再活性化エピソードは、抗ウイルス免疫応答の内因的上昇をもたらし得るSnyderら2008Immunity29:650~659頁。よって、MCMV-ΔM94ゲノムが、ワクチン接種した宿主において維持されるかを試験することに興味があった。CMV疾患の鍵となる徴候部位であるBalthesenら1993JVirol67:5360~5366頁肺から抽出したトータルDNAに対する定量PCR分析を行った。12カ月p.i.にて、MCMV-ΔM94のゲノムを、試験した全てのマウスにおいて検出でき図7AおよびB、このことは、MCMV-ΔM94のゲノムが維持されたことを示した。興味深いことに、MCMV-ΔM94およびMCMV-wtへの感染の1年後に肺で検出されたゲノム数は、有意な差がなかったP>0.05。この知見は、最初の標的細胞の少なくともいくらかは、ウイルスにより誘導される細胞死または免疫応答による排除によって感染後に失われないことを証明した。まとめると、これらのデータは、ウイルス伝播が、長期間のゲノム維持のために必要でなく、MCMV-ΔM94の最初の標的細胞が、より持続的な免疫応答に貢献できることについての最初の証拠ももたらす。本実施例の結果を図7に示す。B6マウスに、i.p.にて105TCID50のMCMV-wtwtn=5またはMCMV-ΔM94ΔM94n=6を感染させた。12カ月p.i.にて、トータルDNAを肺から抽出した。図7APCR分析を行って、ポリメラーゼ遺伝子M54の特異的246bp断片を得た。対照として、105TCID50のMCMV-wtwt急性n=5、PBS1、鋳型なし2またはBACプラスミドpSM3fr3への感染の5日後の肺からのDNAを用いた。図7B定量リアルタイムPCR分析を行い、ウイルスM54遺伝子コピーを、1μgのゲノムDNAあたり算出した。各記号は、1匹の個体マウスを表す。水平なバーは、各群の中央値を示す。MCMV-wtwtおよびMCMV-ΔM94ΔM94のゲノムコピー数は、有意な差がないP>0.05。両方の群は、急性感染肺wt急性と比較して有意に異なる、P<0.01。MW=分子量マーカー;DL=検出限界。図7Cおよび図7DB6マウスn=5を、i.p.にて105TCID50のMCMV-wtwt;塗りつぶした記号、MCMV-ΔM94ΔM94;塗りつぶしていない記号、Δm01-17m144-158-MCMVΔΔ;灰色の記号またはPBS薄い灰色の記号で免疫した。ウイルス調製物に、記載するように、免疫前にUV照射したUV。攻撃感染を、i.v.にて、初回の1年後に106PFUのMCMV-wtを用いて行った。プラークアッセイを図7C攻撃の5日後に肺を用い、図7D攻撃の14日後に唾液腺SGを用いて行った。水平のバーは、各群の中央値を示す。各記号は、1匹の個体マウスを表す。DL=検出限界。[MCMV-ΔM94でのワクチン接種は、気道でのウイルス複製を妨げる]疫学的研究から、唾液が、HCMVの伝達の重要な経路であることが示唆されたPassら1986N.Engl.JMed314:1414~1418頁。ワクチンMCMV-ΔM94が唾液腺および肺におけるウイルス複製を遮断できるかを試験するために、C57BL/6マウスを、MCMV-ΔM94または対照ウイルスで免疫し、12カ月後に、106PFUのMCMV-wtでの攻撃感染をi.v.で与えた図7CおよびD。MCMV-ΔM94の単回投与は、6匹の動物のうち4匹において、肺で1,000を超える係数で攻撃ウイルス複製を抑制するために十分であった図7C。さらに、攻撃ウイルスは、攻撃の14日後に唾液腺から単離できなかった図7D。このことは、唾液を介して気道からウイルスが出てくることおよびそれによるこの経路による水平伝達が、伝播欠損性MCMVでのワクチン接種により抑止されることを意味する。[考察]本明細書において、伝播欠損性ワクチンを用いるベータヘルペスウイルスに対するワクチン接種について報告する。このワクチンは、MCMV-wtに匹敵する強い適応免疫応答を誘導し、高度に免疫低下したマウスにおいてさえ防御を授けた。このことは、最初の標的細胞の感染が、ワクチン接種の成功にとって十分であることを意味する。インタクトな免疫系は、通常、HCMV疾患に対して防御する。よって、野生型ウイルスの抗原性能力は、防御免疫応答の誘導のために十分である。UV不活性化ウイルスが攻撃感染に対して効果的に防御できないことは、非構造性抗原を含むウイルス抗原発現の必要性を実証したCicin-Sainら2007既出;Gillら2000JMedVirol62:127~139頁。その結果、理想的なワクチンは、野生型ウイルスの完全な免疫原性の能力を活用するが、病原性の能力を回避すべきである。アルファ-ヘルペスウイルスの分野は、複製欠損ウイルスをワクチンとして用いることにより開拓されてきたDudekら、既出。これらのワクチンは、ウイルス複製のために必須の遺伝子の欠失により作製され、よって、非病原性であるDudekら、既出。今回、伝播欠損性ベータヘルペスウイルスワクチンを構築するために、M94の欠失が、以下の理由により選択された。まず、M94は、MCMVの伝播のために必須であり、HCMVの研究から推測して、ウイルス複製の後期速度論に従って発現されるはずであるScottら、既出;Wingら、既出。次に、pM94は、HCMVの中和抗体応答についての主要な標的を含む糖タンパク質の群に属さない。第3に、MCMVのM94は、ヒト病原体への翻訳を原則的に可能にするヒトCMVにおけるUL94の相同体であるWingら、既出。最後に、HCMVのUL94の欠失は、pUL94が全身性硬化症に関連する自己反応性抗体を誘導するので、より有利であり得るLunardiら2000NatMed6:1183~1186頁。SSc交差反応性UL94ペプチドを配列番号28に示す。興味深いことに、伝播欠損性MCMV-ΔM94のゲノムは、i.p.感染後の肺において検出され、ウイルスが、遊離の粒子としてHsuら2009JGenVirol90:33~43頁または細胞に付随して広まることができることを示す。単球およびマクロファージは、感染後の腹腔に誘引され、ウイルスを血液中に輸送することが示されたStoddartら1994JVirol68:6243~6253頁;vanderStrateら2003JVirol77:11274~11278頁。これらの細胞は、離れた部位にてウイルスを放出して、ECまたは他の細胞型に感染することもできたトランス感染と呼ばれるプロセスHalaryら2002Immunity17:653~664頁。本明細書に示す伝播欠損性ベータヘルペスウイルスワクチンは、野生型CMV感染に類似する強い防御能力を有する。ワクチンの免疫応答は、全ての分析した器官においてウイルス複製を制御して、顕性CMV疾患を妨げる。長期間ワクチン接種したマウスの唾液腺において攻撃の2週間後に検出可能な量の感染性ウイルスが存在しなかったことは、唾液を介する他の個体への水平伝達も抑止されることを意味する。このことにより、このような等価なワクチンが、予め存在する感染の防御効果と同様に、HCMV疾患に対して防御する可能性が高い。このことは、HCMVに曝露された女性が、非感染女性と比較して、徴候となる疾患を有する小児を生む危険性がより低かったという観察結果により支持されるFowlerら2003JAMA289:1008~1011頁。母体が血清陽性であることは、感染を妨げることはできなかったが、小児の発病を妨げることができた。さらに、異なるCMV株に頻繁に曝露されることは、再感染に対する免疫をさらに増加できたAdlerら、既出。よって、ここでもまた、伝播欠損性ヒトCMVワクチンが、徴候となるヒトCMV感染に対して防御する自然感染に等しい免疫応答を、再活性化および発病の危険性なしで誘導する可能性が高い。MCMV-ΔM94に対する免疫応答は、MCMV-wtに匹敵するレベルに達した。防御は、32のウイルス遺伝子を欠くが、invitroで伝播欠損性でない最近作製されたワクチンΔm01-17m144-158-MCMVCicin-Sainら2007既出と同様であった。Δm01-17m144-158-MCMVにおいて、免疫回避遺伝子は、抗ウイルス免疫応答を増加させ、よって、ウイルスを弱毒化するために欠失されているScalzoら2007ImmunolCellBiol85:46~54頁。a少なくとも1つの必須遺伝子とb少なくとも1つの免疫回避遺伝子が欠失されていることが本発明の実施形態の範囲内であり、ここで、欠失される少なくとも1つの免疫回避遺伝子が、抗原提示、サイトカインとの相互作用、補完系および体液性免疫に影響する遺伝子生成物をコードする遺伝子を含む群から選択されることが好ましい。より好ましくは、欠失される少なくとも1つの免疫回避遺伝子は、MHCIを下方制御してCTL応答を回避する遺伝子生成物、NK細胞応答を回避する遺伝子生成物、MHCII提示に干渉し、接着分子を下方制御する遺伝子生成物、IL-1と相互作用する遺伝子生成物、TGF-βを活性化する遺伝子生成物をコードする遺伝子を含む群から選択される。感受性IFNαβR-/-マウスの伝播欠損性MCMVへの感染は、ワクチン接種コンセプトの安全性を証明した。さらに、IFNαβR-/-マウスは、本来なら致死の攻撃に対して、その他の感染モデルと同様に防御されたCalvo-Pinillaら2009PLoSOne.4:e5171;Paranら2009JInfectDis199:39~48頁。最近の研究は、I型インターフェロンを効果的に誘導するMCMVの能力について明らかにしているがHokeness-Antonelliら2007JImmunol179:6176~6183頁、IFNαβR-/-マウスにおける伝播欠損性MCMVワクチンの効力は、I型インターフェロン依存性免疫が、短期間のワクチン接種により授けられる防御において必須でないことを意味する。興味深いことに、伝播欠損性MCMVは、適応免疫応答を、MCMV-wtと同様の効率で誘導した。CD4およびCD8T細胞応答は、MCMV-wtと同じレベルであり、中和抗体応答は、わずかに低減されただけであった。このわずかにより低い中和能力は、感染細胞の数がより少ないことおよびそれによりMCMV-ΔM94での感染後に放出される抗原の量が低減されたことを原因とする可能性がある。より少数の抗原-抗体複合体は、あまり効果的でない親和性成熟を導き、より低い中和能力の抗体を創出する可能性がある。それにもかかわらず、ウイルスの中和は、ウイルス複製を制御するために十分であるとみられる。なぜ、ワクチンに対する適応免疫応答は、伝播不能性にもかかわらずMCMV-wt感染に近いレベルに達したのかMCMV-ΔM94は、ウイルスゲノム維持を、MCMV-wtと同様に効果的に確立できた。ヘルペスウイルス潜伏感染の伝統的な定義は、後続の感染性ウイルスの放出を有する再活性化遺伝子発現の能力を含むRoizmanら1987AnnuRevMicrobiol41:543~571頁。用語潜伏感染は、増殖性感染がないMCMV-ΔM94での状況に形式的に当てはめることはできないが、pM94が遺伝子発現の再活性化に影響するという証拠は存在しない。MCMV-ΔM94の防御効果は、時間経過とともに衰えるよりもむしろ増加したので、本発明者らは、遺伝子発現の再活性化による免疫応答の周期的な再刺激が、MCMV-ΔM94により誘導される持続的な防御に貢献したと考える。興味深いことに、ウイルスに感染した細胞は、活性化された免疫応答により排除されない。このことは、伝播欠損性ワクチンに感染した最初の標的細胞が、排除に対して耐性であることを意味する。同様に、ガンマヘルペスウイルスMHV-68の伝播欠損性変異体に感染した細胞は、適応免疫応答により攻撃されなかったTibbettsら2006Virology353:210~219頁。MCMV-wtについて、T細胞が、専門のAPCにより提示されるM45の抗原性が高いウイルスエピトープに対して活性化されたが、活性化されたT細胞は、C57BL/6マウスの器官において感染した標的細胞を排除しなかったことが示されたHoltappelsら2004JExpMed199:131~136頁。この防御は、MHCクラスIを下方調節することが知られているm152により引き起こされた。CD8T細胞排除から防御された標的細胞は同定されず、これらの防御された細胞の少なくともいくらかは、MCMVの最初の標的細胞であることを示すことができた。内皮細胞EC、肝細胞Hcおよびマクロファージは、HCMVおよびMCMVについてinvivoでの最初の標的細胞であるHsuら、既出;Sacherら、既出。さらに、ECは、ウイルス潜伏感染の部位として最近同定されSeckertら2009JVirol83:8869~8884頁、少なくとも肝臓ECは、細胞傷害性T細胞応答を直接刺激できるKernら2010Gastroenterology1381:336~46頁。MCMV-ΔM94構築物を条件的遺伝子発現のために用いて、CD8T細胞応答を活性化するECおよびHcの能力において実質的な差が認められた。ECとは対照的に、急性感染中のMCMVによる最も重要な最初の標的の1つであるHcSacherら、既出は、乏しいCD8T細胞応答だけを誘導した。この刺激能力の欠如は、明らかに、専門の抗原提示細胞による交差提示により補償されない。交差提示は、単サイクルMCMVに感染した線維芽細胞に対するT細胞応答の誘導のために重要であること示されたSnyderら2010PLoSOne.5:e9681。他方、重要な交差提示細胞であると考えられる骨髄由来APCは、MCMV感染に対する交差提示によるCD8T細胞応答の活性化に必要でないとみられるKernら、既出。ほとんどの感染細胞における抗原発現が感染ECのみにおける発現よりも強いT細胞応答を導いたので、ECに加えて、その他の細胞型もCD8T細胞刺激に貢献するとみられる。感染樹状細胞およびマクロファージは、MCMVに対するT細胞応答をinvitroにて活性化すると記載されMathysら2003JInfectDis187:988~999頁、invivoで感染するAndrewsら2001NatImmunol2:1077~1084。よって、このこと自体が、感染した専門APCが、ECに加えて、MCMVに対する免疫刺激に貢献することを示唆する。免疫原性の20倍の低減および免疫防御を授けることができないことを特徴とするAdlerら、既出TowneおよびAD169のような弱毒化ヒトCMV株が、変異を蓄積し、EC、上皮細胞、平滑筋細胞およびマクロファージに感染できなくなったHahn,G.ら2004JVirol78:10023~10033頁ことは、注目すべきことであるとみられる。よって、制限された細胞向性は、実際に、ヒトCMVワクチンとしてそれらが失敗したことの原因である可能性が高い。[MCMV-ΔM94の伝播アッセイ]MCMV-ΔM94の表現型を、細胞間伝播において分析した。このことは、以下の改変を有する本明細書の実施例1に本質的に記載したようなinvitro伝播アッセイにより調査した。本実施例の結果を図9に示す。NIH/3T3およびNT/M94-7細胞を播き、MCMVΔ1-16-FRTdel1-16およびMCMVΔM94tTAΔに0.25のMOIにて1時間感染させ、次いで、D-PBSで2回洗浄した。細胞を6時間インキュベートし、その後、D-PBSで4回洗浄した。同数の非感染細胞を、5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルCFSEで8分間染色し、2FCS/D-PBSでブロックし、2FCS/D-PBSで2回洗浄し、その後、未染色であるが感染した細胞の上に播種した。細胞を、感染の48時間後に4PFAを用いてD-PBS中で10分間、37°Cにて固定し、洗浄し、0.1TritonX-100を10分間用いて透過にした。3回の洗浄後、細胞を、3BSA/D-PBSで1時間ブロックした。最初期遺伝子生成物の染色を、MCMV最初期1に対するモノクローナル抗体と固定細胞を3BSA/D-PBS中でインキュベートすることにより行った。3回のD-PBS洗浄の後に、細胞を、AlexaFluor555結合抗マウス2次抗体Invitrogenと3BSA/D-PBS中でインキュベートした。最後に、細胞を3回洗浄し、LSM510MetaZeissを用いて共焦顕微鏡により画像化した。ウイルス伝達は、最初期1陽性細胞およびCFSE陽性細胞を、ImageJCellCounterプラグインを用いて計数することにより決定した。図9は、MCMVΔ1-16-FRTMohrCAら、Engineeringofcytomegalovirusgenomesforrecombinantliveherpesvirusvaccines;IntJMedMicrobiol.2008年1月;2981~2:115~25頁。Epub2007年8月16日、概説およびMCMV-ΔM94へのNIH/3T3およびNT/M94-7NTM94細胞の感染と、感染後の多数回の洗浄による過剰ウイルスの除去を示す。次に、CFSE染色NIH/3T3を加え、ウイルス複製を可能にした。さらに48時間後に、培養物を固定し、最初期1について染色した。このことにより、最初期1陽性、CFSE陽性または両方の染色について陽性の細胞が得られた図9A。染色された細胞を計数し、細胞間伝播を、最初期1陽性/CFSE染色細胞と最初期1陽性/CFSE陰性細胞の間の比率を算出することにより決定した図9C。MCMVΔ1-16-FRTの伝播率を100とした。MCMVΔ1-16-FRT感染は、多数の二重染色された核により示されるように、細胞培養物全体に迅速に伝播した図9B。これとは対照的に、M94欠失変異体は、新しく加えた細胞に感染しなかった。1つだけの二重染色された核が、416の最初期1/CFSE陰性細胞を計数した後にみられた。新鮮な細胞に感染するその能力は、しかし、補完NT/M94-7細胞上で変異体が成長したときに97の伝達率まで回復した。よって、このことは、マウスCMVの2次エンベロープ化に対するM94欠失の影響も、細胞間伝播の欠損をもたらしたことの証拠になる。[伝播欠損性ヒトCMVの繁殖][トランス補完性細胞株TCL94/99-BPの作製]aEGFPと結合したUL99pCB-Ubic-UL99-IRES-gfp;配列番号18によりコードされると、bUL94mCherryと結合したUL99pCB-Ubic-UL94-IRES-mChe;配列番号17によりコードされると、cピューロマイシン耐性遺伝子と結合したベータ-ラクタマーゼpLV-Ubiqc-BLAs-IRES-Puro;配列番号19によりコードされるとを発現する組換えレンチウイルスを構築し、SirionGmbHによりViraPowerレンチウイルスパッケージングミックスInvitrogenを293FT細胞Invitrogenにおいて用いて繁殖させた。2×106のMRC5線維芽細胞ATCCCCL-171に、5TDU/細胞形質導入単位/細胞の各レンチウイルスを、製造業者のプロトコールに従ってスピン感染により形質導入した。形質導入細胞を、10cmの皿に播き、OPTI-MEM5FCS中の20μg/mlピューロマイシンを用いて5日間選択した。形質導入細胞を20μg/mlのピューロマイシンの存在下で1回継代し1:2、二重陽性mCherryEGFP細胞を、蛍光関連細胞選別により精製し、2.5×104細胞/cm2の密度で再び播いた。集密の48時間後に、細胞を20μg/mlのピューロマイシンの存在下でさらに2回継代し1:5、上記のようにして再選別した。OPTI-MEM5FCS20μg/mlのピューロマイシン中でさらに1回継代した後に、細胞を0.7×107細胞/バイアルに分割し、10FCSおよび10DMSOを補ったOPTI-MEM中で急速冷凍した。[伝播欠損性ヒトCMVの構築]非機能的UL94遺伝子座を作製するために、pTB40E-BAC4-FRT;配列番号20ScrivanoLら、2011.HCMVspreadandcelltropismaredeterminedbydistinctviruspopulations.PLoS.Pathog.7:e1001256;Sinzger,C.ら、2008.Cloningandsequencingofahighlyproductive,endotheliotropicvirusstrainderivedfromhumancytomegalovirusTB40/E.J.Gen.Virol.89:359~368頁をGS1783大腸菌株Tischer,B.K.ら、2010.Enpassantmutagenesis:atwostepmarkerlessredrecombinationsystem.MethodsMol.Biol.634:421~430頁に導入した。aRed組換えを、合成DNA断片LIFdel94;配列番号15を標準的なプロトコールTischer,B.K.ら、既出に従って電気的形質転換することにより誘導して、pTB40E-BAC4-delUL94-SZeoを得た。25μg/mlクロラムフェニコールおよび30μg/mlゼオシンの存在下でLB寒天プレート上に形質転換体を播いた後に単独クローンを採取することにより、組換え体を選択した。配列番号20を参照してnt122630から123668までのBAC配列がLIFdelUL94、配列番号15で正しく置き換えられたことを、制限パターン分析および配列決定により確認した。bゼオシンカセットをUL94遺伝子座から除くために、2回目のRed組換えを、pTB40E-BAC4-delUL94-Szeoの液体培養物中で、標準的なプロトコールTischer,B.K.ら、既出に従って、25μg/mlクロラムフェニコールおよび2のL-アラビノースの存在下で誘導した。25μg/mlクロラムフェニコール1のL-アラビノースの存在下でLB寒天プレート上に組換え体を播いた後に単独クローンを採取することにより、新造pTB40E-BAC4-del94である組換え体を選択した。作動配列の正しい除去は、制限パターン分析および配列決定により確認した。c次のred組換えを、合成突然変異誘発断片LIFdel99、配列番号16の上記のようなこの項のaを参照されたい電気的形質転換により誘導して、pTB40E-BAC4-delUL94-del99-SZeoを得た。25μg/mlクロラムフェニコールおよび30μg/mlゼオシンの存在下でLB寒天プレート上に形質転換体を播いた後に単独クローンを採取することにより、組換え体を選択した。nt130670から131243まで本明細書において配列番号20というBACの番号付けに従うの配列の正しい置き換えを、制限パターン分析および配列決定により確認した。dゼオシンカセットをUL99遺伝子座から除くために、最後の回のred組換えを、pTB40E-BAC4-delUL94-delUL99-Szeoの液体培養物中で、上記のようにして誘導したこの項のbを参照されたい。25μg/mlクロラムフェニコール1のL-アラビノースの存在下でLB寒天プレート上に形質転換体を播いた後に単独クローンを採取することにより、新造pTB40E-BAC4-del94-del99である組換え体を選択した。UL99遺伝子座からの作動配列の正しい除去は、制限パターン分析および配列決定により確認した。1.新しい様式でのBAC改変の説明は、次のとおりである。M1非機能的UL94を作製するまたはUL94遺伝子を不活性化するために、nt122630とnt123668との間のpTB40E-BAC4-FRT配列番号20のnt配列を、合成断片delUL94S配列番号34で置き換える。M2非機能的UL99を作製するまたはUL99遺伝子を不活性化するために、nt130670とnt131243との間のpTB40E-BAC4-FRT配列番号20のnt配列を、合成断片delUL99S配列番号35で置き換える。UL94-UL99の二重変異体のために、このことは、M1の改変に加えて行わなければならない。M3非機能的UL50を作製するまたはUL50遺伝子を不活性化するために、nt58442とnt59622との間のpTB40E-BAC4-FRT配列番号20のnt配列を、合成断片delUL50S配列番号32で置き換える。M4非機能的UL53を作製するまたはUL53遺伝子を不活性化するために、nt62129とnt63261との間のpTB40E-BAC4-FRT配列番号20のnt配列を、合成断片delUL53S配列番号33で置き換える。UL50-UL53の二重変異体のために、このことは、M3の改変に加えて行わなければならない。[伝播欠損性ヒトCMVの再構築]0.7×107凍結TCL94/99-BP細胞を、0.2μg/mlピューロマイシンを含有するOPTI-MEM5FCS中で10cmの皿に播き、2日後に、接着細胞を剥がし、6cmの皿に、皿あたり2×106細胞の密度で播いた。次の日に、2枚の6cm培養物に、2μgの精製pTB40E-BAC4-FRT-del94-del99-DNAをそれぞれ、Lipofectamin2000Invitrogenにより、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。24時間後に、2枚の培養物を併せ、OPTI-MEM5FCS中で10cmの皿に播いた。10日後に、組換えTB40E-BAC4-FRT-del94-del99ウイルスの再構築が、プラークの形成により示された。トランスフェクトされた培養物中のほとんどの細胞がCPEを示した14~16日後に、培養物全体を採集した。生存ウイルスの量を、MohrらMohr,C.A.ら、2010.Aspread-deficientcytomegalovirusforassessmentoffirst-targetcellsinvaccination.Virol.2010年8月;8415:7730~42頁。Epub2010年5月12日に記載されるTCID50中央組織培養感染量法を用いて、96ウェルプレート中で、集密以下のTCL94/99-BP細胞上での限界希釈により決定した。TB40E-BAC4-FRTdel94-99から再構築した伝播欠損性ヒトCMVは、細胞あたり0.1MOIで感染した後のTCL94/99-BP細胞を用い、ScrivanoらScrivanoら、既出に記載されるヒトCMVの繁殖のための標準的なプロトコールを用いて繁殖できる。2次エンベロープ化複合体、すなわちUL99およびUL94を欠くHCMVは、伝播欠損性である。TB40E-BAC4-FRTdel94-99から再構築したUL94-UL99二重欠失CMVの表現型を、細胞間伝播において試験した。このことは、TB40E-BAC4-FRT-del94-del99およびTB40E-BAC4-FRTからそれぞれ再構築したCMVに、本明細書の実施例1に本質的に記載するようにして、MRC5およびTCL94/99-BP細胞を感染させ、その後、過剰のウイルスを、感染後の多数回の洗浄により除去することにより調べた。次に、CFSE染色MRC5細胞を加え、ウイルス複製を可能にした。さらに72時間後に、培養物を固定し、最初期1発現について本明細書の実施例1に記載するようにして染色した。このことにより、最初期1陽性、CFSE陽性または両方の染色について陽性の細胞が得られた。これらの細胞を、各調製物について計数した。TB40E-BAC4-FRT-del94-del99に感染した後のMRC5において二重陽性細胞の増加がないことは、細胞間伝播の欠損の決め手である。[伝播欠損性ヒトCMVでの免疫化]伝播欠損性ヒトCMVを用いる初回免疫および追加免疫の後に、ヒト血清は、内皮細胞または上皮細胞例えばそれぞれHUVEC[ATCCCRL1730]またはARPE-19[ATCCCRL2302]においてアッセイして、ヒト線維芽細胞株化細胞例えばMRC5、ATCCCLL-171においてアッセイした同じウイルスに対するよりも、TB40EまたはVR1814のような内皮向性ヒトCMV株に対して少なくとも64倍高い中和効力を示す。さらに、UL130、UL128またはUL131Aの遺伝子生成物に対してここでは、少なくとも1つの特異性が見られれば十分である、ウェスタンブロットにより特異的抗体応答を検出できる。記載した遺伝子の以下の欠失は、伝播欠損性である組換えヒトベータヘルペスウイルスをもたらす。本明細書、特許請求の範囲、配列表および/または図面に開示する本発明の特徴は、別々にでもそれらの任意の組み合わせにおいても、本発明を様々な形態で実現するために実質的である。配列表が、本明細書の一部分であることが認識されなければならない。"