"担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤を用いてクロマトグラフィーによって二種以上の水溶性生体関連物質の混合液から水溶性生体関連物質を分離する方法。前記水溶性生体関連物質が、糖類、核酸化合物類、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドから選ばれる1種以上であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記多糖がセルロース又はアミロースであることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる、水溶性生体関連物質分離用の分離剤。前記水溶性生体関連物質が、糖類、核酸化合物類、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドから選ばれる1種以上であることを特徴とする、請求項4に記載の分離剤。前記多糖がセルロース又はアミロースであることを特徴とする請求項4又は5に記載の分離剤。本発明は、水溶性生体関連物質を分離する新規な方法を提供する。本発明者らは、シリカゲルに多糖が化学結合してなる分離剤が、水溶性生体関連物質の化合物ごとへの分離に優れていることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤を用いてクロマトグラフィーによって二種以上の水溶性生体関連物質の混合液から水溶性生体関連物質を分離する方法を提供する。また本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる、水溶性生体関連物質分離用の分離剤を提供する。また本発明は、前記水溶性生体関連物質が、糖類、核酸化合物類、アミノ酸、水溶性ビタミン、生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドから選ばれる1種以上である前記の方法及び分離剤を提供する。また本発明は、前記多糖がセルロース又はアミロースである前記の方法及び分離剤を提供する。本発明は、担体と担体の表面に化学結合によって結合する多糖とからなる分離剤という、これまで水溶性生体関連物質の化合物ごとへの分離能を有することが知られていない分離剤を用いることから、水溶性生体関連物質の新たな分離方法を提供することができる。180°C、2時間における真空乾燥によって予め活性化しておいたシリカゲル富士シリシア化学株製、平均孔径50nm、粒径5μm10gに脱水ベンゼン12mL、脱水ピリジン1mLを添加し、3-アミノプロピルトリエトキシシラン0.7mLを加えて90°Cで12時間反応させた。この表面処理シリカゲルを、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄した後、60°Cで2時間真空乾燥し、表面にアミノプロピル基が結合した表面処理シリカゲルを得た。得られた表面処理シリカゲルに、アミロース1.0g平均重合度:160を脱水DMSO8mLに溶解した溶液を加え、得られたスラリーに、NaBH3CN150mgを脱水DMSO5mLに溶解した溶液に酢酸30mgを添加した溶液を加え、窒素下50°Cで12時間反応させて表面処理シリカゲルのアミノ基とアミロースの還元末端とを化学結合させ、アミロース結合シリカゲルを得た。得られたアミロース結合シリカゲルを、ガラスフィルターG4を用いて濾過し、残渣をDMSO、テトラヒドロフラン、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄し、アミロース結合シリカゲルから未結合のアミロース等を除き、60°Cで2時間真空乾燥し、アミロースがシリカゲルの表面に化学結合によって結合してなる分離剤1を得た。分離剤1の元素分析値はC:4.29、H:0.90、N:0.22であった。また、前記表面処理シリカゲルに、セルロース1.0gMerck社製、平均重合度:200を脱水DMA/LiCl21mLに溶解した溶液を加え、得られたスラリーに、NaBH3CN150mgを脱水DMA/LiCl5mLに溶解した溶液に酢酸30mgを添加した溶液を加え、窒素下50°Cで36時間反応させて表面処理シリカゲルのアミノ基とセルロースの還元末端とを化学結合させ、セルロース結合シリカゲルを得た。得られたセルロース結合シリカゲルを、ガラスフィルターG4を用いて濾過し、残渣をDMA/LiCl、テトラヒドロフラン、メタノール、アセトン、ヘキサンで洗浄し、セルロース結合シリカゲルから未結合のセルロース等を除き、60°Cで2時間真空乾燥し、セルロースがシリカゲルの表面に化学結合によって結合してなる分離剤2を得た。分離剤2の元素分析値はC:2.12、H:0.56、N:0.15であった。分離剤1及び2をそれぞれ内径0.46cm、長さ25cmのステンレススチール製空カラムにスラリー充填法にて充填し、充填された分離剤1を収容するカラム1と、充填された分離剤2を収容するカラム2とをそれぞれ得た。なお、分離剤のカラムへの充填には、株京都クロマト製のPS10、PS-20オートパッキングシステムを用いた。これらのカラム1及び2を使用して、グルコース、キシロース、フルクトース、グリセロール、マルトース、ラクトース、及びスクロースの計7種の糖類に対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液には、7種の糖類を総量で約4,000ppmにて移動相に溶解した溶液を用いた。移動相には水とアセトニトリルとの混合液水/アセトニトリル=25/75体積比を用いた。移動相の流量は0.5mL/minであり、カラム温度は25°Cであり、試料溶液の打ち込み量は20μLであり、検出器にはRI検出器及びUV検出器を用いた。UV検出器における検出波長は190nmとした。分離剤1による糖の分離のRI検出器によるクロマトグラムを図1に、分離剤1による糖の分離のUV検出器によるクロマトグラムを図2に、分離剤2による糖の分離のRI検出器によるクロマトグラムを図3に、分離剤2による糖の分離のUV検出器によるクロマトグラムを図4に、それぞれ示す。<核酸塩基の分離>前記カラム1及び2を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの計4種の核酸塩基に対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、4種の核酸塩基が各々50ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4aq/CH3CN=10/90を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は1μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。分離剤1による核酸塩基のクロマトグラムを図5に、分離剤2による核酸塩基のクロマトグラムを図6に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの計4種の核酸塩基に対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、4種の核酸塩基が各々250ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4aq/CH3CN=90/10体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は1μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。ODSカラムによる核酸塩基のクロマトグラムを図16に示す。ODSカラムでは核酸塩基化合物を保持できない。<ヌクレオシドの分離>前記カラム1及び2を使用して、チミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンのヌクレオシドに対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、5種のヌクレオシドが各々200ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4aq/CH3CN=10/90体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は1μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。分離剤1によるヌクレオシドのクロマトグラムを図7に、分離剤2によるヌクレオシドのクロマトグラムを図8に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用して、チミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンのヌクレオシドに対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、5種のヌクレオシドが各々200ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4aq/CH3CN=10/90体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は1μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。ODSカラムによるヌクレオシドのクロマトグラムを図17に示す。ODSカラムではヌクレオシドを保持できない。<水溶性ビタミンの分離例>前記カラム1及び2を使用して、ニコチンアミド、ビタミンB6、ビタミンB1、ビタミンB12、ビタミンCの水溶性ビタミンに対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、5種の水溶性ビタミンが各々160ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液A液:10mMAcONH4aq、B液:CH3CN、B液:0-10分90→50、10.01-30分50を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は5μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。分離剤1による水溶性ビタミンのクロマトグラムを図9に、分離剤2による水溶性ビタミンのクロマトグラムを図10に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用して、ニコチンアミド、ビタミンB6、ビタミンB1、ビタミンB12、ビタミンCの水溶性ビタミンに対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、5種の水溶性ビタミンが各々160ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4aq/CH3CN=90/10体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は3μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。ODSカラムによるヌクレオシドのクロマトグラムを図18に示す。ODSカラムでは水溶性ビタミンを保持できない。<アミノ酸の分離>カラム1及び2を使用して、トリプトファン、ロイシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンのアミノ酸に対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、トリプトファンが8ppmそれ以外の6種のアミノ酸が800ppmとなるような濃度とした。移動相には20mMリン酸緩衝液pH=6.2とアセトニトリルとの混合液20mMH3PO4pH=6.2buffer/CH3CN=25/75体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は40°C、試料溶液の打ち込み量は5μL、検出器にはUV検出器200nmを用いた。分離剤1によるアミノ酸のクロマトグラムを図11に、分離剤2によるアミノ酸のクロマトグラムを図12に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用して、トリプトファン、ロイシン、プロリン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリンのアミノ酸に対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、チロシンが8ppmそれ以外の6種のアミノ酸が800ppmとなるような濃度とした。移動相には20mMリン酸緩衝液pH=6.2とアセトニトリルとの混合液20mMH3PO4pH=6.2buffer/CH3CN=25/75体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は40°C、試料溶液の打ち込み量は5μL、検出器にはUV検出器200nmを用いた。ODSカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図19に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。ODSカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図19に示す。ODSカラムではアミノ酸を保持できない。<生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体の分離>カラム1及び2を使用して、ニコチン酸メチル、ニコチン酸、6-ヒドロキシニコチン酸、5-ヒドロキシニコチン酸に対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、ニコチン酸メチルが100ppm、それ以外の生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体が250ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4/CH3CN=10/90体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は40°C、試料溶液の打ち込み量は5μL、検出器にはUV検出器220nmを用いた。分離剤1による生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体のクロマトグラムを図13に、分離剤2による生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体のクロマトグラムを図14に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用してニコチン酸メチル、ニコチン酸、6-ヒドロキシニコチン酸、5-ヒドロキシニコチン酸に対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、ニコチン酸メチルが100ppm、それ以外の生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体が250ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液10mMAcONH4/CH3CN=90/10体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は5μL、検出器にはUV検出器220nmを用いた。ODSカラムによるアミノ酸のクロマトグラムを図20に示す。ODSカラムでは生理活性を有する酸性化合物及びその誘導体を保持できない。<核酸塩基とヌクレオシド混合物の分離>カラム2を使用して、チミン、ウラシル、アデニン、シトシンの4種の核酸塩基およびチミジン、ウリジン、アデノシン、シチジン、グアノシンの5種のヌクレオシド、合計9化合物に対する分離剤2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、4種の核酸塩基が各々100ppm、5種のヌクレオシドが120ppmとなるような濃度とした。移動相には10mM酢酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルとの混合液A液:10mMAcONH4aq、B液:CH3CN、B液:0-20分95→70、20.01-30分70を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は25°C、試料溶液の打ち込み量は1μL、検出器にはUV検出器254nmを用いた。分離剤2による核酸塩基とヌクレオシド混合物のクロマトグラムを図15に示す。<ジペプチド及びトリペプチドの分離>カラム1及び2を使用して、H-Trp-Phe-OH、H-Ala-Leu-OH、H-Glu-Tyr-Glu-OH、H-Glu-GluOHのジペプチドおよびトリペプチドに対する分離剤1及び2の分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、H-Trp-Phe-OHが70ppmそれ以外の3種試料が290ppmとなるような濃度とした。移動相には20mMリン酸緩衝液pH=6.2とアセトニトリルとの混合液20mMH3PO4pH=6.2buffer/CH3CN=40/60体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は40°C、試料溶液の打ち込み量は3μL、検出器にはUV検出器200nmを用いた。分離剤1によるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図21に、分離剤2によるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図22に示す。溶出順序は分離剤1及び2ともに同様である。市販されているODSカラム商品名:Lcolumn;化学物質評価研究機構を使用して、H-Trp-Phe-OH、H-Ala-Leu-OH、H-Glu-Tyr-Glu-OH、H-Glu-Glu-OHのジペプチドおよびトリペプチドに対するODSカラムの分離能をHPLCによって評価した。試料溶液は、H-Trp-Phe-OHが70ppmそれ以外の3種試料が290ppmとなるような濃度とした。移動相には20mMリン酸緩衝液pH=6.2とアセトニトリルとの混合液20mMH3PO4pH=6.2buffer/CH3CN=90/10体積比を用いた。移動相流量は1.0mL/min、カラム温度は40°C、試料溶液の打ち込み量は3μL、検出器にはUV検出器200nmを用いた。ODSカラムによるジペプチドおよびトリペプチドのクロマトグラムを図23に示す。ODSカラムではジペプチドおよびトリペプチドの分離には適さない。図1~図15、図21及び22から明らかなように、分離剤1及び2のいずれにおいても、糖類、核酸化合物、アミノ酸、水溶性ビタミン、酸性化合物及びその誘導体並びにオリゴペプチドに対して十分な分離が得られている。また分離剤1及び2における上記分離対象物の溶出順序は同じである。分離剤1は分離剤2に比べて全体の溶出時間がより短く、分離剤2は分離剤1に比べて各ピーク間の距離がより長い。よって、例えば分離剤1は上記分離対象物の分析への適用が期待され、分離剤2は上記分離対象物の分取への適用が期待される。"