"配列番号4または配列番号6を含む単離されたポリヌクレオチド分子。核酸分子が酵母発現構築物をさらに含む、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。配列番号4を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された酵母発現ベクターを含む、酵母発現構築物。前記酵母発現構築物は、配列番号4を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項3に記載の酵母発現構築物。配列番号4を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードする前記ポリヌクレオチド配列が配列番号6である、請求項4に記載の酵母発現構築物。配列番号4または配列番号6を含む酵母発現構築物を含む酵母細胞。前記発現構築物は前記酵母細胞内に過渡的に含有される、請求項6に記載の酵母細胞。前記発現構築物は前記酵母細胞内に安定的に含有される、請求項6に記載の酵母細胞。前記酵母細胞は、ピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞、ピキアメタノリカPichiamethanolica株からの細胞、ピキアアングスタPichiaangusta株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica株からの細胞を含む、請求項6に記載の酵母細胞。前記酵母細胞はピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞である、請求項6に記載の酵母細胞。エンテロキナーゼの生成方法であって、酵母細胞内で配列番号4または配列番号6を含む酵母発現構築物を発現させるステップを含む、前記方法。前記酵母細胞はピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞、ピキアメタノリカPichiamethanolica株からの細胞、ピキアアングスタPichiaangusta株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica株からの細胞を含む、請求項11に記載の方法。前記酵母細胞はピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞である、請求項11に記載の方法。配列番号4または配列番号6によりコードされる前記エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、請求項11に記載の方法。組換えポリペプチドの切断方法であって、配列番号1の切断部位を含むポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、前記エンテロキナーゼは配列番号4または配列番号6を含む酵母発現構築物を酵母細胞内で発現させることにより生成され、前記ポリペプチドを前記エンテロキナーゼと接触させることは配列番号1の特異的切断をもたらす、前記方法。酵母発現系は異種のポリペプチドのための生成システムとしていくつかの利点を提供する。第1に、酵母細胞は発酵槽内で高いバイオマスになるまで>300g/Lウェット細胞重量生育され、大量の所望のポリペプチドを生成するための濃い培養物を提供し得る。第2に、原核生物の発現系と異なり、酵母発現系は真核生物ポリペプチドに特異的な翻訳後フォールディングおよび他の修飾を正確に制御することができ、それによりその異種のポリペプチドの生理活性、機能および安定性の保持を確実にする。第3に、酵母発現系は多用途かつ柔軟性があり、1染色体外またはゲノムベースの発現、2発現の構成的または誘導的制御、および3発現された異種のポリペプチドを特定の細胞または細胞外区画に方向付け、単離、および精製を促進する能力を提供する。本明細書はコスト効率の良い様式かつ商業適用に有用であるように十分多い量で組換えエンテロキナーゼを生成するために有用な改善された発現構築物を開示する。これらの結果はエンテロキナーゼをコードする開示された遺伝子工学で改変されたポリヌクレオチド分子のいずれか1つを用いて達成され得る。一旦、酵母発現ベクター内にクローニングされ、および酵母細胞内に導入されたら、これらの改変された分子は現在可能な量よりも顕著に多い量のエンテロキナーゼを生成し得る。したがって、本明細書の態様は、部分的に、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子は生物のゲノムから単離された一重鎖または二重鎖DNA、組換え生成cDNA、化学合成DNA分子であり得る。さらに、単離されたポリヌクレオチド分子はゲノム源から単離されまたは組換え技術により生成されたとき典型的に他の細胞物質から実質的に制約を受けないまたは化学的に合成されたとき化学前駆体または他の化学物質から実質的に制約を受けない。本明細書の態様は、部分的に、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で使用されるとき、用語エンテロキナーゼはEKと同意語であり、そしてペンタ‐ペプチド配列Asp‐Asp‐Asp‐Asp‐Lys配列番号1を選択的に認識し、リジン残基の後ろに位置する切断しやすい結合で切断し得るDDDDK↓どんなポリペプチドをも言う。本明細書中で使用されるとき、エンテロキナーゼについて使用されるとき用語選択的に認識し、そして切断するはエンテロキナーゼの配列番号1を含む分子との識別的な相互作用および配列番号1のリジン残基の後ろに位置する切断しやすい結合の切断、ならびに一方で、その分子内に位置する他のペンタ‐ペプチド配列とは実質的に相互作用せず、そしてそれらを切断しないことを言う。そのように、エンテロキナーゼは単一のジスルフィド架橋により結合された約82~140kDa重鎖および約35~62kDa軽鎖を含む天然ヘテロダイマー糖タンパク質および触媒的に活性な軽鎖断片を言う。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子の作出の例は実施例1、2、および4~6中に示される。1つの実施形態において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体であり得る。本明細書中で使用されるとき、用語相補体はエンテロキナーゼをコードするセンス分子に対してアンチセンス分子であるポリヌクレオチド分子を言う。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は例えば、精製タグ、細胞分泌シグナル、および/または細胞小器官ローカリゼーションシグナルの如き、他の型のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド領域を含み得る。そのような種類の例示的なポリヌクレオチド分子は配列番号6である。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は例えば、転写、翻訳、および/または翻訳後プロセッシングの局面を方向付けまたは促進する制御または調節ポリヌクレオチド領域をもまた含み得る。別の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のヌクレオチド変異形であり得る。ただし、配列番号4もしくは配列番号6またはそれらの相補体におけるヌクレオチド変化はそのポリヌクレオチド変異形によりコードされるエンテロキナーゼのアミノ酸配列を変えない。そのように、本明細書中に開示される配列番号4ポリヌクレオチド変異形は配列番号5のエンテロキナーゼをコードし、そして本明細書中に開示される配列番号6ポリヌクレオチド変異形は配列番号7のエンテロキナーゼをコードする。この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98または少なくとも99同一であり得る。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して例えば、約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の不連続ヌクレオチド置換を有し得る。この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して例えば、約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の連続ヌクレオチド置換を有し得る。非限定的に、グローバル法、ローカル法および例えばセグメントアプローチ法の如きハイブリッド法を含む、さまざまな配列整列法のいずれも本明細書中に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのパーセント同一性を決定するために使用され得る。パーセント同一性を決定するためのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。グローバル法はその分子の始めから終わりまでの配列を並べ、そして個々の残基ペアのスコアを足すことによりおよびギャップペナルティを課すことにより最も良い整列を決定する。非限定的な方法は、例えば、CLUSTALW例えば、JulieD.Thompsonetal.,CLUSTALW:ImprovingtheSensitivityofProgressiveMultipleSequenceAlignmentThroughSequenceWeighting,Position‐SpecificGapPenaltiesandWeightMatrixChoice,2222NucleicAcidsResearch4673‐46801994を参照のこと;および反復改良法例えば、OsamuGotoh,SignificantImprovementinAccuracyofMultipleProteinSequenceAlignmentsbyIterativeRefinementasAssessedbyReferencetoStructuralAlignments,2644J.Mol.Biol.823‐8381996を参照のことを含む。ローカル法は全てのインプット配列に共有される1以上の保存されたモチーフを同定することにより配列を整列する。非限定的な方法は、例えば、マッチボックス例えば、EricDepiereuxandErnestFeytmans,Match‐Box:AFundamentallyNewAlgorithmfortheSimultaneousAlignmentofSeveralProteinSequences,85CABIOS501‐5091992を参照のこと;ギブスサンプリング例えば、C.E.Lawrenceetal.,DetectingSubtleSequenceSignals:AGibbsSamplingStrategyforMultipleAlignment,2625131Science208‐2141993を参照のこと;アライン‐M例えば、IvoVanWalleetal.,Align‐M‐ANewAlgorithmforMultipleAlignmentofHighlyDivergentSequences,209Bioinformatics,:1428‐14352004を参照のことを含む。ハイブリッド法はグローバルおよびローカル整列法両方の機能的局面を組み合わせる。非限定的な方法は、例えば、セグメント対セグメント比較例えば、BurkhardMorgensternetal.,MultipleDNAandProteinSequenceAlignmentBasedOnSegment‐To‐SegmentComparison,9322Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.12098‐121031996を参照のこと;T‐Coffee例えば、CedricNotredameetal.,T‐Coffee:ANovelAlgorithmforMultipleSequenceAlignment,3021J.Mol.Biol.205‐2172000を参照のこと;MUSCLE例えば、RobertC.Edgar,MUSCLE:MultipleSequenceAlignmentWithHighScoreAccuracyandHighThroughput,325NucleicAcidsRes.1792‐17972004を参照のこと;およびDIALIGN‐T例えば、AmarendranRSubramanianetal.,DIALIGN‐T:AnImprovedAlgorithmforSegment‐BasedMultipleSequenceAlignment,61BMCBioinformatics662005を参照のことを含む。この実施形態のさらなる態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は厳密な条件下で、配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド変異形であり得る。上記厳密なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、そして例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,N.Y.1989,6.3.1‐6.3.6中に見られることができ、当該出願はその全体が援用される。厳密な例えば、高い厳密さハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は約45°Cで6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC中でのハイブリダイゼーション後、50~65°Cで0.2×SSC、0.1SDS中での1回以上の洗浄である。この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は表1中に開示されるポリヌクレオチド変異形であり得る。この表はエンテロキナーゼ軽鎖のアミノ酸配列、この軽鎖断片をコードする配列番号4および配列番号6のポリヌクレオチド領域のオープンリーディングフレームを含むコドン、ならびに配列番号4および配列番号6のコドンについて置換され得るコドン変異形を含む。この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表1の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表1の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する。この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表1の多くて1、多くて2、多くて3、多くて4、多くて5、多くて6、多くて7、多くて8、多くて9、多くて10、多くて11、多くて12、多くて13、多くて14、多くて15、多くて16、多くて17、多くて18、多くて19または多くて20の変異コドンを有する。この実施形態のさらなる態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は表2中に開示されるポリヌクレオチド変異形であり得る。この表はエンテロキナーゼ軽鎖のアミノ酸配列、この軽鎖断片をコードする配列番号4および配列番号6のポリヌクレオチド領域のオープンリーディングフレームを含むコドン、ならびに配列番号4および配列番号6のコドンについて置換され得るコドン変異形を含む。この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表2の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は、配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表2の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表2の多くて1、多くて2、多くて3、多くて4、多くて5、多くて6、多くて7、多くて8、多くて9、多くて10、多くて11、多くて12、多くて13、多くて14、多くて15、多くて16、多くて17、多くて18、多くて19または多くて20の変異コドンを有する。また別の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号4、配列番号6またはそれらのヌクレオチド変異形の切断断片であり得る。本明細書中で使用されるとき、用語配列番号4、配列番号6またはそれらのヌクレオチド変異形の切断断片は配列番号4もしくはそのヌクレオチド変異形により示される710のヌクレオチド配列または配列番号6もしくはそのヌクレオチド変異形により示される953のヌクレオチド配列からのヌクレオチドの除去を言う。配列番号4、配列番号6またはそれらのヌクレオチド変異形の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方からのヌクレオチドが除去され得る。この実施形態の態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50のヌクレオチドが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。この実施形態の他の態様において、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50のヌクレオチドが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。この実施形態のさらに他の態様において、多くて1、多くて2、多くて3、多くて4、多くて5、多くて6、多くて7、多くて8、多くて9、多くて10、多くて11、多くて12、多くて13、多くて14、多くて15、多くて16、多くて17、多くて18、多くて19、多くて20、多くて25、多くて30、多くて35、多くて40、多くて45または多くて50のヌクレオチドが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。この実施形態の他の態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のコドンが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。この実施形態の他の態様において、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20のコドンが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。この実施形態のさらに他の態様において、多くて1、多くて2、多くて3、多くて4、多くて5、多くて6、多くて7、多くて8、多くて9、多くて10、多くて11、多くて12、多くて13、多くて14、多くて15、多くて16、多くて17、多くて18、多くて19または多くて20のコドンが配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から除去される。本明細書の態様は、部分的に、酵母発現ベクターを含むポリヌクレオチド分子を開示する。非限定的に、ピキアパストリスPichiapastoris発現ベクター、ピキアメタノリカPichiamethanolica発現ベクター、ピキアアングスタPichiaangusta発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica発現ベクターを含む、広くさまざまな酵母発現ベクターがEKをコードするポリヌクレオチド分子を発現するために使用され得る。酵母発現ベクターの非限定的な例はpGal‐MF発現ベクターDualsystemsBiotech,AG,Schlieren,CH、pMET発現ベクターInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、PICHIAPINK発現ベクターInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、pPICZ発現ベクターInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、pPpT4アルファ発現ベクターIngenza,Ltd.,Midlothian,UK、pTEF‐MF発現ベクターDualsystemsBiotech,AG,Schlieren,CH、pYES発現ベクターInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CAを含む。酵母発現ベクターは例えば、複製、統合、転写、翻訳、および/または翻訳後プロセッシングの局面を方向付けまたは促進する制御または調節ポリヌクレオチド領域を典型的に含む。例えば、酵母発現ベクターはEK発現を方向付けるために使用される構成的プロモーターおよびエンハンサーエレメントおよび/または誘導的プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み得る。構成的発現ベクターの非限定的な例はEK生成を方向付けるためにグリセルアルデヒド‐3‐フォスフェートデヒドロゲナーゼGAPプロモーターを使用するものである。誘導的発現ベクターの非限定的な例は誘導剤としてメタノールを伴う、アルデヒドオキシダーゼ1AOX1プロモーターを使用するものである。いずれの場合にも、高レベルの発現が達成されることができ、1リットル当たり数グラムまでの生成物が得られる。例えば、メタノール誘導酵母細胞において、AOX1は可溶性タンパク質全体の30を生成し得る。AOX1遺伝子を欠く株MutS株とも呼ばれるでも、それらはアルコールオキシダーゼ2遺伝子AOX2を発現するので、メタノールにより誘導され得るが、それらはメタノールが唯一の炭素源として使用されるとき野生型株よりゆっくり生育する。しかしながら、AOX1タンパク質生成のために主にエネルギーおよび源を用いる代わりに、MutS株においてAOX1のプロモーターの力は主に組換えタンパク質生成に向かって方向付けられ得る。さらに、より低いメタノール値が適用され得る。酵母発現ベクターは例えば、精製タグ、細胞分泌シグナル、および/または細胞小器官ローカリゼーションシグナルの如き、他の型のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド領域を含み得る。そのようなポリヌクレオチド領域は通常融合ポリペプチドの形態でEKに機能的に連結される。精製タグの非限定的な例はヒスチジンタグ、mycタグ、V5タグを含む。シグナル配列の非限定的な例はEKを細胞質、ペルオキシソームの如き細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列を含む。例えば、アルファ因子ペプチドシグナルの包含はEKの培養培地への分泌を可能にする。本明細書の態様は、部分的に、酵母発現構築物を含むポリヌクレオチド分子を開示する。酵母発現構築物は本明細書中に開示されるように酵母発現ベクターに機能的に連結された本明細書中に開示されるようなEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む。酵母発現構築物の例は実施例2および4~6中に示される。本明細書の態様は、部分的に、酵母細胞内に本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子を導入することを開示する。細胞内に導入されたポリヌクレオチド分子はその細胞に過渡的にまたは安定的に維持され得る。安定的に維持されるポリヌクレオチド分子は染色体外に存在し、そして自律的に複製し得るまたはそれらはその細胞の染色体物質に統合され、そして非自律的に複製し得る。細胞内への本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子の導入のためのいずれかのおよび全ての方法が使用され得ることが構想される。細胞内へ核酸分子を導入するために有用な方法は、非限定的に、例えば、リン酸カルシウム仲介、ジエチル‐アミノエチルDEAEデキストラン仲介、脂質仲介、ポリエチレンイミンPEI仲介、ポリリジン仲介およびポリブレン仲介の如き化学物質仲介トランスフェクション、例えば、微粒子銃粒子デリバリー、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポーレーションの如き物理的仲介トランスフェクション、および例えば、レトロウイルス仲介トランスフェクションの如きウイルス仲介トランスフェクションを含む。当業者は、細胞への発現構築物の導入のための特定の方法の選択は、部分的に、その細胞が発現構築物を過渡的に含有するであろうかどうかまたはその細胞が発現構築物を安定的に含有するであろうかどうかによるであろうことを理解する。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。例えば、IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCells,pp.16.1‐16.62SambrookRussell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001を参照のこと。本明細書中に開示される酵母発現構築物の酵母細胞内への導入の例は実施例2および4~6中に示される。本明細書の態様は、部分的に、本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を含む酵母細胞を開示する。この実施形態の態様において、酵母細胞は本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を過渡的に含有する。この実施形態の別の態様において、酵母細胞は本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を安定的に含有する。この実施形態の態様において、酵母細胞はピキアパストリスPichiapastoris、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキアアングスタPichiaangusta、分裂酵母、出芽酵母またはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica由来の酵母細胞株である。この実施形態の他の態様において、酵母発現構築物はピキアパストリスPichiapastoris発現ベクター、ピキアメタノリカPichiamethanolica発現ベクター、ピキアアングスタPichiaangusta発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターまたはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica発現ベクターである。この実施形態のさらに他の態様において、EKをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体である。本明細書の態様は、部分的に、酵母発現系を用いて本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子からEKを発現することを開示する。酵母発現系を用いたポリヌクレオチド分子の発現は、非限定的に、誘導的発現、非誘導的発現、構成的発現、ウイルス仲介発現、安定的統合発現、および過渡的発現を含むさまざまな特徴のいずれかを含み得る。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。酵母発現系の非限定的な例はEASYSELECT商標ピキア発現キットInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、EASYSELECT商標ECHO商標ピキア発現キットInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、ピキアメタノリカPichiamethanolica発現系Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、PICHIAPINK商標分泌タンパク質キットInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CA、YES‐ECHO商標発現ベクターキットInvitrogen,Inc.,Carlsbad,CAおよびSPECTRA商標分裂酵母発現系Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CAを含む。酵母発現系を用いた本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子からのEKの発現の例は実施例2~6中に示される。1つの実施形態において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたEKの量は配列番号2から発現されたEKの量に比較して増加される。この実施形態の態様において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたEKの量は配列番号2から発現されたEKの量に比較して、例えば、少なくとも0.5倍、少なくとも1倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも30倍、少なくとも35倍または少なくとも40倍増加される。この実施形態の他の態様において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたEKの量は配列番号2から発現されたEKの量に比較して、例えば、約1倍~約5倍、約1倍~約10倍、約1倍~約15倍、約1倍~約20倍、約1倍~約25倍増加される。この実施形態の他の態様において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたEKの量は約100mg/L~約30g/Lである。この実施形態の態様において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子から発現されたEKの量は、例えば、少なくとも100mg/L、少なくとも500mg/L、少なくとも1g/L、少なくとも1.5g/L、少なくとも2.5g/L、少なくとも5g/L、少なくとも7.5g/L、少なくとも10g/L、少なくとも12.5g/L、少なくとも15g/L、少なくとも20g/L、少なくとも25g/Lまたは少なくとも30g/Lであり得る。この実施形態のさらに他の態様において、配列番号4、配列番号6またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたEKの量は、例えば、約100mg/L~約5g/L、約100mg/L~約10g/L、約100mg/L~約15g/L、約500mg/L~約5g/L、約500mg/L~約10g/L、約500mg/L~約15g/L、約1g/L~約5g/L、約1g/L~約10g/L、約1g/L~約15g/L、約1g/L~約20g/L、約5g/L~約10g/L、約5g/L~約15g/L、約5g/L~約20g/L、約5g/L~約25g/L、約5g/L~約30g/Lであり得る。本明細書中に開示される酵母発現構築物から発現されたEKはさまざまな方法のいずれかを用いて酵母細胞または培養培地から精製され得る。精製方法の例は、非限定的に、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除分子ふるいクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ファストパフォーマンス液体クロマトグラフィーFPLC、および高速液体クロマトグラフィーHPLCを含む。問題の標的ペプチドの結合部分は、非限定的に、樹脂、アガロース、および磁気ビーズを含むさまざまな物質のいずれかに結合され得る。さらに、非限定的に、バッチ式プロセッシング、および重力送りカラムを含むさまざまなプロセッシング技術のいずれかが使用され得る。タンパク質再折りたたみステップはまた本明細書中に開示される核酸分子によりコードされる機能的に活性なBoNT/Aの回復を確実にすることが必要であり得る。タンパク質の精製および回復のための特定のプロトコルの非限定的な例は、例えば、JohnAbelsonetal.,GUIDETOPROTEINPURIFICATION,AcademicPress,1990、PROTEINPURIFICATION:PRINCIPLESANDPRACTICE,RobertK.Scopesetal.eds.,SpringerVerlag,3rd.ed.1994、PROTEINPURIFICATIONTECHNIQUES:APRACTICALAPPROACH,SimonRoeed.,OxfordUniversityPress,2nded.2001、MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,上記,2001、IanM.Rosenberg,PROTEINANALYSISPURIFICATION:BENCHTOPTECHNIQUES,SpringerVerlag,2002中に示される。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。EKの量はさまざまな方法のいずれかを用いてEK発現中、EK発現の完了後、および/またはEK精製後に計測され得る。タンパク質計測法の例は、非限定的に、ゲル電気泳動法およびタンパク質染色、ウェスタンブロッティング、ELISA、タンパク質ラベリング、UV吸収、Lowry法、ビウレット分析、スミス銅/ビシンコニン酸BCA分析、およびブラッドフォード染色分析を含む。例えば、ChristineV.Sapanetal.,ColorimetricProteinAssayTechniques,292BIOTECHNOL.APPL.BIOCHEM.99‐108,1999を参照のこと。本明細書の態様は、部分的に、EKを用いたEK切断部位を含むポリペプチドの切断方法を開示する。1つの実施形態において、EK切断部位を含むポリペプチドの切断方法はEK切断部位を含むポリペプチドをEKと接触させるステップを含み、そのEKは酵母細胞内で配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形を含む酵母発現構築物を発現させることにより生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはEK切断部位の特異的切断をもたらす。この実施形態の1つの態様において、そのEK切断部位は配列番号1である。そのポリペプチドは天然にEK切断部位を有するものであり得るまたはそれはEK切断部位を含有するよう遺伝子工学で作出された組換えポリペプチドであり得る。本明細書の態様は、部分的に、EKを用いたEK切断部位を含むポリペプチドの調製方法を開示する。1つの実施形態において、EK切断部位を含むポリペプチドの調製方法はEK切断部位を含むポリペプチドをEKと接触させるステップを含み、そのEKは酵母細胞内で配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形を含む酵母発現構築物を発現させることにより生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはEK切断部位の特異的切断をもたらす。この実施形態の1つの態様において、EK切断部位は配列番号1である。そのポリペプチドは天然にEK切断部位を有するものであり得るまたはそれはEK切断部位を含有するように遺伝子工学で作出された組換えポリペプチドであり得る。EK切断部位を含むポリペプチドの切断または調製のためにEKを使用する方法は標準のinvitroタンパク質分解切断分析を用いて行われ得る。例えば、EK切断部位を含むポリペプチドは20mMTris‐HClpH7.4、50mMNaCl、20mMCaCl2および本明細書中に示されるように生成されたEKを含む反応混合物に添加され、そして約20~約22°Cで約2時間~約16時間インキュベートされ得る。そのようにして生成された切断されたまたは調製されたポリペプチドの量は例えば、SDS‐PAGE分析、ウェスタンブロット分析もしくはELISAのような免疫ベースの分析またはそのポリペプチドの活性分析の如き、標準の手順を用いて評価され得る。切断されたまたは調製されたポリペプチドはまた標準の手順を用いて精製され得る。EK切断部位を含むポリペプチドの切断または調製のために有用な分析は例えば、Ogiwara,etal.,ModifiedEnteropeptidaseProtein,米国特許第8,013,137号;LaVallie,CloningofEnterokinaseandMethodofUse,米国特許第6,746,859号中に示され、当該出願はそれぞれその全体が援用される。本明細書の態様はまた以下のように示され得る。1.配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド分子。2.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98または少なくとも99同一である、ポリヌクレオチド分子。3.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の不連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。4.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。5.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド分子。6.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表1からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。7.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表2からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。8.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50のヌクレオチドを除去されている、ポリヌクレオチド分子。9.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20のコドンを除去されている、ポリヌクレオチド分子。10.酵母発現ベクターである、実施形態1~9に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。11.実施形態10に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターはピキアパストリスPichiapastoris発現ベクター、ピキアメタノリカPichiamethanolica発現ベクター、ピキアアングスタPichiaangusta発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica発現ベクターである、ポリヌクレオチド分子。12.実施形態10または11に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、ポリヌクレオチド分子。13.実施形態12に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ1AOX1プロモーターである、ポリヌクレオチド分子。14.実施形態10~14に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。15.実施形態10~14に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。16.実施形態14または15に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、ポリヌクレオチド分子。17.酵母発現構築物である、実施形態1~9に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。18.酵母発現ベクターおよび配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物。19.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98または少なくとも99同一である、酵母発現構築物。20.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の不連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。21.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1~約10、約1~約15、約1~約20、約1~約25、約1~約30、約5~約25、約5~約30、約5~約35、約5~約40、約5~約45、約10~約40、約10~約45、約10~約50、約10~約55または約10~約60の連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。22.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、酵母発現構築物。23.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表1からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、酵母発現構築物。24.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表2からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、酵母発現構築物。25.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50のヌクレオチドを除去されている、酵母発現構築物。26.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20のコドンを除去されている、酵母発現構築物。27.実施形態18~26に記載の酵母発現構築物であて、その酵母発現ベクターはピキアパストリスPichiapastoris発現ベクター、ピキアメタノリカPichiamethanolica発現ベクター、ピキアアングスタPichiaangusta発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica発現ベクターである、酵母発現構築物。28.実施形態27に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、酵母発現構築物。29.実施形態28に記載の酵母発現構築物であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ1AOX1プロモーターである、酵母発現構築物。30.実施形態27~29に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。31.実施形態27~29に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1~9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。32.実施形態30または31に記載の酵母発現構築物であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、酵母発現構築物。33.実施形態1~17に記載のポリヌクレオチドを含む酵母細胞。34.実施形態33に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。35.実施形態33に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。37.ピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞、ピキアメタノリカPichiamethanolica株からの細胞、ピキアアングスタPichiaangusta株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica株からの細胞を含む、実施形態33~35に記載の酵母細胞。38.ピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞である、実施形態33~35に記載の酵母細胞。39.実施形態18~32に記載の酵母発現構築物を含む酵母細胞。40.実施形態39に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。41.実施形態39に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。42.ピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞、ピキアメタノリカPichiamethanolica株からの細胞、ピキアアングスタPichiaangusta株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイアリポリティカYarrowialipolytica株からの細胞を含む、実施形態39~41に記載の酵母細胞。43.ピキアパストリスPichiapastoris株からの細胞である、実施形態39~41に記載の酵母細胞。44.エンテロキナーゼの生成方法であって、実施形態33~43の酵母細胞を用いてエンテロキナーゼを発現するステップを含む、方法。45.エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、実施形態44に記載の方法。46.組換えポリペプチドの切断方法であって、配列番号1の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態44または45の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号1の特異的切断をもたらす、方法。47.組換えポリペプチドの調製方法であって、配列番号1の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態44または45の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号1の特異的切断をもたらす、方法。以下の非限定的な例はここで企図される代表的な実施形態のより完全な理解を促進するために例示目的のためにのみ提供される。これらの実施例は本明細書中に開示されるような酵母発現系を用いたEKの発現方法に関するものを含む、本明細書中に示される実施形態のいずれかを限定するものと解釈されるべきでない。実施例1EKをコードするポリヌクレオチド分子の合成ポリヌクレオチド分子配列番号4は標準の化学的手順を用いて合成されるBlueHeronBiotechnology,Bothell,WA。例えば、長さ20~50塩基のオリゴヌクレオチドは標準のホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして二重鎖にし、ライゲートして全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる。このポリヌクレオチド分子を標準の分子生物学的方法を用いてpUCBHB1ベクター内のSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/EKを作出する。その合成されたポリヌクレオチド分子をBigDyeTerminator商標Chemistry3.1AppliedBiosystems,FosterCity,CAおよびABI3100シークエンサーAppliedBiosystems,FosterCity,CAを用いたシークエンスにより検証する。同様の合成法をポリヌクレオチド分子配列番号6、配列番号4または配列番号6のヌクレオチド変異形、および配列番号4または配列番号6の切断変異形を作出するために使用する。所望の場合、配列番号2、配列番号4または配列番号6に基づく、発現を最適化されたポリヌクレオチド分子が酵母細胞内での発現を改善するために合成される。EKをコードするポリヌクレオチド分子は1選択の酵母株の天然ポリヌクレオチド分子中に典型的に存在する同義のコドンを含むよう、2選択の酵母株中に見られる天然ポリヌクレオチド分子の平均GC含有量により厳密に合うGC含有量を含むよう、3そのポリヌクレオチド分子内に見られるポリモノヌクレオチド領域を減少させるよう、および/または4そのポリヌクレオチド分子内に見られる内在の調節または構造部位を消去するよう改変される。例えば、LanceE.Stewardetal.,OptimizingExpressionofActiveBotulinumToxinTypeE,国際特許公開公報WO2006/0119662006年2月2日;LanceE.Stewardetal.,OptimizingExpressionofActiveBotulinumToxinTypeA,国際特許公開公報WO2006/0177492006年2月16日を参照のこと、および当該出願はそれぞれその全体が援用される。一旦、配列最適化が完了したら、長さ20~50塩基のオリゴヌクレオチドは標準のホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二重鎖にし、ライゲートして全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる。このポリヌクレオチド分子を標準の分子生物学的方法を用いてpUCBHB1ベクター内のSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/EKを作出する。合成されたポリヌクレオチド分子をBigDyeTerminator商標Chemistry3.1AppliedBiosystems,FosterCity,CAおよびABI3100シークエンサーAppliedBiosystems,FosterCity,CAを用いたシークエンスにより検証する。同様の合成法を配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形であるポリヌクレオチド分子を作出するために使用する。実施例2pPpT4アルファ/EKの構築および発現本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、配列番号4を含むpJ201/rEK構築物をXhoIおよびNotIで消化し、配列番号4挿入物を切り出した。生ずる制限酵素処理断片をQIAQUICK登録商標ゲル抽出キットQIAGEN,Inc.,Valencia,CAにより精製し、そして配列番号4断片を制限酵素エンドヌクレアーゼXhoIおよびNotIで消化したpPpT4アルファ_SベクターIngenza,Ltd.,Midlothian,UK内にサブクローニングした。pPpT4アルファ_Sベクターはアルファ因子分泌シグナル配列、AOX1プロモーターの一部、AODおよびAOX1転写終了配列、およびZEOCIN商標のオープンリーディングフレームを含む。その断片およびベクターを、T4DNAリガーゼプロトコルを用いてライゲートし、pPpT4アルファ/rEKを作出し、そしてこのライゲーション混合物の一部を用いて標準のエレクトロポーレーションプロトコルによりエレクトロコンピテントNEB10細胞NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MAを形質転換した。形質転換された細胞を25μg/mLのZEOCIN商標を含む1.5Luria‐BertaniLennoxアガープレートpH7.0上に撒き、そして37°Cのインキュベーター内に入れ、一晩生育させた。候補発現構築物をZEOCIN商標耐性コロニーとして選択した。耐性コロニーを続いて生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドDNAを単離し、そして正しい挿入断片の存在および向きを決定するために、候補発現構築物をXhoIおよびNotI、XbaIまたはNdeIを用いた制限酵素消化によりスクリーニングした。所望のpPpT4アルファ/rEK発現構築物を含む培養物を生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドDNAを単離し、そして正しい発現構築物が作出されたことを検証するために、候補発現構築物をシークエンスした。このクローニング法は配列番号4を含む酵母発現構築物を作出した。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpPpT4アルファ/EK発現構築物を作出するために使用する。あるいは、配列番号4のポリヌクレオチド分子、配列番号4、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を実施例1中に示されるように合成する。配列番号4によりコードされるエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、pPpT4アルファ/rEK発現構築物からのDNAを配列番号8のAOX前向きプライマーおよび配列番号9のPUC逆向きプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅し、直鎖状の統合カセットを作出した。AOX前向きプライマーのはじめの5つの塩基対はpPpT4アルファ/EKDNA配列に同一でないBglII部位を含む。AOX前向きプライマーはAOX1プロモーターの部分である領域の後ろに結合する。全長AOX1遺伝子は直鎖状の統合カセット上に存在しないが、全長AOX1遺伝子全体はピキアパストリスPichiapastoris染色体との統合に際して再構築される。生ずる直鎖状発現構築物で、エレクトロポーレーション法を用いて適切なピキアパストリスPichiapastorisMutS株CBS7435を形質転換した。形質転換混合物を100μg/mL、250μg/mLまたは500μg/mLのZEOCIN商標を含む1.5酵母、ペプトン、デキストロース、ソルビトールYPDSアガープレートpH7.5上に撒き、そして28~30°Cのインキュベーター内に1~3日間入れる。5’AOX1位置でpPpT4アルファ/EK断片を統合した形質転換体の選択をZEOCIN商標に対するコロニー耐性により決定する。62個の組換えコロニーを異なる濃度のZEOCIN商標を含むさまざまなYPDSプレートから選択し、そして100μg/mLZEOCIN商標を含む酵母、ペプトン、およびデキストロースYPD培養液に接種した。単離された酵母細胞系は予想されたとおりZEOCIN商標を含むYPD培養液中で生育し、その株がZeocin耐性であり、そして統合pPpT4アルファ/EKカセットを含むことを示した。単離された酵母細胞系を含むYPD培養物の一部を10v/vグリセロールを含む1mLYPD培養液を有するバイアル中に入れて確立された酵母細胞系を作出し、そしてそのバイアルを-80°Cで貯蔵した。同様の方法を配列番号6のエンテロキナーゼ、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を発現する酵母細胞系を作出するために使用する。統合pPpT4アルファ/Eカセットの存在をさらに検証し、そして各単離された酵母細胞系中の相対的EK遺伝子コピー数を決定するために、62個の単離された細胞系についてPCR分析を行った。上記に議論されるYPD培養物から1mL取り、それを溶解し、そして標準の手順を用いてゲノムDNAを単離した。単離されたゲノムDNAを配列番号10のEK前向きプライマーおよび配列番号11のEK逆向きプライマーを用いて29サイクル、PCR増幅し、EK遺伝子からの250塩基対生成物を作出した。増幅完了後、その反応混合物を0.1Kb~10Kbサイズ2‐logDNAラダーと並べてポリヌクレオチド染色を含む0.8アガロースゲル上に溶解した。これらの実験から、試験された61個の細胞系について、予想された250塩基対EK断片が作出されたことが確実となった。同じゲノムDNA調製物を用いて、株間の相対的コピー数を見積もるために18サイクルのみ、PCR増幅を繰り返した。比較的低レベルの変異が観察されたが、4つの細胞系は他に比較してより高い遺伝子コピー数を示した。実施例3エンテロキナーゼ活性の分析発現されたエンテロキナーゼの存在、質および量について試験するために、統合pPpT4アルファ/EKカセットを含む細胞系を液体比色エンテロキナーゼEK分析、SDS‐PAGE、ウェスタンブロット、およびELISAを用いて分析した。統合pPpT4アルファ/EKカセットからエンテロキナーゼの発現を誘導するために、各確立された酵母細胞系からの等分を1.34w/v酵母窒素ベースYNB、200mMリン酸緩衝液、4×10-5w/vビオチン、および1v/vグリセロールを含む10mLの定義された生育培養液を含む100mLバッフル付き振とうフラスコに接種するために使用した。接種したものを振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで約60~65時間生育させた。細胞を遠心分離22°Cで3,000×g、5分間により回収した。エンテロキナーゼ発現を誘導するために、その細胞ペレットを1.34w/v酵母窒素ベースYNB、200mMリン酸緩衝液、4×10-5w/vビオチン、および5v/vメタノールを含む1mLの第1誘導培養液中に再懸濁した。その細胞を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで約8~10時間培養した。その培養物を100μLのメタノールでチャージし、約16~18時間培養し、そして追加の100μLのメタノールを24時間毎にその培養液に添加し、最終的なチャージを誘導から約72~74時間後に添加した。振とうフラスコサンプルから得られたデータを比較するために、基準株B18Hisタグエンテロキナーゼを生成するピキアパストリスPichiapastorisCBS7435MutSpPpT4アルファ/EK‐HIS発現構築物を統合株と並べて2つの振とうフラスコ中にセットした。発現されたエンテロキナーゼの酵素活性を決定するために、サンプルを培養物誘導の過程中に取り、そして液体比色エンテロキナーゼ活性分析を用いてエンテロキナーゼ活性について分析した。誘導後0時間、24時間、48時間、72時間および96時間に、培養液の試験用部分を上記に示される酵母培養物から取った。試験用部分を管に添加し、そして14,000rpmで2回遠心分離し、確実に細胞を除去した。調製培養液サンプルの一部をその後5,5’ジチオ‐ビス2‐ニトロ安息香酸DTNBの存在下で1mMの比色ペプチド基質N‐カルボベンジルオキシ‐Lys‐チオベンジルエステルZ‐Lys‐SBZL;Bachem,AG,Bubendorf,CHを含む反応混合物に添加した。切断反応は無色~黄色の変化を開始させ、そして開始速度を405nmの吸収、速度論モードで、プレートリーダー上で計測した。サンプル希釈が分析の直線状の範囲内0~100mOD/分であることを確実にするように、酵素濃度を調節した。サンプルをネガティブおよびポジティブコントロールと並べて三重で分析した。全ての株のエンテロキナーゼ活性分析結果に続いて、液体比色エンテロキナーゼ活性分析を、YCL‐48、YCL‐49、YCL‐98、YCL‐99と呼ばれる最も高いエンテロキナーゼ活性を有する4つの確立された酵母細胞系、およびYCL‐40およびYCL‐88と呼ばれる最も低いエンテロキナーゼ活性を有する2つの細胞系を用いて繰り返した。全てのサンプルを1バッチの基質を用いて三重で分析した。図Xは誘導後の時間に対する各酵母細胞系についての平均エンテロキナーゼ活性を示す。エラーバーは三重の振とうフラスコ値間の95信頼区間を示す。このデータから、YCL‐49は最も高いエンテロキナーゼ活性を有し、そしてYCL‐88は最も低い活性を有した。発現されたエンテロキナーゼの同一性および質を決定するために、YCL‐40、YCL‐48、YCL‐49、YCL‐88、YCL‐98およびYCL‐99の誘導後96~98時間時点からのサンプルを取り、そしてSDS‐PAGEおよびウェスタンブロット分析を用いて分析した。サンプルを2×SDSサンプル緩衝液に添加し、そして変性、還元条件下で10~20Bis‐TrisプレキャストポリアクリルアミドゲルExpedeon,Inc.,SanDiego,CAを用いたMOPSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。SDS‐PAGE分析のために、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、タンパク質バンドパターンを染め出した。ウェスタンブロット分析のために、上記のように分離されたポリペプチドをニトロセルロースに移し、そしてポリクローナルアルファ‐エンテロキナーゼ抗体で染色した。エンテロキナーゼポリペプチドは約38kDaの単一のバンドとしてSDS‐PAGEおよびウェスタンブロット上で明らかに見えた。電気泳動での移動は、そのエンテロキナーゼが翻訳後修飾を受けたことを示す。さらに、検出可能な偽のバンドがないことから、統合pPpT4アルファ/EKカセットを含む酵母細胞系の発現されたエンテロキナーゼの質が高いことが示された。発現されたエンテロキナーゼの濃度を決定するために、YCL‐49、YCL‐88、およびYCL‐98の誘導後96~98時間時点からのサンプルを取り、そしてサンドウィッチ酵素結合免疫吸着分析ELISAを用いて分析した。1連の希釈物を試験サンプルから調製し、そして市販の組換えエンテロキナーゼ標準EMDBiosciences‐Novagen,Madison,WIから定義された濃度を並べて三重で分析した。市販の標準の希釈シリーズから作出された標準曲線からYCL‐49およびYCL‐88サンプルの定量が可能となった。ELISA結果を振とうフラスコでの生育および統合株の発現後に得られた培養液サンプル全体の上清中に存在するEK物質のレベルを計測するために使用した表3。上記に示される分析は、いくつかの確立された酵母細胞系が統合pPpT4アルファ/EKカセットから高品質の酵素的に活性なエンテロキナーゼを発現したことを示した。実施例4pPICZA/EK‐myc‐Hisの構築および発現本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpPICAベクターInvitrogen,Inc,Carlsbad,CAにクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’‐および3’末端に導入した。この構築物を1エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、および2この挿入物がpPICAベクターに機能的に連結されることを可能にする制限酵素で消化する。この挿入物をT4DNAリガーゼ手順を用いてpPICA/BoNT/E‐myc‐Hisを作出するのに適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpPICAベクター内にサブクローニングする。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを形質転換し、25μg/mLのZEOCIN商標を含む1.5低塩Luria‐BertaniアガープレートpH7.5上に撒き、そして37°Cのインキュベーター内に入れ一晩生育させる。発現構築物を含む細菌はZEOCIN商標耐性コロニーとして同定される。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端c-mycおよびポリヒスチジン結合ペプチドに機能的に連結されたエンテロキナーゼをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpPICA/EK発現構築物を作出するために使用する。エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、pPICZA/EK‐myc‐Hisを好適な制限酵素エンドヌクレアーゼすなわち、SacI、PmeIまたはBstXIで消化し、そして生じる直鎖状発現構築物でエレクトロポーレーション法を用いて適切なピキアパストリスPichiapastorisMutS株KM71Hを形質転換する。形質転換混合物を100μg/mLのZEOCIN商標を含む1.5YPDSアガープレートpH7.5上に撒き、そして28~30°Cのインキュベーター内に入れ、1~3日間生育させた。5’AOX1位置にpPICZA/EK‐myc‐Hisを統合する形質転換体の選択はZEOCIN商標に対するコロニー耐性により決定する。pPICZA/EK‐myc‐His構築物を統合する細胞系はその後エンテロキナーゼ発現について試験される。統合pPICZA/EK‐myc‐Hisを有する試験細胞系から単離されたコロニーを100mLのMGYH培養液を含む1.0Lバッフル付きフラスコを接種するために使用し、そして振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで、その培養物がOD600=2~6に達するまで約16~18時間生育させる。細胞を遠心分離22°Cで3,000×g、5分間により回収する。発現を誘導するために、その細胞ペレットを15mLのMMH培養液中に再懸濁し、そして100メタノールを終濃度0.5になるように添加する。培養物を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで6日間生育させる。追加の100メタノールを24時間毎に終濃度0.5になるようにその培養物に添加する。0時間時点で始まり144時間時点で終わるように24時間毎に1.0mLの試験用部分をその培養物から取る。細胞をその細胞をペレットにするための微量遠心分離によりその部分から回収し、そして-80°Cで5分間、その後37°Cで5分間からなる3回の凍結融解ラウンドを用いて溶解する。溶解サンプルを2×SDSサンプル緩衝液Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAに添加し、そして確立された細胞系からの発現をSDS‐PAGEおよびウェスタンブロット分析により計測する実施例3中に示されるように。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルを示すピキアパストリスPichiapastorisMutSKM71H細胞系を市販の発酵手順を用いたラージスケール発現に選択する。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が5LBioFlo3000発酵槽内で生育される約2.5LMGYH培養液であることおよび全ての試薬の濃度がこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては、上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、EasySelect商標ピキア発現キット、バージョンG、AManualofMethodsforExpressionofRecombinantProteinsUsingpPICZandpPICZαinPichiapastoris,122701,25‐0172Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを参照のこと。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使用する。実施例5pMET/EK‐V5‐Hisの構築および発現本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpMETベクターInvitrogen,Inc,Carlsbad,CAにクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’および3’末端に導入する。この構築物を、1エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、2この挿入物がpMETベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をT4DNAリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpMETベクター内にサブクローニングし、pMET/BoNT/E‐V5‐Hisを作出する図9。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含む1.5低塩Luria‐BertaniアガープレートpH7.5上に撒き、そして37°Cのインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端V5に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpMET/EK発現構築物を作出するために使用する。エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、pMET/BoNT/E‐V5‐Hisを好適な制限酵素エンドヌクレアーゼすなわち、ApaI、AscI、FseI、PacI、KpnIまたはPstIで消化し、そして生ずる直鎖状発現構築物でエレクトロポーレーション法を用いて適切なピキアメタノリカP.methanolicaMutS株PMAD16を形質転換する。その形質転換混合物を、アデニンを欠く1.5MDアガープレートpH7.5上に撒き、そして28~30°Cのインキュベーター内で3~4日間生育させる。pMET/EK‐V5‐Hisを統合した形質転換体の選択はアデニン欠損培地上でのコロニーの生育により決定される。pMET/EK‐V5‐His構築物を統合したAde細胞系を、スモールスケール発現試験を用いてエンテロキナーゼ発現について試験する。統合pMET/EK‐V5‐Hisを有する試験細胞系から単離されたAdeコロニーを15mLのBMDY培養液に接種するために使用し、そして細胞を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで、その培養物がOD600=2~10に達するまで約16~18時間生育させる。細胞を遠心分離22°Cで1,500×g、5分間により回収する。発現を誘導するために、細胞ペレットを5mLのBMMY培養液中に再懸濁し、そして培養物を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで生育させる。24時間後、一部500μLを取り、メタノールを終濃度0.5になるように添加し、そしてその培養物を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで生育させる。一部500μLを取り、そして追加のメタノールをその培養物に24時間毎に3~5日間、終濃度0.5になるように添加する。回収された細胞を遠心分離4°Cで1,500×g、5分間し、水中で1回洗浄し、そして細胞ペレットを必要になるまで-80°Cで貯蔵する。誘導されたエンテロキナーゼの発現を検出するために、各時点の細胞ペレットを、酸洗浄ガラスビーズ法を用いて溶解する。溶解サンプルを2×SDSサンプル緩衝液Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAに添加し、そして確立された細胞系からの発現をSDS‐PAGEおよびウェスタンブロット分析により計測する実施例3中に示されるように。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルを示すピキアメタノリカP.methanolicaMutSPMAD16細胞系を市販の発酵槽手順を用いたラージスケール発現に選択する。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が5LBioFlo3000発酵槽中で生育される約2.5LBMDY/BMMY培養液であることおよび全ての試薬の濃度がこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては、上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、ピキアメタノリカP.methanolica発現キット、バージョンC、AManualofMethodsforExpressionofRecombinantProteinsinPichiamethanolica,062101,25‐0288Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを参照のこと。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使用する。実施例6pYES2/EK‐V5‐Hisの構築および発現本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpYES2ベクターInvitrogen,Inc,Carlsbad,CA内にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’および3’末端に導入する。この構築物を、1エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、および2この挿入物がpYES2ベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をT4DNAリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpYES2ベクター内にサブクローニングし、pYES2/EK‐V5‐Hisを作出する図10。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含む1.5低塩Luria‐BertaniアガープレートpH7.5上に撒き、そして37°Cのインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端V5に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpYES2/EK発現構築物を作出するために使用する。エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、リチウムベースの形質転換法を用いてpYES2/EK‐V5‐Hisでコンピテント出芽酵母株INVSc1を形質転換する。その形質転換混合物を、0.01ウラシルを有するまたはウラシルを欠く2グルコースを含む2SC最低限培地アガープレートpH7.5上に撒き、そして28~30°Cのインキュベーター内に入れ、1~3日間生育させる。pYES2/EK‐V5‐Hisを含む形質転換体の選択はウラシルを含むプレート上でのみのコロニーの生育により決定される。pYES2/EK‐V5‐His構築物を含む細胞を、スモールスケール発現試験を用いてエンテロキナーゼ発現について試験する。pYES2/EK‐V5‐Hisを含む試験細胞から単離されたコロニーを2グルコースおよび0.01ウラシルを含む15mLのSC培養液を含む50mL管に接種するために使用し、そして振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで一晩生育させる。一晩の培養物のOD600を決定し、そして50mL体積中0.4のOD600の細胞濃度を得るよう等分する。これらの部分を遠心分離22°Cで1,500×g、5分間し、そして生ずる細胞ペレットを20ガラクトースおよび10ラフィノースを含むSC培養液中に再懸濁する。細胞を振とうインキュベーター250rpm内で約28~30°Cで生育させ、そして5mL部分を0時間、4時間、8時間、12時間、16時間および24時間で取り、そしてOD600濃度を各サンプルについて決定する。回収された細胞を遠心分離4°Cで1,500×g、5分間し、水中で1回洗浄し、そして細胞ペレットを必要になるまで-80°Cで貯蔵する。誘導されたBoNT/E‐V5‐Hisの発現を検出するために、各時点の細胞ペレットを、酸洗浄ガラスビーズ法を用いて溶解する。溶解サンプルを2×SDSサンプル緩衝液Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAに添加し、そして確立された細胞系からの発現をSDS‐PAGEおよびウェスタンブロット分析により計測する実施例3中に示されるように。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルをもたらす誘導条件は市販の発酵槽手順を用いたラージスケール発現に選択される。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が5LBioFlo3000発酵槽内で生育される約2.5LSC培養液であることおよび全ての試薬の濃度はこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、pYES2/CT,pYES3/CT,andpYC2/CTYeastExpressionVectorswithC‐terminalTagsandAuxotrophicSelectionMarkers,versionE,25‐0304,2003年1月27日Invitrogen,Inc,Carlsbad,CAを参照のこと。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使用する。終わりに、本明細書の態様は特定の実施形態を参照することにより強調されるが、当業者はこれらの開示された実施形態は本明細書中に開示される主題の原理の例示のみであることを容易に理解するであろう。それゆえ、開示された主題は本明細書中に示される特定の方法、プロトコル、および/または試薬等に限定されることはないことが理解されるべきである。そのように、開示された主題に対するさまざまな改変もしくは変化または開示された主題の代替の配置は本明細書の精神から離れることなく本明細書中の教示に従ってなされ得る。最後に、本明細書中で使用される技術は特定の実施形態を示す目的のためのみであり、そして本発明の範囲を限定するとは意図されず、本発明の範囲は請求項によってのみ定義される。したがって、本発明は表示されおよび説明されるように正確なものに限定されない。本発明者に知られる本発明を実施するのに最も良いモードを含む、本発明のある実施形態が本明細書中に示される。もちろん、これらの示される実施形態についての変形は上記の説明を読めば当業者に明らかになるであろう。本発明者は、当業者が適切なようにそのような変形を使用することを予想し、そして本発明者は本発明が本明細書中に特に示されるものとは異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は適用可能な法により許可されるように、付属の請求項中に列挙される主題の全ての改変および相当物を含む。さらに、上記に示される実施形態のそれらの全ての可能な変形でのどんな組み合わせも、包含されないことが本明細書中に示されない限りまたは包含されることが文脈により明らかに否定されない場合、本発明により包含される。本発明に係る代替の実施形態、要素またはステップのグループ化は限定として解釈されるべきでない。各グループの構成要素は個々にまたは本明細書中に開示される他のグループ構成要素との組み合わせでも参照され、および請求され得る。あるグループの1以上の構成要素は利便性および/または特許性の理由のためにグループに含まれまたはグループから消去され得ることが予想される。そのような包含または消去が起こるとき、本明細書は改変され、したがって付属の請求項中で使用される全てのマーカッシュグループの記述を満たすように、そのグループを含むと考えられる。別段の定めなき限り、本明細書および請求項中で使用される特徴、項目、量、パラメーター、特性、用語等を表現する全ての数字は用語約により全ての場合に改変されると理解されるべきである。本明細書中で使用されるとき、用語約は、そのように限定された特徴、項目、量、パラメーター、特性または用語が示された特徴、項目、量、パラメーター、特性または用語の値の±10超および未満の範囲を含むことを意味する。したがって、逆のように示されない限り、本明細書および付属の請求項中に設定される数字パラメーターは変化し得る概数である。少なくとも、そして請求項の範囲の相当物の原則の適用を制限する意図としてではなく、各数字表示は少なくとも報告された顕著なディジットの数字に照らしておよび通常の端数の切り捨て技術を適用することにより解釈されるべきである。本発明の広い範囲に設定される数字範囲および値は概数であるにもかかわらず、特定の実施例中に設定される数字範囲および値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、数字範囲または値はそれらの各試験計測中に見られる標準偏差から必然的に生ずるある誤差を固有に含む。本明細書中の値の数字範囲の詳述は単にその範囲に入る各別々の数値に個々に言及する略記法としてはたらくと意図される。本明細書中に別段の定めなき限り、数字範囲の各個々の値はそれが本明細書中で個々に列挙されるかのように本明細書中に援用される。本発明を示す文脈中で特に以下の請求項の文脈中で使用される用語a、an、theおよび同様の指示物は、本明細書中に別段の定めなき限りまたは文脈により明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中に示される全ての方法は本明細書中に別段の定めなき限りまたは文脈により明らかに別段のように否定されない限り、どんな好適な順序でも行われ得る。本明細書中に提供されるいずれのおよび全ての実施例または例示的な言語例えば~の如きの使用は単に本発明をよりよく照らすことが意図され、そして別段のように請求される本発明の範囲の限定を提示しない。本明細書中のいかなる言語も本発明の実施に本質的な非請求要素を示すと解釈されるべきである。本明細書中に開示される特定の実施形態は言語からなることまたは本質的に言語からなることを用いた請求項中にさらに限定され得る。請求項中で使用されるとき、出願されまたは修正毎に追加されるとき、遷移用語~からなるは請求項中で特定されない要素、ステップまたは成分を排除する。遷移用語本質的に~からなるは請求の範囲を特定の物質またはステップならびに基本的なおよび新規特徴単数または複数に実質的に影響しない物質またはステップに限定する。そのように請求される本発明の実施形態は本明細書中で固有にまたは特に示され、および可能にされる。本明細書中に引用され、同定される全ての特許、特許公開公報、および他の出版物は例えば、本発明に関連して使用され得るそのような出版物中に示される組成物および方法を示すおよび開示する目的のために、個々にかつ明示的にその全体が援用される。これらの出版物は、本出願の出願日前の開示であるために提供されているに過ぎない。この点におけるいずれも、本発明者が先行発明によってまたは他の理由のためにそのような開示に先行する権利を有さないという容認として解釈されるべきでない。日付についての全ての主張またはこれらの書類の内容についての提示は本出願者に入手可能な情報に基づき、これらの書類の日付または内容の正確さについて何ら容認するものではない。"