単離された形態、精製された形態、または組換えられた形態の、グルテンを含有する乾燥穀物製品を食する昆虫由来のグルテン分解プロテアーゼ。前記昆虫が小麦粉害虫である、請求項1記載のプロテアーゼ。前記小麦粉害虫がコクヌストモドキである、請求項1記載のプロテアーゼ。表1に記載されるプロテアーゼ、またはそのホモログ、オルソログ、もしくはバリアントである、請求項1記載のプロテアーゼ。前記ホモログ、オルソログ、もしくはバリアントが、表1に記載されるプロテアーゼに対して少なくとも80の配列同一性を有する、請求項4記載のプロテアーゼ。食料中のグルテンを8アミノ酸よりも短い断片に分解する、請求項4記載のプロテアーゼ。正常な消化酵素に耐性があるグルテン断片を消化する、請求項4記載のプロテアーゼ。薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化される、請求項1記載のプロテアーゼ。食品と混合される、請求項1記載のプロテアーゼ。酸条件に対して安定である、請求項1記載のプロテアーゼ。請求項1~10のいずれか一項記載のプロテアーゼのコード配列と、適切な宿主細胞中での該プロテアーゼの発現を駆動するプロモーターとを含む、グルテン分解プロテアーゼのための組換え発現ベクター。グルテン含有食品を請求項1~10のいずれか一項記載のプロテアーゼの1つまたは複数と接触させる段階を含む、食品中のグルテンを分解するための方法。1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と混合された請求項1~10のいずれか一項記載のプロテアーゼを含む、経口投与に適した薬学的製剤。1つまたは複数の非昆虫プロテアーゼをさらに含む、請求項13記載の薬学的製剤。前記非昆虫プロテアーゼが、オオムギのエンドプロテアーゼアスペルギルスオリゼー由来のXProジペプチダーゼアスペルギルスサイトイ由来のカルボキシペプチダーゼフラボバクテリウムメニンゴセプチカムのPEPスフィンゴモナスカプスラータのPEPペニシリウムシトリナムのPEPラクトバチルスヘルベティクスのPEPおよびミクソコックスクサントスのPEPのうちの1つまたは複数である、請求項14記載の薬学的製剤。以下の段階を含む、それを必要とする患者においてグルテン不耐性を処置するための方法であって、該処置によって免疫原性グルテンペプチドへの患者の曝露が低減する、方法:グルテンを含有している可能性のある食品の摂取と同時に、請求項1~10のいずれか一項記載のプロテアーゼの1つもしくは複数またはその薬学的製剤の治療的に有効な用量を、該患者に経口投与する段階。1つまたは複数の非昆虫プロテアーゼの治療的に有効な用量を前記患者に経口投与する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。前記非昆虫プロテアーゼが、オオムギのエンドプロテアーゼアスペルギルスオリゼー由来のXProジペプチダーゼアスペルギルスサイトイ由来のカルボキシペプチダーゼフラボバクテリウムメニンゴセプチカムのPEPスフィンゴモナスカプスラータのPEPペニシリウムシトリナムのPEPラクトバチルスヘルベティクスのPEPおよびミクソコックスクサントスのPEPのうちの1つまたは複数である、請求項17記載の方法。態様の詳細な説明本発明は、単離された形態、精製された形態、およびまたは組換えられた形態のグルテン分解プロテアーゼを提供する。消化管中でのグルテンの分解に関するこれらのプロテアーゼの好ましい特性の一部には、以下が含まれる:消化管中でのいっそう長い活性持続時間をもたらすGI管中でのプロテアーゼによる分解に対する耐性位置しうるペプチドまたはタンパク質のサイズにかかわらず免疫原性グルテンペプチドの分解を可能にする広い基質サイズ寛容性グルテン分解活性におけるプロテアーゼによる相乗効果胃の酸性条件下での最適活性を促進する広いpH安定性および活性範囲胃内容排出が起きる前にグルテンの分解を可能にする好ましい動態ならびに低グルテン濃度でさえもグルテン分解を可能にする、グルテンに対する低いKm。本発明のいくつかの態様では、本発明のグルテナーゼは小麦粉害虫に、例えば、ゴミムシダマシのトリボリウム属またはテネブリオ属のメンバーに由来し、これらは穀物サイロの害虫である。関心対象の小麦粉害虫は、非限定的に、コクヌストモドキヒラタコクヌストモドキクロヒラタコクヌストモドキチャイロコメノゴミムシダマシコメノゴミムシダマシなどを含む。小麦粉害虫プロテアーゼの記載、例えばVinokurovetalArchInsectBiochemPhysiol7025479GoptaretalBioorgKhim343106OppertetalBullEntomolRes9616772OppertetalCompBiochemPhysiolCToxicolPharmacolおよびLiangetalFEBSLett27813942を参照することができ、これらは参照により本明細書に明示的に組み入れられる。例示的なプロテアーゼのアミノ酸配列は表1中のSEQIDNOおよび他の識別情報を参照することにより、ならびにタンパク質およびコードヌクレオチド配列として配列表に記載されている。配列表はプロテアーゼのアミノ酸配列を提供し、さらに、6個のヒスチジンから構成される配列およびトロンビン切断部位が、本発明の組換えプロテアーゼ型の1例を例証するために各プロテアーゼのC末端に示されている。この任意的な付加配列は、それを含む組換えプロテアーゼの金属アフィニティークロマトグラフィーを用いた精製を容易にする。ヌクレオチド配列はピキアパストリスおよび大腸菌での発現のために最適化されるように天然配列から改変された。配列の領域は、SEQIDNO4~6においてピキアパストリス発現ベクターへのクローニングを容易にするために組換えDNA技術により導入された制限部位またはSEQIDNO15~16において大腸菌発現ベクターへのクローニングを容易にするために組換えDNA技術により導入された制限部位を含む。表1昆虫由来のプロリン特異的プロテアーゼの例本明細書において用いられる場合、プロリン特異的プロテアーゼとは、表1に示されるプロテアーゼもしくは表1に示されるプロテアーゼとの相同性を有する真核細胞由来のプロテアーゼ、またはどちらかのバリアントである。SEQIDNO9~11に記載されるプロテアーゼも任意で含まれる。1つの態様では、プロテアーゼは昆虫由来プロテアーゼ、例えば小麦粉害虫のプロテアーゼである。したがって、本発明は、表1に記載される特異的配列に加えて、提供される配列のバリアント、ホモログおよびオルソログを提供する。バリアントは天然配列と実質的に類似であり、すなわち少なくとも1アミノ酸異なることができ、少なくとも2アミノ酸、しかし通常は約10アミノ酸以下異なることができる。配列変化は置換、挿入または欠失でありうる。アラニン、または他の残基を系統的に導入する系統的突然変異を用いて、バリアント配列において維持されるべき重要なアミノ酸を判定することができる。提供される配列のホモログまたはオルソログは、小麦粉害虫のいずれかにおける対応プロテアーゼを含み、かつ通常、アミノ酸レベルで少なくとも約50の配列同一性、少なくとも約75の配列同一性、少なくとも約80の配列同一性、少なくとも約85の配列同一性、少なくとも約90の配列同一性、少なくとも約95の配列同一性、少なくとも約99の配列同一性、またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。種々の態様では、本発明のプロテアーゼは、いくつかのホモログの多重アライメントに基づくコンセンサス配列によって規定される任意のプロテアーゼであり、以下に提供される。多重配列アライメントは汎用の多重配列アライメントプログラムClustalW2を用いて行った。これは図1に示されており、ここでコンセンサス残基にはアライメントの下部に印が付けられている。本発明のバリアント配列を提供するために使用できる保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下のグループ内における置換を含むおよび。提供される配列のホモログまたはオルソログは、小麦粉害虫のいずれかにおける対応プロテアーゼを含み、通常、アミノ酸レベルで少なくとも約50の配列類似性、少なくとも約75の配列類似性、少なくとも約80の配列類似性、少なくとも約85の配列類似性、少なくとも約90の配列類似性、少なくとも約95の配列類似性、少なくとも約99の配列類似性、またはそれ以上の配列類似性を有するであろう。天然に存在するプロテアーゼのアミノ酸配列を、当技術分野において公知のさまざまな方法で改変でき、標的とする配列変化を生じることができ、よって本発明の異種配列を提供することができる。そのようなバリアントは、典型的には、機能的に保存されたバリアントであり、これは、通常は配列の点で、対応する天然タンパク質または親タンパク質とは異なるが、それでも、所望の生物学的活性およびもしくは機能を保持するか、または生物学的活性およびもしくは機能の増強を示す。当技術分野において公知のさまざまな方法、例えばランダム変異および標的変異と組み合わせたファージディスプレイ、走査変異の導入などを用いて、標的変化をもたらし、本発明の異種配列を提供することができる。本明細書において例示されるように、精製を補助するためのHisまたはエピトープタグの付加が含まれる。関心対象の特定の特徴を提供するように修飾された酵素を、酵素の活性を最適化するか、または例えば野生型のレベルに回復させるために、例えば当技術分野において公知のように、例えば、変異誘発、エクソンシャッフリングなどと、これに続くスクリーニングまたは選択によってさらに修飾し、そうして本発明の他の異種配列を提供することができる。プロテアーゼという用語はまた、生物学的に活性な断片を含む。関心対象の断片は、少なくとも約20個の隣接アミノ酸、より一般的には少なくとも約50個の隣接アミノ酸の断片を含み、100個またはそれ以上のアミノ酸、最大で完全なタンパク質を含むこともあり、さらなる配列を含むようにさらに伸長されることもある。いずれの場合でも、重要な基準は、断片がグルテンオリゴペプチドを消化する能力を保持しているかどうかである。一次配列を変化させないが本発明の他の異種プロテアーゼを提供する、プロテアーゼに対する関心対象の修飾には、タンパク質の化学的誘導体化、例えば、例えばラウリル基、ステアリル基、ミリスチル基、デシル基もしくは他の基による、アシル化PEG化、エステル化およびまたはアミド化が含まれる。そのような修飾を用いて、例えばPEG側鎖またはラウリル基を表面のリジンに結合させることによって、タンパク質分解に対する酵素の耐性を高めることができる。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成およびプロセッシングの際にまたはさらなるプロセッシング段階でタンパク質のグリコシル化パターンを修飾することにより行われる例えばタンパク質を、哺乳類のグリコシル化酵素もしくは脱グリコシル化酵素などの、グリコシル化に影響する酵素に曝露することにより行われる、グリコシル化の修飾も含まれる。リン酸化されたアミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も含まれる。一次配列に影響しない別の形の修飾は、活性に必要とされない配列の切断または除去、および、プロテアーゼが活性となる前に除去されなければならない配列の除去である。後者のタイプの修飾の周知の例はチモーゲンの活性化である。チモーゲンは、タンパク質分解的切断によって活性なプロテアーゼに変換される不活性型のプロテアーゼである。したがって、本発明によれば、プロテアーゼは、チモーゲンが作用部位で活性化されるか、または、それらをグルテン含有食品と接触させる前にもしくはその前に同時に前活性化される限り、チモーゲンとして用いることができる。例えば、産生またはプロセッシングを促進するためにチモーゲン型のプロテアーゼとして用い、その後、使用前に、チモーゲンのプロペプチド領域が切断されるような処理に供してもよい。チモーゲン型のそのような前活性化を利用して、例えば、製剤の投薬を簡単にし、およびまたは作用部位での活性化の必要性を低減してもよい。タンパク質分解に対する耐性、およびまたは胃内に見られるような酸性条件に対する耐性を改善するために、ならびに可溶性の特性を最適化するために、もしくは治療剤としてより適切なものとするために、分子生物学的手法およびまたは化学的手法によって修飾されたタンパク質も、本発明の実践および本発明によって提供される実践において有用である。例えば、ペプチダーゼの主鎖を環状化して、安定性を高めることができるJBiolChem2752378323789を参照のこと。このようなタンパク質の類似体は、天然のLアミノ酸以外の残基、例えばDアミノ酸または非天然の合成アミノ酸を含有するものを含む。本発明のプロリン特異的プロテアーゼは、任意の真核生物酵素を含み、例えば、セリアック病患者に対して免疫原性であるグルテンオリゴペプチドの切断に関して、特に、比較的長い、生理学的に作出されたペプチド、例えばαグリアジン由来の33merおよびγグリアジン由来の26merの切断に関して、少なくとも約25s1M1、通常は少なくとも約250s1M1、および好ましくは少なくとも約25000s1M1のkcatKmを有する、組換え型または精製型の昆虫プロテアーゼ、例えば小麦粉害虫のプロテアーゼを含むが、これらに限定されない。本発明のプロテアーゼは、消光された蛍光発生基質に対する特異性kcatKmが2mM1s1を上回るペプチダーゼまたはプロテアーゼを含む。これらのアッセイ法は、HPLCまたは蛍光分光法によりモニタリングすることができる。後者のアッセイ法の場合、適当なフルオロフォアを、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に結合させることができる。本発明の実践において有用なプロテアーゼは、前処理した基質を切断して毒性グルテンオリゴペプチドを除去するその能力によって特定することができ、ここで前処理した基質とは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、ならびにカルボキシペプチダーゼAおよびBを含む、生理学的量の胃および膵臓のプロテアーゼで処理されたグリアジン、ホルデイン、セカリンまたはアベニンタンパク質である。ペプシンによる消化は、胃内における消化を再現したpH2における20分間の処理によって実施することができ、続いて反応混合物を十二指腸における分泌型の膵臓酵素による消化を再現した、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼによるpH7における1時間のさらなる処理に供する。前処理した基質は、例えば生理学的条件の下で消化に耐性を示すオリゴペプチドを含む。グルテナーゼは、PQPQLPYPQより長いのが産物の10未満となるように、ペプシントリプシンキモトリプシンエラスターゼカルボキシペプチダーゼで処理されたグルテンの切断を触媒しうる。本発明のプロテアーゼを特徴付けるのに適したグルテナーゼアッセイ法はまた、米国特許第7303871号同第7320788号および同第7534426号に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。前処理した基質をプロテアーゼが切断する能力は、37°Cで1時間インキュベートされた、1mgmlの前処理基質および10μgmlのペプチダーゼまたはプロテアーゼを含有する反応混合物中で、酵素が遊離NH2末端の濃度を上昇させる能力を測定することによって決定することができる。本発明の実践において有用なプロテアーゼは、このような条件の下で、遊離アミノ末端の濃度を、一般的には少なくとも約25、より一般的には少なくとも約50、および好ましくは少なくとも約100上昇させる。プロテアーゼには、10μgmlの酵素との1時間のインキュベーション後に、1mgmlの前処理した基質中で約1000Da超のオリゴペプチドの残存モル濃度を少なくとも約12、一般的には少なくとも約15、および好ましくは少なくとも約110に低下させる能力を有する酵素が含まれる。このようなオリゴペプチドの濃度は、当技術分野において公知の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー法などによって推定することができる。本発明のプロテアーゼは、セリアック病患者の腸生検に由来するポリクローナルT細胞株によってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができLCMSMSによってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができかつまたは、グリアジンに特異的な配列を認識する能力を有するモノクローナル抗体を使用するELISA法によってモニタリングされる全グルテンを無毒化することができる、酵素を含む。本発明のプロテアーゼはまた、セリアック病患者におけるグルテン負荷試験食に対する抗tTG抗体応答を、少なくとも約12、より一般的には少なくとも約15、および好ましくは少なくとも約110に低下させる酵素を含むことができる。グルテン負荷試験食は、直前までグルテン非含有食を摂取していたセリアック病の成人患者による3日間のパン100g日の摂取と定義される。抗tTG抗体応答は、当技術分野において公知のように、標準的な臨床診断手順を用いて末梢血中で測定することができる。本発明の実践において有用なプロテアーゼはまた、組換え産生系からおよび天然源から、従来の方法にしたがって単離および精製することができる。プロテアーゼの産生は、大腸菌、出芽酵母、ピキアパストリス、ラクトバチルス、バチルスおよびアスペルギルスなどの生物における、確立された宿主ベクター系を用いて達成することができる。組込み型または自己複製型のベクターをこの目的で用いることができる。このような宿主の一部では、プロテアーゼが細胞内タンパク質として発現され、その後、精製されるが、他の宿主では、酵素が細胞外培地中に分泌される。タンパク質の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、Niアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびまたは他の精製法の組み合わせにより行うことができる。典型的には、本発明の実践において用いられる組成物は、所望の産物の少なくとも20重量、より一般的には少なくとも約50重量、好ましくは少なくとも約85重量、少なくとも約90を含み、および治療目的では、産物の調製およびその精製法に関連する混入物に関して少なくとも約95重量である場合がある。一般的には、これらの百分率は全タンパク質に基づく。このような組成物中のタンパク質は、少なくとも約500μgml少なくとも約1mgmg少なくとも約5mgml少なくとも約10mgmlまたはそれ以上の濃度で存在する場合がある。適当な方法には、参照により本明細書に組み入れられる、PCT公開番号2008115428に記載されているものが含まれる。1つの局面では、本発明は昆虫由来プロテアーゼの精製された調製物を提供する。このような酵素は天然源から単離されうるが、本発明は組換え法によってそれらを産生可能にする。1つの態様では、このような方法では発現用に細菌宿主を利用するが、一部の目的には、昆虫系を含む、真菌系および真核系が有用である。シグナル配列を含むコード配列、またはシグナル配列を含むように人工的に作られたコード配列を、細菌宿主の細胞周辺腔中に分泌させることができる。次に浸透圧ショックプロトコルを用いて、細胞周辺腔のタンパク質を上清中に放出させることができる。酵素が細胞質酵素である場合、周辺質分泌のためにシグナル配列を導入してもよく、または酵素を細胞質溶解物から単離してもよい。精製方法は、例えばヒスチジンタグの導入と組み合わせる、NiNTAアフィニティー精製および当技術分野において公知のクロマトグラフィー法、例えば陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、HPLC、FPLCなどを含む。安定な保存などのさまざまな目的のために、酵素を凍結乾燥させることができる。凍結乾燥は好ましくは、例えば少なくとも約1mgmlの、最初に濃縮された調製物に対して行われる。Pegを加えて酵素の安定性を高めることができる。MXPEPを、比活性を損なうことなく凍結乾燥できることが分かっている。凍結乾燥した酵素および賦形剤は、腸溶コーティングが施されたカプセル剤または錠剤の製造において有用であり、例えば1個のカプセル剤または錠剤は少なくとも約1mgの酵素、一般的には少なくとも約10mgの酵素を含んでよく、少なくとも100mgの酵素、少なくとも約500mgの酵素、またはそれ以上を含んでよい。かなりの割合の活性が保持され、かつ少なくとも約1ヶ月間にわたり4°Cで安定となる、コーティングを施すことができる。酵素の組み合わせの目的に関して、以下の非限定的なプロテアーゼの一覧が関心対象となるオオムギのエンドプロテアーゼアスペルギルスオリゼー由来のXProジペプチダーゼアスペルギルスサイトイ由来のカルボキシペプチダーゼフラボバクテリウムメニンゴセプチカムのPEPスフィンゴモナスカプスラータのPEPペニシリウムシトリナムのPEPラクトバチルスヘルベティクスのPEPおよびミクソコックスクサントスのPEP。関心対象の組み合わせには、2つまたはそれ以上の昆虫由来プロテアーゼが含まれる。他の態様では、昆虫由来プロテアーゼを非昆虫由来プロテアーゼ、例えばオオムギのエンドペプチダーゼC、スフィンゴモナスカプスラータのプロリルエンドペプチダーゼなどと組み合わせることができ、例えば本明細書において記載されるプロリン特異的プロテアーゼをオオムギのエンドペプチダーゼBなどと組み合わせることができる。組み合わせにより、複数のプロテアーゼが別個の製剤中で同時に投与されるか、または共製剤化されることが意図される。いくつかの態様では、プロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせが個体によって食料と同時に、例えば食事の時間に摂取される。各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7303871号および同第7320788号ならびにPCT公開番号2010047733、2009075816および2008115411に記載されているプロリン特異的プロテアーゼおよびグルタミン特異的プロテアーゼは、そのような組み合わせで用いるのにとりわけ適している。本発明の組み合わせ製剤で用いるのに適した他のグルタミン特異的プロテアーゼは、発明者PawanKumarによって本発明と同日付で出願され、ProteasesforDegradingGlutenという名称を付され、参照により本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国仮特許出願に記載されている。本発明のプロリン特異的なグルテン分解プロテアーゼは、ある種の利点を提供する。それらは、昆虫消化系の酸性部分において天然に存在するプロテアーゼに由来し、またはそのプロテアーゼと極めて相同であり、そのため、その機能的pH範囲は酸性範囲内であり、このことにより、ヒト胃内でグルテンを分解するのに理想的となる。プロテアーゼは他の昆虫消化プロテアーゼのタンパク質分解に対する安定性を有し、多くの昆虫消化プロテアーゼはヒト消化プロテアーゼと相同であるため、タンパク質分解耐性のこの特性はヒト消化プロテアーゼに当てはまる。プロテアーゼは、その天然環境において、食事が排泄される前にタンパク質を分解しなければならず、そのため、食事の消化に好ましい動態を有する。多くの穀物ではグルテンを貯蔵タンパク質として用いるので、本発明のプロテアーゼはグルテンを特異的に分解するように進化させた。グルテンはグルタミンおよびプロリン残基に富んでおり、本発明のプロテアーゼのある種のものはプロリン特異的である。これらのプロリン特異的プロテアーゼは、本発明によれば、オオムギEPB2プロテアーゼまたはその組換え型ALV001などのグルタミン特異的プロテアーゼと組み合わせて、極めて強力な、グルテン分解性のプロテアーゼ混合物を作出することができる。本発明の方法ならびに特定の患者または用途におけるその有効性を判定するための検査は、本明細書における教示にしたがい、当技術分野において標準的な手順を用いて行うことができる。したがって、本発明の実践では、当業者の技術の範囲内の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来法を利用することができる。そのような技法は、MolecularCloningALaboratoryManual、secondeditionOligonucleotideSynthesisAnimalCellCultureMethodsinEnzymologyHandbookofExperimentalImmunologyGeneTransferVectorsforMammalianCellsCurrentProtocolsinMolecularBiologyPCRThePolymeraseChainReactionおよびCurrentProtocolsinImmunologyなどの文献、ならびにこれらの全ての最新版または改訂版に詳しく説明されている。本発明の目的に関して、毒性グリアジンオリゴペプチドとは、食用穀物、例えばコムギ、ライムギ、オオムギなどに由来するグリアジンおよび関連する保存タンパク質の正常ヒト消化に際して誘導されるペプチドであり、これらはセリアック病患者において免疫原性である、例えば、T細胞に対する抗原として作用する。免疫原性ペプチドは一般的に、約8~20アミノ酸長であり、より一般的には約10~18アミノ酸またはそれ以上である。そのようなペプチドはPXPモチーフを含むことができる。オリゴペプチドが特定の患者に対して免疫原性であるかどうかの判定は、当業者に公知の標準的なT細胞活性化および他のアッセイ法によって容易に下される。候補酵素が毒性グルテンオリゴペプチドを消化するかどうかの判定は、経験的に下すことができる。例えば、候補をオリゴペプチドと混合してもよく、または、生理学的量の胃および膵臓のプロテアーゼで処理されたグリアジン、ホルデイン、セカリンもしくはアベニンタンパク質の1つもしくは複数を含む前処理した基質と混合してもよい。各場合において、酵素がオリゴペプチドを切断できるかどうかが判定される。そのようなアッセイ法のためのオリゴペプチドまたはタンパク質の基質は合成、組換え法、天然源からの単離などの従来の技法にしたがって調製することができる。例えば、固相ペプチド合成では、アミノ酸の連続的付加を伴って、直線状のペプチド鎖を作出するJAmChemSoc8521492154を参照のこと。組換えDNA技術を用いてペプチドを作出することもできる。毒性オリゴペプチドの消化のレベルをベースライン値と比較することができる。グルテンを、10アミノ酸長未満のペプチド、例えば8アミノ酸のペプチド、6アミノ酸のペプチド、またはさらに短いペプチドに分解すると、毒性がかなり低くなる。出発物質の消失およびまたは消化産物の存在は、インビトロおよびインビボアッセイ系を含むモデル系において、従来の方法によりモニタリングすることができる。例えば、検出可能なマーカーをペプチドに結合させることができ、次に、例えば酸沈殿法、分子量排除などで、マーカーと関連する分子量の変化を判定する。ベースライン値は、対照試料の値、または対照集団を代表する統計値であることができる。観察された活性が信頼できるものであることを確実とするために、同時に行われる平行反応、陽性および陰性の対照、ならびに用量反応などを含む、さまざまな対照を実施することができる。本発明はまた、本発明の組換えプロテアーゼのコード配列を含む組換え核酸を提供する。これらの組換え核酸には、ピキアパストリス、大腸菌、または、そのようなタンパク質またはそのバリアントが天然で産生される細胞にとっては異種である、他の宿主細胞における発現のために最適化された1つまたは複数のコドンを含むヌクレオチド配列を有するものが含まれる。最適化されたヌクレオチド配列の例は、配列表の中にSEQIDNO4~6として提供されている。本発明はまた、宿主細胞におけるコード配列の発現を駆動するように位置付けられたプロモーターに機能的に連結されている本発明のプロテアーゼをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明はまた、プロテアーゼの発現に適した条件の下で本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を培養する段階を含む、本発明のプロテアーゼを産生するための方法を提供する。本明細書において用いられる場合、市販の化合物は、AcrosOrganics、AldrichChemical、ApinChemicalsLtd、AvocadoResearch、BDHInc、Bionet、ChemserviceInc、CrescentChemicalCo、EastmanOrganicChemicals、EastmanKodakCompany、FisherScientificCo、FisonsChemicals、FrontierScientific、ICNBiomedicalsInc、KeyOrganics、LancasterSynthesis、MaybridgeChemicalCoLtd、ParishChemicalCo、PfaltzBauerInc、Polyorganix、PierceChemicalCo、RiedeldeHaenAG、SpectrumQualityProductInc、TCIAmerica、TransWorldChemicalsInc、WakoChemicalsUSAInc、NovabiochemならびにArgonautTechnologyを含むがこれらに限定されない、商業的供給源から得ることができる。本発明のプロテアーゼおよび処理済の食品との同時投与に有用な化合物は、当業者に公知の方法によって作出することもできる。本明細書において用いられる場合、当業者に公知の方法は、さまざまな参考文献およびデータベースを通じて特定することができる。本発明の化合物の調製において有用な反応物の合成について詳述した適当な参考書および専門書、または調製に関して記載された記事の参考文献は、例えば、SyntheticOrganicChemistryJohnWileySonsIncNewYorkSRSandleretalOrganicFunctionalGroupPreparations2ndEdAcademicPressNewYork1983HOHouseModernSyntheticReactions2ndEdWABenjaminIncMenloParkCalif1972TLGilchristHeterocyclicChemistry2ndEdJohnWileySonsNewYork1992JMarchAdvancedOrganicChemistryReactionsMechanismsandStructure4thEdWileyInterscienceNewYork1992を含む。特異的かつ類似の反応物は、大半の公共図書館および大学図書館で、ならびにオンラインデータベースを通じて利用可能な、米国化学会のケミカルアブストラクトサービスによって調製された既知化合物のインデックスによって特定することもできる。公知ではあるがカタログにて市販されていない化合物はカスタム化学合成業者によって調製することができ、多くの標準的な化合物供給業者がカスタム合成サービスを提供している。本発明のプロテアーゼ、ならびにまたは、それとともに投与される化合物および酵素の組み合わせは、治療的投与のためにさまざまな製剤中に組み入れられる。1つの局面では、このような剤は、薬学的に許容される適切な担体または希釈剤との組み合わせにより薬学的組成物に製剤化され、かつ、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル、微粒子、およびエアロゾルなどの、固体、半固体、液体または気体の形態で調製物に製剤化される。したがって、プロテアーゼおよびまたは他の化合物の投与はさまざまな方法で、一般的には経口投与により達成することができる。プロテアーゼおよびまたは他の化合物は、投与後に全身移行性であってもよく、または、製剤化によって、もしくは活性用量を移植部位に保持するように作用する移植片の使用により、局所性であってもよい。薬学的投与形態では、プロテアーゼおよびまたは他の化合物を、その薬学的に許容される塩の形態で投与することができ、または、単独でもしくは適切な関係で、ならびに他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて、使用することもできる。剤を、既述のように組み合わせて、タンパク質分解活性のカクテルを提供することができる。以下の方法および賦形剤は例示的であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。経口調製物の場合、剤は単独で、または、錠剤、粉末剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製するための適切な添加物と組み合わせて、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチもしくはポテトスターチなどの従来の添加物と結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチンなどの結合剤とコーンスターチ、ポテトスターチもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤とタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤とおよび、望ましいならば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および着香剤とともに、用いることができる。グルテン感受性を有する個体のためのグルテンの無毒化は、食物が胃に入ると直ちに始まりうる。というのは、胃の酸性環境はグルテンの可溶化に有利に働くからである。プロテアーゼの胃内への導入は、ペプシンの作用と相乗的に作用し、これにより、セリアック病患者の小腸内へのグルテン侵入の際の毒性ペプチドの崩壊の加速がもたらされる。そのようなプロテアーゼは、腸溶性の製剤化を必要としえない。別の態様では、プロテアーゼを食品と混合するか、または、グルテンを含有する食品を前処理するために用いる。食品中で混合されるプロテアーゼは、摂取前または摂取中に酵素的に活性であることができ、活性のタイミングを制御するためにカプセルに充填するか、または別の方法で処理することができる。あるいは、プロテアーゼをカプセルに充填して、摂取後の、例えば摂取から一定時間後のおよびまたは腸管内の所定の位置での持続放出を達成することができる。製剤は典型的には、単位投与形態で提供され、ここで単位投与形態という用語は、ヒト対象への単位投与量として適した物理的に不連続な単位であって、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体または媒体と関連して所望の効果を十分に生じると算出された量で、所定量のプロテアーゼを含有する。本発明の単位投与形態の仕様は、利用される特定の複合体、および達成されるべき作用、ならびに宿主における各複合体と関連する薬物動態に依る。媒体、アジュバント、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤が市販されている。さらに、pH調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も市販されている。本発明の方法および組成物において有用な任意の化合物は、薬学的に許容される塩基付加塩として提供され得る。薬学的に許容される塩基付加塩とは、遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持している塩を指し、これは、生物学的にも他の面でも望ましくないものではない。このような塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することで調製される。無機塩基に由来する塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などを含むがこれらに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩である。有機塩基に由来する塩は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2ジメチルアミノエタノール、2ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Nエチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの、一級、二級、および三級のアミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂を含むがこれらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。処置される患者および条件に応じて、ならびに投与経路に応じて、プロテアーゼを001mg~500mgkg体重日の投与量、例えば約1~100mgkg体重日の投与量、例えば、平均的な人では20mgkg体重日の投与量で、投与することができる。成人のインビボにおけるグルテンの効率的なタンパク質分解では、治療的に有効な酵素が少なくとも約500単位、もしくは少なくとも約5000単位、もしくは少なくとも約50000単位、少なくとも約500000単位、またはそれ以上、例えば、約5×106単位もしくはそれ以上必要であり得、ここで1単位は、指定の条件下で選択した基質を1分間あたり1μmol加水分解するのに必要な酵素の量と定義される。用量は増加可能であるが、有用な投与量を超えてもさらなる利益は得られない場合があることを、当業者は理解するであろう。経口的に投与される本発明のプロテアーゼは無毒性であり、従って投与されるプロテアーゼの量は、一緒に摂取される食品中のグルテンの相当量または全てを分解するのに十分な用量を超えうることを当業者は理解するであろう。小児用製剤の場合、投与量は適切に調節される。小児では、有効な用量はもっと低くなりうる。併用療法では、同等の用量の2種類の酵素が投与されうるしかしながら、その比は例えば、2種類の酵素の、活性の相乗効果ならびにまたは胃および十二指腸での不活性化に対する相対的安定性の影響を受けうる。セリアック病または他の形態のグルテン不耐性のプロテアーゼ処置は、食事前または食事とともに施される場合に最も有効であると予想される。しかし、食品は胃内に05~2時間留まりうるので、プロテアーゼは食後1時間以内までに投与することもできよう。本発明のいくつかの態様では、製剤は、選択されたプロテアーゼのカクテル、例えば本発明のプロテアーゼとスフィンゴモナスカプスラータのPEP、オオムギのシステインエンドプロテアーゼBなどのうちの1つまたは複数との組み合わせを含む。そのような組み合わせによって、さらに大きな治療効果を達成することができる。特定の酵素、症状の重症度、および副作用に対する対象の感受性に応じて用量レベルが変わりうることを、当業者は容易に理解するであろう。一部のプロテアーゼは、他のものよりも強力である。所与の酵素に関して好ましい投与量は、当業者によってさまざまな手段で容易に判定可能である。好ましい手段は、所与の化合物の生理学的な効力を測定することである。本発明の組成物は、治療目的だけでなく予防目的でも使用することができる。本明細書において用いられる場合、処置するという用語は、疾患の予防および疾患または既存の状態の処置の両方を指し、より一般的には、グルテン摂取が患者に毒性効果を及ぼすことの予防、またはプロテアーゼ治療の非存在下での同量のグルテンの摂取の毒性効果と比べた、毒性の低減を指す。本発明は、進行中の疾患の処置における重大な進歩をもたらし、かつ、患者の臨床症状の安定化およびまたは改善に役立つ。そのような処置は望ましくは、罹患組織の機能喪失の前に実施されるが、失われた機能を回復させるのに、またはさらなる機能喪失を防ぐのにも役立ちうる。治療効果の証拠は、疲労、慢性の下痢、栄養吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血、皮膚発疹などの症状、ならびにセリアック病およびまたは疱疹状皮膚炎およびまたはグルテン感受性の他の症状の重症度によって特に測定される、疾患の重症度の何らかの減少でありうる。他の疾患の兆候は、グルテンに特異的な抗体の存在、組織トランスグルタミナーゼに特異的な抗体の存在、炎症促進性T細胞およびサイトカインの存在、組織学的検査または他の検査によって明らかとなる小腸の絨毛構造の損傷、腸の透過性の昂進などを含む。本発明の方法により処置されうる患者には、1回もしくは複数回の血清学的検査、例えば抗グリアジン抗体、抗トランスグルタミナーゼ抗体、抗筋肉膜抗体例えばセリアック病変を特定するための内視鏡による評価例えば、繊毛萎縮、陰窩過形成、上皮内リンパ球の浸潤を検出するための小腸粘膜の組織学的評価およびグルテンの食事への含有に依る任意のGI症状によって、セリアック病または他のグルテン不耐性と診断された患者が含まれる。経口プロテアーゼの安全性を考慮すれば、これらを、I型糖尿病、セリアック病患者、疱疹状皮膚炎患者であると診断された者の家族、HLADQ2陽性の者、およびまたは正式な診断は未だ下されていないグルテン関連症状が見られる患者などの高リスク集団において、予防的に使用することもできる。このような患者は、通常用量または低用量の酵素によって治療される可能性がある。同様に、このような剤の一時的な高用量での使用もまた、例えば便中脂肪排泄アッセイ法で判断されるような、腸の機能が未だ正常に戻っていないグルテン媒介性腸疾患から回復中の患者に対して予想される。本発明から利益を得る可能性のある患者は、任意の年齢であってよく、成人および小児を含んでよい。特に小児は予防的治療による利益を得る。というのは、毒性グルテンペプチドに対する早期曝露の予防により、該疾患の初回発生を防ぐことが可能であるからである。予防に適した小児は、素因の遺伝的検査によって、例えばHLA分類よって、家族歴によって、T細胞アッセイ法によって、または他の医学的手段によって特定することができる。当技術分野において公知のように、小児使用の際には、投与量を調節することができる。治療効果は、臨床転帰に関して測定してもよく、または免疫学的もしくは生化学的な検査によって判定してもよい。有害なT細胞活性の抑制は、反応性Th1細胞の計数によって、病変部位におけるサイトカインの放出の定量によって、または、自己免疫性T細胞の存在についての当技術分野で公知の他のアッセイ法を用いて測定することができる。あるいは、疾患の症状の緩和を調べることができる。さまざまな投与法を利用することができ、好ましくは、例えば食事を用いる経口投与が使用される。治療用製剤の投与量は、疾患の性質、投与頻度、投与様式、宿主からの剤のクリアランスなどに応じて大きく変動する。初回用量を多くして、その後、より少量の維持用量を続けることができる。用量は、週に1回もしくは2週に1回という低頻度で投与することができ、または、より少量に分けてより頻繁に、食事と共に毎日、週2回、もしくはそれ以外で、有効投与量レベルを維持するための必要に応じて、投与することができる。本発明のさまざまな局面および態様は、以下の実施例において非限定的に例証される。以下の実施例は、当業者に提供する目的で、本発明の作製法および使用法の完全な開示および説明とともに記載し、かつ本発明の範囲を制限するか、または以下に示す実験が全てであるか、もしくは実施された唯一の実験であることを意味する意図はない。使用される数値に関して精度を高めるための取り組みが成されているが、ある程度の実験誤差および偏差が存在する可能性はある。特に明記された部分を除き、割合は重量の割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、および圧力は大気圧または大気圧の近傍である。消化環境においてグルテンを分解するのに好ましいプロテアーゼの特性には、以下が含まれる:酵素の持続時間をより長くするための、消化管に存在する他のプロテアーゼに対する耐性可能性のある最も小さな断片へとグルテンを分解するための、およびまた、酵素の組み合わせが用いられる場合には2つのプロテアーゼの相乗効果を促進するための、ペプチドサイズに対する広い特異性胃の酸性条件下で酵素を機能させるための広いpH安定性および動作範囲胃内容排出前にグルテンの大部分を分解するために好ましい動態ならびに、低グルテン濃度でのグルテン分解速度を顕著に低下させることなくグルテンの分解を可能にするための、グルテンに対する低いKm。乾燥穀物製品からタンパク質をもたらす昆虫、例えば小麦粉害虫を含むいくつかの天然供給源において、酵素は上記の特徴とともに進化してきた。小麦粉害虫は、コクヌストモドキ、ヒラタコクヌストモドキクロヒラタコクヌストモドキチャイロコメノゴミムシダマシコメノゴミムシダマシなどを含む。小麦粉害虫のグルテン分解酵素は以下の利点のうちの1つまたは複数を有するそれが作用する昆虫消化系の部分は酸性であり、それゆえ、消化酵素の機能的なpH範囲は酸性である他のプロテアーゼと比べて、該酵素は、他の酵素消化プロテアーゼに対してタンパク質分解に対する安定性を有する。というのは、これらが互いの存在下で機能するように進化してきたからである。昆虫の消化プロテアーゼの多くはヒト消化プロテアーゼと相同であるので、タンパク質分解耐性はヒトでの消化環境に引き継ぐことができる。消化プロテアーゼは、食事が排泄される前にタンパク質を素早く分解しておかなければならないので、酵素は食事の消化に好ましい動態を有する。多くの穀物は貯蔵タンパク質としてグルテンを有しており、それゆえ、消化酵素は、グルテンの分解が昆虫にとって好都合な環境において進化してきた。グルテンはグルタミンおよびプロリン残基に富んでいるため、これらの消化酵素プロテアーゼは、グルタミンおよびまたはプロリンに富むタンパク質の切断において効率的である。コクヌストモドキのゲノムが最近になって公表され949552008、200種超の推定プロテアーゼがゲノムにおいて特定された。プロテアーゼ配列が分類され、機能が既知のプロテアーゼとの比較に基づき推定機能が割り当てられている。同様に、チャイロコメノゴミムシダマシの場合、幼虫期中腸cDNA転写産物が分析され、幼虫期中腸において発現されるプロテアーゼが特定され分類された16455468。本発明によれば、これらのプロテアーゼのいくつかがプロリン特異的プロテアーゼとの相同性によりプロリン特異的グルテナーゼとして選択された。これらのプロテアーゼは上記の表1に、および配列表に記載されている。ピキアパストリスにおけるプロリン特異的プロテアーゼのクローニングおよび発現コドン最適化したヌクレオチド配列を合成し、PichiaPINKキットを用いたピキアパストリス菌株1での分泌発現のために各プロテアーゼのN末端にα接合因子配列を付加して、pPINKHCベクターのXhoIとKpnIとの間にクローニングした。α接合因子分泌シグナルはタンパク質の分泌によって除去される。エレクトロコンピテント細胞を調製し、発現プラスミドで形質転換した。PichiaPinkキット中の菌株はade2栄養要求株であった。発現プラスミドはADE2遺伝子を含んでおり、これがアデニン栄養要求株を補完した。発現プラスミドでのPichiaPink菌株の形質転換により、アデニンを欠く培地上で菌株が増殖できるようになる。形質転換体をAdeドロップアウトプレート上で選択し、プロテアーゼの発現についてスクリーニングした。タンパク質発現のため、10mLの開始培養物を50mLのFalcon試験管に入れた緩衝化グリセロール複合培地中にて48時間24~28°Cで増殖させた。開始培養物を用いて、2Lの振盪フラスコ中のBMGY500mLに接種した。細胞を250rpmで振盪させながら24~28°Cで48時間増殖させた。細胞を遠心分離し、1メタノールと複合された緩衝化メタノール複合培地100mL中に再懸濁して、メタノール誘導性AOX1プロモーターの制御下でタンパク質の発現を誘導した。250rpmで振盪させながら、24時間後に05のメタノールを補完して、24~28°Cで48時間タンパク質を発現させた。プロテアーゼXP972061はこの発現系において十分に発現した。発酵収量は精製後のタンパク質の量に基づき、およそ50~100mgLのプロテアーゼであった。ピキアパストリス由来のプロリン特異的プロテアーゼの精製タンパク質の発現後、細胞を遠心分離によって除去し、上清を2~8°Cに冷却した。上清30mLへの1MTris3mLの添加により、上清のpHを85に調整した。さらに、モノチオグリセロールを上清に終濃度2mMまで加えた。50mMTris2mMMTGの中で予め平衡化されたNiセファロースFF3mLを上清に加えた。樹脂へのタンパク質のバッチ結合のために上清を2~8°Cで2時間振盪させた。スラリーをKontes重力流カラムの中に充填した。樹脂床を50mMTris2mMMTG10mLで洗浄した。タンパク質を100mMリン酸カリウム、2mMMTGおよび250mMイミダゾール10mL中で溶出させた。プロテアーゼを100mMリン酸カリウム、2mMMTG中で透析して、イミダゾールを除去した。グリセロールを20の終濃度まで加えた。タンパク質を100μLのアリコートとして液体窒素中で急速冷凍した。純度およびタンパク質濃度をSDSPAGE分析によって推定した。XP972061タンパク質はSDSPAGE分析に基づき90超の純度であると推定された。XP972061の産生プロセスの規模拡大発酵および精製プロセスを30Lの流加発酵まで規模拡大した。XP972061の発現プラスミドを含有するピキアパストリスの培養プレートから細胞バンクを作出した。BMGY培地を含有する2つのフラスコに、細胞バンクのグリセロールストックのアリコート1mL2つを接種した。フラスコを48時間28°Cで振盪した。振盪フラスコ培養物をOD543に到達させ、その後これを用いて、BMGY培地を含有する30Lの発酵槽に接種した。発酵は400~800rpmの撹拌速度および空気20lpmの通気速度により28°Cで行った。水酸化アンモニウムおよび硫酸を用いてpHを55に制御した。溶存酸素のレベルを30に維持した。増殖を1時間ごとにモニタリングし、グリセロール濃度が1未満に下がり、溶存酸素の突然の急上昇が観察された時点でグリセロールの供給を開始した。グリセロールの供給は5mL分で開始し、5時間の間に0mL分にまで徐々に減らした。メタノールの供給を15mL分で開始することによってタンパク質発現を誘導し、これを5時間の間に5mL分にまで増やし、発酵の終わりまで継続した。発酵を誘導48時間後に停止し、細胞を遠心分離によって除去した。およそ19Lの上清を回収し、さらなる処理のために80°Cで凍結した。BPG100カラムに14LのHISSelectNickelAffinity樹脂を充填した。カラムを2カラム体積の水で洗浄し、その後、AktaPilotクロマトグラフィー系を用い130mL分の流速にて4CVの平衡化洗浄緩衝液で平衡化した。30L発酵物からの上清のpHを1MTrisによって85に調整し、130mL分でカラムに負荷した。カラムを2CVの平衡化洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を次に、溶出緩衝液を用いて溶出させた。溶出画分を限外ろ過して、凍結乾燥緩衝液に入れた。限外ろ過の後に、産物を、02ミクロンのフィルタを通してろ過し、80°Cで貯蔵した。凍結されたXP972061の濃度は74mgmLであった。精製後、産物を凍結乾燥し、30mLの容器中に250mgのアリコートとして分注し、使用するまで2~8°Cで貯蔵した。グルテン分解試験での使用の前に、産物を水中で新たに再構成し、タンパク質濃度10mgmLとした。大腸菌Ecoliにおけるプロリン特異的プロテアーゼのクローニングおよび発現コドン最適化したヌクレオチド配列を合成し、大腸菌株BL21での細胞質発現のためにpET28bベクターのNcoI部位とBamHI部位との間へクローニングした。大腸菌発現ベクターへのサブクローニングにより、添付のタンパク質配列における2つのN末端残基MetGlyの付加が起こる。化学コンピテント細胞を調製し、発現プラスミドで形質転換した。発現プラスミドはkan遺伝子を含み、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えた。発現プラスミドを用いた大腸菌株の形質転換によって、菌株は、カナマイシンを含有する培地上で増殖することが可能になった。形質転換体を、カナマイシンを含有するプレート上で選択し、プロテアーゼの発現についてスクリーニングした。タンパク質発現のため、10mLの開始培養物を、50mLのFalcon試験管内のLuriaBroth中で、250rpmで振盪させながら37°Cで12時間増殖させた。開始培養物を用いて、2Lの振盪フラスコ中のLB1000mLに接種した。細胞を、600nmでの吸光度により測定した光学密度06~08となるまで、250rpmで振盪させながら37°Cで増殖させた。細胞を30°C未満に冷却し、イソプロピルβD1チオガラクトピラノシドを02~1mMの濃度まで加えて、IPTG誘導性T7プロモーターの制御下でタンパク質の発現を誘導した。タンパク質を、250rpmで振盪させながら30°Cで12時間発現させた。プロテアーゼはこの発現系において封入体として十分に発現した。発酵収量はおよそ50mgLのプロテアーゼであった。大腸菌から得られたプロリン特異的プロテアーゼの再折り畳み細胞を15分間5000×gでの遠心分離によって収集する。収集した細胞を溶解緩衝液に再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解し、封入体を30分間10000×gでの遠心分離によって可溶物から分離する。洗浄のため、封入体を当初容量の2分の1まで水に再懸濁する。封入体を30分間10000×gでの遠心分離によって回収する。封入体の洗浄過程を1回繰り返す。洗浄された封入体を当初容量の2分の1で室温にて4~6時間、可溶化緩衝液に可溶化する。可溶化の後、不溶物を30分間10000×gでの遠心分離によって除去する。タンパク質を4°Cで10mMリン酸ナトリウムpH82、880mMアルギニン、1mMGSHおよび1mMGSSGに1~20倍希釈し、一晩インキュベートすることによってタンパク質の再折り畳みを行う。プロリン特異的プロテアーゼによるセリアック病関連ペプチドの分解50μgmLのさまざまなセリアック病関連ペプチドをpH45、37°Cで25μgmLのXP972061とともに1時間インキュベートした。この研究において、用いた3つのペプチドはであった。ペプチドの分解を逆相液体クロマトグラフィーによって分析した。酵素なしの対照反応と比較したペプチドピークの消失によって認められるように、XP972061により3つのペプチドの各々が完全にタンパク質分解された。このことは、活性なプロテアーゼが精製されたこと、および該プロテアーゼが低pHでセリアック病関連ペプチドを分解できたことを示唆している。低pH条件下でのプロテアーゼのペプシン安定性05mgmLのXP972061を04mgmLのペプシンおよび1mgmLのBSAとともに37°C、pH30でインキュベートした。XP97206110μLを種々の時点で採取し、発色基質HAlaPhePropNA990μLに加え、XP972061のタンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410nmにおける活性をモニタリングした。このデータは初期活性に対する百分率として以下に示されており、XP972061がおよそ3分の半減期を有することを示し、XP972061が低pH環境における高濃縮ペプシンへの短時間曝露に対して適度な安定性を有することを実証している。低pH環境でのペプシンに対する耐性は、多様な胃環境でのこのプロテアーゼの持続的活性に有益である。表3pH30でのペプシンによるタンパク質分解に対するXP972061の安定性酸化条件下でのプロテアーゼの安定性バナナ1本、およそ335mLの40mMHCl、およびAmysGlutenFreeKorma1食分を混合し、室温で30分間インキュベートした。固形物を遠心分離によって除去し、上清これは特定のシステインプロテアーゼを酸化的に不活性化するを、以下の実験に用いた。05mgmLのXP972061を70の酸化性の食事上清とともにpH40、37°Cでインキュベートした。XP97206110μLを種々の時点で採取し、発色基質HAlaPhePropNAに加え、タンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410nmにおける活性をモニタリングした。このデータは以下に示されており、XP972061が30分超の半減期を有することを示し、XP972061が酸化条件への曝露に対して非常に高い安定性を有することを実証している。酸化に対する耐性は、多様な胃環境での持続的活性に有益である。表4酸化条件下でのXP972061の安定性XP972061の高いpH安定性05mgmLのXP972061を250mMTrisとともにpH75、37°Cでインキュベートした。XP97206110μLを種々の時点で採取し、発色基質HAlaPhePropNAに加え、タンパク質分解作用による基質からのpNA発色団の放出により410nmにおける活性をモニタリングした。このデータは以下に示されており、XP972061が30分超の半減期を有することを示し、高いpH条件への曝露に対する非常に高い安定性を実証している。高いpH条件に対する耐性は、多様な胃環境でのこれらのプロテアーゼの持続的活性に有益である。表5高いpH条件でのXP972061の安定性ペプシン消化グルテンの分解6mgmLのペプシン消化グルテンを、25~100μgmLのALV001、つまりグルテン中のグルタミン残基に対する特異性を有するグルテナーゼ、100μgmLのXP972061または2つのプロテアーゼの組み合わせとともに100μLの反応液中にて10分間pH30および37°Cでインキュベートした。グルテン分解をRPLCによって定性的に分析し、かつ、セリアック病に関連する免疫刺激エピトープの1つを測定するELISAによって、定量的に分析した。RPLCデータから、XP972061単独でグルテンを分解できること、ならびにXP972061およびALV001の組み合わせではプロテアーゼ単独のどちらか一方を超える程度までグルテンが分解されたことが、定性的に示された。同様に、ELISAデータから、2つのプロテアーゼの組み合わせはプロテアーゼ単独のどちらか一方よりも効果的であることが定量的に示された。2つのプロテアーゼの組み合わせによってALV001の場合の量を2倍超上回って効果的にグルテンが分解されたという所見は、2つのプロテアーゼの間でのグルテン分解の相乗効果を実証している。表6ALV001およびXP972061によるペプシン消化グルテンにおける免疫刺激エピトープの分解の定量分析本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられると示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れられる。本発明を、本発明の実践に好ましい様式を含むように、本発明者によって見出された、または提案された特定の態様に関して記載した。本開示に照らして、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、例示された特定の態様に対して数多くの修正および変更がなされうることが、当業者に理解されよう。さらに、生物学的な機能等価性により、方法、構造、および化合物に関して、生物学的作用の種類または量に影響を及ぼすことなく変更がなされうる。そのような全ての修正は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。