"からなる群から選択される配列を含有する化合物。ペプチドAc-ASHLRKL-Aib-KRLL-NH2配列番号6。ペプチドAc-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2配列番号7請求項1に記載の化合物を含む医薬組成物。Ac-ASHLRKL-Aib-KRLL-NH2配列番号6を含む医薬組成物。Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2配列番号7を含む医薬組成物。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによってCNS炎症、外傷性脳損傷、脳虚血、または脳浮腫を治療する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによってグリア活性化、ミクログリア活性化、または神経細胞死を軽減する方法。グリア細胞またはミクログリア細胞に結合する請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって、グルタミン酸興奮毒性またはN-メチル-D-アスパラギン酸NMDA曝露と関係した神経細胞死を軽減する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって、アテローム性動脈硬化症を治療する、またはアテローム斑の形成を軽減する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって細菌性敗血症の症状を治療、予防、または改善する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって多発性硬化症の症状を治療、予防、または改善する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または多関節性若年性関節リウマチを治療、予防、または改善する方法。請求項1に記載の化合物または請求項2もしくは3に記載のペプチドをそれを必要とする対象に投与することによって炎症性腸疾患IBD、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状を治療、予防、または改善する方法。アポE類似体にコンジュゲートしたPTDを含む化合物。前記アポE類似体が残基133~149からのアポEの類似体である請求項15に記載の化合物。前記アポE類似体がからなる群から選択される請求項15に記載の化合物。前記PTDコンジュゲートがからなる群から選択される請求項15に記載の化合物。RQIKIWFQNRRMKWKK-LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号57である化合物。請求項15、16、17、18、または19に記載の化合物を含む医薬組成物。前記方法が、請求項15、16、17、18、または19に記載の化合物、または請求項20に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、外傷性脳損傷を治療、予防、または改善する方法。前記外傷性脳損傷がCNS炎症またはCNS浮腫である請求項21に記載の方法。前記外傷性脳損傷が前記対象において神経学的欠損を引き起こす請求項21に記載の方法。前記治療が神経学的回復を含む請求項21に記載の方法。前記治療が認知的機能の改善である請求項21に記載の方法。放射線の少なくとも1つの作用から、それを必要とする対象を保護するための方法であって、保護に必要な量のアポEまたは少なくとも1つのアポE類似ペプチドを前記対象に投与するステップを含む、方法。前記放射線が全身照射TBIである請求項26に記載の方法。前記対象が移植を受ける請求項27に記載の方法。前記移植が血液または骨髄移植である請求項28に記載の方法。前記放射線が放射線療法である請求項26に記載の方法。前記放射線療法が癌の治療用である請求項30に記載の方法。前記癌が、脳腫瘍、頭部および頸部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、直腸癌、頸および子宮癌、リンパ腫、および肉腫からなる群から選択される請求項31に記載の方法。前記投与が少なくとも1つのサイトカインの放射線誘発性産生を阻止、または軽減する、請求項26に記載の方法。前記少なくとも1つのサイトカインが、腫瘍壊死因子アルファTNFα、インターロイキン-1アルファIL1α、インターロイキン-1ベータIL1β、およびインターロイキン-6IL6からなる群から選択される請求項33に記載の方法。前記投与が、放射線誘発性神経毒性を阻止、または軽減する請求項26に記載の方法。前記投与が、遅延性放射線誘発性脳壊死を阻止、または軽減する請求項26に記載の方法。前記投与が、放射線誘発性軟組織または血管損傷を阻止し、または軽減する請求項26に記載の方法。前記軟組織損傷が、皮膚萎縮、放射線性膀胱炎膀胱の炎症、直腸炎直腸および肛門の炎症、および喉頭の損傷からなる群から選択される請求項37に記載の方法。前記投与が放射線誘発性口内乾燥を阻止し、または軽減する請求項26に記載の方法。前記口内乾燥が急性である請求項38に記載の方法。前記アポE類似ペプチドが、配列番号1-34からなる群から選択される配列を含む請求項26に記載の方法。前記ペプチドが、配列番号1COG133の配列を含む請求項41に記載の方法。前記ペプチドが、配列番号7COG1410の配列を含む請求項41に記載の方法。前記ペプチドがタンパク質導入ドメインPTDにコンジュゲートしている請求項26に記載の方法。前記PTDが、ポリリシン、ポリアルギニン、およびβ-ホモリシンオリゴマーからなる群から選択される請求項44に記載の方法。前記PTDは、前記コンジュゲートペプチドに脳を標的とさせる請求項44に記載の方法。前記PTDは、配列番号50-56からなる群から選択される配列を含む請求項46に記載の方法。外傷性脳損傷TBIは、米国における小児、若年成人、および高齢者のうちで損傷関連死亡および障害の主要な原因である。疫学的データは、入院治療費のみで毎年10億ドルを越えることを推計する、TBIの社会への深刻な社会経済的影響を明らかにした。TBIの推定発生率は年齢5~14歳で倍になり、成人期初期の間に男女で十万人当たりおよそ250人でピークとなる。中等度~重度のTBIの大部分の生存者の生活は、さまざまな程度の依存状態とともに慢性の生涯にわたる神経学的生涯を伴うため、患者の費用、家族の負担、および社会への経済的負担は、生存年数が多い者にとってより大きくなるとみられる。したがって、TBIに対する治療に改善の必要がある。2002年9月23日に出願された米国特許出願第10/252,120号明細書は、脳虚血または脳炎症の神経学的影響を治療し、または改善するCOG133を含むアポE類似体を使用する方法を開示している。COG133は、総アポEタンパク質の残基133-149から成る小さな切断ペプチドである。COG133は動物試験で有用であることが判明したが、投与すべき範囲の限定された治療の窓を有する。したがって、依然としてTBIに対する治療の改善の必要がある。TBIに加えて、化学療法および放射線療法と関係がある毒性が、短長期の患者の生活の質に悪影響を及ぼし、治療の用量および持続期間を制限し、生命にかかわりうるとともに、医療費および非医療費に寄与しうる。癌治療の悪影響は、特定の化学療法および放射線療法毒性を改善し、または軽減することが意図された特定の薬剤の開発をもたらした。理想的な化学療法および放射線療法保護剤は、癌治療の抗腫瘍効果に悪影響を及ぼすことなく、生命にかかわらない副作用脱毛から、潜在的に致死的なイベント重篤な心筋症、重篤な血小板減少症への不可逆性の病的状態治癒喪失、神経毒性までのすべての毒性を防ぎ、かつ投与が容易であり、それ自体で比較的非毒性であろう。しかし、これまで開発された大部分の薬剤は毒性保護のはるかに狭いスペクトルを有するヘンスレイHensleyら、1999年。口内乾燥および粘膜炎は放射線療法と関係がある主要な毒性である。これらの合併症のリスクは放射線を受ける領域、放射線療法の線量およびスケジュール、放射線療法が化学療法と併用されているかどうか、および部分的にのみ理解されている多くの宿主疾患関連因子と関連しているモスマンMossman、1994年。これらの毒性はまれに死亡と関係があるが、死亡率は急性および長期にわたる影響を有する患者にきわめて重要でありうる。口内乾燥が頭部および頸部への標準分割放射線療法と関係がある最も一般的な毒性である。放射線からの急性口内乾燥は炎症反応によるものであるが、放射後1年に発生する口内乾燥を含む遅発口内乾燥は、唾液腺の線維症を示し、かかるものとして、通常、持続性である。口内乾燥は結果として口渇の症状をもたらし、これは患者の摂食および発話能力に影響を及ぼす。また、口内乾燥を有する患者は虫歯、経口感染、および骨壊死にかかる可能性が高い。放射線療法は脳癌患者のための一次治療である。放射線が脳に送達されることによる死亡率薬物療法、攻撃、または核事故と無関係に、脳は一般的に脳細胞死の徴候である緩徐に重篤な臨床症状に反応するファイケFikeら、1988年。これらの問題は深刻であり、数か月の間に致死的になりうるが、あまり深刻ではない急性の症状は放射線療法後数日~数週間で弱体化もしているマンデルMandellら、1990年。脳細胞の死および/または機能障害の理由は正確には知られていないが、放射線の適用後のさまざまな反応から生じると考えられている。電離放射線は放射線エネルギーに依存して一連の分子イベントにより生体組織に損傷をもたらす。急性放射線損傷は、水に対する放射線の作用によって発生される水性フリーラジカルによる。水性放射線分解に起因する主要なフリーラジカルは、OH、H、HO2、H3O、等である。ショレスScholes、1983年、プラドハンPradhanら、1973年、ドラガリックDragaricとドラガリックDragaric、1971年。これらのフリーラジカルは、DNA、RNA、タンパク質、および膜など細胞高分子と反応し、最終的に死をもたらしうる細胞機能障害を引き起こす。細胞への放射線損傷は、細胞環境における酸素、スルフヒドリル化合物、および他の分子の存在などいくつかの因子に依存して強化または軽減されるプラドハンPradhanら、1973年、バックBacq、1965年。酸素の存在下、水和電子およびH原子は分子酵素と反応し、他の水性フリーラジカルは別として、HO2、O2-などのラジカルを産生するバラボイBaraboiら、1994年、ビアコフBiakovとステパノフStepanov、1997年。ラジカル種を発生させる放射線の直接の影響を超えて、いくつかの報告により放射線治療後の脳におけるサイトカインの放出が記録されている例えば、ジリンスキーGirinskyら、1994年、ホングHongら、1995年、チャンChiang、1997年。具体的には、ホングHongら1995年は、腫瘍壊死因子アルファTNFa、インターロイキン1アルファ、およびベータIL1aおよびIL1bのmRNAが、10未満の死亡に移される線量である1回の25グレイGy線量の脳照射を受けたマウスの脳において大幅に増大したことを報告している。それほどではないにせよ、インターロイキン6IL6も放射線量の増加とともに用量依存的に誘発される。全身照射は同様のパターンのサイトカイン誘発を発生させたが、誘発のレベルは脳特異的照射で見られたものよりはるかに低かった。これら照射後のサイトカインレベルで確認された変化は、脳が疾患および/または病原体の侵入に反応して高まる星状細胞増加症およびミクログリア細胞症と一致している。われわれの最近の刊行物リンチLynchら、2003年において報告されているように、リポ多糖LPSによる末梢治療は、放射線治療でこれらの著者らによって確認されたものと同様の星状細胞増加症、ミクログリア細胞症、およびサイトカイン放出を含む脳炎症性反応も誘発しうる。3つの薬剤が現在、化学療法および/または放射線療法保護のために米国食品医薬品局FDAによって承認されている。すなわち、デクスラゾキサン、メスナ、およびアミフォスチンである。しかしこれらの承認薬剤の各々は、それらの有効性を制限する重要な問題を有する。デクスラゾキサンおよびメスナは各々比較的限定されたスペクトルの心臓および尿路の毒性保護をそれぞれ有するが、アミフォスチンはより広い潜在的な細胞保護スペクトルを有する。朗報は、これらの薬剤はおそらくメスナを除き全身的に作用し、明らかに特定の細胞型をターゲットとせず、おそらく大部分の細胞型を保護する働きをすることである。骨髄抑制または急性嘔吐/嘔吐とは異なり、これらの薬剤と関係がある毒性の測定はより困難であり、または転帰の主観性神経毒性、潜在的発症心筋症、または不明の臨床的関連血清クレアチニン、顕微鏡的血尿における無症候性増加、または心臓駆出分における無症候性減少のため臨床試験において再現性を評価するには大きな労働力を要するヘンスレイHensleyら、1999年。アミフォスチンは、以前はWR-2721として知られ、その活性代謝産物はアミノチオールであるが、酸素由来フリーラジカルを捕捉することによって損傷から細胞を保護しうる。この薬物は、米国陸軍の後援の下に機密の核戦争プロジェクトから生じ、最終的にその優れた放射線保護特性および安全性プロフィールのためスクリーニングされた4,400超のグループの化学薬品から選択されたシュクターSchucterとグリックGlick、1993年。その後、アミフォスチンは、アルキル化剤およびプラチナ剤など、DNAの構造および機能を変化させる放射線療法および化学療法剤の毒性の軽減におけるその潜在的な役割について評価された。保護効果が特定の臓器に対して方向づけられたデクスラゾキサンおよびメスナとは異なり、アミフォスチンは広域スペクトルの細胞保護剤として評価されている。プロフィールが、放射線療法の細胞障害性効果から、中枢神経系CNSおよび新生物組織を除くほぼすべての正常組織を選択的に保護するアミフォスチンの能力を証明した前臨床試験から出現したシュクターSchucterとグリックGlick、1993年、コールマンColemanら、1988年。したがって、依然として、特に脳およびCNSにおいて放射線および放射線療法の効果を軽減する有効な治療の大きな必要がある。炎症性腸疾患IBDは、クローン病または潰瘍性結腸炎としても知られるが、腸の炎症、腹痛、けいれん、および下痢を有するおよそ100万人のアメリカ人に影響を及ぼす。これらの症状は重篤度の点で異なるが、それらがかれらの生活の質を大きく変化させる程度まで患者をしばしば弱体化する。疾患の重篤度に依存して治療様式の組合せを必要とするほぼすべての患者により利用可能な多様な治療法がある。しかし、これらの治療は、インフリキシマブ抗TNFモノクローナル抗体による場合のようにしばしば高価であり、一般的に、感染または悪性腫瘍、糖尿病、膵炎、および重篤な骨喪失のリスクを含むコルチコステロイドおよび免疫抑制剤で見られるような重大な望ましくない副作用を示す。これらの問題に加えて、IBD患者が直面する甚大な死亡率は新しく有効な治療法を開発する継続的な努力の明らかな推進要因である。アポEは、先天性免疫における有利な効果を有するように思われるが、アポE欠乏マウスにおける全身感染および敗血症や炎症の悪化に対する先天性免疫の喪失によって証明されるように腸炎におけるアポEの役割は完全に未調査のままである。4.概要本発明は、アポEの残基133-149から成る切断ペプチドであるCOG133の類似体および誘導体を提供する。この切断アポEペプチドは、COG133LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1と呼ばれ、脳虚血または脳炎症の治療または軽減に有用であるとわかった。参照によりその全体が本明細書で援用される、2002年9月23日出願の米国特許出願第10/252,120号明細書。しかし、動物モデルでは、COG133は、TBI直後に投与されると最も効果的である。本発明の化合物は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防に対する広い治療の窓を提供する。治療の窓は、本発明の化合物がTBI後に有効に投与されうる時間を指す。治療の窓を増大させることによって、本発明の化合物はTBI後のより大きな時間間隔で投与され、TBIの神経学的影響を有効に治療または予防し、TBI後の脳炎症もしくは虚血を減少させ、または認知機能を改善することができる。また、本発明の化合物は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の有効性の増強、大きな治療指数、および長い治療の窓を提供する。本発明は、上記の化合物の使用方法も提供する。例えば、本発明の化合物は、外傷性脳損傷、アルツハイマー、脳虚血、脳浮腫、またはグリアもしくはミクログリア活性の軽減を含む中枢神経系CNS疾患および障害の治療のために使用されうる。本発明は、CNS外傷、炎症、または脳虚血と関係がある症状の改善のための方法も提供する。1つの実施形態において、本発明は、神経細胞死を軽減し、またはマクロファージ活性化を抑制する方法を提供する。CNS疾患および傷害の治療において、血液脳関門BBBは、ペプチドなど極性分子の脳への輸送を大幅に制限する。invivoでの予備データは、COG133および他のアポEペプチド類似体の有効性がタンパク質導入ドメインPTDへのコンジュゲートによって大幅に改善されうることを示す。PTDは、その他の点では細胞膜を横断することなく、または最小限にのみ横断する輸送物の細胞内送達を促進する短い塩基ペプチドである。しかし、輸送物を細胞内に輸送するPTDの能力は、BBBによる輸送が可能であることを保証することはないが、これはさらに複雑な過程であり、invivoでBBB上の輸送物の輸送について試験されたPTDの数は比較的少ない。したがって、BBB輸送の適切なPTDは、実験的に決定され、かつ/または既知のPTDの改良によって生成されることが必要である。本発明は、COG133およびそれに誘導体および類似体を含むアポE類似体および誘導体のPTDコンジュゲートを含む化合物を提供する。本発明は、関節、肺、および心臓など末梢組織における中枢神経系CNS傷害および疾患などを治療し、予防し、または改善する本明細書に記載された化合物を使用する方法も提供する。1つの実施形態において、本発明は、神経細胞死を軽減し、またはマクロファージ活性化を抑制するための方法も提供する。別の実施形態において、本発明はアテローム性動脈硬化症を治療し、またはアテローム斑を軽減するための方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、細菌性敗血症の症状の治療、予防、または改善のための方法を提供する。本発明の1つの態様は、少なくとも1つの上記のアポE類似体を投与することによって、invitroまたは哺乳類対象のいずれかでグリアまたはミクログリア活性化を抑制するための方法を提供する。1つの実施形態において、この方法は、化合物がグリアまたはミクログリア活性化を軽減する量で投与されうることを提供する。本発明の1つの態様は、上記の少なくとも1つの化合物を投与することによって、CNS外傷、CNS炎症、脳虚血、または脳浮腫と関係がある症状を治療し、または改善する方法を提供する。少なくとも1つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べCNS外傷、CNS炎症、脳虚血、または脳浮腫を軽減する量で投与されうる。特定の実施形態において、本発明の方法は、外傷性脳損傷後のCNS外傷、CNS炎症、脳虚血、または脳浮腫を軽減する。特定の実施形態において、この方法は外傷性脳損傷からの回復を加速する。特定の実施形態において、この方法は、外傷性脳損傷後の機能的回復または認知機能を改善する。1つの実施形態において、本発明は、哺乳類対象におけるグルタミン酸興奮毒性またはN-メチル-D-アスパラギン酸NMDA曝露と関係がある神経細胞死を、前記対象に少なくとも1つの本発明の化合物を投与することによって軽減する方法を提供する。少なくとも1つの化合物は、化合物の非存在下に起こる軽減と比べグルタミン酸毒性と関係がある神経細胞死を軽減する量で投与されうる。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を投与することによって、哺乳類対象におけるマクロファージ活性化を抑制する方法を提供する。少なくとも1つの化合物は、化合物の非存在下に起こる活性化と比べマクロファージ活性化を抑制する量で投与されうる。1つの実施形態において、本発明は、関節炎またはリウマチ疾患の症状を治療し、または改善する方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎などの症状の治療または改善を提供する。1つの実施形態において、本発明は、多発性硬化症MSの症状を治療し、または改善する方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を投与するステップを含む、再発性/寛解型MS、二次進行性MS、進行性再発性MS、または一次進行性MSの症状の治療または改善を提供する。1つの実施形態において、本発明は、冠状動脈バイパス移植CABG手術中またはそれと同時に化合物を投与する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を投与するステップを含む、アテローム性動脈硬化症を治療し、またはアテローム斑の形成を軽減する方法を提供する。少なくとも1つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べアテローム斑の形成を軽減する量で投与されうる。特定の実施形態において、この方法は、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を投与することによってアテローム斑発現の予防を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも1つの投与によって細菌性敗血症の症状の治療、予防、または改善のための方法を提供する。少なくとも1つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べ敗血症関連炎症を軽減する量で投与されうる。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、CNSまたは神経学的損傷、リウマチ疾患、多発性硬化症、CABG手術、アテローム性動脈硬化症、または細菌性敗血症の治療、予防、または改善の別の薬物とともに、本明細書に記載された少なくとも1つの化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内、筋内、皮下、または経皮投与を含む、それを必要とする対象に投与を促進するような方法で提供されうる。参照により本明細書で援用される、RemigntonsPharmaceuticalScience、第19版、レミントンRemingtonとジェナロGennaro編、マックパブリッシング社MackPublishingCo.、Easton、ペンシルベジアPAを参照。本発明の方法はさらに、本明細書に記載された疾患を治療し、予防し、または改善するさまざまな投与スケジュール、投与時間、投与間隔および期間を提供する。本発明で開示されたアッセイを使用して特定された開示された化合物および変異形の機能的変異形も含まれるが、ここでかかる化合物は本明細書で開示された機能的効果を介在する。それと一致して、本発明は、本明細書で論じたさまざまな疾患および障害を治療するための薬剤を製造する方法における開示された化合物およびそれの機能的変異形の使用も含む。本発明はさらに、それを必要とする対象にアポEタンパク質または1つもしくはそれ以上のアポE類似ペプチドを投与するステップを含む放射線および放射線療法の1つもしくはそれ以上の影響に対して保護するための新規治療を提供する。この方法は、例えば、血液または骨髄移植法の一環として、全身照射TBIを受ける対象の治療のために使用されうる。この方法は、例えば、癌の治療のために、または環境放射線に曝露された個体の保護または治療のために、放射線を受ける対象を治療するためにも使用されうる。本発明はさらに、化合物の非存在下に起こるものと比べIBD、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状を軽減する量でアポEタンパク質または1つもしくはそれ以上のアポE類似ペプチドをそれを必要とする対象に投与するステップを含む炎症性腸疾患IBD、クローン病、または潰瘍性結腸炎の新規治療を治療する。6.発明の詳細な説明本発明は、脳浮腫、脳虚血およびアルツハイマーのほか、リウマチ疾患、多発性硬化症、CABG手術、アテローム性動脈硬化症、敗血症、結腸炎、および放射線保護を含む中枢神経系CNS疾患の治療のための化合物、組成物、および方法を提供する。本明細書に記載された化合物、組成物、および方法は、CNS疾患と関係がある症状を改善し、認知機能を改善する。化合物理論に拘束されることなく、損傷脳におけるアポE作用に対する少なくとも2つの明確な機序、すなわち、グリア調節および神経保護を裏づける証拠がある。脳は急性および慢性損傷に対する反応の限定されたレパートリーを有する。反応酵素種ROS、グルタミン酸、プロテアーゼ、および炎症性サイトカインのその後の放出によるグリア活性化は、アルツハイマー病ADおよび急性脳損傷において確認されるものなど両方の神経変性過程におけるニューロン損傷に関与していると考えられている。出願人最近、アポEが、混合グリア培養およびリポ多糖LPSによる刺激後の精製ミクログリア培養におけるグリア活性化、酸化窒素NOの放出、および炎症性サイトカインの放出をダウンレギュレートすることを明らかにしたラスコウィッツLaskowitzら、1997年を参照。これらのinvitro所見は、マウスアポEタンパク質を発現する対応対照と比べると、LPSを注射したアポE欠乏マウスまたは閉鎖性頭部損傷にさらされた脳において大幅にアップレギュレートされた炎症性遺伝子の発現として生物学的に重要であると思われるリンチLynchら、2001年。アポEとグリア活性化および炎症性サイトカイン放出との関係は、アポEがミクログリアとして周知の脳特異的マクロファージと密接に関連するマクロファージにおけるシグナル反応を誘発することを示す最近の報告に照らして特に興味深いミスラMisra、2001年。アポE/グリア活性化関係の別の証拠が、多発性硬化症のける障害の進行が患者が発現する特定のアポEイソフォームに依存すると思われる臨床所見によって提供されるチャップマンChapmanら、1999年。アポEが神経学的疾患において役割を果たす別の機序は、直接の神経保護効果を与えることによるものである。増大する多数の証拠が、神経突起伸長の促進ナタンNathanら、1994年、ベロスタBellostaら、1995年、ホルツマンHoltzmanら、1995年、酸化的ストレスに対する保護ハイエクHayekら、1994年、ミヤタMiyataとスミスSmith、1996年、マシューズMatthewsとビールBeal、1996年、およびニューロン生存を促進させる成長因子との相互作用グットマンGutmanら、1997年におけるアポEのイソフォーム特異的役割に関与している。出願人は最近、限局性および広範囲の虚血のマウスモデルで見られるアポEの保護効果と一致するグルタミン酸誘発興奮毒性および酸化的ストレスのバイオアッセイにおける一次ニューロン培養に対する神経保護効果をアポEが与えることを明らかにしたシャングShengら、1998aおよび1999b。ミスラMisraら、2001年は、他の人と共に最近、アポEが神経におけるカルシウム依存シグナル伝達系を開始することを明らかにした。したがって、1つの可能性は、これらの神経保護効果が神経におけるシグナル伝達系を誘発するアポEの能力に関連していることであるミュラーMullerら、1998年、ミスラMisraら、2001年。アポE130-150ペプチドの多数の類似体が以前に作成され、それらの活性が炎症性サイトカインおよびフリーラジカルの放出の抑制のための細胞ベースのアッセイおよび受容体結合アッセイにおいて試験された。その各々の内容が参照によりその全体が本明細書で援用される、リンチLynchら、2003年、J.Biol.Chem.2784、48529-33頁、および米国特許出願第10/252,120号明細書2002年9月23日出願、同第09/957,909号明細書2001年9月21日出願、および米国仮特許出願第60,077,551号明細書1998年3月11日出願の利点を請求する、現在放棄された同第09/260,430号明細書1999年3月1日出願。本発明は、脳虚血または脳炎症の治療または軽減に有用であるとわかったCOG133LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1と呼ばれる、アポEの残基133-149から成る切断ペプチドであるCOG133の類似体および誘導体を提供する。参照により本明細書でその全体が援用される、2002年9月23日に出願された米国特許出願第10/252,120号明細書。しかし、動物モデルでは、COG133はTBI直後の30分以内に投与されると最も効果的である。本発明は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の広い治療の窓および広い治療指数を提供するアミノ酸置換誘導体、ペプチド類似物、および融合タンパク質コンジュゲートを含むCOG133類似体および誘導体を提供する。治療の窓は、本発明の化合物がTBI後に有効に投与されうる時間を指す。治療の窓を増大させることによって、本発明の化合物はTBI後のより大きな時間間隔で投与され、TBIの神経学的影響を有効に治療または予防し、TBI後の脳炎症もしくは虚血を減少させ、または認知機能を改善することができる。本発明の化合物、その類似体および誘導体は、COG133よりも広い治療指数も提供する。治療指数は、損傷後の性能が生理食塩水対照よりも大幅に優れている最小の有効量によって割れる動物が死亡しない最大耐量を指す。本発明の化合物は、CNS貫通の増大を提供するか、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の治療の窓を増大させる。CNS貫通は、ペプチドを含む化合物の血液脳関門を横断し、中枢神経系CNSに侵入する能力を指す。理論に拘束されることなく、PTDが、アポE類似体ペプチドを含む化合物のCNS貫通を増強しうると仮定されている。CNS貫通を増大させることによって、本明細書に記載されたPTD-アポE-類似体コンジュゲート化合物はアポE類似体の有効性を増大させ、治療の窓、すなわち、脳損傷とCOG133を含むアポE類似体の有効な投与との間の時間の長さを拡大させることができる。予備データは、COG133がTBI後30分までに投与されると神経保護的であったが、PTD-COG133コンジュゲートがTBI後150分までに投与されると同等に効果的であったことを示す。これは、この新規治療化合物によって助けられうる患者の数を劇的に拡大しうる治療の窓の実質的な増大を示す。さらに、COG133を含むアポE類似体のBBB貫通性を増強することにより、これらの化合物が、BBBが障害を起こしているかどうかに関係なく、無数の炎症性の神経変性疾患の治療、予防、または改善に有用にされうる。本発明のPTDコンジュゲートは、脳を特異的にターゲットするため投与されることが必要な薬物COG133の量を低下させる追加の利点も提供する。これは、所望の保護効果を見るために投与されることが必要な化合物の最小有効量によって割れる、死亡が見られない化合物の最大耐量であるコンジュゲート化合物の優れた治療指数を提供する。指数が大きいほど、副作用プロフィールが所望の保護効果を見るために必要な濃度で減少するという点で化合物は安全となる。異なるPTDが治療される障害に依存して他の特定の組織および/または臓器を優先的にターゲットされうる。1つの実施形態において、本発明は、下記の方法のための化合物を提供する。1つの態様において、本発明は、アポE類似体である化合物を提供する。1つの態様において、本発明は、α-らせんペプチドである化合物を提供する。好ましい実施形態において、化合物は、配列LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1のペプチドである、COG133の類似体および誘導体である。より好ましい実施形態において、本発明は、からなる群から選択される配列を含有するペプチド化合物を提供するが、ここでNMe-LはN-メチル化ロイシンであり、Aibはアミノイソ-ブチル酸であり、ornはオルニチンであり、nargはニトロアルギニンであり、NLeはニューロロイシンneurleucineであり、hargはホモアルギニンであり、dmargはジメチルアルギニンであり、aclysはアセチルリシンであり、azlysはアザリシンであり、Acはアセチル化カルボキシ末端である。アミノ酸残基の1字略語は当業者に公知である。本発明は、アポE類似体にコンジュゲートしたタンパク質導入ドメインPTDを提供する。PTDはサイズが不均一であり、配列相同性を欠くが、大部分は正電荷を共有し、両親媒性である。本発明のPTDは、CNS貫通を促進し、または細胞内輸送を促進するものである。特定の実施形態において、PTDは、プロテグリン1、バクテネシン7、ブフォリン、およびマギニンなど抗菌ペプチド、アルギニンが豊富なRNAおよびDNA結合ペプチドの宿主例えば、HIV-1転写活性化タンパク質TATおよびショウジョウバエDrosophilaホメオドメイン転写因子アンテナぺディアa.k.a.ぺネトラチン、トランスポルタンなどキメラPTD、ファージディスプレイライブラリー由来のリシンおよびアルギニンが豊富なペプチド、ポリアルギニン、およびごく最近では、β-ホモリシンオリゴマーである参照によりその全体が本明細書で援用される、フィッシャーFisherら、2001年、リンジーLindsay、2002年、タンTungら、2003年、レイファートLeifertら、2003年、ボゴイエビッチBogoyevitchら、2002年、ガルシア-エシェベリアGarcia-Echeverria、2003年を参照。特定の実施形態において、PTDは、本明細書に記載されたPTDの多くの追加のレベルソ-、レトロ-インベルソ、およびエナンチオ形態である。好ましい実施形態において、本発明は、よりなる群から選択されるPTDコンジュゲートを提供する。特定の実施形態において、PTDコンジュゲートは、SynB5と呼ばれるRGGRLAYLRRRWAVLGR配列番号55、またはSynB3と呼ばれるRRLSYSRRRF配列番号54である。本発明のPTD-アポE-コンジュゲート化合物としては、例えば、SynB5-COG133、SynB3-COG133、またはSynB5、および本明細書に記載されたCOG133類似体のいずれかのSynB3コンジュゲートが挙げられる。したがって、PTD輸送は当初、受容体およびエネルギー非依存、非エンドサイトーシスとして特徴づけられ、細胞特性を欠いていた。しかし、これらのデータは固定細胞での蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって細胞取込みの分析により収集された。一部のグループは最近、このようにして収集されたデータが細胞固定のアーチファクト対象となったことを明らかにした参照によりその全体が本明細書で援用される、フタキFutaki、2002年、ビベスVivesら、2003年、スズキSuzuki、2001年、リチャードRichardら、2003年、ルンドベルクLundbergら、2002年、トレンThorenら、2003年。これらPTDの多く、例えば、ペネトラチンTAT、ポリ-アルギニンがエンドサイトーシスによって吸収されることが明らかになっている参照によりその全体が本明細書で援用される、ドリンDrinら、2003年、トレンThorenら、2003年。PTDの構造活性関係の分析のために同じ方法も使用された。これらの試験、および、やはり固定細胞由来であった細胞特異性の試験の結果の検証は、したがって、疑問を呼んだ。例えば、生体細胞におけるぺネトラチンの取込みは最近、エンドサイトーシスであることが明らかにされた。さらに、トランスサイトーシスに重要として以前に同定された2つのトリプトファン残基の置換は、ぺネトラチンの取込みを変更することはなかった参照によりその全体が本明細書で援用される、トレンThorenら、2003年。輸送の機序に関する疑問とは別に、ペプチド、タンパク質、ペプチド核酸、オリゴヌクレオチド、リポソーム、および磁性ナノ粒子を含むPTDによって運ばれる輸送物の生物学的効果の無数の報告があり、その転移の能力を実証している参照によりその全体が本明細書で援用される、シュワルツェSchwarzeら、2000年、ボゴイエビッチBogoyevitchら、2002年、タンTungら、2003年、ビベスVivesら、2003年。PTDに関するわれわれの知見は再検討の必要があり、輸送機序がPTD間で異なる可能性があり、おそらくその一次構造も異なることが明らかになっている。比較試験は、PTDが交換可能ではなく、それらは取込み速度、転移に必要な濃度、毒性、および細胞コンテキストが異なることを示した参照によりその全体が本明細書で援用される、トレンThorenら、2003年、スズキSuzukiら、2002年、マイMaiら、2002年。生きた細胞を使用する試験では、PTDが、細胞コンテキストによって異なる多数の輸送様式を有しうることが報告された参照によりその全体が本明細書で援用される、ドリンDrinら、2003年、フタキFutaki、2002年、レイファートLeifertら、2003年。最近のデータは、PTDが細胞特異性を示し、その原因がPTDと特定の細胞表面グリコサミノグリカンとの優先的な相互作用でありうることを示している参照によりその全体が本明細書で援用される、マイMaiら、2002年、コンソールConsoleら、2003年、コペルフースKoppelhusら、2002年。この効果の証拠は、硫酸デキストランがペネトラチン複合体ではなかくTATの取込みを阻害し、かつヘパリンが異なる程度にTATおよびぺネトラチン複合体の内部化を阻害したことを示す試験に由来する参照によりその全体が本明細書で援用される、コンソールConsoleら、2003年。これらのデータは、組織の選択的ターゲティングが特定の細胞表面発現グリコサミノグリカンをターゲットするPTDを最適化することによって可能でありうることを示す。明らかに、全体にわたって輸送物の送達に最適であるPTDは存在しない。PTD、輸送物、および標的器官はすべて考慮されなければならない。1つの態様において、化合物はアポEタンパク質の類似体またはペプチド類似物である。さらに別の好ましい実施形態において、ペプチドは、AcASHLRKLAibKRLL配列番号6COG432である。別の好ましい実施形態において、ペプチドは、Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2配列番号7COG1410である。COG1410は特に、COG133と比べ治療の窓における4倍の増幅率、治療指数における7.4倍の増幅率を示す。特定の実施形態において、本発明は、以下に詳述されるように、活性ペプチドの機能性を模倣するペプチド類似物およびそれを製造する方法を提供する。化合物調製本発明のペプチドは、当業界で周知の標準方法によって製造されうる。これらのペプチドと関係がある機能的活性を増強する本明細書に開示されたペプチドの変更は、当業者によって容易に達成されうる。例えば、本発明の方法で使用されるペプチドは、化学的に変更され、溶解度、血清安定性等などのパラメータを増強すると同時に、機能的活性を保持するために他の分子にコンジュゲートしうる。具体的には、本発明のペプチドはN末端でアセチル化され、かつ/またはC末端でアミド化され、またはアルブミン、免疫グロブリン、およびそれの断片、トランスフェリン、リポタンパク、リポソーム、α-2-マクログロブリン、およびα-1-糖タンパク質、PEG、およびデキストランを含むが、これらに限定されない血清安定性を増強する分子にコンジュゲート、複合、または融合されうる。かかる分子は米国特許第6,762,169号明細書に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書で援用される。コンジュゲートを特定の細胞または組織にターゲットする小分子も使用されうる。ビオチン-アビジン複合体の存在が、内皮細胞上のかかる修飾ペプチドの取込みを増大させることが知られている。ペプチドの糖質部分への、例えば、β-グリコシドへのぺプチド上のセリン残基によるβ-O結合グリコシドを形成する連結は、グルコース輸送担体によりグリコシド誘導体の輸送を増強するポルトPolt,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7144-7118頁1994年、オーOhら、DrugTransportandtargeting,InMembraneTransportersasDrugTargets、アミドンAmidon,G.L.およびサデーSadee,W.編、59-88頁、プレナムプレスPlenumPress、ニューヨーク、1999年。ペプチドは、検出および追跡のための放射活性標識および蛍光標識などさまざまな標識部分を付着させたとみられる。蛍光標識としては、フルオレセイン、エオシン、アレクサフルオル、オレゴングリーン、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、クマリンおよびNBD蛍光プローブ、QSY7、dabcylanddabsyl発色団、BODIPY、Cy.sup.5等が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、他の天然起源または合成ペプチドおよびタンパク質を使用し、対象ペプチドに対する抗体を発生させるための担体免疫原を提供しうるが、ここで抗体は免疫調節ペプチドを検出し、または同等の構造を有する他のペプチドを同定するための試薬としての機能を果たす。抗体を発生させるための適切な担体としては、とりわけ、ヘモシアニン例えば、キーホールリンペットヘモシアニン--KLH、アルブミン例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン等、免疫グロブリン、チログロブリン例えば、ウシチログロブリン、毒素例えば、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、およびポリリシン、またはポリアラニン-リシンなどのポリペプチドが挙げられる。タンパク質は好ましい担体ではあるが、他の担体、好ましくは、糖質、多糖、リポ多糖、核酸、および十分なサイズと免疫原性のものなどを含む高分子量化合物が使用されうる。また、結果として得られる抗体を使用し、標的部位への結合のための対象ペプチドと競合しうる抗イディオタイプ抗体を調製しうる。これらの抗イディオタイプ抗体は、対象ペプチドが結合するタンパク質を同定するために有用である。本発明の治療ペプチドの別の変化は、1~15個のアミノ酸または類似体の治療ペプチドのN末端またはC末端アミノ酸への連結である。本発明のペプチドの類似体は、1~15個の追加のアミノ酸の活性ペプチドのN末端、C末端、もしくはN末端およびC末端への付加によっても調製されうるが、ここでかかるアミノ酸の付加は、本発明のペプチドによって結合される部位での受容体に結合するペプチドの能力に悪影響を及ぼすことはない。本発明のペプチドはさらに本明細書に記載されたペプチドの保存的変異形を含む。本明細書で使用される保存的変異形は、ペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼすことがないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入、または欠失が、変化した配列がペプチドと関係がある生物学的機能を阻止または崩壊させる場合にペプチドに悪影響を及ぼすと言われている。例えば、ペプチドの全体的な電荷、構造、または疎水性/親水性は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変化しうる。したがって、アミノ酸配列は、例えば、ペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドをより疎水性または親水性にするように変化されうる。通常、ペプチドの保存的置換変異形、類似体、および誘導体は、開示された配列、配列番号1-56と少なくとも約55、少なくとも約65、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、もしくは少なくとも約96~99同一のアミノ酸配列を有する。かかる配列に関して同一性または相同性は、本明細書では、配列を整列させ、ギャップを導入し、必要に応じて、最大パーセントの相同性を達成した後の既知のペプチドと同一である候補の配列におけるアミノ酸残基の比率として定義され、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。N末端、C末端、または内部伸長、欠失、またはペプチド配列への挿入は、相同性に影響を及ぼすと考えるべきではない。したがって、本発明のペプチドは、配列番号1-56で開示されたアミノ酸配列を有する分子、治療ペプチドの少なくとも約3、4、5、6、10、15個、もしくはそれ以上のアミノ酸残基の保存的配列を有するそれの断片、アミノ酸残基が、NまたはC末端で開示された配列に、またはその内部に挿入されているかかるペプチドのアミノ酸配列変異形、および開示された配列のアミノ酸配列変異形、または、別の残基によって置換されている上記のその断片を含む。本発明のペプチド配列を含むペプチド化合物は、15、20、25、30、35、40、45、50個、もしくはそれ以上のアミノ酸でありうる。さらに考えられる変異形としては、例えば、相同的組換え、部位特異的、またはPCR突然変異による所定の変異を含有するもの、および、ウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヒト以外の霊長類種を含む他の動物種の対応するペプチド、およびペプチドが、天然起源のアミン酸以外の部分例えば、酵素または放射性同位体など検出可能な部分による置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段によって共有結合的に修飾されている誘導体が挙げられる。本発明の治療ペプチドは、自由形態または塩の形態でありうるが、ここで塩は医薬として許容可能である。これらにはナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンなどの無機塩が含まれる。ペプチドのさまざまな有機塩は、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、サリチル酸等を含むが、これらに限定されないものによっても製造されうる。方法以前に、COG133ペプチドが、N-メチル-D-アスパラギン酸曝露と関係がある神経細胞死およびカルシウム流入を大幅に抑制することが証明された。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願第10/252,120号明細書。したがって、本発明のペプチドは、NMDA興奮毒性と関係がある疾患を治療するための改善された治療組成物の基礎を提供する。例えば、NMDA興奮毒性は、HIV認知症および脳障害と関係があるペレスPerezら、2001年、ホーヒーHaugheyら、2001年、ドーブルDoble、1999年。NMDA興奮毒性は、神経ラシリズム、筋萎縮性側索硬化症ALSドーブルDoble1999年、ヌイムファックNguimfack2002年、統合失調症、ハンチントン舞踏病、パーキンソンヌイムファックNguimfack、2002年、ミチリニューMytilineouら、1997年、クロップマンKlopmanとセダイクSedykh、2002年、レーLeとリプトンLipton2001年、双極性障害ファルバーFarberら、2002年、ヒトにおける多発性硬化症、および動物における実験的自己免疫脳炎EAEポールPaulとボルトンBolton、2002年、うつ、脳卒中レーLeとリプトンLipton、2001年、てんかん、および遺伝性神経代謝疾患d-2-ヒドロキオキシグルタル酸尿コルカーKolkerら、2002年とも、アルツハイマー病バイBiら、2002年、バイBiとスゼSze2002年および外傷性脳損傷ラオRaoら、2001年、レグナーRegnerら、2001年、スーXuとルオLuo、2001年に加えて関係がある。NMDA拮抗薬は臨床麻酔ファルバーFarberら、2002年においても使用され、慢性疼痛マックケナMcKennaとメルザックMelzack、2001年、レーLeとリプトンLipton、2001年、薬物耐性カディCady、2001年、および動物モデルにおけるアルコール依存コトリンスカKotlinska、2001年を阻害することが証明されている。したがって、本発明は、上記の疾患または障害のいずれかの治療のための方法および医薬製剤、およびさまざまな疾患を治療するために有用な他の既知の化合物を含有する複合治療組成物における開示されたペプチドおよびペプチド類似物の使用を含む。例えば、本発明のペプチドおよび他の化合物は、ウイルス複製を阻害し、HIV認知症を予防または治療することに適合した併用療法において、HIV逆転写酵素およびプロテアーゼ阻害剤を含む既知のHIV薬物と組合され、または単独もしくは補助製剤における他のNMDA拮抗薬とともに投与されうる。ある著者は最近、CNSの抗レトロウイルス療法がAIDS認知症候群を示す患者における機能および予後の改善に重要である場合でも、毒性の重要な部分は抗レトロウイルス療法中でも継続する間接的機序によって介在されると思われるため、長期的には、追加の神経保護を提供し、神経毒性の二次機序を阻止することも必要でありうると論評したクリフォードClifford、2002年。1つの実施形態において、ペプチドは、スタチンとも呼ばれる、HMG-CoA還元酵素阻害剤を含む抗硬化症と組合せられうる。本発明の方法における使用に適切なスタチンとしては、例えば、ロバスタチンMEVACOR登録商標、メルクMerck、シンバスタチンZOCOR登録商標、メルクMerck、プラバスタチンPRAVACHOL登録商標、ブリストルマイヤーズスキブBristolMyersSquibb、ロスバスチンCRESTOR登録商標、アストラゼネカAstraZeneca、フルバスタチンLESCOL登録商標、ノバルティスNovartis、およびアトルバスタチンLIPITOR登録商標、ワーナーランバートWarner-Lambertが挙げられる。リルゾールRILUTEK登録商標、ローンポーレンクRhone-Poulencは、筋萎縮性側索硬化症における神経保護治療のために使用され、現在、ハンチントン病およびパーキンソン病の治療にたいする臨床試験において試験されているグルタミン酸拮抗薬特性を有する薬物であるシーファーSchieferら、2002年、ドーブルDoble、1999年。シーファーSchieferらは最近、リルゾールがハンチントン病のトランスジェニックマウスモデルにおける生存時間を延長させ、核内封入体形成を変化させることを明らかにした。したがって、NMDAが本発明のペプチドおよび化合物の拮抗的役割であると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独またはリルゾールなど他のグルタミン酸拮抗薬と組合せて、ALS、ハンチントン、およびパーキンソンの治療用の医薬製剤において使用されうる。L-デプレニルは、パーキンソン病の障害の出現および徴候と症状の進行を遅らせるモノアミンオキシダーゼMAO-Bの阻害剤であり、グルタミン酸受容体の活性化から下流に生じるイベントからの保護効果を発揮すると予想されるミチリニューMytilineouら、1997年。MAO-B阻害剤、レボドパなどドーパミン受容体拮抗薬、およびNMDA受容体拮抗薬はすべて抗パーキンソン効果を有することが証明されており、多剤併用が薬物の抗パーキンソン効果を相乗的に増強することが証明されているクロップマンKlopmanとセダイクSedykh、2002年。したがって、NMDAが本発明のペプチドおよび化合物の拮抗的役割であると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独または他のNMDA受容体拮抗薬、L-デプレニルなどMAO-B阻害剤、およびレボドパなどドーパミン受容体拮抗薬と組合せて、パーキンソンの治療用の医薬製剤において使用されうる。グルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生は、統合失調症の病因に関与しているヌイムファックNguimfack2002年。したがって、研究者は、ALS、パーキンソン病、およびハンチントン病など他の神経学的疾患において使用される抗酸化薬物による統合失調症の治療の検討を開始した。本発明のNMDA受容体拮抗ペプチドおよび化合物がグルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生を阻害するために使用されうると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独または他の抗酸化薬物と組合せて、統合失調症の治療用の医薬製剤において使用されうる。NMDA受容体の機能低下を阻害する抗けいれん薬、抗てんかん薬は、双極性障害における臨床用途であることがわかったファルバーFarberら、2002年。かかる薬剤としては、フェニトインDILANTIN登録商標、ファイザーPfizer、カルバマゼピンTEGRETOL登録商標、ノバルティスNovartis、バルプロ酸DEPAKOTE登録商標、アボットAbbott、ラモトリギンLAMICTAL登録商標、グラクソスミスクリンGlaxoSmithKline、リルゾールRILUTEK登録商標、ローンポーレンクRhone-Poulenc、テトロドトキシン、フェルバメートFELBATOL登録商標、ウォレスWallace、ガバペンチンNEURONTIN登録商標、ファイザーPfizerおよびエトスキシミドZARONTIN登録商標、ファイザーPfizerが挙げられる。本発明の化合物のペプチドもNMDA受容体関連神経毒性を阻害すると考えると、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のNMDA受容体拮抗薬またはNMDA受容体低下機能の阻害剤と組合せて、双極性障害またはてんかんを治療する医薬および方法において使用されうる。多発性硬化症MSは、免疫療法に対する反応および動物モデルの実験的自己免疫脳炎EAEの存在の所見によって判定される免疫介在性疾患である。例えば、ミックスMixら、2004年、J.Neuroimmunol.1511-2:158-70頁、アンダーソンAndersonら、2004年、Ann.Neurol.555:654-9、およびニーNiら、2004年、Mult.Scler.102:158-64頁を参照。インターフェロンIFNベータ1b、IFNベータ-1a、および酢酸ガラティラメルCOPAXONE登録商標、テヴァTevaは、再発または寛解型のMSのために使用されている現在の治療薬であり、MSの免疫学的病因に対処する作用の機序を有するジブヤルブットDhib-Jalbut、2002年。例えば、インターフェロンは細胞表面特異的受容体に結合し、抗ウイルス、抗増殖性、および免疫調節遺伝子産物の分泌で終わる、続いて起こるシグナル経路を開始する。合成分子である酢酸ガラティラメルは、ミエリン塩基性タンパク質反応T細胞の活性化を阻害し、抗炎症効果によって特徴づけられるT細胞レパートリーを誘発する。IV免疫グロブリンGAMAGARD登録商標、バクスターBaxter、メトトレキサートRHEUMATREX登録商標、アメリカンシアナミドAmericanCyanamid、およびアザチオプリンIMURAN登録商標、グラクソスミスクリンGlaxoSmithKlineを含むいくつかの現在市販の治療薬は、承認治療薬と組合せて再発-寛解型の多発性硬化症のための治療薬として評価されているカラブレシCalabresi、2002年。NMDA受容体拮抗薬メマンチンNAMENDA登録商標、メルツMerzが血液脳関門の破壊を予防し、これを修復し、かつinvivoでEAEの病因と関係がある症状を軽減することが証明されていることを考えるとポールPaulとボルトンBolton、2002年、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のNMDA受容体拮抗薬と組合せて、もしくはインターフェロンまたは酢酸ガラティラメルに加えてヒトにおけるMSの治療のために使用されうる。持続性のヒト疼痛の動物モデルを使用することにより、マックケナMcKennaおよびメルザックMelzackは最近、疼痛挙動がNMDA受容体拮抗薬AP5による治療によって大幅に軽減されたことを示したマックケナMcKennaおよびメルザックMelzack、2001年。同様に、フォンベルゲンVonBergenらは最近、競合的非-N-メチル-D-アスパラギン酸興奮性アミノ酸受容体拮抗薬であるLY293558の髄腔内投与が、180分の間中ラットの感覚および運動反応を阻害し、翌日に完全な回復が確認されたことを明らかにした。LY293558の効果は、ブピバカインの効果よりも顕著かつ持続的であり、著者らはグルタミン酸受容体を阻害するLY293558のような薬物がヒトにおける脊髄麻酔のための局所麻酔薬の代替になりうると結論づけるに至ったフォンベルゲンVonBergenら、2002年。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のNMDA受容体拮抗薬と組合せて、もしくは局所麻酔薬として他の麻酔化合物に加えてヒトおよび動物において使用されうる。NMDA受容体は、薬物使用の病理生理学において主要な役割を果たすとも考えられているコトリンスカKotlinska、2001年、ソイカSoykaら、2000年。例えば、コトリンスカKotlinskaは、エタノール投与前に投与されるNMDA受容体拮抗薬メマンチンがラットにおけるエタノール依存の発現を予防することを示した。ジョーンズJonesらは、モルヒネ禁断症候群の強さがNMDA受容体拮抗薬LY235959で前処置したラット子において軽減したことを明らかにした。頭部の動き、足の移動、回転、歩行など禁断行動は減少し、LY235959で前処置した子において発声は完全に除去されたジョーンズJonesら、2002年。最近の調査によると、依存症の基本機序のターゲットをめざした方法は、依存症が中枢神経系における適応変化によって引き起こされ、再発の主な原因である渇望がドーパミン作動機序に依存し、かつ高い全身興奮性を要求するという仮定に依拠する。したがって、薬理学的方法は、電位依存性チャンネル例えば、ニモジピンおよびNMDA受容体例えば、メマンチンにより神経へのカルシウムエントリーを阻害することによってニューロン適合性を軽減する薬物、および抑制GABA作動系を刺激する薬物ガンマ-ビニル-GABA、バクロフェンを必要とした。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独またはメマンチンなど他のNMDA受容体拮抗薬と組合せて、もしくはニモジピン、ガンマ-ビニル-GABA、バクロフェンなど他のニューロン適合性化合物に加えてヒトにおけるアルコールおよび薬物依存症の予防および治療のための組成物および方法において使用されうる。ラオRaoらは、ラットにおける外傷性脳損傷後のメマンチンによる神経保護を報告したラオRaoら、2001年。他の著者らは最近、NMDA受容体の過剰な活性化が二次脳障害を誘発する最も重要な因子の1つであり、かつAP5などNMDA受容体拮抗薬が脳損傷後の浮腫から脳を保護しうることを論評した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独またはNMDA受容体拮抗薬と組合せてヒトおよび動物における脳損傷および関連性の二次脳障害の治療用の組成物および方法において使用されうる。スタチンは、頭部外傷を有する患者の治療および頭部外傷やアルツハイマー病と関係がある炎症の軽減において有効であることが証明されている。例えば、マックガートMcGirtら、2002年、Stroke,2002年12月によって報告されているように、シンバスチン治療がくも膜下出血SAHのマウスモデルにおける血管けいれんを軽減し、かつ機能的転帰を改善することが証明された。別の試験では、アトルバスチンによる前処置が同様の保護効果を有し、SAHおよび閉鎖性頭部損傷における転帰の改善において有効な薬剤クラスとしてのスタチンの役割を示している。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、シンバスチンおよび/またはアトルバスチンを含む、1つもしくはそれ以上のスタチン薬剤と組合せて、ヒトおよび動物における脳損傷および関連二次脳障害の治療のための組成物および方法において使用されうる。関節炎の新しい治療薬としては、腫瘍壊死因子と結合するペプチドおよびタンパク質が挙げられる。エタネルセプトENBREL登録商標、アムゲンAmgenは、ヒトIgG1のFc部分と連結したヒト75kd腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分から成る二量体融合タンパク質である。アダリムマブHUMIRA登録商標、アボットAbbottは組換えヒトIgG1モノクローナル抗体である。腫瘍壊死因子結合タンパク質は、関節リウマチおよび他のリウマチ疾患の進行を遅らせ、かつその症状を緩和することにおいて優れた結果を示した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独、または、例えば、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多関節経過若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎を含むリウマチ疾患の治療用の他の薬物と組合せて使用されうる。本方法および化合物は、急性CNS損傷と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、および改善に有用である。本明細書で使用される急性CNS損傷としては、脳卒中血栓症、塞栓症、または血管収縮によって引き起こされる、閉鎖性頭部損傷、全脳虚血例えば、心筋梗塞、心不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳損傷を含むいずれかの原因の全身性低血圧による虚血、局所虚血、および頭蓋内出血が挙げられるが、これらに限定されない。中枢神経系への虚血損傷は、全虚血または局所虚血状態のいずれかによりもたらされうる。全虚血は、全脳への血流が、心停止中などある期間にわたって停止する場合に生じる。局所虚血は、脳の一部が、血栓塞栓閉塞、外傷性損傷、浮腫、および脳腫瘍の間に脳血管の正常血流を奪われている場合に生じる。脳虚血によるCNS損傷の多くは、虚血状態後の数時間もしくはさらに数日の間に生じ、損傷組織による細胞毒性産物の放出に続発する。特定の実施形態において、本発明の方法は、冠状動脈バイパス移植CABG手術の前、最中、または同時の化合物の使用を提供する。デュークDuke大学で実行され、2001年2月のNewEnglandJournalofMedicineで発表された試験によれば、冠状動脈バイパス手術後の患者の実質的部分は、その精神能力においてポンプヘッド現象と呼ばれる測定可能な障害を経験する。この試験によれば、試験された患者の42は手術後に試験スコアの少なくとも20の低下を示した。さらに、認知能力の減少は5年間持続した。本方法および化合物は、アルツハイマー病ADおよびHIV関連脳症を含むが、これらに限定されない慢性神経学的疾患と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、または改善にも有用である。アポEペプチドがグリア活性化を抑制するために使用されうる本発明者による所見は、ミクログリア活性化を伴う神経学的疾患の治療における本発明のペプチドおよび化合物の役割を提供する。例えば、ミクログリアはADにおける活性化のマーカーを発現し、ADにおける重大な炎症性イベントがミクログリアに影響を及ぼすことを示している。かかる活性化ミクログリアはアミロイド斑の近くに群がるグリフィンGriffinら、1995年。ミクログリアはてんかんにおいても活性化されるシェングShengら、1994年。最近、アミロイドベータペプチドの取込みおよび病原性効果がNMDA受容体拮抗薬によって阻害されることが証明されているバイBiら、2002年。他の試験は、抗炎症性薬物がADの発症および進行を遅らせうることを示すブライトナーBreitnerら、1995年、ロジャースRogersら、1993年。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独もしくは他のNMDA受容体拮抗薬または他の既知の医薬および特にADの治療に使用される抗炎症薬と組合せてヒトにおけるADの治療用の組成物および方法において使用されうる。本方法および化合物は、多発性硬化症、脈管炎、急性播種性脳脊髄炎、およびギランバレー症候群を含むが、これらに限定されないCNSを含む神経系に影響を及ぼす炎症性状態と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、または改善にも有用である。これに関しては、本発明のアポEペプチドおよび他の化合物を単独もしくは他の既知の抗炎症薬またはサイトカインと組合せて使用し、CNS炎症性状態の治療用の医薬組成物を形成することができる。本方法および化合物は、急性または慢性CNS疾患の一部として生じるCNSにおけるグリアの活性化の予防、抑制、または軽減に有用である。本方法および化合物の効果は、細胞または組織レベル例えば、組織学的または形態計測学的にで、または対象の神経学的状態を評価することによって評価されうる。グリア活性化の抑制または軽減は、当業者に明らかであろうさまざまな方法によって評価されうるが、かかる方法の1つは活性化グリアによって産生されることが知られている化合物の産生または存在を測定し、かつかかる測定値を対照条件下の同じ化合物のレベルと比較することである。あるいは、ミクログリア活性化の抑制、軽減、または予防における本方法および化合物の効果は、治療対象および対照対象におけるCNS疾患の徴候および/または症状を比較することによって評価されうるが、ここでかかる徴候および/または症状はミクログリアの活性化と関係があり、またはこれに続発する。アポE受容体結合ペプチドは、敗血症のinvivo動物モデルにおける末梢においてサイトカインのLPS誘発産生に対して保護することも証明されている。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願第10/252,120号明細書。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他の既知の抗炎症性サイトカインおよび抗体と組合せて敗血症の治療用の組成物および方法において使用されうる。本明細書で使用される治療するおよび改善するという語は、処置される対象を苦しめるCNSまたは敗血症状態の基礎を成す疾患過程の逆転または停止を示すことを必ずしも意味していない。かかる語は、処置される状態と関係がある有害な徴候および/または症状が緩和もしくは軽減され、または進行速度が、治療の非存在下に生じるものと比べ軽減されることを示す。疾患徴候または症状における変化は、対象のレベルで例えば、対象の機能または条件が評価される、または組織もしくは細胞レベルで例えば、グリアまたはマクロファージ活性化のマーカーの産生が緩和または軽減される評価されうる。本発明の方法が慢性CNS状態アルツハイマー病などを治療するために使用される場合、方法は認知症など症状の発症を減速または遅延させることができるが、基礎を成す疾患過程に必ずしも影響を及ぼさず、または逆転することはない。炎症性過程がアテローム硬化性過程の状況を介在することが知られている。例えば、ハンソンHansson1994年、ベルリーナーBerlinerら1995年、ワタナベWatanabeら1997年を参照。アポEは血管壁で局所にマクロファージによって分泌されることが知られているただし、個体においてマクロファージによって分泌される量は、肝によって産生されるアポEの量と比べ些細である。アテローム性動脈硬化症の標準的なモデルにおいて、アポEはコレステロールを血流から除去し、かつそれをマクロファージまたは肝に送達する働きをする。しかし、血管壁でのマクロファージによって分泌されるアポEは、いかなる脂質代謝効果とも無関係に、アテローム斑形成を減少させることが明らかになった。例えば、アポE欠乏マウスは高コレステロール血症およびアテローム性疾患のモデルとして認められている。アポE分泌マクロファージをかかるマウスに提供することにより、アテローム斑形成が劇的に減少する。リントンLintonら1995年。逆に言えば、野生型マウスのマクロファージをアポE欠乏マクロファージと置換することにより、マウスが継続して肝によってアポEを産生する場合でも、アテローム性変化は加速する。ファジオFazioら1997年。アテローム性動脈硬化症においては、アポEが、受容体介在イベントによって、血管壁も近くでマクロファージ活性化をダウンレギュレートすると仮定されている。マクロファージ活性化のかかるダウンレギュレーションは、アテローム斑形成と関係がある一連のイベントを中断し、またはこれに干渉し、それによって、アテローム性病変の形成を軽減または遅くさせる。アテローム性動脈硬化症と関係があることが知られている一連のイベントとしては、平滑筋細胞および内皮細胞増殖、および泡沫細胞形成が挙げられる。アポEがこれらの過程の各々をダウンレギュレートする証拠がある。したがって、アポEは、脂質に対するその効果とは無関係に、invivoでアテローム性動脈硬化症の存在および増殖に影響を及ぼす。アテローム性動脈硬化症の進行は、アテローム斑の量またはサイズ、またはアテローム性病変によって阻害される血管の割合、またはかかる斑の成長速度を測定することによって評価されうる。アポEがマクロファージにおけるカルシウム介在シグナルを変換しCa2/イノシトールリン酸シグナル変換、アポEがマクロファージ活性化をダウンレギュレートすることによってマクロファージ機能を変更し、したがって、その後の炎症を変更することを示すことが証明されている。したがって、ミクログリアおよびCNS医薬本明細書に記載されたペプチド、化合物、方法、および医薬製剤は、アテローム性動脈硬化症を抑制、予防し、遅らせるマクロファージの活性化を抑制する方法において有用である。アテロームせ動脈硬化症は、動脈内膜の肥厚およびアテローム斑における脂質の蓄積を指す。アテローム性動脈硬化症を治療または予防する本発明の化合物の投与は、本明細書で論じたいずれかの手段、および当業界で周知である他の適切な方法によって行われうる。アテローム硬化性変化を予防し、遅らせ、または治療する本化合物を使用すると、それらが血液脳関門を通過するように形成される必要がないことが明らかである。本方法によって治療されうる状態としては、冠状動脈、頸動脈など中枢神経系を供給する動脈、末梢循環または内蔵循環の動脈のアテローム性動脈硬化症、および腎動脈疾患が挙げられる。非経口投与などの投与は、部位特異的または全身血流内でありうる。本方法および化合物は、放射線の悪影響からの対象の保護においても有用である。照射後の脳損傷増大の所見は、抗炎症治療法が照射後の損傷から正常な脳組織を保護しうることを本発明者に示唆した。アポE欠乏動物はLPS注射後の全身炎症性反応の増大および高い死亡率を有し、かつ外因性アポEの投与が炎症カスケードをダウンレギュレート/抑制することによって死亡を改善することが報告されているファンオーステンVanOostenら、1991年。したがって、本発明は、放射線の悪影響から対象を保護するアポEおよび具体的にはアポE類似ペプチドの投与を包含する。具体的には、本発明は、放射線の少なくとも1つの影響に対してそれを必要とする対象を保護するための方法を包含するが、これは前記対象に保護量のアポEもしくは少なくとも1つのアポE類似ペプチドを投与するステップを含む。好ましいアポE類似ペプチドとしては、COG133、配列LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1のペプチド、および本明細書に記載されたCOG133の誘導体が挙げられる。本発明の方法によって対処されうる放射線曝露の種類としては、例えば、前記対象が移植法もしくはより具体的には血液または骨髄移植を受けた全身照射TBI、例えば、癌の治療中の臓器の1つもしくはそれ以上の特定の臓器の放射線療法、および環境放射線曝露、すなわち、例えば、核施設もしくは核廃棄物貯蔵地、戦争、テロ行為、または放射線への曝露を伴う実験もしくは他の作業など偶発的もしくは意図的な曝露が挙げられる。本発明の方法は、放射線曝露の前、最中、または同時に実行されうる。放射腺曝露が癌の放射線療法である場合、かかる癌としては、脳腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、直腸癌、頸子宮癌、リンパ腫、および肉腫を含むが、これらに限定されない放射線療法の影響を受けやすい癌が挙げられる。放射線療法は、外部ビーム照射または近接照射療法によって与えられうる。本発明の方法は、放射線療法の前、最中、または同時に実行されうる。例えば、一般に、本発明の方法は、放射線曝露後数分から数時間以内、または放射線曝露後約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、もしくは約2~3週間~1か月以内に実行されうる。一般に、アポEおよびペプチドは、最良の結果のために放射線曝露後できるだけ速やかに投与されるべきである。放射線に曝露される予定の--もしくは曝露の危険にある--対象における放射線曝露の影響を予防または軽減するために方法が実行される場合、本発明の化合物は、曝露前の約10日、約7日、約6日、約5日、約4日、約3日、約2日、もしくは約1日の時点で、または曝露の直前例えば、曝露前の数時間から数分以内に投与されうる。次いで、投与は上記の通り暴露後に継続されうる。上記の通り、本発明の方法は、放射線の少なくとも1つの影響に対してそれを必要とする対象を保護する。放射線曝露の症状または影響が発現した後に与えられると、本発明の方法は放射線の少なくとも1つの影響を治療または減少させるために使用されうる。本明細書で使用される保護する治療するおよび減少させるという語は、放射線曝露に付随する、またはこれによって引き起こされる疾患過程の逆転または停止を示すことは必ずしも意味されない。かかる語は、放射線曝露と関係がある有害な徴候および/または症状が緩和もしくは軽減され、または進行速度が、治療の非存在下に生じるものと比べ軽減されることを示す。疾患徴候または症状における変化は、対象のレベルで例えば、対象の機能または条件が評価される、または組織もしくは細胞レベルで例えば、グリアまたはマクロファージ活性化のマーカーの産生が緩和または軽減される評価されうる。本発明の方法が放射線曝露を治療するために使用される場合、本発明の方法は、放射線毒性の症状の発症を遅らせ、または遅延させうるが、基礎を成す疾患過程に必ずしも影響を及ぼさず、または逆転しない。本発明による放射線曝露もしくはTBIまたは放射線療法の影響としては、少なくとも1つのサイトカインの放射線誘発産生が挙げられるが、これに限定されない。かかるサイトカインとしては、とりわけ、腫瘍壊死因子アルファTNFα、形質転換成長因子ベータTGF-β、インターロイキン-1アルファIL1α、インターロイキン-1ベータIL1β、インターロイキン-6IL6、およびインターロイキン-12IL12からなる群から選択されるサイトカインが挙げられる。白血球活性化の酵素マーカーの変化例えば、ミエロペルオキシダーゼ、COX-2発現、iNOS発現等および細胞アポトーシス例えば、DNA断片化、カスパーゼ活性化等も含まれる。放射線誘性の影響としては、行動の影響、急性および遅発口内乾燥を含む口内乾燥、放射線誘発神経毒性、遅延性放射線誘発脳壊死、とりわけ、皮膚萎縮、放射線膀胱炎膀胱の炎症、直腸炎直腸および肛門の炎症、および喉頭への損傷からなる群から選択される傷害を含む放射線誘発軟組織または血管傷害、白血球減少症、紫斑、出血、脱毛、下痢、発熱、電解質平衡異常、けいれん、運動失調、振戦、および昏睡も挙げられるが、これらに限定されない。集合的に放射線皮膚症候群と呼ばれる放射線誘発皮膚損傷としては、腫脹、落屑、潰瘍、およびフィステル形成を含む遅発性皮膚線維症を伴う急性皮膚反応を挙げることができる。本発明はさらに、炎症性腸疾患IBD、クローン病または潰瘍性結腸炎を治療する方法を提供するが、これは、それを必要とする対象にアポEタンパク質または1つもしくはそれ以上のアポE類似ペプチドを、そのタンパク質の非存在下に生じるものと比べIBD、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状を軽減する量で投与するステップを含む。本発明の方法の実施において、治療ペプチドおよび/またはそれの誘導体は、単独または他の活性成分と組合せて使用されうる。必要に応じて、炎症性腸疾患を治療するために一般的に使用される1つもしくはそれ以上の薬剤は、本発明の方法および組成物における治療ペプチドの代わりとして、またはこれに加えて使用されうる。かかる薬剤としては、生物製剤例えば、インフリキサマブ、アデリムマブ、およびCDP-870、小分子免疫調節剤例えば、VX702、SCIO469、ドラマピモド、RO30201195、SCIO323、DPC333、プラナルカサン、マイコフェノレート、およびメリメポジブ、非ステロイドイムノフィリン非依存免疫抑制剤例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ピメクロリムス、およびISAtx247、5-アミノサリチル酸例えば、メサラミン、スルファサラジン、バルサラジド2ナトリウム、およびオルサラジンナトリウム、DMARD例えば、メトトレキサートおよびアザチオプリンおよびアロセトロンが挙げられる。したがって、1つの実施形態において、本発明は、配列番号1-56の配列を含むペプチド化合物および前記薬剤のいずれかの組合せ、およびそれによる炎症性腸疾患を治療する方法を特徴づける。本発明の方法から恩恵を受ける適切な対象としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、および霊長類以外の哺乳類を含む雌雄の哺乳類対象が挙げられる。対象としては、獣医コンパニオン動物対象のほか、家畜類および外来種が挙げられる。組成物本発明の化合物および治療は自由形態または塩の形態でありうるが、ここで塩は医薬として許容可能である。本明細書で使用される対象の脳に投与するという語は、化合物を中枢神経系組織、かつ具体的には、治療される対象の脳に提供する、当業界で周知である投与の経路の使用を指す。好ましくは、本発明の化合物は、医薬として許容可能な担体と組合せて使用される。したがって、本発明は、対象への投与に適切な医薬組成物をも提供する。かかる組成物は、医薬として許容可能な担体と組合せて本発明の化合物の有効量を含む。担体は、組成物が非経口投与に適合されるように液体であり、または固体、すなわち、経口投与のために形成された錠剤または丸剤でありうる。さらに、担体は、組成物が吸入用に適合されるように噴霧可能な液体または固体の形でありうる。非経口投与される場合、組成物は発熱物質を含まず、許容可能な非経口担体中にあるべきである。あるいは、活性化合物は、既知の方法を使用してリポソームにカプセル化して形成されうる。また、CNS状態を治療するペプチドの鼻内投与は当業界で周知である例えば、ADを治療するペプチドTの鼻内投与に関する、パートPertへの参照により本明細書で援用される米国特許第5,567,682号明細書を参照。鼻内投与のための本発明の化合物の調製は、当業界で周知の方法を使用して実行されうる。免疫調節ペプチドは単独、または、例えば、スーパオキシドジスムターゼなど酸素ラジカル捕捉剤、またはコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンなどの抗炎症剤、ロペルアミドなどの下痢止め剤、ペニシリン、セファロスポリン、バシトラシンなどの抗菌剤、キナクリン、クロロキンなどの抗寄生虫剤、ニスタチン、ゲンタマイシンなどの抗真菌剤、アシクロビル、ガンシクロビル、リバビリン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、サリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、フルビプロフェン、モルヒネなどの鎮痛剤、リドカイン、ブピバカイン、ベンゾカインなどの局所麻酔剤、結腸刺激因子、顆粒球マクロファージ結腸刺激因子などの成長因子、ジフェンヒドラミン、クロルフェンクラミンなどの抗ヒスタミン剤、抗嘔気剤、ロイコボリンなどの栄養添加剤、および他の同様の物質と組合せて使用されうる。放射線曝露を受けた対象の治療用の栄養剤は、参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願公開第20030105027号明細書に記載されている。本発明は、抗炎症性サイトカイン、成長因子、または白血球遊走阻止化合物と組合せても使用されうる。有用なサイトカインとしては、炎症性サイトカインの産生を抑制し、免疫系の修復に関与していることが知られているIL-4、IL-10、IL-11、およびIL-13、特にIL-4およびIL-10が挙げられるが、これらに限定されない。成長因子としては、とりわけGM-CSFが挙げられる。これらのサイトカインおよび成長因子は、精製タンパク質--天然または組換え起源から得られる--として投与され、または、これらのペプチドを発現する核酸の形で、特に融合タンパク質として投与されうる。本発明の化合物の医薬調製物としては、医薬として許容可能な希釈剤または賦形剤が挙げられる。本発明の化合物の有効量は、化合物の非存在下に生じるものと比べミクログリア活性化を減少させる量であり、言い換えれば、化合物の非存在下に生じるものと比べミクログリアによる神経毒性および神経調節化合物の産生を減少させる量である。神経調節は、神経機能における非致死的変化を指す。有効量および投与様式は個体レベルで決定され、使用される特定の治療分子、および対象サイズ、年齢、全体的な健康、処置される状態AD、急性頭部損傷、脳炎症等、処置される症状の重篤度、求められる結果、使用される特定の担体または製剤処方、投与経路、および当業者に明らかである他の因子の検討に基づく。有効量は、当業界で周知である方法を使用して当業者によって決定されうる。本明細書に記載された化合物の治療有効量は、当業界で周知である、invitro試験、動物モデル、または他の用量反応試験を使用して決定されうる。本発明の化合物は、急性すなわち、脳炎症または虚血をもたらすイベントの発症中またはその直後に投与され、または予防的例えば、計画された手術前、または神経学的徴候もしくは症状の出現前に投与され、またはその他の場合に生じる症状の進行を軽減または改善する変性疾患の経過中に投与されうる。投与のタイミングおよび間隔は対象の症状によって異なり、当業者によって決定されるように、数時間、数日、数週、もしくはそれ以上に時間経過にわたって、数時間から数日の間隔で投与されうる。一般的な毎日の処方は、約.01μg/kg体重/日から、約1mg/kg体重/日から、約10mg/kg体重/日から、約100mg/kg体重/日から、約1,000mg/kg体重/日でありうる。好ましい投与量は、化合物によって、約.01μg/kg体重/日~約10mg/kg体重/日であり、より好ましくは、約1mg/kg体重/日~約10mg/kg体重/日である。血液脳関門は、血流からCNSのさまざまな部位への薬物の受動拡散への関門を示す。しかし、特定の薬剤の活性輸送が血液脳関門上のいずれかの方向で生じることが知られている。血流から脳への限定されたアクセスを有しうる薬物は脳脊髄液へ直接注射されうる。脳虚血および炎症は血液脳関門を変更し、結果として血流における薬物へのアクセスの増大をもたらすことが知られている。化合物の脳への直接の投与が当業界で周知である。髄腔内注射により薬剤が脳室および脊髄駅へ投与される。外科的に移植可能な注入ポンプが薬物の脊髄液への直接の持続的投与を提供するために利用可能である。医薬化合物の脳脊髄液への注射脊髄注射による腰椎穿刺が当業界で周知であり、本化合物の投与のために適している。本明細書にk際されたPTDドメインのほか当業界で周知の他のペプチドおよび非ペプチド部分の使用も血液脳関門上の輸送を促進するために使用されうる。親水性化合物の脂溶性薬物への変換を含む血液脳関門を回避するための薬理学に基づく方法も当業界で周知である。活性剤は脂質小胞またはリポソームにカプセル化されうる。血液脳関門を一時的に開放し、親水性薬物の脳への通過を可能にする動脈内注入も当業界で周知である。コザリッチKozarichへの米国特許第5,686,416号明細書は、血液脳関門の浸透性の増大をもたらし、化合物の脳への送達増大をもたらす脳の間質液コンパートメントへ送達される化合物との受容体介在浸透性RMPペプチドの同時投与を開示している。活性剤を血液脳関門上へ輸送する1つの方法が、血液脳関門を浸透し、活性剤を血液脳関門上輸送するその能力のために選択されるペプチドまたは非タンパク性部分である第2の分子担体への活性剤の結合またはコンジュゲートである。適切な担体の実施例としては、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体またアドビタミンCが挙げられる。担体は、脳内皮細胞における特定の輸送系を通じて脳へ入る化合物でありうる。血液脳関門を通じる受容体介在トランスサイトーシスによって神経医薬薬剤を脳へ送達するために適合したキメラペプチドが、パルドリッジPardridgeらへの米国特許第4,902,505号明細書に開示されている。これらのキメラペプチドは、トランスサイトーシスによって血液脳関門を横断することができる輸送可能なペプチドとコンジュゲートされた医薬剤を含む。パルドリッジPardridgeらによって開示された特定の輸送可能なペプチドとしては、ヒストン、インスリン、トランスフェリンなどが挙げられる。血液脳関門を横断する担体分子との化合物のコンジュゲートもポドゥスロPodusloへの米国特許第5,604,198号明細書に開示されている。開示された特定の担体分子としては、ヘモグロビン、リゾチーム、シトクロムc、セルロプラスミン、カルモジュリン、ユビキチン、およびサブスタンスPが挙げられる。ボーダーBodorへの米国特許第5,017,566号明細書を参照。本発明のペプチドを投与する別の方法が、ペプチドをコード化する核酸配列を有するベクターを対象に投与することによって行われるが、ここでベクターはペプチドが発現され、分泌されるように脳細胞に入ることが可能であり、したがって、ミクログリア細胞に利用可能である。適切なベクターは、DNAウイルス、RNAウイルス、およびレトロウイルスを含むウイルスベクターである。ベクター送達系を利用し、遺伝子療法を行うための方法が当業界で周知である。ヘルペスベクターが、本発明の化合物の投与において使用されうるベクターの特定の種類である。以下の実施例は本発明を説明するために記載されており、それの限定としては考えられていない。7.実施例実施例1.改善されたペプチド類似体のデザインおよび特性レトロインベルソペプチドD-アミノ酸によるL-アミノ酸の置換を含むペプチド類似体をアポE130-150活性の特性の性質を調査するために製造した。出願人はすべてのL-アミノ酸をすべてのD-アミノ酸ペプチドと比較し、アポE130-150のレトロ-インベルソ類似体が活性であったかどうか試験した。レトロ-インベルソ類似体は、D-アミノ酸のみ全-DアポE150-130で製造された逆配列すなわち、アポE150-130であった。ペスカロロPescaroloら2001年によって報告された実験とは逆に、出願人は、レトロ-インベルソペプチドが0.01uMを超える濃度で信じられないほど毒性であることを見出した。したがって、酸化窒素のBV-2ミクログリア細胞産生において確認された劇的な軽減は、アッセイにおける細胞がこのレトロ-インベルソペプチドの適用で殺傷されていたためアーチファクトであった。また、アポE130-150の全-Dアミノ酸類似体は、リポ多糖LPS処置BV2ミクログリア細胞からの酸化窒素NO放出の抑制において活性なしであった。本化合物の利用の可能性は、マクロファージ、および癌治療における骨髄移植の前駆体としての免疫抑制療法の可能性としてレトロインベルソアポE133-149によって殺傷される他の細胞を全滅させたいと思う場合であろう。LPS処置BV2細胞からのNOおよびTNFα放出を抑制する全-Lアミノ酸アポE130-150ペプチドの活性、およびアポE130-150の全D-アミノ酸類似体の活性の欠如は、適切な細胞受容体への全-Lアミノ酸ペプチドの立体特異的結合と一致している。このデータに基づき、レトロ-インベルソ法の別の追求が、免疫抑制パラダイムへの今後の試験において拡大される必要がある。部位特異的置換次いで、出願人は体系的にアポE133-149COG133における各々アミン素をアラニンと置換し、次いで各々アポEペプチド類似体の活性を測定した。これらの置換に使用される略語は当業者に周知であり、例えば、アポE133-149ペプチドの149位でのロイシンLを意味するL149A133-LRVRLASHLRKLRKRLL-149配列番号1はアラニンAと置換されており、L149A類似体133-LRVRLASHLRKLRKRLA-149配列番号14を示す。表1に示されているように、アラニンスキャニング置換は、アラニンが139、143、144、146、147、および149位に存在した場合に炎症性活性の結合および/または抑制に関して効力の減少を示した。L144Aにおいて見られる減少と同様、L144M置換は、炎症性活性のアポE133-149受容体結合および抑制と比べると効力の減少を示した。これは、ロイシンが短い分岐炭素側鎖を有する疎水性残基であり、メチニンも疎水性であるが、イオウ原子を有するわずかに長い側鎖を有するため興味深い所見である。これは活性の減少が長い側鎖またはイオウ原子対炭素原子もしくは両方の増大サイズのいずれかのため側鎖サイズの増大によるため側鎖サイズが重要であることを可能にする。活性の減少は、塩基性アルギニンが酸性グルタミン酸残基と置換されたR142E置換においても確認され、電荷がこの位置で重要であることを示した。活性の減少がL148N置換でも確認されたが、そこでは疎水性ロイシンはその側鎖が同様の炭素骨格構造を示すが、酸素およびアミノ基を同様の炭素骨格の末端に配置するL148N置換においても確認され、サイズおよび/または反応がこの位置で重要な役割を果たすことを示した。試験された置換の残りは、アポE130-150親ペプチドまたはCOG133アポE133-149ペプチドと比べ活性における重要な変化を示さなかった。全299アミノ酸アポEタンパク質ホロ-アポEの提案された結晶構造に基づき、130-150からの部位が、アポEタンパク質リガンドの受容体への結合のために必要な部位を含有するアルファらせんを形成する。出願人は、アポE130-150ペプチドが円二色スペクトルによって測定される溶液中のアルファらせん構造を示すことも発表したラスコウィッツLaskowitz、2001年。一般的なアルファらせんは360度の1つの完全ターンあたり3.6アミノ酸残基または10の完全ターンあたり36残基を含有する。この情報をペプチドのHelicalwheel表示と共に使用することにより、われわれのアッセイにおけるペプチドの活性と関係があるこのらせん構造の1つの側/表面があると思われる図1、Helicalwheel。この情報は、アポE130-150の活性に重要である残基に対する初期マップを提供するように重要である。表1の結果に達するために、各々のペプチド類似体で多数の試験が実行された。炎症プロファイリングの抑制のために、各々ペプチド類似体をNOおよび/またはTNFαのLPS誘発BV2ミクログリア細胞放出において0.1、0.5、1、3、5、10、および25μMの最終濃度で試験された。特定の残基位置での活性の減少が上付き文字-記号で示されており、その濃度がCOG133の3.5μMEC50よりも高かったEC50を指すNOまたはTNFα放出の50軽減が少なくとも2つの異なる検定日で確認された濃度と規定。受容体結合が修正された公開方法ミスラMisraら、2001年により得られ、実質的に同一の結果が公開方法で得られた。修正はアポEペプチドでのビオチン標識ビオチン-LRVRLASHLRKLRKRLL-アミドであったが、これは125I-ストレプトアビジンISA、アマシャムAmershamによる検出を可能にする。また、出願人は、4°C下に6ウェルディッシュヌンクNuncでウェルあたり250,000個の細胞への結合を使用したが、これはより一貫した多数の計数の特定のペプチドの結合を提供する助けとなった。本方法の実施例として、出願人は、非標識アポE133-149が4μMでビオチン化アポE133-149の結合の50を阻害したIC50=4μMことを測定したが、これは炎症活性の抑制のためのアポE133-149の3.5μMEC50と十分に合致する数である。一般に、異なるペプチド類似体へのEC50およびIC50の値は、結合アッセイと生物学的活性アッセイとの間で一致した。切断型誘導体最大の活性を保存しながらアポE130-150のサイズを最小限に抑える努力において、ペプチドは漸次、アミノ末端およびカルボキシ末端から切断された。カルボキシ末端から開始することにより、アポE130-149はアポE130-150親ペプチドの活性を維持した。対照的に、アポE130-148およびアポE130-147は25μMで活性を示さなかった。アミノ末端から開始することにより、アポE133-149はアポE130-150親ペプチドの活性を維持した。アポE139-149は25μMでも活性を示さなかった。残りの介在ペプチドのうち、アポE134-149が最も活性であったが、アポE130-150よりも効力が2.5倍低かった。アポE135-149およびアポE136-149はアポE130-150よりも効力が5倍および8倍低かったが、アポE137-149およびアポE138-149は25μMでも活性を示さなかった。これらの活性測定値から、アポE133-149COG133は、アポE130-150親ペプチドの完全な活性を維持する最も短いアポEペプチドであった。出願人は、新しいペプチド類似体の基礎をアポE133-149COG133に置き、アポEペプチドの薬理学的活性に重要である残基の構造活性関係をさらに精緻化した。構造-活性関係の特性ペプチド類似物の分野は、選択ペプチド化合物を薬物状の医薬特性を有する小分子への変換を含むオルソンOlsonら、1993年、1995年、スミスSmithら、1997年、1998年、2000年、ヒルシュマンHirschmannら、1996年、リューLiuら、2000年。ペプチド類似物は、ペプチド類似体骨格に非天然アミノ酸を有する、ペプチド代理物ペプチドアミド結合をオレフィンまたは他の等量式で置換する、およびペプチドが非ペプチドテンプレートを使用してデザインされた小分子によって合理的な方法で置換されている小分子類似物からさまざまな方法を包含する。新しい特性が類似物へ組込まれているが、これらはその有用性を多くの潜在的な受容体標的に拡大し、新規構成単位、構造的テンプレート、および天然過程または遺伝子工学によってが可能ではないアセンブリの経路を作成することによって多様性を大いに増大させる。これらの類似物は、有力な生物学的活性を増強されたバイオアベイラビリティと結合させ、新規の特許性のある新しい医薬品を構成する他とは異なる独自仕様の骨格を組込む。例えば、図2-5を参照。酵素阻害に適切なテンプレートは、ピロリノン化学的分類プロビドファーマシューティカルズProvidPharmaceuticals、Piscataway、ニュージャージー州NJに基づきデザインされている。他の系はペプチドの非ペプチド類似物の優先テンプレートとしての糖質に基づき、これはタンパク質-タンパク質相互作用およびG-タンパク質結合受容体の阻害剤に至った領域である。HIV-プロテアーゼ阻害剤およびインテグリン受容体のRGDベースの阻害薬など非ペプチド類似物は臨床的および商業的に成功した技術例である。例としては、サキナビルINVIRASE登録商標、ロシュRoche、インディナビルCRIXIVAN登録商標、メルクMerck、リトナビルNORVIR登録商標、アボットAbbott、ネルフィナビルVIRACEPT登録商標、アグロンAgouron/ファイザーPfizer、アンプレナビルAGENERASE登録商標、ベルテックスVertex/グラクソGlaxoであり、これらはHIV/AIDSを治療可能な慢性疾患へ変換するために医学的に信頼できる商業的に成功した薬物であるグループとして10億ドルを超える販売。一例として、プロビドProvidの非ペプチド類似化学における努力は、MHCクラスII、具体的には、疾患と関係があるHLA-DR2分子による抗原提示の阻害に基づく自己免疫疾患における臨床開発のための主要な化合物の同定をもたらした。ホフマンラロシュHoffmann-LaRocheの関係者であったプロビドProvid上級社員によって実行されたHLA-DR1およびHLA-DR4に関する関連試験もこれらの研究者によって発表されているボリンBolinら、2000年。ペプチドを非ペプチドに変換する方法の一例が、活性化内皮細胞での血管細胞接着分子VCAM-1と循環リンパ球で見られるインテグリン最晩期抗原-4VLA-4受容体との相互作用を阻止する阻害剤のデザインにおいて示されている。この例において、開始点は、以下に示された同様の方法を使用し、分子モデル化されて有力な非ペプチド分子に変換されたペプチド拮抗薬であったフォトイFotouhiら、2000年、チェンChenら、2002年。この方法は、環状ペプチドの小分子への変換によって例示されるが、方法は有機化合物およびペプチドに適用される。らせん類似物は非ペプチド類似物技術の適用の特定の領域であるオルソンOlsonら、1993年。らせんペプチドが受容体相互作用に関与している場合、ペプチドの骨格アミド基はすべて分子内水素結合され、らせんの構造的骨格を形成するエルンストErnstら、2002年、オルネーOrnerら、2001年。この場合、側鎖官能基は支配的活性基であり、らせんは置換可能なテンプレートとして見ることができる。COG133に関する出願人の予備試験により、らせん構造の受容体の認識が生物学的活性のために重要であり、受容体結合におけるらせん双極性構造も、例えば、炎症反応を抑制するためなど生物学的活性に重要であるという主張が裏づけられる。アポE類似体の役割構造活性関係を解明するために、出願人はCOG133の新しい類似体の合成に以下の通り着手した。すなわち、aアルファらせん特徴を実証するためにらせん破壊剤またはアルファらせん安定剤を組込む類似体、b重要部位の相対サイズおよび組成物を決定する活性に重要である残基に隣接した部位で新しいアミノ酸を組込む類似体、およびcアミノ酸骨格が有機テンプレート置換されている類似体。COG13317merのペプチドは、単一アミノ酸置換および切断試験を利用して調査されている原型の活性配列を表し、それによる構造活性データは表1上記に示されている。データの分析では、生物学的活性に影響を及ぼす重要な残基S139、R142、K143、L144、K146、R147、およびL149が同定された。アポEタンパク質において、この部分は、4つのらせん束におけるらせん、およびらせんの一面での残基クラスター、または縁の1つの一部であり、COG133がらせんペプチドとしてその確認された生物学的効果を発揮する場合は同様のエピトープを示すことになる図1。20個の残基アポE130-149ペプチド、および2つの切断17-merペプチド[130-146および133-149]は、円偏向二色性分光計によって検査されており、すべてが質的にらせんおよびランダムコイル構造の混合物と一致するラスコウィッツLaskowitzら、2001年。アポE133-149ペプチドが生物学的に活性であるようにらせん構造を取る必要があるという仮説を試験するために、出願人は、D-プロリンなどらせん構造への折畳みを阻害することが公知であるアミノ酸残基を組込んだ類似体を試験したバララムBalaramら、1994年、ミッチェルMitchellら、2003年。出願人は、L141およびR145の位置でらせん破壊アミノ酸残基、D-プロリンpを含有するCOG133の2つの類似体を合成した。COG133のL141p類似体もR145p類似体も炎症性サイトカインTNFα放出の抑制についてのアッセイにおいて、またはフリーラジカル放出酸化窒素の抑制についてのアッセイにおいて25μMで活性を示さなかった。したがって、これは、COG133およびCOG133の活性類似体が炎症アッセイの抑制におけるなど生物学的活性を示す場合にらせん構造を取る可能性があるという出願人の仮説を裏づける。初期ペプチド類似体デザインおよび合成により生物学的活性に必要とされる構造的要件および活性基要素側鎖官能基が調査される。天然および非天然アミノ酸構成要素はCOG133配列へ組込まれ標準FMOC固相合成プロトコールを使用、両方は単一および多重の置換としてこのペプチドのための活性基モデルを構築する。これは官能基が生物学的活性およびその空間的な提示/関係の性質に必要であることの大きな理解につながる。正電荷を持つ側鎖の重要性、およびその相対位置および構造移動度を調査する。表3は、構造的特性を増強または不安定化する潜在的な隣接基相互作用に基づき選択された組合せで合成されうる変更の範囲を示すカールKarle、2001年、ビジャヤラクシュミVijayalakshmiら、2000年、カールKarleら、1990年。アポE-3およびアポEホロタンパク質は炎症反応を軽減する。したがって、COG133がらせん構造を形成し、その生物学的活性を働かせて炎症性メディエータの放出を軽減するという仮説は妥当である図1およびリンチLynchら、2003年。一般に、COG13317merなど小さなペプチドは、溶液中で自由の場合にほとんどらせん内容を有さないことが予想されるが一部の小さならせん内容を有する大多数のランダムコイル構造と一致したCDスペクトル、しかし、それらは受容体の存在下にかかる構造単位へ折畳まれるように誘導されうる。特にらせん破壊剤による新しい予備データ表2、上記に照らして、かかるペプチドのらせん形態の安定化は有利に働き、かつ前組織化によって受容体結合との親和性を増強することが予想される。らせん形成と関係がある分子内水素結合も極性アミド骨格の曝露を軽減し、結果としてタンパク質分解消化に対する改善された膜透過および安定性をもたらす。これらの考えに基づき、出願人は、らせん安定化およびらせん不安定化アミノ酸を最初に組込むことによってCOG133のらせん構造を試験することを提案する表4を参照。D-プロリンなどの残基バララムBalaramら、1994年、ミッチェルMitchellら、2003年は、有効ならせん不安定剤であることが証明されている。対照的に、Aidジメチルグリシン様などのアルファ二置換グリシンは、7個の残基ほどの短いペプチド配列においてらせん傾向を大きく増強することが証明されているカールKarle、2001年、ビジャヤラクシュミVijayalakshmiら、カールKarleら、1990年。らせんを増強させる他の方法としては、アミノおよびカルボキシ末端キャッピングドイグDoigら、2002年、1994年、1993年、およびペプチドの構造を制限する分子内側鎖と側鎖の共有結合の形成が挙げられる。この状況において有用であることが証明されているかかる共有結合はジスルフィド、オレフィンメタセシス化学由来のラクタム架橋および炭素‐炭素結合であるグルッブスGrubbsら、2001年、ベルディンVerdineら、2000年。生物学的活性のために必要な分子の機能性の正確な空間的アレイを保持する最小の長さの配列が得られると、不要なペプチド特性アミドNH/連結は除去され、必要な機能性は、医薬品に望まれる優れた特性安定性等などの多くを本質的に有する非ペプチド骨格またはテンプレートで提示されうる。構造活性関係データを使用して新しい世代の類似体の合成を誘導し、適切な類似物を選択するとともに、適切な骨格/テンプレートを選択して活性に必要でないペプチド部分を置換することができる。これらの構成要素の特性は、グラクソスミスクラインGlaxoSmithKlineにおけるグループによって最近報告されたバイオアベイラビリティに重要であると判定された分子の特徴と一致するように選択されるベーバーVeberら、2002年。らせん類似物の場合、非ペプチド骨格は有効にアルファらせんの2-4の回転を模倣することが報告されている約7~14個のアミノ酸残基。このクラスにおける類似物はテルフェニルなど低分子量有機化合物であるが、これらはらせん認識を含むタンパク質‐タンパク質相互作用と競合することが証明されているハミルトンHamiltonら、2003年、2002年、2001年。SAR試験および/または活性基モデルから同定された特定の側鎖官能基はテンプレート/骨格例えば、図2で示されているテルフェニルフレームワークで提示され、所望のペプチドによって提供される官能基を模倣する図3はらせん類似物としての三環性骨格を示す。モデル化試験により、必要な官能基を提示する骨格として働く追加の分子フレームワークが同定され、柔軟性のある合成経路が2つのクラスの三環性骨格、カルバゾールおよびフェノチアジンのために開発された。テルフェニル、カルバゾール、およびフェノチアジンの一連の官能化類似体の合成は、必要な官能基上記の活性基モデル化によって判定を骨格のX、Y、およびZの位置に組込むことによって実行されうる。次いで、化合物が細胞ベースおよび動物ベースにおける生物学的活性について評価されうる。例えば、各々の類似体の活性は、炎症の軽減の細胞ベースのアッセイにおいて、受容体結合アッセイにおいて、かつTBIマウスモデルにおける性能の長期的な行動測定において試験されうる。invitro炎症抑制アッセイ炎症抑制アッセイのために、炎症の抑制の公開された細胞ベースのモデルを、COG133またはCOG133の類似体の非存在または存在下にリポ多糖LPSで刺激されたBV-2マウスミクログリア細胞を用いて使用されうるラスクウィッツLaskwitzら、2001年。一般的に、BV-2細胞は完全培地における96ウェルプレートにプレーティングされ、次いで培地は翌日、血清を含まない培地または軽減された血清1培地と交換される。細胞は、LPSの添加によって、または陽性対照としてLPSさまざまな濃度のCOG133の添加によって刺激される。LPSさまざまな濃度のCOG133の類似体もウェルを分離するために添加される。さまざまな濃度のCOG133の類似体もウェルを分離し、ペプチドのみLPSの非存在下の活性を制御するために添加される。ペプチドの各々濃度標準初期濃度は0.1、0.5、1、3、10、および25μMは、少なくとも6ウェルの細胞に添加され例えば、6ウェルは0.1μMペプチドになり、6ウェルは0.5μMペプチド等になる、データは6ウェルすべてから平均化される。24時間のインキュベーション後、馴化培地中のTNFαおよび亜硫酸塩レベルをラスコウィッツLaskowitzら2001年に記載されたELISAおよびグリースGriessアッセイで測定される。細胞生死はさらにMTTアッセイで測定されるラスコウィッツLaskowitzら2001年。各々の試験ペプチドのEC50は、t検定および/またはANOVAによって生物学的活性についてCOG133のEC50と比較され、ここでp<0.05が有意とみなされる。受容体結合アッセイ受容体結合は公開方法の修正として試験されうるミスラMisraら、2001年。出願人の修正は、125I-ストレプトアビジンISA、アマシャムAmershamで検出されうるビオチン-LRVRLASHLRKLRKRLL-アミドを合成することによってアポEペプチドでビオチン標識を使用することである。また、出願人は、より一貫した多数の計数の特定のペプチドの結合を提供する助けとなる、4°C下に6ウェルディッシュヌンクNuncでウェルあたり250,000個の細胞への結合を使用する。125I-ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン‐セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、またはCDPStarロシュアプライドサイエンスRocheAppliedScienceを検出試薬として使用してストレプトアビジン‐アルカリホスファターゼコンジュゲートと置換されうる。毒性試験次いで、候補の化合物が、損傷後30分で静脈内投与による外傷性脳損傷のわれわれの閉鎖性頭部損傷モデルにおいてスクリーニングされる。新規化合物が最初にその最大耐量0.5×MTDの半分で試験される。最大耐量MTDは、マウスの死亡をもたらさない尾静脈注射で投与されるペプチドの用量である。死亡は、呼吸の完全欠如、および10分もしくはそれ以上の間のテイルピンチおよび/またはトーピンチなど外部刺激に対する完全無反応として規定される。動物には1mg/kgのペプチド類似体または非ペプチド類似体の初期用量が投与され、継続的に15分間観察され、次いで15分間隔で2時間、次いで1時間間隔で4時間以上観察される。動物は注射後24時間の時点でも観察される。最大耐量は、動物がこれらの観察時間のいずれの時点でも死亡しない最大用量である。この方法の例として、MTDは最初に1mg/kgでマウス3匹の群に投与することによって実験的に決定される。この用量が耐性である場合は、別のマウス3匹の群に3mg/kgで投与される。この用量が耐性である場合は、別のマウス3匹の群に9mg/kg等で投与される。例えば、9mg/kgが1匹もしくはそれ以上の動物が死亡したため耐性ではない場合は、3mg/kg~9mg/kgの用量がMTDが確認されるまで調査される。MTDが実験的に決定されると、別のマウス7匹の群でMTDで試験される合計10匹のマウスについて確認され、これがMTDであることを確認するためにそのすべてが死亡する必要はない。ややはっきししないが、これは全動物における新しい化合物の毒性をプロファイルする迅速かつ強固な方法であることが判明した。invivo外傷性脳損傷モデルTBIの実験モデルは、TBIと関係がある複雑な生理的、行動的、および組織学的変化を評価し、理解する過程において重要な役割を果たす。この相互作用ネットワークをさらに解明するために、TBIの既存の前臨床モデルがヒトTBIの臨床続発症を厳密に模倣するようにデザインされている。TBIを生成する最も広く使用されている実験法の1つでは、堅いインパクタを使用し、機械的エネルギーを発生させ、衝撃の送達中に通常、拘束され続ける動物の無傷頭蓋に衝撃を与える。現在、この種類の損傷をもたらす最も一般的な方法では、鋼のチップインパクタを頭蓋内へ推進し、下記の通り、外傷性脳損傷と呼ばれる機械的エネルギー源として加圧空気が使用される。マウスを含むいくつかの種における使用に適合させスミスSmithら、1995年、空気圧作動デバイスによる変形パラメータ衝撃の時間、粘度、および深度を制御する能力、およびリバウンド損傷のリスクの欠如ライトホールLighthall1988年により、外傷性脳損傷TBIモデルが自由落下誘導錘の重力によって推進されるデバイスよりも優れているフィーニィFeeneyら、1981年、デイルDailら、1981年。いくつかの異なる前臨床パラダイムが閉鎖性頭部損傷をモデル化するために開発されている。伝統的に、これら頭部損傷モデルの多くは、開頭術が行われ、液体打撃または制御皮質衝撃など再現可能な損傷を脳実質に直接与えた齧歯類で実行されたリンダーRinder、1969年。この種類のモデルは組織損傷の再現可能かつ明確な領域を作成する利点を有する。しかし、このモデルによって生成される損傷は、交通事故中に生じるなど迅速な加速‐減速力によってもたらされるヒト閉鎖性頭部損傷が、しばしばねじれ力びまん性軸索損傷、皮質打撲、および出血性硬膜下硬膜外血腫の要素によるはるかに多くの異種損傷をもたらすほど臨床的に重要ではないかもしれない。これらの制限に対処するために、閉鎖性頭蓋に対してより生理的衝撃を与える落錘モデルが開発された。これにより短期に神経学的欠損を、長期に認知的欠損をもたらすより臨床的に重要な損傷が生じたゾウハーZohar、2003年。しかし、これらの初期モデルの1つの欠点は、不完全な生理学的モニタリングおよび錘落下によって生じる機械的損傷の変動によってもたらされる実験制御および再現性の欠如であった。これらの制限に対処し、かつ現在利用可能なトランスジェニックマウス技術を活用するために、このモデルは、重要な生理学的パラメータ中核および頭蓋骨膜温度、平均動脈圧、血糖、血液ガス等がモニタリングされる人工呼吸器装着マウスの無傷頭蓋に対して較正空気衝撃を使用することによってマウスに適合させた図5。閉鎖性頭部損傷パラダイムの仕組みC57Bl/6JオスマウスザジャクソンラボラトリーTheJacksonLaboratory、メイン州ME、年齢12-16週および体重24-32gをすべての実験に使用した。麻酔を最初に30O2/平衡N2中イソフランで誘発する。気管に挿管し、30O2/平衡N2中1.6イソフランで肺を機械的に換気する。温度を直腸プローブでモニタリングし、加熱ランプで36.5°C下に維持する。右内頸静脈にシリコーンカテーテルを挿入する。この損傷モデルはラットの閉鎖性頭蓋外傷の既述モデルマルマロウMarmarouら、1994年から、既述通りリンチLynchら、2002年に適合させた。次いで、挿管動物を成形アクリル鋳造物上に腹臥位に配置する図6A。動物をアクリルモールド上に配置することにより動物が安定し、衝撃法の間の移動を阻止し、より均質の損傷を作成する助けとなる。頭皮を切開し、頭蓋を露出させる。凹面の3mm金属円盤を接着剤で頭蓋に対して並列に凹表面とともに頭蓋表面に固定する。モデルの開発中、この円盤の配置が頭蓋骨折の発生を軽減する助けとなり、よりびまん性の脳損傷が生じることがわかった。円盤はブレグマに対して尾側正中線に直接配置した図6B。さらに、この正中腺損傷は、びまん性軸索損傷のより臨床的に重要なモデルであることが判定された。この損傷は結果として、フルオロジェードヒストケム社HistoChem,Inc.染色によって測定される、同等の機能的欠損による片側損傷と比べ比較的軽度の両側海馬損傷が生じる。マウスは定位フレームに配置される。定位フレームは動物を安定化し、衝撃時の鉛直変位3mmを正確に較正する助けとなるが、イヤーバーははるかに高い頭蓋骨折率または頭部が衝撃中にイヤーバーの軸の周りを回転する場合には脳幹損傷により使用すべきではない。ピストンは、アクリルモールドにおける頭蓋を衝撃して最大およそ3mm移動させるために6.8±0.2m/sで放出させる図6C。吸引イソフルランは衝撃直後に0.7に減少される。頭皮をリドカインで浸潤し、縫合で閉鎖した。眼軟膏を保護用に眼に塗った。頭蓋骨折の発生率は、金属円盤が衝撃の拡散を助けるため低くおよそ10、イヤーバー固定を行わないことにより全頭部の転位が可能である。陥没頭蓋骨骨折が確認された場合は発生率およそ10、マウスを除外した。動物を自然換気に戻させ、次いで抜管した。代理の生理学的対照群の使用は長期の転帰を含む実験に必要である。動脈カテーテルの配置は生理学的パラメータを測定するために必要であり、他の配置は大腿神経叢を損傷し、運動障害をもたらしうる。他の配置は運動技能モリスの水迷路における泳ぎを含むを含む行動試験を解釈不能にする。これらのマウスにおいて、ベースライン、損傷直後、および損傷後15分での動脈血圧、血液ガス、および血糖を回復期間中にモニタリングする。組織学的転帰この正中線閉鎖性頭部損傷は結果として、フルオロジェード染色によって視覚化された海馬のCA3部位における再現可能な病変をもたらす。しかし、片側液体打撃モデルとは異なり、このパラダイムは結果としてよりびまん性の損傷をもたらし、行動の欠陥に対して比例して海馬ニューロン損傷が少ない。出願人は、この正中線損傷が結果として放射線学的脳浮腫および炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらすことも明らかにした。これは、これがびまん性軸索損傷の臨床的に重要なモデルであるという主張を裏づける。行動転帰このパラダイムは軽度‐中等度閉鎖性頭部損傷としてデザインされた。マウスは最初に、下記の通り損傷後1-5日目の回転棒および神経学的重篤度スコアによって評価された運動および小脳障害を有する。頭部損傷の生存者において一般的なより適切な長期の神経学的障害をモデル化するために、損傷後21‐25日目にモリスの水迷路に記憶が評価される。具体的には、これにより90秒間隔以内で直径105cmのプールにおける直径7.5cmの隠されたプラットフォームを見つけ出す能力が試験される。回転棒試験外傷性脳損傷TBI、ペプチドの静脈内投与、および行動性能は上記および発表リンチLynchら、2002年、リンチLynchら、提出済み通りに実行される。手短に言えば、回転棒でのベースライン性能をマウスが挿管される前に確認し、頭皮上の皮膚を反映し、空気インパクタからの制御された皮質衝撃を正中線に与える。皮膚は外科クリップで閉鎖され、動物は麻酔から覚めるまでつねに、さらにその後の4時間にわたって1時間ごとにモニタリングされる。衝撃後30分の時点で、生理食塩水賦形剤または試験品COG133、COG133の類似体、またはCOG133の非ペプチド類似体が尾静脈注射によって投与される。回転棒での性能は衝撃後24時間、次いで5日間毎日試験され、データは記載通り示されている。マウス12匹の群を0.5×MTDでの各々の化合物のために使用される。陰性対照群には生理食塩水賦形剤のみが投与され、陽性対照群には尾静脈注射によって100ul量の生理食塩水中4mg/kgのCOG133が投与される。新規ペプチドおよび非ペプチド類似体も尾静脈注射によって投与される。ペプチドの活性の対照としてのみ、偽動物を調製し、皮質衝撃を与えないことを除き、上記の通り試験品を投与することができる。回転棒での行動性能を上記の通り測定し、尾静脈注射によって4mg/kgでCOG133が投与された偽動物の性能と比較する合計12群×動物12匹=動物144匹。プリズムおよび/またはインスタットコンピュータプログラムを使用し、反復測定ANOVAによってCOG133と新規化合物との間の有意性の測定を支援する。毎日の回転棒RR試験を行って頭部損傷後の短期の運動および小脳障害を評価したハムHammら、1994年。マウスをその尾で支え、静かな揺れる動きを使用して壁に面すると同時に一定の速度モードで走行するRR上に配置する。全マウスが適所に配置されると、RRは加速モードに切替わり、棒から落ちる、または2回回転する720度までのいずれかのレイテンシータイムを記録した。その3つの試験の平均レイテンシータイムは毎日記録した。損傷後invivoモデルわれわれのマウスTBIモデルにおいて外傷性脳損傷後60、90、および180分の時点で類似体をさらに試験することができる。このより厳密な遅延試験において、新規化合物の有効性を、上記の通り再現可能な外傷性脳損傷TBIを与える標準閉鎖性頭部損傷後60分の時点で尾静脈注射によって投与されるCOG133と比較されうる。化合物が、反復測定ANOVAで分析される回転棒性能によって判定される通りTBI遅延後60分の時点でCOG133より大幅に優れていることが判明する場合は、これはTBI遅延後90分で試験される。化合物が、反復測定ANOVAで分析される回転棒性能によって判定される通りTBI遅延後90分の時点でCOG133より大幅に優れていることが判明する場合は、これはTBI遅延後180分で試験される。運動障害の行動試験および長期の記憶試験認知および学習異常は臨床集団におけるTBIの一般的な長期の続発症である。われわれのモデルの感度および臨床上の重要性を最大限にするために、神経学的機能における学習、保持、および行動障害が評価されうる。このために、モリス水迷路タスクにおける性能の変化が試験されうるモリスMorris、1984年。このタスクでは自然に泳いでいる齧歯類の平均を取り、視空間合図を作業および基準記憶へ組込む動物の能力を測定する。このタスクでの性能はヒト臨床集団において見られる神経精神障害の相関でありうる。理論上、マウスは水泳によるタスクから任意に、またはプールの全体を通じて非系統的な通路で逃げることもできるが、しかし、作業記憶が無傷である場合は、マウスは試験チャンバーの固定物から遠位の合図を使用し、プラットフォームの相対位置を学習する。したがって、プラットフォームを見出すタイムレイテンシーは実行の関数として減少し、学習能力の指数として使用されうる。タンパク質分解開裂アッセイ一部のペプチドは、トリプシン様プロテアーゼによって開裂されうる。ペプチドの開裂は、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレイイオン化質量分析LC/MS法においてトリプシンおよび脳ホモジネートを使用して測定されうる。手短に言えば、ビードアガロースパースPierceに結合したトリプシンを0.1M炭酸アンモニウム、pH8.0で2回洗浄し、その後にカルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水、pH8.0PBS-8で2回洗浄する。20ug/mlのペプチド基質を含有するPBS-8中に樹脂を再懸濁し、0、0.1、1、5、および20時間37°C下に消化させる。3通りの試料を各々時点で評価する。試料を一時的に遠心分離し、樹脂を含まない上清をATIアセトニトリル、TFA、内部標準で抽出し、処理して以下の条件でLC/MS定量にかける。LC条件:カラム:アジレントゾルバックスAgilentZorbax300SBC182.1×75mm×5um粒子300A細孔サイズ勾配:4.5分で5B~65BA=5アセトニトリル/95水0.025TFAB=95アセトニトリル/5水0.025TFA流量:0.5mL/分注入量:10uL分析時間:3.5分の平衡時間で4.5分MS条件:操作モード:アジレントAgilent1100MSDシステムで陽イオンエレクトロスプレイ走査範囲:SIM、m/z724.1でCOG133およびm/z695.7でIS-11について[M3H]3を検出ドゥエル時間:49ms/イオンキャピラリー出口電圧:200V乾燥ガス:350C下に9.5L/分噴霧圧:50psi同様に、全マウス脳ホモジネートをペプチドを分解させる細胞内および細胞外プロテアーゼの供給源として使用されうる。この場合、新鮮マウス脳は100mg湿重量/mlPBSpH7.4で均質化されうる。PBSpH7.4中40ug/mlでのペプチド基質を同等量の脳ホモジネートと混合し、ATIによる抽出、上記のLC/MSによるわれわれの内部標準ペプチドに対する分解産物の定量のための処理、および提出前に37C下に0、0.1、1、1、5、および20時間インキュベートする。3通りの試料を各々の時点で評価する。各々実験において、無傷、非分解ペプチドのモル、および主要な代謝産物無傷、非分解ペプチドのモル量の少なくとも20である断片を各時点で測定する。均質化脳も使用し、ペプチドの脳への取込みをLC/MS法を使用して測定することができる。ペプチドの血漿半減期も各々ペプチド誘導体をマウス血液血漿に曝露し、標準対照と比べ経時的に回復を測定することによってLC/MS法をお使用する測定することができる。実施例2.COG432の特性図4は、4mg/kgまたは1mg/kgのCOG432、COG432:Ac-ASHLRKLAibKRLL配列番号6または対照生理食塩水によるTBI後の回転棒試験の結果を示す。縦軸は、回転棒性能を示す100はTBI前の回転棒性能。COG432、4mg/kg、または生理食塩水による処置を外傷性脳損傷後2時間の時点で開始し、動物をTBI後1日目に開始して次の5日間毎日試験した。TBI後5日までに、4mg/kgのCOG432ペプチドで処置した動物は回転棒試験によって測定されるように約80の機能まで回復していた。生理食塩水賦形剤のみで処置した対照マウスが回復した機能は50未満であった。実施例3.COG1410の特性われわれは、L140およびR145の位置で2つのアミノイソブチル酸Aib置換を含有する類似体であるCOG1410を合成した。Aibは、ペプチドに存在するアミノ酸の種類に関係なくらせん構造を形成することが証明されている非天然アミノ酸であるマーシャルMarshallら、1990年。また、Aibは、他のアミノ酸に対して結合時に配座エントロピー喪失の軽減を示すため結合親和性を改善するラトナパルキーRatnaparkhiら、2000年。細胞ベースのアッセイ図7に示されているように、COG1410は、酸化窒素9AおよびTNFa9B放出の抑制のわれわれの細胞ベースのアッセイにおいてCOG133よりも大幅に強力であった。また、invivoでの予備スクリーニングは、COG1410がTBI後120分で投与すると神経保護性であることを示したが、これはこの時点で神経保護活性を欠いているCOG133とは異なる図8。用量反応試験予備用量反応試験は、COG1410の最小有効量MED、賦形剤処置対照と比べ性能における統計的に有意な改善を示す最低用量は、COG133のものとほぼ同じであり、それぞれ、0.3mg/kg対0.4mg/kgであった。しかし、COG1410の最大耐量MTD、24時間でマウスの死亡をもたらさない最高用量は、COG133の1.4mg/kgのMTDに対して8mg/kgであった。COG1410の治療指数TI、MTDのMEDに対する比は26であり、COG133の3.5のTIよりも大幅に良好である。TIが高いほど、薬物は安全であるとみなされる。COG1410のこの高いTIは、有利かつ所望の保護硬化をもたらすよりも毒性反応を引き起こすためにはるかに高い用量を取ることを示す。薬理動態パラメータの分析考慮する多くの薬物動態パラメータのうち、血漿半減期およびタンパク質分解に対する耐性が、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレイイオン化質量分析LC/MS法で正確に測定されうるペプチドの2つの特性である。LCMS-LLCを用いて、われわれは、ペプチド量および血液血漿およびマウス脳抽出物におけるペプチド断片を測定するLC/MS法を開発した。手短に言えば、0、0.005、0.025、0.1、1.0、5、10、または25ug/mlのCOG133をマウス血液血漿に添加することによって較正曲線を構成した。これら同じ濃度のCOG133をPBSリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4にも添加した。COG133を含有する血漿またはPBSを1体積のPBSおよび1体積のATIATI=アセトニトリル中0.6トリフルオロ酢酸および3ug/mlの内部標準ペプチド[LAVLLASHLRKLRKRLL]を添加し、ボルテックスし、15,000xgで10分間遠心分離し、上部有機層を抽出試料として採集することによって抽出した。抽出試料を上記実施例1の条件下にLC/MS定量にかけ、信号増大が試料中のCOG133の増大量に直線的に比例したことを示す直線濃度/信号曲線を示したデータを示さず、R2=0.9984。われわれの内部標準ペプチドLAVLLASHLRKLRKRLLと比べ、われわれは一貫して、各々の血漿試料におけるCOG133の80以上を回復させ、以下の表に示されている分析結果を示した。われわれの半減期実験のために、COG1330.4mg/kgをオスC57B1/6マウスの尾静脈へ注射し、指示時点で心穿刺によって1mlの血液を採取し、上記の通り血液血漿を処理した。血漿濃度時間グラフはCOG133にマウス血液血漿における8分半減期を示す図9。内部標準とともにこの同じ方法を使用して、われわれは、マウス血液血漿における無傷、非分解COG1410の2分半減期を計算するデータは示さず。われわれは、同様のLC/MS法を使用し、脳における無傷、非分解COG1410の量を測定した。手短に言えば、われわれは、0時点で尾静脈注射によって4mg/kgのCOG1410を投与し、心穿刺によって等張性生理食塩水の注射後5分の時点マウスを灌流し、血液を脳血管系から除去し、かつ注射後10分の時点で灌流脳を除去した。脳材料の0.1g湿重量あたりプロテアーゼ阻害剤カクテルロシュディアグノスティックスRocheDiagnostics、10mg/mlを含有する1mlのPBS中に脳を均質化した。ホモジネートを同等量のATIと混合し、ボルテックスし、遠心分離し、試料を上記の通りLC/MSにかけた。この方法を使用して、われわれは、3dCOG1410および2dCOG1410脳において4.90分でピークを見出し、COG1410の[M2H]2イオンで705の正確なm/z比を有する。この予備試験は、COG1410の測定可能量が5分のエントリー期内に脳に入り、この実験の次の5分の灌流期中に脳内に残留することを示す。これは、TBI後の性能の行動試験における有意なCOG1410介在改善を示すわれわれの薬理学的データと一致するデータを示さず。われわれは、分解過程によって生じうるCOG1410の断片を同定する同様のLC/MS法を使用した。手短に言えば、COG1410を投与したマウスからの血漿を使用することにより、一部の小さめのペプチド断片が、未処置マウスからの血漿には見られないこのLC/MS法で同定されたデータは示さず。質量分析計でのMS/MSを使用し、これらの断片の部分的配列を得ることにより、少なくとも1つの主要な代謝産物が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性によって無傷COG1410の消化に由来しうる断片であるアセチル-AS-Aib-LRKL-Aib-KRである可能性が高いと思われる。この断片の存在は、COG1410の短い半減期の1つの説明が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性の影響を受けやすいことにあることを示す。結論COG1410によるこれらのデータは、増大した安定性、増強された効力およびBBB透過性、減少した毒性、増大した治療指数、およびTBIの治療に対する拡大した治療の窓を有する化合物を発現する実現可能性を示す。分解に対する増大した耐性など、さらに優れた医薬特性を有する追加の類似体が、上記のガイドラインを使用して制限された数の誘導体の合成によって達成可能である。実施例4.COG1410のさらなる最適化COG1410は、多くの基準によってCOG133に対して大幅な改善である。われわれの予備データは、アルファらせん構造がきわめて重要であり、このらせん構造の強化がCOG1410をもたらすことを示した。らせん構造を促進するAibのようなアミノ酸を含めるわれわれの初期の方法は、潜在的にアラニンスキャニング作業から可能である2つの新しい位置に拡大される実施例1を参照。COG1410のらせん性質へのさらなる強化は、ペプチドの生物活性を直接与えるとは思われないらせんの表面でアミノ酸の側鎖の誘導体化によって達成されうる。これらの誘導体の全体的な性質は、その柔軟性を抑制し、らせん構造に残る傾向を増大させる選択アミノ酸間のオレフィン架橋を含めるべきである。われわれの予備データは、COG1410のタンパク質分解がその安定性の欠如に関与しうることも示した。また、われわれのアラニンスキャニングデータは、カルボキシ末端ロイシンが活性には重要であることを示したが、これはこの残基のタンパク質除去が結果として生物活性の欠如をもたらすことを示している。タンパク質分解断片のより正確な定義に引き続いて選択アミノ酸の置換および/または選択アミノ酸の誘導体化が、タンパク質分解に対する耐性を増大させると同時に生物活性を維持する。したがって、COG1410はさらに誘導体化され、以下の3つの方法でらせん構造を増大させうる。すなわち、1選択位置でのAib残基の組込みによってらせん構造を強化し、2アミノ末端キャッピングによってらせん構造を強化しドイグDoigら、2002年、1994年、1993年、および3ペプチドの構造を制限する分子内側鎖の側鎖との共有結合を形成することによってらせん構造を強化する。この状況で有用であることが証明された共有結合はオレフィンメタセシス化学由来であり、架橋を含有するアルケンでi~i4またはi~i7の位置を補うグラブスGrubbsら、2001年、シャフマイスターSchafmeisterら、2000年。側鎖架橋閉環メタセシスRCM法を使用することにより、オレフィン側鎖が組込まれ、配列:ASHLRKLRKRLLにおける選択残基で側鎖と側鎖を共有結合しうる。COG1410は、らせんの一面上の荷電残基のすべておよびらせんの対向面上の疎水性残基のすべてを有する両親媒性アルファらせんを形成するように思われる。大部分の荷電残基のアラニン置換は大幅に抗炎症活性を軽減したため表1、荷電残基は側鎖結合法の候補ではないAib置換が生物活性を増強したR145を除く。これは疎水性残基の大部分を側鎖結合法による変更に利用可能なままにする。したがって、以下の架橋結合分子が合成されうるが、ここでXおよびZで示されたアミノ酸は、架橋結合オレフィン架橋に結合される側鎖を含有するアミノ酸でありうる。すなわち、ASHXRKLZKRLL、XSHLRKLZKRLL、ASXLRKLRKZLL、およびASHXRKLRKRZL。手短に言えば、XおよびZは、従来の固相合成中にペプチド鎖へ組込まれたアルファ‐メチル、アルファ‐アルケニルジ置換アミノ酸i:i4架橋に対して両方のブテニル、i:i7に対して1つのブテニルと1つのペンテニルである。固相支持およびキャップ状態でありながら、ペプチドは、1,2ジクロロエタン中でグラブス触媒ビストリシクロヘキシルホフィン二塩化ベンジリジンルテニウムIVと反応する。触媒は樹脂を洗浄することによって除去され、転換ペプチドはトリフルオロ酢酸で樹脂から開裂され、C18逆相HPLCカラムで精製され、エレクトロスプレイ質量分析計によって確認される。らせん構造を強化する可能性に加えて、架橋の存在は、ペプチドのプロテアーゼへの結合を物理的に遮断するオレフィン側鎖によってタンパク質分解に対する耐性をも増大させうるベルディンVerdineら、2000年。プロテアーゼ感受性部位での耐性の強化LC/MSによるわれわれの予備データにより、COG1410の潜在的に重要な代謝産物としてアセチル-AS-Aib-LRKL-Aib-KRが同定された。この断片は、トリプシン様プロテアーゼによる細胞内タンパク質分解開裂および/またはカルボキシペプチダーゼによる細胞外タンパク質分解開裂によって生成されうる。エンドプロテアーゼの可能性に対処するために、オルニチン、ニトロアルギニン、ホモアルギニン、またはジメチル‐アルギニンをアルギニンに対して147の位置で自動ペプチド合成器で標準Fmoc化学によって置換するCOG1410の誘導体が合成されうる。エクソプロテアーゼの可能性に対処するために、バリン、メチオニン、またはイソロイシンをロイシンに対して149の位置で置換するCOG1410の誘導体が合成されうる。実施例5.実験自己免疫脳脊髄炎のマウスモデルにおけるアポE類似物の保護効果多発性硬化症MSの信頼できる動物モデルの1つとして、実験自己免疫脳脊髄炎EAEは中枢神経系CNSにおいて重篤な脱髄を引き起こす炎症性疾患であるペンダーPenderとウォルフェWolfe2002年。EAEおよびMSは、ミクログリア活性化、および主にTリンパ球およびマクロファージから成る炎症性細胞のCNSへの顕著な浸潤を含む共通の組織学的特徴を共有するへーバーカッツHeber‐Katz1993年へマーHemmer、アルケロスArchelosら、2002年。これらの活性化エフェクタ細胞は、TNFα、IL-1β、IFNγ、およびリンホトキシンなど一連の前炎症性サイトカインを放出する。次いで、これらの因子はさらに浸潤細胞の蓄積を促進するが、これらは炎症、および組織損傷と関係があるエングEng、ジルニカーGhirnikar、1996年ベンベニストBenveniste1997年ウィーマンWiemann、ファンVanら、1998年。多発性硬化症遺伝子の染色体局在のスクリーニングにより、MS遺伝子は、アポリポタンパクEアポE遺伝子が位置している19q13.3部位に位置したマーカーに結合されるルコットLucotte2002年。この所見は、患者がアポE4を有する患者が重篤なMSで影響される可能性がより高いという報告チヤプマンChapman、ビノクロフVinokurovら、2001年ファゼカスFazekas、シュトラッサーフックスStrasser‐Fuchsら、2001年シュミットSchmidt、バルセロスBarcellosら、2002年メーターマンMaterman、チャンZhangら、2002年とともに、アポEが多発性硬化症の発現に関与しうることを示すウェザーバイWeatherby、マンMannら、2000年ウェザーバイWeatherby、マンMannら、2000年。材料と方法マウスメスC57BL/6Jマウス12週齢をジャクソンラボラトリーズJacksonLaboratoriesから購入し、デュークDuke大学実験動物施設に収容した。動物ケアおよび実験法はデューク大学動物ケアおよび使用委員会によって承認された規則に一致した。試薬ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質MOGペプチドは、マウスMOGタンパク質の残基35‐55MOG35‐55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由来であり、アポE類似ペプチドCOG133は、アセチル-LRVRLASHLRKLRKRLL-アミドの配列を有するヒトアポリポタンパク‐Eの残基133~149由来である。アポE逆ペプチドCOG-149で示されるは、ここではCOG133のスクランブル対照として処置される。アンテナペディア結合ペプチドCOG134、akaCOG4502として示されるは、アンテナぺディアプレフィックスペプチドをCOG133と結合する。ペプチドはすべて、RP‐HPLCによりメリフィールド固相化学および精製によりFMOC試薬を使用してUNCでのペプチド合成施設によって合成された。以下の試薬をシグマSigmaから購入した。すなわち、百日咳毒素、LPS、およびIFN‐γ。TNFαおよびIL‐6の定量ELISAキットをバイオソースBiosourceから得た。MOGペプチドのEAEの誘発EAEをファインスタインFeinsteinらの方法に従ってマウスにおいて誘発したファインスタインFeinstein、ガレアGaleaら、2002年12回のs.c.注射、5mg/mlのヒト型結核菌MycobacteriumtuberculosisH37RAジフコDifco、St.Louis、ミズーリ州MOを含有する同等量のCFA中に乳化したPBS0.1ml中MOG35‐55ペプチド300μgを後足の各々の側面に0日目に投与した。2百日咳毒素PBS0.1ml中マウス1匹につき200ngを最初のMOG注射の直後および48時間後にi.p.投与した。3同一の乳剤、投与経路、および位置による追加免疫を7日目に投与した。アポEによる処置最初のMOG注射0日後、マウスを無作為に1群マウス15匹の3群に分け、対照群、アポE133‐149COG133処置群、およびアポE逆ペプチド処置群とした。生理食塩水中COG133、生理食塩水中逆ペプチド、または生理食塩水を6、7、8、10、12、14、16、18、20、および22日に100μl量中1mg/kgの用量で静脈内注射し、各々の処置群に合計10用量を投与した。EAEの臨床評価脳炎誘発性チャレンジの後、マウスを毎日モニタリングし、神経学的障害を以下の通り臨床スコアC.S.によって評価した。すなわち、0、EAEの臨床徴候なし、1、だらりとした尾、2、たるんだ尾と異常な歩き方後肢の運動失調および/または麻痺、3、重度の後肢麻痺hindbodyによる、4、完全麻痺、5、瀕死または死亡。腹膜マクロファージ調製、培養、および処置このために、30dpi免疫後の日数で臨床スコアが0のマウス3匹および臨床スコアが4のマウス3匹を腹膜マクロファージ培養の調製用に使用した。PBSを含有するヘパリン10U/ml3mlによる腹膜洗浄後にマクロファージを回収し、次いで96ウェルマイクロプレートに1×105細胞/ウェルの密度で10ウシ胎仔血清、2mML‐グルタミン血清、1HEPES、および100U/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコMEM中、5CO2による加湿インキュベータ中37°C下に接種した。24時間後、血清含有培地を除去し、血清を含まない培地で細胞を1回洗浄した。免疫促進剤に対するマクロファージの分化反応を検査するために、臨床スコア0または4のマウスから得られたマクロファージを連続濃度のIFN‐γ/LPSまたはMOG35‐55ペプチドに曝露した。IFN‐γ/LPSまたはMOG誘発サイトカイン産生に対するCOG133またはCOG134の効果を調査するために、これらペプチドの指定濃度をIFN‐γ/LPSまたはMOG治療前30分に適用した。培地を45時間または72時間の時点で回収し、以下の詳述通り、TNF-γおよびIL-6または酸化窒素NOについてELISAによって分析した。亜硫酸塩および総タンパク質の測定酸化窒素放出の安定した最終産物として、50μl培地試料をシーバースSievers280NOA分析器ボルダーBoulder、コロラド州CO、米国USAヘ注入することによって馴化培地中の亜硫酸塩レベルを測定した。総タンパク質μg/ウェルを標準としてBSAによるメーカーの指示に従いBCA法パースPierce、Rockford、イリノイ州IL、米国USAを使用して測定した。BCA値をOD562でモレキュラーデバイセスサーモマックスマイクロプレートリーダーMolecularDevicesThermomaxMicroplateReaderメンロパークMenloPark、カリフォルニア州CA、米国USAを使用して測定した。酸化窒素レベルはμMNO2-/mgタンパク質で表される。ELISAによるTNF-γおよびIL-6の測定サイトカインアッセイのために、TNF-γ/LPSまたはMOG処置後45時間に回収し、選択ペアのモノクローナル抗体を使用する定量ELISAをメーカーのバイオソースBiosourceによる推奨通り実行し、サイトカイン、TNF-αおよびIL-6を定量した。TNF-αELISAのために、96ウェルELISAプレートを捕捉抗体としてのTNF-αに対するウサギ抗マウスポリクローナルで18時間、2-8°Cでプレコートし、次いで2時間、室温で阻止した。ウェルを試料またはマウスTNF-α標準でインキュベートした。室温下に2時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、その後にハムスター抗マウスTNF-αビオチン化二次抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。次いで、テトラメチルベンジジンTMB溶液を添加し、ペルオキシダーゼ触媒変色を2NH2SO4による酸性化によって停止した。プレートを波長450nmでスキャンニングし、吸光度を測定した。結果は平均濃度pg/ml±SEMで表されている。IL-6ELISAのために、捕捉抗体としてIL-6に対するラット抗マウスモノクローナルを、検出抗体としてIL-6に対するビオチン化ラットマウス喪のクローナルを使用した。残りの方法はTNF-αELISAのものと同一である。ルーチン組織学マウスを麻酔し、出血させ、PBS25mlおよび緩衝PBS中4パラホルムアルデヒド25mlで灌流した。脳および脊髄を臨床スコアが0のマウス3匹および臨床スコアが4の別のマウス3匹から免疫後30日に切除した。組織をさらに24時間4パラホルムアルデヒド中に後固定し、次いで0.1アジ化ナトリウムとともに1×PBS中に保存した。固定組織をパラフィン中に埋設し、5μM厚切片を脳、脳幹、および脊髄の3つの異なるレベル頸部、胸部、および腰部から切断した。切片を炎症の証拠のためにヘマトキシリン/エオシン、および脱髄ためにルクソールファーストブルーで染色した。炎症の重篤度を以下の基準を使用して評価した。すなわち、0、炎症なし、1、血管周囲および髄膜でのみの細胞浸潤、2、実質でのみの軽度浸潤1-10/切片、3実質での中等度浸潤11‐100/切片、4、実質での顕著な細胞浸潤>100切片。統計的分析回転棒データ、サイトカイン、および亜硫酸塩濃度をANOVAの後、ダネットの比較によって分析した。疾患スコアをマンホイットニー検定によって分析した。結果COG133は活性EAEの発現を軽減するCOG133の推定の保護効果を検査するために、1mg/kgCOG133、もしくは逆ペプチド、または生理食塩水の10用量の静脈内投与を尾静脈注射によって行い、6日目に開始して22日目に終了した。臨床徴候を毎日、回転棒での行動を1日おきに検査した。COG133処置群の平均最大臨床スコアは、生理食塩水またはスクランブルペプチド処置群のものより大幅に低かったP<0.05図10。この結果は、COG133で処置した動物が疾患の重篤な臨床徴候をあまり示さないように思われるというわれわれの一般的な所見に対応する。エンドポイントとして5の臨床スコアを生む死亡を使用して、マウス4匹が15匹の生理食塩水処置群における疾患で死亡したが、15匹のCOG133処置群における動物は死亡せず、かつこの処置群の最も高い臨床スコアは3であった表6を参照。COG133処置群の疾患発症までの平均時間は対照群と比較してわずかに遅延しているようにみえるが、統計的に有意差はなかった。さらに、COG133処置は、COG133群の平均臨床スコアが30日目に対照群よりもはるかに低かったことを示すデータによって疾患からの回復を強固に促進した。各々のマウスの回転棒での性能を2日おきの計画で試験した。値を0日のものに対する割合で示した。回転棒データは疾患の発現期において有意性を示さなかったが、COG133処置群の値は回復期ファージにおける対照群のものよりもはるかに高かったP<0.05データは示さず。MOGまたはLPS/IFN-γ-処置は臨床スコア依存的にNO、TNF-α、およびIL-6のマクロファージ産生を誘発するEAEの病因におけるTNF-αおよびIL-6およびフリーラジカル、酸化窒素、またはNOなどサイトカインの役割を検査するために、マクロファージを臨床重篤度が異なるC.S.0および4マウスから採集し、次いでさまざまな免疫促進剤、すなわち、LPSおよびIFN-γまたはMOGペプチドでチャレンジした。MOGペプチドはLPSIFN-γと比べ比較的低刺激性の免疫促進剤であるが、NOの強固な産生が依然として濃度依存的にEAEマウスからのマクロファージにおいて確認された図11A。C.S.が4のマウスの重度障害マウスからの高濃度のMOG20μg/ml、7.75μMに相当処置マクロファージは、C.S.が0の非障害マウスからのMOG処置マクロファージからのものよりはるかに高い酸化窒素の放出を誘発し、NOの産生が有害な疾患の発現の大きな原因になりうることを示している。MOG処置は、NO放出パターンと異なるパターンを示すTNFα分泌を誘発した。C.S.0でのTNF-αのベースラインはC.S.4のものよりもはるかに高く図11B、疾患の開始におけるTNF-αの役割を示している。また、MOG誘発IL-6分泌は本試験において検出不可能であった。C.S.4マウスからのマクロファージにおいて、LPSIFN-γは、C.S.0マウスからのLPSIFN-γ刺激マクロファージにおけるよりもNO、TNF-γおよびIL-6の高い産生を有意に刺激した図11C、D、E。COG133はNOおよびTNFαのMOG誘発産生を阻害する。EAEの発現に対するCOG133の有利な効果の機序を調査するために、C.S.4マウスからのマクロファージの培地におけるNOおよびTNFαのレベルをMOG20μg/ml、7.75μMへの曝露後72時間に測定した。COG133は濃度依存的にNOおよびTNFαの産生を阻害したそれぞれ、図12AおよびBが、逆ペプチドはかかる阻害効果を示さなかった。COG133はNO、TNFα、およびIL-6のLPS/IFN-γ-誘発産生を阻害する。NO、TNFα、およびIL-6の強固な産生がマクロファージのLPSおよびIFNγ処置によって誘発された図13。高濃度5μMではなく、低濃度1μMでは、COG133は、NOA、TNFαB、およびIL-6Cの産生を有意に阻害したP<0.05。逆ペプチドは再びこの産生を阻害しなかった。COG133アンテナペディア-COG133キメラ、akaCOG4502はMOGまたはLPS/IFN-γ処置によって誘発されるサイトカインの産生を強く抑制した。COG133と比べ、アンテナぺディアに引き続きアポE133-149キメラペプチドで構成されたキメラペプチドakaCOG134またはCOG4502は、MOGまたはLPS/IFN-γ処置のいずれかによって誘発されるサイトカイン産生の阻害において有意により強い図14。5μMでのCOG134COG4502は、NO、TNFα、およびIL-6の産生を完全に阻害し、すべてのサイトカインのレベルが基礎レベルに戻ったことを示した。COG134もサイトカインおよびフリーラジカル放出を阻害する用量依存能を示す。COG134の対照として、COG133のプレフィックスとしての機能を果たすアンテナぺディアの部分が合成され、この系においても試験された。このアンテナぺディアプレフィックスペプチドはわれわれの系において活性を示さなかった。COG133は細胞およびinvivo系におけるサイトカイン放出を阻害するわれわれは以前、COG133が、ミクログリア脳のマクロファージ活性化ラスコウィッツLaskowitzら、2001年を抑制し、培養細胞における細胞内シグナル伝達系を開始するミスラMisraら、2001年その能力における無傷アポEタンパク質の生物活性を保持することを示した。アポEがその免疫調節効果を誘発する機序を調査するために、われわれは、C57BL6マウスにおけるinvivoでの全身炎症性反応を抑制するCOG133の能力を検査した。LPSに対する炎症性反応は、末梢循環および脳における2つの明確なプロ炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子アルファTNFaおよびインターロイキン-6IL-6の一時的分泌および発現プロフィールを測定することによってモニタリングされた。マウスに対し、尾静脈を通じてLPS注射し、血清試料を指示時点で得るとともに、TNFaおよびIL-6のレベルをELISAで測定した。LPSと同時投与すると、COG133は1時間で血清TNFaレベルを有意に軽減し、かつ血清IL-6レベルを1および3時間で軽減した図15。各群において注射後24時間の時点で測定可能なTNFaまたはIL-6タンパク質はなかった。これらの結果は、COG133が全動物モデルにおけるLPS誘発炎症を抑制することができ、TNFaおよびIL6放出の抑制において特に有効であるように思われることを示すリンチLynchら、2003年。末梢におけるサイトカイン放出の抑制に加えて、われわれは、LPSの尾静脈投与後に誘発されるCNS炎症性反応を抑制するCOG133の能力も検査した。脳試料の血液および他の細胞による汚染を防ぐため、これらの試験におけるマウスを生理食得水で灌流し、血液を微小血管系から洗い流し、したがって、脳コンパートメント内のサイトカインのみが存在する。COG133処置動物は、賦形剤を投与した動物と比べLPSの注射後1および3時間で有意に減少した脳内のTNFaレベルを示したp<0.05、図16A。同様に、COG133処置動物は、賦形剤を投与した動物と比べ、LPSの注射後3時間で有意に減少した脳内のIL6レベルを示したp<0.05、図16B。各群において注射後24時間で測定可能なTNFaまたはIL-6はなかった。これらの結果は明らかに、COG133のIV投与が脳実質におけるLPS誘発炎症を有意に抑制したことを示すリンチLynchら、2003年。脳内のレベルの軽減は末梢で合成されたサイトカインの結果ではなく、マウスは犠死前に灌流されたため血液脳関門を横断しえない。また、リンチLynchら2003年は、これらのサイトカインに対する脳のmRNAレベルがLPSCOG133処置動物においてLPSのみで処置した動物と比べ減少することを報告した。これらの結果により、無傷全動物において、尾静脈を通じたCOG133投与が、血液脳関門BBBによって血液から分離されたコンパートメントである脳の実質における炎症を制御しうることが明らかにされる。考察本試験において、われわれは、アポE類似ペプチドであるCOG133が、ヒトにおける多発性硬化症の特徴の大部分を模倣する実験的に誘発されたアレルギー性脳脊髄炎EAEの行動転帰を改善する顕著な能力を示すことを明らかにする。MSは、広範囲な炎症、限局性脱髄、およびさまざまな程度の軸索喪失によって特徴づけられる中枢神経系の慢性炎症性疾患であるコルネックKornek、ストルヒStorchら、2000年。マクロファージおよびTリンパ球の大規模な浸潤が、全能にわたって、特に脊髄における炎症の顕著な徴候として確認されうるレインRaine1994年。浸潤および活性化マクロファージおよびTリンパ球によるプロ炎症性サイトカインの放出は、EAEにおけるCNS病因の重要なメディエーターである。実際に、大量のTNF-α、IFN-α、およびIL-1βが脱髄斑に存在するブロスナンBrosnan、カネラCannellaら、1995年。また、浸潤免疫反応性細胞は毒性サイトカインを放出することによって直接、または間接に星状膠細胞およびミクログリアを活性化するが、これらはCNSにおけるマクロファージと考えられ、したがって、炎症性反応の二次カスケードをもたらすプリネアスPrineas、クォンKwonら、2001年。次いで、脊髄における炎症は増悪中に顕著となり、運動の顕著な障害をもたらし、場合により、マウス対象の死亡をもたらす。したがって、抗炎症性介入は、疾患の有害な過程を防ぐ有望な方法として相当な関心を引出したリークマンRieckmannとマウラーMaurer2002年。本発明において見られるアポE類似ペプチドの有利な効果としては、EAEの症状の発症の遅延、疾患の重篤度の軽減、および回復の促進が挙げられる。MOGペプチドによる免疫またはLPS/IFNガンマによる治療の標準プロトコールを使用することにより、疾患の強固な弱体化が確認された。この免疫プロトコールおよびその後の生理食塩水賦形剤の尾静脈注射または逆ペプチドすなわち、アポE149-133により処置された動物は、COG133を注射した動物よりも臨床疾患の顕著により悪い徴候を示す。したがって、本試験は、MSの治療介入におけるCOG133の利用可能性を示し、かつ広い治療の窓および高い治療指数を示すCOG432およびCOG1410など改善されたペプチド誘導体も治療介入に有用であることを示す。興味深いことに、われわれの研究室の以前の研究では、COG133が抗炎症効果を誘発することが示されたリンチLynch、タンTangら、2003年。COG133は、一次グリア培養およびBV2細胞、すなわちマウスミクログリア細胞系においてNOおよびTNF-αのLPS誘発産生を大幅に阻害したラスコウィッツLaskowitz、テクジThekdiら、2001年。ところで、本試験は、COG133がEAEの症状を大幅に改善し、アポEペプチドがinvivoで抗炎症効果を誘発するという考えを裏づける新規証拠を提供する。実施例6.マウスにおける関節リウマチのコラーゲン誘発モデルにおけるアポE類似ペプチドの抗炎症活性自己免疫モデル、EAE、およびEANにおけるアポE欠乏の分離invivo試験は、1炎症性反応の規模、および2慢性、Th1介在、自己免疫反応において持続される組織破壊の量を阻害することによって、アポEが大きな疾患重篤度および死亡からマウスを保護することを示した。したがって、アポE類似ペプチドは、関節リウマチのコラーゲン誘発モデルにおける有効性について試験されうる。ムーアMoore2003年によって書かれたプロトコールに従い、DBA/1マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎を誘発する。このプロトコールは、II型コラーゲンを使用してマウスにおいてCIAを発生させるためのコンドレックス社ChondrexInc推奨方法に類似している。80-90の疾患発生率がこの方法を使用してルーチンに達成される。われわれは、疾患が出現する最初の日にマウスの処置を開始し、さらに14日間処置し、感作後およそ40日でマウスを屠殺する。マウスは以下のプロトコールによってII型コラーゲンに感作される。0.01M酢酸の溶液をニワトリII型コラーゲンに添加し、4mg/mlの濃度を作るコンドレックス社ChondrexInc、Redmond、ワシントン州WA。コラーゲンを一夜溶解し、上清を4°C下にローラーミキサーで混合する。溶解コラーゲンを同等量のよく冷えたフロイント完全アジュバントを添加することによって乳化する。フロイント完全アジュバントは、最終濃度4mg/mlで加熱死ヒト結核菌Mycobacteriumtuberculosis菌株H37Raと混合されたフロイント完全アジュバントから成るジフコラボラトリーズDifcoLaboratories、Detroit、ミシガン州MI。各々マウスに対し、尾の基部で皮内注射100ulを投与する。0.01酢酸中1mg/mlウシII型コラーゲンを含有する100ulブースタ注射を感作後21日にi.p.投与する。このプロトコールを使用することにより、症状がルーチンに感作後約25日から発現する。しかし、マウスは、関節の症状が出現する最初の日まで14日処置を開始しない。われわれが動物が犠死されることを予期する感作後の平均時間は40日である。偽関節炎群には他の群が感作され、ブーストされる場合に抗原の注射を投与しない。10-12週齢の合計270匹のオスDBA/マウスジャクソンラボラトリーJacksonLaboratory、BarHarbour、メイン州Maineを3つの別個の実験および2つの予備実験で使用し、疾患モデルを有効にする。マウスを無作為に処置群に割り当てる。各々群はマウス15匹を含む。賦形剤のみPBSから成る陰性対照、逆ペプチド対照2.7mg/kg、デキサメタゾン1.0mg/kgから成る陽性対照、および滅菌生理食塩水中に希釈したCOG133または他のアポEペプチドの3用量、すなわち、0.3、0.9、および2.7mg/kgを試験する。投与量は、予備結果の部に示されているinvitroおよびinvivo実験で得られたデータに基づく。アポEペプチド、賦形剤、またはデキサメタゾンを以下のスケジュールに従って各々日に腹腔内注射によって投与する。すなわち、0日、感作日、21日、ブースター、約21-25日、活性疾患の14日間の処置、約40日、疾患の14日後に犠死。マウスを実験の全体を通じて疾患重篤度および足の腫脹についてマウスが犠死されるまで毎日分析する。疾患の14日目、CO2による窒息によって犠死させ、体重を量り、炎症および疾患重篤度について評価した。各々の膝蓋骨を切開し、乾燥させ、秤量する。健康なマウスにおける炎症および骨喪失に対するCOG133療法の効果も評価する。偽マウスの群については感作せず、他のマウスに対しコラーゲン誘発関節炎を与える時点でブーストしない。これらのマウスには高用量のCOG133療法2.7mg/kgまたはCOG14100.6mg/kgを14日間与える。試験の開始前、われわれは、組織学的および生物化学的手段によって未処置マウスの群におけるCIAモデルを有効にする。DBA/1オスマウス10匹を感作し、上記の通りブーストするが、処置せず、炎症のパラメータを足の容積によってモニタリングし、疾患の14日後、マウスを犠死させ、体重を量り、血液を採取して抗II型コラーゲンIgGについて試験する。マウス5匹については骨関節を組織学的分析用に除去し、CIAの存在および均一性を確認し、他のマウス5匹については各々の膝蓋骨を除去し、乾燥させて秤量し、測定可能かつ再現可能な骨喪失を確認する。別の5匹の健康な年齢を適合させた対照を犠死させ、組織学および膝蓋骨の骨量のベースライン値を得る。この実験は2回繰り返され、われわれの疾患重篤度が一貫しており、再現可能であることを確認する。犠死の時点で、末梢血を採集し、血漿を分離し、次いで存在する抗コラーゲン抗体の量についてELISAで測定する。市販のアッセイキット、アルスロゲンarthrogen-CIA登録商標マウスIgG抗II型コラーゲンELISAキットを使用し、II型コラーゲン感作およびブーストの均一性を確認するコンドレックスChondrex。組織学を用いたCIAの検証:足首および手首の関節を切除し、10緩衝ホルマリン中に固定し、次いで3日間、10ギ酸の溶液中で脱灰化するカワブタKawabutaら、2003年。組織は、デュークDuke大学医療センター病理学科または受け入れ可能な民間専門業者に送られ、パラフィンに埋設し、6um切片に切断し、ガラススライドに載せられる。スライドは3つの異なる手段によって染色され、以下の疾患マーカーが評価されるのを可能にする。すなわち、骨関節に存在するコラーゲンの量の変化マッソントリクローム、軟骨の軽減サフラニンO、およびパンヌス組織の形成、関節腔の狭窄、および炎症性細胞浸潤ヘマトキシリンおよびエオシン。組織切片を半定量手段を使用して評価するファンメウルスvanMeursら、1999年、ベーラーBeehlerら、2003年、カワバタKawabataら、2004年。足の容積による炎症性反応の定量:疾患重篤度/臨床スコアをムーアMoore2003年によって概説されている通り評価する。障害の徴候を示す各々の数字は1で記録され、後肢または前肢の炎症は1/肢と記録され、足蹠部、足首、または手首における腫脹、各々は1のスコアを臨床スコアに加える。炎症を起こした肢/マウスの総数にも留意する。ディジタルプレチスモメーター足容積測定装置、ステルチング社StoeltingCo.、WoodDale、イリノイ州ILを使用し、経時的に足の腫脹の変化を測定し、平均/-標準誤差SEM/実験群として表される。足の体積変化の測定における一貫性を確実にするために、マウスには実験開始2週間前に感作前のひじおよびひざ関節に線で入れ墨をし、各々のマウスの足の一貫した量が測定されるようにする。総足腫脹は試験中の各々の動物の曲線下面積を測定することによって判定する。各々の実験群からのデータは総足腫脹±S.E.M.で表される。骨喪失の定量:マウスが犠死される時点で、各々の膝蓋骨をばらばらにする。各々の膝蓋骨を一夜70°C下に乾燥させ、再び秤量する。膝蓋骨の重量は同様の年齢および重量の健康なマウスと比べた比率として表されている。同様に、膝蓋骨の乾燥重量は実験群の平均±標準誤差として表される。統計:実験群間の差は分散分析ANOVAによって判定されるが、群のペア間の差はマンホイットニーU検定によって判定される。p値≦0.05を有意とみなす。われわれは、上記の用量および処置時間でのCOG133、COG1410、および他のアポE類似ペプチドが正常マウスにおいて十分に耐性であると期待する。EAEを有するマウスにおけるCOG133を使用する予備データは、ペプチドが十分に耐性であることを示した。さらに、この処置が、CIAの重篤度における用量依存阻害、および疾患の14日後の炎症および骨喪失の尺度を導くことが期待される。われわれは、COG133が炎症性過程または骨喪失にのみ作用することを期待しないが、両方の疾患過程を同等に軽減することは期待する。実施例7:刺激ウサギ線維芽細胞におけるアポE類似ペプチドの抗炎症性活性パンヌス組織は、関節リウマチを有する患者およびCIAを有するマウスの骨関節内で過剰増殖を受けた滑膜細胞から成る。この組織は、そのサイトカイン、MMP、および酸化窒素の産生のため軟骨および骨の破壊の主要な原因であるピリンジャーPillingerら、2000年。疾患過程に生理学的に関連する細胞を使用してRAに対する候補の療法の試験は、その処置がinvivoで有する潜在的な利点の判定の助けとなる。HIG-82細胞アメリカンタイプカルチャーコレクションAmericanTypeCultureCollection、Manassas、バージニア州VAを10重量ウシ胎仔血清、50μg/mlペニシリン-ストレプトマイシン、および1mML-グルタミンインビトロジェンInVitrogenを補充したハムF-12培地で培養する。細胞を150mm通気口付きフラスコヌンクNunc中で成長させ、5CO2とともに37°C、加湿環境下に維持した。HIG-82細胞を最初にCa2/Mg2を含まないD-PBS10mlで2回洗浄し、引き続きヴェルセンインビトロジェンInVitrogenの1/5000希釈ストック5mlを添加することによって、フラスコの底から分離する。ヴェルセン処置細胞を遠心分離200xg、7分によって洗浄し、培地中に静かに再懸濁する。HIG-82細胞培養からの上清におけるMMPおよびNOを測定するための実験プロトコールは、パナガコスPanagakosら2000年およびコロミキンKolomyikinら2002年によって発表された方法に基づく。手短に言えば、2mlの培地中2.0×105細胞を12ウェルプレートヌンクNuncの各々ウェルに添加し、密集成長させる。細胞が密集すると、培地をウェルから吸引し、血清を含まない培地1mlを添加する。24時間後、滑膜線維芽細胞を増加濃度のCOG133の存在または非存在下に炎症性メディエーターで処置する。さらに24時間後、上清を回収し、酸化窒素、TNF-アルファ、およびMMP-1、3-9、および13について検査する。COG133またはCOG1410が滑膜線維芽細胞からのTNF-アルファ産生を阻害するかを試験するために、HIG-82細胞をCOG133またはCOG14100.1、0.5、1、3、10、および25uMの存在または非存在下、LPS0.001、0.01、および0.1ug/mlで活性化する。上清を採集し、市販のウサギTNF-アルファELISAキットBDバイオサイエンス社Biosciencesで分析する。MMPおよびNO実験でのように、経時的試験を行い、COG133またはCOG1410試験前のTNF-アルファ産生のピーク時間を判定する。賦形剤、逆ペプチド、COG1410、またはCOG133または他のアポE類似ペプチド処置滑膜線維芽細胞を、TNF-アルファ、MMP、およびNO産生について、各々アッセイに最適である濃度およびインキュベーション時間で各々プロ炎症性メディエーターの多重用量での刺激後に試験することがわれわれの目的である。予備試験では、LPS大腸菌E.coli055:B5、シグマSigma、IL-1ベータRDシステムズSystemsまたはTNF-アルファRDシステムズSystemsのほか、IL-1ベータおよびTNF-アルファによる培養の同時処置によるHIG-82細胞を活性化するための最適な濃度およびインキュベーション時間を確立する。ピリンジャーPillingerら2000年は、20ng/mlで組換えヒトIL-1ベータまたはTNF-アルファを使用し、MMPMMP-1および13およびNOのアッセイにおけるHIG-82細胞を活性化した。HIG-82によるMMP産生の最適な時間は14-48時間の範囲であることが報告されている。ピークMMP産生を刺激するために使用されたヒトIL-1Bの濃度も変動する0.001-20ng/mlパナガコスPanagakosら、2000年、コロミトキンKolomytkinら、2002年、ピリンジャーPillingerら、2004年。TNF-アルファ、NO、およびMMP1、3、9、および13の産生の最適な条件は、最小3つの独立実験を表3に示されている通り4の複製において実行される。次善、最適な、および高用量の各々のメディエーターを試験する。統計的有意性をANOVAに引き続きダネットt検定を使用して判定する。マトリックスメタロプロテアーゼMMP活性のアッセイ:われわれは、Cognosciで開発された方法、すなわち、多重酵素/多重試薬アッセイ系MEMRAS、ラスムッセンRasmussenら、2004年を使用してMMP1、3、9、および13を測定することを提案する。MEMRASは単一試料での多重MMPの活性の測定を可能にする。データは各々の実験群で検出された各々のMMPの平均濃度±S.E.M.として表される。NOのアッセイ:細胞培養実験からの上清をグライスGreiss試薬系プロメガPromega、Madison、ウィスコンシン州WIを使用して分析し、酸化窒素、亜硫酸塩NO2-の安定、非揮発性の分解産物を測定する。データは陽性対照細胞LPSまたはサイトカインの平均比率±S.E.M.で表される。ウサギTNF-アルファのアッセイ:ウサギTNF-アルファ、およびウサギTNF-アルファ標準の捕捉および検出の抗体ペアは市販でありBDバイオサイエンス社Biosciences、メーカーの指示に従って使用され、HIG-82細胞が産生するTNF-アルファの量を定量する。データは陽性対照細胞LPSまたはサイトカインの平均比率±S.E.M.で表される。われわれが観察するMMP、NO、またはTNF-アルファの量の軽減が細胞死によるものではないことを確実にするために、提案されたすべての実験条件下、MTTアッセイプロメガPromega、Madison,ウィスコンシン州WIを使用してHIG-82細胞で実行する。実施例8ペネトラチン-COG133コンジュゲートアポE類似物はTBIのマウスモデルにおいて神経保護性であるTBI後30分に、マウスを406μg/kgCOG133または生理食塩水賦形剤で処置した。損傷後24時間、生理食塩水注射動物は回転棒試験によって測定される通り運動神経および平衡の顕著な障害を示した図15A。この運動障害は体重喪失と関係があったデータは示さず。COG133処置マウスは、それらの生理食塩水処置対照よりも毎日、有意に優れて機能した、p<0.01リンチLynchら、2001年。この回復の機能は、生理食塩水処置マウスと比べCOG133処置マウスの海馬におけるニューロン死の減少と相関した、p<0.05、データは示さず。これらの結果は、COG133の静脈内投与が回転棒での性能を改善し、頭部外傷と関係があるニューロン死を予防したことを強く示す。回転棒による神経学的機能の急性回復の肉眼的試験に加えて、出願人はモリスの水迷路タスクモリスMorris、1984年における性能の変化を試験することによってTBI後20日での慢性回復も測定した。このタスクでは視空間合図を作業および基準記憶へ組込む動物の能力を測定する。このタスクでの性能は、ヒト臨床集団において見られる神経精神障害の相関であるスケルトンSkeltonら、2000年。図15Bに示されているように、COG133で静脈内処置した頭部損傷マウスは、対照として静脈内生理食塩水賦形剤を投与した損傷動物よりも23および24日に有意に優れて機能した、p<0.01リンチLynchら、2001年。この一連の実験により、静脈内投与されるCOG133がマウスにおいてTBI後30分に投与すると神経保護性であること原理の証明が明らかにされた。この保護は、神経運動、神経認知、および神経病理的エンドポイントにまで及んだ。BV-2細胞におけるペネトラチン-COG133活性先の研究では出願人は、COG133がBV2マウスミクログリア細胞におけるLPS刺激亜硫酸塩分泌の用量依存抑制を示したことを明らかにした。図16に示されているように、50抑制がおよそ3μMCOG133の用量で達成された。出願人の予備研究のために、2つの最も一般的なPTD、TATおよびペネトランを使用した。図17に示されているように、TAT-COG133コンジュゲートは、25-1000nMの範囲では効果的ではなかった。1000nMよりも高い容量は結果として細胞の90以上の死をもたらしたデータは示さず。図18は、ぺネトラチン-COG133コンジュゲートが有意により強力であったことを示す。ぺネトラチン-COG133COG4502による50パーセント抑制がおよそ30nMで生じたが、COG133のみでは本実験で使用された用量範囲内では50抑制は達成されなかった。50の抑制が3μMで達成された図16におけるデータと図18におけるデータの比較は、COG133の有効性がぺネトラチンにコンジュゲートするとCOG4502約100倍に増大したことを示す。これらの予備データは、TAT-COG133は細胞傷害性であったが、ぺネトラチン-COG133COG4502はBV2ミトコンドリアにおけるCOG133の有効性を有意に増大したことを示す。PTDコンジュゲートCOG133の有効性をさらに判定するために、BV2細胞をさまざまな濃度のPTD-COG133PTDおよびCOG133配列について表7を参照で処置し、NO産生を定量し、細胞生存に基づき標準化した。図19に示されているように、試験されたPTDのすべてとのCOG133のコンジュゲートは、COG133の有効性をさまざまな程度に増強した。IC50、すなわち、未処置対照に対してNO産生の50抑制をもたらしたPTD-COG133コンジュゲートの濃度を各々化合物について測定した。図19に示され、表7に詳述されているように、COG133は試験された最も高い濃度、すなわち、25μMで未処置対照の50に辛うじてNO産生を軽減することができたが、antpCOG133は0.7μMの用量でこれを軽減し、25μMでは100抑制を達成した。興味深いことに、切断antpPTD、すなわち、他のinvitro試験フィッシャーFisherら、2000年において完全長antpと同様に効果的と報告されたantp52-58は、11μMのIC50で有意に減少した有効性を示した。SynB3、SynB5、および8Rはほぼ同じ程度にCOG133の活性を増強し、IC50は、それぞれ、5.9μm、3.2μM、および4μMであった。antpCOG133は最も効果的なコンジュゲートであり、結果としてCOG133に対して効力の40倍の増大をもたらした。同様の転帰がinvivoで生じるかを判定するために、出願人は、TAT-COG133およびぺネトラチン-COG133COG4502コンジュゲートをTBI後のさまざまな時点でマウスに投与した。invivoでのペネトラチン-COG133COG4502活性マウスにはCOG133、TAT-COG133、またはペネトラチン-COG133COG4502をTBI後のさまざまな時点で投与し、回転棒タスクでの性能によって効果を分析した。図20に示された結果は、COG133のペネトラチンとのコンジュゲートがCOG133の治療の窓を増大せさうるが、TAT-COG133による処置は効果的ではなく、生理食塩水と同様であったことを示すデータは示さず。これらのデータは、BV2細胞におけるCOGコンジュゲートの活性をスクリーニングし、それによってCOG活性の一次スクリーンとしてのBV2細胞の有効性を確立することにより得られた結果と一致する。出願人は、invitroおよびinvivoで、COG133がその抗炎症性および神経保護特性を示すことを明らかにした。輸送の機序が1つもしくはそれ以上の既知のアポE受容体による可能性が高いが、ペネトラチンなどのPTDが輸送物を細胞膜上、かつ、場合によって、BBB上を輸送する能力を有することが明らかである。BV2細胞およびinvivoの予備データは、出願人が、COG133のさまざまなPTDとのコンジュゲートはCOG133の有効性および治療の窓を増大させうるという仮説を試験するように提案する固体塩基を形成する。現在、TBIを治療するために利用可能な確実な神経保護剤はない。これはプラットフォーム送達賦形剤として新規PTDの開発のための戦略における最初のステップである。新規PTD類似体によって与えられるBBBを通じた送達の増強により、COG133で処置されうる神経疾患の範囲がTBIにおいて見られる明らかなBBB侵害を欠くものを含むために拡大される。また、COG133の細胞通過能がその活性を全身的に増強し、潜在的にCOG133が抗炎症性治療薬として広い適用を享受することを可能にする。実施例9:BV2マウスミクログリア細胞におけるCOG133の細胞内送達および機能を促進するPTDの同定実験デザイン:独立変数がPTDであり、依存変数が培養培地に存在する酸化窒素のレベルとなる無作為化デザインが使用される。PTD-COG133コンジュゲートの合成:ペプチドは、ニューイングランドペプチド社NewEnglandPeptidesまたは他の適切な専門業者によって95の純度に合成され、滅菌等張性PBS中で再構成される。各々のPTDはCOG133のN末端に付加されるが、その配列はLRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1である。ここで留意すべきは、COG133が5つのアルギニンを有することである。PTDのトランスサイトーシスに重要であることが報告されているアルギニンの存在は、COG133がそれ自体でPTDの特性を有し、かつ/またはPTD輸送を促進しうることを示している。細胞培養:十分に特徴づけられたマウスミクログリア細胞系であるボチーニBochini、1992年BV-2が、1ペニシリン/ストレプトマイシン、10ウシ胎仔血清、1非必須アミノ酸、および1ピルビン酸ナトリウムで補充した高いグルコース含有DMEM中で培養する。細胞を密集成長させ、トリプシン化し、遠沈し、1N2補給剤、1ペニシリン/ストレプトマイシン、1非必須アミノ酸、および1ピルビン酸ナトリウムを含有する血清を含まないOptiMEM中に再懸濁し、20,000細胞/ウェルの濃度でプレーティングし、非接着性細胞および血清を除去する。PTD-COG133による細胞および処置のLPS刺激:BV2細胞をOptiMEMで洗浄し、血清の除去を確実にし、200μlの新鮮OptiMEMで保護し、次いでさまざまな濃度のPTD-COG133もしくは適切に希釈された炭酸アンモニウム賦形剤対照溶液および大腸菌E.coliカタログ番号L8274、シグマSigmaからの100ng/mlLPSで処置する。上清をLPS刺激後24および/または48時間に採集し、亜硫酸塩について測定する。酸化窒素NOの定量:培地中の亜硫酸塩NO産生の安定最終産物の蓄積をコロメトリックcolometricグリースGriess試薬系プロメガPromegaによって測定し、吸光度を540nmで測定する。細胞生存アッセイ:細胞生存を非放射線活性細胞生存アッセイ細胞タイター96AQ、プロメガPromegaを使用して測定する。アッセイではMTS3-4,5-ジメチルチアゾール-2--5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウムの生細胞によるホルマザンへの生体内還元性を測定する。コロメトリックアッセイの吸光度をλ490nmで測定する。生存を評価し、これを使用して亜硫酸塩データを標準化する。データ収集および統計的分析:実験を最小3つの異なる培養群に対する実験条件ごとに分析された最小6ウェルで行う。値は平均±標準誤差で表されうる。有意性は対応のないスチューデントt検定またはANOVAを使用して判定する。実施例10:マウスにおける外傷性脳損傷の確立された回復モデルを使用してCOG133の有効性を強化し、かつ/またはその治療の窓を拡大する候補のPTD-COG133コンジュゲートの能力を測定する。実験デザイン:2つの独立変数、a損傷と処置との間の経過時間すなわち、30、60、90、および180分、およびbBV-2細胞における上位3つのPTD-COG133コンジュゲートベースの性能とともに無作為化デザインを使用する。依存変数は回転棒スコアおよび重量とする。制御された空気衝撃デバイスによる頭部損傷モデル:麻酔誘発ボックス中で90秒間、50のFiO2で酸素中4.3イソフルランでマウスを麻酔する。気管に挿管し、肺を機械的に通気し、50O2および50N2中1.4イソフランで麻酔する。体温を表面加熱/冷却を使用して37°C下に維持する。各々のマウスを定位デバイスに配置する。頭蓋の上部を曝露し、解剖学的目印を特定する。制御された速度6.0±0.2m/秒および鉛直変位3.0mmで2.0mm鋼チップインパウンダーを使用して、動物を空気インパクタエアーパワーAir-Power、ハイポイントHighPoint、ノースカロライナ州NCによる制御された頭蓋衝撃にかける。動物を抜管前に自発換気に回復させる。回復後、マウスには自由に飼料と水を与えるリンチLynchら、2001年a、b。薬物投与:TBI後30、60、90、または180分の時点で、マウスには100ulの滅菌リン酸緩衝生理食塩水賦形剤、1mg/kgの用量でCOG133、または1mg/kgの用量でさまざまなPTD-COG133コンジュゲートにより静脈内注射する。以前の実験に基づき、実験処置群あたり動物20匹を使用し、有意な統計的比較が行えうるように十分なデータを得る。回転棒試験:回転棒試験を実験的に適用されるTBIの約2時間前に与える。手短に言えば、各々マウスを尾によって持ち上げ、ゆっくりかつ一定の速度で回転する回転棒に静かに配置する。5~10秒後、回転棒を加速モードに切替え、タイマーをスタートさせる。マウスが回転棒から落下し、またはマウスが棒にしがみつき、2度回転した場合720度の回転にタイマーを止める。5分の休息期間後、同じマウスを回転棒に再び配置することによって第2の試験を実行し、レイテンシーすなわち回転棒で費やした時間を再び測定する。さらに5分の休息期間後、第3の試験を実行し、レイテンシータイムを各々のマウスについて測定する。TBI後の翌日および衝撃後20~24時間および翌5日間の毎日、各々のマウスを下記の通り回転棒試験で3回の試験によって試験し、各々のマウスをその独自の対照とすることを可能にする。データ分析のために、マウスの群の各々マウスの3つのレイテンシータイムを共に平均化し、標準偏差を計算する。この試験パラダイムは、外傷後機能障害の存在、およびその後の回復を検出する感度を有することを明らかにしたTBIに関するわれわれの以前の調査に基づいて選択されたリンチLynchら、2001年a、b。すべての試験は群の割当が知らされていない研究者によって行われる。データ収集および統計的分析:値は平均±標準誤差として表されうる。有意性は、対応のないスチューデントt検定またはANOVAを使用して判定される。SynB3-COG133の結果図23に示されたデータは、SynB3-COG133コンジュゲートが、外傷性脳損傷後2時間に1回尾静脈注射によって投与するとマウスにおける頭部外傷からの転帰を有意に改善する回転棒レイテンシーによって測定ことを示す。実施例11.COG133の抗炎症性特性アポEホロ-タンパク質由来のペプチドによりホロ-アポE-タンパク質と同じ抗炎症活性が得られるか試験するために、われわれは最初、COG133aka.アポE133-149またはアポE130-149の添加が結果としてリポ多糖LPSで刺激したBV2ミクログリア細胞系からのTNFα放出の用量依存阻害をもたらすことを示したラスコウィッツLaskowitzら、2001年。対照的に、スクランブルペプチドで処置した細胞は、TNFα放出を阻害しなかった。同様に、COG133およびアポE130-149はLPS処置BV2細胞からの酸化窒素放出を有意に軽減したが、スクランブルペプチド処置は酸化窒素放出を阻害しなかった。これらのデータは、マクロファージ細胞のLPS誘発死激後のサイトカインTNFαおよびフリーラジカルNOの放出がCOG133の存在下に有意に軽減され、COG133が抗炎症剤として機能しうることを示しているのを明らかにした。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許第10/252,120号明細書を参照。われわれは次に、COG133アポE-133-149が、細胞ベースのモデルラスコウィッツLaskowitzら、2001年と同じやり方で丸ごとの動物リンチLynchら、2003年における炎症性反応を抑制するか調査した。LPSと同時投与すると、COG133アポE-類似ペプチドは血清TNFαおよび血清IL-6レベルを有意に軽減した。末梢におけるサイトカイン放出の抑制に加えて、われわれは、野生型マウスの脳におけるサイトカインmRNAレベルに対するLPSCOG133の尾静脈注射の効果を調査したリンチLynchら、2003年。LPS生理食塩水と比べ、TNFαおよびIL6mRNAレベルはLPSCOG133の注射後3時間で動物において有意に減少し、アポE類似ペプチドであるCOG133の投与が丸ごとの動物モデルにおけるLPS誘発炎症を有意に抑制しうることを示した。実施例12.内因性アポEタンパク質の放射線保護の役割アポEの抗炎症効果がTBIおよび放射線療法を受ける対象の保護に有用であることを確認するために、われわれは、マウスアポEタンパク質を発現する野生型C57B1/6マウスにおけるTBIの7Gyおよび8Gyの効果をアポEノックアウトマウスジャクソンラボ社JacksonLabs、BarHarbor、メイン州MEにおけるTBIの7Gyおよび8Gyの効果と比較した。マウス10匹の群を0の時点で照射し、その生存を翌36日にわたって追跡した。図22に示されているように、7Gyへ曝露された野生型マウスのうち1匹も30日の時間的経過中に死亡しなかったが、アポEノックアウトマウス10匹のうち2匹が照射後13日で死亡し20死亡/80生存、30日の時間的経過中にさらなる死亡はなかった。野生型マウス10匹の群を8GyのTBIへ曝露した場合、4匹が照射後21日目に死亡し、さらに2匹が23日目に死亡したが、36日までにそれ以上の死亡はなかった。アポEノックアウトマウス10匹の群を8GyのTBIへ曝露した場合、6匹が照射後10日で死亡し、さらに2匹が11日目に死亡し、最後の2匹は12日目に死亡した。この8GyTBIデータを要約するいくつかの方法がある。すなわち、最大100のアポEノックアウトマウスが照射後12日までに死亡するのに対し、照射後23日までに最大60の野生型マウスが死亡する。あるいは、60のアポEノックアウトマウスが照射後10日までに死亡するのに対して、60の野生型マウスが照射後23日までに死亡する。データのいずれかの表示からも、アポEノックアウトマウスにおけるアポEタンパク質の不在は早期での死亡と関係があり、大きな割合のアポEノックアウト動物が、その野生型のアポE含有対照と比べ所定用量のTBIで死亡することが明らかである。この所見は、アポEタンパク質が、TBI後の丸ごとの動物の生存を増強する保護効果を与え、アポEの欠損が高荷電、高エネルギーHZE粒子曝露の行動毒性を悪化させうることを示す以前の実験ヒグチHiguchiら、2002年と一致することを本発明者に示した。全身照射は、全身炎症における顕著な増大と関係がある。われわれおよび他の人々は、TBIへ曝露されたマウスの血液中のサイトカインのレベルの顕著な増大を見出したブダゴフBudagov2004年および未発表。ブダゴフBudagovおよびウリアノバUlianova2004年は、同じ損傷へ曝露され、抗IL6モノクローナル抗体を受けなかったマウスの100の死亡率と比べ、7.5GyのTBI10の体表面全層熱傷を受けたマウスへの抗IL6モノクローナル抗体のマウスへの投与が結果として損傷後30日での60レベルへの大幅に改善された生存をもたらしたことを見出した。ファンデルメーレンVanderMeerenら2002年の優れた報告が、8GyのTBIを受けた後、2時間遅延され、次いでrIL11を5日間毎日投与されたマウスが死亡から大幅に保護されたことを示した。具体的には、TBI後30日に、rIL11処置群が74の生存率を享受したが、プラセボ処置対照は11生存率しか達成しなかったp<0.001。これらの試験は、体の免疫反応の調節が全身照射へ曝露された個体の生存において有意に好ましい役割を果たしうるという考えを強く裏づける。アポEが炎症において果たす役割に基づき、われわれは、ホロ-アポEの組織保護活性を有する小ペプチドであるCOG133を作成した図22ラスコウィッツLaskowitzら、2001年、リンチLynchら、2003年、リンチLynchら、2005年。野生型マウスにおけるリポ多糖LPS誘発炎症を使用することにより、COG133による処置が、LPSおよび生理食塩水賦形剤で処置したその野生型対照と比べると、血液および脳における腫瘍壊死因子アルファTNFaおよびインターロイキン-6IL6放出を顕著に軽減した。炎症が実験的に適用された外傷性脳損傷後に誘発される別の野生型のマウスモデルにおいて、われわれは、COG133が、外傷性脳損傷後30分に投与されると、大幅に死亡を阻止し、行動機能を修復することにおいて効果的であったことを報告したリンチLynchら、2005年。より最近の試験において、われわれは、腹腔内経路によるCOG133投与がマウスにおけるLPS注射後の炎症の軽減においても効果的であることを見出したデータは示さず。われわれの結果は、COG133が天然起源のアポEタンパク質の内因性レベルの存在下に炎症を効果的に軽減し、COG133が炎症性刺激後に投与されている場合でもそのように軽減しうることを示す。実施例13.COG133の存在および非存在下にTBIを受けるマウスの生存TBIが炎症を刺激し、アポE類似物であるCOG133が丸ごとの動物における炎症を調節しうるという情報を組合わせることにより、われわれは、全身照射へ曝露された野生型マウスにおける生存を改善するCOG133の能力を試験した。われわれが実行した独立研究から、COG133の最大耐量は14mg/kgであるデータは示さず。この最大耐量は、COG133の尾静脈注射の24時間以内に動物が死亡しない用量である。われわれは、LPS介在TNFaおよびIL6レベルがCOG133の同時投与によって大幅に軽減されることも報告したリンチLynchら、2003年。したがって、われわれは、0~12グレイの全身照射TBIを受けたマウスにゼロ~最大耐量の半分0~0.5×MTDであるCOG133の量用量を投与する。このようにして、TBIのみの効果、COG133のみの効果、およびTBICOG133の効果を比較することができる。最初に試験される放射線量の範囲0~12Gyは、中間および低用量の照射をカバーするホールHall、2000年。放射線の中間線量5~12Gyでは、死亡は数日中に起こることが予想され、下痢および胃腸粘膜の破壊胃腸症候群と呼ばれると関係がある。低い放射線量およそ2.5~5Gyでは、死亡は曝露の数週間後に起こり、血液形成臓器に対する影響によって引き起こされる骨髄死または造血症候群と呼ばれる。したがって、高い線量群では早期の胃腸症候群および低線量群では遅延造血症候群が予想される。図23に示されているように、アポEタンパク質を発現する野生型マウスは、10GyのTBIへ曝露されるとLD100/12を受けるすなわち、10GyのTBIへ曝露されるマウスの100が照射後12日で死亡する。対照的に、TBI10Gy後1分でCOG133の1回の腹腔内注射生理食塩水中4mg/kgを投与されるマウスは、より優れた生存を示し、その生理食塩水処置対照よりも優れているLD100/13を示す。われわれが10GyのTBIをマウスに投与した後、1時間の遅延の後、さらにCOG133の初期投与4mg/kgの後、TBI後1日、2日、および3日目に追加のCOG133を投与した場合は、生存はさらに増強され、その生理食塩水処置対照よりも有意に優れているLD100/16を示したp<0.01。これらのパイロット実験、およびTBIにおける免疫修飾因子の文献の報告は上記参照、TBI後30日で生存を大幅に増大させる放射線生物学的標準に合致するCOG133の能力をさらに試験することにわれわれをかきたてる。これらのデータは、C57Bl6マウスのTBIへの曝露後にCOG133の投与が結果として、放射線を受け、かつCOG133を欠く生理食塩水賦形剤を受けたマウスと比べ寿命の拡大をもたらしたことを示す。これらの動物のいずれもが30日まで生存しなかったが、われわれは、照射後12日で生理食塩水処置マウスにおける100の死亡率を示したLD100/1210Gyの高い線量を使用した。10Gyの後COG133による処置を受けた全動物も死亡したが、それらは14日および16日までに死亡し、その生存時間は明らかにCOG133が投与されたパラダイムに関係があった。4用量のCOG133が投与された動物は、ANOVAによって分析されると、照射後に生理食塩水賦形剤処置対照群よりも有意に長い時間生存したp<0.05。別のやり方で示すと、10Gyへ曝露された各々群のLD50は生理食塩水対照、LD50/100、照射後1分でCOG133、LD50/12、および照射後1時間照射後1、2、および3日でCOG1331mg/Kgで合計4用量のCOG133、LD50/14であった。われわれはこのデータを用量軽減因数またはDRFとして示したと思ったが、1回の放射線量で得られたこの制限されたデータセットで行うことは不可能である。放射線量の変化が、次いでDRF計算を可能にするCOG133の存在および非存在下にLD50/30を実験的に測定する実験で与えられる必要がある。所定レベルの致死率では、用量軽減因数は、COG133の非存在下に放射線量によって割られるCOG133の存在下の放射線量に等しい。この計算方法を使用することにより、ホールHall2000年は、アミホステンが照射イベント直前に投与されるとマウスにおける照射後30日でアミホステンについて2.7の用量軽減因数を報告している。最大用量軽減因数は2.5~3であると計算されるがホールHall、2000年、われわれは、TBIイベント後に投与され、マウスにおける生存期間を延長させるCOG133の能力に集中している。したがって、われわれの目的は、COG133が組織を保護することができ、それによってTBIを受け、その後にTBI後COG133を投与される動物の生存期間を延長させることを示すことである。われわれはこれらの実験を、マウスアポEタンパク質を発現する野生型、C57B1/6マウスにおいても実行する。われわれは、これらの野生型、アポE含有マウスへのCOG133の添加がその生存を改善するかを試験している。われわれは、これは、COG133などの放射線保護療法がすでにアポEタンパク質を有するヒトに潜在的に投与されるため重要であると思う。われわれは、COG133によるアポEノックアウトマウスにおける実験を行うことを考慮したが、これは低いバーであり、すでにその独自の内因性アポEタンパク質を発現したヒトに与えられるう療法の長期の基準に合致しないと思われた。ペプチド合成:ペプチドはマルチプルペプチドシステムズSanDiegoによって質量分析で確認されるように95の純度に合成され、トリフルオル酢酸塩から再構成される。COG133は配列:LRVRLASHLRKLRKRLL配列番号1を有し、逆-COG133は配列:LLRKRLKRLHSALRVRL配列番号57を有する。処置条件:一般に、各々の治療群は、週齢12~16のオス、C57BL/6マウス12匹から成る。われわれは、0×MTDすなわち、生理食塩水賦形剤、0.1×MTD、0.2×MTD、および0.5×MTD0、2.6、5.2、および13mg/Kg、本実験では合計50mgに対応するCOG133の用量を投与する表8。COG133の初期腹腔内投与は全身照射後1時間すなわちTBI後1時間であり、その後、合計30日間または動物が死亡するまで毎日注射する。TBIによる文献およびわれわれ独自の予備データからの値に基づき、われわれは、上記のCOG133の各々の異なる用量とともに、0、4、5、6、7、8、9、および10Gyの全身電離照射を使用する。したがって、4つの量のCOG133×8つの異なる量の放射線量により32の異なる条件が得られる。32の異なる条件×条件あたりマウス12匹で合計マウス384匹となる。全身照射TBIを受けるために、マウスは較正照射器へ配置され、上記の予備の結果の部で行われた通り電離放射線の所望量を生成する長さの時間にわたって曝露される。生理食塩水のみおよび全化合物は、TBI後60分、次いで30日間毎日、腹腔内注射によって滅菌生理食塩水賦形剤で投与されるCOG133のQD投与。動物評価:動物の生存はさまざまなやり方で測定される。死亡は、呼吸の完全欠如、および10分もしくはそれ以上の間のテイルピンチおよび/またはトーピンチなど外部刺激に対する完全無反応として規定される。生存は、TBI曝露後30日の各々について毎日、各々の動物において評価される。動物はTBI前の3日間毎日およびTBI後30日間毎日、電子スケールで体重を量る。臨床徴候は動物のCNS活性に関連した所見であり運動活性、運動失調、立ち直り反射、およびけいれん、毒性または病的状態の早期指標である。これらの所見を使用し、TBI後に機能する動物の能力およびこの性能がCOG133で改善されているかを評価することができる。われわれは、修正神経重篤度評価システムを使用し、サマリー神経重篤度スコアNSSを、われわれの協力者であるラスコウィッツLaskowitz博士によって記載された通り示すシェングShengら、1999年。各々の動物をTBI前の3日間毎日およびTBI後30日間毎日評価する。群の割当が知らされていない訓練を受けた監視者がこれらの評価を行う。0点のスコアが正常な神経学的検査を意味し、10点のスコアは最も重篤な神経障害を意味する。値はサマリーNSSスコアとして以下の通り要約される。すなわち、1=正常0点、2=中等度障害1-6点、3=重篤な障害7-10点、4=死亡。各評価間、動物をそのケージに戻し、飼料と水を自由に与える。神経-重篤度スコアをマンホイットニーU統計値を用いて比較する。過度の苦痛の徴候を示していると思われる動物、それらはヒト用途および動物のケアのIACUCのガイドラインにより直ちに安楽死させられる。非致死的罹患率の測定は実施例4において対処される。死亡データは、ログランク検定および/またはフィッシャーの正確検定両側を使用して処置および未処置動物の生存曲線を比較することによって分析される。生存データの統計的分析は、全群間でプリズムPrismコンピュータプログラムにより比較される。有意性は対応のないスチューデントt検定またはANOVAを使用して判定され、p<0.05の場合に統計的有意性と仮定する。線量軽減因数:ホールHall2000年は、同じレベルの効果LD50/30に対する薬剤COG133などの非存在下の放射線量に対する薬剤COG133などの存在下の放射線量の比としてDRFを規定している。したがって、DRF=50レベルの致死率=50生存をもたらすCOG133の非存在下の放射線量によって割られるCOG133の存在下の放射線量である。上記の試験から収集されたデータを使用することにより、われわれは、TBI後30日で50生存を示す全身照射の線量が補間されうる生存対曝露曲線をプロットするヘンシュケHenschkeとモルトンMorton1957年。生理食塩水対照動物からのLD50/30のほか、COG133の0.1×MTD、COG133の0.2×MTD、およびCOG133の0.5×MTDのLD50/30を使用することにより、われわれは、COG133の各々量のDRFを計算する。DRFが1よりも大きい場合は、この結果はTBI後のCOG133による動物の処置がTBIへの曝露の動物の生存に対する保護効果を有することを示す。DRFが1である場合は、COG133処置によって保護が得られない。DRFが1未満である場合は、COG133はTBIに対して動物を感作する薬剤として作用しているとみられる。図3におけるわれわれの予備試験に基づき、われわれは、COG133が、TBIへ曝露されたマウスの生存を有意に増大させ、1より大きいDRFを生む放射線保護剤として作用することを予測する。マウスは、TBIに対して一貫して反応するため、この概念の検証実験には最適な動物であり、照射器械へ都合よく適応させるのに十分に小さく、その小さなサイズによりこの試験パラダイムにおけるCOG133の使用が節約される。その後のタスクにおけるCOG133の効果を正確に判定するために、われわれは、各々の処置条件に対する完全な放射線量対生存率曲線を生成する必要がある。マウスに関しては、4Gy未満のTBI曝露が一般的に生存に対する測定可能な効果を示さず、したがって、われわれは、この提案においてその低線量実験で重要な動物資源を消費することは選択しなかった。しかし、線量照射試験からの異なる転帰が今後の提案の対象となりうる。他方、10Gyを超えるTBI曝露は一般的に10未満の生存90を超える死亡をもたらす。10Gyを超えるものに対する動物の反応は軍事的および民間的理由で重要ではあるが、われわれは、動物の死亡とも顕著に関係がある曝露の範囲に集中することを選択した。われわれの治療介入がTBIのこれら低~中程度の線量で生存を有意に改善しうる場合は、今後の提案は、10Gyを超えるTBIなど高い線量のTBI後の生存の保護に対する可能性に集中することになる。実験のスケジュール:動物48匹の1群を計画の1年間にわたってほぼ6週間ごとに試験する。したがって、以下のスケジュールが提案される。実施例14.COG133処置の有無によるTBI動物のワイヤハング/回転棒での行動性能全体としては、マウスをワイヤハング試験で試験し、マウスがその肢の強さを有することを示す。マウスが強さを有する場合は、次いで、運動強度および調整の行動性能の統合試験である回転棒で試験される。ストレスをかける前にこれらの試験にパスしない動物は、われわれのその後の研究で使用されない。TBICOG133を受けた動物がTBIのみを受けたものより有意に優れて機能する場合は、これはCOG133が死亡を改善するだけではなく、病的状態も改善することを示す。ワイヤハング試験:把握prehensile反射および一般運動強度を評価するために、ワイヤハング試験を使用する。本試験のわれわれのバージョンでは、マウスを尾で持ち上げ、標準靴箱ケージこれは、20cm×30cmの靴箱の全上部をカバーする約1cm間隔で配置された直径およそ2mmの平行のステンレス鋼ワイヤから成るのワイヤふた上に配置する。マウスは一般的にふた上のワイヤをつかみ、マウスを保持するふた全体はベンチの上部に位置する気泡ゴムパッドの上部より上の約20~30cmで反転される。マウスは30秒間ふたをつかんだままにされる。マウスがふたをつかみそこねて30秒前に落下した場合は、反転から落下までの時間がレイテンシータイムとして記録される。マウスが落下しない場合は、30秒のレイテンシータイムが与えられる。3つの試験がTBI前の3日間毎日、各々のマウスについて実行される。各々試験は、休息期間として少なくとも5分で分離される。平均レイテンシータイムおよび標準偏差を各々の日の各々群について計算する。ワイヤハングはTBI後の毎日に同じやり方でも実行される。動物が、TBI前の3日の各々における各々の試験で全30秒間、ワイヤハングを成功裏に実行し、ワイヤふたで保持することができない場合は、TBIおよびその後の試験から除外される。われわれの実験ではすべての健康な野生型、C57B1/6マウスは容易にこの試験をパスしている。回転棒試験:毎日の回転棒RR試験を使用し、全身照射後の短期の運動および小脳障害を評価するハムHammら、1994年。回転棒試験は、TBI前の3日間毎日およびTBI後の30日間毎日与えられる。手短に言えば、各々のマウスを尾によって持ち上げ、ゆっくりかつ一定の速度で回転する回転棒に静かに配置する。5~10秒後、回転棒を加速モードに切替え、タイマーをスタートさせる。マウスが回転棒から落下し、またはマウスが棒にしがみつき、2度回転した場合720度の回転にタイマーを止める。5分の休息期間後、同じマウスを回転棒に再び配置することによって第2の試験を実行し、レイテンシーすなわち回転棒で費やした時間を再び測定する。さらに5分の休息期間後、第3の試験を実行し、レイテンシータイムを各々のマウスについて測定する。毎日、各々のマウスを上記の通り回転棒試験で3回の試験によって試験し、それによって各々のマウスをその独自の対照とすることを可能にする。データ分析のために、マウスの群の各々マウスの3つのレイテンシータイムを共に平均化し、標準偏差を計算する。この試験パラダイムは、回転棒が外傷後機能障害の存在、およびその後の回復を検出する感度を有することを明らかにした行動実行に関するわれわれの以前の調査に基づいて選択された。群の割当が知らされていない研究者がすべての試験を行う。われわれは、プリズムPrism統計的分析プログラムとともに反復測定ANOVAを使用し、実験化合物を投与したマウス、および生理食塩水対照を投与したマウスの群間の差の有意性を計算するが、ここでp<0.05を有意とみなす。動物が、一般的に、TBIの3日の各々における各々の試験でこの齢の健康なマウスでは約200秒であるレイテンシータイムである回転棒で成功裏に実行できない場合は、TBIおよびその後の試験からこれを除外する。統計的分析:行動転帰の統計的分析は、対照群に対する多重比較の補正するためのダンネットのポストホック法による分散の反復測定分析で実行される。有意性は、p<0.05の場合に仮定される。すべての値が平均±標準偏差として表される。実施例15:抗炎症性特性を有するアポE類似ペプチドアポEタンパク質の抗炎症性特性に基づき、われわれは、299アミノ酸、アポEホロタンパク質の受容体結合部位に位置したアミノ酸残基133-149由来のペプチドであるCOG133を開発したラスコウィッツLaskowitzDTら、2001年。われわれは、培養マクロファージラスコウィッツLaskowitzDTら、2001年およびC57B1/6マウスリンチLynchJ.R.ら、2003年を使用することにより、COG133がアポEタンパク質の抗炎症性特性を保持することを明らかにした。炎症をLPS注射±COG133によってナイーブマウスにおいて誘発し、注射後0、1、3、および24時間の時点で血清を回収した図24AおよびB。サイトカインELISAキットパースPierceを使用することによって、COG133処置動物は、生理食塩水対照と比べ、有意に低い血清TNF-αおよび有意に低い血清IL-6を有したリンチLynchJ.R.ら、2003年。われわれもリンチLynchらにおいて、TNF-αおよびIL-6の脳レベルが、定量的RT-PCRによってタンパク質レベルまたはmRNAレベルのいずれかの測定によって、生理食塩水対照と比べCOG133処置動物において有意に低いことを報告した。新鮮ヒト血液±COG133のLPS刺激も、COG133が生理食塩水処置対照と比べ、酸化窒素およびTNF-αレベルを有意に軽減したことを示した。これらのデータは、COG133がinvitro、invivo、およびエクスビボで炎症を軽減することを示し、これは、COG133がヒト疾患における炎症を効果的に軽減しうるというわれわれの考えを裏づける。実施例16.COG133はEAEを有するマウスにおける疾患重篤度を軽減するマウスにおけるMOG誘発実験アレルギー性脳脊髄炎EAEは、MSおよびEAEの臨床的および組織病理学的特徴が多くの基本的な点で同様とみなされるため多発性硬化症MSと関係がある炎症の最もしばしば使用されるマウスモデルである。これらには、CNSの全体を通じて多発性病変の臨床症状、発生率、脱髄性斑、血管周囲炎症、およびTNF-α、IL-6、およびNOのような炎症原を放出する侵入炎症性細胞を関与が含まれるランゾホフRansohoffR.M.、1999年。したがって、このモデルは、COG133がその抗炎症性特性によりMSの障害を改善しうるというわれわれ仮説を試験するために選択された。手短に言えば、C57BL/6メスマウスを最初にMOGペプチドpMOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKで免疫化し、免疫化後6~24日に開始することにより、1mg/kgのCOG133もしくは逆COG133、または同量の生理食塩水を尾静脈ボーラス注射によって一日おきに投与した。全体で、10用量のペプチドを投与した。われわれは、COG133処置動物における平均最大臨床スコアが生理食塩水対照動物におけるよりも有意に低いことを示すことによって、COG133がEAEの重篤度を有意に改善することを見出した図10。COG133は、生理食塩水群の15匹中4匹および逆ペプチド群の15匹中5匹から、COG133処置群の15匹中0匹へ死亡を有意に軽減したp<0.05。疾患進行のパターンは、マウスがCOG133処置群において免疫化後23日から回復し始めたが、対照動物は依然として高いレベルの重篤度のままであった図2。逆COG133はBV2細胞におけるinvitroで生物活性を欠き、EAEの行動症状を改善しなかった図10。逆ペプチド群と生理食塩水群との間に統計的に有意差はなかったp>0.05が、いずれかの対照群と比べCOG133群における統計的に有意な改善が認められるp<0.05。示されてはいないが、きわめて同様の結果が、COG133処置動物による投与の腹腔内経路i.v.の代わりにi.p.を使用して得られ、生理食塩水対照と比べ有意な改善を示したp<0.05。これらの結果は、COG133がEAEと関係がある炎症を有意に軽減し、疾患からの回復を促進しうることを示す。侵入炎症性細胞を含む病理学的変化を示すために、動物を30日目に犠死させ、全脊髄をばらばらにし、COG133処置動物および生理食塩水処置対照の脊髄の頸部、胸部、および腰部から5μm厚の切片を作成した。これらの切片をルクソールファーストブルーで染色しミエリンについて、青色に染色、次いでエオシンで対比染色した末梢浸潤物を赤紫色に示す。図25-A、B、およびCに示されているように、大規模な脱髄青色染色の喪失および増強された浸潤物赤紫色粒子で示されるが対照動物の脊髄全体を通じて白質において確認されうる。行動変化と一致して、COG133はMOG処置動物における脱髄を軽減し、かつ炎症性浸潤物を軽減した図25-D、E、F、H。実施例16COG133の類似体も抗炎症性活性を有するCOG133をテンプレートとして使用することにより、われわれは、増強された所望の医薬特性を有する新しい類似体を生成し続けている。図26に示されているように、COG1410は、非天然アミノ酸を含有し、COG133親化合物よりも優れたLPS-刺激、BV2ミクログリア細胞におけるNO放出を抑制することができる類似体である。同様に、COG4502は、エキストラアミノ酸のプレフィックスに引き続きCOG133配列を含有し、COG133親よりもはるかに優れてこの系でNO放出を抑制することができる別の類似体である。より生理的な系におけるCOG4502の有用性をさらに検証するために、われわれは、マウス腹膜マクロファージを単離し、それらをCOG4502の存在または非存在下にLPSで刺激した。図27に示されているように、COG4502はTNFaの用量依存阻害およびIL6放出の用量依存阻害をもたらす。これらの結果は、COG化合物が、細胞系、腹膜マクロファージ、および丸ごとの動物において有力な抗炎症性分子であることを強く示す上記で詳述。実施例17結腸炎のマウスモデル:アルギナーゼおよびODCの保護的役割およびiNOSの有害な効果炎症はクローン病および潰瘍性結腸炎の進行および症状の基礎にあり、場合によって、これは狭窄形成、瘻、閉塞、およびせん孔の合併症に進行しうる。IBDにおけるこの炎症性反応の一部が、一般に疾患活性の悪化と結合しているNO放出の刺激である。NOは基質としてアルギニンからのNO合成NOSによって生成され、この酵素の誘導性形態iNOSはIBDに関与する主要な担い手である。しかし、アルギニンは、ポリアミンを生成する別の経路によっても使用される。これは、制限アルギニン基質の2つの経路間での競合を誘発する。ウィルソンラボWilsonLabは、粘膜免疫学におけるiNOSおよびアルギナーゼ/ODC経路の競合活性に集中してきたクロスCrossRKら、2003年、ゴベルトGobertAPら、2004年、チヤツルヴェディChaturvediR.ら.2004年、スーXuH.ら、2004年、ブシールBussiereFIら、2005年、ゴベルトGobertAPら、2001年、2002年、チェンChengY.ら、2005年。結腸炎のマウスモデルは、別のアルギナーゼ-オルニチンデカルボキシレートODC経路が、結腸炎の改善における重要な役割を果たす、結腸におけるポリアミンの形成をもたらすことを発見するために使用されているゴベルトGobertら、2004年。追加のアルギニンが投与された別の経路に入るアルギニンの量を増大させるiNOS欠乏マウス高レベルのNOを作る酵素を欠くまたは野生型マウスのいずれかが、シトロバクターローデンティウム、またはデキストラン硫酸ナトリウムDSSによって誘発される結腸炎の改善を示すことが証明されている。さらに、アルギニンを有するiNOS欠乏マウスが結果として疾患の劇的な改善およびプロ炎症性サイトカイン産生の逆転をもたらした。対照的に、アルギナーゼまたはODCの阻害剤によるマウスの処置は結腸炎の劇的な悪化をもたらす。これらのデータは、NOへのアルギニン代謝が問題を悪化させる疾患の部位でアルギニンの競合が認められるが、ポリアミンへのアルギニン代謝は疾患を改善することを示す。この指摘に基づき、NO産生の軽減および/またはポリアミン合成の増大をめざした治療法は、炎症性腸疾患に対する効果的な治療であるべきである。C.ローデンティウム結腸炎:2つの既存のマウスモデルのうちゴベルトGobertAPら、2004年、チェンChengY.ら、2003年、ヒトIBDと同様の組織学的変化を有するTh1-支配的粘膜炎症をもたらすため、C.ローデンティウムモデルが選択されたヒギンスHigginsLMら、1999年。このモデルにおいて、マウスを、ヒトにおける下痢の原因である病原性大腸菌E.coliの齧歯類同等物であるグラム陰性病原性細菌である、C.ローデンティウムゴベルトGoebertAPら、2004年と強制経口投与によって感染させる。アルギナーゼIおよびiNOSの誘発。われわれが、結腸炎組織におけるアルギナーゼおよびiNOS酵素の発現を試験したところ、われわれはアルギナーゼImRNAおよびタンパク質発現が大幅に増大したが、アルギナーゼIIは誘発されなかったことを見出した図28AおよびB。これらのデータはリアルタイムPCRによって確認されたが、ここでわれわれは、アルギナーゼIの9.7±2.5倍の増加が見出されたが、アルギナーゼIIの増大は見出されなかった。iNOSmRNAもRT-PCRによって一貫して増大し図28A、これもリアルタイムPCRによって確認された。免疫組織化学によって、われわれは、図29B-C、および29Hに示されている通り、感染マウスの結腸組織においてアルギナーゼIに対する局所的に強い染色を見出した。染色は上皮細胞に存在した図29BおよびCが、重篤な結腸炎における粘膜の全体を通じても見出され図29H、浸潤炎症性細胞の染色を示した。同じ組織からの連続切片において、iNOSは上皮、および固有層および粘膜下炎症性細胞に局在した図29E-F、および29I。染色は、アルギナーゼIに対するAbを有する非感染組織図29AもしくはiNOS図29DまたはイソタイプIg対照でインキュベートされた感染組織図29Gにおいて欠如していた。iNOS染色がiNOS-/-マウスからの組織において完全に欠如していたデータを示さず。われわれは、アルギナーゼ活性が感染マウス対対照マウスで2.4倍に増大したことを確認することができた図30A。NO濃度における有意な増大が、対照マウスと比べ感染マウスの血清において確認された図30B。L-Arg濃度の同時の顕著な減少が感染マウスの血清において確認された図30C。これらのデータは、C.ローデンティウムモデルにおけるように、顕著な腸炎症の条件下に、全身アルギンのほぼ完全な枯渇が認められた。iNOSおよびアルギナーゼの対照的な役割:L-Arg追加およびiNOS欠失による臨床パラメータの改善アルギナーゼIおよびiNOSが両方とも結腸炎組織において多量に発現され、L-Argは完全に代謝されたため、われわれは、飲料水中1L-Argの投与の効果を調査した。野生型WTマウスにおいて、C.ローデンティウム結腸炎は、感染後9日も開始した高レベルの死亡を誘発した図31A。L-Argで処置したWT動物において、死亡は、感染後12および14日にそれぞれ、水のみが与えられたマウスと比べ42および62阻害された図31A。Cox回帰分析によって、L-Argで処置したWTマウスは、水のみが与えられたマウスと比べ死亡の31の危険のみを示したp<0.0009。iNOS-/-マウスにおいて、L-Argの有無に関係なく、死亡は確認されなかった図31A。WTマウスにおいて、L-Arg処置は体重喪失を軽減し、L-Argが与えられたiNOS欠乏マウスはさらに改善を示し、実際に感染の存在下に体重を増加した図31B。ここで留意すべきは、依然として生きている動物の体重のみが含まれたため、WTマウスの体重喪失が過小評価であることである。結腸重量は、C.ローデンティウム感染WTマウスでは2倍より多く大幅に増大し図31C、WT-L-ArgおよびiNOS-/-マウスでは、それぞれ、28、および38減少した。iNOS欠失およびL-Arg投与の追加の効果が認められ、結腸重量が68減少した。iNOS欠失でもL-Arg処置でも非感染対照マウスにおける結腸重量に対する影響はなかった。重要なことに、これらの変化は結腸組織学における変化によって密接に対比された図32。結腸炎組織におけるプロ炎症性サイトカインの誘発はL-Arg処置またはiNOS欠乏によって弱化される。C.ローデンティウム結腸炎はTH1サイトカインIFN-γ、および関連プロ炎症性サイトカインTNF-α、およびIL-1の活性化と強く関係があるため30、46、われわれは、われわれがこれらの免疫学的パラメータで確認した臨床と組織学的効果との関係の判定を求めた。リアルタイムPCR分析では、正常な組織と比べC.ローデンティウム結腸炎組織においてIFN-γ図33A、TNF-α図33B、およびIL-1図33Cにおける有意な増大、およびiNOS欠失またはL-Arg処置のいずれかによるこれらの増大の有意な弱化が明らかにされた。ODC活性がC.ローデンティウム感染マウスの結腸において誘発される。アルギナーゼの産物であるオルニチンは、ODCによって代謝され、ポリアミンpolyamainesを形成するため、われわれは、C.ローデンティウム感染WTマウスの結腸におけるODC発現を調査した。リアルタイムPCRによって、われわれは、対照マウスn=4、示さずと比べ感染マウスn=13におけるmRNAレベルの2.5±0.5倍の増大が見出された。しかし、ODC活性の40倍の増大は、感染WTマウスまたはL-Argで処置した感染WTマウスのいずれかの結腸において測定された図34A。この増大は、C.ローデンティウムそのものからのODC活性による可能性は低かったが、それはわれわれが、細菌性ODC活性を測定し、組織中に全ODC活性の1以下を示すことを判明したためである。C.ローデンティウム感染WTマウスにおける結腸ポリアミンの1.8±0.1倍の増大、L-Arg処置により有意な、さらなる2.7±0.2倍の増大が認められ図34B、アルギナーゼ活性がポリアミン合成の重要な決定因子であったことを示した。ポリアミンにおける適度の増大対ODC活性における大幅な増大は、ポリアミンは迅速にアセチル化され、細胞からの流出および分泌をもたらすという事実を反映している可能性が最も高い31。アルギナーゼまたはODC阻害によるC.ローデンティウム結腸炎の悪化アルギナーゼおよびポリアミン形成の有利な効果をさらに明らかにするために、マウスに対し、アルギナーゼおよびODCの阻害剤である、S-2-ボロノエチル-L-システインBECまたは-ジフロロメチルオリニチンDFMOをそれぞれ、飲料水中で与えた。非感染対照マウスにおいて、BBCまたはDFMOは効果を示さなかった表I。しかし、BECまたはDFMOで処置したC.ローデンティウム感染マウスにおける有意な生存の喪失が認められた表9。実際に、実験は、感染後10日に、この時点での死亡および重篤な疾患のため早期に終了されなければならなかった。C.ローデンティウム-BECおよびC.ローデンティウム-DFMO群の結腸は、C.ローデンティウム-水群のものよりも重量および組織学的損傷の大幅な増大を示した表9。水でのみ処置した感染WTマウスと比較した場合、BECおよびDFMO処置マウスの結腸は顕著な貫壁性炎症およびムチン欠失を示したゴベルトGobertAPら、2004年。BEC処置マウスは実質的な粘膜下膿瘍形成を有し、DFMO処置マウスは粘膜および粘膜下出血を示したが、これらはいずれも重篤な急性炎症を示した。BECがiNOS-/-C.ローデンティウム感染マウスに投与されると、結腸は増大し、iNOS-/-のみと比べ、BECは結腸組織学的損傷スコアiNOS-/-:2.42±0.46、n=12、対iNOS-/-BEC:6.44±0.98、n=8、p<0.01および結腸重量iNOS-/-:総体重の0.36±0.01対iNOS-/-BEC:0.92±0.20、p<0.05の有意な悪化をもたらした。これらのデータはさらに、iNOS-/-マウスを保護するNO産生の予防のみではなく、むしろL-Argのアルギナーゼ経路への短絡である証拠を提供する。実施例18.デキストラン硫酸ナトリウムDSS結腸炎モデルこのモデルは、結腸炎のマウスモデルとして一般的に受け入られており、単にDSSを飲料水に添加するだけのため、使用するのにきわめて実用的であるため選択されたモチューMoteauOら、2000年、ウィリアムズWilliamsKLら、2001年、アンドレスAndresPGら、2000年、マーラーMahlerM.ら、1998年、テッサーTesserTGら、1998年。初期実験では、われわれは、2.5~5の文献モチューMoteauOら、2000年、ウィリアムズWilliamsKLら、2001年、アンドレスAndresPGら、2000年、マーラーMahlerM.ら、1998年、テッサーTesserTGら、1998年からの報告された範囲でさまざまな用量を試験し、われわれが4DSSで最も信頼できる反応を得たことがわかった。また、われわれは、十分に生存しているマウスが提供されれば、DSSを水中に6日間含め、次いでそれを除去すること、DSSが長い連続した日数の間、水中に放置された場合、死亡率は高くなりすぎるため、生存したものを容易に分析しうる方法を生存するマウスを十分に得られなかったことがわかった。アルギナーゼI、iNOS、およびiNOS結腸炎の誘発確立され次第、われわれは、本モデルにおける10日の時点でマウスにおけるアルギナーゼおよびiNOS発現を評価した。図35Aに示されているように、C.ローデンティウムモデルにおけるように、アルギナーゼIのアップレギュレーションが認められたが、アルギナーゼIImRNA発現については認められず、iNOSレベルの増大が認められた。われわれは、ウェスタンブロット法図35Bおよび免疫組織化学図36によってタンパク質レベルでのアルギナーゼI発現を確認した。これらのデータと一致して、われわれは、リアルタイムPCRによってアルギナーゼImRNA、および結腸炎組織におけるアルギナーゼ酵素活性の平行の増大を検出したデータは示さず。同様に、ODCmRNAおよび酵素活性における増大が認められたデータは示さず。アルギニン追加またはiNOS欠失によるDSS結腸炎における改善われわれのC.ローデンティウムモデルにおける上記の結果と一致して、さらにiNOS欠失またはL-Arg投与のいずれかによるDSSモデルにおける結腸炎の臨床パラメータの軽減が認められ、L-ArgがiNOS-/-マウスに投与されると、さらに生存、体重、および結腸重量の改善が認められた図37。これらのデータは、結腸組織病理の改善によって対比された図38。プロ炎症性サイトカインIFN-γ、TNF-α、およびIL-1のレベルもDSS結腸炎組織において誘発され図39、C.ローデンティウムモデルにおけるわれわれの所見と同様、レベルは結腸炎の軽減とともにマウスにおいて減少し、それらが疾患重篤度の有用なマーカーであることを示した。留意すべきは、iNOS-/-マウスにおけるレベルはL-Arg処置マウスにおけるほど軽減されなかったことであるが、これは図37および38における10日の体重、結腸重量、および組織学の所見に対応する。総合すれば、これらの所見は、DSSモデルにおいて、アルギナーゼ経路により作用するアルギニン追加が有利であることを示す。ポリアミンレベルはL-ArgおよびiNOS欠失によって増大する興味深いことに、ポリアミンレベルを評価したところ、臨床改善した群における一貫した増大が認められた図40。C.ローデンティウムモデルにおけるように、L-Argの添加はポリアミンレベルを増強した。しかし、C.ローデンティウムと対照的に、L-Argを含まないWTマウスにおけるポリアミの増大は認められず、われわれは、これは、われわれがこれらの組織において確認した酵素スペルミンオキシダーゼおよびスペルミジン/スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼSSATを代謝するポリアミンの誘発によるものであると推測するデータは示さず。結腸炎におけるアルギナーゼ-ODC経路の重要性を裏づける追加のデータDSSモデルにおけるアルキナーゼの保護的役割と一致して、アルギナーゼ阻害剤BECが投与されると、われわれは、WTおよびiNOS-/-マウスにおける結腸炎の臨床および組織学的パラメータの悪化が確認されたデータは示さず。最後に、潰瘍性結腸炎およびクローン病からのヒトIBD組織において、われわれは、アルギナーゼIおよびODCmRNAレベルの増大を確認した図4。マウスとは異なり、アルギナーゼIIにおける増大も認められ、ミトコンドリア酵素もこれらの組織において誘発される。実施例19アポE類似ペプチドはC.ローデンティウム刺激マクロファージにおけるiNOSを阻害する試験を開始し、IBDのモデルに対するアポE類似COGペプチドの考えうる関連性を検証するために、われわれは、それらをC.ローデンティウムで活性化したマウスRAW264.7マクロファージにおいて試験した。われわれは、細菌溶解物を使用し、固有層マクロファージが曝露される可能性ある細菌産物により密接に模倣する。実際に、われわれは、規則的に感染マウスにおける上皮下粘膜において細菌凝集体を確認した図32、高倍率像を参照。意外にも、われわれは、試験した両方のペプチド、すなわちCOG1410、およびCOG133のアンテナぺディア結合形態のCOG4502により、亜硫酸塩NO2ーレベルによって測定される通り、マクロファージ上清中にNO産生の阻害が認められた図42。COG1410については、細胞毒性が5μM以上の濃度で確認され、そこで2μMでのデータのみが示されており、COG4502については、毒性がXTT細胞生存アッセイによって10μMで確認され、そこで毒性が生じない0.1-5μM範囲でのデータが示されている。また、mRNAレベルをCOG4502処置で評価した場合、iNOSmRNA発現の有意な濃度依存阻害が認められた。7.引用文献ここで引用された全ての文献および特許以下のものを含むがこれらの限定されないは、参照によりその全体が本明細書で援用される。Albertsetal1995ApoEgenotypeandsurvivalfromintracerebralhaemorrhageLancet346575Albertsetal1996Stroke27183Amadoretal1963SerumlactatedehydrogenaseactivityananalyticalassessmentofcurrentassaysClinChem93914AonoMLeeYGrantERZivinRAPearlsteinRDWarnerDSBennettERandLaskowitzDTApolipoproteinEprotectsagainstNMDAexcitotoxicityNeurobiolDis1121420AonoMBennettERKimKSLynchJRMyersJPearlsteinRDWarnerDSandLaskowitzDTProtectiveeffectofapolipoproteinEmimeticpeptidesonNmethylDaspartateexcitotoxicityinprimaryratneuronalglialcellculturesNeuroscience11643745AsohSOhsawaIMoriTKatsuraKHiraideTKatayamaYKimuraMOzakiDYamagataKandOhtaSProtectionagainstischemicbraininjurybyproteintherapeuticsPNAS991710717112Avilaetal1982JBiolChem2575900BacqZM1965ChemicalprotectionagainstionizingradiationCharlesCThomasSpringfieldILBalaramandGurunath1994IncorporationofapotentiallyhelixbreakingDPheProsequenceintothecenterofarighthanded16residuepeptidehelixBiochemBiophysResCommun202241BaraboiVABeloshiskiiPVKrasiukANandKorkachVI1994OxygendependentprocessesintheirradiatedorganismsFiziolZh40116-128Bartetal1998RegionalcerebralbloodflowinapolipoproteinEdeficientmiceandwildtypemiceduringfocalcerebralischemiaNeuroReport926152620Bellostaetal1995StableexpressionandsecretionofapolipoproteinsE3andE4inmouseneuroblastomacellsproducesdifferentialeffectsonneuriteoutgrowthJBiolChem2702706327071BenNathanDPadgettDALoriaRM1999AndrostenediolanddehydroepiandrosteroneprotectmiceagainstlethalbacterialinfectionsandlipopolysaccharidetoxicityJMedMicrobiol1999May4842531BenvenisteEN1997RoleofmacrophagesmicrogliainmultiplesclerosisandexperimentalallergicencephalomyelitisJMolMed7516573Bolinetal2000PeptideandpeptidemimeticinhibitorsofantigenpresentationbyHLADRclassIIMHCmoleculesDesignstructureactivityrelationshipsandXraycrystalstructuresJMedChem43213548Bacskaietal2000TheendocyticreceptorproteinLRPalsomediatesneuronalcalciumsignalingviaNmethylDaspartatereceptorsProcNatlAcadSci971155111556BargerandHarmon1997Nature388878Bartetal1998RegionalcerebralbloodflowinapolipoproteinEdeficientvswildtypemiceundergoingmiddlecerebralarteryocclusionNeuroreport1126152620Belletal1994UpregulationofthemacrophagescavengerreceptorinresponsetodifferentformsofinjuryintheCNSJNeurocytol2360513Berlineretal1995Circulation912488Bietal2002Uptakeandpathogeniceffectsofamyloidbetapeptide142areenhancedbyintegrinantagonistsandblockedbyNMDAreceptorantagonistsNeuroscience11282740Bietal2002NmethylDaspartatereceptorsubunitNR2AandNR2BmessengerRNAlevelsarealteredinthehippocampusandentorhinalcortexinAlzheimersdiseaseJNeurolSci200118BiakovVMandStepanovSV1997MechanismofprimaryradiobiologicactionRadiatBiolRadioecol37469-474BocchiniVRMazzollaRBarluzziEBlasiPSickandHKettenmannAnimmortalizedcelllineexpressespropertiesofactivatedmicroglialcellsJNeurosciRes31616-621BogoyevitchMAKendrickTSNgDCHandBarrRKTakingthecellbystealthorstormProteintransductiondomainsasversatilevectorsfordeliveryDNAandCellBiology21879894BoltonSJJonesDNCDarkerJGEgglestonDSHunterJandWalshFSCellularuptakeandspreadofthecellpermeablepeptidepenetratininadultratbrainEuropeanJournalofNeuroscience1228472855BrainInjuryAssociationofAmericaBrainInjuryFactSheethttpwwwbiausaorgwordfilestopdfgoodpdfs2002FactSheetBrainInjurypdfBreitneretal1995NeurobiolAging16523Brodericketal2001ApolipoproteinEphenotypeandtheefficacyofintravenoustissueplasminogenactivatorinacuteischemicstrokeAnnNeurol49736744CentersforDiseaseControlandPreventionTraumaticbraininjuryintheUnitedStatesUnpublisheddatafromtheNationalCenterforInjuryPreventionandControlMay1998CaoGWPeiHGeQLiangYLuoFRSharpALuRRanSHGrahamandChenJInvivodeliveryofaBclxLfusionproteincontainingtheTATproteintransductiondomainprotectsagainstIschemicBrainInjuryandNeuronalApoptosisSocietyofNeuroscience2254235431Cady2001UnderstandingopioidtoleranceincancerpainOncolNursForum2815618Calabresi2002ConsiderationsinthetreatmentofrelapsingremittingmultiplesclerosisNeurology58S1022CentersforDiseaseControlandPreventionReporttoCongressonMildTraumaticBrainInjuryintheUnitedStatesStepstoPreventaSeriousPublicHealthProblemSeptember2003Chapmanetal1999PreliminaryobservationsonAPOEepsilon4alleleandprogressionofdisabilityinmultiplesclerosisArchNeurol5614841487ChapmanJVinokurovSAchironAKarussisDMMitosekSzewczykKBirnbaumMMichaelsonDMKorczynAD2001APOEgenotypeisamajorpredictoroflongtermprogressionofdisabilityinMSNeurology563126Chenetal1997MotorandcognitivedeficitsinapolipoproteinEdeficientmiceafterclosedheadinjuryNeuroscience8012551262Chenetal2002NacylLphenylalaninederivativesaspotentVLA4antagoniststhatmimicacyclicpeptideconformationBioorgMedChemLett1213740ChesnutetalRehabilitationfortraumaticbraininjuryEvidencereportno2RockvilleMDAgencyforHealthCarePolicyandResearchFebruary1999Chensueetal1991AmJPathol138395402ChiangCSHongJHStalderASunJRWithersHRMcBrideWH1997DelayedmolecularresponsestobrainirradiationIntJRadiatBiol1997Jul724553ColemanNBumpEKramerRChemicalmodifiersofcancertreatment1988JClinOncol6709733Clifford2002AIDSdementiaMedClinNorthAm8653750viCohenetal1992InteractionoflactoferrinandlipopolysaccharideeffectsontheantioxidantpropertyoflactoferrinandtheabilityofLPStoprimehumanneutrophilsforenhancedsuperoxideformationJInfectDis16613751378Connollyetal1996Stroke27174ClodiandYounes1997ReedSternbergcellsandtheTNFfamilyofreceptorsligandsLeukLymphoma27195205ColtonCABrownCMCookDNeedhamLKXuQCzapigaMSaundersAMSchmechelDERasheedKandVitekMPAPOEandtheregulationofmicroglialnitricoxideproductionalinkbetweengeneticriskandoxidativestressNeurobiologyofAging2377785ConsoleSMartyCGarciaEcheverriaCSchwendenerRandBallmerHoferRAntennapediaandHIVTATproteintransductiondomainspromoteendocytosisofhighMrcargouponbindingtocellsurfaceglycosaminoglycansJBiolCheminpressCorderetal1993GenedosesofapolipoproteinEtype4alleleandtheriskofAlzheimersdiseaseinlateonsetfamiliesScience261921923CrawfordFCVanderploegRDFreemanMJSinghSWaismanMMichaelsLAbdullahLWardenDLipskyRSalazarAMullanMJ2002APOEgenotypeinfluencesacquisitionandrecallfollowingtraumaticbraininjuryNeurology5811158Crawley2000WhatswrongwithmymouseBehavioralphenotypingoftransgneicandknockoutmiceDailetal1981ResponsestocorticalinjuryIIWidespreaddepressionoftheactivityofanenzymeincortexremotefromafocalinjuryBrainRes21179-89DenicourtCandDowdySFProteintransductiontechnologyoffersnoveltherapeuticapproachforbrainischemiaTrendsinPharmacologicalSciences24216218DietzGPHKilicEandBahrMInhibitionofneuronalapoptosisinvitroandinvivoUsingTATmediatedproteintransductionMolecularandCellularNeuroscience212937deBontNNeteaMGDemackerPNVerschuerenIKullbergBJvanDijkKWvanderMeerJWStalenhoefAF1999ApolipoproteinEknockoutmicearehighlysusceptibletoendotoxemiaandKlebsiellapneumoniaeinfectionJLipidRes1999Apr406805DiScalaetal1997ChildrenhospitalizedfortraumaticbraininjurytransitiontopostacutecareJHeadTraumaRehabil12110Doig2002RecentAdvancesinhelixcoiltheoryBiophysChem101102281Doigetal1994DeterminationoffreeenergiesofNcappinginalphahelicesbymodificationoftheLifsonRoighelixcoiltheorytoincludeNandCcappingBiochemistry333396DoigandBaldwin1993NandCcappingpreferencesforall20aminoacidsinalphahelicalpeptidesProteinSci41325DhibJalbut2002MechanismsofactionofinterferonsandglatirameracetateinmultiplesclerosisNeurology58S39Doble1999TheroleofexcitotoxicityinneurodegenerativediseaseimplicationsfortherapyPharmacolTher81163221DrinGSCottinEBlancARReesandTemsamaniJStudiesontheinternalizationmechanismofcationiccellpenetratingpeptidesTheJournalofBiologicalChemistryInpressDragaricIGandDragaricZD1971Theradiationchemistryofwaterpp256AcademicPressNewYorkDunlopetal1997HIVdementiaandapolipoproteinEActaNeurolScand953158Dyeretal1991JBiolChem26615009Ernstetal2002Designofaproteinsurfaceantagonistbasedonalphahelixmimicryinhibitionofgp41assemblyandviralfusionAngewChemIntEdEngl4127881EdgingtonandCurtiss1981CancerRes413786EngLFGhirnikarRSLeeYL1996InflammationinEAEroleofchemokinecytokineexpressionbyresidentandinfiltratingcellsNeurochemRes2151125FazekasFStrasserFuchsSKolleggerHBergerTKristoferitschWSchmidtHEnzingerCSchiefermeierMSchwarzCKornekBReindlMHuberKGrassRWimmerGVassKPfeifferKHHartungHPSchmidtR2001ApolipoproteinEepsilon4isassociatedwithrapidprogressionofmultiplesclerosisNeurology578537FeinsteinDLGaleaEGavrilyukVBrosnanCFWhitacreCCDumitrescuOzimekLLandrethGEPershadsinghHAWeinbergGHenekaMT2002PeroxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaagonistspreventexperimentalautoimmuneencephalomyelitisAnnNeurol51694702Feeneyetal1981ResponsestocorticalinjuryIMethodologyandlocaleffectsofcontusionsintheratBrainRes21167-77FisherPMEKrauszDPLane2001CellulardeliveryofimpermeableeffectormoleculesintheformofconjugateswithpeptidescapableofmediatingmembranetranslocationBioconjugateChemistry12825841FikeJRCannCETurowskiKHigginsRJChanASPhillipsTLDavisRL1988RadiationdoseresponseofnormalbrainIntJRadiatOncolBiolPhys1988Jan146370FlegelWABaumstarkMWWeinstockCBergANorthoffH1993PreventionofendotoxininducedmonokinereleasebyhumanlowandhighdensitylipoproteinsandbyapolipoproteinAIInfectImmun1993Dec6151406Flemingetal1996DifferentialbindingofapolipoproteinEisoformstotauandothercytoskeletalproteinsExpNeurol138252260Friedmanetal1999ApolipoproteinEepsilon4genotypepredictsapooroutcomeinsurvivorsoftraumaticbraininjuryNeurology52244248Fotouhietal2000ThedesignandsynthesisofpotentcyclicpeptideVCAMVLA4antagonistsincorporatinganachiralAspPromimeticBioorgMedChemLett1011713FutakiSArgininerichpeptidespotentialforintracellulardeliveryofmacromoleculesandthemysteryofthetranslocationmechanismsInternationalJournalofPharmaceutics24517Farberetal2002AntiepilepticdrugsandagentsthatinhibitvoltagegatedsodiumchannelspreventNMDAantagonistneurotoxicityMolPsychiatry772633Fazioetal1997ProcNatlAcadSci944647Flahertyetal1999RegulationoftauphosphorylationinmicrotubulefractionsbyapolipoproteinEJNeurosciRes562714GarciaEcheverriaCJiangLRamseyTMSharmaSKandChenY-NPAnewAntennapediaderivedvectorforintracellulardeliveryofexogenouscompoundsBioorganicMedicinalChemistryLetters1113631366GarciaEcheverriaCandRuetzSβHomolysineoligomersanewclassofTrojancarriersBioorganicMedicinalChemistryLetters13247251GaffinSLWellsMJordanJP1985AntilipopolysaccharidetoxintherapyforwholebodyXirradiationoverdoseBrJRadiol1985Sep588814GirinskyTAMPallardyEComoyTBenassiRRogerGGanemJMCossetGSocieandHMagdelenat1994PeripheralbloodcorticotropinreleasingfactoradrenocorticotropichormoneandcytokinelevelsafterhighandlowdosetotalbodyirradiationinhumansRadiatRes139360363Galloetal1994PotentialroleofapolipoproteinEinfibrillogenesisAmJPathol145526530Gotschalletal1995ComparisonofthreemeasuresofinjuryseverityinchildrenwithtraumaticbraininjuryJNeurotrauma12611-619Grubbsetal2001RingclosingmetathesisofolefinicpeptidesDesignSynthesisandStructuralcharacterizationofmacrocyclichelicalpeptidesJOrgChem665291Gutmanetal1997ApolipoproteinEbindstoandpotentiatesthebiologicalactivityofciliaryneurotrophicfactorJNeurosci1761146121Gehrmennetal1995MicrogliaintrinsicimmuneffectorcellofthebrainBrainResBrainResRev2026987Giulianetal1996JNeuroscience163139Griffinetal1995JNeuropathExpNeurol54276GrubbsRHBlackwellHESadowskyJDHowardRJSampsonJNChaoJASteinmetzWEandOLearyDJ2001RingclosingmetathesisofolefinicpeptidesDesignSynthesisandStructuralcharacterizationofmacrocyclichelicalpeptidesJOrgChem665291HallEJ2000RadiobiologyfortheRadiologistLippincottWilliamsandWilkins5theditionp138Hammetal1994TheRotarodTestAnEvaluationOfItsEffectivenessInAssessingMotorDeficitsFollowingTraumaticBrainInjuryJNeurotrauma11187196Hamiltonetal2003DesignandapplicationofanalphahelixmimeticscaffoldbasedonanOligoamidefoldamerstrategyAntagonismoftheBakBH3BclxLcomplexAngewChemIntEd42535Hamiltonetal2002DesignofaproteinsurfaceantagonistbasedonalphahelixmimicryInhibitionofgp41assemblyandviralfusionAngewChemIntEd41278Hamiltonetal2001TowardsproteomimeticsterphenylderivativesasstructuralandfunctionalmimicsofextendedregionsofanalphahelixJAmerChemSoc1235382Hayeketal1994IncreasedplasmaandlipoproteinlipidperoxidationinapoEdeficientmiceBiochemBiophysResCommun20115671574HeberKatzE1993TheupsanddownsofEAEIntRevImmunol927785HemmerBArchelosJJHartungHP2002NewconceptsintheimmunopathogenesisofmultiplesclerosisNatRevNeurosci3291301HillGRCrawfordJMCookeKRBrinsonYSPanLFerraraJL1997TotalbodyirradiationandacutegraftversushostdiseasetheroleofgastrointestinaldamageandinflammatorycytokinesBlood1997Oct1590320413HillRPHPRodemannJHHendrySARobertsandMSAnscher2001NormaltissueradiobiologyFromthelaboratorytotheclinicIntJRadiationOncologyBiolPhys49353-365HongJHChiangCSCampbellILSunJRWithersHRMcBrideWH1995InductionofacutephasegeneexpressionbybrainirradiationIntJRadiatOncolBiolPhys1995Oct153361926Hirschmannetal1996SynthesisofPotentCyclicHexapeptideNK1AntagonistsUseofaMinilibraryinTransformingaPeptidalSomatostatinReceptorLigandintoanNK1ReceptorLigandviaaPolyvalentPeptidomimeticJMedChem3924412448Holtzmanetal1995LowdensitylipoproteinreceptorrelatedproteinmediatesapolipoproteinEdependentneuriteoutgrowthinacentralnervoussystemderivedneuronalcelllineProcNatlAcadSciUSA9294809484Horsburghetal1999IncreasedneuronaldamageinapolipoproteinEdeficientmicefollowingglobalischaemiaNeuroreport10837841Horsburghetal2000IntraventricularinfusionofapolipoproteinEamelioratesacuteneuronaldamageafterglobalcerebralischemiainmiceJCerebralBloodFlowMetab20458462Horsburghetal1999IncreasedneuronaldamageinapolipoproteinEdeficientmicefollowingglobalischaemiaNeuroreport10837841Hansson1994BasicResCardiol8941Harrisetal1998Hepatol27134148Harrisetal1993JClinInvest91102834HarrisHWGrunfeldCFeingoldKRRappJH1990HumanverylowdensitylipoproteinsandchylomicronscanprotectagainstendotoxininduceddeathinmiceJClinInvest1990Sep86696702Haugheyetal2001HIV1TatthroughphosphorylationofNMDAreceptorspotentiatesglutamateexcitotoxicityJNeurochem7845767Hendersonetal1996MicrobiolRev6031634HoltzmanetalLowdensitylipoproteinreceptorrelatedproteinmediatesapolipoproteinEdependentneuriteoutgrowthinacentralnervoussystemderivedneuronalcelllineProcNatlAcadSci9294809484HensleyMLLMSchuchterCLindleyNLMeropolGICohenGBroderWJGradisharDMGreenRJLangdonRBMitchellRNegrinTPSzatrowskiJTThigpenDVonHoffTHWassermanEPWinerDGPfisterfortheAmericanSocietyofClinicalOncology1999AmericanSocietyofClinicalOncologyClinicalPracticeGuidelinesfortheUseofChemotherapyandRadiotherapyProtectantsJClinOncol1733333355HiguchiYGANelsonMVazquezDTLaskowitzJMSlaterandRDPearlstein2002ApolipoproteinEexpressionandbehavioraltoxicityofhighchargehighenergyparticleradiationJRadiatRes43S219S224Huangetal2001ApolipoproteinEfragmentspresentinAlzheimersDiseasebrainsinduceneurofibrillarytanglelikeintracellularinclusionsinneuronsProcNatlAcadSciUSA911118311186Huettingeretal1988CharacteristicsofchylomicronremnantuptakeintoratliverClinBiochem218792Innerarityetal1979JBiolChem25441864190Innerarityetal1983ThereceptorbindingdomainofhumanapolipoproteinEbindingofapolipoproteinEfragmentsJBiolChem2581234147Jordanetal1997ApolipoproteinEepsilon4associatedwithchronictraumaticbraininjuryinboxingJAmMedAssoc278136140Jonesetal2002AttenuationofacutemorphinewithdrawalintheneonatalratbythecompetitiveNMDAreceptorantagonistLY2359592002Neuropsychopharmacology2630110Jordanetal1998IsoformspecificeffectofapolipoproteinEoncellsurvivalandbetaamyloidinducedtoxicityinrathippocampalpyramidalneuronalculturesJNeurosci18195204JosephJASEratandBMRabin1998CNSeffectsofheavyparticleirradiationinspacebehavioralimplicationsAdvSpaceRes22209216Karle2001ControlsexertedbytheAibresidueHelixformationandHelixreversalBiopolymers60351KarleandBalaram1990StructuralcharacteristicsofalphahelicalpeptidemoleculescontainingAibresiduesBiochemistry296747KilicUKilicEDietzGPHandBahrMIntravenousTATGDNFisprotectiveafterfocalcerebralischemiainmiceStroke3413041310Knouffetal1999ApoEstructuredeterminesVLDLclearanceandatherosclerosisriskinmiceJClinInvest103157986Krausetal1990BraininjuriesamonginfantschildrenadolescentsandyoungadultsAJDC144684-691Kimetal1996HumanapolipoproteinEreceptor2JBiolChem27183738380KlopmanandSedykh2002AnMCASEapproachtothesearchofacureforParkinsonsDiseaseBMCPharmacol28Kolkeretal2002NMDAreceptoractivationandrespiratorychaincomplexVinhibitioncontributetoneurodegenerationind2hydroxyglutaricaciduriaEurJNeurosci16218KoppelhusUAwasthiSKZacharVHolstHUEbbsenPNielsonPECelldependentdifferentialcellularuptakeofPNApeptidesandPNApeptideconjugatesAntisenseNucleicAcidDrugDev125163Kotlinska2001NMDAantagonistsinhibitthedevelopmentofethanoldependenceinratsPolJPharmacol534750KriegerandHerz1994StructuresandfunctionsofmultiligandlipoproteinreceptorsmacrophagescavengerreceptorsandLDLreceptorrelatedproteinAnnRevBiochem6360137Kudoetal2001AbsenceofdirectantioxidanteffectsfromvolatileanestheticsinmixedneuronalglialcultureAnesthesiology94303312Laskowitzetal2000AlteredimmuneresponsesinapolipoproteinEdeficientmiceJLipidRes41613620Laskowitzetal1998bApolipoproteinEandtheCNSresponsetoinjuryJCerebralBloodFlowMetab18465471LaskowitzandRoses1998aApolipoproteinEanexpandingroleintheneurobiologyofdiseaseAlzheimersReports1512Laskowitzetal2001DownregulationofmicrogliaactivationbyapolipoproteinEandapoEmimeticpeptidesExptNeurol1677485Laskowitzetal1997aApolipoproteinEdeficientmicehaveincreasedsusceptibilitytofocalcerebralischemiaJCerebBloodFlowMetab17753758Laskowitzetal1997cEndogenousapolipoproteinEsuppressesLPSstimulatedmicroglialnitricoxideproductionNeuroreport9615618Laskowitzetal1997bApolipoproteinEsuppressesglialcellsecretionofTNFαJNeuroimmunology767074LiefertJAandWhittonJLTranslocatoryproteinsandproteintransductiondomainsacriticalanalysisoftheirbiologicaleffectsandtheunderlyingmechanismsMolecularTherapy81319LindsayMAPeptidemediatedcelldeliveryapplicationinproteintargetvalidationCurrentOpinionsinPharmacology2587594LoEHSinghalABTorchlinVPandAbbottNJDrugdeliverytodamagedbrainBrainResearchReviews38140148LomnitskiLChapmanSHochmanAKohenRShohamiEChenYTrembovlerVandMichaelsonDMAntioxidantmechanismsinapolipoproteinEdeficientmicepriortoandfollowingclosedheadinjuryBiochimBiophysActa145335968LendonetalNoeffectofapolipoproteinEonneuronalcelldeathduetoexcitotoxicandapoptoticagentsinvitroandneonatalhypoxicischaemiainvivoEuroJNeurosci1222352242Lighthall1988ControlledcorticalimpactanewexperimentalbraininjurymodelJNeurotrauma51-15LintonetalPhenotypesofapolipoproteinBandapolipoproteinEafterlivertransplantationJClinInvest27081LintonetalScience2671034Lintonetal1997PhenotypesofapolipoproteinBandapolipoproteinEafterlivertransplantationJClinInvest270281Liuetal2000SynthesisofaSubstancePAntagonistwithaSomatostatinScaffoldFactorsAffectingAgonismAntagonismatGPCRsandtheRoleofPseudosymmetryJMedChem4338273831LucotteGLFrenchMSConsortium2002Confirmationofageneformultiplesclerosistochromosomeregion19q133GenetCouns131338Lynchetal2001aApolipoproteinEmimeticpeptideisneuroprotectiveinamurineheadinjurymodelSocNeuroscienceAbstractsLynchetal2001bApolipoproteinEmodulatesglialactivationandtheendogenouscentralnervoussysteminflammatoryresponseJNeuroimmunology114107113Lynchetal2002ApolipoproteinEaffectstheCentralNervousSystemResonsetoInjuryandtheDevelopmentofCerebralEdemaAnnNeurol511137LynchTangetal2003ApoEgenotypeandanapoEmimeticpeptidemodifythesystemicandCNSinflammatoryresponseJBiolChemepubaheadofprintLalazaretal1998SitespecificmutagenesisofhumanapolipoproteinEReceptorbindingactivityofvariantswithsingleaminoacidsubstitutionsJBiolChem26335423545LeandLipton2001PotentialandcurrentuseofNmethylDaspartatereceptorantagonistsindiseasesofagingDrugsAging1871724Lendonetal2000NoeffectofapolipoproteinEonneuronalcelldeathduetoexcitotoxicandapoptoticagentsinvitroandneonatalhypoxicischaemiainvivoEuroJNeurosci1222352242Lintonetal1995Science2671034LynnWAandJCohen1995AdjunctivetherapyforsepticshockareviewofexperimentalapproachesClinInfectDis20143-158Lovestoneetal2001ApolipoproteinEgeneandAlzheimersdiseaseistauthelinkBiochemSocSymp11120LundbergMandJohanssonPositivelychargedDNAbindingproteinscauseapparentcellmembranetranslocationBiochemViophysResComm291367371MaiJCShenHWatkinsSCChengTandRobbinsPDEfficiencyofproteintransductioniscelltypedependentandisenhancedbydextransulfateTheJournalofBiologicalChemistry2773020830218MandellLRSteinherzPFuksZ1990DelayedcentralnervoussystemradiationinchildhoodCNSacutelymphoblasticleukemiaResultsofapilottrialCancer1990Aug16644750MastermanTZhangZHellgrenDSalterHAnvretMLiliusLLannfeltLHillertJ2002APOEgenotypesanddiseaseseverityinmultiplesclerosisMultScler898103MatthewsandBeal1996Increased3nitrotyrosineinbrainsofApoEdeficientmiceBrainRes718181184McArronetal1998TheapolipoproteinEepsilon4alleleandoutcomeincerebrovasculardiseaseStroke2918821887Misraetal2001ApolipoproteinEandmimeticpeptideinitiateacalciumdependentsignalingresponseinmacrophagesJLeukocyteBiol70677683MitchellandSmith2003DaminoacidresiduesinpeptideandproteinsProteins50563MiyataandSmith1996ApolipoproteinEallelespecificantioxidantactivityandeffectsoncytotoxicitybyoxidativeinsultsandbetaamyloidpeptidesNatGenet145561Morris1984DevelopmentsofawatermazeprocedureforstudyingspatiallearningintheratJNeurosciMethods114760MossmanKLFrequentshorttermoralcomplicationsofheadandneckradiotherapy1994EarNoseThroatJ73316320Mulleretal1998ApolipoproteinEisoformsincreaseintracellularCa2differentiallythroughaomegaagatoxinIVasensitiveCa2channelBrainPathology8641653Matsubaraetal2002MonoclonalantibodiesagainstinflammatorymediatorsforthetreatmentofpatientswithsepsisNipponRinsho6057884Mayeuxetal1995Neurology45555McArronetalTheapolipoproteinEepsilon4alleleandoutcomeincerebrovasculardiseaseStroke2918821887McGeeretal1993Glia788McKennaandMelzack2001BlockingNMDAreceptorsinthehippocampaldentategyruswithAP5producesanalgesiaintheformalinpaintestExpNeurol172929Meldrumetal1990ExcitatoryaminoacidneurotoxicityandneurodegenerativediseaseTrendsPharmacolSci11379387Misraetal1994Therelationshipbetweenlowdensitylipoproteinrelatedproteinalpha2macroglobulinreceptorsandthenewlydescribedalpha2MsignalingreceptorJBiolChem269183036Miyazawaetal1991LactoferrinlipopolysaccharideinteractionsEffectoflactoferrinbindingtomonocytemacrophagedifferentiatedHL60cellsJImmunol146723729Moulderetal1999AnalysisofanovelmechanismofneuronaltoxicityproducedbyanapolipoproteinEderivedpeptideJNeurochem7210691080Myersetal1997HelixpropensitiesareidenticalinproteinsandpeptidesBiochemistry361092310929Mytilineouetal1997LdeprenylprotectsmesencephalicdopamineneuronsfromglutamatereceptormediatedtoxicityinvitroJNeurochem68339NairCKDKParidaandTJNomura2001RadioprotectorsinradiotherapyRadiatRes422137NeteaMGdeBontNDemackerPNKullbergBJJacobsLEVerverJansenTJStalenhoefAFVanderMeerJW1998LipoproteininhibitslipopolysaccharideinducedtumornecrosisfactoralphaproductionbyhumanmononuclearcellsInfectImmun1998May6623657NIAIDWhtePaperNIAIDExpertPanelReviewonRadiobiologicalResearch26Feb2003Nathanetal1994DifferentialeffectsofapolipoproteinsE3andE4onneuronalgrowthinvitroScience264850852NIHConsensusStatementRehabilitationofPersonswithTraumaticBrainInjury1998NIHReportoftheConsensusDevelopmentConferenceontheREHABILITATIONOFPERSONSWITHTRAUMATICBRAININJURYhttpwwwnichdnihgovpublicationspubstraumaticNIHConsensusStatementhtmNewmanetal1995AnnThoracSurg591326Nguimfack2002DotheglutamateexcitotoxicitytheoryandpotentialfreeradicalsimplicationinschizophreniaaetiopathogenesisprovideanewenlightenmenttolinksbetweengenomeenvironmentandbiologyinthedeterminismofthatdisorderEncephale2814753Nicolletal1995NatMed1135Novaketal1996Anewlowdensitylipoproteinreceptorhomologuewith8bindingligandrepeatsinbrainofchickenandmouseJBiolChem2711173211736Olsonetal1993PerspectiveConceptsandProgressintheDevelopmentofPeptideMimeticsJMedChem3630393049Olsonetal1995PeptideMimeticsofThyrotropinReleasingHormoneBasedonaCyclohexaneFrameworkDesignSynthesisandCognitionEnhancingPropertiesJMedChem3828662879Orneretal2001TowardproteomimeticsterphenylderivativesasstructuralandfunctionalmimicsofextendedregionsofanalphahelixJAmChemSoc12353823PaulandBolton2002ModulationofbloodbrainbarrierdysfunctionandneurologicaldeficitsduringacuteexperimentalallergicencephalomyelitisbytheNmethylDaspartatereceptorantagonistmemantineJPharmacolExpTher302507Pearlsteinetal1998NeuroprotectiveeffectsofNMDAreceptorglycinerecognitionsiteantagonismdependenceonglycineconcentrationJNeurochem7020122019PenderMPWolfeNP2002PreventionofautoimmuneattackanddiseaseprogressioninmultiplesclerosiscurrenttherapiesandfutureprospectsInternMedJ3255463Perezetal2001EvaluationofHIV1TatinducedneurotoxicityinratcorticalcellcultureJNeurovirol7110Pescaroloetal2001Aretroinversopeptidehomologoustohelix1ofcMycisapotentandspecificinhibitorofproliferationindifferentcellularsystemsFASEBJ15313ParkerTSLevineDMChangJCLaxerJCoffinCCRubinAL1995ReconstitutedhighdensitylipoproteinneutralizesgramnegativebacteriallipopolysaccharidesinhumanwholebloodInfectImmun1995Jan632538PoirierJ1994ApolipoproteinEinanimalmodelsofCNSinjuryandAlzheimersdiseaseTrendsNeurosci17525530PradhanDSNairCKKandSreenivasanA1973RadiationinjuryrepairandsensitizationofmicroorganismsProcIndNatlSciAcad39B516-530RedlichCAGaoXRockwellSKelleyMEliasJA1996IL11enhancessurvivalanddecreasesTNFproductionafterradiationinducedthoracicinjuryJImmunol1996Aug15157170510Raoetal2001NeuroprotectionbymemantineanoncompetitiveNMDAreceptorantagonistaftertraumaticbraininjuryinratsBrainRes91196100Regneretal2001NeurochemicalcharacterizationoftraumaticbraininjuryinhumansJNeurotrauma1878392Rensenetal1997HumanrecombinantapolipoproteinEredirectslipopolysaccharidefromKupffercellstoliverparenchymalcellsinratsinvivoJClinInvest99243845RichardJPMelikovKVivesERamosCVerbeureBGaitMJChernomordikLVandLebleuBCellpenetratingpeptidesAreevaluationofthemechanismofcellularuptakeTheJournalofBiologicalChemistry278585590RousselleCClairPLefauconnierJKaczorekMScherrmannJandTemsamaniJNewadvancesinthetransportofdoxorubicinthroughthebloodbrainbarrierbyapeptidevectormediatedstrategyMolecularPharmacology57679686RousselleCSmirnovaMClairPLefauconnierJChavanieuACalasBScherrmannJandTemsamaniJEnhanceddeliveryofdoxorubicinintothebrainviaapeptidevectormediatedstrategysaturationkineticsandspecificityTheJournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics296124131RousselleCClairPSmirnovaMKolesnikovYPasternakGWGacBretonSReesARScherrmannJandTemsamaniJImprovedbrainuptakeandpharmacologicalactivityofdalarginusingapeptidevectormediatedstrategyTheJournalofPharmacologyandExperimentalherapeutics36371376Rogersetal1993Neurology431609RothwellandRelton1993CerebrovascBrainMetabRev5178RoselaarSEDaughertyA1998ApolipoproteinEdeficientmicehaveimpairedinnateimmuneresponsestoListeriamonocytogenesinvivoJLipidRes1998Sep3917403RosesADandAMSaunders1998ApoEAlzheimersdiseaseandrecoveryfrombrainstressAnnNYAcadSci826200212SchmidtSBarcellosLFDeSombreKRimmlerJBLincolnRRBucherPSaundersAMLaiEMartinERVanceJMOksenbergJRHauserSLPericakVanceMAHainesJLMultipleSclerosisGeneticsGroup2002AssociationofpolymorphismsintheapolipoproteinEregionwithsusceptibilitytoandprogressionofmultiplesclerosisAmJHumGenet7070817Shengetal1999aCharacterizationofarecoveryglobalischemiamodelinthemouseJNeurosciMethods88103109Shengetal1999aCharacterizationofarecoveryglobalischemiamodelinthemouseJNeurosciMethods88103109Shengetal1998ApolipoproteinEisoformspecificdifferencesinoutcomefromfocalischemiaintransgenicmiceJCerebBloodFlowMetab18361366Shengetal1999bApolipoproteinEdeficiencyworsensoutcomefromglobalcerebralischemiainthemouseStroke3011181124ScholesG1983RadiationeffectsonDNATheSilvanusThomsonmemoriallectureApril1982BrJRadiol56221-231SchuchterLMGlickJTheCurrentstatusofWR2721Achemotherapyandradiationtherapyprotector1993BiologicTherCancer3110SkeltonRWBukachCMLauranceHEThomasKGandJacobsJWHumanswithtraumaticbraininjuriesshowplacelearningdeficitsincomputergeneratedvirtualspaceJClinExpNeuropsychol2215775Slooteretal1997ApolipoproteinEepsilon4andtheriskofdementiawithstrokeApopulationbasedinvestigationJAmMedAssoc277818821Smithetal1995AmodelofparasagittalcontrolledcorticalimpactinthemousecognitiveandhistopathologiceffectsJNeurotrauma12169-78Smithetal1997AnOrallyBioavailablePyrrolinoneInhibitorofHIV1ProteaseComputationalAnalysisandXRayStructureoftheEnzymeComplexJMedChem4024402444Smithetal1998DesignSynthesisandEvaluationofaPyrrolinonepeptideHybridLigandfortheClassIIMHCProteinHLADR1JAmChemSoc1201270412705Smithetal2000DesignSynthesisandEvaluationofaPyrrolinoneBasedMatrixMetalloproteaseInhibitorOrgLett238093812Strittmatteretal1994IsoformspecificinteractionsofapolipoproteinEwithmicrotubuleassociatedproteintauimplicationsforAlzheimerdiseaseProcNatlAcadSciUSA911118311186Strittmatteretal1993ApolipoproteinEhighaviditybindingtobetaamyloidandincreasedfrequencyoftype4alleleinlateonsetfamilialAlzheimerdiseaseProcNatlAcadSciUSA9019771981Schieferetal2002RiluzoleprolongssurvivaltimeandaltersnuclearinclusionformationinatransgenicmousemodelofHuntingtonsdiseaseMovDisord1774857Schiefermeieretal2000ApolipoproteinEpolymorphismSurvivalandneurologicaloutcomeaftercardiopulmonaryresuscitationStroke2120682071SchwarzeSRHoAVoceroAkbaniAandDowdySFInvivotransductiondeliveryofabiologicallyactiveproteinintothemouseScience28515691572SchwarzeSRandDowdySFInvivoproteintransductionintracellulardeliveryofbiologicallyactiveproteinscompoundsandDNATrendsPharmacolSci214548Seligeretal1997NeurologypageA213Shengetal1994JNeurochem631872Shengetal1999ApolipoproteinEdeficiencyworsensoutcomefromglobalischemiainthemouseStroke3011181123ShengHDTLaskowitzEBennettDESchmechelRDBartAMSaundersRDPearlsteinADRosesandDSWarner1998ApolipoproteinEisoformspecificdifferencesinoutcomefromfocalischemiaintransgenicmiceJCerebBloodFlowMetab18361366ShengHDTLaskowitzRDPearlsteinandDSWarner1999aCharacterizationofarecoveryglobalischemiamodelinthemouseJNeurosciMethods88103109ShengHDTLaskowitzGBMackensenMKudoRDPearlsteinandDSWarner1999bApolipoproteinEdeficiencyworsensoutcomefromglobalcerebralischemiainthemouseStroke3011181124ShukittHaleBGCasadesusJJMcEwenBMRabinandJAJoseph2000Spatiallearningandmemorydeficitsinducedbyexposuretoiron56particleradiationRadiatRes1542833Sorbietal1996Neurology46A307Sorbietal1995ApoEasaprognosticfactorforposttraumaticcomaNatMed1852Soykaetal2000NMDAreceptorchallengewithdextromethorphansubjectiveresponseneuroendocrinologicalfindingsandpossibleclinicalimplicationsJNeuralTransm10770114StollandMueller1986NeurosciLett72233Stolletal1989Glia2170Strittmatteretal1993Apolipoproteineepsilon4alleledistributionsinlateonsetalzheimersdiseaseandinotheramyloidformingdiseasesProcNatlAcadSciUSA90197781SuzukiTFutakiSNiwaMTanakaSUedoKandSugiuraYPossibleexistenceofcommoninternalizationmechanismsamongArgininerichpeptidesTheJournalofBiologicalChemistry27724372443TakahashiSXZSunYKubotaNTakaiandKNojima2002HistologicalandelementalchangesinratbrainafterlocalirradiationwithcarbonionbeamsJRadiatRes43143152TakeshimaKChikushiALeeKYoneharaSandMatsuzakiKTranslocationofAnaloguesoftheantimicrobialpeptidesmagaininandbuforinacrosshumancellmembranesTheJournalofBiologicalChemistry27813101315Tardiffetal1997PreliminaryreportofageneticbasisforcognitivedeclineaftercardiacoperationsTheNeurologicOutcomeResearchGroupoftheDukeHeartCenterAnnThoracSurg6471520Teasdaleetal1999ChallengesintranslatingtheefficacyofneuroprotectiveagentsinexperimentalmodelsintoknowledgeofclinicalbenefitsinheadinjuredpatientsActaNeurochir73Suppl111-6Teasdaleetal1997AssociationofapolipoproteinEpolymorphismwithoutcomeafterheadinjuryLancet35010691071Tesseuretal2000ExpressionofhumanapolipoproteinE4inneuronscauseshyperphosphorylationofproteintauinthebrainsoftransgenicmiceAmJPathol15695164ThorenPEGPerssonDIsaksonPGoksorMOnfeltAandNordenBUptakeofanalogsofpenetratinTatandoligoarginineinlivecellsBiochemicalandBiophysicalResearchCommunications307100107Tolaretal1999TruncatedapolipoproteinEcausesincreasedintracellularcalciumandmaymediateapoEneurotoxicityJNeurosci1971007110Tolaretal1997Neurotoxicityofthe22kDathrombincleavagefragmentofapolipoproteinEandrelatedsyntheticpeptidesisreceptormediatedJNeurosci1756785686TungCandWeisslederRArgininecontainingpeptidesasdeliveryvectorsAdvancedDrugDeliveryReviews55281294VanLentenBJFogelmanAMHaberlandMEEdwardsPA1986TheroleoflipoproteinsandreceptormediatedendocytosisinthetransportofbacteriallipopolysaccharideProcNatlAcadSciUSA1986Apr8327048VanOostenMRensenPCVanAmersfoortESVanEckMVanDamAMBreveJJVogelTPanetAVanBerkelTJKuiperJ2001ApolipoproteinEprotectsagainstbacteriallipopolysaccharideinducedlethalityAnewtherapeuticapproachtotreatgramnegativesepsisJBiolChem2001Mar2327688204Veberetal2002MolecularpropertiesthatinfluencetheoralbioavailabilityofdrugcandidatesJMedChem452615Verdineetal2000AnallhydrocarboncrosslinkingsystemforenhancingthehelicityandmetabolicstabilityofpeptidesJAmerChemSoc1225891Vijayalakshmietal2000ComparisonofHelixstabilizingeffectsofααDialkylGlycineswithLinearandCycloalkylSideChainsBiopolymers5384VivesERichardJPRispalCandLebleuBTATpeptideinternalizationseekingthemechanismofentryCurrentProteinandPeptideScience4125132VanOostenetal2001ApolipoproteinEprotectsagainstbacteriallipopolysaccharideinducedlethalityJBiolChem276882024Veinbergsetal2001RoleofapolipoproteinEreceptorsinregulatingthedifferentialinvivoneurotrophiceffectsofapolipoproteinEExpNeurol170152VonBergenetal2002EffectofintrathecalnonNMDAEAAreceptorantagonistLY293558inratsanewclassofdrugsforspinalanesthesiaAnesthesiology9717782Wellonsetal2000AcomparisonofstrainrelatedsusceptiblitiyintwomurinerecoverymodelsofglobalcerebralischemiaBrainRes8681421Waageetal1987JExpMed16933338Wangetal1998ApolipoproteinEpeptideregulatestauphosphorylationviatwodifferentsignalingpathwaysJNeurosciRes51658665Wangetal1997RapidelevationofneuronalcytoplasmiccalciumbyapolipoproteinEpeptideJCellPhysiol1737383Watanabeetal1997IntJCardiol54551Weisbargeretal1983ThereceptorbindingdomainofhumanapolipoproteinEmonoclonalantibodyinhibitionofbindingJBiolChem2581234854Weisgraberetal1982AbnormallipoproteinreceptorbindingactivityofthehumanEapoproteinduetocysteinearginineinterchangeatasinglesiteJBiolChem25725182521Weisgraber1994ApolipoproteinEStructurefunctionrelationshipsAdvProteinChem45249302WellsMTGaffinSLJordaanJP1987RadiationinducedgramnegativebacteremiaandendotoxemiainrabbitsmodificationbyantilipopolysaccharidehyperimmuneequineplasmaLifeSci1987Jun2940254350WellsMTGaffinSLWesselsBCBrockUtneJGJordaanJPvandenEndeJ1990AntiLPSantibodiesreduceendotoxemiainwholebody60CoirradiatedprimatesapreliminaryreportAviatSpaceEnvironMed1990Sep618026WenderPAMitchellDJPattabiramanKPelkeyETSteinmanLandRothbardJBThedesignsynthesisandevaluationofmoleculesthatenableorenhancecellularuptakepeptoidmoleculartransportersProcNatlAcadSci971300313008Wettereauetal1988HumanapolipoproteinE3isaqueaoussolutionEvidencefortwostructuraldomainsJBiolChem263624048WiemannBVanGYDanilenkoDMYanQMathesonCMunyakaziLOgenstadSStarnesCO1998CombinedtreatmentofacuteEAEinLewisratswithTNFbindingproteinandinterleukin1receptorantagonistExpNeurol14945563Wisniewskietal1992ApolipoproteinEapathologicalchaperoneinpatientswithcerebralandsystemicamyloidNeurosciLet135235238WrightLRRothbardJBandWenderPAGuanidiniumrichpeptidetransportersanddrugdeliveryCurrentProteinandPeptideScience4105124XuandLuo2001RelationshipbetweenchangesofNmethylDaspartatereceptoractivityandbrainedemaafterbraininjuryinratsChinJTraumatol41358YeDXuDSingerAUandJulianoRLEvaluationofstrategiesfortheintracellulardeliveryofproteinsPharmaceuticalResearch1913021309Zanottietal2002CytokinemodulationinsepsisandsepticshockExpertOpinInvestigDrugs11106175本発明は上記の実施例を参照して詳細に記載されているが、本発明の精神を逸脱せずにさまざまな変更が行われうることが理解される。したがって、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。本出願において言及されたすべての引用特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書で援用される。"