MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、MAGEA2またはMAGEA12と特異的に結合しない抗原結合タンパク質。MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、MAGEAサブファミリーのいずれかの他のメンバーと特異的に結合しない抗原結合タンパク質。配列番号52、配列番号58、配列番号64から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するCDRH3を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。さらに、CDRH1配列番号50、CDRH1配列番号56、CDRH1配列番号62、CDRH2配列番号51、CDRH2配列番号57、CDRH2配列番号63、CDRL1配列番号53、CDRL1配列番号59、CDRL1配列番号65、CDRL2配列番号54、CDRL2配列番号60、CDRL2配列番号66、CDRL3配列番号55、CDRL3配列番号61、CDRL3配列番号67から選択される1以上のまたは全てのCDRを含む、請求項3に記載の抗原結合タンパク質。CDRH1が配列番号50であり、CDRH2が配列番号51であり、そしてCDRH3が配列番号52である、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。CDRH1が配列番号56であり、CDRH2が配列番号57であり、そしてCDRH3が配列番号58である、請求項1~5のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。CDRH1が配列番号62であり、CDRH2が配列番号63であり、そしてCDRH3が配列番号64である、請求項1~6のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。CDRL1が配列番号53であり、CDRL2が配列番号54であり、そしてCDRL3が配列番号55である、請求項1~7のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。CDRL1が配列番号59であり、CDRL2が配列番号60であり、そしてCDRL3が配列番号61である、請求項1~8のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。CDRL1が配列番号65であり、CDRL2が配列番号66であり、そしてCDRL3が配列番号67である、請求項1~9のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。さらにa配列番号39のフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する重鎖可変域アクセプター抗体フレームワーク;b配列番号43のフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する重鎖可変域アクセプター抗体フレームワーク;c配列番号47のフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する重鎖可変域アクセプター抗体フレームワーク;d配列番号41に示したフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインアクセプター抗体フレームワーク;e配列番号45に示したフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインアクセプター抗体フレームワーク;またはf配列番号49に示したフレームワーク域と75以上の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインアクセプター抗体フレームワーク;の少なくとも1つを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。i配列番号47の重鎖可変域または配列番号47と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域、および配列番号49の軽鎖可変域または配列番号49と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域;ii配列番号39の重鎖可変域または配列番号39と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域、および配列番号41の軽鎖可変域または配列番号41と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域;またはiii配列番号43の重鎖可変域または配列番号43と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域、および配列番号45の軽鎖可変域または配列番号45と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域;を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号52GGNNGFAYのCDRH3、または、配列番号52のアミノ酸残基番号2におけるGlyのTrpへの置換を有する変異体;b配列番号50SDYVWNのCDRH1、または、配列番号50のアミノ酸残基番号4におけるValのAlaへの置換を有する変異体;c配列番号51YIGHSGRTSYNPSLKSのCDRH2、または、配列番号51のアミノ酸残基番号2におけるIleのMetもしくはValへの置換、配列番号51のアミノ酸残基番号4におけるHisのTyrへの置換、または配列番号51のアミノ酸残基番号10におけるTyrのLeuへの置換を含む変異体;d配列番号53KSSQSLLNSGNQKNYLTのCDRL1、または、配列番号53のアミノ酸残基番号5におけるSerのAsn、Asp、ThrまたはGluへの置換、配列番号53のアミノ酸残基番号7におけるLeuのAsp、Tyr、Val、Ile、Ser、Asn、Phe、His、GlyまたはThrへの置換、配列番号53のアミノ酸残基番号14におけるAsnのSer、Thr、LysまたはGlyへの置換、配列番号53のアミノ酸残基番号15におけるTyrのPhe、Asn、Ala、His、SerまたはArgへの置換、または配列番号53のアミノ酸残基番号16におけるLeuのMet、Val、IleまたはPheへの置換を含む変異体;e配列番号54WTSTRDSのCDRL2;およびf配列番号55QNDYSYPPTのCDRL3、または、配列番号55のアミノ酸残基番号1におけるGlnのSer、Gly、PheまたはLeuへの置換、配列番号55のアミノ酸残基番号2におけるAsnのGlnまたはHisへの置換、配列番号55のアミノ酸残基番号3におけるAspのAsn、Phe、Gly、Ser、Arg、His、Thr、TyrまたはValへの置換、配列番号55のアミノ酸残基番号4におけるTyrのAsn、TrpThr、Ser、Arg、Gln、His、AlaまたはAspへの置換、配列番号55のアミノ酸残基番号5におけるSerのGlu、Asn、Gly、His、Thr、Arg、Alaへの置換、配列番号55のアミノ酸残基番号6におけるTyrのAsp、Thr、Val、Leu、His、Asn、Ile、Trp、ProまたはSerへの置換、または配列番号55のアミノ酸残基番号8におけるProのLeu、Tyr、Arg、Ile、TrpまたはPheへの置換を含む変異体;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号52のCDRH3;b配列番号50のCDRH1;c配列番号51のCDRH2;d配列番号53のCDRL1;e配列番号54のCDRL2;f配列番号55のCDRL3;g配列番号39に記載の重鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にVal;アミノ酸残基番号20にLeu;アミノ酸残基番号22にCys;アミノ酸残基番号24にVal;アミノ酸残基番号26にGly;アミノ酸残基番号29にIle;アミノ酸残基番号36にTrp;アミノ酸残基番号47にTrpまたはTyr;アミノ酸残基番号48にMet;アミノ酸残基番号69にIleまたはMet;アミノ酸残基番号71にArg、LysまたはVal;アミノ酸残基番号76にAsn;アミノ酸残基番号78にPhe;アミノ酸残基番号80にLeu;またはアミノ酸残基番号92にCysを含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記重鎖フレームワーク;およびh配列番号41に記載の軽鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にIle、LeuまたはVal;アミノ酸残基番号3にVal、Gln、LeuまたはGlu;アミノ酸残基番号4にMetまたはLeu;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号71にTyrまたはPhe;アミノ酸残基番号88にCys、またはアミノ酸残基番号98にPheを含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記軽鎖フレームワーク;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項13に記載の抗原結合タンパク質。a重鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にVal;アミノ酸残基番号20にLeu;アミノ酸残基番号22にCys;アミノ酸残基番号24にVal;アミノ酸残基番号26にGly;アミノ酸残基番号29にIle;アミノ酸残基番号36にTrp;アミノ酸残基番号47にTrp;アミノ酸残基番号48にMet;アミノ酸残基番号69にIle;アミノ酸残基番号71にArg;アミノ酸残基番号76にAsn;アミノ酸残基番号78にPhe;アミノ酸残基番号80にLeu;およびアミノ酸残基番号92にCysを含み;アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている;およびb軽鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にIle;アミノ酸残基番号3にVal;アミノ酸残基番号4にMet;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号71にPhe;アミノ酸残基番号88にCys、およびアミノ酸残基番号98にPheを含み;アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている、請求項14に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号58QDYFDYのCDRH3、または、配列番号58のアミノ酸残基番号6におけるTyrのHis、Val、Ile、Ser、AspまたはGlyへの置換を有する変異体;b配列番号56TNAMSのCDRH1、または、配列番号56のアミノ酸残基2におけるAsnのIle、His、Tyr、Phe、Thr、Cys、GlueまたはAspへの置換、配列番号56のアミノ酸残基3におけるAlaのTyr、Trp、Gly、Thr、LeuまたはValへの置換、配列番号56のアミノ酸残基4におけるMetのIle、ValまたはTrpへの置換、または配列番号56のアミノ酸残基5におけるSerのHis、Glu、Asn、Gln、TyrまたはThrへの置換を含む変異体;c配列番号57TITSGGGSTYYPVSVKGのCDRH2、または、配列番号57のアミノ酸残基1におけるThrのGly、Tyr、Phe、Ile、GluまたはValへの置換、配列番号57のアミノ酸残基2におけるIleのLeu、Val、Thr、SerまたはAsnへの置換、配列番号57のアミノ酸残基3におけるThrのSer、Phe、TrpまたはHisへの置換、配列番号57のアミノ酸残基4におけるGlyのAsp、SerまたはAsnへの置換、配列番号57のアミノ酸残基5におけるGlyのSerへの置換、配列番号57のアミノ酸残基8におけるSerのTyr、Thr、Asn、AspまたはArgへの置換、または配列番号57のアミノ酸残基10におけるTyrのGly、His、Phe、AspまたはAsnへの置換を含む変異体;d配列番号59RSSTGAVTSTNYANのCDRL1、または、配列番号59のアミノ酸残基6におけるAlaのThrへの置換、または配列番号59のアミノ酸残基12におけるTyrのHisへの置換を含む変異体;e配列番号60GTNNRAPのCDRL2;およびf配列番号61ALWYSNHWVのCDRL3、または、配列番号61のアミノ酸残基5におけるSerのAsnへの置換、または配列番号61のアミノ酸残基7におけるHisのLeuへの置換を含む変異体;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号58のCDRH3;b配列番号56のCDRH1;c配列番号57のCDRH2;d配列番号59のCDRL1;e配列番号60のCDRL2;f配列番号61のCDRL3;g配列番号43に記載の重鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にVal、IleまたはGly;アミノ酸残基番号4にLeuまたはVal;アミノ酸残基番号20にLeu、Ile、MetまたはVal;アミノ酸残基番号22にCys;アミノ酸残基番号24にThr、Ala、Val、GlyまたはSer;アミノ酸残基番号26にGly;アミノ酸残基番号29にIle、Phe、LeuまたはSer;アミノ酸残基番号36にTrp;アミノ酸残基番号47にTrp;アミノ酸残基番号48にIle、Met、ValまたはLeu;アミノ酸残基番号69にIle、Leu、Phe、MetまたはVal;アミノ酸残基番号71にArg;アミノ酸残基番号78にAla、Leu、Val、TyrまたはPhe;アミノ酸残基番号80にLeuまたはMet;アミノ酸残基番号90にTyrまたはPhe;アミノ酸残基番号92にCys;およびアミノ酸残基番号94にArg、Lys、Gly、Ser、HisまたはAsnを含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記重鎖フレームワーク;およびh配列番号45に記載の軽鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にAlaまたはGln;アミノ酸残基番号3にVal;アミノ酸残基番号4にVal;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号48にIle;アミノ酸残基番号66にLeu;アミノ酸残基番号71にAla;アミノ酸残基番号88にCys、およびアミノ酸残基番号98にPheを含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記軽鎖フレームワーク;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項16に記載の抗原結合タンパク質。a重鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にVal:アミノ酸残基番号4にVal:アミノ酸残基番号20にLeu:アミノ酸残基番号22にCys:アミノ酸残基番号24にAla:アミノ酸残基番号26にGly:アミノ酸残基番号29にPhe:アミノ酸残基番号36にTrp:アミノ酸残基番号47にTrp:アミノ酸残基番号48にVal:アミノ酸残基番号69にIle:アミノ酸残基番号71にArg:アミノ酸残基番号78にLeu:アミノ酸残基番号80にLeu:アミノ酸残基番号90にTyr:アミノ酸残基番号92にCys:およびアミノ酸残基番号94にArgを含み:アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている;およびb軽鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にAla;アミノ酸残基番号3にVal;アミノ酸残基番号4にVal;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号48にIle;アミノ酸残基番号66にLeu;アミノ酸残基番号71にAla;アミノ酸残基番号88にCys、およびアミノ酸残基番号98にPheを含み;アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている、請求項17に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号64GGGVLLRLPLFAYのCDRH3、または、配列番号64のアミノ酸残基13におけるTyrのHis、Val、Ile、Ser、AspまたはGlyへの置換を有する変異体;b配列番号62SYTMSのCDRH1、または、配列番号62のアミノ酸残基2におけるTyrのIle、His、Phe、Thr、Asn、Cys、GluまたはAspへの置換、配列番号62のアミノ酸残基3におけるThrのTyr、Ala、Trp、Gly、LeuまたはValへの置換、配列番号62のアミノ酸残基4におけるMetのIle、ValまたはTrpへの置換、または配列番号62のアミノ酸残基5におけるSerのHis、Glu、Asn、Gln、TyrまたはThrへの置換を有する変異体;c配列番号63TITSGGGSSYYPDSVKGのCDRH2または配列番号63のアミノ酸残基1におけるThrのGly、Tyr、Phe、Ile、GluまたはValへの置換、配列番号63のアミノ酸残基2におけるIleのLeu、Val、Thr、SerまたはAsnへの置換、配列番号63のアミノ酸残基3におけるThrのSer、Phe、TrpまたはHisへの置換、配列番号63のアミノ酸残基5におけるGlyのAsp、SerまたはAsnへの置換、配列番号63のアミノ酸残基6におけるGlyのSerへの置換、配列番号63のアミノ酸残基8におけるSerのTyr、Thr、Asn、AspまたはArgへの置換、または配列番号63のアミノ酸残基10におけるTyrのGly、His、Phe、AspまたはAsnへの置換を含む変異体;d配列番号65RSSTGAVTASNYANのCDRL1、または配列番号65のアミノ酸残基番号6におけるAlaのThrへの置換、または配列番号65のアミノ酸残基番号12におけるTyrのHisへの置換を含む変異体;e配列番号66GINNRAPのCDRL2、または、配列番号66のアミノ酸残基番号2におけるIleのThrへの置換を含む変異体;およびf配列番号67ALWYNNHWVのCDRL3、または、配列番号67のアミノ酸残基5におけるAsnのSerへの置換、配列番号67のアミノ酸残基7におけるHisのLeuへの置換を含む変異体;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。a配列番号64のCDRH3;b配列番号62のCDRH1;c配列番号63のCDRH2;d配列番号65のCDRL1;e配列番号66のCDRL2;f配列番号67のCDRL3;g配列番号47に記載の重鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にVal、IleまたはGly;アミノ酸残基番号4にLeuまたはVal;アミノ酸残基番号20にLeu、Ile、MetまたはVal;アミノ酸残基番号22にCys;アミノ酸残基番号24にThr、Ala、Val、GlyまたはSer;アミノ酸残基番号26にGly;アミノ酸残基番号29にIle、Phe、LeuまたはSer;アミノ酸残基番号36にTrp;アミノ酸残基番号47にTrp;アミノ酸残基番号48にIle、Met、ValまたはLeu;アミノ酸残基番号69にIle、Leu、Phe、MetまたはVal;アミノ酸残基番号71にArg;アミノ酸残基番号78にAla、Leu、Val、TyrまたはPhe;アミノ酸残基番号80にLeuまたはMet;アミノ酸残基番号90にTyrまたはPhe;アミノ酸残基番号92にCys;またはアミノ酸残基番号94にArg、Lys、Gly、Ser、HisまたはAsnを含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記重鎖フレームワーク;およびh配列番号49に記載の軽鎖フレームワークであって、アミノ酸残基番号2にAlaまたはGln;アミノ酸残基番号3にVal;アミノ酸残基番号4にVal;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号48にIle;アミノ酸残基番号66にLeu;アミノ酸残基番号71にAla;アミノ酸残基番号88にCys、またはアミノ酸残基番号98にPhe、を含み、アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている前記軽鎖フレームワーク;を含むものであって、MAGEA3と結合する、請求項19に記載の抗原結合タンパク質。a重鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にVal;アミノ酸残基番号4にLeu;アミノ酸残基番号20にVal;アミノ酸残基番号22にCys;アミノ酸残基番号24にAla;アミノ酸残基番号26にGly;アミノ酸残基番号29にPhe;アミノ酸残基番号36にTrp;アミノ酸残基番号47にTrp;アミノ酸残基番号48にVal;アミノ酸残基番号69にIle;アミノ酸残基番号71にArg;アミノ酸残基番号78にLeu;アミノ酸残基番号80にLeu;アミノ酸残基番号90にTyr;アミノ酸残基番号92にCys;およびアミノ酸残基番号94にSerを含み;アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている;およびb軽鎖フレームワークがアミノ酸残基番号2にAla;アミノ酸残基番号3にVal;アミノ酸残基番号4にVal;アミノ酸残基番号23にCys;アミノ酸残基番号35にTrp;アミノ酸残基番号48にIle;アミノ酸残基番号66にLeu;アミノ酸残基番号71にAla;アミノ酸残基番号88nにCys、およびアミノ酸残基番号98にPheを含み;アミノ酸残基はKabatスキームを用いて番号付けられている、請求項20に記載の抗原結合タンパク質。請求項1~21のいずれか1項に定義した抗原結合タンパク質をコードする核酸分子。i配列番号38の重鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体重鎖;ii配列番号42の重鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体重鎖;iii配列番号46の重鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体重鎖;iv配列番号40の軽鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体軽鎖;v配列番号44の軽鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体軽鎖;またはvi配列番号48の軽鎖DNA配列または75以上の同一性を持つ変異体軽鎖;またはを含む、請求項22に記載の核酸分子。請求項22~23のいずれか1項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。請求項24に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。抗原結合タンパク質を作製する方法であって、請求項25に定義した宿主細胞を培養するステップおよび抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである前記方法。ヒトホルマリン固定パラフィン包埋組織中のMAGEA3および/またはMAGEA6を検出する方法であって、請求項1~21のいずれか1項に定義したモノクローナル抗体を用いて前記組織について酵素結合免疫吸着アッセイを実施するステップを含む前記方法。前記組織が腫瘍組織である、請求項27に記載の方法。前記腫瘍組織が黒色腫または非小細胞性肺癌である、請求項28に記載の方法。本発明はMAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。本発明はMAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、MAGEA2またはMAGEA12と結合しないまたは特異的に結合しない抗原結合タンパク質を提供する。本発明はMAGEA3と特異的に結合しかつ配列番号52、58および64、またはそれらの変異体から選択されるCDRH3を含むものである抗原結合タンパク質を提供する。本発明はMAGEA3と特異的に結合しかつ配列番号55、61および67、またはそれらの変異体から選択されるCDRL3を含むものである抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、MAGEA3と特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、i配列番号47の重鎖可変域および/または配列番号49の軽鎖可変域;または配列番号47と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域;または配列番号49と75以上の配列同一性を持つ変異体軽鎖可変域;ii配列番号39の重鎖可変域および/または配列番号41の軽鎖可変域;または配列番号39と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域;または配列番号41と75以上の配列同一性を持つ変異体軽鎖可変域;あるいはiii配列番号43の重鎖可変域および/または配列番号45の軽鎖可変域;または配列番号43と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域;または配列番号45と75以上の配列同一性を持つ変異体軽鎖可変域;を含むものである前記抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を作製する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップおよび抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである前記方法を提供する。本発明はまた、MAGEA3の様々なペプチドを用いて免疫化することによる本明細書に記載の抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を用いてヒトホルマリン固定パラフィン包埋組織中のMAGEA3および/またはMAGEA6を検出する方法を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を用いてヒトホルマリン固定パラフィン包埋組織中のMAGENを検出する方法を提供する。本発明の詳細な説明GlaxoSmithKlineBiologicalsSAは転移性黒色腫およびNSCLC非小細胞肺癌を治療するMAGEA3抗原特異的な癌免疫治療薬AntigenSpecificCancerImmunotherapeuticまたはASCIを開発している。この免疫治療薬はMAGEA3の断片を含む融合タンパク質を、抗腫瘍免疫応答を増加するように選択した免疫刺激性化合物の特定の組み合わせであるアジュバント系と組み合わせるBrichardetalVaccine25B61。新しい臨床試験に登録する前に、患者をスクリーニングして彼らがMAGEA3を発現する腫瘍を有するかどうかを確認する。現在、腫瘍中のMAGEA3の分析はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RTPCRにより行っている。ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE腫瘍組織保存組織ブロックを用いる免疫組織化学IHCによる検出は、MAGEA3に特異的でFFPE組織中の抗原の検出が可能な信頼しうるモノクローナル抗体mAbを必要とする。MAGEAタンパク質群は配列類似性が高いために、MAGEA3に対する抗体は他のMAGEAタンパク質と交差反応しうる。例えば、Kochらはマウスを組換えMAGEA3タンパク質で免疫化することにより抗MAGEA3モノクローナル抗体を産生したKocheretalCancerRes5522361995。得られるmAb57Bと呼ばれるはその後、MAGEA1、A2、A3、A4、A6およびA12と交差反応することが示されたRimoldietalIntJCancer867492000。ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE組織と57BmAbの反応性のさらなる分析は、57BmAbが他のMAGEA抗原を発現する組織とそれらの発現レベルに関わりなく反応しないので、主にMAGEA4を検出することが報じられたLandryetalIntJCancer868352000。抗MAGEA3mAb6D10AbnovaGeneTexandNovusBiologicalsの特異性の分析は、このmAbがMAGEA2およびMAGEA6と交差反応することを示した本出願人の未公開データ。加えて、ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE組織に対するIHC免疫組織化学分析におけるこのmAbの使用は成功しなかった本出願人の未公開データ。MAGEA3A6に対する他のmAbはmAbM3H67として公知であるLICRNewYorkUSA;例えば、SharmaetalClinicalCancerResearch125442;ChitaleetalModernPathology18119を参照。この抗体はホルマリン固定パラフィン包埋FFPE組織中のMAGEA3A6の発現を特徴付けるために用いられているが、その特異性の分析は公開されてない例えば、ChitaleetalModPathol181192005;PerezetalIntJCancer12315512008;ObaShinjoetalCancerImmun872008;NelsonetalCancerImmun712007;LuftletalBrJDermatol15112132004LohmannetalMelanomaRes135952003andDhodapkaretalCancerImmun392003を参照。高度に類似したMAGEA3とMAGEA6タンパク質を認識する一方、密接に関係するMAGEA2またはA12タンパク質または他の公知のMAGEAタンパク質と交差反応しないmAbに対する必要性は残ったままである。さらに、FFPE組織上のMAGEA3および/またはA6を信頼して検出できる抗体が必要である。本発明はMAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は抗体、例えば、モノクローナル抗体mAbであってもよい。特に断らない限り、本明細書に使用する技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者により通常理解される意味を有する。分子生物学における通常の用語の定義は、BenjaminLewinGenesVOxfordUniversityPress1994;KendrewetalTheEncyclopediaofMolecularBiologypublishedbyBlackwellScienceLtd1994;およびRobertAMeyersMolecularBiologyandBiotechnologyaComprehensiveDeskReferenceVCHPublishersInc1995に見出すことができる。単数の用語1つのa、anおよびtheは、文脈が明らかに別な意味を意味しない限り、複数の言及を含む。同様に、用語またはは、特に文脈が明らかに別な意味を意味しない限り、およびを含むことを意図する。用語複数は2以上を意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに対する所与の全ての分子量値は近似値であり、説明のために与えられると解釈すべきである。アミノ酸は本明細書において次のように省略して記載される:アラニンAlaまたはA;アルギニンArgまたはR;アスパラギンAsnまたはN;アスパラギン酸AspまたはD;システインCysまたはC;グルタミン酸GluまたはE;グルタミンGlnまたはQ;グリシンGlyまたはG;ヒスチジンHisまたはH;イソロイシンIleまたはI;ロイシンLeuまたはL;リシンLysまたはK;メチオニンMetまたはM;フェニルアラニンPheまたはF;プロリンProまたはP;セリンSerまたはS;トレオニンThrまたはT;トリプトファンTrpまたはW;チロシンTyrまたはYおよびバリンValまたはV。本明細書で使用する用語抗原結合タンパク質は抗体、抗体断片および他のタンパク質構築物、例えば、MAGEA3と特異的結合することができるドメインまたは領域を意味する。用語抗体は本明細書において最も広い意味では免疫グロブリン様ドメインを持つ分子を言及するのに使用され、それには、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二特異的およびヘテロコンジュゲート抗体;単一可変ドメインまたは領域、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、1本鎖Fv、ダイアボディ、TANDABSなどが含まれる代わりの抗体フォーマットの総括についてはHolligerandHudsonNatureBiotechnology2005Vol23No911261136を参照されたい。本明細書で使用する修飾語モノクローナルは、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を意味し、その抗体が特定の方法により産生されたことを意味するものではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体mAbはハイブリドーマ法KohlerandMilsteinNature256495によりまたは組換えDNA法により産生してもよく、またはファージライブラリーから単離してもよい。本発明のモノクローナル抗体はそれらを単離した元のハイブリドーマによって名付けられ、例えば、mAb1B1はハイブリドーマ1B1から得たものである。表現単一可変域は独立して抗原またはエピトープと特異的に結合する、色々な可変域の抗原結合タンパク質可変域例えば、VH、VHH、VLを意味する。ドメイン抗体またはdAbは、ある抗原と結合することができる単一可変ドメインと同じであると考えてもよい。単一可変ドメインはヒト抗体可変ドメインであってもよいが、また他の種、例えばげっ歯類例えば、WO0029004に開示された、ナースサメnursesharkおよびラクダ科動物VHHdAb由来の単一可変ドメインを含む。ラクダ科動物VHHはラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。かかるVHHドメインは当技術分野で利用しうる標準技法によってヒト化されていてもよく、かかるドメインはドメイン抗体であると考えられる。本明細書で使用するVHはラクダ科動物VHHドメインを含む。本明細書で使用する用語ドメインはフォールディングされたタンパク質構造を意味し、残部のタンパク質とは独立した三級構造を有する。一般に、ドメインはタンパク質の明確な機能特性に関わり、そして、多くの場合、タンパク質および/またはドメインの残部の機能を喪失することなく、他のタンパク質に加えるか、除去するかまたは導入することができる。単一抗体可変ドメインまたは単一可変域は抗体可変ドメインの特徴的な配列を含むフォールディングされたポリペプチドドメインである。それ故に、単一抗体可変ドメインには、完全な抗体可変ドメイン、および、例えば、1以上のループが抗体可変ドメインの特徴でない配列により置き換えられている改変された可変ドメイン、または、末端切断されている、またはNもしくはC末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性および特異性を保持するフォールディングされた可変ドメインの断片が含まれる。1つのドメインは異なる可変域またはドメインとは独立して、抗原またはエピトープと結合することができる。本明細書で使用するMAGEAは、特に断らない限り、ヒトMAGEAと同じ配列から得たまたはそれらを有するMAGEAを意味する。本明細書で使用するMAGEA3は、特に断らない限り、ヒトMAGEA3と同じ配列を有するポリペプチドを意味する。本発明者らは次の表1に説明したスキームを用いてモノクローナル抗体を産生した。マウスを、様々なMAGEA3ペプチドの組み合わせまたは全長組換えMAGEA3で免疫化した。免疫化マウスから得た血清の反応性を全長組換えMAGEA3に対する酵素結合免疫吸着アッセイELISAを用いて試験し、ハイブリドーマ産生に用いる動物を選択した。得られるハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体をMAGEA3に対してスクリーニングし、次いで選択したmAbをMAGEA3、MAGEA12およびMAGEA2に対する;およびMAGEA3発現組織に対する反応性について試験した。このスキームを用いて、MAGEA2および/またはMAGEA12と交差反応せずに、MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するさらなるmAbを産生した。産生したmAbを任意に免疫化に用いたペプチドに対する反応性について試験してもよい。抗原結合断片は、非抗体タンパク質足場、例えばドメイン上の1以上のCDRの配置を用いて提供することができる。非抗体タンパク質足場またはドメインは、その天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学で作られたもの、例えば、その天然リガンド以外のリガンドとの結合を得るためにタンパク質工学で作られたCTLA4EVIBODY登録商標;リポカリン;プロテインA由来の分子、例えばプロテインAのZドメインアフィボディ登録商標、SpA、Aドメインアビマーマキシボディ;熱ショックタンパク質、例えばGroElおよびGroES;トランスフェリントランスボディ;アンキリンリピートタンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;C型レクチンドメインテトラネクチン;ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチンアフィリン;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼインヒビターのスコーピオントキシンクニッツ型ドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチンから選択される足場の誘導体であるドメインである。抗原結合断片または免疫学的に有効な断片は重鎖または軽鎖可変配列の一部分を含みうる。断片は長さが少なくとも5、6、8または10アミノ酸である。あるいは、断片は長さが少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも75、または少なくとも100アミノ酸である。本明細書を通して抗原結合タンパク質に関連して使用する用語特異的に結合する、特異的結合、または特異的に結合しているはタンパク質またはポリペプチドと抗原結合タンパク質との間の相互作用を意味する。相互作用は、抗原結合タンパク質により認識されるタンパク質またはポリペプチドの特異的構造すなわち、抗原決定基またはエピトープに依存する。抗原結合タンパク質は同じ抗原決定基またはエピトープを有する色々なタンパク質/ポリペプチドと交差反応しうる;これは非特異的結合とみなさない。さらにこれらの用語は非特異的結合と比較して、高い親和力での結合を意味する。例えば、LodishCellBiology5389を参照されたい。本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、MAGEA2またはMAGEA12などの近い関係の分子と結合するより少なくとも2、5、10、50、100、または1000倍大きい親和力でMAGEA3および/またはMAGEA6と結合する。抗原結合タンパク質とMAGEA3の相互作用の結合親和力または平衡解離定数KDは100nM以下、10nM以下、2nM以下または1nM以下でありうる。あるいはKDは5~10nM;または1~2nMでありうる。KDは1pM~500pM;または500pM~1nMでありうる。抗原結合タンパク質の結合親和力は会合速度定数kaと解離速度定数kdにより決定されるKDkdka。結合親和力はBIACOREなどの好適な当技術分野で公知の方法により、例えば、一級アミン結合によりCM5チップ上に結合したMAGEA3を用いる抗原捕獲とこの表面上への抗体捕獲により測定することができる。あるいは、結合親和力はFORTEBIO法により、例えば、一級アミンカップリングによりCM5ニードル上に結合したMAGEA3を用いる抗原捕獲とこの表面上への抗体捕獲により測定することができる。抗原結合タンパク質の解離速度定数kdは1x103s1以下、1x104s1以下、または1x105s1以下でありうる。kdは1x105s1~1x104s1;または1x104s1~1x103s1でありうる。遅いkdは抗原結合タンパク質リガンド複合体の遅い解離をもたらしうる。本明細書で使用する用語由来は、参照源がその物質の物理的起源であるという意味で物質の源参照源を定義するだけでなく、構造的にその物質と同一であるが参照源から物理的に得たものでない物質も定義する。従って、ドナー抗体由来のアミノ酸配列はドナー抗体から物理的に得た例えば、精製したた配列と共に、同一であるがドナー抗体から物理的に得たものでない配列も意味する。単離されたにより、分子、例えば抗原結合タンパク質はそれが天然で見出されうる環境から取り出されたことを意図する。例えば、前記分子はそれが天然で通常存在しうる物質から精製して取り出されうることを意味する。例えば、抗原結合タンパク質は、その抗原結合タンパク質を含有する培地と比較して少なくとも95、96、97、98または99以上精製することができる。用語VHおよびVLは本明細書においてそれぞれ抗原結合タンパク質の重鎖可変域および軽鎖可変域を意味する。本明細書で使用するCDRは抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列を意味する。CDRは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変域である。免疫グロブリンの可変部には3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRまたはCDR域が存在する。従って、本明細書で使用するCDRは全ての3つの重鎖CDR、全ての3つの軽鎖CDR、全ての重および軽鎖CDR、または少なくとも2つのCDRを意味する。本明細書を通して、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基は、特に断らない限り、Kabat番号規定に従って番号が付けられている。同様に、実施例で使用する用語CDR、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2、CDRH3はKabat番号規定に依っている。さらなる情報については、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest4thEdUSDepartmentofHealthandHumanServicesNationalInstitutesofHealthを参照されたい。当業者には、可変ドメイン配列および全長抗体配列中のアミノ酸残基に対する代わりの番号規定が存在することは明らかであろう。またCDR配列に対する代わりの番号規定も存在し、これらは、例えば、ChothiaetalNature342877883に記載されている。抗体の構造とタンパク質フォールディングは他の残基がCDR配列の一部分であることを意味しうるしかつ当業者はそのように解釈するであろう。それ故に、用語対応するCDRは本明細書において任意の番号規定、例えば表2に掲げたものを用いるCDR配列を意味する。当業者が利用しうるCDR配列に対する他の番号規定には、AbMUniversityofBathおよびcontactUniversityCollegeLondon法が含まれる。Kabat、Chothia、AbMおよびcontact法の少なくとも2つを用いる最小重複領域を決定して最小結合ユニットを与えることができる。最小結合ユニットはCDRのサブ部分であってもよい。次の表2は各CDRまたは結合ユニットに対するそれぞれの番号規定を用いる1つの定義を掲げる。Kabat番号スキームは表2において可変ドメインアミノ酸配列を番号付けるために用いられた。注意すべきは、いくつかのCDR定義は使用した個々の出版物によって変わりうることである。本明細書で使用する用語抗原結合部位は抗原と特異的に結合することができる抗原結合タンパク質上の部位を意味する。これは単一ドメイン例えば、エピトープ結合ドメイン、または単一鎖FvScFvドメインであってもよく、または標準抗体上に見出されうる対のVHVLドメインであってもよい。本明細書で使用する用語エピトープは、抗原が抗原結合タンパク質の特別な結合ドメインと接触する部分を意味する。エピトープは本質的に抗原由来の直鎖のアミノ酸配列を含む直鎖でありうる。あるいは、エピトープは立体構造であってもまたは不連続であってもよい。例えば、立体構造のエピトープは構造的束縛エレメントを必要とするアミノ酸残基を含む。不連続なエピトープは他の配列、すなわち抗原の一次配列の連続配列中に存在しない配列によって分離されたアミノ酸残基を含む。抗原の三次および四次構造の文脈において、不連続なエピトープの残基は抗原結合タンパク質が結合できるようにお互いに十分近くに存在する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列について、用語同一性、配列同一性、または配列類似性は2つの核酸または2つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を意味し、もし必要あれば、最適に整列しかつ適切な挿入または欠損を行って比較する。2つの配列間の同一性は、その2つの配列を最適にアライメントするために導入が必要とされるギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有する同一位置の数の関数であるすなわち、同一性=同一の位置の数/全位置の数×100。2つの配列間の配列の比較及び同一性の決定は、以下に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つのヌクレオチド配列間の同一性は、GCGソフトウエアパッケージ中のギャッププログラムを用いて、NWSgapdnaCMPマトリックスならびに40、50、60、70、または80のギャップウェイトおよび1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを使って決定することができる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性はまたALIGNプログラムversion20に組み込まれたEMeyersおよびWMillerComputApplBiosci、4:1117のアルゴリズムを用い、PAM120ウェイト残基表、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使って決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一性はGCGソフトウェアパッケージ中のギャッププログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunschJMolBiol48444453のアルゴリズムを用い、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかおよび16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイトおよび1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを使って決定することができる。一方法において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列例えば、配列番号38、40、42、44、46または48を参照と同一、すなわち100同一であるか、または、参照配列と比較してある特定の整数、例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、98、または99まで同一であるヌクレオチド改変を含みうる。かかる改変は少なくとも1つのヌクレオチド欠失、置換転移および転換を含む、または挿入から選択され;ここで前記改変は参照ヌクレオチド配列の5または3末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のいずれかに存在し;参照配列中のヌクレオチドのなかで個々にまたは参照配列内の1以上の近接グループ中に分散している。ヌクレオチド改変の数は、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列例えば、配列番号38、40、42、44、46または48を参照中のヌクレオチドの総数にそれぞれの同一性の数字100で除したものを乗じ、そしてその積を前記の本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数から減ずること、またはnn≦xnxny[式中、nnはヌクレオチド改変数であり、xnは本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数であり、yは05050に対して、06060に対して、07070に対して、07575に対して、08080に対して、08585に対して、09090に対して、09595に対して、09898に対して、09999に対してまたは100100に対してであり、は乗算演算子の記号であり、そしてxnとyのいずれの非整数積もxnから減ずる前に最も近い整数に切り下げて丸められる]により決定される。同様に、ポリペプチド配列は、本明細書に記載の参照ポリペプチド配列例えば、配列番号39、41、43、45、47、49、または50~67を参照と同一、すなわち100同一でありうるか、または、参照配列と比較して、同一性が100未満、例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、98、または99同一であるようなある特定の整数のアミノ酸改変を含みうる。かかる改変は少なくとも1つのアミノ酸欠失、置換保存的および非保存的置換を含む、または挿入からなる群より選択され;ここで前記改変は参照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置においてまたはこれらの末端位置の間のいずれかに存在し;参照配列中のアミノ酸のなかで個々にまたは参照配列内の1以上の近接グループ中に分散している。所与の同一性に対するアミノ酸改変の数は、本明細書に記載のポリヌクレオチド参照配列によりコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性の数字100で除したものを乗じ、そしてその積を前記の本明細書に記載の参照ポリペプチド配列のアミノ酸の総数から減ずること、またはna≦xaxay[式中、naはアミノ酸改変数であり、xaは本明細書に記載の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、yは05050に対して、06060に対して、07070に対して、07575に対して、08080に対して、08585に対して、09090に対して、09595に対して、09898に対して、09999に対してまたは100100に対してであり、は乗算演算子の記号であり、そしてxaとyのいずれの非整数積もxaから減ずる前に最も近い整数に切り下げて丸められる]により決定される。同一性は、配列の全長またはそのいずれかの断片にわたって;およびいずれかの挿入もしくは欠失を伴ってもしくは伴わないで決定することができる。用語ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質はそれぞれ2つ以上のアミノ酸残基を含む分子を意味する。ペプチドは単量体または多量体であってもよい。特定のアミノ酸置換は保存的である、すなわち、そのアミノ酸は類似の化学および物理的特性を有するとみなされることは当技術分野でよく認識されている。保存的アミノ酸置換の表は当技術分野で公知である。アミノ酸は典型的には共通の側鎖特性に基づくグループに分割され、抗原結合タンパク質の結合親和力の全てまたは実質的に全てを維持するグループ内置換は保存的置換とみなされる。例示であって、限定するものでないが、脂肪族側鎖を持つアミノ酸は他の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンによって置換することができ;ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸はヒドロキシル側鎖を持つ他のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンによって置換することができ;芳香族側鎖を有するアミノ酸は他の芳香族側鎖を有するアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンによって置換することができ;塩基性側鎖を持つアミノ酸は他の塩基性側鎖を持つアミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジンによって置換することができ;酸性側鎖を持つアミノ酸は他の酸性側鎖を持つアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸によって置換することができ;そして疎水性または親水性アミノ酸は他の疎水性または親水性アミノ酸によって、それぞれ置換することができる。本明細書に記載の本発明の抗原結合タンパク質はMAGEAファミリーからのMAGEA3およびMAGEA6とだけ特異的に結合する。本発明はMAGEA3と特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、i配列番号47の重鎖可変域または配列番号47と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域および配列番号49の軽鎖可変域または配列番号49と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域;ii配列番号39の重鎖可変域または配列番号39と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域および配列番号41の軽鎖可変域または配列番号41と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域;またはiii配列番号43の重鎖可変域または配列番号43と75以上の配列同一性を持つ変異体重鎖可変域および配列番号45の軽鎖可変域または配列番号45と75以上の配列同一性を持つ軽鎖可変域を含むかまたはから成る前記抗原結合タンパク質を提供する。本発明はMAGEA3と結合しかつ配列番号52、58または64、またはそれらの変異体CDRH3配列から選択される配列を有するCDRH3を含む抗原結合タンパク質を提供する。かかる抗原結合タンパク質はさらに、上記のCDRH3に加えて、1以上のCDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2、またはCDRL3を任意の組み合わせで含むものであって、ここで、CDRは配列番号50、56または62CDRH1、配列番号51、57または63CDRH2、配列番号53、59または65CDRL1、配列番号54、60または66CDRL2、および配列番号55、61または67CDRL3;またはそれらの変異体CDR配列から選択される配列を有する。本発明はまた、MAGEA3と結合しかつ配列番号39、43または47から選択される重鎖可変域を含むものである抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質は配列番号41、45または49から選択される軽鎖可変域を含んでもよい。重鎖可変域のいずれかを軽鎖可変域のいずれかと組み合わせてもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合しかつ次の重鎖可変域および軽鎖可変域組み合わせ:配列番号39および配列番号41または配列番号43および配列番号45、または配列番号47および配列番号49のいずれか1つを含む抗原結合タンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号39、43および47いずれか1つと75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上または100同一性を有する抗体重鎖可変域を提供する。本発明はまた、配列番号41、45、および49のいずれか1つと75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、98以上、99以上または100同一性を有する抗体軽鎖可変域を提供する。配列番号39、43、47、41、45または49の変異体のパーセント同一性は配列の全長にわたって決定することができる。以上に記載した正準CDRまたはフレームワーク残基置換は、上記の配列同一性を有するかかる重鎖または軽鎖可変域中に存在しうる。上記配列同一性を有する抗原結合タンパク質は、参照配列が示す効力の10倍以内または5倍以内の、EC50により示されるMAGEA3との結合に対する効力を提示しうる。EC50により示されるMAGEA3との結合に対する効力はELISAアッセイにより行うことができる。抗体重鎖可変域は30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する配列番号39、43、および47のいずれか1つの変異体であってもよい。抗体軽鎖可変域は30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する配列番号41、45および49のいずれか1つの変異体であってもよい。例えば、抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号52およびCDRH1配列番号50またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号52およびCDRH2配列番号51またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号50およびCDRH2配列番号51、およびCDRH3配列番号52またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号53およびCDRL2配列番号54またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL2配列番号54およびCDRL3配列番号55またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号53およびCDRL2配列番号54、およびCDRL3配列番号55またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号52およびCDRL3配列番号55、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号52、CDRH2配列番号51およびCDRL3配列番号55、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号52、CDRH2配列番号51CDRL2配列番号54およびCDRL3配列番号55、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号50、CDRH2配列番号51、CDRH3配列番号52、CDRL1配列番号53、CDRL2配列番号54およびCDRL3配列番号55を含んでもよい。あるいは、変異体CDRが存在してもよい。本発明はまたMAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH3の代わりに、配列番号43または配列番号47の可変ドメイン配列の対応するCDRH3、またはその変異体CDRH3を含む前記抗原結合タンパク質を提供する。従って、抗原結合タンパク質は上記の通りであってもよいが、配列番号58または配列番号64のCDRH3を有してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2またはCDRL3の代わりに、配列番号43、配列番号45、配列番号47、または配列番号49の可変ドメイン配列の対応するCDR、またはその変異体CDRを含む前記抗原結合タンパク質を提供する。。例えば、抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH1、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、および対応するCDRH3またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1および対応するCDRL2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1、および対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、対応するCDRH3、対応するCDRL1、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号58およびCDRH1配列番号56またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号58およびCDRH2配列番号57またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号56およびCDRH2配列番号57、およびCDRH3配列番号58またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号59およびCDRL2配列番号60、またはそれらの変異体を含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質はCDRL2配列番号60およびCDRL3配列番号61、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号59、CDRL2配列番号60およびCDRL3配列番号61、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号58およびCDRL3配列番号61、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号58、CDRH2配列番号57およびCDRL3配列番号61、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号58、CDRH2配列番号57、CDRL2配列番号60およびCDRL3配列番号61、またはそれらの変異体を含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号56、CDRH2配列番号57、CDRH3配列番号58、CDRL1配列番号59、CDRL2配列番号60およびCDRL3配列番号61を含んでもよい。あるいは、変異体CDRが存在してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH3の代わりに配列番号39または配列番号47の可変ドメイン配列の対応するCDRH3またはそれらの変異体CDRH3を含む前記抗原結合タンパク質を提供する。従って、抗原結合タンパク質は上記の通りであってもよいが、配列番号52または配列番号64のCDRH3を有してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2またはCDRL3の代わりに、配列番号39、配列番号41、配列番号47、または配列番号49の可変ドメイン配列の対応するCDRまたはそれらの変異体CDRを含む前記抗原結合タンパク質を提供する。例えば、抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH1、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、および対応するCDRH3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1、および対応するCDRL2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL2、および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1、対応するCDRL2、および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2、および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、対応するCDRH3、対応するCDRL1、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号64およびCDRH1配列番号62またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号64およびCDRH2配列番号63またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号62およびCDRH2配列番号63、およびCDRH3配列番号64、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号65およびCDRL2配列番号66、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL2配列番号66およびCDRL3配列番号67、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRL1配列番号65、CDRL2配列番号66およびCDRL3配列番号67またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号64およびCDRL3配列番号67、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号64、CDRH2配列番号63およびCDRL3配列番号67、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH3配列番号64、CDRH2配列番号63CDRL2配列番号66およびCDRL3配列番号67、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はCDRH1配列番号62、CDRH2配列番号63、CDRH3配列番号64、CDRL1配列番号65、CDRL2配列番号66およびCDRL3配列番号67を含んでもよい。あるいは、変異体CDRが存在してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH3の代わりに配列番号39または配列番号43の可変ドメイン配列の対応するCDRH3またはそれらの変異体CDRH3を含む前記抗原結合タンパク質を提供する。従って、抗原結合タンパク質は上記の通りであってもよいが、配列番号52または配列番号58のCDRH3を有してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する上記の抗原結合タンパク質であって、上述したCDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2またはCDRL3の代わりに配列番号39、配列番号41配列番号43、または配列番号45の可変ドメイン配列の対応するCDR、またはそれらの変異体CDRを含む前記抗原結合タンパク質を提供する。例えば、抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH1、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRH2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、および対応するCDRH3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1および対応するCDRL2、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRL1、対応するCDRL2、および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH3、対応するCDRH2、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。抗原結合タンパク質は対応するCDRH1、対応するCDRH2、対応するCDRH3、対応するCDRL1、対応するCDRL2および対応するCDRL3、またはそれらの変異体を含んでもよい。対応するCDRはKabat1987、Chothia1989、AbMまたはcontact方法を参照することにより定義することができる。それぞれの方法の1つの定義は表2に見出すことができるし、対応するCDRを確認するには参照重鎖可変域配列番号39、43、または47および参照軽鎖可変域配列番号41、45、または49を適用することができる。CDR変異体または変異体結合ユニットには少なくとも1つのアミノ酸例えば1、2、または6つ以下のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列であって、その改変は変異体が未改変配列の生物学的特徴を保持することを容認するものである前記アミノ酸配列が含まれる。例えば、変異体はMAGEA3と結合する機能性変異体である。CDRアミノ酸配列の部分的改変は1、2またはいくつかのアミノ酸の欠失または置換による;または1、2またはいくつかのアミノ酸の付加または挿入による;またはそれらの組み合わせによる例えば、1、2または6つ以下のアミノ酸によるものであってもよい。CDR変異体または結合ユニット変異体は、任意の組み合わせで、アミノ酸配列中に、1、2、3、4、5または6つのアミノ酸置換、付加または欠失を含有してもよい。アミノ酸残基の置換は保存的置換、例えば、1つの疎水性アミノ酸を代わりの疎水性アミノ酸に置換するものであってもよい。例えばロイシンはバリン、またはイソロイシンで置換することができる。CDRL1、L2、L3、H1およびH2は有限数の主鎖立体構造の1つを構造的に表す傾向がある。CDRの特別な正順構造クラスはCDRの長さおよびループパッキングの両方により定義され、CDRとフレームワーク域の両方のキー位置に位置する残基構造決定基またはSDRにより決定される。MartinおよびThornton1996;JMolBiol263:800815は、キー残基正準テンプレートを定義する自動化した方法を作製した。クラスター分析を用いて数セットのCDRの正順クラスを定義し、次いで正順テンプレートを、埋められた疎水性、水素結合残基、および保存されたグリシンおよびプロリンを分析することにより特定する。抗体配列のCDRは、キー残基テンプレートと比較しかつ各テンプレートを同一性または類似性マトリックスを用いてスコアを付けることにより、配列を正準クラスに割り当てることができる。参照CDRに対応するCDRを含む本発明の抗原結合タンパク質は、EC50により示して、参照CDRを含む抗原結合タンパク質が示す効力の10倍以内、または5倍以内のMAGEA3と結合する効力を発揮しうることが示されている。参照CDRの変異体を含む本発明の抗原結合タンパク質は、EC50により示して、参照CDRを含む抗原結合タンパク質が示す効力の10倍以内、または5倍以内のMAGEA3と結合する効力を発揮しうることが示されている。参照CDRは、配列番号50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、6465、66、および67からなる群より選択される配列を有するものを含む。本明細書に記載の1以上のCDR、対応するCDR、変異体CDRまたは結合ユニットは、ヒトフレームワークの文脈において、例えば、ヒト化もしくはキメラ可変ドメインとして存在しうる。重鎖可変域のいずれかを好適なヒト定常域と組み合わせてもよい。軽鎖可変域のいずれかを好適なヒト定常域と組み合わせてもよい。抗原結合タンパク質が結合するMAGEA3ポリペプチドは組換えポリペプチドであってもよい。MAGEA3は溶液中であってもよくまたは固体表面に付着していてもよい。例えば、ビーズ、例えば磁性ビーズに付着していてもよい。MAGEA3はビオチン化されていてもよい。MAGEA3とコンジュゲートしたビオチン分子を用いて、ビオチンストレプトアビジンを固体表面上でカップリングすることにより、MAGEA3を固体表面上に固定してもよい。本発明はまた、MAGEA3と結合する抗原結合タンパク質であって、配列番号39、配列番号43、SEQIDNO:47、配列番号41、配列番号45、および配列番号49からなる群より選択されるフレームワークと75以上の配列同一性を有する重鎖可変域アクセプター抗体フレームワークを含むものである前記抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質はラット、マウス、霊長類例えば、カニクイザル、旧世界サルまたは類人猿またはヒト由来であってもよい。抗原結合タンパク質はヒト化またはキメラ抗体であってもよい。抗原結合タンパク質は、いずれかのアイソタイプまたはサブクラスでありうる定常域を含んでもよい。定常域はIgGアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの変異体のものであってもよい。抗原結合タンパク質定常域はIgG1であってもよい。抗体のFcエフェクター部分に対する突然変異変化を利用してFcRnと抗体の間の相互作用の親和力を変えて抗体代謝回転をモジュレートすることができる。抗体の半減期はinvivoで延長することができる。本発明の抗原結合タンパク質はFcが無効化されていてもよい。あるいは、本発明の抗原結合タンパク質はFcが有効であってもよい。本発明はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。その核酸分子は1以上のCDRH、または重鎖可変配列;および1以上のCDRL、または軽鎖可変配列をコードする配列を、とを同じ核酸分子上に含みうる。あるいは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、1以上のCDRH、または重鎖可変配列;または1以上のCDRL、または軽鎖可変配列をコードする配列を、とを別々の核酸分子上に含みうる。重鎖可変配列をコードする核酸分子は配列番号38、42または46のいずれか1つを含むかまたはから成ってもよい。軽鎖可変配列をコードする核酸分子は配列番号40、44、または48のいずれか1つを含むかまたはから成ってもよい。本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。また、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本明細書に記載の抗原結合タンパク質を好適な宿主細胞で産生してもよい。抗原結合タンパク質を作製する方法は本明細書に記載の宿主細胞を培養するステップおよびその抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである。組換え、形質転換、形質移入、または形質導入された宿主細胞は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含みかつさらに本明細書に記載の抗原結合タンパク質の軽鎖可変域をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むものであってもよい。あるいは、組換え、形質転換、形質移入、または形質導入された宿主細胞は、少なくとも1つの発現カセットここで、第1の発現カセットは本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖可変域をコードするポリヌクレオチドを含むを含み、かつさらに本明細書に記載の抗原結合タンパク質の軽鎖可変域をコードするポリヌクレオチドを含む第2のカセットを含んでもよい。安定して形質転換された宿主細胞は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の重鎖および/または軽鎖可変域をコードする1以上の発現カセットを含むベクターを含んでもよい。例えば、かかる宿主細胞は軽鎖可変域をコードする第1のベクターおよび重鎖可変域をコードする第2のベクターを含んでもよい。宿主細胞は真核生物、例えば哺乳動物であってもよい。かかる細胞の例はCHOチャイニーズハムスター卵巣またはNS0骨髄腫細胞株を含む。宿主細胞は非ヒト宿主細胞であってもよい。宿主細胞は非胚性宿主細胞であってもよい。宿主細胞を培地、例えば、血清を含まない培地で培養してもよい。抗原結合タンパク質は宿主細胞により培地中に分泌されてもよい。抗原結合タンパク質を含有する前記培地については、抗原結合タンパク質を少なくとも95以上例えば、98以上に精製することができる。本発明の抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質および生理学的に許容される担体を含む組成物として、または抗原結合タンパク質および製薬上許容される担体として提供することができる。かかる組成物を使用のための取扱説明書と一緒に含む部品のキットを提供してもよい。便宜上、前記キットは所定量の試薬を使用のための取扱説明書と共に含んでもよい。抗体構造ほとんどの脊椎動物種は、定常域のアミノ酸配列に基づいて、2つの型、いわゆるKappaおよびLambdaのうちの1つに割り当てることができる。それらの重鎖の定常域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体は5つの異なるクラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに割り当てることができる。それらの重鎖の定常域のアミノ酸配列によって、ヒト抗体IgGおよびIgAはさらにサブクラス、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4;およびIgA1およびIgA2に細分することができる。マウスおよびラットについては少なくともIgG2a、IgG2bを有する種特異体が存在する。可変域のより保存された部分はフレームワーク域FRと呼ばれる。無処置の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ3つのCDRにより接続された4つのFRを含む。各鎖中のCDRは4つのFRにより他の鎖由来のCDRとごく近位に一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。産生方法抗原結合タンパク質は遺伝子組換え生物、例えば、ヤギ例えば、PollocketalJImmunolMethods231147157を参照、ニワトリ例えば、MorrowGenetEngNews20155を参照、マウス例えば、Pollocketal1999を参照または植物例えば、DoranCurrOpinionBiotechnol11199204MaNatMed4601606BaezetalBioPharm135054StogeretalPlantMolBiol42583590を参照で産生することができる。抗原結合タンパク質はまた化学合成により作製することができる。しかし、抗原結合タンパク質は典型的には、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて産生される。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離して複製可能なベクター、例えばプラスミド中に挿入し、さらにクローニング増幅または発現を行う。1つの発現系はグルタミン酸シンテターゼ系例えば、LonzaBiologicsBaselSwitzerlandより販売であり、その場合、特に宿主細胞はCHOまたはNSOである。抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは容易に単離され、慣用の手順例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いて配列決定される。使用できるベクターにはプラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ミニ染色体が含まれ、そのなかで典型的にはプラスミドが使用される。一般に、かかるベクターにはさらに、シグナル配列、複製起点、1以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列sが含まれ、これらは発現を促進するために抗原結合タンパク質ポリヌクレオチドと機能的に連結されている。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別々のベクター中に例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーションまたは形質導入により挿入し、同じ宿主細胞中に同時にまたは逐次導入してもよく、または所望であれば、重鎖および軽鎖の両方を前記導入前に同じベクター中に導入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、宿主細胞により産生されるタンパク質のレベルを増加してもよい。いくつかの方法が開示されているNakamuraetalNucleicAcidsResearch24214215W09834640W09711086。遺伝コードの縮退によって、本明細書に開示したものの代わりのポリヌクレオチド特に所与の宿主細胞における発現に対して最適化されたこれらのコドンも本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードすることができる。本発明の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン利用を改変して宿主細胞のコドンバイアスに適応させ、転写物および/または産物収率を増加することができる例えば、HoekemaetalMolCellBiol19877291424。コドンの選択は発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づいてもよい。抗原結合タンパク質は、成熟タンパク質のN末端に特異な切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として作製してもよい。このシグナル配列は認識されかつ宿主細胞によりプロセシングされなければならない。原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱に安定なエンテロトキシンIIリーダーであってもよい。酵母分泌については、シグナル配列は例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸ホスファターゼリーダーであってもよく、例えば、WO9013646を参照されたい。哺乳動物細胞系においては、ウイルス分泌性リーダー、例えばヘルペスシンプレックスgDシグナルおよび未変性免疫グロブリンシグナル配列が好適でありうる。典型的にはこのシグナル配列を、抗原結合タンパク質をコードするDNAと読み枠内で結合する。複製起点は当技術分野で周知であり、pBR322はほとんどのグラム陰性細菌に対して、2μプラスミドはほとんどの酵母に対して、および、様々なウイルス起源のもの、例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVはほとんどの哺乳動物細胞に対して好適である。一般に複製起点成分は哺乳動物発現ベクターに必要でないが、SV40は初期プロモーターを含有するので使用してもよい。典型的な選択遺伝子は抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるタンパク質または補体栄養要求性欠陥または複合培地で利用できない補給栄養分または両方の組み合わせをコードする。選択スキームは宿主細胞の増殖を静止することに関わる。例えば、抗原結合タンパク質をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、共に送達された選択マーカーにより与えられる薬物耐性によって生存する。一例は、形質転換体をメトトレキセートの存在のもとで培養するジヒドロ葉酸レダクターゼDHFR選択マーカーである。細胞を増加量のメトトレキセートの存在のもとで培養して目的の外因性遺伝子のコピー数を増幅することができる。CHO細胞はDHFR選択用に特に有用な細胞株である。さらなる例はグルタミン酸シンテターゼ発現系LonzaBiologicsBaselSwitzerlandである。酵母で使用する選択遺伝子の一例はtrp1遺伝子であり、StinchcombetalNature28238を参照されたい。抗原結合タンパク質を発現するために好適なプロモーターを、抗原結合タンパク質をコードするDNA/ポリヌクレオチドと機能的に連結する。原核生物宿主のためのプロモーターには、phoAプロモーター、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばTacが含まれる。酵母細胞における発現に好適なプロモーターには、3ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6リン酸塩イソメラーゼ、3ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグリコキナーゼが含まれる。誘導性酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロームC、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトースガラクトース利用に関与する酵素が含まれる。哺乳動物細胞系での発現のためのプロモーターには、ウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよび初期または後期シミアンウイルス40が含まれる。勿論、プロモーターの選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。第1のプラスミドはRSVおよび/またはSV40および/またはCMVプロモーター、ネオマイシンおよびアンピシリン耐性選択マーカーと一緒に軽鎖可変域VL、κC領域をコードするDNAを含んでもよく、そして第2のプラスミドはRSVまたはSV40プロモーター、重鎖可変域VHをコードするDNA、γ1定常域、DHFRおよびアンピシリン耐性マーカーをコードするDNAを含んでもよい。適宜、例えば高等真核生物での発現については、ベクター中のプロモーターエレメントと機能的に連結されたエンハンサーエレメントを用いることができる。哺乳動物のエンハンサー配列には、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント、例えばSV40エンハンサーbp100~270、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはマウスIgG2a遺伝子座を使用することができるWO04009823を参照のこと。エンハンサーはベクターでプロモーターの上流部位に位置してもよい。あるいは、エンハンサーは他の場所、例えば非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択および位置は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づいてよい。真核生物系において、ポリアデニル化シグナルは抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。かかるシグナルは典型的にはオープンリーディングフレームの3に置かれる。哺乳動物系において、非限定的な例には成長ホルモン、伸長因子1αおよびウイルス例えば、SV40遺伝子またはレトロウイルス長末端反復配列由来のシグナルが含まれる。酵母系では、ポリアデニル化/終結シグナルの非限定的な例には、ホスホグリセリン酸キナーゼPGKおよびアルコールデヒドロゲナーゼ1ADH遺伝子由来のものが含まれる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは典型的に必要とされず、代わりに、通常、より短くてより規定されたターミネーター配列を用いる。ポリアデニル化/終結配列の選択は、発現に使用される宿主細胞との好適な適合性に基づく。上記に加えて、収率を高めるために利用できる他の特徴には、クロマチン再構築エレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。本発明の抗原結合タンパク質をコードするクローニングまたは発現ベクターに好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞には、真正細菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア菌Escherichia、例えば大腸菌Ecoli例えばATCC31446;31537;27325、腸内細菌Enterobacter、エルウィニア菌Erwinia、クレブシエラ菌Klebsiellaプロテウス菌Proteus、サルモネラ菌Salmonella、例えばネズミチフス菌、セラチア菌Serratia、例えばセレトアマルセンス菌Serratiamarcescens、および赤痢菌Shigella、ならびにバシラス菌Bacilli、例えば枯草菌Bsubtilisおよびバシラスリシェニフォルミス菌Blicheniformis;DD266710を参照のこと、シュードモナス菌Pseudomonas、例えば緑膿菌Paeruginosaおよびストレプトマイセス菌Streptomycesが含まれる。酵母宿主細胞のなかでは、サッカロミセスセレビジエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベschizosaccharomycespombe、クルイベロミセスKluyveromyces例えばATCC16045124242417856500、ヤロウィアyarrowiaEP402、226、ピキアパストリスPichiaPastorisEP183、070、PengetalJBiotechnol1082004185192も参照、カンジダCandida、トリコデルマリーシアTrichodermareesiaEP244、234、ペニシリンPenicillin、トリポクラジウムTolypocladiumおよびアスペルギルス属Aspergillus宿主、例えばAnidulansおよびAnigerも意図している。高等真核宿主細胞には、哺乳動物細胞、例えばCOS1ATCCNoCRL1650COS7ATCCCRL1651、ヒト胎性腎系統293、ベビーハムスター腎細胞BHKATCCCRL1632、BHK570ATCCNO:CRL10314、293ATCCNOCRL1573、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO例えばCHOK1、ATCCNO:CCL61、DHFRCHO細胞株またはDHFRマイナスCHO細胞株、例えばDG44Urlaubetal、SomatCellMolGenet1986Vol12pp555566、特に懸濁培養に適合させたそれらのCHO細胞株、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞ATCCCRL1587、HELA細胞、イヌ腎細胞ATCCCCL34、ヒト肺細胞ATCCCCL75、HepG2および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えばNS0米国特許US5807715を参照、Sp20、Y0が含まれる。かかる宿主細胞をさらに遺伝子操作するかまたは適合させて、抗原結合タンパク質の品質、機能および/または収率を改変してもよい。限定されるものでない例には、特定の修飾酵素例えばグリコシル化酵素およびタンパク質フォールディングシャペロンの発現が含まれる。抗原結合タンパク質、例えば抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞を当業者に公知の任意の方法により培養してもよい。宿主細胞は、スピナーフラスコ、ローラーボトル、または中空繊維系で培養することができるが、大量生産には攪拌タンクリアクターまたはバッグリアクター例えば、WaveBiotechSomersetNewJerseyUSAを特に懸濁培養に使用する。例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断インペラーを使用して攪拌タンカーを曝気用に改造してもよい。バブルカラムおよびエアリフトリアクターについては、空気または酸素気泡での直接曝気を用いることができる。宿主細胞を無血清培地で培養する場合、曝気工程の結果としての細胞損傷の防止を支援するためにプルロニックF68等の細胞保護剤を培地に補充する。宿主細胞の特徴に応じて、ミクロキャリアを足場依存性細胞株の増殖基質として用いるか、または細胞を懸濁培養に適合させてもよい。宿主細胞、特に脊椎動物宿主細胞の培養では、様々な操作様式、例えば流加バッチ、反復バッチプロセスDrapeauetalcytotechnology15103109を参照、拡張バッチプロセスまたは潅流培養を利用してもよい。遺伝子組換えで形質転換された哺乳動物宿主細胞は、ウシ胎児血清FCSなどの血清添加培地で培養してもよいが、例えば、かかる宿主細胞をKeenetalCytotechnology17153163に開示されたような合成無血清培地、またはProCHOCDMもしくはUltraCHOCambrexNJUSAなどの市販の培地で培養し、必要に応じてエネルギー源、例えばグルコースおよび合成成長因子、例えば組換えインスリンを補充する。宿主細胞の無血清培養は、これらの細胞が無血清条件での成長に適合することを必要としうる。1つの適合化手法は、かかる宿主細胞を血清添加培地で培養し、培地の80を無血清培地と交換することを繰り返し、その結果、宿主細胞が無血清条件への適合を習得することである例えば、ScharfenbergKetalinAnimalCelltechnologyDevelopmentstowardsthe21stcenturypp619623KluwerAcademicpublishersを参照。培地中に分泌された本発明の抗原結合タンパク質を回収し、そして使用目的に好適な精製の程度を与える様々な技術を用いて精製することができる。例えば、ヒト患者の治療に対する本発明の治療用抗原結合タンパク質の使用は、典型的には、少なくとも95の純度、より典型的には98または99以上の純度粗培地と比較してを必要とする。培地由来の細胞砕片は、典型的には、遠心分離、続いての例えば、精密ろ過、限外ろ過およびまたは深層濾過を使用する上清の清澄化ステップを使用して除去される。種々の他の技法、例えば透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技法、例えばヒドロキシアパタイトHA、アフィニティークロマトグラフィー場合によりポリヒスチジン等のアフィニティータグ付け系を含むおよび/または疎水性相互作用クロマトグラフィーHIC、米国特許5429746を参照が利用可能である。様々な清澄化ステップの後に、抗体をプロテインAまたはGアフィニティークロマトグラフィーを用いて捕獲することができる。さらなるクロマトグラフィーステップ、例えばイオン交換およびまたはHAクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫安沈降をその後に続けることができる。種々のウイルス除去ステップ例えばナノ濾過例えばDV20フィルターを使用するを用いることもできる。これらの様々なステップの後に、少なくとも75mgml以上、または100mgml以上の抗原結合タンパク質を含む精製された調製物が得られる。かかる調製物は抗原結合タンパク質の凝集型を実質的に含まない。細菌系を抗原結合タンパク質の発現に用いることができる。かかる断片は細胞内または周辺質内に局在するかまたは細胞外に分泌しうる。当業者に公知の方法に従って、不溶性タンパク質は抽出して再フォールディングし、活性タンパク質を形成させることができる。SanchezetalJBiotechnol721320;およびCupitPMetalLettApplMicrobiol29273277を参照されたい。脱アミドはアミド官能基を除去する化学反応である。生化学において、この反応はタンパク質を分解する上で重要である、何故なら、これはアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンのアミド含有側鎖を損傷するからである。脱アミド反応は、医療用タンパク質の製造中に起こる共通の翻訳後改変である。例えば、組換えヒトDNAseおよび組換え可溶性CD4についてはinvitroまたはinvivo生物学的活性の低下または喪失が報じられているが、他の組換えタンパク質は影響を受けないようである。MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するmAbを産生する方法本発明はさらにMAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、MAGEA2またはMAGEA12と結合しないまたは特異的に結合しないモノクローナル抗体を作り、特定し、そして産生する方法を提供する。その方法は、動物例えばマウスを、多様なエピトープ、すなわち、MAGEA3およびMAGEA6の両方で見出される配列と100類似するが、MAGEA2もしくはMAGEA12のいずれの部分とも低い配列類似性しか示さないアミノ酸配列を含む、少なくとも1つの免疫化ペプチドを用いて免疫化するステップを含む。アミノ酸配列はMAGEA2またはMAGEA12のいずれの部分とも90、80、77、75、または70未満の低い類似性を示しうる。前記アミノ酸配列を含む免疫化ペプチドを合成して任意に担体タンパク質例えば、キーホールリンペットヘモシアニンと連結し;1つまたは2つのアミノ酸をアミノ酸配列に加えて担体タンパク質との連結を容易にしかつ距離を離した。かかるペプチドの例には配列番号35、配列番号36、および配列番号37が含まれる。本発明はさらに、MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、いずれの他のMAGEAサブファミリーメンバーとも結合しないまたは特異的に結合しないモノクローナル抗体を作り、特定し、そして産生する方法を含む。免疫化の後、免疫した動物を用いて、いずれかの好適な方法、例えば、KohlerandMilsteinNature256495に初めて記載されたハイブリドーマ法によりモノクローナル抗体を産生する。スクリーニングを行い、MAGEA3およびMAGEA6と特異的に結合するが、MAGEA2またはMAGEA12と結合しないモノクローナル抗体を特定する。かかるスクリーニングはハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体を用いて行うことができる。モノクローナル抗体をコードするDNAをハイブリドーマ細胞から単離して当技術分野で公知の方法を用いて配列決定し、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を得ることができる。所望のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の部分をコードするDNAを次いで発現ベクター中に配置して好適な宿主細胞に形質移入し、コードされたポリペプチドを発現することができる。DNAはまた、例えば、ヒト重鎖および/または軽鎖フレームワーク域をコードする配列を、対応する配列の代わりに、置き換えることにより改変することもできる。使用方法本明細書に記載の抗原結合タンパク質を用いて生体サンプル中のMAGEA3および/またはMAGEA6をinvitroまたはinvivoで検出することができる。検出は研究、治療または診断の目的であってもよい。例えば、抗MAGEA3抗原結合タンパク質を用いて培養細胞中の、組織中の、体液中のまたは血清中のMAGEA3を検出することができる。組織は最初にヒトまたは動物身体から何らかの理由例えば、バイオプシー、または、外科中に切除された組織で取り出されていてもよいし、またヒト患者から得た腫瘍組織限定されるものでないが、黒色腫および非小細胞性肺癌を含むであってもよい。通常のイムノアッセイを使うことができ、それはELISA、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または免疫沈降を含みうる。MAGEA3の存在またはレベルを疾患と関係づけることにより、当業者はMAGEA3発現に関連する疾患を診断することができる。被験体、例えば、ヒト被験体からの腫瘍組織中のMAGEA3の検出を用いて、腫瘍を発現するMAGEA3を治療するように設計された治療薬に被験体が好適であるかまたは反応しうるかを確認することができる。本発明の抗原結合タンパク質はMAGEA3および/またはMAGEA6タンパク質を検出するのに有用であり、ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE組織をMAGEA3および/またはMAGEA6についてスクリーニングするのに有用でありうる。MAGENの予想アミノ酸配列配列番号68Genebank、遺伝子座番号AF443295;ZhangetalOncologyReport202452008はMAGEA3のN末端領域アミノ酸1~129と97類似性を有し、1つのアミノ酸差を持つ。MAGENのN末端領域のアミノ酸73~90に対応する配列は、MAGEA3中のアミノ酸73~90に対応するペプチドMA33配列番号37中のMAGEA3断片のアミノ酸配列と同一である。本明細書に記載の抗原結合タンパク質はMA33ペプチドと特異的に結合する図7。従って、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を用いて生体サンプル中のMAGENをinvitroまたはinvivoで検出することができる。検出は治療または診断目的のためであってもよい。例えば、抗MAGEA3抗原結合タンパク質を用いて培養細胞中の、組織中の、体液中のまたは血清中のMAGENを検出することができる。組織は最初にヒトまたは動物身体から何らかの理由例えば、バイオプシー、または、外科中に切除された組織で取り出されていてもよいし、またヒト患者から得た腫瘍組織限定されるものでないが、肝細胞癌を含むであってもよい。ELISA、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または免疫沈降を含む、通常のイムノアッセイを用いることができる。MAGENの存在またはレベルを疾患、例えば肝細胞癌と関係づけることにより、当業者はMAGEN発現に関連する疾患を診断することができる。被験体、例えば、ヒト被験体からの腫瘍組織中のMAGENの検出を用いて、腫瘍を発現するMAGENを治療するように設計された治療薬に被験体が好適であるかまたはおそらく反応しうるかを確認することができる。本発明の抗原結合タンパク質はMAGENタンパク質を検出するのに有用であり、ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE組織をMAGENについてスクリーニングするのに有用でありうる。本発明の抗原結合タンパク質を、1以上の抗原結合タンパク質、検出可能な標識、およびキット使用のための取扱説明書を含む診断キットに入れて提供することができる。便宜上、キットは予め定めた量の試薬を、使用の説明書と共に含みうる。配列配列番号1~11:それぞれ、ヒトMAGEA1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11、およびA12。配列番号12~22:MAGEA3aa66~91に対応するMAGEA1、A12、A2、A3、A6、A4、A5、A8、A10、A11、およびA9の断片。配列番号23:MAGEA3aa6691に対応する断片のコンセンサス配列。配列番号24~33:MAGEA3aa137180に対応するMAGEA1、A12、A2、A3、A6、A4、A8、A10、A11、およびA9の断片。配列番号34:MAGEA3aa137180に対応する断片のコンセンサス配列。配列番号35:免疫化用のペプチドMA31。配列番号36:免疫化用のペプチドMA32。配列番号37:免疫化用のペプチドMA33。配列番号38~49:mAb16G7およびmAb23D2に対する重鎖および軽鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。配列番号50~52:mAb1B1のCDRH1~CDRH3。配列番号53~55:mAb1B1のCDRL1~CDRL3。配列番号56~58:mAb16G7のCDRH1~CDRH3。配列番号59~61:mAb16G7のCDRL1~CDRL3。配列番号62~64:mAb23D2のCDRH1~CDRH3。配列番号65~67:mAb23D2のCDRL1~CDRL3。配列番号68:MAGEN実施例全長MAGEA3およびMAGEA3ペプチドの合成他のMAGEAタンパク質と交差反応する抗体を得る機会を減ずるために、MAGEA3タンパク質からの多様なエピトープを特定し、これらのエピトープを含有するペプチドを用いてマウスを免疫化した。マウスを全長組換えMAGEA3タンパク質配列番号3を用いて免疫化することから成る第2の計画も用いた。多様なエピトープを特定した。これらのエピトープは他のMAGEAタンパク質配列高度に類似するMAGEA6配列を除いてに対して、より低い配列類似性を示すMAGEA3の2つの領域を起源とした。第1の領域はMAGEA3のアミノ酸AA66~91配列番号15にまたがり、MAGEA2およびMAGEA12とそれぞれ73および76同一性を示す。第2の領域はMAGEA3配列番号27のAA137~180配列番号27を含み、MAGEA2およびMAGEA12の両方と72同一性を示す図3。多様なエピトープを含有する3種のペプチドの全てを合成した表3;MAGEA3中のアミノ酸163~180の配列はGIELMEVDPIGHLYIFATである図1参照。不注意な誤りがあってMA32ペプチドをCGIELMEVDPIGHLYFATとして合成し、MAGEA3配列の残基177に対応するイソロイシンを含有しなかった。1つまたは2つのアミノ酸表3で下線を引いたものをMA3ペプチドのNH2末端に加えて担体タンパク質との連結を容易にしかつ距離を離した。3種のMAGEA3断片はMAGEA6と高い配列類似性を有するので、得られる抗体はこのタンパク質と交差反応しうると予想した。MA31、MA32、およびMA33ペプチドを合成しNewEnglandPeptideInc、キーホールリンペットヘモシアニンKLHと直接コンジュゲートした。ペプチドKLHコンジュゲートは1mgmlの濃度であった。コンジュゲートしてない凍結乾燥MA31、MA32、およびMA33ペプチドも合成したNEPInc。バキュロウイルス中に全0426mgmlの濃度で産生した3mgのMAGEA3組換えタンパク質および大腸菌中に1487mgmlの濃度で産生した3mgのMAGEA3組換えタンパク質を得たGSKBiologicalsRixensartBelgium。0486mgmlの濃度のMAGEA2組換えタンパク質および0458mgmlの濃度のMAGEA2組換えタンパク質も得たGSKBiologicalsLavalCanada。全てのこれらの材料を20°Cにてアリコートとして保存した。免疫化計画異なる免疫化計画を有する2つのプロトコルを同時に実施した。これらの実験は制度上の動物倫理委員会theinstitutionalAnimalEthicsCommitteeにより承認されたものである。各プロトコルは、CharlesRiverIncから購入した4匹の6~8週齢の雌性Balbcマウスを免疫化するステップから成った。免疫化前に、各マウスについて血液サンプルを採取して免疫前血清を得た。第1のプロトコルIMM134はアジュバントQuilACedarlaneLaboratoriesLtdHornbyONCanadaSuperfosBiosectorVedbaekDenmarkの存在のもとで3種のペプチドKLHコンジュゲートの混合物実施例1に記載の通りでマウスを免疫化するステップから成った。各マウスに、第0日、第14日および第35日に、10μgの各ペプチドKLHコンジュゲートおよび10μgのQuilAを100μlの容積で皮下sc注射した。第45日に血液サンプルを採取して分析した。実施例11は以下のプロトコルの詳細を説明する。第2のプロトコルIMM135はMAGEA3組換えタンパク質でマウスを免疫化するステップから成った。各マウスに、第0日、第14日および第35日に、バキュロウイルスで産生した20μgのMAGEA3組換えタンパク質および10μgのQuilAを100μlの容積で皮下sc注射した。第45日に血液サンプルを採取して分析した。実施例11は本実施例で実施した以下のプロトコルの詳細を説明する。力価決定、マウス選択および最終追加免疫の結果実施例2からの各免疫化マウスから得た免疫前第0日血清および第45日に得た色々な濃度の血清を、バキュロウイルスで産生した組換えMAGEA3タンパク質についてELISAにより試験した図4Aおよび4B。次いで第2のELISA分析を行い、各プロトコルからの1マウスの血清を組換えMAGEA3、MAGEA2およびMAGEA12タンパク質でならびにそれぞれKLHとコンジュゲートした3種のMAGEA3ペプチドMA31、MA32およびMA33で試験した。これらの血清の反応性を免疫前血清マウス1、IMM135、mAb57B陽性対照として、無関係なmAbM344陰性対照、および二次抗体ヤギ抗マウスGAMIgGHRP、JacksonImmunoResearch単独陰性対照の反応性と比較した図5。NuncMAXISORP登録商標96ウエルのウエルを抗原でコーティングした。抗原をTris緩衝化生理食塩水TBS中に精製組換えMAGEタンパク質について01μg50μlにてまたはKLHとコンジュゲートしたペプチドについて01μg50μlにて希釈し、そして01μg50μlにて配給し、そして一晩37°Cにて乾燥した。ウエルを数回TBSで洗浄し、50μlのTBS1カゼインを各ウエルに加えた。ウエルを1時間37°Cにてインキュベートし再び数回TBSで洗浄した。50μlのマウス血清を加え、TBS002カゼインで希釈し、次いで1時間37°Cにて加湿室内でインキュベートしそしてTBSで6回洗浄した。次いで二次抗体を加えた:50μlウエルの西洋わさびペルオキシダーゼHRPコンジュゲートした二次抗体GAMIgGHRPJacksonImmunoResearchを加え、TBS002カゼインに15000で希釈し加湿室内で1時間37°Cにてインキュベートした。次いでウエルを6回TBSで洗浄した。顕色:50μlウエルの22アジノビスABTSChemiconInternationalCatES004500mlを加え、30分間37°Cにて加湿室内でインキュベートした。反応を50μlウエルのABTSブロック溶液を加えることにより停止した。405nmの光学密度をプレートリーダーMolecularDevicesで読み取った。全8マウスからの血清を11000~1500000の範囲で希釈したMAGEA3タンパク質に対して試験した。図4Aは、KLHとコンジュゲートした3ペプチドの混合物で免疫化したマウスの間でプロトコルIMM134、マウス3が最高力価を有したことを示す。第2に高い力価はマウス4であった。図4Bに示すように、組換えMAGEA3タンパク質プロトコルIMM135で免疫化したマウスのグループ中では、マウス1が最高力価を有した。抗血清の特異性を確認するためにおよびプロトコルIMM134からのマウスのどのペプチド抗血清と反応性があるかを確認するために第2のELISA分析を実施し、この試験では、各プロトコルからのマウスの血清1:1000希釈を、組換えMAGEA3、MAGEA2およびMAGEA12タンパク質ならびにKLHとコンジュゲートした3種のMAGEA3ペプチドのそれぞれで試験した。図5は、IMM134マウス4の血清は組換えMAGEA3と反応したが、MAGEA2またはMAGEA12、ペプチドと反応しなかったことを示す。これはまた、多様なペプチドを用いる免疫化計画IMM134がMAGEA3A6に特異的な抗体を産生するのに有効であったことを示す。このマウスの血清はまた、MAGEA3ペプチド2および3と反応性があるがペプチド1と反応性がなく、ペプチド1は免疫原性が小さいことおよびペプチド2と3はMAGEA3に特異的なエピトープを含有することを示す。IMM135マウス1の血清は、他方、MAGEA2およびMAGEA12とも交差反応するので、MAGEA3に特異的でなかった。この血清のMAGEA3ペプチド3との強い反応性はこのペプチドが免疫優性エピトープを含有することを示唆する図5。細胞融合結果KLHとコンジュゲートしたペプチドの混合物で免疫化したマウスからの血清の抗体力価の故に、およびこれがMAGEA3/A6に特異的な抗体の産生をもたらした上記実施例3を参照故に、マウス3IMM134;実施例2からの脾細胞を用いて細胞融合を実施した。最終追加免疫は、先のマウス3IMM134における免疫化に用いたのと同じ量の抗原10μgの各ペプチドKLHコンジュゲートを注射することにより実施した。しかし、最終追加免疫は静脈内にivアジュバント無しで与えることを意図した。マウス3IMM134の最終追加免疫で技術的誤りがあって抗原をQuilAの存在のもとで注射し、注射後数分間にマウスが死亡した。それ故に最終追加免疫を、マウス4IMM4を用いて繰り返した。マウス4を最終追加免疫の3日後に心穿刺により犠牲にした。採集した血液を用いて血清を調製した。マウス4の脾臓を無菌条件のもとで取出し、脾細胞を単離して融合体を調製した。実施例12は本実施例実施後のプロトコルを説明する。概要を述べると、脾細胞を数回培地βメルカプトエタノール、100Uのペニシリン、および100Uのストレプトマイシンを含有するIscove培地で洗浄し、計数を行った。総数で1875×106個の生細胞および80×106個の死細胞70生存率を得た。脾細胞を培養し、希釈し、洗浄し、そして計数した実施例12を参照。総数で663×106個の生細胞および15×106個の死細胞77生存率を得た。1875×106個の脾細胞を次いで663×106個のSP2細胞と融合したおよそ3:1の脾細胞SP2比。ハイブリドーマを、200μlウエルの細胞懸濁液を用いて23枚の96ウエルプレートにまいた。抗体スクリーニングの結果実施例4に記載の融合後13日に、クローンを試験する準備ができた。23枚のプレートを観察すると各ウエル中に1~5クローンが見出された。抗MAGEA3反応性のクローンをELISAにより特定した。NuncMAXISORP登録商標96ウエルプレートのウエルを組換えMAGEA3タンパク質でコーティングした。MAGEA3をTris緩衝化生理食塩水TBSに01μg50μlで希釈し、50μlウエルで配給しそして一晩37°Cにて乾燥した。ウエルを数回、TBSで洗浄しそして50μlのTBS1カゼインを各ウエルに加えた。ウエルを1時間37°Cにてインキュベートしそして再び数回TBSで洗浄した。実施例4で得た23枚の96ウエルプレートの各ウエルからTBS002カゼインに希釈した50μlの培地上清を得て、MAGEA3タンパク質でコーティングしたウエル中に移し、次いで1時間37°Cにて加湿室内でインキュベートし、そしてTBSで6回洗浄した。各プレートのウエルH12からの上清を、陽性対照として50μlの57Bハイブリドーマ上清で置き換えた。反応性の抗体を、実施例3に説明したMAGEA3に対するELISAプロトコルで示したように明らかにした。陽性クローンは、405nmにて大部分の他のクローンと比較してより高い吸収をもつものであった。少なくとも135個のMAGEA3反応性のクローンを特定した結果は示してない。これらの可能性のあるクローンを、1mlの完全培地を含有する24ウエルプレートのウエル中に移し、細胞を拡大した。ハイブリドーマ選択とサブクローニング結果24ウエルプレートに移した後に容易に生育した実施例5からの総数75個のクローンを2日後に、次の抗原:組換えMAGEA3、組換えMAGEA2;組換えMAGEA12;KLHとコンジュゲートしたペプチドMA31;KLHとコンジュゲートしたペプチドMA32;およびKLHとコンジュゲートしたペプチドMA33との反応性についてELISAで試験した。各クローンについて50μlの培地上清を、01μgウエルの組換えMAGEタンパク質の1つまたは05μgウエルのKLHとコンジュゲートしたペプチドの1つを含有する96ウエルプレートの1ウエル中に移した。陽性対照として、50μlの57Bハイブリドーマ上清を各抗原について試験した。反応性の抗体を、実施例3に記載のプロトコルを用いて明らかにした。75個のクローンから58個がMAGEA3との反応性を保存したが50個だけがMAGEA3に特異的であった8個のクローンはMAGEA12と交差反応性を示し、1個はMAGEA2とも交差反応したクローン3H2、4B5、5D3、9H8、12F3、13A6、18H11、19H3。少数のクローンは全ての抗原と反応し非特異的であった。ペプチドKLHコンジュゲートとの反応性については、MAGEA3に特異的なクローンの大部分はペプチドMA33とだけ反応性であったが、少数はペプチドMA32とも低い反応性を示した。ただ2つのクローンはペプチドMA33とよりもペプチドMA32とより強い反応性を示したクローン9A5および21A8。図6Aおよび6Bは、1B1、16G7および23D2を含む、これらの75個のクローンのいくつかの反応性を示す。全クローンに対する結果は示してない。ホルマリン固定パラフィン包埋組織中のMAGEA3を検出するmAbの能力を評価するために、一連の22個のMAGEA3特異的クローン上清110希釈したの反応性を、TC1細胞のマウス異種移植片TC1;MAGEA3を発現するTC1細胞のマウス異種移植片TC1MAGEA3細胞、およびヒト精巣サンプルに対する免疫組織化学IHCにより試験した。対照として、同じ組織を1200に希釈したmAb57B上清で試験した。TC1細胞のマウス異種移植片はGSKにより提供された;以下のIHCプロトコルについては実施例13を参照されたい。最良の分泌能力と特異性を持つクローンのなかから22個のクローンを無作為に拾い、クローンのFFPE組織中のMAGEA3を検出する能力の初期評価を与えた。TC1腫瘍細胞はTCWuJohnsHopkinsUniversity、Baltimore、MDからの好意による提供であった。これらはC57BL6マウスの一次肺細胞から、HPV16E6およびE7遺伝子および活性化ras癌遺伝子の逐次導入により産生されたものであり、先に記載されているLinKetalCancerRes56216。次いで、TC1細胞にMAGEA3をコードするプラスミドを安定して形質移入した。表4はIHC分析の結果を示す。22クローンはいずれもTC1異種移植片と反応性を示さなかった。しかし、7クローンクローン1B1、1B12、3A5、5A2、16C1、16G7および23D2はTC1MAGEA3細胞と反応性を示した。これらの7クローンのうちで、23D2上清だけがヒト精巣サンプルと弱い反応性精原細胞とおよび場合によっては一次精母細胞と関連する反応性を示した。MAb57BはTC1細胞の異種移植片に陰性であったが、TC1MAGEA3細胞の異種移植片と、ならびにヒト精巣ここでは精母細胞および精原細胞の強い染色が観察されたと強い反応性があった。IHCで反応性の7クローン1B1、1B12、3A5、5A2、16C1、16G7および23D2を次いで、クローン13A6これはMAGEA2およびA12と交差反応性を示したのようにサブクローニングした以下のプロトコルについては実施例14を参照されたい。最初のサブクローニング後に、クローン1B1、3A5、16G7および23D2はなお組換えMAGEA3と反応性であった。1B1、16G7および23D2の第2のサブクローニングにおいて、試験したクローンの1002020は組換えMAGEA3と反応性であって、これらのハイブリドーマはモノクローナル抗体を分泌する純粋なクローンと考えられた。第2のサブクローニングはクローン13A6に対しても行った。クローン3A5は第2サブクローニング後に純粋と考えることはできなかった、というのは、試験した20サブクローンのうちの1つのサブクローンはMAGEA3と反応しなかったからである。それ故に第3のサブクローニングをクローン3A5について実施したが、24クローンのうちの15サブクローンが反応性になり、このクローンは不安定であることを示した。それ故にクローン3A5のサブクローニングを停止した。クローン1B1、16G7、23D2、および13A6の第2のサブクローニング後、これらのクローンは標準培地100Uのペニシリンおよび100Uのストレプトマイシン、50μMβメルカプトエタノールおよび10ウシ胎児血清を含有するIscove培地での増殖に徐々に適合した。細胞を最初、HATおよびP288D1順化培地なしの完全培地で増殖した。次いで細胞を20の代わりに10ウシ胎児血清だけを含有する培地で増殖した。細胞が標準完全培地での増殖に完全に適合した時に、ELISAを実施してクローンがまだ抗MAGEA3抗体を分泌しているのを確認した図7。クローン1B1、16G7および23D2はKLHとコンジュゲートしたMAGEA3ペプチド3とおよび組換えMAGEA3タンパク質と強く反応したが、他の抗原と反応せず、サブクローニングの後、クローンがその本来の反応性を保持することを示した。安全処置として、全クローンからの細胞をサブクローニングプロセスの様々なステップで凍結した。凍結細胞のマスターストックの調製標準培地での増殖に適合した実施例6からのハイブリドーマを増幅して凍結細胞の大きいストックを調製した。各ハイブリドーマについて、10x106生細胞1ml中にを含有する少なくとも20個のクリオチューブを90FCS10DMSO中で凍結した。クリオチューブをMrFrostyNalgeneCat5100001ボックス中で80°Cにて一晩凍結し、次いで80°Cにて貯蔵した。マスターストックを保存している80°C生物凍結器に機械的な問題が起こって温度が40°Cに上昇した。細胞を直ちに解凍し、標準培地で培養した。高い死亡率のパーセント>90は実施例6に記載の2つの追加のサブクローニングの実施をもたらし、ハイブリドーマが分泌ハイブリドーマの純粋なクローンであることを保証した。第2のサブクローニングの後、90超の生存率で、90FCS10DMSO中に10x106生細胞を含有する少なくとも20クリオチューブを含むものである新しいマスターストックを調製した。クリオチューブをMrFrostyNalgeneCat5100001ボックス中で80°Cにて一晩凍結し、そして液体窒素中に移した。抗体特徴付けハイブリドーマ1B1、16G7および23D2から産生されたmAbの性質、活性および特異性を特徴付けるために、実施例7から得たハイブリドーマを大量に増殖して500mlロットのハイブリドーマ上清を産生した。抗体濃度:これらのロットのハイブリドーマのそれぞれにおける抗体濃度をサンドイッチELISAによりマウスIgG標準曲線を用いて測定した。マウスIgGおよびIgMに対するヤギポリクローナル抗体JacksonImmunoresearchCat115005044の05μg50μlウエルでコーティングした96ウエルプレートを用いた。コーティング後、プレートを一晩37°Cにて乾燥し、次いでウエルを3回TBSで洗浄しそして1ウエル当たり50μlのTBS1カゼインを加えた。プレートを1時間37°Cにてインキュベートし、そして再び3回TBSで洗浄した。標準曲線の05~3ng50μlの範囲のIgGSigmaCat:I5381を調製し、3重でウエル50μlウエルに加えた。ハイブリドーマ1B1、16G7および23D2からの上清のPBSリン酸緩衝化生理食塩水中の希釈液、1:1000~1:8000を調製し、三重で配給した50μlウエル。プレートを1時間37°Cにて加湿室内でインキュベートし、次いでTBSで6回洗浄した。各ウエルに、TBS002カゼイン中に15000希釈した50μlのHRPコンジュゲート二次抗体ヤギ抗マウスIgGHRP、JacksonImmunoResearchCat:115035062を加え、プレートを1時間37°Cにて加湿室内でインキュベートし、次いでTBSで6回洗浄した。ABTSChemiconInternationalCatES004500ml、100μlウエルを加え、30分間37°Cにて加湿室内でインキュベートした。100μlウエルのABTSブロック溶液を加えて反応を停止した。光学密度をMolecularDevices社のプレートリーダーで405nmにて読み取った。mAb23D2、16G7および1B1ハイブリドーマ上清中の抗体濃度はそれぞれ103、29および60μgmlであった。抗体アイソタイプ決定:mAb23D2、16G7および1B1のそれぞれのアイソタイプを、SigmaCatNoISO2のマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キットを用いてELISAにより決定した。ハイブリドーマ上清からの抗体を抗マウス重鎖特異的抗体で捕獲し、結合した抗体をHRPで標識した二次抗体と続いてのABSの存在のもとでのインキュベーションを用いて明らかにした。表5に掲げた試薬を用いた。抗体をPBS中に11000で希釈し、100μlウエルを二重で96ウエルプレート中に配給し、1時間37°Cにて加湿室内でインキュベートし、そしてTBS005Tween20中で3回洗浄した。次いで100μlのサンプル上清を加え、1時間室温にてインキュベートし、そして3回TBS005Tween20中で洗浄した。二次抗体をTBS005Tween20中に1600で希釈し、100μlウエルを配給し、1時間37°Cにてインキュベートし、そして3回TBS005Tween20中で洗浄した。ABTSChemiconInternationalCat:ES004500mlを100μlウエル加え、そして30分間37°Cにて加湿室内でインキュベートした。反応を100μlウエルのABTSブロック溶液を加えることにより停止し、そして光学密度をMolecularDevicesプレートリーダーで405nmにて読み取った。MAb23D2はIgG2a抗体であると決定する一方、mAb16G7および1B1は両方ともIgG1であると決定した結果は示してない。抗体の精製予備IHC分析実施例6はmAb23D2がIHCでよく機能していることを示唆した。50mlサンプルのハイブリドーマ上清23D2ロット090309を用いて、MABTRAP登録商標キットGEHealthcareInc、UnitedKingdomを使って精製した。以下のプロトコルは実施例15を参照されたい。IgGに対するBradfordアッセイは、合計432mgのmAb23D2を50mlの上清から精製できることを示した。得たmAb2302の純度を次いでSDSPAGE分析法により分析した以下のプロトコルについては実施例15を参照されたい。結果は、mAb23D2サンプルが高度に純粋であることを示し、還元条件下で夾雑タンパク質は存在せず、2つのバンドしか示されなかった重鎖および軽鎖;55kDaおよび23kDa。抗体ビオチン化競合アッセイに用いるために、MAb23D2をビオチン化した。精製mAb23D2432μgμlにて100μlを最初に一晩4°Cにて01Mホウ酸塩バッファーpH88に対して透析した。得られる抗体濃度を定量すると、透析後に174μgμlであった実施例15に記載のBradfordアッセイを用いた。29μl174μgμlの精製mAb23D2合計50μgに25μl05μgμlのビオチン合計125μgを加えた。次いで25μlのDMSOFishercat:D4540を加え、そして4時間室温にてインキュベートした。反応を1μlの01MNH4Clを加えることにより停止し、続いて10分間室温にてインキュベートした。抗体を一晩PBSに対して4°Cにて透析し、そして透析後のビオチン化mAbの濃度を決定して133μgμlを得た実施例15に記載のBradfordアッセイを用いた。次いでMAGEA3に対するELISAをビオチン化mAb23D20、05、01、015、02、025および03μg50μlの希釈液を用いて実施し、ビオチン化mAb23D2の使用に有用な条件を決定した。ビオチン化mAbの希釈曲線は0032μg50μlの抗体希釈液が飽和でない強いシグナルを与えることを示す。抗体競合mAb23D2、1B1および16G7の3つが全て同じエピトープを指向するか、または異なるエピトープを指向するかを確認するために、競合アッセイをビオチン化mAb23D2および増加量のmAb1B1および16G7の間で実施した。無標識mAb23D2を競合の陽性対照として用い、mAbM75無関係なIgG1抗体を競合の陰性対照として用いた。図9は競合の結果を示す。少なくとも40倍超の無標識mAb23D2がビオチン化mAb23D2と95競合するために必要であった。しかし、わずか10倍超のmAb16G7がビオチン化mAb23D2と95競合するために必要であった。さらに、5倍超のmAb16G7がビオチン化mAb23D2と85競合するために必要であった。対照的に、5倍超のmAb1B1はビオチン化mAb23D2との競合が小さく、40倍超のmAb1B1でもわずかに55競合し得た。無関係なmAbM75とは40Xで競合が観察されなかった。これらの結果はmAb23D2および16G7が同じエピトープを指向するが、mAb16G7は23D2より高い親和力/結合活性を有することを示す。MAb1B1はmAb23D2と部分的に競合するので、異なるが近いエピトープに指向するか;または、より完全にmAb23D2と競合するために多量の40Xを超える1B1抗体を必要とするので、mAb23D2と同じエピトープに指向するが低い親和力/結合活性を有する。抗体特異性MAGEA1、A2、A3、A4、A6、A8、A9、A10、A11およびA12をコードするプラスミドを用いて一過的に形質移入したHEK293細胞に対するmAb1B1、16G7および23D2の特異性を、ウェスタンブロット分析で試験した。非形質移入細胞を対照として用いた。形質移入または非形質移入細胞の25~85μgの溶菌液をSDSPAGEで電気泳動し、ニトロセルロース上に移した。ブロットとmAb1B1、16G7および23D2それぞれとのインキュベーションにより免疫検出を実施した。さらに、形質移入体により発現された全てのMAGEA抗原を一緒に認識するmAbの混合物を用いて免疫検出を実施したこの混合物中のmAbについては表6を参照されたい。方法:ミニゲルを、ランニングゲルについては10アクリルアミドでおよびスタッキングゲルについては45アクリルアミドで調製した。サンプルを40μlのローディングバッファー還元条件で調製し、スタッキングゲルでは100Vでおよびランニングゲルでは200Vで供給しかつ泳動した。タンパク質を100mAで1時間4°Cにてニトロセルロース上に移し、その膜をTBS5脱脂乳中でインキュベートし、そしてTBS1脱脂乳に希釈した抗体と共に1時間室温にてインキュベートした。膜を3回TBS中で洗浄し、HRPJacksonImmunoresearchCat115035062とコンジュゲートしたヤギ抗マウスと共に1時間室温にてインキュベートし、次いで3回TBSで洗浄した。結合した抗体を化学発光PerkinElmerWesternlightningCat:NEL102により明らかにし;フィルムを1分間~30分間曝したAmershamCat28906836。全てのmAb1B1、16G7および23D2はMAGEA3およびA6と特異的に反応し、他のMAGEA抗原と反応性を示さなかった。しかし、mAb16G7は長時間の曝露後に、非形質転換および形質転換HEK293細胞において見出されなかったより高い分子量の非特異的なバンドを明らかにした。mAb23D2は、MAGEA3およびA6に制限されたパターンをおそらく分解産物である低い分子量のいくつかのバンドと共に明らかにした。mAb1B1はmAb23D2の様に、MAGEA3およびA6に高度に特異的であり、分解産物と反応性のないクリーンなパターンを示したウェスタンブロットは示してない。mAb23D2を用いて、精製全長MAGEA2、A3、A9およびA12組換えタンパク質について別のウェスタンブロット分析を実施した。各組換えタンパク質について、1μgの精製タンパク質をSDSPAFEにより電気泳動し、ニトロセルロース上に移した。ブロットを次いで、mAb23D2で、および4種のMAGEAタンパク質を認識できるmAbの混合物mAb14A11および57Bで試験した。MAb23D2はMAGEA3と特異的に認識し、MAGEA2、A9またはA12タンパク質と交差反応しなかった結果は示してない。mAb1B1、16G7、および23D2の反応性と特異性をまた、MAGEA抗原をトランスジーンを高レベルで発現しうる形質移入体より低いレベルで発現する癌細胞の溶菌液についてウェスタンブロットにより試験した。4つの型の癌細胞GERL、K562、STAQおよびCRL1555を試験した。一過的にMAGEA3で形質転換したHEK293細胞を陽性対照として用いた。タンパク質をSDSPAFEにより電気泳動し、ニトロセルロース上に移し、3つのmAbで試験した。3つのmAbは全てHEK293MAGEA3形質移入体と強く反応した。MAb23D2および16G7はK562およびGERL細胞の溶菌液と陽性に反応し、MAGEA3および/またはMAGEA6に対応する45kDa付近にバンドを明らかにした。STAQおよびCRL1555細胞の溶菌液との反応性は見られなかった。MAb16G7はまた、全ての細胞溶菌液に現れる約60kDaにおけるいくつかの非特異的バンドも明らかにした。mAb1B1については、4つの細胞溶菌液と反応性は観察されないが、非常に長い曝露後、45kDa付近にいくつかの弱いバンドが観察し得た。mAb1B1のK562およびGERL細胞溶菌液との反応の欠落はこのmAbの低い親和力/結合活性に因るものであり得て、これがMAGEA3が大量に見出される形質移入HEK293細胞と比較して低い量の抗原を検出することを阻止したのであろう。遊走パターンの相違はHEK293細胞に発現されるMAGEA3とK562およびGERL細胞に発現されたものとの間に見られ;HEK293細胞を形質移入するために用いたMAGEA3プラスミドが相違を生じたHisタグ付きMAGEAタンパク質をコードした。MAGEAmRNAの発現のRTPCR分析は、K562細胞がMAGEA6を発現しかつGERL細胞がMAGEA3とA6を発現することを示した表7。STAQもCRL1555もMAGEA3またはMAGEA6を発現しなかった。それ故に、mAb23D2および16G7について得た結果はRTPCR結果と一致する。組織サンプル中のMAGEA3の分析ハイブリドーマ1B1、16G7および23D2からの上清を用いる、ホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるMAGEA3A6発現のIHC分析用に適当なmAb希釈液を決定した。1:100~1:1000の範囲の上清の希釈液を、ヒト精巣の切片についておよびTC1細胞、またはTC1MAGEA3形質移入細胞のどちらかのマウス異種移植片全てホルマリン固定かつパラフィン包埋されたものについて試験した。Mab57Bを精原細胞および精母細胞との反応性の陽性対照として用いた。熱誘導した抗原リトリーバルで処理した組織について、IHCを実施した実施例13に記載のプロトコルを用いた。mAb23D2ハイブリドーマ上清;lot090309に対して、最良の結果を得る希釈は1:750である一方、mAb16G7ハイブリドーマ上清;lot090309に対しては、最良の結果を得る希釈は1:200であった。対照的に、mAb1B1は低希釈であっても、組織を適当に染色しなかったので、このmAbはホルマリン固定パラフィン包埋組織のIHC分析用には不適当であると考えた結果は示してない。ヒト精巣、マウスTC1およびTC1MAGEA3細胞:ヒト精巣サンプルにおいて、mAb23D2および16G7それぞれ1:750および1:200の希釈で精原細胞および全てではないがいくつかの一次精母細胞を強く染色し、MAGEA3および/またはA6が精子形成の初期段階に発現されることを示唆した。TC1およびTC1MAGEA3細胞のマウス異種移植片を試験する場合、23D2と16G7の両方はTC1MAGEA3異種移植片mAb57Bで得たものと類似に対して強いシグナルを与えたが、TC1異種移植片に対してはシグナルを与えなかった。しかし、mAb16G7はTC1異種移植片に対してmAb23D2より強いバックグランドを与え;mAb2302はより特異的であってほとんどバックグランドを与えなかった。これらの結果は16G7と23D2はこれらの対照組織を同じ様に染色するが、mAb23D2がIHCおよびウェスタンブロット分析においてより特異的なシグナルを与えることを示したので、mAb23D2を膀胱腫瘍におけるMAGEA3A6発現の分析用に選択した。ヒト膀胱腫瘍:ホルマリン固定パラフィン包埋FFPE膀胱腫瘍サンプルのコホートにおけるMAGEA3A6の発現をmAb2302を用いて分析した。MAb23D2を用いて33腫瘍サンプルを染色したが、これらはPicardetalIntJCancer12021702177mAb14A11MAGEA4およびmAb57bMAGEA9を用いて行ったRTPCR分析、IHCにより確認されたMAGEA3、A4、A8およびA9mRNAの発現が報じた先に分析されている46腫瘍サンプルから残ったものである。図10はmAb23D2MAGEA3A6を用いるこのパネルの腫瘍に対するIHCの結果を示し、先にPicardらが得た結果と比較した。Picardらは、mAb57bを用いて試験した腫瘍の361336におけるMAGEA4発現およびmAb14A11で試験した腫瘍の421536におけるMAGEA9発現を報じたPicardetalIntJCancer12021702177。mAb23D2で試験すると、3324のうちのわずか8つの腫瘍が反応性を示した。ほとんどの場合、反応性は限局性であり、腫瘍細胞の2未満に限定された。一腫瘍TUM660では細胞の40が染色された。この腫瘍はMAGEA3mRNAを中度に発現したが全体にMAGEA3mRNA発現とmAb23D2による染色の間に良い相関がなく、MAGEA3を発現するほとんどの腫瘍はmAb23D2により染色されなかった。しかし、これらの腫瘍のほとんどにおけるMAGEA3mRNAの発現は低く、この発現が限定数の細胞に限定されていることを示唆し、これはmAb23D2によるIHCにおいてわずか1つの腫瘍セクションを分析するときに逸したのかも知れない。対照的に、mAb23D2によるIHCで陽性であった2つの腫瘍はMAGEA3mRNAに対して陰性であった。これらの場合には、mAb23D2の反応性はMAGEA6mRNAのこれらの細胞における発現よるのかも知れない試験した腫瘍におけるMAGEA6の発現に対するデータは利用できなかった。加えて、MAGE抗原発現の不均一性の故におよびIHC分析とRNA単離に用いた腫瘍部分が必ずしも並置されてなかった故に、本IHCと先のRTPCR結果の間の相関はmAb23D2の特異性の欠如を示すと解釈されない。さらに、いくつかの腫瘍サンプルは古くかついくつかはBouin溶液で固定された。多くのmAbは年数および固定形式に非常に感受性があることが示されている。非筋肉侵襲性腫瘍:46のより最近の腫瘍のコホート全てホルマリン固定パラフィン包埋FFPEにおけるMAGEA3A6発現のIHC分析をmAb23D2を用いて実施し;さらにMAGEA4およびMAGEA9の発現をmAb57Bおよび14A11を用いてそれぞれ評価した。これらの非筋肉侵襲性腫瘍Ta、T1およびTis期は2005年12月および2007年4月に切除された。表8はMAGEA4およびMAGEA9のそれと比較したこれらの腫瘍におけるMAGEA3A6の発現の結果を示す。23D2による染色は一般に細胞質であったが、少数の事例10未満の事例では稀な陽性核を観察することができた。ほとんどの事例2446では、染色は弱く、細胞の10以下で、概して低強度で観察されたが、中間濃度が時々観察される。46腫瘍のうちのわずか9つが全て陰性であった。スライドの注意深いスクリーニングはほとんどの場合に少数の島状のかすかに陽性の細胞を検出した。いくつかの腫瘍は中間レベルの染色を示し、20~50の陽性細胞が見られた。これらにおいて、染色強度は非常に可変性であり、或る領域は染色が弱く、他の領域は中度または強い強度で染色された。乳頭腫瘍では、強い染色が通常乳頭の表面において観察された。扁平腫瘍は一般に陽性の傾向があった。少数の腫瘍346は大多数が陽性細胞≧90であり、染色は一般に中間強度であったが可変で、数バッチでは強い強度に達した。2つの他のMAGEA抗原の発現と比較すると、mAb23D2はMAGEA4またはMAGEA9に対して陰性であった7つの腫瘍を染色することが観察され、MAGEA3A6がMAGEA9を相補しうることを示唆した。実際、MAGEA3A6および/またはMAGEA9を発現する腫瘍は腫瘍の93を数え、46のうちのわずか3腫瘍はいずれの抗原も発現しなかった。MAGEA3A6とは逆に、MAGEA4はMAGEA9と相補性でなく、MAGEA4を発現する全ての腫瘍はMAGEA9も発現した。全てのこれらの抗原のうち、MAGEA9は最も均一に発現され、48腫瘍のうちの15において腫瘍細胞の50以上で見出される一方、わずか9および6腫瘍がMAGEA4およびMAGEA3A6をそれぞれ腫瘍細胞の類似の比率で発現した。細胞の50超のMAGEA3A6またはMAGEA4を発現した腫瘍の全て但し1つP1063を除くは細胞の50超においてMAGEA9も発現した。ヒト精巣FFPE:MAb1B1、16G7および23D2を、2つの異なる抗原回収ステップ用バッファーを使って、5μmのFFPEヒト精巣組織上のIHC染色で試験した。陰性対照として、UniversalNegativeControl抗体DakoCytomationIncDenmarkCodeN1698を用いた。免疫染色に先立って、LabVisionPTモジュールThermoFisherScientificFremontCaliforniaを用いてサンプルスライドを調製した。1スライド脱パラフィンと再水和:キシレン3x3分間エタノール952x2分間エタノール701x3分間脱イオン水1x3分間2抗原回収ステップ:再水和後、スライドを室温にて、バッファーとしてpH80でエチレンジアミン四酢酸EDTA、またはpH60でクエン酸を含有するPTモジュール内に置いて、熱誘導エピトープ回収を始めた。25°Cから97°Cまで:およそ45分間97°Cにて:20分間97°Cから65°Cまで:およそ30分間65°Cにて、スライドを浴から取り出し、脱イオン水中で2分間、次いでPBSバッファー中で2分間漱いだ。次いで全てのインキュベーションを加湿室内で行いながら、免疫組織化学染色を実施した。3免疫組織化学染色第1日:内因性ペルオキシダーゼをH20215を含むPBS中でのインキュベーションにより15分間ブロックしたコプリン瓶。スライドをPBS中で2回3分間漱ぎ、そして通常のヤギ血清5を含むPBSBR05ブロック試薬、Roche、11096176001中で30分間飽和させた。スライドを排水し、セクション回りをティッシュペーパーで拭った。一次抗体をPBSBR05に希釈し、一晩4°Cにて適用した希釈150;1100;1200;1400。第2日:スライドをPBS中で2回5分間漱ぎ、そして酵素結合した二次抗体をスライドEnvisionDakoCytomationReadytoUseforMouseK4004に適用して45分間置いた。次いでスライドをPBS中で2回3分間漱ぎ、そして色素源DABキット、Invitrogenで5分間現像した。スライドを次いで脱イオン水で3回3分間漱ぎ、そしてMayerのヘマラムKlinipathで1~3分間、対比染色し、水道水で5分間漱ぎ、次いで脱イオン水で2分間漱いだ。スライドを次いで脱水し、DePex培地BDHChemicals、361254Dで封入した。結果を表Aに示した。考察:このように、本明細書で報じた免疫化計画IMM134では、多様と推定されるエピトープを含有するMAGEA3ペプチドでマウスを免疫化した。MAGEA3ペプチドMA33は、得られた陽性ハイブリドーマのほとんどがこの配列中に見出されるエピトープと反応する抗体を分泌したので、高度に免疫原性であった。MAGEA3ペプチドMA32も免疫原性であったが、より少ない抗体を誘導し、それに対して、MAGEA3ペプチドMA31は明らかに免疫原性が低かった。MAGEA3A6と特異的に反応する3つのmAbが産生された。MAb1B1、IgG1抗体はホルマリン固定パラフィン包埋組織中のMAGEA3A6ウエルを検出しなかったが、ウェスタンブロットでは良く機能した。MAb16G7はウェスタンブロットおよびホルマリン固定パラフィン包埋組織上のIHCの両方で良く機能したが、特異的でなく、より高いバックグランドを与える。MAb23D2、IgG2a抗体はIHCおよびウェスタンブロットにおいて良く機能した。MAb23D2および16G7は同じエピトープと反応するが、16G7はmAb23D2より高い親和力/結合活性を有すると思われる。MAb1B1は見かけ上、mAb23D2が認識するものに近いエピトープと反応するかまたは同じエピトープを認識するが、他の2つのmAbよりはるかに低い親和力/結合活性で認識する。これらの結果は、ペプチドMA33と反応性である産生される抗体は単一優性エピトープを指向していること、および得られる抗体の相違は親和力/結合活性によるものでありうることを示唆する。モノクローナル抗体V遺伝子配列決定mAb1B1、16G7および23D2のそれぞれのV遺伝子可変域をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。各ハイブリドーマの凍結細胞を蘇生させて増殖し、上清中に存在する抗体のアイソタイプを決定した。細胞を回収し終わるとそれらを溶菌した。RNAを細胞溶菌液からPromegaSVTotalRNASystemを用いて単離した。RNAの逆転写を実施して第1鎖cDNAを合成した。V遺伝子増幅をPCRにより、全cDNAをテンプレートとしてならびにフォワードプライマーのプールおよび各反応に対する関係アイソタイプ特異的リバースプライマーを用いて行った1B12=IgG1κ;16G7=IgG1λ;および23D2=IgG2aλ。逆転写およびPCRはPromegaAccessQuickキットを用いて製造業者の取扱説明書に従って行った。PCR産物を精製し、DNAの配列を決定した。mAb1B1、16G7および23D2可変軽鎖および可変重鎖のヌクレオチド配列を図11に示す。図12はこれらのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列であり、相補性決定領域CDRには下線を引いたフレームワーク領域には下線を引いてない。表9も参照されたい。次の2つのプロトコルは実施例2実施に続くものである。2つの免疫化スケジュールIMM134およびIMM135はまた、表10および表11にまとめられている。IMM134プロトコル:KLHとコンジュゲートした3種のMAGEA3ペプチドの混合物によるBalbcマウスの免疫化免疫源:3種のMAGEA3ペプチドMA31、MA32、およびMA33、本明細書の実施例1を参照されたいの混合物を調製し、各ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニンKLH;NEPInc、凍結されかつPBS中に1mgmlにて再構成したにコンジュゲートし、各ペプチドの最終濃度を01μgμlにする。アジュバント:QuilA10mgmlCedarlaneSuperfrosBiosectorCat:7401免疫化:4匹のBalbcマウスCharlesRiverIncにおいて、各マウスから100μl血液サンプルを採取する免疫前血清。5μlのQuilA10mgmlを500μlの3種のMAGEA3ペプチドKLHとコンジュゲートしたもの01μgμlの混合物に加え、そしてよく混合する。皮下に100μlマウスを注射する。各マウスは従って、10μgの各MAGEA3ペプチドKLHコンジュゲートと10μgのQuilAを受ける。追加免疫:5μlのQuilA10mgmlを500μlの3種のMAGEA3ペプチドKLHとコンジュゲートしたもの01μgμlの混合物に加え、そしてよく混合する。皮下に100μlマウスを注射する。各マウスはそれ故に10μgの各MAGEA3ペプチドKLHコンジュゲートおよび10μgのQuilAを受ける。最終追加免疫:静脈内に3種のMAGEA3ペプチドKLHとコンジュゲートしたもの01μgμlを100μlマウスを注射する選択されたマウスはそれ故に10μgの各ペプチドKLHコンジュゲートを受けるがアジュバントは受けない。表10:IMM134スケジュール:マウス3は最高力価を有したが最終追加免疫に生存しなかった、その理由は実験の誤りに因る。融合はマウス4で実施した。IMM135プロトコル:Balbcマウスの組換えMAGEA3による免疫化免疫源:組換え全長MAGEA3GlaxoSmithKlineより提供されたバキュロウイルスで産生したものの溶液を調製する。ストック溶液は0426mgmlのMAGEA3とし、PBS中の希釈液をMAGEA3の最終濃度02μgμlにて調製した。アジュバント:QuilA10mgmlNF31052002CedarlaneSuperfrosBiosector;Cat:7401。免疫化:4匹のBalbcマウスCharlesRiverIncにおいて、各マウスから100μl血液サンプルを採取する免疫前血清。5μlのQuilA10mgmlを500μlの組換えMAGEA3タンパク質02μgμlに加え、そしてよく混合する。皮下に100μlマウスを注射する。各マウスはそれ故に20μgの組換えMAGEA3および10μgのQuilAを受ける。追加免疫:5μlのQuilA10mgmlを500μlの組換えMAGEA3タンパク質02μgμlに加え、そしてよく混合する。皮下に100μlマウスを注射する。各マウスはそれ故に20μgの組換えMAGEA3および10μgのQuilAを受ける。最終追加免疫:静脈内に100μlマウスのMAGEA3抗原を注射する。選択されたマウスはそれ故に20μgの組換えMAGEA3を受けるがアジュバントは受けない。表11IMM135スケジュール融合プロトコルIscovePenStrepβME溶液の調製:Iscove改変Dulbecco培地GIBCOCat12200028を含有し、この溶液は100Umlのペニシリン、100UmlのストレプトマイシンGibcoCat:15140122および50μMβメルカプトエタノールを含有する。IscovePenStrepβME5FCS溶液の調製:Iscove改変Dulbecco培地GIBCOCat:12200028を含有し、この溶液は100Umlのペニシリン、100UmlのストレプトマイシンGibcoCat:15140122、50μMβメルカプトエタノールおよび5の胎児ウシ血清GibcoCat:12483020を含有する。IscovePenStrepβME20FCSHycloneHAT1CM溶液の調製:Iscove改変Dulbecco培地GIBCOCat:12200028を含有し、この溶液は100Umlのペニシリン、100UmlのストレプトマイシンGibcoCat:15140122、50μMβメルカプトエタノールおよび20の胎児ウシ血清HycloneCat:SH3007103、1XHATGibcoCat:21060017および1のP388D1細胞由来の順化培地VP21042005を含有する。全ての溶液と培地は37°Cに予熱した。脾細胞の調製:心穿刺によりマウスを犠牲にした。脾臓を無菌条件下で取り出す。脾臓の細胞内容物を空にし、細胞を3回IscovePenStrepβMEで洗浄するSorvallRT6000D、1500rpm、10分間。細胞数をトリパンブルー排除法により数える。結果:生存細胞1875x106および死細胞80x106=70生存細胞であった。SP2細胞の調製:融合の1週前にSP2細胞の培養を開始する。細胞をIscovePenStrepβME10FCS中で増殖する。融合の前日に、細胞を3x105細胞mlに希釈する。融合当日に、細胞を1回IscovePenStrepβMEで洗浄しSorvallRT6000D、1500rpm、10分間、細胞をトリパンブルー排除法により数える。結果:生存細胞663x106および死細胞15x106=77生存細胞であった。融合:50mlチューブ中で、脾細胞とSP2細胞を3:1の比1875x106脾細胞と663x106SP2細胞で組み合わせ、そして容積をIscovePenStrepβMEで50mlまで補給し、そして遠心分離したSorvallRT6000D、1500rpm、10分間。1mlの50PEG4000SigmaCat:P7306を1分間にわたって細胞ペレットに徐々に加え、これをデカンテーション後にほぐした。チューブを37°Cにて90秒間徐々に撹拌した。20mlのIscovePenStrepβMEを徐々に最初の1mlを30秒に、続いて2mlを30秒に、そして最後の17mlを60秒に加えることにより反応を停止する。容積を50mlまで補給しそして5分間インキュベートした後、細胞を遠心分離したSorvallRT6000D、1500rpm、10分間。細胞を1回、50mlのIscovePenStrepβME5FCSで洗浄するSorvallRT6000D、1500rpm、10分間s。細胞を完全培地IscovePenStrepβME20FCSHycloneHAT1CMに再懸濁し、23枚の96ウエルプレートの200μlウエルに配給する。37°C、5CO2にて10~15日間インキュベートする。免疫組織化学IHC組織のセクション:所要数の組織の5μmセクションを切り取って分析した。セクションはできるだけ新鮮なものを調製しなければならない。古いセクションはシグナルの強度を減少しうる。パラフィンの除去と組織の水和:表12に記載のステップをドラフトのもとで行う。バッファーの予熱:加圧調理器DakoDiagnostiqueCanadaIncを1200mlの001Mクエン酸バッファーpH60で満たす。加圧調理器の蓋をしっかりと閉じ、電子レンジSAMSUNG900W内に置く。圧力計が上昇するまで最高強度で加熱する約12分間。抗原回収のための加熱:圧力計が低下すると、加圧調理器を開けてスライドを内部に入れ、バッファーでスライドを覆う。蓋を閉じ、電子レンジ内に再び置く。最高強度で約12分間またはスチームジェットが最高になるまで加熱し、次いでさらに6分間加熱する。電子レンジを開けて圧力計が下がった後、加圧調理器の蓋を明ける。免疫組織化学:IDETECTSuperstainSystemHRPIDLabsIncCatIDST1007を用いて免疫検出を実施する。スライドをPBS1X中に少なくとも5分間置く。スライドをH2O23LaboratoireMatHR0133の浴中で5分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックする。PBS1Xの浴中で漱ぐ。過剰なバッファーを吸取り紙で取り除いて、スライドを加湿室内に置く。一度に1つのスライドを処置し、組織の乾燥を避ける。2~3滴のブロック血清バッファーを加え、20分間室温にてインキュベートする。過剰バッファーを取り除いて一次抗体を所望の希釈組織のサイズに応じて150~200μlにて加える。一晩室温にてインキュベートする。2つのPBS浴で洗浄する。上記の通り、過剰バッファーを取り除く。200~250μlのビオチン化した抗免疫グロブリン連結試薬を加え、20分間室温にてインキュベートする。2回PBSで洗浄する。吸取り紙を用いて過剰バッファーを取り除き、スライドを加湿室内に置く。一度に1つのスライドを処置し、組織の乾燥を避ける。200~250μlのウルトラストレプトアビジン/ペルオキシダーゼ複合体標識試薬を加え、20分間室温にてインキュベートする。2回PBSで洗浄する。吸取り紙を用いて過剰バッファーを取り除き、スライドを加湿室内に置く。一度に1つのスライドを処置し、組織の乾燥を避ける。250μlスライドのDAB溶液ZymedCat:002014を加え、インキュベートするインキュベーション時間は各mAbに対して最適化し、シグナルの飽和を避けなければならない。3回蒸留水浴で漱ぐ。対比染色:スライドをHarrisヘマトキシリン溶液FischerCat:SH26500D中で30秒~1分間インキュベートする。対比染色を顕微鏡下でチェックする。過剰の染料を水道水のもとで除去する。スライド作製:表13のステップをドラフトのもとで行う:一度に1枚のスライドを処理する。1滴のエンテランBDH、CatUN1866を組織上に置く。カバースリップをエンテラン上に置く。乾燥させ、注意深くスライドを特定しそして顕微鏡下で読み取る。ハイブリドーマのサブクローニングと培養各候補クローンを、25mlの完全培地IscovePenStrepβME20FCSHycloneHAT1CMを含有する6ウエルプレートのウエル中に移す。プレートを37°Cにて5CO2中で、細胞が必要な密度に達するまでインキュベートする。トリパンブルー排除法により細胞を数える。3750細胞を13mlチューブ中に移す。容積を75ml100細胞200μlまで完全培地で補給する。一連の1:10希釈液をこのチューブから調製して10細胞200μlおよび1細胞200μlを含有する懸濁液を得る。これらの3つの細胞懸濁液100、10および1つの細胞/200μlのそれぞれを、96ウエルプレートの32ウエル200μlウエル中に配給し、このプレートを37°C、5にて10~15日間インキュベートする。1細胞200μl懸濁液を含有するウエル中で増殖するクローンをELISAで、組換えMAGEA3タンパク質との反応性について試験する反応性クローンを陽性とみなす。試験したクローンは視覚で制御して1コロニーだけがウエル中に存在することを保証する。もし1細胞200μl懸濁液を含有するウエルからクローンが得られなければ、10細胞200μl懸濁液、または100細胞200μl懸濁液を含有するウエルで増殖するクローンをELISAで組換えMAGEA3タンパク質との反応性について試験し、試験したクローンは視覚で制御して1コロニーだけがウエル中に存在することを保証する。陽性クローンを6ウエルプレートのウエル中に移し、細胞を、時を改めて、上記の通りクローン性を保証する。クローン性は、ELISAにより試験した全てのサブクローニングが陽性の場合に得られる。最終サブクローンを徐々に適合させて標準培地IscovePenStrepβME10FCSで増殖する。標準培地に適合したハイブリドーマを90FCS10DMSO10x106細胞クリオチューブでMrFrosty凍結コンテナーNalgeneCat:51000001内で一晩、80°Cにて凍結し、次いで80°Cにて少なくとも24時間後に液体窒素中に移す。抗体の精製ハイブリドーマ上清からの抗体の精製はMABTRAP登録商標キットGEHealthcareCat:17112801を用いて実施した。調製:カラムおよびバッファーを室温にて温める。バッファーを取扱説明書に記載のように調製する。採集画分1ml当たり60~200μlの中和化バッファーを加えることにより採集チューブを調製する。ハイブリドーマ上清を遠心分離しかつ濾過して粒子を除去する。精製:シリンジを水で満たし、それをカラムに接続し、そしてエタノール保存剤を5mlの水で洗い流す。カラムを15mlの結合バッファーで平衡化する。50mlのハイブリドーマ23D2上清Lot:090309を、上清をシリンジを用いて徐々に通すことによりカラムに適用する。25mlの結合バッファーで洗浄し、5mlの溶出バッファーをそれぞれ1mlの5つの画分で溶出する。各画分1:100希釈したサンプルのOD280を測定する。結果:23D2ハイブリドーマ上清については、ピークが画分2で見出されたOD280nm=0055。Bradfordアッセイによる抗体濃度の定量:0、25、5、10、15、20、25および30μgのIgGSigmaCat:I5381を用いて標準曲線を調製する。PBSで100μlまで補給しそして1mlのBradford試薬VP270908を加える。よく混合する。2、5および10μlのMab23D2画分2の濃度を測定する。PBSで100μlまで補給し、1mlのBradford試薬VP270908を加える。よく混合する。光学密度ODを595nmにて読み取る。この曲線の式を用いて濃度を決定する。結果:23D2画分2の濃度は432μgμlであった。mAb23D2の純度の分析:ランニングゲル中の10アクリルアミドおよびスタッキングゲル中の45アクリルアミドでミニゲルを調製する。40μlの還元ローディングバッファーβメルカプトエタノールの存在のもとの中の精製23D2432μgμlの2つのサンプル2および10μgを伴うゲルを供給する。10ポリアクリルアミドゲル上で150Vにて90分間の電気泳動後分子量マーカーも含む、ゲルをクーマシーブルー溶液を用いて30分間染色する。ゲルを脱染色溶液中で一晩洗浄し、翌日、ゲルを白色光下で写真撮影する。正準物哺乳動物種では、抗体ポリペプチドは定常域すなわち、高度に保存されたと可変域を含有する。可変域内には、CDRとフレームワーク重鎖または軽鎖可変域内で、CDRの外側に存在するが存在する。CDRは可変域内のアミノ酸の非隣接配列であるが、種に関わらず、可変重鎖および軽鎖内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置は類似している。全ての正順抗体の可変重鎖と可変軽鎖はそれぞれの軽Lおよび重H鎖に対して3つのCDR域L1、L2、L3、H1、H2、H3と呼ぶを有する。容認されたCDR域はKabatetal、JBiolChem252:660966161977が記載している。mAb1B1、16G7および23D2に対する正順サブタイプをMartinThorntonの正順定義MartinThornton、JMolBiol263:8008151996に基づいて推定した。モノクローナル抗体1B1、16G7および23D2のCDRまたはフレームワーク領域に見出される正順残基を下表14~28に下線を引きかつ太字で示した。もしmAb配列中に存在する残基が正準セット中に存在しなければ、括弧で示した。代わりの残基正準セットに対するは標準フォントで示した。表15~29のアミノ酸の番号はKabat番号スキームに従う。1B1H1正準2ループH1211A11SOURCE1baf1B1H2正準1ループH219A9SOURCE1gig1B1L1正準3ループL1317A17SOURCE1hil1B1L2正準1ループL217A7SOURCE1lmk1B1L3正準1ループL319A9SOURCE1tet16G7H1正準1ループH1110A10SOURCE2fbj16G7H2正準3ループH2310B10SOURCE1igc16G7L1正準7ループL1714B14SOURCE1gig16G7L2正準1ループL217A7SOURCE1lmk16G7L3正準8ループL389D9SOURCE1gig23D2H1正準1ループH1110A10SOURCE2fbj23D2H2正準3ループH2310B10SOURCE1igc23D2L1正準7ループL1714B14SOURCE1gig23D2L2正準1ループL217A7SOURCE1lmk23D2L3正準8ループL389D9SOURCE1gig