"1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、a前記液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスと接触させる段階と、b前記免疫グロブリン含有タンパク質を、前記リガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階と、c免疫グロブリン含有タンパク質を吸着したマトリックスを洗浄する任意選択の段階と、d前記タンパク質を放出する溶出剤とマトリックスを接触させることによって前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階とを含み、前記リガンドのそれぞれがブドウ球菌プロテインASpAE、D、A、B、C若しくはプロテインZ又はそれらの機能的変異体の1以上のドメイン単量体を含む点で改良されており、1以上の単量体の1以上において、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが別のアミノ酸で置換されており、前記リガンドが、非置換のリガンドと比較して溶出pHの上昇をもたらすと共に、動的結合能及び収率が本質的に不変であるか又は改良されている、方法。プロテインA又はプロテインZの前記1以上のドメインが、同一のドメインE、D、A、B、C又はプロテインZの2以上のコピーである、請求項1記載の方法。プロテインA又はプロテインZの前記1以上のドメインが、ドメインE、D、A、B、C又はプロテインZから選択される2以上のドメインである、請求項1記載の方法。プロテインA又はプロテインZの前記1以上のドメインが、ドメインB、ドメインC又はプロテインZから選択される、請求項1記載の方法。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、多量体リガンド中の単量体の1以上において別のアミノ酸で置換されている、請求項1乃至4のいずれか1項記載の方法。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、多量体リガンド中の全ての単量体において別のアミノ酸で置換されている、請求項1乃至5のいずれか1項記載の方法。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、溶出pHを上昇させる別のアミノ酸で置換されている、請求項1乃至6のいずれか1項記載の方法。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、セリンで置換されている、請求項1乃至7のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、非置換のリガンドと比較して、溶出pHの0.2以上の上昇をもたらす、請求項1乃至8のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、非置換のリガンドと比較して、溶出pHの0.4以上の上昇をもたらす、請求項1乃至9のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、溶出pHの4.0以上までの上昇をもたらし、その一方で標的分子の収率が80以上又は好ましくは95超である、請求項1乃至10のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、免疫グロブリンのFc部に対する親和性を有するが、免疫グロブリンのFab部に対する親和性を欠いている、請求項1乃至11のいずれか1項記載の方法。プロテインAのBドメインの29位に相当するグリシン残基がアラニンに変更されている、請求項1乃至12のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、1個以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性となっている、請求項1乃至13のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが、1個以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性が達成されているプロテインZである、請求項1乃至14のいずれか1項記載の方法。プロテインZのアルカリ安定性が、少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによって達成されている、請求項15記載の方法。前記多量体が二量体である、請求項1乃至16のいずれか1項記載の方法。前記多量体が四量体である、請求項1乃至16のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項1乃至18のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項1乃至18のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質が、別のタンパク質と融合した免疫グロブリンFc部分を含有する融合タンパク質である、請求項1乃至18のいずれか1項記載の方法。ブドウ球菌プロテインASpAE、D、A、B、C若しくはプロテインZ又はそれらの機能的変異体の1以上のドメイン単量体を含むリガンドであって、単量体の1以上において、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが別のアミノ酸で置換されている、リガンド。前記アスパラギン又はヒスチジンがセリンに置換されている、請求項22記載のリガンド。固体担体にカップリングされている、請求項22又は23記載のリガンドを含むアフィニティー分離のためのマトリックス。固体担体が多糖ベースである、請求項24記載のマトリックス。前記リガンドが、チオエーテル結合によってカップリングされている、請求項24又は25記載のマトリックス。pH勾配溶出が実施され、結果として凝集体と標的の単量体種とが効率的に分離される、請求項1乃至21のいずれか1項記載の方法。前記リガンドが4.2以上までの溶出pHの上昇をもたらし、その一方で標的分子の収率が80以上又は好ましくは95超である、請求項1乃至21又は24のいずれか1項記載の方法。定義タンパク質という用語は、本明細書中において、タンパク質及びその断片を記載するのに使用する。よって、三次元構造を示すアミノ酸のあらゆる鎖が用語タンパク質に含まれ、したがってタンパク質断片も包含される。タンパク質の機能的変異体という用語は、本明細書中において、本発明との関連で親和性及び安定性と定義される機能が本質的に保持されている変異体タンパク質を意味する。したがって、前記機能に関連しない1種以上のアミノ酸が、交換されていてもよい。親分子という用語は、本明細書中において、本発明による突然変異が導入される前の形態である、対応するタンパク質に使用する。構造安定性という用語は分子の3次元形態の完全性を指し、化学的安定性は化学分解に耐える能力を指す。Fc断片結合タンパク質という用語は、タンパク質が免疫グロブリンのFc断片に結合可能であることを意味する。ただし、Fc断片結合タンパク質が他の領域、例えば、免疫グロブリンのFab領域にさらに結合できることを除外しない。本明細書中において、アミノ酸は、それらのフルネームで言及しない場合、従来の1文字又は3文字の記号で示される。突然変異は、本明細書中において、野生型又は非突然変異アミノ酸の後に交換位置番号を付し、その後に突然変異アミノ酸を付すことによって定義する。したがって、例えば、23位のアスパラギンのスレオニンへの突然変異は、N23Tと示す。本発明は一態様において、1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、a前記液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスと接触させる段階と、b前記免疫グロブリン含有タンパク質を、リガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階と、c免疫グロブリン含有タンパク質を吸着したマトリックスを洗浄する任意選択の段階と、dタンパク質を放出する溶出剤とマトリックスを接触させることによって前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階とを含む方法に関する。この方法は、ブドウ球菌プロテインASpAE、D、A、B、C若しくはプロテインZ又はそれらの機能的変異体の1以上のドメイン即ち、単量体をそれぞれ含むリガンドを使用することによって免疫グロブリン分子の溶出pHの上昇をもたらし、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンは任意の他のアミノ酸で置換されている。免疫グロブリン結合タンパク質即ち、リガンドは、天然免疫グロブリン結合能を有する任意のタンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインASpA若しくは連鎖球菌プロテインGSpG又はこれらのタンパク質のIgG結合ドメインを含有する組換えタンパク質とすることができる。他のこのようなタンパク質の総説に関しては、例えば、Kronvall,G.,Jonsson,K.Receptins:anoveltermforanexpandingspectrumofnaturalandengineeredmicrobialproteinswithbindingpropertiesformammalianproteins,J.Mol.Recognit.1999Jan-Feb;121:38-44を参照されたい。リガンドは、SpAのE、D、A、B及びCドメインの1以上を含むことができる。より好ましくは、リガンドは、プロテインAのドメインB、プロテインAのドメインC又は改変プロテインZを含む。いずれのプロテインZ又はプロテインAドメインも、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置にアスパラギン又はヒスチジンを含有する例えば、図1、図2、及び配列番号1~8参照。図2に示されるように、プロテインAの5つのドメイン間の配列は、関連性が高い。欠失又は挿入はなく、置換の多くは保存的変化であり、タンパク質の構造又は機能の予測される変化は最小である。例えば、BドメインとCドメインの間には、58アミノ酸ポリペプチド全体にわたって4つの変化しかない。したがって、これらのドメインのそれぞれにおける、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンは、プロテインA又はそのドメインを含有するリガンドと同様な構造的/機能的寄与を有する。同様に、アスパラギン又はヒスチジンの変化は、このような変化を含有するリガンドの構造/機能に同様な効果をもたらす。ある特定の実施形態では、アスパラギン又はヒスチジンは、IgGへの結合能を保持しながら、溶出pHを増加させるアミノ酸で置換されている。好ましくは、置換はセリンに対するものである。ある特定の好ましい実施形態では、親の分子配列は、配列番号1~2、4~8又はそれらの任意の機能的変異体によって定義される配列を含む。ある特定の実施形態では、多量体リガンド中の単量体ドメインの1以上における、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中の全ての単量体ドメインにおけるアスパラギン又はヒスチジン残基が、置換されている。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外にも、免疫グロブリン、例えば、IgG、IgA及び/若しくはIgM又はFc断片を含有する融合タンパク質の、pH勾配における溶出pHを上昇させる。好ましくは、溶出pHは、pH0.2からpH1.0超上昇する。より好ましくは、溶出pHは、pH0.3以上上昇し、最も好ましくは、溶出pHは、pH0.4以上上昇する。あるいは、溶出pHは4.0超、好ましくはpH4.2超まで上昇し、その一方で標的分子の収率は80以上又は好ましくは95超である。溶出pHのこのような上昇の利点は、免疫グロブリンが凝集体を形成する傾向が大きく低減し得ることである。抗体凝集体は、免疫原性である可能性があり、免疫グロブリンを医薬として使用する前に除去する必要がある。これは、処理コストをかなり増加させる。一実施形態では、リガンドはまた、例えば、SpAドメインB又はプロテインZの単量体ドメインの1以上の1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性にする。前述のように、米国特許出願公開第2005/0143566号は、1以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させた場合に、このような突然変異が高pHにおけるリガンドの化学安定性を増大させる例えば、N23Tことを開示している。さらに、これらのリガンドを含む親和性媒体は、アルカリ剤を使用する清浄手順によりよく耐え得る。米国特許出願公開第2006/0194955号は、突然変異リガンドがプロテアーゼによりよく耐え、したがって分離プロセスにおけるリガンド漏出を低減し得ることも示している。これらの出願の開示全体を、参照によって本明細書中に組み込む。別の実施形態では、こうして調製されたリガンド複数可は抗体のFab部に対する実質的な親和性を欠いているが、Fc部に対する親和性を有する。したがって、ある特定の実施形態では、リガンドの1以上のグリシンは、アラニンによって置き換えられている。米国特許出願公開第2006/0194950号は、リガンドがFabに対する親和性を欠くがFc親和性を保持するように、アルカリ安定性ドメインを例えばG29A突然変異によってさらに修飾できることを示している。この出願の開示全体を、参照によって本明細書中に組み込む。本明細書中で使用する、アミノ酸の番号付けは、当技術分野で通常使用されているものであり、プロテインAのドメインB上の位置によって例示され、当業者ならば、E、D、A、B、Cの各ドメインに関して突然変異させる位置が容易にわかる。有利な一実施形態では、リガンドはドメインBの多量体コピーからなり、ドメインBのアルカリ安定性が、1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させる例えば、N23Tことによって達成されており、リガンドは、アルカリ安定性ドメインBの29位のアミノ酸残基の突然変異、例えば、G29A突然変異を含む。有利な一実施形態では、リガンドは、H18のヒスチジンHistine残基が突然変異しているドメインC又はその機能的変異体の多量体コピーからなる。任意選択で、リガンドはまた、29位にアミノ酸残基の突然変異、例えば、G29A突然変異を含む。別の実施形態では、リガンドは、1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性が達成されているプロテインZの多量体コピーからなる。有利な一実施形態では、アルカリ安定性は、少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによって達成されている。当業者ならば、18位のアスパラギン又はヒスチジンの置換、突然変異によるアルカリ安定性の付与、及びG-A突然変異を、従来の分子生物学技術を使用して任意の配列順序で実施できることが容易にわかるであろう。さらに、リガンドは、突然変異タンパク質リガンドをコードしている核酸配列を含有するベクターによって発現できる。別法として、リガンドは、タンパク質合成技術によっても作製することができる。所定の配列のペプチド及びタンパク質を合成するための方法は、当技術分野において周知であり、一般に入手可能である。したがって、本発明において、ブドウ球菌プロテインAのアルカリ安定性ドメインBという用語は、SpAのドメインBをベースとするアルカリ安定化タンパク質、例えば、米国特許出願公開第2005/0143566号及び米国特許出願公開第2006/0194950号に記載されている突然変異体タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等のアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。当業者にはわかるように、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適切な程度まで精製すべきである。このような精製方法は当分野でよく知られており、タンパク質をベースとするリガンドの担体への固定化は、標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体について、以下により詳細に記載する。したがって、一実施形態では、本発明による突然変異タンパク質は、配列番号1又は2で定義される配列の約75以上、例えば約80以上又は好ましくは約95以上を含むが、ただし、アスパラギン突然変異は21位にない。本明細書中において、配列番号1AlaAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysは、SpAのB-ドメインのアミノ酸配列を定義し、配列番号2ValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysは、プロテインZとして知られているタンパク質を定義する。プロテインZは、29位のグリシンがアラニンと交換されている、SpAのB-ドメインに由来する合成構築物である例えば、Stahletal,1999:Affinityfusionsinbiotechnology:focusonproteinAandproteinG,inTheEncyclopediaofBioprocessTechnology:Fermentation,BiocatalysisandBioseparation.M.C.FleckingerandS.W.Drew,editors.JohnWileyandSonsInc.,NewYork,8-22参照。一実施形態では、前記突然変異体タンパク質は、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のヒスチジンが置換されている、配列番号1、2若しくは8において定義されるアミノ酸配列から構成されるか又はその機能的変異体である。別の実施形態では、前記突然変異体タンパク質は、プロテインAのBドメインのH18に相当する位置のアスパラギンが置換されている、配列番号4~6において定義されるアミノ酸配列から構成されるか又はその機能的変異体である。これに関連して使用する機能的変異体という用語は、免疫グロブリンに対する突然変異体タンパク質の親和性に影響を及ぼさない、又はpH値が上昇した環境における化学安定性を改善するアミノ酸位置の1以上のさらなるバリエーションを含む任意の同様な配列を包含する。有利な一実施形態では、本発明のアスパラギン又はヒスチジンの置換は、アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン酸、イソロイシン、リシン、スレオニン、アラニン又はセリンからなる群から選択され、親分子は配列番号1~2及び4~8、又はそれらの任意の機能的変異体によって定義される配列を含む。より好ましくは、置換はセリンに対してである。前述のように、アルカリ条件下において長期間にわたって高い結合能を有する、リガンドとして有用な突然変異体タンパク質を獲得するために、21位のアスパラギン残基の突然変異を回避する。一実施形態では、3位のアスパラギン残基は、突然変異していない。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外なことに、免疫グロブリン、例えば、IgG、IgA及び/若しくはIgM又はFc断片を含有する融合タンパク質の溶出pHを上昇させる。好ましくは、溶出pHは、pH0.2からpH1.0超上昇する。より好ましくは、溶出pHは、pH0.3以上上昇し、最も好ましくは、溶出pHは、pH0.4以上上昇する。あるいは、溶出pHは4.0超、好ましくはpH4.2超まで上昇し、その一方で標的分子の収率は、80以上又は好ましくは95超である。ある特定の実施形態では、多量体リガンド中の1以上の単量体のアスパラギン又はヒスチジン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中の全ての単量体のアスパラギン又はヒスチジン残基が置換されている。有利な一実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基の間に位置するアスパラギン残基もまた、例えば、スレオニン残基に突然変異している。したがって、一実施形態では、配列番号2で定義される配列の23位のアスパラギン残基は、例えばスレオニン残基に突然変異している。特定の一実施形態では、配列番号2で定義される配列の43位のアスパラギン残基もまた、例えばグルタミン酸に突然変異している。アミノ酸番号43が突然変異している実施形態では、それは最も有利には、1以上のさらなる突然変異、例えばN23Tと組み合わされるようである。したがって、本発明は、前述の単量体突然変異体タンパク質を包含する。ただし、このようなタンパク質単量体は、多量体リガンド、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体などに組み合わせ得る。したがって、本発明の別の態様は、本発明による1種以上の突然変異タンパク質と2以上のさらなる単位とから構成される多量体であり、好ましくはこれもまた本発明による突然変異体タンパク質である。したがって、本発明は、例えば、2つの反復単位から構成される二量体、又は4つの反復単位から構成される四量体である。ある特定の実施形態では、多量体リガンドは、プロテインAのドメインE、D、A、B、C若しくはプロテインZ又は任意の機能的変異体の同一の単量体ドメインの2以上のコピーを含有する。他の実施形態では、多量体リガンドは、プロテインAのドメインE、D、A、B、C若しくはプロテインZ又は任意の機能的変異体から選択される2以上の異なる単量体ドメインを含有する。一実施形態では、本発明による多量体は、好ましくは0~15個、例えば、0~10個又は5~10個の範囲の長さのアミノ酸によって連結された単量体単位を含む。このような連結の性質は、好ましくは、タンパク質単位の空間的コンフォメーションを不安定化すべきでない。さらに、前記連結は好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分に安定でもあるべきである。別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは、配列番号3AlaGlnValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCysの配列を含む。さらなる一実施形態では、本発明の四量体リガンドは、配列番号9AlaGlnValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCysの配列を含む。別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは、配列番号10AlaGlnValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerValSerLysGluIleLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuSerLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerValSerLysGluIleLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLysCysの配列を含む。本発明は、意外にも、リガンドの溶出pHを比較すると、リガンドの単量体ドメインの1以上における、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンの置換が、非置換リガンドと比較して高い溶出pHをもたらすことを見出した。一実施形態では、本発明は、固体担体にカップリングされた免疫グロブリン結合タンパク質を含むリガンドを含む、アフィニティー分離のためのマトリックスに関する。好ましくは、プロテインAドメインE、D、A、B、C又はプロテインZの単量体ドメインの1以上における、プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、リガンドは多量体である、即ち、プロテインAドメインE、D、A、B、C及びプロテインZから選択される2以上の単量体ドメインを含有している。本発明のマトリックスは、置換のないマトリックスと比較して、上昇した溶出pHを示す。突然変異タンパク質リガンドは好ましくは、Fc断片結合タンパク質であり、IgG、IgA及び/又はIgM、好ましくはIgGの選択的結合に使用できる。本発明によるマトリックスは、その任意の実施形態では前述した突然変異体タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは、前述のような置換を含む。本発明によるマトリックスの固体担体は、よく知られている任意の好適な種類のものであり得る。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合、有機性のものであり、使用される水性媒体に親水性表面を曝露する、即ち、外表面及び存在する場合にはさらに内表面のヒドロキシ-OH、カルボキシ-COOH、カルボキサミド-CONH2、場合によりN-置換された形態の、アミノ-NH2、場合により置換された形態の、オリゴ-又はポリエチレンオキシ基を曝露するポリマーをベースとする。一実施形態では、ポリマーは例えば、有利には架橋されて、例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、1,2,3-トリハロ置換されている低級炭化水素で架橋されて好適な多孔度及び剛直性を提供する多糖、例えば、デキストラン、澱粉、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどをベースとすることができる。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔質アガロースビーズである。本発明において使用する担体は、逆懸濁ゲル化inversesuspensiongelationなどの標準的方法に従って容易に調製できるSHjerten:BiochimBiophysActa792,393-3981964。あるいは、ベースマトリックスは、市販製品、例えば、HAROSE商標FFGEHealthcare社である。大規模な分離に特に有利な一実施形態では、担体は、その剛直性を増加させるように、したがってマトリックスが高流速により好適になるように構成されている。あるいは、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどのような合成ポリマーをベースとする。疎水性ポリマー、例えば、ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンをベースとするマトリックスの場合、マトリックスの表面は、前記で定義した親水基を周囲の水性液体に曝露するように親水化されることが多い。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造される例えば、StyrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerizationRArshady:ChimicaeL’Industria709,70-751988参照。あるいは、市販製品、例えば、SOURCE商標GEHealthcare社を使用する。別の選択肢において、本発明による固体担体は、無機性の担体、例えば、シリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。さらに別の実施形態では、固体担体は、表面、チップ、毛細管又はフィルターなどの別の形態である。本発明によるマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは、多孔質モノリスの形態である。代替的実施形態では、マトリックスは、ビーズ又は粒子の形態であり、多孔質又は非孔質のいずれであってもよい。ビーズ又は粒子の形態のマトリックスは、充填層として又は懸濁された形態で使用できる。懸濁された形態には、膨張層として知られるもの及び純粋な懸濁液が含まれ、それらにおいて粒子又はビーズは自由に移動できる。モノリス、充填層及び膨張層の場合、一般に、濃度勾配による従来のクロマトグラフィーの後に分離手順を行う。純粋な懸濁液の場合には、回分式方法を使用する。リガンドは、リガンド中に存在する例えばアミノ基及び/又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術によって担体に付着させ得る。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシスクシンイミドNHSなどが、よく知られているカップリング試薬である。リガンドの利用能を改善し且つ担体へのリガンドの化学カップリングを容易にする、スペーサーとして知られる分子を、担体とリガンドの間に導入し得る。あるいは、リガンドは、物理的吸着又は生物特異的吸着などの非共有結合的結合によって、担体に付着させることができる。マトリックスのリガンド含量は、例えば、5~15mg/mlマトリックス、有利には5~10mg/mlとすることができる。有利な一実施形態では、本発明のリガンドは、チオエーテル結合によって担体にカップリングされている。このようなカップリングを実施するための方法は、当分野で周知であり、当業者によって、標準的な技術及び装置を用いて容易に実施される。有利な一実施形態では、カップリングにおけるその後の使用のために、最初にリガンドに末端システイン残基を提供する。当業者ならばまた、適切な精製段階を容易に実施する。本発明のある特定の実施形態では、吸着段階の条件は、任意の通常使用されている条件を、標的抗体の特性、例えば、そのpIに応じて適切に適合させたものであり得る。任意選択の洗浄段階を、PBS緩衝液などの一般に使用されている緩衝液を使用して実施し得る。溶出は、プロテインA媒体からの溶出に使用される任意の好適な溶液を使用して実施し得る。本発明の方法は、標的抗体を捕捉するために、例えば、治療的使用又は診断的使用のための抗体の精製プロトコールにおける第1の段階において有用である。一実施形態では、75以上の抗体が回収される。有利な一実施形態では、80以上、例えば90以上、好ましくは95以上の抗体を、個々のリガンド系に好適なpHを有する溶出剤を使用して回収する。本発明の方法の後に、1以上の追加段階、例えば、他のクロマトグラフィー段階を実施し得る。したがって、特定の一実施形態では、約98を超える抗体が回収される。SpAドメインE、D、A、B、C又はプロテインZリガンドに関して前述したように、1以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させた場合、これらの突然変異体リガンドを含む親和性媒体は、アルカリ剤を使用する清浄手順によりよく耐え得る米国特許出願公開第2005/0143566号。この増大された安定性は、免疫グロブリンに対する突然変異タンパク質の初期親和性が、長期間にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合能は、アルカリ性環境において、親分子よりゆっくり低下する。この環境はアルカリ性と定義でき、pH値の上昇した環境を意味する。これは、例えば、約10を超える、例えば約13又は14までの、即ち、10~13又は10~14のpHであり、これは一般にアルカリ条件と表される。あるいは、これらの条件は、NaOHの濃度によって定義でき、その濃度は約1.0M以下、例えば、0.7M又は詳細には約0.5M、したがって0.7~1.0Mの範囲とすることができる。よって、前述のアスパラギン突然変異の存在下における免疫グロブリンに対する親和性、即ち、リガンドの結合特性、したがってマトリックスの能力は、アルカリ剤での処理によって経時的に本質的に変化しない。従来、アフィニティー分離マトリックスの定置清浄処理に使用されるアルカリ剤はNaOHであり、その濃度は0.75M以下、例えば0.5Mである。したがって、その結合能は、0.5MNaOHで7.5時間処理した後に、約70未満に、好ましくは約50未満に、より好ましくは約30未満に、例えば、約28に低下するであろう。さらなる態様において、本発明は、本発明によるリガンド又はマトリックスを使用する、IgG、IgA及び/又はIgMなどの免疫グロブリンを単離するための方法に関する。したがって、本発明は、1種以上の標的化合物を、前述のリガンド又はマトリックスに吸着させることによって液体から分離するクロマトグラフィーの方法を包含する。目的生成物は、分離される化合物又は液体であり得る。したがって、本発明のこの態様は、広範囲に使用されている周知の分離技術であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡潔に述べると、第1の段階において、標的化合物、好ましくは前述の抗体を含む溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドに標的化合物を吸着させる条件下で分離マトリックス上に流す。このような条件は、例えば、溶液のpH及び/又は塩濃度、即ち、イオン強度によって制御する。マトリックスの能力を超えないように注意すべきである。即ち、フローは、満足できる吸着を行えるように十分に遅くすべきである。この段階において、溶液の他の成分は、原則的に妨げられずに通過する。任意選択で、マトリックスは次に、例えば水溶液によって洗浄することによって、保持されている及び/又は緩く結合している物質を除去する。本発明のマトリックスは最も有利には、溶媒、塩若しくは洗浄剤又はそれらの混合物などの添加剤を用いて中間洗浄段階に使用される。次の段階において、溶出剤と称する第2の溶液を、標的化合物を脱着させる、即ち、放出させる条件下でマトリックス上に流す。このような条件は一般に、pH、塩濃度、即ち、イオン強度、疎水性などの変化によってもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出などの種々の溶出スキームが知られている。溶出はまた、マトリックス上で目的とする抗体と置き換わる競合物質を含む第2の溶液によって実現できる。天然又は組換えプロテインAをベースとする普通のプロテインA媒体例えば、MABSELECT商標及びnProteinAHAROSE商標4FastFlowは通常、主にそのVH3結合に応じてpH3.1~4.0ピーク頂点において測定において溶出する例えば、Ghose,S.etal.BiotechnologyandBioengineering92665-673[2005]参照。プロテインAのB-ドメインに由来するアルカリ安定化製品MABSELECTSURE商標は、VH3結合を本質的に欠いており、3.7~4.0のより高い溶出pHを生じる。アフィニティークロマトグラフィーの原理の一般的な総説に関しては、例えば、Wilchek,M.,andChaiken,I.2000.Anoverviewofaffinitychromatography.MethodsMol.Biol.147:1-6を参照されたい。プロテインAのBドメイン又はプロテインZのH18に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外なことに、免疫グロブリン又はFc断片を含有する融合タンパク質の溶出pHを上昇させる。したがって、この置換は、標的分子の収率が80以上又は好ましくは95超でありながら、pH4.0超、好ましくはpH4.2超での溶出を可能にするリガンドを生じる。これにより、標的分子の凝集又は不活性化のリスクを最小限に抑える、より穏やかな溶出条件が得られる。単量体からの凝集体分離は、抗体精製、特により高い分解能での抗体精製において課題となっている。本発明のリガンドは、単量体と凝集体との改良された分離を示し、これは、大規模であっても、捕捉段階における凝集体の除去の実行可能なアプローチとなる図5及び図6参照。以下に、本発明を例によって説明する。これらの例は、単に例示を目的として記載するのであり、したがって添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解してはならない。以下及び本明細書中の他の場所に示した参考文献は全て、参照によって本明細書中に組み入れる。タンパク質の突然変異誘発部位特異的突然変異誘発を、ヒスチジンの置き換えをコードするオリゴヌクレオチドを用いて2段階PCRによって実施した。鋳型として、Z又はCの単一ドメインを含有するプラスミドを使用した。PCR断片を、大腸菌発現ベクターpGOにライゲーションさせた。DNA配列決定を用いて、挿入断片の正確な配列を検証した。ZH18S及びCH18Sの多量体を形成するために、アミノ酸VDに対応する、C又はZドメインの開始コドンに位置するAccI部位GTAGACを使用した。pGOZH18S1及びpGOCH18S1を、AccIを用いて切断し、CIP処理した。各変異体に特異的なAccI粘着末端プライマーを設計し、2つのオーバーラップPCR産物を各鋳型から作製した。PCR産物を精製し、2アガロースゲル上でPCR産物を比較することによって濃度を推定した。等量の1対のPCR産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした90°C->25°C、45分間。得られた産物は、約1/4までが、AccI部位にライゲーションされる可能性がある断片からなる正確なPCR断片及び/又は消化されたベクター。ライゲーション及び形質変換の後、コロニーは、PCRによりスクリーニングして、ZH18S2、ZH18S4、CH18S2及びCH18S4を含有する構築物を同定した。陽性クローンを、DNA塩基配列決定によって検証した。構築物の発現及び精製構築物を、標準培地中で大腸菌K12を培養することによって細菌ペリプラズム内で発現させた。培養後、細胞を熱処理して、培地中にペリプラズムの内容物を放出させた。培地中に放出された構築物を、細孔径0.2μmのメンブランを用いて精密濾過によって回収した。その時点で濾過段階からの透過液中に存在する各構築物を、親和性によって精製した。透過液を、固定化IgGを含有するクロマトグラフィー媒体にロードした。ロードした産物を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、pHを低下させることによって溶出させた。溶出プールを中性のpHに調整し、ジチオスレイトールを添加することによって還元した。次いで、試料を陰イオン交換体にロードした。洗浄段階の後、構築物をNaCl勾配中で溶出させて、あらゆる夾雑物から構築物を分離した。溶出プールを、限外濾過によって40~50mg/mlに濃縮した。精製されたリガンドを、LC-MSによって分析して純度を求め、分子量が予想される値に一致するアミノ酸配列に基づいてことを確認した。活性化使用したベースマトリックスは、US6602990の方法に従って調製された、平均直径85ミクロンの硬質な架橋アガロースビーズであり、細孔サイズは、GelFiltrationPrinciplesandMethods,PharmaciaLKBBiotechnology1991,pp6-13で記載された方法により、Mw110kDaのデキストランに対する逆相ゲル濾過クロマトグラフィーKav値0.70に相当する。固形物ベースマトリックス25mLg、蒸留水10.0mL及びNaOH2.02gを、100mLフラスコ中で25°Cにおいて10分間機械的に撹拌しながら混合した。エピクロロヒドリン4.0mLを添加した。反応は2時間進行した。活性化されたゲルを、10ゲル沈降体積gelsedimentvolumeGVの水で洗浄した。カップリング50mlファルコンチューブ内のリガンド溶液50mg/mL20mLに、NaHCO3169mg、Na2CO321mg、NaCl175mg及びEDTA7mgを添加した。ファルコンチューブを、5~10分間、ローラーテーブル上に置き、次いでDTE77mgを添加した。還元が45分間超にわたって進行した。次いで、リガンド溶液を、セファデックスG-25を充填したPD10カラム上で脱塩した。脱塩された溶液中のリガンド含有量を、276nmのUV吸収を測定することによって求めた。活性化されたゲルを3~5GVの{0.1Mリン酸塩/1mMEDTApH8.6}で洗浄し、次いで、リガンドを、US6399750に記載された方法に従ってカップリングさせた。実験で使用した緩衝液は全て、窒素ガスによって少なくとも5~10分間脱泡してある。固定化後、ゲルは、3×GVの蒸留水で洗浄した。ゲル1GVの{0.1Mリン酸塩/1mMEDTA/10チオグリセロールpH8.6}を混合し、チューブを振盪テーブル内に室温で終夜放置した。次いで、ゲルを3×GVの{0.1MTRIS/0.15MNaClpH8.6}及び0.5MHAcで交互に洗浄してから、8~10×GVの蒸留水で洗浄した。ゲル試料を、アミノ酸分析のために外部研究機関に送り、総アミノ酸含有量からリガンド含有量mg/mlゲルを算出した。実施例1プロトタイプ突然変異体ZH18S2配列番号3:それぞれH18S置換を有するプロテインZの2つのコピーを含有するリガンド二量体ZH18S2リガンド密度6.1mg/ml。Z2H18がSに置換されていない以外は配列番号3と同様:プロテインZの2つのコピーを含有するリガンド二量体Z2リガンド密度5.9mg/ml。突然変異体ZH18S4配列番号9:それぞれH18S置換を含有するプロテインZの4つのコピーを含有するリガンド四量体ZH18S4リガンド密度9.6mg/ml。Z4H18がSに置換されない以外は配列番号9と同様:プロテインZの4つのコピーを含有するリガンド四量体Z4リガンド密度6mg/ml。樹脂2mlをTricorn5100カラムに充填。突然変異体CH18S2配列番号10:それぞれH18S置換を含有するCドメインの2つのコピーを含有するリガンド二量体CH18S2リガンド密度6.5mg/ml。C2H18がSに置換されていない以外は、配列番号10と同様:ドメインCの2つのコピーを含有するリガンド二量体C2リガンド密度6.9mg/ml。タンパク質Gammanorm165mg/mlOctapharmaを、平衡化緩衝液中で1mg/mLに希釈。平衡化緩衝液APBリン酸緩衝液20mM0.15MNaCl、pH7.4ElsichromAB溶出緩衝液クエン酸緩衝液0.1M、pH6。クエン酸緩衝液0.1M、pH3。CIP0.1MNaOH。実験の詳細及び結果ブレークスルー容量破過容量を、AKTAExplorer10システムを用いて滞留時間2.4分で決定した。安定なベースラインが得られるまで、平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは、自動ゼロ目盛り調整の前に行った。100のUVシグナルが得られるまで、試料をバイパスから適用した。次いで、安定なベースラインが得られるまで、平衡化緩衝液を再びカラムに適用した。最大吸光度の85のUVシグナルに達するまで、試料をカラムにロードした。次に、流速0.5ml/分において最大吸光度の20のUVシグナルまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。タンパク質を10カラム容量にわたって流速0.5ml/分で、pH6.0で開始しpH3.0で終了する直線勾配で溶出させた。次いで、カラムを、0.1MNaOHで流速0.5ml/分で清浄にし、平衡化緩衝液で再平衡化してから、20エタノールを添加した。最後の段階は、試料濃度を調べることであり、100のUVシグナルが得られるまでバイパスカラムから試料をロードすることによって行った。10におけるブレークスルー容量を算出するために、下記式を使用した。これは、即ち、カラム流出液中のIgGの濃度が供給材料中のIgG濃度の10となるまで、カラムにロードされるIgGの量である。10ブレークスルーでの動的結合能DBCを算出し、曲線の形を研究した。曲線は、結合、溶出及びCIPピークに関しても研究した。動的結合能DBCは、5、10及び80のブレークスルーに関して算出した。一部の結果を表1に示す。H18S置換を有するリガンドについても、親のH18リガンドZ2又はZ4と比較して、同様な能力が観察された。ヒトポリクローナルIgG及び異なるmABに関するIgGの能力及び溶出の研究を、ZH18S2、ZH18S4、Z2及びZ4について行った。能力値は、ZH18S2とZ2では異ならなかった。いくつかの例を表1に示す。溶出研究は、リン酸緩衝液中の異なる細胞培養物上清mAbC、mAbD又はヒトポリクローナルIgGについて行った。溶出pHは、ZH18S2及びZH18S4の場合、Z2及びZ4と比較して、0.4pH単位から1pH単位超まで上昇している。最大の差はポリクローナルIgGGammanormの場合に示され、mAbDは最小の差を示している。これらの溶出研究においては、約10mgの細胞培養物上清異なる細胞培養物上清を使用した、表2参照をカラムにロードした。0.1Mクエン酸緩衝液を使用して、pH6からpH3までの勾配溶出を行った。ピーク頂点のpHを記録した表2参照。ZH18S2及びZH18S4に関するより高い溶出pHを除いて、それらはまた、Z2及びZ4よりも良好な分離特性を有するように思われる。図5において、例えば、3つの異なるプロトタイプ全てにおいてテーリングが見られるが、ZH18S2の場合には2つのピークが実際に分離している。平衡化緩衝液並びに流速0.2ml/分及び215nmでのUV検出図6を使用する、直列に連結された2つの3mlTRICORN商標5/150SUPERDEX商標200カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、主ピークB7は検出可能な量の凝集体を含まないが、第2のピークB2は主に凝集体を含むことが明らかであった。上記の例は、本発明の特定の態様を例示するのであって、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではなく、そのように解釈すべきでない。上記のような本発明の教示の恩恵を受ける当業者ならば、本発明に多数の修正を行い得る。これらの修正は、添付した特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含されるものと解釈すべきである。"