配列番号:1に示すアミノ酸配列を有するヒト第VII因子またはヒト第VIIa因子に関連する1~15個のアミノ酸改変を有し、疎水性アミノ酸残基の34位における置換による導入、および36位におけるアミノ酸置換から選択される少なくとも一つの改変を含む、第VII因子または第VIIa因子ポリペプチド変種。34位に疎水性アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項1記載の変種。置換がA34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34Y、およびA34Wからなる群より選択される、請求項2記載の変種。置換がA34I、A34L、およびA34Vからなる群より選択される、請求項3記載の変種。置換がA34Lである、請求項4記載の変種。36位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項2~5のいずれか一項記載の変種。36位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項6記載の変種。置換がR36Eである、請求項7記載の変種。A34LR36Eの置換を含む、請求項8記載の変種。アミノ酸配列が36位におけるアミノ酸置換を含む、請求項1記載の変種。36位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項10記載の変種。置換がR36Dである、請求項11記載の変種。置換がR36Eである、請求項11記載の変種。34位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項10~13のいずれか一項記載の変種。34位に陰性荷電アミノ酸残基が置換により導入されている、請求項14記載の変種。置換がA34Eである、請求項15記載の変種。A34ER36Eの置換を含む、請求項16記載の変種。10位およびまたは32位にアミノ酸置換をさらに含む、請求項1~17のいずれか一項記載の変種。K32Eの置換を含む、請求項18記載の変種。P10Qの置換を含む、請求項18記載の変種。P10QK32Eの置換を含む、請求項18記載の変種。P10QK32EA34ER36Eの置換を含む、請求項21記載の変種。P10QK32EA34Lの置換を含む、請求項21記載の変種。P10QK32EA34LR36Eの置換を含む、請求項21記載の変種。非ポリペプチド部分への結合基を含む少なくとも一つのアミノ酸残基が、Glaドメイン外に位置する部位に導入されている、請求項1~24のいずれか一項記載の変種。結合基がインビボグリコシル化部位である、請求項25記載の変種。グリコシル化部位が置換によって導入されたインビボNグリコシル化部位である、請求項26記載の変種。インビボNグリコシル化部位がA51N、G58N、T106N、K109N、G124N、K143NN145T、A175T、I205S、I205T、V253N、T267N、T267NS269T、S314NK316S、S314NK316T、R315NV317S、R315NV317T、K316NG318S、K316NG318T、G318N、D334N、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換により導入されている、請求項27記載の変種。T106N、I205T、およびV253Nからなる群より選択される少なくとも一つの置換を含む、請求項28記載の変種。P10QK32EA34ER36ET106NI205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34ER36ET106NV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34ER36EI205TV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LT106NI205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LT106NV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LI205TV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LR36ET106NI205Tの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LR36ET106NV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。P10QK32EA34LR36EI205TV253Nの置換を含む、請求項29記載の変種。3位と4位の間に少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入をさらに含む、請求項1~38のいずれか一項記載の変種。3位と4位の間に一つのアミノ酸残基の挿入を含む、請求項39記載の変種。3位と4位の間に疎水性アミノ酸残基が挿入されている、請求項39または40記載の変種。挿入がA3AYである、請求項41記載の変種。A3AYP10QK32EA34ER36Eの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34Lの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LR36Eの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34ER36ET106NI205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34ER36ET106NV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34ER36EI205TV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LT106NI205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LT106NV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LI205TV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LR36ET106NI205Tの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LR36ET106NV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。A3AYP10QK32EA34LR36EI205TV253Nの改変を含む、請求項42記載の変種。配列番号:1に関連する6位、7位、14位、16位、19位、20位、25位、26位、29位および35位において改変が行われていない、請求項1~54のいずれか一項記載の変種。変種が活性型である、請求項1~55のいずれか一項記載の変種。本明細書に開示されているTF非依存性第X因子活性化アッセイにおいてアッセイされた場合に、活性型の変種のFX活性化活性とrhFVIIaのFX活性化活性の比率が少なくとも約5である、請求項1~56のいずれか一項記載の変種。請求項1~57のいずれか一項に定義される変種をコードするヌクレオチド配列。請求項58記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。請求項58記載のヌクレオチド配列または請求項59記載の発現ベクターを含む宿主細胞。インビボグリコシル化が可能なγカルボキシル化細胞である、請求項60記載の宿主細胞。請求項1~57のいずれか一項に定義される変種および少なくとも一つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。請求項1~57のいずれか一項に定義される変種、または請求項62に定義される組成物の、薬剤としての使用。凝血形成が望ましい疾患または障害の治療用の薬剤を製造するための、請求項1~57のいずれか一項に定義される変種の使用。疾患または障害が、脳出血、外傷などの重度の制御不能な出血、移植または切除を受ける患者の出血、静脈瘤の出血、および血友病を含む、出血からなる群より選択される、請求項64記載の使用。疾患または障害が外傷である、請求項65記載の使用。疾患または障害が血友病である、請求項65記載の使用。凝血形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、請求項1~57のいずれか一項に定義されている変種または請求項62記載の組成物の有効量を、必要としている哺乳動物に投与する段階を含む方法。疾患または障害が、脳出血、外傷などの重度の制御不能な出血、移植または切除を受ける患者の出血、静脈瘤の出血、および血友病を含む、出血からなる群より選択される、請求項68記載の方法。疾患または障害が外傷である、請求項69記載の方法。疾患または障害が血友病である、請求項69記載の方法。発明の詳細な開示定義本記載および特許請求の範囲の文脈において、以下の定義を適用する。FVIIまたはFVIIポリペプチドという用語は、一本鎖形状で提供されるFVII分子を意味する。FVIIポリペプチドの一例は、配列番号:1に示すアミノ酸配列を有する野生型ヒトFVIIである。しかし、FVIIポリペプチドという用語には、例えば配列番号:1の断片や変種、特に配列番号:1と比較してその配列に少なくとも一個、例えば15個以内、好ましくは10個以内のアミノ酸改変を含む変種といったhFVII様分子も含まれるということが理解されるべきである。FVIIaまたはFVIIaポリペプチドという用語は、活性型二本鎖形状で提供されるFVIIa分子を意味する。FVIIaのアミノ酸配列を記載するのに配列番号:1のアミノ酸配列が使用される場合、一本鎖形状のR152とI153の間のペプチド結合が開裂し、それらの鎖の一方はアミノ酸残基1~152となり、他方はアミノ酸残基153~406となると理解される。rFVIIおよびrFVIIaという用語は、組換え技術によって産生されたFVIIおよびFVIIaポリペプチドを意味する。hFVIIおよびhFVIIaという用語はそれぞれ、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を有するヒト野生型FVIIおよびFVIIaを意味する。rhFVIIおよびrhFVIIaという用語は、組換え手段により作製された、配列番号:1に示されるアミノ酸配列を有するヒト野生型FVIIおよびFVIIaを意味する。rhFVIIaの一例は、NovoSevenである。本明細書で使用される場合、Glaドメインという用語は、配列番号:1の1~45位のアミノ酸残基を含むことを意図する。したがって、Glaドメイン外に位置する部位とは、配列番号:1の46~406位のアミノ酸残基を含む。FX、TFおよびTFPIという略語は、それぞれ、第X因子、組織因子、組織因子経路阻害剤を意味する。プロテアーゼドメインという用語は、N末端から数えて153~406位の残基について使用される。触媒部位という用語は、ポリペプチド変種のS344、D242およびH193からなる触媒三構造を意味するために使用される。親という用語は、本発明に従って改変改良されるべき分子を示すことを意図している。本発明によって改変される親ポリペプチドは、任意のFVIIまたはFVIIaポリペプチドであってよく、ゆえに任意の起源、例えば非ヒト哺乳動物起源に由来してもよいが、親ポリペプチドはhFVIIまたはhFVIIaであることが好ましい。変種とは、一つまたは複数のアミノ酸残基、通常は1~15個のアミノ酸残基、例えば1~10個のアミノ酸残基、例えば1~8、1~6、1~5、または1~3個のアミノ酸残基が親ポリペプチドと異なるポリペプチドである。通常、親ポリペプチドはhFVIIまたはhFVIIaである。結合型または互換的に結合型ポリペプチドとは、1つまたは複数のポリペプチドを、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分または有機誘導体化物質のような1つまたは複数の非ポリペプチド部分に共有結合させることによって形成された不均一な組成の意味においてまたはキメラ分子を示すと解釈される。好ましくは、結合型は、適切な濃度および条件で可溶性である、すなわち血液のような生理的液体において可溶性である。本発明の結合型ポリペプチドの例には、グリコシル化および/またはPEG化ポリペプチドが含まれる。共有結合または共有結合したという用語は、ポリペプチド変種および非ポリペプチド部分が、互いに直接共有結合しているか、または架橋、スペーサー、もしくは連結部分のような、少なくとも1つの介在する部分を通して、間接的に共有結合していることを意味する。非ポリペプチド部分という用語は、アミノ酸単量体から構成されペプチド結合によって結合されているペプチド重合体とは異なる分子を意味し、この分子は本発明のポリペプチド変種の結合基に結合することができる。そのような分子の好ましい例として、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物または有機誘導体化物質が挙げられる。本発明の結合型変種の文脈で使用される場合、非ポリペプチド部分は、ポリペプチドの結合基を介して結合型変種のポリペプチド部分に結合していると理解される。上記に説明されているように、非ポリペプチド部分は、直接的または間接的に結合基と共有結合できる。ポリマー分子は、単量体がいずれもアミノ酸残基ではなく、ポリマーがヒトアルブミンまたは他の豊富な血漿タンパク質である場合を除く、二つまたはそれ以上の単量体の共有結合によって形成された分子である。ポリマーは、ポリマー分子という用語と互換的に用いてもよい。この用語はまた、インビトログリコシル化によって結合された糖質分子、すなわち、選択的にクロスリンク剤を用いて糖質分子をポリペプチド変種の結合基に共有結合させることを含む、通常インビトロで行われる合成グリコシル化を含むと解釈される。糖部分は、インビボグリコシル化によってグリコシル化ポリペプチド変種の形でポリペプチド変種結合型を産生するためにポリペプチド変種に結合することができる、1つまたは複数の単糖類残基を含む糖質含有分子を示すと解釈される。インビボグリコシル化という用語は、すなわちポリペプチド変種の発現のために用いられるグリコシル化細胞における翻訳後プロセシングの際に、例えばN結合およびO結合グリコシル化によって、インビボで起こる糖部分の任意の結合を意味すると解釈される。正確なオリゴ糖構造は、当該グリコシル化生物に依存するところが大きい。Nグリコシル化部位は、配列NXSTCを有し、式中Xはプロリンを除く任意のアミノ酸残基、Nはアスパラギン、およびSTCはセリン、トレオニン、またはシステインのいずれか、好ましくはセリンまたはトレオニンであり、最も好ましくはトレオニンである。好ましくは、アスパラギン残基に対して3位のアミノ酸残基は、プロリン残基ではない。Oグリコシル化部位は、セリンまたはトレオニン残基のOH基である。結合基という用語は、ポリペプチド変種の官能基、特にポリマー分子、親油性分子、糖部分または有機誘導体化物質のような非ポリペプチド部分を結合させることができるそのアミノ酸残基または糖質部分の官能基を示すと解釈される。有用な結合基およびそのマッチする非ポリペプチド残基は、下記の表から明らかであると思われる。インビボNグリコシル化の場合、結合基という用語は、Nグリコシル化部位を構成するアミノ酸残基を示すために従来とは異なる意味で用いられる上記の配列NXSTC。Nグリコシル化部位のアスパラギン残基は、それに対して糖部分がグリコシル化の際に結合する部位であるが、そのような結合は、Nグリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しなければ、起こり得ない。したがって、非ポリペプチド部分が糖部分であって、結合がインビボNグリコシル化によって得られる場合、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変に関連して用いられる非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基という用語は、機能的インビボNグリコシル化部位がアミノ酸配列に導入されるように、インビボNグリコシル化部位を構成する1つまたは複数のアミノ酸残基を変化させるという意味であると理解すべきである。本出願において、アミノ酸名および原子名例えば、CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等は、IUPAC命名法IUPACNomenclatureandSymbolismforAminoAcidsandPeptidesresiduenamesatomsetc、EurJBiochem138:9~371984と共に、EurJBiochem152:11985の修正版に基づいてタンパク質データバンクPDBwwwpdborgによって定義される通りに用いられる。アミノ酸残基という用語は、任意の天然または合成アミノ酸残基を含むと解釈され、かつ本来は20個の天然に存在するアミノ酸、すなわちアラニンAlaまたはA、システインCysまたはC、アスパラギン酸AspまたはD、グルタミン酸GluまたはE、フェニルアラニンPheまたはF、グリシンGlyまたはG、ヒスチジンHisまたはH、イソロイシンIleまたはI、リジンLysまたはK、ロイシンLeuまたはL、メチオニンMetまたはM、アスパラギンAsnまたはN、プロリンProまたはP、グルタミンGlnまたはQ、アルギニンArgまたはR、セリンSerまたはS、トレオニンThrまたはT、バリンValまたはV、トリプトファンTrpまたはW、およびチロシンTyrまたはY残基からなる群より選択されるアミノ酸からなる群に含まれるアミノ酸残基を示すと解釈される。アミノ酸の位置を同定するために用いられる用語を以下に説明する:G124は、配列番号:1に示すアミノ酸配列において124位がグリシン残基で占められていることを示す。G124Rは、124位のグリシン残基がアルギニン残基に置換されていることを示す。もう1つの置換は、で示され、例えばN145STは、145位のアスパラギンがセリンまたはトレオニンのいずれかに置換されているアミノ酸配列を意味する。多数の置換はで示し、例えばK143NN145STは、143位のリジン残基のアスパラギン残基への置換および145位のアスパラギン残基のセリンまたはトレオニン残基への置換を含むアミノ酸配列を意味する。G124の後のアラニン残基の挿入のような、さらなるアミノ酸残基の挿入は、G124GAで示される。G124の後で二つのさらなるアラニン残基が挿入される場合、G124GAA等によって示される。本明細書において用いる場合、X位に挿入またはX位での挿入という用語は、アミノ酸残基がアミノ酸残基XとX1とのあいだに挿入されることを意味する。アミノ酸残基の欠失は、星印で示される。例えば、124位のグリシン残基の欠失は、G124によって示される。特に明記していない限り、本明細書において行ったアミノ酸残基の番号付けは、hFVIIhFVIIaポリペプチドのアミノ酸配列配列番号:1に対してなされている。特異的変異に関連して用いられる異なるという用語は、明記されたアミノ酸の差とは別にさらなる差が存在することを認めることを意図する。例えば、FX活性化を増大させるためにGlaドメインにおいて行った改変に加えて、ポリペプチドはこの効果に必ずしも関係しない他の改変を含んでも良い。したがって、本明細書に開示したアミノ酸改変に加えて、本発明のポリペプチド変種のアミノ酸配列は、望ましい場合、その他の改変すなわち置換、挿入、または欠失を含んでも良いことが理解される。これらには、例えばNおよび/またはC末端での1つまたはそれ以上のアミノ酸残基例えば、アミノ酸残基1~10個の切断、またはNおよび/またはC末端での1つまたはそれ以上の余分の残基の付加、例えばN末端でのメチオニン残基の付加、またはC末端近傍もしくはC末端でのシステインの導入と共に保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸、例えば小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、および芳香族アミノ酸の群内で行われる置換が含まれてもよい。そのような保存的置換の例を以下の表に示す。さらなる改変の他の例については、Glaドメイン外部での改変およびGlaドメイン外部でのその他の改変と題された項に開示されている。ヌクレオチド配列という用語は、二つまたはそれ以上のヌクレオチド分子が連続伸長したものを示すことを意図している。ヌクレオチド配列はゲノム起源、cDNA起源、RNA起源、半合成起源、合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。ベクターという用語は、宿主細胞内で複製可能または宿主細胞ゲノム内に組み込み可能なプラスミドまたは他のヌクレオチド配列を意味し、それ自体は、ヌクレオチド配列のクローニングを容易にするため、すなわち有用な量の配列を産生するため、その配列にコードされた遺伝子産物の発現を誘導するため、および宿主細胞のゲノム内にヌクレオチド配列を組み込むために、適合する宿主細胞と連動してさまざまな機能を実行するのに有用である。ベクターは、実行すべき機能に応じてさまざまな成分を含むであろう。細胞、宿主細胞、細胞系および細胞培養物は、本明細書において互換的に用いられ、このような全ての用語には、細胞の増殖および培養により生じる子孫が含まれることを理解すべきである。形質転換およびトランスフェクションは互換的に用いられ、細胞にDNAを導入する工程を意味する。機能的に結合されるとは、二つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を、配列の通常の機能を実行できるような互いに関連した構造に、酵素的ライゲーションまたは他の手段によって共有結合することを意味する。一般的に、機能的に結合されるとは、連結されたヌクレオチド配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。もしそのような部位が存在しなければ、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを標準的な組換えDNA法とともに用いる。本発明の文脈において、改変またはアミノ酸改変という用語は、アミノ酸側鎖の交換、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠失、またはアミノ酸残基の挿入を含むことが意図される。導入するという用語は、特に既存のアミノ酸残基の置換による、またはさらなるアミノ酸残基の挿入による、アミノ酸残基の導入を意味する。除去するという用語は、特に除去されるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することによる、あるいは除去されるアミノ酸残基を欠失することによる、アミノ酸残基の除去を意味する。本発明の文脈において、活性という用語は、その活性が実際に測定されるアッセイに伴う関連した活性であると理解されるべきである。したがって、アミド溶解活性という用語は、本明細書に記載のアミド溶解アッセイにおいて測定された活性を意味するために用いられる。アミド溶解活性を示すために、本発明の変種はその活性化型において、本明細書に記載のアミド溶解アッセイでアッセイした場合に、rhFVIIaのアミド溶解活性の少なくとも10を有しなければならない。本発明の好ましい態様において、変種はその活性化型において、本明細書に記載のアミド溶解アッセイでアッセイした場合に、rhFVIIaのアミド溶解活性の少なくとも20、例えばrhFVIIaのアミド溶解活性の少なくとも30、例えば少なくとも40、より好ましくは少なくとも50、例えば少なくとも60、例えば少なくとも70、さらにより好ましくは少なくとも80、例えば少なくとも90を有する。興味深い態様において、変種はその活性化型において、rhFVIIaと実質的に同じアミド溶解活性、例えばrhFVIIaのアミド溶解活性の75~125のアミド溶解活性を有する。凝血活性という用語は、本明細書に記述の全血アッセイにおいて測定された活性、すなわち凝血形成を得るために必要な時間を意味する。したがって、凝血時間がより短いということは凝血活性がより高いことに対応する。凝血活性の増加という用語は、本明細書に記載の全血アッセイにおいて測定し、同等の条件下で決定した場合に、本ポリペプチド変種の凝血時間がrhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaにより生じたものと比較して、統計学的に有意に減少していることを示すために用いられる。本文脈において、活性という用語は、FXをFXaに活性化する本変種の能力にも関連して用いられる。この活性はまたFX活性化活性またはFXa生成活性ともよばれ、本明細書に記載のTF非依存性第X因子活性化アッセイにおいて決定されうる。FX活性化活性の増加またはFXa生成活性の増加という用語は、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較して、活性化型の本発明の変種のFXをFXaに活性化する能力が統計学的に有意に増加していることを示すために使用される。本発明の変種が、どの程度増加したFX活性化活性を有するかということは、本明細書に記載のTF非依存性第X因子活性化アッセイにおいて簡便に決定することができる。所定の物質に関連して用いられる免疫原性という用語は、物質の免疫系からの反応の誘導能を示すことを意図する。免疫応答は、細胞性または抗体媒介反応であってもよい例えば、免疫原性の詳しい定義に関しては、Roitt:EssentialImmunology第10版、Blackwellを参照されたい。通常、抗体の反応性の減少は、免疫原性の減少の指標となると思われる。免疫原性は、例えばインビボまたはインビトロでの当技術分野で既知の任意の適した方法を用いることによって決定してもよい。機能的インビボ半減期という用語は、その通常の意味において用いられ、すなわちポリペプチドの生物活性の50が生体/標的臓器になお存在している時間、またはポリペプチドの活性が最初の値の50である時間である。機能的なインビボ半減期を決定するための代用として、血清半減期、すなわち排泄される前にポリペプチドの50が血漿または血流において循環している時間を決定してもよい。血清半減期の決定はしばしば機能的インビボ半減期を決定するより単純であり、血清半減期の程度は通常、機能的インビボ半減期の程度の良好な指標である。血清半減期に対する別の用語には、血漿半減期、循環中半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。ポリペプチドは、細網内皮系RES、腎臓、脾臓、または肝臓の1つまたは複数の作用によって、組織因子、SEC受容体、もしくは他の受容体媒介排泄によって、または特異的もしくは非特異的タンパク質分解によって排泄される。通常、クリアランスは、大きさ糸球体濾過速度のカットオフに関して、電荷、結合した炭化水素鎖、およびタンパク質の細胞受容体の存在に依存する。保持される機能性は通常、前凝固、タンパク質溶解、または受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、当技術分野で既知の任意の適した方法によって決定してもよい。機能的インビボ半減期または血清半減期に関して用いられる場合の増加したという用語は、ポリペプチド変種の関連する半減期が、同等の条件で決定した場合にrhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaのような参照分子の半減期と比較して統計学的に有意に増加していることを示すために用いられる典型的には、ラット、ウサギ、ブタ、またはサルなどの実験動物において決定される。AUCivまたは静脈内投与した場合の曲線下面積は、その通常の意味において、すなわちポリペプチド変種が静脈内投与されている場合、特にラットに静脈内投与されている場合の、血清時間曲線における活性下面積として用いられる。典型的に、測定する活性は上記で定義される凝固活性である。実験的活性時間点が決定された後、AUCivは、GraphPadPrism301のようなコンピュータープログラムによって計算することが都合がよい可能性がある。異なる分子間で、直接AUCiv値を比較するためには、同量の活性を投与すべきであることが理解されるであろう。その結果、AUCiv値は典型的に標準化され、AUCiv投与用量として表される。タンパク質分解に対する感受性の低下という用語は主に、比較できる条件下で決定した場合に、ポリペプチド変種が、hFVIIa、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaと比較してタンパク質分解に対する感受性が低下していることを意味すると解釈される。好ましくは、タンパク質分解は、少なくとも25例えば、25~50、25~75、または25~100のような少なくとも10例えば、10~25または10~50、より好ましくは少なくとも50例えば、50~75、または50~100のような少なくとも35、さらにより好ましくは、少なくとも75例えば、75~100のような少なくとも60、または少なくとも90減少する。腎クリアランスという用語は、腎臓によって、例えば糸球体濾過、尿細管排泄または尿細管細胞における分解によって起こる任意のクリアランスを示すためにその通常の意味において用いられる。腎クリアランスは、大きさ直径、流体力学容積、対称性、形状/硬度、および電荷を含むポリペプチドの物理的特徴に依存する。通常、分子量約67kDaを腎クリアランスに関するカットオフ値と見なすことが多い。腎クリアランスは、任意の適したアッセイ法、例えば確立されたインビボアッセイ法によって確立してもよい。典型的に、腎クリアランスは、標識された例えば、放射標識または蛍光標識ポリペプチドを患者に投与すること、および患者から採取した尿中の標識活性を測定することによって決定される。腎クリアランスの低下は、比較できる条件下で対応する参照ポリペプチド、例えばrhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaと比較して決定される。好ましくは、ポリペプチド変種の腎クリアランス率は、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaと比較して、少なくとも50、好ましくは少なくとも75、および最も好ましくは少なくとも90減少する。組織因子結合部位、活性部位領域および活性部位結合裂の隆起という用語は、実施例1に定義されている。疎水性アミノ酸残基という用語には、次のアミノ酸残基が含まれる:イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、バリンV、フェニルアラニンF、チロシンTおよびトリプトファンW。陰性荷電アミノ酸残基と言う用語には、次のアミノ酸残基が含まれる:アスパラギン酸D、およびグルタミン酸E。陽性荷電アミノ酸残基という用語には、次のアミノ酸残基が含まれる:リジンK、アルギニンR、およびヒスチジンH。本発明の変種親ポリペプチドのGlaドメインに行われた改変は、結果として生じる分子に、リン脂質膜結合親和性の増加、FXをFXaに活性化する能力の増加、およびまたは凝血活性の増加を提供することが好ましい。本発明の変種はまた、組織因子結合親和性が減少しており、組織因子に結合したときの活性が減少している。いかなる特定の理論に限定されるわけではないが、現在、リン脂質膜結合親和性の増強は、他の凝固因子、特にFXに近接している活性型ポリペプチド変種の、局所濃度の上昇をもたらすと考えられている。したがって、単純にFXに対する活性型FVII変種のモル比が高くなることにより、FXからFXaへの活性化率がより高くなる。FX活性化率の増加は、活性型トロンビン量の増加をもたらし、したがってフィブリン架橋率がより高くなる。結果として、本発明のポリペプチド変種を用いた医学的治療は、現在利用可能なrhFVIIa化合物に対して、より低用量、増大した有効性、およびまたはより迅速な作用などの有利な点を提供しうると考えられる。さらに、組織因子非依存性変種、すなわち野生型ヒト第VIIa因子と比較して組織因子と結合したときに活性が減少する変種は、望ましくない凝血形成の危険性が少ないという点において、特に外傷などの急性の制御不能な出血の治療に用いられる場合、確実に安全性の利点を提供すると考えられる。したがって、本発明の非常に好ましい態様において、ポリペプチド変種はその活性化型において、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較して、特に本明細書に開示されるTF非依存性第X因子活性化アッセイなどの組織因子非依存性アッセイでアッセイした場合に、FX活性化活性が増加している。より詳細には、活性型のポリペプチド変種のFX活性化活性と、参照分子のFX活性化活性との比率は、本明細書に開示されるTF非依存性第X因子活性化アッセイでアッセイした場合、少なくとも125であることが好ましい。より好ましくは、この比率は少なくとも15、例えば少なくとも175、例えば少なくとも2、さらにより好ましくは少なくとも3、例えば少なくとも4であり、最も好ましくは少なくとも5である。参照分子がrhFVIIaの場合、活性化型のポリペプチド変種のFX活性化活性と、rhFVIIaのFX活性化活性との比率は、本明細書に開示されるTF非依存性第X因子活性化アッセイでアッセイした場合、好ましくは少なくとも約5、典型的には少なくとも約10、例えば少なくとも約15または20である。もう一つの本発明の非常に好ましい態様において、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaと比較して、本発明の変種は凝血活性が増加している。本発明の好ましい態様において、本変種の場合の凝血形成に達する時間と、rhFVIIaの場合の凝血形成に達する時間またはP10QK32ErhFVIIaの場合の凝血形成に達する時間との比率は、本明細書に開示されている全血アッセイでアッセイした場合、多くても09である。より好ましくは、この比率は多くても075、例えば07であり、さらにより好ましくはその比率は多くても06であり、最も好ましくはその比率は多くても05である。上記の特性のうち一つまたは複数が、本明細書に記載されている改変によって達成されうる。第34位に疎水性アミノ酸残基を含む本発明の変種上記のように、本発明は、第一の局面において、hFVIIまたはhFVIIaに関連する1~15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、34位に疎水性アミノ酸残基が置換により導入されているFVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。34位に導入された疎水性アミノ酸残基は、I、L、M、V、F、YおよびWからなる群より選択され、好ましくはI、LおよびVであり、特にLが好ましい。好ましい態様において、本変種はさらに10位におけるアミノ酸置換、特にP10Q、およびまたは32位におけるアミノ酸置換、特にK32Eをさらに含む。本発明の特に好ましい態様において、本変種は10位と32位の両方におけるアミノ酸置換、例えばP10QK32Eを含む。したがって、本発明の興味深い態様において、本変種はP10QK32EA34Lの置換を含む。本発明の特に興味深い態様において、本変種は、3位と4位の間に少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入をさらに含む。挿入されるアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基であることが好ましい。挿入はA3AYであることが最も好ましい。したがって、本発明の特に興味深い態様において、本変種はA3AYP10QK32EA34Lの改変を含む。上記の任意の改変に加えて、本変種は33位における置換をさらに含んでもよい。好ましくは、疎水性アミノ酸残基が置換によって33位に導入され、特にD33Fである。Glaドメインも他の部位、特に8位、11位、28位において、例えばR28FまたはR28Eなどの改変を含んでよい。他方で、Glaドメインは、膜結合特性が損なわれる程度にまで改変すべきではないということは理解されるべきである。したがって、γカルボキシル化される残基には改変を加えないことが好ましく、すなわち6位、7位、14位、16位、19位、20位、25位、26位、29位および35位の残基には改変を加えないことが好ましい。同様に、非ポリペプチド部分、例えば糖部分およびまたはPEG基をGlaドメインに導入することは一般的に好ましくない。結果として、GlaドメインにはインビボNグリコシル化部位を作出する改変を加えないことが好ましい。最後に、この項で論じたGlaドメインにおける改変は、Glaドメイン外に位置する部位における一つまたは複数の改変と組み合わせることが有利でありうると理解される。第36位にアミノ酸置換を含む本発明の変種上記のように、本発明は、第二の局面において、hFVIIまたはhFVIIaに関連する1~15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列が36位にアミノ酸置換を含む、FVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。好ましくは、36位に置換によって導入されるアミノ酸残基は陰性荷電アミノ酸残基であり、例えばR36EまたはR36D、特にR36Eである。好ましい態様において、本変種は10位におけるアミノ酸置換、特にP10Q、およびまたは32位におけるアミノ酸置換、特にK32Eをさらに含む。本発明の特に好ましい態様において、本変種は10位と32位の両方における置換、例えばP10QK32Eを含む。本変種は、38位における置換をさらに含んでもよい。例えばK38EまたはK38Dのように、陰性荷電アミノ酸残基が置換により38位に導入されることが好ましく、特にK38Eが好ましい。したがって、興味深い変種は、P10QK32ER36EまたはP10QK32ER36EK38Eの置換を含むものである。特に興味深い態様において、本変種は34位におけるアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、例えばA34EまたはA34Dのように、一つの陰性荷電アミノ酸残基が置換によって34位に導入される。好ましい変種の特定の例は、P10QK32EA34ER36EまたはP10QK32EA34DR36EK38Eの置換を含むものである。本発明の興味深い態様において、本変種は3位と4位の間に少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入をさらに含む。挿入されるアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基であることが好ましい。最も好ましくは、挿入はA3AYである。上記の任意の改変に加えて、本変種は33位にさらなる置換を含んでもよい。好ましくは、疎水性アミノ酸残基が置換によって33位に導入され、特にD33Fが好ましい。Glaドメインも他の部位、特に8位、11位、28位において、R28FまたはR28Eなどの改変を含んでもよい。他方で、Glaドメインは、膜結合特性が損なわれる程度にまで改変すべきではないということが理解されるべきである。したがって、γカルボキシル化される残基には改変を加えないことが好ましく、すなわち6位、7位、14位、16位、19位、20位、25位、26位、29位および35位の残基には改変を加えないことが好ましい。同様に、非ポリペプチド部分、例えば糖部分およびまたはPEG基をGlaドメインに導入することは一般的に好ましくない。結果として、GlaドメインにはインビボNグリコシル化部位を作出する改変を加えないことが好ましい。最後に、この項で論じたGlaドメインにおける改変は、Glaドメイン外に位置する部位における一つまたは複数の改変と組み合わせることが有利でありうると理解される。第74位、第77位または第116位にアミノ酸置換を含む本発明の変種上記のように、本発明は、第三の局面において、hFVIIまたはhFVIIaに関連する3~15個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸配列が、10位、32位におけるアミノ酸置換、ならびに74位、77位、および116位からなる群より選択される部位における少なくとも一つのさらなるアミノ酸置換を含む、FVIIまたはFVIIaポリペプチド変種に関する。好ましい態様において、10位のアミノ酸置換はP10Qであり、32位のアミノ酸置換はK32Eである。74位、77位または116位の置換は、P74S、E77AおよびE116Dからなる群より選択されることがさらに好ましい。興味深い態様において、本変種はさらに34位にアミノ酸置換を含む。好ましくは、例えばA34EまたはA34Dのように、陰性荷電アミノ酸残基が置換によって34位に導入されるのが好ましく、特にA34Eが好ましい。本発明のもう一つの興味深い態様において、本変種は3位と4位の間に少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入をさらに含む。挿入されるアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基であることが好ましい。最も好ましくは、挿入はA3AYである。本変種の興味深い特定の例として、A3AYP10QK32EE116D、A3AYP10QK32EE77A、およびP10QK32EA34EP74Sの改変を含む変種が挙げられる。上記の任意の改変に加えて、本変種は33位におけるさらなる置換を含んでもよい。好ましくは、疎水性アミノ酸残基が置換によって33位に導入され、特にD33Fが好ましい。Glaドメインも他の部位、特に8位、11位、および28位において、R28FまたはR28Eなどの改変を含んでもよい。上記で説明したように、Glaドメインは、膜結合特性が損なわれる程度にまで改変すべきではないということが理解されるべきであり、すなわち6位、7位、14位、16位、19位、20位、25位、26位、29位および35位の残基には改変を加えないことが好ましく、かつGlaドメインにはインビボNグリコシル化部位を作出しないことが好ましい。最後に、この項で論じたGlaドメインにおける改変は、Glaドメイン外に位置する部位における一つまたは複数の改変と組み合わせることが有利でありうると理解される。Glaドメイン外部での改変循環rhFVIIaの半減期は23時間であることが、SummaryBasisforApprovalforNovoSeven、FDA参照番号960597に報告されている。望ましい治療的または予防的効果を達成し維持するためには、比較的高用量で頻繁に投与する必要がある。その結果、適切な用量調節を得ることが困難となり、頻繁な静脈内投与を必要とすることから患者の生活様式が制限される。循環半減期がより長く、かつまたは生物学的利用能が増加した分子は、必要な投与回数を減少させると考えられる。現在の頻繁な注射の必要性、および治療効果の増強を伴ったより最適な治療的FVIIaレベルを得る可能性を考えると、改良されたFVII様分子またはFVIIa様分子が必要なことは明らかである。したがって、本発明のさらなる目的は、生物学的利用能が増加しており例えば、静脈内投与された場合に、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較して曲線下面積が増加している、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較して、より効率的に組織因子に結合することなく第X因子を第Xa因子に活性化することのできるそれによって、外傷などの制御不能な出血、または血友病などの慢性的状態をより効率的に治療可能である、改良型FVIIまたはFVII分子を提供することである。したがって、本発明の興味深い変種は、その活性型において、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較して、静脈内投与された場合の曲線下面積の増加をもたらすものである。これは、ラットに静脈内投与することによって簡便に決定することができる。より詳細には、本発明の興味深い変種は、活性型における変種のAUCivと、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子のAUCivとの間の比率が、特にラットに投与した場合、少なくとも125、例えば少なくとも15、例えば少なくとも175、より好ましくは少なくとも2、例えば少なくとも3であり、さらにより好ましくは少なくとも4、例えば少なくとも5であるものである。この効果は、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子と比較した機能的インビボ半減期の増加およびまたは血清半減期の増加にしばしば対応すると考えられる。したがって、本発明のもう一つの興味深い態様において、活性化型における本変種と、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子との機能的インビボ半減期または血清半減期の比率は、少なくとも125である。より好ましくは、活性化型における本変種と、rhFVIIaまたはP10QK32ErhFVIIaなどの参照分子との当該半減期の比率は、少なくとも15、例えば少なくとも175、例えば少なくとも2であり、さらにより好ましくは少なくとも3、例えば少なくとも4、例えば少なくとも5である。タンパク質の循環半減期を増加させる一つの方法は、そのタンパク質の腎クリアランスを確実に減少させることである。これは、タンパク質の腎クリアランスを減少させることのできる化学的部分、例えばポリエチレングリコールをそのタンパク質に結合させることにより達成されうる。さらに、タンパク質に化学的部分を付加するか、またはタンパク質分解を受けるアミノ酸を置換することにより、さもなければそのタンパク質のタンパク質分解性劣化をもたらすタンパク質分解酵素の接触を効率的に遮断することができる。上記のように、タンパク質分解性劣化による不安定性は、現在のrhFVIIa治療における公知の問題である。したがって、タンパク質分解性劣化は、凍結乾燥製品とは反対に、調製物を溶液で得るにあたって大きな障害となる。安定した可溶性調製物を得ることの利点は、患者にとって扱いが容易であること、および緊急時に作用がより速いことであり、それにより生命を救える可能性がある。主要なタンパク質分解部位に部位特異的変異を加えることによってタンパク質の分解劣化を防ぐ試みが、国際公開公報第8810295号に開示されている。国際公開公報第0158935号は、AUCiv、機能的インビボ半減期、およびまたは血清半減期の増加をもたらす多くの適切な改変を開示している。国際公開公報第0158935号に開示された変種は、改善されたFVII分子またはFVIIa分子を開発するための一般的な新たな方法の結果であり、これを本発明の親FVIIまたはFVIIaポリペプチドのために使用してもよい。より具体的には、親FVIIまたはFVIIaのポリペプチドにおいて非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基を除去および/または導入することにより、選択した非ポリペプチド部分への結合に対してより感受性のある分子を作製するためにポリペプチドを特異的に適合させること、結合パターンを最適化すること例えば、FVIIまたはFVIIaのポリペプチド変種の表面上の非ポリペプチド部分の最適な分布および数を保証にすること、ならびに結合が意図される結合基のみが分子に存在することを保証すること、ならびにそれによって、アミド分解活性を有し、さらにrhFVIIa分子と比較して1つまたは複数の改善された特徴を有する新規の結合分子を得ることが可能である。本発明の興味深い態様において、Glaドメイン外に位置する複数のアミノ酸残基は、変更され、例えばこの変更は、選択した非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基の除去および導入を含む。アミノ酸残基の除去および/または導入に加えて、ポリペプチド変種は、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基の導入および/または除去に関連していない他の置換を含んでもよい。また、ポリペプチド変種は、ポリペプチド変種の触媒部位を阻害するためのセリンプロテイナーゼ阻害剤に結合されてもよい。または、触媒部位に存在する一つまたは複数のアミノ酸残基S344、D242およびH193を、得られる変種を不活性にするために変異させてもよい。そのような変異の一例はS344Aである。非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基は、それが除去または導入されているかに関わらず、選択した非ポリペプチド部分の性質に基づいて選択され、ほとんどの場合、ポリペプチド変種と非ポリペプチド部分との間で結合が達成される方法に基づいて選択される。例えば、非ポリペプチド部分が、ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイドに由来する分子のようなポリマー分子である場合、結合基を含むアミノ酸残基は、リジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、およびチロシンからなる群より選択されてもよく、好ましくは、リジン、システイン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されてもよく、より好ましくはリジンおよびシステインからなる群より選択されてもよく、特にシステインであってよい。非ポリペプチド部分に対する結合基が、親ポリペプチドに導入されるか、または親ポリペプチドから除去される場合には、改変されるアミノ酸残基の位置は、好ましくは親FVIIまたはFVIIaのポリペプチドの表面に位置し、より好ましくは、その側鎖の少なくとも25が表面に露出しているアミノ酸残基で占められ本明細書の実施例1に定義されるように、好ましくは、その側鎖の少なくとも50が表面に露出しているアミノ酸残基で占められる本明細書の実施例1に定義されるように。そのような位置は、国際公開公報第0158935号に記載されているように、hFVIIまたはhFVIIa分子の三次元構造の解析に基づいて同定されている。さらに、改変される位置は、好ましくは組織因子結合部位、および/または活性部位領域の外部、および/または活性部位結合裂の隆起の外部に位置するFVIIまたはFVIIa分子の一部から選択される。これらの部位/領域は、本明細書の実施例1および国際公開公報第0158935号で同定されている。結合基を除去する場合には、そのような基を含み上記に定義される部位を占める当該アミノ酸残基は、問題の非ポリペプチド部分の結合基を含まない異なるアミノ酸残基で置換することが好ましい。通常、除去されるアミノ酸残基は、それに対する結合が不都合なもの、例えばそのポリペプチドの機能的部位またはその付近に位置するアミノ酸残基であるそのような部位における結合は、例えば受容体の認識障害のために、得られた結合物の不活性化または活性の減少をきたすことがあるため。本文脈において、機能的部位という用語は、FVIIまたはFVIIaの機能または動作に必須であるか、そうでなければそれに関与する一つまたは複数のアミノ酸残基を示すことを意図する。そのようなアミノ酸残基は、機能的部位の一部である。機能的部位は、当技術分野で公知の方法により決定してもよく、好ましくはFVIIa組織因子複合体の構造解析によって同定される。結合基を導入する場合には、そのような基を含むアミノ酸残基を、該当する部位へ、好ましくはその部位を占めるアミノ酸残基の置換によって導入する。FVIIまたはFVIIaポリペプチドにおいて、結合に利用可能なものとして存在する結合基の正確な数は、結合によって達成されることを望む効果に依存する。得られる効果は、例えば結合の性質や程度に依存する。親FVIIまたはFVIIaポリペプチドのGlaドメイン外部で改変されるアミノ酸残基の総数は、典型的には10個を超えない。好ましくは、FVIIまたはFVIIa変種は、配列番号:1に示す46~406位のアミノ酸残基と1~10個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み、典型的には1~8個または2~8個のアミノ酸残基、例えば1~5個または2~5個のアミノ酸残基、例えば1~4個または1~3個のアミノ酸残基、例えば1、2または3個のアミノ酸残基が配列番号:1に示す46~406位のアミノ酸残基と異なるアミノ酸配列を含む。同様に、本発明のポリペプチド変種は、1~10個の非ポリペプチド部分、典型的には1~8個または2~8個の非ポリペプチド部分、好ましくは1~5個または2~5個の非ポリペプチド部分、例えば1~4個または1~3個の非ポリペプチド部分、例えば1、2または3個の非ポリペプチド部分を含んでもよい。そのようなさらなる非ポリペプチド部分は、Glaドメイン外に位置する結合基に共有結合されることが理解される。非ポリペプチド部分が糖部分である本発明のポリペプチド変種本発明の好ましい態様において、糖部分に対する結合基、例えばグリコシル化部位、特にインビボグリコシル化部位、例えばインビボNグリコシル化部位が、Glaドメイン外に位置する部位において導入およびまたは除去されており、好ましくは導入されている。本発明の文脈において用いる場合、天然に存在するグリコシル化部位という用語は、N145、N322、S52およびS60の位置でのグリコシル化部位を含む。天然に存在するインビボOグリコシル化部位という用語には、S52およびS60の位置が含まれ、天然に存在するインビボNグリコシル化部位という用語には、N145およびN322の位置が含まれる。したがって、本発明の非常に興味深い態様において、非ポリペプチド部分は、糖部分であり、導入された結合基はグリコシル化部位、好ましくは、インビボOグリコシル化部位またはインビボNグリコシル化部位のようなインビボグリコシル化部位、特にインビボNグリコシル化部位である。典型的に、1~10個のグリコシル化部位、特にインビボNグリコシル化部位は、好ましくは1~8個、1~6個、1~4個または1~3個のグリコシル化部位が導入されており、特にインビボNグリコシル化部位は、Glaドメイン外に位置する一つまたは複数の位置に導入されている。例えば、特に、1個、2個または3個のグリコシル化部位、特にインビボNグリコシル化部位が、Glaドメイン外に好ましくは置換によって導入されている。1つまたは複数のグリコシル化部位を含む、ポリペプチド変種を調製するために、ポリペプチド変種は、グリコシル化部位で糖オリゴ糖部分を結合することができる宿主細胞において発現させるか、またはインビトログリコシル化に供しなければならないと理解されると考えられる。グリコシル化宿主細胞の例は、以下の糖部分へのカップリングと題する項においてさらに示される。グリコシル化部位、特にインビボNグリコシル化部位が導入されうる位置の例には、側鎖の少なくとも25、例えば側鎖の少なくとも50が表面に露出しているアミノ酸残基が含まれる。位置は、本明細書の実施例1に定義されるように、好ましくは組織因子結合部位およびもしくは活性部位領域の外部ならびにまたは活性部位結合裂の隆起の外部に位置する分子の一部分から選択される。側鎖の少なくとも25が表面に露出しているという用語が、インビボNグリコシル化部位の導入と関連して用いられる場合には、この用語は、糖部分が実際に結合する位置でのアミノ酸側鎖の表面到達性を意味すると理解されるべきである。多くの場合には、糖部分が実際に結合するアスパラギン残基に対して2の位置にセリン残基またはトレオニン残基を導入する必要があり、セリン残基またはトレオニン残基が導入されるこれらの位置を埋没させることができる、すなわち表面に露出する側鎖を25未満にすることができる。インビボNグリコシル化部位を作出する、そのような置換の特定の好ましい例には、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換が含まれる。より好ましくは、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換によって、インビボNグリコシル化部位が導入される。さらにより好ましくは、T106N、A175T、I205T、V253N、T267NS269T、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される置換、特にT106N、I205T、およびV253Nの一つ、二つまたは三つによってインビボNグリコシル化部位が導入される。ある態様では、ただ一つのインビボNグリコシル化部位のみが置換によって導入されている。別の態様では、二つまたはそれ以上のインビボNグリコシル化部位が置換によって導入されている。二つのインビボNグリコシル化部位を作出する好ましい置換の例には、からなる群より選択された置換が含まれる。より好ましくは、置換はからなる群より選択され、さらにより好ましくはT106NI205T、T106NV253NおよびI205TV253Nからなる群より選択される。さらなる態様において、三つまたはそれ以上のインビボNグリコシル化部位が置換により導入されている。三つのインビボNグリコシル化部位を作出する好ましい置換の例には、I205TV253NT267NS269TおよびT106NI205TV253Nからなる群より選択される置換が含まれる。上記のように、インビボNグリコシル化部位は、本明細書に定義されるような組織因子結合部位、活性部位領域、または活性部位結合裂の隆起の一部を形成しない部位に導入されることが好ましい。上述の34位およびまたは36位における置換、特にA34ELおよびまたはR36Eと組み合わせて、さらに上記の項で言及された任意の改変を互いに組み合わせてもよく、好ましくは上述の10位およびまたは32位における置換、特にP10QおよびまたはK32Eと組み合わせてもよいことが理解される。インビボNグリコシル化部位の導入のための上記の改変のうち、好ましい改変はT106N、I205T、およびV253Nの改変のうちの一つ、二つ、または三つを含み、特にこれらの改変のうち二つ、すなわちT106NI205T、T106NV253N、またはI205TV253Nを含む。したがって、本発明の一つの好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34ER36ET106NI205Tの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34ER36ET106NV253Nの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34ER36EI205TV253Nの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LT106NI205Tの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LT106NV253Nの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LI205TV253Nの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LR36ET106NI205Tの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LR36ET106NV253Nの改変を含む。さらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種はP10QK32EA34LR36EI205TV253Nの改変を含む。上記でも説明されているように、これらの改変のうちの任意の一つまたは複数を、少なくとも一個のアミノ酸残基、典型的には単一のアミノ酸残基の3位と4位の間への挿入と組み合わせてもよく、挿入される残基は好ましくは疎水性アミノ酸残基である。最も好ましくは、挿入はA3AYである。したがって、本発明のさらに好ましい態様において、FVIIまたはFVIIa変種は、から選択される改変を含む。Glaドメイン外部でのその他の改変本発明のさらなる態様において、FVIIまたはFVIIa変種は、上記の項に記載されている改変に加えて、例えば国際公開公報第0222776号に記載されているものなどの、本ポリペプチドの内在性活性を増加させることが既知の変異を含んでもよい。例えば、本変種は、157位、158位、296位、298位、305位、334位、336位、337位、および374位からなる群より選択される部位における少なくとも一つの改変を含んでよい。好ましい置換の例には、V158D、E296D、M298Q、L305V、およびK337Aからなる群より選択される置換が含まれる。より好ましくは、置換はからなる群より選択される。本発明のさらなる態様において、FVIIまたはFVIIa変種は、上記の項に記載されている改変に加えて、Neuenschwanderら、Biochemistry19953487018707に開示されているK341Qの置換などの、その他の変異も含んでよい。可能性のあるさらなる置換には、D196K、D196N、G237L、G237GAA、およびそれらの組み合わせが含まれる。FVIIまたはFVIIa変種の、非ポリペプチド部分への結合に関する追加の詳細な情報は、本明細書において参照され、かつ参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第0158935号および国際公開公報第03093465号に見いだされる。本発明の結合型ポリペプチド変種の調製方法一般的に、本発明による結合型変種は、変種ポリペプチドの発現のために行われる条件下で適切な宿主細胞を培養する工程、および変種ポリペプチドを回収する工程によって生産してもよく、ここで、a変種ポリペプチドは少なくとも1つのNまたはOグリコシル化部位を含み、かつ宿主細胞はインビボグリコシル化を行うことができる真核宿主細胞であり、および/またはb変種ポリペプチドは、インビトロで非ポリペプチド部分との結合を受ける。ポリマー分子との結合変種ポリペプチドにカップリングされるポリマー分子は、天然または合成ホモポリマーまたはヘテロポリマーのような任意の適したポリマー分子であってもよく、典型的に分子量約500~20000Daのような、分子量の範囲が約300~100000Da、より好ましくは約500~15000Daの範囲、さらにより好ましくは約3~10kDaの範囲のような約2~12kDaの範囲の分子である。本明細書において特定の分子量に関連して約という用語を用いる場合、約という用語は、通常、おおよその平均分子量を示し、所定のポリマー調製物において特定の分子量の分布が存在するという事実を反映する。ホモポリマーの例には、ポリオールすなわち、ポリOH、ポリアミンすなわち、ポリNH2、およびポリカルボン酸すなわちポリCOOHが含まれる。ヘテロポリマーは、ヒドロキシル基およびアミン基のような異なるカップリング基を含むポリマーである。適したポリマー分子の例には、ポリエチレングリコールPEGおよびポリプロピレングリコールPPGのようなポリアルキレングリコールPAGを含むポリアルキレンオキシドPAO、分枝状PEG、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンコ無水マレイン酸、ポリスチレンコ無水マレイン酸、カルボキシメチルデキストランを含むデキストラン、または免疫原性を減少させる、ならびに/または機能的インビボ半減期および/もしくは血清半減期を増加させるために適した他の任意の生体ポリマーからなる群より選択されるポリマーが含まれる。ポリマー分子のもう1つの例は、ヒトアルブミンまたはもう1つの大量に存在する血漿タンパク質である。一般的に、ポリアルキレングリコールに由来するポリマーは生体適合性、非毒性、非抗原性、非免疫原性、水溶性を有し、生きている生物から容易に排泄される。PEGは、例えばデキストランのような多糖類と比較すると、クロスリンクすることができる反応基がごく少数であることから、好ましいポリマー分子である。特に、一官能基PEG、例えばメトキシポリエチレングリコールmPEGは、そのカップリング化学が比較的単純1つの反応基のみがポリペプチド上の結合基を結合するために使用できるであることから重要である。その結果、クロスリンクのリスクが消失すると、得られた結合型変種はより均一となり、ポリマー分子と変種ポリペプチドとの反応はより容易に制御される。1つまたは複数のポリマー分子を変種ポリペプチドに共有結合させるために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は、活性型、すなわち反応官能基その例には一級アミノ基、ヒドラジドHZ、チオール、コハク酸塩SUC、スクシニミジルスクシネートSS、スクシニミジルスクシンアミドSSA、スクシニミジルプロピオネートSPA、スクシニミジルブチレートSBA、スクシニミジルカルボキシメチレートSCM、ベンゾトリアゾールカーボネートBTC、NヒドロキシスクシンイミドNHS、アルデヒド、ニトロフェニルカーボネートNPC、およびトレシレートTRESが含まれると共に提供されなければならない。適した活性化ポリマー分子は市販されており、例えばNektarTherapeutics、Huntsville、AL、USAまたはPolyMASCPharmaceuticalsplc、UKから入手可能である。本発明の使用のための活性化された直鎖状または分枝状ポリマー分子の特定の例は、参照として本明細書に組み入れられるNektarMoleculeEngineeringCatalog2003NektarTherapeuticsに記載されている。活性化PEGポリマーの特定の例には、以下の直鎖状PEG:NHSPEG、およびNORPEG、BTCPEG、EPOXPEG、NCOPEG、NPCPEG、CDIPEG、ALDPEG、TRESPEG、VSPEG、IODOPEG、およびMALPEG、ならびに、PEG2NHSおよび米国特許第5932462号および米国特許第5643575号ともに参照として本明細書に組み入れられるに開示されているものなどの分枝鎖状PEGが含まれる。有用なポリマー分子、PEG化化学および結合方法をさらに開示している追加の刊行物は、国際公開公報第0158935号および国際公開公報第03093465号に列記されている。特にシステイン残基とのカップリングに好ましい活性化PEGポリマーの特定の例には、以下の直鎖状PEG:ビニルスルホンPEG、好ましくはビニルスルホンmPEG;マレイミドPEG、好ましくはマレイミドmPEGおよびオルトピリジルジスルフィドPEG、好ましくはオルトピリジルジスルフィドmPEGが含まれる。典型的には、そのようなPEGまたはmPEGポリマーは、大きさが約5kDa、約10kDa、約12kDa、または約20kDaであると考えられる。使用される活性化方法およびまたは結合化学は、ポリマーの官能基だけでなく、本変種ポリペプチドの結合基に依存することを、当業者は認識すると考えられる。PEG化は、本変種ポリペプチドの全ての利用可能な結合基に結合するように行ってもよく、または一つまたは複数の特定の結合基、例えば米国特許第5985265号に記載されるN末端アミノ基もしくはシステイン残基に対して行ってもよい。さらに、結合は一段階で達成しても、段階的に達成してもよい。システイン残基のPEG化のためには、通常、FVIIまたはFVIIa変種はPEG化前にジチオスレイトールなどの還元剤で処理される。その後、還元剤は、脱塩などの任意の従来法により除去される。PEGのシステイン残基への結合は、典型的にはpH6~9の適切な緩衝液中で、4°C~25°Cのさまざまな温度で、最大で16時間までの期間行われる。PEG化は、結合するPEG分子の数、その分子のサイズおよび形状、ならびに本変種ポリペプチドにおける結合部位に関して、最適な分子を産生するよう設計されることが理解される。使用するポリマーの分子量は、例えば達成されるべき望ましい作用に基づいて選択される。タンパク質上の単一の結合基のみへの結合に関して、ポリマー分子は、直鎖状でも分枝鎖状でもよいが、好ましくは約10~25kDa、例えば約15~25kDa、例えば約20kDaの高分子量を有するのが有利である。通常、ポリマー結合は、できるだけ多くの利用可能なポリマー結合基がポリマー分子と反応することを目的とした条件下で行われる。これは、本ポリペプチドに対するポリマーの適切なモル過剰によって達成される。典型的には、ポリペプチドに対する活性化ポリマー分子のモル比は約1000対1まで、例えば約200対1まで、または約100対1までである。しかしながら、最適な反応を得るために、例えば約50対1、10対1、5対1、2対1、または1対1までなど、その比率がいくらか低い場合もある。リンカーを介して本ポリペプチドとポリマー分子をカップリングすることも本発明によって企図される。適切なリンカーは当業者に周知である;国際公開公報第0158935号を参照。結合の後、残余の活性型ポリマー分子は、当技術分野で公知の方法、例えば反応混合物への一級アミンの添加によって遮断され、その結果生じた非活性型ポリマー分子は適切な方法によって除去される。状況に応じて、例えば変種ポリペプチドのアミノ酸配列、使用される活性型PEG化合物の性質、PEG対ポリペプチドのモル比を含む特定のPEG化条件に応じて、様々な程度のPEG化が得られる可能性があり、一般的に変種ポリペプチドに対するPEGの比率が高いほど高度のPEG化が得られる、ということが理解される。しかしながら、任意の所定のPEG化過程により生じるPEG化変種ポリペプチドは、通常、わずかにPEG化の程度が異なる結合ポリペプチド変種の確率的分布を含むと考えられる。糖部分へのカップリング一つまたは複数のグリコシル化部位を含むFVII分子のインビボグリコシル化を達成するためには、変種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化する真核生物発現宿主に挿入されなければならない。発現宿主細胞は真菌、昆虫または動物細胞から、またはトランスジェニック植物細胞から選択され得る。一つの態様において、宿主細胞は、CHO細胞、BHK細胞またはHEK細胞などの哺乳類細胞、またはSF9細胞などの昆虫細胞、またはサッカロミセスセレビジエSaccharomycescerevisiaeまたはピチアパストリスなどの酵母細胞、または後に記載される任意の宿主細胞である。例えば、国際公開公報第8705330号およびAplinら、CRCCritRevBiochempp2593061981に記載されているように、糖部分と変種ポリペプチドのアミノ酸残基とのインビトロ共有結合も使用されうる。FVIIまたはFVIIa変種のインビトログリコシル化についてのさらなる情報は、国際公開公報第03093465号も参照のこと。セリンプロテアーゼ阻害剤の結合セリンプロテアーゼ阻害剤の結合は、国際公開公報第9612800号に記載される方法に従って行うことができる。本発明のポリペプチド変種を調製する方法グリコシル化型であってもよい、本発明のポリペプチド変種は、当技術分野で周知の任意の適した方法によって産生してもよい。そのような方法には、ポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列を構築する段階、および適した形質転換またはトランスフェクトした宿主において配列を発現させる段階が含まれる。好ましくは宿主細胞は、哺乳類細胞のようなγカルボキシル化宿主細胞である。しかし、本発明のポリペプチド変種は、あまり効率的ではないが、化学合成もしくは化学合成の組み合わせ、または化学合成と組み換えDNA技術の組み合わせによって産生してもよい。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親FVII、例えば配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するhFVIIをコードするヌクレオチド配列を単離または合成すること、次に、1つまたは複数の関連するアミノ酸残基の導入すなわち挿入または置換または除去すなわち欠失または置換を行うためにヌクレオチド配列を変化させることによって構築してもよい。ヌクレオチド配列は、通常の方法に従って部位特異的変異誘発によって簡便に改変される。または、ヌクレオチド配列は、化学合成によって、例えばオリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいてデザインされるオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて、好ましくは組み換え型ポリペプチドが産生される宿主において都合がよいコドンを選択することによって、調製される。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成して、PCRポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション、またはライゲーション連鎖反応LCRBarany、ProcNatlAcadSciUSA88:189~193、1991によって構築してもよい。個々のオリゴヌクレオチドは典型的に、相補的構築のために5または3オーバーハングを含む。一旦構築されると合成、部位特異的突然変異、または他の方法による、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は組換えベクターに挿入され、望ましい形質転換宿主細胞において、FVIIの発現のために必要な制御配列に機能的に結合されている。当業者は、ポリペプチドを発現するための適したベクター、発現制御配列、および宿主を選択することができると思われる。組換えベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体の複製に依存しない染色体外実体として存在するベクター、例えばプラスミドであってもよい。または、ベクターは、宿主細胞に導入した場合、宿主細胞のゲノムに組み入れられ、それが組み入れられている1つまたは複数の染色体と共に複製されるベクターである。ベクターは好ましくは、その中で本発明のポリペプチド変種をコードするヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の転写にとって必要なさらなるセグメントに機能的に結合している発現ベクターである。ベクターは、典型的にプラスミドまたはウイルスDNAに由来する。本明細書において言及した宿主細胞における発現に適した多くの発現ベクターが市販されているか、または文献に記述されている。FVIIを発現するための適したベクターに関する詳細な情報は、参照として組み入れられる国際公開公報第0158935号に見出され得る。制御配列という用語は、本明細書において、本発明のポリペプチド変種の発現にとって必要または有利な全ての成分が含まれると定義される。各制御配列は、ポリペプチド変種をコードする核酸配列に対して先天的または外来配列であってもよい。そのような制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されることはない。少なくとも制御配列には、プロモーターが含まれる。本発明において、様々な発現制御配列が使用されてもよく、例えば、参照として組み入れられる国際公開公報第0158935号に開示された任意の制御配列を使用してもよい。ポリペプチド変種をコードする本発明のヌクレオチド配列は、それが部位特異的突然変異、合成、PCRまたはその他の方法により調製されたかに関わらず、任意で、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチド変種が発現される細胞から分泌される場合に存在する。そのようなシグナルペプチドは、存在する場合、ポリペプチド変種の発現に関して選択された細胞によって認識されるペプチドでなければならない。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対して同種すなわち、hFVIIに通常会合するもしくは異種すなわち、hFVIIとは異なる他の起源から発生するであってよく、または宿主細胞に対して同種もしくは異種、すなわち宿主細胞から通常発現するシグナルペプチドもしくは宿主細胞から通常発現しないシグナルペプチドであってよい。適したシグナルペプチドのさらなる情報は、国際公開公報第0158935号を参照されたい。細菌しかし、あまり好ましくない、真菌酵母を含む、植物、昆虫、哺乳類、もしくは他の適切な動物の細胞または細胞系、およびトランスジェニック動物または植物を含む、任意の適した宿主を、ポリペプチド変種を産生するために使用してもよい。哺乳類細胞が好ましい。細菌宿主細胞の例には、バチルス属例えば、Bブレビスもしくは枯草菌、シュードモナス属またはストレプトミセス属のようなグラム陽性細菌;または大腸菌株のようなグラム陰性細菌が含まれる。適した糸状真菌宿主細胞の例には、アスペルギルス属例えばAオリゼー、AニガーもしくはAニデュランス;フザリウム属;またはトリコデルマ属の株が含まれる。適切な酵母宿主細胞の例には、サッカロミセス属例えば、Sセレビジエ;分裂酵母;クリヴェロミセス属Kluyveromyces;ピチア属例えばPパストリスPpastorisもしくはPメタノリカPmethanolica;ハンゼヌラ属例えばHポリモルファHPolymorpha;またはヤロウィア属Yarrowiaの株が含まれる。適した昆虫宿主細胞の例には、スポドプテラフルギペルタSpodopterafrugiperdaSf9もしくはSf21またはトリコプルシオアニTrichoplusioani細胞ハイファイブHighFive米国特許第5077214号のような、鱗翅目細胞系が含まれる。適した哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞系例えばCHOK1ATCCCCL61、ミドリザル細胞系COS例えばCOS1ATCCCRL1650、COS7ATCCCRL1651マウス細胞例えばNSO;胎仔ハムスター腎臓BHK細胞系例えばATCCCRL1632またはATCCCCL10;およびヒト細胞例えばHEK293ATCCCRL1573が含まれる。さらなる適した細胞系は、当技術分野に公知であり、AmericanTypeCultureCollection、Rockville、Marylandのような、公共の寄託所から入手可能である。また、CHO細胞のような哺乳類細胞は、ポリペプチド変種の改善されたグリコシル化を提供するために、例えば米国特許第5047335号に記載されるような、シアリルトランスフェラーゼ、例えば16シアリルトランスフェラーゼを発現するように改変されてもよい。分泌を増加させるために、本発明のポリペプチド変種を、エンドプロテアーゼと共に、特にPACE、例えばKex2エンドプロテアーゼと共に産生することは特に興味深い。上記細胞型に外因性DNAを導入する方法、ならびにFVII変種の発現、産生および精製に関するその他の情報は、本明細書に参照として組み入れられる国際公開公報第0158935号に見出される。本発明の薬学的組成物およびその使用さらなる局面において、本発明は、本発明のポリペプチド変種および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物、特に薬学的組成物に関する。本発明によるポリペプチド変種および薬学的組成物を、薬剤として使用してもよい。上記の改善された性質のために、本発明のポリペプチド変種、または本発明の薬学的組成物は、外傷患者、血小板減少症患者、抗凝固治療を受けている患者、静脈瘤出血または他の上部消化管出血を有する肝硬変患者、正位肝臓移植または肝切除を受ける患者輸血を伴わない手術を可能にする、または血友病患者における、制御できない出血事象の治療に特に有用である。外傷は、外因性物質によって引き起こされる生きている組織への損傷として定義される。これは米国における死因の第4位であり、経済に対しても大きな財政的負担となっている。外傷は、鈍的外傷または貫通性外傷のいずれかに分類される。鈍的外傷によって、内部圧迫、臓器損傷、および内出血が起こり、貫通性外傷物質が体を貫通して組織、血管および臓器を破壊した結果としてによって外部出血が起こる。外傷は、例えば、交通事故、銃による損傷、墜落、機械の事故、および刺し傷などの多くの事象によって引き起こされる可能性がある。肝硬変は、慢性アルコール中毒、慢性ウイルス性肝炎B型、C型、およびD型および自己免疫性肝炎を含む直接的な肝損傷に加え、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、および胆管閉鎖を含む胆管損傷による間接的な損傷によって引き起こされる可能性がある。あまり一般的でない肝硬変の原因には、嚢胞性線維症、α1アンチトリプシン欠損症、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ガラクトース血症、および糖原病のような遺伝性疾患による直接的な肝損傷が含まれる。移植は、末期肝硬変患者を治療するための重要な介入である。したがって、さらなる局面において、本発明は、凝血形成が望ましい疾患または障害の治療のために薬剤を製造するために本発明のポリペプチド変種に関する。本発明のなおさらなる局面は、本発明のポリペプチド変種または薬学的組成物の有効量をそれを必要とする哺乳類に投与することを含む、凝血形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳類を治療する方法に関する。凝血形成の増加が望ましい疾患/障害の例には、脳出血を含む出血および、外傷のような制御されない激しい出血のある患者が含まれるが、これらに限定されない。さらなる例には、生体移植を受ける患者、切除を受ける患者、および静脈瘤出血を有する患者が含まれる。本発明のポリペプチドが凝血形成の増加に有効であると意図される、他の広範にわたる疾患/障害は、血友病、例えば、フォンウィルブランド病、血友病A、血友病Bおよび血友病Cである。本発明のポリペプチド変種は治療的有効量で、通常、NovoSeven登録商標のようなrFVIIを用いた治療において用いられる用量とほぼ平行な用量でまたはより低い用量で患者に投与される。本明細書における治療的有効量とは、それが投与される病態に関連して望ましい作用を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、状況に依存し、既知の技術を用いて当業者によって確認可能となると思われる。通常、用量は、治療される病態または適応の重症度または拡大を予防または弱めることができなければならない。本発明のポリペプチド変種または組成物の有効量は、中でも疾患、用量、投与スケジュールに依存し、ポリペプチド変種もしくは組成物が単独で投与されるのか、または他の治療物質と共に投与されるのかに関わらず、組成物の血漿半減期、および患者の全身健康に依存することは当業者には明らかであると思われる。本発明のポリペプチド変種は好ましくは、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物において投与される。薬学的に許容されるとは、それが投与される患者において如何なる望ましくない作用も引き起こさない担体または賦形剤を意味する。そのような薬学的に許容される担体および賦形剤ならびに適切な薬学的製剤法は当技術分野で周知である例えば、RemingtonsPharmaceuticalSciences、第18版、ARGennaro編、マック出版社1990;PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins、SFrokjaerおよびLHovgaard編、TaylorおよびFrancis2000;およびHandbookofPharmaceuticalExcipients、第3版、AKibbe編、PharmaceuticalPress2000を参照されたい。本発明のポリペプチド変種は、そのままおよび/またはその塩の形で用いることができる。適した塩には、ナトリウム、カリウム、およびマグネシウムのようなアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩と共に、例えば亜鉛塩が含まれるがこれらに限定されない。これらの塩または複合体は、結晶および/または非晶系構造として存在してもよい。本発明の薬学的組成物は単独または他の治療物質と共に投与してもよい。これらの物質は、同じ薬学的組成物の一部として組み入れてもよく、または本発明のポリペプチド変種とは個別に、同時にまたはもう1つの治療スケジュールに従って投与してもよい。さらに、本発明のポリペプチド変種または薬学的組成物は、他の治療に対する補助剤として用いてもよい。本発明の目的に関して患者には、ヒトおよび他の哺乳類の両方が含まれる。したがって、方法はヒトの治療および獣医学応用の両方、特にヒトの治療に適用可能である。本発明のポリペプチド変種を含む薬学的組成物は、多様な剤形、例えば液体、ゲル、凍結乾燥、または圧縮個体の形で製剤化してもよい。好ましい剤形は治療される特定の適応に依存し、当業者に明らかであると思われる。特に、本発明のポリペプチド変種を含む薬学的組成物は、凍結乾燥または安定な可溶性型で調製してもよい。ポリペプチド変種は、当業者に公知の多様な方法によって凍結乾燥してもよい。ポリペプチド変種は、本明細書に記述のようにタンパク質分解部位の除去または保護による安定な溶解型であってもよい。安定な溶解調製物を得る長所は、患者がより容易に取り扱いできる点にあり、緊急の場合には、生命を救うようになりうるより迅速な作用である。好ましい剤形は、治療される特定の適応に依存し、当業者に明らかであると思われる。本発明の製剤の投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内、または他の任意の許容される方法を含むがこれらに限定されない多様な方法で行うことができる。製剤は、注入によって連続的に投与することができるが、ポンプまたは埋め込みのような当技術分野で周知の技術を用いるボーラス注射が許容される。場合によっては、製剤は溶液またはスプレーとして直接適用してもよい。非経口投与薬学的組成物の好ましい例は、非経口投与のためにデザインされた溶液、特に好ましくは水溶液である。多くの場合において、薬学的溶液製剤は、直ちに使用するために適用な液体型で提供されるが、そのような非経口製剤はまた凍結または凍結乾燥型で提供してもよい。前者の場合、組成物は使用前に融解しなければならない。凍結乾燥調製物は一般的にその液体対応物より安定であることが当業者によって認識されていることから、後者の型は、組成物に含まれる活性化合物の安定性を広く多様な保存条件で増強するために用いられる。そのような凍結乾燥調製物は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩液のような1つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤を加えることによって使用前に溶解する。非経口投与の場合、それらは適当であれば、所望の程度の純度を有するポリペプチド変種を、当技術分野で典型的に用いられるその全てが賦形剤と呼ばれる1つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤、例えば緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、または洗浄剤、抗酸化剤、および/または他の雑多な添加剤、例えば増量剤、充填剤、キレート剤、抗酸化剤、および共溶媒と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液として保存するために調製される。FVII変種の投与に適した非経口製剤および徐放性製剤に関する詳細な情報は、本明細書に参照として組み入れられている国際公開公報第0158935号および国際公開公報第03093465号に見出すことができる。本発明は、以下の非制限的な実施例によってさらに記載される。材料と方法活性部位領域活性部位領域を、触媒三構造残基H193、D242、S344における任意の原子から10Å以内に、少なくとも1つの原子を有する任意の残基として定義する。タンパク質分解に対する感受性低下の測定タンパク質分解は、タンパク質分解が自己タンパク質分解である、米国特許第5580560号、実施例5に記載されるアッセイ法を用いて測定することができる。さらに、タンパク質溶解の減少は、放射標識試料を用いて、血液試料を採取してこれらにSDSPAGEおよびオートラジオグラフィーを行うことによって、rhFVIIaと本発明のポリペプチド変種とのタンパク質分解を比較するインビボモデルにおいて試験することができる。タンパク質分解を決定するために用いられるアッセイ法によらず、タンパク質分解の減少は、クーマシー染色SDSPAGEゲルのゲルスキャニング、HPLCによって測定されるように、または下記の組織因子比依存的活性アッセイ法を用いて野生型と比較して保存された触媒活性によって測定されるように、rhFVIIaによって得られた分解と比較した切断の測定可能な減少を意味すると解釈される。ポリペプチド変種の分子量の測定ポリペプチド変種の分子量は、SDSPAGE、ゲル濾過、ウェスタンブロット、マトリクス支援レーザー脱離質量分析、または平衡遠心、例えばLaemmliUK、NatureVol2271970、pp680~85によるSDSPAGEによって決定される。リン脂質膜結合親和性の決定リン脂質膜結合親和性は、NelsestuenetalBiochemistry1977301081910824に記載のとおり、または米国特許第6017882号の実施例1に記載されているとおりに決定してよい。TF非依存的第X因子活性化アッセイ本アッセイは、Nelsestuenら、JBiolChem2001、276:39285~39381の39826頁に詳細に記述されている。簡単に説明すると、アッセイされる分子hFVII、rhFVIIa、またはその活性化型での本発明のポリペプチド変種を、BSAを含むTris緩衝液において、リン脂質源好ましくは、ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンを8:2でおよび再脂質添加された第X因子と混合する。明記されたインキュベーション期間の後、過剰量のEDTAを加えて反応を停止させる。次に、第Xa因子の濃度を、発色基質S2222、クロモゲニックスChromogenixを添加した後の405nmでの吸光度の変化から測定する。バックグラウンドに関して補正後、rhFVIIaawtの組織因子非依存的活性を、10分後の吸光度の変化として決定し、本発明のポリペプチド変種の組織因子非依存的活性a変種を、10分後の吸光度の変化として決定する。その活性化型のポリペプチド変種の活性と、rhFVIIaの活性との比をa変種awtとして定義する。凝血アッセイFVIIaおよびその変種の凝血活性を一段階アッセイにおいて測定し、凝血時間をトロンボトラックIV凝固計Medinorにおいて記録した。第VII因子枯渇ヒト血漿AmericanDiagnosticaを再構築して、室温で15~20分平衡化した。次に、血漿50μlを凝固計のカップに移した。FVIIaおよびその変種をグリオキサリン緩衝液57mMバルビツレート、43mMクエン酸ナトリウム、117mMNaCl、1mgmlBSA、pH735において希釈した。試料50μlをカップに加えて、37°Cで2分間インキュベートした。トロンボプラスチンMedinorを水に溶解して、CaCl2を最終濃度45mMで加えた。トロンボプラスチン100μlを加えて反応を開始した。TFの非存在下で凝血活性を測定するために、トロンボプラスチンを加えない同じアッセイを用いた。PRISMソフトウェアを用いてデータを分析した。全血アッセイFVIIaおよびその変種の凝血アッセイを一段階アッセイにおいて測定し、凝血時間をトロンボトラックIV凝固計Medinorにおいて記録した。FVIIaまたはその変種100μlを、10mMグリシルグリシン、50mMNaCl、375mMCaCl2、pH735を含む緩衝液において希釈して、反応カップに移した。10013Mクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として含む血液50μlを加えて凝血反応を開始した。エクセルまたはPRISMソフトウェアを用いてデータを分析した。アミド溶解アッセイ変種が小さいペプチド基質を切断できるか否かは、発色基質S2288DIleProArgpニトロアニリドを用いて測定することができる。FVIIaをアッセイ緩衝液50mMNaHepes、pH75、150mMNaCl、5mMCaCl2、01BSA、1Umlヘパリンにおいて約10~90nMに希釈した。さらに、可溶性TFsTFをアッセイ緩衝液において50~450nMに希釈する。アッセイ緩衝液120μlをFVIIa試料20μlおよびsTF20μlと混合する。室温で軽く振とうさせながら5分間インキュベートしてから37°Cで10分間インキュベートした後、S2288基質を1mMとなるように加えて反応を開始させ、405nmでの吸光度をいくつかの時点で決定する。ELISAアッセイFVIIFVIIaまたは変種濃度をELISAによって決定する。マイクロタイタープレートのウェルを、プロテアーゼドメインに対する抗体の2μgmlのPBS溶液を用いてコーティングした100μl/ウェル。RT室温で一晩コーティングした後、ウェルをTHT緩衝液100mMNaCl、50mMTris塩酸、pH72、005Tween20によって4回洗浄した。その後、1カゼイン100mMNaCl、50mMTris塩酸、pH72を用いて25保存液を希釈200μlをブロッキングのためにウェルに加える。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを空にして、試料100μl任意で希釈緩衝液THT01カゼインにおいて希釈を加える。室温で1時間さらにインキュベーションした後、THT緩衝液でウェルを4回洗浄し、EGF様ドメインに対する100μlのビオチン標識抗体1μgmlを添加する。さらに室温で1時間インキュベーションした後、THT緩衝液で4回洗浄し、100μlのストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼDAKOAS、Glostrup、Denmark、10000倍希釈を添加する。さらに室温で1時間インキュベーションした後、THT緩衝液で4回洗浄し、100μlのTMB3355テトラメチルベンジジン、KemenTechAS、Denmarkを添加する。暗室で室温で30分間インキュベーションした後、100μlの1MH2SO4を添加し、OD450nmを測定する。rhFVIIaNovoSeven登録商標を用いて標準曲線を作製する。あるいは、FVIIFVIIaまたは変種を、プロテアーゼドメインよりむしろGlaドメインを介して定量化することができる。このELISAの条件において、ウェルをEGF様ドメインに対する抗体で一晩コーティングして、検出のために、カルシウム依存ビオチン標識抗Glaドメインモノクローナル抗体を使用する2μgml、1ウェル当たり100μl。この状件において、THTおよび希釈緩衝液に5mMCaCl2を添加する。トロンボグラムアッセイヒト血漿中のhFVIIa、rhFVIIa、またはFVIIa変種のトロンビン生成に対する効果は、HemkerらThrombHaemost8358991の589ページに記載されているアッセイ法の改変版で試験される。簡単に説明すると、アッセイする分子を、再脂質化組換え組織因子またはリン脂質のいずれかを含むFVII除去貧血小板血漿と混合する。蛍光原性トロンビン基質および塩化カルシウムを加えることにより、反応を開始する。蛍光を連続的に測定し、トロンビンアミド溶解活性を、蛍光曲線の傾きを計算することによって決定する。このようにして、最大トロンビンアミド溶解活性に達するまでの時間が得られ、かつトロンビン生成率、および総トロンビン仕事量が計算できる。凍結クエン酸加FVII除去血漿を、凝固の接触経路を阻害するために、トウモロコシトリプシン阻害剤存在下で解凍する。96ウェルマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに対して、80μlの血漿と、最終濃度が01から100nMの間とした被験rhFVIIまたは変種を含む緩衝液20μlを加える。組換えヒト組織因子を、最終濃度が1pMとなるように5μlのアッセイ緩衝液中に加える。アッセイ緩衝液は、蒸留水に溶解した20mMHepes、150mMNaClおよび60mgmlBSAからなる。01Mの塩化カルシウムを含む20μlの基質溶液を加えることによって、反応を開始する。アッセイプレートおよび試薬は37°Cにあらかじめ温めておき、その温度で反応を行う。使用する蛍光測定器は、390nmの励起フィルターおよび460nmの発光フィルターを備えたBMGFluormeterである。透明底の96ウェルプレートのそれぞれのウェルにおいて、20~40秒間隔で30~180分間蛍光を測定する。データはPRISMソフトウェアを用いて解析する。組織因子結合表面プラズモン共鳴アッセイ表面プラズモン共鳴解析は、野生型第VIIa因子とその変種の可溶性組織因子に対する相対的結合を決定するために用いた。細胞外ドメインを含む組換え可溶性組織因子を、NHSEDCカップリングを用いてBiacoreCM5チップ上で270反応単位カップリングさせた。可溶性組織因子は、チップ表面と相互作用させるため、pH45でカップリングさせた。このアッセイにおいて、第VII因子タンパク質の組織因子結合を、本変種と野生型との相対的比較を可能にするため、FVIIaまたは変種の単一濃度で比較した。この濃度は、75から0μgmlの間の濃度でチップ上に流した野生型FVIIaの標準曲線により決定した。10mMのEDTAを加えることによりFVIIaを除去した。この方法で、15μgmlの濃度が直線領域内の結合を生ずることが明らかとなった。次に、FVIIaの変種を15μgmlの濃度でチップ上に流し、組織因子に対するFVIIaまたは変種の相対的結合強度を決定した。実施例実施例1Banneretal、JMolBiol、19962852089による可溶性組織因子との複合体におけるhFVIIaのX線構造を、本実施例のために使用する。この実施例の計算に関するさらなる情報は、国際公開公報第0158935号を参照されたい。表面の露出部分的なASA計算を行った結果、それらの側鎖の25より多くが表面に露出していることが決定された以下の残基が得られた:A1~S45はGlaドメインに位置し、残りの位置はGlaドメイン外に位置する。以下の残基は、それらの側鎖の50より多くが表面に露出していることが決定された:A1~S43はGlaドメインに位置し、残りの位置はGlaドメイン外に位置する。組織因子結合部位hFVII中の以下の残基が複合体中のASAを変更することを、ASA計算を使用して決定した。これらの残基を受容体結合部位を構成するものとして定義した:活性部位領域活性部位領域を、触媒三構造残基H193、D242、S344における任意の原子から、距離10Å以内の少なくとも1つの原子を有する任意の残基として定義する:活性部位結合裂の隆起活性部位結合裂領域の隆起を、N173、A175、K199、N200、N203、D289、R290、G291、A292、P321およびT370として、FVIIa構造1FAKpdbの視覚的検査によって定義した。実施例2哺乳類細胞におけるrhFVIIa発現の発現カセットの設計rhFVIIa発現用の発現カセットは、国際公開公報第0158935号の実施例2に記載されているように、設計およびクローニングした。実施例3本発明の変種をコードする発現カセットの構築置換されたコドンを有する変種FVIIオープンリーディングフレームを有する構築物を作製するために、標準的方法を用いて配列突出伸長PCRを使用した。実施例4CHOK1細胞におけるポリペプチド変種の発現CHOK1細胞系ATCCCCL61を、MEMα、10FCSGibcoBRLCat10091、PSおよび5μgmlのフィロキノンを用いたT25フラスコ中に50コンフルエントで播種して、コンフルエントとなるまで増殖させる。コンフルエントな単層細胞に、リポフェクトアミン2000物質LifeTechnologiesを製造者の指示に従って使用して、5μgの上記関連プラスミドをトランスフェクトさせる。トランスフェクションの24時間後、試料を採取して、例えばhFVIIのEGF1ドメインを認識するELISAなどを用いて、この試料を定量する。この時点で、安定したトランスフェクタントのプールを作製する目的で、関連した選択例えば、ハイグロマイシンBを細胞に適用してもよい。CHOK1細胞、およびプラスミド上の選択マーカーとしてハイグロマイシンB耐性遺伝子を使用する場合には、通常これは一週間以内に達成される。実施例5ポリペプチド変種を安定して発現するCHOK1細胞の作製CHOK1トランスフェクタントプールのバイアルを融解して、細胞を、25mlのMEMα、10FCS、フィロキノン5μgml、100Umlペニシリン、100μgmlストレプトマイシンを含む175cm2組織フラスコに播種して、24時間増殖させる。細胞を回収して、希釈し、細胞密度12個~1個/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに播種する。1週間増殖させた後、20~100個の細胞のコロニーがウェルに存在し、1個のコロニーのみを含むウェルを標識する。さらに2週間後、1個のコロニーのみを含む全てのウェルにおける培地を、200μlの新鮮な培地に交換する。24時間後、培地試料を採取して、例えばELISAによって分析する。高産生クローンを選択し、これをFVIIまたはその変種の大規模産生のために用いる。実施例6ポリペプチド変種の精製および結果として生じた活性化FVIIおよびFVII変種は以下のように精製する。技法は4°Cで行う。大規模産生から回収した培養培地を、MilliporeTFFシステムを用いて、30kDaカットオフペリコンメンブレンを用いて限外濾過する。培地を濃縮した後、クエン酸塩を5mMとなるように加えて、pHを86に調節する。必要であれば、伝導率を10mScm未満に低下させる。その後、試料を、50mMNaCl、10mMTris、pH86によって平衡化したQセファロースカラムに適用する。100mMNaCl、10mMTris、pH86によってカラムを洗浄してから150mMNaCl、10mMTris、pH86によって洗浄した後、FVIIを10mMTris、25mMNaCl、35mMCaCl2、pH86を用いて溶出する。第二のクロマトグラフィー段階に関して、モノクローナルカルシウム依存的抗Glaドメイン抗体をCNBr活性化セファロースFFに対して共役させることによってアフィニティカラムを調製する。樹脂1mlあたり抗体約55mgを共役させる。カラムを10mMTris、100mMNaCl、35mMCaCl2、pH75によって平衡化する。NaClは、濃度100mMNaClとなるように試料に加えて、pHを74~76に調節する。試料のON適用後、カラムを100mMNaCl、35mMCaCl2、10mMTris、pH75によって洗浄して、FVIIタンパク質を100mMNaCl、50mMクエン酸塩、75mMTris、pH75によって溶出する。第三のクロマトグラフィーに関して、試料の伝導率を必要であれば10mScm未満に低下させて、pHを86に調節する。次に、試料をQセファロースカラム50mMNaCl、10mMTris、pH86によって平衡化したに、有効な活性化を得るためにゲル1mlあたりタンパク質約3~5mgの密度で適用する。適用後、カラムを50mMNaCl、10mMTris、pH86によって3~4カラム容積cv/時間の流速で約4時間洗浄する。FVIIタンパク質を、40cvで500mMNaCl、10mMTris、pH86の0~100の勾配を用いて溶出した。FVII含有分画をプールする。最終クロマトグラフィー段階に関して、伝導率を10mScm未満に低下させる。その後、試料をQセファロースカラム140mMNaCl、10mMグリシルグリシン、pH86によって平衡化したに、ゲル1mlあたりタンパク質約3~5mgの濃度で適用する。次に、カラムを140mMNaCl、10mMグリシルグリシン、pH86によって洗浄して、FVIIを140mMNaCl、15mMCaCl2、10mMグリシルグリシン、pH86によって溶出する。溶出液を10mMCaCl2となるように希釈して、pHを68~72に調節する。最後に、Tween80を001となるように加えて、80°Cで保存するためにpHを55に調節する。実施例7実験結果-FX活性化活性本発明の変種をTF非依存性第X因子活性化アッセイに供し、以下の結果が得られた。上記の結果からわかるように、rhFVIIaと比較して、またP10QK32ErhFVIIaと比較して、本発明の変種はFX活性化活性の実質的な改善を示した。実施例8実験結果-全血アッセイにおける凝血活性本発明の変種を全血アッセイに供したところ、それらの凝血活性はrhFVIIaならびにP10QK32ErhFVIIaと比較して有意な増加を示すことが判明した。実験結果は図1および下記の表2に示す。実施例9実験結果-凝血アッセイにおける凝血活性TF依存性凝血アッセイにおいてアッセイした場合、R36Eの置換を有する本発明の変種は、rhFVIIまたは他の本発明の変種と比較して、有意に凝血活性が減少することが明らかだった。下記の表3を参照。それにも関わらず、上記の実施例7に説明されているように、R36Eの置換を有する変種はTF非依存性第X因子活性化アッセイにおいて第X因子活性化活性が増加している。実施例10実験結果-トロンボグラムアッセイにおけるトロンビン生成リン脂質依存性および組織因子依存性トロンボグラムの両方を用いて、異なる変種タンパク質濃度におけるFVIIa変種の最大トロンビン生成率を決定した。最大トロンビン生成率sec2として表されるをpMで表した変種濃度の関数としてプロットすることによって、図2および図3に示す結果が得られた。これらの結果から、FVIIa変種であるP10QK32EA34ER36Eは、反応がPL依存性かTF依存性であるかによって、異なるトロンビン生成力を有することが明らかである。本変種の最大TF依存性トロンビン生成率は、FVIIa変種であるP10QK32EまたはA3AYP10QK32EA34Lと比較して、およそ10倍減少している。また、P10QK32EA34ER36Eでは他の変種と比較して、ラグタイム、ピークまでの時間、ピークの高さ、およびAUCも減少している。TF依存性活性とは対照的に、P10QK32EA34ER36E変種のPL依存性活性は、本実施例で試験した他の変種の活性と同等であり、すなわち本変種はTF依存性活性が実質的に減少しても十分なPL依存性活性を有する。同実験において、P10QK32EA34ER36Eの変種を、図2に示すように高いTF依存性トロンビン生成率を有するP10QK32EA34EP74Sの変種と直接比較した。二つの変種間のTF結合の差は、おそらくA34Eの置換と共に、R36Eの置換の存在に直接起因すると考えられる。実施例11実験結果-Biacoreアッセイにおける組織因子へのFVIIa結合本発明の変種を、材料と方法の項に記載されているように、TFチップを用いたBiacoreシステム上での表面プラズモン共鳴によるアッセイに供したところ、以下の結果が得られた。トロンボグラムアッセイからのTF依存性トロンビン生成率のデータと一致して、表4の結果はR36Eの置換により組織因子への結合が減少することを示す。同Biacoreアッセイにおいて、グリコシル化部位を導入する二つの追加の改変とともに表4に列記される変種と同じ改変を有するFVIIa変種も、組織因子への結合について試験した。その結果は下記の表5に示す。これらの結果は表4の結果と一致しており、追加のグリコシル化部位がない表4の同変種と比較して、表5の変種における新たな二つのグリコシル化部位の存在は、組織因子結合の減少を提供する。表4の変種の場合のように、グリコシル化変種にR36Eの置換が存在すると、この置換を有しない他のグリコシル化変種の組織因子結合レベルよりも、組織因子結合レベルが実質的に低下する。