昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む、昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤。昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫。請求項2に記載の昆虫の卵、子孫またはクローン。卵および体が薄色化された昆虫の生産方法であって、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする方法。昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価することを含む方法。遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価し、卵および/または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法。本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、昆虫の様々な発生段階において肉眼で識別可能であり、野生型個体にも適用可能であり、かつ、母性遺伝しない、遺伝子組換えマーカーを提供することにある。カイコの幼虫のヒフには、w1遺伝子が関わるオモクローム系色素の他に、メラニン色素が存在する。メラニンは昆虫の体表の主要な色素のグループの1つである。メラニンは昆虫のクチクラに存在し、黒や茶などの色を呈する。例えば、キイロショウジョウバエの腹部の着色や、コクヌストモドキの鞘翅の茶色、ナミアゲハやキアゲハの幼虫の模様の黒色、カイコの幼虫の黒色の模様はメラニンであることが報告されている。メラニンはチロシンを前駆体として合成される。まず、チロシンが、チロシン水酸化酵素によりドーパに変換され、Dopaはドーパ脱炭酸酵素DopadecarboxylaseDDCによりドーパミンに変換される図1。ドーパミンが昆虫のメラニン合成の主要な基質であることが、多くの昆虫で報告されており、ドーパミンからドーパミンメラニンが合成される過程でyellow遺伝子やlaccase2遺伝子が関与することが示されている図1。また、ebonyの作用により、ドーパミンがβアラニンと反応して合成されるNβalanyldopamineは、ショウジョウバエにおける黄色いメラニンやナミアゲハの終齢幼虫の眼状紋における赤い色素の前駆体であることが報告されている図1。この他、ドーパミンは、Nアセチル化されると、脱皮直後のヒフでクチクラたんぱく質を架橋してクチクラの形成に働くNアセチルドーパミンとなることが報告されている図1。ドーパミンなどをNアセチル化する活性を持つ酵素はアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼと呼ばれ、ショウジョウバエでは神経等での機能が解析されているものの、皮膚の着色に関与するかどうかは現時点でも不明である。最近、カイコのNAT遺伝子に変異がある系統melanismで、終齢幼虫の頭や尾部、成虫の翅の着色に異常が見られることが報告された。しかしながら、他の部位やステージではmlnと野生型で表現型が異なるという報告はない。また、カイコのNAT遺伝子については、遺伝子組換えを利用した遺伝子機能の証明や、組換えマーカーとしての開発は行われていない。この遺伝子がコードする酵素を野生型個体において過剰発現させた場合に、この酵素がドーパミンメラニンの合成反応と競合してNADAを合成できるのか否か、そして、いかなる表現型を野生型個体にもたらすのかについては報告されておらず、予測することはできない。ショウジョウバエのNAT1遺伝子欠損ホモ個体は胚性致死であり、NATは神経系においても機能すると考えられているため、強制発現により致死的影響を受けることも考えられる。そこで、本発明者らは、昆虫の例としてカイコを選択し、カイコにおいて、NAT1遺伝子を全身で過剰発現する遺伝子組換え体を作出して、この遺伝子の機能を検証した。まず、GAL4UAS系を利用してこの遺伝子を全身発現させるために、酵母の転写因子GAL4によって活性化されるUAS配列にNAT1遺伝子をつないだpiggyBacトランスポゾンベクターを持つ遺伝子組換えカイコを作出し、全身でGAL4を発現する遺伝子組換えカイコカイコの細胞質アクチンプロモーター領域に、酵母の転写因子であるGAL4を結合したpiggyBacトランスポゾンベクターを持つトランスジェニックカイコとの交配を行った。その結果、孵化直後の一齢幼虫の体色が著しく薄くなることが判明した。一齢幼虫の体色が著しく薄いことは、孵化前の卵の段階でも判別できた。また、その他の齢の幼虫においても、ほとんどの系統は斑紋があるが、その斑紋等の色が薄くなることが判明した。さらに、成虫の触角においても色が薄くなることが判明した。これらの結果は、昆虫において、アルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させた場合、その卵および体が薄色化することを初めて証明するものである。アルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を持つ遺伝子は、様々な昆虫において知られているため図14~16、非特許文献29~32、36、37、本発明は広く昆虫に適用可能である。すなわち、本発明は、昆虫の卵および体を薄色化させるための、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用、並びに、この薄色化を指標とした遺伝子組換え体の選抜などのための、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用に関し、より詳しくは以下の発明を提供するものである。1昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む、昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤。2昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫。32に記載の昆虫の卵、子孫またはクローン。4卵および体が薄色化された昆虫の生産方法であって、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする方法。5昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価することを含む方法。6遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価し、卵および/または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法。本発明により、昆虫の卵および体の薄色化を誘導する活性を持つ遺伝子としてアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が同定された。アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いれば、昆虫の卵や眼の色を薄色化させることが可能であり、当該遺伝子は、遺伝子組換え体の選抜のためのマーカーとして好適に利用することができる。チョウ目昆虫であるカイコにおける組換え個体の識別においては、従来EGFP等が主に利用されてきたが、蛍光を検出するために、眼や卵に着色のないw1遺伝子に変異が入った系統を用いる必要があった。また、識別に蛍光顕微鏡を必要とするため、蛍光顕微鏡を持たない施設での組換え個体の識別は行えず、分子生物学の専門教育を受けていない者が識別作業を行うことは問題であった。さらに、w1変異系統を用いた場合でも、産卵後7日目にならないと組換え体の判別ができないが、産卵後9日目以降になると頭部が黒く着色されるため、組換え体の判別が困難であった。本発明によれば、眼や卵に着色のない変異系統を用いることなく、卵、幼虫、成虫などの様々な発生段階で、かつ、蛍光顕微鏡を持たない施設において肉眼で、組換え個体の判別が可能になる。アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、優性マーカーとして機能するため、養蚕農家で飼育されているような実用品種などの野生型系統に適用することが可能となる。アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、蛍光マーカーとの併用が可能であり、さらに蛍光マーカーの判別も容易になる。これは、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をw1変異系統に適用した場合には、産卵後約9日目以降や孵化後の幼虫でも頭部着色が薄くなるためである。アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を野生型系統に適用した場合であっても、幼虫の段階においては、蛍光マーカーを判別することが可能である。従って、この組み合わせは、多重遺伝子組換えのマーカーとして優れている。カイコの様々な突然変異体を用いた基礎研究において、遺伝子組換えにより原因遺伝子の機能証明する際には、従来は、数世代の交配によって個々の突然変異系統の個体にw1変異を導入してから遺伝子組換え個体を作出する必要があったが、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いれば、このような変異導入は不要で、個々の突然変異系統に対して直接遺伝子組換えを行うことが可能になる。このため、解析に要する期間を大幅に短縮することができる。<昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤、並びに、卵および体が薄色化された昆虫、およびその生産方法>本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤は、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含むことを特徴とする。本発明において昆虫の卵および体を薄色化させる活性とは、典型的には、昆虫の卵の色、幼虫における体の全体、斑紋例えば、半月紋や星状紋若しくは気管の色、または成虫の触角の色を薄色化させる活性を意味する。薄色化される部位は、ドーパメラニンが蓄積する部位であれば、特に制限はない。昆虫としては、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAの導入により、その卵および体を薄色化させることができるものであれば特に制限はない。メラニン色素は幅広い昆虫に存在している。また、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAの存在は、広く昆虫において知られている図14~16。従って、本発明が適用される昆虫としては、例えば、カイコなどのチョウ目昆虫、キイロショウジョウバエやネッタイシマカなどのハエ目昆虫、ワモンゴキブリなどのゴキブリ目昆虫が挙げられるが、これらに制限されない。昆虫は、野生型系統であっても、変異系統例えば、カイコにおけるw1変異系統であってもよい。このため、本発明は、実用品種を含む幅広い系統に適用できる点で有利である。本発明において用いられる、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAとしては、特に制限はないが、例えば、カイコのアクセション番号NM0010796541で特定されるDNANAT1タンパク質をコードするDNA;非特許文献32やアクセション番号NM0011908421で特定されるDNANAT2タンパク質をコードするDNA、キイロショウジョウバエのアクセション番号NM2062121で特定されるDNAやアクセション番号NM1351613で特定されるDNA非特許文献29、30、ネッタイシマカのアクセション番号XM0016613501で特定されるDNAやアクセション番号XM0016630721で特定されるDNA非特許文献36、ワモンゴキブリのアクセション番号AB1065621で特定されるDNA非特許文献31、37が挙げられる。本発明においては、昆虫におけるアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性の発現と昆虫の卵および体の薄色化との相関関係が見出されたため、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質すなわち、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAである限り、広く本発明に適用可能である。なお、カイコにおけるアクセション番号NM0010796541で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:1に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:2に示す。カイコのアクセション番号NM0011908421で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:3に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:4に示す。キイロショウジョウバエのアクセション番号NM2062121で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:5に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:6に示す。キイロショウジョウバエのアクセション番号NM1351613で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:7に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:8に示す。ネッタイシマカのアクセション番号XM0016613501で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:9に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:10に示す。ネッタイシマカのアクセション番号XM0016630721で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:11に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:12に示す。ワモンゴキブリのアクセション番号AB1065621で特定されるDNAの塩基配列を配列番号:13に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:14に示す。現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の昆虫におけるアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列は異なるが、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNAを取得することが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明において用いるDNAは、これら特定の昆虫におけるアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列例えば、配列番号:2、4、6、8、10、12、14において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。ここで複数とは、改変後のタンパク質がアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を維持する範囲における、アミノ酸の改変数であり、通常、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、2アミノ酸である。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の昆虫からアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が得られた場合、そのDNAの塩基配列情報を利用して、同一または他の昆虫から、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNAを取得することが可能である。従って、本発明において用いるDNAは、特定の昆虫におけるアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子例えば、配列番号:1、3、5、7、9、11、13とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。こうして得られた変異遺伝子や相同遺伝子をコードするDNAが、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、文献非特許文献29~32、36、37に記載の方法によって判定することができる。なお、上記した変異遺伝子をコードするDNAを作製するための、DNAへの人為的な変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発sitedirectedmutagenesis法KramerWFritzHJMethodsEnzymol1543503671987により行うことができる。また、上記した相同遺伝子をコードするDNAを単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術SouthernEMJournalofMolecularBiology985031975やポリメラーゼ連鎖反応PCR技術SaikiRKetalScience230135013541985、SaikiRKetalScience2394874911988が挙げられる。相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、04SDS、05xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、04SDS、01xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離されたDNAは、核酸レベルあるいはアミノ酸配列レベルにおいて、少なくとも50以上、さらに好ましくは70以上、さらに好ましくは90以上例えば、95、96、97、98、99以上の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN核酸レベルやBLASTXアミノ酸レベルのプログラムを利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLASTに基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore100、wordlength12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore50、wordlength3とする。また、GappedBLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、AltschulらNucleicAcidsRes25338934021997に記載されているように行うことができる。BLASTとGappedBLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。本発明において用いられるアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAとしては、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、カイコからゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリーベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、フォスミド、BAC、PACなどが利用できるを作成し、これを展開して、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子例えば、配列番号:1、3、5、7、9、11、13に記載のDNAの塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、アリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、鱗翅目昆虫から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤において、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、ベクターに挿入されている形態であってもよい。ベクターとしては、例えば、染色体中に遺伝子導入可能なベクターまたは自律複製可能なベクターを使用することができる。カイコ卵に対してDNAの導入を行う場合、例えば、トランスポゾンベクターを利用してカイコの発生初期卵へ注射する方法TamuraTetalNatureBiotechnology188184を利用することができる。例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列HandlerAMetal1998ProcNatlAcadSciUSA951375205の間に上記DNAを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクターヘルパーベクターをカイコ卵に導入する。ヘルパーベクターとしては、pHA3PIGTamuraTetalNatureBiotechnology188184が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に用いるトランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナmariner、ミノスMinos等を用いることもできるShimizuKetal2000InsectMolBiol9277281;WangWetal2000InsectMolBiol9214555。また、本発明では、バキュロウイルスベクターを使用することも可能であるYamaoMetalGenesDev13511516。昆虫の細胞にベクターを導入する場合、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法CurrentprotocolsinMolecularBiologyeditAusubeletalPublishJohnWileySons.Section9199、リポフェクタミン法GIBCOBRL社製、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。ベクターに用いるプロモーターとしては、例えば、昆虫の全身での発現を誘導するアクチンプロモーター、AcNPVのhr5IE1プロモーターなどが挙げられる。一旦、染色体内に上記DNAが導入された昆虫が得られれば、該昆虫から、卵、子孫、あるいはクローンを得て、それらを基に昆虫を繁殖させることも可能である。従って、本発明は、上記昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫、並びに、その卵、子孫およびクローンをも提供するものである。また、本発明は、上記昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする、卵および体が薄色化された昆虫の生産方法をも提供するものである。昆虫に、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAに加えて、遺伝子組換えを行いたい任意のDNAを導入する場合、昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、任意のDNAによる遺伝子組換え体を選抜するためのマーカーとして利用することができる。<昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法、遺伝子組換え昆虫の生産方法>従って、本発明は、昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価することを含む方法を提供するものである。また、本発明は、遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価し、卵および/または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法をも提供するものである。昆虫に導入する任意のDNAとしては、特に制限はない。例えば、医薬品や検査薬の原料となる有用タンパク質をコードするDNA、高機能シルクの生産に有用な蛋白質をコードするDNA、ヒトの病態のモデルを作製するために有用なDNAが挙げられる。任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、一つのベクターに配置して昆虫に導入することが好ましいが、それぞれを異なるベクターに配置して導入することも可能である。任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、ベクター上では、昆虫において発現を保証するプロモーター例えば、アクチンプロモーターに発現可能に連結されている。任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミンNアセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、該DNAが発現している昆虫は、その卵および体が薄色化する。従って、昆虫の卵および体の薄色化を指標に、遺伝子組換え昆虫を評価し、選抜することが可能である。以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例における実験材料と方法は、下記の通りである。1カイコの飼育カイコは人工飼料日本農産工業で25~27度で飼育した。トランスジェニックカイコの作成に用いたw1pnd系統w1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。トランスジェニックカイコの交配相手であるActinA3Gal43xP3DsRed2を保持する系統と、黒縞系統は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。2pBacUASNAT13xP3EGFPベクターの作成NAT遺伝子はカイコ蛹期翅から作成したESTライブラリーよりpBacMCSUASBlnIKozakBmNAT1ORFsプライマーとpBacMCSUASBlnIBmNAT1ORFaプライマーとPhusionHotStartIIHighFidelityDNApolymeraseを用いて増幅した。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、09kbの断片をQiaquickgelextractionkitを用いて、切り出し、精製を行った。NAT1のORFの配列は、GenBankaccessionnoDQ256382と同一である。この断片を、InfusionHDcloningkitを用いて、pBacUASMCS3xP3EGFPベクターのBlnIサイトにサブクローニングした。完成したプラスミドの配列はABI3130xlを用いたシークエンシングにより確認した。3トランスジェニックカイコの作成トランスジェニックカイコの作成は、Tamuraらの方法非特許文献1と同様の方法で行った。pBacUASNAT13xP3EGFPと、ヘルパープラスミドpHA3PIGを5mMKCl05mMリン酸バッファーpH70にそれぞれ400ngμl、200ngμlになるように調整した。この混合溶液を、産下後35~8時間のw1pnd系統w1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統の卵に注入した。遺伝子組換え体の選抜はG1世代の卵でEGFPの蛍光を用いて蛍光顕微鏡を用いて行った。樹立したUASNAT13xP3EGFP系統の雄蛾とActinA3Gal43xP3DsRed2系統の雌蛾を交配し、生まれた卵をEGFPとDsRed2の蛍光を用いてスクリーニングを行った。4カイコの観察蛍光顕微鏡ライカを用いて観察した。5解剖1xPTUフェニルチオ尿素PBS中で解剖した。実施例1NAT1遺伝子を強制発現させたカイコの1齢幼虫の表現型の解析NAT1遺伝子をカイコ1齢幼虫のヒフで強制発現させるために、Gal4UASシステムを用いた。UASの下流にカイコのNAT1遺伝子のORFの全長をつないだものと、眼での遺伝子発現を誘導する3xP3プロモーターにEGFPをつないだもの2種類をpiggyBac転移因子の認識配列ITRの間に組み込んだプラスミドを作成し図2、これをw1pnd系統w1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統の卵に微小注射することで、UASNAT13xP3EGFPを持つカイコの系統を作成した。UASNAT1の有無は、眼のEGFPの蛍光で識別した。次に、全身でGal4の発現が観察されるActinA3プロモーターGal43xP3DsRed2以下、ActinA3Gal43xP3DsRed2と称するトランスジェニック系統の蛾をUASNAT13xP3EGFPの蛾と交配した。産下後7日目の時期に、UASNAT1とActinA3Gal43xP3DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。EGFPのみや、DsRed2のみの個体では、NAT1は強制発現されないが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる個体では、NAT1が全身で強制発現されていると考えられる。対照区では産下後9~10日目では、幼虫の体も着色し、卵全体が灰色にみえるが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる区でのみ、その着色が薄い茶色であった。孵化した幼虫を観察すると、対照区のw1pnd系統w1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統は頭及び体の着色が黒であるのに対し、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる区では、明るい茶色であった図3。すなわち、NAT1の強制発現によりカイコの1齢幼虫の体色が薄くなることが明らかとなった。このことは、カイコの1齢幼虫の体表のクチクラおよび頭にはドーパミンメラニンが含有されていることを示唆している。興味深いことに、頭の色が薄くなったためか、幼虫の眼の蛍光が見やすくなった図3、DsRed2の写真。また、孵化までの時点で、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。さらに、w1遺伝子が正常に働いており、オモクローム系の色素が正常に合成される系統においても、NAT1を強制発現させると、1齢幼虫の頭が薄い茶色に、体色が赤褐色になったことから図4、実用系統など、他の様々な系統でNAT1の強制発現が1齢幼虫の体色を変化させることが可能であると考えられる。NAT1はActinA3プロモーターの機能により発現が制御されているため、ActinA3プロモーターとNAT1を繋げれば、肉眼で遺伝子組換え個体を判別するためのマーカーとして非常に有用であると考えられる。実施例2NAT1遺伝子を強制発現させた黒縞系統の幼虫の表現型の解析カイコの2齢幼虫以降の体色の大部分は尿酸からなる白であり、部分的にメラニン色素やオモクローム系色素からなる着色が見られる。この着色は系統により異なるが、NAT1の強制発現に用いた系統は、元々紋様が薄い系統であった。そこで、NAT1強制発現により幼虫のメラニン色素の色が変化するかを明確に調べるために、ActinA3Gal43xP3DsRed2とUASNAT13xP3EGFPの両方を持つ個体と、黒縞遺伝子をホモで持つ個体pSpSを交配し図5、産まれた卵をUASNAT1とActinA3Gal43xP3DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。オス親は、pS遺伝子をホモで持っており、メス親は持っていないため、F1はすべてpS遺伝子座をヘテロで保持しpSpS、体表に太い黒の縞模様が現れる。この黒の縞模様にNAT1の強制発現が与える影響を観察したところ、3~4齢幼虫では、黒の縞模様が茶褐色~黄褐色を呈していた図6~8。縞の体の側面の部分の色の体色が顕著に薄くなっており、半月紋や星状紋がオレンジ色になっていた。特に、体の側面や半月紋、星状紋の体色が顕著に変化していた。5齢幼虫も、全体的に色が薄くなっており、さらに、眼状紋の着色部位が狭くなっていた図9~10。半月紋と星状紋で顕著に着色部位が減少しており、紋様自体の変化を引き起こした図10。以上より、pS遺伝子座を持つ個体の幼虫では、NAT1の影響がより顕著にみられ、遺伝子組換え体を容易に判別可能であることが判明した。実施例3NAT1を強制発現させた幼虫の気管の表現型の解析カイコの幼虫の気管は通常黒っぽい色をしている。NAT1を強制発現させたカイコの5齢3日目の幼虫を解剖し、気管を観察した。その結果、NAT1強制発現カイコは気管が薄い金色であった図11。実施例4NAT1を強制発現させたカイコの成虫の触角の表現型の解析NAT1を強制発現させたカイコを飼育し、その成虫を観察したところ、鱗粉や体毛の色には変化は認められなかったが、触角の色が対照区では通常濃い茶色であるのに対し、NAT1を強制発現させたカイコの触角は黄色に近い茶色になることが判明した図12、13。この形質は、UASNAT13xP3EGFPのみ持つ個体や、ActinA3Gal43xP3DsRed2のみの個体では認められなかった。このことから、カイコの成虫の触角にも、ドーパミンメラニンが含有されていることが示唆される。また、成虫まで飼育する間、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。