"下記化学式1で表される化合物1、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれる活性成分を含有する、非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物。活性成分が、前記化学式1で表される化合物1またはその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の組成物。活性成分が前記化学式1の酒石酸塩である、請求項2に記載の組成物。活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の組成物。活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項4に記載の組成物。活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の組成物。活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項1に記載の組成物。非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物。非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物。下記化学式1で表される化合物1、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩よりなる群から選ばれた活性成分の有効量を、非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防を必要とするヒトを含む哺乳類に投与し、前記疾患を予防または治療する方法。活性成分が、前記化学式1で表される化合物1またはその薬学的に許容される塩である、請求項10に記載の方法。活性成分が前記化学式1の酒石酸塩である、請求項11に記載の方法。活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項10に記載の方法。活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項13に記載の方法。活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項10に記載の方法。活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項10に記載の方法。非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項10~16のいずれか1項に記載の方法。非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項10~16のいずれか1項に記載の方法。非アルコール性脂肪肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を製造するための、化学式1で表される化合物1、シタグリプチン、ビルダグリプチン、リナグリプチンまたはこれらの薬学的に許容される塩の使用。活性成分が、化学式1で表される化合物1またはその薬学的に許容される塩である、請求項19に記載の使用。活性成分が化合物1の酒石酸塩である、請求項20に記載の使用。活性成分がシタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項19に記載の使用。活性成分がシタグリプチンリン酸塩である、請求項22に記載の使用。活性成分がビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項19に記載の使用。活性成分がリナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩である、請求項19に記載の使用。非アルコール性脂肪肝疾患が高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項19~25のいずれか1項に記載の使用。非アルコール性脂肪肝疾患が単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎、肝線維症及び肝硬変よりなる群から選ばれる、請求項19~25のいずれか1項に記載の使用。そこで、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患Nonalcoholicfattyliverdisease、NAFLDの予防または治療用薬学的組成物、及びこれを用いた治療方法を提供することを目的とする。本発明は、下記化学式1、2、3、4で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する、非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防用薬学的組成物に関する。化学式1で表される化合物1は、R-4-[R-3-アミノ-4-2,4,5-トリフルオロフェニル-ブタノイル]-3-t-ブトキシメチルピペラジン-2-オンであり、韓国特許出願第2008-0036052号にて開示されている。化学式2で表される化合物2は、シタグリプチンであり、Januviaという商標で市販されており、化学式3で表される化合物3は、ビルダグリプチンであり、Glavusという商標で市販されており、化学式4で表される化合物4は、リナグリプチンとして知られている。本発明の化学式1~4は、公知の方法によって製造して使用してもよく、市販するもの例えば、ビルダグリプチンはTrademax社中国から販売されるものを使用してもよい。前記化学式1または2に示すように、化合物1または2はβ炭素とピペラジノンの3位の炭素に非対称中心を有することができ、単一鏡像異性体、単一ジアステレオ異性体、ラセミ体、またはジアステレオ異性体の混合物は、本発明の化学式1または2の化合物1または2に含まれ得る。また、本発明の化学式1または2の化合物1または2は、互変異性体としても存在し得る。さらに、それぞれの互変異性体だけでなく、それらの混合物も本発明の化合物1または2に含まれ得る。本発明に係る前記化合物1または2のβアミノ基を含むヘテロ化合物は、その薬学的に許容される塩、該塩から製造できる水和物及び溶媒和物を含む。前記化合物1または2のβアミノ基を含むヘテロ化合物の薬学的に許容される塩は、通常用いられる塩の調製方法によって調製され得る。また、化合物3及び4も、それらが示し得る全ての光学異性体及びその薬学的に許容される塩を含む。本発明において、薬学的に許容される塩は、無機または有機塩基及び無機または有機酸を含む、薬学的に許容される非毒性塩基または酸により調製される塩をいう。無機塩基から誘導される塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などを含む。特にアンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムまたはナトリウム塩が好ましい。固形の塩は一つ以上の結晶構造形態で存在していてもよく、水和物の形態で存在してもよい。薬学的に許容される非毒性有機塩基から誘導される塩の例には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなど、一級、二級または三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンの塩、塩基性イオン交換樹脂が含まれる。本発明の化合物が塩基性である場合、その塩は、無機及び有機酸を含む薬学的に許容される非毒性酸により調製され得る。前記酸の例には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、p-トルエンスルホン酸などが含まれ、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、フマル酸または酒石酸が好ましい。本発明の化合物1、2、3または4、またはその薬学的に許容される塩の水和物は、非共有結合的な分子間力を介して結合した化学量論量または非化学量論量の水を含むものと解される。前記水和物は、1当量以上、通常1~5当量の水を含有し得る。かかる水和物は、水または水を含有する溶媒中において、本発明の化合物1または2、または薬学的に許容される塩を結晶化させることにより調製され得る。本発明の薬学的組成物において、活性成分は、化学式1で表される化合物1、またはその薬学的に許容される塩であることが好ましく、化合物1の酒石酸塩であることがより好ましい。本発明の薬学的組成物において、活性成分は、シタグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましく、シタグリプチンリン酸塩であることがより好ましい。本発明の薬学的組成物において、活性成分は、ビルダグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。本発明の薬学的組成物において、活性成分は、リナグリプチンまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。本発明に係る非アルコール性脂肪肝疾患の治療または予防用薬学的組成物は、一般的な医薬品製剤の形で使用することができる。すなわち、実際臨床的に投与する際、種々の経口的及び非経口的な剤形で投与することができ、本発明では経口投与が好ましい。さらに、薬学的組成物を所望の剤形に製剤化する際には、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤など、当技術分野で通常知られ、使用される希釈剤または賦形剤が用いられる。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ得る。このような固形製剤は、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、またはラクトース、ゼラチンなどと、活性成分とを混合して調製される。さらに、賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も使用され得る。経口投与のための液体製剤には、懸濁剤、内服液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれる。水、流動パラフィンなどの汎用される希釈剤に加えて、液状製剤には、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水溶液、懸濁剤の溶媒としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィッテプゾールハードファット、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。本発明に係る薬学的組成物の活性成分の1日投与量または服用量は0.1~1000mg/kgであるが、これは患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与回数、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度によって異なる。本発明において、非アルコール性脂肪肝疾患nonalcoholicfattyliverdisease、NAFLDは、原発性及び続発性の非アルコール性脂肪肝疾患の双方を含むが、好ましくは原発性高脂血症、糖尿病または肥満に起因する非アルコール性脂肪肝疾患を意味する。また、本発明において、非アルコール性脂肪肝疾患nonalcoholicfattyliverdisease、NAFLDは、単純脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎nonalcoholicsteatohepatitis、NASH、ならびにこれら疾患の進展により発症する肝線維症及び肝硬変を含む。本発明の薬学的組成物は、化学式1~4の化合物またはその薬学的に許容される塩に加えて、同一または類似の機能を示す活性成分を1種以上含有することができる。また、本発明は、前記化学式1、2、3、4で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩の有効量を、非アルコール性脂肪肝疾患の治療及び予防を必要とするヒトを含む哺乳類に投与し、非アルコール性脂肪肝疾患を予防または治療する方法を提供する。本発明において、投与の用語は、何らかの適切な方法で、患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の薬学的組成物は、それが標的組織に到達し得る限り、何らかの一般的な経路を介して投与することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、内皮、鼻内、肺内、直腸内、腔内、硬膜下投与等することができるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物は、1日1回または一定の時間間隔で1日2回以上投与できる。非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療には、本発明の薬学的組成物は単独で、または外科手術、ホルモン療法、薬物療法及び生物学的反応調節剤を採用する方法と併用して用いることができる。また、本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療用薬学的組成物を製造するための、化学式1~4の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明の薬学的組成物は、非アルコール性脂肪肝の典型的な病変として現れるトリグリセリドTriglyceride、TGの蓄積を予防及び治療し、血中に検出される肝細胞損傷の指標であるアラニンアミノトランスフェラーゼalanineaminotransferase、ALTを正常化させる効果を有する。また、本発明の薬学的組成物は、肝線維症を誘発する肝星細胞hepaticstellatecell、HSCの活性化及び分化を抑制して、肝線維症、さらには肝繊維症から肝硬変への進展を抑制し、肝線維症または肝硬変を予防及び治療する効果を有する。従って、本発明の薬学的組成物は、非アルコール性脂肪肝の予防または治療剤として使用することができる。本発明の治療方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の予防及び治療に有用である。以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、以下の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲及び精神を限定するものとして解釈されるべきではない。マウスにおける、高脂肪飼料により誘導された単純脂肪症に対する化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の予防効果化合物1の酒石酸塩韓国特許出願第2008-0036052号に開示された方法により製造及びシタグリプチンリン酸塩の単純脂肪症に対する予防効果を調べるため、次の実験を行った。6週齢の雄性C57BL/6マウスを安定化させた後、5群に分けた。1個群には10の脂肪を含有する標準飼料商品名:D12450B、Researchdiets社製を供給し、もう1個群には60の脂肪を含有する高脂肪飼料商品名:D12492、Researchdiets社製を供給した。薬物処理群として、残りの3個群には、高脂肪飼料と薬物を混合し、特別に処方された薬物混合飼料を供給した。化合物1の酒石酸塩の場合、1日の平均高脂肪飼料消費量に基き、化合物1の酒石酸塩の1日目標用量である100mg/kg及び300mg/kgを供給するため、高脂肪飼料と0.2重量及び0.5重量の化合物1の酒石酸塩をそれぞれ混合し、飼料を処方した。シタグリプチンリン酸塩の場合も、1日の平均高脂肪飼料消費量に基き、1日の目標用量である300mg/kgを供給するため、高脂肪飼料と約0.5重量のシタグリプチンリン酸塩を混合し、飼料を処方した。各薬物処理群に、処方した薬物混合飼料を供給した。各飼料を供給してから8週後、16週後及び24週後に、動物を解剖して血清を分離し、血液分析器を用いて血清ALTレベルアラニンアミノトランスフェラーゼ、GPT、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼを測定した表1及び図1。摘出された肝臓は、5v/vTriton-X溶液中でホモジナイズした後、トリグリセリドworkingreagent[遊離グリセリン試薬F6428、Sigma及びトリグリセリド試薬Sigma、T2449を4:1v/vで混合して調製する]を添加し、540nmで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した表1及び図2。また、摘出された肝臓の一部分は、組織学的脂肪分布を観察するため、10v/vホルマリン溶液で固定した後、組織標本を作成してヘマトキシリンエオシン染色を行い、画像分析プログラムを用いて写真撮影した図3、紫色に染色された部分は正常な肝臓組織を示し、白色に染色された部分は脂肪滴を示す。。その結果、図1に示すように、化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の供給は、16週と24週において、血清アラニンアミノトランスフェラーゼALTの有意な減少を示した。また、肝臓のトリグリセリド含量も、肝臓トリグリセリド分析図2及び組織学的分析図3において、高脂肪飼料供給群に比べて有意な減少を示した。これらの結果は、化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が、高脂肪飼料により誘導される脂肪肝に対し、肝臓のトリグリセリド含量を減少させ、脂肪肝に対する予防効果を有することを示す。ラットにおいて高脂肪飼料により誘導された単純脂肪症に対する化合物1の酒石酸塩の治療効果化合物1の酒石酸塩韓国特許出願第2008-0036052号に開示された方法により製造の単純脂肪症に対する治療効果を調べるため、次の実験を行った。6週齢の雄性ウィスター系ラットを安定化させた後、2群に分け、それぞれ、10の脂肪を含有する標準飼料商品名:D12450B、Researchdiets社製及び60の脂肪を含有する高脂肪飼料商品名:D12492、Researchdiets社製を24週間供給した。飼料供給22週目に飼料消費量を計算すると、高脂肪飼料群は、33.40g/kgの飼料摂取を示した。化合物1の酒石酸塩の1日目標用量である10mg/kgを供給するために、高脂肪飼料と0.03重量の化合物1の酒石酸塩を混合し、飼料を処方した。各飼料供給から24週後に、動物を高脂肪飼料供給群n=8、高脂肪飼料化合物1の酒石酸塩0.03重量混合供給群n=8、標準飼料供給群n=8に分けて、さらに14週間供給した。その後、動物を解剖して血清を分離した後、血液分析器を用いて血清ALTレベル、GPTを測定した図4。摘出された肝臓は、5v/vTriton-X溶液中でホモジナイズした後、トリグリセリドworkingreagent[遊離グリセリン試薬Sigma、F6428及びトリグリセリド試薬Sigma、T2449を4:1v/vで混合して調製する]を添加し、540nmで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した図5。また、摘出された肝臓の一部分は、組織学的脂肪分布を観察するため、10v/vホルマリン溶液で固定した後、組織標本を作成してヘマトキシリンエオシン染色を行い、画像分析プログラムを用いて写真撮影した図6において、紫色に染色された部分は正常な肝臓組織を示し、白色に染色された部分は脂肪滴を示す。その後、標本の単位面積当たりの脂肪滴の面積を計算した図7。その結果、図4に示すように、化合物1の酒石酸塩の投与は、血清アラニンアミノトランスフェラーゼALTの有意な減少を示した。また、肝臓のトリグリセリド含量も、肝トリグリセリド分析図5及び組織学的分析図7において、高脂肪飼料供給群と比較して有意な減少を示した。これらの結果は、既存の脂肪肝に対して化合物1の酒石酸塩が肝臓のトリグリセリド含量を減少させ、脂肪肝の治療剤として使用できることを示す。マウスにおいて、高脂肪飼料により誘導される単純脂肪症に対する化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩及びビルダグリプチンの非アルコール性脂肪肝予防効果化合物1の酒石酸塩の非アルコール性脂肪肝単純脂肪症に対する予防効果を調べるため、次の実験を行った。7週齢の雄性C57BL/6マウスを安定化させた後、体重及び血糖値により9群n=9に分けた。標準飼料供給群と高脂肪飼料供給群は、各飼料のビヒクル溶液0.5MCを1日1回10mL/kgで経口投与し、残りの群は、高脂肪飼料と共に、指定された群に応じて、化合物1の酒石酸塩30、100、300mg/kg、シタグリプチンリン酸塩100、300mg/kg及びビルダグリプチン100、300mg/kgを1日1回、それぞれ28日間経口投与した。最後の経口投与から24時間後に動物を解剖し、摘出された肝臓を5v/vTriton-X溶液中でホモジナイズした後、トリグリセリドworkingreagentを添加し、540nmで吸光度を測定してトリグリセリド含量を測定した表2。また、摘出された肝臓の一部分は、10v/vホルマリン溶液で固定し、組織標本を作成してヘマトキシリンエオシンHE染色を行い、写真撮影した図8。表2に示すように、高脂肪飼料供給群は、標準飼料供給群に比べて、肝臓のトリグリセリド含量において54の増加を示した。化合物1の酒石酸塩300mg/kg投与群は肝臓のトリグリセリド含量において11、シタグリプチンリン酸塩100mg/kg投与群は肝臓のトリグリセリド含量において21、ビルダグリプチン300mg/kg投与群は肝臓のトリグリセリド含量において11の増加を示し、本発明の化合物が、高脂肪飼料による脂肪肝の発生に対し予防効果を有することが示された。また、高脂肪飼料供給群に対する肝臓のトリグリセリド含量の最大減少量は、化合物1の酒石酸塩投与群では最大81、シタグリプチンリン酸塩投与群では最大61、ビルダグリプチン投与群では最大79の減少であり、これも脂肪肝の発生に対する本発明の化合物の予防薬効を示す。かかる予防効果の組織学的評価のために組織標本を写真撮影したところ、化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、及びビルダグリプチンによる脂肪滴の減少が確認された図8。これらの結果は、脂肪肝の発生に対して3種の薬物すべてが予防効果を有することを示唆する。ラット肝星細胞活性化に対する化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンの抑制効果本発明の化合物の肝星細胞活性化に対する抑制作用を、次の細胞培養法により試験した。体重が500~700gの雄性ウィスター系ラットを麻酔し、腹部を切開した後、肝門脈にカニューレを連結して、ヘパリン含有HBSSと第1型コラゲナーゼ含有HBSSを順次灌流した。灌流が終わった後、肝臓を摘出し、手術用はさみを用いて粉砕した後、第1型コラゲナーゼ含有HBSSに入れて37°Cで15分間振盪培養した。完全に粉砕された液体状態の肝臓組織をガーゼに通した後、500gで10分間遠心分離した。得られた細胞沈殿物をリン酸緩衝液で洗浄し、次いで100gで5分間遠心分離して上澄み液を回収した。上澄み液をさらに500gで10分間遠心分離して得た沈殿物にFicoll液GEhealthcareとPercollGEhealthcare液の9:1v/v混合液を加えて混合した後、リン酸緩衝液を混合層上に載せ、1,400gで15分間遠心分離した。次に、上層と下層との間に設けられた細胞層を回収し、10v/vウシ胎仔血清を含むダルベッコ修正イーグル培地DMEMで1回洗浄した。得られた細胞を3.1×105個/cm2の細胞密度で加え、24時間後に培地を新しい培地と交換し、2~3日ごとに培地を交換しながら7日間培養した。その後、ヒトTGFβ11ng/mLを含有する培地及びTGFβ1を含有しない培地中、薬物を提示の濃度でそれぞれ処理した。TGFβ1は、薬物の処理濃度の1000倍高い濃度となるようにジメチルスルホキシドに溶解し、1倍1×容積となるように培地にて1000倍に希釈し、細胞に処理された。7日間の薬物処置の後、培地を収集してリン酸緩衝液で洗浄し、界面活性剤を含む緩衝液を加えて細胞を溶解させた。次いでタンパク質を定量し、4-12Bis-Trisgelinvitrogenにて電気泳動した後、ニトロセルロースメンブランに移動させた。移動させたタンパク質は、α-平滑筋アクチンまたはTGFβ1に対して特異的な1次抗体と反応させた後、セイヨウワサビペルオキシダーゼが結合した特異的2次抗体と反応させた。標的タンパク質の発現量は化学発光液を用いて確め、アクチンβactin発現量を単位として補正した図9。本発明の各化合物100μMによる観察タンパク質発現の減少は、DMSOのみ加えた陰性対照群と比較して、TGFβ1で処理した陽性対照群におけるタンパク質発現の増加に基づき、薬物による減少率を百分率で表した表3。その結果、表3及び図9に示すように、ラットの活性化された肝星細胞において、hTGF-β1によって増加した肝の線維症の病態生理学的に重要な因子であるTGFβ1とα-SMAのタンパク質発現量が、化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンによって減少し、また、化合物1の酒石酸塩の濃度の増加に伴って、TGFβ1及びα-SMAのタンパク質発現減少率が増加することが確認された図9。これらの結果は、脂肪肝炎及び肝線維症に対して化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、ビルダグリプチン及びリナグリプチンが治療効果を示し得ることを示唆する。ヒト肝癌細胞において、遊離脂肪酸により誘導された細胞内脂肪蓄積に対する化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の抑制効果肝細胞の遊離脂肪酸による処置は、細胞内脂肪蓄積の増加をもたらす。遊離脂肪酸と薬物の併用処理により細胞内脂肪蓄積に対して各薬物が及ぼす抑制効果を、トリグリセリド染色法で定量した。ヒト肝癌細胞株であるHepG2細胞を、10v/vウシ胎仔血清を含む最小基礎培地MEMで48時間培養した。その後、培地を、1v/vウシ血清アルブミンを含むMEM培地にオレイン酸塩及びパルミチン酸塩Sigmaをモル比が2:1となるように溶解して調製した0.5mM遊離脂肪酸混合液に交換した後、0.1v/vジメチルスルホキシドDMSOまたは各試験薬物を加え、24時間細胞培養した。陰性対照群は、1v/vウシ血清アルブミンを含むMEMを、遊離脂肪酸を加えずに、0.1v/vジメチルスルホキシドで処理した。培養終了後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液で洗浄した。1v/vPluronicF127Invitrogenを含有するジメチルスルホキシドに溶解した10mMNileRedSigma原液を、リン酸緩衝液で1,000倍希釈して細胞に加えた後、37°C、200rpm、遮光条件下で30分間細胞内脂肪を染色した。染色後、上澄み液を除去してリン酸緩衝液に交換し、励起波長488nm、発光波長550nmの条件下に蛍光強度を測定した。次いで、細胞数計測による偏差を補正するために、同一のウェル内に10μMレザズリンSigmaを溶解したリン酸緩衝液を加えた後、37°Cで1時間遮光状態で反応させた前後において、蛍光光度計で励起波長535n、発光波長580nmの条件で蛍光強度を測定し、細胞内ミトコンドリア活性により還元、生成されたレソルフィンによる蛍光強度の増加を測定した。実験結果は、NileRedの蛍光強度をレザズリン還元による蛍光強度の増加について補正した値を用いて、陰性対照群と比較して、遊離脂肪酸処理により増加した脂肪蓄積に対する百分率で表した。その結果、図10に示すように、化合物1の酒石酸塩とシタグリプチンリン酸塩は、遊離脂肪酸による肝細胞における脂肪蓄積を濃度依存的に抑制した。1μM濃度における28.7±3.2の抑制効果は、肝細胞膜のグルカゴン様ペプチド-1glucagonlikepeptide1、GLP-1受容体の活性化を介して脂肪酸生合成を抑制することが知られているGLP-115841592が100nMの濃度で示す28.0±4.9の抑制効果、脂肪酸の酸化促進を介して脂肪蓄積を減少させることが知られているフェノフィブラート62533が30μmの濃度で示す35.6±6.5の抑制効果、及びAMPK活性化タンパク質キナーゼAMPK活性化を介して脂肪酸の酸化を促進し且つ脂肪酸生合成を抑制することが報告されたメトホルミン4789847905が1mMの濃度で示す23.6±5.0の抑制効果と同等である。これらの結果は、化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が、内因性GLP-1量の増加による間接的効果と共に、肝細胞に直接作用して脂肪蓄積を抑制することにより、脂肪肝予防効果を示し得ことを示唆する。CCl4誘発急性肝損傷マウスモデルにおける化合物1の酒石酸塩、シタグリプチンリン酸塩、及びビルダグリプチンのTGF-β1活性化抑制効果CCl4により誘発される急性肝損傷マウスモデルにおいて、肝細胞の線維化過程で重要な役割を果たすことが知られているTGF-β1発現に対する本発明の化合物の抑制効果を調べるために、次の実験を行った。7週齢の雄性C57BL/6マウスを安定化させ、体重によって9群n=7に分けた後、CCl40.1mL/kgを腹腔内に投与した。正常対照群にはオリーブ油を投与した。対照群には、ビヒクル溶液0.5MCを1日1回10mL/kgにて3日間24時間間隔で経口投与した。残りの群には、指定された群に応じて、化合物1の酒石酸塩30、100、300mg/kg、シタグリプチンリン酸塩WO2004/085378またはWO2005/003135に開示された方法で製造する100、300mg/kg、及びビルダグリプチンTrademax、China100、300mg/kgをそれぞれ1日1回経口投与した。最後の経口投与の1時間後に解剖し、摘出された肝臓をTGF-β1mRNAの発現の評価に供した。液体窒素中で保管した肝臓組織をTRIZOL溶液中でホモジナイズした後、全RNAを抽出した。単離したRNAを0.1v/vDEPCで希釈して1μg/μLの濃度とした後、RNA混合液[各RNA2μg/μL0.5μg/μLoligodT152μL0.1DEPC水15μLとする量]をPCR装置を用いて72°Cで5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。混合液[PCRnucleotidemix1μL5XMMLVRTbf.Promega、M531A5μL200μg/μLM-MLVreverse1μL]を調製し、42°Cで60分間伸長させ、95°Cで5分間変性させた後、8°Cで急冷してcDNAを生成し、次の使用まで-20°Cで保管した。RT-PCRを行うために、混合液[20pmol各プライマー1μLヌクリアーゼ-フリー水9.5μL]を調製した後、各cDNA2μLを、滅菌したPCRチューブに入れ、remixTaqTMTaKaRa、RR003A12.5μLを添加して混合した後、下記条件表4にてThermalCyclerPTC-200、MJResearchを用いてPCRを行った。PCT生成物を電気泳動した後、画像分析機VilberLourmatを用いて分析し、β-actinの発現を用いてターゲット遺伝子TGF-β1の発現を正規化した図11。その結果は表5のとおりである。その結果、表5及び図11に示すように、CCl4対照群では肝臓のTGF-β1mRNA発現が正常群と比較して22増加し、化合物1の酒石酸塩及びビルダグリプチン処理により、TGF-β1の発現は正常化された。シタグリプチンリン酸塩処理群においても、CCl4群と比較してTGF-β1の発現が減少し、CCl4誘発性TGF-β1の発現に対する抑制効果を示した。また、CCl4対照群と比較した肝臓のTGF-β1mRNA発現の減少率は、化合物1の酒石酸塩投与群では最大135、シタグリプチン投与群では最大41、ビルダグリプチン投与群では最大115であり、本発明の化合物がTGF-β1の発現増加による肝線維症の発生に薬効を有することが示唆される。肥満動物モデルob/obマウスにおける、化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩のアラニンアミノトランスフェラーゼ低下効果化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の単純脂肪症に対する治療効果を調べるために、次の実験を行った。5週齢の雄性C57BL/6マウス正常マウス群及びob/obマウス肥満マウス群を安定化させた後、体重及び血糖値によって6群に分け、標準飼料及び薬物混合飼料を供給した。マウスの飼料消費量は、マウス体重の10g当たり約1gの飼料摂取を示す。よって、化合物1の酒石酸塩の1日目標用量である10、100、300mg/kgを供給するために、標準飼料と、0.01重量、0.1重量、0.3重量の化合物1の酒石酸塩、及び0.3重量のシタグリプチンリン酸塩とをそれぞれ混合して、飼料を処方した。飼料供給4週後に解剖して血清を分離した後、血液分析器を用いて血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ値を測定した表6。その結果、化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩の投与によって血漿アラニンアミノトランスフェラーゼが減少したことが確認された。これらの結果は、脂肪肝により増加したアラニンアミノトランスフェラーゼに対して化合物1の酒石酸塩及びシタグリプチンリン酸塩が減少作用を示し、単純脂肪肝の治療剤として使用できることを示唆する。"