"a配列番号1のヌクレオチド配列の2番目から7番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、b薬剤的に許容される担体と、を含むことを特徴とする神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する請求項1に記載の医薬組成物。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、DNA又はRNA分子である請求項1に記載の医薬組成物。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNA分子である請求項3に記載の医薬組成物。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、2’-O-修飾オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート-バックボーンデオキシリボヌクレオチド、PNApeptidenucleicacid又はLNAlockednucleicacidである請求項1に記載の医薬組成物。神経変性疾患が、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症である請求項1に記載の医薬組成物。miR-424、miR-18b、miR-135a、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191及びmiR-134からなる群から選択されるmiRNAのヌクレオチド配列、その相補的配列又は前記配列の断片を含むことを特徴とするアルツハイマー疾患の診断用キット。miRNAが、miR-206である請求項7に記載のキット。ヒト生物学的試料におけるmiR-424、miR-18b、miR-135a、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191又はmiR-134の発現を検出する工程を含み、これにより神経変性疾患の診断又は予後に必要な情報が提供されることを特徴とするアルツハイマー疾患マーカーを検出する方法。miRNAが、miR-206である請求項9に記載の方法。a配列番号1のヌクレオチド配列の2番目から7番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、b薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含むことを特徴とする神経変性疾患の予防又は治療方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する請求項11に記載の方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、DNA又はRNA分子である請求項11に記載の方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNA分子である請求項13に記載の方法。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、2’-O-修飾オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート-バックボーンデオキシリボヌクレオチド、PNApeptidenucleicacid又はLNAlockednucleicacidである請求項11に記載の方法。神経変性疾患が、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症である請求項11に記載の方法。投与が、鼻腔内投与である請求項11に記載の方法。本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療できるターゲット分子を見出し、これをターゲットとする医薬を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、miR-206が神経変性疾患の脳において特異的に高発現し、miR-206をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、シナプスを再生して記憶力を回復させるなど、神経変性疾患を治療することができることを実質的に確認することにより、本発明を完成した。本発明の目的は、神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。本発明の他の目的は、神経変性疾患の診断用キットを提供することにある。本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。本発明の一様態によると、本発明は、a配列番号1のヌクレオチド配列の2番目から7番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、b薬剤的に許容される担体とを含む神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。本発明の一様態によると、本発明は、a配列番号1のヌクレオチド配列の2番目から7番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、b薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む神経変性疾患の予防又は治療方法を提供する。本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療できるターゲット分子を見出し、これをターゲットとする医薬を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、miR-206が神経変性疾患の脳において特異的に高発現し、miR-206をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、シナプスを再生して記憶力を回復させるなど、神経変性疾患を治療することができることを実質的に確認した。本明細書において、用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’は、ターゲットとするmiRNA、特にmiRNAのシードseed配列に対する相補的な配列を有しており、miRNAと二本鎖duplexを形成できる核酸に基づく分子を包括する。したがって、本明細書において、用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’は、‘相補的核酸ベース抑制剤acomplimentarynucleicacid-basedinhibitor’と記載できる。配列番号1は、miR-206の成熟配列を示す。配列番号1において、2番目から7番目までのヌクレオチド配列は、miR-206のシード配列である。一般に、miRNAのシード配列は、ターゲット認知に非常に重要な配列であってKrenz、M.etal.、J.Am.Coll.Cardiol.44:2390-23972004;H.Kiriazis、etal.、Annu.Rev.Physiol.62:3212000、多様な種に対して保存されている。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-206のシード配列である配列番号1の2番目から7番目までのヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、この相補的な配列のみによってもmiR-206を抑制することができる。本明細書において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを言及しながら使用される用語‘相補的’は、所定のハイブリッド形成又はアニーリング条件、好ましくは、生理的条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドがmiR-206ターゲットに選択的にハイブリッド形成する程度に十分相補的であることを意味し、実質的に相補的substantiallycomplementary及び完全に相補的perfectlycomplementaryであることを包括する意味を有し、好ましくは、完全に相補的であることを意味する。本発明の好ましい具現例によると、本発明で有効成分として利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列即ち、miR-206の成熟配列の1~8番目や2~8番目、又は2~7番目ヌクレオチド配列に相補的な配列を有する。最も好ましくは、本発明で有効成分として利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列即ち、miR-206の成熟配列全体に相補的な配列を有する。本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多様な分子を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はRNA分子であり、より好ましくは、RNA分子である。選択的に、本発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドRNA、デオキシヌクレオチドDNA、2’-O-修飾オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート-バックボーンデオキシリボヌクレオチド、PNApeptidenucleicacid又はLNAlockednucleicacidである。2’-O-修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、2’-O-アルキルオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、2’-O-C1-3アルキルオリゴヌクレオチドであって、最も好ましくは、2’-O-C1-3メチルオリゴヌクレオチドである。上述のように、本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-206に相補的な配列を有する核酸ベース抑制剤を含む包括的な意味を有する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるものは、例えば、狭い意味のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミアantagomir及び抑制RNA分子を含む。用語‘アンタゴミア’は、一本鎖化学的修飾リボヌクレオチドであって、miR-206に少なくとも部分的に、好ましくは完全に相補的な配列を有する。アンタゴミアは、一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド例えば、2’-O-メチル-糖修飾を含む。ある具現例によると、アンタゴミアは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴミアは、一つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合を含み、これに部分的に又は完全にホスホロチオエートバックボーンを有するようになる。インビボ運搬及び安定性を改善するために、アンタゴミアは、その3’-末端にコレステロール又は他の領域を結合させることができる。miR-206を抑制するために、アンタゴミアの長さは、7~50ヌクレオチド、好ましくは、10~40ヌクレオチド、より好ましくは、15~30ヌクレオチド、最も好ましくは、20~25ヌクレオチドである。miR-206機能の抑制は、典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより達成できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの化学的修飾を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上のLNAslockednucleicacidsを含むことができる。LNAは、修飾リボヌクレオチドであって、リボース糖部位の2’乃至4’炭素間に追加的なブリッジを含み、Locked形態を有し、これにより、LNAのあるオリゴヌクレオチドは、改善された熱安定性を有するようになる。択一的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PNAspeptidenucleicacidsを含むことができ、これは、糖-ホスフェートバックボーンの代わりに、ペプチドベースバックボーンを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の化学的修飾を含むことができ、そのような他の化学的修飾としては、例えば、2’-O-アルキル例えば、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル、2’-フルオロ及び4’-チオ修飾のような糖修飾;ホスホロチオエート、モルフォリノ又はホスホノカルボキシレート結合のようなバックボーン修飾例えば、米国特許第6,693,187号及び第7,067,641号を含む。他の具現例において、適合したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、2’-O-メトキシエチル‘ギャップマー’であり、これは、5’-末端及び3’-末端に2’-O-メトキシエチル-修飾リボヌクレオチドを含み、中央に少なくとも10個のデオキシリボヌクレオチドを有する。この‘ギャップマー’は、RNAターゲットのRNaseI依存性分解メカニズムを誘発させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、7~50ヌクレオチド、好ましくは、10~40ヌクレオチド、より好ましくは、15~30ヌクレオチド、最も好ましくは、20~25ヌクレオチドである。miR-206の機能を抑制する他のアプローチは、抑制RNA分子を投与することであって、前記抑制RNA分子は、miR-206の成熟配列に相補的な配列を含む。このような抑制RNA分子は、siRNAsmallinterferingRNA、shRNAshorthairpinRNA及びリボザイムを含む。本発明の医薬組成物により治療できる疾患は、多様な神経変性疾患を含み、好ましくは、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症であり、最も好ましくは、アルツハイマー疾患である。下記の実施例で立証されたように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-206の機能を抑制し、BDNF及びIGF-1のレベルを大きく増加させ、シナプス再生を増加させ、その結果、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療する。本発明の医薬組成物に含まれる薬剤的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤的に許容される担体及び製剤は、Remington’sPharmaceuticalSciences19thed.、1995に詳細に記載されている。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、鼻腔内注入、局所注入、脳室内注入、脊髄腔注入、皮下注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。本発明の医薬組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、普通に熟練した医者は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によると、本発明の医薬組成物の一日投与量は、体重当たり、0.001mg/kg~100mg/kgである。本発明の医薬組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤的に許容される担体及び/又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、油性又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。miR-206の抑制剤として本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miRNAをターゲットとした神経変性疾患の治療において、最初に成果を挙げたことを示唆する。本発明の他の様態によると、本発明は、miR-424、miR-18b、miR-135a、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191又はmiR-134のヌクレオチド配列、その相補的配列又は前記配列の断片を含む神経変性疾患の診断用キットを提供する。本発明のまた他の様態によると、本発明は、ヒト生物学的試料におけるmiR-424、miR-18b、miR-135a、miR-1228、miR-320、miR-296-5p、miR-557、miR-338-5p、miR-206、miR-92a、miR-1238、miR-513a-5p、miR-423-5p、miR-188-5p、miR-140-3p、miR-575、miR-640、miR-1237、miR-191又はmiR-134の発現を検出する工程を含み、これにより神経変性疾患の診断又は予後に必要な情報が提供される神経変性疾患マーカーを検出する方法を提供する。前記miRNA分子のヌクレオチド配列は、GenBankで確認することができる。最も好ましくは、前記miRNA分子は、miR-206である。本発明の診断キットは、多様な神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症に利用でき、最も好ましくは、アルツハイマー疾患の診断に利用できる。本発明のキットは、上記の成分の外にも、他の成分を追加的に含むことができる。例えば、本発明のキットがPCR増幅過程に適用される場合は、本発明のキットは選択的に、PCR増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、DNAポリメラーゼ例えば、ThermusaquaticusTaq、ThermusthermophilusTth、Thermusfiliformis、Thermisflavus、Thermococcusliteralis又はPyrococcusfuriosusPfuから収得した熱安定性DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子及びdNTPsを含むことができる。本発明のキットは、上記の試薬成分を含む多数の別途パッケージング又はコンパートメントとして製作できる。本発明の好ましい具現例によると、本発明のキットは、マイクロアレイである。本発明の好ましい具現例によると、本発明のキットは、遺伝子増幅キットである。本発明のキットがマイクロアレイである場合は、マイクロアレイの固相表面にプローブが固定化されている。本発明のキットが遺伝子増幅キットである場合は、プライマーを含む。本発明の診断用キットで利用されるプローブ又はプライマーは、PRDX1ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する。本明細書において用語‘相補的complementary’は、ある特定なハイブリッド形成hybridization又はアニーリング条件下で上述のヌクレオチド配列に選択的にハイブリッド形成できる程度の相補性を有することを意味する。したがって、用語‘相補的’は、用語‘完全に相補的perfectlycomplementaryとは異なる意味を有し、本発明のプライマー又はプローブは、上述のヌクレオチド配列に選択的にハイブリッド形成できる程度であれば、一つ又はそれ以上のミスマッチmismatch塩基配列を有することができる。プライマー又はプローブ製作時に参照すべき本発明のmiRNAのヌクレオチド配列は、GenBankで確認することができ、この配列を参照してプライマー又はプローブをデザインすることができる。本発明のキット又は方法により分析された前記miRNAの発現程度、例えば、RTreversetranscriptase-PCR又はリアルタイムreal-time-PCR方法参照:Sambrook、J.etal.,MolecularCloning.ALaboratoryManual,3rded.ColdSpringHarborPress2001により測定された発現程度が、正常対照群と比較し、1.5倍以上、好ましくは2倍以上、最も好ましくは、3倍以上の発現度を示す場合は、分析試料を採取した対象が神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を有しているか、発病危険度が高いと判定する。本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである:a本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患に対する治療ターゲットとしてmiR-206を提供する。b本発明で見出されたmiR-206ターゲットは、アルツハイマー動物モデル及びヒト脳試料において共通的に高発現したものであって、実験的誤差artifacterrors無しに選択された、実質的な治療ターゲットである。cmiR-206の抑制剤として本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miRNAをターゲットとした神経変性疾患治療において最初に成果を挙げたことを示唆する。d本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、miR-206の機能を抑制し、BDNF及びIGF-1のレベルを大きく増加させ、シナプス再生を増加させ、その結果、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療する。以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。実験材料及び実験方法ADアルツハイマー疾患モデル本実験は、AAALACAssociationfortheAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareInternational、国際実験動物管理公認協会により認可されたソウル大学病院のIACUCInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeの許可を得て実施した。スウェーデン二重変異スウェーデン変異;Lys670→Asn、Met671→Leuを含むヒトアミロイド前駆体タンパク質の695アミノ酸イソフォームをプリオンプロモーターの調節下で発現するTg2576マウスTaconic、Hudson、NY、USAHsiaoetal.、1996をAD形質転換モデルとして利用した。形質転換及び野生型マウスを、独立したケージ及び室温25°Cで飲水に自由に摂取できるようにしながら12時間の明暗サイクル条件下で維持し、7ヶ月齢又は12ヶ月齢でmiRNA分析に利用した。miRNAマイクロアレイマウス又はヒト用miRNAマイクロアレイキットを使用して行ったAgilentmiRNAMicroarray8×15Kkits、Agilent、SantaClara、CA。マウス脳から抽出したRNAを二匹分ずつ一つに集めた。冷凍されたヒト側頭皮質temporalcortexサンプルは、ボストン大学アルツハイマー病センターBostonUniversityAlzheimer’sDiseaseCenter、Boston、MAの脳バンクから得た。本発明者らは、マウスサンプルを下記のRNAクオリティー基準に適したものを利用した:260/280比率>1.8、260/230比率>2.0、28S/18SrRNA比率>1.6、及びRNA完全性数RNAintegritynumber>8.0。ヒト剖検サンプルは、RNAの死後分解post-mortemdegradationを経るため、アルツハイマーとコントロールサンプルは、死後の期間を合わせた。Real-TimePCRmiRNAのReal-timePCRは、miRNA検出キットmirVanaqRT-PCRmiRNADetectionKit及びプライマーセットAppliedBiosystems、FosterCity、CAを利用して行った。内在性snoRNA202検出キットendogenoussnoRNA202detectionkit、Ambion-AppliedBiosystemsを使用してレベルを測定し、miRNAレベルの規準化に使用した。miRNAを、35サイクルで増幅した後、1.0アガーロスゲル電気泳動で可視化した。BDNFmRNA発現のためのReal-timePCRは、遺伝子発現キットTaqMangeneexpressionassay、AppliedBiosystemsのプライマー及びプローブを使用して行った。miRNAのinsituハイブリダイゼーションロックド核酸LNAsを利用して、miRNAのinsituにおける発現を分析した。前記LNAsは、miRNA検出に必要な短いプローブに対してハイブリッド形成温度を大きく増加させ、強化された厳密条件stringencyが利用されるようにするバイ-サイクリックRNA類似体であるObernostereretal.、2007。miRNA検出に利用されるLNAプローブは、Exiqonで購入し、DIG30endラベリングキットRocheを利用して凍結切片化組織をラベリングしたObernostereretal.、2007。miRNAのターゲット遺伝子予測miRNA成熟配列データベースをmiRBasehttp://www.mirbase.orgから得た。マウス遺伝子3’-非解読部位UTRにあるmiRNAターゲット候補位置を見つけるために、3種のターゲット予測プログラムを利用した:TargetScanhttp://www.targetscan.orgLewis、2005;PicTarhttp://pictar.mdc-berlin.de/Krek、2005、及びmicroThttp://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/Kiriakidou、2004。アルツハイマーマウスのアンタゴミアantagomir処理マウスに1ケタミンketamine、30mg/kg及びキシラジンヒドロクロライド4mg/kgを腹腔注射してマウスを麻酔した。30ゲージハミルトン注射器を使用して、0.5nmolのアンタゴミアAM2062’-O-methylated-5’-ccacacacuuccuuacauucca-3’又はスクランブル配列対照アンタゴミア2’-O-methylated-5’-aaggcaagcugacccugaaguu-3’Bioneer、Daejon、SouthKoreaを含む1μLのPBSphosphate-bufferedsalineを、下記の座標で第三脳室に5分間注入した:ブレグマbregmaから前後方向antero-posterior、-1.06mm;左右方向medio-lateral、0.00mm;背腹方向dorso-ventral、-2.4mm。注射針を、注入後さらに5分間座標に維持した後、穏やかに除去した。AM206の拡散を可視化するために、マウスに、AM206の代わりにCy3ラベルされたAM206Cy3-2’-O-methylated-5’-ccacacacuuccuuacauucca-3’、Bioneerを注入した。AM206の鼻腔投与のために、マウスを麻酔して、仰臥位で頭部を直立姿勢uprightpositionにした。AM206又はCy3ラベルされたAM2065nmolを含む0.1v/vジエチルピロカーボネートで処理された蒸留水24μLを2分毎に各外鼻孔にピペットで4μLずつ落として投与した計6分画fractions。コントロールTg2576マウスは、週齢を合わせて同量のビヒクルvehicleで処理した。文脈的及び手がかり的恐怖条件付けContextualandcuedfearconditioning恐怖条件付けは、従来方法Jeonetal.、2008にしたがって、恐怖条件付けショックチャンバシステムCoulbournInstruments、Whitehall、PA、米国で実施した。条件付けのために、マウスを恐怖条件付け装置チャンバに5分間置いた後、28-sアコースティック条件付け刺激を与えた後、非条件付け刺激として床グリッドに2秒間0.7mAショックを印加した。前記過程を60秒間隔で3回繰り返した。文脈的記憶を評価するために、条件付け24時間後、マウスをアコースティック刺激無しに訓練装置に再び移した後、萎縮行動を5分間観察した。手がかり記憶を評価するために、条件付け24時間後、異なる匂い、床及び視覚を有するチャンバにマウスを移して、その行動を5分間モニタリングした。前記試験の最終3分間、動物をアコースティック刺激に露出させた。呼吸運動を除いた運動の欠如を示すクラウチング位置で定義される萎縮行動の長さを測定し、恐怖反応を定量化したJeonetal.、2008。Y迷路試験Y-迷路試験を従来の方法に従って行ったSarteretal.、1988。迷路を黒色プラスチックで、それぞれのアームを長さ35cm、高さ15cm、幅5cmとして製作して、同一な角度に配置した。マウスの一つのアームの末端に配置して、迷路を通って5分間自由に移動するようにした。アーム進入のシリーズを視覚的に記録し、マウスの踵がアーム内に完全に位置した場合を、アーム進入に成功したと評価した。交差回数Alternationは、オーバーラッピングトリプレットセットの三つのアームへの連続的な進入で定義した。交差回数は、実際:可能性actualtopossibleの比で計算した。ウェスタンブロッティング麻酔されたマウスを断頭で屠殺し、脳を直ちに摘出した。各脳のホモジネートに対して、従来の方法によって、ウェスタンブロッティングのために処理しLeeetal.、2009、この場合、BDNFbrain-derivedneurotrophicfactor、Abcam、IGF-1insulin-likegrowthfactor-1、Abcam、Notch3Abcam、MEOX2Abcam又はβ-アクチンSantaCruzBiotechnologyに対する抗体を利用した。増強化学発光試薬Pierce、Rockford、IL、USAでブロットを現像し、デジタル的にスキャニングしたGS-700;Bio-Rad、Hercules、CA、米国。それぞれのバンドのβ-アクチンに対する相対的光学密度を、MolecularAnalystTMソフトウェアBio-Radを利用して測定した。脳ホモジネートにおいてAβ40及びAβ42のレベルは、AβUltrasensitiveELISAキットInvitrogenを利用して測定した。Tg2576マウスの組織学分析マウスを麻酔して、心臓に10mLの冷たい塩水及び10mLの4パラホルムアルデヒドを含む0.1MPBSを灌流させた。20μm厚の切片を4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ハリエニシダUlexeuropaeusIレクチンVectorLaboratories、Burlingame、CA又はMAP2microtubule-associatedprotein2、Chemicon-Millipore、Billerica、MA、GFAPglialfibrillaryacidicprotein、SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CA、シナプトフィシン又はダブルコルチンAbcam、Cambridge、MAに対する抗体で染色した。海馬に対するシナプトフィシン染色の光学的密度を求めるために、各マウスから三つの連続した冠状面組織切片500μm間隔、ブレグマから前後方向に約-1.5mmから-2.5mmを、Image-JNationalInstitutesofHealth、Bethesda、MDを使用して分析した。値は、コントロールTg2576マウスとの相対値で示した。隣り合う三つの海馬セクション500μm間隔において、歯状回の顆粒下層でダブルコルチン免疫反応細胞の数を測定して、歯状回の長さ1200μmにより規準化した。二重ルシフェラーゼ試験Dualluciferaseassay可能なターゲット遺伝子の3’-UTR位置に対するオリゴヌクレオチドを、5’-末端及び3’-末端にSacI及びXbaIの制限酵素サイトを含めてデザインした。その後、pmirGLO二重ルシフェラーゼmiRNAターゲット発現ベクターPromega、Madison、WIでサブクローニングした。BDNFの全体3’-UTRシーケンスSwitchDB、MenloPark、CAを有するトランスフェクション用のルシフェラーゼレポーターコンストラクションを用いた。24ウェルプレートにHeLa細胞ウェル当たり5×104細胞を撒いて24時間培養後、細胞を30pmolのmiRNA-206二重鎖又はスクランブルされたmiRNA二重鎖;Bioneer、Daejon、SouthKorea及び50ngのルシフェラーゼ発現ベクターでリポフェクタミンLipofectamine2000、Invitrogen、Carlsbad、CAを利用してトランスフェクションした。ホタルFirefly及びウミシイタケRenillaルシフェラーゼ活性は、48時間後、二重ルシフェラーゼレポーター1000アッセイシステムPromegaを使用して評価し、規準化した値ホタルルシフェラーゼ活性/ウミシイタケルシフェラーゼ活性を分析のために用いた。樹状突起スパインdendriticspine密度の分析E17C57BL/6マウス胚芽からプライマリー海馬ニューロンを培養した。ニューロンを、ポリリジンコートされたカバースリップ上で、星状細胞フィーダー層上に懸濁することで培養し、N2培地Invitrogen中で維持した。Aβオリゴマーを作製するために、5mMAβ42ペプチド又はスクランブルAβペプチドMilliporeを含むDMSOdimethylsulfoxideを、冷たい培養培地を用いて100μMに希釈した後、10分間超音波処理して、4°Cで24時間放置した。培養3週後、ニューロンを5μMAβオリゴマーで処理した。これと同時に、培養培地に500nMのAM206又はスクランブルアンタゴミアを加えた。48時間後、ニューロンを40分間4パラホルムアルデヒドで固定し、ローダミンラベルされたファロイジンInvitrogenで染色して、共焦点顕微鏡LSM510MetaConfocalmicroscope、CarlZeissで樹状突起スパインを観察した。各グループで30個の細胞から無作為に選別された100個の樹状突起セグメントにおけるスパインの数をカウントした。密度は、10μmの樹状突起長さに対して算出した。データ分析及び統計miRNA発現のためのヒートマップHeatmapsをZ-スコアを利用して製作した。二つのグループ間の比較のためにMann-WhitneyUテストを用い、三つ以上のグループ間の比較のためにKruskall-Wallis変化分析を用いた。また、死後グループ間の比較のために、Mann-WhitneyUテストを用いた。全ての統計的分析は、SPSSversion17.0、SPSSInc.、Somers、NYを用いて行った。0.05未満の両側検定p値が統計的に有意であることを示す。実験結果アルツハイマーモデルにおけるmiR-206の上方調節アルツハイマーモデルにおいて変化したmiRNAの一つがBDNFの調節に重要なmiRNAであるという仮説に基づいて、本発明者らは、まずマイクロアレイを利用し、7月齢及び12月齢の野生型WT及びアルツハイマーの形質転換モデルのTg2576マウス間のmiRNAを比較した図1a。Tg2576マウスにおいて、7月齢では増加したAβ42発現を示し、12月齢では記憶に障害があることが確認された。7月齢及び12月齢マウスにおいて最も上方調節されたmiRNAは、miR-206であることを確認した。Real-timePCRにより12月齢Tg2676マウスでmiR-206の上方調節が確認された図1b。insituハイブリダイゼーションも、12月齢Tg2576マウスの脳でmiR-206の拡散した発現が増加することを示した図1c。これと同様に、real-timePCRは、Neuro-2aマウスの神経芽細胞腫細胞においてAβ42がmiR-206のレベルを増加させるが、HUVEChumanumbilicalveinendothelialcellsではそうではないことを示した図1d。このような知見がヒトアルツハイマー疾病に関連があるかどうかを評価するため、アルツハイマー患者BraakstageV、clinicaldementiarating[CDR]3及びほぼ同じ年齢と性別の四人の非アルツハイマーコントロール群BraakstageI、CDR0からのヒト上側頭皮質superiortemporalcortexサンプルでmiR-206のレベルを測定した。我々の脳バンクにおいて、略3時間~3.5時間の死後期間は、剖検でヒト脳組織を得る最も短い実際的な時間である。ヒト剖試料は、RNAの死後分解を経るため、28S/18SrRNA比率及びRNAintegritynumberは、マウスの場合、死後2時間後に減少する。アルツハイマー及びコントロールサンプルは、死後間隔を揃えて比較されて、このような条件でreal-timePCRを通じて、アルツハイマー脳においてmiR-206が上方調節されたことを確認した図1e。ADモデルにおけるアンタゴミア-206の治療学的応用アルツハイマーモデルにおけるmiR-206の持続的な上方調節は、これを利用したターゲット遺伝子探索を可能にし、実際、TargetScan、PicTar及びmicroTは、マウス及びヒト3’-UTRs部位でBDNFをコーディングする三つの推定miRNA-206のターゲットを発見した図2a。本発明者らは、Tg2576マウスの月齢によってmiR-206のレベル増加及びBDNFのタンパク質レベルが減少することを見出し、これを裏付けた。さらに試験するために、マウスBDNFmRNAの推定結合部位BDNF1、2、3及びBDNFmRNAの3’-UTRを含む、ターゲットとなり得る位置を有するmiR-206及びルシフェラーゼベクターでHeLa細胞をトランスフェクションさせた。BDNFmRNAの全3’-UTR及びBDNF3を有するベクターを含む細胞において、miR-206のトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性を減少させ、このことは、miR-206が3’-UTRへの結合を介して直接的にBDNFmRNAの翻訳を抑制することを示す図2b。また本発明者らは、miR-206を中和するアンタゴミアAM206でコトランスフェクションしたNeuro-2a細胞及びHUVECにおいて、BDNFのタンパク質レベルが減少するということを見出した図2c。Neuro-2a細胞においてAβオリゴマーの処理は、miR-206を増加させ、BDNFmRNAレベルの減少無しにBDNFタンパク質レベルを減少させ、このことは、BDNFの翻訳抑制を示す図2d。AβオリゴマーによるBDNFタンパク質レベルの減少は、細胞をAM206処理することにより回復した図2e。プライマリーマウス海馬ニューロンにおいてAβオリゴマーは、AM206処理を通じて回復された樹上突起の密度を減少させた図2f。このような結果は、miR-206によりBDNF発現が下方調節され得、したがって、アルツハイマーが進行する可能性を示唆する。インビボinvivoでmiR-206の機能を調べるために、Cy3ラベルされたAM206Cy3-AM206を12月齢Tg2576マウスの第三脳室に注入して、Cy3-AM206は、一日後、海馬及び周辺組織に拡散したことが観察された図2g。Ulex-レクチン陽性内皮細胞、GFAPglialfibrillaryacidicprotein陽性グリア細胞及びMAP2陽性神経細胞によりCy3-AM206が検出された図2h。実際、スクランブルアンタゴミアと比較し、AM206を脳室内に注入した12月齢Tg2576マウスは、1週後にBDNFの脳レベルが非常に増加した図2i。さらに、Tg2576マウスのAM206注入は、CREBcAMPresponseelementbindingを活性化させ、c-JNKJunN-terminalkinase及びGSK-3βglycogensynthasekinase3βを非活性化させた。これは、BDNFシグナリングが増加することを示す。アンタゴミア-206は、ADマウスにおいて記憶力及びシナプス再生を増加させた次いで、本発明者らは、BDNF増強の治療効果を、12ヶ月目の記憶テストの各1週前又は3週前にTg2576マウスの第三脳室にAM206を注入することによって確認することを探求した。文脈的恐怖条件付けテストにおいて、Tg2576コントロールマウスのためのフリージングタイムが野生型マウスに比べてさらに低く、このことは、Tg2576マウスの海馬記憶に障害があることを示す図3a。注入後、1週及び3週目のフリージングタイムは、両方ともコントロールTg2576マウスよりAM206処理したTg2576マウスの方がさらに高く、このことは、少なくとも3週間AM206が海馬記憶機能を増加させることを示す。扁桃体が重要な役割をする手がかり条件付け試験においては、グループ間に差はなかった図3b。Y-迷路テストにおいて、注入1週後にAM206で処理されたTg2576マウスは、Tg2576コントロールマウスよりさらに良好な行動を示した図3c。その反面、AM206は、皮質又は海馬の全体プラーク面積には何の影響もないことを、チオフラビンS染色により確認し、またAβ40又はAβ42の脳レベルには影響を及ぼさないことを、ELISAで測定して確認した。したがって、AM206マウスによる記憶向上は、Aβレベルの変化によるものというより、メカニズムによるものであることが分かる。AM206がBDNF発現を増加させるため、海馬シナプトフィシンレベル及びダブルコルチン陽性細胞の数への影響を測定した。Tg2576コントロールマウスでは、野生型マウスに比べシナプトフィシンレベルが低かった図3d。テスト1週前又は3週前のTg2576マウスへのAM206注入は、Tg2576コントロールマウスと比較し、シナプトフィシン発現を増加させ、このことは、シナプス密度を増加させることを示す。さらに、Tg2576コントロールマウスにおいて、海馬歯状回においてダブルコルチン陽性細胞が野生型マウスより少数であるにもかかわらず、染色1週前又は3週前にAM206を注入したマウスは、Tg2576コントロールマウスよりさらに多いダブルコルチン陽性細胞を示した図3e。このことは、海馬の神経発生が増加することを示す。アンタゴミアの鼻腔投与効果治療上の鼻腔投与は、嗅覚神経経路に沿って鼻腔から血液脳関門blood-brainbarrierを介して直接的に脳に伝達することにより、薬物を迅速に脳にアクセスさせることが容易であるため、薬物伝達方法のうち、この便利な非侵襲性方法は、アルツハイマー患者に効果的である。本発明者らは、アンタゴミアが同様にこのルートを経由して伝達されるかどうかを評価した。実際に、鼻腔伝達されたCy3ラベルAM206は、24時間後、マウスの嗅球、皮質及び海馬から検出された図4a。多数のMAP2陽性神経細胞、Ulex-レクチン陽性内皮細胞及び少数のGFAP陽性グリア細胞がCy3-AM206でラベルされた。鼻腔投与されたAM206は、ビヒクル投与から1週後のTg2576マウスと比較して、BDNFの脳レベルを増加させた図4b。さらに、1週後のY-迷路テスト図4e及び恐怖条件付けテスト図4c及び4dによる測定結果によると、AM206の鼻腔伝達は、マウスの記憶能力を増加させた。これらの結果は、鼻腔を介したアンタゴミアの脳への伝達が実現可能であることを示す。考察アルツハイマー疾患におけるmiRNAの役割及び変化についての以前の研究では、BACE1/β-セクレターゼの発現又はNF-κB誘導炎症を調節するmiR-29a/b-1、miR-107、miR-146a、miR-298及びmiR-328などの多様なmiRNAを同定した。miR-206は、通常、筋肉組織で発現し、筋形成及び神経筋接合部の再生に関与する。miR-206のレベルは、正常の脳では非常に低いが、アルツハイマーでは異常に高く発現する。実験的に、脳におけるmiR-206の上方調節は、脳虚血及び神経毒性への露出後に観察される。ヒト場合、筋萎縮性側索硬化症患者の前頭皮質でmiR-206発現が増加し、統合失調症患者では、miR-206の遺伝的変異が観察された。さらに、本発明の結果は、miR-206がBDNFレベルを抑制することにより、アルツハイマーの発病にも関与するということを示す。したがって、本発明は、アルツハイマーの治療にmiR-206調節因子を利用してアプローチしなければならない明白な理由を提供する。アルツハイマーモデルにおいて、レンチウイルスベクターを介するか、タンパク質注入ポンプ又は神経幹細胞を利用する場合、BDNFを大脳に伝達することができ、記憶能力及びシナプス密度を向上させる。しかし、神経栄養因子を脳に伝達することは、侵襲的な施術が必要であり、中和抗体の発生により、苦痛を受けるようになる。本発明は、AM206の鼻腔伝達が脳内BDNFを向上させるための実現可能な代替方法であることを示し、アンタゴミアを利用した同様のアプローチを通じて、他の脳疾患にも応用可能性を提示する。-参考資料-BoissonneaultV,PlanteI,RivestS,ProvostP.MicroRNA-298andmicroRNA-328regulateexpressionofmousebeta-amyloidprecursorprotein-convertingenzyme1.JBiolChem.2009;284:1971-81.BonauerA,CarmonaG,IwasakiM,MioneM,KoyanagiM,FischerA,BurchfieldJ,FoxH,DoebeleC,OhtaniK,ChavakisE,PotenteM,TjwaM,UrbichC,ZeiherAM,DimmelerS.MicroRNA-92acontrolsangiogenesisandfunctionalrecoveryofischemictissuesinmice.Science.2009;324:1710-3.BraakH,BraakE.EvolutionoftheneuropathologyofAlzheimer’sdisease.ActaNeurolScandSuppl.1996;165:3-12.BramhamCR,MessaoudiE.BDNFfunctioninadultsynapticplasticity:thesynapticconsolidationhypothesis.ProgNeurobiol.2005;76:99-125.CarroE,TrejoJL,Gomez-IslaT,LeRoithD,Torres-AlemanI.Seruminsulin-likegrowthfactorIregulatesbrainamyloid-betalevels.NatMed.2002;8:1390-7.CarroE,TrejoJL,SpuchC,BohlD,HeardJM,Torres-AlemanI.Blockadeoftheinsulin-likegrowthfactorIreceptorinthechoroidplexusoriginatesAlzheimer’s-likeneuropathologyinrodents:newcuesintothehumandiseaseNeurobiolAging.2006;27:1618-31.ChabriatH,JoutelA,DichgansM,Tournier-LasserveE,BousserMG.Cadasil.LancetNeurol.2009;8:643-53.CogswellJP,WardJ,TaylorIA,WatersM,ShiY,CannonB,KelnarK,KemppainenJ,BrownD,ChenC,PrinjhaR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