原核生物の細胞培養物からヘパリン結合タンパク質を回収するための方法であって、該原核生物の細胞培養物の周辺質から該ヘパリン結合タンパク質を単離する;カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離されたヘパリン結合タンパク質を変性させる;ヘパリン結合タンパク質の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤と硫酸化ポリ陰イオン剤を含む第二緩衝溶液中で、変性したヘパリン結合タンパク質をインキュベートする;そして、該再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、このとき硫酸化ポリ陰イオン剤とインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質の回収がおよそ2~5倍に増加する方法。前記ヘパリン結合タンパク質がヘパリン結合増殖因子である、請求項1に記載の方法。前記ヘパリン結合増殖因子が血管内皮細胞増殖因子である、請求項2に記載の方法。前記VEGFがVEGF165である、請求項3に記載の方法。前記硫酸化ポリ陰イオン剤がおよそ3000ダルトンから10000ダルトンの間である、請求項1に記載の方法。前記第二緩衝溶液がデキストラン硫酸を含む、請求項3に記載の方法。前記第二緩衝溶液が硫酸ナトリウムを含む、請求項3に記載の方法。前記第二緩衝溶液がヘパリンを含む、請求項3に記載の方法。前記デキストラン硫酸がおよそ8000から10000ダルトンの間である、請求項6に記載の方法。前記第一および第二の緩衝溶液がHEPPSpH8.0を含む、請求項3に記載の方法。さらに、前記第二緩衝溶液が還元剤を含む、請求項1に記載の方法。前記第二緩衝溶液の還元剤がシステインとDTTの組合せを含む、請求項11に記載の方法。さらに、前記第二緩衝溶液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。さらに、前記第二緩衝溶液がアルギニンおよび/またはリジンを含む、請求項1に記載の方法。前記の回収工程が、前記の再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体;陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させることを含む、請求項1に記載の方法。前記第一及び第二の疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチル、プロピル、オクチル及びアリルアガロース樹脂からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。前記第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がブチルアガロース支持体であり、前記第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体がフェニルアガロース支持体樹脂である、請求項15に記載の方法。前記回収工程が、前記の再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出することを含む、請求項1に記載の方法。原核生物の細胞培養物からヘパリン結合タンパク質を回収するための方法であって、該ヘパリン結合タンパク質を該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する;カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該ヘパリン結合タンパク質を変性させる;ヘパリン結合タンパク質の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤と硫酸化ポリ陰イオン剤を含む第二緩衝溶液中で、変性したヘパリン結合タンパク質をインキュベートし、このとき硫酸化ポリ陰イオン剤とインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質の回収がおよそ2~5倍に増加するものであり;そして、再び折り畳まれた該ヘパリン結合タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させるという工程を含んでなる方法。再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ支持体、第一疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、陽イオンクロマトグラフィ支持体、および第二疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させる工程を含んでなる、ヘパリン結合タンパク質を精製するための方法。原核生物の細胞培養物からヘパリン結合タンパク質を回収するための方法であって、該ヘパリン結合タンパク質を該原核生物の細胞培養物の周辺質から単離する;カオトロピック剤と還元剤を含む第一緩衝溶液中で単離した該ヘパリン結合タンパク質を変性させる;ヘパリン結合タンパク質の再折り畳みが生じる時間と条件で、カオトロピック剤と硫酸化ポリ陰イオン剤を含む第二緩衝溶液中で、変性したヘパリン結合タンパク質をインキュベートし、このとき硫酸化ポリ陰イオン剤とインキュベートしなかった場合と比べて再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質の回収がおよそ2~5倍に増加するものであり;そして、再び折り畳まれた該ヘパリン結合タンパク質を、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させるという工程を含んでなる方法。前記ポリ陰イオン剤が、およそ3000ダルトンから10000ダルトンの間である、請求項19又は21に記載の方法。再び折り畳まれたヘパリン結合タンパク質を、陽イオン交換支持体;疎水性相互作用クロマトグラフィ支持体、およびイオン交換クロマトグラフィ支持体に順次接触させ、選択的に各支持体から該ヘパリン結合タンパク質を溶出させる工程を含んでなる、ヘパリン結合タンパク質を精製するための方法。実施例I:大腸菌において発現した組み換えヒトVEGF組み換えヒトVEGFを大腸菌において発現させた。合成の間、タンパク質は細胞膜周辺腔に分泌され、屈折小体として蓄積された。したがって、タンパク質の抽出および再折り畳みを達成するために研究を行った。これらの研究により、ポリ陰イオン剤を付加することなく標準的な回収技術を用いて少なくとも3種のVEGFが単離されたことが明らかとなった。天然のVEGFを用いた研究により、ヘパリン添加がカオトロプ及びチオール誘導性の変性剤に対する耐性を増すことが示された。さらに、ヘパリンは、小規模再折り畳み実験において適切に再折り畳みされたVEGFの量を有意に増やした。この結果を大規模な方法に応用するために、ヘパリンに構造上類似する分子であるデキストラン硫酸の存在下においてVEGFの再折り畳みを可能にした条件を探した。デキストラン硫酸の添加により、適切に折り畳まれた生物学的に活性なVEGFの収率がコントロールと比べて3~5倍に増加した。方法VEGF165発現のためのプラスミド-プラスミドpVEGF171は大腸菌周辺質におけるヒトVEGF165の発現のために設定したScience24613061309を参照。VEGFコード配列の転写は、アルカリホスファターゼプロモーターの厳格なコントロール下にあのに対してNucleicAcidsResearch956718を参照、翻訳開始に必要な配列はシャインダルガーノ領域にあるNucleicAcidsResearch9664768を参照。VEGFコード配列は、その後の大腸菌周辺質への分泌のために細菌性耐熱性毒素IIシグナル配列の下流に融合したInfectImmun422648;及びPicken等InfectImmun4226975を参照。STIIシグナル配列のコドン修飾により翻訳レベルが調節され、その結果、周辺質におけるVEGFが最適レベルに集積したNatureBiotechnoloy1462934を参照。転写終結区に対するラムダNucleicAcidsResearch153185を参照はVEGF翻訳終止コドンの下流に位置した。複製起点と、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子は、プラスミドpBR322から得た。例えば、Bolivar等Gene295113を参照。細胞均質化と屈折小体の調製-回収した大腸菌細胞を凍結し、-70°Cに保存した。細胞は、BTUX遠心にて回収し、BEPEXに凍結保存した。細胞は、5容量の50mMHEPES/150mMNaCl/5mMEDTApH7.5に懸濁し、モデル15M実験室ホモジナイザーGaulin15M又はM3にて均質化した。次いで、細胞懸濁液を等量の同じバッファにて希釈し、BTPX205の連続速度遠心にて遠心分離して屈折小体を回収した。中間生成物スケール遠心機はSA1を使用した。あるいは、細胞を均質にし、BEPEXに凍結して再水和することなく直接ペレットを回収することもできる。実施例II:大腸菌Iにおいて発現させた組み換えヒトVEGFの抽出及び再折り畳み方法抽出と再折り畳み-屈折性ペレットは、5Lのバッファ/kgペレットで、7M尿素/50mMHEPPS/pH8を含有する抽出バッファに懸濁した。次いで、固形ジチオトレイトールを、4mM終濃度となるように3.7g/kgペレットで加えた。例として、VEGFの抽出に対する尿素とDTTの効果についての図9を参照のこと。懸濁液は20°Cで1~2時間かけて完全に混合した。pHは、50水酸化ナトリウムにてpH8.0に調整してもよい。抽出バッファの容量当たり、19容量の再折り畳みバッファを加えて再折り畳みを生じさせた。再折り畳みバッファには、50mMHEPPS/1M-2M尿素/2-5mMシステイン/0.05-0.2TRITONTMX100/pH8、終濃度を含めた。例えば、再折り畳みの間に存在する尿素およびDTT濃度の効果についての図10を参照のこと。示すように、デキストラン硫酸、ヘパリン又は硫酸ナトリウムを加えた。再折り畳みインキュベーションは室温で4~24時間行った。場合によって、インキュベートは室温で最大およそ48時間行うことができる。折畳みは、SDSPAGEおよび/またはヘパリンHPLCにてモニターした。生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過の後に0.45μm濾過を行って浄化した。ヘパリン結合HPLCアッセイ-適切に再び折り畳まれたVEGFの質および量は、固定されたヘパリンを含有するカラムを使用して決定した。カラムPOROSHE2/Mは0.15M塩化ナトリウムを含有する10mMリン酸ナトリウム、pH7にて平衡化した。1ml/分又は2ml/分の流速で、カラムは、10分かけて、0.15~2M塩化ナトリウムを含む平衡バッファから直線濃度勾配を使用して溶出した。あるアッセイでは、16分で溶出した。溶出物を280nmでモニターした。一般的に、ほとんどのタンパク質は空隙容量で溶出し、3種のVEGFが同定されうる。最も高い親和性で、最も溶出が遅い種を適切に折り畳まれたVEGFとして同定し、その後ピーク3のVEGFと同定した。結果システインが媒介する変性からVEGFを保護するヘパリン-天然のVEGFに10mMシステインを加えると、適切に折り畳まれた分子が大きく減少した。この変性は、20mMほどのわずかな濃度の2つの異なる形態のヘパリンを加えると阻止された。表IaVEGF再折り畳みに対するヘパリンとデキストラン硫酸の効果表の値は、屈折性ペレット当たりのピーク3の形成されたVEGFの量である。各々の添加の濃度は示すとおりである。平均コントロール表IbVEGF再折り畳みに対する硫酸ナトリウムの効果表の値は、屈折性ペレット当たりのピーク3の形成されたVEGFの量である。硫酸ナトリウムの濃度は示すとおりである。表IIVEGF再折り畳みに対するヘパリンとデキストラン硫酸の効果表の値は、屈折性ペレット当たりのピーク3の形成されたVEGFの量である。まとめ再折り畳み収率を増加させるヘパリンおよびデキストラン硫酸-上記の変性に対する保護的特性のため、VEGFの再折り畳みに対する様々な異なる形態の硫酸化ポリマーの効果を調べた。表Iaに示すように、低分子量及び高分子量の形態のヘパリンは再び折り畳まれたVEGFの収率をおよそ3倍に増加した。表Ibに示すように、硫酸ナトリウムは再び折り畳まれたVEGFの収率をおよそ2倍に増加した。また、10Kd形態のデキストラン硫酸は再折り畳み収率の増加に有効であったが、調査した濃度の高い範囲では基質阻害が生じた。更なる研究により、5Kd、8Kd及び10Kdの形態のデキストラン硫酸はすべて、再折り畳みの際のVEGFの収率を有意に増加したことが示された。図7を参照。また図8も参照。実施例III:VEGFの回収に対する異なるバッファとTRITONTMX100の効果結果まとめ実施例I、II及びIIIのデータをまとめると、ヘパリン結合増殖因子であるVEGFが再び折り畳まれる際にヘパリン硫酸塩又はデキストラン硫酸のいずれかを含めると収率が有意に改善することと、回収条件が示唆される。この方法は工業規模で成功裏に実施された。この方法はヘパリンを結合する他の基本的な増殖因子および他のタンパク質の再折り畳みに応用することができると期待される。実施例IV:大腸菌IIにおいて発現される組み換えヒトVEGFの方法抽出と再折り畳み-屈折性ペレットを抽出バッファに懸濁した。この抽出バッファの終濃度は5Lのバッファ/kgペレットで7M尿素、2-30mMDTT、50mMHEPPS/pH7-9とした。懸濁液は室温で1~2時間かけて完全に混合した。抽出バッファの容量当たり、19容量の再折り畳みバッファを加えて再折り畳みを生じさせた。再折り畳みバッファは、終濃度として1M又は1.3M尿素、2-15mMシステイン、0.5mMDTT、0-0.75Mアルギニン、15mg/Lのデキストラン硫酸、50mMHEPPS、0.05TRITONTMX100/pH8を含有した。荷電アミノ酸の存在下における再折り畳みに対する効果について、例えば図12を参照のこと。ここでは、ヒスチジンの添加によりアミノ酸の付加がない場合と同じ効果が生じた。再折り畳みインキュベーションは室温で12~24時間行った。場合によって、インキュベートは室温で最大およそ48時間行うことができる。場合によって、再折り畳みの間に空気又は酸素を添加してもよい。折畳みは、SDSPAGEおよび/またはヘパリンHPLCにてモニターした。生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過の後に0.45μm濾過を行って浄化した。抽出および再折り畳みの工程の全体の希釈物は1100とした。抽出及び再折り畳みの工程の全体の希釈の、例えば1100へ、1200への増加により活性なVEGFの総量が増加したが、濃度は低い。図13を参照。再折り畳みの効率は、二量体/単量体の量を測定することによって決定することができ、このとき単量体は、C18逆相HPLCカラムで測定することができ、二量体形成は、ヘパリンカラムクロマトグラフィ又はSP5PW陽イオン交換クロマトグラフィアッセイで測定することができる。実施例V:大規模な再折り畳み最適化の再折り畳み条件の拡張性を試験するため、小規模、中規模及び試験的設備のスケールでの再折り畳みの動態を調べるために実験を行った。図4に示すように、大規模スケールの再折り畳みの動態はより小さいスケールと違いがなく、再び折り畳まれたVEGFの最終力価はわずかに増加した。これらのデータから、デキストラン硫酸による再折り畳みの拡張性が示された。さらに、生成物は、Cuno90SPフィルターによるデプス濾過の後に0.45μm濾過を行って浄化した。実施例VI:再折り畳み後のrhVEGFの精製IMacroPrepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ-再折り畳みの後、プール中の不溶性物質をデプス濾過によって除去した。次いで、浄化したプールを、50mMHEPPS/005TRITONTMX100/pH8で平衡化したセラミックヒドロキシアパタイトカラムに流した。非結合タンパク質は平衡バッファにて洗浄して除去し、50mMHEPPS/005TRITONTMX100/015Mリン酸ナトリウム/pH8の均一濃度工程を用いてVEGFを溶出した。流速は120cm/時とした。プールする分画を分画のヘパリンHPLC分析にて測定した。ブチルセファロースTM高速流量クロマトグラフィ-VEGFのプールを、50mMHEPPS/005TRITONTMX100/015Mリン酸ナトリウム/pH8で平衡化したブチルセファロースTM高速流量のカラムに流した。流速は100cm/時とした。カラムは平衡化バッファにて洗浄し、VEGFはカラム溶出物に集まった。分画を集め、タンパク質含有分画をプールし、A280nmを測定した。MacroPrepハイSクロマトグラフィ-ブチルセファロースTMプールを、50mMHEPES/pH8にて平衡化したMacroPrepハイSのカラムに流した。溶出物を洗浄した後、280nmの吸光度を規準とし、2カラム容量の50mMHEPES/025M塩化ナトリウム/pH8にて洗浄した。VEGFは、線形の、8カラム容量の0.25~0.75M塩化ナトリウムの濃度勾配を含む50mMHEPES/pH8を用いて溶出した。流速を75~200cm/時とした。分画を回収し、ヘパリン結合アッセイ、例えばヘパリンHPLCによって測定したように、適切に折り畳まれたVEGFを含むものをプールした。フェニル5PWTSKクロマトグラフィ-MacroPrepハイSプールは、等量の50mMHEPES/0.8Mクエン酸ナトリウム/pH7.5にて調整した。次いで、調整したプールを、50mMHEPES/04Mクエン酸ナトリウム/pH75にて平衡化したフェニル5PWTSKのカラムに流した。平衡バッファをカラムに通して非結合タンパク質を洗浄した後、10カラム容量の0.4-0Mクエン酸ナトリウム勾配を含む50mMHEPES、pH7.5を用いてVEGFを溶出した。SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画をアッセイし、十分な純度のVEGFを含有するものをプールした。限外濾過/ダイアフィルトレーション-プールしたVEGFを5kD再生セルロースメンブレン;UnitPellicon;FeedRate171L/分に限外濾過した。ポリソルベート20にてメンブレンを調整した。プールしたVEGFは、6g/Lの濃度で限外濾過した。試料は、5mMコハク酸ナトリウム/275mMトレハロース/pH5.0と7-14DVにてダイアフィルトレートした。最終製剤は、5mg/mlの濃度の、5mMコハク酸ナトリウム/275mMトレハロース/0.01ポリソルベート20/pH5.0であった。実施例VII:再折り畳み後のrhVEGFの精製II陽イオン交換液体クロマトグラフィ-再折り畳みの後、プール中の不溶性物質をデプス濾過によって除去することができる。再び折り畳まれたプールは、pH5.0-7.5、及び2~6.5mS/cmに調整する。一実施態様では、プールはpH6.5および5mS/cmに調整している。次いで、再び折り畳まれたプールは、スルホプロピル高度負荷カラムに流し、漸増塩濃度勾配により溶出した。プールした分画を、分画のヘパリンHPLC分析で測定することができる。疎水性相互作用カラム:VEGFのSPXL溶出プールを、フェニルTSKクロマトグラフィカラムに流すために、50mS/cmに調整してもよい。分画を集め、タンパク質含有分画をプールする。IEX又は混合モード:フェニルTSKプールを、イオン交換クロマトグラフィ又は混合モードクロマトグラフィのカラムに流してもよい。分画を集め、本明細書に記載のアッセイによって決定した適切に折り畳まれたVEGFを含むものをプールした。限外濾過/ダイアフィルトレーション-プールしたVEGFを5kD再生セルロースメンブレン;UnitPellicon;FeedRate171L/分に限外濾過してもよい。例えば、ポリソルベート20にてメンブレンを調整する。プールしたVEGFは、6g/Lの濃度で限外濾過する。試料は、5mMコハク酸ナトリウム/275mMトレハロース/pH5.0と7-14DVにてダイアフィルトレートする。本明細書に記載の方法及びプロセスでは、最終純度及び/又は活性は、ペプチドマッピング、ジスルフィドマッピング、SDSPAGE、円二色性、リムルスアメーバ様細胞可溶化液、ヘパリンクロマトグラフィ、ヘパリンHPLC、逆相HPLCクロマトグラフィ、ヘパリン結合、レセプター結合、SEC分析、細胞アッセイ、HUVEC作用強度アッセイ、VEGF抗体を用いたELISA、質量分析などによって評価することができる。本明細書に記載の寄託、実施例及び実施態様は例示的な目的のみであり、この見地の様々な修飾及び変更は当業者に示唆されており、本出願の精神及び権限と添付の特許請求の範囲内に包含されることは理解されるものである。本明細書において引用されるすべての刊行物、参考文献、特許および特許出願は、すべての目的のために出典明記によりその全体がここに援用される。