"下記を含む、組織または臓器から細胞を除去する方法:臓器または組織の脈管構造内に一つ以上の電極を挿入し;前記脈管構造を通じて灌流液で前記組織または臓器を機械的に灌流させ;及び標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造内に電場を与える。下記を含む組織または臓器から細胞を除去する方法:臓器または組織内に、臓器または組織上に、または臓器又は組織の近くに一つ以上の電極を置き;灌流液で前記組織または臓器を機械的に灌流させ;及び標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記組織または臓器内に電場を与える。電気化学療法ECT、電気遺伝子療法EGT、ナノ秒パルス電場nsPEF、高周波不可逆的電気穿孔H-FIRE、高周波アブレーション、または急性温熱療法から選択された療法である、請求項1または2に記載の方法。標的細胞の壊死を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造内にエネルギーを与えることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。第1電極が前記臓器の動脈内に挿入され、第2電極が前記臓器の静脈内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。第1電極が前記臓器の血管内に挿入され、第2電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。第1電極が前記臓器の血管内に挿入され、第2電極が前記臓器の流体管fluidduct内に挿入され、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。第1電極が前記臓器の血管内に挿入され、第2電極が前記臓器の他の血管内に挿入され、前記第1血管及び第2血管の間に前記臓器の治療領域が位置し、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。第1電極が前記臓器の血管内に挿入され、第2外部グラウンディングパッド、プレート電極または前記臓器外部の伝導性ゲルが第2電極として用いられ、電気穿孔が前記臓器の前記脈管構造を通じて前記電極間に与えられる、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の方法。機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、前記標的領域内で発生する疾患を治療するための治療的な遺伝子構成物の導入を可能とする、請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法。機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、全身疾患を治療するために細胞を交替するための治療的な遺伝子構成物の導入を可能とする、請求項10に記載の方法。機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、電気パルスが標的細胞の電気穿孔を生じるに十分な時間の間、十分な電力で前記脈管構造を通じて電場を誘導するために与えられることにより、前記標的領域内または全身疾患内の疾患を治療するために治療的な巨大分子の導入を可能とする、請求項10に記載の方法。機械的灌流下の臓器または生きている動物で実行され、前記脈管構造を通じて交差電場を与えることが、臓器の標的領域または全部の熱焼灼を生成する、請求項10に記載の方法。前記電気穿孔が、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を含むものである、請求項1乃至13のいずれか一項に記載の方法。機械的灌流、生理学的灌流、物理的、化学的または酵素的技術、またはこれらのいずれかの組合せにより前記組織または臓器から細胞破片を除去することをさらに含む、請求項1乃至14のいずれか一項に記載の方法。電気測定を通じて観察することにより、電気穿孔を感知し、観察することをさらに含む、請求項1乃至15のいずれか一項に記載の方法。前記組織の灌流の間、前記標的細胞に不可逆的電気穿孔を与えることにより、天然の組織源から標的細胞を除去することにより形成された組織スキャフォールド。前記電気穿孔が前記組織の脈管構造を通じて与えられるものである、請求項17に記載のスキャフォールド。天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含む、請求項17または18に記載のスキャフォールド。前記組織スキャフォールドが、約1~10cmの少なくとも一つの大きさの厚みを有するものである、請求項17乃至19のいずれか一項に記載のスキャフォールド。組織スキャフォールドを得るために、前記組織の灌流の間、前記標的細胞に不可逆的電気穿孔を与え、前記スキャフォールド内または前記スキャフォールド上に生存している細胞の成長を許容する条件下で前記細胞を前記スキャフォールドに再接種することにより、天然の組織源から前記標的細胞を除去することにより構築された、人工組織。前記電気穿孔が前記天然組織の脈管構造内に与えられるものである、請求項21に記載の人工組織。前記組織スキャフォールドが動物を由来とするものであり、前記生存している細胞がヒトを由来とするものである、請求項21または22に記載の人工組織のスキャフォールド。前記組織スキャフォールドが、天然の組織源の細胞外マトリックス及び血管構造を含むものである、請求項21乃至23のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。前記作製された組織スキャフォールドが、約5~10cmの少なくとも一つの大きさの厚みを有するものである、請求項21乃至24のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、消化管、膀胱、前立腺、卵巣、脳、耳、目または肌またはその一部である、請求項21乃至25のいずれか一項に記載の人工組織のスキャフォールド。下記を含む、組織または臓器の標的細胞を除去するための装置:前記組織または臓器脈管構造の動脈から静脈まで灌流液を輸送するに適した灌流システム;前記組織または臓器脈管構造の前記動脈及び前記静脈内に各々挿入されるに適した第1電極及び第2電極;及び前記第1電極及び第2電極間における標的細胞の電気穿孔を実行するに十分な時間の間、十分な電圧で灌流の間前記第1電極及び第2電極間に電圧を印加するために前記電極との疎通を作動させる電圧源。前記電気穿孔が、標的細胞の非熱的不可逆的電気穿孔を含むものである、請求項27に記載の装置。参考は、本発明の様々な例示的実施形態を詳細にするために現在作られるだろう。例示的実施形態の下記議論は、本発明を制限しようとする意図ではないことが理解されるだろう。むしろ、下記議論は、読者が本発明の明確な側面及び特徴をさらに詳細に理解するように提供される。本発明の実施形態によれば、生存可能な脱細胞化された組織スキャフォールドは、持続的な灌流下で臓器上に非熱的不可逆的電気穿孔non-thermalirreversibleelectroporation,N-TIREを用いることで達成できる。電気穿孔可逆及び/又は不可逆は、プレート電極または針電極を含む公知の技術を用いて、または、さらには臓器または組織の脈管構造を通じて電気的電荷を輸送することで組織及び器官に輸送され得る。さらに具体的には、電気穿孔は、多くの医学症状を治療するための療法として用いられ得る。非熱的IREを含む不可逆的電気穿孔は、ECM血管、及び神経を保存しながら組織内で電場を用いて望まない細胞を殺す方法である。細胞を横切って適用されたとき、ある電場は、電気穿孔と命名される過程を通じて細胞膜を脱細胞化させる能力を有する。電場が細胞は生存させて細胞膜を一時的に透過するとき、前記工程は不可逆的電気穿孔であると知られた。可逆的電気穿孔は、生命工学及び医学で重要な道具となってきた。他の電場は、細胞膜が透過された後、細胞が死ぬことを引き起こすことがある。このような壊死工程は不可逆的電気穿孔として知られた。非熱的不可逆的電気穿孔は、望まない組織、例えば、腫瘍組織を除去する新規で最小限に侵襲的な手術技術である。前記技術は、適用しやすく、観察して調節でき、局所血流により影響を受けず、アジュバント薬物を必要としない。最小限に侵襲的な過程は、細胞死亡を促進する細胞膜での構造的変化を引き起こす短く集中的な一連のパルスを輸送するために標的領域内にまたは周囲に針状電極を位置させることを含む。前記電圧は、主要血管及びECMをかなり損なう相当なジュールJoule加熱を誘導せず組織を電気穿孔させるために適用される。特定組織型及びパルス条件の設定において、不可逆的に電気穿孔された容積を決定するための一次パラメータは、組織内における電場分布である。最近、IRE動物実験は、細胞外マトリックス、主要血管、及びミエリン鞘のような主要構造の保存、瘢痕非形成だけでなく、有益な免疫反応の促進のような非熱的細胞除去の特定モードからもたらされた有益な多くの効果が証明された。電気穿孔は、恐らく脂質二重層のナノ規模ポアの形成を通じて、細胞の透過度の増加を導くパルス電場が適用される非線形生物理学的工程である。Weaver,J.C,Electroporationofbiologicalmembranesfrommulticellulartonanoscales,IEEETrns.Dielectr.Electr.Insul.10,754-7682003.前記パルスの長さ及び強度がある基準を超えなければ、このような透過度は可逆的であり、細胞の健康及び機能は維持される。決定的な電場強度閾値を超えるとパルスパラメータの通常のセッティングでおよそ500~700V/cm、細胞膜は回復が不可能であり、細胞死が生じることとなる。Garcia,P.etal.Intracranialnonthermalirreversibleelectroporation:invivoanalysis.JMembrBiol236,127-1362010;Sel,D.etal.Sequentialfiniteelementmodeloftissueelectropermeabilization.IeeeTransactionsonBiomedicalEngineering52,816-827,doi:10.1109/tbme.2005.8452122005;andLee,E.W.etal.AdvancedHepaticAblationTechniqueforCreatingCompleteCellDeath:IrreversibleElectroporation.Radiology255,426-433,doi:10.1148/radiol.100903372010Lee2010を参照してほしい。サブミリメートル解像度を持つ正確で調節可能な方式で壊死を誘導する、細胞の膜を永久的に不安定にするパルスの適用Edd,J.F.,Horowitz,L.,Davalos,R.V.,Mir,L.M.Rubinsky,B.Invivoresultsofanewfocaltissueablationtechnique:Irreversibleelectroporation.IeeeTransactionsonBiomedicalEngineering53,1409-1415,doi:10.1109/tmbe.2006.8737452006は、非熱的不可逆電気穿孔non-thermalirreversibleelectroporation,N-TIREでも言及される工程であるDavalos,R.V.,Mir,L.M.Rubinsky,B.Tissueablationwithirreversibleelectroporation.AnnalsofBiomedicalEngineering33,223-231,doi:10.1007/s10439-005-8981-82005Davalos2005。前記技術は、熱メカニズムDavalos2005に依存せず、下にある細胞外マトリックスの構造を保存するものと見られる。研究は、神経導管及び胆管が除去領域内で損傷を受けないことを示す。Maor,E.,Ivorra,A.,Leor,J.Rubinsky,B.Theeffectofirreversibleelectroporationonbloodvessels.TechnologyinCancerResearchTreatment6,307-3122007。さらに、生体内の肝切開領域は、小血管で最小限の損傷及び最小限の脈管炎を示したLee2010。低温酸素化灌流hypothermicoxygenatedperfusion,HOPEは、生理学的な温度以下で全体臓器に酸素化された、栄養素が豊富な血液代替物を機械的に輸送する全体臓器保存方法である。Dutkowski,P.,deRougemont,O.Clavien,P.A.Machineperfusionfor‘Marginal’livergrafts.Am.J.Transplant.8,917-924,doi:10.1111/j.1600-6143.2008.02165.x2008;及びMonbaliu,D.Brassil,J.Machineperfusionoftheliver:past,presentandfuture.Curr.Opin.OrganTranspl.15,160-166,doi:10.1097/MOT.0b013e328337342b2010を参照してほしい。この方法は、72時間の保存時間に達するために行われた研究Yamamoto,N.etal.72-HourPreservationofPorcineLiverbyContinuousHypothermicPerfusionwithUWSolutioninComparisonwithSimpleColdStorage,JournalofSurgicalResearch51,288-2921991であり、温虚血warmischemiaを持って腎臓の保存質及び移植成功率を改善することが成功的に証明された{Olschewski,P.etal.Theinfluenceofstoragetemperatureduringmachineperfusiononpreservationqualityofmarginaldonorlivers.Cryobiology60,337-343,doi:10.1016/j.cryobiol.2010.03.0052010;及びStegemann,J.,Hirner,A.,Rauen,U.Minor,T.UseofaNewModifiedHTKSolutionforMachinePreservationofMarginalLiverGrafts.JournalofSurgicalResearch160,155-162,doi::10.1016/j.jss.2008.10.0212010参照}。Schonetal.及びBrockmannetal.は、灌流流体が生理学的な温度またはその近くで維持される正常温度の灌流を用いて臓器質を延ばす能力を証明した。Schon,M.R.etal.Livertransplantationafterorganpreservationwithnormothermicextracorporealperfusion.AnnalsofSurgery233,114-1232001;及びBrockmann,J.etal.NormothermicPerfusionANewParadigmforOrganPreservation.AnnalsofSurgery250,1-6,doi:10.1097/SLA.0b013e3181a63cl02009を参照してほしい。このような臓器保存方法は、死後postmortem組織の生体内及び自然分解で観察される免疫反応からN-TIRE組織除去効果を分離するのに用いられ得る。最近は、細胞外マトリックスを破壊せずに細胞を破壊するN-TIREの能力を活用してDavalos,R.V.IrreversibleElectroporationtoCreateTissueScaffolds.UnitedStatespatent2009;及びPhillips,M.,Maor,E.Rubinsky,B.Non-ThermalIrreversibleElectroporationforTissueDecellularization.J.Biomech.Eng,doi:10.1115/1.40018822010N-TIREを臓器脱細胞化によるスキャフォールド形成のための実行可能な手段にすることが変形実験室モデルの使用を通じて決定された。N-TIRE処理の結果は、臨床的に意味があり、組織工学に広く用いられ得る、多くのモデリング組織除去/脱細胞化を通じて予想され得る。Davalos,R.V.Rubinsky,B.Temperatureconsiderationsduringirreversibleelectroporation.InternationalJournalofHeatandMassTransfer51,5617-5622,doi:10.1016/j.ijheatmasstransfer.2008.04.0462008;Edd,J.F.Davalos,R.V.MathematicalModelingofirreversibleElectroporationfortreatmentplanning.TechnologyinCancerResearchTreatment6,275-2862007;及びNeal,R.E.,IIDavalos,R.V.,TheFeasibilityofIrreversibleElectroporationfortheTreatmentofBreastCancerandOtherHeterogeneousSystems.AnnalsofBiomedicalEngineering37,doi::10.1007/sl0439-009-9796-92009を参照してほしい。人工スキャフォールドはレシピエントの細胞で再接種され、機能的臓器構造をもたらす。このような臓器再生方法は、移植用臓器の供給不足を減少させるのに用いられるだろう。本発明の実施形態は、臓器の脈管構造を通じる不可逆的電気穿孔IREの輸送方法、システム及び装置に関するものである。生体外または生体内にこのような方法で投与されるIREは、血管化された臓器内に深く内在した腫瘍を治療するのに用いられ得る。本発明の実施形態の適用は、また、臓器を脱細胞化し、細胞外マトリックスを損なわずに細胞破片は除去された既存の組織からスキャフォールドを生成するために、組織及び臓器の脈管構造を通じてIREを用いることを含む。一般に、除去過程は、標的組織に一連の低エネルギー集中的であるが短い電気パルスを輸送することを含む。このようなパルスは、前記標的組織の細胞膜を回復できないくらい不安定にして、電場により影響を受ける細胞を殺す。前記治療は非熱的であり、本質的に前記標的組織の前記細胞膜にのみ影響を及ぼし、治療された組織内で神経または血管には影響を及ぼさない。本発明は、非熱的-不可逆的電気穿孔IREを用いて形成され得る脱細胞化されたスキャフォールドを提供する。前記臓器または組織は、医学分野において一般的な技術である前記過程中に及び/又は後に灌流され得る。スキャフォールドを製造した後、組織工学は、スキャフォールドへのヒト細胞の生体外接種及び付着を含むことができる。これまで、組織工学用に最も成功的なスキャフォールドは天然のものであり、大きな動物例えば、豚の臓器を化学的及び/又は機械的脱細胞化して作られた。本発明の実施形態は、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する方法を提供する。一般に、細胞及びその下のスキャフォールドを含む組織は、前記組織の細胞を殺すに十分な期間の間、電力の電場で生体内または生体外で処理され得る。前記電場は、前記臓器の前記脈管構造内に直接的に投与される。前記電場は、血管システムの壁により前記臓器の脈管構造を通じて誘導される。好ましくは、前記電気パルスは、下にあるスキャフォールド及び前記臓器または組織の脈管構造に崩壊を避ける方式で投与される。前記方法は、人工組織で用いるための組織スキャフォールドを製造するに適している。組織の源は制限されないが、例示的な実施形態において、前記組織は、豚、牛、馬、猿、または類人猿のような、相対的に大きな動物または重要な組織においてヒトと類似した解剖学構造を有するものと認知される動物に由来する。実施形態において、前記組織の源はヒトであり、これは、前記スキャフォールドに基づく人工組織の拒絶の可能性を減少させるための用途である。好ましい実施形態において、前記方法は、毛細管のような血管構造を損傷しない。実施形態において、前記方法は、前記電場で処理する前に、前記組織内に存在する神経管を損傷しない。本願において用いられたように、用語損なわれていないは、要素が相当な規模でその本来の機能を行えるようにする状態を意味する。それゆえ、例えば、損なわれていない毛細管は、血液を運搬可能な毛細管であり、損なわれていない神経管は、ニューロンを収容可能な神経管である。実施形態において、血管系及び神経系だけでなく胆管または乳管のような例を含む他の腺状構造の細胞は、損なわれずに残っている。このような実施形態において、前記細胞は、前記スキャフォールド及び人工組織の一部として残ることがあるか、または適切な処理技術またはスキャフォールド上に接種された細胞または前記人工組織を収容する身体の細胞により除去され得る。本発明の実施形態によれば、組織は、前記組織の細胞の壊死を引き起こすには時間及び電力で十分な、しかし、細胞が存在するスキャフォールドを有意に破壊するには不十分な電場に露出する。しかも、好ましい実施形態において、前記電場は、前記組織の加熱の結果として不可逆的組織損傷を発生させない。このような電場を提供する様々な方式が可能である。典型的な実施形態において、一つ以上の電気パルスが適用されて電気の結果として細胞膜破壊を発生させ、熱の結果としてはほとんど発生させない。二つ以上のパルスが用いられると、前記パルスは、他のものの中で、前記組織が冷却されるようにする時間の期間により分離されて、熱損傷が相当な規模で起こらないようにした。例えば、一つ以上の電気パルスは、約5マイクロ秒μsから約200秒の範囲の間、関連する組織に適用され得、パルスは、1~24時間の間の期間にわたってさらに低い繰返し率で適用され得る。便宜上、短期間の処理が望まれる。このように、好ましい実施形態において、約1~10000μsの期間の間、電気パルスが適用される。また、組織に輸送されるパルスの数に対する制限はないが、好ましい実施形態において、約1~約100個のパルスが前記組織に適用される。例えば、例示的な実施形態において、期間内にそれぞれ100μsの約10~1000個のパルスが細胞性の除去のために前記組織に適用される。しかる後、臓器は、細胞破片を除去するために灌流パラメータを調節することで脱細胞化スキャフォールドを形成するために処理され得る。細胞破片の機械的浄化は、前記破片の除去の所望の結果を達成するために必須なある程度の時間の間、例えば、4、12、24、48、または72時間の期間にわたって実行され得る。心臓収縮圧力、心臓拡張圧力、及び温度を含む灌流パラメータは、細胞破片の除去効率を改善するために調節され得る。また、細胞破片の除去を増加させるか促進させることが必須な場合、マイルドな洗浄剤が加えられ得る。好ましい実施形態は、99の細胞破片及びDNA構造の除去をもたらす灌流プロトコルを提供する。本発明の実施形態は、エネルギー量を変更して適用可逆及び不可逆的電気穿孔のいずれもすることは、一般細胞及び新生物細胞の選択的な除去を含む広範囲な好ましい組織除去効果を生成するために調節され得る方法を提供する。本発明によれば、エネルギー適用の前記効果は、例えば、下記を含む多数のパラメータを変更して調節され、調整され得る:エネルギーの電圧、アンペア数、期間及び周波数;エネルギー供給システムの設計及び位置調整;精巧で、精密に調節された血管灌流システムの設計及び使用;精巧で、精密に調節された血管灌流システムの生理学的模倣特性;生体外臓器及び組織の灌流及び保存条件;生体内臓器及び組織の灌流及び保存条件;及び/又は前記エネルギー適用システム及びプロトコルの拡張として部分的にまたは全体的に作用する血管内流体の組成。このような努力で、組織スキャフォールドの製造、または生体内または生体外腫瘍の治療、または疾患にかかったか他の方式で標的化された組織内での適した巨大分子の生体輸送の保障のために非熱的IREの使用で観察されるか調節され得る種々のパラメータがある。例えば、本発明の実施形態は、インスリン生成を刺激するI型糖尿病での膵島の遺伝子療法、即ち、非がん性疾患組織がある状況で用いられ得る。本発明は、また、所望の抗体を生成するために筋肉のような組織内に遺伝子を導入させ、即ち、療法のための導管として健康な組織を用いて、免疫調節にも適用され得る。特定適用のために変更され得るパラメータは、電圧勾配を含む。実施形態において、前記パルスは、約10volt/cm~約10,000volt/cmの範囲で電圧勾配を生成する。電圧勾配磁場は、組織サンプル、組織特性及びその他の因子に依存して変更される、電極及び電極幾何学の間の距離の関数である。いくつかの実施形態において、二つの電極が用いられ、この電極を約5mm~10cmの間隔で位置させた。典型的な電極直径は、0.25~1.5mmの範囲であり、通常、2個または4個の電極が用いられる。実施形態において、一つの双極電極が用いられる。また、前記電極は、絶縁される部分非伝導性被覆の使用を含む及び伝導性部分例えば、端部を含むことができ、電気電流の適した適用を保障し、前記組織の一部における過度な熱の生成を最小化することができる。適した電場及び露出期間は、腫瘍の除去のための医学治療に適したものとして文献で報告されたものである。例示的な露出パラメータは、次を含む:1Hzまたは4Hzの周波数での1.5kV/cmで90個の90マイクロ秒μsパルス;1Hzまたは4Hzの周波数での2.5kV/cmで80個の100μsパルス;400V/cmで1個の200ミリ秒パルス;1秒当たり10個のパルスの周波数で3800V/cmでの10個の100μsパルス;約1Hzまたは4Hzの周波数で1000~1667V/cmの範囲の90個の100μsパルス;及び1Hzまたは4Hzで1000~3000V/cmの範囲の80個の100μsのパルス。一般に、パルシングの前記周波数は、パルス幅の半分程度に低くてもよく、かなり遠い間隔であってもよい。前記組織に相当な熱損傷なしに電気穿孔を可能とする、ある適した周波数も許容可能である。電流は、DCまたはACのいずれかに適用され得る。実際に、特定の所望の結果を達成するために適用可能なこのようなパラメータを調整することは、本分野の技術に属する。ある数のパルス、例えば1~1000個のパルスが投与され得る。前記パルスは、1マイクロ秒~1秒のような、ある時間量の期間を有することができる。前記電圧は、所望の効果によって可逆または不可逆的電気穿孔を達成するためのある量となることができ、例えば500V/cm~5000V/cm、例えば1500V/cmを含むことができる。実際に、毛細管床でIREを達成するために、遥かに少ない電圧、例えば、約1V/cmから約1000V/cmまでの順序で要求され得る。前記電極の形態及び大きさは、本発明の実施において重要でない。本分野の当業者は、前記組織内に所望の電場を伝送するに適した如何なる形態及び大きさでも選択できる。例えば、前記電極は、プレート型、ワイヤ型、または針型であってもよく、円形、楕円形、四角形、矩形、ダイヤモンド形、六角形、八角形等の形態であってもよい。ワイヤ型電極において、前記電極が脈管構造を閉塞しないようにするために、ワイヤが挿入される脈管構造よりも小さい直径が好ましい。いくつかの設計及び兆候において、臓器または組織の循環の一部の分離を提供する閉塞装置の一部である電極の使用が好ましい。同様に、前記電極の表面領域は、本発明の実施において重要でない。それゆえ、例えば、前記表面領域は、約0.5cm2、約1cm2またはそれ以上であってもよい。臓器または組織の脈管構造に直接挿入される電極において、好ましくは、前記電極は、前記脈管構造内で適した距離の電極を提供するために十分な長さの長いワイヤ型電極である。前記ワイヤ型電極の直径は、また、好ましくは、前記電極と前記脈管構造の内壁との接触を避けるか最小化させ得るように、臓器脈管構造の様々な類型内に挿入するために調整され得る。いくつかの実施形態において、前記電極及び前記脈管構造の壁の間が少なくとも一部分離されている。ワイヤ型電極において、前記電極間の標的領域の境界boundsを越えて移動する結合されたエネルギー損失及び電流の電位を減少させるために前記標的領域の血管のアップストリーム及びダウンストリームを一時的に閉塞させることが可能である。生体内で実行されるこのような実施形態は、標的領域及びあるダウンストリーム領域に許容されない虚血効果を誘導しない時間期間内で前記パルスを輸送するだろう。さらに具体的には、このような技術は、前記標的臓器または組織の上下の前記血管をクランピングclampingして、前記血管の残りが電流を伝導しないようにする絶縁された血管壁を有するクランピングは、回路を開放するだろう。これは、細胞を殺すことを目的としない遺伝子または薬物輸送の適用にさらに適切で、前記組織の損傷なしにこれを行うことができる適したウィンドウが存在しなければならない。本発明のこのような方法は、例えば、プラークの除去に用いられ得、例えば、約10分間頸動脈を閉塞させて頸動脈からプラークを除去する。いくつかの状況において電場に組織を露出させると熱が発生する。熱による組織の損傷を避けるために、前記組織に移送されるエネルギーの量を単位時間当たり閾値水準未満にセッティングした。時間及び温度パラメータは、IREに対して本分野において公知になっており、如何なる適切な組合せも用いられ得る。例えば、前記組織の温度は、除去のための処理の間観察され得、電気パルスは、100°C以下、例えば、60°C以下、または体温に前記温度が維持されるように調節する。実施形態において、前記温度は、特定臓器または被検者に正常な生理学的温度に維持され得る。いくつかの実施形態において、前記温度は50°C以下に維持される。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記組織の生物細胞にわたって平均の不可逆的電気穿孔を得るために適用された電圧、パルスの長さ、及び/又はパルスの数を調節して、非標的組織での損傷を最小化する水準で前記組織内の前記生物細胞の不可逆的電気穿孔を達成することを含む。プロトコルは、電気電荷の投与を通じて同一または変更されたパラメータを含むことができる。同様に、いくつかの実施形態において、前記適用される電圧の期間は、確認された標的細胞の不可逆的電気穿孔を達成するために、電圧に対する電流の割合によって調節され、これによって、細胞膜が細胞死滅を引き起こす方式で崩壊される。さらなる例示パラメータを下記に記載した。実施例1-マルチフィジックスモデリング電気パルスの輸送のための経路として血管系を用いることの実現可能性を確立するために、予備マルチフィジックスモデリングが実施された。細胞膜における多孔可逆的または不可逆的の発達のための主要因子である電場分布は、有限要素法finiteelementmethodを用いてモデリングされた。3つの肝組織モデルが細部の異なるレベルで肝臓構造を示すように開発された。コムソルマルチフィジックスComsolMultiphysicsがラプラスの方程式に従い、電気電位Φを計算するために用いられた:ここで、σは、電気伝導度である。モデル1:先ず、前記組織の側面のうち一つに1cm直径のプレート電極を有する2cm厚さの均質構造を、前記肝臓をモデルとして形成した。このようなモデルを電場強度に対して実験的病変を関連させるために用いた。単一10マイクロ秒1500V/cmパルスを上部電極に輸送し、下部電極は接地された。図2に示されたように、このモデルの結果は、用いられた電気パラメータに対して、約400V/cmのシミュレーションされた電場強度が実験結果と同程度の幅の病変を生成するために要求されることを示した。モデル2:肝臓は、脈管構造、リンパ及び胆管の多くのセットが存在する複合的な器官である。肝臓の門静脈hepaticportalvein及び肝臓の動脈の分枝は、血液をろ過し、バクテリアを除去し、胆汁を生成するために構造的に機能する、基本機能単位である小葉に血液を輸送する。小葉を通じて輸送された血液は、結局、肝静脈内に流れて循環系に血液を戻す大きな中央細静脈に届く。灌流下において、灌流液は、前記脈管構造を通じて移送される流体として血液を代替する。しかし、胆汁の生産が24時間まで持続することが見出されたことが言及された。二つの異なる様相の電圧適用が用いられたとき、前記の複合的な脈管構造がどのように電場分布に影響を及ぼすかを理解するために秒second多重-規模モデルを製造した。第一の様相は、前記組織の外部に位置した典型的な電極を用い、第二の様相は、電圧源として中央細静脈を用い、接地として外部電極を用いた。小葉を、豚組織学と一致するように、5ミクロンの結合組織層及び200ミクロン直径の中央細静脈で囲まれた1mmの等価半径を持つ六角形のモデルに形成した。単一10マイクロ秒1500V/cmパルスで再び刺激した。前記組織内の前記電場分布は、外部電極が用いられたとき、前記小葉の上皮層により発生するさらなる不均質性に有意に変化しなかった。ほとんどの有意な変化は、さらに高い伝導性の中央細静脈に近接して現れた。各小葉の前記中央細静脈は1500Vで充電され、かなり異なった電場分布が形成された。不可逆的に電気穿孔されるに十分な電場に達した組織領域は、前記組織内にわずかにおよそ0.5cm広がった。電場適用のこのような様相は全体の脱細胞化に十分ではないが、高度に血管化された臓器の表面に近い腫瘍を治療するには効果的な手段となり得る。図3Aに示したモデルは、1500V上部または接地設定下部のいずれか一つで充電された外部電極を示すものであり、このような様相を用いる前記電場分布が添加された不均質性とともに有意に変化しないことを立証した。図3Bに示されたモデルは、1500Vで充電された各小葉の中央細静脈を示し、外部電極は接地された。図3A-Bに示したモデルは、流体が前記小葉を通じて門細動脈portalarterioles及び門細静脈portalvenulesから前記中央細静脈に容易に流れるので、完全に生理学的に精密でないことが言及された。モデル3:モデル3は、単一小葉の頂点に門細動脈、門細静脈、及び胆管を含む。中央静脈は、バルク肝組織により囲まれている。適用された10マイクロ秒パルスの規模は、バルク肝組織で見られる範囲で電場分布が発達するまで変更された。このようなシミュレーションからの結果を図4Aに示した。このようなシミュレーションからの結果は、単一小葉内で電場を誘導するIREの発達が、前記臓器の脈管構造を用いて可能なものであることを示す。さらに、50VパルスがIRE誘導水準に対して前記電場を増加させるに非常に十分であることが見出された。これは、電場が全体組織構造にわたって適用されたとき、IREを誘導するために必須な1500Vパルスよりもかなり少ない。前記中央静脈から門細動脈及び細静脈に接触する複合的な微細脈管構造ネットワークがあることが、図4B及び組織学的試料から見られる。.前記脈管構造の間に胆管に胆汁を分泌する肝細胞がある。モデル1及び2は、このような微細脈管構造ネットワークが電流の流れに対して相当な抵抗を示し、前記小葉の内部構造が不均質組織としてモデリングされ得ることを推定する。これは、赤血球生体内または上皮細胞が電場により損なわれた場合に、どこで血管閉塞が生じ得るかの適当な推定である。脈管構造及び微細脈管構造の抵抗Rの近似値は、関係式を解いて前記流体伝導度ρが知られた場合、容易に得られる:ここで、L及びAは、それぞれ前記血管の長さ及び前記血管の断面積である。表2で表される結果は、血管がリン酸塩緩衝溶液で満たされたとき、直径が10μm直径及び長さが100μmの血管は、抵抗が90kΩと同じくらい高くなり得る。非常に著しいが、この抵抗は、微細脈管構造を通じる電流の流れを防止するほど十分に高くはない。さらに、前記臓器のあらゆるところで平行に連結された多大な数の微細血管は、全体電気抵抗を急激に減少させるだろう。本発明の一実施形態は、前記臓器または組織の能動的な灌流activeperfusionの間にIREを投与することにより、スキャフォールドを調整することである。電極は、標的領域を通じて前記細胞の不可逆的または可逆的電気穿孔を発生させる電気パルスの適用を伴う前記組織の近傍内にまたは近くに位置できる。前記電気パルスを投与する一つの方式は、前記臓器自体の前記脈管構造を通じるものである。前記電極の位置は、処理される領域を規定する;それゆえ、前記治療される領域は、開始物質として用いられる全体組織または器官の単に一部分であってよい。前記電気パルスは、治療される細胞の膜を不可逆的にまたは可逆的に通過して不可逆的な場合細胞死滅を起こす。前記電気パルスの時間の長さ、適用された前記電圧、及び結果的に生成された膜透過性は、規定された範囲内で全て調節される。細胞死滅を引き起こす電気パルスの適用は、前記臓器、好ましくは、微細循環microcirculation及びマクロ循環macrocirculationに関連した臓器の脈管構造の一部または全部を依然として保護することができる。いくつかの実施形態において、微細循環構造は、部分的または全体的に損なわれ得るが、さらに大きい構造は維持された。本発明のinvitro及びexvivoの実施例において、細胞内物質を除去するための二次技術が用いられ得る。例えば、公知の全ての物理的、化学的または酵素的技術を、前記不可逆的に透過された細胞から細胞破片を除去するのに用いることができる。同様に、前記人工組織は、前記人工組織を通じて液状組成物例えば、洗浄剤含有液状組成物をポンピングできる人工灌流システムに付着され得、前記スキャフォールドから細胞破片を除去できる。このような二次処理が細胞破片の除去を可能とするが、前記スキャフォールディング構造血管及び神経構造を含むの残留も可能とする相対的に穏やかな条件下で適用され得ることが重要である。非熱的IREの使用は、このような穏やかな工程を可能とし、非熱的IREに依存しない工程に比べて、最終的に製造されるスキャフォールドを改善する。前記invitroの実施例の方法において、前記不可逆的透過された細胞から残っている前記破片は、insituで残っていることがあり、身体の自体循環及び免疫システムのような自然的な工程を通じて除去され得る。組織を脱細胞化させる不可逆的電気穿孔の概念は、本分野において用いられる他の形態の脱細胞化と異なる。不可逆的電気穿孔は細胞を死滅するために電気を用いるため、化学的及び物理的方法または浸透圧不均衡を用いる細胞溶解と異なる。不可逆的電気穿孔は、前記標的された組織内の細胞の細胞膜だけを破壊し、その下にある細胞外マトリックスECMには損傷を与えないため、より穏やかな方法である。逆に、化学的及び物理的方法は、ECM、血管、及び神経のような必須構造を損なうことがある。本願において記述されるタイプIREは、特定の手段、即ち、細胞膜の致命的な崩壊により細胞死滅を誘導するための有効手段として提供するために電気パルスを用いる。不可逆的電気穿孔は、前記ECMに実質的に影響を与えないか、影響を及ぼさない最小限に侵襲的な過程で組織を脱細胞化するのに用いられ得る。脱細胞化の非選択的モードは、組織工学分野において許容可能であり、浸透圧不均衡、冷却、または化学的脱細胞化を誘導するいくつかの方式は、超音波処理に相当するという結果を提供する。本発明の例示的な一実施形態は、前記臓器または組織の能動的な灌流activeperfusionの間、非常に正確に決定された長さのパルス及び電圧を適用することにより組織の細胞が不可逆的に電気穿孔される方法を含む。これは、熱損傷なしに不可逆細胞損傷を得るためにリアルタイムで電気的インピーダンスでの変化を測定及び/又は観察し、電気穿孔の開始で減少に注目し、リアルタイムで電流を調節して実施され得る。そのため、前記方法は、電気処理の効果を観察するためのコンピュータ装置及びセンサを含むことができる。電圧が適用される実施形態において、前記インピーダンスの観察は、使用者に多孔の存在及び欠如に対する情報を提供する。このような測定により、多孔形成の進展を示し、細胞の死滅を導く不可逆的多孔形成が発生したかが示される。他の実施形態は、組織中の細胞の電気穿孔の開始及び規模が、前記組織の電気インピーダンス本願においては、電流に対する電圧を意味するために用いられたでの変化に相互に関連し得る方法を提供する。与えられた地点で、前記電気穿孔が不可逆的となる。生物細胞のグループの耐性での減少は、前記細胞の膜が多孔形成により透過性となったときに生じる。組織中の生物細胞のインピーダンスを観察して、細胞の多孔形成が発生する平均的な時間だけでなく、前記多孔形成に起因した細胞膜透過性の相対的な程度を検出できる。与えられた組織内で電圧を段階的に増加させて細胞を試験することにより、不可逆的電気穿孔が生じる地点を決定できる。しかる後、このような情報を前記組織の前記細胞に不可逆的電気穿孔が経たことの確立に用いることができる。このような情報は、また、前記電圧の大きさの選択を決定することにより前記電気穿孔の工程を調節するために用いることができる。他のイメージ技術を、領域がどれだけ処理されたかを観察するために用いることができる例えば、超音波、MRI、CT等。本発明は、電気穿孔の実際発生の直接誘導及び多数の細胞で平均程度の電気穿孔の誘導を提供する多数の細胞に同時に起こる不可逆的電気穿孔を提供する。このような発見は、同様の理由から、生物組織隣接する膜を有する生物細胞の塊の不可逆的電気穿孔において同様に有用である。このような工程の利点は、電気穿孔の開始点に対する高水準の統制を含む。本発明の実施形態の一特性は、前記組織の電気穿孔の間、電流の大きさが電気穿孔の程度に依存するようになるにつれ電流及びパルス長さが所定の範囲に調節されて、細胞及び組織周囲の細胞損傷を最小化する前記組織の標的細胞の不可逆的電気穿孔を得ることである。本発明の実施形態の他の特性は、パルスの長さ及び電流が、細胞の死滅を引き起こす細胞内の電気調節よりもさらに高く、そして、周辺組織に熱的損傷をもたらし得るものよりも低いる範囲内で正確に調節されることである。本発明の実施形態の他の特性は、回路を通じて電流リアルタイムを測定することが、前記組織中の前記細胞が達成する電気穿孔の平均的な全体としての程度の測定値を与えることである。実施形態のまた他の特徴は、前記組織の正確な電気抵抗が、プローブ電極への交差時間の電圧測定及び電気穿孔の電極に付着された回路を用いた交差電流の測定から計算され得ることを含む;前記組織の正確な電気抵抗が、プローブ電極への交差時間の電圧測定及び電気穿孔の電極に付着された回路を用いた交差電流の測定から計算されることを含む;前記組織の電気測定は、前記組織の電気穿孔分布をマッピングするのに用いられ得る。不可逆的電気穿孔において、実際に不可逆的であることを立証するために、前記電気穿孔後に実質的な時間数分またはそれ以上で電流またはEITの測定を実行することが可能であるか、ひいては好ましい。前記方法の実施形態において、非熱的IREへの一次細胞破壊後に脱細胞化されたスキャフォールディングから細胞破片を除去することが好ましい。このような実施形態において、公知の全ての物理的、化学的、及び/又は酵素的方法を含む、このようにするための全ての公知技術が用いられ得る。例示的な一実施形態において、細胞物質の除去は、残っている無償の脈管構造を通じる一般的な拡散、移送またはこの両方の混合を用いて、適切な剤例えば、水、pH調節された水、一つ以上のキレート剤の水溶液等と共に組織スキャフォールディングの灌流を通じて少なくとも部分的になされ得る。invitroの方法において、前記スキャフォールドを殺菌することが好ましく、特に宿主内に移植するために処理された組織及び臓器を製造するためにスキャフォールドを用いる場合、殺菌することが好ましい。患者の拒絶リスク例えば、DNA断片に起因するを低下するために、脱細胞化後の殺菌及び/又は破片の除去が、移植物として用いられるスキャフォールドに対して一般的になされる。スキャフォールドがいくつかのタイプの殺菌を必要とするとき、スキャフォールドの殺菌のために、文献において公開された方法を用いることができる。invitroの方法において、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する前記方法は、その自然環境から単離された脱細胞化された組織スキャフォールドをもたらす。invivoの方法において、脱細胞化された組織スキャフォールドを製造する前記方法は、通常の細胞形質成分のない組織スキャフォールドをもたらす。そのため、本発明の側面において、前記人工組織のスキャフォールドが提供される。前記処理された組織スキャフォールドは、その自然環境から除去されたか/細胞形質成分が除去された天然のスキャフォールドを含む。本発明の前記人工組織のスキャフォールドは、その天然状態における前記組織内に存在する前記血管構造即ち、動脈、静脈、毛細管及び伝導性の構造即ち、導管の少なくとも一部、好ましくはほとんど、及びさらに好ましくは実質的に全部または全部を含む。実施形態において、前記組織スキャフォールドは、その天然状態において前記組織に存在する神経構造の少なくとも一部、好ましくはほとんど、及びさらに好ましくは実質的に全部または全部を含む。実施形態において、前記スキャフォールドは、このような血管構造及び/又はこのような神経構造を構成する前記細胞をさらに含む。好ましくは、前記人工組織のスキャフォールドは、前記スキャフォールドに自然的に存在する減少した数の前記細胞を含む。起源となる細胞のほとんど、さらに好ましくは、前記起源となる細胞の実質的に全部、及び最も好ましくは、前記起源となる細胞の全部は、前記人工スキャフォールドに見られない。実施形態において、残っている細胞は、血管または神経構造を含む細胞である。好ましい実施形態において、前記細胞からの一部、ほとんど、または全部の細胞破片は、前記人工組織のスキャフォールドに見られない。同様に、実施形態において、前記組織スキャフォールドは、前記組織中に元から存在するニューロンの一部または全体を含む。しかし、実施形態において、前記ニューロンは破壊されるが、前記ニューロンが存在する神経管は損なわれずに残っている。いくつかの実施形態において、前記人工スキャフォールドは、前記スキャフォールドに元から即ち、自然的に存在する細胞からの細胞破片を含む。前記議論されたように、このような実施形態において、前記細胞破片は、公知の手段を利用して除去され得る。あるいは、前記細胞破片の一部または全部が前記スキャフォールド内及び上に残ってもよい。細胞破片が前記スキャフォールド上に残っている実施形態において、前記スキャフォールド上に接種される新たな細胞の作用によって、及び/又は新たな細胞の接種、浸透、及び成長工程の間に後ほど除去され得る。例えば、新たな細胞が細胞破片を含むスキャフォールド上に接種されると、前記新たな細胞の浸透及び成長の活動のみで、または前記の新たな細胞の付与及び支持のための灌流手段との組合せで前記細胞破片の除去をもたらし得る。本発明は、前記スキャフォールド上及び内で細胞が成長するための栄養素及びガスを提供する機能を果たす血管構造を含む人工組織のスキャフォールドを提供する。前記人工スキャフォールドを生成するための非熱的IREの使用は、このような重要な構造の維持を許容し、医学、獣医学及び研究活動での使用のための改善されたスキャフォールドを提供する。そのため、本発明は、相対的に大きな寸法を有し得る人工スキャフォールドを提供する。即ち、独創的なスキャフォールド内で成長する再接種した細胞が栄養素及びガスを得るために外部表面に近接即ち、1mm以内する必要がないため、前記人工スキャフォールドは、本分野において既に公知のスキャフォールドよりもさらに厚いことがある。人工スキャフォールドは、脱細胞化をもたらすために十分な電場を生成する能力があることを唯一の制限として、どのような望ましい範囲の厚さをも有し得る。しかし、このような制限は、有意な物理学的制限ではなく、これは、IREに影響を及ぼす電極の位置が本発明の実行者の要求によって容易に調節され、調整されるためである。本発明の人工スキャフォールドは、これらが由来とする前記組織及び臓器の厚さに近接するか類似した厚さを有してもよい。例示的な厚さは、相対的に薄い即ち、1mm以下厚さから中間の厚さ即ち、約5mm~1cm及び相対的に厚い厚さ即ち、5cm以上、例えば、10~20cm以上の範囲である。本発明の前記方法による能動的な灌流activeperfusionの間、組織のIREから人工スキャフォールドを提供する実施例を下記に提供した。理想的にexvivoで実行されたIREが行われなければならないが、これは、前記組織がバイオリアクター内で灌流されるためである。バイオリアクター内の組織の灌流は文献に公開されており、前記文献に記載されたパラメータは、一般的に本文脈内で適用され得る。IREは、主要血管、結合組織、神経、及び周囲の組織に損傷を与えずに、前記標的領域で前記細胞を殺すことができるため、スキャフォールドを製造するために完全に適した細胞除去のための特定モードである。通常、穏やかな酵素または化学物質非イオン性洗浄剤、両性洗浄剤、キレート剤、酵素方法が、脱細胞化後のDNA断片の除去を可能とするために用いられ得るinvivoのIREにおいて、細胞の前記除去は、身体の自然なシステムにより達成され得る。バイオリアクター灌流システムでexvivoのIREを実行する一つのアプローチは、下記を含む:a新鮮な切断した臓器をバイオリアクター灌流システムに取り付け、生理学的環境を維持するか特定の結果をなすために他の温度条件下で維持し;b前記臓器の前記脈管構造内のような標的領域内に電極を挿入し;c前記臓器を生理食塩水または他の適切な灌流液で灌流させ;及びd一つ以上の電極を通じて電気的パルスを投与し、前記脈管構造を通じて可逆的または不可逆的電気穿孔を投与する。一旦望まない細胞が除去されたら、化学的例えば、非イオン性洗浄剤または物理的技術を用いて細胞破片を除去し、細胞成分/破片特に、細胞外の場合を除去する。しかる後、前記スキャフォールドは、前記標的とされた/処理された領域内に接種細胞を接種できる。前記臓器のさらなる灌流は、前記接種された細胞に栄養素及び/又は成長培地を投与し得てIREの間の灌流の実施、Eddetal,2006、前記バイオリアクター灌流システムは、細胞成長のための最適な条件37°Cで維持され得る。一つ以上のこのような方法のあるステップを実行することができ、好ましい容積の人工組織を得るためにも実行できる。例えば、臓器の多数の領域を処理するか臓器の全体を処理するために、電気穿孔が臓器のさらに小さい多数の領域に繰り返され、前記臓器から細胞破片を洗い流せるようにする実質的な間欠的休止期またはIREなしに一定期間の灌流をIRE実行後に実施することができる。同様に、プレートまたは針状電極を用いる場合、前記電極を位置させるか挿入する前に灌流を実施することができ、前記脈管構造内に位置したワイヤ型電極を持って、適切に前記電極を位置させた後、能動的な灌流activeperfusionを開始することが好ましい。実際、一つ以上のこのようなあるステップは、省略されるか、変更されるか、他のステップと再編成されるか、または適切に他のステップに交替され得る。実施例II-能動的な灌流の間のIRE交雑種の飼育された子豚にバルビツール酸塩を過多投与してと殺した。肝臓を採って死亡後15分以内に氷上に位置させた。灌流システムを伴う血管吻合装置vascularanastomosisを門静脈portalvein、肝動脈及び主要肝静脈内にルアーロック式注射器の連結管を挿入して形成し、ジップタイziptiesで固定した。前記灌流システム上に置く前に、前記肝臓を乳酸リンゲル液lactatedRinger’ssolution,LRSで洗い流して血液/凝固物を除去した。VasoWave登録商標PerfusionSystemSmartPerfusion,Denver,NCを用いて肝臓を4時間及び24時間の間灌流させた。このシステムは、心臓摸倣パルス波を生じて前記臓器内で生理学的心臓収縮及び心臓拡張圧力及び流速を発生させた。このシステムは、生理学的な標準以上及び未満に前記灌流液の酸素含量を調節できる。変形されたLRSで構成された灌流液は、門静脈portalvein及び肝動脈に輸送され、肝静脈を通じてシステムに戻り再使用された。全ての肝臓を死後1時間以内に能動的に機械灌流させた。灌流下で、ECM830SquareWaveBTXElectroporationSystemHarvardApparatus,Cambridge,MAを用いて前記肝組織に低エネルギーパルスを輸送した。2cm直径の二つの金属プレート電極を、ベルクロを用いる一対のラチェッティングバイスグリップratchetingvicegrips38mm、IrwinQuick-Gripsに取り付けた。BTXユニットに前記電極を連結するのに高電圧ワイヤを用いた。前記電極を前記肝臓に静かにクランプで固定し、前記電極の中心間距離center-to-centerdistanceを測定した。BTXユニットでの前記電圧出力を、近似値の適用電場が1000V/cmとなるように調整した。99個の個別100μsスクエアパルスを0.25、0.5、1.0及び4.0Hzの繰返し率で投与した。繰返し率の試験は、任意に実行され、最小3回繰り返した。如何なるパルスも輸送せず、前記組織上に前記電極を位置させる虚偽対照を実施した。2回の追加試験を1Hz及び4Hzの割合で1500V/cmの電圧対距離の割合を用いて0.5cmの間隔で位置された針電極を用いて実施した。このようなプロトコルのための設定は、図5Aから見られる。全てのN-TIRE処理を死後2時間以内に完了した。各処理部位で発生する表面病変を24時間の灌流期間の末期に測定した。N-TIRE処理及び機械灌流後に、肝臓をVasoWave登録商標systemから分離し、病変を保存するために区画化し、組織を10の天然緩衝ホルマリン溶液内に含浸させて固定した。固定後、組織を手入れし、通常のパラフィン包埋paraffinembeddingで処理した後、4マイクロメータで区画化し、ヘマトキシリン-エオシンhematoxylin-eosin,HE及びトリクロム着色剤trichromestainsで染色した。前記N-TIRE処理パラメータについて知らない獣医病理学者が組織区画を評価した。電場分布を予想して、組織での前記N-TIRE処理領域に対する洞察を提供するために数値モデリングを用いることができる。Edd,J.F.Davalos,R.V.Mathematicalmodelingofirreversibleelectroporationfortreatmentplanning.TechnologyinCancerResearchandTreatment6,275-2862007Edd2007。これは、前記肝臓で発生する病変に対する効果的な電場閾値を有する病変容積に関連性がある方法として選択されたものである。N-TIRE領域を予想するための方法は、Edd及びDavalosの文献Edd2007により記載されたものと類似している。前記肝臓内にN-TIREを誘導するための効果的な電場閾値を理解するために、有限要素シミュレーションfiniteelementsimulationsを、ComsolMultiphysics3.5aComsol,Stockholm,Swedenを用いて実施した。前記数値モデルを、前記組織の上及び下に位置されたそれぞれ1mmの厚さの2cmの直径のプレートを用いて構成した。前記モデルをGarciaetal.Garcia,P.etal.Intracranialnonthermalirreversibleelectroporation:invivoanalysis.JMembrBiol236,127-1362010により規定されたように解いた。前記電場分布は、ラプラスの方程式Laplaceequationを解いて得られた。ここで、σは、前記組織の電気伝導度であり、ψは電位である。前記エネルギー化された電極と接触した前記組織による前記電気的境界electricalboundary条件は、ψ=Voである。他の電極の接点での電気的境界条件は、ψ=0である。分析された領域が電極と接触していない前記境界は、電気絶縁として処理されたものである。前記エネルギー化された電極と接触した前記組織による前記電気的境界electricalboundary条件は、ψ=Voである。他の電極の接点での電気的境界条件は、ψ=0である。分析された領域が電極と接触していない前記境界は、電気的に絶縁されるように処理されたものである。電気穿孔及び温度に起因した伝導率変化は、下記式によって動的伝導度を計算してモデリングされた:Boone,K.,Barber,D.Brown,B.Review-Imagingwithelectricity:reportoftheEuropeanConcertedActiononImpedanceTomography.J.Med.Eng.Technol.21,201-2321997;Sel,D.,Lebar,A.M.Miklavcic,D.Feasibilityofemployingmodel-basedoptimizationofpulseamplitudeandelectrodedistanceforeffectivetumorelectropermeabilization.IEEETransBiomedEng54,773-7812007;Sel,D.etal.Sequentialfiniteelementmodeloftissueelectropermeabilization.IEEETransBiomedEng52,816-827,doi:10.1109/TBME.2005.8452122005;及びPavselj,N.etal.Thecourseoftissuepermeabilizationstudiedonamathematicalmodelofasubcutaneoustumorinsmallanimals.IEEETransBiomedEng52,1373-13812005参照。前記組織が露出された電場のシミュレーションを得るために、前記肝臓に用いられた前記パルスパラメータに対して、このような数値モデルを計算した。しかる後、前記N-TIRE電場閾値を、病変の面積を測定し、前記モデルでのこのような領域における電場数値を決定して見出した。処理を始めてから30分以内の灌流の間に表面病変が現れた。プレート電極により生成された前記肝表面の病変の領域は、針電極からの領域よりもさらに大きかったが、同一のタイプであった。図5Bにおいて、処理4時間後に収得され、1500Vの適用電圧から生成された3.3cmの表面病変が見られる。数値的にモデリングされたこのような病変の大きさは、379±142V/cmまたはそれ以上の電場が適用された組織の領域内で生成されたものである。このような試験に対する数値モデルの結果は、図6A~6Cから見られる。周波数試験において、プレート間の距離に対する適用電圧の平均は、962V/cmであった。このような試験からの病変は、死後22時間にわたって発生し、平均的に2.5cmの直径を有していた125の電極直径;これは、0.25Hz及び936V/cmで発生した2cmの最小病変、及び1.0Hz及び950V/cmで発生した3.2cmの最大病変を有する。著しく重要ではないが、前記結果は、病変の大きさが1Hzで最も大きな平均であり、周波数が増加するか減少するにつれて減少することを提案する。0.25及び4Hzで適用される処理後に発生した病変は、1Hzで適用された処理に対して発生した病変よりも統計的に小さいα=0.1図7A~7B。前記の処理された組織の分析は、前記組織を通じて円筒状に延びる均一な処理領域を示す。これは、0.628cm及び0.792cmの相応する組織厚さに対する1.97cm3及び6.37cm3間の計算された処理容積を算出した。処理後24時間からの組織学的実験において、前記の処理された領域は、対照図8Aに比べて細胞の死滅図8Bを示している。さらに具体的には、図8A~8Bは、穏やかにIRE処理した領域における結合組織及び血管の維持に対し、非処理の肝組織の領域における組織学的な比較を示している。非処理の試料をHEで染色したもの図8A及び10xの倍率で、24時間の心臓摸倣灌流のプレート電極を用いて99個の100μs、1000V/cmパルスを投与した試料をHEで染色したもの図8Bである。豚での肝小葉Hepaticaciniは、血管及び胆汁構造を含む結合組織によりさらに広くなり、肝細静脈で終結する重要なコード構造cordarchitectureを有する。エネルギー輸送に隣接した領域において、肝細胞コードは、若干の液胞が形成された肝細胞24時間のexvivoの機械灌流サイクルで予想された発見を伴い、よく保存された。非処理領域での類洞構造sinusoidalstructureは開放され、肝動脈/門静脈portalvein及び肝静脈間の灌流液の流れを反映する。N-TIRE処理は、肝細胞索hepaticcordsを崩壊させ、細胞分解を誘導する図8B。さらに広い結合組織及び血管を含む主要肝小葉の保存が見られる。N-TIRE処理の領域において、細胞コードは明確でなく、類洞内膜は、程度を多様化して分画された。ヒトと同様に、豚も門脈三管portaltriads間につながる繊維状の結合組織の薄いバンドにより肝小葉が実質的に分離される。このような微細構造は、電気穿孔により誘導される病変の分布に影響を及ぼす。病変は、前記電気穿孔フィールドの縁で病変を持つ小葉か、通常であるか、ほとんど通常の小葉である構造的小葉内に局限される。そのため、電気穿孔で中心肝病変を処理するか、それに続く組織の処理のために損なわれていない結合組織/導管/血管マトリックスを発達させる工程を考慮するとき、結合組織のバンドが電気パルシングのための絶縁体として作用することは重要な発見である。図9A~図9Cは顕微鏡写真であり、図9A24時間の灌流後、処理されていない肝臓の部分を示している。24時間灌流後、針電極を用いて4Hzで90個の、1500V/cm、100μsパルスで処理された同一の肝臓の部分図9B10xの倍率及び図9C20xの倍率を示している。図9Aは、門脈管portaltractsから中央静脈まで整列した一般的な類洞細胞コードを有する非処理の豚の肝臓の部分を示す。細胞の形態はよく保存されている。赤血球細胞を有するいくつかの血管充血が見られ、また、軽微な小葉中心性の胆汁うっ滞centrilobularbiliarystasisもある。若干損なわれた豚小葉がプレート電気穿孔をした領域で観察された図9B。前記小葉の中心は、コード構造の崩壊及び一部の細胞の変質及び群集が現れる。この領域のさらに高い解像度の写真は図9Cから見られ、細胞性変化がさらに容易にわかる。このような処理領域は、肝細胞コード分布及びコード基底板から層間分離される細胞で構成される軽微な病変を示す。軽微な胆汁うっ滞が見られる暗い色素。針電極またはプレート電極のいずれか一つを有するN-TIRE処理の投与は、区別されるいくつかの肝小葉での病変を生成した。各小葉内の病変の深刻度は、軽微な程度から適当に深刻な程度までの範囲である。軽微な病変は、基底膜から分離された肝細胞の小さな群集からなる。このような細胞は、微細細胞内構造の組織及び細胞質/細胞器官の群集の損失を示す図9A~9C。適度に深刻な病変は容易に把握される図10A~10B。N-TIRE処理により影響を受けた細胞は、様々な程度の細胞膨張及び核融解を示す図10B。個別の小葉内において、ほとんどの細胞が影響を受ける。いくつかの小葉において、基底膜から分離される高色素細胞hyperchromiccellsの小さな群集を伴うフランク核濃縮症franknuclearpyknosis及び細胞変質が見られる。一部の小葉において、末梢類洞空間で胆汁色素の凝集を伴う小葉中心性胆汁うっ滞が見られる。全ての場合において、言及されたように、結合組織の架橋バンドが、無傷の胆管及び血管構造で観察され、相当なN-TIREによって誘導された組織の損傷を有する小葉がさらに広がって現れた。この試験は、臓器移植用の脱細胞化された組織スキャフォールドの作製において、この使用のために能動的に灌流された臓器における非熱的不可逆的電気穿孔の効果を報告する。本願において報告された前記結果は、単一のN-TIRE処理において6.37cm3まで組織の容積を局限させた。これは、部分及び全体の肝移植に対する脱細胞化構造を生成する目標で多重処理を行うことによりさらに大きな容積に容易に拡大することができる。24時間灌流後に、前記組織構造内に多量の細胞破片が一般的に残っている。このような破片の除去は、レシピエントの免疫反応を最小化するのに必須であり、さらに長くさらに効果的な灌流プロトコルを通じて及び/又は身体自体のメカニズムによる灌流を利用して、細胞成分の除去を最大化することで達成され得る。脱細胞化された組織スキャフォールドの製造以外に、このような方法は、パルス長さ、繰返し率、及び全体臓器構造でのフィールド強度のようなパルスパラメータの効果を研究するための理想的な足場を提供する。さらに、前記灌流液の電気特性に対する直接的な調節があるので、独特な電気的または物理的特性を持つ疾患にかかった臓器または癌にかかった臓器でのN-TIREの効果を試験するためのモデルとして提供され得る。本発明の方法を、疾患にかかった組織または臓器の部分を治療するか、不必要であるか疾患にかかった組織を除去するのに適用することができ、しかる後、前記臓器または組織の再接種が行われ得る。例えば、脈管構造を通じて肝臓の損なわれた領域だけを対象とし、身体が脱細胞化させることができ、再接種されるようにして肝疾患を持つ患者を治療することができる。灌流を伴うN-TIREから結果的に生成されたスキャフォールドは、非血管構造で存在する栄養素の分散制限よりも遥かに大きい構造内への灌流のために必須な脈管構造を維持する。用いられた灌流液の温度が4°Cだけ低いことがあるので、ジュール加熱に関連した熱的側面は、無視してもよい程である。これは、熱損傷の効果から分離された電場の細胞及び組織での効果を評価するための理想的な足場を提供する。さらに、invivoの適用に比べて前記臓器の低い温度は熱損傷を誘導せず、さらに厚い構造を脱細胞化するための適切な電場を獲得するためにさらに高い電圧を適用することを可能とする。これは、ヒトの肝臓の厚さが一部の領域で10cmを超えることがあるので重要である。本願において示されて記述されているように、能動的な灌流activeperfusionを実行した組織及び臓器を脱細胞化しようとする計画であるとき、脱細胞化された組織の処理領域は、数値モデリングを通じて予想され得る。本願において用いられた病変の大きさ及び数値モデルから、移植可能なスキャフォールドに対して全体臓器を脱細胞化するとき、前記プロトコルは、379±142V/cmの電場に前記組織の全体を露出するはずである。これは、所望の細胞をスキャフォールドに包括的に再接種してレシピエントの拒絶効果を最小化させることを可能とする、完全な細胞の死滅を保障するだろう。本願において見出された前記閾値は、従来の研究における閾値よりももう少し低く、これは、灌流下にあるときに用いられた独特なパルスパラメータまたは前記パルスに対する前記細胞の固有の感受性が増加した結果であり得ることが言及された。前記脱細胞化工程における持続的で能動的な機械灌流は、また、再細胞化recellularizationにも有用である。前記脱細胞化工程が完了すると、前記灌流システムから新たに生成されたスキャフォールドの除去を伴う損傷のリスクなしに前記スキャフォールドを再接種することが可能である。前記動脈及び静脈供給を個別的に扱うことができるため、複数の細胞タイプを前記臓器の他の領域に同時に輸送できる。同様に、前記胆汁システムを通じた逆行する灌流が、前記再接種工程で肝細胞を輸送する理想的な経路となり得る。微視的に見られる病変は、電気穿孔を用いる細胞ストリッピングcellularstrippingのためのメカニズム及び形態学を明らかに示す。さらには24時間で、本願に記載の前記電気穿孔パラメータを用いたとき、小葉構造の普通程度の損失だけがあるということは非常に興味深い。エネルギー輸送のさらに厳しい条件がこれを変えられると予想されるが、重要な結合組織及び血管構造に損傷を誘導する。前記灌流流体内にアジュバント細胞毒性製剤、酵素、及び洗浄剤を添加することで、また、細胞ストリッピングの厳格性及び臨時的な性質を調節し得る。論理的に、細胞及び基質を急速に除去するよりは、組織工学的な目標のために重要な構造を保存する、穏やかな条件を立てることがさらに良い。心臓摸倣システムを伴う灌流期間及び灌流条件を処理する能力が、肝臓の脱細胞化及び究極的な再細胞化に対するこのような段階的かつ漸進的なアプローチに有用なことが明らかである。実施例III-能動的な灌流activeperfusionを伴う脈管構造が管理するIRE死後の豚から正常腎臓を標準的で印加された方式を通じて得た。収得したとき、前記腎臓の腎臓動脈及び静脈を分離し、心臓血管摸倣システムcardiovascularemulationsystem,CVESVasoWave2.3TM,SmartPerfusionLLC,Denver,NCへの吻合anastomosisが可能となるように適するように連結させた。前記臓器をCVESに連結させ、前記腎臓を1.5リットルのKrebs-Hensleit/グルタチオン生理溶液で5分間洗浄した。その後、前記腎臓をCVESへの前記動脈及び血管コネクタに吻合させて灌流を始めた1分当たり60回の拍動で輸送される生理学的パルス列pulsetrainを有する、動脈の心臓収縮圧力:110mmHg、心臓拡張圧力60mmHg。灌流を25°Cで行った。前記腎臓静脈を連結させずに残すが、管組織の端は低い背圧これは、およそ1mmHgであるを生成するために高くした。灌流を15分間隔で安定化させた。前記Krebs溶液伝導度を0.72S/mで測定した。図11から見られるように、注文製作されるエネルギー適用電極が特定適用のために製造され得る。この実施例において、中央点近くの折り畳み可能な配管の小さな分画を貫通して穴を通じて露出された端部例えば、露出された端部を有するむき出しのワイヤまたはエナメルコーティングワイヤの一部分を有する絶縁ワイヤを挿入して接着し、サイトを封止することにより電極を生成した。前記ワイヤの末端のエナメルは、前記配管内で電気的な連結を生成するために除去され、外部的に安全のために前記ワイヤのほとんどを絶縁コーティングした。さらに、縮められた包装された配管がさらなる電気絶縁のために前記配管の長さによって適用された。しかる後、ルアーロックの連結管を前記配管の末端内に挿入し、灌流システムへの連結を可能とした。このような電極は、パルス生成システム及び灌流流体間の1ohm未満の電気抵抗を示す。図11から見られるように、小径のワイヤは配管内に位置し、外部からアプローチ可能であり、灌流と同時にパルスが輸送されることを許容する。図12は、腎臓静脈及び動脈により原型の電極及び灌流システムに同時に取り付けられる腎臓を示すグラフである。一つの電極がCVESからの動脈供給及び前記腎臓血管コネクタ間に一直線で位置した。静脈電極の一末端を腎臓静脈血管コネクタに連結し、電極配管の他の末端を注射器で支えて前記背圧を形成した。これは、また、前記CVESを通じた前記灌流液の逆流を通じた最小の抵抗の経路を発見すること、または前記システム及び前記腎臓を通じて部分的に電流を送ることにより前記電気的電流を防止した。前記血管ネットワークの前記抵抗及び静電容量をLCRメータで測定した。低い周波数100Hzにおいて前記抵抗及び静電容量の数値は、それぞれ372.6kOhms及び0.248nano-Faradsであった。これは、92.4マイクロ秒のRC時間定数及びおよそ462マイクロ秒の完全な消滅時間5RCを算出する。パルシング前に前記腎臓からのインピーダンス測定を提供する図13から示されるように、前記臓器は、相当な電気抵抗及び静電容量を示した。100及び10,000Hz間で観察される動向図13は、大きな直流DC成分を有する矩形波パルスsquarewavepulsesを示し、前記RC時間定数はさらに大きいはずであった。単一50マイクロ秒パルスをBTXパルス再生機HarvardApparatusを用いて、100、500、750、1000、1500、及び2000Vの電圧で前記脈管構造を通じて輸送した。輸送された電流及び前記パルスの消滅時間を記録した。全ての場合において、前記消滅時間は、予想されたものより少なかった。結果的に生成された波形を図14に示した。さらに具体的には、図14は、1000Vの振幅を有する50マイクロ秒パルスから結果的に生成された波形を提供する。パルスの消滅は、抵抗及び静電容量成分を両方とも有する組織の特性である。代表的なパルス電圧及び電流プロットが図14から見られる。前記消滅時間は、100V及び500V間でかなり減少し、500及び2000V間の電圧で相対的に一定に維持された。全ての場合において、前記輸送された電流は、循環を根拠として予想されたものよりさらに大きかった23~53。図15は、輸送される最大電流及び100及び2000V間の振幅で輸送されるパルスに対する消滅時間を示したグラフである。動向は、500V及びそれ以上のパルスに対して、前記組織の前記抵抗が電気穿孔に起因して減少することを示す。その後、前記臓器に毎秒ごとに一つのパルスの繰返し率を有する、1000Vでの200個のパルスを適用させた。TTC着色剤Krebs溶液の2をパルシングが完了した後、15分間灌流により投与し、前記臓器をさらに30分間前記灌流システム上に維持した。前記TTC着色剤は、組織デヒドロゲナーゼの活性を通じて発色した反応産物レッドホルマザンの形成により生存組織及び非生存組織を示すのに用いられる。酸素呼吸が可能な生存組織を赤色で染色し;非生存組織または虚血性組織は、比較したとき、薄い色である。図16から見られるように、パルシング後30分で腎臓分画は生きている組織は赤色領域で、IREパルスにより除去された領域は白色領域で示される。分画された臓器を固定及び組織学的検査のためにホルマリン内に固定した。腎臓の大容積に不可逆的電気穿孔が適用されたことがこの図面から明白である。脈管構造内の血栓は、電気穿孔の適用から全体臓器を保護することができる。このような問題は、手術摘出後に直ちに前記臓器の脈管構造を洗浄することによって解決できる。前記臓器の前記脈管構造及び微小脈管構造を、短いが強い電気パルスをバルク組織に輸送するのに用いて、その下の細胞外マトリックスの構造と機能は維持する非熱的な細胞の死滅を引き起こすことができる。組織学的染色を前記組織の全体的な健康状態HE、内皮細胞の損傷及び除去vWF、及び前記細胞外マトリックスの構造トリクロム及びこのような予備実験の結果として生成された脱細胞化を評価するために用いることができる。4時間の総灌流プロトコルを、脱細胞化プロトコルのためのベースラインとして用いることができ、血管新生された臓器の内部に深く内在する固形腫瘍を治療するなど、組織の構築を超えて拡張される。人工スキャフォールドが製造されれば、前記スキャフォールドをさらに生体内で再生するように構築するか、生体内への移植に適した組織及び臓器に構築できる。人工組織を製造する方法は、下記を含むことができる:重要な細胞を本発明に係る人工スキャフォールドに接種し、及び接種されたスキャフォールドを、接種された細胞が前記スキャフォールドマトリックスに浸透して成長できる条件に露出させる。前記スキャフォールドの接種は、本分野において公知の全ての技術によりなされ得る。同様に、前記接種されたスキャフォールドを、接種された細胞が前記スキャフォールドに浸透して成長できる条件に露出させることは、前記結果を達成するために本分野において公知の全ての技術を用いてなされ得る。例えば、市販の成長培地内で前記接種されたスキャフォールドを約37°Cの市販のインキュベータ内でinvitroの条件で恒温することを含むことができ、必要であれば、前記成長培地に適した成長因子、抗生剤等を補充することができる。本分野の当業者は、本願の詳細な記載なしにも適切な接種及び増殖技術及びパラメータを適宜選別できる。言い換えれば、細胞の接種及び成長に関して、本発明の前記スキャフォールドは本分野において公知の他の天然スキャフォールドと同様に一般的に挙動する。本発明のスキャフォールドは他のスキャフォールドが有しない有益な特徴を有しているが、このような特徴は、細胞の接種及び成長には有意な影響を及ぼさない。人工組織は、傷ついたか、疾患にかかったか、他の方式で欠陥のある組織に対する交替物として開発された。組織工学の分野の重要な目標は、ヒトの健康における医学/治療学的用途を発達させることである。スキャフォールドの源としてヒト組織を使用することを取り巻く難しさ及び倫理的問題の観点から、大動物からの組織が天然スキャフォールドのための源として通常用いられる。しかる後、ヒトでのinvivoでの使用のために異種型xenotypicスキャフォールドにヒト細胞を接種する。現在記載の人工組織は動物スキャフォールドを基礎とするヒト組織に制限されているが、人工組織の一次構成を形成することが構想されている。そのため、実施形態において、本発明の前記人工組織は、ヒト組織以外の動物組織に由来したスキャフォールド上及び内にヒト細胞を含む組織である。特定のinvivoでの用途のために、動物組織を非熱的IREに生体内適用させ、前記処理組織は、宿主動物の身体により細胞破片が除去された。そのため、特定のinvivoでの実施形態において、宿主動物の身体自体でこのような除去このようなコンセプトは、同様にヒトにおいてスキャフォールドのinvivoでの構築に適用されるが可能であるので、二次細胞破片除去ステップは不要である。その後、処理組織を、例えばヒト細胞で生体内接種し、前記接種された細胞が前記スキャフォールドを浸透して成長するようにする。適切な浸透及び成長によって、再生された組織を除去し、好ましくは、可能な汚染宿主細胞を洗浄し、受容動物、例えば、ヒトに移植する。このような状況において、前記宿主動物は、外部細胞として前記接種された細胞を認識できないか、よく認識できない損なわれた免疫システムを有することが好ましい。例えば、損なわれた免疫システムを有する遺伝学的に変異した動物が宿主動物として用いられ得る。代案的として、例えば、前記宿主動物に免疫抑制剤を与えて、前記接種された細胞に対する前記動物の免疫反応を減少させるか除去できる。レシピエントまたは宿主動物は、ヒト、コンパニオンアニマル即ち、犬または猫のようなペット、家畜例えば、牛、豚、羊、またはスポーツ用動物例えば、馬を含むあらゆる動物であってよい。そのため、本発明は、ヒト及び動物の健康管理及び研究分野のいずれにも適用可能である。体内invivoまたは体外invitroまたは生体外exvivoにおいて接種する細胞の選択が実施者に残っている。多くの細胞タイプが収得され得、組織工学分野の熟練者であれば、組織の接種のために用いる細胞のタイプを容易に決定することができる。例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、または肝細胞を用いることができる。実施形態において、胚性幹細胞、生体幹細胞のような間葉幹細胞が前記スキャフォールドに接種するための細胞として用いられる。接種された細胞の源は、特に制限されない。そのため、前記接種された細胞は、自家組織、同類syngenicまたは同質isogenic、同種allogenic、または異種xenogenicであってよい。本発明の特徴は、免疫原性が低減した本分野において現在公知のスキャフォールド及び組織と比較してスキャフォールド及び組織を生成することであるため、前記接種された細胞が自家組織前記人工組織のレシピエントと関連するであることが好ましい。特定の実施形態においては、前記接種された細胞が、幹細胞または重要な組織から適切な細胞タイプに分化できる他の細胞であることが好ましい。またはさらに、スキャフォールドを生成するinvivoの方法及び人工組織を生成するinvivoの方法は、不可逆的電気穿孔を伴う非熱的IREによる処理細胞の近くで組織を処理することを含むことができる。前記不可逆的電気穿孔の一部として、一つ以上の遺伝要素、タンパク質または他の物質例えば、薬物が前記処理された細胞に挿入され得る。前記遺伝要素は、コーディング領域、または、いつ発現するか、前記接種された細胞と前記細胞の相互作用を減少させるか、他の方法で抗炎症あるいは他の抗炎症物質を製造するかに対するその他の情報を含むことができる。このような遺伝要素の短期間の発現は、損傷または拒絶なしにinvivoにおいて人工組織を成長させる能力を増強することができる。タンパク質及びその他の物質は、不可逆的に電気穿孔された細胞内に、または電気穿孔後に前記細胞から分泌された産物として直接的に影響を与えることができる。本発明の特定の実施形態は、ヒトの人工組織の製造に用いるためのヒトスキャフォールドの用途に関するものである。他の人工組織と共に、このような人工組織をinvitro、invivo、または部分的にinvitro及び部分的にinvivoで構築することができる。例えば、組織提供者は、非熱的IREが適用された組織の一部または全部を有し、レシピエントの細胞の移植のための組織工学用スキャフォールドを構築した後、これらの細胞を成長させることができる。前記移植された細胞の浸透及び成長によって、前記組織を除去し、その必要に応じてレシピエントに移植することができる。もちろん、倫理的な懸念として、前記提供者の組織は、提供者の生命及び健康に致命的でない組織でなければならない。例えば、前記組織は、肝臓の一部であってよい。前記人工組織は、前記宿主からの除去及び前記レシピエントでの移植によって、完全に機能する肝臓に再生でき、宿主の肝臓に残っている部分は、除去された部分を再生することができる。このような点によって、本発明は、人工組織のスキャフォールド、人工組織、及びこれらを製造する方法について記載された。同様に、本発明が、人工臓器及びこれらを製造する方法を含むことが言及されたことが重要である。これは、一般に、臓器が前記動物の別個の機能または機能のセットを実行する多細胞動物の部分を意味するものと見なされる。これは、また、一般に臓器が組織で作られ、複数のタイプの組織で作られるものと見なされる。本発明は一般に組織及び臓器のいずれにも適用され得るものであり、前記両方の区分が本発明の実施を理解するのに決定的なものではないので、前記用語の組織及び臓器は、本願において互いに交替可能に使われ、両方を区別しようとする意図はない。本発明に含まれる多くの概念は、人工組織に関連した種々の例示的な概念で作られて言及され得る。例えば、人工臓器の構築において、初期の臓器は、再接種前に不可逆電気穿孔を用いて細胞が完全に除去され得るこれは、特に1mm未満の少なくとも一つの大きさを有する臓器に係る;前記臓器は、分画において不可逆的に電気穿孔され、再接種されて、ヒト細胞が一度に小さな分画を浸透することができる;前記臓器は、ステップにおいて前記細胞を誘導する増加スライスincrementalslicesで不可逆的に電気穿孔して生存ヒト細胞が、置換する生存動物細胞と接触しないようにする;前記臓器を全体でまたは分画で不可逆的に電気穿孔し、前記ヒト細胞を前記臓器内の標的位置内に注入できる;前記全体臓器を不可逆的に電気穿孔して、動物細胞を殺した後、ヒト細胞が前記臓器の上部に移植されて前記スキャフォールドに浸透し、他の細胞と交替することができる前記動物細胞が死ぬことで、前記ヒト細胞が内部を満たし、置換して新たな臓器を生成する。提供された分離された人工組織及び臓器により、これらを用いる方法を提供することができる。本発明は、invitro及びinvivoのいずれの設定においても前記人工組織の用途を考慮する。そのため、本発明は、研究目的及び治療または医学/獣医学的目的のための前記人工組織の用途を提供する。研究的な設定において、多大な数の実用化技術が存在する。このような適用の一例は、研究室において様々な除去技術例えば、放射線処理、化学療法処理、または組合せを含むの効能を試験し、病気の患者の使用を避けて治療方法を最適化するためのものである、exvivoの癌モデルにおける前記人工組織の使用である。例えば、最近除去された肝臓例えば、豚の肝臓をバイオリアクターまたはスキャフォールドに付着し、組織を除去して肝臓を治療することができる。さらに、相当数の免疫細胞の欠如によって、自発的手段発癌物質または前記組織内への腫瘍形成細胞株の導入のいずれか一つにより、前記除去された器官に腫瘍を成長させることができる。その後、このような腫瘍をの知識を得るために増加させ、生理学的に関連する同所orthotopic設定での治療技術の最適化を促進するために治療することができる。invivoでの使用のその他の例は、人工組織のためのものである。本発明の前記人工組織は、invivoの用途を有する。様々な用途のうち、被検者本願においては患者を互いに交替可能な用語として使用し、ヒト及び動物をいずれも含むのinvivoの治療の方法が言及され得る。特定の実施形態に対して、一般に、被検者を治療する方法は、被検者の表面内部または上に本発明に係る人工組織を移植することを含み、前記組織の移植は、前記被検者の検出可能な変化を引き起こす。前記検出可能な変化は、自然的な感覚または人工の装置を用いて検出可能なあらゆる変化であってよい。どのタイプの治療でも本発明により構想され疾患または障害、皮膚の傷の美容治療等、多くの実施形態において、前記治療は、疾患、障害または被検者の他の苦痛の治療学的治療であるだろう。そのため、検出可能な変化は、変化、例えば、被検者が影響を受けている疾患または障害の少なくとも一つの臨床症状での改善の検出であってよい。例示的なinvivoの治療方法は、腫瘍治療後の臓器の再生、医療装備の移植のための手術部位の準備、皮膚移植、及び疾患または障害により損傷または破壊されたような組職または臓器例えば、肝臓の一部または全部の交替を含む。例示的な臓器または組織は、下記を含む:心臓、肺、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、膵臓、卵巣、脳、耳、目、または肌。被検者がヒトまたは動物であるという事実を勘案して、本発明は、医学及び獣医学の適用のいずれであってもよい。例えば、前記治療方法は、被検者の疾患に係る機能不全した組織を再生する方法であってよい。前記方法は、非熱的IREに組織を暴露させて処理された組織の細胞を殺し、組織スキャフォールドを生成することができる。前記方法は、前記組織スキャフォールドに前記被検者の外部からの細胞を接種し、前記接種された細胞が前記組織スキャフォールド内及び上で増殖するようにすることをさらに含むことができる。前記細胞の増殖は、健康で機能的な細胞を含む再生された組織を産生する。このような方法は、前記被検者から前記組織スキャフォールドの除去を必要としない。むしろ、前記スキャフォールドは、元来の組織から構築され、健康で機能的な細胞を再接種されたものである。スキャフォールドの生成、人工組織の生成及び被検者の治療の全体工程は、接種される細胞の拡張をできる限り除いてinvivoで実施され、仮に必要であれば、invitroで実行され得る。また他の例示的な実施形態において、組織スキャフォールドを、非熱的IREを用いてドナー動物での組織を除去することで構築した。前記人工組織は、提供者の身体内に残り、前記組織スキャフォールドから細胞破片がないようにする。適当な時間後に、前記人工組織を提供者の身体から除去してレシピエントの身体内に移植する。移植されたスキャフォールドは、外部細胞で再接種されない。むしろ、前記スキャフォールドは、レシピエントの身体により自然に再接種されて機能的組織を生成する。本発明のまた他の実施形態において、前記ワイヤ電極を、パルス電場または持続的な電場を可能とするのに用いてinvivoまたはexvivoのいずれか一つに標的領域に不可逆電気穿孔または熱損傷を誘導することができる。不可逆的電気穿孔が、能動的な灌流activeperfusionが適用される前記臓器のほとんどに可能なことがこのような例において示される場合、前記組織に電気パルスを輸送するに十分な電気導管として組織/臓器の天然の脈管構造を提供することが証明された。不可逆的電気穿孔が、不可逆的電気穿孔よりも低いエネルギーパルスパラメータを示す現象である場合、前記脈管構造を通じて不可逆的な電気穿孔がまた可能なことが明白である。このような技術は、実施者が標的領域は除去しないが、前記標的領域に遺伝子または薬物のような治療的な巨大分子を導入することを希望する場合、非常に有用である。用いられた前記巨大分子及び希望する治療的効果は、前記実施者に一任される。さらに、高周波アブレーションは、連続的な交差磁場を用いて組織を加熱する一般に用いられる熱を中心とする熱アブレーションであって、医学での使用が増加し、本発明において記載された血管電極技術を導入することにより浸湿性が減少する。本発明は、移植によって現在発生するほとんどの問題のうち一部を解消する。提供者の臓器から残っている唯一の細胞が血管及び神経を形成するのに関連した細胞であるため、本願に記載の方法は、拒絶のリスクを低減させる伝統的な臓器移植に比べて。同時に、血管、神経、及び腺構造が維持される。本発明は、実質的に天然の構造及び機能を有し、低い免疫原性を有する人工組織を生産するための相対的に早く、効果的で簡単な方式を提供する。そのため、本発明の前記人工組織が相対的に低い拒絶の可能性を有しており、治療的及び美容的な用途に非常に適している。ヒト臓器がスキャフォールドの源として用いられる例えば、生体提供者または死体から実施形態においては、拒絶のリスクが非常に少ない。要約すれば、本発明者は、細胞、組織及び臓器を含む望まない軟質組織の高度で選択的な除去に用いられ得る、新たに製造された道具電極及び灌流システムを用いる、新規なプロセスを確立した。特別な実施形態は、管組織、または血管床内で含まれる流体内にパルス電気エネルギーの適用、灌流流体の含量及び流れパラメータの調節、パルスエネルギー輸送のスキーム、及び治療学的効果を局限させて規定するための他の調整の使用を含む。損傷を受けていない組織からの細胞除去が可能で、様々な用途のための新規な組織マトリックスの生成に有用であることがさらに確認された。本願に示されたこのような結果は、exvivoで実行される実験に基づいたものである。しかし、灌流される流体は、組成及び伝導度が血液と類似している。これは、このような実験結果がinvivoで見られる反応を示すものであることを示す。例えば、器官の脈管構造を通じて直接輸送する、本明細書において記載のエネルギー輸送方法は、また他の治療学的反応を誘導するのに用いられ得る。致死量に近い電気パルス不可逆的電気穿孔は、遺伝子または薬物を特定臓器または臓器の領域内に導入して局所疾患を治療するのに用いられ得る。同様に、高周波アブレーション技術は、前記脈管構造を用いて無線周波数エネルギーを輸送し、急性温熱療法を通じて疾患にかかった組織または腫瘍を破壊することができる。このような方法は、このような効果を増加させるために他の電気特性と共に生理学的に許容可能な流体共同-灌流によりを輸送して改善され得る。このエネルギーは、前記脈管構造を通じて適用されるため、調節可能な大規模な治療容積を達成することができる。前記エネルギーが針電極により輸送されず、臓器に穴が不要であるので、臓器の全体構造が破壊されない。さらに、理論的に予想され、実験的に証明されたように、前記輸送されたエネルギーは、バルク組織を横切るよりは前記血管床または毛細管床を直接的に横切って消滅する。針またはプレート電極を用いる通常の治療は、同様の電圧を用いて、1Ampを超える電流を輸送し、少ない容積にのみ影響を及ぼす。これとは逆に、腎臓の血管ネットワークを用いるエネルギー輸送は、およそ50mA200倍未満の電力の電流を引き起こし、さらに一層大きな容積を治療することができる。本発明は、様々な特徴を有する特定の実施形態を参照として記載された。本発明の範囲及び精神から外れずに本発明の実施において様々な変更及び変異が行われることは本分野の当業者に自明であるだろう。本分野の当業者は、与えられた適用または設計の必要条件及び明細書に基づいて、単独でまたはある組合せでこのような特徴が用いられ得ることを認識するだろう。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書及び実施を考慮して本分野の当業者に自明になるだろう。数値範囲が本明細書に提供された場合、この範囲の上限及び下限間の各数値は、また特定に記載された。このようなさらに小さな範囲の上限及び下限は、同様に独立して前記範囲に含まれたか、排除された。本明細書において言及されたように、単数形である一つa、an及び前記theは、他に明確に描写されない限り、複数の対象を含む。そのため、例えば、一つのパルスapulseの言及は、このようなパルスの複数を含み、前記試料thesampleの言及は、一つ以上の試料及び本分野の当業者に公知のその等価物を含む。本明細書及び実施例は、事実上、例示として見なされるものを意図し、本発明の本質から外れない変形は、本分野の範囲内に含まれるものと意図される。また、本記載において言及された参考文献は、全体が本願に参考文献として取り込まれたものである。"