"増殖性疾患を予防または治療するための方法であって、その方法が治療上有効な量の:ナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;前記宿主細胞によって産生される発現産物;または前記植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、もしくは発現産物を、製薬上許容される担体、賦形剤、もしくは添加剤とともに含有する医薬組成物;を被験体に投与することを含んでおり、それによって増殖性疾患を予防もしくは治療する、前記方法。前記植物ディフェンシンがハナタバコNicotianaalata、ニコチアナスアベオレンスNicotianasuaveolens、ペチュニアPetuniahybridaまたはトマトSolanumlycopersicumに由来し、またはそれらから得ることができる、請求項1に記載の方法。前記植物ディフェンシンがNaD1、NsD1、NsD2、PhD1A、およびTPP3からなる1群から選択される、請求項1に記載の方法。前記植物ディフェンシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、もしくは配列番号26、またはそれらの機能的断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。前記植物ディフェンシンが、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、もしくは配列番号27、またはそれらの機能的断片からなる1群から選択される核酸配列、または前記核酸配列のいずれかに対して70同一性を有する機能的核酸配列によってコードされる、請求項1に記載の方法。増殖性疾患ががんである、請求項1~5のいずれか1つに記載の方法。がんが、基底細胞がん、骨肉腫、大腸がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または甲状腺がんからなる1群から選択される、請求項6に記載の方法。増殖性疾患を予防または治療するための薬剤の調製におけるナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;または前記宿主細胞によって産生される発現産物;の使用。前記植物ディフェンシンがハナタバコNicotianaalata、ニコチアナスアベオレンスNicotianasuaveolens、ペチュニアPetuniahybridaまたはトマトSolanumlycopersicumに由来し、またはそれらから得ることができる、請求項8に記載の使用。前記植物ディフェンシンがNaD1、NsD1、NsD2、PhD1A、およびTPP3からなる1群から選択される、請求項8に記載の使用。前記植物ディフェンシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、もしくは配列番号26、またはそれらの機能的断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の使用。前記植物ディフェンシンが、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、もしくは配列番号27、またはそれらの機能的断片からなる1群から選択される核酸配列、または前記核酸配列のいずれかに対して70同一性を有する機能的核酸配列によってコードされる、請求項8に記載の使用。増殖性疾患ががんである、請求項8~12のいずれか1つに記載の使用。がんが、基底細胞がん、骨肉腫、大腸がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または甲状腺がんからなる1群から選択される、請求項13に記載の使用。増殖性疾患を予防または治療するために使用されるキットであって、そのキットが治療上有効な量の:ナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;前記宿主細胞によって産生される発現産物;または前記植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、もしくは発現産物を、製薬上許容される担体、賦形剤、もしくは添加剤とともに含有する医薬組成物;を含んでなる、前記キット。前記植物ディフェンシンがハナタバコNicotianaalata、ニコチアナスアベオレンスNicotianasuaveolens、ペチュニアPetuniahybridaまたはトマトSolanumlycopersicumに由来し、またはそれらから得ることができる、請求項15に記載のキット。前記植物ディフェンシンがNaD1、NsD1、NsD2、PhD1A、およびTPP3からなる1群から選択される、請求項15に記載のキット。前記植物ディフェンシンが、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、もしくは配列番号26、またはそれらの機能的断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項15に記載のキット。前記植物ディフェンシンが、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、もしくは配列番号27、またはそれらの機能的断片からなる1群から選択される核酸配列、または前記核酸配列のいずれかに対して70同一性を有する機能的核酸配列によってコードされる、請求項15に記載のキット。増殖性疾患ががんである、請求項15~19のいずれか1つに記載のキット。がんが、基底細胞がん、骨肉腫、大腸がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または甲状腺がんからなる1群から選択される、請求項20に記載のキット。増殖性疾患を予防または治療するための請求項15~21のいずれか1つに記載のキットの使用であって、治療上有効な量の:ナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;前記宿主細胞によって産生される発現産物;または前記植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、もしくは発現産物を、製薬上許容される担体、賦形剤、もしくは添加剤とともに含有する医薬組成物;が被験体に投与され、それによって増殖性疾患を予防または治療する、前記使用。増殖性疾患を予防または治療するために使用される医薬組成物であって、その医薬組成物が:ナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;または前記宿主細胞によって産生される発現産物;を、製薬上許容される担体、賦形剤、もしくは添加剤とともに含有する、前記医薬組成物。増殖性疾患を予防または治療するために使用される、ナス科クラスII植物ディフェンシン。ナス科クラスII植物ディフェンシンの哺乳類腫瘍細胞に対する細胞毒性についてスクリーニングするための方法であって、その方法が、ナス科クラスII植物ディフェンシン;ナス科クラスII植物ディフェンシンをコードする核酸;前記核酸を含有するベクター;前記ベクターを含有する宿主細胞;または前記宿主細胞によって産生される発現産物;を、哺乳類細胞株とともにインキュベートすること、ならびに植物ディフェンシンとの接触に起因する哺乳類細胞株に対する細胞毒性についてアッセイすることを含み、それによって、ナス科クラスII植物ディフェンシンの哺乳類腫瘍細胞に対する細胞毒性についてスクリーニングする、前記方法。請求項25に記載の方法でスクリーニングされたナス科クラスII植物ディフェンシン。溶血作用の低下したナス科クラスII植物ディフェンシンを作製するための方法であって、その方法が少なくとも1つのアラニン残基を、植物ディフェンシンのN末端もしくはその近傍に導入することを含む、前記方法。請求項27に記載の方法により作製された、溶血作用の低下したナス科クラスII植物ディフェンシン。実施例のいずれか1つもしくはいくつかに準拠して実質的に本明細書に記載される、溶血作用の低下したナス科クラスII植物ディフェンシン。発明の詳細な説明驚くべきことに、本発明者らは、γチオニンとしても知られるディフェンシンが、強力な細胞毒性作用を有することを見いだした。これらの重要な知見は、増殖性疾患を予防および治療することができる新規の重要な方法を説明する。したがって、これらの知見は、がんなどの増殖性疾患の予防もしくは治療のための方法、ならびに関連する使用、システムおよびキットを提供する。たとえば、NaD1は、ハナタバコNicotianaalataの花組織から単離された植物ディフェンシンである。NaD1のアミノ酸配列およびコード配列は、国際特許公開公報WO02063011に公表されており、その内容は全体を参考として本明細書に含めるものとする。NaD1などの活性ディフェンシンを大量に作製できることは、臨床の場で治療として使用する可能性を考慮すると、根本的に重要である。天然起源観賞用タバコであるハナタバコNalataの花から、必要とされる大量のNaD1を精製することは、実現不可能であり、活性のある組換えタンパク質を作製する必要がある。活性のある精製組換えNaD1を高レベルで作製するために、一定のタンパク質精製法と組み合わせたPichiapastoris発現系を確立することに成功した図1A、B。組換えNaD1は、天然型NaD1と類似した折り畳み構造を有し図1C、Fオキシスポルムの菌糸増殖を阻害する能力を保持している図1D。これらのデータは、NaD1などの活性のある精製組換えディフェンシンを大量に生産するための効率的なシステムの確立を実証する。天然型および組換えNaD1は、invitroで、低いμM濃度で腫瘍細胞を選択的に死滅させることが示された図2AF。種々の組織を起源とするさまざまなヒト腫瘍細胞株前立腺がんPC3、結腸がんHCT116、乳がんMCF7、およびメラノーマMM170、およびマウスメラノーマ細胞株B16F1はすべて、天然型もしくは組換えNaD1のいずれによっても同様の効率で死滅し、IC50は2から45μMの間であった。正常な初代細胞ヒト冠動脈平滑筋または臍帯静脈内皮細胞も、天然型もしくは組換えNaD1によって死滅するが、腫瘍細胞株より有意に高濃度IC50は7512μMを必要とした。これらのデータから、NaD1などの植物ディフェンシンが、特定の低いμM濃度で使用される場合、腫瘍細胞を選択的に死滅させるが正常細胞は死滅させないように適用することができる抗がん剤として可能性を示すことが示唆された。NaD1ナス科クラスIIディフェンシンとは対照的に、ナス科クラスIディフェンシンNaD2またはプロテアーゼインヒビターStPin1Aは、腫瘍細胞を死滅させる能力を示さなかった図2AIが、これは、クラスIIディフェンシンが腫瘍細胞を死滅させる固有の可能性を有することを示唆する下記でさらに検討する。還元型およびアルキル化型のNaD1は腫瘍細胞の生存に影響を及ぼさなかったが、これは、インタクトな三次構造がNaD1の腫瘍細胞への細胞毒性に決定的に重要であることを示す。NaD1の腫瘍細胞に対する作用メカニズムを検討し、細胞膜の透過性に関与することが明らかになった。蛍光色素PIの取り込み図3A、3B、およびATPの放出図3C、3Dのどちらにも関与しうるNaD1の能力によって実証されるように、NaD1は、用量依存的に、ヒト腫瘍細胞株U937およびMM170を透過性にした。腫瘍細胞の透過化は急速で、ATPは細胞への添加後すぐに放出され、約5分でATP放出がピークになった。還元型もしくはアルキル化型NaD1は、腫瘍細胞を透過性にすることができなかった図3D。NaD1の腫瘍細胞透過化作用に関するさらなる裏付けは、走査電子顕微鏡を用いた、NaD1で処理したヒト前立腺がんPC3細胞の検査によって与えられた図3E。これらのデータは、NaD1が、細胞膜を迅速に不安定化して、細胞の透過化を引き起こすことによって、腫瘍細胞を死滅させることを示す。NaD1の作用メカニズムに関する理解は、ディフェンシンを単独で、または他の抗がん剤と併用して、治療に使用するために有用な情報を与える。NaD1などのディフェンシンを抗がん剤として適用する可能性は、ディフェンシンが血清血漿中で活性を保持すること、ならびに赤血球への溶解活性を示さないことも必要とする。NaD1は、ヒト赤血球RBCに対して、invitroで腫瘍細胞を死滅させるために必要とされる濃度で、溶血作用を示さなかった。125μM以上の濃度で、天然型NaD1は溶血作用を示し、100μMで約50のRBC溶解を示し最大となった。意義深いことに、組換えNaD1は、100μMに達するまで高濃度でも溶血作用を示さなかった図4。天然型および組換えNaD1は、組換えNaD1のN末端への、1つのアラニン残基の付加により、一次アミノ酸配列が異なっている。天然型と組換えNaD1の間には大きな構造的相違はないように思われ図1C、どちらも腫瘍細胞の透過化には非常によく似た活性を示すので、組換えNaD1のN末端の付加アラニンが、NaD1の溶血作用の喪失の原因となった可能性がある。このように、N末端にアラニンを有するNaD1のような組換えディフェンシンを作製することは、最小限の溶血作用を伴う治療法として適用するという観点から、天然型ディフェンシン配列よりかなり有利であると予想される。天然型および組換えNaD1が40以下の血清の存在下で腫瘍細胞を死滅させる能力を保持していることに留意すべきである図5。多くのカチオン性ペプチドは、血清存在下で腫瘍細胞透過化作用が大きく低下することが明らかになっており、治療薬として無効になるので、血清存在下でNaD1が腫瘍細胞透過化作用を保有することは、重要な所見である。NaD1のようなディフェンシンの抗がん剤としての可能性は、マウスでのメラノーマ増殖のinvivoモデルにおいてさらに実証された。固形の進行B16F1腫瘍を、1mgNaD1体重kgの腫瘍内直接注入によって処置した結果、還元型およびアルキル化NaD1不活性または溶媒のみで処置した腫瘍と比べて、腫瘍増殖が有意に減少した図6。その上、NaD1は、300mgNaD1体重kg以下で経口投与される場合、有害な作用がないことが判明した。本明細書に記載のデータは、低いμM濃度でinvitro腫瘍細胞選択性が広範であること、血清存在下で活性を保持すること、ならびに溶血作用のないことを示すので、NaD1のようなディフェンシンは、抗がん剤として有望なモデルとなる。NaD1相互作用分子候補の研究は、NaD1のリガンドとしてリン脂質の同定に至った。NaD1は、さまざまなホスホイノシチド、ならびにホスファチジルセリンPS、ホスファチジルアラニンPA、ホスファチジルグリセロールPG、およびスルファチドと、特異的に結合することが判明した図7AC。天然型および組換えNaD1はいずれも、非常に類似した脂質結合特異性を示した図7C。興味深いことに、クラスIディフェンシンNaD2もリン脂質と結合することが判明したが、NaD1とははっきり異なる特異性を有しており、強い結合がPAに対して観察されたが、NaD1との結合が示されたホスホイノシチドの多くに対しては観察されなかった図7DF。こうした特定のリン脂質とのNaD1の相互作用が、NaD1の腫瘍細胞傷害作用の一因となっている可能性がある。また、NaD1の還元およびアルキル化がリン脂質との結合を失う結果をもたらすことに留意すべきである図7G。これらのデータは、NaD1の三次構造がリン脂質結合にも、抗腫瘍活性にも必須であることを示唆する。ナス科クラスIIディフェンシンNaD1は腫瘍細胞を死滅させることができるがクラスIディフェンシンNaD2はできないことから、ナス科クラスIIディフェンシンが腫瘍細胞に対して特有の細胞障害作用を有する可能性が示唆された。実際、ナス科クラスIIディフェンシンTPP3およびPhD1Aはいずれも、NaD1と類似した腫瘍細胞透過化作用を有することが判明した図9AD。NaD1について記載したように、TPP3およびPhD1Aも、血清存在下で腫瘍細胞透過化作用を保持していることが判明した図11AおよびB。それに対して、非ナス科クラスIディフェンシンDmAMP1、γ1H、およびγ2Zは、腫瘍細胞透過化作用を示さなかった図10。腫瘍細胞を死滅させる能力がナス科クラスIIディフェンシンに特有であって、クラスIディフェンシンはそうでないことをさらに裏付ける証拠は、クラスIIディフェンシンNaD1およびNsD2は腫瘍細胞を透過化したが、クラスIディフェンシンNsD3は透過化しなかったことで示される図12。また、観察された、ヒト赤血球に対するNaD1の溶血作用の喪失は、他のクラスIIディフェンシンでも維持されることに留意すべきである。NsD1、NsD2、およびPhD1Aはすべて、30μMの濃度以下ではPBC溶解能力を示さないか、ごくわずかに示した図13。さらに、クラスIIディフェンシンNaD1およびクラスIディフェンシンNaD2について確認された、はっきり異なるリン脂質特異性パターン図7は、他のナス科クラスIおよびIIディフェンシンについても観察された。クラスIIディフェンシンNsD1、NsD2、TPP3、およびPhD1Aはすべて、概してホスホイノシチドとの結合を優先する傾向を示した図14AB、DEが、クラスIディフェンシンNaD3はPAともっとも強く結合した図14C。増殖性疾患の予防もしくは治療に使用するための植物ディフェンシン本発明は増殖性疾患の予防もしくは治療に使用するための植物ディフェンシンを提供する。ある実施形態において、植物ディフェンシンは任意の植物γチオニンである。他の実施形態において、植物ディフェンシンは、少なくとも8個の基準のシステイン残基を有するが、これらはCysICysVIII、CysIICysIV、CysIIICysVI、およびCysVCysVIIの配置でジスルフィド結合を形成している。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシンは、C末端プロドメインもしくはプロペプチドCTPPを有する、またはかつて有していた、クラスII植物ディフェンシンである。具体的な実施形態において、植物ディフェンシンは、ナス科Solanaceae、イネ科Poaceae、またはキク科Asteraceaeに由来し、またはそれらから得ることができる。ある実施形態において、植物ディフェンシンは、CcD1NCBIデータベース受入番号AF128239ではない。好ましい実施形態において、植物ディフェンシンは、CysICysVIII、CysIICysIV、CysIIICysVI、およびCysVCysVIIのコンフォメーションでジスルフィド結合を形成する少なくとも8個の基準のシステイン残基を有し、しかもC末端プロドメインもしくはプロペプチドCTPPを有する、またはかつて有していたクラスII植物ディフェンシンである。ある実施形態において、植物ディフェンシンは、、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26に記載のアミノ酸配列、またはその断片を含有する。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシンは、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26に記載のアミノ酸配列に対して95、90、85、80、75、70、65、または60同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含有する。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシンは、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、もしくは26に記載のアミノ酸配列に対して99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含有する。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシンは、ナス科クラスIIディフェンシンである。具体的な実施形態において、植物ディフェンシンは、ハナタバコNicotianaalata、ニコチアナスアベオレンスNicotianasuaveolens、ペチュニアPetuniahybrida、トマトSolanumlycopersicum、タバコNicotianatabacum、Nicotianaattenuata、Nicotianaexcelsior、Nicotianapaniculata、ジャガイモSolanumtuberosum、ハバネロCapsicumchinenseまたはトウガラシCapsicumannuumに由来し、またはそれらから得ることができる。より具体的な実施形態において、植物ディフェンシンは、ハナタバコNicotianaalata、ニコチアナスアベオレンスNicotianasuaveolens、ペチュニアPetuniahybrida、またはトマトSolanumlycopersicumに由来し、またはそれらから得ることができる。ある実施形態において、ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1A、TPP3、FST、NatD1、NeThio1、NeThio2、NpThio1、CcD1、PhD1、PhD2、NCBIデータベース受入番号EU367112、EU560901、AF112869もしくはAF112443に記載の配列のいずれかに相当するアミノ酸もしくは核酸配列を有する任意のディフェンシン、またはSolGenomicsNetworkデータベース受入番号SGNU448338、SGNU449253、SGNU448480、SGNU447308、SGNU578020、SGNU577258、SGNU286650、SGNU268098、SGNU268098、SGNU198967、SGNU196048、SGNU198968もしくはSGNU198966に記載の配列のいずれかに相当するアミノ酸もしくは核酸配列を有する任意のディフェンシンからなる1群から選択される。特に好ましい実施形態において、植物ディフェンシンは、NaD1、NsD1、NsD2、PhD1AまたはTPP3である。ある実施形態において、植物ディフェンシンは、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列の断片、または任意の核酸配列の断片もしくは相補体であってもよい。特定の実施形態において、断片は成熟ドメインを含有することができる。好ましい実施形態において、成熟ドメインのアミノ酸配列は、配列番号4、6、10、12、18、22、または26に示される。ある実施形態において、植物ディフェンシンは、単離された、精製された、または組換え型の、植物ディフェンシンとすることができる。特定の実施形態において、組換え植物ディフェンシンは、N末端またはその近傍に追加のアラニン残基を有する。好ましい実施形態において、組換え植物ディフェンシンは、溶血作用が低下している。特に好ましい実施形態において、組換え植物ディフェンシンは、配列番号6、22もしくは26に示すアミノ酸配列、またはその断片を含有する。ポリヌクレオチド本発明の組成物がポリペプチドを含有する実施形態において、本発明はまた、そうしたポリペプチドをコードする核酸、またはその断片もしくは相補体を提供する。そのような核酸は、天然に存在することもあるが、合成または組換えであることもある。ある実施形態において、核酸は、1つもしくは複数のプロモーターと、機能しうるように連結することができる。特定の実施形態において、核酸は、増殖性疾患を予防もしくは治療するポリペプチドをコードすることがある。したがって、ある実施形態において植物ディフェンシンは核酸の形で与えられる。ある実施形態において、植物ディフェンシン核酸は、配列番号1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24もしくは26に示すアミノ酸配列、またはその断片をコードする。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシン核酸は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、もしくは27に示すヌクレオチド配列、またはその断片もしくは相補体を含有する。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシン核酸は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、もしくは27に示すヌクレオチド配列と95、90、85、80、75、70、65、もしくは60同一であるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは相補体を含有する。さらに他の実施形態において、植物ディフェンシン核酸は、配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、もしくは27に示すヌクレオチド配列と99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1同一であるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは相補体を含有する。ベクター、宿主細胞、および発現産物本発明はまた、本明細書に記載の核酸を含有するベクターを提供する。ベクターは、外来配列の挿入、細胞内への導入、および導入された配列の発現に適した、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または他の任意の適当な伝達体とすることができる。ベクターは真核生物発現ベクターであってもよく、プロモーターのような発現調節およびプロセシング配列、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、ならびに転写終結配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、ベクターは、本明細書に記載の植物ディフェンシンのうち任意の1つもしくは複数を機能しうるようコードする、1つもしくは複数の核酸を含有する。本発明はさらに、本明細書に記載のベクターを含有する宿主細胞を提供する。典型的には、宿主細胞はベクターによって、形質転換、トランスフェクト、または形質導入されるが、それはたとえば、エレクトロポレーション後に形質転換、トランスフェクト、または形質導入された細胞を選択培地上で選択することによる。その結果得られる、ベクターおよびそれに挿入された核酸の形をとる異種核酸配列は、染色体外に維持されるが、相同組換えにより宿主細胞ゲノム内に導入されることもある。このような細胞の形質転換、トランスフェクション、または形質導入のための方法は当業者によく知られている。指針は、たとえば、標準的な指導書であるSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborNewYork1989、およびAusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublAssocandWileyIntersciences1992などから得ることができる。本発明はさらに、本明細書に記載の宿主細胞の発現産物を提供する。ある実施形態において、発現産物は、増殖性疾患を予防もしくは治療するポリペプチドとすることができる。好ましい実施形態において、発現産物は本明細書に記載の植物ディフェンシンのいずれか1つもしくはいくつかである。組成物本発明はまた、増殖性疾患の予防もしくは治療用の医薬組成物を提供するが、この医薬組成物は、本明細書に記載の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、または発現産物を、製薬上許容される担体、賦形剤もしくは添加剤とともに含有する。したがって、本発明の組成物は、治療のために投与することができる。そうした適用において、組成物は、すでに疾患に罹患している被験体に、その疾患および合併症を治癒させるのに十分な量、または少なくともある程度は抑えるのにじゅうぶんな量を、投与することができる。組成物の量は、患者を効果的に治療するのに十分であるべきである。組成物は、当業者に知られている方法にしたがって調製することができるが、それに応じて、化粧品もしくは医薬品として許容される担体、添加剤もしくは賦形剤を含有することができる。投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者には明白であって、たとえばRemingtonsPharmaceuticalScience15thedMackPublishingCompanyEastonPaにより詳細に記載されており、これは参考として本明細書に含めるものとする。組成物は、アニオン性、カチオン性、もしくは非イオン性界面活性剤のような任意の適当な界面活性剤、たとえばソルビタンエステルもしくはそのポリオキシエチレン誘導体などを組み込むことができる。懸濁剤、たとえば天然ガム、セルロース誘導体、またはシリカsilicaceoussilicasなどの無機材料、およびラノリンなどの他の成分も含有することができる。組成物はまた、リポソームの形で投与することができる。リポソームはリン脂質もしくは他の脂質材料から得られ、水性溶媒中に分散したモノもしくはマルチラメラ水和液晶によって形成することができる。リポソームを形成することができる、毒性のない、生理的に許容される、代謝可能な脂質であればどれも使用することができる。リポソーム型の組成物は、安定化剤、防腐剤、および添加剤を含有することができる。好ましい脂質としては、リン脂質およびホスファチジルコリンレシチンがあり、天然でも合成でもよい。リポソームを作製するための方法は当技術分野で知られており、これについては特にPrescottEdMethodsinCellBiologyVolumeXIVAcademicPressNewYorkNYp33以下参照、に言及するが、その内容は参考として本明細書に含めるものとする。ある実施形態において、組成物は、錠剤、液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、または乳剤の形をとることができる。投与量任意の個別の患者に対する治療上有効な用量レベルは、さまざまな要因に応じて決まってくるが、こうした要因には、治療すべき疾患、疾患の重篤度、用いられる化合物もしくは薬剤の活性、用いられる組成物、患者の年齢、体重、全身健康状態、性別、および食習慣、投与時間、投与経路、植物ディフェンシンまたは組成物の除去率、治療の持続期間、および治療と併用して、または治療と同時に使用される任意の薬物が、当技術分野でよく知られているほかの関連要因とともに、含まれる。したがって、当業者は、通常の実験によって、適用可能な疾患を治療するために必要とされる、有効で毒性のない植物ディフェンシンもしくは組成物の量を決定することが可能となる。典型的には、治療適用において、治療は病状の持続する間、行われることになる。さらに、組成物の個別投薬の最適な量および間隔が、治療すべき疾患の性質および程度、投与の形態、経路、および部位、ならびに治療すべき特定の個人の性質によって決まってくることは当業者にとって明白である。また、こうした最適条件は、従来の技術で決定することもできる。最適な治療コース、たとえば決められた日数の間、1日あたり与えられる組成物の投与回数を、当業者が従来の治療コース決定試験を用いて確認できることも当業者にとって明白である。重量については、患者に投与するための組成物の治療上有効な用量は、24時間につき体重kgあたり約001mgから約150mgまでであると予想されるが;典型的には24時間につき体重kgあたり約01mgから約150mgまで;24時間につき体重kgあたり約01mgから約100mgまで;24時間につき体重kgあたり約05mgから約100mgまで;または24時間につき体重kgあたり約10mgから約100mgまでの範囲内であると予想される。より典型的には、有効な用量範囲は、24時間につき体重kgあたり約5mgから約50mgまでの範囲内であると予想される。あるいはまた、有効な投与量は、約5000mgm2以下とすることができる。概して、有効な投与量は、約10から約5000mgm2まで、典型的には約10から約2500mgm2まで、約25から約2000mgm2まで、約50から1500mgm2まで、約50から1000mgm2まで、または約75から約600mgm2までの範囲内であると予想される。投与経路本発明の組成物は、標準的な経路で投与することができる。一般に、組成物は非経口たとえば、静脈内、脊髄内、皮下、もしくは筋肉内、経口、または局所経路で投与することができる。ほかの実施形態において、組成物は、ほかの経腸腸内経路、たとえば直腸、舌下もしくは口唇下、または中枢神経系を経て、たとえば硬膜外、脳内もしくは脳室内経路で、投与されることもある。ほかの投与部位としては、皮膚上、経皮、皮内、経鼻、動脈内、心臓内、骨内、くも膜下腔内、腹腔内、膀胱内、硝子体内、陰茎海綿体内、膣内、または子宮内経路を挙げることができる。担体、添加剤、および賦形剤担体、添加剤、および賦形剤は、組成物の他成分と融和性であって、レシピエントにとって有害でないという点で許容できるものでなければならない。こうした担体、添加剤および賦形剤は、本発明の組成物の完全性を高め、半減期を増やすために使用することができる。これらはまた、本発明の組成物の生物学的活性を増強または保護するために使用することができる。製薬上許容される担体または賦形剤の例は、脱塩水もしくは蒸留水;食塩水;植物油、たとえばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、コーン油、ゴマ油、ラッカセイ油、もしくはヤシ油;ポリシロキサンなどのシリコーン油、たとえばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、およびメチルフェニルポリシロキサン;揮発性シリコーン;鉱油、たとえば流動パラフィン、軟パラフィン、もしくはスクアラン;セルロース誘導体、たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース;低級アルカノール、たとえばエタノールもしくはイソプロパノール;低級アラルカノール;低級ポリアルキレングリコール、もしくは低級アルキレングリコール、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、13ブチレングリコール、もしくはグリセリン;脂肪酸エステル、たとえばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、もしくはオレイン酸エチル;ポリビニルピロリドン;寒天;トラガカントゴム、またはアカシアゴム、およびワセリンである。典型的には、1つもしくは複数の担体が、重量比で組成物の10から999を構成する。本発明の組成物は、注射による投与に適した形態、経口摂取に適した製剤たとえばカプセル、錠剤、カプレット、エリキシル剤などの形態、局所投与に適した軟膏、クリームもしくはローション剤の形態、鼻内吸入もしくは経口吸入などの吸入による投与に適したエアロゾル形態、非経口投与、すなわち皮下注射、筋肉注射もしくは静脈注射に適した形態をとることができる。注射可能な溶液もしくは懸濁液として投与するために、毒性のない許容される賦形剤もしくは担体として、リンゲル液、等張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび12プロピレングリコールを挙げることができる。増殖性疾患を予防もしくは治療するための方法本発明は、増殖性疾患を予防もしくは治療するための方法を提供するが、その方法は、本明細書に記載のように、治療上有効な量の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、または医薬組成物を被験体に投与し、それによって増殖性疾患を予防もしくは治療することを含む。本発明はまた、増殖性疾患を予防もしくは治療するための薬剤の調製における、本明細書に記載の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、および発現産物の使用を提供する。ある実施形態において、増殖性疾患は、血管新生疾患、転移性疾患、腫瘍形成疾患、腫瘍性疾患およびがんからなる1群から選択される細胞増殖性疾患とすることができる。ある実施形態において、増殖性疾患はがんとすることができる。具体的な実施形態において、がんは、基底細胞がん、骨肉腫、大腸がん、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、白血病、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または甲状腺がんからなる1群から選択することができる。ほかの実施形態において、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、AIDS関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、B細胞リンパ腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨肉腫、大腸がん、脳幹グリオーマ神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、気管支腺腫カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、大脳星状細胞腫悪性神経膠腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚T細胞性リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣細胞腫、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、眼球内黒色腫網膜芽細胞腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍GIST、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、胃カルチノイド、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞肝臓がん、下咽頭がん、視床下部および視経路グリオーマ、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭がん、白血病急性リンパ芽球性急性骨髄性慢性リンパ球性慢性骨髄性ヘアリー細胞、口唇およびまたは口腔がん、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫AIDS関連バーキット皮膚T細胞ホジキン非ホジキン原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫形質細胞種、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成骨髄増殖性疾患、骨髄性myelogenous白血病、骨髄性myeloid白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔およびまたは副鼻腔がん、鼻上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、上皮性卵巣がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵島細胞がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫およびまたはテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚がん非黒色腫、皮膚がん黒色腫、皮膚がんメルケル細胞、小細胞肺がん、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮細胞がん、原発不明転移性頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫およびまたは胸腺がん、甲状腺がん、移行性がん、絨毛性腫瘍、尿管およびまたは腎盂がん、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、膣がん、視経路および視床下部膠腫、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍からなる一群から選択することができる。キット本発明は、増殖性疾患を予防もしくは治療するためのキットを提供するが、このキットは、本明細書に記載の、治療上有効な量の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、または医薬組成物を含む。本発明はまた、増殖性疾患を予防もしくは治療するための、本明細書に記載のキットの使用を提供するが、この場合、本明細書に記載の、治療上有効な量の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、または医薬組成物を被験体に投与し、それによって、増殖性疾患を予防もしくは治療する。本発明のキットは、本発明の方法の使用を容易にする。典型的には、本発明の方法を実施するためのキットは、本発明の方法を実施するのに必要な試薬をすべて含んでいる。たとえば、ある実施形態において、キットは、本明細書に記載の植物ディフェンシン、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、発現産物、または医薬組成物を含有することができる。典型的には、本明細書に記載のキットはまた、1つもしくは複数の容器を含む。本発明に関して、区分されたキットとしては、化合物もしくは組成物を別々の容器に入れた任意のキットが挙げられ、これは小ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙のストリップを含んでいてもよい。こうした容器は、サンプルの二次汚染を回避する一方で、化合物もしくは組成物を1つの区画から別の区画へ効率よく移すこと、ならびに各容器の薬剤もしくは溶液を、一方の容器から別の容器に定量的に添加することを可能にする。典型的には、本発明のキットは、適当な方法を実施するためにキットの構成成分を使用するための使用説明書も含んでいることがある。本発明の方法およびキットは、ヒトおよび他の動物、たとえばヒト以外の霊長類、ウマ科、ウシ亜科、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、鳥類、ネコ科およびイヌ科の種を含む、いかなる動物にも等しく適用可能である。したがって、異なる種に適用するために、本発明の単一のキットが適用可能である場合もあるが、あるいはまた、たとえば、それぞれ個々の種に特異的な化合物もしくは組成物を含有する、別の異なるキットが必要とされることもある。本発明の方法およびキットは、増殖性疾患を予防もしくは治療することが望ましい、いかなる状況にも応用される。組成物の前駆体およびモジュレーターのスクリーニング本発明は、哺乳類腫瘍細胞に対する植物ディフェンシンの細胞毒性をスクリーニングするための方法を提供するが、その方法は、本明細書に記載の植物ディフェンシン、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物もしくは医薬組成物を、哺乳類細胞株と接触させること、ならびに植物ディフェンシンとの接触に起因する、哺乳類細胞株に対する細胞毒性をアッセイすることを含む。本発明はまた、本明細書に記載の核酸およびその断片もしくは相補体を使用して、当業者によく知られている組換えDNA法によって、対応する部分配列および完全配列を他の種から同定して得ることを検討するものであって、その方法にはサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、および遺伝子マッピング法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の核酸およびその断片は、当業者に知られている技法を用いて、アンチセンス分子の作製にも使用することができる。したがって、本発明は、相同配列を同定するためのプライマーおよびプローブとして使用するために、本明細書に記載の核酸の配列に基づくオリゴヌクレオチドおよび断片を検討する。オリゴヌクレオチドは、PCRなどの核酸増幅反応に使用するのに適した、短い一続きのヌクレオチド残基であって、典型的には少なくとも約10ヌクレオチドから約50ヌクレオチドの長さであり、より典型的には約15から約30ヌクレオチドまでの長さである。プローブは、さまざまな長さのヌクレオチド残基であるが、たとえば、約10ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの間であって、典型的にはハイブリダイゼーションによる相同配列の検出に使用するためのものである。配列間の相同性のレベル配列同一性は、大部分はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって決まってくる。詳細には、プローブとして使用されるヌクレオチド配列は、ストリンジェンシーの低い、中程度の、または高い条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドのホモログ、もしくは他の機能的に同等なバリアントとハイブリダイズすることができる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、2xSSC中50°Cで実施されるハイブリダイゼーションに相当するといえる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変更するために利用することができる、当業者によく知られた、数多くの条件および要因が存在する。たとえば、特定の核酸とハイブリダイズする核酸の長さおよび特質DNA、RNA、塩基組成;塩濃度および他の化合物濃度、たとえば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールなどの有無;ならびにハイブリダイゼーションの温度およびまたは洗浄ステップの変更。たとえば、ハイブリダイゼーションフィルターは、2XSSC、05SDS中で30分間、ならびに少なくとも55°C低ストリンジェンシー、少なくとも60°C中程度のストリンジェンシー、少なくとも65°C中高ストリンジェンシー、少なくとも70°C高ストリンジェンシー、または少なくとも75°C非常に高いストリンジェンシーで2回、洗浄することができる。好ましい実施形態において、ディフェンシンは、MTT325ジフェニルテトラゾリウム臭化物アッセイを用いてスクリーニングされる。MTTアッセイは、当業者が細胞の生存および増殖を評価することを可能にする。したがって、それを用いて、治療薬となる可能性のある薬剤の細胞毒性を、そうした薬剤が細胞の生存および増殖を促進するか阻害するかということに基づいて、判定することができる。アッセイにおいて、MTTは生細胞では紫色のホルマザンに還元される。可溶化溶液通常ジメチルスルホキシド、酸性エタノール溶液、または希塩酸中の界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム溶液のいずれかを添加して、不溶性の紫色のホルマザン生成物を溶解させて、着色溶液とする。この着色溶液の吸光度は、分光光度計で一定の波長通常500から600nmで測定することで数値化することができる。最大吸収は、使用される溶媒によって決まる。本発明はまた、増殖性疾患の予防もしくは治療に使用するために、本明細書に記載の方法でスクリーニングされた植物ディフェンシンを提供する。溶血作用の低下した植物ディフェンシンを作製するための方法本発明は、溶血作用の低下した植物ディフェンシンを作製するための方法を提供するが、その方法は、少なくとも1つのアラニン残基をディフェンシンのN末端で、またはその近傍で、植物ディフェンシンに導入することを含む。当業者には当然であるが、そうしたN末端アラニンの付加を達成するために、いくつかの方法、たとえば、部位特異的変異誘発、相同組換え、トランスポゾン、および非相同末端結合などを使用することができる。植物ディフェンシンの溶血作用が結果として、溶血作用を低下させるよう改変されていない対応する植物ディフェンシンの使用によって生じる、もしくは生じると合理的に予想されるよりも、相対的に少ない溶血をもたらすならば、溶血作用が低下したと見なすことができる。本発明はまた、本明細書に記載の方法で作製された、溶血作用の低下した植物ディフェンシンを提供する。併用療法当業者には当然のことながら、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物は、本明細書に記載の1つもしくは複数のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物を本明細書に記載の方法への他の治療アプローチと併せて使用する、併用療法アプローチの一環として投与することができる。こうした併用療法のために、併用の各成分は、望ましい治療効果を与えるように、同時に投与しても、任意の順序で順次投与しても、別の時に投与してもよい。別々に投与される場合、成分は、同じ投与経路で投与されることが好ましいかもしれないが、ただし、これがその通りであることは必要ではない。あるいはまた、成分は、併用製品として、1回分の投与単位の中に一緒に製剤されていてもよい。本発明の組成物と併用して使用することができる適当な薬剤は、当業者に知られており、たとえば、化学療法剤、ラジオアイソトープ、および抗体などの標的療法が含まれる。本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物と併用して使用される化学療法薬としては、アルキル化薬、たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、およびイホスファミド、代謝拮抗薬、たとえば、プリンもしくはピリミジン、植物アルカロイドおよびテルペノイド、たとえば、ビンカアルカロイドビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンなどおよびタキサンパクリタキセル、およびドセタキセルなど、ポドフィロトキシン、トポイソメラーゼ阻害薬、たとえばイリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシド、抗悪性腫瘍薬、たとえば、ドキソルビシン、エピルビシン、およびブレオマイシン、ならびにチロシンキナーゼ阻害薬を挙げることができる。本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物と併用して使用される標的療法としては、たとえば、メシル酸イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、トラスツズマブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、テムシロリムス、エベロリムス、ボリノスタット、ロミデプシン、ベキサロテン、アリトレチノイン、トレチノイン、ボルテゾミブ、プララトレキサート、ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、リツキシマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、131lトシツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、デニロイキンディフティトックス、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、およびレトロゾールが挙げられる。他の療法も、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物と併用して使用することができるが、これにはたとえば、外科的介入、食事療法およびサプリメント、催眠療法、代替医療、および理学療法が含まれる。治療時期当業者には当然のことながら、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物は、そうした治療のために現在用いられている治療法の補完として、診断時に、またはその後に、たとえば追跡治療もしくは地固め療法として、単独の薬剤として投与してもよいが、本明細書に記載の方法への併用療法アプローチの一部として投与してもよい。本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、発現産物、および組成物はまた、遺伝的または環境的にそうした疾患を発症しやすい被験体に対する予防的治療として使用することもできる。当業者には当然のことであるが、本明細書に記載のさまざまな特徴を組み合わせて、本発明の範囲に含まれる特徴の組み合わせを構成することができる。本発明は、ここで、以下の実施例に準拠してさらに説明することとするが、この実施例は単に説明のためのものであって、限定するものではない。実施例材料および方法ハナタバコNicotianaalataからのNaD1の精製NaD1をその天然起源から単離するために、前述Layetal2003aのように、花の発生の花弁呈色期までのハナタバコNalataの花全体を微粉末に粉砕し、希硫酸で抽出した。手短に述べると、花湿重量760gを液体窒素中で凍結し、すり鉢とすりこぎで微粉末にまで粉砕し、50mM硫酸中生重量g当たり3mLで、5分間、UltraTurraxホモジナイザーを用いてホモジナイズした。4°Cにて1時間撹拌した後、細胞残渣をMiraclothCalbiochemSanDiegoCAによる濾過、および遠心分離25000xg、15分、4°Cによって除去した。その後10MNaOHを添加してpHを調整し、抽出物を4°Cで1時間撹拌した後、遠心分離25000xg、15分、4°Cして、沈殿したタンパク質を除去した。上清18Lを、10mMリン酸ナトリウムバッファーであらかじめ平衡化したSPSepharose商標名FastFlowカラム25x25cmにアプライした。20カラム容の10mMリン酸ナトリウムバッファーpH60で洗浄することによって未結合タンパク質を除去し、結合したタンパク質は、500mMNaClを含有する10mMリン酸ナトリウムバッファーpH60で、3x10mL画分中に溶出された。各精製ステップのサンプルを、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSPAGE、および抗NaD1抗体によるイムノブロッティングによって分析した。SPSepharoseカラムから得られたNaD1含有画分を、逆相高速液体クロマトグラフィーRPHPLCにかけた。逆相高速液体クロマトグラフィー検出器モデル166Beckmanに接続したSystemGoldHPLCで、ガードカラムを付けた調製用C8カラム22x250mmVydacを用いて、逆相高速液体クロマトグラフィーRPHPLCを行った。タンパク質サンプルは、バッファーA01vvトリフルオロ酢酸でロードし、1100バッファーB0089vvトリフルオロ酢酸中60vvアセトニトリルの直線勾配で、40分かけて10mL分の流速で溶出した。タンパク質は、215nmの吸光度をモニターすることで検出した図1B。タンパク質ピークを集め、SDSPAGEで分析した。DaN1精製の各段階のサンプル30μLを、NuPAGE登録商標LDSサンプルローディングバッファー10μL、Invitrogenに添加し、10分間70°Cに加熱した。その後サンプルをNuPAGE登録商標プレキャスト412ビスTrisポリアクリルアミドゲル上にロードし、200Vで作動するXCellSurelock電気泳動装置を用いてタンパク質を分離した。CoomassieBlue染色でタンパク質を可視化し、または抗NaD1抗体によるイムノブロッティングのためにニトロセルロース上に移した。他のディフェンシンNsD1、NsD2、PhD1Aの植物からの単離ハナタバコの花からNaD1を精製するための本明細書に記載の手順を用いて、種子または花からディフェンシンを単離した。手短に述べると、種子500gをUltraTurraxホモジナイザーに入れ、微粉末に粉砕した後、50mM硫酸を添加した生重量g当たり4mL。液体窒素中で花を微粉末に粉砕した後、50mM硫酸を添加した生重量g当たり3mL。ホモジナイズを5分間続行した後、ホモジネートをビーカーに移し、4°Cにて1時間撹拌した。細胞残渣をMiraclothによる濾過および遠心分離25000xg、15分、4°Cによって除去した。その後、10MNaOHの添加によりpHを70に調整し、抽出物を4°Cにて1時間撹拌した後、遠心分離して25000xg、15分、4°C、沈殿したタンパク質を除去した。上清を、10mMリン酸ナトリウムバッファーであらかじめ平衡化したSPSepharose商標名FastFlowカラム25x25cmにアプライした。20カラム容の10mMリン酸ナトリウムバッファーpH60で洗浄することによって未結合タンパク質を除去し、結合したタンパク質は、500mMNaClを含有する10mMリン酸ナトリウムバッファーpH60で、3x10mL画分中に溶出された。分析用Zorbax300SBC8RPHPLCカラムおよびAgilentTechnologies1200シリーズシステム、または調製用C8RPHPLCカラムとBeckmanCoulterSystemGoldHPLCを用いて、SPSepharoseカラムから得られた画分を、逆相高速液体クロマトグラフィーRPHPLCにかけた。タンパク質サンプルは、バッファーA01vvトリフルオロ酢酸でロードし、1100バッファーB0089vvトリフルオロ酢酸中60vvアセトニトリルの直線勾配で溶出した。溶出されたタンパク質は、215nmの吸光度をモニターすることで検出した。タンパク質ピークを集め、SDSPAGEおよび質量分析によってディフェンシンを同定した。ピキアパストリスPichiapastorisにおける組換えディフェンシンの発現および精製ピキアパストリス発現系はよく知られており、InvitrogenCarlsbadCA;pPIC9発現ベクターの配列を記載するメーカーのPichiaExpressionManualピキア発現マニュアルを参照されたいから市販されている。NaD1、TPP3、γ2z、γ1H、DmAMP1などの当該ディフェンシンを、pPIC9発現ベクター中にクローニングしたこれらのクローンによってコードされるタンパク質は、それぞれrNaD1、rTPP3、rγ2z、rγ1H、rDmAMP1と命名された。次に、これらの構築物を用いてPpastorisGS115細胞を形質転換した。各クローンのコロニーを用いて、100mLフラスコ内の10mLBMG培地InvitrogenPichiaExpressionManualに記載に接種し、30°Cの振盪培養器140rpmで一晩培養した。その培養物を用いて2Lのバッフル付きフラスコ内の500mLBMG培地に接種し、そのフラスコを30°Cの振盪培養器140rpmに入れた。OD600が20に達したら約18時間、細胞を遠心分離2500xg、10分によって集め、5Lバッフル付きフラスコ内の1LBMM培地中に再懸濁しOD60010、28°Cの振盪培養器で3日間培養した。発現培地を遠心分離4750rpm、20分によって細胞から分離し、等量の20mMリン酸カリウムバッファーpH60で希釈した。培地をNaOHでpH60に調整した後、あらかじめ10mMリン酸カリウムバッファー、pH60で平衡化したSPSepharoseカラム1cmx1cm、AmershamBiosciencesにかけた。その後、カラムを100mLの10mMリン酸カリウムバッファー、pH60で洗浄し、結合したタンパク質を、500mMNaCl含有10mMリン酸カリウムバッファー10mL中に溶出した図1A。溶出されたタンパク質を、本明細書書きの40分の直線勾配でRPHPLCにかけた。タンパク質ピークを集め、SDSPAGE、および抗DaN1抗体によるイムノブロッティングで分析した。ディフェンシンを含有する画分を凍結乾燥し、滅菌MilliQ超純水中に再懸濁した。ピキア発現ディフェンシンのタンパク質濃度は、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンBSAを用いたビシンコニン酸BCAタンパク質アッセイPierceChemicalCoによって測定した。rNaD1の円二色性スペクトルPpastorisから精製されたNaD1rNaD1が正しく折り畳まれているかどうかを調べるために、その遠紫外円二色性CDスペクトルを記録して、天然型NaD1のスペクトルと比較した図1C。2つのスペクトルの類似性は、rNaD1の構造が天然型NaD1と比べて有意に変化しなかったことを示す。rNaD1の抗真菌活性フザリウムオキシスポルムFusariumoxysporumfspvasinfectumの増殖に及ぼすrNaD1の影響を天然型NaD1と比較した。組換えNaD1は、IC50が約16μMの低濃度で抗真菌活性を示した。NaD1はIC50が約10μMで、わずかに、より有効であった図1D。還元型およびアルキル化NaD1の調製凍結乾燥NaD1500μgを400μLストックバッファー200mMTrisHClpH80、2mMEDTA、6M塩酸グアニジン、002vvTween登録商標20中に溶解した。還元バッファー15mMジチオスレイトールDTTを含有するストックバッファーを添加した44μL後、40°Cにて45時間インキュベートした。反応混合物を室温に冷却した後、ヨード酢酸05M、1MNaOH中、55μLを添加し、暗所で室温にて30分間インキュベートを続行した。Nanosepomega登録商標スピンカラム3K分子量カットオフ、PALLLifeSciencesを用いて、塩、DTT、およびヨード酢酸を除去し、タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイPierceを用いて測定した。Fovの増殖に及ぼす還元型およびアルキル化NaD1NaD1RAの影響を本明細書に記載のように評価した。イムノブロット分析イムノブロット分析のために、タンパク質をニトロセルロースに転写し、プロテインA精製抗NaD1抗体13000希釈を75mgmL、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギIgG13500希釈:AmershamPharmaciaBiotechで探索した。高感度ケミルミネッセンス法ECL検出試薬AmershamPharmaciaBiotechを用いて、ChemiGenius商標名バイオイメージングシステムによって、結合した抗体を可視化した。抗NaD1または抗NaD2抗血清を作製するために、HarlowandLaneに記載のようにグルタルアルデヒドを用いて、精製NaD1もしくはNaD215mgを、それぞれキーホールリンペットヘモシアニン05mgSigmaに結合した。等容量のフロイント完全アジュバントSigma中のタンパク質150μgNaD115mLをウサギに注射した。複合タンパク質100μgNaD1またはNaD2およびフロイント不完全アジュバントSigmaAldrichの追加免疫を、4週間後および8週間後に投与した。注射前に免疫前血清を採取し、免疫血清は、3回目および4回目の免疫処置の14日後に採取した。免疫前血清および免疫血清のIgG画分を、ProteinASepharoseCL4Bを用いて精製し、それぞれ34mgmLおよび75mgmLの濃度で80°Cで保存した。rStPin1Aの細菌発現および精製ジャガイモSolanumtuberosumから単離されたI型セリンプロテアーゼ阻害剤StPin1Aは、米国特許第7462695号Insectchymotrypsinandinhibitorsthereofおよび第11753072号MultiGeneExpressionVehicleにPot1Aとしてすでに記載されており、参考として本明細書に組み入れられる。StPin1Aの成熟ドメインをコードするDNA断片を、大腸菌Ecoliでの組換えタンパク質発現用のベクターpHUEにサブクローニングするためにPCR増幅したBakeretal2005Cantanzaritietal2004。以下のプライマー:Sac2StPin1A5’5’CTCCGCGGTGGTAAGGAATCGGAATCTGAATCTTG3’PotISalI3’5’GGTCGACTTAAGCCACCCTAGGAATTTGTACAACATC3’を使用したが、これは、5および3末端にそれぞれSacIIおよびSacI制限酵素部位を組み込んだ。PCR反応には、2xGoTaqMastermix、Sac2PotI5’プライマー、PotISalI3’プライマー、滅菌蒸留水、および鋳型としてpGEMTEasyStPin1AplasmidDNAを入れた。初回の変性は、94°Cで2分間行い、続いて94°Cで1分間、60°Cで1分間、および72°Cで1分間を30サイクル行い、その後、最後の伸長ステップ、72°Cで10分間を行った。PCR産物をpCR21TOPOベクターInvitrogenにクローニングし、次にそれを用いて、化学的コンピテント細胞である大腸菌TOP10Invitrogenをメーカーの使用説明書にしたがって形質転換した。WizardPlusSVMiniprepキットを用いてプラスミドDNAを単離し、TOPO特異的M13フォワードおよびリバースプライマーを用いて、ベクターインサートを配列決定したMacrogen。SacIIおよびSacIを用いてインサートを切り出し、Perfectprepキットを用いてアガロースゲルから抽出し、pHUEにライゲートしたが、次にこれを用いて大腸菌TOP10細胞を形質転換した。StPin1A含有pHUEのプラスミドDNAを抽出した後、大腸菌BL21CodonPlusRIL細胞を形質転換した。形質転換された大腸菌のシングルコロニーを用いて、アンピシリン01mgmL、クロラムフェニコール0034mgmLおよびテトラサイクリン001mgmLを含有する2YT培地10mL、16gLトリプトン、10gL酵母エキス、5gLNaCl20mLに接種し、37°Cにて振盪しながら一晩培養した。この培養物を用いて、抗生物質を含有する新調製2YT培地1Lに接種し、つぎにそれを光学濃度595nmが約08になるまで振盪しながら37°Cで培養した。IPTGを添加し終濃度1mM、培養物をさらに3時間増殖させた。細胞を遠心分離によって集め、TheQiaExpressionistManualで概略が述べられている天然型タンパク質精製プロトコールを用いて、ニトリロ三酢酸ニッケルNiNTA樹脂Qiagenでのアフィニティクロマトグラフィーによって、可溶性組換えタンパク質を精製した。結合したタンパク質は、樹脂から、250mMイミダゾール含有バッファー中に溶出した後、50mMTrisHClおよび300mMNaCl含有溶液中で4°Cにて816時間透析した。脱ユビキチン化プロテアーゼ6HUsp2ccとともに37°Cで1時間インキュベートすることによって、透析された融合タンパク質を切断した。次に、切断されたタンパク質を、検出器モデル166、Beckmanに接続されたSystemGoldHPLC、および調製用C8カラム22x250mmVydacを用いて精製した。タンパク質サンプルは、10mL分の流速で、バッファーA01vvトリフルオロ酢酸中でロードし、5分間の060バッファーBの段階勾配、ならびに20分間の60100バッファーBの段階勾配で溶出した。タンパク質は215nmの吸光度をモニターして検出した。タンパク質ピークを手作業で集め、SDSPAGEで分析した。細胞株および培養本研究に使用した哺乳類細胞株は以下の通りである:ヒト黒色腫MM170細胞、不死化Tリンパ球Jurkat細胞、ヒト白血病単球リンパ腫U937細胞、ヒト前立腺がんPC3細胞、マウス黒色腫B16細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、GAG欠損CHO変異体pgsA745細胞、およびアフリカミドリザル腎臓線維芽細胞COS7細胞。細胞は、組織培養フラスコ内で37°Cにて5CO295空気の加湿環境で増殖させ、増殖速度に応じて週に2、3回、規定通りに継代した。哺乳類細胞はすべて、10熱不活化ウシ胎児血清FBS、Invitrogen、100UmLペニシリンInvitrogen、および100μgmLストレプトマイシンInvitrogenを添加したRPMI1640培地Invitrogen中で培養したが、例外としてCHOおよびPGS細胞は10FBS、100UmLペニシリン、および100μgmLストレプトマイシンを添加したDMEMF12培地DMEMInvitrogen中で培養した。接着細胞株は、025トリプシンおよび05μMEDTAを含有する混合物35mLを添加することでフラスコから剥離した。末梢血単核細胞PBMCのFicollpaqueによる分離PBMCは、Ficollpaque分離後に、細胞濃度1×106PBMCmLとなるよう再懸濁した。手短に述べると、ヘパリン添加チューブに血液を採取し、滅菌1×PBS05BSAで、1→2に希釈した。50mL滅菌チューブを用いて、希釈した血液35mLを15mLficollpaqueに重層し、続いて、1800rpmで30分間遠心分離したブレーキオフ。上部の血漿層を未使用のチューブに取り出し、再度回転させた後、PBMC層を取り出し、1×PBS05BSAをいれた4つのチューブに細胞を分割した。細胞を室温にて1000rpmで10分間回転させ、各チューブのペレットを50mL1×PBS05BSAで3回洗浄した。より多くの血小板を除去するために、800rpmで15分間回転させた。赤血球RBC溶解Ficollpaque分離後、RBCを集め、1×PBSで洗浄し、1000×g、10分間でペレットとした。RBCは処理のために1→10に希釈し、ディフェンシンの濃度を増加させて0100μM、5CO295空気の加湿環境で一晩インキュベートした。24時間インキュベート後、細胞を2000rpmで10分間遠心分離し、上清を1×PBSで1→10に希釈した。赤血球溶解の程度を412nmの吸光度で評価した。MTT細胞生死判別アッセイ腫瘍細胞を4連で、平底96ウェルマイクロタイタープレートのウェル50μLに、2×106細胞個mLから始めてさまざまな密度で接種した。完全培地のみを入れた4つのウェルを、各アッセイにおいてバックグラウンド対照として含めた。マイクロタイタープレートを37°Cにて、5CO295空気を含有する加湿環境下で、一晩インキュベートした後、完全培地100μLを各ウェルに添加し、さらに48時間37°Cにてインキュベートした。細胞生死判別アッセイに最適な細胞密度3050培養密度は、光学顕微鏡によって、各細胞株について決定された。腫瘍細胞を96ウェルマイクロタイタープレート50μLウェルに、上記の細胞最適化アッセイで決定された最適な密度で播種した。同量の完全培地を入れたバックグラウンド対照ウェルn8をこのアッセイに含めた。マイクロタイタープレートを37°Cにて一晩インキュベートした後、さまざまな濃度でタンパク質を添加し、そのプレートをさらに48時間インキュベートした。細胞生存に関する325ジフェニル2HテトラゾリウムブロミドMTTSigmaAldrichアッセイは次のように実施した:MTT溶液1mgmLを各ウェルに添加し100μL、プレートを5CO295空気を含む加湿雰囲気下で37°Cにて23時間インキュベートした。その後、接着細胞株については、培地を除去して、ジメチルスルホキシド100μL、DMSO、SigmaAldrichに置き換え、5分間振盪器に乗せて、テトラゾリウム塩を溶解した。浮遊細胞の場合には、DMSO添加前に、細胞を1500rpmで5分間回転させた。各ウェルの吸光度を570nmで測定し、IC50値細胞増殖を50阻害するタンパク質濃度をOriginSoftwareProgramを用いて決定した。ATPバイオルミネッセンスアッセイATPバイオルミネッセンスアッセイRocheDiagnosticsNSWAustraliaを用いて、透過化された腫瘍細胞によるATPの放出を定量した。ルシフェラーゼ試薬をメーカーの説明書通りに溶解し、4°Cにて5分間インキュベートした。手短に述べると、細胞を1×PBS01BSA中に1×106細胞個mLの濃度で再懸濁し、10μLタンパク質サンプルを入れた空のマイクロタイタープレートNunc商標名のルシフェラーゼ試薬50μLウェルに加えた40μLウェル。一斉にマルチチャンネルピペットを用いて、その混合物を加え90μLウェル、サンプルは直ちにマイクロタイタープレートリーダーで、562nmで30分間読み取り、読み取りは30分間隔で行った。データはSoftMaxPro40ソフトウェアで解析した。蛍光活性化細胞選別FACSによる細胞透過性アッセイ特に指示のない限り、細胞は、10FBS、100UmLペニシリン、および100μgmLストレプトマイシンを添加した完全培地RPMI1640中に4×105細胞個mLの細胞濃度で再懸濁して、V底96ウェルプレートまたは微量遠心管に加えた。細胞は、さまざまな濃度の、または10μMの設定濃度のタンパク質を添加する際に、特に指示のない限り37°Cに維持した。典型的には、細胞は当該タンパク質と混合し、37°Cで30分間インキュベートした。また、ある実施形態において、細胞は、フローサイトメトリー分析前に4°Cまたは37°Cののいずれかで、260分間インキュベートした。等量の2μgmLヨウ化プロピジウムPIAnnexinVFITCApoptosisDetectionKitInvitrogen含有完全培地に細胞を添加し、直ちにFACSCantoセルソーターBectonDicksonFanklinLakesNJおよびCellQuestProSoftwareを用いてフローサイトメトリーで分析した。典型的には、サンプル当たり500010000個の事象を収集し、得られたデータをFlowJoソフトウェアTreeStarAshlandORを用いて解析した。細胞は前方散乱FSCおよび側方散乱SSCに基づいて適切に流路を制御し、生存細胞はPIを排除する能力によって測定された。分析するために、全データは対照に対して標準化された正常細胞は約07の範囲であった。透過化細胞の走査型電子顕微鏡検査走査型電子顕微鏡法を本研究に用いて、NaD110μMで処理した場合のPC3細胞を未処理対照と比較して可視化した。細胞は、いったんインキュベーターから取り出したら、必要になるまで氷上に保持した。小型のガラス製シャーレを、蒸留水に浸した濾紙と重ねて、その後カバーガラスをシャーレ上に載せた。最初の固定の前にサンプルを洗浄バッファー02Mリン酸ナトリウムおよび54グルコースで洗浄し、サンプルを4°Cにて30分間,等量の125グルタルアルデヒドおよび05四酸化オスミウム固定剤中に浸漬した。サンプルは、洗浄バッファーで2回15分間洗浄した後、氷上、遮光気密ガラス製シャーレ内で1時間2オスミウム中に浸漬した。その後の脱水手順の前に、サンプルを洗浄バッファーで3回5分間洗浄した。次にプロトコールの中の脱水ステップを実施したが、これはエタノールEtOH濃度を増加させて、次々と浸漬することを必要とした:50EtOH中1×10分、70EtOH中1×10分、90EtOH中1×10分、95EtOH中1×10分、および最後に100EtOH中2×10分。サンプルの固定および脱水に続いて、凍結乾燥したが、このサンプルは数秒間液体窒素中に浸漬した後、真空蒸発装置Dynavac中の銅製のブロックに入れた。48時間凍結乾燥した後、金属スタブ上にマウントし、デシケーター内に保存した。最後に自動化スパッタ塗布装置SC7640Polaronを用いて、サンプルを金属金およびパラジウムの薄層でコーティングした。高分解能デジタル電界放射型走査電子顕微鏡、FESEMを用いてサンプルを分析した。脂質コート膜ストリップによるアッセイ膜脂質ストリップMembraneLipidStrips商標名、PIPストリップPIPStrips商標名およびスフィンゴストリップSphingoStrips商標名EchelonBiosciencesSaltLakeCityUTをPBS3BSAとともに室温で12時間インキュベートし、非特異的な結合をブロックした。次に膜ストリップを、PBS1BSA中に希釈したディフェンシン012μMとともに、4°Cにて一晩インキュベートした後、PBS01Tween20で室温にて60分間完全に洗浄した。ウサギ抗NaD1ポリクローナル抗体NaD1、NsD1、NsD2、rTPP3、またはPhD1A検出用またはウサギ抗NaD2抗体NaD2またはNsD3検出用いずれの場合もPBS1BSAで12000希釈を用いて4°Cにて1時間、続いてHRP標識ロバ抗ウサギIgG抗体PBS1BSAで12000希釈を用いて4°Cにて1時間、膜ストリップを探索することによって、膜に結合したタンパク質を検出した。それぞれ抗体とインキュベートした後、膜ストリップを室温にてPBS01Tween20で60分間十分に洗浄した。高感度化学発光ECLウェスタンブロッティング試薬GEHealthcareBioSciencesNSWAustraliaを用いて化学発光を検出し、Hyperfilmに露光して、Xomatを用いて現像した。ImageJを用いて、脂質ストリップから得られた画像についてデンシトメトリー分析を行った。手短に述べると、同等な大きさの円が当該領域付近に追跡された。同じ大きさのバックグラウンド円も、脂質が存在せずバックグラウンドとして設定された膜上の領域にあった。当該領域は、バックグラウンドから差し引かれた平均ピクセル強度として数値化された。NaD1のinvitro抗腫瘍活性実施例1:序論腫瘍細胞株および初代ヒト細胞分離株の生存能力に及ぼすNaD1ハナタバコNalataの花由来の精製天然型タンパク質またはPpastorisで作製された精製組換えタンパク質の影響を、325ジフェニル2Hテトラゾリウムブロミドinvitro細胞培養生死判別アッセイによって判定した。テストした腫瘍細胞株は、HCT116ヒト結腸がん、乳がんMCF7ヒト乳がん、MM170ヒト黒色腫、PC3ヒト前立腺がん、および、B16F1マウス黒色腫、CASMCヒト冠動脈平滑筋細胞およびHUVECヒト臍帯静脈内皮細胞である。NaD1は、精製植物タンパク質組換えStPin1ArStPin1AまたはNaD2と並行してテストした。細胞を、次の細胞数で96ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し:MM170、MCF7、HCT116、PC3、B16F1、HUVEC、CASMC、一晩培養した。その後NaD1、rNaD1またはrStPin1Aを終濃度1~100μMとなるよう細胞に添加し、48時間インキュベートしたが、そこで材料および方法に記載のようにMTTアッセイを行った。実施例1:結果NaD1およびrNaD1は調べたすべての腫瘍細胞株の生存率を劇的に低下させ、IC50の値は低いμM濃度25μMであった図2A2E。2つの型のNaD1はいずれも非常によく似た阻害効果を示したが、NaD1はrNaD1よりわずかに大きい活性を有していた図2F。これに対して、植物タンパク質rStPin1Aは、腫瘍細胞の細胞生存に対し有意な影響を示さなかった図2A2E。NaD2同様にハナタバコNalataの花から分離されたナス科クラスIディフェンシンもMM170細胞について調べたが、細胞生存への有意な影響は観察されなかった図2G。NaD1およびrNaD1は、正常なヒトCASMCおよびHUVECの細胞生存も低下させることが明らかになったが、IC50値は腫瘍細胞株に対する値より高かった7512μM図2Hおよび2I。NaD2またはrStPin1Aは、CASMCおよびHUVECの細胞生存に対して有意な影響を示さなかった図2Hおよび2I。NaD1と比べて、還元型およびアルキル化型NaD1NaD1RAは、マウス黒色腫B16F1でテストしたとき、腫瘍細胞生存への影響を示さなかった図2J。これらのデータは、NaD1が天然型も組換え型も、低いμM濃度で腫瘍細胞を選択的に死滅させることを示す。invitroでヒト細胞の透過性に及ぼすNaD1の影響実施例2:序論NaD1は、Foxysporumfspvasinfectumの菌糸を透過性にする能力を有することがすでに示されているvanderWeerdenetal2008。NaD1が真菌と同様の様式で腫瘍細胞を死滅させるのかどうかを判断するために、NaD1が腫瘍細胞を透過化する能力を、2つの異なるアプローチによって評価した。第1は、細胞内ATPの放出を測定するためにバイオルミネッセンスアッセイを利用した。4x104U937またはMM170細胞を、天然型NaD1の濃度を増加させて020μM処理し、ATPの放出を、562nmで吸光度を測定することにより、30秒間隔で全体として30分間測定した。第2のアプローチは、NaD1の濃度を増加させて0100μM30分間細胞を処理した後の、U937およびMM170細胞4x105mLによる蛍光色素ヨウ化プロピジウムPI2μgmLの取り込みを測定するために、フローサイトメトリーを用いた。それに加えて、電界放射型走査電子顕微鏡法FESEMを用いて、腫瘍細胞膜の形態変化を観察した。ヒトPC3細胞前立腺がんをNaD110μMで30分間処理し、または処理せず、その後FESEMのために固定して加工した。実施例2:結果U937およびMM170細胞は、NaD1で処理すると、時間依存性、および濃度依存性のATP放出を示した図3Cおよび3D。いずれの場合も、ATPは、NaD1に暴露してほとんどすぐに、細胞から放出された。NaD1RAは、U937もしくはMM170を透過性にする能力を示さなかった図3D。これらの結果は、NaD1のインタクトな構造が、細胞透過化に必須であって、実施例2に示すように腫瘍細胞を死滅させるNaD1の能力と相関することを示す。NaD1による腫瘍細胞の透過化をさらに調べるために、U937およびMM179細胞を、NaD1の濃度を増加させて0100μM37°Cにて30分間処理した後、PI取り込みをフローサイトメトリーで測定した。NaD1によってもたらされるATPの放出について記載したように、U937およびMM170細胞によるPIの取り込みは、NaD1の濃度増加に伴って増加した。図3AおよびBに記載のように、PIのU937またはMM170細胞数は、さまざまな濃度のNaD1への暴露に際してよく似ており、625μMで約30PIであるが、100μMでは100PIに増加した。NaD1に暴露したPC3細胞のFESEMによる研究は、そうした細胞が未処理細胞に対して明確な形態の差異を示すことを明らかにした。NaD1処理細胞は、未処理細胞の滑らかなインタクトな表面と比べて、歪んだ不規則な細胞表面によって実証されるように、破壊された細胞膜を示した図3E。これらの変化は、細胞膜の不安定化を示し、NaD1が腫瘍細胞の細胞膜を透過性にするという上記の知見を裏付ける。赤血球溶解に及ぼすNaD1および組換えNaD1の影響実施例3:序論濃度を増加させたNaD10100μMとともに107RBCを37°Cにて16時間インキュベートすること、ならびに412nmでの吸光度を測定することによりヘモグロビン放出を測定することによって、天然型NaD1またはrNaD1がヒト赤血球を溶解する能力を調べた。実施例3:結果低濃度125μMのNaD1は、PBSのみの対照と比較して、RBC溶解に影響しなかった。しかしながら、もっと高濃度125100μMのNaD1はRBC溶解を引き起こし、放出されるヘモグロビンのレベルは、水で100完全に溶解を生じさせた陽性対照に対して100μMで最大約50の溶解に達した。これに対して、rNaD1は、100μMに至るまでの濃度で、RBCの溶解能力を示さなかった図4。血清存在下でのNaD1の透過化作用実施例4:序論血清存在下で腫瘍細胞を透過性にするNaD1の能力を評価するために、PI取り込みフローサイトメトリーアッセイを実施例2に記載のように利用したが下記を変更した:4x105mLU937細胞を10μM天然型NaD1とともに、ウシ胎児血清FCS存在下でその濃度を増加させて04060分間インキュベートし、続いて2mgmLPIを添加した。その後PI細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。実施例4:結果NaD1は、40FCS存在下で70のPI細胞が検出されたことから実証されるように、血清存在下でU937細胞を透過性にする能力を保有したが、それは0FCSでの90PI細胞よりごくわずかに低かった。NaD1のinvivo抗腫瘍活性実施例5:序論マウスにおける固形黒色腫増殖のinvivoモデルで、腫瘍増殖に及ぼすNaD1の影響を評価した。C57BL6マウスに5x105B16F1腫瘍細胞を皮下注射し、固形腫瘍を直径約10mmまで増殖させた。次に、50μLPBS中の1mg体重kgのNaD1またはNaD1RA、または50μLPBSのみを2日ごとに、マウスを屠殺するまで腫瘍内に注射した。2日ごとの注射の前に、腫瘍サイズを測定した。各群6匹のマウスを使用した。実施例5:結果1mg体重kgのNaD1の腫瘍内注入は、NaD1RAおよびPBS単独の対照と比較して、腫瘍増殖の有意な減少をもたらした。4日までに、腫瘍サイズは、NaD1RAまたはPBS単独処理マウスについてそれぞれ40±04または37±06であったのと比較してNaD1処理マウスについてはわずか18±02に達していた腫瘍サイズは0日の各マウスについて1に標準化した。B16F1腫瘍は、処置が開始されたとき、高度に進行した段階となっていたことに留意すべきである。マウスにおけるNaD1の急性経口毒性実施例6:序論本研究は、OECDTestGuidelineテストガイドライン423に基づいて行った。同腹に由来する健康な雌C57BL6マウスは、LaTrobeUniversityのCentralAnimalHouse、またはMonashAnimalServicesから入手した。動物は耳パンチによって識別し、研究中はケージ当たり3匹を維持した。動物は、LaTrobeUniversityでの標準的な動物舎の条件にしたがって、ケージ内に3匹のグループで収容され維持される。投与日に、試験マウスは体重を量り、投与前4時間は絶食させた。投与直前に、マウスは再度体重を測定した。タンパク質溶液純粋NaD1の水溶液は、3匹の試験マウスのそれぞれが、0水のみの溶媒対照、20、50、または300mgNaD1体重kgの固定された投与レベルで全体として400μLのタンパク質溶液を受けとるように、投与の少し前に調製した。タンパク質溶液は、先端が円形のカニューラ針を用いて強制経口投与によって投与された。飼料は投与の1時間後に元に戻した。マウスは標準的な齧歯類飼料および水を不断給餌で受け取った。マウスは第1日に投与後4時間の間、1時間に1度観察し、その後は第14日に予定通り屠殺するまで1日2回観察した。肉眼的毒性、薬理学的悪影響、および行動変化の兆候を、飼料および水の消費と同様に、毎日評価して記録した。第7、8、および14日に再度、マウスの体重を測定した。研究最終日第14日に、マウスを二酸化炭素吸入により屠殺し、剖検した。マウスはすべて、肉眼的病理検査を受けた。次の臓器の重さを記録した:脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、消化管、脾臓、および胸腺。その後、サンプルは4vvパラホルムアルデヒド中で固定してから、パラフィン包埋し、切片を作製し、さらにAustralianPhenomicsNetworkUniversityofMelbourneノードで組織病理学検査を行った。消化管は、次のセクションに分けた:胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸。実施例6:結果:体重および臨床的兆候すべての動物は外見上健康であって、肉眼的毒性、薬理学的悪影響、または行動変化の兆候を示さず、研究の終了まで生存した。治療に関係する体重への影響はなく、体重は、研究開始時の絶食前の体重に厳密に一致した。研究終了時に、二酸化炭素窒息によってマウスを屠殺し、次の臓器を採取した:脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、消化管、脾臓、および胸腺。これらの組織は、4vvパラホルムアルデヒド中で固定した。消化管は下記のセクションに分けた:胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸。すべての臓器は、パラフィン包埋して切片を作製し、AustralianPhenomicsNetworkUniversityofMelbourneノードに基づいてヘマトキシリンおよびエオシンおよび、脳切片についてはルクソールファスト青で染色した。タンパク質投与に起因する病的状態はいかなるマウスにおいても観察されなかったが、例外は、300mgNaD1体重kgの最高用量で予想される、胃上皮に対するわずかな炎症であった。NaD1およびNaD2の細胞脂質結合特性実施例7:序論Echelon商標名の3つの異なる市販の脂質ストリップMembrane、PIP、およびスフィンゴ脂質ストリップSphingolipidStripを用いて固体脂質結合アッセイを実施することにより、NaD1およびNaD2と細胞脂質との相互作用を調べた。これらのストリップには、各脂質100pmolが生物学的に活性な形でスポットされている。NaD1、もしくはNaD2、rNaD1もしくはrNaD2012μMを脂質ストリップとともに4°Cにて一晩インキュベートし、NaD1もしくはNaD2に対する特異的ウサギポリクローナル抗体、続いてHRP標識ロバ抗ウサギ抗体で、結合を検出した。NaD1もしくはNaD2結合は、発色した脂質ストリップ上でデンシトメトリーを行うことによって定量した。実施例7:結果NaD1は、PtdInsP2、PtdInsP2、PtdInsP2、およびPtdInsP3などのホスホイノシチドPtdInsPIP2およびPIP3ともっとも強く結合したが、PtdInsP、PtdInsP2、およびPtdInsPなどの、カルジオリピンおよびPtdInsに対しても強い結合を示した図7Aおよび7B。NaD1は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルアラニン、ホスファチジルグリセロール、およびスルファチドに対しても弱い結合を示した図7A、BおよびC。組換えNaD1はNaD1と同様の脂質結合特異性を示したが、例外は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルアラニン、およびホスファチジルグリセロールに対してもっと強い結合が観察されたことである図7G。NaD1RAはいかなる細胞脂質にも結合を示さなかった図7G。NaD2も細胞脂質と結合するが、NaD1とは異なる特異性を有することが明らかとなった。NaD1とは対照的に、NaD2はホスファチジン酸に対して強い結合を示したが、PtdInsP2、PtdInsP2、PtdInsP2、およびPtdInsP3に対しては明確な結合を示さなかった。しかしながら、NaD1と同様に、NaD2もPtdInsP、PtdInsP、およびPtdInsP2に対して結合を示した図7D、EおよびF。以上をまとめると、これらのデータは、関連ディフェンシンNaD1およびNaD2がともに、重複はあるが異なる特異性をもって細胞リン脂質と結合することを示唆する。組換えNaD2は、NaD2と類似した脂質結合特異性を示したが、例外は、ホスファチジルセリンに対してもっと強い結合が観察されたことである図7G。rNaD1とは対照的に、rNaD2は脂質結合を示さなかった図7G。invitroでヒト細胞の透過性に及ぼすペチュニアPetuniahybridaディフェンシンPhD1AまたはトマトSolanumlycopersicumディフェンシンTPP3の影響実施例8:序論ナス科植物の他のディフェンシンも哺乳類腫瘍細胞をNaD1と同様に透過化することができるかどうかを判定するために、ペチュニアPetuniahybridaディフェンシンPhD1AまたはトマトSolanumlycopersicumディフェンシンTPP3がU937細胞を透過性にする能力を、2つのアプローチによって評価した。第1は、細胞内ATPの放出を測定するためにバイオルミネッセンスアッセイを利用した。4x104U937をPhD1AまたはrTPP3とともに、その濃度を増加させて020μM処理し、ATPの放出を、562nmで吸光度を測定することにより、30秒間隔で全体として30分間測定した。第2のアプローチは、濃度を増加させたPhD1A050μMまたはrTPP3040μMで30分間、細胞を処理した後、U9374x105mLによる蛍光色素ヨウ化プロピジウムPI2μgmLの取り込みを測定するために、フローサイトメトリーを用いた。実施例8:結果U937細胞は、PhD1A図9BまたはrTPP3図9Dで処理すると、時間依存性、および濃度依存性のATP放出を示した。NaD1と同様に、ATPは、PhD1AまたはrTPP3に暴露してほとんどすぐに、細胞から放出された。PhD1AまたはrTPP3による腫瘍細胞の透過化をさらに調べるために、U937細胞を、PhD1A050μMまたはrTPP3050μMの濃度を増加させて37°Cにて30分間処理した後、PI取り込みをフローサイトメトリーで測定した。PhD1AまたはrTPP3によってもたらされるATPの放出について記載したように、U937細胞によるPIの取り込みは、PhD1AまたはrTPP3の濃度増加に伴って増加した。図9Aに記載のように、PIのU937細胞数は、625μMで約35であるが、50μMでは約90PIに増加した。TPP3については、PIU937細胞は5μMで約35であるが、40μMでは約90PIに増加した。ナス科および非ナス科ディフェンシンγチオニンによるU937細胞への透過化作用の比較実施例9:序論ナス科クラスIIディフェンシンNaD1、PhD1A、およびTPP3が腫瘍細胞を透過化する能力を、非ナス科ディフェンシンおよび関連γチオニンフジイロテンジクボタンDahliamerckiiディフェンシンDmAMP1、オオムギHordeumvulgareγチオニンγ1H、トウモロコシγチオニンγ2Zと比較して評価するために、PI取り込みフローサイトメトリーアッセイを、下記の変更を行って実施例2に記載のように行った:4x104U937細胞を10μMの各植物ディフェンシンγチオニンNaD1、PhD1A、組換えTPP3、組換えγ1H、および組換えγ2Zとともに60分間血清なしでインキュベートした後、2μgmLPIを添加した。次にPI細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。実施例9:結果3つのナス科クラスIIディフェンシン、NaD1、PhD1AおよびrTPP3はすべて、U937細胞を透過化する能力を示し、それは細胞のみの対照と比較してPI細胞数が有意に増加したことで示された;10μMのNaD1、PhD1AおよびrTPP3処理の結果、5607±365、5707±276、および4997±293PI細胞対照2703±052となった。これに対して、DmAMP1、γ1H、またはγ2Zについては、細胞のみの対照と比べて有意な活性は観察されなかった。血清存在下でのペチュニアPetuniahybridaディフェンシンPhD1AまたはトマトSolanumlycopersicumディフェンシンTPP3の透過化作用実施例10:序論血清存在下で腫瘍細胞を透過性にするPhD1AまたはrTPP3の能力を評価するために、PI取り込みフローサイトメトリーアッセイを実施例2に記載のように用いたが、下記の変更を加えた:4x105mLU937細胞を、ウシ胎仔血清FCS存在下でその濃度を増加させて040、10μMPhD1AまたはrTPP3とともに60分間インキュベートした後、2μgmLPIを添加した。その後PI細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。実施例10:結果PhD1AおよびrTPP3はいずれも血清存在下でU937細胞を透過性にする能力を、活性は低下するものの保持していた。PhD1Aに関して、0FCSでは90PI細胞であるのに対して、40FCS存在下では40PI細胞が検出された図11A。組換えTPP3は、540FCSの存在下で最大70の活性を保持することで示されるように、血清存在下でPhD1Aより強い活性を示すと思われた図11B。0FCSでPI陽性細胞レベルが高いのは、血清がまったく存在しないことの結果である点に留意すべきである。invitroでのヒト腫瘍細胞の透過化に及ぼす天然型タバコNicotianasuaveolensディフェンシンNsD1、NsD2、およびNsD3の影響実施例11:序論ナス科の他のクラスIIディフェンシンもNaD1と同様に哺乳類腫瘍細胞を透過化することができるかどうか、ならびに他のクラスIディフェンシンはできないかどうかをさらに調べるために、NicotianasuaveolensクラスIIディフェンシンNsD1およびNsD2、またはクラスIディフェンシンNsD3の、U937細胞を透過性にする能力を、2つのアプローチによって、NaD1と比較して評価した。第1のアプローチは、バイオルミネッセンスアッセイを用いて、細胞内ATPの放出を測定した。4x104U937を10μMの各ディフェンシンで処理し、562nmで吸光度を測定することにより、ATP放出を30秒間隔で全体として30分間測定した。第2のアプローチは、細胞を10μMの各ディフェンシンで30分間処理した後、フローサイトメトリーを用いて、U9374x105mLによる蛍光色素ヨウ化プロピジウムPI2μgmLの取り込みを測定した。実施例11:結果U937細胞は、天然型NsD1およびNsD2で処理すると、時間依存性および濃度依存性のATP放出を示した図12A。NaD1と同様に、ATPは、NsD1およびNsD2に暴露するとほとんどすぐに細胞から放出された。これとは対照的に、天然型NsD3は、細胞のみの対照と比較して、ATPの放出をもたらさなかった図12A。NsD1およびNsD2による腫瘍細胞透過化を、NsD3と対比してさらに調べるために、U937細胞を10μMの各ディフェンシンで37°Cにて30分間処理した後、PI取り込みをフローサイトメトリーで測定した。NsD1およびNsD2はNaD1と同レベルで、U937細胞によるPIの取り込みをもたらした10μMで約60PIのに対して、NsD3は低いPI取り込みしかもたらさなかった10μMで約10PI図12B。赤血球溶解に及ぼすナス科クラスIIディフェンシンの影響実施例12:序論NaD1がヒト赤血球RBCを溶解する能力のないことが、他のナス科クラスIIディフェンシンにも保存されているかどうかを判定するために、107RBCを10μMまたは30μMの各ディフェンシンとともに37°Cにて16時間インキュベートし、412nm吸光度測定でヘモグロビン放出を測定することによって、天然型NsD1、NsD2およびPhD1AのPBC溶解能力を調べた。実施例12:結果NsD1およびPhD1Aはともに10μMおよび30μMで、PBCのみの対照と比較してPBCの溶解に影響を及ぼさなかった。それに比べて、NsD2は10μMおよび30μMで、低い溶血作用を示したそれぞれ約17溶解、および約23溶解図13。ナス科クラスIおよびIIディフェンシンの細胞脂質結合特性実施例13:序論EchelonTMPIPストリップを用いた固体脂質結合アッセイで、ナス科クラスIおよびクラスIIディフェンシンと細胞脂質との相互作用をさらに調べた。クラスIディフェンシンNsD3、またはクラスIIディフェンシンNsD1、NsD2、PhD1A、およびrTPP3012μMを脂質ストリップとともに4°Cにて一晩インキュベートし、NaD2もしくはNaD1に対する特異的ウサギポリクローナル抗体これらの抗体はそれぞれクラスIもしくはクラスIIディフェンシンと交差反応する、続いてHRP標識ロバ抗ウサギ抗体を用いて、結合を検出した。ディフェンシン結合は、発色した脂質ストリップのデンシトメトリーによって定量した。実施例13:結果NaD1について説明したように、概してクラスIIディフェンシンはすべて、ホスホイノシチドPtdInsおよび、たとえばPtdInsP2、PtdInsP2、PtdInsP2、およびPtdInsP3などともっとも強く結合したが、PtdIns、たとえばPtdInsP、PtdInsP、およびPtdInsPなどとの結合も示した図14A、14B、14C、および14D。例外はPhD1Aであって、これはホスファチジン酸とも強く結合した図14E。クラスIディフェンシンNsD3も細胞脂質と結合することが判明したが、特異性はクラスIIディフェンシンの特異性と明確に異なっていた。クラスIIディフェンシンPhD1Aを除くとは対照的に、NsD3はホスファチジン酸に対して強い結合を示し、PtdIns、、およびに対して弱い結合を示した図14E。まとめると、これらのデータは、ナス科クラスIおよびクラスIIディフェンシンが、重なり合うが異なる特異性で細胞リン脂質と結合するものであって、クラスIディフェンシンはホスファチジン酸と優先的に結合し、クラスIIディフェンシンはPtdIns、、およびと結合することを示唆する図7G。参考文献AluruetalPlantPhysiol120633AnayaLopezetalBiotechnolLett2811018BakeretalMethodsEnzymol398540554BenschetalFEBSLet368331335BlochetalFEBSLett279101104BohlmannCritRevPlantSci13116BohlmannandApelAnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42227240BonmatinetalJBiomolNMR2235256BrandstadteretalMolGenGenet252146154BroekaertetalBiochemistry3243084314BroekaertetalPlantPhysiol10813531358BroekaertetalCritRevPlantSci16297323BruixetalBiochemistry32715724CammueetalJBiolChem26722282233CatanzaritietalProteinSci1313311339ChenetalJAgricFoodChem50725863ColillaetalFEBSLett2701914CornetetalStructure3435448CraiketalJMolBiol29413271336CraikToxicon3918091813CraiketalCurrProtPeptSci5297315DaSilvaetalProteinSci12438446deZelicourtetalPlanta226591600DiamondetalProcNatlAcadSciUSA9351565160FehlbaumetalJBiolChem2693315933163GanzetalJClinInvest7614271435GuetalMolGenGenet2348996GustafsonetalJAmChemSoc11693379338HancockandLehrerTrendsBiotech168288HanzawaetalFEBSLett269413420HarlowandLaneAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYorkHarwigetalBlood7915321537JanssenetalBiochemistry4282148222JenningsetalProcNatlAcadSciUSA981061410619KaderAnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol47627654KaderTrendsPlantSci26670KomorietalPlantPhysiol115314KushmericketalFEBSLett440302306LambertyetalJBiolChem27493209326LambertyetalBiochemistry401199512003LandonetalProteinSci618781884LayandAndersonCurrProteinPeptSci685101LayetalPlantPhysiol13112831293LayetalJMolBiol325175188LehrerandGanzCurrOpinImmunol1496102LinetalBiosciRep30101109LoboetalBiochemistry4698796LoenzaAngelesetal3017131719MaetalPeptides3020892094MaderandHoskinExpertOpinInvestigDrugs1593346ReviewMarcusetalEurJBiochem244743749McManusetalJMolBiol293629638MeloetalProteins48311319MendezetalEurJBiochem194533539MendezetalEurJBiochem2396773MilliganetalPlantMolBiol28691711MirouzeetalPlantJ47329342MorenoetalEurJBiochem223135139NgaiandNgBiochemCellBiol8321220OsbornetalFEBSLett368257262PateletalBiochemistry37983990PelegriniandFrancoIntJBiochemCellBiol37223953RamamoorthyetalMolMicrobiol66771786RusselletalInfectImmun6415651568SeguraetalFEBSLett435159162SelstedetalJClinInvest7614361439SelstedetalJBiolChem26866416648TailoretalJBiolChem2722448024487TametalProcNatlAcadSciUSA9689138918TangandSelstedJBiolChem26866496653TangetalScience286498502TangetalInfectImmun6761396144TarveretalInfectImmun6610451056TerrasetalJBiolChem2671530115309TerrasetalFEBSLett316233240TerrasetalPlantCell7573588ThommaetalCurrDrugTargetsInfectDis318TrabietalBiochemistry4042114221vanderWeerdenJBiolChem2831444514452WijayaetalPlantSci159243255WongandNgIntJBiochemCellBiol37162632YamadaetalPlantPhysiol115314ZhangandLewisFEMSMicrobiolLett1495964ZhangetalCerealChem74119122"