"ヒト血液細胞を抗原、刺激物質及びヒト血清を含む培養液中で免役する体外免疫方法。前記血清濃度が5~60で好ましくは、20~50である請求項1に記載の体外免疫方法。前記刺激物質がB細胞増殖活性化因子、体細胞変異誘導因子及びクラススイッチ誘導因子よりなる請求項1に記載の体外免疫方法。前記体細胞変異誘導因子がIL21、LPSLipopolysaccharide、前記B細胞増殖活性化因子がIL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL7、IL10、IL11、IL13、IL21、IL22、BAFFBcellActivatingFactor、CD30Ligand、antiCD30抗体、CD40Ligand、antiCD40抗体、INFγ、FasLigand、LPS、前記クラススイッチ誘導因子がIL4、IL5、IL6、IL13、INFγ、TGFβTransformingGrowthFactorbeta、BAFF、APRILAProliferationInducingLigandであり、これら因子から1乃至複数選ばれてなる請求項3に記載の体外免疫方法。前記体外免疫方法で得られた免疫細胞を含む細胞から遺伝子を分離し、分離した遺伝子に所定の抗体用プライマーを用いてPCR処理を行うステップ、前記PCR処理後の遺伝子に対し量的な分離により抗体遺伝子を選別する量的分離ステップを含む抗体作製方法。前記抗体遺伝子から一本鎖抗体を形成するステップ、当該一本鎖抗体を宿主細胞で培養するステップを更に有する請求項5に記載の抗体作製方法。前記血液細胞が、末梢血からえられた単核細胞である請求項1及び5に記載の抗体作製方法。体外免疫作業を簡素化し、手間と時間が係る作業が必要な抗体作製をより短時間で、しかも容易に安定したヒト抗体が作製できる手段を提案しようとするものである。上述した先行技術に記載されている通り末梢血の利用は、ヒト抗体の製造においては、より手軽ではあるが、いずれの手法も特異性及び親和性がある抗体を確実に製造する方法にまでは至っておらず未解明な部分が多い。本発明は、ヒト末梢血から採取された血液細胞に対し、LPSを含む刺激物質と、抗原及びヒト血清による体外免疫を行うことで、特異性及び親和性のあるヒト抗体が得られることを知見し、本発明に到達した。更に、本発明は、ヒト血液細胞に特定の刺激物質、ヒト関連培養成分を添加した培養液で、抗原による感作を行い、この免疫された免疫担当細胞をこの血液細胞群から選別することなく、ヒト抗体遺伝子に特異的なプライマーを適用したPCR増幅操作を行い、PCR処理後の遺伝子を電気泳動等の量的分離手段により、増幅された遺伝子のみを取り出し、この遺伝子から一本鎖抗体scFvを作製すると共にこのscFv抗体遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞に挿入して形質転換を行い、これを培養して抗体遺伝子の大量生産を短時間で行うことを可能とする。血液細胞は、例えば、単核細胞、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、赤血球等が例示されるが、本発明によれば、血液を遠心分離した後のような個体と液体を分離したものを出発材料としてもよく、赤血球等の選別を要することがない場合もあり、選別工程を簡素化できる。本発明における量的な分離手法とは、目的とする遺伝子の分子量等の量的相違に基づく分離を行うもの例えば電気泳動による泳動距離の相違による分離手法が示される。又電気泳動に限らず、その他、HPLC等のクロマトグラフィーを用いた手法が利用できる。本発明は、生体外において、所望の抗体産生細胞を得るために、刺激物質をヒト血液細胞に添加して特定の血液細胞を刺激活性化し、胚中心様B細胞又は、抗体産生細胞、メモリーB細胞へ分化誘導することも可能とする。本発明における刺激物質としてはIL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL13、IL21、表面抗原に対する刺激物質としてFasligand、INFγ、TGFβTransformingGrowthFactorbeta、BAFFBcellActivatingFactor、APRILAProliferationInducingLigand、CD40ligand、CD38ligand、BCDFBCellDifferentiationFactor、BCAFBCellActivationFactor、シグナル伝達に関与する受容体に対する刺激物質としてLPSLipopolysaccharideCpG等が例示される。これらの刺激物質は、体細胞変異誘導因子、前記B細胞増殖活性化因子、及びクラススイッチ誘導因子に分けられ、それぞれ、前記体細胞変異誘導因子がIL21、LPSLipopolysaccharide、前記B細胞増殖活性化因子がIL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL7、IL10、IL11、IL13、IL21、IL22、BAFFBcellActivatingFactor、CD30Ligand、antiCD30抗体、CD40Ligand、antiCD40抗体、INFγ、FasLigand、LPS、前記クラススイッチ誘導因子がIL4、IL5、IL6、IL13、INFγ、TGFβTransformingGrowthFactorbeta、BAFF、APRILAProliferationInducingLigandと分けることが出来、これらの刺激物質は、本発明に有効に用いられる。使用濃度は、免疫する細胞濃度に依存するが、LPSは10ngmL~500μgmLの濃度が良く、特に20~80μgmLの濃度が推奨される。また、LPS以外の物質では一般に1ngmL~50μgmLの濃度が良く、特に5ngmL~40ngmLの濃度が推奨される。また、これら物質の機能を代替するアゴニスト抗体であっても問題はない。その分化誘導の過程において、特にIL4、IL13、IL21、LPS刺激により、抗体の体細胞変異およびクラススイッチを誘導することがより好ましい場合もある。本発明における、体外免疫手法において、各種刺激物質と各種分化、誘導等との関係について以下に説明する。本発明で示す抗原は、免疫用血液細胞の調製直後の1回で充分であるが、2~3日の間隔を置いて、複数回行っても制限はない。またその際の抗原濃度は1pmol~1mmolが好ましく、1nmolが例示される。抗原刺激を補助する目的でLPSに代表されるTLRを刺激する物質を添加しても良い。この刺激の添加は、抗原刺激の度に行うことが好ましく、添加量は10ngmL~500μgmLの濃度が良く、特に20~80μgmLの濃度が良い。本発明で用いられる抗原には、例えば、hヒトS100A10、he鶏EL、hヒトRas、hヒトrap74,hヒトTOPO2B、bウシSA、bウシCasein、マウス由来のmマウスS100A10、mSA、mMapk1等の蛋白質、ペプチドが例示され、更に本発明は、従来抗体を得るために用いることができない、低分子化合物ローダミン等の蛍光物質、FITCを利用可能とする。本発明は、体外での目的に応じた刺激物質の導入による抗体産生細胞に分化誘導する工程により、低分子抗原の利用が可能になるほか、クラススイッチによる好ましい抗体、親和性成熟による抗体が得られる免疫細胞を得ることができる場合がある。血液細胞から得られる遺伝子に対し、目的とする所定の抗体遺伝子を所定の抗体用のプライマーを導入しPCRpolymerasechainreaction法により増幅して量的分離を可能とすると共に更に大腸菌、ヒト関連細胞等の宿主細胞により、好ましくはコロニー化させて抗体を得るステップを組み合わせることで、親和性があるヒト抗体を数多く短時間で作製可能としたものである。宿主細胞としては、大腸菌の他、ストレプトマイセス、枯草菌、酵母、CHO細胞、COS細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、等が例示される。又、本発明では、HepG-2細胞、RPMI8226、HS-スルタン、HeLa細胞、HEK293細胞のようなヒト胎児腎細胞をアデノウィルスのE1遺伝子によりトランスフォーメーションした細胞株や、HEK293T細胞、HEK293S細胞、HEK293EBNA細胞、その他のヒト関連の細胞を宿主細胞として用いてもよく、より親和性が高い抗体の発現が促されるなど好ましい抗体医薬の態様となる場合がある。発現ベクターとしては、宿主細胞で発現されるものであれば良いが、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、染色体、エピソーム、ウィルス由来、レトロウィルス由来のベクターが例示される。ここで、ベクターとは、当業者に周知であって、投与対象となる動物細胞内で組み込まれたDNAから、ポリペプチドを発現するように適切なプロモーターを有していれば特に制限はされず、pcDNA3発現ベクターやpMX発現ベクターが例示される。本発明における抗体の選別方法としては、例えば、Phageや大腸菌酵母動物細胞の表面に抗体を表示させる方法、酵母、大腸菌等を用いる2-ハイブリッド法、IVV法、ribosomeデイスプレイ法のようなDNAやmRNAに提示させる方法、表面プラズモン共鳴を利用したBIACORE法、ELISA法、ウェスタンブロット法、磁気ビーズに抗体もしくは高原を固定化し、磁力を用いた選別MACS方法等が例示されるが、タンパク質間相互作用を調べ得る手法であれば、特に限定されるものではない。本発明は、上述した様に特異性及び親和性の高いヒト抗体が製造できる体外免疫法及びこの体外免疫法を導入した抗体作製方法を可能とする。本発明における体外免疫で用いられる血清の濃度は、例えば、5~60の範囲が示される。刺激物質は、上述したものが示されるが、更に特異性及び親和性を備えた抗体を得るためのものとしては、IL45ngmL~40ngmL、IL65ngmL~40ngmL、IL105ngmL~40ngmL、IL135ngmL~40ngmL、IL215ngmL~40ngmL、BAFF5ngmL~40ngmL、antiCD40抗体50ngmL~5μgmL、LPS20~80μgmLが例示される。これらの刺激物質を全て組み合わせたものがより好ましい。体外免疫で一般的に用いられるLPSは、インターロイキン等の他の刺激物質と異なり、作用が複数存在していることからLPSを使用することで刺激物質の種類を少なくすることができ、生産コストを抑えることが出来るが、血液細胞の体外免疫でのLPSの利用は、その他の培養液の成分によっては、免疫効率が低くなる場合もあるが、ヒト抗体を得る工程との組み合わせにおいて、全体として合理的なscFv型のヒト抗体が得られれば本発明に含まれる場合もある。本発明では、LPSを体外免疫の際の培養液成分を所定の濃度のヒト血清、抗原及び刺激物質と組み合わせることで結果として特異性及び親和性の高いヒト抗体の製造を可能としている。本発明は、末梢血の血液細胞を分離不要で使用可能であり、遺伝子工学的な手法による抗体を作製することで迅速で医薬に適したヒト抗体の生産取得を可能とする。更に本発明は、特異性及び親和性の高いヒト抗体が得られる体外免疫法を実現し、ヒト抗体を製造する方法の他、抗体医薬全般を見据えた手法と成り得る。本発明は、免疫担当細胞を分離することなくヒト末梢血等から得られた血液細胞に体外免疫を行い、その後、所定の抗体によるPCR処理を施して量的に分離可能な状態とすることで抗体遺伝子を得る。又、ヒト末梢血から採取された血液細胞に対し、LPSを含む刺激物質と、抗原及びヒト血清による体外免疫を行うことで、より特異性や親和性の高いヒト抗体を得る。この抗体遺伝子から更にPCR法によりH鎖、L鎖の遺伝子を取得、宿主細胞で発現できるように一本鎖抗体scFvに改変してプラスミド化した後、宿主細胞内で発現させて抗体を得るものであれば、抗原については、特定するものではない。以下、本発明の実施例について、ニワトリ卵白リゾチームタンパク質を抗原例として用い、一本鎖抗体の作製方法について詳細に説明する。末梢血単核細胞peripheralbloodmononuclearcellPBMCの調製PBMCを購入し、凍結サンプルとして入手した。これをメーカー推奨プロトコールに従い、溶解回復を行った。免疫に先立ち、細胞は無血清培地で洗浄し、1×107cellsmLになるように無血清培地で再懸濁した。体外免疫HeneggLysozymeをPBSにて1nmolμLに調製した。022μmのフィルターを用いてろ過滅菌を行い、抗原として体外免疫に使用した。15mLの遠沈管に1nmolのHELと、アジュバントとして、NアセチルムラミルLアラニルDイソグルタミン10mgmLを5μL加えた。ここに、PBMCを1.5×107cells添加し、室温で15分間感作させた。ここに刺激物質IL4、IL13、antiCD40抗体、LPS終濃度40μgmLを添加し、次に40FBS含有RPMI1640培地を35mL添加し、5CO237°Cで2日間培養した。培養後、IL21を添加し、さらに3日間培養した。培養後の細胞を顕微鏡観察し、免疫によって発生すると考えられている細胞塊の発生、細胞の幼若化に伴う細胞サイズの増大を観察した。図1では、免疫前後の細胞の顕微鏡画像。免疫によって発生すると考えられている細胞塊の発生、細胞の幼若化に伴う細胞サイズの増大が観察された。DNA抽出、一本鎖抗体scFvプラスミドの作製免疫後の細胞2.5×106cellsより、Isogenニッポンジーン社製を用いてTotalRNAを取得した。取得したTotalRNAをテンプレートとして、QuantitectReverseTranscriptionKitにより、1stPCRを実施した。使用したプライマー配列は、AntibodyEngineeringMethodsandprotocolsに紹介されているものを利用した。その後、2AgaroseGel電気泳動により確認した。を用いてVH遺伝子VL遺伝子を抽出精製した。そのVH遺伝子VL遺伝子を各200ng用いて、PrimeSTARHSPolymeraseにより、プライマーを添加せず、LinkPCRを実施し、scFv遺伝子を構築した。その後、18AgaroseGel電気泳動により確認した。を用いてscFv遺伝子を抽出精製した。そのscFv遺伝子10ngをテンプレートとして2ndPCRPrimerPremixを用いて、PrimeSTARHSPolymeraseにより、2ndPCRを実施した。使用したプライマー配列は、AntibodyEngineeringMethodsandprotocolsに紹介されているものを利用した。その後、16AgaroseGel電気泳動により確認した。を用いてscFv遺伝子を抽出精製した。同様にプラスミドベクターpMALc2Eを制限酵素EcoRI、HindIIIおよびCIAPと37°Cで1時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、QIAquickGelExtractionkitを用いてプラスミドベクター遺伝子を抽出精製した。これらをプラスミドベクター遺伝子1molに対しscFv遺伝子10molの割合で混合し、DNALigationkitを用いてライゲーションした。ライゲーション溶液10μLを大腸菌JM109株のコンピテントセル100μLと混合し、大腸菌JM109株を形質転換した。この形質転換体を100μgmLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、37°Cで18時間培養した。形成したコロニーを、scFv遺伝子の連結したプラスミドを持つ大腸菌クローンをセレクションするために、コロニーPCR法を実施し、16AgaroseGel電気泳動により確認した。を含むLB液体培地により30°Cで18時間培養した。遠心分離により培地を交換し、500μLの100μgmLのアンピシリンとOvernightExpressAutoinductionsystemと1mMIPTGを含むLB液体培地に懸濁し、30°Cで3時間培養した。培養終了後、遠心分離により大腸菌菌体を回収した。ここに、ガラスビーズを添加し、1300rpm、20min、15°Cで振とうすることにより大腸菌を破砕した。遠心分離により未破砕菌体やガラスビーズを沈殿させ、scFvを含む培養上清を得た。ELISAPlateの調製HEL抗原をPBSにて20μgmLに希釈し、50μLずつ96wellplateNuncImmunomoduleF8maxisoapNunc社製に添加した。これを4°Cで1日間静置した後、上清を捨て、ProteinFreeBlockingBufferを400μLずつ添加した。室温で2時間静置したのち、PBSで3回洗浄し、HELELISAPlateを調製した。同様にBSA、antiFLAG抗体を固相化したプレートも作製した。ELISAAntiFLAG抗体ELISAPlateに上記大腸菌による一本鎖抗体scFvの発現の項で取得した50μLの培養上清を加え、37°Cインキュベーターにて1時間静置した。上清を捨て、PBSで4回洗浄し、PBSで2000倍に希釈した二次抗体antiMBPHRP、NEB社製を50μL添加し、37°Cインキュベーターにて1時間静置した。上清を捨て、PBSで4回洗浄し、100μLのTMB溶液を添加し、室温にて10分間静置した。その後直ちに1NHCl和光純薬社製を100μL添加に、反応を止めた。その後、各ウェルの450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーModel550Biorad社製にて測定した。本実施例によれば、体外免疫法によって、10日間で抗原特異的なヒト抗体を取得することが出来た。従来はファージディスプレイ法等を用いている為、数週間を要しているが、短期間で取得することが出来た。本法を用いることによって、免疫して得たヒト抗体を取得することが容易となる。次に本発明の他の実施例について、ヒトS100A10タンパク質を抗原例として用い、ヒト末梢血単核球に対して特定の刺激物質、抗原、ヒト血清成分を含む培養液を用いて体外免疫を行うことで、免疫効率を下げず、且つ高効率に体細胞変異の導入された、特異性及び親和性の高い抗ヒトタンパク質一本鎖ヒト抗体を作製する方法について詳細に説明する。ヒト末梢血単核細胞peripheralbloodmononuclearcellPBMCの調製ヒトPBMCを購入し、凍結サンプルとして入手した。これをメーカー推奨プロトコールに従い、溶解回復を行った。免疫に先立ち、細胞は無血清培地で洗浄し、1×107cellsmLになるように無血清培地で再懸濁した。体外免疫ヒトS100A10タンパク質をPBSにて1nmolμLに調製した。022μmのフィルターを用いてろ過滅菌を行い、抗原として体外免疫に使用した。15mLの遠沈管に5nmolのhS100A10と、アジュバントとして、NアセチルムラミルLアラニルDイソグルタミン10mgmLを5μL加えた。ここに、PBMCを1.5×107cells添加し、室温で15分間感作させた。ここに刺激物質IL4、IL6、IL10、BAFF、IL13、antiCD40抗体、LPSを添加し、次に40ヒト血清含有RPMI1640培地を4mL添加し、5CO237°Cで3日間培養した。培養後、IL21を添加し、さらに4日間培養した。DNA抽出、一本鎖抗体scFvプラスミドの作製免疫後の細胞6.8×106cells、および免疫せずに同日数培養した細胞1.2×106cellsからそれぞれIsogenニッポンジーン社製を用いてTotalRNAを取得した。取得したTotalRNAをテンプレートとして、QuantitectReverseTranscriptionKitにより、1stPCRを実施した。使用したプライマー配列は、AntibodyEngineeringMethodsandprotocolsに紹介されているものを利用した。電気泳動後のアガロースゲルから目的の約400bpのバンドを切り取り、QIAquickGelExtractionkitを用いてVH遺伝子VL遺伝子を抽出精製した。そのVH遺伝子VL遺伝子を各500ng用いて、PrimeSTARHSPolymeraseにより、プライマーを添加せず、LinkPCRを実施し、scFv遺伝子を構築した。電気泳動後のアガロースゲルから目的の約800bpのバンドを切り取り、QIAquickGelExtractionkitを用いてscFv遺伝子を抽出精製した。そのscFv遺伝子10ngをテンプレートとして2ndPCRPrimerPremixを用いて、PrimeSTARHSPolymeraseにより、2ndPCRを実施した。使用したプライマー配列は、AntibodyEngineeringMethodsandprotocolsに紹介されているものを利用した。scFvPCR産物を、制限酵素EcoRIおよびHindIIIと37°Cで2時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、QIAquickGelExtractionkitを用いてscFv遺伝子を抽出精製した。同様にプラスミドベクターpMALc2Eを制限酵素EcoRI、HindIIIおよびCIAPと37°Cで1時間反応させて分解し、電気泳動後のアガロースゲルから目的のバンドを切り取り、QIAquickGelExtractionkitを用いてプラスミドベクター遺伝子を抽出精製した。これらをプラスミドベクター遺伝子1molに対しscFv遺伝子10molの割合で混合し、DNALigationkitを用いてライゲーションした。ライゲーション溶液10μLを大腸菌JM109株のコンピテントセル100μLと混合し、大腸菌JM109株を形質転換した。この形質転換体を100μgmLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、37°Cで18時間培養した。形成したコロニーを、scFv遺伝子の連結したプラスミドを持つ大腸菌クローンをセレクションするために、コロニーPCR法を実施した。大腸菌による一本鎖抗体scFvの発現形成したコロニーを、未免疫PBMC由来scFvライブラリから64クローン、免疫後PBMC由来ライブラリからランダムに40クローンずつを画線培養した後、500μLの100μgmLのアンピシリンとOvernightExpressAutoinductionsystemを含むLB液体培地により30°Cで18時間培養した。遠心分離により培地を交換し、500μLの100μgmLのアンピシリンとOvernightExpressAutoinductionsystemと1mMIPTGを含むLB液体培地に懸濁し、30°Cで3時間培養した。培養終了後、遠心分離により大腸菌菌体を回収した。ここに、ガラスビーズを添加し、1300rpm、20min、15°Cで振とうすることにより大腸菌を破砕した。遠心分離により未破砕菌体やガラスビーズを沈殿させ、scFvを含む培養上清を得た。ELISAPlateの調製hS100A10抗原をPBSにて20μgmLに希釈し、50μLずつ96wellplateNuncImmunomoduleF8maxisoapNunc社製に添加した。これを4°Cで一晩静置した後、上清を捨て、ProteinFreeBlockingBufferを400μLずつ添加した。室温で2時間静置したのち、PBSで3回洗浄し、hS100A10ELISAプレートを調製した。同様にネガティブコントロールとしてHenEggLysozyme、濃度定量用にantiFLAG抗体を固相化したプレートも作製した。ELISAによるスクリーニングAntiFLAG抗体ELISAPlateに上記大腸菌による一本鎖抗体scFvの発現の項で取得した50μLの培養上清を加え、37°Cインキュベーターにて1時間静置した。上清を捨て、PBSで4回洗浄し、PBSで2000倍に希釈した二次抗体antiMBPHRP、NEB社製を50μL添加し、37°Cインキュベーターにて1時間静置した。上清を捨て、PBSで4回洗浄し、100μLのTMB溶液を添加し、室温にて10分間静置した。その後直ちに1NHCl和光純薬社製を100μL添加に、反応を止めた。その後、各ウェルの450nmの吸光度をマイクロプレートリーダーModel550Biorad社製にて測定した。同様に、精製し濃度定量済みのMBPFLAGhS100A10タンパク質を用いて検量線を作製し、これをもとに各クローンのscFv発現量を算出した。算出した濃度値をもとに、各クローン2pmolwellになるように濃度調整し、hS100A10固層化プレートおよびHEL固層化プレートを用いたELISAを実施することで、抗原であるhS100A10への各クローンの親和性および特異性の評価を行った。その結果、本法を用いた体外免疫を実施することによって、抗原に対して親和性および特異性を有したクローンが多数得られた。加えて、ライブラリに占める抗原陽性クローンの存在比率が大幅に上昇した。図6図6は、ELISAによる、体外免疫実施でのscFvライブラリの活性分布比較例を示すものであって、Y軸には抗原への親和性の指標となるhS100A10固層化プレートを用いた際の450nmの吸光度を、X軸には特異性の指標となるhS100A10固層化プレート対HEL固層化プレートの吸光度比を示した。図6によれば、本実施例でしめす体外免疫を実施することで、抗原に対して親和性の高いクローン高Absorbanceおよび特異性の高いクローン高hS100A10HEL比を有したクローンを高い存在比率で取得することが出来た。DNAならびにアミノ酸配列解析上記ELISAによるスクリーニングの結果得られた、抗原に対して反応性を有していたクローン未免疫ライブラリcloneNon1~n4、免疫後ライブラリcloneNoi1~i4について、DNAシーケンス解析を行った。その結果、本法を用いた体外免疫を実施することにより、効率的に体細胞変異が誘導されていることが確認できた。図7図7は、図6中でナンバリングしたクローンn1~n4、およびi1~i4のDNA配列解析結果に対し、IgBLAST解析を行い、各領域FWR1、CDR1,FWR2、CDR2、FWR3について、各scFvクローンの由来となるGermlineVgeneデータベースと、これと比較した際のミスマッチ塩基数、およびアミノ酸変異数図中括弧内に記すを示した。図7によれば、免疫せずに同日数培養した場合では体細胞変異は蓄積されておらず、本法を用いた体外免疫を実施することによってDNAレベルにおいてもアミノ酸レベルにおいても高効率に体細胞変異が誘導されていることが示された。"