"持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された、単離された機能的ウレアーゼを含む遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555のアミノ酸配列が、欠失、突然変異又は挿入によって変更された、請求項1に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ細胞。変更される前記アミノ酸が、配列番号1の547、548及び549からなる群より選択される、請求項1又は請求項2に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ細胞。前記突然変異が保存的又は非保存的アミノ酸変化を含む、請求項2に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記変更が1つ又はそれ以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記挿入が10~100のアミノ酸を含む、請求項5に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。少なくとも1つの異種抗原、又はその機能的断片をコードする核酸分子をさらに含む、請求項1~6のうちいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記異種抗原、又はその機能的断片が病原微生物由来である、請求項7に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。異種抗原をコードする核酸が得られる病原微生物が、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択される、請求項6に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルスHIV抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌Vibriocholerae抗原、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum抗原、三日熱マラリア原虫Plasmodiumvivax抗原、卵形マラリア原虫Plasmodiumovate抗原、四日熱マラリア原虫Plasmodiummalariae抗原、二日熱マラリア原虫Plasmodiumknowlesi抗原、肺炎球菌Streptococcuspneumoniae抗原、化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes抗原、ヘリコバクターピロリ抗原、ストレプトコッカスアガラクチアStreptococcusagalactiae抗原、髄膜炎菌Neisseriameningitidis抗原、淋菌Neisseriagonorrhoeae抗原、ジフテリア菌Corynebacteriumdiphtheriae抗原、破傷風菌Clostridiumtetani抗原、百日咳菌Bordetellapertussis抗原、ヘモフィルスHaemophilus抗原、クラミジアChlamydia抗原及び大腸菌Escherichiacoli抗原からなる群より選択される、請求項7又は請求項8に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記アミノ酸挿入が異種抗原又はその機能的断片をコードする、請求項5又は請求項6に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。前記異種抗原が、ヒト免疫不全ウイルスHIV抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌Vibriocholerae抗原、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum抗原、三日熱マラリア原虫Plasmodiumvivax抗原、卵形マラリア原虫Plasmodiumovate抗原、四日熱マラリア原虫Plasmodiummalariae抗原、二日熱マラリア原虫Plasmodiumknowlesi抗原、肺炎球菌Streptococcuspneumoniae抗原、化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes抗原、ヘリコバクターピロリ抗原、ストレプトコッカスアガラクチアStreptococcusagalactiae抗原、髄膜炎菌Neisseriameningitidis抗原、淋菌Neisseriagonorrhoeae抗原、ジフテリア菌Corynebacteriumdiphtheriae抗原、破傷風菌Clostridiumtetani抗原、百日咳菌Bordetellapertussis抗原、ヘモフィルスHaemophilus抗原、クラミジアChlamydia抗原及び大腸菌Escherichiacoli抗原からなる群より選択される、請求項11に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ。請求項1~12のいずれか一項に記載の遺伝子改変ヘリコバクターピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物。アジュバントをさらに含む、請求項13に記載の免疫原性組成物。免疫学的に有効な量の請求項13又は請求項14に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、哺乳類を病原微生物感染から保護する方法。改変されたウレアーゼのUreBサブユニットを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列を変更する工程を含み、その際前記ウレアーゼは脱酸機能を保持するが前記ヘリコバクターピロリは持続性感染を確立又は維持することができない、ヘリコバクターピロリの持続性感染確立能力を制御する方法。持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリを哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類にヘリコバクターピロリ感染の予防接種を行う方法。哺乳類への予防接種に使用するための免疫原性組成物であって、持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物。配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555及び薬学的担体から本質的になるペプチドワクチン。アジュバントをさらに含む、請求項19に記載のペプチドワクチン。被験者に請求項19又は請求項20に記載のペプチドワクチンを投与する工程を含む、被験者にヘリコバクターピロリの予防接種を行う方法。本発明者らは、UreBGenBankAAD07143.1;配列番号1の約アミノ酸529~約アミノ酸555の領域が、ヘリコバクターピロリの持続性感染確立能力を、ウレアーゼ活性に影響することなく制御することを明らかにした。したがって、本発明の第1の態様において、本発明は、持続性感染を確立又は維持できない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリを提供する。いくつかの実施形態において、配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555のアミノ酸配列は、欠失、突然変異又は挿入によって変更される。当該変更は、保存的又は非保存的アミノ酸変化を含んでもよい。いくつかの実施形態において、変更されるアミノ酸は配列番号1の547、548及び549からなる群より選択される。好ましくは、前記アミノ酸変更は、配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列への1つ又はそれ以上のアミノ酸のインフレーム挿入を含む。いくつかの実施形態において、前記挿入は、10~100のアミノ酸を含む。好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88,89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99~100のアミノ酸である。最も好ましくは、約20~約50のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、本発明の遺伝子改変ヘリコバクターピロリは、少なくとも1つの異種抗原又はその機能的断片をコードする1つ又はそれ以上の核酸分子をさらに含むであろう。前記核酸分子は染色体外に存在してもよく、又は好ましくは配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列への挿入を含むであろう。いくつかの実施形態において、前記挿入はアミノ酸549と550の間である。いくつかの実施形態において、異種抗原又はその機能的断片は、病原微生物に由来するであろう。好ましくは、前記病原微生物は、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択されるであろう。いくつかの実施形態において、前記異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルスHIV抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌Vibriocholerae抗原、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum抗原、三日熱マラリア原虫Plasmodiumvivax抗原、卵形マラリア原虫Plasmodiumovate抗原、四日熱マラリア原虫Plasmodiummalariae抗原、二日熱マラリア原虫Plasmodiumknowlesi抗原、肺炎球菌Streptococcuspneumoniae抗原、化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes抗原、ヘリコバクターピロリ抗原、ストレプトコッカスアガラクチアStreptococcusagalactiae抗原、髄膜炎菌Neisseriameningitidis抗原、淋菌Neisseriagonorrhoeae抗原、ジフテリア菌Corynebacteriumdiphtheriae抗原、破傷風菌Clostridiumtetani抗原、百日咳菌Bordetellapertussis抗原、ヘモフィルスHaemophilus抗原、クラミジアChlamydia抗原及び大腸菌Escherichiacoli抗原からなる群より選択される。第2の態様において、本発明は、持続性感染及び薬学的に許容可能な担体を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリを含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。第3の態様において、本発明は、機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を免疫学的に有効な量投与する工程を含む、哺乳類を病原微生物感染から保護する方法を提供し、その際前記ウレアーゼは持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更される。第4の態様において、本発明は、改変されたウレアーゼのUreBサブユニットを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列を変更する工程を含み、その際前記ウレアーゼは脱酸機能を保持するが、前記ヘリコバクターピロリは持続性感染を確立することができない、ヘリコバクターピロリの持続性感染確立能力を制御する方法を提供する。第5の態様において、本発明は、持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリを哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類にヘリコバクターピロリ感染の予防接種を行う方法を提供する。第6の態様において、本発明は、哺乳類の予防接種に使用するための免疫原性組成物であって、持続性感染を確立することができない遺伝子改変ヘリコバクターピロリを産生するように配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列が変更された機能的ウレアーゼを含む単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリ及び薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物を提供する。いくつかの態様において、異種抗原は、プラスミドベクターであってa異種抗原をコードするヌクレオチド配列及びb前記ベクターが本発明の改変ヘリコバクターピロリに形質転換されたときにヌクレオチド配列の発現を制御することができる、そこに機能的に連結した制御又は調節配列を含むプラスミドベクターに存在するであろう。本発明に包含される哺乳類の非限定例は、霊長類、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びげっ歯類である。特定の種類及び比率のヘリコバクターピロリ、プラスミドベクター及び本明細書に記載のその他の送達機構、並びにその本文が参照により本明細書に明確に組み込まれるRemington’sPharmaceuticalSciences、第20版、MackPublishingCompanyに記載されているもののような、処方技術分野で当業者に既知の処方技法を所与として、本組成物の種々の送達形態は、本発明の実施に使用するために容易に調製される。第7の態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列の機能に影響することができる作用剤を哺乳類に投与する工程を含む、前記哺乳類のヘリコバクターピロリ感染持続を防止する方法を提供する。本発明を詳細に説明する前に、本発明は、具体的に例示された方法に限定されるものでなく、当然、変化してもよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記述することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される範囲を制限することを意図しないことも理解されるべきである。本明細書において引用されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記か下記かを問わず、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ただし、本明細書に記載の刊行物は、当該刊行物に報告された及び本発明に関連して使用される可能性のあるプロトコル、試薬及びベクターを記述及び開示する目的で引用され、先行発明を理由として、本発明がかかる開示に先行する権利がないことを承認すると解されるべきではない。0001さらに、本発明の実施は、特記のない限り、製薬学、分子生物学組換え技法を含む、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技法を当業者の技能範囲内で利用する。かかる技法は当業者に周知であり、文献に十分に説明されている。たとえば、Coliganetal.CurrentprotocolsinProteinScience1999VolumeI及びIIJohnWileySonsInc.;Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd3rdEditions,ColdSpringHarborLaboratorypress19892001;及びBailey,J.E.andOllis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait,ed.,1984;AnimalCellCultureR.I.Freshney,ed.,1987;MethodsinEnzymologyシリーズAcademicPress,Inc.;HandbookofExperimentalImmunologyD.M.WeirC.C.Blackwell,eds.;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.M.MillerM.P.Calos,eds.,1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubeletal.,eds.,1987,andperiodicalsPolymeraseChainReactionMullisetal.,eds.,1994;及びCurrentProtocolsinImmunologyJ.E.Coliganetal.,eds.,1991を参照。最も広い態様において、本発明は単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリを提供する。いくつかの実施形態において、前記ヘリコバクターピロリは、H.ピロリに慢性感染した哺乳類被験者から採取した臨床試料から最初に単離される。続いて、ウレアーゼureB遺伝子配列番号1が、欠失、突然変異又は挿入によって改変され、その結果前記ウレアーゼは機能性、すなわち尿素を炭酸アンモニウムに変換する能力を維持し、前記炭酸アンモニウムはその後アンモニア及び二酸化炭素に分解する。改変されるウレアーゼの領域は、UreBGenBankAAD07143.1;配列番号1の約アミノ酸529~約アミノ酸555である。いくつかの実施形態において、前記領域は529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554及び555の間である。いくつかの実施形態において、変更されるアミノ酸は、配列番号1の547、548及び549からなる群より選択される。変更は、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCR突然変異誘発のような当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発Carteretal.,1986,Nucl.AcidsRes.,13:4331;Zolleretal.,1987,Nucl.AcidsRes.,10:6487、カセット突然変異誘発Wellsetal.,1985,Gene,34:315、制限部位選択突然変異誘発Wellsetal.,1986,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317:415又は他の既知の手法を、クローニングされたDNAに対して行うことにより、ウレアーゼ変異型DNAを生成することができる。いくつかの実施形態において、ヘリコバクターピロリの単離株から得たゲノムDNAは、その形質転換性を評価するために、適切なシャトルベクター、たとえば選択可能なマーカーたとえば抗生物質マーカーを有するシャトルプラスミドに挿入される。広義には、適切なシャトルベクターは、クローニング部位、ヘリコバクターピロリ複製起点、E.coli複製起点、及び抗生物質耐性遺伝子並びに/又は選択可能なマーカーという特徴の1つ、2つ、3つ又はそれ以上を包含するであろう。この目的に適した、又はこの目的に容易に適応できる当該分野で既知のベクターとしては、たとえば、Robertsetal.ApplEnvMircobiol.,54:268-2701988が記載した組換えシャトルプラスミドpHR106;Bannametal.Plasmid,29:233-2351993が記載したPJIR750及びPJIR751プラスミド;Matsushitaetal.Plasmid,31,317-3191994のプロモーターレスPPSVプロモーター選択ベクター;Lyrasetal.Plasmid,39,160-1641988が記載したシャトルプラスミドpJIR1456及びpJIR1457;並びにKimetal.ApplEnvironMicrobiol.,55,360-3651989が記載したpAK201シャトルベクターが挙げられ、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヘリコバクターピロリ複製起点の除去は、シャトルベクターを自殺ベクターに変換する。あるいは、相同組換えを使用して、突然変異又は外因性配列をウレアーゼ遺伝子に導入することができる。いったん変更が行われると、形質転換/形質移入、電気穿孔法、リポソーム媒介核酸転移、N-[1-2,3-ジオロイルオキシプロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート媒介形質転換等の核酸転移プロトコルが使用される。当業者は、当該分野の知識及び設計選択にしたがってヘリコバクターピロリの遺伝子改変に適したツール及び方法を用意に選択できるであろう。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリによって分泌される免疫優性抗原の粘膜送達に関する。前記送達の目的は、局所的及び全身的なT細胞応答の抑制である。この抗原送達のアプローチは、確立された過敏症の環境においても経口免疫寛容を増強する能力がある。したがって、病原体によって引き起こされる疾患の予防すなわち予防接種だけでなく、自己免疫疾患及び/又はアレルギー疾患の治療にも適用できる。したがって、いくつかの実施形態において、前記アミノ酸変更は、配列番号1のアミノ酸529~アミノ酸555の近接アミノ酸配列への1つ又はそれ以上のアミノ酸のインフレーム挿入を含み、これは1つ又はそれ以上の抗原又はその機能的断片をコードする。好ましくは、挿入はアミノ酸549と550の間である。いくつかの実施形態において、挿入は10~100のアミノ酸を含むであろう。好ましくは、約20~約50のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、異種抗原又はその機能的断片は病原微生物に由来するであろう。好ましくは、前記病原微生物は、ウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルスHIV抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌Vibriocholerae抗原、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparum抗原、三日熱マラリア原虫Plasmodiumvivax抗原、卵形マラリア原虫Plasmodiumovate抗原、四日熱マラリア原虫Plasmodiummalariae抗原、二日熱マラリア原虫Plasmodiumknowlesi抗原、肺炎球菌Streptococcuspneumoniae抗原、化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes抗原、ヘリコバクターピロリ抗原、ストレプトコッカスアガラクチアStreptococcusagalactiae抗原、髄膜炎菌Neisseriameningitidis抗原、淋菌Neisseriagonorrhoeae抗原、ジフテリア菌Corynebacteriumdiphtheriae抗原、破傷風菌Clostridiumtetani抗原、百日咳菌Bordetellapertussis抗原、ヘモフィルスHaemophilus抗原、クラミジアChlamydia抗原及び大腸菌Escherichiacoli抗原からなる群より選択される。好ましくは、抗原はヘリコバクターピロリの表面に示されるか又は分泌される。本発明の1つの態様において、抗原に対する免疫寛容を誘導するための方法が提供され、該方法は哺乳類の免疫応答関連疾患の治療を目的とした粘膜送達用の薬物、病人用特別食又は栄養補助食品の調製のための抗原を分泌する単離された遺伝子改変ヘリコバクターピロリによる前記抗原の粘膜送達を含み、その際前記抗原は好ましくは前記哺乳類中に継続的に存在する。好ましくは、免疫寛容は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ及びヒトからなる群より選択される哺乳類で誘導される。好ましくは、前記哺乳類はヒトである。好ましくは、免疫寛容は粘膜寛容である。本明細書で使用するとき、粘膜は、口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、肺粘膜及び鼻粘膜のようないかなる粘膜でもありうる。本明細書全体を通じて使用される粘膜送達は、粘膜への送達を包含する。経口粘膜送達は、口腔内、舌下及び歯肉経路の送達を包含する。したがって、本発明は、前記粘膜送達が、直腸送達、口腔内送達、肺内送達、眼内送達、経鼻送達、膣内送達及び経口送達からなる群から選択される方法に関するものである。好ましくは、前記粘膜送達は経口送達であり、前記寛容は経口寛容である。本出願の全体を通じて使用する粘膜寛容は、哺乳類ヒトを含むが粘膜経路で抗原に暴露された後の、動物における前記抗原に対する特異的免疫応答性の阻害である。好ましくは、前記粘膜寛容は全身寛容である。抗原のその後の暴露は、非経口注射による暴露、粘膜送達による暴露、又は自己抗原の場合のような内因性産生による暴露のような、当業者に既知のそれぞれの暴露でありうる。経口寛容は、哺乳類ヒトを含むが経口経路で抗原に暴露された後の、前記哺乳類における抗原に対する特異的免疫応答性の阻害である。したがって本発明は、本明細書に記載される方法又は使用に関するものであり、ここで、前記免疫寛容の誘導は、前記誘導の前の少なくとも1.5倍、好ましくは2倍、より好ましくは3倍以上である。あるいは、前記抗原は、前記誘導の前の少なくとも1.5倍、2倍、又は3倍以上寛容化される。免疫寛容の誘導は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。好ましくは、前記免疫寛容の誘導は、前記動物におけるサイトカインレベルの調節により測定することができる。調節は、それ自体、サイトカインレベルの増大である可能性があり、たとえば前記サイトカインレベルの増大は、前記誘導の前の少なくとも1.5倍、2倍、又は3倍以上であるたとえばIL-10又はTGF-β。あるいは、前記調節は、特定のサイトカインレベルのレベルの減少であり、たとえば前記サイトカインレベルの減少は、前記誘導の前の少なくとも1.5分の1、2分の1、又は3分の1以下であるたとえばIL-12、IL-17及びIFN-γ。調節されるサイトカインは、任意の関連するサイトカインから選択することができ、好ましくは前記サイトカインは、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、MCP-1、TGF-β、RANK-L及びFlt3Lからなる群から選択される。本発明を、以下の非限定的実施例のみを参照することによってさらに説明する。しかし、以下の実施例は例示的なものであり、いかなる形でも本明細書に記載の発明の一般性に対する制限とみなされるべきではないことが理解されるべきである。挿入による突然変異宿主病原体相互作用におけるウレアーゼ表面の関与の可能性を試験するため、UreA/UreB構造Haetal.、2001,上記をインシリコinsilicoで解析し、2つのエピトープタグの挿入を寛容化する可能性のある表面領域を識別した図1a。続いて、標準的なPCR技法を用いて、野生型ureA又はureB遺伝子DNAを、ウレアーゼ図4の8つのサイトにおいてセミランダムな6つのアミノ酸リンカーによってフランクされたタグ配列をコードするインフレーム挿入突然変異DNAで染色体置換することによってH.ピロリ突然変異株を作製した。簡単に述べると、すべてのPCR構築は、初期増幅のテンプレートとして26695ゲノムDNAを用いた。この研究で使用したプライマーを表1に示し、使用した組合せを表2に示す。オーバーラップPCRによるスプライシングの原理は過去に報告されているShevchuketal.,2004,NucreicAcidRes.,322,e19。相同組換え領域にフランクされたrpsL.ermBカセットDailidieneetal.,2006,Appl.Environ.Microbiol.,729,5908-5914を構築するため、3段階PCRを実施した。本研究に使用されたオリゴヌクレオチドの配列改変DNAを作製するために使用したプライマーの組合せmdaB遺伝子座においてrpsL.ermBが存在するX47からのゲノムDNA段階1は、rspL.ermBカセットの増幅、及びウレアーゼ遺伝子座における相同組換え領域のフランキングを含む。段階2は、2waySOEPCRを用いて、いずれかのフランキング領域をrpsL.ermBカセットに付加し、段階3はこれらの産物をテンプレートとして使用して、2waySOEPCRを用いて両方のフランキング領域をrpsL.ermBカセットに付加する表2。HAインフルエンザウイルスA/PR/8/34ヘマグルチニンタンパク質のaa150-159及びaa110-120;Casaresetal.,1997,ViralImmunol.,103,129-136及び4つのアミノ酸リンカーによって分離され、セミランダムな6つのアミノ酸リンカー及び相同組換え領域によってフランクされたFLAGDYKDDDDKエピトープをコードするDNAを作製するため、AccuPrime登録商標PfxSupermixInvitrogenを用いて3段階PCRを実施した。段階1はフランキングリンカーの付加を含み、段階2はHA及びFLAGエピトープの付加を含み、段階3は2waySOEPCRを用いた相同組換えのためのフランキング領域の付加を含む表2。サーモサイクル条件は以下の通りである:94°Cで15秒間、56°Cで20秒間、68°Cで3.5分間10サイクル。プライマーの添加後、さらに94°Cで15秒間、62°Cで20秒間、68°Cで3.5分間を35サイクル実施し、その後3分間の最終伸長を行った。伸長時間はPCR産物の長さにしたがって変動した。ストレプトマイシン耐性H.ピロリ株X47をすべての実験で使用したKleanthousetal.,1995,Gut,37,A94。細菌は、脳心臓浸出液BHIベースに5ウマ血液及び適切な場合にはエリスロマイシン10μg/mL又はストレプトマイシン10μg/mLを添加した寒天平板上で、5CO2環境下で生育した。BHIベースの寒天平板上で一晩培養したH.ピロリを、DENTOxoidを添加した平板上で直径約2cmの菌叢にて継代培養した。PCR産物は、形質転換に使用する前に、DpnI処理して残留ゲノムDNAを除去し、QIAQuickPCRPurificationKitQuiagenで精製した。形質転換は、菌叢を6~8時間生育した後、約1μgの精製PCR産物を添加することによって実施した。一晩インキュベーションした後、推定形質転換体を選択培地上にストリークした。機能的ウレアーゼ産生H.ピロリを、BHIベースに7v/vウマ血清、フェノールレッド100mg/L、及び尿素600mg/Lを添加した寒天平板上で選択した。図2に示すように、培地は機能的ウレアーゼ産生H.ピロリ用に選択した1MHClを用いてpH3に酸性化した。8つの候補サイトのうち4つで、H.ピロリの生育及び尿素の代謝を可能にする突然変異ウレアーゼ酵素が得られた図1b。残りの4つのサイトにおける挿入からは、前記の条件下で機能的ウレアーゼを発現する細菌は単離されなかった。H.ピロリをマウスの胃から集菌し、4日間生育し、採取してSDS-PAGEローディングバッファ中に再懸濁した。標準的なSDS-PAGE及びウェスタンブロット法を実施したSambrookRussell,2001,MolecularCloning,supra。不連続な10ゲル上でSDS-PAGEを用いて電気泳動を実施した。ウェスタンブロットのため、タンパク質をPVDFImmuno-BlotPVDF0.2μMメンブレンBioradに移した。メンブレンを、0.2v/vTween20添加マレイン酸緩衝液100mMマレイン酸、150mMNaCl、pH7.5、20°Cに2ブロッキング試薬Rocheを含む溶液で一晩ブロックした。FLAGを検出するため、メンブレンを、モノクローナル抗FLAGSigmaAldrichの0.1v/vTween20添加1ブロッキング試薬による1:1000希釈液で室温にて2時間プローブした。検出のため、メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼに接合したウサギの抗マウスIgGJacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.と共に同一条件下で室温にて1時間インキュベートした。検出は、化学発光ペルオキシダーゼ基質-3Sigma-Aldrich及び富士フィルムLAS-3000Imagerを用いて実施した。ウレアーゼは、1:200希釈の抗ウレアーゼαサブユニットbc-14;SantaCruzBiotechnologyを用いて同様にプローブし、1:2500希釈のウサギの抗ヤギHRP接合抗体JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.を用いて検出した。ウェスタンブロット解析で、サイト1、3、4又は8で組換え型ウレアーゼを産生するH.ピロリは、エピトープタグの挿入を含有することが確認された図2a。胃粘膜感染を確立するためにH.ピロリが横断しなければならないマウス胃内腔のpHは3~4であるMcConnelletal.,2008,JPharmPharmacol.,601,63-70。ウレアーゼの表面露出ループにおけるこれらの挿入がその活性又は安定性を変更するか否かを明らかにするため、酸pH3暴露後に野生型又は突然変異型ウレアーゼを発現する細菌における酵素活性を測定した。突然変異型ウレアーゼの1つサイト1における挿入は野生型よりも高感度であり、他の3つの突然変異型ウレアーゼは酸処理に対する感度が野生型に類似していた図2b;学生のT-検定;p<0.05。マウスの実験的感染ヘリコバクターフリーのC57BL/6マウスを、アニマルリソースセンター西オーストラリア、パースから購入した。研究は、UWA動物倫理委員会AnimalEthicCommitteeの承認を受けて実施した承認番号07/100/598。8週齢のマウスに、オーバーナイト寒天平板ベースの培養液からBHI培地Oxoidに採取した約1.0×109のH.ピロリを経口胃接種した。マウスに、野生型又は組換え型ウレアーゼを発現する3つの独立した遺伝的に特性決定されたクローンのプールを接種した。コロニー形成のレベルを測定するため、屠殺した動物から胃を取出し、切開して残留食物を除去した。切開した胃を500μLのPBS中に懸濁し、5mmのステンレス鋼ビーズを用いて、30QiagenTissueLyserの設定で25秒間ホモジナイズした。続いて、組織からの細菌放出を促進するため、試料を10の設定でさらに2分間ホモジナイズした。ホモジネートの段階希釈液を、アンホテリシンB8μg/mL、トリメトプリム5μg/mL及びバンコマイシン6μg/mL、ナリジクス酸10μg/mL、ポリミキシンB10μg/mL及びバシトラシン200μg/mLを添加したBHIベースの寒天平板に播種したDailidieneetal.,2006,ApplEnvironMicrobiol.,729,5908-5914。播種5~7日後に細菌の生育を調べた。血清を異なる時点でマウスから回収し、ウレアーゼ特異的IgGの存在について評価した。Nuncの96ウェルマキシソーププレートに10μg/mLのウレアーゼBタンパク質プラスミドpILL927から発現し、文献Ferreroetal.,1994,Infect.Immuno.,6211,4981-4989に記載のように精製したものの炭酸緩衝液100μLをコーティングし、4°Cで一晩インキュベートした。プレートを0.05v/vTween20PBSTを含むPBSで5回洗浄した後、2BSAw/vを含むPBS200μLを用いて37°Cで2時間ブロックした。PBSTで2回洗浄した後、2w/vBSAを含むPBST100μLで1:20希釈したマウス血清を添加してウェルを複製し、プレートを室温で1時間インキュベートした。その後、プレートをPBSTで5回洗浄した後、2w/vを含むPBST100μLで1:1000希釈した抗マウスIgGアルカリホスファターゼSigmaAldrichを各ウェルに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。PBSTで5回洗浄した後、200μLのニトロフェニルリン酸基質のジエタノールアミン緩衝溶液を各ウェルに添加し、暗所、室温下で40分プレートをインキュベートした後、405nmの吸光度を測定した。H.ピロリをBHI寒天平板上で24時間生育した後に採取し、冷却生理食塩水0.9v/vで洗浄した。この細菌懸濁液を、OD600が4になるまで希釈し、15μLを、Tween200.2v/vを含む生理食塩水15μLに添加した。各試料に90μLのKCl200mM;pH3を添加し、試料を室温下、300rpmで振盪しながら10分間インキュベートした。続いて、前記溶液を120μLのPBSpH6.8の添加によって中和した。各試料150μLに、25μLのフェノールレッドナトリウム塩80mg/mLを添加し、37°Cに加温した。75μLの0.5M尿素の添加によって反応を開始し、560nmの吸光度を70秒毎に読み取ることによってpHの変化を測定した。突然変異型ウレアーゼ産生H.ピロリ株の各々についてC57BL/6マウスコロニー形成能を試験した。サイト3-突然変異ウレアーゼを有する菌株は、マウスコロニー形成せずデータ非表示、それ以上研究しなかったのに対し、他の3つの突然変異菌株は、短期<3カ月感染において野生型と同程度の効率でコロニー形成した。サイト8-突然変異ウレアーゼを有するH.ピロリの持続性は、時間が長くなると大幅に低下した図3a。確認では、マウス胃及び血清中の抗H.ピロリIgGの細菌力価の各々は、この菌株による10カ月感染の場合、野生型及び他の2つの突然変異型と比べて大幅に低下した図3b,c。前記の感染プロトコルで重要なことは、各接種で3つの独立した形質転換クローンのプールを使用したことであり、これによりウレアーゼ内の挿入と異なる二次的突然変異による弱毒化の可能性に対する懸念が排除される。さらなる試験で、接種10カ月後にマウスから回収したほぼすべての細菌が期待される突然変異型ウレアーゼを依然として発現することが明らかにされ、これによりコロニー形成の成功が挿入DNAの喪失によるものではないという予想が支持された。唯一の例外として、サイト1突然変異型菌株に初期感染したマウス1匹のみが、10カ月で復帰突然変異型ウレアーゼを産生しているように見えた図4。サイト1突然変異体でウレアーゼの酸安定性が野生型及び他のコロニー形成マウスよりも低い点、並びにサイト8突然変異体で、ウレアーゼ活性は耐酸性では野生型に近いにもかかわらずマウスコロニー形成の持続性は低い点で、インビトロで測定されたウレアーゼ活性低下はコロニー形成能力低下とあまり相関関係がないことも印象的であった。本発明者らは、サイト8図1a周辺のウレアーゼ表面の別の役割が慢性感染において重要であると提案する。要約すると、ウレアーゼ複合体の構造ベースの挿入突然変異誘発は、H.ピロリのコロニー形成又は持続性に必要な酵素表面上の2つの別個の領域、サイト3及びサイト8を識別した図1a。サイト3における挿入により組換え型H.ピロリがマウスコロニー形成できないことは、酸中和とは異なるウレアーゼの別の役割をさらに支持するものであり、さらなる調査の正当な根拠となる。さらに、本発明者らの結果は、サイト8領域はウレアーゼの脱酸機能に不可欠ではなく、むしろ宿主中での持続性に必要な別の機能に関与することを示唆する。サイト8はウレアーゼ複合体の表面においてβ-メアンダーの曲折部に位置する。相同ウレアーゼ配列のこのサイトにおける挿入又は欠失は、多様な生物で見出されず補足図2、したがってこのβ-メアンダーの精密構造が、長期的コロニー形成におけるウレアーゼの別の役割にとって重要であると提案する。サイト3及び8は、いずれも3つのα/β三量体と接触する回転軸の近接に位置する点で共通する。酵素活性はα/β三量体の完全性に依存することから、サイト3及び8におけるタグの挿入により、酵素活性を損なうことなく三量体/三量体相互作用表面を修飾することが可能である。適応免疫応答は、慢性H.ピロリ感染の確立及び維持の間に、特に感染サイトにおいて劇的に変化する。ウレアーゼのサイト8は、確立されたH.ピロリCD4T細胞エピトープと重なり、これに応答して脾臓リンパ球はTh2応答のプロモーターであり抗原産生のドライバーであるサイトカインIL-4を産生するShietal.,2007,Vaccine,2514,2583-2590のに対し、サイト1、3及び4はいずれの既知のB又はT細胞エピトープとも関係しない。本発明者らは、サイト8においてウレアーゼ組換え体を発現するH.ピロリは、感染3カ月で動物に感染し、このときその細菌負荷は野生型ウレアーゼを発現する細菌のそれに近く図3a、ウレアーゼBサブユニットUreBに対しては弱いホルモン応答を示すが、全H.ピロリ抗原に対しては正常応答を示す図3dことを指摘する。ウレアーゼは最大で細菌タンパク質の10を構成するMarcusScott,2001,Helicobacter,62,93-99;HuMobley,1990,InfectImmun.,584,992-998ことから、豊富なTh2ドライバーを除去することで、持続性において重要なH.ピロリによる適切な免疫調節が妨げられ、それによって細菌排除が促進される可能性がある。あるいは、胃上皮でのH.ピロリのCD74MHCクラスIIへの結合がIL-8分泌及び炎症性サイトカインの上方調節を増大するBeswicketal.,2006,InfectImmun.,742,1148-1155ことを考えると、ウレアーゼサイト8領域のCD74型宿主細胞受容体との直接的相互作用が宿主細胞のシグナル伝達に影響し、それによって慢性感染を助長すると推測できる。この仮説は、CD74受容体が三量体として機能するという観察Beswicketal.2009,WorldJGastroenterol.15:2855におけるレビューによって支持され、サイト3及び8におけるタグ挿入がα/β三量体の三量体形成に影響する可能性が高い。結論として、ウレアーゼ複合体の表面特性は、ウレアーゼ活性自体とは異なり、H.ピロリのコロニー形成及び持続性にとって重要であることが見出された。抗H.ピロリワクチン開発への多数の取り組みが失敗していることを考慮すると、持続性に重要な因子の分子的理解を深めることが、新たな、切望される治療的アプローチの開発に貢献するはずである。"