以下を特徴とする齧歯動物細胞:aエプスタインバーウイルス核抗原1EBNA1を発現する;b以下を含むエピソームを含む:i原核生物複製起点;ii選択マーカー;iiiエプスタインバーウイルスEBV複製起点oriP;iv該齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、該異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む、発現カセット。以下の段階を含むことを特徴とする、齧歯動物細胞を入手するための方法:a齧歯動物細胞を提供する段階;b以下を含むプラスミドを提供する段階:i原核生物複製起点;ii選択マーカー;iiiエプスタインバーウイルス核抗原1EBNA1用の機能性発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、EBNA1をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳配列を含む、発現カセット;cプラスミドbを齧歯動物細胞aに導入する段階、および安定に形質転換された齧歯動物細胞を選択する段階;d以下を含む、1つから4つまでのさらなるプラスミドを提供する段階:i原核生物複製起点;ii選択マーカー;iiiエプスタインバーウイルスEBV複製起点oriP;iv該形質転換された齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを伴う3非翻訳領域を含む、発現カセット;eさらなるプラスミドdを、該安定に形質転換された齧歯動物細胞に導入する段階。以下の段階を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドの産生のための方法:a請求項1記載の齧歯動物細胞を提供する段階;b該齧歯動物細胞を、該異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階;c該ポリペプチドを培養物から回収する段階。以下を含むことを特徴とする、請求項1記載の齧歯動物細胞の産生のためのキット:a齧歯動物細胞;b以下を含む、第1のプラスミド:i原核生物複製起点;ii選択マーカー;iiiエプスタインバーウイルス核抗原1EBNA1用の機能性発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、EBNA1をコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む、発現カセット;c以下を含む、第2のプラスミド:i原核生物複製起点;ii選択マーカー;iiiエプスタインバーウイルスEBV複製起点oriP;iv該齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、核酸配列の導入のためのクローニング部位、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む、発現カセット。異種ポリペプチドが、プロドラッグ、酵素、酵素断片、酵素阻害物質、酵素活性化物質、生物活性ポリペプチド、ヘッジホッグhedgehogタンパク質、骨形成タンパク質bonemorphogeneticprotein、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、GCSF、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片を含む群から選択されることを特徴とする、請求項2~3のいずれか一項記載の方法。以下の段階を含むことを特徴とする、齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のための方法:aEBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子で安定にトランスフェクトされた齧歯動物細胞を提供する段階、b該齧歯動物細胞に、エプスタインバーウイルスEBV複製起点oriPを含む発現プラスミドをトランスフェクトする段階;c該トランスフェクトされた細胞を、該異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階、d該異種ポリペプチドを培養物から回収する段階。異種ポリペプチドが、分泌性の異種ポリペプチドであることを特徴とする、請求項2~3および5~6のいずれか一項記載の方法。発現プラスミドが、EBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子を全く含まないことを特徴とする、請求項2~3および5~7のいずれか一項記載の方法。培養する段階が一過性トランスフェクション下で行われることを特徴とする、請求項2~3および5~8のいずれか一項記載の方法。齧歯動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項2~3および5~9のいずれか一項記載の方法。CHO細胞が、CHODBX11細胞、CHOK1細胞、CHODG44細胞、およびEBNA1を発現するCHO細胞を含む群から選択される、請求項10記載の方法。発明の詳細な説明本発明は、エプスタインバーウイルス核抗原1EBNA1を発現し、かつエピソームを含む齧歯動物細胞であって、前記エピソームが以下のものを含む齧歯動物細胞を提供する:a原核生物複製起点;b選択マーカー;cエプスタインバーウイルスEBV複製起点oriP;d前記齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、前記異種ポリペプチドをコードする核酸配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む、発現カセット。本発明を実施するために有用な方法および手法は、例えば、AusubelFMedCurrentProtocolsinMolecularBiologyVolumesItoIII;GloverNDandHamesBDedDNACloningAPracticalApproachVolumesIandIIOxfordUniversityPress;FreshneyRIAnimalCellCultureapracticalapproachIRLPress;WatsonJDetalRecombinantDNASecondEditionCHSLPress;WinnackerELFromGenestoClones;NYVCHPublishers;CelisJedCellBiologySecondEditionAcademicPress;FreshneyRICultureofAnimalCellsAManualofBasicTechniquesSecondEditionAlanRLissIncNYに記述されている。本明細書で用いる核酸という用語は、組換え的に産生することができるポリペプチドをコードする、少なくとも部分的に非天然の核酸を指す。非天然のは、個々のヌクレオチドの配列、またはプロモーター、3非翻訳領域、エンハンサーもしくは複製起点を非限定的に含む、使用される機能性エレメントの組み合わせのいずれかを指すことができる。核酸は、核酸断片、好ましくはDNA断片で構築することができ、それらは単離されたか化学的手段によって合成されたものである。核酸は、別の核酸、例えばプラスミドまたは真核宿主細胞のゲノム染色体の中に組み込むことができる。プラスミドには特にシャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミドは、複製起点例えば、ColE1複製起点および選択用マーカー例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子を、細菌における複製および選択のそれぞれのために含む、原核生物増殖ユニットprokaryoticpropagationunitも含む。核酸は同様に、個々のヌクレオチドからなる、その核酸配列によって特徴づけられる。本明細書の中で用いる核酸配列という用語は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質またはそれらの機能性変異体、すなわち例えば、異なるアミノ酸配列を有するものの同じ生物学的機能活性を有するタンパク質をコードする、核酸分子およびその変異体のヌクレオチド配列を指す。これらの改変は例えば、遺伝暗号の縮重、突然変異、例えば点突然変異、欠失、挿入などに起因する。タンパク質の変異体は、親タンパク質配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失およびまたは置換のために、アミノ酸配列の点で、親タンパク質のアミノ酸配列とは異なる。通常、変異体は、親タンパク質配列に対して少なくとも90、より好ましくは少なくとも95、最も好ましくは少なくとも99のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有すると考えられる。発現カセットとは、細胞における、少なくとも、含まれる構造遺伝子の、発現および分泌のために必要なエレメントを含む核酸配列のことを指す。遺伝子とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のために必要な、例えば染色体上またはプラスミド上にある、セグメントのことを指す。遺伝子は、コード領域のほかに、プロモーター、イントロンおよびターミネーターを含む、他の機能性エレメントを含む。構造遺伝子とは、シグナル配列を伴わない、遺伝子のコード領域のことを指す。本明細書の中で用いるプロモーターという用語は、下流の核酸配列の転写を推し進めるために用いられる調節性核酸配列を指す。プロモーター配列は、サイトメガロウイルスCMV、初期および後期シミアンウイルス40SV40BernoistCandChambonPNature29030410、ラウス肉腫ウイルスRSVの3長末端反復配列に含まれるプロモーターYamamotoetalCell22:78797、グリセリンアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼGADPH、レトロウイルスLTR、伸長因子1αEF1α、ユビキチン、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼHSVTK例えば、LeeAetalMolCell7495501WagneretalProcNatlAcadSciUSA78:144145も参照のことのプロモーター配列、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列BrinsteretalNature2963942などを含む群から選択することができる。好ましいものは、アデノウイルスプロモーター例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、アルブミンプロモーター、ApoA1プロモーター、βアクチンプロモーター、熱ショックプロモーター、異種プロモーター例えば、CMV、ヒトのグロブリンおよび成長ホルモンのプロモーター、誘導性プロモーター例えば、MMT、レトロウイルスLTRプロモーター、RSV、ならびにチミジンキナーゼプロモーター例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのような強力なプロモーターである。特に好ましいものは、アデノウイルスプロモーター、最初期および後期サイトメガロウイルスプロモーターCMV;BoshartetalCell4152130、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターMMTV、およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列由来のプロモーターLTRRSV;GormanetalProcNatlAcadSciUSA79677781のような強力なウイルスプロモーターである。本明細書の中で用いるポリアデニル化シグナルという用語は、特定の核酸配列セグメントの一次転写物の切断およびポリアデニル化を誘導するために用いられる核酸配列を指す。ポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域は、SV40、ウシ成長ホルモンBGHの遺伝子、免疫グロブリン遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子tk、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルに由来するポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域からなる群より選択することができる。本明細書の中で互換的に用いられる、耐性遺伝子または選択マーカーとは、対応する選択剤の存在下で、その遺伝子を有する細胞を選択的に選択または除外選択することを可能にする遺伝子のことである。有用な陽性耐性遺伝子には抗生物質耐性遺伝子がある。この選択マーカーは、その遺伝子によって形質転換された細胞を、対応する抗生物質の存在下で陽性選択することを可能にする;形質転換されていない細胞は、選択的培養条件下で増殖または生存することができないと考えられる。選択マーカーは、陽性、陰性または二機能性でありうる。陽性選択マーカーはそのマーカーを保有する細胞の選択を可能にし、一方、陰性選択マーカーはそのマーカーを保有する細胞を選択的に除外することを可能にする。典型的には、選択マーカーは薬物に対する耐性を付与するか、または宿主細胞における代謝的もしくは異化的な欠陥を代償する。原核細胞では特に、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が頻繁に用いられる。真核細胞に有用な耐性遺伝子には、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼAPH、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼhyg、ネオマイシンおよびG418APHなど、ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFR、チミジンキナーゼtk、グルタミンシンテターゼGS、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼインドール、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼヒスチジノールDの遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Zeocinおよびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。そのほかのマーカー遺伝子は、国際公開公報第9208796号および国際公開公報第9428143号に記載されている。対応する選択剤の存在下における選択に加えて、選択マーカーが、細胞内に通常は存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子を提供することもできる。GFPをコードするそのような遺伝子を有する細胞は、GFPによって放出される蛍光の検出のみにより、この遺伝子を有さない細胞と識別することができる。真核生物発現ベクタープラスミドは、原核細胞において増殖可能である。このため、真核生物発現ベクタープラスミドは、複数の耐性遺伝子、すなわち原核細胞選択のために用いうる1つの耐性遺伝子および真核細胞選択のために用いうる1つの耐性遺伝子を保有することが多いと考えられる。本明細書で用いる調節エレメントという用語は、関心対象のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする構造遺伝子の転写およびまたは翻訳のために必要な、シス性に存在するヌクレオチド配列のことを指す。転写調節エレメントは通常、発現される構造遺伝子の上流にあるプロモーター、転写開始部位および終結部位ならびにポリアデニル化シグナル配列を含む。転写開始部位という用語は、一次転写物、すなわちmRNA前駆体に組み入れられる、最初の核酸に対応する遺伝子中の核酸塩基のことを指し;転写開始部位がプロモーター配列と部分的に重複してもよい。転写終結部位という用語は、転写される関心対象の遺伝子の3末端に通常示される、RNAポリメラーゼが転写するのを終結させるヌクレオチド配列のことを指す。ポリアデニル化シグナル配列、またはポリA付加シグナルは、真核生物mRNAの3末端の特定の部位での切断、および切断された3末端に対する約100~200個のアデニンヌクレオチドの配列ポリA尾部の核内での転写後付加のためのシグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列は、切断の部位から約10~30ヌクレオチド上流に位置するコンセンサス配列AATAAAを含みうる。分泌性のポリペプチドを産生するために、関心対象の構造遺伝子はさらに、シグナル配列リーダーペプチドをコードするDNAセグメントを含む。シグナル配列は新たに合成されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をER膜へと、さらにはそれを通過するように導き、そこでポリペプチドは分泌のために送られる。シグナル配列は、タンパク質がER膜を通過する時にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナル配列の機能に関しては、宿主細胞の分泌機構による認識が不可欠である。したがって、用いられるシグナル配列は、宿主細胞の分泌機構のタンパク質および酵素によって認識されなければならない。翻訳調節エレメントには、翻訳開始AUGおよび終止コドンTAA、TAGまたはTGAが含まれる。配列内リボソーム進入部位IRESは、いくつかの構築物に含めることができる。プロモーターとは、それと機能的に連結されている遺伝子構造遺伝子または核酸配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列のことを指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。用いられるプロモーターは、選択された配列の発現を企図している宿主細胞の細胞種において機能性であると考えられる。多種多様な供給源からの、構成性、誘導性および抑制性のプロモーターを含む数多くのプロモーターが当技術分野で周知でありおよびGenBankなどのデータベース中に同定され、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはその内部に入手可能である例えば、ATCCなどの寄託機関、ならびに他の商業的または個別的な供給源から。プロモーターは、構造遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、遺伝子の上流領域5に位置し、構造遺伝子の転写開始部位に対して近位にある。転写の開始に働くプロモーター内部の配列エレメントは、しばしばコンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらのプロモーターエレメントには、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメントDSE;McGeheeREetalMolEndocrinol755160、サイクリックAMP応答エレメントCRE、血清応答エレメントSRE;TreismanRSeminarsinCancerBiol14758、グルココルチコイド応答エレメントGRE、ならびにCREATFOReillyMAetalJBiolChem2671993843、AP225728、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質CREB;LoekenMRGeneExpr325364およびオクタマー因子概論については、WatsonetaledsMolecularBiologyoftheGene4thedTheBenjaminCummingsPublishingCompanyInc1987、およびLemaigreFPandRousseauGGBiochemJ303114を参照などの他の転写因子の結合部位が含まれる。プロモーターが誘導性プロモーターであるならば、誘導物質に反応して転写の速度は上昇する。これに対して、プロモーターが構成性プロモーターであるならば、転写の速度は調節されない。抑制性プロモーターも公知である。例えば、cfosプロモーターは、細胞表面上にあるその受容体に対する成長ホルモンのの結合によって特異的に活性化される。テトラサイクリンtetにより調節される発現は、例えば、CMVプロモーターの後に2つのTetオペレーター部位が続くものからなる人工的なハイブリッド型プロモーターによって実現することができる。Tetリプレッサーは2つのTetオペレーター部位と結合して転写を阻止する。誘導物質であるテトラサイクリンを添加すると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出されて、転写が進行するGossenMandBujardHPNAS8955475551。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含む、他の誘導性プロモーターについては、例えば、Sambrooketal前記およびGossenMetalCurrOpinBiotech5516520を参照されたい。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1αCHEF1、例えば、US5888809号を参照、ヒトEF1α、ユビキチンおよびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターCMVIEがある。プロモーターは構成性であっても誘導性であってもよい。エンハンサーすなわち、プロモーターに作用して転写を増大させるシス作用性DNAエレメントは、プロモーターとともに働いて、プロモーターのみによって得られるよりも発現レベルを高めるために必要である可能性があり、転写調節エレメントとして含まれうる。しばしば、プロモーターを含むポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列例えば、CMVまたはSV40も同様に含むと考えられる。本明細書で用いるエンハンサーとは、それと機能的に連結されている遺伝子またはコード配列の転写を強化するポリヌクレオチド配列のことを指す。プロモーターとは異なり、エンハンサーは配向および位置に対して比較的非依存的であり、転写ユニットに対して5または3側LuskyMetalMolCellBio3110822、イントロン内部BanerjiJetalCell3372940ならびにコード配列それ自体の内部に認められるOsborneTFetalMolCellBio41293305。このため、エンハンサーは転写開始部位の上流もしくは下流のいずれに位置してもよく、またはプロモーターからかなりの距離をおいて位置してもよいが、実際上はエンハンサーはプロモーターと物理的および機能的に重複しうる。さまざまな供給源からの多数のエンハンサーが当技術分野で周知でありかつGenBankなどのデータベース中に同定されており、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはその内部に入手可能である例えば、ATCCなどの寄託機関、ならびに他の商業的または個別的な供給源から。プロモーター配列例えば一般的に用いられるCMVプロモーターを含むさまざまなポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含む。例えば、以上に列記した強力なプロモーターはすべて、強力なエンハンサーも含みうる例えば、BendigMMGeneticEngineering791127。機能的に連結されているとは、2つまたはそれ以上の構成要素の並置であって、そのように記載された構成要素がそれらの意図した様式で機能することを許容する関係にあるような並置のことを指す。例えば、プロモーターおよびまたはエンハンサーは、それが、連結している配列の転写を制御または調節するようにシス性に作用するならば、コード配列と機能的に連結されている。一般的には、しかし必ずしもそうではないが、機能的に連結されているDNA配列は連続しており、分泌性のリーダーおよびポリペプチドなどの2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、連続しておりかつリーディングフレームが合っている。しかし、機能的に連結されたプロモーターは一般にコード配列の上流に位置するものの、それは必ずしもそれと連続している必要はない。エンハンサーは連続していなくともよい。エンハンサーは、そのエンハンサーがコード配列の転写を増大させるならば、コード配列と機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部または下流に、プロモーターからかなりの距離をおいて位置する可能性がある。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を経てポリアデニル化配列へと進行するように、それがコード配列の下流末端に位置するならば、コード配列構造遺伝子と機能的に連結されている。連結は、当技術分野で公知の組換え方法により、例えば、PCR法を用いて、およびまたは好都合な制限部位での連結により、実現することができる。好都合な制限部位が存在しないのであれば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手法を踏まえて用いる。本明細書で用いる発現という用語は、宿主細胞内部で起こっている転写およびまたは翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、選択された配列から転写されたmRNAを、PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができるSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressNewYorkを参照。選択された配列によってコードされるタンパク質は、さまざまな方法、例えばELISAによって、タンパク質の生物活性をアッセイすることによって、またはタンパク質を認識してそれを結合する抗体を用いるウエスタンブロット法もしくはラジオイムノアッセイといったそのような活性に非依存的なアッセイを用いることによって、定量することができるSambrooketal1989前記を参照。宿主細胞とは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が導入される細胞のことを指す。宿主細胞には、プラスミドベクターの増殖のために用いられる原核細胞、および構造遺伝子の発現用の真核細胞の両方が含まれる。典型的には、真核細胞は哺乳動物細胞である。ポリペプチドとは、天然または合成的に産生されたかのいかんを問わず、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の重合体のことである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドはペプチドと呼んでもよい。タンパク質とは、少なくとも1つの鎖が100アミノ酸長またはそれ以上の長さを有する、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む高分子のことである。タンパク質が、炭水化物基などの非ペプチド性構成要素を含んでもよい。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質に対して、そのタンパク質が産生される細胞によって付加されてよもく、細胞の種類によってさまざまでありうる。タンパク質は、本明細書において、そのアミノ酸骨格構造によって定義され;炭水化物基などの付加物は一般に特定されないが、それにもかかわらず存在してよい。異種DNAまたは異種ポリペプチドとは、所定の宿主細胞の内部に天然では存在しない、DNA分子もしくはポリペプチド、またはDNA分子の集団もしくはポリペプチドの集団のことを指す。特定の宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主性DNAすなわち外因性DNAと組み合わされている限り、宿主細胞種に由来するDNAすなわち内因性DNAを含んでもよい。例えば、プロモーターを含む宿主DNAセグメントと機能的に連結されているポリペプチドをコードする非宿主性DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であるとみなされる。その反対に、異種DNA分子が、外因性プロモーターと機能的に連結された内因性構造遺伝子を含むこともできる。非宿主性DNA分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、異種ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書の中で用いるプラスミドおよびベクターという用語は、遺伝物質の細胞内への移入のための媒体を指す。この物質は、一般的には環状核酸分子であるが、それに限定されるわけではない。プラスミドの意図される目的に応じて、それがさらに、例えば、宿主におけるプラスミドの複製または転写を可能にするための、必要な複製制御セグメントを備えた複製起点を含んでもよい。クローニングベクターとは、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、ファージミドまたは細菌人工染色体BACなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須な生物学的機能の欠失を伴うことなく、確定可能な様式での核酸分子の挿入を可能にする1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに適した耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。耐性遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。発現プラスミドとは、宿主細胞において発現させようとするタンパク質をコードする核酸分子のことである。典型的には、発現プラスミドは、原核生物プラスミド増殖ユニット例えば、大腸菌の場合には複製起点および選択マーカーを含む、真核生物選択マーカー、および関心対象の構造遺伝子の発現のための1つまたは複数の発現カセットを含む。発現カセットは、典型的には、プロモーター、5非翻訳領域、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む。遺伝子発現は通常はプロモーターの制御下におかれ、そのような構造遺伝子はプロモーターに機能的に連結されているという。同様に、調節エレメントおよびコアプロモーターは、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節するならば、機能的に連結されている。単離されたポリペプチドとは、ポリペプチドに天然で随伴する、炭水化物、脂質または他のタンパク質性不純物といった混入性細胞成分を本質的に含まないポリペプチドのことである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、ポリペプチドを高度に精製された形態で、すなわち少なくとも約80の純度、少なくとも約90の純度、少なくとも約95の純度、95を上回る純度、または99を上回る純度で含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの方法は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウムSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色の後の単一のバンドの出現による。しかし、単離されたという用語は、二量体、点突然変異などによる突然変異、または代替的にグリコシル化もしくは誘導体化された形態といった、代替的な物理的形態にある同じポリペプチドの存在を除外するものではない。免疫グロブリンという用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認知されている免疫グロブリン遺伝子は、種々の定常領域遺伝子、ならびに莫大な数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、例えば、Fv、FabおよびF2ならびに一本鎖scFvを含む、さまざまな型で存在しうる例えば、HustonJSetalPNASUSA8558795883;BirdetalScience242423426;および、概論についてはHoodLEWeissmanIWoodWBandWilsonJHImmunologyBenjaminCummingsMenloParkCaliforniaandHunkapillerandHoodNature3231516。免疫グロブリンは一般に、少なくとも2つの軽鎖ポリペプチドおよび2つの重鎖ポリペプチドを含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用しうる結合ドメインを含む可変領域一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分を含みうる。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、定常領域一般にカルボキシル末端部分を含む。重鎖の定常領域は、iFcγ受容体FcγRを有する食細胞などの細胞への、またはiiBrambell受容体としても知られる新生児Fc受容体FcRnを有する細胞への、抗体の結合を媒介する。それはまた、補体C1qなどの古典的補体系の因子を含む、いくつかの因子に対する結合も媒介する。さらに、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインはまた、異なるセグメント、すなわち4つのフレームワーク領域FRおよび3つの超可変領域CDRを含む。免疫グロブリン断片は、挿入、欠失およびまたは変異を伴うか、または伴わない、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、CLドメイン、VHドメイン、VLドメイン、フレームワーク領域1、フレームワーク領域2、フレームワーク領域3、フレームワーク領域4、超可変領域1、超可変領域2および超可変領域3からなる群より選択される、1つまたは複数のセグメントを含むポリペプチドを指す。本明細書の中で示されるポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域とは、真核生物mRNAの3末端の特定の部位での切断、および切断された3末端に対する約100~200個のアデニンヌクレオチドポリA尾部の核内での転写後付加のためのシグナルを提供する、長さ50~750塩基対のDNA配列のことである。極めて効率的なポリアデニル化シグナルが推奨されるが、これは非効率的な切断およびポリアデニル化が、望ましくない、例えばプラスミドにコードされた遺伝子発現の理由となりうるオペロン様mRNAの形成をもたらす可能性があるためである。本明細書の中で用いる宿主および細胞という用語は、本発明によるプラスミドを収容するのに好適である細胞を指す。好ましくは、この細胞は、CHOChineseHamsterOvary細胞、BHKBabyHamsterKidney細胞および他の齧歯動物細胞を含む群から選択される。好ましいものは、CHO細胞、またはCHOK1細胞、CHODXB11細胞、CHODG44細胞、およびEBNA1タンパク質を発現するCHO細胞を含む、派生CHO細胞である。本発明に従って提供される細胞の子孫も同じく含まれる。突然変異、環境影響または遺伝暗号の縮重性のいずれかのために生じうる改変を連続した世代に有する、本発明に従って提供される細胞の子孫も同じく含まれる。細胞系という用語は、特に、特定された期間にわたってインビトロで増殖させることのできる細胞の集団を指す。この期間に、細胞は成長し細胞分裂によって増殖する。本明細書の中で用いる一過性トランスフェクションという用語は、細胞に導入された核酸がその細胞のゲノムまたは染色体DNAに組み込まれないプロセスを指す。それは実際には、染色体外エレメント、例えばエピソームとして細胞内に維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響されず、例えば、エピソームの核酸によってコードされるタンパク質は産生される。本明細書の中で用いる安定に形質転換されたという用語は、宿主細胞のゲノム染色体への外因性核酸の遺伝性かつ安定な組み込みを指す。本明細書で用いる生物活性ポリペプチドという用語は、有機分子、例えば、細胞系およびウイルスを用いたバイオアッセイ系などの人工的生体系に対して、またはインビボで、鳥類、およびヒトを含む哺乳動物を非限定的に含む動物に対して投与された場合に生物学的影響を引き起こす、ペプチド、タンパク質、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドまたはタンパク質などの生体高分子のことを指す。この生物学的影響は、酵素の阻害、活性化またはアロステリック修飾、結合部位または周囲での受容体との結合、受容体、シグナル伝達または抗原結合の遮断または活性化でありうるが、それらに限定されるわけではない。EBVの複製起点oriP、EBVの2回対称エレメントおよびEBVの反復配列群の核酸配列は、SEQIDNO:01からSEQIDNO:03までに示されており、それらはGenBankエントリーV01555から導き出されている。EBNA1タンパク質をコードする配列は、SEQIDNO:04に核酸配列として、SEQIDNO:05にアミノ酸配列として示されている。これらの配列は、それぞれV01555GenBankおよびP03211SwissProtから導き出されている。タンパク質の精製のためには、種々の方法が十分に確立され、広く用いられており、微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー例えば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー例えば、陽イオン交換カルボキシメチル樹脂、陰イオン交換アミノエチル樹脂および混合モード交換、チオフィリックthiophilic吸着例えば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック樹脂azaarenophilicresinまたはmアミノフェニルボロン酸を用いる、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー例えば、NiIIおよびCuII親和性材料を用いる、サイズ排除クロマトグラフィーおよび電気泳動の方法ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などVijayalakshmiMAApplBiochemBiotech7593102などである。本発明は、齧歯動物細胞における標的ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の発現のための方法を提供する。本発明はさらに、異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生のための齧歯動物細胞であって、異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする構造遺伝子が齧歯動物細胞内のエピソームによって提供される齧歯動物細胞を提供する。2つまたはそれ以上のサブユニットで構成されるポリペプチドまたはタンパク質、すなわち例えば免疫グロブリンを、本発明の方法に従ってかえって好都合に産生することができる。例えば、軽鎖および重鎖の2つの対で構成される免疫グロブリンの場合には、免疫グロブリンの両方の鎖をコードする2つの構造遺伝子を含む1つのエピソームを用いることができる。または、例えば、軽鎖をコードする構造遺伝子を含むものが1つ、および重鎖をコードする構造遺伝子を含むものが1つという、2つのエピソームを用いてもよい。EBNA1タンパク質の発現に向けられたプロモーターが、本発明において用いられる。強力なプロモーターを用いることが好ましく、強力な異種プロモーター、例えばCMVなどを用いることが好ましい。EBNA1タンパク質用の発現カセットの染色体DNAへの安定な組み込みは、結果として、EBNA1タンパク質を発現する改変された齧歯動物細胞をもたらした、すなわちEBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子およびプロモーターが染色体DNA中に機能的に連結されて組み込まれた。本発明の対象を例示するために、本発明を以下に説明する。第1の段階として、EBNA1タンパク質を発現する基本的な齧歯動物細胞系を構築する。培養下でEBNA1タンパク質を定常的に発現する、基本的な齧歯動物細胞系を構築することが好ましい。その後に、1つまたは複数の異種ポリペプチド用の発現カセットを含むプラスミドを設計し、基本的な齧歯動物細胞系に導入する。EBNA1タンパク質を発現し、かつ異種ポリペプチドの発現のためのプラスミドを保有する、得られた細胞系を、異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する実施例1~4を参照。以下の説明および例は本発明を例示する目的で提示されており、本発明の範囲を限定することが目的ではない。宿主細胞系の構築本発明の宿主細胞は、EBNA1タンパク質をコードする核酸を提供する。EBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子を備えた発現カセットを含むプラスミドの構築は、実施例2aに記載されている。プラスミドの注釈付きマップは図1に示されている。齧歯動物細胞をこのプラスミドを用いてトランスフェクトした。G418を選択剤として用いる選択的培養条件下でのトランスフェクト細胞の選択の後に、形質転換体を採って増殖させ、EBNA1タンパク質の産生に関して試験した。基本的な齧歯動物細胞系の形成のために構築されたプラスミドは、EBVoriP配列の機能性コピーを含まないものとする。これは、oriPの両方のエレメント、2回対称エレメントおよび反復配列群を含む。発現プラスミドの構築異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現のためには、対応する構造遺伝子用の発現カセットを含む発現プラスミドを構築しなければならない。タンパク質例として、モノクローナルヒト抗IGF1R抗体参照、US20050008642号を選択した。本発明の基本的な齧歯動物細胞系を用いるHuMab抗IGF1Rの産生のために、発現プラスミドを構築した実施例3および図3~5を参照。異種ポリペプチドの発現のために構築されたプラスミドは、EBNA1構造遺伝子の機能性コピーを含まないものとする。一般的に言うと、サブクローニングおよびオーバーラップPCRにより、HuMab抗IGF1Rの重鎖可変領域VHおよびヒトγ1重鎖定常領域CH1ヒンジCH2CH3の構造遺伝子と同様に、HuMab抗IGF1Rの軽鎖可変領域VLおよびヒトκ軽鎖定常領域CLをコードする構造遺伝子を連結した。続いて、これらの構築物を、EBVoriPを欠くか、または保有するかのいずれかの哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。基本的な齧歯動物細胞系におけるポリペプチドの発現本発明による基本的な齧歯動物細胞系に対して、構築した発現プラスミドの1つまたは複数をトランスフェクトした。トランスフェクト細胞の培養は、例えば一過性トランスフェクションの下での、異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で行った。一般的に言うと、一過性トランスフェクションの下での培養は、選択剤によって課せられる選択圧が存在しないために、トランスフェクトされた発現プラスミドが宿主細胞の染色体に組み込まれないことを可能にする。これらの選択的でない増殖条件のために、発現プラスミドは、培養物のすべての細胞において100の頻度で複製するわけではない。これは、全体的なタンパク質発現率の緩徐な低下を引き起こす。培養は一般に、培養物中の発現されたタンパク質の濃度が最大値に達するまで行われる。好ましくは、培養は最長で20日間、好ましくは最長で10日間、より好ましくは5~10日間行われる。この期間の後に、当業者に公知の標準的な手法に従って、上清を分離し、産生された分泌性の免疫グロブリンを単離して精製する。上記のバッチ培養のほかに、スプリットバッチsplitbatchプロセスを、細胞の培養のために用いることができる。スプリットバッチ培養プロセスの際には、培養期間の半分の後に栄養培地を交換する。したがって、本発明の目的は、異種ポリペプチドの発現のための方法であって、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞のそれと類似したグリコシル化パターンを有する前記異種ポリペプチドを短時間で産生することを可能にする方法を提供することであった。驚いたことに、本発明による方法はこの需要を満たすことが現在では見いだされているこの方法が基にしている細胞系は、治療用ポリペプチドおよびタンパク質の産生のための細胞系に関して設定されている規制に準拠する、すなわち、ポリオーマウイルスのラージT抗原などの原癌遺伝子を含まない、齧歯動物細胞、好ましくはCHO細胞である。驚いたことに、EBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子、好ましくはプロモーターと機能的に連結されたものが安定にトランスフェクトされた細胞において、エプスタインバーウイルスEBV複製起点を有し、かつEBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子を伴わない、すなわち含まない染色体外エレメント、例えば、発現プラスミドが、異種ポリペプチドの発現において機能性であることが見いだされた。一般に、本発明による方法では、エプスタインバーウイルス由来の2つのエレメント、複製起点oriPおよびEBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子を用いる。本発明の1つの局面は、齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のための方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法である:aEBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子が安定にトランスフェクトされた齧歯動物細胞を提供する段階、b前記齧歯動物細胞に、エプスタインバーウイルスEBV複製起点oriPを含む発現プラスミドをトランスフェクトする段階、c前記トランスフェクトされた細胞を、前記異種ポリペプチドの発現のために適した条件下で培養する段階、d前記異種ポリペプチドを培養物から回収する段階。1つの態様において、前記異種ポリペプチドは免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片であり、好ましくは、前記免疫グロブリンは免疫グロブリンGまたは免疫グロブリンEである。1つの態様において、前記異種ポリペプチドは分泌性の異種ポリペプチドであり、前記異種ポリペプチドは培地から回収される。1つの態様において、前記齧歯動物細胞はCHO細胞である。1つの態様において、EBNA1タンパク質をコードする前記構造遺伝子は、プロモーター、好ましくは強力なプロモーター、特に好ましくはCMV由来のプロモーターと機能的に連結されている。1つの態様において、前記発現プラスミドは、単一のEBV由来エレメントとして、エプスタインバーウイルスEBV複製起点oriPを含む。1つの態様において、前記発現プラスミドは、EBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子を全く含まない。1つの態様において、前記発現プラスミドはさらに以下のものを含む:‐原核生物複製起点‐選択マーカー‐前記齧歯動物細胞における異種ポリペプチドの発現のために適した発現カセットであって、プロモーター配列、5非翻訳領域、前記異種タンパク質をコードする核酸配列構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む3非翻訳領域を含む、発現カセット。1つの態様において、異種ポリペプチドが分泌性の異種ポリペプチドであるならば、前記発現カセットはさらに、前記異種ポリペプチドをコードする構造遺伝子と機能的に連結されているシグナル配列を含む。1つの態様において、異種ポリペプチドの発現のための方法はバッチプロセス、スプリットバッチプロセス、または連続プロセスとして行われる。好ましい態様において、前記方法はバッチプロセスまたはスプリットバッチプロセスとして行われる。1つの態様において、異種ポリペプチドの発現のための方法はさらに、段階e前記異種ポリペプチドを精製する段階を含む。一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用法は当業者に周知である。例えば、Chromatography5theditionPartAFundamentalsandTechniquesHeftmannEElsevierSciencePublishingCompanyNewYork;AdvancedChromatographicandElectromigrationMethodsinBiosciencesDeylZElsevierScienceBVAmsterdamTheNetherlands;ChromatographyTodayPooleCFandPooleSKElsevierSciencePublishingCompanyNewYorkScopesProteinPurificationPrinciplesandPractice;SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY、または、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelFMetalJohnWileySonsIncNewYorkを参照のこと。免疫グロブリンの精製プロセスは一般に、多段階クロマトグラフィーの部分を含む。第1の段階では、非免疫グロブリン性のポリペプチドおよびタンパク質を、例えばプロテインAを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、免疫グロブリン画分から分離する。その後に、個々の免疫グロブリンクラスを分離するため、および第1のカラムからともに流出した微量のプロテインAを除去するために、イオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。最後に第3のクロマトグラフィー段階が、免疫グロブリン単量体を多量体および同じクラスの断片と分離するために必要である。時には、凝集物の量が多く5またはそれ以上、それらを第3の精製段階で効率的に分離できないために、さらなる精製段階が必要になることがある。特定の免疫グロブリンの組換え産生により、種々の免疫グロブリンクラスの分離のための分離段階が不要になる。このため、組換え的に産生された免疫グロブリンの全精製プロセスは、2回のクロマトグラフィーの段階に減らすことができる。プロテインA溶出液は、一般に、各々の免疫グロブリンタンパク質の等電点以下のpH値にある陽イオン交換材料に対してクロマトグラフィーで処理される。1つの態様において、異種ポリペプチドの発現のための方法は、一過性トランスフェクションの下で行われる。異種ポリペプチドの発現のための前記方法の1つの態様において、EBNA1タンパク質をコードする構造遺伝子は、EBNA1タンパク質をコードする完全長構造遺伝子SEQIDNO:4であり、前記発現プラスミドは、EBNA1タンパク質をコードする完全長構造遺伝子SEQIDNO:4を全く含まない。以下の例、配列表および図は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。示された手順に、本発明の精神を逸脱することなく、改変を加えうることは理解されるであろう。実施例の説明実施例1一般的な手法実施例2EBNA1タンパク質を発現するCHO細胞系の構築実施例3EBVoriP、ならびにヒトモノクローナル抗IGF1R抗体の軽鎖および重鎖用の発現カセットを保有するプラスミドの構築実施例4EBNA1陽性DG700IIIE3sub1細胞による、oriPを保有するプラスミドからの抗体の産生実施例1一般的な手法a組換えDNAの手法DNAの操作のためには、SambrookJFritschEFandManiatisTMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYorkに記載された通りに標準的な方法を用いた。分子生物学用試薬は、製造元の指示に従って用いた。bDNA配列の決定DNA配列は、MediGenomixGmbHMartinsriedGermanyで行われた二本鎖シークエンシングによって決定された。cDNAおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データの管理GCGGeneticsComputerGroupMadisonWisconsinのソフトウエアパッケージ、バージョン102およびInfomax社のVectorNTIAdvanceスイート、バージョン80を、配列の生成、マッピング、解析、注釈付けおよび図示のために用いた。d細胞培養の手法CurrentProtocolsinCellBiologyBonifacinoJSDassoMHarfordJBLippincottSchwartzJandYamadaKMJohnWileySonsIncに記載された通りに、標準的な細胞培養手法を用いた。eEBNA1発現のウエスタンブロット分析細胞を200×gでの遠心によって収集し、PBSリン酸緩衝食塩水で洗浄した上で、溶解用緩衝液50mMTrisHClトリスアミノメタン塩酸、pH80、120mMNaCl、05vvNonidet登録商標P40、10vvグリセロール、5mMDTTジチオトレイトール、1mMEGTAエチレンビス四酢酸、1vvTrasylol登録商標、2mMPMSFフェニルメタンスルホニルフロリド、50μgmlロイペプチン中で氷上にて30分間インキュベートした。13000×gでの遠心の後に、可溶性上清を収集し、BioRadタンパク質アッセイカタログ番号:50000001を製造元のプロトコールに従って用いてタンパク質濃度に関して検査した。タンパク質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム、SDSPAGEおよびエレクトロブロット法を、NuPAGE登録商標ゲルシステムInvitrogenを製造元の推奨に従って用いて行った。手短に述べると、タンパク質の溶解物100μgタンパク質を、4倍容積の還元性LDSドデシル硫酸リチウム試料用緩衝液と混ぜ合わせ、70°Cで10分間インキュベートした上で、10NuPAGE登録商標NovexBisTrisゲルInvitrogen、カタログ番号:NP0301にローディングした。タンパク質の分離は、還元性NuPAGE登録商標MESSDS4モルホリノエタンスルホン酸ドデシル硫酸ナトリウム泳動緩衝液中で行った。SDSポリアクリルアミドゲルからのタンパク質のエレクトロトランスファーには、標準的なナイロン膜を用いた。エレクトロトランスファーの後に、膜を50mMTrisHCl、pH75、150mMNaClTBS、トリス緩衝食塩水で洗浄し、1wvWesternBlockingReagentRoche、カタログ番号:11921673001を含むTBS中に4°Cで一晩おいて、非特異的な結合部位をブロックした。EBNA1を対象とするマウスモノクローナル抗体E826Oncogene、カタログ番号:DP15Lを一次抗体として、1wvWesternBlockingSolutionを含むTBSで1:1000に希釈して用いた。TBSで2回、005vvTween20を加えたTBSTBSTで2回洗浄した後に、ペルオキシダーゼを結合させた抗マウス抗ウサギIgG抗体Roche、カタログ番号1520709を二次抗体として、1wvWesternBlockingSolutionを含むTBSで1:10000に希釈して用いた。TBSTで2回、TBSで3回洗浄した後に、結合したペルオキシダーゼ結合物を、LumiLightPlus基質溶液Roche、カタログ番号12015196001およびLumiImagerF1分析装置RocheMolecularBiochemicalsを用いる化学発光によって検出した。f細胞培養上清中の組換え抗体の定量細胞培養上清中の抗体は、ヒトFc検出キットCisBio、カタログ番号:62HFCPEBを用いる競合的イムノアッセイによって定量した。本アッセイは、HTRF登録商標技術HomogeneousTimeResolvedFluorescenceに基づく。手短に述べると、試料を希釈用緩衝液で1:10~1:100に希釈した。50μlの希釈試料を、96ウェルOptiPlatesPerkinElmer、カタログ番号:6005279中にて、25μlの抗ヒトIgGFcクリプテートおよび25μlのヒトIgGXL665と混ぜ合わせた。このアッセイ混合物を室温で一晩インキュベートした。320nmで励起した後に、Victor1420分析装置PerkinElmerを用いて蛍光発光を620nmおよび665nmで測定した。抗体濃度は、較正曲線を用いた比較により、665nm620nmの比から推定した。実施例2EBNA1タンパク質を発現するCHO細胞系の構築aCHO細胞におけるEBNA1タンパク質の発現のためのプラスミドpcDNA3EBNA1の構築プラスミドpcDNA31Invitrogen、カタログ番号:V79020を制限ヌクレアーゼSacIおよびDraIIIで切断し、その結果生じた4715bp断片を、オリゴヌクレオチド1SEQIDNO:06およびオリゴヌクレオチド2SEQIDNO:07のアニーリングによって得られたDNAリンカーと連結させた。その結果生じたプラスミドをHindIIIおよびDraIIIで切断した。この4748bpベクター断片を、pCEP4Invitrogen、カタログ番号:V04450をテンプレートとして、オリゴヌクレオチド3SEQIDNO:08およびオリゴヌクレオチド4SEQIDNO:09をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得られた、EBNA1をコードするHindIIIDraIIIcDNA断片と連結させた。このEBNA1用の真核生物発現プラスミドをpcDNA3EBNA1と命名した図1。bpcDNA3EBNA1によるCHO細胞のトランスフェクション、および安定なトランスフェクタントの選択無血清浮遊培養に対してあらかじめ順化させたCHODG44細胞を、DHI培地SchlaegerEJJImmunolMethods194191199を入れたスピナーフラスコ内にて、5pCO2下にある37°Cの加湿インキュベーター内で維持した。トランスフェクションの前に、細胞を24ウェルプレートに1×106個mlで播いた。トランスフェクションは、LipofectAmine2000Invitrogen、カタログ番号:11668027を製造元のプロトコールに従って用いて行った。手短に述べると、DNAおよびLipofectAmine2000をOptiMEMI培地Invitrogen、カタログ番号:31985047で希釈し、DNAのμg数とLipofectAmine2000のμl数が1:3~1:6の比になるように混ぜ合わせた。室温での20分間のインキュベーションの後に、この混合物を細胞に添加した。24時間後に細胞をDHI培地で希釈して、96ウェルプレートに細胞300個ウェルの比で播いた。さらに24時間後に、G418を培地に700μgmlとして添加した。トランスフェクションから10日後に、G418耐性コロニーを増殖させて、EBNA1タンパク質の発現に関してウエスタンブロットハイブリダイゼーションによって分析した図2a。EBNA1タンパク質を定常的に発現するHEK293細胞HEK293EBNAまたはHEK293Eおよび非トランスフェクトCHODG44細胞を参照標準として用いた。クローンDG700IIIE3はEBNA1に関して強陽性であり、これを限界希釈によってサブクローニングした。EBNA1陽性サブクローンDG700IIIE3sub1を連続培養し、ウエスタンブロットハイブリダイゼーションによってEBNA1発現に関して調べた図2b。図2bに示されているように、EBNA1タンパク質レベルは54日間の培養期間中変化しなかった。実施例3EBVoriPならびにヒトモノクローナル抗IGF1R抗体の軽鎖および重鎖用の発現カセットを保有するプラスミドの構築サブクローニングおよびオーバーラップPCRにより、抗IGF1R抗体の重鎖可変VH領域およびヒトγ1重鎖定常CH1CH2CH3領域の遺伝子と同様に、抗IGF1R抗体の軽鎖可変VL領域およびヒトκ軽鎖定常CL領域をコードする遺伝子セグメントを正確に連結した。抗IGF1R抗体の構造遺伝子κ軽鎖およびγ1重鎖をコードするDNA配列をDNAシークエンシングによって確認し、その後に、EBVoriPを保有する哺乳動物細胞発現ベクターまたは保有しないそれの中に挿入した。HuMab抗IR18κ軽鎖発現ベクターp4816pUCLIR18kappaBsmIp4816は、以下のエレメントから構成される:‐このプラスミドの大腸菌における複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点pUCori‐大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子Amp‐以下のエレメントから構成される、抗IGF1R抗体κ軽鎖の発現のための転写ユニット:‐ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期プロモーターおよびエンハンサーhCMVIE1‐コザック配列を含む合成5UTR‐シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列L1イントロンL2‐5末端の一意的なBsmI制限部位ならびに3末端のスプライスドナー部位および一意的なNotI制限部位を伴って配列された、クローニングされた抗IGF1R抗体可変軽鎖cDNAVL‐イントロン性のマウスIgκエンハンサーを含む、ゲノム性のヒトκ軽鎖遺伝子定常領域[NotIマウスIgκエンハンサーイントロン2ヒトイントロン2Cκ]‐ポリアデニル化シグナル配列を含む、ヒトκ免疫グロブリン3UTR3UTRCκ‐代替的な発現プラスミドへの発現カセットの移入を可能にするための、それぞれ5および3末端にある一意的な制限部位Sse8371IおよびFseI。p4816pUCLIR18kappaBsmIのプラスミドマップは図3aに示されている。抗IGF1R抗体γ1重鎖発現ベクターp4817pUCHIR18gamma1BsmIp4817は、以下のエレメントから構成される:‐このプラスミドの大腸菌における複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点pUCori‐大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子Amp‐以下のエレメントから構成される、抗IGF1R抗体γ1重鎖の発現のための転写ユニット:‐ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期プロモーターおよびエンハンサーhCMVIE1‐コザック配列を含む合成5UTR‐シグナル配列イントロンを含むネズミ免疫グロブリン重鎖シグナル配列L1イントロンL2‐5末端の一意的なBsmI制限部位ならびに3末端のスプライスドナー部位および一意的なNotI制限部位を伴って配列された、クローニングされた抗IGF1R抗体可変重鎖cDNA‐マウスIgμエンハンサーを含む、ゲノム性のヒトγ1重鎖遺伝子定常領域[介在イントロンを伴うNotIマウスIgμエンハンサーヒトイントロン2CH1CH2CH3]‐ポリアデニル化シグナル配列を含む、ヒトγ1免疫グロブリン3UTR‐代替的な発現プラスミドへの発現カセットの移入を可能にするための、それぞれ5および3末端にある一意的な制限部位SgrAIおよびAscI。p4817pUCLIR18gamma1BsmIのプラスミドマップは図3bに示されている。図4に示されているプラスミドp4818pUCHygOriPHeavyIR18BsmIp4818およびp4819pUCHygOriPLightIR18BsmIp4819は、以下の2つのエレメントの導入により、それぞれプラスミドp4817pUCHIR18gamma1BsmIおよびp4816pUCLIR18kappaBsmIから導き出された:‐真核細胞における選択用マーカーとして適したハイグロマイシン耐性遺伝子‐エプスタインバーウイルスの複製起点oriP。p4818pUCHygOriPHeavyIR18BsmIおよびp4819pUCHygOriPLightIR18BsmIのプラスミドマップは図4aおよび図4bに示されている。プラスミドp4821pUCHygOriPIR18heavylightBsmIは、γ1重鎖転写ユニットを含むp4818のSgrAIAscI断片を、p4819のSgrAIおよびAscI制限部位に導入することによって構築した。その結果生じたプラスミドは、EBVoriPおよびκ軽鎖用の転写ユニットを含む、p4819と同じエレメントに加えて、γ1重鎖転写ユニットも含む。p4821pUCHygOriPIR18heavylightBsmIのプラスミドマップは図5に示されている。実施例4EBNA1陽性DG700IIIE3sub1細胞によるoriP保有プラスミドからの抗体の産生DG700IIIE3sub1細胞および非改変CHODG44型細胞を、ProCHO4CDMCambrex、カタログ番号:BE12029Q、2mMグルタミン、2vv50×HT補給物質Invitrogen、カタログ番号:41065012および300μgmlのG418中での37°C、5CO2下の静置培養下にて維持した。トランスフェクションの1時間前に細胞を遠心処理によって収集し、DHI培地SchlaegerEJJImmunolMethods194191199中に05×106個mlで再懸濁させた。トランスフェクションは、LipofectAmine2000Invitrogen、カタログ番号:11668027を用いて行った。培養容積1mlのトランスフェクションのために、以下の成分を混ぜ合わせた:200μlのOptiMEMIInvitrogen、カタログ番号:31985047、2μgのDNAおよび6μlのLipofectAmine。室温での5~30分間のインキュベーションの後に、混合物を細胞に添加した。トランスフェクションから5~10日後に細胞培養上清を採取し、実施例1fに記載した通りに抗体濃度に関して検査した。3種の異なるプラスミドのセットを、CHODG44細胞系またはEBNA1を発現するCHODG44由来の細胞系DG700IIIE3sub1に対してトランスフェクトした。抗体軽鎖の発現用のプラスミドp4816を、抗体重鎖の発現用のp4817とともに同時トランスフェクトした。両方のプラスミドがEBVoriPを欠いている。抗体軽鎖の発現用のプラスミドp4819を、抗体重鎖の発現用のp4818とともに同時トランスフェクトした。両方のプラスミドがEBVoriPを保有する。さらに、抗体軽鎖および重鎖の両方の発現用のプラスミドp4821を単独でトランスフェクトした。プラスミドp4821はEBVoriPを保有する。図6に示されているように、EBNA1陽性DG700IIIE3sub1細胞におけるoriP保有プラスミドp4818およびp4819のトランスフェクションは、同じ細胞系またはEBNA1陰性CHODG44細胞におけるoriPを含まないp4816およびp4817のトランスフェクションと比較して、抗体の2~3倍の発現上昇をもたらした。DG700IIIE3sub1細胞における抗体の発現は、抗体軽鎖および重鎖用の発現カセットをp4821のような単一のoriP保有プラスミド中に組み合わせた場合に、さらに高度であった。これに対して、oriP保有プラスミドp4817p4818およびp4821は、EBNA1陰性CHODG44細胞において抗体発現レベルの上昇を引き起こさなかった。その結果、免疫グロブリンの最大の発現は、oriP保有プラスミドをEBNA1陽性CHO細胞にトランスフェクトした場合に達成された。