"小さいGTP結合タンパク質であるRabG3bタンパク質またはそのタンパク質の突然変異体を過発現させることを特徴とする植物バイオマスの増加方法。前記RabG3bタンパク質は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載の植物バイオマスの増加方法。前記RabG3bタンパク質の突然変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸のうち67番残基を、グルタミンからロイシンに置換した配列を有することを特徴とする請求項1に記載の植物バイオマスの増加方法。RabG3b遺伝子を過発現させることを特徴とする植物バイオマスの増加方法。前記RabG3b遺伝子は、配列番号2または配列番号3に記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項4に記載の植物バイオマスの増加方法。前記増加は、植物の木部発達を調節して行うことを特徴とする請求項4に記載の植物バイオマスの増加方法。植物バイオマス関連遺伝子の発現を促進可能な1つ以上の調節遺伝子に作動的に連結されたRabG3b遺伝子を暗号化する核酸配列を含むことを特徴とする植物バイオマス増進用発現ベクター。前記RabG3b遺伝子は、配列番号2または配列番号3に記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項7に記載の植物バイオマス増進用発現ベクター。前記発現ベクターは、図26に示す開裂地図を有することを特徴とする請求項7または8に記載の植物バイオマス増進用発現ベクター。a植物または植物細胞内に請求項7または8に記載の発現ベクターを導入させるステップと、b前記発現ベクターを含む植物または植物細胞を植物バイオマスを増進する条件下に培養するステップとを含むことを特徴とする植物バイオマス増進用形質転換植物の製造方法。請求項7または8に記載の発現ベクターを含み、相応する野生型植物と比較して植物バイオマスが増加していることを特徴とする形質転換植物。前記植物は、全体の植物、植物器官、種、植物細胞またはこれらの子孫であることを特徴とする請求項11に記載の形質転換植物。本発明は、上記の問題を解決し、上記の必要性によりなされたものであって、本発明の目的は、植物バイオマスの増加に関与するタンパク質を提供することである。また、本発明の他の目的は、植物バイオマスの増加に関与する遺伝子を提供することである。さらに、本発明のさらに他の目的は、前記遺伝子を用いた植物バイオマスの増加方法を提供することである。また、本発明のさらに他の目的は、前記遺伝子を含む形質転換植物の生産方法を提供することである。なお、本発明のさらなる目的は、前記形質転換植物を提供することである。上記の目的を達成するために、本発明は、小さいGTP結合タンパク質であるRabG3bタンパク質またはそのタンパク質の突然変異体及びそのタンパク質またはその突然変異体をコード化する遺伝子を過発現させることにより、植物バイオマスを増加させる方法を提供する。本願において、バイオマスは、対象の産物を含む有用な生物学的物質を言及し、この物質は、対象の産物を分離または濃縮する追加の過程で意図的に回収される。バイオマスは、実またはその部分または種、葉、または茎または根を含むことができ、ここで、これらは、産業的目的について特に関心のある植物の部分である。植物物質について言及したように、バイオマスは、対象の産物を含むか、または植物の任意の構造を含む。本願において、形質転換は、これを実行可能な手段の例を下記に述べ、アグロバクテリウムAgrobacteriumを介した形質転換[双子葉植物の形質転換Needleman及びWunsch1970JMol.Biol48:443;Pearson及びLipman1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444、単子葉植物の形質転換Yamauchietal.1996PlantMolBiol.30:321-9;Xuetal.1995PlantMol.Biol.27:237;Yamamotoetal.1991PlantCell3:371]、及び生物学的biolistic方法P.Tijessen、HybridizationwithNucleicAcidProbesInLaboratoryTechniquesinBiochemistry及びMolecularBiology、P.C.vandderVliet、ed.,c.1993byElsevier、Amsterdam、電気穿孔法、インプランタinplanta技術などを含む。外因性核酸を含む植物は、本願においては、第1の遺伝子導入植物についてはT0、第1の世代についてはT1として言及される。本発明の一具体例において、使用されたRabG3bタンパク質またはそのタンパク質をコード化する遺伝子配列は、シロイヌナズナarabidopsisthalianaに由来するものであるが、関心の対象である異なる種からのRabG3b遺伝子または偽遺伝子も使用することができる。本発明の一具体例において、前記RabG3bタンパク質は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有することが好ましいが、配列番号1に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ以上のアミノ酸を、置換、欠失、付加などの方法により突然変異させ、本発明が目的とするバイオマスの増加効果を有するすべての突然変異体が本発明の範囲内に属し、その例は、配列番号1に記載のアミノ酸のうち67番残基を、グルタミンからロイシンに置換した配列を有する突然変異体である。本発明は、前記本発明のタンパク質またはその突然変異体をコード化する遺伝子は、配列番号2または配列番号3に記載の核酸配列と実質的な同一性を有することが好ましいが、これに限定されない。本発明において、ポリヌクレオチド配列の実質的な同一性という用語は、ポリヌクレオチドが標準パラメータを用い、下記のプログラムを用いて、参照配列と比較して60以上の配列同一性、通常は70以上、より通常は80以上、及び最も好ましくは、90以上の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当該分野の熟練者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、読取フレームの位置づけなどを考慮し、2つのヌクレオチド配列により暗号化されたタンパク質の相応する同一性を測定するように、適切に調節できることを認識するはずである。配列同一性パーセント及び配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例は、文献参照:Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410、1990に記載されたブラストBLASTアルゴリズムである。ブラスト分析を行うためのソフトウェアは、国立生物学情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformationのウェブサイトより利用可能である。本発明の一具体例において、前記遺伝子の発現は、プロモーターの調節下にあることが好ましい。本発明に記載された方法を用いて植物バイオマスの増加に関連する遺伝子に作動的に連結させて発現させるのに適したプロモーターは、形質転換される植物の同一種からまたは異種からのものを使用することができる。また、プロモーターは、本発明の遺伝子に対して同一種に由来するか、または異種に由来することができる。また、本発明の方法に使用するためのプロモーターは、1つ以上の下記に記載されたのと共通する発現プロファイルを有するプロモーターの組み合わせを含むことができるキメラプロモーターを含むことができる。植物ゲノムDNAにおいてプロモーター領域を確認し特性化する方法は、当該分野の熟練者に周知であり、例えば、文献[参照:Jordanoetal,PlantCell1:855-866、1989;Bustosetal.,PlantCell1:839-854、1989;Greenetal.,EMBOJ.7:4035-4044、1988;Meieretal.,PlantCell3:309-316、1991;及びZhangetal.,PlantPhysiol.110:1069-1079、1996]に記載されている。このプロモーター配列の例は、アミノ酸パーミアーゼ遺伝子に対するプロモーターAAP1例:シロイヌナズナからのAAP1プロモーター参照:Hirneretal.,PlantJ.14:535-544、1998、オレイン酸12-ヒドロキシラーゼ:デサチュラーゼ遺伝子に対するプロモーター例:レスクレラフェンドレリからLFAH12に指名されたプロモーター参照:Brounetal.,PlantJ.13:201-210、1998、2S2アルブミン遺伝子に対するプロモーター例:シロイヌナズナからの2S2プロモーター参照:Guercheetal.,Plantcell2:469-478、1990、脂肪酸エロンガーゼ遺伝子プロモーターFAEl例:シロイヌナズナからのFAE1プロモーター参照:Rossaketal.,PlantMol.Biol.46:717-715、2001、及び葉状の子葉遺伝子プロモーターLEC2例:シロイヌナズナからのLEC2プロモーター参照:KrojetalDevelopment130:6065-6073、2003を含む。また、本発明の一実施例で使用されたCaMvcauliflowermosaicvirus35Sプロモーターも含むことができる。また、本発明は、植物バイオマス関連遺伝子の発現を促進可能な1つ以上の調節遺伝子に作動的に連結されたRabG3b遺伝子を暗号化する核酸配列を含む植物バイオマス増進用発現ベクターを提供する。本発明において、ベクターまたは発現ベクターは、外因性DNAにこれを挿入可能な、通常二本鎖のDNA鎖をいう。ベクターまたはレプリコンは、例えば、プラスミドまたはウイルスに由来可能である。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自己複製を促進させるレプリコンポリヌクレオチド配列を含む。また、当該技術に関し、レプリコンという用語は、宿主染色体内にベクター配列の組み換えを標的化したり、あるいはその他の促進させるポリヌクレオチド配列を含む。また、外因性DNAが初期に、例えば、DNAウイルスベクター内に挿入できるとしても、ウイルスベクターDNAの宿主細胞内への形質転換は、ウイルスDNAのウイルスRNAベクター分子内への転換をもたらすことができる。外因性DNAは、異種DNAと定義され、これは、例えば、ベクター分子を複製し、選別可能または選別可能なマーカーまたは形質転換遺伝子を暗号化する、宿主細胞内で天然的に発見されないDNAである異種DNAと定義される。ベクターは、外因性または異種DNAを適した宿主細胞内に伝達するために用いられる。宿主細胞内において、ベクターは、宿主染色体DNAとは独立してまたは一致しないように複製可能であり、いくつかのベクターコピー及びその挿入DNAを生成させることができる。また、ベクターは、外因性または異種DNAの宿主染色体内への挿入を標的化することができる。また、ベクターは、挿入DNAのmRNA分子への転写を許容したり、または挿入DNAの多数のコピーのRNAへの複製を誘発する必須成分を含むことができる。一部の発現ベクターは、追加でタンパク質分子内にmRNAの解読を許容する挿入DNAに近接した配列成分を含有する。したがって、多くのmRNA分子及び挿入DNAによって暗号化されたポリペプチドは迅速に合成可能である。本発明の形質転換遺伝子ベクターという用語は、DNAの挿入断片、すなわち、宿主細胞内でmRNA内に挿入されるか、またはRNAとして複製される形質転換遺伝子をいう。本発明において、形質転換遺伝子という用語は、RNAに転換される挿入DNA断片のみを意味するのではなく、RNAの転写または複製に必要なベクターの部位を意味する。また、形質転換遺伝子は、タンパク質を生産可能な開放読取フレームを含有するポリヌクレオチド配列を必須的に含む必要がない。本発明において、形質転換された宿主細胞、形質転換された及び形質転換という用語は、DNAの細胞内への導入をいう。細胞は宿主細胞と名づけられ、これは原核または真核細胞であり得る。代表的な原核宿主細胞は、各種大腸菌E.coliの菌株を含む。代表的な真核宿主細胞は、植物細胞例:キャノーラ、綿花、カメリナ、アルファルファ、大豆、稲、燕麦、小麦、大麦、またはトウモロコシ細胞など、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞である。導入されたDNAは、一般的に、DNAが挿入された断片を含有するベクターの形態である。導入されたDNA配列は、宿主細胞と同一種、または宿主細胞とは異なる種に由来するか、または、これは宿主種由来の一部のDNA及び一部の外因性DNAを含有するハイブリッドDNA配列であり得る。本発明において、植物という用語は、全体の植物、植物器官例:葉、茎、花、根など、種及び植物細胞組織培養細胞を含む及びこれらの子孫を含む。本発明の方法に使用可能な植物の群は、一般的に、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含む形質転換技術に適用可能な高等植物の群、及び藻類のような特定の下等植物などと広範囲である。これは、倍数体、二倍体及び半数体を含む各種の倍数性レベルの植物を含む。本発明のRabG3bを過発現させる形質転換植物は、例えば、植物内にRabG3b遺伝子に作動的に連結されたプロモーターを暗号化する遺伝子転移ベクター例:プラスミド、ウイルスなどを形質感染させることによって収得可能である。通常、ベクターがプラスミドの場合、当該ベクターは、選別性マーカー遺伝子、例えば、カナマイシンへの耐性を暗号化するカナマイシン遺伝子を含む。植物形質転換の最も一般的な方法は、標的形質転換遺伝子を植物形質転換ベクター内にクローン化させた後、文献[参照:Hoeckemeetal.,Nature303:179-181、1983]に記載されたように、ヘルパーTiプラスミドを含有するアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumifaciens内に形質転換させる。追加の方法は、例えば、文献参照:Maloneyetal.,PlantCellReports8:238、1989に記載されている。形質転換遺伝子ベクターを含有するアグロバクテリウム細胞は、文献参照:Anetal.,PlantPhysiol.81:301-305、1986;Hooykaas、PlantMol.Biol.13:327-336、1989に記載されたように形質転換される植物の葉断片と共に培養することができる。培養された植物宿主細胞の形質転換は、通常、前述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスにより達成することができる。堅い細胞膜障壁を有さない宿主細胞の培養物は、一般的に、元々、文献参照:Grahametal.,Virology52:546、1978に記載されており、文献参照:Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.,1989ColdSpringHarborLaboratoryPress、NewYork、NYに記載されたように変形されたリン酸カルシウム方法を用いて形質転換させる。しかし、ポリブレン参照:Kawaietal.,Mol.Cell.Biol.4:1172、1984、原形質融合参照:Schaffner、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2163、1980、電気穿孔参照:Neumannetal.,EMBOJ.1:841、1982、及び核内への直接的な微細注射参照:Capecchi、Cell22:479、1980のように、DNAを細胞内に導入するための他の方法も用いることができる。形質転換された植物細胞は、細胞を、例えば、カナマイシンと、適切な量の、カルスcallus及び若枝部shootを誘導するためのナフタレン酢酸及びベンジルアデニンのような光ホルモンを含有する培地上で成長させ、選別可能なマーカーにより選別することができる。その後、植物細胞を再生させて収得される植物は、当該分野の熟練者に公知の技術を用いて土壌に移すことができる。前述した方法のほか、クローン化DNAを裸子植物、胞子植物、単子葉及び双子葉植物を含む広範囲な植物種内に移すための複数の方法が当該分野に広く公知されている[参照:GlickandThompson、eds.,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology、CRCPress、BocaRaton、Florida、1993;Vasil、PlantMol.Biol、25:925-937、1994;andKomaietal.,CurrentOpinionsPlantBiol.1:161-165、1998一般的な検討;Loopstraetal.,PlantMol.Biol.15:1-9、1990;及びBrasileiroetal.,PlantMol.Biol.17:441-452、1990木の形質転換;Eimertetal.,PlantMol.Biol.19:485-490、1992ブラシカbrassicaの形質転換;Hieietal.,PlantJ.6:271-282、1994;Hieietal.,PlantMolBiol.35:205-218、1997;Chanetal.,PlantMol.Biol.22:491-506、1993;米国特許第5,516,668号及び第5,824,857号稲の形質転換;及び米国特許第5,955,362号小麦の形質転換;第5,969,213号単子葉植物の形質転換;第5,780,798号トウモロコシの形質転換;第5,959,179号及び第5,914,451号大豆の形質転換]。代表例は、原形質体による電気穿孔促進されたDNA吸収参照:Rhodesetal.,Science240:204-207、1988;Bates、Meth.MoLBiol.111:359-366、1999;DΗalluinetal.,Meth.MoLBiol.111:367-373、1999;米国特許第5,914,451号;ポリエチレングリコールを使用した原形質体の処理参照:Lyzniketal.,PlantMol.Biol.13:151-161、1989;Dattaetal.,Meth.Mol.Biol.,111:335-334、1999;及びDNAを含む微細発射を用いた細胞の衝撃bombardment参照:Kleinetal.,PlantPhysiol.91:440-444、1989;Boyntonetal.,Science240:1534-1538、1988;Registeretal.,PlantMoLBiol.25:951-961、1994;Barceloetal.,PlantJ.5:583-592、1994;Vasiletal.,Meth.Mol.Biol.111:349-358、1999;Christou、PlantMoLBiol.35:197-203、1997;Fineretal.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.240:59-80、1999を含む。追加的に、植物形質転換ステップ及び技術は、文献参照:Birch、Ann.Rev.PlantPhys.PlantMoLBiol.48:297、1997;Foresteretal.,Exp.Agric.33:15-33、1997で探すことができる。若干の変異は、当該技術が広範囲な植物種に適用可能である。単子葉植物形質転換の場合、粒子衝撃は、通常、選別方法である。しかし、トウモロコシのような単子葉植物は、米国特許第5,591,616号に記載されたようなアグロバクテリウム形質転換方法を用いて形質転換させることができる。単子葉植物、例えば、トウモロコシ形質転換を行うための他の方法は、胚形成懸濁液培養物からの細胞を繊維懸濁液[5w/v、シラーSC-9ウィスカーSilarSC-9whiskers]及びプラスミドDNA1μg/μlを混合した後、これをボルテックスジェニーIIVortexGENIEIIボールテックスミキサ[米国、ニューヨークボヘミア所在のScientificIndustries社製造]上の多数のサンプルヘッド内に直接置いたり、またはMIXOMAT歯のアマルガムミキサ[dentalamalgammixer;カナダオンタリオバーリントン所在ののDegussaCanada社製造]のホルダ内に水平に置くのである。その後、形質転換は約60秒例えば、ボルテックスジェニーIIを用いるの最高速度で混合したり、または1秒MIXOMAT間固定速度で振とうさせて行うことができる。当該過程により安定した形質転換体が選別可能な細胞集団が生産される。植物は安定的に形質転換されたカルスから再生され、これらの植物及びこれらの子孫は、サザンハイブリッド化分析により形質転換されたことが明らかになった。植物細胞、特に、トウモロコシの形質転換のための毛の使用は、例えば、米国特許第5,464,765号に記載されている。米国特許第5,968,830号は、大豆を形質転換させて再生させる方法を記載している。米国特許第5,969,215号は、サトウダイコンのような形質転換されたベターバルガリスBetavulgaris植物を生産するための形質転換技術を記載している。各々の前記形質転換技術は利点欠点を有する。各々の技術において、プラスミドからのDNAを遺伝子操作することにより、これが目的の遺伝子だけでなく、選別可能でふるい分け可能なマーカー遺伝子も含有するようにする。ふるい分け可能なマーカー遺伝子を用いてプラスミドの統合されたコピー当該作製物は、目的の遺伝子及び選別可能な遺伝子が単位として形質転換されるようにするを有する細胞のみを選別するのに用いられる。選別可能な遺伝子は、目的の遺伝子を有する細胞のみを成功的に培養するための他の点検を提供する。抗生剤耐性の選別可能なマーカーを用いた伝統的なアグロバクテリウム形質転換は、このような植物が動物及び人に対して抗生剤耐性を拡散させる過度の危険性を含むために問題となり得る。このような抗生剤マーカーは、植物を米国特許第5,731,179号に記載されたのと類似のアグロバクテリウム技術を用いた形質転換植物により、植物から除去可能である。抗生剤耐性問題は、米国特許第5,712,135号に記載されたようなバーまたはパットpatの暗号化配列を用いて効果的に避けることができる。このような好ましいマーカーDNAは、グルタミンシンテターゼ抑制剤、除草剤、ホスフィノスリシングルホシネート及びグルホシネートアンモニウム塩Basta、Igniteの作用を抑制させたり中和させる第2タンパク質またはポリペプチドを暗号化する。1つ以上の前記遺伝子を含有するプラスミドは、前述した技術のいずれか1つにより植物原形質体またはカルス内に導入させる。マーカー遺伝子が選別可能な遺伝子の場合、DNAパッケージが混入された細胞のみが適切な植物毒素剤を使用した選別下に生存する。適切な細胞が確認されて増殖されると、植物が再生される。形質転換された植物からの子孫をテストすることにより、DNAパッケージが植物ゲノム内に成功的に統合されたことを確認しなければならない。形質転換の成功に影響を及ぼす複数の因子が存在する。外因性遺伝子作製物の設計及び作製、及びこれの調節成分は、外因性配列の植物核の染色体DNA内への統合及び細胞により発現する形質転換遺伝子の能力に影響を及ぼす。外因性遺伝子作製物を植物細胞核内に非致命的な方法で導入させるのに適した方法は必須的である。重要な点は、全体の植物が回収される場合に作製物が導入される細胞の類型が再生に対して補正可能な類型であるため、適切な再生プロトコールを提供しなければならないという点である。また、原核細胞は、本発明の初期のクローン化段階のための宿主細胞として使用可能である。方法、ベクター、プラスミド及び宿主細胞システムは、このような初期のクローン化及び拡張段階に使用可能な当該分野における熟練者に周知であり、本願では記載しないものとする。本発明の他の具体例において、プロモーターは、当該分野の熟練者に公知の方法を用いて形質転換される植物でRabG3bのような植物バイオマス増加関連遺伝子を暗号化する遺伝子に作動的に連結させることができる。プロモーターの挿入は、遺伝子形質転換植物の発達する種において遺伝子の発現を許容するはずである。本発明の方法において、形質転換植物は、単子葉及び双子葉植物を含むが、これらに限定されない。これらのうち、関心の対象である植物は、キャノラ、トウモロコシ、綿花、小麦、稲、大豆、大麦及びその他の種生産植物、及びアルファルファなどを含むが、これらに限定されない、その他の植物を含み、農業的、工業的、その他の産業的に関心の対象であるもののすべてを含む。本明細書において、異種配列は、異なる種に由来するか、または同一種に由来する場合、元々の形態から実質的に変形されたオリゴヌクレオチド配列である。例えば、構造遺伝子に作動的に連結された異種プロモーターは、構造遺伝子とは異なる種に由来するか、または同一種の場合、元々の形態から実質的に変形されたものに由来する。本明細書において、プライマーは、核酸混成化により相補的標的DNA鎖にアニールされ、プライマーと標的DNA鎖の間に混成体hybridを形成し、次に、重合酵素、例えば、DNA重合酵素により標的DAN鎖に沿って延長される、分離された核酸である。本発明のプライマー対は、例えば、重合体連鎖反応PCRまたは他の従来の核酸増幅方法による標的核酸配列を増幅するための前記使用を示す。プローブとプライマーを製造して使用する方法は、例えば、MolecularCloning:ALaboratoryManual、2nded.,vol.1-3、ed.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、1989以下、Sambrooketal.,1989;CurrentProtocolsinMolecularBiology、ed.Ausubeletal.,GreenePublishingandWiley-Interscience、NewYork、1992周期的に改訂される以下、Ausubeletal.,1992;及びInnisetal.,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications、AcademicPress:SanDiego、1990に説明されている。PCR-プライマー対は、例えば、この目的のために開発されたPrimerVersion0.5、1991、WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch、Cambridge、MAのようなコンピュータプログラムを用いて、公知の配列から導き出すことができる。核酸の増幅は、重合酵素連鎖反応PCRを含む当業界で公知の多様な核酸増幅方法のいかなるものも利用可能である。多様な増幅方法が当業者に公知されており、特に、米国特許第4,683,195号と第4,683,202号及びPCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications、ed.Innisetal.,AcademicPress、SanDiego、1990に説明されている。PCR増幅方法は、最大22kbのゲノムDNA及び最大42kbのバクテリオファージDNAを増幅する程度に発展しているChengetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5695-5699、1994。以下、本発明を説明する。木部の導管trachearyelement、以下TEというは、植物維管束系の水を運ぶ木部として作用する。これを行うために、TEは、2次的な細胞壁の肥厚thickening及び細胞死を進行する。TEの細胞死は、自食による典型的な発生学的にプログラム化された細胞死である。しかし、TE分化において、自食に関する証拠は知られていない。本発明は、小さいGTP結合タンパク質であるRabG3bが自食作用によりTE分化に関与することを明らかにした。野生型TE細胞の分化は、アラビドプシス培養システムで自食を経験することを発見した。自食とTE分化の両方は、持続的に活性化突然変異体RabG3bCAの過発現により顕著に促進され、優性ネガティブ突然変異体RabG3bDNまたはRabG3bRNAi、ブラシノステロイドbrassinosteroidインセンティブ突然変異体bri1-301、及び自食突然変異体atg5-1を過発現する形質転換植物体で阻害された。この結果により、本発明は、TE分化中に自食が起き、自食の構成要素としてRabG3bはTE分化を調節することを示唆する。木部の発達、特に、導管細胞の分化の最後の段階に起きる細胞死は、木部の完成に非常に重要な過程であり、この過程により、細胞質のすべての内容物が分解され、中空の木部を形成できるからである。本発明で確認したのは、自食がこの発達過程の細胞死を促進させるということである。結局、自食に関与するRabG3bの活性化された形態であるRabG3bCAを過発現したとき、木部発達過程中に自食が増幅され、これによって細胞死が促進され、窮極的に植物茎の木部の発達が促進されるということである。本発明の重要性は、次のとおりである。木部は、木の木材層を構成する組織である。したがって、本発明の過発現したRabG3bCAを木に過発現させ、シロイヌナズナで観察された同じ形質すなわち、木部の増大を形成できる場合、これは、産業的に応用可能な非常に重要な形質になる。なぜなら、これは、木のバイオマスの増加を意味するからである。現在、ポプラやユーカリの木などが代表的な木材原料となっている。木材は、パルプ、ペーパーの主な原料であり、さらに、現在最も大きな懸案になっているバイオエタノール次世代の代替エネルギーの生産における重要な原料として注目されている。以下、本発明を詳細に説明する。木部の分化に対するRabG3bの作用小さいGTP結合タンパク質であるRabG3bは、プロテオーム分析によりサリチル酸反応タンパク質として同定されたOhetal.,2005。マイクロアレイ分析は、RabG3bがブラシノライドBL/H3BO3処理に反応して高く発現した図12。本発明では、1RabG3bがTE分化に関与するか否か、2RabG3bが自食に関与するか否か、及び3自食がTE分化に関与するか否かを調査した。RabG3bノックダウン植物体RabG3bRNAiを生成し、それは単にRabG3bの発現がテストされたRabG3系要素の中で減少し、RabG3bタンパク質がウェスタンブロット分析から分かるように検出されなかった図13。それぞれ持続的に活性を有するCA及び優性ネガティブDNRabG3bCA及びRabG3bDNの2つの異なるRabG3b形質転換植物体を機能分析に用いた。また、維管束の欠失を示すBRインセンシティブ突然変異体bri1-301Cano-Delgado、A.,等2004Development、131、5341-5351、及び自食突然変異体atg5-1Thompson、A.R.,等2005PlantPhysiol.138、2097-2110を使用した。植物の成長表現型を長周期条件16/8h明/暗周期下で調査した図1。顕著な表現型として、RabG3bCA植物は、すべての他のテストした植物体に比べて茎でより大きく成長し、WT植物体と比較して茎の肥厚が14増加した図1b、c。これに対し、atg5-1植物体は、WTより大きさがより短く、bri1-301植物体は、大きさが大きく減少したことを示した。抽薹boltingにおいて、ロゼット葉の数と抽薹時間を決定した。RabG3bCA植物体は、他のものに比べて少し早く抽薹されたが図14、葉の数における顕著な差はテストした植物体の中では観察されなかった図15。この結果は、RabG3bCA植物体で観察された増加した茎の長さが開花時間の調節の変更というよりは、より早い茎の成長に起因することを示す。次に、維管束発達の変化と成長表現型間の可能な関連性を、3つの異なる位置からの花序inflorescenceの茎の断面の組織分析により調査した図2及び図3。すべての植物の全体の維管束の表現型は正常であるのに対し、WTと比較して、木部細胞の数は、RabG3bCA花序の中間及び基底部で顕著に増加した図2。また、後生木部metaxylem及び原生木部protoxylemの2つの異なるタイプに分けられる木部細胞の数量化は、後生木部細胞がWTと比較してRabG3bCA植物体の維管束で大きく増加したことを示した図3、図4及び図16。これとは対照的に、RabG3bDN、RabG3bRNAi、及びatg5-1植物体は、花序の茎の基底部で原生木部及び後生木部とも数が大きく減少した。この結果は、増加した茎の成長は、RabG3bCA植物体で増加した木部の分化と関連があることを示す。また、atg5-1植物体において、木部細胞の減少は、ATG5及びATG5リンクされた自食が木部の分化に関連し得ることを示唆する。木部分化の指標である2次的な細胞壁の形成は、フロログルシノール-HClによるリグニン染色図17a-f及びリグニンの自己蛍光図17g-lにより、花序の茎の断面で調査された。リグニン化された細胞壁は、WTと比較して、RabG3bCA植物体で膨張したが、RabG3bDN、RabG3bRNAi、bri1-301、及びatg5-1植物体ではやや減少した。花序の茎において、RabG3bの位置づけは、抗RabG3b抗体を使用した免疫金電子顕微鏡法によって調査した図18。RabG3bタンパク質は、主に、木部に位置している。皮層細胞において、金粒子が、原形質、液胞及び細胞壁を含む複数の位置で発見されたが図18e-h、それらの原形質の内容物を欠失した木部TE細胞では、RabG3b免疫反応性が2次的細胞壁でのみ現れた図18m-p。木部分化中におけるRabG3bCA培養細胞でのTE形成の増加木部の分化において、RabG3bの機能を定義するために、アラビドプシスs懸濁細胞の培養に対するインビトロ木部TE誘導システムを開発した。TE分化がBL及びH3BO3処理によって誘導されたとき、RabG3bCA細胞がTE誘導4日後、液胞の崩壊及び細胞内容物のロスを主に経験する図19。その後、WTと比較して、RabG3bCA細胞はTEでより顕著に発生した図5。対照的に、WTに比べて、RabG3bDN、RabG3bRNAi、atg5-1、及びbri1-301のTE誘導された培養で分化した細胞はほとんどなかった。強いリグニン染色は、RabG3bCA細胞で追加的に観察された図20。この結果は、RabG3bがTE分化でポジティブの役割を果たし、ATG5を介した自食もTE分化にポジティプな影響を与えることを示唆する。TE分化中における自食の活性化RabG3bが自食でその機能によりTE分化を調節するのかを決定するために、TE形成中に、自食の過程を酸性指向性染料LysoTrackerGreenLTGで自食胞/分解小体を染色して調査したVia、L.E.,等1998J.CellSci.111、897-905図6。TE誘導前、薄っすらと一部染色されたスポットを示すRabG3bCA細胞を除けば、テストされた植物の中でLTG染色された構造は検出されなかった図6a-e。BL及びH3BO3処理は、WT細胞でLTG染色された自食胞/分解小体様構造の形成を誘導し、これは、RabG3bCA細胞で顕著に増加した図6k-l。同一の誘導条件下において、LTG染色された構造は、RabG3bDN、RabG3bRNAi、またはatg5-1細胞で形成されなかった図6c-e、h-j、m-o。これらの結果により、自食はTE分化中に発生し、これは、RabG3bのGTP結合形成により活性化可能であることが分かる。TE分化中における数多くの自食構造を蓄積するRabG3bCA細胞透過電子顕微鏡TEM分析は、TE分化中に細胞で微細構造的な変化を調査し、LTG染色結果を確認するために行った図7。非誘導細胞は、テストされた植物の間で形態学的な差がほとんどなかった図7a-e。TE誘導に対して、BL/H3BO3処理4日後、WT細胞で細胞内容物の分解及び液胞の破壊が観察された図7f。この時期の間、WT細胞は、分解される細胞構成要素を含む自食胞/分解小体様構造を示す図7f、p。RabG3bCA細胞は、多数の自食胞/分解小体様構造を蓄積し、細胞器官及び細胞内容物のロスが速かに進行した図7g、q。TE誘導7日後、RabG3bCA細胞は、成熟したTE細胞で完全に分解され、これは、空の原形質及び2次細胞壁の蓄積により証明され図7l、WT細胞は、TE分化の最後の段階に向かって引き続き進行していた図7k。対照的に、自食胞/分解小体様構造及びTE関連の形態学的な変化は、誘導期間中、RabG3bDN、RabG3bRNAi、またはatg5-1細胞では観察されなかった図7h-j、m-o。TE分化過程中に、WT及びRabG3bCA細胞で自食構造の形成をさらに調査した図8a-h。WT細胞は、前自食胞preautophagosomal構造または細胞膜phagophoresを示し図8b、自食胞/分解小体様構造を伴った図8c、d。類似の自食構造がRabG3bCA細胞で観察されたが、WT細胞より早期に形成されてより豊富であった図8e-h。原形質物質及び細胞小器官例えば、ミトコンドリアを含む多くの細胞膜がBL/H3BO3処理1日後に現れ図8e、自食胞の蓄積は、2日後に処理されたRabG3bCA細胞で観察され、WT細胞では引き続き前自食胞構造が膨張していた。本発明者等は、追加的にRabG3bCA細胞で自食活性化が一般的な自食条件である栄養欠乏に対しても現れるのかをテストした図8i-p。同様に、WT及びRabG3bCA細胞とも、砂糖欠乏に反応して自食形態を示し、WTに比べてRabG3bCA細胞で自食構造が時間的により早くそしてより豊富であった。この結果は、RabG3bが自食でポジティブ調節者であり、RabG3b活性化された自食は、細胞死の過程を促進してTE分化に寄与することを示唆する。自食構造に位置するRabG3b自食胞/分解小体構造に対するRabG3bタンパク質の位置づけは、TE誘導されたWT及びRabG3bCA細胞において、自食胞マーカータンパク質ATG8e及びRabG3bに対する抗血清を使用した免疫金EMによって分析した。WT及びRabG3bCA細胞とも、RabG3bタンパク質は、自食構造においてATG8eタンパク質と同時に位置づけられた図9a-d。また、ATG8eタンパク質のレベルは、WTと比較してRabG3bCA細胞で増加し、BL/H3BO3処理されたRabG3bCA細胞で自食構造と大部分関連があり、さらに増加した図9e。自食及び木部分化関連遺伝子の発現分析Genevestigatorでマイクロアレイデータにより、36の現在定義された自食遺伝子ATGsのうち、20以上がPCDまたはBL/H3BO3処理中に上方調節された。したがって、自食の複数の段階で関連する13ATG遺伝子が選択され、それらの発現レベルをTE分化中に調査した。テストされたATG遺伝子のうち9つは、顕著な増加は示していなかった2倍以下が、4つのATG遺伝子ATG6、8g、18h、及びVPS34は、BL/H3BO3処理に対して2倍以上上方調節され、これは、自食がTE分化に関与することをさらに裏付けるものである図10a。また、TE分化の後期段階で特異的な2群の遺伝子の発現レベルを調査したPCD関連遺伝子BFN1、XCP1、AtXyn3、及びAtMC9及び2次細胞壁関連遺伝子IRX1、3、5、12、FRA8、CcOAOMT、及び4CL1図21及び22。TE分化の初期段階を調節する維管束系関連転写因子遺伝子AtHB8、AtHB15、PHB、PHV、REV、VND6、及びVND7及びBR関連遺伝子BRI1、BRL1、2、及び3の発現も調査した図23a及び図24a。多くのテストされた遺伝子の転写体レベルは、TE誘導に対して大きく増加した。上方調節されたATGsATG6、8g、18h、及びVPS34の発現は、TE誘導中にWT、RabG3bCA、及びatg5-1cells細胞で比較し、複数の細胞株間に差は現れなかった図10b。ATG8eタンパク質で大きな増加が未処理及びBL/H3BO3処理されたRabG3bCA細胞ですでに観察された図9eため、ATG8eの発現は、WT、RabG3bCA、及びatg5-1細胞で付加的に決定された図25。ATG8eの基底転写体のレベルは、WTよりRabG3bCA細胞でより高かった。上方調節されたPCD関連AtMC9、XCP1、及びBFN1、2次細胞壁関連IRX1、5、12及びFRA8、維管束系関連転写因子AtHB8、REV、及びVND7、及びBR関連BRL2及びBRL3遺伝子の発現は、WT、RabG3bCA、及びatg5-1細胞で調査した。テストされたPCD及び2次細胞壁関連遺伝子は、TE分化において、WTに比べてRabG3bCA細胞でより強く発現し図11、これは、PCD及び2次細胞壁の蓄積がRabG3bCA細胞で上方調節されることを示唆する。維管束系関連転写因子及びBR関連遺伝子の発現は、テストされた細胞間に顕著な差はなかった図23b及び図24b。この結果は、RabG3bの機能が、初期の維管束の発生よりはTE分化後により重要であることを示す。本発明から分かるように、本発明のRabG3b遺伝子を過発現させた場合、野生型に比べてそのバイオマスが増加することを確認することができた。この効果は、RabG3bCA細胞において、GTP結合したRabG3bは、自食過程を持続的に活性化することができ、多数の自食胞及び分解小体の蓄積によって行う。以下、非限定的な実施形態に基づいて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施形態は、本発明を例示するための意図で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施形態により制限されるものではない。実施例1:植物材料及び成長条件シロイヌナズナ植物を長周期条件16-h明/8-h暗の周期下、24°C成長室で成長させた。アラビドプシスカルスは、誘導培地MurashigeandSkoog[MS]培地、pH5.8、3スクロース、0.8寒天及び2mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸[2,4-D]上に若い苗木の子葉から生成した。懸濁細胞の培養は、3スクロース及び1mg/lの2,4-Dが補なわれた50mlのMS培地で1~2gのカルスを接種して開始し、24°C暗条件下で振とうしてサブ培養した。TE誘導のために、サブ培養された細胞を1μMのBL及び10mMのH3BO3を含有する2,4-D欠乏の新鮮培地に移した。部分標本Aliquotsを、追加分析のために、所与の時期に取った。砂糖欠乏を誘導するために、MS1スクロース培地上に成長した1週齢の苗木を砂糖のないMS培地に移し、暗条件下で成長させた。植物を移した後、0、1、及び2日後に取った。実施例2:RabG3bノックダウン植物の生成RabG3bのアグリコーラAgrikolaRNAiノックダウンデリバリークローンCATMA1a21795をNottinghamArabidopsisStockCentreNASCから入手した。その構造を、アグロバクテリウムツメファシエンス菌株GV3101を用いて、真空浸透によりアラビドプシスに形質転換したCloughandBent、1998。形質転換体T1をBASTA抵抗性に基づいて選別した。T3同型接合体を回収し、RabG3b発現の減少に対してテストを行った。2つの独立したライン1-2及び3-16の追加分析のために使用した。実施例3:RNA分析定量的リアルタイムでのRT-PCRをLightCycler480システムRocheでKAPASYBRFASTqPCRを用いて行った。PCR反応は、製造業者のプロトコールによって行われた。本発明に使用された遺伝子特異的なプライマーは表1に示した。テストされた遺伝子の発現をUBQ5の持続的な発現レベルで標準化し、2-ΔΔt方法LivakandSchmittgen、2001を用いて計算された。実験は、生物学的に独立したサンプルで、少なくとも3回繰り返し行った。実施例4:組織化学分析植物サンプル培養された細胞及び7週齢植物の花序の茎を0.1Mリン酸緩衝液pH7.4内の2.5グルタルアルデヒド及び4パラホルムアルデヒドを含む溶液で、4°Cで4時間固定し、0.1Mリン酸緩衝液pH7.4で洗い流し、常温で2時間、1OsO4で固定した。0.1M緩衝液で洗い流した後、サンプルを脱水し、LRホワイトレジンLondonResinに充填した。断面1μmを、超ミクロトームRMCMTXを用いて製造し、ろ過した1トルイジンブルーで短く染色した。これらの断面を光顕微鏡Olympus、BX51TRFを用いて撮影し、イメージを、茎の厚さを測定し、維管束n=10内の原生木部及び後生木部細胞を計数するために用いた。TEM分析のために、薄い断面60~70nm厚さを銅グリッド1-GN、150メッシュ上に収集し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色し、TEMPhilips、Tecnai12で調査した。免疫位置づけのために、ニッケルグリッド上で収集された断面を、BSA-TBS緩衝液500mMのNaCl、1のBSA、0.3のTween20、及び10mMのTris-HCl、pH7.4で1時間ブロックした。その後、断面を、抗RabG3b抗血清ラビット及び/または抗ATG8e抗血清ラットで、常温で4時間培養した。BSA-TBSで洗い流した後、1次抗体結合を、抗ラビットIgG20-nm金、ElectronMicroscopySciences及び抗ラットIgG1-nm金、Sigmaを用いて検出した。BSA-TBS及び脱イオン水で洗浄後、サンプルをTEM分析前に酢酸ウラニルで染色した。実施例5:リグニン染色リグニン染色は、Pomar、F.,等2002Protoplasma220、17-28に記載されたように行った。花序の茎を染色するために、6週齢植物から花序の茎の中央部からの断面をカミソリで切断して製造した。断面及び培養された細胞をフロログルシノール溶液2エタノール/水、95/5v/vで1分染色し、6NのHClに浸した。細胞培養サンプル及び染色された花序の茎サンプルの明視野Brightfield写真は、それぞれ双眼顕微鏡LeicaEZ4D及び光顕微鏡Olympus、BX51TRFを用いて収集した。リグニンの自己蛍光を、共焦点顕微鏡ZeissLSM510METAを用いて420/480nm励起/発光で検出した。実施例6:LTG染色LTG染色は、Liu、Y.,等2005Cell、121、567-577に記載されたように行った。培養された細胞を、1μMのLTGDND-26MolecularProbesで、暗条件で1時間培養した。イメージを、488/505nm励起/発光で、共焦点顕微鏡ZeissLSM510METAを用いて得た。"