"非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して146位でのアミノ酸突然変異を含み、該ポリペプチドが、該PS4改変体ポリペプチドの該親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、PS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドがさらに、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含む、請求項1に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、33位、34位、121位、134位、141位、157位、161位、178位、179位、223位、307位および334位からなる群から選択される1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項1または2に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pからなる群から選択される1つ以上の突然変異をさらに含む、請求項1または請求項2または請求項3に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:a33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;b33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;c33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;d33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334P;e33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334P;f33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334P;g33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334P;h33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334P;i33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334P;j33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334P;k33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334P;l33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334P;m33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334P;n33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tの各々を含む、請求項1、請求項2または請求項3または請求項4のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:aN26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P;bN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;cN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;dN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;eN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;fN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339A;gN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eの各々を含む、請求項1~請求項5のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、87位における突然変異をさらに含む、請求項1~請求項6のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、突然変異87Sをさらに含む、請求項1~請求項7のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、G87Sである突然変異をさらに含む、請求項1~請求項8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、非マルトース生成エキソアミラーゼを含む、請求項1~請求項9のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、グルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼEC3.2.1.60を含む、請求項1~請求項10のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、シュードモナス種であるか、またはシュードモナス種から誘導可能である、請求項1~請求項11のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、PseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstutzeriであるか、またはPseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstutzeriから誘導可能である、請求項1~請求項12のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、配列番号1もしくは配列番号5に示した配列を有するPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、請求項1~請求項13のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。配列番号1または配列番号5と少なくとも75同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1~請求項14のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記親ポリペプチドが、配列番号7もしくは配列番号11に示した配列を有するPseudomonasstutzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、請求項1~請求項13のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。配列番号7または配列番号11と少なくとも75同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1~請求項13または請求項16のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。本明細書、請求項または図面に記載の配列を含む、請求項1~請求項17のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。SSM381配列番号15、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379O13およびSAS1379O9からなる群から選択される配列を含む、請求項1~請求項18のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。非マルトース生成エキソアミラーゼ内に存在する1つ以上のドメインを欠失する、請求項1~請求項19のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。デンプン結合ドメインを欠失する請求項1~請求項20のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドであって、該デンプン結合ドメインが、配列番号1に示したPseudomonassaccharophilia配列の位置の番号付けを参照して429位の後のアミノ酸に対応する、PS4改変体ポリペプチド。60°Cにおける半減期t1/2が、前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、15以上増加している、請求項1~請求項21のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。60°Cにおける半減期t1/2が、前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、50以上増加している、請求項1~請求項22のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。60°Cにおける半減期t1/2が、前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、100以上増加している、請求項1~請求項23のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドもしくは前記野生型ポリペプチドと比較して、10以上のエキソ特異性を有する、請求項1~請求項24のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドもしくは前記野生型ポリペプチドと比較して、20以上のエキソ特異性を有する、請求項1~請求項25のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。前記PS4改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドもしくは前記野生型ポリペプチドと比較して、50以上のエキソ特異性を有する、請求項1~請求項26のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。請求項1~請求項27のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの少なくとも20個の残基のフラグメントを含むポリペプチドであって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。請求項1~請求項28のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド配列の1つ以上の残基での突然変異によって該PS4改変体ポリペプチドから誘導可能であるポリペプチドであって、該PS4改変体ポリペプチドの前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較してより高い熱安定性もしくはより高いエキソ特異性またはその両方を有するポリペプチド。請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの、食品または飼料添加物としての使用。デンプンを処理するためのプロセスであって、該デンプンを請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドと接触させる工程と、該ポリペプチドに該デンプンから1種以上の直鎖状生成物を生成させる工程とを包含するプロセス。食品または飼料製品を調製する際の請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。食品または飼料製品を調製するプロセスであって、請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドを食品の成分または飼料の成分と混合する工程を包含するプロセス。前記食品が生地もしくは生地製品、好ましくは加工された生地製品を含む、請求項32に記載の使用、または請求項33に記載のプロセス。前記食品がベーカリー製品である、請求項30~請求項34のいずれか1項に記載の使用またはプロセス。ベーカリー製品を製造するためのプロセスであって:aデンプン媒質を提供する工程と;b該デンプン媒質に請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドを添加する工程と;cベーカリー製品を製造するために工程bの間または工程bの後に該デンプン媒質に熱を加える工程と、を包含するプロセス。請求項32~請求項36のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる食品、飼料製品、生地製品またはベーカリー製品。生地のための改善剤組成物であって、請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチド、および少なくとも1種のさらなる生地成分もしくは生地添加物を含有する、改善剤組成物。粉および請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドを含有する組成物。生地製品において、該生地製品の硬化を遅延もしくは減少させ、好ましくは有害な老化を遅延もしくは減少させるための、請求項1~請求項39のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。請求項1~請求項40のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドと、Novamyl、またはマルトース生成αアミラーゼ活性を有するNovamylの改変体、ホモログ、または突然変異体との組み合わせ。請求項1~請求項41のいずれか1項に記載の用途のための請求項41に記載の組み合わせの使用。請求項41に記載の組み合わせを用いた処理によって製造された食品または飼料製品。請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドをコード可能である核酸。配列番号6または配列番号12と少なくとも75同一である核酸配列を有する、請求項44に記載の核酸。非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコード可能である、請求項40または請求項45に記載の核酸の少なくとも60残基のフラグメントを含む核酸。親配列から誘導可能である核酸配列であって、該親配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコード可能であり、該核酸配列は、該核酸が配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して特定された146位における突然変異をコードするように1つ以上の残基において置換を含み、該核酸によってコードされる該ポリペプチドが、該親配列もしくは野生型配列によってコードされるポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、核酸配列。請求項47に記載の核酸配列であって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して特定された位置における以下の突然変異、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eの1つ以上をコードするように1つ以上の残基において置換を含む、核酸配列。1つ以上のヌクレオチド残基の置換によって非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、請求項44~請求項48のいずれか1項に記載のPS4核酸配列。請求項44~請求項49のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むプラスミド。請求項44~請求項50のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むか、または請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である発現ベクター。請求項50に記載のプラスミドまたは請求項51に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは該プラスミドまたは該発現ベクターを用いて形質転換されている宿主細胞。請求項1~請求項29のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である細胞。細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞である、請求項52に記載の宿主細胞、または請求項53に記載の細胞。PS4改変体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項52、請求項53または請求項54に記載の宿主細胞もしくは細胞を得る工程と、該細胞もしくは該宿主細胞から該ポリペプチドを発現させる工程と、および必要に応じて該ポリペプチドを精製する工程と、を包含する方法。非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内に配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、146位にアミノ酸置換を導入する工程によってポリペプチドの配列を変化させる方法であって、該変化させたポリペプチドが、該親配列もしくは野生型配列によってコードされるポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、方法。さらに、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内に配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A,158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T,188H、272Q、339A、および、339Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を導入する工程による、請求項56に記載のポリペプチドの配列を変化させる方法。配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、146位に置換を導入する工程によって非マルトース生成エキソアミラーゼの配列を変化させる方法であって、該変化させた非マルトース生成エキソアミラーゼが、親配列もしくは野生型配列によってコードされるポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、方法。さらに、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A,158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T,188H、272Q、339A、および、339Eからなる群から選択される置換を導入する工程による、請求項58に記載の非マルトース生成エキソアミラーゼの配列を変化させる方法。前記非マルトース生成エキソアミラーゼの配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を変化させる工程によって変化させられる、請求項56または59に記載の方法。PS4改変体ポリペプチドを製造する方法であって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入する工程であって、該アミノ酸置換が配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して146位であり、該製造されたPS4ポリペプチドが、親配列もしくは野生型配列によてコードされるポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、方法。請求項61に記載のPS4改変体ポリペプチドを製造する方法であって、さらに、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入する工程を包含し、該アミノ酸置換が配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択される、方法。前記親ポリペプチドをコードする核酸の配列が前記アミノ酸置換を導入するように変化させられる、請求項60、61または62に記載の方法。非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変化させる方法であって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、146位のアミノ酸残基をコードするコドンを該配列に導入する工程を、包含し、該核酸によってコードされる該ポリペプチドが、親配列もしくは野生型配列によってコードされるポリペプチドと比較して高い熱安定性もしくは高いエキソ特異性またはその両方を有する、方法。請求項64に記載の非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変化させる方法であって、該方法は、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、145D、188S、188T、188H、272Q、339A、および、339Eからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを該配列に導入する工程をさらに包含する、方法。ポリペプチドの熱安定性、もしくはエキソ特異性、またはその両方を増加させる方法であって、請求項54~請求項65のいずれか1項に記載の工程を包含する方法。前記ポリペプチドが単離されるかもしくは精製される、または単離されかつ精製される、請求項54~請求項66のいずれか1項に記載の方法。請求項54~請求項67のいずれか1項に記載の方法によって得られ得るポリペプチド。請求項54~請求項68のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド。実質的に、添付の図面を参考として上述しそして添付の図面に示した通りである、PS4改変体ポリペプチド、使用、プロセス、食品、飼料製品、生地製品、ベーカリー製品、改善剤組成物、組成物、核酸、ベクターもしくは宿主細胞。概要本発明者らは、本発明によって、特許請求の範囲に記載したPS4改変体ポリペプチドを提供する。本発明者らは、特許請求の範囲に記載した食品添加物、食品、ベーカリー製品、改善剤組成物、動物用飼料を含む飼料製品としてのPS4改変体ポリペプチドの使用、およびそれらに含まれるPS4改変体ポリペプチドの使用をさらに提供する。本発明者らは、特許請求の範囲に記載したPS4改変体ポリペプチドをコードする核酸、およびそれらに関連する核酸を提供する。当該のPS4改変体ポリペプチドを生成する方法ならびに本発明の他の態様もまた特許請求の範囲に記載されている。配列表配列番号1は、Pseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列を示している。配列番号2は、PSac-D34配列;11の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号3は、PSac-D20配列;13の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号4は、PSac-D14配列;14の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号5は、Pseudomonassaccharophilia由来グルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質EC3.2.1.60G4-アミラーゼマルトテトラオース生成アミラーゼエキソ-マルトテトラヒドロラーゼマルトテトラオース生成エキソアミラーゼを示している。SWISS-PROTアクセッション番号P22963。配列番号6は、マルトテトラヒドロラーゼEC番号=3.2.1.60をコードするP.saccharophiliamta遺伝子を示している。GenBankアクセッション番号X16732。配列番号7は、Pseudomonasstuzeriマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列を示している。配列番号8は、PStu-D34配列;9つの置換を伴うPseudomonasstuzeriマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号9は、PStu-D20配列;11の置換を伴うPseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号10は、PStu-D14配列;12の置換を伴うPseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号11は、PseudomonasstuzeriPseudomonasperfectomarinaグルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質EC3.2.1.60G4-アミラーゼマルトテトラオース生成アミラーゼエキソ-マルトテトラヒドロラーゼマルトテトラオース生成エキソアミラーゼを示している。SWISS-PROTアクセッション番号P13507。配列番号12は、P.stuzeriマルトテトラオース生成アミラーゼamyP遺伝子、完全コドンを示している。GenBankアクセッション番号M24516。配列番号13は、pMD55配列;11の置換G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121Fを伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121Fおよびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121Fを伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号13は、pMD55配列;11の置換G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121Fおよびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号14は、PMD96配列;N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307LおよびS334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号15は、SSM381配列;33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号16は、SSM279B1配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号17は、SSM237P2配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号18は、33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号19は、SSM325F3配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号20は、pMD129配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号21は、SSM341A9配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号22は、SSM341G11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号23は、SSM350B11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号24は、SSM350C12配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号25は、SSM332Q4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号26は、SSM365B4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号27は、SSM365F4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。配列番号28は、SSM360C7配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列を示している。例えば、本発明は以下の項目を提供する。項目1非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して121、161、223、146、157、158、198、229、303、306、309、316、353、26、70、145、188、272、339からなる群から選択される1つ以上の位置でのアミノ酸突然変異を含む、PS4改変体ポリペプチド。項目2前記PS4改変体ポリペプチドが、121F、121Y、121W、161A、223E、223K、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T、26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含む、項目1に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目3前記PS4改変体ポリペプチドが、33位、34位、121位、134位、141位、157位、161位、178位、179位、223位、307位および334位からなる群から選択される1つ以上の突然変異であって、好ましくは33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pからなる群から選択される突然変異をさらに含む、項目1または項目2に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目4前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:a33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;b33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;c33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334P;d33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334P;e33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334P;f33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334P;g33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334P;h33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334P;i33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334P;j33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334P;k33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334P;l33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334P;m33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334P;n33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tの各々を含む、項目1、項目2または項目3のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目5前記PS4改変体ポリペプチドが、以下の突然変異:aN26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P;bN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;cN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P;dN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;eN33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339E;fN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339A;gN33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eの各々を含む、項目1~項目4のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目6前記PS4改変体ポリペプチドが、87位における突然変異であって、好ましくは87Sであり、より好ましくはG87Sである突然変異をさらに含む、項目1~項目5のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目7前記親ポリペプチドが、非マルトース生成エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼEC3.2.1.60を含む、項目1~項目6のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目8前記親ポリペプチドが、シュードモナス種、好ましくはPseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstuzeriであるか、またはシュードモナス種から、好ましくはPseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstuzeriから誘導可能である、項目1~項目7のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目9前記親ポリペプチドが、配列番号1もしくは配列番号5に示した配列を有するPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、項目1~項目8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目10配列番号1または配列番号5と少なくとも75同一であるアミノ酸配列を有する、項目1~項目9のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目11前記親ポリペプチドが、配列番号7もしくは配列番号11に示した配列を有するPseudomonasstuzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼである、項目1~項目8のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目12配列番号7または配列番号11と少なくとも75同一であるアミノ酸配列を有する、項目1~項目8または項目11のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目13本明細書、項目または図面に記載の配列を含む、項目1~項目12のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目14PSac-D34配列番号2、PSac-D20配列番号3、PSac-D14配列番号4、PStu-D34配列番号8、PStu-D20配列番号9、PStu-D14配列番号10、pMD55配列番号13、pMD96配列番号14、SSM381配列番号15、SSM279B1配列番号16、SSM237P2配列番号17、配列番号18、SSM325F3配列番号19、pMD129配列番号20、SSM341A9配列番号21、SSM341G11配列番号22、SSM350B11配列番号23、SSM350C12配列番号24、SSM332Q4配列番号25、SSM365B4配列番号26、SSM365F4配列番号27およびSSM360C7配列番号28、SSM219B3、SAS1401L10、SAS1387D16bf、pMD236、pMD237bf、SAS1379O13およびSAS1379O9からなる群から選択される配列を含む、項目1~項目13のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目15前記PS4改変体ポリペプチドが、同一条件下で試験した場合に前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有する、項目1~項目14のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目16半減期t1/2であって、好ましくは60°Cにおける半減期が、前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、15以上、好ましくは50以上、最も好ましくは100以上増加している、項目1~項目15のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目17同一条件下で試験した場合に前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有する、項目1~項目16のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目18前記PS4改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドもしくは前記野生型ポリペプチドと比較して、10以上、好ましくは20以上、好ましくは50以上のエキソ特異性を有する、項目1~項目17のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド。項目19項目1~項目18のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの少なくとも20個の残基のフラグメントを含むポリペプチドであって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。項目20項目1~項目19のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチド配列の1つ以上の残基での突然変異によって該PS4改変体ポリペプチドから誘導可能であるポリペプチドであって、該PS4改変体ポリペプチドの前記親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較してより高い熱安定性もしくはより高いエキソ特異性またはその両方を有するポリペプチド。項目21項目1~項目20のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの、食品または飼料添加物としての使用。項目22デンプンを処理するためのプロセスであって、該デンプンを項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドと接触させる工程と、該ポリペプチドに該デンプンから1種以上の直鎖状生成物を生成させる工程とを包含するプロセス。項目23食品または飼料製品を調製する際の項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。項目24食品または飼料製品を調製するプロセスであって、項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを食品の成分または飼料の成分と混合する工程を包含するプロセス。項目25該食品が生地もしくは生地製品、好ましくは加工された生地製品を含む、項目23に記載の使用、または項目24に記載のプロセス。項目26該食品がベーカリー製品である、項目21~項目25のいずれか1項に記載の使用またはプロセス。項目27ベーカリー製品を製造するためのプロセスであって:aデンプン媒質を提供する工程と;b該デンプン媒質に項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを添加する工程と;cベーカリー製品を製造するために工程bの間または工程bの後に該デンプン媒質に熱を加える工程と、を包含するプロセス。項目28項目23~項目27のいずれか1項に記載のプロセスによって得られる食品、飼料製品、生地製品またはベーカリー製品。項目29生地のための改善剤組成物であって、項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチド、および少なくとも1種のさらなる生地成分もしくは生地添加物を含有する、改善剤組成物。項目30粉および項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを含有する組成物。項目31生地製品において、該生地製品の硬化を遅延もしくは減少させ、好ましくは有害な老化を遅延もしくは減少させるための、項目1~項目30のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。項目32項目1~項目31のいずれか1項に記載のPS4改変体ポリペプチドと、Novamyl、またはマルトース生成αアミラーゼ活性を有するNovamylの改変体、ホモログ、または突然変異体との組み合わせ。項目33項目1~項目32のいずれか1項に記載の用途のための項目32に記載の組み合わせの使用。項目34項目32に記載の組み合わせを用いた処理によって製造された食品または飼料製品。項目35項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドをコード可能である核酸。項目36配列番号6または配列番号12と少なくとも75同一である核酸配列を有する、項目35に記載の核酸。項目37非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコード可能である、項目35または項目36に記載の核酸の少なくとも60残基のフラグメントを含む核酸。項目38親配列から誘導可能である核酸配列であって、該親配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコード可能であり、該核酸配列は、該核酸が配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して特定された位置における以下の突然変異:a121F、121Y、121W、161A、223E、223K;b146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;およびc26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eの1つ以上をコードするように1つ以上の残基において置換を含む、核酸配列。項目391つ以上のヌクレオチド残基の置換によって非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする親配列から誘導される、項目35~項目38のいずれか1項に記載のPS4核酸配列。項目40項目35~項目39のいずれか1項に記載のPS4核酸を含むプラスミド。項目41項目35~項目40のいずれか1項に記載のPS4核酸を含む発現ベクター、または項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である発現ベクター。項目42項目40に記載のプラスミドまたは項目41に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは該プラスミドまたは該発現ベクターを用いて形質転換されている宿主細胞。項目43項目1~項目20のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現可能である細胞。項目44細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞である、項目42に記載の宿主細胞、または項目43に記載の細胞。項目45PS4改変体ポリペプチドを発現する方法であって、項目42、項目43または項目44に記載の宿主細胞もしくは細胞を得る工程と、該細胞もしくは該宿主細胞から該ポリペプチドを発現させる工程と、および必要に応じて該ポリペプチドを精製する工程と、を包含する方法。項目46非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内に、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してa121F、121Y、121W、161A、223E、223K;b146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;およびc26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を導入する工程によってポリペプチドの配列を変化させる方法。項目47配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してa121F、121Y、121W、161A、223E、223K;b146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;およびc26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択される置換を導入する工程によって非マルトース生成エキソアミラーゼの配列を変化させる方法。項目48非マルトース生成エキソアミラーゼの配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を変化させる工程によって変化させられる、項目46または47に記載の方法。項目49PS4改変体ポリペプチドを製造する方法であって、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド内にアミノ酸置換を導入する工程であって、該アミノ酸置換が配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してa121F、121Y、121W、161A、223E、223K;b146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;およびc26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択される工程を包含する方法。項目50前記親ポリペプチドをコードする核酸の配列が前記アミノ酸置換を導入するように変化させられる、項目48または49に記載の方法。項目51非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変化させる方法であって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照してa121F、121Y、121W、161A、223E、223K;b146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353T;およびc26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eからなる群から選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを該配列に導入する工程を、包含する方法。項目52ポリペプチドの熱安定性、もしくはエキソ特異性、またはその両方を増加させる方法であって、項目44~項目51のいずれか1項に記載の工程を包含する方法。項目53前記ポリペプチドが単離されるかもしくは精製される、または単離されかつ精製される、項目44~項目52のいずれか1項に記載の方法。項目54項目44~項目53のいずれか1項に記載の方法によって得られ得るポリペプチド。項目55項目44~項目54のいずれか1項に記載の方法によって得られたポリペプチド。項目56実質的に、添付の図面を参考として上述しそして添付の図面に示した通りである、PS4改変体ポリペプチド、使用、プロセス、食品、飼料製品、生地製品、ベーカリー製品、改善剤組成物、組成物、核酸、ベクターもしくは宿主細胞。詳細な説明以下の説明および実施例では、文脈が他のことを指示しない限り、PS4改変体ポリペプチドの用量は、粉のppm100万分の1gで示される。例えば、表2に使用した1D34は、重量/重量ベースでpSac-D34の1ppmを指示している。好ましくは、酵素の量は、Bradford1976,Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254に記載されたアッセイを用いて、標準物質としてウシ血清アルブミンBSAを用いて測定した活性アッセイに基づいて純粋酵素タンパク質の当量として決定される。生成された、または本明細書によって含まれることが企図されている様々なPS4改変体ポリペプチド改変体を記載する際には、容易な参照のために以下の用語法を採用する:i置換が数字および文字例えば141Pを含む場合は、これは[番号付けシステムにしたがった位置/置換アミノ酸]を意味する。したがって、例えば、141位における1つのアミノ酸のプロリンへの置換は141Pと指定される;ii置換が文字、数字および文字例えばA141Pを含む場合は、これは[元のアミノ酸/番号付けシステムにしたがった位置/置換アミノ酸]を意味する。したがって、例えば、141位におけるアラニンのプロリンによる置換はA141Pと指定される。2つ以上の可能な置換基が特定の位置で存在可能である場合は、これは必要に応じてスラッシュマーク/によって分離される連続する文字例えば、G303EDもしくはG303E/Dによって指定されるであろう。1つの位置の関連アミノ酸を任意のアミノ酸で置換できる場合は、これは[番号付けシステムにしたがった位置/X]、例えば121Xによって指定される。複数の突然変異はスラッシュマーク/によって分離することによって指定することができ、例えばA141P/G223Aは、アラニンがプロリンでそしてグリシンがアラニンで各々置換されている、141位および223位における突然変異を表している。本明細書で他に規定しない限り、本明細書で使用したすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解されている意味と同一の意味を有する。Singleton,ら,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,2DED.,JohnWileyandSons,NewYork1994,andHaleMarham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY1991は、本発明によって使用された多数の用語の一般的辞典を当業者に提供する。本発明の実践または試験において、本明細書に記載した方法および材料に類似するかまたはこれらと同等である任意の方法および材料を使用できるが、以下では好ましい方法および材料について記載する。数値範囲は、範囲を規定する数を含んでいる。他に指定しない限り、各々、核酸は左から右への5’から3’の方向に書かれている;アミノ酸配列は、左から右へのアミノからカルボキシ方向に書かれている。本発明の実践は、他に特に指定しない限り、当業者の能力の範囲内に含まれる化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来型の技術を使用するであろう。そのような技術は文献において説明されている。例えば、J.Sambrook,E.F.Fritsch,およびT.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel,F.M.ら1995および定期補遺;CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9章,第13章,および第16章,JohnWileySons,NewYork,N.Y.;B.Roe,J.Crabtree,およびA.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWileySons;J.M.PolakおよびJamesO’D.McGee,1990,InSituHybridization:PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress;M.J.Gait編集,1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress;D.M.J.LilleyおよびJ.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress;UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7;Antibodies:ALaboratoryManualbyEdHarlow編集,DavidLane編集1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2,1855,Lars-IngeLarssonImmunocytochemistry:TheoryandPractice,CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1,JohnD.Pound編集;ImmunochemicalProtocols,vol80,intheseries:MethodsinMolecularBiology,HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編集2001,NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9;ならびにLabRef:AHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,EditedJaneRoskamsandLindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3を参照されたい。これらの全記載は各々、参考として本明細書中に援用される。すべての特許および刊行物は、本明細書で参照したそのような特許および刊行物の中で開示された全配列を含めて、明示的に参考として本明細書中に援用される。PS4改変体ポリペプチド本発明者らは、親酵素と比較して変化した特性、好ましくは変化したエキソ特異性もしくは変化した熱安定性、またはその両方を達成する1つ以上の位置で置換を有する非マルトース生成エキソアミラーゼを提供する。本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを含む食品添加物、食品、ベーカリー製品、改善剤組成物、動物用飼料を含む飼料製品などを含む組成物、ならびにそのようなポリペプチドおよび組成物の製造方法および使用方法をさらに提供する。本発明者らは、そのような組成物の他の使用例えば、洗剤の調製における甘味料、シロップなどとしての使用を提供する。本組成物は、少なくとも1つの他の構成成分とともに本ポリペプチドを含んでいる。具体的には、本発明者らは、本ポリペプチドを含む食品添加物または飼料添加物を提供する。そのようなポリペプチドおよび核酸は、多数の突然変異を含むことによってそれらの親配列とは相違しており、便利にも、PS4改変体ポリペプチドとして知られている。これを言い換えると、PS4改変体ポリペプチドもしくは核酸の配列は、多数の位置または残基でその親とは相違している。好ましい実施形態では、突然変異はアミノ酸置換、すなわち1つのアミノ酸残基と他のアミノ酸残基との交換を含んでいる。従って、PS4改変体ポリペプチドは、親配列の1つ以上の位置でのアミノ酸残基の性質における多数の変化を含んでいる。本明細書で使用する用語改変体は、親分子から誘導可能である分子を意味すると理解されたい。改変体には、ポリペプチドならびに核酸が含まれる。改変体は、特に、1つ以上の位置での置換、挿入、転換および転化を含んでいる。改変体は、短縮もまた含んでいる。改変体は、親分子の相同的かつ機能的な誘導体を含んでいる。改変体は、本明細書に明示したヌクレオチド配列へハイブリダイズすることができる、配列に相補的である配列を含んでいる。PS4改変体ポリペプチドに対する置換本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼ配列内にアミノ酸置換を含む配列変化を伴うPS4改変体ポリペプチドを提供する。アミノ酸置換は、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して、26位、70位、121位、145位、146位、157位、158位、161位、188位、198位、223位、229位、272位、303位、306位、309位、316位、339位および353位のうちの任意の1つ以上の位置に存在し得る。アミノ酸突然変異は、a121位、161位、223位;b146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位、353位;およびc26位、70位、145位、188位、272位、339位;ならびにa、bおよびcの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上の位置に存在し得る。アミノ酸置換は、121F、121Y、121W、161A、223E、223Kへの変化を含んでいてよい。または、あるいは追加して、アミノ酸置換は、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Q、353Tへの変化を含んでいてよい。さらにまたは、あるいは追加して、アミノ酸置換は、26E、70D、1145D、188S、188T、188H、272Q、339A、339Eへの変化を含んでいてよい。そのような改変体ポリペプチドは、本明細書ではPS4改変体ポリペプチドと呼ばれる。そのような改変体ポリペプチドをコードする核酸もまた開示されており、便宜的にPS4改変体核酸と呼ばれるであろう。以下ではPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸についてより詳細に記載する。親配列、すなわちPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸が基づくところの配列は、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドである。したがって用語親酵素および親ポリペプチドは、PS4改変体ポリペプチドが基づくところの酵素およびポリペプチドを意味すると解釈されたく、かつ見なされたい。以下ではそれらをさらに詳細に記載する。特に好ましい実施形態では、親配列は非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素、好ましくは細菌性非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素である。非常に好ましい実施形態では、親配列は、グルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼEC3.2.1.60を含んでいる。好ましくは、親配列はシュードモナス種、例えばPseudomonassaccharophiliaまたはPseudomonasstuzeriから誘導可能である。一部の実施形態では、親ポリペプチドは、例えばシュードモナス種由来の野生型非マルトース生成エキソアミラーゼ配列を含むか、またはそれと相同である。従って、親ポリペプチドは、配列番号1に示した配列を有するPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼを含む可能性がある。他の実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号11に示した配列を有するPseudomonasstuzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼを含んでいるか、またはSWISS-PROTアクセッション番号P13507を有するPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼを含んでいる。他方、親ポリペプチドは、任意の野生型配列の改変体であってもよい。つまり、親ポリペプチドはそれ自体が操作されていてもよく、またはPS4改変体ポリペプチドを含んでいてもよい。しかし、PS4改変体ポリペプチドはすでに突然変異している配列を突然変異させることによって誘導可能であるが、そのような改変体ポリペプチドは、野生型配列または実際は任意の適切な配列から出発する工程と、出発配列と所望の改変体との間の相違を同定する工程と、および所望の改変体を得るために必要な突然変異を出発配列に導入する工程とによって構築できることは、当業者には明白であろう。配列番号1に示したPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼ配列または配列番号11に示した配列を有するPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼに関連するタンパク質および核酸、好ましくはこれらと配列相同性または機能的相同性を有するタンパク質および核酸は、本明細書ではPS4ファミリーのメンバーであると呼ばれる。以下ではPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸を生成する際に使用するために適切なPS4ファミリー非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素の例についてさらに詳細に開示する。本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドは、好ましくは親ポリペプチドの特徴を維持しており、そしてさらに好ましくはさらなる有益な特性、例えば増強した活性もしくは熱安定性、またはpH耐性、あるいは任意の組み合わせ好ましくは全部を有する。以下ではこれをさらに詳細に記載する。本明細書に記載したPS4置換変異体は、任意の適切な目的のために使用できる。この変異体は、好ましくは親酵素が適切である目的のために使用できる。具体的には、この変異体は、エキソ-マルトテトラヒドロラーゼが使用される任意の用途において使用できる。非常に好ましい実施形態では、この変異体は、より高度の熱安定性、またはより高度のエキソアミラーゼ活性もしくはより高度のpH安定性、あるいは任意の組み合わせの追加された長所を有する。PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸についての適切な使用の例には、食品製造特にベーキング、ならびに食材の製造が含まれる;以下ではその他の例について詳細に記載する。PS4改変体ポリペプチドは、上記に記載した位置に加えて1つ以上のさらなる突然変異を含んでいてよい。それらは、すでに記載したものに加えて、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ以上の突然変異、好ましくは置換であってもよい。1つ以上の他の場所での欠失、挿入、置換、転換、転位および転化のような他の突然変異もまた含むことができる。さらに、PS4改変体は、列挙した位置のすべての置換を有している必要はない。実際に、それらは1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの置換欠損すなわち野生型アミノ酸残基がそのような位置に存在するを有していてよい。野生型配列に基づくPS4改変体ポリペプチド親ポリペプチドが野生型配列を含む実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは野生型配列であって、121位、161位および223位のうちの任意の1つ以上の位置における突然変異、好ましくは121F、121Y、121W、161A、223Eもしくは223K、より好ましくはG121F、G121Y、G121W、S161A、G223EもしくはG223Kの突然変異を有する配列を、含み得る。PS4改変体ポリペプチドは、野生型配列、もしくは先行段落に記載の配列であって、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位もしくは353位のうちの任意の1つ以上の位置での突然変異、好ましくは146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Qもしくは353T、より好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tの突然変異を有する配列を、含み得る。PS4改変体ポリペプチドは、野生型配列、もしくは先行する2つの段落に記載した配列であって、26位、70位、145位、188位、272位もしくは339位のうちの任意の1つ以上の位置での突然変異、好ましくは26E、26D、70D、145D、188S、188T、188H、272Q、339Aもしくは339E、より好ましくはN26E、N26D、G70D、N145D、G188S、G188T、G188H、H272Q、W339AもしくはW339Eの突然変異を有する配列を、含み得る。一般に、位置、置換および特定の突然変異の任意の組み合わせは、本明細書に開示したPS4改変体ポリペプチドを生成するために任意の方法および任意の数で組み合わせることができる。従って、本発明者らは、野生型PS4親配列、好ましくは配列番号1に示した配列を有するPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼに基づくPS4改変体ポリペプチドを開示する。従って、PS4改変体ポリペプチドは、配列番号1に示した配列であって、上記に記載した位置における任意の1つ以上の突然変異を有する配列を、含み得る。PS4改変体ポリペプチドは、以下の配列番号7に示す野生型Pseudomonasstuzeri非マルトース生成酵素配列に基づき得るが、上記に記載した位置における任意の1つ以上の突然変異を伴っていてよい。PS4改変体ポリペプチドは野生型PS4親配列に基づいてよいが、好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは野生型PS4親配列の操作されたもしくは突然変異したバージョンに基づいている。従って、そのような実施形態では、親配列はすでに突然変異したPS4配列を含んでいる。そのような配列は、新規に作製され得るか、または以下でより詳細に記載するように、1つの塩基配列を1回以上突然変異させることによって作製され得る。121位、161位および/または223位PS4改変体ポリペプチドは、野生型配列、または121位、161位および223位などの1つ以上の位置での置換を伴うすでに突然変異した配列のような野生型配列の改変体である変異体配列を含んでいてもよい。従って、一般に、関連位置におけるこの突然変異は、有益には121位、161位もしくは223位の1つ、2つもしくは全部におけるさらなる単一の突然変異と組み合わせることができる。121位の置換は、存在する場合は、好ましくは121F、121Y、121W、121H、121A、121M、121G、121S、121T、121D、121E、121L、121Kおよび121Vからなる群から選択される。好ましくは、121位の置換は、121F、121Yまたは121Wである。161位の置換は、存在する場合は、好ましくは161A,より好ましくはS161Aである。161位が突然変異している場合は、160位におけるさらなる突然変異好ましくは160D、より好ましくはE160Dもまた存在し得る。223位の置換は、存在する場合は、好ましくは223K、223E、223V、223R、223A、223Pおよび223Dからなる群から選択される。より好ましくは、223位の置換は223Eまたは223Kである。特に好ましい実施形態では、さらなる置換が、G121F、G121Y、G121W、161A、223Eおよび223Kからなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、少なくとも3つの以下の置換:121F/Y/W、161A、223E/Kを含んでいる。以下に記載するその他の突然変異を含むことができる。146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位PS4改変体ポリペプチドは、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のような1つ以上の位置における置換を有する、野生型配列または野生型配列の改変体である変異体配列例えば、121位、161位および223位のうちの1つ以上の位置における突然変異を有するPS4改変体ポリペプチドを含む、既に変異した配列を含み得る。26位、70位、145位、188位、272位および339位PS4改変体ポリペプチドは、26位、70位、145位、188位、272位および339位のような1つ以上の位置における置換を有する、野生型配列または野生型配列の改変体である変異体配列例えば、121位、161位、223位、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの1つ以上の位置における突然変異を有するPS4改変体ポリペプチドを含む、既に変異した配列を含み得る。従って、一般に、関連位置におけるこの突然変異は、有益には、26位、70位、145位、188位、272位および339位の1つ、2つもしくは全部におけるさらなる単一の突然変異と組み合わせることができる。PS4改変体ポリペプチドは、26位における置換、好ましくは26Eまたは26Eを含んでいてよい。より好ましくは、26位の置換はN26EまたはN26Dを含んでいる。最も好ましくは、26位の置換はN26Eを含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、70位における置換、好ましくは70Dを含んでいてよい。より好ましくは、26位の置換はG70Dを含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、145位における置換、好ましくは145Dを含んでいてよい。より好ましくは、145位の置換はN145Dを含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、188位における置換、好ましくは188S、188Tまたは188Hを含んでいてよい。より好ましくは、188位の置換はG188S、G188TまたはG188Hを含んでいる。最も好ましくは、188位の置換はG188SまたはG188Hを含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、272位における置換、好ましくは272Qを含んでいてよい。より好ましくは、272位の置換はH272Qを含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、W339Aの位置における置換、好ましくは339Aまたは339Eを含んでいてよい。より好ましくは、339位における置換はW339AまたはW339Eを含んでいる。改変体配列に基づくPS4改変体ポリペプチド33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および/または334位との組み合わせ一部の実施形態では、親配列は、33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および334位のうちの1つ以上の位置、好ましくは全部の位置での突然変異を含んでいるしたがって、PS4改変体ポリペプチドは関連の対応する突然変異を含む。そのような実施形態では、突然変異は、好ましくはN33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307LおよびS334Pのうちの1つ以上、好ましくは全部である。そのような実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、便利にも、配列PSac-D34配列番号2を含むPseudomonassaccharophilia非マルトース酵素配列から誘導可能である。33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位ならびに334位、121位、161位および/または223位との組み合わせPS4改変体ポリペプチドは、121位、161位および/または223位のいずれかにおける突然変異と組み合わせて33、34、121、134、141、157、178、179、223、307および334位のいずれかにおける突然変異をさらに含み得る。従って、本発明者らは、以下の任意の組み合わせを含むPS4改変体ポリペプチドを開示する:a残基33位、34位、121位、134位、141位、157位、178位、179位、223位、307位および334位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくはN33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307LおよびS334P;b121位、161位もしくは223位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくは121F、121Y、121W、161A、223Eもしくは223K、より好ましくは121F、161Aもしくは223E位、およびc146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位もしくは353位における任意の1つ以上の突然変異、好ましくは146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Qもしくは353T、より好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tの。一部の好ましい実施形態では、本発明者らは、上記のcに記載した1つ以上の突然変異と組み合わせた上記のaに記載した突然変異の全部を含む、PS4改変体ポリペプチドを提供する。他の好ましい実施形態では、本発明者らは、上記のcに記載した任意の1つ以上の突然変異と組み合わせた、上記のbに記載した突然変異の全部と組み合わせた、上記のaに記載した突然変異の全部を含む、PS4改変体ポリペプチドを提供する。pMD96に基づくPS4改変体ポリペプチドaおよびbの全部における突然変異が含まれる実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、便利にも、配列pMD96配列番号14を含むPseudomonassaccharophilia非マルトース酵素配列から誘導可能である。従って、本発明者らは、具体的には、配列番号15~28を有する、実施例12~20に記載のPS4改変体ポリペプチドを提供する。実施例に示したように、これらのポリペプチドは各々、その親と比較して1つ以上の改善された特性を有する。その他の組み合わせさらに、他の位置例えば134位、141位、157位、223位、307位および334位のうちの任意の1つ以上の位置における突然変異を含む親配列もまた使用され得る。必要に応じて、これらは33位および34位の一方または両方における突然変異を含み得る。従って、親配列は、134位、141位、157位、223位、307位、334位、ならびに必要に応じて33位および34位からなる群から選択される位置における1つ以上の突然変異を含んでいてよいしたがって、当然ながらPS4改変体ポリペプチドは関連の対応する突然変異もまた含む。一部の実施形態では、親ポリペプチドは、134位におけるアルギニン、141位におけるプロリン、334位におけるプロリンの置換例えばG134R、A141PおよびS334Pを含んでいる。さらなる実施形態では、親ポリペプチドは、121位における突然変異をさらに含んでいる。親ポリペプチドは、178位における突然変異をさらに含んでいてよい。親ポリペプチドは、179位における突然変異をさらに含んでいてよい。親ポリペプチドは、87位における突然変異をなおさらに含んでいてよい。各々の特に好ましい置換は、好ましくは121D、より好ましくはG121D、好ましくは178F、より好ましくはL178F、好ましくは179T、より好ましくはA179Tおよび好ましくは87S、より好ましくはG87Sである。これらの位置における残基は、多数の残基によって置換されてよい例えばI157VもしくはI157NもしくはG223LもしくはG223IもしくはG223SもしくはG223TもしくはH307IもしくはH307VもしくはD34GもしくはD34AもしくはD34SもしくはD34TもしくはA179V。しかし、親ポリペプチドは、好ましくは置換I157L、G223A、H307L、L178FおよびA179T必要に応じてN33Y、D34Nを含んでいる。非常に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの任意の1つ以上の位置での置換、好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tを含み、ならびにL178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33YおよびD34Nのうちの1つ以上の置換を含んでいる。PSac-D20に基づくPS4改変体ポリペプチドPS4改変体は、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成親酵素配列PSac-D20配列番号3に基づいていてよい。そのような実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの任意の1つ以上の位置における置換、好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tを含み、ならびにL178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34NおよびG121Dのうちの1つ以上の置換を含んでいる。PSac-D14に基づくPS4改変体ポリペプチドPS4改変体は、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成親酵素配列PSac-D14配列番号4に基づいていてよい。このためそのような実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの任意の1つ以上の位置での置換、好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tを含み、ならびにL178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121DおよびG87Sのうちの1つ以上の置換を含んでいる。pMD55に基づくPS4改変体ポリペプチドPS4改変体は、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成親酵素配列pMD55配列番号13に基づいていてよい。そのような実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは位、146位、157位、158位、198位、229位、303位、306位、309位、316位および353位のうちの任意の1つ以上の位置での置換、好ましくは146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316Pもしくは353Tを含み、ならびにL178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121FおよびG87Sのうちの1つ以上の置換を含んでいる。PS4改変体ポリペプチドは、そのような置換を有する親ポリペプチドから誘導され得る。Pseudomonasstuzeri親ポリペプチドに基づくPS4改変体ポリペプチド一部の実施形態では、PS4改変体は、好ましくは以下の配列番号7に示したように、Pseudomonasstuzeri非マルトース生成酵素配列から誘導される。したがって、PS4改変体ポリペプチドは、配列PStu-D34配列番号8から誘導することができる。本発明者らは、Pseudomonasstuzeri非マルトース生成酵素配列に基づき、かつG121および/またはG87の置換を含むPS4改変体ポリペプチドを開示する。これらは、L178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34NおよびG121Dを含んでいてよく、ならびにPS4改変体ポリペプチドはL178FおよびA179Tの一方または両方と一緒に、次の置換:G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121DおよびG87Sの置換を含んでいてよい。従って、PS4改変体ポリペプチドは、Pseudomonasstuzeri非マルトース生成酵素親配列から誘導することができ、その親配列は、G121Dを含む配列PStu-D20配列番号9、またはG87Sをさらに含む配列PStu-D14配列番号10を有し得る。PS4改変体核酸本発明者らはまた、PS4改変体ポリペプチド配列における変化に対応する配列、またはこの変化をコードする配列を有するPS4核酸であって、本明細書に記載した目的のためにそのようなポリペプチドを作製する際に使用するためのPS4核酸を、さらに記載する。従って、本発明者らは、本明細書に記載した任意のポリペプチド配列をコードできる核酸を提供する。当業者は、核酸配列とポリペプチド配列との間、特に遺伝コードとこのコードの縮重との間の関係を知っており、そして困難なくそのようなPS4核酸を構築できるであろう。例えば、当業者は、PS4改変体ポリペプチド配列内の各アミノ酸置換について、置換アミノ酸をコードする1つ以上のコドンがあり得ることを知っているであろう。したがって、特定アミノ酸残基に関する遺伝コ-ドの縮重に依存して、PS4改変体ポリペプチド配列に対応する1種以上のPS4核酸配列を生成できることは明白であろう。さらに、PS4改変体ポリペプチドが1つより多い置換例えばA141P/G223を含む場合は、対応するPS4核酸は、2つのアミノ酸変化を各々コードするコドンの対の組み合わせを含んでいてよい。PS4改変体核酸配列は、上述した親ポリペプチドのいずれかをコードする親核酸から誘導することができる。特に、親核酸は、野生型配列、例えば配列番号6または配列番号12を含んでいてよい。従ってPS4改変体核酸は、野生型非マルトース生成エキソアミラーゼをコードし得るが、野生型アミノ酸残基の代わりに関連位置で別のアミノ酸をコードする核酸を含んでいてもよい。PS4改変体核酸配列は、1つ以上の突然変異を伴う、例えば組み合わせの下で上述した親ポリペプチドをコードする野生型配列をさらに含んでいてよい。特定のPS4改変体核酸配列とは同一ではないが、これらに関連する核酸配列例えば、PS4改変体核酸配列の改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメント、またはこれらにハイブリダイズすることができる相補体もしくは配列は、本明細書に記載した方法および組成物のためにも有用であろうことは理解されるであろう。文脈が他のことを指示しない限り、用語PS4改変体核酸は、上記に列挙したこれらの実体の各々を含むと理解されたい。アミノ酸配列および核酸配列における突然変異は、当技術分野において公知であるように、任意の多数の技術によって作製できる。改変体配列は、任意の公知の突然変異誘発技術例えば,適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRを使用する部位特異的突然変異誘発、5’付加add-on突然変異誘発、ミスマッチプライマー突然変異誘発などを用いて容易に作製できる。または、あるいは追加して、PS4改変体核酸配列は新規に作製できる。特に好ましい実施形態では、突然変異は、実施例に例示したように、適切なプライマーを用いたPCRポリメラーゼ連鎖反応によって親配列内に導入される。このため、記載のように、PseudomonassaccharophiliaまたはPseudomonasstuzeriエキソアミラーゼのような、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに、アミノ酸または核酸レベルで任意の所望のアミノ酸置換を導入することによって、ポリペプチドの配列を変化させることが可能である。本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼの配列が非マルトース生成エキソアミラーゼをコードする核酸の配列を変化させる工程によって変化させられる方法を記載する。しかし、当然ながら、PS4改変体ポリペプチドは、実際のところ、例えば漸進的な突然変異によって野生型ポリペプチドもしくは野生型核酸配列から実際に誘導される必要はないことは理解されるであろう。むしろ、PS4改変体ポリペプチドの配列が確立されれば、当業者は、例えば適切なオリゴヌクレオチドプライマーおよびPCRを用いて、当技術分野において公知の手段によって野生型から全突然変異を備える配列を容易に作製することができる。実際に、突然変異全部を有するPS4改変体ポリペプチドは、例えば、ペプチド合成方法を通して、新規に作製することができる。しかし一般に、PS4改変体ポリペプチドおよび/またはPS4改変体核酸は、前駆物質配列から誘導されるか、または誘導可能である。本明細書で使用する用語前駆物質は、本明細書に記載した方法および組成物に従って改変される酵素に先行する酵素を意味する。従って、前駆物質は、改変された酵素を生成するために使用される酵素を含んでいる。従って、前駆物質は、本明細書のどこかで記載した突然変異誘発によって改変される酵素であり得る。同様に、前駆物質は、野生型酵素、改変体野生型酵素またはすでに突然変異した酵素であってもよい。PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、当技術分野において公知である任意の手段によって生成できる。具体的には、PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、本質的にインビトロまたはインビボであり得る発現系から発現させることができる。具体的には、本発明者らは、好ましくはPS4改変体ポリペプチドを発現できる、PS4核酸配列を含むプラスミドおよび発現ベクターについて記載する。PS4核酸、プラスミドおよびベクターを含み、好ましくはそのようなPS4核酸、プラスミドおよびベクターを用いて形質転換されている、細胞および宿主細胞もまた開示され、これらもまた本明細書に含まれることも明確にしておきたい。好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチド配列は、単離形態で食品添加物として使用される。用語単離されたは、その配列が天然において見いだされるように天然において本質的に関連している少なくとも1つの他の構成成分を、その配列が少なくとも実質的に含んでいないことを意味する。1つの態様では、好ましくは、その配列は精製形態にある。用語精製されたは、その配列が比較的純粋な状態例えば、少なくとも約90純粋、または少なくとも約95純粋または少なくとも約98純粋であることを意味する。位置の番号付け本明細書において番号によって言及するすべての位置は、以下に示すPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ参照配列配列番号1の番号に関連する:この参照配列は、SWISS-PROTアクセッション番号P22963を有するがシグナル配列を備えていないPseudomonassaccharophilia配列に由来する。C末端デンプン結合ドメインは任意で無視することができる。または、それが含まれていてもよい。本明細書の文脈においては、PS4エキソアミラーゼ酵素におけるアミノ酸残基の位置の特定の番号付けが使用される。これに関連して、様々な公知のエキソアミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントによって、アミノ酸配列が公知である任意のエキソアミラーゼ酵素における任意のアミノ酸残基位置に対しエキソアミラーゼアミノ酸位置番号を明白に割り当てることが可能である。、他の公知の多数のエキソアミラーゼのアミノ酸配列と並列させた、例えばPseudomonassaccharophiliaから得られたエキソアミラーゼのアミノ酸配列に由来するこの番号付けシステムを用いて、エキソアミラーゼ内のアミノ酸残基の位置を明白に指示することが可能である。従って、番号付けシステムは、それが基本参照点として特定の配列を使用できる場合でさえ、すべての関連相同配列にも適用することができる。例えば、位置の番号付けは、他のシュードモナス種由来の相同配列または他の細菌由来の相同配列に適用できる。好ましくは、そのような相同配列は、上記の配列番号1の配列、SWISS-PROTアクセッション番号P22963もしくはP13507を有する配列または好ましくはこれら全部の配列と、60以上の相同性、例えば70以上、80以上、90以上または95以上の相同性を有する。タンパク質間の配列相同性は、本明細書に記載の周知のアラインメントプログラムおよびハイブリダイゼーション技術を用いて確定することができる。そのような相同配列、ならびに以下に記載する機能的同等物を、本明細書ではPS4ファミリーと呼ぶ。さらに、そして上記に記載したように、本明細書で使用した番号付けシステムは、参照配列の配列番号1を参照しており、この配列は、SWISS-PROTアクセッション番号P22963を有するが、シグナル配列を備えていないPseudomonassaccharophilia配列から誘導される。このシグナル配列は、参照配列のN末端に位置しており、21アミノ酸残基からなる。したがって、シグナル配列を含む対応する配列内、または実際に任意の他のN末端もしくはC末端の伸長もしくは欠失を含む対応する配列内において、突然変異されるかもしくは置換される特定の残基を同定することは、慣用的である。N末端への付加もしくは欠失に関連して、挿入または欠失される残基の数によって位置の番号付けを相殺することだけが、必要とされる全てである。例えば、配列番号1における1位はシグナル配列を備える配列内の22位に対応する。親酵素/ポリペプチドPS4改変体ポリペプチドは、親酵素、親ポリペプチドまたは親配列として知られる別の配列から誘導されるか、またはそれらの改変体である。本明細書で使用する用語親酵素は、生じる改変体すなわちPS4改変体ポリペプチドもしくはPS4改変体核酸に対して緊密な、好ましくは最も緊密な化学構造を有する酵素を意味する。親酵素は、前駆物質酵素すなわち、実際に突然変異している酵素であってもよく、または新規に作製されてもよい。親酵素は野生型酵素であってもよく、または1つ以上の突然変異を含む野生型酵素であってもよい。本明細書で使用する用語前駆物質は、酵素を生成するように改変されている、該酵素に先行する酵素を意味する。従って、前駆物質は突然変異誘発によって改変される酵素であってもよい。同様に、前駆物質は、野生型酵素、改変体野生型酵素またはすでに突然変異した酵素であってもよい。用語野生型は、当業者によって理解されている技術用語であり、天然に存在する種の大多数のメンバーに特徴的であり、突然変異体の表現型とは対照的な表現型を意味する。従って、本明細書の文脈では、野生型酵素は、関連種の大多数のメンバーにおいて天然に見いだされる酵素の形態である。一般に、本明細書に記載した改変体ポリペプチドに関連する関連野生型酵素は、配列相同性に関して最も緊密に関連する対応する野生型酵素である。しかし、特定の野生型配列が本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドを生成するためのベースとして使用されていた場合は、アミノ酸配列相同性に関してより密接に関連する別の野生型配列の存在に関わりなく、この特定の配列が対応する野生型配列となる。親酵素は、好ましくは、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチドである。好ましくは、親酵素は、非マルトース生成エキソアミラーゼ自体である。例えば、親酵素は、SWISS-PROTアクセッション番号P22963を有するポリペプチドのようなPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼであってもよく、またはSWISS-PROTアクセッション番号P13507を有するポリペプチドのようなPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼであってもよい。PS4ファミリーの他のメンバーも親酵素として使用できる;そのようなPS4ファミリーメンバーは、一般にこれら2種の酵素のいずれかに類似するか、相同であるか、または機能的に同等であり、そしてプローブを用いる適切なライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングのような標準方法またはゲノム配列分析によって同定することができる。特に、これら2種の酵素の一方の機能的同等物、ならびにPS4ファミリーの他のメンバーもまた、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドを生成するための出発点または親ポリペプチドとして使用できる。タンパク質の機能的同等物は、そのタンパク質の機能の1つ以上、好ましくは実質的に全部を共有するものを意味する。好ましくは、そのような機能は生物学的機能であり、好ましくはアミラーゼ活性のような酵素機能であり、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性である。親酵素に関連して、用語機能的同等物は、好ましくは親分子と類似する機能、または同一の機能を有する分子を意味する。親分子は、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼもしくはPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼ、または他の起源から得たポリペプチドであってもよい。SWISS-PROTアクセッション番号P22963を有するポリペプチドのようなPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼ、またはSWISS-PROTアクセッション番号P13507を有するポリペプチドのようなPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼである親酵素に関連する用語機能的同等物は、他の起源から得られ得る機能的同等物を意味する。機能的に同等の酵素は、相違するアミノ酸配列を有していてよいが、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する。機能性を決定するためのアッセイの例は本明細書に記載されており、当業者には公知である。非常に好ましい実施形態では、機能的同等物は、上述したPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼおよびPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼの一方、好ましくは両方に対する配列相同性を有する。機能的同等物は、配列番号1~14のいずれか、好ましくは配列番号1もしくは7または両方に記載した配列との配列相同性を有し得る。そのような配列間の配列相同性は、好ましくは少なくとも60、好ましくは65以上、好ましくは75以上、好ましくは80以上、好ましくは85以上、好ましくは90以上、好ましくは95以上である。そのような配列相同性は、当技術分野において公知である多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えばBLASTまたはFASTAなどによって生成することができる。そのようなアラインメントを実行するために適切なコンピュータープログラムは、GCGWisconsinBestfitパッケージUniversityofWisconsin,U.S.A;Devereuxら,1984,NucleicAcidsResearch12:387である。配列比較を実行できる他のソフトウエアの例には、BLASTパッケージAusubelら,1999同書、Chapter18を参照、FASTAAtschulら,1990,J.Mol.Biol.,403-410および比較ツールのGENEWORKSパッケージソフトが含まれるが、それらに限定されない。BLASTおよびFASTAはどちらもオフラインおよびオンライン検索のために利用できるAusubelら,1999同書、p.7-58~7-60を参照。しかし、GCGBestfitプログラムを使用するのが好ましい。他の実施形態では、機能的同等物は、上述した配列のいずれかへ特異的にハイブリダイズすることができるであろう。1つの配列が別の配列にハイブリダイズできるかどうかを決定する方法は当技術分野において公知であり、例えばSambrook,ら前出およびAusubel,F.M.ら前出に記載されている。非常に好ましい実施形態では、機能的同等物はストリンジェントな条件、例えば65°Cおよび0.1×SSC{1×SSC=0.15MNaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムpH7.0}の条件下でハイブリダイズ可能である。例えば、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼおよびPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼに対する配列相同性を有する機能的同等物は、親酵素として使用するために適切である。そのような配列は、任意の1つ以上の位置でPseudomonassaccharophilia配列と相違していてよい。さらに、ATCC17686のようなシュードモナス種の他の菌株由来の非マルトース生成エキソアミラーゼもまた親ポリペプチドとして使用できる。PS4改変体ポリペプチド残基は、PS4改変体ポリペプチド配列を生成するためにこれらの親配列のいずれかに挿入することができる。PS4改変体ポリペプチドがさらに上述したような1つ以上の突然変異を含むことが所望される場合は、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドを生成するための出発点もしくは親ポリペプチドとして使用できるようにするために、シュードモナス種の非マルトース生成エキソアミラーゼならびにPS4ファミリーの他のメンバーの機能的同等物の核酸配列内に対応する突然変異が作製され得ることは理解されるであろう。用語PS4改変体ポリペプチドの中には、特別には以下の中で開示されたポリペプチドが含まれる:US60/485,413,60/485,539および60/485,616;PCT/US2004/021723およびPCT/US2004/021739;US10/886,905および10/866,903;US60/608,919;US60/612,407;US60/485,539;PCT/IB2004/002487;US10/886,023;US10/886,505,US10/886,527およびUS10/886,504;US10/947,612。そのようなポリペプチドは、本明細書に記載した用途において使用するために、特に、食品添加物として、本明細書に記載のようにデンプンを処理するため、食品を製造するため、ベーカリー製品を製造するため、改善剤組成物を調製するため、組み合わせを調製するためなどに適切である。親配列の改変親酵素は、本明細書に記載したPS4改変体配列を生成するためにアミノ酸レベルまたは核酸レベルで改変できる。従って、本発明者らは非マルトース生成エキソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内に1つ以上の対応するコドン変化を導入する工程によるPS4改変体ポリペプチドの生成を提供する。核酸番号付けについては、好ましくは、配列番号6として示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼヌクレオチド配列の位置の番号付けを参照されたい。または、あるいは追加して、GenBankアクセッション番号X16732を備える配列を参照されたい。好ましい実施形態では、核酸番号付けは、配列番号6として示したヌクレオチド配列を参照されたい。しかし、アミノ酸残基番号付けと同様に、この配列の残基番号付けは参照のためだけに使用されなければならない。特に、上記のコドン変化は任意のPS4ファミリー核酸配列内に作製できることは理解されるであろう。例えば、配列変化は、Pseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼまたはPseudomonasstuzeri非マルトース生成エキソアミラーゼの核酸配列例、X16732、配列番号6またはM24516、配列番号12に対して行うことができる。親酵素は、完全な、すなわちそれが天然に存在するまたは突然変異した全長を備える酵素を含んでいてもよく、またはその短縮形態を含んでいてよい。したがってそのような酵素に由来するPS4改変体は、短縮形態であっても、または全長であってもよい。短縮は、N末端にあっても、C末端にあってもよいが、好ましくはC末端にある。親酵素もしくはPS4改変体は、活性であるか活性でないかなどにかかわらず、サブ配列、シグナル配列、ドメインもしくは部分のように、1つ以上の部分が欠如していてもよい。例えば、親酵素もしくはPS4改変体ポリペプチドは、上述したようなシグナル配列が欠如していてもよい。または、あるいは追加して、親酵素もしくはPS4改変体は1つ以上の触媒ドメインもしくは結合ドメインが欠如していてもよい。非常に好ましい実施形態では、親酵素もしくはPS4改変体は、非マルトース生成エキソアミラーゼ中に存在する1つ以上のドメイン例えばデンプン結合ドメインが欠如していてもよい。例えば、PS4ポリペプチドは、配列番号1に示したPseudomonassaccharophilia非マルトース生成エキソアミラーゼの番号付けと比較して、429位までの配列しか有していない。これは、PS4改変体pSac-d34、pSac-D20およびpSac-D14についても当てはまることに留意されたい。他の実施形態では、親酵素もしくはPS4改変体は、N末端もしくはC末端での1つ以上のさらなるアミノ酸配列と一緒に、完全な酵素すなわち、それが天然に存在するまたは突然変異したとおりの全長の酵素を含み得る。例えば、親酵素もしくはPS4改変体ポリペプチドは、C末端もしくはN末端においてさらなる単一のアミノ酸残基、例えば、M、A、Gなどを含み得る。好ましくは、さらなるアミノ酸残基は、N末端に存在する。1つ以上のさらなる残基が含まれる場合は、位置の番号付けは付加の長さによって補正される。アミラーゼPS4改変体ポリペプチドは、一般にアミラーゼ活性を含んでいる。用語アミラーゼは、例えば、特にデンプンの分解を触媒できる酵素として、通常の意味で使用される。特に、アミラーゼは、デンプン中のα-D-1→4O-グリコシド結合を開裂できるヒドロラーゼである。アミラーゼは、デンプン中のα-D-1→4O-グリコシド結合を開裂するヒドロラーゼとして分類される、デンプン分解酵素である。一般に、αアミラーゼE.C.3.2.1.1、α-D-1→4-グルカングルカノヒドロラーゼは、無作為方法でデンプン分子内のα-D-1→4O-グリコシド結合を開裂するエンド作用型酵素であると規定されている。対照的に、βアミラーゼE.C.3.2.1.2、α-D-1→4-グルカンマルトヒドロラーゼ、およびマルトース生成αアミラーゼE.C.3.2.1.133のような一部の生成物特異的アミラーゼのようなエキソ作用型のデンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を開裂する。βアミラーゼ、αグルコシダーゼE.C.3.2.1.20、α-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ、グルコアミラーゼE.C.3.2.1.3、α-D-l→4-グルカングルコヒドロラーゼ、および生成物特異的アミラーゼは、デンプンから特定長さのマルトオリゴ糖を生成できる。非マルトース生成エキソアミラーゼ本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドは、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチドまたはその改変体から誘導される。好ましくは、これらの親酵素は、非マルトース生成エキソアミラーゼ自体である。非常に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチド自体も、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を示す。非常に好ましい実施形態では、本明細書で使用する用語非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素は、この酵素が本明細書に記載した生成物決定方法にしたがって分析した場合に、最初はデンプンを実質的な量のマルトースへ分解しないことを意味すると理解されたい。非常に好ましい実施形態では、非マルトース生成エキソアミラーゼは、エキソ-マルトテトラヒドロラーゼを含んでいる。エキソ-マルトテトラヒドロラーゼE.C.3.2.1.60は、より正式にはグルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼとして公知である。この酵素は、非還元連鎖端から連続するマルトテトラオース残基を除去できるように、デンプン質多糖中の1,4-α-D-グルコシド結合を加水分解する。非マルトース生成エキソアミラーゼは、参考として本明細書中に援用される米国特許第6,667,065号の中に詳細に記載されている。非マルトース生成エキソアミラーゼ活性についてのアッセイ以下のシステムは、本明細書に記載した方法および組成物によって使用するために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを性質決定するために使用される。このシステムは、例えば、本明細書に記載したPS4親ポリペプチドもしくは改変体ポリペプチドを性質決定するために使用できる。最初に背景情報として、ろう様トウモロコシアミロペクチンフランス国、Roquette社からWAXILYS200として入手できるは、極めて高いアミロペクチン含量90超を備えるデンプンである。20mg/mlのろう様トウモロコシデンプンを50mMのMES2-N-モルホリノエタンスルホン酸、2mMの塩化カルシウムpH6.0のバッファー中で3分間沸騰させ、引き続いて50°Cでインキュベートし、その後30分間以内に使用する。1単位の非マルトース生成エキソアミラーゼは、上述したように調製した50mMのMES、2mMの塩化カルシウムpH6.0中の10mg/mlのろう様トウモロコシデンプン4mlとともに50°Cの試験管中でインキュベートした場合に1分あたり1μmolの還元糖と同等である加水分解産物を放出する酵素の量であると規定されている。還元糖は、標準物質としてマルトースを用い、Bernfeld,MethodsEnzymol,1954,1,149-158のジニトロサリチル酸法または還元糖を定量するために当技術分野において公知であるまた別の方法を使用して測定する。非マルトース生成エキソアミラーゼの加水分解産物パターンは、0.7単位の非マルトース生成エキソアミラーゼを上述したように調製したバッファー中の10mg/mlのろう様トウモロコシデンプン4mlとともに50°Cの試験管中で15分間もしくは300分間にわたりインキュベートすることによって決定する。反応は、試験管を沸騰水浴中に3分間浸漬することによって停止させる。加水分解産物は、パルス式電流測定検出により、標準物質としてグルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴ糖を用いて、溶離液として酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水を用いるDionexPA100カラムを使用するアニオン交換HPLCによって分析および定量する。マルトオクタオースからマルトデカオースへの反応因子は、マルトヘプタオースについて見いだされる反応因子である。好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、前記非マルトース生成エキソアミラーゼの0.7単位の量を、50mMの2-N-モルホリノエタンスルホン酸および2mMの塩化カルシウムを含有するバッファー液1mlにつき事前に沸騰させたろう様トウモロコシデンプン10mgの水溶液4mlpH6.0中で50°Cの温度で15分間にわたりインキュベートすると、その酵素は2~10のD-グルコピラノシル単位からなる1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖および任意でグルコースからなる加水分解産物を産生する少なくとも60重量、好ましくは少なくとも70重量、より好ましくは少なくとも80重量、および最も好ましくは少なくとも85重量の前記加水分解産物が、3~10のD-グルコピラノシル単位、好ましくは4~8のD-グルコピラノシル単位からなる直鎖状マルトオリゴ糖であるように、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する。容易に参照するため、および今回の目的のために、50mMの2-N-モルホリノエタンスルホン酸および2mMの塩化カルシウムを含有するバッファー溶液1mlにつき10mgの事前に沸騰させたろう様トウモロコシデンプンを含む水溶液4mlpH6.0中での温度50°Cでの15分間にわたり0.7単位の非マルトース生成エキソアミラーゼをインキュベートする工程の特徴は、ろう様トウモロコシデンプンインキュベーション試験と呼ぶことができる。従って、また別の表現をすると、非マルトース生成エキソアミラーゼである好ましいPS4改変体ポリペプチドは、トウモロコシデンプンインキュベーション試験において、1~10のD-グルコピラノシル単位の1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖、および任意でグルコースからなる加水分解産物前記加水分解産物の少なくとも60重量、好ましくは少なくとも70重量、より好ましくは少なくとも80重量、および最も好ましくは少なくとも85重量が1~10のD-グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴ糖、好ましくは4~8のD-グルコピラノシル単位からなる直鎖状マルトオリゴ糖からなるを産生する能力を有すると特徴付けられる。ろう様トウモロコシデンプンインキュベーション試験における加水分解産物は、2~10のD-グルコピラノシル単位の1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖および任意でグルコースを含むことができる。ろう様トウモロコシデンプンインキュベーション試験における加水分解産物はまた、他の加水分解産物を含むこともできる。しかし、3~10のD-グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴ糖の重量は、2~10のD-グルコピラノシル単位の1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖および任意のグルコースからなる加水分解産物の量に基づいている。言い換えると、3~10のD-グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴ糖の重量は、2~10のD-グルコピラノシル単位の1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖およびグルコース以外の加水分解産物の量には基づいていない。加水分解産物は、任意の適切な手段によって分析できる。例えば、加水分解産物は、パルス式電流測定検出により、例えば標準物質としてグルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴ糖を用いて、DionexPA100カラムを使用するアニオン交換HPLCによって分析することができる。容易に参照するため、および今回の目的のために、パルス式電流測定検出により、標準物質として使用するグルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴ糖を用いて、DionexPA100カラムを用いるアニオン交換HPLCを使用して加水分解産物を分析する特徴は、アニオン交換により分析する工程と呼ぶことができる。当然ながら、そして先に指示したように、他の分析技術、ならびに他の特定のアニオン交換技術もまた有用であろう。従って、また別の表現をすると、好ましいPS4改変体ポリペプチドは、ろう様トウモロコシデンプンインキュベーション試験において、2~10のD-グルコピラノシル単位の1つ以上の直鎖状マルトオリゴ糖および任意でグルコースからなる加水分解産物を産生する能力を有するような非マルトース生成エキソアミラーゼを有するが、前記加水分解産物は、アニオン交換によって、前記加水分解産物の少なくとも60重量、好ましくは少なくとも70重量、より好ましくは少なくとも80重量、および最も好ましくは少なくとも85重量が3~10のD-グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴ糖からなり、好ましくは4~8のD-グルコピラノシル単位からなる直鎖状マルトオリゴ糖からなる、と特徴付けられる。本明細書で使用する用語直鎖状マルトオリゴ糖は、α-1→4結合によって結合された2~10単位のα-D-グルコピラノースを意味する通常の意味で使用される。非常に好ましい実施形態では、本明細書に記載したPS4ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較した場合に、好ましくは同一条件下で試験した場合に、改善されたエキソアミラーゼ活性、好ましくは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する。特に、非常に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、好ましくはろう様トウモロコシデンプン試験において測定した場合に、それらの親と比較して、10以上、好ましくは20以上、好ましくは50以上のエキソアミラーゼ活性を有する。加水分解産物は、任意の適切な手段によって分析できる。例えば、加水分解産物は、パルス式電流測定検出により、例えば標準物質としてグルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴ糖を用いて、DionexPA100カラムを使用するアニオン交換HPLCによって分析することができる。本明細書で使用する用語直鎖状マルトオリゴ糖は、α-1→4結合によって結合された2~20単位のα-D-グルコピラノースを意味する通常の意味で使用される。改善された特性本明細書に記載したPS4改変体は、好ましくは、それらの親酵素と比較した場合に、改善された熱安定性、改善されたpH安定性、または改善されたエキソ特異性などのうちの任意の1つ以上の改善された特性を有する。特に、303位における突然変異、例えば303E、303D、306Tおよび306Gを有するPS4改変体ポリペプチドは、上昇されたエキソ特異性を有する。146位、157位、158位、198位、229位、好ましくは198位および229位の両方、309位、316位、316位および353位のうちの任意の位置での突然変異、例えば、146G、157M、158T、198W、229P、198W、229P、309P、316S、316Pおよび353Tを有するPS4改変体ポリペプチドは、改善された熱安定性を示す。いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、本発明者らは、特定位置における突然変異は、そのような突然変異を含むポリペプチドの特性に個々の作用および累積作用を及ぼすと考える。熱安定性およびpH安定性好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、熱安定性である;好ましくは、PS4改変体ポリペプチドはその親酵素より高い熱安定性を有する。従って、本発明者らは、同一条件下で試験した場合に親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有するPS4改変体ポリペプチドを提供する。具体的には、本発明者らは、121位、145位、146位、157位、158位、188位、198位、223位、229位、316位、353位のうちの任意の1つまたは複数での突然変異、より好ましくは121A、121D、121F、121H、121M、121W、121Y、145D、146G、157M、158T、188H、188S、198W、223A、223E、223K、223R、223V、229P、316P、316S、353Tのうちの任意の1つ以上の突然変異を含むPS4改変体ポリペプチドを提供する。小麦および他の穀類では、アミロペプチン内の外側鎖はDP12~19の範囲内にある。非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有すると記載されたPS4改変体ポリペプチドによるアミロペクチン側鎖の酵素加水分解は、それらの結晶化傾向を顕著に減少させることができる。ベーキング目的のために使用される小麦およびその他の穀類中のデンプンは、アミラーゼによる酵素の攻撃に一般に抵抗性であるデンプン顆粒の形態で存在する。従って、デンプンの変性は、主として損傷したデンプンに限定され、約60°Cで糊化が始まるまで生地の加工処理および初期のベーキング中は極めて緩徐に進行する。この結果として、高度の熱安定性を備えるアミラーゼだけがベーキング中にデンプンを効率的に変性させることができる。そして一般に、アミラーゼの効率は熱安定性の上昇に伴って上昇する。すなわち、熱安定性が高いほど酵素はベーキング中により長時間にわたり活性であり続けるので、したがってより高度の硬化防止作用を提供するであろう。したがって、食品に加工処理する任意の段階、例えばパンへのベーキング前、ベーキング中、ベーキング後にデンプンに添加する場合、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドの使用は、老化を遅延または妨害または緩徐化することができる。以下ではそのような使用についてさらに詳細に記載する。本明細書で使用する用語熱安定性は、上昇した温度に曝露した後に酵素が活性を維持する能力に関する。好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、約55°Cから約80°C以上の温度でデンプンを分解させることができる。適切には、この酵素は、約95°Cまでの温度に曝露した後にその活性を維持する。非マルトース生成エキソアミラーゼなどの酵素の熱安定性は、その半減期によって測定される。従って、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドは、好ましくは55°Cから約95°C以上、好ましくは約80°Cの上昇した温度で、親酵素と比較して好ましくは10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200以上延長された半減期を有する。本明細書で使用する半減期t1/2は、規定加熱条件下で酵素活性の半分が不活化される時間単位:分間である。好ましい実施形態では、半減期は少なくとも80°Cでアッセイされる。好ましくは、サンプルは80°C以上で1~10分間加熱される。次いで、半減期の値は、本明細書に記載した方法のいずれかによって、残留アミラーゼ活性を測定する工程によって計算される。好ましくは、半減期アッセイは、実施例においてより詳細に記載するように実施される。好ましくは、本明細書に記載したPS4改変体は、ベーキング中に活性であり、約55°Cの温度で始まるデンプン顆粒の糊化中および糊化後にデンプンを加水分解する。熱安定性が高いほど非マルトース生成エキソアミラーゼは活性である時間が長くなり、したがってこの改変体が提供する硬化防止作用はより高くなるであろう。しかし、約85°Cより高い温度でのベーキング中には、酵素の不活化が起こる可能性がある。これが起こると、非マルトース生成エキソアミラーゼは次第に不活化され、最終のパンにおけるベーキングプロセス後には実質的に活性が残っていない。このため好ましくは、上述した使用に適切な非マルトース生成エキソアミラーゼは、50°Cより高く98°C未満の最適温度を有する。本明細書に記載したPS4改変体の熱安定性は、より熱安定性になるように、そして本明細書に記載した使用により適切なように操作したタンパク質を使用することによって改善できる;このため本発明者らは、タンパク質操作によってより熱安定性になるように改変されたPS4改変体の使用を含んでいる。好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、pH安定性である;より好ましくは、PS4改変体ポリペプチドはその同起源親酵素より高いpH安定性を有する。本明細書で使用する用語pH安定性は、広範囲のpHにわたって酵素が活性を維持する能力に関する。好ましくは、PS4改変体ポリペプチドは、約5~約10.5のpHでデンプンを分解させることができる。1つの実施形態では、pH安定性の程度は、特定pH条件において酵素の半減期を測定することによってアッセイできる。また別の実施形態では、pH安定性の程度は、特定pH条件において酵素の活性または比活性を測定することによってアッセイできる。特定のpH条件は、pH5~pH10.5までの任意のpHであってもよい。従って、PS4改変体ポリペプチドは、同一条件下で親ポリペプチドと比較した場合にアッセイに依存してより長い半減期、またはより高い活性を有し得る。PS4改変体ポリペプチドは、同一pH条件下でそれらの親ポリペプチドに比較した場合に、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200以上長い半減期を有し得る。または、あるいは追加して、それらは同一pH条件下で親ポリペプチドと比較した場合に、より高い活性を有し得る。エキソ特異性一部の非マルトース生成エキソアミラーゼは、ある程度のエンドアミラーゼ活性を有する可能性があることは公知である。一部の場合には、エンドアミラーゼ活性は分枝状デキストリンの蓄積に起因して粘着性もしくはゴム状のクラムを生成することによって最終パン製品の品質に有害な影響を及ぼす可能性があるので、このタイプの活性を減少させるか、または排除する必要がある。本発明者らは、同一条件下で試験した場合に親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有するPS4改変体ポリペプチドを提供する。具体的には、本発明者らは、26位、70位、121位、145位、161位、223位、223位、303位、306位、309位、339位、339位のうちの任意の1つまたは複数での突然変異、より好ましくは26E、70D、121A、121D、121H、121M、121W、121Y、145D、161A、223A、223E、223K、223R、223V、303D、303E、306G、306T、309P、339A、339Eのうちの任意の1つ以上の突然変異を含むPS4改変体ポリペプチドを提供する。エキソ特異性は、全アミラーゼ活性対全エンドアミラーゼ活性の比率を決定することによって有用に測定できる。この比率は、本明細書ではエキソ特異性指数と呼ばれる。好ましい実施形態では、酵素は、20以上のエキソ特異性指数を有する場合、すなわちその全アミラーゼ活性エキソアミラーゼ活性を含むがそのエンドアミラーゼ活性の20倍以上である場合は、エキソアミラーゼであると見なされる。非常に好ましい実施形態では、エキソアミラーゼのエキソ特異性指数は、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、または100以上である。非常に好ましい実施形態では、エキソ特異性指数は、150以上、200以上、300以上、400以上、500以上または600以上である。全アミラーゼ活性およびエンドアミラーゼ活性は、当技術分野において公知である任意の手段によって測定できる。例えば、全アミラーゼ活性は、デンプン基質から遊離した還元末端の総数をアッセイすることによって測定できる。または、Betamylアッセイの使用については実施例においてさらに詳細に記載されており、便宜性のために、実施例においてアッセイしたアミラーゼ活性は、表の中のBetamyl単位によって記載されている。エンドアミラーゼ活性は、PhadebasキットPharmaciaandUpjohnを使用してアッセイできる。これは、アゾ色素によって標識されている青色標識架橋デンプンデンプン分子内の内部切断だけが標識を遊離し、外部切断は標識を遊離しないを利用する。色素の遊離は、分光測光法によって測定できる。したがって、Phadebasキットはエンドアミラーゼ活性を測定し、便宜性のために、そのようなアッセイの結果実施例に記載は、本明細書ではPhadebas単位と呼ばれる。このため非常に好ましい実施形態では、エキソ特異性指数は、Betamyl単位/Phadebas単位によって表示され、したがってB/Phadと呼ばれる。エキソ特異性は、例えば本発明者らの国際特許公開第WO99/50399号におけるように、先行技術において記載された方法によってアッセイすることもできる。これは、エンドアミラーゼ活性対エキソアミラーゼ活性の比率によってエキソ特異性を測定する。従って、好ましい態様では、本明細書に記載したPS4改変体は、1単位のエキソアミラーゼ活性あたり0.5未満のエンドアミラーゼ単位EAUを有するであろう。好ましくは、本発明によって使用するために適切な非マルトース生成エキソアミラーゼは、1単位のエキソアミラーゼ活性あたり0.05EAU未満、より好ましくは1単位のエキソアミラーゼ活性あたり0.01EAU未満を有するであろう。本明細書に記載したPS4改変体は、好ましくは、上述したように、例えばエキソ特異性指数によって測定したエキソ特異性を有し、エキソアミラーゼであることと一致する。さらに、PS4改変体は、好ましくは、PS4改変体が誘導された親酵素もしくはポリペプチドと比較した場合に、より高い、または上昇したエキソ特異性を有する。そこで、例えば、PS4改変体ポリペプチドは、好ましくは同一pH条件下で、それらの親ポリペプチドと比較した場合に、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200以上高いエキソ特異性を有していてよい。それらは、好ましくは同一条件下で、それらの親ポリペプチドに比較した場合に、1.5倍以上、2倍以上、5倍以上、10倍以上、50倍以上、100倍以上を有するであろう。PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸の使用PS4改変体ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクターなどは、アミラーゼを使用できる任意の用途において使用できる。特に、それらは任意の非マルトース生成エキソアミラーゼにの代わりに使用できる。それらは、単独であるか、他の公知のアミラーゼまたは非マルトース生成エキソアミラーゼと組み合わせられるかにかかわらず、アミラーゼまたは非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を補充するために使用できる。本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドは、例えばベーカリー製品および飲料製品などの食品工業における様々な用途において使用することができ、それらは医薬組成物などの他の用途または化学工業においてさえ使用することもできる。特に、PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、ベーキングWO99/50399に開示されているおよび粉標準化量の増強もしくは改善を含む様々な工業用途において有用である。PS4改変体ポリペプチドは、デンプンおよびその他の基質からマルトテトラオースを生成するために使用できる。このため本発明者らは、食品を調製するための方法であって:a非マルトース生成エキソアミラーゼを得る工程と;b本明細書に記載した非マルトース生成エキソアミラーゼの任意の1つ以上の位置で突然変異を導入する工程と;c結果として生じたポリペプチドを食品成分と混合する工程と、を包含する方法について記載する。PS4改変体ポリペプチドは、パンなどのベーカリー製品の容積を増加させるために使用できる。いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、本発明者らは、これはアミロース分子を短縮するエキソアミラーゼの結果として加熱ベーキングなど中のパン生地の粘度における減少の結果として生じると考えている。これは、発酵によって生成した二酸化炭素がより妨害を受けずにパンのサイズを増加させることを可能にする。従って、PS4改変体ポリペプチドを含む食品、またはPS4改変体ポリペプチドで処理された食品は、そのように処理されていない製品、または親ポリペプチドを用いて処理されている製品と比較した場合に容積が増加している。言い換えると、この食品は、食品の容積あたりでより大きな容積の空気を有している。または、あるいは追加して、PS4改変体ポリペプチドを用いて処理された食品は、より低い密度、または重量もしくは質量/容積比を有している。特に好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、パンの容積を増加させるために使用される。容積の増加もしくは拡大は、食品の粘着性またはデンプン質を低下させるので有益である。消費者には軽い食品が好まれており、顧客の経験は強化されている。好ましい実施形態では、PS4改変体ポリペプチドの使用は、容積を10、20、30、40、50以上増加させる。食品の容積を増加させるためのPS4改変体ポリペプチドの使用は、実施例に詳細に記載されている。食品使用本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、食品として、または食品の調製において使用できる。特に、それらは食品添加物として食品に添加できる。用語食品は、調製された食品、ならびに粉などの食品のための成分を含むことが意図されている。好ましい態様では、食品はヒトが消費するためのものである。食品は、使用および/または適用様式および/または投与様式に依存して、溶液もしくは固体の形態であってもよい。PS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、食品成分として使用されてもよい。本明細書で使用する用語食品成分は、機能的食品もしくは食材に添加される、もしくは添加できる調製物を含んでおり、さらに例えば酸化もしくは乳化を必要とする広範囲の製品において低レベルで使用できる調製物を含んでいる。食品成分は、使用および/または適用様式および/または投与様式に依存して、溶液もしくは固体の形態であってもよい。本明細書に開示したPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、栄養補助食品であってもよく、または栄養補助食品に添加されてもよい。本明細書に開示したPS4改変体ポリペプチドおよびPS4改変体核酸は、機能的食品であってもよく、または機能的食品に添加されてよい。本明細書で使用する用語機能的食品は、栄養作用および/または味覚の充足を提供できるだけではなく、消費者へいっそう有益な作用を送達できる食品を意味する。機能的食品の法的定義はないが、この分野に関心を抱いている関係者の大多数は、それらが特定の健康作用を有するとして市販される食品であることを承知している。PS4改変体ポリペプチドは、食品または食材を製造する際に使用することもできる。典型的な食材には、乳製品、肉製品、家禽肉製品、魚加工品および生地製品が含まれる。生地製品は、揚げた生地、たっぷりの油で揚げたdeepfried生地、ローストした生地、ベーキングした生地、蒸した生地および茹でた生地例えば、蒸しパンや餅を含む任意の加工生地製品であってもよい。非常に好ましい実施形態では、食品はベーカリー製品である。好ましくは、食材は、ベーカリー製品である。典型的には、ベーカリーベーキング製品には、ローフパン、ロールパン、丸パン、ピザベースなどのパン、ペストリー、プレッツェル、トーティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカーなどが含まれる。このため本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼを含む食品添加物を改変する方法であって、本明細書に記載したように非マルトース生成エキソアミラーゼの任意の1つ以上の位置で突然変異を導入する工程を含む方法について記載する。同一の方法は、食品成分、または栄養補助食品、食品、または食材を変性させるために使用できる。老化/硬化本発明者らは、デンプンゲルなどのデンプン媒質の硬化を遅延させることのできるPS4改変体タンパク質の使用について記載する。PS4改変体ポリペプチドは、特別にはデンプンの有害な老化を遅延させることができる。ほとんどのデンプン顆粒は、2種のポリマーである本質的に直鎖状のアミロースおよび高度に分枝状のアミロペクチンの混合物から構成される。アミロペクチンは、1-4結合によって連結されたα-D-グルコピラノシル単位の鎖からなる極めて大きな分枝状分子であり、ここで、前記鎖はα-D-1-6結合によって連結されて分枝鎖を形成する。アミロペクチンは、すべての天然デンプン中に存在し、ほとんどの一般的デンプンの約75を構成している。アミロースは、本質的にはほとんどα-D-1-6分枝鎖を有さない1-4結合α-D-グルコピラノシル単位の直鎖である。ほとんどのデンプンは約25のアミロースを含有している。水の存在下で加熱されたデンプン顆粒は、糊化と呼ばれる秩序-無秩序相転移を受けるが、ここで、液体は膨潤顆粒によって取り込まれる。ゲル化温度は、様々なデンプン毎に相違する。新しくベーキングされたパンが冷めると、アミロース分画は数時間以内に老化して網状組織を発生させる。このプロセスは、それが低度の堅さと改善されたスライシング特性を備える望ましいクラムの構造を作り出す点で有益である。ゲル化したデンプン顆粒内で起こるアミロペクチンの結晶化は、ベーキング後数日間はより緩やかに発生する。このプロセスでは、アミロペクチンは、デンプン顆粒が埋め込まれているアミロース網状組織を強化すると考えられる。この強化は、クラムの堅さの上昇をもたらす。この強化は、パン硬化の主因の1つである。パン製品の品質は、保管中に徐々に悪化することは公知である。デンプンの再結晶化老化とも呼ばれるの結果として、クラムの水分保持能力は変化し、これは、感覚的および栄養的特性に重要な意味を伴う。クラムは柔らかさや弾力性を失い、堅くて砕けやすくなる。クラムの堅さの増加は、しばしばパンの硬化プロセスの尺度として使用されている。アミロペクチンの有害な老化の速度は、アミロペクチンの側鎖の長さに左右される。従って、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するPS4改変体ポリペプチドによるアミロペクチン側鎖の酵素加水分解は、それらの結晶化傾向を顕著に減少させることができる。したがって、食品に加工処理する任意の段階、例えばパンへのベーキング前、ベーキング中、ベーキング後にデンプンに添加する場合の本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドの使用は、老化を遅延または妨害または緩徐化することができる。以下ではそのような使用についてさらに詳細に記載する。このため本発明者らは、非マルトース生成エキソアミラーゼが生地製品の硬化を防止する能力、好ましくは有害な老化を防止する能力を向上させる方法であって、本明細書に記載したように非マルトース生成エキソアミラーゼの任意の1つ以上の位置で突然変異を導入する工程を含む方法について記載する。老化硬化を含むを測定するためのアッセイ本明細書に記載した非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するPS4改変体ポリペプチドの硬化防止作用を評価するために、クラムの堅さは、Instron4301万能食品テクスチャー分析装置または当技術分野において公知である類似の装置によって、ベーキングの1、3および7日後に測定できる。当技術分野において伝統的に使用されており、非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有するPS4改変体ポリペプチドがデンプン老化に及ぼす作用を評価するために使用される別の方法は、DSC示差走査熱量測定法に基づいている。ここで、酵素を用いるか、または用いずにコントロール、ベーキングしたクラムまたはモデル系の生地からのクラム内の老化したアミロペクチンの融解エンタルピーを測定する。本明細書に記載した実施例において適用したDSC装置は、20~95°Cで1分あたり10°Cの温度勾配で実行されるMettler-ToledoDSC820である。サンプルを調製するためには、10~20mgのクラムが計量され、Mettler-Toledoアルミニウム皿へ移され、これが次に密封される。本明細書に記載した実施例で使用したモデル系の生地は、PS4改変体非マルトース生成エキソアミラーゼを含むか、または含まずに、標準的な小麦粉および最適な量の水もしくはバッファーを含有している。それらは、10または50gのBrabenderファリノグラフ内で各々6もしくは7分間混合される。生地のサンプルは蓋付きのガラス製試験管150.8cm中に入れられる。これらの試験管は、水浴中で33°Cで30分間のインキュベーションから開始して、次に1分あたり1.1°Cの勾配で33~95°Cへの加熱、そして最後に95°Cでの5分間のインキュベーションを行なうベーキングプロセスにかけられる。引き続き、試験管はDSC分析の前に20°Cの恒温槽内に保管される。好ましい実施形態では、本明細書に記載したPS4改変体は、コントロールと比較して低下した融解エンタルピーを有している。非常に好ましい実施形態では、PS4改変体は、10以上低下した融解エンタルピーを有している。好ましくは、それらは、コントロールと比較して20以上、30、40、50、60、70、80、90以上低下した融解エンタルピーを有している。上記の表2は、相違する用量のPSac-D34を用いて調製した生地モデル系の7日間の保管後のDSC値を示している。0.5、1および2ppmまたはμg/gの粉が試験されている。デンプン製品の調製本発明者らは、食品、特にデンプン製品の調製におけるPS4改変体ポリペプチドの使用を提供する。本方法は、PS4改変体ポリペプチドなどの非マルトース生成エキソアミラーゼ酵素をデンプン媒質へ添加することによってデンプン製品を形成する工程を含んでいる。デンプン媒質が生地である場合は、生地は粉、水、PS4改変体ポリペプチドである非マルトース生成エキソアミラーゼおよび必要に応じて他の考えられる成分および添加物を一緒に混合することによって調製される。用語デンプンは、デンプン自体またはその構成成分、特にアミロペクチンを意味すると見なされたい。用語デンプン媒質は、デンプンを含む任意の適切な媒質を意味する。用語デンプン製品は、デンプンを含有するか、デンプンをベースとするか、またはデンプンから誘導される任意の製品を意味する。好ましくは、デンプン製品は、小麦粉から得られるデンプンを含有するか、これをベースとするか、またはこれから誘導される。本明細書で使用する用語粉は、小麦または他の穀物の微細に粉砕された粉の同義語である。しかし好ましくは、この用語は他の穀物からではなく小麦自体から得られた粉を意味する。従って、他に特別に明示しない限り、本明細書で使用する粉との言及は、好ましくは小麦粉自体ならびに生地などの媒質中に存在する場合の小麦粉についての言及を意味する。好ましい粉は、小麦粉またはライ麦粉または小麦粉とライ麦粉の混合物である。しかし、例えば米、トウモロコシ、大麦、およびアズキモロコシなどの他のタイプの穀物から作製された粉を含む生地もまた想定されている。好ましくは、デンプン製品は、ベーカリー製品である。より好ましくは、デンプン製品は、パン製品である。いっそうより好ましくは、デンプン製品は、ベーキングしたデンプン質のパン製品である。用語ベーキングしたデンプン質のパン製品は、生地形成条件下で粉、水、および膨張剤を混合する工程によって入手できる生地をベースとする任意のベーキング製品を意味する。当然ながら、生地混合物にはさらなる構成成分を添加することができる。従って、デンプン製品がベーキングしたデンプン質のパン製品である場合は、プロセスは、生地形成条件下で任意の適切な順序で粉、水および膨張剤を混合する工程およびさらに任意でプレミックスの形態にあるPS4改変体ポリペプチドを添加する工程を含んでいる。膨張剤は、重炭酸ナトリウムなどの化学膨張剤または任意の菌株のSaccharomycescerevisiaeパン酵母であってもよい。PS4改変体非マルトース生成エキソアミラーゼは、水を含む任意の生地成分、もしくは生地成分混合物または任意の添加物もしくは添加物混合物と一緒に添加できる。生地は、ベーキング産業または粉生地をベースとする製品を製造する他の産業において一般的な任意の従来型生地調製方法によって調製できる。例えば白パン、ふるいにかけたライ麦粉と小麦粉とから作ったパン、ロールパンなどのデンプン質のパン製品のベーキングは、典型的には約15~60分間にわたり180~250°Cの範囲内の温度のオーブンでパン生地をベーキングすることによって遂行される。ベーキングプロセス中には、急な温度勾配200→120°Cが外側生地層全体に広がり、ベーキング製品に特徴的なクラストが発生する。しかし、蒸気発生に起因する熱消費のために、クラム中の温度はベーキングプロセスの終了時においてもほぼ100°Cに過ぎない。このため本発明者らは、パン製品を製造する工程であって:aデンプン媒質を提供する工程と;b本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドをデンプン媒質に添加する工程と;cパン製品を製造するために工程b中または後にデンプン媒質に熱を加える工程と、を包含するプロセスを提供する。本発明者らは、パン製品を製造するプロセスであって、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドをデンプン媒質に添加する工程を含むプロセスについても記載する。PS4改変体ポリペプチドの非マルトース生成エキソアミラーゼは、単一活性成分として、または1つ以上のさらなる生地成分もしくは生地添加物と混合して該酵素を含む液体調製物、または乾燥粉末状組成物として添加できる。改善剤組成物本発明者らは、パン改善剤組成物および生地改善剤組成物を含む改善剤組成物について記載する。これらは、必要に応じてさらなる成分と、もしくはさらなる酵素、またはその両方と一緒に、PS4改変体ポリペプチドを含んでいる。本発明者らは、ベーキング工程におけるそのようなパンおよび生地改善剤組成物の使用をさらに提供する。また別の態様では、本発明者らは、パン改善剤組成物および生地改善剤組成物から得られたベーキング製品または生地を提供する。また別の態様では、本発明者らは、パン改善剤組成物および生地改善剤組成物の使用から得たベーキング製品または生地について記載する。生地調製物生地は、粉、水、PS4改変体ポリペプチド上述したようなを含む生地改善剤組成物ならびに必要に応じて他の成分および添加物を混合する工程によって調製できる。生地改善剤組成物は、粉、水、または任意の他の成分もしくは添加物を含む任意の生地成分と一緒に添加することができる。生地改善剤組成物は、粉もしくは水もしくは任意の他の成分および添加物の前に添加できる。生地改善剤組成物は、粉もしくは水もしくは任意の他の成分および添加物の後に添加できる。生地は、ベーキング産業または粉生地をベースとする製品を製造する他の産業において一般的な任意の従来型生地調製方法によって調製できる。生地改善剤組成物は、単一活性成分として、または1つ以上の他の生地成分もしくは添加物と混合して該組成物を含む液状調製物または乾燥粉末組成物の形態で添加できる。添加されるPS4改変体ポリペプチドの非マルトース生成エキソアミラーゼの量は、通常は粉1kgに付き最終生地中に50~100,000単位、好ましくは粉1kgに付き100~50,000単位の存在が生じる量である。好ましくは、この量は粉1kgに付き200~20,000単位の範囲内である。または、PS4改変体ポリペプチドの非マルトース生成エキソアミラーゼは、粉に基づいて最終生地中に0.02~50ppm粉1kgに付き0.02~50mgの酵素、好ましくは0.2~10ppmの存在が生じる量で添加される。本明細書の文脈では、1単位の非マルトース生成エキソアミラーゼは、以下で記載するように調製した50mMのMES、2mMの塩化カルシウムpH6.0中の10mg/mlのろう様トウモロコシデンプン4mlとともに50°Cの試験管中でインキュベートした場合に1分あたり1μmolの還元糖と同等である加水分解産物を放出する酵素の量であると規定されている。本明細書に記載した生地は、一般に小麦ミールもしくは小麦粉および/またはコーンフラワー、コーンスターチ、メイズフラワー、米粉、ライミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、モロコシミール、モロコシフラワー、ポテトミール、ポテトフラワーもしくは馬鈴薯デンプンなどの他のタイプのミール、粉もしくはデンプンを含んでいる。生地は、生、冷凍、または部分ベーキングであってもよい。生地は、発酵済み生地または膨張工程を受けさせなければならない生地であってもよい。生地は、例えば重炭酸ナトリウムのような化学膨張剤を添加するか、または酵母を添加する生地を発酵させるような様々な方法で膨張させることができるが、生地はSaccharomycescerevisiaeパン酵母例えば購入できるS.cerevisiaeの菌株の培養物などの適切な酵母培養物を添加することによって膨張させるのが好ましい。生地は、顆粒状脂肪またはショートニングのような脂肪を含んでいてよい。生地は、モノもしくはジグリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはリゾレシチンなどの別の乳化剤をさらに含んでいてよい。本発明者らは、本明細書に記載した組み合わせと一緒に粉を含むプレミックスについてもさらに記載する。プレミックスは、他の生地改善用および/またはパン改善用添加物例えば上述した酵素を含む添加物のいずれかを含有することができる。また別の生地添加物または成分ベーキング製品の特性をさらに改善し、ベーキング製品に際立った品質を付与するために、さらなる生地成分および/または生地添加物を生地の中に組み込むことができる。典型的には、そのようなさらなる添加される成分は、塩、穀物、脂肪および油、糖もしくは甘味料、食物繊維などの生地成分、粉乳、グルテン大豆もしくは卵などのタンパク質源ならびに乳化剤、他の酵素、親水コロイド、フレーバー剤、酸化剤、ミネラルおよびビタミンなどの生地添加物を含むことができる。乳化剤は、生地強化剤およびクラム軟化剤として有用である。生地強化剤として、乳化剤は寝かせ時間に関する耐性およびホイロ中の耐衝撃性を提供できる。さらに、生地強化剤はまた、発酵時間の変動に対する所定の生地の耐性を向上させるであろう。大多数の生地強化剤は、ホイロ済み製品からベーキング製品への容積の増加を意味する釜のびもさらに改善する。最後に、生地強化剤は、レシピ混合物中に存在する任意の脂肪を乳化するであろう。適切な乳化剤には、レシチン、ステアリン酸ポリオキシエチレン、食用脂肪酸のモノおよびジグリセリド、食用脂肪酸のモノおよびジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノおよびジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノおよびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のスクロースエステル、ステアロイル-2-乳酸ナトリウム、およびステアロイル-2-乳酸カルシウムが含まれる。さらなる生地添加物もしくは生地成分を、粉、水、または任意の他の成分もしくは添加物を含む任意の生地成分、または生地改善剤組成物と一緒に添加することができる。さらなる生地添加物もしくは成分は、粉、水、または任意の他の成分および添加物または生地改善剤組成物の前に添加することができる。さらなる生地添加物もしくは成分は、粉、水、または任意の他の成分および添加物または生地改善剤組成物の後に添加することができる。さらなる生地添加物もしくは成分は、便利にも、液体調製物であってもよい。しかし、生地添加物もしくは成分は、便利にも、乾燥組成物の形態であってもよい。好ましくは、さらなる生地添加物もしくは成分は、生地の粉成分の重量の少なくとも1である。より好ましくは、または生地添加物もしくは成分は、少なくとも2、好ましくは少なくとも3、好ましくは少なくとも4、好ましくは少なくとも5、好ましくは少なくとも6である。添加物が脂肪の場合は、典型的には、脂肪は1~5、典型的には1~3、より典型的には約2の量で存在していてよい。さらなる酵素PS4改変体ポリペプチドに加えて、1つ以上の別の酵素を使用できる、例えば食品、生地調製物、食材またはデンプン組成物に添加することができる。生地に添加できるさらなる酵素には、オキシドレダクターゼ、例えばリパーゼおよびエステラーゼなどのヒドロラーゼならびにαアミラーゼ、プルラナーゼ、およびキシラナーゼなどのグリコシダーゼが含まれる。例えばグルコース酸化酵素およびヘキソース酸化酵素などのオキシドレダクターゼは、生地の強化およびベーキング製品の容積の調節に使用することができ、キシラナーゼおよび他のヘミセルラーゼは、生地取り扱い特性、クラムの柔らかさおよびパンの容積を改善するために添加できる。リパーゼは、生地強化剤およびクラム軟化剤として有用であり、αアミラーゼおよび他のデンプン分解酵素はパンの容積を調節し、さらにクラムの堅さを低下させるために生地の中に組み込むことができる。使用できるさらなる酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼからなる群から選択できる。有用なオキシドレダクターゼの例には、マルトース酸化酵素、グルコース酸化酵素EC1.1.3.4、炭水化物酸化酵素、グリセロール酸化酵素、ピラノース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素EC1.1.3.10およびヘキソース酸化酵素EC1.1.3.5が含まれる。デンプン分解酵素の中では、アミラーゼが生地改善剤添加物として特に有用である。αアミラーゼはデンプンをデキストリンに分解し、これはさらにβアミラーゼによってマルトースへ分解される。生地組成物に添加できる他の有用なデンプン分解酵素には、グルコアミラーゼおよびプルラナーゼが含まれる。好ましくは、さらなる酵素は少なくともキシラナーゼおよび/または少なくともアミラーゼである。本明細書で使用する用語キシラナーゼは、キシロシド結合を加水分解するキシラナーゼEC3.2.1.32を意味する。本明細書で使用する用語アミラーゼは、αアミラーゼEC3.2.1.1、βアミラーゼEC3.2.1.2およびγアミラーゼEC3.2.1.3などのアミラーゼを意味する。さらなる酵素は、粉、水、または任意の他の成分もしくは添加物を含む任意の生地成分、または生地改善剤組成物と一緒に添加することができる。さらなる酵素は、粉、水、および任意の他の成分および添加物または生地改善剤組成物の前に添加することができる。さらなる酵素は、粉、水、および任意の他の成分および添加物または生地改善剤組成物の後に添加することができる。さらなる酵素は、便利にも、液体調製物であってもよい。しかし、この組成物は、便利にも、乾燥組成物の形態であってもよい。生地改善剤組成物の一部の酵素は、粉生地の流動学的特性および/または機械加工特性および/または酵素による、生地から製造される製品の品質の改善に及ぼす作用が、相加的であるのみならず、相乗的である程度まで、生地条件下で相互に相互作用することができる。生地から製造された製品最終製品の改善に関連して、これらの組み合わせがクラム構造に関して実質的な相乗作用を生じさせることを見いだすことができる。さらに、ベーキング製品の特定の容積に関しても、相乗作用を見いだすことができる。さらなる酵素は、カルボン酸エステル結合を加水分解してカルボキシレートを遊離させることのできるリパーゼEC3.1.1であってもよい。リパーゼの例には、トリアシルグリセロールリパーゼEC3.1.1.3、ガラクトリパーゼEC3.1.1.26、ホスホリパーゼA1EC3.1.1.32、ホスホリパーゼA2EC3.1.1.4およびリポタンパク質リパーゼA2EC3.1.1.34が含まれるがそれらに限定されない。その他の使用PS4改変体は、マルトースおよび高マルトースシロップを製造するために適切である。そのような生成物は、マルトースの低吸湿性、低粘性、良好な熱安定性およびマイルドで甘すぎない味のために、所定の菓子類の製造においては相当に関心が高い。マルトースシロップを製造する工業プロセスは、デンプンを液化する工程、次にマルトース産生酵素および必要に応じてアミロペクチン内の1.6分岐点を開裂する酵素例えばα-1.6-アミログルコシダーゼを用いる糖化する工程を含んでいる。本明細書に記載したPS4改変体は、洗剤組成物に添加することができる、したがって洗剤組成物の構成成分にすることができる。洗剤組成物は、例えば、染みの付いた衣類の前処置に適切な洗濯用添加物組成物および織物柔軟仕上げ剤組成物を含む手洗い用もしくは洗濯機用洗剤組成物として調製できるか、または一般的な家事での塗装面を洗浄する作業に使う洗剤組成物として調製できるか、または食器洗い用もしくは食器洗浄機用洗剤として調製できる。特定の態様では、本発明者らは、PS4改変体を含む洗剤添加物について記載する。洗剤添加物ならびに洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルホヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、および/またはペルオキシダーゼなどの1つ以上の他の酵素を含んでいてよい。一般に、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合しなければならずすなわち、pH至適値、他の酵素成分および非酵素成分との適合性など、そして酵素は有効量で存在しなければならない。PS4改変体はまた、特に再パルプ化が7を超えるpHで発生し、そしてアミラーゼが強化デンプンの分解を通して古紙材料の崩壊を促進できる場合に、デンプン強化古紙およびボール紙からのパルプ、紙およびボール紙などのリグノセルロース材料の製造において使用することができる。PS4改変体は、デンプン被覆印刷紙から製紙用パルプを製造するためのプロセスにおいて特に有用である。このプロセスは、WO95/14807に記載されたように実施することができ、aパルプを製造するために紙を崩壊させる工程と、b工程aの前、中または後にデンプン分解酵素を用いて処理する工程と、c工程aおよびbの後にパルプからインク粒子を分離する工程と、を包含する。PS4改変体はさらに、製紙工程において酵素的に改変されたデンプンが炭酸カルシウム、陶土および粘土などのアルカリ性充填剤と一緒に使用される場合に、デンプンを改変する際に極めて有用である。本明細書に記載したPS4改変体を用いると、充填剤の存在下でデンプンを改変することが可能になるので、したがってより単純な統合プロセスが可能になる。PS4改変体はまた、織物の糊抜きにおいても極めて有用な場合がある。織物加工業では、アミラーゼは製織中に横糸への保護コーティング剤として機能していたデンプン含有糊の除去を容易にするための糊抜きプロセスにおける助剤として伝統的に使用されている。製織後の糊コーティング剤の完全な除去は、織物が洗い上げられ、漂白され、そして乾燥させられるその後のプロセスにおける最適な結果を保証するために重要である。酵素によるデンプン分解は、繊維材料に何の有害な作用も及ぼさないので、好ましい。PS4改変体は、単独で、またはセルロース含有織物もしくは布地を糊抜きする場合はセルラーゼと組み合わせて使用できる。PS4改変体はまた、デンプンから甘味料を製造するための精選アミラーゼであってもよい。デンプンからフルクトースシロップへ転換させるための伝統的プロセスは、通常は3つの連続する酵素プロセス、すなわち液化プロセス、次に糖化プロセスおよび異性化プロセスからなる。液化プロセス中、デンプンは5.5~6.2のpH値および95~160°Cの温度で、約2時間にわたってアミラーゼによってデキストリンへ分解される。これらの条件下で最適の酵素安定性を保証するために、1mMのカルシウム40ppmの遊離カルシウムイオンが添加される。液化プロセス後、デキストリンはグルコアミラーゼおよび脱分岐酵素例えばイソアミラーゼもしくはプルラナーゼの添加によってデキストロースへ転換させられる。この工程の前に高温95°Cより高いを維持しながらpHは4.5未満の数値に低下させられ、液化中のアミラーゼ活性は変性させられる。温度は60°Cへ低下させられ、グルコアミラーゼおよび脱分岐酵素が添加される。糖化プロセスは24~72時間にわたり進行する。飼料用途1つの実施形態では、PS4改変体ポリペプチドは、耐性デンプンを分解できる。本明細書で使用する用語分解する工程は、部分的もしくは完全な、加水分解または耐性デンプンからグルコースおよび/もしくはオリゴ糖例えばマルトースおよび/またはデキストリンへの分解に関する。PS4改変体ポリペプチドは、動物性アミラーゼによって完全には分解されていない残留耐性デンプンを分解することができる。例えば、PS4改変体ポリペプチドは、耐性デンプンの分解を改善する際に動物性アミラーゼ例、膵アミラーゼを補助するために使用できる。膵αアミラーゼは、動物によって消化器系に排出される。膵αアミラーゼは、飼料中のデンプンを分解する。しかし、デンプンの一部分である耐性デンプンは、膵αアミラーゼによって完全には分解されないため、小腸では吸収されない耐性デンプンの定義を参照。一部の実施形態におけるPS4改変体ポリペプチドは、消化器系においてデンプンを分解する際に膵αアミラーゼを支援し、それによって動物によるデンプンの利用を増加させることができる。酵素が耐性デンプンを分解する能力は、例えばサンプルの耐性デンプン含有量、可溶化デンプン含有量および全デンプン含有量を測定するためにMegazymeInternationalIreland社によって開発され、そして開示された方法ResistantStarchAssayProcedure,AOACMethod2002.02,AACCMethod32-40によって分析できる。したがって、PS4改変体ポリペプチドは、有益な目的で動物によって摂取されるので、従って、動物用飼料中に組み込むことができる。このため本発明者らは、デンプンを含有する飼料中に使用するための、または飼料改善剤組成物中に使用するための構成成分としてのPS4改変体ポリペプチドの使用を開示し、ここで、PS4改変体ポリペプチドは耐性デンプンを分解することができる。本発明者らは、デンプンおよびPS4改変体ポリペプチドを含む飼料をさらに開示する。本発明者らはまた、前記耐性デンプンをPS4改変体ポリペプチドと接触させる工程を包含する、飼料中の耐性デンプンを分解する方法をさらに開示する。本発明者らは、耐性デンプンを分解するために、デンプンを含む飼料の調製におけるPS4改変体ポリペプチドの使用についてさらに記載する。さらに、本発明者らは、前記飼料の発熱量を改善するための飼料の調製におけるPS4改変体ポリペプチドの使用を開示する。本発明者らは、動物の能力を改善するための飼料の調製における酵素の使用を開示する。さらなる実施形態では、本発明者らは、デンプンとPS4改変体ポリペプチド酵素とを混合する工程を包含する、飼料を調製するためのプロセスについて記載する。例えば、PS4改変体ポリペプチドを含み、耐性デンプンを分解することができる構成成分の使用は、動物におけるデンプンの分解および/またはデンプン分解産物の顕著な増加が生じるので、有益である。さらに、そのような使用は、動物によるデンプンの消化率および/またはデンプン分解産物の顕著な増加が生じるので、有益である。さらに、そのような使用は、動物による飼料からエネルギーを引き出す効率を強化する手段を提供するので、有益である。さらに、そのような使用は、耐性デンプンの生体内利用率を強化するための手段を提供するので、有益である。動物用飼料PS4改変体ポリペプチドを使用するために適切な動物用飼料は、特定の動物群の特異的な必要を満たすように、そして動物が代謝できる形態で必要な炭水化物、脂肪、タンパク質および他の栄養素を提供するように、調製することができる。好ましくは、動物用飼料はブタまたは家禽類用の飼料である。本明細書で使用する用語ブタは、ブタ、去勢した雄豚または去勢しない雄豚などの非反芻雑食動物に関する。典型的には、ブタ用飼料には、約50の炭水化物、約20のタンパク質および約5の脂肪が含まれる。高エネルギーのブタ用飼料の例は、コーンをベースとしており、例えばタンパク質、ミネラル、ビタミンならびにリジンおよびトリプトファンなどのアミノ酸のような飼料用栄養剤としばしば結合される。ブタ用飼料の例は、動物性タンパク質製品、海産物、乳製品、穀物製品、および植物性タンパク質製品を含んでいるが、これらは全部がさらに天然フレーバー剤、人工フレーバー剤、ミクロミネラルおよびマクロミネラル、動物性脂肪、植物性脂肪、ビタミン、保存料または医薬品例えば抗生物質を含んでいる。添付の特許請求の範囲を含めて本明細書においてブタ用飼料と言及する場合は、そのような言及は移行用もしくはスターター用飼料幼いブタを離乳させるために使用するおよび仕上げ用もしくは飼育用飼料移行期に続いてブタを市場に出すために適切な年齢および/またはサイズへ成長させるために使用するを含むことが意図されていると理解されたい。本明細書で使用する用語家禽類は、ニワトリ、ブロイラー、メンドリ、オンドリ、去勢ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、シャモ、若雌鳥もしくはヒヨコなどの鳥類に関する。家禽類用飼料は、タンパク質、エネルギー、ビタミン、ミネラル、ならびに鳥の適正な成長、産卵および健康に必要な他の栄養素をすべて含有しているので完全飼料と呼ぶことができる。しかし、家禽類用飼料は、ビタミン、ミネラルまたは例えば抗コクシジウム剤例えば、モネンシンナトリウム、ラサロシド、アンプロリウム、サリノマイシン、およびスルファキノキサリンおよび/または抗生物質例えば、ペニシリン、バシトラシン、クロルテトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリンなどの医薬品をさらに含んでいてよい。食肉製造のために飼育される若いニワトリもしくはブロイラー、シチメンチョウおよびアヒルには、産卵のために飼育される若雌鳥とは異なる飼料が与えられる。ブロイラー、アヒルおよびシチメンチョウはより大きな身体を有し、産卵型のニワトリより急速に体重を増加させる。このため、これらのトリ類にはより高いタンパク質およびエネルギーレベルを備える飼料が与えられる。添付の特許の範囲を含めて本明細書において家禽類用飼料と言及する場合は、そのような言及はスターター用飼料孵化後、仕上げ用、飼育用もしくは育成用飼料6~8週齢から畜殺サイズに達するまでおよび産卵ニワトリ用産卵中に与えられるを含むことが意図されていると理解されたい。動物用飼料は、例えば食肉製造、産乳、産卵、繁殖およびストレスへの応答に関して動物の栄養的な必要を満たすように調製することができる。さらに、動物用飼料は、肥料の品質を改善するために調製される。好ましい態様では、動物用飼料は、豆果、例えばエンドウマメもしくはダイズまたは穀物、例えば小麦、コーントウモロコシ、ライ麦もしくは大麦などの生材料を含有している。適切には、生材料はジャガイモであってもよい。飼料用材料PS4改変体ポリペプチドは、単独でまたは食品成分などの他の成分と組み合わせてのいずれかで、PS4改変体ポリペプチドの飼料への間接的もしくは直接的適用によって動物が消費するための飼料中に使用できる。典型的な食品成分は、動物性もしくは植物性脂肪、天然もしくは合成シーズニング、抗酸化物質、粘度改変剤、精油、および/またはフレーバー、色素および/または着色剤、ビタミン、ミネラル、天然アミノ酸および/または非天然アミノ酸、栄養素、さらなる酵素遺伝子組換え酵素を含む、グアーガムもしくはキサンタンガムなどの結合剤、緩衝剤、乳化剤、潤滑剤、アジュバント、懸濁化剤、保存料、コーティング剤または可溶化剤などの任意の1つ以上の添加物を含むことができる。適用方法の例には、PS4改変体ポリペプチドを含む材料中に飼料を被覆する工程、PS4改変体ポリペプチドを飼料と混合することによる直接的適用、PS4改変体ポリペプチドを食品表面にスプレーする工程、または飼料をPS4改変体ポリペプチドの調製物中に浸漬する工程が含まれるが、それらに限定されない。PS4改変体ポリペプチドは、好ましくはそれを飼料と混合する工程によって、または動物が消費するための飼料粒子にスプレーする工程によって適用される。または、PS4改変体ポリペプチドは、飼料のエマルジョン中に含まれてもよく、またはインジェクションもしくはタンブリングによって固形生成物の内側に含まれてもよい。PS4改変体ポリペプチドは、飼料を散在させるか、被覆するかそして/または染み込ませるために適用することもできる。他の成分との混合物もまた使用することができ、個別に、同時にまたは連続的に適用され得る。キレート剤、結合剤、乳化剤ならびにミクロミネラルおよびマクロミネラル、アミノ酸、ビタミン、動物性脂肪、植物性脂肪、保存料、フレーバー剤、着色剤などの他の添加物は、同様に、飼料へ同時に混合物中または個別のいずれかで適用されてもよく、または連続的に適用されてもよい。PS4改変体ポリペプチドの量使用されるPS4改変体ポリペプチドの最適な量は、処理される飼料および/または飼料とPS4改変体ポリペプチドとを接触させる方法および/または意図されるその使用に依存するであろう。PS4改変体ポリペプチドの量は、飼料の摂取後および摂取中に耐性デンプンを実質的に分解するために効果的である十分な量でなければならない。有益にも、PS4改変体ポリペプチドは動物が消費するための飼料の摂取後および飼料の摂取中に、飼料のより完全な摂取が得られるまで、すなわち飼料の増加した発熱量値が放出されるまで有効なままである。アミラーゼの組み合わせ本発明者らは、PS4改変体ポリペプチドとアミラーゼ特にマルトース生成アミラーゼとの組み合わせを特に開示する。マルトース生成αアミラーゼグルカン1,4-α-マルトヒドロラーゼ、E.C.3.2.1.133は、アミロースおよびアミロペクチンをα立体配置にあるマルトースへ加水分解することができる。バシラスBacillus属由来のマルトース生成αアミラーゼEP120693は、商標NovamylNovoNordiskA/S,Denmarkの下で市販されており、デンプンの老化を減少させる能力ゆえに硬化防止剤としてベーキング産業において広範囲で使用されている。Novamylは、国際特許公開第WO91/04669において詳細に記載されている。マルトース生成αアミラーゼであるNovamylは、配列相同性HenrissatB,BairochA;Biochem.J.,316,695-6961996およびトランスグリコシル化生成物の形成Christophersen,C,ら,1997,Starch,vol.50,No.1,39-45を含む数種の特性をシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼCGTasesと共有している。非常に好ましい実施形態では、本発明者らは、Novamylまたはその改変体のいずれかと一緒にPS4改変体ポリペプチドを含む組み合わせを開示する。そのような組み合わせは、ベーキングなどの食品製造のために有用である。Novamylは、特にNovamyl1500MGを含んでいてよい。Novamylおよびその使用について記載している他の文書には、Christophersen,C,Pedersen,S.,およびChristensen,T.,1993Methodforproductionofmaltoseanalimitdextrin,thelimitdextrin,anduseofthelimitdextrin.DenmarkおよびWO95/10627号が含まれる。これは、さらに米国特許第4,598,048号および第4,604,355号に記載されている。これらの文書は各々参考として本明細書に援用され、その中に記載された任意のNovamylポリペプチドは、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドのいずれかと組み合わせて使用できる。Novamylの改変体、ホモログ、および突然変異体は、それらがαアミラーゼ活性を維持していることを条件に、組み合わせのために使用できる。例えば、その全開示が参考として本明細書中に援用される米国特許第6,162,628号に開示された任意のNovamyl改変体は、本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドと組み合わせて使用できる。具体的には、米国特許第6,162,628号に記載された任意のポリペプチド、特に、米国特許第6,162,628号に記載の配列番号1の改変体であって、Q13、I16、D17、N26、N28、P29、A30、S32、Y33、G34、L35、K40、M45、P73、V74、D76、N77、D79、N86、R95、N99、I100、H103、Q119、N120、N131、S141、T142、A148、N152、A163、H169、N171、G172、I174、N176、N187、F188、A192、Q201、N203、H220、N234、G236、Q247、K249、D261、N266、L268、R272、N275、N276、V279、N280、V281、D285、N287、F297、Q299、N305、K316、N320、L321、N327、A341、N342、A348、Q365、N371、N375、M378、G397、A381、F389、N401、A403、K425、N436、S442、N454、N468、N474、S479、A483、A486、V487、S493、T494、S495、A496、S497、A498、Q500、N507、I510、N513、K520、Q526、A555、A564、S573、N575、Q581、S583、F586、K589、N595、G618、N621、Q624、A629、F636、K645、N664および/またはT681に対応する任意の1つ以上の位置における改変体を、使用できる。アミノ酸配列本発明は、PS4改変体核酸を利用するが、そのようなPS4改変体核酸のアミノ酸配列は本明細書に記載した方法および組成物に含まれる。本明細書で使用する用語アミノ酸配列は、用語ポリペプチドおよび/または用語タンパク質と同義語である。一部の場合には、用語アミノ酸配列は用語ペプチドと同義語である。一部の場合には、用語アミノ酸配列は用語酵素と同義語である。アミノ酸配列は適切な起源から調製/単離することができ、または合成により作製でき、または組換えDNA技術を使用して調製できる。本明細書に記載したPS4改変体酵素は、他の酵素と結び付けて使用できる。従って本発明者らは、酵素の組み合わせであって、ここで、この組み合わせは本明細書に記載したPS4改変体ポリペプチドおよび他の酵素それ自体が別のPS4改変体ポリペプチド酵素であってもよいを含んでいる組み合わせを、開示する。PS4改変体のヌクレオチド配列上述したように、本発明者らは、本明細書に記載した特異的な特性を有するPS4改変体酵素をコードするヌクレオチド配列を開示する。本明細書で使用する用語ヌクレオチド配列または核酸配列は、オリゴヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列、およびそれらの改変体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体それらの部分などを意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源もしくは合成起源または組換え起源であってもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれを表していようと、二本鎖であっても、もしくは一本鎖であってもよい。本明細書で使用する用語ヌクレオチド配列には、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、およびRNAが含まれる。好ましくは、これはPS4改変体ポリペプチドをコードするDNA、より好ましくはcDNA配列を意味する。典型的には、PS4改変体ヌクレオチド配列は、組換えDNA技術を用いて調製されるすなわち、組換えDNAである。しかし、さらなる実施形態では、ヌクレオチド配列は、全体としてもしくは部分的に、当技術分野において周知の化学方法を用いて合成することもできよう例えば、CaruthersMHら,1980NucAcidsResSympSer215-23andHornTら,1980NucAcidsResSympSer225-232を参照。核酸配列の調製本明細書に記載した特定の特性を有する酵素例、PS4改変体ポリペプチドまたは親酵素などの改変のために適切な酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記酵素を産生する任意の細胞もしくは生物から同定および/または単離および/または精製することができる。ヌクレオチド配列を同定および/または単離および/または精製するための様々な方法は、当技術分野において周知である。例えば、適切な配列が同定および/または単離および/または精製されると、PCR増幅技術を使用して、より多くの配列を調製することができる。さらなる例として、該酵素を産生する生物由来の染色体DNA、またはメッセンジャーRNAを用いるとゲノムDNAおよび/またはcDNAライブラリーを構築できる。該酵素のアミノ酸配列もしくは該酵素のアミノ酸配列の一部が既知である場合、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを使用して、該生物から調製したゲノムライブラリーから酵素をコードするクローンを同定することができる。または、他の既知の酵素遺伝子に相同である配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、酵素をコードするクローンを同定できる。後者の場合は、ハイブリダイゼーションおよび低ストリンジェントな洗浄条件が使用される。または、酵素をコードするクローンは、酵素陰性細菌を形質転換させるプラスミドなどの発現ベクター内へゲノムDNAのフラグメントを挿入してゲノムDNAライブラリーを得、そして次に形質転換させた細菌を、酵素に対する基質すなわち、マルトースを含有する寒天プレート上に平板培養し、それによってクローンに同定すべき酵素を発現させることによって同定できる。なおさらなる代替において、該酵素をコードするヌクレオチド配列は、例えばBeucageSX.ら,1981TetrahedronLetters22,p1859-1869によって記載されたホスホロアミダイト法、またはMatthesら,1984EMBOJ.3,p.801-805によって記載された方法のような確立された標準方法によって合成的に調製できる。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドが例えば自動DNA合成装置内で合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、そして適切なベクター内にクローン化される。ヌクレオチド配列は、標準技術にしたがい、適切な場合ゲノム起源もしくはcDNA起源のフラグメントをライゲーションすることによって調製された、ゲノム起源および合成起源の混合物、合成起源およびcDNA起源の混合物、またはゲノム起源およびcDNA起源の混合物であり得る。ライゲーションされたフラグメントは各々、全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。DNA配列は、例えば米国特許第4,683,202号またはSaikiRKら,Science1988239,pp487-491に記載されたように、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRによって調製することもできる。改変体/ホモログ/誘導体本発明者らは、酵素の任意のアミノ酸配列の改変体、ホモログおよび誘導体または例えばPS4改変体ポリペプチドもしくはPS4改変体核酸などの酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の使用についてさらに記載する。文脈が他のことを指示しない限り、用語PS4改変体核酸は、以下に記載する核酸実体の各々を含むと見なさなければならず、そして用語PS4改変体ポリペプチドは、同様に以下に記載するポリペプチドもしくはアミノ酸実体の各々を含むと見なさなければならない。ここで、用語ホモログは、本発明のアミノ酸配列および本発明のヌクレオチド配列と所定の相同性を有する実体を意味する。ここで用語相同性は、同一性と同等と考えることができる。本明細書の文脈では、相同配列は、本発明の配列と少なくとも75、80、85または90同一、好ましくは少なくとも95、96、97、98または99同一であり得るアミノ酸配列を含むと見なされる。典型的には、ホモログは本発明のアミノ酸配列と同一活性部位などを含む。相同性は類似性すなわち、類似の化学的特性/機能を有するアミノ酸残基によって考察することもできるが、本明細書の文脈においては相同性は配列同一性によって明示するのが好ましい。本明細書の文脈では、相同配列は、PS4改変体ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列PS4改変体核酸などと少なくとも75、80、85または90同一、好ましくは少なくとも95、96、97、98または99同一である可能性のあるヌクレオチド配列を含むと見なされる。典型的には、ホモログは本発明の配列と同一活性部位などをコードする配列を含む。相同性は類似性すなわち、類似の化学的特性/機能を有するアミノ酸残基によって考察することもできるが、本明細書の文脈においては相同性は配列同一性によって明示するのが好ましい。相同性の比較は、目で見て実施可能であり、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムを用いて実施できる。これらの市販で入手できるコンピュータープログラムは、2つ以上の配列間の相同性を計算できる。相同性は、連続する配列にわたって計算できる。すなわち1つの配列が他の配列と並列させられ、1つの配列内の各アミノ酸は他の配列内の対応するアミノ酸と直接的に、1度に1残基ずつ比較される。これはギャップを入れないungappedアラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップを入れないアラインメントは、比較的少数の残基についてのみ実施される。これは極めて単純かつ一貫性のある方法ではあるが、例えば他の点では同一である一対の配列において、1つの挿入もしくは欠失によりその後のアミノ酸残基がアラインメントから追い出されることを考慮に入れることができないので、したがって全体的アラインメントが実施される場合は相同性の大きな低下が生じる可能性がある。結果として、大多数の配列比較方法は、過度に全相同性スコアにペナルティを課すことなく可能性のある挿入および欠失を考慮に入れた最適のアラインメントを生じさせるように設計されている。これは、ローカル相同性を最大化することを試みるために配列アラインメントにおいてギャップを挿入することによって達成される。しかし、これらのより複雑な方法はギャップペナルティをアラインメントにおいて生じる各ギャップに指定するので、その結果同一数の同一アミノ酸について、最小限のギャップを備える配列アラインメントは、多くのギャップを備える配列アラインメントより2つの比較対象の配列間でのより高度の関連性を反映して高いスコアを達成するであろう。典型的にはギャップの存在について比較的高いコストを課し、ギャップ内のその後の各残基に対しては小さなペナルティを課すアフィンギャップコストが使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながらより少数のギャップを備える最適化されたアラインメントを生じさせるであろう。大多数のアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を許容する。しかし、配列比較のためにそのようなソフトウエアを使用する場合は、デフォルト値を使用するのが好ましい。例えば、GCGWisconsinBestfitパッケージを使用する場合は、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、1つのギャップに対しては-12、各伸長に対しては-4である。このため最大相同性の計算には、最初に、ギャップペナルティを考慮に入れた、最適なアラインメントを必要とする。そのようなアラインメントを実行するために適切なコンピュータープログラムは、GCGWisconsinBestfitパッケージDevereuxetal,1984,Nuc.AcidsResearch12p.387である。配列比較を実行できる他のソフトウエアの例には、BLASTパッケージAusubelら,1999ShortProtocolsinMolecularBiology,4thEd-Chapter18を参照、FASTAAltschulら,1990,J.MoI.Biol.,403-410および比較ツールのGENEWORKSパッケージソフトが含まれるが、それらに限定されない。BLASTおよびFASTAはどちらもオフラインおよびオンライン検索のために利用できるAusubelら,1999,ShortProtocolsinMolecularBiology,pages.7-58to7-60を参照。しかし、一部の用途には、GCGBestfitプログラムを使用するのが好ましい。BLAST2配列と呼ばれる新規のツールもまたタンパク質とヌクレオチド配列を比較するために利用できるFEMSMicrobiolLett19991742:247-50;FEMSMicrobiolLett19991771:187-8およびtatianancbi.nlm.nih.govを参照。最終的な相同性は同一性によって測定できるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には全か無かのペア比較に基づいてはいない。その代わりに、化学的類似性または進化的な距離に基づいて各一対の比較に対してスコアを指定する縮尺類似性スコアマトリックスscaledsimilarityscorematrixが一般に使用されている。そのような一般に使用されるマトリックスの例は、プログラムのBLASTパッケージソフトのためのデフォルトマトリックスであるBLOSUM62マトリックスである。GCGWisconsinプログラムは、一般に公衆デフォルト値または供給される場合カスタム記号比較表詳細についてはユーザーマニュアルを参照のどちらかを使用する。一部の用途のためには、GCGパッケージ用の公衆デフォルト値、または他のソフトウエアの場合は、BLOSUM62などのデフォルトマトリックスを使用するのが好ましい。または、相同性は、CLUSTALHigginsDGSharpPM1988,Gene731,237-244に類似するアルゴリズムに基づいてDNASIS商標HitachiSoftwareにおける多重アラインメント機能を使用して計算できる。ソフトウエアが最適アラインメントを生成すると、相同性、好ましくは配列同一性を計算することができる。このソフトウエアは、典型的にはこれを配列比較の一部として行ない、数値結果を生成する。配列は、サイレント変化を生じ、結果として機能的に同等の配列を生じさせるアミノ酸の欠失、挿入または置換を有することもある。意図的アミノ酸置換は、アミノ酸特性残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の性質などにおける類似性に基づいて作製することができるので、このため官能基内においてアミノ酸をまとめて分類することが有用である。アミノ酸は、それらの側鎖特性にのみ基づいてまとめて分類することができる。しかし、突然変異データをもまた含めることがより有用である。このように誘導されたアミノ酸のセットは、おそらく構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形で記載することができるLivingstoneCD.andBartonGJ.1993Proteinsequencealignments:astrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservationComput.ApplBiosci.9:745-756TaylorW.R.1986TheclassificationofaminoacidconservationJ.Theor.Biol.119;205-218。保存的置換は、例えば、一般に容認されたアミノ酸のベン図分類について記載している以下の表にしたがって作製できる。本発明者らは、塩基性対塩基性、酸性対酸性、極性対極性などの同類置換を生じ得る相同置換置換および交換はどちらも本明細書では先在アミノ酸残基と代替残基との交換を意味するために使用されるを含む配列をさらに開示する。非相同置換は、1クラスの残基から別のクラスの残基へ生じ得るか、または代わりにオルニチン本明細書中以下ではZと呼ぶ、ジアミノ酪酸オルニチン本明細書中以下以下ではBと呼ぶ、ノルロイシンオルニチン本明細書中以下以下ではOと呼ぶ、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸を含むことによって生じ得る。改変体アミノ酸配列は、配列の任意の2つのアミノ酸残基間に挿入できる、グリシンもしくはβアラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えてメチル基、エチル基もしくはプロピル基などのアルキル基を含む適切なスペーサー基を含むことができる。さらなるバリエーションの形態は、ペプトイド形態中に1つ以上のアミノ酸残基の存在を含むことが、当業者には明確に理解されるであろう。疑念を回避するために、ペプトイド形態は、改変体アミノ酸残基を呼ぶために使用されるが、ここで、α炭素置換基は残基のα炭素ではなく窒素原子上に存在する。ペプトイド形態にあるペプチドを調製するためのプロセスは、例えばSimonRJら,PNAS19928920,9367-9371およびHorwellDC,TrendsBiotechnol1995134,132-134のように、当技術分野において公知である。本明細書に記載したヌクレオチド配列、および本明細書に記載した方法および組成物PS4改変体核酸などにおいて使用するために適切なヌクレオチド配列は、それらの中に合成ヌクレオチドもしくは改変ヌクレオチドを含んでいてよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の様々な型の改変は、当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホネート主鎖およびホスホロチオエート主鎖、ならびに/もしくは分子の3’末端および/または5’末端でのアクリジンもしくはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書のために、本明細書に記載したヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。そのような改変は、ヌクレオチド配列のインビボ活性を増強するかまたは寿命を延長させるために実行することができる。本発明者らは、本明細書に提示した配列に相補的であるヌクレオチド配列、もしくは任意の誘導体、フラグメントまたはそれらの誘導体の使用についてさらに記載する。配列がそのフラグメントに相補的である場合は、その配列は他の生物における類似のコード配列を同定するなどのためにプローブとして使用できる。PS4改変体配列に100相同ではないポリヌクレオチドは、多数の方法で得られ得る。本明細書に記載した配列の他の改変体は、例えば広範囲の個体例えば様々な集団由来の個体から作製されたDNAライブラリーをプローブ検査probingすることによって得られ得る。さらに、他のホモログが得られ得、そのようなホモログおよびそのフラグメントは一般に本明細書の配列表に示した配列へ選択的にハイブリダイズすることができるであろう。そのような配列は、中ストリンジェントから高ストリンジェントな条件下で添付の配列表に記載の任意の1つの配列の全部または一部を含むプローブを用いて、他の種から作製されたcDNAライブラリー、または他の種由来のゲノムDNAライブラリーをプローブ検査するか、そのようなライブラリーを精査することによって得られ得る。本明細書に記載したポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の種のホモログおよび対立遺伝子改変体を得るためにも、類似の考察が当てはまる。改変体および菌株/種のホモログは、また、保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重PCRを用いて得ることもできる。保存配列は、例えば数種の改変体/ホモログ由来のアミノ酸配列を並列することによって予測できる。配列アラインメントは、当技術分野において公知であるコンピューターソフトウエアを用いて実施できる。例えば、GCGWisconsinPileUpプログラムが広汎に使用されている。縮重PCRに使用されるプライマーは1つ以上の縮重位置を含有しており、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件よりも低いストリンジェントの条件で使用されるであろう。または、そのようなポリヌクレオチドは、性質決定された配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えばポリヌクレオチド配列が発現させられる特定の宿主細胞に対するコドン選択性を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要とされる場合に有用なことがある。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの特性もしくは機能を変化させるために、他の配列変化が望ましいことがある。本明細書に記載したPS4改変体核酸などのポリヌクレオチドヌクレオチド配列は、プライマー例えばPCRプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ例えば放射性標識もしくは非放射性標識を用いる従来型手段によって解明できる標識で標識したプローブ、またはベクター内へクローン化することができるポリヌクレオチドを生成するために使用できる。そのようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、30もしくは40のヌクレオチド長であり、やはり用語ポリヌクレオチドに含まれる。DNAポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換えによって、合成によって、または当業者が利用できる任意の手段によって生成できる。それらは、標準技術によってクローン化することもできる。一般に、プライマーは、1度に1ヌクレオチドという所望の核酸配列の段階的製造を包含する合成手段によって生成される。自動技術を用いてこれを遂行する技術は、当技術分野において容易に利用できる。長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段例えばPCRポリメラーゼ連鎖反応クローニング技術を用いるを用いて生成される。プライマーは、増幅したDNAを適切なクローニングベクター内へクローン化できるように適切な制限酵素認識部位を含有するように設計できる。好ましくは、改変体配列などは、少なくとも本明細書に提示した配列と同等に、生物学的に活性である。本明細書で使用する生物学的に活性は、天然に存在する配列の類似の構造機能必ずしも同程度ではない、および/または類似の調節機能必ずしも同程度ではない、および/または類似の生化学的機能必ずしも同程度ではないを有する配列をいう。ハイブリダイゼーション本発明者らは、PS4改変体の核酸配列に相補的である配列またはPS4改変体配列もしくはそれに相補的である配列のいずれかへハイブリダイズすることができる配列についてさらに記載する。本明細書で使用する用語ハイブリダイゼーションは、核酸の鎖が塩基対合を通して相補的鎖と結合するプロセスならびにポリメラーゼ連鎖反応PCRテクノロジーにおいて実施されるような増幅プロセスを含むものとする。このため本発明者らは、本明細書に提示した配列に相補的である配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、または任意の誘導体、フラグメントもしくはそれらの誘導体の使用について開示する。用語改変体は、本明細書に明示したヌクレオチド配列へハイブリダイズすることができる配列に相補的である配列をさらに含んでいる。好ましくは用語改変体は、ストリンジェントな条件例えば、50°Cおよび0.2×SSC{1×SSC=0.15MNaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムpH7.0}下で本明細書に提示したヌクレオチド配列へハイブリダイズすることができる配列に相補的である配列を含んでいる。より好ましくは、用語改変体は、高ストリンジェント条件例えば、65°Cおよび0.1×SSC{1×SSC=0.15MNaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウムpH7.0}下で本明細書に提示したヌクレオチド配列へハイブリダイズすることができる配列に相補的である配列を含んでいる。本発明者らは、PS4改変体のヌクレオチド配列本明細書に提示した配列に相補的な配列を含むにハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、ならびにPS4改変体のヌクレオチド配列本明細書に提示した配列に相補的な配列を含むにハイブリダイズすることができる配列に相補的であるヌクレオチド配列をさらに開示する。本発明者らは、中間から最高までのストリンジェントの条件下で本明細書に提示したヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列についてさらに記載する。好ましい態様では、本発明者らは、ストリンジェントな条件例えば、50°Cおよび0.2×SSC下でPS4改変体核酸のヌクレオチド配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を開示する。より好ましくは、このヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件例えば、65°Cおよび0.1×SSC下でPS4改変体のヌクレオチド配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることができる。部位特異的突然変異誘発酵素をコードするヌクレオチド配列か、または酵素をコードすると推定されるヌクレオチド配列が単離されると、酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが所望され得る。したがって、PS4改変体配列は、親配列から調製できる。突然変異は合成オリゴヌクレオチドを用いて導入できる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有している。適切な方法は、Morinagaら,Biotechnology19842,p646-649の中で開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列内へ突然変異を導入するさらなる方法は、NelsonandLongAnalyticalBiochemistry1989,180,p147-151に記載されている。さらなる方法は、SarkarandSommerBiotechniques1990,8,p404-407-Themegaprimermethodofsitedirectedmutagenesisの中に記載されている。1つの態様では、本明細書に記載した方法および組成物において使用するための配列は、組換え配列すなわち、組換えDNA技術を用いて調製されている配列である。これらの組換えDNA技術は、当業者の能力の範囲内に含まれる。そのような技術は、例えばJ.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPressのような文献において説明されている。1つの態様では、本明細書に記載した方法および組成物において使用するための配列は、合成配列すなわち、インビトロ化学合成または酵素合成によって調製されている配列である。これは、メチロトローフ酵母であるピチアPichia属およびハンセヌラHansenula属などの宿主生物のために最適なコドン使用codonusageにより作製された配列を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載した方法および組成物において使用するためのヌクレオチド配列は、組換え複製可能なベクター内に組み込むことができる。ベクターは、適切な宿主細胞中で、および/または宿主細胞から、酵素の形態でヌクレオチド配列を複製して発現させるために使用できる。発現は、制御配列例えば調節配列を用いて制御することができる。ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞から生成された酵素は、使用された配列および/またはベクターに依存して分泌されてもよく、または細胞内に含有されていてもよい。特定の原核生物細胞膜もしくは真核生物細胞膜を通してコード配列に物質の分泌を指示するシグナル配列を備えるコード配列を、設計できる。PS4核酸およびポリペプチドの発現PS4ポリヌクレオチドおよびPS4核酸は、合成および天然両方の起源のDNAおよびRNAを含んでいてよい。そのDNAもしくはRNAは、改変もしくは未改変のデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドあるいはそれらのアナログを含有し得る。PS4核酸は一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNA、RNA/DNAヘテロ二本鎖またはRNA/DNAコポリマーとして存在することができ、ここで、用語コポリマーは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む単一核酸鎖を意味する。PS4核酸は、いっそう発現を増加させるように最適化されたコドンでさえあってもよい。本明細書で使用する用語合成は、インビトロ化学合成または酵素合成によって生成することであると定義されている。これは、メチロトローフ酵母であるピチア属およびハンセヌラ属などの宿主生物のために最適なコドン使用により作製されたPS4核酸を含むが、それらに限定されない。ポリヌクレオチド例えば本明細書に記載したPS4改変体ポリヌクレオチドは、組換え複製可能なベクター内に組み込むことができる。ベクターを使用して、適合する宿主細胞内でこの核酸を複製することができる。このポリヌクレオチド配列を含むベクターは、適切な宿主細胞、形質転換させることができる。適切な宿主は、細菌、酵母、昆虫および真菌細胞を含むことができる。用語形質転換細胞は、組換えDNA技術を使用して形質転換させられている細胞を含んでいる。形質転換は、典型的には1つ以上のヌクレオチド配列を形質転換させるべき細胞内へ挿入することによって起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列すなわち形質転換させるべき細胞にとって自然ではない配列であってもよい。さらに、あるいはその代わりに、挿入されたヌクレオチド配列は、相同ヌクレオチド配列すなわち、形質転換させるべき細胞にとって自然である配列であってもよく、それにより、その細胞は既にその中に存在するヌクレオチド配列の1つ以上の余分なコピーを受け入れる。従ってさらなる実施形態では、本発明者らは、ポリヌクレオチドを複製可能なベクター内へ導入する工程と、そのベクターを適切な宿主細胞内へ導入する工程と、およびベクターの複製が起こる条件下で宿主細胞を増殖させる工程とによってPS4改変体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収できる。発現構築物PS4核酸は、当該宿主細胞内で活性な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントへ作動可能に連結させることができる。PS4核酸は、さらに例えばSchwanniomycesoccidentalis由来のグルコアミラーゼ遺伝子、Saccharomycescerevisiae由来のα因子接合型遺伝子およびAspergillusoryzae由来のTAKA-アミラーゼに由来するシグナル配列などのシグナル配列を含む融合タンパク質をさらにコードできる。または、PS4核酸は、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコードすることができる。発現ベクターPS4核酸は、発現ベクターを用いて宿主生物において所望のレベルで発現させることができる。PS4核酸を含む発現ベクターは、選択された宿主細胞内でPS4核酸をコードする遺伝子を発現できる任意のベクターであってよく、ベクターの選択は、それを導入すべき宿主細胞に依存する。従って、ベクターは自律複製ベクターすなわちエピソーム実体として存在するベクターであってよく、その複製は、例えばプラスミド、バクテリオファージもしくはエピソームエレメント、ミニ染色体もしくは人工染色体などの染色体複製とは無関係である。または、ベクターは、宿主細胞内へ導入されると宿主細胞ゲノム内に統合され、染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。発現ベクターの構成成分発現ベクターは、典型的には、例えば選択された宿主生物内でのベクターの自律複製を許容するエレメント、および選択目的のための1つ以上の表現型によって検出可能なマーカーなどのクローニングベクターの構成成分を含んでいる。発現ベクターは、通常はプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、ならびに必要に応じて、リプレッサー遺伝子または1つ以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含んでいる。さらに、発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラまたは特定宿主細胞区画へPS4改変体ポリペプチドを標的化できるアミノ酸配列をコードする配列を含んでいてよい。そのような標的化配列としては、配列SKLが挙げられるが、それに限定されない。本明細書の文脈では、用語発現シグナルは、上記の制御配列、リプレッサー配列もしくはアクチベーター配列のいずれかを含んでいる。制御配列の指示下で発現させるために、PS4改変体ポリペプチドの核酸配列は発現に関して適正な方法で制御配列と作動可能に連結している。好ましくは、ベクター内のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供できる制御配列に作動可能に連結している。すなわちベクターは発現ベクターである。用語作動可能に連結したは、記載の構成成分が意図された様式で機能することを許容する関係にあることを意味している。コード配列に作動可能に連結した調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合した条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。制御配列は、例えば転写調節因子により反応性である制御配列によって指示された転写レベルを作り出すためにさらなる転写調節エレメントの付加によって改変することができる。制御配列は、特に、プロモーターを含んでいてよい。プロモーターベクター内では、PS4改変体ポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモーター配列と作動可能に結合している。プロモーターは、選択された宿主生物内で転写活性を有する任意のDNA配列であってよく、そして宿主生物に同種または異種である遺伝子から誘導することができる。細菌プロモーター細菌宿主内でPS4核酸などの改変ヌクレオチド配列の転写を指示するために適切なプロモーターの例としては、E.coliのlacオペロンのプロモーター、Streptomycescoelicolorアガラーゼagarase遺伝子dagAプロモーター、Bacilluslicheniformisαアミラーゼ遺伝子amyLのプロモーター、Bacillusstearothermophilusマルトース生成アミラーゼ遺伝子amyMのプロモーター、Bacillusamyloliquefaciensαアミラーゼ遺伝子amyQのプロモーター、BacillussubtilisのxylAおよびxylB遺伝子のプロモーターならびにP170プロモーターを含むラクトコッカス種Lactococcussp.由来のプロモーターが挙げられる。PS4改変体ポリペプチドをコードする遺伝子がE.coliなどの細菌種中で発現させられる場合は、適切なプロモーターは、例えばT7プロモーターおよびファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択できる。真菌プロモーター真菌種中で転写させるために有用なプロモーターの例は、AspergillusoryzaeのTAKAアミラーゼ、Rhizomucormieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillusniger中性αアミラーゼ、Aspergillusniger酸安定性αアミラーゼ、Aspergillusnigerグルコアミラーゼ、Rhizomucormieheiリパーゼ、Aspergillusoryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillusoryzaeトリオースリン酸イソメラーゼまたはAspergillusnidulansアセトアミダーゼをコードする遺伝子から誘導されるプロモーターである。酵母プロモーター酵母種において発現させるために適切なプロモーターの例としては、SaccharomycescerevisiaeのGal1およびGal10プロモーターならびにPichiapastorisのAOX1もしくはAOX2プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。宿主生物I細菌宿主生物適切な細菌宿主生物の例は、Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacilluslentus、Bacillusbrevis、Bacillusstearothermophilus、Bacillusalkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluscoagulans、Bacilluslautus、BacillusmegateriumおよびBacillusthuringiensisを含むバシラス種、Streptomycesmurinusなどのストレプトミセス種、Lactococcuslactisなどのラクトコッカス種を含む乳酸菌種、Lactobacillusreuteriを含むラクトバシラス種、リューコノストックLeuconostoc種、ペジオコッカスPediococcus種および連鎖球菌種などのグラム陽性細菌種である。または、E.coliを含む腸内細菌属またはシュードモナス属に属するグラム陰性細菌種の菌株もまた宿主生物として選択できる。II酵母宿主生物適切な酵母宿主生物は、ピチア種、ハンセヌラ種もしくはクリュイベロミセスKluyveromyces種、Yarrowinia種またはSaccharomycescerevisiaeを含むサッカロミセス種もしくは例えばS.Pombe種などのシゾサッカロミセス種Schizosaccharomycesに属する種などのバイオ技術的に重要な酵母種から選択できる。好ましくは、メチロトローフ酵母種であるPichiapastorisの菌株が宿主生物として使用される。好ましくは、宿主生物はハンセヌラ種である。III真菌宿主生物糸状菌の中で特に適切な宿主生物としては、アスペルギルス種、例えばAspergillusniger、Aspergillusoryzae、Aspergillustubigensis、AspergillusawamoriまたはAspergillusnidulansが含まれる。または、フザリウムFusarium種、例えばFusariumoxysporumまたはRhizomucormieheiなどのリゾムコール種の菌株を宿主生物として使用できる。その他の適切な菌株には、サーモミセスThermomyces種およびムコールMucor種が含まれる。タンパク質の発現および精製ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、PS4改変体ポリペプチド、フラグメント、ホモログ、改変体もしくはそれらの誘導体などのポリペプチドを発現するために使用できる。宿主細胞は、タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養できる。ポリペプチドの発現は、それらが継続的に産生されるように構成的であってもよく、または発現を開始するための刺激を必要とするように誘導性であってもよい。誘導性発現の場合には、タンパク質産生は、必要なときに、例えばデキサメタゾンもしくはIPTGのような培養培地へのインデューサー物質の添加によって開始できる。ポリペプチドは、酵素的、化学的および/または浸透圧性の溶解および物理的破壊を含む当技術分野において公知である様々な技術によって宿主細胞から抽出できる。ポリペプチドは、TnT商標Promegaウサギ網赤血球系などのインビトロ無細胞系において組換え的に生成することもできる。実施例1.PS4のクローニングPseudomonassaccharophiliaをLB培地上で一晩増殖させ、標準方法によって染色体DNAを単離したSambrookJ,1989。プライマーP1およびP2表3参照を用いるPCRによって、PS4オープンリーディングフレームZhouら,1989を含有する2190bpフラグメントをP.saccharophilia染色体DNAから増幅させた。生じたフラグメントはプライマーP3およびP4を用いるネステッドPCRにおけるテンプレートとして使用し、そのシグナル配列を使用せずにPS4のオープンリーディングフレームを増幅させ、遺伝子の5’末端にNcoI部位を、そして3’末端にBamHI部位を導入した。PS4を細胞内発現させるために、NcoI部位と一緒に、N末端メチオニンについてのコドンを導入した。1605bpフラグメントをpCRBLUNTTOPOInvitrogen内にクローン化し、構築物の完全性を配列決定によって分析した。P32プロモーターおよびctgaseシグナル配列の制御下でPS4を発現させるために、E.coliバシラスシャトルベクターpDP66KPenningaら,1996を改変した。生じたプラスミドのpCSmtaをBacillussubtilis内へ形質転換させた。PS4のデンプン結合ドメインを取り除いた第2発現構築物を作製した。pCSmta上でプライマーP3およびP6表3を用いたPCRにおいて、mta遺伝子の短縮バージョンを生成した。pCSmta内の全長mta遺伝子を短縮バージョンと交換し、プラスミドpCSmta-SBDを得た。実施例2.PS4の部位特異的突然変異誘発2つの方法によって2段階PCRに基づく方法、またはQuickExchangeQE法のいずれかによってmta遺伝子内に突然変異を導入した。便宜性のために、mta遺伝子を3つの部分に分割した;PvuI-FspIフラグメント、FspI-PstIフラグメントおよびPstI-AspIフラグメント、以下ではさらに各々フラグメント1、2および3と呼ぶ。2段階PCRに基づく方法では、PfuDNAポリメラーゼStratageneを用いて突然変異を導入した。初回PCRは、コーディング鎖について突然変異誘発プライマー表4に加えて下方鎖の下流にあるプライマー2Rまたは3Rのいずれか、表3を用いて実施した。この反応生成物をコーディング鎖の上流にあるプライマーと一緒に第2回PCRにおいて使用した。最終反応の生成物をpCRBLUNTtopoInvitrogen内へクローニングし、配列決定した後に、このフラグメントをpCSmta内の対応するフラグメントと交換した。QuickExchange法Stratageneを用いて、mta遺伝子、またはmta遺伝子の一部を含有するプラスミド上のPCRにおいて2つの相補的プライマーを使用して突然変異を導入した。このために、3SDMプラスミドおよび3pCSΔプラスミドを含む便利な一組のプラスミドを構築した。SDMプラスミド各々は、その中に所望の突然変異がQEによって導入される上述したmta遺伝子のフラグメントのうちの1つを有していた。配列決定によって検証した後、フラグメントを対応するレシピエントpCSΔプラスミド内へクローニングした。pCSΔプラスミドはpCSmta由来の不活性の誘導体である。活性は、容易なスクリーニングを可能にしたSDMプラスミドから、対応するフラグメントをクローニングすることによって回復した。表3.mta遺伝子をクローニングする際に使用されるプライマー、および2段階PCRを用いて部位特異的突然変異体を構築する際に使用される標準プライマー表4.mtaに部位特異的突然変異を導入するために使用したプライマー表5.SDMおよびpCSΔプラスミドの特徴実施例3.マルチSDMPS4改変体を、QuickChange登録商標多重部位特異的突然変異誘発キットStratageneを下記のように一部の変更を加えて製造業者のプロトコールにしたがって使用して生成した。工程1:突然変異体鎖合成反応PCR3mlのLB22g/lのLennoxLBrothBase、Sigma抗生物質0.05μg/mlのカナマイシン、Sigmaを10mlのFalcon試験管中で接種する。37°C、約200rpmでインキュベートする。遠心分離分離によって細胞を遠心沈殿させる5,000rpm/5分。培地を廃棄する。QIAGENPlasmidMini精製プロトコールを用いてds-DNAテンプレートを調製する。1.サーマルサイクリングのための突然変異体鎖合成反応液は以下のとおりに調製した:PCRミックス:2.5μlの10×QuickChange登録商標Multi反応バッファー0.75μlのQuickSolutionXμlのプライマープライマー長28~35bp→10pmolプライマー長24~27bp→7pmolプライマー長20~23bp→5pmol1μlのdNTPミックスXμlのds-DNAテンプレート200ng1μlのQuickChange登録商標Multi酵素混合物2.5単位/μlPfuTurbo登録商標DNAポリメラーゼXμlのdH2O25μlの最終容量まで全構成成分をピペッティングによって混合し、反応混合物を短時間で遠心沈殿する。2.以下のパラメーターを用いて反応を反復実施する:35サイクルの変性96°C/1分間プライマーのアニーリング62.8°C/1分間伸長65°C/15分間その後4°Cで保持する。PCR装置の蓋を105°Cに、プレートを95°Cに予備加熱し、その後にPCR管を装置内エッペンドルフ型サーマルサイクラーへ置く。工程2:DpnIの消化1.2μlのDpnI制限酵素10単位/μlを各増幅反応液に加え、ピペッティングによって混合し、混合物液を遠心沈殿させる。2.37°Cで約3時間インキュベートする。工程3:XL10-Gold登録商標Ultracompetent細胞の形質転換1.氷上でXL10-Goldを解凍する。事前に冷却したFalcon試験管へ1回の突然変異誘発反応につき45μlの細胞を分取する。2.水浴42°Cのスイッチを入れ、予備加熱するために水浴中へNZYブロスを含む試験管を配置する。3.2μlのβ-メルカプトエタノールミックスを各試験管に加える。試験管を回転させて軽くたたき、2分毎に回転させながら氷上で10分間インキュベートする。4.細胞の各アリコートに1.5μlのDpnI処理DNAを加え、混合するために回転させ、氷上で30分間インキュベートする。5.30秒間にわたり42°Cの水浴中で試験管をヒートパルスし、氷上に2分間置く。6.各試験管に事前に加熱した0.5mlのNZYブロスを加え、225~250rpmで攪拌しながら1時間にわたり37°Cでインキュベートする。7.1デンプンおよび0.05μg/mlのカナマイシンを含有するLBプレート33.6g/lLennoxLAgar、Sigma上で200μlの各形質転換反応液を平板培養する。8.形質転換プレートを37°Cで一晩インキュベートする。表6.pPD77d14についてのプライマー表:表7.pPD77d20についてのプライマー表:表8.pPD77d34についてのプライマー表:pPD77に基づくベクター系pPD77のために使用されるベクター系は、pCRbluntTOPOIIinvitrogenに基づいている。ゼオシンzeocin耐性カセットは、pm1I、393bpフラグメントによって取り除かれている。次に、pCCベクターP32-ssCGTase-PS4-tt由来の発現カセットが、ベクター内に挿入されている。PS4改変体のpCCMini内へのライゲーション関連する突然変異MSDMによって作製されたを含有するプラスミドを、制限酵素Nco1およびHindIIIBiolabsを用いて切断する:3μgのプラスミドDNA、Xμlの10×バッファー2、10単位のNco1、20単位のHindIII、37°C、2時間のインキュベーション。1アガロースゲル上での消化物を泳動する。サイズが1293bpPS4遺伝子のフラグメントをゲルから切り出し、Qiagenゲル精製キットを用いて精製する。ベクターpCCMiniは次に制限酵素Nco1およびHindIIIを用いて切断し、次に消化を1アガロースゲル上で実施する。サイズが3569bpのフラグメントはゲルから切断し、Qiagenゲル精製キットを用いて精製する。ライゲーション:急速DNAライゲーションキットRocheを使用。ベクターと比較して2倍量のインサートを使用する。例えば、2μlのインサートPS4遺伝子1μlのベクター5μlのT4DNAライゲーションバッファー濃度2倍1μlのdH2O1μlのT4DNAリガーゼ5分間/RTでライゲーションする。製造業者InvitrogenのプロトコールにしたがってOneShotTOPOコンピテント細胞内へライゲーション液を形質転換させる。1回の形質転換に付き5μlのライゲーション液を使用する。1デンプンおよび0.05μg/mlのカナマイシンを含有するLBプレート33.6g/lLennoxLAgar、Sigma上で50μlの形質転換形成ミックスを平板培養する。インサートPS4改変体を含有するベクターを、デンプンプレート上でのハロ形成によって認識できる。実施例4.Bacillussubtilis内への形質転換プロトプラスト形質転換Bacillussubtilis菌株DB104A;Smithら,1988;Gene70,351-361を、以下のプロトコールにしたがって突然変異pCS-プラスミドを用いて形質転換させた。A.プロトプラスト培養および形質転換のための培地2×SMM1リットルに付き:342gのスクロース1M;4.72gのマレイン酸ナトリウム0.04M;8:12gのMgCl2、6H2O0.04M;濃NaOHを用いてpH6.5にする。50ml部分に分配し、10分間にわたりオートクレーブ滅菌にかける。4×YT1/2NaCl100mlにつき2gの酵母抽出物3.2gのトリプトン0.5gのNaCl。SMMP当量の2×SMMおよび4×YTを混合する。PEG25mlの1×SMM10分間にわたりオートクレーブ滅菌する中の10gのポリエチレングルコール6000BDHまたは8000Sigma。B.平板培養/再生用の培地寒天4のDifco最小寒天。15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。コハク酸ナトリウム270g/L1M、HClを用いてpH7.3にする。15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。リン酸バッファー100mlにつき3.5gのK2HPO41.5gのKH2PO4。15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。MgCl2100mlにつき20.3gのMgCl2、6H2O1M。カザミノ酸5w/v溶液。15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。酵母抽出液100mlにつき10gを15分間にわたりオートクレーブ滅菌する。グルコース20w/v溶液。10分間にわたりオートクレーブ滅菌する。DM3再生培地:60°Cで混合する水浴;500mlボトル:250mlのコハク酸ナトリウム50mlのカザミノ酸25mlの酵母抽出液50mlのリン酸バッファー15mlのグルコース10mlのMgCl2100mlの溶融寒天適切な抗生物質を加える:クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン、5μg/ml;エリスロマイシン、1μg/ml。カナマイシン上の選択はDM3培地中では問題が生じる250μg/mlの濃度が必要になることがある。C.プロトプラストの調製1.全試験を通して洗剤無含有プラスチックまたはガラス製品を使用する。2.単一コロニーから100mlフラスコ内の2×YT培地10mlを接種する。25~30°Cのシェーカー内で培養液を一晩増殖させる200回転/分。3.100mlの新鮮2×YT培地250mlフラスコ内へ一晩培養液を20倍に希釈し、37°Cのシェーカー内でOD600=0.4~0.5約2時間となるまで増殖させる200~250回転/分。4.遠心分離によって細胞を採取する9000g,20分間、4°C。5.ピペットを用いて上清を取り出し、細胞を5mlのSMMP5mgのリゾチーム中に再懸濁させ、濾過滅菌する。6.37°Cの水浴シェーカー100回転/分内でインキュベートする。30分後、およびその後は15分間隔で、顕微鏡によって25μlのサンプルを検査する。99の細胞がプロトプラストされる球状の外観になるまでインキュベーションを継続する。プロトプラストを遠心分離4000g、20分間、室温によって採取し、上清をピペットで取り除く。ペレットを1~2mlのSMMP中に穏やかに再懸濁させる。これでプロトプラストの使用準備が整う。将来使用するために小部分例えば、0.15mlに分けて-80°Cで冷凍できるグリセロールの添加は必要としない。これは形質転換能力のある程度の低下を生じさせることがあるが、冷凍プロトプラストを用いて1μgのDNAにつき106の形質転換体が得られ得る。D.形質転換1.450μlのPEGをマイクロチューブへ移す。2.1~10μlのDNA0.2μgを150μlのプロトプラストと混合し、この混合液をPEG入りのマイクロチューブへ添加する。即時に、しかし穏やかに混合する。3.室温に2分間放置し、次に1.5mlのSMMPを加えて混合する。4.微量遠心分離10分間、13,000回転/分10~12.000gによってプロトプラストを採取し、上清を除去する。ティッシュペーパーを用いて残留している液滴を除去する。300μlのSMMPを加えボルテックスミキサーにはかけない、抗生物質耐性マーカーを発現させるように37°Cの水浴シェーカー100回転/分中で60~90分間インキュベートする。プロトプラストは水浴の攪拌作用を通して十分に再懸濁させられる。1×SSM中で適切な希釈液を作製し、DM3プレート上で0.1mlを平板培養する。実施例5.攪拌フラスコ内でのPS4改変体の発酵攪拌フラスコ内の基質は以下のとおりに調製した:基質は、オートクレーブ滅菌の前に4N硫酸または水酸化ナトリウムを用いてpH6.8へ調整した。100mlの基質を1枚のバッフル付き500mlフラスコ内に入れ、30分間にわたりオートクレーブ滅菌した。引き続き、6mlの無菌デキストロースシロップを加えた。デキストロースシロップは、1容積の50w/vデキストロースを1容積の水と混合し、次に20分間にわたりオートクレーブ滅菌することによって調製した。攪拌フラスコに改変体を接種し、インキュベーター内で35°C/180rpmで24時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞は遠心分離10,000×g、10分間によってブロスから分離し、最後に上清は0.2μmでの精密濾過によって細胞無含有にした。細胞無含有上清をアッセイおよび適用試験に使用した。実施例6.アミラーゼアッセイBetamylアッセイ1Betamyl単位は、1分間に付き0.0351mMのPNPがアッセイミックス中の過剰なαグルコシダーゼによって放出され得るように、1分間に付き0.0351mMのPNP結合マルトペンタオースを分解させる活性であると定義されている。アッセイミックスは、Megazymeアイルランドの25μlの酵素サンプルおよび25μlのBetamyl基質Glc5-PNPおよびa-グルコシダーゼ1バイアルを10mlの水に溶解させたとともに50μlの50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2pH6.5を含有していた。アッセイミックスを40°Cで30分間インキュベートし、次に150μlの4Trisを加えて停止させた。ELISAリーダーを用いて420nmでの吸光度を測定し、Betamyl活性を活性=A420dアッセイ対象の酵素サンプル1mlあたりBetamyl単位に基づいて計算した。エンドアミラーゼアッセイエンドアミラーゼアッセイは、製造業者PharmaciaUpjohnDiagnosticsABによるPhadebasアッセイ実行と同一であった。エキソ特異性エキソ特異性は、エキソアミラーゼ活性対Phadebas活性の比率を使用して評価した。比活性PSac-D14改変体、PSac-D20改変体およびPSac-D34改変体について、本発明者らはBradford1976;Anal.Biochem.72,248に従って測定した精製タンパク質1μgにつき10Betamyl単位の平均比活性を見いだした。この比活性を、適用試験に使用する用量を計算するために活性に基づいて使用した。実施例7.半減期の決定t1/2は、規定加熱条件下でその間に酵素活性の半分が不活化される時間単位:分間である。酵素の半減期を決定するために、サンプルを60°C~90°Cの一定温度で1~10分間にわたり加熱した。半減期は、残留Betamylアッセイに基づいて計算した。方法:エッペンドルフバイアル中で、1,000μlのバッファーを60°C以上で少なくとも10分間予備加熱する。サンプルの熱処理は熱インキュベーターEppendorfのThermomixercomfort内でのエッペンドルフバイアルを継続的に混合800rpmしながら予備加熱バッファーに100μlのサンプルを添加することによって開始される。0、2、4、6、8および9分間のインキュベーション後、45μlのサンプルを20°Cで平衡化した1,000μlのバッファーへ移し、1,500rpmおよび20°Cで1分間インキュベートすることによって処理を停止させる。残留活性を、Betamylアッセイを用いて測定する。計算:t1/2の計算は、残留Betamyl活性対インキュベーション時間のlog10ベース-対数10の勾配に基づいており、t1/2は勾配/0.301=t1/2として計算する。実施例8.モデル系のベーキング試験生地は30.0°Cのファリノグラフ内で作製した。10.00gの改善reformした粉を計量し、ファリノグラフ内に加えた;1分間混合した後、捏ね上げバットkneadingvatの穴を通して無菌ピペットを用いて参照物質/サンプル参照物質=バッファーもしくは水、サンプル=酵素バッファーもしくは水を加える。30秒後、同様に捏ね上げバットの穴を通して、粉を辺縁からこすり落とす。サンプルを7分間捏ねる。最終参照物質を実行する前にファリノグラフでバッファーもしくは水を用いた試験を実施した。FUは参照物質上では400でなければならず、そうでない場合は、例えば液体の量によって調整しなければならなかった。参照物質/サンプルをスパチュラで取り出し、ディスポーザブルグローブをはめた手の中に入れ、その後小さなガラス製試験管長さ約4.5cm内に満たし、これをNMR試験管に入れてコルク栓をする。1種の生地に付き7本の試験管を作製する。サンプルを全部調製したら、試験管をコルク栓なしで25分間にわたり33°Cのプログラム可能な水浴中に入れ、その後水浴を5分間は33°Cに維持し、次に56分間にわたり98°Cへ加熱し1分に付き1.1°C、最後に96°Cで5分間維持するように設定する。試験管は20.0°Cのサーモカップボード内に保管する。クラムの固体含量は、図2に0ppm、0.5ppm、1ppmおよび2ppmのPSacD34を用いて調製したクラムサンプルについて示したように、第1、3および7日にBrukerNMS120MinispecNMR分析装置を用いて陽子NMRによって測定する。経時的な固体含量のより低い増加は、アミロペクチン老化の減少を表している。20.0°Cのサーモカップボード内での7日間の保管後に、10~20mgのクラムサンプルを計量し、40μlのアルミニウム製標準DSCカプセル内に入れ、20°Cで保管する。このカプセルをMettlerToledoDSC820装置上での示差走査熱量測定のために使用する。パラメーターとしては、1分間の加熱に付き10°Cでの20~95°Cの加熱サイクルおよびガス/流量:N2/80ml/分を使用する。結果を分析し、老化アミロペクチンを融解させるためのエントロピーをJ/gで計算する。実施例9.硬化防止作用モデルのパンクラムbreadcrumbは、実施例8にしたがって調製して測定する。表2に示したように、PS4改変体は、示差走査熱量測定によって測定すると、コントロールと比較してベーキング後にアミロペクチン老化の強い減少を示す。PS4改変体は、明白な用量作用を示す。実施例10.ベーキング試験における堅さの作用ベーキング試験を、米国式トーストのための標準白パンのスポンジおよび生地のレシピを用いて実施した。スポンジ生地はSiscoMillsUSAの1,600gの粉AllPurposeClassic、950gの水、40gの大豆油および32gのドライイーストから調製する。スポンジを、Hobartスパイラルミキサーを用いて低速で1分間、続いて速度2で3分間混合した。スポンジは引き続いて35°C、85RHで2.5時間、次に5°Cで0.5時間にわたり発酵させる。その後、このスポンジに400gの粉、4gのドライイースト、40gの塩、2.4gのプロピオン酸カルシウム、240gの高フルクトースコーンシロップIsosweet、5gの乳化剤PANODAN205、5gの酵素活性大豆粉、30gの非活性大豆粉、220gの水および30gのアスコルビン酸溶液水500gに溶解させた4gのアスコルビン酸から調製したを添加する。生じた生地は、Diosnaミキサーを用いて低速で1分間、続いて速度2で6分間混合した。その後、その生地を周囲温度で5分間寝かし、次に550gの生地片を量り、次に各辺を1:4、2:4、3:15、4:12および10に設定したGlimekシーター上でシート成形し、ベーキング型に移す。90RHの43°Cでの60分間のプルーフィング後に、この生地を218°Cで29分間ベーキングする。堅さと弾性を、TA-XT2テクスチャー分析装置で測定した。柔らかさ、密着性および弾性は、StableMicroSystemsUKのテクスチャー分析装置を用いるテクスチャープロフィル分析によってパン薄片を分析することによって決定した。以下の設定を使用した:試験前速度:2mm/s試験速度:2mm/s試験後速度:10mm/s破壊試験間隔:1間隔:40力:0.098N時間:5.00秒間カウント:5ロードセル:5kgトリガータイプ:自動-0.01N堅さの測定値は、PS4改変体ポリペプチドが第1日から第7日の堅さの発達を有意に減少させることを示しており、そして酵素用量の増加に伴ってより高い作用を示す。実施例11.デニッシュロールの容積の制御デニッシュロールを2,000gのデニッシュ用改善粉Cerealia、120gの圧搾イースト、32gの塩、および32gのスクロースをベースとする生地から調製する。事前の水の最適化に従って生地に水を加える。生地を、Diosnaミキサーを用いて低速で2分間、および高速で5分間混合する。混合後の生地の温度を26°Cで維持する。1,350gの生地を量り、30°Cの加熱キャビネット内で10分間寝かせる。デニッシュロールをFortua成形機上で成形し、34°Cおよび85相対湿度で45分間プルーフィングする。引き続いてデニッシュロールを最初の13秒間は蒸気を出して、250°CのBago2オーブン内で18分間ベーキングする。ベーキング後にデニッシュロールを25分間冷まし、その後に計量して容積を測定する。デニッシュロールは、クラストの外観、クラムの均質性、クラストのキャッピング、パンの模様ausbundおよび比容積菜種置換法rapeseeddisplacementmethodを用いて容積を測定するに関して評価する。これらの基準に基づき、PS4改変体は比容積を増加させ、デニッシュロールの品質パラメーターを改善することが見いだされる。従って、PS4改変体は、ベーキング製品の容積を制御することができる。実施例12.結果表9.野生型PSac-cc1と比較したPsac改変体の生化学的特性配列pPD77d40、pMD55、pMD85、pMD96、pMD86およびpMD109は、第5列で変異した残基およびP.saccharophilia野生型バックグラウンド配列番号1において欠失したデンプン結合ドメインを有する。それらの配列は、この情報を用いると簡単な方法で構築できる。様々な位置での個々の突然変異の詳細な作用について以下の小節で記載する。突然変異121Fを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、L178F、A179Tでのアミノ酸突然変異を有するpMD55と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。突然変異161Aを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD96と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。突然変異223Eを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD85と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。上記の実施例12および表9も参照されたい。実施例13.突然変異121Dを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121D、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例14.突然変異121Wを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121W、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD44と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例15.突然変異121Hを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121H、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD43aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例16.突然変異121Mを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121M、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD41aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例17.突然変異121Aを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121A、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD74aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例18.突然変異121Yを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G121Y、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD73aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例19.突然変異223Aを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例20.突然変異223Kを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223K、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM173F6と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例21.突然変異223Vを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223V、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD49aと名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例22.突然変異223Eを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223K、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM171G11と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例23.突然変異G223Rを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223R、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM173B6と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。実施例24.突然変異Y146Gを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM381と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例25.突然変異157Mを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM279B1と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例26.突然変異158Tを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM237P2と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例27.突然変異198Wおよび/または229Pを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM325F3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するpMD129と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例28.突然変異G303EまたはG303Dを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM341A9と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM341G11と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。実施例29.突然変異H306TまたはH306Gを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM350B11と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM350C12と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。実施例30.突然変異A309Pを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM332Q4と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例31.突然変異R316SまたはR316Pを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM365B4と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316P、および334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM365F4と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例32.突然変異R353Tを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334P、および353Tでのアミノ酸突然変異を有するSSM360C7と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。実施例33.突然変異26Eを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N26E、N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223E、H307L、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSSM219B3と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例34.突然変異70Dを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223A、S229P、H307L、A309P、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSAS1401L10と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例35.突然変異145Dを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性およびエキソ特異性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334Pでのアミノ酸突然変異を有するSAS1387D16bfと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性およびエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性および改善されたエキソ特異性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例36.突然変異188Hを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188H、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するpMD236と名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例37.突然変異188Sを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強された熱安定性N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、N145D、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G188S、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するpMD237bfと名付けられたPS4改変体ポリペプチドを熱安定性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善された熱安定性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例38.突然変異339Aを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Aでのアミノ酸突然変異を有するSAS1379O13と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。実施例39.突然変異339Eを備えるPS4改変体ポリペプチドの増強されたエキソ特異性N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、G158T、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307L、A309P、S334P、W339Eでのアミノ酸突然変異を有するSAS1379O9と名付けられたPS4改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験した。このポリペプチドは、以下の表に示すように改善されたエキソ特異性を示した。半減期t1/2-85は、50mMのクエン酸ナトリウム、5mMのCaCl2、pH6.5のバッファーを用いてPD-10カラムAmershamBiosciencesを用いたサンプルのゲルろ過後に、実施例8にしたがって決定した。さらなる態様以下では、本発明のさらなる態様および実施形態を以下の番号付けした段落に記載する;本発明はこれらの態様を含むと理解されたい。段落A1.非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して121位におけるアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A2.段落A1によるPS4改変体ポリペプチドであって、121位におけるアミノ酸突然変異が置換121F、121Yおよび/または121W、好ましくはG121F、G121Yおよび/またはG121Wを含むPS4改変体ポリペプチド。段落A3.段落A1またはA2によるPS4改変体ポリペプチドであって、161および223からなる群から選択される位置で1つ以上のさらなる突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落A4.段落A3によるPS4改変体ポリペプチドであって、1つ以上のさらなる突然変異が161A、223Eおよび223K、より好ましくはS161A、G223Eおよび/またはG223Kからなる群から選択されるPS4改変体ポリペプチド。段落A5.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、161;121、223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A6.段落A5によるPS4改変体ポリペプチドであって、121F/Y/W、161A;121F/Y/W、223E/Kからなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A7.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、161および223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A8.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121F/Y/W、161A、223E/Kからなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A9.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、134、141、157、223、307、334位からなる群から選択される1または複数、好ましくは全部のさらなる突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落A10.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、33および34のいずれかもしくは両方の位置での突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落A11.段落A10によるPS4改変体ポリペプチドであって、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334Pからなる群から選択される1つまたは複数、好ましくは全部の置換、ならびに任意でN33YおよびD34Nの一方もしくは両方をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落A12.先行段落AのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって:a121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;b178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;c179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/またはd87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。段落B1.非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して161位におけるアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落B2.段落B1によるPS4改変体ポリペプチドであって、161位における突然変異が置換161A、好ましくはS161Aを含むPS4改変体ポリペプチド。段落B3.段落B1またはB2によるPS4改変体ポリペプチドであって、121および223からなる群から選択される位置で1つ以上のさらなる突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落B4.段落B3によるPS4改変体ポリペプチドであって、1つ以上のさらなる突然変異が121F、121Y、121W、223Eおよび223K、より好ましくはG121F、G121Y、G121W、G223Eおよび/またはG223Kからなる群から選択されるPS4改変体ポリペプチド。段落B5.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、161;161、223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落B6.段落B5によるPS4改変体ポリペプチドであって、121F/Y/W、161A;161A、223E/Kからなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落B7.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、161および223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落B8.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121F/Y/W、161A、223E/Kを含むPS4改変体ポリペプチド。段落B9.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、134位、141位、157位、223位、307位、334位からなる群から選択される1または複数、好ましくは全部のさらなる突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落B10.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、33および34のいずれかもしくは両方の位置での突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落B11.段落B10によるPS4改変体ポリペプチドであって、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334Pからなる群から選択される1つ以上の置換、好ましくは全部、ならびに任意でN33YおよびD34Nの一方もしくは両方をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落B12.先行段落BのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって:a121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;b178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;c179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/またはd87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。段落C1.非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して223位におけるアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落C2.段落C1によるPS4改変体ポリペプチドであって、223位における突然変異が置換223Eおよび/または223K、好ましくはG223Eおよび/またはG223Kを含むPS4改変体ポリペプチド。段落C3.段落C1またはC2によるPS4改変体ポリペプチドであって、121および161からなる群から選択される位置で1つ以上のさらなる突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落C4.段落C3によるPS4改変体ポリペプチドであって、1つ以上のさらなる突然変異が121F、121Y、121Wおよび161A、より好ましくはG121F、G121Y、G121Wおよび/またはS161Aからなる群から選択されるPS4改変体ポリペプチド。段落C5.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、223;161、223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落C6.段落C5によるPS4改変体ポリペプチドであって、121F/Y/W、223E/K;161A、223E/Kからなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落C7.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、121、161および223からなる群から選択される位置での突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落C8.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、突然変異121F/Y/W、161A、223E/Kを含むPS4改変体ポリペプチド。段落C9.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、134位、141位、157位、223位、307位、334位からなる群から選択される1または複数、好ましくは全部のさらなる突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落C10.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、33および34のいずれかもしくは両方の位置での突然変異をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落C11.段落C10によるPS4改変体ポリペプチドであって、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334Pからなる群から選択される、1つ以上の置換、好ましくは全部、ならびに任意でN33YおよびD34Nの一方もしくは両方をさらに含むPS4改変体ポリペプチド。段落C12.先行段落CのいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって:a121位における突然変異、好ましくは121D、より好ましくはG121D;b178位における突然変異、好ましくは178F、より好ましくはL178F;c179位における突然変異、好ましくは179T、より好ましくはA179T;および/またはd87位における突然変異、好ましくは87S、より好ましくはG87Sを含むPS4改変体ポリペプチド。段落D1.非マルトース生成エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導可能であるPS4改変体ポリペプチドであって、配列番号1に示したPseudomonassaccharophiliaエキソアミラーゼ配列の位置の番号付けを参照して146、157、158、198、229、303、306、309、316および353からなる群から選択される1つ以上の位置でのアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落D2.段落D1によるPS4改変体ポリペプチドであって、146G、146M、157M、158T、158A、158S、198W、198F、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、316K、316Qおよび353Tからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落D3.段落D1によるPS4改変体ポリペプチドであって、146G、157M、158T、198W、229P、303E、303D、306T、306G、309P、316S、316P、または353Tからなる群から選択されるアミノ酸突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落D4.段落D1によるPS4改変体ポリペプチドであって、位置33、34、121、134、141、157、161、178、179、223、307および334からなる群から選択される、好ましくは33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pからなる群から選択される1つ以上のさらなる突然変異を含むPS4改変体ポリペプチド。段落D5.段落D1によるPS4改変体ポリペプチドであって、各々、以下:a33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号15を有する;b33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号16を有する;c33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号17を有する;d33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号18を有する;e33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号19を有する;f33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号20を有する;g33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号21を有する;h33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号22を有する;i33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号23を有する;j33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号24を有する;k33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号25を有する;l33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316S、および334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号26を有する;m33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316P、および334Pの突然変異を含み、好ましくは配列番号27を有する;n33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tの突然変異を含み、好ましくは配列番号28を有する;PS4改変体ポリペプチド。段落13.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、親ポリペプチドが非マルトース生成エキソアミラーゼ、好ましくはグルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼEC3.2.1.60を含むPS4改変体ポリペプチド。段落14.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、親ポリペプチドがシュードモナス種、好ましくはPseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstuzeriであるか、またはPseudomonassaccharophiliaもしくはPseudomonasstuzeriから誘導可能である、PS4改変体ポリペプチド。段落15.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、親ポリペプチドが配列番号1もしくは配列番号5に示した配列を有するPseudomonassaccharophilia由来エキソアミラーゼ由来の非マルトース生成エキソアミラーゼであるPS4改変体ポリペプチド。段落16.先行段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5、13および14のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、親ポリペプチドが配列番号7もしくは配列番号11に示した配列を有するPseudomonasstuzeri由来の非マルトース生成エキソアミラーゼであるPS4改変体ポリペプチド。段落17.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、本明細書、段落または図面に記載の配列を含むPS4改変体ポリペプチド。段落18.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、同一条件下で試験した場合に親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有するPS4改変体ポリペプチド。段落19.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、好ましくは60°Cでの半減期t1/2が、親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、15以上、好ましくは50以上、最も好ましくは100以上増加させられたPS4改変体ポリペプチド。段落20.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、同一条件下で試験した場合に親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有するPS4改変体ポリペプチド。段落21.先行段落のいずれかによるPS4改変体ポリペプチドであって、親ポリペプチドもしくは野生型ポリペプチドと比較して、10以上、好ましくは20以上、好ましくは50以上のエキソ特異性を有するPS4改変体ポリペプチド。段落22.先行段落のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドの食品添加物としての使用。段落23.デンプンと段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載したPS4改変体ポリペプチドとを接触させる工程と該ポリペプチドにデンプンから1つ以上の直鎖状生成物を生成させる工程とを包含する、デンプンを処理するプロセス。段落24.食品を調製する際の段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。段落25.段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載のポリペプチドを食品成分と混合する工程を包含する、食品を調製するプロセス。段落26.食品が生地もしくは生地製品、好ましくは処理された生地製品を含む、段落24による使用、または段落25によるプロセス。段落27.食品がベーカリー製品である、段落24~26のいずれかによる使用またはプロセス。段落28.ベーカリー製品を製造するためのプロセスであって:aデンプン媒質を提供する工程と;bデンプン媒質に段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドを添加する工程と;cベーカリー製品を製造するために工程b中または後にデンプン媒質に熱を加える工程と、を包含するプロセス。段落29.段落24~28のいずれかによるプロセスによって得られる食品、生地製品またはベーカリー製品。段落30.生地用の改善剤組成物であって、段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載したPS4改変体ポリペプチド、および少なくとも1つのさらなる生地成分もしくは生地添加物を含む改善剤組成物。段落31.粉および段落1~21のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドを含有する組成物。段落32.生地製品において生地製品の硬化を遅延もしくは減少させるため、好ましくは有害な老化を遅延もしくは減少させるための、段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドの使用。段落33.任意の先行段落に記載のPS4改変体ポリペプチドと、Novamyl、またはマルトース生成αアミラーゼ活性を有するその改変体、ホモログ、または突然変異体との組み合わせ。段落34.先行段落のいずれかによる用途のための段落33による組み合わせの使用。段落35.段落34による組み合わせを用いた処理によって製造された食品。段落36.段落A1~A12、B1~B12、C1~C12、D1~D5および13~21のいずれかに記載のPS4改変体ポリペプチドを含有する食品添加物。参考文献本明細書に言及した特許出願および特許の各々、および前記特許出願および特許の各々の係属中も含む上記の特許出願および特許の各々に言及もしくは参照された各文書特許出願に言及された文書、ならびに前記特許出願および特許の各々および特許出願に言及された文書のいずれかに言及もしくは参照された任意の製品の製造業者の取扱説明書もしくはカタログは、本明細書に参考として援用される。さらに、本明細書に言及した全文書、および本明細書に言及した文書内で言及もしくは参照された全文書、ならびに本明細書に言及もしくは参照された任意の製品についての任意の製造業者の取扱説明書もしくはカタログは、本明細書に参考として援用される。本発明に記載した方法およびシステムの様々な改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に理解される。本発明を特定の好ましい実施形態に結び付けて記載してきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定すべきではないと理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するために記載した様式の様々な改変は、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。配列表配列番号1Pseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列。配列番号2PSac-D34配列;11の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号3PSac-D20配列;13の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号4PSac-D14配列;14の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号5Pseudomonassaccharophilia由来グルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質EC3.2.1.60G4-アミラーゼマルトテトラオース生成アミラーゼエキソ-マルトテトラヒドロラーゼマルトテトラオース生成エキソアミラーゼ。SWISS-PROTアクセッション番号P22963。配列番号6マルトテトラヒドロラーゼEC番号=3.2.1.60をコードするP.saccharophilia由来mta遺伝子。GenBankアクセッション番号X16732。配列番号7Pseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来するPS4参照配列。配列番号8PStu-D34配列;9の置換を伴うPseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号9PStu-D20配列;11の置換を伴うPseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号10PStu-D14配列;12の置換を伴うPseudomonasstuzeri由来マルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号11PseudomonasstuzeriPseudomonasperfectomarina由来グルカン1,4-α-マルトテトラヒドロラーゼ前駆物質EC3.2.1.60G4-アミラーゼマルトテトラオース生成アミラーゼエキソ-マルトテトラヒドロラーゼマルトテトラオース生成エキソアミラーゼ。SWISS-PROTアクセッション番号P13507。配列番号12P.stuzeri由来マルトテトラオース生成アミラーゼamyP遺伝子、完全コドン。GenBankアクセッション番号M24516。配列番号13pMD55配列;11の置換G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179TおよびG121Fおよびデンプン結合ドメインの欠失を伴うPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号14PMD96配列;N33Y、D34N、G121F、G134R、A141P、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、H307LおよびS334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号15SSM381配列;33Y、34N、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号16SSM279B1配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157M、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号17SSM237P2配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、158T、161A、178F、179T、223E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号1833Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、307Lおよび334Pでのアミノ酸突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号19SSM325F3配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号20pMD129配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、198W、223E、229P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号21SSM341A9配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303E、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号22SSM341G11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、303D、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号23SSM350B11配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306T、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号24SSM350C12配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、306G、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号25SSM332Q4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、309P、307Lおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号26SSM365B4配列;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Sおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号27SSM365F4;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、316Pおよび334Pでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。配列番号28SSM360C7;33Y、34N、121F、134R、141P、157L、161A、178F、179T、223E、307L、334Pおよび353Tでの突然変異を有するPseudomonassaccharophiliaマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。"