個体において腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、前記個体に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み、前記ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質が、i免疫グロブリンFcおよび前記がん細胞によって発現される抗原または前記免疫グロブリンFc領域および前記抗原のペプチド模倣物;またはii前記免疫グロブリンFcおよび前記腫瘍細胞によって発現されるレセプターのアンタゴニストペプチドを含み、前記抗原を発現する腫瘍細胞の増殖が前記iの投与後に抑制される;または前記レセプターを発現する腫瘍細胞の増殖が、前記iiの投与後に抑制されることを特徴とする方法。前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、組換え腫瘍退縮性ワクシニアウイルス中に存在する、請求項1に記載の方法。前記融合タンパク質がさらにTヘルパーエピトープを含む、請求項1に記載の方法。前記FcがヒトIgG1FcまたはヒトIgG3Fcである、請求項1に記載の方法。前記ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質が、前記レセプターのアンタゴニストペプチドを含み、当該アンタゴニストペプチドが、配列KGVSLSYR配列番号6を含む、請求項1に記載の方法。前記ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質が、配列番号1の配列を含む、請求項1に記載の方法。前記投与が全身投与である、請求項2に記載の方法。さらに、前記個体に腫瘍血管破壊剤を投与することを含む、請求項7に記載の方法。前記免疫グロブリンFcが、免疫グロブリンの抗原結合部を含まない、請求項5に記載の方法。前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、抗原提示細胞に存在する、請求項1に記載の方法。タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記タンパク質が免疫グロブリンFcおよび抗原または当該抗原のペプチド模倣物を含み、前記免疫グロブリンFcが抗原結合部を含まないことを特徴とする、組成物。前記タンパク質が前記ペプチド模倣物を含み、当該ペプチド模倣物が配列番号1の配列を含む、請求項11に記載の組成物。タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記タンパク質が、免疫グロブリンFcおよび腫瘍細胞によって発現されるレセプターのアンタゴニストペプチドを含むことを特徴とする、組成物。請求項11のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む組成物。請求項13のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む組成物。本発明は、これらの及び他の関連する要求を満たすことを課題とする。本発明は、個体において細胞の増殖を抑制する組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法によって標的にされる細胞は、抗原、抗原のミモトープ、またはCXCR4ケモカインレセプターを発現する。一実施形態において、前記方法は、個体に、免疫グロブリンFcおよび前記細胞によって発現される抗原または前記抗原のミモトープをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において、前記方法は、個体に、免疫グロブリンFcおよび前記細胞によって発現されるCXCR4ケモカインレセプターのアンタゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む。様々な実施形態において、本発明はがん細胞腫瘍細胞であってもよいが、必ずしもそれに限定されないの増殖を抑制する。IgFcをコードするポリヌクレオチドは、一実施形態において、組換え腫瘍退縮性ワクシニアウイルスである。前記ポリヌクレオチドによってコードされた融合タンパク質は、ヒトIgG1FcもしくはヒトIgG3Fcを含んでもよく、さらに、Tヘルパーエピトープを含んでもよい。本発明は、また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び/又は前記コード化タンパク質を含む組成物を提供する。前記タンパク質は、免疫グロブリンFcおよび抗原または当該抗原のペプチド模倣物、または、免疫グロブリンFcおよびがん細胞によって発現されるレセプターのアンタゴニストペプチドを含む。本発明は、抗体のFc領域と、i抗原に存在するエピトープを模倣するミモトープ;あるいはiiがん細胞上に発現するレセプターのペプチドアンタゴニスト、を含有する融合タンパク質が、前記抗原を発現する細胞に対する免疫応答を増強するため、および、前記ペプチドアンタゴニストが結合するレセプターを通じたシグナル伝達を阻害するために使用できるという我々の発見を利用する。本発明は、そのような融合タンパク質を含有する組成物、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物、および、疾患の予防及び/又は治療のためにそのような組成物を使用する方法を包含する。前記方法は、本発明の組成物を個体に投与し、前記抗原を発現する細胞または前記ペプチドアンタゴニストが結合するレセプターを発現する細胞の増殖を抑制することを含む。本明細書中で使用されるミモトープは、エピトープの構造を模倣するペプチド配列を意味する。ミモトープに対して生じた免疫応答は、それが模倣するエピトープに向けられ、それゆえ前記エピトープを含む抗原をも認識するであろう。ある実施形態では、ミモトープ自体が抗原として機能することができると見なされる。我々は、活性化Fc融合タンパク質と、ミモトープもしくはがん細胞上に発現されるレセプターのペプチドアンタゴニストのいずれかを含む融合タンパク質を含有する治療ワクチンが、抗腫瘍応答を生成することを実証する。本発明のある証明において、我々は、活性化Fc融合タンパク質と関連して発現されたGD2ガングリオシドのCD166交差反応性ミモトープを用いた治療ワクチンが、担がん同系マウスにおいて腫瘍特異的T細胞を産生したことを示す。前記ミモトープは、樹状細胞上の活性化Fcγレセプターに抗原性カセットを送達するために、普遍的なTヘルパーエピトープおよびマウスのIgG2aFcフラグメントと協同して融合タンパク質として発現された。47LDAミモトープの配列は、GPGPGEDPSHSLGLDAALFMである。普遍的なTヘルパーエピトープと47LDAミモトープを含む代表的なアミノ酸配列は、配列番号2として提示され、以下の通りである。KCKRQCGPGPGAKFVAAWTLKAAAGPGPGCKRKIHIGPGQAFYTGPGPGEDPSHSLGLDAALFM配列番号2の1~6位アミノ酸は、スペーサーを構成する。7~11および25~29位のアミノ酸は、リンカーを構成する。どのTヘルパーエピトープも本発明との関連で使用できると考えられるが、好適なTヘルパーエピトープの非限定的な実施形態は、非天然panDRエピトープAKFVAAWTLKAAA:配列番号3およびHIVgp120糖タンパク質のV3ループCKRKIHIGPGQAFYT:配列番号4と称される普遍的なThペプチドを含む。これらの代表的なTヘルパーエピトープのそれぞれは、配列番号Xにも示される。我々は、また、47LDAFcγ2a融合タンパク質を用いた担がんマウスの免疫化が、47LDAポリペプチド樹状細胞ワクチンよりも高いレベルの抗腫瘍性免疫応答と保護を誘導したことを示した。治療的47LDAFcγ2aDCワクチンの抗腫瘍有効性は、47LDAFcγ2a融合タンパク質を発現している組換え腫瘍退縮性ワクシニアウイルスを使用するウイルス療法関連癌ワクチンによって達成される有効性に匹敵した。後者の治療は、しかしながら、全身照射または養子細胞移入を要求せず、確立された耐性の状況において抗腫瘍性免疫応答の誘発をもたらした。本発明の別の実施形態において、我々は、CXCR4ケモカインレセプターアンタゴニストである抗がん剤を採用する。CXCR4のこのペプチドアンタゴニストは、アミノ酸配列:KGVSLSYRKRYSLSVGKを含む。したがって、一実施形態において、CXCR4のペプチドアンタゴニストは、配列KGVSLSYRを含む。CTCE9908は、転移細胞による器官組織の浸潤に重要な意味をもつ、CXCR4レセプターとCXCL12の相互作用をブロックし、それにより、腫瘍転移を減じる。CXCR4レセプターは多くの腫瘍細胞タイプで発現される。CTCE9908ペプチドは、カナダ、バンクーバーのChemokineTherapeutics社によって開発され、後期のがん患者における臨床治験のフェースIIIにおいて使用されてきた。本発明の方法を行うことによって、我々は、Fcフラグメントが生来持っているジスルフィド結合を利用し、CTCE9908ペプチドの二量体構造を保存する。我々は、DNAベクターにおいて、活性化マウスおよびヒトのFcγフラグメントと関連してCTCE9908ペプチドを発現させ、CTCE融合タンパク質のマウスバージョンを用いて、マウスの同系および異種移植モデルにおいてその構築物の抗腫瘍有効性を実証する。我々は、これが、抗体依存性細胞傷害殺腫瘍メカニズムを動員することによって、ペプチドの治療有効性を増強すると信じる。したがって、本発明は、抗原に対する免疫応答を増強するための様々な組成物および方法を提供し、この際、前記抗原が、免疫グロブリンのFc領域とのコンビネーションで融合構築物として提示される。したがって、一実施形態において、本発明は、融合構築物を含む組成物を提供し、ここで、前記融合構築物は、マウスIgG2aもしくはヒトIgG1のFc領域、またはそのようなFc領域のフラグメントを含む。様々な実施形態において、前記Fc領域は、IgA、IgGあるいはIgE抗体に由来するFc領域またはそのフラグメントである。前記Fc領域は、ヒト等の哺乳類によって産生されたFc領域と同一のアミノ酸配列を含んでもよく、あるいはそれからなってもよい。様々な実施形態において、前記Fc領域は、マウス及び/又はヒトによって産生されるFc領域との80~100の間のアミノ酸配列類似性を有してもよい。前記Fc領域は、無傷のFc領域であってもよく、当該Fc領域のフラグメントであってもよい。前記Fc領域のフラグメントは、好ましくは、Fcγレセプターに特異的に結合するアミノ酸配列を含む。当業者は、抗体のFc領域が、抗体のクラスに応じて2ないし3の定常ドメインを与える2つの重鎖を含む抗体のFragmentcrystallizable領域を意味することを認識するであろう。マウスおよびヒトの免疫グロブリンのFc領域のアミノ酸配列と同様、Fc領域をコードするヌクレオチド配列は、当該分野において周知である。一実施形態において、本発明において前記Ig領域として使用するための、好適なヒトIgガンマ1C領域Homosapiensは、以下の配列を有する;ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号7別の実施形態において、好適なヒトIgガンマ3鎖C領域は、以下の配列を有する。ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK配列番号8個体の抗体アイソタイプは、Fcγレセプターへの異なる親和性を有するため、提示された抗原複合体による活性化対抑制型レセプター結合の比率の違いから、免疫応答を誘導するためのDCsの能力が予測できる可能性が有る。この経路を利用することは、抗体治療あるいは癌ワクチンによる獲得免疫と免疫記憶の補充を可能にする可能性が有る。一実施形態では、融合タンパク質のFc部分は抗体重鎖のみを含む。当業者は、マウス動物モデルを使用した本発明の実演では、前記融合タンパク質のFc部が好ましくはIgG2aもしくはIgG2bFcマウスIg部であるが、人間における疾患の治療及び/又は予防には、前記Fc部は、好ましくはIgG1もしくはIgG3Fc部であることを認識するであろう。ある実施形態において、本明細書中で提供される融合タンパク質のFc部は、抗原認識部を含まない。このように融合タンパク質は、抗原結合部を含む抗体と異なり、架橋ないしは別の方法で連結されたミモトープ、抗原、あるいはペプチドレセプターリガンドを含んでいてもよい。Fc融合タンパク質をコードするDNA構築物は、当業者によく知られている従来技術のいずれかを使用して作ることができる。例えば、Fc融合をコードする構築物は、市販の試薬を使用して作ることができる。例えば、INVIVOGEN社は、免疫グロブリンのFc領域に所定のタンパク質をコードする配列を融合することによって、Fc融合タンパク質の作成を促進するために開発されたプラスミドのpFUSEFcファミリーを提供する。この構築物において、Fc領域は、IgG重鎖のCH2およびCH3ドメインおよびヒンジ領域を含む。ヒンジは、Fc融合タンパク質の2つの部分の間の可動性スペーサーとして働き、融合タンパク質の各部分が独立して機能することを可能にする。一般に、Fcγレセプターを活性化するいずれのFc領域も、本発明を実行するために使用できる。融合タンパク質をコードするDNA構築物は、単離及び/又は精製のための、あるいは治療目的のための融合タンパク質を産生するために、好適なタンパク質発現システムを使用して発現させられることができる。様々なタグまたは他の部分は、融合タンパク質が容易に精製できるように、融合タンパク質に付加されてもよい。治療目的のために、融合タンパク質を含む、及び/又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む医薬品等の組成物を製造できる。治療目的で使用するための組成物は、Fc融合タンパク質及び/又はそれらをコードするポリヌクレオチドと、任意の好適な製薬的に許容されるキャリア、賦形剤及び/又は安定剤と混合することによって調製されてもよい。前記薬剤と混合するのに好適な組成のいくつかの例は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy21stEditionPhiladelphiaPALippincottWilliamsWilkinsに記載されている。前記組成物はさらに、任意の好適なアジュバントを含んでもよい。本発明の方法で使用される治療薬がポリヌクレオチドの場合、それはネイキッドポリヌクレオチドとして、送達試薬との組み合わせで、あるいは前記ポリヌクレオチド剤を含む及び/又は発現する組換プラスミドもしくはウイルスベクターとして、個体に投与されることができる。投与に好適な送達試薬は、MirusTransitTKOの親油性試薬であるリポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、または、ポリカチオン、またはリポソームを含む。一実施形態において、FcAgアンタゴニスト融合は、組換え腫瘍退縮性組換えワクシニアウイルスによってコードされている。この関連で、腫瘍退縮ウイルスは、選択的にがん細胞内で増殖し、がん細胞を破壊する。作用のこの一次メカニズムは、細胞溶解部位におけるウイルスによる免疫原性治療的タンパク質の発現を含む二次メカニズムによって補完される。腫瘍退縮ウイルスの活性を評価するための臨床治験の大多数は、局所性あるいは領域性のルートを使用したが、浸潤性および転移性のがんの効果的な治療は、好ましくはウイルスの全身投与を使用して実行されると考えられる。ポックスウイルスは、細胞外のエンベロープワクシニアウイルスが、いくつかのホスト補体制御タンパク質および、補体による中和に対してそれを耐性にするわずかな露出ウイルスタンパク質を含むホスト細胞由来のエンベロープにそれ自身を包むため、血液を通じて全身性に移動する能力によって特徴づけられる。改変された腫瘍退縮性ワクシニアウイルスは、前臨床モデルおよび初期の臨床治験においてがんの治療において有望な結果を実証し、及び全身性のウイルス伝播が、広範な転移を有する患者において実証された。しかしながら、たいていの患者は効果的に治療されず、したがって、ヒトにおけるOVVの有効性は本発明によって提供される組成物および方法との組み合わせから恩恵を受けるはずである。一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、FcAgアンタゴニスト融合タンパク質を発現するポリヌクレオチドを含む抗原提示細胞の投与によって、個体に投与される。FcAgアンタゴニストは、前記Fc領域が、抗原、そのミモトープ、またはがん細胞特異的ペプチドレセプターアンタゴニストのいずれかとともに、キメラタンパク質内、またはそのようなキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列内に存在することを意味する。一実施形態において、前記FcAgアンタゴニストは、抗原特異的T細胞の誘発のために抗原提示細胞上の活性化Fcγレセプターに抗原性カセットを送達するために、普遍的なTヘルパーエピトープおよびFcフラグメントと協同した融合タンパク質として発現されることができる。別の実施形態において、本発明は、前記個体に、FcAg融合タンパク質樹状細胞によって増殖されたT細胞を養子導入することを含む、抗原への免疫応答を増強するための方法を提供する。一実施形態において、養子導入T細胞は、CD8T細胞である。CD8T細胞は、CD8を発現するT細胞を意味する。CD8は、T細胞レセプターのためのコレセプターとして機能する、特徴がはっきりした膜貫通糖タンパク質である。CD8は、ヒトにおいて、抗原提示細胞の表面上のクラスI主要組織適合遺伝子複合体タンパク質に結合する。一実施形態において、本発明は、ワクチン誘導CD8T細胞およびFcAg融合タンパク質発現樹状細胞の単離集団を、担がんホストへ養子移入し、生体内で前記養子移入T細胞の増殖および腫瘍増殖の抑制を促進することを提供し、また、前記FcAg融合をコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明は、本発明のFcAg融合物内の抗原である抗原に対する増強されたT細胞応答を誘発する。増強されたT細胞応答には、前記抗原を有する細胞に対する細胞傷害活性を示すT細胞、前記抗原への抗原リコール応答及び/又は増強された栄養を示すT細胞の増加、前記抗原に特異的なエフェクターT細胞の量及び/又は活性の増加、または細胞性免疫応答の前述のタイプの組み合わせが含まれ得るが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の方法によって誘発されたT細胞応答は、液性及び/又は自然免疫応答における有益な変更を伴い得る。一実施形態において、増強された免疫応答は、個体における前記抗原を発現する腫瘍細胞の増殖の抑制によって、及び/又は個体の生存時間の延長によって証明されることができる。ペプチドによって模倣されることができるエピトープを含む抗原はいずれも、本発明での使用に好適であると考えられる。前記抗原は、MHCクラスI分子と協同した抗原提示細胞による提示に好適なエピトープを含むことが好ましい。したがって、前記抗原は、それが融合タンパク質中に存在する場合、タンパク質またはペプチドであってもよく、またはそれらを含んでもよい。前記抗原は、組換え抗原であってもよく、それは化学的に合成されてもよく、それは細胞培養液から単離されてもよく、または、それは個体から得られた生物サンプルから単離されてもよい。前記抗原は、感染性の生物における細胞上に存在してもよく、または前記抗原は病気のまたは感染した細胞、組織もしくは器官によって発現されてもよい。一実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、市販されている抗原であってもよく、あるいは組換え法による等従来技術によって、あるいは本発明の組成物および方法において使用するための新規な抗原を同定するために腫瘍細胞可溶化物の調製によって、得ることができる。様々な実施形態において、がん細胞抗原は、がん細胞によって発現されてもよく、その具体例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない:線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、腹膜偽粘液腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、内皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、頭頸部癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、胸腺腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病。一実施形態において、前記抗原は、GD2ガングリオシドのCD166交差反応性ミモトープである。別の実施形態では、前記抗原はCTCE9908である。前記抗原は、感染病原体もしくは感染性生物によって発現される抗原であってもよく、その非限定的な例には、ウイルス、バクテリア、真菌、原生動物、または他の寄生虫もしくはその他の感染病原体が含まれる。当業者は、前記抗原の分子構造、治療する個体の大きさや年齢、疾患を有する疑いのある、または有すると診断された個体の疾患の種類と段階のようなファクターを考慮して、本発明の方法を実施するための投与計画をどのように策定すればよいか認識するであろう。本発明は、予防的もしくは治療的な増強された免疫応答を誘発するために使用されてもよい。前記組成物が投与される個体は、治療を必要としている個体であってもよく、及び/又は、前記抗原の発現と関連する疾病もしくは他の障害を有すると診断された、有することが疑われる、あるいは発病するリスクのある個体であってもよい。本発明の組成物中に含まれる、及び/又は本発明の方法において使用される、FcAgアンタゴニスト融合タンパク質の量、あるいはFcAgアンタゴニストタンパク質をコードする発現ベクターの量、あるいは、FcAgアンタゴニスト融合タンパク質あるいはFcAgアンタゴニスト融合物をコードする発現ベクターもしくは他の発現カセットを含む抗原提示細胞等の細胞の量は、当業者によって決定されることができ、本開示の利益を供与する。したがって、一実施形態では、本発明の組成物の有効量が投与される。有効量は、前記抗原を発現する個体中の細胞の増殖を抑制する組成物の量であってもよく、あるいは、個体の生存時間を延ばす量、もしくは個体において抗原の発現に付随する疾患症状を軽減する量であってもよい。本発明の方法は、前記抗原と関連する疾患もしくは障害の治療を目的とする従来の療法とともに行われてもよい。例えば、前記方法が個体において腫瘍抗原に対する免疫応答を増強するために使用される場合、治療様式には、本発明の方法の前に、同時に、もしくは後に行われることができる化学療法、外科的処置および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で提示された実施例によって証明されるように、担がんマウスにおけるTreg細胞と相互作用する癌ワクチンの能力を制限する手段を開発するために、我々はまず、DCsに提示される47LDAペプチド模倣物による機能的な腫瘍特異的細胞応答の発生を、普遍的Thエピトープと協同する線状ポリペプチドとして、あるいは、マウスIgG2aFcフラグメントを有する融合タンパク質として比較した。我々は、47LDAFcγ2a融合タンパク質DCワクチンが、腫瘍特異的CD8T細胞を増大しただけでなく、骨髄破壊的TBIおよびBM移植を受けた担がんマウスへの未処置脾細胞のACT後の一次免疫応答も誘発したことを示した。47LDAFcγ2aワクチン誘発CD8T細胞は、原発腫瘍の増殖を抑制し、および、担がんマウスを微小残存病変の発達から保護した。他方、47LDAポリペプチドDCワクチンによって誘発された保護は、腫瘍増殖の遅延をもたらし、骨髄破壊的な状況でのACT後のみ有意であった。これらの研究の結果は、FcγRsが担がんマウスにおける治療的なワクチン接種の間、T細胞性免疫応答を調節することができるという所見と一致する。47LDADCsによって産生されるものと比較してより高レベルの腫瘍特異的免疫応答を誘発する47LDAFcγ2aDCsの増加した能力に関与するメカニズムは、依然として不明である。IL12を発現する抗原提示細胞が、Treg細胞応答よりむしろタイプ1を刺激する能力を増強したので、LPS誘発成熟後の47LDAFcγ2aDC集団内のIL12発現細胞の増加した数が、この効果に寄与した可能性がある。この観察は、さらに、47LDAFcγ2aDCsにおけるCCL22ケモカインの発現の減少、および、47LDADCワクチンを受けた動物と比較して47LDAFcγ2aDC免疫化マウス中のTreg細胞のより少ない比率によって裏付けられる。我々の結果は、炎症性の環境の特徴が、TeffとTreg細胞活性化の間のバランスに影響を与えることができるという以前の発見と一致する。しかしながら、癌ワクチンのデザインにおいてDC機能の変化が示唆されてきたが、腫瘍関連抗原のミモトープを用いた治療的ワクチン接種の間、腫瘍増殖と関連する免疫抑制を妨げるDC応答の調整が、広範に評価されてこなかったということは注目に値する。したがって、これらの所見は、がんの免疫療法のためのペプチドミモトープの新しい適用に脚光を当てる。活性化および抑制型低親和性FcγRsがエフェクター免疫応答の調節に重要な意味を持つことは十分に確立されている。獲得免疫の誘発におけるそれらの役割は、免疫複合体の形でDCsに抗原を投与する間、活性化抑制型レセプターの機能における変化が、生体内でのDCsの賦活化に影響を与えることができ、且つ、抗腫瘍性T細胞応答を増強することができることを示した。この概念は、抑制型FcγRIIbレセプターの選択的遮断が、ヒトDC成熟および抗体被覆腫瘍細胞に対する免疫を可能にし、およびFcγRIIb欠損マウス由来のDCsが、抗原特異的T細胞を刺激する能力の増加の主要因となりうる共刺激分子のより高い発現を示すという観察によって裏付けられる。しかしながら、巨大なタンパク質キャリアの使用は、ワクチン有効性及び/又は実用的な実行可能性を危険にさらし得る、抗原結合の再現性の観点において困難をもたらす。それゆえ、抗原性のおよびヘルパーエピトープ、並びに、活性化FcγRsへの増強された結合親和性を有するIgG抗体のFc部を包含する合成構築物は、製造および特性評価に関して免疫複合体を超える明白な利点を提供するはずである。これはまた、担がんマウスにおいて、DCsに、特異的CD8CTL応答を効率的に刺激し、拡大する権限を与える47LDAFcγ2a融合タンパク質の能力が、腫瘍免疫療法の有効性の改善をもたらす可能性があることも示唆する。DCワクチンあるいは手術後の抗腫瘍性免疫応答の研究は、Treg細胞が、免疫原性が不十分な腫瘍を有するホストにおけるT細胞記憶の発展への基本的な障害であることを示した。手術は現在のところ固形腫瘍の主要な治療法であるが、メモリーT細胞応答が、手術後の腫瘍の再発および転移の耐久性ある予防のために必要かもしれない。がんを有するたいていの患者で見られるように、我々の研究結果は、手術あるいはDCワクチン単独が、免疫原性の低い腫瘍関連抗原に対する保護を誘発しないことを示した。しかしながら、我々のモデルでは、手術と、リンパ球の枯渇、ACTおよびDCワクチン接種の併用が、長続きする腫瘍保護の発展を可能にする。我々は、腫瘍それ自体が抗原のソースとして働いた可能性を除外できないが、おそらくTregsの不存在下で手術後免疫の誘発の間に多数の腫瘍抗原に対するT細胞応答を刺激しても、47LDAミモトープDCワクチン接種の不存在化で生成した抗腫瘍性免疫は、担がんマウスの生存期間を延ばしただけである。対照的に、骨髄破壊された担がんホストにおける活性化FcγRsを標的とする47LDAFcγ2a融合タンパク質を用いた能動免疫は、原発腫瘍の有意な抑制および自然転移性疾患の発症からの保護をもたらした。生体外で生成したDCsの使用が、腫瘍誘発性のDC機能障害を回避する唯一の機会を提供し、DC特性の正確な操作を可能にするが、患者細胞の生体外操作のための特殊化した細胞培養施設の必要性は、担がんホストの身体内の内在性DCをターゲットにする能力がある無細胞ワクチンを開発する試みを促した。腫瘍抗原あるいはそれらのミモトープを選択的にDCsに送達するために改変されたそのようなワクチンは、なんら生体外処理なしで、インビボのDC極性化を誘発する戦略と併用されることができる。DCsによる分泌および交差提示のために腫瘍病巣に直接導入遺伝子を送達する、rOVV47LDAFcγ2aベクターを用いたウイルス療法アプローチを使用する我々の研究結果は、保護的なTeffの誘発、および、外因性サイトカイン療法、ACT、TBIもしくは生体外操作の不存在化におけるメモリーT細胞の誘発を実証した。TeffsとTregsの間、およびウイルス療法により誘発された抗腫瘍性免疫応答の有効性と長寿命の間のバランスによる腫瘍微小環境内に、ウイルス性に送達された47LDAFcγ2a融合タンパク質の交差提示の効果をより明確にするために、更なる研究が必要とされる。この関連で、エビデンスのいくつかの系統は、VVがTLR2MyD88依存的経路を通じて自然免疫応答を誘発し、炎症性サイトカインの産生をもたらし、そしてTLR非依存的経路が、インビトロおよびインビボでINFβの賦活化を導くことを示す。自然免疫のTLRsの持続的な刺激が、インビボで確立されたTreg媒介耐性を破壊するのに要求され、そしてVVがTLRシグナルを提供できるため、ワクチン媒体としてのVVのこの独特な効能は、宿主防御の賦活化を導くことができ、腫瘍チャレンジからマウスを保護することができる。このように、CD4CD25Tregsの存在下でのウイルスベースのワクチンによるCD8T細胞耐性の破壊の可能性は、rOVV発現47LDAFcγ2a融合タンパク質あるいは他の腫瘍関連の抗原が、インビボでCD4CD25T細胞性CD8耐性を克服するDCワクチンの魅力的な代替案を証明するかもしれないことを示唆する。要約すると、この研究は、免疫エフェクター細胞を活性化するために、および抗炎症性のTreg細胞を誘引する能力を制限するために、DCsによる腫瘍自己抗原の取込みおよびプロセシングを探索する重要性を強調する。我々の知見は、免疫細胞の炎症性vs制御性タイプの選択的賦活化を目的とするがん免疫療法の新しいパラダイムに光を当てる。以下の実施例は、本発明を具体的に説明することを意図し、限定を意図しない。本実施例は、本明細書で提示されるデータを得るために使用された材料および方法の説明を提供する。動物および株化細胞6~8週齢のメスのAJマウスを、JacksonLaboratoryから入手した。実験手順は、ロズウェルパークがん協会の施設内実験動物委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。マウスのNXS2神経芽細胞腫株化細胞は、GD2ネガティブC1300マウスの神経芽細胞腫とGD2ポジティブマウスの後根神経節腫細胞とのハイブリッドである。前記ハイブリッド株化細胞は、そのH2KkポジティブH2Kbネガティブ表現型によってAJマウスと同系のMHCクラスIであることが示された。GD2特異的mAbを分泌する14G2aハイブリドーマ株化細胞は、DrRAReisfeldによって提供された。47LDAFcγ2a融合タンパク質の産生組織プラスミノーゲン活性化因子分泌性のシグナル配列を有する47LDA発現ベクターの作成2つの普遍的なThペプチドPADREAKFVAAWTLKAAA:配列番号3、および、HIVgp120糖タンパク質のV3ループCKRKIHIGPGQAFYT:配列番号4が、47LDA模倣ペプチドとともに他で報告されている。マウスの47LDAFcγ2a融合タンパク質は、EcoRIおよびBglII制限酵素切断部位を使用して、pFUSEmIgG2AaFc1ベクターのhEF1HTLVプロモーターとマウスIgG2aFc領域の間に、47LDAポリペプチドコード配列を挿入することによって作成された。293T細胞の安定な形質移入は、47LDAFcγ2a融合タンパク質コンストラクト、またはリポフェクタミン試薬を使用する偽のベクターを用いて行われ、続いてゼオシン含有培地で選択を行った。47LDAFcγ2a融合タンパク質は、トランスフェクト細胞の培養上清から、プロテインGカラムで精製された。融合タンパク質は、製造者のプロトコルに従い、SDS15PAGEと14G2amAbを用いた免疫ブロット法によって、続いてECLウエスタンブロット検出システムによって分析された。免疫化DCsは、前述の通り、BM前駆物質からインビトロで産生した。簡単に説明すると、BM細胞は、6~8週齢のメスのAJマウスの脛骨および大腿骨から収集し、その後、10ngmlのGMCSFを追加した完全培地中で37°Cで6日間培養した。前記培地は2~3日ごとに補充された。7日目に、ほとんどの非付着性細胞は、DC形態を獲得し、フローサイトメトリー分析によって特定されるように、CD11cが高く、CD80、CD86、CD40およびMHCクラスIIが低かった。DCsは5時間、10μmlの47LDAFcγ2a融合タンパク質または47LDAポリペプチドでパルスされ、成熟を誘発するために1時間、LPSとともにインキュベートされ、洗浄され、マウスに静脈内注射された。20μgのDNAプラスミドコード化IL15およびIL21サイトカインは、ワクチン接種時および5日後に、それぞれ筋肉内注射された。フローサイトメトリー未熟DCsは、ビオチン標識47LDAFcγ2a融合タンパク質または47LDAポリペプチドとともに、続いてストレプトアビジン結合PEとともにインキュベートされた。いくつかの実験で、DCsは以下のmAbsを用いて染色された:抗CD11cFITC、抗CD80PE、抗CD86PE、抗CD40PEまたは抗MHCクラスIIPE。脾細胞は、抗CD4PE、抗CD8PE、抗CD25FITCあるいは関連するアイソタイプコントロールを用いて標識された。特異的な抗体染色の前に、細胞はFcブロッカーとともに10分間インキュベートされた。前記細胞は、001のアジ化ナトリウムと1のFCSを含むHBSS中で二度洗浄され、1のパラホルムアルデヒドで固定され、分析前は暗所で4°Cにて貯蔵された。バックグラウンド染色は、適切な蛍光色素結合もしくは非結合マウスIgG1、IgG2aまたはIgG2bを含むアイソタイプコントロールを用いて評価された。腋窩、上腕リンパ節および脾臓内のTreg細胞の数は、製造者のプロトコルに従って、抗FoxP3AlexaFluor647mAbを用いたCD4CD25リンパ球の細胞内染色によって決定された。INFγあるいはTNFαを分泌するCD4およびCD8脾細胞の数は、抗IFNγPEあるいは抗TNFαPEmAbと協同した抗CD4FITCおよび抗CD8FITCmAbsを用いて決定された。LPS刺激DCsにおけるIL12p70の細胞内発現は、IL12p35サブユニット内のエピトープを検出し、IL12p40と交差反応しないラット抗マウスIL12p70mAbを用いた染色によって測定した。LPS刺激DCsにおけるCCL22の細胞内発現は、ラット抗マウスCCL22mAbを用いた染色によって決定した。47LDAFcγ2a、47LDAポリトープあるいはCD86DCsの選別は、BDFACSAriaフローサイトメーターを用いて実施された。全てのフローサイトメトリー評価は、FACScanもしくはFACSCaliburフローサイトメーターを用いて実施された。前方および側方散乱パラメーターにゲーティング後、少なくとも10000のゲート化イベントがルーチン的に獲得され、CellQuestソフトウェアを用いて分析された。T細胞の養子移入とDCワクチンAJマウスは、図1Aに描写されるように、2×106のNXS2神経芽細胞腫細胞を皮下注射され、15日後、47LDAFcγ2aもしくは47LDAポリトープDC免疫化マウスから単離したCD8強化脾細胞を用いた静脈内注射で治療された。CD8脾細胞は、製造者の説明書に従って、抗マウスCD4および抗マウスCD45RmAbsと結合した常磁性ミクロビーズを使用してネガティブに選択された。単離されたCD8脾細胞は、LPS成熟47LDAポリペプチドもしくは47LDAFc融合タンパク質被覆DCsとともにインキュベートされた。T細胞およびDCsの混合物は、下記の文献に記載されるように、rmIL2の存在下、リンパ球枯渇NXS2担がんマウスに静脈内注射された。担がんマウスにおけるリンパ球減少症は、ACTおよびワクチン接種の一日前に、5Gyの骨髄非破壊的なTBIもしくは9Gyの骨髄破壊的なTBIおよびBM移入によって誘発された。確立された皮下NXS2腫瘍を有するコントロールマウスは、5Gyもしくは9Gyで照射され、且つBM移植された。マウスは、2週間間隔で、下記の文献に記載されるように、IL15およびIL21ベクターの存在下、DCワクチンで免疫化された。腫瘍増殖は、週に一度から三度、マイクロキャリパーを用いて皮下腫瘍を測定し、腫瘍体積を決定することによってモニターされた。播種性疾患の免疫療法のために、NXS2担持マウスは、腫瘍切除時に、骨髄非破壊的なもしくは骨髄破壊的なTBIを受けた。腫瘍切除の1日後、前記マウスは、免疫化された若しくは未処置のマウス由来の脾細胞のACTをDCワクチンとともに受けた。マウスは、2週間間隔で、下記の文献に記載されるように、IL15およびIL21ベクターの存在下、DCワクチンで免疫化された。コントロールマウスは、TBIおよびBM移植有りまたは無しで、原発腫瘍を切除された。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプランマイヤー生存プロットが作成され、有意性が、ログランクMantelCox法を使用して判定された。ワクチン誘発INFγおよびTNFα発現およびT細胞増殖のインビトロ分析47LDAFcγ2aもしくは47LDAポリペプチド被覆DCsで免疫化されたAJマウスから得られた脾細胞は、201の比率にて47LDA発現DCsで一晩刺激された後、INFγおよびTNFα発現について分析された。偽ベクター免疫化マウスから単離された細胞は、コントロールとして利用された。47LDADCおよび47LDAFcγ2aDCワクチンで免疫化されたマウスにおけるTreg細胞の誘発を研究するために、脾臓、腋窩および上腕リンパ節が最後の免疫化の3週間後に免疫化マウスから除去され、抗CD4PE、抗CD25FITCおよび抗FoxP3AlexaFluor647mAbs、または関連するアイソタイプコントロールを用いた染色によってTreg細胞の数が分析された。Teff細胞増殖へのTreg細胞の効果を分析するために、47LDADCもしくは47LDAFcγ2aDCワクチンで免疫化されたマウス由来のCD8T細胞は、37°Cにて10分間、25μMのカルボキシフルオセインサクシニミジルエステルを負荷され、Treg細胞の存在下もしくは不存在下、72時間、47LDA発現同系DCsとともに培養された。細胞は、PE結合抗CD8mAbsで染色され、フローサイトメトリーで分析された。Treg細胞集団は、製造者のプロトコルに従って、CD4CD25調節性T細胞単離キットを用いて単離された。ACTおよびDCワクチン接種後の担がんマウスおよび無腫瘍マウスにおける増殖性CD4およびCD8T細胞応答を分析するために、脾細胞は25μMのCFSEで標識され、47LDA発現DCsとともに72時間インキュベートされた。細胞は、PE結合抗CD4もしくは抗CD8mAbsで染色され、フローサイトメトリーによって分析された。CTLアッセイ脾細胞は、外因性IL2のソースとして、15のT細胞刺激因子中で201の比率にて47LDA発現DCsとともに培養された。刺激の3日後、細胞は分裂され、マウスのrIL2を追加した培地中で培養された。刺激前に、CD8T細胞は、製造者のプロトコルに従ってT細胞富化カラムを使用したネガティブセレクションによって単離された。NXS2腫瘍細胞に対するCTLsの細胞溶解活性は、スタンダード4h51Crリリースアッセイによって5日後に分析された。特異的溶解のパーセントは、次のように算定された:×100。最大リリースは、5のTritonX100の添加によって、溶解された細胞の上清から定量された。自発的リリースは、培地のみとインキュベートされた標的細胞から定量された。腫瘍ウイルス療法に基づく癌ワクチンのための、rOVVs発現高感度緑色蛍光タンパク質および47LDAFcγ2a融合タンパク質の産生本発明における使用に好適なrOVVsを作成できる種々の方法が存在する。ある特定の実演において、rOVVs発現EGFPおよび47LDAFcγ2a融合タンパク質が、VSC20ワクシニアウイルスおよびワクシニアシャトルプラスミドpSELEGFP並びにpCB02347LDAFcγ2aをそれぞれ使用してCV1細胞における相同組換えによって産生された。親ワクシニアウイルスは、VGF遺伝子の代わりにクローン化されたLacZ遺伝子を有するVSC20であった。VSC20ワクシニアウイルスは、米国特許公開公報20070154458号に記述されており、そのVSC20ウイルスに関する記述は参照により本明細書に組み込まれる。pCB02347LDAFcγ2aシャトルプラスミドは、pCB023のEcoRIおよびSmaI制限酵素サイトに47LDAFcγ2a融合タンパク質遺伝子をクローン化することによって産生された。DNA配列検証後、293T細胞トランスフェクタントの培養上清中での47LDAFcγ2a融合タンパク質の分泌が、14G2amAbを用いた免疫ブロット法によって確認された。組換えウイルスの複数のプラークが、BrdU選択によってTK細胞内で単離された。HeLa細胞での増幅後、rOVVEGFPおよびrOVV47LDAFcγ2aウイルスは、ショ糖密度勾配で精製され、力価測定され、NXS2細胞でのインビトロおよびインビボの研究で使用された。rOVVEGFP感染NXS2細胞におけるEGFPの発現は、免疫蛍光顕微鏡によって確認され、一方では、rOVV47LDAFcγ2a感染NXS2細胞からの47LDAFcγ2a融合タンパク質の分泌が、14G2amAbを用いた免疫ブロット法によって決定された。腫瘍ウイルス療法に基づくワクチンのために、AJマウスは、2×106NXS2細胞を皮下注射され、15日後、108プラーク形成単位のrOVV47LDAFcγ2aまたはrOVVEGFPベクターの静脈内注射で治療された。PBSで治療された担がんマウスはコントロールとして使用された。生存時間は、マウスが広範な腫瘍増殖のために犠牲になった時点と定義された。カプランマイヤー生存プロットが作成され、有意性が、ログランクMantelCox法を使用して判定された。統計解析グループ間の差異の統計的有意性が、等しい分散を想定する両側スチューデントt検定を用いて実施された。平均腫瘍増殖の対グループ比較のためのP値は、ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を使用してコンピューターで計算された。カプランマイヤー生存プロットが作成され、生存期間中央値が、マウスのNXS2チャレンジグループについて決定された。複数のグループにわたる生存時間の統計的有意差は、ログランクMantelCox法を用いて評価された。データは、算術的な平均値±標準偏差として表され、ウィンドウズベースのプラットフォーム上でJMPプログラムを用いて分析された。マウス47LDAFcγ2a融合タンパク質の特性評価マウスの47LDAFcγ2a融合タンパク質は、EcoRIおよびBglII制限酵素切断部位を使用して、pFUSEmIgG2AaFc1ベクターのhEF1HTLVプロモーターと、マウスIgG2aFc領域との間のインフレームに、関連するコード配列組織プラスミノーゲン活性化因子分泌性シグナル配列、2つの普遍的なThペプチド、および47LDAミモトープを含むを挿入することによって産生された。無損傷のオープンリーディングフレームの存在を確認するための47LDAFcγ2a構築物の配列決定後、14G2amAbを用いた47LDAFcγ2トランスフェクト293T細胞の免疫蛍光染色と、それに続くフローサイトメトリー分析が、融合タンパク質の発現を判定するためにトランスフェクションから48時間後に行われた。ゼオシン含有培地中で選択された、47LDAFcγ2a安定発現株からの融合タンパク質の分泌は、14G2amAbを用いて培養上清の免疫ブロット法によって確認された。図2Aに示すように、319kDaの顕著なバンドが、47LDAFcγ2aトランスフェクタントから収集された培養上清中で、14G2amAbを用いて検出された。偽プラスミドをトランスフェクトされた細胞から調製された上清にはバンドは存在しなかった。ポジティブコントロールとして分析に含まれた、66kDaの分子量の47LDAポリペプチドは、14G2amAbによってはっきりと認識された。ようするに、これらの結果は、47LDAFcγ2a融合タンパク質と関連して発現されたGD2ミモトープが、14G2amAbによって認識される合成ペプチドの生来の抗原決定基を保持することを示した。BM由来の未熟DCsへの47LDAFcγ2a融合タンパク質および47LDAポリペプチドの結合が、フローサイトメトリー分析によって判定された。図2Bに示すように、50を超えるCD11cDCsが、ビオチン化47LDAFcγ2a融合タンパク質もしくはビオチン標識47LDAポリペプチドと反応した。47LDAFcγ2a融合タンパク質の結合47LDAポリペプチドではなくは、47LDAFcγ2a融合タンパク質とその細胞リガンドの間で特異的な相互作用を示すFc遮断抗体CD1632によって抑制された。しかしながら、LPSの添加が、CD86、CD40およびCD86抗原の表面発現を上方制御するのに必要であったため、FcγRsへの47LDAFcγ2a融合タンパク質の結合が、DC成熟に影響がなかったことは注目に値する。活性化および抑制型FcγRsが、免疫複合体の形でDCsに抗原を投与する間、エフェクター免疫応答の調節に重要な意味を持ち、およびIL12が1型免疫の産生に関与する重要なサイトカインであるので、我々は、47LDAポリペプチドもしくは47LDAFcγ2a融合タンパク質と相互作用するDCsがLPSでの刺激によりIL12p70を発現する能力に差があるかどうか研究した。これらの実験のために、47LDAおよび47LDAFcγ2aDCs並びにそれらのネガティブな対応物が、細胞選別によって得られた。CD86発現に対してポジティブまたはネガティブなDCsが、特異性コントロールとして含まれた。選別されたDC集団は、1μgmlのLPSで一晩刺激され、細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によってIL12p70発現を分析された。図2Cは、同程度レベルのIL12p70が、47LDAおよび47LDADC集団またはCD86抗原発現の存在もしくは不存在で選別されたものにおいて測定されたのに対し、47LDAFcγ2aDCsが、LPSでの刺激後、それらのネガティブ対応物より有意に高いレベルのIL12p70を発現したことを示す。選別され、LPSで刺激された47LDAおよび47LDAFcγ2aDCsにおけるTreg誘引性CCL22ケモカインの平行発現研究は、前者のDC集団における約2倍多い数のCCL22ポジティブ細胞を明らかにした。インビボにおける47LDAFcγ2aパルス樹状細胞の増強された免疫賦活活性LPS刺激47LDAFcγ2aDCおよび47LDADCsの間のIL12とCCL22の発現レベルの差は、これらの細胞が、インビボでTeffおよびTreg細胞と相互作用する能力が異なる可能性が有ることを示唆する。それゆえ、我々は、47LDAFcγ2aおよび47LDADCワクチンを用いたAJマウスの免疫化後の、腫瘍特異的なTh1およびCTL応答の誘発を研究した。各DCワクチンは、2週間間隔で3回静脈内注射によって送達され、これとともにDNAプラスミドコード化IL15およびIL21がワクチン接種時および5日後にそれぞれ筋肉内に送達された。最後の免疫化の3週間後、免疫化されたマウス由来のCD4脾細胞は、47LDA発現DCsで一晩刺激した後、細胞内染色およびフローサイトメトリーによってINFγおよびTNFα産生について分析された。DCsおよびIL15ならびにIL21ベクターを用いて免疫化されたマウスから単離された細胞は、コントロールとして含まれた。図3Cに示すように、IFNγおよびTNFα産生CD4細胞の数は、47LDAFcγ2a融合タンパク質被覆DCsで免疫化されたマウスにおいて、コントロールの動物より4倍以上高く、47LDADCワクチンによって誘発された応答より2倍以上高かった。ET比の広範囲にわたって、47LDAFcγ2a融合タンパク質ワクチン後のIFNγ産生CD4T細胞応答の増加は、NXS2神経芽細胞腫瘍に対するより高いCD8T細胞性細胞傷害活性と関連した。我々は、腋窩、上腕リンパ節および脾臓におけるCD4CD25FoxP3リンパ球のフローサイトメトリー分析によって47LDAおよび47LDAFcγ2aDCワクチン後のTreg細胞の誘発も試験した。47LDA免疫化マウスの腋窩リンパ節では、CD4CD25集団内のFoxP3細胞の絶対数は、031×106から042×106細胞にわたり、47LDAFcγ2aDCワクチンで免疫化された動物と比較して2倍近く高かった。後者のグループのマウスでは、細胞内FoxP3発現がポジティブなCD4CD25リンパ球の数は、017×106から024×106細胞にわたった。Treg細胞の発生頻度における同様の違いは、免疫化マウスの上腕リンパ節と脾臓で検出された。47LDADCおよび47LDAFcγ2aDC免疫化マウスから調製されたCFSE標識CD8リンパ球とTreg細胞が、11の比率で混合され、それぞれLPS成熟47LDADCsおよび47LDAFcγ2aDCsとともに共培養された場合、両方の集団のTreg細胞は、Teff細胞の増殖を抑制した。しかしながら、47LDAFcγ2aDC刺激された培養物におけるエフェクターT細胞の増殖率は、47LDADCsで誘発された刺激と比較して有意に高かった。47LDAFcγ2aDCワクチンとの併用における骨髄破壊的TBIは、ACT治療を増強する47LDAおよび47LDAFcγ2aDCワクチンの治療的有効性を比較するために、我々は、NXS2担癌AJマウスにおいて、抗原経験CD8脾細胞を用いたACT実験を行った。CD8T細胞が、Teff細胞の増殖を誘発するために、およびリンパ球枯渇ホストへの養子移入による二次応答を開始するために、47LDAもしくは47LDAFcγ2aDCワクチンとともに、NXS2担持マウスに静脈内注射された。図5Aは、ACTおよび47LDAポリペプチド被覆DCワクチンに先立つ骨髄非破壊的な投与計画でのリンパ球枯渇が、腫瘍増殖の抑制にバックグラウンド作用を持つことを示す。養子導入CD8T細胞の抗腫瘍有効性は、治療マウスの全生存期間が25日から70日に延長したことから判定されるように、骨髄破壊的なTBI後に増強された。我々は、骨髄破壊的な投与計画が、7LDAFcγ2aDCsとともに送達された養子導入CD8脾細胞との組み合わせで特に効果的であることを見い出した。図5Bに示すように、後者の治療は、未処置マウス由来の同系BMの移植を伴う骨髄破壊的な量のTBIを受けたNXS2担持動物の22において腫瘍増殖の完全寛解をもたらした。骨髄非破壊的な状況において47LDAFcγ2aDCワクチンで刺激されたCD8T細胞を用いた治療は、完全な腫瘍の消散を示さなかったが、コントロール群と比較した際、治療マウスにおいて生存期間の有意な延長があったことは注目に値する。全てのコントロールマウスが、進行性に増大する腫瘍を発症し、25日までに屠殺されなければならなかったので、ACTの抗腫瘍効力は特異的であった。養子導入CD8脾細胞および47LDAFcγ2aDCワクチンによる転移性疾患のコントロール原発腫瘍の切除後、自然転移を起こすNXS2神経芽細胞腫の能力は、播種性疾患をコントロールするために、養子導入CD8脾細胞の有効性を研究するためのモデルを提供した。Treg細胞の枯渇と協同した根治目的の手術が、持続的な腫瘍保護の発展とCD8細胞記憶を可能にするという累積証拠を考慮して、NXS2担癌マウスは、腫瘍切除および抗原経験CD8脾細胞のACT時に骨髄非破壊的なもしくは骨髄破壊的なTBIを受けた。図5Cに示すように、47LDAポリペプチド被覆DCsによって増殖されたCD8T細胞の移入は、骨髄破壊マウスにおいてのみ観察された転移性疾患の進行を遅延した。無腫瘍生存率は、この動物のグループでは観察されなかった。ACTおよび47LDAFcγ2aDCワクチンに先立ち5GyTBIを受けたNXS2チャレンジマウス6匹のうち2匹のみが、50日の治療期間内に自然転移を発生したので、養子導入CD8T細胞の抗腫瘍有効性は、ACTおよび47LDAFcγ2aDCワクチン接種によって有意に増強された。このグループの残りのマウスは、90日の最長生存期間を有し、転移性疾患の進行の遅延を示した。予想通り、養子導入脾細胞の最も高い抗腫瘍有効性は、骨髄破壊的な投与計画と47LDAFcγ2aDCワクチンを用いたACT後に観察された。他方、原発腫瘍が切除され、TBIを受けたコントロールマウスは、疾患の進行のため、40日までに屠殺されなければならなかった。NXS2反応14G2amAbを用いた染色およびRTPCR分析によって判定されるように、転移巣は、主に上腕および腋窩のリンパ節で発達し、および、肝臓、脾臓およびBMではより頻度が低かった。47LDAFcγ2aDCワクチンによって誘発された一次免疫応答による転移性疾患の抑制我々は、次に、治療開始前に原発腫瘍が切除された骨髄破壊マウスへの未処置脾細胞の養子移入後に、転移性疾患を抑制できる抗腫瘍性免疫応答を誘発する、47LDAおよび47LDAFcγ2aDCワクチンの能力を研究した。CD4T細胞は、増殖因子を有するCD8T細胞を提供するため、および抗腫瘍性応答を誘発するためにも要求されるので、これらの実験では、未処置脾細胞の全集団が、ACTのために使用された。図5Eは、NXS2担持マウスにおいてインビボで刺激した未処置のT細胞の測定可能な治療的影響は、抗原経験CD8T細胞によって媒介されたものと比較して低かったものの、20の治療マウスは、47LDAFcγ2aDCワクチンを用いたACT後100日間、腫瘍が無いままであったことを示す。47LDADCワクチンは、たとえより小さい程度でも、抗腫瘍性T細胞応答を誘発する能力もあった。原発腫瘍が切除されたコントロールマウスは、治療の最初の二ヵ月以内に転移性疾患を発症し、NXS2担持マウスにおける47LDAFcγ2aDCワクチンを用いた能動免疫によって誘発される腫瘍特異的T細胞の有意な効果を示した。ACTおよびDCワクチン接種後の、担がんマウスおよび腫瘍の無いマウスにおける細胞応答我々は、次に、ACTおよびDCワクチン後の、担がんマウスおよび腫瘍の無いマウスにおける細胞応答を研究した。治療的な47LDAおよび47LDAFcγ2aDCワクチンの両方が、養子導入される未処置脾細胞と一緒に、原発性NXS2腫瘍の切除後、骨髄破壊マウスに送達され、Teff細胞の誘発を分析された。ACTおよび47LDADCワクチンでの免疫化後、無腫瘍生存率は観察されなかったので、リンパ節に可視の転移巣を有する動物は、脾臓における抗腫瘍性免疫応答について試験された。図6Aに示すように、担がんマウス中のCD4あるいはCD8脾細胞の15未満が、47LDA発現DCsでの72時間の刺激後、インビトロで分裂し、NXS2細胞へのCTL応答は、バックグラウンドレベルであった。対照的に、CD4およびCD8脾細胞の力強い増殖が、ACTおよび47LDAFcγ2aDCワクチンを受けた後で腫瘍の無いマウスにおいて検出された。増殖応答は、NXS2細胞に対する抗腫瘍性CTL活性も伴っていた。rOVV発現47LDAFcγ2a融合タンパク質を用いたウイルス療法に基づく癌ワクチン47LDAFcγ2aDCワクチンの抗腫瘍性効果が照射された担がんホストにおけるACTに限定されないことを決定するために、我々は次に、rOVVワクシニアウイルスによって発現された47LDAFcγ2a融合タンパク質の治療的な有効性を試験した。ワクシニアrOVV47LDAFcγ2aの腫瘍退縮性TKVGF変異体が腫瘍特異的な複製を示すため、融合タンパク質が感染細胞から分泌され、腫瘍退縮部位で、腫瘍浸潤DCsによって交差提示されるであろうことが予測された。並行研究において、NXS2担がんマウスの追加グループが、ウイルス感染したNXS2細胞からリリースされる腫瘍関連抗原によって誘発される保護の程度を決定するために、特異性コントロールとして、rOVVEGFPベクターを注射された。動物は、一週間に一度~三度、皮下腫瘍を測定することによって腫瘍増殖を試験された。図7Aに示すように、コントロールrOVVEGFPベクターを用いて治療されたNXS2担持マウスの約25が、腫瘍が無い状態になった。対照的に、ウイルスベクターの代わりにPBSを用いて治療された全ての担がんマウスは、進行性に増大する腫瘍を発症し、20日までに屠殺されなければならなかった。最も高い抗腫瘍有効性は、rOVV47LDAFcγ2aベクターを用いた腫瘍退縮性免疫ウイルス療法後、担がんマウスで観察された、100日の間60を超える無腫瘍生存率によって特徴付けられる。担がんホストでの免疫記憶細胞の発達への腫瘍ウイルス療法の効果をより総合的に理解するために、rOVVEGFPあるいはrOVV47LDAFcγ2a治療後に少なくとも40日間腫瘍がないままであった、NXS2チャレンジマウスを、106のNXS2細胞を用いて皮下に再チャレンジした。図7Bは、NXS2腫瘍での再負荷で、全てのrOVVEGFP治療マウスが、進行性に増大する腫瘍を発症したことを示す。しかしながら、無処置の動物と比較して、rOVVEGFP治療マウスでの腫瘍増殖の開始には、20日間の遅延があった。この発見は、腫瘍ウイルス療法の間、DCsによるアポトーシス細胞の取込みと、腫瘍抗原の交差提示に起因して抗腫瘍性免疫応答を誘発するrOVVの能力と一致する。他方、6匹のrOVV47LDAFcγ2a治療およびNXS2再チャレンジマウスのうち1匹のみが、腫瘍接種の35日後に、ゆっくり進行する腫瘍を発症し、これはrOVVEGFPもしくはPBS治療マウスと比較して、47LDAFcγ2a誘導免疫の有意な抗腫瘍性の影響を反映している。本実施例は、臨床的に意義のあるマウスモデルにおいて2つの明瞭な腫瘍の成長を阻害するために使用される方法の一実施形態を実証するものである。我々は、CXCR4ケモカインレセプターアンタゴニストである新規な抗がん剤CTCE9908を発現させた。このCXCR4のペプチドアンタゴニストは、SDF1ケモカインのN末端領域の二量体である。CTCE9908は、CXCR4レセプターのCXCL12との相互作用をブロックし、それによって腫瘍転移を減少させる。CXCR4レセプターは、多くの腫瘍細胞タイプで発現される。CTCE9908ペプチドは、カナダのバンクーバーでChemokineTherapeutics社によって開発され、後期のがん患者でフェースIII臨床治験で使用されてきた。我々は、DNAプラスミドあるいは腫瘍退縮性組換えワクシニアウイルスを使用して、活性化マウスおよびヒトのIgG2aとIgG1のFcフラグメント、それぞれとの関連でCTCE9908ペプチドを発現した。天然に存在するジスルフィド結合を有するFcレセプターは、CTCE9908ペプチドの二量体構造を保存するために使用される。したがって、本発明は、それぞれ配列番号6からなる単量体ユニットを空間的に近接させるために、Fc重鎖の間に生じる自然発生のジスルフィド結合を活用する。これは、同じペプチドにおける単量体ユニットの2つのコピーを提供する必要なく、CTCE9908ペプチドの二量体化を模倣する。それは、CTCE9908ペプチドにおけるRKR配列中のKなどのように、連結しているアミノ酸を有する必要性も除去する。さらなる利点は、ここにさらに記載するように、Tヘルパーエピトープとの物理的な関連における前記二量体の提示を含むが、必ずしもこれに限定されない。図8から分かるように、CTCE融合タンパク質のマウスバージョンを用いたマウスの同系および異種移植モデルで行われた我々の実験は、活性化Fc融合タンパク質との関連でCTCE9908ペプチドの抗腫瘍有効性を示した。乳がんおよびストロマ細胞、血管内皮細胞および骨髄由来サプレッサー細胞上のCXCR4を標的にするために、我々は同系マウスにおける非常に攻撃的なトリプルネガティブマウス4T1腫瘍の原発性および転移性増殖の抑制を導く戦略を考案した。無腫瘍生存率を導いた戦略は、CXCR4のアンタゴニストを発現するOVVと腫瘍ウイルス療法との組み合わせであり、その後、腫瘍に栄養を与える血管を標的とする腫瘍血管破壊剤を用いた治療が続く。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、個体に腫瘍血管破壊剤を投与することを含む。一実施形態では、腫瘍血管破壊剤は、当技術分野でASA404と呼ばれている化合物であり、TozerGMKanthouCandBaguleyBCDisruptingtumourbloodvesselsNatRevCancer20055423435に記載されている。ASA404は、市販されている化合物である。例えば、Selleck社が、カタログ番号S1537、製品名DMXAAとしてASA404を提供している。ASA404が誘発する血管シャットダウンの主要なメカニズムは、増加する血管透過性が、腫瘍内で、体液の血管外漏出、血漿の損失および大きな圧力差をもたらし、それが最終的な血流の損失に寄与すると信じられている。この関連で、我々は、ASA404への4T1血管応答の分析のために造影MRIを使用した。画像のパネルは、治療の2時間後に、明らかに、増加した造影剤の血管外漏出を示した。造影剤濃度のさらなる増加は、血管透過性における変化が原因で4時間後となった。我々は、VSC20ワクシニアウイルスおよびワクシニアシャトルプラスミドpSELEGFPとpCB023CXCR4AFcをそれぞれ使用して、CV1細胞での相同組換えによってOVVEGFPおよびOVVCXCR4AFcを作成したMcCartJAWardJMLeeJHuYAlexanderHRLibuttiSKMossBandBartlettDLSystemiccancertherapywithatumorselectivevacciniavirusmutantlackingthymidinekinaseandvacciniagrowthfactorgenesCancerRes20016187518757。融合タンパク質は、OVVCXCR4AFc感染TK細胞の培養上清から精製され、還元および非還元の状況下でウエスタンブロット法によって分析され、前記融合タンパク質が、289kDaのモノマーからなる二量体であることを明らかにした。前記融合タンパク質は、SupT1細胞上に発現したCXCR4レセプターに結合する能力があり、前記結合は、CTCE9908ペプチドを用いてこれらの細胞のプレインキュベーションによって抑制され、このことは両方のリガンドがCXCR4の同じエピトープに結合することを示している。80μmの孔のフィルターを用いた直径24mmのチャンバーにおける4T1細胞のインビトロ遊走アッセイは、CXCR4AFc融合タンパク質あるいはCTCE9908ペプチドのいずれかの添加が、1000ngmlの濃度で使用されたSDF1に向かう腫瘍細胞の遊走を80より多く抑制することを明らかにした。両方のアンタゴニストが、SUPT1細胞におけるSDF1誘導カルシウム動員を抑制する能力もあった。BALBcマウスにおける4T1原発性および転移性増殖の抑制メスのBALBcは、胸部の乳房脂肪体中に、50μlのPBS中7×104の4T1細胞を接種された。100~150mm3の腫瘍体積を有する4T1担持マウスは、OVVEGFPもしくはOVVCXCR4AFc単独で、または前記ウイルスの24時間後腹腔内に送達される最大耐用量のASA404との組み合わせで、静脈内に注射された。今回のASA404送達は、前記ウイルスの4時間前または同時に送達された薬物で治療された動物と比較して最適な抗腫瘍効率を示した。図10Aは、OVVCXCR4AFcもしくはASA404を用いた単独療法は、腫瘍増殖を有意に抑制したが、無腫瘍生存率は、併用療法で治療された動物でのみ達成されたことを示す。OVVEGFPとASA404を用いた治療は、13の生存者をもたらし、一方、OVVCXCR4FcとASA404は、42の腫瘍の無い動物をもたらした。転移性疾患の治療のために、4T1担持マウスV=~200mm3は、腫瘍ウイルス療法を単独でもしくはASA404との併用で受け、腫瘍は8日後に切除された。コントロールマウスは、治療なしで原発腫瘍を切除された。図10Cに示すように、転移性疾患に対する最も高い保護は、OVVCXCR4FcとASA404の組み合わせで治療された動物で観察された。腫瘍ウイルス療法またはASA404治療単独では、保護効果はより小さかった。生存特性における変化に対応して、治療の4日後に切除された4T1腫瘍中のGr1CD11bMDSCsの数は、コントロール動物での数とは異なった。図10Dに示すように、MDSCsの数は、OVVCXCR4AFc治療後、コントロール腫瘍と比較して、4倍程度低かった。対照的に、ASA404治療後の腫瘍は、MDSCsの最も高い蓄積を含んだ。これは、薬剤による炎症が原因で末梢からのMDSCsの遊走が増加するか、血管の損傷のためにこれらの細胞が腫瘍を離れることができないか、いずれかに起因する可能性が有る。ASA404治療腫瘍におけるSDF1の高レベルおよびOVVCXCR4AFc治療後のその低下した発現は、前者の可能性をサポートする。このように、腫瘍微小環境に存在するがん関連線維芽細胞におけるSDF1の発現が、パラクリン、および内分泌性メカニズムの両方を介して腫瘍血管新生を誘導することによって原発腫瘍増殖を促進するので、本発明の方法によるCXCR4のターゲティングは、悪性の腫瘍増殖および遠隔転移を抑制するのに効果的であると予期されることが、当業者に認識されるであろう。当業者は、前述した内容から、様々な実施形態において本発明が、少なくとも3つの独特の試薬を利用し、かつそれぞれが作用の直接的または間接的メカニズムを通して腫瘍増殖を抑制する特徴的な役割を果たすことができることを認識するであろう。理論に拘束されることを意図しないが、腫瘍増殖の破壊は、主に、腫瘍退縮性ワクシニアウイルスによって発揮される悪性細胞への細胞溶解効果、およびASA404による腫瘍血管系のシャットダウンを通じて達成され、一方では、間接的な抗腫瘍効果が、腫瘍とストロマ細胞間のクロスコミュニケーションを妨げることによって、一部分において、炎症およびCXCR4レセプターの標的化を通じて、達成されると考えられる。我々は、この戦略が生存期間、特に、同系マウスの高転移性マウス4T1乳がんの、手術後の移転性パラダイムにおいて、深刻な影響を持つことを示す。我々は、悪性細胞とストロマ細胞の両方を攻撃する併用療法が、より効果的であり、形質転換細胞に持続性の獲得免疫を誘発することもできると予期する。前述の実験は、本発明を具体的に説明することを目的とする、当業者は、本発明の精神を逸脱することなく、マイナーな変更が可能であることを理解するであろう。