"ヒトモノクローナル抗SOD1抗体であって、好ましくは、ミスフォールドまたは凝集SOD1に結合できることを特徴する;ならびに生理的SOD1二量体に結合し、生理的SOD1二量体よりミスフォールドもしくは凝集SOD1を優先的に認識する、または生理的SOD1二量体を実質的に認識しない;ならびに/あるいは好ましくはヒト野生型およびマウスSOD1に結合する抗体。アミノ酸配列DGVADVS配列番号2、GGPKDEERHVG配列番号51、LKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNT配列番号52、IIGRTLV配列番号53、LGNVTADKDGV配列番号54、HEKADDLGKGGNEES配列番号55、EDSVISL配列番号56、KTGNAGS配列番号57、LGNVTADKDGV配列番号58またはGGPKDEE配列番号59を含む、或いはこれらのいずれかから成るSOD1エピトープに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。その可変領域に、図1A~1Lのいずれか1つに図示する少なくとも1つの相補性決定領域CDRを含む、好ましくは、図1A~1Lのいずれか1つに図示するVHおよび/またはVL領域のアミノ酸配列を含む、請求項1もしくは2に記載の抗体またはそのSOD1結合フラグメント。請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体とSOD1への特異的結合について競合する抗体または抗原結合分子。キメラマウス-ヒトもしくはマウス化抗体ならびに/または一本鎖FvフラグメントscFv、Fab’フラグメント、FabフラグメントおよびFab’2フラグメントから成る群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の結合ドメインまたは可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチド。場合によっては、前記結合分子の他の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドとの組み合わせで、請求項6に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。請求項6に記載のポリヌクレオチドまたは請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。i検出可能に標識されており、好ましくは、その検出可能標識が、酵素、放射性同位体、蛍光体および重金属から成る群より選択される;ならびに/またはii薬物に付けられている、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。請求項1から5もしくは9のいずれか一項に記載の抗体、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載のベクターまたは請求項8に記載の細胞を含む組成物であって、好ましくは、i医薬組成物であり、および医薬的に許容される担体をさらに含み、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症の治療に有用な追加の薬剤をさらに含む、またはii診断用組成物であり、免疫または核酸ベースの診断方法に従来使用されている試薬を場合により含む、組成物。被験体における筋萎縮性側索硬化症の予防的もしくは治療的処置に使用するための、または筋萎縮性側索硬化症の進行もしくは筋萎縮性側索硬化症の処置に対する反応のモニタリングに使用するための、請求項1から5もしくは9のいずれか一項に記載の抗体またはそれらのいずれか1つの結合特異性と実質的に同じ結合特異性を有するSOD1結合分子、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載のベクターあるいは請求項8に記載の細胞。被験体における筋萎縮性側索硬化症の進行を診断またはモニターする方法であって、診断すべき被験体からのサンプル中のミスフォールドまたは凝集SOD1の存在を、請求項1から5または9のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体を用いて判定することを含み、ミスフォールドまたは凝集SOD1の存在が、筋萎縮性側索硬化症の指標となり、および生理的SOD1二量体のレベルと比較してミスフォールドまたは凝集SOD1のレベルの増加が、該被験体における筋萎縮性側索硬化症の進行の指標となる方法。ヒトまたは動物体内のSOD1の体内検出、または該SOD1への治療薬および/もしくは診断薬の標的化に使用するためのSOD1結合分子であって、好ましくは、該生体内画像診断が、陽電子放射断層撮影PET、単一光子放射断層撮影SPECT、近赤外NIR光イメージングまたは磁気共鳴画像診断MRIを含む、請求項1から5または9のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも1つのCDRを含むSOD1結合分子。請求項1から5または9のいずれか一項に記載の抗体によって特異的に認識されるSOD1のエピトープを有するペプチドであって、好ましくは、請求項2に記載のアミノ酸配列、または1つ以上のアミノ酸が置換、欠失および/もしくは付加されているその修飾配列を含みまたは該配列から成り、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体によって認識されるペプチド。筋萎縮性側索硬化症の進行の診断またはモニタリングに有用なキットであって、請求項1から5もしくは9のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体またはそれらのいずれか1つの結合特異性と実質的に同じ結合特異性を有するSOD1結合分子、請求項6に記載のポリヌクレオチド、請求項7に記載のベクター、あるいは請求項8に記載の細胞、ならびに/あるいは請求項14に記載のペプチドを、場合により試薬および/または使用説明書と共に含むキット。以下の実施例は、本発明をさらに例証するものであるが、いかなる点においても本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。実施例1から7における下記実験を、クローニングした抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3およびNI-204.25H3、すなわち、ヒト可変重および軽鎖の生殖細胞系GL配列に合わせていない枠組み1FR1Ig可変領域に関して例証し、説明する;図1参照。材料および方法本明細書において用いるものなどの従来の方法についての詳細な説明は、引用文献の中で見つけることができる;BeersおよびBerkowにより編集されたTheMerckManualofDiagnosisandTherapy、第17版MerckCo.、Inc.2003も参照されたい。本発明の実施は、別の指示がない限り、当業者の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えDNA、および免疫学の従来の技術を用いることとなる。本発明の実施に有用な一般技術のさらなる詳述について、実施者は、細胞生物学および組織培養に関する標準的な教科書および総説を参照することができる;本実施例に引用する参考文献も参照されたい。分子生化学および細胞生化学に関する一般的方法は、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第3版Sambrookら、HarborLaboratoryPress2001;ShortProtocolsinMolecularBiology、第4版Ausubelら編、JohnWileySons1999;DNACloning、第IおよびII巻Glover編、1985;OligonucleotideSynthesisGait編、1984;NucleicAcidHybridizationHamesおよびHiggins編、1984;TranscriptionAndTranslationHamesおよびHiggins編、1984;CultureOfAnimalCellsFreshneyおよびAlan、Liss,Inc.、1987;GeneTransferVectorsforMammalianCellsMillerおよびCalos編;CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology、第3版Ausubelら編;およびRecombinantDNAMethodologyWu編、AcademicPress;GeneTransferVectorsForMammalianCellsMillerおよびCalos編、1987、ColdSpringHarborLaboratory;MethodsInEnzymology、第154および155巻Wuら編;ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress、1986;Perbal、APracticalGuideToMolecularCloning1984;thetreatise,MethodsInEnzymologyAcademicPress,Inc.、N.Y.;ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyMayerおよびWalker編、AcademicPress、London、1987;HandbookOfExperimentalImmunology、第I-IV巻WeirおよびBlackwell編、1986;ProteinMethodsBollagら、JohnWileySons1996;Non-viralVectorsforGeneTherapyWagnerら編、AcademicPress1999;ViralVectorsKaplittおよびLoewy編、AcademicPress1995;ImmunologyMethodsManualLefkovits編、AcademicPress1997;ならびにCellandTissueCulture:LaboratoryProceduresinBiotechnologyDoyleおよびGriffiths、JohnWileySons1998のような標準的教科書の中で見つけることができる。本開示において言及する遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、供給業者、例えば、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-AldrichおよびClonTechから入手できる。細胞培養および培地回収に関する一般技術は、LargeScaleMammalianCellCultureHuら、Curr.Opin.Biotechnol.81997、148;Serum-freeMediaKitano、Biotechnology171991、73;LargeScaleMammalianCellCultureCurr.Opin.Biotechnol.21991、375;およびSuspensionCultureofMammalianCellsBirchら、BioprocessTechnol.191990、251;ExtractinginformationfromcDNAarrays、Herzelら、CHAOS112001、98-107に概説されている。SOD1特異的B細胞の同定方法およびそれぞれの抗体のクローニング方法特に記載のない限り、SOD1特異的B細胞の同定、および所望の特異性を提示する抗SOD1抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組み換え発現および機能の特性付けは、一般に、国際公開第WO2008/081008号として公開された国際出願第PCT/EP2008/000053号の実施例および補足的方法の部に記載されているとおりに行った、または行うことができ、該参考文献の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。SOD1特異的B細胞の同定および所望の特異性を提示するSOD1抗体の分子クローニングならびにそれらの組み換え発現および機能の特性付けのための新規方法を本願の中で提供する。上で説明したように、本発明の一実施形態では、単一またはオリゴクローナルB細胞の培養物を培養し、該B細胞によって産生された抗体を含有する該培養物の上清を、その中の新規抗SOD1抗体の存在および親和性についてスクリーニングする。このスクリーニング工程は、国際公開第WO2004/095031号パンフレットこの開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれているに記載されているような感受性組織アミロイド班免疫反応性TAPIRアッセイ段階;実施例4に記載し、図6に示すような、突然変異ヒトSOD1形態を発現するトランスジェニックマウスの脊髄組織を用いてSOD1の病的凝集体についてスクリーニングする段階;類似に実施例5に記載し、図7に示すような配列番号1によって表されるアミノ酸配列のSOD1に由来するペプチドと抗体NI-204.10D12についてのエピトープ立体構造実験によるペプチドの結合についてスクリーニングする段階;配列番号1によって表される前記アミノ酸配列の完全長SOD1の結合についてスクリーニングし、国際公開第WO2008/081008号パンフレットに記載されているように、ならびに実施例1に記載し、図2、5および7に示すように、結合が検出される抗体または該細胞を産生する細胞を単離する段階を含む。SOD1抗原組み換えヒトSOD1は、Biomolドイツ国ハンブルクから購入した。ヒト赤血球からの野生型SOD1生理的二量体および他の全ての試薬は、別途言及しなければSigma-Aldrichスイス国ブーフスから購入した。ヒトSOD1抗体スクリーニングELISA:被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42、pH9.6中3.3μg/mLまたは5μg/mLの濃度に希釈した組み換えヒトSOD1Biomol、ドイツ国ハンブルクまたはBSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスのいずれかで96ウェルマイクロプレートCorningを一晩、4°Cで被覆した。あるいは、被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中34μg/mLの濃度の体外酸化ヒトSOD1で被覆した96ウェルマイクロプレートCorningを使用する。プレートをPBS-TpH7.6中で洗浄し、2BSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスを含有する、PBS/0.1Tween-20を用いて1時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。B細胞調整培地を記憶B細胞培養物プレートからELISAプレートに移し、1時間、室温でインキュベートした。ELISAプレートをPBS-T中で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP接合抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体JacksonImmunoResearch、英国ニューマーケットを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。培地中に含有された抗体の、BSAへの結合ではなく、組み換えSOD1への結合を示したB細胞培養物のみを、抗体クローニングに付した。MULTI-ARRAY登録商標マイクロプレートスクリーニング標準96ウェル10-SpotMULTI-SPOTプレートMesoScaleDiscovery、米国を、PBS中30ug/mLのSOD1Biomol、ドイツ国ハンブルクで被覆した。3BSAを含有するPBS-Tで非特異的結合部位を1時間、室温でブロックし、その後、B細胞調整培地と共に1時間、室温でインキュベートした。プレートをPBS-T中で洗浄し、その後、SULFO-Tag接合抗ヒトポリクローナル抗体MesoScaleDiscovery、米国と共にインキュベートした。PBS-Tでの洗浄後、SECTORImager6000MesoScaleDiscovery、米国を使用する電気化学発光測定により、抗体の結合を検出した。SOD1抗体の分子クローニング記憶B細胞を含有するサンプルを健常ヒト被験体から得た。選択された記憶B細胞培養物の生B細胞を回収し、mRNAを調製する。その後、ネステッドPCRアプローチを用いて、免疫グロブリン重および軽鎖配列を得る。ヒト免疫グロブリン生殖細胞系レパートリーの全ての配列ファミリーを表すプライマーの組み合わせを、リーダーペプチド、VセグメントおよびJセグメントの増幅に使用する。5’末端にはリーダーペプチド特異的プライマーを、および3’末端には定常領域特異的プライマー使用して、第一ラウンド増幅を行うSmithら、NatProtoc.42009,372-384.重鎖およびカッパ軽鎖のための第二ラウンド増幅は、5’末端にはVセグメント特異的プライマーを、および3’末端にはJセグメント特異的プライマーを使用して行う。ラムダ軽鎖のための第二ラウンド増幅は、5’末端にはVセグメント特異的プライマーを、および3’末端にはC領域特異的プライマーを使用して行うMarksら、Mol.Biol.2221991、581-597;deHaardら、J.Biol.Chem.261999,18218-18230.所望の特異性を有する抗体クローンの同定を、完全抗体の組み換え発現に基づくELISAでの再スクリーニングによって行う。完全ヒトIgG1抗体またはキメラIgG2a抗体の組み換え発現は、正しい読み枠内の可変重鎖および軽鎖配列の発現ベクターへの挿入により、該発現ベクターが、リーダーペプチドをコードする配列を該可変領域配列の5’末端に、および適切な定常ドメイン単数または複数をコードする配列を3’末端に補足することによって果たされる。そのために、前記プライマーは、前記可変重および軽鎖配列の抗体発現ベクターへのクローニングを助長するように設計された制限部位を含有した。シグナルペプチドとヒト免疫グロブリンガンマ1またはマウス免疫グロブリンガンマ2aの定常ドメインとを有する重鎖発現ベクターにインフレームの免疫グロブリン重鎖RT-PCR産物を挿入することによって、重鎖免疫グロブリンを発現させる。シグナルペプチドとヒトカッパ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを供給する軽鎖発現ベクターにインフレームのカッパ軽鎖RT-PCR産物を挿入することにより、カッパ軽鎖免疫グロブリンを発現させる。シグナルペプチドとヒトまたはマウスラムダ軽鎖免疫グロブリンの定常ドメインとを供給するラムダ軽鎖発現ベクターにインフレームのラムダ軽鎖RT-PCR産物を挿入することにより、ラムダ軽鎖免疫グロブリンを発現させる。Ig重鎖発現ベクターおよびカッパまたはラムダIg軽鎖発現ベクターのHEK293またはCHO細胞またはヒトもしくはマウス起源の任意の他の適切なレシピエント細胞系統への同時トランスフェクションにより、機能的組み換えモノクローナル抗体を得る。その後、標準的なプロテインカラム精製を用いて調整培地から組み換えヒトモノクローナル抗体を精製する。一過的にトランスフェクトされた細胞または安定的にトランスフェクトされた細胞いずれかを使用して、無制限量の組み換えヒトモノクローナル抗体を産生することができる。直接Ig発現ベクターを使用すること、またはIg可変領域を異なる発現ベクターに再クローニングすること、いずれかによって、組み換えヒトモノクローナルを産生する細胞系統を確立することができる。Fab、Fab2およびscFvなどの誘導体もこれらのIg可変領域から産生することができる。抗体マウスモノクローナル抗SOD1抗体72B1SantaCruzBiotechnology、米国サンタクルーズおよびウサギモノクローナル抗SOD1抗体EPR1726Epitomics、米国バーリンゲームを製造業者のプロトコルに従って使用した。組み換えヒトまたはキメラSOD1抗体NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3,NI-204.34A3およびNI-204.25H3は、本発明の抗体である。別の言明がない限り、それらをHEK293またはCHO細胞において発現させ、調整培地から精製し、その後の用途に直接使用した。実施例1から4では、本発明の精製組み換え抗体を使用した。ダイレクトELISA炭酸塩ELISA被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中3.3/mLの濃度に希釈した組み換えヒトSOD1タンパク質Biomol、ドイツ国ハンブルクで、4°Cで一晩、96ウェルマイクロプレートCostar、Corning、米国を被覆した。2BSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスと0.5Tween20とを含有するPBSを用いて2時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。HRPと接合したロバ抗ヒトIgGg抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットを使用して本発明のヒト抗体NI-204.10D12、NI-204.9F6、NI-204.12G7およびNI-204.10A8の結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。GraphPadPrismソフトウェア米国サンディエゴを使用する非線形回帰により、ED50値を推定した。トランスジェニックマウスB6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスを使用して、本発明のSOD1抗体およびそれらの結合特異性を有する分子を検証した。前記トランスジェニックマウス系統は、ALSについての非常によく確立され、特性付けされているマウスモデルである。このALSマウスモデルの脊髄に関する顕著な神経病理学的特徴は、後角でより前角ならびに白質の前および後柱でのほうが見つけられる頻度が高い、ヒト筋萎縮性側索硬化症の際に見られるものに類似した神経フィラメントに富むスフェロイドの存在;免疫反応性神経フィラメントに富む封入体で満たされた肥厚ジストロフィー性神経突起の存在;神経細胞体の空胞、グリア増殖症および星状細胞増多症の存在を特徴とする運動ニューロン変性である。スーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質の異常凝集体から主として成る、細胞内分散封入体、レヴィー小体様封入体および細胞外凝集体が、追加の顕著な神経病理学的特徴である。実施例1ヒトSOD1抗体の標的および結合特異性の検証単離された抗体の認識標的としてのSOD1を検証するために、上で説明したようにダイレクトELISAアッセイを行った。例示的組み換えヒトNI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.9F6およびNI-204.10A8抗体については、炭酸塩ELISA被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中3.3μg/mLの濃度に希釈した、組み換えヒトSOD1Biomol、ドイツ国ハンブルクでまたはBSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスで96ウェルマイクロプレートCostar、Corning、米国を被覆し、該抗体の結合効率を試験した。ELISAにより、例示的NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.9F6およびNI-204.10A8抗体は、ヒトSOD1に特異的に結合する。BSAへの結合は観察されなかった;図2参照。例示的抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.9F6およびNI-204.10A8の半最大有効濃度EC50の決定のために、様々な抗体濃度で追加のダイレクトELISA実験を行った。炭酸塩ELISA被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中3.3μg/mLの濃度に希釈した組み換えヒトSOD1Biomol、ドイツ国ハンブルクで96ウェルマイクロプレートCostar、Corning、米国を被覆し、前記抗体の結合効率を試験した。HRPと接合したロバ抗ヒトIgGg抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。GraphPadPrism米国サンディエゴソフトウェアを使用する非線形回帰により、ED50値を推定した。組み換えヒト由来抗体NI-204.10D12、NI-204.10A8およびNI-204.12G7は、高親和性で組み換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ1と結合し、それぞれ10.0nM、2.7nMおよび0.4nMのEC50を有する。抗体NI-204.9F6は、組み換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ1に結合し、ナノモル範囲104.8nMのEC50を有する;図3参照。したがって、NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8およびNI-204.9F6抗体は、家族性ALSのための適したヒト由来候補薬であり、スーパーオキシドジスムターゼ1突然変異体を過発現する確立されたトランスジェニックマウスモデルでそれらを研究することができる。実施例2ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1SOD1の漸増被覆濃度についての、したがって立体構造エピトープの形成の選好についてのEC50分析立体構造エピトープへのNI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7およびNI-204.9F6の結合能力を判定するために、被覆用緩衝液中、異なる4つの被覆濃度0.1;1;10または30μg/mLのヒト組み換えSDO1Biomol、ドイツ国ハンブルクを用いてダイレクトELISA実験を行った。一次抗体ヒトNI-204.10D12、ヒトNI-204.10A8、ヒトNI-204.9F6およびマウスモノクローナル抗体SOD-172B1SantaCruzBiotechnology、米国サンタクルーズを、示されている濃度図4に希釈し、1時間、室温でインキュベートした。HRPと接合したヤギ抗マウスIgG抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットまたはロバ抗ヒトIgGgJacksonimmunoResearch、英国ニューマーケット抗体いずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。GraphPadPrism米国サンディエゴソフトウェアを使用する非線形回帰により、ED50値を推定した。ダイレクトSOD1ELISAを用いて、低および高被覆濃度のヒト組み換えSOD1について、抗体の作用強度を示す半最大有効濃度ED50を判定した。24nMのEC50を有する組み換えNI-204.10D12の高い親和性が、高いヒトSOD1タンパク質被覆密度10または30μg/mLについて観察された図4AおよびF。より低いヒトSOD1被覆濃度で親和性の実質的降下が観察され、NI-204.10D12についてはEC50が相応じて25倍近くまで増加した図4AおよびF。0.4nMのEC50を有する組み換えNI-204.12G7の非常に高い親和性結合が、高いヒトSOD1タンパク質被覆濃度10または30μg/mLについて観察された図4DおよびF。より低いヒトSOD1被覆濃度で親和性の実質的降下が観察され、NI-204.12G7についてはEC50が相応じて195倍近くまで増加した図4DおよびF。対照的に、NI-204.10A8抗体は、既に低いヒトSOD1タンパク質被覆密度0.1および1μg/mLで高結合性で結合し、それぞれ96nMおよび19nMのEC50を有する図4BおよびF。10μg/mLのヒトSOD1タンパク質被覆濃度でNI-204.10A8の結合親和性のさらなる増加が観察され、EC50は2nMに増加した図4BおよびF。NI-204.9F6抗体は、NI-204.10A8抗体の結合特性に非常に類似している組み換えヒトSOD1タンパク質への結合特性を示す図4C。しかし、NI-204.9F6結合親和性は、NI-205.10A8について判定された結合親和性よりはるかに低い図4B、CおよびF。市販SOD-172B1抗体は、より低いヒトSOD1被覆密度で結合親和性の強い増加を示さなかった図4D。ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1被覆濃度を増加させるNI-204.10D12のEC50分析は、高いSOD1被覆濃度で親和性の強い獲得を明示した。24nMのEC50が10μg/mLの被覆で測定されたが、この値は、低いSOD1被覆密度0.1μg/mLについては25倍近くに増加した。これは、親和性の相当な降下を示唆する。NI-204.10D12に類似して、NI-204.12G抗体のEC50分析は、高いSOD1被覆濃度で親和性の非常に強い獲得を明示した。0.4nMのEC50が10μg/mLの被覆で測定されたが、この値は、低いSOD1被覆密度0.1μg/mLについては195倍近くに増加した。これは、親和性の相当な降下を示唆する。これらの発見は、ELISAプレート上での高い局所濃度の組み換えヒトSOD1ついての起こり得る自然凝集によって説明される可能性が高く、ならびにSOD1ミスフォールディングまたは凝集体形成により露出されるNI-204.10D12およびNI-204.12G7抗体のエピトープを示す。対照的に、NI-204.10A8抗体の高いSOD1被覆濃度10μg/mLでの親和性の獲得と共に低密度被覆0.1μg/mLでの高い親和性結合は、この抗体が、生理的タンパク質立体構造で存在するヒトSOD1のエピトープを認識できることを示す。NI-204.9F6は、全てのSOD1濃度でNI-204.10A8より低い結合親和性と、高い被覆濃度でのわずかな親和性獲得を示し、これは、この抗体が、生理的立体構造で存在するヒトSOD1のエピトープも認識することができることを示唆している。実施例3生理的SOD1二量体へのおよび体外ミスフォールド/凝集SOD1への結合分析金属触媒酸化反応を用いて体外スーパーオキシドジスムターゼ1凝集を誘導したRakhitら、J.Biol.Chem.2792004、15499-504。ヒト赤血球からの野生型SOD1二量体および多の全ての試薬は、Sigma-AldrichSigma-Aldrich、スイス国ブーフスから購入した。凝集のために、4mMアスコルビン酸と0.2mMCuCl2とを含有する10mMTris酢酸緩衝液、pH7.0中で10μMヒトSOD1を48時間37°Cでインキュベートした。対照として、10μMヒトSOD1を10mMTris酢酸緩衝液、pH7.0中で48時間、37°Cでインキュベートした。生理的ヒトSOD1二量体または体外凝集ヒトOSD1二量体のいずれかを被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中34μg/mLの濃度で用いて96ウェルマイクロプレートCorningを被覆した。2BSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスを含有する、PBS/0.1Tween登録商標-20を用いて1時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。一次抗体ヒトNI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6およびマウスモノクローナル抗体SOD-172B1SantaCruzBiotechnology、米国サンタクルーズを、示されている濃度に希釈し、1時間、室温でインキュベートした。HRPと接合したヤギ抗マウスIgG抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットまたはロバ抗ヒトIgGg抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットいずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。GraphPadPrismソフトウェア米国サンディエゴを使用する非線形回帰により、ED50値を推定した。ヒトNI-204.10D12図5AおよびNI-204.12G7図5C抗体は、ミスフォールド/凝集ヒトSOD1に優先的に結合し、それぞれ15nMおよび3.6nMのEC50を有する。ヒトNI-204.9F6図5D抗体は、ミスフォールド/凝集ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1にわずかに優先的に結合し、127nMのEC50を有する。これらの発見は、NI-204.10D12、NI-204.12G7およびNI-204.9F6抗体が、生理的形態ではなくミスフォールド/凝集形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ1の病理学的に意味のある立体構造の、露出されるヒトSOD1のエピトープを優先的に標的にすることを示唆している。対照的に、NI-204.10A8抗体は、ヒト生理的SOD1二量体およびミスフォールド/凝集ヒトSOD1と同等の親和性で結合し図5B、それぞれ、19.1nMおよび29.5nMのEC50を有する。これらの発見は、ミスフォールド/凝集形態および生理的形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ1の病理学的に意味のある立体構造両方の、露出されるヒトSOD1のエピトープを標的にすることを示唆している。市販SOD-172B1抗体は、ヒト生理的SOD1二量体およびミスフォールド/凝集ヒトSOD1にほぼ同等の親和性で結合する;図5E参照。金属触媒酸化によって誘導されるSOD1凝集体は、ALS生体内スーパーオキシドジスムターゼ1凝集体でのものと同一の特性を有する。NI-204.10D12図5AおよびNI-204.12G7図5Cは、ミスフォールド/凝集SOD1などの治療上意味のある病的形態のヒトSOD1への顕著な結合を示す。SOD1凝集体への結合は、生理的二量体より選好されるようである。NI-204.9F6図5Dは、治療上意味のある病的形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ1へのわずかに優先的な結合を示す。しかし、NI-204.9F6抗体のミスフォールド/凝集SOD1に対する結合親和性は、NI-204.10D12およびNI-204.12G7抗体について判定された親和性より低い。興味深いことに、NI-204.10A8抗体図5Bは、NI-204.10D12、NI-204.12G7およびNI-204.9F6抗体とは対照的に、生理的二量体よりSOD1凝集体への優先的結合を示さない。この抗体は、低ナノモル範囲で、高親和性で、両方のSOD1種に結合する。これらの発見は、病理学的に意味のある立体構造のSOD1タンパク質に標的化されるヒト由来NI-204.10D12およびNI-204.12G7抗体の治療上魅力的なプロファイル、ならびにNI-204.10A8抗体がNI-204.10D12およびNI-204.12G7抗体のものとは異なる生化学的特性を保有することを強調する。したがって、ヒト由来NI-204.10A8は、分子NI-204.10D12およびNI-204.12G7のものとは異質の特性を有する、ALSのための可能性のある治療抗体に相当する。さらに、これらの発見は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1の被覆濃度を増加させる前記結合分析と一致する。実施例4トランスジェニックマウス脊髄組織におけるSOD1の病的凝集体に結合するNI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8およびNI-204.9F6の結合の評価疾病末期のB6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスの脊髄をリン酸緩衝4パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋し、5μm切片に切断した。ギ酸前処理後、切片を異なる抗スーパーオキシドジスムターゼ1抗体:キメラNI-204.10D1250nM、ヒトNI204-10A850nM、ヒトNI-204.12G720nM、ヒトNI-204.9F650nMおよびEPR1726抗SOD1Epitomics、1:10000と共にインキュベートし、その後、ビオチン化ロバ抗マウスまたはビオチン化ロバ抗ヒトまたはビオチン化ロバ抗ウサギ二次抗体JacksonImmunoResearchEuropeLtd;1:250のいずれかと共にインキュベートした。抗体シグナルをVectastainABCキットVectorLaboratoriesで増幅し、ジアミノベンジジンDakoで検出した。スーパーオキシドジスムターゼ1へのNI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10D12およびNI-204.9F6の結合を疾病末期のB6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスからの脊髄切片の免疫組織化学分析により特性付けした。NI-204.10D12は、主として、SOD1病態ならびに細胞内分散封入体のびまん性染色を示す;図6A参照。NI-204.12G7は、細胞質SOD1封入体、主として運動ニューロンにおけるもの、および細胞外SOD1凝集体を含む、SOD1病態の顕著な染色を示す図6C。NI-204.10A8は、細胞質SOD1封入体、主として運動ニューロンにおけるもの、および細胞外SOD1凝集体を含む、SOD1病態の顕著な染色を示す図6B。さらに、この抗体は、脊髄組織の強いびまん性染色によって証明されるように、高感度で病的SOD1も認識するようである図6B。これらの発見は、前記3つの抗体の生化学的結合特性と一致する:ミスフォールド/凝集SOD1への強い結合選好性を示すNI-204.10D12およびNI-204.12G7抗体、ならびに生理的SOD1二量体およびミスフォールド/凝集SOD1への同等の結合親和性を示すNI-204.10A8抗体。NI-204-9F6抗体は、被験染色条件下で非常に弱く反応し、主として細胞内SOD1および細胞内分散SOD1封入体を検出する;図6D参照。ヒトSOD1を特異的に検出するが、マウスSOD1を検出しない、市販EPR1726抗SOD-1抗体は、生理的SOD1および病的SOD1凝集体両方に高感度で結合する;図6E。本発明の全ての抗体を試験するために、上記の実験を反復した。図9に示すように、ヒト由来SOD1特異的抗体は、B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスの腰部脊髄において、異なるSOD1病態パターン、例えば、分散されたパターン、細胞内封入体パターン、細胞質封入体パターンおよびより大きいパターン、主として細胞外のSOD1凝集体パターンを明示した。図9に示した全ての抗体は、適切な抗体濃度を用いると、細胞内分散封入体、びまん性細胞質構造および空胞構造の染色を示す。参照抗体B8H10との比較対象となるより大きな凝集体の染色図9Mにより、本発明の抗体は2群に分けられる:抗体NI-204.12G7図9B、NI-204.11F11図9C、NI-204.6H1図9F、NI-204.12G3図9G、NI-204.7G5図9H、NI-204.25H3図9I、NI-204.34A3図9JおよびNI-204.7B3図9Kは、脊髄腹側角においてこれらの凝集体を染色し、これに対してNI-204.10D12図9A、NI-204.10A8図9D、NI-204.67E12図9Eは、これらの構造を染色せず、可溶性、ミスフォールド形態の突然変異体ヒトSOD1Boscoら、2010、NatNeuroscience1311;1396-1403に特異的である参照抗体C4F6図9Lに類似している。加えて、抗体NI204.10D12、NI204.6H1およびNI204.7G5は、脊髄背側角切片において膠様質のびまん性染色を示す。さらに、前記抗体の一部NI-204.10D12図9A、NI-204.10A8図9DおよびNI-204.67E12図9Eは、脊髄組織の強いびまん性染色によって証明されるように、高感度で生理的SOD1も認識するようである。市販C4F6MediMabs、カナダ;MM-0070-2およびB8H10MediMabs、カナダ;MM-0070抗体を対照抗体として使用した。C4F6抗体またはB8H10抗体とのインキュベーションに続いて、ビオチン化ウマ抗マウス二次抗体VectorLaboratories;1:250とのインキュベーションを行った。抗体シグナルをVectastainABCキットVectorLaboratoriesで増幅し、ジアミノベンジジンDakoで検出した。この染色は、2つの異なる染色パターンを明示した:C46A抗体は、点状/びまん性染色を示した図9Lのに対し、B8H10抗体は、主として、粒状SOD1封入体およびSOD1凝集体を染色した図9M。結論これらのデータは、NI-204抗体がB6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスモデルにおいて病的スーパーオキシドジスムターゼ1構造を認識することを立証する。実施例5NI-204抗体エピトープマッピングオーバラップペプチドのスキャンをエピトープマッピングのために用いた。ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1の全配列を、個々のペプチド間に11aaオーバーラップがある合計36の直鎖状15量体ペプチドとして合成しJPTPeptideTechnologies、ドイツ国ベルリン、ニトロセルロース膜にスポットした。その膜を5分間、メタノール中で活性化し、その後、室温でTBS中で10分間洗浄した。非特異的結合部位を2時間、室温で、Roti登録商標-BlockCarlRothGmbhCo.KG、ドイツ国カールスルーエでブロックした。ヒトNI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3それぞれNI-204.25H3抗体1μg/mLを3時間、室温で、Roti登録商標-Block中でインキュベートした。HRP接合ロバ抗ヒトIgG二次抗体を使用して、一次抗体の結合を判定した。ECLおよびImageQuant350検出GEHealthcare、スイス国オッテルフィンゲンを使用してブロットを現像した。NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3それぞれによりNI-204.25H3抗体により認識されるスーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質内のエピトープをマッピングするために、ペプスキャン膜pepscanmembraneと全スーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質配列をカバーする36の15aaペプチドペプチド間に11のアミノ酸のオーバーラップを使用した。図7に具体例として示すように、ペプチド番号22、23および24へのNI-204.10D12の顕著な結合が観察され、これは、この抗体によって認識されるエピトープがSOD1の中央ドメインに局在することを示す。したがって、NI-204.10D12結合エピトープは、SOD1アミノ酸93-99内に局在すると予測される。NI-204.10D12は、脂肪および配列DGVADVSの下線の付いたアミノ酸93-99配列番号2から成る中央ドメインに結合する。本発明のヒト由来SOD1特異的抗体NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3およびNI-204.25H3の類似に同定された結合エピトープを下の表IVにまとめる。表IV:ヒトSOD1タンパク質配列の示されているアミノ酸配列内の異なるヒト由来SOD1特異的抗体の同定結合エピトープ。ND:PepSpot技術の使用により結合エピトープ同定なし。実施例6野生型、G93A突然変異体およびマウスSOD1由来ペプチドへのNI-204.10D12結合スーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質のNI-204/10D12結合エピトープをカバーするビオチン化ペプチドJPTPeptideTechnologies、ドイツ国ベルリンをPBS中50μg/mLの濃度で用いて4°Cで一晩、ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロプレートFischerScientificを被覆した。2BSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスを含有する、PBS/0.1Tween-20を用いて1時間、室温で、非特異的結合をブロックした。一次抗体キメラNI-204.10D12を示されている濃度に希釈し、1時間、室温でインキュベートした。HRPと接合したヤギ抗マウスIgG抗体JacksonimmunoResearch、英国ニューマーケットを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。キメラ組み換えNI-204.10D12抗体は、野生型ヒト、G93Aヒトおよびマウススーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質に由来する同定NI-204.10D12結合エピトープをカバーするアミノ酸配列を有する合成ペプチドに、濃度依存的様式で結合する図8。NI-204.10D12は、前記3つの異なるSOD1種に同等の親和性で結合する。ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1におけるNI-204.10D12エピトープ内にある位置93でのアミノ酸交換は、家族性形態のALSに結び付けられる。これらの発見は、NI-204.10D12抗体が散発性および家族性ALSの治療に適した候補薬であることを示す。実施例7本発明の抗体の生体内試験上で既に説明したしょうに、抗ヒトSDO1抗体の直接脳室内注入に基づく受動免疫アプローチを用いるトランスジェニックマウス系統での研究により、そのような治療が、SOD1fALSマウスモデルにおいて寿命を延長することおよび運動ニューロン減少を減弱することにより疾病を軽減し得ることは証明されているUrushitaniら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1042007、2495-2500;Gros-Louisら、J.Neurochem.2010113、1188-1199。対照的に、能動的ワクチン接種アプローチは、有意な防御を付与することができなかったUrushitaniら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1042007、2495-2500。しかし、能動的ワクチン接種は、老人集団の有意な割合がワクチン接種に対する非応答者であると予想されるので、ヒトでは特に利用できないことがある。さらに、SOD1に対する免疫反応に随伴する潜在的副作用は、制御が難しい場合がある。本発明のSOD1結合分子が、マウス抗体について上で説明したのと同様のSOD1凝集体の脳内レベル低減を果たすことは、病的ミスフォールド/凝集SOD1種に対するそれらの同様の結合特性のため、合理的に予想することができる。しかし、ヒト免疫系内での進化的最適化および親和性成熟のため、本発明の抗体は、健常ヒト被験体から単離され、安全性プロファイルが優れているおよび免疫原性がない可能性が高いため、価値ある治療ツールをもたらす。マウス抗体の代わりにヒト抗体を用いて上述の出版物に記載の試験方法により、これらの予想される治療効果を、確認することができる。詳細には、スクリーニングすべき抗体を動物に多様な可能な経路、例えば、腹腔内抗体注射、頭蓋内注射、脳室内脳内注入で適用し、治療効果について試験した。AβおよびSOD1G93A突然変異体の共発現は、ダブルトランスジェニックマウスにおいて緩衝液不溶性SOD1凝集体の上昇をもたらし、これはALS発現におけるAβの潜在的役割を示唆しているLiら、AgingCell.52006、153-165。SOD1トランスジェニックマウスの脳へのベータ-アミロイド調製物の事前の脳内注射後に、上述のいずれかの適用可能性を利用して、Aβ誘導SOD1病態に対する治療効果を評価することができる。本発明の抗体の治療効果の評価および確認は、前記マウスの筋肉萎縮の発症に起因する体重変化および全生存時間をモニターすることにより行うことができる。筋肉萎縮の発症前に、協調運動または動作いずれかに関する多様な運動障害を、治療の結果としての発生遅延について試験することができる。これは、例えば回転棒、握力試験、伸展反射試験、足把持持久力試験pawgripendurancetesting、Y迷路、新規物体認識試験またはオープンフィールド活動などの、標準的な行動試験によって行うことができるCrawley,J.N.2000What’sWrongwithMyMouse:BehavioralPhenotypingofTransgenicandKnockoutMice.Wiley-Liss、NewYork。さらに、毒性細胞内封入体の形成のモニタリング、脊髄切片を用いる運動ニューロンの染色および計数、全ヒトSOD1染色、ならびに/または逐次的脊髄抽出による脊髄可溶性および不溶性SOD1レベルの生化学的判定を含む、組織化学的方法を用いることができるUrushitaniら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1042007,2495-2500。実施例8天然SOD1二量体、変性/酸化SOD1および組み換えSOD1への結合分析方法体外スーパーオキシドジスムターゼ1凝集金属触媒酸化反応を用いて体外スーパーオキシドジスムターゼ1凝集Rakhitら、J.Biol.Chem.2792004、15499-15504に従ってを誘導した。ヒト赤血球からの天然SOD1二量体および多の全ての試薬は、Sigma-AldrichSigma-Aldrich、スイス国ブーフスから購入した。凝集のために、4mMアスコルビン酸と0.2mMCuCl2とを含有する10mMTris酢酸緩衝液、pH7.0中で10μMヒトSOD1を48時間37°Cでインキュベートした。対照として、10μMヒトSOD1を10mMTris酢酸緩衝液、pH7.0中で48時間、37°Cでインキュベートした。体外スーパーオキシドジスムターゼ1変性Zetterstromら、JNeurochem.1172011、91-99に従って、スーパーオキシドジスムターゼ1変性反応を行った。ヒト赤血球からの天然SOD1二量体および多の全ての試薬は、Sigma-AldrichSigma-Aldrich、スイス国ブーフスから購入した。変性のために、23μMヒトSOD1を3.5M塩化グアニジウムおよび25mMEDTA、pH7.0中で4時間、22°Cでインキュベートした。その後、5mMEDTA、pH7.0を含有するPBSに対して変性溶液を透析し、20,000gで遠心分離してSOD1凝集体を除去し、変性SOD含有上清を回収した。ダイレクトELISA天然ヒトSOD1二量体または体外変性/酸化ヒトSOD1または組み換えSOD1Biomol、ドイツ国のいずれかを被覆用緩衝液15mMNa2CO3、35mMNaHCO3、pH9.42中20μg/mLの濃度で用いて96ウェルマイクロプレートCorningを被覆した。2BSASigma-Aldrich、スイス国ブーフスを含有する、PBS/0.1Tween登録商標-20を用いて1時間、室温で非特異的結合部位をブロックした。一次抗体を示されている濃度に希釈し、1時間、室温でインキュベートした。HRPと接合したロバ抗ヒトIgGFcγ特異的抗体、またはHRPと接合したヤギ抗マウスIgGHL特異的抗体のいずれかを使用して結合を判定し、その後、標準的な比色アッセイでHRP活性を測定した。EC50決定GraphPadPrismソフトウェア米国サンディエゴを使用する非線形回帰により、ED50値を推定した。結果天然ヒトSOD1二量体、変性/酸化ヒトSOD1および組み換えSOD1に対する異なるヒト由来SOD1特異的抗体のEC50を、それらの異なるSOD1種を20μg/mL濃度で被覆してダイレクトELISAにより決定した。前記異なるSOD1種に対する前記ヒト由来SOD1特異的抗体について判定された結合親和性を下の表IIIにまとめる。表III:異なるSOD1種に対する異なるヒト由来SOD1特異的抗体の結合親和性。ND:判定されなかったヒトSOD1特異的抗体は、組み換えおよび変性/凝集ヒトスーパーオキシドジスムターゼ1に優先的に結合し、ピコモルから低ナノモル値の範囲のEC50を有する。これらの発見は、NI-204抗体の大部分が、天然形態ではなく変性/酸化形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ1の病理学的に意味のある立体構造の、露出されるヒトSOD1のエピトープを優先的に標的にすることを示唆している。抗体NI-204.67E12、NI-204.10A8およびNI-204.9F6だけは、異なるSOD1種を区別せず、NI-204.67E12抗体はピコモルの高い総合結合親和性を有し、ならびに抗体NI-204.10A8およびNI-204.9F6はナノモル範囲の親和性を有する。結論金属触媒酸化によって誘導されるスーパーオキシドジスムターゼ1凝集体およびフォールディングされていないSOD1は、ALS関連、体内スーパーオキシドジスムターゼ1凝集体に類似したまたは該凝集体と同一の特性を保有する。幾つかのヒト由来SOD1特異的抗体は、治療上意味のあるミスフォールド形態のヒトスーパーオキシドジスムターゼ1、例えば、フォールディングされていない/酸化されたSOD1への顕著な結合を示す。フォールディングされていない/酸化されたスーパーオキシドジスムターゼ1への結合は、天然二量体より選好されるようである。これらの発見は、病理学的に意味のある立体構造のスーパーオキシドジスムターゼ1タンパク質に対して標的化される本発明のヒト由来SOD-1抗体の治療上魅力的なプロファイルを強調する。その後、間に数か月の遅延期間を設けて実施例3および8を行った。この間、抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8およびNI-204.9F6は、数か月間の凍結融解に起因する損傷を最小にするためにCaCl2およびMgCl2不含のリン酸緩衝食塩水、pH7.4Invitrogen中で少量ずつ、4°Cで、または好ましくは-20°C、もしくは-80°Cで保存した。一般に、結合親和性に関して類似したデータが両方の実験で得られた場合、抗体NI-204.10A8は、生理的SOD-1に対しておよび凝集SOD-1に対しても、20nM、実施例3において算出するとそれぞれ30nMから、表IIIに示すように両方の形態のSOD1について100nMを超えるまでの結合親和性の有意な減少を示した。タンパク質が、そのような安定性の減少につながることがある氷-水表面変性、凍結濃縮および低温変性を冷凍中に被ることは公知である。例えば、KolheおよびBadkar、BiotechnologyProgress272011、494-504;Haweら、EurJPharmSci.382009、79-87;LuYら、JPharmSci.972008、1801-1812;ならびにGlickSM、JClinEndocrinolMetab.371973,461-462を参照されたい。本態様において、本発明が提供する抗体は異なる安定性プロファイルを示し、使用前に少なくとも数か月という長期間にわたって保存することができる抗体例えば、NI-204.10D12およびNI-204.12G7もあり、産生後に凍結段階なしで使用しなければならない抗体例えば、NI-204.10A8もある。実施例9NI-204.10D12治療効力:生体内概念実証抗ヒトSDO1抗体の直接脳室内注入に基づく受動免疫アプローチを用いるトランスジェニックマウス系統での研究により、そのような治療が、SOD1fALSマウスモデルにおいて寿命を延長することおよび運動ニューロン減少を減弱することにより疾病を軽減し得ることは証明されているUrushitaniら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1042007、2495-2500;Gros-Louisら、J.Neurochem.2010113、1188-1199。B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウス系統をヒト由来SOD-1抗体の治療効力の評価に使用した。このトランスジェニックマウス系統は、ALSについてのよく確立され、特性付けされているマウスモデルである。NI-204.10D12抗体の治療効力の評価および確認を、前記マウスの筋肉萎縮の発症に起因する体重変化および全生存期間をモニターすることによって行った。筋肉萎縮の発症前に、動作に関する運動障害を、治療の結果としての発生遅延について足把持持久力試験により試験した。さらに、運動ニューロン減少のNI-204.10D12媒介減弱を評価するための脊髄切片での運動ニューロンの染色および計数に、組織化学的方法を用いた。慢性治療レジメン中のマウス抗ヒト抗体反応を回避するために、マウスIg2a定常ドメインに融合したNI-204.10D12ヒト可変ドメインから成るキメラバージョンのNI-204.10D12抗体を研究に使用した。方法脳内注入のためのAlzet登録商標浸透圧ミニポンプの外科的埋め込み60日齢B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスに深麻酔フェンタニル/ミダゾラム/メデトミジンし、小さな正中切開を施して頭骨を露出させ、抗体溶液またはPBSを充填した滅菌Alzet登録商標ミニポンプALZETOsmoticPumps;Cupertino、米国カリフォルニア、モデル1004、長さ1.5cm、直径0.6cmおよび空重量0.4g加重を挿入することができるようにマウスの背部の肩甲骨中央領域に皮下ポケットを作製した。その後、脳定位固定装置内にマウスの頭部を固定し、骨縫合接合部ブレグマを基準点として使用して頭骨に穴をあけ、Alzet登録商標脳内注入キット3カニューレを左側脳室へと低下させた;ブレグマに従って調整する;AP、-0.2mm;ML、0.9mm;およびDV、2.5mm。カニューレの配置後、2本の小さなネジを頭骨内に配置し、歯科用セメントを塗布して頭骨にしっかりと取り付けた。ナロキソン56952Swissmedic、OrPhaSwissGmbH、スイス国キュスナハト、フルマゼニル48280Swissmedic、RochePharmaSchweiz、スイス国ライナッハ/アチパメゾール60562Swissmedic、Dr.E.GraubAG、スイス国ベルンおよびメタカムBoehringerIngelheim、ドイツ国を解毒剤および術後鎮痛薬として皮下投与し、さらに飲料水中のメタカムおよびブプレノルフィン41931、44100Swissmedic、ReckittBenckiserHealthcare、英国/フェニルブタゾン42726Swissmedic、StreuliPharmaAG、スイス国ウツナッハ/アミノフェナゾン/ベンジルペニシリン56271Swissmedic、GrunenthalPharmaAG、スイス国グラールス/ジヒドロストレプトマイシン42790Swissmedic、StreuliPharmaAG、スイス国ウツナッハを鎮痛薬/抗生物質として1週間与えた。術後、回復を促進するためおよび脱落を低減するために、マウスを3日間、ヒートパッド上で飼育し、カーゴの床に含水飼料を置いた。Alzet登録商標浸透圧ミニポンプモデル1004が、抗体またはPBS溶液を1時間につき0.11μL=1日につき2.64μLの持続注入速度で合計28日の期間にわたって側脳室に送る。ポンプ内の抗体溶液の濃度を、1日につき0.1mg/kg体重になるように選択した。ポンプ交換28日ごとに浸透圧ミニポンプを交換した。B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスに吸入麻酔3.5Sevofluran53211Swissmedic、AbbottAG、スイス国バールによって深麻酔し、ポンプの上に小切開を施し、ポンプを脳内注入用カニューレから取り外し、取り出した。新たに充填されたポンプを挿入し、注入用カニューレに接続し、創傷クリップを使用して切開部位を閉じた。握力分析握力測定装置UgoBasile、イタリア国コメロ、カタログ番号47106を使用して、マウスの握力を測定した。このシステムにはセンサーに接続しているグリッドが備えられている。4本の足がグリッドをつかむまでマウスを低下させ、その後、握った足を離すまで穏やかに引き戻した。3回の施行にわたってマウスが達成した最大の力を電子的に記録した。臨床エンドポイントマウスが横向きに寝てから15秒以内に自らを起こすことができないことにより、重症動作不能運動ニューロン病の臨床エンドポイントを定義した。運動ニューロン病の被定義臨床エンドポイントに、実験時間中の任意の時点で、到達していなかったマウスのカプランマイヤー生存分析によって、生存確率を試験した。免疫組織化学および運動ニューロン計数疾病末期のB6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスの脊髄をリン酸緩衝4パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィン包埋し、5μm切片に切断した。ニッスル染色0.5クレシルバイオレット溶液Sigma-Aldrich、C5042については、切片をニッスル溶液で3分間、室温で染色し、その後、3分間、蒸留水で洗浄した。標準プロトコルに従って、切片をさらに処理した。NeuN染色については、ギ酸前処理後、切片をモノクローナルNeuN抗体、1:1000希釈MAB377;Miliporeと共にインキュベートした。抗体シグナルを標準DAB検出システムで増幅した。NeuN染色は、自動LeicaBondMax商標染色システムLeica、ドイツ国ヴェッツラーで行った。動物1匹につき8個の腰部脊髄切片それぞれ100μmの間隔をあけたの両方の側腹角における30μmより大きい直径を有するニッスル陽性またはNeuN陽性ニューロンを計数した。結果SOD1を標的にするヒト由来抗体の薬理学的治療効果を評価するために、B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスに、日齢60日で開始して3ヶ月間、直接脳室内脳内注入によりNI-204.10D12抗体を慢性投与した。慢性204.10D12抗体治療は、SOD1トランスジェニックマウスの寿命を11日まで有意に延長し、平均生存時間は、慢性NI-204.10D12注入を受けたマウスでは164±3日であり、これに対してビヒクル処置群では153±4日であったp<0.05;図10A。さらに、B6.Cg-TgSOD1G93A1Gur/Jトランスジェニックマウスの慢性NI-204.10D12治療は、PBS治療対照群と比較して、全疾病経過を通して体重減少の有意な遅延をもたらした図10B。SOD1トランスジェニックマウスにおいて疾病進行中に観察された重度進行性運動障害は、ビヒクル対照と比較して抗体治療群での握力動作改善によって明らかであるように、NI-204.10D12治療によって改善された図11。腰部脊髄側腹角における運動ニューロンの補足の定量分析は、ビヒクル治療マウスと比較してNI-204.10D12で治療したマウスにおける運動ニューロン減少の有意な減弱を明示した。これは、NI-204.10D12治療が突然変異体SOD-1過発現によって媒介される運動ニューロンの変性から保護できることを示唆している図12。これらの発見は、慢性投与により疾病発症を遅延することができ、生存を延長することができ、体重および運動動作を向上させることができ、ならびに神経変性を改善することができる、ヒト由来SOD1特異的抗体の絶大な治療効果を強調する。したがって、ヒト由来SOD1特異的抗体は、ALSの治療のための有望な新規候補薬である。実施例10SOD1抗体のIgG生殖細胞系ファミリー分類異なるヒトSOD1特異的抗体の可変領域の配列分析により、NI-204抗体を生殖細胞系IgGファミリーに分類することができる表V。ヒトNI-204抗体を生殖細胞系Vセグメントファミリーに分類するために、MRCCentreforProteinEngineering英国ケンブリッジによって提供されているデータベースVbasehttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/で、元の可変領域のヌクレオチド配列をヒト生殖細胞系配列とアラインした。それらの生殖細胞系を、重鎖についてはそれらの遺伝子座によって、および軽鎖についてはそれらのVbase登録番号によって特定した下の表Vを参照されたい。表V:生殖細胞系免疫グロブリン配列比較によるNI-204抗体ファミリーの分類抗体名の最後の文字がそれらのタイプを示す:H-重、K-カッパ、L-ラムダ"