非接合体糖タンパク質と比較して増大したインビボ血漿半減期を有し、且つ少なくとも1つの末端ガラクトースまたはこれらの誘導体と、これに対して共有結合した遅延基とを有する糖タンパク質を含んでなる糖タンパク質接合体を製造するための方法であって:a少なくとも1つの末端ガラクトースまたはこれらの誘導体を有する糖タンパク質をガラクトースオキシダーゼと接触させて、反応性アルデヒド官能基を有する酸化された末端ガラクトースまたはこれらの誘導体を含む糖タンパク質を形成する工程と;b工程aで生成された糖タンパク質生成物を、アルデヒド基と反応することができ且つ遅延基を含む反応体Xと接触させて、式糖タンパク質遅延基によって表される接合体を形成する工程と;を含んでなる方法。非接合体糖タンパク質と比較して増大したインビボ血漿半減期を有し、且つ少なくとも1つの末端ガラクトースまたはこれらの誘導体と、これに対して共有結合した遅延基とを有する糖タンパク質を含んでなる糖タンパク質接合体を製造するための方法であって:a少なくとも1つの末端ガラクトースまたはこれらの誘導体を有する糖タンパク質をガラクトースオキシダーゼと接触させて、反応性アルデヒド官能基を有する酸化された末端ガラクトースまたはこれらの誘導体を含む糖タンパク質を形成する工程と;b工程aで生成された糖タンパク質生成物を、アルデヒド基と反応することができ、且つ任意に保護された第二の反応性基を更に含む連結部分を含んでなる反応体Xと接触させて、糖タンパク質と連結部分との接合体を形成する工程と;c工程bの生成物を、連結部分の第2の反応基と反応することができる遅延基と接触させて、式糖タンパク質連結部分遅延基によって表される接合体を形成する工程と;を含んでなる方法。請求項1または請求項2に記載の方法であって、前記工程aまたは前記工程cの前にそれぞれ行われる、以下の工程a1および工程a2を更に含んでなる方法:a1糖タンパク質を、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼgalacosidases、Nアセチルヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼfucosidases、マンノシダーゼ、エンドH、およびエンドF3の一以上と接触させて、グリカン構造の一部が除去されている糖タンパク質を形成する工程;a2工程a1の生成物をガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトース基質と接触させて、少なくとも一つの末端ガラクトースまたはその誘導体を備えた糖タンパク質を形成する工程。請求項1または請求項2に記載の方法であって、前記工程aの前に行われる下記第1の工程a3を更に含んでなる方法:a3少なくとも1つの末端シアル酸残基を有する糖タンパク質を、グリカンからシアル酸を除去できるシアリダーゼまたは別の試薬と接触させて、少なくとも1つの末端ガラクトースまたはその誘導体を含むアシアロ糖タンパク質を形成する工程。請求項1、3、または4の何れか1項に記載の方法であって、前記反応体Xは式nucRを有し、ここでのnucは、アルデヒドと反応して共有結合を形成できる官能基であり、Rは遅延基である方法。請求項2、3、または4の何れか1項に記載の方法であって、前記反応体Xは式nucL1Rを有し、ここでのnucは、アルデヒドと反応して共有結合を形成できる官能基であり、Rは遅延基であり、L1は連結部分である方法。請求項5に記載の方法であって:前記反応体Xは、H2NR、HR1NR、H2NOR、HR1NOR、H2NNHCOR、H2NCHR1CHRSH、H2NCHRCHR1SH、H2NNHSO2R、およびZCH2ZRからなる群より選択され;ここで、Rは遅延基であり;R1は、Hまたは第2の遅延基であり;ZおよびZは、例えばCOOEt、CN、NO2などの電子吸引基を表し;またZ基の一方または両方がR基に結合することができる方法。請求項6に記載の方法であって:前記反応体Xは、H2NL1R、HR1NL1R、H2NOL1R、HR1NOL1R、H2NNHCOL1R、H2NCHR1CHSH、H2NCHCHR1SH、H2NNHSO2L1R、ZCH2ZL1Rからなる群より選択され;ここで、L1は連結部分であり、Rは遅延基であり、R1はHまたは第2の遅延基であり;ZおよびZは、例えばCOOEt、CN、NO2などの電子吸引基を表し、またZ基の一方または両方がR基に接続することができる方法。請求項2、3、または4の何れか1項に記載の方法であって:前記反応体Xは、式nucL1Rnを有し、ここでのnucは、アルデヒドと反応して共有結合を形成することができる官能基であり、Rは遅延基であり、L1は、1以上の遅延基Rを反応性官能基nucに結合する多官能性連結部分であり、並びにL1は、遅延protractionに寄与してもよく、または寄与しなくてもよく;nは、n=1~10のような1~25の整数を表す。請求項1~11の何れか1項に記載の方法であって、前記遅延基は下記からなる群より選択される方法:デンドリマー、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリエチレングリコールPEG、ポリプロピレングリコールPPG、分枝のPEG、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンcoマレイン酸無水物、ポリスチレンcoマレイン酸無水物、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン;脂肪酸、C5C24脂肪酸、脂肪族二酸例えばC5C24などの、アルブミンに結合する化合物などの血清タンパク結合性リガンド、グリカンが受容体例えばアシアロ糖タンパク質受容体およびマンノース受容体に結合するのを阻害する構造例えばシアル酸誘導体または擬態、カルボン酸またはアミンなどの生理学的条件下で電荷特性を変更する部分か、または小さなアルキル置換基例えば、C1C5アルキル等の、グリカン特異的な認識を防げる中性置換基を含む小有機分子、1以上のカルボン酸、スルホ基のアミン、ホスホン酸、またはこれらの組み合わせを含んでもよい低分子有機荷電ラジカル例えばC1C25;シクロデキストリン等の低分子中性親水性分子例えばC1C25、または任意に分枝していてもよいポリエチレン鎖;2~40KDaの平均分子量をもつポリエチレングリコール;700~20000Da、またはより好ましくは700~10000Daの間の範囲の正確な分子量をもつデンドリマー等の十分に定義された正確な重合体;並びにアルブミンまたは抗体もしくは任意にFcドメインを含む抗体の部分等の実質的に非免疫原性のポリペプチド。請求項1~10の何れか1項に記載の方法であって、前記糖タンパク質は、以下からなる群より選択される方法:FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI1、組織因子、FXI、FXII、FXIII、並びにこれらの配列変異体;免疫グロブリン、インターロイキン、α、β、およびγインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来成長因子、およびホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP、等のサイトカイン、インスリン、レクチンおよびリシン等の植物タンパク質、腫瘍壊死因子および関連した対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体およびインターロイキン受容体の可溶性形態、TGFasまたはTGFpsおよび上皮細胞成長因子等の組織成長因子等の成長因子の、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛膜ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、などを含む一般的な生物学的および治療的な関心対象のその他のタンパク質およびペプチド、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、およびこれらの断片を含む関心対象の免疫グロブリン。非接合体糖タンパク質と比較して、増大したインビボ血漿半減期を有する糖タンパク質の接合体であって、少なくとも1つの末端ガラクトースまたはこれらの誘導体と、任意に連結部分を介して、これに対して共有結合した遅延基とを有する糖タンパク質を含む接合体。請求項12に記載の糖タンパク質接合体であって、前記遅延基は、以下からなる群より選択される接合体:デンドリマー、ポリアルキレンオキシドPAO、ポリアルキレングリコールPAG、ポリエチレングリコールPEG、ポリプロピレングリコールPPG、分枝のPEG、ポリビニルアルコールPVA、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンcoマレイン酸無水物、ポリスチレンcoマレイン酸無水物、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン;アルブミンに結合する化合物のような血清タンパク結合性リガンド、例えば脂肪酸、C5C24脂肪酸、脂肪族二酸例えばC5C24、グリカンが受容体例えばアシアロ糖タンパク質受容体およびマンノース受容体に結合するのを阻害する構造例えばシアル酸誘導体または擬態、カルボン酸またはアミンなどの生理学的条件下で電荷特性を変更する部分か、または小さなアルキル置換基例えば、C1C5アルキルなどのグリカン特異的な認識を防げる中性置換基を含む小有機分子、1以上のカルボン酸、スルホ基のアミン、ホスホン酸、またはこれらの組み合わせを含んでもよい低分子有機荷電基例えばC1C25;シクロデキストリンなどの低分子中性親水性分子例えばC1C25、または任意に分枝していてもよいポリエチレン鎖;2~40KDaの平均分子量をもつポリエチレングリコール;700~20000Da、またはより好ましくは700~10000Daの間の範囲の正確な分子量をもつデンドリマーなどの十分に定義された正確な重合体;並びにアルブミンまたは抗体もしくは任意にFcドメインを含む抗体の部分などの実質的に非免疫原性ポリペプチ。請求項12または13の何れか1項記載の糖タンパク質接合体であって、前記糖タンパク質は、以下の群より選択される接合体:FVII、FVIII、FIX、FX、FII、FV、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI1、組織因子、FXI、FXII、FXIII、並びにこれらの配列変異体;免疫グロブリン、インターロイキン、α、β、およびγインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来成長因子、およびホスホリパーゼ活性化タンパク質PUP等のサイトカイン、インスリン、レクチンおよびリシンなどの植物タンパク質、腫瘍壊死因子および関連した対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態、インターロイキン受容体およびインターロイキン受容体の可溶性形態、TGFasまたはTGFpsおよび上皮細胞成長因子などの組織成長因子などの成長因子の、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛膜ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲンアクティベーターなどを含む一般的な生物学的および治療的な関心対象のその他のタンパク質およびペプチド、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD、およびこれらの断片を含む関心対象の免疫グロブリン。請求項1~11の何れか1項に記載の方法によって入手できる糖タンパク質接合体。請求項12~15の何れか1項に記載の糖タンパク質接合体を含む薬学的組成物。実施例1~4は、本発明に従ってガラクトース酸化されたグリカンに対して接合するための適切な代表的なO置換されたヒドロキシルアミン求核試薬の合成を示す。実施例1:ONNジエチルアミノエチルヒドロキシルアミンNヒドロキシフタルイミド100g、25mmolをTHF100mlに溶解し、炭酸カリウム1863g;0134molを添加した。ジエチルアミノエチルクロライド1054g;615mmolを添加し、混合物を加熱して4時間還流した。混合物を冷却して、水100mlを添加し、固体の全てが溶解されるまで撹拌した。次いで、混合物をDCMで2回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発して透明な黄色の油として863g53のNNNジエチルアミノエトキシフタルイミドを得た。油を最小限のアセトニトリルに溶解し、11規定の1NHClの酢酸エチル溶液を添加して、NNNジエチルアミノエトキシフタルイミドハイドロクロライドを沈殿させた。1HNMRD2O:δ124ppmt6H;328m4H;356t2H;445t2H;772s4H13CNMRD2O:δ825ppm;4793;5046;7210;12427;12834;13581;16582。NNNジエチルアミノエトキシフタルイミドハイドロクロライド250g;837mmolをエタノール20mlに溶解し、ヒドラジン一水和物1ml;206mmolを添加した。混合物を30分間還流した。沈殿が急速に形成された。混合物を氷浴上で冷却した。結晶質の材料を濾過することによって除去して、濾液を乾燥させた。半結晶質の残渣が得られた。これを冷却エタノール10mlに再懸濁して、濾過した。濾液を再び乾燥させて、09gの透明な黄色の油を得た。1HNMRCDCl3:δ105ppmt6H;258m4H;265t2H;375t2H;512bs2H。実施例2:32アミノオキシアセチル2カルボキシエチルアミノプロピオン酸3アミノプロピオン酸tertブチルエステルハイドロクロライド727g、40mmolをDMF40mlに溶解した。トリエチルアミンを添加した405g、40mmol。tertブチルアクリラート513g、40mmolのDMF40ml溶液を不活性雰囲気下で溶液に添加した。16時間rtで撹拌した後に、沈殿を濾過して、濾液を濃縮し、酢酸エチル100mlに溶解し、sarNaHCO3で洗浄し2×50ml、MgSO4を通して乾燥して濃縮した。油を減圧蒸留002torr、103~107°Cによって精製し、無色油状物47g、43収率として32tertブトキシカルボニルエチルアミノプロピオン酸tertブチルエステルを得た。1HNMRCDCl3:δ145ppms18H241tJ64Hz4H284tJ65Hz4HLCMS:mz=274M1Rt=241min。32tertブトキシカルボニルエチルアミノプロピオン酸tertブチルエステル063g、307mmol、Ntertブトキシカルボニルアミノオキシ酢酸107g527mmol、および1ヒドロキシベンゾトリアゾール050g、368mmolをDMF20mlに溶解し、DIEA048g、368mmolおよび3ジメチルアミノプロピルエチルカルボジイミドハイドロクロライド071g、368mmolを添加した。溶液を不活性雰囲気下で一晩撹拌した。試料を濃縮した後に、これを酢酸エチル50mlに溶解し、5の酢酸、satNaHCO3、および水それぞれ2×20mlで洗浄した。試料をMgSO4を通して乾燥し、淡黄色油32tertブトキシカルボニルアミノオキシアセチル2tertブトキシカルボニルエチルアミノプロピオン酸tertブチルエステルに濃縮した105g、77収率。1HNMRCDCl3:δ144ppms18H147s9H247257m4H348tJ71Hz2H356tJ71Hz2H460s2H816s1HLCMS:mz=469M23Rt=430min。32tertブトキシカルボニルアミノオキシアセチル2tertブトキシカルボニルエチルアミノプロピオン酸tertブチルエステル050g、11mmolを不活性雰囲気下においてrtで1時間トリフルオロ酢酸5mlと共に撹拌した。濃塩酸2mlを添加し、試料を濃縮した。試料を、10mlのトルエンを添加すること、および試料2回を濃縮することによって乾燥した。残渣をエタノール2mlに溶解し、冷却ジエチルエーテルに滴下した。生じる沈殿をフラスコに固着させ、および溶媒をデカントですてることができる。残渣を乾燥減圧下で乾燥させて、粘着性の白い残渣32アミノオキシアセチル2カルボキシエチルアミノプロピオン酸を得た。1HNMRD2O:δ267ppmtJ68Hz2H274tJ68Hz2H356tJ68Hz2H365tJ72Hz2H498s2H。LCMSmz235Rt037min。実施例3:mPEG5000CH22CONHCH24ONH2工程1:O4アミノブチルNtertブトキシカルボニルヒドロキシルアミン120mg、0584mmolを窒素下でDCM25mlに溶解した。mPEG5000スクシンイミジルプロピオン酸1g、0195mmolを添加して、溶液を16時間撹拌した。ジエチルエーテル150mlを添加して、生じるも沈殿を濾過して、ジエチルエーテル2×60mlで洗浄した。沈殿を乾燥減圧下で16時間乾燥させて、白色固体911mgを得た。mPEG5000CH22CONHCH24ONHBoc:1HNMRDMSOd6、400MHz:δAmongothersignalswasobserved:140s、9H、229t、2H、303m、2H、351s、454H、368m、4H、780t、1H、991s、1H。工程2:mPEG5000CH22CONHCH24ONHBoc911mg、0174mmolをTFA8mlに溶解した。溶液をrtで窒素下において30分間撹拌した。ジエチルエーテル150mlを添加して、30分間撹拌した後に、生じる沈殿を濾過して、ジエチルエーテル2×50mlで洗浄した。固体を35°Cにおいて真空オーブン中で16時間乾燥し、白色固体800mg、90収率を得た。mPEG50002CONH4ONH2:1HNMRδAmongothersignalswasobserved1431552293053243513683907831023。実施例4:16アミノオキシヘキサデカン酸工程1:16ブロモヘキサデカン酸メチルエステル105g、3mmolおよびNtertブトキシカルボニルヒドロキシルアミン1g、75mmolをフラスコ内に配置し、DBU225mlに溶解した。溶液を3時間窒素下で撹拌した。DCM100mlを添加して、相分離を援助するために、溶液を数回のブラインおよびメタノールを使用して1NHCl3×25mlで洗浄した。溶液をMgSO4を通して乾燥し、濃縮して油性結晶質の残渣109g、90収率を得た。16Ntertブトキシカルボニルアミノオキシヘキサデカン酸メチルエステル:1HNMRδ125162230367384716。LCMSmz=425Rt=617。工程2:16Ntertブトキシカルボニルアミノオキシヘキサデカン酸メチルエステル105g、262mmolをTHF100ml中に置き、1NNaOH275mlを添加した。試料をrtで16時間撹拌し、次いで2時間還流した。rtに冷却した後に、4NNaOH20mlおよびメタノール50mlを添加して、溶液をrtで45分間撹拌した。溶液を濃HClで中和して、氷浴中で冷却した。沈殿を濾過して、濾液を減圧下で濃縮して白色固体を得て、相分離において援助するために、これを10mlのブラインを使用してDCM100mlと033NHCl150mlとに分けた。有機相をMgSO4を通して乾燥し、濃縮してオフホワイトの残渣730mg、72収率を得た。残渣をフラッシュクロマトグラフィー二酸化ケイ素、AcOEt/ヘプタン3:7400ml、次いで1:1200mlを経て精製し、白色固体を得た150mg、15収率。16Ntertブトキシカルボニルアミノオキシヘキサデカン酸:1HNMRδ125149162235384723LCMSmz=410Rt=553。工程3:16Ntertブトキシカルボニルアミノオキシヘキサデカン酸110mg、28mmolをTFA2mlに溶解し、rtで30分間に撹拌した。ジエチルエーテル20mlを添加し、沈殿を濾過して、乾燥減圧下で乾燥し、白色固体011gを得た。16アミノオキシヘキサデカン酸:δ12414915521839010501165LCMSmz=288Rt=358。実施例5~15は、本発明による修飾されたグリカン構造をもつ糖タンパク質を得るための、酵素プロトコルおよび化学物質接合法を示す。rFVIIaの脱シアリル化アシアロrFVIIaの調製実施例5:バンテロバクターウレファシエンス由来の可溶性ノイラミニダーゼを使用する方法250μlのrFVIIa124mgml、24μMの、10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMグリシルグリシン緩衝液pH60溶液を25mUα23689ノイラミニダーゼに添加し、反応混合物を4°Cで32時間インキュベートした。反応をモニターするために、反応の少量の一定分量は、Invitrogenの手順図2を参照されたいに従って行われる適切な緩衝液およびIEFゲルで希釈した。また、試料をαシアノ4ヒドロキシケイ皮酸マトリックス図3を参照されたいを使用して、MALDITOF分光法によって解析した。700Daの分子量の平均減少が観察された。実施例6:コレラ菌由来の可溶性ノイラミニダーゼを使用する方法5mlのFVIIa溶液14mgmlの10mMグリシルグリシン、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH6をノイラミニダーゼ20μl、300mU、コレラ菌、II型、SigmaN6514に添加して、混合物を24時間室温で振盪した。シアル酸の除去は、Invitrogenによって発明されたプロトコルを使用するIEFゲル電気泳動によって確認したNovexミニゲルpI585→655、図4、レーン4。次いで、混合物を氷上で冷却して、50mMNaOH水溶液を添加することによってpHを80に合わせた。EDTA450μl、100mM、pH80、Ca2と同等の水溶液を添加して、試料51mS/cmを5mlのHiTrapQHPイオン交換カラムAmershamBiosciencesに充填し、10mMトリス、50mMNaCl、pH80で平衡化した。カラムを10mMトリス、50mMNaCl、pH8010vol、流束:1ml/分で溶出した。次いで、溶離緩衝液を10mMトリス、50mMNaCl、25mMCaCl2、pH80に変えた10vol、流束:1ml/分。純粋なFVIIa試料をプールした。次いで、NAP10カラムAmershamを使用して、緩衝液を10mMグリシルグリシン、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH6に交換し、後に使用するまで試料を80°Cに貯蔵した。ペプチド基質S2288に対するアミド分解活性インビトロでの加水分解アッセイ法の節を参照されたいは、修飾されていないrFVIIaと同一であることが測定された。タンパク質上に暴露されたガラクトース残基の量を定量化するために使用される解析手順の節を参照されたい、MolecularProbesA22179からのガラクトースアッセイ法キットは、2つのN連結されたN145322双アンテナ構造の存在を想定するときに、FVIIaからの全てのシアル酸の完全な除去に相当する370μmolガラクトース/μmolFVIIa図1定量を与えた。実施例7:アガロース支持されたウェルシュ菌由来のノイラミニダーゼを使用する方法硫酸アンモニウム懸濁液2mlとしてのノイラミニダーゼアガロース樹脂ウェルシュ菌、TypeVIA、SigmaN5254をMilliQ水で広範に洗浄し、次いで排液して、5mlのFVIIa溶液14mgmlの10mMグリシルグリシン、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH6に添加した。混合物を48時間室温で穏やかに振盪し、ノイラミニダーゼアガロース樹脂を濾過した。シアル酸の除去は、Invitrogenによって発明されたプロトコルを使用するIEFゲル電気泳動NovexミニゲルpI585→655、図4、レーン8によって確認した。ペプチド基質S2288に対するアミド分解活性インビトロでの加水分解アッセイ法の節を参照されたいは、修飾され廷内rFVIIaと同一であることが測定された。後に使用するまで試料を80°Cに貯蔵した。タンパク質上に暴露されたガラクトース残基の量を定量化するために使用される解析手順の節を参照されたい、MolecularProbesA22179からのガラクトースアッセイ法キットは、2つのN連結されたN145322双アンテナ構造の存在を想定するときに、FVIIaからの全てのシアル酸の完全な除去に相当する390μmolガラクトース/μmolFVIIa図1の比を与えた。あるいは、シアル酸の除去は、解析の節に記載されているようにCEプロトコルによって解析することができる。実施例8:ガラクトシル誘導体化されたFVIIa類似体の調製のための一般的なワンステップ手順:工程A緩衝液交換:FVIIa1ml、28nmol、14mgmlの10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMグリシルグリシン緩衝液pH60溶液を10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60で事前にキャリブレートしたcallibrated1mlのNAP10カラムAmershamBioscienceに添加する。溶液を、カラム層を通過させ、次いで、10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60を添加し、その一方で、15mlの溶出液を収集する。工程Bノイラミニダーゼ処理:溶出液を75mUノイラミニダーゼコレラ菌由来EC32118に添加し、混合物を24時間室温でインキュベートする。工程Cガラクトースオキシダーゼ求核試薬との反応:中の12UガラクトースオキシダーゼEC。1139および240UカタラーゼEC11116およびO置換されたヒドロキシルアミン誘導体500nmolまたは酸化されたガラクトース残基あたり約5当量の新たに調製した200μlのMES緩衝液10mMMES、10mMCaCl2、および50mMNaCl、pH60溶液を添加する。修飾の程度は、問題の特定の修飾のために適した解析技術例えば、荷電した部分については、IEFゲル、またはより大きなサイズのヒドロキシルアミンについては還元/非還元SDSPAGEゲルによって行うが、転換を得るためには、典型的には室温において8~24時間の間である。少量の一定分量からのNグリカンを、その後にPNGaseFプロトコルを使用して切断し、解析の節に記載されている手順を使用して解析し、次いで、FVIIa修飾された最終生成物を実施例6に記載されているように精製して、その後に使用するまでの80°Cに貯蔵した。実施例9:アシアロrFVIIaのワンポットガラクトース酸化およびヒドロキシルアミンRONH2との反応についての一般的な手順:250μlの脱シアリル化したrFVIIa24μMの、10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMMES緩衝液pH60溶液上記の通りに調製したを、930mUのガラクトースオキシダーゼおよびカタラーゼ145Uの、120mM50×のO誘導体化されたヒドロキシルアミンを含む10mMMES緩衝液pH60溶液と反応させる。反応を4°Cで24~72時間置く。反応の進行は、Invitrogenの手順に従って少量の一定分量に対して、材料の節に明記した方法を使用するキャピラリー電気泳動法によって、またはIEFゲルまたはヒドロキシルアミンの型に応じてSDSPAGEゲルを行うことによって、何れかでモニターする。反応が完了に達したときに、グリカン誘導体化されたFVIIa類似体をLThimetalBiochemistry19882777857793に従ってイオン交換クロマトグラフィによって、または実施例6に記載されているように精製する。生成物を、最終的にタンパク質解析のための解析の節に記載されているとおりのキャピラリー電気泳動法、MALDITOF、またはその他の適切な方法によって特徴づける。修飾されたNグリカンをPNGaseFプロトコルを使用して切断し、解析の節に記載されているMALDI飛行時間法によって解析する。実施例10:アシアロ糖タンパク質のワンポットガラクトース酸化および求核試薬例えば、RCONHNH2、RNHNH2またはRONH2との反応のための一般的な手順:250μlのアシアログリコプロテイン24μMの10mMMES緩衝液pH60溶液を、120mM50×の求核試薬例えば、RCONHNH2、RNHNH2またはRONH2を含む10mMMES緩衝液pH60の中のガラクトースオキシダーゼおよびカタラーゼと反応させる。反応を4°Cで24~72時間置く。反応の進行は、Invitrogenの手順に従って少量の一定分量に対して、材料の節に明記した方法を使用するキャピラリー電気泳動法によって、またはIEFゲルまたはヒドロキシルアミンの型に応じてSDSPAGEゲルを行うことによって、何れかでモニターする。反応が完了に達したときに、グリカン誘導体化された糖タンパク質を適切なクロマトグラフ的技術によって精製する。生成物を、最終的にタンパク質解析のための解析の節に記載されているとおりのキャピラリー電気泳動法、MALDITOF、またはその他の適切な方法によって特徴づける。修飾されたNグリカンをPNGaseFプロトコルを使用して切断し、解析の節に記載されているMALDI飛行時間法によって解析する。実施例11:アシアロ糖タンパク質のワンポットガラクトース酸化およびビーズに支持された酵素を使用する、求核試薬例えばRCONHNH2、RNHNH2、またはRONH2との反応のための一般的手順:250μlのアシアログリコプロテイン24μMの10mMMES緩衝液pH60溶液を、アガロース固定されたガラクトースオキシダーゼ100mg、典型的には70U/g支持体の活性をもつおよびアガロース固定されたカタラーゼ100mg、典型的には3000U/g支持体の活性をもつと、120mM50×の求核試薬例えば、RCONHNH2、RNHNH2またはRONH2を含むMES緩衝液pH60中で反応させる。反応を4°Cで24~72時間置く。反応の進行は、Invitrogenの手順に従って少量の一定分量に対して、材料の節に明記した方法を使用するキャピラリー電気泳動法によって、またはIEFゲルまたはヒドロキシルアミンの型に応じてSDSPAGEゲルを行うことによって、何れかでモニターする。反応が完了に達したときに、グリカン誘導体化された糖タンパク質を適切なクロマトグラフ的技術によって精製する。生成物を、最終的にタンパク質解析のための解析の節に記載されているとおりのキャピラリー電気泳動法、MALDITOF、またはその他の適切な方法によって特徴づける。修飾されたNグリカンをPNGaseFプロトコルを使用して切断し、解析の節に記載されているMALDI飛行時間法によって解析する。実施例12:FVIIaに対するmPEG5000CH22CONHCH24ONH2のライゲーション工程1アシアロFVIIaの調製:ノイラミニダーゼアガロース上ウェルシュ菌、SigmaN5254をmilliQ水3×15mlで洗浄し、FVIIa11ml、14mgml、Glygly緩衝液中の溶液に添加した。試料を16時間穏やかに振盪した。ノイラミニダーゼを濾過して、緩衝液を、NAP25カラムおよびNAP10カラムAmershambiosciencesを使用してMES緩衝液10mMMES、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH6に交換し、アシアロFVIIaのMES緩衝液を得た。IEFゲルを使用する解析は、タンパク質pIの中の変化を示す。工程2mPEG5000CH22CONHCH24ONH2でのワンスポットガラクトース酸化およびオキシム形成:上記からのいくらかのアシアロFVIIa5mlをガラクトース酸化酵素128mgの51Umg、カタラーゼ1183Umgの924mg、およびmPEG5000CH22CONHCH24ONH2に添加した。試料を20時間rtで静置させた。pHを50mMNaOHで8に合わせて、100mMEDTA500μlを添加し、その後、再びpHを8に合わせた。試料を5mlのHiTrapQカラムAmershamBiosciences、スタート緩衝液10mMTRIS、50mMNaCl、pH80、および溶出緩衝液10mMTRIS、50mMNaCl、25mMCaCl2、pH80を使用して精製した。FVIIaを含む画分を収集して、SDSPAGEによって解析した。生成物の質量の増大が、SDSPAGEによって見えた図5。実施例13:アミノキシ酢酸誘導体化されたFVIIaを調製するための大規模法実施例2または3において調製したアシアロFVIIa105mg、GlyGly緩衝液pH6075ml溶液を、10mMMES、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH60で事前に平衡化した3つのNAP25Amershamカラムを用いて、10mMMES、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH60緩衝液への緩衝液交換に供した。次いで、225mlの10mMアミノキシ酢酸の10mMMES、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH60溶液を添加し、続いて135Uのガラクトースオキシダーゼ193mg、78Umgおよび6039Uのカタラーゼ257mg、2350Umgの225mlの10mMMES、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH60溶液を添加した。混合物を時々振盪しながら4°Cで48時間インキュベートした。50mMNaOHを使用してpHを80まで上げた。pH8017mlの100mMEDTA溶液を添加することによって、溶液からカルシウムイオンを除去した。溶液の伝導率は、83mS/cmに測定された。次いで、溶液を10mMトリス、50mMNaCl、pH80で平衡化した5mlのHiTrapQHPイオン交換カラムAmershamBiosciencesに充填した。カラムを10mMトリス50mMNaClで溶出されたpH8010vol、流束:1ml/分。次いで、溶離緩衝液を10mMトリス、50mMNaCl、25mMCaCl2、pH80に変えた10vol流束:1ml/min。画分はIEFゲルによって解析して図6、純粋なアミノキシ酢酸修飾されたFVIIa試料ゲル上で約58pIを有するをプールした。次いで、緩衝液を、NAP10カラムAmershamを使用して10mMGlyGly、10mMCaCl2、50mMNaCl、pH7に交換し、その後に使用するまで試料を80°Cに貯蔵した。ペプチド分解性peptidolytical活性は、S2288ペプチド基質を使用してインビトロでのアッセイ法の節を参照されたい、出発原料の54と測定された。実施例14:pニトロベンジルオキシアミンでの誘導体化のためのワンポット法工程A緩衝液交換:FVIIa1ml、28nmol、14mgmlの10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMグリシルグリシン緩衝液pH60溶液を10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60で事前にキャリブレートしたcallibrated1mlのNAP10カラムAmershamBioscienceに添加する。溶液を、カラム層を通過させ、次いで、10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60を添加し、その一方で、15mlの溶出液を収集する。工程Bノイラミニダーゼ処理:溶出液を75mUノイラミニダーゼコレラ菌由来EC32118に添加し、混合物を24時間室温でインキュベートする。工程Cガラクトースオキシダーゼ求核試薬との反応:12UガラクトースオキシダーゼEC1139および240UカタラーゼEC11116およびO置換されたヒドロキシルアミン誘導体500nmolまたは酸化されたガラクトース残基あたり約5当量の新たに調製した200μlのMES緩衝液10mMMES、10mMCaCl2、および50mMNaCl、pH60溶液を添加する。混合物をrtで24時間反応させた。工程D誘導体化されたNグリカンの解析:全ての試料を解析のために使用した。NグリカンをPNGaseFを使用して切断し、解析の節に記載されている方法を使用してMALDITOF分光法によって放出されたNグリカンを同定した。2つの誘導体化グリカン構造が、それぞれGalおよびGalNAc修飾で修飾された双アンテナに対応することが同定された図7。実施例15:アミノキシ酢酸でのワンポット誘導体化工程A緩衝液交換:FVIIa1ml、28nmol、14mgmlの10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMグリシルグリシン緩衝液pH60溶液を10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60で事前にキャリブレートしたcallibrated1mlのNAP10カラムAmershamBioscienceに添加する。溶液を、カラム層を通過させ、次いで、10mMCaCl2および50mMNaClを含む15mlの10mMMES緩衝液pH60を添加し、その一方で、15mlの溶出液を収集する。工程Bノイラミニダーゼ処理:溶出液を150mUノイラミニダーゼコレラ菌由来EC32118に添加し、混合物を24時間室温でインキュベートする。工程Cガラクトースオキシダーゼ求核試薬との反応:12UガラクトースオキシダーゼEC1139および240UカタラーゼEC11116およびO置換されたヒドロキシルアミン誘導体500nmolまたは酸化されたガラクトース残基あたり約5当量の新たに調製した200μlのMES緩衝液10mMMES、10mMCaCl2、および50mMNaCl、pH60溶液を添加する。混合物をrtで24時間反応させた。それぞれの工程から採取した一定分量をIEFゲル解析図8によって解析した。また、30mUガラクトースオキシダーゼを使用して工程Cを行った。実施例16:固体に支持されたノイラミニダーゼを使用する、シアル化された糖タンパク質の脱シアリル化アシアロ糖タンパク質の調製:250μlのrFVIIa124mgml、24μMの、10mMCaCl2および50mMNaClを含む10mMグリシルグリシン緩衝液pH60溶液を25mUα23689ノイラミニダーゼに添加し、反応混合物を4°Cで32時間インキュベートした。反応をモニターするために、反応の少量の一定分量は、Invitrogenの手順に従って行われる適切な緩衝液およびIEFゲルで希釈した。また、試料を材料の節に記載されている方法に従ってキャピラリー電気泳動法によって解析した。実施例17:以下の例は、デンドリマー化合物の合成に関する。実施例および一般的な手順は、構造の詳細において、および合成スキームにおいて同定される中間化合物および終末生成物をいう。本発明のデンドリマー化合物の調製は、以下の実施例を使用して詳述してあるが、記載されている化学反応は、選択された本発明の分枝重合体の調製に対してこれらを一般的に適用できることに関して、開示している。時々、本発明の開示された範囲内に含まれるそれぞれの化合物について記載されている反応を適用できないかもしれない。これが生じる化合物は、当業者によって容易に認識される。これらの場合、反応は、当業者に公知の従来の修飾によって、即ち干渉する基の適切な保護によって、その他の従来の試薬に変更することによって、または反応条件のルーチンな修飾によって、首尾よく行うことができる。あるいは、本明細書に開示したか、またはさもなければ従来のその他の反応を、対応する本発明の化合物の調製にも適用できるであろう。全ての調製的方法において、全ての開始材料が公知であるか、または公知の開始材料から容易に調製してもよい。全ての温度は、摂氏度で記載されており、特に明記しない限り、全ての部および割合は、収率に関して記載してきるときは重量によるものであり、溶媒および溶出剤をいうときは、全ての部が体積によるものである。全ての試薬は、AldrichSigmaなどから供給される標準的な等級のものであった。プロトン、炭素、およびリンの核磁気共鳴1H、13C、および31PNMRは、BrukerNMR装置で記録してあり、報告した化学シフトδは、テトラメチルシランまたはリン酸からの低磁場のものである。LCMS質量スペクトルは、以下の通りの装置および準備条件を使用して得た:HewlettPackardシリーズ1100G1312ABinPumpHewlettPackardシリーズ1100ColumnコンパートメントHewlettPackardシリーズ1100G1315ADADダイオードアレイ検出器HewlettPackardシリーズ1100MSD計測器は、HPChemstationソフトウェアによって制御した。HPLCポンプは、以下を含む2つの溶出剤貯蔵所に接続した:A:001TFAの水溶液B:001TFAのアセトニトリル溶液。解析は、適切な量好ましくは、1μLのカラム上に試料を注射することによって40°Cで行い、これをアセトニトリル勾配で溶出した。使用したHPLC条件、検出器設定、および質量分析計設定は、以下の通りである:カラムWatersXterraMSC18、50×3mmid勾配10~100のアセトニトリルをリニアに、10ml/分で75分間検出UV:210nmDADからのアナログ出力MSイオン化モード:APIESScan100~1000amustep01amu。以下の実施例に示したくつかのNMRデータは、選択したデータだけである。実施例において、以下の用語は、以下の一般的な意味を有することが意図される:略語Boc:tertブトキシカルボニルCDI:カルボニルジイミダゾールDCM:ジクロロメタン、メチレンクロライドDIC:ジイソプロピルカルボジイミドDIPEA:NNジイソプロピルエチルアミンDhbtOH:3ヒドロキシ123ベンゾトリアジン43HオンDMAP:4ジメチルアミノピリジンDMF:NNジメチルホルムアミドDMSO:ジメチルスルホキシドDTT:ジチオスレイトールEtOH:エタノールFmoc:9フルオレニルメチルオキシカルボニルHOBt:1ヒドロキシベンゾトリアゾールMeOH:メタノールNMP:Nメチル2ピロリドンNEt3:トリエチルアミンTHF:テトラヒドロフランTFA:トリフルオロ酢酸TSTU:2スクシンイミド1133テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート。以下の非限定の実施例は、固相合成または溶液相合成を使用する単量体の合成および重合技術を示す。単量体ビルディングブロックおよびリンカーの合成実施例17222クロロエトキシエトキシメチルオキシラン22クロロエトキシエタノール10000g;0802molをジクロロメタン100mlおよびボラントリフルリドエーテラートborontriflurideetherateの触媒量228g;16mmolに溶解した。透明な溶液を0°Cに冷却し、エピブロミドリンepibromhydrin10446g;0762molを滴下して添加し、温度を0°Cに維持した。透明溶液を0°Cでさらに3時間撹拌し、溶媒を回転式蒸発によって除去した。残油を一旦アセトニトリルから蒸発して、粗製1ブロモ322クロロエトキシエトキシプロパン2オールを得て、これをTHF500mlに再融解した。次いで、粉末状のカリウムtertブトキシド850g;0765mmol添加し、混合物を30分間加熱して還流した。不溶性塩を濾過によって除去して、真空中で濾液を濃縮し、透明な黄色の油を得た。油を真空蒸留することによってさらに精製し、5613g41の純粋な表題材料を得た。bp=6575°C065mbar1HNMRCDCl3:δ261ppmm1H;270m1H;317m1H;343dd1H;360385m9H13CNMRCDCl3:δ4273ppm;4418;5080;70647069maycollaps;7137;7265。実施例1813ビス22クロロエトキシエトキシプロパン2オール222クロロエトキシエトキシメチルオキシラン220g;122mmolをDCM20mlに溶解し、22クロロエトキシエタノール152g;122molを添加した。混合物を0°Cに冷却し、ボラントリフルリドエーテラートborontriflurideetherateの触媒量02ml;15mmolを添加した。混合物を2時間0°Cで撹拌し、溶媒を回転式蒸発によって除去した。残りのボラントリフルリドエーテラートをアセトニトリルから2回共蒸発することによって除去した。こうして得られた油をクーグラー蒸留kuglerohrdestilationによって精製した。表題材料は、透明な粘りけがある油として、210g45の収率で得られた。bp=270°C025mbar。1HNMRCDCl3:δ331bs1H;355ppmddd4H;365372m12H;375t4H;390m1H13CNMRCDCl3:δ4312ppm;6992;7095;7111;7169;7269。実施例1913ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2オール13ビス22クロロエトキシエトキシプロパン2オール250mg;081mmolをDMF25mlに溶解し、アジ化ナトリウム200mg;310mmolおよびヨウ化ナトリウム100mg;066mmolを添加した。懸濁液を100°C内部温度まで一晩加熱した。次いで、混合物を冷却して、濾過した。濾液を乾燥させ、半結晶質の油をDCM5mlに再懸濁した。非可溶性塩を濾過によって除去し;濾液を乾燥まで蒸発して、無色油状物として純粋な表記物質を得た。収率:210mg84。1HNMRCDCl3:δ348ppmt4H;360375m16H;408m1H13CNMRCDCl3:δ5105ppm;6910;7024;7053;7078;7137LCMSanyone:me=319M1;341MNa;291MN2Rt=278min。実施例2013ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルpニトロフェニルカルボナート13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2オール200g;66mmolをTHF50mlに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン10mlに添加した。次いで、透明な黄色溶液を4ジメチルアミノピリジン160g;131mmolおよびpニトロフェニルクロロホルミアートpnitorphenylchloroformiate264g;131mmolに添加し、外界温度で撹拌した。沈殿が迅速に形成された。懸濁液を室温で5時間撹拌し、次いで濾過して、真空中で濃縮した。残渣を、溶出剤として酢酸エチルヘプタントリエチルアミン4060/2を使用するクロマトグラフィーによってさらに精製した。生成物は、透明な黄色の油として、500mg16の収率で得られた。1HNMRCDCl3:δ338ppmt4H;360372m12H;376m4H;512q1H;741d2H;828d2HLCMSanyone:me=506MNa;456MN2Rt=441min。実施例2113ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルクロロホルミアートトリクロロアセチルクロライド142g、785mmolをTHF10mlに溶解し、溶液を0°Cい冷却した。13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2オール100g;33mmolおよびトリエチルアミン032g、33mmolのTHF5ml溶液を10分間にわたってゆっくりと滴下して添加した。冷却coolingを除去し、生じる懸濁液を外界温度で6時間撹拌した。混合物を濾過して、濾液を蒸発させて、明るい茶色の油を得た。蒸発後に油をアセトニトリルで2回処理して、生成物をさらに精製することなく使用した。1HNMRCDCl3:δ340t4H;355371m12H;375d4H;528m1H。実施例22213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸水素化ナトリウム750g;80の油懸濁液をヘプタンで2回洗浄し、乾燥THF100mlに再懸濁した。次いで、13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2オール1000g;330mmolの乾燥THF100ml溶液を室温で30分間にわたってゆっくりと滴下して添加した。次いで、ブロモ酢酸650mg;47mmolのTHF100ml溶液を20分間にわたって滴下して添加した→わずかに発熱。クリーム色の懸濁液を形成した。混合物を外界温度で一晩撹拌した。混合物を冷却すると共に、過剰な水素化ナトリウムを加水20mlによって慎重に破壊した。懸濁液を回転式蒸発によって乾燥し、残渣をDCMと水に分けた。次いで、水相をDCMで2回抽出し、酢酸25mlを添加することによって酸性化した。次いで、水相をDCMで瞬間抽出して、有機相を組み合わせて硫酸ナトリウムを通して乾燥し、乾燥するまで蒸発した。この時点の残油は、表題材料並びにブロモ酢酸を含んだ。後者のものを、ピペリジン5mlを含むDCM50ml溶液に油を再融解することによって除去し;30分間撹拌し、次いで、有機溶液を1NHCl水溶液で3×瞬間洗浄した。次いで、溶媒の乾燥Na2SO4および蒸発の後に、純粋な表題物質が得られた。収率:754g63。1HNMRδ311ppm35336838042513CNMRδ3818ppm65436609685569136923771817342。実施例23イミダゾール1カルボン酸13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルエステル13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2オール100g;33mmolをたDCM5mlに溶解しカルボニルジイミダゾール118g、63mmolを添加した。混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を除去して、残渣をメタノール20mlに溶解し、20分間撹拌した。溶媒を除去し、こうして得られた透明な油を、溶出剤として2のMeOHのDCM溶液を使用してシリカでのカラムクロマトグラフィーによってさらに精製した。収率:3724mg35。1HNMRCDCl3:δ333t4H;360375m12H;380d4H;535m1H;706s1H;743s1H;816s1H。LCMSanyone:me=413M1;Rt=235min。実施例24tブチル213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸50g;1328mmolをトルエン20mlに溶解し、反応混合物を不活性雰囲気下で加熱して還流した。次いで、NNジメチルホルムアミドジtertブチルアセタール13ml;5421mmolを30分にわたって滴状に添加した。還流を24時間続けた。次いで、濃褐色の溶液をセライトを介して濾過した。溶媒を減圧下で除去し、油性残渣を、溶出剤として3のメタノールジクロロメタンを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分をプールして、乾燥するまで蒸発した。黄色の透明な油のとして表題物質が得られた。収率:507g88。1HNMRCDCl3:δ142ppms9H;335t4H;354369m16H;375385m1H;416s2H13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ3035ppm;5293;7065;7225;7312;7390;8044;8355;17228Rf=033inethylacetate-heptane1:1。実施例25tブチル213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテートtブチル213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート597g、117mmolをエタノール水25ml;2:1に溶解し、酢酸5ml、続いてラネーニッケル5mlの水性懸濁液を添加した。次いで、混合物を、Parr装置を使用して16時間3気圧で水素付加した。次いで、触媒を濾過することによって除去して、反応混合物を回転式蒸発によって乾燥させた。油状残渣を水に溶解し、凍結乾燥して、表題材料の定量的収率を得た。1HNMRCDCl3:δ145ppms9H;315bs4H;348389broadm17H;415s2H13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ2844ppm;3981;6817;7058;7079;7099;7881;8231;17059。実施例26213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸100g;265mmolを1N水性塩酸10mlに溶解し、炭素1ml上で5パラジウムの50水性懸濁液を添加した。混合物をParr装置を使用して35気圧で水素付加した。1時間後に、反応を停止し、触媒を濾過することによって除去した。溶媒を回転式蒸発によって除去して、残渣をアセトニトリルから2回蒸発した。収率:930mg88。1HNMRD2O:δ311ppmt4H;353368m16H;380m1H;425s2H13CNMRD2O:δ3818ppm;6543;6609;6855:6913;6923;7718;17342。実施例27:213ビス229フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸935g;288mmolをDIPEA10ml;57mmolに添加した。反応混合物を氷浴上で冷却して、DCM50mlに溶解したクロロトリメチルシラン15ml;118mmolを、続いてDIPEAによって11ml;627mmolを液滴で添加した。ほぼ透明な溶液に、FmocCl150g;57mmolのDCM50ml溶液を滴下して添加した。反応混合物を一晩撹拌し、次いでDCM500mlで希釈して、001N水性溶液500mlに添加した。有機層を分離して;水3×200mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウムを通して乾燥させた。溶媒を回転式蒸発によって除去した。粗生成物を、溶出剤として酢酸エチルヘプタン1:1を使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分を収集し、乾燥して920g42の表題物質を得た。1HNMRD2O:δ334ppmt4H;345365m16H;369bs1H;420t2H;426s2H;438d4H;560t2H;730t4H;335t4H;758d4H;772d4H13CNMRD2O;selectedpeaks:δ2120ppm;3075;3464;6766;6890;7038;7051;8002;12037;12554;12748;12809;12867;13627;14169;17363;17680。実施例28222アジドエトキシエトキシエタノール222クロロエトキシエトキシエタノール250g、148mmolおよびナトリウムアジド145g、222mmolのジメチルホルムアミド250ml溶液のスラリーを100°Cで一晩静置した。反応混合物を氷浴で冷却し、濾過して、有機溶媒を真空中で蒸発した。残渣をジクロロメタン200mlに溶解し、水75mlで洗浄して、水相をさらにジクロロメタン75mlで抽出して、合わせた有機相を硫酸マグネシウムMgSO4で乾燥し、濾過して、真空中で蒸発し、油を得て、さらに精製することなく使用した。収率:300g100。13CNMRCDCl3:δ7253;70667005;6174;5065。実施例29222アジドエトキシエトキシエトキシ酢酸222アジドエトキシエトキシエタノール26g148mmolをテトラヒドロフラン100mlに溶解し、窒素雰囲気下でゆっくりと、氷冷水素化ナトリウム24g、593mmol、60の油中のスラリーに添加したこれは、ヘプタン2×100mlのテトラヒドロフラン250ml溶液で前もって洗浄した。反応混合物を40分間静置し、次いで氷浴で次冷却して、続いてゆっくりとテトラヒドロフラン150mlに溶解したブロモ酢酸31g、223mmolを添加して、RTで約3時間静置した。有機溶媒を真空中で蒸発した。残渣をジクロロメタン400mlに懸濁した。水100mlをゆっくりと添加し、その後、混合物を機械での攪拌下で30分間静置した。水相を分離し、ハイドロクロライド4Nで酸性化して、ジクロロメタン2×75mlで抽出した。全ての合わせた有機相を真空中で蒸発し、黄色の油を得た。ピペリジン37ml、371mmolのジクロロメタン250ml溶液をゆっくりと油に添加し、混合物を機械での攪拌下で1時間静置した。透明溶液をジクロロメタン100mlで希釈して、ハイドロクロライド4N、2×100mlで洗浄した。水相をさらにジクロロメタン2×75mlで抽出して、合わせられた有機相を真空中で蒸発し、黄色の油を得て、さらに精製することなく使用した。収率:270g66。13CNMRCDCl3:δ17330;7136;70667005;6865;5065。実施例30S26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル上記の222アジドエトキシエトキシエトキシ酢酸13g、469molをジクロロメタン100mlに溶解した。Nヒドロキシスクシンイミド65g、563mmolおよび1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライド108g、563mmolを添加し、反応混合物を1時間静置した。ジイソプロピルエチルアミン39ml、234mmolおよびLリジンメチルエステルジハイドロクロライド60g、258mmolを添加して、反応混合物を16時間静置した。反応混合物をジクロロメタン300mlで希釈し、水100ml、ハイドロクロライド2N、2×100ml、水100ml、50の飽和したナトリウム水素カルボナート100ml、および水2×100mlで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムを通して乾燥し、濾過して、真空中で蒸発し、油を与えて、これはさらに精製することなく使用した。収率:11g73。LCMS:mz=591。13CNMRCDCl3:selectedδ17248;16987;16984;710937002;5351;5234;5135;5064;3848;3648;3199;3140;2913;2282。実施例31S26ビス2222tブチルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル上記のS26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル10g、17mmolのエチルアセテート15ml溶液をジtertブチル二炭素at09g、424mmolおよび10PdC035gに添加した。次いで、水素を、溶液を通して3時間常に泡立てた。反応混合物を濾過して、有機溶媒を真空中で除去した。残渣を溶出剤として酢酸エチル/メタノール9:1を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分をプールして、有機溶媒を真空中で除去し、油を得た。収率:060g50。LCMS:mz=739M1。実施例32S26ビス2222アミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル上記S26ビス2222tブチルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル06g、081mmolをジクロロメタン5mlに溶解した。トリフルオロ酢酸5mlを添加して、反応混合物を約1時間静置した。反応混合物を真空中で蒸発し、油を得て、これはさらに精製することなく使用した収率:0437g100。LCMSm/z=539M1。実施例33S26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸S26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル20g、347mmolのメタノール10ml溶液にナトリウムヒドロキシド水酸化物4N18ml、694mmolを添加し、反応混合物を2時間静置した。有機溶媒を真空中で蒸発し、残渣を水45mlに溶解し、水素クロライド4Nで酸性化した。混合物をジクロロメタン150mlで抽出し、これを飽和した塩化ナトリウム水溶液2×25mlで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムを通して乾燥して、濾過し、真空中で蒸発して、油を得た。LCMSm/z=577M1。実施例34NtertブチルオキシカルボニルアミノキシブチルフタルイミドN4ブロモブチルフタルイミド189g、670mmol、MeCN14mlおよびNBocヒドロキシルアミン127g、954mmolの撹拌混合物に、一部にDBU150ml、101mmolを添加した。生じる混合物を50°Cで24時間撹拌した。水300mlおよび12MのHCl10mlを添加して、生成物をAcOEtで3回抽出した。合わせられた抽出物をブラインで洗浄し、乾燥してMgSO4、減圧下で濃縮した。生じる油28gをクロマトグラフィーヘプタン/AcOEtで140gSiO2、勾配溶出によって精製した。179g80の標記化合物が油として得られた。1HNMRDMSOd6δ136s9H150m2H167m2H358tJ=7Hz2H368tJ=7Hz2H785m4H990s1H。実施例354tertブチルオキシカルボニルアミノキシブチルアミンNtertブチルオキシカルボニルアミノキシブチルフタルイミド835g、250mmolの、EtOH10ml溶液にヒドラジン水和物20mlを添加し、混合物を38時間80°Cで撹拌した。混合物を濃縮して、残渣をEtOHおよびPhMeで共蒸発させた。残渣にEtOH50mlを添加して、沈殿するフタルヒドラジドphthalhydrazideを濾過して、EtOH50mlで洗浄した。合わせた濾液の濃縮により、508gの油を得た。この油をK2CO310g水溶液20mlと混合して、生成物をH2Cl2で抽出した。乾燥MgSO4および濃縮により、228g45の標記化合物を油として得て、これをさらに精製することなく使用した。1HNMRDMSOd6δ138m2H139s9H151m2H251tJ=7Hz2H366tJ=7Hz2H。実施例3622トリチルオキシエトキシエタノールトリチル塩化物10g、358mmolを乾燥ピリジンに溶解し、ジエチレングリコール343mL、358mmolを添加して、混合物を窒素下で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去した。残渣をジクロロメタン100mLに溶解し、水で洗浄した。有機相を、Na2SO4を通して乾燥し、溶媒を真空中で除去した。粗生成物をヘプタン/トルエン3:2からの再結晶によって精製し、標記化合物を得た。1HNMRCDCl3:δ746m6H728m9H375t2H368t2H362t2H328t2HLCMS:mz=371MNa;Rt=213min。実施例37222トリチルオキシエトキシエトキシメチルオキシラン22トリチルオキシエトキシエタノール665g、19mmolを乾燥THF100mLに溶解した。60のNaH-油懸濁液0764mg、19mmolをゆっくりと添加した。懸濁液を15分間撹拌した。エピブロモヒドリン158mL、19mmolを添加して、混合物を室温において窒素下で一晩撹拌した。反応を氷でクエンチし、ジエチルエーテル300mLと水300mLとに分けた。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を集めて、乾燥させNa2SO4、溶媒を進級中で除去して油を得て、DCM/MeOH/Et3N98:1:1で溶出するシリカゲルカラムで精製し、標記化合物を得た。1HNMRCDCl3:δ745m6H725m9H382dd1H368m6H345dd1H325t2H315m1H278t1H259m1HLCMS:mz=427MNa;Rt=244min。実施例3813ビス22トリチルオキシエトキシエトキシプロパン2オール22トリチルオキシエトキシエタノール114g、328mmolを乾燥DMF5mLに溶解した。60のNaH-油懸濁液144mg、361mmolをゆっくり添加して、混合物を30分間に室温において窒素下で撹拌した。混合物を40°Cまで加熱した。222トリチルオキシエトキシエトキシメチルオキシラン14g、328mmolを乾燥DMF5mLに溶解し、一方で撹拌して、窒素下で溶液に滴下して添加した。添加終了後、混合物を40°Cにおいて一晩窒素下で撹拌した。加熱をやめて室温に冷却した後に、反応を氷でクエンチして、飽和したNaHCO3水溶液100mLに注いだ。混合物をジエチルエーテル3×75mLで抽出した。有機相を集めて乾燥しNa2SO4、溶媒を真空中で除去して、油を得て、EtOAc/Heptane/Et3N49:50:1で溶出するシリカゲルカラムで精製して標記化合物を得た。1HNMRCDCl3:δ745m12H725m18H395m1H378345m16H322t4HLCMS:mz=775MNa;Rt=294min。実施例3913ビス22トリチルオキシエトキシエトキシプロパン2イルオキシβシアノエチルNNジイソプロピルホスホラミダイト13ビス22トリチルオキシエトキシエトキシプロパン2オール095g、126mmolを乾燥ピリジンから2回および乾燥アセトニトリルから一度蒸発した。残渣を乾燥THF15mLに溶解し、その一方で、窒素下で撹拌した。ジイソプロピルエチルアミン12mL、695mmolを添加した。混合物を氷浴で0°Cに冷却し、2シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト039mL、177mmolを窒素下で添加した。混合物を0°Cで10分間、続いて室温で30分間撹拌した。NaHCO3水溶液50mLを添加して、混合物をDCM/Et3N98:23×30mLで抽出した。有機相を集めて、乾燥しNa2SO4、溶媒を真空中で除去して油を得て、EtOAc/Heptane/Et3N35:60:5で溶出するシリカゲルカラムの上で精製して703mgの標記化合物を得た。31PNMRCDCl3:δ1496ppm。実施例40213ビス22ヒドロキシエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸tertブチルエステル13ビス22トリチルオキシエトキシエトキシプロパン2オール03g、040mmolを乾燥ピリジンから一度および乾燥アセトニトリルから一度蒸発させた。窒素60のNaH下で、残渣を乾燥DMF2mLに溶解し-油懸濁液24mg、06mmolを添加した。混合物を15分間室温で撹拌した。tertブチルブロモアセテート007mL、048mmolを添加して、混合物をさらに60分間撹拌した。反応を氷でクエンチし、ジエチルエーテル100mLと水100mLとに分けた。有機相を集めて、乾燥しNa2SO4、溶媒を真空中で除去して油を得て、これをEtOAc/Heptane/Et3N49:50:1によりシリカゲルカラム上で溶出した。主な生成物を含む画分を収集した。溶媒を真空中で除去して、残渣を80の水性酢酸5mLに溶解し、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗製物質をジエチルエーテル25mLに溶解し、水2×5mLで洗浄した。水相を集めて、水を回転式蒸発で除去して63mgの標記化合物を得た。1HNMRCDCl3:δ419s2H378355m21H149s9H。実施例41:NNビス22フタルイミドエトキシエチルOtertブチルカルバミン酸NNビス2ヒドロキシエチルOtertブチルカルバミン酸をTHFまたはDMFなどの極性の非プロトン性溶媒に溶解する。水素化ナトリウム60の鉱油懸濁液をゆっくり溶液に添加する。混合物を3時間撹拌する。N2ブロモエチルフタルイミドを添加する。反応が完全になるまで、混合物を撹拌する。反応は、メタノールをゆっくりと添加することによってクエンチする。酢酸エチルを添加する。溶液を水性炭酸水素ナトリウムで洗浄する。有機相を濾過し、乾燥して、その後に可能な限り減圧下で濃縮する。粗製化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーによって精製する。実施例42:NNビス22アミノエトキシエチルOtertブチルカルバミン酸NNビス22フタルイミドエトキシエチルOtertブチルカルバミン酸をエタノールなどの極性溶媒に溶解する。ヒドラジンまたはフタロイル保護基を除去するための公知の別の薬剤を添加する。反応が完了するまで、混合物を室温または必要に応じて昇温状態で撹拌する。混合物を減圧下で可能な限り濃縮する。粗製化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーによって、または可能ならば真空蒸留destillationによって精製する。実施例43:NNビス22ベンジルオキシカルボニルアミノエトキシエチルOtertブチルカルバミン酸NNビス22アミノエトキシエチルOtertブチルカルバミン酸を水酸化ナトリウム水溶液とTHFとの混合物に、または水酸化ナトリウム水溶液とアセトニトリルとの混合物に溶解する。ベンジル基を含むクロロ炭酸塩を添加する。反応が完了するまで、混合物を部屋温度で撹拌する。必要に応じて、真空中で体積を減少させる。酢酸エチルを添加する。有機相をブラインで洗浄する。有機相を乾燥し、濾過し、その後可能な限り真空中で濃縮する。粗製化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーによって精製する。実施例44:ビス22フタルイミドエトキシエチルアミンビス22フタルイミドエトキシエチルtertブチルカルバミン酸をトリフルオロ酢酸に溶解する。反応が完了するまで、混合物を室温で撹拌する。混合物を可能な限り真空濃縮する。粗製化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーによって精製する。実施例45:11オキソ17フタルイミド1222フタルイミドエトキシエチル36915テトラオキサ12アザヘプタデカン酸369トリオキサウンデカン酸をジクロロメタンに溶解する。カルボジイミド例えば、NNジシクロヘキシルカルボジイミドまたはNNジイソプロピルカルボジイミドを添加する。溶液を室温で一晩撹拌する。混合物を濾過する。濾液を、必要に応じて真空濃縮することができる。形成された分子内無水物をもつアミンのアシル化は、文献から公知である例えば、CookRM;AdamsJH;HudsonDTetrahedronLett19943567776780orStoraT;DienesZ;VogelH;DuschlCLangmuir20001654715478。無水物をビス22フタルイミドエトキシエチルアミンの、ジクロロメタンまたはNNジメチルホルムアミドなどの非プロトン溶媒溶液と混合する。反応が完了するまで混合物を撹拌する。粗製化合物を抽出およびその後の標準的なカラムクロマトグラフィーによって精製する。実施例46:5オキソ11フタルイミド622フタルイミドエトキシエチル39ジオキサ6アザウンデカン酸ジグリコール酸の無水物の、ジクロロメタンまたはNNジメチルホルムアミドなどの非プロトン溶媒溶液を、ビス22フタルイミドエトキシエチルアミンの、ジクロロメタンまたはNNジメチルホルムアミドなどの非プロトン溶媒溶液に滴下する。反応が完了するまで、混合物を撹拌する。粗製化合物を抽出およびその後の標準的なカラムクロマトグラフィーによって精製する。実施例47123ベンゾトリアジン43Hオン3イル222メトキシエトキシエトキシアセテート3ヒドロキシ123ベンゾトリアジン43Hオン100g;613mmolおよび222メトキシエトキシエトキシ酢酸109g;613mmolをDCM125mlに懸濁し、DIC77g;613mmolを添加した。混合物を一晩、外界温度で乾燥雰囲気下で撹拌した。ジイソプロピル尿素沈殿を形成させて、濾過した。有機溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で広範に洗浄し、次いで乾燥しNa2SO4、真空中で蒸発させ、透明な黄色の油として標記生成物を得た。収率は、1615g81であった。1HNMRδ339ppm35836837638947078780382383713CNMRδ5716ppm649668716879695969991203212387127171309613363142401482216497。オリゴマー生成物固相オリゴマー形成:下記に記載されている反応の全ては、Wangリンカーで官能性をもたせたポリスチレン上で行われる。また、反応は、一般にその他のタイプの固体支持体上で、並びにその他のタイプの官能性をもたせたリンカーでも作用する。固相アジ化物の還元:反応は、公知でありSchneiderSEetalTetrahedron199854501506315086、過剰のトリフェニルホスフィンのTHFと水との混合物溶液で、室温において12~24時間支持体に結合したアジ化物を処理することによって行うことができる。あるいは、ChanTYetalTetrahedronLett1997381628212824によって記載されているように、トリメチルホスフィンのTHF水溶液を使用することもできる。また、アジ化物の還元は、ジチオスレイトールなどの硫化物MeldalMetalTetrahedronLett1997381425312534、12ジメルカプトエタンおよび13ジメルカプトプロパンMeinjohannsEetalJChemSocPerkinTrans119976871884、または塩化スズIIなどのスズII塩KimJMetalTetrahedronLett1996373053055308を使用して固相上で行うこともできる。固相カルバメート形成:反応は公知であり、通常、活性化されたカルボナートまたはハロギ酸誘導体をアミンと、好ましくは塩基の存在下において反応させることによって行われる。実施例48313ビス2213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸本実施例は、222メトキシエトキシエトキシ酢酸でキャップされたデンドリマーに基づいた第二ジェネレーションのアミドの合成において、実施例6で調製した213ビスアジドエトキシエチルプロパン2イルオキシ酢酸単量体ビルディングブロックを使用する。カップリング化学は、標準的な固相ペプチド化学に基づいており、保護法は、上記の通りに固相アジ化物還元工程に基づいている。工程1:FmocβalaWang樹脂100mg;充填031mmol/gBACHEMをジクロロメタンに30分間懸濁し、DMFで2回洗浄した。20のピペリジンのDMF溶液を添加して、混合物を周囲温度で15分間に振盪した。この工程を繰り返して、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程2:単量体ビルディングブロックのカップリング:213ビスアジドエトキシエチルプロパン2イルオキシ酢酸527mg;14mmol、4×およびDhbtOH225mg;14mmol、4×の溶液をDMF5mlに溶解し、DhbtOH225mg;14mmol、4×を添加した。混合物を10分間放置しプレ活性化、次いで、DIPEA240μl;14mmol、4×と共に樹脂に添加した。樹脂を90分間振盪し、次いで排液し、DMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程3:無水酢酸でのキャップ形成:次いで、樹脂を酢酸無水物、DIPEA、DMF12:4:48の溶液で外界温度において10分間処理した。溶媒を除去して、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程4:脱保護アジド基の還元:樹脂を、DTT2MおよびDMFのDIPEA1M溶液で50°Cにおいて1時間処理した。次いで、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。少量の樹脂を再び吸い込んで、1時間ベンジルクロライド05MおよびDMFのDIPEA1M溶液で処理した。樹脂を50のTFA/DCMで切断し、ジベンジル化された生成物をNMRおよびLCMSで解析した。1HNMRCDCl3:350375m20H;385s1H;425d2H;695t1H;740750m6H;775m4HLCMSanyone:me=576M1;Rt=263min。工程5~7は、2倍量の試薬を使用して、しかし同じ量の溶媒を使用して、工程2~4のように行った。工程8:222メトキシエトキシエトキシ酢酸でのキャップ形成:222メトキシエトキシエトキシ酢酸997mg;56mmol、樹脂充填に関して16×およびDhbtOH900mg;56mmol、16×をDMF5mlに溶解し、DIC864μl、56mmol、16×を添加する。混合物を10分間放置しプレ活性化、次いでDIPEAと共に樹脂に添加する960μl;56mmol、16×。樹脂は90分間振盪し、次いで排液して、DMF3×およびDCM3×で洗浄する。工程9:樹脂からの切断:樹脂を50のTFADCM溶液で外界温度において30分間処理する。溶媒を集め、樹脂を50のTFADCMで更なる回数洗浄する。合わせた濾液を乾燥するまで蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーによって精製する。実施例49313ビス2213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシカルボニルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシカルボニルアミノプロパン酸本実施例は、222メトキシエトキシエトキシ酢酸でキャップされた第二ジェネレーションのカルバメートの合成において、実施例4で調製された13ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルpニトロフェニルカルボナート単量体ビルディングブロックを使用する。カップリング化学は、標準的な固相カルバメート化学に基づいており、保護法は、上記の通りの固相アジ化物還元工程に基づいている。工程1:FmocβalaWang樹脂100mg;充填031mmol/gBACHEMをジクロロメタンに30分間懸濁し、DMFで2回洗浄した。20のピペリジンのDMF溶液を添加して、混合物を周囲温度で15分間に振盪した。この工程を繰り返して、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程2:単量体ビルディングブロックのカップリング:13ビスアジドエトキシエチルプロパン2イルpニトロフェニルカルバミン酸527mg;14mmol、4×の溶液をDIPEA240μl;14mmol、4×と共に樹脂に添加した。樹脂を90分間振盪し、次いで排液し、DMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程3:無水酢酸でのキャップ形成:次いで、樹脂を酢酸無水物、DIPEA、DMF12:4:48の溶液で外界温度において10分間処理した。溶媒を除去して、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。工程4:脱保護アジド基の還元:樹脂を、DTT2MおよびDMFのDIPEA1M溶液で50°Cにおいて1時間処理した。次いで、樹脂をDMF3×およびDCM3×で洗浄した。少量の樹脂を再び吸い込んで、1時間ベンジルクロライド05MおよびDMFのDIPEA1M溶液で処理した。樹脂を50のTFA/DCMで切断し、ジベンジル化された生成物をNMRおよびLCMSで解析した。1HNMR350375385425695740750775LCMSme=576Rt=263min。工程5~7は、2倍量の試薬を使用して、しかし同じ量の溶媒を使用して、工程2~4のように行った。工程8:222メトキシエトキシエトキシ酢酸でのキャップ形成:222メトキシエトキシエトキシ酢酸997mg;56mmol、樹脂充填に関して16×およびDhbtOH900mg;56mmol、16×をDMF5mlに溶解し、DIC864μl、56mmol、16×を添加する。混合物を10分間放置しプレ活性化、次いでDIPEAと共に樹脂に添加する960μl;56mmol、16×。樹脂は90分間振盪し、次いで排液して、DMF3×およびDCM3×で洗浄する。工程9:樹脂からの切断:樹脂を50のTFADCM溶液で外界温度において30分間処理する。溶媒を集め、樹脂を50のTFADCMで更なる回数洗浄する。合わせた濾液を乾燥するまで蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーによって精製する。実施例503213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸工程1:Fmocβアラニン連結Wang樹脂A22608、A22608、NovaBiochem、300g;充填、083mmol/gをDCMに20分間溶解し、次いで、DCM2×20mlおよびNMP2×20mlで洗浄した。次いで、樹脂を20ピペリジンのNMP2×15分溶液で2回処理した。樹脂をNMP3×20mlおよびDCM3×20mlで洗浄した。工程2:213ビス22アジドエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸370g;10mmolをNMP30mlおよびDhbtOH160g;10mmolに溶解し、DIC155ml;10mmolを添加した。混合物を外界温度で30分間撹拌し、次いでDIPEAと共に工程1で得られた樹脂に添加する171ml;10mmol。反応混合物を15時間振盪し、次いで排液し、NMP5×20mlおよびDCM3×20mlで洗浄した。工程3:次いで、SnCl22H2O112g;498mmolのNMP15mlおよびDCM15ml溶液を添加した。反応混合物を1時間振盪した。樹脂を排出して、NMP:MeOH5×20ml;1:1で洗浄した。次いで、樹脂を真空中で乾燥させた。工程4:222メトキシエチルエトキシ酢酸120g;664mmol、DhbtOH106g;660mmolおよびDIC105ml;660mmolのNMP10ml溶液を、室温で10分間に混合し、次いで工程3で得られた3213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸につながれたwang樹脂10g;083mmol/gを添加した。DIPEA115ml、660mmolを添加して、反応混合物を25時間振盪した。溶媒を除去して、樹脂をNMP5×20mlおよびDCM10×20mlで洗浄した。工程5:工程4の樹脂生成物をTFA:DCM10ml、1:1で1時間処理した。樹脂を濾過して、TFA:DCM10ml、1:1で一度洗浄した。合わせられた濾液および洗浄し、次いで乾燥させ、黄色の油711mgを得た。油を10のアセトニトリル水20mlに溶解し、C18カラムおよび15~40のアセトニトリル水の勾配を使用する調製用HPLC装置での2回の実施にわたって精製した。その後、画分をLCMSによって解析した。生成物を含む画分をプールして、乾燥させた。収率:222mg37。LCMSmz716Rt197min。1HNMRCDCl3:δ256ppmt2H;336s6H;346366m39H;403s4H;416s2H;755t2H;805t1H13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ3371ppm;3490;5889;6894;6940;6998;7009;7033;7074;7091;7107;7174;7907;17162;17197;17363。実施例51313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸この材料は、使用する試薬の量を2倍にして工程2~5を繰り返すことによって、実施例50の工程3で得られる3213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸につながれたwang樹脂10g;083mmol/gから調製した。収率:460mg33。MALDIMSシアノヒドロキシシナピン酸マトリックス:mz=1670MNa。1HNMRCDCl3:δ257ppmt2H;338s12H;350373m85H;405s8H;417s2H;419s4H;748m4H;797m3H13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ3881ppm;5892;6946;6992;7005;7005;7013;7040;7073;7097;7111;7188;7674;7706;7738;17133;17202。実施例52313Bis{22213ビス{22213ビス22{エトキシ222メトキシエトキシアセトアミノ}エトキシエトキシプロパン2イルoxyアセチルアミノエトキシエトキシ}プロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシ}プロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸この材料は、使用する試薬の量を2倍にして工程2~3を繰り返し、次いで使用する試薬の量を2倍にして工程2~5を繰り返すことによって、実施例50の工程3で得られる3213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸につながれたwang樹脂10g;083mmol/gから調製した。収率:84mg4。LCMS:m21=1758;m31=1172;m41=879;m51=704Rt=272min。1HNMRCDCl3:δ251ppmt2H;333s24H;344370m213H;393s16H;408s14H;725m8H;769m7H13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ3894ppm;5933;6978;7008;7037;7044;7056;7082;7110;7126;7151;7217;7924;17060;17122。実施例53Nヒドロキシスクシンイミジル3213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパノアート3213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸67mg;82μmolをTHF5mlに溶解した。反応混合物を氷浴上で冷却した。DIPEA20μl;120μmolおよびTSTU34mg;120μmolを添加した。混合物を外界温度で一晩で撹拌し、その時に、反応をLCMSに従って完了させた。LCMS:m/z=813MH;Rt=222min。実施例54Nヒドロキシスクシンイミジル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパノアート実施例53に記載されているように、313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸およびTSTUから調整した。LCMS:m21873、Rt255min。実施例55Nヒドロキシスクシミジル313ビス22213ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパノアート実施例53に記載されているように、Nヒドロキシスクシンイミジル313ビス22213ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパン酸およびTSTUから調製した。LCMS:m41903、Rt269min。実施例56N4tertブトキシカルボニルアミノキシブチル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパンアミドNヒドロキシスクシンイミジル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパノアート105mg;006mmolをDCM2mlに溶解した。次いで、4tertブチルオキシカルボニルアミノキシブチルアミン49mg;024mmolの溶液49mg;024mmolを、続いてDIPEAを添加した13μl;007mmol。混合物を1時間の外界温度で撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣を20のアセトニトリル水4mlに溶解し、C18カラムおよびアセトニトリル水の0、10、20、30、および40それぞれ、10mlの溶出の段階的勾配を使用して調製用HPLC装置で精製した。純粋な生成物を含む画分を濃縮して、真空オーブン中で16時間乾燥し、黄色の油を得た。収率:57mg51。LCMS:m21=918Rt=275min。1HNMRCDCl3:δ142ppms9H;240t2H;321dd2H;333s12H;338372m99H;380m2H;395s8H;408s6H;699m1H;723m4H;769m2H;785m1H;800m1H。13CNMRCDCl3selectedpeaks:δ2827ppm;3858;5897;6942;6972;7001;7008;7020;7041;7046;7073;7091;7116;7122;7181;7889;8133;17027;17089。実施例57N4アミノキシブチル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパンアミドN4tertブトキシカルボニルアミノキシブチル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパンアミド19mg;10μmolを50のTFA/DCM10mlに溶解し、透明な溶液を30分間外界温度で撹拌した。溶媒を回転式蒸発によって除去して、残渣をDCMから2回取り除き、標記生成物の定量的収率19mgを得た。LCMS:m21=868、m31=579、Rt=235min。以下の実施例は、ペプチドまたはタンパク質に対する溶液相接合を示す。実施例58tブチル213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテートtブチル213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート174g;45mmolおよび123ベンゾトリアジン43Hオン3イル222メトキシエトキシエトキシアセテート294g;9mmolをDCM100mlに溶解した。DIPEA385ml;223mmolを添加し、セラーcelar混合物を室温で90分間撹拌した。溶媒を真空中で除去して、溶出剤として残渣をMeOHDCM1:16を使用するシリカでのクロマトグラフィーによって精製した。純粋な画分をプールして、乾燥させて、透明な油として表題物質を得た。収率は、113g36であった。1HNMRCDCl3:δ146ppms9H;338s6H;349369m37H;401s4H;418s2H;720bs2H。実施例59213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸:tブチル213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート470mg;073mmolをDCMTFA25ml、1:1に溶解し、混合物を外界温度で30分間撹拌した。真空中で溶媒を除去して、残渣を2回DCMから取り除いた。LCMS:m1=645Rt=226min。1HNMRCDCl3:δ345ppms6H;354372m37H;415s4H;436s2H。実施例60Nヒドロキシスクシミジル213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシ酢酸115mg;018mmolをTHF5mlに溶解した。反応混合物を氷浴上に置いた。TSTU65mg、021mmolおよびDIPEA37μl;021mmolを添加し、反応混合物を0°Cで30分間、次いで室温で一晩撹拌した。次いで、反応を乾燥させて、透明な油のとして130mgの表題物質を得た。LCMS:m1=743m21=372Rt=227min。実施例61tブチル313ビス22213ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテート材料は、2当量のNヒドロキシスクシミジル213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテートおよび1当量のtブチル213ビス22アミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセテートから実施例58に記載されているプロトコルおよび精製法を使用して調整する。その後のtブチル基の除去は、実施例59に記載されているように行い、Nヒドロキシスクシミジルエステル形成は、実施例60に記載されているように行う。実施例62S26ビス222226ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステルS26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸18g、310mmolを1:310mlジメチルホルムアミド/ジクロロメタンの混合物に溶解し、ジイソプロピルエチルアミンを使用してpHを塩基性反応液に合わせ、Nヒドロキシベンゾトリアゾールおよび1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライドを添加して、反応混合物を30分間静置した。次いで、この反応混合物をS26ビス2222アミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル037g、070mmolのジクロロメタン溶液に添加し、反応混合物を一晩静置した。反応混合物をジクロロメタン150mlで希釈し、水2×40ml、50の飽和炭酸水素ナトリウム2×30ml、および水3×40mlで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムを通して乾燥し、濾過して、真空中で蒸発して油を得た。収率:16g89。LCMS:mz=1656M1andmz=8288M21andmz=553M31。実施例63S26ビス2222S26ビス2222tertブトキシカルボニルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル上記S26ビス2222S26ビス2222アジドエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル16g、097mmolの酢酸エチル60ml溶液には、ジtertブチルジカルボナート10g、48mmolおよびPdC10、11gを添加した。水素を、反応混合物を通して2時間常に泡立てた。反応混合物を濾過して、有機溶媒を真空中で除去し、油を得て、さらに精製することなく使用した。収率:18g98。LCMS:m/z=1953M1、およびm/z=977M21。実施例64S26ビス2222S26ビス2222アミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル上記S26ビス2222S26ビス2222tertブトキシカルボニルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステルをジクロロメタン20mlに溶解し、トリフルオロ酢酸20mlを添加した。反応混合物を2時間静置した。有機溶媒を真空中で蒸発し、油を得た。収率:14g100。LCMS:mz=1552M1;7773M21;5185M31and3891M41。実施例65S26ビス2222S26ビス2222222メトキシエトキシエトキシアセチルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル22メトキシエトキシエトキシ酢酸13g、732mmolのジクロロメタンとジメチルホルムアミド3:120mlの混合物の溶液に、Nヒドロキシスクシンイミド08g、732mmolおよび1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミドハイドロクロライド14g、732mmolを添加した。反応混合物を1時間静置し、その後、混合物をS26ビス2222S26ビス2222アミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステル142g、092mmolおよびジイソプロピルエチルアミン24ml、1464mmolのジクロロメタン10ml溶液に添加した。反応混合物を一晩静置した。反応混合物をジクロロメタン100mlで希釈して、水3×25mlで抽出した。合わせた水相をさらにジクロロメタン2×75mlで抽出した。残渣を、溶出剤として500mlの酢酸エチル、続いて500mlの酢酸エチル/メタノール9:1、および最後にメタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含む画分を真空中で蒸発させて、油を得た。収率:075g38。LCMS:mz=1097M21;732M31and549M41。S26ビス2222S26ビス2222222メトキシエトキシエトキシアセチルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサノイルアミノエトキシエトキシエトキシアセチルアミノヘキサン酸メチルエステルは、遊離酸にけん化することができ、活性化されたエステルを経て使用してペプチドまたはタンパク質のアミノ基に付着することができる。活性化エステルは、ジイソプロピルエチルアミンおよびNヒドロキシベンゾトリアゾールまたはその他の活性化条件などの、当技術分野に公知の標準的なカップリング法によって、作製し、およびペプチドまたはタンパク質のアミノ基に結合してもよい。従って、図16、または実施例53、並びに実施例56および57の類似体に従った更なる変換により、本発明に従った接合体を調製するために使用することができる樹状物質がもたらされる。実施例66213ビス22ヒドロキシエトキシエトキシプロパン2オキシ酢酸tertブチルエステル63mg、016mmolを乾燥アセトニトリルから2回蒸発させた。13ビス22トリチルオキシエトキシエトキシプロパン2オキシβシアノエチルNNジイソプロピルホスホラミダイト353mg、037mmolを乾燥アセトニトリルから2回蒸発させ、乾燥アセトニトリル2mLに溶解して添加した。テトラゾールの乾燥アセトニトリル025M、264mL溶液を窒素下で添加して、混合物を1時間室温で撹拌した。55mLのI2溶液01Mの7:2:1THF/ルチジン/水を添加し、混合物をさらに1時間撹拌した。ヨウ素色が消えるまで、反応混合物を酢酸エチル20mLで希釈して、2の亜硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を乾燥しNa2SO4、溶媒を真空中で除去した。残渣を80の酢酸5mL水溶液に溶解し、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去して、粗製物質には、ジエチルエーテル25mLおよび水10mLを添加した。水相を集めて、水を真空中で除去した。生成物を逆相調製用HPLCC18カラム、01のTFAを含む0~40のアセトニトリル勾配で精製し、tertブチル保護された第二ジェネレーションデンドリマー生成物を得た。HPLCMS:mz=1171MNa;1149M1093lostoftertbutylintheMSRt=276min。その後、当業者に公知の従来の塩基および酸処理を使用して、βシアノエチル基の脱保護、およびtertブチルエステル基の除去を行った。従って、図16、または実施例53、並びに実施例56および57の類似体に従った更なる変換により、本発明に従った接合体を調製するために使用することができる樹状物質がもたらされる。実施例67アシアロrFVIIa102mg、02μmolの135mlTRIS緩衝液10mMCacl2、10mMTRIS、50mMNaCl、05Tween80、pH74溶液を氷浴で冷却した。N4アミノキシブチル313ビス22213ビス22222メトキシエトキシエトキシアセトアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノエトキシエトキシプロパン2イルオキシアセチルアミノプロパンアミド17mg;100μmol、50×のリス緩衝液溶液を、続いて25mlのガラクトース酸化酵素135Uおよびカタラーゼ7500Uのトリス緩衝液溶液を添加した。反応混合物を4°Cで48時間穏やかに振盪した。次いで、わずかに不透明な溶液を045μmフィルタSartoriusMinisart登録商標を通して濾過した。次いで、NAP10カラムAmershamを使用して、緩衝液をMES10mMCaCl2、10mMMES、50mMNaCl、pH60に交換した。次いで、混合物を氷上で冷却して、EDTAの水溶液35ml、100mM、pH80、Ca2に相当を添加した。1MのNaOH水溶液を添加することによってpHを76に合わせて、試料68mS/cmを5mlのHiTrapQHPイオン交換カラムAmershamBiosciences10mMトリス、50mMNaCl、pH74で平衡化されるに充填した。カラムを10mMトリス、50mMNaCl、pH7410vol、流束:1ml/分で溶出した。次いで、溶離緩衝液を10mMトリス、50mMNaCl、25mMCaCl2、pH7410vol、流束:1ml/分に変えた。溶出液をUVによってモニターし、タンパク質を含むそれぞれの画分をSDSPAGEゲル電気泳動によって解析した。Nグリカン修飾されたrFVIIの純粋な試料をプールし80°Cに貯蔵した。