"トキシン内のアルギニン残基が、薬剤として使用できるように一般構造R-COCOR’のα-ジカルボニル化合物との反応を経た、トキシンから誘導されるトキソイド。α-ジカルボニル化合物がグリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、4-フルオロフェニルグリオキサール、4-ニトロフェニルグリオキサールおよび4-ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項1に記載のトキソイド。α-ジカルボニル化合物がフェニルグリオキサールである、請求項2に記載のトキソイド。植物トキシンから誘導される、請求項1から3のいずれかに記載のトキソイド。植物トキシンがリシンである、請求項4に記載の蛋白質トキソイド。トキシンが動物から誘導される、請求項1から3のいずれかに記載のトキソイド。トキシンが蛇毒である、請求項6に記載のトキソイド。トキシンが細菌から誘導される、請求項1から3のいずれかに記載のトキソイド。トキシンがボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはSEBである、請求項8に記載のトキソイド。薬剤がワクチンである、請求項1から9のいずれかに記載のトキソイド。トキシンによる中毒の予防的または治療的処置に用いられる、一般構造R-COCOHのα-ジカルボニル化合物との反応を経た、トキシンから誘導されるトキソイド。α-ジカルボニル化合物がグリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、4-フルオロフェニルグリオキサール、4-ニトロフェニルグリオキサールおよび4-ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項11に記載のトキソイド。α-ジカルボニル化合物がフェニルグリオキサールである、請求項12に記載のトキソイド。α-ジカルボニル化合物が約0.05mMから約5mMの範囲内の濃度で溶解される、請求項11から13のいずれかに記載のトキソイド。α-ジカルボニル化合物の濃度が約1mMである、請求項14に記載のトキソイド。ジカルボニル化合物がpH6から14の範囲内の緩衝液に溶解される、請求項11から15のいずれかに記載のトキソイド。pHが8である、請求項16に記載のトキソイド。反応を37°Cで少なくとも1時間実施する、請求項11から17のいずれかに記載のトキソイド。反応を37°Cで1から168時間実施する、請求項11から18のいずれかに記載のトキソイド。反応を37°Cで約24時間実施する、請求項19に記載のトキソイド。トキシンが植物から誘導される、請求項11から20のいずれかに記載のトキソイド。トキシンがリシンである、請求項21記載のトキソイド。トキシンが動物から誘導される、請求項11から22のいずれかに記載のトキソイド。トキシンが蛇毒である、請求項23に記載のトキソイド。トキシンが細菌から誘導される、請求項11から24のいずれかに記載のトキソイド。トキシンがボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはSEBである、請求項25に記載のトキソイド。請求項1から26のいずれかに記載のトキソイドと、医薬として許容される希釈液または担体とを含む、医薬組成物。アジュバントを更に含有する、請求項27に記載の医薬組成物。請求項1から28のいずれかに記載のトキソイドまたは医薬組成物をアンチトキソイド抗体の生成を誘発するための有効量だけ動物に投与する工程と、前記動物から血液を採取し、前記血液から血清を分離して、前記血清から抗体を抽出する工程とを含む、抗毒素の生成方法。抽出された抗体を、生成された特異性除去抗毒素の抗体フラグメントに断片化する、請求項29に記載の方法。請求項29または30に記載の方法で生成される抗毒素。トキシン中毒の治療に有用である、請求項31に記載の抗毒素。請求項31に従って生成された抗毒素を医薬的な有効量だけ個体に投与する工程を含む、中毒状態の個体を処置する方法。請求項1から26のいずれかに記載のトキソイド、または請求項27および28のいずれかに記載の医薬組成物を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、トキシンによる中毒に対してワクチン接種をする方法。請求項31に記載の抗毒素を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、ヒトを含めた中毒状態の哺乳動物を処置する方法。従って、本発明の一態様では、トキシンから誘導されるトキソイドを提供する。ここで、トキシン内のアルギニン残基は、次に示す一般構造R-COCOR’のα-ジカルボニル化合物との化学反応を経る。[RCOCOR’]。ここで、RおよびR’は水素H、アルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリール基である。構造A図1を参照。ジカルボニル化合物のトキソイド化試薬は、上の一般構造に分類される化学化合物であれば、どのようなものでもよい。例えば、構造AにおけるRまたはR’は水素であるまたは、任意のアルキル基またはアリール基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、フェニル、この他または、これらの分枝もしくは置換型の変種であってもよい。従って、トキソイド化試薬は好都合にも、グリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、フェニルグリオキサール、4-フルオロフェニルグリオキサール、4-ニトロフェニルグリオキサールおよび4-ヒドロキシフェニルグリオキサールからなる群から選択することができる。これらはいずれも、現在市販されている。本発明の好ましい実施形態は、R’が水素の場合である。かかるトキソイド化剤はケトアルデヒドの一般クラスに分類される。特に好ましいジカルボニルケトアルデヒド化合物はフェニルグリオキサールである図1。フェニルグリオキサールは、蛋白質のアルギニル残基と選択的に反応して、アルギニンのグアニジン基につき2つのフェニルグリオキサール基を有する生成物を生じることが既に明らかにされてきたが、本発明者らは、フェニルグリオキサールがアルギニル残基に対する高度な特異性を有することで、生成されたトキソイドが完全ならびに不可逆的に不活性化され、トキシン/トキソイドの立体配座構造を有意に変えることなく高度に免疫原性であるという驚くべき発見をした。理論に束縛されるものではないが、トキソイド化反応は2つの工程に従うと考えられている。第1の工程は、1つのグアニジンのアミノ基と、グリオキサールにおいて立体障害が最小限である炭素原子即ち、フェニルまたは4-ヒドロキシフェニルグリオキサール内のCHO基、またはブタンジオンもしくはシクロヘキサンジオン内の2つの同一のC=O基のいずれか一方との可逆的な縮合であることが予期される。2番目の工程は、残りのグアニジンのアミノ基の2回目の縮合によってヘテロ環を生成するもので、可逆が容易でないことが予期される。フェニルグリオキサールPGは、このような形質転換に好適な試薬である。電気陰性のフェニルカルボニル基は、求核攻撃に対して立体障害の少ないCHO基を活性化することによって、以降の環化を容易にするからである。結果的に、フェニルグリオキサールの誘導体例えば、4-ヒドロキシフェニルグリオキサールもまた、トキソイドの生成に使用できる。4-ヒドロキシフェニルグリオキサールは、フェニルグリオキサールに比べて反応性が低い場合があるが、水可溶性が高いため有益であろう。4位に電子求引性基を有するPGの他の誘導体例えば、4-シアノ誘導体、4-フルオロ誘導体、4-トリフルオロメチル誘導体、または4-ニトロ誘導体は、PGよりも高速に反応し、トキソイドを数分で生成できる可能性を有する。一般に、アルデヒド基CHOを有する一般構造R-COCOHのジカルボニルトキソイド化試薬は、ケトン基C=Oを有する一般構造R-COCOR’のジカルボニルトキソイド化試薬よりも迅速に反応するため、好ましい。本発明のジカルボニルトキソイド化試薬特に、フェニルグリオキサールは、何らかの供給源から誘導されたトキシンのトキソイドを生成する際に使用できる。例えば、蛋白質トキソイドは、植物から誘導されるトキシンから生成することができる。好適な植物トキシンには、アブリンおよびリシンを挙げることができる。以降本明細書中に示すように、トキソイド化試薬は、リシンのトキソイドを調製する上で特に有効である。ただし、トキシンが動物または微生物から同様に誘導し得ることは、当業者によって理解されるであろう。動物毒としては、具体的には、蛇毒例えば、α-ブンガロトキシン、β-ブンガロトキシン、コブラ毒、クロトキシン、エラブトキシン、タイカトキシンおよびテクスチロトキシン、クモ毒例えば、アガトキシン、アトラコトキシン、グラムモトキシン、ラトロトキシン、ホニュートリアトキシン、フリクソトキシンおよびベルストキシン、ならびにサソリ毒例えば、マルガトキシン、イベリオトキシン、またはノキシウストキシンが挙げられるが、これらに限定されない。微生物が産生するトキシン、ならびに、特に、細菌、菌類、藻および原生動物が排泄する外毒素はトキソイド化が可能であり、本発明の文脈ではワクチンとして用いられている。細菌により生成されるトキシンはヒトにおける疾患の主因となっているため、特定の臨床的意義を有し、感染の深刻度は、個体にとって致命的なものから下痢性疾患の根本原因のものまでに及んでおり、発展途上国においては健康上重大な問題となっている。従って、本発明のトキソイド化試薬および方法は、細菌トキシンのトキソイドの調製、薬剤として使用および抗毒素の調製に特に有用である。トキソイドの特に有用な例としては、クロストリジウム属ニューロトキシン、例えば、ボツリヌストキシンもしくはテタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシンA、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、大腸菌易熱性トキシン、炭疽トキシン、SEBから生成されるトキソイドが挙げられる。シガ様トキシンは、大腸菌によって産生され得る。トキシンの誘導元となる細菌は、典型的には、疾患の原因に関与する細菌、例えば、クロストリジウムテタニClostridiumtetani、クロストリジウム-ボツリナムClostriiumbotulinum、コリネバクテリウム-ジフセリエCorynebacteriumdiphtheriae、ビブリオコレラVibriocholerae、シゲラディセンテリエShigelldysenteriae、ボルデテラ-ペルツッシスBordetellapertussisまたはシュードモナス-アエルギノーザPseudomonasaeruginosaである。以下に示すとおり、トキソイド化試薬は、臨床上重要なトキソイド例えば、C.ディフィシール、コレラおよびジフテリアの調製に特に有用である。本明細書に記載されているトキソイド化試薬および方法は、生物兵器またはバイオテロリズム剤として使用できるトキシンからトキソイドを調製する場合に、特に有用である。この場合、本発明のトキソイドは、ワクチンとして直接用いることも、抗体応答の生成に用いることもできる。この抗体はいったん採取された後、トキソイドの誘導元となるトキシンによる中毒に対する治療的処置の基準となる。結果的に、第2の態様において本発明は、一般構造R-COCOR’またはR-COCOHのα-ジカルボニル化合物との化学反応を経たトキシンから誘導されるトキソイドを、トキシントキシンの毒作用による中毒の予防的または治療的処置に使用することを目的として提供する。α-ジカルボニル化合物は、トキソイドの調製に有用である上述の化合物のいずれかであってもよい。特に好適なジカルボニル化合物は、グリオキサール、メチルクリオキサール、ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、4-フルオロフェニルグリオキサール、4-ニトロフェニルグリオキサール、4-ヒドロキシフェニルグリオキサールおよびフェニルグリオキサールからなる群から選択されるものを含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、フェニルグリオキサールは特定のトキシンのトキソイドを調製する場合に用いられる。このトキソイドは、反応混合物から単離されてもよく、必要に応じて精製されてもよく、トキソイドの誘導元となるトキシンに対する予防的または治療的なワクチンとして直接投与することもできる。当該技術分野で一般的であるようにトキソイドは、好適な希釈剤、賦形剤、担体等を用いて医薬として許容される処方物に処方することができる。当該技術分野で理解されるように、処方物は、トキソイドの免疫原性作用を向上させるためのアジュバントを含有してもよい。従って、このようなトキソイドの生成方法は、本発明の重要な態様である。本発明のトキソイドは、トキシンが実質的に不活性化されるまでトキシンの溶液を一般構造R-COCOR’構造Aのジカルボニル化合物の溶液と単純に混合するだけで調製することができる。ジカルボニル化合物をトキシンの溶液に添加し、トキシンが実質的にまたは完全に不活性化されるまで、結果として得られた混合物を好適な温度でインキュベートするのが適切である。トキシンの活性評価のためのアッセイは、当該技術分野において周知であって、本発明の目的上、トキシンの活性は、トキシンおよび引き続いてトキソイドを、トキシンの作用を受けやすいことが周知である細胞培養液に暴露することによって評価することができる。例えば、ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性は、ベロ細胞培養物を特定の濃度のトキシンに暴露する工程と、培養液における細胞の生存能力および/または生育をモニターしてベースライン測定値を形成する工程によって定量することができる。この後、反応混合物から採取されたサンプルを定期的に暴露し、類似する細胞培養液に暴露して、再び細胞の生存能力および/または生育を測定することによって、トキシンの不活化のレベルを測定することができる。本方法に用いられるジカルボニル化合物は、本明細書に記載されているいずれか1つのジカルボニル化合物であってもよい。特に好適な例は、グリオキサール、メチルクリオキサール、ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびフェニルグリオキサールからなる群から選択される。特定の実施形態において、フェニルグリオキサールは、ホルムアルデヒドがトキソイド化に要する時間よりも有意に短い反応時間で特に安定なトキソイドを生成する目的で使用される。さらに、トキソイド化反応は室温で実施できる。トキシンの実質的または完全な不活化を達成するには、十分なジカルボニルトキソイド化試薬を用いて天然型トキシンと反応させなければならない。例えば、フェニルグリオキサールを用いる場合は、天然型トキシン、即ちホロトキシンにおいて自由に利用可能なアルギニン残基の数を基準とした化学量的な超過量を好都合に用いることによって、トキシンを実質的に、つまり完全に不活性化できることが保証される。大モル過剰のジカルボニル化合物は必要がなく、更なる精製工程を利用するだけで済む可能性が高い。等モル量のジカルボニル試薬およびトキシンを用いれば十分であり、以下に例証されているように、トキソイド化試薬の濃度が低い場合でも、きわめて有効ならびに効率的にトキソイド化が達成される。結合調査Herbertの促進および作用機序Belfanz;Watanabeの解明を含めた様々な理由から、蛋白質を修飾するために、以前は本明細書に記載されているようなジカルボニル試薬が用いられてきた。しかし、これらの例ではジカルボニル化合物のモル量および濃度が非常に大きく、ジカルボニル対トキシンのモル比が100:1から3100:1の範囲に及ぶ。このような比率は、蛋白質構造および機能の基本的な調査に有用であるが、医薬用途には適さないほど高い。本発明では、低濃度のトキソイド化試薬を利用するため、このような高濃度またはモル比を用いる必要がなく、医療用途に特に有用である。ジカルボニル化合物の濃度が高いと、トキシンの立体配座に歪みまたは変化が生じる可能性があるという点では、ジカルボニルトキソイド化試薬の濃度を抑えれば、有意なメリットがある。この問題は、ホルムアルデヒドを用いてトキソイド化した場合に生じることが既に知られている。本発明の方法は、トキソイド化試薬の不活化が低濃度で発生した結果、トキシンがトキソイド化/不活性化を経た後にこの立体配座構造を維持し得るという特定の利点をもたらす。蛋白質の完全性および質を確保する上で蛋白質の三次元構造は重大な因子となるため、この方法は有益である。ワクチンおよび解毒剤の研究において、高品質な抗体産生応答が確実に行われるようにするには、元のトキシンの属性をできるだけ多く保持する抗原に対する抗体を産生することが重要である。変性蛋白質または自己会合型蛋白質に対する抗体を産生した場合、不利な免疫原性作用を誘導し、および/または生成された抗体血清の作用強度を低減し得るという余計なリスクを伴う。2番目の構造を維持することもまた、トキソイドの安定性を維持する上で重要な因子である。ゆえに、本発明のトキソイドは好適には約0.01mMから約10mM、より好ましくは約0.05mMから約5mMまでの範囲、更により好ましくは約0.5mMから約2.5mMまでの範囲の濃度のジカルボニル化合物溶液を用いて調製される。本方法に使用されるジカルボニル化合物の特に好適な濃度は、約1mMである。特定の実施形態においては、1mM以下の濃度のフェニルグリオキサールをトキソイド化試薬として使用することによって、良好に折り畳まれていて、トキシンの二次構造を実質的に保持するリシントキソイドを生成する。トキソイドは24時間で得ることができ、しかも高度に免疫原性である。トキソイド化反応は中性pHで実施するのが好適であり、緩衝液での処理によって、反応の間中、特定のpHを確実に維持できる。特定の実施形態においては、ジカルボニル化合物溶液はpH6から14までの範囲、より好ましくはpH7から10の間になるように緩衝液で処理される。また、特定の実施形態においては反応が約pH8にて維持される。トキソイドは室温および室圧で調製することができる。ホルムアルデヒドを利用する先行技術の方法に比べると室温および室圧での反応の方がはるかに迅速であり、数時間で完全に不活化されたトキソイドが生成される。ホルムアルデヒドを用いた場合は、数日または数週間を要する。このため、本方法はトキソイドの工業生産または大量生産に特に好適なものとなっている。一方、特定の実施形態においては、反応を37°Cで少なくとも24時間実施する。この温度は生物学的調製物をインキュベートし培養する場合に一般的に用いられている。従って、当業界において既に利用可能であり、反応を一晩で完了できるように反応を早めに完了できるという利点がある。これゆえ、本方法では反応混合物を37°Cで8時間から120時間インキュベートするのが適切であり、好ましくは37°Cで約96時間インキュベートする。これらの時間尺度は、トキシンを最大限のレベルで確実に不活化するのに十分であるばかりでなく、ホルムアルデヒドによるトキソイド化の現行の要件に比べてかなり短時間で済む。前掲の反応条件は、上述したように、アブリンまたはリシンなどの植物から誘導されるトキシンからトキソイドを生成する用途に適している。同様に、本明細書に記載されているような動物から誘導されるトキシンを用いる場合にも同じ方法を利用できることを理解されたい。本方法は、蛇毒からトキソイドを生成する用途に特に適している。上述したように、トキシンは好適には細菌から誘導され、特に、ボツリヌストキシン、テタヌストキシン、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、百日咳菌トキシン、シュードモナスエンドトキシン、シガトキシンもしくはシガ様トキシン、炭疽、またはSEBからなる群から選択される。なお、この他のトキシンが本発明の方法を使用して不活化できることは、当該技術分野においてよく理解されるであろう。理論に束縛されるものではないが、ジカルボニルトキソイド化試薬が選択的にアルギニン残基上のグアニジン基と反応すると考えられている。ただし、選択性のレベルは構造Aに分類される幾つかのジカルボニル基の間で異なるようである。例えば、フェニルグリオキサールは選択的にグアニジン残基と反応してグアニジン基につき2つのフェニルグリオキサール残基を有する生成物を生じると考えられる一方、グリオキサール、メチルグリオキサール、ブタンジオンおよびシクロヘキサジオンは、グアニジン残基内のα-またはε-アミノ基とも反応でき、またはトキシン内のこの他のアミノ酸残基とも反応できる点で選択性が低いと考えられる。こうした選択性のレベルは化合物のトキソイド化能力に影響を及ぼすものである必要はないが、このような副反応が考慮されるように相対量を調整することができる。トキソイドの最終的構造は、トキソイドを薬剤もしくはワクチンとして用いるか、または抗体もしくは抗毒素の生成に用いる目的で、完全に定量する必要のない場合がある。そえゆえに、本発明は上述および以下に例証された方法で生成されたトキソイドを包含している。好適な実施形態において、トキソイドはフェニルグリオキサールを使用して生成される。この種のトキソイドの具体的な例としては、ジフテリア、コレラ、クロストリジウムディフィシレ、溶血素またはシュードモナスエキソトキシンのフェニルグリオキサールの不活化によって生成されるトキソイドが挙げられる。これらの特定のトキソイドが置換フェニルグリオキサール例えば、シアン、フルオロ誘導体、トリフルオロメチル、ヒドロキシまたはニトロフェニルグリオキサールおよび一般構造Aに分類されるこの他化合物を使用して調製できることは、もちろん当業者に理解されるであろう。当該技術分野において周知のように、本発明のトキソイドは好適には医薬組成物中に処方される。これによって、予防ワクチンとして直接投与することも、アンチトキソイド抗体の産生に用いることも可能になり、更に、採取してトキシンの毒作用または中毒の処置に露光後療法として直接使用できる。または、生成された抗体は、抗体フラグメントに加工してもよいし、ヒューマナイズしてもよく、または別の方法でヒト被験者への投与の適合性を改良するように加工することも可能である。このため、更なる態様において、本発明では上述のトキソイドと医薬として許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含有する医薬組成物を検討する。好適な希釈剤、賦形剤および担体は当業者に公知である。これらは固体または液体の担体を包含することができる。好適な液体担体としては、水または生理食塩水が挙げられる。本組成物のトキソイドは乳濁液の形態に処方してもよいし、生分解性微小球またはリポソームの形態に処方するかこれらに配合することも可能である。本組成物は、アジュバントを更に含有することができる。本発明の更なる態様では、上述のトキソイドと、医薬として許容される希釈剤または担体と、アジュバントとを含有するワクチン組成物を含む。アジュバントの多くは、組成物を投与する対象の宿主においてアジュバントが免疫応答を促すという条件では、ワクチン組成物への配合に好適である。特に好適なアジュバントとしては、ISCOMs商標Quillajasaponins、CpGオリゴヌクレオチド、アルハイドロゲル、MPLTDM、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。この種の組成物およびトキソイドは、トキソイドの誘導元となるトキシンに対するワクチンとしての使用に適している。加えて、または、上述のトキソイドはトキシンによる中毒を処置するための抗体製造に使用することができる。結果的に、トキソイドによって生成する抗体は、本発明の更なる態様を形成する。このような抗体は、トキシンの毒作用または中毒の処置に特に有用である。他の更なる態様において、本発明は抗毒素の生産方法を提供するものであって、この方法は、上述のトキソイドを、アンチトキソイド抗体を誘発するための有効量だけ動物に投与する工程と、該動物から血液を採取し、血液から血清を分離して、血清から抗体を抽出する工程とを含む。この後、当該技術分野において周知の方法を用い、抽出された抗体を精製することができる。ポリクローナル抗体は、治療用抗体を生成する目的に日常的に用いられる任意の動物例えば、ウサギ、ネズミ、ニワトリ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ウシなどに免疫することによって生成することができる。動物の免疫化には、必要なアジュバントを利用することができる。都合の良いことに、ポリクローナル抗体は、同じ抗血清バッチから、または結合可能な幾つかの抗血清バッチから誘導することができる。このような方法で生成された抗体は、直接使用してもよいし、または当該技術分野において周知の医薬組成物中に処方することもできる。抗体は、従来の方法を使用してヒューマナイズしてもよいし、またはキメラ抗体を含んでいてもよい。または、特異性除去抗毒素抗体フラグメントを生成する場合は、抗体を断片化する。抗体のフラグメントは、誘導元となる抗体をかなりの割合で含むため、大きくなる場合がある。例えば、大フラグメントは可変領域全体と定常領域Fcの一部とを含む。特に、大きな抗体フラグメントは、Fab’2またはFab2フラグメントを含むだけでなく、抗体配列の欠失突然変異体も含む場合がある。特に大きな結合フラグメントはFab’2である。この種の大きい結合フラグメントもまた、従来の方法例えば、ペプシン等の酵素による酵素消化を使用して好適にはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から誘導され、Fab’2フラグメントを生成する。または、抗体配列が決定されているという条件では、従来の組み換えDNA技術を使用してフラグメントを生成することができる。抗体の小フラグメントもまた、使用することができる。このような小フラグメントは、トキシンへの結合能を保持しているという条件では、誘導元となる抗体の有意要素が欠如した例えば、Fc連鎖の有意部分が欠如している可能性のある抗体フラグメントを包含する。特に抗体の小フラグメントは、FabフラグメントおよびFab’フラグメントの他、単鎖sc抗体、FV、VHおよびVKフラグメントを含む。抗体フラグメントの利点は、動物の供給源から誘導された抗体を投与するときに、望ましくない副作用のリスクを軽減できることである。加えて、抗体と抗体フラグメントとの組み合わせは、本発明の特許請求の範囲内で想定される。この種の組成物は、全抗体と大フラグメントもしくは小フラグメントとの混合物、または大フラグメントもしくは小フラグメントの混合物を含み、高速ならびに持続的な抗毒素活性を提供することができるという点で有益である。トキシン中毒の処置においてそのタイミングのいい機会に影響を及ぼす一因子は、抗毒素が身体中に分散してトキシンの作用部位にいくまでの速度である。全抗体および大きな抗体フラグメントはサイズが大きいため、たいていの場合は小さい抗体フラグメントよりも狭い範囲で血管外の空間に分散される。他方、小フラグメントは、血管外の空間を迅速に通過する抗毒素能力を提供し、迅速な防御を行える可能性が高い。抗体およびフラグメントからトキシンへの結合は通常可逆的であり、血漿中に残存する少なくとも幾つかの機能抗体または抗体フラグメントが、放出されたトキシンに結合する場合を除き、放出されたトキシンによるリバウンド作用のリスクを伴う。小さな抗体フラグメントの急速なクリアランスとは、小さな抗体フラグメントのモップアップへの可用性が低く、放出されたトキシンを中和することを意味する。ただし、サイズが大きくクリアランス速度が遅いため、全抗体および大フラグメントは血漿における方が広範に利用可能であり、結果的に、放出されたトキシンを中和するができこれによってリバウンド作用を最小限に抑えることができる。クリアランス速度が遅く血漿中での持続期間が長いことは、全抗体および抗体の大フラグメントによって長期にわたる防御が行われることを意味する。そえゆえに、結果的に、この種の組成物のプライムブースト効果によって、本発明の特に好ましい実施形態が作成される。トキソイドおよび生成されたアンチトキソイド抗体またはフラグメント即ち、抗毒素は、トキシン中毒の処置に特に有用である。それゆえに、発明の更なる態様は、上に記載したトキソイドまたは本明細書に記載の医薬組成物もしくはワクチン組成物を医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、トキシンによる中毒に対してワクチン接種をする方法と、上に記載したアンチトキソイド抗体および/または抗体の組成物、ならびにフラグメントまたは大型および小型の結合フラグメントを医薬的な有効量だけ哺乳動物に投与する工程を含む、中毒の哺乳動物ヒトを含む。を処置する方法とを通して形成される。ここで、以下の図面を参照しながら本発明について説明する。[実施例1]ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性細胞生存率アッセイリシンZan030を、Griffithsetal1995Griffiths,G.D.,Rice,P.,Allenby,A.C.,Bailey,S.C.,andUpshall,D.G.1995.InhalationToxicologyandHistopathologyofRicinandAbrinToxins.InhalationToxicology72,269-288の方法に従い、DefenceScienceandTechnolgyLaboratoryにてトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取し、調製した。これ以外のトキシンはSigma-Aldrich,Dorset,UKから購入し、以下の量だけ使用した:溶血素1mgクロストリジウムディフィシール2μgジフテリア1mgシュードモナスエキソトキシン0.5mgすべてのトキシンを無菌PBSで希釈して、以下の最終濃度を得た。溶血素1.0mg/mlクロストリジウムディフィシール4.0μg/mlジフテリア1.0mg/mlシュードモナスエキソトキシン1.0mg/mlリシン1.6mg/mlトキシン溶液を50μLのアリコートで調製し、使用に必要とされるまで-80°Cにて凍結した。最初に、図2に示すように、ベロ細胞に対するトキシンの細胞毒性を定量した。図2において、トキシンに48時間暴露された後の細胞生存率がきわめて低いレベルであることをトキシンの濃度を漸増させて示してあるように、それぞれのトキシンがベロ細胞にとって有毒であることが明示されている。試験したすべての濃度にて、リシンおよびジフテリアがベロ細胞に対して毒性を示し、これらのトキシンの毒性限度がきわめて低いことを実証しており、注目に値する。[実施例2]トキソイド化がトキシンの活性に及ぼす影響実施例1に記載されているジカルボニルトキソイド化試薬がトキシンを不活化トキソイド化する能力は、pH8.0の重炭酸塩緩衝液中に溶かし5mM濃度になるように調整されたフェニルグリオキサールPG図3Aを使用して実証されている。比較対照の目的で、PGによるトキソイド化の影響を一般的に使用されているホルムアルデヒドと比較するために、ホルムアルデヒド2.5を用いた不活性化も行った。トキシン溶液を37°Cにて7日間インキュベートして、ホルムアルデヒドを用い完全に不活性化を行った。結果は図3に示すとおりである。図から明らかであるように、5mMPGに37°Cにて7日間暴露することによって、すべてのトキシンが完全に不活化された。対照データセットは、トキソイドに対して評価される等濃度の未処理トキシンを指す。図4に示すように、7日後でさえ、必ずしもすべてのトキシンがホルムアルデヒド処理で不活化されるとは限らなかった。[実施例3]トキソイド化能力に対する濃度の影響実施例2に記載されている実験を、0.5mMおよび0.05mMなどのような低濃度のPGを使用して繰り返した。0.5mMの濃度において完全に不活化されたトキシンは、5種類中3種類溶血素、C.ディフィシールおよびコレラであった。このことは図5Aに示すとおりである。0.05mMPGでは、図5Bに示すとおりトキソイド化の影響がまったく観測されなかった。このことは、少なくとも0.5mMを超える濃度において、PGが効力のあるトキソイド化剤であることを実証している。[実施例4]フェニルグリオキサールを用いた場合のトキシンの不活性化の速度上述のアッセイおよび方法を使用して、リシンおよびジフテリアのトキシンが完全に不活性化されるまでに要する時間の長さを評価した。ただし、トキシンおよびPGのインキュベーションは24時間、28時間および96時間後に終了させた。結果は図6に示すとおり、わずか24時間後でも0.5mMPGがリシンおよびジフテリアのトキシンの両方を完全に不活化できることがはっきり証明されている。このことは、PGが低濃度のトキソイド化試薬を用いかなり短い時間で完全に不活性化する点で、従来のホルムアルデヒド処理よりも有意に優れていることを示唆している。[実施例5]C.ディフィシールトキシンの不活化実施例4に記載されている実験をC.ディフィシールに対して実施したが、48時間後に不活性化が完了しなかった。しかしながら、7日後には完全に不活性化が観測された。このことは、従来のホルムアルデヒドで処理した場合3週間よりも所要期間が大幅に短縮されることを表している。これらの結果を表1に示す。[実施例6]代替のリシントキソイドとアジュバントとの組み合わせを使用して達成される防御の質リシントキソイドを上述の説明に従って調製した。トキソイドが防御免疫応答を誘発する能力は、Balb/Cマウスを5×LCt50のエアロゾル化したリシンに暴露した後、新規なリシンワクチン候補フェニルグリオキサールPGホロトキシントキソイドの免疫原性および防御作用を、標準リシンワクチン処方物ホルムアルデヒドで不活化されたリシンホロトキシンと比較することで実証された。ワクチン候補を皮下経路または筋内経路のいずれかを介して投与し、alhydrogel20v/vまたはIscomatrix5μg/動物のいずれかで処方した。リシンを抗原として投与する前に、ワクチン抗原に対する体液性抗体IgG1およびIgG2a応答を測定した。トキシンを抗原として投与した後の最大7日間、生存率、体重の変化、ならびにリシン中毒の徴候および症状を測定して、防御の質もモニターした。20mMPGトキソイドは、投与経路またはアジュバントタイプに関係なく、防御免疫応答の誘発に失敗した。このトキソイドは、食塩対照と同様に無効であった。1mMPGトキソイドを用いた免疫によって、血液中のリシン特異的IgG1の濃度上昇によって特徴付けられる強力なTh2型応答が誘発され、暴露の後に、ホルムアルデヒドトキソイドFトキソイドを用いた場合に見出されるのと同様な高度な防御が行われた。FトキソイドおよびPGトキソイドの両方の皮下免疫および処方は、alhydrogelを用いた場合に、筋内ルートおよびIscomatrixを用いた場合より防御の質が低いことが見出された。この実験は、Iscomatrixを用いて処方されたPGでトキソイド化されたリシンホロトキシンが、alhydrogelで処方される現行のFトキソイドと少なくとも同等であり、特定の特性に関しては優れている可能性があることを示す。リシンの精製天然リシンは、Griffiths1995上記の方法に従いトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取されて組織内で調製された。種子を塩化ナトリウムで均質化し、次にHClでpH4.8に酸性化した。この後に、4°Cにて一晩撹拌する。翌日、ホモジェネートを遠心分離し、種子破片および石油エーテルで澄ませた上澄みを取り除いた。続いて、結果として生じた可溶性蛋白質を遠心分離300gにより沈殿させた後、過剰量の硫酸アンモニウムを加えて、沈殿物を回収した。沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水PBS中に再懸濁させ、濾過して、透析によって残留硫酸アンモニウムを取り除き、それから、使用前まで20mlのアリコート中に貯蔵する。使用する当日に天然トキシン溶液を13,400gにて5分間遠心分離し、新たに形成された固体破片を取り除いてから、結果として得られた溶液を吸入検査用に調製した。酵素結合免疫吸着剤検定法ELISA:enzymelinkedimmunosorbantassayでの検査用に、Griffithsetal.1995,上記に記載されている完全な方法に従い、精製リシンホロトキシンを調製した。トキソイドFトキソイドを調製し、ホルムアルデヒド37v/vをリシン1mg/mlに加えた後、最終濃度2.5v/v0.625Mホルムアルデヒドと等量を得た。この混合物を37°Cにて3週間インキュベートしてから、最終濃度が0.1Mになるまでリシンを添加した。この後、PD10クロマトグラフィカラムを使用して溶液を脱塩して生理食塩水にした。等量のトキシン2mg/mlおよびフェニルグリオキサールpH8の2mMまたは40mM重炭酸塩緩衝液を添加してPGトキソイドを調製すると、1mMおよび20mMフェニルグリオキサール中で最終濃度1mg/mlのトキシンが得られる。次いで、溶液を室温および圧力にて96時間インキュベートした。インキュベーション後に、PD10クロマトグラフィカラムを使用してPGトキソイドを脱塩して生理食塩水にした。各トキソイドの蛋白質濃度は、以前に公開された方法Griffithsetal.Vaccine1719992562-2668を使用して測定された。両方のトキソイドのアリコートは、使用するまで-80°Cで冷凍貯蔵された。動物群雌のBalb/CマウスCharles-RiverLaboratories,Margate,Kent,UK:体重20gを、生理食塩水、Fトキソイド、1mMPGトキソイドおよび20mMPGトキソイドからなる4つのワクチン群n=24頭の動物/群に分けた。これらのすべての群からの動物を、Alhydrogel登録商標20v/vまたはIscomatrix商標5ug/動物のいずれかを用いて処方された群に更に分けて、皮下s.c.または筋内i.m.の2経路のうちの一方を介して投与した。これにより、合計16群n=6頭の動物/群が得られた。0日目および21日目にマウスにワクチン処方物5μg/kg体重を注射し、35日目にすべての動物を5×LCt50のエアロゾル化した天然リシンに暴露させた。トキシンを抗原として投与する24時間前に、尾静脈血液サンプル100μLを採取し、4°Cで一晩インキュベートしてから、13,400gにて1分間遠心分離した。分離された血清を除去して-20°Cで貯蔵してから、リシン特異的IgGlおよびIgG2a濃度を測定する。リシン特異的血清抗体の測定結果リシン特異的血清に対する抗体レベルIgG1およびIgG2aを、間接ELISAを使用して定量し、精製マウス免疫グロブリンIgGlまたはIgG2aの標準曲線との照合によってサンプルを分析した。96ウェルマイクロプレートImmulonHBポリスチレン製平底マイクロプレートThermoScientific,Basingstoke,UKのA列に、PBS中5μg/mlヤギ抗マウスIgG1またはIgG2aAbDSerotec,Oxford,UK1ウェルあたり100μLを塗布した。残りのウェルにPBS中5μg/ml精製リシンホロトキシン1ウェルあたり100μLを塗布し、これらのプレートを40Cで一晩インキュベートした。次の日に、自動プレート洗浄器ThermoLabsystemsUltrawashPlusを使用して1ウェルあたり300μLの洗浄用緩衝液0.05Tweenを含有する1倍濃度のPBSで3回洗浄した。次いで、ウェルをPBS中100μLの1w/vBlotto脱脂乾燥粉ミルク粉末Biorad,HemelHempstead,UKを加えて37°Cにて1時間ブロックした。ブロック後、連続希釈法serialdilutionを使用して開始濃度10μg/mlにてA列に精製マウスIgG1またはIgG2aAbDSerotec,Oxford,UKの標準曲線を作成した。血清サンプル希釈剤:PBS中1w/vBlottoを繰り返し分析し、プレート列CからH全体を順次に希釈した。事前に同定された標準品質の対照血清サンプルリシンに暴露後のマウスプール血清も分析し、ブランクには希釈液のみを用いてプレート間変動性列Bを確認する。プレートを37°Cにて1時間インキュベートしてから、洗浄した上述。ヤギ抗マウスIgG1:HRP希釈液中1/2000の濃度に希釈およびIgG2a:HRP希釈液中1/1000の濃度に希釈AbDSerotec,Oxford,UKを用い37°Cにて1時間にわたって、リシン特異的IgG1およびIgG2aの検出を行った。最終的な洗浄工程を実施した後、ABTS2,2’-アジノ-ビス3-エチルベンズチアゾリン-6スルホン酸とH2O20.01v/vからなる比色基質をクエン酸リン酸緩衝液に添加した。プレートを37°Cにて30分間インキュベートして顕色させた。414nmにてプレートThermoLabsystemsMultiskanAscentプレートリーダーを読み、分析した。サンプル抗体レベルを標準曲線と比較して定量し、相対μg/mlIgG1およびIgG2aとして表した。用語relativeは、抗動物種antispecies免疫グロブリンとそれぞれの標的に結合しているリシン特異的免疫グロブリンとの間に結合動力学の差異があり得るという理解を意味する。ThermoLabsystemsMultiskanAscentプレートリーダーにて4つのパラメータロジスティックPL曲線処方物:y:=bα-b/1xcd;ここで、a=最大値シグナル、b=極小波長シグナル、c=変曲点における濃度、d=勾配を使用して、サンプルを分析した。4PL曲線の線形部分からサンプルIgG1およびIgG2aレベルを読んだ。ここで、平行は最良適合であった。品質管理データで定量されたプレート間変動性は30CV未満であった。吸入誘発LiuandLee定出力ネブライザーを使用してエアロゾル濃度が6.36μg蛋白質/リットルの空気5×LCt50を生成し、天然リシンのPBS溶液20μg/mlフルオレセイン含有からリシンエアロゾルを生成した。LCt50はあらかじめ組織内での検査によって定義された。動物暴露システムは、横の長さ1.4メートルのガラスチューブに12ポート両方の側部に沿って6ポートずつを設けて構成されている。動物をプレチスモグラフィチューブリアルタイム呼吸モニター用にローディングして、ポートに繋いだ。動物の頭がエアロゾルストリームに投入され、首の回りにぴったりと嵌入されたラテックス隔膜は体内に毒物が到達するのを防いでいる。エアロゾル濃度を見積もるために、フルフローインライングラスファイバーフィルターでエアロゾルを捕捉し、各分析run後に回収した。このフィルターを50mlのPBS中で機械的に振盪して崩壊させた。フィルター停止のアリコートを採取し、13,400gにて5分間遠心分離して、上澄みの適切な希釈度を蛍光定量的に測定した励起513nmおよびエミッション487nm。エアロゾル中のトキシン濃度を、捕獲されたフルオレセインの量、当初のサンプル中のフルオレセイン対トキシンの既知の比率に、暴露時間10分および動物の鼻を通して排出された空気の全容量に基づいて計算した。動物ごとの吸入量をリアルタイムプレチスモグラフィデータに基づく吸入容積およびエアロゾル濃度から計算した。暴露後、動物を吸入ラインから取り出し、収容ケージに戻した。生存率、体重、ならびにリシン中毒の徴候および症状を7日間にわたって毎日記録した。7日目に生き残っていたすべての動物に過剰量のペントバルビタールナトリウムEuthatal0.7ml/kgを投与して殺し、肺を取り除いて体重を計測した。統計分析一元配置分散分析法を実施して、毎分換気量に対する経路、アジュバントおよびトキソイドの効果を確証した。循環血中のリシン特異的抗体濃度IgG1およびIgG2aならびに体重時間に対する反復計測に対して3とおりの分散分析方法を実施することによっても、経路、アジュバントおよびトキソイドの効果を確証した。ボンフェローニ事後試験Bonferroniposthoc-testを使用して、群間の有意性も更に同定した。フィッシャーの正確確率検定FischerExacttestおよび序数ロジスティック回帰分析ordinallogisticregressionanalysisを実施し、生存率、ならびにリシン中毒の徴候および症状に対する経路、アジュバントおよびトキソイドの効果をそれぞれ確証した。生存率、体重の変化、ならびにIgG1およびIgG2a濃度間の相関は、ピアソンランク試験Pearsonranktestを使用して実施された。あらゆる場合において、0.05未満のp値は有意であると見なされた。結果抗体応答吸入されたリシン暴露される前に得られた循環血中リシン特異的IgG1およびIgG2aレベルは、表2で概説したとおりである。トキソイドの投与経路またはアジュバントタイプに関係なく、20mMPGトキソイドは整合的または強健な免疫応答の開始に失敗した。つまり、生理食塩水対照に対して得られたほどの統計的有意性はない。Fトキソイドおよび1mMPGトキソイドは、強力なリシン特異的IgGl応答を誘発し、IgGl濃度は、Fトキソイドを投与された動物における方が一般的に高くなった。更なる調査では、ルート、トキソイドおよびアジュバントの複合的な相互作用が観測された。筋内経路でトキソイを投与した場合は一般的に、抗体応答が強化される。Iscomatrixが存在する場合も、alhydrogelが存在する場合に比べて抗体レベルが高まる。両方のトキソイドとIscomatrixとの処方物は、経路に関係なく緩和なTh1型応答を誘発した。このことは、IgG2aの血中循環レベルの増大によって示された。吸入データ生存率において観測された差異を、吸入されたトキシンのレベルの増加に起因したものでないことを確認するために、毎分換気量、更にはトキシンの総吸入量に関してすべての群を比較した。リシンエアロゾルを抗原として投与する間、どの群の間でも統計的な有意差は観測されなかった範囲:47.8ml.min-1から67.5mls.min-1、p=0.77。生存率5×LCt50のエアロゾル化した天然リシンに暴露された後のすべての動物を、7日間にわたって毎日をモニターした。死亡を記録し表4に示した。すべての対照アジュバントを含む生理食塩水動物は3日から5日の間に死亡した。このデータは、20mMPGトキソイド群に対して確認されたデータと有意差はなかった。Fトキソイドまたは1mMPGトキソイドのいずれかのワクチンの接種を受けた動物は、リシンを抗原として投与された後の生存率が対照動物に比べて有意に高かったが、ワクチンの接種を受けた動物同士の間では有意差がなかった。一方、個体群を更に詳細に調査したところ、alhydrogelで処方された1mMPGトキソイドを皮下経路で免疫された動物のうち、生き残ったのは50にすぎなかった。生存率を循環血中のリシン特異的IgG1濃度データ不表示と比較すると、有意な正相関p<0.05が観測された。このことは、死亡した動物は防御抗体の濃度が最低であった傾向にあることを示している。体重体重の変化の測定は、動物の健康状態を示す良い指標であり、Fトキソイドおよび1mMPGトキソイドによる防御の質の違いを見分ける助けにもなり得る。リシンを抗原として投与した後の最初の3日間にわたるワクチン群間の体重の比較は、図7に示すとおりである。この期間を超えると、生存率レベルの違いからデータを解釈しづらくなる可能性がある。生理食塩水および20mMPGトキソイドワクチンの接種を受けた動物は、トキシンに暴露された後で同様に応答した。両方の動物の体重は、暴露前の当初より最高20減少した。単に群ごとに即ち、すべて1mMPG対すべてFトキソイドの動物データを分析してみると、Fトキソイドまたは1mMPGトキソイドのいずれか一方を投与された動物は対照に比べて体重の減少が少なかった。ただし、このことはFトキソイドデータセットに関してのみ有意であった。1mMPGデータセットが有意水準に達しなかった理由は、このワクチンが皮下経路で投与されたときに作用が乏しいことに起因する。体重の変化と、循環血中のリシン特異的IgG1抗体p<0.001および生存率p<0.05データは非公開の両方との間には、有意な負の相関係数が存在する。ただし、あらゆる場合において皮下経路でワクチンを投与された動物は、最初の3日間で連続的に体重が減少した。筋内経路でワクチンを投与された動物は、体重が回復し始めるのがより速やかで、2日目以後に平均体重が増大した。中毒の徴候および症状生存中のすべての動物におけるリシン中毒の徴候および症状を最高7日間にわたって評価したが、群間の比較はすべての動物が生きている場合に3日目に行った表5。動物は暴露されてから24時間以内にリシン毒作用による徴候を示し始めた。対照群および20mMPGトキソイド群においては死亡に至るまでにリシン中毒の徴候の強度が漸増した。Fトキソイドまたは1mMPGトキソイドを受けている動物は中毒の徴候および症状が有意に少なかったが、1mMPGトキソイドを投与された群は、Fトキソイド群と比べてはっきりした中毒の徴候を有する傾向があった。リシン中毒の徴候および症状と、循環血中のリシン特異的抗体データは非公開との間には、有意なp<0.01相関がある。このことは、血中の抗体濃度が低いほど防御の質が乏しいことを示している。肺湿潤重量トリシンを抗原として投与されてから7日後に選別された生存中のすべての動物からの肺の重量を計り、データを組み合わせて経路、アジュバントおよびトキソイドの影響を比較した。1mMPGトキソイド群とFトキソイド群とでは、肺湿潤重量に統計的な差異がない。経路およびアジュバントの影響は、図8に示すとおりである。ワクチンを皮下経路から接種され、ならびにalhydrogelを用いた処方を受けた生存中の動物は、ワクチンが筋内経路から接種されたかまたはIscomatrixを用いた処方を受けた動物に比べて肺が有意に重かった。このことは、動物がワクチンを皮下経路で投与されならびにalhydrogelを用いた処方を受けた場合、吸入したリシンに対してなされる防御は最小限になるという観測を裏づける。肺湿潤重量は、リシン特異的IgG1抗体の血中循環のレベルに対して負の相関p<0.001を示すだけでなく、リシンを抗原として投与されてから3日後の体重の変化に対しても負の相関p<0.0001を示す。これとは逆に、毒性の徴候および症状に対しては、有意な正の相関p<0.0001が観測された。考察この研究では、先に特徴を述べてきたトキソイド化アプローチAlhydrogelで処方されたFトキソイドを使用して、代替のトキソイド化工程フェニルグリオキサールを利用する工程の可能性を調査し、新規なリシンワクチン候補を生成する。1mMPGを使用して調製されたトキソイドをBalb/Cマウスに免疫すると、免疫スケジュール全体を通じてすべての動物が十分な耐容性を示した。高濃度の循環血中リシン特異的IgGl抗体を誘導した結果、大多数20/24の動物が、超致死用量のエアロゾル化トキシンに暴露された後も生き残った。以降の7日間の観察期間を通じて、これらの動物が示した中毒の徴候および症状は最小限で、体重の変化は、食塩水を免疫された動物に対して観測されたほどは明確でなかった。これらの観察結果は、Fトキソイドについて得られた結果生存率23/24と同等であり、PGを用いリシンホロトキシンを化学修飾することによって生成されるトキソイドは、ワクチン接種検査においてリシン暴露による外傷および死亡を防ぐための代替アプローチとなり得るというここでの議論を裏づけている。リシン中毒後に肺を損傷作用および死亡から防御できるライセンス可能な製品は一切ないが、免疫学を基礎にした幾つかの方策が探究されていて、これらの方策にはリシン特異的抗毒素およびワクチンの使用が含まれている。初期の臨床試験に存在する現行ワクチンの候補は、リシンA鎖の短縮形態または変異形態である。ラボでの初期試験では、A鎖候補によって開始された防御免疫応答が、ホルマリン系リシンホロトキソイドによる防御免疫応答ほど強力でなかったことが一貫して見出された。しかし、ホルムアルデヒド系トキソイドに関しては、幾つかの欠点が同定された。これらの欠点としては、トキシンの不活化が不完全であることおよびトキソイドが活性トキシンに転換されてしまう可能性のあることが挙げられる。この上、長時間のインキュベーションおよび高濃度のホルムアルデヒドによって、蛋白質の三次構造に変化が起こる可能性がある。サブユニットワクチンアプローチに対する現実的代案としてリシントキソイドを重視する必要があるなら、これらの問題を克服しなければならない。これまで、新規アプローチにてPGを用いリシンをトキソイド化することの有用性を探索してきた。フェニルグリオキサールは、リシンA鎖を含む蛋白質中のアルギニン残基の役割を研究するための調査ツールとしてよく使用される、反応性ケトアルデヒドである。他のトキソイド化手順では、免疫原性の低下を伴わずにトキシンを不活性化できるかどうかが探索されたが、これらの成功の程度は多様であることが示された。我々のラボでの最近の研究によると、1mMを超える濃度では、PG系リシントキソイドの蛋白質の三次構造が変更され得る。このことは、トキソイドの免疫原性に対して大きな影響力を有する。この研究では20mMPGトキソイドが免疫反応を誘発しなかったため、生理食塩水を用いた場合と同様、吸入されたトキシンの致死作用から動物を防御する効果はなかった。1mMPGでは、リシンの構造完全性は維持されるが、蛋白質の細胞毒性は除去される。このPGトキソイドは免疫原性が高度であり、Fホルムアルデヒドトキソイドと同等な防御免疫応答を誘発し得ることも見出された。リシンの吸入が死を招く原因は、重篤な肺損傷によって肺水腫が生じ、結果として生じる呼吸不全に陥るためである。この研究で、7日目に初めて生存者から採取された肺湿潤重量は、PGトキソイドおよびFトキソイドを投与された後も変化がなかった。一方、筋内経路でIscomatrixを投与された動物の方が、表肺湿潤重量が有意に軽く、リシンの損傷作用に対する防御がより強力であることが判る。一般的には、特異的抗体がリシンを中和することによって防御が遂行されると考えられている。我々のデータはこの見解を裏づけ、循環血中のリシン特異的抗体の濃度が高いことと肺の損傷が少ないこととの間の相関を示している。この相関は中毒の徴候および症状、ならびに体重減少の裏づけにもなっている表3。徴候および症状に関して、高感度な健全性指標として、毒物学者が久しく用いてきたのは体重である。この研究では、無防備な動物が、リシンを抗原投与されてから3日後には当初の体重の最高1/5を失った。20mMPGトキソイドをワクチン接種された動物は、生理食塩水対照群とほぼ同じレベルで体重が減少した。この体重減少と以後の死は、接種されたワクチンが予防ワクチンでなかったことを示唆している。他の調査結果に対するこの相関は、リシンにおける大きな構造変化が、20mMPGと共にインキュベートしたことに起因することを立証している。防御の欠如は、結果として得られた構造に変化が生じリシンの適切な抗原性を改変したことを強く示唆している。ワクチン投与によって誘導される免疫応答は動物間で異なるだけでなく、経路の関数としても変化することが、研究によって判ってきた。従って、必要とされる応答のタイプおよび大きさを決定する際には、経路の選択を慎重に考慮する必要がある。免疫細胞プロフィールは公知のとおり部位ごとに異なり、外因性抗原に暴露されると、局所T細胞およびB細胞、ならびに分泌されたサイトカインのパターンが更に変化する可能性がある。組織サイトカインプロフィールによってTh1/Th2バランスが示され、更に免疫応答の特徴が決定される。本研究においては原発性ワクチンとブースターワクチンとを同じ経路で投与したが、筋内経路の方が有効であった。この理由は定かでないが、免疫学的応答において、異なるコンパートメントからの退化、提示およびドレナージが重要である。幾つかの研究によって、免疫プロトコール中にワクチン接種の経路を変えると、免疫応答を相乗作用で広範化し改善できることも示されてきた。PGトキソイドに関してこのことは未調査であるが、特に吸入されたリシンに対する防御は最も懸念されるため、粘膜免疫は付加的な経路として考慮されている。重要なトキシン例えば、リシンに対抗する有効なワクチンが必要とされている。トキソイドの免疫学的特性を増強するためにアラムalumを使用した1926年度の最初の研究以来、ワクチン接種後の免疫応答の誘発および増強におけるアジュバントの役割が知られるようになった。アジュバントは、免疫系をTh1またはTh2免疫にバイアスして抗原に対して有意に免疫応答を増強する化合物として定義できる。ヒト用途に使用されるアジュバントは厳しい要件を果たす必要があるため、適切なアジュバントの可給度は制限される。現在、アルミニウム系化合物は、ヒトワクチンまたは獣医学的ワクチンに広く使用されている唯一のアジュバントであり、新規なアジュバント処方物を評価するためのベンチマークまたは、基準となっている。本研究における処方物alhydrogelと混合されたFトキソイドおよび1mMPGトキソイドはTh2型応答の誘発に有効であった。ただし、処方物中にIscomatrixを使用したため、同じ用量の抗原に対してきわめて高度なTh2型応答が誘発された。同時に誘発されたTh1型応答は緩和であった。Iscomatrixは、種々のサイトカインを誘発させるための既知の強力な免疫調節物質であり、サイトカインは抗体および細胞性免疫応答の両方を媒介して、MHCクラスII陽性細胞の数を増加させる。Iscomatrixアジュバントのこれらの特性は、Tヘルパー細胞応答をより効率的に発生させ、B細胞によって媒介される抗体応答を増強し得る。これらの結果によると、フェニルグリオキサールを使用してリシンを化学的にトキソイド化することによって、防御免疫応答を誘発できる構造的に安定なワクチンの候補が生成される。この応答の有効性は、現行のホルムアルデヒド系トキソイドと同等に有効であり、筋内経路から投与し、ならびにISCOMATRIXを用いて処方した場合、ヒト用途のリシンワクチンの開発にとって望ましいアプローチとなり得る。[実施例7]PGトキソイドが治療用抗体を生成する能力本発明の方法およびジカルボニルトキソイド化試薬を使用して調製されたトキソイドの免疫原性を評価するために、6匹のヒツジの群に、100μgのトキソイドおよびフロイント完全アジュバントを含有する医薬品組成物を免疫した。この後、6週目、12週目、18週目、24週目および30週目に、同じ量のトキソイドおよびフロイント不完全アジュバントで効果を高めた。リシンを上述のホルムアルデヒドまたはフェニルグリオキサールでトキソイド化された。結果は図9に示すとおりである。当分野で公知のように、標準ELISAアッセイで測定される抗体価は、アンチトキソイド抗体に特異的である。図9Aは、従来のホルムアルデヒドの不活性化を用いて調製されたキソイドから得られた結果である。フェニルグリオキサールを不活性化して得られた同等な結果は図9Bに示すとおりである。100μgのトキソイドのワクチン接種した場合でさえ、フェニルグリオキサールを用いて調製されるトキソイドの免疫原性は、従来のホルムアルデヒドの不活化によって調製されるトキソイドと少なくとも同等である。事実上、週単位で見た場合、50週後に、PGトキソイドからの抗体滴定量が最大の約80mg/mlに達した一方、ほぼ同じ期間を通してホルムアルデヒドトキソイドからの抗体滴定量は最大約45mg/mlに達した。PGで調製されたトキソイドはホルムアルデヒドで調製されるトキソイドに勝るとはいかないまでも少なくとも同じ程度であり、少なくとも免疫原性および防御はホルムアルデヒドトキソイドと同じ程度で、毒性が低く、しかも24時間以下というかなりの短期間に低濃度でトキシンを完全に不活化できるという更なる利点を有することが実証された。[実施例8]細胞死を引き起こさない付加的なトキシンから調製されたトキソイド;コレラトキシンの細胞毒性ジフテリアトキシンおよびコレラトキシンは両方とも、Sigma-Aldrich,Dorset,UKから購入した。クロストリジウムディフィシールC.ディフィシールトキシンAはQuadratechLtd,Epsom,Surreyから購入した。リシントキシンは実施例1に記載されている方法と同様にDstlにてトウゴマ変種ザンジバリエンシスの種子から採取されて組織内で調製した。すべてのトキシンを滅菌水で再構成し、下記の最終濃度を得た:コレラ2.0mg/mlクロストリジウムディフィシールトキシンA1.0mg/mlジフテリア1.0mg/mlリシン1.6mg/mlトキシン溶液を50μlアリコートに分け、使用するまで、Oリングで密封されたEppendorf商標チューブで-80°Cにて凍結する。ベロ細胞におけるジフテリアトキシン、リシントキシンおよびC.ディフィシールトキシンの細胞毒性は、前と同様に定量された。結果は図10Aに示すとおりである。48時間の暴露後にベロ細胞の生存率が濃度依存的に低下したことに示されているように、これらのトキシンのそれぞれはベロ細胞培養液中で細胞毒性を呈することが見出された。WST-1試薬を用い3時間インキュベートし、プレート上で450nmにおける測定値を読み生存率を定量した。GraphPadPrism4.0を使用したデータに適合する4つのパラメータロジスティックを使用して、感受性細胞の50を死に至らしめる濃度LC50を計算した。これらの値は図10Aに示すとおり、C.ディフィシール=7pM、リシン=0.9pM、ジフテリア=0.2pMである。コレラトキシンは細胞死を引き起こさないため、同じ細胞毒性アッセイを使用してこの影響を調査することはできない。ベロ細胞をコレラトキシンに暴露すると環状AMPが増加することは知られているので、ベロ細胞内の環状AMPアデノシン一リン酸を測定する際は、代替アッセイを使用した。ベロ細胞を3とおりの濃度のコレラトキシン10nM、20nMおよび40nMと共に1時間インキュベートした。塩酸を使用して細胞を溶解させ、結果として得られた上澄みを市販の環状AMPcAMPELISAキットで分析runし、変化を測定した。図10に示す結果は、コレラトキシンを用い1時間インキュベートした後にベロ細胞のcAMPレベルが用量依存的に増加したことを示している図10Bを参照。[実施例9]様々なα-ジカルボニル試薬がトキソイドを産生する能力一般構造R-COCOHのα-ジカルボニルトキソイド化試薬が実施例8に記載されているトキシンを不活化する能力トキソイドは、フェニルグリオキサールPG、2,3-ブタンジオンBDおよび1,2-シクロヘキサンジオンCHDいずれもSigma-Aldrich,Dorset,UKから購入した。を使用して実証された。pH8.3の重炭酸塩緩衝液中に含有されているPGおよびCHDの濃度が0.5mMになるように、またBDの濃度が5mMになるようにジカルボニル試薬を調製した。トキシン活性に対する影響を調べるために、ベロ細胞生存率アッセイを使用して残留毒性を評価する前に、トキシン溶液最終濃度75nmを各ジカルボニル試薬と共に、37°Cにて数とおりの期間でインキュベートした。PGによるトキソイド化の結果PGによるトキソイド化の結果は以下に示すとおりである。図11Aは、リシントキシンおよびジフテリアトキシンが0.5mMPGに37°Cにて24時間暴露された後、完全に不活化されたが、C.ディフィシールトキシンAは完全に不活性化されなかったことを示している。図11Bに示すように、これらの条件の下では、このトキシンが唯一7日間のインキュベーション後に完全にトキソイド化された。これらの条件の下では、コレラトキシンも部分的に不活化されると考えられる。このことは、ベロ細胞中のcAMPレベルが、0.5mMPGで7日間トキソイド化された40nMのコレラトキシンに1時間暴露された後、40nMのコレラトキシンのみに1時間暴露された細胞と比較して大幅に低減していることから判る図11Cを参照のこと。このトキシンに関しては、他のトキソイド化の時点を調査対象外とした。以上から、0.5mMの濃度のPGは、有効なトキソイド化剤であることと、従来のホルムアルデヒド処置よりも有意に優れることが実証される。このことは、リシントキシンおよびジフテリアトキシンが、わずか24時間でトキソイド化を完了するつまり、ホルムアルデヒドを用いた場合に3週間から4週間の暴露を必要とするのとは対照的に、はるかに迅速に作用する。という点から言える。CHDおよびBDによるトキソイド化の結果37°Cにて0.5mMCHDに7日間暴露すると、コレラトキシンが不活化された図12。一方、リシントキシンまたはジフテリアトキシンは不活化されなかったC.ディフィシールは試験対象外図2.5を参照。ジフテリアトキシンおよびコレラトキシンを5mMBDに37°Cにて7日間暴露して不活化した。リシンの毒性は緩和されたが、完全には不活性化されなかったC.ディフィシールは試験対象外。これらのデータは、PGが他の2つのジカルボニルトキソイド化試薬に比べてはるかにトキソイド化剤としての有効性が高いことを示している。[実施例10]フェニルグリオキサールPGのトキソイド化能力に対する温度の影響リシントキシンをトキソイド化するPGの能力に対して温度が及ぼす影響が、評価された。すべての予備実験をインキュベーション温度37°Cで実施し、これによって、リシンが24時間で不活性化されることが示された。PGが室温約20°Cでトキソイド化されるかどうかを調査するための実験を実施した。PG0.5mMをpH8.3の重炭酸塩緩衝液中で、75nMリシントキシン溶液と共に室温にて24時間または7日間のいずれかにわたってインキュベートした。ベロ細胞生存率アッセイを使用して、PGで処理したリシンの残差活性を評価した。図14に示すように、室温で24時間0.5mMPGに暴露した後、リシンの毒性が1/1000に低減されたことが見出された。一方、同じ条件の下での7日間処置によってリシンが完全にトキソイド化されたことを確認した。より高濃度のPGを使用することによって、より迅速に7日未満にトキソイド化することが事実上十分可能である。この点においても、トキシンの不活化に37°Cの温度を要する従来のホルムアルデヒド処理に比べて、PGの方が優れている。[実施例11]PGトキソイドおよびリシントキソイドの安定性に対してpHおよび貯蔵温度が及ぼす影響PGでトキソイド化されたリシンの安定性を、-20°Cおよび4°Cの2とおりの貯蔵温度ならびに3とおりの貯蔵用緩衝液にて時系列で評価した。0.5mMPGを含有するpH8.3重炭酸塩緩衝液中で、37°Cにて7日間リシンをトキソイド化した。続いて、NAPS10カラムを使用して過剰なPGを取り除き、トキソイド化されたトキシンをpH8の重炭酸塩緩衝液、pH5の酢酸ナトリウム-酢酸緩衝液、またはpH7のPBSのいずれかで溶出させた。これらのサンプルを4°Cまたは-20°Cのいずれかで貯蔵してから1か月、2か月、3か月および6か月後に、ベロ細胞生存率アッセイを使用して細胞毒性を評価した。データは表6に示すとおりである。結果は4°Cおよび-20°Cの両方で3とおりの貯蔵用緩衝液のいずれにおいてもトキソイドがきわめて安定していることを示している。ならびに、貯蔵用緩衝液中に過剰なPGの存在を必要としなくてもトキソイドの安定性が維持されることが実証されている。この点は、過剰なホルムアルデヒドを転換防止に必要とするホルムアルデヒドトキソイドに比べて有意に利点である。4°Cで安定していることもまた、PGトキソイドの貯蔵および輸送が容易になるという点で有利である。[実施例12]インビボモデルにおいてPGトキソイドを使用して達成される防御の質PGトキソイドがインビボにて防御免疫応答を誘発する能力は、3LD50のC.ディフィシールトキシンAに暴露されたBalb/CマウスにおけるPGC.ディフィシールトキソイドの免疫原性および防御作用を検査して、防御免疫応答を調査した。トキシンを抗原として投与した後の最大7日間、生存率、体重の変化、ならびにC.ディフィシール中毒の徴候および症状を測定して、防御の質をモニターした。トキソイドに対する特異的抗体のレベルおよび中和能力は、インビトロで評価した。雌のBalb/CマウスCharles-RiverLaboratories,Margate,Kent,UK:体重20gを、ビヒクル対照PGのみ、低用量625ngのトキソイド、高用量2.5gのトキソイドおよび陽性対照トキシンのみからなる4つの群n=6頭の動物/群に分けた。0.5mMPGを含有するpH8.3重炭酸塩緩衝液中で、37°Cにて7日間にわたってC.ディフィシールトキシンAをトキソイド化した。0日目および42日目に、50μlのトキソイド溶液をマウスに筋内注射した。63日目に、3LD5030ngのC.ディフィシールトキシンAをすべての動物に腹腔経路で注射して暴露させた。動物を抗原投与の14日後に選別し、血液を心臓穿刺によって採取して、特異抗体レベルをELISAで測定した。トキソイドを免疫されなかった対照動物は3LD50のトキシンを抗原として投与されてから48時間に死亡したことが、結果から判る。低用量群は24時間後に毒作用による徴候を示し、毛を逆立てうずくまった姿勢を呈したが、いずれも48時間で完全に回復した。高用量群は毒作用による徴候をまったく示さず、いずれもトキシンを抗原として投与された後も生き残った。C.ディフィシールトキシンに対する特異的抗体についてELISAを実施した結果は、図15に示すとおりである。高用量を投与された動物においては、未投与naive対照動物と比較して抗体が高度なレベルで存在している図15Aことが確認できる。低用量群において存在する抗体の量ははるかに少量で、個体動物間での差異が大きい図15B。これらのデータは、PGトキソイドが免疫原性であることと、致死トキシンを抗原として投与に対して産生された抗体によって完全な防御が行われることを立証している。次いで、動物HD1から採取された血清を使用してインビトロ中和アッセイを実施したところ、ELISAで確認されたように、C.ディフィシールトキシンに対する特異的抗体が最高レベルで産生された。最初に血清を媒質で1/5に希釈し、次いで順次1:1に希釈し、漸増的に血清を希釈する。続いて、この希釈液を作業台上で1時間インキュベートした。C.ディフィシールトキシンの最終濃度は、組織培養液中で約3×LC5025pMと同等になった。ここで、この混合物100μLをベロ細胞に添加し、37°Cにて5CO2で48時間インキュベートした後、前と同様に、WST-1試薬を用い細胞生存率を評価した。結果は図16に示すとおりである。血清濃度が高いときは推定上、血清中に存在する抗体が中和され、C.ディフィシールトキシンの細胞毒性が完全に阻害されることを確認できる。血清濃度が減少するにつれて中和活性が低下し、細胞生存率が逓減する。インビボデータによって実証されるように、PGトキソイドが産生する抗体は防御力を備えていることが以上の結果から確認される。[実施例13]トキソイドの円偏光二色性分光法ホルムアルデヒド37v/vをリシン1mg/mlに添加した後、ホルムアルデヒドトキソイドを調製して、最終濃度2.5v/vを得た。この混合物を37°Cにて3週間インキュベートしてから、最終濃度が0.1Mになるまでリシンを添加した。この後、PD10クロマトグラフィカラムを使用して溶液を脱塩して生理食塩水にした。等量のトキシン2mg/mlおよびPGpH8の重炭酸塩緩衝液中0mMから40mMを添加してフェニルグリオキサールPGトキソイドを調製すると、0mMから20mMPG中で最終濃度1mg/mlのトキシンが得られる。この後、溶液を室温にて24時間および96時間、または37°Cにて24時間インキュベートした。インキュベーション後に、PD10クロマトグラフィカラムを使用して溶液PGトキソイドを脱塩して生理食塩水にした。前掲の方法Griffithsetal.,1999,上記を使用してトキソイドの濃度を測定し、必要になるまで-80°Cで凍結貯蔵した。PGトキソイドのPG濃度は0mM、0.001mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.5mM、5.0mMおよび20mMであった。ホルミル化された単一のリシンサンプル300mMを調べた。PGトキソイドを常温常圧RTPにて24時間および96時間0mMから20mMでインキュベートし、37°Cにて24時間0mMから20mMでインキュベートしてから、実験に先だって室温で自然に解凍させた。すべてのサンプルをpH7.0の10mMリン酸緩衝液で1:1の比率に希釈し、10mmおよび0.5mmの細胞経路長で測定した。AppliedPhotophysicsLtdChirascanスペクトロメータを使用して、400nmから230nmおよび260nmから190nmの領域内でUVおよびCDスペクトルを測定した。適用したパラメータは、1nmのスペクトル帯域幅、0.5nmの刻み幅、1.5s400nmから230nmおよび3.0s260nmから190nmの1点当たり時間である。すべてのスペクトルをベースライン補正し、ここで適切な温度を記録した。濃度および経路長に対する遠紫外CDスペクトルを補正してから、平均残基モル楕円率[θ]または平均残基モル吸光係数、ΔεM-1cm-1に換算して表す平均残基分子量113を使用した。。各溶液のCDスペクトルを室温20°Cにて記録し、高温90°Cになるまで加熱し、加熱後に20°Cになるまで再び冷却した。融解プロフィールもまたλ=233nmでモニターした。MelcorThermoelectricPeltierユニット装備の機器は、1°C/分の速度、1°Cの刻み幅および0.2°Cの公差にて温度を20°Cから96°Cに変化させるように設定された。10s点当たりの時間CD測定時間を使用した。蛋白質溶液中で熱電対プローブを用い、温度を直接測定した。すべての測定が矩形0.5mm細胞経路長で行われた。OriginソフトウェアOriginLabCorporation,USAを使用して、CD対温度プロットを1成分のファントホフVan’tHoff式に適合させた。pH滴定は、ThermoRusselKシリーズ電極搭載のCorningpH105pHmeterを使用して測定した。pH2から8までの範囲でpHを変えるために、NaOHおよびHClのアリコートを使用した。理論的pH曲線は、Originv7.5ソフトウェアで生成された。無傷のwhole天然型リシンの遠紫外CDスペクトルのオーバレイ、1mMPGリシントキソイドおよびホルミル化されたリシントキソイドは、図17に示すとおりである。1mMPGがCDスペクトルに対して及ぼす影響は明らかに最小限である。重要なことに、リシンの立体配座の変化をほとんどまたは一切推論することなく223nm陽性機能のほとんどが保持される。他方、ホルミル化は233nm陽性機能を失うため、CDスペクトルの全体的な縮小につながる。このことにより、秩序正しい立体配座における縮小アンフォールディングを示される。様々なPGレベルの作用をモニターする遠紫外CDスペクトルおよびそれぞれのインキュベーション条件は、図18に示すとおりである。インキュベーション条件に関係なく、PGレベルが高いと、CDスペクトルが変化しやすくなり、結果として蛋白質立体配座も変わる。PG濃度の関数として、24時間および96時間の両方の常温常圧RTPで室温にてインキュベートすると、CDシグナルが累進的減少し、B鎖に関連付けられている233nm陽性CD機能が顕著に失われるのが確認される。225nm以下約225nmにて、B鎖の2つの成分変性を表す見かけ上の等濃度点が観測される。PGレベルを高くして常温常圧RTPで37°Cにてインキュベートションした場合5mMおよび20mMPG、更なる変性を呈する。CD233nmB鎖完全性とフェニルグリオキサール含有量を対照的に示したプロットは、変性過程をグラフで図解した図18Dに示すとおりである。現在の作業の一環として測定を行っている間、それぞれのトキソイド中のPG濃度に関連してPGトキソイド溶液の250nmでの吸光度が顕著になることが注目されたデータは非公開。これにより、蛋白質濃度尺度となるA280の使用が阻止されている。ホルミル化は、リシン残基で起こることが知られている。リシンA鎖に含まれるリシン残基は2つだけであるのに対し、リシンB鎖には7つ含まれている。従って、リシンB鎖の方がホルミル化に対する感度が大きい。SwissProtPDBビューアを使用してアミノ酸配列およびX線構造を見ると、リシンB鎖のリシン残基のうちの5つK40、K62、K168およびK203が空間的にジスルフィド結合に近接していることが認められた。従って、リシンB鎖のホルミル化が233nm陽性CD機能を司るジスルフィド立体配座を混乱させたことは、驚くべきことではない。フェニルグリオキサール化は、アルギニン残基で起こることが知られている。アルギニン残基はリシンA鎖に21個、リシンB鎖には13個存在し、両方の領域にわたって均一に分布している。ここに提示されているCD結果は、二次構造に対する影響が考慮されるのは、フェニルグリオキサール化が高度な場合のみ>1mMであることを示している。毒性結果と連関させると、低レベルのフェニルグリオキサールによる抑制アルギニンの修飾は、二次構造変化と関係していないことが、CDデータから判る。他方、ホルミル化によって二次構造の変化が誘発された。上の例から、本発明のα-ジカルボニルトキソイド化試薬例えば、PGは特に有効なトキソイド化試薬であり、この点で本発明が特に有利であると結論づけることができる。本発明のα-ジカルボニルトキソイド化試薬は、ホルムアルデヒドと同等なトキソイド化能力を提供しながらも、より低い温度、短い期間および低い濃度で使用して安定なトキソイドを生成することが可能で、しかもこの際にトキソイド化剤を更に添加して処方する必要がない。例えば、PGは0.5mMの濃度でリシン、ジフテリア、コレラおよびC.ディフィシールトキシンをトキソイド化する。トキソイド化は37°Cにて7日間以下で達成される。20°CにてPGはリシンを7日間以下で不活化する。他の関係のあるグリオキサールも、トキシン活性を抑制させるが、この適用可能性はPGほどは広範でないと思われる。リシントキシンのPGトキソイドは、調製に過剰なPGを必要とすることなしにpH5、7および8にて少なくとも6か月間安定している。C.ディフィシールトキシンのPGトキソイドは、3LD50のC.ディフィシールトキシンを抗原として投与から、マウスを防御する能力のある応答を誘発する。このトキソイドは、C.ディフィシールに対する抗体の生成を誘発し、これらの抗体によってトキシンがインビトロで中和される。このことは、ベロ細胞における細胞毒性の阻止によって実証された。"