"Nefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、およびp17Gagおよび/もしくはp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなるポリペプチドであって、p17Gagおよびp24Gagの両方が含まれている場合、それらの間に少なくとも1つのHIV抗原または免疫原性断片が存在する、上記ポリペプチド。PolもしくはRTまたはそれらの免疫原性断片もしくは誘導体をさらに含んでなる、請求項1に記載のポリペプチド。前記RTまたはその免疫原性断片が、RTがC末端において切断されており、それによりカルボキシ末端のRNaseHドメインが失われている断片である、請求項1または2に記載のポリペプチド。前記RT断片がp51断片である、請求項3に記載のポリペプチド。前記RTが、592位においてメチオニンをリジン等の他の残基に置き換える突然変異を含んでなる、請求項2~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。前記Nefが全長Nefである、請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。以下のもの:1.p24-RT-Nef-p172.p24-RT-Nef-p173.p24-p51RT-Nef-p174.p24-p51RT-Nef-p175.p17-p51RT-Nef6.p17-p51RT-Nef7.Nef-p178.Nef-p17、リンカーあり9.p17-Nef10.p17-Nef、リンカーありはRTのメチオニン592のリジンへの突然変異を表す、のうち1つより選択されるポリペプチド。請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチドの精製方法であって、i未精製ポリペプチドを含んでなる組成物を用意すること;ii該組成物を少なくとも2つのクロマトグラフィー工程に供すること;iii任意により該ポリペプチドをカルボキシアミド化すること;iv製剤化に適したバッファー中に該タンパク質を提供するためにバッファー交換工程を行うことを含む、上記方法。最大で2つのクロマトグラフィー工程を行う、請求項8に記載の方法。前記カルボキシアミド化を前記2つのクロマトグラフィー工程の間に行う、請求項8または9に記載の方法。iNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびp17Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなるポリペプチド、およびiip24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなるか、あるいはiNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなるポリペプチド、およびiip17Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなる組成物。RTまたはその免疫原性断片もしくは誘導体をさらに含んでなる、請求項11に記載の組成物。iNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびp17Gagおよび/もしくはp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなるポリペプチドであって、p17Gagおよびp24Gagの両方が含まれている場合、それらの間に少なくとも1つのHIV抗原または免疫原性断片が存在するポリペプチド、ならびにiip51RTポリペプチドを含んでなる組成物。iが、以下のもの:1.Nef-p172.Nef-p17、リンカーあり3.p17-Nef4.p17-Nef、リンカーありより選択される、請求項11~13のいずれか1項に記載の組成物。前記RTまたはその免疫原性断片が、RTがC末端において切断されており、それによりカルボキシ末端のRNaseHドメインが失われている断片である、請求項12~14のいずれか1項に記載の組成物。前記RT断片がp51断片である、請求項15に記載の組成物。前記RTが、592位においてメチオニンをリジン等の他の残基に置き換える突然変異を含んでなる、請求項11~16のいずれか1項に記載の組成物。前記Nefが全長Nefである、請求項11~17のいずれか1項に記載の組成物。Nef、PolおよびGagであるかまたはそれらから誘導される少なくとも4つのHIV抗原または免疫原性断片もしくは誘導体を含んでなる、HIV抗原の融合体であるポリペプチド。前記Gagが、前記融合体において少なくとも1つの他の抗原により隔てられている2つの別個の成分として存在する、請求項19に記載のポリペプチド。前記Nefが全長Nefである、請求項19または20に記載のポリペプチド。前記Polが、p66またはp51RTである、請求項19~21のいずれか1項に記載のポリペプチド。前記Gagがp17およびp24Gagである、請求項19~22のいずれか1項に記載のポリペプチド。請求項1~23のいずれか1項に記載のポリペプチド、ポリペプチド組成物もしくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群。p51RTポリペプチドもしくはその誘導体、または好ましくはコドンが大腸菌での発現のために最適化されているそれをコードするポリヌクレオチド。請求項25に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。請求項1~26のいずれか1項に記載のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの組成物あるいは請求項1~26のいずれか1項に記載の精製ポリペプチドと、製薬上許容される担体もしくはアジュバントとを含んでなる、医薬組成物。前記アジュバントが、QS21もしくは3D-MPLまたはQS21および3D-MPLの配合物等のTh1誘導性アジュバントである、請求項27に記載の医薬組成物。一態様においては、本発明はNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、ならびにp17Gagおよび/もしくはp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、p17Gagとp24Gagの両方が存在する場合、それらの間には少なくとも1つのHIV抗原またはその免疫原性断片が存在する、前記ポリペプチドを提供する。本明細書に記載の本発明による構築物および組成物においては、Nefは完全長Nefであるのが好ましい。本発明による構築物においては、p17Gagおよびp24Gagは、それぞれ完全長のp17およびp24であるのが好ましい。一実施形態においては、前記ポリペプチドはp17およびp24の両方のGagまたはその免疫原性断片を含む。そのような構築物においては、p24Gag成分とp17Gag成分は、少なくとも1つのさらなるHIV抗原またはその免疫原性断片、例えば、Nefおよび/もしくはRTまたはその免疫原性断片もしくは誘導体により分離されている。あるいは、p17またはp24のGagを別々に提供する。かくして、本発明はまた、Nefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびp17Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチド、ならびにp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体;またはNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチド、ならびにp17Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含む組成物も提供する。別の実施形態においては、本発明によるポリペプチド構築物は、PolまたはPolの誘導体、例えば、RTまたはその免疫原性断片もしくは誘導体をさらに含む。本発明における使用にとって好適であるRTの特定の断片は、好ましくは、これらがカルボキシ末端RNaseHドメインを欠くように、RTをC末端で切断した断片である。カルボキシ末端RNaseHドメインを欠く1つのそのような断片は、本明細書に記載のp51断片である。好ましくは、本明細書に記載の融合タンパク質中のRTまたはその免疫原性断片はp66RTまたはp51RTである。本発明による融合タンパク質または組成物のRT成分は、必要に応じて、メチオニンを、リジン等の別の残基への突然変異により除去するような、位置592での突然変異、またはHXB2以外の株における等価な突然変異を含む。この突然変異の目的は、原核発現系における内部開始部位として働く部位を除去することである。RT成分はまた、またはあるいは、酵素活性を除去するための突然変異を含む。かくして、K231がWの代わりに存在してもよい。p24およびRTを含む本発明による融合タンパク質においては、抗原を大腸菌において単独で発現させる場合、RTよりもp24の方がより良好な発現が観察されるため、p24は前記構築物中でRTの前に配置されるのが好ましい。本発明による好ましい構築物としては、以下のもの:1.p24-RT-Nef-p172.p24-RT-Nef-p173.p24-p51RT-Nef-p174.p24-p51RT-Nef-p175.p17-p51RT-Nef6.p17-p51RT-Nef7.Nef-p178.Nef-p17リンカーあり9.p17-Nef10.p17-NefリンカーありはRTのメチオニン592のリジンへの突然変異を表す。が挙げられる。上記構築物に含まれるリンカーは、それが連結する2つの融合パートナー間での相互作用の可能性を減少させるための任意の短いアミノ酸配列であってよい。このリンカーは、例えば、4~10アミノ酸の長さであってよい。例えば、それは実施例中、本明細書に記載のGSGGGP配列などの6アミノ酸の配列であってよい。本発明の別の態様においては、Nef、PolおよびGagから誘導される、少なくとも4つのHIV抗原またはその免疫原性断片を含むHIV抗原の融合タンパク質を提供する。Gagは、前記融合体において少なくとも1つの他の抗原により隔てられている2つの別個の成分として存在するのが好ましい。Nefは完全長Nefであるのが好ましい。Polは、p66またはp51RTであるのが好ましい。Gagは、p17およびp24Gagであるのが好ましい。本発明のこの態様における前記融合体の抗原成分の他の好ましい特徴および特性は、本明細書に記載の通りである。本発明のこの態様の好ましい実施形態は、上記に既に列挙された4つの成分の融合体である:1.p24-RT-Nef-p172.p24-RT-Nef-p173.p24-p51RT-Nef-p174.p24-p51RT-Nef-p17。本発明に含まれるHIV抗原に関する用語から誘導されるまたは誘導体とは、該抗原がその天然の対応物と比較して限定された方法で変更されていることを意味する。これは、例えば、原核系における発現を改良するか、または望ましくない酵素活性などの望ましくない活性を除去することにより、該タンパク質の特性を変化させ得る点突然変異を含む。RTに関する本明細書に記載の点突然変異を、これらの事象を達成するために設計する。しかしながら、前記抗原は、それらがワクチンにおいて望ましい抗原特性を保持し、かくして、それらが天然の抗原に対する免疫応答を生じる能力を保持するように、該天然の抗原と十分に類似したままでなければならない。特定の誘導体がそのような免疫応答を生じるかどうかを、ELISAまたは細胞マーカーおよびサイトカインのための好適な染色を用いるフローサイトメトリーなどの好適な免疫学的アッセイにより測定することができる。本発明によるHIV抗原のポリペプチド構築物を、大腸菌などの原核系などのinvitro系で発現させることができる。有利には、これらを従来の精製方法により精製することができる。本明細書に記載の融合体は、選択された発現系において発現される場合、可溶性である、すなわち、それらが該発現系からの粗抽出物の上清中に実質的な量で存在するのが好ましい。該粗抽出物中の融合タンパク質の存在を、SDSゲル上での泳動、クマシー染色および密度測定による好適なバンドのチェックなどの従来の手段により測定することができる。本発明による融合タンパク質は、実施例中、本明細書に記載の技術により測定した場合、好ましくは少なくとも50可溶性、より好ましくは少なくとも70可溶性、より好ましくは90以上可溶性である。組換え発現されたタンパク質の可溶性を改善するための技術は公知であり、例えば、原核発現系においては、遺伝子発現を誘導する温度を低下させることにより、可溶性が改善する。本明細書に記載の融合タンパク質を精製することができる。具体的には、それらを、可溶性であるか、または顕著に可溶性であるまま精製することができる。本明細書に記載の免疫原性断片は、前記抗原の少なくとも1つのエピトープを含み、HIV抗原性を示し、また、例えば、他のHIV抗原に融合されるか、または担体上に存在する場合など、好適な構築物中に存在する場合、前記天然の抗原に対する免疫応答を生じる能力を有するであろう。典型的には、前記免疫原性断片は、HIV抗原に由来する、少なくとも20個、好ましくは50個、より好ましくは100個の連続したアミノ酸を含む。本発明は、さらなる態様において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。このポリヌクレオチドを、プラスミドDNA、細菌およびウイルス発現系などの核酸発現系などの、当業者には公知の様々な送達系のいずれかの中に存在させることができる。RollandCritRevTherapDrugCarrierSystems151431981998およびそこに引用された参考文献により記載されたものなどの、いくつかの遺伝子送達技術が当分野でよく知られている。好適な核酸発現系は、患者における発現のための必須DNA配列を含む。この発現系が、ウイルスまたは細菌などの組換え生微生物である場合、目的の遺伝子を、生のlive組換えウイルスまたは細菌のゲノム中に挿入することができる。この生ベクターを用いる接種およびinvivoでの感染は、前記抗原のinvivoでの発現および免疫応答の誘導をもたらすであろう。この目的のために用いられるウイルスおよび細菌は、例えば、ポックスウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、リステリア菌、サルモネラ菌、シゲラ菌、ナイセリア菌、BCGである。これらのウイルスおよび細菌は毒性のものであってもよいし、または生ワクチンを取得するために様々な方法で弱毒化されたものであってもよい。そのような生ワクチンも本発明の一部を形成する。本発明による生ベクターとしての使用のための好ましい麻疹ベクターは、Schwartz株またはそれから誘導された株である。生ベクターとしての使用のための好ましいアデノウイルスは、Ad5もしくはAd35などの低い血清陽性率のヒトアデノウイルスか、またはサルアデノウイルスなどの非ヒト霊長類アデノウイルスなどの非ヒト起源のアデノウイルスである。そのような低い血清陽性率のヒトまたは類似のアデノウイルスは、集団中で60未満、典型的には50未満の血清陽性率を有するであろう。このベクターは複製欠損性であるのが好ましい。典型的には、これらのウイルスは、E1欠失を含み、E1遺伝子で形質転換された細胞株で増殖させることができる。好ましいサルアデノウイルスは、チンパンジーから単離されたウイルスである。特に、C68ならびにPan5、6およびPan7が本発明における使用にとって好ましい。これらのベクターを操作して、本発明によるポリペプチドが発現されるように、本発明による異種性ポリヌクレオチドを挿入することができる。そのような組換えアデノウイルスベクターの使用、製剤および製造はWO03/046142に詳細に記載されている。かくして、本発明による好ましいワクチンのNef、p17およびp24GagならびにRTを、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で提供することができる。本発明によるポリヌクレオチドを用いて、選択された発現系において、コードされたポリペプチドを発現させることができる。少なくとも1つのHIV抗原、例えば、RTを、ポリヌクレオチド中のコドン最適化された配列によりコードさせることができる。すなわち、この配列を、大腸菌などの選択された組換え発現系における発現のために最適化することができる。本発明の別の態様においては、好ましくは、好適な発現系、特に、大腸菌などの原核生物系における発現のためにコドン最適化された、p51RTポリペプチドもしくはその誘導体またはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。p51RTポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを、単独で、または本発明によるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド構築物と組合わせて用いることができる。かくして、本発明のさらなる態様においては、NefまたはNefエピトープを含む断片ならびにp17Gagおよび/もしくはp24Gagを含むポリペプチドであって、p17およびp24の両方のGagが存在する場合、それらの間に少なくとも1つのHIV抗原または免疫原性断片が存在するポリペプチド、ならびにp51RTポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はさらに、これらをコードするポリヌクレオチドを提供する。この実施形態に従えば、を、例えば、1.Nef-p172.Nef-p17リンカーあり3.p17-Nef4.p17-Nefリンカーありから選択することができる。好ましくは、Nefは完全長のNefである。好ましくは、p17は完全長のp17である。本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、他の抗原または他の抗原をコードするポリヌクレオチドと組合わせることができる。特に、これはHIVのenvタンパク質またはその断片もしくは誘導体を含んでもよい。envの好ましい形態はgp120、gp140およびgp160である。このenvは、例えば、R2として知られるHIV-1のクレードBエンベロープクローンに由来する、WO00/07631に記載のエンベロープタンパク質、またはその断片もしくは誘導体であってよい。かくして、本発明はさらに、HIVenvタンパク質またはその断片もしくは誘導体と共に、本発明によるポリペプチド群のいずれかを含む組成物またはポリペプチド組成物を提供する。同様に、本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはポリペプチド群をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド群およびHIVのenvタンパク質またはその断片もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドを調製する方法であって、好適な発現系、特に、大腸菌などの原核生物系において前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させること、および発現されたポリペプチドを回収することを含む前記方法を提供する。発現を低温、すなわち、37°Cより低い温度で誘導して、前記ポリペプチドの可溶性を促進するのが好ましい。本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドの精製方法であって、i未精製ポリペプチドを含む組成物を用意すること;ii該組成物を少なくとも2つのクロマトグラフィー工程に供すること;iii必要に応じて、該ポリペプチドをカルボキシアミド化すること;iv製剤化に適したバッファー中に該タンパク質を提供するためにバッファー交換工程を行うこと、を含む方法を提供する。カルボキシアミド化を、2つのクロマトグラフィー工程の間に行ってもよい。カルボキシアミド化を、ヨードアセトイミドを用いて行ってもよい。1つの例においては、本発明による方法は2つ以下のクロマトグラフィー工程を用いる。本発明はさらに、本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドと、製薬上許容し得るアジュバントまたは担体とを含む医薬組成物および免疫原性組成物およびワクチンを提供する。本発明によるワクチンを、HIVに対する予防的または治療的な免疫付与に用いることができる。本発明はさらに、HIVに対する予防的または治療的な免疫付与のためのワクチンの製造における、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリペプチド組成物ならびにポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド組成物の使用を提供する。本発明のワクチンは、免疫保護的もしくは免疫治療的な量のポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド抗原を含み、これを従来の技術により調製することができる。ワクチンの調製は、NewTrendsandDevelopmentsinVaccinesVollerらUniversityParkPressBaltimoreMarylandUSA1978に一般的に記載されている。リポソーム内へのカプセル封入は、例えば、Fullertonの米国特許第4,235,877号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合は、例えば、Likhiteの米国特許第4,372,945号およびArmorらの米国特許第4,474,757号により開示されている。ワクチン用量中のタンパク質の量を、典型的なワクチンにおいて、顕著な有害副作用を示すことなく免疫保護応答を誘導する量として選択する。そのような量は、どの特異的免疫原を用いるか、およびどのワクチン接種計画を選択するかに依存して変化するであろう。一般的には、各用量は1~1000μgの各タンパク質、好ましくは2~200μg、最も好ましくは4~40μgのポリペプチド融合体を含むと予想される。特定のワクチンにとって最適な量を、被験体における抗体力価および他の免疫応答の観察を含む標準的な試験により確認することができる。初回のワクチン接種の後、被験体は約4週間以内に追加免疫を受けてもよく、続いて、2回目の追加免疫を受けてもよい。本発明のタンパク質を、本発明のワクチン製剤中でアジュバント化するのが好ましい。アジュバントは、ワクチンの設計サブユニットおよびアジュバント手法、PowellおよびNewmanPlenumPressNewYork1995に一般的に記載されている。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、もしくはアシル化された糖、陽イオンもしくは陰イオン的に誘導体化された多糖、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。本発明の製剤においては、前記アジュバント組成物は優先的にTh1応答を誘導するのが好ましい。しかしながら、他の体液性応答などの他の応答も排除されないことが理解されるであろう。免疫応答を、抗原と、免疫系の細胞との相互作用を介して、該抗原に対して生じさせる。得られる免疫応答を、体液性免疫応答または細胞媒介性免疫応答の2つの極端なカテゴリーに広く区別することができる。応答のこれらのカテゴリーは、Th1型応答、およびTh2型免疫応答と呼ばれてきた。極端なTh1型免疫応答は、抗原特異的な、ハプロタイプにより制限された細胞傷害性Tリンパ球、およびナチュラルキラー細胞応答の生成を特徴とする。マウスにおいては、Th1型応答は、IgG2aサブタイプの抗体の生成を特徴とすることが多いが、ヒトにおいては、これらはIgG1型抗体に対応する。Th2型免疫応答は、マウスのIgG1、IgA、およびIgMなどの広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成を特徴とする。これらの2つの型の免疫応答の発達を助ける駆動力はサイトカインであり、いくつかの同定されたタンパク質メッセンジャーは免疫系の細胞を助けるように働き、Th1またはTh2応答のいずれかに対して結果として起こる免疫応答を制御すると考えられる。かくして、高レベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導しやすい傾向があるが、高レベルのTh2型サイトカインは該抗原に対する体液性免疫応答を誘導しやすい傾向がある。Th1型およびTh2型の免疫応答の区別が絶対的なものではないことを覚えておくことが重要である。実際には、個体は、主にTh1または主にTh2として表される免疫応答を支持するであろう。しかしながら、マウスCD4T細胞クローンにおいてMosmannおよびCoffmanTH1andTH2cellsdifferentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalpropertiesAnnualReviewofImmunology7p145173により記載されたという点で、サイトカインのファミリーであると考えるのが都合が良いことが多い。通常は、Th1型応答は、Tリンパ球によるINF-γおよびIL-2サイトカインの産生と関連する。他のサイトカインは、IL-12などのT細胞により産生されないTh1型免疫応答の誘導と直接関連することが多い。対照的に、Th2型応答は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10および腫瘍壊死因子-βの分泌と関連する。特定のワクチンアジュバントが、Th1またはTh2型のサイトカイン応答の刺激にとって特に好適であることが知られている。伝統的には、ワクチン接種または感染後の免疫応答のTh1:Th2の平衡の最良の指示因子としては、抗原による再刺激後のinvitroでのTリンパ球によるTh1もしくはTh2サイトカインの産生の直接的測定、および/または抗原特異的抗体応答のIgG1:IgG2a比の測定が挙げられる。かくして、Th1型アジュバントは、単離されたT細胞集団を刺激して、invitroで抗原により再刺激された場合、高レベルのTh1型サイトカインを産生し、かつTh1型アイソタイプと関連する抗原特異的免疫グロブリン応答を誘導するものである。本発明における使用にとって好適なアジュバントを製造するために製剤化することができる好ましいTh1型免疫刺激因子としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。モノホスホリルリピドA、特に、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAが、本発明における使用にとって好ましいTh1型免疫刺激因子である。3D-MPLはRibiImmunochemMontanaにより製造されるよく知られたアジュバントである。化学的には、それは3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAと、4、5、または6アシル化鎖との混合物として供給されることが多い。それを、GB2122204Bに教示された方法により精製および調製することができ、この参考文献はジホスホリルリピドA、およびその3-O-デアシル化変種の調製も開示している。他の精製されたリポ多糖および合成リポ多糖が記載されている3926;Hilgersら、1987Immunology601416およびEP0549074B1。3D-MPLの好ましい形態は、直径0.2μm未満の小さい粒径を有する粒子状製剤の形態にあり、その製造方法はEP0689454に開示されている。サポニンも、本発明に従う好ましいTh1免疫刺激因子である。サポニンはよく知られたアジュバントであり、LacailleDuboisMおよびWagnerHに教示されている。例えば、QuilAの樹皮に由来する、およびその画分が、米国特許第5,057,540号およびSaponinsasvaccineadjuvantsKensilCRCritRevTherDrugCarrierSyst199612155ならびにEP0362279B1に記載されている。溶血性サポニンQS21およびQS17が強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は米国特許第5,057,540号およびEP0362279B1に開示されている。また、これらの参考文献には、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして働くQS7の使用も記載されている。QS21の使用は、Kensilらにさらに記載されている。QS21とポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも公知であるWO99/10008。QS21およびQS7などのQuilAの画分を含む粒子状アジュバント系はWO96/33739およびWO96/11711に記載されている。1つのそのような系はIscornとして公知であり、1種以上のサポニンを含んでもよい。別の好ましい免疫刺激因子は、非メチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。CpGはDNA中に存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの省略形である。CpGは、全身経路および粘膜経路の両方により投与される場合のアジュバントとして当分野で公知である870876McCluskieおよびDavisJImmunol199816144636。歴史的には、BCGのDNA画分が抗腫瘍作用を示し得ることが観察された。さらなる研究において、BCG遺伝子配列から誘導された合成オリゴヌクレオチドが、免疫刺激作用を誘導することができることが示された。これらの研究の著者らは、中央のCGモチーフなどの、特定のパリンドローム配列がこの活性を有すると結論付けた。免疫刺激におけるCGモチーフの中心的な役割はKriegNature374p5461995による刊行物において後に解明された。詳細な分析により、CGモチーフが特定の配列の前後関係の中になければならず、そのような配列は細菌のDNAにおいて一般的であるが、脊椎動物のDNAにおいては稀であることが示された。免疫刺激性配列は多い:プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジン;ここで、CGモチーフはメチル化されていないが、他の非メチル化CpG配列も免疫刺激性であることが知られており、本発明において用いることができる。6つのヌクレオチドの特定の組合せ中に、パリンドローム配列が存在する。これらのモチーフのいくつか、1つのモチーフの繰り返しまたは異なるモチーフの組合せのいずれかが、同じオリゴヌクレオチド中に存在してもよい。これらの免疫刺激性配列を含む1つ以上のオリゴヌクレオチドの存在は、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージ1977などの様々な免疫サブセットを活性化することができる。この共通配列を含まない他の非メチル化CpGを含む配列も、現在では免疫刺激性であることが示されている。ワクチン中で製剤化する場合、一般的には、CpGを、遊離の抗原と共に遊離の溶液中で投与するか、または抗原に共有結合させるか、または水酸化アルミニウムなどの担体と共に製剤化するDavisら、上掲BrazolotMillanら、ProcNatlAcadSciUSA199895155538。上記のような免疫刺激因子を、例えば、リポソーム、水中油型乳濁液、および/またはアルミニウム塩などの金属塩などの担体と一緒に製剤化することができる。例えば、3D-MPLを、水酸化アルミニウムEP0689454または水中油型乳濁液WO95/17210と共に製剤化することができる;有利には、QS21を、コレステロールを含有するリポソームWO96/33739、水中油型乳濁液WO95/17210またはミョウバンWO98/15287と共に製剤化することができる;CpGを、ミョウバンと共にDavisら、上掲BrazolotMillan、上掲または他の陽イオン性担体と共に製剤化することができる。免疫刺激因子の組合せ、特に、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組合せWO94/00153;WO95/17210;WO96/33739;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241、より具体的には、WO94/00153に開示されたようなQS21と3D-MPLの組合せも好ましい。あるいは、CpGとQS21などのサポニンの組合せも、本発明における使用のための強力なアジュバントを形成する。あるいは、サポニンをリポソーム中で、またはIscorn中で製剤化し、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組合わせることもできる。かくして、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは3D-MPLと、アルミニウム塩との組合せが挙げられる。増強された系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組合せ、特に、WO94/00153に開示されたようなQS21と3D-MPLの組合せ、またはWO96/33739に開示されたようなコレステロールを含有するリポソーム中でQS21をクエンチする低反応性組成物を含む。この組合せはさらに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。水中油型乳濁液中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がWO95/17210に記載されており、本発明における使用にとって別の好ましい製剤である。別の好ましい製剤は、CpGオリゴヌクレオチドのみ、またはCpGオリゴヌクレオチドとアルミニウム塩とを含む。本発明のさらなる態様においては、本発明によるポリペプチドを、好適なアジュバントと混合することを含む、本明細書に記載のワクチン製剤の製造方法を提供する。本発明による製剤における使用にとって特に好ましいアジュバントの組合せは以下の通りである:i3D-MPLQS21iiミョウバン3D-MPLiiiミョウバンQS213D-MPLivミョウバンCpGv3D-MPLQS21水中油型乳濁液viCpG。医薬組成物の投与は、例えば、同じポリペプチドを含む組成物の反復用量として、または異種性の初回-追加ワクチン接種計画中での、1もしくは2回以上の個々の用量の形態を取ってもよい。異種性の初回-追加計画は、初回および追加において異なる形態のワクチンの投与を使用し、その各々はそれ自身、2回以上の投与を含んでもよい。初回用組成物および追加用組成物は、一般的には少なくとも1種の抗原を有するが、それは同一の形態の抗原である必要はなく、同じ抗原の異なる形態であってもよい。本発明による初回-追加免疫を、タンパク質およびDNAに基づく製剤の組合せを用いて実施することができる。そのような戦略は、広範な免疫応答を誘導するのに有効であると考えられる。アジュバント化されたタンパク質ワクチンは、主に抗体およびTヘルパー免疫応答を誘導するが、プラスミドまたは生ベクターとしてのDNAの送達は強力な細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導する。かくして、タンパク質およびDNAワクチン接種の組合せは幅広い免疫応答を提供するであろう。中和抗体およびCTLは両方ともHIVに対する免疫防御にとって重要であると考えられるため、これはHIVとの関連において特に適切である。本発明に従えば、ワクチン接種のためのスケジュールは、ポリペプチド抗原および該ポリペプチドをコードするDNAの連続的または同時的な投与を含んでもよい。このDNAを、プラスミドDNAなどの裸のDNAとして、または、例えば、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、麻疹ウイルスベクターもしくは任意の他の好適な生ベクターなどの組換え生ベクターの形態で送達することができる。タンパク質抗原を、1回もしくは数回注入した後、1回以上、DNAを投与してもよいし、またはDNAを最初に1回以上の投与に用いた後、1回以上のタンパク質による免疫付与に用いてもよい。本発明による初回-追加免疫の特定例は、改変ポックスウイルスベクター、例えば、改変ウイルスアンカラもしくはアルファウイルス、例えば、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、またはアデノウイルスベクター、または麻疹ウイルスベクターなどの組換え生ベクターの形態のDNAを用いて初回免疫した後、タンパク質、好ましくはアジュバント化されたタンパク質を用いて追加免疫することを含む。かくして、本発明はさらに、以下のもの:aNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体ならびにp17および/もしくはp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、p17およびp24の両方のGagが存在する場合、それらの間に少なくとも1つのHIV抗原またはその免疫原性断片もしくは誘導体が存在するポリペプチドと、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物;ならびにb1つ以上のNefおよびGagをコードするポリヌクレオチドまたはaのポリペプチド中に存在するNefもしくはGagエピトープを含むNefもしくはGagの免疫原性断片もしくは誘導体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物、を含む医薬キットを提供する。好ましくは、aのポリペプチドは、RTまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、例えば、p51RTなどをさらに含む。代替的な実施形態においては、前記医薬キットは、aNefまたはその免疫原性断片もしくは誘導体ならびにp17および/もしくはp24Gagまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、p17およびp24の両方のGagが存在する場合、それらの間に少なくとも1つのHIV抗原またはその免疫原性断片もしくは誘導体が存在するポリヌクレオチドと、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物;ならびにb1つ以上のNefおよびGagを含むポリペプチドまたはaのポリペプチド中に存在するNefもしくはGagエピトープを含むNefもしくはGagの免疫原性断片もしくは誘導体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物、を含む。好ましくは、aのポリヌクレオチドは、RTまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、例えば、p51RTなどをさらに含むポリペプチドをコードする。本発明による初回/追加キットにおける使用にとって好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリヌクレオチドである。かくして、タンパク質/DNA型の初回-追加手法のタンパク質成分は、本明細書に記載の好ましい融合タンパク質のいずれかであってよい。同様に、DNA成分は好ましいタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドであってよい。かくして、例えば、本明細書に記載のp24RTNefp17、p24RTNefp17、p24p51RTNefp17、p24p51RTNefp17、p17p51RTNefもしくはp17p51RTNef融合体またはp17-Nef融合体のいずれかを、初回用組成物が融合タンパク質を含み、追加用組成物が該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、または初回用組成物が該ポリヌクレオチドを含み、追加用組成物が該融合タンパク質を含む、初回-追加キット中で提供することができる。初回用組成物および追加用組成物は両方とも、2回以上の用量中で送達することができる。さらに、最初の初回および追加用量に、例えば、DNAプラスミドによる初回/タンパク質による追加/さらなるDNAプラスミド用量/さらなるタンパク質用量をもたらすように変化させてもよいさらなる用量を続けることができる。コドン最適化とは、ポリヌクレオチド配列を、所望の発現系、例えば、大腸菌などの原核生物系における遺伝子のコドン使用頻度に類似するように最適化することを意味する。特に、該配列におけるコドン使用頻度を、高度に発現される大腸菌遺伝子のものと類似するように最適化する。本発明による組換え系における発現のためのコドン最適化の目的は2つである:組換え産物の発現レベルを改善すること、および発現産物をより均質にさせることである。改善された均質性とは、切断型などの無関係の発現産物があまり存在しないことを意味する。大腸菌発現へのコドン使用頻度の利用により、推定フレームシフト配列ならびに早期終結および/または内部開始部位を排除することもできる。DNAコードは4文字を有し、これらを用いて、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質中のアミノ酸を表す、3文字のコドンを綴る。DNA分子に沿ったコドンの直線状配列を、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸の直線状配列に翻訳する。このコードは非常に縮重性が高く、61種類のコドンが20種類の天然アミノ酸をコードし、3種類のコドンは停止シグナルを表す。かくして、多くのアミノ酸は2種類以上のコドンによりコードされ、実際、いくつかのものは4種類以上の異なるコドンによりコードされる。所与のアミノ酸をコードさせるのに2種類以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンが非常に非無作為的であることが観察された。異なる種は、そのコドン選択において異なる偏りを示し、さらに、コドンの使用頻度は高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間で、1つの種において顕著に異なっていてもよい。この偏りは、ウイルス、植物、細菌および哺乳動物細胞中で異なっており、いくつかの種は他のものよりも無作為なコドン選択から離れてより強い偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物は特定の細菌またはウイルスよりもあまり強く偏っていない。これらの理由から、大腸菌中で発現される哺乳動物ウイルス由来のウイルス遺伝子、または哺乳動物細胞中で発現される外来遺伝子もしくは組換え遺伝子が、効率的な発現のためには不適当なコドンの分布を有するかなり大きな可能性が存在する。コドンのクラスターの異種DNA配列中での存在、または発現を起こさせる宿主中で稀に観察されるコドンが多く含まれることは、その宿主における低い異種性発現レベルを予測させる。かくして、本発明のポリヌクレオチドにおいては、コドン使用パターンを、典型的なヒト免疫不全ウイルスのものから変化させて、標的生物、例えば、大腸菌のコドンの偏りにより近づけることができる。コドン最適化にとって有用な様々な公共的に利用可能なプログラムが存在し、例えば、CalcGeneが挙げられる。HIV-1p24-RT-Nef-p17融合体F4およびコドン最適化されたF4coの構築および発現1.コドン最適化されていないF4HIV-1gagp24およびp17、逆転写酵素およびNefタンパク質を、バクテリオファージT7プロモーターの制御下で、大腸菌B834株はBL21のメチオニン要求性の親株であるで発現させた。これらを、4つのタンパク質の完全な配列を含む1個の融合タンパク質として発現させた。成熟p24コード配列はHIV-1BH10分子クローンに由来し、成熟p17配列およびRT遺伝子はHXB2に由来し、かつNef遺伝子はBRU単離体に由来する。誘導後、組換え細胞は総タンパク質の10の量の顕著なレベルのp24-RT-Nef-p17融合体を発現した。細胞を22°Cで増殖および誘導した場合、p24-RT-Nef-p17融合タンパク質は主に細菌ライセートの可溶性画分に確認された。30°Cで増殖させた場合、約30の組換えタンパク質が不溶性画分に存在した。融合タンパク質p24-RT-Nef-p17は1136個のアミノ酸からなり、約129kDaの分子量を有する。完全長タンパク質はSDSゲル上で約130kDaに移動する。このタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づいて7.96の理論等電点を有し、これは2D-ゲル電気泳動により確認された。組換えプラスミドの詳細名称:pRIT15436または研究室における名称pET28b/p24-RT-Nef-p17宿主ベクター:pET28bレプリコン:colE1選択:カナマイシンプロモーター:T7インサート:p24-RT-Nef-p17融合遺伝子。組換えタンパク質の詳細p24-RT-Nef-p17融合タンパク質:1136アミノ酸N末端-p24:232a.a.-ヒンジ:2a.a.-RT:562a.a.-ヒンジ:2a.a.-Nef:206a.a.-P17:132a.a.-C末端ヌクレオチドおよびアミノ酸配列:ヌクレオチド配列[配列番号1]p24配列を太字で示す。Nef配列を下線付きで示す。囲み:遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。アミノ酸配列[配列番号2]P24配列:アミノ酸1-232RT配列:アミノ酸235-795Nef配列:アミノ酸798-1002P17配列:アミノ酸1005-1136囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸K:トリプトファンの代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。組換えタンパク質の発現:pETプラスミドにおいては、標的遺伝子は強力なバクテリオファージT7プロモーターの制御下にある。このプロモーターは大腸菌RNAポリメラーゼにより認識されず、宿主細胞中のT7RNAポリメラーゼの起源に依存する。B834宿主細胞は、lacUV5の制御下のT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含み、その発現は細菌培養物へのIPTGの添加により誘導される。前培養物を、振とうフラスコ中、37°Cで中間対数増殖期まで増殖させた後、4°Cで一晩保存した。培養物を、1グルコースおよび50μg/mlカナマイシンを添加したLBT培地中で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基底状態での組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する。4°Cで一晩保存した10mlの培養物を用いて、カナマイシンを含む200mlのLBT培地に植菌した。培養物を30°Cおよび22°Cで増殖させ、O.D.620が0.6に達した時、IPTGを添加した。培養物をさらに3、5および18時間インキュベートした。サンプルを、誘導前と、誘導の3、5および18時間後に回収した。抽出物の調製は以下の通りであった:細胞ペレットをブレーキングバッファー中に懸濁し、フレンチプレスに4回の通すことにより破壊した。粗抽出物を20000gで30分間遠心分離して、可溶性画分と不溶性画分とを分離した。ブレーキングバッファー:50mMTris-HClpH8.0、1mMEDTA、1mMDTTプロテアーゼインヒビターカクテル。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析:不溶性ペレット、上清および粗抽出物に対応する画分を、10の還元的SDS-PAGEで泳動した。p24-RT-Nef-p17組換え体を、クマシーブルー染色により、およびウェスタンブロットで検出した。クマシー染色:p24-RT-Nef-p17タンパク質は以下のように現れる:130kDa付近の1本のバンドMW理論値:128,970ダルトンMW見かけ:130kDaウェスタンブロット分析:試薬=RTに対するモノクローナル抗体ABIから購入希釈率:1/5000アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体希釈率:1/7500発現レベル:22°Cで20時間の誘導後の非常に強力なp24-RT-Nef-p17特異的バンド、総タンパク質の最大10にあたる。組換えタンパク質の可溶性:新鮮な細胞抽出物:22°Cで20時間の増殖/誘導を用いた場合、ほとんど全てのp24-RT-Nef-p17融合タンパク質が細胞抽出物の可溶性画分中に回収される。30°Cで20時間の増殖/誘導を用いた場合、約30のp24-RT-Nef-p17タンパク質が不溶性画分に存在する。凍結/解凍:可溶性画分を-20°Cで保存した。解凍および20000g/30分間で遠心分離:S2およびP2。DTTを含むブレーキングバッファー:ほとんど全てのp24-RT-Nef-p17融合タンパク質が可溶性のままであった。DTTを含まないブレーキングバッファー:85~90のp24-RT-Nef-p17が可溶性のままであった。図面:図1A-クマシー染色およびウェスタンブロット図1B-p24-RT-Nef-p17可溶性アッセイ。F4タンパク質を、実施例7の精製方法Iを用いて精製した。以下の実施例のための細胞の増殖および誘導条件ならびに細胞抽出物の調製は、他の条件を特定しない限り、実施例1に記載の通りである。2.コドン最適化されたF4以下のポリヌクレオチド配列は、そのコドン使用頻度が大腸菌で多く発現される遺伝子におけるコドン使用頻度と類似するようにコドン最適化されている。アミノ酸配列は、コドン最適化されていないF4について上記に示したものと同一である。F4coのヌクレオチド配列:[配列番号3]p24配列を太字で示す。Nef配列を下線付きで示す。囲み:遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。コドン最適化されていないF4に関して用いた手順を、コドン最適化された配列に適用した。組換えプラスミドの詳細:名称:pRIT15513宿主ベクター:pET28bレプリコン:colE1選択:カナマイシンプロモーター:T7インサート:コドン最適化された、p24-RT-Nef-p17融合遺伝子。F4のコドン最適化された遺伝子を、B834株のrecA-誘導体である大腸菌BLR細胞中で発現させた。RecA突然変異は推定されるλファージの産生を防止する。前培養物を、振とうフラスコ中、37°Cにて、中間対数増殖期まで増殖させた後、4°Cで一晩保存した。培養物を、1グルコースおよび50μg/mlカナマイシンを添加したLBT培地中で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は基底状態での組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する。4°Cで一晩保存した10mlの培養物を用いて、カナマイシンを含む200mlのLBT培地に植菌した。培養物を37°Cで増殖させ、O.D.620が0.6に達した時、IPTGを添加した。培養物をさらに19時間、22°Cにてインキュベートした。サンプルを、誘導前および誘導19時間後に回収した。抽出物の調製は以下の通りであった:細胞ペレットをサンプルバッファー中に再懸濁し、ボイルし、SDS-PAGEに直接ロードした。SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析:粗抽出物サンプルを10の還元的SDS-PAGEで泳動した。p24-RT-Nef-p17組換えタンパク質をクマシーブルー染色により、およびウェスタンブロットで検出する。クマシー染色:p24-RT-Nef-p17タンパク質は以下のように現れる:130kDa付近の1本のバンドMW理論値:128.967ダルトンMW見かけ:130kDaウェスタンブロット分析:試薬=ウサギポリクローナル抗RT希釈率:1/10000ウサギポリクローナル抗Nef-Tat希釈率:1/10000アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体希釈率:1/7500。22°Cで19時間の誘導の後、組換えBLR細胞は、総タンパク質の10~15の範囲の非常に高いレベルでF4融合体を発現した。ネイティブな遺伝子由来のF4と比較して、コドン最適化された遺伝子に由来するF4組換え産物のプロフィールはわずかに単純化されている。60kDaの主要なF4関連バンド、ならびにそれ以下の小さいバンドは消失した。F4を発現するB834組換え株と比較して、F4coを産生するBLR株は以下の利点を有する:F4完全長タンパク質のより高い産生、組換え産物のより複雑性の低いバンドパターン。P51RTの構築および発現アミノ酸428~448の間のRT/p66領域は大腸菌プロテアーゼに対して感受性である。P51構築物はLeu427で終結し、RNaseHドメインの排除をもたらす。RTのネイティブな遺伝子配列中で特定された推定上の大腸菌フレームシフト配列も排除された。p51合成遺伝子の設計/構築合成p51遺伝子の配列を、大腸菌のコドン使用頻度に従って設計した。かくして、それは、そのコドン使用頻度が大腸菌中で多く発現される遺伝子におけるコドン使用頻度に類似するようにコドン最適化された。合成遺伝子を以下のように構築した:32個のオリゴヌクレオチドを単一工程PCR中で組み立てた。2回目のPCRにおいて、完全長集合体を末端プライマーを用いて増幅し、得られたPCR産物をpGEM-T中間プラスミド中にクローニングした。遺伝子合成の間に導入されたポイントエラーの補正後、p51合成遺伝子をpET29a発現プラスミド中にクローニングした。この組換えプラスミドを用いて、B834細胞を形質転換した。組換えタンパク質の特性:p51RTヌクレオチド配列[配列番号4]囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。アミノ酸配列:[配列番号5]囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。K:トリプトファンの代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。長さ、分子量、等電点:433AA、MW:50.3kDa、IP:9.08B834細胞中でのp51の発現P51の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、RT/p66産生株と並行して評価した。p51の発現レベル:誘導条件:5時間、37°Cで細胞を増殖/誘導ブレーキングバッファー:50mMTris/HCl、pH:7.5、1mMEDTA、/-1mMDTTウェスタンブロット分析:試薬:ウサギポリクローナル抗RTアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体粗抽出物、不溶性ペレットおよび上清に対応する細胞画分を、10の還元的SDS-PAGEで泳動した。クマシー染色されたゲルおよびウェスタンブロットに示されるように、非常に高いP51の発現が観察され、これはP66について観察されたものよりも高かった。p51およびp66タンパク質の両方について、80の組換え産物を、細胞抽出物の可溶性画分中に回収した。30°Cで発現させた場合、99の組換えタンパク質が可溶性画分に存在していた。p51のウェスタンブロットパターンは複数のバンドであったが、P66について観察されたものよりも複雑性は低かった。可溶性アッセイ可溶性アッセイ:還元的条件および非還元的条件下で調製された可溶性画分の凍結/解凍。解凍後、S1サンプルを20,000gで30分間遠心分離し、S2およびP2を生成した。還元的ならびに非還元的条件で調製された、可溶性画分の凍結/解凍後、99のp51およびp66が依然として可溶性画分中に回収される。1のみが沈降物中に認められる。これを図5に示す。リンカーを含むか、または含まないp17-NefおよびNef-p17の構築および発現二重融合タンパク質を、リンカーを用いて、および用いずに構築した。このリンカーは、2つの融合パートナー間の相互作用の可能性を減少させるためのものであり、以下の通りである:組換えプラスミドの構築:pET29a/Nef-p17発現ベクター:Nef-p17融合遺伝子を、F4組換えプラスミドからPCRにより増幅した。PCR産物をpGEM-T中間クローニングベクター中にクローニングした後、続いてpET29a発現ベクター中にクローニングした。pET28b/p17-Nef発現ベクター:Nef遺伝子を、F4組換えプラスミドからPCRにより増幅した。PCR産物をpGEM-T中間クローニングベクター中にクローニングした後、続いてp17遺伝子とのC末端インフレーム融合体として、pET28b/p17発現ベクター中にクローニングした。pET29a/Nef-リンカー-p17およびpET28b/p17-リンカー-Nef発現ベクター:ヘキサペプチドリンカーをコードする18bpのDNA断片を、部位特異的突然変異誘発により、Nefとp17融合パートナーの間に挿入した。組換えタンパク質の特性:長さ、分子量、等電点アミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列:Nef-p17ヌクレオチド配列[配列番号6]Nef-p17[配列番号7]囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。Nef配列を太字で示す。P17-Nefヌクレオチド配列:[配列番号8]P17-Nef[配列番号9]囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。p17配列を太字で示す。Nef-リンカー-p17ヌクレオチド配列:[配列番号10]Nef-リンカー-p17[配列番号11]ヘキサペプチドリンカー囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。P17-リンカー-Nefヌクレオチド配列:[配列番号12]P17-リンカー-Nef[配列番号13]ヘキサペプチドリンカー囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸。リンカーを含む、および含まないNef-p17、p17-Nef融合体の発現の比較4種類の組換え株を、F4およびNef産生株と並行して、30°Cで3時間に渡って誘導した。粗抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。ウェスタンブロット分析:試薬:ウサギポリクローナル抗RTアルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体。図6に示されるように、リンカーを含む、および含まないNef-p17およびp17-Nef融合体は高レベルで発現される。ウェスタンブロット分析においては、4種類の二重融合構築物は複数のバンドパターンを示すが、F4について観察されたものよりも複雑性が低かった。単独で発現させた場合、Nefおよびp17タンパク質は単一のバンドパターンを示す。リンカーペプチドを含まない、Nef-p17およびp17-Nef融合体を発現する株を、さらに分析した。Nef-p17およびp17-Nefの可溶性アッセイ:Nef-p17およびp17-Nefタンパク質を、F4およびNef産生株と並行して誘導した。誘導条件:30°Cで3時間に渡る細胞増殖/誘導ブレーキングバッファー:50mMTris/HClpH:8、50mMNaCl、1mMEDTA。新鮮な細胞抽出物:細胞抽出物を調製し、粗抽出物、不溶性ペレット、および上清に対応する画分をクマシー染色ゲルおよびウェスタンブロット上で分析した。クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロットで図7に示されるように、ほとんど全てのNef-p17、p17-Nef、ならびにNefタンパク質は、細胞抽出物の可溶性画分中に回収される。F4構築物については、5~10の組換えタンパク質がペレット画分中に回収されている。結論:試験した全ての二重融合構築物は強く発現される。P17-NefおよびNef-p17融合タンパク質はF4よりも可溶性が高い。両方とも複雑性の低いWBパターンを示す。p24-RT-Nef-p17の構築および発現F4は、592位のメチオニンをリジンに置き換えたF4融合体の突然変異体である。このメチオニンは、F4精製実験のQセファロース溶出物サンプルについて行ったN末端配列決定により支持されるように、推定上の内部転写開始部位である。実際、Q溶出物サンプル中に存在する、主要なF4に対応する62kDaの小さいバンドは、メチオニン592から始まる。メチオニンを、リジンに置き換える:RMR→RKR。RKRモチーフはクレードAのRT配列中に天然に存在する。CD4-CD8エピトープに対するこの突然変異の影響を評価した:1個のHLA-A3CTLエピトープが失われるが、他の9個のHLA-A3エピトープがRT配列中に存在する。ヘルパーエピトープはこの領域中で同定されなかった。組換えタンパク質の特性:長さ、分子量、等電点:1136AA、129kDa、IP:8.07ヌクレオチド配列:[配列番号14]p24配列を太字で示す。Nef配列に下線を付す。囲み:遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。アミノ酸配列[配列番号15]P24配列:アミノ酸1-232RT配列:アミノ酸235-795Nef配列:アミノ酸798-1002P17配列:アミノ酸1005-1136囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸K592:メチオニンの代わりK464:トリプトファンの代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。B834細胞中でのF4の発現F4組換え株を、F4非突然変異構築物と並行して、18時間、22°Cで誘導した。粗抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図8に示されるように、F4は高レベルで発現され、これはF4と比較してわずかに高く、小さい62kDaのバンドは消失した。ウェスタンブロット分析:試薬:プールした3種類のMab抗p24JC13.1、JC16.1、IG8.1.1希釈率:1/5000ウサギポリクローナル抗RTウサギPO3L16希釈率:1/10000ウサギポリクローナル抗Nef-Tatウサギ388希釈率:1/10000アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体希釈率:1/7500アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体希釈率:1/7500。F3およびF3の構築および発現F3およびF3中の推定上の内部メチオニン開始部位をリジンで置き換えた。F3およびF3融合体をp24と組合わせて用いることができた。組換えプラスミド構築物:F3:p51をコードする配列をpET29a/p51発現プラスミドから切り出し、pET28b/p17-Nefプラスミド中、StuI部位に、p17およびNef配列とインフレームの融合体として連結した。得られた融合構築物p17-p51-NefをF3と命名する。F3:推定上の内部メチオニン開始部位の突然変異を、GeneTailor部位特異的突然変異誘発システムを用いて行い、F3構築物を作製した。F3およびF3プラスミドを用いて、B834細胞を形質転換した。組換えタンパク質の特性:長さ、分子量、等電点770AA、88.5kDa、IP:8.58ヌクレオチド配列[配列番号16]P17:配列を太字で示す。P51:配列を大文字で示す。Nef:配列を小文字で示す。囲み:遺伝子構築物により導入されたヌクレオチド。アミノ酸配列[配列番号17]P17配列:アミノ酸1-134P51配列:アミノ酸137-562Nef配列:アミノ酸565-770囲み:遺伝子構築により導入されたアミノ酸F3構築物においてはメチオニン494をリジンに置き換えた。K366:トリプトファンの代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。B834細胞におけるF3の発現:F3の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、F4およびp17-Nef産生株と並行して評価した。誘導条件:37°Cで細胞増殖/30°Cで3時間誘導ブレーキングバッファー:F4:50mMTris/HClpH:8.0、50mMNaCl、1mMEDTA、/-1mMDTTF2:50mMTris/HClpH:8.0、50mMNaCl、1mMEDTA、DTTを含まないF3:50mMTris/HClpH:7.5、50mMNaCl、1mMEDTA、/-1mMDTTウェスタンブロット分析:試薬ウサギポリクローナル抗RTウサギPO3L16希釈率:1/10000ウサギポリクローナル抗Nef-Tatウサギ388希釈率:1/10000アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体希釈率:1/7500。新鮮な細胞抽出物粗抽出物、不溶性ペレットおよび上清に対応する細胞画分を、10還元的SDS-PAGEで分析した。図9に示されるように、F3融合タンパク質は高レベルで発現される。ほとんど全てのF3が細胞抽出物の可溶性画分中に回収されるが、5~10のF4産物は既にペレット画分に存在している。WBパターンはF4と比較して単純である。B834細胞におけるF3の発現:F3組換え株を、F3非突然変異構築物と並行して、3時間に渡って37°Cで誘導した。粗細胞抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図10に示されるように、F3融合タンパク質は非常に高レベルで発現される。F3と比較して単純なWBパターンであり、32kDa付近の非常に弱いバンドが消失した。F4およびF4の構築および発現RT/p51を、F4融合構築物中で用いた。F4=p24-p51-Nef-p17F4=p24-p51-Nef-p17突然変異型F4:推定上の内部メチオニン開始部位をリジンに置き換えて、抗原パターンをさらに単純化する。組換えプラスミドの構築:F4:p51をコードする配列を、pET29a/p51発現プラスミドからPCRにより増幅した。制限部位をPCRプライマー中に組み入れた。PCR産物をpGem-T中間プラスミド中にクローニングし、配列決定した。pGem-T/p51中間プラスミドをNdeIおよびAvrIIにより制限処理し、p51断片を、NdeIおよびNheIにより制限処理されたpET28b/p24-RT/p66-Nef-p17発現プラスミド中に連結した。連結を、T4DNAリガーゼの存在下で、好適な濃度で消化反応と組合わせることにより行った。連結産物を用いて、DH5α大腸菌細胞を形質転換した。正しい翻訳読み枠へのp51の挿入の確認を、DNA配列決定により行った。得られた融合構築物p24-RT/p51-Nef-p17をF4と命名する。F4:推定上の内部メチオニン開始部位の突然変異を、GeneTailor部位特異的突然変異誘発システムを用いて行い、F4構築物を作製した。F4およびF4発現プラスミドを用いて、B834細胞を形質転換した。組換えタンパク質の特性:長さ、分子量、等電点:1005AA、114.5kDa、IP:8.47ヌクレオチド配列について[配列番号18]P24:配列を太字で示す。P51:配列を大文字で示す。Nef:配列を小文字で示す。P17:配列に下線を付す。囲み:遺伝子構築物により導入されたヌクレオチド。アミノ酸配列について[配列番号19]P24:アミノ酸1-232P51:アミノ酸237-662Nef:アミノ酸666-871P17:アミノ酸874-1005K594:メチオニンの代わりK466:トリプトファンの代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。B834細胞におけるF4の発現:F4の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、F4発現株と並行して評価した。誘導条件:37°Cで細胞増殖/22°Cで19時間に渡って誘導ブレーキングバッファー:50mMTris/HClpH:7.5、1mMEDTA、1mMDTTウェスタンブロット分析:試薬ウサギポリクローナル抗RTウサギPO3L16希釈率:1/10000ウサギポリクローナル抗Nef-Tatウサギ388希釈率:1/10000アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体希釈率:1/7500粗抽出物、不溶性ペレットおよび上清に対応する細胞画分を、10還元的SDS-PAGE上で分析した。図11に示されるように、F4は、F4と同様、高レベルで発現された。ほとんど全てのF4は細胞抽出物の可溶性画分中に回収される。抗Nef-tat試薬を用いる検出に際しては、F4のWBパターンが単純化されることが示された。B834細胞におけるF4の発現:F4組換え株を、F4非突然変異型構築物、F4およびF4と並行して、22°Cで18時間に渡って誘導した。粗細胞抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図12に示されるように、F4およびF4融合体の高い発現が観察され、それは総タンパク質の少なくとも10であった。WBパターン:60kDa付近より小さい切断された産物の減少。さらに、F4構築物については、47kDaのバンドが消失した。F4、F4およびF4の精製-精製方法I4つのHIV抗原p24-RT-Nef-p17を含む融合タンパク質F4を、以下の基本工程:F4の硫酸アンモニウム沈殿SO3フラクトゲル陽イオン交換クロマトグラフィーオクチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーQセファロースFF陰イオン交換クロマトグラフィーSDSの存在下でのSuperdex200ゲル濾過クロマトグラフィー透析および濃縮を含む精製方法Iに従って、大腸菌細胞のホモジネートから精製した。さらに、F4融合タンパク質およびF4タンパク質を、同じ精製方法Iを用いて精製した。タンパク質の定量総タンパク質をLowryアッセイを用いて測定した。タンパク質濃度を測定する前に、全てのサンプルをPBS、0.1SDSに対して一晩透析して、干渉物質尿素、DTTを除去する。BSAPierceを標準として用いた。SDS-PAGEおよびウェスタンブロットサンプルを還元的または非還元的SDS-PAGEサンプルバッファー中で調製し、95°Cで5分間加熱した。プレキャストNovexTris-グリシンゲルまたはCriterionゲルBioRad1mmの厚さを用いて、200Vで75分間、4-20SDSポリアクリルアミドゲルで、タンパク質を分離した。タンパク質を、クマシーブルーR250を用いて可視化した。ウェスタンブロットのために、タンパク質を、4°Cにて、100Vで1.5時間、または30Vで一晩、SDSゲルからニトロセルロース膜BioRadにトランスファーした。F4を、種々の抗原に対するモノクローナル抗体抗p24、抗Nef-Tat、抗RTを用いて検出した。アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギ抗体を一次抗体に結合させ、タンパク質バンドをBCIPおよびNBTを基質として用いて可視化した。抗大腸菌ウェスタンブロット5μgのタンパク質LowryをSDS-PAGEにより分離し、上記のようにニトロセルロース膜にトランスファーした。残りの宿主細胞タンパク質を、ポリクローナル抗大腸菌抗体を用いて検出した。タンパク質バンドを、上記のようにアルカリホスファターゼ反応を用いて可視化した。精製方法I方法Iは、硫酸アンモニウムによる沈殿および4つのクロマトグラフィー工程を含む:大腸菌細胞を、10mMDTT、1mMPMSF、1mMEDTAの存在下、OD50で、50mMTrisバッファーpH8.0中でホモジナイズした~360ml。2回のRannieでのパッセージを1000バールで行った。細胞破片および不溶性物質を、14400×gで20分間の遠心分離により除去した。清澄化した上清に硫酸アンモニウムASを3.8Mストック溶液から1.2Mの最終濃度で添加した。タンパク質を約2時間、室温RTにて沈殿させた後、遠心分離14400×gで10分間によりペレット化した。ペレットを、10mMリン酸バッファーpH7.0中の8M尿素、10mMDTT中に再懸濁した。抗原を、リン酸バッファー中の8M尿素および10mMDTT、pH7.0の存在下で、SO3フラクトゲルカラムMerckで捕捉した。カラムを洗浄して未結合のタンパク質を溶出させた後、170mMNaClを用いて予備溶出工程を行って、結合した宿主細胞タンパク質を除去した。次いで、F4を、リン酸バッファーpH7.0中の460mMNaCl、8M尿素、10mMDTTを用いて溶出させた。SO3溶出液を、10mMリン酸バッファーpH7を用いて2倍希釈し、リン酸バッファーpH7.0中の4M尿素、1mMDTT、230mMNaClの存在下でオクチルセファロースカラムにロードした。洗浄工程の後、結合したF4を、25mMTrisバッファーpH8.0中の8M尿素、1mMDTTを用いて溶出させた。オクチル溶出液を希釈し、pH9.0に調整した後、F4を、8M尿素pH9.0の存在下でQセファロースカラムに結合させた。未結合のタンパク質を洗浄除去し、予備溶出工程によりHCPおよびF4分解産物を除去した。F4を、Trisバッファー、pH9.0中の200mMNaCl、8M尿素を用いてカラムから脱離させた。Q溶出液のアリコートに1SDSを加え、0.1SDSおよび1mMDTTを含むPBSバッファーに対して透析して、尿素を除去した後、サンプルをゲル濾過カラムに注入した。対応する画分を、工程途中のSDS-PAGE分析後にプールした。サンプルを、110.5Mアルギニン、10mMTris、5mMグルタチオン、pH8.5に対して一晩、透析膜中でRTにて2回透析した。一連の精製工程を以下のフローチャートに示す。精製フローチャート360mlホモジネートOD5050mMTrispH8.0、1mMPMSF、10mMDTT、2mMEDTA↓清澄化14400×gでの20分間の遠心分離↓硫酸アンモニウム沈殿1.2MAS、RTで2時間、14400×g、10分間の遠心分離↓ペレットを、8M尿素、10mMPO4、10mMDTT、pH7.0に再懸濁↓SO3フラクトゲルEMD650クロマトグラフィーpH7.0、8M尿素、10mMDTT、170mMNaClでの予備溶出、溶出460mMNaCl↓pH7.0、4M尿素、5mMDTT、230mMNaClに2倍希釈↓オクチルセファロースクロマトグラフィーpH7.0、4M尿素、230mMNaCl、溶出8M尿素、20mMTrispH8.0↓約2倍希釈、pH9.0に調整↓QセファロースFFクロマトグラフィーTrispH9.0、8M尿素、予備溶出90mMNaCl、溶出200mMNaCl↓1SDSの添加↓透析→TBS、0.1SDS、pH8.5↓Superdex200ゲル濾過クロマトグラフィー16×120cmTBS、0.1SDS、pH8.5↓IPASDS-PAGE↓プール/濃縮/透析→製剤適合性バッファーIPA-工程途中の分析inprocessanalysis全てのバッファーは、特に指摘しない限り、1mMDTTを含む。F4の精製の結果精製プロセスのSDS-PAGE/ウェスタンブロットによる追跡図13は、F4の精製中に回収されたF4を含有する画分のSDSゲルおよび抗p24/抗Nef-Tatウェスタンブロットを示す。大腸菌ホモジネートを図13、レーン2に示すが、F4は総タンパク質の約10に相当すると見積もられる。遠心分離後、F4の可溶性画分は、清澄化された上清中に回収された。硫酸アンモニウム沈殿工程により多くの不純物を除去し、その後のクロマトグラフィー工程のためにタンパク質電荷を低下させた。さらに、8M尿素を用いて沈殿を懸濁して、F4とHCPとの複合体を解離させ、SO3樹脂によるF4の完全な捕捉および同樹脂からの定量的溶出の両方を可能にした。レーン5に示されるSO3溶出物においては、かなりF4が富化されているが、異種性パターンは基本的に未変化のままであった。疎水性オクチルセファロースカラムは主に低分子量のHCPおよびF4分解産物を除去し、それによってF4パターンを単純化した。QセファロースクロマトグラフィーはさらにF4パターンを単純化し、多くの不純物を除去した。大腸菌の不純物の点での最終的な純度がこの工程後に得られた。実際、抗大腸菌ウェスタンブロット分析によっては、Q溶出物中に宿主細胞タンパク質は検出されなかった。かくして産生された精製済みF4をF4Qと呼ぶ。Superdex200カラムは完全長F4からLMWF4分解産物を分離し、Superdex200溶出物中でのF4の均質性を改善した。用語F4Sを、方法Iの完全なスキームに従って精製されたF4について用いる。抗大腸菌ウェスタンブロットを、F4の精製中に回収された同じ画分について行った。抗大腸菌ウェスタンブロット上に可視的バンドがないことは、Q溶出物およびSuperdex溶出物中に存在するHCP夾雑物が1未満であることを示していた。F4およびタンパク質の回収精製プロセスの各工程でのF4の回収を、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析から評価した。SDSゲルからのF4の回収を評価するために、SDSゲル上に載せられるサンプル容量は、精製中に回収されるそれぞれの画分の容量に対応させる。表1は、F4を含有する画分中でのタンパク質の回収を示す。この表は、清澄化工程の後に上清中に回収された、ホモジネートおよび可溶性物質、F4を含めたタンパク質の量を示す。AS沈殿工程は大量のHCPを除去し、F4のわずかな損失のみがSDSゲルで観察された。SO3クロマトグラフィーはさらに多くの不純物を除去し、SDSゲルはF4の高い回収を示した。対照的に、オクチルセファロースおよびQセファロースカラムの両方では、測定された約50のタンパク質の回収は、F4の損失も伴っていた。ゲル濾過クロマトグラフィー後のタンパク質の回収は約50であった。SDSゲルは、F4回収の減少に付随して、多くのLMWタンパク質バンドが除去されたことを示している。F4の収率上記の表1は、約36mgの精製されたF4がOD50の360mlのホモジネートから得られたことを示している。従って、OD50の1Lのホモジネートは約100mgの精製されたF4をもたらすはずである。70~90のODが発酵プロセス中に達成されたため、1Lの発酵装置あたりの収率は従って140~180mgの範囲のF4である。F4の精製の結果F4融合構築物を、改変せずに上記の精製方法Iを用いて精製した。精製プロセスのSDS-PAGE/ウェスタンブロットによる追跡図14は、F4の精製中に回収されたF4を含有する画分のSDSゲルおよび抗p24/抗Nef-Tatウェスタンブロットを示す。SDSゲルおよびウェスタンブロットは、F4融合タンパク質が、全体的には、硫酸アンモニウム沈殿工程において、ならびにクロマトグラフィー工程中にF4と同様に振舞ったことを示している。精製されたF4は精製されたF4と類似する均質なパターンを有していた。抗大腸菌ウェスタンブロットは、Q溶出物およびSuperdex溶出物の両方におけるHCP夾雑物が1未満であることを示していた。収率約25のF4がホモジネートの不溶性画分中から失われた。さらに、この精製方法はこのタンパク質には適合しないため、クロマトグラフィー工程において損失が観察された。従って、F4の全体の回収はホモジネート1リットルあたり約25mgに減少した。OD177で1リットルの培養物を想定した場合、収率は従って85mg程度のF4となる。F4の精製の結果F4融合構築物を、改変せずに上記の精製方法Iを用いて精製した。精製プロセスのSDS-PAGE/ウェスタンブロットによる追跡図15は、F4の精製中に回収されたF4含有画分のSDSゲルおよび抗p24/抗Nef-Tatウェスタンブロットを示す。F4と同様、F4は全体的に精製手順中にF4と全く同様に振舞ったことにも気づくであろう。このタンパク質は、SDSゲルおよびウェスタンブロットにより示された予想される画分中に回収された。抗大腸菌ウェスタンブロットはまた、多くのHCPがQセファロースカラム後に既に排除されたことを示していた。収率全体の回収は、OD50の465mlのホモジネートから得られた約17mgの精製されたF4であった。OD140の1Lの培養物を想定した場合、収率は従って100mg程度のF4となる。まとめると、3種類の融合タンパク質F4、F4およびF4を、精製方法Iを用いて精製した。図16中のSDSゲルは、Qセファロース工程後、およびSuperdex200カラムによるLMWバンドの排除後の3種類の精製されたタンパク質を比較し、前記構築物の異なるレベルの均質性を示す。F4およびF4coの精製-精製方法II精製方法II方法Iと比較して単純化された精製手順である方法IIも開発した。方法IIは、2つのクロマトグラフィー工程およびバッファー交換のための最終的な透析/ダイアフィルトレーションのみからなる。注目すべきことに、CMハイパーZクロマトグラフィーカラムを導入して、方法Iの清澄化工程、硫酸アンモニウム沈殿およびSO3クロマトグラフィーを置換した。方法IIを用いて、F4および完全にコドン最適化されたF4の両方を精製した。F4coについては、1つはカルボキシアミド化を含み、1つはそれを含まない、2つの異なる形態の方法IIを実施した。カルボキシアミド化工程の目的は、タンパク質の酸化的凝集を防止することであった。このカルボキシアミド化を、1回目のクロマトグラフィー工程の後に実施する。大腸菌細胞を、OD90で、10mMDTTの存在下で50mMTrisバッファーpH8.0中でホモジナイズした。2回のRannieでのパッセージを1000バールで行った。8M尿素をホモジネートに添加した後、ホモジネートをpH7のリン酸バッファー中の8M尿素で平衡化させたCMハイパーZ樹脂に用いた。抗原の捕捉をバッチ様式で行った。次いで、この樹脂をカラム中に充填し、未結合のタンパク質を平衡化バッファーを用いて洗浄除去し、結合した宿主細胞タンパク質を、120mMNaClを用いる前溶出工程により除去した。次いで、F4coを、pH7.0のリン酸バッファー中の360mMNaCl、8M尿素、10mMDTTを用いて溶出させた。融合タンパク質の酸化的凝集を抑えるために、F4coのシステイン基をヨードアセトアミドを用いてカルボキシアミド化することができる。従って、必要に応じて、50mMのヨードアセトアミドをCMハイパーZ溶出物に添加し、暗室中、室温にて30分間、カルボキシアミド化を行った。次いで、CMハイパーZ溶出物を十分に希釈し、pH9.0に調整した。次いで、F4coまたはF4cocaを、TrisバッファーpH9.0中の8M尿素の存在下でQセファロースカラムに結合させた。未結合のタンパク質を平衡化バッファーを用いて洗浄除去し、同じバッファー中の90mMNaClを用いる前溶出工程により結合したHCPを除去した。F4coをTrisバッファーpH9.0中の200mMNaCl、8M尿素を用いて、カラムから脱離させた。サンプルを、1Lの0.5Mアルギニン、10mMTrisバッファー、10mMグルタチオン、pH8.5に対して一晩、透析膜中、RTにて2回透析した。あるいは、バッファー交換を、30または50kDaのカットオフを有する接線流膜tangentialflowmembraneを用いて、10倍サンプル容量の同じバッファーに対するダイアフィルトレーションにより行った。最後に、透析産物を0.22μmの膜を通して滅菌濾過した。一連の精製工程を以下のフローチャートに示す。精製フローチャートホモジネートOD9050mMTrispH8.0、10mMDTT↓8M尿素の添加、pH7.0に調整↓CMハイパーZクロマトグラフィーpH7.0、8M尿素、10mMDTT、120mMNaClで前溶出、溶出360mMNaCl↓必要に応じたカルボキシアミド化:50mMヨードアセトアミドの添加、RTにて30分間↓希釈およびpH9.0に調整、8M尿素↓QセファロースFFクロマトグラフィーTrispH9.0、8M尿素、NaClで前溶出、溶出↓透析/ダイアフィルトレーション→リン酸バッファー、0.5Mアルギニン、pH8.5↓滅菌濾過全てのバッファーは、F4coがカルボキシアミド化されていない場合にはDTTおよび精製されたバルク中にグルタチオンを含んでいた。一度、タンパク質がカルボキシアミド化されれば、還元剤を除去した。NaCl:F4coについては、これは200mMNaClであり、F4cocaについては、溶出はNaClの勾配によるものであった。この工程を、F4cocaについては60mMNaClを用いる前溶出および100mMNaClを用いる溶出により;ならびにF4coについては100mMNaClを用いる溶出によりさらに最適化することができる。結果:F4coの精製図17は、F4coの精製およびカルボキシアミド化されたF4coの精製中に回収されたF4を含む画分のSDSゲルを示す。CMハイパーZ樹脂は、8M尿素の存在下で粗ホモジネートからF4coを完全に捕捉し、360mMNaClを用いて定量的溶出を達成した。レーン2に示されたCMハイパーZ溶出物はF4co中でかなり富化されていた。好適な希釈およびサンプルのpH9への調整の後、F4coまたはF4cocaをQセファロースカラムに結合させた。次いで、F4coまたはF4cocaを、レーン3に示されるように200mMNaClを用いて特異的に溶出させた。このクロマトグラフィーは残存する宿主細胞タンパク質だけでなく、DNAおよびエンドトキシンをも除去した。製剤適合性バッファー中に精製された物質を入れるために、Qセファロース溶出物を、12~14kDaのカットオフを有する透析膜中の10mMTrisバッファー、0.5Mアルギニン、10mMグルタチオンpH8.5に対して透析した。グルタチオンはカルボキシアミド化されたタンパク質については省略した。F4coおよびF4cocaの両方の精製により、OD130の培養物1Lあたり約500mgの精製された物質が得られた。これはコドン最適化されていないF4を用いる前に観察されたものと類似する範囲にあった。上記のように、2つの異なる精製方法を、異なるF4構築物を精製するために開発した。図18は、得られた異なる精製バルクを比較するものである。図18中のSDSゲルは、2つの異なるタンパク質、F4およびF4coの識別パターンを明確に図示するものである。F4はいくつかの強い低分子量のバンドを示したが、コドン最適化されたF4coについてはかすかなバンドのみが可視的であった。方法Iおよび方法IIは非常に類似するF4coパターンをもたらした。抗大腸菌ウェスタンブロット分析により、精製されたタンパク質の純度を確認したところ、全ての調製物中で1未満の宿主細胞タンパク質夾雑物を示した。マウスにおけるF4の免疫原性製剤:アジュバント製剤1B:アジュバント製剤1Bを調製するために、有機溶媒中の脂質およびコレステロールおよび3D-MPLの混合物を減圧下で乾燥する。次いで、水性溶液を加え、全ての脂質が懸濁されるまで容器を攪拌する。次いで、この懸濁液を、リポソームの大きさが約100nmに減少するまで微小流体化した後、0.2μmフィルターを通して滅菌濾過する。押出しまたは超音波処理をこの工程の代わりに行ってもよい。典型的には、コレステロール:ホスファチジルコリン比は1:4であり、水性溶液を添加して5~50mg/mlの最終コレステロール濃度を得る。リポソームは100nmの規定の大きさを有し、SUVと呼ばれる。この溶液を繰り返し凍結/解凍すると、小胞は融合して、500nm~15μmの範囲の大きさの大きな多層構造物を形成する。リポソーム自体は長時間に渡って安定であり、融合能力を有さない。水性溶液中のQS21をリポソームに添加して、100μg/mlの最終3D-MPLおよびQS21濃度を達成する。製剤2A:水中油型乳濁液中の3-脱アシル化モノホスホリルリピドAおよびQS21:水中油型乳濁液の調製は、WO95/17210に記載のプロトコルに従うことにより行うことができる。詳細には、この乳濁液は5スクアレン、5トコフェロール、2.0tween80を含み、その粒径は180nmである。水中油型乳濁液の調製Tween80をリン酸緩衝生理食塩水中に溶解して、PBS中の2溶液を得る。100mlの2倍濃縮乳濁液を得るために、5gのDLαトコフェロールおよび5mlのスクアレンをボルテックスして完全に混合する。90mlのPBS/Tween溶液を添加し、完全に混合する。次いで、得られた乳濁液をシリンジに通し、M110S微小流体装置を用いることにより最終的に微小流体化する。得られる油滴は約180nmの大きさを有する。滅菌バルク乳濁液をPBSに添加して、1mlあたり500μlの乳濁液の最終濃度を達成する。次いで、3D-MPLを添加して、100μgの最終濃度を達成する。次いで、QS21を添加して、100μg/mlの最終濃度を達成する。成分のそれぞれの添加の間に、中間生成物を5分間攪拌する。精製方法Iに従って精製された、コドン最適化されていないF4Qを、リン酸/アルギニンバッファーpH6.8中で希釈した。この希釈液を2つの異なる濃度のアジュバントと混合して、290-300mMのアルギニン、50μgのMPLおよび50μgのQS21の存在下で、500μlのF4の40μg/用量の最終製剤を取得した。100μlの各製剤をマウスに注入した。マウスの免疫原性試験を実施して、F4内に認められる4つの抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を評価した。F4抗原の複雑性に起因して、それぞれ異なる遺伝的背景を有する8系統のマウスを、100μlの容量中、上記のように調製された8μgのアジュバント化されたF4タンパク質を用いて、0日目および21日目に2回免疫した。血清および脾臓サンプルを、F4の4つの成分の各々、ならびにF4に対する体液性および細胞性応答の分析のために、最後の免疫の14日後に回収した。総抗体応答を、p24、p17、RT、NefおよびF4にとって特異的なELISAにより特性評価した。以下の表2は、抗原特異的体液性応答が各系統において観察された場合をまとめたものである。この結果は、アジュバントのみで免疫された対照動物と比較した抗体の存在または不在を示す。示した結果は、2回の別々であるが同一の実験からのまとめである。表中、2Aは水中油型乳濁液中で3D-MPLおよびQS21を用いて製剤化された抗原を指し、1Bは3D-MPL、QS21およびコレステロールを含むリポソームを用いて製剤化された抗原を指す。OF1マウスでは4つ全てのF4成分に対する抗体応答を増加していた。観察された応答を図19に示す。/-は、観察された応答が弱いか、または2つのアジュバントの1つについてのみ観察されたことを示す。例えば、B6D2F1マウスのp17応答:全体として/-であり、2Aおよび-1Bとは、2Aについての応答が存在し、1Bについての応答が存在しないことを意味する。Balb/cマウスのp17応答:全体としては-であり、/-2Aおよび-1Bとは、この場合/-はアジュバント2Aについての応答が弱かったことを意味する。細胞性応答を、11merの重複を有する15merのペプチドライブラリープールを用い、p24、p17、RTまたはNefに特異的なペプチドを用いた脾臓細胞の再刺激後に、CD4およびCD8、IFNγおよびIL-2発現についてのフローサイトメトリー染色により特性評価した。CD4応答は主要な細胞応答であることが観察された。以下の表3は、抗原特異的CD4IL-2応答が各マウス系統について観察された場合をまとめたものである。ここでも、これは応答の存在または不在として示されるものである。DBAマウスでは4つ全てのF4成分に対するCD4応答を増加していた。このマウス系統について観察されたCD4IL-2およびCD4IFNγ応答を、図20に示す。まとめると、2つのアジュバント製剤のいずれかにおいて製剤化されたF4は、p24、p17、RTおよびNefに対する体液性および細胞性応答を促進することができる。これは、F4の各領域がinvivo状況において免疫原性であることを示す。"