"a配列番号2、4、および6に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、b0.1×SSC、0.1SDSで65°Cの洗浄条件でaとハイブリダイズする単離された核酸分子、またはaまたはbと相補的な単離された核酸分子よりなる群から選択される、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。配列番号1、配列番号3、および配列番号5よりなる群から選択される請求項1に記載の単離された核酸分子。請求項1に記載の単離された核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。配列番号2に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス-ウォーターマンのアライメント法に基づいて少なくとも75の同一性を有する、少なくともアミノ酸249個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第1のヌクレオチド配列または第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。配列番号4に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス-ウォーターマンのアライメント法に基づいて少なくとも75の同一性を有する、少なくともアミノ酸260個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子、または第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列。配列番号6に記載の配列を有するポリペプチドと比較すると、スミス-ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも75の同一性を有する、少なくともアミノ酸260個のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子、または第1のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第2のヌクレオチド配列。適切な調節配列に作動的に結合した、請求項1、2、5、または6のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。請求項7に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項8に記載の形質転換宿主細胞。宿主細胞が、アスペルギルスAspergillus、トリコデルマTrichoderma、サッカロミセスSaccharomyces、ピチアPichia、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenula、またはサルモネラSalmonella、バシラスBacillus、アシネトバクターAcinetobacter、ザイモモナスZymomonas、アグロバクテリウムAgrobacterium、エリスロバクターErythrobacter、クロロビウムChlorobium、クロマチウムChromatium、フラボバクテリウムFlavobacterium、サイトファーガCytophaga、ロドバクターRhodobacter、ロドコッカスRhodococcus、ストレプトマイセスStreptomyces、ブレビバクテリウムBrevibacterium、コリネバクテリアCorynebacteria、マイコバクテリウムMycobacterium、デイノコッカスDeinococcus、エシェリヒアEscherichia、エルウィニアErwinia、パントエアPantoea、シュードモナスPseudomonas、スフィンゴモナスSphingomonas、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、メチロジーナスMethylosinus、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロシスティスMethylocystis、アルカリゲネスAlcaligenes、シネコシスティスSynechocystis、シネココッカスSynechococcus、アナベナAnabaena、チオバシラスThiobacillus、メタノバクテリウムMethanobacterium、クレブシエラKlebsiella、およびミクソコッカスMyxococcusよりなる群から選択される、請求項9に記載の形質転換宿主細胞。宿主細胞がC1代謝性細菌である、請求項9の形質転換宿主細胞。宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシスArabidopsis、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項9の形質転換宿主細胞。aゲノムライブラリーを請求項1、2、4、5または6のいずれか一項に記載の核酸分子でプローブし、b0.1×SSC、0.1SDSで65°Cの洗浄条件で、請求項1、2、4、5または6のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするDNAクローンを同定し、そしてcステップbで同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定する、ことを含んでなり、配列決定されたゲノム断片がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。ステップaの核酸分子が、配列番号2、配列番号4、および配列番号6よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項13に記載の方法。a配列番号1、配列番号3、および配列番号5よりなる群から選択される配列の一部分に対応する、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そしてbステップaのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅する、ことを含んでなり、増幅された挿入物がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。請求項14または15に記載の方法の生成物。a環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、baの宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項1、2、4、5または6のいずれか一項に記載の遺伝子で形質転換し、そしてcbの形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる、ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成方法。カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号2、配列番号4、および配列番号6よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項17に記載の方法。環状ケトカロテノイド化合物が、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、4-ケト-γ-カロテン、4-ケト-ルビキサンチン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、デオキシフレキシキサンチン、ミキソバクトンよりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。環状カロテノイドが、β-カロテン、γ-カロテン、ゼアキサンチン、β-クリプトザンチン、アドニキサンチン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、ルビキサンチン、エキネノンおよびトルレンよりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。形質転換された宿主が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。形質転換宿主細胞が、アスペルギルスAspergillus、トリコデルマTrichoderma、サッカロミセスSaccharomyces、ピチアPichia、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenula、またはサルモネラSalmonella、バシラスBacillus、アシネトバクターAcinetobacter、ザイモモナスZymomonas、アグロバクテリウムAgrobacterium、エリスロバクターErythrobacter、クロロビウムChlorobium、クロマチウムChromatium、フラボバクテリウムFlavobacterium、サイトファーガCytophaga、ロドバクターRhodobacter、ロドコッカスRhodococcus、ストレプトマイセスStreptomyces、ブレビバクテリウムBrevibacterium、コリネバクテリアCorynebacteria、マイコバクテリウムMycobacterium、デイノコッカスDeinococcus、エシェリヒアEscherichia、エルウィニアErwinia、パントエアPantoea、シュードモナスPseudomonas、スフィンゴモナスSphingomonas、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、メチロジーナスMethylosinus、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロシスティスMethylocystis、アルカリゲネスAlcaligenes、シネコシスティスSynechocystis、シネココッカスSynechococcus、アナベナAnabaena、チオバシラスThiobacillus、メタノバクテリウムMethanobacterium、クレブシエラKlebsiella、およびミクソコッカスMyxococcusよりなる群から選択される、請求項21に記載の方法。形質転換宿主細胞がC1代謝性細菌である、請求項21に記載の方法。形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシスArabidopsis、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される、請求項21に記載の方法。a適切な調節配列の制御下にある請求項1、2、4、5または6のいずれか一項に記載のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞中に導入し、そしてbaの宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイド生合成が制御される条件下で生育させる、ことを含んでなる、生物において環状ケトカロテノイド生合成を制御する方法。カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号2、配列番号4、および配列番号6よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項25に記載の方法。カロテノイドケトラーゼ遺伝子がアップレギュレートされる、請求項25に記載の方法。前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子がマルチコピープラスミド上に過剰発現する、請求項27に記載の方法。前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が誘導可能プロモーターまたは調節プロモーターに作動的に結合する、請求項27に記載の方法。カロテノイドケトラーゼ遺伝子がダウンレギュレートされる、請求項25に記載の方法。前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子がアンチセンス方向で発現する、請求項30に記載の方法。前記遺伝子がコード領域への外来性DNAの挿入によって中断される、請求項30に記載の方法。ai天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子、ii前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチド断片の第1の集団、iii前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチド断片の第2の集団を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、制限酵素断片の混合物が生成され、b前記制限酵素断片の混合物を変性させ、cステップbの変性させた前記制限酵素断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、dステップbおよびcを反復して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子が生成される、ことを含んでなる方法によって生成される、改変された生物学的活性を有するカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする変異遺伝子。a環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、baの宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項1、2、4、5または6のいずれか一項に記載の遺伝子から選択される第1の遺伝子で形質転換し、caの宿主細胞を前記第1の遺伝子と比較すると65未満の核酸配列同一性を有し、CrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第2の遺伝子で形質転換し、そしてd前記aの第1の遺伝子および前記bの第2の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第1の遺伝子または前記第2の遺伝子のみを発現する形質転換宿主細胞に比べて環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、ことを含んでなる環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法。宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される請求項34に記載の方法。形質転換宿主細胞が、アスペルギルスAspergillus、トリコデルマTrichoderma、サッカロミセスSaccharomyces、ピチアPichia、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenula、またはサルモネラSalmonella、バシラスBacillus、アシネトバクターAcinetobacter、ザイモモナスZymomonas、アグロバクテリウムAgrobacterium、エリスロバクターErythrobacter、クロロビウムChlorobium、クロマチウムChromatium、フラボバクテリウムFlavobacterium、サイトファーガCytophaga、ロドバクターRhodobacter、ロドコッカスRhodococcus、ストレプトマイセスStreptomyces、ブレビバクテリウムBrevibacterium、コリネバクテリアCorynebacteria、マイコバクテリウムMycobacterium、デイノコッカスDeinococcus、エシェリヒアEscherichia、エルウィニアErwinia、パントエアPantoea、シュードモナスPseudomonas、スフィンゴモナスSphingomonas、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、メチロジーナスMethylosinus、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロシスティスMethylocystis、アルカリゲネスAlcaligenes、シネコシスティスSynechocystis、シネココッカスSynechococcus、アナベナAnabaena、チオバシラスThiobacillus、メタノバクテリウムMethanobacterium、クレブシエラKlebsiella、およびミクソコッカスMyxococcusよりなる群から選択される、請求項35に記載の方法。形質転換宿主細胞が、スピルリナSpirulina、ヘマトコッカスHaematococcus、およびデュナリエラDunaliellaよりなる群から選択される、請求項35に記載の方法。形質転換宿主細胞が、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシスArabidopsis、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および牧草よりなる群から選択される請求項35に記載の方法。したがって解決すべき問題は、ケトカロテノイドすなわちカンタキサンチンおよびアスタキサンチンの工学生成のために有用な新しいcrtWケトラーゼ遺伝子を同定し、単離することである。本発明は、組換え宿主細胞中におけるケトカロテノイド生成に有用な3つの新しいcrtW遺伝子を提供することによって、既述の問題を解決した。本CrtWケトラーゼを使用してケトカロテノイドを生成する方法もまた、提供される。本発明は、環状カロテノイドから環状ケトカロテノイドへの転換ができる新しいカロテノイドケトラーゼ酵素に関する。よって本発明は、a配列番号2、4、6に記載のアミノ酸をコードする単離された核酸分子、b0.1×SSC、0.1SDSで65°Cの洗浄条件でaとハイブリダイズする単離された核酸分子、またはaまたはbと相補的な単離された核酸分子よりなる群から選択されるカロテノイドケトラーゼ酵素コードする単離された核酸分子を提供する。同様に本発明は、適切な調節配列に作動的に結合した単離された核酸分子、本発明の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド、および同物質を含んでなる形質転換された生成宿主細胞を含んでなる遺伝的キメラを提供する。本発明は、プライマー誘導増幅またはハイブリダイゼーション法のどちらかによって、本発明の核酸分子を得る方法をさらに提供する。別の実施態様では、本発明は、a環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、baの宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の遺伝子で形質転換し、そしてcbの形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが生成する条件下で生育させる、ことを含んでなる、環状ケトカロテノイド化合物の生成方法を提供する。同様に本発明は、a適切な調節配列の制御下にある本発明のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入し、baの宿主細胞をカロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイドの生合成が制御される条件下で生育させる、ことを含んでなる、生物において環状ケトカロテノイド生合成を制御する方法を提供する。代案の実施態様では、本発明は、a環状カロテノイドを生成する宿主細胞を提供し、baの宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする本発明の第1の遺伝子で形質転換し、caの宿主細胞をCrtWカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第2の遺伝子で形質転換し、そしてd前記aの第1の遺伝子および前記bの第2の遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞を前記第1の遺伝子または前記第2の遺伝子いずれかのみを発現する形質転換宿主細胞に比べて、環状ケトカロテノイドの生成が増大する条件下で生育させる、ことを含んでなり、前記第2の遺伝子が前記第1の遺伝子と比べると65未満の核酸配列同一性を有する、環状ケトカロテノイド化合物の生成を増大させる方法を提供する。ai天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子、ii前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチド断片の第1の集団、iii前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチド断片の第2の集団を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、制限酵素断片の混合物が生成され、b前記制限酵素断片の混合物を変性させ、cステップbの変性した前記制限酵素断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、dステップbおよびcを反復して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子が生成される、ことを含んでなる方法によって生成される、本発明の変異遺伝子もまた提供される。本crtW遺伝子およびそれらの発現生成物であるカロテノイドケトラーゼは、環状ケトカロテノイド化合物を生成する能力を有する組換え生物を作り出す上で有用である。CrtWケトラーゼをコードする核酸断片は、スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18、ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263、およびフラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202Cをはじめとするいくつかの細菌株から単離されている。単離された核酸断片は、当業者によく知られているBLASTおよびFASTAアルゴリズムを使用して、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公開データベースと比較することで同定され、特性決定された。本crtWケトラーゼ遺伝子は、操作されて適切な基質すなわちβ-カロテンを生成する遺伝子導入微生物宿主中で発現される。遺伝子の機能的発現は、異種の宿主中でのケトカロテノイド例えばカンタキサンチンおよびアスタキサンチンの生成によって測定された。さらに遺伝子導入宿主内のケトカロテノイド生成に対する多岐にわたるケトラーゼ同時発現の効果は、ケトカロテノイド生成の相対変化を測定することで特性決定された。本発明の遺伝子および遺伝子産物は、環状ケトカロテノイド化合物の生成または制御のために多様なやり方で使用してもよい。本crtWケトラーゼ遺伝子は、適切な基質を生成する能力を有する異種の宿主中におけるケトカロテノイド生成のために使用できる。さらにケトカロテノイドの最適化された生成のために、異種の宿主中で2つの以上の本crtWケトラーゼ遺伝子が同時に発現されてもよい。本crtW遺伝子の同時発現は、その他の既知のCrtWケトラーゼに対するそれらの比較的低~中程度のヌクレオチド配列相同性のために、可能である。比較的低/中程度の相同性は、最適のケトカロテノイド生成のための組換え宿主細胞中における複数のCrtWケトラーゼの安定した発現を可能にする。ここで述べる遺伝子および遺伝子配列は、ケトカロテノイドの生成を工業的に適切な宿主細胞に直接組み込むことを可能にする。この側面によって、その中にこれらの遺伝子が組み込まれたあらゆる組換え宿主は、より望ましい生成宿主になる。生成したケトカロテノイドは、動物飼料をはじめとする多様な用途で使用するために、生成宿主から単離できる。望ましい着色と健康上の利点を追加することが知られているカロテノイドの存在のために、任意に組換え宿主細胞細胞全体、均質化、または自己融解細胞を動物飼料に直接に組み込むことができるカロテノイド単離ステップなし。サケとエビの水産養殖は、カロテノイド着色がこれらの生物の価値にとって決定的に重要であるので、本発明の特に有用な用途であるF.シャヒディShahidi、J.A.ブラウンBrown、海産食品および水産養殖におけるカロテノイド顔料Carotenoidpigmentsinseafoodandaquaculture、CriticalReviewsinFoodScience、381:1~671998。さらにケトカロテノイドアスタキサンチンは、強力な抗酸化剤であることが知られており、ヒトにおいて免疫機能を高め発ガンを低下させることが報告されているジョウノウチJyonouchiら、Nutr.Cancer、23:171~1831995;タナカTanakaら、CancerRes.、55:4059~40641995。本開示中では、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。ここでの用法では含んでなるという用語は、特許請求の範囲で言及される既述された徴群、整数、ステップ、または構成要素の存在を意味するが、1つ以上のその他の徴群、整数、ステップ、構成要素またはそれらの群の存在または添加を除外しない。読み取り枠はORFと略記される。ポリメラーゼ連鎖反応はPCRと略記される。ここでの用法では、単離された核酸断片または単離された核酸分子という用語は同義的に使用され、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるRNAまたはDNAのポリマーを指す。DNAポリマーの形態の単離された核酸断片は、1個またはそれ以上のcDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAの断片を含んでなっても良い。pBHR-crt1という用語は、β-カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドはパントエアスティワルティPantoeastewartiiATCC8199からのcrtEXYIBカロテノイド遺伝子クラスターをpBHR1中にクローンして構築されたドイツ国ゲッティンゲンのモビテックMoBioTechGoettingen,Germany、および参照によってここに援用する米国特許出願第09/941947号明細書。得られるプラスミドは、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下で発現されるP.スティワルティstewartii遺伝子クラスターを含有した。pDCQ329という用語は、β-カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、腸内細菌科EnterobactericeaeDC260からのcrtEXYIBカロテノイド遺伝子クラスターをpBHR1米国特許出願第10/808979号明細書中にクローンして構築された。pDCQ330という用語は、β-カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、パントエアアグロメランスPantoeaagglomeransDC404からのcrtEidiYIBカロテノイド遺伝子クラスターを広域宿主範囲ベクターpBHR1中にクローンして構築された。pCDQ335という用語は、pDCQ330からのβ-カロテン合成遺伝子クラスターおよびアグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumcrtZW遺伝子を含んでなるプラスミドを指す。プラスミドpDCQ335は、crtZWEidiYIB遺伝子をクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下にあるオペロン中に含有する。得られるプラスミドを適切な異種の宿主中に形質転換すると、アスタキサンチンが生成できる図1。pDCQ335TAという用語は、pTrcHis2-TOPO発現ベクター中にクローンされたアグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumcrtWZ遺伝子を含んでなるプラスミドを指すカリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェンInvitrogenCarlsbad,CA。pDCQ340という用語は、β-カロテン生成プラスミドを指す。プラスミドは、広域宿主範囲ベクターpBHR1中にクローンされた腸内細菌科EnterobactericeaeDC260からのcrtEYIB遺伝子を含有する。pDCQ341TAという用語は、pTrcHis2-TOPOベクター中にクローンされたスフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18からのcrtW遺伝子を発現するプラスミドを指すインビトロジェンInvitrogen。pDCQ342TAという用語は、pTrcHis2-TOPOベクター中にクローンされたブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263からのcrtW遺伝子を発現するプラスミドを指すインビトロジェンInvitrogen。pDCQ339TAという用語は、pTrcHis2-TOPOベクター中にクローンされたフラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202CからのcrtW遺伝子を発現するプラスミドを指すインビトロジェンInvitrogen。化合物について言及されるイソプレノイドまたはテルペノイドという用語は、カロテノイドおよびキサントフィルなどの炭素10個のテルペノイドおよびそれらの誘導体をはじめとする、イソプレノイド経路から誘導されるあらゆる分子である。カロテノイドという用語は、炭素5個のイソプレン単位から縮合したポリエン主鎖から構成される化合物を指す、カロテノイドは、非環状であることができ、または1個単環式または2個二環式の環状末端基で終結することができる。カロテノイドという用語は、カロテンおよびキサントフィルの双方を含んでも良い。カロテンとは、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ-、メトキシ-、オキソ-、エポキシ-、カルボキシ-、またはアルデヒド官能基の形態で、あるいはグリコシド、グリコシドエステル、またはスルフェート内に1つ以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、まとめてキサントフィルとして知られている。本発明で特に適切なカロテノイドは単環式および二環式カロテノイドである。カロテノイド生合成経路という用語は、上流イソプレノイド経路、および/または下流カロテノイド生合成経路の構成要素を構成する遺伝子を指す。上流イソプレノイド経路および上流経路という用語は区別なく使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド-3-リン酸からファルネシルピロリン酸FPPへの転換に関与する酵素を指す。これらの酵素をコードする遺伝子としては、dxs遺伝子1-デオキシキシルロース-5-リン酸シンターゼをコードする、dxr遺伝子1-デオキシキシルロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼをコードする、ispCとしても知られている、ispD遺伝子2C-メチル-D-エリスリトールシチジル転移酵素をコードする、ygbPとしても知られている、ispE遺伝子4-ジホスホシチジル-2-C-メチルエリスリトールキナーゼをコードする、ychBとしても知られている、ispF遺伝子2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸シンターゼをコードする、ygbBとしても知られている、pyrG遺伝子CTPシンターゼをコードする、ispFとしても知られている、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与するlytB遺伝子ispHとしても知られている、2-C-メチル-D-エリスリトール4-リン酸の合成に関与するgcpE遺伝子ispGとしても知られている、idi遺伝子IPPからジメチルアリルピロリン酸への分子内転換に関与する、およびイソプレノイド経路中のispA遺伝子ゲラニル転移酵素またはファルネシル二リン酸シンターゼをコードするが挙げられるが、これに限定されるものではない。用語下流カロテノイド生合成経路および下流経路は区別なく使用され、FPPを一連のカロテノイドに転換する酵素を指す。これらとしては合成がC30カロテノイド生合成にユニークな第1のステップを代表するジアポフィトエン、または合成がC40カロテノイド生合成にユニークな第1のステップを代表するフィトエンのいずれかの合成に関与する、遺伝子および遺伝子産物が挙げられる。様々なC30~C40カロテノイド生成をもたらす全ての引き続く反応は、下流カロテノイド生合成経路に含まれる。これらの遺伝子および遺伝子産物には、crtM、crtN、crtN2、crtE、crtX、crtY、crtI、crtB、crtZ、crtW、crtO、crtR、crtA、crtC、crtD、crtF、およびcrtUをはじめとするが、これに限定されるものではないcrt遺伝子の全てが含まれる。最後に下流カロテノイド生合成酵素という用語は、CrtM、CrtN、CrtN2、CrtE、CrtX、CrtY、CrtI、CrtB、CrtZ、CrtW、CrtO、CrtR、CrtA、CrtC、CrtD、CrtF、およびCrtUをはじめとするが、これに限定されるものではない、下流経路中の酵素の全部または一部を指す包括的用語である。C30ジアポカロテノイドは、2個の中央メチル基が1,6-位の関係にあり、残りの非末端メチル基が1,5-位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合する6個のイソプレノイド単位からなる。全てのC30カロテノイドは、i水素付加、ii脱水素化、iii環化、iv酸化、vエステル化/グリコシル化、またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせによって、接合二重結合の長い中央鎖を有する非環状C30H42構造から形式的に誘導されても良い。テトラテルペンまたはC40カロテノイドは、2個の中央メチル基が1,6-位の関係にあり、残りの非末端メチル基が1,5-位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合した8個のイソプレノイド単位からなる。全てのC40カロテノイドは、非環状C40H56構造から形式的に誘導されても良い。C40カロテノイドの制限を意図しない例としては、フィトエン、リコペン、β-カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびカンタキサンチンが挙げられる。CrtEという用語は、crtE遺伝子によってコードされ、トランス-トランス-ファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸をピロリン酸とラニルゲラニル二リン酸に転換する、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼを指す。Idiという用語は、idi遺伝子によってコードされるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼE.C.5.3.3.2を指す。CrtYという用語は、crtY遺伝子によってコードされ、リコペンをβ-カロテンに転換するリコペン環化酵素を指す。CrtIという用語は、crtI遺伝子によってコードされるフィトエン不飽和化酵素を指す。CrtIは4個の二重結合の導入により、フィトフルエン、ζ-カロテン、およびニューロスポレンの中間物を通じて、フィトエンをリコペンに転換する。CrtBという用語は、プレフィトエン二リン酸からフィトエンへの反応を触媒するcrtB遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼを指す。CrtZという用語は、β-カロテンからゼアキサンチンへの水酸化反応を触媒するcrtZ遺伝子によってコードされる、β-カロテン水酸化酵素を指す。CrtWという用語は、環状カロテノイドのイオノン環上にケト基が導入される酸化反応を触媒するcrtW遺伝子によってコードされる、β-カロテンケトラーゼ酵素を指す。CrtWケトラーゼは、典型的に基質融通性を示すことが知られている。カロテノイドケトラーゼまたはケトラーゼという用語は、ケト基を環状カロテノイドのイオノン環に付加できる酵素群を指す。CrtXという用語は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン-β-ジグルコシドに転換し、crtX遺伝子によってコードされるゼアキサンチングルコシル転移酵素を指す。ケト基またはケトン基という用語は区別なく使用されて、その中でカルボニル基が2つの炭素原子に結合する群を指す:R2C=OどちらがもRがHでなくてもよい。ケトカロテノイドという用語は、環状カロテノイドのイオノン環上に少なくとも1つのケト基有するカロテノイドを指す。ケトカロテノイドの例としては、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンが挙げられるが、これに限定されるものではない。ここでの用法では、実質的に類似したとは、1個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、1個またはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、DNA配列によってコードされるタンパク質の官能特性に影響しない核酸断片を指す。実質的に類似したとは、1個またはそれ以上ヌクレオチド塩基の変化が、アンチセンスまたはコサプレッション技術によって、遺伝子発現の変更を媒介する核酸断片の能力に影響しない核酸断片も指す。実質的に類似したとは、得られる転写物の官能特性実質的に影響しない、1個またはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって本発明は特定の例示的な配列以上のものを包含するものと理解される。例えば特定部位で化学的に等価のアミノ酸の生産をもたらすが、コードされるタンパクの機能特性に影響しない遺伝子の変化が一般的であることは、技術分野で周知である。本発明の目的では、置換は以下の5つの群中の1つの交換として定義される。1.小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、ThrPro、Gly、2.極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln、3.極性、正に帯電した残基:His、Arg、Lys、4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、ValCys、および5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンは、別のより疎水性が低い残基グリシンなどまたは疎水性がより高い残基バリン、ロイシン、またはイソロイシンなどをコードするコドンによって置換されても良い。同様に、1つの負に帯電した残基を別のものにするグルタミン酸からアスパラギン酸など、または1つの正に帯電した残基を別のものにするアルギニンからリジンになど置換をもたらす変化も機能的に等しい生成物を生じることが期待できる。多くの場合、タンパク分子のN-末端およびC-末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もタンパク活性を変更させるとは考えられない。それぞれの提案される変更は、十分に技術分野のルーチン技術の範囲内であり、コードされる生成物の生物学的活性保持の判定も同様である。さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した配列が、ストリンジェントな条件0.1×SSC、0.1SDSで65°C、および2×SSC、0.1SDSで洗浄後、0.1×SSC、0.1SDS下で、ここで例証する配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。一実施態様では、本発明の実質的に類似した核酸断片は、そのDNA配列が、ここで報告する核酸断片のDNA配列と少なくとも約80同一の核酸断片である。さらに別の実施態様では、実質的に類似した核酸断片は、ここで報告する核酸断片のDNA配列と少なくとも約90同一である。なおさらに別の実施態様では、実質的に類似した核酸断片は、ここで報告する核酸断片のDNA配列に少なくとも約95同一である。核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子とハイブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルックSambrook、J.、フリッチュFritsch、E.F.およびマニアティスManiatis、T.分子クローン化:実験室マニュアルMolecularCloning:ALaboratoryManual、第二版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor,1989以下マニアティスManiatisの特に第11章およびその表11.1で例証される。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを定める。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的配列などの中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして機能性酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。一実施態様では、ストリンジェンシー条件は、室温において6×SSC、0.5SDSで約15分間に始まり、次に約45°Cにおいて2×SSC、0.5SDSで約30分間を反復し、次に約50°Cにおいて0.2×SSC、0.5SDSを約30分間を2回反復する、一連の洗浄を使用する。別の実施態様では、ストリンジェンシー条件はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の0.2×SSC、0.5SDS中での2回の30分間の洗浄の温度を約60°Cに増大させること以外は上述したのと同一である。さらに別の実施態様では、高度にストリンジェントな条件は、0.1×SSC、約65°Cでの0.1SDS中での2回の最終洗浄を使用する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのTm値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性より高いTmに対応するは、次の順で低下する。RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Tmを計算する式が導かれているサムブルックSambrookら、前述9.50~9.51参照。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定するサムブルックSambrookら、前述11.7~11.8参照。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約10個である。別の実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくともヌクレオチド約15個、さらに別の実施態様では少なくともヌクレオチド約20個、そしてさらにまた別の実施態様では長さが少なくともヌクレオチド約30個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。アミノ酸またはヌクレオチド配列のかなりの部分は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはBLAST基礎的局在性整列化検索ツールBasicLocalAlignmentSearchTool、アルトシュルAltschulS.F.ら、1993J.Mol.Biol.215:403~410などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して10個以上の隣接するアミノ酸または30個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、約20~30個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法例えばサザンハイブリダイゼーションおよび単離例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置insituハイブリダイゼーションにおいて使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基約12~15個の短いオリゴヌクレオチドをPCRで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列のかなりの部分は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および/または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、1つまたはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に知られている目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。相補的と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばDNAについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的である単離された核酸断片も含む。技術分野で既知のパーセント同一性と言う用語は、配列を比較して判定される2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野において同一性は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性および類似性は、計算分子生物学ComputationalMolecularBiologyレスクLeskA.M.編、OxfordUniversityPress、NY1988、バイオコンピューティング:情報科学およびゲノムプロジェクトBiocomputing:InformaticsandGenomeProjectsスミスSmithD.W.編、AcademicPress、NY1993、配列データのコンピュータ分析ComputerAnalysisofSequenceData、第一部、グリフィンGriffinA.M.、およびグリフィンGriffinH.G.編、HumanaPress、NJ1994、分子生物学における配列分析SequenceAnalysisinMolecularBiologyフォンハインェvonHeinjeG.編、AcademicPress1987、配列分析入門SequenceAnalysisPrimerグリブスコフGribskovM.およびデュヴルーDevereuxJ.編、StocktonPress、NY1991で述べられたものをはじめとするがこれに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。一実施態様では、同一性を判定するために使用される方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合およびパーセント同一性の計算は、ウィスコンシンマディソンのDNASTARDNASTARInc.Madison、WIからのLASERGENEバイオインフォマティクス計算スイートのMegalignプログラムを使用して実施しても良い。Clustal整合法ヒギンズHigginsおよびシャープSharp、CABIOS.5:151~1531989を使用して、デフォルトのパラメータGAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=10で、配列の複数の整合を実施できる。Clustal法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、KTUPLE1、GAPPENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALSSAVED=5であった。適切な核酸断片本発明の単離ポリヌクレオチドは、少なくとも約75同一のポリペプチドをコードする。一実施態様では、適切な核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約85同一である。さらに別の実施態様では、核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約90同一のアミノ酸配列をコードする。さらにまた別の実施態様では、核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約95同一のアミノ酸配列をコードする。なおさらに別の実施態様では、適切な核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約99同一のアミノ酸配列をコードする。本発明の適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも約240個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。本発明では、多岐にわたる遺伝子、多岐にわたるケトラーゼ、および多岐にわたる配列という用語は区別なく使用されて、CrtWケトラーゼ間の核酸断片配列の同一性の欠如を指す。2つ以上のcrtW遺伝子間のヌクレオチド配列比較によって、配列同一性の相対程度についての関連性の分類が可能になる。高度に相同的な遺伝子の同時発現は、遺伝的不安定性をもたらすすなわち相同的遺伝子組換え率が増大する傾向がある。中程度にまたは高度に多岐にわたる遺伝子の発現は、遺伝的安定性をもたらす可能性が高い。ここでの用法では遺伝的安定性または遺伝的に安定したは、本カロテノイドケトラーゼ遺伝子と核酸配列同一性が75未満、好ましくは核酸配列同一性が65未満のコード配列を有する複数のカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現について述べるために使用される。これは遺伝的に安定した形質転換体中でケトカロテノイド生成を増大させるために、2個以上のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を染色体性に組み込む場合に、特に重要である。一実施態様では、同時発現のために有用なcrtWケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が75未満のものである。別の実施態様では、同時発現のために使用されるcrtWケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約65未満のものである。さらに別の実施態様では、同時発現のために使用されるcrtWケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約55未満のものである。なおさらに別の実施態様では、同時発現のために使用されるcrtWケトラーゼ遺伝子は、配列アライメントによって比較すると、同一性が約45未満のものである。コドン縮重とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード中の性質を指す。したがって本発明は、配列番号2、4、および6で示される本微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示されるコドンバイアスを十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。合成遺伝子は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成しても良い。DNA配列に関連して化学的に合成されたとは、構成要素ヌクレオチドが生体外でinvitroアセンブルされたことを意味する。DNAの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の1つを使用して自動化学合成を実施できる。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好まれるコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。遺伝子とは、コード配列に先行する調節配列5’非コード配列およびその後ろの調節配列3’非コード配列を含めた特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。天然遺伝子とは、それ自体の調節配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。キメラ遺伝子とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される調節配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された調節配列およびコード配列を含んでなっても良い。内在性遺伝子とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。外来性遺伝子とは、通常では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。導入遺伝子とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。コード配列とは、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。適切な調節配列とは、コード配列の上流5’非コード配列、配列内、または下流3’非コード配列に位置して、転写、RNAプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム-ループ構造を含んでも良い。プロモーターとは、コード配列または機能性RNAの発現を調節できるDNA配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して3’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成DNAセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に構築プロモーターと称される。ほとんどの場合、調節配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。3’非翻訳配列は、コード配列の下流に位置するDNA配列を指し、ポリアデニル化認識配列通常では真核細胞に限られるおよびmRNAプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆物質の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加通常では真核細胞に限られるに影響することで特徴づけられる。RNA転写物とは、DNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写から得られる生成物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるRNA配列であるかもしれず、成熟RNAと称される。メッセンジャーRNAmRNAとはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるRNAを指す。cDNAとは、mRNAに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖DNAを指す。センスRNAとは、mRNAを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるRNA転写物を指す。アンチセンスRNAとは、標的一次転写物またはmRNAの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするRNA転写物を指す米国特許第50,107,065号明細書、国際公開第99/28508号パンフレット。アンチセンスRNAの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち5’非コード配列、3’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。機能RNAとは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスRNA、リボザイムRNA、またはその他のRNAを指す。作動可能に連結したと言う用語は、1つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結するすなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結できる。発現と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンスmRNAまたはアンチセンスRNAの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。形質転換は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物ゲノム中への核酸断片の転移を指す。ここでの用法では宿主細胞ゲノムは、宿主細胞内の染色体または染色体外すなわちベクター遺伝子の双方を含む。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、遺伝子導入または組換えまたは形質転換生物と称される。接合とは、1つの細菌細胞すなわち供与体から別のすなわち受容体細菌細胞への一方向性のDNA転位例えば細菌プラスミドからのが起きる、特定のタイプの形質転換を意味する。プロセスは直接的な細胞と細胞の接触を伴う。炭素基質という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることができる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖、多糖類、および一炭素基質またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を指す。用語C1炭素基質は、炭素-炭素結合を欠くあらゆる炭素含有分子を指す。制限を意図しない例は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルマート、メチル化アミン例えばモノ-、ジ-、およびトリ-メチルアミン、メチル化チオール、および二酸化炭素である。一実施態様では、C1炭素基質はメタノールおよび/またはメタンである。C1代謝個体という用語は、その唯一のエネルギーおよび生物量源として、単一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。C1代謝個体は、典型的にメチロトローフおよび/またはメタノトローフである。C1代謝性細菌という用語は、それらの唯一のエネルギーおよび生物量源として単一炭素基質を使用する能力を有する細菌を指す。C1代謝個体のサブセットであるC1代謝性細菌は、典型的にメチロトローフおよび/またはメタノトローフである。一実施態様では、C1代謝個体はメチトローフであり、単一炭素基質はメタンおよび/またはメタノールよりなる群から選択される。別の実施態様では、C1代謝個体はメタノトローフであり、単一炭素基質はメタンおよび/またはメタノールよりなる群から選択される。メチロトローフという用語は、炭素-炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できる生物を意味する。メチロトローフがCH4を酸化できる場合、メチロトローフはメタノトローフでもある。メタノトローフまたはメタノトローフ細菌という用語は、その主要な炭素およびエネルギー源として、メタンを利用できる原核生物を意味する。メタンから二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解経路によって起きる。本発明で有用な典型的なメタノトローフの例としては、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、およびメチロジーナスMethylosinus属が挙げられるが、これに限定されるものではない。高生育メタノトローフ細菌株という用語は、メタンおよび/またはメタノールを唯一の炭素およびエネルギー源として生育でき、機能的エムデンマイヤーホフ炭素流束経路を有して、高い生育速度と、代謝されるC1基質のグラム当たりの高細胞量生成量とが得られる細菌を指す米国特許第6,689,601号明細書。ここで述べられる特定の高生育メタノトローフ細菌株は、メチロモナスMethylomonas16a、16aまたはメチロモナスMethylomonas種16aと称され、それらの用語は区別なく使用されて、本発明で使用されるメチロモナスMethylomonas株を指す。CrtN1という用語は、crtN1遺伝子によってコードされ、メチロモナスMethylomonas種16aの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、crtN2およびaldを含んでなるオペロン内に位置する。ALDという用語は、ald遺伝子によってコードされ、メチロモナスMethylomonas種16aの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、crtN1およびcrtN2を含んでなるオペロン内に位置する。CrtN2という用語は、crtN2遺伝子によってコードされ、メチロモナスMethylomonas種16aの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、crtN1およびaldを含んでなるオペロン内に位置する。CrtN3という用語は、crtN3遺伝子によってコードされ、メチロモナスMethylomonas種16aの天然カロテノイド生合成において活性である酵素を指す。この遺伝子はcrt遺伝子クラスター内に位置せず、代わりにこの遺伝子はメチロモナスMethylomonasゲノムの異なる位置に存在する。crtN1遺伝子クラスター、C30crt遺伝子クラスター、crt遺伝子クラスター、および内在性メチロモナスMethylomonascrt遺伝子クラスターという用語は、メチロモナスMethylomonas種16aの天然カロテノイド生合成経路内で活性であるcrtN1、ald、およびcrtN2遺伝子を含んでなるオペロンを指す。MWM1200ΔcrtクラスタープロモーターΔcrtN3という用語は、その中でC30crtクラスタープロモーターおよびcrtN3遺伝子が中断されているメチロモナスMethylomonas種16aの変異体を指す。天然C30カロテノイド生合成経路の中断は、C40カロテノイド生成を操作するための適切な背景をもたらす。メチロモナスMethylomonasMWM1200株が以前作り出されており、適切なカロテノイド生成宿主である米国特許出願第60/527083号明細書、参照によってここに援用する。無着色または白色変異体という用語は、その中で天然ピンク顔料例えばC30カロテノイドが生成されないメチロモナスMethylomonas種16a細菌を指す。したがって細菌細胞は、色がピンクとは対照的に白色であるように見える。プラスミド、ベクター、およびカセットという用語は、多くは細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を保有して、通常環状二本鎖DNA断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、その中でいくつかのヌクレオチド配列がユニークな構造に結合または組換えられた、あらゆる供給源から誘導される直線または環状の一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAであってもよい。形質転換カセットは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特定のベクターを指す。発現カセットは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主におけるその遺伝子の増強された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。配列分析ソフトウェアと言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、ウィスコンシン州マディソンのジェネティックコンピュータグループGCGGeneticsComputerGroupMadison,WIからのGCGパッケージプログラムウィスコンシンパッケージWisconsinPackageバージョン9.0、BLASTP、BLASTN、BLASTXアルシュールAltschulら著、J.Mol.Biol.215:403~4101990、およびウィスコンシン州53715マディソン、サウスパーク通り1228のDNASTARDNASTAR,Inc.1228S.ParkSt.Madison,WI53715USAからのDNASTAR、およびスミス-ウォーターマンアルゴリズムを組み入れたFASTAプログラムW.R.ピアースンPearson著、Comput.MethodsGenomeRes.[国際シンポジウム議事録]1994、1992年会議、111~20、編集者:スハイ,サンドルSuhai,Sandor、出版社:Plenum、NewYork,NYが挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムのデフォルト値に基づくものと理解される。ここでの用法では、デフォルト値とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、製造業者によって設定されるようなあらゆる値またはパラメータの組を意味する。本発明は、カロテノイドケトラーゼをコードする新たに発見されたcrtW遺伝子を提供する。本CrtWケトラーゼは、環状カロテノイド化合物からのケトカロテノイド生成のために、生体外invitroおよび/または生体内invivoで使用してもよい。スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18crtWヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公開データベースとの比較からは、スミス-ウォーターマンSmith-Watermanアライメントアルゴリズムを使用して、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸249個の長さにわたり約57同一であることが明らかにされたW.R.ピアソンPearson、Comput.MethodsGenomRes.、[国際シンポジウム議事録]1994、1992年会議、111~20、スハイ,サンドールSuhai,Sandor編、出版社:Plenum、NewYork,NY。ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263crtWヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公開データベースとの比較からは、スミス-ウォーターマンSmith-Watermanアライメントアルゴリズムを使用して、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸260個の長さにわたり約63同一であることが明らかにされた。フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202CcrtWヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と、公開データベースとの比較からは、スミス-ウォーターマンSmith-Watermanアライメントアルゴリズムを使用して、最も類似した既知の配列が、ここで報告されるアミノ酸配列とアミノ酸256個の長さにわたり約47同一であることが明らかにされた。一実施態様では、本発明は、ここでの配列と少なくとも約75~85同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約85~約95同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。さらに別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約95同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。さらにまた別の実施態様では、本発明は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約99同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片を含んでなる。同様に、適切な核酸断片は、ここで報告される核酸配列と少なくとも約80同一である、対応する活性CrtWケトラーゼをコードする核酸配列を含んでなるものである。一実施態様では、適切なcrtW核酸断片は、ここでの核酸配列と少なくとも約90同一の核酸配列を有するものである。別の実施態様では、適切なcrtW核酸断片は、ここでの核酸配列と少なくとも約95同一の核酸配列を有するものである。さらに別の実施態様では、適切なcrtW核酸断片は、ここで報告される核酸配列と少なくとも約99同一の核酸配列を有するものである。相同体の単離本発明の核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離しても良い。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。核酸ハイブリダイゼーション法、および様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるようなDNAおよびRNA増幅法例えばポリメラーゼ連鎖反応PCR、ミュリスMullisら、米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応LCR、タボールTaborS.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:10741985;または鎖置換増幅SDA、ウォーカーWalkerら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、89:3921992。例えば、本発明のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に良く知られている方法を使用して、本核酸断片の全部または一部をDNAハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の細菌からのライブラリーをスクリーニングして直接単離できる。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインして合成できるマニアティスManiatis。さらに利用できる生体外invitro転写システムを使用して、ランダムプライマーDNA標識、ニックトランスレーション、末端標識技術またはRNAプローブなどの当業者に知られている方法によって、配列全体を直接使用してDNAプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部または全長を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切な厳密さ条件下で完全長DNA断片を単離できる。典型的にPCRタイプ増幅技術ではプライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。PCRプライマーデザインの方法は一般的であり、技術分野で周知であるヒト遺伝病:実際的アプローチHumanGeneticDeseases:APracticalApproachK.E.デービスDavis編、からテインTheinおよびウォーレスWallace著、遺伝病における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders、1986、33~50ページ、IRLPress、Herndon、バージニアVirginia;リュクリックRychlikW.分子生物学的方法:PCRプロトコル:現行の方法と応用MethodsinMolecularBiology:PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications第15巻、31~39ページ、ホワイトWhite,B.A.編1993、HumaniaPress:Totowa,NJ。概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の2本の短い断片を使用して、DNAまたはRNAから相同的遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応は、1つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、別のプライマーの配列が真核生物遺伝子のmRNA前駆物質の3’末端のポリアデニル酸のトラクトの存在を利用する、クローン化された核酸断片のライブラリーにおいて実施しても良い。ポリアデニル化mRNAを欠く微生物遺伝子の場合、ランダムプライマーを使用してもよい。ランダムプライマーはまた、DNAからの増幅にも有用かもしれない。代案としては、第2のプライマー配列は、クローン化ベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、RACEプロトコルフローマンFrohmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:89981988に従って、PCRを使用して、転写物の一点と3’または5’末端との間の領域のコピーを増幅し、cDNAを作り出すことができる。3’および5’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。市販される3’RACEまたは5’RACE系BRLを使用して、特定の3’または5’cDNA断片を単離できるオハラOharaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:56731989;ローLohら、Science243:2171989。代案としては、相同体の同定のために、ハイブリダイゼーション形成試薬として本配列を用いても良い。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列とハイブリダイズ可能である。プローブの長さは、5個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約15個の塩基から約30個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的である必要がある。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。ハイブリダイゼーション法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感応性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にするヴァンネスVanNessおよびチェンChenNucl.AcidsRes.19:5143~51511991。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約3Mの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に30~50v/vで添加できる。様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約20~60、好ましくは30容積の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約30~50v/vのホルムアミド、約0.15~1Mの塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス-HCl、PIPESまたはHEPESなどの約0.05~0.1Mの緩衝液pH範囲約6~9、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約0.05~0.2の界面活性剤、または0.5~20mMのEDTA、ファーマシアPharmaciaInc.からのFICOLL約300~500キロダルトン、ポリビニルピロリドン約250~500kD、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約0.1~5mg/mLの未標識のキャリア核酸、仔ウシ胸腺またはサケ精子DNA、または酵母RNAなどの断片化核DNA、および場合により約0.5~2重量/容積のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールなどの多様な極性水溶性剤または膨潤剤をはじめとする容積排除剤、例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性糖ポリマーなどその他の添加剤を含めても良い。核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なものの1つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ-タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補的な固定核酸プローブを有する。本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、DNA発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本アミノ酸配列の一部を代表する合成ペプチドを合成しても良い。これらのペプチドを用して、動物を免疫し、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成できる。次にこれらの抗体を使用して、DNA発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長DNAクローンを単離するラーナーLernerR.A.、Adv.Immunol.36:11984、マニアティスManiatis、前出。カロテノイド生成に関与する遺伝子カロテノイドの生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド-3-リン酸からファルネシルピロリン酸FPPへの転換を提供する上流イソプレノイド経路、およびフィトエンの合成と、全ての引き続いて生成されるカロテノイドを提供する下流カロテノイド生合成経路の2つの部分に都合良く分けることができる。上流経路は多くの非カロテノイド産生性微生物に遍在性であり、これらの場合、所望のカロテノイド生合成のための下流経路を含んでなる遺伝子を導入することだけが必要である。2つの経路間の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸塩の合成に関わる。FPPが天然に存在する場合、下流カロテノイド経路の要素のみが必要である。しかしカロテノイド生成において下流経路カロテノイド遺伝子が効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのFPPを有することが必要なことが理解される。別の実施態様では、イソプレノイド生合成遺伝子を任意にアップレギュレートされて、利用できるカロテノイド生合成のFPPのレベルが増大されてもよい。FPP合成が宿主細胞によって提供されない場合、FPPの生成に必要な遺伝子を導入することが必要である。これらの各経路について下で詳細に述べる。上流イソプレノイド経路イソプレノイド生合成は、一般的なC5イソプレンサブユニットであるイソペンテニルピロリン酸塩IPPを生じる2つの経路のどちらかを通じて起きる。最初に良く知られている酢酸/メバロン酸経路を通じてIPPを合成しても良い。しかし最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物で作動しているわけではないことを実証している。IPP生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されているホルバックHorbachら、FEMSMicrobiol.Lett.111:135~1401993;ローマーRohmerら、Biochem.295:517~5241993;シュベンダーSchwenderら、Biochem.316:73~801996;およびアイゼンライヒEisenreichら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:6431~64361996。メバロン酸非依存イソプレノイド経路中の多くのステップが知られている。例えばIPPの生成をもたらす代案の経路の最初のステップは、コールColeらNature393:537~5441998によって結核菌Mycobacteriumtuberculosisにおいて研究されている。経路の第1のステップは、D-1-デオキシキシルロース-5-リン酸として知られている五炭素化合物を生じる、2つの三炭素分子ピルビン酸およびD-グリセルアルデヒド3-リン酸の縮合を伴う。この反応はdxs遺伝子によってコードされるDXS酵素によって起きる。次にD-1-デオキシキシルロース-5-リン酸の異性化および還元から、2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸が生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素の1つは、遺伝子dxrによってコードされるD-1-デオキシキシルロース-5-リン酸レダクトイソメラーゼDXRispCとしても知られているである。2-C-メチル-D-エリスリトール-4-リン酸を引き続いて、注釈なしの遺伝子ygbPでコードされる酵素によって、CTP-依存反応において4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールに転換する。しかし最近ygbP遺伝子は、isp遺伝子クラスターの一部としてispDと改名されたSwissProtein登録番号Q46893。次にychB遺伝子によってコードされる酵素によって、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールの第2位のヒドロキシ基をATP-依存反応においてリン酸化できる。YchBは4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトールをリン酸化して、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール2-リン酸が得られる。ychB遺伝子もまたisp遺伝子クラスターの一部としてispEと改名されたSwissProtein登録番号P24209。YchBはCTP-依存様式で、4-ジホスホシチジル-2C-メチル-D-エリスリトール2-リン酸を2C-メチル-D-エリスリトール2,4-シクロ二リン酸に転換する。この遺伝子もまた最近ispFSwissProtein登録番号P36663と改名されている。gcpEispGとしても知られているおよびlytBispHとしても知られているおよびおそらくはその他の遺伝子によってコードされる酵素はイソペンテニルピロリン酸IPPおよびジメチルアリルピロリン酸DMAPPの形成をもたらす反応に関与すると考えられる。IPPは、idi遺伝子によってコードされるIPPイソメラーゼを通じてDMAPPに異性化しても良い。しかしこの酵素は生存には必須ではなく、2-C-メチル-D-エリスリトール4-リン酸MEP経路を使用するいくつかの細菌では不在でも良い。最近の証拠はMEP経路がIPPの前に分岐して、lytB遺伝子産物を通じてIPPとDMAPPを別個に生成することを示唆する。lytBノックアウト変異は、IPPおよびDMAPPの双方を補った培地中以外では、大腸菌に対して致死性である。FPPの合成は、IPPのジメチルアリルピロリン酸への異性化を通じて起きる。この反応に、ispAによって触媒される2つのプレニル転移酵素反応手順が続き、ゲラニルピロリン酸GPP、炭素数10の分子およびファルネシルピロリン酸FPP、炭素数15の分子の生成をもたらす。上流経路の要素をコードする遺伝子は、表1に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。下流カロテノイド生合成経路上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、いくぶん主観的である。FPP合成はカロテン産生性および非カロテン産生性細菌の双方において一般的であるので、下流カロテノイド生合成経路中の第1のステップは、ファルネシルピロリン酸FPPをゲラニルゲラニルピロリン酸GGPPに転換する、プレニル転移酵素反応によって開始すると考えられる。GGPP合成酵素をコードする遺伝子crtEは、IPPをFPPに付加して炭素数20の分子であるGGPPを生成するこのプレニル転移酵素反応に関与する。2つのGGPP分子の縮合反応が起きて、下流カロテノイド生合成経路における第1の炭素数40の分子であるフィトエンPPPPが形成する。この酵素的反応は、フィトエンシンターゼをコードするcrtBによって触媒される。赤色のスペクトルを与えるリコペンは、遺伝子crtIフィトエンデサチュラーゼをコードするによって触媒される8個の水素原子の除去によって、4回の逐次脱水素化反応を通じてフィトエンから生成する。この反応の中間体は、フィトフルエン、ζ-カロテン、およびニューロスポレンである。リコペン環化酵素crtYリコペンをβ-カロテンに転換する。本発明では、遺伝的最終生成物としてβ-カロテンを生成するレポータープラスミドが使用される。しかし追加的遺伝子を使用して、多様なその他のカロテノイドを作り出してもよい。例えばβ-カロテンは、β-カロテン水酸化酵素crtZ遺伝子によってコードされるの活性がもたらす水酸化反応を通じて、ゼアキサンチンに転換される。β-クリプトキサンチンはこの反応の中間体である。β-カロテンは、crtWまたはcrtO遺伝子のどちらかによってコードされるβ-カロテンケトラーゼによって、カンタキサンチンに転換される。エキネノンはこの反応の中間体である。次にカンタキサンチンは、crtZまたはcrtR遺伝子によってコードされるβ-カロテン水酸化酵素によってアスタキサンチンに転換できる。アドンビルブリンはこの反応の中間体である。ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン-β-ジグルコシドに転換できる。この反応はゼアキサンチングルコシル転移酵素crtXによって触媒される。下流カロテノイド生合成経路の要素をコードする遺伝子は、表2に示すように多様な植物、動物、および細菌源から知られている。好ましい非crtWカロテノイド遺伝子供給源は、パントエアスティワルティPantoeastewartiiATCC8199;国際公開第02/079395号パンフレット、腸内細菌科EnterobactericeaeDC260米国特許出願第10/808979号明細書、およびパントエアアグロメランスPantoeaagglomeransDC404米国特許出願第10/808807号明細書である。好ましいcrtW遺伝子供給源は、スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18配列番号1、ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263配列番号3、およびフラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202C配列番号5である。宿主生物中で十分なFPP源が利用できれば、本発明の方法を使用して、表2に示す遺伝子と、本発明の好ましいcrtW遺伝子との様々な組み合わせを使用することで、多数の異なるカロテノイドおよびカロテノイド誘導体を作ることができる。例えば遺伝子クラスターcrtEXYIBは、β-カロテンの生成を可能にする。crtEXYIBへのcrtW遺伝子の添加は、カンタキサンチンの生成を可能にする。本発明の有用な生成物は、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、β-クリプトキサンチン、ケト-γ-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、およびC30-ケトカロテノイドをはじめとするが、これに限定されるものではない、ここで定義されるようなあらゆるケトカロテノイド化合物を含むことが想定された。組換え発現-微生物本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種の宿主細胞中、特に微生物宿主の細胞中で生成されてもよい。組換え微生物宿主中での発現は、様々な経路中間体の発現のため、宿主中に既存の経路の調節のため、またはこれまで宿主を使用して可能でなかった新しい生成の合成のために有用かもしれない。本遺伝子および核酸断片の発現のために好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、pH価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。例えばあらゆる細菌、酵母菌、および糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主であることが考察された。転写、翻訳およびタンパク質生合成器官は、それぞれの細胞供給原料に関係なく同一であるので、細胞バイオマスを生成するのに使用される炭素供給材料に関係なく、機能性遺伝子が発現される。大規模微生物生育させるおよび機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用しても良い。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育させる条件によって、制御され、阻止され、または抑圧されても良い。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されても良い。生育させる速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であっても良い。宿主株の例としては、アスペルギルスAspergillus、トリコデルマTrichoderma、サッカロミセスSaccharomyces、ピチアPichia、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenulaなどの細菌、真菌または酵母種、またはサルモネラSalmonella、バシラスBacillus、アシネトバクターAcinetobacter、ザイモモナスZymomonas、アグロバクテリウムAgrobacterium、エリスロバクターErythrobacter、クロロビウムChlorobium、クロマチウムChromatium、フラボバクテリウムFlavobacterium、サイトファーガCytophaga、ロドバクターRhodobacter、ロドコッカスRhodococcus、ストレプトマイセスStreptomyces、ブレビバクテリウムBrevibacterium、コリネバクテリアCorynebacteria、マイコバクテリウムMycobacterium、デイノコッカスDeinococcus、エシェリヒアEscherichia、エルウィニアErwinia、パントエアPantoea、シュードモナスPseudomonas、スフィンゴモナスSphingomonas、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、メチロジーナスMethylosinus、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロシスティスMethylocystis、アルカリゲネスAlcaligenes、シネコシスティスSynechocystis、シネココッカスSynechococcus、アナベナAnabaena、チオバシラスThiobacillus、メタノバクテリウムMethanobacterium、クレブシエラKlebsiella、およびミクソコッカスMyxococcusなどの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施態様では、適切な細菌宿主株として、エシェリヒアEscherichia、バシラスBacillus、およびメチロモナスMethylomonasが挙げられる。外来性タンパクの高レベル発現を導く調節配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者には周知である。本ケトラーゼの発現のために、これらのいずれでも使用してキメラ遺伝子を構築できる。次に形質転換を通じて、これらキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できる。したがって適切なプロモーター制御下にある本細菌酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、増大または改変された環状ケトカロテノイド生成を実証することが期待される。本遺伝子を天然宿主細胞、ならびに異種の宿主の双方において発現することが有用であることが考察された。本crtW遺伝子の天然宿主中への導入は、既存のケトカロテノイドの改変されたレベルの生成をもたらす。さらに本遺伝子はまた、既存のカロテノイド経路が操作されていてもよい非天然宿主細菌中に導入しても良い。本発明によって生成される具体的なケトカロテノイドとしては、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、4-ケト-γ-カロテン、4-ケト-ルビキサンチン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、デオキシフレキシキサンチン、およびミキソバクトンが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に関心が高いのは、その合成が図1で示されるアスタキサンチンおよびカンタキサンチンの生成である。本CrtW酵素のための特異的基質は、環状カロテノイドである。環状カロテノイドは技術分野でよく知られており、市販されている。本発明で好ましいのは、β-カロテン、γ-カロテン、ゼアキサンチン、β-クリプトキサンチン、3’-ヒドロキシエキネノン、ルビキサンチン、エキネノン、およびトルレンをはじめとするが、これに限定されるものではないCrtWケトラーゼ基質である。適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の5’領域、および転写終結を制御するDNA断片の3’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。所望の宿主細胞において本ORFの発現を駆動させるのに有用なイニシエーション調節領域、またはプロモーターは多数有り、当業者には良く知られている。実質的にこれらの遺伝子を駆動できる、以下をはじめとするが、これに限定されるものではないあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPIサッカロミセスSaccharomycesにおける発現に有用、AOX1ピチアPichiaにおける発現に有用、およびlac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、およびtrc大腸菌Escherichiacoliにおける発現に有用、ならびに例えばバシラスBacillusにおける発現に有用なamy、apr、nprプロモーター、および様々なファージプロモーター、およびメチロモナスMethylomonas米国特許出願第10/689200号明細書における発現に有用な、nrtA、glnB、moxF、glyoxII、htpG、およびhps遺伝子から単離されたプロモーター。さらにクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターなどのプロモーターもまた、メチロモナスMethylomonas中での発現において有用かもしれない。終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。場合により、終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。本遺伝子の配列の知識は、このような経路を有するあらゆる生物中で、特にメチロモナスMethylomonas種16aおよび大腸菌中でカロテノイド生合成経路を操作する上で有用である。遺伝的経路を操作する方法は一般的であり、技術分野でよく知られている。特定の経路中で選択された遺伝子は、種々の方法によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされてもよい。さらに競合経路生物は、遺伝子中断および類似した技術によって除外または昇華してもよい。ひとたび重要な遺伝的経路が同定および配列決定されると、特定の遺伝子をアップレギュレートして経路の産出量を増大できる。例えばpBR322などのマルチコピープラスミド上で、標的遺伝子の追加的コピーを宿主細胞に導入しても良い。代案としては、非天然プロモーターの調節の下におかれるように標的遺伝子を変性しても良い。経路が、細胞サイクル中または発酵生産中の特定点で作動することが所望される場合、制御されたまたは誘導性プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置き換えても良い。同様に場合によっては、天然または内在性プロモーターを変性させて、遺伝子発現を増大させても良い。例えば内在性プロモーターは、生体内でinvivo突然変異、欠失、および/または置換によって変性できるクミークKmiecの米国特許第5,565,350号明細書、ザーリングZarlingらのPCT/US93/03868号明細書を参照されたい。代案としては、標的経路、またはエネルギーまたは炭素の競合シンクとして役割を果たすかもしれない競合経路における特定の遺伝子の発現を低下させるまたは除外することが必要かもしれない。この目的で遺伝子をダウンレギュレートする方法が探求された。中断する遺伝子配列が知られている場合、遺伝子ダウンレギュレートの最も効果的な方法の1つは、外来性DNAを構造的な遺伝子に挿入して転写を中断する、標的を定めた遺伝子中断である。これは、中断する遺伝子の一部に対して高度な相同性を有する配列で両脇を挟まれた、挿入するDNA遺伝子マーカーであることが多いを含んでなる遺伝子カセットの製造によってもたらされる。カセットの宿主細胞への導入は、細胞の天然DNA複製機序を通じた、構造的遺伝子への外来性DNAの挿入をもたらす。例えばハミルトンHamiltonら、J.Bacteriol.171:4617~46221989;バルバスBalbasら、Gene、136:211~2131993;ゲルデナーGueldenerら、NucleicAcidRes.24:2519~25241996;およびスミスSmithら、MethodsMol.Cell.Biol.5:270~2771996参照。アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子をダウンレギュレートする別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化して、RNAのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、RNAのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスRNAは、関心のあるタンパク質をコードするmRNAの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関わることを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者に知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子をダウンレギュレートする効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をUV放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしても良い。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、HNO2およびNH2OHなどの非複製DNAに影響する化学物質、ならびにフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料などの複製DNAに影響する薬剤が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野で良く文書化されている。例えばトーマスD.ブロックThomasD.Brock著バイオテクノロジー:工業微生物学テキストブックBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology第二版1989SinauerAssociates,Inc.、Sunderland、MA、またはデシュパンデ,ムカンドDeshpande,MukundV.、Appl.Biochem.Biotechnol.、36、2271992を参照されたい。別の非特異的遺伝子中断方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、DNAに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内invivoおよび生体外invitro転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されても良いので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外invitro転位のためのキットは市販される例えばニュージャージー州ブランチバーグのパーキンエルマーアプライドバイオシステムズPerkinElmerAppliedBiosystemsBranchburg、NJから入手できる酵母菌Ty1因子に基づく、プライマーアイランド転位キットPrimerIslandTranspositionKit、マサチューセッツ州のニューイングランドバイオラブズNewEnglandBiolabs、Beverly、MAから入手できる細菌性トランスポゾンTn7に基づくゲノムプライミングシステムGenomePrimingSystem、およびウィスコンシン州マディソンのエピセンターテクノロジーズEpicentreTechnologiesMadison、WIから入手できる、Tn5細菌性転移因子に基づくEZ::TNトランスポゾン挿入システムを参照されたい。微生物宿主としてのメチロトローフおよびメチロモナスMethylomonas種16a組換え微生物源からいくつかのカロテノイドが生成されている[例えばリコペン生成のための大腸菌およびカンジダユチリスCandidautilisファーマーFarmerW.R.およびJ.C.リヤオLiao、Biotechnol.Prog.17:57~612001;ワングWangC.ら、BiotechnolProg.16:922~9262000;ミサワMisawaN.およびH.シマダShimada、J.Biotechnol.59:169~1811998;シマダShimadaH.ら、Appl.Environm.Microbiol.64:2676~26801998;β-カロテン生成のための大腸菌、カンジダユチリスCandidautilis、およびパフィアロドジマPfaffiarhodozymaアルブレヒトAlbrechtM.ら、Biotechnol.Lett.21:791~7951999;ミウラMiuraY.ら、Appl.Environm.Microbiol.64:1226~12291998;米国特許第5,691,190号明細書;ゼアキサンチン生成のための大腸菌およびカンジダユチリスCandidautilisアルブレヒトAlbrechtM.ら、前出;ミウラMiuraY.ら、前出;アスタキサンチン生成のための大腸菌およびパフィアロドジマPfaffiarhodozyma米国特許第5,466,599号明細書、米国特許第6,015,684号明細書、米国特許第5,182,208号明細書、米国特許第5,972,642号明細書;米国特許第5,656,472号明細書、米国特許第5,545,816号明細書、米国特許第5,530,189号明細書、米国特許第5,530,188号明細書、米国特許第5,429,939、および米国特許第6,124,113号明細書もまた参照されたい]が、異なるcrt遺伝子の様々な組み合わせを使用したこれらのカロテノイド生成法には、低い収率と比較的高価な供給材料への依存という欠点がある。したがって微生物宿主中で安価な供給材料から、高収率のカロテノイドを製造する方法を同定することが望ましい。単一エネルギー源として単一炭素基質を利用する、いくつかの微生物がある。このような微生物はここでC1代謝個体と称される。これらの生物は、単一エネルギーおよびバイオマス源として炭素-炭素結合が欠如している炭素基質を使用する能力によって特徴付けられる。これらの炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルメート、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン例えば、モノ-、ジ-、およびトリ-メチルアミン、メチル化チオール、二酸化炭素、およびその他の様々なあらゆる炭素-炭素結合が欠如している還元炭素化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施態様では、単一炭素基質はメタンおよびメタノールよりなる群から選択される。全てのC1代謝性微生物は、概してメチロトローフとして分類される。メチロトローフは、炭素-炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できるあらゆる生物として定義されても良い。しかし通性メチロトローフ、絶対メチロトローフ、絶対メタノトローフは、全てメチロトローフの様々なサブセットである。具体的には次のようである。通性メチロトローフは、炭素-炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーおよびバイオマスのために、糖および複合炭水化物などのその他の炭素基質を使用しても良い。通性メチロトローフ細菌は多くの環境中に見られるが、最も一般には土壌、ごみ埋め立て、および廃棄物処理場から単離される。多くの通性メチロトローフは、プロテオバクテリアProteobacteriaのβおよびγ亜群のメンバーであるハンソンHansonら、Microb.GrowthC1Compounds[国際シンポジウム]第7回1993、p285~302、マレルJ.コリンMurrellJ.CollinおよびドンP.ケリーDonP.Kelly編、Intercept:Andover、UK;マディガンMadiganら、ブロックの微生物生物学BrockBiologyofMicroorganisms、第8版、PrenticeHall:UpperSaddleRiver、NJ1997。絶対メチロトローフは、エネルギー生成が、炭素-炭素結合を含有しない有機化合物の使用に限定された生物である。絶対メタノトローフは、メタンを酸化する特徴的能力を有する絶対メチロトローフである。さらに単一炭素基質を利用する能力は細菌に限定されず、酵母菌および真菌にも及ぶ。いくつかの酵母菌属は、エネルギー源としてより複雑な材料に加えて単一炭素基質を使用できるすなわちメチロトローフ酵母菌。数多くのこれらのメチロトローフ生物が知られているが、これらの微生物のわずかなものだけが材料合成のための工業プロセスにおいて成功裏に利用されている。そして単一炭素基質は対費用効果の高いエネルギー源であるが、これらの微生物の遺伝子操作における困難さ、ならびにそれらの遺伝的機構に関する情報不足が、主に天然生成物合成のためのそれらの使用を制限している。これらの困難さにもかかわらず、多くのメタノトローフはこれらの生物が色素を合成できるようにする固有のイソプレノイド経路を含有し、様々な非内在性イソプレノイド化合物を生成するために、これらの微生物を遺伝子操作する構想の可能性を提供する。メタノトローフは単一炭素基質すなわちメタンおよび/またははメタノールをエネルギー源として使用できるので、これらの生物においてカロテノイドを安価に生成することが可能であろう。メタノトローフがβ-カロテン生成のために遺伝子操作される実施例の1つは、参照によってここに援用する米国特許出願第09/941947号明細書で述べられる。単一炭素基質を唯一のエネルギー源として使用できる微生物における、カロテノイド化合物生合成に関与する遺伝子発現のための方法が提供される。宿主微生物は、カロテノイドのための代謝前駆物質として、ファルネシルピロリン酸FPPを合成する能力を有するあらゆるC1代謝個体であっても良い。より具体的には、本発明で適切な通性メチロトローフ細菌としては、メチロフィラスMethylophilus、メチロバシラスMethylobacillus、メチロバクテリウムMethylobacterium、ヒフォミクロビウムHyphomicrobium、キサントバクターXanthobacter、バシラスBacillus、パラコッカスParacoccus、ノカルジアNocardia、アルスロバクターArthrobacter、ロドシュードモナスRhodopseudomonas、およびシュードモナスPseudomonasが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用な具体的なメチロトローフ酵母菌としては、カンジダCandida、ハンゼヌラHansenula、ピチアPichia、トルロプシスTorulopsis、およびロドトルラRhodotorulaが挙げられるが、これに限定されるものではない。例示的なメタノトローフとしては、メチロモナスMethylomonas、メチロバクターMethylobacter、メチロコッカスMethylococcus、メチロジーナスMethylosinus、メチロシクティスMethylocyctis、メチロミクロビウムMethylomicrobium、およびメタノモナスMethanomonas属が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で特に興味深いのは、エネルギー的に好ましい炭素流経路を有する高生育させる絶対メタノトローフである。例えばメタノトローフの特定の株は、いくつかの経路特性を有し、それを炭素流束操作のために特に有用なものにする。この株はメチロモナスMethylomonas種16aATCCPTA2402米国特許第6,689,601号明細書として知られており、この特定の株およびその他の近縁メチロトローフは、C40カロテノイド生成に有用な本発明の遺伝子産物発現のための好ましい微生物宿主である。メチロモナスMethylomonas種16aの最適化されたバージョンが作りされ、メチロモナスMethylomonas種16aMWM1200米国特許出願第60/527083号明細書と称された。内在性C30カロテノイド経路がノックアウトされΔcrtクラスタープロモーターΔcrtN3、C40カロテノイド発現のための最適化されたプラットフォームが作り出された。内在性crtクラスターcrtN1-ald-crtN2クラスターの発現に関与するプロモーターの欠失は、無着色株天然に生成するC30カロテノイドのために通常ではピンク色の野生型株をもたらした。この最適化された宿主内のC40カロテノイド生合成遺伝子発現は、所望のC40カロテノイドの増大する生成を可能にした。C1代謝性細菌の形質転換C1代謝性細菌形質の転換技術は十分開発されていないが、当業者に良く知られているその他の細菌のために用いられる一般方法を応用しても良い。メチロバクテリウムエキストロクエンMethylobacteriumextorquensAM1トヤマToyamaH.ら、FEMSMicrobiol.Lett.166:1~71998、メチロフィラスメチロトロファスMethylophilusmethylotrophusAS1キムKimC.S.およびT.K.ウッドWood、Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105~1081997、およびメチロバシラスMethylobacillus種株12SヨシダYoshidaT.ら、Biotechnol.Lett.、23:787~7912001の形質転換のために、電気穿孔が成功裏に使用されている。しかし当業者には良く知られているように、1つの特定のC1代謝性利用生物から別の生物への具体的電気穿孔パラメーターの推定は、困難かもしれない。供与細胞と受容細胞の直接接触に依存する細菌接合は、C1代謝性細菌中への遺伝子の転位のために、より容易に受け入れられることが多い。簡単に述べると、この細菌接合プロセスは、供与細胞と受容細胞を互いに密接に接触させて一緒に混合することを伴う。接合は、新たに合成された供与DNAの受容細胞中への直接転位を伴う、供与細菌と受容細菌間の細胞質連絡の形成によって起きる。技術分野で良く知られているように、接合の受容体は、供与細菌からの水平転位を通じてDNAを受容できるあらゆる細胞として定義される。接合転位中の供与体は、接合プラスミド、接合トランスポゾン、または可動性プラスミドを含有する細菌である。供与体プラスミドの物理的転位は、下で述べられる2つの様式の1つによって起きることができる。1.場合によっては、供与体と受容体のみが接合にとって必要とされる。これは転位されるプラスミドが接合性かつ可動性である自己伝播性のプラスミドの場合すなわちtra-遺伝子と、Mobタンパク質をコードする遺伝子の双方を保有するに起きる。一般にプロセスは、1.oriT中の特定部位で二本鎖プラスミドDNAにニックが入れられ、2.細孔構造または繊毛構造を通じて、一本鎖DNAが受容体に放出され、3.DNAリラクセース酵素が二本鎖DNAをoriTで開裂して結合し、5’末端を放出し中間体構造としてリラクソゾームを形成する、そして4.引き続いて、補助タンパク質の複合体がoriTでアセンブルして、DNA転位プロセスを容易にする、ことを伴う。2.代案としては、供与体プラスミドの受容体への転位のために三親交雑接合が必要とされる。このタイプの接合には、供与細胞、受容細胞、およびヘルパープラスミドが関与する。供与細胞は、可動性プラスミドまたは接合トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッケースをコードする遺伝子であるoriTを含有し、Mobタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしMobタンパク質は、単独ではゲノムの転位達成するのに十分でない。したがって可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド供与体内またはヘルパー細胞内に位置するによって適切な接合システムが提供されない限り、それら自身の転位を促進できない。プラスミドは、細孔または繊毛の形成に関与する転位タンパク質Traをコードするので、接合プラスミドは噛合対の形成およびDNA転位のために必要とされる。C1代謝性細菌が関与する成功裏の接合の例としては、ストリアーStolyarらMikrobiologiya645:686~6911995;モトヤマMotoyama,H.らAppl.Micro.Biotech.421:67~721994;ロイドLloyd,J.S.らArchivesofMicrobiology1716:364-3701999;およびオドムOdom,J.M.ら米国特許出願第09/941947号明細書の研究が挙げられる。工業生産本crtW遺伝子を使用した環状ケトカロテノイド化合物の商業的生産が所望される場合、多様な培養方法を応用してもよい。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現する特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチおよび連続の培養方法の双方で生産してもよい。古典的なバッチ培養法は閉鎖システムであり、そこでは培地の組成が発酵の最初に設定され、培養プロセス中の人為的変化を受けない。したがって培養プロセス開始時に培地に所望の生物または生物群を接種し、生育させるまたは代謝活動を生じさせながらシステムには何も添加しない。しかし典型的にはバッチ培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、pHおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。システムによっては対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。その他のシステムでは、静止または対数期後生成を得ることができる。標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ培養プロセスも本発明において適切であり、培養の進行と共に基質が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、pH、溶存酸素、およびCO2などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ培養法は、技術分野で一般的であり周知であって、実例はトマスD.ブロックThomasD.Brock著、バイオテクノロジー:工業微生物学テキストBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology、第二版1989SinauerAssociates,Inc.、Sunderland、MA.、またはデシュパンデ,ムカンドDeshpande,MukundV.、Appl.Biochem.Biotechnol.、36:227、1992にある。環状ケトカロテノイドの商業生産は、連続培養によって達成しても良い。連続の培養は開放システムであり、規定の培地をバイオリアクターに連続的に添加して、等量の慣熟培地を工程から同時に除去する。連続培養は、概して細胞を恒常的な高い液相密度に維持し、そこでは細胞が主に対数増殖期にある。代案としては連続培養を固定細胞で実施しても良く、そこでは炭素および養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、天然および/または合成材料から構成される広範囲の固体担体を使用して実施しても良い。連続または半連続培養は、細胞生育させるまたは最終生成物濃度に影響する1つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を固定された割合に維持し、その他の全パラメーターの調節ができるようにする。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育させるに影響するいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは定常状態生育させる条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、培養中の細胞生育させる率に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法が上記のブロックBrockで詳述される。本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類と、ラクトースまたはスクロースなどの二糖類と、デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖類と、乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物とが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている、二酸化炭素、メタンおよび/またはメタノールなどの一炭素基質であっても良い。一または二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物はまた、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための多様なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母菌は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られているベリオンBellionら、Microb.GrowthC1Compounds[国際シンポジウム]第7回1993、415~32。編集者:マレル,J.コリンMurrell,J.Collin、ケリー,ドンP.Kelly,DonP.、出版社:Intercept:Andover,UK。同様に、様々なカンジダCandida種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝するサルターSulterら、Arch.Microbiol.153:485~4891990。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含しても良く、生物の選択によってのみ制限されることが考察された。植物における組換え発現植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を製造することが知られている。本発明の核酸断片を使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有する遺伝子導入植物を作り出しても良い。好ましい植物宿主は、本タンパク質の高生成レベルを支えるいずれかの品種であることができる。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナBrassicanapus、B.campestris、コショウ、ヒマワリHelianthusannus、綿Gossypiumhirsutum、トウモロコシ、タバコNicotianatabacum、アルファルファMedicagosativa、コムギTriticum種、オオムギHordeumvulgare、カラスムギAvenasativa、L、モロコシSorghumbicolor、イネOryzasativa、シロイヌナズナArabidopsis、アブラナ科野菜ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、落花生、ブドウ、草種子、甜菜、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライムギ、亜麻、堅木、軟木、および飼料としての草が挙げられるが、これに限定されるものではない。商業的に重要な宿主としては、スピルリナSpirulina、ヘマトコッカスHaematococcus、およびデュナリエラDunaliellaなどの藻類の種が挙げられるが、これに限定されるものではない。カロテノイド化合物の生成は、最初に本発明のキメラ遺伝子を構築することによって達成されても良く、その中でコード領域は、所望の発生段階で所望の組織中の遺伝子の発現を導くプロモーターに作動可能に連結される。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなっても良い。転写終止シグナルをコードする3’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために1個もしくはそれ以上のイントロンも含んでなる。コード領域の発現を誘導できるあらゆるプロモーターとあらゆるターミネーターのあらゆる組み合わせをキメラ遺伝子配列で使用しても良い。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼnos、オクトピンシンターゼocs、およびカリフラワーモザイクウィルスCaMV遺伝子からのものが挙げられる。使用しても良い効率的な植物プロモーターの1タイプは、高等植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と機能的に連結するこのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できなくてはならない。本発明で使用しても良い高等植物プロモーターとしては、例えばダイズからのリブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼの小型サブユニットssのプロモーターベリー-ロウBerry-Loweら、J.MolecularandApp.Gen.、1:483~4981982、およびクロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの2つのプロモーターは、植物細胞において光誘導されることが知られている例えば植物の遺伝子操作、農業における展望GeneticEngineeringofPlants,anAgriculturalPerspectiveA.キャッシュモアCashmore、Plenum:NY1983、29~38ページ;コルッジCoruzziG.ら、J.Biol.Chem.、258:13991983;およびダンスミアDunsmuirP.ら、J.Mol.Appl.Gen.、2:2851983参照。次に本キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築できる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を良く知っている。当業者はまた、異なる独立形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことを認識するのでジョーンズJonesら、EMBOJ.4:2411~24181985;デアルメイダDeAlmeidaら、Mol.Gen.Genetics218:78~861989、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数イベントをスクリーニングしなくてはならない。このようなスクリーニングは、DNAブロットのサザン分析サザンSouthern、J.Mol.Biol.98:5031975、mRNA発現のノーザン分析クロツェックKroczek、J.Chromatogr.Biomed.Appl.、6181~2:133~1451993、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって達成しても良い。用途によっては、本タンパク質を異なる細胞区画に方向付けることが有用であろう。したがってトランジット配列キーグストラKeegstra,K.、Cell56:247~2531989、シグナル配列または小胞体局在化をコードする配列クリスピールスChrispeels,J.J.、Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42:21~531991、または核局在化シグナルライケルRaikhel,N.、PlantPhys.100:1627~16321992などの適切な細胞内標的配列を添加することで、および/または既存の標的配列を除去することで、酵素をコードするコード配列を変更して上述のキメラ遺伝子をさらに補完しても良いことが想定された。引用した参考文献はこれらの各例を示すが、リストは網羅的でなく、有用なさらに多くの標的シグナルが、将来発見されるかもしれない。タンパク質操作本ヌクレオチドを使用して、向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察された。誤りがちなPCRメルニコフMelnikovら、NucleicAcidsResearch、274:1056~10621999、部位特異的変異誘発クームズCoombsら、Proteins1998、259~311、1図版。編集者ら:アンジェレッティ,ルースホーグAngeletti,RuthHogue、出版社:Academic:SanDiego、CA、および遺伝子シャフリングgeneshuffling参照によってここに援用する米国特許第5,605,793号明細書、米国特許第5,811,238号明細書、米国特許第5,830,721号明細書、米国特許第5,837,458号明細書、および米国特許出願第10/374366号明細書をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発と容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、関心のある遺伝子と類似したまたは違っているDNA領域の追加的集団存在下における、関心のある遺伝子の特定サイズの断片への制限エンドヌクレアーゼ開裂を伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。本発明の本微生物の配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしても良い。配列は二本鎖であるべきで、50bp~10kB範囲の様々な長さであることができる。配列は技術分野で良く知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約10bp~1000bpの範囲の断片に無作為に消化されても良いマニアティスManiatis、同上。本微生物の配列に加えて、微生物の配列の全部または部分とハイブリダイズ可能な断片集団を添加しても良い。同様に、本配列とハイブリダイズ可能でない断片集団を添加しても良い。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約10~20倍過剰に添加される。一般にこのプロセスに従えば、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約100~約1000個になる。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。その他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されても良い。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは温度は、80°C~100°Cである。核酸断片を冷却によって再アニールしても良い。好ましくは温度は20°C~75°Cである。再生は、ポリエチレングリコールPEGまたは塩の添加によって加速できる。適切な塩濃度は、0mM~200mMの範囲であっても良い。次にアニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよびdNTPすなわちdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Taqポリメラーゼまたは技術分野で知られているあらゆるその他のDNAポリメラーゼであっても良い。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加しても良い。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは2~50回反復され、より好ましくは手順は10~40回反復される。得られる核酸は約50bp~約100kBの範囲のより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローン化および発現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしても良いマニアティスManiatis、同上。さらにハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャフリングエクソンシャフリング法を使用した、機能性領域の融合によってアセンブルできるニクソンNixonら、PNAS、94:1069~10731997。本遺伝子の機能性領域は、その他の遺伝子の機能性領域と組み合わせて、所望の触媒機能を有する新しい酵素作り出すことができる。PCRオーバーラップ伸長法を使用してハイブリッド酵素を構築し、当業者に良く知られている技術使用して、様々な発現ベクター中にクローン化しても良い。好ましい実施態様の説明着色微生物は、環境サンプルから単離され、標準微生物学的技術使用して培養された実施例1。2つの着色コロニーDC18およびDC263を選択し、16SrRNA遺伝子配列決定を実施した。DC18株配列番号4からの16SrRNA遺伝子配列をジェンバンクGenBank登録商標に対するBLASTNを使用したクエリー検索として使用した。公開データベースに対する最も近い整合は、スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisに対して98同一であった。本株をスフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18と命名した。DC263株配列番号5からの16SrRNA遺伝子配列は、ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisに対して相同性99同一を示した。単離された株をブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263と命名した。第3の着色微生物株フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202Cは、ドイツ国のJ.W.ゲーテ大学J.W.GoetheUniversity,GermanyのゲルハルトサンドマンGerhardSandmann博士から得られた。この株は、サイトファーガCytophaga種KK1020Cとしても知られており、日本国の海洋バイオテクノロジー研究所MBIから入手できる。各株からのカロテノイドサンプルをHPLC/LC-Mによって分析した。スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ-β,β’-カロテン-4-オンと判定された。ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ-β,β’-カロテン-4,4’-ジオンと判定された。フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202C中の主要カロテノイドは、フレキシキサンチンであった。全3株中の主要カロテノイドはケトカロテノイドであり、それらが全てカロテノイドケトラーゼを有することが示唆された。pEZseqベクター実施例2中の小型挿入物ライブラリー4~6kbの断片を作るために、各株からゲノムDNAを調製した。それぞれのプラスミドをβ-カロテン生成プラスミドを含む大腸菌細胞中に電気穿孔した。オレンジ色の形質転換体が単離され、それぞれのカロテノイド含量が分析された。ケトカロテノイドは、各オレンジ色形質転換体によって生成される。pEZベースのプラスミド上の挿入物をランダムトランスポゾン挿入によって、および/またはプライマー歩行によって配列決定した。挿入物の配列をアセンブルし、ジェンバンク登録商標に対してBLAST分析したBLASTNnrおよびBLASTXnr。CrtWケトラーゼをコードする遺伝子を同定した実施例3、表3。本crtW配列およびいくつかの以前報告されたcrtWs表4を使用して、ペアワイズ比較分析を行った。本crtW配列は、以前報告されたカロテノイドケトラーゼに対して中程度の相同性のみを示す。本カロテノイドケトラーゼ遺伝子をpTrcHis2-TOPO発現ベクター実施例5中に個別にクローンした。各crtW発現ベクターをβ-カロテン蓄積大腸菌株中に形質転換した。それぞれのオレンジ形質転換体のカロテン含量をHPLCによって分析した。カンタキサンチンが単独に、それぞれの形質転換体中で生成された。いくつかのβ-カロテン発現プラスミドpDCQ340、pDCQ330を作り出し、本crtWケトラーゼ遺伝子を発現する効果を測定した実施例4および7。腸内細菌科EnterobactericeaeDC260米国特許出願第10/808979号明細書またはパントエアアグロメランスPantoeaagglomeransDC404米国特許出願第10/808807号明細書のいずれかから、カロテノイド遺伝子クラスターをクローンして発現プラスミドを作り出した。本CrtWケトラーゼは、β-カロテンをカンタキサンチンに転換する能力を示す。別の実施態様では、多岐にわたるケトラーゼの同時発現を行った実施例6。実施例5で使用したβ-カロテン合成遺伝子pDCQ330を発現するプラスミドを操作して、アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtWZ遺伝子をさらに発現させた。得られたプラスミドpDCQ335を使用して、アスタキサンチン/アドニキサンチン生成大腸菌株を作り出した。DC263pDCQ342TAからのcrtWまたはK1-202CpDCQ339TAからのcrtWのいずれかを発現するプラスミドをアスタキサンチン/アドニキサンチン生成株中に形質転換した。pDCQ335のみを含む株と、追加的プラスミドpDCQ342TAまたはpDCQ339TAを含有する株との比較を行った。1つ以上の多岐にわたるケトラーゼ遺伝子を発現する株では、ケト基付加の効率が改善され、アスタキサンチンの生成が増大した。以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。一般方法実施例で使用される標準組換えDNAおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルックSambrookJ.、フリッチュFritschE.F.、およびマニアティスManiatisT.分子クローン化:実験室マニュアルMolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor1989マニアティスManiatis、およびT.J.シルハビーSilhavy、M.L.ベンナンBennanおよびL.W.エンクイストEnquist遺伝子融合実験ExperimentswithGeneFusionsColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor,NY1984;およびオースベルAusubelF.M.ら分子生物学現代プロトコルCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscienceによる出版1987で述べられている。細菌培養の維持および生育させるに適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。一般微生物学方法マニュアルManualofMethodsforGeneralBacteriology、フィリップゲアハルトPhillippGerhardt、R.G.E.マレーR.G.E.Murray、ラルフN.コスティロウRalphN.Costilow、ユージーンW.ネスターEugeneW.Nester、ウィリスA.ウッドWillisA.Wood、ノエルR.クリーグNoelR.Krieg、およびG.ブリッグスフィリップスG.BriggsPhillips編、米国微生物学会、Washington,D.C.1994またはトーマスD.ブロックThomasD.Brock著バイオテクノロジー:工業微生物学テキストブックBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology第2版1989SinauerAssociates:Sunderland,MA1989。細菌細胞の生育させるおよび維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチケミカルズAldrichChemicalsMilwaukee,WI、メリーランド州スパークスのディフコラボラトリーズ/BDダイアグノスティックスDIFCOLaboratories/BDDiagnosticsSparks,MD、ウィスコンシン州マディソンのプロメガPromegaMadison,WI、マサチューセッツ州ベヴァリーのニューイングランドバイオラブズNewEnglandBiolabsBeverly,MA、カリフォルニア州カールズバッドのギブコ/BRLライフテクノロジーズGIBCO/BRLLifeTechnologiesCarlsbad,CA、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカルSigmaChemicalCompanySt.Louis,MOから得た。遺伝的配列操作は、ウィスコンシン州マディソンのジェネティックスコンピューターグループGCGGeneticsComputerGroupInc.Madison,WIから入手できる一式のプログラムウィスコンシンパッケージWisconsinPackageバージョン9.0を使用して達成した。GCGプログラムパイルアップPileupでは、ギャップ生成デフォルト値12を使用して、ギャップ延長デフォルト値4を使用した。CGCギャップGapまたはベストフィットBestfitプログラムでは、デフォルトギャップ生成ペナルティ50を使用し、デフォルトギャップ延長ペナルティ3を使用した。スミス-ウォーターマンSmith-Watermanアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムを使用して、複数の整列化を作り出したW.R.ピアソンPearson、Comput.MethodsGenomRes.、[国際シンポジウム議事録]1994、1992年会議、111~20、編集者ら:スハイ,サンドールSuhai,Sandor編、出版社:Plenum、NewYork,NY。これらのまたはあらゆるその他のプログラムにおいて、プログラムパラメーターについて言及されない場合は、デフォルト値を使用した。略語の意味は次のとおり。hは時間を意味し、minは分を意味し、secは秒を意味し、dは日を意味し、mLはミリリットルを意味し、μLはマイクロリットルを意味し、Lはリットルを意味し、gはグラムを意味し、mgはミリグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、ppmは100万分の1を意味する。実施例1細菌株生成するケトカロテノイドこの実施例は、ケトカロテノイドを生成する3つの細菌株の単離、およびそれらのカロテノイドの予備分析について述べる。株単離および分類新しいカロテノイド生成細菌株を単離するために、環境サンプルのコレクションからから着色微生物を単離した。デラウェア州ウィルミントンWilmington,Delawareの庭からのおよそ1gの表面土壌を10mLの水道水に再懸濁した。10μLのループを満たす水をルリアブロスLBプレート上に画線し、プレートを30°Cでインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に2回LBプレートに画線して、30°Cでインキュベートした。これらのコロニーから、オレンジ~ピンクのコロニーを形成したものをDC263株と命名した。DC18株は、ペンシルベニア州の河川から単離した。水性サンプルの連続希釈10-2、10-4、および10-6をトリプトンおよび酵母で栄養強化した基礎培地の大型245×245mm15寒天プレート上に播種した。基礎培地構成要素1リットルあたりは次のようであった。NH4Cl0.8g、KH2PO40.5g、MgCl26H200.2g、CaCl22H200.1g、NaNO31.3g、およびNa2SO40.5g。原液1の構成要素1リットルあたりは次のようであった。ニトリロ三酢酸12.8g、FeCl24H2O0.3g、CuCl22H2O0.0254g、MnCl24H2O0.1g、CoCl26H2O0.312g、ZnCl20.1g、H3BO30.01g、Na2MoO42H2O0.01g、およびNiCl26H2O0.184g。1リットルの基礎培地あたり10ミリリットルの原液1を添加した。培地を濃度10g/Lのトリプトンおよび5g/Lの酵母抽出物で強化した。培地のpHを7に調節した。プレートを室温でインキュベートし、単一コロニーを同一プレートに2回画線した。オレンジコロニーを形成した1つの株を選択して、DC18株と命名した。DC18およびDC263で16SrRNA遺伝子配列決定を実施した。具体的には、プライマーHK12:5’-gagtttgatcctggctcag-3’配列番号7およびJCR14:5’-ACGGGCGGTGTGTAC-3’配列番号8を使用して、株の16SrRNA遺伝子をPCRによって増幅した。製造業者キアゲンQiagenの使用説明書に従ってキアクイックQIAquickPCR精製キットを使用し、増幅された16SrRNA遺伝子を精製して自動化ABIシーケンサー上で配列決定した。プライマーHK12、JCR14、およびJCR15:5’-GCCAGCAGCCGCGGTA-3’配列番号9で、シーケンス反応を開始した。アセンブリされたDC18の1291bp16SrRNA遺伝子配列配列番号10およびDC263の1268bp16SrRNA遺伝子配列配列番号11をジェンバンク登録商標に対するBLASTN検索アルトシュルAltschulら、NucleicAcidsRes.、25:3389~34021997のクエリー配列として使用した。DC18の16SrDNA配列は、スフィンゴモナスSphingomonas株のそれに対する相同性を示し、トップヒットはスフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisと98同一であった。したがってこの株は、スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18と命名された。DC263の16SrDNA配列は、ブレバンジモナスBrevundimonas株に対して相同性を示し、トップヒットはブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisと99同一であった。したがってこの株は、ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263と命名された。フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202Cは海洋から単離され、ドイツ国のJ.W.ゲーテ大学J.W.GoetheUniversity,GermanyのゲルハルトサンドマンGerhardSandmann博士から得られた。フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202CはサイトファーガCytophaga種KK10202CMBIC0139としても知られており、日本国岩手県のの海洋バイオテクノロジー研究所MBIから入手できる。カロテノイド分析スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18を株単離について述べたのと同一の100mLの培地中で生育させた。ブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263を100mLのLB中で生育させた。フラボバクテリウムFlavobacterium種K1-202Cをミシガン州デトロイトのディフコDifcoDetroit,MIからの100mLのマリンブロス中で生育させた。3株は全て振盪して30°Cで一晩生育させた。4000gで15minの遠心分離によって細胞をペレットにし、細胞ペレットを10mLのアセトンで抽出した。抽出物を窒素下で乾燥させ、1~2mLのアセトンに再溶解した。抽出物をミシガン州アナーバーのパルコーポレーションPallCorporationAnnArbor,MIからのアクロディスクAcrodiscaCR25mmシリンジフィルターで濾過した。次にそれをカリフォルニア州フォスターシティのアジレントAgilentFosterCity,CAからのアジレントシリーズAgilentSeries1100LC/MSDSIを使用して、HPLC分析用0.1mL10アセトン90アセトニトリル中で濃縮した。サンプル20μLをアジレントテクノロジーズAgilentTechnologies,Inc.からの150mm×4.6mmZORBAXC183.5μm粒子カラムに装填した。カラム温度を40°Cに維持した。流速は1mL/minであり、使用した通過溶剤プログラムは次のとおりであった。0~2min:95緩衝液Aおよび5緩衝液B、2~10min:95緩衝液Aおよび5緩衝液Bから60緩衝液Aおよび40緩衝液Bへの直線濃度勾配、10~12min:60緩衝液Aおよび40緩衝液Bから50緩衝液Aおよび50緩衝液Bへの直線濃度勾配、12~18min:50緩衝液Aおよび50緩衝液B、および18~20min:95緩衝液Aおよび5緩衝液B。緩衝液Aは95アセトニトリルおよび5dH2Oであり、緩衝液Bは100テトラヒドロフランであった。図2a、2b、および2cは、DC18、DC263、およびK1-202C中で生成するカロテノイドのHPLCプロフィールを示す。各株について主要カロテノイドの吸収スペクトルも示される。主要カロテノイドの分子量は、LC-MSによって求めた。50μLの各サンプルをカリフォルニア州のアジレントテクノロジーズAgilentTechnologiesCAからのZorbax2.1×150mmSB-C18LCカラムに、以下の溶剤プログラムで通過させた。0~30min:70アセトニトリルおよび30水から100アセトニトリルへの直線濃度勾配、30~45min:100アセトニトリル。英国マイクロマスリミテッドMicromassLimitedUKからの質量分析器マイクロマスクアトロLCMicromassQuattroLCトリプル四重極をコロナ放電針3KVおよびAPCI大気圧化学イオン化プローブ450°Cで、APCIモードにおいて0.1secの飛び越し走査遅延で、100~1000AMUを0.9secでスキャンした。LC-MS分析は、DC18中の主要カロテノイド分子量を614、DC263中の主要カロテノイド分子量を628、K1-202C中の主要カロテノイド分子量を582と判定した。HPLC溶出時間、吸収スペクトル、および分子量に基づいて、DC18中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ-β,β’-カロテン-4-オンであると予想された。DC263中の主要カロテノイドは、テトラヒドロキシ-β,β’-カロテン-4,4’-ジオンであると予想された。DC18およびDC263中の主要カロテノイドについて我々が判定した特性は、これらのカロテノイドに関する文献で報告されたものと一致したヨコヤマYokoyamaら、Biosci.Biotech.Biochem.、60:200~203、1996;クライニッヒKleinigら、HelveticaChimicaActa、60:254~2581977。K1-202C中の主要カロテノイドは、サンドマンSandmannのグループによってフレキシキサンチンであると判定された。K1-202C中の主要カロテノイドについて判定された特性は、フレキシキサンチンについて報告されたものと一致したオーセンAasenら、ActaChemicaScandinavica、20:1970~19881966;アンドリューAndrewesら、ActaChemicaScandinavica、B38:337~3391984。3つの株全てにおいて主要カロテノイドはケトカロテノイドであるので、これらの3つの株はカロテノイドケトラーゼ遺伝子の潜在的供給源である。実施例2小型挿入物ライブラリーの構築およびスクリーニングこの実施例は、細菌株からの小型挿入物ライブラリーの構築、および潜在的にケトラーゼ遺伝子を含有する陽性クローンの同定について述べる。ライブラリー構築実施例1で述べるようにしてDC18、DC263、およびK1-202Cの細胞を生育させた。キアゲンQiagenゲノムDNA調製キットを使用して、細胞からゲノムDNAを調製した。部分的制限酵素消化法によって、K1-202C株の小型挿入物ライブラリーを調製した。K1-202CのゲノムDNAをウィスコンシン州マディソンのプロメガPromegaMadison,WIからのHincIIで部分的に消化し、0.8アガロースゲル上で分離した。4~6kbの画分をゲルから切り取って、キアゲンミンエリュートQiagenMinEluteゲル抽出キットを使用して抽出した。抽出したDNAをウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェンLucigenMiddletown,WIからのpEZSeqブラントBluntクローニングキットを使用して、pEZseqベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をβ-カロテン生成プラスミドpBHR-crt1米国特許出願第09/941947号明細書を含有する、新鮮に調製した大腸菌10Gのコンピテント細胞中に電気穿孔した。形質転換体を100μg/mLアンピシリンおよび50μg/mLカナマイシンと共にLBプレートに播種した。DC18およびDC263株の小型挿入物ライブラリーをランダム剪断方法によって調製した。ニュージャージー州フランクリンレイクスのベクトンディッキンソンBectonDickinson,FranklinLakes,NJからの291/2Gインシュリンシリンジを約300回通過させて、DC18およびDC263のゲノムDNAを剪断し、0.8アガロースゲル上で分離した。4~6kbの画分をゲルから切除し、キアゲンQiagenからのキアゲンミンエリュートQiagenMinEluteゲル抽出キットを使用して抽出した。ルシジェンLucigenDNAターミネーター修復キットを使用して、抽出したDNAの末端を修復した。ルシジェンLucigenからのpEZSeqブラントクローニングキットを使用して、修復したDNA挿入物をpEZseqベクターにライゲートした。ライゲーション混合物をβ-カロテン生成プラスミドpDCQ329米国特許出願第10/808979号明細書、参照によってここに援用するを含有する、新鮮に調製した大腸菌10Gのコンピテント細胞中に電気穿孔した。形質転換体を100μg/mLアンピシリンおよび50μg/mLカナマイシンと共にLBプレートに播種した。陽性クローンの同定および分析各ライブラリーからおよそ20,000~100,000個の形質転換体が得られた。各ライブラリーについて、数万の黄色コロニーからいくつかのオレンジコロニーが同定された。これらの陽性クローンをβ-カロテンをケトカロテノイドに転換するケトラーゼ遺伝子をおそらく含有するものとして同定した。各陽性株を抗生物質と共に100mLのLB中で振盪して30°Cで3日間生育させた。実施例1で述べるようにして、細胞からのカロテノイドを抽出し、HPLCで分析した。DC18、DC263、およびK1-202Cのライブラリーから単離された陽性大腸菌クローン中で、ケトカロテノイドカンタキサンチンおよびエキネノンが生成された。実施例3新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の単離この実施例は、陽性大腸菌クローン上の挿入物の配列決定、および挿入物上にコードされる新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の同定について述べる。カロテノイド分析は、陽性クローンが、β-カロテンからカンタキサンチンおよびエキネノンへの転換に関与するケトラーゼ遺伝子をおそらく含有することを示唆した。アンピシリン抵抗性でカナマイシン感応性のクローンについて選択して、pEZベースのプラスミドをβ-カロテンレポータープラスミドから分離した。ウィスコンシン州マディソンのエピセンターEpicentreMadison,WIからのEZ-TN<TET-1>キットを使用したランダムトランスポゾン挿入、および/またはプライマー歩行によって、pEZベースのプラスミド上への挿入物を配列決定した。ミシガン州アナーバーのジーンコーズGeneCodesCorp.AnnArbor,MIからのシーケンチャーSequencherプログラムによって、配列をアセンブリした。BLASTnrデータベース全ての非重複性ジェンバンク登録商標CDS翻訳、3次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンクから誘導される配列、SWISS-PROTタンパク質配列データベース、EMBL、およびDDBJデータベースを含んでなるに含有される配列に対する類似性について、BLAST基礎的局在性整列化検索ツールBasicLocalAlignmentSearchToolアルトシュルAltschulS.F.ら、J.Mol.Biol.215:403~4101993検索を行って、CrtWケトラーゼをコードする遺伝子を同定した。全米バイオテクノロジー情報センターNCBIによって提供されるBLASTNアルゴリズムを使用して、nrデータベースに含有されるあらゆる一般公開されたDNA配列に対する類似性について、配列を分析した。NCBIによって提供されるBLASTXアルゴリズムギッシュGish,W.およびステーツStates,D.J.、NatureGenetics、3:266~2721993を使用して、全ての読み枠でDNA配列を翻訳し、nrデータベースに含有されるあらゆる一般公開されたタンパク質配列に対する類似性について比較した。全ての比較は、BLASTNnrまたはBLASTXnrアルゴリズムのいずれかを使用して実施した。各遺伝子が最も高い類似性を有する配列を要約した表3に、BLAST比較の結果を示す。表3はBLASTXnrアルゴリズムに基づくデータを示し、値は期待値で報告される。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、ベクターNTI中の複数の配列アライメントアルゴリズムを使用して、いくつかの既知のケトラーゼ遺伝子とも比較した。表4は、ペアワイズ比較についてのヌクレオチド配列同一性およびアミノ酸配列同一性の百分率を示す。単離された3つのcrtW遺伝子は、既知のcrtW遺伝子と中程度の相同性のみを有する。さらにそれらは表4におけるペアワイズ比較から示されるように、互いに非常に異なる。実施例4β-カロテン合成プラスミドpDCQ330の構築P.アグロメランスagglomeransDC404は、カロテノイド合成遺伝子クラスターcrtEidiYIBZ配列番号12米国特許出願第10/808807号明細書参照を含有する環境単離物であった。デラウェア州ウィルミントンWilmington,Delawareの宅地野菜畑からの土壌を収集して、LB培地に再懸濁した。10μLのループを満たす再懸濁液をLBプレート上に画線し、プレートを30°Cでインキュベートした。多様なコロニーの外見がある着色細菌を拾い出し、均一に2回LBプレートに画線して、30°Cでインキュベートした。これらのコロニーから、淡黄色のなめらかで半透明なコロニーを形成したものをDC404株と命名した。P.アグロメランスagglomerans株DC404を25mLのLB培地中で30°Cで一晩通気して生育させた。細菌細胞を4,000×gで10min遠心分離した。細胞ペレットを5mLの50mMトリス-10mMEDTApH8.0に穏やかに再懸濁し、リゾチームを最終濃度2mg/mLに添加した。懸濁液を37°Cで1hrインキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度1に、タンパク質分解酵素Kを100μg/mLに添加した。懸濁液を55°Cで2hインキュベートした。懸濁液は透明になり、透明溶解産物を等容積のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1で2回、クロロホルム:イソアミルアルコール24:1で1回抽出した。4,000rpmで20minの遠心処理後、水性相を注意深く除去して新しい試験管に移した。2倍量のエタノールを添加して、DNAを密封したガラスパスツールピペットで穏やかに巻き取った。70エタノールを含有する試験管にDNAを浸した。風乾後、DNAをRNaseA100μg/mLと共に400μLのTE10mMトリス-1mMEDTA、pH8.0中に再懸濁し、4°Cで保存した。DNAの濃度および純度は、分光光度法によりOD260/OD280で判定した。ウィスコンシン州マディソンのエピセンターEpicentreMadison,WIからのpWEBコスミドクローニングキットを使用して、製造業者の使用説明書に従って、DC404のコスミドライブラリーを構築した。シリンジ針を通過させてゲノムDNAを剪断した。剪断されたDNAを末端修復し、低融点アガロース上で40kBの標準と比較してサイズ選択した。大きさがおよそ40kBのDNA断片を精製して、ブラントエンドクローニング-レディpWEBコスミドベクター中にライゲートした。超高効率マックスプラックスMaxPlaxラムダパッケージング抽出物を使用して、ライブラリーをパッケージングし、EPI100大腸菌細胞上に播種した。コスミドライブラリークローンから2つの黄色コロニーが同定された。2つのクローンからのコスミドDNAは、類似した制限酵素消化パターンを有した。ここでpWEB-404と称されるこのコスミドDNAは、配列番号12として示されるcrtWEidiYIBZ遺伝子クラスターを含有した。プライマーpWEB404F:5’-GAATTCACTAGTCGAGACGCCGGGTACCAACCAT-3’配列番号13およびpWEB404R:5’-GAATTCTAGCGCGGGCGCTGCCAGA-3’配列番号14を使用して、PCRによって、crtEidiYIB遺伝子配列番号15を含有するDC404からの断片を増幅した。コスミドDNApWEB-404をテンプレートとして、カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーンStratageneLaJolla,CAからのプロターボPfuTurboTMポリメラーゼ、および92°C5min、94°C1min、60°C1min、72°C9minを25回、および72°C10minの加熱サイクル条件と共に使用した。ゲル電気泳動に続いて、およそ5.6kBの単一生成物が観察された。インディアナ州インディアナポリスのロッシュアプライドサイエンスRocheAppliedScienceIndianapolis,INからのTaqポリメラーゼを72°Cで10分間の反応において使用し、pTrcHis2-TOPO中へのTOPO登録商標インビトロジェンInvitrogenクローニングのために、追加的3’アデノシンヌクレオチドを断片に付加した。大腸菌TOP10細胞への形質転換に続いて、いくつかのコロニーの色は明るい黄色に見え、それらがカロテノイド化合物を生成していることが示唆された。次に遺伝子クラスターをフロリダ州マルコアイランドのモビテックMoBiTec,LLCMarcoIsland,FLからの広域宿主範囲ベクターpBHR1中にサブクローンし、ウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェンLucigenMiddletown,WIからの大腸菌10G細胞中に電気穿孔した。得られるプラスミドpDCQ330を含有する形質転換体を50μg/mLカナマイシン含有LB培地上で選択した。pDCQ330では、crtE上流でユニークなSpeI部位を操作した。実施例5大腸菌中における新しいCrtWカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現この実施例は、β-カロテンを生成する大腸菌株における、新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現について述べる。ケトラーゼ遺伝子の機能は、β-カロテンのカンタキサンチンへの転換によって実証された。この実験で使用されたβ-カロテン生成株は、パントエアアグロメランスPantoeaagglomeransDC404米国特許出願第10/808807号明細書からのβ-カロテン合成遺伝子クラスターを運ぶプラスミドpDCQ330を含有する大腸菌株であった。3つの細菌株からの推定上のケトラーゼ遺伝子は、PCRによって増幅された。DC18からのcrtWは、プライマーcrtW-18_F:5’-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGACCGTCGATCACGACGCAC-3’配列番号16およびcrtW-18_R:5’-TCTAGACTACCGGTCTTTGCTTAACGAC-3’配列番号17を使用して増幅された。DC263からのcrtWは、プライマーcrtW-263_F:5’-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGCGGCAAGCGAACAGGATG-3’配列番号18およびcrtW-263_R:5’-TCTAGACTAGCTGAACAAACTCCACCAG-3’配列番号19を使用して増幅された。K1-202CからのcrtWは、プライマーcrtW/K1-202CF:5’-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGGCTGATGGAGGAAGTGAAGG-3’配列番号20およびcrtW/K1-202CR:5’-TCTAGATTAGTTTGATTGAGATTCTT-3’配列番号21を使用して増幅された。PCR生成物をpTrcHis2-TOPOインビトロジェンInvitrogenベクター中にクローンして、挿入物を順方向に含有するクローンについてスクリーンした。これらはDC18からのcrtW遺伝子を発現するpDCQ341TA、DC263からのcrtW遺伝子を発現するpDCQ342TA、およびK1-202CからのcrtW遺伝子を発現するpDCQ339TAをもたらした。これらのコンストラクトをpDCQ330を含有するβ-カロテン蓄積大腸菌株に形質転換した。オレンジ形質転換体を得て、それらのカロテノイドを実施例1で述べるようにHPLCによって分析した。HPLC結果を図3に示す。7.29minで溶出されたカンタキサンチンは、それぞれの株で限定的に生成されたカロテノイドであった。カンタキサンチン標準は、スイス国ルプシンゲンのカロテナチュアCaroteNatureLupsingen,Switzerlandから購入した。これは3つの新しいcrtW遺伝子のケトラーゼ機能を明らかに実証した。実施例6大腸菌中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現この実施例は、アスタキサンチンおよび中間体を生成する大腸菌株中における多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現について述べる。追加的ケトラーゼ遺伝子の発現は、アスタキサンチン生成を増大させた。アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtWおよびcrtZ遺伝子を使用して、大腸菌などの異種の宿主中においてアスタキサンチンを生成した。我々は、多岐にわたるcrtWの同時発現がアスタキサンチン転換を改善するかどうか評価した。3つの新たに単離されたDC18、DC263、およびK1-202Cからのカロテノイドケトラーゼ遺伝子は、表4に示すようにいくつかの既知のcrtWケトラーゼ遺伝子と中程度の相同性しか有さない。具体的にはDC18からのcrtW遺伝子は、アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtW遺伝子配列番号23に対して、57のDNA配列同一性および48のアミノ酸配列同一性を有する。DC263からのcrtWは、アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtW遺伝子に対して、55のDNA配列同一性および45のアミノ酸配列同一性を有する。K1-202CからのcrtWは、アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtW遺伝子に対して、39のDNA配列同一性および31のアミノ酸配列同一性を有する。それらの相互の中程度~低い相同性のために、単一宿主中のcrtW遺伝子の複数のコピーの存在が不安定性の問題を引き起こす可能性は低い。プラスミドpDCQ335は、pDCQ330中のβ-カロテン合成遺伝子クラスター中への合成アグロバクテリウムAgrobacteriumcrtZW遺伝子のクローニングによって構築された。crtZ配列番号22およびcrtW配列番号23遺伝子は、SOEingPCRによって結合された。crtZ遺伝子は、順方向プライマーcrtZW_F:5’-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGACCAAC-3’配列番号24および逆方向プライマーcrtZW_soe_R:5’-AGGGCATGGGCGCTCATGGTATATTCCTCCTTTCTAGATTAGGTGCGTTCTTGGGCTTC-3’配列番号25を使用して増幅された。crtW遺伝子は、順方向プライマーcrtZW_soe_F:5’-GAAGCCCAAGAACGCACCTAATCTAGAAAGGAGGAATATACCATGAGCGCCCATGCCCT-3’配列番号26および逆方向プライマーcrtZW_R:5’-GCTAGCTGTACATCACGCGGTGTCGCCTTTGG-3’配列番号27を使用して増幅された。2つのPCR生成物をゲル精製し、プライマーcrtZW_FおよびcrtZW_Rを使用してPCRによって結合させた。1272bpのPCR生成物をインビトロジェンInvitrogenからのpTrcHis2-Topoベクター中にクローンして、プラスミドpDCQ335TAを得た。crtZW遺伝子を含有するpDCQ335TAからの約1.2kbのNheI/SpeI断片をpDCQ330中のユニークなSpeI部位中にライゲートした。得られたコンストラクトpDCQ335中で、crtZWEidiYIB遺伝子はオペロン中に編成され、ベクターのクロラムフェニコール抵抗性遺伝子プロモーターの制御下にある。DC263からのcrtW遺伝子を発現するプラスミドpDCQ342TA、およびK1-202CからのcrtW遺伝子を発現するプラスミドpDCQ339TAを、pDCQ335を含有する大腸菌細胞中に形質転換した。アグロバクテリウムアウランティアカムAgrobacteriumaurantiacumからのcrtW遺伝子を含有するプラスミドpDCQ335は、プラスミドpDCQ342TAまたはpDCQ339TAと適合性である。pDCQ335のみを含有する大腸菌株、および追加的プラスミドpDCQ342TAまたはpDCQ339TAを含有する株をLB中で30°Cで3日間生育させ、実施例1で述べるようにしてHPLC分析を実施した。結果を図4に示す。その溶出時間、吸収スペクトル、および分子量をミズーリ州セントルイスのシグマSigmaSt.Louis,MOからの純正標準のそれらと比較して、アスタキサンチンを同定した。吸収スペクトルおよびその分子量582ダルトンに基づいて、アドニキサンチンの存在を予測した。pDCQ335のみを含有する大腸菌株では、生成された全カロテノイドのおよそ24がアスタキサンチン5.0minであり、カロテノイドの大部分46はアドニキサンチン5.6minであった。pDCQ342TAまたはpDCQ339TAと同時発現するpDCQ335を含有する株では、生成したカロテノイドのおよそ50がアスタキサンチン4.8-4.9minであり、およそ10がアドニキサンチン5.5minであった。この結果は、2つ以上の多岐にわたるケトラーゼ遺伝子の同時発現が、ケト基付加の効率を改善してアスタキサンチンなどのケトカロテノイド生成を増大させることを実証した。実施例7β-カロテン合成プラスミドpDCQ340の構築この実施例の目的は、ここでpDCQ340と称されるβ-カロテン発現プラスミドを調製することである。腸内細菌科EnterobactericeaeDC260米国特許出願第10/808979号明細書、参照によってここに援用するは、天然遺伝子クラスターcrtEXYIBZを含有する。β-カロテン合成に必要な遺伝子すなわちcrtEYIBは、PCRによって結合される。crtE遺伝子は、プライマーcrt-260_F:5-GAATTCACTAGTACCAACCATGGATAGCCATTATG-3’配列番号28およびcrt-260SOE_R:5’-ATCAGGTCGCCTCCGCCAGCACGACTTTCAGTTGAATATCGCTAGCTGTTG-3’配列番号29を使用して増幅された。crtY遺伝子は、プライマーcrt-260SOE_F:5’-CAACAGCTAGCGATATTCAACTGAAAGTCGTGCTGGCGGAGGCGACCTGAT-3’配列番号30およびcrt-260R1_R:5’-CATTTTTTCTTCCCTGGTTCGACAGAGTTCAACAGCGCGCGCAGCGCTT-3’配列番号31を使用して増幅された。crtIB遺伝子は、プライマーcrt-260R1_F:5’-AAGCGCTGCGCGCGCTGTTGAACTCTGTCGAACCAGGGAAGAAAAAATG-3’配列番号32およびcrt-260_R:5’-GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA-3’配列番号33を使用して増幅された。crtY遺伝子の3’末端に広がるプライマーに導入されたサイレント変化によって、crtY遺伝子の3’末端のEcoRI部位を除去した。crtEY遺伝子を最初にプライマーcrt-260_F配列番号28およびcrt-260R1_R配列番号31を使用して、SOEingPCRによって結合した。次にcrt-260_F配列番号28プライマーおよびcrt-260_R配列番号32プライマーを使用して、crtIB遺伝子とのPCRによってcrtEY遺伝子を結合した。最終的な4.5kBのcrtEYIB断片をpTrcHis2-TOPOベクター中にクローンして、次にpBHR1中にサブクローンしてpDCQ340を得た。pDCQ340を含有する大腸菌細胞は、β-カロテンを生成することが示された。実施例8メチロモナスMethylomonas中における新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現この実施例は、以前報告された方法米国特許出願第09/941947号明細書および米国特許出願第60/527083号明細書に基づいて、当業者が、メチロモナスMethylomonas種16aATCCPTA-2402中において、カンタキサンチンなどのケトカロテノイドの生成のための新しいカロテノイドケトラーゼ遺伝子をどのようにして発現できるかについて述べる。スフィンゴモナスメロニスSphingomonasmelonisDC18およびブレバンジモナスベシキュラリスBrevundimonasvesicularisDC263からのcrtW遺伝子をβ-カロテン合成プラスミドpDCQ340実施例7中に個別にクローンして、プラスミドpDCQ341およびpDCQ342をそれぞれ生成した。三親接合交配米国特許出願第60/527083号明細書によって、プラスミドpDCQ341およびpDCQ342をメチロモナスMethylomonas16aに転移した。pRK2013ATCCNo.37159を含有する大腸菌ヘルパー株、およびプラスミドpDCQ341またはpDCQ342を含有する大腸菌10Gドナー株をカナマイシン50μg/mLを含有するLB培地中で一晩生育させ、LBで3回洗浄し、元の培養容積のおよそ60倍の濃度に相当する容積のLBに再懸濁した。メチロモナスMethylomonas種16aMWM1200株は、天然crtN1aldcrtN2遺伝子クラスターのためのプロモーターの二重交差ノックアウト、および天然crtN3遺伝子のノックアウトを含有して、天然C30カロテノイド米国特許出願第60/527083号明細書の合成を中断する。このMWM1200株は、米国特許出願第09/941947号明細書で述べられる一般条件を使用して、受容株として生育できる。簡単に述べると、少なくとも8:1の気体/液体比すなわち総容積160mL中の20mLの硝酸塩液体BTZ-3培地を使用して、30°Cで絶え間なく振盪しながら、メチロモナスMethylomonas16aMWM1200株をイリノイ州ホイートンのホイートンサイエンティフィックWheatonScientificWheaton,ILからの血清ストッパーホイートンボトルWheatonbottles中で生育させた。メチロモナスMethylomonas16Aのための硝酸塩培地ここで合成培地またはBTZ-3培地とも称される硝酸塩液体培地は、下で示されるように表5および6溶液1と混合された様々な塩を含んでなり、明記される場合は、硝酸塩は15mM塩化アンモニウムで置き換えられた。溶液1は、微量元素の100倍濃縮原液のための組成を提供する。培養のための標準気相は、空気中に25のメタンを含有する。メチロモナスMethylomonas種16aMWM1200受容株をこれらの条件下で48時間BTZ-3培地中で培養し、BTZ-3で3回洗浄し、元の培養容積のおよそ150倍の濃度に相当する容積のBTZ-3に再懸濁した。0.5w/vの酵母抽出物を含有するBTZ-3寒天プレート表面で、ドナー、ヘルパー、および受容細胞ペーストをそれぞれ1:1:2の比率で合わせた。プレートを25メタン中で30°Cに16~72時間維持して接合を生じさせ、その後細胞ペーストを収集してBTZ-3に再懸濁した。カナマイシン50μg/mLを含有するBTZ-3寒天に希釈溶液を播種して、25メタン中で30°Cで1週間までインキュベートした。橙赤色の接合完了体をカナマイシン50μg/mLと共にBTZ-3寒天上に画線した。カロテノイド組成物の分析のために、接合完了体をカナマイシン50μg/mLを含有する25mLBTZ-3中で培養し、唯一の炭素源として25メタン中で30°Cで1週間までインキュベートして、細胞を遠心分離によって採取して-20°Cで凍結した。解凍後実施例1に述べるようにペレットを抽出し、HPLCでカロテノイド含量を分析した。pDCQ340を含有するメチロモナスMethylomonas16aMWM1200からの抽出物のHPLC分析図5は、β-カロテンの合成を示した。pDCQ341またはpDCQ342のいずれかを含有するメチロモナスMethylomonas16aMWM1200はカンタキサンチンを合成し、それはこのメタノトローフ宿主中の新しいケトラーゼのケトラーゼ活性を証明した。"