細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子であって、およびSEQIDNO2~SEQIDNO4のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性をその全長にわたって有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつアミノ酸配列を有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも200の効率で細胞内に内部移行される、ペプチド分子。前記ペプチドの少なくとも一部がαへリックス二次構造を形成している、請求項1記載のペプチド。哺乳動物、好ましくはヒト由来のものである、請求項1または2記載のペプチド。請求項1~3のいずれか一項記載のペプチドをコードする、核酸分子。請求項4記載の核酸分子を含む、ベクター。請求項5記載のベクターを含む、宿主細胞。請求項1~3のいずれか一項記載のペプチドの生産方法であって:請求項6記載の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階;および産生されたペプチドを単離する段階を含む、方法。1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに結合されており、該結合が共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成されている、請求項1~3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを含む組成物。少なくとも1つのペプチドが1つ以上の他のペプチドに結合されている、請求項8記載の組成物。前記1つ以上の他のペプチドが少なくとも部分的にαへリックス二次構造を形成している、請求項9記載の組成物。前記1つ以上の他のペプチドがプロアポトーシス性ペプチドである、請求項9または10記載の組成物。請求項8~11のいずれか一項記載の組成物の生産方法であって:請求項1~3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドを提供する段階;および該少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階を含む、方法。請求項1~5のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8~11のいずれか一項記載の組成物の内部移行挙動を検出する方法であって:該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階;および該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階を含む、方法。請求項1~3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドまたは請求項8~11のいずれか一項記載の組成物を含み、かつ任意に、1種以上の薬学的に許容される賦形剤およびまたは添加剤をさらに含む、薬学的組成物。1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための、請求項1~3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8~11のいずれか一項記載の組成物の使用。癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防およびまたは治療に使用するための、請求項1~3のいずれか一項記載のペプチドまたは請求項8~11のいずれか一項記載の組成物。請求項1~3のいずれか一項記載の少なくとも1つのペプチドまたは請求項8~11のいずれか一項記載の組成物を対象に投与する段階を含む、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防およびまたは治療の方法。以下の少なくともいずれか1つを含むキットオブパーツ:請求項1~3のいずれか一項記載のペプチド;請求項4記載の核酸分子;請求項5記載のベクター;請求項6記載の宿主細胞;および請求項8~11のいずれか一項記載の組成物。発明の詳細な説明本発明は、バイオインフォマティクス的スクリーニングと候補ペプチドのその後の実験的評価を組み合わせることによって、以前のゴールドスタンダード基準ペプチドTATに比べて、優れた機能性プロファイル、特に、高い全体的なトランスフェクション効率、血清の存在下での高いトランスフェクション活性、ならびに低度の細胞毒性を示す、いくつかのCPPを同定することができた、という予期せざる知見に基づいている。驚くべきことに、これらのCPPはその一次アミノ酸配列に関していかなる有意な類似性も示さない。かくして、これらのペプチドは治療的介入のための新しい強力な送達剤の開発におけるモジュールとして役立つ可能性がある。以下で例示的に説明される本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない要素、限定の非存在下で、適切に実施することが可能である。用語含むが本明細書および特許請求の範囲で用いられるとき、それは他の要素またはステップを排除するものではない。本発明において、用語からなるは、用語含むの好ましい態様であると考えられる。以後、ある群が少なくとも一定数の態様を含むように定義される場合、それはまた、これらの態様のみから好ましくはなる群を開示していると理解されるべきである。単数形の名詞に言及する際に不定冠詞または定冠詞、例えばa、anまたはtheが用いられる場合、特に断りのない限り、これはその名詞の複数形を含むものである。本発明との関連で数値が示される場合、当業者は、問題になっている構成の技術的効果が、与えられた数値の±10、好ましくは±5の偏差を一般に包含する、精度の区間内で確保されることを理解するであろう。さらに、本明細書および特許請求の範囲中の第1、第2、第3、、、などの用語は、類似の要素同士を区別するために用いられ、必ずしも逐次的または時間的な順序を記述するために用いられるものではない。そのような用語は適切な状況下で交換可能であり、また、本明細書に記載した本発明の態様は本明細書で説明または例示した順序以外の順序で操作が可能であることを理解すべきである。用語のさらなる定義は、その用語が用いられる文脈において以下で与えられる。以下の用語または定義は単に本発明の理解を助けるために提供される。これらの定義は、当業者が理解している範囲よりも狭いと解釈されるべきではない。第1の局面において、本発明は、細胞内に内部移行する能力があるペプチド分子に関し、ここにおいて、該ペプチド分子は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸残基の長さを有し;その一次アミノ酸配列中に少なくとも25、好ましくは少なくとも30の正に荷電したアミノ酸残基を含み;そしてアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQを有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80、好ましくは少なくとも90の効率で細胞内に内部移行される。本明細書中で用いる用語ペプチド分子は、複数の天然のまたは修飾されたアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されている、天然に存在するまたは合成の直鎖状の巨大分子を指す。そうしたペプチドは、少なくとも2つの同一のまたは異なるペプチド分子からなるオリゴマーを形成することができる。本発明のペプチドは、少なくとも10アミノ酸残基の長さを有し、好ましくは、少なくとも15アミノ酸残基の、少なくとも20アミノ酸残基の、少なくとも25アミノ酸残基の、少なくとも30アミノ酸残基の、少なくとも35アミノ酸残基の、少なくとも40アミノ酸残基の、または少なくとも45アミノ酸残基の長さを有する。特定の態様では、本発明のペプチドは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、43、44または45アミノ酸残基の長さを有する。本明細書中で用いる用語天然のアミノ酸残基とは、自然界でペプチドに組み込まれている22種類の標準アミノ酸のいずれかを意味する。これら22種類のうち、20は普遍的遺伝子暗号によって直接コードされる。残りの2つ、セレノシステインとピロリシンは、ユニークな合成機構によってタンパク質に組み込まれる。一般的に、本発明によるペプチドのアミノ酸残基はL異性体として存在する。いくつかの態様では、本発明によるペプチドの1個以上のアミノ酸残基はD異性体として存在する。本明細書中で用いる修飾されたアミノ酸残基とは、翻訳後修飾されたアミノ酸のような非標準アミノ酸を意味する。翻訳後修飾の例としては、特に、リン酸化、グリコシル化、アシル化、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化、ビオチン化、ユビキチン化、化学的性質の変化が挙げられる。本明細書中で定義されるペプチドのアミノ酸配列は、一般的な規則に従って、アミノ末端からカルボキシル末端へと記載される。しかし、対応するリバースペプチドもまた、本発明の範囲内である。本明細書中で用いる用語リバースペプチドとは、その通常のカウンターパートと同じ配列を有するが、逆方向、すなわちC末端からN末端の方向にあるペプチドを表す。例えば、通常のTATペプチドはアミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQをもつ。対応するリバースTATペプチドはアミノ酸配列QPPRRRQRRKKRGをもつ。本発明のペプチドは、それぞれの一次アミノ酸配列中に少なくとも25、好ましくは少なくとも30の正に荷電したアミノ酸残基を有する。本明細書中で用いる用語正に荷電したアミノ酸は、特定のペプチド中に存在するリシン、ヒスチジンおよびアルギニン残基の全体を表す。特定の態様では、本発明のペプチドは、その一次アミノ酸配列中に25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35の正に荷電したアミノ酸残基を含む。他の態様では、本発明のペプチドは、それぞれの一次アミノ酸配列中に少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、または少なくとも60の正に荷電したアミノ酸残基を含む。本明細書中で用いる用語細胞内に内部移行する能力があるとは、細胞膜、エンドソーム膜、および小胞体の膜を含むを通過するペプチドの能力、およびまたは所定の薬剤またはカーゴにこれらの細胞膜を通過させるペプチドの能力を指す。そのような細胞膜通過は本明細書では細胞透過とも呼ばれる。それに応じて、前記細胞膜を通過する能力があるペプチドは本明細書では細胞透過性ペプチドと呼ばれる。本発明においては、あらゆる可能な内部移行機構が想定され、例えば、エネルギー依存性輸送機構とエネルギー非依存性輸送機構の両方が含まれる。本明細書中で用いる用語内部移行は、原形質膜を通過したペプチドの少なくとも一部の細胞質への局在を含むものとして理解されるべきである。特定の態様において、用いた所定の輸送機構は、内部移行されたペプチドまたは組成物の少なくとも001、少なくとも005、少なくとも01、少なくとも05、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも5、または少なくとも10が細胞質に局在することを保証する。本発明のペプチドは、アミノ酸配列前掲も参照のことを有するTATペプチドの内部移行効率の少なくとも80、好ましくは少なくとも90の効率で細胞内に内部移行される。言い換えれば、ペプチドの機能的活性は基準ペプチドと比較して特徴づけられる。特定の態様では、本発明のペプチドは、TATペプチドの内部移行効率の80、85、90または95の効率で内部移行される。特定の好ましい態様では、本発明のペプチドは、TATペプチドと少なくとも同じ効率で内部移行される。特に好ましくは、本発明のペプチドは、TATペプチドより高い効率で、例えば、TATペプチドの内部移行効率の105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190、または200で内部移行される。本明細書中で用いる用語内部移行効率とは、広い意味で理解されるべきである。この用語は、本発明のペプチドが細胞の原形質膜を通過する程度を指すだけでなく、ペプチドが所定の薬剤またはカーゴに細胞の原形質膜を通過させる効率ともいうを指す。所定のペプチドの内部移行挙動およびまたはトランスフェクション能力を判定する方法が当技術分野では数多く確立されており、例えば、ペプチドに検出可能な標識を結合させることによる方法、またはペプチドをレポーター分子に融合させる方法などがあり、したがって、いったんペプチドの細胞内取り込みが起こったら、例えばFACS解析を用いてまたは特異的抗体を介して、検出が可能になるCurrentProtocolsinMolecularBiologyWileySonsHobokenNJUSAを参照されたい。当業者はまた、そのような方法で用いられるペプチドの、該当する場合はカーゴの、それぞれの濃度範囲を選択する方法を十分に把握している。こうした濃度範囲はペプチドの性質、カーゴの大きさ、用いる細胞型などに左右される。さらなる態様において、本発明のペプチドは、内部移行された後で、それぞれの標的細胞に有意な細胞毒性およびまたは免疫原作用を及ぼすことがなく、すなわち、それらは細胞の生存を妨げることがない。本明細書中で用いる用語有意でないとは、標的細胞の50未満、好ましくは40または30未満、特に20または10未満が本発明のペプチドの内部移行後に死滅することである、と理解されるべきである。他の態様では、細胞への内部移行後に本発明のペプチドが及ぼす細胞毒性の作用は、アミノ酸配列を有するTATペプチドが及ぼす対応する作用と同じまたはより低いものである。特定の態様では、細胞への内部移行後に本発明のペプチドが及ぼす細胞毒性の作用は、TATペプチドが及ぼす作用の95未満、90未満、85未満、80未満、75未満、70未満、60未満、50未満、40未満、30未満、20未満、または10未満である。当業者は、所定の化合物の細胞毒性およびまたはそうした化合物が適用される所定の標的細胞の生存率を測定する方法について熟知している前掲をも参照されたい。対応するアッセイキットはさまざまな供給業者から市販されている。特定の態様において、本発明のペプチドの潜在的な固有の細胞毒性およびまたは免疫原作用は、例えば化学合成または組換えDNA技術を用いて、ペプチドに1つ以上の修飾を導入することによってマスクすることができる。そのような修飾は、例えば、官能基の付加、除去もしくは置換、またはそうした官能基の位置の変化に関するものであり得る。当業者は、所定のペプチドのそのようなマスキングをどのように達成すればよいのか、よく承知している。さらなる態様において、本発明のペプチド分子は、少なくとも1つの構造化されたドメイン、すなわち、直鎖状配列で互いに近接して配置されたアミノ酸残基の特定の空間的配置である、安定した二次構造を形成している要素を含む。多くの場合、アミノ酸残基間の立体的関係は一般的なものであって、αへリックスおよびβ鎖などの当技術分野でよく知られた周期的構造を生じさせる。本発明の範囲内で、ペプチド分子は、非構造化部分に取り囲まれた1つのそのような構造化ドメインを含んでもよいし、あるいは互いに分離された2つ以上のそうした構造化ドメインを含んでもよい。いくつかの態様では、ペプチド分子がその全長にわたって二次構造を形成している。好ましい態様において、本明細書で定義したペプチド分子の少なくとも一部は、αへリックス二次構造を形成する。αへリックス要素は少なくとも4または6個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも8または10個のアミノ酸残基を含むことができる。特定の態様では、本発明のペプチド分子は唯一の二次構造として単一のαへリックス要素を含む。好ましい態様において、本発明のペプチド分子は哺乳動物由来のものであり、すなわち、それらはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマまたはサルなどの生物に由来する。特に好ましくは、ペプチド分子はヒト由来のものであり、すなわち、それらはヒト配列に由来するか、またはヒト配列に相当する。本明細書中で用いる用語ヒト配列に由来するとは、天然に存在するヒト配列に比較して、マイナーな修飾を保有するヒト由来の配列を意味する。本明細書中で用いる用語ヒト配列に相当するとは、天然に存在するヒト配列と同一である配列を意味する。さらなる好ましい態様において、本発明のペプチド分子は、;SEQIDNO10;およびSEQIDNO2~SEQIDNO10のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性をその全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。特に好ましい態様において、ペプチドはSEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、およびSEQIDNO2~SEQIDNO4のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。本明細書中で用いる用語配列同一性パーセントとは、テンプレートアミノ酸配列の全長を構成するアミノ酸残基の数と比較したときの、2つ以上のアライメントしたアミノ酸配列の同一アミノ酸のマッチ数を表す。言い換えれば、2つ以上の配列または部分配列に対してアライメントを用いる場合、同一であるアミノ酸残基のパーセントは、比較ウィンドウにわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて測定される指定領域にわたって、配列を比較して、最大の一致のためにアライメントする場合、あるいは配列を手動でアライメントして目視により検査する場合に、決定することができる。かくして、上記の定義は、SEQIDNO2~SEQIDNO10の全長配列のみならず、SEQIDNO2~SEQIDNO10のいずれかに含まれる少なくとも10、好ましくは少なくとも15アミノ酸配列の任意のトランケーションにも適用される。2つのタンパク質配列間の同一性レベルを評価するために、当技術分野で知られている適当なコンピュータプログラムを用いて、それらをコンピュータ上でアライメントすることができる。そのようなプログラムとして、特にBLASTJMolBiol215403410、FASTAScience22714351441、またはSmithWatermanアルゴリズムJMolBiol147195197の実行が挙げられる。これらのプログラムは、ペアワイズ配列アライメントを提供することに加えて、さらに配列同一性レベルおよび偶然によるそのアライメントの発生の確率をも報告する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとしてワード長3および期待値10を使用する。BLOSUM62スコア行列ProcNatlAcadSciUSA891091510919は、アライメント50、期待値10、M5、N4、および両鎖の比較を用いる。CLUSTALWNuclAcidsRes246734680のようなコンピュータプログラムは、3つ以上の配列をアライメントするために用いることができる。さらに、CLUSTALWではその同一性の計算において配列ギャップが考慮される。アミノ酸配列が、その全長にわたり、SEQIDNO2~SEQIDNO10のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性を有する限り、それは本発明の態様の範囲内である。存在するアミノ酸変化のタイプは無関係である。特定の態様では、アミノ酸配列誘導体は、SEQIDNO2~SEQIDNO10のいずれか1つに対して少なくとも70、少なくとも72、少なくとも74、少なくとも76、または少なくとも78の全体的な配列同一性を有する。好ましくは、アミノ酸配列誘導体は、SEQIDNO2~SEQIDNO10のいずれか1つに対して少なくとも80、少なくとも82、少なくとも84、少なくとも86、少なくとも88、少なくとも90、少なくとも92、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、または少なくとも99の全体的な配列同一性を有する。第2の局面において、本発明は、本明細書中で先に定義したペプチド分子をコードする核酸分子に関する。本明細書中で用いる用語核酸分子は、本発明のペプチドをコードする任意の核酸を表す。そのような核酸分子の例には、天然に存在する核酸、例えばデオキシリボ核酸またはリボ核酸、ならびに化学合成されるかまたは組換え遺伝子技術を用いて作製される人工的に設計された核酸、例えば核酸アナログ、特にペプチド核酸またはロックド核酸が含まれるMolecularcloningAlaboratorymanualColdSpringHarborNYColdSpringHarborLaboratoryPressを参照されたい。天然に存在する核酸の具体的な例としては、DNA配列、例えばゲノムDNAもしくはcDNA分子、ならびにRNA配列、例えばhnRNA、mRNAもしくはrRNA分子、またはそれらの逆相補的核酸配列が挙げられる。そうした核酸は任意の長さのものであってよく、一本鎖または二本鎖分子のどちらでもよい。一般的に、本発明の標的核酸は長さが30~5000ヌクレオチド、例えば30~3000ヌクレオチド、45~2000ヌクレオチド、60~1000ヌクレオチド、または75~500ヌクレオチドである。本明細書中で用いる用語ヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を指すと理解すべきである。好ましくは、本発明の核酸分子は、その発現を可能にする遺伝子構築物の不可欠な部分として存在する。遺伝子構築物は、それが転写およびまたは翻訳調節に関する情報を含む配列要素を含む場合に、そしてそのような配列がペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている場合に、核酸分子を発現する能力がある、または核酸配列の発現を可能にすることができる、と称される。機能的な連結とは、調節配列要素と発現される配列とが遺伝子発現を可能にする方法で接続されている結合のことである。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は種間で異なることがあるが、一般には、これらの領域はプロモーターを含み、そのプロモーターは、原核生物では、プロモーターそれ自体、すなわち転写の開始を指令するDNA要素、ならびにRNAに転写されたとき翻訳開始のシグナルを出すDNA要素の両方を含む。そのようなプロモーター領域には通常、転写と翻訳に関与する5非コード配列、例えば、原核生物では3510ボックスおよびShineDalgarno要素、または真核生物ではTATAボックス、CAAT配列および5キャップ形成要素が含まれる。これらの領域はまた、エンハンサーまたはリプレッサー要素、ならびに天然のポリペプチドを宿主細胞の特定のコンパートメントに標的化するための翻訳されるシグナルおよびリーダー配列を含むことができる。適当な原核生物プロモーターとしては、特に大腸菌のlacUV5、trp、tetおよびtacプロモーター、ならびにT7ファージプロモーターが挙げられる。適当な真核生物プロモーターとしては、特にSV40初期および後期プロモーター、RSVおよびCMVプロモーター、ならびに酵母AOX1およびGAL1プロモーターが挙げられる。さらに、3非コード配列は転写終結、ポリアデニル化などに関与する調節要素を含むことができる。しかし、これらの終結配列が特定の宿主細胞内で十分に機能しない場合には、それらをその細胞内で機能するシグナルと置き換えることができる。当業者はこれらすべての調節要素に精通しており、所定の状況下で核酸分子を発現させるのに適したそのような要素の選択は当業者の常識の範囲内である。本発明の核酸分子は、必要に応じて発現カセットの一部として、ベクターまたは他のクローニング用運搬体内に含まれていてもよい。したがって、さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージ、人工染色体、または遺伝子工学で一般的に用いられる他の運搬体であり得る。好ましくは、ベクターは本発明の核酸分子の発現を指令することができる発現ベクターである。そうした発現ベクターは、上記の調節配列および発現される核酸配列を別として、少なくとも1つの複製起点、および発現のために用いる宿主と適合しうる種に由来する制御配列、ならびにトランスフェクトされた細胞に選択可能な表現型を付与する1つ以上の選択マーカーを含むことができる。2つ以上の複製起点を含む、特別に設計されたベクターは、細菌と真菌細胞間または細菌と動物細胞間など、異なる宿主間でDNA分子の移し変えが可能である。原核細胞に適した複製起点には、例えば、ColE1およびM13が含まれる。哺乳動物ベクター内の代表的な複製起点はSV40である。適切な原核細胞用の選択マーカーとしては、特にカナマイシン、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。真核細胞では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびグルタミンシンターゼ遺伝子が、使用される代表的な選択マーカーに相当する。組換えベクターを設計およびまたは変更するために使用できる方法は当技術分野で確立されている前掲を参照されたい。適切なベクターが数多く市販されており、当業者には周知である。さらに、当業者であれば、所定の状況下で関心対象の核酸分子を発現させるためにどのベクターが適しているかを判別することができる。そうしたベクターの例としては、とりわけ、原核生物用のベクター、例えばpUCシリーズ、pBluescript、pETシリーズ、pCRTOPO、λgt11、pBBR1MCSシリーズ、およびpBC2、ならびに哺乳動物細胞での発現に適合しうるベクター、例えばpCEP4、pXT1、pSG5、pRSVneo、pSV2dhfr、pcDNA3、pSIR、およびpIRESEGFPが挙げられる。ピキアパストリスでの遺伝子発現に適するプラスミドベクターの例としては、特にpAO815、pPIC9K、およびpPIC35Kが挙げられる。あるいは、本明細書中で定義した本発明の核酸分子はまた、別の核酸分子との翻訳融合体をもたらすようなベクター内に挿入することもできる。その別の核酸分子は、例えば、本発明のペプチドの溶解性を高めるおよびまたは精製を容易にするペプチドもしくはタンパク質をコードし得る。そのようなベクターの例としては、pET32、pET41、およびpET43が挙げられる。別の局面において、本発明は、本明細書で先に定義したベクターを含む宿主細胞に関する。核酸ベクターの宿主細胞への導入は、さまざまな形質転換、形質導入またはトランスフェクション法の手段によって達成することができ、それらのすべてが当技術分野で確立されている前掲を参照されたい。本発明の範囲内で、導入されたベクターは、独立した遺伝単位として宿主細胞内で増やして維持することができるか、またはそれは遺伝子組換えを介して宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。そうした組換えは非相同組換えによってゲノムのランダムな位置で、または相同組換えによってゲノムの特定の位置で、または部位特異的インテグラーゼを介して起こり得る。本発明の宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよいが、後者の細胞が好適である。適切な原核宿主細胞には、特に大腸菌、枯草菌、サルモネラ属菌種、およびアグロバクテリウムツメファシエンスが含まれる。適切な真核宿主細胞には、特に酵母、昆虫細胞S2細胞およびヨトウガSf9細胞、および植物細胞が含まれる。好ましくは、本発明で用いる真核宿主細胞は哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、特に不死化細胞株、例えばヒトHela、HEK293、H9、MCF7、およびJurkat細胞、マウスNIH3T3、C127、およびL細胞、サルCOS1およびCOS7細胞、ウズラQC13細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられる。これらすべての宿主細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションまたはドイツ微生物培養細胞コレクションなどの寄託機関に加えて、さまざまな商業的供給業者からも入手することができる。また、初代哺乳動物細胞、すなわち生物から直接得られた細胞は、本発明の範囲内である。適切な初代細胞の例には、心筋細胞、初代肝細胞、線維芽細胞、神経細胞、ならびに幹細胞が含まれる。初代細胞に由来する安定した不死化細胞株も本発明の範囲内である。いくつかの態様において、本発明の宿主細胞は多細胞生物の一部を構成している。言い換えれば、本発明はまた、本明細書で定義した少なくとも1つの宿主細胞を含むトランスジェニック生物に関する。好ましくは、トランスジェニック生物は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、サルまたはヒトである。さらなる局面において、本発明は、本明細書で定義したペプチドの生産方法に関し、その方法は、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する段階;および産生されたペプチドを単離する段階を含む。多くの適切な方法がペプチドを適切な宿主細胞内で産生させるために利用可能である。原核細胞または哺乳動物細胞株などの単細胞宿主を用いる場合、当業者はさまざまな培養条件に戻すことができる。好都合なことに、産生されたペプチドは培養培地、培養細胞の溶解物もしくは抽出物から、または単離された膜から、確立された手法により収穫される前掲を参照されたい。宿主細胞が多細胞生物の一部である場合には、これらの細胞の部分が本発明のペプチドを単離するための供給源となり得る。上記の宿主細胞に適した培養培地および条件は当技術分野で周知である。例えば、細菌培養に適した条件では、ルリアベルターニ培地で通気下に細菌を増殖させる必要がある。発現産物の収量および溶解性を高めるためには、培地を緩衝化したり、当技術分野で公知の適当な添加剤を培地に補充したりすることができる。一般的に、大腸菌は4~37°Cで培養されるが、正確な温度または一連の温度は発現される分子によって決まる。一般に、当業者はまた、こうした条件を宿主の要求と発現されるペプチドまたはタンパク質の要件に適応させねばならないことも分かっている。宿主細胞内での関心対象の核酸分子の発現を調節するために誘導性発現系が用いられる場合は、適切な誘導剤の添加によって発現を引き出すことができる。使用する特定の細胞型およびその特定の増殖要件に応じて、哺乳動物細胞の培養は、例えば、10FCS、2mMLグルタミン、および100Umlペニシリンストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地またはDMEMで行うことができる。あるいはまた、血清濃度を低減させた増殖培地、例えばOptiMEMを使用してもよい。細胞は5CO2の水飽和雰囲気下に37°Cでインキュベートすることが可能である。昆虫細胞の培養に適した培地には、特に10FCSを添加したTNM、またはSF900培地が含まれる。昆虫細胞は通常、27°Cで付着培養または懸濁培養として増殖させる。原核細胞と真核細胞の両方に適した発現プロトコルは当技術分野で周知である前掲を参照されたい。それぞれのアッセイ系、キットおよび試薬はさまざまな供給業者から市販されている。本発明のペプチド分子を生産するための代替方法には、mRNAのインビトロ翻訳が含まれる。適当な無細胞インビトロ翻訳システムとしては、とりわけ、ウサギ網状赤血球溶血液、コムギ胚芽抽出液、イヌ膵臓ミクロソーム液、大腸菌S30抽出液、ならびに連続した転写翻訳システムが挙げられる。対応するアッセイ系はさまざまな供給業者から市販されている。産生されたペプチドの単離方法は当技術分野で周知であり、とりわけ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、、高圧液体クロマトグラフィー、逆相HPLC、ディスクゲル電気泳動、および免疫沈降が挙げられる前掲を参照されたい。別の局面において、本発明は、少なくとも1つの他の成分に結合されている、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドを含む組成物に関し、前記の少なくとも1つの他の成分は好ましくは1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つであり、ここにおいて、前記結合は共有結合および非共有結合からなる群より選択される結合によって達成される。本明細書中で用いる用語結合とは、その最も広い意味で理解されるべきであり、すなわち、それは2つ以上の化合物間の分子間相互作用の任意のタイプを指す。用語共有結合は、得られる分子を結び付ける相互引力を生じさせる、2つの成分間の1対以上の電子の共有によって特徴づけられる化学結合の分子内形態を指す。用語非共有結合は、分子同士または分子の部分同士を通常は特定の方向または配置で結び付けるための力を提供する分子間または分子の部分間の、天然では共有結合性でない、さまざまな相互作用を指す。そのような非共有結合相互作用には、特にイオン結合、疎水相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、および双極子双極子結合が含まれる。共有結合の場合には、本発明のペプチドは少なくとも1つの他の成分に直接連結させるか、または本発明のペプチドと少なくとも1つの他の成分を物理的に分離するのに役立つリンカー分子を介して連結させることができる。少なくとも1つの他の成分に応じて、リンカーは、例えばペプチド結合、アミノ酸、適切な長さのペプチド、または所望の機能を提供する異なる分子であり得る。特定の態様では、リンカーはリシンまたはアルギニン残基であり、そのεアミノ基は本明細書で定義したペプチドを種々の他の成分に連結させるのに適している。当業者は、一般的な知識に基づいて、適切なリンカー分子、特にリンカーペプチドを設計する方法を知っている。例えば、ペプチドリンカーはLIPデータベースProtEng56979985から選択することができる。そうしたリンカーは、本発明のペプチドのNまたはC末端に、適切と見なされる場合には、非末端アミノ酸残基にも、結合させることができる。好ましい態様において、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つの他の成分に非共有結合相互作用を介して、例えば複合体形成を介して、結合される。他の特定の態様において、本明細書中で先に定義した少なくとも1つのペプチドは、少なくとも1つの他の成分に共有結合相互作用を介して、例えば融合分子の形で、結合される。本明細書中で用いる用語融合分子は、少なくとも1つの他の成分に連結された本発明のペプチドを含み、それゆえ単一の化学種を形成している、少なくとも2つの成分からなる分子を意味する。ペプチドと少なくとも1つの他の成分は、先に記載したようにリンカーによって分離されていても、直接連結されていてもよい。少なくとも1つの他の成分は、本発明のペプチドにN末端、C末端または末端アミノ酸以外の任意のアミノ酸で融合させることができるが、N末端への融合が好適である。追加の成分を、融合分子にすでに含まれている成分に融合させることも可能である。当業者は、本発明の融合分子中の成分の最適な順序およびまたはそれらの組み合わせを判別するためのアッセイを熟知している。一般的に、融合分子が本発明のペプチドと少なくとも1つの他のペプチドを含むとき、その用語は、融合が結果的に天然のペプチドをもたらす場合の融合分子を含まない。本発明のペプチドの生産について先に記載した方法に従って、融合分子を生産し、単離することができる。本発明の組成物は本明細書中で定義した1つ以上のペプチドを含むことができる。少なくとも2つの複数のペプチドの場合、これらは同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る。その逆に、本発明の少なくとも1つのペプチドが2つ以上の他の成分に結合される場合、これらの成分は同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る。特定の態様では、本発明の単一のペプチドが2つ以上の複数の他の成分に結合される。他の態様では、2つ以上の複数の本発明のペプチドが単一の他の成分に結合される。好ましい態様において、少なくとも1つの他の成分は、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドまたはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群より選択される。本発明による組成物はまた、さらなる成分を含むことができ、例えば、本明細書中で定義した1つ以上のペプチドと少なくとも1つの他の成分との結合を安定化させるための作用剤;組成物を保護するための作用剤;または細胞への取り込みを促進するために組成物の正味電荷を補償するための作用剤を含んでいてよい。本明細書中で用いる用語小分子とは、その最も広い意味で理解されるべきであり、それは低分子量の有機化合物を含むだけでなく、標識およびレポーター分子、ハプテン、例えばヒドララジン、ウルシオール、フルオレセイン、ビオチン、およびジゴキシゲニン、ならびにアプタマーをも含むものである。本明細書中で用いる用語ナノ粒子とは、少なくとも1つの寸法が100nm未満の微細粒子を表す。一般的に、ナノ粒子は50nm~500nmの範囲の直径を有し、生理学的環境で構造的に安定しており、かつ薬物または他の生物活性剤などのより小さい分子を収容することが可能であり、その後所望の部位に送達され得るものである。多くのナノ粒子は温度感受性およびまたはpH感受性であり、すなわち、それらは加熱およびまたはpHの変化によりそれらのカーゴを放出する。そのようなナノキャリアは、閉じ込められた化合物が解放されるまで、分解および消化液からそれらの化合物を保護している。特定の態様において、組成物中に含まれる本発明の少なくとも1つのペプチドは、1つ以上の核酸分子に結合される。好ましくは、1つ以上の核酸分子が結合される本発明の少なくとも1つのペプチドは、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、およびSEQIDNO2~SEQIDNO4のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチドが結合される1つ以上の核酸分子は、任意の長さの天然のまたは人工的なDNA分子もしくはRNA分子とすることができ、それらは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。2つ以上の核酸分子が少なくとも1つのペプチドに結合される態様では、これらの核酸分子は同じタイプまたは異なるタイプのものであり得る。一般的には、本発明の1つのペプチドが単一の核酸分子に結合される。特定の態様において、1つ以上の核酸分子はRNA分子であり、一般的には、小さい非コードRNA分子であり、好ましくは、RNA分子はsiRNA分子、miRNA分子、およびshRNA分子からなる群より選択される。本明細書中で用いる用語miRNA分子は、当技術分野での通常の意味を有するCell23281292HeLandHannonGJNatRevGenet5522531に概説される。したがって、用語マイクロRNAは、局所RNA前駆体miRNA構造を形成することができる、転写産物からプロセッシングされたゲノム遺伝子座由来の内因性RNA分子を表す。成熟miRNAは通常20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さであるが、他の数のヌクレオチド、例えば18、19、26または27ヌクレオチドも存在し得る。miRNAをコードする配列は、フランキングゲノム配列と対合して、成熟miRNAを不完全なRNA二重鎖内に配置する能力があり、このRNA二重鎖はより長い前駆体転写産物からのmiRNAのプロセッシングのための中間体として機能する。このプロセッシングは一般に、それぞれDroshaとDicerと呼ばれる2種類の特異的なエンドヌクレアーゼの連続作用を介して起こる。Droshaは、一次転写産物から、一般的にはヘアピンまたはステムループ構造に折りたたまれるmiRNA前駆体を生成する。このmiRNA前駆体から、miRNA二重鎖がDicerによって切り出され、それはヘアピンまたはステムループ構造の一方のアームに成熟miRNAを、他方のアームに同様のサイズのセグメントを含む。その後miRNAはその機能を発揮するためにその標的mRNAへと導かれるが、miRNAはほとんどの場合分解される。miRNAとその標的との相補性の程度に応じて、miRNAは異なる調節プロセスを導くことができる。miRNAに高度に相補的な標的mRNAはRNA干渉と同じメカニズムにより特異的に切断され、そしてmiRNAは短鎖干渉性RNAとして機能する。miRNAにあまり相補的でない標的mRNAは、細胞分解経路に送られ、かつまたは翻訳が抑制される。しかしながら、miRNAがその標的mRNAの翻訳を抑制するメカニズムは、まだ論争中である。いくつかの態様において、本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチド分子に結合される1つ以上の核酸分子は、成熟miRNA分子である。他の態様では、miRNA前駆体分子が用いられる。本明細書中で用いる用語miRNA前駆体は、成熟miRNAがプロセッシングされるmiRNA一次転写産物の部分を指す。一般的に、premiRNAは安定したヘアピンまたはステムループ構造に折りたたまれる。ヘアピン構造は長さが50~120ヌクレオチド、一般には55~100ヌクレオチド、好ましくは60~90ヌクレオチドの範囲であると介在セグメントをカウントするが、より遠位の配列を除く。本明細書中で用いる用語siRNA分子もまた、当技術分野での通常の意味を有するNatRevDrugDisc3318329RanaTMNatRevMolCellBiol82336に概説される。したがって、siRNAは、一般にはその3末端に2ヌクレオチドオーバーハングがあって、その5末端にリン酸基がある、二本鎖RNA分子を表す。成熟siRNAは通常20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さであるが、他の数のヌクレオチド、例えば18、19、26または27ヌクレオチドも存在し得る。本発明の範囲内で、最大49ヌクレオチドまでの長さをもつsiRNA前駆体分子も同様に用いることができる。成熟siRNAはDicerによってそのような前駆体からプロセッシングされる。伝統的には、細胞に外因的に導入される干渉性RNAを指すために用語siRNAが用いられた。その間に、内在性siRNAがさまざまな生物で発見されており、少なくとも4つのクラスに分類される:トランス作動性siRNA、リピート関連siRNA、低分子スキャンRNAおよびPiwi相互作用性RNA前掲に概説される。siRNAの一方の鎖は、RNA誘導サイレンシング複合体として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれる。RISCは、このsiRNA鎖を用いて、取り込まれたsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的なmRNA標的分子を同定し、その後これらの標的mRNAを切断する。RISCに取り込まれるsiRNA鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られる。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られる他方のsiRNA鎖は、siRNAから取り除かれ、そして標的mRNAに少なくとも部分的に相同である。当業者であれば、原理的に、siRNAのいずれか一方の鎖がRISCに取り込まれて、ガイド鎖として機能し得ることを認識するだろう。しかし、siRNAの設計は、RISCへの所望のガイド鎖の取り込みに有利に働くことができる。siRNAのアンチセンス鎖はsiRNAの能動的なガイド剤である。というのは、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれ、その結果として、切断または翻訳抑制のためにアンチセンスsiRNA鎖に少なくとも部分的に相補的な標的mRNAをRISCが同定するのを可能にするからである。ガイド鎖に少なくとも部分的に相補的な配列を有するmRNAのRISC媒介切断は、そのmRNAおよび対応するタンパク質の定常状態レベルの減少につながる。本明細書中で用いる用語shRNA分子とは、ステムループまたはヘアピン構造のsiRNA二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含む人工的な一本鎖干渉性RNA分子を表す。このヘアピン構造のステムは一般に長さが19~29ヌクレオチドの範囲であり、そしてループは一般に4~15ヌクレオチドの長さであるNatBiotechnol23227231を参照されたい。通常、shRNA分子はDNA発現ベクター内でRNAポリメラーゼIIIプロモーターの制御下にコードされる。いくつかの態様において、上記のRNA分子はもっぱらリボヌクレオチド単位で構成される骨格構造を含む。他の態様では、そうしたRNA分子は少なくとも1つのリボヌクレオチド骨格単位と少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチド骨格単位を含む。さらに、RNA分子はリボースの2OH基の2Oメチル基または2Oメトキシエチル基への1つ以上の修飾を含むことができ、これによって、培養培地中でのヌクレアーゼ分解が防止され、かつ、重要なことには、小さいRNA分子の不可逆的阻害につながる、RNA誘導サイレンシング複合体ヌクレアーゼによるヌクレオチド鎖切断も防止された。2Oメチル化と機能的に同等であるもう1つの可能な修飾には、ロックド核酸が含まれ、これは、RNAを模倣する糖コンフォメーションでロックされた二環式フラノース単位を有する1つ以上のLNAヌクレオチド単量体を含む核酸アナログに相当するGene372137141を参照されたい。他のいくつかの態様において、本発明の少なくとも1つのペプチド分子に結合される核酸分子は、内在性miRNA発現のサイレンサーに相当する。そのようなサイレンサーの一例は、アンタゴミアと呼ばれる、化学的に作製されたオリゴヌクレオチドであり、これはコレステロールにコンジュゲート化された一本鎖23ヌクレオチドRNA分子に相当するNature438685689。このような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドに代わるものとして、トランスジーンから産生されるRNAとして細胞内で発現させることができるマイクロRNA阻害剤が作製された。マイクロRNAスポンジと呼ばれる、これらの競合阻害剤は強力なプロモーターから発現される転写産物であり、関心対象のマイクロRNAへの複数のタンデム結合部位を含むNatMethods4721726。特に好ましい態様において、前記組成物中に含まれる少なくとも1つのペプチドは、1つ以上の他のペプチドに結合される。本明細書中で用いる用語他のペプチドとは、これらのペプチドが、本明細書中で定義した、細胞内に内部移行する能力があるペプチドとは異なっている、ことを意味する。特に好ましくは、1つ以上の他のペプチド分子が結合される本発明の少なくとも1つのペプチドは、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、およびSEQIDNO2~SEQIDNO4のいずれか1つに対して少なくとも70、好ましくは少なくとも80の全体的な配列同一性を全長にわたり有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチドが結合される1つ以上の他のペプチドは、任意の長さの天然のまたは人工的な分子であり得る。例えば、そのような他のペプチドの長さは2~500アミノ酸または5~200アミノ酸の範囲とすることができる。一般的には、そうしたペプチドは8~100アミノ酸または10~50アミノ酸の長さを有する。好ましくは、そうしたペプチドの長さは10~40アミノ酸、12~35アミノ酸または15~30アミノ酸の範囲であり得る。人工的なペプチド分子は化学合成、組換えDNA技術またはそれらの組み合わせによって得ることができる。これらすべての合成方法は当技術分野で確立されている前掲を参照されたい。2つ以上の他のペプチド分子が本発明の少なくとも1つのペプチドに結合される態様において、これらの他のペプチド分子は、同じタイプのものまたは異なるタイプのものであり得る。一般的には、本発明の1つのペプチドが単一の他のペプチド分子に結合される。さらなる態様において、1つ以上の他のペプチド分子は、少なくとも1つの構造化されたドメイン、すなわち、直鎖状配列で互いに近接して配置されたアミノ酸残基の特定の空間的配置である、安定した二次構造を形成している要素を含む。多くの場合、アミノ酸残基間の立体的関係は、通常のものであって、αへリックスおよびβ鎖などの当技術分野でよく知られた周期的構造を生じさせる。ペプチド分子は、非構造化部分に取り囲まれた1つのそのような構造化ドメインを含んでもよいし、あるいは互いに分離された2つ以上のそうした構造化ドメインを含んでもよい。ペプチド分子はその全長にわたってそのような二次構造を形成することができる。2つ以上の他のペプチド分子が本明細書中で定義した組成物に含まれる場合には、他のペプチド分子の一部が少なくとも1つの構造化ドメインを含むのに対し、残りの部分が構造化されていないこともあり得る。好ましい態様において、本明細書中で定義した1つ以上の他のペプチド分子の少なくとも一部はαへリックス二次構造を形成する。αへリックス要素は少なくとも4または6個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも8または10個のアミノ酸残基を含むことができる。特定の態様では、本発明のペプチド分子は唯一の二次構造として単一のαへリックス要素を含む。他の特定の態様において、1つ以上の他のペプチドは、プロアポトーシス性ペプチド、すなわち、アポトーシスを誘導およびまたはモジュレートする能力があるペプチドである。当業者は、アポトーシスの開始およびまたは仲介に関与するタンパク質因子、ならびにプロアポトーシス機能を保持するペプチド配列を選択するための適切な手段に精通している。例えば、そのようなプロアポトーシス因子は、科学文献からだけでなく、APOPTOSISDatabaseなどの各種データベースからも取得することができるCellDeathDiff10621623。他の態様において、1つ以上の他のペプチドは、細胞腫瘍サプレッサーの活性化抑制解除、細胞癌遺伝子の阻害、および構成的に活性なタンパク質変異体の阻害からなる群より選択される機能を有する。さらに他の態様では、1つ以上のペプチドは、サイトカイン受容体、アンギオテンシン受容体、エンドセリン受容体、バソプレシン受容体、およびブラジキニン受容体などの細胞受容体の天然または合成のリガンドに相当する。この場合も同様に、多数のこの種のペプチドが当技術分野で周知であり、さまざまな供給源から容易に取得することができる。さらなる局面において、本発明は、本明細書中で先に定義した組成物の生産方法に関し、その方法は、本発明の少なくとも1つのペプチドを提供する段階;および少なくとも1つのペプチドを、1つ以上の核酸分子、1つ以上のペプチドもしくはタンパク質、1つ以上の小分子、および1つ以上のナノ粒子からなる群のいずれか1つに接触させ、それにより結合を形成させる段階を含む。当業者は、前記方法を実施するための適切な反応条件について熟知している前掲AusubelFMetal前掲を参照されたい。さらなる局面において、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明の組成物の内部移行挙動を検出する方法に関し、その方法は、該ペプチドまたは該組成物を1つ以上の細胞に投与する段階;および該ペプチドまたは該組成物の内部移行を検出する段階を含む。前記方法は、医療または研究目的のためのペプチドまたは組成物の適用可能性を予測するのに特に適している。ペプチドまたは組成物の効果的な内部移行が検出され、任意で、その局在が細胞質内である場合、それは、それぞれの化合物を特定の用途に使用できることを示している。そのために、本発明のペプチドまたは組成物は1つ以上の検出可能な標識に融合させることができる。本発明に従って使用できる標識には、化学的、物理的または酵素的反応で検出可能な化合物またはシグナルを直接または間接的に生成する任意の化合物が含まれる。標識化とその後の検出は当技術分野で周知の方法によって達成することができる前掲およびLottspeichFandZorbasHBioanalytikSpektrumAkademischerVerlagHeidelbergBerlinGermanyを参照されたい。標識は、とりわけ、蛍光標識、酵素標識、発色標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属、および金コロイドから選択することができる。これらすべてのタイプの標識は当技術分野で確立されており、さまざまな供給業者から商業的に入手することができる。そうした標識によって媒介される物理的反応の例は、照射による蛍光または燐光の放出である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼは、発色反応生成物の形成を触媒し、本発明で使用することができる酵素標識の例である。別の局面において、本発明は、1つ以上の細胞の形質転換またはトランスフェクションのための本明細書中で定義したペプチドまたは本明細書中で定義した組成物の使用、すなわち、特定の標的細胞にカーゴを輸送するための運搬手段としての前記化合物の適用に関する。特定の態様において、本発明は、特定の細胞のトランスフェクションおよびまたは特定の細胞への薬剤の標的送達のための、1つ以上の核酸分子および1つ以上のペプチドまたはタンパク質からなる群の少なくともいずれか1つに結合された本発明の少なくとも1つのペプチドを含む本明細書中で先に定義した組成物の使用に関する。さらに別の局面において、本発明は、本明細書中で定義した少なくとも1つのペプチド分子または本明細書中で定義した組成物を含み、必要に応じて、1種以上の薬学的に許容される賦形剤およびまたは添加剤をさらに含む薬学的組成物に関する。本明細書中で用いる用語薬学的組成物は、対象に、特にヒト患者に、投与するための組成物に関係する。本発明による薬学的組成物としては、当技術分野で確立された任意の医薬剤形、例えば、特にカプセル剤、マイクロカプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、粉剤、ペレット剤、多粒子製剤、腹腔内および非経口投与に適した製剤、または吸入もしくは吹送による投与に適した製剤が含まれる。投与は局所的でも全身的でもよい。薬学的組成物は確立された方法に従って調製することができるRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy第20版LippincottWilliamsWilkinsPhiladelphiaPACrowderTMetalAGuidetoPharmaceuticalParticulateScienceInterpharmCRCBocaRatonFLNiaziSKHandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulationsCRCPressBocaRatonFLを参照されたい。前記組成物を調製する場合、1種以上の薬学的に許容される、不活性な、無機または有機賦形剤を用いることができる。例えば、丸剤、錠剤、カプセル剤または顆粒剤を調製するために、例えば、乳糖、タルク、ステアリン酸およびその塩、脂肪、ワックス、固体または液体ポリオール、天然油および硬化油を使用することができる。溶液剤、懸濁液剤、乳剤、エアゾール混合物、または使用前に溶液剤もしくはエアゾール混合物に再調製するための粉剤を調製するのに適した賦形剤としては、特に水、アルコール、グリセロール、ポリオール、およびこれらの適当な混合物、ならびに植物油が挙げられる。薬学的組成物はまた、添加剤、例えば、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、安定剤、防腐剤、乳化剤、さらに溶剤もしくは可溶化剤、またはデポー効果を達成するための作用剤などを含んでもよい。後者は、本発明の活性ペプチドまたは組成物を徐放性もしくは持続放出性送達システムまたは標的化された送達システム、例えばリポソーム、ナノ粒子、およびマイクロカプセルに組み込むことができる、と理解されるべきである。本発明の薬学的組成物は適切な用量で対象に投与することができる。適用される特定の投薬レジメンは、主治医ならびに臨床的要因により決定されるだろう。医療分野では周知であるように、所定の患者のための適切な投与量は、患者の体格、性別および年齢、投与される特定の化合物、投与時間および経路、全身的な健康状態、既往歴、ならびに同時に投与される他の薬物を含めて、多くの要因に左右される。所定の状況のための治療有効量はルーチンワークの実験により容易に決定され、通常の臨床医または医師の技量と判断の範囲内である。一般的に、定期的な投与としての投与量は1日あたり1μg~1gの範囲とすべきである。しかし、好ましい投与量は1日あたり001mg~100mgの範囲、さらに好ましい投与量は001mg~50mgの範囲、最も好ましい投与量は1日あたり001mg~10mgの範囲であり得る。さらに別の局面において、本発明は、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防およびまたは治療に使用するための、本明細書中で定義したペプチドまたは本明細書中で定義した組成物に関する。この目的のために、本発明のペプチドまたは組成物は、本明細書中で先に定義した薬学的組成物に製剤化して、対象、好ましくはヒト患者に投与することができる。本明細書中で用いる用語癌とは、遺伝的再プログラミングに基づいた標的細胞の制御不能な分裂と、浸潤を介した隣接組織への直接増殖により、または転移による遠隔部位への着床により、波及する標的細胞の能力とによって特徴づけられる悪性新生物の任意のタイプまたは形態を意味する。例としては、特に乳癌、大腸癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、黒色腫、肝臓癌、および肺癌が挙げられる。本明細書中で用いる用語免疫疾患とは、免疫系のあらゆる障害を指す。そうした免疫疾患の例には、特に免疫不全症、過敏症、および自己免疫疾患が含まれる。本明細書中で用いる用語自己免疫疾患とは、内因性物質および組織に対する生体の過剰な免疫応答に起因するあらゆる障害を意味する、と理解されるべきである。自己免疫疾患の例としては、特に多発性硬化症、クローン病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、関節リウマチ、および多発性関節炎が挙げられる。本明細書中で用いる用語心血管疾患とは、心臓と冠状血管のあらゆる障害を指す。心血管疾患の例としては、特に冠状動脈性心臓病、狭心症、動脈硬化症、心筋症、心筋梗塞、虚血、および心筋炎が挙げられる。本明細書中で用いる用語神経疾患とは、中枢神経系の疾患および末梢神経系の疾患を含む神経系のあらゆる障害を指す。CNS疾患の例としては、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、閉じ込め症候群、およびトゥレット症候群が挙げられる。末梢神経系の疾患の例としては、例えば、多発単神経炎および多発ニューロパシーが挙げられる。本明細書中で用いる用語感染症とは、細菌、ウイルスまたは真菌などの外来病原体による宿主生物のコロニー形成に基づくあらゆる障害を指す。細菌感染症の例には、特に、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、リステリア症、百日咳、サルモネラ症、破傷風、およびチフスが含まれる。ウイルス感染症の例には、特に、風邪、インフルエンザ、デング熱、エボラ出血熱、肝炎、おたふく風邪、ポリオ、狂犬病、および天然痘が含まれる。真菌感染症の例には、特に、足白癬、ブラストミセス症、およびカンジダ症が含まれる。本明細書中で用いる用語炎症性疾患とは、例えば、にきび、喘息、花粉症、関節炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、および移植拒絶を含めて、炎症を伴うあらゆる障害を指す。さらなる局面において、本発明は、癌、免疫疾患、心血管疾患、神経疾患、感染症、および炎症性疾患からなる群より選択される症状の予防およびまたは治療方法に関し、その方法は、本発明の少なくとも1つのペプチドまたは本発明の組成物を対象に投与することを含む。好ましくは、対象はヒト患者である。最後の局面において、本発明は、以下の成分~の少なくともいずれか1つを含むキットオブパーツに関する:本明細書中で先に定義したペプチド分子;本明細書中で先に定義した核酸分子;本明細書中で先に定義したベクター;本明細書中で先に定義した宿主細胞;および本明細書中で先に定義した組成物。キットの種々の成分~は、1つ以上のバイアルなどの、1つ以上の容器に包装することができる。例えば、キットに含まれる各成分を別々の容器に包装してもよい。キットの上記成分は、凍結乾燥もしくは乾燥した形で、またはリン酸緩衝生理食塩水もしくはTrisEDTA緩衝液などの適切な緩衝液中に溶解した状態で、提供することができる。本発明の宿主細胞は、寒天プレート上に画線培養されたステップ培養として、または長期保存に適したいずれか他の形で提供することができる。このような保存方法は当技術分野で確立されている。キットはまた、特に防腐剤、上記成分の保存およびまたは再調製のための増殖培地およびまたは緩衝液、洗浄液などを含めて、追加の試薬を含むことができる。こうした試薬は成分~の1つ以上と組み合わせて、すなわち、同じ容器に入れて提供してもよい。あるいは、こうした追加の試薬の少なくとも一部を別々の容器で提供してもよい。本発明は、図面および以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは単に本発明の特定の態様を例示する目的のためのものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。実施例1:材料および方法11哺乳動物細胞培養MCF7細胞を96ウェルプレートに15000個ウェルの細胞密度で播種した。その細胞を10FCSとLグルタミンを添加したRPMI1640培地で37°C、5CO2および85湿度にて24時間インキュベートした。機能アッセイのため、細胞をOptiMEM培地で洗浄し、かつRPMI1640をOptiMEMで置き換えたから購入した。siRNAとペプチドの複合体は、100nMsiRNAを、示した濃度のペプチドとOptiMEM中で室温にて30分インキュベートすることによって形成させた。その複合体を細胞に添加して3時間インキュベートした。その後、OptiMEMを通常のRPMI1640増殖培地と交換した。細胞は、bDNA溶解液を生成するためにさらに21時間インキュベートし、CellTiterGloまたはCytoToxGloアッセイを行うためにさらに45時間インキュベートした。12mRNAレベルの定量化細胞のmRNAレベルの定量化のため、個々のmRNAレベルの検出を可能にするbDNAアッセイを行った。そのために、分析すべき細胞の特定数を96ウェルプレートに播種して、一晩付着させた。翌日、細胞をsiRNAでトランスフェクトした。さらに24時間後、QuantiGenePlex20アッセイキットを用いてメーカーの指示に従ってmRNA種を定量した。簡単に説明すると、細胞溶解物を遺伝子特異的プローブセットの存在下で捕捉プレートに移し、53°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、そのウェルを増幅剤およびアルカリホスファターゼ結合標識プローブと53°Cで順次インキュベートしたが、その合間に洗浄工程を入れた。続いて、発光AP基質ジオキセタンを添加して、53°Cで30分インキュベートした。発光はInfiniteF200発光プレートリーダーを用いてアッセイした。13細胞生存率アッセイ生細胞の数を測定するために、CellTiterGlo発光細胞生存率アッセイをメーカーのプロトコルに従って使用した。細胞をペプチドおよびsiRNAの存在下で48時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、存在するATPの量に比例する発光シグナルを生成させ、このシグナルはひいては、存在する生細胞の数に比例する。発光はInfiniteF200発光リーダーで解析した。14細胞毒性アッセイペプチドの細胞毒性を測定するため、CytoToxGlo細胞毒性アッセイをメーカーのプロトコルに従って使用した。細胞をペプチドおよびsiRNAの存在下で48時間インキュベートした。その後、細胞膜の完全性が失われた細胞から放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定するために、細胞を発光性ペプチド基質で処理した。この基質は生細胞の無傷の膜を通過することができず、生細胞の集団からは認めうるシグナルを生成しない。したがって、このアッセイの発光は死細胞を表す。その後、96ウェルプレートをInfiniteF200発光リーダーで解析した。15ペプチド合成ペプチド合成は、Fmoc化学を用いて自動AppliedBiosystemsABI433Aペプチド合成機で確立されたプロトコルに従って行った。反復サイクルで、それぞれのペプチド配列を、対応するFmocアミノ酸の連続的カップリングによって組み立てた。各カップリング工程において、N末端のFmoc基は、Nメチルピロリドン中の20ピペリジンで樹脂を処理することによって除去した。カップリングは、DMF中でHBTUHOBtとDIPEAにより活性化されたFmoc保護アミノ酸を用いて実施した。カップリング工程後、未反応のアミノ基を、NMP中でAc2O、DIPEAおよびHOBtの混合物で処理することによってキャップした。2工程の合間に、樹脂をNメチルピロリドンとDMFで十分に洗浄した。立体障害の大きいアミノ酸の取り込みは自動二重カップリングで達成された。この目的のために、中間キャッピング工程なしに1mmolの活性化ビルディングブロックで樹脂を2回処理した。目的配列の完成時に、Fmoc12アミノ4710トリオキサドデカン酸を、標準的な反応条件を用いて、ペプチドにカップリングさせた。続いて、FmocCysOHをすべてのペプチド配列のアミノ末端に結合させた。最後のFmoc脱保護の後に、ペプチド樹脂をフィルタフリットに入れて、トリフルオロ酢酸と水とトリイソプロピルシランの混合物で25時間処理した。切断溶液を濾過し、冷ジイソプロピルエーテルを添加してペプチドを沈殿させると、無色の固体が得られ、これをジイソプロピルエーテルで繰り返し洗浄した。粗生成物を酢酸と水の混合物中に再溶解し、凍結乾燥させ、分取逆相HPLCで01TFAを含むアセトニトリル水勾配を用いて精製した。16FACS解析FACS解析のため、MCF7細胞を、アキュターゼ中で15分インキュベートすることにより剥離させた。FACS緩衝液で洗浄した後、細胞を96ウェルの丸底マルチウェルプレートに3×105個mlの最終細胞密度で播種し、直ちに使用した。細胞はOptiMEM培地中で1μM、5μMおよび10μMのFITC標識ペプチドのそれぞれの存在下に37°Cで3時間インキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、プロテイナーゼK含有緩衝液中37°Cで30分インキュベートした。細胞を2回洗浄し、FITCチャネルを用いてFACSCantoIIで解析した。17ゲルシフトアッセイゲルシフトアッセイは、水中で500μgのsiRNA二重鎖をそれぞれのペプチドと所定のモル比で混合することによって行った。複合体を37°Cで1時間形成させ、エチジウムブロマイドを用いた25アガロースゲル上で分析した。プロテイナーゼK処理の場合は、1μlのプロテイナーゼKを上で示した標準反応に添加した。実施例2:潜在的なヒトCPPの同定21バイオインフォマティクス的アプローチHIV由来のTATCell5511891193VivesEetal前掲およびモデルペプチドのポリアルギニンProcNatlAcadSciUSA971300313008FutakiSetalJBiolChem27658365840により代表される、細胞透過性ペプチドの1つのグループは、正に荷電したアミノ酸の含有量が高いことによって特徴づけられる。その他のCPP、いわゆる傾斜ペプチドは、荷電した親水性アミノ酸のストレッチと荷電していない親油性アミノ酸のストレッチの両方で構成されているBiochimBiophysActa177815371544。それゆえ、CPPはこれらの特性を両方とも備えるべきであると推測したくなる。ヒトプロテオーム中でそのような配列を同定するために、バイオインフォマティクス的アプローチが採用された。図1は、ペプチドの候補リストを作成するために使用されたワークフローの概略図を示す。ペプチドのライブラリーを作製するために、スライディングウィンドウアプローチを用いた。30アミノ酸のウィンドウサイズを選択して、SwissProtタンパク質データベースの全エントリに適用した。これにより10459557個のペプチドのライブラリーが得られ、1024818個がユニークであった。163887個のペプチドは複数回見いだされ、これは数種のタンパク質の反復性を反映している。作製されたライブラリー内で、各ペプチド配列は、その対応するソース情報、ならびに起源タンパク質の遺伝子オントロジーアノテーションNatGenet252539にリンクされる。各ペプチドに関連づけられる追加の情報には、そのアミノ酸組成、例えば荷電数、等電点、および予測される疎水性が含まれる。30アミノ酸のスライディングウィンドウを用いることの理論的根拠は、より大きいペプチドは二次構造の点で構造化されている確率が高いので、通常CPPとして用いられるよりも大きいペプチドを得ることであった。こうした二次構造をもつペプチドは、非構造化ペプチドに比較して、細胞透過にとって有利であることが示されたBiochemistry4376987706。さらに、長さが12アミノ酸より短いαへリックスペプチドは、核酸分子と相互作用する能力、それゆえに核酸分子をトランスフェクトする能力が低いことが報告されたBioconjugChem10773780。さらなる工程では、正に荷電したモデルペプチドTATおよびPolyArgに対してより高い類似性をもつペプチドを得るために、一次アミノ酸配列中に30を超える正に荷電したアミノ酸残基、ヒスチジン、およびリシンを含むペプチドがフィルタにかけられた。このフィルタは227307個のペプチドをもたらした。得られた選択を、免疫系によって許容される可能性がより高いペプチドについて富化するために、これらの結果を対応するタンパク質エントリのGOにアライメントし、かつ細胞外タンパク質に限定した。最後に、このフィルタは、ペプチドの数を8630個から583個のタンパク質へと大幅に減少させた。22実験的特性評価のためのペプチド候補の選択ペプチド候補の数を減少させるに至った主な要因は、インシリコ手法から実験的ウエットラボ解析へのシフトであった。さらに、候補リストを短縮するための別の実際的な考慮事項は、取り扱いの容易さ、生物学的アッセイでの適用可能性、そして最後に薬理活性化合物を開発するための実現可能性であった。一方で、明らかに難溶性であるか、または合成するのが難しいペプチド配列は、さらなる評価から除外された。この最終段階の候補選択が単一の、またはおそらく2つの、ストリンジェントなパラメータによって決定されるのを避けるために、実験的評価のための最終候補リストは3つの異なるアプローチを用いてまとめられた:候補ペプチドの1つのサブセットは、少なくとも30の正に荷電した残基を含むだけでなく、多くの疎水性残基をも含むことにより特徴づけられる。それゆえに、ペプチドはそれらのIEPならびに疎水性に関してランク付けされた。両方のリストで最高得点を獲得した1000個のペプチドの交点から、29のタンパク質に由来する91のペプチドが得られた。最終的に、交点最高値をもつ20のタンパク質に由来する20のペプチドが選択された。候補の第2のサブセットはTATペプチド配列への類似性に基づいて得られた。すべてのペプチドはFASTAアルゴリズム前掲を用いて相同性の比較を行った。ペプチドはそれぞれのE値に従ってランク付けされた。このアプローチによって、10のタンパク質に由来する135のペプチドが得られた。最終的に、5つのタンパク質に由来する5つのペプチドがさらなる解析のために選択された。第3のサブセットとして、25の個々のタンパク質に由来する36の候補ペプチドが、それらの起源タンパク質の機能に関係する文献情報解析に基づいて、実験的評価のために選択された。タンパク質数に対するペプチド数の不一致は、1つのタンパク質からの複数の配列または1つの配列の種々の変異体の使用によって説明される。総じて、30アミノ酸残基の長さが維持されたが、既知モチーフがこうした30merを含むと同定された場合には、そのペプチドの長さを、FALLActaPharmacolSin25239245の場合のように39アミノ酸残基に、または多数のリパーゼのコンセンサス配列であるLIPConsCWTJLipidRes2916031611の場合のように48アミノ酸残基に延長した。制限はこれらの配列に関して得られた文献情報およびBLAST結果の慎重な解析に基づいていた。好ましいものは以下のペプチドであった:補体系の因子のような、膜を妨害することが知られているタンパク質に由来するペプチド;脂質を分解するタンパク質に由来するペプチド;FALLCurrOpinHematol164147またはBPIL3Immunogenetics54293300などの、殺菌性因子を生じさせるタンパク質に由来するペプチド;およびCPPとして作用することが報告されたペプチドに類似するペプチドJBiolChem27813101315ArrighiRBetalAntimicrobAgentsChemother5234143417。さらなる実験的評価を行ったすべてのペプチドは表1に記載される。初期フィルタの視覚的な実証のため、ペプチドのIEPをその疎水性に対してプロットした。ランダムに選択された500のペプチドに比較して、初期フィルタは明らかに、選択されたペプチドの蓄積につながった。さらなる比較のために、5つの陽性対照ペプチドも加えた。この解析からは、正に荷電した対照ペプチドTAT、REV、プロタミン、および10xArgがフィルタ基準に適合するのに対して、負に荷電した疎水性ペプチドであるINF7はこのスケールの他端に見いだされることが示される。選択されたヒト由来のCPP候補に加えて、CPP活性が報告された8つのペプチドを対照としてスクリーニングに加えた。これらのペプチドはヌクレオチドとの非共有結合複合体を形成することができ、トランスフェクション能力を備えている:HIVのトランス活性化タンパク質由来のCPPであるTATJBiolChem2784262542636;HIVのTAT関連ペプチドであるREV;正に荷電したペプチドの真正な例としてのpolyArgMolTher14343350;クロタミンJBiolChem2822134921360。さらに、トランケートされたプロタミンNatBiotechnol23709717およびパーフォリンのN末端をヒトペプチドの例として加えた。TAT様CPPのクラスに入らない、さらなる2つの対照は、インフルエンザウイルスHA由来のペプチドInf7JBiolChem2691291812924およびMTSJBiolChem2701425514258であった。実施例3:siRNAトランスフェクションを媒介するペプチドのスクリーニングsiRNAを哺乳動物細胞にトランスフェクトする能力について潜在的なCPPを分析するために、次第に増加するペプチド濃度を一定のsiRNA濃度とともに使用した。このペプチド濃度範囲は、TATなどの正に荷電したペプチドが10μMまでの範囲で細胞内に内部移行され、かつサイトゾルへの有意な放出なしに細胞内膜区画にとどまることが示されたことから、採用されたTraffic8848866。約5~10μMの閾値以上でのみ、これらのペプチドはサイトゾルに出ることがわかった。10nMsiRNAの濃度は、DharmaFECTトランスフェクション試薬を用いた対照実験で決定された飽和範囲にある。用いたsiRNAオリゴヌクレオチドは、ヒトAha1mRNAMolCell1013071318に対して、または対照としてのルシフェラーゼmRNAに対して向けられたものであったsiRNAと各ペプチドとの複合体をOptiMEM培地中で形成させ、室温で15分インキュベートした。その複合体の存在下にOptiMEM中で細胞を3時間インキュベートした。洗浄後、細胞を通常の増殖培地でさらに21または45時間インキュベートした。その後、Aha1mRNAと基準mRNAのレベルをbDNAアッセイにより測定した。これらのアッセイは、それぞれsiAHA1および対照siRNAでトランスフェクトされた細胞を用いて行った。特異的なRNAiの指標として、GAPDHmRNAレベルに対するAha1mRNAレベルの低下をsiAHA1トランスフェクト細胞とsiGL3トランスフェクト細胞において比較した。特異的siRNA媒介トランスフェクションは、siGL3トランスフェクト細胞に比較して、siAhA1トランスフェクト細胞においてAha1GAPDHmRNA値の低下を引き起こす。図3は、これらのアッセイのスクリーニング読み出しを表す:トランスフェクトされなかった対照細胞のAha1GAPDHmRNA値を100に設定し、それに比較してsiAha1またはsiGL3トランスフェクト細胞のAha1GAPDHmRNA値を表した。この正規化されたデータセットでは、siAha1およびsiGL3トランスフェクト細胞のそれぞれのAha1GAPDHmRNAレベル間の差を求めた。特定のペプチドは、siGL3トランスフェクションを減少させることなくsiAha1トランスフェクションの有意な減少を引き起こし、結果的に正の差分値になる。これらの値が顕著であればあるほど、より特異的なRNAiが観察される。選択されたサンプルでは、Aha1mRNAおよびまたはGAPDHmRNAの減少がすべてのトランスフェクション法で観察された。このことは、siRNAの特異性とは無関係に、適用されたペプチドの増殖阻害または毒性効果の方向に向かわせる。膜の完全性を妨げるペプチドは、多くの場合、これらのペプチドの一部が殺菌剤としても作用するという事実によって強調されるように、細胞を損傷する固有の能力を備えている前掲。したがって、推定上のヒトCPPの細胞毒性活性がCytoToxGloおよびCellTiterGloアッセイを用いて分析された。CellTiterGlowアッセイにより検出されたペプチド媒介増殖阻害または細胞毒性は、GAPDHmRNAレベルの対応する減少とよく相関した。この観察に基づいて、GAPDHmRNAレベルを毒性のための一般的な読み出し情報として使用した:培地対照に対して100のGAPDHmRNAの平均測定を無毒性とみなし、99~70の値を中程度の毒性とみなし、そして70未満の値を毒性とみなした。トランスフェクションを媒介するペプチドの効力およびまたは増殖阻害毒性に基づいて、異なる表現型カテゴリーが定義された:TATより低いAha1特異的siRNAトランスフェクション効率を示したペプチドは、カテゴリー非トランスフェクションペプチドに割り当てた;TATと同等以上のトランスフェクション効率を示したペプチドは、トランスフェクションペプチドと名づけた。同様に、GAPDHmRNA値>70をもたらすペプチドは無毒性と分類したのに対し、GAPDHmRNAをより低い値に低減させたペプチドは毒性と称した。これらのカテゴリーに基づいて、すべてのペプチドは以下の4つのクラスのいずれかに割り当てられた:非機能性ペプチド毒性の非トランスフェクションペプチド毒性のトランスフェクションペプチド無毒性のトランスフェクションペプチド。31非機能性ペプチドスクリーニングした61のヒト由来ペプチドのうち41がこのカテゴリーに分類された。これらのペプチドは細胞に対して有意な毒性を示さなかったし、またそれらは適用された濃度でsiRNAトランスフェクションを媒介しなかった。したがって、インシリコ手法で推定上のCPPとして選択されたペプチドの67は、トランスフェクションおよび生存率実験においていかなる表現型も示さなかった。以前にCPP活性をもつことが報告された8つの対照ペプチドのグループから、3つのペプチドがこのカテゴリーに分類された。一例として、図4は、WNTシグナル伝達に関与するタンパク質WNT16に由来するペプチドの表現型を示すOncogene2453965400。WNT16ペプチド配列は、それがKHR10細胞外検索プロファイルに適合するとして、実験的評価の候補として加えられた。32毒性の非トランスフェクションペプチドスクリーニングした61のヒト由来ペプチドのうち11が毒性の証拠を示したが、適用された濃度でsiRNAトランスフェクションを媒介しなかった。したがって、それらのトランスフェクション能力はTATペプチドと比べて劣っていた。分析した対照ペプチドのいずれもこのカテゴリーに分類されなかったので、これらの対照は実際にトランスフェクション能力があると確認された。図5は、このクラスに属するペプチドの2つの例の表現型を示す。1つのペプチドはヒトタンパク質BPLI3に由来するものであるTrendsImmunol255355。CellTiterGloアッセイでは、このペプチドに曝した細胞に生存率の用量依存的低下が観察された。これはGAPDHmRNAレベルの用量依存的低下と平行しており、このことは、増殖抑制およびまたは毒性の読み出し情報として平均GAPDHmRNA値を用いるアプローチを裏付けている。興味深いことに、CytoToxGloアッセイは、BPIL3ペプチドに曝した細胞で有意なアポトーシスを示さなかった。したがって、このペプチドはアポトーシス以外の作用機序によって増殖阻害およびまたは細胞死を引き起こす。トランスフェクション活性はこのペプチドに認められなかった。細胞毒性を示したもう1つのペプチドは、ヒトタンパク質カテリシジンに由来するものである前掲。FALLと呼ばれるこのペプチドはまた、抗菌機能を保持することが記載された。FALLペプチドは細胞への曝露時に顕著な毒性を示し、これは細胞の生存率の低下およびGAPDHmRNAレベルの減少によって反映される。潜在的トランスフェクション活性の分析は、毒性が顕著である10μM以上の濃度で特異的Aha1mRNA減少の非確定的な証拠を明らかにしたにすぎない。これらの条件下でわずかなmRNA減少が観察されただけである。しかし、より低濃度では、Aha1mRNAの明確かつ特異的な減少を観察することができる。このことは、FALLが、TATよりも劣るトランスフェクション効率であっても、すなわち、トランスフェクションペプチドのクラスに設定された閾値以下であっても、siRNAをトランスフェクトする能力をもつ可能性があることを示している。33毒性のトランスフェクションペプチドこのペプチドのクラスには、対照はどれも含まれないが、ヒト候補ペプチドのうち5つが含まれる。後者はトランスフェクション活性の明確な証拠を示したが、細胞増殖阻害およびまたは毒性をも生じさせた。一例として、図6は、CU025タンパク質由来のペプチドに曝露された細胞の表現型を示す。CU025は、機能が不明なカルシウム結合ドメイン含有タンパク質である。siRNAトランスフェクション実験は、GAPDHmRNAレベルと比較して、Aha1mRNAレベルの有意かつ特異的な減少を実証した。しかし、このペプチドはまた、生存率アッセイで測定したとき増殖阻害およびまたは毒性を生じさせ、かつGAPDHmRNAの有意な減少を引き起こした。この生存率の低下は、トランスフェクションおよびRNAiを達成するのに必要なペプチド濃度ですでに明らかになった。したがって、このペプチドおよびこのペプチドクラスの他のメンバーのsiRNAトランスフェクションへの適用可能性は、それらの毒性表現型によって厳しく制限される。34無毒性のトランスフェクションペプチドこのクラスのペプチドは、これらのペプチドが細胞の生存率を妨げない濃度でトランスフェクション機能を有するので、siRNAのトランスフェクションを含む用途にとって最も興味深いものである。大部分の対照ペプチドはこのクラスに分類される。実験的評価のために選択された61のヒトペプチド候補のうち、3つのペプチドは、細胞の生存率をまったく妨げないか、ほんの少ししか妨げない濃度で、トランスフェクション活性の明確な証拠を示した。これらのペプチドは、まだ特性解析が行われていないカルボキシペプチダーゼCPXM2、酸性スフィンゴミエリナーゼ様ホスホジエステラーゼASM3B、およびヒトGDNF関連神経栄養因子ニュールツリンNature384467470に由来するものであった。図7は、CPXM2、ASM3B、およびNRTNペプチドのトランスフェクション媒介特異的Aha1ノックダウンおよび細胞生存率に対する影響を、TATおよびPolyArgのそれと比較したものである。CPXM2とASM3Bはどちらも、Aha1特異的siRNAと共に適用したとき、有意な毒性なしに内因性Aha1mRNAレベルの顕著な減少をもたらした。この表現型は対照ペプチドTATおよびPolyArgに観察されたものと同様であった。NRTNペプチドは、細胞の生存率にわずかな影響を与えるだけで、GAPDHmRNAレベルに比してAha1mRNAレベルのより効果的な減少を媒介した。細胞増殖生存率は高濃度で影響を受けたにすぎない。興味深いことに、NRTNペプチドは、無毒性の低濃度で、顕著なトランスフェクション機能をまだ示した。これらの濃度で、NTRN由来ペプチドのトランスフェクション効率は、分析したすべての対照ペプチドのそれよりも高かった。この表現型に関して、NRTNペプチドをさらに詳細な特性評価に供した。実施例4:ペプチドsiRNA複合体の形成はトランスフェクションを媒介するのに必要であるが十分ではないTATまたはプロタミンなどの荷電ペプチドのトランスフェクション機能を説明し得る作用機序として、正に荷電したペプチドと負に荷電した核酸との複合体の形成が挙げられる。このような複合体は、ペプチドが介在する膜相互作用およびまたはエンドソーム脱出機能によって、複合体化された核酸が細胞のサイトゾルに移送されることを可能にするBiotechnolProg24957963。上記の作用機序がNTRN由来ペプチドにも同様に当てはまるかどうかに対処するため、ゲルシフトアッセイを実施した。そのために、siRNAを漸増濃度のペプチドと共にインキュベートし、続いてゲル電気泳動によってそれらの移動パターンを解析した。TATペプチドは、siRNA移動の予想された濃度依存的遅滞を示した。それゆえ、TATはsiRNA分子との複合体を形成する。TATの場合は、ゲルシフトが10:1のペプチドとsiRNAの比から開始して観察されたが、最も顕著な効果は25:1以上の比で観察された。NTRN由来ペプチドに曝露されたsiRNAを用いる平行分析を図8Bに示す。siRNAの遅滞は1:1以上のペプチドとsiRNAの比ですでに観察された。さらに、TATとは対照的に、25:1のNTRNペプチドsiRNA比では、形成された複合体がローディングポケット内に保持された。より高い比では、エチジウムブロマイド染色による検出が妨げられた。この知見は、核酸とポリカチオン性ペプチドとの複合体がインターカレート剤に接近しにくい、という観察と一致しているGeneTher3269273。ただし、プロテアーゼKで処理することにより、対応するsiRNAシグナルをゲルで観察することができた。したがって、NRTN由来ペプチドは、高度に凝縮されているような、siRNAとの安定な複合体を形成することが可能である。これらの結果は、ペプチドsiRNA複合体の形成がTATおよびNTRN由来ペプチドの両方のトランスフェクション機能と関連していることを示した。それゆえ、siRNAトランスフェクションのためにペプチドの膜相互作用およびまたはエンドソーム脱出機能を利用するのに前記複合体化が必要である、と仮定することは理にかなっている。しかし、解決すべき問題は、観察された複合体化がトランスフェクション機能にとっても十分であるかである。かくして、siRNA複合体化能力が、細胞毒性もトランスフェクション機能も示さないWNT16由来ペプチドについて、さらに分析された。WNT16由来ペプチドに曝されたsiRNAのゲルシフトアッセイは、TATペプチドに観察されたよりもさらに強い、電気泳動siRNA移動度の明確な用量依存的遅滞を示した。1:1以上のペプチド:siRNA比は効果的なゲルシフトを媒介した。非トランスフェクションペプチドが効果的に複合体を形成するという観察は、ペプチドとsiRNAとの複合体化それ自体がトランスフェクション機能を付与するのに十分ではない、ことを示している。したがって、siRNA複合体化は機能するために必要な前提条件であるようだが、ペプチドの追加の配列およびまたは構造的特徴もまた、トランスフェクションを媒介する上で重要であるのかもしれない。上記のデータは、NTRN由来ペプチドがsiRNA分子と複合体を形成し、かつそのトランスフェクションを効果的に媒介することを示した。適用されたsiRNAはsiAha1であったが、siAha1は、熱ショックタンパク質90ATPaseホモログ1の活性化剤である、細胞ハウスキーピング遺伝子のmRNAを標的とする前掲。ルシフェラーゼmRNAに対するsiRNAを対照として用いた。NTRNペプチドがsiRNAトランスフェクションに一般的に適用可能であることを証明するために、siAha1以外のsiRNAをトランスフェクトするその能力が検討された。図9は、有糸分裂キネシンEg5のmRNAを標的とするsiRNAのNTRNペプチド媒介トランスフェクションの結果を示すCell8311591169。細胞Eg5mRNAレベルの効果的な減少が10μMを超えない濃度で見られた。これらの用量で、NTRNペプチドは細胞の生存率を妨げない。Eg5mRNAの効果的な枯渇は有糸分裂の停止を引き起こし、結果的にアポトーシスを発生させることが知られている前掲。これに応じて、アポトーシス表現型がNTRNペプチド媒介siEg5トランスフェクションの際に観察された。同一条件下に対照siRNAでトランスフェクションを行っても細胞毒性はなく、したがって、アポトーシス表現型がEg5mRNAの枯渇によって生じたことが確認される。上記のデータは、ヒトNRTN由来ペプチドがsiRNAのトランスフェクションを媒介するのに一般的に適用可能であるだけでなく、そのトランスフェクション効率がRNAi介在細胞表現型を引き出すのに十分であることをも示している。実施例5:トランスフェクション能力のあるペプチドは細胞内に内部移行されるスクリーニングの手法で同定されたCPPの内部移行挙動を調べるために、前記ペプチドのFITC標識誘導体をFACSによって分析した。次のペプチドを使用した:トランスフェクションペプチドとしてNRTN、非トランスフェクションペプチドとしてWNT16、毒性ペプチドとしてFALL、および基準としてTAT。MCF7細胞をOptiMEM中で蛍光ペプチド誘導体の存在下に37°Cで3時間インキュベートした。続いて、細胞表面に結合したタンパク質を除去するために、それゆえに、内部移行ペプチドのモニタリングのみを確実にするために、細胞をプロテイナーゼKにより37°Cで30分処理した。その後、細胞をPBSで洗浄し、FACSによって分析した。結果は、対照ペプチドTATがMCF細胞内に内部移行されることを示す。TATの細胞内への取り込みはペプチドの濃度への線形依存性を示し、このことは、TATがsiRNAトランスフェクション試薬として機能する、という知見とも合致する。無毒性の非トランスフェクションペプチドWNT16は、MCF7細胞内への有意な取り込みを示さず、このことは、このペプチドがsiRNAをトランスフェクトする能力がないという観察に一致する。これはまた、ペプチドの取り込みが正に荷電したアミノ酸の存在に単純に相関しないことを実証している。毒性のFALLペプチドは線形濃度依存的にMCF細胞内に内部移行された。トランスフェクション陽性ペプチドNRTNもまたMCF7細胞内に内部移行された。しかし、他のペプチドとは対照的に、NRTNは線形濃度依存的な取り込みを示さなかった。実際、濃度を5μMから10μMに増加させると、内部移行の大幅な増加が観察された。この知見は閾値が存在することを示唆しており、その閾値以下では取り込みが有意であるが、少ない。閾値を超えると、細胞への取り込みの顕著な増加が認められる。まとめると、これらの結果は、細胞と相互作用しかつ細胞内に内部移行されるようになるトランスフェクション陽性ペプチドの能力を示している。さらに、これらのデータは、分析されたペプチドがトランスフェクション試薬として機能するだけでなく、細胞透過性ペプチドとしても作用することを示している。実施例6:ペプチド候補のソーティング、フィルタリング、および分類インシリコ手法と実験的スクリーニング手法を組み合わせることによって、潜在的CPPまたはトランスフェクション機能を有するペプチド配列がヒトプロテオーム中に見いだされた。これらの候補のうち、3つのペプチドは、トランスフェクション能力があるものの、無毒性であることが判明した;すなわち、それらは細胞の生存率を妨げない用量でトランスフェクション機能を保持している。こうしたペプチドは、とりわけ、将来のsiRNAベースの薬物の一部としてsiRNA送達剤を開発する際にモジュールとして役立つ可能性がある。61バイオインフォマティクス的アプローチ採用したインシリコ手法は、ヒトタンパク質に存在するすべての重複ペプチドを含む30merペプチドライブラリーに基づいていた。10×106個を超えるこれらのペプチドから、583のヒト細胞外タンパク質に由来する8630のペプチドが同定されたが、これらのペプチドは初期の検索文字列>30を満たすものであった。ウェットラボ実験に供したペプチドのショートリストを作成するために、候補ペプチドの数を負および正の選択段階によってさらに制限した:長い塩基性ストレッチのため、複数のペプチドヒットが単一のタンパク質に生じた場合には、冗長性を回避した。これらのケースのほとんどで、所定のタンパク質に由来する1つの代表的なペプチドが選択された。ペプチドの合成または取り扱いが、例えば複数のジスルフィド橋の存在または予測された低溶解性のために、困難であると認められたペプチドは、さらなる検討から除外した。実験的評価のための候補を選択するための、以下を含むいくつかの正の選択パラメータが適用された:高いIEPおよび高度の疎水性;TATとの配列類似性;ならびに補体系のタンパク質、殺菌因子、およびリパーゼなどの、ペプチドの起源となるタンパク質の提案された膜相互作用機能。62実験的アプローチ実験的評価の際に、候補ペプチドを4つのクラスに分類した:非機能性ペプチド、毒性の非トランスフェクションペプチド、毒性のトランスフェクションペプチド、および無毒性のトランスフェクションペプチド。第1のアプローチでは、ペプチド候補がそれらの最高のIEP値および疎水性プロファイルに基づいて選択され、例えば、トランスフェクション能力のある毒性ペプチドCU025およびCPXM、トランスフェクション能力のない毒性ペプチドCD026およびMMP25などが選択された。したがって、このフィルタは、正電荷アミノ酸に富むペプチド源から推定上の細胞透過性ペプチドを同定することができる。適用された別のフィルタは、TAT基準ペプチドと候補ペプチドとの配列類似性に基づいていた。TATに対して最も顕著な類似性を有する5つのペプチドが実験的に評価された。しかし、これらのペプチドのうち4つは、細胞の生存率を妨げない用量で検出可能なトランスフェクション活性を示さなかった。NRTN由来のペプチドが唯一の機能性メンバーであった。このペプチドは、トランスフェクション効率がTATよりさらに高く、実施したアッセイにおいて最高のトランスフェクション機能を示した。このことは、これらのペプチドのトランスフェクション活性が一次アミノ酸配列によってだけでなく、特定の配列モチーフ、特に二次構造によっても決定される、ことを示している。第3のアプローチでは、候補ペプチドのリストを制限するために、文献データとBLAST結果の両方が採用された。実験的評価のために選択されたものは、その活性のために膜との相互作用を必要とするタンパク質に由来するペプチドであった。選択されたペプチドの大部分は機能的表現型を示さなかった。膜の完全性を破壊することがよく知られたタンパク質に由来するペプチドでさえ、トランスフェクション機能を示さなかった。この知見は、これらのタンパク質の膜破壊活性を付与するには、適切に構造化されたドメインが必要でありうることを示唆しているCellMicrobiol1017651774。明らかに、この機能は、たとえペプチドが採用した検索戦略にマッチしたとしても、それらのペプチドが模倣することのできない機能である。一方、CPXM2およびASM3Bにそれぞれ由来する無毒性のトランスフェクションペプチドと、BPIL3およびFALL39に由来する毒性ペプチドはこの第3のグループに含まれる。興味深いことに、毒性と分類されたペプチドの一部は殺菌ペプチドに由来するものであった。この種のペプチドは病原菌の膜の完全性を妨げる。高濃度では、これらのペプチドはヒト癌細胞に対し有毒である。少なくともFALLペプチドは、特定の濃度範囲で、siRNAトランスフェクションを媒介することが示された。この知見は、原形質膜に穴が形成され、その穴を通してsiRNAの非特異的取り込みが起こる、ということで説明できる。別の説明は、ペプチドによって媒介されるsiRNA取り込みがそのペプチドの毒性によってマスクされる、というものである。さらに、最近提案された、CPP取り込みに関与する膜修復機構FASEBJ23214223もまた、これらのペプチドの一部の機能を説明するのに役立つ可能性がある。しかし、これらのペプチドがすでにトランスフェクションに必要な濃度で細胞の生存率を低下させるという事実は、siRNA送達のためのこのクラスのペプチドの適用可能性を妨げる。実施例7:NRTN由来ペプチドの特性評価71NRTN由来ペプチドの構造的特徴ニュールツリン由来ペプチドは、今回のスクリーニングで同定された候補であり、細胞の生存率を妨げない濃度でsiRNAをトランスフェクトする最高の能力を一貫して示していた。このペプチドは、核酸の強い凝縮を伴うsiRNAとの非共有結合複合体を形成することが可能である。この特徴は、NRTN複合体化siRNAがエチジウムブロマイドのインターカレーションに接近できないという知見に沿っている。ゲルシフトアッセイを用いて測定したとき、NRTNとsiRNAとの複合体形成は1:50の比で最大であった。これは本明細書中で用いた機能についてのインビトロ試験系での100nMsiRNA対5μMペプチドの比に相当する。しかし、インビトロ系でNRTNの濃度を複合体飽和以上の比に増加させると、さらなるトランスフェクション活性が観察される。この知見は、細胞表面でのアニオン性プロテオグリカンによる破壊からsiRNANRTN複合体を保護する遊離の正電荷NRTNペプチドの能力によって説明できるかもしれない。NRTNペプチドがsiRNAトランスフェクションを媒介するメカニズムは何なのだろうか核酸との複合体の形成は、トランスフェクション能力があるすべてのペプチドがこの特徴を示したので、確かにペプチド機能の1つの必要な要件である。しかし、TATと同様によく、またはそれ以上によくsiRNA複合体を形成するが、トランスフェクション機能を持ち合わせていないペプチドも同定されていたので、複合体形成だけではトランスフェクションを媒介するのに十分ではない。さらに、一次配列の組成、すなわち存在する荷電残基およびまたは疎水性残基の数が、それだけで機能を媒介することもありそうにない。TATに対して配列類似性をもつ多くのペプチドは非機能的であることが判明した。NRTN由来ペプチドのトランスフェクション機能のための1つの考えられる説明は、その二次構造に見ることができる。スクリーニングを行うために30merペプチドを前掲CrombezLetalBiochemSocTrans354446JafariMandChenPCurrTopMedChem910881097とは対照的に選択することは、これらのペプチドが特定の二次構造に折りたたまれて、その構造を維持する可能性がより高いという利点を有する。NRTNはTGF増殖因子タンパク質ファミリーのメンバーであり、また、それぞれの構造がすでに解明されているGDNFおよびアルテミンに類似しているNatStructBiol4435438WangXetalStructure1410831092。ラットGDNF配列とヒトNRTN配列の配列アライメントおよび提案された二次構造の比較から、トランスフェクション活性NRTNペプチドストレッチは二次構造を形成し得ることが明らかになった。機能性NRTNペプチドに対応する配列は、一部がそのタンパク質の接近可能な表面上に位置しており、かつアミノ酸の正に荷電したαへリックスストレッチを含んでいる。NRTN内のαへリックス構造の同定は、αへリックス構造が膜透過に関して有利であるという既存の仮説に、完全に沿うものである前掲。分析したNRTN由来ペプチドが完全なαへリックス構造だけでなく周囲の領域をも含むという観察は、より大きいペプチドをスクリーニングする本アプローチの妥当性を支持している。αへリックス構造それ自体が効率のよいトランスフェクションを媒介するのに十分であるかどうかは、まだ解明されていない。しかし、追加の残基の少なくとも一部もまた、ペプチドの機能に必要とされるようである。これらの二次構造予測の実験的証拠を得るために、NRTNペプチドは、UV円偏光二色性分光法を用いて二次構造要素の存在についてさらに分析されたBiopolymers89392400に概説される。この技法は、非構造化ランダムコイルストレッチに比較して、二次構造に折りたたまれる配列要素をそれらの特定のUVスペクトルに基づいて同定することを可能にする。分析は、JascoJ715分光偏光計を用いてデータピッチ01nmとバンド幅1nmで195nmから260nmまで行った。この装置のセルは01cmの長さを有していた。ペプチドは01mgmlの濃度で用いた。αへリックス構造に折りたたまれることが以前に示されたFALLペプチドを陽性対照として使用したProcNatlAcadSciUSA92195199。水溶液中で、FALLペプチドはランダムコイル構造をとった。共溶媒特性としての10トリフルオロエタノールの存在下で、スペクトルは208nmと222nmのそれぞれで特徴的な最小ピークを示し、TFE濃度の増加に伴い、より顕著になった。TFEはペプチドおよびタンパク質における二次構造を安定化し、かつそうした構造の形成を誘導することが知られているQRevBlophys31297355。NRTNペプチドをFALLペプチドと同じアッセイ条件下で分析したとき、同様のスペクトル、すなわち、208nmと222nmのそれぞれで最小ピークを示すスペクトルが観察された。それゆえ、NRTNペプチドは、配列相同性データに基づいて予測されるように、αへリックス部分を実際に含んでいる。対照的に、TATペプチドを用いて得られたスペクトルは、このペプチドが二次構造に折りたたまれる形跡を示さなかった。50TFEの存在下でさえ、このペプチドはランダムコイル構造をとった。さらに、FACS解析によってモニタリングされた内部移行挙動は、NRTNペプチドが、例えばsiRNAのための、トランスフェクション試薬として機能するだけでなく、核酸分子の非存在下でさえ、細胞透過性ペプチドとして機能することを実証した。この知見から、NRTNはまた、他のペプチドまたはタンパク質などの、コンジュゲート化カーゴのための適切なキャリアとなり得ることが示唆される。とりわけ、NRTNの内部移行は使用した濃度に線形的に依存しないようである。それどころか、特定の閾値があって、それを超えると細胞への取り込みが生じるようである。こうした閾値現象はTATおよびPolyArgなどの他のペプチドの内部移行挙動にも観察された前掲。さらに、FACS解析は細胞内へのFALLペプチドの強い蓄積を明らかにした。この知見は、FALLが細胞毒性ペプチドとして作用するという観察と一致する。毒性はペプチドと標的細胞との直接の物理的相互作用を必要とする。しかし、NRTNペプチドとは対照的に、FALLの内部移行挙動はその濃度に線形的に依存していた。したがって、FALLの毒性には閾値がなく、これは得られた細胞生存率データと一致して、濃度依存的な細胞毒性を示す。一方、非トランスフェクションペプチドWNT16は、細胞内に有意な程度に内部移行されなかった。したがって、ペプチドの一次配列中に正電荷アミノ酸が存在するだけでは、ペプチドのCPPとしての使用可能性を示していない。これらの結果は、二次構造に折りたたまれる配列モチーフがCPPの細胞への取り込みのための主な決定要因になり得る、というさらなるヒントを提供する。72NRTN由来ペプチドは血清の存在下でトランスフェクション活性を有する治療用siRNAの送達は、同定されたヒトCPP様ペプチドの興味をそそる1つの適用例である。非ヒト病原体由来配列を同様の機能またはより優れた機能を示すヒト配列で置換することは、トランスフェクションモジュールが免疫原性であり得るというリスクを低減させるので、治療上のアプローチとして有利である。所定のペプチドの治療への応用には、そのペプチドが十分な活性をもつことも必要とされる。さらに、観察されたペプチドのインビトロ活性が、インビボ状況においてもその通りでなければならない。本明細書に記載したアッセイのほとんどは、ペプチド媒介トランスフェクションを検出するための、当技術分野で確立されている標準的なインビトロ条件下で行ったNucleicAcidsRes3127172724RichardJPetalJBiolChem2801530015306AbesRetalBiochemSocTrans35775779KumarPetalNature4483943MuellerJetalBioconjugChem1923632374SugitaTetalBrJPharmacol15311431152。したがって、初期のトランスフェクション段階でのインキュベーションは基本的には無血清の条件下で行われる。この段階での血清の添加はCPPのトランスフェクション能力を妨げる前掲も参照されたい。しかしながら、ペプチドの治療への適用可能性は、明らかに血清との接触を必要とするだろう。NRTNペプチドが、媒体の存在下で、依然としてトランスフェクションを媒介できる、ということは注目に値する。73NRTN由来ペプチドは血液脳関門細胞培養モデルにおいて上皮細胞に結合して内部移行する細胞透過性ペプチドは、細胞へのsiRNA送達のためのトランスフェクション運搬体として適用可能であるだけでなく、例えば脳内にRNAiを媒介するために、血液脳関門などの障壁を透過する上でも機能的であるらしい、ことが以前に報告されているExpertOpinTherPat19137140。NRTNは中枢神経系に接近する可能性があるグリア細胞由来の神経栄養因子JCellSci11638553862であるため、NRTNはこの点でも同様に機能的でありうると推測したくなる。NRTN由来ペプチドと血液脳関門を形成する内皮細胞との潜在的相互作用を評価するために、血液脳関門モデルで、hCMECD3細胞または初代ヒト脳内皮細胞をNRTN由来ペプチドに曝露したFASEBJ1918721874PollerBetalJNeurochem10713581363。これらの分析の結果から、NRTN由来ペプチドはこれらのアッセイ条件下でエンドソーム構造に蓄積することが明らかになった。BBB内皮細胞では、親水性分子の細胞通過が密着結合によって効果的に防止され、そしてエンドソームが血液脳関門を横切る巨大分子の制御された輸送を可能にするトランスサイトーシス機構の主な構成要素となる。こうして、NRTN由来ペプチドはBBB機能にとって重要なコンパートメントに局在する。CPPの治療への適用可能性のさらに考えられる進展は、抗体および抗体フラグメントなどのターゲティング成分とのそれらの組み合わせであろう。実施例8:プロアポトーシス性ペプチドの細胞内送達のためのNRTN由来ペプチドの適用NRTN由来ペプチドの内部移行挙動は、これらのペプチドが、例えばsiRNA分子の、トランスフェクション試薬として機能するだけでなく、古典的な細胞透過性ペプチドとしても機能することを示した。この知見は、NRTNが他のペプチドまたはタンパク質などのコンジュゲート化カーゴのための適切なキャリアにもなり得ることを示唆する。NRTN由来配列はペプチドの細胞への取り込みを媒介することが可能であるかどうかを調べるために、さまざまな生物学的活性ペプチドをNRTNに融合させた。使用したペプチド融合パートナーは、アポトーシスの媒介に関与する細胞質標的タンパク質と相互作用することが示された。言い換えれば、発現されるかまたは癌細胞の細胞質に能動的に送達される場合、これらのペプチドはアポトーシスを誘導する。しかし、これらのプロアポトーシス性ペプチドは生体膜それ自体を透過することができない。TAT、ペネトラチン、およびpolyArgなどの既知CPPへのそれらのコンジュゲーションまたは融合のみが、細胞への取り込みと、ひいてはアポトーシスの誘導を可能にする。NRTN由来配列の細胞透過機能を評価するために、次の融合パートナーを使用した:BCL2と相互作用して、それをプロアポトーシス性分子に変換する、核内受容体Nur77由来ペプチド;およびmRNAの5キャップ構造に結合して、癌細胞のアポトーシスをモジュレートすることが知られている翻訳因子elF4Eと相互作用する、4EBP1由来ペプチド。81プロアポトーシス性NUR77由来ペプチドのNRTN媒介細胞内取り込みNur77は、BCLBおよびBCL2などの、アポトーシスの重要なメディエーターと相互作用することができる核内オーファン受容体である。Nur77とBCL2との相互作用は、BCL2のコンフォメーション変化を引き起こし、結果的にそのBH3ドメインの露出をもたらす。これによって、BCL2はプロアポトーシス機能のあるタンパク質に変換されるCell116527540LucianoFetalBlood10938493855。同じ変換は、Nor1などの関連ペプチドに由来するペプチドを用いても達成することができるCancerCell14285298。Nor1およびNur77のそれぞれのBCL2相互作用配列は次のようにアライメントすることができる:BCL2と相互作用することが可能な、さらに小さいペプチドは、Nor1のC末端12アミノ酸からなる:BCL2をプロアポトーシス性分子に変換する能力が判明したにもかかわらず、後者のペプチドの癌細胞への添加は、高濃度でさえも、アポトーシスを誘導するのに十分ではない。それは、細胞標的タンパク質が細胞質内に位置するが、ペプチドそれ自体が標的に到達するために細胞膜を効果的に透過することができないためである。簡単に説明すると、MCF7乳癌細胞をこのペプチドの存在下で24時間インキュベートした。細胞の生存率の低下またはアポトーシスの誘導は観察されなかった。同様に、ヒト由来CPPNRTNへのこれらの細胞の曝露は、細胞の生存率に影響を及ぼさず、アポトーシスの誘導にもつながらなかった。NRTNが実際にCPP機能をもつかどうかを分析するために、C末端でNRTNペプチドの一部に融合されたN末端のNur77由来ペプチドストレッチを含むハイブリッド配列を作製した。適切な融合位置を定めるために、Nur77ペプチドのC末端部分はNRTNペプチド内の配列ストレッチに類似していることが分かり、その領域を融合点として選んだ。得られたNurNRTN融合ペプチドならびに2つの親ペプチドのアミノ酸配列を図15の下部パネルに概略的に示してある。その融合ペプチドはNur77の全長配列ストレッチとNRTNペプチドの短縮されたN末端ストレッチを保持している。得られたペプチドは親NRTNペプチドと同じ長さを有する。NurNRTNのアミノ酸配列は次のとおりである:Nur77由来ペプチドのBCL2結合特性がNurNRTN融合ペプチドで維持されているかどうかを調べるために、それぞれのNurNRTNおよびNRTNペプチドをヨードアセチルビーズにカップリングさせた。そのビーズを組換えBCL2とインキュベートし、PBSおよび05MNaCl0025NaN3005Tween20で洗浄して未結合タンパク質を除去した。固定化NurNTRN融合ペプチドへのBCL2の特異的結合は、溶出緩衝液を用いてビーズから結合ペプチドを溶出し、溶出された画分をニトロセルロースに移行させ、そしてMemCodeReversibleProteinStainKitを用いてタンパク質を検出することによって測定した。これらの分析の結果は、BCL2がNurNRTN融合ペプチドでコーティングされたビーズからの溶出液中に検出され得ることを明らかにした。これとは対照的に、NRTNペプチドでコーティングされたビーズからはごく少量のBCL2しか溶出されなかった。それゆえ、NurNRTN融合ペプチドはBCL2に結合する能力を保持している。続いて、NurNRTN融合ペプチドは細胞膜を透過する能力があり、それによって細胞内でプロアポトーシス活性を誘導するかどうかを評価した。MCF7ヒト乳癌細胞をモデルとして使用した。実験的アプローチは先に記載したとおりであった。Nur77およびNRTNペプチドをそれぞれ試験したとき細胞毒性をもたらさなかったペプチド濃度で、融合ペプチドはアポトーシスの誘導によっても反映される顕著な細胞毒性を示した。この効果は用量依存的であった:細胞毒性はペプチドの濃度の増加に伴って増加した。対照として、NURペプチドの不活性変異体をNRTNペプチドに融合させた。このペプチドは細胞の生存率を妨げなかった。さらに、NURペプチドと不活性WNT16ペプチドとの融合体も細胞生存率を妨げなかった。これらの結果は、NRTN由来配列とそれ自体細胞透過性でないペプチドとの融合体が細胞に進入して、細胞内活性を誘発できる、ことを実証している。言い換えれば、その融合ペプチドのNRTN部分は、細胞内でNur77のプロアポトーシス活性を発揮させるために、運搬体として機能する。さらに、これらの結果は、そのアミノ末端で改変されているNRTN由来配列がCPP機能を保持しているという証拠を提供する。82プロアポトーシス性4EBP1由来ペプチドのNRTN媒介細胞内取り込みelF4Eは、mRNAの5キャップ構造に結合する翻訳因子であり、細胞の生存にとって重要である。elF4Eの機能を妨害すると、癌細胞のアポトーシスに導くことができる。タンパク質4EBP1はelF4Eに結合し、それによってelF4Eの機能をモジュレート妨害する。その結果、4EBP1レベルの上昇は、そのelF4E機能のモジュレーションゆえに、翻訳の阻害をもたらし、ひいては癌細胞のアポトーシスを誘導するCancerSurv27293310RobertFandPelletierJExpertOpinTherTargets1312791293。全長4EBP1のプロアポトーシス機能は20アミノ酸長の小さいペプチドでも達成することができるBiochemJ140237246。このペプチドはel4FE結合モチーフCell128257267を含む。さらなる解析によって、この結合モチーフの残りの3つのアミノ酸残基はプロアポトーシス機能にとって重要であることが示されたMolCell3707716。これらの残基を変異させると、活性4EBP1由来ペプチドが不活性誘導体へと変換されることになる。本明細書で用いる活性および不活性4EBP1ペプチドのアミノ酸配列は次のとおりである:elF4Eをブロックする能力が判明しているにもかかわらず、4EBP1由来ペプチドの癌細胞への単純な添加は、高濃度でさえも、アポトーシスを誘導するのに十分ではない。それは、細胞標的タンパク質が細胞質内に位置するが、ペプチドそれ自体が標的に到達するために細胞膜を効果的に透過することができないためである。簡単に説明すると、MCF7乳癌細胞をこのペプチドの存在下で24時間インキュベートした。細胞の生存率の低下またはアポトーシスの誘導は観察されなかった。同様に、ヒト由来CPPNRTNへのこれらの細胞の曝露は、細胞の生存率に影響を及ぼさず、アポトーシスの誘導にもつながらなかった。以前に、TATなどの既知CPPを4EBP1由来ペプチドに融合させると、その融合ペプチドの細胞への取り込みが起こることが示されていたClinCancerRes1543364347。次のTATelFE4融合ペプチドを本明細書で用いた:これらのTAT4EBP1融合ペプチドの存在下で24時間インキュベートしたMCF7乳癌細胞は、20μMの濃度で、細胞生存率の低下およびアポトーシスの誘導による細胞毒性についての明確な証拠を示した。この効果は、対応する変異体が完全に不活性であったので、機能的に活性な4EBP1ペプチド配列によって特異的に媒介されたものである。NRTNが実際にCPP機能をもつかどうかを分析するために、C末端で活性または不活性4EBP1由来ペプチドストレッチに融合されたN末端のNRTNペプチドの一部を含むハイブリッド配列を作製した。得られた2つの融合ペプチドのアミノ酸配列を図16の下部パネルに概略的に示してある。これらの融合ペプチドは4EBP1の全長配列ストレッチおよび全長NRTNペプチドを保持しており、合計の長さが50アミノ酸となる。したがって、これらの分子は既知CPPよりかなり大きくなっている。活性または不活性NRTN4EBP1融合ペプチドのアミノ酸配列は次のとおりである:続いて、NRTN4EBP1融合ペプチドは細胞膜を透過する能力があり、それによって細胞内でプロアポトーシス活性を誘導するかどうかを評価した。MCF7ヒト乳癌細胞をモデルとして使用した。実験的アプローチは先に記載したとおりであった。4EBP1およびNRTNペプチドをそれぞれ試験したとき細胞毒性をもたらさなかったペプチド濃度で、融合ペプチドはアポトーシスの誘導によっても反映される顕著な細胞毒性を示した。この効果は用量依存的であった:細胞毒性はペプチドの濃度の増加に伴って増加した。さらに、NRTN融合ペプチドは、そのTAT融合対応物と比較して、有意に高い効率を示した。その上、観察された細胞毒性は、融合ペプチドの対応する変異体が不活性であったので、機能的に活性な4EBP1ペプチド配列部分によって特異的に媒介されたものである。4EBP1ペプチドとWNT16ペプチドとの融合体は細胞生存率を妨げなかった。これらの結果は、NRTN由来配列とそれ自体細胞透過性でないペプチドとの融合体が細胞に進入して、細胞内活性を誘発できる、ことを実証している。TAT融合ペプチドとの直接比較は、NRTN融合体がより高い効率をもつことを明らかにした。これらの結果はまた、そのカルボキシ末端で改変されているNRTN由来配列がCPP機能を保持するという証拠を提供する。最後に、NRTN由来配列を利用することによって、少なくとも50アミノ酸の長さを有する機能性CPPを作製することが可能である。本明細書で例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素、限定の非存在下で、適切に実施することが可能である。したがって、例えば、用語含むは、拡張的かつ限定なしと読み取るものとする。さらに、本明細書で用いた用語および表現は、限定のためではなく、説明のための用語として使用されており、また、示されたおよび記載された特徴またはその部分の任意の均等物を除外するための、そうした用語および表現の使用を意図しておらず、さまざまな変更がクレームされた本発明の範囲内で可能であることが認識される。かくして、本発明は態様および任意的な特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に記載の本発明の変更および改変が当業者によってなされ得ること、そしてそのような変更および改変は本発明の範囲内にあるとみなされること、を理解すべきである。本発明は本明細書中では広範にかつ上位概念で記載されている。上位概念の開示の範囲内に入る、より狭い種および下位概念のグループ分けもまた、それぞれが本発明の一部を構成する。これには、その属から任意の主題を除く但し書きまたはマイナスの限定を含む本発明の上位概念の記載が含まれ、除かれた材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関係はない。他の態様は以下の特許請求の範囲内である。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループで記載されている場合、当業者は、本発明がそのマーカッシュグループの個々のメンバーまたは複数のメンバーのサブグループによっても記載されることを認識するだろう。表1実験的評価に供されたヒト候補CPPおよび対照ペプチド対照ペプチドはグレーで示される。クラスの欄は、ペプチドのトランスフェクション能力および細胞毒性に関するペプチドの機能的分類を表す:、無毒性の非トランスフェクションペプチド;tox、毒性の非トランスフェクションペプチド;tox、毒性のトランスフェクションペプチド;、無毒性のトランスフェクションペプチド。