"糸状菌宿主細胞発現系であって、a.染色体DNAの中に非相同組み換えNHR経路の1つ以上の構成要素の破壊と、第1選択機能を欠く第1選択マーカーと、第2選択機能を付与するように機能する第2選択マーカーと、を含有する菌細胞宿主、並びに、b.前記菌宿主細胞に導入されると、前記第1選択機能を前記第1選択マーカーに付与する配列と、目的の遺伝子の1つ以上を発現させるように機能する配列と、前記染色体選択マーカーに隣接する配列と実質的な相同性を有する配列と、を含有する核酸分子、を含み、前記相同配列が、機能性第1選択マーカーを生じ、前記第2選択マーカーを除去し、前記目的の遺伝子を発現させる相同組み換え事象を引き起こす、糸状菌宿主細胞発現系。前記NHR経路の1つ以上の構成要素が、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4及びxrsからなる群から選択される、請求項1に記載の糸状菌宿主細胞発現系。前記第1選択マーカー及び前記第2選択マーカーが、alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、及びチミジンキナーゼからなる群から選択される異なるマーカーである、請求項1に記載の糸状菌宿主細胞発現系。前記菌宿主細胞が、トリコデルマ、アオカビ、アスペルギルス、フミコーラ、クリソスポリウム、フザリウム、アカパンカビ及びエメリセラからなる群から選択される属から得たものである、請求項1に記載の糸状菌宿主細胞発現系。前記トリコデルマがトリコデルマリーゼイである、請求項4に記載の糸状菌宿主細胞発現系。前記アスペルギルスがアスペルギルスニガーである、請求項4に記載の糸状菌宿主細胞発現系。前記目的の遺伝子が、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の糸状宿主細胞発現系。前記目的の遺伝子が、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、加水分解酵素、インベルターゼ、異性化酵素、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクタートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の糸状宿主細胞発現系。前記目的の遺伝子が、ペプチドホルモン、成長因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原及びこれらの断片からなる群から選択される、請求項1に記載の糸状宿主細胞発現系。請求項1~9のいずれか一項に記載の糸状宿主細胞発現系において目的の遺伝子を発現させる方法であって、前記核酸分子を前記糸状菌宿主細胞の中に導入すること、前記宿主細胞を培養すること、及び前記第1選択機能を有するが前記第2選択機能を持たない宿主細胞を選択すること、を含む、方法。前記目的の遺伝子の発現についてのアッセイを更に含む、請求項10に記載の方法。前記目的の遺伝子によりコードされるポリペプチドの生化学的機能についてのアッセイを更に含む、請求項11に記載の方法。テロメアの染色体外複製ベクターをゲノム組み込みの代わりとして使用できるが、この方法は、形質転換体間の発現レベルにおける変動性をなくすものではない。それゆえに、当該技術分野は、糸状菌宿主株からの遺伝子発現における配列とは独立した差異を低減するためのツールから利益を享受する。本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えDNA構築物に関する。糸状菌宿主株は高信頼性で形質転換体を作製し、発現レベルにおいて変動性を低減して酵素を発現させる。この糸状菌宿主細胞は、組み換えタンパク質をコードするDNAライブラリーの効率的なスクリーニングに有用である。特に、本開示は、a染色体DNAの中に非相同組み換えNHR経路の1つ以上の構成要素の破壊と、第1選択機能を欠く第1選択マーカーと、第2選択機能を付与するように機能する第2選択マーカーと、を含有する糸状菌細胞宿主、並びに、bこの菌宿主細胞に導入されると、第1選択マーカーに第1選択機能を付与する配列と、目的の1つ以上の遺伝子又は目的の変異体遺伝子を発現するように機能する配列と、染色体選択マーカーに隣接する配列に対する実質的な相同性を有する配列と、を含有する核酸分子、を含む糸状菌宿主細胞発現系を提供し、ここで、相同配列は、相同組み換えを引き起こし、機能性第1選択マーカーを生じ、第2選択マーカーを除去し、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子を発現させる。一部の実施形態では、NHR経路の1つ以上の構成要素は、ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4及びxrs2からなる群の1つ以上を含む。特定の実施形態では、bにおいてこの菌宿主細胞の中に導入される核酸分子は、非自生分子か又は菌宿主細胞に対して非自生形態で存在する自生分子かのいずれかであることができる。遺伝子欠失は、欠失プラスミドの使用により達成され得る。例えば、欠失させること又は破壊されることが望まれる遺伝子は、プラスミドの中に挿入することができる。欠失プラスミドは、次に、所望の遺伝子コード領域に対して内部の適切な制限酵素部位にて切断され、その遺伝子コード配列又はその部分は選択マーカーで置換される。好ましくは約0.5kb~約2.0kbの、遺伝子が欠失する又は破壊される位置からの隣接DNA配列は、選択マーカー遺伝子のいずれかの側にとどまる。好適な欠失プラスミドは、一般に、隣接DNA配列を含む欠失遺伝子と、単一の直線状部分として除去される選択マーカー遺伝子と、を含有する断片を可能にするために存在する独特の制限酵素部位を有する。欠失プラスミドはまた、PCRを使用して所望の隣接領域及び選択マーカーを増幅することにより構築されてもよく、増幅された断片の末端にある制限酵素部位は、断片の結合を促進する。あるいは、欠失プラスミドは、適切な隣接DNA及び選択マーカー配列を特定することにより、新たに合成することができる。一部の実施形態では、第1選択マーカーと第2選択マーカーは、異なるマーカーである。一部の実施形態では、第1マーカーと第2マーカーは、alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子及びチミジンキナーゼからなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、相同配列のうちの少なくとも1つは、pyr2配列からの上流又は下流である。一部の実施形態では、相同配列は、pyr2配列から上流及び下流である。他の実施形態では、相同配列は、目的の1つ以上の遺伝子又は目的の1つ以上の変異体遺伝子を発現させるように機能する配列と、第1選択マーカーに第1選択機能を付与する配列と、を含む。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、トリコデルマTrichoderma、アオカビPenicillium、アスペルギルスAspergillus、フミコーラHumicola、クリソスポリウムChrysosporium、フザリウムFusarium及びエメリセラEmericellaからなる群から選択される属の一種である。一部の実施形態ではトリコデルマはトリコデルマリーゼイT.reeseiであり、一方、他の実施形態ではアスペルギルスはアスペルギルスニガーA.nigerである。本開示は、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子がヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びこれらの混合物からなる群から選択される、糸状宿主細胞発現系を提供する。目的の遺伝子又は変異体遺伝子の非限定例は、デンプン代謝に関与するタンパク質若しくは酵素、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質若しくは酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、加水分解酵素、インベルターゼ、異性化酵素、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクタートリアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解性酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼD-ヘキソース:O2-酸化還元酵素、EC1.1.3.5、これらの変異体、及びこれらの組み合わせをコードする。一部の実施形態では、目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子は、ペプチドホルモン、成長因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子及び微生物抗原例えば、HBV表面抗原、HPVE7など並びにこれらの変異体例えば、断片からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。加えて、本開示は、非自生分子か又は自生ただし、非自生形態で存在する分子かのいずれかであり得る、第1選択機能を第1選択マーカーに付与する核酸分子を糸状菌の中に導入することと、宿主細胞を培養することと、第1選択機能を有するが第2選択機能を欠く宿主細胞を選択することと、を含む、糸状菌宿主細胞における目的の遺伝子又は目的の変異体遺伝子の発現方法を提供する。一部の実施形態では、このようにして達成される発現は、当該技術分野における従来方法を使用して得られるものより高い信頼性を有する。一部の実施形態では、本方法は、目的の遺伝子若しくは目的の変異体遺伝子の発現についての、並びに/あるいは、目的の遺伝子により又は目的の変異体遺伝子によりコードされるポリペプチドの生化学的機能についての、アッセイを更に含む。本明細書に引用されているすべての特許、特許出願、文書、ヌクレオチド及びタンパク質配列データベースの受入れ番号、並びに論文は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。本開示は、糸状菌宿主株、並びに、その作製及び使用のための組み換えDNA構築物に関する。糸状菌宿主株は、当該技術分野において既知の他の発現方法と比較して、より高い信頼性及び/又は発現レベルにおけるより低い変動性で、これらの宿主において目的の遺伝子又は変異体の発現を提供するために、使用することができる。糸状菌宿主株は、具体的な実施形態では、組み換えタンパク質をコードするDNAライブラリーを効率的にスクリーニングするのに有用である。本明細書に記載の方法は、改善された信頼性で、目的のタンパク質又は目的の変異体を発現させる。この意味では、用語改善された信頼性は、1形質転換体の少なくとも60例えば、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、若しくは少なくとも99が安定な形質転換体であること、又は、形質転換体の少なくとも60例えば、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、若しくは少なくとも99がバックグラウンド発現レベルよりも多く意図された目的のタンパク質若しくは変異体を発現させること、並びに、2目的のタンパク質若しくは変異体が60未満例えば、55未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、10未満、5未満、又は2未満の発現レベル変動で発現されること、に反映され、用語発現レベル変動は、最も高い発現レベルと最も低い発現レベルの間の差を最も高い発現レベルとバックグラウンド発現レベルの間の差である値で除算することにより定義され、これらはすべて同じ構築物及び同じ目的の遺伝子若しくは変異体で測定されるものである。前述の一般的説明と後述の発明を実施するための形態はどちらも本明細書に記載の組成物及び方法を例示及び説明することのみを目的とし、これらを制限するものではないことを理解されたい。本出願では、単数形の使用は、特記しない限り、複数形も包含するものとする。又はの使用は、特記しない限り、及び/又はを意味するものとする。同様に、用語含むcomprise、含んでいるcomprising、含むcomprises、含むinclude、含んでいるincluding及び含むincludesは、制限を意図するものではない。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物例えば、このような特許及び刊行物内に開示されているすべてのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、参照により明示的に組み込まれるものとする。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、全体としての本明細書を参照することにより理解され得る。したがって、本明細書の用語は、全体として本明細書を参照することにより、より完全に定義されるものである。本明細書で特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に解釈されるものと同じ意味を有するものである。Singleton,etal.,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,2DED.,JohnWileyandSons,NewYork1994、並びに、HaleMarham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY1991は、当業者に本開示で使用される用語の多くの一般的辞書を提供する。本開示を実施又は試験する上で本明細書に記載されるものと同様又は同等のいかなる方法及び材料も使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。特に示さない限り、それぞれ、核酸は左から右に5’→3’配向で記載され、アミノ酸は左から右にアミノ→カルボキシル配向で記載される。実施者は、当該技術分野の定義及び用語については、特に、Sambrooketal.,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUALSecondEdition,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.,1989、並びに、AusubelFMetal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,N.Y.,1993を参照されたい。本開示が記載されている特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、これらは変動し得ることを理解されたい。1.定義以下の用語は、本明細書を全体として参照することによってより十分に定義される。本明細書で使用するとき、用語ポリペプチドは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の単鎖からできている化合物又は分子を指す。本明細書で使用するとき、用語タンパク質は、用語ポリペプチドと同義であり得る。変異体は、C末端及びN末端のいずれか又は両方に1つ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列の1つの若しくは多数の異なる部位にて1つ以上のアミノ酸を置換することにより、あるいは、タンパク質のいずれかの若しくは両方の末端にて又はアミノ酸配列の1つ以上の部位にて1つ以上のアミノ酸を欠失させることにより、前駆体タンパク質例えば、自生タンパク質から誘導されるタンパク質を意味する。目的のタンパク質例えば、目的の遺伝子によりコードされているの変異体又は目的の変異体目的の変異体遺伝子によりコードされているの調製は、当該技術分野において既知の任意の手段により行うことができる。例えば、目的の変異体は、自生タンパク質をコードするDNA配列例えば、目的の遺伝子を修飾し、修飾したDNA配列を好適な宿主に形質転換させ、修飾されたDNA配列を発現させて、目的の変異体を形成させることにより、調製される。非限定例では、目的のセルラーゼの変異体は、当該技術分野において既知の任意の手段により行われ得る。例えば、セルラーゼ変異体は、その自生のすなわち、自然発生する対応物をコードするDNA配列を修飾し、修飾されたDNA配列を好適な宿主に形質転換させ、修飾されたDNA配列を発現させて、変異体セルラーゼを形成させることにより、調製される。本開示の目的の変異体酵素は、目的の自生酵素のものと比較して、変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。目的の変異体酵素は、特定の実施形態では、目的の自生酵素の一部の特徴を保持し得るが、一方、目的の自生酵素からの特定の変異した特徴を有する。例えば、本開示の変異体セルラーゼは、前駆体酵素アミノ酸配列と比較して変異したアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ここで、この変異体セルラーゼは、前駆体酵素の特徴的なセルロース分解性を保持するが、一部の特定の態様では、変異した特性を有し得る。例えば、変異体セルラーゼは、最適pHの上昇、又は温度上昇、又は酸化安定度上昇、又は、非セルロース系物質に対する親和力若しくは結合力の減少を有し得るが、その特徴的なセルロース分解活性を保持する。非限定例では、本開示による目的の変異体は、変異体をコードするヌクレオチド配列から誘導され得ると想到され、ここで、発現された変異体の機能活性は保持される。例えば、セルラーゼ変異体は、セルラーゼ変異体をコードするDNA断片から誘導され得、ここで、発現された変異体のセルラーゼ活性は保持される。セルラーゼをコードするDNA断片は、一部の実施形態では、5’末端又は3’末端のいずれかにてセルラーゼDNA配列に結合されているヒンジ又はリンカーをコードするDNA配列又は部分を更に含み得、ここで、コードされているセルラーゼ領域の機能活性は保持される。用語変異体及び誘導体は、本明細書で互換的に使用され得る。等価残基は、三次元構造がX線結晶解析により判定されている前駆体又は参照酵素についての三次元構造のレベルでの相同性を判定することにより定義され得る。例えば、等価残基は、セルラーゼとハイポクレアジェコニアHypocreajecorinaCBH2の特定のアミノ酸残基の主鎖原子の2つ以上の原子配位NはN上に、CAはCA上に、CはC上に、OはO上にがアラインメント後、0.13nm以内であり、好ましくは0.1nm以内であるものとして、定義される。アラインメントは、酵素と問題の前駆体/参照酵素の非水素タンパク質原子の原子配位の最大限の重複をもたらすように、最良のモデルが配向及び配置された後で、達成される。例えば、好適なモデルとしては、入手可能な最高解像度での実験回折データについて最小のR因子を与える結晶学的モデルが挙げられる。例えば、米国特許出願公報第2006/0205042号を参照されたい。前駆体又は参照酵素の特定の残基と機能的に類似している等価残基は、所定のやり方で酵素の構造に、基質結合に又は触媒に対して、変異、修飾又は寄与し得るような配座を採用し得る残基として定義される。例えば、ハイポクレアジェコニアCBH2の等価残基は、定義されているやり方でタンパク質構造、基質結合又は触媒に対して、変異、修飾又は寄与し得るような配座を採用し得るセルラーゼのアミノ酸である。一部の実施形態では、等価残基は、所与の残基の主鎖原子が相同位置の占有に基づく等価基準を満たさないこともあるが、残基の側鎖原子の1つ以上例えば、2、3又はそれ以上の原子配位が前駆体/参照酵素の対応する側鎖原子から短い距離以内例えば、約0.02nmm以内、約0.05nm以内、約0.08nm以内、約0.10nm以内、約0.12nm以内、約0.13nm以内、約0.14nm以内、約0.15nm以内、約0.17nm以内、約0.18nm以内、約0.20nm以内、約0.25nm以内などに位置するような程度に相同な位置を占有するものであることができる。例えば、三次元構造がX線結晶解析により得られるセルラーゼは、好適には、所与の残基の主鎖原子が相同位置の占有に基づく等価基準を満たさないといえども、残基の側鎖原子の少なくとも2つの原子配位がハイポクレアジェコニアCBH2の対応する側鎖原子から0.13nmに位置する等価残基を含み得る。ハイポクレアジェコニアCBH2の結晶構造は、Zouetal.1999Structure79:1035~45に示されている。用語核酸分子は、RNA分子、DNA分子及びcDNA分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質及び/又はその変異体をコードする多数のヌクレオチド配列が作製され得るものと理解される。本開示は、目的の変異体酵素をコードするあらゆる可能な変異体ヌクレオチド配列を想到しており、これらのすべては遺伝コードの縮重も可能である。例えば、複数のヌクレオチド配列は、CBH2及び/又はその変異体などのセルラーゼをコードすることができ、これらは、遺伝コードの縮重のため、本明細書に記載の方法又はプロセスにより製造することができる。異種核酸構築物又は配列は、自生ではない、すなわち、発現される細胞に対して自生形態で存在しない、配列の一部を有する。制御配列に関して、異種は、今ではその発現を制御している同一の遺伝子を制御するように、天然では機能しない制御配列すなわち、プロモーター又はエンハンサーを指す。通常、異種核酸配列は、それらが存在する細胞又は遺伝子の一部にとって内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔法又はこれらに類するものにより、細胞に添加されている。異種核酸構築物は、自生細胞に見られる制御配列/DNAコード配列の組み合わせと同一である又は異なる制御配列/DNAコード配列の組み合わせを含有し得る。本明細書で使用するとき、用語ベクターは、異なる宿主間での移動のためにデザインされた核酸構築物を指す。発現ベクターは、異なる細胞に異種DNA断片を組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核及び真核細胞性発現ベクターは、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に既知である。したがって、発現カセット又は発現ベクターは、標的細胞において特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素との組み換え又は合成で生じた核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウィルス又は核酸断片の中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分は、他の配列としては、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。本明細書で使用するとき、プラスミドは、クローニングベクターとして使用される環状二本鎖dsDNA構築物を指し、これは多くの細菌及び一部の真核生物において染色体外自己複製遺伝要素を形成する。本明細書で使用するとき、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、細胞中での発現が可能であるヌクレオチド配列を指し、ここで、選択マーカーの発現は、発現させた遺伝子を含有する細胞に、対応する選択作用剤の存在下又は対応する選択培養条件下で、培養する能力を付与する。本明細書で使用するとき、プロモーターは、下流遺伝子を直接転写する働きをする核酸配列を指す。プロモーターは、通常、標的遺伝子が発現される宿主細胞にとって適切である。プロモーターは、他の転写及び翻訳制御核酸配列制御配列とも称するは、多くの場合、所与の遺伝子を発現させるために使用される。概して、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び終止配列、及びエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で定義されるとき、キメラ遺伝子構築物は、制御因子を含む異なる遺伝子の部分から構成され得る非自生遺伝子すなわち、宿主に導入されているもの、又は、宿主にその自生形態で存在しないものを指す。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、典型的には、タンパク質コード領域に、又は、選択マーカーキメラ遺伝子においては、例えば、形質転換された細胞に抗生物質耐性を付与する、タンパク質をコードしている選択マーカー遺伝子に、機能するように連結している転写制御領域プロモーターから構成される。宿主細胞での形質転換のための本開示の典型的なキメラ遺伝子は、構成性又は誘導性である転写制御領域、タンパク質コード配列及びターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築物はまた、標的タンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする第2DNA配列を含み得る。例えば、例えば、Archy3トリコデルマリーゼイ株といった本明細書に記載の構築物の特定のものは、キメラ遺伝子構築物である。核酸は、別の核酸配列と機能関係に配置されると機能するように連結される。例えば、分泌リーダーをコードするDNAは、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするDNAと機能するように連結され、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に機能するように連結され、あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に機能するように連結される。通常、機能するように連結は、連結されているDNA配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、リーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、PCRのための合成オリゴヌクレオチドアダプター、リンカー又はプライマーを従来の実践法に従って使用する。本明細書の選択マーカーは、完全選択機能を有する場合に機能すると言うものとする。本明細書で使用するとき、用語遺伝子は、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するDNAの部分を指し、これは、このコード領域に先行する領域及び後続する領域例えば、5’非翻訳配列5’UTR又はリーダー配列及び3’UTR又はトレイラー配列、並びに、個々のコード部分エクソン間の介在配列イントロンを含んでもよく、含まなくてもよい。概して、目的の変異体をコードする核酸分子は、中~高の厳密性条件下で野生型前駆体/参照配列に対してハイブリッド形成する。例えば、CBH2などの変異体セルラーゼをコードする核酸分子は、中~高の厳密性条件下で、本明細書では配列番号7として提供されているもののような野生型配列に対してハイブリッド形成する。しかしながら、特定の実施形態では、目的の酵素をコードするヌクレオチド配列は、実質的に異なるコドン使用頻度を反映する場合もあるが、目的の同じ酵素をコードし続け得る。例えば、このコード配列は、特定のコドンが宿主により利用される頻度に従って、特定の原核又は真核発現系において目的の酵素又は変異体のより強固な発現を促進するために修飾されてもよい例えば、糸状菌における発現のための遺伝子の最適化を説明している、Te’oetal.,FEMSMicrobiologyLetters,190:13~19,2000を参照されたい。核酸配列は、参照核酸配列に対して、これらの2つの配列が中~高の厳密性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリッド形成する場合に、選択的にハイブリッド形成可能であるとみなされる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度Tmに基づく。例えば、最高厳密性は典型的には約Tm-5°CプローブのTmよりも5°C低温にて生じ、高厳密性はTmよりも約5°C~約10°C低温にて生じ、中厳密性又は中度厳密性はプローブのTmよりも約10°C~約20°C低温にて生じ、低厳密性はTmよりも約20°C~約25°C低温にて生じる。機能的に、最高厳密性条件は、ハイブリダイゼーションプローブとの厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を特定するために使用される一方で、高厳密性条件は、プローブとの約80以上の配列同一性を有する配列を特定するために使用される。中~高厳密性ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において周知である例えば、本明細書に参照により明示的に組み込まれている、Sambrook,etal,1989,Chapters9and11及びAusubel,F.M.,etal.,1993を参照されたい。高厳密性条件の例としては、50ホルムアミド、5xSSC、5xデンハルト液、0.5SDS及び100μg/mL変性キャリアDNAの中での約42°Cにおけるハイブリダイゼーション、それに続いての、2xSSC及び0.5SDSの中での室温における洗浄、並びに、0.1xSSC及び0.5SDSの中で42°Cにおける2回の追加の洗浄、が挙げられる。例えば、細胞又は核酸、タンパク質又はベクターについての参照と共に使用するとき、用語組み換えは、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は、自生核酸若しくはタンパク質の変異により修飾されたこと、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞から誘導されること、を意味する。それゆえに、組み換え細胞は、細胞の自生非組み換え形態には見出されない遺伝子を発現させ、又は、別の方法では異常に発現させた、低発現させた、若しくは全く発現させない自生遺伝子を発現させる。本明細書で使用するとき、細胞についての参照付きでの用語形質転換された、安定に形質転換された又はトランスジェニックは、細胞が、非自生又は、その自生形態では存在しない核酸配列を、そのゲノムの中に統合されている、又は、複数の世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして有することを意味する。本明細書で使用するとき、用語発現は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写と翻訳の両方を含む。核酸配列を細胞の中に挿入する文脈での用語導入されたは、トランスフェクション又は形質転換又は形質導入を意味し、核酸配列を原核又は真核細胞のなかに組み込むことを示し、ここで、この核酸配列は、細胞のゲノム例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアDNAの中に組み込まれ、自律レプリコンへと転化され、又は、一過性発現される例えば、トランスフェクションされたmRNA。用語目的のタンパク質又は変異体の発現は、目的の遺伝子又は目的の変異体の転写及び翻訳を指し、その産物は、前駆体RNA、mRNA、ポリペプチド、翻訳後に加工されたポリペプチド及びこれらの誘導体を含む。例えば、CBH2発現は、cbh2遺伝子又はその変異体の転写及び翻訳を指し、その産物は、前駆体RNA、mRNA、ポリペプチド、翻訳後に加工されたポリペプチド及びこれらの誘導体を含み、トリコデルマコニンギTrichodermakoningii、ハイポクレアジェコニアトリコデルマロンギブラキアタムTrichodermalongibrachiatum、トリコデルマリーゼイ又はトリコデルマビリデTrichodermavirideとしても既知及びハイポクレアシュワイニッチHypocreaschweinitziiなどの関連種からのCBH2を含む。発現レベルは、例えば、目的のタンパク質若しくは変異体についてのウェスタンブロット、目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子のmRNAについてのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRアッセイ並びに好適な基質についての酵素活性アッセイといった様々な既知の方法により判定することができる。例として、CBH2発現についてのアッセイとしては、CBH2タンパク質についてのウェスタンブロット、cbh2mRNAについてのノーザンブロット分析及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRアッセイ、並びに、以下に記載のようなリン酸膨潤セルロースPASC及びp-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドPAHBAHアッセイ:aPASC:Karlsson,J.etal.2001,Eur.J.Biochem,268,6498~6507,Wood,T.1988inMethodsinEnzymology,Vol.160.BiomassPartaCelluloseandHemicelluloseWood,W.Kellog,S.Eds.,pp.19~25,AcademicPress,SanDiego,Calif.,USA及びbPAHBAH:Lever,M.1972Anal.Biochem.,47,273,Blakeney,A.B.Mutton,L.L.1980J.Sci.FoodAgriculture,31,889,Henry,R.J.1984J.oftheInstituteofBrewing,90,37が挙げられる。用語宿主細胞は、ベクターを含有し、発現構築物の複製及び/又は転写又は転写及び翻訳発現を補助する細胞を指す。本開示での使用のための宿主細胞は、大腸菌細胞などの原核細胞、又は、酵母、植物、昆虫、両生類又は哺乳類細胞などの真核細胞であることができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、好適には、糸状菌である。用語糸状菌は、当業者により認識される任意の及びすべての糸状菌を意味する。好ましい真菌は、アスペルギルスAspergillus、トリコデルマTrichoderma、フザリウムFusarium、クリソスポリウムChrysosporium、アオカビPenicillium、フミコーラHumicola、アカパンカビNeurospora又は、エメリセラEmericella、ボタンタケHypocreaなどのこれらの代替的性形態からなる群から選択される。無性産業用真菌トリコデルマリーゼイが子嚢菌ハイポクレアジェコニアのクローン誘導体であることは今では示されているKuhlsetal.,PNAS,93:7755~7760,1996を参照されたい。木材腐朽菌トリコデルマ、コンポスト細菌サーモモノスポラThermomonospora、バチルスBacillus及びセルロモナスCellulomonas、ストレプトミセスStreptomyces並びに、真菌フミコーラ、アスペルギルス及びフザリウムなどの多くの微生物は、セルロースを加水分解する酵素を産生する。本明細書で使用するとき、用語単離された又は精製されたは、天然で関連している少なくとも1つの成分から除去される核酸又はアミノ酸を指す。糸状菌は、副分類である真菌及び卵菌のすべての菌糸形態を含む。例えば、糸状菌としては、アクレモニウムAcremonium、アスペルギルス、エメリセラ、フザリウム、フミコーラ、ケカビMucor、ミセリオフトーラMyceliophthora、アカパンカビ、スキタリジウムScytalidium、チエラビアThielavia、トリポクラジウムTolypocladium又はトリコデルマ種が挙げられるが、これらに制限されない。一部の実施形態では、糸状菌は、アスペルギルスアクレアータスAspergillusaculeatus、アスペルギルスアワモリAspergillusawamori、アスペルギルスフォエティダスAspergillusfoetidus、アスペルギルスジャポニクスAspergillusjaponicus、アスペルギルスニデュランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガー又はアスペルギルスオリザエAspergillusoryzaeであり得る。一部の実施形態では、糸状菌は、フザリウムバクトリジオイデスFusariumbactridioides、フザリウムセレアリスFusariumcerealis、フザリウムクルックウェレンセFusariumcrookwellense、フザリウムカルモラムFusariumculmorum、フザリウムグラミネアラムFusariumgraminearum、フザリウムグラミヌムFusariumgraminum、フザリウムヘテロスポラムFusariumheterosporum、フザリウムネグンジFusariumnegundi、フザリウムオキシスポラムFusariumoxysporum、フザリウムレティキュラツムFusariumreticulatum、フザリウムロゼウムFusariumroseum、フザリウムサムブキヌムFusariumsambucinum、フザリウムサルコクロウムFusariumsarcochroum、フザリウムスポロトリキオイデスFusariumsporotrichioides、フザリウムスルフレウムFusariumsulphureum、フザリウムトルロスムFusariumtorulosum、フザリウムトリコセキオイデスFusariumtrichothecioides又はフザリウムベネナタムFusariumvenenatumであり得る、一部の実施形態では、糸状菌は、フミコーラインソレンスHumicolainsolens、フミコーララヌギノーサHumicolalanuginosa、ムコールミエヘイMucormiehei、ミセリオフトーラサーモフィラMyceliophthorathermophila、ニューロスポーラクラッサNeurosporacrassa、スキタリジウムサーモフィルムScytalidiumthermophilum又はチエラビアテレストリスThielaviaterrestrisである。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマハルジアヌムTrichodermaharzianum、トリコデルマコニンギ、トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマリーゼイであり、例えば、RL-P37Sheir-Neissetal.,Appl.Microbiol.Biotechnology,201984pp.46~53;MontenecourtB.S.,Can.,1~20,1987、QM9414ATCCNo.26921、NRRL15709、ATCC13631、56764、56466、56767であり、あるいは、トリコデルマビリデTrichodermaviride、例えば、ATCC32098及び32086である。一部の実施形態では、糸状菌は、トリコデルマリーゼイRutC30であり、これは、トリコデルマリーゼイATCC56765としてAmericanTypeCultureCollectionから入手可能である。これに関し、一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の糸状菌のいずれか1つの全細胞培養調製物を提供する。通常、微生物は、酵素の産生に好適な細胞培養培地で培養される。培養は、当該技術分野で既知の手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地で行われる。好適な培養培地、温度範囲、並びに、培養及び酵素産生に好適な他の条件は、当該技術分野において既知である。非限定例としては、トリコデルマリーゼイによるセルラーゼの産生についての通常温度範囲は、24°C~28°Cである。通常、全細胞培養調製物は、回収及び/又は精製を全く若しくは最小限にしか用いない発酵により産生されるときに使用される。例えば、いったん目的の酵素又は変異体あるいは1つを超える目的の酵素又は変異体が細胞により細胞培養培地の中に分泌されてから、目的の酵素又は変異体を含有する細胞培養培地を使用することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、細胞培養培地、細胞外酵素及び細胞を含む発酵物質の未分画内容物を含む。あるいは、全細胞培養調製物は、任意の便利な方法により、例えば、沈殿、遠心分離、親和性、濾過又は当該技術分野において既知の任意の他の方法により、処理することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、例えば、濃縮し、その後、更なる精製なしで使用することができる。一部の実施形態では、全細胞培養調製物は、細胞の生存能力を低下させるか又は細胞を殺す化学作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、当該技術分野において既知の方法を用いて、溶解又は透過される。例えば、目的のセルラーゼ又は変異体例えば、CBH2又はその変異体、Fv43B、Fv43Aは、細胞により細胞培養培地の中に分泌することができ、この細胞培養培地はこのセルラーゼ又は変異体を含有する。この細胞培養培地は、全細胞培養調製物として使用することができる。2.分子生物学特定の実施形態では、本開示は、目的の酵素又は変異体の発現をもたらす。特定の実施形態では、目的の酵素又は変異体をコードする遺伝子は、糸状菌において機能性であるプロモーターの制御下に置かれる。この実施形態の例では、糸状菌において機能性である好適なプロモーターの制御下で変異体cbh2遺伝子を発現させる方法が提供される。組み換え遺伝学の分野における既知の技術を適用することができる例えば、Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.,1989;Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual,1990;及びAusubeletal.,eds.,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork,1994を参照されたい。3.組み換えタンパク質の発現本開示の方法は、任意の特定の方法に発現方法を限定しない組み換えタンパク質を発現させる人工宿主細胞に関連する。目的の組み換えタンパク質又は変異体は、好ましくは、細胞から分泌される。本開示は、タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質導入、形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。温度、pH及びこれらに類するものなどの培養条件は、形質導入、形質転換又はトランスフェクションに先立って親宿主細胞に予め使用されたものであり、当業者には明白である。一アプローチでは、糸状菌又は酵母菌は、プロモーター又は生物学的に活性なプロモーター断片又は1つ以上の例えば、一連のエンハンサーを有する発現ベクターでトランスフェクションされ、宿主細胞株で機能し、目的のタンパク質又は変異体をコードするDNA部分に機能するように連結され、その結果、目的のタンパク質又は変異体は細胞株で発現される。A.核酸構築物/発現ベクター目的のタンパク質又は変異体をコードする天然又は合成のポリヌクレオチド断片は、糸状菌又は酵母菌に導入することができ、複製することができるキメラ構築物又はベクターの中に組み込まれ得る。本明細書に開示されているベクター及び方法は、タンパク質又は変異体の発現のために宿主細胞中で使用するのに好適である。導入される細胞中で複製可能及び生存可能である限り、任意のベクターを使用することができる。多数の好適なベクター及びプロモーターは、当業者に既知であり、多くは市販されている。クローン及び発現ベクターはまた、Sambrooketal.,1989、AusubelFMetal.,1989及びStrathernetal.,TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces,1981に記載されており、これらは各々本明細書に参照により明示的に組み込まれる。真菌に好適な発現ベクターは、vandenHondel,C.A.M.J.J.etal.1991In:Bennett,J.W.andLasure,L.L.eds.MoreGeneManipulationsinFungi.AcademicPress,pp.396~428に記載されている。適切なDNA配列は、様々な手順によりプラスミド又はベクター本明細書では総じてベクターと呼ぶの中に挿入され得る。場合により、このDNA配列は、既知の手順を用いて、好適な制限エンドヌクレアーゼ部位の中に挿入される。他の例では、制限消化及び/又は連結を伴わないベクター構築方法が好適に適用され得る。このような手順及び関連するサブクローニング手順は、当業者の既知の範囲内であるとみなされる。目的のタンパク質又は変異体についてコードする配列を含む組み換え糸状菌は、目的のタンパク質又は変異体のコード領域を糸状菌の選択された株の細胞の中に導入することにより、産生され得る。いったん所望の形態の核酸配列が得られたら、これは様々なやり方で修飾され得る。例えば、配列が非コード隣接領域を伴う場合、これらの隣接領域は、切除、変異誘発などにさらされ得る。それゆえに、トランジション、トランスバージョン、欠失及び挿入は、天然に生じる配列において行われ得る。選択されたコード配列は、既知の組み換え技術に従って好適なベクターの中に挿入され、糸状菌の形質転換に使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、同じ又は機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、目的のタンパク質又は変異体をクローン及び発現させるのに使用され得る。したがって、コード領域内でのこのような置換は、本開示の範囲に収まる配列変異体に含まれる。これらの配列の任意のもの及びすべては、本明細書に記載のものと同じやり方で利用することができる。例えば、CBH2などのセロビオヒドロラーゼの配列変異体は、目的のタンパク質又は変異体がセルラーゼである場合に使用することができる。用語セルラーゼ、セルロース分解性酵素又はセルラーゼ酵素は、セルラーゼポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース及び/又はグルコースに加水分解できる酵素の範疇を指す。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ及びグルコシダーゼなどのセルラーゼの数多くの例は、特に真菌、植物及び細菌などのセルロース分解性組織から得られてきた。これらの微生物により産生される酵素は、セルロースをグルコースに転化するのに有用な三種の作用を有するタンパク質の混合物である:エンドグルカナーゼEG、セロビオヒドロラーゼCBH及びβ-グルコシダーゼ。これらの三つの異なるタイプのセルラーゼ酵素は、層状的に作用して、セルロース及びその誘導体をグルコースに転化する。ハイポクレアジェコニアからのCBH2は、グリコシルヒドロラーゼファミリー6すなわち、Cel6のメンバーであり、特にハイポクレアジェコニアにおいて同定されたファミリーの第1メンバーであったすなわち、Cel6A。グリコシルヒドロラーゼファミリー6はエンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼ/エキソグルカナーゼの両方を含有し、CBH2はセロビオヒドロラーゼ/エキソグルカナーゼである。それゆえに、語句CBH2、CBH2型タンパク質及びCel6セロビオヒドロラーゼは、多くの場合、本明細書において互換的に使用される。それゆえに、用語変異体cbh2遺伝子は、ハイポクレアジェコニアからのcbh2遺伝子の核酸配列がコード配列を除去、付加及び/又は操作することにより変更されたことを意味する。本開示はまた、上記のような1つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を含む組み換え核酸構築物を含む。この構築物は、プラスミド又はウィルスベクターなどのベクターを含み、これらの中には順配向又は逆配向で本開示の配列が挿入されている。キメラ構築物は、目的のタンパク質又は変異体についてのコード配列を含み得る。一部の実施形態では、コード配列は、i単離で、ii例えば、融合タンパク質又はシグナルペプチドのコード配列などの追加のコード配列と組み合わせて但し、コード配列は優性コード配列である、iii例えば、イントロン及び制御要素例えば、好適な宿主におけるコード配列の発現に有効な、プロモーター及びターミネーター要素又は5’及び/若しくは3’非翻訳領域などの非コード配列と組み合わせて、並びに/あるいはivコード配列が自生若しくは非自生遺伝子であるベクター又は宿主環境において、存在する。特定の態様では、キメラ構築物は、インビトロで細胞の中にタンパク質をコードする核酸配列を移動させるために、採用される。好ましくは、タンパク質をコードする核酸配列を移動させる細胞は、確立された糸状菌又は酵母菌株である。目的のタンパク質又は変異体の長期にわたる産生のために、安定した発現が好ましい。安定した形質転換体を産生するのに有効な様々な既知の方法が、本開示を実施するのに使用され得る。好適なベクターは、典型的には、選択マーカーをコードする核酸配列、挿入部位、並びに、プロモーター及び終止配列などの好適な制御要素を備えている。ベクターは、コード配列に機能するように連結された、例えば、イントロン及び制御要素例えば、宿主細胞における並びに/あるいは、修飾された可溶性タンパク質コード配列が正常に発現されないベクター又は宿主細胞環境におけるコード領域の発現にとって有効な、プロモーター及びターミネーター要素又は5’及び/若しくは3’非翻訳領域などの非コード配列が挙げられる、調節配列を含んでもよい。多くの好適なベクター及びプロモーターは当業者に既知であり、多くは市販されており、並びに/あるいは、Sambrook,etal.上記に記載されている。好適なプロモーターの例としては、CMVプロモーター、SV40earlyプロモーター、RSVプロモーター、EF-1αプロモーター、説明するようなtet-on又はtet-offシステムにおけるtet応答因子TREを含有するプロモーターClonTech及びBASF、β-アクチンプロモーター、並びに、特定の金属塩の付加により上方制御できるメタロチオネインプロモーターなどの、構成性プロモーター及び誘導性プロモーターが挙げられる。プロモーター配列は、発現目的のための特定の糸状菌により認識されるDNA配列である。これは、目的のタンパク質又は変異体をコードするDNA配列に機能するように連結されている。このような連結は、目的のタンパク質をコードするDNAの開始コドンに対するプロモーターの配置を含む。プロモーター配列は、目的のタンパク質又は変異体の発現を媒介する転写又は翻訳制御配列を含有する。非限定例としては、アスペルギルスニガー、A.アワモリ又はA.オリザエの、グルコアミラーゼ、α-アミラーゼ又はα-グルコシダーゼをコードする遺伝子、A.ニデュランスのgpdA又はtrpC遺伝子、ニューロスポーラクラッサのcbh1又はtrp1遺伝子、A.ニガー又はリゾムコールミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼをコードする遺伝子、ハイポクレアジェコニアトリコデルマリーゼイのcbh1、cbh2、egl1、egl2又は他のセルラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターが挙げられる。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主にとって適切なマーカーは当該技術分野において周知である。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、A.ニデュランス又はトリコデルマリーゼイからのargB、A.ニデュランスからのamdS、ニューロスポーラクラッサ又はトリコデルマリーゼイからのpyr4、アスペルギルスニガー又はA.ニデュランスからのpyrGが挙げられる。好適な選択マーカーの追加の例としては、trpc、trp1、oliC31、niaD又はleu2が挙げられるがこれらに限定されず、これらは、trp-、pyr-、leu-及びこれらに類するものなどの変異株を形質転換するために使用されるキメラ構築物に含まれる。このような好適なマーカーは、形質転換体に、糸状菌には通常は代謝されない代謝産物を利用する能力を付与する。例えば、酵素アセトアミダーゼをコードするハイポクレアジェコニアからのamdS遺伝子は、形質転換体細胞が窒素源としてのアセトアミド上で培養することを可能にする。選択マーカー例えば、pyrGは、栄養要求変異株が選択最少培地上で培養する能力を回復させ得、あるいは、選択マーカー例えば、olic31は、形質転換体に阻害薬又は抗生物質の存在下で培養する能力を付与し得る。選択マーカーコード配列は、当該技術分野で一般に採用される方法を用いて、任意の好適なプラスミドの中にクローニングされる。好適なプラスミドの例としては、pUC18、pBR322、pRAX及びpUC100が挙げられる。pRAXプラスミドは、A.ニデュランスからのAMAL配列を含有し、これによりA.ニガーにおける複製が可能になる。本開示を実施するにあたって、特に明記しない限り、当該技術分野内に存在する分子生物学、微生物学、組み換えDNA及び免疫学の従来技術を採用するものとする。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Sambrooketal.,1989;Freshney,AnimalCellCulture,1987;Ausubel,etal.,1993;及びColiganetal.,CurrentProtocolsinImmunology,1991を参照されたい。B.組み換えタンパク質産生のための糸状菌及び培養条件組み換えタンパク質発現のために処理及び/又は改変され得る親糸状菌種の例としては、トリコデルマ例えば、トリコデルマリーゼイ、トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギ、アオカビ種、フミコーラ種フミコーラインソレンスなど、アスペルギルス種、クリソスポリウム種、フザリウム種、ボタンタケ種及びエメリセラ種が挙げられる。形質転換された細胞は、親真菌株を培養するのに典型的に採用される条件下で、培養される。例えば、細胞は、Pourquie,J.etal.,BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation,eds.Aubert,J.P.etal.,AcademicPress,pp.71~86,1988及びIlmen,M.etal.,Appl.Environ.Microbiol.63:1298~1306,1997に記載されているような生理学的塩及び栄養素を含有する標準的な培地で培養することができる。様々な一般的な培養条件が好適であり得、例えば、培養物は、所望のレベルの組み換えタンパク質発現が達成されるまで、振盪培養器又は発酵槽内で28°Cにてインキュベートされる。所与の糸状菌についての好適な培養条件は、科学文献に及び/又はAmericanTypeCultureCollectionATCC;www.atcc.org/などの真菌供給源から見出され得る。真菌培養が確立した後、細胞は、組み換えタンパク質の発現を生じさせる又は許容するのに有効な条件下に曝露される。コード配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、誘導剤例えば、砂糖、金属塩又は抗生物質を、組み換えタンパク質発現を誘導するのに有効な濃度で培地に添加する。一部の実施形態では、糸状菌はアスペルギルスニガーであり、これは、目的のタンパク質の過剰発現を得るのに有用な株である。例えば、アスペルギルスニガーvarアワモリdgr246は、増加した量のセルラーゼを分泌することが既知であるGoedegebuuretal.,Curr.Genet200241:89~98。GCDAP3、GCDAP4及びGAP3-4などのアスペルギルスニガーvarアワモリの他の株もまた既知である。例えば、Wardetal,Appl.Microbiol.Biotechnol.39:738~743を参照されたい。一部の実施形態では、糸状菌はトリコデルマリーゼイであり、これは、目的のタンパク質の過剰発現を得るのに有用な別の株である。一部の実施形態では、このような糸状菌宿主細胞は、有害な活性又は特徴例えば、発現、安定性に対する有害、特定の特質についての問い合わせ又はアッセイを困難にする混乱作用などに関連付けられる特定の遺伝子又は本明細書では有害遺伝子を欠失させる又は低減することができる。一部の実施形態では、このような真菌宿主細胞は、例えば、分泌増加、安定性増加、溶解度増加などといった特定の好ましい作用又は特徴に関連付けられる遺伝子又は本明細書では好ましい遺伝子を得る又は増強するように改変することができる。例えば、トリコデルマリーゼイ株RL-P37は、Sheir-Neiss,etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46~531984により記載されているように、増加した量のセルラーゼ酵素を分泌することが既知である。RL-P37の機能的等価物としては、トリコデルマリーゼイ株RUT-C30ATCCNo.56765及び株QM9414ATCCNo.26921が挙げられる。これらの株は、CBH1若しくはCBH2などの特定のセロビオヒドロラーゼ又は特定のエンドグルカナーゼが挙げられるがこれらに限定されないタンパク質及びその変異体を過剰発現させるのに有用であることも想到される。例として、組み換えタンパク質が変異体CBH2である場合、潜在的に有害である自生セルロース分解活性を欠く変異体を産生することが好ましい。それゆえに、変異体CBH2をコードするDNAフラグメントを含有するDNA構築物又はプラスミドを導入するのに先立って1つ以上のセルラーゼ遺伝子を欠失しているトリコデルマ宿主株を得ることが有用である。このような好適な多重欠失株は、例えば、米国特許第5,246,853号及び国際公開第92/06209号に開示されている方法により調製され得、ここで、これらの開示は参照により組み込まれるものとする。1つ以上のセルラーゼ遺伝子を失っている宿主微生物において変異体CBH2セルラーゼを発現させることにより、同定手順及びそれに続く精製手順が単純化される。クローン化されたトリコデルマ種の任意の遺伝子はそれゆえに欠失させることができ、例えば、cbh1、cbh2、egl1及びegl2遺伝子並びにEGIII及び/又はEGVタンパク質をコードする遺伝子は、トリコデルマ宿主株から欠失させることができる例えば、それぞれ米国特許第5,475,101号及び国際公開第94/28117号を参照されたい。遺伝子欠失は、欠失又は欠損されるある形態の所望の遺伝子をプラスミドの中に挿入することにより達成され得る。欠失プラスミドは、次に、所望の遺伝子コード領域に対して内部の適切な制限酵素部位にて消化され、その遺伝子コード配列又はその部分は選択マーカーにより置換される。好ましくは約0.5kb~約2.0kbのサイズを有する、遺伝子が欠失する又は破壊される位置からの隣接DNA配列は、選択マーカー遺伝子のいずれかの側にとどまることができる。好適な欠失プラスミドは、一般に、隣接DNA配列を含む欠失遺伝子と、単一の直線状部分として除去される選択マーカー遺伝子と、を含有する断片を可能にするために存在する独特の制限酵素部位を有する。一部の実施形態では、選択マーカーは、形質転換された微生物の検出を可能にするように選択される。選択された微生物において発現される任意の選択マーカー遺伝子は好ましいものであり得る。例えば、アスペルギルス種に関し、選択マーカーは、形質転換体における選択マーカーの存在が微生物の特性を有意に変更しないように、選択することができる。好適な選択マーカーの例は、アッセイ可能な生成物をコードする遺伝子である。例えば、宿主株において欠く場合に宿主株が栄養要求表現型を表すアスペルギルス種遺伝子の機能的コピーが使用され得る。選択マーカーは、トリコデルマ種についても存在する。一部の実施形態では、アスペルギルス種のpyrG-誘導体株は、機能性pyrG遺伝子で形質転換され、これは形質転換についての選択マーカーを提供する。pyrG-誘導体株は、フルオロロロチン酸FOA耐性であるアスペルギルス種株を選択することにより、得ることができる。pyrG遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン-5’-モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。完全pyrG遺伝子を有する株は、ウリジンを欠く培地で培養するが、フルオロオロチン酸には感受性である。したがって、FOA耐性選択は、機能性オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠き、それゆえに培養のためにウリジンを必要とするpyrG-誘導体株を選択するために使用することができる。FOA選択技術を使用して、機能性オロテートピロホスホリボシル転移酵素を欠くウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞は、この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーで形質転換することができるBergesBarreau,Curr.Genet.19:359~3651991及びvanHartingsveldtetal.,1986Mol.Gen.Genet.206:71~75。誘導体株の選択は、上記FOA耐性技術を用いて、行われる。一部の実施形態では、pyrG遺伝子は、選択マーカーとして採用される。一部の実施形態では、ボタンタケ種トリコデルマ種のpyr4-誘導体株は、機能性pry4遺伝子で形質転換され、これは形質転換についての選択マーカーを提供する。pyr4-誘導体株は、フルオロオロチン酸FOAに耐性であるボタンタケ種トリコデルマ種株の選択により得ることができる。pyr4遺伝子は、ウリジンの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン-5’-モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。完全pyr4遺伝子を有する株は、ウリジンを欠く培地で培養するが、フルオロオロチン酸には感受性である。したがって、FOA耐性選択は、機能性オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠き、それゆえに培養のためにウリジンを必要とするpyr4-誘導体株を選択するために使用することができる。FOA選択技術を使用して、機能性オロテートピロホスホリボシル転移酵素を欠くウリジン要求性株を得ることも可能である。これらの細胞は、この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーで形質転換することができるBergesBarreau,1991。誘導体株の選択は、上記のようにFOA耐性技術を用いて、行われる。一部の実施形態では、pyr4遺伝子は、選択マーカーとして採用される。例えば、上記に例示したもののような有害遺伝子が欠損又は欠失した単一DNA断片は、次に、欠失プラスミドから単離され、適切なpyrG-アスペルギルス又はpyr4-トリコデルマ宿主を形質転換するのに用いられる。形質転換体は、これらがpyrG又はpyr4遺伝子産物を発現させ、それゆえに、宿主株のウリジン要求性を補う能力に基づいて同定及び選択される。サザンブロット分析は、その間に遺伝子のゲノムコピーのコード領域の部分又はすべてが欠失され、好適なpyr選択マーカーで置換されるダブルクロスオーバーイベントを同定及び確認するために、得られた形質転換体で好適に行うことができる。上述した特定のプラスミドベクターがpyr形質転換体の調製に関するといえども、本開示はこれらのベクターに限定されるものではない。様々な遺伝子は、上記技術を上記のように用いて、アスペルギルス種又はボタンタケ種トリコデルマ種において欠失させる及び置換することができる。加えて、多くの選択マーカーは、本明細書で説明するように、好適である。実際、同定された任意の遺伝子は、上記方法を用いて、例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種といった任意の宿主のゲノムから好適に欠失させることができる。特定の実施形態では、使用される宿主株は、選択された選択マーカーに対応する非機能性遺伝子単数又は複数を欠失する又は有するボタンタケ種トリコデルマ種の誘導体であり得る。例えば、pyrGの選択マーカーがアスペルギルス種のために選択される場合、特定のpyrG-誘導体株が形質転換手順において受容体として使用される。別の例では、pyr4の選択マーカーがボタンタケ種のために選択される場合、特定のpyr4-誘導体株が形質転換手順において受容体として使用される。一部の実施形態では、例えば、amdS、argB、trpC又はniaDといった、アスペルギルスニデュランス遺伝子に類似したボタンタケ種トリコデルマ種遺伝子を含む選択マーカーが使用され得る。対応する受容体株は、したがって、それぞれamdS-、argB-、trpC-又はniaD-株などの誘導体株である。目的のタンパク質又は変異体をコードするDNAは、次に、適切な微生物への挿入のために調製することができる。本開示によると、目的のタンパク質又は変異体をコードするDNAは、野生型タンパク質の活性を有するタンパク質又は変異体をコードするDNAを含み得る。目的のタンパク質又は変異体をコードするDNA断片は、例えば、アスペルギルスにおけるglaA遺伝子のプロモーター又はトリコデルマにおけるcbh1若しくはegl1遺伝子のプロモーターといった、真菌プロモーター配列に機能的に結合され得る。目的のタンパク質又は目的の変異体をコードするDNAは、そのタンパク質又は変異体をコードするDNAを保有する発現ベクターを構築することにより、調製され得る。目的のタンパク質又は変異体をコードする挿入DNA断片を保有する発現ベクターは、例えば、典型的にはプラスミドの形態である、所与の宿主生物において自律的に複製できるか又は宿主のDNAの中に統合することができる任意のベクターであり得る。特定の実施形態では、遺伝子の発現を得るために二つのタイプの発現ベクターが想到される。第1のタイプは、プロモーター、遺伝子コード領域及びターミネーター配列がすべて、発現される遺伝子に由来する、DNA配列を含有する。望ましくない例えば、不必要なドメインをコードしているDNA配列を欠失させ、それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを残すことにより、所望される遺伝子トランケーションを得ることができる。選択マーカーはまた、所望の遺伝子配列の複数のコピーを宿主の中に統合するための選択を可能にするベクターの一部として含有され得る。第2のタイプの発現ベクターは、予め組み立てられており、高レベル転写及び選択マーカーに有用な配列を含有する。遺伝子又はその一部についてのコード領域は、このような汎用発現ベクターの中に挿入することができ、それを発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に置くことができると想到される。このような汎用発現ベクターの非限定例は、アスペルギルスにおけるpRAXである。目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子又はこれらの一部は、強力なglaaプロモーターの下流に挿入することができる。このような汎用発現ベクターの非限定例は、ボタンタケにおけるpTEXである。目的の遺伝子若しくは変異体遺伝子又はこれらの一部は、強力なcbh1プロモーターの下流に挿入することができる。特定の実施形態では、ベクターにおいて、目的のタンパク質又は変異体をコードするDNA配列は転写及び翻訳配列に機能するように連結され、例えば、好適なプロモーター配列及びシグナル配列はリーディングフレームにおいて構造遺伝子に機能するように連結されている。プロモーターは、好適には、特定の宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であり、宿主細胞に対して相同又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。任意のシグナルペプチドは、目的のタンパク質又は変異体の細胞外産生を提供し得る。シグナル配列をコードするDNAは、好ましくは、発現される遺伝子と天然に関連しているものである。しかしながら、例えば、トリコデルマの、エキソセロビオヒドロラーゼから又はエンドグルカナーゼからといった、任意の好適な供給源からのシグナル配列が想到される。目的のタンパク質又は変異体をコードするDNA配列をプロモーターに連結するために使用できるプロトコル及びこのような構築物を好適なベクターの中に挿入することは、当該技術分野において既知である。本明細書に記載のDNAベクター構築物は、形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロ穿孔法、微粒子銃照射及びこれらに類するものなどの既知の技術により、宿主細胞の中に導入され得る。例えば、本明細書に記載のDNAベクター又は構築物が真菌宿主細胞を形質転換するのに使用される場合、DNAに対するボタンタケ種トリコデルマ種の細胞壁の透過性は低いものであり得る。したがって、所望のDNA配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みは、多くの場合、最小限である。形質転換プロセスに先立って誘導体株例えば、使用される選択マーカーに対応する機能性遺伝子を欠くもののボタンタケ種トリコデルマ種細胞壁の透過性を上昇させるために、多くの方法を使用することができる。特定の実施形態では、形質転換のためにアスペルギルス種又はボタンタケ種トリコデルマ種を調製するために、菌糸体からのプロトプラストを調製する。Campbelletal.Curr.Genet.16:53~56;1989を参照されたい。菌糸は、発芽した栄養胞子から得ることができる。菌糸は、細胞壁を消化する酵素で処理され、プロトプラストを生じる。プロトプラストは次に懸濁培地内で浸透安定剤の存在により保護される。好適な安定剤としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及びこれらに類するものが挙げられる。通常、安定剤の濃度は、0.8M~1.2M例えば、0.9M~1.2M、1,0M~1.2M、1.1M~1.2Mなどで様々であり得る。特定の実施形態では、1.2Mのソルビトールが懸濁培地内で安定剤として使用される。宿主株例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種トリコデルマ種へのDNAの取り込みは、多くの場合、カルシウムイオン濃度に依存し得る。通常、約10mMのCaCl2~約50mMのCaCl2例えば、約15mM~約45mM、約20mM~約40mM、約25mM~約35mMが取り込み溶液中で使用される。取り込み溶液中にカルシウムイオンを含む他、多くの場合含まれる他の品目は、TE緩衝液10mMのトリス、pH7.4、1mMのEDTA又は10mMのMOPSのpH6.0の緩衝液モルホリンプロパンスルホン酸及びポリエチレングリコールPEGなどの緩衝系である。この緩衝液中のポリエチレングリコールは、細胞膜を溶解するように作用して、これにより培地の内容物が宿主細胞例えば、アスペルギルス種又はボタンタケ種の細胞質の中に送達されるようにし、プラスミドDNAは核に移動される。特定の実施形態では、この溶解プロセスは、宿主染色体の中に統合されたプラスミドDNAの複数のコピーを残す。通常、105~106/mL、好ましくは2×105/mLの密度にて透過性処理にかけられたアスペルギルス種プロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が形質転換に使用される。同様に、108~109/mL、好ましくは2×108/mLの密度にて透過性処理にかけられたボタンタケ種トリコデルマ種プロトプラスト又は細胞を含有する懸濁液が形質転換に使用される。これらのプロトプラスト又は細胞の容量100μLを適切な溶液例えば、1.2Mのソルビトール、50mMのCaCl2の中で所望のDNAと共に混合する。一部の実施形態では、相当な量のPEGが取り込み溶液に添加される。例えば、約0.1~約1容量の25PEG4000をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。具体例では、約0.25容量の25PEG4000をプロトプラスト懸濁液に添加する。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム及びこれらに類するものなどの添加物も取り込み溶液に添加してもよく、形質転換の助けとなり得る。特定の実施形態では、混合物は、約0°Cにて約10~約30分の期間にわたってインキュベートされる。追加のPEGを混合物に添加して、所望の遺伝子又はDNA配列の取り込みを強化することができる。特定の実施形態では、25PEG4000は、形質転換混合物の5~15倍である容量で添加することができるが、より多量及び少量もまた好適であり得る。例えば、25PEG4000は、一部の実施形態では形質転換混合物の10倍の容量で添加される。PEGが添加された後、形質転換混合物は次に室温又は氷上のいずれかでインキュベートされ、その後、ソルビトール及びCaCl2溶液を添加する。プロトプラスト懸濁液を次に培養培地の溶融アリコートに添加する。この培養培地は、形質転換体の培養を許容する。多くの培養培地は、本開示の所望の形質転換体を培養するのに好適に使用することができる。特定の実施形態では、例えば、Pyr形質転換体が選択されている場合、ウリジンを全く含有しない培養培地を使用することが好ましい。例えば、コロニーは、ウリジンを欠く培養培地上に移され、精製される。この段階で、安定な形質転換体は、そのより速い培養速度により、不安定な形質転換体から識別され得る。また、例えば、トリコルデマといった、多くの糸状菌宿主について、ウリジンを欠く固体培養培地上でのギザギザした外郭とは反対に滑らかさを有する環状コロニーの形成を識別特性として使用することができる。一部の実施形態では、固体の非選択培地例えば、ウリジンを含有している上で形質転換体を培養し、この培養培地から胞子を採取し、これらの胞子の百分率を判定することにより、安定度の更なる試験及び選択が行われ得る。選択された胞子は、発芽を許容され、ウリジンを欠く選択培地上での培養を許容される。C.宿主細胞内への組み換えタンパク質をコードする核酸配列の導入本開示は、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含むように遺伝学的に改変した細胞及び細胞組成物を更に提供する。親細胞又は細胞株は、クローニングベクター又は発現ベクターで遺伝学的に改変すなわち、形質導入、形質転換又はトランスフェクションされ得る。ベクターは、上記に詳述されていたように、例えば、プラスミド、ウィルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。本開示の形質転換方法により、形質転換ベクターのすべて又は部分を糸状菌のゲノム内に安定的に統合することがもたらされ得る。自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換もまた想到される。相当の量の非自生又は自生タンパク質を発現させる糸状菌、例えば、トリコデルマリーゼイ、細胞株を産生するために、多くの標準的なトランスフェクション方法を使用することができる。例えば、多くの公開方法が存在し、トリコデルマの酵素産生株の中にDNA構築物を導入するためにはLoritoetal.,1993,Curr.Genet.24:349~356;Goldmanetal.,1990,Curr.Genet.17:169~174;Penttilaetal.,1987,Gene6:155~164が挙げられ、アスペルギルスの酵素産生株の中にDNA構築物を導入するためにはYeltonetal.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470~1474が挙げられ、フザリウムの酵素産生株の中にDNA構築物を導入するためにはBajaretal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8202~8212が挙げられ、ストレプトミセスの酵素産生株の中にDNA構築物を導入するためにはHopwoodetal.,1985,TheJohnInnesFoundation,Norwich,UKが挙げられ、バチルスについてはBrigidietal.,1990,FEMSMicrobiol.Lett.55:135~138が挙げられる。キメラ構築物発現ベクターを糸状菌例えば、ハイポクレアジェコニアの中に導入するための他の方法としては、粒子又は遺伝子銃、形質転換プロセスに先立つ糸状菌細胞壁の透過例えば、高濃度のアルカリ、例えば、0.05M~0.4MのCaCl2又は酢酸リチウムの使用による、原形質融合又はアグロバクテリウム媒介形質転換の使用が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコール及びCaCl2を有するプロトプラスト又はスフェロプラストによるこのような糸状菌形質転換方法の例は、Campbell,E.I.etal.,Curr.Genet.16:53~56,1989;及びPenttila,M.etal.,Gene,63:11~22,1988に記載されている。異なるヌクレオチド配列を宿主細胞の中に導入するための任意の既知の手順が使用され得る。これらとしては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、原形質融合、電気穿孔法、バイオリスティック、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウィルスベクター、並びに、宿主細胞の中にクローン化DNA、cDNA、合成DNA又は他の異なる遺伝的物質を導入するための任意の他の既知の方法の使用が挙げられる例えば、Sambrooketal.上記を参照されたい。米国特許第6,255,115号に記載のアグロバクテリウム媒介トランスフェクション法も有用である。用される特定の遺伝工学手順が非自生又は内因性しかしながら非自生形態遺伝子を発現できる宿主細胞の中に少なくとも1つの遺伝子をうまく導入できることが重要である。一部の実施形態では、組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含むキメラ構築物は、インビトロで転写することができ、得られたRNAは例えば、インジェクションといった既知の方法により宿主細胞の中に導入することができる。本開示は、真菌酵素、その変異体、及びこれらの分子を含む組成物を産生することにおいて使用するためのハイポクレアジェコニア及びアスペルギルスニガーなどの糸状菌の新規及び有用な形質転換体を更に含む。本開示は、糸状菌、特に特定の組み換えタンパク質をコードする配列又は特定の内因性コード配列の欠失を含む真菌、の形質転換体を含む。目的のタンパク質又はその変異体のためのコード配列を含むキメラ構築物の導入に続いて、遺伝学的に改変された細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は組み換えタンパク質をコードする核酸配列の発現増幅にとって適切なように改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pH及びこれらに類するものなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に予め使用されたものであり、当業者には明白である。このようなキメラ構築物が導入された細胞の子孫は、キメラ構築物に見られるタンパク質をコードする核酸配列を含むと通常考えられる。本開示は、真菌酵素、その変異体、又はこのような分子を含む組成物を産生することにおいて使用するためのH.ジェコニアなどの糸状菌の新規及び有用な形質転換体を更に含む。例えば、アスペルギルスニガーも、組み換えタンパク質及びその変異体の産生において使用され得る。本開示は、糸状菌、特に目的のタンパク質若しくはその変異体のコード配列又は特定の内因性タンパク質をコードする配列の欠失を含む真菌、の形質転換体を含む。本開示は、以下の実施例において更に詳細に説明されるが、これは、請求される本開示の範囲を制限することを意図するものでは決してない。添付の図は、本開示の明細及び説明の一体部分として考えられるものである。以下の実施例は、請求された開示を例示するために提供されるものであるが、制限するものではない。以下に続く実験開示において、以下の省略形を適用する:Mモル濃度;mMミリモル濃度;μMマイクロモル濃度;nMナノモル濃度;molモル;mmolミリモル;μmolマイクロモル;nmolナノモル;gmグラム;mgミリグラム;μgマイクログラム;pgピコグラム;Lリットル;ml若しくはmLミリリットル;μl若しくはμLマイクロリットル;cmセンチメートル;mmミリメートル;μmマイクロメートル;nmナノメートル;Uユニット;Vボルト;MW分子量;sec秒;min分;h若しくはhr時間;°C摂氏度;QS十分量;ND実施せず;NA該当なし;rpm分当たり回転数;H2O水;dH2O脱イオン水;HCl塩酸;aaアミノ酸;bp塩基対;kbキロベース対;kDキロダルトン;cDNAコピー若しくは相補的DNA;DNAデオキシリボ核酸;ssDNA一本鎖DNA;dsDNA二本鎖DNA;dNTPデオキシリボヌクレオチド三リン酸;RNAリボ核酸;MgCl2塩化マグネシウム;NaCl塩化ナトリウム;w/v重量対体積;v/v体積対体積;g重力;OD光学密度;HPLC高速液体クロマトグラフィー;PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動;PCRポリメラーゼ連鎖反応;RT-PCR逆転写PCR;及びSEL部位評価ライブラリー。実施例1トリコデルマリーゼイ発現株の作製発現レベルが同一アミノ酸配列の変異体全体にわたってより低変動性であるように、目的の変異体この例ではCBH2変異体の発現一貫性を増加させるように改善された株を作製した。特に、トリコデルマリーゼイ株を標的ベクターと組み合わせて成長させて、cbh2変異体遺伝子の統合を強制した例えば、調節配列と機能するように組み合わせたコード領域。本開示の開発中調製された新しい株は、変異体ライブラリーをスクリーニングするのに有利である複数の変異を組み合わせている。遺伝工学工程の概略は、図1に示す。トリコデルマリーゼイのquad欠失誘導体株からのku80の欠失。quad欠失誘導体株は、国際公開第2005/001036に記載されている。MUS52の単一オルソログヒトKU80のN.クラッサオルソログは、ハイポクレアジェコニアQM6aトリコデルマリーゼイのゲノム配列でのTBLASTN検索により同定されており、結果的にトリコデルマリーゼイku80、タンパク質id58213と命名され、U.S.DepartmentofEnergyJointGenomeInstituteから入手可能である。トリコデルマリーゼイku80遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号13として提供される:ATGGCGGACAAGGAAGCAACCGTCTTCATCATCGACCTCGGCGCGTCCATGGCAGCTGTCAATGGGGGTCGAGAAGAATCCGACCTTGATTGGAGCATGAGCTACGTCTGGGACAAGATCAGCAACGTCGTGGCCTCGAATCGCAAGACGCTGTGCGTTGGCGTCGTGGGGTTCAGAACCGACGAGACAAACCACACGCTGAGCGAGGATGGGTACGAGAACATCTCCATATTGCAGCCCCTGGGGCCGATGAGCATGTCCAGCCTCAAGGCTCTTCAGCCCAAGGTGAAGCCGAGCAGGACGGTGGAAGGCGATGCCATCTCGGCGATTGTCATTGCCGTCGACATGATTGACAAGTACACGAAGAAGAACAAATGGAAGCGGCAGATTGTTCTCATTACCGACGGCCAAGGCGAGATTGATCCAGATGATATTGGCGACATTGCTAGAAAGATGCGCGACTCGAATATTGAATTGACAGTCTTGTGAGTTGGCGAGACCGTTTGGCGGACGGTAATGGTGCTGACGGTGATGCAAGGGGCGTCGACTTTGATGCTCCCGATTACGGCTTCAAAGAGGAGGACAAACCTTCAGTCAAGGTACTCCATATGTTCACTTCTTTTCTTTTTCTTCTTTATTTTCTTTTCTTTTGAAGCTTTCATTAACCTCTTCGTTAGAAGCAAAACGAAGAGACCCTAAAAAAGCTCGTGGATGGCTGTGGCGACGACTCAAGGTTCGCCTCCATGGTCGAGGCCATTGACGACTTGAATGAGCCACGAGCAAAGTCGGTCAAGCCTTACAAAACGTACGAAGGTCTCTTGACCTTGGGAGATCCGAAAAACGCTCCCGCAGTGGTGGAAATCCGCGTCGAGAGATACTTCAAGACCCATCTAGCCAGGCCACCTGCCGCCAGCACCGTGGTGGTCAAGGAGGAGCAAGCTGGGCCGTCTCAGGCAGACGAGGACGAACAGATGGACGGAGCGGAACTTACAGCTGTGAGGCAGGCCAGGACATACAAGGTCAATGATCCAGATGCCCCTGGCGGTAAGCGTGACGTTGAGTTTGAGTCTCTGGCCAAAGGGTACGAGTACGGCAGGACGGCAGTCCACATCAGCGAGTCTGATCAAAACGTCACCAAGCTCGCGACAGAAAAGAGCTTCAAGATCATCGGCTTCGTCCAGAAAGAAAAGGTATTGGCTTGGCTCTCAGCATTTGACCCGTTGCTCTTGGCTAACCCTTGTTTAGTATGAAATGCTCCTTAATCTTGGCGAAACCTGCGTTACCGTTGCATCCAAGTACGATGAAAAGTCTGAGCTGGCTTTTAGCTCTCTGGTGTGGGCGCTCTCGGAGCTCGACGCCTACGCCGTGGCCCGCCTAGTAACTAAGGACCAAAAGGACCCCATGCTGGTGTTACTGATGCCGTATATGGAGCCTGATTATGTTTGTCTCTATGATGTGCCTCTGCCTTTCGCAGAGGACATCAGGACGTACCAGTTTCCTCCCTTGGACAGAGTCGTTACCGTCAGTGGCCAAACGCTCACCAACCATCGCCTATTGCCATCCGACGAGCTCAACCAAGCGATGAGCGACTACGTAGATGCCATGGACATTTCAAGTTATGGTATCGATGAAGATGGGTGAGTATAGAAGATGATTGTTCAAATCTTTCACTTCTAAGCATTGCTTCTGATCTAGGCAACCGGCTGAATATGCCACCATCGATGAGTTATACAACCCTGCGATACATCGCATAGGCCATGCGATCAAACAACGAGCGATCCACCCAGAGAAACCCGTGCCCGAGATCCCCCCAGTCTTGCTTAGATTCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGAquad欠失誘導体株からトリコデルマリーゼイku80遺伝子を欠失させるために、例えば、国際公開第2005/001036号に概要が記載されているような標準的方法をこの目的のために適応させた。簡潔には、図2に概略的に示すように、1.3kbの5’ku80配列と2.3kbの3’ku80配列に挟まれて隣接される選択マーカーを採用するku80欠失カセットを利用した。除草剤クロリムロンエチルに対する耐性を付与する変異体トリコデルマリーゼイalsを選択マーカーとして使用した。例えば、国際公開第2008/039370号を参照されたい。ku80ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、7685塩基対の長さである:塩基1~1271は5’ku80相同領域に対応する;塩基1280~7685はals-クロリムロンエチル耐性変異体A190Dに対応する;並びに、塩基5381~7685は3’ku80相同領域に対応する。ku80ノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号1として提供される:GGCCGCCTCAACACCCACACTCGAGGCACACGAGTTCATCGGCGGCTTCCCCCACAAGCTCTCGGCCAACCTGCTACCGGCTCTCTCGCGAGACTTCCCAAAGCCTACAAACGAGGTCGACGTCAAGGAGGCCCTCGAGCGCCAGCCCGGCAGATGGAGCCTCCAGGGCCAGATCAAGGCCAACAACATGAGAGCCCAGAGCGCCGCACTCCGGCTCGACGACAAGGAGGGCAAGGCGAGAGCCTTTGAGGAGGCCAAGCGCGAGCTACTGGCGTATCACCACAGCGCCCTGCGGAAGCCTTCCGGCGCAAGATAATGAGCTTGATCGCAATGACGAGTTCACGTACGCTTTGCCATATTGTTGTTGCTTTTTGTTTGGTCCTACATGTACGGCGCATTGGTTGGGAGGATATACCCACGGAGAGTGTCCGAGTGGCTTCTGGGATTTAGAGCGTCATTAGCAGGATAGAGATGGTTGGCCAGGGGAATGGAATTGACTTTTCACTACAAGGAACTTGTTCACTCTGGTGTTGATTCCCATTGCGTGACTGGTAGTAGGGAGGAATGCTTTTACTTTGTGCCACTAGACCGCAGAGAAGGGTTGGTTGCAAGCGGGGTCCGTGTATACCGACCAAGAGTGATGGGCATACAGCAACGTTTCTGAACGACTTCATTTTGTCCGAGTCTACTGGATGCGAGATGCCAGCGTGAAGCCGTACGCCACCAGGGCGACGAACTCGACAAGGTTGACGAGGGAGGAGATGCCGTGCAGCATGCCAAACTTCTTGTTGAGGGCACGCATCTCATCCGACTGTGCATCCTTGTCATACCACTCCTTTCCGTCTCGCTTGGCTGGTGGGAGGGTTCAACAAATCCATCGTCAGCCATCCGGGGTCTCAAATCAATGGCGTGCATGCGGAGTCGGGCTTGAGGCTAACCTTGTCCATGGCGGTCCTTCATGGTCTTGACAGTGGCGGGAAGCAGCACGGCGAGGTTGACGAGGCCGCTGACGAACATGGTTGCGATGGGCACCAAGGAGCTCCACTTGTTGGGAGCGTCGACGAGGCCGCCGATGCCGCCCTTGATGCCCAAGAGGGCGTTTCCGGGGAACGTGAGGGCGAGCAGCGCGGGGATGGCCGTCTGCATGCCAAAGTAGATGGGGAACAGCTTGCTCTGGATGGCGGAGAAGGAGGGCCGGCTGACGGTGCGGAACATGACGATGCCGTTGACGAAGGACTGCAGTAGCGTAGTGTGATGGTAAGCAGCTGGCCGGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAAGGACCAAGATGTACTAGGTAGTTGCAATGTGGCTTATTACCTACCTACTACCTGGTAGGCACCTACTAGGTACTTGGGTAGACGGACAATGAAATTTGAAGTCGGGGTTGCAGGAAAGCAGGGCGCTGGACACATTGTGCTTCAGGCGGTACCCGTCGTCATCGTCAGCCAATGTCGAGGCCCGGCAGCCCGAGGAGCGAGACAACCTTGGCCGGAGGAGCCCGCAGGTACCTGCCAAAGCGCGGCTGGTACCTCTCAACCCTCTCAGGCCTGTTGGATGCCCTATGACATGCCCTGGGGGATGCAGCTGTTGCCCCGGCCCCGCACTTTCGGGTGACCGCGAGGCTGCTGATTGGCTGGTTGCCACGGGCTGGGCGGTCCCTGAAGTTGTTGCCATCTGAACTCTGTCGGCGCTGGCGTCGGCTGCGCCCAATGGGAGGCGAGACAACTCAGGGTACTAGAATCACTGACAGAAGAAGAGAATCGAAAGTAGGTAGACAGCCAATTCGTTGCATGGCAGGCAACCGCACAGGAGAAAAATTGACTACCCCACAATCAGGCACAGTAAGTAGGGCACAGTACGTATGTACAGACAAGGCGCAAGCGATACTGCGCGACCCGGTACCTCGCCGGCTTGACACGTGCGACAGGCTACTTTACTAGTATTCGCAGCGGCGGGTCGCGCATTATTACATGTACTGTGCCGCCATTTGATGACTGGGCTGCTGCAGTATTAGTAGATCTGCCCGGCATCGCCCTTCCATGGGCGCGACCCGGGACTGGACCCTCTGACTCTACCTACATGTACCTAGGCCGGGCCGGGCTTGGTGACTTTTGTCCGATCAGGTCGTTCGCCTGGCTACCTATTATTTCTCTTTCTTCTTCTCCATCCTGCTTCTGGCCTTGCAATTCTTCTTCGCCACTCCTCCCTCTTCCCCCCGCGATACCCTTGAATTCGTCAGAGAGGAAAAGACGAGAAAAAAAAGGGCAGCAGAGACGTCGGTCTGGCTCACGTGCTGCATCTCTGCGCACTCTCATTTTTTTTATTGTCCGACCCCTCCCTCAACCTTCTCCTTCGTTGACAGGCTAAGCCTTGCTTCGACGCTCTCTCTTTGAATTTTTCTACTTCTACCTTCTTTTCTTGCGTGTTACCCACCATAGCTCGATTCACGATGCTCCGAAGTCGCCAAGTCACAGCCAGGGCCGTCCGGGCTCTGGGCCAGGCGCGCGCCTTTACCTCGACGACCAAGCCTGTCATGATCCAGAGCAGCCAGAGGAAACAGGCCAACGCCAGCGCTGCTCCGTAAGTCGCCCATTGCCATTGCATCTTCTGTTTGATATATACTTCCTGCTGCTTGCGTGGCGTCGTCTCTCGGTTATGCGTGTCAAGGACCAGGTGTGTTCGCATCGTGGTTTTCCAGCGCCGATTACCGGGGGACGAATTTTTGGCTGCTCAACTCGCGCGCGCGCATTCTGATTCTTCGTTTTCAATCTTGAGCGACAACTGGCTAACATAATGGCCATTGGCAATTGCTTCACACAGACAAGTCCGCCCTGTACCGAGCCCTGCTTTCAACGCTGAAGACAAAGACCGCAGCCATGTGCAGCCTCTGGTCAACCCGTCGAAGCCCGACATGGATGAATCGTATGTCCACGTCCCCTCGTCCCGCCCTACAAAATGAACACGATTACACCAGAATTTTTGCAACAATCGACACTTCTATAACAGACCAATTGAGCTTTGTTCTGACCAATCATGTTGCTCTAGATTCATTGGCAAAACCGGAGGCGAAATCTTCCACGAGATGATGCTGCGACAGGGTGTCAAGCACATTTGTAGGTTCCGATGCCGGCCGCCCACACGGGCTCCATCCTTGCTCCATCTCTCCAGCTAGGCAAATCTCGCTAACCTTGAGTCACCATCCAGTCGGATACCCTGGCGGCGCTATCCTGCCCGTCTTCGACGCCATCTACAACTCAAAACACTTCGACTTCATCCTGCCCCGTCATGAGCAGGGAGCTGGCCATATGGCCGAGGGCTATGCCCGTGCCTCGGGCAAACCCGGTGTCGTCCTGGTGACTTCCGGCCCCGGTGCTACCAATGTCATCACGCCCATGCAGGATGCCCTGTCGGACGGAACGCCCTTGGTCGTCTTCTGCGGCCAGGTCCCCACCACGGCCATCGGCAGCGATGACTTCCAAGAGGCCGACGTCGTGGGCATCTCGCGGGCCTGCACCAAGTGGAACGTCATGGTCAAGAGCGTTGCTGAGCTGCCGCGGAGAATCAACGAGGCCTTTGAGATTGCCACCAGCGGCCGCCCTGGCCCCGTCCTCGTCGACCTGCCCAAGGATGTCACGGCTGGTATCCTGAGGAGAGCCATCCCTACGGAGACTGCTCTGCCGTCTCTGCCCAGTGCCGCCTCCCGCGCCGCCATGGAGCTGAGCTCCAAGCAGCTCAACGCCTCCATCAAGCGTGCCGCCGACCTCATCAACATCGCCAAGAAGCCCGTCATCTACGCCGGTCAGGGTGTCATCCAGTCCGAGGGCGGCGTTGAGCTCCTGAAGCAGCTGGCGGACAAGGCCTCCATCCCCGTCACCACCACCCTCCATGGCCTGGGTGCCTTTGATGAGCTGGACGAGAAGTCGCTGCACATGCTGGGCATGCACGGCTCGGCGTATGCCAACATGGCCATGCAGCAGGCCGACCTCATCATCGCCCTCGGCAGCCGATTCGACGACCGTGTTACTCTGAATGTCTCCAAATTTGCGCCTGCAGCCAGGCAAGCTGCTGCCGAGGGCCGCGGCGGCATCATTCACTTTGAGATCATGCCCAAGAACATCAACAAGGTCATCCAGGCGACCGAGGCCGTCGAGGGCGACGTCGCCACCAACCTGAAGCACCTCATTCCCCAGATTGCCGAAAAGTCCATGGCGGACCGAGGAGAGTGGTTCGGCCTCATCAATGAGTGGAAGAAGAAGTGGCCCCTGTCAAACTACCAGCGCGCGGAGCGGGCTGGCCTCATCAAGCCGCAGACGGTCATGGAGGAGATTAGCAACCTGACGGCCAACCGAAAGGACAAGACGTACATTGCCACGGGTGTCGGCCAGCACCAGATGTGGGTTGCCCAGCACTTCCGCTGGAGGCACCCTCGATCCATGATTACCTCTGGTGGTCTGGGCACCATGGGCTACGGTCTCCCCGCGGCCATTGGCGCCAAGGTGGCCCAGCCCGACGCTCTCGTAATTGACGTTGATGGCGATGCCTCGTTTAACATGACGCTGACGGAGCTGTCGACTGCTGCACAGTTCAACATTGGCGTCAAGGTGGTTGTGCTCAACAACGAGGAGCAGGGCATGGTGACGCAGTGGCAGAACCTCTTTTACGAGGACCGATATGCCCACACGCACCAGAAGAACCCCGACTTCATGAAGCTGGCCGACGCCATGGGCGTTCAGCACCAGCGCGTGACGGAGCCGGAGAAGCTGGTCGATGCCCTGACGTGGCTGATCAACACCGATGGCCCGGCCCTGTTGGAGGTTGTCACGGACAAGAAGGTGCCTGTCCTGCCCATGGTGCCCGCCGGATCGGCCCTGCACGAGTTCCTCGTCTTTGAACCTGGTGAGTCTACTTCAGACATATTGCTTGCGCATTGCAGATACTAACACTCTCACAGAAAAGGATAAGCAGCGCCGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGGGTGTGCACTCCTAAAGCGATGATGTCTGCGAGGGGTTCTTCGTTGAACCCTAGTTCAGGCACCATCTTACCCTCTTATTTTTTCCCGTGGGCTTTCATTTTGTGTCATCCGAGCATGACGTTGTAGGGTTGGAGTTTCTTCCTTTTTATCTTGTCATTTACTGGTACCCATAGGCGCGAGACTAGGCTTCCATGTTTTGTTTTGCGACTTTCAAAAAGTACTTTTAGTGGTTTGGGGCACGACGAGGGGGGGCAACCTCTTCTGTCGAAAAAGGTGGCTGGATGGATGAGATGAGATGAGATGAGGGTGAAGATAGATACCTGCAGTGTTTTTGACGCGACGGGATGGCGATCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGATATGATTATTGATGAACCGGACAAAAGGGGGTAGGGGATTGATGCCATCACGACCGATTGACCAGACCTGGATTCTCGCACAGCATGGCTGCTGATTTTGTTGACCTTGCGACGTAACATCCCTGAAGAACAACCTACTATTAACCTATCATTTAGCAGAAGCTCTGTAACCTTCTTGATTCTTGTATTCAGCTTCTGAGTCTGTCAAATGTAATCATTTCGAGGTTGTGTAATTCCGGCCAAGCAGGCGGCCGTCTGCCAGCGCCTGCCTAGGCTGCACCGCAATCTGCCCAATCAGCTGCCCTTCAGTTTCGTTTGACCTTGCAGCTGCCCTTCATCCTTTATCTGCACACAATTCTTTTTCCTCTGCTCTGCGCATTCTTCTCTCTCTCGTCTCCCTTCTCAAGCTCAACTTCACCTCATCCGCTCCACTACAAGCCCTCCCGTCGTCGTCTCGCATCCTCATCTCGACTGCGGCCAGCAAAACAAGCAAAGCCGTGATCGATCCTCAGCATGGCTACCTTCAACCTCACCGTCCGCCTGGAGATGCTCAAAGAAATTGGAATCACCGTCCAATACGGCGAGCATGTAGCGAAAGAAGCAGCCAGCAACGAAGCAGCGATGGCATTCGAAGAAGAAGAAGAGTTCCCCGCCGTTGTGCCGCCCAAGGCAGA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ATCGCAGGATGTCTCATTATCGGGGTCCTTGGAGAACGATCATGATTGCATGGCGATGCTAACACATAGACAGCCTTCTACACTCGAAAGGTCAAGTTCACCCAGGAGACGTTTTCCGAAAAGTTCGCCTCCATCCTCGACAGCTTCCCTCGCCTCCAGGACATCCACCCCTTCCACAAGGACCTTCTCAACACCCTCTACGATGCCGACCACTTCAAGATTGCCCTTGGCCAGATGTCCACTGCCAAGCACCTGGTCGAGACCATCTCGCGCGACTACGTCCGTCTCTTGAAATACGCCCAGTCGCTCTACCAGTGCAAGCAGCTCAAGCGGGCCGCTCTCGGTCGCATGGCCACGCTGGTCAAGCGCCTCAAGGACCCCCTGCTGTACCTGGACCAGGTCCGCCAGCATCTCGGCCGTCTTCCCTCCATCGACCCCAACACCAGGACCCTGCTCATCTGCGGTTACCCCAATGTTGGCAAGTCCAGCTTCCTGCGAAGTATCACCCGCGCCGATGTGGACGTCCAGCCCTATGCTTTCACCACCAAGAGTCTGTTTGTCGGCCACTTTGACTACAAGTACCTGCGATTCCAGGCCATTGATACCCCCGGTATTCTGGACCACCCTCTTGAGGAGATGAACACTATCGAAATGCAGAGGTATGTGGCGCGGCTAArchy2トリコデルマリーゼイ株からのArchy3株の作製。Archy2株は、ヒグロマイシン欠失カセットで形質転換されて、同じpyr2遺伝子座にて統合して、pyr2遺伝子のコード領域でヒグロマイシン耐性遺伝子を置換した。ヒグロマイシン欠失カセットは、図4に描写されている。pr2遺伝子をpyr2遺伝子座内へと戻すこの再導入は、トリコデルマリーゼイcbh1プロモーターと部分amdS選択マーカーの間にpyr2遺伝子を配置した。この株は、ウリジン原栄養性及びヒグロマイシンに対する感受性により選択された。hygRノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、9088塩基対の長さである:塩基1~1994はpyr23’相同領域に対応する;塩基1995~3497はトリコデルマリーゼイcbh1プロモーターに対応する;塩基3564~5137はpyr2選択マーカーに対応する;塩基5280~7270はA.ニデュランスamdS3’部分マーカーに対応する;塩基7271~9088はpyr25’相同領域に対応する。hygRノックアウトカセットのヌクレオチド配列は、配列番号3として提供される:ATCACGCCCTCGCATAAAAGACCCTCAAGAGTCCATGTGCCCTATCTGCCTGATCTTCCTAACCCTTATTTAACATTGGCCCTATCACAACCTAGTTCTTCTTCAGCCTGCTTTGTCAACACTTGTCACGGTTCAACTCAACGTAATCAGCAGGTAGCAGGACGAGGATAGGGAGAGAAACGAAGAGAAGAAGAGGAGAGAGGAAGAAAAAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGGGAAAAGGAAAGAAGGAGGAAAAGAGAAGAAAGTCAGATGAAGAAGCAAGAAGACGCCATGGTAGCCACCGCTTGTCAGGGCTCCTTAGCAACGAACAACTCTAGCTTGGGGACTTGTCGATGTGTCGTTTCCTTCCTACCCATCAGCACCAACGATGAGTTCGATATAGACGAGGACCTCATGGAAGTAGAGACCATTGGGTTCGACAGGATCTCTCAGTTTCACTTCTATGAGGTCTGTCGCTCGGATGACTTTTTGAGGAGCTTCCCCTTCTGCTTCAACCCCAAACTCTCTTTCCTGAAACCGCAGCACGTTGGCACGGCCGTGTTGCTGGAGCAGTTTGCTTTCGAGCACTCTCAGCGTGGTTTCAGCAGCCCACTGGTGAGTGGCCTCCTTTGACGTCCACACCTTGCTCCTGTCGCATGCGTATCTGGTGGGAACGACTGCTCCAAGGAGGATTGCTAACGAGGTTGTAGGCCGAATATCGCATCAGATTCTCCGGTAACCTTAGCTACGGCCTCTTCAACATCTGTGACATGACGGAGCGCAAGTACTGGTGGTTGGCGACCAAGATGCGCGGCTGGAACATCGACGGCTGCCCCGAAGACGTCAGGAGACTCATGTTTGTTCACATCATCGCCACCCTGGGATGCAGCCCCGTCGTGACGGATGAAGACATGGACTACCCCAAGAACTGGGCGGCAATTCTCCACGGTAGAGACAGATATCCGAGTGAACCTGTGGGCCACCGGCCTCATGGGCGCACCATCTGCCTCCACTCGGTGGCCGTCTGCCCTCGTCTCCAGGGCTTGGGTCTCGGTACTGCGACTCTGAAGTCGTATGTGCAGCGCATGAACAGCCTCGGCGCCGCGGACCGTGTTGCTCTCGTTTGCCGCAAGCCCGAGACGAGATTTTTTGAAAGATGCGGCTTCAGGAACAGCGGCCGGAGTAGTATCAAGACTCTGGTCGGCGAATACTACAACATGGTGTGTGCTTCCACATCGACTTGGCCAGACTCTATACGATTTTCAAACCTCGCTATACGTCATATTGACTTGTTTCTTTAGGTCTTCGATTTGCCCGGGCCCAAAGACTTTATCGACTGGAATAGCATTGCCGACGCTGCCAAGAAGATGTGAACCATTTGACTGATACGATGTGTGCTACGCATGTCGACCTTCTTTGTTTGTTTCTTTGGCGGCTCTTTGTATACCTTGGGACACGGCAGACGCATGTCTATGTGAAGAAAACGTTCACGGCGCTGTTTGCATCAGGAATATGATCATTAAACATGGAGCGTAATGGTATTAATGATCAACTAGAAAAATGGTATGGAAGGGCGAGAGGGCGATCAACAAAGCAGCCCGGGGCATAGTCTGGAAGCAGCAGGAATTGGAAGGGAAAAGGAAGCTGCACAATGAAGGGATATCGTGAGCGGAGTGGCTCACGAGAGTATCAACAGACTGGCGAAAGCAAGCAATTGCCAACGCCGGCTATTAGGCCATAAGATGGCCTGTTGTGAGTCCCAGTTGCACGTATCCCCATATGACTGCTCTGTCGCTGACTTGAAAAAAAATAGGGAGGATAAAGGAGAAAGAAAGTGAGACAACCCGTGAGGGACTTGGGGTAGTAGGAGAACACATGGGCAACCGGGCAATACACGCGATGTGAGACGAGTTCAACGGCGAATGGAAAATCTTGAAAAACAAAATAAAATAACTGCCCTCCATACGGGTATCAAATTCAAGCAGTTGTACGGAGGCTAGATAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACACCTCGTGCTAGACTAGGCGCGTCAATATGTGGCCGTTACTCGAGTTTATAAGTGACAACATGCTCTCAAAGCGCTCATGGCTGGCACAAGCCTGGAAAGAACCAACACAAAGCATACTGCAGCAAATCAGCTGAATTCGTCACCAATTAAGTGAACATCAACCTGAAGGCAGAGTATGAGGCCAGAAGCACATCTGGATCGCAGATCATGGATTGCCCCTCTTGTTGAAGATGAGAATCTAGAAAGATGGCGGGGTATGAGATAAGAGCGATGGGGGGGCACATCATCTTCCAAGACAAA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ACCAAGCTCGTCGAGCGCTGGATTTCTGTCTCCGGCGTCGCTGACGACCCCAACAACTACCTCTTCTGCCGCGTCCGAAAGAACGGCGTCGCCGCCCCTTCTGCCACCTCTCAGCTCAGCACCCGAGCCCTGGAGGGCATCTTTGAGGCCACCCACCGCCTCATCTACGGCGCCAAGGACGACTCTGGCCAGCGCTACCTCGCCTGGTCTGGCCACTCTGCCCGAGTCGGCGCTGCCCGAGACATGGCCCGAGCCGGCGTCAGCATCCCCGAGATTATGCAGGCCGGCGGCTGGACCAACGTCAACATCGTCATGAACTACATCCGCACCCTCGACTCTGAGACCGGCGCCATGGTCCGACTCCTCGAGGACGGCGACTAAACCCAGCTTTCA5Dトリコデルマリーゼイ株からのMAD6株の作製。bgl1欠失について先述したもの上記を参照されたいと同様の方法を用いて、自生egl3をA5D株上記から欠失させた。egl3欠失カセットの概略を図6に示す。ヒグロマイシン耐性をegl3欠失に対する選択マーカーとして使用した。ヒグロマイシン耐性マーカーをloxP部位により隣接させた。形質転換体がegl3の欠失を有することを確認した。A5D株の作製について記載したように、この株からヒグロマイシンマーカーを除去した。A5D株の作製について記載したようにこの株からcreリコンビナーゼをコードするテロメアベクターを除去した。egl3欠失カセットのヌクレオチド配列は、配列番号6として提供される:GGGAGGTAGGCGCAGATACGGTGCATGGGACCCGAACCCGTAACCGGAACACGACCTTATCAGCCCTCCAACTCACACCCTCTCGCCTATCACTATCCTAGATAGTTCATCGGCCAACTCATGTAACCTAGCTACCTACCTACCTGGTAAGAATGCGGGCTATCATGTCTCACGGCGCGGTACATGTCGGTATCTCGCTGCTTCCCCGCAGGTTGACGTCGGAATCCATGCAAGTACTCCCTGAAATCGAGACGACAGAGAGAACAACCAACGCGCTTAAACGCTTCATGTTCATCTAAGAGGCACATTCGAAGAACTAGCTTAACACACTAGACCTGGCTTTTCGACCCCCTCCGCAGAAAGCCGTTTTCTCCTCAATCCTCCCGGGCTTGGCTTTTGTCAGTCCGTACTTGCTGCGCTAACAGAGTCTTGGACGCAGCGTTTGCGCATCAGTCTTGCAGGCGGTTCACGGGACTAGGACAACAGGGGATGTGACAGGCCGGATAGTAATTATGGGTTATCCGGGGTAAGCAGGGAATTTACGAGGCCGCTTTACGTGGGGGAACAGCCACTTGCGGGGGGAAGAGGAGTAGTAGGCGACTCGGTCGATGAGCTCGAGGTGTCTGGTTGACTTGGACTGCAGAGCGTAGGTAATTGAGATCGGGCAACATTATCGGTGTTCGGCTCGGTATGGCCGAGTTGCGACTGCTTGGTCATTCGGCGAAGCTGATGTCGTGGTATCCTGAAGCATCGATATCGGAAACCATGATGGTCAGTCTATCTGACGTGTGCGGTGACAAGCGAGTCCGGATTTTGTGACATGACGTTCAACTTCAGTCAATGCCTTAGGGCTCGATAAGATTAAGATTGGGTTCTGGCAGCGGTCTAGAACACCGCCACAAATTCTGTCCATTGAGGAGCGTGATGTCTAGGCGCATCACTAACACGGAGCTGTATGACCGGCAGCTCAACGGACTTCTCTTCGTTCAACGGCAGTCTATTTGCGGTACACGAATGGATCTTTCTTCCTGGTCTTGAAGTGCCGCAGTGGCGTGCGAATGTATAGATGTCTCGCTACCTAGAAAAGCTGGCTTTTCTGACAGGGTCCCTTCCACCTCTCCTACCAACGACAAACTGAACAAGTATCTGGCGGTTTCCCAACGCCGAATAGGCCAGTCGCCAATACTCCCTCCAGCCCTGATTGGGCCCCTCGAAGTATCGCCATGTCTGTGTGTTGAGATTATTCGATGGACGTCACTCCCCCAACCTACAGGAAGAGCAAAATGGGAGCAGTGTTCTGCAATGAGCTATATAATAGATCGCTCGATCTCATACAAATTGTATGCTCAGTCAATACAACGAGCGGTTCCAAGATCCCTTCTCCAACGACCCTCGAAACATTGCAACCCGGTGCAGCCTGAACTTGTTCGTATAGCCTAGAAAGCGACGCCATCTTCATCTTTTACGCGATTAGCCTCATGGCTATTTGTGCCGAAGTGGGAGTTGTATGGTAGCAGTGAGGAGATTGTGGCTACGACACAGGCGGGTTCTCTTGAGCGGCTTACATCTCCGCATTAGGCCTGCGTACGATCCAGATCATGGGAAACTTTACAATGGCTTACTCGTTTTATCTCAACACTGAGCTTCCAATTCACTCTATGCATTGATTAACACGTTTGGTCATGTGGTTCTTCAGCTGTAAATCTTCAGCTTCCCAAGAATTGCAACCTCGCTGATTGCTAATAGTGTTGCATGCGTTGCATCCTGGTGCGGCAGTGCAAAGGAGAGTCAAAGTAGCCGGCAGATTAATTTAAGCTTATATCACTCAGGGGTAAACAGCCGTAAAGGACCTTTTGATCTAACATGCCGATGTGTATGTAGATCACGCAATGCCCACCATATCTTGGCAGTCAGATTTGTCCGTGGCGCGCCAAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGGCCGGCGTATTGGGTGTTACGGAGCATTCACTAGGCAACCATGGTTACTATTGTATACCCATCTTAGTAGGAATGATTTTCGAGGTTTATACCTACGATGAATGTGTGTCCTGTAGGCTTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGCAATTATCTTTGCGAACCCAGGGGCTGGTGACGGAATTTTCATAGTCAAGCTATCAGAGTAAAGAAGAGGAGCATGTCAAAGTACAATTAGAGACAAATATATAGTCGCGTGGAGCCAAGAGCGGATTCCTCAGTCTCGTAGGTCTCTTGACGACCGTTGATCTGCTTGATCTCGTCTCCCGAAAATGAAAATAGACTCTGCTAAGCTATTCTTCTGCTTCGCCGGAGCCTGAAGGGCGTACTAGGGTTGCGAGGTCCAATGCATTAATGCATTGCAGATGAGCTGTATCTGGAAGAGGTAAACCCGAAACGCGTTTTATTCTTGTTGACATGGAGCTATTAAATCACTAGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGACAAATGAACGTATCTTATCGAGATCCTGAACACCATTTGTCTCAACTCCGGAGCTGACATCGACACCAACGATCTTATATCCAGATTCGTCAAGCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCCGGTCGGCATCTACTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCGATTGTGATGTGATGGAGTTGAGATGGAGGTGAGGAGATGGATGATGGGAAAGGAAGATGGACTGAGGATGGAAGAAGAGAAGAAGAGAGAGAGAGAAAGTCTTCCAGGAGAGAAAGGGAACCGAAGAAAAATGGGGAGGAAACCGGCCCTAGCACCTAAATACGTCTCCCGCTTAATTTTCGCCCTTTTTTCACCAAACCCTCCGCGTCTTTCGTGCGCTAGCTGTCTTGGGGGGTGTGTAAAACTTGGGAACAACCCTACGCCGAACCTCCCGTACGAAGCCCGTACAGTGTATTCTATCCCTGGCTTTCCCAGCCTGGTAAGTCGGGTCCCTTCGGGACGGGGCCAAGGAGACTGAGTTTCCGGGTTAACCAATAATGCCGCCAGCCGTGGAGCGGTCTGAGCTGTCTATCGTGAATCCGTGACGCTGAATTGCTCAGTCCAAGTCGGAGACGCTGGAATCCACCGGTTGCTCCAGCCACGGCGAAGAATCCACTTACCTTCCGGGCTTCCGCCAGCTGGCAACATATTTTTGAGGCTGATATAGCCTTCTCCTCCATCACGATAAGCCCTGACTACCTTGCTACGGGCCAATTGCAATTTGTTTGCTGGTTACGCTTTACAAAA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AAGCCGACGCGAAACGTTCCCGGAGATGGGCCCTTCAACGCTGACCCAGACAACTACAACTTGAAGAAGACTAAGAAGATCCCTCCTCACTTTGTGCACCATAGAGTCCCAAGAGACGGTGCCTTCTCTTTGTCTTCCAAGGGTCTGCACATCGTGCCTAGTCGAAACAACGTTACCGGTAGTGTGTTGCCAGGAGATGAGATTGAGCTATCAGGACAGCGAGGTCTAGCTTTCATCGGACGCCGCCAAACTCACACTCTGTTCAAATATAGTGTTGATATCGACTTCAAGCCCAAGTCCGATGATCAGGAAGCTGGAATCACCGTTTTCCGCACGCAGTTCGACCATATCGATCTTGGCATTGTTCGTCTTCCTACAAACCAAGGCAGCAACAAGAAATCTAAGCTTGCCTTCCGATTCCGGGCCACAGGAGCTCAGAATGTTCCTGCACCGAAGGTAGTACCGGTCCCCGATGGCTGGGAGAAGGGCGTAATCAGTCTACATATCGAGGCAGCCAACGCGACGCACTACAACCTTGGAGCTTCGAGCCACAGAGGCAAGACTCTCGACATCGCGACAGCATCAGCAAGTCTTGTGAGTGGAGGCACGGGTTCATTTGTTGGTAGTTTGCTTGGACCTTATGCTACCTGCAACGGCAAAGGATCTGGAGTGGAATGTCCCAAGGGAGGTGATGTCTATGTGACCCAATGGACTTATAAGCCCGTGGCACAAGAGATTGATCATGGTGTTTTTGTGAAATCAGAATTGTAGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTC得られたFv43C発現ベクター、pTrex3gM-Fv43C、を図12として概略的に示す。発現ベクターpTrex3gM内のFv43Cグリコシルヒドロラーゼの完全ヌクレオチド配列は、配列番号15として下記に提供される。TTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGGCCATTTAGGCCTCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGCGTCTTCTATCGTTTCCCAGCCATCTCCTCGTGGCCTTCCTAACCCTCAAAGAGGCTTCATCCCTCGCCCTCAGCAAACGGGATAGCCCTGTCCTCCCCGGCCTCTGGGCGGACCCCAACATCGCCATCGTCGACAAGACATACTACATCTTCCCTACCACCGACGGTTTCGAAGGCTGGGGCGGCAACGTCTTCTACTGGTGGAAATCAAAAGATCTCGTATCATGGACAAAGAGCGACAAGCCATTCCTTACTCTCAATGGTACGAATGGCAACGTTCCCTGGGCTACAGGTAATGCCTGGGCTCCTGCTTTCGCTGCTCGCGGAGGCAAGTATTACTTCTACCATAGTGGGAATAATCCCTCTGTGAGTGATGGGCATAAGAGTATTGGTGCGGCGGTGGCTGATCATCCTGAGGGGCCGTGGAAGGCACAGGATAAGCCGATGATCAAGGGAACTTCTGATGAGGAGATTGTCAGCAACCAGGCTATCGATCCCGCTGCCTTTGAAGACCCTGAGACTGGAAAGTGGTATATCTACTGGGGAAACGGTGTCCCCATTGTCGCAGAGCTCAACGACGACATGGTCTCTCTCAAAGCAGGCTGGCACAAAATCACAGGTCTTCAGAATTTCCGCGAGGGTCTTTTCGTCAACTATCGCGATGGAACATATCATCTGACATACTCTATCGACGATACGGGCTCAGAGAACTATCGCGTTGGGTACGCTACGGCGGATAACCCCATTGGACCTTGGACATATCGTGGTGTTCTTCTGGAGAAGGACGAATCGAAGGGCATTCTTGCTACGGGACATAACTCCATCATCAACATTCCTGGAACGGATGAGTGGTATATCGCGTATCATCGCTTCCATATTCCCGATGGAAATGGGTATAATAGGGAGACTACGATTGATAGGGTACCCATCGACAAGGATACGGGTTTGTTTGGAAAGGTTACGCCGACTTTGCAGAGTGTTGATCCTAGGCCTTTGTAGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCフザリウムバーティシリオイデスからのGH43ファミリー酵素Fv43B、についてのヌクレオチド配列は、以下に配列番号16として提供される:ATGCGCTTCTCTTGGCTATTGTGCCCCCTTCTAGCGATGGGAAGTGCTCTTCCTGAAACGAAGACGGATGTTTCGACATACACCAACCCTGTCCTTCCAGGATGGCACTCGGATCCATCGTGTATCCAGAAAGATGGCCTCTTTCTCTGCGTCACTTCAACATTCATCTCCTTCCCAGGTCTTCCCGTCTATGCCTCAAGGGATCTAGTCAACTGGCGTCTCATCAGCCATGTCTGGAACCGCGAGAAACAGTTGCCTGGCATTAGCTGGAAGACGGCAGGACAGCAACAGGGAATGTATGCACCAACCATTCGATACCACAAGGGAACATACTACGTCATCTGCGAATACCTGGGCGTTGGAGATATTATTGGTGTCATCTTCAAGACCACCAATCCGTGGGACGAGAGTAGCTGGAGTGACCCTGTTACCTTCAAGCCAAATCACATCGACCCCGATCTGTTCTGGGATGATGACGGAAAGGTTTATTGTGCTACCCATGGCATCACTCTGCAGGAGATTGATTTGGAAACTGGAGAGCTTAGCCCGGAGCTTAATATCTGGAACGGCACAGGAGGTGTATGGCCTGAGGGTCCCCATATCTACAAGCGCGACGGTTACTACTATCTCATGATTGCCGAGGGTGGAACTGCCGAAGACCACGCTATCACAATCGCTCGGGCCCGCAAGATCACCGGCCCCTATGAAGCCTACAATAACAACCCAATCTTGACCAACCGCGGGACATCTGAGTACTTCCAGACTGTCGGTCACGGTGATCTGTTCCAAGATACCAAGGGCAACTGGTGGGGTCTTTGTCTTGCTACTCGCATCACAGCACAGGGAGTTTCACCCATGGGCCGTGAAGCTGTTTTGTTCAATGGCACATGGAACAAGGGCGAATGGCCCAAGTTGCAACCAGTACGAGGTCGCATGCCTGGAAACCTCCTCCCAAAGCCGACGCGAAACGTTCCCGGAGATGGGCCCTTCAACGCTGACCCAGACAACTACAACTTGAAGAAGACTAAGAAGATCCCTCCTCACTTTGTGCACCATAGAGTCCCAAGAGACGGTGCCTTCTCTTTGTCTTCCAAGGGTCTGCACATCGTGCCTAGTCGAAACAACGTTACCGGTAGTGTGTTGCCAGGAGATGAGATTGAGCTATCAGGACAGCGAGGTCTAGCTTTCATCGGACGCCGCCAAACTCACACTCTGTTCAAATATAGTGTTGATATCGACTTCAAGCCCAAGTCCGATGATCAGGAAGCTGGAATCACCGTTTTCCGCACGCAGTTCGACCATATCGATCTTGGCATTGTTCGTCTTCCTACAAACCAAGGCAGCAACAAGAAATCTAAGCTTGCCTTCCGATTCCGGGCCACAGGAGCTCAGAATGTTCCTGCACCGAAGGTAGTACCGGTCCCCGATGGCTGGGAGAAGGGCGTAATCAGTCTACATATCGAGGCAGCCAACGCGACGCACTACAACCTTGGAGCTTCGAGCCACAGAGGCAAGACTCTCGACATCGCGACAGCATCAGCAAGTCTTGTGAGTGGAGGCACGGGTTCATTTGTTGGTAGTTTGCTTGGACCTTATGCTACCTGCAACGGCAAAGGATCTGGAGTGGAATGTCCCAAGGGAGGTGATGTCTATGTGACCCAATGGACTTATAAGCCCGTGGCACAAGAGATTGATCATGGTGTTTTTGTGAAATCAGAATTGTAGFv43Bのタンパク質配列は以下に配列番号17として提供される:MRFSWLLCPLLAMGSALPETKTDVSTYTNPVLPGWHSDPSCIQKDGLFLCVTSTFISFPGLPVYASRDLVNWRLISHVWNREKQLPGISWKTAGQQQGMYAPTIRYHKGTYYVICEYLGVGDIIGVIFKTTNPWDESSWSDPVTFKPNHIDPDLFWDDDGKVYCATHGITLQEIDLETGELSPELNIWNGTGGVWPEGPHIYKRDGYYYLMIAEGGTAEDHAITIARARKITGPYEAYNNNPILTNRGTSEYFQTVGHGDLFQDTKGNWWGLCLATRITAQGVSPMGREAVLFNGTWNKGEWPKLQPVRGRMPGNLLPKPTRNVPGDGPFNADPDNYNLKKTKKIPPHFVHHRVPRDGAFSLSSKGLHIVPSRNNVTGSVLPGDEIELSGQRGLAFIGRRQTHTLFKYSVDIDFKPKSDDQEAGITVFRTQFDHIDLGIVRLPTNQGSNKKSKLAFRFRATGAQNVPAPKVVPVPDGWEKGVISLHIEAANATHYNLGASSHRGKTLDIATASASLVSGGTGSFVGSLLGPYATCNGKGSGVECPKGGDVYVTQWTYKPVAQEIDHGVFVKSELフザリウムバーティシリオイデスからのGH43ファミリー酵素Fv43C、についてのヌクレオチド配列は、以下に配列番号18として提供される:ATGCGTCTTCTATCGTTTCCCAGCCATCTCCTCGTGGCCTTCCTAACCCTCAAAGAGGCTTCATCCCTCGCCCTCAGCAAACGGGATAGCCCTGTCCTCCCCGGCCTCTGGGCGGACCCCAACATCGCCATCGTCGACAAGACATACTACATCTTCCCTACCACCGACGGTTTCGAAGGCTGGGGCGGCAACGTCTTCTACTGGTGGAAATCAAAAGATCTCGTATCATGGACAAAGAGCGACAAGCCATTCCTTACTCTCAATGGTACGAATGGCAACGTTCCCTGGGCTACAGGTAATGCCTGGGCTCCTGCTTTCGCTGCTCGCGGAGGCAAGTATTACTTCTACCATAGTGGGAATAATCCCTCTGTGAGTGATGGGCATAAGAGTATTGGTGCGGCGGTGGCTGATCATCCTGAGGGGCCGTGGAAGGCACAGGATAAGCCGATGATCAAGGGAACTTCTGATGAGGAGATTGTCAGCAACCAGGCTATCGATCCCGCTGCCTTTGAAGACCCTGAGACTGGAAAGTGGTATATCTACTGGGGAAACGGTGTCCCCATTGTCGCAGAGCTCAACGACGACATGGTCTCTCTCAAAGCAGGCTGGCACAAAATCACAGGTCTTCAGAATTTCCGCGAGGGTCTTTTCGTCAACTATCGCGATGGAACATATCATCTGACATACTCTATCGACGATACGGGCTCAGAGAACTATCGCGTTGGGTACGCTACGGCGGATAACCCCATTGGACCTTGGACATATCGTGGTGTTCTTCTGGAGAAGGACGAATCGAAGGGCATTCTTGCTACGGGACATAACTCCATCATCAACATTCCTGGAACGGATGAGTGGTATATCGCGTATCATCGCTTCCATATTCCCGATGGAAATGGGTATAATAGGGAGACTACGATTGATAGGGTACCCATCGACAAGGATACGGGTTTGTTTGGAAAGGTTACGCCGACTTTGCAGAGTGTTGATCCTAGGCCTTTGTAGFv43Cについてのタンパク質配列は以下に配列番号19として提供される:MRLLSFPSHLLVAFLTLKEASSLALSKRDSPVLPGLWADPNIAIVDKTYYIFPTTDGFEGWGGNVFYWWKSKDLVSWTKSDKPFLTLNGTNGNVPWATGNAWAPAFAARGGKYYFYHSGNNPSVSDGHKSIGAAVADHPEGPWKAQDKPMIKGTSDEEIVSNQAIDPAAFEDPETGKWYIYWGNGVPIVAELNDDMVSLKAGWHKITGLQNFREGLFVNYRDGTYHLTYSIDDTGSENYRVGYATADNPIGPWTYRGVLLEKDESKGILATGHNSIINIPGTDEWYIAYHRFHIPDGNGYNRETTIDRVPIDKDTGLFGKVTPTLQSVDPRPLpTrex3gM-Fv43B及びpTrex3gM-Fv43Cベクターを、各々独立して、PEG媒介原形質融合によりMAD6株に、及び、粒子銃照射によるquad欠失株に、形質転換した。2.quad欠失トリコデルマリーゼイ株の形質転換。PDS-1000/ヘリウムシステムBioradHercules,CAによる微粒子銃照射を製造者の教示に従って用いて、米国特許出願公開第2006/0003408号の実施例2に記載のように、ベクターpTrex3gM-Fv43B及びベクターpTrex3gM-Fv43Cを独立してトリコデルマリーゼイquad欠失株に形質転換した。3.fv43B及びfv43Cで形質転換したトリコデルマリーゼイquad欠失クローンのSDS-PAGE国際公開第2011/038019号に記載のように、安定な形質転換体を96ウェルマイクロタイタープレートで培養した。培養上清にSDS-PAGEを行い、続いて、SimplyBlueステインInvitrogenでクマシー青色染色を行った。ゲルをスキャンし、光学密度測定により分析した。ImageJNationalInstitutesofHealthからを使用し、ユーザーガイドのサブセクション27.13に記載のようにAnalyzeGelサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。Fv43Bタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。図13は、fv43Bで形質転換させたトリコデルマリーゼイquad欠失クローンから発現させたタンパク質のSDS-PAGEの写真を提供する。Fv43Cタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Fv43Cはゲル上を2つのバンドとして走っており、異なる糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。Fv43Cで形質転換させたトリコデルマリーゼイquad欠失クローンから発現させたタンパク質のSDS-PAGEを図14に示す。4.MAD6トリコデルマリーゼイ株のPEG媒介原形質融合形質転換PCRにより、プライマー1061F及び1085Rを用いて、ベクターpTrex3gM-Fv43B及びpTrex3gM-Fv43Cの発現カセット部分を各々増幅して、それぞれ5.1kb及び4.4kbの線状DNA断片を産生させ、これらをMAD6株のPEG媒介原形質融合形質転換に使用した例えば、Pentilla,M.,etal.1987Gene612:155~164を参照されたい。1061F:5’-GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT-3’配列番号201085R:5’-GTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG-3’配列番号21プロトプラストを作るために、Trichodermaharzianumからの連結酵素SigmaカタログL1412を10mg/mLで使用した。DNA及びPEGを形質転換させながらインキュベートした後、0.5ウリジンを有する冷却した溶解ソルビトール/アセトアミド寒天にプロトプラストを添加した。これらのプレートを30°Cにてインキュベートした。24時間後、0.5ウリジンと1.2g/Lの5-フルオロオロチン酸FOAを補充した同じ培地を等容量だけ重層形態のプレートに添加した。これらのプレートを30°Cにて一週間にわたってインキュベートした。以下のレシピを用いて、溶解ソルビトール/アセトアミド寒天を調製した:ソルビトール/アセトアミド寒天5.fv43B又はfv43Cで形質転換させたトリコデルマリーゼイMAD6クローンのSDS-PAGE国際公開第2011/038019号に記載のように、Fv43Bの3つの形質転換体とFv43Cの2つの形質転換体を96ウェルマイクロタイターウェルプレートで培養した。培養上清にSDS-PAGEを行い、続いて、SimplyBlueステインInvitrogenでクマシー青色染色を行った。ゲルをスキャンし、光学密度測定により分析した。ImageJNationalInstitutesofHealthからを使用し、ユーザーガイドのサブセクション27.13に記載のようにAnalyzeGelサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。図15は、fv43B及びfv43Cで形質転換させたトリコデルマリーゼイMAD6クローンのSDS-PAGEを示す。Fv43Cタンパク質に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Fv43Cタンパク質はゲル上を2つのバンドとして走っており、異なる糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。6.発現されたタンパク質の量の定量的測定quad欠失株により発現されたタンパク質の量をMAD6株により得られたものと比較した。上記のように、関連するゲル、図13、14及び15をスキャンし、光学密度測定により分析した。ImageJNationalInstitutesofHealthからを使用し、ユーザーガイドのサブセクション27.13に記載のようにAnalyzeGelサブメニュー機能を採用することにより、画像処理及びバンド強度定量化を行った。目的のタンパク質の各々に対応するバンドを定量化し、総タンパク質の百分率として報告した。Fv43Cはゲル上を2つのバンドとして走っており、糖型を表し、これらは光学密度測定分析において合計された。この分析の結果を以下の表2-1に要約する:この比較は、MAD6株を使用する発現が、発現レベルにおいて最小限の変動性例えば、20未満の変動性を有するはるかに高い信頼性の発現をもたらしたことを明確に示している。対照的に、quad欠失株を使用すると、かなりの部分の形質転換体が、目的のタンパク質を発現させるのに失敗しており、発現の変動性はかなりのものである例えば、50を超える変動性。実施例3ハイポクレアジェコニアCBH2のDNAライブラリーの作製CBH2変異体酵素をコードするDNAライブラリーの作製のための参照配列として、ハイポクレアジェコニアCBH2タンパク質をコードする配列を含有するpTTTpyrG-cbh2プラスミド例えば、国際特許第2010/141779号を参照されたいを使用した。配列番号7は、参照の、ハイポクレアジェコニアCBH2をコードするDNA配列を説明する:ATGATTGTCGGCATTCTCACCACGCTGGCTACGCTGGCCACACTCGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTGCTCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTACTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTCTGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATGTTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATTACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCTTCTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTGGATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCACTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCAAACCCATCGTTCCTGTAA。配列番号8は、ハイポクレアジェコニアCBH2完全長タンパク質配列である:MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL配列番号9は、ハイポクレアジェコニアCBH2成熟タンパク質配列である:QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL合成CBH2コンビナトリアルライブラリーは、GeneOracleMountainView,CAにより調製した。CBH2の多数のアミノ酸残基を複数の他のアミノ酸残基で置換した。表3-1は、CBH2コンビナトリアルライブラリーのメンバーの置換を列挙するCBH2成熟アミノ酸配列に従って番号付与した。ライブラリーは精製PCR産物として提供され、ここで、プライマーGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT配列番号10及びGTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG配列番号11を使用して、ハイポクレアジェコニア宿主株のpyr2遺伝子座における統合の強化のために、約1.1kbのcbh1プロモーターの上流で、及び、1.85kbのamdSマーカーの下流で、隣接しているcbh2遺伝子を増幅した。発現カセットをスクリーニング株に相同組み換えする概略を図8に描写する。上記プライマーを用いてpTTTpyrG-CBH2から増幅されたPCR断片部分cbh1プロモーター、cbh2遺伝子及び部分amdS遺伝子のヌクレオチド配列は、以下に配列番号12として提供される:GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCCACCATGATTGTCGGCATTCTCACCACGCTGGCTACGCTGGCCACACTCGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTGCTCAAGCGTCTGGTAATTATGTGAACCCTCTCAAGAGACCCAAATACTGAGATATGTCAAGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTACTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTCTGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTGTAGGTCCTCCCGGAACCAAGGCAATCTGTTACTGAAGGCTCATCATTCACTGCAGAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGGTATGAGTTTAAACACCTGCCTCCCCCCCCCCTTCCCTTCCTTTCCCGCCGGCATCTTGTCGTTGTGCTAACTATTGTTCCCTCTTCCAGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATGTTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATTACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCTTCTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTGGATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCACTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCAAACCCATCGTTCCTGTAAAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACC。実施例1に記載のAD5ハイポクレアジェコニア株Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2、Δbgl1のプロトプラストを記載のような線状DNAライブラリーで形質転換させ米国特許出願公開第2006/0094080号、アセトアミドを含有する選択寒天上で28°Cにて7日にわたって培養した0.6g/Lのアセトアミド、1.68g/LのCsCl、20g/Lのグルコース、6g/LのKH2PO4、0.6g/LのMgSO47H2O、0.6g/LのCaCl22H2O、0.5g/Lのウリジン、微量元素の塩、10g/Lの低融点アガロース。24時間後、この寒天に、1.2g/Lのフルオロオロチン酸FOAを補充した選択寒天を重ねた。合計380コロニーを、1.2g/LのFOAを含有するジャガイモデキストロース寒天に移し、28°Cにて4~5日にわたってインキュベートした。胞子を新しいジャガイモデキストロース寒天プレートに移し、これを28°Cにて3日にわたってインキュベートした。別の方法としては、実施例1に記載のMAD6株のプロトプラストは、変異体ライブラリーのメンバーの発現のためにAD5の代わりに採用することができる。同様に、追加のセルラーゼが不活性化されたMAD6株の誘導体のプロトプラストは、この目的に使用することができる。このような誘導体は、更に低いバックグラウンドセルラーゼ活性を呈する。CBH2変異体タンパク質産生のために、96ピンのレプリケーターを用いて胞子を、PVDFフィルタープレート内で2グルコース/ソホロース混合物を補充した200μLグリシン最少培地に移した:6.0g/Lのグリシン、4.7g/LのNH42SO4;5.0g/LのKH2PO4;1.0g/LのMgSO47H2O;33.0g/LのPIPPS;pH5.5;炭素源として2グルコース/ソホロース混合物を滅菌添加、10mL/Lの100g/LのCaCl2、2.5mL/Lのトリコデルマリーゼイ微量元素400X:175g/Lの無水クエン酸;200g/LのFeSO47H2O;16g/LのZnSO47H2O;3.2g/LのCuSO45H2O;1.4g/LのMnSO4H2O;0.8g/LのH3BO3。各CBH2変異体を4組培養した。プレートを酸素透過性膜で封止した後、これらのプレートを、200rpmで振盪しながら、28°Cにて6日にわたってインキュベートした。低圧下で培養培地をマイクロタイタープレートに移すことにより、上清を採取した。CBH2を目的の特性について試験した。SDSPAGEを用いて、個々の変異体の発現を調査した。図16Aは、4つのSDS-PAGEの写真であり、多数の変異体の発現を示しており、図16Bは、これらの変異体についての平均産生レベルを描写し、誤差バーは発現の変動性を示している。洗浄した希酸で予め処理した50°Cでのトウモロコシ茎葉についての比活性PCS50°C、50°Cでのトウモロコシ穂軸の比活性CC50°C及び57°Cでのトウモロコシ穂軸の比活性CC57°Cを測定した。57°Cでのトウモロコシ穂軸において活性の回線を示した合計で10の変異体を単離した。これらの株のゲノムDNAを単離し、これらのcbh2遺伝子配列を判定した。トウモロコシ穂軸及びトウモロコシ茎葉についてのコンビナトリアルライブラリーの置換及び比活性性能指数を表3-2に示す。比活性についての性能指数は、変異体の標準化タンパク質発現レベルに基づいて判定された。PCS50°Cトウモロコシ茎葉を記載のように2w/wのH2SO4で前処理しSchelletal.,JApplBiochemBiotechnol,105:69~86,2003、その後、脱イオン水で複数回洗浄したところ、pH4.5を有するペーストを得た。酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0を次に、50mM酢酸ナトリウムの最終濃度まで添加し、この混合物を次に1NのNaOHを適切に用いてpH5.0まで適定した。反応混合物中のセルロース濃度はおよそ7であった。このセルロース懸濁液を96ウェルマイクロタイタープレートNuncFlatBottomPSにウェル当たり65μL添加した。各ウェルに、10μLの酵素サンプルを添加し、各々はquad欠失株Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2からの上清中49μgのタンパク質を含有した。野生型CBH2又はCBH2変異体のいずれかを発現させているハイポクレアジェコニアからの培養上清を最大20μL添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。プレートを封止した後、これらを、200rpmで振盪しながら、50°Cにてインキュベートした。2日後、プレートを氷上で5分にわたって乗せ、100μLの100mMグリシンpH10.0を添加した。混合後、プレートを3000rpmにて5分にわたって遠心分離した。10μLの容量の上清を190μLの水で希釈した。10μLの希釈溶液を、各ウェルの中に100μLのABTSグルコースアッセイ混合物2.74mg/mLの2,2’アジノ-ビス3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸、1U/mLのセイヨウワサビペルオキシダーゼVI型、1U/mLのグルコースオキシダーゼを含有する新しい96ウェルマイクロタイタープレートCostarFlatBottomPSに移し、A420の増加をマイクロタイタープレート光分析装置SpectramaxPlus384、MolecularDevicesで記録した。各プレート上にある範囲のグルコース濃度を標準として含ませた0;0.008;0.016;0.031;0.063;0.125;0.25;0.5;1mg/mL。アッセイを2回行った。Temkin等温式y=abln1cxにデータを入れることにより野生型CBH2についての用量反応曲線を作成し、CBH2変異体の活性を同じプレートの野生型CBH2の計算した活性で除算して、性能指数を得た。トウモロコシ穂軸50°Cトウモロコシ穂軸を粉砕して、0.9mmスクリーンを通過させ、その後、国際公開第2006/110901号の実施例4に記載の方法に従って前処理した。前処理したトウモロコシ穂軸は、50mM酢酸ナトリウムpH5.0中7セルロース懸濁液として使用した。この懸濁液を96ウェルマイクロタイタープレートNuncFlatBottomPSにウェル当たり70μL添加した。各ウェルに、quad欠失株Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2からの上清の46.55μgのタンパク質を含有する10μL溶液を添加し、4.90μgのトリコデルマリーゼイCBH1、6.84μgのトリコデルマリーゼイXyn2Y5Xiongetal,Extremophiles8:393~400,2004、2.28μgのフザリウムバーティシリオイデスFv51A、5.32μgのFv3A、0.76μgのFv43D、及び2.45μgのトリコデルマリーゼイBGL1を補充した。フザリウムバーティシリオイデス酵素は、国際公開第2011/038019号に記載されている。野生型CBH2又はCBH2変異体のいずれかを発現させるハイポクレアジェコニア株からの上清最大20μLを各ウェルに添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。このプレートを、200rpmで振盪しながら、50°Cにてインキュベートした。2日後、プレートを氷上で5分にわたって乗せ、100μLの100mMグリシンpH10.0を添加した。混合後、プレートを3000rpmにて5分にわたって遠心分離した。10μLの容量の上清を190μLの水で希釈した。この希釈溶液10μLを、100μLのABTSグルコースアッセイ混合物を含有している新しい96ウェルマイクロタイタープレートCostarFlatBottomPSに移し、上記のようにアッセイ及び分析した。トウモロコシ穂軸57°Cトウモロコシ穂軸を粉砕して、0.9mmスクリーンを通過させ、その後、国際公開第2006/110901号の実施例4に記載の方法に従って前処理した。前処理したトウモロコシ穂軸は、50mM酢酸ナトリウムpH5.0中7セルロース懸濁液として使用した。この懸濁液を96ウェルマイクロタイタープレートNuncFlatBottomPSにウェル当たり70μL添加した。各ウェルに、quad欠失株Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2からの上清の46.55μgのタンパク質を含有する10μL溶液を添加し、4.90μgのCBH1変異体S8P/T41I/N89D/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/E295K/T296P/T332Y/V403D/S411F/T462I、6.84μgのトリコデルマリーゼイXyn2Y5Xiongetal,Extremophiles8:393~400,2004,2.28μgのFv51A、5.32μgのFv3A、0.76μgのFv43D、2.45μgのTalaromycesemersoniiβ-グルコシダーゼを添加した。野生型CBH2又はCBH2変異体のいずれかを発現させるハイポクレアジェコニア株からの上清最大20μLを添加した。調節容量のアセテート緩衝液を添加して、合計容量の差を補った。このプレートを、200rpmで振盪しながら、57°Cにてインキュベートした。2日後、プレートを氷上で5分にわたって乗せ、100μLの100mMグリシンpH10.0を添加した。混合後、プレートを3000rpmにて5分にわたって遠心分離した。10μLの容量の上清を190μLの水で希釈した。この希釈溶液10μLを、100μLのABTSグルコースアッセイ混合物を含有している新しい96ウェルマイクロタイタープレートCostarFlatBottomPSに移し、上記のようにアッセイ及び分析した。"