"ヒト多能性細胞の皮質形成をインビトロで誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:i単離されたヒト多能性幹細胞の集団を提供するステップ;及びii前記集団が皮質幹細胞及び前駆細胞に分化するように、レチノイドシグナリングを刺激し、且つTGFβスーパーファミリーシグナリングを阻害する培養条件下で、前記集団を培養するステップ。請求項1に記載の方法であって、前記培養条件が、TGFβ及びBMPシグナリングを阻害する該方法。請求項1又は2に記載の方法であって、前記集団が神経誘導培地中で培養され、該培地は、レチノイドを含み、且つ、1種以上のTGFβ-SMADシグナリング阻害剤を含む該方法。請求項3に記載の方法であって、前記レチノイドが、レチノイン酸、all-transレチノール、又は酢酸レチノールである該方法。請求項3又は4に記載の方法であって、前記1種以上のTGFβ-SMADシグナリング阻害剤が、以下から選択される該方法:4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド、Noggin及びDorsomorphin。請求項5に記載の方法であって、前記神経誘導培地が、4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド及びNogginを含む該方法。請求項3~6のいずれか1項に記載の方法であって、前記神経誘導培地がインシュリンを含む該方法。請求項1~7のいずれか1項に記載の方法であって、前記ヒト多能性幹細胞の集団が、少なくとも15日間培養される該方法。請求項1~8のいずれか1項に記載の方法であって、少なくとも95の前記集団が、皮質幹細胞及び前駆細胞に分化する該方法。前記請求項いずれか1項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団を増殖させるステップを含む該方法。前記請求項いずれか1項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団を保存するステップを含む該方法。前記請求項いずれか1項に記載の方法であって、皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団が、大脳皮質ニューロンに分化することを可能にするステップを含む該方法。前記請求項いずれか1項に記載の方法であって、前記ヒト多能性幹細胞がiPS細胞である該方法。請求項13に記載の方法であって、前記iPS細胞が、損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する個体から得られた健全な細胞のサンプルに由来する該方法。請求項13に記載の方法であって、前記iPS細胞が、病気に関連した表現型又は遺伝子型を有する細胞のサンプルに由来する該方法。請求項15に記載の方法であって、前記iPS細胞が、ダウン症候群細胞のサンプルに由来するダウン症候群iPS細胞DS-iPSである該方法。請求項16に記載の方法であって、前記DS-iPS細胞から産生された前記大脳皮質ニューロンにおいて、1以上のアルツハイマー病の病理、又は年齢に関連した病理を、検出又は測定するステップを含む該方法。請求項1~17のいずれか1項に記載の方法によって産生された、単離された皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞、又は単離された大脳皮質ニューロンの集団。ヒト又は動物の身体の治療方法において使用するための、請求項18に記載の集団。損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者を治療する方法において使用するための請求項18に記載の集団。損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者を治療する方法であって、請求項18に記載の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップを含む該方法。損傷した又は機能不全の大脳皮質を有する患者の治療において使用するための薬品の製造における請求項18に記載の集団の使用。請求項18に記載の集団であって、前記細胞が、DS-iPS細胞から産生され、1種以上のアルツハイマー病又は年齢に関連した病理を示す該集団。神経変性病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む方法:請求項1~17のいずれか1項に記載の方法によって製造された単離大脳皮質ニューロンを、試験化合物に接触させるステップ;及び前記ニューロンに対する試験化合物の効果を検出するステップ。請求項24に記載の方法であって、前記大脳皮質ニューロンがDS-iPS細胞から製造され、1種以上の年齢に関連した、又はアルツハイマー病の病理に対する前記試験化合物の効果を検出する該方法。請求項25に記載の方法であって、前記試験化合物による以下のものに対する効果を決定する該方法:Aβ42の発現レベル、AB40に対するAB42の割合;ニューロン内のAB42レベル;前記細胞外培地におけるAb42のレベル;AB42オリゴマー形成;高リン酸化されたTauのレベル;細胞内カルシウムレベル;細胞内及び細胞外のアミロイドプラークの形成;、及び単離された大脳皮質ニューロンの前記集団におけるプログラム化された細胞死の割合。本発明は、ヒト多能性細胞に対して誘導をかけて、インビトロで高効率で皮質形成を行うための方法の開発に関する。本発明は、例えば、皮質ニューロンの製造に有用となる可能性があり、特に、患者に特有の皮質ニューロン;未成年及び大人で発症する神経病のモデリング;、及び、これらの病気に対する治療剤の開発等に有用となる可能性がある。本発明の一態様は、以下の方法を提供する。ヒト多能性細胞の皮質形成をインビトロで誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法:i単離されたヒト多能性幹細胞の集団を提供するステップ;及びii前記集団が皮質幹細胞及び前駆細胞に分化するように、レチノイドシグナリングを刺激し、且つTGFβ及びBMPシグナリングを阻害する培養条件下で、前記集団を培養するステップ。皮質幹細胞及び前駆細胞は、培養中で維持することができ、保存することができ例えば、従来技術を用いて凍結することができ、又は本明細書に記載するように、治療や他の応用に利用することができる。幾つかの実施形態において、皮質幹細胞及び前駆細胞は、皮質ニューロンに分化することができる。本発明の方法は更に以下のステップを含むことができる:iii皮質幹細胞及び前駆細胞の前記集団が、大脳皮質ニューロンに分化することを可能にするステップ。ヒト多能性幹細胞は、特殊化していない未分化の細胞であり、自身を複製したり、自己更新することができ、そして、全3つの初期胚葉層、即ち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の特殊な細胞へと発生することができる。しかし、栄養外胚葉を含めた全ての胚組織や胚体外組織に発生することができない即ち全能性ではない。ヒトの多能性幹細胞は、神経系統へとは分化しないnotcommitted。ヒト多能性細胞には、胚幹ES細胞や、非胚幹細胞が含まれ、そして、胎児や大人の体性幹細胞、及び非多能性細胞由来の幹細胞が含まれる。適切なES細胞は、培養hES細胞株例えば、Edi2、H9、又はhSF-6から入手することができる。適切なヒト胚幹細胞の更なる例については以下の文献に記載されている:ThomsonJAetalScience282:1145-11471998;Reubinoffetal.NatBiotechnol18:399-4042000;Cowan,C.A.etal.N.Engl.J.Med.350,1353-13562004,Gage,F.H.,etal.Ann.Rev.Neurosci.18159-1921995;andGotlieb2002Annu.Rev.Neurosci25381-407;Carpenteretal.StemCells.51:79-882003;、また、オンラインでアクセス可能な以下のページも参照されたい:NIHstemcellregistry。潜在的な臨床レベルのhESCが以下の文献に記載されている:Klimanskaya,I.etal.Lancet365,1636-16412005;及びLudwig,T.E.etal.Nat.Biotechnol.24,185-1872006。他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、非多能性細胞由来である人工多能性iPS細胞であってもよい。iPS細胞について、後で詳述する。ヒト多能性幹細胞は、1種以上の、以下の全能性に関連したマーカーを発現することができる:Oct4、Sox2、アルカリホスファターゼ、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、及びTra-1-60。好ましくは、ヒト多能性幹細胞が、Oct4を発現する。ヒト多能性幹細胞は、神経細胞マーカー例えば、Tuj1を発現しない。細胞が発現するマーカーは、全能性に関連したマーカーも含めて、標準的な技術を用いて特定することができる:例えば、PCR、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、及び、insituハイブリダイゼーション。本発明の方法において使用するためのヒト多能性細胞の集団は、従来の技術を用いて、多能性細胞株から、細胞を培養することによって得ることができるVallier,L.etalDev.Biol.275,403-4212004,Cowan,C.A.etal.N.Engl.J.Med.350,1353-13562004,Joannides,A.etal.StemCells24,230-2352006Klimanskaya,I.etal.Lancet365,1636-16412005,Ludwig,T.E.etal.Nat.Biotechnol.24,185-1872006。例えば、本発明の方法において使用に適したヒト多能性細胞は、従来、以下のような形で培養することができる:支持細胞の層例えば、放射状マウス胚性線維芽細胞MEFの上、培養ディッシュ内、適切な密度例えば、105~106細胞/60mmディッシュ、又は条件付のフィーダー若しくは決められた培地を備える適切な基質上。本発明の方法において使用するためのヒト多能性細胞は、酵素的又は機械的な手段により継代することができる。ヒト多能性細胞のための適切な培養培地は以下の物を含む:SC培地ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地KO-DMEM、添加物として、20の血清代替物、1の非必須アミノ酸、1mML-グルタミン、0.1mMβ-メルカプトエタノール、及び4ng/ml~10ng/mlヒトbFGF、及びES培地DMEM/F12、添加物として20ノックアウト血清置換代替物KSR、6ng/mlFGF2PeproTech、1mML-Gln、100μm非必須アミノ酸、100μM2-メルカプトエタノール、50U/mlペニシリン、及び50mg/mlストレプトマイシン。インビトロの皮質形成誘導のためのヒト多能性幹細胞の集団は、実質的に1種以上の他の細胞種を含まないことが好ましい。上述したように、ヒト多能性細胞は、通常、MEF支持細胞上で、培養され、維持される。ヒト多能性細胞は、任意の適切な技術により、支持細胞から分離することができる。例えば、細胞は短時間例えば、1時間ゼラチン上で培養することができ、その後、ゼラチンに結合していないヒト多能性細胞を、ゼラチンに結合しているMEFから分離することができる。後述するが、このことにより、胚様体が形成されることが回避される。分離した後は、ヒト多能性細胞は、単層で適切な培地上で培養することができ、培地としては、例えば、10ng/mlのFGF2を添加した上述のSC培地又はES培地が挙げられる。好ましくは、培地は、Rho結合コイルドコイル含有する蛋白質キナーゼROCK阻害剤例えば、10μM含むことができ、ヒト多能性細胞を、単細胞懸濁液中へ分離する際の細胞死を減少させることができるOlson,M.F.2008.CurrOpinCellBiol20:242-8;Watanabe,K.etal.2007NatBiotechnol25:681-6,US2010/0009442。適切なROCK阻害剤が当分野で知られており、以下の物が挙げられる-4-[1R-アミノエチル]-N-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イルベンズアミドジヒドロクロリド水和物;1R,4r-4-R-1-アミノエチル-N-ピリジン-4-イルシクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド;及びN-2-2-ジメチルアミノエトキシ-4-1H-ピラゾール-4-イルフェニル-2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-2-カルボキサミド全てStemgentUSA、又はCalbiochemUSAから入手可能。単層とは、基質例えば、培養プレートの表面上にある一層の細胞層のことである。ヒト多能性細胞の単層培養により、制御され且つ決められた分化を可能とし、胚様体の形成が回避される。胚様体は、幹細胞の制御されない分化によって形成される集合体であり、様々なタイプの分化細胞からなっており、そして、神経幹細胞を更にそこから精製しなければならなくなる。また、単層は、培養の長期間のイメージングも可能にすることができる。胚様体を形成することなく、本明細書に記載したように、単層培養中で、ヒト多能性幹細胞を培養し、分化させることが好ましい。インビトロでの皮質形成を開始する前に、単離されたヒト多能性幹細胞の集団は、増殖expandさせることできる。例えば、ヒト多能性幹細胞は、FGF2シグナリングを刺激する条件下で、単層で培養することができる。幾つかの実施形態において、細胞は、FGF2例えば、5~20ng/mlFGF2,好ましくは10ng/mlを添加した培養培地中で培養することができる。適切な培養培地としては、上述したようにSC培地やES培地が挙げられ、MEF条件で、且つFGF2を添加した物であってもよい。任意のほ乳類のFGF2を使用することができるが、好ましくは、ヒト線維芽細胞成長因子2FGF2を用いるNCBIGeneID:2247,核酸配列NM_002006.3GI:41352694,アミノ酸配列NP_001997.4GI:41352695。FGF2は、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元例えば、RD,ミネアポリス,MN,USAから入手することができる。好ましくは、インビトロでの皮質形成を開始するためのヒト多能性幹細胞の集団は、単層培養で提供される。ヒト多能性細胞を単層培養するための方法は周知である。単層培養中のヒト多能性細胞が、少なくとも85コンフルエント即ち、細胞容器の表面の少なくとも85が細胞で覆われている、少なくとも90コンフルエント、又は少なくとも95コンフルエントになったときに、皮質形成を誘導することが好ましい。上述したように、皮質形成は、レチノイドシグナリングを刺激し、TGFβスーパーファミリーシグナリングを阻害する培養条件下でヒト多能性幹細胞を培養することによって開始される。TGFβスーパーファミリーシグナリングは、SMAD蛋白質例えばSMAD1-3,5及び9によって仲介され、ヒト多能性細胞においてTGFβ及びBMPシグナリングを阻害することによって阻害することができるChambers,S.M.,etalNatBiotechnol27,275-2802009,SchmiereretalNatRevMolCellBiol.2007Dec;812:970-82。TGFβ-SMADシグナリングは、前記神経誘導培地中のTGFβ及びBMPシグナリング阻害剤によって阻害することができる。好ましくは、一旦神経誘導が開始されると、ヒト多能性細胞の集団が、皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞に分化するまで、レチノイドシグナリング刺激、並びにTGFβ及びBMPシグナリング阻害は継続的に行われることが好ましい。例えば、細胞は、以下を含む神経誘導培地で培養することができる:1種以上の因子であって、細胞内において、レチノイドシグナリング刺激し、又は促進し、且つTGFβ及びBMPシグナリングを阻害する因子。前記神経誘導培地は、ヒト多能性幹細胞においてレチノイドシグナリングを刺激するレチノイドを含むことができる。適切なレチノイドは、周知であり、以下の物が含まれる:レチノイン酸、ビタミンAalltransレチノール、酢酸レチノール。例えば、前記神経誘導培地は、0.01μM~10μMのall-transレチノールを含むことができ、典型的には0.5μMを含むことができる。多能性細胞においてレチノイドシグナリングを刺激するための技術は周知である例えば、以下の文献を参照されたい:国際公開2008071960号明細書、米国特許出願20070224650号明細書、米国特許出願7632679号明細書、国際公開2008060792号明細書、国際公開2009058451号明細書、米国特許出願20060073587号明細書、及び国際公開2005021720号明細書。TGFβスーパーファミリーシグナリングは、前記神経誘導培地中において、1種以上のTGFβ-SMADシグナリング阻害剤によって阻害することができる。TGFβ-SMADシグナリング阻害剤には、TGFβシグナリング阻害剤及びBMPシグナリング阻害剤を含めることができる。前記神経誘導培地は、TGFβシグナリング阻害剤を含むことができる。TGFβシグナリングは、SMAD2及びSMAD3が介在した経路を通して発生し、TGF-β1アクチビンレセプター-様キナーゼALKALK-4、-5、及び-7によって介在されてもよいSchmiereretalNatRevMolCellBiol.2007Dec;812:970-82。TGFβシグナリング阻害剤は、SMAD2及びSMAD3が介在したシグナリングを阻害することができる。適切なTGFβシグナリング阻害剤には、ALK4,5及び7受容体の阻害剤が含まれ、例えば、以下の物が挙げられる:2-5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル-6-メチルピリジン塩酸SB-505124;4-[4-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル-5-2-ピリジニル-1H-イミダゾール-2-イル]ベンザミドSB431542;TocrisBioscienceUSA;StemgentUSA、及び3-6-メチル-2-ピリジニル-N-フェニル-4-4-キノリニル-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミドA83-01;TocrisBioscienceUSA;StemgentUSA。SB431542は、TGF-β1アクチビンレセプター-様キナーゼALKの阻害剤である。SB431542は、ALK-4,-5及び-7の選択的且つ効能のある阻害剤であり、従って、BMPが介在するSMAD2/3のリン酸化をブロックするLaping,N.J.etal.,Mol.Pharmacol.,62:58-642002。例えば、前記神経誘導培地は、5μM~20μMのSB431542を含むことができ、例えば約10μM含むことができる。ヒト多能性細胞においてTGFβシグナリングを阻害するための方法は周知である例えば、以下の文献を参照されたい:米国特許7250294号明細書、米国特許7560281号明細書、及び国際公開20100638481号明細書;Chambers,S.M.,etalNatBiotechnol27,275-2802009。前記神経誘導培地は、BMPシグナリング阻害剤を含むことができる。BMPシグナリングは、SMAD1、SMAD5、及びSMAD8を介した経路を通して発生する。そして、該シグナリングは、TGF-β1アクチビンレセプター-様キナーゼALKs-1、-2及び-3及び-6を介することができるSchmiereretalNatRevMolCellBiol.2007Dec;812:970-82。BMPシグナリング阻害剤は、SMAD1、SMAD5、及びSMAD8を介したシグナリングを阻害することができる。適切なBMPシグナリング阻害剤は、ヒト多能性幹細胞において、SMAD1、SMAD5、及びSMAD8またはSMAD9とも呼ばれるを介した経路を通したシグナリングを阻害することができる。BMPシグナリングは、BMPのI型受容体であるALK1、ALK2、ALK3、及びALK6によって介在される。そして、適切なBMPシグナリング阻害剤には、ALK1、ALK2、ALK3、及びALK6の受容体の阻害剤が含まれる。適切なBMPシグナリング阻害剤は、公知であるCunyetal2008BioorgMedChemLett184388-4392;Yuetal2008NatMed141363-9。そして、該阻害剤には、以下の物が含まれる:ノギン、ドルソモルフィン、ホリスタチン、インヒビン、スクレロスチン、コーディン、CTGF、ホリスタチン、グレムリン、及び4-6-4-ピペラジン-1-イルフェニルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イルキノリンLDN-193189StemgentUSA。幾つかの実施形態において、BMP阻害剤はノギンであってもよい。ノギンは、分泌されるホモダイマーの糖蛋白質であり、トランスフォーミング増殖因子-ベータTGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナリングタンパク質に結合し、不活性化させる例えば、骨形成タンパク質-4BMP4GroppeetalNature420,636-642。任意の哺乳動物のノギンを用いることができる。例えば、ヒトノギンNOGNCBIGeneID:9241,核酸配列NM_005450.4GI:189339247,アミノ酸配列NP_005441.1GI:4885523、又はマウスノギンNogNCBI18121,核酸配列NM_008711.2GI:158187522アミノ酸配列NP_032737.1GI:7110675については、ルーチンの組み換え技術を用いて産生することができるし、又は販売元例えば、RDシステム、ミネアポリス,MN,USAから入手することができる。例えば、前記神経誘導培地は、250ng/ml~1000ng/mlのノギンを含むことができ、例えば、約500ng/mlのノギンを含むことができる。幾つかの実施形態において、ノギンは他の成分と結合してもよい。例えば、キメラのノギン分子例えば、マウスノギン-FcキメラRDシステムを用いることができる。他の実施形態では、BMP阻害剤は、ドルソモルフィン6-[4-[2-1-ピペリジニルエトキシ]フェニル]-3-4-ピリジニル-ピラゾロ[1,5-a]ピリミジンジヒドロクロリドであってもよい。ドルソモルフィンは、BMPのI型受容体であるALK2、ALK3、及びALK6の阻害を通して機能する。従って、BMPを介したSMAD1/5/8のリン酸化をブロックする。ドルソモルフィンは、胚形成に必要なBMPシグナル、及び鉄の代謝を阻害するYuetalNatChemBiol4:33-41。ドルソモルフィンは、販売元例えば、TocrisBioscienceUSA;StemgentUSAから入手することができる。多能性細胞において、BMPシグナリングを阻害するための方法は周知である例えば以下の文献を参照されたい国際公開2008026198号明細書;Chambers,S.M.,etalNatBiotechnol27,275-2802009。幾つかの好ましい実施形態では、前記神経誘導培地において、1種以上のTGFβ-SMADシグナリング阻害剤が、SMAD2/3が介在するシグナリング、及びSMAD1/5/8が介在するシグナリングの両方を阻害する。例えば、上述したように、前記神経誘導培地は、TGFβシグナリング阻害剤例えば、SB431542、及びBMPシグナリング阻害剤例えば、ノギンを含むことができる。前記神経誘導培地は、インシュリンを更に含むことができる。該インシュリンは、例えば、皮質幹細胞、前駆細胞、及びニューロンの生存率を向上させることができる。例えば、前記神経誘導培地は、1μg/ml~10μg/mlのインシュリンを含むことができ、例えば、約5μg/ml含むことができる。上述したように、ヒト多能性細胞は、TGFβスーパーファミリーTGFβ及びBMPの両方を含むのシグナリングを阻害する条件下で培養するのが好ましい。これは、TGFβ及びBMPシグナリング経路の両方を阻害することによって達成することができる。そして、結果として、ヒト多能性細胞における全てのSMADシグナリングを阻害する例えば、SMAD1~3、5及び9によって介在されるシグナリング。従って、適切な神経誘導培地は、上述したように、レチノイド、TGFβシグナリング阻害剤、BMP阻害剤、及びインシュリンを含むことができる。また、神経誘導培地は、標準的な神経細胞培養試薬を含むことができる。例えば、培地は、基礎的な神経培養培地を含むことができ、例えば、DMEM/F12GIBCOにN2Bottensteinetal1979PNASUSA761514-517;GIBCOを添加した物や、NeurobasalInvitrogenにB27GIBCO/Invitrogenを添加した物が挙げられる。他の適切な基礎的神経培養培地及び添加物は、周知であり、及び/又は販売元から入手できる。例えば、NS21添加物ChenetalJournalofNeuroscienceMethod1712008239-247をB27の代わりに使用することができる。幾つかの実施形態において、1種以上のレチノイド、TGFβシグナリング阻害剤、BMP阻害剤、及びインシュリンを、標準培地の一部として添加することができる。例えば、レチノイン酸は、B27培地添加物の成分として添加することができる。基礎的神経培地には、必要に応じて、抗生物質例えば、ストレプトマイシン及びペニシリン、非必須アミノ酸、L-グルタミン、及び還元剤例えば、メルカプトエタノールを添加してもよい。適切な神経誘導培地は、神経誘導、神経形成、及び神経分化をサポートする標準的な培地を基礎とした物であってもよい。3N培地は、N2含有培地とB27含有培地とを1:1の比率で、混合物した物を含むことができる。ここで、N2含有培地は、MEM/F12にN2GIBCO、インシュリン、L-グルタミン、非必須アミノ酸、2-メルカプトエタノール、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した物を含む。そして、B27含有培地は、neurobasalInvitrogenにB27添加物GIBCO、L-グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した物を含む。典型的には、N2培地は、以下の物を含むことができる:5μg/mlインシュリン、1mML-グルタミン、100μm非必須アミノ酸、100μM2-メルカプトエタノール、50U/mlペニシリン、及び50mg/mlストレプトマイシン。そして、B27培地は、以下の物を含むことができる:200mMグルタミン、50U/mlペニシリン、及び50mg/mlストレプトマイシン。上述した3N培地は、神経誘導培地を生成するために、TGFβ及びBMPシグナリング阻害剤を添加してもよい。哺乳動物細胞の培養は公知である例えば、以下の文献を参照されたい:BasicCellCultureProtocols,C.Helgason,HumanaPressInc.U.S.15Oct2004ISBN:1588295451;HumanCellCultureProtocolsMethodsinMolecularMedicineS.HumanaPressInc.,U.S.9Dec2004ISBN:1588292223;CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,R.Freshney,JohnWileySonsInc2Aug2005ISBN:0471453293,HoWYetalJImmunolMethods.2006310:40-52,HandbookofStemCellsed.R.LanzaISBN:0124366430。培地及びこれらの成分については、販売元から入手することができる例えば、Gibco,Roche,Sigma,Europabioproducts,RDSystems。標準的な哺乳動物細胞培養条件を用いることができる。例えば、37°C、21酸素、5二酸化炭素の条件を用いることができる。培地は、2日ごとに交換し、細胞は、重力によって設置されることが可能となることが好ましい。細胞は、適宜、細胞外マトリックス成分例えば、Matrigel商標でコーティングされた表面上で培養する。ヒト多能性幹細胞は、前記神経誘導培地中で5日以上、10日以上、又は15日以上培養することができる。例えば、細胞は、最大で15日間、20日間、又は25日間、典型的には、8~11日間培養することができ、ヒト多能性細胞が、皮質幹細胞、並びに幹細胞及び前駆細胞に転換することを可能にする。上述したように、ヒト多能性細胞を前記神経誘導培地中で培養すると、細胞が皮質幹細胞及び前駆細胞へ分化することを誘導する。例えば、前記神経誘導培地で培養後は、集団中85以上、90以上、95以上、又は98以上のヒト多能性幹細胞が、皮質幹細胞及び前駆細胞へ分化することができる。好ましくは、集団中95以上のヒト多能性幹細胞が、分化開始後14日以内で、皮質幹細胞及び前駆細胞へと分化することができる。皮質幹細胞及び前駆細胞は、未分化のヒト多能性幹細胞の娘細胞又は子孫であり、確定的な皮質表現型を有しており、元々の幹細胞と比べると分化能力が低くなっている。更に、皮質幹細胞及び前駆細胞は、例えば、任意のクラス又は層例えば、大脳皮質の1層~6層のいずれか1つの層のニューロンの大脳皮質ニューロンに分化することができる。本明細書に記載の、ヒト多能性細胞の神経誘導によって生成される皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、以下の2つの細胞の両方を含む:増殖可能で、多能性を維持した皮質細胞皮質幹細胞;及び、必ずしも自己更新する能力を持たない、能力がより限られた細胞前駆細胞。皮質幹細胞及び前駆細胞は、培養中、神経上皮ロゼットneuroepithelialrosettesを形成することができる。これらの神経上皮ロゼットは、皮質神経上皮のインビボでの性質を1種以上示すことができる例えば、頂底極性apico-basalpolarity;頂部での分裂apicalmitoses、及び有意な量の脳室からはなれたabventricular領域での分裂。皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、頂端及び基底の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。皮質幹細胞及び前駆細胞は、Pax6を発現することができる。また、皮質幹細胞及び前駆細胞は、1種以上のFoxG1、Emx1、Emx2、及びCOUP-TF1を発現することができる。また、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団のサブセット即ち、基底細胞は、Tbr2を発現することができる。皮質幹細胞及び前駆細胞は、多能性に関連するマーカー例えば、Oct4、Sox2、アルカリホスファターゼ、SSEA-3、Nanog、SSEA-4、及びTra-1-60を発現しない。本発明の方法は、1種以上の皮質幹細胞及び前駆細胞マーカー、及び/又は1種以上の多能性細胞マーカーの発現を、集団の細胞内で、モニター又は検出するステップを含むことができる。これにより、前記神経誘導培地で培養した際に、集団の分化又は神経誘導の度合いを決定することが可能となる。本発明の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞は、実質的に他の細胞種を含まないようにすることができる。例えば、細胞集団は、前記神経誘導培地で培養後、80以上、85以上、90以上、又は95以上の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。好ましくは、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、他の細胞種を含まない度合いが十分であるため、精製の必要がない。前記神経誘導培地で培養後、上述したように、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、前記神経誘導培地から単離したり、及び/又は除去したりすることができる。適切な技術については周知である。幾つかの実施形態において、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、増殖させることができる。皮質幹細胞及び前駆細胞の増殖のための適切な培養条件には、FGF2シグナリングを刺激する条件が含まれる。例えば、皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、線維芽細胞成長因子2FGF2を添加した増殖培地中で培養することによって増殖させることができる。例えば、培地は、10~40ng/mlのFGF2、好ましくは20ng/mlのFGF2を含むことができる。適切な増殖培地は、FGF2を添加した上述の3N培地を含むことができる。他の適切な培地については、当業者にしてみれば明らかであろう。皮質幹細胞及び前駆細胞の製造及び随意的な増殖の後、皮質幹細胞及び前駆細胞の神経形成を開始して、大脳皮質ニューロンの集団を生成することができる。皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、神経形成を促進する条件で培養することができる。例えば、細胞は、増殖培地例えば、上述したような3N培地中で、FGF2無しにした物で培養することができる。皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、少なくとも40日間、少なくとも60日間、少なくとも80日間、少なくとも100日間、若しくは100日超、又は神経形成が完了するか、若しくは十分な量の神経形成が発生するまで培養することができる。標準的な細胞培養技術を用いることができる。大脳皮質ニューロンは、機能的グルタミン酸作動性投射ニューロンに十分に分化する。大脳皮質ニューロンは、以下の群から選ばれる1種以上のマーカーを発現することができる:Tbr1、CTIP2、Cux1、Satb2、Brn2、reelin、Fezf1、Fezf2、Sox5、Bhlhb5、Pou3f1、及びOtx1以下の文献を参照されたいMolyneauxetal.,NatRevNeurosci.2007Jun;86:427-37。本発明の方法は、集団中の細胞において、1種以上の大脳皮質ニューロンのマーカー、並びに/又は1種以上の皮質幹細胞及び前駆細胞のマーカーの発現をモニター又は検出するステップを含むことができる。大脳皮質ニューロンは任意のクラスであってもよい。例えば、前記ニューロンは、皮質層6、皮質層5、皮質層4、皮質層3、皮質層2、又は皮質層1のニューロンであってもよい。異なるクラスの大脳皮質ニューロンは、神経クラスマーカーの発現によって特定することができる。例えば、層1ニューロンでは、reelinが発現;層2/3ニューロンでは、Brn2が発現;層2~4ニューロンでは、Cux1及びSatb2が発現;層5ニューロンでは、CTIP2、Pou3f1/SCIP、又はOtx1が発現;層5皮質脊髄運動ニューロンでは、CTIP2が発現するが、Tbr1は発現しない;及び層6ニューロンでは、Tbr1及びFezf2が発現。神経クラスマーカーの発現は、免疫細胞化学、蛍光抗体法、及びRT-PCRを含めた適切な技術によって決定することができる。大脳皮質ニューロンの異なるクラスは、皮質幹細胞及び前駆細胞の分化を開始した後、例えば80、90、又は100日間にわたって、進行する形で形成することができる。幾つかの実施形態において、層5の皮質脊髄運動ニューロンが、表層層2~4のニューロンとともに続いて出現する前に、深層6ニューロンは分化する。おおまかに等しい量で、深層と表層のニューロンを生成することができる。所望のクラスの大脳皮質ニューロンが生成されるまで細胞を培養することができる。細胞培養中に存在する前記クラスのニューロンは、上述したように、神経クラスのマーカーの発現を検出することによってモニターすることができる。幾つかの実施形態において、神経生成の速度は、例えば、培養培地にFGF2を添加したり、又は取り除いたりすることにより、制御して特定の神経細胞クラスの出現を遅くすることができる。本発明の方法は、細胞培養から特定のクラスのニューロン集団を単離するステップを含むことができる。例えば、皮質層6、皮質層5、皮質層4、皮質層3、皮質層2又は皮質層1のニューロンの集団を単離することができる。これらのニューロンは、後述するように治療や他の応用にわたって、有用となりうるものである。幾つかの好ましい実施形態において、皮質層5のニューロンの集団を単離することができる。これらの中には、皮質脊髄運動ニューロンが含まれ、該ニューロンは、脊髄損傷、及び運動ニューロンの病気の治療若しくはモデリング、又はこれらの症状に対する治療剤のためのスクリーニングにおいて、特に有用となりうるものである。本発明の方法によって生成された皮質ニューロン特に、特定のクラス又はサブセットの皮質ニューロン例えば、皮質脊髄運動ニューロンは、実質的に、他の細胞種を含まない物であってもよい。幾つかの実施形態において、対象となる皮質ニューロンは、当業者にとって公知の任意の技術を用いて、細胞培養中に、他の細胞種又は細胞クラスから分離することができる。該技術の中には、抗体、又は磁気ビーズ、又は蛍光活性細胞ソーティングFACSによって、細胞外エピトープ例えば、神経クラスマーカー等を認識させることに基づくものも含まれる。本明細書に記載の方法で生成された大脳皮質ニューロンは、機能的には、電気生理学的特性を示すことができ、そして、神経シナプスを形成することができる。大脳皮質ニューロン集団の興奮性のシナプス特性は、例えば、微小興奮性シナプス後電位mEPSPの存在、又は集中したシナプトフィシンの免疫蛍光の存在を検出することにより、決定することができる。こうした事は、標準的な技術を用いて行うことができる。上述したように、ヒト多能性幹細胞は、人工多能性幹iPS細胞であってもよい。iPS細胞は、非多能性の、即ち完全に分化した先祖の細胞に由来する多能性細胞である。適切な細胞には、成人の線維芽細胞や、末しょう血液細胞が含まれる。通常、先祖となる細胞は、多能性遺伝子又は多能性蛋白質例えば、Oct4、Sox2及びSox1を細胞内に導入することによって、再プログラムすることができる。前記遺伝子又は蛋白質は、任意の適切な技術によって分化した細胞に導入することができる。該技術には、ウィルス性又はプラスミドのトランスフェクションや、直接の蛋白質の送達等が含まれる。また、導入効率を上げる目的で前記細胞に他の遺伝子を導入してもよい例えば、Kif遺伝子例えば、Kif-1、-2、-4及び-5;Myc遺伝子例えば、C-myc、L-myc及びN-myc;nanog;及びLin28。多能性遺伝子又は蛋白質を導入した後、先祖細胞を培養することができる。多能性マーカーを発現する細胞は、単離及び/又は精製して、iPS細胞の集団を生成することができる。iPS細胞を製造するための技術は周知であるYamanakaetalNature2007;448:313-7;Yamanaka62007Jun7;11:39-49.KimetalNature.2008Jul31;4547204:646-50;TakahashiCell.2007Nov30;1315:861-72.ParketalNature.2008Jan10;4517175:141-6;KimetalCellStemCell.2009Jun5;46:472-6.幾つかの実施形態において、iPS細胞は、個体から得られた健常な細胞即ち、病気に関連した表現型又は遺伝子型を持たない細胞由来であってもよい。幾つかの実施形態において、細胞は、損傷した又は機能不全の皮質ニューロンを有する患者例えば、神経病、頭部の外傷、多発性硬化症、脳卒中、又は脊髄損傷を有する個体から得られた物であってもよい。これらの細胞から生成された皮質ニューロンは、患者の治療に有用な物となりうる可能性がある。幾つかの実施形態において、iPS細胞は、病気特有のiPS細胞であってもよい。病気特有のiPS細胞は、ある個体からの病気に関連した細胞即ち、病気例えば、神経病、例えば散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症、並びに脳性麻痺に関連した表現型又は遺伝子型を有する細胞に由来する物であってもよい。iPS細胞の製造のための細胞であって、病気に関連した細胞は、神経病に苦しむ個体、又は神経病になりやすい若しくは神経病のリスクがある個体から得ることができる。神経病には、損傷した又は機能不全の皮質ニューロンに関連する病気が含まれる例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症及び脳性麻痺。幾つかの好ましい実施形態において、神経病には、若年発症性の又は成人発症性の神経変性病が含まれる。病気特有のiPS細胞は、本明細書に記載するように分化させて、神経病のモデルとして有用な皮質ニューロンの集団を生成することができる。特に、本明細書に記載するように病気特有のiPS細胞から生成された皮質ニューロンは、短時間枠即ち、数週間又は数ヶ月で病理を示すことができる。このことにより、治療用分子のスクリーニングを促進する。幾つかの好ましい実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、ダウン症候群iPS細胞DS-iPS細胞である。DS-iPS細胞は、ダウン症候群を有する個体から得られた細胞に由来するiPS細胞であるPark,I.H.,etalCell134,877-8862008。ダウン症候群/トリソミー21は、ヒトの精神遅滞において最もありふれた遺伝的原因であるWiseman,F.KetalHumMolGenet18,R75-832009。ダウン症候群を有する個体は、21番目染色体上にあるアミロイド前駆体蛋白質APP遺伝子の存在に起因するアルツハイマー病ADの発症率が非常に高いRumble,B.,etal.NEnglJMed320,1446-14521989;Selkoe,D.J.BiolChem271,18295-182981996。本明細書に記載の方法によって、DS-iPS細胞において、皮質形成をインビトロで誘導すると、21番目の染色体の余分な複製を有する大脳皮質ニューロンが生成されることとなる。これら大脳皮質ニューロンは、細胞培養において、ADの病理を示す。例えば、DS-iPS由来の皮質ニューロンは、アミロイド前駆体蛋白質APPのAβ42フラグメントを高いレベルで生成し、細胞内及び細胞外アミロイドプラークを形成し、そして、プログラム細胞死の率が上昇する。ADの病理を有する皮質ニューロンを生成する方法においては、以下のステップを含むことができる;上述したように、DS-iPS細胞の集団の皮質形成をインビトロで誘導するステップ;該ステップにより、ADの病理を有する皮質ニューロンの集団を生成するステップ。DS-iPS由来の皮質ニューロンは、DS-iPS細胞、又は該細胞由来の保存皮質幹細胞からの分化を開始して、1、2、3、4ヶ月又はそれ以上の間にADの病理を示すことができる。一旦生成されると、ADの病理を有する皮質ニューロンは、例えば、スクリーニングでの使用を目的として、培養及び維持をすることができる。ADの病理を有する皮質ニューロンを維持する方法は、以下のステップを含むことができる;上述したように、DS-iPS細胞由来の皮質ニューロンの集団を培養するステップ。ニューロンを培養する方法は、周知である。本発明の方法は、前記細胞内で、1種以上のADの病理を測定又は検出するステップを更に含むことができる。ADの病理としては、以下のものが含まれる:Aβ42の発現レベルの上昇、AB40非毒性形態に対するAB42の割合上昇;ニューロン内でのAB42レベルの情報;細胞外培地におけるAB42レベルの上昇;AB42オリゴマー形成の上昇;高リン酸化されたTauレベルの上昇;細胞内カルシウムレベルの上昇;細胞内及び細胞外アミロイドプラーク形成の上昇;及びプログラム細胞死の率の上昇。後で更に詳述するが、こうした病理は、例えば、スクリーニングの方法において有用となる可能性がある。ダウン症候群を有する個体は、早老の症状を示す可能性がある。本明細書に記載の方法で、DS-iPS細胞において皮質形成をインビトロで誘導すると、大脳皮質ニューロンが生成されることとなり、該ニューロンは、老化及び年齢に関連した認知低下の研究において有用となる可能性がある。年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンを生成する方法では以下のステップを含むことができる:上述したように、DS-iPS細胞の集団の皮質形成をインビトロで誘導するステップ;それによって、年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンの集団を生成するステップ。DS-iPS由来の皮質ニューロンは、DS-iPS細胞、又は該細胞に由来する保存皮質幹細胞から分化を開始して1、2、3、4ヶ月又はそれ以上の間に、年齢に関連した病理を示すことができる。一旦生成されると、年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンは、例えば、スクリーニングでの使用を目的として、培養及び維持をすることができる。年齢に関連した病理を有する皮質ニューロンを維持する方法は、以下のステップを含むことができる:上述したように、DS-iPS細胞由来の皮質ニューロンの集団を培養するステップ。年齢に関連した病理には、以下のものを含めることができる:成長の低下、プログラム細胞死の率の上昇、シナプス活動の低下、及び興奮性の活動の低下。本発明の他の態様では、以下の物を提供する:上述したようなインビトロでの皮質形成の方法によって生成された単離大脳皮質ニューロン、又は単離皮質幹細胞及び前駆細胞、並びに上述したようなインビトロでの皮質形成の方法によって生成された単離大脳皮質ニューロン、又は単離皮質幹細胞及び前駆細胞の集団。単離大脳皮質ニューロンの集団は、機能的に興奮特性を有するグルタミン酸作動性投射ニューロンを80以上、85以上、90以上、95以上、又は99以上含むことができる。前記集団は、介在ニューロンの含有量が1未満であってもよく、好ましくは、介在ニューロンを全く含まず、又は、免疫細胞学の手法において検出できない程度の介在ニューロン量であってもよい。単離皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、80以上、85以上、90以上、95以上、又は99以上の皮質幹細胞及び前駆細胞を含むことができる。本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞は、大脳新皮質細胞dorsaltelencephaliccells即ち、これらの細胞は、皮質組織に特有であるである。本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞の集団は、後脳又は脊髄の幹細胞及び前駆細胞を含まない。幾つかの好ましい実施形態において、ニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、機能不全の例えば、損傷した又は病気をもった大脳皮質を有する個体に由来するiPS細胞から生成される。これら皮質幹細胞及び前駆細胞、又はニューロンは、患者の治療において利用することができる。例えば、前記皮質細胞を投与して、機能不全の大脳皮質を有する個体即ち、病気の又は機能不全の皮質ニューロンを有する個体において、損傷した皮質ニューロンを置き換えることができる。本発明の更なる態様は、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団を提供する。該集団は、ヒト又は動物の身体の治療方法において例えば、機能不全の大脳皮質を有する患者の治療において使用することを目的とする。また、本発明の更なる態様は、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団の使用を提供し、該使用は、機能不全の大脳皮質の治療における使用を目的とする薬品の製造における使用である。機能不全の大脳皮質を有する個体は、損傷した、又は機能不全の皮質ニューロンに関連する病気例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症、運動ニューロン病、脳性麻痺、多発性硬化症、又は脳卒中を有する個体であってもよい。或いは、機能不全の大脳皮質を有する個体は、脳又は脊髄に対する損傷又は外傷に苦しむ個体であってもよい。例えば、上述したような方法で生成された皮質脊髄運動ニューロン層5は、脊髄損傷を治療するために使用することができる。個体を治療するために使用される皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団は、該個体から得られた細胞に由来するiPS細胞から生成されることが好ましい。治療への応用を目的として、本明細書に記載の方法によって生成された皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンは、臨床グレードclinicalgrade細胞であることが好ましい。ある個体に投与される皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団は、遺伝的操作を行い、治療用分子例えば、薬剤又は成長因子を生成することができるBehrstockSetal,GeneTher2006Mar;135:379-88,KleinSMetal,HumGeneTher2005Apr;164:509-21。医薬組成物、薬品、薬剤、又は他の組成物については、医薬的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存薬防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の物質とともに、皮質幹細胞及び前駆細胞又は皮質ニューロンの集団を含むことができる。キャリア又は他の物質の正確な特性については、投与経路に依存することになるであろう。医薬組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、又はキャリア、及び随意的に1種以上の他の成分と共に、皮質幹細胞及び前駆細胞、又は皮質ニューロンの集団を混合することによって生成することができる。前記組成物は、患者に投与することができ、例えば、上述したように、機能不全の皮質組織の治療予防的な治療も含めることができるを目的としたものであってもよい。液体医薬組成物は、一般的に、液体キャリア例えば、水、石油、動物性油、植物性油、鉱物油、又は合成油を含む。生理食塩水溶液、組織培養培地若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はグリコール例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールを含めることができる。組成物は、非経口的に許容可能な水性溶液の形態であってもよく、該形態では、感染源が含まれておらず、適切なpH、等張性及び安定性を有する。当分野に関わるものであれば、例えば、塩化ナトリウム等の等張性のビヒクル、リンゲル注射、又は乳酸リンゲル注射を用いて適切な溶液を調製することは十分可能である。組成物は、人工的な脳脊髄液を用いて調製してもよい。細胞は、任意の公知技術によって、患者に移植することができる例えば、Lindvall,O.1998Mov.Disord.13,Suppl.1:83-7;Freed,C.R.,etal.,1997CellTransplant,6,201-202;Kordower,etal.,1995NewEnglandJournalofMedicine,332,1118-1124;Freed,C.R.,1992NewEnglandJournalofMedicine,327,1549-1555,LeBlancetal,Lancet2004May1;3639419:1439-41。本発明に従った組成物の投与は、予防としての有効量又は治療としての有効量であることが好ましい場合によっては、予防を治療とみなすこともできるかもしれないが。そして、該量とは、個体に対して利点を示すのに十分な量である。実際の投与する量、割合、及び時間変化は、治療対象の性質や深刻度によるだろう。治療の処方箋例えば、投与量等の決定については、一般的に実践する者、又は他の医療ドクターの責任の範囲内である。組成物は、治療する症状に応じて、単独で投与することもでき、又は他の治療と組み合わせて同時に若しくは連続のいずれかで投与することができる。他の好ましい実施形態において、ニューロン、皮質幹細胞及び前駆細胞、又はこれらの集団は、病気特有のiPS細胞、例えばDS-iPS細胞に由来する。ニューロン、若しくは幹細胞及び前駆細胞、又はこれらの集団は、神経変性病の病理例えば、細胞内又は細胞外の蛋白質の凝集、アポトーシスの上昇を示すことができる。例えば、DS-iPS細胞に由来するニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、ADの病理を示すことができる。神経変性病の病理を示す細胞は、治療薬の開発に有用となりうる有効な化合物のスクリーニングにおいて有用となる可能性がある。本発明の他の態様は、上述したように、生成された大脳皮質ニューロンを、治療活性を有する化合物神経病等の病気の治療において有用となり得る物のスクリーニング方法において使用することに関する。神経病の治療において有用な化合物のスクリーニング方法では、以下のステップを含むことができる:上述した方法によって生成された単離大脳皮質ニューロンを、試験化合物に接触させるステップ;及び前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。例えば、試験化合物による効果を決定する対象としては、神経細胞の死/生存、成長、増殖、症状、集合、電気的な活動、シナプス活動、及び/又は遺伝子の発現等を挙げることができる。幾つかの実施形態において、神経変性病の治療において有用な化合物のスクリーニングの方法は、以下のステップを含むことができる:上述の方法で生成された単離大脳皮質ニューロンに対する神経毒性効果を、試験化合物が存在する場合と存在しない場合とで決定するステップ。ニューロンに対する神経毒性効果を減少又は改善する試験化合物は、神経変性病の治療又は治療薬の開発において有用となる可能性がある。神経毒素としては、神経変性病に関連する集合傾向のaggregationprone蛋白質例えばAB42を含めることができる。また、本明細書に記載の方法で生成された大脳皮質ニューロンは、例えば、毒性試験において有用となる可能性がある。幾つかの実施形態において、化合物の神経毒性を決定する方法は以下のステップをふくむことができる:上述の方法で生成された単離大脳皮質ニューロンに前記化合物を接触させるステップ:、及び前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。例えば、以下の現象をかえる化合物は神経毒素と同定することができる:例えば、神経細胞の死/生存の増加若しくは減少、成長、増殖、症状、集合、電気的活動、シナプス活動、及び/又は遺伝子発現。ニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、病気特有のiPS細胞に由来することが好ましく、例えば、皮質ニューロンの損傷又は機能不全に関連した病気例えば、散発性及び家族性アルツハイマー病、家族性及び散発性てんかん、自閉症、統合失調症及び脳性麻痺に苦しむ個体から得られた細胞に由来するiPS細胞であることが好ましい。病気特有のiPS細胞に由来するニューロン、又は幹細胞及び前駆細胞は、神経病の病理例えば、異常なシナプス活動又は電気的活動、細胞内又は細胞外での蛋白質の凝集、異常な遺伝子発現、又は細胞死の上昇を示す可能性がある。神経病の病理に対する試験化合物の効果を決定することが可能である。前記病理を減少又は阻害する化合物は、神経病の治療、又は神経病に対する治療薬の開発において潜在的に有用な物として特定される可能性がある。神経学的な病理例えば、アルツハイマー病の病理は、分化を開始して、1、2、3、4、5、6週間又はそれ以上の間で、決定することができる。これらの病理は、試験化合物の効果を決定する目的で、1、2、3、4、5、6週間又はそれ以上の間で、測定することができる。幾つかの好ましい実施形態において、アルツハイマー病の治療において有用な化合物のスクリーニング方法は、以下のステップを含むことができる:上述の方法でDS-iPS細胞から生成された単離大脳皮質ニューロンを試験化合物に接触させるステップ;及び前記ニューロンに対する試験化合物の効果を決定するステップ。例えば、試験化合物の効果を、以下の1種以上のアルツハイマー病の病理に関して決定することができる:例えば、Aβ42の発現レベル、AB40非毒性形態に対するAB42の割合;ニューロン内のAB42レベル;細胞外培地内でのAB42レベル;AB42オリゴマー形成;高リン酸化されたTauのレベル;細胞内カルシウムレベル;細胞内及び細胞外アミロイドプラークの形成;プログラム細胞死の率。試験化合物で処理していないコントロールの細胞に比べて、これらの病理のいずれかが減少することにより、試験化合物は抗AD活性があり、アルツハイマー病の治療及び/又はAD治療薬の開発に有用となる可能性を示すことができる。アルツハイマー病の病理例えば、AB40非毒性形態に対するAB42の割合;ニューロン内のAB42レベル;細胞外培地内でのAB42レベル;AB42オリゴマー形成;高リン酸化されたTauのレベル;細胞内カルシウムレベル;Aβ42の発現;細胞内及び細胞外アミロイドプラークの形成;及び/又はプログラム細胞死の率は、標準的な技術を用いて測定することができる。例えば、アミロイドプラークの進行は、ThioflavinTのアナログであるBTA124で生体染色livestainingすることによって決定することができる。本明細書に記載の方法では、皮質ニューロンにおいて1種以上の神経病の病理を減少又は改善する試験化合物を同定するステップを含むことができる。神経病の病理を減少する化合物は、神経病の治療、又は該化合物の設計のための化合物の候補となる。皮質ニューロンにおいて1種以上の神経病の病理を減少又は改善する化合物を同定した後は、本発明の方法は、前記化合物の医薬的特性を最適化するために、該化合物を改変するステップを更に含むことができる。該ステップは、上述したようなモデリング技術によって成しうるものである。試験化合物は、皮質ニューロンにおいて1種以上の神経病の病理を減少又は改善する能力を有する物として、1種以上の初期スクリーンニングを用いて同定されるが、1種以上の二次スクリーンニングを用いて更に評価することができる。二次スクリーンニングは、インビトロ及び/又はインビボ例えば、動物モデルで、生物学的機能及び活性について試験することを含めることができる。例えば、病気の動物モデルにおいて神経病と関連する1種以上の症状又は病理を減少又は改善する試験化合物の能力を決定することができる。皮質ニューロンにおいて、1種以上の神経病の病理を減少又は改善する試験化合物を同定した後は、前記化合物を単離及び/又は精製することができ、或いは、組み換え発現や化学合成の従来技術を用いて合成することができる。更に、化合物は、組成物の調製、即ち、組成物例えば、薬品、医薬組成物、又は薬剤の製造又は形成において製造したり、及び/又は使用することができる。これらの物は、神経病を治療するために個体に投与することができる。本明細書に開示した内容を参照すれば、本発明に係る更なる様々な態様及び実施形態があることが当業者にとって明らかであろう。本明細書で記述した全ての文献及びデータベースエントリは、参照により、その内容全体を本明細書に組み込む。本明細書で引用した細胞マーカーは、全て周知であり、完全な詳細情報については、公共のデータベース例えば、オンラインNCBIデータベース上で容易に入手できる。これらのマーカーの発現を検出するための抗体は、ルーチン技術で生成することが可能であり、又は販売元例えば、AbcamLtd,ケンブリッジUKから入手することが可能である。本明細書で使用する及び/又はという表現該表現において、及びを並びにに置き換えた場合や、又はを若しくはに置き換えた場合も同様は、特定の二つの特性又は成分のうちのそれぞれであって、他方の要素を伴うもの、又は伴わないものである旨を特定して開示するものとして解釈すべきものである。例えば、A及び/又はBという表現は、iA、iiB、及びiiiAとBのそれぞれが、ちょうど本明細書において個別に列挙されたかのように、特定して開示するものとして解釈すべきものである。特記しない限り、上述した特徴に関する記載や定義は、本発明のあらゆる特定の態様や実施形態に限定されない。そして、記載した全ての態様及び実施形態に等しくあてはまるものである。本発明の特定の態様及び実施形態については、後述する図面及び表を参照しながら、例示的な意味合いで以下述べることとする。実施例方法ヒト多能性幹細胞培養ヒトES細胞の研究は、UK幹細胞バンク及び幹細胞株の使用に関する運営委員会の承認を得た。そして、ヒト幹細胞株の使用のための実施のUKコードtheUKCodeofPracticeに従い行った。hESH9、WiCellResearchInstitute、及びEdi2、JennyNicholsより提供、CambridgeCentreforStemCellResearch、及びhiPS細胞株DS1-iPS4、HarvardStemCellInstitute22の培養は、標準的な方法13に従って、マイトマイシン処理マウス胚の線維芽細胞MEFs上で行った。要するに、細胞は、hESC培地全ての成分は、特記しない限りInvitrogen中で維持した:DMEM/F12で以下の成分を含有する:20KSR、6ng/mlFGF2PeproTech,1mML-Gln,100μm非必須アミノ酸、100μM2-メルカプトエタノール、50U/mlペニシリン、及び50mg/mlストレプトマイシン。大脳皮質への分化誘導hESC培地添加物として、10ng/mlFGF2、及び10μMROCK阻害剤Calbiochem中で、ゼラチンーコートしたディッシュ上で、1時間、予めAccutaseInnovativeCellTechnologiesを置くことによって、単一の細胞に分離した。その後、hESC又はiPSCは、MEFから単離した。非接着性の多能性幹細胞を回収して、MatrigelBDでコートした12ウェルプレートにまいた。各ウェルには、MEF-条件hESC培地10ng/mlのFGF2とともにをいれた。いったん、細胞培養状態が、95のコンフルエンスに達したら、培養培地を変えて、神経誘導を開始した。変更後の培養培地は、神経誘導、神経生成、及び神経分化をサポートする3N培地と呼ぶ物であり、N2及びB27を含有する培地を1:1で混合した物である。N2培地は、以下の成分を含む:DMEM/F12、N2GIBCO、5μg/mlインシュリン、1mML-グルタミン、100μm非必須アミノ酸、100μM2-メルカプトエタノール,50U/mlペニシリン及び50mg/mlストレプトマイシン;B27培地:NeurobasalInvitrogen、B27、ビタミンAGIBCO、200mMグルタミン、50U/mlペニシリン、及び50mg/mlストレプトマイシン。神経誘導の間TGFβシグナリングを阻害するために、3N培地には、500ng/mlマウスノギン-CFキメラRDsystems、及び10μmSB431542Tocrisを添加した。細胞は、該培地中で、8-11日間維持した。その間、特徴的な神経上皮細胞の形態を有する細胞が出現しないかどうかをもって、神経誘導の効果をモニターした。神経上皮細胞を、Dispaseで分離して回収した。そして、3N培地該培地は、20ng/mlFGF2を含む中、そして、ポリ-オルニチン及びラミニンコートしたプラスチックプレート上に再度まいた。更に2日後、FGF2を除去して分化を促進した。培養については、Accutaseを用いてもう一度継代を行った。そして、ポリオルニチン及びラミニンコートしたプラスチックプレート上に、そして、3N倍地中に、50,000cells/cm2の濃度でまいた。それ以降毎日、最大で90日間、培地を変えながら維持した。免疫細胞化学及び定量化培養物は、4パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定した。そして、免疫蛍光染色及び共焦点顕微鏡の工程へと進んだ。本研究の為に用いた抗体は以下の通りである:Tbr1Abcam,Tbr2Millipore,CTIP2Abcam,Prominin/CD133Abcam,リン酸化ヒストンH3Abcam,Pax6Chemicon,Oct4Abcam,Ki67BD,DoublecortinSantaCruz,β-TubulinIIIChemicon,β-TubulinIIICovance,vGlut1Synapticsystems,Cux1SantaCruz,Brn2SantaCruz,Satb2Abcam,切断カスパーゼ3CellSignaling,Aβ42のC末端Chemicon。一次抗体に対する二次抗体の検出は種特異的なものとしたAlexa-dyeconjugates、Invitrogen。特異的な皮質神経マーカーを発現する細胞の数を定量するために、細胞培養物は、Accutaseを用いて単一の細胞に分離した。そして、100,000cells/mlの密度で再懸濁した。20,000の細胞をCytospinCentrifugeThermoScientificを用いて、各ポリ-リシンコートガラススライド上に、設置した。共焦点顕微鏡用に固定し、染色した。神経培養中にアミロイドの生体染色を行うために、DMSOに溶解したBTA-1Sigmaを、最終濃度100nMで20分間添加し、その後洗浄及びイメージングを行った。細胞カウントの統計的な比較は、Studentt検定を用いて行った。高解像度顕微鏡によるシナプスタンパク質のイメージングは、標準的な固定化及び染色技術を用いて行った。DeltavisionOMXシステムAppliedPrecisionを用いて視覚化した。細胞外Aβ42の定量化は、DS及びH9皮質ニューロンを65日間培養した物から得た10μlの細胞培養上澄み液をドットブロットすることによって行った。ブロッティングする前に、上澄みは、濾過して、細胞の残骸を除去した0.22μmフィルター。Aβ42は、Aβ42のC末端に特異的なポリクローナル抗体Chemiconを用いて検出した。ドットブロットは、ImageJNIHを用いて定量化した。Aβペプチド検出及び定量化分泌Aβ40及びAβ42の定量化は、DS、iPSコントロール及びH9hES皮質ニューロンの培養物から得た50μlの細胞培養上澄みに対するサンドイッチELISAInvitrogen法によって行った。水可溶性及び不溶性Aβペプチドを定量化する目的で、皮質培養の全細胞抽出物から水可用性及びギ酸可溶性蛋白質フラクションを調製し、ELISAInvitrogenで各ペプチドのレベルを測定した。γセクレターゼの阻害は、DS皮質培養中で、50日の分化開始から、48時間ごとにDAPTCalbiochemを添加することによって行った。量的RT-PCRトータルRNAは、ES及びDS-iPS培養の両方において、各時間ポイント日数で5、10、15、20及び25で、3例の培養物から単離したTrizol,Sigma。トータルRNAは、逆転写を行い、量的RT-PCRの為に使用した。該RT-PCTでは、Foxg1及びTbr2に特異的なプライマーを用い、且つAppliedBiosystems7000システムを用いた。電気生理学ホールセル電流クランプ記録を、人工的な脳脊髄液中、室温で行った。該液は以下の物を含有する単位mM:125NaCl,25NaHCO3,1.25NaH2PO4,3KCl,2CaCl2,1MgCl2,25グルコース,3ピルビン酸。そして、95O2及び5CO2でバブリングした。ホウ珪酸ガラス電極抵抗6-10MΩ内を、細胞内溶液を満たした。該液は、以下の物を含有する単位mM:135K-グルコン酸、7NaCl、10ヘペス、2Na2ATP、0.3Na2GTP,2MgCl2。赤外-DIC光学を備えたBW50WI顕微鏡オリンパスを用いて細胞を観察した。記録は、Multiclamp700AamplifierMolecularDevicesを用いて行った。信号は、4kHzでフィルターをかけ、16-bitの解像度で且つ20kHzでサンプリングを行い、MatlabMathWorksを用いて解析した。ヒト皮質ニューロンのスライス培養LeicaVT1000SVibratomeを用いて、胚マウスの脳16日目の胚のCoronalスライスを250μm厚さの切片として調製した。脳スライスを、CostarTranswellプレート中の透過性膜インサート上で培養した。前膜の下には、N2B273N培地を添加した。早期ステージ分化35日のヒトESC及びiPSC由来の皮質ニューロンは、単一の細胞に分離した。そして、実質的には前述のように23したマウス脳スライス上に、前記細胞をまいた。培養物は、14日間維持し、その後、固定処理と、Tbr1に対する抗体マウス及びヒトの両方を認識する、及びヒト特異的なNCAM抗体を用いた免疫染色のための処理を行った。結果本発明者らは複数の異なるアプローチを探索した。そして、該アプローチにより、所定の培地及び公知のシグナリング経路を用いて、hES細胞を、最初に、単層培養内で、大脳皮質の神経幹細胞及び前駆細胞に分化誘導させることができた。皮質幹細胞/前駆細胞については、転写因子Foxg1、Pax6、Otx1/2及びTbr2がこれらの細胞で発現すること、そして、腹側終脳ventraltelencephalon又は更に尾側morecaudallyで通常発現する遺伝子Nkx2.1、Dlx1及びHoxB4が発現しないことによって同定した。後述するが、ヒトES及びiPS細胞から分化した神経幹細胞/前駆細胞が神経的な出力を行うことに基づいて、皮質に誘導されたことを最終的に示すものとする。レチノイドは、マウス大脳皮質における神経幹細胞増殖から神経生成への遷移を制御し、マウスES細胞からグルタミン酸作動性ニューロンへの誘導を増大させる。レチノイドがないと、hES細胞からの神経誘導は、かなり効率が悪かった。本発明者らが見出したところでは、レチノイドシグナリングをTGFβシグナリング阻害と組み合せることにより、hESCから大脳皮質幹細胞及び前駆細胞への分化を誘導する神経誘導を促進した。このアプローチを用いたところ、神経誘導開始14日後では、培養中のほとんど全ての細胞>95は、Pax6を発現する神経幹細胞であった。該アプローチにより誘導された神経幹細胞培養物は、Foxg1のmRNAを非常に高いレベルで発現し、続いて、Tbr2のmRNAを発現する図1。本発明者らは、ヒト胚幹細胞からの皮質分化がレチノイドに依存することが、他の多能性幹細胞株ES及びiPSの両方に一般化できるかどうかを検証した。本発明者らは、本明細書に記載の方法を用い、レチノイドの存在下及び非存在下で、2つのヒトESC株及び4つのiPSC株を神経幹細胞に分化させた。前記2つのhESC株は、2つの異なる施設で誘導された物でありH9及びEdi2、前記4つiPSC株は、2つの異なるグループにより誘導された。Pax6発現によって評価したところ、レチノイド非存在下では、二重のSMAD阻害によるhES及びhiPS細胞からの皮質神経誘導は、不充分であった図3。Pax6発現細胞のパッチを観察した。該細胞の量は、各培養中約25であった図3。しかし、大半の細胞は、Pax6陰性であった。対照的に、レチノイドレチノール酢酸及びall-transレチノールを含有させると、著しく効率的に全ての株が皮質神経幹細胞/前駆細胞へと分化する結果となった。ここで、殆ど全ての細胞でPax6図3及びOtx1/2を発現していた。このことは、由来や誘導方法に関係なく全てのhES及びhiPSにあてはまった。皮質幹細胞及び前駆細胞に特有な転写因子の組合せPax6,Foxg1,Otx1/2及びVimentinの発現のほかに、本明細書で報告した皮質神経ロゼットvrosette細胞は、インビボで皮質神経上皮に特徴的な性質を示す。ヒトESC由来の神経幹細胞は、神経誘導後、ロゼット構造を形成するRovelet-Lecrux,A.,etal.NatGenet38,24-262006;Quon,D.,etal.Nature352,239-2411991。皮質ロゼットは、明らかに頂底極性であり、CD133/prominin、トランスフェリン受容体、及びaPKCを、各細胞の頂極部apicalluminalextremeに局在化させた図8j。更に、インビボで発生するが、各ロゼッタの頂/管腔表面に有糸分裂が数多く存在している。最後に、インビボで発生するが、これらは、セントロメアASPM及びCEP135蛋白質の局在化で視覚化を各細胞の極頂端extremeapicalendに局在化させ、典型的には各ロゼッタの管腔の中心まで伸長している図8j。このことは、培養物内に、頂部apical及び底部basalの両方の皮質幹細胞及び前駆細胞が存在することと合致している。神経上皮ロゼットの管腔から移動した分裂細胞の大半は、Pax6を発現する。神経上皮であることを示す特性として、内部キネシン核移動IKNMの工程が挙げられる。該工程では、各幹細胞/前駆細胞の核の位置が細胞周期の間移動する:G1期の細胞の核は、頂部表面から出発して、基底表面の方向に向かって移動する。S期では、脳室/頂部表面から移動する。その後、G2期及び頂部表面での有糸分裂の間に核が、ある方向に移動する。頂部表面において、M期の核の大半が各ロゼッタの中心に局在化することにより、IKNMがロゼッタ内で起こっていることが示された。これを確認すべく、本発明者らは、皮質ロゼット内での細胞の動きの微速度イメージングを用いて、核の動き及び有糸分裂を観察した。ホスホ-ヒストンH3染色と合致して、大半の分裂は、頂部/管腔表面で起こった。そして、少数については、ロゼッタの末梢方向に向かって発生した。全ての頂部の分裂は、G2期まで進み、ここで、核は、脳室からはなれた領域から移動し、典型的には、幾つかの核径がロゼッタの管腔から移動した。該G2期においては、典型的には、頂部へ向かっての移動が、数時間にわたって起こった。ロゼットの分極を伴って、IKNMが存在すること、並びに、頂部及び底部の両方の分裂が存在することは、皮質ロゼットが、円状の上皮ディスクcircularepithelialdiscsを形成することにより、直線状のインビボ皮質神経上皮を模倣していることを示唆している。インビボでの大脳皮質の発達において、皮質幹細胞の主な集団は、極性をもった、擬似的な層を形成した神経上皮を形成する。一方で、前駆細胞の二次集団は、内側及び外側脳室下帯それぞれSVZ及びoSVZと呼ぶ内に見出されるHansen,D.Vetal.Nature464,554-5612010;FietzetalNatNeurosci13,690-92010。本明細書で報告した方法で生じた神経幹細胞は、幹細胞及び前駆細胞について、以下のように、少なくとも2つ、可能であれば3つの集団を含む:ロゼッタ内の細胞の大半は、Pax6/Otx/Ki67であり、放射プロセスを伴って頂部基底部の極性をもった細胞であり、及びIKNM及び頂部分裂を行う;第二の細胞集団は、脳室からはなれた領域及び基底部での分裂を行う;そして、第3の集団は、Tbr2/Ki67の集団である。Tbr2陽性である増殖性細胞の小集団の存在図8iは、外側脳室下帯OSVZ前駆細胞と一致する。約半分のTbr2発現細胞が、Ki67を発現しており、且つ細胞周期が回っている前駆細胞図4であるが、その一方で、残り半分の細胞は、新たに誕生した細胞であり、インビボで発達中のヒト皮質において、上述した二重コルチン陽性ニューロンであるHansenetal2010supra。Tbr2/Ki67の集団は、25日目の各ロゼッタ中の細胞において平均15を占める図5。そして、幹細胞/前駆細胞集団からの神経出力に実質的に貢献している。皮質神経生成は、培養培地からFGF2を除去することにより刺激されるが、hES及びhiPS細胞からの神経誘導の後、2ヶ月間にわたって発生する図6。このことは、マウスでの6日の皮質神経生成期間TakahasietalJNeurosci16,6183-961996と比べると、約70日間の期間にわたるヒトにおける皮質神経生成と合致するCavinessetalsupra。PSC由来の皮質幹細胞及び前駆細胞は、もっぱらグルタミン酸作動性投射ニューロンを発生させ、GABA作動性の介在ニューロンについては検出可能なレベルで発生させない。神経生成の初期の波は、深層、即ち、Tbr1を発現する層の投射ニューロンを含み、ロゼッタの皮質と同一であることを裏付ける。ロゼッタは、過程のなかで、比較的遅くアストロサイトを生成し始めた。アストロサイトは、約70日で出現する。GABA作動性介在ニューロンは、皮質誘導条件下では発生しないが、早期段階では、皮質ロゼットは、領域の同一性について柔軟性をもつ:ヘッジホッグシグナリングアゴニストであるプラポモルヒネpurapomorphineで処理すると、ロゼッタを腹側化させ、結果として、GAD67のGABA作動性介在ニューロンを発生させる。PSC由来皮質ニューロンの分化を更に評価するために、本発明者は、皮質スライス培養アッセイPolleuxetalSciSTKE2002,PL92002を用いて、これらの移動能力、最終的な分化する能力、及びマウス大脳皮質内に適応する能力を分析した。分離したPSC由来ニューロンは、発達途中のマウスの脳胚14.5日のCoronalスライス上にまき、14日間培養した。ヒトPSC由来皮質ニューロンは、マウス皮質内で数多く生存した。そして、神経突起を豊富に伸ばした。顕著な現象として、大半のヒトニューロンは、発達中のマウス皮質内で脳室表面に垂直に放射状に伸びていた。そして、サブセットは、辺縁帯にそって並んでいた。最後に、ヒトPSC由来ニューロンは、マウス皮質内で培養しているとき、該ニューロンの層のアイデンティティを維持していた。例えば、多くは、層6の転写因子Tbr1を発現していた。全てのほ乳類において皮質神経生成の鍵となる特徴は、皮質幹細胞及び前駆細胞の多能性であり、決まった時間順で異なる層の運命を有する興奮性グルタミン酸作動性ニューロンを生成させる能力であるMountcastleetalsupra。hES細胞からのヒト皮質形成は、インビボでの皮質の発達を再現する:各皮質層のヒト皮質投射ニューロンは、正確な時系列順で、且つ高い効率で、hES細胞から生成される。また、アストロサイトは、本発明の培養システム内で、後期段階で発生する。成人の皮質のグルタミン酸作動性投射ニューロンは、ステレオタイプな時系列順で生成される。最初は深層ニューロンが生成され、最後に上層ニューロンが生成される。げっ歯類では、皮質グルタミン酸作動性ニューロンに関して、層の運命及び投射タイプの違いは、異なる転写因子の組合せで発現することによって規定することができる図11a:Tbr1/CTIP2-低レベル又は存在しない層6/皮質視床投射ニューロン;CTIP2/Tbr1-層5/皮質下投射ニューロン;Cux1/Brn2層2-4ニューロン;及び、Satb2層2-4脳梁投射ニューロン。本発明者らは、ニューロン内でこれらの因子が発現することを利用して、70日間の間隔にわたり、PSCから皮質投射ニューロンのサブタイプへの分化FGF2を除くことにより開始の時間経過timecourseを検証した。深層である層6ニューロンTbr1が最初に出現し、その後CTIP2発現層5及び6ニューロンが出現する。更に上の層では、Brn2/Cux1脳梁投射層2-4ニューロンが続いて分化する。25-30日の間に開始し、その後65から80日の間にSatb2の発現が見られる図10-12。同一の時間順での投射ニューロン生成が、異なる4つのhiPSC株から観察された。上述した転写因子の組合せを用いて、培養70日後の、異なる皮質投射ニューロンタイプの割合を定量した。重要な点であるが、おおよそ等しい数の深層及び表層ニューロンが本発明のシステムにおいて存在した図10-12。これは、マウスES細胞からの上層ニューロンの生成が減少したという以前の報告や、ヒトESC由来の集合培養において上層ニューロンの製造が最小限となったという以前の報告とは対照的である。再度、hESCと、異なる4つのhiPSとから生成した異なる投射ニューロンのサブタイプの割合が著しく類似していた図10-12。インビボで起こるのと同様に、アストロサイトは、本発明の培養システムにおいて、後期段階で全ての皮質層のニューロンの後で発生した。従って、本明細書に記載のhES細胞由来のヒト皮質形成では、インビボでの皮質形成を再現する:各皮質層のヒト皮質投射ニューロンは、正確な時系列順で、且つ高い効率で、極性をもった神経上皮細胞から生成される。神経生成を促進する条件で培養した場合、hES由来の皮質幹細胞及び前駆細胞は、グルタミン酸作動性投射ニューロンを専ら生成し、介在ニューロンについては検出可能なレベルでは生成しない図13。機能性のシナプスは、微小興奮性後シナプス電位mEPSPの存在、及びシナプトフィシンの免疫蛍光が集中することによって示されるが、培養して約90日後、機能性のシナプスがhES由来皮質ニューロン培養中で検出可能となった図14。従って、インビトロで、数週間にわたって、これらのニューロンが自発的に活動電位を発火させ、成熟した発火特性を発達させる。本発明者らは、PSC由来皮質投射ニューロンが機能的なニューロンとして分化することを確認した図15A,B。個々の細胞トータルでn=54例のニューロンからのホールセルパッチクランプ記録によれば、電位依存性ナトリウム電流テトロドトキシンTTXによってブロックされたの存在と、電位依存性カリウム電流一時的な成分が4-アミノピリジン4-APによってブロックされたの存在を示した。従って、hESC及びhiPSCの両方に由来するPSC由来皮質ニューロンは、最終的には、適宜興奮性の細胞に分化する。皮質投射ニューロンは、新生児のげっ歯類の皮質内で数日から数週間にわたって最終的には分化をし、成熟した発火特性を発達させる。同様のプロセスが、げっ歯類皮質ニューロンの初代培養でも起こる。hESC由来及びhiPSC由来の皮質ニューロンは、インビトロで、時間と共に増加する電流注入に応答して、活動電位のバーストを発火させる能力を成熟させる図15C:若い方28日のニューロンでは典型的には単発の活動電位を発火させた、一方で、古い49日のニューロンでは、電流注入の後、最大5回の活動電位を発火させた。65日までに、多くのニューロンn=32において、電流注入のステップで刺激されたときに一連の活動電位の発火が活発になった。こうした成熟プロセスは、hES及びhiPSの両方に由来する皮質ニューロンにおいて観察された図15D,E。そして、こうしたプロセスは、インビボで発生する成熟プロセスと同様であった。シナプス発生は、神経ネットワーク形成において、重要なステップである。PSC由来皮質投射ニューロン間での物理的なシナプス形成は、超解像構造化照明顕微鏡を用いて、前シナプス及び後シナプスの蛋白質局在化を視覚化して、検出した。シナプスについては、直径が100nmであり、樹状突起MAP2染色で検出に見出され、前シナプス及び後シナプスの区画特有の蛋白質が並んでいる領域として定義した。シナプスを同定するために、2つの異なるペアの前シナプス及び後シナプスの蛋白質を使用した:PSD95興奮性グルタミン作動性の後シナプス後肥厚において豊富とシナプトフィシン主要なシナプス小胞蛋白質;及び、Homer1広範に発現するシナプス後肥厚の蛋白質と、シナプス前部蛋白質Munc13-1。hESC及びhiPSCの両方で発生したニューロンの樹状突起の表面上では、100nmサイズの範囲でPSD95が豊富に集まっていた。また、hESC及びhiPSCの両方に由来する皮質ニューロンを培養した際に、28日目で、並んでいるが重ならないで、約100nmで、シナプス前部シナプトフィシン、Munc13-1及び後シナプスPSD95,Homer1蛋白質が豊富に集まっていた。最後に、観察された物理的なシナプスが機能するかどうかを試験するために、本発明者らは、ホールセルパッチクランプ記録を使用して、45から100日の間の培養で、微小興奮性シナプス後電位mEPSPを検出したトータルで、n=48例のニューロン。全てのhESC株及びhiPSC株から生成した培養物において、mEPSCを5-10pAの振幅で頻繁に検出した図16。前記mEPSCは、AMPAレセプターブロッカーCNQXによってブロックされた図16。そして、AMPAレセプター介在シナプス電流に特徴的なキネティクスを示した急速な開始及び、遅くゆったりとした減衰図17。ヒトPSC由来皮質ニューロンは、培養中で、機能的なグルタミン酸作動性シナプスのネットワークを形成すると本発明者らは結論づけた。患者特有の皮質ニューロンを生成するため、及び神経病例えば、アルツハイマー病のモデリングのための本発明の方法の可能性について検証するため、本発明者らはこのアプローチを用いて、病気特有のヒトの人工多能性幹細胞iPSを皮質ニューロンへと分化させた。ダウン症候群/トリソミー21は、最もありふれた精神遅滞の遺伝的原因であり、約1/700-800出生で発生するWiseman,F.KetalHumMolGenet18,R75-832009。ダウン症候群である個体は、アルツハイマー病の発症率が非常に高く、該病気は、21番目の染色体上にあるアミロイド前駆体蛋白質APP遺伝子の存在が原因となっているSelkoe,D.J.BiolChem271,18295-182981996。ヒトにおいてAPP遺伝子が二重に複製されると、結果として常染色体優性の早期発生の認知症となる。APP遺伝子量が増加したマウスでは、アミロイドプラーク及びアルツハイマー型認知症に関する神経病理学的な特徴を発達させる。本発明者らは、ヒトの健康なコントロールiPS細胞と、ヒトのダウン症候群のiPS細胞DS1-iPS422とを皮質ニューロンに分化させるべく、本明細書に記載のプロセスを適用した図18~21。コントロールのhiPS及びダウン症候群のhiPSここでは、DS-iPSとよぶの細胞は、皮質幹細胞及び前駆細胞を高い効率で発生させ、再び、極性のある神経上皮ロゼットを発達させた図18。各層の皮質ニューロンは、正確な時系列順で分化し、そして、hESから分化するのと同一の時間スケールでDS-iPS細胞から分化した図19及び20。hES由来皮質ニューロンに関しては、これらのニューロンはグルタミン酸作動性であり、電気的活性がある図21。アルツハイマー病がインビボで進行する際に鍵となるステップは、大脳皮質のグルタミン作動性ニューロンによって、短い38-42アミノ酸であるAβペプチドが、APPから、生成される量が増えることであるMountcastle1998supra。このプロセスは、ダウン症候群の人々において10代及び20代で発生する可能性があるRovelet-Lecrux,A.,etal.NatGenet38,24-262006。本発明者らは、コントロール及びDSiPS細胞由来の皮質ニューロンによるAβ40及びAβ42ペプチドの分泌をモニターした図22。通常、ニューロンでは、Aβ42よりもAβ40の生成が著しい。しかし、Aβ42は、アルツハイマー病における主要な病理的Aβペプチドと考えられている。Aβ42が自己凝集をして、Aβ40も含むことができる可溶性及び不溶性オリゴマー、並びに不溶性線維及びプラークを形成する。Aβ40ペプチドの分泌は、コントロール及びDS皮質ニューロンの両方で、神経分化を開始して数日以内に、低レベルで最初に検出可能となる図22。しかし、DS皮質ニューロンは、その後10日間にわたって、Aβ40の生成を高レベルにまで指数関数的に増加させる。一方で、コントロールのニューロンでのAβ40の生成は、一貫して低いまま維持される図22。コントロール又はDS皮質ニューロンによる病理的Aβ42ペプチドの分泌は、神経分化のこうした早期段階では検出されなかった。一定時間にわたって、DS皮質ニューロンによるAβ40の生成が上昇したと仮定して、本発明者らは、チオフラビンTアナログであるBTA124で、細胞内及び細胞外のアミロイドの凝集物を生体染色することにより、DS-iPS由来の皮質ニューロンの培養中でのアミロイドプラークの発達について、アッセイを行った図23。皮質分化開始後3ヶ月にわたり、DS-iPS皮質ニューロンは、細胞内及び細胞外の両方で、BTA1ラベルしたアミロイドの凝集物を生成する。一方で、同一の期間にわたるhES由来皮質ニューロンの培養では、BTA1陽性のニューロン又は細胞外凝集物は、ほとんど観察されなかった。Aβ42ペプチドは、可溶性及び不溶性オリゴマーを形成し、アルツハイマー病の早期段階でシナプス機能を阻害する。Aβ42ペプチドは、DS-iPS皮質ニューロンによって非常に高レベルで生成され、細胞培養培地図24中に蓄積される。本発明者らは、活性化されたカスパーゼ-3染色でアッセイしたところ、検出可能な細胞内アミロイド凝集物を有する多くのDS-iPSニューロンが、プログラムされた細胞死を起こすことを見出した図25。免疫蛍光及び共焦点顕微鏡が示すところによれば、DS-iPS皮質ニューロンの内側及び外側の両方で、数多くのAβ42を含有する凝集物が存在した。そして、細胞外Aβ42陽性の凝集物は、神経突起周辺に存在することが多く図26及び27、DS皮質ニューロンからのAβ42の生成量が経時的に増加することが示された。一方で、hES由来の皮質ニューロンの培養では、Aβ42の生成レベルがかなり低く約10分の1、Aβ42含有凝集物が見出される頻度はかなり低かった図28。アルツハイマー病において、Aβ42の生成量増加とプラークの形成は、大脳皮質における神経細胞死と関係がある。分泌された可溶性の細胞内フラクションと、不溶性蛋白質フラクションとを、DS皮質ニューロン及びコントロールhES皮質ニューロンの古い方の培養70日から抽出し分析したところ、より古い方のDSニューロンは、48時間の期間で、Aβ40及びAβ42の両方を、著しい量で分泌することが確認された。その一方で、hES皮質ニューロンは、Aβ40については少量生成し、Aβ42については検出可能なレベルの生成はなかった図29。とりわけ、DS皮質ニューロンの培養において、Aβ42に対するAβ40の割合は、4.6:1であった。DS皮質ニューロンは、単純により多くのAβペプチドを生成しているのではなく、生成されるAβ40及びAβ42の相対量も変化させていることを反映しており、これらのことは、インビボの散発性アルツハイマー病でも起こる。高レベルのAβペプチド分泌は、DSニューロン特異的であった。そして、DS線維芽細胞によるAβペプチドの生成量は、殆ど検出不可能であった図29。インビボでは、Aβ42ペプチドは、可溶性及び不溶性オリゴマーを形成し、アルツハイマー病の早期段階でのシナプス機能を阻害するPalopetalNatNeurosci13812-8182010。分泌された可溶性Aβ40及びAβ42ペプチドがELISAで検出されたほか、可溶性Aβオリゴマーも、DS皮質ニューロンの細胞培養培地で存在した。分泌された可溶性Aβペプチドとは対照的に、可溶性細胞内Aβペプチドレベルは、DS及びコントロールhES由来皮質ニューロンの両方で、検出レベルを下回った図30。しかし、不溶性Aβ40及びAβ42は、両方ともDS皮質ニューロンの培養物の中で見出され、健全な皮質ニューロン培養物の中では見出されなかった図30。DS培養物中における不溶性Aβの大半は、Aβ42であって、Aβ40は、4分の1であった図30。これは、分泌されたAβで見られた割合と逆であった。最後に、本発明者らは、DS-iPS皮質ニューロンによるAβ40及びAβ42ペプチドの生成及び分泌がγセクレターゼ複合体の阻害によって減少させることができるかどうかを検証した。γセクレターゼは2つの非常に重要なプロテアーゼ複合体のうちの1つであり、APPを切断して、Aβペプチドを生成する。短期間4日、γセクレターゼを阻害したところ、Aβ40及びAβ42の生成がほぼ半分にまで減少した。一方で、長期間処理21日したところ、両方のAβペプチドの分泌は、検出可能なレベルを下回るまでに減少した図29。しかし、DS皮質ニューロン培養中において、γセクレターゼを阻害しても、不溶性Aβ42の量を有意に減少させなかった図30。これは、皮質ニューロン培養において、アミロイドを除去するためのクリアランス機構が欠如したことが原因である可能性が高い。結論として、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞を大脳皮質ニューロンに分化させることができる方法を開発し、該方法はインビボでの発達を再現するものである。本発明の方法は、複数の特有のステップから成る:ヒトPSCを分化誘導し皮質幹細胞及び前駆細胞の複合集団を形成するステップ;期間を延長して、皮質神経生成させるステップ;後期でアストロサイトを生成するステップ;神経末端を分化させて成熟した電気生理学的な特性を獲得するステップ;シナプスを生成しネットワークを形成するステップ。マウスESCの分化誘導についての以前の報告とは対照的に、本発明のシステムでは、皮質投射の多様性を再現しており、培養中数ヶ月の期間にわたって生成される、深層早期に誕生及び上層後期に誕生のニューロンの割合がほぼ等しくなっている。本発明の方法において、重要なステップは、ヒトPSCを皮質神経幹細胞/前駆細胞ロゼッタへ高効率で分化させること、及び本発明のシステムにおいて、頂部の前駆細胞と基底部の前駆細胞の両方を生成させることである。本発明者らは、ソニックヘッジホッグを阻害しても、皮質誘導を促進せず、本明細書で用いた神経誘導の条件の下で、ヒトPSCから効率よく皮質誘導を行うためには、レチノイドが必要であることを見出した。こうした発見は、マウス大脳皮質において、神経幹細胞の増殖から神経生成に遷移するのをレチノイドが制御していること、マウスES細胞からのグルタミン酸作動性のニューロンの誘導がレチノイドに依存することと合致している。初期のマウス皮質幹細胞/前駆細胞は、インビボと比べると上層/後発ニューロンの生成量がずっと少ないものの、インビトロで、クローン密度clonaldensity成長させると、投射ニューロンを生成する。FGF2はロゼッタ細胞を増殖させるために使用することができるが、この有糸分裂促進性であるFGF2を除去すると、本発明のシステムにおいて神経生成の開始を促す。各層の投射ニューロンの生成の時間的な順序は、本発明のシステムでは保存されている:深層、層6ニューロンが最初に出現し、一方で、層2/3では、最後にニューロンが生成される。その後、アストロサイトが出現する。マウスでは6日の間隔にわたって皮質神経生成が起こるが、これとは対照的に、ヒトの皮質神経生成は、インビボで約100日間皮質神経生成が続く。本発明者らは、本発明のシステムにおける、投射ニューロンの生成期間は、ヒトの胚で見られる期間と近似していることを見出した:深層、層6ニューロンは、神経生成の開始から数日以内に生成され、一方で、上層の、Satb2を発現する皮質下行性ニューロンは、約60日より後になって初めて出現し始める。PSCの分化誘導による全てのクラスの皮質投射ニューロンを生成する能力は、皮質ロゼット内に、頂部及び基底部両方の前駆細胞種が存在することが原因となっている可能性が高い。本発明者らは、皮質誘導後に、少なくとも2つの、そして、可能であれば3つの固有の集団を観察した。ロゼッタ内の細胞の大半は、Pax6/Otx/Ki67であり、放射プロセスを持ち、頂部-基底部の極性を持った細胞であり、IKNM及び頂部の有糸分裂を行う;幹細胞/前駆細胞の第二の集団は、基底部での有糸分裂を行う;そして、Tbr2/Ki67集団である。これらの集団は、発達中のヒト皮質において、3つの集団の幹細胞/前駆細胞に近似している:VZ神経上皮細胞、SVZ細胞、及びoSVZ細胞。本発明のシステムで生成された幹細胞/前駆細胞の集団は、インビボでのヒト皮質で見出される投射ニューロン種の多様性を確実に生み出す能力があり、本発明のシステムによってヒト皮質前駆細胞種の複雑さをとらえられることを示唆している。皮質誘導から興奮性シナプス及びネットワーク形成への皮質発達をモデル化する能力があれば、ヒト皮質の発達について将来的に機能的研究を行うことを可能にするであろう。そして、特有の皮質細胞種例えば、皮質脊髄運動ニューロンを生成するために利用することができる。該アプローチは、ヒトESC及びiPSCからの効率面で等しいため、病気のモデリング、そして、潜在的には治療を目的として患者特有の皮質ニューロンを生成することができる。本発明者らは、ダウン症候群のiPS細胞由来の皮質ニューロンにおいて、早期に開始されるアルツハイマー病の進行を検証することにより、大脳皮質の病気及び成人発症性の神経病のモデリングのための本発明のシステムの潜在的な可能性を示した。インビボでは、典型的には数十年の期間起こるのと比べると、本発明のシステムでは、数ヶ月の期間にわたって、Aβ42の生成とアミロイドプラークの形成が起こる。本明細書に記載の早期に開始するアルツハイマー病の病理をモデル化するためにDS-iPS由来のニューロンを使用すると、皮質シナプス機能及び神経変性においての、APP及び該APPのペプチド産物の通常の機能及び病理学上の機能を分析するための、潜在的に強力なインビトロシステムが提供される。"