invitroで、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別する、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定する方法であって、a前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;b独立した方法で、前記生物学的サンプルを、天然型HBHAおよびESAT6と、IFNγの分泌が可能となる条件下で接触させること;cHBHAに特異的なIFNγ分泌およびESAT6に特異的なIFNγ分泌を測定すること;ならびに、dHBHAに特異的なIFNγ分泌とESAT6に特異的なIFNγ分泌との比率を計算すること、を含み、潜在性の結核を示す哺乳類またはMtuberculosisに感染していない哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、1より大きく、一方で、活動性の結核を示す哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、1未満である、方法。潜在性の結核を示す哺乳類またはMtuberculosisに感染していない哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、100から400の範囲である、請求項1に記載の方法。活動性の結核を示す哺乳類に由来するサンプルから得られた前記分泌の比率が、05未満である、請求項1に記載の方法。前記生物学的サンプルが、気管支吸引物、肺胞洗浄液BAL、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液ならびに他の身体の液体などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿または血液サンプル、ならびに膿吸引物からなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記工程bが、天然型HBHAおよびESAT6を、独立した方法でPBMCと接触させることを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。前記工程bの前に、生物学的サンプルを培養するという補足的な工程を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別する、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定するキットであって、天然型HBHAおよびESAT6;独立した方法で、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、天然型HBHAおよびESAT6との接触を行うための媒体を構成する試薬;ならびに、接触後のIFNγ分泌を検出するための試薬、を含むキット。invitroで、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別する、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定する方法であって、a前記哺乳類の局所的な感染部位から生物学的サンプルを得ること;b前記生物学的サンプルを、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと、求めるIFNγに対する効果が可能となる条件下で接触させること;およびc以下のc1の測定、c2の計算のいずれかを実施することによって、前記哺乳類の状態を求めること;c1天然型HBHAまたは組換え型HBHAと細胞との接触後における、分泌したIFNγの量の測定であって、当該測定において、1000pgmlより多いHBHAに特異的な分泌したIFNγの量が、活動性の結核を示す哺乳類の特徴を示し、一方で、1000pgml未満のHBHAに特異的な分泌したIFNγの量が、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類の特徴を示し、またはc2リンパ球群またはリンパ球亜群における、細胞をHBHAと接触させた後での細胞質内IFNγを含む細胞の割合の計算であって、当該計算において、03よりも大きい細胞質内IFNγを含む細胞の割合が、活動性の結核を示す哺乳類の特徴を示し、一方で、03未満の細胞質内IFNγを含む細胞の割合が、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類の特徴を示す、を含む、方法。活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFNγの前記量が、5000pgmlより多い、請求項8に記載の方法。Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから分泌した、HBHAに特異的なIFNγの前記量が、100pgml未満である、請求項8に記載の方法。活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の前記割合が、05よりも大きい、請求項8に記載の方法。前記工程bの前に、生物学的サンプルを培養するという補足的な工程を含む、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。前記生物学的サンプルが、気管支吸引物、肺胞洗浄液BAL、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿サンプル、ならびに膿吸引物からなる群から選択される、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が、CD3CD4Tリンパ球である、請求項8から13のいずれか一項に記載の方法。活動性の結核を示す哺乳類とMtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、天然型HBHAまたは組み換え型HBHA;前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、HBHAとの接触を行うのに適した媒体を構成する試薬;接触後のIFNγ分泌または細胞質内IFNγを定量する試薬、を含むキット。それゆえ、結核を迅速に診断するための新規の手段を開発することは、緊急事項であるように思われる。1つの可能性ある方法は、病気であるか無いかに依存する、非感染の対象と感染した個体とに存在するであろう免疫応答性の差異を探し出すことからなる。マイコバクテリア抗原による循環リンパ球のIFNγの誘導分泌の研究に基づく、異なる試験が、文献に報告されている8。しかしながら、ツベルクリンマイコバクテリア抗原の複合的な混合物によって誘導されるIFNγ分泌の分析は、皮膚試験の使用と同様の制限を有する。実際に、病気であろうと無かろうと全ての感作された個体が、そして、ある変種のマイコバクテリアに存在する抗原または単純にBCGで感作されたヒトが、反応してしまう。皮膚試験を超えるこの試験の利点は、リンパ球応答の分析により、陽性コントロールフィトヘマグルチニンと並行させて、重篤な免疫不全性が原因でPPDに応答しない患者でも検出することができることである。Mtuberculosisiに対する特異的な抗原を単離し、invitroでのIFNγ分泌試験に使用したところ、前記試験の特異性を明確にはるかに優れていた。原則的には、抗原ESAT6およびCFP10を使用することができるが、これらの抗原によって得られる、病気の感染対象または健康な感染対象間の区別については、未だ完成には程遠い。ヘパリン結合ヘマグルチニンHBHAに関するヒトでの免疫応答の研究が、病気の感染対象または健康な感染対象間の優れた区別をもたらすことを示す。HBHAは、付着を担い、Mycobacteriumcomplexの部分を形成する細菌の表面には発現しており、Msmegmatisなどの非病原性細菌の表面には発現していない10。このタンパク質は、Mtuberculosisによって分泌され、感染の蔓延の原因となっている11。HBHAは、メチル化C末端領域を有し、表面で発現し、非メチル化のN末端部分は、マイコバクテリア壁で接着部分を固定している12。メチル化は、ヒトでの免疫応答だけでなく、マウスでの防御免疫応答を誘導するのにも重要である13。invitroでのHBHA刺激による循環リンパ球におけるIFNγの誘導分泌は、Mtuberculosisで感染したヒトが病気であるか無いかに依存して、異なることが示されている14。IFNγは、HBHAに応答して、大部分の健康な患者で末梢リンパ球によって分泌されるが、少数の結核患者のみが、IFNγを分泌することによって抗原に応答する。しかしながら、これら予備的な結果に基づく、これらのグループ個体間の区別は、診断試験を実施するには不十分であった。本発明は、哺乳類におけるMycobacteriumtuberculosis感染のinvitro検出のための方法を提供することが目的である。本発明は、また、その症状を示すMycobacteriumtuberculosisに感染した哺乳類と、感染しているが結核について無症状である哺乳類とをinvitroで区別する方法、健康な集団の中から潜在性の結核患者をinvitroで同定する方法、および、活動性の結核を示す哺乳類と、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とをinvitroで区別する方法を提供することを目的とする。最後に、本発明は、また、Mycobacteriumtuberculosis感染を検出するために必要な全てのエレメントを含み、感染した無症状の患者潜在性の結核から、感染した症状を示す患者活動性の結核を区別することができるキット、および、活動性の結核を示す哺乳類と、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とを区別するキットを提供することを目的とする。本発明は、また、Mycobacteriumtuberculosisによる感染を検出するための、および、潜在性の結核を示す患者と結核の全ての症状を示し病気である患者とを区別するための、天然型または組換え型のHBHAの使用に関連する。本明細書の記載および好ましい実施だけでなく特許請求の範囲によっても明示されているように、これらの目的および他の目的は、本発明において具現化される。本発明は、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する方法であって、a前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;b前記生物学的サンプル中に含まれている、2つの異なる形態のHBHAタンパク質に対する抗体IgGの量を測定すること;およびc2つの形態のHBHAタンパク質について得られた抗体のタイターを比較することを含み、潜在性の結核を示す哺乳類における2つの異なる形態について得られた抗体タイターの比較が、活動性の結核を示す哺乳類において得られた抗体タイターとは異なる方法を開示する。本発明の範囲には、また、潜在性の結核を示す患者と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、a天然型HBHAおよび組換え型HBHA、またはbrHBHAΔC断片およびHBHAメチル化C末端断片からなる群から選択される2つの異なるHBHA、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに含まれる抗体と異なる形態のHBHAとの免疫反応を行うための媒体を構成するのに必要な試薬、ならびに、前記免疫反応の間に形成される免疫複合体の検出を可能とする試薬を含むキットも包含される。本発明は、また、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する方法、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定する方法であって、a前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;b独立した方法で、前記生物学的サンプルを、天然型HBHAおよびESAT6と接触させること;cHBHAに特異的なIFNγ分泌およびESAT6に特異的なIFNγ分泌を測定すること;ならびに、dHBHAに特異的なIFNγ分泌とESAT6に特異的なIFNγ分泌との比率を計算することを含み、潜在性の結核を示す哺乳類で得られた比率が、活動性の結核を示す哺乳類で得られた比率、またはMtuberculosisに感染していない哺乳類で得られた比率よりも高い方法に関する。本発明は、また、活動性の結核を示す哺乳類から潜在性の結核を示す患者を検出し区別するキット、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定するキットであって、天然型HBHAおよびESAT6、独立した方法で、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、天然型HBHAおよびESAT6との接触を行うための媒体を構成するのに必要な試薬、ならびに、接触後のIFNγ分泌を検出するための試薬を含むキットに関連する。本発明は、また、活動性の結核を示す哺乳類と、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する方法であって、a前記哺乳類の局所的な感染部位から生物学的サンプルを得ること;b前記サンプルを、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと接触させること;ならびに、cHBHAに特異的なIFNγに対する前記接触の効果を測定することを含み、HBHAに特異的なIFNγの効果が、活動性の結核を示す哺乳類では、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類よりも高い方法に関連する。本発明は、また、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類から、活動性の結核を示す哺乳類を検出し区別するキットであって、天然型HBHAまたは組み換え型HBHA、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、HBHAとの接触を行うのに適した媒体を構成するのに必要な試薬、および、接触後のIFNγの検出を可能とする試薬を含むキットを明示する。本発明の文脈においては、用語哺乳類は、子供に乳を与え、生きた子供を生む、体毛または毛皮に覆われた任意の温血動物を指す。用語哺乳類には、これらに限定されないが、ヒト、ゾウ、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、シカ、サル等が含まれる。Mycobacteriumtuberculosisは、原則的には、ヒト宿主に感染するが、他の哺乳類もまた、この細菌性疾患によって影響を受けうる。この場合、ヒト以外の哺乳類における結核の感染は、逆転動物原性感染症inversezoonosisとして知られている。なぜならば、Mycobacteriumtuberculosisは、ヒトから動物へと伝染するからである。略語HBHAは、ヘパリン結合ヘマグルチニンアドヘシンを意味し、上皮細胞への付着に関与する表面タンパク質であるGenbankaccessionnumbersAF07390andAAC260521。天然型のHBHAタンパク質の同定については、Menzozzietalによって記載されているJExpMed1849931001。HBHAは、199のアミノ酸からなるタンパク質であり、そのC末端部分は豊富なリジン反復を有し、ヘパリン結合部位を含む。このタンパク質は、Mycobacteriumtuberculosisの肺外播種に必要であるPetheetalNatur412190194。組み換えHBHArHBHAは、仏国特許出願FRA0114953に開示されており、この特許出願においては、野生型HBHAタンパク質nHBHAとは対照的に、組み換えHBHAタンパク質は、C末端部分のリジン残基がメチル化されていない。rHBHAΔC断片は、Petheetal1427314280に開示されている。この断片は、アミノ酸161199が欠失した組み換えHBHAに由来する。メチル化されたC末端断片には、以下の配列:KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK配列番号1を有するアミノ酸161199が含まれる。前記で引用した全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の文脈においては、略語PBMCは、末梢血単核細胞peripheralbloodmononuclearcellsを意味する。本明細書に開示されるPBMCは、文献に開示された任意の方法で得ることができる。本発明の1つの実施形態においては、PBMCは、約91のsodiumdiatriazoate溶液と約57の多糖類溶液とを使用して、静脈血サンプルから密度勾配遠心分離によって得られる。この溶液は、約1077±0001gmlの密度を有し、280±15mOsmの重量オスモル濃度を有する。この溶液は、商標名Lymphoprepを有する。用語潜在性の結核または潜在性のMycobavteriumtuberculosisは、本明細書では相互変換可能に使用され、哺乳類がMycobacteriumtuberculosis群の細菌に感染したが、無症状である、すなわち結核の症状を発症しないことを意味する。更に、感染した哺乳類は、他の哺乳類に伝播しない。なぜならば、如何なる結核の病原菌も痰の中に存在しないからである。言い換えれば、哺乳類は感染するが、病気を発症していない。結核の様々な形態が以下のように分類されている:TB0:結核因子に曝露していない;感染なし:TB1:Mycobacteriumtuberculosisに曝露、感染の程度は不明:TB2:結核因子に感染、症状は発症していないツベルクリン皮膚試験では陽性反応:陽性PPD:TB3:活動性の結核、完全な診断:TB4:臨床的には不活動性の結核、適切に治療または寛解期:TB5:結核の可能性あり、診断中結核を除外。本発明の文脈における表現健康な集団は、感染状態が何であれすなわち、感染せずTB0または感染しているが健康である潜在性の結核;TB2結核症状を発症していない個人を指す。本発明の文脈に記載された方法およびキットは、前記で分類したTB2型からTB3型を、TB0型からTB2型を、そしてTB0型からTB3型を区別することができる。略語PPDは、ツベルクリンタンパク質精製誘導体tuberculinproteinpurifiedderivativeを意味する。結核は、通常、PPDへの皮内曝露を含む試験によって診断される。この試験は、PPDに曝露した部位での皮膚反応が特定の大きさ例えば10mm以上を超えた場合に、結核に対して陽性であると判断される。本明細書において定義される用語生物学的サンプルには、呼吸器官サンプルおよび非呼吸器官サンプルが含まれる。呼吸器官サンプルには、気管支吸引物、肺胞洗浄液BAL、胃洗浄液および痰が含まれる。本発明の方法において使用することができる非呼吸器官サンプルの例には、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液ならびに他の身体の液体などの滲出液、リンパ節、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿または血液サンプルPBMCすなわち末梢血単核細胞、膿吸引物等が含まれる。用語感染部位からには、結核感染部位から取り出した任意の生物学的サンプルが含まれ、前記した任意の生物学的サンプルおよび他のものが含まれる。本発明の方法は、一方で、感染した哺乳類において、前記した病原因子による感染の兆候である、MycobacteriumtuberculosisのHBHAタンパク質に対する免疫応答をinvitroで検出することができ、そして、他方で、場合によっては従来の診断方法を補って、活動性の結核と潜在性の結核とを言い換えれば、感染形態と非感染形態とをinvitroで区別することができる。本発明は、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する方法であって、前記方法が、a前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;b2つの異なる形態のHBHAタンパク質に対する抗体IgGであって、前記生物学的サンプル中に含まれている抗体の量を、抗体HBHA相互作用の形成に適した条件下で測定すること;およびc2つの形態のHBHAタンパク質について得られた抗体のタイターを比較すること、を含み、潜在性の結核を示す哺乳類における2つの異なる形態について得られた抗体タイターの比較が、活動性の結核を示す哺乳類において得られた抗体タイターとは異なる方法に関する。哺乳類に由来する生物学的サンプルから開始し、異なる型活動性対潜在性の結核に特異的であるMycobacteriumtuberculosisのHBHAタンパク質に対する免疫応答の特徴を使用することによって、本方法は、発症した感染哺乳類と発症していない感染哺乳類とを区別することができる。それ故、潜在性の結核を示す哺乳類と、活動性の結核を示す哺乳類とは、HBHAタンパク質について異なる免疫応答、特に液性免疫を有する。潜在性の結核を示す哺乳類や活動性の結核を示す哺乳類に由来するイムノグロブリンGIgGのような抗体は、HBHAタンパク質の異なる部分を認識する。それ故、HBHAタンパク質の構造を調節して、異なる形態のHBHAを得て、異なる型の結核を区別することが可能となる。用語異なる形態のHBHAは、そのアミノ酸残基数欠失もしくは付加、およびまたは、そのアミノ酸残基の特徴異なるもしくは同じ大きさの、電荷の、立体障害のアミノ酸の置換に関する、ならびにまたは、アセチル化、アミド化、ビオチン化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化もしくは硫酸化などの翻訳後修飾、または、脂質の付加イソプレニル化、パルミトイル化およびミリストイル化、糖の付加グリコシル化またはポリペプチドの付加ユビキチン化による翻訳後修飾に関する、HBHAタンパク質の構造への任意の改変を意味する。本発明の文脈においては、2つの形態のHBHAが、潜在性の結核を示す哺乳類に由来する抗体と活動性の結核を示す哺乳類に由来する抗体とによって、異なる方法で認識される場合、その2つの形態は、異なると称される。タイター測定、すなわちそれぞれの形態のHBHAを認識する抗体の量の測定血清学的アッセイは、生物学的サンプルに含まれる抗体を異なる形態のHBHAと接触させる、直接もしくは間接ELISAenzymelinkedimmunosolventassayなどの当業者に知られた任意の手法を使用して、またはラジオイムノアッセイRIAによって、独立した方法で実施される。独立した方法では、サンプルの一部を、1つの形態のHBHAタンパク質と接触させ、サンプルの他の部分を、第2の形態のHBHAタンパク質と接触させることを意味する。相互作用および前記相互作用の検出を可能とする、サンプルに存在する抗体とそれら形態のHBHAとの接触は、当業者に知られた適切な条件下で実施される。それ故、例として、以下の方法を改変することができる:支持体へ抗原HBHAをカップリングする方法、生物学的サンプルの希釈、異なる形態のHBHAの濃度、温度および接触時間、そして必要であれば二次抗体の特性および濃度だけでなく、相互作用の検出を可能とするパラメーター例えば、バックグラウンドノイズの低減、標識の選択放射能、蛍光、または検出シグナル収集時間。ELISA方法の例としては、異なる形態のHBHAを、適切なバッファーコーティングバッファーで、1から10μgmlの範囲の濃度に希釈し、50から200μlをマイクロプレートのウェル内で、室温RTで1から6時間、または4°Cで一晩インキュベートする。一般に使用されるバッファー溶液は、50mM炭酸ナトリウムpH69;20mMTrisHClpH85または10mMPBSpH7274である。その後、プレートを、終濃度001から005のTritonまたはTween20などの界面活性剤とともに01MPBSまたはTBSpH74を含む200から300μlの洗浄溶液で洗浄する。その後、脱脂乳粉末、カゼインまたはゼラチンを含むPBSなどの200から300μlの飽和溶液を、非特異的相互作用をブロックするために、37°Cまたは室温で30から60分間添加し、その後、残った液を何回かの洗浄で除去する。110から11000倍に希釈した生物学的サンプル100から200μlを、37°Cもしくは室温で30分から2時間、または4°Cで一晩インキュベートし、その後、何回か洗浄する。その後、飽和溶液で希釈した約100μlの二次抗体を、室温または37°Cで30分から2時間添加する。残った液を何回かの洗浄で除去する。必要であれば、100μlの基質を、暗黒下で、室温で1から5分間加え、その後、停止溶液を加えた。タイター結果によって、同じ哺乳類で比較すべき2つの異なる形態について得られた2つの値が求められる。潜在性の結核を示す1つまたは複数の哺乳類、および、活動性の結核を示す1つまたは複数の哺乳類において同時に実施するような比較により、感染哺乳類に生じる特異的な免疫応答が原因で、非常に異なった結果が得られる。天然型HBHAタンパク質nHBHAは、C末端部分でリジン残基がメチル化されていることは、仏国特許出願FRA0114953において、以前から示されていた。対照的に、組換え型HBHAタンパク質rHBHAは、このような翻訳後修飾を受けないので、異なるメチル化の程度を有する。それ故、天然型および組換え型の使用により、活動性の結核を有する哺乳類に由来する生物学的サンプルは、天然型および組換え型に対する抗体を同等な量で含むことが示され、それ故、これらの哺乳類においては、タンパク質の同じ部分N末端が認識されることが示された。対照的に、潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルは、天然型に対する抗体のタイターが、組換え型に対する抗体のタイターよりも高いことが示され、このことにより、これらの哺乳類においては、メチル化された天然型が優先的に認識されることが示された。それ故、これらの結果により、潜在性の結核と活動性の結核が、野生型HBHAに対する抗体のタイターと組換え型HBHAに対する抗体のタイターとを比較することによって、区別することが可能となった。本発明の文脈において使用される2つの異なる形態のHBHAとは、タンパク質のN末端部分アミノ酸1から160であるrHBHAΔC断片、およびメチル化C末端である。生物学的サンプルに由来する抗体タイターの比較により、潜在性の結核を示す哺乳類においては、メチル化C末端断片を認識する抗体が多数を占めることが観察された一方、活動性の結核を示す哺乳類においては、rHBHAΔC断片を認識する抗体が多数を占めることが観察された。抗体のタイター測定を含むこのような方法は、IgGを含む任意の生物学的サンプルで実施することができる。本発明の更なる態様においては、前記方法は血液サンプルで実施する。本発明は、また、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、前記した2つの異なる形態のHBHA1つは、天然型HBHAと組換え型HBHA、他方は、rHBHAΔC断片とHBHAのメチル化C末端断片;前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに含まれる抗体と異なる形態のHBHAとの免疫反応を行うための媒体を構成するのに必要な試薬本試薬には、抗体と異なる形態のHBHAとの相互作用に必要な全ての化合物だけでなく、前記相互作用を増加または改善することができる任意の化合物または前記相互作用をより特異的にする任意の化合物が含まれる;前記免疫反応の間に形成される免疫複合体の検出を可能とする試薬本試薬には、前記した抗体と異なる形態のHBHAとの反応を示すことができる、または検出することができる任意の化合物が含まれる。本試薬には、場合によっては放射線で標識された、または蛍光色素とカップリングした二次抗体だけでなく、検出シグナルを増強できる、または調節することができる任意の分子が含まれる、を含むキットを提供する。キットには、場合によっては、陰性コントロールTB0段階の非感染の哺乳類に由来するサンプルとして、または陽性コントロールTB2およびもしくはTB3段階として使用することができる1つまたは複数のリファレンス組織または生物学的サンプルが含まれる。HBHAに特異的なIFNγ分泌に基づく一般的な方法は、現在のところ、図12のROC曲線に示されるように、健康なコントロール群における潜在性の結核患者を同定するには十分であるだけでなく、潜在的な結核患者と活動性の結核患者とを区別するのにも十分なようである。しかしながら、これらの方法は、ESAT6に特異的なIFNγ分泌を考慮に入れることによって、大いに改良することができた。それ故、本発明は、HBHA特異的およびESAT6特異的IFNγ分泌の両方に基づく、これら一般的な方法の代替的な方法を開示する。本発明は、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する第2の方法、または健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類をinvitroで同定する第2の方法であって、前記方法が、a前記哺乳類から生物学的サンプルを得ること;b独立した方法で、前記生物学的サンプルを、IFNγの分泌をもたらす条件下で、天然型HBHAおよびESAT6と接触させること;cHBHAに特異的なIFNγ分泌およびESAT6に特異的なIFNγ分泌を測定すること;ならびにdHBHAに特異的なIFNγ分泌とESAT6に特異的なIFNγ分泌との比率を計算すること、を含み、潜在性の結核を示す哺乳類で得られた比率が、活動性の結核を示す哺乳類で得られた比率、またはMtuberculosisに感染していない哺乳類で得られた比率よりも高い方法に関する。工程aにおいては、生物学的サンプルは、健康な集団、すなわち結核の症状を示していない個体から、またはMtuberculosisに感染した集団のいずれかから得る。健康な集団を用いた方法の目的は、結核の症状を有さない個体の中から、Mtuberculosisに感染しているが症状を示さない個体潜在性の結核を同定することである。対照的に、感染した患者の集団を用いた方法の目的は、活動性の結核を示す患者と潜在性の結核を示す患者とを区別することである。本方法は、生物学的サンプルを、天然型のHBHAと接触させること、および、独立してESAT6と接触させることを含む。表現独立した方法では、サンプルを、HBHAと接触させ、そして、空間的に別々にESAT6と接触させることを意味する。これら2つの分子を生物学的サンプルに添加することによって、前記サンプルに存在する細胞が刺激を受け、IFNγなどのサイトカインの分泌を引き起こす。サンプルとHBHAおよびEAST6との接触は、IFNγの分泌がもたらされる条件下で実施する。ここで、培地、接触のための培地のpHおよび温度、接触時間、生物学的サンプルの希釈、HBHAタンパク質の濃度の選択は、サンプルの特徴の機能として、当業者によって変更することができる。IFNγは、サンプルとHBHAとの接触後にHBHAに特異的なIFNγと称する、および、サンプルとESAT6との接触後にESAT6に特異的なIFNγと称する、ELISA、ELISPOT、フローサイトメトリーFACS、定量RTPCRなどの当業者に知られた任意の手法を使用して測定する。抗体、その標識および相互作用条件などのIFNγ分泌を可能とするパラメーターに関して、当業者は改変を行なうことができる。ELISA条件は、前記したものと同じであり、異なる形態のHBHAタンパク質の代わりに抗IFNγ抗体を含むバッファー溶液を使用する。IFNγに対する二次抗体も使用する。HBHAに特異的なIFNγとESAT6に特異的なIFNγとの比率を計算することによって、潜在性の結核を、活動性の結核と区別することが可能となる。ここで、潜在性の哺乳類においては、1を超える、50を超える、100を超える、200を超える、または300を超える非常に高い比率が得られる。それゆえ、100から400の範囲の比率は、潜在性の結核であることを示す。対照的に、活動性の哺乳類、またはMtuberculosisに感染していない哺乳類においては、この比率は非常に低く、1未満、075未満、または05未満である。それ故、比率0または05未満の比率は、Mtuberculosisに感染した患者群例えば、陽性のツベルクリン試験を示すから活動性の結核の患者を確認するか、結核の症状が生じない健康な集団からMtuberculosisに感染していない患者を確認する。この第2の方法は、一般的に結核の診断に使用されている任意の生物学的サンプル気管支吸引物、肺胞洗浄液BAL、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液ならびに他の身体の液体などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿または血液サンプル、膿吸引物等で実施される。本発明の1つの実施においては、本方法は、血液サンプリングに由来する当業者によって知られた任意の方法によって抽出されたリンパ球を使用して実施される。更なる実施においては、PBMCを、末梢血から抽出する。更なる実施においては、生物学的サンプルを得てから前記サンプルを接触させる前に、前記方法は、生物学的サンプルを培養するという補足的な工程を含む。培養は、生物学的サンプルの特性に適合させる。本発明は、また、潜在性の結核を示す哺乳類と活動性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキット、または、健康な集団の中から潜在性の結核を示す哺乳類を同定するキットであって、天然型HBHAおよびESAT6;独立した方法で、前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞と、天然型HBHAおよびESAT6との接触を行うための媒体を構成するのに必要な試薬本試薬には、前記キットのための試薬が含まれる;接触後のIFNγ分泌を検出するための試薬分泌したIFNγは、任意の既知の方法を使用して測定され、そして、場合によっては標識されているIFNγに特異的な一次抗体、または一次抗体を認識することができる場合によっては標識されている二次抗体だけでなく、検出シグナルを増強できる、もしくは調節することができる任意の分子を、キットに含むことができる、を含むキットに関する。キットには、場合によっては、陰性コントロールTB0段階の非感染の哺乳類に由来するサンプルとして、または陽性コントロールTB2およびもしくはTB3段階として使用することができる1つまたは複数の生物学的なリファレンス組織またはサンプルが含まれる。更なる実施においては、キットは、天然型HBHAまたはESAT6と接触させる前にサンプルを培養するのに使用する培養用培地および任意の化合物を含む。本発明は、また、活動性の結核を示す哺乳類と、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とをinvitroで検出し区別する第3の方法であって、a前記哺乳類の局所的な感染部位から生物学的サンプルを得ること;b前記サンプルを、IFNγへの効果を得るのに適した条件下で、天然型HBHAまたは組換え型HBHAと接触させること;cHBHAに特異的なIFNγに対する前記接触の効果を測定すること、を含み、HBHAに特異的なIFNγの効果が、活動性の結核を示す哺乳類では、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類よりも高い方法に関する。本発明の文脈においては、表現局所的な感染部位は、病原菌Mycobacteriumtuberculosisがもたらし、感染の原因となる任意の部位を含む。それ故、この定義には、肺、リンパ節、胸膜胸膜腔関節、骨、尿生殖管、髄膜、腹膜、消化管、中枢神経系、副腎または心膜が含まれる。本方法においては、PBMCを含む血液起源の全てのサンプルは除外される。本方法は、生物学的サンプルを、天然型または組換え型HBHAと接触させ、前記サンプルの細胞の刺激を引き起こすことを含む。この第3の方法で使用する表現組換え型のHBHAは、Ecoli種BL21から精製したHBHAなどの完全に非メチル化型のHBHAを意味する。その後、前記刺激のIFNγに対する効果を測定する。用語IFNγに対する効果は、IFNγ分解、成熟グリコシル化などまたは分泌に関して、転写レベルmRNAまたは翻訳レベルタンパク質の両方における、IFNγ発現に及ぼす任意の修飾を意味する。局所的な感染部位に由来するサンプルを、IFNγに対する効果を得るのに適した条件下で、HBHAと接触させる。この適した条件は、培地、pHおよび接触のための培地の温度の選択、接触時間、生物学的サンプルの希釈、ならびにHBHAタンパク質の濃度などであり、当業者によって改変することができる。本発明の1つの実施においては、分泌したIFNγの量を、ELISA、ELISPOT、フローサイトメトリーFACSまたは定量RTPCRなどの化合物の量を測定するための任意の既知の方法を使用して測定する。活動性の結核を示す哺乳類の生物学的サンプルからのHBHAに特異的なIFNγ分泌の量は、1000、2000pgml、5000pgmlまたは10000pgmlを超える。それ故、5000から45000pgmlの範囲または10000から45000pgmlの範囲の量は、活動性の結核であることを示す。対照的に、生物学的サンプルからのHBHAに特異的なIFNγ分泌の量が、0または100、400もしくは1000pgml以下であることは、Mtuberculosisに感染していない、または潜在性の結核であることを示す。更なる実施においては、IFNγに関する陽性の細胞の割合は、HBHAを用いた16時間の刺激の後でのIFNγを発現している細胞のパーセンテージと、刺激無しでの自発的分泌IFNγを産生している細胞のパーセンテージとの差異によって定量する。この計算は、リンパ球、CD4細胞、または任意の他のリンパ球亜群などの、定量プロトコールの標的となる生物学的サンプルの細胞について実施する。標識は、細胞内標識化合物のための任意の既知の方法によって実施され、サポニン001から01、トリトン01、ジギトニンなどの透過処理剤、およびまたは、2のパラホルムアルデヒドなどの細胞固定化剤、または場合によっては放射線標識された、もしくは蛍光色素とカップリングした抗体を使用することができる。HBHAとサンプルを接触させた後、BrefeldinA10μgmlをサンプルに3から5時間37°Cまたは室温で加え、サンプルに含まれる細胞の任意の分泌をブロックする。その後、細胞を、前記したような固定化剤を用いて、15から30分間4°Cで固定化し、その後、前記したような固定化処理剤を用いて、15から30分間室温暗黒下で透過処理を行なう。一次抗体および二次抗体を透過処理溶液で希釈し10mgml、15から30分間4°Cでインキュベーションするために加える。細胞が感受性である固定化剤を用いる前に、または固定化に耐性である細胞のための透過処理を行なった後のいずれかで、CD4またはCD8などの表面抗原を標識する。その後、標識された細胞を、フローサイトメトリーによって分析する。それ故、活動性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の割合は、03を超え、05を超え、075を超え、または1を超える。5、10および15までの数字を得ることができる。対照的に、Mtuberculosisに感染してない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類に由来する生物学的サンプルから得られた細胞の割合は、0または02から03未満である。この方法により、哺乳類における活動性の結核を求めることができる。対照的に、前記した値のような低分泌のIFNγまたは少量の細胞質内のIFNγは、活動性の結核が存在しないことを示し、そして、Mycobacteriumtuberculosisに感染していないか、もしくは潜在性の結核であると解釈することができる。場合によっては、生物学的サンプルを得る工程と、サンプルと接触させる工程との間に、前記生物学的サンプルを培養することからなる工程を加える。1つの実施においては、生物学的サンプルは、気管支吸引物、肺胞洗浄液BAL、胃洗浄液、痰、胸膜液、腹腔液および関節液、脳脊髄液、頭部液体、髄液、腹水、心膜液などの滲出液、リンパ節生検、経気管支生検、胸膜生検および肝臓生検、延髄穿刺および腰椎穿刺、尿サンプル、ならびに膿吸引物からなる群から選択される。本発明の更なる実施においては、前記方法で使用した細胞は、CD3CD4Tリンパ球などのTリンパ球である。本発明は、また、活動性の結核を示す哺乳類と、Mtuberculosisに感染していない哺乳類または潜在性の結核を示す哺乳類とを検出し区別するキットであって、天然型HBHAまたは組み換え型HBHA;前記哺乳類に由来する生物学的サンプルに存在する細胞を、天然型または組換え型HBHAと接触させるのに適した媒体を構成するための試薬本試薬には、前記キットにおける試薬が含まれる;接触後のIFNγの検出を可能とする試薬分泌したIFNγまたは細胞質内IFNγは、任意の既知の方法を使用して測定され、そして、標識されていてもよいIFNγに特異的な一次抗体、一次抗体を認識することができる標識されていてもよい二次抗体、検出シグナルを増強できる、または調節することができる任意の分子を、キットに提供することができる、を含むキットに関する。キットには、場合によっては、コントロール非感染の哺乳類に由来するサンプルTB0段階、TB2段階に由来するサンプルおよびまたはTB3段階に由来するサンプルとして使用することができる1つまたは複数のリファレンス組織または生物学的サンプルが含まれる。1つの実施においては、キットは、HBHAと接触させる前にサンプルを培養するのに使用する培養用培地および任意の化合物を含む。以下の実施例は、本発明を例示するのに使用され、本発明の範囲を限定するものではない。実施例1:血液サンプルの由来血液サンプルを、同意を得てから、結核患者および潜在性の結核患者から入手した。結核患者は、直接的な試験での陽性およびまたはMycobacteriummtuberculosisの培養での陽性に基づいて選択した。全ての患者を、治療の最初の3週間の終了前に入院させた。潜在性の結核を有する患者は、ツベルクリンに対する遅延型過敏性試験の陽性診断時での18mmを超える硬結直径に基づいて選択した。活動性の結核は、通常の胸部レントゲン写真に基づいて除外した。全ての患者は、HIVについて血清反応陰性であり、いずれの患者も免疫抑制治療を受けていなかった。全ての患者は、募集時にヨーロッパに在住していた。実施例2:他のサンプル肺胞洗浄液BALを、約200mlの生理水を注入後に、内視鏡によって取り出した。その後、取り出した液を遠心した約10ml。胸膜液、関節液、腹水、頭部液体および他の体液を滅菌したシリンジに回収し、研究室に到着するとすぐに遠心した。神経節または他の疑わしい塊のために、外科的手術を実施した。研究所へ到着してから、回収した解剖断片を分割し、組織から細胞の連続的な放出を可能とする培養用培地でインキュベートした。実施例3:抗原他の文献14に記載されているように、天然型のHBHAnHBHAを、MbovisBCGから、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーに続き、高圧液体クロマトグラフィーHPLCによって精製した。HPLCクロマトグラム、およびSDSPAGE分析後のCoomassieBlueを用いた染色により、調製物はタンパク質の混入が無かったことが証明された。ガスクロマトグラフィーを使用して、糖脂質が混入していないことを確認した。リムルス試験によって、リポ多糖の濃度が10pgml未満であることが示された。メチル化されていない組換え型rHBHAを、Ecoli種BL21から精製した。天然型タンパク質と比較した、組換え型タンパク質のメチル化の程度を、仏国特許出願FRA0114953に開示する。C末端部分を切断した組換え型rHBHAΔCを、Ecoli種BL21から精製した。この切断型rHBHAΔCは、Petheetal1427314280、参照によって本明細書に組み込むに開示されており、アミノ酸161199が欠失した組み換えHBHAに由来する。予めメチル化されたアミノ酸と組み合わせて合成された、単離されたC末端ペプチドは、HBHAタンパク質のアミノ酸161から199に対応し、以下の配列:KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK配列番号1を有する12、13。Petheetal1427314280およびTemmerman935941を、参照により本明細書に組み込む。実施例4:HBHAに特異的なIgGの検出ELISAを、抗nHBHAIgG、抗rHBHAIgG、抗rHBHAΔCIgGおよび抗CペプチドIgGを検出するために使用した。詳細には、PBSで希釈した15μglの抗原溶液nHBHA、rHBHA、rHBHAΔCまたはCペプチドを50μlウェルで用いて、96穴ポリスチレンプレートMaxisorpNuncを一晩4°Cでインキュベートした。プレートを、PBSTween20005を用いて三回洗浄し、PBSに溶かした1のカゼイン溶液を用いて、1時間37°Cで飽和させた。洗浄後、PBSTween20溶液005で希釈した患者由来の血清150から112800に希釈を、各ウェルに30分間室温で添加し、攪拌した。PBSTween20005で250倍に希釈した、ビオチンで標識したヤギ抗ヒトIgG抗体を、二次抗体として使用しbiotinylatedgoatantihumanIgGSouthernBiotechnologiesAssociatesBirminghamUSA204008、二次抗体の検出を、1100005カゼインで希釈したペルオキシダーゼ溶液extravidinperoxidaseconjugatedE2886Sigmaを50μlウェルで添加して確認した。50μlの基質溶液01Mクエン酸ナトリウムpH5に溶かした01mgmlの33’55’テトラメチルベンジジンおよび1μlmlの30過酸化水素を、洗浄後に、暗黒下で10から30分間添加した。反応を、25μlウェルの塩酸2mMollによって停止した。抗体タイターを、陰性の血清プールに対して陽性であると判断した最終的な血清希釈率で示す。実施例5:nHBHAESAT6に応答するPBMCによるガンマインターフェロンの分泌ELISAPBMCを、末梢血サンプルの密度勾配遠心分離によって入手したlymphoprepNycomedPharma。前記PBMCを、培養培地40μgmlのゲンタマイシン、50μM2メルカプトエタノール、1×非必須アミノ酸LifeTechnologiesおよび10のウシ胎児血清FCSを添加した完全RPMI:RPMI1640を用いて2×106細胞mlで再懸濁した。細胞を、2μgmlのnHBHAと、並行して5μgmlのearlysecretedantigentarget6StatensSerumInstitutDenmarkとを用いて、96時間、5のCO2の雰囲気下37°Cで刺激した。幾つかの実験においては、ブロッキング抗体:抗TGFβ123を、5μgmlの濃度で添加し、結果を、コントロール抗体mouseIgG1RDSystemの存在下で得られた結果と比較した。上清を、培養4日後に回収し、ELISAIFNγCytosetBiosourceを使用して、分泌したIFNγを測定した。実施例6:局所的なガンマインターフェロン応答<実施例6a:生物学的液体および解剖学的パーツ>分析した生物学的液体は、胸膜液、関節液および腹水であった。分析した解剖学的パーツは、神経節または様々な疑わしい塊から切除した生検であった。生物学的液体からの有核成分の単離を、最初のろ過cellularsieveNylon100μmFalcon登録商標352360に続き、15分間の2300rpmの遠心によって行なった。必要であるならば、細胞残渣に存在する赤血球を溶解した。その後、細胞を、完全RPMI溶液で再懸濁した。解剖学的サンプルに由来する有核成分を、そのパーツの切除、および、完全RPMI溶液内で、37°C、5CO2雰囲気下で一晩インキュベーションすることによって単離した。上清を回収し、そのパーツをリンスし、まだ入手可能な任意の細胞を回収した。その後、これらの回収した液体を、2300rpmで15分間遠心した。必要であるならば、細胞残渣に存在する赤血球を溶解した。細胞残渣を、完全RPMI溶液で再懸濁した。<実施例6b:抗原性刺激>単離した細胞が十分である場合は胸膜液、それらを、PBMCと同じ方法でinvitroで刺激し、HBHAによる96時間のinvitro刺激後の培養上清における分泌したIFNγの濃度を測定した。PBMCに関しては、肺胞洗浄液、関節液または腹水、神経節等について、これらの細胞によるIFNγ合成の分析も、以下に記すHBHAによる短時間のinvitro刺激後に、フローサイトメトリーによって実施した。単離した細胞2×106mlを、10μgmlの濃度でHBHAによって、16から18時間invitroで刺激した。その後、細胞からのサイトカイン分泌を、BrefeldinAの存在下で4時間インキュベーションすることによってブロックし、細胞内でのIFNγの存在を、細胞を標識した後で、フローサイトメトリーによって分析した。細胞を固定後、細胞を透過処理しFixandPermCellPermeabilizationKitCaltagLaboratories、洗浄し、その後、暗黒下で30分間、蛍光色素とカップリングした抗体抗CD3PerCP、抗CD4APC、抗IFNγPE、全てはBectonDickinsonから入手の存在下でインキュベートした。その後、陽性細胞の割合を、FACSCaliburcytometerを用いて、最初に、大きさおよび粒度に基づいて標的リンパ球を分析し、その後で、表面マーカー発現の作用として、異なるリンパ球亜群を分析した。実施例7:統計学的分析対になっていないデータについて、MannWhitneynonparametricUtestまたはnonparametricKruskallWallistestを実施し、その後、Dunntestを使用して事後試験を実施した。対になったデータを、WilcoxontestまたはFriedmantestによって分析した。Receiveroperatingcharacteristic分析:曲線図12上のそれぞれの点は、各対の感度および特異度に対応し、表1、2または3で得られた値に従って計算したものである。完成した曲線特に、曲線の下の領域により、全体試験の概観が得られる。良好な曲線は、左上の角に近づくのに対して、好ましくない場合は、対角線点線が得られる。ROC曲線より下の全体領域が、診断試験の能力の指標である。なぜならば、この領域が、全ての可能なカットオフ値での試験の能力を反映しているからである。この領域は、区間051に該当し、より大きな領域が、試験のより良好な能力を意味する。試験の正確性は、曲線の下の領域に従って、以下のように分類分けされる:091:最良;0809:良;0708:通常;0607:悪い;0506:不可。以下の定義を使用する:感度:陽性診断の患者における、試験で陽性となった患者の確率:真陽性TP;特異度:陰性診断の患者における、試験で陰性となった患者の確率:真陰性TN;1特異度:陰性診断の患者における、試験で陽性となった患者の確率:擬陽性FP;1感度:陽性診断の患者における、試験で陰性となった患者の確率:偽陰性FN。ROC試験によって、感度および特異度が高い最適なカットオフ値を求めることができる。結果<1.液性応答>nHBHAに特異的なIgGは、良好な健康初期感染primoinfected対象または潜在性である場合であろうと、罹患し結核の症状を示す活動性場合であろうと、Mycobacteriumtuberculosisで感染した対象の約40に由来する血清から検出された。これら2つの対象群で観察された抗体タイターは差異がなかった図1。しかしながら、メチル化されていない組換え型HBHArHBHAに対する抗体のタイターと、メチル化された天然型HBHAnHBHAに対する抗体のタイターとの比較により、Mycobacteriumtuberculosisに感染した患者が症状を示す活動性、または症状を示さない潜在性かどうかに依存して、それらの抗体が異なるという仮定が導かれた。図2に見られるように、初期感染primoinfected対象においては、抗nHBHAIgGのタイターは、抗rHBHAIgGのタイターよりも顕著に高いのに対してp00015図2A、結核の患者においては、その差異は顕著ではなかった図2B。その後、我々は、一方で、N末端ドメインのみからなる切断した組換え型HBHArHBHAΔCに対するIgGを、他方で、メチル化されたC末端ペプチドに対するIgGをアッセイした。図3に示されるように、これらの結果から、結核患者に由来する血清に存在する抗HBHAIgGがrHBHAΔCを認識するのに対して図3A、初期感染primoinfected対象に由来する抗体がメチル化されたC末端を認識することが示された図3B。Mycobacteriumtuberculosisで感染した対象に由来する血清に存在する抗体のタイプに依存して、対象を2つの群、初期感染primoinfectedの群または症状を示す群に分けることができ、その分類分けは、IgGが、メチル化されていないHBHAのN末端部分に対するものか、メチル化されたC末端部分であるかに依存する。<2.循環リンパ球によるIFNγの分泌>a.我々は、以前に、PBMCによる天然型HBHAに応答するIFNγの分泌が、結核患者よりも初期感染primoinfected対象のほうが顕著に高いことを以前に示している。しかしながら、得られる区別は、診断目的のために使用するには十分ではなかった。試験を行った対象の数が増したので、初期感染primoinfected対象の中から、感染の予想される日が5年以内であるという選択が可能となった。図4の結果により、2つの群間の差異は僅かに存在するが、まだ不十分であることが示された。b.天然型HBHAによって誘導されるIFNγ分泌の潜在的な数値を、Mycobacteriumtuberculosisによる潜在性感染を診断するのに良好に評価するために、ROCreceiveroperatingcurvesを作成し、もたらされる問題のための最も良好な感度特異度の組み合わせを付与するIFNγの濃度最適カットオフを求めた。1健康な集団内の潜在性結核患者の診断潜在性結核患者と非感染の個体との区別潜在性結核IPを示すヒトは、症状を示さないが、コッホ桿菌の転移源となり、試験により、健康な集団におけるそのようなヒトを同定できなければならない。それ故、コントロール対象Mtuberculosisに感染していないn14、およびツベルクリンPPD陽性皮内反応の結果に基づく潜在性結核を示すヒトn46から、HBHAによって誘導され、PBMCによって分泌したIFNγの濃度に基づいて、ROC曲線を作成した。これを、参考用診断基準とする表1。このような実験においては、陽性および陰性のヒトは、以下のように定義される:TP陽性のツベルクリン皮内反応を有する患者における、陽性結果最適カットオフより高いを示す患者の確率;FP陰性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陰性結果最適カットオフより低いを示す患者の確率;FN陰性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陽性結果最適カットオフより高いを示す患者の確率;TN陽性のツベルクリン皮内反応を有する患者の中で、陰性結果最適カットオフより低いを示す患者の確率。図12Aに示すROC曲線は、曲線より下の領域が09595信頼区間:090100;P00001であるので、優れている。110pgml最適カットオフを超えるIFNγの濃度に関して、潜在性結核の診断のための試験の感度は、100の特異度CI95:7684100で、8913CI95:76439638であった。このROC試験のコントロールが、結核のためのワクチンBCGを受けていないヒトであったことは注目に値する。BCGワクチンがもたらす妨害の可能性は、以前に試験され、2002年に報告されているMasungietalJInfDis200218551320。これらの予備的な試験によって、15人のBCGワクチン接種を受けたヒト血液サンプリングの10年以上前にBCGワクチンを受けたに由来する循環リンパ球は、HBHAに応答するIFNγを分泌しないにも関わらず、PPDに応答することが示された。しかしながら、研究は、健康な大人の集団における結核の区別に関するものであり、大部分の国ではワクチンを子供時代に受けるので、10年以上前にワクチンを受けたヒトを試験することは適切であると思われる。これらのヒトから、5人が陽性のツベルクリン皮内反応を示し、3人が疑わしい結果を示した。更にその上、これらの健康なBCGワクチンを受けたヒトの10人に由来する循環リンパ球が、PPDに応答するIFNγを分泌した。結論として、BCGワクチン接種は、invitroでのHBHAによるIFNγ誘導に基づく、健康な集団の中から潜在性結核患者を区別するための可能な診断上の利益を妨害しないと思われる。2潜在性結核と活動性結核との間の診断上の差異患者が結核に対応する診断履歴を有し、ツベルクリン皮内反応が陽性である場合、潜在性結核も有する患者に生じる可能性がある他の疾患から、結核を区別することは重要である。それゆえ、試験は、Mtuberculosisに感染した患者の集団の中から、潜在性結核の患者を同定しなければならない。それゆえ、一方はツベルクリン皮内反応の結果に基づいて定義された潜在性結核を示す患者重要な診断参考であるn46に由来し、他方は非治療の活動性結核を示す患者n50に由来する、HBHAによって誘導され、PBMCによって分泌したIFNγの濃度に基づいて、ROC曲線を作成した表2。このような実験においては、陽性および陰性のヒトは、以下のように定義される:TP結核の症状を示す患者の中で、陽性結果最適カットオフより高いを示す患者の確率;FP結核の症状を示さない患者の中で、陰性結果最適カットオフより低いを示す患者の確率;FN結核の症状を示さない患者の中で、陽性結果最適カットオフより高いを示す患者の確率;TN結核の症状を示す患者の中で、陰性結果最適カットオフより低いを示す患者の確率。得られたROC曲線図12Bは、曲線より下の領域が0855IC95:07770932であるので、良好である。480pgml最適カットオフのIFNγの臨界濃度に関して、潜在性結核の診断のための試験の感度は、82の特異度CI95:68569142で、7609CI95:61238741であった。このROC曲線の結果は、PBMCにおけるPPDにより誘導されるIFNγの濃度を考慮すれば、実質的には、よりものたりないものであることに注目すべきである。31人の潜在性結核および41人の活動性結核から得られた結果表3に基づいて計算した曲線図12Cは、曲線より下の領域が073のみであったCI95062084。前記結果から、HBHAにより誘導されるIFNγの分泌により、Mtuberculosisに感染していない個体および活動性結核の患者から、潜在性結核の患者を区別することが可能となることが明らかとなった。この区別は、ツベルクリン皮内試験、またはPPDもしくはESAT6により誘導されるIFNγの分泌のいずれかに基づく他の一般的な試験では不可能であった。この区別は、主として、患者のより良好な臨床的選択をもたらすであろう。c.文献では、結核患者は、初期感染primoinfected対象に対して、ESAT6に応答するIFNγを分泌することが報告されているが、図5に示すように、その差は十分ではない。d.我々は、nHBHAによる特異的IFNγ分泌とESAT6による特異的IFNγ分泌との間の比率の計算により、症状が現れていない初期感染primoinfected対象と結核患者とを区別するための優れた手法をもたらすことができることを求めたp00003;n8図6。実際に、その比率は、活動性結核の患者については約01pgmlであるのに対して、潜在性結核の患者については約1462pgmlであり、重複した値は示さなかった。Mtuberculosisに感染していない患者は、ESAT6に応答するIFNγを分泌しない、または非常に低い濃度でした分泌しないのでデータは示さない、これらの結果は、また、健康な集団からの潜在性結核の患者の同定にも適用される。抗TGFβブロッキング抗体を添加することによって、多くの場合において、HBHAによるリンパ球刺激に応答する末梢IFNγ分泌がもたらされないことは、明確に、症状を示す患者におけるMycobarteriumtuberculosisによる感染が原因であり、感染していないことが原因ではないことを求めることができる。図7に示すように、抗TGFβの存在により、結核患者に由来するPBMCからのIFNγ分泌は、顕著に増加したp001。これは、初期感染primoinfected患者では見られなかった。3.nHBHAに応答するIFNγの局所的分泌結核の患者において、nHBHAに応答するPBMCによるIFNγの分泌が生じないこととは対照的に、胸膜液、関節液、肺胞液および腹腔液などの局所感染部位に由来する細胞の刺激により、nHBHAまたはrHBHAによる刺激に応答する主要なIFNγ応答を観察することできた。これは、Mycobacteriumtuberculosisに感染していないが、結核に対応する臨床的兆候およびX線の兆候を示すコントロール対象とは対照的である。局所的サンプルの量により、十分量のリンパ球の単離が可能となる場合は、これらの細胞を天然型HBHAによって刺激し、培養上清のIFNγの量をELISAによって測定した。図8の結果により、HBHAによる刺激後の胸膜細胞により分泌したIFNγの濃度は、コントロールである初期感染primoinfected対象または他の対象に由来する細胞によって分泌するIFNγの濃度よりも非常に高くなることが示された。PPDなどの他の抗原を、invitroで胸膜細胞を刺激するのに使用する場合に、結核患者とコントロールとの差異は、非常にとぼしいものであった図8。結核を原因とする胸膜滲出の患者の胸膜細胞によるHBHA誘導IFNγの合成は、フローサイトメトリーを使用したリンパ球を分析することによっても求めることができる。この手法により、細胞内IFNγを含み、そのIFNγの合成がHBHAによるinvitro刺激によって誘導されたものであるリンパ球の割合を測定することが可能である。この手法は、非常に迅速であり、HBHA刺激期間が一晩で済むという利点を有し、それがゆえに、24時間で結果を得ることができる。図9および10の結果により、胸膜液に由来するCD4リンパ球の大部分が、HBHA刺激後にIFNγを含むのに対して、この結果は、結核を原因としない滲出に由来する胸膜細胞の場合すなわち、Mycobacteriumtuberculosisで感染していない個体は見られないことが示された図10。リンパ球の大きさおよび粒度に基づいて選択されるリンパ球ウィンドウlymphocytewindowへの分析を制限することによって、HBHA誘導IFNγの分泌の研究を単純化することができる。肺結核の場合胸膜への発病なし、診断は、肺胞洗浄液に由来するリンパ球を研究することによって実施することができる。実際に、HBHAでの簡単なinvitro刺激後一晩に、局所的CD4リンパ球局所的感染部位に由来するの大部分が、コントロール患者に由来するリンパ球とは対照的に、細胞内IFNγを含んでいた図11。結核患者と非結核患者との差異は、局所的CD8細胞よりもむしろ局所的CD4細胞を標的とした場合に、良好であり図11、この分析は、また、リンパ球ウィンドウに制限することもできる。関節結核では、滲出液滲出液の陽性KB培地から単離したリンパ球の大部分は、結核を原因としない滲出を生じるコントロール個体から取り出した局所的リンパ球とは対照的に、簡単なHBHAでのinvitro刺激後に、IFNγを合成した表4。最後に、結核を原因とする腹膜炎の場合、この液に存在するリンパ球の31が、簡単なHBHAでのinvitro刺激後に、細胞内IFNγを含む。結核を原因とするリンパ節肥大の場合、リンパ球の18が、HBHAに応答してIFNγを合成し、このことにより、24時間未満での、この疾患の結核由来の診断を再度可能にする表4。参考文献