"有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRを行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16SrDNA量又は16SrRNA量を測定することを含むモニタリング方法。前記真正細菌が、配列番号3に示される塩基配列を含む16SrDNAを有する、請求項1に記載のモニタリング方法。有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のモニタリング方法。前記食品廃棄物がシロップ廃液である、請求項3に記載のモニタリング方法。有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。これまで、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、メタン発酵の運転管理を行う手法は開発されていない。したがって、本発明の目的は、特定微生物の関与に基づいて、メタン発酵の失敗を客観的に予測し、安定的なメタン発酵を達成させるための運転管理の方法を提供することにある。上記実情に鑑み、本発明者らは、メタン発酵が失敗するときに、いわゆる悪玉菌ともいうべき、かかる失敗を誘発する特定の微生物を同定することに成功し、該微生物の増殖をメタン発酵中にモニタリングすることにより、メタン発酵の運転管理を首尾よく行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の通りである。[1]有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRを行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16SrDNA量又は16SrRNA量を測定することを含むモニタリング方法。[2]前記真正細菌が、配列番号3に示される塩基配列を含む16SrDNAを有する、上記[1]に記載のモニタリング方法。[3]有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記[1]又は[2]に記載のモニタリング方法。[4]前記食品廃棄物がシロップ廃液である、上記[3]に記載のモニタリング方法。[5]有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下の開始とともに増殖する真正細菌を検出又は定量するためのプライマーセットであって、ここで、該プライマーセットは、a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。本発明は、有機性廃棄物の有効利用を目的としたメタン発酵において、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を特定の微生物のDNA情報に基づいて客観的に予測することにより、メタン発酵の運転管理が可能となる。以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法であって、下記のプライマーセット:a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRを行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16SrDNA量又は16SrRNA量を測定することを含むモニタリング方法に関する。1メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子のクローニング本発明のモニタリング方法において標的とする真正細菌は、AnaerobicsyntrophicbacteriumNE23-3に近縁の真正細菌であって、固有の16SrRNA又は16SrDNAを有する。本発明者らは、メタン発酵中に有機物負荷を徐々に増大させていくと、ある量限界負荷量という。を超えた時点からメタン発酵効率の低下が見られ、この限界負荷量の前後からある種の真正細菌が増加することを見出し、メタン発酵中のこの真正細菌の16SrRNA又は16SrDNA本明細書において、その部分塩基配列をバンドB6と呼ぶ。量をリアルタイムPCRで測定することにより、メタン発酵効率のモニタリングに成功し、本発明を完成させた後述する実施例4参照、図6。なお、バンドB6の塩基配列を図1に示す配列番号3。バンドB6は、近縁のAnaerobicsyntrophicbacteriumNE23-3GenBankAccessionNo.AB231802の16SrRNA又は16SrDNAの部分塩基配列配列番号4の情報を利用することにより同定された実施例3参照。バンドB6を有する真正細菌、及び上記NE23-3株はいずれも未同定であり、基準株typestrainが存在しない。本発明のモニタリング方法においては、モニタリングの標的となる真正細菌の固有の16SrRNA又は16SrDNAの一部であるバンドB6の部分配列配列番号3のヌクレオチド118-255を検出の対象とする。本発明のモニタリング方法において使用されるバンドB6の同定は、例えば、以下のようにして行うことができる。簡単には、真正細菌から核酸を抽出後、PCRで増幅して、アガロースゲル電気泳動等の分子量により核酸断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。メタン発酵に関与する真正細菌は複数種含まれるため、最初に特定の真正細菌における固有の16SrRNA遺伝子を同定することが必要である。まず、グラニュール菌体に含まれる微生物群微生物叢の16SrRNAをPCR-DGGE法によって分離及び検出する。具体的には、メタン発酵中のリアクター内溶液をサンプリングし、グラニュール状メタン菌を遠心分離によって回収した後、溶菌し、メタン菌に含まれるタンパク質及び脂質をクロロホルムの添加によって抽出除去する。続いて、エタノールの添加により核酸のみを回収する。その後、真正細菌由来のDNAを検出するために汎用されている以下のプライマーセット以下、プライマーセットIと称する場合がある。:357fフォワード:5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’配列番号5配列番号4のヌクレオチド324-340に対応517rリバース:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’配列番号6配列番号4のヌクレオチド518-502に対応を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応PCR法により増幅する。上記プライマーセットIは、真正細菌を含む大部分の原核生物の16SrRNA遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、大腸菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマー357f及び517rは、それぞれヌクレオチド341-357及び517-534に対応する。なお、上記プライマー357fには、GCクランプ5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’配列番号7が付加されている。また、核酸を増幅するための方法としては、PCR法SaikiR.K.ら,Science,230,1350-13541985に限定されず、当業者であれば、ライゲース連鎖反応LCRWuD.Y.ら,Genomics,4,560-5691989、及び転写に基づく増幅KwohD.Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1173-11771989等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応SDAWalkerG.T.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-3961992;WalkerG.T.ら,Nuc.AcidsRes.,20,1691-16961992等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明のモニタリング方法では、メタン発酵効率をリアルタイムで測定する必要性からPCR法を利用することが好ましい。PCR反応条件は、例えば、2本鎖DNAの熱変性を90~98°Cで5秒~10分間行い、アニーリングを50~70°Cで10秒~2分間行い、伸長反応を60~75°Cで10秒~10分間行う。任意に、最終伸長反応を伸長反応と同じ温度で10秒~15分間行う。熱変性-アニーリング-伸長反応のサイクルを5~50回行う。次に、上記で核酸を増幅させたPCR増幅産物をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。電気泳動によるPCR増幅産物の分離は常法に従って容易に行うことができる。電気泳動で使用するゲルは、核酸を変性させるための変性剤を含み、核酸の分離に適した所定の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。また、電気泳動に使用される泳動溶液及び電圧等の泳動条件は適宜調整することができる。上記のPCR-DGGE法を使用することにより、各真正細菌に該当する核酸のバンドの濃淡から、可視的に真正細菌の経時的な増減をモニタリングすることができる。ここで、ゲル上のバンドの検出は、限定されないが、エチジウムブロマイド含有溶液を用いてゲルを染色することにより行う。さらに、本発明のモニタリング方法で対象とされる真正細菌は、限界負荷量の前後において出現する細菌であり、上記の電気泳動上の経時的なバンドの濃淡の変化において限界負荷量の前後に出現したバンド固有の16SrRNA遺伝子に対応するDNA断片を切り出し、塩基配列を解析することにより、メタン発酵効率の低下に関与する真正細菌の遺伝子をクローニングすることができる。ゲルから切り出されたDNA断片には、目的以外のDNA断片が混在している可能性があるため、所望のDNA断片を得るためにさらに分離及び精製することが好ましい。一般に、PCR産物をクローニングするため、ベクター例えば、pCR4、pMW、pBluescript、pBR322、pUC、pDEL系などのプラスミドベクター、M13mpなどのファージベクター、Charomid9系などのコスミドベクターに、PCR産物をライゲーションさせ、コンピテントセルに形質転換させる。ベクターにはさらにプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを適宜含めることができる。形質転換したコンピテントセルを培養してコロニーを形成させ、塩基配列の解読のためのサンプルとする。その後、所望のDNA断片の塩基配列を決定するが、塩基配列の解読は、従来法を用いればよく、例えば、Sanger法、サイクルシークエンス法による自動シークエンサーを利用することができる。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したDyeprimer法、ddNTPを蛍光標識したDyeterminator法、さらに基質のdNTPに標識したInternal-label法があるが、いずれの方法でもよい。本発明のバンドB6のクローニングにおいては、所望のDNA断片を得るために、PCRによるDNA合成の際に付加されるデオキシアデノシンdAを利用したTAクローニング法を用いることができる。TAクローニング法は、3’→5’エキソヌクレア-ゼ活性を有するDNAポリメラーゼを利用したクローニング法であり、まず、このDNAポリメラーゼを用いて得られたPCR産物の平滑末端をTaqDNAポリメラーゼ等のpolI型酵素によって処理することによって、3’末端にアデニン又はチミンを付加させる。一方、ベクターにdTTP又はtaqDNAポリメラーゼを反応させることによってTAベクターを作製する。次に、上記のように処理した核酸断片とベクターをライゲーションさせて宿主細胞に形質転換し、所望のDNAをクローニングする方法である。より具体的には、上記でゲルから切り出されたDNA断片をまず上記のプライマーセットIを使用し、PCRにより増幅する。次に、得られたPCR産物をTAクローニング用のプラスミドに組込み、このプラスミドを大腸菌に形質転換する。次に、PCR産物が組み込まれたプラスミドによって大腸菌に形質転換されたことを確認するために、アンピシリン等の抗生物質による選択を行う。その後、プラスミドDNAを抽出し、プライマーセットIを用いて所望のPCR産物を増幅させ、さらに、上記と同様にDGGEを行い、バンド位置を確認した後、バンドB6の部分塩基配列を決定することができる。本明細書においては、プライマーセットIを用いて決定されたバンドB6の部分塩基配列配列番号3のヌクレオチド18-178から、DDBJhttp://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.htmlを用いた相同性検索を行い、最も近縁な微生物として、AnaerobicsyntrophicbacteriumNE23-3GenBankAccessionNo.AB231802を特定した実施例3参照。上述の通り、NE23-3株は、未同定であり、基準株が存在しない。得られたバンドB6の部分塩基配列配列番号3のヌクレオチド18-178とNE23-3株の部分塩基配列の一部配列番号4のヌクレオチド341-501とを比較すると、両者は一致していた。なお、プライマーセットIは、引用文献Pedro,S.M.ら,J.Biosci.Bioeng.,92,159-1642001に記載され、特に変更せずに使用した。また、後述するように、バンドB6の塩基配列としてヌクレオチド1-255を決定した配列番号3、図1参照。2モニタリング方法本発明によれば、有機性廃棄物のメタン発酵系におけるメタン発酵効率をモニタリングする方法が提供され、より具体的には、下記のプライマーセット:a配列番号1に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;及びb配列番号2に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応PCRを行い、該メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16SrDNA量又は16SrRNA量を測定することを含むモニタリング方法である。本明細書で使用するとき、用語有機性廃棄物とは、一般に、生物学的分解によって環境中に直接還元することができる廃棄物を指し、限定されないが、生ごみなどの食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥などが挙げられる。食品廃棄物には、一般廃棄物事業系及び家庭系を問わない及び産業廃棄物が含まれる。具体的には、食品廃棄物の例は、限定されないが、生ごみ、シロップ廃液、おから、排乳、コーヒーかす、茶かすなどが挙げられる。本発明によれば、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌のバンドB616SrRNA量を測定するために使用されるバンドB6に特異的なプライマーセットを提供することができる。本発明においては、下記のプライマーセットII:GMP478Fフォワード:5’-CGGGTGCTAATATCATCTGCGC-3’配列番号1配列番号3のヌクレオチド118-139に対応GMP575Rリバース:5’-ATCAAACCGCCTACACGCGC-3’配列番号2配列番号3のヌクレオチド255-236に対応を設計し、メタン発酵効率のモニタリングに使用した。大腸菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列を基準にすると、プライマーGMP478F及びGMP575Rは、それぞれヌクレオチド457-478及び575-594に対応する。本発明のモニタリング方法では、上記プライマーセットII以外に、各プライマーに実質的に同一な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することができる。ここで、本明細書で使用するとき、語句実質的に同一な塩基配列とは、対応する上記プライマーの塩基配列と90以上、95以上、98以上、若しくは99以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは5個、より好ましくは4個、さらに好ましくは3個、さらにより好ましくは2個、最も好ましくは1個が欠失、付加及び/又は置換されている塩基配列をいう。プライマーの設計は以下の通りである。上述した通り、バンドB6は、プライマーセットIプライマー357Fと517Rに含まれる塩基配列の情報からAnaerobicsyntrophicbacteriumNE23-3AccessionNo.AB231802に最も近縁であることが判明した図3参照。そこで、NE23-3株の塩基配列情報配列番号4、図2に基づいて、BioEditv7.0.9GeneralInformationを用いて、NE23-3株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをFastPCRURL:http://www.primerdigital.com/fastpcr.htmlの推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは80~150塩基増幅効率を100にするため、プライマー長さは17~25塩基長過ぎるとアニーリング効率が低下するGC含量は40~6045~55が望ましいとし、偏りがないように、部分的にGC、ATリッチができないように注意する、T/C、A/Gが連続しないように注意する、プライマー内部での3塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での3塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー3’末端が2塩基相補する配列を避ける。プライマーの標的塩基配列への特異性を確認するため、所定のPCR反応条件下で定量的PCR法例えば、SYBRグリーンを利用したリアルタイムPCR法、蛍光プローブ法、競合PCR法を行い、増幅曲線分析及び融解曲線分析を行ってバンドB6に相当する微生物濃度を定量することができる。上記で設計したプライマーセットIIの使用により、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下に先駆けて増殖するか又は該低下と同時に増殖する真正細菌の16SrRNA又は16SrDNA一部にバンドB6遺伝子を含むを検出し、例えば、リアルタイムPCR法によってバンドB6を経時的に定量することができる。なお、バンドB6を有する真正細菌菌体は、バンドB6の塩基配列を含む約1500塩基の16S領域を有するが、現時点では完全に配列決定されていない。また、このバンドB6は、メタン発酵効率の低下と関連付けて見出されたが、バンドB6を有する真正細菌は、メタン発酵系においてメタン発酵効率の低下の開始前、開始と同時、又は開始後に増殖してメタン発酵系に出現する細菌である。本発明のモニタリング方法においては、メタン発酵効率の低下を予測することを目的としているため、メタン発酵効率の低下に先駆けて低下の開始前に増殖するか又は該低下と同時に増殖するバンドB6を有する真正細菌を検出されることが望ましい。ここで、本明細書で使用するとき、先駆けてとは、メタン発酵効率の低下開始の少なくとも2~3週間前、1週間前、数日前、1日前、12時間前、6時間前、3時間前、1時間前、又は30分前に、該真正細菌が増殖を開始するか又はバンドB6が検出される場合をいう。検出されるバンドB6は、遺伝子DNA若しくはmRNAの形態であるか又はタンパク質の形態であってもよい。本発明のモニタリング方法によれば、プライマーセットIIを用いたリアルタイムPCRを行った後、バンドB6に対応する菌体を含んでいるメタン発酵過程で採取したグラニュールサンプルを連続希釈し、この希釈率に応じた菌体数に対するバンドB6の検量線を作成することができる。これにより、目的とする真正細菌の試料中での有無、その数量を精度よく知ることができる。また、本明細書で使用するとき、メタン発酵効率の低下とは、有機性廃棄物の限界負荷量を超えて添加された場合に、メタン発酵系に有機性廃棄物を添加することによって発生していたメタンガスの量が減少している、又は有機性廃棄物を添加したとしてもメタンガスが発生しないことを意味する。限界定負荷量を超えたことによるメタン発酵効率の低下は、メタンガスの発生量が5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100減少した場合を指す。本発明のモニタリング方法を適用することにより、メタン発酵効率の低下に先駆けて又は低下と同時に増加するバンドB6量をリアルタイムで定量することにより、メタン発酵が失敗に至る状態の変化を予測することができるため、添加する有機性廃棄物の量を調節することによって、安定なメタン発酵が可能になる。また、本発明によれば、本発明のモニタリング方法を応用したバイオセンサーを提供することができる。より具体的には、前述のプライマーセットIIが電極に固定化されたバイオセンサーを用いることにより、リアクター内の発酵液中のバンドB6量を検出及び定量することにより、リアクターに供給する有機性廃棄物の量を調節することができる。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。実施例1:UASBメタン発酵メタン発酵にはUASB法を使用し、原料の有機性廃棄物としては、共同出願人である山梨缶詰株式会社の工場において缶詰製造過程で排出される平均2.2トン/日のシロップ廃液を用いた。使用したシロップ廃液は、主成分がスクロースであり、糖度が15.2ブリックス、全有機炭素TOC濃度が約71g/Lであった。メタン発酵には、外寸法φ2500×H5000mmのUASB発酵槽を用いた。発酵液容積は20m3であった。実験開始時にビール工場のUASB発酵槽で形成されたグラニュール汚泥を15m3充填した。また、実験開始から2日間は馴致期間とし、シロップ廃液を供給せずに温度を40°Cに維持した。実験開始から2日以降にシロップ廃液の供給を始めるが、シロップ廃液をそのままUASB発酵槽へ投入すると負荷が高すぎるため、調整槽において水で適宣希釈し、pHが7.5付近になるように苛性ソーダを用いて調整した。その後、温調槽で39°Cまで昇温した後にUASB発酵槽に導いた。水で希釈したシロップ廃液の濃度を段階的に変化させたが、およそ4~5ヶ月後にはシロップ廃液を等量の水で希釈し、TOC濃度が35.5g/Lとなるように負荷を増加させた図4参照。なお、145日目以降は再び負荷量を低下させた。また、運転開始49日以降にはメタン発酵を担う微生物の活性を高める目的で金属塩CoCl2、MgCl2、MnCl2、NiCl2をそれぞれ20gずつ供給するシロップ廃液の1ppm程度に相当を添加し、さらに、64日以降にはC/N比が15になるように調整槽にて尿素を添加した。ガス発生量は発酵槽上部に取り付けたガス出口の流量計山武、気体用マスフローメーター、CMS0500で計測し、pHは槽内のpHメータYOKOGAWA、pH100で計測した。なお、発生するガスは、1日1回、テドラーバッグに捕集し、その中に含まれるメタンガス濃度をガスクロマトグラフ分析装置ヤナコ、G-1011、カラムMS13XMS5Aを用いて測定した。メタン発酵の設定温度を40°Cとし、グラニュールを含む発酵液サンプルを発酵槽下部から1700mm、壁面から750mmのサンプリング口から所定の時間間隔で、約200mLを採取して、微生物叢の解析に用いた。実施例2:グラニュール粒子からのDNA抽出及びPCR増幅採取した発酵液サンプル中のグラニュールの約1gを滅菌したスパーテルですくい取り、30mLの滅菌水で洗浄してグラニュール表面に付着している微生物を除去した。その後、その0.3gを使用して、IsoilforBeadsBeatingkitNipponGeneCo.,Ltd.によりDNAを抽出した。次に、グラニュールから抽出したDNAには、真正細菌及び古細菌に由来するDNAが含まれるが、真正細菌に由来するDNAを増幅させるために、前述のプライマーセットIプライマー357fと517rを用いた。増幅条件を以下の表1に示す。使用したPCR増幅装置はPTC-100thermalcyclerTaKaRaShuzoCO.,Ltd.,Kyoto,Japanであった。また、PCR反応液の組成を表2に示す。実施例3:バンドB6の分離及び同定真正細菌からバンドB6を検出するためにDGGE変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法を用いた。DGGEにはTheDcodeUniversalMutationDetectionsystemBio-Rad、Hercules、Calif.を使用した。まず、グラニュールから抽出した真正細菌由来のDNAを増幅したPCR産物を変性剤の濃度勾配が30から60変性剤100では7Mの尿素と40[wt/vol]のホルムアミドを含むの厚さ0.8mmのポリアクリルアミドゲル10[wt/vol]アクリルアミドとビスアクリルアミドの割合は37.5:1を用いて、1.0×Tris-acetate-EDTATAE溶液中で60°C、200V、3.5時間の条件で電気泳動を行った。なお、電気泳動の後、200mLの1.0×TAE溶液と20μLのエチジウムブロマイド溶液を混合した溶液にゲルを浸し、30分間染色した後、紫外線下で可視化した。DGGE法で検出されたポリアクリルアミドゲル中のバンドからDNA断片を抽出回収した。抽出したDNA断片から所望のDNA断片を分離及び精製するために、TAクローニング法を用いた。まず、抽出されたDNA断片は、前述のプライマーセットIを用いて、上記と同一の増幅条件を用いて増幅させた。得られたPCR増幅産物は、TOPOTACloningKitInvitrogenCopration,USAを用いてプラスミドにライゲーション後、大腸菌に形質転換した。この形質転換した大腸菌を、アンピシリンを添加したLB寒天培地に塗沫し、カラーセレクションを行った。カラーセレクションによりPCR産物をライゲーションしたプラスミドを有することが確認された大腸菌については、まず、下記に示すプライマーセットIII:M13F5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’配列番号8M13R5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’配列番号9を用いてDNAを増幅し、その増幅産物について、さらにプライマーセットIを用いてPCRを行い、再度DGGEを行ってバンドの出現位置を確認した。なお、プライマーセットIIIを用いたPCR条件を以下の表3に示す。その後、確認された所望のDNA断片はWizard登録商標SVGelandPCRClean-UPsystemPromegaCopration,USAを用いて精製した。精製したPCR増幅物はBigDyeterminatorkitPerkinElmerJapan,AppliedBiosystemsDivisionを用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はABIPrism310GeneticAnalyzerAppliedBiosystemsで解析した。決定した塩基配列については、DDBJhttp://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.htmlに登録されている配列に対して相同性検索を行い最も近縁な微生物名を決定した。実施例4:リアルタイムPCR法を用いたDNA濃度の定量一般に嫌気性菌は増殖が遅く、生成するコロニーも小さいので寒天平板上でのコロニーアピアランスによる識別が困難であることから、メタン発酵のような複数の微生物が共存する複合微生物の系で特定の微生物の濃度を選択的に定量するためには、その微生物に特徴的な遺伝子の配列を検出するリアルタイムPCR法を有効に使用することができる。そこで、バンドB6を特異的に検出するプライマーセットを設計し、これを用いてメタン発酵槽のグラニュール中の真正細菌に含まれるバンドB6を定量した。ここで使用するリアルタイムPCR法は、PCRによるDNAの増幅量をリアルタイムでモニタリングし、測定される蛍光強度の閾値と増幅曲線が交わるサイクル数Ct値ThresholdCycleと、初期鋳型量、すなわち初期微生物濃度の間に直線関係があることを利用して、微生物濃度を定量する方法である。1プライマーの設計バンドB6は、前述のプライマー357Fと517Rに含まれる塩基配列の情報からAnaerobicsyntrophicbacteriumNE23-3AccessionNo.AB231802に最も近縁であることが判明した。NE23-3株の塩基配列情報図2をもとにBioEditv7.0.9GeneralInformationを用いて、NE23-3株とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列の中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをFastPCRURL:http://www.primerdigital.com/fastpcr.htmlの推奨結果を参考に設計した。なお、プライマーの設計時は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは80~150塩基増幅効率を100にするため、プライマー長さは17~25塩基長過ぎるとアニーリング効率が低下するGC含量は40~6045~55が望ましいとし、偏りがないように、部分的にGC、ATリッチができないように注意する、T/C、A/Gが連続しないように注意する、プライマー内部での3塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での3塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー3’末端が2塩基相補する配列を避ける。設計したプライマープライマーセットIIの塩基配列は前述の通りである。2設計したプライマーの特異性の検討設計したプライマーセットIIが目的菌に選択的であることをBioEditv7.0.9GeneralInformationを用いて、プライマーの塩基配列と目的菌以外の微生物群の塩基配列とを比較することで確認するとともに、実際のメタン発酵グラニュールサンプルに設計したプライマープライマーセットIIを作用させて、増幅される複数のDNA断片の塩基配列がすべて同一であることを確かめたデータ示さず。増幅されるDNA断片の塩基配列が同一であれば、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出する可能性は極めて小さくなる。まず、メタン発酵グラニュールサンプルにプライマーセットIIを加えてPCRによりDNA断片を増幅させた。なお、PCR条件を以下の表4に示す。次に、増幅したDNA断片をTAクローニング法により大腸菌に形質転換した。続いてPCR産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌にプライマーセットIII前述を加えて、PCR増幅し、精製した。その後、BigDyeterminatorkitPerkinElmerJapan,AppliedBiosystemsDivisionを用いてシーケンス反応を行った。塩基配列はABIPrism310GeneticAnalyzerAppliedBiosystemsで解析した。目的としたPCR産物がライゲーションされたプラスミドを持つことが確認された大腸菌コロニーが12個得られた。これらのすべてについてPCR産物の塩基配列を解析したところ、塩基配列は完全に同一であり、設計したプライマーが類似の塩基配列を有する複数種類の微生物を検出している確率は極めて小さいことが判明した。また、このプライマーセットIIで増幅したDNA領域は、バンドB6の同定に用いたDNA領域と同じ遺伝子上に存在することを確かめた。3設計したプライマーを用いた検量線の作成メタン発酵グラニュールサンプルを適宜希釈して、設計したプライマーの定量性を確認した。メタン発酵グラニュールサンプルは発酵開始125日目のものを用いた。リアルタイムPCR装置はSmartCyclerIIタカラバイオ株式会社を用い、PCR反応液は、プライマーセットIIとSYBRPremixExTaqタカラバイオ株式会社を用いて、下記の表5のように調製した。増幅条件は最初に95°C、10秒の変性をおこなった後、95°C、5秒変性、60°C、20秒アニーリング/伸長を40サイクルとした表6参照。作製した検量線を図5に示す。検量線のR2値は0.976であり、定量に用いるのに十分な精度であった。4リアルタイムPCR法によるバンドB6に対応する微生物の定量メタン発酵グラニュールサンプルからのDNA抽出物にリアルタイムPCR法を適用してバンドB6に対応する菌体濃度を測定した。用いたプライマーセットとPCR条件は、検量線を作成したときと同様とした。なお、菌体濃度はメタン発酵125日後の菌体濃度が最大になるときを1とした相対濃度で示した図6参照。"