"一般式3で表される活性化剤を用いて一般式2で表されるヌクレオシドと縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことにより一般式4又は5で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体を製造する方法に用いるための一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3-ホスホロアミダイト。[一般式1中の記号の意味は下記のとおり。R1は炭素数1~3の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数6~14のアリール基を示す。R2は水素原子、炭素数1~3の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数6~14のアリール基を示す。R3は炭素数1~3の直鎖又は分岐アルキル基を示す。R4は水酸基の保護基を示す。Bsは式:で表されるチミン、アデニン、シトシン、若しくはグアニン、又はアミノ基が保護されたアデニン、シトシン、若しくはグアニンを示す。][一般式2中、R5は水酸基の保護基、Bsは一般式1と同じ意味を示す。一般式3中の記号の意味は下記のとおり。XはBF4、PF6、TfOTfはCF3SO2を表す。以下同じ。、Tf2N、AsF6又はSbF6を示す。R6及びR7は同一又は異なっていてもよい、炭素数1~5の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を示す。R6及びR7は窒素原子と共に炭素数3~7のモノシクロ構造を形成しても良い。][一般式4及び一般式5中の記号の意味は下記のとおり。YはBH3Zを示すZはアンモニウムイオン、第1級~第4級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す。Bsは一般式1と同じ意味を示し、各式中の2個のBsは同一でも異なっていても良い。]一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3-ホスホロアミダイトが、一般式6で表される光学活性な1,2-アミノアルコールと三塩化リンを反応させて得られる一般式7で表される光学活性なホスフィチル化剤と、一般式8で表されるヌクレオシドを反応させて得られるものである請求項1記載のヌクレオシド3-ホスホロアミダイト。[式中、R1、R2、R3、R4及びBsは、一般式1と同じ意味を示す。]請求項1記載の製造法における反応を繰り返す工程を含む一般式9で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造に用いるための請求項1記載のヌクレオシド3-ホスホロアミダイト。[式中、Y及びBsは一般式1、4、5と同じ意味を示し、nは1~150の整数但し、1は含まないを示す。]非特許文献2の方法では、ボラノ化を行なう前の3価のホスファイトの段階でジアステレオマー比が94:6になっており、ボラノ化後のジアステレオマー比は90:10にとどまっている。非特許文献3の方法では、P-キラルなH-ホスホネートを得ることができるのは二量体までであるため、この方法は固相法によるオリゴマーの合成には適さない。本発明は、リン原子上の立体を制御した立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチドの効率的な製造法を提供することを課題とする。本発明は、課題の解決手段として、一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトと、一般式2で表されるヌクレオシドとを、一般式3で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、一般式4又は5で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法を提供するものである。[一般式1中の記号の意味は下記のとおり。R1及びR2は同一又は異なって、水素原子、炭素数1~3の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数6~14のアリール基を示す。R3は炭素数1~3の直鎖又は分岐アルキル基を示す。R2とR3は窒素原子と窒素原子に隣接する炭素原子と共に炭素数3~16の環状構造を形成しても良い。R4は水酸基の保護基を示す。Bsは式:で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらから誘導される基を示す。][一般式2中、R5は水酸基の保護基、Bsは前記と同じ意味を示す。一般式3中の記号の意味は下記のとおり。XはBF4、PF6、TfOTfはCF3SO2を表す。以下同じ。、Tf2N、AsF6又はSbF6を示す。R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、炭素数1~5の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数6~14のアリール基を示す。R6及びR7は窒素原子と共に炭素数3~7のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良い。][一般式4及び一般式5中の記号の意味は下記のとおり。Yは炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数6~14のアリール基、炭素数1~5のアルキルチオ基、炭素数15のアシル基、又はY=Y’Zを示すY’はSe、BH3を、Zはアンモニウムイオン、第1級~第4級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す。Bsは前記と同じ意味を示し、各式中の2個のBsは同一でも異なっていても良い。]本発明によれば、アンチセンス分子として有効な立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体及びそのオリゴマーを高い収率で得ることができる。以下、本発明の製造法を、縮合反応第1反応工程と、求電子試薬との反応及び脱保護反応第2反応工程に分けて説明する。第1及び第2の分け方は説明の便宜のためだけのものであり、これに限定されるものではなく、また必要に応じて精製処理等の公知の処理工程を付加することもできる。第1反応工程一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトと、一般式2で表されるヌクレオシド以下ヌクレオシド2というとを、一般式3で表される活性化剤以下活性化剤3というの存在下で縮合反応させる。一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトは、下記のとおり、適当な1,2-アミノアルコールから公知の方法で合成することができる例えばTetrahedron:Asymmetry1995610511054参照。即ち、一般式6で表される光学活性な1,2-アミノアルコール以下アミノアルコール6というと、三塩化リンを反応させて得られる一般式7で表される光学活性なホスフィチル化剤以下ホスフィチル化剤7というと、一般式8で表されるヌクレオシドを反応させて得ることができる。[式中、R1、R2、R3、R4及びBsは、一般式1と同じ意味を示す。]アミノアルコール6としては、S-及びR-2-メチルアミノ-1-フェニルエタノール、1R,2S-エフェドリン、1R,2S-2-メチルアミノ-1,2-ジフェニルエタノール等が挙げられる。ヌクレオシド8において、Bsはチミン、アデニン、シトシン又はグアニンあるいはそれらから誘導される基を示すが、具体的には、アデニン、シトシン及びグアニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、更に具体的には、下記一般式で表される化合物が挙げられる。[式中、R8は炭素数1~15の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールオキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシメチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、R9及びR10は、それぞれ炭素数1~4の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。]ヌクレオシド8は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の5位の水酸基を、tert-ブチルジフェニルシリル基TBDPS、tert-ブチルジメチルシリル基TBDMS、4,4’-ジメトキシトリチル基DMTr、4-メトキシトリチル基MMTr等の保護基で保護したものである。上記のような方法で得られた一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトにおいて、R1及びR2としては、R1及びR2のいずれか一方が水素原子で他方がフェニル基、R1及びR2のいずれか一方がメチル基で他方がフェニル基、あるいはR1及びR2が共にフェニル基の組合わせが好ましく、R1がフェニル基、R2が水素原子の組合わせが更に好ましい。R3はメチル基が好ましい。R4はTBDPS、TBDMSが好ましく、TBDPSが更に好ましい。ヌクレオシド2は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の3位の水酸基を保護したものであり、Bsで示されるチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド8で例示したものが挙げられる。ヌクレオシド2とヌクレオシド8のBsは同一でも異なっていても良い。R5で示される水酸基の保護基としては、TBDPS、TBDMS,アセチル基Ac、ベンジル基Bz、DMTr、MMTr等が挙げられ、TBDMSが好ましい。活性化剤3は、一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトの窒素原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。活性化剤3中、XはBF4、PF6、TfO、Tf2Nが好ましい。R6及びR7は窒素原子と共に炭素数3~7のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良く、中でも炭素数4又は5のモノシクロ又はビシクロ構造が好ましい。活性化剤3は、式11で表されるアミンと、式12で表される化合物とを反応させることにより、容易に得ることができる。[一般式11中、R6及びR7は前記と同じ意味を示し、一般式12中、Xは一般式3と同じ意味を示す。]活性化剤3は、特にアセトニトリルに良い溶解性を示すので、一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトとヌクレオシド2との反応は、アセトニトリル等の溶媒中で行うことが好ましい。一般式1で表される光学活性なヌクレオシド3’-ホスホロアミダイトとヌクレオシド2は、一般式1で表されるホスホロアミダイトに対し、ヌクレオシド2を0.5~2.0当量倍で反応させることが好ましく、0.5~1.2当量倍の割合で反応させることがより好ましい。反応温度は0~40°Cが好ましい。反応圧力は1気圧が好ましい。以上の第1反応工程により、下記の一般式10で表されるホスファイト以下ホスファイト10というを得ることができる。[一般式10中、R1、R2、R3、R4、R5及びBsは一般式1、2と同じ意味を示す。]第2反応工程まず、第1反応工程で得られたホスファイト10を無水酢酸等でN-アセチル化した後、求電子剤と反応させて、下記の一般式13で表される化合物以下化合物13というを得る。[一般式13中、R1、R2、R3、R4、R5、Bsは一般式1、2と同じ意味を示し、Yは炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数1~3の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数6~14のアリール基、アルキルチオ基、アシル基、又はY=Y’Zを示し、Y’はSe、BH3を、Zはアンモニウムイオン、第1級~第4級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示し、R11は水素原子又は窒素原子の保護基を示す。]R11で示される窒素原子の保護基としては、アセチル基Ac、ベンジル基Bz、トリメチルシリル基等が挙げられ、トリメチルシリル基が好ましいが、保護基が導入されていなくても良い。求電子剤としては、BH3THF、BH3CH32S等のホウ素化剤、ジスルフィド、CH3I等のアルキル化剤、CH2=O等のアルデヒド、酸クロリド又はセレン等が挙げられる。次に、リン酸修飾後、化合物13のキラル補助物質を1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エンDBU等で処理して除き、一般式14で表される保護されたジヌクレオチドホスフェート誘導体を得る。[一般式14中、R4、R5、Bs及びYは一般式1、2と同じ意味を示す。]最後に、水酸基の保護基を、CH3CH23N3HF等で除くことにより、一般式4又は一般式5で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体を効率的に得ることができる。また、本発明においては、上記した第1反応工程と第2反応工程を繰り返すことにより、一般式9で表されるオリゴマー以下オリゴマー9というを製造することができる。[式中、Y及びBsは一般式1、4、5と同じ意味を示し、nは1~150の整数但し、1は含まないを示す。構成単位中の2個のBsは同一でも異なっていても良い。]オリゴマー9の製造は、溶液中で行っても固相上で行っても良い。固相上で行う場合は、有機高分子系担体又は無機高分子担体をベースポリマーとして用いる。有機高分子系担体としては、ポリスチレン、ポリエチレングリコール-ポリスチレングラフト重合体が挙げられ、アミノメチルポリスチレンが好ましい。無機高分子担体としては、シシカゲル担体であるコントロールドポリグラスCPGが挙げられ、アミノプロピルCPGが好ましい。また、リンカー部分としては、サクリネートリンカー-CO-CH2―CH2―CO-、オキサリルリンカー-CO-CO-が挙げられる。リンカー部分とヌクレオチドとは、エステル結合を介して結合していることが好ましい。一般式9におけるnは1~150の整数を示し、好ましいnの範囲は10~100であり、より好ましい範囲は10~50、更に好ましい範囲は15~30である。本発明の製造法により得られる立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体は、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つであるアンチセンス法に使用することができる。本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。製造例1N-シアノメチルピロリジウムトリフルオロメタンスルホネートの製造;活性化剤3の製造N―シアノメチルピロリジン0.551g5.00mmolのジクロロメタン5.00ml溶液を0°Cに冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸0.442ml5.00mmolを滴下した後、エチルエーテル10mlを加えた。生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル1ml×3回で洗浄した後、減圧下で乾燥し白色粉末状の目的物11.1g4.27mmol、収率85を得た。IRKBrνmax:2996284126512477234722821637146214371269122811681033985911849761641cm11H-NMR300MHz,CD3CNδ:816430350214~20913C-NMR75MHz,CD3CNδ:1212559420235製造例25R-2-クロロ-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサアザホスホリジンの製造;ホスフィチル化剤7の製造R-2-メチルアミノ-1-フェニルエタノールアミノアルコール62.27g15.0mmol、トリエチルアミン5.58ml40.0mmolのテトラヒドロフランTHF20.0ml溶液を、0°Cに冷却した三塩化リン1.75ml20.0mmolのTHF20.0ml溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして30分間攪拌した。生じた塩をグラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、THF1ml×3回で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣を減圧下で蒸留することにより、無色透明液体の目的物2.59g12.0mmol、収率60を得た。1H-NMR300MHz,CDCl3δ:708~705691~68161561546426431P-NMR121MHzCDCl3δ:1717製造例32R5R-2-5’-O-tert-ブチルジフェニルシリルチミジン-3’-イル-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサアザホスホリジンの製造;一般式1の化合物の製造5’-O-tert-ブチルジフェニルシリルチミジンヌクレオシド82.18g4.55mmolをピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、THF7.50mlに溶解した。これに、トリエチルアミン3.17ml22.73mmolを加え、-78°Cに冷却した。この溶液に、アルゴン雰囲気下、製造例2で得られた化合物ホスフィチル化剤7のTHF溶液7.5ml4.55mmol滴下した後、室温で30分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液75ml及びクロロホルム75mlを加えた。有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液75ml×2回で洗浄し、集めた洗浄液をクロロホルム75ml×2回で抽出した。次に、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン、30:70:3、vvvで分離精製した。得られたフラクションを集めて飽和炭酸水素ナトリウム溶液100mlで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮することにより無色非晶質である目的物957.0mg収率32を得た。1H-NMR300MHz,CDCl3δ:812br1H766~762m4H746~716m12H639ddJ2457Hz1H555ddJ6972Hz1H495~490m1H404~402m1H395dd2JH182Hz3JH11Hz1H389dd2JH182Hz3JH11Hz1H351~346m1H293~286m1H275~271dJ6Hz3H246~240m1H228~217m1H158dJ06Hz3H110s9H31P-NMR121MHzCDCl3δ:1435実施例1Rトリエチルアンモニウム5’-O-tert-ブチルジフェニルシリルチミジン-3’-イル3’-O-ブチルジメチルシリルチミジン-5’-イルボラノフォスフェートの製造製造例3で得られた化合物一般式1の化合物49.5mg75μmolと3’-O-tert-ブチルジメチルシリルチミジンヌクレオシド217.8mg50μmolとを五酸化二リン存在下で12時間乾燥した。ここに、モレキュラーシーブMS3Aで8時間乾燥させた製造例1で得られた化合物活性化剤3200μl100μmolの0.5Mアセトニトリル溶液をアルゴン雰囲気下で加え、5分静置した。その後、1.04Mボランテトラヒドロフラン錯体のテトラヒロドフラン溶液求電子試薬0.5ml500μlを加えた。添加後10分間静置し、減圧下でアセトニトリルと過剰のボラノ化剤を留去した。その後、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン74.6μl500μmolを加え、50°Cで26時間放置した。その後、室温に戻し、クロロホルム10mlで希釈し、pH=7.0の0.2Mリン酸緩衝液10mlで洗浄した。洗浄液をクロロホルム10ml×3回で抽出した後、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣を薄相クロマトグラフィージクロロメタン:メタノール:トリメチルアミン=99:1:0.5、vvvで3回、96:4:0.5、vvvで2回で分離精製し、得られた生成物をクロロホルム/1Mトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液により塩交換することで脱保護、無色非晶質である目的物25.6mg収率51を得た。1H-NMR300MHz,CDCl3δ:9.3~88br1H769~764m6H752~736m6H644~631m2H519~510m1H439s1H398~389m4H306qJ72Hz6H259~256m1H225~220m1H198s1H156s3H132tJ69Hz9H110s9H087s9H005s6H10~0br3H31P-NMR121MHzCDCl3δ:950実施例2Rトリエチルアンモニウムチミジン-3’-イルチミジン-5-イル-ボラノフォスフェートの製造実施例1で得られた化合物25.6mg25.5μmmolをピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、トリエチルアミン-3フッ化水素500μlに溶解した。この溶液を室温で24時間攪拌した後、0.1M酢酸アンモニウム緩衝液3mlを加え、逆相カラムクロマトグラフィー0.1M酢酸アンモニウム緩衝液pH=7.0アセトニトリル0~10の線形的グラディエントにより精製し、無色非晶質である目的物10.6mg収率61を得た。1H-NMR300MHz,D2Oδ:769s1H763s1H630~618m2H487br1H455~454m1H414~405m4H380~377m2H318qJ36Hz6H249~246m1H190s3H187s3H127tJ72Hz9H10~0br3H31P-NMR121MHzD2Oδ:930実施例35’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル3’O2R5R3メチル5フェニル132オキサザホスホリジン2イル2’デオキシアデノシン1の製造5’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル2’デオキシアデノシン080g150mmolをピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF750ml溶液とした。これにトリエチルアミン147ml105mmolを加え、-78°Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、下記式15の022MTHF溶液100ml225mmolを滴下した。反応混合物を-78°Cに保ったまま1時間撹拌した後、飽和重曹水75ml及びクロロホルム75mlを加えた。有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄75ml×2し、集めた洗液をクロロホルム75ml×2で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー25×16cmシリカゲル50gジクロロメタン-ヘキサン-ピリジン-トリエチルアミン5729142vvvvで分離精製した。1を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液100mlで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の14691mg44を得た。薄黄色非晶質。1HNMRδ82879874071367667364664260255955750449942342037235335334934133429628427126726325531PNMRδ1414実施例45’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル3’O2R5R3メチル5フェニル132オキサザホスホリジン2イル2’デオキシシチジン2の製造5’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル2’デオキシシチジン079g150mmolをピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF溶液とした。これにトリエチルアミン147ml105mmolを加え、-78°Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の022MTHF溶液100ml225mmolを滴下した。反応混合物を-78°Cに保ったまま1時間撹拌した後、飽和重曹水75ml及びクロロホルム75mlを加えた。有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄75ml×2し、集めた洗液をクロロホルム75ml×2で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー25×16cmシリカゲル50gジクロロメタン-ヘキサン-ピリジン-トリエチルアミン7114142vvvvで分離精製した。2を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の24521mg42を得た。薄黄色非晶質。1HNMRδ78978774071067967762862455254348748240640537736634634128728226926525823423222331PNMRδ1435実施例55’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル3’O2R5R3メチル5フェニル132オキサザホスホリジン2イル2’デオキシグアノシン3の製造5’Oビス4メトキシフェニルフェニルメチル2’デオキシグアノシン085g150mmolをピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF750ml溶液とした。これにトリエチルアミン147ml105mmolを加え、-78°Cに冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の022MTHF溶液100ml225mmolを滴下した。反応混合物を-78°Cに保ったまま1時間30分撹拌した後、飽和重曹水75ml及びクロロホルム75mlを加えた。有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄75ml×2し、集めた洗液をクロロホルム75ml×2で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー25×16cmシリカゲル50gジクロロメタン-ピリジン-トリエチルアミン83172vvvで分離精製した。3を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液100mlで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の33327mg30を得た。薄黄色非晶質。1HNMRδ11010478473471968167864861561155955448548039539337136834833528527125824823822731PNMRδ1375"