哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法であって、a選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子に少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されるように、該多細胞生物にDNA構築物を導入する段階であって、該異なるレポーター遺伝子の転写物それぞれが選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる成熟mRNAのそれぞれと融合するように、該レポーター遺伝子が挿入される、段階;およびb該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階を含む、方法。被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法であって、a選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子に少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されるように、哺乳類多細胞生物にDNA構築物を導入する段階であって、該異なるレポーター遺伝子の転写物それぞれが選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる成熟mRNAのそれぞれと融合するように、該レポーター遺伝子が挿入される、段階;b該多細胞生物を該被験化合物と接触させる段階;c該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;およびd該被験化合物と接触させていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む、方法。特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法であって、a選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子に少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されるように、哺乳類多細胞生物にDNA構築物を導入する段階であって、該異なるレポーター遺伝子の転写物それぞれが選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる成熟mRNAのそれぞれと融合するように、該レポーター遺伝子が挿入される、段階;b該多細胞生物を変異原で処理する段階;c該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;d該変異原処理に供されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化した個体を選択する段階;およびe該個体における突然変異した遺伝子領域を同定する段階を含む、方法。特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法であって、a突然変異が導入されておりかつ選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子に、少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されるように、哺乳類多細胞生物にDNA構築物を導入する段階であって、該異なるレポーター遺伝子の転写物それぞれが選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の成熟mRNAのそれぞれと融合するように、該レポーター遺伝子が挿入される、段階;b該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;およびc該特定の遺伝子に突然変異が導入されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、bで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む、方法。哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法であって、a該多細胞生物にDNA構築物の組み合わせを導入する段階であって、該DNA構築物中で、選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子にレポーター遺伝子が挿入され、かつ、該DNA構築物の組み合わせが、以下の条件i~iv:i各DNA構築物に挿入されるレポーター遺伝子は互いに異なり、ii各DNA構築物中で、該レポーター遺伝子の転写物が選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAと融合するように、該レポーター遺伝子は該特定の遺伝子に挿入され、iii各DNA構築物から選択的スプライシングによって生じる該複数の成熟mRNAのうちただ1つの成熟mRNAのみにおいて、該レポーター遺伝子の転写物部分が正しい読み枠で翻訳され、かつiv選択的スプライシングパターンの中から特定のスプライシングが選択された場合にのみ各DNA構築物において正しい読み枠での翻訳が誘導され、かつ、該正しい読み枠での翻訳を誘導する特定のスプライシングが各DNA構築物によって異なるのすべてを満たす、段階;ならびにb該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階を含む、方法。被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法であって、a哺乳類多細胞生物にDNA構築物の組み合わせを導入する段階であって、該DNA構築物中で、選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子にレポーター遺伝子が挿入され、かつ、該DNA構築物の組み合わせが以下の条件i~iv:i各DNA構築物に挿入されるレポーター遺伝子は互いに異なり、ii各DNA構築物中で、該レポーター遺伝子の転写物が選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAと融合するように、該レポーター遺伝子は該特定の遺伝子に挿入され、iii各DNA構築物から選択的スプライシングによって生じる該複数の成熟mRNAのうちただ1つの成熟mRNAのみにおいて、該レポーター遺伝子の転写物部分が正しい読み枠で翻訳され、かつiv選択的スプライシングパターンの中から特定のスプライシングが選択された場合にのみ各DNA構築物において正しい読み枠での翻訳が誘導され、かつ、該正しい読み枠での翻訳を誘導する特定のスプライシングが各DNA構築物によって異なるのすべてを満たす、段階;b該多細胞生物を該被験化合物と接触させる段階;c該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;ならびにd該被験化合物と接触させていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む、方法。特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法であって、a哺乳類多細胞生物にDNA構築物の組み合わせを導入する段階であって、該DNA構築物中で、選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子にレポーター遺伝子が挿入され、かつ、該DNA構築物の組み合わせが以下の条件i~iv:i各DNA構築物に挿入されるレポーター遺伝子は互いに異なり、ii各DNA構築物中で、該レポーター遺伝子の転写物が選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAと融合するように、該レポーター遺伝子は該特定の遺伝子に挿入され、iii各DNA構築物から選択的スプライシングによって生じる該複数の成熟mRNAのうちただ1つの成熟mRNAのみにおいて、該レポーター遺伝子の転写物部分が正しい読み枠で翻訳され、かつiv選択的スプライシングパターンの中から特定のスプライシングが選択された場合にのみ各DNA構築物において正しい読み枠での翻訳が誘導され、かつ、該正しい読み枠での翻訳を誘導する特定のスプライシングが各DNA構築物によって異なるのすべてを満たす、段階;b該多細胞生物を変異原で処理する段階;c該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;d該変異原処理に供されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化した個体を選択する段階;ならびにe該個体における突然変異した遺伝子領域を同定する段階を含む、方法。特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法であって、a哺乳類多細胞生物にDNA構築物の組み合わせを導入する段階であって、該DNA構築物中で、突然変異が導入されておりかつ選択的スプライシングを受ける該特定の遺伝子にレポーター遺伝子が挿入され、該DNA構築物の組み合わせが以下の条件i~iv:i各DNA構築物に挿入されるレポーター遺伝子は互いに異なり、ii各DNA構築物中で、該レポーター遺伝子の転写物が選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAと融合するように、該レポーター遺伝子は該特定の遺伝子に挿入され、iii各DNA構築物から選択的スプライシングによって生じる該複数の成熟mRNAのうちただ1つの成熟mRNAのみにおいて、該レポーター遺伝子の転写物部分が正しい読み枠で翻訳され、かつiv選択的スプライシングパターンの中から特定のスプライシングが選択された場合に各DNA構築物において正しい読み枠での翻訳が誘導され、かつ、該正しい読み枠での翻訳を誘導する特定のスプライシングが各DNA構築物によって異なるのすべてを満たす、段階;b該レポーター遺伝子の発現によって、該多細胞生物における該特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;ならびにc該特定の遺伝子に突然変異が導入されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、bで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む、方法。少なくとも2種類のレポーター遺伝子のそれぞれが、選択的スプライシングの結果として、別々の転写物に含まれる別々のエクソンと連結される、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。特定の遺伝子が1つのプロモーターの調節下で機能するように該特定の遺伝子が該プロモーターと連結されており、該プロモーターが組織特異的プロモーターおよび発生段階特異的プロモーターのいずれかである、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。多細胞生物がマウスに由来する、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。特定の遺伝子がFGFR2である、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項1~8のいずれか一項記載の方法。選択的スプライシングパターンを可視化するためのDNAベクターを調製するための方法であって、1関心対象の遺伝子に含まれるエクソンaおよびbを有する増幅されたDNA領域のDNA構築物を調製する段階;2該DNA構築物の両端にattBを付加する段階;3上記2のDNA構築物と、選択用遺伝子およびタンデムに配置されたattPを有するドナーベクターとの組換え体を得る段階;4上記3のDNA構築物上のエクソンaにフレームシフト突然変異を導入する段階;5下記i~iiiの組み換え体:i上記4のDNA構築物ii選択用遺伝子と、2種類のレポーター遺伝子が連結された構造を有するDNAの両端に互いに対抗する向きに配置されたattLを有するDNAとを含む、DNAベクターiii3カセットDNAと、プロモーターと、選択用遺伝子を有するDNAの両端に互いに対抗する向きに配置されたattRを有するDNAとを含む、DNAベクターを得る段階を含む、方法。関心対象の遺伝子がFGFR2遺伝子である、請求項14記載の方法。エクソンaおよびbがFGFR2遺伝子のエクソン8および9である、請求項15記載の方法。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項14~16のいずれか一項記載の方法。第1および第2の選択的スプライシングレポーターシステム第1の局面において、本発明は、選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子に少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されているDNA構築物例えば、図2Cおよび2Dを参照を用いる、哺乳類多細胞生物における選択的スプライシングレポーターシステムに関する。第2の局面において、本発明は、選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子に1つのレポーター遺伝子が挿入されているDNA構築物の組み合わせ少なくとも2種類の異なるDNA構築物の組み合わせ例えば、図2Aおよび2Bを参照を用いる、哺乳類多細胞生物における選択的スプライシングレポーターシステムに関する。第1および第2のシステムはいずれも、合計で少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されているDNA構築物またはDNA構築物の組み合わせを哺乳類多細胞生物に導入することによって、その哺乳類多細胞生物におけるインビボまたはインビトロまたはエクスビボでの特定の遺伝子の選択的スプライシングパターンの検出を可能にする。第1および第2のシステムはそれぞれ、後述する本発明の1哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法、2被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法、3特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法、および4特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法のために好適に利用される。インビボでの組織特異的およびまたは段階特異的な選択的スプライシングパターンを、培養細胞などを用いる選択的スプライシングに関する従来のインビトロ試験の結果から正確に予測することは困難であった。第1および第2のシステムの使用により、哺乳類多細胞生物におけるインビボでの組織特異的およびまたは段階特異的な選択的スプライシングパターンの直接的かつ正確な検出が可能になる。したがって、第1および第2のシステムは、哺乳類多細胞生物における選択的スプライシングの機構を解明するための強力な実験ツールになりうると考えられる。<多細胞生物>第1および第2のシステムにおいて、哺乳類多細胞生物は特に限定されず、それが多くの細胞からなりかつ選択的スプライシングの機構を有する限り、用途に応じて適切に選択されることができ、例えばマウスおよびラットを含む。すなわち、本発明に用いられる哺乳動物は、好ましくは非ヒト動物、例えば齧歯類動物すなわち、マウス、ラットなどである。本発明の哺乳類多細胞生物は、哺乳類動物に由来する細胞を含む。すなわち、本発明は、哺乳類動物に由来する細胞を用いる方法を包含する。<選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子>第1および第2のシステムにおける選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子以下、本明細書では、単に特定の遺伝子と称することもあるは特に限定されず、それが哺乳類多細胞生物の遺伝子でありかつ、選択的スプライシングの結果としてエクソンの種々の組み合わせからなる成熟mRNAの複数のアイソフォームを産生しうる限り、用途に応じて適切に選択されることができる。本明細書において選択的スプライシングとは、RNAスプライシングによってイントロンがmRNA前駆体から除去されるとスプライシングのパターンが変化することによって、エクソンの種々の組み合わせからなる成熟mRNAの複数のアイソフォームが細胞内で産生される現象を指す。この現象は、選択的スプライシング機構を有する生物が単一の遺伝子から様々なタンパク質を産生することを可能にする。<レポーター遺伝子>第1および第2のシステムにおいて、レポーター遺伝子は特に限定されず、用途に応じて適切に選択することができる。レポーター遺伝子の例には、緑色蛍光タンパク質GFPおよび赤色蛍光タンパク質RFPなどの蛍光タンパク質遺伝子、色素生成反応または発色反応または発光反応を触媒する酵素遺伝子などが含まれる。第1および第2のシステムでは、合計で少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子を用いる。それらの発現を蛍光または発色の違いに基づいて互いと区別することができる限り、それらの組み合わせは特に限定されず、用途に応じて適切に選択することができる。例えば、緑色蛍光タンパク質GFPと赤色蛍光タンパク質RFPとの組み合わせなどを好適に用いることができる。<DNA構築物>‐第1のシステムのDNA構築物‐第1のシステムにおけるDNA構築物は、選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子に少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子が挿入されているものである。この少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子は、該少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子の転写物それぞれが特定の遺伝子の選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる成熟mRNAのそれぞれと融合するように、該特定の遺伝子に挿入される。好ましくは、少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子はそれぞれ、特定の遺伝子の選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる転写物成熟mRNAの中に含まれる異なるエクソンと連結される例えば、図2Cおよび2Dを参照。各レポーター遺伝子は、各エクソンの上流5側に連結されてもよく、またはそれらの下流3側に連結されてもよい;しかし、各レポーター遺伝子は、各レポーター遺伝子が連結している各エクソンが正しい読み枠で翻訳される場合にのみ各レポーター遺伝子が正しい読み枠で翻訳されるように、各エクソンと連結される必要がある。DNA構築物のそのような構造により、各レポーター遺伝子の発現が検出された時に、各レポーター遺伝子が連結している各エクソンが正しい読み枠で翻訳されているか否かを確認することが可能になる。すなわち、少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子の各発現パターンの解析により、特定の遺伝子の選択的スプライシングパターンを網羅的に確認することが可能になる。‐第2のシステムのDNA構築物‐一方、第2のシステムにおけるDNA構築物は、選択的スプライシングを受ける特定の遺伝子1つに1つのレポーター遺伝子が挿入されているものである。第2のシステムは、そのようなDNA構築物の組み合わせ少なくとも2種類の異なるDNA構築物の組み合わせを用いることを特徴とする。ここで、DNA構築物の組み合わせは、以下i~ivのすべての条件を満たす:i各DNA構築物に挿入されるレポーター遺伝子は互いに異なり;ii各DNA構築物中で、レポーター遺伝子の転写物が選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAと融合するように、該レポーター遺伝子が特定の遺伝子に挿入され;iii各DNA構築物から選択的スプライシングによって生じた複数の成熟mRNAのうち1つの成熟mRNAのみにおいて、レポーター遺伝子の転写物部分は正しい読み枠で翻訳され;かつiv選択的スプライシングパターンの中で特定のスプライシングが選択された場合にのみ、各DNA構築物において正しい読み枠での翻訳が誘導され、かつ、正しい読み枠での翻訳を誘導する特定のスプライシングは各DNA構築物によって異なる。好ましくは、各DNA構築物における各レポーター遺伝子は、特定の遺伝子の選択的スプライシングによって生じる少なくとも2種類の異なる転写物成熟mRNAに含まれる複数の異なるエクソンの1つと連結される例えば、図2Aおよび2Bを参照。各レポーター遺伝子は、各エクソンの上流5側に連結されてもよく、またはそれらの下流3側に連結されてもよい;しかし、各レポーター遺伝子は、各レポーター遺伝子が連結している各エクソンが正しい読み枠で翻訳される場合にのみ各レポーター遺伝子が正しい読み枠で翻訳されるように、各エクソンと連結される必要がある。そのような様式で構築されたDNA構築物の組み合わせの使用により、各レポーター遺伝子の発現が検出された時に、各レポーター遺伝子が連結している各エクソンが正しい読み枠で翻訳されているか否かを確認することが可能になる。すなわち、DNA構築物の組み合わせにおける各レポーター遺伝子の各発現パターンの解析により、特定の遺伝子の選択的スプライシングパターンを網羅的に確認することが可能になる。第1および第2のシステムのDNA構築物において、特定の遺伝子およびレポーター遺伝子は、それらが哺乳類多細胞生物において発現可能なように、プロモーターの下流で連結されていることが好ましい。プロモーターは特に限定されず、用途に応じて適切に選択することができる。その例には、CAGGSプロモーターなどの組織特異的プロモーターが含まれる。DNA構築物は限定されない任意の方法によって構築することができ、公知の手法を適切に用いることができる。例えば、レポーター遺伝子のcDNAが特定の遺伝子のゲノムDNA断片中に挿入されているレポーターカセットを、所望のプロモーターを含む発現ベクター中に組み込むことによって、DNA構築物を構築できる。例えば、本発明のために用いられるDNA構築物は、図1または3に示した方法によって作製することができる。以下、本明細書において、第1および第2の選択的スプライシングレポーターシステムを利用する、本発明によるさまざまな方法を説明する。1哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法本発明の、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法は、a哺乳類多細胞生物に、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせそれぞれが該特定の遺伝子およびレポーター遺伝子を含むを導入する段階、およびb該レポーター遺伝子の発現を検出することによって、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階を含む。<段階a>段階aでは、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせを哺乳類多細胞生物に導入して、トランスジェニック哺乳類多細胞生物を作製する。DNA構築物またはDNA構築物の組み合わせは、限定されない任意の方法によって、哺乳類多細胞生物に導入することができる。例えば、マイクロインジェクションなどの従来より公知である遺伝子移入技術を適切に利用することができる。<段階b>段階bでは、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを、レポーター遺伝子の発現を検出することによって検出する。レポーター遺伝子の発現は、限定されない任意の方法によって検出することができ、レポーター遺伝子の種類に応じて公知の検出方法を適切に利用することができる。例えば、蛍光タンパク質をレポーターとして用いる場合には、蛍光顕微鏡または蛍光利用ソーターfluorescenceassistedsorterを用いて発現を検出することができる。DNA構築物またはDNA構築物の組み合わせは合計で少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子を含み、かつ上記の通り、これらのレポーター遺伝子は、異なるレポーター遺伝子の転写物が、選択的スプライシングによって生じる複数の成熟mRNAそれぞれと融合されるように、該特定の遺伝子に挿入される。したがって、段階bにおけるこれらの少なくとも2種類の異なるレポーター遺伝子の発現を検出することによって、選択的スプライシングによってどの形態の成熟mRNAが産生されたかを確認することができる;換言すれば、哺乳類多細胞生物におけるインビボでの特定の遺伝子の選択的スプライシングパターンの検出が可能になる。哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法はまた、DNA構築物もしくはDNA構築物の組み合わせに含まれるプロモーターの種類を変更することにより、または用いる哺乳類多細胞生物の発生段階を変更することにより、組織特異的かつまたは発生段階特異的な選択的スプライシングパターンの詳細な検出も可能にする。2被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法本発明の、被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法は、a哺乳類多細胞生物に、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせそれぞれが該特定の遺伝子およびレポーター遺伝子を含むを導入する段階、b哺乳類多細胞生物を被験化合物と接触させる段階、cレポーター遺伝子の発現を検出することによって、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階;およびd該被験化合物と接触させていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む。<段階aおよび段階c>段階aおよび段階cは、上述の哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法における段階aおよび段階bと、それぞれ同じ様式で行うことができる。<段階b>段階bでは、段階aでDNA構築物またはDNA構築物の組み合わせが導入された哺乳類多細胞生物を、被験化合物と接触させる。被験化合物は特に限定されず、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かについて試験したい物質から、用途に応じて適切に選択することができる。その例には、精製タンパク質、部分精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、天然の化合物などが含まれる。加えて、哺乳類多細胞生物を被験化合物と接触させるための方法も特に限定されない;その例には、被験化合物をマイクロインジェクションによって注入する方法、被験化合物を飼料中に混合することによって哺乳類多細胞生物に供給する方法などが含まれる。<段階d>段階dでは、被験化合物と接触させていない対照におけるレポーター遺伝子の発現と比べ、cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する。レポーター遺伝子の発現の変化は特に限定されない;その例には、一方のレポーター遺伝子の発現が他方のレポーター遺伝子の発現に置き換わること、1つのレポーター遺伝子の発現レベルが低下または上昇することなどが含まれる。段階dにおいて、被験化合物と接触させていない対照におけるレポーター遺伝子の発現と比べ、段階cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したと判定されたならば、該被験化合物は該特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすと評価することができる。3特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法本発明の、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法は、a哺乳類多細胞生物に、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせそれぞれが該特定の遺伝子およびレポーター遺伝子を含むを導入する段階、b哺乳類多細胞生物を変異原で処理する段階、cレポーター遺伝子の発現を検出することによって、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階、d該変異原処理に供されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、段階cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化した個体を選択する段階、およびe該個体における突然変異した遺伝子領域を同定する段階を含む。この方法は、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすトランス作用因子の同定を可能にする。<段階aおよび段階c>段階aおよび段階cは、上述の哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法における段階aおよび段階bと、それぞれ同じ様式で行うことができる。<段階b>段階bでは、段階aにおいてDNA構築物またはDNA構築物の組み合わせが導入された哺乳類多細胞生物を、変異原で処理する。哺乳類多細胞生物の変異原処理は特に限定されず、公知の方法によって行うことができる。その例には、エチルメタンスルホネートEMSによる処理、UVによる処理などが含まれる。<段階d>段階dでは、変異原処理に供されていない対照におけるレポーター遺伝子の発現と比べ、段階cで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化した個体を選択する。レポーター遺伝子の発現の変化は特に限定されない;その例には、一方のレポーター遺伝子の発現が他方のレポーター遺伝子の発現に置き換わること、レポーター遺伝子の発現レベルが低下または上昇することなどが含まれる。<段階e>段階eでは、レポーター遺伝子の発現が変化した個体における、突然変異した遺伝子領域を同定する。遺伝子領域を同定するための方法は特に限定されず、従来より公知の染色体マッピングなどを適切に利用することができる。4特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法本発明の、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法は、a哺乳類多細胞生物に、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせそれぞれが該特定の遺伝子およびレポーター遺伝子を含むを導入する段階であって、該DNA構築物またはDNA構築物の組み合わせにおいて、該特定の遺伝子に突然変異が導入されている、段階b該レポーター遺伝子の発現を検出することによって、哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出する段階、およびc該特定の遺伝子に突然変異が導入されていない対照における該レポーター遺伝子の発現と比べ、bで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する段階を含む。この方法は、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすシス作用性DNA配列の同定を可能にする。<段階a>段階aでは、第1のシステムにおけるDNA構築物または第2のシステムにおけるDNA構築物の組み合わせそれぞれが該特定の遺伝子およびレポーター遺伝子を含むを哺乳類多細胞生物に導入し、ここで該DNA構築物またはDNA構築物の組み合わせにおいて、特定の遺伝子には突然変異が導入されている。特定の遺伝子に突然変異を導入するための方法は特に限定されず、従来より公知の手法を利用することによって、欠失、挿入、置換などを特定の遺伝子内で適切に誘導することができる。加えて、突然変異が導入される特定の遺伝子中の領域は特に限定されず、該特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを評価したい領域を適切に選択することができる。<段階b>段階bは、上述の哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法における段階bと同じ様式で行うことができる。<段階c>段階cでは、特定の遺伝子に突然変異が導入されていない対照におけるレポーター遺伝子の発現と比べ、bで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したか否かを判定する。レポーター遺伝子の発現の変化は特に限定されない;その例には、一方のレポーター遺伝子の発現が他方のレポーター遺伝子の発現に置き換わること、レポーター遺伝子の発現レベルが低下または上昇することなどが含まれる。特定の遺伝子に突然変異が導入されていない対照におけるレポーター遺伝子の発現と比べ、bで検出された該レポーター遺伝子の発現が変化したと判定されたならば、突然変異が導入された該特定の遺伝子内の領域を、該特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす領域として同定することができる。本発明の方法:本発明者らによって開発された第1および第2の選択的スプライシングレポーターシステムを利用する、1哺乳類多細胞生物における特定の遺伝子の選択的スプライシングを検出するための方法、2被験化合物が特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法、3特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす遺伝子領域を同定するための方法、および4特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす該特定の遺伝子内の領域を同定するための方法は、哺乳類多細胞生物における選択的スプライシングの制御機構の網羅的研究のための非常に有用な方策となりうる。本発明は、蛍光選択的スプライシングレポーターミニ遺伝子を構築するための方法に関する。1つの好ましい態様において、本出願は、選択的スプライシングパターンを可視化するためのDNAベクターを調製するための方法であって、1関心対象の遺伝子に含まれるエクソンaおよびbを有する増幅されたDNA領域のDNA構築物を調製する段階;2該DNA構築物の両端にattBを付加する段階;3上記2のDNA構築物と、選択用遺伝子およびタンデムに配置されたattPを有するドナーベクターとの組換え体を得る段階;4上記3のDNA構築物上のエクソンaにフレームシフト突然変異を導入する段階;5下記i~iiiの組み換え体:i上記4のDNA構築物ii選択用遺伝子と、2種類のレポーター遺伝子が連結された構造を有するDNAの両端に互いに対抗する向きに配置されたattLを有するDNAとを含む、DNAベクターiii3カセットDNAと、プロモーターと、選択用遺伝子を有するDNAの両端に互いに対抗する向きに配置されたattRを有するDNAとを含む、DNAベクターを得る段階を含む、方法を提示する。この態様において、関心対象の遺伝子は特に限定されず、FGFR2遺伝子であることができる。例えば、エクソンaおよびbは、FGFR2遺伝子のエクソン8および9である。レポーター遺伝子は限定されず、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることができる。1つの好ましい態様において、蛍光選択的スプライシングレポーターミニ遺伝子は、図1または3に明示する方法によって構築することができる。2.理論的背景21.複数の蛍光タンパク質による選択的スプライシングパターンの可視化生細胞における選択的スプライシングの制御機構を明らかにするために、複数のエクソンおよびイントロンを含むレポーターミニ遺伝子構築物が用いられることが多い。ミニ遺伝子由来のmRNAのスプライシングパターンは通常、トランスフェクト細胞から全RNAを抽出した後の逆転写RTポリメラーゼ連鎖反応PCR産物の比率を用いて定量的に解析される。スプライシングパターンの解析における手間を要する多数の工程によって、しばしば結果の偏りが引き起こされ、かつ選択的スプライシングのハイスループット解析が妨げられてきた。蛍光タンパク質を発現する蛍光選択的スプライシングレポーターの利用により、状況が変わってきている。初期には単色すなわち単一色の蛍光レポーターが、培養細胞におけるスプライシングイベントの指標として用いられた。選択的エクソンの正しいスプライシングまたはスキッピングをモニターするために単色レポーターミニ遺伝子が設計され、これが、選択的スプライシングの制御に欠陥のある突然変異細胞株の単離SheivesPandLynchKWRNA814731481、スプライシング制御エレメントの機能的スクリーニングWangZetalCell119831845およびスプライシングパターンを改変する低分子化合物のスクリーニングLevinsonNetalRNA12925930のために用いられている。単色レポーターの利点は、それらの構造の単純さにある。しかし、単色レポーターの読み取り値は、転写および翻訳などの遺伝子発現に対する作用によって影響を受ける可能性がある。多色選択的スプライシングレポーターは、単色レポーターの注意事項の大部分を克服している。多色レポーターミニ遺伝子は、各蛍光タンパク質の発現がある特定のスプライシングイベントを表すように設計された。多色蛍光レポーターの利点とは、個々の細胞において、発現された蛍光タンパク質の比率がmRNAアイソフォームの比率を反映すること、または蛍光タンパク質の1つが発現レベルの内部対照としての役割を果たすことである。このため、多色レポーターは、多細胞生物における選択的スプライシングパターンの可視化のために適している。多色レポーターミニ遺伝子は、多構築物型および1構築物型という2つの型にさらに分類することができる。前者は、そのそれぞれが単一の蛍光タンパク質をコードする複数のミニ遺伝子からなり、後者は2つの蛍光タンパク質cDNAを単一のミニ遺伝子構築物中に含む。多構築物型レポーターは、培養細胞のフローサイトメトリーによってトランス因子およびシスエレメントを検索するためNewmanEAetalRNA1211291141、ならびに、Cエレガンスにおいて発生的に制御される選択的スプライシングを可視化するため、さらには遺伝子解析のためOhnoGetalGenesDev22360374に利用されている。1構築物型2色レポーターの際立った特徴とは、単一の蛍光タンパク質をそれぞれがコードする2つの選択的mRNAアイソフォームが、1つの共通のmRNA前駆体から相互排他的な様式で生じることである。このため、1構築物型レポーターは、選択的スプライシングパターンのわずかな変化に対しても感受性がある。これらのレポーターは、制御因子を解析するためOrengoJPetalNucleicAcidsRes34e148、スプライシング制御を変更させる化学物質に関するハイスループットスクリーニングのためStoilovPetalProcNatlAcadSciUSA1051121811223、ならびに、CエレガンスKuroyanagiHetalNatMethods3909915およびマウスにおける細胞型特異的な選択的スプライシングの可視化のために利用されている。22.スプライシングパターンをモニターするための蛍光レポーターミニ遺伝子の設計ここで本発明者らは、本発明者らが実施例に記載した通りに構築した多色選択的スプライシングレポーターミニ遺伝子の典型的な構造図2を示し、各蛍光タンパク質の発現が特定の選択的スプライシングイベントをどのように知らせるのかを説明する。本明細書に記載されたレポーターミニ遺伝子は、可能な選択的スプライシングレポーターの数例に過ぎないことに留意されたい。可視化しようとする関心対象の選択的スプライシングイベントに応じて、各レポーターを柔軟に設計することができる。理想的なミニ遺伝子は、特定の蛍光タンパク質の発現が、特定のmRNAアイソフォームまたは特定の選択的スプライシングイベントを明白に示すように設計されるべきであるKuroyanagiHetalVisualizationandgeneticanalysisofalternativesplicingregulationinvivousingfluorescencereportersintransgenicCaenorhabditiselegansNatProtoc。上述したように、図2におけるミニ遺伝子は、多構築物型図2A、Bおよび1構築物型図2C、Dに分けることができる。レポーターの型の選択は、生物、およびミニ遺伝子移入の方法に左右される。標準的なマイクロインジェクション方法によって産生されたトランスジェニック線虫は、プラスミドDNAの数百ものコピーを染色体外アレイとして保有しておりMelloCCetalEMBOJ1039593970、したがって一般的に、同一のベクター骨格を持つ数種類のミニ遺伝子の混合物の注入によって、すべての構築物が染色体外アレイに比例して組み込まれると想定されている。多構築物型レポーターの利点の1つは、セクション4で述べるように、一緒に導入するミニ遺伝子の数を3種類以上に増やすことができることである。移入するミニ遺伝子のコピー数が少ないかまたは不定である状況では、1構築物型レポーターの方が好ましい可能性がある。図2Aは、相互排他的エクソンに関する一対のレポーターミニ遺伝子の模式的構造を示す。上流の構成的エクソンから下流の構成的エクソンまでの関心対象のゲノム断片が、1つの共通プロモーターおよび1つの構成的イントロンの下流に配置され、その後に2種の蛍光タンパク質いずれか1つのcDNAおよび3カセットが続いている。ゲノム断片の5末端にはインフレームの翻訳開始コドンが人為的に導入されている。各構築物において、2つの選択的エクソンの一方には終止コドンが人為的に導入されている。図2Aに示されたミニ遺伝子に由来する、エクソンaのみが含まれたmRNAアイソフォームからはGFP融合タンパク質が産生され、エクソンbのみが選択されたmRNAアイソフォームからはRFP融合タンパク質が産生される。図2Bは、カセットエクソンの包含およびスキッピングをモニターするための一対のレポーターミニ遺伝子の模式的構造を示す。断片カセットの順序および組成は、図2Aの通りである。図2Bに示す場合において、カセットエクソンの長さは3塩基の倍数ではなく、そのため、カセットエクソンの包含により下流エクソンの読み枠が変化する。カセットエクソンが含まれる場合にはGFPcDNAがインフレームで連結され、カセットエクソンが除外される場合にはRFPcDNAがインフレームで連結される。図2Cおよび2Dは、1構築物型2色レポーターの模式的構造を示す。これらの構築物は、選択的読み枠の1つが終止コドンを持たないという、一部の蛍光タンパク質cDNAの独特な特徴に依拠しているOrengoJPetalNucleicAcidsRes34e148。図2Cおよび2Dに示す場合において、RFPcDNAの選択的フレームの翻訳がGFPcDNAからの蛍光タンパク質の生成を導くように、RFPおよびGFPのcDNAが異なる読み枠で連結されている。蛍光タンパク質がRFPcDNAから生成される場合、翻訳はそれ自体の終止コドンで停止すると考えられる。図2Cに示したミニ遺伝子は、カセットエクソンの包含およびスキッピングをモニターするためのものである。カセットエクソンが含まれる場合はGFPcDNAがインフレームにあり、カセットエクソンが除外される場合はRFPcDNAがインフレームにある。図2Dに示されたミニ遺伝子は相互排他的エクソンの選択をモニターするためのものである。この場合、このエクソンが選択された場合にはヌクレオチド1個がエクソンaの中に挿入され、フレームシフトが引き起こされる。大腸菌EcoliのグルタチオンSトランスフェラーゼGSTを、融合タンパク質の発現のためのN末端タグとして用いる。エクソンaのみが含まれた場合にはGFP融合タンパク質が産生され、エクソンbのみが選択された場合にはRFP融合タンパク質が産生される。両方のエクソンが含まれるかまたはスキップされた場合には、どちらの蛍光タンパク質も産生されない。23.蛍光レポーターミニ遺伝子の構築本発明者らは、MultiSiteGatewayシステムInvitrogenを利用する部位特異的組換えによって、蛍光選択的スプライシングレポーターミニ遺伝子を構築する。ミニ遺伝子構築における相同組換えの主な利点は、エントリーベクターおよびデスティネーションベクターの中にクローニングされたモジュール式DNA断片を組み立てることによって、上記のような種々の構造を有する発現ベクターを容易かつ迅速に構築できることである。このセクションで、本発明者らは、MultiSiteGatewayシステムの実際の利用、および蛍光レポーターミニ遺伝子の設計において考慮すべき他の局面に焦点を当てる。231.MultiSiteGatewayシステムMultiSiteGatewayシステムは、部位特異的組換えクローニングを用いて、関心対象の別個のDNA断片2つ、3つまたは4つを規定の順序および向きで同時クローニングさせる。図3は、2断片組換え反応を行うことによる発現クローンの構築を模式的に説明している。関心対象のゲノムDNA断片をエントリーベクター中にクローニングして図3A、デスティネーションベクターの相同組換え部位との間で断片を組み立てる図3B。MultiSiteGatewayシステムの重要な特徴とは、5組の改変att部位が一方向を向いており、標準的なGatewayシステムにおけるような相同組換えの特異性を示すことである:例えば、BP反応ではattB1部位はattP1部位のみと反応して他のattP部位とは反応せず、attL1部位およびattR1部位を生じ図3A、LR反応ではattL5部位はattR5部位のみと反応して他のattR部位とは反応せず、attB5部位およびattP5部位が生じる図3B。MultiSiteGatewayシステム、ならびに3断片および4断片組換え反応のそれ以上の詳細については、供給元のウェブサイトwwwinvitrogencomを参照されたい。本発明者らのレポーターミニ遺伝子、または発現クローンにおけるatt部位はすべてattB部位であり、エクソン中にある図2および3。attB配列21~25塩基対は、att部位すべての中で最も短い区間である。本発明者らは、Cエレガンスまたは哺乳類細胞のいずれにおいてもattB配列内部での潜在的スプライシングに遭遇したことはない。attB配列には固定の読み枠を用いることが推奨されており、本発明者らは通常そのようにしたセクション3を参照。attB1、attB5およびattB2の配列はATGおよび終止コドンをいずれのフレームにも有しないため、それらは理論的にはあらゆるフレームで用いることができる。232.ミニ遺伝子の構築において考慮すべき他の局面早期終止ナンセンスコドンPTCを有するmRNAは、ナンセンス変異依存mRNA分解NMDと呼ばれる品質管理機構によって選択的に分解される。哺乳動物では、RNAスプライシング後にエクソンエクソン境界部の上流に集積するタンパク質複合体であるエクソン接合部複合体EJCが1回目の翻訳の際に終止コドンの下流に存在する場合に、NMDが誘導されると考えられているChangYFetalAnnuRevBiochem765174IskenOandMaquatLEGenesDev2118331856。蛍光タンパク質をコードするmRNAアイソフォームがNMDを回避するように蛍光レポーターミニ遺伝子を設計することが、極めて重要である。GFPcDNAおよびRFPcDNAが、図2に示されたミニ遺伝子中の最終エクソン中に存在する場合には、これらのミニ遺伝子由来の産生型アイソフォームproductiveisoformは、哺乳動物におけるNMDを回避すると考えられる。CエレガンスKuroyanagiHetalMolCellBiol2786128621PulakRandAndersonPGenesDev718851897および酵母KebaaraBWandAtkinALNucleicAcidsRes3727712778AmraniNetalNature432112118では、長い3非翻訳領域UTRによってエクソンエクソン境界部とは無関係にNMDが誘発されるため、したがって、これらの生物では、図2Cおよび2DにおいてRFPタンパク質をコードするmRNAアイソフォームはNMDによって分解されると考えられる。ミニ遺伝子構築物中に利用されるゲノム断片は通常、正しいスプライシングを受ける。しかし、構成的エクソンのトリミングおよびまたは長いイントロン領域の欠失は、非効率的なスプライシングを導く、または選択的スプライシングの制御解除を導く可能性がある。内因性遺伝子の選択的スプライシングパターンを反映するレポーターを確立するためには、ミニ遺伝子最適化の繰り返しが必要となる可能性がある。本発明者らはGFPcDNAおよびRFPcDNAのいずれにおいても潜在的スプライシングに遭遇したことはないが、N末端およびC末端タグに対する他のcDNAが潜在的スプライス部位としてはたらく可能性がある。関心対象の遺伝子に由来するアミノ酸配列は、蛍光性融合タンパク質のフォールディング、安定性およびまたは細胞内局在に大きな影響を及ぼす可能性がある。このため、ミニ遺伝子の設計においては、融合タンパク質の特性を予想することが重要である。GST図2DなどのさまざまなN末端タグは、融合タンパク質の発現を安定化して、結果を改善する可能性がある。また、設計した開始コドンでの翻訳開始を強制的に行わせることも極めて重要である。エクソン領域におけるおよびN末端タグにおけるATGコドンは、異常翻訳開始の原因となり得、蛍光タンパク質の産生を減少させ得る。FGFR2遺伝子のスプライシング制御を可視化するためのレポーターシステムは、いくつかのグループにより作製されてきた。Newmanらは、AT3およびDT3細胞における内因性スプライシング制御を反映しうる最小ゲノム領域を有する蛍光レポーターベクターを作製した。彼らはこのレポーターを用いて、ISSISS3を含む特異的ISEを同定し、これらはFox制御に応答する[NewmanEAMuhSJetalRna1211291141]。Bonanoらはエクソン8の周りのゲノム断片を用いることによって別の蛍光レポーターベクターを構築し、彼らはマウスにおけるエクソン8包含の制御を可視化した[BonanoVIetalRna1220732079]。本発明において、本発明者らは、FGFR2遺伝子をモデルとして用いるトランスジェニックレポーターシステムを独自に開発し、マウスにおけるEGFPおよびRFPの差次的発現によって相互排他的エクソンの組織特異的発現プロファイルを可視化することに初めて成功した。本発明者らは、選択的エクソンの周りのゲノム領域ほぼ全体を、それらの上方および下方の構成的エクソンとともに用いて、制御のために真に重要なのはどのスプライス部位配列およびシスエレメントであるかを評価することができた。このシステムは、1インビボでのスプライシング制御の変遷を単一細胞分解能でモニターするため、2本研究のように、必須のシスエレメントおよびトランス因子を同定するため、ならびにスプライシング制御の隠された機構を明らかにするため、3蛍光色の変化によって必須因子候補を同定するため、またはcDNAライブラリーもしくはsiRNAライブラリーを用いて制御因子をスクリーニングするための、大きな利点を有する。このように、スプライシングレポーターシステムは、隠されたスプライスコードを解読するため、かつまた発生中または成体において選択的スプライシングによって組織特異的または細胞型特異的な様式で制御される重要な役割を明らかにするための、大きな利点を有する。スプライシングレポーターシステムを用いて、本発明者らは、FGFR2遺伝子の2つの相互排他的エクソンが一次的な運命および二次的な運命を有するように思われることを示した。組織特異的制御因子がないと、一次エクソン9がデフォルトとして選択され、二次エクソン8はそれらの3スプライス部位の相対的強度に応じて無視される図12A、非上皮性制御または間葉性制御。重要な組織特異的制御因子ESRPが発現されると、これらの因子は一次エクソン9の3スプライス部位の近傍にFoxとともに結合して、エクソン9の認識を抑制する図12A、上皮性制御。線虫では、組織特異的因子による順序づけられたスプライシング認識を通じて制御される相互排他的選択的スプライシングが観察されている[OhnoGetalGenesDev22360374]。この順序づけられたスプライス部位認識により、トランス作用性制御因子は、チェスの駒、通常はナイトが、ルークへの攻めとキングへの王手かけを同時に行い、これにより前者を必ず取ることができるのと類似した様式で、相互排他的エクソンの選択を組織特異的な様式で逐次的に制御することができる図12A。この制御機構は、上述した本発明者らの最初の疑問に対する明らかな回答となる。これまで、組織特異的な選択的スプライシング制御は、特異的シスエレメントを通じてトランス因子によって媒介される選択的エクソンの増強とサイレンシングの間の均衡という見地から理解されてきた[MatlinAJetalNatRevMolCellBiol6386398]。この考え方では、各選択的エクソンは別個に制御され、最終的なスプライシングアイソフォームはこれらの独立した制御の総和および均衡によって決定される。もし相互排他的選択的スプライシングにもこれが当てはまるのであれば、最初のスプライシング産物は、単一エクソン包含形態、二重包含形態、および二重スキップ形態の混合物であったと考えられる。後者2つのアイソフォームはNMDによって除去されたであろうから[ChangYFetalAnnuRevBiochem765174]、単一エクソン包含形態のみが最終的なスプライシング産物として残ったと考えられる。一方、相互排他的スプライシングがスイッチ様の様式で制御されるのであれば、最初のスプライシング産物は主として単一包含形態の一方からなったと考えられる。AT3細胞におけるエクソン選択が、エクソン9に対するエンハンサーとエクソン8に対するリプレッサーとの複合制御の均衡にかかっているのであれば、エクソン9に対するリプレッサーの過剰発現により、大部分は二重スキップ形態が産生されたはずである。しかし、本発明者らはこれを認めなかった図10A。さらに、レポーター中のエクソン8の3スプライスslice部位をエクソン9のそれと同じくらい強くなるように変化させた場合には、エクソン8に影響を及ぼすトランス作用因子および特異的シスエレメントのいかなる変化も伴うことなく、二重包含スプライシング産物がAT3細胞において優位になった図7、レーン2。また、非上皮性AT3細胞において、エクソン9のスプライス部位突然変異は上皮性エクソン8への切り替えを引き起こした図8、レーン2および4。これらの結果は、選択的スプライシングが複数の制御因子の複雑な均衡によって達成されるのではなく、重要な制御因子によって唯一の適切なエクソンが選択されて切り替えられる単純なスイッチ様機構によって規定されることを示唆している。本発明者らの以前の研究により、線虫FGFR相同遺伝子egl15の相互排他的スプライシングは、広範に発現されるFox1ASD1ファミリーと筋特異的RNA結合モチーフタンパク質RBMであるSUP12mRBM24の線虫相同体との協調によって制御されており、それらが共に作用して選択的エクソン5Bの包含を抑制し、エクソン5Aの筋特異的発現を促進することが示された[KuroyanagiHetalNatMethods3909915KuroyanagiHetalMolCellBiol2786128621]図12B、線虫。哺乳類FGFR2の場合には、全身性に発現されたFoxファミリーが組織特異的因子ESRPRBM35aおよびbと協働してエクソン9の選択的包含を抑制し、かつエクソン8の上皮組織特異的発現を促進する図12B、哺乳動物。さらに、線虫および哺乳類のFoxファミリータンパク質はいずれもUGCAUGエレメントに結合し、SUP12およびESRPはGU区間に結合する。線虫は哺乳動物と比較してかなり類似した数の遺伝子およそ20000個を有するが、そのゲノムのサイズははるかに小さく約30分の1、イントロンは非常に短い平均561bp。そのため、線虫における選択的スプライシングは極めて簡単な規則によって制御されていると考えられる[ZahlerAMWormBook113KabatJLetalPLoSComputBiol2e86]。このように、組織特異的選択的スプライシングの制御機構が線虫から哺乳動物まで進化的に保存されていることは驚くべきことであり、Foxおよび別の組織特異的RBMを通じた制御が、複数の遺伝子の組織特異的選択的スプライシングを制御するための広範な必須の現象であることが判明する可能性がある。本発明者らの知見はまた、スプライシングを受ける多数の遺伝子が限られた数の制御因子によってさまざまな組織特異的様式でどのように制御されるのかを理解するため、最終的には、一見複雑であるように思われる発生過程または組織特異的機能を理解するための、重大な手がかりをも与えるものである。本明細書中に引用した先行技術文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。以下に本発明の実施例を説明するが、これらは本発明を限定するものとみなされるべきではない。実施例1プロトコール1.エントリーベクター中のゲノムDNA断片カセットの構築本発明者らは、BP反応を行って、MultiSiteGatewayシステムのエントリーベクター中に関心対象のゲノム断片をクローニングした。attBに隣接するゲノム断片を増幅するために、本発明者らは通常、2段階PCR手法を行う。1回目のPCRは、遺伝子特異的でありかつattB配列の一部を自身の5末端に含むプライマーを用いて行う。続いて1回目のPCR産物を、attBアダプタープライマーとともに、2回目のPCRのためのテンプレートとして用いる。2段階PCR手法の利点は、合成すべき遺伝子特異的プライマーGSPがより短くなると考えられること、およびattBアダプタープライマーを、異なるミニ遺伝子プロジェクトで他のDNA断片をクローニングするために繰り返して使用可能であることである。ここで本発明者らは、図3Aに図式的に示したように、2断片組換え反応のためのエントリークローンをどのように構築するのかを示す。ゲノムDNA断片を、構築しようとするミニ遺伝子の設計に応じたエントリーベクターのいずれかにクローニングするセクション22参照。3断片および4断片組換え反応をミニ遺伝子構築に利用することもできるが、これらは効率が低いため、本発明者らはほとんど用いたことがない。11.プライマーの設計GSPは、5末端に12塩基のattB部位、その後に18~25塩基のテンプレート特異的または遺伝子特異的な配列表1;エントリークローンを構築するために用いるプライマーの配列を有するものとする。表1に示すように、コザックコンセンサス配列をattB1配列と遺伝子特異的配列との間に挿入して、翻訳開始を強制的に行わせることができる。終止コドンは、レポーターミニ遺伝子の設計に応じて、逆方向GSP内に含めるか、またはそこから除くものとする。DNA断片をN末端およびまたはC末端タグと融合するように設計している場合には、表1に表示したようなattB配列中の正しい読み枠が維持されるようにGSPを注意深く設計しなければならない。2回目のPCRのためのattBアダプタープライマーは、以下の共通構造からなる:5末端に4つのグアニンG残基、その後に22塩基または25塩基の完全attB配列表1。下線部は、GSP中に含まれる12塩基のattB配列を示す。12.PCRの実施PCRは、PrimeSTARHSDNAポリメラーゼTaKaRaなどのプルーフリーディングポリメラーゼを用いて行うべきである。アニーリング配列がわずか12塩基対であるため、2回目のPCRのアニーリング温度は45°Cであるべきである。プロトコール1:attBDNA断片の2段階PCR増幅1.各02μMのGSPとともに標準的な試薬を含む25マイクロリットルμLの混合物中で1回目のPCRを行う。PCRの条件は、テンプレートの量および増幅しようとする断片のサイズに応じて最適化すべきである。PCR産物を標準的なアガロースゲル電気泳動によって確認する。2.標準的な試薬および各03μMのattBアダプタープライマーを含む2回目のPCR混合物50マイクロリットルμLを調製する。混合物を1回目のPCR反応混合物10マイクロリットルμLに添加して、アニーリング温度を45°Cとした5サイクルのPCRを行う。PCR産物の量が2回目のPCRで増加したことをアガロースゲル電気泳動によって確認する。3.任意で、1マイクロリットルμLのDpnINewEnglandBiolabsを添加し、37°Cで1時間インキュベートして、テンプレートDNAを破壊する。PCRテンプレートがカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドである場合には、attBPCR産物を精製する前にPCR混合物をDpnIで処理すべきである。DpnIは細菌由来DNA中のメチル化GATC部位を認識する。DpnI処理は、BP組換え反応におけるテンプレート混入に伴うバックグラウンドを大きく減少させる。4.標準的なDNA精製カラムを用いてattBPCR産物を精製する。13.BP組換え反応およびエントリークローンの選択attBに隣接する各DNA断片と適切なattP含有ドナーベクターとの間のBP組換え反応表2:BP反応によってエントリークローンを構築するためのドナーベクターの選択を行って、エントリークローンを作製する。プロトコール2:BPクロナーゼII反応、および適切なエントリークローンの選択1.以下の構成成分を15ml微量遠心管に添加して混合する:attBPCR産物15~150ng、pDONRベクタースーパーコイル、75ng、最終容量4マイクロリットルμLの脱イオン蒸留水DDWまたはTE。1マイクロリットルμLのBPクロナーゼII酵素ミックスInvitrogenを上記の構成成分に添加して、短時間のボルテックス処理またはタッピングによって十分に混合する。2.BP反応混合物を室温または25°Cで1時間または一晩インキュベートする。本発明者らは通常、プロテイナーゼK消化を省略している。3.大腸菌株DH5αまたは他の菌株を、1~3マイクロリットルμLの反応混合物によって形質転換させて、カナマイシン耐性エントリークローンを選択する。挿入物の配列を確認する。Fエピソームを有する大腸菌株例えば、TOP10Fは、エントリークローンを選択するための形質転換に用いることができない。これらの菌株はccdA遺伝子を含み、pDONRベクター中のccdB遺伝子による陰性選択を妨げると考えられる。14.エントリークローンの改変任意ミニ遺伝子の設計に応じて、終止コドンまたはフレームシフトをエクソンに導入し、かつまたはエントリークローンの推定シスエレメントを改変もしくは欠損させる。ゲノム断片の配列は、推定シス制御エレメントの欠失を避けるように注意深く改変すべきである。本発明者らは、近縁種の間であまり保存されていない区間中に終止コドンまたはフレームシフトを導入している。本発明者らはQuickchangeIIまたはQuickchangeIIXLStratageneを部位指定突然変異誘発に利用している。本発明者らは通常、突然変異誘発後に挿入物全体のシーケンシングを行う。2.LR組換え反応、および発現クローンの選択通常、Gatewayデスティネーションベクターにより、プロモーターおよび3カセットが与えられる図2。培養細胞における発現用の種々のデスティネーションベクターが市販されている。また、デスティネーションベクターを、アンピシリン耐性遺伝子を含む既存のベクター中への連結に基づくデスティネーションベクターカセットInvitrogen挿入によって構築することもできる。本発明者らは、既存の発現ベクターを、本発明者らの以前の研究で用いたデスティネーションベクターに変換するために、BP反応を行った[OhnoGetalGenesDev22360374KuroyanagiHetalNatMethods3909915KuroyanagiHetalMolCellBiol2786128621]。本発明者らは、アンピシリン耐性遺伝子を含むあらゆる既存のベクターを、デスティネーションベクターに、所望の位置で、所望のフレームを有するように変換することができる。変換方法の詳細は他所に記載されるであろう[KuroyanagiHetalNatProtoc]。Cエレガンスにおける発現のために本発明者らが構築したデスティネーションベクターのヌクレオチド配列は、CエレガンスのPromoterMarkerDatabasehttpwwwshigennigacjpceleganspromoterindexjspで入手可能である。本発明者らは、開始コドンおよびまたは終止コドンを伴うかまたは伴わない、pENTRL1R5ベクターおよびpENTRL5L2ベクター中にある蛍光タンパク質カセットの種々のエントリークローンを構築した。プロトコール3:LRクロナーゼIIPlus反応、および適切な発現クローンの選択1.以下の構成成分を15ml微量遠心管に添加して混合する:デスティネーションベクター75ng、エントリークローン各15~100ng、最終容量4マイクロリットルμLのDDWまたはTE。1マイクロリットルμLのLRクロナーゼIIPlus酵素ミックスInvitrogenを上記の構成成分に添加して、短時間のボルテックス処理またはタッピングによって十分に混合する。2.LR反応混合物を25°Cまたは室温で一晩インキュベートする。本発明者らは通常、プロテイナーゼK消化を省略している。3.大腸菌株DH5αまたは他の菌株を、1~3マイクロリットルμLの反応混合物によって形質転換させて、アンピシリンカルベニシリン耐性発現クローンを選択する。本発明者らは、アンピシリンカルベニシリン耐性コロニーのアンピシリンカルベニシリン、クロラムフェニコール、およびカナマイシンに対する耐性を日常的に確認している。Fエピソームを有する大腸菌株は、発現クローンを選択するために用いることができない。4.アンピシリンカルベニシリンのみに対して耐性のあるクローンを選択し、miniprepプラスミドDNAの制限酵素消化パターンを確認し、DNA断片の境界部のシーケンシングを行う。3.培養細胞のトランスフェクションおよびトランスジェニック動物の作製蛍光レポーターミニ遺伝子による培養細胞の一過性トランスフェクションを、標準的なトランスフェクション試薬を用いて行う。蛍光タンパク質の発現は、標準的な複合顕微鏡、フローサイトメトリーおよび他の装置を利用することによって解析可能である。トランスジェニック動物は標準的な方法によって作製することができる。マウスにおける蛍光タンパク質の発現は、複合顕微鏡または共焦点顕微鏡の下で切片を観察することによって解析可能である。本発明者らは通常、高倍率蛍光解剖顕微鏡または共焦点顕微鏡を利用して、トランスジェニック線虫における蛍光レポータータンパク質の細胞特異的および組織特異的な発現を解析した。4.ミニ遺伝子由来mRNAのスプライシングパターンの確認本発明者らは、レポーターミニ遺伝子が発現され正しくスプライシングされていること、および、選択的スプライシングパターンが内因性遺伝子のスプライシングパターンから予想された通りでありかつ発現された蛍光タンパク質の比率とも一致していることを確認するために、ミニ遺伝子由来mRNAのスプライシングパターンを解析することを強く推奨する。プロトコール4:ミニ遺伝子由来mRNAのRTPCR解析1.RNeasyMiniQIAGENまたは同等物、およびDNaseIを製造元の指示に従って利用することによって、全RNAを細胞、組織または生物から抽出する。2.PrimeScriptTaKaRaまたはSuperscriptIIInvitrogen、およびプライマーとしてのオリゴdTを製造元の指示に従って用いて、RTで、1~2マイクログラムの全RNAを逆転写させる。3.PCRに関して、本発明者らは通常、ExTaqTaKaRaおよびBIOTAQBIOLINEなどの非プルーフリーディングポリメラーゼ、ならびにミニ遺伝子特異的プライマーセットを用いている。GFP特異的リバースプライマーとして、本発明者らは5TGTGGCCGTTTACGTCG3SEQIDNO:10または5TTTACTTGTACAGCTCGT3SEQIDNO:11を用いている。mRFP特異的リバースプライマーとして、本発明者らは5GGAGCCGTACTGGAACTGAG3SEQIDNO:12または5TTAGGCGCCGGTGGAGTG3SEQIDNO:13を用いている。attBアダプタープライマーを用いることもできる。4.RTPCR産物を解析するために、精製産物を直接シーケンシングするか、または産物をpGEMTEasyPromegaなどのTAベクター中にクローニングしてそれらをシーケンシングする。実施例2実験例図4Aおよび4Bは、Cエレガンスにおける相互排他的エクソンの組織特異的選択的スプライシングの可視化の一例を示す。図4Cおよび4Dは、HeLa細胞におけるウイルス感染誘導性イントロン保持の可視化の一例を示す[NojimaTetalNucleicAcidsRes3765156527]。図4Eおよび4Fは、マウスにおける相互排他的選択的スプライシングの可視化の一例を示す。本明細書中に用いている略号の正式名称を以下に示す。略号EJC、エクソン接合部複合体;GFP、緑色蛍光タンパク質;GSP、遺伝子特異的プライマー;GST、グルタチオンSトランスフェラーゼ;mRNA、メッセンジャーRNA;NMD、ナンセンス変異依存mRNA分解;PCR、ポリメラーゼ連鎖反応;PTC、早期終止コドン;RFP、赤色蛍光タンパク質;RT、逆転写;UTR、非翻訳領域。材料および用語解説材料および方法プラスミドの構築本発明者らは、本質的には本文中に記載した通りにレポーターベクターを構築した。マウスゲノムDNAのエクソン7からエクソン10までの範囲にわたるFGFR2ゲノム領域をPCRによって増幅し、CAGGSプロモーターの調節下にあるEGFPClontechおよびmRFP[CampbellREetalProcNatlAcadSciUSA9978777882]の両方を異なる読み枠で保有するGatewayデスティネーションベクターInvitrogen中に、クローニングした。レポータータンパク質発現の安定化および増強のために、改変グルタチオンSトランスフェラーゼGST遺伝子QIAGENの人工配列をFGFR2ゲノム断片の前方に導入し、エクソン7とインフレームで連結させた。FGFR2のイントロン9の中心部の1kbp断片は、mRNA発現を顕著に低下させる効果を有するので、除去した。シスエレメントの突然変異はQuikChangeXLIIStratageneを用いることによって導入した。マウスのFox1cDNAおよびFox2cDNAは、DrKawamotoに寄贈いただき[NakahataSKawamotoSNucleicAcidsRes3320782089]、CAGGSプロモーターによって作動するGatewayデスティネーションベクター中にクローニングした。FGFR2を増幅するため、イントロン9の中央部の1kbpを欠失させるため、および突然変異を導入するためのプライマー配列を、以下に示した。FGFR2を増幅するため、イントロン9の中央部の1kbpを欠失させるため、および突然変異を導入するためのプライマー配列は以下である。FGFR2amplifyF:ggctgccctacctcaaggtcctgSEQIDNO14FGFR2amplifyR:ctctctcacaggcgctgggttgcagSEQIDNO15intron9partialdeletionF:gcatgccttgatagagtggcctctcctgttgaaccttcccctggagSEQIDNO16intron9partialdeletionR:ctccaggggaaggttcaacaggagaggccactctatcaaggcatgcSEQIDNO17exon9mutationfordeletingPTCF:gaggttctctatattcggaatgtTacttttgaggatgctgggSEQIDNO18exon9mutationfordeletingPTCR:cccagcatcctcaaaagtAacattccgaatatagagaacctcSEQIDNO19exon93splicesitemutationF:gcttcgtttgttttctctgccgccggtgttaacaccacggacSEQIDNO20exon93splicesitemutationR:gtccgtggtgttaacaccggcggcagagaaaacaaacgaagcSEQIDNO21exon95splicesitemutationF:ctgcatggttgacagttctgccaccaacatactgctctttctctcSEQIDNO22exon95splicesitemutationR:gagagaaagagcagtatgttggtggcagaactgtcaaccatgcagSEQIDNO23TGCATGmutationF:gggccaatttttccatgtgttcaatttacgtacgttctaggtggtgacgSEQIDNO24TGCATGmutationR:cgtcaccacctagaacgtacgtaaattgaacacatggaaaaattggcccSEQIDNO25ISEISS3mutationF:taggtggtgacgccgaatctcctgatggccSEQIDNO26ISEISS3mutationR:ggccatcaggagattcggcgtcaccacctaSEQIDNO27FGFR2スプライシングレポーターマウスの作製構築したFGFR2スプライシングレポーターベクターを直鎖化して、C57BL6卵母細胞の前核に注入した。出生後および後期胚の尾部、またはより初期の胚の卵黄嚢由来のゲノムDNAを用い、EGFPに対するプライマーを用いるPCRによってマウスの遺伝子型を判定した。実験はすべて、東京医科歯科大学の動物実験委員会によって認証されたプロトコール承認番号0070220、0080179および0090084に従って行った。細胞培養およびトランスフェクションラットのAT3およびDT3前立腺癌細胞株は、DrGarciaBlancoおよびDrCarsteinに寄贈いただいた。10ウシ胎仔血清FCSを加えたDulbecco改変イーグル培地DMEM中で細胞を維持し、TransFectinBioRadを用いてベクターをトランスフェクトした。内因性Fox2に対するノックダウン実験にはステルスsiRNAを用い、これは、LipofectamineRNAiMAXInvitrogenを用いてトランスフェクトした。顕微鏡検査レポータートランスジェニックマウスの胚全体の蛍光画像を、電荷結合素子CCDカメラDP71、Olympusを備えた蛍光顕微鏡MZ16FA、Lecia下で取り込んだ。本発明者らはまた、切片化したトランスジェニック胚の蛍光画像を取り込むために共焦点顕微鏡FluoviewFV1000、Olympusも用い、取り込んだ画像はMetamorphMolecularDevicesによって加工処理した。培養細胞の蛍光画像、およびインサイチューハイブリダイゼーションを示す明視野画像は、CCDカメラDP71、Olympusを備えたNikonEclipseE600顕微鏡を用いることによって取り込んだ。RTPCR全RNAおよびRTPCRは以前に記載された通りに行った[KuroyanagiHetalNatMethods3909915TakeuchiAetalEurJNeurosci1016131620]。すべてのスプライシングバリアントの正体をシーケンシングによって確認した。2100BioAnalyzerをAgilentDNA1000キットAgilentTechnologyとともに用いてPCR産物の量を測定し、定量解析は3回を上回る独立した実験にて行った。RTPCRアッセイに用いたプライマー配列を以下に列挙する。RTPCRアッセイに用いたプライマー配列は以下である。レポーターFGFR2F5GGCCTTTGCAGGGCTGGC3SEQIDNO28レポーターFGFR2R5GGAGCCGTACTGGAACTGAGG3SEQIDNO29Fox1F5GGCACCGCCACACAGACAGATGA3SEQIDNO30Fox1R5TCCTGGTTGGCCTGGCACAACAG3SEQIDNO31Fox2F5CAACAACTCCTGACGCAATGGTTCAGC3SEQIDNO32Fox2R5GATTTTACGGCCCTCTACCACGGTG3SEQIDNO33ESRP1F5CAGGAGATGCCTTTATCCAGATGAAGTC3SEQIDNO34ESRP1R5CAGTATTGTAGGCCAGGCCCTG3SEQIDNO35ESRP2F5CCTACACAGCCACCATTGAAGACATTC3SEQIDNO36ESRP2R5GGTGAGGTAGCCCACAGTAGTG3SEQIDNO37インビトロでのエクソン認識アッセイT7ex9wtマウスFGFR2のイントロン8、200nt;エクソン9、145nt;およびイントロン9、105nt、イントロン8中にUGCAUGおよびISEISS3を含むT7ex9イントロン8、237nt;エクソン9、145nt;およびイントロン9、74ntおよびT7ex8wtイントロン8、200nt;エクソン8、149nt;およびイントロン9、100ntのPCR産物を、T7転写のためのDNAテンプレートとして用いた。図3Aに示したように、イントロン8中の3ssおよびイントロン9中の5ssの突然変異DNAテンプレートを突然変異レポーターベクターから調製した。RNA基質をインビトロでのT7転写によって32Pで標識した。インビトロでのスプライシング反応およびUV架橋は、Sawaによって記載された条件下で行った[SawaHShimuraYGenesDev6244254]。UV架橋によってシフトしたバンドを同定するために、U15CGGAGTGCAATG3SEQIDNO:38またはU25CAGATACTACACTTG3SEQIDNO:39に対する予熱cDNAオリゴ10マイクログラムmLをUV架橋後のRNAに添加し、U1またはU2cDNAオリゴRNA混合物を30°Cで10分間、50UmLのRNアーゼHで消化した。図5Cでは、高精製FlagFox2およびFlagESRP1をRNAに添加して、室温で5分間インキュベートした後にスプライシング反応を行い、それらがU1snRNAまたはU2snRNAのエクソン認識に与える阻害効果または活性化効果を検討した。これらの反応後に、RNAを変性PAGE解析およびオートラジオグラフィーに供した。インサイチューハイブリダイゼーションインサイチューハイブリダイゼーションは、以前に記載されたもの[TakeuchiAetalNatGenet33172176TakeuchiAOLearyDDJNeurosci2644604464]に修正を加えて行った。手短に述べると、胚を4パラホルムアルデヒドで固定し、30スクロースで凍結保護処理し、最適切削温度OCT化合物中に包埋し、20μm厚の切片として切り出した。ジゴキシゲニンで標識したアンチセンスRNAプローブを、アルカリホスファターゼを結合させたジゴキシゲニン抗体Roche由来のFab断片および5ブロモ4クロロ3インドリルリン酸BCIPニトロブルーテトラゾリウムNBT溶液によって可視化した。メチルグリーンで切片を対比染色した。以下のcDNAをリボプローブとして用いた:Fox1マウスcDNA由来の131~865bp、Fox2マウスcDNA由来の2261~2991bp、ESRP1マウスcDNA由来の1168~1708bpおよびESRP2マウスcDNA由来の208~807bp。実施例3FGFR2スプライシングレポーターシステムの作製本発明者らは、上流および下流エクソンエクソン7および10に隣接した2つの選択的エクソンエクソン8および9と、それらの間のイントロンとを含む、FGFR2遺伝子の37kbゲノム断片を用いた図6A。選択的エクソン周辺のゲノム領域のほとんどすべてを用いることにより、このレポーターシステムは、組織特異的制御に必須な制御性シスエレメントのすべてを含みかつどのスプライス部位配列およびシスエレメントが制御のために真に重要であるかを伝えることが、予想された。RFPおよびEGFPを異なる読み枠でタンデムに含むベクター中に、このゲノム断片をクローニングした[OrengoJPetalNucleicAcidsRes34e148]。このレポーターシステムにより、エクソン8が選択された場合にはEGFPを発現し、エクソン9が選択された場合にはRFPを発現する単一のレポーターベクターから、スプライシング制御がモニターできたと考えられる図6A。本発明者らは次に、2つの前立腺癌細胞株であるAT3およびDT3細胞を用いることにより、本レポーターシステムが細胞型特異的なスプライシング制御を反映できるか否かを検討した。AT3細胞は内因性FGFR2のエクソン9アイソフォームを特異的に発現する間葉型細胞であり、DT3細胞はエクソン8アイソフォームを優位に発現する上皮型細胞である[YanGetalMolCellBiol1345134522]。このレポーターシステムをこれらの2つの細胞株に導入したところ、AT3細胞はエクソン9RFPを特異的に発現し、DT3細胞はエクソン8EGFPを優位に発現した図6B。したがって本発明者らは、これらのレポーターベクターが内因性FGFR2スプライシングの細胞型特異的制御を反映すると結論づけることができた。本発明者らは次に、このレポーターからトランスジェニックマウスを作製することによって、本レポーターシステムがインビボでのFGFR2スプライシングの組織特異的制御を示しうるか否かを確認した。E145からE165までの発生段階にあるマウスにおいて、FGFR2スプライシングアイソフォームに変化が起こることは周知である。これらの段階では、未来の上皮細胞の分化が誘導され、それらはFGFR2のエクソン8アイソフォームを発現して、間葉細胞からFGF10などのモルフォゲンシグナルを受け取り始める[FinchPWetalDevDyn203223240]。トランスジェニック胚全体をE145時点で調べたところ、広範なRFPシグナルが全体にわたって検出され、特異的EGFPシグナルはひげのパターンとして、および肢端または身体の端でも検出された図6C。本発明者らはさらに、後期発生段階E165のトランスジェニック胚の一連の切片を検討することにより、詳細な発現プロファイルを評価した図6D。EGFPシグナルは皮膚および毛包球の表面上の細胞において特異的に検出され、ここに分化した上皮細胞が位置していた図6D、矢印で示す。また、EGFPシグナルは肺胞内、食道内および結腸内の上皮細胞において、胸腺上皮において、ならびに唾液腺管細胞でも検出された図6D、上方および中央のパネル内の矢印。発生中の脳海馬および末梢神経系三叉神経節では強いRFPシグナルが検出された図6D、下方パネル内の矢印。EGFPの発現パターンは、報告されたFGFR2のエクソン8の発現パターンに合致し[FinchPWetalDevDyn203223240OrrUrtregerAetalDevBiol158475486]、これにより、本発明者らのレポーターシステムがインビボでのFGFR2の内因性スプライシング制御を反映し、かつベクター中に用いたゲノム断片が相互排他的エクソンの組織特異的切り替えのために必要な制御エレメントを含むことが示された。実施例43スプライス部位の不均衡な配列は、相互排他的エクソン選択のために必須であるスプライシングレポータートランスジェニックマウスの胚において、RFPはほぼ全身にわたって発現され、EGFPは上皮細胞内で特異的に発現されていた。この発現パターンは、レポータートランスジェニックマウスにおいてエクソン9がデフォルトとして優位に選択され、上皮特異的制御因子によってエクソン8の包含が促進されうるという制御機構の可能性を示唆する。この仮説を検証するために、本発明者らはまず、その3および5スプライス部位を含む選択的エクソンの配列を比較した。これらの2つのエクソン間で同定された主な違いとは、エクソン8は、弱い3スプライス部位と、コンセンサス配列に対するいくつかのミスマッチを含むポリピリミジン部分とを有する図7A、TGTTCTAGcaSEQIDNO:40一方、エクソン9は、保存的コンセンサス配列を有する強い3スプライス部位を有する図7A、TTTTCTAGgcSEQIDNO:41という点である。それらの5スプライス部位には明らかな違いはないデータは示さず。不均衡な3スプライス部位が非上皮細胞におけるエクソン9のデフォルト選択のために必須であるか否かを検討するために、本発明者らはそれらの3スプライス部位に突然変異を導入して、スプライシング制御の変化について観察した。本発明者らは2つの型の突然変異ベクターを調製した。一方は、同一の強い方の3スプライス部位をエクソン8および9の両方に有し図7A、E8Sベクター、もう一方は、同一の弱い方の3スプライス部位をエクソン8および9の両方に有する図7A、E9Wベクター。これらのベクターをAT3およびDT3細胞にトランスフェクトして、スプライシング制御の変化をRTPCRによって検討した。WTベクターをAT3細胞に導入した場合にはそのほぼ100がエクソン9形態をとったが、DT3細胞では単一包含産物のうち45前後{345345427}がエクソン8形態をとり図7B、レーン1、4、これは、図6Bにおける蛍光の発現パターンと一致した。ナンセンス変異依存分解NMD反応を回避するため、本発明者らのスプライシングレポーターは、二重包含形態において初期早期終止コドンが生じないように設計された[ChangYFetalAnnuRevBiochem765174]。したがって本発明者らは、二重包含形態および二重スキップ形態を含むすべてのスプライシング産物をモニターすることができた。注目に値することとして、E8SベクターをトランスフェクトしたらAT3細胞のほとんどが二重包含形態を発現し、これは、2つの選択的エクソンが構成的エクソンとしてプロセシングを受けたことを意味する図7B、レーン2。この結果は、非上皮性AT3細胞において2つの相互排他的エクソンからエクソン9を単一エクソン選択するためには、エクソン8の弱い方の3スプライス部位が極めて重要であることを示している図7B、レーン2。また、これらのベクター内で、エクソン8周辺の報告されているエクソン性およびイントロン性のスプライシングサイレンサー配列は突然変異していないことから、この結果により、AT3細胞におけるエクソン8は仮定のリプレッサーによって完全にサイレンシングされるのではなく、その弱い3スプライス部位のためにWTベクター中で非エクソン配列として単に無視されているに過ぎないことも示された[CarstensRPetalMolCellBiol2073887400DelGattoFBreathnachRMolCellBiol1548254834WagnerEJetalJBiolChem2801401714027]。エクソン9の3スプライス部位を弱くするとE9Wベクター、DT3細胞における選択はほぼ完全にエクソン8に切り替わり図7B、レーン4および6、このことは、エクソン9の完全な抑制が上皮性DT3細胞におけるエクソン8包含のために重要である可能性を示している。したがって、相互排他的エクソンからの単一エクソン選択およびそれらの切り替えのためには不均衡な3スプライス部位が必須である。実施例5エクソン9の破壊はエクソン8への切り替えを引き起こす図7における結果から、非上皮性AT3細胞におけるエクソン9の単一エクソン選択のためには、エクソン8の弱い方の3スプライス部位が必須であることが示された。さらに、エクソン9の3スプライス部位を弱い方にすると、上皮性DT3細胞はエクソン8形態を効率的に選択した。これらの所見は、エクソン9の抑制によってエクソン8への切り替えが引き起こされている可能性を示唆する。この仮説を検討するために、本発明者らは、エクソン9の3および5スプライス部位の一方または両方に、抑制を模してそのスプライス部位コンセンサス配列を破壊するための突然変異を導入し、これらをAT3細胞にトランスフェクトした図8A。エクソン9の両方のスプライス部位を突然変異させた場合図8A、35ssMut、AT3細胞はエクソン8形態229および二重スキップ形態771を発現した図8B、レーン4。これらの結果から、AT3細胞におけるエクソン9の遮断は、少なくとも部分的にエクソン8への切り替えを促進することが示された。興味深いことに、この切り替えを引き起こすためには3スプライス部位の突然変異図8A、3ssMutだけで十分であった図8B、レーン2が、5スプライス部位の突然変異図8A、5ssMutは、エクソン9中のggGTにおける潜在的5スプライス部位を用いたエクソン9の異常スプライシング産物を生じさせた図8B、レーン3に矢尻で示し、模式図を右側に図示している。これらの結果により、エクソン9選択のために3スプライス部位の認識が必須であることが示され、このことは、エクソン9の認識がその3スプライス部位に依存している可能性を示唆する。この仮説を検証するために、本発明者らは、U2およびU1snRNAsnRNPの結合によるスプライス部位認識を直接モニターするためのインビトロスプライシングアッセイを行った図8C。フランキングイントロンを含む野生型および突然変異型のエクソン9に対する32P標識RNAプローブ図8Cの上方パネルを、HeLa核抽出物とのインキュベーション後にUV照射によって架橋させ、電気泳動によって分離した。図10Aに示したように、HeLa細胞は非上皮性細胞の特徴を有することが確認された。U2またはU1結合の特異性は、U2またはU1に相補的なオリゴヌクレオチドの添加、およびRNアーゼH消化によって確認された[KonarskaMMSharpPACell46845855SawaHShimuraYGenesDev6244254]図8C。スプライシング条件下で、WTRNAプローブを用いてU1およびU2snRNAの結合およびシフトが観察され、U1およびU2のバンドは一致した図8C、レーン1~4、矢印で示す。注目に値することとして、3スプライス部位の突然変異を保有するプローブは、U1およびU2の両方で、シフトしたバンドの完全消失をもたらした図8C、レーン5~8。これらの結果から、エクソン9の認識はU2snRNAの3スプライス部位への結合に全面的に依存することが示された。それとは反対に、5スプライス部位の突然変異5ss突然変異を保有するプローブではU1およびU2両方の結合が保たれ図8C、レーン9~12、これは図8B、レーン3に示されたRTPCRの結果によく一致した。これらの結果は、U2snRNAの結合がU1snRNAの結合を支持し、その結果、エクソン9中のはるかに弱い潜在的5スプライス部位がその5ss突然変異の際に用いられたことを示唆する図8B、レーン3および図8C、レーン12、星印を付した矢尻で示す。これらの所見は、非上皮性細胞におけるエクソン9の選択的使用がなぜその3スプライス部位の相対的強度に依存しているかを説明することができる。図12A、非上皮性制御または間葉性制御に示されたモデルを提唱しうるであろう。実施例6エクソン9認識のためのサイレンシングエレメントの同定図12A、非上皮性制御または間葉性制御に示されているように、非上皮性細胞におけるエクソン9の単一エクソン選択のためには不均衡な3スプライス部位が必須であり、エクソン9の認識はその3スプライス部位に依存的である。また、このエクソン9の3スプライス部位の欠失は、エクソン8への切り替えも部分的に引き起こした。これらの結果は、上皮細胞においてエクソン8への切り替えを引き起こす、エクソン9に対するサイレンサーの存在を示唆している。この仮説を検証するために、本発明者らはまず、エクソン9の3スプライス部位の近傍に位置する抑制性シスエレメントのスクリーニングを行い、高度に保存されている2つの配列、すなわちイントロン8中のUGCAUG配列およびISEISS3イントロン性スプライシングエンハンサーサイレンサー3を取り出したが、これらはいずれもエクソン9に対するサイレンシング性シスエレメントであることが報告されている[BaraniakAPetalMolCellBiol2612091222HovhannisyanRHCarstensRPMolCellBiol25250263]図9A。これらの2つのシスエレメントがエクソン9のサイレンシングに必須であるか否かを検討するために、本発明者らはUGCAUGおよびISEISS3の一方または両方のそれらのレポーターに突然変異を導入し、上皮性DT3細胞にトランスフェクトした。本発明者らはまず、エクソン9のリプレッサーであることが報告されているFoxのRNA結合タンパク質への結合を妨害するために、UACGUACGUGSEQIDNO:43をUGCAUGCAUGSEQIDNO:42で置換した[BaraniakAPetalMolCellBiol2612091222]。すると、DT3細胞におけるエクソン8選択の比率は2分の1に低下した447から219、図9B、レーン2。次に本発明者らは、いくつかのジヌクレオチドGU配列を含む85bp配列である、ISEISS3を欠失させた。ISEISS3の欠失により、エクソン8包含の比率は4分の1まで低下した447から124、図9B、レーン3。これらのエレメントの両方を突然変異させると、DT3細胞はもはやエクソン8を選択することができず、すべてのスプライシング産物がエクソン9形態になった図9B、レーン4。これらの結果は、おそらくその3スプライス部位を介してエクソン9をサイレンシングすることによってエクソン8を選択するために、DT3細胞がこれらのシスエレメントの両方を用いることを示している。実施例7エクソンを切り替えるためのトランス作用因子の制御機構図9からの結果により、エクソン8の選択のためにはUGCAUGおよびISEISS3の両方が必要かつ十分であることが示唆される。以前の研究により、Fox2はイントロン8中のUGCAUGを通してエクソン8包含を促進することが示されている[BaraniakAPetalMolCellBiol2612091222]。また、cDNAライブラリースクリーニングによる最近の研究により、ISEISS3への結合を通してエクソン8包含を媒介する上皮性スプライシング制御タンパク質ESRP1およびESRP2も同定されている[WarzechaCCetalMolCell33591601]。このため、本発明者らは、Fox1、Fox2、ESRP1およびESRP2がエクソン9からエクソン8への切り替えを促進するか否かを検討した。本発明者らはまず、AT3細胞とDT3細胞との間でこれらのRNA結合タンパク質の発現レベルをRTPCRによって検討して比較した。Fox2は両方の細胞株で同程度のレベルで発現されたが、上皮型DT3細胞ではFox1の発現は検出不能であり図9C、ESRP1およびESRP2の両方が特異的に発現された図9C。UGCAUGおよびISEISS3の両方がエクソン8の選択のために必須なシスエレメントであるという所見を考慮すると図9B、広く発現されるFox2はエクソン8包含に関して上皮特異的ESRP1およびESRP2と協働する可能性がある。この仮説を検証するために、本発明者らは、それらのFGFR2スプライシングレポーターを、Fox1、Fox2、ESRP1もしくはESRP2またはこれらの組み合わせとともに、非上皮性細胞の特徴を有するHeLa細胞にトランスフェクトした図10A、レーン1。Fox1またはFox2をHeLa細胞に導入したところ、エクソン8の選択が用量依存的な様式で増加し、それぞれ10図10A、レーン2~4または40図10A、レーン5~7に達した。ESRP1またはESRP2を導入した場合にもエクソン8の選択は用量依存的な様式で増加し、90超に達した図10A、それぞれレーン8~10および15~17。HeLa細胞は内因性Fox2をAT3細胞と類似した様式で発現するため図10A、レーン1、本発明者らはESRP1またはESRP2をFox2ノックダウン条件下で導入し、ESRP1またはESRP2と内因性Fox2との協調効果について評価した。Fox2のノックダウン効率はmRNAレベルでは80を上回った平均812。内因性Fox2のノックダウンはESRP1またはESRP2によって促進されるエクソン8選択の比率を低下させ、最大低下率はそれぞれ24351~110図10A、レーン8対レーン11または23559~326、レーン15対レーン18であった。Fox2およびESRP1の両方をトランスフェクトした場合、エクソン8包含の比率は、ESRP1の単独トランスフェクションで得られたものと同程度であった図10A、レーン21~24。これらの結果は、導入されたESRPが内因性Fox2とともにエクソン8包含を促進することを示し、これは、Fox2およびESRPがエクソン8包含のために共に協調して作用することを示唆する。これらの結果は、Fox1、Fox2、ESRP1もしくはESRP2、またはFox2およびESRP1の両方をコトランスフェクトしたスプライシングレポーターからの蛍光によっても確認された図10B。ESRP1またはESRP2の過剰発現は色を赤色から緑色に変化させたが、Fox1またはFox2のみが色変化に与える影響はそれより小さかった。Fox2およびESRP1のコトランスフェクションは、相互排他的エクソンによってコードされるタンパク質の切り替えを反映した色の切り替えに対して最大の影響を及ぼした。本発明者らは続いて、Fox2およびESRP1によるエクソン切り替えがイントロン8中のUGCAUGおよびISEISS3に依存するか否かを検証した。本発明者らは、UGCAUG、ISEISS3、またはこの両方を突然変異させたレポーターベクターにおけるFox2およびまたはESRP1の過剰発現試験を行って、FoxおよびESRPによって引き起こされるエクソン切り替えがそれぞれUGCAUGおよびISEISS3に左右されることを確認した図13。これらの結果から、FoxおよびESRPは、エクソン9の近傍に位置するUGCAUGおよびISEISS3というシスエレメントを通して、エクソン8から9への切り替えを協調的に促進することが示された。次に本発明者らは、FoxおよびまたはESRPがエクソン9認識の妨害を通してエクソン9からエクソン8への切り替えを引き起こすのかどうかを検証した。本発明者らはこれを、UGCAUGおよびISEISS3部位を含むイントロンを有するエクソン9の32P標識RNAプローブ図10C、上方パネル、ならびに、同じ区間のエクソン8RNAプローブを用いた、インビトロでのスプライシング条件下で検討した。エクソン9プローブをHeLa核抽出物とのインキュベーション後にUV照射によって架橋させ、電気泳動によって分離したところ、図8Cと同様、U1およびU2の架橋によってシフトしたバンドが一致して観察された図10C、レーン2、矢印で示す。しかしエクソン8プローブでは、U1によってシフトしたバンドのみが観察され図10C、レーン8、矢印で示す、RNアーゼH消化に関してはデータを示さず、これはおそらくその弱い方の3スプライス部位に起因すると考えられた。組換えFox2またはESRP1タンパク質をエクソン9プローブとともに添加したところ、U1およびU2snRNAによりシフトしたバンドは減少し図10C、それぞれレーン4および5、Fox2およびESRP1タンパク質の両方の添加によってほとんど消失した図10C、レーン6。しかし、エクソン8プローブを用いると、Fox2またはおよびESRP1の抑制効果も活性化効果もみられなかった図10C、レーン9~12。これらのデータは、FoxおよびESRPの両方がインビトロでのエクソン9認識を妨害することを示している。図10および図13の結果を総合すると、FoxおよびESRPは、UGCAUGおよびISEISS3を通したその3スプライス部位に起因するエクソン9の認識を妨害し、エクソン8への切り替えを促進したことが示される。図12A、上皮性制御に示されたモデルを提唱しうるであろう。実施例8FoxおよびESRPの発現プロファイルはインビボでのエクソン8EGFPと一致するUGCAUGおよびISEISS3を介したFoxおよびESRPによるエクソン9のその3スプライス部位からの認識の妨害により、エクソン8への切り替えが促進されることが、インビトロ試験によって示された。残る疑問は、FoxおよびESRPの発現が、インビボでの発生の際の組織特異的な様式におけるエクソン8形態の発現と一致するか否かである。本発明者らは、Fox1、Fox2、ESRP1およびESRP2の発現プロファイルを、E165でのそれらのレポータートランスジェニックマウス胚からの連続切片を用いるインサイチューハイブリダイゼーションによって検討した図11。本発明者らが図6Dで既に示したように、エクソン8EGFPの発現は左のパネルにある白の矢印で示す。隣接切片を用いて行ったインサイチューハイブリダイゼーションにおいて、Fox1mRNAはこの段階の胚全体にわたって広範に検出され、その発現は上皮組織に局在するエクソン8EGFPシグナルと一致した黒の矢印で示す。しかし、EGFPシグナルが観察された組織ではFox2が検出されなかった一方、同じ切片中の神経組織および筋肉ではFox2の強いシグナルが検出されたデータは示さず。ESRP1およびESRP2の発現は上皮組織で特異的に検出され黒の矢印で示す、これらの発現は発生段階の際のエクソン8EGFPシグナルとほぼ完全に重なり合った。インビボでのこれらの所見は、組織特異的因子ESRPが全身的に発現されるFoxファミリーと共に作用してエクソン8包含を促進するという、図12Aにおける上皮性制御モデルを裏づけるものである。実施例9被験化合物が哺乳類多細胞生物において特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法被験化合物が哺乳類多細胞生物において特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼすか否かを試験するための方法の戦略は、図14に示されている。該方法のために用いたレポータータンパク質はGFPおよびFRPである。該方法の結果は表41~422に示されている。これらの結果は、特定の遺伝子の選択的スプライシングに影響を及ぼす化合物が、本発明の方法によって実際に単離されていることを実証している。表42は表41の続きである。表43は表42の続きである。表44は表43の続きである。表45は表44の続きである。表46は表45の続きである。表47は表46の続きである。表48は表47の続きである。表49は表48の続きである。表410は表49の続きである。表411は表410の続きである。表412は表411の続きである。表413は表412の続きである。表414は表413の続きである。表415は表414の続きである。表416は表415の続きである。表417は表416の続きである。表418は表417の続きである。表419は表418の続きである。表420は表419の続きである。表421は表420の続きである。表422は表421の続きである。産業上の利用可能性多色蛍光レポーターは、培養細胞および生きている生物における選択的スプライシングのパターンを単一細胞分解能で可視化するために有用なツールである。多色レポーターは、選択的スプライシングの制御に関与するシスエレメントおよびトランス作用因子の探索のため、ならびにスプライシングパターンに影響を及ぼす化学物質のスクリーニングのために利用されている。本発明において、本発明者らは、線虫セノラブディティスエレガンスCaenorhabditiselegans、培養細胞およびマウス用の蛍光選択的スプライシングレポーターミニ遺伝子をどのように構築するのかを記載している。ミニ遺伝子の構築は部位指定組換えに基づいており、別々のベクター中にあるプロモーター、タグタンパク質cDNA、関心対象のゲノム断片、蛍光タンパク質cDNA、および3カセットなどのモジュール式DNA断片を組み立てることによって、さまざまなミニ遺伝子を容易に構築することができる。本発明者らはまた、蛍光選択的スプライシングレポーターの設計において考慮すべき点も記載している。このスプライシングレポーターシステムは、理論的にはあらゆる他の生物に対して適用可能である。