温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含む遺伝子改変された水疱性口内炎ウイルスであって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該VSV。病原性が神経毒性である、請求項1に記載のVSV。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である、請求項1に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している、請求項3に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項3に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項3に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項3に記載のVSV。該N遺伝子が野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされており、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gは付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項3に記載のVSV。3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5および3PMNGL5からなる群より選択される突然変異させたゲノムを含み、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項3に記載のVSV。該突然変異させたゲノムが3PMNGL5である、請求項9に記載のVSV。該突然変異させたゲノムが3PNMGL5である、請求項9に記載のVSV。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、アンビセンスRNA突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、遺伝子欠失突然変異、遺伝子挿入突然変異または点突然変異である、請求項9に記載のVSV。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100倍大きいLD50を有する、請求項1に記載のVSV。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも1000倍大きいLD50を有する、請求項1に記載のVSV。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも10000倍大きいLD50を有する、請求項1に記載のVSV。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100000倍大きいLD50を有する、請求項1に記載のVSV。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異および非細胞変性M遺伝子突然変異である、請求項1に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している、請求項17に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項17に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項17に記載のVSV。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項17に記載のVSV。該M遺伝子非細胞変性突然変異がM遺伝子のメチオニン33およびメチオニン51における突然変異である、請求項17に記載のVSV。突然変異させたゲノム3NPMGL5または3NPMGL5を含む、請求項17に記載のVSV。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、遺伝子欠失突然変異、遺伝子挿入突然変異、G遺伝子挿入突然変異、Gステム突然変異または点突然変異である、請求項17に記載のVSV。該2つの突然変異がN遺伝子温度感受性突然変異およびL遺伝子温度感受性突然変異である、請求項1に記載のVSV。突然変異させたゲノム3NPMGL5を含む、請求項25に記載のVSV。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である、請求項25に記載のVSV。突然変異の1つの種類がGステム突然変異である、請求項1に記載のVSV。温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変されたVSVベクターであって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該VSVベクター。病原性が神経毒性である、請求項29に記載のベクター。該外来RNAがオープンリーディングフレームである、請求項29に記載のベクター。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である、請求項29に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している、請求項32に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項32に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項32に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項32に記載のベクター。該N遺伝子が野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされており、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gは付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項32に記載のベクター。3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5および3PMNGL5からなる群より選択される突然変異させたゲノムを含み、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項32に記載のベクター。該突然変異させたゲノムが3PMNGL5である、請求項38に記載のベクター。該突然変異させたゲノムが3PNMGL5である、請求項38に記載のベクター。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子欠失突然変異、遺伝子挿入突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である、請求項38に記載のベクター。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100倍大きいLD50を有する、請求項32に記載のベクター。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも1000倍大きいLD50を有する、請求項32に記載のベクター。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも10000倍大きいLD50を有する、請求項32に記載のベクター。4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVが、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100000倍大きいLD50を有する、請求項32に記載のベクター。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌Haemophilus遺伝子、クラミジア菌Chlamydia遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項32に記載のベクター。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項46に記載のベクター。該HIV遺伝子がgagである、請求項47に記載のベクター。突然変異させたゲノムが3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55または3PMNGLgag55である、請求項48に記載のベクター。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異および非細胞変性M遺伝子突然変異である、請求項29に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項50に記載のベクター。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項50に記載のベクター。該M遺伝子非細胞変性突然変異がM遺伝子のメチオニン33およびメチオニン51における突然変異である、請求項50に記載のベクター。突然変異させたゲノム3NPMGL5または3NPMGL5を含む、請求項50に記載のVSV。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、または遺伝子欠失突然変異である、請求項50に記載のベクター。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌Haemophilus遺伝子、クラミジア菌Chlamydia遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項50に記載のベクター。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項56に記載のベクター。該HIV遺伝子がgagである、請求項57に記載のベクター。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55または3NPMGLgag55である、請求項58に記載のベクター。該2つの突然変異がN遺伝子温度感受性突然変異およびL遺伝子温度感受性突然変異である、請求項29に記載のベクター。突然変異させたゲノム3NPMGL5を含む、請求項60に記載のベクター。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である、請求項60に記載のベクター。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌Haemophilus遺伝子、クラミジア菌Chlamydia遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項60に記載のベクター。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項63に記載のベクター。該HIV遺伝子がgagである、請求項64に記載のベクター。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55である、請求項65に記載のベクター。該2つの突然変異がGステム突然変異および遺伝子シャフリング突然変異である、請求項29に記載のベクター。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5である、請求項67に記載のベクター。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が点突然変異、温度感受性突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である、請求項68に記載のベクター。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌Haemophilus遺伝子、クラミジア菌Chlamydia遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項67に記載のベクター。温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された少なくとも1つの外来RNA配列を含む遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を含む免疫原性組成物であって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該免疫原性組成物。病原性が神経毒性である、請求項71に記載の免疫原性組成物。該外来RNAがオープンリーディングフレームである、請求項71に記載の免疫原性組成物。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である、請求項71に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している、請求項74に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項74に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項74に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項74に記載の免疫原性組成物。該N遺伝子が野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされており、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gは付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項74に記載の免疫原性組成物。3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5および3PMNGL5からなる群より選択される突然変異させたゲノムを含み、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、Gはカルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である、請求項74に記載の免疫原性組成物。該突然変異させたゲノムが3PMNGL5である、請求項80に記載の免疫原性組成物。該突然変異させたゲノムが3PNMGL5である、請求項80に記載の免疫原性組成物。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子欠失突然変異、遺伝子挿入突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である、請求項80に記載の免疫原性組成物。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項71に記載の免疫原性組成物。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項84に記載の免疫原性組成物。該HIV遺伝子がgagである、請求項85に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノムが3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55または3PMNGLgag55である、請求項86に記載の免疫原性組成物。該組成物が静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、直腸、鼻内、頬、膣および生体外exvivoからなる群より選択される経路により投与される、請求項71に記載の免疫原性組成物。該2つの突然変異が切断型G遺伝子突然変異および非細胞変性M遺伝子突然変異である、請求項71に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質がカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している、請求項89に記載の免疫原性組成物。該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質が1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する、請求項89に記載の免疫原性組成物。該M遺伝子非細胞変性突然変異がM遺伝子のメチオニン33およびメチオニン51における突然変異である、請求項89に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノム3NPMGL5または3NPMGL5を含む、請求項89に記載の免疫原性組成物。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、または遺伝子欠失突然変異である、請求項89に記載の免疫原性組成物。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項89に記載の免疫原性組成物。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項95に記載の免疫原性組成物。該HIV遺伝子がgagである、請求項96に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55または3NPMGLgag55である、請求項97に記載の免疫原性組成物。該2つの突然変異がN遺伝子温度感受性突然変異およびL遺伝子温度感受性突然変異である、請求項71に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノム3NPMGL5を含む、請求項99に記載の免疫原性組成物。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である、請求項99に記載の免疫原性組成物。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項99に記載の免疫原性組成物。HIV遺伝子がgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択される、請求項102に記載の免疫原性組成物。該HIV遺伝子がgagである、請求項103に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55である、請求項104に記載の免疫原性組成物。該2つの突然変異がG突然変異および遺伝子シャフリング突然変異である、請求項71に記載の免疫原性組成物。突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5である、請求項106に記載の免疫原性組成物。ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異が点突然変異、温度感受性突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である、請求項106に記載の免疫原性組成物。該外来RNAがHIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項108に記載のベクター。現在知られているVSVベクター推定上弱毒化されていようと、いるまいとは、小動物および非ヒト霊長類神経毒性モデルを用いて試験すると、許容できないレベルの残留毒性を有していた。免疫原性組成物用ベクター、遺伝子治療ベクター、等として使用するためのVSVベクターの開発は、動物神経毒性モデルにおいて病原性が最小または検出不能レベルであるVSVベクターを必要とする。したがって、現在、ウイルスベクターの技術分野では、哺乳動物において大幅に減少させたまたは消失させた病原性を有する、遺伝子改変された、弱毒化VSV突然変異体を同定する必要がある。本発明は、概括的には、水疱性口内炎ウイルスの相乗的弱毒化に関する。より具体的には、本発明は、VSVベクターの哺乳動物における病原性を相乗的に減衰させる、組み合わせた突然変異の種類の同定及びその免疫原性組成物に関する。したがって、特定の実施形態においては、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含む遺伝子改変されたVSVであって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該VSVに関する。1つの特定の実施形態において、VSV病原性はさらに神経毒性と規定される。別の実施形態において、突然変異の種類は、温度感受性突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異である。1つの特定の実施形態において、該2つのVSV突然変異は、切断型G遺伝子突然変異以下、Gと記載するおよびN遺伝子シャフリング突然変異すなわち、VSVの遺伝子の順序において、N遺伝子がその野生型における3プロモーター近位の第1の位置からより遠位に移動させられることである。別の実施形態においては、切断型G遺伝子によってコードされるVSVGタンパク質は、カルボキシ末端アミノ酸の最後の20個を欠失している以下、Gと記載する。さらに別の実施形態においては、切断型G遺伝子によってコードされるVSVGタンパク質は、カルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している以下、Gと記載する。さらに別の実施形態においては、VSVN遺伝子は、野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされており、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gは付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である。特定の実施形態においては、VSVは、突然変異させたゲノム3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5または3PMNGL5を含み、ここでNはヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子であり、Pはリンタンパク質をコードする遺伝子であり、Mはマトリックスタンパク質をコードする遺伝子であり、Gは1個のアミノ酸からなる細胞質尾部領域を有する付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、Gは9個のアミノ酸からなる細胞質尾部領域を有する付着糖タンパク質をコードする遺伝子であり、そしてLはRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質をコードする遺伝子である。1つの特定の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは3PMNGL5である。別の特定の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは3PNMGL5である。別の実施形態において、VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である。別の実施形態においては、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された改変されたVSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100倍大きいLD50を有する。特定の別の実施形態においては、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも1000倍大きいLD50を有する。さらに別の実施形態においては、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも10000倍大きいLD50を有する。さらに別の実施形態においては、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100000倍大きいLD50を有する。本発明の別の実施形態においては、該2つのVSV突然変異は、切断型G遺伝子突然変異および非細胞変性M遺伝子突然変異である。特定の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインまたは9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する。別の実施形態において、M遺伝子非細胞変性突然変異以下、Mと記載は、Mタンパク質の第33位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異および第51位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異である。1つの特定の実施形態において、VSVは突然変異させたゲノム3NPMGL5または3NPMGL5を含む。別の実施形態において、VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、遺伝子欠失突然変異、遺伝子挿入突然変異、G遺伝子挿入突然変異、Gステム突然変異または点突然変異である。セクションA3に後述するように、VSVのG、M、N、PまたはL遺伝子のうち任意のもののts突然変異は、本発明の独立した突然変異の種類と規定される。したがって、本発明の特定の実施形態においては、該2つのVSV突然変異はtsN遺伝子突然変異以下、Nと記載およびtsL遺伝子突然変異以下、Lと記載である。1つの特定の実施形態において、VSVは突然変異させたゲノム3NPMGL5を含む。別の特定の実施形態において、VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。特定の実施形態において、該2つのVSV突然変異はGステム突然変異以下、Gと記載および遺伝子シャフリング突然変異である。別の実施形態において、VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、ts突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。別の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変されたVSVベクターに関するものであり、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるものである。以下に定義するように、外来RNA配列とは、野生型VSVのゲノムにとって内因性ではない任意のポリヌクレオチド配列をいう。1つの特定の実施形態において、ベクター病原性はさらに神経毒性と規定される。特定の他の実施形態においては、外来RNAはオープンリーディングフレームと規定される。特定の他の実施形態においては、突然変異の種類は、ts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、該2つのVSVベクター突然変異は切断型G遺伝子突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である。別の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は、カルボキシ末端アミノ酸の最後の20個またはカルボキシ末端アミノ酸の最後の28個を欠失している。他の特定の実施形態において、VSVベクターのN遺伝子は、野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされている。1つの特定の実施形態において、VSVベクターは、突然変異させたゲノム3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5または3PMNGL5を含む。1つの特定の実施形態において、突然変異させたベクターゲノムは3PMNGL5である。別の実施形態において、突然変異させたベクターゲノムは3PNMGL5である。さらに別の実施形態において、VSVベクターはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である。特定の他の実施形態において、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該VSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100倍大きいLD50を有する。さらに別の実施形態おいて、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該改変されたVSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも1000倍大きいLD50を有する。さらに別の実施形態おいて、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該改変されたVSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも10000倍大きいLD50を有する。さらに別の実施形態おいて、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された該改変されたVSVは、4週齢雌SwissWebsterマウスに頭蓋内投与された野生型VSVよりも100000倍大きいLD50を有する。特定の別の実施形態において、VSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された外来RNAは、HIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ピロリ菌Helicobacterpylori遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカイン遺伝子、Tヘルパーエピトープ、CTLエピトープ、アジュバント遺伝子および補助因子遺伝子からなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、外来RNAは、gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択されるHIV遺伝子である。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、ここでgag遺伝子はVSVゲノムの位置1または位置5に挿入される。特定の実施形態において、突然変異させたVSVベクターのゲノムは、3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55または3PMNGLgag55である。別の実施形態において、該外来RNAは、腫瘍例:悪性腫瘍に対する防御免疫応答を誘導するために、腫瘍特異性抗原または腫瘍随伴抗原を発現する。このような腫瘍特異性または腫瘍随伴抗原としては、KS14汎癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺酸性フォスフェート、前立腺特異性抗原、黒色腫随伴抗原p97、黒色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原および前立腺特異性膜抗原が含まれるが、それらだけに限定されない。特定の他の実施形態において、該2つのVSVベクター突然変異は、G突然変異およびM突然変異である。特定の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は、1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメイン又は9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する。さらに別の実施形態において、M突然変異は、Mタンパク質の第33位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異および第51位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異である。1つの特定の実施形態において、突然変異させたゲノムは3NPMGL5または3NPMGL5である。別の実施形態において、該ベクターはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、または遺伝子欠失突然変異である。特定の実施形態において、該VSVベクターは、gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択されるHIV遺伝子を含む。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、突然変異させたゲノムは3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55または3NPMGLgag55である。さらに別の実施形態においては、該2つのVSVベクター突然変異は、N遺伝子突然変異およびL遺伝子突然変異である。1つの特定の実施形態において、該ベクターは突然変異させたゲノム3NPMGL5を含む。別の実施形態において、該ベクターはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。特定の実施形態において、該VSVベクターは、gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択されるHIV遺伝子を含む。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、突然変異させたゲノムが3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55である。セクションA1に後述するように、外来核酸配列例:HIVgagをVSVゲノムのN、P、M、GまたはL遺伝子のうち任意のものの3側に挿入することは、効果的に遺伝子シャフリング突然変異をもたらす。したがって、特定の実施形態において、該2つのVSVベクター突然変異はG突然変異および遺伝子シャフリング突然変異である。1つの実施形態において、突然変異させたベクターゲノムは3gag1NPMGL5である。別の実施形態において、VSVベクターはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、ts突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。別の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を含む免疫原性組成物であって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該免疫原性組成物に関する。別の実施形態において、突然変異の種類は、ts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される。特定の実施形態において、該2つの突然変異は、切断型G遺伝子突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である。特定の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は、1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメイン又は9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する。さらに別の実施形態において、N遺伝子は、野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされている。特定の実施形態において、免疫原性組成物のVSVベクターは、突然変異させたゲノム3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5または3PMNGL5を含む。1つの特定の実施形態において、免疫原性組成物における突然変異させたベクターゲノムは3PMNGL5である。別の実施形態において、突然変異させたベクターゲノムは3PNMGL5である。別の実施形態において、免疫原性組成物のVSVベクターは、ゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、アンビセンスRNA突然変異、点突然変異、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である。特定の別の実施形態において、免疫原性組成物における遺伝子改変されたVSVベクターに挿入された外来RNAは、HIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ピロリ菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカイン遺伝子、Tヘルパーエピトープ、CTLエピトープ、アジュバント遺伝子および補助因子遺伝子からなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、外来RNAは、gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択されるHIVタンパク質をコードする。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、ここでgag遺伝子はVSVゲノムの位置1または位置5に挿入される。別の実施形態において、免疫原性組成物のVSVベクターは、突然変異させたゲノム3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55または3PMNGLgag55を含む。特定の別の実施形態において、免疫原性組成物のVSVベクターは、G突然変異およびM突然変異を含む。別の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は、1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメイン又は9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する。別の実施形態において、M突然変異は、Mタンパク質の第33位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異および第51位におけるメチオニンからアラニンへの突然変異である。1つの特定の実施形態において、免疫原性組成物は、突然変異させたゲノム3NPMGL5または3NPMGL5である。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物のVSVベクターはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、または遺伝子欠失突然変異である。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物の遺伝子改変されたVSVベクターに挿入された外来RNAは、HIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、HIV遺伝子はgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、突然変異させたゲノムは3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55または3NPMGLgag55である。特定の他の実施形態において、該免疫原性組成物はN遺伝子突然変異およびL遺伝子突然変異を含む。1つの特定の実施形態において、該免疫原性組成物は突然変異させたVSVゲノム3NPMGL5を含む。別の実施形態において、該免疫原性組成物はゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物の遺伝子改変されたVSVベクターに挿入された外来RNAは、HIV遺伝子、HTLV遺伝子、SIV遺伝子、RSV遺伝子、PIV遺伝子、HSV遺伝子、CMV遺伝子、エプスタインバーウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子、ムンプスウイルス遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、インフルエンザウイルス遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ライノウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、ノーウォークウイルス遺伝子、トガウイルス遺伝子、アルファウイルス遺伝子、風疹ウイルス遺伝子、狂犬病ウイルス遺伝子、マールブルグウイルス遺伝子、エボラウイルス遺伝子、乳頭腫ウイルス遺伝子、ポリオーマウイルス遺伝子、メタニューモウイルス遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コレラ菌遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、ピロリ菌遺伝子、ストレプトコッカスアガラクチエ遺伝子、髄膜炎菌遺伝子、淋菌遺伝子、ジフテリア菌遺伝子、破傷風菌遺伝子、百日咳菌遺伝子、ヘモフィルス菌遺伝子、クラミジア菌遺伝子、大腸菌遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、Tヘルパーエピトープをコードする遺伝子、CTLエピトープをコードする遺伝子、アジュバントをコードする遺伝子および補助因子をコードする遺伝子からなる群より選択される。特定の実施形態において、HIV遺伝子はgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択される。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、突然変異させたゲノムは3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55ある。特定の他の実施形態において、該免疫原性組成物は、G突然変異および遺伝子シャフリング突然変異を含む。特定の実施形態において、該免疫原性組成物は突然変異させたゲノム3gag1NPMGL5を含む。別の実施形態においては、該免疫原性組成物はゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、ts突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。さらに別の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経口、直腸、鼻内、頬、膣および生体外exvivoからなる群より選択される任意の通常の経路によって投与される。別の実施形態において、本発明は、HIV感染に対して哺乳動物被験者を免疫感作する方法であって、遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を被験者に投与することを含んでなり、該ベクターは少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つのHIVRNA配列を含み、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させ、そして該HIVRNAはgag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revおよびvpuからなる群より選択される抗原をコードする、該方法に関する。特定の実施形態において、該VSVベクターは、3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55、3PMNGLgag55、3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55、3NPMGLgag55、3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55である。特定の他の実施形態において、本発明は、哺乳動物宿主を細菌感染に対して免疫感作する方法であって、遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を投与することを含んでなり、該ベクターはats突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるものであり;かつbVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された少なくとも1つの外来RNA配列を含み、ここで該RNAはコレラ菌タンパク質、肺炎連鎖球菌タンパク質、化膿連鎖球菌タンパク質、ストレプトコッカスアガラクチエタンパク質、ピロリ菌タンパク質、髄膜炎菌タンパク質、淋菌タンパク質、ジフテリア菌タンパク質、破傷風菌タンパク質、百日咳菌タンパク質、ヘモフィルス菌タンパク質、クラミジア菌タンパク質および大腸菌タンパク質からなる群より選択される細菌タンパク質をコードするものである;該方法に関する。1つの特定の実施形態において、該2つの突然変異はG突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である。特定の実施形態において、該切断型G遺伝子によってコードされるGタンパク質は、1個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメイン又は9個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメインを有する。特定の別の実施形態において、N遺伝子は、野生型VSVゲノムの3NPMGL5と比較して3PNMGL5または3PMNGL5にシャフリングされている。他の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは、3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5または3PMNGL5を含む。1つの特定の実施形態において、突然変異させたゲノムは3PMNGL5または3PNMGL5である。他の実施形態において、該VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子欠失突然変異、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子挿入突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物宿主をウイルス感染に対して免疫感作する方法であって、遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を投与することを含んでなり、該ベクターはats突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異および遺伝子欠失突然変異からなる群より選択される少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるものであり;かつbVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された少なくとも1つの外来RNA配列を含み、ここで該RNAはHIVタンパク質、HTLVタンパク質、SIVタンパク質、RSVタンパク質、PIVタンパク質、HSVタンパク質、CMVタンパク質、エプスタインバーウイルスタンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質、ムンプスウイルスタンパク質、麻疹ウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ポリオウイルスタンパク質、ライノウイルスタンパク質、A型肝炎ウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスタンパク質、C型肝炎ウイルスタンパク質、ノーウォークウイルスタンパク質、トガウイルスタンパク質、アルファウイルスタンパク質、風疹ウイルスタンパク質、狂犬病ウイルスタンパク質、マールブルグウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、乳頭腫ウイルスタンパク質、ポリオーマウイルスタンパク質、メタニューモウイルスタンパク質およびコロナウイルスタンパク質からなる群より選択されるウイルスタンパク質をコードするものである;該方法に関する。1つの特定の実施形態において、該RNAは、gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuからなる群より選択されるHIV遺伝子である。特定の実施形態において、該2つの突然変異はG突然変異およびN遺伝子シャフリング突然変異である。1つの特定の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは、3PNMGL5、3PNMGL5、3PMNGL5または3PMNGL5である。別の実施形態においては、該HIV遺伝子はgagであり、ここでgag遺伝子はVSVゲノムの位置1または位置5に挿入され、突然変異させたゲノムは、3gag1PNMGL5、3gag1PNMGL5、3gag1PMNGL5、3gag1PMNGL5、3PNMGLgag55、3PNMGLgag55、3PMNGLgag55または3PMNGLgag55である。別の実施形態において、VSVはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子欠失突然変異、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子挿入突然変異または非細胞変性M遺伝子突然変異である。哺乳動物宿主をウイルス感染に対して免疫感作する上記方法の別の実施形態においては、該2つのVSV突然変異は、G突然変異およびM突然変異である。1つの特定の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは、3NPMGL5または3NPMGL5である。別の実施形態においては、突然変異させたVSVゲノムは、3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3NPMGLgag55または3NPMGLgag55である。別の実施形態においては、VSVゲノムはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異はts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、または遺伝子欠失突然変異である。哺乳動物宿主をウイルス感染に対して免疫感作する上記方法の別の実施形態においては、該2つのVSV突然変異は、N遺伝子突然変異およびL遺伝子突然変異である。1つの特定の実施形態において、突然変異させたVSVゲノムは、3NPMGL5、3gag1NPMGL5または3NPMGLgag55である。別の実施形態において、VSVゲノムはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。哺乳動物宿主をウイルス感染に対して免疫感作する上記方法の別の実施形態においては、該2つのVSV突然変異は、G突然変異および遺伝子シャフリング突然変異である。1つの実施形態において、突然変異させたゲノムは3gag1NPMGL5である。別の実施形態において、VSVゲノムはゲノム内に第3の種類の突然変異をさらに含み、該突然変異は点突然変異、ts突然変異、遺伝子シャフリング突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、アンビセンスRNA突然変異、切断型G遺伝子突然変異、G遺伝子挿入突然変異または遺伝子欠失突然変異である。本発明の他の特徴および有利な点は、以下の詳細な説明、好ましい実施形態、および請求の範囲より明確であろう。以下に説明する本発明は、哺乳動物において大幅に減衰させた病原性、特に動物神経毒性モデルにおいて明らかにされる減衰させた神経病原性を有する水疱性口内炎ウイルスベクターの当技術分野における必要性に取り組むものである。前述のように、VSVは、それを免疫原性組成物および/または遺伝子治療のための魅力的なベクターとする多くの特徴を備えている。例えば、ヒトのVSV感染は稀であり、そして無症候であるか、または合併症を起こすことなく3~8日でおさまる穏やかなインフルエンザ様の症状によって特徴づけられる。それゆえ、VSVはヒトの病原体とは考えられない。VSVを魅力的なベクターとする他の特徴としては、細胞培養物中でたくましく複製する能力;宿主細胞DNAに組み込まれることも、遺伝子組換えを受けることも出来ないこと;複数の血清型が存在し、プライムブースト免疫感作戦略の可能性を許すこと;興味のある外来遺伝子をVSVゲノムに挿入し、ウイルス転写酵素によって豊富に発現させることが可能であること;ウイルスゲノムのcDNAコピーからの感染性ウイルスのレスキューのための高度に特化された系の開発米国特許第6033886号;米国特許第6168943号;およびヒト集団においてVSVに対する免疫があらかじめ存在することは稀であること、が含まれる。当技術分野において記述された初期の種類の弱毒化VSVベクターは、温度感受性突然変異体と呼ばれ、このts突然変異体は制限温度ではウイルス粒子を産生することができなかった。例えば、種々のVSVts突然変異体が当技術分野で公知である例えば、Hollowayetal1970Pringleetal1971Evansetal1979Pringleetal1981Moritaetal1987GopalakrishnaandLenard1985参照。さらに、別の種類の弱毒化VSV突然変異体も当技術分野において記述されており、それらにはVSVGタンパク質切断型細胞質尾部突然変異、遺伝子シャフリングまたは遺伝子順序再編成突然変異、Gステム突然変異、非細胞変性Mタンパク質突然変異、およびアンビセンスRNA突然変異が含まれる。しかしながら、上述のように、現在入手可能な弱毒化VSVベクターは、動物モデルを用いて試験すると残留毒性を保持しており、そのため、ヒト臨床試験に向けて開発するベクター候補としてふさわしくない。本明細書に詳述するように、本発明は、公知の弱毒化突然変異の種類遺伝子シャフリング突然変異、Gタンパク質の挿入および切断型突然変異、ts突然変異および他の点突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、Gステム突然変異、アンビセンスRNA突然変異、遺伝子欠失突然変異、等を2つまたはそれ以上組み合わせると、獲得される病原性弱毒化レベルに相乗効果相加効果とは対照的にを有する、という予期せぬ驚くべき観察に関する。例えば、N遺伝子シャフリング突然変異体と組み合わせると、VSVGタンパク質切断型突然変異体は、VSV増殖および神経毒性の相乗的減衰を示すことが本明細書において実証される。さらに、本発明の特定の実施形態は、他の種類の突然変異の組合せに関するものであり、それらもまたVSVの弱毒化に相乗効果を有する。それらの種類としては、ts突然変異、点突然変異、遺伝子シャフリング突然変異N、P、M、GおよびL遺伝子シャフリングを含む、Gステム突然変異、G遺伝子挿入突然変異、非細胞変性M遺伝子突然変異、切断型G遺伝子突然変異例:ct突然変異体、アンビセンスRNA突然変異および遺伝子欠失突然変異が含まれるが、これらだけに限定されない。したがって、特定の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変されたVSVベクターに関するものであり、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるものである。特定の別の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変されたVSVベクターを含む免疫原性組成物に関するものであり、ここで該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるものである。A.水疱性口内炎ウイルスの突然変異の種類上述のように、本発明の遺伝子改変されたVSVベクターは、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をそのゲノム内に含む。以下においては、突然変異種類または突然変異の種類という用語は相互交換可能に使用され、そして単数形で用いられる場合は、VSVを弱毒化するための当技術分野で公知の突然変異をいうものとする。例えば、本発明の突然変異種類は、以下のものを含むが、それらだけに限定されない:VSV温度感受性N遺伝子突然変異以下、Nと記載、温度感受性L遺伝子突然変異以下、Lと記載、点突然変異、Gステム突然変異以下、Gと記載、非細胞変性M遺伝子突然変異以下、Mと記載、遺伝子シャフリングまたは再編成突然変異、切断型G遺伝子突然変異以下、Gと記載、アンビセンスRNA突然変異、G遺伝子挿入突然変異、遺伝子欠失突然変異、等。以下においては、突然変異は、挿入、欠失、置換、遺伝子再編成またはシャフリング改変として当技術分野において公知の突然変異を含むものとする。以下においては、相乗的弱毒化という用語は、相加的弱毒化よりも大きいVSV弱毒化レベルをさすものとする。例えば、本発明によるVSVの相乗的弱毒化は、同一のVSVゲノム内に少なくとも2種類の突然変異を組合せることを含み、それによって各VSV突然変異種類単独について観察される相加的弱毒化レベルよりもはるかに大きいVSV病原性の低下をもたらす。したがって、特定の実施形態においては、VSVの相乗的弱毒化とは、少なくとも各突然変異種類単独について観察される相加的弱毒化レベルすなわち、2つの突然変異種類の合計よりも大きいLD50と定義され、ここで弱毒化レベルすなわち、LD50は小動物神経毒性モデルを用いて測定される。非限定的例としては、下記の式1がVSVの相加的弱毒化を示すとすると:1ΔaLD50ΔbLD50xLD50式中、ΔaLD50は第1の突然変異種類をゲノム内に有するVSVのLD50であり、ΔbLD50は第2の突然変異種類をゲノム内に有するVSVのLD50であり、そしてxLD50はΔaLD50およびΔbLD50の合計である。次に、少なくとも各突然変異種類単独について観察される相加的弱毒化レベルよりも大きいLD50値を有する本発明のVSV相乗的弱毒化は、式2によって示される:2ΔabLD50>ΔaLD50ΔbLD50;式中、ΔabLD50は2つの突然変異種類の組合せをゲノム内に有するVSVのLD50であり、ΔaLD50は第1の突然変異種類をゲノム内に有するVSVのLD50であり、そしてΔbLD50は第2の突然変異種類をゲノム内に有するVSVのLD50である。したがって、特定の実施形態において、VSV弱毒化の相乗性すなわち、同一VSVゲノム内に2つの突然変異種類が存在するは、2つのVSVコンストラクト各VSVコンストラクトはそのゲノム内に1つの突然変異種類を有するのLD50と比較して記述され、ここでゲノム内に2つの突然変異種類を有する該VSVの相乗的弱毒化は、ゲノム内に1つの突然変異種類を有する2つのVSVコンストラクトの相加的LD50よりも少なくとも大きいLD50と定義される例えば、表7に記載のVSVLD50値参照。別の特定の実施形態においては、VSV弱毒化の相乗性は、野生型VSVのLD50と比較して記述される。したがって、1つの実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、少なくとも野生型VSVのLD50より大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。1つの実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、野生型VSVのLD50より少なくとも10倍大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。別の実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、野生型VSVのLD50より少なくとも100倍大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。別の実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、野生型VSVのLD50より少なくとも1000倍大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。さらに別の実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、野生型VSVのLD50より少なくとも10000倍大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。特定の他の実施形態において、VSVの相乗的弱毒化は、野生型VSVのLD50より少なくとも100000倍大きいLD50と定義され、ここでLD50は動物神経毒性モデルを用いて測定される。特定のVSVベクターの50致死量LD50は、公知の試験方法および動物モデルを用いて当業者によって容易に測定される例えば、実施例1参照。したがって、特定の実施形態において、本発明は、以下に記述する少なくとも2つの異なる種類の突然変異を含む、遺伝子改変されたVSVに関する。1.遺伝子シャフリング突然変異特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、そのゲノム内に遺伝子シャフリング突然変異を含む。本明細書においては、遺伝子シャフリング、シャフリングされた遺伝子、シャフリングされた、シャフリングする、遺伝子再編成および遺伝子転位という用語は相互交換可能に使用されるものとし、そして野生型VSVゲノム順序における変化突然変異を意味するものとする。本明細書に明示するように、野生型VSVゲノムは以下の遺伝子順序を有する:3NPMGL5。3プロモーターに対するVSV遺伝子の位置が発現およびウイルス弱毒化のレベルを決定することが当技術分野で公知である米国特許第6596529号およびWertzetal1998;それぞれ参照として本明細書に特に組み入れる。VSVのG、M、N、PおよびLタンパク質をコードするヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第6596529号は、Nタンパク質をコードする遺伝子がその野生型におけるプロモーター近位の第1の位置からゲノム上の連続したより遠い位置へ転位するシャフリングされる遺伝子シャフリング突然変異それぞれN2、N3およびN4と呼ばれる3PNMGL5、3PMNGL5および3PMGNL5を記述している。したがって、特定の実施形態においては、遺伝子改変されたVSVは、そのゲノム内に遺伝子シャフリング突然変異を有する。1つの特定の実施形態における1種類の突然変異において、遺伝子改変されたVSVは、N遺伝子の転位例:3PNMGL5または3PMNGL5からなる遺伝子シャフリング突然変異を含む。ここで、外来核酸配列例:HIVgagをVSVゲノムのN、P、M、GまたはL遺伝子のうち任意のものの3側に挿入することは、上述したように、効果的に遺伝子シャフリング突然変異をもたらすことが留意されねばならない。例えば、HIVgag遺伝子をVSVゲノムの位置1に挿入すると例:3gag1NPMGL5、N、P、M、GおよびL遺伝子はそれぞれの野生型における位置からゲノム上のより遠位へ移動させられる。したがって、本発明の特定の実施形態においては、遺伝子シャフリング突然変異は、外来核酸配列をVSVゲノムのN、P、M、GまたはL遺伝子のうち任意のものの3側に挿入することを含む例:3gag1NPMGL5、3Ngag2PMGL5、3NPgag3MGL5、等。2.Gタンパク質挿入および切断型突然変異他の特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは突然変異させたG遺伝子を含み、それによってコードされるGタンパク質はその細胞質ドメインカルボキシ末端Gタンパク質の細胞質尾部領域とも呼ばれるが切断されている。細胞質ドメインのカルボキシ末端を切断するG遺伝子突然変異は、VSV出芽に影響を及ぼし、そしてウイルス産生を減衰させることが当技術分野において公知である。野生型VSVGタンパク質の細胞質ドメインは29個のアミノ酸を含むRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGKCOOH;配列番号:1。特定の実施形態において、本発明の切断型VSVG遺伝子は、細胞質ドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基の最後の28個が欠失しているGタンパク質配列番号:1に記載の29個のアミノ酸からなる野生型細胞質ドメインのうちアルギニンのみを保持しているをコードする。別の特定の実施形態において、本発明の切断型VSVG遺伝子は、細胞質ドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基の最後の20個配列番号:1に記載の29個のアミノ酸からなる野生型細胞質ドメインと比較してが欠失しているGタンパク質をコードする。他の特定の実施形態において、本発明の切断型VSVG遺伝子は、細胞質ドメイン細胞質尾部領域に1個のアミノ酸のみを含むGタンパク質をコードしており、該1個のアミノ酸は天然に存在する任意のアミノ酸である。さらに別の実施形態において、本発明の切断型VSVG遺伝子は、細胞質ドメイン細胞質尾部領域に9個のアミノ酸を含むGタンパク質をコードしており、該9個のアミノ酸は天然に存在する任意のアミノ酸である。他の特定の実施形態において、本発明の突然変異させたVSV遺伝子は、外来エピトープを表す挿入を含むGタンパク質をコードする。そのような突然変異体は当技術分野において公知である例えば、SchlehuberandRose2003参照。本明細書においては、配列番号:1に記載の野生型配列と比較して、細胞質ドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基の最後の28個を欠失しているGタンパク質をコードするG遺伝子突然変異体をGと称し、ここでGの細胞質ドメインはアミノ酸配列RCOOHを有する。本明細書においては、配列番号:1に記載の野生型配列と比較して、細胞質ドメインのカルボキシ末端アミノ酸残基の最後の20個を欠失しているGタンパク質をコードするG遺伝子突然変異体をGと称し、ここでGの細胞質ドメインはアミノ酸配列RVGIHLCIKCOOH配列番号:2を有する。したがって、本発明の特定の実施形態においては、本発明の遺伝子改変されたVSVは、突然変異させたG遺伝子を含み、それによってコードされるGタンパク質はGまたはGである。3.温度感受性および他の点突然変異本明細書において、以後、VSV温度感受性突然変異は、非許容温度においてVSV増殖を制限する、VSVゲノムにおける突然変異と定義される。例えば、本発明のVSVts突然変異体は、許容温度例:31°Cでは正常に増殖し、高力価に達するが、その増殖または再生は非許容温度例:37°Cまたは39°Cでは制限される。化学的および部位特異的突然変異誘発法によるts突然変異体の作出は、当技術分野において周知であり例えば、Pringle1970Lietal1988参照、そして多数のts突然変異体が特徴付けられ、記述されている例えば、FlamandandPringle1971FlamandandBishop1973PrintzandWagner1971GopalakrishnaandLenard1985Pringleetal1981Moritaetal1987Lietal1988Rabinowitzetal1977Lundhetal1988DalCantoetal1976Rabinowitzetal1976参照。特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVはゲノム内にts突然変異を含み、ここで該ts突然変異はG、M、N、PまたはLタンパク質をコードする核酸配列の1つ以上の突然変異である。本明細書においては、VSVのG、M、N、PまたはL遺伝子の任意のもののts突然変異は、本発明の独立した突然変異の種類と規定される。例えば、本発明の特定の実施形態において、少なくとも2つの異なる種類の突然変異この2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させるをゲノム内に含む遺伝子改変されたVSVは、第1の種類の突然変異として1つ以上のN遺伝子ts突然変異以下、Nを、そして第2の種類の突然変異として1つ以上のL遺伝子ts突然変異以下、Lを含む。非限定的例として、3NPMGL5等のゲノムを含む遺伝子改変されたVSVは、2種類の突然変異すなわち、N遺伝子突然変異およびL遺伝子突然変異を含み、また3gag1NPMGL5等のゲノムを含む遺伝子改変されたVSVは、3種類の突然変異すなわち、N遺伝子突然変異、L遺伝子突然変異、およびgag1挿入、遺伝子シャフリング突然変異を含む。他の特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVはゲノム内に点突然変異を含み、該点突然変異はN、P、M、GまたはLタンパク質をコードする核酸配列の1つ以上の突然変異であり、該突然変異は寒冷順応、融合又は細胞障害性効果の低下、等の弱毒化表現型を付与する例えば、FredericksenandWhitt1998AhmedandLyles1997参照。例えば、FredericksenandWhittは、G遺伝子の3つの弱毒化点突然変異例:D137L、E139LまたはDESSを記述しており、これらの突然変異は融合活性のpH許容限界をシフトさせる。AhmedandLylesは、M遺伝子の弱毒化点突然変異N163Dを記述しており、このMタンパク質は宿主遺伝子発現の抑制に大きな欠陥を有し、そして野生型Mタンパク質よりも高速に代謝回転した。したがって、特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、1つ以上の突然変異をゲノム内に有する。4.非細胞変性M遺伝子突然変異他の特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、そのM遺伝子内に非細胞変性突然変異を含む。VSVIndiana血清型のM遺伝子は、229個のアミノ酸からなるMマトリックスタンパク質をコードし、ここでNH2末端の最初の30個のアミノ酸はプロリンが豊富なPPPYモチーフを含む。VSVMタンパク質のPYモチーフは、VSVIndianaおよびNewJersey血清型の両方において、アミノ酸番号24~27に位置する。Jayakaretalによって、PYモチーフにおける突然変異は、ウイルス出芽の後期段階をブロックすることによってウイルス収量を低下させることが示された。したがって、特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、そのM遺伝子に非細胞変性突然変異を含み、該突然変異はコードされるMタンパク質のPPPYモチーフに存在する。最近、MmRNAがM2およびM3と呼ばれる2つの付加的タンパク質をさらにコードすることが報告された。M2およびM3タンパク質は、229個のアミノ酸からなるMタンパク質M1と呼ぶをコードするものと同一のリーディングフレーム内の下流のメチオニンから合成され、そしてM1タンパク質の最初の32個M2タンパク質または50個のアミノ酸を欠失している。Mタンパク質を発現するがM2およびM3は発現しない組換えVSVに感染した細胞は、細胞毒性効果の遅延発症を示す特定の細胞種においてが、正常なウイルス収量をもたらすことが観察された。したがって、特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、そのM遺伝子に非細胞変性突然変異を含み、該M遺伝子突然変異はM2またはM3タンパク質を発現しないウイルスをもたらす。本明細書においては、Irieetalに記載されているMタンパク質PSAPモチーフのアミノ酸突然変異例:欠失、置換、挿入、等もまた考慮されている。5.Gステム突然変異特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、そのG遺伝子に突然変異を含み、該G遺伝子にコードされるGタンパク質は、Gタンパク質外部ドメインの膜近位のステム領域Gステムタンパク質と呼ぶに突然変異を有する。該Gステム領域は、Gタンパク質のアミノ酸残基421から462までを含む。最近の研究は、Gタンパク質のGステムにおける挿入および/または欠失突然変異によるVSVの弱毒化を示した。したがって、特定の実施形態において、遺伝子改変されたVSVは、Gステム挿入、欠失、置換、またはそれらの組合せを含む。1つの特定の実施形態において、Gステム突然変異を含む本発明の遺伝子改変されたVSVベクターおよびその免疫原性組成物は、3gag1NPMGL5というゲノムを含む。6.アンビセンスRNA突然変異特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVはアンビセンスRNA突然変異を含み、ここで5アンチゲノムプロモーターは3ゲノムプロモーターの1コピーと置換されている。VSVならびに他の非分節型マイナス鎖RNAウイルスの5AGPは、3GPが転写プロモーターおよび弱い複製プロモーターとして作用するのに対し、強力な複製プロモーターとして作用する。VSV感染の通常の経過においては、アンチゲノムコピーの3~4倍優位のゲノムコピーが存在する;この比は、ラブドウイルス科の別のメンバーである狂犬病ウイルスではさらに高くなる。狂犬病ウイルスを用いた以前の研究は、5AGPを1コピーのGPと置換するアンビセンスRNA突然変異として公知と、感染細胞内でゲノムRNAコピーとアンチゲノムRNAコピーのレベルが等しくなることを示した。さらに、ゲノムの5末端に位置させたGPのコピーから外来遺伝子を発現させた。培養細胞中で連続継代させると、該アンビセンスRNA突然変異を保有する狂犬病ウイルスは、一貫して組換え野生型狂犬病ウイルスよりも10~15倍低い力価に複製されたFinkeandConzelmann1997。このような突然変異は、ウイルス複製を減衰させ、そして外来遺伝子を発現させるという両方の目的で、VSVベクターに使用されている。したがって、特定の実施形態において、遺伝子改変されたVSVはアンビセンスRNA突然変異を含む。7.遺伝子欠失他の特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVは、VSV遺伝子GまたはM、等がゲノムから削除されたウイルスからなる。例えば、Robertsetalは、Gタンパク質をコードする遺伝子全体が削除されΔG、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質によって置換されたVSVベクターを記述しており、該VSVベクターΔGHAは弱毒化された病原性を示した。B.組換え水疱性口内炎ウイルスベクター特定の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての少なくとも1つの外来RNA配列を含む、遺伝子改変された組換えVSVベクターを提供する。組換えRNAウイルスの作製方法は、当技術分野においてはレスキューまたは逆遺伝学法と呼ばれている。VSVの具体的なレスキュー法は、それぞれ参照により本明細書に組み入れる米国特許第6033886号、米国特許第6596529号およびWO2004113517に記述されている。マイナス鎖、一本鎖、非分節型RNAウイルスゲノムの転写および複製は、リボヌクレオタンパク質コアヌクレオキャプシドに作用する多量体タンパク質複合体の酵素活性によって達成される。裸のゲノムRNAは鋳型として機能することができない。そのかわり、Nタンパク質によってキャプシド形成されてヌクレオキャプシド構造体とされて始めて、これらのゲノム配列は認識される。この背景があってのみ、ゲノムおよびアンチゲノム末端プロモーター配列は認識されて、転写または複製経路が始まるのである。VSVゲノムのクローン化されたDNA等価物を適切なDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター例:T7RNAポリメラーゼプロモーターと自己開裂性リボザイム配列例:肝炎デルタリボザイムの間に配置し、これを適切な転写ベクター例:増殖可能な細菌性プラスミド中に挿入する。この転写ベクターは、容易に操作可能なDNA鋳型を提供する。ここから、RNAポリメラーゼ例:T7RNAポリメラーゼは、正確な又はほぼ正確な5および3末端を有するVSVアンチゲノムまたはゲノムの一本鎖RNAコピーを忠実に転写することができる。VSVゲノムDNAコピー、側方に位置するプロモーターおよびリボザイム配列の方向が、アンチゲノムまたはゲノムRNA等価物のどちらが転写されるかを決定する。裸の、一本鎖VSVアンチゲノム又はゲノムRNA転写物をキャプシドで包んで機能性ヌクレオキャプシド鋳型とするために必要とされるVSV特異的で、トランスに作用する支持タンパク質もまた新しいVSV子孫のレスキューに必要である:それらは、ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ随伴リンタンパク質およびポリメラーゼタンパク質である。これらのタンパク質は、活性なウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。該ポリメラーゼは、このヌクレオキャプシド鋳型を使って転写および複製を達成する必要がある。このように、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含む例えば、セクションA参照本発明の遺伝子改変弱毒化VSVは、当技術分野において公知のレスキュー法にしたがって作製される。例えば、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含む遺伝子改変されたVSVベクターは、VSVのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含む転写ベクター、およびキャプシド形成、転写および複製に必要なトランスに作用するN、PおよびLタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの単離された核酸分子を含む少なくとも1つの発現ベクターを用いて、これらのベクターの同時発現および組換えVSVの産生を可能にするに十分な条件下にある宿主細胞中で作製される。任意の適切なVSV株または血清型を本発明にしたがって用いることができる。適切なVSVとしては、VSVIndiana、VSVNewJersey、VSVChandipura、VSVIsfahan、VSVSanJuan、VSVGlasgow、等が含まれるが、それらだけに限定されない。弱毒化形態のVSVをコードするポリヌクレオチド配列に加えて、該ポリヌクレオチド配列は1つ以上の異種すなわち外来ポリヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレームをもコードしていてよい例えば、セクションC参照。異種ポリヌクレオチド配列は所望により様々であってよく、そして下記のものを含みうるが、それらだけに限定されない:補助因子、サイトカインインターロイキン等、Tヘルパーエピトープ、CTLエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または異なる微生物病原体例:ウイルス、細菌、寄生体または真菌のタンパク質、特に望ましい免疫応答を誘導可能なタンパク質。特定の実施形態において、異種ORFはHIV遺伝子例:gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、revまたはvpuを含む。1つの特定の実施形態において、該HIV遺伝子はgagであり、ここでgag遺伝子はVSVゲノムの位置13gag1NPMGL5または位置53NPMGLgag55に挿入される。異種ポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いられる作用物質を提供するためにも使用される。別の実施形態において、異種ポリヌクレオチド配列は、さらにインターロイキン12等のサイトカインをコードし、それらは組換えVSVの予防または治療特性を改善するために選択される。特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変弱毒化VSVは、通常の手段例えば、化学的突然変異誘発法によって突然変異させられる。例えば、細胞培養物中でウイルスが増殖している間に、化学的変異誘発物質を添加し、次に温度感受性および/または寒冷順応突然変異を選択するために、最適以下の温度で継代に付されたウイルスを選択し、細胞培養物中に小さいプラークを生じる突然変異体ウイルスを同定し、および異種宿主により継代し、宿主範囲突然変異の選択を行う。他の実施形態において、弱毒化突然変異は、部位特異的突然変異誘発法を用いて予め定めた突然変異を作製し例えば、セクションA参照、次にこれらの突然変異を有するウイルスをレスキューすることを含む。先に記述したように、本発明の遺伝子改変されたVSVは、少なくとも2種類の突然変異をそのゲノム内に含む。特定の実施形態においては、1つ又は2つ以上の種類の突然変異がさらに複数の突然変異を含む。例えば、二重突然変異欠失、挿入、置換、等、三重突然変異などを有するGステム突然変異種類、等である。次に、これらの弱毒化VSVベクターは、動物モデルにおける毒性の減衰についてスクリーニングされる例えば、実施例1および3参照。レスキューのための典型的必ずしも限定的ではないが状況は、ウイルスゲノムcDNAを含む転写ベクターからのアンチゲノムまたはゲノム一本鎖RNAの転写を導くためにT7ポリメラーゼが存在する、適切な哺乳動物細胞環境を含む。同時転写的に、またはその少し後で、このウイルスアンチゲノムまたはゲノムRNA転写物は、ヌクレオキャプシドタンパク質によってキャプシド形成されて機能性の鋳型とされ、そして必要とされるウイルス特異的トランス作用性タンパク質をコードする、同時トランスフェクションされた発現プラスミドから同時に生成される必要なポリメラーゼ成分によって使われる。これらの現象および過程は、ウイルスmRNAの欠くことのできない転写、複製、および新しいゲノムの増幅、ならびにそれによる新規VSV子孫の産生、すなわちレスキューをもたらす。上記転写ベクターおよび発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における発現のために設計されたプラスミドベクターである。キャプシド形成、転写および複製に必要なトランス作用性タンパク質をコードする少なくとも1つの単離された核酸分子を含む発現ベクターは、これらのタンパク質を同一の発現ベクターから、または少なくとも2つの異なるベクターから発現する。これらのベクターは、基本的レスキュー法より一般に公知であり、そして本発明の改善された方法に用いるためにそれらのベクターを変更する必要はない。VSV等のウイルスのレスキューを実施するためのさらなる技法が、米国特許第6673572号および米国暫定特許第60477389号に記載されている。これらは参照により本明細書に組み入れる。VSVのレスキューに用いる宿主細胞は、組換えVSVの産生に必要な必須構成要素のベクターからの発現を可能とする細胞である。そのような宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、そして好ましくは脊椎動物細胞から選択することができる。一般に、宿主細胞はヒト胎児腎細胞例:293等のヒト細胞に由来する。ベロ細胞および多数の他の細胞種も宿主細胞として用いうる。以下は適切な宿主細胞の非限定的例である:ヒト二倍体一次細胞株例:WI38およびMRC5細胞;サル二倍体細胞株例:FRhL胎児アカゲザル肺細胞;準一次連続継代性細胞株例:AGMKアフリカミドリザル腎細胞;ヒト293細胞;および他の使用可能な細胞株、例えば、CHO、MDCK、一次ニワトリ胚繊維芽細胞。特定の実施形態においては、トランスフェクションを容易にする試薬を加えて、細胞によるDNA取り込みを増大させる。これらの試薬の多くは、当技術分野において公知である例:リン酸カルシウム。LipofectaceおよびEffecteneは一般的な例である。LipofectaceおよびEffecteneは、両方ともカチオン性脂質である。これらは両方ともDNAを被覆し、細胞によるDNA取り込みを増大させる。LipofectaceはDNAを取り囲むリポソームを形成し、他方、EffecteneはDNAを被覆するがリポソームは形成しない。レスキューされた弱毒化VSVは、次に、所望の表現型温度感受性、寒冷順応、プラーク形態、ならびに転写および複製の減衰について、まずinvitro手段によって試験される。突然変異はまた、必要とされるトランス作用性キャプシド形成およびポリメラーゼ活性が野生型又はワクチンヘルパーウイルスによって、または遺伝子特異的弱毒化突然変異を有するN、Pおよび異なるL遺伝子を発現するプラスミドによって提供される、ミニレプリコン系を用いて試験される。弱毒化VSVはまた、動物神経毒性モデルにおける相乗的弱毒化についてもinvivoで試験される。例えば、神経毒性検出のためにはマウスおよび/またはフェレットモデルが確立されている。すなわち、10匹のマウスからなる群に、予測されるLD50値動物の50にとって致死的な量にまたがる範囲の各濃度のウイルスを頭蓋内投与する。例えば、予測されるウイルスのLD50が103104pfuの範囲内にある場合は、102、103、104および105pfuの濃度でウイルスを含むIC接種物が用いられる。ウイルス調製物は、精製したウイルスストックをPBSで連続希釈することにより調製する。次に、頭蓋骨の頂部からマウスに必要用量50100μlのPBSで希釈されているを注入する。動物を体重減少、病的状態および死亡について毎日モニターする。次に、ウイルスベクターのLD50を、試験した濃度範囲全体にわたるマウスの累積死亡から計算する。C.異種核酸配列および抗原特定の実施形態において、本発明はVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された、独立した転写単位としての外来RNA配列をさらに含む、相乗的に弱毒化されたVSVを提供する。ここで、該外来RNA配列マイナス鎖に存在するは、VSVに感染した宿主細胞中で発現されうるタンパク質の産生を導く。この組換えゲノムは、該タンパク質をコードする外来DNAをVSVcDNAに挿入することによって最初に作製される。特定の実施形態においては、免疫原性抗原これは単独で、または同一の若しくは異なるVSVによって発現される他の抗原と組み合わせて、融合または非融合タンパク質として本発明の相乗的に弱毒化された組換えVSV中で発現されると疾患又は障害に対する予防又は治療免疫をもたらすをコードする任意のDNA配列が単離され、そして本発明の免疫原性組成物に用いるためのVSVベクターに組み込まれる。特定の実施形態において、相乗的に弱毒化された組換えVSVによる抗原の発現は、病原性微生物に対する免疫応答を誘導する。例えば、抗原は、疾患または障害の原因物質である細菌、寄生体、ウイルスまたは真菌に見出される抗原の免疫原性または抗原性を示しうる。1つの実施形態においては、ヒト病原体の抗原または他の興味のある抗原の抗原性または免疫原性を示す抗原が用いられる。抗体との結合を検出することにより免疫原性または抗原性を決定するためには、当技術分野において公知の種々のイムノアッセイが用いられる。それらには、以下の技法を用いる競合および非競合アッセイ系が含まれるが、それらだけに限定されない:ラジオイムノアッセイ、ELISA酵素結合イムノソルベントアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射線検定法、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散法、insituイムノアッセイ例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、凝集アッセイ例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光法、プロテインAアッセイ、免疫電気泳動法、中和アッセイ、等。1つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することにより測定される。別の実施形態においては、二次抗体または試薬の一次抗体との結合を測定することによって、一次抗体が検出される。さらなる実施形態においては、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多数の手段が、当技術分野において公知である。免疫原性を検出するための1つの実施形態において、T細胞媒介応答は、標準的方法例えばinvitroまたはinvivo細胞毒性アッセイ、四量体アッセイ、エリスポットアッセイ、またはinvivo遅延型過敏アッセイ等によってアッセイされる。相乗的に弱毒化されたVSVここでは外来RNAが、寄生体若しくは細菌の抗原、またはそのエピトープを含むその誘導体の産生を導くによって発現されるエピトープ抗原決定基を発現する寄生体および細菌は、表1に記載のものを含むが、それらだけに限定されない。別の実施形態において、抗原は、線虫によって引き起こされる障害から防御するため、線虫の抗原のエピトープを含む。別の実施形態においては、マラリア原虫エピトープ組換えVSVによって発現されると、脊椎動物宿主中で免疫原性を示すをコードする任意のDNA配列が単離され、本発明にしたがってVSVDNAに挿入される。DNA源として役立つマラリア原虫の種は、ヒトマラリア寄生体である熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫および動物マラリア寄生体であるPberghei、Pyoelii、PknowlesiおよびPcynomolgiを含む。さらに別の実施形態においては、抗原はコレラ毒素のβサブユニットのペプチドを含む。相乗的に弱毒化されたVSVここでは外来RNAが、ウイルスの抗原、またはそのエピトープを含むその誘導体の産生を導くによって発現されるエピトープを発現するウイルスは、表2に記載のものを含むが、それらだけに限定されない。表2は、そのようなウイルスを科ごとに記載しているが、これは便宜のためであって限定するためではない。特定の実施形態において、弱毒化VSVによる宿主の感染の結果発現される、外来配列によってコードされる抗原は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素;ヒト呼吸器多核体ウイルスG糖タンパク質;麻疹ウイルス赤血球凝集素または単純ヘルペスウイルスII型糖タンパク質gDの抗原性または免疫原性を示す。弱毒化VSVによって発現される他の抗原としては、下記の抗原の抗原性または免疫原性を示すものが含まれるが、それらだけに限定されない:ポリオウイルスIVP1;HIVIのエンベロープ糖タンパク質;B型肝炎表面抗原;ジフテリア毒素;ストレプトコッカス24Mエピトープ、SpeA、SpeB、SpeCおよびC5aペプチダーゼ;および淋菌ピリン。他の実施形態において、弱毒化VSVによって発現される抗原は、仮性狂犬病ウイルスg50、仮性狂犬病ウイルスII、仮性狂犬病ウイルスgIII、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質H、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質E、伝染性胃腸炎糖タンパク質195、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質38、ブタパルボウイルスキャプシドタンパク質、ブタ赤痢菌感染防御抗原、ウシウイルス性下痢症糖タンパク質55、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ赤血球凝集素、またはブタインフルエンザノイラミニダーゼの抗原性または免疫原性を示す。特定の実施形態において、弱毒化VSVによって発現される抗原は、イヌまたはネコ病原体ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、等を含むがこれらだけに限定されないに由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。他の特定の実施形態において、弱毒化VSVによって発現される抗原は、ブタ赤痢菌、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタコレラウイルス、ブタ流行性肺炎菌、感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス例:感染性ウシ鼻気管支炎ウイルス糖タンパク質Eまたは糖タンパク質G、または感染性喉頭気管炎ウイルス感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Gまたは糖タンパク質Iに由来する抗原の抗原性または免疫原性を示す。別の実施形態において、該抗原は、ラクロスウイルス、新生仔ウシ下痢症ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、プンタトロウイルス、マウス白血病ウイルスまたはマウス乳癌ウイルスの糖タンパク質の抗原性または免疫原性を示す。他の実施形態において、該抗原は、ヒト病原体[ヒトヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルスI型および/またはII型、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、熱帯熱マラリア病原虫、および百日咳菌を含むがこれらだけに限定されない]の抗原の抗原性または免疫原性を示す。弱毒化VSVによって発現される抗原として有用である可能性のある抗原またはその誘導体は、種々の基準、例えば、病原体の感染性の中和における抗原の関与、型または群特異性、患者の抗血清または免疫細胞による認識、および/または抗原に特異的な抗血清または免疫細胞の感染防御効果の立証によって同定される。別の実施形態において、弱毒化VSVの外来RNAは、エピトープを含む抗原の産生を導く。この抗原は、該弱毒化VSVが所望の宿主に導入されると、該エピトープを含む実体によって引き起こされる病態または障害から防御する免疫応答を誘導する。例えば、該抗原は、腫瘍例:悪性腫瘍に対する防御免疫応答を誘導するための腫瘍特異性抗原または腫瘍随伴抗原であることができる。このような腫瘍特異性または腫瘍随伴抗原としては、KS14汎癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺酸性フォスフェート、前立腺特異性抗原、黒色腫随伴抗原p97、黒色腫抗原gp75、高分子量黒色腫抗原および前立腺特異性膜抗原が含まれるが、それらだけに限定されない。抗原をコードする外来DNAこれは弱毒化VSVDNAの非必須部位に挿入されているは、場合により、弱毒化VSVに感染した宿主中で発現可能でかつ免疫応答を刺激することができるサイトカインをコードする外来DNA配列をさらに含む。例えば、そのようなサイトカインとしてはインターロイキン1α、1β、2、4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17および18、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子αおよびβが含まれるが、それらだけに限定されない。D.免疫原性および医薬組成物特定の実施形態において、本発明は、少なくとも2つの異なる種類の突然変異をゲノム内に含み、かつVSVゲノムの複製に非必須の領域に挿入された又はこれと置換された少なくとも1つの外来RNA配列を含む遺伝子改変されたVSVベクターの免疫原性用量を含む免疫原性組成物であって、該2つの突然変異はVSV病原性を相乗的に減衰させる、該免疫原性組成物に関する。本発明の相乗的に弱毒化されたVSVベクターは、哺乳動物被験者例えば、ヒトに投与するために調製される。このような組成物は、典型的には、VSVベクターおよび製薬上許容される担体を含んでなる。本明細書に使用する製薬上許容される担体という表現は、任意のおよび全ての、医薬投与に適した溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、等を含むことを意図している。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。VSVベクターに非適合性である場合を除いて、従来の媒体または作用物質が本発明の免疫原性組成物に使用される。該組成物には、補助的な活性化合物を組み込むことも可能である。したがって、本発明のVSV免疫原性組成物は、意図される投与経路に適合するように調製される。投与経路の例としては、非経口例:静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内および粘膜例:経口、直腸、鼻内、頬、膣、呼吸器が含まれる。非経口、皮内または皮下投与に用いられる溶液または懸濁物は、以下の成分を含む:無菌希釈剤例えば、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;抗菌剤例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン;酸化防止剤例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム;キレート化剤例えば、エチレンジアミン四酢酸;バッファー例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸バッファー;および張性調節剤例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。組成物のpHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによって調節される。非経口用調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、またはガラスまたはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。注射用途に適した医薬組成物は、無菌水性溶液水溶性の場合または分散物;および滅菌注射液または分散物をその場で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切な担体は生理食塩水、静菌水、CremophorELTMまたはリン酸緩衝食塩水を含む。あらゆる場合において、該組成物は無菌でなければならず、そして容易にシリンジに入れられる程度まで流動的でなければならない。該組成物は、製造および保管条件下で安定でなければならず、また微生物細菌および真菌、等の汚染作用から守られる必要がある。担体は、水、エタノール、ポリオール例:グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール、等およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、等によって達成される。多くの場合、該組成物に等張化剤例えば、糖;マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等のポリアルコール類を含ませることが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる作用物質例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを該組成物に含ませることによってもたらされる。無菌注射液は、必要量用量のVSVベクターを、必要であれば上述の成分の1つまたは組合せと共に、適切な溶媒に組み込み、次にフィルター滅菌することにより調製される。一般に、分散物は、基本的分散媒および上述の成分から選択される必要な他の成分を含む無菌媒体に活性な組成物を組み込むことにより調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これらの方法は、予めフィルター滅菌した溶液に由来する、活性成分プラス任意の所望の付加的成分からなる粉末をもたらす。吸入投与のためには、該組成物は適切な噴霧剤例:二酸化炭素等の気体、または噴霧器を含有する加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形でデリバリーされる。全身投与もまた、粘膜または皮内経路によって可能である。粘膜または皮内投与のためには、浸透させるべき障壁に適切な浸透剤が調製物中に使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば、粘膜投与用には界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。粘膜投与は、鼻スプレーまたは座剤の使用により行われる。該組成物は、直腸デリバリー用の座剤例えば、カカオバターおよび他のグリセリド等の常用の座薬基材を含むまたは停留浣腸の形にも調製される。特定の実施形態においては、経口または非経口用組成物を単位剤形に調製することが、投与の容易さおよび用量の均一性の点から有利である。本明細書に使用する単位剤形という用語は、治療すべき被験者のための単位用量として適した、物理的に個別の単位をいう。ここで、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された、予め定められた量の活性組成物を、必要な医薬担体とともに含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性組成物の独自の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のためにこのような活性組成物を配合する技術に固有の限界によって規定され、またそれらに直接依存する。本明細書に引用する全ての特許および刊行物は、参照によりここに組み入れている。以下の実施例は、標準的技法を用いて実施されている。それらは、別途詳細に説明してあるものを除き、周知の技法であり、当業者にとっては日常的なものである。以下の実施例は、説明を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。材料および方法VSVGタンパク質細胞質尾部突然変異体本発明のGタンパク質細胞質尾部突然変異体の作製に用いる方法は、当技術分野において公知であり、Schnelletal1998に詳述されている。これらのGタンパク質突然変異体は、野生型VSVIndiana株の29個のアミノ酸からなる細胞質尾部ドメイン配列番号:1と比較して、G細胞質尾部ドメインに1個または9個のアミノ酸を保持していた。この細胞質尾部の末端切断は、翻訳停止コドンを本来の停止コドンからヌクレオチド60個分または84個分すなわち、それぞれ9個のアミノ酸からなる細胞質尾部および1個のアミノ酸からなる細胞質尾部に対応上流に移動させ、その結果Gタンパク質を切断することによって作出した。VSVN遺伝子シャフリング突然変異体N遺伝子転位突然変異体Nシャフルは、N遺伝子をウイルスゲノムの3末端から2番目、3番目または4番目の遺伝子として再配置することによって作製した。例えば、野生型VSVの本来の遺伝子順序である3NPMGL5を、3PNMGL5および3PMNGL5に突然変異させた。N遺伝子を唯一の3RNA転写プロモーターからさらに離して転位させることは、N遺伝子発現レベルの比例的低下を引き起こす例えば、参照として全体を本明細書に特に組み入れる米国特許第6596529号参照。感染細胞におけるNタンパク質レベルの低下は、ウイルスヌクレオキャプシドの形成を遅らせ、最終的にはゲノム複製およびウイルス粒子形成の速度を低下させる。N遺伝子転位に用いた方法を以下に記述する。N遺伝子シャフル作製の第1ステップとして、全長ウイルスゲノムcDNAからN遺伝子を完全に取り除いた。その結果、P遺伝子はN遺伝子に代わってウイルスリーダーの直ぐ隣に位置した。N遺伝子を削除するため、全長ゲノムcDNAを鋳型として2個のPCR産物を作製した。第1のPCR産物は、T7プロモーターの上流に位置する天然のBsaAI部位からウイルスリーダーの末端まで、および付加された下流BsmBI部位にまたがって伸びる配列を含んでいた。第2のPCR産物は、P遺伝子の天然のXbaI部位からP遺伝子の転写開始シグナル付加された上流BsmBI部位に隣接するまで伸びる配列を含んでいた。これらのBsmBI部位は、両PCR産物が継ぎ目なく連結され、切断および連結後、P遺伝子の直ぐ隣に位置するウイルスリーダーを含む1個のDNA断片をもたらすように配置されていた。次に、このDNA断片を全長ゲノムcDNAのXbaIBsaAI部位に挿入し、ウイルスゲノムからN遺伝子を効果的に削除した。N遺伝子シャフル作製の次のステップにおいて、N遺伝子を欠くゲノムcDNAのPおよびM遺伝子の間、MおよびG遺伝子の間、またはGおよびL遺伝子の間にN遺伝子を挿入した。N遺伝子をPおよびM遺伝子の間に挿入するため、全長ゲノムcDNAを鋳型として3個のPCR産物を作製した。第1のPCR産物は、P遺伝子の天然のXbaI部位からM遺伝子の転写開始シグナル側方にBsmBI部位が付加されているまで伸びる配列を含んでいた。第2のPCR産物は、N遺伝子の転写開始シグナルから、N遺伝子の3AAAAAAAポリアデニル化シグナルに隣接する保存されたTATG配列側方にBsmBI部位が付加されているまで伸びる配列を含んでいた。第3のPCR産物は、G遺伝子の最初の天然のMluI部位からP遺伝子の保存されたTATGAAAAAAAポリアデニル化シグナル側方にBsmBI部位が付加されているまで伸びる配列を含んでいた。次に、これら3つの断片全てをBsmBIで切断し、再連結して、N遺伝子がP遺伝子の一部およびM遺伝子によって両側を囲まれている1つのDNA断片を形成した。このDNA断片を次にXbaIおよびMluIによって切断し、ΔNウイルスゲノムのXbaIMluI部位に挿入し、3PNMGL5cDNAを形成した。3PMNGL5ゲノムcDNAを作製するため、2つの別個のPCR産物を調製した。第1のPCR産物は、P遺伝子の天然のXbaI部位からG遺伝子の転写開始シグナル側方にBsmBI部位が付加されているまで伸びる配列を含んでいた。第2のPCR産物は、全N遺伝子配列をその転写開始シグナル上流BsmBI部位が側方に付加されているからN遺伝子転写停止/ポリアデニル化シグナルG転写開始シグナルからG遺伝子の天然のMluI部位まで伸びる配列を側方に有するまで含んでいた。G遺伝子特異配列を、PCRプライマーの1つの一部としてN遺伝子配列に付加した。両方のPCR産物をBsmBIで切断し、連結して1つのDNA断片を形成した。次にこれをXbaIおよびMluIで切断し、N遺伝子を欠くゲノムcDNAのXbaI/MluI部位に挿入し、5PMNGL3という遺伝子配置をもたらした。5PMGNL5ゲノムcDNAを作製するため、完全長ゲノムcDNAを鋳型として3つのPCR産物を調製した。第1のPCR産物は、G遺伝子の天然のSwaI部位からL遺伝子の転写開始シグナルまでこの側方にBsmBI部位が付加されている伸びる配列を含んでいた。第2のPCR産物は、全N遺伝子配列をその転写開始シグナルから転写停止シグナルまで含んでおり、該配列の両側にBsmBI部位が付加されていた。第3のPCR産物は、L遺伝子の転写開始シグナル側方にBsmBI部位が付加されているからL遺伝子の天然のHpaI部位まで伸びる配列を含んでいた。次に、これらの3つのPCR産物全てをBsmBIで切断し、連結して1つのDNA断片を形成した。次にこれをSwaIおよびHpaIで切断し、N遺伝子を欠くゲノムcDNAのSwaIHpaI部位に挿入し、5PMGNL3という遺伝子配置をもたらした。3つの再編成ゲノムの全てにおいて、各遺伝子および両側に位置する制御配列の配列統合性は、変更していないウイルスのそれと同一であった。N遺伝子の位置だけが異なっていた。Gタンパク質細胞質尾部突然変異およびNシャフリング突然変異の組合せN遺伝子シャフリング突然変異およびGタンパク質細胞質尾部突然変異の両者の組合せは、二重突然変異ゲノムすなわち、2つの突然変異種類、例えば、3PNMGL5、3PNMGL5および3PMNGL5、3PMNGL5をもたらした。二重突然変異体ゲノムcDNAは、N遺伝子をシャフリングしたゲノム中の天然のG遺伝子を、上述の切断型GまたはG遺伝子と交換することによって構築した。この交換は、ドナーcDNAL3および5NPMGL3をMluIおよびHpaIで切断し、次に、精製した切断型G遺伝子を、N遺伝子をシャフリングしたcDNAゲノムのMluIHpaI部位に挿入した。これらの二重突然変異体をcDNAからレスキューし、3回プラーク精製し、増幅し、そして細胞培養物中でプラークサイズおよび以下に記述する増殖速度論によって特徴付けた。非細胞変性M遺伝子突然変異VSVM遺伝子は、ウイルスマトリックスタンパク質および2つのより小さいフレーム内ポリペプチドをコードしている。M2およびM3ポリペプチドは、Mタンパク質と同一のオープンリーディングフレームから翻訳され、そしてそれぞれ最初の33個および51個のアミノ酸を欠失している。非細胞変性M遺伝子突然変異を含む組換えVSVベクターすなわち、M2およびM3タンパク質を発現しないVSVベクターは、以下に記述するように作製された。該ベクターは、1つまたは2つ以上のさらなる突然変異を含んでおり、それによって細胞培養物中および動物中で高度に弱毒化されたVSVベクターがもたらされた。第33位および第51位のメチオニンがアラニンに変換される非細胞変性M遺伝子突然変異Mは、PCRに基づくクローニング戦略によって作出した。この戦略においては、必要なヌクレオチド置換AUGからGCTがPCRプライマーに組み込まれた。M3351A突然変異を有する、得られたPCR産物を、次に全長VSVcDNAゲノム中にクローン化し、M2およびM3ポリペプチドを発現しないウイルスのレスキューを可能とした。JayakarおよびWhittによって設計された組換えVSVベクターcDNA中に存在するM3351A突然変異を、XbaIMluI断片全M遺伝子およびP遺伝子の一部にまたがるを交換することにより、VSVベクターcDNAに導入した。このcDNA断片の交換は、M3351A突然変異以外のさらなるアミノ酸コード変化を引き起こさなかった。Gタンパク質細胞質尾部突然変異および非細胞変性M遺伝子突然変異の組合せGタンパク質細胞質尾部切断および非細胞変性M遺伝子突然変異の両者の組合せは、二重突然変異ゲノムすなわち、2つの突然変異種類、例えば、3NPMncpGct1L5または3NPMncpGct9L5をもたらした。二重突然変異ゲノムcDNAは、非細胞変性表現型を生じる突然変異を含むM遺伝子cDNAを、GまたはG突然変異を含む全長ゲノムcDNAと交換することによって構築した。各場合において、交換されたcDNA断片は、P遺伝子の唯一のXbaI部位からG遺伝子の5非翻訳領域の唯一のMluI部位まで伸びており、そして非細胞変性M遺伝子の全配列を含んでいた。上述のように、非細胞変性Mタンパク質は、もとのMタンパク質と2つのアミノ酸置換によってのみ異なっており、これらの置換は非細胞変性表現型を生じる。これらの二重突然変異ゲノムを、次に、ゲノムの位置5にHIV1gag遺伝子を挿入することによりさらに改変し、免疫原性試験のためのgagタンパク質の発現を可能とした。他のウイルス組換えVSVベクターについては、上記gag遺伝子は、ゲノムcDNAの位置5に存在する唯一のXhoINheI部位にクローン化された。VSVN遺伝子温度感受性突然変異および/またはVSVL遺伝子温度感受性突然変異ウイルスゲノム中にHIVGagタンパク質を第1の3シストロンからコードする組換えVSVを、そのN遺伝子および/またはL遺伝子を、公知の、生物学的に引き出したVSV温度感受性突然変異体Pringle1970に由来する相同なコード配列と置換することにより改変した。その結果得られたベクターは、rVSVGag1tsNすなわち、3gag1NPMGL5はVSV株ts41由来のtsN遺伝子を含んでいた;rVSVGag1tsLすなわち、3gag1NPMGL5はVSV株ts11由来のL遺伝子を含んでいた;そしてrVSVGag1tsNLすなわち、3gag1NPMGL5はVSV株ts41由来のtsN遺伝子およびVSV株ts11由来のL遺伝子の両方を含んでいた。VSV株ts41およびts11は、当技術分野においてそれぞれtsG41およびtsG11としても知られている。生物学的に引き出したts遺伝子ドナー株の両方は、Pringleによって、ラボに適合したVSVIndiana血清型を有するGlasgow株を化学的突然変異誘発にかけた後、単離されたものである。Pringleはまた、ts突然変異をNまたはL遺伝子にマッピングした。感染細胞RNAからts41N遺伝子およびts11L遺伝子をクローン化した。すなわち、許容温度でBHK細胞をts11またはts41に感染させた。細胞単層の75以上で細胞変性効果が明らかになるまで、感染を進行させた。この時点で全RNAを抽出し、精製した。次に、遺伝子特異的プライマーを用いてこのRNAを逆転写してcDNAを合成し、このcDNAをPCRで増幅した。次に、増幅されたcDNAをrVSVベクターのゲノムcDNA中にクローン化し、配列分析により確認した。ts11、ts41およびそれらの祖先株の完全なゲノム配列を決定し、ts表現型に寄与するコード変化を同定した。rVSVベクターバックグラウンド、Pringleのts突然変異体およびGlasgow祖先ウイルスのコード配列を比較することによって、どのコード変化がts表現型rVSVGag1tsN、rVSVGag1tsLおよびrVSVGag1tsNLに寄与するかを予測することが可能である。表3は、Nタンパク質アミノ酸配列の比較を示す。データから、rVSVベクターのN遺伝子をts41ホモログで置換すると、4つのアミノ酸置換がもたらされることが明らかである。これらの変化のいずれもが、ベクターの遺伝子的バックグラウンドという状況においてNタンパク質機能に影響を及ぼし、そしてts表現型に寄与する可能性がある。ただ1つの変化74位におけるTyrからCys;残基をイタリック体で表示がts41を祖先ウイルスと区別していることは注目に値し、この置換が決定的なts決定基であるかもしれないことを示唆している。同様に、表4はLタンパク質の比較を示す。rVSVベクターのL遺伝子をts11カウンターパートで置換すると、13のアミノ酸コード変化がもたらされた。N遺伝子について上に記述したように、これらのコード変化のいずれもが、L遺伝子の置換によって作製された、観察されたts表現型に寄与しうる。しかし、これらのコード変異のうちいくつかイタリック体で表示はより興味深い。なぜなら、これらもまたts11をその祖先ウイルスGlasgowと区別しており、これらのアミノ酸置換をts表現型への重大な寄与物として潜在的に同定しているからである。Gステム突然変異およびGステム/遺伝子シャフリング突然変異特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変されたVSVはG遺伝子に突然変異を含み、それによってコードされるGタンパク質は、Gタンパク質外部ドメインの膜近位ステム領域Gステムタンパク質と呼ばれるに突然変異を有する。Gステム突然変異は、VSVXNベクター遺伝子的バックグラウンドSchnelletal1996のG遺伝子を、Gステムをコードする改変されたG遺伝子で置換することによって導入された。Gステムは、512個のGタンパク質アミノ酸のうち108個からなり、以下のものを含む:Gタンパク質の最初の17個アミノ酸膜挿入のためのポリペプチドに標的を定めるシグナル配列を含む;膜近位細胞外ドメインステムと呼ばれるの42個のアミノ酸;20個のアミノ酸からなる膜貫通ドメイン;および29個のアミノ酸からなるカルボキシ末端細胞内尾部。Gステムポリペプチドのこの配置は、ウイルス粒子の成熟を媒介するに十分なGタンパク質配列を含むが、細胞付着タンパク質として作用するために必要な配列を欠く。その結果、Gステムベクターに感染した細胞は、ウイルスタンパク質およびコードされた外来抗原を発現するが、非感染性の子孫ウイルス粒子を産生する。なぜなら、Gステムベクターは、完全に機能的なGタンパク質をコードしていないからである。標的細胞に感染するのに必要な機能性Gタンパク質を含むGステムベクター粒子を産生するためには、全長Gタンパク質がトランスでintrans提供されなければならない。これは、ウイルスレスキューおよびそれに続くワクチン作製の間に、以下の方法のうちの1つによって達成されうる:1Gタンパク質を発現する細胞株を開発することが可能である;2Gタンパク質を発現する補足的ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、MVAまたはVEE等を用いることができる;または3産生に使用する細胞を、Gタンパク質をコードするプラスミドDNAベクターまたはmRNAによってトランスフェクトすることができる。現在、Gステムベクターは、Gタンパク質を発現するように設計されたプラスミドによってトランスフェクトされた細胞中で、一過性で相補性を生じることによって産生される。これは、Gタンパク質を発現する細胞株を作出するGタンパク質は毒性なので、これは困難である必要を回避し、またヘルパーウイルス等の生物学的試薬を産生プロセスに導入することを回避する。Gステムベクターのいくつかの配置において、ウイルスタンパク質をコードするシストロンは下流にシャフリングされていて、ゲノムの第1位への外来遺伝子の挿入を可能とする。これはウイルスを弱毒化し、該外来抗原遺伝子をプロモーターの近位に位置させ、高レベルの発現を確実にする。セクションA1に記述したように、VSVゲノムの位置1へのHIVgag遺伝子または他の任意の遺伝子の挿入3gag1NPMGL5は、遺伝子シャフリング突然変異を効果的にもたらす。ここでは、N、P、M、GおよびL遺伝子は、それぞれその野生型における位置からゲノム上のより遠位へ動かされる。よって、G突然変異およびVSVゲノムの位置1へのgag遺伝子の挿入gag1の組合せは、二重突然変異ゲノム3gag1NPMGL5をもたらした。293細胞における水疱性口内炎ウイルスのレスキュー国際出願WO2004113517参照により特に本明細書に組み入れるに記載の基本的熱ショック/プラスミドT7系を用いて、下記の改変したプロトコールにしたがって、293細胞からのVSVのレスキューを上首尾に達成した。材料プラスミドDNA:1全長ウイルスゲノムcDNA、2pT7N3pT7P4pT7L5pT7M6pT7Gおよび7pClNeobclT7。リン酸カルシウムトランスフェクション試薬:12XBES緩衝食塩水50mMBES280mNNaCl15mMNa2HPO4225MCaCl2および3Hepes緩衝食塩水洗浄液20mMhepes140mMKCl1mMMgCl2。細胞培養液:1質が保証され、熱不活性化した10FBSを添加したDMEM2質が保証され、熱不活性化した10FBSを添加したIscove改変最小必須培地3ポリLリシンH2O中0014PBSおよび5ブタトリプシンEDTA。方法293細胞の培養:293細胞は培養が難しい場合があり、この細胞を取り扱うための多数の異なる方法がある。現方法は、VSVおよび改変VSVベクターコンストラクトのためのレスキュー系の一部として上手く用いられてきたものである。日常的継代培養:1培地を除去し、コンフルエントな単層10cmプレートを5mlの温めたPBSで洗浄する;細胞の剥離を防ぐため、培養ディッシュの側面に沿って穏やかにピペッティングする。22mlのトリプシンを穏やかに添加し、プレートを揺すって単層の細胞すべてが覆われるようにする。該トリプシンを吸引し、プレートを室温で約1分間静置する。プレートを45度の角度で傾け、フードの作業面にプレートを軽く打ちつけて細胞を剥離する。細胞が剥れてこないときは、室温でさらに1分インキュベートする猛烈なピペッティングを回避できるように、この段階で細胞を確実に剥離させる。35mlのDMEMFBSを穏やかに添加し、ピペットでゆっくり吸引排出し、細胞を分散させる。49mlのDMEMFBSを含有するプレートに、1mlの細胞を添加する。537°C、5CO2下でインキュベートする。トランスフェクションのための継代培養:1所望の数のプレートをポリLリシンでコーティングする。プレート1枚あたり34mlの0001ポリLリシンを添加し、室温で少なくとも30分間静置する。該ポリLリシン液を吸引する。5mlの培地でプレートをすすぐ。2上述のように細胞をトリプシン処理する。翌日に5075コンフルエントなプレートが得られる分割比を用いる13から16。3細胞を剥離した後、IMEMFBSを加え、そして細胞を9mlのIMEMFBSを含有するコーティングされたプレートに移す。トランスフェクションに先立って、細胞を分け、IMEMFBS中で一晩増殖させることが重要であるように思われる。437°C、5CO2下でインキュベートする。トランスフェクション:1トランスフェクションの13時間前に、細胞に9mlのIMEMFBSを供給し、そして3CO2に設定した32°Cのインキュベーター中でインキュベートする。2リン酸カルシウムDNAトランスフェクション混合物を以下のように調製する:a5mlのポリプロピレン製試験管内で以下のDNAを混合する:8μgT7N4μgT7P12μgT7L10μgT7M10μgT7G10μgのウイルスゲノムcDNAクローン、および10μgのhCMVT7発現ベクター。b水を用いて最終容量を450μlに調整する。c50μl25MCaCl2を添加する。d試験管を穏やかにボルテックス撹拌しながら、500μlの2XBBSを添加し、次に試験管を室温で1520分間静置する。3細胞をインキュベーターから取り出し、上記のリン酸カルシウムDNA混合物を培養物にゆっくり添加し、穏やかに渦を巻くようにして沈殿物を分散させる。細胞を直ちに32°C、3CO2インキュベーターに戻す。4トランスフェクション開始から3時間後に、プラスチックバッグに培養ディッシュを入れてシールし、そして43°Cに設定した湯浴中に2時間完全に沈めて細胞性熱ショック応答を誘導する。5熱ショック後、細胞を32°C、3CO2インキュベーターに戻し、一晩インキュベーションを続ける。6翌日、HBSで細胞を2回洗浄し、細胞に10mlのIMEMFBSを供給する。37°C、5CO2下でインキュベートする。7トランスフェクション開始から4872時間後に、トランスフェクトされた細胞をより大きい容器に移すために、20mlのDMEMFBSを含有するT150フラスコを十分な数だけ準備する。トランスフェクトされた各10cmプレートにつき、T150フラスコ1個。8培地を単層上で穏やかにピペッティングして細胞表面からそれを除去することにより、トランスフェクトされた293細胞を移す。力強いピペッティングを避け、細胞を剥がすのにちょうど十分な力を用いる。細胞を剥がした後、約5回ピペットで吸い上げ排出を行って細胞塊のサイズを小さくし、次に培地および細胞を20mlのIMEMFBSを含有するT150フラスコに移す。946時間後に、10FBSを添加した新鮮なDMEMで培地を置換する細胞がプレートに接着していない場合、このステップは24時間後まで延期可能である。また、このステップを省略しても成功した。10細胞を57日間モニターし、細胞変性効果の証拠を検出する。11CPEが明確に現れたら、培地および株化ベロ細胞単層を含有する6ウエルプレートのウエルに50μlの培地上清を移す。レスキューが起こっていれば、翌日CPEが見られるはずである。このステップは重要であることに留意されたい。なぜなら、293細胞は時々T150フラスコの表面から剥離して、実際にはそうでないのにVSVに感染したように見えるからである。12上記少量のサンプルをベロ細胞単層に移した後、T150フラスコから細胞および培地を回収し、70°Cで凍結する。一般に、293細胞は、単層上で培地をピペッティングして細胞を剥がすことにより回収することができる。ベロ細胞における水疱性口内炎ウイルスのレスキュー溶液以下の溶液は、宿主細胞トランスフェクションに一般に有用である:1280mMNaCl164gNaCl50mMBES107gBESおよび15mMリン酸ナトリウム021gNa2HPO4の2XBBSリットルあたり溶液2XBES緩衝食塩水。このBBS溶液は、NaOHを用いてpH695698に調整される。次にフィルター滅菌し、凍結保存される。2全量100mlあたり368gの25MCaCl2溶液が調製され、20°Cで保存される。この溶液は、ニトロセルロースを用いてフィルター滅菌される。酢酸セルロースフィルターは詰まるので、避けるべきである。または、トランスフェクション溶液はオートクレーブ滅菌される。しかし、オートクレーブ処理の間に2XBBS溶液はわずかに変化する可能性があるので、この方法はあまり望ましくない。以下の溶液は、培地として一般に有用である:1DMEMのDMEMFBS溶液グルタミンを含む高グルコース;GibcoBRLGrandIslandNY、熱不活性化および保証された10のFBS、ならびに1020μgmlゲンタマイシンを補充してある。2MEMのMEMFBS溶液2025mMHepesバッファー;GibcoBRLGrandIslandNYを補充され、そして場合により1XFungizoneを含む。3Hepes緩衝食塩水洗浄液のHBS溶液、20mMHepespH70150mMNaCl1mMMgCl2。方法一般に有用な宿主細胞は、分けて培養したベロ細胞から選択することができる。それらのベロ細胞は、トランスフェクションの前日に、翌日約50コンフルエントRSVについては8090になっているようにDMEMFBS溶液中に播種する6ウエルプレートまたは125cm2フラスコ。より高い細胞密度では効率が悪くなる。翌日、トランスフェクションの14時間前に各培養物に45mlのDMEMFBSを供給する。次に、細胞を3CO2および32°Cに設定したCO2インキュベーターに移す。ベロ細胞は、トランスフェクション時に約50コンフルエントである限り、一晩以上生育させることが可能である。CaCl2リン酸沈降物を以下のようにして得る:開始前、BBSおよびCaCl2は室温に保持する。プラスミドDNA合計220μgおよび25μlのCaCl2を用いて、全容量250μlを含有する5mlのポリプロピレン試験管にDNA混合物を調製する。全長レスキューのためのDNAは、5μgのVSVの全長cDNAコンストラクト、400ngのNタンパク質、300ngのPタンパク質、100200ngのLタンパク質、および510μgのpClNeoBclT7プラスミドを含む。ベロ細胞におけるレスキューの効率は低いので、レスキューされる全長コンストラクト1個につき36個のウエルをトランスフェクションする。全てのDNACaCl2溶液を調製後、2XBBSを添加する。これは通常、連続的に低速ボルテックスで穏やかに撹拌しながら250μlの2XBBSを試験管の側壁に沿って滴下することにより行われる。全試験管についてこれを繰り返し、次に試験管を室温でさらに1520分間静置し、DNAカルシウムリン酸沈降物を形成させる。室温インキュベーションの後、沈降物を細胞培地に滴下し、プレートを揺することによって分散させる。次に、この培地を3CO2にセットしたインキュベーターで3時間インキュベートする。3CO2というレベルは、BBSCaCl2トランスフェクション技法にとって重要である。5CO2は、もし機能するとしても、全く不十分である。3CO2とは、培地のpHを制御し、そして培地中に有効なカルシウムリン酸DNA沈降物の形成を可能とする。次に、場合により、例えばトランスフェクション開始の3時間後に、熱ショック操作を実施する。すなわち、44°Cに設定した湯浴に細胞を移す。培養物を完全に水中に沈めることができるように、プラスチックの保存バッグで細胞をシールする。44°Cで3時間経過後、細胞を3CO2にセットした32°Cインキュベーターに戻し、一晩インキュベーションを継続する。翌日、トランスフェクション培地を除去し、細胞をHBSで2回洗浄する。洗浄後、2mlの新鮮なDMEMFBSを添加する。PBSおよびハンクスバッファーは、洗浄ステップではうまく機能しない。おそらく、これらのバッファー中のリン酸がトランスフェクション培地からより多量のCaCl2を沈降させるからであろう。次に、場合により、共培養操作を実施する。トランスフェクション後4872時間目に、トランスフェクトされた細胞を培地中に掻き落とし、そして該細胞および培地をT25フラスコ50コンフルエントのベロ細胞の単層を含有するに移すことによって回収する。この共培養開始の6時間後に、培地を4mlのMEMFBSと交換する。次に、培養物を5日間インキュベートする。このインキュベーション期間中に培地が枯渇したように見え始めたら、2mlの培地を除去して新鮮なMEMFBSと交換する。どれほど少量であれレスキュー中に産生され、培地中に存在するかもしれないウイルスを保存するために、培地を全部交換することは推奨できない。この共培養期にCPEが明らかになるかもしれないが、通常はそうならない。CPEが全く明らかでない場合は、レスキューを継続することができる。共培養開始の5日後に細胞を回収する。最初に、05mlの218Mショ糖;376mMKH2PO4;710mMK2HPO4;490mMグルタミン酸ナトリウムを培地に添加し、フラスコを揺することにより混合する。次に、細胞を培地中に掻き落とし、ピペットで吸引排出を行って混合し、アリコートに分けて出荷用フリーザーチューブに入れ、ドライアイス/エタノール浴中で急速凍結し、80°Cで保存される。VSVベクターの精製レスキューしたVSVベクターを、トランスフェクトされた細胞の上清からプラーク精製した。プラーク精製を連続3回実施した後、BHK細胞を用いてウイルスを増幅し、シードストックを作製した。次に、BHK細胞を用いてシードストックをさらに増幅し、ウイルスワーキングストックを作製した。動物実験用に大量のウイルスを調製するため、ワーキングストックを用いて、T150フラスコ1020個分のコンフルエントなBHK細胞を感染多重度0510プラーク形成単位細胞で感染させた。32°Cで48時間経過後、感染細胞上清を4000xgで遠心して清澄化した。次に、SW28ローターを用いて25000rpmで1時間遠心することにより、10ショ糖クッションを用いてウイルスを上清から濃縮した。ウイルスペレットをリン酸緩衝食塩水に懸濁し、エタノール/ドライアイス浴中で急速凍結した。次に、濃縮ウイルスストックをベロ細胞単層上で滴定し、調製物中の感染性粒子の数を測定した。ウイルス滴定ウイルス調製物中の感染性ウイルス粒子の数を標準的プラークアッセイにより測定した。すなわち、6ウエルプレート中の新たにコンフルエントになった、一晩培養されたベロ細胞単層を、ウイルス調製物の10倍連続希釈物を用いて感染させた。これを実施するため、増殖培地を細胞単層から吸引し、そしてDMEMを用いた各ウイルス希釈物の100μlアリコートを細胞単層の中心に移した各希釈物につきアリコート3個を使用。細胞の乾燥を防ぐため、次に400μlのDMEMを各細胞単層に添加し、プレートを15分間室温に保持した。次に、時々揺すりながら、37°C、5CO2下で30分インキュベートした。ウイルス接種物を除去し、各細胞単層に3mlの、DMEMで希釈した08アガロースで重層した。次に、プレートを37°C、5CO2下で14日間インキュベートし、プラークを形成させた。アガロースプラグを除去し、細胞を室温で10分間クリスタルバイオレット50メタノールに溶解した2クリスタルバイオレットで染色した。次に、過剰な染色剤を除去し、細胞単層を水で十分すすいだ。すると、青色に染まらない小さい穴としてウイルスプラークが細胞単層中で可視化された。リアルタイムPCRによるウイルスRNAの定量動物組織中のVSVゲノムを検出し、定量するために、定量リアルタイムPCRアッセイを用いた。このアッセイは、マイナス鎖ウイルスゲノムRNAを特異的に検出し、そして標準曲線を作成するために全アンプリコンの合成オリゴヌクレオチドを用いる2ステップRTPCRアプローチを利用するものである。すなわち、サル、フェレットおよびマウス由来の脳組織を、SPGを用いて20WVスラリーにホモジェナイズした。このスラリーを3000xgで15分間遠心し、粒状物質をペレット化した。次に、上清をさらに14000xgで遠心し、得られた上清から全RNAを抽出した。このRNAを鋳型として、ウイルス特異的プライマーと共に逆転写に用いた。その生成物を次にリアルタイムPCRアッセイに用いた。マウスにおけるVSVベクターの50致死量の測定VSVベクターの相対的弱毒化の基準として、マウスLD50モデルを用いた。野生型VSV、3NPMGL5、3PNMGL5および3PMNGL5の数個の対数倍希釈物を45週齢雌SwissWebsterマウス610匹/群に頭蓋内投与した。その後、マウスの体重減少、麻痺および死亡を3週間観察した。LD50は、ReedMuench法により累積死亡率から計算した。マウス免疫原性試験マウスに実施例4記載のVSVベクターIndiana血清型1x107pfuを筋肉内投与して免疫感作した。1セットのマウスプライム、n5由来の脾細胞を、プライムした後7日目のエフェクター期のピークに単離した。2セットのマウスを、記載のVSVベクター1x107pfuを用いてブーストした。1セットのマウスブースト、n5由来の脾細胞を、ブースト後5日目のエフェクター期のピークに単離した。もう1セットのマウスメモリー、n5由来の脾細胞を、ブースト後30日目のメモリー期に単離した。四量体染色によりgag特異的CD8T細胞頻度を測定した。gag免疫優性ペプチドを用いて一晩刺激した後、エリスポット法によりgag特異的IFNγ分泌を測定した。VSV突然変異体の特徴づけ実施例1に記載の2種類の突然変異を組み合わせたVSVベクターNシャフル/Gタンパク質ct切断および1種類の突然変異のみを含むVSVベクターのプラークサイズの実質的相違を観察した表5。典型的には、1種類の突然変異のみを含むVSVベクターは24時間プラークアッセイにおいて数えられるサイズのプラークを形成したが、Nシャフル/Gタンパク質ct切断ベクターのいくつかは同等サイズのプラークを形成するまでに34日を要した。VSVベクター間のプラークサイズにおける相対的相違も、細胞培養物における増殖速度論的試験の間に観察された相対的相違と類似していた図1から図3。VSV神経毒性試験2種類以上の突然変異の組合せを含むVSVの相乗的弱毒化を、1種類の突然変異のみを含むVSVベクターと比較して、一連のマウス、フェレット、およびサル神経毒性試験において評価した。その方法は実施例1に記述されている。マウスはVSV複製を高度に許容し、この特性は、ウイルス増殖および弱毒化の異なるレベルを識別するためにマウスを使用することを可能とする。異なるVSVベクターについて、病原性/弱毒化の明瞭な勾配がマウスにおいて観察された表6および表7。例えば、3NPMGL5、3NPMGL5、3PNMGL5または3PMNGL5表6を頭蓋内接種されたマウスにおけるLD50は、以下の相対的弱毒化勾配を示した:3PMNGL5LD502x1053PNMGL5LD501x1043NPMGL5LD501453NPMGL5LD5032。突然変異を0種類野生型VSV、1種類、2種類、3種類および4種類gag遺伝子挿入有するVSVベクターを頭蓋内接種されたマウスにおけるLD50下記の表7に示すもまた、同様の弱毒化勾配を示した。さらに、VSVベクター3gag1PMNGL5、3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3gag1PMNGL5および3gag1NPMGL5を頭蓋内接種されたマウスは、死亡を全く示さなかった。同じ一連のベクターを視床内接種したマカクザルの病理組織学データは、非常によく似た弱毒化勾配を示した。これら動物データの両方のセットは、一連のフェレット神経毒性試験の結果によって確証された。フェレット神経毒性試験では、感染性ウイルスおよび頭蓋内接種された動物の脳に存在するゲノムRNAのレベルが、それぞれプラークアッセイおよびリアルタイムPCRによって定期的に測定された。全体として、これらのデータは、2種類以上の突然変異の組合せは、1種類のみの突然変異を有するVSVベクターよりも実質的に大きい弱毒化レベルを有することを示している。マウスLD50力価は、同一のVSVベクター内に2つの異なる種類の突然変異を組み合わせることは、弱毒化に対して強力な相乗作用があることを強く示している。弱毒化VSVベクターの増強された免疫原性弱毒化VSVベクター3gag1NPMGL5、3gag1PMNGL5および3gag1NPMGL5の免疫原性を、VSV原型ベクターである3NPMGgag5L5および3NPMGL5と比較した。すなわち、上記VSVベクターの1つを用いて、実施例1に記述するようにマウスを免疫感作した。弱毒化VSVベクターは、原型VSVGag5ベクター3NPMGgag5L5によって誘導される免疫応答よりも強い免疫応答を誘導した。最も注目すべきは3gag1PMNGL5で、プライム後およびブーストした後、ならびに応答のメモリー期に評価したところ、原型によって誘導されるよりも統計的に有意に高いGag特異的T細胞頻度を誘導した。3gag1PMNGL5はIFNγ分泌も誘導し、これは原型3NPMGgag5L5によって誘導されるものより高い傾向があった表9。3gag1NPMGL5および3gag1NPMGL5への応答もまた、原型3NPMGgag5L5によって誘導されるものより高い傾向があった表9。アカゲザルにおけるHIVgagを発現する弱毒化VSVベクターの筋肉内および鼻内デリバリーの免疫原性HIVgagタンパク質を発現する弱毒化VSVベクターで免疫感作した後にアカゲザル中に誘導される免疫応答を測定するため、下記の試験が設計された。表10に示す試験は、合計24匹の遺伝子的選択をしていない雄アカゲザルを用いて実施される。各動物群すなわち、群16を、下記のVSVベクターの1つを用いて1x107の用量で筋肉内投与または鼻内投与して免疫感作する:3gag1NPMGL5、3gag1PMNGL5または3NPMGgag5L5。表11に示す試験は、合計24匹の遺伝子的選択をしていない雄アカゲザルを用いて実施される。各動物群すなわち、群18を、下記のVSVベクターの1つを用いて1x107の用量で筋肉内投与または鼻内投与して免疫感作する:3gag1NPMGL5、3gag1NPMGL5、3gag1PMNGL5または3NPMGgag5L5。一般に、以下のアッセイは、全身性および体液性免疫応答ならびに各動物からのVSV排出を調べるために用いられる。細胞性免疫応答:HIVgagペプチド特異的IFNγエリスポット応答およびVSVNペプチド特異的IFNγエリスポット応答。体液性免疫応答:ELISAによる血清抗HIVgag抗体力価、ELISAによる血清抗VSV抗体力価、および血清抗VSV中和抗体力価。