血小板又は血小板表面分子と相互作用パートナーとの相互作用を検出及び/又は定量化するための方法であって、aレーザー走査又は蛍光サイトメトリー又は顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされる];b標識された血小板を、i1つ又はそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル及びii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上:ii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用せず又は強く相互作用しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ若しくはそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;cウェルを洗浄して未結合の血小板を除去する工程;dウェル又はプレートの予め選択された領域においてレーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより:i血小板の総数、及び/又はii活性化された血小板の数を検出する工程;を含み、ここで強い血小板相互作用を有する相互作用パートナーは、低コントロールと比較して検出された血小板の増加、及び/又は低コントロールと比較して活性化された血小板の増加に基づいて同定され得、一方弱いか又は低い血小板相互作用を有するパートナーは、高コントロールと比較して検出された血小板の減少及び/又は高コントロールと比較して活性化された血小板の減少に基づいて同定され得る、上記方法。以下のパラメーター:a弱くなった蛍光シグナルを有する血小板の数b異常な形態断片を有する血小板の数c異常なレッドシフトした蛍光を有する物体大型赤色物質の数のうちの1つが決定され、かつここで請求項1のbiii又はivと比較して、請求項1のbiについて検出されたa、b又はcのうちのいずれかの増加が、相互作用パートナーの毒性又は異常な作用についての識別子としての役割を果たす、請求項1に記載の方法。血小板又は血小板表面分子の相互作用パートナーとの結合を調節する試験物質の能力を検出及び/又は定量化するための方法であって、以下:aレーザー走査又は蛍光サイトメトリー又は顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされる];b標識された血小板を:i1つ又はそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル、及び場合によりii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上:ii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用せず又は強く相互作用しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iii血小板と特異的に相互作用せず若しくは強く相互作用せず、かつ/又は血小板を活性化しないことが知られている血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;c試験物質を血小板と接触させる工程;dウェルを洗浄して未結合の血小板を除去する工程;eウェル又はプレートの予め選択された領域において、レーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより血小板の総数を検出する工程;及び場合によりfウェルの予め選択された領域において、レーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより、以下のパラメーターI、ii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上を検出する工程:i弱くなった蛍光シグナルを有する血小板の数;ii異常な形態を有する血小板の数;iii異常なレッドシフトした蛍光を有する物体の数;iv活性化された血小板の数;並びにge及び場合によるfに従う値と、試験物質を加えずに生成された1つ又はそれ以上の参照値とを比較する工程;を含み、ここで試験物質を用いて検出された値と試験物質を用いずに検出された値との間の差が、該試験物質が血小板表面分子又は血小板の結合を調節可能であることを示す、上記方法。fi、ii又はiiiのうちの1つ又はそれ以上が検出され、ここで試験物質を含まない参照サンプルと比較して、fi、ii、iii又はivの値の1つ又はそれ以上との間の増加は試験物質の毒性作用を示す、請求項3に記載の方法。fivに従う活性化された血小板の数が検出され、試験物質を含まない参照サンプルと比較した間の増加が試験物質の血小板活性化効果を示す、請求項3又は4に記載の方法。血小板が、試験物質及び血小板をコーティングされたプレートと接触させる前に試験物質と混合される、請求項2~5のいずれか1項に記載の方法。血小板が、以下:カルセイン-AM、CMFDA5-クロロメチルフルオレセインジアセテート、PKH67、レサズリン、ラバセル、固定可能FM1-43、ナノ-オレンジ又は蛍光標識されたファロイジン[顕微鏡検査/サイトメトリーにおいて検出可能なシグナルを与えるように規定される標識/色素]のうちの1つのような蛍光色素で標識される、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。血小板表面分子が、GP1b、コラーゲン受容体、PAR1、PAR4、P2Yプリン受容体1、P2Yプリン受容体12、接合部接着分子AJAMA、JAMCのような血小板表面タンパク質である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。血小板表面受容体の相互作用パートナーが、天然に存在する相互作用パートナー、その機能的誘導体若しくはフラグメント、又は合成相互作用パートナーである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。相互作用パートナーが、以下:フォンビルブランド因子1vWF-1、vWF-1のA1ドメイン、コラーゲン、フィブリノーゲン、プロテインc、Mac-1αMβ2、P-セレクチン、CD62P、高分子量キニノーゲン、トロンボスポンジン-1、可溶性GPVI、PSGL1、又はこれらのうちのいずれかの機能的フラグメント若しくは誘導体のうちの1つである、請求項9に記載の方法。マルチウェルプレートが、96ウェル、386ウェル又は1536ウェルのプレートであり、好ましくは386ウェルプレートである、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。請求項1~11のいずれか1項に記載の方法についての指示を含む説明書を含んでなる製品。物質が哺乳動物に対して毒性である可能性があるかどうかを決定する方法であって、a該哺乳動物と同じ種の一員である対象からの血小板サンプルを準備する工程;bフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントを準備する工程;c血小板をフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントと混合する工程;d血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性を決定する工程;e物質を、フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントと共に血小板と混合する工程;及びf血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性を決定する工程;を含み、ここで血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の親和性が、物質が存在しない場合よりも物質の存在下でより低い場合、該物質は該哺乳動物に対して毒性である可能性がある、上記方法。フォンビルブランド因子のフラグメントが配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の方法。フォンビルブランド因子のフラグメントが、配列番号1の核酸配列を含むポリヌクレオチドから翻訳される、請求項13に記載の方法。工程cの混合がマルチウェルプレートのウェル中で行なわれる、請求項13に記載の方法。フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントがマルチウェルプレートのウェル上にコーティングされる、請求項16に記載の方法。血小板が工程cの後でかつ工程dの前に洗浄される、請求項17に記載の方法。血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性が、血小板の洗浄後に残っている血小板の数を検出することにより測定される、請求項18に記載の方法。血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性が、血小板の洗浄後に活性化状態にある血小板の数を検出することにより測定される、請求項17に記載の方法。工程eの混合がマルチウェルプレートのウェル中で行なわれる、請求項13に記載の方法。フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントがマルチウェルプレートのウェルにコーティングされる、請求項21に記載の方法。血小板が工程cの後でかつ工程dの前に洗浄される、請求項22に記載の方法。血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性が、血小板の洗浄後に残っている血小板の数を検出することにより測定される、請求項23に記載の方法。血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性が、血小板の洗浄後に活性化状態にある血小板の数を検出することにより測定される、請求項22に記載の方法。従って本発明の目的は、迅速で、かつ血小板毒性のような望ましくない副作用の同定を可能にする、血小板を調節する試験物質のスクリーニング方法を提供することである。この目的は、本発明に従う方法により解決される。要旨本開示は、血小板又は血小板表面分子と相互作用パートナーとの相互作用を検出及び/又は定量化するための方法を提供し、本方法は以下の工程:aレーザー走査又は蛍光サイトメトリー又は顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされている];b標識された血小板を、i1つ又はそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル及びii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上;ii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用せず又は強く相互作用しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子低コントロールでコーティングされた、上記のマルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ若しくはそれ以上のウェル;iii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ又はそれ以上の分子高コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子活性化コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;cウェルを洗浄して未結合の血小板を除去する工程;dウェル又はプレートの予め選択された領域においてレーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより:i血小板の総数、及び/又はii活性化された血小板の数を検出する工程を含み、ここで強い血小板相互作用を有する相互作用パートナーは、低コントロールと比較して多数の検出された血小板、及び/又は低コントロールと比較して多数の活性化された血小板に基づいて同定され得るのに対して、弱いか又は低い血小板相互作用を有するパートナーは、高コントロールと比較して少数の検出された血小板及び/又は高コントロールと比較して少数の活性化された血小板に基づいて同定され得る。本方法の特定の実施態様において、以下のパラメーター:1弱くなった蛍光シグナルを有する血小板の数、2異常な形態断片を有する血小板の数、又は3異常なレッドシフトした蛍光を有する物体の数大型赤色物質;のうちの1つが決定され、ここで上記のbiii又はiv高コントロール又は活性化コントロールと比較して、上記のbiについて1、2又は3のうちのいずれかにおいて多数が検出されることは、相互作用パートナーの毒性又は異常な効果についての識別子としての役割を果たす。本開示はまた、血小板又は血小板表面分子の相互作用パートナーとの結合を調節する試験物質の能力を検出及び/又は定量化するための方法を提供し、本方法は、以下の工程:aレーザー走査又は蛍光サイトメトリー又は顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされている];b標識された血小板を:i1つ若しくはそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル、及び場合によりii、iii若しくはivのうちの1つ若しくはそれ以上;ii血小板若しくは血小板表面分子と特異的に相互作用せずかつ/若しくは強く相互作用しないことが知られている1つ若しくはそれ以上の分子低コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート若しくはさらなるマルチウェルプレートの1つ若しくはそれ以上のウェル;iii血小板と特異的に若しくは強く相互作用せず、かつ/若しくは活性化しないことが知られている血小板若しくは血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ若しくはそれ以上の分子高コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート若しくはさらなるマルチウェルプレートの1つ若しくはそれ以上のウェル;又はiv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ若しくはそれ以上の分子活性化コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート若しくはさらなるマルチウェルプレートの1つ若しくはそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;c試験物質を血小板と接触させる工程;dウェルを洗浄して未結合の血小板を除去する工程;eウェル又はプレートの予め選択された領域において、レーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより血小板の総数を検出する工程;及び場合によりfウェルの予め選択された領域において、レーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより、以下のパラメーターI、ii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上を検出する工程:i弱くなった蛍光シグナルを有する血小板の数;ii異常な形態断片を有する血小板の数;iii異常なレッドシフトした蛍光を有する物体大型赤色物質の数;iv活性化された血小板の数;並びにge及び場合によりfに従う値と、試験物質を加えずに生成された1つ又はそれ以上の参照値とを比較する工程を含み、ここで試験物質を用いて検出された値と試験物質を用いずに検出された値との間の差は、その試験物質が血小板表面分子又は血小板の結合を調節することができるということを示す。この方法の一実施態様において、fi、ii又はiiioriiiorのうちの1つ又はそれ以上が検出され、ここで試験物質を含まない参照サンプルと比較して、fi、ii、iii又はivの値の1つ又はそれ以上との間の増加は試験物質の毒性作用を示す。別の実施態様において、fivに従う活性化された血小板の数が検出され、ここで試験物質を含まない参照サンプルと比較した間の増加が試験物質の血小板活性化効果を示す。本開示はまた、血小板が、試験物質及び血小板をコーティングされたプレートと接触させる前に試験物質と混合され得る、上記の方法のいずれかに従う方法を提供する。さらに、上記の方法のいずれかについて、血小板は以下のうちの1つのような蛍光色素で標識され得る:カルセイン-AM、CMFDA5-クロロメチルフルオレセインジアセテート、PKH67、レサズリン、ラバセルLavacell、固定可能FM1-43、ナノ-オレンジNano-Orange又は蛍光標識されたファロイジン。さらに、上記の方法のいずれかについて、血小板表面分子は、GP1b、コラーゲン受容体、PAR1、PAR4、P2Yプリン受容体1、P2Yプリン受容体12、接合部付着分子AJAMA、又はJAMCのような血小板表面タンパク質であり得る。さらに、上記の方法のいずれかについて、血小板表面受容体の相互作用パートナーは、天然に存在する相互作用パートナー、その機能的誘導体若しくはフラグメント、又は合成相互作用パートナーであり得る。さらに、上記の方法のいずれかについて、相互作用パートナーは、以下:フォンビルブランドvanWillebrand因子1vWF-1、vWF-1のA1ドメイン、コラーゲン、フィブリノゲン、プロテインc、Mac-1αMβ2、P-セレクチン、CD62P、高分子量キニノーゲン、トロンボスポンジン-1、可溶性GPVI、PSGL1、又はこれらのうちのいずれかの機能的フラグメント若しくは誘導体のうちの1つであり得る。さらに、上記の方法のいずれかについて、マルチウェルプレートは、96ウェル、386ウェル又は1536ウェルのプレートであり得、好ましくは386ウェルプレートである。本開示はまた、上記の方法のいずれかについての指示を含む説明書leafletを含んでなる製品を提供する。本開示はまた、物質が哺乳動物に対して毒性である可能性があるかどうかを決定する方法を提供し、本方法は、その哺乳動物と同じ種の一員である対象からの血小板サンプルを準備すること;フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントを準備すること;血小板をフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントと混合すること;血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性を決定すること;物質を、フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントと共に血小板と混合すること;及び血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性を決定すること;を含み、ここで血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の親和性が、物質が存在しない場合よりも物質の存在下でより低い場合、その物質は哺乳動物に対して毒性である可能性がある。特定の実施態様において、フォンビルブランド因子のフラグメントは配列番号2のアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、フォンビルブランド因子のフラグメントは配列番号1の核酸配列を含むポリヌクレオチドから翻訳される。さらに、これらの工程の混合はいずれもマルチウェルプレートのウェルにおいて起こり得る。フォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントはマルチウェルプレートのウェルにコーティングされ得る。血小板は、血小板及びフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントを混合する後で、しかし決定する工程の前に洗浄され得る。血小板とフォンビルブランド因子タンパク質又はそのフラグメントとの間の結合親和性は、血小板の洗浄後に残っている血小板の数を検出することにより、又は血小板の洗浄後に活性化状態にある血小板の数を検出することにより測定され得る。詳細な説明本発明は、血小板又は血小板表面分子例えばGP1bのそれらの相互作用パートナー例えばvWFとの相互作用を調節する新規な試験物質の同定のための改善されたアッセイ方法を提供することにより上記の必要性を満たし、ここで望ましくない副作用、例えば試験物質の血小板毒性が並行してモニタリングされ得る。一実施態様によれば、本発明は、血小板又は血小板表面分子と相互作用パートナーとの相互作用を検出及び/又は定量化するための方法に関し、本方法は、aレーザー走査サイトメトリー若しくは顕微鏡検査による、又は蛍光サイトメトリー若しくは顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされる];b標識された血小板を、i1つ又はそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル及びii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上:ii血小板若しくは血小板表面分子と特異的に相互作用せず若しくは強く相互作用しないことが知られている1つ若しくはそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ若しくはそれ以上のウェル;iii血小板と特異的に相互作用せず若しくは強く相互作用せず、かつ/又は活性化しないことが知られている血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ又はそれ以上の分子高コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子活性化コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;cウェルを洗浄して未結合の血小板すなわち、相互作用パートナーと特異的に相互作用しなかった血小板を除去する工程;dウェル及び/又はプレートの予め選択された領域ここで、プレート及び/又は各ウェルの一部又は全体の領域が分析され得るにおいてレーザー走査又は蛍光顕微鏡検査又はサイトメトリーにより:i血小板の総数ここでbiにおける血小板の数をbiiにおける血小板の数で割り、100を掛けて、相互作用パートナーに特異的に結合した血小板のパーセンテージXを得る、及び/又はv活性化された血小板の数[ここでbi、ii、iii又はivのいずれかにおける血小板の数を、bi、ii、iii又はivのうちの同じものにおける活性化された血小板の数で割り、100を掛けて、bi、ii、iii又はivの各々における活性化された血小板のパーセンテージを得る]を検出する工程;を含み、ここで強い血小板相互作用を有する相互作用パートナーは、低コントロールと比較して検出された血小板の増加、及び/又は低コントロールと比較して活性化された血小板の増加に基づいて同定され得るのに対して、弱いか又は低い血小板相互作用を有するパートナーは、高コントロールと比較して検出された血小板の減少及び/又は高コントロールと比較して活性化された血小板の減少に基づいて同定され得る。強い血小板結合相互作用を有する相互作用パートナーは、例えば多数の血小板、及び/又は多数の活性化された血小板に基づいて同定され得る。弱いか低い血小板結合相互作用を有する相互作用パートナーは、少数の血小板、及び/又は少数の活性化された血小板に基づいて同定され得る。本発明に従うこの方法は、新しい血小板相互作用パートナーの同定、さらには既知の血小板相互作用パートナーの分析も可能にし、ここで、分析に含まれるべきパラメーターに依存して、血小板相互作用加えて効果も容易かつ迅速に検出され得る。分析しようとする血小板相互作用パートナーは、いずれの種類の分子又は分子複合体でも、1つより多くの分子でもよく、そしてまた以下に定義されるようないずれの種類の試験物質でも1つ又はそれ以上の試験物質を含む混合物であってもよい。このようなさらなる効果を分析及び検出する目的に向かって、以下のパラメーター:a弱くなった蛍光シグナルを有する血小板の数b異常な形態断片を有する血小板の数c異常なレッドシフトした蛍光を有する物体大型赤色物質の数の1つ又は両方が決定され得、かつここでbiii又はiv高コントロール又は活性化コントロールと比較して、biについてa、b又はcのうちのいずれかにおける多数は、相互作用パートナーの毒性又は異常な効果についての識別子としての役割を果たす。本発明の別の局面は、血小板又は血小板表面分子の相互作用パートナーとの結合を調節する試験物質の能力を検出及び/又は定量化するための方法に言及し、本方法は、以下の工程:aレーザー走査又は蛍光サイトメトリー又は顕微鏡検査による光学的分析に適したマルチウェルプレートを準備する工程[ここでプレートの1つ又はそれ以上のウェルは、血小板表面分子の相互作用パートナーでコーティングされている];b標識された血小板を:i1つ又はそれ以上の相互作用パートナーでコーティングされたウェル、及び場合によりii、iii又はivのうちの1つ又はそれ以上:ii血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用せず又は強く相互作用しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子でコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iii血小板と特異的に相互作用せず若しくは強く相互作用せず、かつ/又は血小板を活性化しないことが知られている血小板又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている1つ又はそれ以上の分子高コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル;iv血小板に結合するが活性化しないことが知られている1つ又はそれ以上の分子活性化コントロールでコーティングされた、上記マルチウェルプレート又はさらなるマルチウェルプレートの1つ又はそれ以上のウェル[III及びIvは同じであってもよい]と接触させる工程;c試験物質を血小板と接触させる工程、核酸、タンパク質などのような、いずれかの化学的分子若しくは生物学的分子又は分子複合体であり得る。血小板表面分子の相互作用パートナーとの結合を調節する試験物質の能力を検出又は定量化するための方法において、fi、ii又はiiioriiiorの1つ又はそれ以上が検出される場合、試験物質を含まない参照サンプルと比較して、fi、ii、iii又はivの値の1つ又はそれ以上との間の増加は、その試験物質の毒性作用を示す。さらに、このような方法において、fivに従う活性化された血小板の数が検出される場合、試験物質を含まない参照サンプルと比較して活性化された血小板の数の増加は、その試験物質の血小板活性化効果を示す。血小板の総数は、以下のパラメーターの1つ、2つ又は3つにより同定され得る:目的の相互作用パートナーに付着している個々の単離された血小板において測定された最小値と最大値の間にある蛍光強度、目的の相互作用パートナーに付着している血小板において測定される、予め選択された最小値と最大値との間の、個々の単離された血小板の寸法、目的の相互作用パートナーに付着している血小板において測定される、よりも低い、単一の血小板あたりの平均及び/又はピーク蛍光強度。好ましくは、血小板あたりの平均及び/又はピーク蛍光強度は、通常の蛍光強度を有する血小板についての平均値より90若しくはそれ以下、80若しくはそれ以下、70若しくはそれ以下、60若しくはそれ以下、又は50若しくはそれ以下であり、70又はそれ以下が好ましい。目的の相互作用パートナーに付着している単一の血小板において測定して、最小値と最大値との間にある個々の単離された血小板の寸法。正確なスペクトルは、血小板の染色に使用されるフルオロフォアのスペクトル特性及び実験設定に依存する。被検体分析されるべき試験物質の毒性作用の指標としての、異常な形態の断片破片を有する血小板の数は、例えば以下のパラメーターの1つ、2つ又は3つを用いて同定され得る:目的の相互作用パートナーに付着している通常の形態を有する単一の血小板において測定された平均値よりも小さい、個々の物体の寸法。好ましくは、個々の血小板あたりの寸法はisis、目的の相互作用パートナーに付着している通常の形態を有する単一の血小板において測定された平均値の寸法よりも、90若しくはそれ以下、80若しくはそれ以下、70若しくはそれ以下、60若しくはそれ以下、又は50若しくはそれ以下であり、70又はそれ以下が好ましい。目的の相互作用パートナーに付着している通常の形態を有する血小板において測定された値の1~100、2~100、3~100、4~100、5~100、6~100、7~100、8~100、9~100又は10~100である、単一物体あたりの平均及び/又はピーク蛍光強度、5~100の値が好ましい。目的の相互作用パートナーに付着している通常の形態を有する血小板において測定されたものに等しい、検出された蛍光の発光波長スペクトル色。正確なスペクトルは、血小板を染色するために使用されるフルオロフォアのスペクトル特性以下を参照のこと、及び実験設定に依存する。被検体分析されるべき試験物質の血小板毒性作用の指標としての、異常なレッドシフトした蛍光を有する物体大型赤色物質の数は、例えば以下のパラメーターの1つ、2つ又は3つを用いて同定され得る:目的の相互作用パートナーに付着している血小板において測定された最大波長と比較してより長波長にシフトした物体の検出された蛍光の発光波長スペクトルに依存する。約5~500μm2、約7~400μm2、約8~350又は約10~300μm2である個々の物体の寸法、約10~300μm2が好ましい。これらの値は、使用された検出器の種類;励起及び発光に使用された波長に依存する。活性化された血小板の数は、例えば以下のパラメーターの1つ又は2つ又は3つを用いて同定され得る:目的の相互作用パートナーに付着している単一の血小板について測定された平均最大値より大きい、血小板の群からなる物体の寸法、目的の相互作用パートナーに付着している血小板において測定して例えば高コントロール、最小値と最大値との間にある平均蛍光強度及び平均蛍光ピーク強度、例えば高コントロールにおいて目的の相互作用パートナーに付着している血小板において測定して、平均最大値と最小値との間にある、検出された蛍光の発光波長スペクトル。正確なスペクトルは、血小板を標識するために使用されるフルオロフォアのスペクトル特性以下を参照のこと、及び実験設定に対する1つの集団の=測定された特徴/パラメーターの阻害のパーセンテージは、例えばにより計算され得る。特定の特徴/パラメーターの活性化パーセンテージは、例えば:により計算され得る。予め選択された領域における分析は、検出された値が異なるサンプル間で比較できるということを保証する。この予め選択された領域は、1つ若しくはそれ以上のウェル全体を含むプレートの決められた領域であり得、又はそれは1つのウェル内の予め選択された領域、又は両方の組み合わせ例えばプレートの予め選択された領域、ここで各ウェルにおいて、そのウェルの予め選択された領域が分析されるであり得、予め選択された領域はまた、プレート全体及び/又は各ウェルの全体であってもよい。一実施態様において、分析されるべき領域は3~5mm×3~5mmであり、別の実施態様では、それは3×3mm、4×4mm又は5×5mmであり、4×4mmが好ましく、さらに、予め選択された領域は、プレートあたりの規定された数のウェルであり得る。プレートのウェルのいくつかのみが同時に分析される場合、この工程はプレートの他のウェルで繰り返され得、又はプレートの別の部分が、全ての方法の工程が行われるまで、本発明に従う方法の1つの異なる工程において分析される。上記の集団は、例えば以下のウェルにおいて測定される:高結合コントロール:血小板及び/又は血小板表面分子と特異的に相互作用することが知られている相互作用パートナーでコーティングされた1つ又はそれ以上のウェル非結合又は低結合コントロールは、BSAのような、非相互作用パートナー又は低相互作用パートナー、ここで試験試験testtest物質がこれらのウェルに加えられ得、血小板の添加と同時に、血小板の添加前に又は後に加えられ得、血小板添加の前の添加が好ましい。実施例の項において後で詳述されるように、一実施例によれば、反応あたり16のウェルを、上記3種のウェルのそれぞれについて分析した。結合パートナーとの血小板相互作用を減少させ、かつ/又は血小板活性化を減少させる試験物質は、例えば以下のパラメーターにより同定され得る:全ての高結合コントロールコントロールcontrolcontrolウェルの平均値より高い、特徴血小板の数の阻害パーセンテージについての値。結合パートナーとの血小板相互作用を増加させ、かつ/又は血小板活性化を増加させる試験物質は、例えば以下のパラメーターにより同定され得る:特徴血小板の数の阻害パーセンテージについての値が、全ての実験用ウェルについて得られた平均値より高いか、又は全ての非結合若しくは低結合コントロールウェルの平均値より高い。血小板に対して毒性作用を有する試験物質は、例えば以下のパラメーターの1つ又は2つ又は3つに基づいて同定され得る:血小板の総数の減少:所定の試験物質についての実験用ウェルにおける特徴血小板の数の阻害パーセンテージの値が、全ての実験用ウェルの平均値より高いか、又は全ての高結合コントロールウェルの平均値より高い。血小板破片の増加:以下の計算-特徴異常な形態の断片、CMFDA、PKH67、レサズリン、Lavacell、FM1-43、Nano-Orange、又は蛍光標識ファロイジンのような蛍光色素が挙げられる。血小板表面分子は、タンパク質又は糖タンパク質のような、受容体又は他の血小板表面タンパク質のような、血小板例えばヒト又は非ヒト血小板のいずれかの表面分子、例えばGP1b、コラーゲン受容体、PAR1、PAR4、P2Yプリン受容体1、P2Yプリン受容体12、接合部付着分子A、JAMC又はいずれかの他の公知の血小板表面分子であり得る。血小板又は血小板表面分子の相互作用パートナーは、血小板又は血小板表面分子と相互作用する生物学的又は人工の例えば化学的な分子又は超分子複合体、例えば血小板表面分子若しくは受容体又はその機能的フラグメント若しくは誘導体の人工又は天然に存在するリガンドであり得る。相互作用パートナーの例としては、フォンビルブランドvanWillebrand因子1、vWF-1のA1ドメイン、コラーゲン、フィブリノゲン、プロテインc、Mac-1、P-セレクチン、、高分子量キニノーゲン、トロンボスポンジン-1、可溶性GPVI、PSGL1、又はこれらのいずれかの機能的フラグメント若しくは誘導体が挙げられる。一実施例によれば、相互作用パートナーはvWF-1である。別の実施例によれば、これは、配列番号2と95、96、97、98、99又は100の配列同一性を有するか、又は配列番号1と95、96、97、98、99又は100の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされる、vWF-1である。別の実施例によれば、相互作用パートナーはvWF-1のA1ドメインである。本発明の状況において使用されるマルチウェルプレートは、レーザー走査顕微鏡若しくは蛍光顕微鏡、レーザー走査血球計算器若しくは蛍光血球計算器を用いる光学的分析に適したいずれかのマルチウェルプレートであり得る。このようなプレートは当該分野で公知である。適切な形式としては、例えば96ウェル、386ウェル又は1536ウェルのプレートが挙げられ、好ましくは386ウェルプレートである。本発明セットはまた、上記の方法の1つ又はそれ以上の指示を含む説明書leafletを含んでなる製品に関する。以下において、本発明は実施例の形態でより詳細に記載され、これら実施例は限定と理解されるべきではない。導入:生血小板におけるvWF-GP1b相互作用の多重パラメーター解析:本発明は、以下において、固定化タンパク質との生きたヒト血小板の相互作用の特異的かつ定量的測定のための血小板ベースのアッセイHTSに適しているの形態で説明される。これは、血小板に対して粘着性である2つのタンパク質:コラーゲン1及びフォンビルブランド因子からのA1ドメインについて示される。血小板を約50000のマルチプレートウェルに分配し、そして未結合の血小板を洗浄により除去した。このアッセイは1日あたり約50000のウェルをスクリーニングするのに適していた。このアッセイは、毒性及び血小板活性化効果を示唆する複数の細胞パラメーターの取得及び分析を含む、阻害剤及び/又は活性化剤の同定を可能にする。生理的条件下では、血小板は血管損傷の部位で凝集して漏出を塞ぐ。血漿フォンビルブランド因子は、このプロセスにおいて細胞外アダプターとして作用し、損傷した血管壁においてコラーゲンに結合し、次いで血小板表面上でそのA1ドメインを介して膜糖タンパク質Ib複合体に結合する。vWF-A1ドメインは、比較的高い流体ずり速度でvWFがコラーゲンに結合する場合にのみ露出されるので、vWF及び血小板は血液中で容易に相互作用しない。この事象を、フォンビルブランドvonWillibrand因子及びGPIb受容体複合体の相互作用を阻害する試験物質を同定することを目標とした生物学的に関連するスクリーニングキャンペーンcampaignに転換するために、新しい結合アッセイが開発された。この結合アッセイでは、生血小板を、単離されたvWF-A1ドメインでコーティングされた384マルチウェルプレートのウェルに加える。アッセイプロトコルを、ツール試験物質としてのvWFA1タンパク質-タンパク質相互作用の既知の阻害剤及び選択された数の既知の細胞傷害性試験物質全部で61を用いて確認した。細胞傷害性のような特異的効果と非特異的効果とを区別するための最も重要な読み出しread-outパラメーターを見つけるためにこのデータをさらに使用した。懸濁液中の血小板の限られた安定性にもかかわらず、1週あたり約48000の単一の点の検出というスループットが、良好な統計的品質で得られた。このアッセイを、619569の試験物質のセットに10μMで使用した。得られた6847のポジティブな試験物質である。vWFは血小板の損傷した表面への付着を媒介する多量体タンパク質である。これはタンパク質の中心部分にA1及びA3ドメインのようないくつかのドメインを含有し、これが凝固のための血小板の捕捉及び活性化に重要な役割を果たす。血小板vWF受容体についての結合部位はA1ドメイン内にあるのに対し、その相同なA3ドメインはコラーゲンに結合する。通常の循環においてA1ドメインは隠れている。従って、傷害が存在しない場合、VWFは循環血小板と相互作用しないように見える。そのA3ドメインを介したコラーゲンへのvWFの結合による固定化はまた、確認confirmationの変化を誘導し、血小板膜上のvWF受容体に対する増加した結合親和性、血小板付着、血小板形状変化及び露出した内皮下層に沿った拡散、他の血小板の動員及び血小板の活性化を介した凝集に通じる血小板顆粒のエキソサイトーシスの放出を引き起こす。さらに、血小板のvWFに対する親和性は、高流体ずり応力の条件下で、VWFの折り畳みをほどいて血小板上のvWF受容体との相互作用のためのvWF-A1配列を露出させることができる条件下で劇的に増加する。この折り畳みをほどくプロセスは可逆的であり、流体力学的ずり応力がなければ、タンパク質はすぐに弛緩してそのまとめられたcompact状態へと戻る。高ずり応力の条件は、特にハイスループットスクリーニングの間に実験室で再現することは煩雑であるので、vWF全体の代わりにA1ドメインを本アッセイでは使用した。vWF-A1ドメインとその受容体との間の相互作用に対する阻害剤を検出するために、vWF-A1ドメインあるは以下ではA1とも呼ぶと直接相互作用するタンパク質である単離されたGpIbタンパク質の代わりに全血小板を使用することが有利である。GP1bタンパク質はGPIb-IX-Vからなる複合体の一部である。この複合体の一部は脂質ラフトと結合しているようであり、GPIb-IX-V媒介血小板機能におけるこの関連についての生理学的役割に関する証拠がある。糖タンパク質Ib-IX-V複合体の脂質ラフトへの局在化は血小板付着及び活性化に必要であるため、全GPIb-IX-V複合体が適切な活性化及びシグナル伝達のために必要とされるということはもっともらしく思われる。VWF血小板相互作用の重要性は、vWF受容体又はvWFタンパク質自体の定量的又は定性的な欠損が、両方とも01~1の罹患率で出血性障害を生じるということから明らかである。欠損の箇所に依存して、いくつかの疾患が知られている;フォンビルブランド因子病vWFに異常がある場合及びベルナール-スーリエ症候群又は巨大血小板症候群vWF受容体に欠損がある場合。血小板が患部血管と相互作用する場合、この上記と同じプロセスが、世界中で主要な死因である心血管疾患の原因である病的な血管閉塞を生じ得る。急性冠症候群の病態生理学的基礎は、その後の血小板付着、凝集、血栓の形成を伴う急性プラーク破綻である。1つのアプローチは、血小板活性化又は凝集の代わりに血栓症の最初の段階、すなわち血小板付着を阻害することである。ほとんど全てのACSは既存の冠動脈硬化症における血栓形成の結果として生じる。プラーク破綻の結果として、血小板は内皮下基質に露出され、これが局所的血栓形成をもたらす。これがその後、冠動脈閉塞及び急性心筋梗塞を引き起こす。AMI後の患者において、高ずり誘導血小板付着及び凝集が増加し、そして抗vWF抗体の投与により阻害され得る。従って、VWF-血小板相互作用を特異的に阻害する治療は、見込みのある新しい抗血小板薬として特に興味が持たれる:61-67theroleofVWF-collageninteractioninacuteplateletthrombusformationKVanhoorelbekeandHDeckmyn。固定化タンパク質への洗浄された血小板の結合を、洗浄により未結合の血小板を除去した後に384マルチウェルプレートのウェルを画像化することにより決定した。このアッセイの目的は、固定化タンパク質と血小板との間の相互作用を阻害するそれらの能力について小分子を同定することであった。しかし、このアッセイは生体分子又は超分子複合体の分析にも適している。例えば特異的血小板-A1相互作用阻害剤として作用する試験物質は、A1でコーティングされたウェルへの血小板への付着を、細胞傷害性であることなく減少させるべきである。輸血を目的とした血小板濃縮物から得られた血小板をカルセイン-AMにより蛍光標識し、そして単離されたvWF-A1ドメイン又はコントロールとしての血清アルブミンでコーティングされたマルチプレートのウェルに加えた。インキュベーションした後、未結合の血小板を洗浄により除去した。固定化vWF-A1に結合している血小板の量を、レーザー走査血球計算器を使用した画像化により決定した。特定の物体の数、それらの寸法、丸さ、放射される色、及び蛍光強度のようないくつかの特徴を測定した。これらのパラメーターは、既知の阻害剤、毒性試験物質及び不活性中性試験物質から構成される訓練セットtrainingsetの試験物質を区別するそれらの能力により選択された。付着した物体をこれらのパラメーターの組み合わせにより同定し、このようにして、血小板を他の血液産物と区別して定量化することができる。開発されたアッセイはスクリーニングを意図しており、週あたり4x30プレートのスループットを良好な統計で得ることができ、そして試験された22の参照試験物質の>90を十分な感度で同定することができた。このアッセイの目的は、血小板とvWF-A1ドメインとの間の相互作用を阻害するそれらの能力について小分子を同定することであった。これらの試験物質を、標識された血小板の直前に、コーティングされたウェルに加えた。アッセイの開発の間に、他の細胞アッセイにおいてそれらの細胞毒性特性について知られている大部分の試験物質がA1ドメインとの血小板の相互作用の有効な阻害剤であるということが明らかになった。注意深く多重パラメーター解析を行うことにより、細胞傷害性試験物質は非毒性阻害剤と区別され得る。さらなる多次元解析はまた、血小板の付着の阻害を生じる毒性作用を有する試験物質に対してフィルターをかけた。試験物質の構造の比較は、さらなる薬物開発のための有力候補である構造的共通要素を同定した。ツール試験物質としてのvWFA1タンパク質-タンパク質相互作用の既知の阻害剤及び選択された数の既知の細胞傷害性試験物質合計61を用いてアッセイプロトコルを検証した。特異的効果と非特異的効果例えば細胞傷害性とを区別するために最も重要な読み出しパラメーターを見つけるためにこのデータをさらに使用した。このアッセイは、600Kの試験物質を384形式でスクリーニングするために適している。懸濁液での血小板の限定された安定性にもかかわらず、週あたり約48000の単一点検出のスループットが、良好な統計的品質で得られた。確認用検証用コレクションValidationCollectionを三重に試験し、07-09のヒット率を示した。ハイコンテントスクリーニングハイコンテントスクリーニングは、全細胞形態変化及び多数の生物学的プロセスに関与するシグナル伝達事象、例えばタンパク質の局在化、トランスロケーション、リン酸化、タンパク質-タンパク質相互作用及びセカンドメッセンジャーカスケードの検出を可能にする。このような画像ベースのスクリーニングアプローチは、それらの豊富な情報含有量のためにHCSと呼ばれている。マイクロタイタープレートにおける細胞の画像は自動的に生成され、そして画像解析アルゴリズムを使用して解析される。このようにして、蛍光強度、粒度、細胞形状、細胞内小器官の構成、目的の物体の空間的関係のような試験物質の効果に関連する細胞の複数の生化学的及び形態学的パラメーターが同時に測定され得る。創薬のためのHCSの主要な利点は、それが:例えば細胞の分集団又は細胞内構造を規定するためのパラメーターの組み合わせ多重化及び場合により望ましくない効果毒性の初期の検出を可能にすることである。周知の参照基準の薬理プロフィールのパラメーターとの比較による薬物プロファイリング:既知の薬物及び薬理的参照に対して表現型ヒットの細胞活性プロフィールを比較する化学構造解析によるヒットの構造-活性相関:多重パラメーター解析により検出して、類似した生物学的効果を生じる試験物質を見出す機会。細胞に対する類似した活性を有する試験物質のコレクションの化学構造の綿密な解析は、共通の構造要素の同定を可能にする。これは、優先順位付けを増強し単純化し、そして見込みのある化学的候補の化学的最適化により、先導する開発を促進させる。多重パラメーター解析単一細胞分析からの世代多重パラメーターはデータの著しい増加をもたらす。多次元空間におけるデータの解析は、単一読み出しアッセイにおける有効性又は効力による通常の等級序列と対照的に、困難な作業になり得る。HCSから得られるこの多量のパラメーターを十分に活用するために、これらのパラメーターを生物学的、化学的及び薬理学的状況で評価、解析及び解釈する必要がある。従って、十分に特徴付けられたコントロール及び参照状況を、多次元データの解析の過程で検討した。多次元データセットの正規化は重要な最初の工程である。この作業を、複数の市販及び学術的なソフトウェアソリューションにより達成した。ツール試験物質又は天然リガンドの作用様式のような十分に確定された参照状況は、通常は主要なはスループットスクリーニングから独立して測定されるという事実に起因して、適切な正規化方法を注意深く選択することが重要である。多次元データが正確に正規化されるとすぐに、標準的な多変量データ解析技術、例えばクラスター分析、因子分析、分類技術及びフィルタリング技術を適用した。Acumen技術Acumenは、励起のために488nmのレーザーを使用する細胞ベースのスクリーニング及び4色同時の検出を可能にする読み取り機である。Acumen技術は、画像解析よりもむしろ血球計算の原理を適用する。レーザーは視野全体を走査して一定間隔で強度読み取りを収集する。これにより、常用の顕微鏡検査により行われるようなウェルの一部の画像を作成する代わりに、ウェル全体の画像化が可能となる。ウェル全体の分析は、ウェル全体の典型ではない画像の分析により誤った解釈をする危険性を排除する。閾値Thresholdingアルゴリズムは、溶液バックグラウンドより高い全ての蛍光強度を識別する。Acumen技術は迅速かつ強固な結果である-いずれのプレートについてもプレートあたり平均で約10分。1材料11貯蔵全ての材料を、供給業者により推奨されるように、それらのウェブサイト以下に列挙されるに記載されるように、又はそれらの製品情報に記載されるように貯蔵した。12細胞血小板を、DRK-BlutspendedienstBaden-Wuertemberg-HessenGmbH;生産者:InstitutFrankfurtPF730367D-60505Frankfurtを介して入手した。輸送はBluttransportにより血液製剤のための法的ガイドラインに従って行われた。血小板濃縮物を室温にてEdmundBuehlerによるTiMixで穏やかな撹拌下にて貯蔵した設定6。これらの濃縮物は、4ドナーからプールされ、約30血漿を含有していた。13プレートアッセイプレート:Greinerhb、黒色、透明底部、384ウェル、Greiner78109714化学薬品試薬供給業者注文番号形態分子量貯蔵Trizma塩基SIGMAT-1503固形MW12114室温TrizmaHClSIGMAT-3253固形MW1576室温NaClSIGMAS-3014固形MW5844室温KClSIGMAP-9541固形MW7455室温CaCl2SIGMAC-3306固形MW1470室温MgCl2x6H2OSIGMAM-2670固形MW20331室温10Pluronic-F-68SIGMAP-5556液状MW8350室温水中10PluronicF-68からなる市販の溶液PGE1SIGMAP-5515固形-20°C無水エタノール中05mgPGE1/mlから作製されたストック液状-20°Cカルセイン-AMInvitrogenC-3099液状-20°C乾燥DMSO中カルセイン-AM1mg/mLを含有する市販の溶液ReoProCentocorBVPZN7123941液状2mg/ml2-8°C15タンパク質及び抗体BSASIGMAA-7906固形4°CBSA脂肪酸非含有SIGMAA-7030固形4°CvWF-A1、液状;53mg/ml-80°C16緩衝液及び溶液TBS-10X濃縮=全ての以後の緩衝液の基礎:500mMTRIS-HCl、pH74、200mMNaCl、27mMKCl、05mMCaCl2;貯蔵室温又は4°C1MMgCl2-ストック溶液vWF-A1-コーティング溶液及びブロッキング溶液のためのTBS-vWF-A1-コーティング/ブロッキング-緩衝液Puffer1X:1xTBS-緩衝液中2mMMgCl2試験物質希釈及びコントロールのための、血小板調製に使用されるTBS-付着Adhaesion緩衝液1X:1xTBS中2mMMgCl2及び01BSAコーティング後の洗浄、ブロッキング及びアッセイ-インキュベーション後のためのTBS-洗浄緩衝液1XTBS-付着緩衝液Adhaesionbuffer1X中のPluronic-F-680001TBS-vWF-A1-コーティング/ブロッキング-緩衝液中のvWF-A1-コーティング溶液:1xTBS-緩衝液中2mMMgCl2中の30μg/mlvWF-A1実際のバッチ:53mg/mlTBS-vWF-A1-コーティング/ブロッキング-緩衝液Puffer1X中5ブロッキング緩衝液:5BSA粉末、脂肪酸非含有PGE1-アッセイ濃度:025μg/ml、貯蔵-20°CPGE1-ストック溶液2μlを、DRK/独国赤十字からの4ml血小板濃縮物を加える前に加えなければならないカルセイン-AM-アッセイ濃度:25μM/ml、カルセイン-AM-ストック溶液からの5μlを、28血小板/mlの濃度を有する血小板懸濁液2mlに加えた:ReoPro-アッセイ濃度:25μg/ml、4°Cで貯蔵-すぐに使えるreadytouse;血小板溶液2E08/mlからvon5E07/mlへauf>1:4TBS-付着Adhaesions緩衝液Puffer最初に3mlをピペットで取るReoPro-ストック溶液添加して短く撹拌する5μl血小板Thrombocyten2E08/ml1ml384アッセイのための血小板希釈5E07/mlから5E05/mlへ血小板希釈>1:100TBS-付着Adhaesions緩衝液最初にこの緩衝液をピペットで取る、PPビーカーにFluegelruehrfisch99ml血小板5E07/ml01ml17参照試験物質a2つの特異的GPIb阻害剤を使用した:OS-1、BenardetalBiochemistry200847pp4674-4682を参照のこと:httpwwwncbinlmnihgovpubmed18363340OS-1ペプチドはGPIbに結合し、そしてそれがVWF-A1との鍵となる相互作用を形成することができなくなるようなやり方でGPIbを安定化する。bChemiconInternationalからのマウス抗ヒトCD42Bモノクローナル抗体。この抗体はCD42b抗原に対して特異的である;血小板糖タンパク質Gp1bアルファ、これはフォンビルブランド因子の受容体として機能する;クローン名:AK2;カタログ番号CBL166、2方法21vWF-A1でのアッセイプレートのコーティング及びBSAによるブロッキングTBS-vWF-A1-コーティング/ブロッキング-緩衝液Puffer1X25μlを、LabsystemsからのMultidropを使用してウェルに滅菌で加えた。プレートをインキュベートし、そして最少で一晩から1週間まで貯蔵した。貯蔵は4°Cで滅菌下で、蒸発に対して保護して行った。本明細書で使用されるvWF-A1ドメインの配列は::cDNA配列アミノ酸配列試験物質を加える1時間前に、プレートのウェルをBSAでブロッキングした。先に、BiotekからのELx405マイクロプレート洗浄機を使用してウェルを1xTBS-洗浄緩衝液、60μl/ウェルで洗浄した。直後に、これらのウェルをLabsystemsからのMultidropを使用して5BSA-脂肪酸非含有40μl/ウェルでブロッキングした。ウェルを試験物質を加えるまで1~2時間インキュベートした。22試験物質希釈試験物質管理から供給された密封されたプレートを使用するまで-20°Cで貯蔵した。試験物質を100DMSOに3mMで溶解させた。試験物質をTBS-付着Adhaesion緩衝液1Xで10μMの最終濃度まで希釈した。希釈された試験物質を室温で貯蔵し、そして数時間以内に使用した。HTSは一点測定で起こった。23ウェルの洗浄及び試験物質添加ウェルを1xTBS-洗浄緩衝液60μl/ウェルでBiotekからのELx405マイクロプレート洗浄機を使用して洗浄することにより、余分のBSAを洗い流し、続いて試験物質溶液又は高コントロール及び低コントロール10μlをCybioロボット工学を使用して加えた。プレートを乾燥させなかった。24HTSの間のコントロール低コントロール:vWF-A1-コーティング無し、ブロッキングのためのBSA処理プレートのみ高コントロール:vWF-A1標準vWF-A1及びOS-110μM25血小板標識及び分配独国赤十字から得られたままの血小板濃縮物からの血小板の取り出しと、マルチウェルプレート中への血小板の分配との間に必要な合計時間は45~60分の間であるべきである。独国赤十字から得られたままの血小板濃縮物を含有するバッグを撹拌台から取り出し、そして滅菌フローキャビネット中で流出物を吸収するように吸収タオル上に置いた。チューブ類、チューブクランプ及びハサミを水中70エタノールで滅菌した。血小板濃縮物を含むバッグからのチューブ類をクランプしてチューブを切断した。クランプを解放し、そしてバッグから出てきた最初の約10mlの濃縮物を廃棄した。濃縮物30mlをポリプロピレン製50mlBD-Falconチューブに入れた。次に、25μlPGE-ストックを空の12mlポリプロピレン製丸底チューブに加えた。これに5ml血小板濃縮物を加え、そしてこのチューブを穏やかに混合し、そして5分間室温でインキュベートした。次に、チューブをMinifugeTで300xgにて15分間室温で遠心分離した加速設定3及びブレーキ設定1。遠心分離の後、上清をデカンテーションし、そしてペレットをTBS-1x中でティッキングtickingすることにより注意深く再懸濁し、最初の25mlはペレットを再懸濁するために使用し、次に約1~2mlを使用した体積合計が5mlを超えないように注意すること。血小板の数を決定するために、この血小板懸濁液2mlを新しいチューブに入れ、そして3mlアッセイ緩衝液Assaypufferで希釈した。これから約02~05mlのアリコートを、BeckmanCoulterAcT5diff型で細胞を計数するためにピペットでエッペンドルフEppdorfチューブに入れた。血小板をカルセイン-AMで染色するために、50mlチューブを選択した。このチューブに、血小板を28血小板/mlまで希釈するために必要な体積のアッセイ緩衝液を最初に加えた。この体積のアッセイ緩衝液を最初に加え、次に等体積のカルセインAMを加えて最終濃度25μMカルセイン-AMとした。チューブ内容物をボルテックスにより簡単に混合した。この混合物に、28血小板/mlの最終密度になるような体積の血小板を注意深く加えた。この混合物を静止して10~15分間、暗所にてインキュベートして血小板を蛍光染色した。新しい50mlチューブを取り、血小板をアッセイ緩衝液中で57細胞/mlに希釈した。必要な体積のアッセイ緩衝液を加えた後、25μg/mlの最終濃度にするために必要な等体積のReoProストック溶液を加えた。次に、必要な体積の血小板を加えた。チューブを静止して10~15分間、暗所にて10分間インキュベートした。その間に、Multidropのカセットをアッセイ緩衝液で十分にthouroughlyすすいだ。10分間ReoProと共にインキュベートした後、血小板をさらにTBS-付着緩衝液Adhaeesionsbufferで55血小板/mlまで希釈したを使用した。このビーカーに必要な体積のTBS-付着緩衝液Adhaeesionsbuffer最初に加え、次に滅菌浮遊撹拌子を加えた。ビーカーを設定3で磁気撹拌装置上に置いて;そして等体積の血小板を、2分間撹拌しながら穏やかに加えて完全な希釈を確実にした。次にMultidropのカセットの体積に等しい体積を血小板懸濁液で十分にすすいだ。直後に、マルチウェル中への血栓の分散が始まった。チューブ及びカセットの死容積deadvolumeと等しい量を廃棄し、その後Multidropを用いて:20μl血小板懸濁液を各ウェルに加えた。チューブ類ができるだけ短くなるようなやり方でシステムを配置した。分配はできるだけ速く行うべきであり、通常は血小板を30のマルチウェルプレートに分配するために30分未満が必要である。26インキュベーション及び洗浄血小板及び試験物質を含むプレートを、蓋をせず暗所で室温にて15~3時間の間インキュベートした。次にウェルを2x60μlTBS-洗浄緩衝液1Xで洗浄し、2回のプレートの洗浄の間に5分の間を置いた。重要なことは、ウェルの全ての隅を洗浄することである。これはElx40596ウェル洗浄機を使用して達成される。吸引を左下の隅及び右上の隅の両方で行い、分配は常に同じ位置であった;-23/0。次に、プレートを180度回転させ、そして吸引及び分配を繰り返した。27Acumen読み取りプレートをAcumen血球計算器でソフトウェアバージョン数3112及びMDAQドライバーバージョン1010を使用して読み取った。プレートをAcumenにTwister2を使用してロードした。スクリーニング室を約18~20°Cまで弱く冷やした。蓋をしていないアッセイプレートの間に、上のプレートへのスクリーニングプレートの凝縮condensationを避けるために使用される空の白いプレートを置いた。白いプレートは廃棄した。Acumenにおけるプレートの読み取りのために使用した設定をここで記載した。アルゴンイオンレーザー出力を6mWに設定:放射される蛍光を以下のチャネルで以下の設定を使用して記録した:波長:500~530nmを有する放射光をチャネル1で記録した:データ収集:使用可能、トリガー:使用可能、PMT電圧:530V波長:540~560nmを有する放射光をチャネル2で記録した:データ収集:使用可能、トリガー:使用可能、PMT電圧:500V波長:575~640nmを有する放射光をチャネル3で記録した:データ収集:使用可能、トリガー:使用可能、PMT電圧:500V関心領域は:ウェルの中心の周りに4x4mmの幅及び高さを有する矩形形状を有していた。全ての記録チャネルにおいてバックグラウンド値より高い2標準偏差の感度閾値thresholdingsensitivityを使用した放射光の収集。ベースライン追跡範囲BaselineTrackingWindow301μm及びノイズ平滑化範囲NoiseSmoothingWindow3μm物体識別設定はX重複:05μm、Y分離:05μmであった。以下の集団を以下のフィルターを使用して識別した。血小板の集団-フィルター:1°ピーク強度-ベースライン:900~200001°面積:90~12001°ピーク強度-ベースライン/3°ピーク強度-ベースラインの比:1~100大型赤色物質の集団-フィルター:1°ピーク強度-ベースライン:50~2003°ピーク強度-ベースライン:80~2503°周囲:45~1003°面積:80~300活性化血小板の集団-フィルター:1°周囲:90~10001°面積:350~40001°ピーク強度-ベースライン:333~90001°半値幅強度HalfWidthIntensity:6900~13e061°ピーク強度-ベースライン/3°ピーク強度-ベースラインの比:1~501°全強度:65000~120000薄暗い血小板platの集団の集団-フィルター:1°ピーク強度-ベースライン:0~200001°面積:0~901°ピーク強度-ベースライン/3°ピーク強度-ベースラインの比:06~100高ch3物体-フィルター:1°面積:0~100001°ピーク強度-ベースライン/3°ピーク強度-ベースラインの比:0~1集団から以下の特徴を抽出した:1.データ:物体の数2.血小板:物体の数3.大型赤色物質:物体の数4.活性化血小板:物体の数5.薄暗い血小板plat:物体の数6.破片血小板:物体の数7.高ch3物体:物体の数8.パーセンテージ:血小板物体の数/データ:物体の数9.パーセンテージ:活性化血小板:物体の数/血小板物体の数10.パーセンテージ:薄暗い血小板plat:物体の数/血小板物体の数11.パーセンテージ:血小板物体の数/破片血小板:物体の数12.血小板:中央値1°平均強度13.血小板:幾何平均1°平均強度14.血小板:幾何平均1°ピーク強度-ベースライン15.血小板:幾何平均1°全強度16.血小板:平均1°周囲17.血小板:中央値1°面積Werea3データ解析31アッセイの質の直接的決定アッセイプレート品質の直接的分析のために、我々はZファクターをZhangetal:ASimpleStatisticalParameterforUseinEvaluationandValidationofHighThroughputScreeningAssaysJBiomolScreen1999;4:67-73に記載されるように計算した。Zファクターを、パラメーター:血小板の数を使用して計算した。Zの計算のために、BSAのみでコーティングされたウェルからのデータを低コントロールとして使用し、そしてvWF-A1でコーティングし、その後BSAでブロッキングしたウェルからのデータを高コントロールとして使用した。32多重パラメーター解析通常、多数の特徴が各単一の処理について決定され得る。大抵は、これらの特徴の小さいサブセットは、十分に確立されたコントロール、参照状態及び可能な毒性表現型の区別に関して関連しており、最も重要な特徴は:データ処理、次元の減少並びに最も関連する生物学的、化学的及び薬理学的プロセスに集中した観点という理由から定義された。特徴選択は、適切な分類子及びナイーブベイズの綿密な設計及び構築により得られた。それらを交差検証及び50の再サンプリング反復により検証した。結果として、これらの分類子は、十分に特徴付けられたコントロール-参照-及び可能な毒性表現型を非常に正確に識別することができた。分類子の最も重要な特徴を識別するために、重要度解析を行った。これらの結果を相関解析の結果と比較した。このアプローチは最も重要でかつ最小の相関の特徴セットの選択を可能にした。得られた特徴セットをHTSの間に使用し、上に列挙した。33使用した装置AcumenExplorerTTPLabtechソフトウェアSoftwwereバージョン3112、MDAQドライバーバージョン1010。BiomekFXBeckmanCoulterMultidropThermoLabsystemsVi-CellTMXRBeckmanCoulterMinifugeTHeraeusELx405SelectBiotekTwister2Caliper4結果41カルセイン-AMを用いた血小板の標識vWF-a1でコーティングされたウェルへの付着後の血小板を検出するために、洗浄した血小板をカルセイン-AMで蛍光標識した。カルセイン-AMを検出するために適したフィルターを使用した顕微分析は、事前活性化preactivationの確実な形態学的徴候のない明るい球状物体を示した。しかし、鮮やかで漠然としたvage蛍光バックグラウンド染色に加え、より大きな明るい構造も頻繁に観察可能であり、度々焦点が合わず、おそらく標識された血球を表していた、図1を参照のこと。42vWF-A1でコーティングされたウェルへの標識されたプレートの付着蛍光標識された洗浄した血小板を固定化vWF-A1に付着させた。付着した血小板を、上記の設定を使用したAcumenでの画像化により定量した。さまざまな量のvWF-A1をプレートに加え、そして付着した血小板の量を洗浄後に96ウェル形式で決定した。図2におけるデータは、検出された血小板の量がvWF-A1の量の増加とともに増加したことを示す。しかし、未処理のウェルでも多量の血小板を観察することができた。これは血小板のプラスチックウェルへの付着により生じ、そしてこの血小板のコーティングされていないウェルへの付着は、ウェルをBSAでコーティングすることにより大幅に減少させることができた。このアッセイに必要なvWF-A1の最適な量を決定するために、Z値を計算した。データから、1μg/ウェルより多いA1の量のさらなる増加はアッセイを改善せず、そしてZ値>05の最小必要条件はまだ達成されなかった、図2を参照のこと。42分散後の血小板の活性化血小板の分散は部分的活性化を誘導し得る。活性化された血小板は、休止resting血小板と比較して異なる付着特性特性を有する。活性化の間、いくつかのタンパク質は血小板の内部から形質膜へと活発に移動した。また、表面からの受容体のクリアランスはHourdilletal;vonWillebrandfactorboundtoglycoproteinIbIsclearedfromtheplateletsurfaceafterplateletactivationbythrombin:Blood:79pp2011-202104151992により記載されている。血小板の分散が形態の変化という点で活性化を引き起こしたかどうかを調べるために、血小板を分散の直後に高分解能蛍光顕微鏡検査法顕微鏡により観察した。A1と相互作用している血小板はいくらかの伸長を有しており、活性が起こったことを示していた。しかし血小板の活性化の形態学的徴候は、プレートが活性化していないはずのウェルwellswereにおいて観察されず、血小板を標識及び分配する手順が形態変化により観察されるいずれの活性化も誘導しなかったことを示していた、図3を参照のこと。44洗浄プログラムの最適化ウェルを観察したときに、洗浄設定は最適化され得るということが明らかになった。多くの低コントロールウェルにおいて、かなりの量の血小板がウェルに付着したままになっていた、図4を参照のこと。付着した血小板は、ウェルの特定の領域の非効率的な洗浄により生じた不規則なパターンを示した。アッセイを改善するために、洗浄機設定洗浄プログラムの多くの変化を試験した。洗浄機プログラムの念入りな試験がアッセイの統計を改善し得るということが明らかになった。図5はアッセイのZ値に対するいくつかの洗浄機プログラムの効果を示す。全細胞サイトメトリーから生成されたウェルからの画像を分析することにより、そしてプレートの統計を比較することにより、洗浄機設定を78からのSB及びZ>06に最適化することができた。これらの設定を使用して、抗体が血小板糖タンパク質gplbアルファに対して特異的であり、かつOS-1を阻害剤としてそれぞれ2μg/ml及び10μMで使用した場合に、血小板付着のほぼ90の阻害が達成された、図6を参照のこと。45特異的阻害剤OS-1についてのIC50値によるアッセイの感度の決定特異的阻害剤OS-1は2008年にBernardらにより発見されたBiochemistry2008474674-4682。ELISA技術を使用して、510nMのIC50値が、vWF-A1及びGPIb相互作用の間の相互作用を阻害するOS-1の能力について決定された。開発されたアッセイが少なくとも同様の感度でOS-1の阻害能力を検出することができるかどうかを決定するために、OS-1のIC50値を決定した。IC50値が384プレートのウェルをコーティングするために使用されたA1の量に依存するということが観察された。従って、限定された量の単離A1タンパク質を最適に使用するが、なお有効なアッセイのために十分な統計学的値を得るために、A1の量を最小限にした。最適化された洗浄プログラムを使用して、より少量のA1を使用することができた。これらのより少量のvWF-A1を用いて、OS-1についてのIC50を、コーティングに使用したA1の量に依存して約65及び150nMに変化させて得た。これらのIC50はBenardらにより公開された510nMの値に近かった。このことは、記載されたアッセイが少なくともBerardら2008により記載されたアッセイと同程度の感度であることを示す、図7を参照のこと。46スクリーニング及びアッセイのスループットの決定の間のプレートの安定性有意義なアッセイに到達するための方法を確定した後、プレートの安定性を決定した。プレートの洗浄及びプレートの読み取りは分配工程より遅いので、プレートの蓄積がアッセイの間に起こるため、これは必要である。これは、最後に分配されたプレートを、読み取りの前に9時間まで蓄える必要があるということを意味する。従ってThereforet、プレートが洗浄の前に室温で貯蔵され得るかどうか長期の試験物質インキュベーション時間を意味する、及びプレートがプレートの洗浄後に;読み取り前に貯蔵され得るかどうかを決定した。図8は、アッセイにおけるプレート貯蔵の効果を示す。プレート貯蔵時間の増加は、検出された血小板の数を増加させた。一見、より多くの血小板が沈降し付着することができたようである。洗浄前の長期の貯蔵は検出された血小板の数のわずかな損失を生じたが、これはアッセイの統計学的有意性に対して影響を有していなかった。全ての場合においてZは>05であった。さらに、既知の毒性の問題を有する試験物質以下の項を参照のことの毒性作用は、貯蔵時間の増加とともに増加するということが観察されたデータは示していない。対照的に、参照阻害剤OS-1はほとんど一定の値を示した、図8を参照のこと。プレートを読み取り前に貯蔵することができる時間が分かって、30のプレートのセットを自動化条件下で試験した。この試験のデータを以下の図に示し、ここでは1番目、6番目、12番目、18番目、24番目及び最後のプレートの結果を示した。この実行の全てのプレートにおいて、少なくとも20xのSBが>05のZ値及びOS-1による高い阻害とともに得られた。従って、このアッセイは1日あたり少なくとも30のプレートを用いるハイスループットスクリーニングに適していると結論づけられた、図9を参照のこと。アッセイは、付着した血小板の数が、使用される分析のための単一のパラメーターである場合に毒性試験物質を阻害剤として同定する。阻害剤を同定することを目的とする多くの細胞アッセイにおいて、毒性特徴を有する試験物質が阻害剤として同定された。従って、多くの細胞ベースのアッセイにおいて毒性作用が知られている2つの試験物質を試験した。両方の毒性試験物質が、30μM濃度でのvWF-A1への血小板付着の完全な阻害とともに、10μMでの実質的な阻害を示した、図10を参照のこと。従って我々は、付着した血小板の数のみが読み出しとして使用される場合に、アッセイは毒性試験物質を阻害剤として同定すると結論づけた。スクリーニングの間の偽陽性の蓄積を避けるために、毒性試験物質の同定による疑陽性の数を減少させようと試みた。48毒性試験物質と阻害剤との区別試験物質の毒性に起因する偽陽性の数を減少させるために、2つの方策を使用した:対比counter-スクリーニングスクリーニングによる毒性試験物質の同定:アッセイの実用的な説明このアッセイのために、本質的にはA1コーティングプレート上への血小板の付着の試験について上で記載された設定と同じ設定を使用した。ラット尾部コラーゲン1でウェルをコーティングするために、001M酢酸中の200μg/mlコラーゲンIからなるストック溶液を準備した。この溶液を001M酢酸で10μg/mlまで希釈し、そして25μlを384ウェルに加えた。コラーゲン1のウェルへの結合のためにプレートを終夜4°Cでインキュベートした。試験物質を加える1時間前に、プレートのウェルを上記のようにBSAでブロッキングした。また、血小板の準備、標識及び分配は、vWF-A1について記載されるとおりであった。コラーゲンIへの血小板付着のために、MgCl2の濃度を4mMまで増加させ、そしてウェルあたり加えた血小板の数を50000血小板まで増加させた。これらの条件を使用して、このアッセイにより特異的阻害剤の相互作用を良好な統計学的パラメータで検出することができた、図11を参照のこと。6つのプレートのセットを自動化条件下で試験した。全てのプレートについて05より大きいZ値が20又はそれ以上のSBと共に得られた。合計で69の試験物質から構成される訓練セットを、このアッセイの確認をするために使用した。これらの試験物質から、31の試験物質が推定毒性試験物質であることが分かり、vWF-A1-血小板相互作用の2つの推定阻害剤、32のコラーゲン-血小板相互作用阻害剤、及び多くの細胞アッセイにおいて毒性であることが知られている4つの試験物質を血小板-コラーゲン相互作用アッセイにおいて10μMで試験した。データの要約を図13に示す:vWF-A1アッセイにおいて阻害剤として作用した試験物質の75より多くが、毒性の可能性があると分類された試験物質のグループからのものであった。大部分の細胞アッセイにおいて毒性であることが知られている4つの試験物質のうち3つが毒性であった。同じ試験物質が血小板-コラーゲン相互作用アッセイにおいて毒性であった。また、全部で32の既知のコラーゲン阻害剤を、同じ順位IC50に基づく、データは示していないで同定することができた。他方では、参照試験物質OS-1のような、血小板-A1相互作用からの真正な阻害剤及びGP1bに対する抗体はコラーゲンとの相互作用を阻害しなかった。従って、血小板とコラーゲン1との間の相互作用についてのアッセイはコラーゲン阻害剤を検出することができ、そして対比スクリーニングとして使用される場合は、細胞傷害性作用を有する大部分の試験物質を検出することができると結論づけた。482検出された血小板は毒性試験物質とのインキュベーション後に異って見える顕微鏡検査によりウェルを見ると、小さい点状の蛍光物質が血小板の代わりに見られた、図14を参照のこと。我々は、この物質を、洗浄後に除去された血小板からのレムナントとして解釈し、それ故それを破片debrisと呼んだ。しかし、この小さな物質が小胞のような他の物質を表すということも排除できない。他の推定毒性試験物質を使用して、大型の血小板又は減少した蛍光強度を有する血小板は、減少した蛍光強度で観察された。Acumenにおいて、血小板を毒性試験物質と共にインキュベートしたウェルでも、多数の小さい点状蛍光物質が観察された。これらのウェルでは血小板の量は減少し、そしてしばしば残った血小板はより低い蛍光であった。図15を参照のこと。従って我々は、多重パラメーター解析を使用することにより毒性試験物質と非毒性阻害剤とを区別しようと試みた。49多重パラメーター解析:設定特徴選択このアッセイの目的はvWF-A1血小板相互作用を阻害する試験物質を同定することである。しかし、vWF-A1血小板相互作用の完全な阻害剤は血小板に対する毒性試験物質ともみなされ得る。従って、以下のコントロール及び参照状態コントロール、中性コントロール、AK2、OS1、毒性グループ1~5を考慮し、そして重要なグループとして選択した。選択されたグループの区別のために最も意味のある特徴を同定するために、最初の工程で個々の血小板、血小板の小さい群又は血小板若しくは他の血球由来であり得る物体の蛍光強度又は形態を表す全ての可能なパラメーターを使用する必要がある。最初の工程において、それぞれ単一の特徴を、9つの重要なグループのうちの少なくとも1つを区別することができる統計学的有意性について試験した。次に、相関解析を行った。43の特徴のセット内で高度に相関したもののセットが存在することを同定することは非常に容易であった。第三の選択基準として、構築された分類子及びナイーブベイズ、50の再サンプリング反復の重要性について全ての特徴の評価を考慮した。以下の特徴のセットが同定された。これらは43の可能な特徴からの代表であり、互いの間の相関は最も少なく、かつ構築された分類子にとって重要である:血小板:中央値1°平均強度活性化actived血小板:物体のN°血小板:幾何平均1°ピーク強度-ベースライン血小板:幾何平均1°全強度:中央値1°面積血小板:平均1°周囲破片血小板:物体のN°薄暗い血小板のパーセンテージ:物体のN°血小板:幾何平均1°平均強度パーセンテージ:血小板物体の数/データ:物体の数パーセンテージ:活性化血小板:物体の数/血小板物体の数パーセンテージ:薄暗い血小板:物体の数/血小板物体の数パーセンテージ:血小板物体の数/破片血小板:物体の数492分類子評価主要スクリーニングの可能性のあるヒットが検出される前に、構築された分類子を評価しなければならない。従って、試験データをHTSモードで自動化条件下で得た。この試験データは、既知の阻害剤、既知の毒性試験物質並びに中性コントロール及び刺激薬コントロールのような選択された試験物質の少数のセットを含んでいた。特異値分解を最初にこのデータセットに適用した。第1及び第3の成分に隠れた支配的因子はあまり明確でないが、第2の成分は、主に刺激薬コントロール及び中性コントロールの区別を説明する。ポジティブ参照のOS1は刺激薬コントロールの領域内にうまく分散している。この結果は、分類子の構築をかなり有望にする。特異値分解の結果にしたがって、以下のグループ-クラスを同定した:刺激薬コントロール、中性コントロール、OS1及び毒性の可能性のある試験物質。毒性の可能性のある試験物質のグループは非常に多様性がある。従ってこのグループを徹底的に調べた。刺激薬コントロール及び中性コントロールを用いた推定毒性試験物質の階層的クラスター分析に基づいて、3つの興味深い毒性の可能性のあるグループを分類子の構築のために同定した及びカッパ-08866。選択された試験物質の小さいサブセットのセットを示す。それぞれの測定された試験物質についての全データベクトルの12次元性に起因して、いわゆる星形プロット表現を選択した。この種の表現は、グループ割り当ての迅速な視覚的評価を可能にする。選択されたツール試験物質は、毒性の可能性のあるグループ及び中性コントロール状態よりも、OS1参照及び刺激薬コントロールにより似ていた。これらの少数の実施例はさらに、多重パラメーター解析が、毒性試験物質とより特異的な非毒性阻害剤とを区別することにより偽陽性試験物質の数を減らすことができるということが期待されるということを説明する。