"以下のを含む多機能性抗体複合体MACi抗体又はその抗原結合部位であって、少なくともKabat番号によるK188を含んでなる軽鎖定常カッパ領域CLκの断片を含んでなる抗体又はその抗原結合部位;ii式X-Y-Zを含んでなるリンカーであって、式中、ZはK188の側鎖によって抗体に共有結合的に接続している基であり、Yは直鎖又は分枝鎖の生物学的に適合性の接続鎖であり、そしてXは少なくとも一つのエフェクター分子に共有結合的に接続された基である、リンカー;並びにその医薬的に受容可能な塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、及びプロドラッグ。更にH188-CLκを含んでなる、請求項1に記載のMAC。更にD151-LCκを含んでなる、請求項1又は2のいずれか1項に記載のMAC。前記CLκ領域が、少なくとも配列番号15、配列番号45、配列番号46又は配列番号47の残基62-103を含んでなる、請求項1から3のいずれか1項に記載のMAC。前記CLκ領域が、少なくとも配列番号15、配列番号45、配列番号46又は配列番号47の残基1-106を含んでなる、請求項1から4のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、K188CLκにおいてのみMACに結合している、請求項1から5のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のK188CLκにおいて、そして抗体上の一つの他の位置においてMACに結合している、請求項1-5のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、少なくとも一つの軽鎖上のK188CLκにおいて、そして抗体上の二つの他の位置においてMACに結合している、請求項1-5のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、両方の軽鎖上のCLκK188に結合している、請求項1から8のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、一つのみの軽鎖上のCLκK188に結合している、請求項1-8のいずれか1項に記載のMAC。前記エフェクター分子が、治療剤、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、小分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝制御物質、ホルモン、毒素、成長因子、又は診断剤である、請求項1から10のいずれか1項に記載のMAC。前記少なくとも一つのエフェクター分子が、タンパク質又はペプチドである、請求項1から11のいずれか1項に記載のMAC。前記リンカーのX基が、タンパク質又はペプチド中のペプチド連結残基のアミノ末端、カルボキシル末端、又は側鎖に共有結合的に接続している、請求項12に記載のMAC。前記ペプチド連結残基が、K、R、C、T、Y、S、Dap、Dab、KSH、並びにK及びCの同族体からなる群から選択される、請求項13に記載のMAC。前記連結残基が、Kである、請求項14に記載のMAC。Y、X-Y、Y-Z、又はX-Y-Zが:からなる群から選択され、式中、m、n及びjは、それぞれ独立に、その下限が、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20からなる群から選択され、そしてその上限が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、200個の原子を超えない、請求項1から15のいずれか1項に記載のMAC。以下の式を含んでなる、請求項1から16のいずれか1項に記載のMAC:式中、K188-CLκは、前記K188-CLκの側鎖への共有結合的な連結であり、エフェクター分子-LRは、エフェクター分子への共有結合的連結であり、そしてm、n及びjは、それぞれ独立に、その下限が、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20からなる群から選択され、そしてその上限が、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択される範囲であり、そしてここにおいて、リンカーの全長が、200個の原子を超えない。前記リンカーの全長が、150個の原子を超えない、請求項1から17のいずれか1項に記載のMAC。前記リンカーの全長が、100個の原子を超えない、請求項18に記載のMAC。前記リンカーの全長が、60個の原子を超えない、請求項19に記載のMAC。前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、及びパリビズマブからなる群から選択される、請求項1から20のいずれか1項に記載のMAC。前記抗体が、触媒性アルドラーゼ抗体である、請求項1-20のいずれか1項に記載のMAC。前記抗体が、全長の抗体、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、dsFv、scFv、VH、二特異性抗体、又はh38c2からのVH及びVLドメインを含んでなるミニボディーである、請求項22に記載のMAC。前記抗体が、配列番号51及び配列番号52、又は配列番号53及び配列番号54を含んでなる、請求項22に記載のMAC。前記抗体が、配列番号5を含んでなるHC領域、配列番号6を含んでなるVH領域、配列番号16を含んでなるVL領域、及び配列番号15、配列番号45、配列番号46又は配列番号47の一つを含んでなるCL領域を含んでなる、請求項1-19のいずれか1項に記載のMAC。前記抗体が、配列番号3及び配列番号4を含んでなる、請求項25に記載のMAC。前記エフェクター分子が、Ang2結合ペプチドである、請求項1から26のいずれか1項に記載のMAC。前記Ang2結合ペプチドが、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、及び配列番号32からなる群から選択される配列を含んでなる、請求項1から27のいずれか1項に記載のMAC。前記Ang2結合ペプチドが、配列番号27を含んでなる、請求項28に記載のMAC。前記ペプチド連結残基が、配列番号27のK11である、請求項29に記載のMAC。以下の構造:を含んでなり、式中、K188-CLκは、前記K188-CLκの側鎖への共有連結であり、そして前記抗体が、配列番号3及び配列番号4を含んでなる、請求項30に記載のMAC。請求項1から31のいずれか1項に記載のMACを含んでなる組成物であって、前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約50が、K188-CLκに結合している、前記組成物。前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約60が、K188-CLκに共役している、請求項32に記載の組成物。前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約70が、K188-CLκに共役している、請求項32に記載の組成物。前記組成物又は試料中のエフェクター分子の少なくとも約80が、K188-CLκに共役している、請求項32に記載の組成物。前記抗体の少なくとも約50が、K188-CLκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項1-31のいずれか1項に記載のMACを含んでなる組成物。前記抗体の少なくとも約60が、K188-CLκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項36に記載の組成物。前記抗体の少なくとも約70が、K188-CLκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項36に記載の組成物。前記抗体の少なくとも約80が、K188-CLκに共有的に接続しているエフェクター分子を含んでなる、請求項36に記載の組成物。戦記重鎖分子の少なくとも約70が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項1-31のいずれか1項に記載のMACを含んでなる組成物。前記重鎖分子の少なくとも約80が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項40に記載の組成物。前記重鎖分子の少なくとも約90が、エフェクター分子と複合体形成していない、請求項41に記載の組成物。前記エフェクター分子に対して一つの結合部位を含んでなる個々の軽鎖断片の量が、約25から95間である、請求項1-31のいずれか1項に記載のMACを含んでなる組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約0.5から約5個間である、請求項1-31のいずれか1項に記載のMACを含んでなる組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約0.5から約3個間である、請求項44に記載の組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約0.5から約1.5個間である、請求項44に記載の組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約1.5から約5.0個間である、請求項44に記載の組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約1.5から約3.0個間である、請求項44に記載の組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約1.5から約2.5個間である、請求項44に記載の組成物。前記抗体当たりの結合の数が、約1.7から約2.3個間である、請求項44に記載の組成物。請求項1-31のいずれか1項に記載の多機能性抗体複合体MAC、又は請求項32-50のいずれか1項に記載の組成物を調製するための方法であって、エフェクター分子を、以下の式:の脱離基Zで終結するリンカーに共有的に接続することを含む結合反応式中、R1はF又はClであり、h=2、3、4、又は5である、及びこのように形成されたエフェクター分子-リンカー-Z複合体を、抗体と反応させることを含んでなる、方法。R1がFである、請求項51に記載の方法。h=3、4又は5である、請求項51-52のいずれか1項に記載の方法。Zが:からなる群から選択される、請求項51-53のいずれか1項に記載の方法。h=4又は5である、請求項51-54のいずれか1項に記載の方法。Zが:の式のものである、請求項51-55のいずれか1項に記載の方法。エフェクター分子:抗体の比が、約1:1から約15:1間である、請求項51-56のいずれか1項に記載の方法。前記比が、約2:1から約5:1間である、請求項57に記載の方法。前記比が、約3:1から約6:1間である、請求項57に記載の方法。前記比が、約3.5:1から約5:1間である、請求項57に記載の方法。前記比が、約5:1から約15:1間である、請求項57に記載の方法。前記比が、約5:1から約7:1間である、請求項57に記載の方法。前記結合反応中の抗体濃度が、約1から約100mgml-1間である、請求項51-62のいずれか1項に記載の方法。前記結合反応中の抗体濃度が、少なくとも約5mgml-1である、請求項51-62のいずれか1項に記載の方法。前記結合反応中の抗体濃度が、少なくとも約10mgml-1である、請求項51-62のいずれか1項に記載の方法。前記結合反応中の抗体濃度が、約5から約50mgml-1間である、請求項51-62のいずれか1項に記載の方法。前記反応が、約4°Cから約40°C間の温度で行われる、請求項51-66のいずれか1項に記載の方法。前記反応が、約4°Cから約30°C間の温度で行われる、請求項51-66のいずれか1項に記載の方法。前記反応が、約15°Cから約25°C間の温度で行われる、請求項51-66のいずれか1項に記載の方法。前記反応が、約6から約9間のpHで行われる、請求項1-69のいずれか1項に記載の方法。前記反応が、約6.5から約8間のpHで行われる、請求項1-69のいずれか1項に記載の方法。前記抗体が、CLλ領域を含んでなり、更にCLλ領域の対応する部分Kabat番号によるを、少なくとも配列番号15、配列番号45、配列番号46又は配列番号47の残基62-103で置換する最初の工程を含んでなる、請求項51-71のいずれか1項に記載の方法。前記抗体の対応するCLλ領域が、少なくとも配列番号15、配列番号45、配列番号46又は配列番号47の残基1-106で置換される、請求項72に記載の方法。請求項51-73のいずれか1項に記載の方法によって製造される、MAC。請求項74に記載のMACを含んでなる、組成物。請求項1-31、又は請求項75のいずれか1項に記載のMAC、或いは請求項32-50のいずれか1項に記載の医薬組成物を含んでなり、そして更に受容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。更に5-フルオロウラシル、イリノテカン、オキシラプラチン、セツキシマブ、スニチニブ、及びリツキシマブからなる群から選択される一つ又はそれより多い化合物を含んでなる、請求項76に記載の医薬組成物。治療的に有効な投与量の請求項76-77のいずれか1項に記載の医薬組成物を、患者に投与することを含んでなる、血管新生を阻害又は減少する、或いは血管新生性疾患に伴う疾病又は徴候を治療若しくは予防する方法。前記疾病が、癌である、請求項78に記載の方法。前記癌が、肺NSCLC及びSCLC、頭頸部、卵巣、大腸、直腸、前立腺、肛門領域、胃、乳房、腎臓又は尿管、腎盂、甲状腺、膀胱、脳の癌、腎細胞細胞腫、中枢神経系CNSの腫瘍の細胞腫、原発性CNSリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、脊髄軸腫瘍、中咽頭、下咽頭、食道、膵臓、肝臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿管の細胞腫;又はリンパ腫、肺癌NSCLC及びSCLC、乳癌、卵巣癌、大腸癌、直腸癌、前立腺癌、肛門領域の癌、或いは一つ又はそれより多い前述の癌の組合せである、請求項79に記載の方法。本発明をよりよく理解することができるために、以下の実施例が記載される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、そしていずれもの様式で本発明の範囲を制約すると解釈されるべきではない。実施例実施例1本発明で使用されるペプチドの合成実施例2:実施例1のように調製したペプチドの樹脂からの開裂。実施例3ABP-チオール-リンカー化合物の合成異なった繋留点を伴うAng2結合ペプチドABPの類似体を合成した実施例1及び2を参照。最初に、遊離のチオールABP中間体を、合成及び精製し、そして次いでマレイミド-PEG2-PFPリンカーを加え、続いて最終的な精製工程により、純粋なPFPで活性化されたABPを得た。ペプチド鎖の構築及び開裂を、スキーム1及び2に概略示すように行って、純粋なABPを産生した。ABP284mg、0.1mmolを、ジメチルホルムアミド0.5ml中に撹拌しながら溶解した。別に、S-トリチル-メルカプトプロピオン酸MPA、62mg、概略0.125mmol、HBTU48mg、0.125mmol及びN-メチルモルホリン0.025ml、0.25mmolを、DMF0.5ml中で溶解するまで5分間撹拌した。ABP溶液及び活性化されたMPA溶液を、2時間一緒に混合した。反応の進行をLCMSによってモニターした。2時間後、溶液を、氷冷のエーテル40ml中にゆっくりと加えて、ABS-S-トリチル-MPA生成物を沈殿させた。白色の沈殿物を濾過によって収集し、次いで乾燥した。次いで固体の残渣を、トリフルオロ酢酸のジクロロメタン中の溶液1:10、10ml中に溶解し、トリイソプロピルシランTIPSを加え0.050ml、そして1時間撹拌した。溶液を減圧下で明るい黄色の油状物まで蒸発し、次いで粗製のチオールペプチドを氷冷のエーテルの添加によって沈殿させた。生成物を遠心によって収集し、そして真空中で乾燥した。残渣をアセトニトリルの50水溶液中に溶解し、次いで凍結乾燥して、粗製のチオールペプチドHPLC分析により概略80の純度を得た。粗製のチオールペプチドを準分離用HPLCによって精製して、145mgの配列番号:27を得た。配列番号:27KSH11-MAL-2PEG-PFPの合成実施例4Ang-2結合ペプチド-チオール中間体ABP-tiの産生ペプチド鎖の構築を、0.1ミリモル規模で行った。使用した樹脂は、Fmoc-Rink-PL樹脂150mg、0.67mmol/g置換であった。標準的なFmoc化学プロトコルを使用して、ペプチドを構築した。Fmocの除去は、20ピペリジン/DMFで3×5分間であり、そして全ての樹脂の洗浄工程はDMFを使用した。アミノ酸を組込むために、それぞれの残基に対して、HBTU/HOBt/NMM活性化を使用する一回のカップリング工程を2時間使用した。連結残基KSHを、Fmoc-LysNε-メルカプトプロピオン酸-S-Trt-OHとして組込んだ。鎖の構築後、N末端のFmoc基を除去し、そしてペプチド樹脂をアセチル化によってキャップした。最終の樹脂をDCMで洗浄し、そして一晩真空中で乾燥した。得られた最終の樹脂の重量は次のとおり:配列番号:29-KSH9:627mg、配列番号:30-KSH16:573mg、配列番号:31-KSH18:642mg、そして配列番号:32-KSH19:641mgであった。保護基の加酸分解的acidolytic除去及び樹脂からのペプチドの開裂は、TFA/水/ジチオトレイトール/トリイソプロピルシラン90:4:4:2の比、5mlのカクテルを2時間使用して達成した。溶液を樹脂から濾過し、そして樹脂を更なる5mlの未希釈のTFAで洗浄した。混合した濾液をシロップ状まで蒸発し、次いで氷冷のエーテルの添加により、白色の粉末が沈殿物した。粉末を遠心によって収集し、次いでアセトニトリルの50水溶液20ml中に溶解し、冷凍し、そして一晩凍結乾燥した。結果:配列番号:29-KSH9得られた粗製の配列番号:29-KSH9の量は、252mgであった。HPLCによる粗製の配列番号:29-KSH9の分析は、きれいな主要ピークを示した;5-95B/30分、C18、Rt=18.3分。粗製の配列番号:29-KSH9の更なるLCMS分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した;[MH]=2930、2=1465、3=977を観察した。配列番号:30-KSH16得られた粗製の配列番号:30-KSH16の量は、229mgであった。HPLCによる粗製の配列番号:30-KSH16の分析は、きれいな主要ピークを示した;5-95B/30分、C18、Rt=22.0分。粗製の配列番号:30-KSH16の更なるLCMS分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した;[MH]=2915、2=1458、3=972を観察した。配列番号:31-KSH18得られた粗製の配列番号:31-KSH18の量は、252mgであった。HPLCによる粗製の配列番号:31-KSH18の分析は、きれいな主要ピークを示した;5-95B/30分、C18、Rt=21.1分。粗製の配列番号:31-KSH18の更なるLCMS分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した;[MH]=2912、2=1456、3=971を観察した。配列番号:32-KSH19得られた粗製の配列番号:32-KSH19の量は、261mgであった。HPLCによる粗製の配列番号:32-KSH19の分析は、きれいな主要ピークを示した;5-95B/30分、C18、Rt=20.0分。粗製の配列番号:32-KSH19の更なるLCMS分析は、主要ピークが所望の生成物であることを示した;[MH]=2930、2=1465、3=977を観察した。精製:分離用HPLCカラムを、TFAの希釈水溶液及びアセトニトリルで事前平衡した。粗製のABP-チオール中間体即ち、連結残基としてKSHを伴うABPをDMF3ml中に溶解し、次いでカラム上に吸着させ、そして希釈TFA中のアセトニトリルの勾配を適用することによって溶出した。画分を、質量M=1465によって自動的に収集した。カラムからの溶出を、UVによってモニターし、得られた画分を分析用RP-HPLCによって分析した。最も純粋な画分分析用HPLCにより>95を混合し、そして凍結乾燥して、次の量:87mgの純粋な配列番号:29-KSH9、50mgの純粋な配列番号:30-KSH16、59mgの純粋な配列番号:31-KSH18、及び39mgの純粋な配列番号:32-KSH19を得た。リンカーの合成ABPを、本発明の抗IGF1R抗体に共役するために、五つの異なった活性化戦略を考慮した、実施例5-9例示的構造は、配列番号:27-KSH11を使用して示す:実施例5N-ヒドロキシスクシンイミドエステルNHS配列番号:27-K11-NHS配列番号:27-K11-5PEG-NHSの合成配列番号:27-K5.1を、NHSで活性化されたカルボキシル基が最終の活性化されたペプチド精製物5.3上に残り、そしてその後の共役のために使用可能なままであるように、ビス-NHS、PEGx-リンカー5.2と反応させた。これは、ABP上の4個の他の遊離カルボキシル基の存在によって必要とされた。これらは、活性化された基の位置が、容易に制御することができず、そしてこれが多数のカルボキシル側鎖が活性化されるものである可能性があるものであるために、簡単なinsituの活性化戦略を妨げる。ビス-PEG5-NHSエステル及びABP配列番号:27間の反応を試験した。DMSO中の10倍過剰のリンカーの溶液を使用して、ABP及びN-メチルモルホリン塩基としてのDMSO中の溶液を、十分に撹拌された溶液中でゆっくりと滴定した。試料を採取し、そしてHPLC及びLCMSによって各種の時点で試験した。約2時間後、かなりの生成物の形成があり5.1から5.3を形成するための概略80転換、そしてこれは、ビス-NHSリンカー試薬から容易に分離された。然しながら、DMSO中でさえ、生成物5.3は時間をかけて遊離酸の形態にゆっくりと転換されたここでNHS-エステル基は、不活性な遊離カルボキシルに転換される。更に、粗製の反応混合物を分画して、所望の生成物5.3を単離する場合、これは、更に精製及びその後の凍結乾燥行程中に加水分解にさらされた。この方法は、ある程度の生成物を合成することにおいて好結果であったが、得られたNHS-エステルの水に対する不安定性が、その後の結合反応におけるその適用を制約するものであると考えられた。MAL-PEG2-NHSの更なる試験を、実施例30Z基Z13を含んでなるに示す。実施例6マレイミドMal配列番号:27-K11-Malマレイミド活性化は、一般的に遊離チオール共役パートナーと協調して使用される。抗体2.12.1.fx中に遊離チオール残基は存在しないが、遊離チオールをタンパク質に導入するために使用することができる、幾つかの化学的方法があり、そして従ってマレイミドに基づく共役のための連結部位が提供される。Mal含有ペプチドは、一般的に簡単なマレイミド/酸含有リンカーを使用して比較的単純に合成される。幾つかの配列番号:27-MAL化合物が以下に示すように合成される。一般的に、マレイミドで活性化されたペプチドは、内因性チオール遊離システイン側鎖から誘導される又は他の化学的手段、例えばトラウトTraut’s試薬によって導入されるチオールのいずれかを欠くタンパク質又は抗体にはよく共役しなかった。配列番号:27-K11-Mal配列番号:27-K11-4PEG-Mal-2実施例7アゼチジノンAZD配列番号:27-K11-AZDAZDで活性化されたABPは、リシン側鎖のアミノ酸と非常にゆっくりと反応した。リン酸緩衝液中のpH7ないし9で、共役を試みて、その電荷を減少することによって抗体表面のリシンの求核性の傾向を増加した表面タンパク質上のリシンのpKaは、約9.1ないし11.2である。抗体の安定性に伴う問題点及びAZDの加水分解は、9より上のpHの使用を妨げた。15モルのAZDで活性化されたABPを、抗体の1モル当たり3日間の反応時間をかけて加え、低いレベルの共役を得た抗体当たり平均2個のAZDで活性化されたABP。塩基性のpHにおいて、AZDの加水分解が急速に起こり24時間後50、減少したレベルの共役に寄与した。実施例8スクアリン酸のエステルスクアリン酸塩。配列番号:27-スクアリン酸スクアリン酸から製造されたアルキルエステルは、中性のpHでチオールと選択的に反応し、一方高いpH概略8.5以上において、これらは、更にアミンと、しかし更にゆっくりと反応することができること知られている。スクアリン酸塩の反応性は、アルキル基のアリール基による置換によって有意に向上することができる。本発明は、ABPの幾つかのスクアリン酸塩誘導体を提供し、ここで、‘R’の性質Rは、エチル、フェニル、2-メトキシカルボニルフェニル、3-フルオロフェニル及び3,5-ジフルオロフェニルからなる群から選択される、及びリンカーの位置が変化する場合、他の誘導体が変化する。スクアリン酸エチルは、遊離チオールによく共役するが、しかしタンパク質及び抗体上の遊離アミンに対して、pHが9より上の場合でない限り不良である。スクアリン酸アリールは、本発明の抗体上の遊離リシンに中性のpHで共役する場合、良好な効率を示す。実施例9ペンタフルオロフェニルエステルPFP配列番号:27-PFP本発明は、更に比較的安定な活性化されたペプチドを形成するためのペンタフルオロフェニルPFPエステルの使用を提供する。この方法は、PFP基が安定な活性化されたペプチド生成物から溶液中で容易に導入することができ、これ自体は観察される僅かなPFPエステルの加水分解を伴って標準的なHPLC法を使用して精製することができることにおいて他の方法を超える幾つかの利点を有する。抗体に共役することが可能な反応性基を伴うリンカーに共有的に接続したABPを合成することにおける挑戦は、ABS配列中の四つの酸性側鎖三つのアスパラギン酸及び一つのグルタミン酸の存在である。これらは、一つの酸側鎖上の部位特異的活性化を確実にする既知の簡単な方法がないため、ペプチド及び活性化剤を使用する簡単な活性化戦略を妨げる。この問題を解決するために、本発明は、これによって、PFPのような活性化されたエステル基が、化学選択性反応チオール/マレイミド化学を使用して又はペプチド側鎖とアミドを形成するが、しかし他の末端を活性なエステルとして残す二重活性なエステルを使用するかのいずれかによって、ペプチド上の側鎖リシンに直接カップリングすることができる合成経路を提供する。幾つかの態様において、戦略は、PFPエステルとして活性化されたそれぞれの酸を伴うビス-酸PEGであることができる。ある塩基の存在を伴う有機溶液において、ビス-PFPリンカーの末端は、リシンのN-ε-アミノ側鎖と必要な繋留点で反応して、安定なアミド連結を形成し、一方他端は、他のPFP基を維持した。この戦略に伴う一つの潜在的な問題は、ペプチドが、リンカーのそれぞれの末端に存在するPFP分子のそれぞれに付加するものであるペプチドダイマーを形成する可能性である。幾つかの側面において、本発明は、化学量論並びにそれぞれのペプチド及びビス-PEG-PFPリンカーの付加を変更することによってこの更なる問題を克服する。本発明によって提供される一つの解答は、ペプチドを超える過剰のリンカーが常に存在するように、過剰のビス-Pfpリンカーを溶液中に有し、そして溶液中のペプチドをゆっくりと加えることである。約3.7:1ないし約4.3:1間の比を、又は幾つかの態様において、約4:1のペプチドを超えるリンカーの比を有することによって、ダイマーの存在を伴わずに必要なPFPで活性化されたペプチドを合成することができる。配列番号:27-K11-5PEG-PFPのための合成スキームを、以下のスキーム8に示す:ビス-dPEG5-OPfpリンカー8.2の合成ビス-dPEG5-酸1mmol、338mgを、無水のジクロロメタン5ml中に溶解し、次いでペンタフルオロフェノール2mmol、368mgを、ジシクロヘキシカルボジイミド1mmol、208mgと共に加えた。溶液を一晩室温で撹拌した。この時間後、微細な白色のジシクロヘキシル尿素副産物を濾過して除去し、そして濾液を乾燥状態まで蒸発して、淡黄色の軽油状物を得た。TLC及びHPLCによる分析は、正しいMS=670を持つ純粋な生成物を示した。生成物を更なる精製無しに次の工程で使用した。生成物は-20°Cで数ヶ月間安定である。配列番号:27-K11-5PEG-PFP8.3の合成配列番号:278.1730mgを、無水のジメチルホルムアミド8ml中に溶解し、そしてN-メチルモルホリン0.05mlを加えた。未希釈のビス-dPEG5-OPfp試薬8.20.5mlのアリコートをガラスバイアル20ml中に入れた。激しく撹拌しながら、配列番号:27/NMM溶液を、4×2mlのアリコートでビス-dPEG5-OPfp試薬に2時間かけて加え、次いで最終混合物を更に1時間撹拌した。配列番号:27-K11-5PEG-PFP生成物への転換の進行を分析用HPLCによってモニターした。反応の終りに、溶液を濾過し、そして2.54cm1のC8カラムの準分離用HPLCによって直接精製した。最も純粋な画分分析用HPLCによって>95を混合し、そして凍結乾燥して、400mg48収率の最終ABP-1-5PEG-PFPペプチドリンカー-2生成物を得た。類似の機構を、配列番号:27-KSH11-マレイミド-2PEG-PFPを産生するために使用することができるスキーム4参照。マレイミド-2PEG-PFPの合成マレイミド-dPEG2-酸328mg、1mmol、QuantaBiodesign、ペンタフルオロフェノール0.103ml、1mmol、PFP及びジシクロヘキシルカルボジイミド206mg、1mmol、DCCを、乾燥DCM10ml中に溶解し、そして1時間室温で撹拌した。形成した微細な白色の沈殿物DCU副産物を濾過によって除去し、そして濾液を乾燥状態まで真空中で蒸発した。生成物を微細な白色の粉末として高い収率490mg、定量的で得た。純度は、分析用HPLCによって>95であった;MSは、[MH]=495を示した。PFPで活性化されたABP類似体の合成精製されたABP-チオール中間体即ち、連結残渣としてKSHを伴うABPのそれぞれの試料30-40mgを、無水のDMF2ml中に溶解した。Mal-PEG2-PFP20mgを、N-メチルモルホリン5mLと共に加えた。反応物を撹拌し、そして生成物の形成の時間経過を追跡するために室温でモニターした。出発ペプチドのPFPで活性化されたABP生成物への完全な転換は、最初の2時間で観察された。溶液を濾過し、そして生成物のピークを、準分離用HPLCによって直接単離した。それぞれの場合、凍結乾燥後、生成物を概略40の収率で単離した。配列番号:27-KSH11-MAL-2PEG-PFP:21mg、配列番号:30-KSH16-MAL-2PEG-PFP:6mg、配列番号:31-KSH18-MAL-2PEG-PFP:9mg、配列番号:32-KSH19-MAL-2PEG-PFP:12mg。実施例10抗体の結合MAC-1及びMAC-2薬物の生成物を、2.12.1.fxをAng2結合ペプチドと共役することによって製造した。MAC-1は、配列番号:27-KSH11-MAL-2PEG-PFPを伴う2.12.1.fxを含んでなり、そしてMAC-2は、配列番号:27-K11-5PEG-PFPを伴う2.12.1.fxを含んでなる。それぞれのMACの試料中の2.12.1.fx分子当たりのペプチド共役の数を計算した表1参照。MAC-1の産生配列番号:27-KSH11-MAL-2PEG-PFP。MAC-2の産生実施例11PFPベースの共役のための条件の最適化方向性共役のための最適反応条件を確立するために一連の実験を行った。それぞれの反応の共役の終了時に、反応をコハク酸塩及びグリシン緩衝液でクエンチし、pHを概略5.5に低下し、そしていずれもの遊離ペプチド又はペプチド/リンカーをクエンチした。MAC-2の分析を、MACのインタクトな分子量MWを、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析法検出を、続いてサイズ排除クロマトグラフィーカラムによる塩及び賦形剤からのタンパク質の分離を使用して測定することによって行った。温度2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド/リンカー配列番号:27-K115PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして2時間、18、22、又は25°Cで反応させた。結果を表2に示す。反応pH2.12.1.fx抗体を、pH6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、又は8.0で、18mgml-1に、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPL2を、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして2時間室温で反応させた。結果を表3に示す。2.12.1.fx抗体を、pH7.0、7.5及び8.0で、2mgml-1に、HEPES緩衝液で0.02Mの最終濃度に調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPを、DMSO中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に5:1のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表4に示す。共役のレベルは、pH8.0より上で減少した。結合反応の時間2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号:27/5PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして30、60、120、180、240、300、又は2400分間、室温で反応させた表5。ペプチドとタンパク質のモル比2.12.1.fx抗体を、pH7.5で18mgml-1に、HEPES緩衝液で0.2MのHEPESの最終濃度に調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に1、2、3,4、及び5:1のモル比で加え表6、そして少なくとも2時間、室温で反応させたが、しかし高濃度のHEPES緩衝液は、共役の減少したレベルをもたらした。2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に5、7、10、12、及び15:1のモル比で加え表7、そして2時間、室温で反応させて、MACを高いレベルの共役で産生した。2.12.1.fx抗体及び配列番号:27-K115PEG-PFFのモル比を更に最適化するために、2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド/リンカーを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に2.5、2.8、3.1、3.4、3.7、4.0、4.3、又は4.6:1のモル比で加え表8、そして2時間、室温で反応させた。2.12.1.fx抗体を、pH7.0で、2mgml-1に、HEPES緩衝液で0.02Mの最終濃度に調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPを、DMSO中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に、5、6、7、8、10:1のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表9に示す。各種のタンパク質濃度における2.12.1.fxの共役特性conjugationprofile2.12.1.fxの、各種の濃度における配列番号:27-K11-5PEG-PFPとの共役特性を分析した。2.12.1.fxを>50mg/mLに濃縮し、20mMの酢酸ナトリウム、pH5.5の200mのトレハロースで所望の濃度に希釈し、そして60mMのpH7.7のリン酸ナトリウムと混合した配列番号:27-K11-5PEG-PFPを50のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と4.3:1のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析法SEC-MSによってインタクトな共役タンパク質として分析して、タンパク質の共役した形態の数及び量を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数の共役部位は、ペプチドの質量差によって分離される個別のシグナルとして観察される。多数の共役種の相対的な量は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表10は、抗体の各種の濃度における2.12.1.fxのペプチドとの共役特性を示す。10mg/mLないし50mg/mLの抗体濃度において、共役は、1.8個又はそれより大きい付加の平均で0-5個間の付加の分布で起こる。0.5ないし5mg/mLの抗体濃度において、共役は、1.5個又はそれより小さい付加の平均で、0-3個間の付加の分布で起こる。反応緩衝液の選択2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はリン酸ナトリウム緩衝液で、0.05Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に、1、2、3、4、又は5:1のモル比で加え、そして2時間、室温で反応させた。低い反応pHは、減少したレベルの共役をもたらした表11。2.12.1.fx抗体を、pH7.5、7.7及び8.0で、18mgml-1に、ホウ酸ナトリウム及びリン酸ナトリウム緩衝液で、0.04Mの最終濃度に調節した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に、4.3:1のモル比で加え、そして2時間、室温で反応させた表12。2.12.1.fx抗体を、pH7.7で18mgml-1に、リン酸ナトリウム緩衝液で、0.04M、0.06M、又は0.08Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド/リンカー配列番号:27-K115PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして2時間、室温で反応させた。結果を表13に示す。共役に対する緩衝液成分の影響プロピレングリコール:2.12.1.fx抗体を、pH7.7で、18mgml-1に、リン酸ナトリウム緩衝液で、0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節した。ペプチド/リンカー配列番号:27-K115PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液結合反応物中の5プロピレングリコール中で20mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして更なる0ないし15のプロピレングリコールと混合し5、10、15、及び20の最終プロピレングリコールのパーセント、そして2時間、室温で反応させた。結果を表14に示す。塩化ナトリウム:2.12.1.fx抗体を、pH7.0で、2mgml-1に、HEPES緩衝液で0.02Mの最終濃度に、0.14Mの塩化ナトリウムの存在及び非存在中で調節した。配列番号:27-K115PEG-PFPを、DMSO中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に5:1のモル比で加え、そして一晩室温で反応させた。結果を表15に示す。共役のレベルは、塩化ナトリウムの存在中で減少する。HEPES:2.12.1.fx抗体を、pH7.0で、2mgml-1に、HEPES緩衝液で0.2M及び0.02Mの最終濃度に調節した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、50のプロピレングリコール中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に5:1のモル比で加え、そして2時間、室温で反応させた。結果を表16に示す。共役のレベルは、0.2MのHEPES緩衝液で減少する。DMSO:2.12.1.fx抗体を、pH7.7で、15mgml-1に、リン酸ナトリウム緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調節し、そしてDMSOを30の最終濃度で加えた。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、プロピレングリコール溶液中で10mgml-1に再構成した。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4:1のモル比で加え、そして2時間室温で反応させた。結果を表17に示す。結合共役反応のパラメーターの考察エフェクター分子この実施例の場合、ペプチドと抗体のモル比が、約3.5:1より低く減少した場合、共役のレベルは、表8に示すように減少する。別の場合として、表9は、モル比を増加することが、増加したレベルの共役をもたらすことを示す。抗体当たりのペプチドの数を増加することは、一般的にその抗原この場合IGF1R受容体に対する抗体この場合2.12.1fxの結合効率を減少し、従って、ペプチドと抗体のモル比は、抗体-抗原、及びペプチド-同族の結合の両方を最大にするように最適化された。共役緩衝液を変更することは、共役パターンを変更することができることも更に見出された。アミンを含有する賦形剤は、これらがPFP基と反応することができるため、一般的にあまり好ましくない。炭酸塩及びホウ酸塩のような緩衝液は、共役のために使用することができるが、しかしこれらのpKaホウ酸はpKaが約9並びに炭酸塩は二つのpKaが約6及び約11が、MAC-1及びMAC-2のために最適として確認された7.7の共役pHから離れていた表11ために回避された。共役のレベルは、反応の化学的条件のみに依存的ではなく、更に時間にも基づいている。2時間後、殆どのPFPで活性化されたペプチドは、抗体と反応してしまったか、又はPFPZは、加水分解されている表5。PFPで活性化されたペプチド/リンカーは、リシンの側鎖のアミノ基と急速に反応した。共役は、リン酸緩衝液中のpH6.5ないし8で行われて、抗体表面のリシンの求核性の傾向を、表3及び4に示すようにその電荷表面タンパク質上のリシンのpKaは約9.1ないし11.2であるを減少することによって増加した。MAC-1及びMAC-2の共役のための最適な条件は、次のように記載される:2.12.1.fx抗体を、リン酸緩衝液で0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度にpH7.7に調節した。ペプチド/リンカー配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、プロピレングリコール中で10mgml-1に再構成した反応物中の最終プロピレングリコール濃度は10。ペプチド/リンカーを、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、そして2時間周囲の室温で反応させた。反応をコハク酸塩及びグリシン緩衝液でクエンチし、pHを概略6.0に低下させ、そしていずれもの遊離のペプチドをクエンチした。幾つかの側面において、反応混合物を濃縮することができ、そしてペプチド関連種リンカーが水溶媒との反応によって加水分解されたペプチドのような及び反応混合物中の他の要素PFPのようなは、例えば50kDa膜を使用するダイアフィルトレーション、又はサイズ排除クロマトグラフィーによって、コハク酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、及び30mgml-1でpH5.5のトレハロース緩衝液に除去することができる。先に列挙した共役条件を、それぞれの工程パラメーターの範囲を決定するために変化させた。パラメーターの範囲は、共役中に起こることができる及び/又は種の集団中に10より大きい変化が観察される迄拡大した可変性に基づいて設定した。表18は、MAC-2に対して同様な共役特性をもたらすパラメーターを要約する。実施例12抗体上のリンカー部位一般的に、スクアリン酸塩及びNHSエステルが、ある状況において使用するためのある程度の可能性を示したが、ハロゲンフェニルエステルを含んでなるZ脱離基のみが方向性の共役の一貫したレベルを示した。5個の提案されたリンカーの2個のみPFPエステル及びスクアリン酸塩が、MACの調製において好結果であった。求電子性リンカーが、一般的にペプチドAng2ペプチドABPのようなの抗体IGF1R抗体のようなへの共役を可能にするものであることを仮定したが、アゼチジノンリンカーは、受容可能な速度におけるペプチドの抗体への共役を可能にしなかった反応は有意に過剰のアゼチジノンリンカーを要し、そして極端に遅かった。表19にMACの調製のために使用したそれぞれのリンカーの幾つかの考慮事項を示す。実施例13抗体上の共役したペプチドの位置MAC-2薬物生成物分子は、2.12.1.fx抗体α-IGF1R-1に、スキーム11に記載したような5PEG-PFPリンカーを使用して接続した1-4個の配列番号:27分子の分布からなる。これは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムによる塩及び賦形剤からのタンパク質分離後に、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析検出を使用してMAC-2のインタクトな分子量MWを測定することによって決定された。2.12.1.fx抗体及びMAC-2の3個のロットのインタクトな分子量MWを示す質量分析データを、図3に示す。図2Aは、共役前の2.12.1.fxを示す。これは、単一のMWを示す均一な分子である。MAC-2のロットは、2.12.1.fxに共役したペプチドの分布を示す;1-4個間の共役付加CAが観察される。それぞれの形態の相対的量は、ロット間で一貫し、そしてそれぞれのロット中の最も普通の形態は、それぞれの個々の2.12.1.fx抗体に接続された2個のペプチド配列番号:27を有する。2.12.1.fx抗体中のジスルフィド結合を還元することによって、軽及び重鎖を別個に観察することができる。ジスルフィドの還元は、インタクトな2.12.1.fx抗体を20mMのトリス2-カルボキシエチルホスフィンTCEPで処理することによって行われる。得られた重及び軽鎖の混合物を、先に記載したようにインタクトな分子量のために分析する。図3に示したデータは、2.12.1.fx上のABPの位置に対する証拠を提供する。MAC-2のロット中の軽鎖の大部分>65は、共役している。殆どの共役した軽鎖は、1個のCAを含有する。2個のCAも低いレベルで更に観察される。殆ど全ての観察された重鎖>90は、非修飾であり、これは、非常に僅かな共役したペプチドが重鎖上に位置することを示唆している。ペプチドマッピングを、共役の正確な位置を決定するために使用した。この方法は、次のとおりであった:MAC-2のアリコートを8Mのグアニジン塩酸塩で変性し、ジスルフィド結合をTCEPで還元し、そして得られたシステインスルフヒドリルをヨードアセトアミドでアルキル化する。次いでこの処理されたタンパク質の試料を、プロテアーゼキモトリプシン1:125のプロテアーゼ:MACの重量比で消化した。次いで得られたキモトリプシンペプチドを、C8液体クロマトグラフィーカラムによる分離後、質量分析によって個別に検出した。この技術により、MAC-2は、キモトリプシンによって、重及び軽鎖上で図4中の配列中に注記された黒丸で位置において断片に消化された。次いでそれぞれのペプチドのMWの液体クロマトグラフィー-質量分析LC-MS検出を使用して、どのリシン残基が共役ペプチドによって修飾されたかを決定した。断片が共役ペプチドの接続によって修飾された場合、そのMWはそれに応じて変化する。重鎖の断片Y1、Y6、Y9、Y10、Y20、Y25、Y26、Y29、Y32、Y33、Y34、Y37、Y40及びY43は、Lys残基を含有する。これらの中で、ペプチドの共役は、Y6、Y10、Y25、Y33、及びY37において検出された。軽鎖の断片Y3、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、及びY16は、Lys残基を含有する。これらの中で、共役は、Y3、Y13、及びY15において検出された。Y15と呼ばれる軽鎖断片軽鎖上のN末端から15番目のキモトリプシン断片は、図5に示したデータに基づき共役していることが見いだされた。MACの修飾されたY15断片のMWは、明確に検出された。非共役の2.12.1.fx試料において、修飾されたY15断片の証拠は存在しなかった。非修飾のY15断片は、MAC及び2.12.1.fxの両方で観察された。この断片の大きさは、この断片の全てが非修飾の形態で存在するために、2.12.1.fx試料において高い。この断片がMAC-2中で共役されるため、非修飾Y15の観察されるレベルは減少し、これは、図5中でより小さい面積を持つピークとして観察される。MAC-2の軽鎖断片Y15上で観察される配列番号:27-5PEGの共役の量は、非修飾のY15の減少したピーク面積を測定することによって推定される。非共役の2.12.1.fxが、100を示すようにシグナル強度を正規化した後、MAC-2の3個の独立したロットは、それぞれ17、27及び22の非共役のY15断片を示した。MAC試料中のY15の観察された大きさを、2.12.1.fx試料中のY15の大きさに正規化した。75-85間のY15断片を、MAC-2中で修飾されたと決定した。MAC-2が殆ど1-2個の共役付加を含有することを考慮して、これは、MAC-2中の共役の殆どが、軽鎖断片Y15の2個のK残基K188又はK190の一つに位置することを示唆する。2.12.1.fxの配列に関係する断片Y15の位置を、図4に示す。トリプシン酵素消化を、K188及びK190間を識別するために使用したトリプシンはK及びRのC末端に対して特異性を有する。トリプシンは、共役したK残基を消化しないため、酵素的消化は、どのK残基が共役されるかによって異なったペプチドの長さを産生する。トリプシンで消化されたMAC-2からのLCMSデータの試験は、ペプチドが、K188に特異的に接続する証拠を提供する。修飾されたK190の証拠は、観察されなかった。MAC-2を、TCEPで還元し、そして先に記載したようにグアニジン塩酸塩で変性した。タンパク質濃度を、2mg/mlに、そしてpHを7.8にトリス消化緩衝液で調節した。精製したトリプシンを、1:125のプロテアーゼ:MACの重量比で加え、そして30°Cで4時間インキュベートした。試料を、LCMSによって分析するまで、-20°Cで保存した。断片の試料を、C18逆相カラムで、水/アセトニトリル0.1TFAの移動相を使用して分離した。断片の検出を、214nmのUV及びESI-TOF質量分析の両方によってモニターした。全てのデータの解析を、MassLynxソフトウェアを使用して行った。MAC-2のトリプシン消化による断片の形成は、ペプチド共役の部位に依存する。リシンは、共役のために標的とされる残基である。図2-5に示したデータは、ペプチド結合の支配的な部位が、K188又はK190のいずれかであることを示す。以下のスキームは、K188又はK190における共役によって起こるトリプシン消化反応を示す。問題となっている二つの潜在的な消化断片の化学構造は以下のとおりである:図6は、K188が、ペプチドに共役した場合のトリプシンペプチドに対する選択されたイオンのLCMSクロマトグラムデータを示す。図7は、K190が、共役したペプチドで修飾された場合のトリプシン断片に対する選択されたイオンのLCMSクロマトグラムデータを示す。これらのデータは、単独のK188のみが共役されることを示唆する;この状況は、MAC-2中で検出されるが、しかし2.12.1.fx対照実験において非存在である有意なシグナルをもたらす。K190における修飾からの結果は、負の対照と比較して独特であるいずれものデータを提供しない。予測できるものとは対照的に、ペプチド/リンカーは、2.12.1.fxの軽鎖のK188配列番号:15のK80を優先的に装飾するように見受けられる。これは、2.12.1.fx抗体のFc部分が、影響されていないという驚くべき利点を有する。試験は、得られたMAC-2のPKが、非共役の2.12.1.fxのPKと概略等しいことを示す。抗体上の多数の部位に対する乱雑な非特異的共役は、より低いPKを持つ生成物をもたらすことができる。MAC-1及びMAC-2によって例示される本発明の方向性共役は、より低いPKを含む乱雑な非特異的共役によって起こされることができる可能な有害な影響の幾つかを最小にする利益を提供する。この方法の再現性を確立するために、実験を繰り返した。MAC-2を2mg/mlに希釈し、そしてインタクトな共役タンパク質として、サイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって分析して、タンパク質の共役形態の数及び量を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数の共役部位が、共役されたペプチド/リンカーの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数の共役種の相対的な定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われた。図8は、代表的なMAC-2のスペクトルを示す;定量化のために使用された計算を、表20に示す。インタクトなMAC-2に対する平均共役付加は、次:SUMPRODUCT共役付加の数CA、CA当たりパーセントの式を使用して、2.11と計算される。この例は、0-4個間のペプチド付加の分布として起こるペプチドの共役を示し、最大の形態は、2個のペプチド付加であり、そしてペプチド付加の平均数は2.11である。多数の個体による再現分析は、共役の特性が一貫し、そして再現可能であることを示す。ペプチド結合共役の程度を、2.12.1.fxの軽及び重鎖で別個に試験した。MAC-2を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。図9は、それぞれの鎖の代表的なスペクトルを示す;定量化のために使用した計算を、表21に示す。還元された重鎖MAC-2に対する平均共役付加平均CAは、次:SUMPRODUCT共役付加の数CA、CA当たりパーセントの式を使用して、0.14と計算され、そして還元された軽鎖MAC-2に対する平均CAは、0.86と計算された。これらのデータは、共役の位置が軽鎖においてより高いことを証明する;軽鎖上の最も豊富な形態は、一つのペプチド付加を含有し、そして軽鎖は、平均0.86個のペプチド付加を含有する。重鎖上の共役は、有意に低いレベルで観察される。多数の個体によるこの実験の再現分析は、共役の特性が一貫し、そして再現可能であることを示す。MAC-2を、ジチオトレイトールで還元し、そしてシステイン残基を、ヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化によってアルキル化した。キモトリプシンをタンパク質分解消化のために使用した。溶液中の消化された断片を、液体クロマトグラフィー質量分析LCMSを使用して分析した。個々の断片をC18のHPLCカラムで分離し、そしてその正確な質量を四重飛行時間Q-ToF質量分析器で測定した。得られた断片の質量を使用して、非修飾の断片又は共役ペプチドで修飾された断片を確認した。この実験は、リシン残基を含有するキモトリプシン断片に焦点を当てることによって、これらがペプチド共役のための可能な部位であると解釈された。表22は、全てのこのような断片の列挙を示す。空白の項目は、この技術を使用して検出されない断片である。ペプチド修飾物質を伴って観察された検出された断片は、共役の潜在的部位であると考えられる。表16の表の項目を以下に説明する:断片番号:N末端からのキモトリプシン断片番号;連結された断片即ち、Y1-2は、欠損した開裂部位を示す。始点/終点:N末端からの断片位置の番号。ペプチド質量Da:ダルトンで記載された断片の理論的質量。保持時間対照/分析物:LCMS断片マッピング実験におけるクロマトグラフーの保持/溶出の時間。MSシグナル強度対照/分析物:MSによって観察された観察シグナルの大きさ。質量誤差-ppm対照/分析物:断片の理論値対観察質量の比較;>10、そして特にゼロ0に近い値は、良好な質量の精度を示す。修飾物質:断片に対する潜在的共有付加;Lys残基のペプチド-抗体結合断片、CAM-システイン残基のカルボキシメチル化。星印は、それぞれの断片の修飾された例えば、共役された変種を示す。Pepは、共役されたペプチドを示す。Y15断片へのペプチドの方向性共役は、共役レベルを定量化することによって示される。次の分析は、2.12.1.fx基準生成物のペプチドマッピング実験中に共役を有することが観察されたそれぞれのペプチド断片に対して行われた。共役された基準生成物MAC-2と比較した、非共役対照2.12.1.fx抗体骨格-共役無し中の非修飾ペプチドに対して観察されたシグナル強度の比を、表23に示す。それぞれの試料の同じペプチドの直接の比較が可能であるため、非修飾シグナルが使用される。例えば、非共役ペプチドは、一1の比をもたらす、対照対生成物試料の同じ観察されたシグナル強度を有することが予測されるものである。共役は、生成物試料中の非修飾ペプチドの観察される量の減少をもたらすものであり、これは、一1より大きい比によって示されるものである。表23のデータは、対照及び生成物間の試料並びに実験の変動を補正するために更に正規化される。表23は、軽鎖ペプチドY15が、それぞれの他の共役されたペプチドより有意に高いレベルで共役されることを示す。これは、共役が、方向性の様式で起こり、そしてK残基間に無作為に分布されないことを示唆する。[実施例13]実施例13Ang1-4結合ELISAハイバインディングハーフウェルHigh-bindinghalf-wellプレートを、50ulのPBS中の組換えヒトAng1、ヒトAng2、マウスAng3又はヒトAng4全ての試薬はRDSystemsから、250μg/mlで被覆し、そして4°Cで一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄緩衝液0.1のTween20、PBS、pH7.4で洗浄し、そして150μl/ウェルのSuperblockで室温で1時間遮断した。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、調製した投与溶液範囲:0.005-50,000ng/mlをプレートに加え、そして1時間インキュベートして、プレート上の被覆されたAngファミリーのメンバーへの化合物の結合を可能にした。それぞれのアンギオポイエチンに対する正の対照は、それぞれのファミリーメンバーRDSystemsによって供給されたに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれかを含んでいた。プレートを3回洗浄し、そして50μlのHRPと共役した抗ヒトIgG0.8μg/mL又は正の対照に対してそれぞれの種を加え、そして室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、そして50μl25μlのTMB25μlのH2O2の基質溶液を加え、そして1-5分間インキュベートした。発色を25μlの2MのH2SO4で停止した。450nmのODを、450nmの補正波長で測定した。実施例14Ang2の逆競合アッセイAng2の逆競合ELISAのために、ヒトTie2-Fc、アンギオポイエチン-2タンパク質、ビオチニル化抗ヒトAng2抗体、及びストレプトアビジンHRPRDSystems並びにPierceからのTMB基質を使用した。ハイバインディングハーフウェルプレートを、50μlのPBS中のTie2-Fc50ng/ウェルで被覆し、そして4°Cで一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄緩衝液0.1のTween20、PBS、pH7.4で洗浄し、そして150μl/ウェルのSuperblockで室温で1時間遮断した。プレートを3回洗浄した。洗浄後、Superblock中の50ng/ml0.83nMのAng2の存在中の50μlのAng2結合ペプチド化合物50nM、一連の5×希釈を加え、そして室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、Superblock中の50μlの1μg/mlのビオチニル化抗Ang2検出抗体を加え、そして2時間室温でインキュベートした。プレートを3回洗浄し、そして50μlのストレプトアビジンHRPSuperblock中の1:200希釈を室温で20分間で加えた。プレートを3回洗浄し、そして50μl25μlのTMB25μlのH2O2の基質溶液を加え、そして20-30分間インキュベートした。発色を25μlの2MのH2SO4で停止した。450nmのODを、540nmの補正波長で測定した。IC50値Ang2-Tie2結合の50阻害を、Prism4ソフトウェア中の非線形S字状用量-反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。Ang2-h38C2-IgG1を、ある実施例における対照として使用した。Ang2-h38C2の産生及び構造は、WO2008056346中の化合物43として完全に記載され、その内容、化合物43の産生に関する側面に対する特別な言及は、本明細書中に組込まれる。簡単には、構造は、以下:のとおりであり、式中、そしてリンカーは、抗体の結合部位のK99Kabat番号によりK93のε-アミノ基に共有的に接続し、そして抗体は、h38C2-IgG1配列番号:51及び52WO2008/056346の配列番号:189及び配列番号:190である。実施例15IGF1R競合アッセイIGF1R競合ELISAのために、組換えヒトIGF1RRDSystems、ビオチニル化IGF1GroPepLtd.ストレプトアビジン-ポリ-HRP20SDT、Superblock、及びTMB基質Pierceを使用した。ハイバインディングハーフウェルプレートを、50ulのPBS中のIGF1R62.5ng/ウェルで被覆し、そして4°Cで一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄緩衝液0.1のTween20、PBS、pH7.4で洗浄し、そして150μl/ウェルのSuperblockで室温で1時間遮断した。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、Superblock中の100ng/mL13.3nMのビオチニル化IGF1の存在中の50μlのIGF1R結合化合物1μM、一連の5×希釈を加え、そして室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、そして50μlのストレプトアビジン-ポリ-HRP20Superblock中の1:5000希釈を室温で20分間で加えた。プレートを3回洗浄し、そして50μl25μlのTMB25μlのH2O2の基質溶液を加え、そして5-10分間インキュベートした。発色を25μlの2MのH2SO4で停止した。450nmのODを、450nmの補正波長で測定した。IC50値IGF1とIGF1Rの結合の50阻害を、Prism4ソフトウェア中の非線形S字状用量-反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。実施例16IGF1誘導IGF1R自己リン酸化阻害アッセイIGF1R自己リン酸化阻害アッセイのために、ヒトIGF1Rを発現するように操作されたマウス3T3細胞を使用し、そしてリン酸化を、CellSignalingTechnologiesのホスホ-IGFI受容体βTyr1131サンドイッチELISAキット7302によって決定した。ヒトIGF1Rを発現しているインタクトな細胞を、96ウェルの組織培養処理丸底プレート中に播種し5.0×104細胞/ウェル、そして50μlの増殖培地37°C、5CO2、10のFBS、2mMのL-グルタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン、及び500μg/mLのジェネチシンを伴うDMEMからなる培養培地中で一晩付着させた。16時間後、増殖培地を吸引によって除去し、そしてウェル当たり50μlの100ng/mL13.3nMの組換えヒトIGF1の存在中のIGF1R結合化合物1mM、一連の8×希釈を含有する新しい増殖培地を加え、そして10分間室温でインキュベートした。プレートを液体を吸引により除去し、そしてウェル当たり100μlの氷冷のPBSを加えることによって洗浄した。冷PBSを直ちに吸引して除去し、そして60μLの溶菌緩衝液溶菌緩衝液で開始、全ての以下の試薬は、CellSignalingTechnologiesによって製造された、チロシン1131におけるIGF1Rのリン酸化を定量するために設計された商業的キットの一部として供給されたを、それぞれのウェルに加え、そして振盪しながら室温で10分間インキュベートした。次いでプレートを4°Cで5分間遠心した。次いで上清ウェル当たり50μlを除去し、そしてホスホ-IGF1受容体ベータTyr1131ウサギ抗体で事前被覆され、そしてウェル当たり50μlの試料希釈物を含有する96ウェルプレートに加えた。プレートを一晩16時間穏やかに振盪しながら4°Cでインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、そして100μLのヒトIGF1受容体検出抗体マウス由来を、それぞれのウェルに1時間で37°Cで加えた。プレートを洗浄緩衝液で4回洗浄し、そして100μLのHRPと連結したマウスIgG二次抗体を、それぞれのウェルに30分間で37°Cで加えた。プレートを4回洗浄し、そして100μLのTMB基質をそれぞれのウェルに加え、そして30分間インキュベートした。発色を、50μlの2MのH2SO4で停止した。450nmのODを、540nmの補正波長で測定した。IGF1処理を伴う及び伴わない内部対照は、リン酸化現象の特異性を確認し、そして膜通過シグナル伝達の阻害を決定した。EC50値最大半量シグナルが達成される濃度を、Prism4ソフトウェア中の非線形S字状用量-反応曲線フィッティング機能を使用して計算した。実施例17IGF1R下方制御アッセイIGF1Rの下方制御のために、ヒト大腸腺癌Colo205細胞を使用し、そしてIGF1Rの細胞表面の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。増殖培地RPMI、10胎児ウシ血清、グルタミン中の5×104細胞/ウェルを蒔かれた組織培養96ウェルプレートを、化合物の滴定で3時間37°Cで処理した。細胞をPBSで洗浄し、CellStripperで取出し、そして新しい96ウェルプレートに移した。細胞を、2.5の胎児ウシ血清を伴うPBSで3回洗浄した。細胞を、フィコエリトリンと共役したマウスモノクローナル抗-ヒトIGF1RRDFAB391P、10μl/5×10-5細胞と共に暗所で1時間インキュベートした。次いで細胞を、3回、2.5の胎児ウシ血清を伴うPBSで洗浄した。細胞表面上のIGF1Rの存在を、FACSアレイを使用するフローサイトメトリーによって決定し、そしてデータをFloJoソフトウェアで解析した。受容体の数を、QuantiBRITEPEビーズBD340495を使用して発生した標準曲線に、データを適合させることによって計算した。データを、負の対照のhIgG2に対する試験化合物による下方制御のパーセントとして報告した。結果及び考察ヒトAng2に特異的に結合するMAC-2の能力を、図10に示す。MAC-2及びAng2-h38c2は、ヒトAng2に結合することが可能であったが、しかしヒトAng1、ヒトAng4又はマウスAng3には可能ではなく、Ang2に対して高い特異性を示し、そして他のアンギオポイエチンファミリーのメンバーに対しては示さなかった。MAC-1及びMAC-2は、Ang2競合アッセイ図11及び表24に示すように、Ang2を結合することが可能であり、そしてTie2への結合を防止した。驚くべきことに、Ang2-h38c2との比較において、MAC-1及びMAC-2の両方は、Ang2を競合的に結合する能力の増加を示した。共役したMACが結合し、そしてAng2のTie2への結合が阻害されたことを確認した後、IGF1が、IGF1Rに結合することに対して競合する能力を、IGF1R競合アッセイ図12によって決定した。MAC-1及びMAC-2は、IGF1R結合に対してIGF1と競合するために、親の抗-IGF1R抗体2.12.1.fxのように効率的であった。MAC-1及びMAC-2は、低いナノモルの範囲のIC50値を示した。対照的に、ある他の抗-IGF1R抗体による試験において、ペプチドの共役は、IGF1Rと相互作用する抗体の能力と干渉することが観察されたデータは示していない。競合アッセイにおいて観察されたIGF阻害を、IGF誘導のシグナル伝達現象を阻害することに翻訳することを確認するために、細胞ベースの機能アッセイを使用して、IGF刺激後のIGF1Rの自己リン酸化の阻害を決定した図13及び表24。MAC-1及びMAC-2は、親の抗-IGF1R抗体2.12.2、fxと、同様な活性を有していた;従って、制約されたAng2ペプチドの共役は、MACの自然の結合及び阻害を変化しないように見受けられる。IGF1Rの自己リン酸化を阻害することに加えて、抗-IGF1R抗体は、更にIGF1Rの内部移行及び分解を起こし、受容体の下方制御をもたらす。この行動は、処理の2時間内に観察され、そして24時間維持される。MACを、ヒト大腸腺癌細胞系Colo205上のIGF1Rレベルを下方制御する能力に対して試験した。細胞を、3時間培養液中でMAC化合物の滴定により処理した。細胞を収集し、そしてIGF1Rの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。負の対照のhIgG2と比較したIGF1Rの下方制御のパーセントを決定した表24。MAC-1及びMAC-2は、親のIGF1R抗体2.12.1.fxと同様なIGF1R下方制御活性を有する。抗体当たり2個のペプチドを共役することがIGF1Rの自己リン酸化及び下方制御を行うことに関して理想的であり、そして抗体当たり2個より多い又は少ないペプチドの共役が、これらの機能をMACが行う能力を減少することを示した。IGF1R活性を調節するための2.12.1.fxの能力に対する、抗体当たりのペプチドの数の影響を評価するために、MAC-1の2種類の試料を調製し、ここで、反応条件は、共役を減少する低MAC-1か、又は共役を増加する高MAC-1かのいずれかを提供するように設定された表25。試料を、IGF1Rを下方制御及びリン酸化する能力に対して分析した表25。IGF1R経路を効率よく調節するための高MAC-1の、低MAC-1と比較した能力に、有意な差が存在する。抗体当たり約2個より多いペプチドの共役は、抗体当たり約2個又はそれより少ないペプチドの共役と比較して、IGF1Rの自己リン酸化を阻害する及びIGF1Rの下方制御を誘導するの両方に対するMACの機能の活性を制約する。従って、一つの二重機能性成分中の二つの異なった生物学的経路を効率よく調節するために、ペプチド及び標的の薬物動態によるが抗体当たり約2個のペプチドの共役が理想的であるかもしれない。実施例18Invivoの薬物動態プロトコルマウス及びサルの血清中の血清MACレベルを測定するために、検証された直接結合の酵素結合免疫吸着検定ELISA法を使用した。簡単には、試料中のMACを、IGFR1又はAng2と結合させ、これを、マイクロタイタープレートに受動的に吸着させ、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼと共役した抗-ヒトIgGを、発色性基質と共に使用して、血清試料中のMAC-2の濃度に比例するシグナルを発生させる。マウス血清中のMAC-2の定量化の上限及び下限は、26.0及び1000ng/mlであり、そしてカニクイザルの血清中では、52.0及び2000ng/mlである。Ang2及びIGF1Rの逆ELISAハイバインディングハーフウェルプレートを、50μlのPBS中のIGF1R62.5ng/ウェル又はAng26.25ng/mlで被覆し、そして4°Cで一晩インキュベートした。プレートを3回洗浄緩衝液0.1のTween20、PBS、pH7.4で洗浄し、そして150μl/ウェルのSuperblockで室温で1時間遮断した。プレートを3回洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄後、調製した投与溶液の標準液範囲:3.91-500ng/ml及び血清試料をプレートに加え、そして1時間インキュベートして、MAC複合体の、プレート上の被覆されたAng2又はIGF1Rへの結合を可能にした。プレートを3回洗浄し、そして50μlのHRPと共役したヤギ抗-ヒトIgG0.8μg/mLを加え、そして室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、そして50μl25μlのTMB25μlのH2O2の基質溶液を加え、そして1-5分間インキュベートした。発色を25μlの2MのH2SO4で停止した。450nmのODを、450nmの補正波長で測定した。MAC複合体の血清濃度を、標準曲線を使用して計算した。ELISAによって決定されたMAC複合体の濃度を、時間の関数としてプロットした。更なるデータ解析を、WinNonlinバージョン4.1PharsightCorporationを使用して行って、MAC複合体のβ半減期T1/2及び曲線下面積AUCを決定した。マウスPKの研究を、投与の開始時の体重が概略20-22グラムのオスのSwissWebsterマウスCFW,CharlesRiver,Hollister,CAを使用して行った。MAC化合物を静脈内投与した。血液試料を、時点当たり4匹のマウスから、次の時点:0.08、0.5、1、3、5、7及び24時間に採取した。試料収集の前に、プロテアーゼ阻害剤カクテルを全ての血液試験管に加えた。血液を氷上で30分間凝固させ、そして次いで12000rpmで5-10分間4°Cで遠心して、血清を収集し、そしてELISAによる分析まで-80°Cで直ちに保存した。投与溶液を、Ang2又はIGF1Rの逆ELISAによる血清試料の分析のための標準曲線を確立するために使用した。それぞれの血清試料のアリコートを、Ang2又はIGF1Rの逆ELISAのいずれかによって分析した。サルMAC-2の薬物動態学的特性を決定した。2匹のオスのカニクイザルMacacafascicularisを、研究において使用した;MAC-2を、静脈内ボーラス注射によって10mg/kgの投与量レベルで投与した。全てのサルを、投与の一日目に、投与後5分、15分、1時間、4時間及び8時間に、そしてその後一日二回、治療に対する何らかの反応に対して観察した。1、2、3、4、5,7及び14日目に体重を測定し、そして記録した。血液試料を、毒物動態学的分析のために所定の時点で得て、そして血清を分離し、そして-80°Cで保存した。MAC-2による治療に関係することができる注目すべき不都合な臨床的徴候は、研究中になかった。体重の特性は、満足であった。概略1.0mLの血液試料を、それぞれのサルの大腿の静脈から時点0.08-504時間に単純な凝固試験管に収集した。血液試料を、収集後室温で1時間静置させたままにし、そして次いで3000rpmで10分間4°Cで遠心した。得られた血清試料を、分析に先だって概略-80°Cで保存した。結果探索的非GLP薬物動態PK研究を、オスのSwissWebsterマウス及びオスのカニクイザルで行った表26及び27。MACのAng2及びIGF1R結合活性の両方を解析した。マウスにおいて、MAC-1及びMAC-2は、383-397時間のベータ相半減期を持つ、親の抗-IGF1R抗体と同様な滞留時間を示した。MAC-1及びMAC-2Ang2結合能力は、一回投与のIV研究のマウスにおける105-120時間のベータ相半減期を持つ、Ang2-h38c2と同様な滞留時間を示した。カニクイザルにおいて、MAC-2は、100.4時間のベータ相半減期を持つ、親の抗-IGF1R抗体よりわずかに短い滞留時間を示した。MAC-2Ang2結合能力は、97.8時間のベータ相半減期と、Ang2-h38c2と同様な滞留時間を示した。実施例19Invivoの薬理学プロトコルMAC-2の抗腫瘍活性を、Colo205ヒト大腸腺癌又はMDA-MB-435黒色腫異種移植モデルで評価した。Colo205又はMDA-MB-435細胞を、10のFBSRPMI培地で培養し、そして0.1mlのハンクス平衡塩液HBSS中の3×106細胞を、生後5-7週のメスのnu/nuマウスの上部側腹部に皮下注射し、そして治療の開始に先立ち200-400mm3の体積を確立させた。腫瘍が確立された後、マウスを、同一の腫瘍体積を持つ治療群n=9-10/群にランダム化し、そしてMAC-2治療剤を腹腔内IP注射によって毎週1回投与した。組合せ研究において、更なる抗癌剤を、MAC-2と同時に開始して毎週IP注射によって投与した。腫瘍体積をノギスを使用して週1回又は2回測定し、そして体重を、治療期間中毎週測定した。幾つかの研究において、ベヒクル治療の対照群の腫瘍体積が2000mm3に達した時点で、全てのマウスをCO2窒息によって安楽死させ、そして腫瘍を切除し、秤量し、そして更なる組織学的及び/又は免疫化学的評価のために加工した。仮性生存研究において、それぞれの治療群の平均腫瘍体積が2000mm3を超えた時点で、マウスをCO2窒息によって安楽死させ、そして腫瘍を切除し、そして秤量した。結果Colo205ヒト大腸腺癌異種移植モデルで行った実験を、図12A及び13Aに例示する。Ang2-h38c2又は抗-IGF1R抗体2.12.1.fxの毎週の投与は、Colo205腫瘍の成長を阻害した。毎週投与されるAng2-h38c2及び抗-IGF1R抗体の組合せは、Colo205腫瘍の成長を阻害することにおいて、更なる利点を示した。単独のMAC-2の毎週の投与は、組合せと同様な利益を示した図14A。別個の研究において、MAC-2は、Colo205腫瘍の成長、及び最終腫瘍重量を用量依存的に阻害した図15A、B。28日目に、化合物で治療されたマウスを犠牲にし、そして腫瘍を切除し、そして瞬間冷凍した。MAC-2の抗血管新生効果を評価するために、腫瘍の微小血管密度を、ベヒクルPBS又はMAC-20.3mg/kgから10mg/kgまでの用量反応範囲で治療したColo205大腸腺腫異種移植腫瘍の冷凍された切片に対して免疫組織化学的に評価した。腫瘍を、マウス特異的モノクローナル抗体でCD31に対して染色し、そして免疫反応性を、それぞれの腫瘍からの三つの切片の五つの部分から定量した図13C。腫瘍の微小血管密度は、MAC-210mg/kg、毎週一回によって、ベヒクル治療群との比較において、約42有意に減少され、MAC-2治療の抗血管新生活性を確認した。MAC-2が、invivoでAng2及びIGF1Rの両方を標的とするか否かを調査するために、Ang2及びIGF1R発現レベルに対するMAC-2の効果を、ベヒクル、Ang2-h32c2、IGF1R抗体2.12.1.fx又はMAC-20.3mg/kgから10mg/kgまでの用量反応範囲で治療された二つの独立のColo205異種移植腫瘍で評価した。溶菌液を冷凍された切除腫瘍から調製し、そしてAng2及びIGF1Rの免疫反応性を、ELISAによって定量した。Ang2及びIGF1Rの免疫反応性は、MAC-2の治療によって用量依存的様式1、3及び10mg/kgで、ベヒクル治療群との比較において有意に減少した図14B、15D、及び15E。IGF1Rレベルに対するMAC-2の効果は、IGF1R拮抗性抗体2.12.1.fxに対して観察されたものと同様である図14B。更に、リン酸化されたIGF1Rのレベルは、MAC-2で治療されたマウスからの腫瘍中で減少されたデータは示されていない。これらに腫瘍の固定された切片の免疫蛍光も、更にIGF1R及びpIGF1Rの減少を確認したデータは示されていない。これらのデータは、MAC-2治療が、Colo205異種移植モデルのAng2及びIGF1R経路に両方に影響することを示す。三つの別個の研究において、MAC-2治療は、ベヒクルPBS、Ang2-h38c2及びIGF1R抗体2.12.1.fx及び2.13.2と比較して、継続した腫瘍阻害に導いた図16A、16B、16C。抗-IGF1R抗体2.13.1は、WO02/053596中の、それぞれのシグナル配列を差引いた配列番号:45及び配列番号:47として記載されている。MAC-2による腫瘍の阻害は、Ang2-h38c2及び2.12.1.fxの組合せと同様であり、そしてAng2-h38c2及び2.13.2より更に活性である図16C。MAC-2治療は、体重増加に影響せずデータは示されていない、そしてマウスは、研究を通して良好な健康状態であるように見受けられた。マウスのそれぞれの群の腫瘍を、疑似生存研究として2000mm3まで進行させた。Ang2-h38c2及び抗IGF1R抗体治療群の両方は、48日目に中止した;然しながら、MAC-2治療3-10mpkの腫瘍は、研究を停止した94日目においてなお2000mm3より小さかった。MAC-2の抗腫瘍効力も、更にMDA-MB-435黒色腫異種移植モデルにおいて評価した。MAC-2の毎週の投与3及び20mg/kgIPは、MDA-MB-435モデルにおける腫瘍の成長の有意な40の減少67日目をもたらした図17。従って、MAC-2は、二つの異なったヒト異種移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍効力を示した。実施例20各種の抗体のペプチド共役特性幾つかの異なった抗体のペプチドとの共役特性を、配列番号:27及び5PEGをそれぞれ例示的ペプチド及びリンカーとして使用して解析した。全ての試験された抗体は、十分に確認され、そして特徴付けされた抗原相互作用を持つヒト又は完全にヒト化されたIgG抗体であった。hAbλテストは、CLλを含んでなり、一方、2.12.1.fx、mAbκテスト1、h28C2-IgG1配列番号:51及び52及びh38C2-IgG2配列番号:53及び54は、それぞれCLκを含んでなる。それぞれの抗体を、20mMのpH7.0のHEPESに緩衝液交換し、そして5-20mg/mLに濃縮した。配列番号:27/K11-5PEG-PFPを、50のプロピレングリコールで再懸濁し、そして関連する抗体と4.3:1のモル比で混合し、そして少なくとも2時間室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数のペプチド共役部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表22は、各種の抗体のペプチド共役特性を示す。CLκを含有する抗体に対して、ペプチド共役は、0-4個間のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は2ないし3個のペプチド付加である。対照的に、CLλを含んでなる抗体、hAbλテストに対して、ペプチドの共役は、0-4個間のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は、1又は2個のペプチド付加である。ペプチド共役の程度を、軽及び重鎖で別個に行った。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。各種の抗体の軽及び重鎖上のペプチド共役特性を、表28に示す。2.12.1.fx及びhAbκテスト1において、データは、共役の位置が軽鎖において高いことを示す;軽鎖上の最も豊富な形態は、一つ1個のペプチド付加を含有する。重鎖上の共役は、有意に低いレベルで観察される。h38C2-IgG1及びh38C2-IgG2において、共役の匹敵するレベルが軽及び重鎖上で観察され、軽鎖上に僅かな共役の優先性がある。CLλを含有する抗体hAbλテストにおいて、共役の大部分は重鎖において起こり、低いレベルの共役が軽鎖において観察された。それぞれの抗体2.12.1.fx、hAbλテスト及びhAbκテスト1を、共役過程の後に評価して、その受容体結合を保持する抗体骨格の能力に対する共役付加の効果を決定した天然のmAbと比較して表29。結果は、試験抗体へのペプチドの方向性共役が、抗体結合を変更しなかったように見受けられることを示す。実施例21IgG2-κの代表的抗体のペプチド共役特性IgG2-κ抗体hAbκテスト2の、39-マーペプチドによる共役特性を解析した。抗体を8mg/mLに濃縮し、そして緩衝されたものを、pH8.0の40mMのHEPESに交換した。ペプチドを100のDMSOで再懸濁し、そして抗体と5.0:1のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数のペプチド共役部位は、ペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表30は、39-マーペプチドによるhAbκテスト2のペプチド共役特性を示す。ペプチドの共役は、0-4個間のペプチド付加の分布で起こり、2.03個のペプチド付加の平均であり、そしてCLκ-K188上の方向性共役と一致する。別個の実験において、39-マーペプチドを、先に記載したように、h38C2-IgG2にMAL-2PEG-PFPと共に、異なったモル濃度で共役させた。更に、39-マーペプチドに対する同族受容体の結合を分析した。示した結果表31は、K188-CLκにおける方向性共役と一致する。更に、抗体当たりのペプチドの平均数の増加は、標的に対する全体的結合を、実質的に増加しなかった。これは、抗体当たりの共役の増加が標的結合を増加することができないというある種のシナリオを示し、本発明の利点の一つを示す;抗体当たりの共役したペプチドの数の制御は、単位ペプチド当たりの最大の標的結合を達成することを援助することができる。実施例22:ビオチンの2.12.1.fxFabへの共役ビオチン-2.12.1.fx2.12.1.fxのFab領域配列番号:50及び4の、PFP-ビオチンとの共役特性を解析した。抗体Fabを20mg/mLに濃縮し、そして緩衝されたものを、pH5.5の20mMの酢酸ナトリウム200mMのトレハロースに交換し、そしてpH7.7の60mMのリン酸ナトリウムを添加した。PFP-ビオチンを100のDMSOで再懸濁し、そして抗体と一連のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数の共役部位は、共役したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表32は、2.12.1.fxのPFP-ビオチンのモル比による共役特性を示す。共役は、モル比の増加に従って、0-2個間の付加の分布で起こる。抗体当たりの低い分子の数は、使用されたモル比に基づき、先の結果と一致する。これは、一つ又はそれより多い反応のパラメーターを変更することによって共役の量を制御するこの方法の柔軟性の有用な証明である。ビオチン-PFP実施例23ビオチンのh38C2-IgG1への共役ビオチン-h38C2-IgG1抗体h38C2-IgG1を、pH7.5のHEPES緩衝液で、0.02Mの最終濃度に、20mg/mLに調節した。ビオチン-PFPを、水中で10mg/mLに再構成し、そしてh38C2-IgG1に5:1のモル比で加え、そして室温で2時間反応させた。未反応のPFP-ビオチンを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、そしてpH6.5のヒスチジン、グリシン、及びスクロース緩衝液に緩衝液交換した。試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。表33は、h38C2-IgG1のビオチン-PFPとの共役特性を示す。h38C2-IgG1の共役は、1.1個の共役の平均で、0-3個間のCAの分布で起こる。共役の増加は、反応条件の最適化後に可能となるものである。h38C2-IgG1上のVH-K99Kabat番号によればK93の反応性は、触媒抗体試験化合物CATC-1と反応させた場合、>95であることが確認され、そして逆相クロマトグラフィーによって分析された。CATC-1h38C2-IgG1実施例242.12.1.fx及びK188、K190変異体の共役特性ペプチドマッピングに基づけば、Y15断片中には2個のLysが存在する。活性な共役部位を識別するために、K188及びK190を、Rにそれぞれ又は組合せて変異させた。変異体を、QuickChange部位特異的変異誘発キットStratageneに記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてDNA配列決定によって確認した。変異されたmAbsを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbsをMSを使用して特徴づけした。配列番号:33、34及び35は、2.12.1.fxのIGF1r変異体軽鎖配列を示す。抗体を、pH7.5又は6.5の0.02MのHEPESに、2mg/mLで緩衝液交換した。pHが6.5の場合、次いでpH7.7の60mMのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、50のプロピレングリコールで希釈し、そしてタンパク質と4.3:1のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数の共役部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表34は、非修飾の2.12.1.fx、2.12.1.fx-K188RLC:配列番号:33、2.12.1.fx-K190RLC:配列番号:34、及び2.12.1.fx-K188R-K190RLC:配列番号:35の共役特性を示す。K188R変異体は、減少した共役を示した。K190Rは、未共役の2.12.1.fxと類似の共役を有していた。MAC-2の共役は、組合せのHEPES/リン酸塩緩衝液を使用するの他のアッセイで観察されたものより低かった。実施例25K188に対する方向性共役の機構を解明するための2.12.1.fx変異体K188に接近した残基を試験した。H189側鎖は、K188のε-アミノ基に非常に近い。Hisは、プロトン移動反応にしばしば関係するために、H189は、K188共役のために必要である可能性が非常にある。K188部位特異的共役におけるH189の役割を研究するために、本出願人等は、ヒスチジンをアラニンで置換することによってイミダゾール環を除去した。D151A及びD151A/H189A変異体を、部位特異的共役におけるD151の役割並びにD151及びH189の組合せ効果を研究するために製造した。変異体を、QuickChange部位特異的変異誘発キットStratageneに記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてDNA配列決定によって確認した。変異されたmAbsを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbsを、MSを使用して特徴づけした。次の2.12.1.fx軽鎖変異体:D151A配列番号:36、K188A配列番号:37、H189A配列番号:38、K190A配列番号:39及びD151A/H189A配列番号:40を産生した。それぞれの抗体を、pH5.5の20mMの酢酸ナトリウム、200mのトレハロースに200mg/mlで緩衝液交換した。次いでタンパク質にpH7.7の60mMのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、50のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と4.3:1のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数の共役部位は、共役したペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表35は、2.12.1.fx、2.12.1.fx-D151A、2.12.1.fx-K188A、2.12.1.fx-H189A、2.12.1.fx-K190A、及び2.12.1.fx-D151A/H189A変異体の共役特性を示す。方向性共役を維持したK190Aを除く、全ての変異体は、非修飾の2.12.1.fx抗体と比較して、減少した平均共役レベルを示した。共役の程度を、軽及び重鎖上で別個に試験した。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。2.12.1.fx及び変異体上の軽並びに重鎖上の共役特性を表35に示す。表に記載した全ての変異体は、K190Aを除き、非修飾の2.12.1.fxと比較して軽鎖上の減少した共役レベルを示した。変異体の重鎖の共役レベルは、非修飾の2.12.1.fxと同様なレベルであった。実施例26ラムダ/カッパ置換hAbλテスト1中のLCλを、LCκで置換して、これがLC誘導体化のレベル、方向性及び/又は制御を増加するか否かを決定した。LCλ/LCκドメイン置換ハイブリッド構築物を、オーバーラップPCRを使用して産生した。LVλ及びLCκを、hAbλテスト及びカッパmAb軽鎖を、別個にテンプレートとして使用してPCRで増幅した。これらの二つのPCR産物をテンプレートとして混合した;hAbλテスト1順方向プライマー及びLCκ逆方向プライマーを、オーバーラップPCR反応中で使用して、全長のhAbλテストLV/LCκDNAを増幅した。ハイブリッド抗体構築物を、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製した抗体を、MSを使用して特徴づけした。hAbλテストLCκハイブリッドは、その同族受容体に天然のmAbhAbλテストと同様に結合した表36。配列番号:41、42及び43は、hAbλテスト、hAbλテスト-λκλJを伴う、及びhAbλテスト-λκJκJを伴うからの軽鎖定常領域である。実施例27hAbλテスト1変異体:モチーフ修飾短いモチーフKHが、CLλの対応する領域でMAC形成のために十分であるか否かを確立するために、hAbλテスト中の残基CLλ188/189の簡単な配列スイッチを伴う変異体を、K187の傍のヒスチジンに入れるために製造し、従ってK187S188H189は、K187H188S189となった。変異体を、QuickChange部位特異的変異誘発キットStratageneに記載されたプロトコルに従って産生した。変異を、オリゴヌクレオチドプライーマーによって誘発し、そしてDNA配列決定によって確認した。変異抗体構築物を、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、そしてタンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製した抗体をMSを使用して特徴づけした。hAbλテスト-S188H/H189SLC:配列番号:44変異体は、その受容体、並びに親hAbλテスト抗体にも結合した表37。実施例28hAbλテスト1変異体の共役特性それぞれの抗体hAbλテスト、hAbλテスト-λκ、hAbλテスト-λκJ及びhAbλテスト-S188H/H189Sを、pH5.5の20mM酢酸ナトリウム、200mのトレハロースに、20mg/mlで緩衝液交換した。次いでタンパク質にpH7.7の60mMのリン酸ナトリウムを添加した。配列番号:27-K11-5PEG-PFPを、50のプロピレングリコールで再懸濁し、そして抗体と4.3:1のモル比で混合し、そして一晩室温で反応させた。全ての試料を2mg/mlに希釈し、そしてサイズ排除クロマトグラフィー-質量分析SEC-MSによって、インタクトな共役したタンパク質として分析して、共役した形態のタンパク質の数及び定量化を決定した。この技術は、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;多数のペプチド共役部位は、ペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。多数のペプチド共役種の相対的定量化は、シグナルの大きさを測定することによって行われる。表38は、共役の全体のレベルが、二つのLCがスイッチされたハイブリッド中で増加されたことを示すλκ及びλκJ-前者はラムダJ断片を含み、後者はカッパJ断片を含む。共役レベルは、hAbλテスト対照の平均CAを超えて増加し、1.66から、それぞれ2.19λκ及び2.53λκJまで行った。変異体は、天然の配列と比較して僅かな影響を有し、単独のKHモチーフがMACに形成のために十分ではないことを示唆した。ペプチド共役の程度を、軽及び重鎖上で別個の試験した表38。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合をグアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。還元分析において、天然のhAbλテストのLCは、5のみの1個のCAを有するが、然しこれは、hAbλテスト-λκにおいて58の1個のCA及びhAbλテストλκJにおいて63の1個のCAに劇的に跳ね上がる。LCスイッチは、HC共役のレベルに対して僅かな影響を有し、これは、かなり一定なままであったHC共役が中程度に増加するλκJを除く。再び、変異体は、天然の配列と比較して僅かな影響を有し、単独のKHモチーフがMAC形成のために十分ではないことを示唆した。これらの共役形態の受容体結合特質を、更に評価して、共役した抗体のその受容体になお結合する能力に対する、配列番号:27-K11-5PEG-PFPによる共役の効果を決定した表39。実施例29異なった脱離基を使用するMACの産生活性なエステル脱離基の活性の程度及び/又は構造が、方向性共役効果を規定することにおいて重要であるか否かを調査するために、配列番号:27-K11SHMAC-2PEG-PFPの一連の代替活性化エステル類似体を合成した。共役生成物の分布を、インタクトな複合体のMSによって試験し、そしてインパクトな複合体の還元及び軽及び重鎖の分離後、軽及び重鎖の両方へのペプチド付加の程度も更にMSによって決定した。代替活性化エステルの構造及び命名を、以下に示す。代替活性化ペプチドを、実施例1-3に先に示したものと同じ戦略及び方法を使用して合成した。簡単には、それぞれの活性化された基を、ZがPFPを置換する新しい脱離基であるマレイミド-2PEG-Zリンカーに組込んだ。上記の化合物を合成するために、精製されたABP-チオールペプチド即ち、連結残基としてKSHを伴うABPの試料30-40mgを、無水のDMF2ml中に溶解した。MAL-PEG2-Z20mgを、N-メチルモルホリン5mLと共に加えた。反応物を撹拌し、そして生成物の形成の時間経過を追跡するために室温でHPLCによってモニターした。出発ペプチドの活性化エステルが連結したABP生成物への完全な転換は、2-6時間内に観察された。溶液を濾過し、そして生成物のピークを、準分離用HPLCによって直接単離した。生成物を、凍結乾燥後、概略30-50の範囲の収率で単離した。結合反応を標準的な条件下で行った。簡単には、2.12.1.fx溶液を、pH7.7のリン酸ナトリウムで0.06Mの最終濃度に希釈することによって、2.12.1.fx抗体溶液を調製した。別個に、ペプチドをプロピレングリコール中で20mg/mlに溶解し、次いでこの溶液を水で10mg/mlに希釈することによって、ペプチド溶液を調製した。結合反応のために、ペプチド及び抗体溶液を4:1のモル比で、処方された時間混合した。時間経過研究のために、結合反応の試料を、pH4.0の40mMのコハク酸、200mMのグリシン1:1、容量/容量の溶液と混合することによって、共役溶液の試料を各種の時点でクエンチした。結合反応の時間経過を、HPLCによって追跡した。配列番号:27を、例示的なペプチドとして使用した。配列番号:27-K11-MAL-2PEG-Z表40は、結合反応の開始後24時間目のインタクトな複合体の最終生成物分布を示す。結果は、幾つかのエステルは全く反応せずZ4、Z12、他は緩慢に反応し例えばZ5、一方幾つかはPFPZ1のそれに近づく特性を与えた例えばZ3ことを示す。共役の動態それぞれの最終複合体に対する時間をかけた付加の速度を、表41、42、43及び44に示す。0CAは、誘導体化されていない2.12.1.fx抗体であり、一方、1、2又は3CAは、それぞれの試験された時点における2.12.1.fx抗体への1、2又は3個のペプチドの付加である。軽及び重鎖の分布それぞれの代替活性化エステルに対するペプチド共役の程度を、軽及び重鎖に対して別個に試験した。それぞれの試料を変性し、そしてジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩及びジチオトレイトールを使用して還元した。得られた遊離の軽及び重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれの共役特性を決定した。2.12.1.fxの軽及び重鎖並びに変異体上のペプチド共役特性を、表45に示す。表に記載した殆ど全ての活性化ペプチドは、PFPZ1を使用する化合物と比較して、同様な共役のレベルを示した2,3,6-トリフルオロフェニルZ3を除き、軽鎖上の減少した共役レベルを示した。N-ヒドロキシスクシンイミドNHSから誘導された活性化されたエステル、即ち、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸イミド及び2-ヒドロキシ-イソインドリン-1,3-ジオンZ8及びZ9は、重鎖の誘導体化に対してより大きい傾向を示した。実施例30代替活性化エステルの更なる例を、表45に示す。PFPエステルの幾つかの類似体の共役の時間経過を試験した。PFP中のフッ素基の数及び位置を減少することによって、より低い反応性の活性なエステルの形態を合成することができ、そして調査した。2,3,5,6-テトラフルオロフェニルエステル及び2,4,6-トリフルオロフェニルエステルを、配列番号:27-K11SHMAC-2PEG-PFPへの共役後、両方試験した。1-ヒドロキシ-ピロリジン-2,5-ジオンNHSを、配列番号:27-K11-5PEG-PFPに共役した。2時間の共役後、これらのより少なく活性化された形態は、PFPより低い2.12.1.fxへの全体的共役を与えた。NHS基は、更により低い全体的な共役を示した。NHS及びPFPを含有するペプチドは、2.12.1.fxに共役した。還元された形態を、2時間目における分布を観察するために分析した。PFPは、1-ヒドロキシ-ピロリジン-2,5-ジオンNHS全体的にLCに31、しかし全体的に重鎖に34と比較して、軽鎖の誘導体化に、はるかに大きい傾向全体的にLCに77、重鎖に6のみを示した。化合物Z1-Z15は、各種の異なった構造の種類の活性なエステルである。これは、芳香族環の周りの異なった数及びパターンのフッ素原子の置換を有する一連のフッ素化された芳香族の活性なエステル化合物Z1、Z2、Z3、Z11、Z14及びZ15を考慮し、そしてこれらの構造が、タンパク質の誘導体化のためにその反応性及び傾向が如何に影響するかを考慮することを啓発する。これらの誘導体の抗体共役の動態は、ペンタフルオロフェニルZ1の反応が完結に達する、2時間の時点で好都合に比較することができる。環の周りのフッ素置換のレベルの増加に伴い、全体の共役の増加したレベル、及び未反応抗体の同時の減少が存在する。反応の速度は、フッ素化されたフェニル脱離基のpKaに直接関係し、最も酸性のフェノールがより高い反応速度を与える。共役の速度は、Z1>Z14>Z3>Z15>Z2>Z11である。フッ素置換パターンの微妙な影響は、化合物Z2、Z3及びZ15を比較することによって観察することができる。活性なエステルの構造は、更に結合反応の方向性に有意に影響した。一般的に、フッ素化された芳香族エステルは、軽鎖誘導体化先に記述したように主としてCLκ-K188に対する顕著な傾向を示した。対照的に、N-スクシンイミド誘導体に基づく幾つかのエステルZ8、Z9及びZ13は、より少ない優先性を示し、しばしばより大きいレベルの重鎖誘導体化が観察された。実施例31MAC-1ペプチド及びPFP活性化基間のPED-2-マレイミド-メルカプトプロピオニルリンカー及びMAC-2ペプチド及びPFP活性化基間の直鎖PEG-5リンカー間の共役の速度を評価した。表47は、2.12.1xに対するこれらの活性化されたペプチドを比較している。結果は、活性化されたペプチドは、これらの僅かに異なったリンカーの構造にもかかわらず、誘導体化の速度及び程度に関して非常に類似して行動することを示す。実施例32リンカーの長さの影響異なった長さのリンカーを有する最終共役分布特性に対する影響を試験した。ペプチドをPFP基に接続する、異なったPEGの長さのリンカーを持つ化合物を合成した。0、1、2、3及び4個のペプチドの2.12.1.fxへの付加に対する結果を、表48に要約する。全体的に、PEGリンカーの長さを変化することは、一般的に共役の分布に僅かな影響を有したことが得られた。実施例33:代替ペプチド配列の共役他のペプチド配列における本発明の適用の可能性を確認するために、配列番号:60及び配列番号:61テスト-ペプチド-1、及び-2を共役した。配列番号:60及び61を、5-PEG-PFPとの、そして次いで2.12.1.fx抗体との共役に、配列番号:27-K11-5PEG-PFPとの反応のために先に最適化した条件下でかけた。共役特性及びLC/HC共役の分析の結果を、表49に示す。配列番号:60及び配列番号:61の両方は、軽鎖に対する方向性共役を示した。LC/HC分布の更なる分析において、MAC-2のそれに対する概略70のLCの誘導体化、及びHCに対する10より少ない誘導体化を伴う同様な特性が観察された。実施例34:ペプチドマッピング実験を、抗体の軽鎖上のK188において方向性共役に導く重要なパラメーターを確認する目的のために、ある範囲のタンパク質/共役の組合せに対して行った。表50は、行われたペプチドマッピング実験の結果を記載する。それぞれの研究パラメーターに対して、先に記載したペプチドマッピング法を使用した。は、K188-CLκに対する高いレベルの方向性共役を示す。及びより低い程度に対するは、方向性共役はなお観察されるが、しかし遅い反応条件、少ない全体的共役、又は一つの軽鎖のみにおける平均のような差を示すことができ、そして従って、抗体当たり0.0ないし1.5個間のペプチドを伴うMACを産生する例えばような特異的状況に更に適していることができることを示す。-は、これらの反応条件が、K188-CLκにおける方向性共役に対して好ましくないように見受けられるものを示す。K188-CLκが方向性共役の位置であるMAC-2において観察されたために、別のパラメーターにおけるペプチドマッピング研究は、この位置に焦点を合わせた。それぞれの研究のパラメーターに対する詳細なペプチドマッピングデータは含まれていないが、しかし他のK残基における有意な共役レベルは観察されず、そして他のMACの観察は、K188-CLκにおける方向性共役と一致した。2.12.1.fxのK188R及びK188A変異は、この部位における方向性共役の喪失をもたらし;この特異的残基の本質的な役割を示唆すた。K190R、及びK190Aの変異は、K188に対する方向性共役を妨害せず、そしてなおこれを向上することができる。試験された他の研究パラメーターの、軽鎖定常領域のサブタイプの少なくとも一部は、方向性共役に対する有意な影響を有することが観察された;軽鎖サブタイプカッパの少なくとも一部は、必要であることが決定された。ラムダ軽鎖サブタイプへの共役例示的なλ含有抗体、hAbλテスト1を使用は、方向性共役を示さなかった。hAbλテスト1のLCλがLCκに変異された場合、K188における方向性共役は回復された。本発明は、先に記載した代表的な態様を参照して、上に述べたように幅広く開示され、そして例示されている。当業者は、本発明に対する各種の改変を、その思想及び範囲から逸脱することなく行うことができることを認識するものである。全ての刊行物、特許出願、及び公表された特許は、本明細書中に参考文献として、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許出願公開又は公表された特許が、具体的に、そして個別に、その全てが参考文献として組込まれることが示されるように、同じ程度に援用される。参考文献によって組込まれた文章中に含有される定義は、これらが、本開示中の定義に矛盾する範囲に対して排除される。明確化のために別個の態様中の文脈に記載された本発明のある種の特徴を、更に一つの態様の組合せにおいて提供することができることは認識されることである。対照的に、簡潔のために、一つの態様の文脈において記載された本発明の各種の特徴は、別個に又はいずれもの適した部分的組合せにおいて提供することができる。本発明の一つの態様に関して考察されたいずれもの制約を、本発明のいずれもの他の態様に適用することができることは明確に意図されている。更に、本発明のいずれもの組成物は、本発明のいずれもの方法において使用することができ、そして本発明のいずれもの方法は、本発明のいずれもの組成物を製造又は使用するために使用することができる。特に、単独で或いは一つ又はそれより多い更なる請求項、及び/又は記載の側面との組合せで特許請求項に記載される本発明のいずれもの側面は、請求項及び/又は記載及び/又は配列の列挙及び/又は図面中の他の場所に明記された本発明の他の側面と組合せ可能であると理解されることである。本明細書中に見出される具体的な例が発明の範囲内に入らない限り、前記具体的例は、明確に否認することができる。特許請求の範囲における用語又はの使用は、代替物のみを指すために明確に示さない限り、及び/又は、或いは、開示が代替物のみ及び及び/又はを指す定義を支持するが、代替物が互いに排他的であることを意味するために使用される。本明細書の仕様中で使用する場合、一つ又は一つのは、他に明確に示さない限り、一つ又はそれより多くを意味することができる。本明細書の特許請求項等で使用する場合、用語含んでなると組合せて使用する場合、用語一つ又は一つのは、一つ又は一つより多くを意味することができる。本明細書中で使用する場合、もう一つは、少なくとも二つ目又はそれより多くを意味することができる。本明細書中で他に定義しない限り、本発明に関して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって普通に理解される意味を有するものである。更に、文脈によって他に要求されない限り、単数の用語は、複数を含むものであり、そして複数の用語は、単数を含むものである。用語含んでなる/含んでなり及び用語有し/含みは、本発明に関して本明細書中で使用する場合、記述した特徴、整数、工程又は成分の存在を規定するために使用されるが、しかしその一つ又はそれより多い他の特徴、整数、工程、成分又は基の存在或いは付加を妨げない。"