"第1DNA配列および前記第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のための方法であって、前記方法は、前記二重鎖アクセプターDNA配列を少なくとも第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドと併用する工程を含み、前記第1オリゴヌクレオチドは、前記第1DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記第1オリゴヌクレオチドは、前記第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記第1オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し、前記第2オリゴヌクレオチドは、前記第2DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記第2オリゴヌクレオチドは、前記第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記第2オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し、前記第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、前記二重鎖アクセプターDNA配列の前記第1DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、前記二重鎖アクセプターDNAの前記第2DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記ヌクレオチドは、前記二重鎖アクセプターDNAにおける相補的な位置を占める、方法。前記第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチまたは前記第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、独立して、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも1ヌクレオチドに位置し、より好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、好ましくは、両方のオリゴヌクレオチド中のミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、請求項1に記載の方法。前記第1オリゴヌクレオチド中および/または前記第2オリゴヌクレオチド中のドメインが、前記少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する、請求項1または2に記載の方法。前記第1オリゴヌクレオチドが、前記ミスマッチを除いては前記第1DNA配列に相補的であり、および/または前記第2オリゴヌクレオチドが、前記ミスマッチを除いては前記第2DNA配列に相補的である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチが、3’末端に存在し、前記第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチが、3’末端に存在する、請求項4に記載の方法。前記第1オリゴヌクレオチドおよび/または前記第2オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも1つの部分を含み、前記修飾は、塩基修飾、3’および/もしくは5’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記修飾ヌクレオチドが、LNAまたはホスホロチオエート結合からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも2、3、4または5個の修飾ヌクレオチドを含み、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、2、3、4または5個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項6~7のいずれかに記載の方法。前記ミスマッチが、修飾ヌクレオチドではない、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに配置される少なくとも1つのミスマッチから少なくとも1ヌクレオチドに存在し、最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、請求項6~9のいずれか一項に記載の方法。前記二重鎖アクセプターDNAの改変は、好ましくは、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および/または胚細胞からなる群から選択される細胞内におけるものである、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記二重鎖アクセプターDNAが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌、げっ歯類またはヒトから得られる、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。前記改変が、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、置換および/または挿入である、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記二重鎖アクセプターDNAが、ゲノムDNA、直鎖DNA、人工染色体、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、オルガネラDNAおよび/またはプラスミドを含むエピソームDNA由来である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のため、好ましくは、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む植物遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、および遺伝子ノックアウトのための、請求項1~15のいずれか一項に記載の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの使用。請求項1~15のいずれか一項に記載の二重鎖アクセプターDNAの標的改変のための方法を行うための指示書を備える、キット。好ましくは、請求項1~15のいずれか一項に記載の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法において使用するための少なくとも2つのオリゴヌクレオチドをさらに備える、請求項17に記載のキット。第1DNA配列および前記第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列と併用されるとき、前記第1オリゴヌクレオチドが、前記第1DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記第1オリゴヌクレオチドが、前記第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、前記少なくとも1つのミスマッチが、前記第1オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し、前記第2オリゴヌクレオチドが、前記第2DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、前記第2オリゴヌクレオチドが、前記第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、前記少なくとも1つのミスマッチが、前記第2オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し、前記第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、前記二重鎖アクセプターDNA配列の前記第1DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、前記二重鎖アクセプターDNAの前記第2DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記ヌクレオチドは、前記二重鎖アクセプターDNAにおける相補的な位置を占める、請求項17~18のいずれかに記載のキット。当該分野において明確にされている技術的課題は、細胞内において特定のおよび所望の遺伝的変更を導入するために、例えば、植物細胞内に存在するゲノムに特定の遺伝的変更を導入するために現在利用可能な方法が、低効率によって妨害されており、その手法が面倒かつ高価になっている点である。代替のおよびより良いTNE法を得る必要がある。ゆえに、解決すべき課題の1つは、細胞に存在するような遺伝情報、特に二重鎖DNA配列に遺伝的変更を導入するための、代替のおよび/またはより良いおよび/またはさらなる方法を提供することである。好ましくは、そのような方法は、当該分野において報告されている効率と比較して向上した効率を有する。そのような方法は、遺伝情報が変更された細胞の提供、より詳細には、標的DNAに改変を導入することによって細胞の機能が変更された細胞の提供を可能にするだろう。そのような機能は、例えば、本発明に係る方法によって変更されたDNAを含むDNA配列によってコードされるタンパク質の変更された特性に関するものであり得る。課題の解決法は、添付の請求項に提示されている。二重鎖または二本鎖DNAは、当業者に非常に周知の用語であり、AとTおよびGとCとの間の相補的な塩基対形成ワトソン-クリック塩基対形成によって二重らせんとして保持されたDNAの2本の鎖のことを指す。本発明者らは、第1DNA配列第1鎖に含まれるおよびその第1DNA配列の相補体である第2DNA配列第2鎖に含まれるを含む二重鎖DNA配列の標的改変のための新しい方法を見出した。その方法は、特異的にデザインされた少なくとも2つの異なるドナーオリゴヌクレオチドを利用する。その2つのドナーオリゴヌクレオチドの各々は、標的にハイブリダイズすることができる当業者に公知であるような、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下においてドメインを含む。その2つのドナーオリゴヌクレオチドの各々は、標的二重鎖DNA配列と比較して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、そのミスマッチは、標的二重鎖DNA配列に導入されるものである。第1オリゴヌクレオチドは、前記第1DNA配列第1鎖中にハイブリダイズすることができるドメインを含み、第2オリゴヌクレオチドは、前記第2DNA配列第2鎖中のにハイブリダイズすることができるドメインを含む。第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、第1DNA配列中のヌクレオチドを対象とする/それに対するものであり、第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、二重鎖DNAの第1DNA配列中の上記ヌクレオチドと塩基対を形成する第2DNA配列中のヌクレオチドを対象とする/それに対するものである。当該分野において、オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、そのオリゴヌクレオチド内に、換言すれば、そのオリゴヌクレオチドの中央のどこかに存在すべきであることは、提唱されている通常の知識である例えば、上で論じた様々な特許出願、特に、米国特許第6936467号明細書および同第7226785号明細書を参照のこと。ミスマッチが中央のどこかに存在して両側に様々なヌクレオチドが隣接しているオリゴヌクレオチドは、例えば互いにハイブリダイズする可能性がある相補的なドメインを少なくとも部分的に共有し、それにより、標的ヌクレオチド交換において使用できなくなるので、当該分野のそのようなオリゴヌクレオチドデザインのせいで、いずれの当業者も、上に記載したような少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのセットを使用できなくなる可能性がある。しかしながら、驚いたことに、かつ予想外にも、本明細書中で詳細に記載される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを使用する本発明に係る方法は、その各オリゴヌクレオチド中のミスマッチがそのオリゴヌクレオチドの中央のどこかでなく特定の位置に配置されるとき、良好な効率で行われ得ることが見出された。特に、効率的なTNEのためには、本明細書中に記載される少なくとも2つのオリゴヌクレオチド中のミスマッチが、独立して各オリゴヌクレオチドに対してオリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに配置されるべきであることが見出された。最も好ましくは、少なくとも1つのミスマッチは、ssオリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。いずれのミスマッチもオリゴヌクレオチドの中央部分に存在すべきであり、例えば、ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの成熟前の分解を防止するためにオリゴヌクレオチドの5’末端および3’末端における修飾が導入されるべきであるという通常の考えとは対照的に例えば、米国特許第6936467号明細書を参照のこと、オリゴヌクレオチドにおいて3’末端から0、1または最大でも2ヌクレオチドにミスマッチを有することによって、標的ヌクレオチド交換の方法、すなわち、本明細書中に記載されるような二重鎖DNA配列の標的改変のための方法において有益に使用できるオリゴヌクレオチドが提供されることが見出された。上記のことから、本明細書中に記載されるような少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを使用することによって、第1DNA配列中のヌクレオチドと、二重鎖DNAの第1DNA配列中のそのヌクレオチドと塩基対を形成する第2DNA配列中のヌクレオチドとを同時に標的化することが可能になり、さらに、予想外にも標的ヌクレオチド交換が改善された。3’末端から0、1または最大でも2ヌクレオチドに少なくとも1つのミスマッチを含む本明細書中に記載されるようなオリゴヌクレオチドの各々は、修飾ヌクレオチド、すなわち、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾、ならびに/または前記ヌクレオチドの3’末端および/もしくは5’末端における修飾を有するヌクレオチドを含めることによってさらに改変され得る。これらの修飾には、オリゴヌクレオチドと標的配列との結合/ハイブリダイゼーションを改善する、および/またはいわゆるヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの分解を妨害するかもしくは阻害する、周知の修飾が含まれる。そのような修飾ヌクレオチドの例としては、ロックトlocked核酸、またはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドが挙げられる。しかしながら、実施例2に示されるように、本発明に係る第1または第2オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを組み込むことを必要とされないし、他の任意のタイプの修飾ヌクレオチドが組み込まれることも必要とされない。定義以下の説明および実施例では、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む明細書および請求項の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書中で別段定義されない限り、使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。本明細書中で使用されるとき、単数形a、anおよびtheは、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、上で使用されたようなaDNA分子を単離するための方法は、複数の分子例えば、10個、100個、1000個、1万個、10万個、100万個またはそれ以上の分子を単離することを含む。特に、本明細書中に記載される本発明は、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの使用を利用する。その説明において、aまたはtheオリゴヌクレオチドについて言及される場合、当業者はこれを、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの1つが存在しないことを指し示していると理解するべきでなく、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、本発明に係る方法において適用される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの1つ、2つもしくはそれ以上またはすべてについて独立して言及されていることを指し示していると理解するべきである。例えば、オリゴヌクレオチドが、LNA-ヌクレオチドを含むことがあると述べられる場合、当業者はこれを、そのオリゴヌクレオチドのうちの1つがそのようなLNA残基を含んでもよいが、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの両方ともが、そのようなLNA残基を含んでもよいと理解するべきである。本文書およびその請求項において、動詞含むおよびその語形変化は、その単語の前に記載される項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目が排除されないことを意味するために、非限定的な意味で使用される。本発明の方法において使用される従来の手法を行う方法は、当業者に明らかであろう。分子生物学、生化学、計算機化学、細胞培養、組換えDNA、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定および関連分野における従来の手法の実施は、当業者に周知であり、例えば、以下の参考文献:Sambrooketal.,MolecularCloning.ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,NewYork,1987および定期的な最新版;ならびに連続出版物のMethodsinEnzymology,AcademicPress,SanDiegoで論じられている。本発明に係る核酸は、ピリミジンおよびプリン塩基、好ましくは、それぞれ、シトシン、チミンおよびウラシルならびにアデニンおよびグアニンの任意のポリマーまたはオリゴマーを含み得るAlbertL.Lehninger,PrinciplesofBiochemistry,at793-800WorthPub.1982その全体が、すべての目的のために本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、およびそれらの任意の化学的バリアント例えば、これらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化またはグリコシル化された形態などを企図する。それらのポリマーまたはオリゴマーは、組成が不均一であっても均一であってもよく、天然に存在する起源から単離されてもよいし、人工的または合成的に生成されてもよい。さらに、核酸は、DNAもしくはRNAまたはその混合物であり得、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖およびハイブリッド状態を含む一本鎖または二本鎖の形態で永久にまたは一時的に存在し得る。合成オリゴヌクレオチド:化学的に合成することができる好ましくは約5~約150塩基を有する一本鎖DNA分子は、合成オリゴヌクレオチドと称される。一般に、これらの合成DNA分子は、独特のまたは所望のヌクレオチド配列を有するようにデザインされるが、関連する配列を有しかつそのヌクレオチド配列内の特定の位置に異なるヌクレオチド組成を有する分子のファミリーを合成することが可能である。合成オリゴヌクレオチドという用語は、計画的なまたは所望のヌクレオチド配列を有するDNA分子のことを指すために使用される。標的ヌクレオチド交換またはTNE。標的ヌクレオチド交換TNEは、染色体またはエピソームの遺伝子中の部位と少なくとも部分的に相補的な少なくとも1つの合成オリゴヌクレオチドが、特定の部位のヌクレオチドの変換を指示するプロセスである。多種多様のオリゴヌクレオチドおよび標的を使用したTNEが報告されている。その報告されているオリゴヌクレオチドのいくつかは、RNA/DNAキメラであり、ヌクレアーゼ抵抗性を付与する末端修飾を含む。発明の詳細な説明1つの態様において、本発明は、第1DNA配列およびその第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のための方法に関する。その方法は、二重鎖アクセプターDNA配列を、第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドである少なくとも2つのドナーオリゴヌクレオチドと併用するcombine工程を包含する。第1オリゴヌクレオチドは、第1DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含む。この少なくとも1つのミスマッチは、前記第1オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置する。好ましくは、そのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも1ヌクレオチドに位置し、なおもより好ましくは、そのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から0ヌクレオチドに存在し、換言すれば、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。第2オリゴヌクレオチドは、第2DNA配列にハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含み、第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含む。この少なくとも1つのミスマッチは、前記第2オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置する。好ましくは、そのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも1ヌクレオチドに位置し、なおもより好ましくは、そのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から0ヌクレオチドに存在し、換言すれば、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、二重鎖アクセプターDNA配列の第1DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、二重鎖アクセプターDNA配列の第2DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記ヌクレオチドは、二重鎖アクセプターDNAにおいて相補的な位置を占めるすなわち、二重鎖アクセプターDNAにおいて塩基対を形成することができる。換言すれば、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドは、二重鎖アクセプターDNA中の同じ塩基対を標的にし、第1オリゴヌクレオチドのミスマッチは、第1DNA配列中のヌクレオチドを標的にし、第2オリゴヌクレオチドのミスマッチは、二重鎖DNAの第2DNA配列中の相補的ヌクレオチドを標的にする。換言すれば、第1DNA配列およびその第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列の標的改変のための方法が提供され、その方法は、二重鎖アクセプターDNAを少なくとも2つのオリゴヌクレオチドと併用する工程を包含し、ここで、その第1オリゴヌクレオチドは、第1DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインを含み、第1DNA配列中のヌクレオチドに対してミスマッチをさらに含み、第2オリゴヌクレオチドは、第2DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインを含み、第2DNA配列中のヌクレオチドに対してミスマッチをさらに含み、第1DNA配列および第2DNA配列中の前記ヌクレオチドは、二重鎖アクセプターDNAにおいて相補的な位置を占め例えば、二重鎖アクセプターDNAにおいて塩基対を形成し、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチおよび第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、独立して、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置する。上で述べたように、本発明に係る少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、第1または第2DNA配列と当業者に公知であるような、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下においてハイブリダイズすることができるドメインを含む。好ましくは、第1DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインは、第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含むか、またはそのミスマッチは、そのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに存在する限り前記ドメインに直接隣接して位置する。好ましくは、第2DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインは、第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含むか、またはそのミスマッチは、そのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに存在する限り前記ドメインに直接隣接して位置する。本発明に係る方法は、二重鎖DNAの両方の鎖を対象にしたオリゴヌクレオチド各々が、その二重鎖DNAに存在する同じ塩基対の異なるヌクレオチドを対象としているを用いて、アクセプターDNA配列の特定部位における1つ以上のヌクレオチドの特異的かつ選択的な改変を可能にする。特に、標的改変は、本発明に係る少なくとも2つのオリゴヌクレオチドすなわち、ハイブリダイズし得る第1DNA配列と比較して少なくとも1つのミスマッチを有する第1オリゴヌクレオチドここで、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置するおよびハイブリダイズし得る第2DNA配列と比較して少なくとも1つのミスマッチを有する第2オリゴヌクレオチドここで、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置するを標的細胞に導入することによって、二重鎖アクセプターDNA配列を含む標的細胞内で行うことができ、ここで、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチおよび第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、各々、その二重鎖DNA中の同じ塩基対の異なるヌクレオチドを対象としている。最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、上記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、なおもより好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、両方のオリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。本方法の結果は、標的DNA配列の配列が改変されるような、1つ以上のヌクレオチドの鎖における標的改変である。本発明は、好ましくは、インビボで行われ得るが、エキソビボまたはインビトロでも行われ得る。本発明の文脈において、二重鎖DNA配列は、第1DNA配列および第2DNA配列を含む。第2DNA配列は、第1DNA配列の相補体であり、第1DNA配列と対形成することにより、その二重鎖を形成する。例えば、第1DNA配列ATTT5’から3’方向の相補体は、TAAA3’から5’方向である。この第2DNA配列は、第1DNA配列と対形成することにより、二重鎖を形成する。二重鎖DNA配列が、例えば、遺伝子の一部である場合、第1DNA配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖に存在し得る。二重鎖DNA配列のDNAは、任意のタイプのDNA例えば、ゲノムDNA、ゲノムDNA由来のDNA、直鎖DNA、人工染色体、核染色体DNA、オルガネラDNA、BAC、YAC、プラスミドDNAまたはエピソームDNAであってよい。そのDNA配列は、イントロンまたはエキソンの一部、コーティングまたは非コーティング、発現を制御するかまたはしないものであり得る。本明細書中に開示される方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、一本鎖であり、第1DNA配列第1オリゴヌクレオチドまたは第2DNA配列第2オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる少なくとも1つのドメインを含む。上記2つのオリゴヌクレオチドの各々に対して、かつ互いに独立して、改変されるDNA配列に対する少なくとも1つのミスマッチそのミスマッチは、そのオリゴヌクレオチドの3’末端から0、1または2ヌクレオチドに位置するは、第1第1オリゴヌクレオチドの場合もしくは第2第2オリゴヌクレオチドの場合DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインに含まれるか、またはそのドメインに直接隣接する。したがって、上記オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのドメインは、改変されるDNA配列に対する少なくとも1つのミスマッチを含み得るか、またはそのミスマッチのすぐ隣りである/そのミスマッチに直接隣接する。換言すれば、そのオリゴヌクレオチドは、その実験の条件下でその二重鎖アクセプターDNA配列の第1または第2DNA配列とハイブリダイズでき、かつ前記第1もしくは第2DNA配列に対するミスマッチを含む、隣り合ったヌクレオチドからなるドメインを含むか、またはそのミスマッチは、前記ドメインのすぐ隣に位置するここで、そのミスマッチは、そのオリゴヌクレオチドの3’末端から0、1または2ヌクレオチドに位置する。例えば、上記ドメインが、5’から3’方向で3’末端から3ヌクレオチドまで位置する場合、ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの3’末端から2ヌクレオチドに位置し、ドメインのすぐ隣りであり得る。例えば、上記ドメインが、5’から3’方向で3’末端から1ヌクレオチドまで位置する場合、ミスマッチは、ドメイン内に含められ得る例えば、3’末端から2ヌクレオチドに配置され得るか、またはドメインに直接隣接し得るすなわち、3’末端から0ヌクレオチドに配置され得る、換言すれば、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し得る。少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの各々におけるミスマッチの位置に関する選択は、他方のオリゴヌクレオチドとは独立して行われ得ることが理解されるべきである。換言すれば、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチが、例えば、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する場合、第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、必ずしも前記オリゴヌクレオチドの3’末端に位置しなければならないわけではなく、例えば、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置してもよい。本発明の文脈において、およびミスマッチ、または第1もしくは第2DNA配列にハイブリダイズすることができるドメインに含まれるミスマッチに対して言及される場合に、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端から2、1または0ヌクレオチドに位置する限り、これらには、そのドメインに含まれるかまたはそのドメインに直接隣接して位置する任意のミスマッチが含まれることが当業者によって理解されるべきである。好ましい実施形態において、第1オリゴヌクレオチドは、好ましくは、第1DNA配列に対してたった1つのミスマッチを含み、かつ/または第2オリゴヌクレオチドは、好ましくは、第2DNA配列に対してたった1つのミスマッチを含むその両方が、二重鎖DNAに存在する塩基対の異なるヌクレオチドを対象にしたものである。ある特定の実施形態において、2つ以上の変異が、同時にまたは連続的に標的DNAに導入され得る。上記オリゴヌクレオチドは、その内部に2つ以上のミスマッチを隣接してまたはオリゴヌクレオチド上の離れた位置に含み得る。ある特定の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、離れていてもよいすなわち、隣接していなくてよい2、3、4個またはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを含み得る。そのオリゴヌクレオチドは、その内部にミスマッチを含むさらなるドメインを含み得る。それらのミスマッチは、同じドメインに存在してもよいし、異なるドメインに存在してもよい。本発明に係るオリゴヌクレオチドが、非ハイブリダイズ部分、換言すれば、第1または第2DNA配列とハイブリダイズしない隣り合ったヌクレオチドをさらに含み得ることが、当業者によって理解されるだろう例えば、これらの部分が、第1または第2DNA配列中のいずれの配列とも相補的でないとき。好ましい実施形態において、第1オリゴヌクレオチドは、第1DNA配列にハイブリダイズすることができ、かつ変更されるDNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチ、好ましくは1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する、1つのドメインを含み、第2オリゴヌクレオチドは、第2DNA配列にハイブリダイズすることができ、かつ変更されるDNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチ、好ましくは1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する、1つのドメインを含み、ここで、第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、二重鎖アクセプターDNA配列の第1DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチは、二重鎖アクセプターDNAの第2DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記ヌクレオチドは、二重鎖アクセプターDNAにおいて相補的な位置を占める例えば、二重鎖アクセプターDNAにおいて塩基対を形成する。そのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは、原則として、それぞれ第1または第2DNA配列にハイブリダイズすることができる2つ以上のドメインを含み得るが、しかしながら、それらのドメインのうちの1つだけが、本明細書中に開示されるような少なくとも1つのミスマッチまたは1つのミスマッチを含み得るか、またはそのミスマッチに直接隣接し得る。別の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド、好ましくは、両方のオリゴヌクレオチドは、二重鎖DNAにハイブリダイズできるただ1つのドメインを含む。そのようなドメインは、オリゴヌクレオチドの3’末端付近または3’末端に位置し、ミスマッチを含むか、またはミスマッチに直接隣接する。本明細書中に開示される方法においてドナーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、様々な長さであり得るが、通常、その長さは、10~500ヌクレオチド、好ましくは、11~100ヌクレオチド、好ましくは、15~90、より好ましくは、20~70の間で変動し得る。上記ドメインは、ミスマッチを含む少なくとも5ヌクレオチドからなり得るが、ミスマッチを含むそのオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドからもなり得る。ミスマッチが上記ドメインに直接隣接する場合、そのドメインは、少なくとも5ヌクレオチドからなり得るが、ミスマッチを除いて、そのオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドからもなり得る。上記オリゴヌクレオチド中のドメインは、通常、ほぼ少なくとも5、10、好ましくは、15、20、25または30ヌクレオチドである。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置する少なくとも1つのミスマッチを含む。好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、第1オリゴヌクレオチドと第2オリゴヌクレオチドの両方において、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。当業者は、3’末端という用語が包含するものを理解する。一本鎖非環状DNA分子は、2つの末端である3’末端および5’末端3プライム末端および5プライム末端とも称されるを有する。一本鎖核酸の5’末端は、C-5炭素原子が糖-リン酸骨格の末端の炭素原子を形成している特定のヌクレオチドを明示する。C-5炭素原子は、ホスホジエステル結合によってリン酸基に連結されていてもよいし、されていなくてもよいが、このリン酸基は、その後、別のヌクレオチドといずれの結合も形成しない。一本鎖核酸の3’末端は、リン酸ジエステル結合を用いるかその他を用いるかを問わず、C-3炭素原子が他のいずれのヌクレオチドとも連結しない特定のヌクレオチドを明示する。C-5原子は、フラノース環の酸素と核酸塩基の両方に直接隣接するC原子から数え始めて、リボースまたはデオキシリボース分子の5番目の炭素原子であり、フラノース環の一部を形成しない。C-3原子は、フラノース環の酸素と核酸塩基の両方に直接隣接するC原子である1から数え始めて、リボースまたはデオキシリボース分子の3番目の炭素原子であり、フラノース環の一部を形成する。用語3’末端から2ヌクレオチドに位置するミスマッチは、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオチドから2ヌクレオチドに存在することを指し示す。用語3’末端から1ヌクレオチドに位置するミスマッチは、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオチドから1ヌクレオチドに存在することを指し示す。用語3’末端から0ヌクレオチドに位置するミスマッチは、そのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオチドであることを指し示す。本明細書中に記載される方法の好ましい実施形態において、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチまたは第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、独立して、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも1ヌクレオチドに位置し、より好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、好ましくは、両方のオリゴヌクレオチド中のミスマッチが、それぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端に存在する。第1オリゴヌクレオチドおよび/または第2オリゴヌクレオチド中のドメインが少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接することも、本明細書中に記載される方法において好ましい。さらに、好ましくは、本明細書中に記載される方法において、第1オリゴヌクレオチドは、ミスマッチを除いては第1DNA配列と相補的であり、かつ/または第2オリゴヌクレオチドは、ミスマッチを除いては第2DNA配列と相補的である。したがって、そのような実施形態において、第1オリゴヌクレオチドは、第1DNA配列に対して1つのミスマッチを含み、第2オリゴヌクレオチドは、第2DNA配列に対して1つのミスマッチを含む各々が、二重鎖DNA中の塩基対の異なるヌクレオチドを対象にしている。そのようなオリゴヌクレオチドは、1つのミスマッチ前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在するを除いては、オリゴヌクレオチドの全長にわたって第1または第2DNA配列と相補的である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ミスマッチの位置3’末端から2、1または0ヌクレオチドに位置するまでのオリゴヌクレオチドの全長にわたって第1または第2DNA配列と5’から3’の方向で相補的である。なおもより好ましくは、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、3’末端に存在し、第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは、3’末端に存在し、第1オリゴヌクレオチドは、ミスマッチを除いてはオリゴヌクレオチドの全長にわたって第1DNA配列と相補的であり、第2オリゴヌクレオチドは、ミスマッチを除いてはオリゴヌクレオチドの全長にわたって第2DNA配列と相補的である。本明細書中に記載される方法の別の好ましい実施形態において、第1オリゴヌクレオチドおよび/または第2オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む少なくとも1つの部分を含み、ここで、その修飾は、塩基修飾、3’および/もしくは5’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾からなる群から選択される。塩基修飾、3’および/もしくは5’末端塩基修飾、骨格修飾ならびに/または糖修飾は、オリゴヌクレオチドと標的配列との結合/ハイブリダイゼーション親和性を高めるため、および、独立してまたはさらに、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるために、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。しかしながら、実施例2に示されるように、第1または第2オリゴヌクレオチドは、いずれの修飾ヌクレオチドも組み込む必要はない。本発明に係る方法における使用に適したオリゴヌクレオチドを提供するおよび前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、少なくとも1つのミスマッチを含むオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの任意の修飾が、有益に使用され得る。修飾は、天然に存在するA、C、T、Gヌクレオチドのうちのいずれか1つに対するものであることが当業者によって理解されるだろう。有益なことに、本発明にとって必須ではないが、本発明に係る方法において使用するための第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。第1と第2の両方のオリゴヌクレオチドが修飾を含む場合、第1の修飾は、第2の修飾と同じであってもよいし、異なってもよい。特に、下記で論じられる任意の修飾を、本発明に係る第1および/または第2オリゴヌクレオチドに組み込んでよい。例えば、第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める修飾を含んでもよい。これらの修飾としては、塩基修飾、骨格修飾および/または糖修飾が挙げられ得る。通常、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高めるそのような修飾ヌクレオチドは、細胞環境においてオリゴヌクレオチドの安定性を高める場合があり、それにより、標的ヌクレオチド交換が改善される場合がある。好ましくは、本発明の方法に従って使用するための第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは少なくとも4個、より好ましくは少なくとも6個、最も好ましくは少なくとも8個の修飾ヌクレオチドを含む。あるいはまたは同時に、本発明の方法に従って使用するための第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める最大でも25個、好ましくは最大でも20個、より好ましくは最大でも15個、最も好ましくは最大でも10個の修飾ヌクレオチドを含む。そのような修飾ヌクレオチドは、第1および/または第2オリゴヌクレオチド内の任意の位置、好ましくは、それぞれのオリゴヌクレオチドの3’末端および/または5’末端から、20ヌクレオチド以内、好ましくは15ヌクレオチド以内、より好ましくは10ヌクレオチド以内、なおもより好ましくは8ヌクレオチド以内、なおもより好ましくは6ヌクレオチド以内、最も好ましくは、3’末端の最後のヌクレオチドおよび/または5’末端の最後のヌクレオチドに位置し得る。標的DNA配列に組み込まれるミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端から0、1または最大でも2ヌクレオチドに位置するとき、そのような修飾ヌクレオチドが、細胞ヌクレアーゼから3’側を保護するがゆえに、第1および/または第2オリゴヌクレオチドの3’末端に例えば、3’末端から20、15、10、9、8、7、6または4ヌクレオチド以内に位置することが特に好ましい。しかしながら、先に記載したように、かつ実施例2に示されるように、実際には、オリゴヌクレオチドが、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高める修飾ヌクレオチドを含むことは、本発明にとって必須ではない。天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高め、本発明に係る方法において使用するために第1および/または第2オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、そのような様々な修飾ヌクレオチドが本明細書中で述べられる。そのような修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドであり得るが、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、または非リン酸のヌクレオチド間結合を有するヌクレオチド例えば、カーボネート、カルバメート、シロキサン、スルホンアミドおよびポリアミド核酸でもあり得る。また、国際公開第0226967号に記載されているような細胞ヌクレアーゼ抵抗性を付与する、LNAロックト核酸などの修飾ヌクレオチド、または当業者に公知であるような、オリゴヌクレオチドの細胞ヌクレアーゼ抵抗性を改善する他の任意の修飾ヌクレオチドを使用してもよい。あるいは、または上に記載されたヌクレアーゼ抵抗性を付与する修飾ヌクレオチドに加えて、本発明に係る方法において使用するための第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、標的DNA配列に対してより高い結合親和性を有する修飾ヌクレオチドを含み得る。これらの修飾としては、塩基修飾、骨格修飾および/または糖修飾が挙げられ得る。通常、高い結合親和性を有するそのような修飾ヌクレオチドは、標的配列とのより強い塩基対形成をもたらし、それによって、オリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリッドの安定性が高まる場合があり、これは、標的ヌクレオチド交換を改善すると考えられている。好ましくは、本発明の方法に従って使用するための第1および/または第2オリゴヌクレオチドは、天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて、標的DNA配列に対してより高い結合親和性を有する、少なくとも1~10個、好ましくは1~8個、より好ましくは1~6個、なおもより好ましくは1~4個例えば、1、2、3または4個、なおもより好ましくは2個の修飾ヌクレオチドを含む。上で述べたような修飾ヌクレオチドは、第1および/または第2オリゴヌクレオチド内の任意に位置に、好ましくは、ミスマッチから1ヌクレオチド離れた位置、好ましくは、ミスマッチから最大でも2、3、4、5、6または7ヌクレオチド離れた位置に位置し得る。好ましくは、そのような修飾ヌクレオチドは、ミスマッチの5’側に配置されるが、ミスマッチが、第1および/または第2オリゴヌクレオチドの3’末端の最後のヌクレオチドに位置しない場合、そのような修飾ヌクレオチドをミスマッチの3’側に位置することが選択されてもよい。天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて標的DNA配列に対してより高い結合親和性を有し、本発明に係る方法において使用するためのオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、そのような修飾ヌクレオチドの様々な例が、本明細書中で述べられ、その修飾ヌクレオチドとしては、2-OMe置換、LNAロックト核酸、リボヌクレオチド、superA、superT、または天然に存在するA、T、CおよびGヌクレオチドと比べて標的DNA配列に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を改善する当業者に公知であるような他の任意のタイプの修飾ヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドが、天然に存在するA、T、G、Cヌクレオチドと比べて細胞ヌクレアーゼに対して高い抵抗性を付与するか否かの判定は、例えば、トマト抽出物、トマト細胞またはE.coliに存在するような、細胞ヌクレアーゼの存在下において、例えば、前記修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの半減期を、前記修飾ヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドと比較することによって、行われ得る。第1に述べたものの半減期のほうが長い場合、前記修飾ヌクレオチドは、天然に存在するA、T、G、Cヌクレオチドと比べて、細胞ヌクレアーゼに対する高い抵抗性を付与する。修飾ヌクレオチドが、天然に存在するA、T、CまたはGヌクレオチドと比べて標的DNA配列に対して高い結合親和性を付与するか否かの判定は、例えば、前記修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドとその標的との間で形成される二重鎖の融解温度Tmを、前記修飾ヌクレオチドを有しないオリゴヌクレオチドとその標的とによって形成される二重鎖と比較することによって、行われ得る。第1に述べたものの融解温度のほうが高い場合、前記修飾ヌクレオチドは、天然に存在するA、T、G、Cヌクレオチドと比べて、標的DNA配列に対してより高い結合親和性を付与する。本発明に係る部分は、オリゴヌクレオチドの任意の一部であり、少なくとも1ヌクレオチドの長さを有すると理解されるべきである。例えば、ある部分は、1~10、好ましくは1~6、より好ましくは1~4、より好ましくは1~2ヌクレオチドを含み、ミスマッチの3’側および/または5’側に位置し得る。少なくとも1つの部分は、本発明に係るドメインの一部であり得る;換言すれば、その部分は、第1または第2DNA配列とハイブリダイズできるドメイン内に存在し得る。あるいは、その部分は、完全にまたは部分的にドメインと重複し得る。完全に重複する場合、その部分は、同じ長さのドメインを有し得るが、ドメインの長さを超える長さを有する場合もある。部分的に重複する場合、そのドメインとその部分とは、少なくとも1つのヌクレオチドを共有する。オリゴヌクレオチドにおいて使用される修飾のタイプに応じて、第1または第2DNA配列とハイブリダイズできるドメインの一部となる修飾ヌクレオチドに優先度が存在する場合があるそのドメインは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接する。これは、特に、天然に存在するA、C、TまたはGヌクレオチドと比べて、その相補的なヌクレオチドに対してより高い結合親和性を有する修飾ヌクレオチドの場合である。塩基修飾としては、例えば、国際公開第0226967号に記載されているような修飾ピリミジンのC-5位の修飾例えば、2’-デオキシウリジン、5-フルオロ-2’-デオキシウリジン、5-ブロモ-2’-デオキシウリジンおよび5-メチル-2’-デオキシシチジンを含むが挙げられるが、これらに限定されない。他の塩基修飾としては、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンのような合成および天然の核酸塩基が挙げられる。末端3’および/または5’修飾としては、2’-O-メチル塩基、3’アミン基、ホスホロチオエート結合、またはヌクレアーゼ抵抗性である他の任意の修飾が挙げられ得る。当業者は、これらの種類の修飾を十分に承知している。ヌクレアーゼに対する抵抗性を提供することによって、標的ヌクレオチド交換がさらに改善されると考えられている。様々な骨格修飾例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイトおよびメチルホスホネートを含む、国際公開第0226967号で述べられているもの、および非リン酸のヌクレオチド間結合を有するもの例えば、カーボネート、カルバメート、シロキサン、スルホンアミドおよびポリアミド核酸は、細胞ヌクレアーゼに対する抵抗性を高める。ゆえに、そのような骨格修飾は、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチドにおいて有用である。さらに、糖修飾2’-O-メチル、2’-フルオロまたは2’-メトキシエトキシを含むがこれらに限定されないは、形成された二重鎖の熱力学的安定性を高めることができ、同時に、ヌクレアーゼ抵抗性を改善することができる。好適な修飾の他の例は、国際公開第2007073149号に記載されている。ドナーオリゴヌクレオチドの修飾は、例えば、ホスホロチオエート結合、2-OMe置換、LNAロックト核酸の使用、リボヌクレオチド、ならびに標的DNAに対する親和性結合の改善もしくはヌクレアーゼ活性の阻害またはその両方によってオリゴヌクレオチドとアクセプター鎖acceptorstandとのハイブリッドの安定性を改変するおよび好ましくは増強する他の塩基を含み得る。これらのすべてのタイプの修飾が、当業者に周知であり、様々な商業的供給源から容易に入手可能である。修飾が、本明細書中に記載される方法において使用される第2オリゴヌクレオチドとは独立して第1オリゴヌクレオチドに導入され得ることが当業者に理解されるだろう。例えば、第1オリゴヌクレオチドが、上に記載したような修飾を含む場合がある一方で、第2オリゴヌクレオチドは、含まない。あるいは、第1オリゴヌクレオチドは、第2オリゴヌクレオチドと比較して、より多い、より少ないまたは異なる修飾を、第1オリゴヌクレオチド中の同じ位置または異なる位置に含む場合がある。ある実施形態において、修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドまたは両方に組み込まれ、修飾ヌクレオチドが、その相補的なヌクレオチドに対して天然に存在するA、C、TまたはGヌクレオチドよりも高い結合親和性を有し、修飾ヌクレオチドが、第1または第2DNA配列中の向かい側の位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比べて第1または第2DNA配列中の向かい側の位置のヌクレオチドにより強く結合し、かつ/または修飾ヌクレオチドが、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドである、本発明に係る方法が提供される。好ましくは、上記修飾は、塩基修飾、3’末端および/もしくは5’末端塩基修飾、骨格修飾または糖修飾である。上で論じられたように、本発明に係るドナーオリゴヌクレオチドは、そのドナーが、標的DNA鎖に対して高い親和性を示し、それにより、そのドナーが容易に挿入され得るようにおよび/または形成された二重鎖の熱力学的安定性を高めるように同じ実験環境下で、そのような修飾を含まない同じオリゴヌクレオチドと比較して、ハイブリダイゼーション特性を改善する修飾を含み得る。ドナーオリゴヌクレオチドは、独立してまたはさらに、ヌクレアーゼに対してより抵抗性になって二重鎖構造を安定化し得るように改変され得る。従来技術では、相補的なヌクレオチドに対して天然に存在するA、C、TまたはGヌクレオチドよりも高い結合親和性を有する多種多様の修飾ヌクレオチドその修飾ヌクレオチドは、第1または第2DNA配列中の向かい側の位置のヌクレオチドに相補的な天然に存在するヌクレオチドと比べて第1または第2DNA配列中の向かい側の位置のヌクレオチドにより強く結合し、かつ/または修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドであるが報告されている例えば、国際公開第2007073154号および上で論じられた様々な修飾を参照のこと。ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチから1ヌクレオチド離れた位置、好ましくは、ミスマッチから2、3、4、5、6または7ヌクレオチド離れた位置に存在する。ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチの下流の位置に配置される。ある特定の実施形態において、修飾は、ミスマッチの上流の位置に配置される。ミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接するドメインと、修飾ヌクレオチドを含む部分とは、重複していることがある。したがって、ある特定の実施形態では、ミスマッチを含むかまたはミスマッチに直接隣接するドメインは、修飾が考慮される部分とは異なるオリゴヌクレオチド上の位置に配置される。ある特定の実施形態では、そのドメインは、1つ以上の部分を組み込んでいる。ある特定の実施形態では、部分が、ドメインを組み込むことができる。ある特定の実施形態では、そのドメインと部分とは、オリゴヌクレオチド上の同じ位置に位置してもよく、同じ長さを有してもよく、すなわち、その部分は、長さおよび位置が一致する。ある特定の実施形態では、1つのドメイン内に2つ以上の部分が存在し得る。本発明の場合、このことは、DNA二重鎖を変更するミスマッチを含むオリゴヌクレオチドの一部が、改変されるオリゴヌクレオチドの部分と異なる位置またはシフトした位置に位置し得ることを意味する。また、修飾が、本明細書中に記載される方法において使用される第2オリゴヌクレオチドとは独立して第1オリゴヌクレオチドに導入され得ることが当業者に理解されるだろう。例えば、第1オリゴヌクレオチドは、上に記載したような修飾を含み得る一方で、第2オリゴヌクレオチドは、含まない。あるいは、第1オリゴヌクレオチドは、第2オリゴヌクレオチドと比較して、より多い、より少ないまたは異なる修飾を、第1オリゴヌクレオチド中の同じ位置または異なる位置に含み得る。好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、LNA、および/またはホスホロチオエート結合bonds/linkageを有するヌクレオチドからなる群から選択される。好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ロックト核酸である。ロックト核酸LNAは、アンチセンス遺伝子治療で使用する場合に興味深い特性を有するDNAアナログであり、当業者に公知である。LNAは、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。LNAおよび関連アナログの構造上および機能上の基本的な特性は、様々な刊行物および特許国際公開第99/14226号、同第00/56748号、同第00/66604号、同第98/39352号、米国特許第6043060号および同第6268490号明細書これらのすべての全体が参考として援用されるを含むに開示されている。LNAヌクレオシドは、通常の核酸塩基のすべてに対して入手可能でありT、C、G、A、U;例えば、Exiqonwww.exiqon.comから、標準的なワトソン-クリック塩基対形成の法則に従って塩基対を形成することができる。LNAは、DNAオリゴヌクレオチドに組み込まれると、より迅速に相補的なヌクレオチド鎖と対形成し、得られる二重鎖の安定性を高める。換言すれば、LNAは、正しい標的と不適当な標的とを識別する能力高特異性を、非常に高い生体安定性bio-stability低代謝回転および前例のない親和性標的に対する非常に高い結合強度と同時に備える。実際に、LNAを用いて記録された親和性の上昇は、以前に報告されたすべてのアナログの低~中程度の範囲の親和性からかけ離れたものである。LNAは、リボースが2’-酸素原子と4’-炭素原子との間のメチレン架橋によって構造的に拘束されているRNAアナログである。この架橋は、リボフラノース環の可撓性を制限し、その構造を堅い二環式の形態に固定する。このいわゆるN型または3’-エンドコンフォメーションによって、LNA含有二重鎖のTm融解温度が上昇し、その結果として、より高い結合親和性およびより高い特異性がもたらされる。重要なことには、LNAの好ましい特性は、核酸アナログを用いたときにしばしば観察されるように他の重要な特性を犠牲にして成り立っているわけではない。LNAは、DNAアナログ分野を構成する他のすべての化学と自由に組み合わせることができる。LNA塩基は、すべてがLNAの短い配列またはそれより長いLNA/DNAキメラとして、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。LNAは、内部、3’位または5’位に配置され得る。しかしながら、その堅い二環式のコンフォメーションのせいで、LNA残基は、時折、核酸鎖のらせんのひねりを妨害する。それゆえ、2つ以上隣接したLNA残基を有するオリゴヌクレオチドをデザインすることは、一般にそれほど好ましくない。好ましくは、LNA残基は、らせんのひねりを妨害しない少なくとも1つの修飾ヌクレオチド例えば、従来のヌクレオチドA、C、TまたはGによって分断される。最初に開発された好ましいLNAモノマー[ベータ]-D-オキシ-LNAモノマーは、新しいLNAモノマーに改変された。その新規[アルファ]-L-オキシ-LNAは、3’エキソヌクレアーゼ活性に対して優れた安定性を示すと示唆されており、強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインする際に、[ベータ]-D-オキシ-LNAよりも有力かつ万能でもある。また、国際公開第9914226号、同第00/56748号、同第00/66604号およびJ.Org.Chem.,2010,757,pp2341-2349に開示されているようなキシロ-LNA、L-リボLNAおよび他のLNAを使用することもできる。本発明では、上記タイプの任意のLNAが、[ベータ]-D-LNAアナログよりも優先して、本発明の目標、すなわちTNEの効率の改善を達成する際に有効である。上で述べたように、好ましくは、LNAは、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチドまたは少なくとも2つのオリゴヌクレオチドの両方中のミスマッチから少なくとも1ヌクレオチド離れている。TNEの分野では、LNA修飾は、TNEにおいて使用されるキメラ分子に対する代替物として可能性のあるオリゴヌクレオチド修飾のリストに列挙されているが、本発明に係る方法において使用されるような一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが、LNAを含むように改変されるとき、TNE効率は、LNAが、ミスマッチから少なくとも1ヌクレオチド、なおもより好ましくは、ミスマッチから1ヌクレオチド離れて位置するときに現在見出されているTNE効率に対して有意に高まることが見出されている。そのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約75超の最も近い整数のヌクレオチドに丸められるLNAを含まない。別の好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを含む。商業的に入手可能なヌクレオチド修飾の多くは、遺伝子治療のためのアンチセンスの用途で使用するために開発された。アンチセンスの用途で利用可能な最も単純かつ最も広く使用されているヌクレアーゼ抵抗性化学構造第1世代アンチセンス-オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートPS結合である。これらの分子では、硫黄原子が、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格における非架橋酸素に取って代わっており例えば、国際公開第2007073154号の図2を参照のこと、その結果、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性が生じる。遺伝子治療の場合、ホスホロチオエート/ホスホジエステルキメラは、一般に、5’末端と3’末端の両方に1~4個のPS修飾ヌクレオシド間結合を有し、中央のコアには無修飾DNAを有する。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチド中の任意の所望の位置に組み込むことができる。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、LNA、またはなおもより好ましくは、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドであり、より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ、例えば、1、2、3または4つのホスホロチオエートを有する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、本発明に係るオリゴヌクレオチドの5’末端にまたは5’末端付近に例えば、5’末端から1、2、3、4、5、6、7ヌクレオチド以内に少なくとも1つのホスホロチオエートを含む。ある実施形態において、少なくとも2、3、4または5個の修飾ヌクレオチドを含む、本発明に係る方法において使用されるオリゴヌクレオチドが提供される。好ましくは、そのオリゴヌクレオチドは、2、3、4または5個の修飾ヌクレオチドを含む。好ましくは、その修飾は、LNAおよび/またはホスホロチオエート結合からなる群から選択される。本発明のある特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド中のミスマッチの位置のヌクレオチドを、修飾することができる。そのミスマッチが修飾できるか否かは、ドナー鎖とアクセプター鎖との間の親和性の差異を利用した、標的ヌクレオチド交換またはその細胞のDNA修復機構の正確な機構に大きく左右される。好ましい実施形態において、ミスマッチの位置のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。ある実施形態において、修飾ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置する少なくとも1つのミスマッチから少なくとも1ヌクレオチドに存在し、最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、本発明に係る方法が提供される。先に論じられたように、本発明に係る方法において使用されるような一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド、例えば、LNAを含むように改変されるとき、修飾ヌクレオチド、好ましくは、LNAが、ミスマッチから少なくとも1ヌクレオチド離れて、なおもより好ましくは、ミスマッチから1ミスマッチに位置するときに現在見出されている程度まで、TNE効率が有意に高まることが見出されている。換言すれば、好ましい実施形態において、修飾ヌクレオチド、好ましくは、LNAは、少なくとも1つの他のヌクレオチドその少なくとも1つの他のヌクレオチドは、LNAではなく、好ましくは、修飾ヌクレオチドではないによってミスマッチと分断されている。しかしながら、例えば、ホスホロチオエート結合の場合、そのような結合は、ミスマッチヌクレオチドに直接隣接してもよい。ある実施形態において、二重鎖アクセプターDNAの改変が、好ましくは、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および/または非ヒト胚細胞からなる群から選択される細胞内での改変である方法が提供される。本発明は、その最も広い形態において、一般に、あらゆる生物例えば、ヒト、動物、植物、魚類、爬虫類、昆虫、真菌、細菌などに適用可能である。したがって、本発明は、原核細胞、細菌細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞および/または胚細胞からなる群から選択される細胞内で行うことができる。好ましい実施形態において、細胞は、植物細胞である。二重鎖アクセプターDNAが、原核生物、細菌、真核生物、植物、動物、酵母、真菌、げっ歯類またはヒトから得られる、本明細書中に記載されるような方法も提供される。好ましい実施形態において、二重鎖アクセプターDNAは、植物から得られるまたは植物細胞に存在する植物DNAである。本発明の実施形態において、二重鎖アクセプターDNA配列の改変は、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、置換および/または挿入である。好ましくは、二重鎖DNA配列の改変は、わずか5ヌクレオチド、好ましくは、わずか4、3、2、1ヌクレオチド、最も好ましくは、1ヌクレオチドの欠失、置換および/または挿入であるつまり換言すれば、二重鎖DNA中の1つの塩基対が改変される。より好ましくは、二重鎖アクセプターDNA配列の改変は、わずか5ヌクレオチド、好ましくは、わずか4、3、2、1ヌクレオチド、最も好ましくは、1ヌクレオチドの置換である。別の実施形態において、二重鎖アクセプターDNAが、ゲノムDNA、直鎖DNA、人工染色体、哺乳動物人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、オルガネラDNAおよび/またはプラスミドを含むエピソームDNAに由来する、本発明に係る方法が提供される。実際に、本発明は、上に開示されたDNAのような任意のタイプのDNAを改変するために適用可能である。本発明は、例えば、標的ヌクレオチド交換が可能なタンパク質、例えば特に、細胞のミスマッチ修復機構において機能性であるタンパク質の存在下において、上記DNAをドナーオリゴヌクレオチドによる改変に供することによって、インビボならびにエキソビボまたはインビトロで行うことができる。細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、エレクトロポレーション、または核もしくは細胞質に送達できる他の従来の手法によって行うことができる。本発明の方法のインビトロ試験は、例えば国際公開第01/87914号、同第03/027265号、同第99/58702号、同第01/92512号に記載されているような無細胞系を用いて行うことができる。上記オリゴヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチド、メチル化されていないヌクレオチドまたはその両方を含み得る。本発明は、その最も広い形態において、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するための多くの目的のために適用可能である。本発明は、細胞を改変するため、野生型への復帰によって変異を修正するため、変異を誘導するため、コード領域の破壊によって酵素を不活性化するため、コード領域を改変することによって酵素の生物活性を変化させるため、コード領域を破壊することによってタンパク質を改変するため、ミスマッチ修復のため、遺伝子変異を含む植物遺伝物質の標的改変のため、標的遺伝子修復のため、および遺伝子ノックアウトのための、本明細書の前述に本質的に記載されたようなオリゴヌクレオチドの使用にも関する。好ましくは、本発明に係る方法は、植物から得られるか、植物に存在するか、または植物に提供される、二重鎖アクセプターDNAの標的改変のための方法である。本発明はさらに、好ましくは、本発明に係る方法において使用され、かつ本明細書中で定義されるような、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくはその両方を、必要に応じて、TNEが可能であるタンパク質とともに備えるキットに関する。特に、上記キットは、本明細書中に記載および請求される方法に従った二重鎖DNAの標的改変のための指示書を備える。その指示書は、本明細書中に記載される本発明に係る方法の工程の説明を本質的に含む。特に、本発明に係るおよび本明細書中に開示されるような二重鎖アクセプターDNAの標的改変のための方法を行うための指示書を備えるキットが提供され、ここで、そのキットは、本明細書中に記載されるような方法において使用するための少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、好ましくは、本明細書中に記載されるような少なくとも2つのオリゴヌクレオチドをさらに備える。したがって、この実施形態において、上記キットは、少なくとも第1および第2オリゴヌクレオチドその各々は独立して、それぞれ第1または第2DNA配列にハイブリダイズできる少なくとも1つのドメインを含み、そのドメインは、それぞれ第1または第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも1つのミスマッチは、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチは、そのオリゴヌクレオチドの3’末端に存在し、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチおよび第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチは各々、異なるヌクレオチドを標的にしており、第1鎖において標的にされているヌクレオチドは、第2鎖において標的にされているヌクレオチドの相補的な位置を占め、例えば、それらのヌクレオチドは、二重鎖DNAにおいて塩基対を形成するを備えてもよく、本発明に係る方法を行うための指示書をさらに備える。当業者が理解するように、上記ミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端または3’末端から1ヌクレオチドまたは3’末端から2ヌクレオチドに位置すること、オリゴヌクレオチドが、二重鎖DNA配列を改変するために使用され得ることを少なくとも通知する指示書を提供することによって、これらの指示書およびオリゴヌクレオチドを備えるそのようなキットは、上に記載されたキットおよび請求されるキットの範囲内のキットとなる。上記キットはまた、例えば、本明細書中に記載および開示されるような本発明の方法に従った二重鎖アクセプターDNAの標的改変、ならびに本発明に係る方法において使用するために適したならびに本明細書中に記載および開示されるようなオリゴヌクレオチドの別個の供給または提供を行うための指示書または情報を提供するウェブサイトまたは文書の形態をとってもよい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドが、第1DNA配列およびその第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列と併用されるとき、第1DNA配列にハイブリダイズできるドメインを含むオリゴヌクレオチドであり、そのドメインが、第1DNA配列に対する少なくとも1つのミスマッチを含むかまたはそのミスマッチに直接隣接し、前記少なくとも1つのミスマッチが、前記オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2、好ましくは最大でも1ヌクレオチドに位置し、最も好ましくは、前記少なくとも1つのミスマッチが、オリゴヌクレオチドの3’末端に存在する、上に記載したような本発明に係るキットが提供される。好ましい実施形態において、第1DNA配列およびその第1DNA配列の相補体である第2DNA配列を含む二重鎖アクセプターDNA配列と併用されるとき、第1オリゴヌクレオチドが、第1DNA配列にハイブリダイズできる少なくとも1つのドメインを含み、その第1オリゴヌクレオチドが、第1DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、その少なくとも1つのミスマッチが、前記第1オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し;第2オリゴヌクレオチドが、第2DNA配列にハイブリダイズできる少なくとも1つのドメインを含み、その第2オリゴヌクレオチドが、第2DNA配列に対して少なくとも1つのミスマッチをさらに含み、その少なくとも1つのミスマッチが、前記第2オリゴヌクレオチドの3’末端から最大でも2ヌクレオチドに位置し;第1オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチが、二重鎖アクセプターDNA配列の第1DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、第2オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのミスマッチが、二重鎖アクセプターDNAの第2DNA配列中のヌクレオチドに対するものであり、前記ヌクレオチドが、二重鎖アクセプターDNAにおける相補的な位置を占める例えば、二重鎖アクセプターDNAにおいて塩基対を形成する、キットが提供される。当業者に理解されるように、好ましい実施形態において、第1オリゴヌクレオチド中のミスマッチおよび第2オリゴヌクレオチド中のミスマッチ各々が、二重鎖DNA中の同じ塩基対における異なるヌクレオチドを対象にしているは、好ましくは、両方のミスマッチが、二重鎖DNAに導入されると、これらは、互いに対して相補的であり、それらが導入される二重鎖DNAにおいて塩基対A-T/C-Gを形成し得るようなものである。実施例1:2つのオリゴヌクレオチドを使用した、タバコプロトプラストにおけるGFPエピソームに対するTNETNEは、オリゴヌクレオチドを細胞に導入することを含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、ゲノムの標的遺伝子座に、そのオリゴヌクレオチド中のミスマッチヌクレオチドによってもたらされる変異を誘導する。下記の実験において、インフレームの終止コドンを含む非機能性の緑色蛍光タンパク質GFPを有するエピソームプラスミドに対してTNEを行うことによって、TNEの正確さおよび効率を測定した。2つのオリゴヌクレオチド各々がGFP中の終止コドンを修復し得るミスマッチヌクレオチドを3’末端に有するをデザインした。上記プラスミドと2つのオリゴヌクレオチドとの同時トランスフェクションによって、GFPの発現および活性が修復されたその修復は、下記の実験において、プロトプラストトランスフェクションの24時間後に単一細胞レベルにおいてスコア付けされた。この第1の実施例では、タバコプロトプラストにおいて行われた実験を説明する。材料および方法構築物機能性のGFPオープンリーディングフレームを合成し、そのコドン使用頻度を、ナス科で使用するために最適化した。図1に示されるように、82位のヌクレオチドを変化させてGからTにGFPのバリアントを作製した。これによって、インフレームの終止コドンが生じ、得られるタンパク質のアミノ酸配列を図2に示す。GFPORFGFPWTおよび終止コドンを有するGFPバリアントGFP-STOPを、植物細胞での遺伝子発現用のCaMV35Sプロモーターを含むpUCベースのベクターのマルチクローニングサイトにXhoI-SacIフラグメントとしてクローニングした。これによって、構築物pKG7381GFP-WTおよびpKG7384GFP-STOPを得た。さらに、GFPを、翻訳によって6×HISタグおよびNLS核局在化シグナル配列に融合することにより、プロトプラスト核へのGFPタンパク質の蓄積が促進され、ゆえに、本発明者らのGFP陽性細胞のスコア付け能力が改善された。これらの構築物を図3に示す。オリゴヌクレオチド上記GFP遺伝子中の終止コドンを修復するオリゴヌクレオチドを表1に示す。表1.本研究において使用されたオリゴヌクレオチド。ODM3およびODM4におけるミスマッチヌクレオチドに下線が引かれている。アスタリスクは、ホスホロチオエートPS結合を表している。オリゴヌクレオチドの向きは、センスGFPコード配列と同一またはアンチセンスGFPコード配列に相補的として与えられている。すべてのオリゴヌクレオチドは、5’-3’方向で示されている。タバコプロトプラストの単離およびトランスフェクションこの実施例の原材料は、25/20°C昼/夜の温度および80μE.m-2.s-1の光子束密度16/24hの明期でガラスジャー750ml内のMS20培地中で無菌的に生育されたタバコのインビトロシュート培養物だった。MS20培地は、2w/vスクロースおよび0.8Difco寒天を含むがホルモン無添加の基本的なMurashige-Skoog培地Murashige,T.andSkoog,F.,PhysiologiaPlantarum,15:473-497,1962である。上記シュートを3週間毎に新鮮培地に継代した。葉肉プロトプラストを単離するために、3~6週齢のシュート培養物の完全に展開した葉を採取した。その葉を1mmの薄片にスライスし、次いでそれを、室温にて30分間の原形質分離前処理preplasmolysistreatmentのために、45mlのMDE基本培地を含む大きな100mm×100mmペトリ皿に移した。MDE基本培地は、900mlという総体積中に0.25gのKCl、1.0gのMgSO4.7H2O、0.136gのKH2PO4、2.5gのポリビニルピロリドンMW10,000、6mgのナフタレン酢酸および2mgの6-ベンジルアミノプリンを含んだ。その溶液の重量オスモル濃度をソルビトールで600mOsm.kg-1に調整し、pHを5.7にした。原形質分離前処理の後、5mlの酵素原液を各ペトリ皿に加えた。その酵素原液は、100mlあたり750mgのCellulaseOnozukaR10、500mgのドリセラーゼおよび250mgのマセロザイムR10からなりDuchefaB.V.,Haarlem,TheNetherlands、例えば、製品C8001およびM8002、Whatman紙で濾過して濾過滅菌した。上記ペトリ皿を密閉し、動かさずに25°Cの暗所において一晩インキュベートすることにより、細胞壁を消化した。次いで、プロトプラスト懸濁液を500μmおよび100μmの篩に通して250mlエルレンマイヤーフラスコに入れ、等体積のKCl洗浄培地と混合し、50mlチューブにおいて85×gで10分間遠心分離した。KCl洗浄培地は、1リットルあたり2.0gのCaCl2.2H2Oおよび重量オスモル濃度を540mOsm.kg-1にするのに十分な量のKClからなるものだった。遠心分離工程を2回繰り返し、1回目は、通常の半分の濃度のMS培地の多量養素Murashige,T.andSkoog,F.,PhysiologiaPlantarum,15:473-497,1962、1リットルあたり2.2gのCaCl2.2H2Oおよび重量オスモル濃度を540mOsm.kg-1にする量のマンニトールであるMLm洗浄培地にプロトプラストを再懸濁し、最後は、マンニトールをスクロースで置き換えたMLm培地であるMLs培地にプロトプラストを再懸濁した。プロトプラストを、スクロース培地中の浮遊相floatingbandから回収し、等体積のKCl洗浄培地に再懸濁した。血球計算器を用いて密度を測定した。続いて、プロトプラストを、再度、10mlガラス管において、85×gで5分間遠心分離し、ペレットを、エレクトロポレーション培地に1×105プロトプラストml-1という密度で再懸濁した。プロトプラストのエレクトロポレーションBioRadGenePulser装置をエレクトロポレーションのために使用した。エレクトロポレーション培地としてPHBS10mMHepes,pH7.2;0.2Mマンニトール、150mMNaCl;5mMCaCl2およびエレクトロポレーション混合物において約1×106/mlのプロトプラスト密度を使用し、エレクトロポレーションの設定は、250V625Vcm-1の電荷および800μFのキャパシタンスとし、パルスと培養との間の回復時間は10分間とした。各エレクトロポレーションにおいて、800マイクロリットルのエレクトロポレーションにつき、約2μgの総オリゴヌクレオチドおよび20μgのKG7381またはKG7384を使用した。エレクトロポレーション処理後、プロトプラストを30分間氷上に置いて回復させ、次いで、1×105プロトプラストml-1という密度でT0培養液に再懸濁し、21°Cの暗所において一晩インキュベートした。T0培養液は、950mgのKNO3、825mgのNH4NO3、220mgのCaCl2.2H2O、185mgのMgSO4.7H2O、85mgのKH2PO4、27.85mgのFeSO4.7H2O、37.25mgのNa2EDTA.2H2O、Heller培地のとおりの微量養素Heller,R.,AnnSciNatBotBiolVeg14:1-223,1953、Morel-Wetmore培地Morel,G.andR.H.Wetmore,Amer.J.Bot.38:138-40,1951のとおりのビタミン、2w/vスクロース、3mgのナフタレン酢酸、1mgの6-ベンジルアミノプリン、および重量オスモル濃度を540mOsm.kg-1にする量のマンニトールを含んだ1リットルあたり,pH5.7。エレクトロポレーションの20時間後に、核内のGFPシグナルを可視化するUV顕微鏡下でプロトプラストを検鏡した。あるいは、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドDNAをタバコプロトプラストに導入するためにPEG処理を用いることもできる。これを行う方法は、文献において周知である。結果構築物KG7381GFP-WTをタバコプロトプラストにエレクトロポレートしたとき、インキュベーションのおよそ20時間後に、核に位置する強いGFPシグナルが観察された。このシグナルは、GFPORFの強い一過性の発現に起因するものである。このシグナルは、おそらく細胞からのプラスミドDNAの分解/排出に起因して、48時間以内に消失した。代表的な実験では、およそ30のプロトプラストが、GFPシグナルを示し、これが、最大のエレクトロポレーション効率である。KG7384GFP-STOPをタバコプロトプラストに導入したときは、GFPシグナルは観察されなかった。いったん実験の設定が実証されたら、上に記載したオリゴヌクレオチドとともにKG7384をタバコプロトプラストに導入する実験を行った。24時間後にGFPシグナルをスコア付けし、結果を表2に示す。表2.エピソームGFPの修復修復効率を、蛍光によってスコア付けされた、GFP発現が修復された細胞のパーセンテージとして算出した。3’末端にミスマッチを欠くオリゴヌクレオチドODM1およびODM2を、別々に処理1および2または同時に処理5加えたとき、GFP活性の回復は観察されなかった。対照的に、3’末端に単一のミスマッチを有するオリゴヌクレオチドODM3およびODM4を使用したとき処理3および4、GFP発現の回復が観察された。驚いたことに、本発明者らは、ODM3およびODM4が同時に加えられたとき、その修復効率は予想よりも高いことを証明することができた。ゆえに、そのようなアプローチは、TNEの効率を有意に改善するとみられ、より効率的なTNE技術の開発を可能にする。実施例2.TNE効率に対するPS結合の効果この実施例では、本発明に係る第1または第2オリゴヌクレオチドが、例えばホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドを組み込んでいる必要もないし、他の任意のタイプの修飾を組み込んでいる必要もないことが示される。方法トマト葉肉プロトプラストをトマトインビトロ植物の幼葉から単離した。CaMV35Sプロモーターによってその発現が引き起こされるeYFPstop遺伝子図5および6を参照のことを有するレポーター構築物およびオリゴヌクレオチドを、PEG媒介性の方法によってトマトプロトプラストにトランスフェクトした。30°C、暗黒下のグロースチャンバー内で一晩インキュベートした後、YFPフィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて感染プロトプラストを観察した。黄色蛍光を発するプロトプラストの数をスコア付けし、黄色プロトプラストの数をトランスフェクトされたプロトプラストの数で除することによって、TNE効率を算出した。試験されたオリゴヌクレオチドの配列:PB72CATGCATGCATGCATGCATGCATGC配列番号725mer,PS,ナンセンス=ネガティブコントロールPB242TGAGGGTGAAGGTGATGCTACTTAC配列番号825mer,PS,3’MM=ミスマッチセンスPB243GATGAACTTAAGTGTAAGTTTACCG配列番号925mer,PS,3’MMアンチセンスTF7TGAGGGTGAAGGTGATGCTACTTAC配列番号1025mer,3’MMセンスTF8GATGAACTTAAGTGTAAGTTTACCG配列番号1125mer,3’MMアンチセンスは、ホスホロチオエート結合を表している。PB242、PB243、TF7およびTF8によって引き起こされるTNE反応は、標的配列をTAAからTACに変換する。ゆえに、オリゴヌクレオチドPB242、PB243、TF7およびTF8は、YFP中の終止コドンを修復するようにデザインされており、ここで、PB72、PB242およびPB243は、PS結合を含み、TF7およびTF8は、PS結合を含まない。図4に示されるように、PB242PB243は、YFP発現を23超修復することができた;TF7TF8は、YFP発現を3超修復することができ、ナンセンスオリゴヌクレオチドを用いたときに得られたシグナルと比較してほぼ10倍高かった。このように、この実施例は、PS結合のような修飾を含むかまたは含まないオリゴヌクレオチドの使用は、TNEにおいて使用することができることを示す。文献Alexeev,V.andYoon,K.1998.StableandinheritablechangesingenotypeandphenotypeofalbinomelanocytesinducedbyanRNA-DNAoligonucleotide.NatBiotechnol16,1343-6.Beetham,P.R.,Kipp,P.B.,Sawycky,X.L,Arntzen,C.J.andMay,G.D.1999.Atoolforfunctionalplantgenomics:chimericRNA/DNAoligonucleotidescauseinvivogene-specificmutations.ProcNatlAcadSciUSA96,8774-8.Dong,C,Beetham,P.,Vincent,K.andSharp,P.2006.Oligonucleotide-directedgenerepairinwheatusingatransientplasmidgenerepairassaysystem.PlantCellRep25,457-65.Igoucheva,O.,Alexeev,V.andYoon,K.2001.Targetedgenecorrectionbysmallsingle-strandedoligonucleotidesinmammaliancells.GeneTher8,391-9.Kmiec,E.B.2003.Targetedgenerepair-inthearena.JClinInvest112,632-6.Kochevenko,A.andWillmitzer,L.2003.ChimericRNA/DNAoligonucleotide-basedsite-specificmodificationofthetobaccoacetolactatesyntasegene.PlantPhysiol132,174-84.Liu,L.,Cheng,S.,vanBrabant,A.J.andKmiec,E.B.2002.Rad51pandRad54p,butnotRad52p,elevategenerepairinSaccharomycescerevisiaedirectedbymodifiedsingle-strandedoligonucleotidevectors.NucleicAcidsRes30,2742-50.Okuzaki,A.andToriyama,K.2004.ChimericRNA/DNAoligonucleotide-directedgenetargetinginrice.PlantCellRep22,509-12.Parekh-Olmedo,H.,Ferrara,L.,Brachman,E.andKmiec,E.B.2005.Genetherapyprogressandprospects:targetedgenerepair.GeneTher12,639-46.Rice,M.C,Czymmek,K.andKmiec,E.B.2001.Thepotentialofnucleicacidrepairinfunctionalgenomics.NatBiotechnol19,321-6.Ruiter,R.,vandenBrande,I.,Stals,E.,Delaure,S.,Cornelissen,M.andD’Halluin,K.2003.Spontaneousmutationfrequencyinplantsobscurestheeffectofchimeraplasty.PlantMolBiol53,675-89.Zhu,T.,Mettenburg,K.,Peterson,D.J.,Tagliani,L.andBaszczynski,C.L.2000.Engineeringherbicide-resistantmaizeusingchimericRNA/DNAoligonucleotides.NatBiotechnol18,555-8.Zhu,T.,Peterson,D.J.,Tagliani,L.,StClair,G.,Baszczynski,C.L.andBowen,B.1999.TargetedmanipulationofmaizegenesinvivousingchimericRNA/DNAoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA96,8768-73."