"生分解性ポリマーからなる高多孔質固体材料であって、前記材料の微細孔ネットワークは平行で稠密な樹枝状空洞の秩序ある繰り返しを含む高多孔質固体材料。前記生分解性ポリマーはポリLラクチドである、請求項1に記載の材料。前記並行で稠密な樹枝状空洞の主微細孔の整列方向は、前記材料の1つの面から垂直に前記1つの面に対抗する面に伸びる、請求項1に記載の材料。前記樹枝状空洞の前記主微細孔の直径は70±10μmであり、前記樹枝状空洞の側枝の直径は45±5μmであり、前記主微細孔の隣接するもの同士の距離は80±20μmである、請求項3に記載の材料。前記側枝は前記主微細孔の軸に対して45°から70°の角度で前記主微細孔から離れる、請求項4に記載の材料。生分解性ポリマーでできた3D高多孔質固体材料を製造する方法であって、以下のステップiからiiiを設け、前記材料の微細孔ネットワークは平行で稠密な樹枝状空洞の秩序ある繰り返しを有する方法。i生分解性ポリマーを定義された濃度でジオキサン中に溶解する。ii前記生分解性ポリマーが溶解した前記ジオキサン溶液を収容した容器を、冷却ユニットによって10°Cより低い定義された温度に熱的に駆動する金属板の上に搭載し、前記溶液が完全に層分離を起こすまで前記容器を前記金属板上に保持する。iii前記層分離から得られた固体をアルコール水溶液に浸漬してジオキサンを浸出させる。前記容器はポリテトラフルオロエチレンモールドである、請求項6に記載の方法。前記容器の形状は円筒状である、請求項6に記載の方法。前記生分解性ポリマーはポリLラクチドである、請求項6に記載の方法。ステップiにおけるポリLラクチドの濃度は2wtから15wtの間である、請求項9に記載の方法。前記定義された温度は-20から-80°Cの間の一定の温度である、請求項6に記載の方法。前記容器の底部は熱勾配が前記底部から垂直に前記溶液に対して付与されるように冷却される、請求項6に記載の方法。以下のaからfのステップを設け、細胞を請求項1による材料で作られた足場中に播種する真空支援方法。a前記足場を第1のシリンジ中に置く。b前記足場に真空処理を適用して、前記空洞中に捉えられた空気を細胞不含有培地で置換する。c前記細胞不含有培地で満たされた前記足場を第2のシリンジ中に置く。d前記第2のシリンジ中に置かれた前記足場に真空処理を適用して、前記細胞不含有培地を新鮮な細胞含有媒体で置換する。e前記細胞含有媒体を含む前記足場を新鮮な培地で覆った状態で培養ウエル中に置く。f前記培養ウエルに入った前記足場を培養器中に保持する。前記第1のシリンジと前記第2のシリンジの少なくとも一方はプラスチック製である、請求項13に記載の方法。前記足場は前記第1のシリンジと前記第2のシリンジの少なくとも一方の中でPTFEリングによって固定される、請求項13に記載の方法。以下のステップaからeにより、請求項1に記載の材料で作られた3D足場から、生分解性ポリマーで作られ平行で稠密な樹枝状空洞の秩序のある繰り返しによって構成された微細孔ネットワークを有する2D高多孔質固体材料を製造する方法であって、前記微細孔ネットワークは前記3D足場を予め定められた面に沿って切断したとき前記樹枝状空洞が魚骨状構造として断面上に出現するように編成されている。a真空処理を使用して前記3D足場に特定の物質を埋め込む。b前記埋め込みが行われた足場を凍結させる。c前記凍結した足場を低温保持装置のチャックに適切な向きで取り付ける。d低温保持装置マイクロトームを用いて選択された足場セクションに沿って巧妙に切断する。e前記3D足場を前記予め定められた面に平行にスライスする。前記物質は超純水に溶解したサッカロースである、請求項16に記載の方法。前記サッカロースのH2O中の濃度は1から40の範囲である、請求項17に記載の方法。前記物質は超純水中に溶解した牛由来のゼラチンである、請求項16に記載の方法。前記牛由来のゼラチンのH2O中の濃度は1から40の範囲である、請求項19に記載の方法。前記物質はPBS中に溶解した牛由来のゼラチンである、請求項16に記載の方法。前記牛由来ゼラチン溶液はPBS中の0.1から30の濃度で使用される、請求項21に記載の方法。本発明の課題は、ポリ乳酸のような生分解性ポリマーで作られ、細胞培養に好適に使用することができる高多孔質足場を提供することである。本発明の他の課題は、上述の高多孔質足場を製造する方法を提供することである。本発明の他の課題は、上述の3D高多孔質足場内に一様に細胞を播種する方法を提供することである。本発明の他の課題は、厚手組織再構成のための構成要素として使用する平面状多孔質2D足場を上述の高多孔質足場から出発して得る、トップダウン式の処理方法を提供することである。これらの考察に従って、我々は、方向性熱誘起相分離法dTIPS、directionalthermallyinducedphaseseparationを使用して再現可能な態様で特定の形態の足場作製のための手順を打ち立てた。挙げられた一連の条件によれば、血管への適合性とともに拡散現象をもっとよく支援し、従って血管新生促進を容易にする多孔質構成を構築する。すなわち、本発明は生分解性ポリマーでできた高多孔質固体材料つまり足場を提供し、その微細孔ネットワークは平行で稠密な樹枝状の空洞が秩序だって繰り返されるところに特徴を有する。本発明はまた生分解性ポリマーでできた高多孔質固体材料すなわち足場の製造方法を提供し、その微細孔ネットワークは平行で稠密な樹枝状の空洞が秩序だって繰り返されるところに特徴を有する。本方法は以下のステップを含む。i生分解性ポリマーを所定濃度でジオキサンに溶解する生分解性ポリマー溶解ステップ。ii上記の溶液を含む容器を冷却ユニットコールドフィンガーによって-10°C未満の所定温度にするように熱的に駆動された金属板上に取り付け、次に上記溶液が完全な相分離を起こすまで上記容器を上記板の上に保持する。言い換えれば、ジオキサンがポリマーから分離して溶液に印加された冷却の方向に沿って平行な稠密に充填された樹枝状形に秩序だって、すなわち規則的に凍結する。それと同時に、溶解されていた生分解性ポリマーは排除されてジオキサンの樹枝状結晶の周囲で凝固する方向性熱誘起相分離ステップ。及びiiiこのようにして得られた固形物をアルコール水溶液に浸漬してジオキサンを浸出させるジオキサン除去ステップ。本発明はまた、3D足場の即時でかつ深い細胞定着ができるようにする新規な真空支援細胞播種方法を提供する。本方法は本発明の構造物に合わせて開発され、この多孔質足場が屈曲度が低いことと物質移送量が大きいことを利用している。本方法は以下のステップを含む。i足場をシリンジ中に置き、多孔質空洞中に捉えられている空気を細胞が含まれていない細胞培地で置換する目的で、予備的に真空処理を受けさせる。実際、捉えられている空気は足場体積全体の奥深くへの一様な細胞浸潤を妨げることがある。ii細胞培地で満たされた足場を別のシリンジ中に置き、細胞が含まれない細胞培地を新鮮な細胞が入った媒体で置き換える目的で、真空処理を受けさせる。iii細胞が入った媒体を含む足場を培養ウエル中に置き、新鮮な媒体で覆って培養器中に保持する。これに加えて、本発明はまた、精密に配向された微細孔形状を有する生分解性ポリマーの2D平面状多孔質足場を、本発明の3DdTIPS足場から出発して得るトップダウン式の方法を提供する。本方法では3D足場に特定の作用物質を取り込ませ、低温保持装置cryostatによってスマートカット、すなわち巧妙に切断する必要がある。薄い切片を作成したら、これらに細胞を培養し、積層して3D組織を作り上げるボトムアップ法。2D多孔質足場を3DのdTIPS足場から得る方法は以下のステップを含む。i足場をシリンジ中に置き、多孔質空洞中に捉えられている空気を適切な生体適合性及び生体吸収性のある埋込み物質biocompatiblebioresorbableembeddingagentで置換する目的で、真空処理を受けさせる。この埋込み物質は細胞の付着力及び/または増殖性を向上させ、及び/または細胞分化を引き起こし、及び/または細胞培養に有益な効果を引き起こすために使用されるものの内から選択される。ii埋込み物質で満たされた足場を低温にさらして、埋込み物質を凝固させる。iii埋込みが行われた足場を低温保持装置に搭載してチャネルの向きに平行な方向に沿ってスライスすることで、向きを精密に制御した切片を作製する。その上、これによってできた2D足場は、細胞の付着力及び/または増殖を向上させ、及び/または細胞分化を引き起こし、及び/または細胞培養に有益な効果を引き起こす埋込み物質によって既にコーティングされている。本発明の高多孔質生分解性固体材料つまり足場は、平行で稠密に充填された樹枝状の空洞の秩序だった繰り返しによって特徴付けられる、血管パターンに類似した新規な形態微細孔/チャネルネットワークを有する。この材料は血管網及び血管形成を目指す用途に役立つ人工足場として期待される。これらの足場のために特に開発された独自な播種方法により、この構造物での細胞コロニー形成cellcolonizationが即座に且つ効率的にできるようになる。これは別の形態で組織化された多孔性を有する足場では達成不能である。本発明により作成された足場は血管ネットワーク及び血管形成を目的とする用途に役立つものと期待される。本発明の製造方法及び生物学的方法によれば、上述の高多孔質生分解性足場を簡単に作製し、また体外での培養を成功裏に行うことができる。先ず、本発明の高多孔質固体材料つまり足場の製造方法を説明する。ここで、高多孔質固体材料とは、以下で実施例中で説明される空孔率測定によって定められる全空孔率totalporosityが80~99より好ましくは88~96である固体材料を意味する。上述したように、本製造方法は以下のステップi~iiiを含む。i生分解性ポリマーを溶解するステップ、ii方向性熱誘起相分離のステップ、及びiiiジオキサンを除去するステップ。作製用装置については、冷却ユニット、油浴、熱駆動金属板、及び溶液容器を使用する。図1左側はこの作製用装置の概略断面図を示し、図1右側は冷却ユニットであるコールドフィンガーcoldfingerの全体図を示す。ここにおいて、溶液の容器として、好ましくはポリテトラフルオロエチレンモールドを使用するのが好ましい。それはポリテトラフルオロエチレンがここにおけるプロセスに関わる溶媒に対して不活性でありまたここで扱う温度範囲内で熱伝導率が低い2.700×10-3W/cmKためである。この低熱伝導率により、熱流はアルミニウム冷却板に直接接触しているモールドの底部に概ね局在化され、またモールドの側壁においては最小化される。このようにして、ジオキサンの凝固は溶液内で垂直方向にすなわち、底から上面へ起こり、また横方向の成分は無視できるように仕向けられる。溶液を収容する容器は原則として任意の形を取るように作製することができる。その形状は立方体状、円筒状などから選択することができる。しかしながら、円筒タイプの形状は稜線や隅部例えば立方体形状のモールドがないために好適である。稜線や隅部のある場合には境界効果が起こって結晶の成長と形状に影響を与え、秩序だった構成を変更しかねない。更に、円筒状の容器は作製しやすい。容器のサイズは、目的に応じて広い範囲のうちから選択することができる。この作業での典型的なサイズは容器の断面積で表せば約20cm2から約50cm2直径で約5cmから約8cmに相当の範囲であった。溶液の全体積に対する容器壁における境界効果が顕著になりえるため、これより小さいサイズの容器は好ましくない。他方、より大きな容器を使用すると同じ足場厚を得るためにより多くのポリマーを使用する必要があり、実験費用が高くなる。更に、熱流が関わる面積が増大するにつれて、溶液全体にわたる熱的条件が不均一になる可能性もまた増大する。足場を作製するための原料であるポリマー材料としては、生分解性で熱可塑性の脂肪族ポリエステル及びその共重合体を使用することができる。これらの脂肪族ポリエステルポリマーとしてはたとえばポリラクチドPLA、polylactideの自然に現れる光学異性体であるポリLラクチドPLLA、poly、及び2つのPLA異性体D-ラクチドDlactideとL-ラクチドLlactideの合成ポリマーブレンドsyntheticblendであるポリD,L-ラクチドPDLA、polyがある。脂肪族ポリエステル共重合体としては、ラクチドとグリコリドとのモル比が50:50から90:10まで変化し得るたとえばPLGA65:35ポリDL-ラクチドコグリコリドPLGA、poly、ラクチドのモル比が60から80まで変化し得るポリL-ラクチド-コグリコリド-コカプロラクトンPLGC、poly及びラクチドのモル比が30から90まで変化し得るポリDLラクチド-コカプロラクトンpolyがある。これらのうちで、もっとも好適にはPLLAを使用することができる。軟組織と硬組織の補修については、PLLAは常に最も広く利用されてきた生体材料のひとつであり続けてきた非特許文献6~9。細胞系への親和性が高く、また化学的機械的な安定性が高いことにより、PLLAは現在FDAが承認したいくつかの生物医学及び食品サービス用途に使用されている非特許文献9。生体内、自然環境中及び堆肥中でのPLLAの生分解速度はよく知られており、またその分子量あるいは化学組成を変更することで調整可能である。最後に、高分子量PLLAは通常の温度では菌類、かびmoldあるいは他の微生物の影響をめったに受けない。PLGA及びPLGCと比較してPLLAの方がかなり固く、分解及び吸収過程がより遅く、またより強い炎症性反応を伴う。しかし、足場は生物学的環境においても細胞の付着力を高めるために高度に疎水性でありまた機械的に自己支持性を持つ必要があるので、下の実施例では一般にPLGAやPLGCではなくPLLAを選んだ。この選択はPLLAがPLGAやPLGCよりも大幅に低価格であることからも正当化される。ジオキサンつまり溶媒としては、1,4-ジオキサン、1,3-ジオキサン、あるいは1,2-ジオキサンを使用することができる。その中でも、好適には1,4-ジオキサン融点11.8°Cを使用することができる。それは、1,4-ジオキサンがその凝固温度より低い温度で好ましい結晶形を取り、またその後、PLLAつまり生分解性ポリマーが失われたりあるいは構築されたPLLA構造を何ら改変することなくアルコール水溶液によって簡単に除去できるからである。PLLAを生分解性ポリマーとして使用し、また1,4-ジオキサンを溶媒として使用するとき、PLLAの濃度を2wtから15wtの範囲で選択することができる。しかしながら、細胞培養体に適用可能な所望の高多孔質固体材料つまり足場を得るためには、4wtから7wtの範囲内のPLLA濃度が好ましい。ステップii方向性熱誘起相分離のステップにおいて、定義された低温の温度としては、好ましくは-20°Cと-80°Cの間の一定の温度を使用することができる。この温度条件を選ぶことで、底から上面への方向性熱誘起がもたらされる。その結果、溶解していたジオキサンが、方向性熱誘起相分離によって、平行で稠密に充填された樹枝状形状の繰り返し秩序で凍結し、その後、溶解していた生分解性ポリマーが凝固する。ステップiiの後、得られた固体をアルコール/水溶液に浸漬してジオキサンを浸出させるつまり除去する。アルコールとしては、エタノールあるいはメタノールが使用でき、その濃度は好ましくは50wtから90wtの範囲である。このようにして、所望の高多孔質固体材料つまり足場を得ることができる。得られた材料つまり足場の主微細孔つまり主チャネル/孔の方向は、一般には底面から上面へ垂直である。ここで、樹枝状空洞の主微細孔の直径は好ましくは70±10μmであり、その側枝の直径は好ましくは45±5μmである。隣接する主微細孔間の距離は好ましくは80±20μmである。側枝は一般に主微細孔軸に対して45°から70°の角度で主微細孔から離れていく。[形態的に新規な高多孔質固定材料が得られる理由]熱勾配が図1に示すように垂直方向のみに現れるようにすることにより、ジオキサン結晶の稠密に充填された垂直アレイが形成される図3は、モールドの底から凍結させることにより得られたジオキサンの単一の樹枝状固体の概略表現を示す。サンプル生分解性ポリマーを溶解したジオキサン溶液がたとえば-40°Cで熱平衡に達した後、ジオキサン結晶をたとえば-18°CのEtOH/H2O浴中で溶解し、ポリマーマトリクス中にその跡を残す。この処理は信頼性が高くまた再現性がある。その結果得られる多孔質の物質は、長い距離に渡って秩序だった階層構造を持つという特徴を有する。低温保持装置による2DdTIPS支持体の製造については、生体適合性、生分解性がある埋込み物質として超純水ベースあるいはPBSベースの溶液を使用した。この溶液に以下の成分のうちのひとつまたは複数のものを溶解した:ヘパラン硫酸heparansulfate、ケラタン硫酸keratansulfate、コンドロイチン硫酸chondroitinsulfateのようなプロテオグリカンproteoglycan及びヒアルロン酸hyaluronicacidのような非プロテオグリカンnonproteoglycanを含むグリコサミノグリカンGAG、glycosaminoglycan;サッカロースsucrose等のような二糖類;フィブロネクチンfibronectin、コラーゲン、エラスチンelastin、ラミニンlamininのようなたんぱく質からなる細胞外基質、その他、牛由来、豚由来あるいは魚由来のゼラチン;最後にポリL-リジンpolyllysine溶液が使用できる。上述の各成分の濃度は個々の成分の水への溶解度に依存して0.1から40の範囲にある。[実施例1]1足場合成市販のPLLAMwa=100,000~150,000、アメリカ合衆国Aldrich社製を6.4wtの固定された濃度で1,4-ジオキサンアメリカ合衆国Aldrich社製に溶解した。この溶液10mlを円形のポリテトラフルオロエチレンモールド内径45mm、内側の深さ30mmに流し込み、この溶液の入ったモールドを図1に示すコールドフィンガー、つまり熱的に駆動され-40°Cに設定されるこの温度は足場中に出来上がるチャネルサイズが細胞を収容するのに十分な大きさであるものとするAl板に取り付け、かくして熱勾配を所定方向で底から溶液の自由表面の上面へ垂直方向に10時間-40°Cで熱平衡に達するのに十分な時間印加した。凝固後、サンプルをエタノールの80wt水溶液100ml中に浸漬して溶媒つまり1,4-ジオキサンを浸出させた。ジオキサンの除去プロセスに影響する唯一のパラメータは80wtエタノール浴の温度であるが、除去の温度がたとえば室温のように高すぎると、ジオキサンの溶解とともに局所的なポリマーの再溶解が起ってすでに形成されている足場構造が失われてしまうことがある。足場の形状を維持しながら一方ではプロセスが過度に遅くなるのを回避するため、除去温度は先ず2日間-18度に設定し、次いで徐々に室温にもっていった。最後に、足場を室温で5時間真空乾燥することによりエタノール溶液を除去した。作製したそのままの構造物を、多形穴あけポンチで直径14mmの円形サンプルに切り抜き、使用するまでデシケータに保管した。2評価図2は得られた足場の形態のSEM像を示す。図2aの断面図から考察を開始するに、直径が約20μmの直線状で平行なチャネルのアレイ図2aの差込み図が足場の厚さ全体に渡って伸びているのを見て取ることができる。各チャネルには同程度の直径のチューブ状の側枝が見えるが、これらの側枝はチャネルの長手方向に渡ってチャネル全体からチャネル軸に対して約45°から70°で伸びる。その結果、観測される断面は、図示するように、典型的な多数の魚骨状微細孔構成を呈する。図2における孔は上面図2b及び図2c及び裏面図2d表面のチャネル末端に対応する。見てわかるように、図4cの中央付近に示されている寸法d及びDが付されている空所であるチャネルセクションは、三つの柱を持つthreepoled、魚のエイのような形をしたセクションで特徴付けられる。微細孔は同心状の列の形に構成されており、これにより、典型的な表面繊維状テクスチャー図2bが与えられる。すなわち、図4aに概略を示すように積み重ねられまた図2b中の足場表面上に右上から左下の方向に伸びる線として出現する樹枝状の面平面状繊維によって、足場表面上にこの繊維状テクスチャーが作られる。この意味で、各面が表面上の繊維に対応している。この特異な構成はひとえにモールド内壁によって与えられる円対称性の結果であり、これが溶媒の異方性核生成のきっかけを与える原因である。全体の構造は、密に接触した平行で平面的な繊維の積み重なったものであって、そのおのおのは相互に侵入する樹枝状ユニットのアレイであると考えられる図4a。単一の微細孔ユニットは、図4bのSEM像で証明され、図4cの簡略化されたモデルにより図式的に示されているように、いくつかのポリマー製薄板状の層の重ね合わせ図4cでは3層であり、その総計は足場の厚さに依存する。微細孔ユニットの各セクションは、魚のエイ状に区分された中央チャネルから広がる3枚の主薄層で構成されている。これらの薄層のうちの2枚はエイの翼部から列方向y方向に伸びて、最初に隣接する微細孔ユニットに向かうが、一方、3枚目の薄層一般には短い方の薄層はエイの尾から放射方向x方向に広がる。図4cに言及すれば、パラメータdとDはそれぞれチャネルセクションの小柱エイの尾の直径とチャネルの断面の最大寸法エイの両翼の形をした開口部分の寸法として定義される。図2aに見える斜めの側部チャネルは2枚の垂直方向zに隣接した層間の隙間に対応する。この間隙は約20μmであり、従ってdと同程度であるが、はっきりした層屈曲がある場合には15~18ミクロンに減少し得る。しかしながら、樹枝状ユニットの側枝に沿って細胞を収容するために利用できる実効スペースは約50μmであり、側方層の図4cに示すx方向の長さに対応する。dTIPSサンプルの断面を観察することにより、μmスケールにおいて足場断裂はエイの尾の首部に対応して起こり、それにより尾の部分のチャネルを切断面にはっきりと晒す傾向があることがわかる。尾の部分のチャネルの直径はdに対応し、また簡単に測定できる。尾の部分のチャネルは非方向性のサンプルでも観測できる。それは断裂の前線は秩序正しく並べられたドメインを通って順次進行するからである。この理由により、直径dは微小孔サイズの冷却温度への依存性を確立する制御パラメータであると考えられた。その値はSEM写真の目視解析によって測定した値のサンプル毎の平均によって決定した。しかしながら、常にdの約3倍大きい主チャネル開口Dは細胞収容の評価について考慮しなければならない有効なパラメータであることを注意しておく必要がある。表1はdTIPS足場について観測された空孔率及び平均微小孔サイズを、比較の目的でTIPS足場についての値とともに示す。dTIPSにより作製されたものは同一の相分離温度において等方性熱処理によってできたものと同じ微小孔サイズを持つことがわかり、微小孔サイズが厳密に熱条件に依存することが確認された。足場の厚さは、使用された溶液の体積によって、600μmから1mmを超える範囲に及ぶ。方向性TIPSにより-40°Cで作製された足場の場合に観察された全空孔率及び相互接続空孔率夫々93及び91の両者は同一の温度で行われた等方性TIPSについてのこれらの値よりも大きく、他方では-80°Cで作製されたTIPSサンプルについて測定されたこれらの値とでは、大きな温度差にもかかわらず同等であることがわかる。この知見、更にはdTIPSサンプルが示した高度の微小孔相互接続性は、その秩序だった構成に関連するはずであり、また考察しているこれらの体系について溶媒成形の背後にある異なる機構を考慮することにより、説明することができる。非方向性の等方性TIPSの場合は、PLLA溶液は非協調的なジオキサン結晶形成を被る。これにより、短距離の秩序化/充填が起こり、この秩序化/充填は排除されたポリマーが集積する非晶質の遷移領域で相互接続されたランダムな向きの領域で終わる。これにより、非相互接続的溶媒相noncocontinuoussolventphaseがもたらされて、結局、ジオキサンの溶解後には閉鎖孔が残る。他方、dTIPSにおける単一軸熱勾配により与えられる整列効果は、結晶化密度を最大化し、従って空隙量を最大化する作用を持つ。更に、凝固の進行につれて、色々な晶子crystalliteからの分岐は最終的に互いに貫通しあって、ジオキサンの除去後に高度に相互接続された何も入っていない空間が残る。[実施例2]1dTIPS3D足場での細胞深部播種及び細胞培養別様に明示しない限り、全ての生物学的検証試験はdTIPSにより-40°Cで作製されたPLLA足場について実行した。細胞播種前に、足場の体積中で一様な細胞培養ができるように、多孔質の空洞中に捉えられた空気を細胞の入っていない培地で置換することを意図して、足場を予備的な真空処理にかける。直径が14mmの丸い足場をEtOH洗浄し、真空乾燥し、更に各面当り5分間の紫外線殺菌を行った。次に、各サンプルを円柱状のサンプルと同じ直径を有する10mLのプラスチックシリンジに入れ、図5aに示すように、ポリテトラフルオロエチレンPTFEシリンダーで底部に固定した。次に、シリンジを培地が入っているペトリ皿図示せずに部分的に浸漬し、図5bと図5cに示すように、吸入とそれに続く空気排出を繰り返すことで、ここから培地を強制的に足場多孔質に通す。この処置の終了時点では、足場が培地中に沈むのが観察された。培地で満たされた足場をプラスチック皿に移し変え、新鮮な培地で被い、培養器中で24時間38°Cで平衡状態にしておいた。初回と類似した第2の吸入/排出サイクルにより、培地を8.0×104個/mLの濃度で細胞が入った新しい血清で置換した。これにより、図5aと図5cに示すように、細胞を足場中深く分散させた。播種された構造物をそっとシリンジから取り外して24ウエル培養皿へ移送し、培養器中で37°C、5CO2で、付着スクリーニングの目的で18時間、あるいは増殖評価のために培地を1週間に2回交換しながら14日間まで保持した。2検証図6は細胞培養前図6a及び18時間の骨髄由来細胞MSC培養後図6bの約1mm厚の事前処理した足場の断面図である。これらの像はヘマトキシリン/エオジン細胞染色後に得られたものである。断面は足場をその直径に沿ってそっと裂くことによって得られた。次いで、鋭い刃を使って露出している表面の厚さを500~800μmまで減らして、光がこの構造を透過し細胞が定着した裂け目表面を観察できるようにした。図6aに示すように、真空駆動による浸水処理vacuumforcedfloodingtreatmentは足場微細孔構造を変更も破壊もしなかった。それどころか、この処理により媒体がすでに充満した足場を得ることができるようになった。これは支持体内部に細胞を円滑に収容するのを促進するという利点がある。これらの条件の下で、細胞はこの多孔質足場内のアクセス可能なあらゆる地点に速やかに到達できることが期待される。それは、細胞が足場厚さ全体にわたって同一の媒体を通って移動できるからであって、侵入中に未処理のPLLA疎水性表面への優先的付着を起こすのではないからである。上述のように、細胞播種は真空下で行った。この細胞播種の結果を図6bに示す。細胞は樹枝状経路に沿って移動してサンプル約1mm厚の内部に顕著にコロニーを形成した。これらの知見により以下のことが確認できた。i真空ベース播種方法の有効性、ii足場と細胞のいずれにも損傷がないこと、及びiii1mmまでもの足場厚さ全体への細胞拡散ができるようにするための相互接続された微細孔の有効性。細胞は軸微細孔から直接、あるいは横方向の枝を滑っていくことで、足場の内部へアクセスできる。3ここで開発された真空支援深部播種方法のメカニズム以前述べたように、ここで提案した播種方法は本発明のdTIPS足場のために特に作ったものである。実際、本方法は曲がりくねっておらずまた多孔質全体を通した高度の質量輸送で特徴付けられる本足場に特有の形状を利用している。しかしながら、図7に概略的に示すように、微細孔の魚骨構造の向きが与えられたとき、底面から行うかそれとも上面から行うかで、浸潤プロセスは大いに異なって行われ得る。細胞が上面側から足場内に押し込まれると、表面終端薄層は多重じょうご状構造のように動作し、その作用は図7a及び図7bに示すように、細胞の流れを主に垂直のチャネルに運ぶことである。図7に示すように、細胞を底面側から浸潤させると、逆じょうご構成により、背骨チャネルから側枝への細胞移動が促進され、本構造内でのいっそう一様な細胞分布がもたらされる。それゆえ、均等細胞分布を改善するため、上述の浸水処理ステップの間と細胞播種ステップの間の両方において、上述の背面をシリンジ入口に隣接させて足場を配置した。[実施例3]12DdTIPS足場のスマートカット作成すでに述べたように、本発明はまた、これまで得ることができなかった、向きを持った樹枝状多孔性を有する、平面状の薄い20~70μm足場をdTIPSによって製造する方法を与える。この方法は3DdTIPS足場から出発するトップダウン式の手法である。薄い2D足場は以下のようにして得られた。3DdTIPS足場をプラスチックのシリンジ中に置き、PTFEリングを使って固定した。30サッカロース/PBS溶液を準備して15mLのプラスチックチューブ中に入れ、埋込み溶液として使用した。あるいは、2の牛由来ゼラチン入りH2Oを0.1PBS中に溶解したものを埋め込み物質として使用した。あるいは、実施例2の2検証の最初の段落に記載されている物質及び濃度を使用して、他の埋め込み溶液を作成することもできる。6mLの埋め込み物質をシリンジ中に吸入して足場を通して流れるようにした。埋込み溶液を排出し、6mLを新たにまた吸入した。シリンジ出口を封止し、シリンジピストンを往復させることで足場埋込み物質に強い真空処理を与えた。足場体積の90よりも多くの部分が溶液中に沈んだ段階でこのプロセスを完了した。この埋込み足場を適切な向きで金属製のひしゃく上に載せて、ヘキサンとドライアイスが入っているデュワー瓶中に浸した。凍結したサンプルをOCT最適切断温度optimalcuttingtemperature化合物で被い、凝固したままにした。OCT中の埋込み足場を凍結浴から取り出して、-20~-30°Cの範囲の温度で低温保持器チャックに搭載した。低温保持器チャック上での足場の向きの選択には特別な注意を払わなければならない。この足場は、魚骨状断面の向きを切断面に平行にするようにマウントされる。この場合、60μm厚の薄いポリマースライスを作成することができ、各スライスは図4aに示す単一の樹枝状面に対応している。切断された薄いセクションをカバーガラスを使用して集め、使用するまで-80°Cで保存した。22D足場の細胞播種及び細胞培養2D足場を載せたガラスカバーを各面当り5分間紫外線で消毒してプラスチック皿に移動した。8.0×104個/mLの濃度で細胞が入った血清40μLを液滴が足場外に広がらないように1枚の足場上に滴下した。プラスチック皿を培養器に30分間入れて細胞が付着するようにし、その後、足場を新鮮な培地で覆い、37°Cで5のCO2の下で培養した。2D足場上にコンフルエントな原組織confluentprototissueが検出された後、培養された足場を鉗子を使ってそっと持ち上げて1枚ずつ積み上げ、細胞層とバイオポリマーが交互に重なったものでできた3Dの厚い組織を構成する。播種された構造物を細胞染色して免疫蛍光顕微鏡immunofluorescencemicroscopyにより解析した。検査時点は、付着スクリーニング目的で24時間、あるいは培地を1週間に2回交換しながら増殖評価に14日までであった。3検証図8a及び図8bは、サッカロース溶液で覆われた、細胞播種前の薄いdTIPS2D足場を、それぞれ高倍率及び低倍率の光学顕微鏡写真で示す。特有の秩序ある樹枝状構造が材料処理の間保持されていて、スマートカットによるスライスの有効性及び再現性を示しているのを見て取ることができる。図8cは6DIVインビトロ日数、daysinvitro後のMSCによる2D足場への定着を示す。この像は蛍光モードで撮ったものであり、被覆された足場上への大規模で明確な細胞付着と成長を明らかにしている。この証拠は作成された材料が有毒でないことだけでなく、細胞培養を持続可能な態様で効率的に支援できることを証明している。最後に、図8dは二層のdTIPS足場、つまり前もってMSCを使って15DIV培養した2枚の60μm厚セクションの重畳物上のコンフルエントな原組織の構成を示す。この像はDAPIを使った核染色を行って蛍光モードで得られたものである。上記実施例に使用した装置と方法は以下の通りである。a冷却装置冷却ユニットとして、コールドフィンガーcoldfingerJulaboFT109、イタリアを使用した。コールドフィンガー構成の断面図及び全体図は図1に示した。b空孔率測定最初に各サンプルの重量Wsを化学天秤を使用して測定し、ポリマーの実効体積実際にポリマーによって占められている体積Vpを得た。VpWs/ρo1ここにおいて、ρoは購入したポリマーの測定された密度であり、ここでは1.27gcm3であった。先ず足場を水に浸漬した。PLLAの疎水性と足場の100μm以下の微細孔サイズによりもたらされた毛細管力によって、水がその構造に浸透するのは不可能である。サンプルを液体に浸漬したとき、これが受ける押し上げる力、すなわち浮力はサンプル全体の体積Vtot、すなわちサンプル中でポリマーが占める体積と空気全体すなわち足場内部の全空孔が占める体積に比例する。すなわちUTtot=Vtotρ’=UT’Ws2ここにおいて、UTtotは足場が浸漬されている液体ここでは水から受ける浮力、ρ’はこの液体、すなわち水の密度1.0gcm-3、UT’は測定される正味の浮力である。全空孔率εtot-aは以下のように定義される。εtot-a=[Vtot-Vp/Vtot]10031式を使ってポリマーの実効体積Vpがわかり、また測定された正味の浮力UT’の値から2式を使用して足場全体の体積がわかるので、3式を使用して全空孔率εtot-aを計算することができる。相互接続空孔率εIC、すなわち存在する空孔を通って足場外部から到達可能な全ての空孔が足場全体に占める割合は以下のようにして求めることができる。サンプルをエタノール中に2時間浸すことでエタノールを完全に浸透させることにより、エタノール浴中でこの足場の重量を測定する。期待される重量Weと実際に測定された重量Waとの差を取る。ここで、期待される重量Weとは、足場中の全ての空孔に完全にエタノールが浸透したものと仮定した場合に期待される重量である。期待される重量Weと実際に測定される重量Waは夫々以下のように表される。We=ポリマーの重量全空孔中のエタノールの重量-足場全体にかかる浮力=[ポリマーの重量-ポリマーの実効体積にかかる浮力][全空孔中のエタノールの重量-全空孔にかかる浮力]=Ws-Vpρ’0Wa=ポリマーの重量相互接続空孔中のエタノールの重量-足場全体にかかる浮力=[ポリマーの重量-ポリマーの実効体積にかかる浮力][相互接続空孔中のエタノールの重量-相互接続空孔にかかる浮力][0-閉鎖空孔にかかる浮力]=Ws-Vpρ’0-VCLρ’ここでρ’はエタノールの密度、すなわち0.8gcm-3、VCLは全閉鎖空孔の体積である。従って両者の差は以下のようになる。We-Wa=Ws-Vpρ’-[Ws-Vpρ’-VCLρ’]=VCLρ’すなわち、これが全ての閉鎖空孔にかかる浮力である。これにより、閉鎖空孔率は以下のように求められる。εCL=VCL/Vtot=We-Wa/ρ’Vtot=[Ws-Vpρ’-Wa]/ρ’Vtot上式のパラメータは全て既知であるので、閉鎖空孔率εCLを求めることができる。これにより、相互接続空孔率εICを以下のように求めることができる。c走査電子顕微鏡SEM足場の形態は主に光学顕微鏡と走査電子顕微鏡SEMによる観察によって判定した。非生物学的に処理された足場を導電性のカーボン接着テープによってアルミニウムスタブ上に搭載して、2分間金スパッタリングEMITECHK500X、英国Ashfordした後、8k~10kVの加速電圧で動作させた電界放出走査電子顕微鏡FESEMLEOSUPRA1250、ドイツ国Oberkochen中で観察した。細胞播種後、PLLA足場に細胞固定及び脱水を施してからSEM検査を行った。簡単に言えば、足場を自製の0.1M、pH7.2のリン酸緩衝液PB中に2.5のグルタルアルデヒドGAを添加したもので2時間覆うことによって細胞を固定し、次にこれをPB中で数回洗浄した。その後、後固定処理postfixationtreatmentを、オスミウムテトラオキサイドOsO41を添加したPB中で室温で一晩行った。本構造物を更にPB中で洗浄し、次にPBEtOH溶液中に保持してEtOH濃度を30から100へ上昇させていった。空気中で乾燥させれば、サンプルは最終的に金属化の準備ができる。d機械的特性解析引っ張り試験により足場の機械的性質を調べた。主円形サンプルから0.5cm×2cmの短冊片stripであって、dTIPSサンプルの場合には2cm側がサンプル半径に沿っているかあるいは垂直な方向を向いたものを切り出した。これらの短冊片をスピードレートを2mm/分に設定したThumlerZ3ドイツ引っ張り試験機に搭載した。各々の試験毎に、引っ張り強度は、厚さ測定とSEM観察を結びつけることによって得られたところの、測定対象のサンプルの平均断面積で正規化した。"