ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子をコードする発現ベクターを黒質および線条体へ直接送達する工程を含む、方法。線条体への直接送達が被殻の少なくとも一つの領域になされる、請求項1記載の方法。線条体へ送達される、神経成長因子をコードする発現ベクターの全単位投与量が、黒質へ送達される、神経成長因子をコードする発現ベクターの単位投与量より多い、請求項1記載の方法。被殻へ送達される単位投与量が、黒質へ送達される単位投与量の10倍以下である、請求項3記載の方法。ドーパミン作動性ニューロンにおける修復または活性の刺激により疾患が寛解する、請求項1記載の方法。パーキンソン病に関連した運動機能障害の回復により疾患が寛解する、請求項1記載の方法。神経成長因子が、GDNF、ニュールツリン、パーセフィン、およびアルテミンからなる分子の群より選択されるGDNFファミリーに属するものである、請求項1記載の方法。神経成長因子がニュールツリンである、請求項7記載の方法。発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項1記載の方法。AAVベクターが2型AAVベクターである、請求項9記載の方法。送達がポンプを用いて実施される、請求項1記載の方法。対象において黒質への逆行性輸送が損なわれている、請求項1記載の方法。被殻へ送達される単位投与量が、黒質へ送達される単位投与量の4倍である、請求項4記載の方法。対象が進行期パーキンソン病を有する、請求項6記載の方法。対象が早期パーキンソン病を有する、請求項6記載の方法。寛解が、処置後1ヶ月目以降に観察可能である、請求項6記載の方法。寛解が、処置後12ヶ月目以降に観察可能である、請求項6記載の方法。寛解が、処置後18ヶ月目以降に観察可能である、請求項6記載の方法。寛解が、処置後24~48ヶ月目以降に観察可能である、請求項6記載の方法。神経成長因子が黒質の細胞体において発現される、請求項1記載の方法。TH上方制御が線条体において起こる、請求項1記載の方法。TH上方制御が黒質において起こる、請求項1記載の方法。線条体における送達が、脳の各側につき少なくとも一つの部位になされる、請求項1記載の方法。黒質への送達が、脳の各側につき少なくとも一つの部位になされる、請求項1記載の方法。ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子を黒質および線条体へ直接送達する工程を含む、方法。ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子をコードする発現ベクターを黒質へ直接送達する工程を含む、方法。ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子を黒質へ直接送達する工程を含む、方法。ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子を含有しているドナー細胞を黒質および線条体へ直接移植する工程を含む、方法。ヒト対象の脳内の、欠陥のある、疾患のある、または損傷を受けたドーパミン作動性の標的ニューロンへの治療用神経成長因子の送達方法であって、該欠陥、疾患、または損傷を、発現される神経成長因子に応答して寛解させるために、神経成長因子を含有しているドナー細胞を黒質および線条体へ直接移植する工程を含む、方法。発明の詳細な説明一般的注意事項具体的な用語が本明細書において利用されるが、それらは、限定のためではなく、一般的かつ記述的な意味でのみ使用される。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載された主題が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲のため、他に示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、量amounts、サイズ、寸法、割合、形、組成、パラメーター、百分率、パラメーター、量quantities、特徴を表す数、およびその他の数値は、全て、約という用語がその値、量、または範囲と共に明示されていなくても、全ての場合において約という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。従って、反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲において示された数的パラメーターは、本明細書に開示された主題によって入手することが求められる所望の特性に依って、正確でないかまたは正確である必要はなく、近似値であって、かつ/または、所望により、より大きいかもしくはより小さくてもよく、許容誤差、換算係数、端数処理、測定誤差等、および当業者に公知のその他の因子を反映していてもよい。例えば、約という用語は、ある値をさす場合、指定された量からの、いくつかの態様においては±100、いくつかの態様においては±50、いくつかの態様においては±20、いくつかの態様においては±10、いくつかの態様においては±5、いくつかの態様においては±1、いくつかの態様においては±05、いくつかの態様においては±01の変動を包含することを意味し得、そのような変動は、開示された方法を実施するかまたは開示された組成物を利用するために適切である。さらに、約という用語は、一つまたは複数の数または数的範囲に関して使用された場合、範囲内の全ての数を含む、全てのそのような数をさし、かつ示された数値の上限および下限を拡大することによってその範囲を修飾することが理解されるべきである。エンドポイントによる数的範囲の記述は、その範囲に内含される全ての数、例えば、整数その端数を含むを参照のこと、注入、ターゲティング分子または共沈殿剤例えば、リポソーム、カルシウムとの化学的な複合体化、電気穿孔例えば、AndreasonandEvansBiotechniques6650660を参照のことを含む当業者に周知の手段により達成され得、神経成長因子をコードする発現ベクターの組成物の送達については、標的組織への微粒子銃法TangetalNature356152154により達成され得る。当業者は、特に遺伝子治療における使用について、本発明により利用される直接送達法が、遺伝子治療に関連した限定的リスクファクター即ち、神経成長因子をコードするトランスジーンを保持しているベクターによる非標的細胞のトランスフェクションの可能性を除去することを認識するであろう。本発明においては、送達が直接的であり、標的ニューロンとの接触を最適化し、非標的細胞との接触を最小化するため、分泌された神経成長因子の拡散が、脳の制御された予定された領域において起こるよう、送達部位が選ばれている。さらに、霊長類およびヒトにおいて、機能性の神経成長因子をコードするトランスジーンを有するウイルスベクターは、脳への送達の後、数年間、ヒト神経成長因子を発現することが示されている。従って、本発明は、脳における神経成長因子の長期にわたって利用可能な供給源を提供する。本発明の実施において使用するための材料本発明の方法において有用な材料には、インビボ適合性の組換え発現ベクター、パッケージング細胞株、ヘルパー細胞株、合成インビボ遺伝子治療ベクター、制御可能な遺伝子発現システム、封入材料、薬学的に許容される担体、および関心対象の神経系成長因子をコードするポリヌクレオチドが含まれる。神経成長因子公知の神経系成長因子には、神経成長因子NGF、脳由来神経栄養因子BDNF、神経成長因子3NT3、神経成長因子45NT45、神経成長因子6NT6、毛様体神経栄養因子CNTF、グリア細胞由来神経栄養因子GDNFおよびGDNF分子ファミリーのその他のメンバーGDNFの天然に存在する類似体、ニュールツリン、パーセフィン、およびアルテミン、繊維芽細胞成長因子ファミリーFGF1~15、白血病抑制因子LIF、インスリン様成長因子ファミリーのある種のメンバー例えば、IGF1、骨形成タンパク質BMP、イムノフィリン、トランスフォーミング成長因子TGF成長因子ファミリー、ニューレグリン、上皮細胞成長因子EGF、血小板由来成長因子PDGF等が含まれる。成長因子は、精製されてもよいし、合成されてもよいし、または組み換え作製されてもよい。神経成長因子とは、本明細書において言及された神経成長因子と実質的に相同であって、かつ生物学的に等価である、任意の起源の成長因子を意味する。そのような実質的に相同な成長因子は、任意の組織または種に固有のものであってもよく、同様に、生物学的活性は、多数の生物学的アッセイ系のうちの任意のものにおいて特徴決定されてもよい。例えば、神経成長因子には、本発明の神経成長因子の生物学的活性を保持している限り、融合タンパク質および断片を含む、分子のハイブリッド型および修飾型、ならびにある種のアミノ酸が欠失しているかまたは置換されているハイブリッド型および修飾型、ならびに1個または複数個のアミノ酸が修飾型アミノ酸または異常アミノ酸へと変化しているような修飾、ならびにグリコシル化などの修飾も含まれる。生物学的活性の保持とは、必ずしも、単離され精製された型の神経成長因子または組み換え作製された神経成長因子と同レベルの効力でではなくてもよいが、ニューロン修復が達成されるかまたは活性が促進されることを意味する。本明細書における神経成長因子のプレプロ配列との言及は、プレ配列またはリーダー配列またはシグナル配列の領域、プロ配列領域、および成熟タンパク質を含有しているプレプロ成長因子を含んで解釈されるものとする。プレ領域および/またはプロ領域のヌクレオチド配列は、他の成長因子またはタンパク質のコード配列とのキメラ遺伝子を構築するために使用されてもよく、同様に、他の成長因子またはタンパク質の遺伝子に由来するプレ領域および/またはプロ領域をコードする配列と結合された、本発明の神経成長因子のコード配列から、キメラ遺伝子が構築されてもよい参照により組み入れられる、BoothetalGene1463038;IbanezGene1463038;StoricietalFEBSLetters3373037;ShaetalJCellBiol114827839。そのようなキメラタンパク質は、活性タンパク質種の改変された産生または発現を示すことができる。例えば、パーキンソン病の処置のために本発明において使用する神経成長因子の具体例には、GDNF、ニュールツリンNRTN、パーセフィン、およびアルテミンのGDNFファミリーが含まれる。これらの神経成長因子のコード配列は、当業者に周知であるか、または当業者によって容易に同定可能であり、ここで繰り返される必要はない。GDNFファミリーについて、例えば、wwwncbinlmnihgovgene2668遺伝子ID2668、ヒトGDNF、wwwncbinimnihgovgene4902遺伝子ID4902、ヒトニュールツリン、米国特許第6090778号も参照のこと、wwwncbinlmnihgovgene5623遺伝子ID5623;ヒトパーセフィン、およびwwwncbinlmnihgovgene9048遺伝子ID9048;ヒトアルテミン、ならびにその他の起源:に示されるヌクレオチド配列を参照することができる。GDNFファミリーについて、例えば、wwwncbinlmnihgovproteinCAG467211を参考にすることができる。多数のウイルスプロモーターおよび非ウイルスプロモーターのプロモーター領域およびエンハンサー領域も記載されている例えば、非ウイルスプロモーターに関しては、SchmidtetalNature314285;RossianddeCrombruggheProcNatlAcadSciUSA8455905594。静止状態の細胞におけるトランスジーンの発現を維持し増加させる方法には、I型コラーゲン1および2プロモーターProckopandKivirikkoNEngJMed311376;SmithandNilesBiochem191820;deWetetalJBiolChem25814385、SV40プロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、およびLTRプロモーターを含むプロモーターの使用が含まれる。プロモーター活性をモジュレートするためにサイトカインを使用して、長期の安定的発現のためにトランスジーン発現を増加させることもできる。例えば、トランスフォーミング成長因子TGF、インターロイキンIL1、およびインターフェロンINFは、LTRなどの様々なプロモーターにより駆動されるトランスジーンの発現を下方制御する。腫瘍壊死因子TNFおよびTGF1は、プロモーターにより駆動されるトランスジーンの発現を上方制御し、該発現を制御するために使用可能である。有用であることが判明し得るその他のサイトカインには、塩基性繊維芽細胞成長因子bFGFおよび上皮細胞成長因子EGFが含まれる。処置された脳において、免疫から防御された状態であるにも関わらず生じる可能性がある、ベクターに対するさらなる免疫応答を抑制することにより、トランスジーン発現を増加させるために、コラーゲンエンハンサー配列Collを有するコラーゲンプロモーターも使用可能である。さらに、ベクター組成物の送達直後に、処置された宿主に対し、ステロイド例えばデキサメタゾンを含む抗炎症剤を投与してもよく、好ましくはサイトカインにより媒介される炎症応答が鎮まるまで継続してもよい。LTRプロモーターおよびCollプロモーターエンハンサーを下方制御してトランスジーン発現を低下させるインターフェロンの産生を低下させるために、シクロスポリンなどの免疫抑制剤を投与してもよい。ヒトニュールツリンcDNA配列を含有しているAAV2ウイルスベクターの構築は、図1、および開示が参照により本明細書に組み入れられるGasmietalMolTher156268に記載されている。プレプロ型ニュールツリンは、切断されて、成熟タンパク質と、プレプロ領域を含有しているヒトプレプロ型とを形成する。成熟ニュールツリン分子の分泌を増強するために、米国特許第6090778号に記載されたような、プレプロニュールツリン以外のシグナルペプチド配列例えばNGFに由来するものを利用してもよいGasmietal前記。ドナー細胞本開示は、好ましいインビボ送達法に焦点を当てているが、神経成長因子をコードする発現ベクターの脳へのエクスビボ送達のため、繊維芽細胞および幹細胞胚性幹細胞および成体の誘導多能性幹細胞または誘導全能性幹細胞を非限定的に含むなどの宿主細胞が利用されてもよいことを、当業者は認識するであろう。神経成長因子トランスジーンをコードする発現ベクターを含有しているドナー細胞の調製は、内容が本明細書に組み入れられる、同一出願人による米国特許第5650148号に詳細に記載されている。調製は、神経成長因子タンパク質をコードするトランスジーンを含有しているベクターの導入によってドナー細胞を改変することにより実施され、続いてその細胞が標的組織へ移植される。ドナー細胞の調製は当業者に公知である。簡単に説明すると、ドナー細胞へのインビトロでの遺伝子移入の戦略には、以下の基本的な工程が含まれる:1発現がCNSの疾患または機能障害と関連している適切なトランスジーンの選択;2遺伝子移入のための適切で効果的なベクターの選択および開発;3例えば、初代培養物または樹立細胞株からのドナー細胞の調製;4新たな機能を発現する移植されたドナー細胞が生存可能であり、安定的かつ効果的にトランスジーン産物を発現し得ることの証明;5移植が重篤な有害効果を引き起こさないことの証明;ならびに6宿主動物における所望の表現型効果の証明。薬学的調製物神経成長因子をコードする発現ベクターのインビボでの直接送達は、本発明において使用するために好ましい。その目的のため、神経成長因子をコードする発現ベクターを、薬学的に許容される懸濁物、溶液、またはエマルションの中に置くことができる。類似の担体を、神経成長因子タンパク質の送達のために利用してもよい。より具体的には、薬学的に許容される担体には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁物、およびエマルションが含まれ得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性/水性の溶液、エマルション、または懸濁物、例えば、生理食塩水および緩衝媒質が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には、水分および栄養素の補充剤、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充剤等が含まれる。本発明の薬学的組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、くも膜下腔内、または脳内を含む、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与可能である。投与は、注射によって迅速になされてもよいし、または徐々に注入もしくは徐放性製剤の投与によってある期間にわたりなされてもよい。中枢神経系の組織の処置のため、投与は、脳脊髄液CSFへの注射または注入によってなされ得る。神経成長因子を中枢神経系の細胞へ投与することが目的の場合、投与は、血液脳関門への分子の浸透を促進することができる1種または複数種の薬剤を用いてなされてもよい。担体は、製剤のpH、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色、無菌性、安定性、溶解速度、または匂いの修飾または維持のためのその他の薬学的に許容される賦形剤を含有していてもよい。同様に、担体は、放出または吸収または血液脳関門への浸透の修飾または維持のためのその他の薬学的に許容される賦形剤をさらに含有していてもよい。そのような賦形剤は、単位投与剤形unitdosageformもしくはマルチ投与剤形multidoseformのいずれかによる非経口投与のため、または連続的もしくは周期的な注入による脳脊髄液への直接注入のため、投与量を処方するために一般的および慣習的に利用されている物質である。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等などの保存剤およびその他の添加剤も存在してもよい。さらに、神経成長因子トランスジーンの組成物は、後に復元して本発明において使用するために、当技術分野において周知の手段を使用して凍結乾燥してもよい。投与は、投与製剤の薬物動態学的パラメーターおよび使用される投与経路によっては反復されてもよい。具体的な用量は、患者の体重もしくは体表面積の近似値、または占有される体腔bodyspaceの体積に応じて計算される。用量は、選択された特定の投与経路に応じても計算される。処置のための適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる改良は、当業者によってルーチンになされる。そのような計算は、標的細胞のアッセイ調製物における本明細書に開示された活性を考慮すれば、過度の実験なしに、当業者によってなされ得る。正確な投与量は、標準的な用量応答研究により決定される。実際に投与される組成物の量は、処置すべき状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重度、ならびに選ばれた投与経路を含む、関連する環境を考慮して、実務者によって決定されることが理解されるであろう。コロイド分散システムも、標的特異的な遺伝子送達のために使用可能である。コロイド分散システムには、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む、脂質に基づくシステムが含まれる。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達媒体として有用な人工膜小胞である。02~40μmの範囲のサイズの大型単層小胞LUVは、大きな高分子を含有している水性緩衝液を十分な割合で封入可能であることが示されている。RNA、DNA、および完全ビリオンを、水性の内部に封入し、生物学的活性を有する形態で細胞へ送達することができるFraleyetalTrendsBiochemSci6771981。リポソームが効果的な遺伝子移入媒体であるためには、以下の特徴が存在しなければならない:1生物学的活性を損なうことのない、アンチセンスポリヌクレオチドをコードする遺伝子の高効率の封入;2非標的細胞と比較して優先的かつ十分な、標的細胞への結合;3小胞の水性内容物の、標的細胞の細胞質への高効率での送達;ならびに4遺伝情報の正確で効果的な発現ManninoetalBiotechniques66821988。一般的に、リポソームの組成は、一般的には、ステロイド、特に、コレステロールと組み合わせられた、リン脂質、特に、相転移温度が高いリン脂質の組み合わせである。その他のリン脂質またはその他の脂質が使用されてもよい。リポソームの物理的特徴は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソーム作製において有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれる。特に有用であるのは、脂質モエティが14~18個の炭素原子、特に、16~18個の炭素原子を含有しており、かつ飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームのターゲティングは、解剖学的因子および機構的因子に基づいて分類可能である。解剖学的分類は、選択性のレベルに基づき、例えば、器官特異的、細胞特異的、および細胞小器官特異的である。機構的ターゲティングは、受動的であるか能動的であるかに基づき区別可能である。受動ターゲティングは、類洞毛細血管を含有している器官の細網内皮系RESの細胞へ分布するリポソームの本来の傾向を利用する。他方、能動ターゲティングは、本来の局在部位以外の器官および細胞型へのターゲティングを達成するための、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質などの特異的なリガンドとリポソームのカップリングによる、またはリポソームの組成もしくはサイズの変化による、リポソームの改変を含む。標的特異的な遺伝子送達システムの表面は、多様な方式で修飾されてもよい。リポソーム標的特異的送達システムの場合、ターゲティングリガンドをリポソーム二重層と安定的に会合させておくため、リポソームの脂質二重層に脂質基を組み入れることができる。ターゲティングリガンドに脂質鎖を結合するため、様々な連結基を使用することができる。動物モデルおよび臨床的評価非ヒト霊長類対象において、老化の過程は、老化中のヒトが経験する脳内の神経学的変化をシミュレートする。高度の完全性を有するパーキンソン病のモデルとなる非高齢動物モデルが、1メチル4フェニル1236テトラヒドロピリジンMPTPにより処理されたサルである例えば、KordoweretalExpNeurology160116を参照のこと。そのような処理は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの広範な変性をもたらし、同時に、行動修飾および運動障害をもたらす実施例2。高老非ヒト霊長類およびMPTP処理動物における本発明の方法の使用および効力を証明するデータは、以前に証明されている。さらに、実施例に記述されるように、ヒトにおける本発明の方法の使用を証明するデータも証明された。処置の臨床的評価およびモニタリングは、上記のインビボ画像技術を使用して実施されてもよいし、処置された組織の生検および組織学的分析によって実施されてもよい。後者に関しては、例えばTH免疫反応性に関して、組織試料中のニューロン数を定量化することができる。疾患の症状の寛解の臨床的評価およびモニタリングは、処置後の様々な時点で査定され観察されてもよい。様々な態様において、寛解は、処置後30日目以降、60日目以降、90日目以降、180日目以降、12ヶ月目以降、18ヶ月目以降、24ヶ月目以降、48ヶ月目以降、72ヶ月目以降に観察可能である。実質的に定義されたpracticallydefinedオフ状態抗パーキンソン病薬の最後の投与からほぼ12時間後、および最良オン状態抗パーキンソン病薬の朝の投与に対する最良の応答において、URPDRSにより、患者を査定することができる。FahnetalRecentDevelopmentsinParkinsonsdiseaseMacmillanHealthcareInformationFlorhamParkNJ2153163。12ヶ月後の各診察時にも、実質的に定義されたオフ状態において、UPDRSの運動サブスケールパート3を実施することができる。運動状態の在宅日記による査定、タイムドモーターテストtimedmotortests、運動障害評価尺度、および臨床的な全体的所見の査定は、定期的に;例えば、基線時、6ヶ月目、およびその後の各診察時に実施することができる。生活の質は、パーキンソン病質問票PDQ39JenkinsonetalAgeAgeing26353357および簡易版SF36WareetalMedCare30473483により、定期的に;例えば、基線時およびその後に査定することができる。本発明を全面的に説明したが、その実施を例示する実施例を以下に示す。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきでなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定められる。実施例1AAV2ニュールツリン遺伝子治療AAVニュールツリンの生理活性:パーキンソン病脳と非ヒト霊長類脳との間の違い中程度の進行期パーキンソン病患者12人における第1相試験は、安全性の問題を特定せず、運動機能のいくつかの測定について可能性のある改善を示唆した。MarksetalLancetNeurol7400408。前述のように、58人の対象におけるその後の二重盲検対照第2相試験は、AAVニュールツリンの安全性をさらに支持したが、第一エンドポイントについて偽手術と比較して利益を識別することができなかった12ヶ月目のオフ時のUPDRS運動。しかしながら、いくつかの第二エンドポイントは、中程度の臨床的利益を示唆し、偽対照に有利な測定値はなかった。さらに、15~18ヶ月目に盲検で処置を受け続けていた患者n=30からの全てのデータの、プロトコルに規定された分析は、第一エンドポイントおよび第二エンドポイントについてAAVニュールツリンAAV2NTRNによる有意な利益を示唆し、偽処置に有利な測定はなかった。第2相試験中、2人のパーキンソン病患者が、AAV2NRTNとは無関係の事象で死亡し、脳が組織学的に調査された。これらの患者における被殻へのAAV2NRTNの送達の効果について、被殻および黒質におけるNRTNの発現、ならびに黒質線条体ニューロンにおけるTH誘導を、若年サル、高齢サル、およびパーキンソン病サルにおける同一処理後のものと比較して以下に詳述する。ベクターの設計および構築ヒトNRTNのみを発現するよう遺伝学的に操作されたAAV2ベクターであるAAVニュールツリンを利用した。GasmietalMolTher156268。パーキンソン病剖検例事前に参加基準を満たし、IRBにより認可されたインフォームドコンセントに署名した患者が、各半球4本の別々の針穿刺経路、各経路2個のデポ剤depositsを介して分布させたAAVニュールツリン54×1011vgを受容した。1人の対象1802は、102年前に診断され、AAVニュールツリン処置後90日目に肺塞栓で死亡した59歳の男性であった。2人目の対象1904は、95年前に診断され、AAVニュールツリン後47日目に致命的な心筋梗塞を起こした73歳の男性であった。対象1904は、3421の基線時UPDRS運動オフ/オン時スコア、および133時間日の自己申告性の日記によるオフ時間を有していた。対象1802は、5134の基線時UPDRS運動オフ/オン時スコア、および47時間日の自己申告性の日記によるオフ時間を有していた。脳を、それぞれ、死後6時間および13時間の間隔で改変ザンボーニ液により固定し、40μmに切片化した。2人目の対象からは片方の半球のみが入手可能であった。非パーキンソン病の高齢ヒトを陽性対照として使用し、脳をNRTNおよびチロシン水酸化酵素THについて染色した。両方の脳が、複数のαシヌクレイン染色レビー小体を伴う、黒質内の細胞の著しい損失を含む、パーキンソン病の典型的な病理学的特色を示した。非ヒト霊長類例実質的により低い用量線条体体積でヒト用量のおよそ4を意図的に与えて脳をわずか28日後に評価した2匹の若年サルを除いて、相対的な線条体体積に基づき、パーキンソン病患者に投与された範囲の用量のAAV2NRTNを、10匹のアカゲザルMacacamulattaに被殻内投与した。全ての飼育および実験がIACUCにより認可された。KordoweretalAnnNeurol60706715;HerzogetalMovDisord2211241132;HerzogetalMolTher1617371744;およびHerzogetalNeurosurgery64602612。AAVニュールツリン投与後、サルに麻酔をかけ、09生理食塩水により経心的に灌流した後、改変ザンボーニで固定し、脳を切片化した。本明細書に提示される具体的なデータは以前に発表されていないが、これらのサルのうちの数匹は、以前の発表の一部であった。KordoweretalAnnNeurol60706715;HerzogetalMovDisord2211241132;HerzogetalMolTher1617371744。2匹の若年サルおよそ5歳に、各半球05×1011vgのAAVニュールツリンを、2個のデポ剤総容量25μLで線条体内投与して1ヶ月後に安楽死させ、さらに1匹の若年サルには、各半球10×1011vgのAAVニュールツリンを与えて3ヶ月後に安楽死させた。3匹の高齢サル22~25歳に、線条体全体に分布させた5個のデポ剤各30μLを介して3×1011vgのAAVニュールツリンを片側に投与し、8ヶ月後に安楽死させた。5匹のサル年齢範囲:6~10歳は、運動障害をもたらすMPTPの片側頚動脈内注入を受容した。次いで、4日後、線条体全体に分布させた5個のデポ剤各15μLを介して15×1011vgのAAVニュールツリンをそれらに投与し、さらに黒質へ10μL02×1011vgの用量を単回注射し、105ヶ月後に安楽死させた。ニュールツリンおよびチロシン水酸化酵素の免疫組織化学的分析ヒトおよび非ヒト霊長類の線条体および黒質におけるNRTNおよびTHを可視化するため、KordoweretalAnnNeurol60706715に記載されるように、免疫ペルオキシダーゼ標識を使用した。立体解析学的試料採取法、複合コンピューター支援イメージングソフトウェア、およびCavalieriの方法を、霊長類線条体におけるNRTN発現を定量化するために使用した。ヒト症例については、被殻におけるNRTN発現の量を計算するため、2種の異なる方法を独立に利用した。一つの方法は、各被殻の全体における6~11の切片の立体解析学的試料採取に基づく容量分析を利用した。第2の方法は、被殻を含有していることが見出された全ての切片各症例19~29の切片を採取した。次いで、施設内のヒトおよび霊長類の組織学的切片およびMRIスキャンからの値を使用し、およそ1200mm3半球の非ヒト霊長類尾状核/被殻、およびおよそ4000mm3半球のヒト被殻の推定値を提供する発表された値も使用して、各標的構造内のNRTN発現の割合を、標的全体の体積に基づいて計算した。結果NRTN発現2例のパーキンソン病例について、AAV2NRTN処置後7週目または3ヶ月目以降に、無関係の原因による死亡の後、入手可能となった3個の半球において、ニュールツリン発現を定量化した。NRTN免疫反応性は、全ての半球に見られ、標的とされた被殻に制限されていた。2つの独立の盲検分析は、控えめにみてNRTNタンパク質が体積で被殻全体のおよそ15をカバーしていると推定した。AAVニュールツリンのために利用された投与パラダイムは、可能性のある副作用を低下させるため、周辺部位への蔓延を制限しながら、被殻の全体にわたり可能な限り広くAAV2NRTNを分布させるよう意図されていた。KordoweretalAnnNeurol46419424;NuttetalNeurology606973;およびEriksdotteretalDementGeriatrCognDisord9246257。検出可能なNRTNタンパク質は、試験された3個の半球の各々において、分析された全ての被殻切片の93、58、および80に見られた。被殻即ち、ドーパミン黒質ニューロンの終末領域における強力なNRTN発現とは対照的に、生存しているドーパミン作動性メラニン陽性ニューロンが認識可能であるにも関わらず、黒質即ち、これらの同一ニューロンのニューロン細胞体に、NRTN染色はほとんど見られなかった。低いNRTN発現レベルによるAAVニュールツリンの初期生理活性の控えめな推定値を提供するため、2匹の若年サルに、特に低い用量のAAVニュールツリン各標的構造の相対体積でヒトパーキンソン病用量の4未満を投与し、わずか1ヶ月後に安楽死させた。これらの2匹のサルにおける線条体NRTN発現の体積は、わずか56および18であると推定された。この低い線条体NRTN発現レベルにも関わらず、パーキンソン病例とは対照的に、NRTN逆行標識が黒質核周部に容易に見られ、順行性輸送されたNRTN繊維が、淡蒼球内および黒質網様部内に走行しているのが見られた。AAV2NRTNを8ヶ月前に投与された3匹の高齢サルについて、NRTNは体積で線条体全体の4、19、および25平均16を覆っていると推定された。線条体NRTNカバー率のばらつきにも関わらず、パーキンソン病組織とは対照的に、NRTNが黒質において一貫して観察された。MPTPにより処理された5匹のサルMPTP処理の4日後にAAV2NRTNを投与され、10ヶ月後に安楽死させられたについて、体積で被殻全体の平均約13それぞれ、8、8、13、15、および23がNRTNについて染色された。他の霊長類研究と同様に、黒質緻密部および網様部において、それぞれ逆行性輸送および順行性輸送されたNRTNの広範な証拠が観察された。チロシン水酸化酵素免疫組織化学ヒトパーキンソン病剖検組織の調査は、AAVニュールツリン後のTH誘導の乏しい証拠しか見出さなかった。TH誘導の最も明らかな証拠は、標的とされた線条体の、NRTN染色の最も強い部位のうちのいくつかの境界の完全に内部に観察された。まばらなTH陽性繊維のみを反映するこのシグナルは、NRTN陽性被殻部位の平均して50に観察された即ち、それぞれ、0、62、および80。パーキンソン病脳の黒質においては、多数のメラニン含有THドーパミン作動性ニューロンの存在にも関わらず、TH誘導の証拠は見出されなかった。パーキンソン病例におけるまばらなTH誘導シグナルとは対照的に、サルにおけるAAV2NRTN処置後のTH誘導は、黒質線条体ニューロンにおいて一貫して観察され、一般に強いものであり、典型的には、線条体および黒質におけるNRTN発現の程度および強度を反映していた。これは、パーキンソン病例より実質的に低い用量および低いNRTN発現で、投与後28日目にすら明白であった。最後に、パーキンソン病脳におけるTH応答とはさらに対照的に、サル線条体におけるTH誘導の区域は、一貫して、隣接切片におけるNRTN染色の区域を越えていた。上記データにより、遺伝子治療は、神経変性患者の脳内の深部において、可能性として強力な治療用タンパク質の標的特異的な発現を生じ得ることが示される。パーキンソン病脳内の被殻へのAAV2NRTNAAVニュールツリンの投与は、標的とされた被殻においてNRTNの明らかな発現をもたらし、控えめにみて体積でその構造のおよそ15を覆うと推定された。パーキンソン病患者における臨床的利益のために、どれだけのカバー率が必要とされるかは未知であるが、この量は、数種の非ヒト霊長類モデルにおいて生物学的利益を提供した範囲内に明らかにあり、現在蓄積されている動物およびヒトにおける安全性データは、そのカバー率を確実にさらに拡大するための正当化を提供する。KordoweretalAnnNeurol60706715;HerzogetalMovDisord2211241132;HerzogetalMolTher1617371744;およびHerzogetalNeurosurgery64602612。しかしながら、過去の全ての動物研究とは対照的に、若年サル、高齢サル、およびMPTPパーキンソン病サルにおいてこの応答を生じるのに十分である以上の被殻カバー率にも関わらず、パーキンソン病被殻におけるNRTN発現は、黒質のニューロン細胞体の標識をもたらさなかった。この相違は、進行期パーキンソン病と、パーキンソン病のトランスレーショナルリサーチのために使用されている典型的な動物モデルとでは、黒質線条体ニューロンの状態および機能が大きく異なっていることを示唆している。以下の実施例に例示されるように、本発明はこの違いを考慮に入れた。等しく興味深いのは、AAV2NRTN投与およびその後のNRTN発現の後に、被殻において見られた、AAV2NRTNにより媒介された中程度のTH誘導であるTHは、ドーパミン合成のための主要な酵素であり、変性ドーパミンニューロンの機能的増強のための代用物質である。AAVNRTNに応答して起こる非ヒト霊長類における強力なTHシグナルは、以下のものを含む多くの重要な点で、パーキンソン病における限定されたシグナルとは著しく対照的である:1パーキンソン病においては、THシグナルの強度がはるかに低く、2より低い頻度および信頼性で起こり、かつ3被殻のはるかに小さな一部分において、NRTN発現の領域の完全に内部で起こった。変性黒質線条体ニューロンにおける神経栄養因子主として、GDNFによる多くの動物研究に基づく従来の通念は、これらのニューロンの終末領域即ち、線条体を標的とすることが、最適の神経栄養性の利益を得るために必要かつ十分であることそして、黒質を標的とすることは、不必要であるか、または逆効果ですらあることを主張した。KiriketalNatNeurosci7105110;BjorklundetalNeurobiolDis4186200;およびKiriketalJNeurosci2046864700。この観点は、神経栄養因子が、ニューロン終末により取り込まれ、細胞体へと逆行性輸送されて、栄養効果を誘導することにより最もしばしば機能することを証明している、神経栄養因子の基礎研究によってさらに支持された。MufsonetalProgNeurobiol57451484およびLindsayetalTrendsNeurosci17182190。実際、線条体の終末領域へのGDNFまたはNRTNの送達は、逆行性輸送を介して、軸索終末および黒質細胞体の両方において、GDNFおよびNRTNのレベルを上昇させるのに十分であることが一貫して示されている。SalvatoreetalExpNeurol202495505;AietalJCompNeurol461250261;SuetalHumanGeneTher2016271640;およびTomacetalNature373335339。しかしながら、被殻における明らかなNRTN、および黒質における十分なドーパミンニューロンにも関わらず、黒質におけるNRTN陽性核周部の欠如を示す本明細書中のデータから、これが、進行期パーキンソン病において同様には起こらないことが明らかになった。被殻送達後のヒト黒質における同様に弱いNRTNシグナルの証拠、黒質の変性核周部へのより大きな神経栄養性の曝露を確実にする戦略は、より迅速で強力な神経栄養性の応答を提供し、従って、より有意義な臨床的利益を提供するであろう。線条体に加えて黒質へもGDNFを注射することは無益であって有害であり得ることを示す反対のデータは、注意して解釈されるべきである。KiriketalJNeurosci2046864700。これらのデータは、線条体GDNFの逆行性輸送により十分な黒質GDNFが存在する時、黒質をさらに標的とする必要はないことを示しているに過ぎない。しかしながら、進行期パーキンソン病を有するヒトにおいて、黒質線条体経路の変性によって、線条体から黒質へのNRTNの逆行性輸送が防止される場合、黒質を標的とすることが不要であるという結論のための基礎は崩壊する。実施例II進行期パーキンソン病のための被殻内AAV2ニュールツリンAAVニュールツリンの多施設無作為化二重盲検偽手術対照研究実施例IおよびGasmietalMolTher156268に記述されたように、AAV2ベクターを、ヒトニュールツリンNRTNのみを発現するよう遺伝学的に操作した。それは、脳の細胞へのニュールツリンNRTNの標的特異的かつ持続的な送達を提供する。AAV2NRTNを使用した多施設二重盲検偽手術対照試験を実施するため、中央のコンピュータにより生成された無作為のコードによって、AAV2ニュールツリン54×1011ベクターゲノムの被殻への両側注射または偽手術のいずれかを受容するよう、患者を無作為に割り当てた2:1。神経外科チームを除く全ての患者および研究人員に対して、処置割り当てが隠された。第一エンドポイントは、実質的に定義されたオフ状態における統一されたパーキンソン病評価尺度の運動サブスコアの基線時から12ヶ月目までの変化であった。基線後に少なくとも1回査定された、無作為に割り当てられた全ての患者を、第一分析に含めた。2006年12月~2008年11月に、米国の9箇所からの58人の患者が試験に参加した。AAV2ニュールツリンにより処置された患者において、対照個体と比較して、第一エンドポイントの有意差は存在しなかった差-031[SE263]、95CI-558~497;p=091。従って、被殻内AAV2ニュールツリンは、12ヶ月目のUPDRS運動スコアを使用して機能的に査定された場合、偽手術より優れてはいなかった。実施例III黒質および被殻へのAAVニュールツリンの送達2010年10月に開始した進行期パーキンソン病における第2b相多施設偽手術二重盲検対照試験において、AAV2ニュールツリンが使用されている。進行期の患者は、疾患の初期段階にあり従って本発明が容易に効力を示すと予想される患者よりも、黒質線条体輸送経路の変性が大きいと予想することができる。本出願の時点で、52人の対象のうちのおよそ20パーセントがCERE120投与または偽手術のいずれかを既に受け、他の多くは手術に登録されて待機中であった。プロトコルは、以下に概説されるパラメーターに沿って本発明を利用する。注射経路を計画するために神経画像処理を用いて定位脳手術を行う。プロポフォールによる深鎮静により、患者に麻酔をかける。積極的治療に割り当てられた患者については、ニュールツリンをコードするDNAを被殻に送達するため、AAV2をベクターとして用いた遺伝子移入法を行う。全脳用量が54×1011のベクターゲノムのAAV2ニュールツリンを両側に投与する。これらの患者において、黒質は、各側2箇所の穿頭孔を通して到達された注射部位において直接標的とされ、被殻へは、より高い用量が、各側3箇所の注射部位において、本発明により送達される。黒質をAAVニュールツリンの標的とし、かつ以前に試験された用量より多い用量を投与することの実現可能性および安全性を初めて評価した、この第2b相試験は、第1相安全性試験における6人の患者への投与の成功の後に開始された。第1相安全性データベースは、各患者について7~13ヶ月の範囲の追跡期間を現在反映しており、体重に対する効果を含め、投与された6人の対象のいずれにおいても重篤な有害事象SAEを示していない。全ての患者が、計画通り、手術から48時間以内に退院した。第1相試験において観察された安全性プロファイルと一致して、AAVニュールツリンに関連する重篤な有害事象は、進行中の第2相試験においても観察されていない。ヒト臨床プロトコルに関して既に概説されたように、登録された最後の患者が15ヶ月目の評価を完了するまで、基線時、術後1ヶ月目、3ヶ月目、6ヶ月目、9ヶ月目、および12ヶ月目に患者を査定し、その後は3ヶ月毎に査定する。神経変性障害の寛解は、処置後早ければ3ヶ月目に観察可能であると予想される。過去の臨床試験において、被殻処置を受けた患者において、12ヶ月後に利益が出現したことから、1年目より後、例えば、処置後18ヶ月目、24ヶ月目、48ヶ月目、または72ヶ月目、および可能性としてそれ以降の追跡も、線条体および黒質の細胞体におけるニュールツリンシグナルのさらなる増幅を立証するかもしれないことが示唆される。本発明を上記実施例に関して説明したが、修飾および変動が本発明の精神および範囲に包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。