3’末端から5’末端へと共有結合した以下の要素を含む、修飾型huU7snRNA:配列番号1の配列を有するポリヌクレオチド配列番号2の配列を有するポリヌクレオチド、及び以下である1つ以上のポリヌクレオチド-前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、標的pre-mRNAの少なくとも一部のアンチセンスであり、且つ-前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つキスドメインが、配列番号1のヌクレオチド12とヌクレオチド20の間に含まれるヌクレオチド内に含まれる少なくとも2つのヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。前記標的pre-mRNAの少なくとも一部が、少なくとも1つのエクソンの1つのスプライス部位である、請求項1に記載の修飾型huU7snRNA。スプライス部位が5’ドナー部位、3’アクセプター部位、分岐点BP配列、エクソン性スプライシングエンハンサーESE配列、イントロン性スプライシングエンハンサーISE配列、並びにイントロン性サイレンサー配列ISS及び末端ステムループTSLからなる群から選択される、請求項2に記載の修飾型huU7snRNA。標的pre-mRNAの少なくとも一部が、トリヌクレオチドリピート伸長である、請求項1に記載の修飾型huU7snRNA。トリヌクレオチドがCUGである、請求項4に記載の修飾型huU7snRNA。アンチセンスが少なくとも15リピートのトリヌクレオチドCAGを含む、請求項5に記載の修飾型huU7snRNA。前記キスドメインがAAGU、GAGU、GGGU及びAGGUから選択される配列を有しているか、又は前記キスドメインがGCAGU、GAAGU、GCGGU、GGAGU、GAGGU及びGGGGUから選択される配列を有している、請求項1~6のいずれか一項に記載の修飾型huU7snRNA。請求項1~7のいずれか一項に記載の修飾型huU7snRNAをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド。前記遺伝子が制御配列に融合している、請求項8に記載のポリヌクレオチド。前記制御配列がヒトU7プロモーターを含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。前記プロモーターが配列番号3の配列を有する、請求項10に記載のポリヌクレオチド。前記制御配列がhuU7snRNA遺伝子下流配列を含む、請求項9~11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。前記下流配列が配列番号4の配列を有する、請求項12に記載のポリヌクレオチド。請求項8~13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。前記ベクターがプラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項14に記載のベクター。請求項14又は15のいずれか一項に記載のベクターによってトランスフェクトされた、単離された真核細胞。前記細胞が、骨格筋細胞、筋芽細胞、又は筋肉へ分化可能な細胞である、請求項16に記載の細胞。前記細胞が人工多能性幹細胞である、請求項18に記載の細胞。請求項14若しくは15のいずれか一項に記載のベクター又は請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。医薬としての、請求項14若しくは15のいずれか一項に記載のベクター又は請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞。神経筋疾患を治療又は予防するための、請求項14若しくは15のいずれか一項に記載のベクター又は請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞。神経筋疾患が神経筋ジストロフィーである、請求項21に記載のベクター又は細胞。神経筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー又は1型筋緊張性ジストロフィーである、請求項22に記載のベクター又は細胞。神経筋疾患が脊髄性筋萎縮症である、請求項21に記載のベクター又は細胞。細胞を請求項14又は15のいずれか一項に記載のベクターと接触させる工程を含む、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なmRNAの根絶により細胞タンパク質の機能を回復する方法。発明の詳細な説明本発明者らは、smOPT配列U7smOPT及びアンチセンス配列を含む修飾型U7snRNAが、特にエクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なmRNAの根絶によって、神経筋疾患を治療するために有用であることを示した。しかしながら、適切なアンチセンス配列をU7smOPTへ導入することは十分といえる程ではなく、多くの場合、その後の操作されたU7は、スプライシング機構を効率的に妨害しない。いくつかのアンチセンスポリヌクレオチドは、たとえそれらが標的pre-mRNA配列と完璧に相互作用するよう設計されていても、スプライシングを是正することにはつながらない例えば実験例におけるアンチセンスSD23又はM23Dを参照されたい。本発明者らは、アンチセンス-U7smOPTの正しい折り畳みが効率性のために必要であることを今や見出した。理論により制約されること無く、この現象を説明する1つの仮説は、アンチセンス配列がその後のsnRNPの折り畳みに影響し、最終的にはその細胞輸送及びスプライソソームへのアドレッシングaddressingを妨害し得るというものである。それ故、該分子のアンチセンス部分とU7ループとの間のハイブリダイゼーションによる相互作用は、修飾型分子の適切な折り畳みを可能にするために必須である。また、本発明者らは、そのような相互作用が天然に存在しないとき、アンチセンス-U7-SmOPT分子にステムループとハイブリダイズすることが可能なドメインキスkissドメインを付加することにより、前記分子を操作することが可能であることを見出した。第一の態様によれば、本発明は、Sm結合ドメインがsmOPT配列で置き換えられ、アンチセンス配列が1つ以上の他のポリヌクレオチドで置き換えられている、修飾型U7snRNAを対象とする。一実施形態において、少なくとも1つの他のポリヌクレオチドが、標的pre-メッセンジャーRNApre-mRNAの少なくとも一部のアンチセンスである。別の実施形態において、少なくとも1つの他のポリヌクレオチドキスドメインが、U7ループとハイブリダイズすることが可能である。更に別の実施形態において、少なくとも1つの他のポリヌクレオチドが、標的pre-mRNAの少なくとも一部のアンチセンスであり、少なくとも1つの他のポリヌクレオチドキスドメインが、U7ループとハイブリダイズすることが可能である。故に、本発明は、3’末端から5’末端へと共有結合した以下の要素を含む、修飾型huU7snRNAを提供する:配列番号1の配列を有するポリヌクレオチド、配列番号2の配列を有するポリヌクレオチド、並びに以下である、1つ以上のポリヌクレオチド-前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つが、標的pre-mRNAの少なくとも一部のアンチセンスであり、且つ-前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つキスドメインが、配列番号1のヌクレオチド12とヌクレオチド20の間に含まれるヌクレオチド内に含まれる、少なくとも2つのヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であるもの。核内低分子リボ核酸snRNAは、真核細胞の核内に見出される低分子RNA分子の一分類である。それらは、RNAスプライシングpre-mRNAからのイントロンの除去、転写因子7SKRNA又はRNAポリメラーゼIIB2RNAの調節、及びテロメアの維持等の種々の重要な過程に関与している。それらは、常に特定のタンパク質と会合しており、結果として生じるRNA-タンパク質複合体は、核内低分子リボ核タンパク質snRNP又は時々snurpsと呼ばれる。多くのsnRNAが存在し、それらはU1、U2...U10と称される。U7型のsnRNAは通常、ヒストンmRNAの成熟に関与している。このsnRNAは、多数の真核生物種これまでのところ56種において同定されており、これらの種のそれぞれのU7snRNAは、本発明のために同様に適しているとみなされるべきである。それでも尚、ヒト由来のU7snRNAの使用が好ましい。本明細書中、huU7snRNAとは、ヒト由来のsnRNAを意味する;huU7snRNAはSU7又は二次secondU7snRNAとしても知られる;本願の目的のためには、これらの名称は互換的である。好ましい実施形態において、U7snRNAは、GenbankエントリーナンバーNR_023317.1に対応する配列を有する、1本鎖ポリヌクレオチドである。野生型U7snRNAは、ステムループ構造、U7特異的Sm配列、及びヒストンpre-mRNAの3’末端にアンチセンスである配列を含む。本明細書中、修飾型snRNAとは、snRNAの初期の機能に関与する配列が不活性化されたRNAを意味する。例えば、snRNA分子は、特定のSm結合ドメイン配列を介して一連の特定のSmタンパク質と相互作用して、snRNPを形成することが知られている。一実施形態において、修飾型snRNAは、Sm結合ドメインが別のsnRNA由来のSm結合ドメインと置き換えられたsnRNAである。この実施形態において、修飾型snRNAの機能は、Sm結合ドメインの交換によって変更される。特に、U7通常はヒストンpre-mRNA3’末端のプロセシングに関与する非スプライソソーム系snRNAは、U7のSm結合ドメインをU1及びU2それぞれ、ドナー及びアクセプタースプライス部位のレベルで作用する2つのsnRNAのSm結合コンセンサス配列へと変換することにより、スプライソソームに向け直されたGormanetalProcNatlAcadSciUSA959:4929-341998。好ましい実施形態においては、天然のSm結合部位を配列番号2の配列のSmOPTドメインで置換することにより、U7snRNAの核内濃度を増加させながら、ヒストンpre-mRNAの成熟を不活性化するために、Sm結合部位の配列が修飾されている。SmOPTドメインに加え、U7は、ヒストンpre-mRNAの3’末端にアンチセンスである配列を含む。この配列が別の標的pre-mRNAにアンチセンスである配列に置換されている場合、U7は新たな標的pre-mRNAへと向け直される。従って、smOPTドメイン及びアンチセンス配列を含む修飾型U7snRNAの安定発現は、様々な標的mRNA構造の配列特異的修飾をもたらしたSuteretalHumMolGenet813:2415-231999;VaceketalBlood1011:104-112003。最近になって、本発明者らは、適切に修飾されたマウスU7遺伝子をその天然のプロモーター及び3’要素と共に含むAAV-2/1ベースのベクターの送達後の、骨格筋への高効率な遺伝子導入及び完全なジストロフィンレスキューを示したGoyenvalleetalScience306:1796-17992004。一態様において、本発明の修飾型U7snRNAは、標的pre-mRNAの少なくとも一部へのアンチセンスであるポリヌクレオチドを含む。本明細書中、標的pre-mRNAの少なくとも一部のアンチセンスとは、その配列が標的pre-mRNAの前記一部の配列に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。それ故、この配列は、少なくとも1つのエクソンのスプライシング部位に向けられたアンチセンスでありうる即ち、それは前記エクソンのスプライシングを妨害することができる。アンチセンス配列は、好ましくはpreferentially、以下からなる群から選択される少なくとも1つの配列に相補的な配列である:5’スプライス部位ドナー部位;3’スプライス部位アクセプター部位;イントロン性BP分岐点BranchingPoint配列;及び随意に内部プリンリッチ配列、より具体的にはエクソン内部スプライシングエンハンサーESE、及びイントロン性スプライシングエンハンサーISE配列。別の実施形態において、エクソンインクルージョンが望まれる場合、アンチセンス配列は、好ましくは、イントロン性サイレンサー配列ISS又は末端ステムループTSLに相補的な配列である。更に好ましい実施形態において、標的mRNAは、その機能が神経筋疾患において改変されるタンパク質をコードしている。更により好ましい実施形態において、前記タンパク質はジストロフィン、DMPK、SMN1又はSMN2である。本明細書中で使用される場合、スプライシングとは、イントロンが除かれ、エクソンが連結される、転写後のpre-mRNAの修飾をいう。スプライシングは、スプライソソームと呼ばれる、5つのsnRNPで構成される大きなRNA-タンパク質複合体によって触媒される一連の反応において起き、イントロン内では、3’スプライス部位、5’スプライス部位、及び分岐部位がスプライシングに必要である。snRNPのRNA成分は、イントロンと相互作用し、触媒反応に関与し得る。本明細書中で使用される場合、用語イントロン性スプライシングエンハンサーISE、イントロン性サイレンサー配列ISS、末端ステムループ及びエクソン内部スプライシングエンハンサーESEは、それぞれイントロン及びエクソン内の配列要素をいい、それらは、pre-mRNA内でのトランス作用性タンパク因子の結合により選択的スプライシングを制御し、それによりスプライス部位の差次的な使用をもたらすBurattietalNucleicAcidsRes3412:3494-5102006;WangandBurgeRNA14:802-8132008。本明細書中、エクソンスキッピングという用語は、構成的スプライシングの修飾によって成熟mRNAからエクソンを排除する過程を意味する。それは、pre-mRNA内のエクソン定義配列に相補的であるアンチセンス配列本発明の修飾型U7snRNA内に含まれるものなどを使用することによる、標的化されたエクソンのスプライシングに関与する鍵となる配列のマスキングを含む。上で論じたように、エクソンスプライシングは、ほぼ全長の半機能的なジストロフィンタンパク質を回復させるために有用であり得るWoodetalPLoSGenet36:e1092007;DuGattiCurrOpinMolTher112:116-232009;しかしながら、それは読み枠を維持することなくエクソンを排除することにより、タンパク質を発現抑制することsilencingのためにも使用され得る。用語エクソンインクルージョンとは、本明細書中で使用される場合、スプライシング欠損に起因して、さもなくば成熟mRNAから除外されたであろうエクソンの、完全にプロセシングされたmRNAへの包含をもたらす過程に関連する。それは通常、ISS及び/又はTSLに相補的であるアンチセンス配列本発明の修飾型U7snRNA内に含まれるものなどを使用して、pre-mRNA内の前記ISS及び/又はTSLをマスキングすることを含む。別の実施形態において、本明細書中に詳述される標的pre-mRNAの少なくとも一部は、トリヌクレオチドリピート伸長である。更に好ましい実施形態において、トリヌクレオチドリピートはCUGである。なお更に好ましい実施形態において、アンチセンスは、少なくとも15リピートのトリヌクレオチドCAGを含む。別の好ましい実施形態において、標的pre-mRNAは、その機能が神経筋ジストロフィーにおいて変化するタンパク質をコードしている。更により好ましい実施形態において、前記タンパク質はジストロフィン又はDMPKである。本発明者らは、U7snRNAの内因性アンチセンス配列を、標的pre-mRNAの少なくとも一部にアンチセンスである配列で置換することは十分でないことを見出した。アンチセンス配列とU7ループとの間でのハイブリダイゼーションによる相互作用が必要である。本明細書中、U7ループとは、塩基が対合していないU7snRNAのドメインを意味する。好ましくは、U7ループは、配列番号1のヌクレオチド12とヌクレオチド20との間に含まれるU7分子の一部からなる。本発明に従う効率的なアンチセンス配列は、U7ループとハイブリダイズすることができる。本明細書中、ハイブリダイゼーションとは、相補的な塩基間の水素結合の形成を意味する。アンチセンスとU7ループの間の相互作用は、修飾型U7snRNAの正しい折り畳みを可能にする。当業者は、適切で安定な折り畳みを保証するために、アンチセンスとU7ループの間のハイブリダイゼーションが最小限の強度を必要とする即ち、最小限の数の連続した塩基が相互作用に関与するべきであることを容易に理解するであろう。アンチセンス-U7ループ相互作用に関与する塩基の数が多くなるほど、この相互作用が強くなることは明白である。好ましくは、塩基の数は少なくとも3つである;より好ましくは、少なくとも4つである。なお更に好ましい実施形態において、相互作用に関与するU7ループの塩基は、ACUUである。別の更に好ましい実施形態において、相互作用に関わるU7ループの塩基は、GCUUUである。本発明者らは、U7ループとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドキスドメインを前記アンチセンス配列に付加することによって、非効率的なアンチセンス配列を正すことが可能であることも見出した。前記キスドメインは、U7ループとハイブリダイズすることができる、いくつかのヌクレオチドを含む。好ましくは、キスドメインは、少なくとも3個のヌクレオチドを含む、より好ましくは、少なくとも4個のヌクレオチドを含む。なお更に好ましい実施形態において、キスドメインは、AAGU、GAGU、GGGU及びAGGUから選択される配列を有する。別の更に好ましい実施形態において、キスドメインは、GCAGU、GAAGU、GCGGU、GGAGU、GAGGU及びGGGGUから選択される配列を有する。本発明は、上記のような修飾型U7snRNAをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドも対象にする。本発明に従う遺伝子は、生物学的な産物即ち、RNA、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする任意の核酸分子である。それ故、本発明の文脈の中で、遺伝子としては、gDNA、cDNA又は合成若しくは半合成のDNAが挙げられる。特に、本発明に従う遺伝子は、1つ以上の天然に存在するか又は人工的に産生された非翻訳領域複数可を含む、生物学的な産物をコードする任意の核酸でありうる。遺伝子が、本発明の修飾型U7snRNAを直接コードする配列に限定されず、その発現に必要な調節要素の制御下にある場合が、最も有用である。従って、本発明は、上記修飾型U7を含む遺伝子であって、調節配列と融合されている前記遺伝子を包含する。多くの強力な構成的プロモーターが当業者に公知である。例えば、当業者は、EisenbergらTrendsinGenetics19:362-3652003に記載されたヒトハウスキーピング遺伝子のプロモーターのいずれかを使用し得る。しかしながら、本発明の修飾型U7snRNAの適切な発現を保証するために、内因性のU7プロモーターを使用することがより有利である。なおより有利には、プロモーターは、ヒトU7プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、プロモーターは、配列番号3の配列を有するヒトU7プロモーターである。invivoで有効な治療用therapeuticRNA分子を得るために、いくつかの重要なパラメーターが考慮された。これらのRNAの遺伝子が高レベルの発現を生み出す効率的なプロモーター下にクローニングされなければならないだけでなく、加えて、治療用RNAが組み込まれているRNAの状況は、安定性及び特定の細胞内局在を提供するべきである。更に、下流配列は、本発明の修飾型U7snRNAの正しい転写終結部位を決定するのを助けるべきである。それ故、本発明の遺伝子は、内在性U7遺伝子の3’調節配列も含む。使用されるU7遺伝子がヒト遺伝子である場合、該ヒト遺伝子の下流配列を使用することが有利である。特に、配列番号4の配列によって表される、前記ヒト遺伝子の下流配列の230ヌクレオチドを使用することが最も有利である。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、修飾型U7snRNAをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。この遺伝子は、上で詳述したように、適切なプロモーター配列の制御下で有利にクローニングされうる。また、本発明のベクターに修飾型U7snRNA遺伝子の下流の適切な3’配列を挿入することは有益である。エクソンenexonが読み飛ばされることを保証するために、同一のベクターにおいて、別個の標的好ましくは5’ドナー部位及びBP配列に対するアンチセンス配列を有する2つの修飾型U7snRNAを使用することは有用であり得る。少なくとも2つの別個のエクソンのスプライス部位に対するアンチセンス配列も、同一のベクターにおいて結合され得る。或いは、いくつかのコンストラクトを用いることが可能であるそれぞれ別個のアンチセンス配列を保持し、前記配列は1つ又はいくつかのエクソンに向けられている。実際には、いくつかのアンチセンス配列同一のエクソン若しくはいくつかの別個のエクソンに向けられるか又はエクソン及びイントロンに対して向けられるが結合される場合、以下の場合があり得る:-アンチセンス配列が同一の修飾型U7snRNA内に挿入されており、前記snRNAがただ1つのベクターによって保持されている、又は-アンチセンス配列が異なるU7snRNAに挿入されており、各snRNAが1つのベクターによって保持されている。本発明のベクターの起源は、ウイルス由来又は非ウイルス由来のいずれかであり得る。非ウイルスベクターとしては、プラスミドが挙げられる。そのようなプラスミドは、安全面の理由から、患者の中では複製することができない条件付複製プラスミドであり得る。これらのプラスミドは、特許PCT出願WO97/10343及びWO2009/027351に記載されたプラスミドに基づき得る。裸のプラスミドDNAは、筋肉細胞へと直接注入され得るかWolffetalScience247:1465-14681990、又は組織へと照射される金粒子へ付着され得るChengetalProcNatlAcadSciUSA90:4455-44591993。非常に効率的というわけではないが、これはinvivoでの長期の低レベル発現をもたらすことができる。プラスミドDNAは、陽イオン性分子負に荷電した核酸と共に自発性の複合体を形成するに基づく、自己集合系と呼ばれる非ウイルス性遺伝子送達ベクターを用いることでも、細胞へとトランスフェクションされ得るEliyahuetalMolecules10:34-642005。本発明の好ましい態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルス生活環の複製期に必要な遺伝子非必須遺伝子を目的の異種遺伝子で置換することによって、組換えウイルスベクターは、それが通常感染するであろう細胞型に形質導入することができる。そのような組換えウイルスベクターを製造するために、非必須遺伝子は、パッケージング細胞株のゲノムへと組み込まれるか又はプラスミド上でかのいずれかで、トランスに提供される。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスAAV、レンチウイルス、又は単純ヘルペスウイルス1HSV1等のウイルスに基づくいくつかのベクターが、遺伝子治療に使用可能である。それらの全てが本発明に包含される。アデノウイルスベクターは現在、ヒトにおける遺伝子治療において、最も頻繁に使用されているウイルスベクターである。いわゆる第三世代又はガットレスgutlessアデノウイルスベクターLindermannandSchnittlerThrombHaemost102:1135-11432009の使用が、本発明における使用に好ましい。当業者は前記アデノウイルスベクターの特徴及び使用を完全に承知しているため、前記ベクターが本明細書に詳述される必要はない。或いは、当業者は、レンチウイルスベクターを使用して、本発明の修飾型U7snRNAを送達し得る。好ましくは、前記レンチウイルスは、自己不活性化SINレンチウイルスである。それでも尚、任意のレンチウイルスベクターが本発明の文脈の中で使用されうる。レンチウイルスベクターの構築及び操作は、当業者に周知である。本発明に従う好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス又はAAVに基づく。8つの血清型の中で、本発明に従って神経筋疾患を治療するために使用されるAAVは、好ましくはAAV1即ち、そのカプシドが血清型1であるである。AAV1は、筋肉細胞の形質導入に最も効率的であることが示されている。一方、導入遺伝子に結合されるウイルス起源の配列特にITRは、好ましくは、AAV2起源のものである。結果として得られる本発明のAAVに基づくベクターは、好ましくは、2/1偽型を有する。しかしながら、当業者は、本発明がこの特定のベクターに限定されないことを容易に理解するであろう;実際、全てのAAV血清型は、本発明における使用に同様に適している。例えば、AAV6、AAV8又はAAV9も横紋筋細胞を効率的に形質導入し、一方AAV5は脳における神経細胞の形質導入において高効率であるMarkakisetalMolecularTherapy18:588-5932010;それ故、それらの全ては、本発明の文脈の中で成功裏に使用され得る。アデノウイルスベクター及びレンチウイルスベクターのように、上記AAVに基づくベクターは、すでに、遺伝子治療の目的で、当業者によって広く使用されている例えば、MichelfelderandTrepelAdvGenet67:29602009を参照されたい;それ故、前記AAVベクターの構築方法及び使用方法を詳述する必要はない。本発明に従うベクターは、invitro適用及び/又はexvivo適用においても使用され得る。本発明のベクターは、好ましくは、標的筋肉における直接注入によって、或いは全身性の静脈内、動脈内送達、又は脳若しくは脳脊髄液への送達によって使用されるが、それらは、例えば患者から採取された分化した筋肉細胞において直接的に、invitroで潜在的なアンチセンス配列の効率を試験するためにも使用され得る。更に、これらのベクターが、筋肉分化が可能な細胞例えば、筋芽細胞又は別の筋原幹細胞CD133細胞TorrenteetalCellTransplant166:563-772007、SMALD細胞VauchezetalMolTher1711:1948-582009、メソアンジオブラストmesangioblast細胞、若しくは周皮細胞などこれらの全ては筋肉細胞の前駆細胞であるへのトランスフェクションに導入される場合、次いで、前記トランスフェクションされた細胞は、患者に移植され得る。当該分野の方法により多能性幹細胞又はiPSへと形質転換したヒト細胞を使用することも可能である例えば、TakahashietalCell131:861-8722007;YamanakaCellStemCell11:39-492007;ParketalNature4517175:141-62008;ParketalNatProtoc37:1180-62008;EP2096169;WO2008118820;US20080280362を参照されたい。従って、前記iPSは、本発明のベクターによってトランスフェクションされ、患者に移植され得る。従って、本発明は、本発明のベクターによってトランスフェクションされた単離された真核細胞も包含する。前記細胞は、好ましくは、血液由来若しくは骨格筋由来の筋原細胞、筋芽細胞、又は筋肉分化が可能な細胞である。本発明の特定の実施形態において、筋肉分化が可能な細胞は、人工多能性幹細胞inducedpluripotentstemcellである。本発明はまた、治療有効量の本発明のベクター及び医薬上許容される担体を含む、神経筋疾患の治療のための治療組成物に関する。別の態様において、ベクターの代わりに、本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体のみならず、上記のように本発明のベクターによってトランスフェクションされた有効量の細胞を含む。一実施形態において、前記医薬組成物は、以下の疾患を含むしかしこれらに限定されない神経筋疾患の治療用である:デュシェンヌ型DMD、ベッカー型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性特にDM1、眼咽頭型、遠位型、エメリドレフュス型、及びSMA。より好ましくは、本発明の治療組成物は、DMD、DM1又はSMAを治療するのに使用される。本発明は、以下を含む医薬組成物を提供する:a有効量の本発明のベクター又はトレンスフェクションされた細胞、及び;b不活性又は生理学的に活性でありうる、医薬上許容される担体。本明細書中で使用される場合、医薬上許容される担体としては、生理学的に適合性のあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤などが挙げられる。適切な担体、希釈剤及び/又は賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせの1つ以上が挙げられる。多くの場合、組成物中に、糖、多価アルコール、又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましいであろう。特に、適切な担体の関連例としては、以下が挙げられる:1ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水pH~7.4、約1mg/mlから25mg/mlのヒト血清アルブミンを含むか又は含まない、20.9生理食塩水0.9w/v塩化ナトリウムNaCl、及び35w/vブドウ糖;トリプタミン等の抗酸化剤及びTween20等の安定化剤も含み得る。本発明のベクターがSMAを治療するよう意図されている場合、マンニトールは周知の血液脳関門妨害剤interruptiveであることから、マンニトールを担体として使用することが可能であるFuetalMolecularTherapy8:911-9172003。本明細書中の組成物は、特定の疾患が治療されるために必要に応じて、更なる治療薬剤も含み得る。例えば、前記組成物は、修飾型U7snRNAの遺伝子を保持するベクターに加え、別の修飾型U7snRNA遺伝子を含む第二のベクターを含み得る。前期修飾型U7遺伝子は、上記のように、同一のエクソンに若しくは異なるエクソンに向けられたか、又はエクソン及びイントロンに向けられたアンチセンスを含み得る。本発明の組成物は多様な形態でありうる。これらとしては、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は目的とする投与及び治療への応用の様式に依存する。治療目的を達成するための、本発明に従う組成物の投与は、標的心筋組織への、局所投与、筋肉内投与、局所領域投与、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、心筋内投与、心膜投与、心外膜投与若しくは経冠動脈内viaintracoronary投与によるか、又は脳内投与によるか若しくは脳脊髄液への投与によるものであり得る。好ましくは、心筋内投与、心外膜投与、心膜投与又は冠動脈内投与は、針又はカテーテルを使用して行われる。典型的な好ましい組成物は、注入可能又は不溶解性infusibleの溶液の形態である。本発明の一実施形態に従い、本発明のベクターは、標的ジストロフィー筋肉組織に局所的な様式で投与される。別の実施形態において、本発明のベクターは、脳内投与されるか又は脳脊髄液へと投与される。投与の部位は、本発明のベクターが治療することを意図している病態に依存するであろう:筋肉への投与は、神経筋ジストロフィーに最も効果的であろうことは明らかであり、一方、脳又は脳脊髄液への投与は、SMAに特に有用であろう。標的組織にベクターを投与する任意の適切な手段が、本発明の文脈の中で使用され得るが、好ましくは、そのような標的筋肉組織、脳、又は脳脊髄液への局所的な注入は、針を使用してベクターを筋肉、脳、又は脳脊髄液へ直接注入することによって達成される。用語注入することinjectingは、ベクターが標的組織に強制的に導入されることを意味する。任意の適切な注入装置が本発明に従って使用され得る。本発明のベクターがジストロフィー筋肉へ又は脳へ若しくは脳脊髄液へ直接注入される場合、医薬組成物は、好ましくは液体の形態である。注入のための無菌の組成物は、適切な溶媒中に必要量の本発明のベクターを取り込み、続いて精密濾過によって無菌化することにより調製され得る。溶媒又は媒体として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、並びにこれらの組み合わせが使用され得る。多くの場合、組成物中に、糖、多価アルコール、又は塩化ナトリウム等の等張剤を含むことが好ましいであろう。これらの組成物は、アジュバント、特に湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤及び安定化剤も含有し得る。注入のための無菌の組成物は、使用時に無菌の水又は任意の他の注入可能な無菌の媒体中に溶解され得る無菌の固体組成物の形態でも調製され得る。1日当り、体重1キログラム当り、約0.1mgから約140mg程度の投与量レベルが、上記状態の治療に有用である1日当り、患者1人当り、約0.5mgから7g。有効な用量は、神経筋疾患を患っている所定の対象の体重及び状態に依存して変わるが、所定の対象及び状態のための適切な用量を決定することは、当業者の技術範囲内であるとみなされる。本発明の修飾型U7snRNAは、細胞タンパク質の正常な機能を回復するために有用である。より具体的には、本発明の修飾型U7snRNAは、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なmRNAの根絶を促進することができ、それ故結果として生じる細胞タンパク質は、完全に又は少なくとも部分的に機能的である。故に本発明は、細胞を本発明のベクターと接触させる工程を含む、エクソンスキッピング、エクソンインクルージョン、又は有害なmRNAの根絶によって細胞タンパク質の機能を回復する方法にも関する。本発明の修飾型U7snRNAの使用は、それ故、特定の種類の病態に限定されず、スプライシング欠損に起因する任意の疾患の治療に応用され得る。それでも本願の文脈の中で、前記細胞タンパク質は、好ましくは、その機能が神経筋疾患において改変されるタンパク質である。なおより好ましくは、前記細胞タンパク質は、ジストロフィン、DMPK又はSMNである。従って本発明は、有効量の本発明のベクターのいずれかを、好ましくは上記のような医薬組成物で、投与することによって筋肉疾患を治療する方法も提供する。従って本発明は、本発明のベクターの医薬としての使用にも関する。より具体的には、本発明のベクターは、以下の疾患を含むしかしこれらに限定されない神経筋疾患を治療するための医薬として使用される:デュシェンヌ型DMD、ベッカー型、肢帯型、先天性、顔面肩甲上腕型、筋緊張性特にDM1、眼咽頭型、遠位型、エメリドレフュス型、及びSMA。より好ましくは、本発明のベクターは、DMD、DM1又はSMAを治療するため使用される。本発明は、例えば、神経筋疾患の治療のための、1つ以上の記載したベクター及び前記ベクターの使用のための説明書を含む、キットも含む。説明書は、ベクターをinvitro、invivo又はexvivoで使用するための指示を含み得る。典型的には、キットは、ベクターを含む区画を有するであろう。ベクターは、凍結乾燥形態、液体の形態、又はキット中に含められるのに適している他の形態であり得る。キットは、キット中の説明書に記載されている方法を実施するために必要な追加要素、凍結乾燥粉末を再構成するための無菌の溶液、患者に投与する前にベクターと合わせるための追加の薬剤、及び患者にベクターを投与するのを助ける道具なども含み得る。実験例修飾型hU7-snRNAを使用することによるDM1における変異型mRNAの選択的破壊材料及び方法細胞培養ヒト筋肉細胞を、倫理規定に関するフランスの法律に従って、EdometalDevBiol164:219-2291994に記載されたように、骨格筋の生検又は剖検から単離した。野生型WT及びDM1筋芽細胞を、20FCS及び5μg/mLゲンタマイシンInvitrogenを補充したハムF10培地中で、5CO2及び37°Cで培養した。分化を引き起こすために、サブコンフルエント培養物から増殖培地を除き、10μg/mLインスリン及び100μg/mLトランスフェリンSigmaを補充したDMEM培地によって置換した。伸長されたDMPK対立遺伝子上にBpmI制限酵素部位多型を含むDM1線維芽細胞HamshereetalProcNatlAcadSciUSA94:7394-73991997を、以前に記載されたような誘導性MoodシステムChaouchetalHumGeneTher20:784-7902009を使用して、不死化し、筋肉細胞へと転換した。レンチウイルス作製及び形質導入自己不活性化HIV-1ベースレンチウイルスベクター、pRRL-hU7-CAGnは、以前に記載されたpRRL-cPPT-hPGK-EGFP-WPREベクターFollenzietalNatGenet25:217-2222000から作り出した。VSV-G-偽型ベクターは、293T細胞の一過性トランスフェクションによって作製したCharrieretalGeneTher12:597-6062005。ウイルス粒子を含有する馴化培養液を回収し、超遠心によって濃縮した。ベクター力価ベクターゲノムvgmLは、CharrieretalGeneTher12:597-6062005に記載されたように、感染した細胞のゲノムDNAについての定量PCRによって決定した。1x106から1x107vg/mLを使用して、1.5x105のヒト筋肉細胞を形質導入した。ベクターの形質導入は、4μg/mlのポリブレンSigmaの存在下で一晩行ない、形質導入された細胞を解析の前に少なくとも1週間培養し、増殖させた。RNA単離及びノザンブロット細胞を、プロテイナーゼK緩衝液500mMNaCl、10mMTris-HCl、pH7.2、1.5mMMgCl2、10mMEDTA、2SDS及び0.5mg/mLのプロテイナーゼK中で、45分間、55°Cで溶解した。その後、RNAを、製造者のプロトコールに従ってTRIzol試薬Invitrogenを使用して単離した。RNAはNP-40存在下での低張溶解によって、以前に記載されたようにHamshereetalProcNatlAcadSciUSA947394-73991997調製した核及び細胞質画分からも単離した。ノザンブロット解析のために、8~10μgのRNAを、0.66Mホルムアルデヒドを含有する1.3アガロースMOPS-ゲル上で分離し、10xSSCを用いたキャピラリートランスファーによって、Hybond-N膜AmershamPharmaciaBiotech上にトランスファーした。ブロットを、ハイブリダイゼーション緩衝液2SDS、10デキストラン硫酸、1xSSPE、10μg/mlサケ精子DNA、2デンハート中で、68°Cで一晩、ランダムプライム法で32P標識したDMPKcDNAのBglII-SacI断片プローブを用いてハイブリダイズさせた。シグナルをホスフォイメージャーphospho-imagerMolecularImagerFX、Bio-Radで解析し、QuantityOneBio-Radを使用して定量した。全ての値を、5’末端32P標識18SrRNA-オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション後の18SrRNAシグナルに対して標準化した。RT-PCR解析製造者のプロトコールInvitrogenに従い、全量20μL中で、1μgのRNAをcDNAへと逆転写した。続いて、1μLのcDNA調製物を、標準的手順に従いReddyMix、ThermoScientific、半定量PCR解析に使用した。PCR増幅は、それぞれの遺伝子についての増幅の直線範囲内で、20~35サイクル行った。GAPDHのシグナルを標準化のために使用した。PCR産物を、エチジウムブロマイドで染色された1~3アガロースゲル上で解析した。定量は、QuantityOneソフトウェアBio-Radを使用して行った。選択的スプライシング解析について、選択した遺伝子及びエクソンは、DM1患者の筋肉において改変されると以前に記載されている:DMDジストロフィンのエクソン78NakamorietalMuscleNerve36:251-2572007、LDB3サイファーのエクソン7LinetalHumMolGenet15:2087-20972006及びBIN1ブリッジングインテグレーター1のエクソン11Hammeretal投稿中。エクソンインクルージョンの割合を定量し、アイソフォームのシグナルの全強度と比較したインクルージョンのパーセンテージとして表した。DMPK解析については、DMPKの2つの対立遺伝子を区別するために、HamshereetalProcNatlAcadSciUSA94:7394-73991997に記載されたように、6μLのPCR混合液を、2.5ユニットのBpmINewEnglandBiolabsを含有する25μlの切断混合液に入れ、37°Cで一晩インキュベートした。以下のプライマーを使用した:GAPDH-F、TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT配列番号5GAPDH-R、GATGACAAGCTTCCCGTTCTCAGCC配列番号6U6snRNA-F、CTCGCTTCGGCAGCACA配列番号7U6snRNA-R、AACGCTTCACGAATTTGCGT配列番号8DMPKexon9-exon10-F、CACTGTCGGACATTCGGGAAGGTGC配列番号9DMPKexon9-exon10-R、GCTTGCACGTGTGGCTCAAGCAGCTG配列番号10DMPKintron9-intron10-F、CTACCCACAGGCCAGAAGTT配列番号11DMPKintron9-intron10-R、GGAAGCCCTCACCTTTTCTC配列番号12DMPKsplicejunctionexon14/16-exon16-F、CTGCTCCCTGCCAGGGCTGA配列番号13DMPKsplicejunctionexon14/16-exon16-R、TGTCGGGGTCTCAGTGCATCCA配列番号14CPA6-F、ACTGATGTCCATATCCCCCA配列番号15CPA6-R、TTTGAGTCGTGATCGTCTGC配列番号16LTBP3-F、GAGAAGAGCCTGTGTTTCCG配列番号17LTBP3-R、GAAAAGTCACTCTCGCCCTG配列番号18LRP8-F、CTCCACTGACTTCCTGAGCC配列番号19LRP8-R、GTGCTCGGTAGCACCTCTTC配列番号20TMCC1-F、GAGCAAAGGTGACTGGCTTC配列番号21TMCC1-R、CGCTCCTCCTGTAAGGTCTG配列番号22CASK-F、CAGAGTTCGGCTGGTACAGT配列番号23CASK-R、ACAGGACGAAGACTGAGTGC配列番号24MAP3K4-F、AAGGGCACGTATAGCATTGG配列番号25MAP3K4-R、TGGTTCTCCAGCAGGTCTCT配列番号26BIN1-exon11-F、AGAACCTCAATGATGTGCTGG配列番号27BIN1-exon11-R、TCGTGGTTGACTCTGATCTCGG配列番号28DMD-exon78-F、TTAGAGGAGGTGATGGAGCA配列番号29DMD-exon78-R、GATACTAAGGACTCCATCGC配列番号30LDB3-exon7-F、GCAAGACCCTGATGAAGAAGCTC配列番号31LDB3-exon7-R、GACAGAAGGCCGGATGCTG配列番号32FISH及び免疫蛍光法蛍光insituハイブリダイゼーションFISHは、Cy3標識ペプチド核酸CAG7プローブを使用して、TanejaBiotechniques24:4724761998に記載されたように行った。核1つ当りのフォーカスの数を決定するために、500を超えるDM1細胞を、少なくとも3回の独立した実験において数えた。FISH免疫蛍光法IF複合実験は、MBNL1モノクローナル抗体G.Morrisによって開発されたMB1aHoltetalAmJPathol174:216-2272009、続いてAlexa488結合ヤギ抗マウスInvitrogen二次抗体を使用して、KleinetalExpCellRes314:1652-16662008に記載されたように行った。画像は、Leica共焦点顕微鏡及びソフトウェアLeicamicrosystemsを使用して取得し、AdobePhotoshopソフトウェアAdobeSystemInc.を用いて加工した。融合指数解析については、デスミンD33、DAKO抗体を使用して、JacqueminetalJCellSci120:670-6812007に記載されたように、分化した筋肉細胞についてIFを実施し、Hoechst33258Sigmaを用いて核を対比染色した。1500を超える核を数え、融合指数を、デスミン陽性細胞における核の総数のパーセンテージとして、分化した筋管>2筋核における核の数により、決定した。ウェスタンブロッティングウェスタンブロッティングは、以前に記載されたようにFurlingetalAmJPathol162:1001-10092003、DMPK抗体MANDM1を使用して標準的な方法で実施した。統計解析集団のデータは、平均/-SEMとして表した。集団間比較は、GraphPadPrism4ソフトウェアを使用して、独立スチューデントt検定図1b、1c、5及び6及びニューマン-クールズ検定図2a、2b、2cにより実施した。P<0.05、P<0.05;、P<0.01;、P<0.001である場合、集団間の差を有意であるとみなした。結果本発明者らは、pre-mRNAスプライシング現象の阻害とは異なる修飾型hU7-snRNAの新規機能を説明する。DMPK転写産物の3’ドメインの伸長されたCUGnトラクトを標的とするポリCAG配列を含むhU7-snRNAは、野生型対立遺伝子の産物に影響することなく、変異DMPKmRNAの特異的な核内nuclear分解を引き起こした。筋緊張性ジストロフィーの原因であるRNA機能獲得型毒性の消失は、非コードリピート伸長疾患における遺伝子サイレンシングのためのhU7-snRNAの使用を支持する。1型筋緊張性ジストロフィーDM1は、成人において最も一般的な神経筋ジストロフィーであるHarperMyotonicdystrophyThirdEdnWBSaunderLondon2001。DM1は、優性遺伝性疾患であり、RNA機能獲得型疾患のグループに属しShinetalMSNeurosciLett466:99-1022009、DMプロテインキナーゼDMPK遺伝子の3’非翻訳ドメインにおける伸長されたCTGリピートに起因するBrooketalCell687991992。数千までの伸長されたCUGリピートCUGexpを含む変異DMPK転写産物は、核内に捕捉されるDavisetalProcNatlAcadSciUSA94:7388-73931997。そのような蓄積は、選択的スプライシングの調節を変化させ、続いていくつかのmRNA転写産物の誤ったスプライシング及び神経筋機能障害をもたらすRanumetalAnnuRevNeurosci:29259-2772006。実際に、CUGexp-DMPKmRNAは、それらがRNA結合タンパク質と結合し、安定なリボ核タンパク質複合体又はフォーカスを形成するように、折りたたまれるMilleretalEMBOJ19:4439-44482000。これらの複合体は、主にmuscleblind-like1MBNL1タンパク質を隔離し、この必須のmRNAスプライシング制御因子の機能喪失を確実にするLinetalHumMolGenet15:2087-2097:2006。DM1における表現型レスキューの戦略は、マウスDM1モデルにおいてCUG伸長を標的とする合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して評価されてきたWheeleretalScience325:336-3392009;MuldersetalProcNatlAcadSciUSA106:13915-139202009。これらの研究は、CUGexp-mRNAを妨害及びアンフォールドしてMBNL1をフォーカスから遊離させ、次いでそれをその全体的なスプライシング機能に利用可能にすることを目的として、モルフォリノ又は2’-O-メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのいずれかの局所送達を使用した。しかしながら、合成オリゴの使用は、繰り返しの処置を必要とする。この問題を克服するために、本発明者らは、効率的で持続性の効果を保証するために、CAGアンチセンス配列を含む最適化されたヒトhU7-snRNAを設計した。ヒトU7遺伝子を含む約0.5kbの断片を、ヒトゲノムDNAから増幅した。hU7-snRNA転写産物を、以前に記載されたように最適化したGoyenvalleetalScience306:1796-17992004。まず、そのSm結合ドメインを、効率的なsnRNPの集合を可能にし、その核内蓄積を増加させる適切なSmタンパク質と結合するように、U2-snRNASm-Opt由来の標準的なSm配列StefanovicetalNucleicAcidsRes23:3141-31511995によって置き換えた。続いて、hU7-snRNAの天然ヒストンpre-mRNA相補配列を、ポリCAGによって置き換えた図1a。操作されたhU7-snRNA-CAGnhU7-CAGnは、その天然のプロモーター及び3’下流要素の制御下に維持した図3。次いで、このコンストラクトを、ヒト骨格筋細胞への高効率な遺伝子導入のためにレンチウイルス骨格へとクローニングした。選ばれたCTG伸長を有するDM1患者から単離された筋肉細胞を、最適化されたhU7-CAG1515CAGリピートを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。これらの細胞において、正常な対立遺伝子は、37リピート未満を示し、一方変異対立遺伝子は、200から2000リピートの範囲にわたるCTG伸長を示した。形質導入された細胞を、DMPKmRNA安定性を評価する前に、少なくとも1週間培養し続けた。ノザンブロット解析によって、伸長されたDMPK転写産物の定常状態レベルが、hU7-CAG15を発現するDM1細胞において71から82有意にP<0.001減少したことが示された図1b。伸長されたDMPKmRNAの消失は、ベクター用量依存的な様式で起こった図4a。重要なことに、正常なDMPKmRNAは維持された。この現象は、13/18CTGリピートを有する野生型筋芽細胞においても確認された図5。更に、エクソン15及びCUGトラクトの両方を欠く、正常DMPKアイソフォームE14/16TiscorniaetalMolCell5:959-9672000の選択的スプライシングは、hU7-CAG15によって影響を受けず図6a、処理したDM1細胞においてDMPKタンパク質レベルの変化はみられなかった図6b。hU7-CAGn系の使用が、細胞継代を通して有害な転写産物の継続的且つ恒久的な標的破壊を維持することを可能にしたことも特筆すべきである。変異型DMPKmRNAの消失を更に評価するために、本発明者らは、通常DM1の核内に多数のフォーカスとして蓄積するCUGexpリボ核タンパク質複合体を調べた。予期されたように、蛍光insituハイブリダイゼーションFISH解析によって、処理したDM1筋芽細胞におけるこれらの核内構造の用量依存的な劇的な消失が示された図1c及び図24b。hU7-CAG15で処理したDM1筋芽細胞の60までがフォーカスを示さなかったP<0.001。この細胞集団の更なる25は、単一のかすかなフォーカスのみを示した。また、細胞質コンパートメントにおいては残存フォーカスが観察されなかった。伸長された対立遺伝子上に制限酵素部位多型を含むDM1細胞HamshereetalProcNatlAcadSciUSA94:7394-73991997の核及び細胞質のRNA分画によって、変異型転写産物が核内に保持され、細胞質に運び出されないことが確認された図1d。hU7-CAG15の存在下において、CTGexp対立遺伝子からの転写産物は、細胞質画分においては検出されず、このことは核内でのCTGexp-mRNAの選択的分解のメカニズムの存在を実証する。著しいことに、このメカニズムはDMPKmRNAに関係せず、このことはhU7-CAG15がmRNA生成のレベルではなくフォーカスのレベルで作用したことを示唆する。CAGアンチセンス配列の長さの効果を評価するために、本発明者らは、短縮したCAG配列7及び11リピートを含む更なるhU7-snRNAコンストラクトを設計した。それらの全てが、DM1細胞においてCUGexp-DMPKmRNAを標的とし、効率的にサイレンシングしたP<0.01。しかしながら、これらの短縮されたコンストラクトは、13CUGリピートを含む正常DMPK対立遺伝子産物にも影響を与えたP<0.01図2a。特異性のそのような喪失は、本発明者らに、7から16リピートの範囲にわたるCUGトラクトを有する6つのヒト転写産物も解析することを促した図6。これらの遺伝子産物のうち4つは、hU7-CAG711又は15のいずれかを発現するDM1細胞において影響を受けなかった。それにもかかわらず、CPA67CUG及びLRP811CUG転写産物の発現の変化は、CAGアンチセンス配列の長さの短縮と相関した。重要なことに、より長いCAG15は、CPA6にもLRP8にも有意に影響しなかった。次いで、本発明者らは、hU7-CAG15が、毒性のあるCUGexp-mRNAの病態生理学的な結果を逆転させることができるかを評価した。我々は、MBNL1の隔離及び選択的スプライシングの異常な調節等の、DM1の特徴に着目した。FISH-免疫蛍光法複合解析によって、CUGexp-mRNAをサイレンシングすることが、処理したDM1細胞における、核内CUGexp凝集体からの隔離されたMBNL1の遊離、及びMBNL1の正常な再配置をもたらすことが示された図2b。分化したDM1筋肉細胞において異常なスプライシングを受ける、BIN1、DMD及びLDB3等のいくつかの遺伝子について、DM1のスプライシング誤調節の結果を調べた。これらの遺伝子のスプライシング特性は、hU7-CAG15存在下で有意にP<0.01正常化され、一方、hU7-CAG15は、野生型細胞においてはこれらの遺伝子のスプライシングに影響しなかった図2c。長いCTG伸長を有するDM1筋肉細胞が、分化欠損を示すことも知られているFurlingetalHumMolGenet10:2079-20872001P<0.001。ここで、hU7-CAG15存在下において、処理したDM1筋芽細胞の融合指数は、かなり回復しP<0.01、野生型筋芽細胞のそれと同様のレベルにまでなった図2e。結論として、本発明者らのデータは、U7-CAG系が、有害なCUGexp-mRNAの持続性の選択的破壊を可能にしたことを示す。MBNL1及びおそらく他のmRNA結合因子は、その後フォーカスから遊離し、処理したDM1細胞におけるスプライシング及び分化の改善をもたらした。CAGアンチセンス配列の長さは重要であるように思われる。15CAGリピート未満であると、オフターゲットの発生が、変異型mRNAの破壊によってもたらされる利益を相殺し得る。U7-CAG15がCUGexp-mRNAの選択的破壊を起こしたメカニズムそのものは、完全には決定されていない。操作されたU7-snRNA並びにモルフォリノ及び2’-O-メチルホスホロチオエートそれらは、DM1において成功裏に適用されてきたWheeleretalScience325:336-3392009;MuldersetalProcNatlAcadSciUSA106:13915-139202009は、RNase活性を作動させないはずである。それどころか、これらの化合物は、エクソンスキッピング及びエクソンインクルージョンの両方の戦略において、選択的スプライシングを強制するために一般に使用されるDuGattiCurrOpinMolTher112:116-232009。CAGアンチセンス分子存在下でのCUGexp-DMPKmRNAの選択的破壊は、標準的なRNA干渉メカニズムには基づかないであろう。むしろ、CUGexp-DMPK/CAGnへテロ二本鎖の消失又は加速された核内崩壊は、変異DMPKmRNAの本来の不安定性に起因しているであろう残念ながら未処理のDM1細胞ではMBNL1によって相殺される現象。キスドメインの概要delineation材料及び方法マウス及びAAV注入全ての動物の処置は、機関に承認されたプロトコールに従い、且つ適切な生物学的封じ込めの下で実施した。8週齢mdxマウスに、AAVベクターを含有する50μLのリン酸緩衝生理食塩水をTAへと注入した表1を参照されたい。1ヵ月後、該マウスを殺し、筋肉を回収し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結し、-80°Cで保存した。コンストラクト及び組換えAAVベクター基準のコンストラクトAAV_U7_SD23/BP22は、WO2006/021724中に以前に記載された。修飾型コンストラクトについては、U7ループにおいて、又は仮説上のループ結合に対応するアンチセンス配列において、1から4塩基対を変異導入PCRStratageneによって変化させる詳細な配列については表2を参照されたい。AAV2/1偽型ベクターは、記載したように293細胞におけるトランスフェクションにより調製し、ベクター粒子を、トランスフェクション後48時間で採取した細胞ライセートから塩化セシウム勾配法で精製し、定量ドットブロットハイブリダイゼーションによって力価測定した。力価を表1に示す。組織学筋肉の全長にわたり200μm間隔で切った一連の8μm横断切片を、免疫組織化学によってジストロフィンについて調べたC末端ドメインに対するNCL-DYS2モノクローナル抗体、NovoCastra。マウントした切片を、共焦点レーザー顕微鏡Leicaによって解析した。中間の組織は、mRNA解析のために回収した。RNA解析TRIzol試薬LifeTechnologiesを使用して、プールした中間切片から全RNAを単離した。ジストロフィンmRNAを検出するために、ランダムヘキサマーInvitrogen存在下でSuperscriptII逆転写酵素を用いて、全RNAについて、まず逆転写を行った。次いで、PCRMasterMixPromegaを使用することにより、cDNAについて、ネステッドPCRを行った。最初の反応は、Ex20ext配列番号33:5’-CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG-3’及びEx26ext配列番号34:5’-TTCTTCAGCTTGTGTCATCC-3’プライマーを用いて、30サイクル94°C/30秒;55°C/1分;72°C/2分で行った。次いで、最初の反応の2μLを使用し、Ex20int配列番号35:5’-CCCAGTCTACCACCCTATCAGAGC-3’及びEx26int配列番号36:5’-CCTGCCTTTAAGGCTTCCTT-3’を用いて、25サイクルで増幅させた。PCR産物は、2アガロースゲル上で解析した。結果以下のセクションは、mdxマウスモデルにおいてU7smOPT-エクソンスキッピングを使用することによるジストロフィンレスキューを達成するためのキスドメインの必要性を示す実験を説明する。mdxマウスBulfieldetal1984;RyderCooketal1988は、ジストロフィン遺伝子のエクソン23内に1塩基置換を有し、これはポリペプチド鎖の中途での終結を起こしSicinskietal1989、そのためジストロフィンの全長427KDaの筋肉でのアイソフォームが産生されない。ジストロフィン遺伝子のエクソンフェージングphasingによれば、mRNAスプライシングの過程においてエクソン23を読み飛ばすことによって、短縮されたジストロフィン準ジストロフィンの翻訳が可能であり得る。mdxジストロフィンmRNA上のエクソン23を含むナンセンス変異を読み飛ばすために、多数のアンチセンス配列を設計した。これらの配列をU7smOPTと結合させ、骨格筋への高効率な遺伝子導入のためにAAV1カプシド内にパッケージされたAAV2ベースベクターへ導入した。約10E12ウイルスゲノムの単一ベクター投与で、成体のmdxマウスの前脛骨筋TAの筋肉内に注入し、1ヵ月後にジストロフィンレスキューを解析した図10。キスドメインとループとの間の相互作用を許すコンストラクトのみが、効率的にジストロフィンをレスキューする。