"バチルスズブチルスBacillussubtilisAZ5512菌株FERMP22135。バチルスズブチルスBacillussubtilisAZ5512菌株FERMP22135を用いて製造したことを特徴とする納豆。納豆は、その有する粘質性と納豆臭により、上述したように、これを食することが敬遠されることもあることから、粘質性と納豆臭の減少化が図られて、よりポピュラーな食品としての地位向上が求められている。本願発明者は、1980年頃より納豆菌の研究を開始し、日本全国に亘る古来より有名な納豆生産地の土壌、稲藁を採取して、納豆菌の分離収集を行い、その特性調査を続けてきたところ、採集保有した土壌、稲藁には、納豆菌が一千数百種を越えて生息していたものと思料されるに至った。そこで本発明は、本願発明者の手元にある納豆菌の中から選定を行い、粘質性と納豆臭の少ない納豆を製造することの可能な菌株と、これを用いて製造した納豆を提供することを目的とする。そして、本願発明者は、所有する稲藁から採取した納豆菌を用いて納豆を製造したところ、納豆特有のネバネバ、ヌルヌルした粘質物が少なく、更に納豆特有の納豆臭も少ない納豆を得ることができた。そこで、これを新種納豆菌と思料し、この菌をAZ5512と命名した。そして、AZ5512に対し16SrDNA塩基配列解析及び生理生化学性状試験を行った結果、AZ5512は、バチルスズブチルスBacillussubtilisに属する菌であると同定され、これを独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した受託番号:FERMP22135。本発明によれば、粘質性と納豆臭の少ない納豆を得ることができた。加えて、本発明の納豆菌からは、甘味が多い納豆が得られ、更に、納豆を柔らかくする性格等を備えていたことが判明した。本菌株AZ5512の同定について。本願出願人は、本菌株の16SrDNA塩基配列解析及び生理生化学性状試験を、静岡県静岡市清水区長崎330番地所在の株式会社テクノスルガラボ以下、単に、テクノスルガラボという。に依頼して、以下の試験結果を得た。尚、図及び表において、検体たる本株菌AZ5512のテクノスルガラボにおける登録番号はSIID10004として表記される。また、本願発明者からテクノスルガラボへの検体受渡は2011年4月7日、分離源は土壌、試験結果報告は2011年5月30日になされた。目的16SrDNA16SrRNA遺伝子塩基配列解析、形態観察及び生理生化学性状試験以下、細菌第一段階試験及び細菌第二段階試験と称する。の結果から検体の帰属分類を推定する。方法1.培養条件以下の条件で培養した菌株を供試菌体とした。培地nutrientagar培養温度30°C培養期間24時間2.16SrDNAFull抽出からサイクルシークエンスまでの操作は各プロトコールに基づいた。DNA抽出lnstaGeneMatrixPCRPrimeSTARHSDNAPolymeraseサイクルシークエンスBigDyeTenllinatorv31CycleSequencingKjt使用プライマーPCR増幅9F1510Rシークエンス9F785F802R1510RシークエンスABIPRISM3130xlGeneticAnalyzerSystem配列決定ChromasProl4相同性検索及び簡易分子系統解析ソフトウェア;アポロン20データベース;アポロンDBBA6.0国際塩基配列データベース3.細菌第一段階試験光学顕微鏡による形態観察及びBARROWらの方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸ガス産生、ブドウ糖の酸化醗酵OFについて試験を行った。グラム染色フェイバーGニッスイ日水製薬、東京顕微鏡光学顕微鏡BX50F4オリンパス、東京4.細菌第二段階試験細菌第二段階試験には以下のキットを用いた。また、英国NCIMBLtdとの技術提携事項及び分類同定の関連文献に従い、追加試験を実施した。使用キットAPI50CHB結果1.16SrDNA16SrRNA遺伝子塩基配列解析BLASTを用いたアポロンDBBA60に対する相同性検索、及び、GenBankDDBJEMBLに対する相同性検索の結果、AZ5512SIID10004の16SrDNA塩基配列は、Bacillus属の16SrDNA塩基配列に対し高い相同性を示したが、基準株に由来する16SrDNA塩基配列は検索されなかったので、2種の16SrDNA塩基配列を取得しBLAST相同性検索を行った。その結果、AZ5512SIID10004の16SrDNA塩基配列はBsubtilissubspinaquosorumNRRLB23052株及びBtequilensisNRRLB41771株に対し、それぞれ相同率999の高い相同性を示した図1。以上のことから、AZ5512SIID10004は属レベルではBacillus属に帰属すると思料される。また、AZ5512SIID10004とBsubtilissubspsubtilisの16SrDNA塩基配列間には、1塩基の相違点が確認され、明確に異なることが判明した図2~図4。このように、16SrDNA塩基配列解析の結果から、AZ5512SIID10004はBsubtilisに近縁なBacillussp.と推定された。尚、図2~図4の本株菌AZ5512SIID10004とBsubtilissubsp及びsubtilisの塩基配列比較を示す図において、配列の一致する箇所はで示し、Bsubtilisは、Bsubtilissubspsubtilisの16SrDNA塩基配列を意味する。2.生理生化学性状試験細菌第一段階試験の結果、AZ5512SIID10004は、運動性を有するグラム陽性有芽胞悍菌で、芽胞による菌体の膨張は認められず、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した。これらの性状は、Bacillus属の性状とほぼ一致すると思料される。細菌第二段階試験の結果、AZ5512SIID10004は、グリセロール、Lアラビノース、リボースおよびグルコース等を酸化し、Dアラビノース及びDキシロース等を酸化せず、アセトインを産生し、ゼラチンを加水分解し、硝酸塩を還元した。また、AZ5512SIID10004は、嫌気条件下で生育せず、50 ゚Cおよび10NaCIで生育し、カゼイン及びでんぷんを加水分解し、馬尿酸を加水分解しなかった。これらの性状は、16SrDNA塩基配列解析の結果において近縁が示唆されたBsubtilisの性状とほぼ一致すると考えられる。以上のように、16SrDNA塩基配列解析においては、AZ5512SIID10004とBsubutilissubspsubtilisの間には若干の相違が認められたものの、両者の明確な相違は1塩基のみであり、更に、AZ5512SIID10004の生理生化学性状試験の結果は、Bsubutilisにほぼ一致した。このことから、AZ5512SIID10004とBsubutilissubspsubtilisとの間で認められた16SrDNA塩基配列の相違は、Bsubtilis種内での相違であるとも捉えられる。一方、16SrDNA塩基配列解析、生理生化学性状試験の何れにおいても、Bsubtilisにおける亜種レベルでの帰属分類群の推定はできないことから、今回の同定試験結果からは、AZ5512SIID10004はBacillussubtilisと推定された。以上のとおり、この菌株は形態学培養学生理学的性質および16SrRNA遺伝子に関する情報を得ての同定の結果、AZ5512はバチルスズブチルスBacillussubtilisに属する菌であることが判明した。ところで、分離菌による納豆製造試験は、多品種の分離菌を、品種ごとに蒸煮大豆に接種し、納豆容器に充填し、一括して研究室用小型自動納豆製造装置内で行う。また、製造後の官能検査の結果、必要と思われる製品に対して、更に、物理的、化学的試験を施し、優良な納豆生産菌を発見し、やがては工業生産に活用し、特色のある納豆生産を行うことができるものである。本株菌AZ5512も、この過程を経て選出された。本株菌AZ5512を用いた納豆の製造は、次のとおりである。即ち、通常の納豆用大豆原料は、通常の適正浸漬を行い、120°C~130°Cの範囲内で、15分から60分間の適正蒸煮を行い、これの1gあたり、菌株の胞子数10×103個~10×105個を接種し、容器に充填し、室温36~40°C高湿度の条件下で醗酵させる。本株菌AZ5512を用いた納豆の製造もこれに従った。本株菌AZ5512を用いた納豆醗酵工程においては、醗酵条件として、室温を適宜37°Cから40°Cで調整し、品温が50°C到達を目安にして、その後、緩やかに時間を掛けて品温を下降させることも、良好な納豆を得る手段となる。前記納豆の製造試験の後、下記の官能検査を行った。官能検査の方法は、本株菌AZ5512を用いた納豆と、同一製造日の市販品A,B納豆の3品種を、製造2日後に冷蔵庫から出して、室温に1時間放置した後、官能検査を行った。外観、色、等について上面と下面について検査した。粘りは、納豆を割り箸で20回かき回した後、割箸で納豆50g入りの場合の2分の1ないし3分の1をつまんで40cm位持ち上げ観察した。次いで香りや、豆の硬さや味を検査した。本願出願人の品質管理課に所属する5名で5段階評価を行った。即ち、市販品A,B納豆を同時に検査し、評価は5段階評価で3普通とし、5を良い、1を悪い、とした図9。前記納豆の官能検査の結果、下記が判明した。外観については、納豆菌苔が厚く被り、クリーム色で美麗であり市販品に優位性があった。香りは、本株菌AZ5512を用いた納豆の方がやや甘い香りがして、納豆臭さがない。納豆臭がしないので、納豆嫌いな人にも十分受け入れられる製品であると思料される。軟らかさは、本株菌AZ5512を用いた納豆は非常に軟らかい製品で、食べ易く、また食品加工用材料として、加工しやすい性質を有している。糸引きは納豆の特徴であるが、本株菌AZ5512を用いた納豆は糸引きが殆んどないことが判明した。尚、本株菌AZ5512を用いた納豆を外国人に試食させたところ、ネバネバヌルヌルの粘質物食感の嫌いな外国人にも食べられることが判明した。次に、本株菌AZ5512を用いた納豆と、一般納豆菌を用いた納豆との成分分析を行った。詳細は図10のとおりである。更に、本株菌AZ5512を用いた納豆と、一般納豆菌を用いた納豆との遊離アミノ酸の比較を行った。これによると、本株菌AZ5512を用いた納豆は、甘味、甘味の要因たるアミノ酸が多いので、甘い納豆製品を得ることができる。詳細は図11のとおりである。次に、スズマル大豆を原料とし、本株菌AZ5512を用いた納豆と、一般市販品に使われている宮城野菌によって醗酵させた納豆の粘度を、東機産業株式会社製TVC5型粘度計TVC5VISCOMETERを用いて測定し、比較した。測定方法は、次のとおりである。分析用の納豆150gを夫々ストマッカー袋に入れ、水道水300mlを加え溶した状態で室温に放置した。20分毎に袋内の納豆を、水に泡が立たない程度に約30秒間静かに撹拌し、納豆表面の粘りを水に均一に溶出させた。60分後の最終回には、同様に撹拌した後、袋内の納豆をザルでろ過し、500mlのステンレスビーカーに200ml以上の濾液を採取した。ビーカーの濾液内に粘度計のローターが沈む程度に設置し、普通納豆の場合、通常ローターNo150~500mPasを使用して絶対粘度を測定し、測定値がローターNo1の範囲より低い場合は、測定範囲を低粘度側に広げたローターNo00~100mPasを使用した。その結果を図12に示す。一般市販用の粘度の自社基準値は220~240であり、140未満では糸引き不良と定められている。今回の結果では、宮城野菌を用いて醗酵させた納豆の粘度は、平均が301mPasと糸引きは大変良好であることに比較し、同じ大豆を原料とし、本株菌AZ5512を用いて醗酵させた納豆では平均値が70mPasと極めて低く、これが本株菌AZ5512の顕著な特徴となっている。次に、納豆の臭い成分について説明する。本株菌AZ5512を用いた納豆と、一般納豆菌を用いた納豆との揮発成分の比較を行った。納豆の揮発成分の分析は、キャピラリーガスクロマトグラフィーとマススペクトロメトリーGCMSで行った。この分析条件は次の通りである。GC条件は次のとおりである。ガスクロマトグラフ...島津製作所GC14B型キャピラリーカラム...DBWax内径053mm×長さ30m、膜厚1μmアジレント社製キャリアガス...ヘリウム:流速、35cm/秒:注入温度、250°C;カラム初期温度:50°C、昇温割合、4°C/分:検出器、FID.MS条件は次のとおりである。機器...日本電子JMSDX303イオン源温度...200°Cイオン化電圧...70Vマスレンジ...35400amuスキャン時間...1スキャン/秒検出...RI検出器。方法は次のとおりである。納豆10gを500ml三角フラスコに採り、TenaxTAカラム直径3mm×長さ15cmを接続し、ヘリウムガスを流速10ml/分で50分間、試料の入った三角フラスコに流して試料の揮発性成分を集気した。集気終了後TenaxTAカラムをDBWaxカラムの上端に接続し、カラム出口をX字キャピラリーコネクターにより、メイクアップガスを加えながら2方向にヒューズドシリカチュープを用いて分岐し、一方をピーク検出のためにFIDへ導き,もう一方をガスクロマトグラフオーブンの外へ導き、スニッフィングSniffing:人が臭いを嗅ぐ法で納豆臭類似成分10種を調べた。揮発性物質の濃度比較について。同一のカラムを日本電子製ガスクロマトグラブマススペクトロメーターJMSDX303に接続し、同一の条件で分析することにより、臭い物質の固定を行った。尚、マススペクトル測定は35400amuの範囲を1秒間で走査することにより行い、電子衝撃法で得られたスペクトルを日本電子製コンピューターDAWINに保存してあるデーターベースと比較することによりピークの固定を行った。更に、リテンションインデックス以下,RIを標品と比較することにより同定を確実なものとした。一部のピークはメタンを反応ガスに用いて得られるCIスペクトルから分子量を推定し、固定をより確実なものとした。GCで得られた臭い物質のピークはGCMSで得られたRIと比較することにより固定した。GCによる検出をFIDで行って得られたピークの面積値を内部標準物質のピーク面積値と比較した結果を図14に掲げた。図13に示されるように、主要な納豆の臭い成分は、次の10成分である。即ち、1.エタノール2.ジアセチル3.ピラジン42-メチルピラジン5.アセトイン62,5ジメチルピラジン72,3,5-トリメチルピラジン8.イソラクサン9.イソ吉草酸10.2メチル酪酸これらのうち、本株菌AZ5512を用いた納豆では、ジアセチルイソ吉草酸及び2メチル酪酸の3成分が検出されないため、納豆臭が少ないものと思料される。次に、納豆の硬度試験について説明する。納豆の硬度試験は、納豆試験法研究会編の納豆試験法による蒸煮大豆及び納豆の計測法に基づいて行った。これは、蒸煮大豆及び納豆の水分を失わないようにして常温に冷却し、上皿時計秤の上に一粒ずつ載せて、人差し指で押し潰し、潰れたときのグラム数をもって硬さとするものであり、本試験では、60粒の平均値を求めた。1.米国産極小粒大豆による納豆軟化試験1試験方法製造条件11蒸煮条件16k-26min-20min12接種菌量原液20×10813醗酵条件温度経過43°C8h、46°C5h、43°C7h、20°C2h湿度経過初発80以上14冷蔵5°C2蒸煮大豆及び本株菌AZ5512を用いた納豆の硬度及び硬度減少率は、図14に示す。3結果31同一の原料大豆で試験を行ったが、醗酵後当日で納豆の硬度は蒸煮大豆に比較し、50となった。323日間の冷蔵保存中の硬度変化はみられなかった。2.異種大豆による市販株菌と本株菌AZ5512の納豆軟化度比較試験1試験方法種類の異なる大豆3種にAZ5512株と市販菌とをそれぞれ接種し、軟化度の比較試験を行った。市販菌は、鈴丸図15、地塚図16、とよまさり図17である。2試験結果21醗酵終了後の硬度は蒸煮大豆の硬度に比較し、本株菌AZ5512では80~70と低下するが、市販菌の場合は110~130に硬化し、硬度の差は60程度となる。22本株菌の場合は、醗酵終了後に軟化する。市販菌の場合は、冷蔵3日後には軟化傾向をみせるが、煮豆の硬度程度にはならない。23本株菌の場合は、原料大豆の品種を選ばず、醗酵後軟化した。"