各結合部位において異なる特異性を保持し、かつ1種の重鎖ポリペプチドの2コピー、第1の軽鎖、および第1の軽鎖とは異なる第2の軽鎖からなる、単離されたモノクローナル抗体。第1の軽鎖の少なくとも一部がκ型であり、かつ第2の軽鎖の少なくとも一部がλ型である、請求項1記載の単離されたモノクローナル抗体。第1の軽鎖がκ定常領域を少なくとも含む、請求項2記載の単離されたモノクローナル抗体。第1の軽鎖がκ可変領域をさらに含む、請求項3記載の単離されたモノクローナル抗体。第1の軽鎖がλ可変領域をさらに含む、請求項3記載の単離されたモノクローナル抗体。第2の軽鎖がλ定常領域を少なくとも含む、請求項2記載の単離されたモノクローナル抗体。第2の軽鎖がλ可変領域をさらに含む、請求項6記載の単離されたモノクローナル抗体。第2の軽鎖がκ可変領域をさらに含む、請求項6記載の単離されたモノクローナル抗体。第1の軽鎖がκ定常領域およびκ可変領域を含み、かつ第2の軽鎖がλ定常領域およびλ可変領域を含む、請求項2記載の単離されたモノクローナル抗体。定常領域および可変フレームワーク領域の配列がヒトのものである、前記請求項のいずれか一項記載の単離されたモノクローナル抗体。以下の工程を含む、請求項1記載の二重特異性抗体を生成する方法:a第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程;b第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程aの抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程;c以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程:i免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン;iiκ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン;およびiii第1の軽鎖の定常ドメインとは異なる型の軽鎖定常ドメインと融合した第2の軽鎖可変ドメイン。κ軽鎖可変ドメインをκ型の定常領域と融合させる、請求項11記載の方法。κ軽鎖可変ドメインをλ型の定常領域と融合させる、請求項11記載の方法。λ軽鎖可変ドメインをκ型の定常領域と融合させる、請求項11記載の方法。λ軽鎖可変ドメインをλ型の定常領域と融合させる、請求項11記載の方法。d工程cにおいて産生された二重特異性抗体を、工程cにおいて産生された単一特異性抗体に対して精製する工程をさらに含む、請求項11~15のいずれか一項記載の方法。工程dがアフィニティクロマトグラフィ精製工程である、請求項16記載の方法。精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、請求項17記載の方法。工程aおよびbが、共通の重鎖と、軽鎖可変ドメインに限局した多様性とを有する抗体ライブラリーの使用により促進される、請求項11~18のいずれか一項記載の方法。抗体ライブラリーが、糸状バクテリオファージ、酵母、細菌、もしくは哺乳動物細胞の表面にディスプレイされるか、またはリボソームディスプレイもしくはその他の型のインビトロディスプレイのために使用される、請求項19記載の方法。以下の工程を含む、第1の抗原、および第1の抗原とは異なる第2の抗原と特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法:a免疫グロブリン定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の重鎖可変領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸分子を準備する工程;b第1のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、第1の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸分子を準備する工程;c第2のκ型またはλ型の軽鎖定常領域に結合されている、工程aの免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片と同一の重鎖可変領域を有しかつ第2の抗原と結合する免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の軽鎖可変領域を含む第3のポリペプチドをコードする第3の核酸分子を準備する工程であって、第1の軽鎖定常ドメインと第2の軽鎖定常ドメインとが異なる型である、工程;ならびにd第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および第3のポリペプチドの発現を可能にする条件の下で、第1の核酸分子、第2の核酸分子、および第3の核酸分子を含む宿主細胞を培養する工程。e二重特異性抗体を回収する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。第2の核酸がκ型軽鎖可変ドメインをコードする、請求項21記載の方法。第2の核酸がκ型定常領域をコードする、請求項23記載の方法。第2の核酸がλ型定常領域をコードする、請求項23記載の方法。第2の核酸がλ型軽鎖可変ドメインをコードする、請求項21記載の方法。第2の核酸がκ型定常領域をコードする、請求項26記載の方法。第2の核酸がλ型定常領域をコードする、請求項26記載の方法。第3の核酸がκ型軽鎖可変ドメインをコードする、請求項21記載の方法。第3の核酸がκ型定常領域をコードする、請求項29記載の方法。第3の核酸がλ型定常領域をコードする、請求項29記載の方法。第3の核酸がλ型軽鎖可変ドメインをコードする、請求項21記載の方法。第3の核酸がκ型定常領域をコードする、請求項32記載の方法。第3の核酸がλ型定常領域をコードする、請求項32記載の方法。二重特異性抗体が、工程eにおいて、アフィニティクロマトグラフィ精製工程を用いて回収される、請求項21~34のいずれか一項記載の方法。精製工程が、κ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、λ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体、またはκ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体およびλ定常ドメイン特異的アフィニティクロマトグラフィ媒体の両方を使用して実施される、請求項35記載の方法。全てが共通の重鎖を有する2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体とを含む、抗体混合物。以下の工程を含む、請求項37記載の抗体混合物を生成する方法:a第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程;b第2の軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程aの抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程;c以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程:i免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン;iiκ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第1の軽鎖可変ドメイン;およびiiiκ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した第2の軽鎖可変ドメイン。d工程cにおいて産生された抗体混合物を細胞培養上清から精製する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。全てが共通の重鎖を有する3種以上の単一特異性抗体と3種以上の二重特異性抗体とを含む、抗体混合物。以下の工程を含む、請求項40記載の抗体混合物を生成する方法:a第1の軽鎖可変ドメインと組み合わされた重鎖可変ドメインにより決定される特異性を有する抗体または抗体断片の領域を単離する工程;b異なる軽鎖可変ドメインと組み合わされた、工程aの抗体と同一の重鎖可変ドメインにより決定される異なる特異性を有する数種の抗体または抗体断片の領域を単離する工程;c以下のものを一つの細胞において同時に発現させる工程:i免疫グロブリン重鎖定常領域と融合した共通の重鎖可変ドメイン;iiκ型の軽鎖定常ドメインまたはλ型の軽鎖定常ドメインのいずれかと融合した工程aおよびbにおいて単離された抗体の軽鎖全て。d工程cにおいて産生された抗体混合物を細胞培養上清から精製する工程をさらに含む、請求項41記載の方法。詳細な説明1種の抗原のみを標的化することができるモノクローナル一価抗体治療薬の制限を克服するため、または一価抗体治療薬の組み合わせの制限を克服するため、二重特異性抗体フォーマットを使用して、複数の抗原を標的化することを目標として、精力的な努力がなされている。複数の特異性を保持しているそのような抗体は、バイオテクノロジーにおいて興味深く、新規の治療アプローチを可能にする治療剤として大きな可能性を有するFischerandLegerPathobiology200774314;MorrisonSLNatureBiotechnol20072512331234。二重特異性抗体は、多重標的化を可能にし、治療的可能性を増加させ、生物学的系の重複に取り組み、リターゲティングおよび/または特異性増強のような能力を通して新規の作用機序を提供するため、有利である。バリデートされた単一治療標的は、ますます使い尽くされてきているため、二重特異性抗体により可能となる組み合わせは、治療剤および適用のための標的の新たな拡張的な分野を提供する。抗体断片の化学的架橋、強制ヘテロ二量体化、クアドローマテクノロジー、ポリペプチドリンカーを介した抗体断片の融合、および単一ドメイン抗体の使用のようないくつかの戦略が、そのような二重特異性分子を生成するために使用されている。組換えDNAテクノロジーの利用可能性は、多数の二重特異性抗体フォーマットの生成をもたらした例えば、RidgwayJBetalProteinEng9617621を参照のこと。ヘテロ二量体形成を強制するかまたは異なる結合モエティを1種の分子へと接続するため、リンカーおよび変異が、抗体の異なる領域へ導入されることが多い。しかしながら、これらの操作された分子は、しばしば、不十分な製造特徴のみならず、免疫原性の増大したリスクを有し、そのことにより、臨床への進展が制限されるかまたは妨げられている。さらに、二重特異性フォーマットを開発するための従来の試みは、不十分な安定性および/または発現のような要因によって制限されている。これらのアプローチは以下にさらに記載され、論じられたフォーマットは図1に示される。化学的架橋。2種の抗体を共有結合的に連結するための化学的架橋試薬の使用は、概念的に簡単なアプローチである。酵素消化によりそれぞれの親抗体から生成された抗体断片、または組換えテクノロジーを通して生成された抗体断片を、二官能性試薬を使用してコンジュゲートさせるGlennieMJetalJExpMed1992175217225。二重特異性種をホモ二量体に対して精製しなければならず、修飾工程は、タンパク質の完全性および安定性を改変する可能性があるため、生成物の均質性がこのアプローチの主要な制限である。複数の工程が含まれるため、このアプローチは、製造および生成物の均質性に関して困難である。クアドローマ。クアドローマおよびトリオーマは、それぞれ、2種のハイブリドーマまたは1種のハイブリドーマのいずれかをBリンパ球と融合させることにより生成され得るSureshMRetalMethodsEnzymol1986121210228。この場合、2本の重鎖および2本の軽鎖の同時の発現が、10種の抗体組み合わせのランダムな構築をもたらし、所望のbsAbは分泌される抗体のうちの小さな画分のみを表す。bsAbは、クロマトグラフィ技術の組み合わせを使用して精製されなければならず、生成物収率を劇的に低下させる。主要な制限は、クアドローマがげっ歯類起源のbsAbを産生し、従って、免疫原性問題のため治療的可能性が制限されるという点である。組換え二重特異性抗体。二重特異性抗体フォーマットの大部分が、ポリペプチドリンカーを介して接続されるビルディングブロックとして、scFv断片またはFab断片のような抗体断片を使用して、遺伝子操作技術により生成されている。連結された抗体断片に基づくフォーマットには、タンデムscFvBiTE、ダイアボディ、およびタンデムダイアボディが含まれるKipriyanovSMMethodsMolBiol2003207323333;KornTetalIntJCancer2002100690697。これらのビルディングブロックは、さらに免疫グロブリンFc領域に連結され、IgG様分子を生ずることができる。これらのフォーマットには、ダイアボディFc、タンデムダイアボディFc、タンデムダイアボディCH3、4Fc、およびDVDIgが含まれるLuDetalJImmunolMethods2003279219232;LuDetalJBiolChem20052801966519672;LuDetalJBiolChem200427928562865;WuCetalNatBiotechnol20072512907。リンカーの使用の可能性のある制限は、これらのペプチドのフレキシブルな性質のため、タンパク質分解切断の傾向が比較的高く、そのことから、不十分な抗体安定性、凝集、および免疫原性の増強がもたらされる可能性があるという点である。さらに、これらの外来ペプチドは、タンパク質とリンカーとの間の連結部またはリンカー自体に対する免疫応答を誘発する可能性がある。一般に、連結されたビルディングブロックに基づくbsAbは、製造に関して困難な分子であり、そのことから治療的可能性が制限されている。ヒト治療のための理想的な二重特異性分子は、通常のIgGと識別不可能であるべきである。2種の重鎖のヘテロ二量体化の強制に基づく戦略が探究されている。ノブイントゥホールknobintoholeと呼ばれる第1のアプローチは、接触界面を修飾するため、CH3ドメインへ変異を導入することにより、2種の異なるIgG重鎖の対合を強制することを目標としているRidgwayJBetalProteinEng19969617621。一方の鎖には、ノブを作出するため、大きい側鎖を有するアミノ酸が導入された。反対に、他方のCH3ドメインにはホールを作出するため、かさの大きいアミノ酸が、短い側鎖を有するアミノ酸に交換された。これらの2種の重鎖を同時発現させることにより、ホモ二量体形成ホールホールまたはノブノブに対して、90を越えるヘテロ二量体形成ノブホールが観察された。類似の概念が、ヒトIgGおよびヒトIgAの配列に基づく鎖交換操作ドメインSEEDヒトCH3ドメインを使用して、開発されたDavisJHetal2010PEDS23195202。これらの操作ドメインは、2種の異なる特異性を保持することができるヘテロ二量体分子の形成をもたらす。これらの2種のアプローチは、関心対象のヘテロ二量体の生成に好都合最大95であるため、魅力的であるが、ホモ二量体形成を完全には防止しない。従って、ホモ二量体をヘテロ二量体から除去することができる下流精製手法がやはり必要とされる。これらのアプローチの別の可能性のある問題は、変異型ドメインが完全ヒト配列ではなく、免疫原性をもたらす場合があり、ドメイン安定性および分子の凝集傾向にも影響を与える可能性があるという点である。これらの戦略は、重鎖の強制対合を可能にするため、異なる軽鎖が2種の重鎖のいずれかと無作為に対合することができ、互いに対して精製される必要のある異なる抗体の生成をもたらす。最近、軽鎖対合問題を解決するため、ノブホールアプローチの改善が記載されたWO2009080253A1。この方法は、ノブホール変異に加えて、軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインのうちのいくつかの交換を含む。この方法の主な利点は、2種の異なる重鎖可変ドメインと2種の異なる軽鎖可変ドメインとを有する二重特異性二価抗体を生成することができる点であり、CrossMabと呼ばれている。しかしながら、この二重特異性抗体の配列は、ヘテロ二量体化を強制するためのFcの変異および異なる免疫グロブリンドメイン間の非天然の連結点の両方を含有しているため、完全ヒト配列ではない。さらに、これらの修飾は、標準的なモノクローナル抗体と比較して、二重特異性フォーマットの発現レベルを低下させるSchaeferetalPNAS20111081118711192。単一ドメインに基づく抗体。ラクダ科の動物ラマおよびラクダならびに軟骨魚テンジクザメの免疫系は、Fcと融合した1種のVドメインを使用しており、このことは、1種のドメインが抗原との高親和性結合を与え得ることを証明している。ラクダ科の動物、サメ、さらにヒトのVドメインは、抗体の代わりになり得るが、bsAb生成のために使用されてもよい。それらは、各アームがVHドメインまたはVLドメインのいずれかを介して2種の標的と結合する可能性を有する、古典的なIgGへとリフォーマットされ得る。この単一ドメインIgGは、IgGに類似した生化学的特性を有し、生成および不均一性に関してその他のbsAbフォーマットが直面する問題を解決する可能性がある。しかしながら、立体障害が、しばしば、両方の抗体アームにおける両方の抗原の同時の結合を防止する可能性が高い。上記の二重特異性抗体フォーマットの図は、図1に示される。これらのフォーマット図のいくつかは、FischerandLegerPathobiology200774314;およびMorrisonSLNatureBiotechnol20072512331234に由来する。これらの従来のフォーマットとは対照的に、本明細書に提供される二重特異性抗体、多重特異性抗体、組成物、および方法は、そのような開発上の障害を克服する。本明細書に提供される二重特異性抗体は、共通の重鎖と、各々異なる特異性を有する2種の軽鎖κおよびλ即ち、2種の軽鎖、2種の特異性とを有する。好ましくは、二重特異性抗体は、リンカー、またはアミノ酸変異を含むその他の修飾を含有していない。本明細書に提供される方法は、多様性がVL領域に制限された、特異的な結合を有する分子を作製する。これらの方法は、3種の鎖1種のVH鎖、2種のVL鎖の制御された同時発現、および二重特異性抗体の精製を通して、二重特異性抗体を作製する。本明細書に記載された二重特異性抗体および/または多重特異性抗体は、所定の標的に対して、その同一標的に対する単一特異性抗体の親和性と比較して類似した親和性を示す。好ましくは、本明細書に記載された二重特異性抗体および/または多重特異性抗体は、標準的なIgG分子と事実上識別不可能である。本明細書に提供された方法は、混合物からの二重特異性抗体の精製を含まない、例えば、多重標的化のために有用な、2種の単一特異性抗体と1種の二重特異性抗体との単純な抗体混合物を生成する手段も提供する。二重特異性抗体の可能な作用様式2種の標的の同時の阻害。定義により、二重特異性抗体は、2種の特異性を保持し、従って、複数の標的を阻害することができる。これらの標的は、可溶性因子であってもよいし、または細胞の表面に位置していてもよい。複数のサイトカインを標的化する多数のフォーマットが成功裡に生成されているWuCetalNatBiotechnol20072512907。リターゲティング。二重特異性抗体フォーマットの大部分が、2種の分子と同時に結合することができ、従って、疾患過程に関与している細胞へ細胞傷害性エフェクター細胞または細胞傷害性薬剤をリターゲティングするための橋渡し分子として使用され得る。この適用は腫瘍学において調査されている。いくつかの場合において、抗体の1種の特異性は、CD19、CD20、HER2、癌胎児性抗原CEAのような腫瘍細胞マーカーに差し向けられた。二重特異性抗体の第2のアームは、薬物、毒素、サイトカイン、または免疫系からのエフェクター細胞それぞれ、CD3、CD16、CD64、およびCD89の標的化により、T細胞、NK細胞、単球、および好中球のような毒性モエティまたは活性を接近させるThielemansKBlood19968743904398;GoldsteinJetalJImmunol1997158872879。アビディティを介した特異性増強。古典的IgGフォーマットにおいて、抗体結合は、抗原に対する各結合部位の親和性、および二価結合により提供されるアビディティ効果の両方により支配される。抗体が放出されるためには、二つの解離イベントが起こらなければならないため、アビディティ効果は、細胞表面マーカーに対する抗体の見かけの親和性を劇的に増強させる。上記の二重特異性フォーマットの中には、二価のものもあるし即ち、各標的について1個の結合部位、四価のものもある。後者は、4個以上の結合部位を有し、二価で各標的に結合する可能性を有する。二価二重特異性治療剤は、細胞表面マーカーの組み合わせを発現している細胞集団を選択的に標的とする。この独特の作用様式は、原理的に、両方の抗原を発現している細胞と、一方のマーカーしか発現していないものとを区別するため、アビディティ成分から利益を得ることができる分子に制限される。二重特異性抗体により媒介される可能な作用様式の図は、図2に示される。この図は、FischerandLegerPathobiology200774314に由来する。二重特異性抗体フォーマットの特徴および制限現在の二重特異性抗体フォーマットの重要な特徴は、表Iに要約される。ヒトドメインに基づくものを除く全てのフォーマットが、ヒト起源でない配列を含有しているか、または異なるタンパク質ドメインの融合により生成された非ヒトタンパク質配列を含有している。リンカーを使用するフォーマットの大部分が、ドメイン凝集による、可能性のある製造上の問題をもたらす。外来配列の存在および不都合な安定性特徴は、免疫原性のリスクを有意に増大させる可能性がある。フォーマット間の重要な違いは、リターゲティングまたはアビディティにより媒介される選択的結合を媒介する能力に直接関係している、結合部位の価数である。従って、全てのフォーマットが、全ての作用様式を可能にすることはできない。特に、完全ヒト免疫グロブリンと識別不可能な唯一のフォーマットは、リターゲティング活性または選択性増加活性を媒介することができない。従って、治療薬の開発のための好都合の特性を有する、即ち、完全ヒト免疫グロブリン分子と識別不可能であり、良好な製造可能性特性を有し、かつ可能な作用様式の完全なスペクトルを可能にする、新規の二重特異性抗体を生成する必要がある。表I異なる二重特異性抗体フォーマットの特徴作用様式:DI、二重阻害;R、リターゲティング;IS、選択性増加二重特異性二価抗体を生成するための改良された方法本発明は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一の二重特異性抗体を生成する方法を提供する。この型の分子は、独特の重鎖ポリペプチドの2コピーと、定常κドメインと融合した第1の軽鎖可変領域と、定常λドメインと融合した第2の軽鎖可変領域とから構成される。各結合部位は、重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。軽鎖可変領域は、λファミリーまたはκファミリーのものであり得、それぞれ、好ましくは、λ定常ドメインおよびκ定常ドメインと融合される。これは、非天然のポリペプチド連結部の生成を回避するために好ましい。しかしながら、第1の特異性のため、κ軽鎖可変ドメインを定常λドメインと融合させ、第2の特異性のため、λ軽鎖可変ドメインを定常κドメインと融合させることにより、本発明の二重特異性抗体を得ることも可能である図3。本明細書に記載された二重特異性抗体は、IgGκλ抗体またはκλボディ新たな完全ヒト二重特異性IgGフォーマットとも呼ばれる。このκλボディフォーマットは、標準的なモノクローナル抗体と識別不可能であって、従って、以前のフォーマットと比較して好都合である特徴を有する、標準的なIgG分子と識別不可能な二重特異性抗体のアフィニティ精製を可能にする。方法の必須の工程は、同一の重鎖可変ドメインを有し、異なる抗原特異性を有する各々、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにより構成される2種の抗体Fv領域の同定である。モノクローナル抗体およびそれらの断片の生成のための多数の方法が記載されている例えば、参照により本明細書に組み入れられる、AntibodiesALaboratoryManualHarlowEandLaneD1988ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYを参照のこと。完全ヒト抗体は、CDR1およびCDR2を含む軽鎖および重鎖の両方の配列が、ヒト遺伝子に起因する抗体分子である。CDR3領域は、ヒト起源であってもよいし、または合成手段により設計されていてもよい。そのような抗体は、本明細書中、ヒト抗体または完全ヒト抗体と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術;ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozboretal1983ImmunolToday472を参照のこと;およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBVハイブリドーマ技術Coleetal1985InMONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPYAlanRLissIncpp7796を参照のことを使用することにより調製され得る。ヒトモノクローナル抗体が利用され得、ヒトハイブリドーマを使用することによりCoteetal1983ProcNatlAcadSciUSA8020262030を参照のこと、またはインビトロでエプスタインバーウイルスによりヒトB細胞を形質転換することによりColeetal1985InMONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPYAlanRLissIncpp7796を参照のこと作製され得る。モノクローナル抗体は、例えば、標的抗原、または免疫原性のその断片、誘導体、もしくはバリアントにより、動物を免疫感作することにより生成される。あるいは、標的抗原が発現され、トランスフェクトされた細胞の表面に会合するよう、標的抗原をコードする核酸分子を含有しているベクターによりトランスフェクトされた細胞により、動物を免疫感作する。異種非ヒト動物を作製するための多様な技術が、当技術分野において周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6075181号および第6150584号を参照のこと。あるいは、抗体は、抗体配列または抗原結合ドメイン配列を含有しているライブラリーを、標的抗原との結合についてスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えば、構築したファージ粒子の表面に発現されるバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質またはペプチドの融合体、およびファージ粒子内に含有されるコーディングDNA配列として、バクテリオファージにおいて調製される即ち、ファージディスプレイライブラリー。次いで、骨髄腫/B細胞融合から得られたハイブリドーマが、標的抗原に対する反応性についてスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、例えば、KohlerandMilsteinNature25649568591;米国特許第6528624号;2009年1月9日に出願されたPCTUS20090191199を参照のこと。本発明の方法は、Fc部分を欠くF2フォーマットで、二重特異性抗体および抗体混合物を生成するためにも使用され得る。本発明の別の重要な工程は、本発明の二重特異性抗体の構築を可能にするための、単一細胞における共通の重鎖および2種の異なる軽鎖の同時発現の最適化である。全てのポリペプチドが同一のレベルで発現され、免疫グロブリン分子を形成するために同等に集合するのであれば、単一特異性同一の軽鎖と二重特異性2種の異なる軽鎖との比率は、50であるはずである。しかしながら、異なる軽鎖は、異なるレベルで発現され、かつ/または同一の効率で集合しない可能性が高い。従って、本発明の方法は、固有の発現特徴または共通の重鎖と集合する異なる傾向を補うため、異なるポリペプチドの相対的な発現をモジュレートする手段も提供する。このモジュレーションは、プロモーター強度、異なる効率を特色とする細胞内リボソーム侵入部位IRESの使用、または転写もしくは翻訳のレベルで作用することができ、mRNA安定性に対して作用してもよい、その他の型の調節要素を介して達成され得る。異なる強度の種々のプロモーターには、CMV前初期サイトメガロウイルスウイルスプロモーター;EF11αヒト伸長因子1αサブユニットプロモーター;UbcヒトユビキチンCプロモーター;SV40シミアンウイルス40プロモーターが含まれ得る。哺乳動物およびウイルスに由来する種々のIRESも記載されている例えば、HellenCUandSarnowPGenesDev2001151593612を参照のこと。これらのIRESは、長さおよびリボソーム動員効率が大きく異なる場合がある。さらに、IRESの複数コピーを導入することにより、活性をさらに調整することが可能であるStephenetal2000ProcNatlAcadSciUSA9715361541。ある軽鎖または他の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増加させ、それにより、相対的な発現を修飾するため、細胞の複数回の逐次トランスフェクションによって、発現のモジュレーションを達成することもできる。本明細書に提供された実施例は、異なる鎖の相対的な発現の制御が、二重特異性抗体の構築および全収率を最大にするために重要であることを証明する。重鎖および2種の軽鎖の同時発現は、細胞培養上清中に3種の異なる抗体2種の単一特異性二価抗体および1種の二重特異性二価抗体の混合物を生成する。関心対象の分子を得るためには、後者を混合物から精製しなければならない。本明細書に記載された方法は、CaptureSelectFabKappaアフィニティマトリックスおよびCaptureSelectFabLambdaアフィニティマトリックスBACBVHollandのような、κ軽鎖定常ドメインまたはλ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティクロマトグラフィ媒体の使用により、この精製手法を大いに促進する。この多工程アフィニティクロマトグラフィ精製アプローチは、効率的であり、本発明の抗体に一般的に適用可能である。これは、抗体混合物を発現しているクアドローマまたはその他の細胞株に由来する各二重特異性抗体について開発され最適化されなければならない特定の精製法とは極めて対照的である。実際、混合物中の異なる抗体の生化学的特徴が類似している場合、イオン交換クロマトグラフィのような標準的なクロマトグラフィ技術を使用した分離は、困難であるか、または全く不可能であり得る。本発明は、同一の重鎖を有し、モノクローナル抗体精製のために使用される標準的なクロマトグラフィ技術を使用して精製され得る、2種以上の単一特異性抗体と1種以上の二重特異性抗体との単純な抗体混合物を作製する新たな手段も提供する例えば、LowyIetalNEnglJMed2010362197205;GoudsmitJetalJInfectDis2006193796801を参照のこと。そのような単純な混合物は、治療的使用のために多重標的化剤として使用され得る。重鎖および2種の軽鎖の成功した同時発現、精製、および特徴決定、ならびに二重特異性抗体の精製は、実施例において示される。共通の重鎖および2種の軽鎖をコードする遺伝子が、3種のプロモーターを含有しているベクターへクローニングされた。一過性トランスフェクションの後、PEAK細胞の上清が収集された。3種の鎖の同時発現は、3種の異なる抗体2種の単一特異性抗体および1種の二重特異性抗体の構築をもたらした。発現レベルおよび集合速度が両方の軽鎖について類似しているのであれば、理論上の相対比率は112であるはずである。二重特異性抗体が、3工程アフィニティクロマトグラフィ手法を使用して精製された:1プロテインA:IgGの捕獲単一特異性および二重特異性、2Kappaselect:κ軽鎖を含有しているIgGの捕獲、ならびに3Lambdaselect:λ軽鎖を含有しているIgGの捕獲。KappaselectおよびLambdaselectは、BACBVおよびGEHealthcareにより開発されたアフィニティクロマトグラフィ媒体である。精製された二重特異性抗体は、以下のように特徴決定された。各アフィニティ精製工程からのフロースルーおよび溶出液がSDSPAGEにより分析された。結果は、各工程で、二重特異性抗体が濃縮されることを示す図8。κλボディは、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖を含有していた。κλボディは、等電点電気泳動ゲルおよびイオン交換クロマトグラフィにおいて、2種の単一特異性抗体と比較して、中間の移動パターンを示した図10。κλボディの特異性および親和性が、ELISAおよび表面プラズモン共鳴により決定された。本発明の方法は、最適化なしに、1ナノモル未満~ナノモル範囲の親和性を有する抗体の同定を可能にする。本明細書に記載された抗体ライブラリーにおける多様性は、標準的な抗体においては結合エネルギーにあまり寄与しない軽鎖に制限されているため、このことは自明ではない。κ型およびλ型の軽鎖可変ドメインを有する2種の抗体にアクセスする必要性が、本発明に対する限定として認知されることを回避するため、本明細書に記載された方法は、図3に表されるように、λ可変ドメインがκ定常ドメインと融合していてもよく、反対に、κ可変ドメインがλ定常ドメインと融合していてもよいハイブリッド軽鎖の生成を可能にする。これは、同一の型の軽鎖を有する抗体対へと本発明の適用を拡大する。本明細書に提供される実施例に記載されるように、可変ドメインと定常ドメインとの間の融合点は、重要であり、二重特異性抗体精製過程に影響を与え得る。本発明の二重特異性抗体および/または多重特異性抗体を作製する一つの方法の概要が、図13に示される。いくつかの態様において、二重特異性抗体および/または多重特異性抗体を生成する方法は、完全無血清既知組成過程を使用する。これらの方法は、製薬産業において最も広範に使用されている哺乳動物細胞株であるチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株を取り入れる。その中に記載された方法は、半安定細胞株および安定細胞株の両方を生成するために使用される。方法は、本発明の二重特異性抗体および/または多重特異性抗体を、小規模例えば、三角フラスコおよび中規模例えば、25LWaveバッグで製造するために使用され得る。方法は、本発明の二重特異性抗体および/または多重特異性抗体ならびに抗体混合物のより大規模な作製のためにも容易に適応可能である。本発明の二重特異性抗体および/または多重特異性抗体を生成する方法は、図8Aに示されるような一般的な精製過程を利用するため、有利である。図16は、半安定細胞株から精製された二重特異性抗体の精製および生成物完全性試験を証明する。二重特異性抗体は、以下の3工程アフィニティクロマトグラフィ手法を使用して精製された:i単一特異性および二重特異性の両方を含むIgG分子を捕獲するためのプロテインA精製;iiκ軽鎖を含有しているIgGを捕獲するためのKappaSelect精製;iiiλ軽鎖を含有しているIgGを捕獲するためのLambdaSelect精製。各アフィニティ精製工程からのフロースルーおよび溶出液が、SDSPAGEにより分析された。結果は、精製過程における各単一特異性型即ち、κ軽鎖を有する単一特異性IgG分子、およびλ軽鎖を有する単一特異性IgG分子の除去を証明した図16A。精製されたκλ含有抗体即ち、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を有する抗体は、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖を含有していた図16B。精製されたκλ含有抗体は、等電点電気泳動ゲル上で、2種の単一特異性抗体と比較して、中間の移動パターンを示した図16C。本発明の二重特異性抗体および/または多重特異性抗体を製造するための既知組成過程は、CHO細胞のプールまたは樹立細胞株を用いて使用され得る。プールまたは樹立細胞株のいずれかを使用した既知組成過程により得られた結果は、対応するκ単一特異性抗体またはλ単一特異性抗体を発現するものと比較可能な産生量および増殖特徴を証明する。従って、κλボディは、古典的なヒトIgGの構造特徴および製造特徴の両方を保存している。上記の種々の抗体操作アプローチを使用した、均質の二重特異性分子の生成の強制を目標とした、二重特異性抗体フォーマットを作製するための以前のアプローチは、産生量、スケーラビリティ、および生成物の安定性を犠牲にしてなされた。本発明は、モノクローナル抗体の産生量およびスケーラビリティの標準的な特徴を有する単純な抗体混合物の作製を可能にし、混合物から二重特異性抗体を精製するためのまたは抗体混合物を精製するための効率的かつ一般的な手段を提供する、異なるアプローチである。実施例1:固定の重鎖を有する抗体ライブラリーの生成重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーについて同一の抗体ライブラリーを、以下のように生成した。まず、定義されたCDR3AKSYGAFDYSEQIDNO1CDR命名法はIMGTによるおよび定義されたFR4配列を含有している重鎖可変VH323ドメインを、SfiIおよびXhoIの制限部位を使用して、pNDSベクターへクローニングし、ファージミドベクターpNDSVHfixedを得た。VKFR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子JK1によりコードされるFR4領域に相当する。VλFR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子JL2およびJL3によりコードされるFR4領域に相当する。106位に単一アミノ酸置換アルギニンまたはグリシンを有するVkFR4配列の2種のバリアントを生成した。各々、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2010年5月20日に出願され、WO2010135558として公開された同時係属中の出願PCTUS2010035619に記載された方法およびRavnetalNuclAcidRes38e193に記載された方法に従って、合成または天然起源の多様性がクローニングされ得、高い多様性のライブラリーが生成され得る、17種のアクセプターベクターを生成するため、CDR3コーディング配列の代わりにスタッファー断片を含有している全部で6種のκ可変ドメイン遺伝子VK133、VK139、VK311、VK315、VK320、VK41および5種のλ可変ドメイン遺伝子Vλ144、Vλ151、Vλ657、Vλ214、Vλ140を、pNDSVHfixedへクローニングした。この過程は、全部で69×109種のバリアントを含有し、全てが共通のVH323ドメインを有し、軽鎖可変相補性決定領域3CDRL3領域において多様化されたVκドメインまたはVλドメインを有する、17種のライブラリーの生成をもたらした図5A。180の無作為に選ばれた形質転換体の配列決定は、インフレームであって、従って、機能性である可能性のあるCDRL3配列が、クローンの>90に組み込まれたことを示した。実施例2:ライブラリーのファージレスキュー以下に簡単に要約される標準的なファージディスプレイ手法に従い、各ライブラリーを独立にレスキューした。ライブラリーの理論上の多様性の少なくとも10倍をカバーするのに十分な量の凍結ライブラリーアリコートからの細胞を、2×TYAG100μgmlアンピシリン;2グルコース500mlに添加し、03~05のOD600に到達するまで、撹拌しながら240rpm37°Cで増殖させた。次いで、培養物にMK13KO7ヘルパーファージを重感染させ、37°Cで1時間インキュベートした150rpm。次いで、細胞を2000rpmで10分間遠心分離し、培地を除去し、2×TYAK100μgmlアンピシリン;50μgmlカナマイシン500mlにペレットを再懸濁させることにより、培地を交換した。次いで、培養物を、30°Cで一夜増殖させた240rpm。細胞をペレット化するため、培養物を4000rpmで20分間遠心分離した。上清を収集し、混合物を氷上で1時間インキュベートすることにより、ファージ粒子を沈殿させるため、30のPEG80002025MNaClを添加した。ファージ粒子を10000rpmでの30分間の遠心分離により収集し、TE緩衝液10mMトリスHClpH80;1mMEDTA10mlに再懸濁させた。再懸濁した溶液を、細菌片を除去するために10000rpmで遠心分離し、沈降手法を繰り返した。最後の再懸濁の後、大腸菌Ecoliの感染および260nmでの吸収により、ファージを滴定した。ファージの表面におけるscFvのディスプレイレベルも、抗cmycモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット分析により評価した。異なるライブラリーから精製されたファージを、15の最終濃度でグリセロールを添加した後、80°Cで凍結保管した。実施例3:固定重鎖ライブラリーを使用したファージディスプレイ選択ビオチン化hCXCL10NusA融合タンパク質hCXCL10NusAおよびビオチン化hIL6受容体複合体hIL6RCに対する液相選択:VHVκファージライブラリーおよびVHVλファージライブラリー1011~1012Pfuのアリコートを、別々に維持し、ロータリーミキサー上で室温で1時間3スキムミルクを含有しているPBSによりブロッキングした。次いで、ブロッキングされたファージを、ロータリーミキサー上で室温で1時間ストレプトアビジン磁性ビーズDynalM280上でデセレクトdeselectedした。次いで、デセレクトされたファージを、ロータリーミキサー上で室温で2時間、インビボでビオチン化されたhCXCL10NusAまたはhIL6RC100nMと共にインキュベートした。ビーズを標的に添加し、磁気スタンドを使用して捕獲した後、PBS01トゥイーン20により4回、PBSにより3回洗浄した。次いで、ビーズを、指数関数的に増殖中のTG1細胞10mlに直接添加し、低速で振とうしながら100rpm37°Cで1時間インキュベートした。選択アウトプットを滴定するため、感染TG1のアリコートを段階希釈した。残りの感染TG1を、3000rpmで15分間スピンし、2×TYAG100μgmlアンピシリンおよび2グルコースを含有している2×TY培地05mlに再懸濁させ、2×TYAG寒天Bioassayプレート上に播種した。30°Cでの一夜のインキュベーションの後、2×TYAG10mlをプレートに添加し、細胞を表面から剥離させ、50mlポリプロピレンチューブに移した。17グリセロールの最終濃度を得るため、50グリセロールを含有している2×TYAGを、細胞懸濁物に添加した。選択ラウンドのアリコートを80°Cで維持した。ファージレスキュー:前選択ラウンドから得られた細胞懸濁物100μlを2×TYAG20mlに添加し、03~05のOD600に到達するまで、撹拌しながら240rpm37°Cで増殖させた。次いで、培養物に33×1010MK13KO7ヘルパーファージを重感染させ、37°Cで1時間インキュベートした150rpm。次いで、3800rpmで10分間細胞を遠心分離し、培地を除去し、2×TYAK100μgmlアンピシリン;50μgmlカナマイシン20mlにペレットを再懸濁させることにより、培地を交換した。次いで、培養物を30°Cで一夜増殖させた240rpm。翌日、遠心分離された上清のアリコートを、次の選択ラウンドのためのインプットとして使用した。ELISAのためのモノクローナルファージレスキュー:単一クローンを、1ウェル当たり150μlの2×TYAG媒体2グルコースを含有しているマイクロタイタープレートへ選び出し、37°C100~120rpmで5~6時間増殖させた。10の感染多重度MOI即ち、培養物中の各細胞について10個のファージを得るため、M13KO7ヘルパーファージを各ウェルに添加し、37°C100rpmで1時間インキュベートした。増殖後、プレートを3200rpmで10分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、細胞を2×TYAK培地150μlに再懸濁させ、30°C120rpmで一夜増殖させた。ELISAのため、5スキムミルク粉末を含有している2×濃度PBS150μlを添加した後、室温で1時間インキュベートすることにより、ファージをブロッキングする。次いで、プレートを、3000rpmで10分間遠心分離し、ファージ含有上清をELISAのために使用した。ファージELISA:ELISAプレートMaxisorpNUNCを、PBS中の2μgmlhCXCL10NusAまたはPBS中の2μgmlhIL6RCにより一夜コーティングした。次いで、室温で1時間、3スキムミルクPBSによりプレートをブロッキングした。プレートをPBS005トゥイーン20により3回洗浄した後、予めブロッキングされたファージ上清を移し、室温で1時間インキュベートした。各クローンを、その特異性を試験するため、両方の標的に対して試験した。次いで、プレートを、PBS005トゥイーン20により3回洗浄した。HRP共役抗M13抗体Amersham、110000希釈を含有している3スキムミルクPBS50μlを各ウェルに添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートを、PBS005トゥイーン20により5回洗浄した。次いで、TMBSigma50μlを添加することにより、ELISAを可視化し、反応を中止するため、2NH2SO450μlを添加した。吸収強度を450nmで読み取った。同一の重鎖可変ドメインを保持しているhCXCL10NusAまたはhIL6RCに特異的なクローンを同定することができた図4。ファージクローン配列決定:単一クローンを、1ウェル当たり5mlの2×TYAG媒体2グルコースにおいて増殖させ、37°C120rpmで一夜増殖させた。翌日、ファージミドDNAを精製し、pNDS1に特異的なプライマー:mycseqを使用したDNA配列決定のために使用した。大規模scFv精製:2×TYAG1mlのスターターカルチャーに、新鮮に画線培養された2×TYAG寒天プレートからの単一コロニーを接種し、37°Cで振とうしながら240rpm5時間インキュベートした。この培養物09mlを、同培地の培養物400mlに接種するために使用し、激しく振とうしながら300rpm30°Cで一夜増殖させた。翌日、1MIPTG400μlを添加することにより、培養物を誘導し、インキュベーションをさらに3時間続けた。細胞を、4°Cでの5000rpmでの10分間の遠心分離により収集した。ペレット化された細胞を、上記のようなプロテアーゼ阻害剤が補足された氷冷TES緩衝液10mlに再懸濁させた。15希釈TES緩衝液15mlを添加し、氷上で1時間インキュベートすることにより、浸透圧ショックを達成した。細胞片をペレット化するため、4°Cで10000rpmで20分間細胞を遠心分離した。上清を、新鮮なチューブに注意深く移した。イミダゾールを、10mMの最終濃度で、上清に添加した。PBSで平衡化されたNiNTA樹脂Qiagen1mlを、各チューブに添加し、4°C20rpmで1時間ロータリーミキサー上でインキュベートした。チューブを、2000rpmで5分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ペレット化された樹脂を、冷4°C洗浄緩衝液150mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mMイミダゾール、pH8010mlに再懸濁させた。懸濁物をpolyprepカラムBioradに添加した。冷洗浄緩衝液250mMNaH2PO4、300mMNaCl、20mMイミダゾール、pH808mlを、重力流によりカラムを洗浄するために使用した。溶出緩衝液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、250mMイミダゾール、pH802mlにより、カラムからscFvを溶出させた。画分を280nmにおける吸収により分析し、タンパク質含有画分をプールした後、PBSにより平衡化されたNAP5脱塩カラムAmershamで緩衝液交換を行った。PBS中のscFvをSDSPAGEにより分析し、280nmにおける吸収により定量化した。精製されたscFvを、等分し、20°Cおよび4°Cで保管した。精製されたscFvを、それらが選択された標的との特異的結合を確認するため、ELISAにおいて使用した。実施例4:異なる固定VHライブラリーを使用した付加的な選択天然に再編成された軽鎖レパートリーを捕獲し、実施例1に記載された単一VHドメインの環境でそれらをクローニングすることによっても、抗体ライブラリーを生成した。この場合、ヒト再編成可変領域の5領域および3領域に対応するプライマーを使用して、ヒトcDNAから軽鎖可変遺伝子領域全体を増幅し、実施例1に記載されたpNDSVHfixedベクターへクローニングした。実施例1に記載されたようにして、ただし、異なるCDRH3配列ARGDDVSSEQIDNO3を含有している固定のVH323ドメインを使用して、もう1セットのライブラリーを生成した。上記のライブラリーは、図5に模式的に表される。これらの固定VHライブラリーを、実施例2および3に記載された選択およびスクリーニングの方法論を使用して、標的タンパク質のパネルに対して使用した。選択は以下の標的を使用して実施された:hCXCL10NusA、IL6RC、CD47、CD16、CD8、およびhIFNγ。それらの標的に特異的であることが同定され示された候補は、表IIにリストされる。これらの結果は、異なる標的と結合し共通の重鎖を有する抗体が生成され得ること、そして軽鎖に制限された多様性が抗原特異性を付与するのに十分であることを証明している。異なるCDRH3配列を有するVH323ドメインを含有しているか、または異なる戦略を使用して多様化されたVLレパートリーを有するライブラリーから、候補を生成することが可能であった。従って、結果は、特定のVH配列または特定の軽鎖可変ドメイン多様化戦略に、アプローチが制限されないことを証明している。表II2種の異なるCDRH3配列を含有している固定のVH配列を有するライブラリーを使用して標的のパネルに対して同定された独立のクローンの数NA:選択未実施。実施例5:固定VH候補のIgGへのリフォーマットおよび哺乳動物細胞における一過性発現スクリーニングの後、scFv候補を、IgGへリフォーマットし、PEAK細胞への一過性トランスフェクションにより発現させた。共通の重鎖を有し、それぞれ、IFNγおよびIL6RCに特異的であり、異なる軽鎖配列を有するいくつかのIgGλn=5およびIgGκn=9を、以下のように生成した。選択されたscFvのVH配列およびVL配列を、特異的なオリゴヌクレオチドにより増幅し、重鎖および軽鎖の定常領域を含有している発現ベクターへクローニングし、構築を配列決定により確証した。発現ベクターを、Fugene6TransfectionReagentRocheBaselSwitzerlandを使用して、哺乳動物細胞へトランスフェクトした。簡単に説明すると、Peak細胞を、ウシ胎仔血清を含有している培養培地2mlにおいて、1ウェル当たり6×105細胞の濃度で、6穴プレートにおいて培養した。候補のVH配列およびVL配列をコードする発現ベクターを、製造業者の説明に従い、Fugene6TransfectionReagentを使用して、細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培養培地を吸引し、新鮮な無血清培地3mlを細胞へ添加し、37°Cで3日間培養した。3日間の培養期間の後、上清を採集し、製造業者の説明に従い、proteinGSepharose4BfastflowカラムSigmaStLouisMOでIgGを精製した。簡単に説明すると、トランスフェクトされた細胞からの上清を、ImmunoPureGIgG結合緩衝液PierceRockfordILと共に4°Cで一夜インキュベートした。次いで、試料を、ProteinGSepharose4Bfastflowカラムに通過させ、従って、溶出緩衝液を使用してIgGを精製した。次いで、溶出したIgG画分を、PBSに対して透析し、280nmにおける吸収によりIgG含量を定量化した。純度およびIgG完全性をSDSPAGEにより確証した。次いで、ELISAにより、IFNγ、および本明細書中IL6RCと呼ばれるIL6IL6R受容体複合体との結合について、IgGを試験した。ビオチン化されたIFNγおよびIL6RCを、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートStreptawellRocheに固定化し、次いで、2BSAが補足されたPBSにより室温で1時間プレートをブロッキングした。プレートを、PBS005トゥイーン20により3回洗浄した後、いずれかの標的によりコーティングされたウェルに、精製された抗INFγIgGλまたは抗IL6RCIgGκを添加した。室温での1時間のインキュベーションおよびプレートの洗浄の後、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されている抗ヒトCκ抗体または抗ヒトCλ抗体により検出した。次いで、TMBSigma50μlを添加することにより、ELISAを可視化し、反応を中止するため、2NH2SO450μlを添加した。吸収強度を450nmにおいて読み取った。結果は、固定VHライブラリーから単離されたscFvの結合特異性が、IgGフォーマットにおいて維持されることを示し、同一の重鎖を有し異なる軽鎖を有する2種のIgGが、別個の標的に対して特異的であり得ることを証明した図6。抗INFγIgGλまたは抗IL6RCIgGκの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、以下に示す:抗IL6RCVκ軽鎖抗INFγVλ軽鎖共通の重鎖実施例6:1種の重鎖および2種の軽鎖の哺乳動物細胞における同時発現同一の細胞における1種の重鎖および2種の軽鎖の同時の発現は、3種の異なる抗体の構築をもたらすことができる図8A。同時の発現は、同時発現される鎖のうちの1種を発現する複数のベクターのトランスフェクション、または多重遺伝子発現を駆動するベクターの使用のような、異なる方式で達成され得る。1種の重鎖、1種のκ軽鎖、および1種のλ軽鎖の同時発現を可能にするため、ベクターpNoviκHλを設計した図7A。3種の遺伝子の発現はヒトサイトメガロウイルスプロモーターhCMVにより駆動され、ベクターは、安定細胞株の選択および樹立を可能にするグルタミン合成酵素遺伝子GSも含有している。λ軽鎖の後にκ軽鎖の第2のコピーが挿入されており、その発現が細胞内リボソーム侵入部位IRESにより駆動される、別のベクターpNoviκHλκも構築した。この2シストロン設計を使用すると、κ軽鎖の相対的な発現を増強させることができる。2種のベクターは、図7に模式的に表される。実施例7:1種の重鎖および2種の軽鎖の哺乳動物細胞における一過性同時発現、ならびに全IgGの精製抗INFγIgGλまたは抗IL6RCIgGκのVH遺伝子およびVL遺伝子を、哺乳動物細胞における一過性発現のため、実施例5に記載されたベクターpNoviκHλへクローニングした。Peak細胞を、ウシ胎仔血清を含有している培養培地2mlにおいて、1ウェル当たり6×105細胞の濃度で、6穴プレートにおいて培養した。プラスミドDNA2μgを、製造業者の説明に従ってTransITLT1トランスフェクション試薬Mirusを使用して、細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培養培地を吸引し、新鮮な無血清培地3mlを細胞へ添加し、37°Cで5日間培養した。5日間の培養期間の後、上清を採集し、4000rpmで遠心分離し、製造業者の説明に従ってMabSelectSurePA樹脂GEHealthcareに適用した。全IgGを酸性条件下で溶出させた後、中和およびPBSへの緩衝液交換を行った。IgG含量を、280nmにおける吸収により定量化し、SDSPAGEにより分析した。2種の軽鎖に対応する2本のバンド、および重鎖に対応する1本のバンドの存在は、同一の細胞において3種の鎖を同時に発現させることが可能であることを示した図8B。実施例8:λ軽鎖とκ軽鎖とを保持している二重特異性抗体の精製同一の細胞における、1種の重鎖および2種の軽鎖の同時発現は、3種の異なる抗体両方のアームに同一の軽鎖を保持している2種の単一特異性抗体、および各アームに重鎖と会合した異なる軽鎖を保持している二重特異性抗体の構築をもたらすことができる。単一特異性抗体と二重特異性抗体との異なる生化学的特性を利用するクロマトグラフィ技術により、後者は、単一特異性抗体から単離され得る。全ての二重特異性抗体の生成に適用可能な一般的な精製アプローチを開発するため、本発明者らは、図8Aに模式的に図示されたアフィニティクロマトグラフィアプローチを使用した。トランスフェクトされた細胞からの培養上清を、実施例7に記載されるように、MabSelectSurePA樹脂GEHealthcareカラムに適用し、全IgGを精製した。次いで、全IgGを、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelectFabKappaアフィニティマトリックスBACBVHollandを含有しているカラムに適用した。次いで、カラムを5~10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。5倍カラム体積の01MグリシンpH20を適用することにより、κ軽鎖を保持している免疫グロブリン分子をカラムから溶出させ、画分を収集し、中和した。抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラムAmershamで緩衝液交換を行った。次いで、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelectFabLambdaアフィニティマトリックスを含有している第2のカラムに、抗体を適用した。次いで、カラムを5~10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。κ軽鎖のみを保持している免疫グロブリン分子は、カラムに結合せず、フロースルー中に見出された。5倍カラム体積の01MグリシンpH30を適用することにより、λ軽鎖を保持している抗体をカラムから溶出させ、画分を収集した。二重特異性抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラムAmershamで緩衝液交換を行った。5倍カラム体積の01MグリシンpH20を適用することにより、κ軽鎖を保持している免疫グロブリン分子をカラムから溶出させ、画分を収集し、中和した。抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラムAmershamで緩衝液交換を行った。次いで、抗体を、10倍容量のPBSにより平衡化されたCaptureSelectFabLambdaアフィニティマトリックスを含有している第2のカラムに適用した。次いで、カラムを5~10倍カラム体積のPBSにより洗浄した。κ軽鎖のみを保持している免疫グロブリン分子は、カラムに結合せず、フロースルー中に見出された。5カラム体積の01MグリシンpH30を適用することにより、λ軽鎖を保持している抗体を、カラムから溶出させ、画分を収集した。二重特異性抗体を含有している画分をプールした後、PBSにより平衡化されたPD10脱塩カラムAmershamで緩衝液交換を行った。各精製工程のフロースルーおよび溶出画分をSDSPAGEにより分析したところ、λ軽鎖を保持している抗体は、CaptureSelectFabKappaアフィニティマトリックスのフロースルーの中に見出され、反対に、κ軽鎖を保持している抗体は、CaptureSelectFabLambdaアフィニティマトリックスのフロースルーの中に見出されることが示された図8B。予想通り、最終的な溶出画分において、2種の軽鎖に対応するバンドの強度は、等しい。このように、この3工程アプローチは、κ軽鎖およびλ軽鎖の両方を保持している二重特異性抗体の精製を可能にする。κ軽鎖およびλ軽鎖を保持している二重特異性抗体の最終的な回収率は、異なる実験においておよそ10~21であった。プロテインA溶出画分は、λ軽鎖の方がκ軽鎖より多く、精製されたIgGへと集合することも示し、このことから、κ軽鎖の発現の増強が、二重特異性抗体の構築および回収率を増大させ得ることが示唆された。実施例9:二重特異性抗体構築を最適化するための軽鎖発現のモジュレーションκ軽鎖の発現を増強させるため、共通のVH遺伝子と、抗INFγ抗体のVλ遺伝子と、抗IL6RCのVκの2コピーとを、実施例6に記載されたベクターpNoviκHλκへクローニングした。Vκ軽鎖の第2のコピーの発現は、IRESにより駆動される。異なるレベルのVκ軽鎖発現を達成するため、異なるIRES要素を試験した。これは、5種の独立のベクターpNoviκHλκ1~5の構築をもたらした。これらのベクターを、実施例7に記載されたような、哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションのために使用し、プロテインAアフィニティ精製を使用して、上清から全IgGを精製した。SDSPAGE分析は、異なるpNoviκHλκベクターが、pNoviκHλベクターを使用した発現と比較して、κ軽鎖の発現およびIgGへの集合を増強させたことを示す図9。これらの構築物の各々についてプロテインA精製の後に得られた全IgG画分を、実施例8に記載されるようなCaptureSelectFabKappaおよびCaptureSelectFabLambdaを使用した連続的な2工程で精製した。二重特異性抗体の収率は、pNoviκHλについては20、pNoviκHλκ構築物については33~41の範囲であり、このことから、κ軽鎖発現の増強が、二重特異性抗体の構築を増強させることが示された。これらの所見をさらに確認するため、pNoviκHλおよび単一特異性抗IL6RCIgGκを発現するベクターを使用したコトランスフェクションを実施した。それにより、κ軽鎖の相対的なレベルも、二重特異性抗体の収率も増大し、このことから、相対的な軽鎖発現を調整するため、いくつかのアプローチを採用し得ることが示された。実施例10:精製された二重特異性抗体の特徴決定上記実施例に記載されるようにして単離された、精製された二重特異性抗体を、異なる技術を使用して特徴決定した。等電点電気泳動ゲルIEF。実施例9に記載されるようにして単離された、精製された二重特異性抗体を、pH3~10の範囲を有するIsoGelAgaroseIEFプレートLonzaを使用して分析し、単一特異性の抗INFγIgGλ抗体および抗IL6RCIgGκ抗体と比較した。電気泳動後、ゲルを固定溶液中に30分間置き、水により5分間洗浄し、次いで、RTで乾燥させた。ゲルを、クーマシー染色により15分間染色し、水により簡単に濯ぎ、脱染溶液により15分間2回濯いだ。最後に、ゲルをRTで乾燥させた後、画像化した。図10Aに示される結果は、IgGκλ二重特異性抗体が、抗体フォーマットおよび理論上の計算から予測されるような2種の単一特異性抗体のpIと比較して、異なる中間のpIを有することを示す。染色は、二重特異性抗体が、実施例8に記載された3工程精製過程の後に、高度に純粋であることも証明した。イオン交換クロマトグラフィIEX。精製された単一特異性抗体および二重特異性抗体50μgを、AgilentcolumnBioMabNP5Agilentを使用したIonExchangeHighPerformanceLiquidChromatographyIEXHPLCHPLCWaterse2695検出器2489により分析した:移動相は以下の通りであった:A:Na2HPO4NaH2PO410mM、pH65;B:Na2HPO4NaH2PO410mM、NaCl100mM、pH65;08mL分の流速、133分での20~60勾配を使用。3種の抗体は、異なる保持時間を有し、二重特異性抗体に対応するピークは、単一特異性抗体と比較して、中間のプロファイルを有する図10B。ELISA。単一特異性の抗INFγIgGλ抗体、抗IL6RCIgGκ抗体、および二重特異性IgGκλ抗体を、INFγおよびIL6RCとの結合について、ELISAにより試験した。図11に示される結果は、二重特異性IgGκλが、両方の標的と結合することができ、抗ヒトCκ二次抗体および抗ヒトCλ二次抗体の両方により検出され得ることを示す。表面プラズモン共鳴SPR。単一特異性の抗INFγIgGλ抗体、抗IL6RCIgGκ抗体、および二重特異性IgGκλ抗体の親和性および結合動力学を、Biacore2000装置BiacoreABUppsalaSwedenで特徴決定した。200RUのヤギ抗ヒトポリクローナルIgGahIgG;Biacoreを、EDCNHS化学によりCM5Biacoreチップに固定化した。この表面を単一特異性ヒトIgGまたは二重特異性ヒトIgGを捕獲するために使用した。30μL分で30秒間、10mMグリシンpH=15を注入した後、HB緩衝液で1分間安定化することにより、各サイクルの後、表面を再生させた。データを、11ラングミュアモデルに従って適合させ、Kon値、Koff値、およびKD値を決定した表III。単一特異性抗体および二重特異性IgGκλ抗体について、類似した親和性値が得られた。データは、2種の抗体結合部位が、単一特異性フォーマットまたは二重特異性フォーマットにおいて、同様に、hIFNγおよびIL6RCと結合することを示す。両方の標的と同時に相互作用する二重特異性IgGκλの能力を、SPRにより試験した。ビオチン化INFγを、ストレプトアビジンでコーティングされたCM5Biacoreチップに固定化した。単一特異性抗体および二重特異性抗体を、この表面に注入した後、IL6RCを注入した。図11Aに示されるセンサーグラムは、二重特異性IgGκλ抗体が、固定化されたINFγと結合することができ、同時にIL6RCを捕獲することもできたことを示す。精製された二重特異性抗体におけるκ軽鎖およびλ軽鎖の相対量を査定するためにも、SPRを使用した。IgGκλを、アミン共役を介してCM5Biacoreチップの表面に直接固定化し、抗ヒトCκ抗体を注入した後、同濃度の抗ヒトCλ抗体を注入した。両方の抗軽鎖抗体により同等の応答が得られ、このことから、フォーマットから予測される通り、等量のκ軽鎖およびλ軽鎖が二重特異性IgGκλ抗体に存在することが示された図12B。表IIIBiacore2000系で測定されたIFNγおよびIL6RCに対する単一特異性抗体およびIgGκλ二重特異性抗体についての結合動力学的分析実施例11:二重特異性IgGκλ抗体の製造IgGκλ二重特異性抗体の発現を、モノクローナル抗体の製造のために広範に使用されているチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞においても実施した。本明細書に提示された実施例において、トランスフェクトされたCHO細胞の半安定プールおよび安定細胞CHO株の両方が、IgGκλ二重特異性抗体の生成のために生成された。本明細書に提示された研究において、安定CHO株は、既知組成動物成分不含CDACF製造過程を使用して、生成され増殖させられた。全過程が図13に示される。CHOプール。上記実施例に記載されたIgGκλ抗INFγ抗IL6RC二重特異性抗体をコードする直鎖化されたベクターpNoviκHλκ、ならびに単一特異性の抗INFγIgGλおよび抗IL6RCIgGκの発現を駆動するプラスミドにより、CHO細胞を電気穿孔した。電気穿孔の後、トランスフェクトされた細胞のプールを、非流加10日間過増殖条件において増殖させた。二重特異性構築物によりトランスフェクトされた細胞は、単一特異性発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞と比較して、類似している増殖プロファイルを示した。さらに、産生量も比較可能であって、非流加過増殖プール培養物について、典型的な抗体産生量の範囲:100~200mgLに達した図14A。三角フラスコ100mLにおける小規模作製から25LWaveバッグにおける中規模作製への規模拡大は、成功裡に達成された図14B。これらの結果は、CHO細胞株における二重特異性IgGκλ抗体および対応する単一特異性抗体の発現において、類似した増殖曲線および産生量が得られることを示す。安定CHO細胞株。二重特異性抗体を産生する組換え細胞株を、pNoviκHλκベクターによるCHO細胞の電気穿孔により生成した。トランスフェクション後、最終濃度50μMのメチオニンスルホキシミンMSXの存在下で細胞培養物を希釈することにより、組換え細胞株を選択した。6週間のインキュベーションの後、組換え細胞株のコロニーを、FastELISA登録商標RDBiotechにより、全IgG産生量についてスクリーニングした図15A~B。選択された細胞株を、25μMMSXを含有している細胞培養培地において増大させ、24穴マイクロタイタープレートに移し、懸濁培養における産生量および増殖特徴についてスクリーニングした図15C~D。結果は、IgGκλ二重特異性抗体が、振とうバッチ過増殖条件において、標準的な単一特異性抗体を発現する細胞株と比較可能なレベルで産生され得ることを明らかにした。上位産生細胞株を選択し、最長で10日間、振とうフラスコにおいて50mLバッチ過増殖培養を行った。プロテインAHPLCを、上清中の全IgGの定量化のために使用した。上位10の産生細胞株の上清からの全IgGを、1mLHiTrapGEHealthcareプレパックカラムを使用したMabSelectSuREクロマトグラフィにより精製した。精製された全IgGの中の単一特異性抗体と二重特異性抗体との相対量を、実施例10に記載されるようなIEXHPLCにより査定した。細胞株の大部分について、IgGκλ二重特異性抗体の画分は、全IgGの37~42の間であり、2種の細胞株は、より少量のIgGκλを発現していた22および25。10のCHO細胞株についての結果は、表IVに要約される。表IVCHOにおいて発現されたIgGκλ二重特異性抗体の精製および特徴決定。二重特異性構築物および単一特異性構築物によりトランスフェクトされたCHO細胞プールの上清を、精製のために使用した。単一特異性の抗INFγIgGλおよび抗IL6RCIgGκを、プロテインAアフィニティクロマトグラフィを使用して精製し、PBSへと脱塩し、二重特異性IgGκλ抗体を、実施例8に記載された3工程アフィニティクロマトグラフィ過程を使用して精製した。異なる工程の溶出画分およびフロースルー、ならびに最終精製試料を、SDSPAGEおよびIEFにより分析した図16。IgGκλの特異性を、ELISAにより、各精製工程の後にモニタリングした図17。結果は、精製過程が、頑強であり、CHOにおける発現と適合性であり、高度に純粋なIgGκλ二重特異性抗体を与えることを証明している。実施例12:二重特異性IgGκλ抗体の付加的な例上記実施例に記載されたようにして、IgGκλ二重特異性抗体のその他の例を単離し、発現させ、精製した。これらには、抗NusA/抗INFγIgGκλ二重特異性抗体、および両方の結合部位がIL6RCと結合するが、κ軽鎖およびλ軽鎖を保持している抗IL6RC抗IL6RCIgGκλ二重特異性抗体が含まれた。これらの精製された二重特異性抗体を、それぞれの単一特異性カウンターパートと共にIEFにより分析した図18。結果は、二重特異性抗体のpIは、常に、単一特異性抗体のpIの中間にあるが、その差は、軽鎖可変ドメインの配列に依って有意に変動し得ることを示している。これは、2種の軽鎖が類似した生化学的特性を有する場合、電荷の差に基づく二重特異性抗体の精製は困難であり得ることを例証しており、本発明のアフィニティ精製アプローチの利点を強調する。実施例13:2種のκ可変ドメインまたは2種のλ可変ドメインを使用した二重特異性IgGκλ抗体の生成二重特異性抗体は、同一の型λまたはκの2種の可変ドメインを使用しても生成され得る。アフィニティ精製工程は、軽鎖の定常κドメインおよび定常λドメインの存在を必要とするため、原理的には、任意の軽鎖可変ドメインを、図3に示されるようなハイブリッド軽鎖を生成するため、これらの定常ドメインと融合させることができる。これは、実施例1に記載された固定VH抗体ライブラリーから単離されたINFγおよびIL6RCに対する2種の抗体を使用することにより証明された。この場合、両方の抗体が、同一のVHを有し、λ軽鎖可変ドメインを有する。抗INFγ抗体のVλドメインをλ定常ドメインと組み合わせ、抗IL6RC抗体のVλドメインをκ定常ドメインと組み合わせた。後者について、VλドメインとCκドメインとの間の異なる融合点を含む、3種の異なる構築物が生成された。1種の構築物ハイブリッド1において、融合点は、Vλドメインのフレームワーク4FR4領域の末端にあり、定常κドメイン全体を含む図19A。もう1種の構築物ハイブリッド2においては、λFR4領域がκFR4領域に交換された図19B。第3の構築物ハイブリッド3においては、定常κドメインの最初の4アミノ酸が、定常λドメインの4アミノ酸に置換された図19C。これらの異なるハイブリッドλ軽鎖κ軽鎖を、共通の重鎖およびλ軽鎖と共にpNoviκHλベクターへクローニングした。上記実施例に記載されるようにして、哺乳動物細胞トランスフェクション、タンパク質発現、およびIgGκλの3工程アフィニティ精製を実施した。溶出画分の分析は、ハイブリッド3の軽鎖が、Kappaselect樹脂と結合せず、従って、効率的な二重特異性抗体精製を可能にしないことを示した。ハイブリッド1およびハイブリッド2は、効率的なIgGκλ二重特異性精製を可能にした。Protein80チップAgilentTechnologiesを使用したAgilentBionalyzer2100で分析された、ハイブリッド軽鎖を保持しているこれらの精製されたIgGκλ、および軽鎖に対応する電気泳動図上のピークは、等しいことが示された図20。結果は、共通の重鎖と、同一の型κまたはλの可変ドメインを有する2種の軽鎖とを有する2種の抗体を使用して、本発明の二重特異性抗体が、生成され得ることを示す。実施例14:記載された抗体のVHおよびVLの両方が抗原結合に関与している共通のVHの抗原結合への寄与を試験するため、実施例1および4において選択された共通のVHを保持しているscFvの異なる軽鎖を、最初の共通のVHとは異なる2種の異なるVHと組み合わせた。実施例3に記載されたようにして、異なるscFvを発現させ、精製し、それらが選択された標的に対する結合について試験した。図21に示される例は、INFγに特異的なscFvおよびIL6RCに対して特異的なscFvが、それらが最初に選択されたVHドメインと組み合わされた時にのみ、それぞれの標的と結合することができ、発現および精製を可能にする2種の他のVHドメインと組み合わされた時には、結合が観察されないことを示している。結果は、多様性がVLドメインに制限されているという事実にも関わらず、共通のVHおよびVLの両方が、抗原結合に寄与することを示す。実施例15:IgGκλ二重特異性抗体定量化のためのELISAの開発IgGκλ二重特異性抗体を定量化するためのサンドイッチELISAを開発した。96穴MaxisorpNuncプレートを、10ugmlマウス抗ヒトλ抗体SouthernBiotechによりコーティングし、4°Cで一夜インキュベートした。洗浄005PBSトゥイーン20、3回の後、PBSBSA3Sigmaにより室温で2時間プレートをブロッキングした。試料定量化のための良好な直線範囲を得るため、精製されたIgGκλ標準物を、PBSBSA1により500ngml~1ngmlの間に段階希釈した。起源に依って、以下のような定量化範囲に入るよう試料を希釈した:粗CHO上清11500;プロテインA精製115000。次いで、試料を12に段階希釈した。プレートの洗浄後、調製された各希釈物50ulをデュプリケートで添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、12000抗ヒトκ抗体SouthernBiotech50ulと共に室温で1時間インキュベートした。最後の洗浄PBST005、5回の後、反応をTMB基質Sigma50ulにより可視化し、15分後、H2SO4水酸化ナトリウム2N50ulを添加することにより中止した。450nmにおける吸収を、精密マイクロプレートリーダーEpochWitecを使用して記録した。単一特異性抗体が、コーティングされた捕獲抗体と結合することによりアッセイに影響を与える可能性があるため、増加する量の単一特異性IgGκ抗体および単一特異性IgGλ抗体をIgGκλ二重特異性標準物に添加することにより、スパイキング実験を実施した。異なる比率を試験した:50IgGκλ二重特異性、25単一特異性IgGκ、25単一特異性IgGλ;67IgGκλ二重特異性;33単一特異性IgGλ;50IgGκλ二重特異性、50単一特異性IgGλ;25IgGκλ二重特異性、75単一特異性IgGλ;50IgGκλ二重特異性、50単一特異性IgGκ。図22に示される結果は、アッセイが、単一特異性抗体により有意に影響を受けず、従って、細胞培養上清のような複雑な試料におけるIgGκλ二重特異性抗体の定量化のために使用され得ることを示す。安定CHO細胞株からの上清、およびプロテインAアフィニティクロマトグラフィにより同上清から精製された全IgGの中のIgGκλ二重特異性抗体を定量化するため、ELISAを使用した。ELISA定量化結果が、プロテインAHPLCまたは280nmにおける吸収により決定された全IgG含量と比較され、表Vに要約される。ELISAにより得られた濃度は、予想される二重特異性の割合である全IgGの30~40に相当した。データは、このアッセイが、細胞培養上清中のIgGκλ二重特異性抗体の量を決定するために使用可能であり、IgGκλ二重特異性抗体の産生量についての安定細胞株のスクリーニングを促進することを示す。表VELISAによる粗上清または全IgGを使用した異なる安定CHO細胞株についてのIgGκλ二重特異性抗体の定量化、ならびにプロテインAHPLCおよびA280による全IgGの定量化の結果との比較その他の態様本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、上記の記載は、本発明を例示するためのものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限するものではない。その他の局面、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。