"金属イオン配位性の環状配位子基を少なくとも1つ含む官能基によって官能化されたポリマー基体であって、前記配位子基は環状基の環内に少なくとも3つの窒素のドナー原子を含み、前記窒素原子の少なくとも1つはこれに共有結合した任意に置換されるカルボキシ低級アルキル基または任意に置換されるホスホノ低級アルキル基を含むポリマー基体。前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項1に記載の官能化されたポリマー基体。前記ポリマーが:多糖およびその誘導体;ポリアルキレングリコールおよびその誘導体;ポリビニルアルコールおよびその誘導体;ポリアクリルアミド;表面の修飾を行ったシリカ;および表面の修飾を行った金属酸化物から成る群から選択される、請求項1または2に記載の官能化されたポリマー基体。前記ポリマーが:アガロースおよびその誘導体;デキストランおよびその誘導体;およびセルロースおよびその誘導体から成る群から選択される、請求項1から3の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体。前記金属イオン配位性の環状配位子基が以下の中から選択される複素環から誘導される、請求項1から4の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体:トリアザシクロアルカンおよびトリアザシクロアルケン;並びにテトラアザシクロアルカンおよびテトラアザシクロアルケン。前記金属イオン配位性の環状配位子基が以下の中から選択される複素環から誘導される、請求項5に記載の官能化されたポリマー基体:1,4,7-トリアザシクロノナン;1,4,7-トリアザシクロデカン;1,4,8-トリアザシクロウンデカン;1,5,9-トリアザシクロドデカン;1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン;1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン;1,4,7,11-テトラアザシクロテトラデカン;1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン;1,4,8,12-テトラアザシクロペンタデカン;および1,5,9,13-テトラアザシクロヘキサデカン。前記任意に置換されるカルボキシ低級アルキル基がカルボキシメチルである、請求項1から7の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体。前記任意に置換されるホスホノ低級アルキル基がホスホノメチルである、請求項1から7の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体。前記官能基が前記ポリマー基体に対しリンカーまたはスペーサー基Xによって共有結合しており、前記基Xが前記金属イオン配位性の環状配位子基の環内の窒素原子に結合している、請求項1から8の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体。前記ポリマー基体がアガロースであり、および前記リンカーまたはスペーサー基Xが、エピクロロヒドリンとアガロースの反応、およびその反応生成物と前記金属イオン配位性の環状配位子基の環内の-NH-基との後続の反応によって生成される、エピクロロヒドリンを由来とする基である請求項9に記載の官能化されたポリマー基体。前記官能基内の少なくとも1つの前記環状基に配位する金属イオンをさらに含む、請求項1から10の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体。前記配位する金属イオンが二価または三価の金属イオンである、請求項11に記載の官能化されたポリマー基体。前記金属イオンがCa2、Mg2、Zn2およびFe3から成る群から選択される、請求項12に記載の官能化されたポリマー基体。請求項1に記載の官能化されたポリマー基体を作製する方法であって:第一および第二の官能基を有する二官能試薬の第一の官能基との間で第一の反応を行うことができる反応性官能基を有するポリマー基体を選択する段階であって、ここにおいて、前記第一の反応は、前記ポリマー基体と前記二官能試薬との間における共有結合の形成をもたらす反応であり、得られた共有結合した試薬の前記第二の官能基は、続いて、少なくとも1つの金属イオン配位性の環状配位子基を含む化学種に存在する反応性の環内-NH-基と第二の反応を起こすことができ、前記金属イオン配位性の環状配位子基は、前記環状基の環内に少なくとも3つの窒素のドナー原子を含み、少なくとも1つの前記窒素原子は、そこに共有結合した任意に置換されるカルボキシ低級アルキル基または任意に置換されるホスホノ低級アルキル基を有し、前記第二の反応は、前記化学種と前記共有結合した試薬との間における共有結合の形成をもたらす反応である段階;前記ポリマー基体と前記二官能試薬とを反応させる段階;および前記生成した共有結合した試薬と前記化学種とを反応させる段階を含んで成る方法。前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項14に記載の方法。前記ポリマーが:多糖体およびその誘導体;ポリアルキレングリコールおよびその誘導体;ポリビニルアルコールおよびその誘導体;ポリアクリルアミド;表面の修飾を行ったシリカ;および表面の修飾を行った金属酸化物から成る群から選択される、請求項14または15に記載の方法。前記ポリマーが:アガロースおよびその誘導体;デキストランおよびその誘導体;およびセルロースおよびその誘導体から成る群から選択される、請求項14から16の何れか1項に記載の方法。前記金属イオン配位性の環状配位子基が以下の中から選択される複素環から誘導される、請求項14から17の何れか1項に記載の方法:トリアザシクロアルカンおよびトリアザシクロアルケン;並びにテトラアザシクロアルカンおよびテトラアザシクロアルケン。前記金属イオン配位性の環状配位子基が以下の中から選択される複素環から誘導される、請求項14から18の何れか1項に記載の方法:1,4,7-トリアザシクロノナン;1,4,7-トリアザシクロデカン;1,4,8-トリアザシクロウンデカン;1,5,9-トリアザシクロドデカン;1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン;1,4,7,10-テトラアザシクロトリデカン;1,4,7,11-テトラアザシクロテトラデカン;1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン;1,4,8,12-テトラアザシクロペンタデカン;および1,5,9,13-テトラアザシクロヘキサデカン。前記任意に置換されるカルボキシ低級アルキル基がカルボキシメチルである、請求項14から19の何れか1項に記載の方法。前記任意に置換されるホスホノ低級アルキル基がホスホノメチルである、請求項14から19の何れか1項に記載の方法。前記ポリマー基体がアガロースであり、および前記二官能試薬がエピクロロヒドリンである、請求項14から21の何れか1項に記載の方法。前記ポリマー基体と前記二官能試薬の反応の時に、還元剤を反応混合物に取り込む、請求項22に記載の方法。前記還元剤が水素化ホウ素ナトリウムである、請求項23に記載の方法。請求項14から24の何れか1項に記載の方法によって得られる官能化されたポリマー基体。請求項1から10または25の何れか1項に記載の官能性ポリマー基に、さらに前記環状基の少なくとも1つに配位した金属イオンが含まれる官能化されたポリマー基体を作製する方法であって、請求項1から10または25の何れか1項に記載の官能化されたポリマー基体と、前記金属イオンの無機塩または有機塩の水溶液とを接触させることを含む方法。請求項26に記載の方法によって得られる、金属イオンを含んだ官能化されたポリマー基体。MDADGNGTIDFAEFSEQ.IDNo.1MDIDGDGHINYEEFSEQ.IDNo.2MDVDGSGTIGSSELSEQ.IDNo.3MDVDRSGTIGSSELSEQ.IDNo.4MDADGNSEQ.IDNo.5MDIDGDSEQ.IDNo.6MDVDGSSEQ.IDNo.7MDVDRSSEQ.IDNo.8および、これら配列中から選択される配列における1以上のアミノ酸残基が、そのアミノ酸残基と化学的に同等な官能性のアミノ酸残基で置き換えられた前記配列の変種から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチド。前記配列群の中から選択される配列におけるAlaA残基がGlyG残基で置き換えられた、またはそれと逆に置き換えられた;前記配列群の中から選択される配列におけるPheF残基がTyrY残基で置き換えられた、またはそれと逆に置き換えられた;前記配列群の中から選択される配列におけるValV、LeuLまたはIleI残基が、ValV、LeuL、IleI、ProPおよびMetMの中から選択される異なるアミノ酸残基で置き換えられた;前記配列群の中から選択される配列におけるAspD残基がGluE残基で置き換えられた、またはそれと逆に置き換えられた;および/または前記配列群の中から選択される配列におけるAsnD残基がGlnQ残基で置き換えられた、請求項28に記載のオリゴペプチド。請求項28または29に記載のオリゴペプチドの少なくとも1つに、アミノ末端またはカルボキシ末端で融合した、関心あるタンパク質分子を含む融合タンパク質であるポリペプチド。前記オリゴペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシ末端が、それぞれ関心あるタンパク質分子に融合している、請求項30に記載のポリペプチド。前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が、酵素的および化学的切断サイトから成る群から選択される切断サイトに隣接している、請求項31に記載のポリペプチド。前記2つの関心あるタンパク質分子が同じタンパク質の分子である、請求項31または32に記載のポリペプチド。前記2つの関心あるタンパク質分子が異なる、請求項31または32に記載のポリペプチド。請求項29から34の何れか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を含む宿主細胞を、適した成長培地において前記ポリペプチドを発現しうる条件下で培養し、および前記ポリペプチドを培養培地から回収することで得られうるポリペプチド。前記宿主細胞がEscherichiacoliの株である、請求項35に記載のポリペプチド。請求項29から34の何れか1項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物。ベクターである、請求項37に記載のポリヌクレオチド構築物。請求項37または38に記載のポリヌクレオチド構築物を含む宿主細胞。Escherichiacoli株である請求項39に記載の宿主細胞。請求項39または40にて定義された宿主細胞を、適した成長培地において前記ポリペプチドを発現しうる条件下で培養し、および前記ポリペプチドを培養培地から回収することを含む請求項29から36の何れか1項に記載のポリペプチドを作製する方法。関心あるタンパク質を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法:前記関心あるタンパク質を含む請求項30から36の何れか1項に記載のポリペプチドとともにその他のタンパク質を含むタンパク質サンプルと、請求項11から13および27の何れか1項に記載の金属イオンを含む官能化されたポリマー基体とを、前記ポリペプチドが前記金属イオンを含む官能化されたポリマー基体と結合し、それらの複合体を形成する条件下にて接触させること;緩衝溶液にてその複合体を洗浄し、前記その他のタンパク質を除去すること;および洗浄した複合体から結合したポリペプチドを溶出すること。さらに前記オリゴペプチドが前記ポリペプチドから切断される段階を含む請求項42に記載の方法。前記オリゴペプチドが酵素的手段によって前記ポリペプチドから切断される請求項43に記載の方法。エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼが前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドを切断するために用いられる請求項44に記載の方法。請求項42から45の何れか1項に記載の方法によって得られうる精製されたタンパク質。略語APS過硫酸アンモニウムBESNNビス2アミノエタンスルホン酸CAPS31プロパンスルホン酸CHES2エタンスルホン酸サイクラム14812テトラアザシクロペンタデカンサイクレン14710テトラアザシクロドデカンDaダルトンDIPEA13ジイソプロピルエチルアミンDMFNNジメチルホルムアミドDO3A147トリス14710テトラアザシクロドデカンDO2P17ビス14710テトラアザシクロドデカンDO3P147トリス14710テトラアザシクロドデカンEDT12エタンジチオールGSTグルタチオンS転移酵素HBTUOベンゾトリアゾールNNN’N’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェートHEPES4ピペラジン1エタンスルホン酸HOBtNIMAC固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIm固定化imCa2固定化カルシウムイオンimFe3固定化三価鉄イオンimMn固定化金属イオンimCa2DO3ADO3AおよびCa2イオン由来の固定化金属イオン複合体imCa2DO3PDO3PおよびCa2イオン由来の固定化金属イオン複合体IPTGイソプロピルβDチオガラクトシドMES2エタンスルホン酸MOPS3プロパンスルホン酸PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動PBSリン酸緩衝食塩水SDSドデシル硫酸ナトリウムTacn1AまたはT1A1147トリアザシクロノナンTacn2AまたはT2A14ビス147トリアザシクロノナンTacn2PまたはT2P14ビス147トリアザシクロノナンTacn147トリアザシクロノナンTrisトリスアミノメタンTFAトリフルオロ酢酸金属イオン配位性配位子17ビス14710テトラアザシクロドデカンの合成DO2Pの多段階合成を、以前報告された方法56によって行った。17ビス14710テトラアザシクロドデカンサイクレンをH2Oに溶解し、6MHClを加えてpHを30に調整し、その後ジオキサンを加えた。クロロギ酸ベンジルをジオキサンに溶解し、その溶液を、2MNaOHを加えてpHを23に維持しつつ、前記混合物にシリンジを通して添加した。16時間後添加が完了し、その溶媒を減圧下において蒸発させた。得られた白色固体残留物をジエチルエーテルで抽出し、透明な油状物質を得た。収量:07g:157mmol541HNMRδ280342515734。17ビス410ビス14710テトラアザシクロドデカンBuraiらによる文献5に記述されるとおり、Iに対してトリエチルホスファイトを加え、混合物を氷上で0°Cまで冷却した。パラホルムアルデヒドを、30分間かけてゆっくりと添加し、その混合物を室温まで温めた。室温で2日間攪拌し、その後40°Cで1日攪拌して、透明な黄色油状物質を得た後、4050°Cにて高い減圧状態を数時間維持して揮発性の不純物を除去した。生成した透明な油状物質を、さらなる精製を行わず、次の合成段階に用いた。収量:05g067mmol4331PNMRδ26621HNMRδ73051340534285130。17ビス14710テトラアザシクロドデカン粗製の油状物質を5MHClに溶解し、24時間還流した。室温まで冷却した後、その混合物をジエチルエーテルで抽出し、ジエチルエーテルを減圧下にて蒸発させた。固体残留物を無水エタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加えた。白色沈殿物が直ちに形成され、その沈殿物をろ過紙減圧下にて乾燥させた。収量:01g028mmol42融点:285290°C31PNMRδ2226分析C10H26N4O6P2165H2O1HClの計測C2817H725N1257foundC2817H716N13141HNMRδ2913033290結晶解析DO2PをEtOHH2O溶液から再結晶し、ジエチルエーテルを添加した。X線結晶解析に適した結晶を、4°Cにて静置し二週間かけて形成させた。結晶のパラメータを表Iに示した:147トリス14710テトラアザシクロドデカンの合成公表されている方法39に従って、合成を4段階にて行った。14710テトラアザトリシクロトリデカンを、Atkinsらの方法9に従って作製し、段階24はDischinoらの方法3によって行った。14710テトラアザトリシクロトリデカンサイクレンを、トルエンに溶解し、ジメチルホルムアミドジメチルアセタールを添加した。その混合物を80°Cで一晩攪拌し、その後トルエンを減圧下にて除去した。粗製の油状物質を、高い減圧状態にて蒸留し、精製した。収量:4g2203mmol761HNMRδ166288444。1ホルミル14710テトラアザシクロドデカン14710テトラアザトリシクロトリデカンを4°Cまで冷却し、EtOHH2O溶液を加えた。その反応混合物を室温にてゆっくりと温め、12時間窒素下にて攪拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、アセトニトリルに溶解し、さらに濃縮した。この工程を3回繰り返し、残っているH2Oを除去した。淡黄色油状物質を、減圧下室温で一晩乾燥させ、白色含水固体を得た。収量:395g198mmol901HNMRδ2528355815。147トリス10ホルミル14710テトラアザシクロドデカンDMFに395gの2を加えた溶液を窒素下で攪拌し、tertブチルブロモアセテートを、30分間かけて加えた。反応混合物の温度を、さらに35分間、30°Cに維持した。水に溶解させた無水炭酸ナトリウムを、上記の反応混合物に加え、30分間攪拌した。トルエンの添加の後、混合物をさらに4時間攪拌した。この混合物を、次に、分液ロートに移し、相を分離した。トルエン相を、1MNa2CO3で3回抽出した後、08MHClにて抽出し、最後にH2Oにて抽出した。水相をまとめ、pHをNa2CO3を用いて94に調整した。これらのまとめた相を次に、ジクロロメタンにて2度抽出し、このDMC相をまとめ、Na2CO3にて乾燥させた。有機相を真空中にて濃縮し、粘性の淡黄色油状物質として3を得た。収量932g172mmol871HNMRδ145268303236805。147トリス14710テトラアザシクロドデカンDO3A2gの3を、5MHClに加え、その溶液を窒素下で6時間加熱して還流した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、水を加え、混合物を再度減圧して濃縮した。この工程を3回繰り返し、残っているHClを除去した。生成された透明な油状物質を、次にH2Oに溶解し、高い減圧下凍結乾燥で溶媒を除去し、淡黄色の生成物を得た。収量127g358mmol9713CNMRδ4134674835115215358167617341HNMRδ293336質量分析mz:calcdforDO3A346found347345147トリス14710テトラアザシクロドデカンの合成DO3Pは、以下模式図Bの文献による方法によって作製した:14710テトラアザトリシクロトリデカンおよび1ホルミル14710テトラアザシクロドデカンを、DO3Aの合成のために上述した方法にそって作製した。147トリス14710tテトラアザシクロドデカン1ホルミル14710テトラアザシクロドデカンおよびトリエチルホスフェートを、丸底フラスコに移し、そのフラスコをアイスバスに浸けた。パラホルムアルデヒドを、30分間かけて少量ずつ添加した。その混合物を室温まで温め、室温にて2日間攪拌し、さらに1日4050°Cで攪拌した。透明な混合物を50°Cで数時間高い減圧下に置いて、揮発性の不純物を取り除いた。その結果できる粗製のホスホン酸エステルを、さらなる精製を行わず、加水分解した。それを5MHClに溶解し、混合物を二日間還流した。塩酸をロータリーエバポレーターで除去し、透明な油状物質を得た。それをの水に溶解し、溶媒を減圧下にて除去した。この手順をさらに二回繰り返した。最後に、その油状物質を水に溶解し、エタノールを加えた。生成物が白色固体として沈殿し、それをろ過して、水で洗浄し風乾した。粗製の生成物を熱湯から再結晶し、微細な白色の結晶性固体として6を得て、それを減圧下にて質量が一定になるまで乾燥した。収量4g86mmol861HNMRδ2824H31534質量分析mzcalcdforDO3P454found455。14812テトラアザシクロペンタデカンの合成NN’N’’N’’’テトラトシル15812テトラアザシクロドデカン方法A15812テトラアザシクロドデカンを蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウムを攪拌しながら、温度が40°C以上にならないようにしながら、ゆっくりと加えた。混合物を、次に15°Cまで冷却し、ジエチルエーテルで希釈した。そしてトシルクロリドを、温度が15°Cに維持されるようしつつ、少量ずつ加えた。その溶液を氷上でさらに一時間攪拌した後、室温で一晩静置した。その結果できる白色の沈殿物をろ過し、水で洗浄し80°Cで2時間乾燥した。そして粗製の生成物を加熱したメタノール中で一時間攪拌し、ろ過し、減圧して乾燥した。収量354g448mmol781HNMRδ77374318295242178融点125128°C1920方法B15812テトラアザシクロドデカンおよびK2CO3を水に溶解し、80°Cに加熱した。トシルクロリドを3時間かけて少量ずつ加えた。その混合物を、一晩加熱して攪拌した。その結果できる透明の溶液を室温まで冷却することで、沈殿物が形成された。その白色固体をろ過し、それぞれ、水、メタノールおよびジエチルエーテルによる三度の洗浄を行い、その後減圧して乾燥させ、白色粉末を得た。収量17g215mmol751HNMRδ77374318295242178融点125128°C1920質量分析mzcalcdforC36H46N4O8S4790found791。セファロース6FFへの配位子の固定化エポキシ活性化セファロース6FFの作製セファロース6FFを水で広く洗浄し、吸引乾燥させ、丸底フラスコに移した。NaBH4を含んだ2MNaOHを加え、懸濁液を2時間室温で攪拌した。そしてエピクロロヒドリンを加え、その懸濁液を5日間攪拌した。その結果できる、エポキシ活性化ゲルを吸引ろ過にて収集し、水にて十分洗浄し、20エタノールで4°Cにて、配位子の固定に用いるまで保存した。DO3Aの固定化02MDO3Aの溶液を作製し、2MNaOHにてpHを12に調整した。このDO3A溶液を吸引乾燥したエポキシ活性化セファロース6FFに加え、反応混合物を4日間室温にて振盪した。その結果できる固定化DO3Aゲルをろ過し、水にて広く洗浄し、20エタノールで4°Cにて保存した。DO3Pの固定化DO3Pは水に不溶のため、水にDO3Pを加えた懸濁液を作製し、2MNaOHにてpHを12に調整した。このようにpHを上げることで、DO3Pは溶解したようであった。これによりできた溶液を最終的に液量が20mlになるように希釈し、吸引乾燥したエポキシ活性化セファロースを加えた。この懸濁液を4時間室温にてインキュベートした。この後、固定化DO3Pゲルを吸引ろ過にて収集し、5x50mlの水にて洗浄した。このゲルを20エタノールで4°Cにて保存した。官能化セファロース吸着剤の窒素分析固定化配位子ゲルを、窒素含量を分析して、配位子の固定化の程度を決定した。それぞれのゲルにおいて、約10gのゲルを、ろ過によって収集し、および真空中にて重量一定になるまで凍結乾燥した。乾燥した吸着剤を正確に重量測定し、窒素含量を、DairyTechnicalServicesLtdに依頼して分析した。固定化キレート化配位子への、カルシウムイオンおよびその他の金属イオンの固定化吸引乾燥した固定化配位子ゲルに、01MCaCl2溶液を加え、その後、pHを2MNaOHにて10に調整し、全液量を50mlに増やした。その混合物を室温にて1時間振盪してインキュベートした。そのゲルを次にろ過により回収し、水にて洗浄した。約1g湿重量のゲルを真空中にて凍結乾燥し、正確に重量を測定し、5MHCl中にて2時間50°Cで消化した。その溶液をH2Oで正確に50mlになるよう希釈し、Ca2含量を、VarianAA1475原子吸光分光器を用い、金属特異的波長および使用範囲例えば、Ca2イオンでは4227nmの波長にて、1から4ppmの使用範囲で、原子吸光分光分析法にて測定した。タグ配列に対応したペプチドの合成固相ペプチドの合成模式図7上記参照に示した配列をもつ八つのペプチドを、PS3ProteinTechnologiesAutomatedPeptideSynthesiserを用いて合成した。樹脂を、特別に設計された反応性導管に充填し、DMFと混合して室温で1時間膨潤させた。2倍の過剰量のFmoc保護したLアミノ酸、HOBtおよびHBTUを、ペプチド合成器の個々の回転台のバイアル瓶に量り入れた。それぞれのペプチドにおいて、1アミノ酸あたりの合成サイクルは以下のとおりである:I脱保護20ピペリジンを含む8mlDMF:2x5minII樹脂の洗浄6x30secIIIAAactivantの溶解1x30secIVAAカップリング1x60minV樹脂の洗浄6x30secVIIに戻り、次のアミノ酸とカップリング。合成完了後、樹脂ペプチド生成物を、DMFとともに可塑性シンターに移し、メタノールおよびジエチルエーテルにて洗浄した。粗製の樹脂ペプチド生成物を乾燥器にて一晩乾燥させた。樹脂からのペプチドの切断乾燥した樹脂ペプチド生成物を、50ml容量の丸底フラスコに移しアイスバスにて冷却した。あらかじめ作製し、冷却しておいた切断試薬混合物フェノールTFAEDTチオアニソール水下記参照を、前記樹脂ペプチド生成物に加え、その混合物を室温で2時間攪拌した。混合物を次にろ過し、そのフィルターをTFAにて洗浄し、ろ液と洗浄した液をまとめて、減圧下にて濃縮した。そして冷却したジエチルエーテルを激しく振盪しながら混合物に加えた。沈殿したペプチドをろ過し、50アセトニトリル水に再溶解し、一晩凍結乾燥して、綿毛状の白色の粗製生成物を得た。切断混合物:0375gフェノール025ml脱イオン水0125mlEDT025mlチオアニソール500mlTFAその結果は、以下の表IIに要約される:粗製ペプチドの精製分取および分析逆相HPLCを、WatersAssociates液体クロマトグラフィーシステムにて行った。前記システムは、2つのModel600溶媒輸送ポンプ、レオダイン注入器、WISPModel712autosampler、および自動化勾配調節器を含む。検出は、WatersMillenniumsoftwareコンピューターに繋がった、Model486可変波長UV検出器を用いて行った。ペプチドは、分取RPHPLCで、バッファーAからバッファーB90アセトニトリル水01TFAへの異なる溶出勾配表III、下記にて、流速6mlminで1時間かけて精製し、TOSOHのTSKODS120TC18カラムを用いて230nmの波長にて検出した。RPHPLCの分取用の運転から得た画分を、PharmaciaBiotechABのPharmacia画分収集器で収集し、一晩凍結乾燥した。収集した画分の精製度は、TOSOHのTSKODS120TC18カラムを用いた分析RPHPLCを、バッファーBの溶出勾配にて、流速1mlminで25分間行い、214nmで検出した。得られた精製ペプチドは、より長いアセトニトリル勾配を用いた分析RPHPLCによってさらに分析し、分子量を質量分析によって確認した。表IVにてみられるように、ペプチド1、2、3G、4、5および6G全てが、計算される質量に対応するスペクトルをもつ。ペプチド3Rおよび6Rは、欠失した生成物を含むと考えられ、ペプチド6Rはメチオニンが消えており、ペプチド3Rはアルギニンが欠失している。全長のペプチドから欠失した生成物を分離するため、溶出勾配の最適化が必要であり、それによって勾配の長さがかなり増加している。エレクトロスプレーイオン化質量分析ペプチドの分子量を、エレクトロスプレー源のMicromassplatform四重極型MSおよびMasslynxNTversion32softwareを用いた、エレクトロスプレーイオン化質量分析にて検出した。ペプチドを、50アセトニトリル水と3ギ酸の1:1混合液に溶解した。スキャンの範囲は、02000mzであり、サンプルは、手動の注入器にて10μlminの割合で注入した。アフィニティタグを伴う標的タンパク質の発現発現GSTタグ融合タンパク質の発現を、組み換えGSTタグプラスミドを含むEcoliのBL21宿主細胞の単一のコロニーを、10mlの2xYT培地16glのトリプトン、10glのイーストエクストラクト、5glNaCl、100μmlのアンピシリンを添加に直接接種することで、異なるスケールで行った。培養液を、37°Cで激しく振盪しながら一晩培養した。これらの培養液のそれぞれ10mlの分量を、500mlの2xYT培地を含む無菌の2L容バッフル付フラスコに入れ、600nmにおける吸収が0510に達するまで37°Cで振盪培養した。終濃度1mMになるようIPTGを添加し、培養を28°Cにてさらに3時間続けた。培養液を遠心分離用容器に移し、7700xg、4°Cで10分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清を捨て、細胞のペレットを、1xPBS、5mMEDTAおよび1mMPMSFを含むライセートバッファーに再懸濁した。溶液を、30mlの全量となるよう調整し、ニワトリ卵白リゾチーム溶液を加えた50mgml、全容量の1100。氷上で10分間溶液をインキュベーションした後、MgCl2およびDNA分解酵素Iの溶液を加え、その溶液を再度20分間氷上でインキュベートした。最後に、懸濁した細胞を、氷上での超音波処理にて破砕した。個々の超音波処理において、30秒間の破砕と30秒間の休止を3回行った。ライセートを、SS34ローターで13000xg、4°Cで20分間遠心して、細胞の細片から分離した。その上清を精製のために保持した。SDSPAGEによる分析分画したサンプルおよびクロマトグラフィーの溶出サンプルフロースルー、洗浄液および溶出液のそれぞれの一定分量をチューブに移し、5xサンプルバッファー下記参照を加えた。これらのサンプルを、90°Cで90秒間加熱し、それぞれの25μlを15SDSポリアクリルアミドゲルのそれぞれのウェルに、ピペットを用いて導入した。SDSポリアクリルアミドゲルは、4の濃縮ゲルを伴う15アクリルアミドゲルであり、以下のように作製した:分離ゲル濃縮ゲルアクリルアミドビスアクリルアミド溶液10ml088ml15MTrisClpH885ml05MTrisClpH68166ml10SDS02ml66μlH2O47ml40ml10APS100μl334μlTEMED14μl7μlサンプルバッファー:5xサンプルバッファーは以下から成る:15MTrisClpH8815mlグリセロール25mlSDS05gブロモフェノールブルー2mgベータメルカプトエタノール10ml水最終的に液量を50mlにするSDSポリアクリルアミドゲルは、TankRunningBuffer中で、HoefferMiniVEVerticalElectrophoresisSystemを用いて、ゲル一枚当たり20mAの定電流で、色素の前線が分離ゲルの下端に到達するまで泳動した。染色銀染色:ゲルは、以下に記述するSwainおよびRoss17の銀染色法を用いて染色した:銀染色プロトコール段階試薬量時間min1固定40エタノール80ml1010酢酸20ml水100ml2すすぎ水200ml103固定増感グルタルアルデヒド200μl5ホルムアルデヒド54μlエタノール80ml水120ml4すすぎ40エタノール200ml205すすぎ水200ml206増感チオ硫酸ナトリウム005g1水250ml7すすぎ水200ml18すすぎ水200ml19銀硝酸銀02g20水200ml10すすぎ水200ml111現像炭酸ナトリウム10gホルムアルデヒド160μl水400ml12停止5酢酸クマシーブルー染色:ゲルを、クマシー染料を用いて一晩染色した。この染料は、ゲルを完全に青く染色する。次の日、ゲルを脱色し、これによりタンパク質のバンドのみに青色が保持される。染色急速脱色クマシー25gメタノール300mlメタノール450ml水600ml水450ml酢酸100ml酢酸100ml結果タグを、組み換えDNA技術によってタンパク質GSTに導入した。GSTは、購入して利用でき、発現が容易であり、特徴が十分わかっており、およびグルタチオンセファロース4Bを用いて細胞ライセートから容易に精製できるため、モデルタンパク質としても用いた。タグ付加GSTタンパク質分子の発現は、宿主の細菌細胞EscherichiacoliBL21を用いて行われる。これらの細胞は、IPTGにより、タグ付加GSTタンパク質の発現が誘導された。宿主細胞の夾雑タンパク質から首尾よく精製されたタグ付加GSTタンパク質はSDSPAGEにて分析した。以下の模式図9でみることができるように、出発材料およびフロースルーは、様々なサイズの宿主の夾雑タンパク質を多く含む。精製し溶出した画分では、それぞれのタグ付加GSTにおいて、理論的なサイズに相当するバンドがみられ、溶出されたタンパク質が相対的に純粋であることがわかる。タグ1GST、タグ2GST、タグ4GSTおよびタグ6GSTでは、主なバンドの下により小さいバンドがあり、これは宿主細胞のプロテアーゼの作用によって形成された、切断されたタグ付加GSTに対応しているのかもしれない。ベクターを用いた、宿主細胞のIMACゲルへのアフィニティに関するSDSPAGE分析から、タグ付加GSTタンパク質と共精製され得る、存在量の低い宿主タンパク質は、ほとんどない、または全くないことが確認された。精製したタンパク質は、発現されるサイズの比較のために、一枚のゲルにて泳動した。期待されたとおり、タグ13長いタグ、模式図9参照は、タグ46よりわずかに長く、タグ2、4および6では、多少のマイナーな夾雑切断産物模式図10が存在した:MALDITOF質量分析によってこれらのタグ付加タンパク質についてさらに特性を調べた結果、全てが期待される分子量を有する全長のタンパク質を発現していることがわかった表V。タグ2、4および6GSTにてみられた夾雑物は、GSTタンパク質からタグが完全に切断されたものに相当する。これらの切断された産物が全産物の10より低い存在量であり、imMnゲル2または3金属イオン、例えばCa2に結合することもできないであろうことを考慮すると、これらのタンパク質サンプルはさらに、続くCa2結合の分析に用いることが可能である。[参考文献]PorathJProtExprPurif19923263281KovacsZSherryADJJChemSocChemCommun1995185DischinoDDDelaneyEJEmswilerJEGaughanGTPrasadJSSrivastavaSKTweedleMFInorgChem19913012651269SunXWuestMKovacsZSherryADJBiolInorgChem20038217225BuraiLRenJKovacsZBruecherESherryADInorgChem1998376975KovacsZSherryADJSynthesis1997759RichmanJEAtkinsTAJAmChemSoc19749622682270ParkerDMacrocycleSynthesisapracticalapproachOxfordUniversityPressNewYork1996Vol2AtkinsTJUS1978WeismanGRVachonDJJohnsonVBGronbeckDAJChemSocChemCommun1987886ZachariouMPhDThesis1994DepartmentofBiochemistryMonashUniversityPorathJOlinBBiochemistry19832216211630JenningsMLAnnuRevBiochem1989589991027BabuNature19853153740NovabiochemNovabiochemcatalogandpeptidesynthesishandbook1999HearnMTWAcostaDJMolRecognit200114323369SwainMRossNWElectrophoresis199516948951ChagaGAnderssonBandPorathJJChromatogrA1996732261269RichmanJEandAtkinsTJJAmChemSoc1974962268ParkerDMacrocycleSynthesisaPracticalApproachOxfordOxfordUniversityPress1996"