"aクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する結合と交差競合するおよび/またはb前記ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。aクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する結合と交差競合するおよび/またはb前記ATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項3に記載の抗体またはその抗原結合性断片。モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号PTA-9692またはその抗原結合性断片。モノクローナル抗体PA-50ATCC受託番号PTA-9694またはその抗原結合性断片。モノクローナル抗体PA-38ATCC受託番号PTA-9888またはその抗原結合性断片。モノクローナル抗体PA-41ATCC受託番号PTA-9693またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項5に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項6に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項7に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である、請求項8に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。請求項1~12のいずれか1項に記載の前記抗体または抗原結合性断片をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む、発現ベクター。請求項1~12のいずれか1項に記載の前記抗体または抗原結合性断片の重鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む、発現ベクター。請求項1~12のいずれか1項に記載の前記抗体または抗原結合性断片の軽鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む、発現ベクター。請求項1~12のいずれか1項に記載の前記抗体または抗原結合断片の前記重鎖またはその一部および軽鎖またはその一部をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む、発現ベクター。請求項13に記載の前記発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞。請求項14に記載の前記発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞。請求項15に記載の前記発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞。請求項16に記載の前記発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞。前記抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する、請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、1μg~1000μgの範囲または1mg/kg~50mg/kgの範囲の量でクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する、請求項21に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、i2、5、10、50または100μgまたはii40または50mg/kgから選択される用量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する、請求項22に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、前記クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する、請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、1μg~1000μgの範囲または1mg/kg~50mg/kgの範囲の量で前記クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する、請求項24に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、i2、5、10、50または100μgまたはii1mg/kg~50mg/kgから選択される用量で、前記クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する、請求項25に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、前記被検体の生存性を高める、請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する前記抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態である、請求項27に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、前記被検体の生存性を高める、請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する前記抗体または抗原結合性断片が、前記ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態である、請求項29に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、治癒率50、60、70、80、90または100を達成する、請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体またはその抗原結合性断片が、i2、5、10、50または100μgまたはii40または50mg/kgから選択される用量で、前記クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する、請求項31に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体またはその抗原結合性断片がiモノクローナル抗体であるかモノクローナル抗体由来であるか、iiヒト化形態であるか、iiiヒトであるか、ivキメラ形態であるか、v二重特異性抗体であるか二重特異性抗体に含まれる、請求項1~4のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。前記抗原結合性断片が、Fab断片、Fab’2断片またはFv断片から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体またはその抗原結合性断片が、単鎖抗体であるか単鎖抗体を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。iATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前記抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインのうちの1つ以上と、iiATCC受託番号PTA-9693で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前記抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888、その抗原結合性断片、前記抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインのうちの1つ以上と、iiATCC受託番号PTA-9693で寄託された単離されたモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前記抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、請求項36に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。請求項1~12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤または希釈剤とを含む、組成物。前記組成物が追加の治療剤をさらに含む、請求項38に記載の組成物。前記追加の治療剤が、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤である、請求項39に記載の組成物。前記追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである、請求項39に記載の組成物。請求項13に記載の前記発現ベクターと、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物。請求項17に記載の前記宿主細胞と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物。i請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の前記抗体またはその抗原結合性断片と、ii請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の前記抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤と、を含む、組成物。iおよびiiの前記抗体またはその抗原結合性断片がヒト化形態である、請求項44に記載の組成物。前記組成物が少なくとも1種類の追加の治療剤をさらに含む、請求項45に記載の組成物。前記少なくとも1つの追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである、請求項46に記載の組成物。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBを結合するための結合部位を含む少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、少なくとも1つのポリペプチド鎖が、第1の重鎖可変ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインまたはその一部を含み、少なくとも1つのポリペプチド鎖が、第1の軽鎖可変ドメイン、第2の軽鎖可変ドメイン、軽鎖定常ドメインまたはその一部を含み、前記ポリペプチド鎖を含む前記可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBに対する機能的結合部位を形成する、結合タンパク質。前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する機能的結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する機能的結合部位を形成する、請求項48に記載の結合タンパク質。前記第1の重鎖可変ドメインおよび前記第1の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する機能的結合部位を形成し、前記第2の重鎖可変ドメインおよび前記第2の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する機能的結合部位を形成する、請求項48に記載の結合タンパク質。前記結合タンパク質がFc領域を含む、請求項48~50のいずれか1項に記載の結合タンパク質。前記結合タンパク質が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの毒性を中和する、請求項48~50のいずれか1項に記載の結合タンパク質。前記結合タンパク質が、a表面プラズモン共鳴で測定した場合の少なくとも102M-1s-1;少なくとも103M-1s-1;少なくとも104M-1s-1;少なくとも105M-1s-1;少なくとも106M-1s-1;または少なくとも107M-1s-1から選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する結合速度定数Konおよび/またはb表面プラズモン共鳴で測定した場合の最大で10-3s-1;最大で10-4s-1;最大で10-5s-1;または最大で10-6s-1から選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する解離速度定数Koffを有する、請求項48~50のいずれか1項に記載の結合タンパク質。前記結合タンパク質が、最大で10-7M;最大で10-8M;最大で10-9M;最大で10-10M;最大で10-11M;最大で10-12M;または最大で10-13Mから選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する解離定数KDを有する、請求項48~50のいずれか1項に記載の結合タンパク質。請求項48~50のいずれか1項に記載の前記結合タンパク質と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤と、を含む組成物。追加の治療剤をさらに含む、請求項55に記載の組成物。前記追加の治療剤が、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤である、請求項56に記載の組成物。前記追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである、請求項56に記載の組成物。ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9693、PTA-9494またはPTA-9888で寄託された、ハイブリドーマ細胞株。被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療する方法であって、前記被検体に、i請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の少なくとも1つの抗体またはその断片、ii請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の前記抗体を、前記クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。iおよびiiの前記抗体またはその断片を、同時に投与する、請求項60に記載の方法。iおよびiiの前記抗体またはその断片を、異なる時点で投与する、請求項60に記載の方法。被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療する方法であって、前記被検体に、請求項44に記載の前記組成物を、前記クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療する方法であって、前記被検体に、請求項45に記載の前記組成物を、前記クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療する方法であって、前記被検体に、請求項46に記載の前記組成物を、前記クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療する方法であって、前記被検体に、少なくとも請求項5~7に記載のモノクローナル抗体および請求項8に記載のモノクローナル抗体と、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、溶媒または賦形剤とを、前記クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で投与することを含み、前記モノクローナル抗体がヒト化形態である、方法。前記モノクローナル抗体を同時に投与する、請求項66に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBによる、細胞に対する毒性を阻害または中和する方法であって、前記細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA阻害用量または中和用量の請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片および有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB阻害用量または中和用量の請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片に曝露することを含む、方法。前記抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片および前記抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片を同時に投与する、請求項68に記載の方法。前記抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片および前記抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片を、異なる時点で投与する、請求項68に記載の方法。前記細胞が被検体に存在し、前記抗体またはその抗原結合性断片を、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBの毒性を阻害または中和するのに有効な量で前記被検体に投与する、請求項68に記載の方法。前記抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片および/または前記抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトであるか、ヒト化形態またはキメラ形態である、請求項68に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンによる細胞に対する毒性を阻害または中和する方法であって、前記細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシン阻害用量または中和用量の請求項38に記載の前記組成物に曝露することを含む、方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンによる細胞に対する毒性を阻害または中和する方法であって、前記細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシン阻害用量または中和用量の請求項44に記載の前記組成物に曝露することを含む、方法。前記細胞が被検体に存在し、前記組成物を、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBを阻害または中和するのに有効な量で前記被検体に投与する、請求項73に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株によって産生されるトキシンを中和する方法であって、i請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、ii請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片とを、前記高病原性株によって産生される前記トキシンを中和するのに有効な量で、その投与が必要な被検体に投与することを含む、方法。iおよびiiの前記抗体またはその抗原結合性断片を同時に投与する、請求項76に記載の方法。iおよびiiの前記抗体またはその抗原結合性断片を異なる時点で投与する、請求項76に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileの前記高病原性株の前記トキシンが、トキシンAおよびトキシンBである、請求項76に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileの前記高病原性株が、BI/NAP1/027、tcdA-/tcdB、外来患者分離株、臨床分離株、臨床上、頻繁に分離される菌株のうちの1つ以上から選択される、請求項79に記載の方法。クロストリジウムディフィシルC.difficileの前記高病原性株が、CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、montreal5、montreal7.1、MH5、Pitt2、CCL14137、UVA17、UVA30/TL42、Pitt7のうちの1つ以上から選択される、請求項80に記載の方法。前記抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトであるか、ヒト化形態またはキメラ形態である、請求項76に記載の方法。請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の前記抗体またはその抗原結合性断片および/または請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の前記抗体またはその抗原結合性断片と、取扱説明書とを含む、キット。前記抗体または抗原結合性断片が、前記キットの同一の容器に収容されるか、前記キットの別の容器に収容される、請求項83に記載のキット。前記抗体またはその抗原結合性断片をコンジュゲートするためのリンカーをさらに含む、請求項83に記載のキット。追加の治療剤をさらに含む、請求項83に記載のキット。前記追加の治療剤が、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤である、請求項86に記載のキット。EC50値が7.7-12M~4.8-8Mの範囲にあることを理由に判断して、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株のトキシンAを中和するおよび/またはEC50値が1.1-11M~6.5-10Mの範囲にあることを理由に判断して、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株のトキシンBを中和する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。前記抗体が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、請求項88に記載のモノクローナル抗体。ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、PTA-9693またはPTA-9692で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される前記抗体が、ヒト化されている、請求項89に記載のモノクローナル抗体。クロストリジウムディフィシルC.difficileの前記高病原性株が、BI/NAP1/027、CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、montreal5、montreal7.1、MH5、Pitt2、CCL14137、UVA17、UVA30/TL42、Pitt7のうちの1つ以上から選択される、請求項88に記載のモノクローナル抗体。前記抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトであるか、ヒト化形態またはキメラ形態である、請求項88に記載のモノクローナル抗体。無症状ではあるが、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADに感染しやすいか罹患するリスクがある被検体を治療する方法であって、前記被検体に、i請求項1、2、5~7または9~11のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片およびii請求項3、4、8または12のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を、前記被検体を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法。前記被検体が入院している、請求項93に記載の方法。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号1に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号3に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号2に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号3に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号1に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号4に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号2に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号4に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号5に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号7に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号6に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号7に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号8に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号10に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなる、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対して生成されるモノクローナル抗体であって、重鎖が各々、配列番号9に記載の連続したアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号10に記載の連続したアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する、モノクローナル抗体。前記CH領域が、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgEまたはIgMから選択される、請求項95~102のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。前記CH領域がIgG1である、請求項103に記載のモノクローナル抗体。前記CL領域が、κアイソタイプまたはλアイソタイプから選択される、請求項95~102のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。前記CL領域がκアイソタイプのものである、請求項105に記載のモノクローナル抗体。L鎖のV領域が、配列番号3、配列番号4または配列番号7のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体またはその断片。L鎖のV領域が配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその断片。H鎖のV領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号6のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体またはその断片。H鎖のV領域が、配列番号8または配列番号9うちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその断片。ATCC受託番号PTA-9692で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される、前記モノクローナル抗体によって認識される前記エピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAのトランスロケーションドメインを含む、請求項1に記載の抗体またはその断片。ATCC受託番号PTA-9694で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される、前記モノクローナル抗体によって認識される前記エピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAのC末端受容体結合エピトープを含む、請求項1に記載の抗体またはその断片。ATCC受託番号PTA-9693で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される、前記モノクローナル抗体によって認識される前記エピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBのN末端酵素ドメインを含む、請求項3に記載の抗体またはその断片。ATCC受託番号PTA-9693で寄託された前記ハイブリドーマ細胞株によって産生される、前記モノクローナル抗体によって認識される前記エピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのN末端酵素ドメインを含む103kDaの断片と63kDaの断片とを含む、請求項113に記載の抗体またはその断片。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、前記抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々VH領域とヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々VL領域とヒトCL領域とを含有し、前記重鎖ポリペプチドが、配列番号14で示される連続したアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号16で示される連続したアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体またはその断片。配列番号14で示すアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチドをコードする、配列番号15に記載の配列を有する単離された核酸。配列番号16で示すアミノ酸配列を有するよって、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症によって引き起こされる疾患が、院内環境と地域社会全体の両方で、あらゆる年齢の人々の生活を危険にさらしていることは明らかである。昨今の世界には、入院する患者や病院で長期間にわたって手当を受ける患者に、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症のリスクが絶えず存在する。病院外の環境でクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症にかかることもあるため、幼い子どもや赤ちゃんが疾患にかかる可能性が大きい。また、クロストリジウムディフィシルC.difficileに用いられている現在の抗生剤治療計画が、最適に効果的とはいえない可能性もある。クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある患者には、広範囲におよぶ入院患者のケアが必要で、長期間病院に入院しなければならない。クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患患者に求められる、病院で高度な支援的ケアと治療を受けることに伴うコストは大きく、医師や看護要員の人数が多くなる、研究室での試験と監視、併用医薬剤、追加の支援的測定などのために、高価な資源を必要とする。結果として、予防および治療上の利点を得るために、クロストリジウムディフィシルC.difficileによって引き起こされる生命をおびやかす疾患、特に、クロストリジウムディフィシルC.difficileによって産生される強力なトキシンを標的とした一層効果的な医薬剤、医薬品、治療薬に需要がある。耐性が生じる可能性を抑え、患者の反応と疾患からの回復が成功する可能性を高め、疾患の根絶につながる、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患に対する成功して長続きする治療に対する、いまだ対処されていない医療上の需要がある。本発明は、少なくとも部分的に、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体および/またはトキシンB抗体を含む新規な抗体試薬および組成物を提供するものである。この試薬および組成物には、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連感染および疾患で悩んでいる、数が増え続ける被検体を治療し、生活の質を改善し、CDADおよびクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症から回復させ、これらの感染個体の生存を助ける上で利点があり得る。一態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する結合と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9692で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9694で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9888で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。もうひとつの態様では、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9692で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9694で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9888で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する結合と交差競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9693で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9692で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。もうひとつの態様では、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9693で寄託される。一実施形態では、ハイブリドーマ細胞株が、ATCC受託番号PTA-9692で寄託される。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片が、0.1~1000μgの量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号9692またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体PA-50ATCC受託番号PTA-9694またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体PA-38ATCC受託番号PTA-9888またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、モノクローナル抗体PA-41ATCC受託番号PTA-9693またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。さらに別の態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片をコードする少なくとも1つの核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片の重鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖またはその一部をコードする核酸分子を含む発現ベクターが得られる。さらに別の態様では、上述した、あるいは本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合断片の重鎖またはその一部と、軽鎖またはその一部とをコードする少なくとも1つの核酸分子を含む発現ベクターが得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するいずれかの発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合断片のいずれかをコードするプラスミドが得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する、抗体または抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片が、0.1μg~1000μgまたは1μg/kg~100,000μg/kgの量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する。もうひとつの実施形態では、単離された抗体または抗原結合性断片が、0.5μg~1000μgまたは5μg~250μgまたは10mg/kg~50mg/kgから選択される量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのinvivo毒性を中和する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号9692またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体PA-50ATCC受託番号PTA-9694またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体PA-38ATCC受託番号PTA-9888またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する、抗体または抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性断片が、0.5μg~1000μg、0.5μg、5μg、40μg、50μg、100μg、200μg、1000μgまたは10mg/kg~50mg/kgから選択される量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのinvivo毒性を中和する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号9692またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体PA-41ATCC受託番号PTA-9693またはその抗原結合性断片である。一実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ形態またはヒト化形態である。もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合するおよび/またはこれを中和する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、CDADを処理および/または被検体の生存性を高める、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を同時に投与する。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を異なる時点で投与する。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を逐次投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンAに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンBに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合するおよび/またはこれを中和する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、CDADを処理および/または被検体の生存性を高める、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を同時に投与する。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を異なる時点で投与する。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその断片を逐次投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンAに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンBに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、CDADを処理および/または被検体の生存性を改善する、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片を、1μg~1000μgまたは1μg~250μgまたは5μg~100μgの量で投与し、抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片の用量を、0.1μg~1000μg.または1μg~250μgまたは5μg~100μgの量で投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンAに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンBに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、CDADを処理および/または被検体の生存性を改善する、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片を、50mg/kgの量で投与し、抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片を、50mg/kgの量で投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンAに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、これらのトキシンBに対する結合と交差反応するモノクローナル抗体である。もうひとつの態様は、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせで、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に投与されると、治癒するまたは生存率を50、60、70、80、90または100にする、抗体または抗原結合性断片を提供するものである。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片を、40~50mg/kgの用量で、2日ごとに4回投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたモノクローナル抗体のうちの1つ以上の、トキシンAに対する結合と交差競合するモノクローナル抗体である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合する単離された抗体または抗原結合性断片が、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、その抗原結合性断片、そのヒト化形態あるいは、ATCC受託番号PTA-9692またはPTA-9693で寄託されたモノクローナル抗体のうちの1つ以上の、トキシンBに対する結合と交差競合するモノクローナル抗体である。もうひとつの態様では、本明細書で説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体または抗原結合性断片が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体のうちの1つ以上の形態をとるか、あるいはその1つ以上から選択される、抗体またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、本明細書で説明するような単離された抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体または抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体またはその抗原結合性断片が、二重特異性抗体または二官能性抗体の形態をとるか、あるいは.二重特異性抗体または二官能性抗体からなるものである。iATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインと、iiATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様は、抗体が、iATCC受託番号PTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインと、iiATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体、その抗原結合性断片、前述の抗体またはその抗原結合性断片のヒト化バージョン、前述の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変ドメインおよび/または前述の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインを含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を提供するものである。さまざまな実施形態では、上述し、かつ本明細書にて説明するような抗体またはその抗原結合性断片であって、抗原結合性断片が、Fab断片、Fab’2断片、Fv断片から選択される抗体またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体またはその抗原結合性断片が単鎖抗体であるか単鎖抗体を含む、抗体またはその抗原結合性断片が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。一実施形態では、組成物が、少なくとも1種類の本発明の抗トキシンA抗体、たとえば、mAbPTA-9692、mAbPTA-9694、mAbPTA-9888、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、少なくとも1種類の本発明の抗トキシンB抗体、たとえば、mAbPTA-9692、mAbPTA-9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、組成物が、本発明の1種類の抗トキシンA抗体、たとえば、mAbPTA-9888、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、本発明の1種類の抗トキシンB抗体、たとえば、mAb9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、組成物が、本発明の1種類の抗トキシンA抗体、たとえば、mAbPTA-9694、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、本発明の1種類の抗トキシンB抗体、たとえば、mAb9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態とを含む。一実施形態では、各mAbが、組成物中に同一の量で存在する。一実施形態では、各mAbが、互いに重量で1:1の比で組成物中に存在する。一実施形態では、各mAbが、組成物中に異なる量で存在する。一実施形態では、各mAbが、互いに重量で1:1以外の比で組成物中に存在し、その比については本明細書に記載してある。一実施形態では、組成物が、追加の治療剤をさらに含む。一実施形態では、追加の治療剤が、抗生剤、抗菌、殺菌、静菌剤またはこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシンまたはこれらの組み合わせである。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の発現ベクターと、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明の発現ベクターを持つ宿主細胞と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような本発明のプラスミドと、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む組成物が得られる。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBを結合するための結合部位を含む少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、少なくとも1つのポリペプチド鎖が、第1の重鎖可変ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメインまたはその一部を含み、少なくとも1つのポリペプチド鎖が、第1の軽鎖可変ドメイン、第2の軽鎖可変ドメイン、軽鎖定常ドメインまたはその一部を含み、ポリペプチド鎖を含む可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBに対する機能的結合部位を形成する、結合タンパク質が得られる。一実施形態では、結合タンパク質の第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する機能的結合部位を形成し、結合タンパク質の第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する機能的結合部位を形成する。一実施形態では、結合タンパク質の第1の重鎖可変ドメインおよび第1の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する機能的結合部位を形成し、結合タンパク質の第2の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖可変ドメインが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する機能的結合部位を形成する。一実施形態では、結合タンパク質がFc領域を含む。一実施形態では、結合タンパク質が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの毒性を中和する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の少なくとも102M-1s-1;少なくとも103M-1s-1;少なくとも104M-1s-1;少なくとも105M-1s-1;少なくとも106M-1s-1;または少なくとも107M-1s-1から選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する結合速度定数Konを有する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴で測定した場合の最大で10-3s-1;最大で10-4s-1;最大で10-5s-1;または最大で10-6s-1から選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する解離速度定数Koffを有する。さまざまな実施形態では、結合タンパク質が、最大で10-7M;最大で10-8M;最大で10-9M;最大で10-10M;最大で10-11M;最大で10-12M;または最大で10-13Mから選択される、トキシンAまたはトキシンBに対する解離定数KDを有する。もうひとつの態様では、上述し、かつ本明細書にて説明するような結合タンパク質と、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤とを含む、組成物が得られる。一実施形態では、組成物が、追加の治療剤をさらに含む。一実施形態では、組成物の追加の治療剤が、抗生剤、抗菌、殺菌、静菌剤またはこれらの組み合わせである。一実施形態では、組成物の追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである。もうひとつの態様では、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9693、PTA-9494またはPTA-9888で寄託された、ハイブリドーマ細胞株が得られる。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体を治療する方法であって、本明細書に記載の少なくとも1種類の組成物を被検体に投与することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、組成物が、本発明の抗体、好ましくはヒト化形態の抗体を1種類以上含む。一実施形態では、組成物が、ヒト化形態での本明細書に記載の少なくとも1種類の抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片と、ヒト化形態での本明細書に記載の少なくとも1種類の抗トキシンB抗体とを含む。さまざまな実施形態では、1つ以上の追加の治療用試薬、医薬品、化合物または成分を組成物中に含有させてもよい。一実施形態では、組成物が、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、溶媒または賦形剤をさらに含む。一実施形態では、組成物を、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患、たとえば、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADを治療するのに有効な量で投与する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療するのに有効な量で、2種類の組成物を被検体に投与する。一実施形態では、2種類の組成物を同時に投与する。一実施形態では、2種類の組成物を異なる時点で投与する。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBによる、細胞に対する毒性を阻害または中和する方法であって、細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA阻害用量または中和用量の本発明による抗トキシンAモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片および有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB阻害用量または中和用量の本発明による抗トキシンBモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片に曝露することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体は、ヒト化形態のものである。一実施形態では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体が、キメラ形態のものである。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、同時に投与する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、異なる時点で投与する。この方法の一実施形態では、細胞が被検体に存在し、抗体またはその抗原結合性断片を、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBを阻害または中和するのに有効な量で被検体に投与する。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンによる細胞の毒性を阻害または中和する方法であって、細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシン阻害用量または中和用量の本明細書で説明するような本発明の組成物少なくとも1種類に曝露することを含む、方法を提供するものである。この方法の一実施形態では、細胞を、有効クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシン阻害用量または中和用量の2種類の組成物に曝露し、一方が抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片を含み、他方が抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片を含む。一実施形態では、抗体がヒト化されている。一実施形態では、抗体がキメラである。実施形態では、2種類の組成物を同時に投与するか、異なる時点で投与する。一実施形態では、細胞が被検体に存在し、少なくとも1つの組成物を、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンを阻害または中和するのに有効な量で被検体に投与する。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株によって産生されるトキシンを中和する方法であって、iクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに結合してこれを中和する本発明の抗体またはその抗原結合性断片と、iiクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに結合してこれを中和する本発明の抗体またはその抗原結合性断片とを、高病原性株によって産生されるトキシンを中和するのに有効な量で、それが必要な被検体に投与することを含む、方法を提供するものである。一実施形態では、iおよびiiの抗体がヒト化抗体である。一実施形態では、iおよびiiの抗体がキメラ抗体である。実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片を、同時に投与するか、異なる時点で投与する。一実施形態では、高病原性株のトキシンが、トキシンAおよびトキシンBである。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株が、BI/NAP1/027、CCL676、HMC553、Pitt45、CD196、montreal5またはmontreal7.1のうちの1つ以上である。一実施形態では、抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片が、EC50値が2.6-12M~7.7-11Mまたは7.7-12M~4.8-8Mであることを理由に判断して、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株によって産生されるトキシンAに対する中和活性を有する。一実施形態では、抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片が、EC50値が1.1-11M~6.5-10Mであることを理由に判断して、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株によって産生されるトキシンBに対する中和活性を有する。もうひとつの態様では、本発明による、本明細書で説明するような抗体、特にヒト化形態の抗体またはその抗原結合性断片と、取扱説明書とを含む、キットが得られる。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片が、キットの同一の容器に収容される。一実施形態では、抗体または抗原結合性断片キットの別の容器に収容される。一実施形態では、キットが、抗体またはその抗原結合性断片をコンジュゲートするためのリンカーをさらに含む。一実施形態では、キットが、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤であってもよい追加の治療剤を含む。一実施形態では、追加の治療剤が、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせである。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株のトキシンAまたはトキシンBを中和するモノクローナル抗体、特にヒト化形態のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、モノクローナル抗体が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、またはPTA-9693で示され、それぞれATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888またはPTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される。一実施形態では、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体が、ヒト化されているか、キメラ形態である。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株が、BI/NAP1/027、CCL676、HMC553、Pitt45、CD196、montreal5、montreal7.1のうちの1つ以上である。もうひとつの態様では、無症状であるが、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症にかかりやすいか罹患するリスクがある被検体を治療する方法であって、i本明細書で提供し、説明する抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体またはその抗原結合性断片と、ii本明細書で提供し、説明するような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその抗原結合性断片とを、被検体を治療するのに有効な量で被検体に投与することを含む、方法が得られる。この方法の一実施形態では、被検体が入院している。もうひとつの態様では、ヒト化クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体が得られる。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対して作製されたヒト化モノクローナル抗体が得られる。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。一実施形態では、このような抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むVH領域と、ヒトCH領域とを含有し、軽鎖が各々、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むVL領域と、ヒトCL領域とを含有する。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号14で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号15に示す図38B。配列番号16で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号17に示す図38A。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号18で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号19に示す図39B。配列番号20で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号21に示す図39A。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片が得られる。配列番号22で示される抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号23に示す図40B。配列番号24で示される抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号25に示す図40A。上述した本発明のヒト化モノクローナル抗体のいずれかを対象とするさまざまな実施形態において、モノクローナル抗体のCH領域が、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgEまたはIgMから選択される。一実施形態では、CH領域がIgG1である。一実施形態では、CL領域が、κアイソタイプまたはλアイソタイプから選択される。一実施形態では、CL領域がκアイソタイプのものである。他の実施形態では、本明細書で説明するような、ヒト化抗体のCDR、すなわち、CDR1、CDR2および/またはCDR3、あるいはその抗原結合性断片が、本発明による生成物および方法でクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに結合および/またはこれを中和することを包含する。もうひとつの態様では、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体またはその断片であって、L鎖のV領域が、配列番号3、配列番号4、配列番号7のうちの1つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片が得られる。また、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその断片であって、L鎖のV領域が配列番号10に記載の配列を含む、抗体またはその断片も得られる。また、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体またはその断片であって、H鎖のV領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号6のうちの1つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片も得られる。また、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB抗体またはその断片であって、H鎖のV領域が、配列番号8または配列番号9のうちの1つ以上から選択される配列を含む、抗体またはその断片も得られる。もうひとつの態様では、iクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する結合と交差競合するか、iiATCC受託番号PTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ATCC受託番号PTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、トランスロケーションドメインなど、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAの受容体結合ドメイン外の領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。もうひとつの態様では、iクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9694で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する結合と交差競合するか、iiATCC受託番号PTA-9694で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ATCC受託番号PTA-9694で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのC末端受容体結合エピトープなどの受容体結合ドメインに少なくとも2つの部位を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。もうひとつの態様では、iクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する結合と交差競合するか、iiATCC受託番号PTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ATCC受託番号PTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのC末端受容体結合エピトープを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。もうひとつの態様では、iクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する結合と交差競合するか、iiATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBエピトープと特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのN末端酵素ドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、ATCC受託番号PTA-9693で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのN末端酵素ドメインを含むトキシンBのカスパーゼ1処理によって生成される63kDaの断片を含む。一実施形態では、ATCC受託番号PTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのトランスロケーションドメインを含む。一実施形態では、ATCC受託番号PTA-9692ので寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープが、トキシンBのカスパーゼ1処理によって生成された167kDaの断片と、未処理のトキシンBを含む63kDaのタンパク質と、を含む。一実施形態では、抗体がヒト化形態である。一実施形態では、抗体がキメラ形態である。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはトキシンBに結合してこれを中和するモノクローナル抗体を作製する方法であって、1匹以上のレシピエント動物を、不活性トキソイドAで一定間隔で免疫し、この動物を、活性トキシンAまたは活性トキシンBの量を増して一定間隔でブーストし、好適な不死化細胞株に融合させた、免疫してブーストした動物の免疫細胞からハイブリドーマ細胞を得ることを含み、ハイブリドーマ細胞が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに結合してこれを中和する抗トキシンA抗体またはクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに結合してこれを中和する抗トキシンB抗体を産生して分泌する、方法が得られる。一実施形態では、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA中和モノクローナル抗体および/または抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンB中和モノクローナル抗体が単離されている。この方法の実施形態では、免疫するステップとブーストするステップが、アジュバントを含む。一実施形態では、アジュバントがQuilAである。この方法の他の実施形態では、免疫するステップとブーストするステップを、3週間ごとの一定間隔で実施する。他の実施形態では、レシピエント動物を2用量または3用量のトキソイドAで免疫した後、活性トキシンAまたは活性トキシンBのいずれかの用量を増量して3~5回ブーストする。もうひとつの態様では、トキシンAの内部移行と細胞毒性cytocellulartoxicityを阻害、ブロックまたは防止することによって、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAの毒性を阻害、ブロックまたは防止する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である。一実施形態では、抗体が、PA-39ATCC受託番号PTA-9692またはヒト化PA-39である。一実施形態では、抗体が、PA-50ATCC受託番号PTA-964またはヒト化PA-50である。他の実施形態では、抗体が、PA-39、ヒト化PA-39、PA-50またはヒト化PA-50の、トキシンAに対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、トキシンAの受容体結合ドメイン外のトキシンAの領域における単一部位に結合する。一実施形態では、抗体が、トキシンAの受容体結合ドメイン外のトキシンAの領域における単一部位に結合することによって、PA-39またはそのヒト化形態と競合する。一実施形態では、抗体が、トキシンAの受容体結合ドメインの少なくとも2つの部位に結合する。一実施形態では、抗体が、トキシンAの受容体結合ドメインの少なくとも2つの部位に結合することによって、PA-50またはそのヒト化形態と競合する。一実施形態では、抗体が、混合-競合的作用機序によってトキシンAの毒性を阻害する。一実施形態では、抗体が、競合的作用機序によってトキシンAの毒性を阻害する。上記の実施形態はいずれも、抗体の抗原結合性断片を包含するものとする。もうひとつの態様では、トキシンBのN末端酵素領域のエピトープ部位に結合することによって、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBの毒性を阻害、ブロックまたは防止する、単離された抗体またはその抗原結合性断片が得られる。一実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である。一実施形態では、抗体がPA-41ATCC受託番号PTA-9693またはPA-41のヒト化形態である。一実施形態では、抗体が、PA-41またはヒト化PA-41の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのN末端酵素領域に対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、PA-41またはヒト化PA-41の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのN末端酵素領域における単一部位に対する結合と競合する。一実施形態では、抗体が、混合-競合的作用機序によってトキシンBの毒性を阻害する。もうひとつの態様は、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号PTA-9692、PA-39のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-50ATCC受託番号PTA-9694、PA-51のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-41ATCC受託番号PTA-9693、PA-41のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-39またはそのヒト化形態の、トキシンAに対する結合と競合する抗体、モノクローナル抗体PA-50またはそのヒト化形態の、トキシンAに対する結合と競合する抗体またはモノクローナル抗体PA-41またはそのヒト化形態の、トキシンBに対する結合と競合する抗体のうちの1つ以上によって認識および/または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBの一部、断片またはペプチドを含むワクチンまたは免疫原を提供するものである。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原が、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号PTA-9692、PA-39のヒト化形態またはモノクローナル抗体PA-39のトキシンAおよびトキシンBへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態のうちの1つ以上によって認識および/または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの一部、断片またはペプチドを含む。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンAおよび/またはトキシンBのエピトープ含有部分、断片またはペプチドが、タンパク質分解性の切断によって、トキシンAまたはトキシンBのタンパク質から得られる。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンAの断片、一部またはペプチドが、エンテロキナーゼによるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンBの断片、一部またはペプチドが、カスパーゼカスパーゼ1によるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のエピトープ含有部分または断片が、トキシンAまたはトキシンBのタンパク質の化学的または組換え的に合成されたペプチドである。一実施形態では、抗体によって認識および結合される、トキシンAおよび/またはトキシンBの1つ以上のエピトープ領域を含有するワクチンまたは免疫原の断片、一部またはペプチドが、トキシンAのアミノ末端、トキシンBのアミノ末端、トキシンAのカルボキシ末端、トキシンBのカルボキシ末端、トキシンAの受容体結合ドメイン、トキシンAの受容体結合ドメイン外の領域、トキシンBの受容体結合ドメイン、トキシンBのN末端酵素領域、トキシンAのグルコシルトランスフェラーゼドメイン、トキシンBのグルコシルトランスフェラーゼドメイン、トキシンAのタンパク質分解ドメイン、トキシンBのタンパク質分解ドメイン、トキシンAの疎水性のポア形成ドメインまたはトキシンBの疎水性のポア形成ドメインのうちの1つ以上に由来する。一実施形態では、トキシンAまたはトキシンBのエピトープ含有断片または部分の大きさが、<300kDa、約158~160kDa、約100~105kDa、たとえば、103kDa、約90~95kDa、たとえば、91kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、63kDaまたは68kDaである。一実施形態では、トキシンAのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約158~160kDa、約90~95kDa、たとえば、91kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、68kDaである。一実施形態では、トキシンBのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約100~105kDa、たとえば、103kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、63kDaである。ワクチンまたは免疫原のいずれの実施形態でも、トキシンAまたはトキシンB、またはその断片一部またはペプチドは、本明細書に記載のいずれかの株のものである。もうひとつの態様は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の中和、阻害、ブロック、低減、緩和、治療cureまたは治療treatを必要とする被検体において、これをする方法であって、上述したワクチンまたは免疫原を有効量で被検体に投与することを含む。この方法の一実施形態では、ワクチンまたは免疫原の投与後のクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに対する液性反応が被検体で誘発されることで、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患またはCDADを特異的に中和、阻害、ブロック、低減、緩和、治療cureまたは治療treat可能な抗トキシンA抗体および/または抗トキシンB抗体が産生される。これらの疾患としては、被検体における、偽膜性大腸炎、中毒性巨大結腸、腸穿孔、敗血症および死亡など、場合によっては重度で生命をおびやかす合併症とも関連している、軽度から重度の下痢症があげられる。この方法の一実施形態では、被検体の液性反応によって誘発される抗体が、本発明のmAbと同様または同一の特異性および作用機序を有する抗体あるいは、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBの中和で本発明のmAbと競合するか、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBの中和に必要な作用機序の点で本発明のmAbと競合する抗体を含む。もうひとつの態様では、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症にかかりやすい細胞においてまたは細胞に対してトキシンAおよび/またはトキシンBの活性を中和、阻害またはブロックする方法であって、細胞を、本発明による抗体またはその抗原結合性断片と接触させることを含み、抗体またはその抗原結合性断片が、トキシン阻害の競合的または混合競合的作用機序によって、細胞においてまたは細胞に対してトキシンAおよび/またはトキシンBの活性を中和、阻害またはブロックする、方法が得られる。この方法の一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体のうちの1つ以上である。この方法の一実施形態では、腸上皮細胞などの細胞が、被検体にあり、抗体またはその抗原結合性断片を、被検体に有効量で投与する。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンAである。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンBである。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、作用機序が競合的阻害作用機序である。この方法の一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、PA-50ATCC受託番号PTA-9694、そのヒト化形態であるか、PA-50のトキシンA活性の中和と競合する抗体またはその断片である。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、作用機序が混合-競合的阻害作用機序である。この方法の一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、PA-39ATCC受託番号PTA-9692、そのヒト化形態であるか、PA-39のトキシンA活性の中和と競合する抗体またはその断片である。この方法の一実施形態では、トキシンがトキシンBであり、作用機序が混合競合的阻害作用機序である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、PA-41ATCC受託番号PTA-9693、そのヒト化形態であるか、PA-41のトキシンB活性の中和と競合する抗体またはその断片である。本発明の上述した態様および他の態様について、本発明の詳細な説明に鑑みてさらに詳細に説明する。本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の病原作用をブロックする抗生物質によらない療法治療を提供し、好ましくは、結腸が治癒するおよび/または結腸、腸、腸管などの消化管の正常な細菌叢が再建されるだけの時間を提供する、抗体およびその抗原結合性断片を包含する。本明細書で説明するようなモノクローナル抗体、その抗原結合性断片そのヒト化抗体またはキメラ抗体などは、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症およびCDADに罹患した患者が、別の疾患または一層重度の疾患または症候の再発なく疾患から回復できるよう、活動性疾患を治療し、再発性の疾患を予防する両方の目的で、抗生物質によらない治療剤および医薬剤を提供するものである。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウムディフィシルC.difficileに感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患に対する治療活性を有する。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウムディフィシルC.difficileに感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患から回復させる。一実施形態では、本発明の抗体は、被検体がクロストリジウムディフィシルC.difficileに感染することで引き起こされる、あるいはこれに関連している、活動性疾患の期間を短縮および/または重症度を低減する治療効果を有する。一実施形態では、本発明の抗体またはその一部またはその断片を、抗生剤の治療剤と併用して提供することが可能である。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびBに対するモノクローナル抗体mAbを、本明細書で説明するようにして作製した。抗トキシンmAbは、invitroアッセイと、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症のinvivoでの前臨床動物モデルの両方で強力な活性を呈する。特に本発明のmAbは、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の関連のストリンジェントなハムスターモデルで死亡率からハムスターを強力かつ永続的に保護する。抗体は、CDADを治療するための抗生物質によらない手法を提供するものであり、抗生剤の中断を可能にし、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンの病原作用をブロックすることで、結腸が治癒するおよび/または正常な腸内細菌叢が再建されるだけの時間を提供できるものである。本明細書で説明するようなmAbは、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンを中和する機能がゆえに、治療上の利点を提供可能であり、クロストリジウムディフィシルC.difficileの多発性再発のある患者を治療する受動的または能動的な戦略で利用できる。特に、感染の再発防止、疾患の重度かつ活動性の形態の治療、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の多発性再発のある患者の治療にmAbを利用してもよい。本明細書で説明するようなmAbは、感染の再発および/または疾患の重度かつ活動性の形態および多発性再発を防止、ブロックまたは阻害するためのクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびBを中和する効果的な手段となり得る。本明細書で使用する場合、トキシンAおよびトキシンBとは、クロストリジウムディフィシルC.difficile微生物によって産生される細胞傷害性のエンテロトキシンを示す。トキシンAおよびBは、クロストリジウムディフィシルC.difficileの主な病原性決定基であり、トキシン陰性株は非病原性である。トキシンAおよびBは、トキシン遺伝子tcdAトキシンAおよびtcdBトキシンBと、3つの調節遺伝子とを含む病原性遺伝子座から転写され、この3つの調節遺伝子のうちの1つtcdCがトキシン転写の推定上の陰性調節因子をコードする。TcdCタンパク質は、細菌のライフサイクルにおける初期と対数期にトキシンの転写を阻害するように見える。トキシンBでは、ロイシン543とグリシン544との間の自己触媒的な切断部位が説明されている。切断は、宿主の細胞質イノシトールリン酸によってアスパルチルプロテアーゼドメインが活性化され、活性なグルコシルトランスフェラーゼドメインが放出された結果として起こるものである。本明細書で提供されるのは、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片、このような抗体またはその抗原結合性断片のうちの1種類以上を含有する組成物、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸配列を含有するベクター、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体またはその抗原結合性断片を、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の治療または予防に使用する方法である。本発明およびそのさまざまな態様および実施形態を説明するにあたって抗体または免疫グロブリンという用語を本明細書で使用する場合、抗体または免疫グロブリンという用語を使うたびに関連する言い回しである抗原結合性断片を必要以上に繰り返すのを避けるために、この用語は通常、そのような抗体または免疫グロブリンの抗原結合性断片も包含することを想定していることを理解されたい。よって、本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンB向けの抗体すなわち、トキシンAおよびトキシンB抗原だけでなく、本明細書でさらに説明するようなクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンB抗原に結合するこのような抗体の断片も包含する。実施形態では、このような抗原結合性断片は、トキシンAおよび/またはトキシンBの毒性を、元のままの抗体と同様に中和できる。本発明に包含される抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAを特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する特異的な結合を競合的に阻害または交差競合する、単離された抗体を含む。この抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAを特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープを特異的に結合する単離された抗体も含む。いくつかの実施形態では、エピトープがtcdAのC末端受容体結合ドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、tcdAに対するPA-50の結合を競合的に阻害または交差競合する。他の実施形態では、エピトープがtcdAのトランスロケーションドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、tcdAに対するPA-39の結合を競合的に阻害または交差競合する。このような単離された抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、その抗原結合断片または一部を含むものであってもよい。本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBモノクローナル抗体の特異性を評価するためのトキシンBの酵素的カスパーゼ1タンパク質分解を用いる実験を、実施例6で説明するようにして実施した。mAbPA-39が認識して結合するトキシンAのエピトープは、トキシンAの受容体結合ドメインとは区別される領域内すなわち、トキシンA受容体結合ドメインの外にあり、C末端トキシンAの受容体結合ドメインに結合することが報告されているヒト抗トキシンA抗体が結合するエピトープとも区別される7。本明細書の実施例6および7で説明し、図22および図31に示すように、Biacoreアッセイは、PA-39に対するトキシンAの単一の結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンAのウェスタンブロット検出によって、PA-39が、PA-50およびCDA-1対照mAbが結合する領域とは別のトキシンAの領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるPA-39のinvitroでの活性は、培養に対するトキシンAの添加量が増えるにつれて、EC50および最大阻害率の両方がシフトすることを示しており、PA-39阻害の混合-競合的機序が認められる。100倍過剰なPA-39で保護した後のトキシンAのELISA検出によって、PA-39によるトキシンの阻害が、トキシンの内部移行と有害な細胞毒cytocellulartoxin作用、たとえば、細胞毒性cytoxicityを防いで起こることが確認された。また、本明細書の実施例6および7で説明し、図22および図31に示すように、Biacoreアッセイは、PA-50に対するトキシンAの少なくとも2つの結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンAのウェスタンブロット検出によって、PA-50が、トキシンAの対照のmAbCDA-1が結合する領域と同様の領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるPA-50のinvitroでの活性は、培養に対するトキシンAの添加量が増えるにつれてEC50がシフトすることを示しており、PA-50阻害の競合的機序が認められる。100倍過剰なPA-50で保護した後のトキシンAのELISA検出によって、PA-50によるトキシンの阻害が、トキシンの内部移行と以後の細胞毒性を防いで起こることが確認された。また、本発明の抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体のクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する特異的な結合を競合的に阻害または交差競合する、単離された抗体も含む。この抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBを特異的に結合し、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのエピトープを特異的に結合する、単離された抗体も含む。いくつかの実施形態では、エピトープが、tcdBのN末端酵素ドメインにある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、tcdBに対するPA-41の結合を競合的に阻害または交差競合する。他の実施形態では、エピトープが、tcdBのトランスロケーションドメイン、たとえば、アミノ酸850~1330にある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、抗体が、tcdBに対するPA-39の結合を競合的に阻害または交差競合する。本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAモノクローナル抗体の特異性を評価するためのトキシンAの酵素的エンテロキナーゼタンパク質分解を用いる実験を、実施例6で説明するようにして実施した。mAbPA-41PTA-9693は、トキシンBのN末端酵素ドメインに由来する約103kDaと63kDaの断片を認識することが明らかになった。主要な消化断片のN末端配列分析によって、この分析結果を確認した。mAbPA-41は、ヒト抗トキシンB抗体が結合するトキシンBのC末端受容体結合ドメインとは区別されるトキシンBのN末端酵素ドメイン内のユニークなエピトープに結合することが明らかになった7。本明細書の実施例6および7で説明し、図19および図31Eおよび図31Fに示すように、Biacoreアッセイは、PA-41に対するトキシンBの単一の結合部位をサポートする。酵素消化したトキシンBのウェスタンブロット検出によって、PA-41が、対照のmAbCDB-1が結合する領域とは異なる別のトキシンBの領域に結合することがわかる。トキシン効力アッセイにおけるPA-41のinvitroでの活性は、培養に対するトキシンBの添加量が増えるにつれて、EC50および最大阻害率の両方がシフトすることを示しており、PA-41阻害の混合-競合的機序が認められる。本明細書で得られる抗体は、寄託され、以下の特許寄託の表示がなされたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を含む。PTA-9692PA-39、PTA-9693PA-41、PTA-9694PA-50、PTA-9888PA-38。これらのハイブリドーマは、2009年1月6日PTA-9692、PTA-9693、PTA-9694および2009年3月24日PTA-9888に、国際寄託機関としてのBudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposesofPatentProcedurewiththeAmericanTypeCultureCollectionATCC、P.O.Box1549,Manassas,VA20108USAに従って、その要件を満たす形で寄託され、上述した特許寄託の表示がなされた。本明細書で使用する場合、寄託されたハイブリドーマと、このハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の両方を、同一のATCC寄託の表示またはATCC寄託の表示に含まれる数字で示すこともある。たとえば、PTA-9888または9888を、寄託されたハイブリドーマまたはこのハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を示すのに、使用することがある。したがって、本明細書に記載のモノクローナル抗体の名称は、それを産生するハイブリドーマの名称と同義に用いられる。ある名称が、どの部分で抗体またはその抗体を産生するハイブリドーマを示すことを意図しているかは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載の抗原結合性断片は、上述した寄託抗体の抗原結合性断片を含む。本発明の抗体は、多数の有益な特徴を呈する。たとえば、抗トキシンA抗体は、トキシンAの毒性をinvitroとinvivoの両方で中和または阻害する。IMR-90細胞、ヒト化PA-39およびヒト化PA-41を用いるinvitroでの中和研究では、細胞のトキシンAに対する46pMの中和力すなわちEC50値と、これらの細胞のトキシンBに対する5pMを示した。ヒト抗トキシンAモノクローナル抗体および抗トキシンBモノクローナル抗体による中和について文献に報告されている値国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号明細書;Babcocketal.,Infect.Immun.,20067と比較すると、hPA-39の46pMのEC50中和値のほうが、ヒト抗トキシンAmAbで報告されている値よりも高いように見え、hPA-41の5pMのEC50中和値もヒト抗トキシンBmAbで報告されている値よりも高いように見えた。したがって、本明細書に記載した研究では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAモノクローナル抗体および抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBモノクローナル抗体、特に、これらのモノクローナル抗体のヒト化形態は、すでに報告のある他の抗トキシン抗体の場合と比較して、抗トキシン中和特性が高かったことがわかる。一実施形態では、本発明の抗トキシンA抗体は、有効用量で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAの毒性をinvivoにて中和または阻害する。もうひとつの実施形態では、抗トキシンB抗体が、トキシンBの毒性をinvivoで中和または阻害する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に有効用量の1種類以上の本発明の抗トキシンA抗体を提供する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に、有効用量の1種類以上の本発明の抗トキシンB抗体との組み合わせで、有効用量の1種類以上の本発明の抗トキシンA抗体を提供する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に、有効用量として、本発明の抗トキシンB抗体との1:1の組み合わせでの本発明の抗トキシンA抗体を提供する。一実施形態では、有効用量の本発明の抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体が、たとえば、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症被検体に提供される複数の抗体の1/2:1、1:1、2:1、3:1、4:1などの組み合わせであってもよい。一実施形態では、抗体がヒト化されている。一実施形態では、抗体が組成物に含まれる。実例として、有効用量の抗トキシンA抗体および/または抗トキシンB抗体は、0.1μg~1000ミリグラムmgの範囲であってもよい。抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片を、たとえば、0.1mg/kg~150mg/kgの量、0.5mg/kg~75mg/kgの量、1mg/kg~100mg/kgの量、1mg/kg~50mg/kgの量、2mg/kg~40mg/kgの量、2mg/kg~50mg/kgの量、5mg/kg~50mg/kgの量、5mg/kg~25mg/kgの量、10mg/kg~40mg/kgの量、10mg/kg~50mg/kgの量、10mg/kg~25mg/kgの量または15mg/kg~50mg/kgの量で被検体に投与すればよい。一実施形態では、上述した量が、組み合わせで提供されるさまざまな比の抗トキシンA抗体と抗トキシンB抗体を含むものであってもよい。本明細書で使用する場合、中和するとは、抗体が特異的に結合するトキシンの有害作用の低減、阻害、ブロック、緩和または排除を示す。トキシンの有害作用の中和としては、1クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症または疾患の発症または進行を遅延、低減、阻害または防止すること、2抗体での治療をしておらず、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体の生存中央値と比較して被検体の生存期間を延ばすこと、3クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症または疾患に関連する1つ以上の症候または有害作用を排除または1つ以上の症候または有害作用の重症度を低減すること、4クロストリジウムディフィシルC.difficileに感染するまたは感染している被検体の正常な消化管の再増殖を可能にすること、5クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患に悩んでいる被検体でクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の再発を防止すること、6クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体での治癒率を少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99または100にすることおよび/または7クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に関連したCDADまたは他の有害イベントによる死を防ぐことがあげられる。本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンB抗体を使用して、人間ヒトおよび他の非ヒト哺乳類動物を含む多数の種の被検体を治療できる。本発明によって治療可能な被検体としては、人間、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマなどがあげられる。ヒト被検体については、本明細書では患者または個体とも呼ぶ。特に、被検体は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のあるヒトの患者を含む。このようなヒト患者には、高齢者や免疫無防備状態の人を含む。本発明によれば、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンA抗体およびトキシンB抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficile疾患を回復させ、被検体の生存期間を延ばすことができる。一実施形態では、1種類以上の抗トキシンA抗体および/または1種類以上の抗トキシンB抗体を、被検体に投与すると、抗体で治療しておらず、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体の生存中央値と比較して、被検体の生存が改善される。いくつかの実施形態では、1種類以上の抗トキシンA抗体または抗トキシンB抗体の用量または量が、たとえば、invivoでのマウスの研究などに基づいて、0.2μg~250μgの範囲または2μg~50μgの範囲または5μg~50μgの範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、1種類以上の抗トキシンA抗体または抗トキシンB抗体、特に抗トキシンA抗体と抗トキシンB抗体との組み合わせの用量または量が、たとえば、invivoでのハムスターの研究などに基づいて、2mg/kg~40mg/kg、2mg/kg~50mg/kg、5mg/kg~40mg/kg、5mg/kg~50mg/kg、10mg/kg~40mg/kgまたは10mg/kg~50mg/kgの範囲であってもよい。もうひとつの例として、本発明の抗体は、治癒率または生存率を、少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97または99にすることが可能なものである。もうひとつの例として、この抗体は、治癒率または生存率を100にすることが可能なものである。一実施形態では、1種類以上の抗トキシンA抗体は、被検体に投与すると、1種類以上の抗トキシンB抗体との組み合わせで、治癒率または生存率を50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、97、99または100にすることができる。本明細書で使用する場合、治癒率とは、本発明の1種類以上の抗体またはその1種類以上の組成物を投与した、感染または疾患のあった被検体集団のうち、感染または疾患がなくなったと臨床医が判断した被検体の割合を示す。生存率とは、本明細書で使用する場合、本発明の1種類以上の抗体またはその1種類以上の組成物を投与した被検体集団のうち、所望の期間にわたって生存する被検体の割合を示す。このような所望の期間の例については、本明細書の別の部分であげておく。本発明によって得られる抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileに感染した被検体で、正常な腸細菌叢の回復を可能にするものである。このようにして、このような抗体は、治療中の患者を疾患から回復させることができる。また、本発明の抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体は、有益なinvivoでの薬物動態も呈する。本発明の抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileに感染した被検体に、長期にわたってまたは持続する療法を提供できるものでもある。本明細書で使用する場合、持続性とは、治療中断後に、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のない状態を1か月以上保てる療法を示す。好ましくは、この療法は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のない状態を2か月以上保つ。いくつかの実施形態では、本発明のmAbを用いる療法で、活性なクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症が治療または抑制され、感染の頑健性が低減または減少される。他の実施形態では、本発明によって得られる療法は、被検体で、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のない状態を、1、2、3、4、5または6か月保つ。他の実施形態では、本発明によって得られる療法が、被検体で、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のない状態を、6か月よりも長い期間保つ。本発明の抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症および/またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の再発を予防することが可能である。CDADの再発性は、新たな抗生剤であるレボフロキサシンおよびモキシフロキサシンという2種類に対して耐性であることが明らかになった高病原性BI/NAP1/027株の出現によって、結局は悪くなっている。このような株は、米国、カナダ、西ヨーロッパ中で頻度が増す流行のきっかけとなった。高病原性株には、NorthAmericanPulsedFieldタイプ1NAP1、制限酵素分析タイプBI、PCRリボタイプ027総称としてBI/NAP1/027で知られるとしてキャラクタライズされた、密接に関連した分離株の群を含む5。BI/NAP1/027株の高病原性は、少なくとも一部は、CDADの2つの病原因子であるトキシンAおよびBの産生量が増えることによるものである6。BI/NAP1/027分離株は、他の株よりも16~23倍高いレベルのトキシンAおよびBを産生する6。これらの株が明らかに適合していくと、他の疾患に対する抗生剤での治療の可能性を危うくする世界的な広まりをみせるおそれがあり、CDADの再発率と重症度が高まるおそれもある。ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニン、フィダキソマイシンなど、CDADの治療用に開発中の抗生剤もあるが、リファキシミンに耐性のクロストリジウムディフィシルC.difficileの臨床分離株が報告されている。最近では、完全なフェーズ3の臨床試験91で、フィダキソマイシンがバンコマイシンよりも全体としてのCDAD再発率を有意に低減させたが、BI/NAP1/027株には効かなかった。高病原性BI/NAP1/027株が広まったことで、入院期間が長くなり、治療が失敗し、再発頻度が上がり、死亡率も上がっている3。新規に開発され、本明細書にて説明するmAbは、CDADの出現率と重症度の上昇にはどめをかけるための新たな治療法となるものである。一実施形態では、本発明のmAbを、クロストリジウムディフィシルC.difficileのさまざまな株によって生じる感染の治療に用いる。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficile株は、極めて感染性が高く、そのトキシンを本発明のmAbで中和する。一実施形態では、BI/NAP1/027をはじめとする、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株のトキシンを、本発明のmAbで中和する。一実施形態では、本発明のmAbは、外来患者分離株由来の株を含む、広範囲にわたる毒素産生性臨床分離株からのトキシンを中和するにあたって治療効果を提供するものである。好ましくは、mAbは、BI/NAP1/027などの高病原性分離株のトキシンを中和し、少なくとも90以上のクロストリジウムディフィシルC.difficileの他の臨床的に関連する分離株のトキシンを中和する。特に、本明細書の実施例8で示すように、本発明のmAbは、BI/NAP1/027および他の高病原性クロストリジウムディフィシルC.difficile株、たとえば、CCL676、HMC553、Pitt45、CD196、montreal5、montreal7.1をはじめとして、クロストリジウムディフィシルC.difficileの19種類の臨床分離株の毒性/活性を有意に中和することが明らかになっている。本発明によれば、たとえば限定なく、抗トキシンAmAbの場合でEC50値が7.7-12M~4.8-8Mの範囲、抗トキシンBmAbの場合でEC50値が1.1-11M~6.5-10Mの範囲になることから判断すると、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株のトキシンAおよびトキシンBを中和する抗体が得られる。また、本発明のmAbは、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症およびこれに関連する疾患の治療の際に、病院由来の分離株および病院以外のところに由来する分離株を含む、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性株の中和に用いるよう提供される。他の実施形態において、かつ、非限定的な例によって、本発明のmAbは、invitroで利用する細胞ベースのアッセイに応じて、トキシンAを中和する場合のEC50中和値が93pM~30nMの範囲またはEC5046pMであり、トキシンBを中和する場合のEC50値が4pM~9.5pMの範囲またはEC55pMである。本明細書の実施例3で説明するように、8μg/mlのトキシンAを用いる、CHO-K1細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンAmAbのEC50値が93pMであった。8pg/mlのトキシンBを用いるCHO-K1細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンBmAbは、EC50値が9.2pMであった。240ng/mlのトキシンAを用いるT-84細胞を含むアッセイでは、本発明の抗トキシンAmAbのEC50値は、146pMおよび175pMであった。Caco-2細胞ベースのアッセイでは、本発明の抗トキシンAmAbが、EC50レベル196pMおよび485pMでトキシンAの毒性を中和した。8μg/mlのトキシンAを用いる赤血球の血球凝集アッセイでは、RBC血球凝集を防止するための本発明の抗トキシンAmAbのEC50中和値が、1.8nMおよび30nMであった。本発明の抗体は、上述した特徴のうち任意の1つ、これらの組み合わせまたはそのすべてを含み得るものである。本明細書の実施例で説明するように、本発明のmAbは、CDADの最も入手可能な前臨床モデルで、invitroとinvivoの両方で優れたトキシン中和効力を示す。また、本発明のmAbは、多数のBI/NAP1/027株から得られるトキシンに対して独特の広くて強力な中和を示す。さらに、このようなmAbは、CDADの高度にストリンジェントなハムスターモデルで死亡率からの完全かつ持続性の保護を示した。これらの結果は、本発明のmAbが、結腸が治癒し、正常な腸内細菌叢が再建され、CDAD疾患および/またはクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症から回復させられるような方法で、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンの病原作用を効率的かつ効果的にブロックする能力を裏付ける。一実施形態では、トキシンAに対する抗体が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含む。好ましいトキシンBに対する抗体は、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する抗体を含み、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する特異的な結合を競合的に阻害またはこれと交差競合する。すべての実施形態が、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888またはPTA-9693で、上述した抗体のヒト化形態をさらに含む。結合の競合的阻害または交差競合を判断するには、当業者に知られた多岐にわたるアッセイを用いることが可能である。たとえば、交差競合アッセイを使用して、抗体が、もうひとつの抗体によってトキシンAおよび/またはトキシンBへの結合を競合的に阻害するか否かを判断することが可能である。このような方法は、フローサイトメトリーまたは固相結合分析を用いる細胞ベースの方法であってもよい。抗体が固相または溶液相においてトキシンAおよび/またはトキシンBに対する結合と交差競合する機能を評価する他のアッセイも使用可能である。本発明に包含される抗体またはその抗原結合性断片の例としては、特異的な結合を、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95または99競合的に阻害するものがあげられる。さまざまなモル比または質量比で、阻害を評価することが可能である。たとえば、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍またはそれを超えるモル過剰の第1の抗体と第2の抗体で、競合的結合実験を実施することが可能である。本発明に包含される他の抗体としては、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体による結合によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。本発明に包含されるさらに他の抗体または抗原結合性断片としては、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。本発明に包含されるさらに他の抗体または抗原結合性断片としては、ATCC受託番号PTA-9692、PTA-9694またはPTA-9888で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAのエピトープに特異的に結合し、かつ、ATCC受託番号PTA-9693またはPTA-9692で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、単離されたモノクローナル抗体の結合によって認識されるクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBのエピトープに特異的に結合するものがあげられる。エピトープを判断するには、従来技術において知られた標準的なエピトープマッピング法を用いることが可能である。たとえば、抗体に結合するトキシン好ましくは合成ペプチドの断片ペプチドを使用して、候補抗体またはその抗原結合性断片が同一のエピトープに結合するか否かを判断することが可能である。線形エピトープの場合、規定の長さたとえば、8アミノ酸以上などのオーバーラップするペプチドを合成する。トキシン配列の8アミノ酸断片ずつカバーする一連のペプチドがが調製されるように、このペプチドは、好ましくは1アミノ酸分だけずれている。たとえば、2または3アミノ酸などのもっと大きなオフセットを使って、これよりも少ないペプチドを調製することも可能である。また、これよりも長いペプチドたとえば、9マー、10マーまたは11マーを合成することも可能である。表面プラズモン共鳴たとえば、BiacoreおよびELISAアッセイをはじめとする標準的な方法を用いて、抗体に対するペプチドの結合を求めることが可能である。本明細書で得られる抗体が、いくつかの実施形態で結合できる立体エピトープを調べるために、さらに大きなペプチド断片を使用することが可能である。質量分析を使って立体エピトープを規定する他の方法が文献に記載され、これを利用することが可能であるたとえば、Baerga-Ortizetal.,ProteinScience11:1300~1308,2002およびそこに引用された参考文献を参照のこと。CurrentProtocolsinImmunology,Coliganetal.,eds.,JohnWileySonsのユニット6.8PhageDisplaySelectionandAnalysisofB-cellEpitopesおよびユニット9.8IdentificationofAntigenicDeterminantsUsingSyntheticPeptideCombinatorialLibrariesなど、エピトープを判断するためのさらに他の方法が、標準的な実験室でのリファレンスワークに提供されている。1つ以上の点変異または欠失を既知のエピトープに導入した後、1種類以上の抗体との結合を試験して、どの変異が抗体との結合を減らすか判断すれば、エピトープを確認することが可能である。本発明によって得られる抗体または抗原結合性断片は、ナノモル以下の親和性でトキシンAおよび/またはトキシンBに特異的に結合するものであってもよい。抗体または抗原結合性断片は、結合親和性が約1×10-9M以下、約1×10-10M以下または約1×10-11M以下のものであってもよい。特定の実施形態では、結合親和性が約5×10-10M未満である。抗体または抗原結合性断片のトキシンAまたはトキシンBに対する結合速度定数Konが、表面プラズモン共鳴で測定した場合の少なくとも102M-1s-1;少なくとも103M-1s-1;少なくとも104M-1s-1;少なくとも105M-1s-1;少なくとも106M-1s-1;または少なくとも107M-1s-1であってもよい。抗体または抗原結合性断片のトキシンAまたはトキシンBに対する解離速度定数Koffが、表面プラズモン共鳴で測定した場合の最大で10-3s-1;最大で10-4s-1;最大で10-5s-1;または最大で10-6s-1であってもよい。抗体または抗原結合性断片のトキシンAまたはトキシンBに対する解離定数KDが、最大で10-7M;最大で10-8M;最大で10-9M;最大で10-10M;最大で10-11M;最大で10-12M;または最大で10-13Mであってもよい。本明細書で使用する場合、抗体または免疫グロブリンという用語は、ジスルフィド結合で相互に連結された少なくとも2つの重H鎖ポリペプチドと2つの軽L鎖ポリペプチドとを含む、糖タンパク質を含む。重鎖は各々、重鎖可変領域本明細書ではHCVRまたはVHと略すおよび重鎖定常領域CHからなる。重鎖定常領域は、3つのドメインすなわちCH1、CH2、CH3からなる。軽鎖は各々、軽鎖可変領域本明細書ではLCVRまたはVLと略すおよび軽鎖定常領域CLからなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。VHおよびVL領域はさらに、相補性決定領域CDRと呼ばれる高頻度可変性の領域と、そのあいだのところどころに介在する一層保存されたフレームワーク領域FRと呼ばれる領域とにわけることができる。VHおよびVLは各々、3つのCDRと4つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配列される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの可変領域は、抗原と相互作用する/抗原に結合する結合ドメインを含むまたは形成する。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞たとえば、エフェクター細胞および古典的補体系の第一成分C1qを含む宿主組織または宿主因子への、免疫グロブリンの結合を媒介できる。本発明は、本明細書でさらに説明するような、単鎖抗体、組換え的に作製された抗体、二重特異性、異種特異的または多量体抗体、二特異性抗体など、他の形態の抗体をさらに提供するものである。抗体の抗原結合性断片という用語は、本明細書で使用する場合、抗原トキシンA、トキシンB、トキシンAおよびトキシンB、などまたは抗原のエピトープ領域に特異的に結合する能力を持つ、抗体の1つ以上の部分を意味する。抗体の抗原結合作用は、全長抗体の断片により実現できることが示されている。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片が、元のままの対応するモノクローナル抗体と同様に機能する。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片が、元のままの対応するモノクローナル抗体と交差反応する。一実施形態では、モノクローナル抗体の断片を、元のままの対応するモノクローナル抗体と同義に用いることが可能である。抗体の抗原結合性断片という用語に含まれる結合断片の例は、iFab断片VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、CH1ドメインからなる一価の断片;iiFab’2断片ヒンジ領域においてジスルフィド結合で結合される2つのFab断片を含む二価の断片;iiiVHドメインとCH1ドメインとからなるFd断片;iv抗体の単一の腕のVLドメインとVHドメインとからなるFv断片;vVHドメインからなるdAb断片Wardetal.,1989Nature341:544~546;vi単離された相補性決定領域CDRを含む。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは、離れた遺伝子でコードされるが、組換え方法を利用して、これらをVL領域およびVH領域の組が一価の分子を形成する1本のタンパク質鎖単鎖FvscFvとして知られている;たとえば、Birdetal.1988Science242:423~426;andHustonetal.1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879~5883を参照のことにさせることのできる合成リンカーによって、これらのドメインを連結することが可能である。このような単鎖抗体も、抗体の抗原結合性断片という用語に含むことを想定している。これらの抗体断片は、本明細書に援用するJ.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp98~118N.Y.AcademicPress1983に記載されているようなタンパク分解断片化手順ならびに当業者らに知られた他の技術などの従来の手順を用いて得られるものである。これらの断片を、元のままの抗体と同じようにして活性または有用性についてスクリーニングする。一実施形態では、本明細書の実施例10で説明するようにして、本発明のmAbのFab断片を生成し、細胞ベースのアッセイで中和活性を試験した。よって、本発明のmAbのFab断片などの抗体断片を利用して、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBを結合および中和してもよい。本明細書で使用する場合、単離された抗体、異なる抗原特性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すことを想定しているトキシンAに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンA以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まないなど。しかしながら、トキシンAまたはトキシンBのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は通常、他のクロストリジウムディフィシルC.difficile株などに由来する他の関連抗原に対する交差反応性を有する。また、トキシンAのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンBにも特異的に結合でき、トキシンBのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、トキシンAにも特異的に結合できる。しかしながら、いくつかの実施形態では、トキシンAのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントを特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、トキシンBに特異的に結合しない。さらに他の実施形態では、トキシンBのエピトープ、アイソフォームまたはバリアントに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片は、トキシンAにも特異的に結合しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まないものであってもよい。異なる抗原特性を有する他の抗体または他の材料および/または化学物質および/またはタンパク質を実質的に含まない抗体が、単離および/または精製された抗体であってもよい。抗体については、親和性クロマトグラフィ、タンパク質Aクロマトグラフィなどの当業者らが一般に実施している方法で精製すればよい。本明細書で使用する場合、特異的な結合とは、あらかじめ定められた抗原または同族抗原に対する抗体結合を示す。一般に、抗体は、あらかじめ定められた抗原または近縁抗原以外の非特異抗原BSA、カゼインなどへの結合親和性より、少なくとも2倍強い親和性をもって結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、トキシンAおよび/またはトキシンBなどの標的抗原のリニアエピトープに結合するものであってもよい。一実施形態では、本発明の抗体は、トキシンAおよび/またはトキシンBなどの標的抗原の立体エピトープに結合するものであってもよい。本発明の単離された抗体は、重鎖クラスまたはアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgEおよびそのサブタイプ、たとえば、IgG2a、IgG2b;軽鎖アイソタイプκおよびλおよびそのサブタイプなどのさまざまな抗体免疫グロブリン重鎖および軽鎖アイソタイプを含む。一実施形態では、単離された抗体は、IgG2aまたはIgG1κのアイソタイプである。本明細書で使用する場合、アイソタイプは、重鎖定常領域遺伝子および軽鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラスIgMまたはIgG1またはλ1などを示す。抗体またはその抗原結合性断片は、全長であってもよいし、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、またはIgEの抗体定常ドメインおよび/または可変ドメインなどの抗原結合性断片のみを含み得るか、あるいはFabフラグメント、Fab’2断片、Fv断片で構成可能なものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との混合物であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の多岐にわたる技術で作製可能なものである。ポリクローナル抗体を作製する手順は周知である。非限定的な例としてポリクローナル抗体は、まずは免疫前血清を得るために採血したニュージーランド白ウサギに、トキシンAおよび/またはトキシンBタンパク質を皮下的に投与することによって作製される。トキシンAおよび/またはトキシンBを、一般には1種類以上のアジュバントsを、異なる6ヶ所へ1ヶ所あたり総量100μl、典型的には1つ以上の調整剤と共に投与し得る。それからウサギを、最初の注射から2週間後に採血し、6週間ごとに3回、同じ抗原を定期的に追加投与する。血清のサンプルは、それぞれの追加投与から10日後に採取する。好ましくはトキシンAおよび/またはトキシンBを使用したアフィニティクロマトグラフィで抗体を捕捉して、ポリクローナル抗体を、血清から回収する。このポリクローナル抗体を作製する手順と他の手順は、E.andLane,D.,Eds.,Antibodies:ALaboratoryManual1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY本明細書中に援用するに開示される。モノクローナル抗体の作製を、この分野で周知の技術によって実施してもよい。モノクローナル抗体という用語は、本明細書で使用する場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体は、ある抗原または免疫原の特定のエピトープに対し、単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体を作製する過程は、抗体産生の可能性のある免疫体細胞特にBリンパ球を得る工程を伴う。この細胞は、かつてinvivoまたはinvitroの一方または利用法で目的の抗原で免疫されており、B細胞骨髄腫株との融合に適している。後述するように、モノクローナル抗体は、ヒトの免疫系を持つよう遺伝子的に操作したマウス株で、マウス、ヒトの細胞および細胞系統などの異なる種から、あるいは例えば免疫細胞および骨髄腫細胞を使用して、同じようにさらに生産することができる。トキシンAおよびトキシンB用のモノクローナル抗体は一般に、トキソイドトキシンAおよびトキシンBの不活性な形態および/またはこれらのトキシンの不活性な断片で動物を免疫することにより作製されたが、本発明のmAbは、新しい免疫化戦略を、使用することによって作製されている。本発明によれば、本明細書で説明して寄託するmAbは、動物をトキソイドで免疫した後、トキシンAおよび/またはトキシンB実施例1参照の活性非トキソイド形態でブーストすることで作製されている。トキシンAまたはトキシンBの活性形態でブーストすると、新規な免疫化スキームによるユニークに保護された抗体を開発した、免疫になった動物を同定するよう機能している。理論に拘泥されるわけではないが、活性トキシンAおよび/またはトキシンBブースト計画は、レシピエント動物で一層高度に免疫原性であった。これらの活性トキシンAまたはトキシンBのブースト用量を増やしたこと一般には未感作の動物には致死的であるに対して耐性となった動物は、非常に効果的な中和抗体を産生し、活性トキシンが入ってきたにもかかわらず、これがゆえに動物を保護して生存に寄与した。トキシンAまたはトキシンBに対する効果的な免疫応答を持つ動物からのハイブリドーマの作製によって、非常に強力な抗トキシンAおよび抗トキシンBモノクローナル抗体が得られ、invitroおよびinvivoで、ハイレベルの保護が得られる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含む抗体を作製する際に、アジュバントを使用してもよい。使用するのに好適なアジュバントの非限定的な例として、不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、RibiすなわちモノホスホリルリピドA、トレハロースジミコール酸、ミコバクテリウム細胞壁骨格、Tween登録商標80、2のスクアレンと、サポニン、QuilAまたはミョウバンがあげられる。トリパルミトイル-S-グリセリルシステイニル-セリル-セリンなど、脂質にトキシンあるいはその断片、不活性な誘導体あるいは類似物をコンジュゲートすることにより、細胞傷害性Tリンパ球CTLの応答をプライムすることができる。他の実施形態では、トキシンAおよび/またはトキシンB向けのモノクローナル抗体の作製に別の免疫化方法を利用することができる。たとえば、動物マウスなどのinvivoでの免疫化を、所望のタイプと量のタンパク質またはポリペプチドトキソイド、トキシンなどで実行することができる。そのような免疫化は、抗体の十分な力価を得られる数週間までの間隔で必要に応じて繰り返される。いちど免疫化すれば、その動物を、抗体を産生するリンパ球の起源として使用することができる。最後の抗原ブースト後、動物を屠殺し、脾臓細胞を除去する。マウスのリンパ球は、本明細書に記載のマウス骨髄腫系統と高い割合で安定した融合をする。これらのうち、BALB/cマウス株が適している。しかしながら、他のマウス株、ウサギ、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、カエルを、抗体産生細胞作製用の宿主として使用してもよい。GodingMonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,2ded.,pp.60~61,Orlando,Fla.,AcademicPress,1986を参照のこと。特に、ヒト免疫グロブリン遺伝子がゲノムに挿入されマウスの免疫グロブリンを産生できないマウス株を使用できる。一例として、Medarex現BristolMyersSquibb/GenPharmInternationalによって作製されたHumAbマウス株や、Abgenixによって作製されたXenoマウス株があげられる。このようなマウスは、免疫に応答して完全にヒトの免疫グロブリン分子を産生する。分割する形質芽細胞にある抗体産生細胞は優先的に融合する。抗原でプライムした動物のリンパ節、脾臓、末梢血から体細胞を得てもよく、選択するリンパ細胞は、特定の融合系での経験的な有用性に大きく左右される。その後、抗体を分泌するリンパ球をマウスB細胞骨髄腫細胞またはトランスフォームされた細胞細胞培養中で無制限に複製できると融合して、免疫グロブリン分泌細胞株を作製する。得られる融合細胞またはハイブリドーマを培養し、こうして得られるコロニーを、所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。このような抗体を産生するコロニーを、invivo腹水としてまたはinvitroのいずれかでクローニング、サブクローニング、増殖させ、大量の抗体を得る。ハイブリドーマ法と技術の説明は、KohlerandMilstein,Nature256:4951975またはHarlow,E.andLane,D.,Eds.,Antibodies:ALaboratoryManual1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY本明細書に援用するに見られる。あるいは、抗体を産生し得るヒト体細胞、特にBリンパ球は、骨髄腫細胞株との融合に適している。個体から生検で得た脾臓材料、扁桃材料またはリンパ節材料由来のBリンパ球を使用してもよいが、一層容易に入手可能な末梢血Bリンパ球PBLが好ましい。また、ヒトB細胞は、エプスタインバーウイルスColeetal.,1995,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77~96によって直接に不死化されたものであってもよい。体細胞ハイブリダイゼーションの手順が好ましいが、原則的には、Bリンパ球のウイルス形質転換または癌化などのモノクローナル抗体を作製するための他の技術を利用できる。ハイブリドーマ産生融合手順で使用するのに適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、融合効率が高く、所望のハイブリドーマの増殖を支える特定の選択培地における増殖を不能にする酵素欠損を有する。融合細胞株の作製に使用できる、このような骨髄腫細胞株の例としては、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4.1、Sp2/0-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、S194/5XX0Bulマウス由来;R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210ラット由来;U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6ヒト由来Goding,inMonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,2ded.,pp.65~66,Orlando,Fla.,AcademicPress,1986;Campbell,inMonoclonalAntibodyTechnology,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyVol.13,BurdenandVonKnippenberg,eds.pp.75~83,Amsterdam,Elseview,1984があげられる。細胞培養で無限に複製可能な哺乳類骨髄腫細胞または他の融合相手との融合は、たとえばポリエチレングリコールPEGまたは他の融合剤を使用するなど、標準的かつ周知の技術によってなされるものであるMilsteinandKohler,Eur.J.Immunol.6:5111976を参照のこと。これを本明細書に援用する。他の実施形態では、抗体は、組換え抗体であっても構わない。組換え抗体という用語は、本明細書で使用する場合、別の種の免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックである動物マウスなどから単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体または免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を含むことを意図する。さらに他の実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。本明細書で使用する場合、キメラ抗体という用語は、マウス免疫グロブリンIgの可変領域または超可変領域と、ヒトIgの定常領域または定常および可変フレームワーク領域とを結合する抗体を示す。いくつかの実施形態では、キメラ抗体が、本明細書に示すいずれかの寄託抗体の可変領域と、ヒト定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト定常領域が、ヒトIgG1定常領域などのヒトIgG定常領域である。キメラ抗体は、実施例で後述する方法または当業者間で周知の任意の方法で作製可能なものである。本明細書で使用する場合、ヒト化抗体という用語は、実質的にマウスモノクローナル抗体などの親抗体由来の抗原結合CDRだけをヒトフレームワーク領域とともに保有する抗体を示すWaldmann,1991,Science252:1657を参照のこと。マウス抗体の結合特異性を持つが、ヒトIg定常/フレームワーク領域を有するこのようなキメラ抗体またはヒト化抗体は、invivoで投与すると、免疫原性が低減されることが期待される。したがって、キメラおよびヒト化抗体は、好ましくは、提供されるモノクローナル抗体のトキシン中和活性を保持し、繰り返し投与に適しているたとえば、ヒトでなど。当業者であれば、周知の方法たとえば、invitro細胞ベースのアッセイを使用して、ヒト化抗体の活性を本明細書にて提供する寄託されたモノクローナル抗体と比較したり、ヒト化抗体が確立されたクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の再発を治療および/または予防するかどうか判断したりすることが可能である。また、当業者であれば、後述するクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症のハムスターモデルを含む本明細書に記載の方法を使用することが可能である。ヒト化mAbの配列を、以下の一例としての非限定的な方法で設計することが可能である。まず、CDR構造にとって重要なフレームワークのアミノ酸残基を同定する。平行して、マウスのVHおよびVLに対して高い相同性を持つヒトVHおよびVL配列を、既知のヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列から選択する。マウスmAb由来のCDR配列を、CDRの構造を維持する上で重要なフレームワークのアミノ酸残基と一緒に、選択されたヒトフレームワーク配列にグラフトする。また、得られるヒト化mAbの潜在的な免疫原性を低減するために、対応するV領域サブグループで異型であることがわかるヒトのヒトフレームワークアミノ酸残基残基を一般的な残基と置換する。これらのヒト化VHおよびVL領域を発現ベクター、たとえば、pCONγ1およびpCONκLonzaBiologics,Berkshire,UKにそれぞれクローニングする。これらのベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域をコードする。Effectene系Qiagen,Valencia,CAを使用して、293T細胞を一過的にこれらの発現ベクターでトランスフェクトする。分泌されたキメラmAbを含有する細胞上清を、たとえば3日後などトランスフェクション後に回収可能であり、プロテインAクロマトグラフィで精製可能である。当業者らが理解するように、他の発現ベクターおよび宿主細胞を使用して、標記の抗体を組換え的に作製してもよい。抗体または抗原結合性断片をヒト化する他の方法が従来技術において周知であり、たとえば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第6,180,370号に記載されている方法を含む。これらの特許に記載のヒト化のための方法を、全体として本明細書に援用する。これらの特許に記載の方法によってヒト化した抗体または抗原結合性断片も、本明細書に提供される。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbhmAbは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、本発明のhPA-39mAbを包含する。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、本発明のhPA-50mAbを包含する。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAbは、免疫グロブリンタンパク質を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。一実施形態では、本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAbは、免疫グロブリンタンパク質またはその断片を包含し、これは、i2つの重H鎖ポリペプチド各H鎖が配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むVH領域とヒトCH領域、たとえば、IgG1C領域を含むおよびii2つの軽L鎖ポリペプチド各L鎖が配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むVL領域とヒトCL領域、たとえば、κ鎖C領域を含むからなる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAbは、本発明のhPA-41mAbを包含する。上述したヒト化本発明の抗体のL鎖およびH鎖のC領域は、それぞれGenBank受託番号NW_001838785およびGenBank受託番号MW_001838121に含まれる配列を有する、ヒトκのL鎖のC領域CLおよびヒトIgG1のH鎖のC領域CHを含むものであってもよい。他の実施形態では、ヒト化抗体が、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4アイソタイプから選択されるヒトH鎖のC領域を含む。一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号14で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号15に示す図38B。配列番号16で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号17に示す図38A。一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号18で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号19に示す図39B。配列番号20で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号21に示す図39A。一例としての実施形態では、本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対して生成されるモノクローナル抗体またはその断片であって、抗体が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む、モノクローナル抗体またはその断片を包含する。配列番号22で示される重鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号23に示す図40B。配列番号24で示される軽鎖ポリペプチドの連続したアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号25に示す図40A。本発明に包含されるのは、上述した抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよび抗トキシンBヒト化抗体の一部または断片である。このような一部または断片は、従来から当業者らが判断できるように、Fab断片、Fab’断片、Fab’2断片、Fc断片、Fd断片などのH鎖とL鎖ポリペプチドのV領域の相補性決定領域CDRを含む。一実施形態では、V領域を含むヒト化抗体の一部または断片またはその機能的部分が、それぞれのトキシンと最適に結合し、トキシンの活性を中和する。一実施形態では、ヒト化抗体のこのような機能的な一部または断片が、完全なヒト化抗体よりも良いというわけではないにしても、これと同様のレベルでトキシン活性を最適に中和する。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはB用の本発明による分子クローニングしたヒト化mAbが得られる。このようなヒト化mAbは、実施例9のセクションDおよびEで説明するようにして単離され、キャラクタライズされる。一実施形態では、各ヒト化抗体の軽鎖定常領域CLがカッパκクラスのものである。一実施形態では、各ヒト化抗体の重鎖定常領域CHが、IgG1アイソタイプのものである。他の実施形態では、ヒト化抗体のCH領域が、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgAまたはIgMアイソタイプのものである。ユニークな可変V領域を含むヒト化mAbが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはトキシンBに結合してその活性を中和することが明らかになった。ヒト化mAbのVLおよびVH領域は、完全な免疫グロブリンIgまたは抗体分子の一部を形成するものであってもよいし、抗体の一部または断片、特に、結合および/または中和活性を有する一部または断片として使用してもよい。抗体断片の非限定的な例として、Fab、Fab2およびFab’、またはFab’2断片があげられる。本発明の実施形態は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する活性を有する抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAヒト化mAbまたはその断片に関するものであり、L鎖のV領域が、配列番号3、配列番号4、配列番号7のうちの1つ以上から選択される。一実施形態では、本発明は、標記の抗体のVHおよびVL領域におけるCDRすなわち、CDR1、CDR2および/またはCDR3に関するものである。本発明の実施形態は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する活性を有する、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBヒト化mAbまたはその断片に関し、L鎖のV領域を、配列番号10に示す。本発明の実施形態は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに対する活性を有する、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAヒト化mAbまたはその断片に関し、H鎖のV領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号6のうちの1つ以上から選択される。本発明の実施形態は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに対する活性を有する、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBヒト化mAbまたはその断片に関し、H鎖のV領域が、配列番号8または配列番号9のうちの1つ以上から選択される。一実施形態では、本発明は、標記の抗体のVHおよびVL領域におけるCDRすなわち、CDR1、CDR2および/またはCDR3に関する。他の実施形態では、本発明は、抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよび/または本発明の抗トキシンB抗体の抗原結合部分、CDRまたは可変V領域をコードする核酸を包含する。さまざまな実施形態では、部分、CDRまたはV領域が、本明細書で説明するような、PA-38、PA-39、PA-41またはPA-50、またはそのヒト化バージョン由来である。別の実施形態では、本発明は、それぞれの核酸にコードされる抗原結合部分、CDRまたはV領域のアミノ酸配列を包含する。もうひとつの実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体を、二重特異性抗体、二官能性抗体、多重特異性抗体または異種機能性抗体の形になるように修飾可能である。二重特異性および異種特異性抗体およびこのような抗体の作製方法の非限定的な例が、多数の例示的な刊行物にみられ、たとえば、UA20090060910号明細書、国際公開第2009/058383号パンフレット、国際公開第2009/030734号パンフレット、国際公開第2007/093630号パンフレット、USP6,071,517号明細書、国際公開第2008/024188号パンフレット、UA20070071675号明細書、USP7,442,778号、USP7,235,641号明細書、USP5,932,448号明細書およびUSP5,292,668号明細書に記載されている。二重特異性抗体という用語は、2つの異なる結合特異性を持ち、aクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびbクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに結合またはこれと相互作用する、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体を含むことを意図する。一実施形態では、二重特異性抗体は、PA-39またはPA-50またはその抗原結合性断片およびPA-41、またはその抗原結合性断片を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、PA-39またはPA-50のキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片およびPA-41、またはその抗原結合性断片を含む。したがって、PA-39およびPA-41、またはそのキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片を含む二重特異性抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの両方に結合する。同様に、PA-50およびPA-41、またはそのキメラ形態またはヒト化形態、またはその抗原結合性断片を含む二重特異性抗体は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの両方に結合する。多重特異性抗体という用語は、3つ以上の異なる結合特異性を持ち、aクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびbクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンB、c少なくとも1つの他の成分に結合またはこれと相互作用する、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質複合体もしくはペプチド複合体などのあらゆる因子を含むことを意図する。したがって、本発明は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、多重特異性抗体を含むが、これに限定されるものではない。一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体の抗体または抗原結合性断片がヒト化されている。二重特異性抗体という用語はさらに、二特異性抗体を含む。二特異性抗体は、二特異性を有し、単一分子で複数の異なるエピトープを標的できる治療抗体を提供する。二特異性抗体は、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖で発現するが、同じ鎖上で2つのドメインの間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用し、それによってそのドメインを他の鎖の相補ドメインと対にさせ、2つの抗原結合部位を作る、二価の二重特異性抗体であるたとえば、Holliger,P.,etal.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444~6448;Poijak,R.J.,etal.1994Structure2:1121~1123を参照のこと。二重特異性抗体の2つの抗原結合領域は、化学的にリンクしているか遺伝的に操作された細胞によって発現され、二重特異性抗体を産生する概要については、Fangeretal.,1995DrugNewsPerspec.83:133~137を参照のこと。一実施形態では、有効量の二重特異性抗体を、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症および/またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体に投与することが可能であり、二重特異性抗体がトキシンAおよびトキシンBの毒性を被検体で中和する。特定の実施形態では、抗体はヒト抗体であってもよい。ヒト抗体という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常Ig領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含み得るたとえば、ランダムなもしくは部位特異的なinvitroの変異誘発によって、またはinvivoの体細胞変異によって誘導された変異。しかしながら、ヒト抗体という用語は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳類の種の生殖細胞系由来であるCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体本明細書ではヒト化抗体と呼ぶを含むことを意図しない。トキシンAおよび/またはトキシンB向けのヒト抗体は、マウスの系よりもヒト免疫系の部分を発現するよう遺伝的に修飾して育種したトランスジェニックマウスを使用して産生可能である。完全なヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックのマウスを免疫することによって、調製可能である。たとえば、米国特許第5,591,669号、同第5,598,369号、同第5,545,806号、同第5,545,807号、同第6,150,584号、これらの中で引用された参考文献その内容を本明細書に援用するを参照のこと。これらの動物は、内因性のたとえばマウスの抗体の産生において機能的な欠失が存在するように、遺伝的に修飾されている。動物は、これらの動物の免疫化が目的の抗原に対する完全なヒト抗体の産生を生じるようなヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むように、さらに修飾される。これらのマウスたとえば、XenoMouseAbgenix、HumAbマウスMedarex/GenPharmの免疫化に続き、モノクローナル抗体を、標準的ハイブリドーマ技術に従って調製する。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有するため、ヒトに投与した場合に、ヒト抗マウス抗体HAMA反応を起こさない。本明細書で提供されるのは、標記の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸およびポリヌクレオチドでもあることは、当業者であれば理解できよう。また、本明細書で提供されるのは、抗体またはその抗原結合性断片をコードする配列を含む核酸およびポリヌクレオチドである。よって、抗体コード核酸およびポリヌクレオチドを含むおよび/または発現するよう操作されたベクターおよびプラスミドも、本発明によって得られる。本明細書で使用する場合、コード領域は、ポリペプチド配列をコードする塩基配列領域を示す。コード領域は、シグナルペプチドなどの後に開裂するタンパク質の一部分をコードする領域を含み得る。場合によっては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、シグナルペプチドをコードするまたはシグナルペプチドである配列を含むこともある。本発明は、シグナルペプチドをコードするまたはシグナルペプチドである配列の一部を含むまたは含まない状態で、これらの配列各々を包含する。以下の方法ならびに、当業者間で知られた他の方法を用いて、本明細書で提供される抗体をクローニングすることが可能である。非限定的な例として、ハイブリドーマコールから全RNAを生成し、オリゴ-dTプライマーを用いてcDNAを逆転写する。RNaseHを使用して、RNAを除去し、1本鎖cDNAを得る。スピンカラム精製を用いて、遊離ヌクレオチドを除去する。次に、末端トランスフェラーゼで3’ポリ-dG尾を加えることが可能である。定常領域に対し、オリゴ-dCプライマーと、縮重プライマーとを用いて、PCR増幅を実施することが可能である。しっかりとした重鎖増幅のために約40サイクルを実施することが可能である。その後、PCR産物のダイレクトシーケンシングを実施可能である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、上述の核酸分子に対し高度に相同である核酸分子にコードされる。相同の核酸分子は、本明細書で提供される塩基配列と少なくとも約90等しい塩基配列を含み得る。相同の核酸分子は、本明細書で提供される塩基配列と少なくとも約95同一、少なくとも約97同一、少なくとも約98同一または少なくとも約99同一の塩基配列を含み得る。さまざまな公的入手可能で当業者に周知のソフトウェアツールを使用して、相同性を計算することが可能である。代表的なツールとしては、NationalInstitutesofHealthのNationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIのウェブサイトから入手し得るBLASTシステムが挙げられる。高度に相同な塩基配列を同定するひとつの方法に、核酸ハイブリダイゼーションによるものがある。本明細書で提供されるのは、トキシンAおよび/またはトキシンB結合特性と、本明細書に記載の他の機能的特性を有する抗体であって、高ストリンジェンシー条件下で、本発明の抗体をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。関連配列の同定は、ポリメラーゼ連鎖反応PCRおよび関連核酸配列のクローニングに適した他の増幅技術を使用しても達成され得る。このような技術では、PCRプライマーは一般に、CDRなど、目的の核酸配列の一部を増幅するために選択される。本明細書で使用する場合、高ストリンジェンシー条件という用語は、よく知られた技術のパラメータを意味する。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、このような方法をまとめた参考文献たとえば、MolecularCloning:ALaboratoryManual,J.Sambrook,etal.,eds.,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989、またはCurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel,etal.,eds.,JohnWileySons,Inc.,NewYorkにおいて見出される。高ストリンジェンシー条件の非限定的な一例は、ハイブリダイゼーション緩衝液3.5×SSC、0.02フィコール、0.02ポリビニルピロリドン、0.02ウシ血清アルブミン、2.5mMNaH2PO4pH7、0.5SDS、2mMEDTAにおける65°Cのハイブリダイゼーションである。SSCは、0.15M塩化ナトリウム/0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7であり;SDSは、ドデシル硫酸ナトリウムであり、EDTAは、エチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーションの後、核酸を移した膜を、たとえば、2×SSCにおいて室温で、そしてそれから0.1~0.5×SSC/0.1×SSCにおいて68°Cまでの温度で、洗浄する。本明細書で提供されるのは、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現に必要な、標記の核酸分子を、ORI、プロモーター、エンハンサー、終結配列など他の核酸配列に加えて含む、ベクター発現ベクター発現またはプラスミドである。ベクターを使用して、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片の結合特異性および/または特徴を有する抗体またはその抗原結合性断片を作製することが可能である。一実施形態では、ベクターが、得られる抗体および抗原結合性断片の重鎖またはその一部をコードする単離された核酸分子を含み得る。もうひとつの実施形態では、ベクターが、軽鎖またはその一部をコードする核酸配列を含み得る。別の実施形態では、本発明のベクターが、重鎖またはその一部の配列、軽鎖またはその一部の配列を含み得る。別の実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片を産生するプラスミドが得られる。本発明の抗体の修飾バージョンも得られる。抗体またはその抗原結合性断片に対する修飾は、一般に、抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸に対してなされ、欠失、点変異、切断、アミノ酸置換、アミノ酸または非アミノ酸部分の追加を含み得る。あるいは、修飾を、ポリペプチドに対して直接実施してもよい切断、リンカー分子の追加、ビオチンなどの検出部分の追加、脂肪酸の追加などによる。修飾は、抗体または抗原結合性断片アミノ酸配列の全部またはその一部を含む融合タンパク質も、含む。修飾されたポリペプチドは、生理学的活性とは関係のないポリペプチドの特徴を変えるよう特異的に修飾されたポリペプチドを含む。たとえば、システイン残基を置換または欠失させて、不要なジスルフィド結合を防ぐことも可能である。同様に、特定のアミノ酸を変更し、発現系でのプロテアーゼによるタンパク質分解をなくすことで、ポリペプチドの発現を高めることも可能であるたとえば、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基。また、2006年7月6日に発行された国際公開第2006/071877号パンフレットなどに記載されているように、1つ以上のアミノ酸を特にIg定常領域で変更して特定の投与経路、たとえば、経口投与に続いて、酵素による抗体のタンパク質分解性の消化を防止することも可能である。修飾は、ポリペプチドをコードする核酸分子を変えることにより、都合良くなされる。ポリペプチドをコードする核酸の修飾は、好ましくは、コード配列のアミノ酸の読み枠を保存し、かつ好ましくは、ハイブリダイズして二次構造ヘアピンまたはループなど、修飾ポリペプチドの発現に有害な構造を形成しやすい領域を、核酸において作製しないものである。修飾は、アミノ酸置換の選択、あるいはポリペプチドをコードする核酸における選択された部位のランダム変異誘発によって、どの抗体またはその抗原結合性断片に対しても実施可能である。その上で、修飾ポリペプチドを発現させ、1つ以上の活性を試験して、どの変異が望ましい特性を有する修飾ポリペプチドを提供するかを判断することが可能である。ポリペプチドのアミノ酸配列としては活性を示さないが、特定の宿主において好ましい翻訳のコドンを提供する、修飾ポリペプチドまたは非修飾ポリペプチドをさらに修飾することも可能である。たとえば大腸菌E.Coliにおける核酸の翻訳に好ましいコドンは、当業者に周知である。また、配列またはcDNAクローンの非コード配列に対して他の変異をつくり、ポリペプチドの発現を増大させることも可能である。修飾ポリペプチドをコードする遺伝子を、発現ベクターにクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞に導入し、修飾ポリペプチドを発現させ、本明細書に開示したポリペプチドの機能的能力を試験することにより、修飾ポリペプチドの活性を試験することが可能である。上述の手順は、当業者に周知である。また、保存的アミノ酸置換をポリペプチドで作り、ポリペプチドとの機能的な等価物を提供してもよいことを、当業者であれば理解できよう。本明細書で使用する場合、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の、相対的な電荷や大きさの特性を変えないアミノ酸置換を示す。修飾ポリペプチドは、ポリペプチド配列を変えることのできる、当業者に知られた方法このような技術をまとめる参考文献MolecularCloning:ALaboratoryManual,J。.Sambrook,etal.,eds.,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989、またはCurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel,etal.,eds.,JohnWileySons,Inc.,NewYorkなどにおいて見いだせるに従って、調製可能なものである。アミノ酸の保存的置換は、以下の群の範囲内のアミノ酸の間に作られる置換を含む:aM、I、L、V;bF、Y、W;cK、R、H;dA、G;eS、T;fQ、N;およびgE、D。ポリペプチドにおける保存的アミノ酸置換は一般に、ポリペプチドをコードする核酸の変化により作られる。このような置換は、当業者にしられた多岐にわたる方法で作られる。たとえば、アミノ酸置換はPCR特異的変異、部位特異的変異誘発またはポリペプチドをコードする遺伝子の化学的合成によって作られる。アミノ酸置換がポリペプチドの小さな断片に合わせて作られた場合、置換はペプチドの直接合成によって作られる。変えられたポリペプチドをコードする遺伝子を細菌発現ベクターまたは哺乳類発現ベクターにクローニングし、そのベクターを適切な宿主細胞に導入し、変更されたポリペプチドを発現させて本明細書に開示するポリペプチドの機能的能力を試験することによって、ポリペプチドの機能的等価物の活性を試験することが可能である。本発明の抗トキシン抗体または抗原結合部分を、誘導体化または別のペプチドまたはタンパク質などの別の機能的分子に結合することが可能である。また、たとえば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合などによって、抗体または抗体部分を、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなどの別の分子との結合を媒介できる別の抗体、検出可能な因子、細胞傷害性因子、治療剤、薬剤および/またはタンパク質またはペプチドなどの1つ以上の他の分子部分に機能的に結合することも可能である。誘導体化したタンパク質または抗体作製するには、同一または異なるタイプの2種類以上のタンパク質または抗体を架橋またはカップリングすればよい。好適な架橋剤またはカップリング剤として、適切なスペーサたとえば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒロドキシスクシンイミドエステルで分離された2つの異なる反応基を有するヘテロ二官能性のものあるいは、ホモ二官能性たとえば、ジスクシンイミジルスベラート、市販のものPierceChemicalCompany,Rockford,ILがあげられる。本発明の抗トキシン抗体またはその抗原結合性断片を、標識などの別の分子部分に結合してもよい。タンパク質を誘導体化または標識するのに用いられる検出可能な因子または標識としては、蛍光化合物、酵素、補欠分子族たとえば、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチン、化学発光材料、生物発光材料、化学部分および放射性材料があげられる。検出可能な蛍光化合物としては、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセインFITC、ローダミン、フィコエリトリンがあげられる。タンパク質または抗体も、アルカリホスファターゼAP、ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化可能である。このような酵素的に誘導体化したタンパク質または抗体は、検出可能な反応産物が得られるように酵素の特定の基質を追加すると検出可能になる。ビオチンなどの補欠分子族で誘導体化したタンパク質については、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出可能である。親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降などの標準的な技術を使用して、診断および/または実験因子または試薬として標識したタンパク質および抗体を使用して、既知の抗原またはあらかじめ定められた抗原を単離してもよいし、特定の治療計画の有効性を監視するための臨床試験手順の一部として組織でのタンパク質レベルを判断するために既知の抗原またはあらかじめ定められた抗原を検出してもよい。一実施形態では、検出対象となる抗原が、細胞可溶化液または患者試料におけるトキシンであってもよい。特定の実施形態では、本発明の複数の抗体または抗原結合性断片を、たとえば、2種類以上の異なる抗体またはその抗原結合性断片たとえば、1種類以上がトキシンA向け、1種類以上がトキシンB向け、2種類以上がトキシンA向け、2種類以上がトキシンB向けなどを含む製剤組成物として併用する。抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせを、単一の治療法と組み合わせてすなわち同時投与、所望の治療効果を得ることも可能である。あるいは、抗体またはその抗原結合性断片を、別々にすなわち異なる時点で投与することが可能である。したがって、抗体またはその抗原結合性断片を一緒にまたは別々に保管することが可能である。抗体またはその抗原結合性断片を、水性媒質に入れて保管してもよいし、使用前に再構成可能な凍結乾燥形態で保管してもよい。もうひとつの実施形態では、1種類以上の単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物が得られる。また、提供されるのは、上述した抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上の組み合わせを含む組成物である。また、提供されるのは、各々が上述した抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上を含む組成物であって、組み合わせで用いることを想定した組成物である。このような組成物は、生理学的にまたは薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤を含むものであってもよい。生理学的にまたは薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、溶媒または希釈剤を、単離された抗体またはその抗原結合性断片と混合することも可能である。一実施形態では、組成物が、複数たとえば、2以上の単離された抗体またはその抗原結合性断片の組み合わせを含む。一実施形態では、組成物の抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合し、その毒性作用を中和するのに対し、抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合し、その毒性作用を中和する。一実施形態では、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAに特異的に結合してその毒性作用を中和するする抗体またはその抗原結合性断片の1つ以上と、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBに特異的に結合してその毒性作用を中和する1つ以上が、ヒト化されている。特定の実施形態では、組成物は、本明細書で説明するような1種類の抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片と、本明細書で説明するような1種類の抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片との組み合わせを含む。このような組成物では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体が、等しい量または1:1などの等しい割合で存在してもよい。あるいは、このような組成物では、抗トキシンA抗体および抗トキシンB抗体が異なる量あるいは、1/2:1;2:1;3:1;4:1などの異なる割合で存在してもよい。一実施形態では、組成物の抗体がヒト化されている。一実施形態では、組成物が、mAbPTA-9888、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、mAb9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態との組み合わせを含む。一実施形態では、組成物が、mAbPTA-9694、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態と、mAb9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態との組み合わせを含む。一実施形態では、組成物が、MabPTA-9692、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびmAb9693、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態;またはmAbPTA-9888、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびmAb9692、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態;またはmAbPTA-9694、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態およびmAb9692、その抗原結合性断片またはそのヒト化形態のうちの1つ同士の組み合わせを含む。また、製剤組成物は、併用療法において投与可能すなわち、他の治療薬と組み合わせることが可能なものである。たとえば、併用療法は、本明細書で提供されるような1種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と、少なくとも1つの他の従来の療法との組み合わせを含み得る。このような追加の治療剤には、抗生剤の治療剤および抗生物質によらない治療剤がある。追加の治療剤として、クロストリジウムディフィシルC.difficileトキソイドワクチン、アンピシリン/アモキシシリン、バンコマイシン、メトロニダゾール、フィダキソマイシン、リネゾリド、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニン、ディフィミシンPAR-101またはOPT-80とも呼ばれる、クリンダマイシン、セファロスポリン第二世代および第三世代セファロスポリンなど、フルオロキノロンガチフロキサシンまたはモキシフロキサシン、マクロライドたとえば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ペニシリン、アミノ配糖体、トリメトプリムスルファメトキサゾール配合剤、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、イミペネムおよびメロペネムがあげられる。また、追加の治療剤として、抗生剤、抗菌剤、殺菌剤または静菌剤もある。一実施形態では、追加の治療剤が、クロストリジウムディフィシルC.difficileおよび/またはそのトキシンを標的する小分子または低分子量の化合物であってもよい。一実施形態では、追加の治療剤がOPT-80である。抗生物質によらない治療剤としては、tolevamer、非特異的な荷電機序でトキシンAおよびBに結合する高分子量アニオンポリマーがあげられる。別の例として、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を他の抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせで用いることも企図される。他の追加の治療剤としては、通常のプールされた免疫グロブリン、静脈内免疫グロブリンまたは血清中のポリクローナル抗トキシンAおよび抗トキシンB免疫グロブリンがあげられる。他の抗体として、刊行物たとえば、国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号明細書に記載され、報告されているようなクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはトキシンB用のヒトmAbがあげられる。また、本明細書に包含されるのは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を用いて、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患、その病理または発症または進行を治療または予防する、すなわち治療し、回復させ、緩和し、根絶し、予防し、または遅延させる方法である。CDADは一般に、クリンダマイシン、セファロスポリン、フルオロキノロンなどの抗生剤の使用によって結腸細菌叢が破壊されることで惹起される。このような結腸微小環境の混乱が、クロストリジウムディフィシルC.difficile胞子への曝露とあいまって、罹患個体でのコロニー形成につながる。コロニー形成が起こった全患者の約3分の1でCDADが発症し、これが重症の下痢症、結腸穿孔、結腸切除、死を引き起こし得る。したがって、この方法は、本発明の抗体または本明細書で説明するような組成物を被検体に投与して、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはCDADを治療することで提供される。本明細書で使用する場合、治療とは、本明細書で提供される抗体または組成物または組成物の組み合わせの投与によって得られる、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のある被検体にとっての利益を示す。たとえば、限定されるものではなく、このような利点は、感染または疾患に起因する1つ以上の症候または有害作用の排除あるいは1つ以上の症候または有害作用の重症度の低減または緩和;遅延、停止あるいは感染症または疾患の進行の逆転;再コロニー形成、消化管、結腸、腸などの正常で自然な細菌叢の再増殖あるいは、感染症または疾患の治癒臨床医が被検体を評価し、感染または疾患がなくなったと判断した状態を含み得る。クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に関連した症候または有害作用としては、結腸の破裂や死につながりかねない脱水症、下痢症、痙攣、腎不全、腸穿孔、中毒性巨大結腸がある。提供される組成物を使用して、本明細書で提供される症候または有害作用のすべてまたはいずれかを低減、減少、緩和または排除することが可能である。本明細書で使用する場合、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症とは、前には存在しなかった腸内細菌叢にクロストリジウムディフィシルC.difficileが存在するか、1つ以上の他の細菌に対して腸内細菌叢でのクロストリジウムディフィシルC.difficileの存在に変化が生じることクロストリジウムディフィシルC.difficileの総量の増加などに起因して、腸管または消化管をなす他の臓器および組織で有害作用を引き起こすまたは引き起こし得るおよび/またはトキシンAおよび/またはBのレベル増加につながる感染症を示す。一般に、CDADは、腸がクロストリジウムディフィシルC.difficileに感染してこれが増殖した後に生じる。Invivoでは、トキシンAおよびトキシンBが、疾患を引き起こす可能性のある相乗効果を持つ異なる病理学的プロファイルを示す。ウサギおよびマウスでは、たとえば、トキシンAが下痢症を誘発するエンテロトキシンで、トキシンBがこの種では流体の反応を引き起こさない。しかしながら、トキシンBは、invitroで一層強力かつ細胞傷害性である。クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンA陰性、トキシンB陽性A-B株の報告数が増加している。A-/B株は、tcdA遺伝子の繰り返しドメインの欠失がゆえにトキシンAを産生できないが、それでも臨床疾患を引き起こすことはできる。対照的に、今日まで、トキシンA陽性、トキシンB陰性A/B-株はヒトでは報告されていない。クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症は一般に、軽度から中度の下痢症として現れ、ときおり腹部の痙攣が生じる。腸管粘膜での接着性のクリーム色がかったプラークである偽膜が観察されることもときおりある。希な症例として、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の患者が、結腸の正常な細菌叢が破壊、クロストリジウムディフィシルC.difficileのコロニー形成、粘膜の炎症および損傷を引き起こすトキシンの放出に起因する可能性がある、生命を危うくする急性かつ劇症性の腹部の大腸炎を持つ場合がある。結腸の細菌叢を変化させるカギになる因子のひとつに抗生剤療法がある。正常な腸細菌叢は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのコロニー形成および異常増殖に対する耐性があるが、抗生剤を使用すると、正常な細菌叢が抑制され、クロストリジウムディフィシルC.difficile細菌が増殖できる。クロストリジウムディフィシルC.difficileは、健康な成人の2~3に存在し、健康な乳幼児では70と多い。その態様のひとつにおいて、無症状であるが、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症にかかりやすいか罹患するリスクがある被検体や、その関連の疾患に悩んでいる被検体の治療に、本発明のmAbを使用する。このような被検体は、入院していてもよいし、院外の被検体であってもよい。クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の主なリスク要因に、抗生剤への事前曝露がある。クロストリジウムディフィシルC.difficile大腸炎と関連のある最も一般的な抗生剤には、セファロスポリン特に第二世代および第三世代、アンピシリン/アモキシシリン、クリンダマイシンがある。これよりは一般的に関連しているわけではない抗生剤としては、マクロライドすなわちエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシンおよび他のペニシリンがある。この疾患を引き起こすことがときどき報告されている化合物または他の因子には、アミノ配糖体、フルオロキノロン、トリメトプリム-スルファメトキサゾール、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、イミペネム、メロペネムがある。特に正常な腸内細菌叢が悪影響を受けているか死滅した場合に、1種類の抗生剤に軽く接しただけでも、クロストリジウムディフィシルCdifficile大腸炎が生じることがある。抗生剤の使用期間が長くなる、あるいは2種類以上の抗生剤を用いていると、疾患のリスクが高くなる。クロストリジウムディフィシルC.difficile大腸炎の治療に従来から用いられている抗生剤は、疾患を引き起こすことがわかっている。クロストリジウムディフィシルC.difficileによる感染に関連した他の危険因子として、高齢>65歳;免疫系が弱い;最近の入院特に感染者と病室が同じ、集中治療室にとどまる、入院が長引く場合;養護施設、ホスピスあるいは他の長期療養所での生活;腹部手術;慢性結腸疾患炎症性腸疾患IBDまたは結腸直腸がんなど;腹痛を抑えてクロストリジウムディフィシルC.difficileを一層容易に腸管に通してしまうことがある処方薬または市販の制酸薬の服用;過去のクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症があげられる。クロストリジウムディフィシルC.difficile疾患に関連した、別の要因には、抗腫瘍薬、主にメトトレキセート、溶血尿毒症症候群、悪性腫瘍、腸管虚血、腎不全、壊死性小腸大腸炎、ヒルシュスプルング病、IBD、経鼻胃管を含む外科以外の胃腸管に対する術式がある。本明細書で提供される組成物を投与可能な被検体は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症のリスクがあるとして説明した被検体を含む。クロストリジウムディフィシルC.difficile大腸炎のほとんどの患者は特別な治療法を使わなくても回復するが、症候が長引いたり衰弱したりすることもある。クロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症は、虚弱な高齢患者では死亡率が最大25の重症となり得る。一層重篤な疾病の患者に焦点をあてた報告では、死亡率が10~30と示されている。クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症は、高齢の人々の間のほうが一般的で、高齢であると、コロニー形成および疾患に対する感受性が増すことがある。乳幼児や幼い子どもはクロストリジウムディフィシルC.difficileおよびそのトキシンを持つことが多いが、臨床感染は一般的ではない。クロストリジウムディフィシルC.difficileの交差感染は新生児室では一般的であるが、新生児ではクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症が発症しないように見える。本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるヒト化本発明の抗体および/または組成物を用いる多数の方法である。たとえば、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症または疾患のある被検体、本明細書で提供される症候または有害作用を呈する被検体、あるいは本明細書で提供される疾患のいずれかに羅患した被検体を治療するための方法が得られる。一実施形態では、この方法は、被検体でのクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に関連した疾患またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の重症度を低減、減少または緩和する。もうひとつの例として、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症に悩んでいる被検体を治療する方法が得られる。提供されるのは、被検体においてクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBを中和する方法である。一例として、全身性のクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの重感染を中和する方法が得られる。一実施形態では、ヒト化抗トキシンA抗体またはその抗原結合性断片とヒト化抗トキシンB抗体またはその抗原結合性断片の両方あるいは、これらの抗体を含む組成物を投与することで、全身性のクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンB重感染を中和する。もうひとつの態様では、トキシンAおよびトキシンBと特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片あるいは、これらの抗体たとえば、ヒト化形態を含む組成物を投与して、全身性のクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンB重感染を中和する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または組成物を、クロストリジウムディフィシルC.difficileを標的する別の治療剤と併用で投与する。もうひとつの実施形態として、クロストリジウムディフィシルC.difficileに感染した被検体で正常な胃腸管細菌叢を回復させることで、クロストリジウムディフィシルC.difficileおよび/またはそのトキシンによって引き起こされる効果的に治療する方法も、得られる。さらにもうひとつの実施形態として、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患に対する被検体の感受性を低減する方法も得られる。もうひとつの実施形態として、被検体においてクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を予防する方法も得られる。上述した方法では、被検体に、本明細書で提供される抗体または組成物たとえば、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンA用のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンB用のモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含む組成物を1つ以上投与する。この組成物については、同時にまたは異なる時点で被検体に投与することが可能である。組成物を、薬学的に許容されるキャリア、溶媒または賦形剤と、任意に、クロストリジウムディフィシルC.difficileおよび/またはそのエンテロトキシンに有効な別の抗生剤、非抗生剤、医薬品または治療剤とを含む組成物中の混合物として被検体に投与する。ヒト化抗トキシンAモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片および/またはヒト化抗トキシンBモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片あるいは、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片を含む薬学的に許容される組成物を、本発明による標記の方法のいずれにおいても別々にまたは一緒に使用することが可能である。本明細書で使用する場合、薬学的に許容されるキャリアまたは生理学的に許容可能なキャリアとしては、任意および全ての塩、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤などがあげられ、これらは、生理学的に適合性である。好ましくは、このキャリアは、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄または表皮の投与注射または輸液によるに適する。投与経路次第で、活性化合物すなわち抗体をコーティングして、化合物を不活性化しかねない酸や他の自然条件の作用から化合物を保護するようにしてもよい。投与すると、本発明の製剤は、薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成物において、薬学的に許容されるという言い回しは、活性成分の生物学的活性の効果に干渉しない、非毒性で生理学的に許容される物質を意味する。このような製剤は、常法では、塩、緩衝液、保存剤、適合性のキャリア、さらにはアジュバント、ケモカイン、サイトカインを含む補充免疫増強剤などの任意の他の治療剤を含むものであってもよい。医薬品で使用する場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩も、その薬学的に許容される塩の調製に適宜使用可能であり、本発明の範囲から除外されるものではない。塩は、親化合物の所望の生物学的活性を保ち、望ましくない毒物学的作用を生じないたとえば、Berge,S.M.,etal.1977J.Pharm.Sci.66:1~19を参照のこと。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩があげられる。酸付加塩としては、非毒性無機酸塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など由来の塩ならびに、非毒性有機酸脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸など由来の塩があげられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど由来の塩ならびに、非毒性有機アミンN,N’-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、酢酸エチレンジアミンEDTA対イオンナトリウムまたはカルシウムありまたはなし、プロカインなど由来の塩があげられる。本発明の組成物を、必要に応じて、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせてもよい。本明細書で使用する場合、薬学的に許容されるキャリアという用語は、ヒトに投与するのに適した、適合性の固体または液体のフィラー、希釈剤またはカプセル化物質を示す。キャリアという用語は、活性成分を組み合わせて投与を容易にする、天然のまたは合成の有機成分または無機成分を示す。製剤組成物の成分も、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用のないような形で、ここで提供する組成物の分子、あるいは互いに、混合できるものである。製剤組成物は、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、塩でのリン酸をはじめとする、好適な緩衝剤を含むものであってもよい。製剤組成物は、任意に、好適な保存剤塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンなども含むものであってもよい。製剤組成物は、単回剤形に都合よく存在し得るものであり、薬学分野で周知の任意の方法で調製できるものである。すべての方法が、1種類以上の付帯成分をなす活性剤を、キャリアと連係させるステップを含む。一般に、この組成物は、活性化合物を、液体キャリア、微細粉状態の固体キャリアまたはその両方と、均一かつ密に連係させ、必要な場合は生成物を成形することによって調製される。抗トキシンAおよび本発明の抗トキシンB抗体またはその一部を、個々の被検体で治療反応または予防反応などの最適な所望の反応を得られるように調節できる投与計画に沿って提供可能である。一例として、個々の治療状況での指示内容に応じて、単回ボーラス投与でもよいし、複数の分割用量を時間をかけて投与してもよく、用量を比例的に増減してもよい。非経口組成物は、投与しやすくして投与量を揃えるために、単位剤形で包装または調製されたものであってもよい。単位剤形とは、治療対象となる被検体に単位投与量として提供される物理的に離れた単位を示し、各単位が、必要な製剤キャリア、溶媒、賦形剤または希釈剤との関連で所望の治療効果が得られるように算出された予め定められた量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の具体的な内容については、a活性化合物の独特な特性と達成したい特定の治療効果、b個体の感受性に対する治療用の活性化合物などの配合分野での固有の制約に影響され、これに直接左右される。非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張の滅菌された水性または非水性の調製物を適宜含む。この調製物は、好適な分散剤や湿潤剤、懸濁剤を用いて周知の方法で配合できるものである。滅菌注射調製物も、1,3-ブタンジオール溶液など、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒solventの滅菌注射溶液または懸濁液であればよい。使用できる、許容範囲内の溶媒vehicleおよび溶媒solventとして、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液があげられる。また、滅菌の固定油が、従来から溶媒solventまたは懸濁媒質として用いられている。この目的で、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめとして、どのブランドの固定油を用いてもよい。また、注射剤の調製時にオレイン酸などの脂肪酸を使用してもよい。経口、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内などの投与に適したキャリア配合物を、Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,PAに見出すことができる。活性成分は、急速な放出から成分を保護するキャリアと一緒に調製可能なものであるインプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む徐放製剤など。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することも可能である。このような処方物を調製するための多くの方法が、特許化されているか、当業者に公知である。たとえば、SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978を参照のこと。治療剤としての本発明の抗体および組成物は、従来の任意の経路で投与可能であり、一例として、注射または時間をかける点滴があげられる。投与経路は、非限定的な例として、経口、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、腔内、後眼窩、経膣、直腸、吸入、吸引、経皮であってもよいし、坐薬または経皮吸収を利用したものであってもよい。本発明の抗体および組成物は、有効量または有効用量で投与される。有効量とは、本明細書で提供されるような抗体またはその抗原結合性断片または組成物が、単独または別の用量または他の治療剤との組み合わせで、被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症、下痢症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療し、緩和し、根絶させ、回復させ、あるいは予防するといった所望の反応を生じる量のことである。これは、長期間にわたって、たとえば、1週間を超えて、2週間、3週間、1か月、2か月、3か月あるいは3か月を超えて、感染、下痢症、または疾患の進行を遅くするだけのことを含み得る。しかしながら、このような有効量は、感染、下痢症または疾患を、永久的に、最適に治療またはその進行を止める。これは、常法で監視可能である。疾患または症状の治療に対する所望の反応も、感染または疾患の発症を遅らせたり、予防することすらあり得る。もちろん、有効量は、医療従事者の知識と経験の範囲内にある治療対象となる特定の感染または疾患、感染または疾患の重症度、個々の患者のパラメータ年齢、健康状態、体格、体重を含む、治療期間、併用療法用いる場合の性質、具体的な投与経路などの要因に左右される。これらの要因は当業者間で周知であり、常法の試験または実験だけで対処可能である。通常、合理的な医療判断に応じて、個々の成分またはその組み合わせを最大用量で用いる、すなわち、安全な最高用量で用いるのが好ましい。しかしながら、医療上の理由、心理的な理由または実質的に他のあらゆる理由で、患者がそれより少ない用量や許容可能な用量を求めることもあることは、当業者であれば理解できよう。上述の方法で用いられる製剤組成物は、好ましくは、滅菌状態で、患者に投与するのに適した重量または容量単位で、所望の反応を得るために本明細書で提供される1種類以上の抗体または抗原結合性断片を有効量で含む。この反応は、たとえば、疾患の症候の低減などの組成物の生理学的作用を判断することによって測定可能である。当業者には他のアッセイも知られており、反応のレベルを測定するのに利用可能である。被検体に投与される組成物の用量あるいは量は、特に使用する投与のモードと被検体の状態という、異なるパラメータに応じて選択可能である。他の要因として、所望の治療期間があげられる。被検体の反応が初回に適用した用量では不十分な場合、患者の耐容能が許すかぎりもっと高い用量を用いてもよいあるいは別の一層局所的な送達経路で効果的に高用量にする。通常、用量または量は、約1μg/kg~約100,000μg/kgの範囲であればよい。本発明の抗体、抗体部分または組成物の治療的または予防的に有効な量をなす用量範囲の非限定的な例として、0.1mg/kg~100mg/kg;0.1mg/kg~60mg/kg;0.5mg/kg~75mg/kg;0.5mg/kg~25mg/kg;0.75mg/kg~40mg/kg;1mg/kg~50mg/kg;または1mg/kg~5mg/kgがあげられる。特定の個体、患者または被検体では、具体的な用量および経時的な投与計画を、個体の需要と、抗体および/または組成物を投与するか投与を監督する熟練した医師の専門的な判断に応じて調節しなければならない旨は理解できよう。このような用量の範囲は例示にすぎず、本発明の範囲または実用を制限することを意図したものではない。組成物に応じて、一用量分を連続ポンプなどで連続的に送達してもよいし、一定間隔で送達する形でも構わない。当業者であれば、個々の組成物についての複数回投与量の場合の所望の間隔を、過度に実験をすることなく判断可能である。組成物を投与するための他のプロトコールが当業者間で周知であろうし、この用量の量、投与スケジュール、投与部位、投与モードなどは、上記とは異なるものとなる。ヒト以外の哺乳類への組成物の投与、たとえば、試験目的または獣医の治療目的なども、上述したものと実質的に同一の条件で実施される。また、本明細書で提供されるのは、本発明の抗体あるいは本発明の抗体を含む組成物と、取扱説明書とを含むキットである。このキットはさらに、追加の治療剤などの少なくとも1種類の別の試薬あるいは、本明細書で提供されるような1種類以上の別の抗体または抗原結合性断片を含み得るキットの第1の抗体またはその抗原結合性断片がトキシンBに対する抗体またはその抗原結合性断片の場合は、トキシンAに対する抗体またはその抗原結合性断片、あるいはその逆など。キットの構成要素を、水性媒質中または凍結形態で包装することが可能である。キットでコンジュゲートの形の抗体またはその抗原結合性断片を用いる場合二重特異性抗体コンジュゲートなど、このようなコンジュゲートの成分を完全にコンジュゲートされた形態、中間体の形態または利用者がコンジュゲーする別の部分として、あるいは添付の取扱説明書に従うキットで提供可能である。キットは、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジなどの1つ以上の容器手段または一連の容器手段を詰め込んで収容できるように、区画されたキャリアを含むものであってもよい。第1の容器手段または一連の容器手段は、1種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含むものであってもよい。第2の容器手段または一連の容器手段が、1種類以上の抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体またはその抗原結合性断片が、第1の容器手段とは異なるものであってもよく、他の追加の治療剤を含むものであってもよい。本明細書で提供されるキットはさらに、第1および第2の容器に収容された抗体または抗原結合性断片と結合させる分子を含む第3の容器を含む。ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片に関して本明細書で使用する場合、単離されたは、その本来の環境から引き離され、同定または使用に充分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドについて単離されたとは、たとえば、i発現クローニングにより選択的に産生された、またはiiクロマトグラフィまたは電気泳動により精製されたことを示す。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、純粋である必要はない。実質的に純粋という言い回しは、タンパク質またはポリペプチドが、自然界またはinvivo系で見い出され得る他の物質を、その意図した用途で実用的かつ適切な範囲で、基本的に含有しないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野において周知の技術で作製される。単離されたタンパク質は、製剤中で薬学的に許容されるキャリアと混合してもよいものであり、タンパク質は、調製物の重量に対してわずかな割合のこともある。それでもなお、タンパク質は、生きている系で本来であれば関連している物質すなわち他の天然に産するタンパク質から分離され、単離される。クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の治療における有効性の候補因子を評価するための方法も提供される。このような方法は、被検体においてクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のリスクを高める因子のある被検体を治療し、被検体にクロストリジウムディフィシルC.difficileを接種し、被検体を候補因子で治療し、候補因子での治療の有効性を評価するステップを含むものであってもよい。本明細書で使用する場合、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患のリスクを高める因子とは、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の発症または進行を促進すると思われる因子である。このような因子は、抗生剤または抗生物質によらない因子であっても構わない。たとえば、因子が、本明細書に記載の抗生剤であってもよい。実例として、このような抗生剤が、クリンダマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、リファキシミン、ラモプラニンまたはこれらの組み合わせであってもよい。これらの方法では、クロストリジウムディフィシルC.difficile接種の前または後に候補因子を被検体に投与することが可能である。候補因子は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を治療または予防する可能性があると思われる因子であり得る。抗生剤または非抗生剤であってもよい候補因子は、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに特異的に結合した抗体またはその抗原結合性断片を含む。これらの方法は、以下の実施例に記載のinvitroの方法およびinvivoの方法を含む。CDAD治療の究極的な目標は、抗生剤をやめて、正常な腸内細菌叢を回復させることである。本発明によれば、本明細書に記載の抗トキシンAおよびBmAbは、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンの病原作用をブロックし、抗生剤を中断できるようにして、結腸が治癒するおよび/または正常な腸内細菌叢が再建されるだけの時間を与えるように設計された抗生物質によらない療法を提供するものである。本発明のモノクローナル抗体は、CDADのストリンジェントなハムスターモデルで完全かつ永続的>37日間な保護が得られるものである。その例外的な特徴および特性に基づいて、本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAbは、疾患の最も重篤な症例に悩む個体など、既存の治療法があまりきかない患者に新たな治療の選択肢と医薬剤を提供するものである。本発明はさらに、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号PTA-9692、PA-39のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-50ATCC受託番号PTA-9694、PA-50のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-41ATCC受託番号PTA-9693、PA-41のヒト化形態、モノクローナル抗体PA-39トキシンAへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態の、モノクローナル抗体PA-50のトキシンAへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態、またはモノクローナル抗体PA-41のトキシンBへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態のうちの1つ以上に認識および/または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBの部分、断片またはペプチドを含むワクチンまたは免疫原を包含する。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原が、モノクローナル抗体PA-39ATCC受託番号PTA-9692、PA-39のヒト化形態、またはモノクローナル抗体PA-39のトキシンAおよびトキシンBへの結合と競合する抗体またはそのヒト化形態の1つ以上に認識および/または結合されるエピトープ領域を含有するクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの一部、断片またはペプチドを含む。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンAおよび/またはトキシンBのエピトープ含有部分、断片またはペプチドが、タンパク質分解性の切断によって、トキシンAまたはトキシンBのタンパク質から得られる。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンAの断片、一部またはペプチドが、エンテロキナーゼによるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のトキシンBの断片、一部またはペプチドが、カスパーゼカスパーゼ1によるタンパク質分解的な切断によって産生される。一実施形態では、ワクチンまたは免疫原のエピトープ含有部分または断片が、トキシンAまたはトキシンBのタンパク質の化学的または組換え的に合成されたペプチドである。一実施形態では、抗体によって認識および結合される、トキシンAおよび/またはトキシンBの1つ以上のエピトープ領域を含有するワクチンまたは免疫原の断片、一部またはペプチドが、トキシンAのアミノ末端;トキシンBのアミノ末端;トキシンAのカルボキシ末端;トキシンBのカルボキシ末端;トキシンAの受容体結合ドメイン;トキシンAの受容体結合ドメイン外の領域;トキシンBのN末端酵素領域;トキシンAのグルコシルトランスフェラーゼドメイン;トキシンBのグルコシルトランスフェラーゼドメイン;トキシンAのタンパク質分解ドメイン;トキシンBのタンパク質分解ドメイン;トキシンAの疎水性のポア形成ドメイン;またはトキシンBの疎水性のポア形成ドメインの1つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAのアミノ末端またはトキシンB由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAのカルボキシ末端またはトキシンB由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAのグルコシルトランスフェラーゼドメインまたはトキシンB由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAのタンパク質分解ドメインまたはトキシンB由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAの疎水性のポア形成ドメインまたはトキシンB由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAの受容体結合ドメイン由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンBの受容体結合ドメイン由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンAの受容体結合ドメイン外の領域由来である。いくつかの実施形態では、抗体に認識され、結合される1つ以上のエピトープ領域を含む断片が、トキシンBのN末端酵素領域由来である。一実施形態では、トキシンAのエピトープ含有断片または部分および/またはトキシンBの大きさが、<300kDaである。他の実施形態では、トキシンAのエピトープ含有断片または部分および/またはトキシンBの大きさが、約158~160kDa、約100~105kDa、たとえば、103kDa、約90~95kDa、たとえば、91kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、63kDaまたは68kDaである。他の実施形態では、トキシンAのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約158~160kDa;約90~95kDa、たとえば、91kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、68kDaである。他の実施形態では、トキシンBのエピトープ含有断片または部分の大きさが、約100~105kDa、たとえば、103kDaおよび/または約63~68kDa、たとえば、63kDaである。クロストリジウムディフィシルC.difficileに感染した被検体またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患に悩む被検体に対するワクチンまたは免疫原の形で投与すると、トキシンのこのような一部、断片またはペプチドは、被検体に液性反応を誘発すなわち、トキシンAおよび/またはトキシンBに特異性を有する抗体を誘発それによって被検体はトキシンに対する免疫反応を得るするとともに、被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患、感染またはCDADを中和、ブロック、低減、緩和、治療cureまたは治療treatさせる。したがって、もうひとつの実施形態は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症またはクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患の中和、ブロック、低減、緩和、治療cureまたは治療treatを必要とする被検体において、これをする方法であって、上述したワクチンまたは免疫原を有効量で被検体に投与することを含む。一実施形態では、被検体が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに対する液性反応を誘発し、被検体におけるクロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患、感染、またはCDADが中和、ブロック、低減、緩和、治療cureまたは治療treatされる。もうひとつの実施形態では、被検体が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに対する細胞免疫反応を誘発する。もうひとつの実施形態では、被検体が、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに対する液性反応と細胞免疫反応の両方を誘発する。もうひとつの実施形態では、本発明は、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に感受性である細胞で、あるいは細胞に対して、トキシンAおよび/またはトキシンBの活性を中和、阻害またはブロックする方法であって、細胞を、本発明による抗体またはその抗原結合性断片と接触させることを含み、抗体またはその抗原結合性断片が、競合的作用機序または混合競合的作用機序で細胞で、あるいは細胞に対して、トキシンAおよび/またはトキシンBの活性を中和、阻害またはブロックする方法を包含する。一実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体の1つ以上である。一実施形態では、細胞が被検体にあり、抗体またはその抗原結合性断片を被検体に有効量で投与する。一実施形態では、細胞が、被検体の消化管内にあり、たとえば、被検体の腸上皮細胞である。一実施形態では、トキシンがトキシンAである。一実施形態では、トキシンがトキシンBである。一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、抗体の作用機序が競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、抗体またはその抗原結合断片が、PA-50ATCC受託番号PTA-9694、そのヒト化形態であるか、PA-50のトキシンA活性の中和と競合する抗体またはその断片である。一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、抗体の作用機序が混合-競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンAであり、抗体またはその抗原結合断片が、PA-39ATCC受託番号PTA-9692、そのヒト化形態であるか、PA-39のトキシンA活性の中和と競合する抗体またはその断片である。一実施形態では、トキシンがトキシンBであり、抗体の作用機序が混合競合的阻害作用機序である。一実施形態では、トキシンがトキシンBであり、抗体またはその抗原結合断片が、PA-41ATCC受託番号PTA-9693、そのヒト化形態であるか、トキシンB活性の中和でとPA-41と競合する抗体またはその断片である。本明細書で使用する場合、トキシンの競合的阻害因子は、培養でトキシンの濃度が増しても最大中和率が変化することなく中和曲線でEC50が右側にシフトするトキシン中和阻害因子、たとえば、抗体、作用剤または小分子または化学的実体を示す。よって、競合的な阻害因子は一般に、さらに多くの阻害因子を加えることで、トキシンの細胞傷害作用に抗することができる。トキシンの非競合的阻害因子という用語は、培養でのトキシン濃度が増すと最大半量反応EC50が得られる、濃度が変化せずに最大中和率が減少するトキシン中和阻害因子を示す。よって、非競合的阻害因子は一般に、阻害因子をさらに加えてもトキシンの細胞傷害作用に対して完全には抗することができない。トキシンの混合-競合的阻害因子という用語は、培養でのトキシン濃度が増すと競合的阻害と非競合的阻害の両方が若干ずつ認められるトキシン中和阻害因子を示す。たとえば、トキシンの混合-競合的阻害因子は、トキシンに結合し、細胞に対するトキシンの結合をブロックならびにトキシンの他の細胞傷害作用をブロックすることで、その作用を発揮させ、混合-競合的作用機序を発揮する。実施例1クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンBに対する中和用モノクローナル抗体の作製A.免疫原の調製クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよび/またはトキシンB用の中和用モノクローナル抗体を、マウスをクロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAトキソイド不活性形態のトキシンおよび活性形態のトキシンAおよび/またはトキシンBで免疫して、作製した。また、動物をトキソイドAで免疫した後、活性形態のトキシンAおよび/またはトキシンBで免役して、マウスmAbPA-38:抗トキシンAmAb、ATCC番号PTA-9888;PA-39:抗トキシンAおよびBmAb、ATCC番号PTA-9692;PA-41:抗トキシンBmAbATCC番号PTA-9693;およびPA-50:抗トキシンAmAb、ATCC番号PTA-9694を作製した。トキシンAトキソイド、トキシンA、トキシンBListBiologicalLaboratoriesInc.,Campbell,CAおよびトキシンATechlabInc.,Blacksburg,VAを、使用するまで4°Cで保管した。トキシンおよびトキソイドには、一般に用いられているクロストリジウムディフィシルC.difficileの参考株である株VPI10463由来のものを用いた。必要な容量のトキソイドまたはトキシンにQuilAアジュバントAccurateChemical,Westbury,NYを加え、混合した。混合物を60分間の免疫で調製し、免疫の準備ができるまで氷上で保管した。融合前の最終ブーストのために、必要なトキシンをPBSで希釈し、免疫に使用するまで氷上で保管した。B.免疫および融合30匹のメスのBALB/cマウスCharlesRiverLabs,Wilmington,MAに、3週間間隔で活性トキシンAまたは活性トキシンBの用量を増してブースト免疫する前に、3週間間隔で、2免疫用量PA-50の場合または3免疫用量PA-38、PA-39、PA-41の場合のトキシンAトキソイド10μgを皮下注射した。PA-38では、1匹のマウスを3週間ごとにブースト免疫し、トキシンAListBiologicalLaboratoriesInc.を合計で3回ブーストした。このとき、ブーストするたびに用量を500ngから2μgに増し、トキシンA8μgの最終ブーストは脾摘出の3日前とした。PA-39およびPA-41では、2匹のマウスをトキシンBで3週間ごとに3回または5回ブースト免疫し、ブーストするたびに用量を2μgから12.5μgに増し、トキシンB20μgの最終ブーストは脾摘出の3日前とした。PA-50では、1匹のマウスをトキシンATechlabInc.で3週間ごとにブースト免疫し、合計で4回ブーストした。このとき、ブーストするたびに用量を20ngから2.5μgに増し、トキシンA10μgの最終ブーストは脾摘出の3日前とした。免疫およびブースト用量のトキソイドおよびトキシンを、QuilA10μgなどのアジュバントと一緒に投与した。活性形態のトキシンAまたはトキシンBでのブーストによって、保護抗体ができたであろう動物を同定した。免疫した動物からの血清を段階希釈し、後述するようにしてCHO-K1細胞に対するトキシンA細胞傷害作用の中和を試験した。中和抗体の力価が最も高かった動物を融合用に選択し、アジュバントなしでトキシンでブーストした。ブースト後、動物を屠殺し、単離した脾細胞を、標準的な方法でSp2/0細胞株と融合した。ハイブリドーマを、選択培地RPMI-1640、10FBS、10BMCondimed-H1RocheAppliedScience,Indianapolis,INおよびβメルカプトエタノールPA-38およびPA-39の場合またはハイブリドーマ-SFMおよび10FBSPA-41およびPA-50の場合100μMのヒポキサンチン、1μg/mlのアザセリンおよび16μMのチミジンを含むに選択目的で懸濁させた。ハイブリドーマを96ウェルの平底組織培養プレートBDBiosciences,SanJose,CAに播種した。プレートを37°Cで3日間インキュベートした後、HT成長培地アザセリンなしの選択培地を加えた。インキュベーションをさらに4~7日間継続した後、ハイブリドーマ上清を中和活性についてスクリーニングした。PA-38の一次スクリーニングで、608のハイブリドーマ上清を、CHO-K1細胞ATCC番号CCL-61、Manassas,VAに対するトキシンAListLaboratoriesの細胞傷害作用の中和能について試験した。PA-39およびPA-41の一次スクリーニングでは、2416のハイブリドーマ上清を、CHO-K1細胞に対するトキシンBListLaboratoriesの細胞傷害作用の中和能について試験した。PA-50の一次スクリーニングでは、1440のハイブリドーマ上清を、T-84細胞に対するトキシンATechlabInc.の細胞傷害作用の中和能について試験した。2回目のアッセイで、ウサギ赤血球のトキシンによる凝集の阻害について検討した。スクリーニング手順から、PA-38抗トキシンA、PA-39抗トキシンA/B、PA-50抗トキシンA、PA-41抗トキシンBで示し、スクリーニングアッセイでクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンを効果的に阻害または中和する4種類のmAbを、単離した。これらのmAbを産生したハイブリドーマ細胞株を限界希釈によって2回クローニングし、クローン細胞株を作製した。IsoStripMouseMonoclonalAntibodyIsotypingKitRocheAppliedScience,Indianapolis,INを用いて、PA-38、PA-39、PA-41、PA-50mAbを、それぞれアイソタイプIgG2a,κ、IgG1,κ、IgG1,κ、IgGI,κと判断した。mAb産生ハイブリドーマ細胞株を、それが産生するmAbと同じ名称で示す。C.スクリーニング:細胞に対するトキシンAまたはB細胞傷害作用の中和ハイブリドーマ上清を、細胞に対するトキシンAまたはトキシンBの細胞傷害作用の中和能についてスクリーニングした。高スループットの方法を開発し、数千のハイブリドーマ上清を同時に処理した。細胞毒性cytoxicityアッセイでは、CHO-K1細胞PA-38、PA-39、PA-41の場合またはT-84細胞PA-50の場合のいずれかを使用した。BiomekFXロボットシステムBeckmanCoulter,Brea,CAを用いて、細胞をアッセイプレート96ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレート;PerkinElmer,Waltham,MAに加えた。アッセイプレートを37°Cで4時間インキュベートし、細胞をウェルに付着させた。T-84のアッセイでは、トキシンAを240ng/mlまで希釈した。CHO-K1アッセイでは、トキシンAを2μg/mlまで希釈するか、トキシンBを6ng/mlまで希釈した。希釈後のトキシンを、BiosafetyCabinetBSCで試薬希釈プレート96ウェルの丸底プレート;BD,FranklinLakes,NJに手作業で加えた。ハイブリドーマ上清を手作業で回収し、BiomekFXシステムを用いて試薬希釈プレートのウェルに加えた。上清とトキシンの混合物を37°Cで1時間インキュベートし、BiomekFXシステムを用いて細胞の入ったアッセイプレートに加えた。37°Cで72時間インキュベートした後、20μL/ウェルのCellTiter-BluePromega,Madison,WIを各ウェルに加えた。プレートをさらに4時間インキュベートした後、励起波長560nm、発光波長590nmでSpectraMaxM5PlateReaderMolecularDevices,Sunnyvale,CAを用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。細胞生存率を濃度に対してプロットした。D.本発明によるマウスmAbの作製Invivoおよびinvitroでの作製方法を利用して、単離および/または精製された本発明のmAbを得た。マウスmAbのinvivoでの産生には、適切なハイブリドーマ細胞株をプリスタンで予備刺激したBALB/cマウスの腹膜腔に注射して、腹水液を調製した。硫酸アンモニウムでの沈殿後、プロテインAクロマトグラフィによってmAbを均一性>95まで精製した。精製抗体をリン酸緩衝生理食塩水PBSに懸濁させた。小規模の<100mginvitroでの作製では、培養で増殖させたハイブリドーマ上清からマウスmAbを精製した。ハイブリドーマをハイブリドーマ-SFMInvitrogenおよび10FBSで培養した。週に3回T-150フラスコに細胞株を通し、細胞濃度が2×106個/mlを超えないように増やした。PA-39IgG1,κ、PA-41IgG1,κ、PA-50IgG1,κを含む上清を、2000rpmで10分間の遠心によって清澄化し、濾過した。清澄化材料をランニング緩衝液で最終濃度60mMグリシン/3MのNaCl、pH8.5に希釈し、ランニング緩衝液で平衡化しておいたプロテインAカラムにロードした。カラムを洗浄後、PA-39またはPA-41mAbを0.1酢酸ナトリウムpH5.5で溶出し、pH7.0に中和した。PA-38IgG2a,κを含む上清を2000rpmで10分間遠心して清澄化し、濾過した。清澄化材料を25mMのリン酸ナトリウム緩衝液/100mMのNaClpH7.0の最終濃度まで調節し、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液/0.5MのNaClで平衡化しておいたプロテインAカラムにロードした。カラムを洗浄し、0.1Mの酢酸ナトリウムpH3.0でPA-38mAbを溶出し、溶出抗体をpH7.0に中和した。大量>100mgのmAbをinvitroで作製するには、5UltraLowIgGFBSを用いて、WAVEBioreactorGEHealthcare,Piscataway,NJに、ハイブリドーマ-SFMの初期密度2×105個/mlでハイブリドーマを接種した。細胞数と生存度を毎日監視した。抗体の産生が変化のない状態に達するほぼ6日目または7日目までに、培養を終了した。培養を清澄化した後、接線流濾過で10~20分の1に濃縮した。60mMのグリシン、3MのNaClpH8.5で平衡化しておいたプロテインAカラムに抗体をロードした。カラムを同一の緩衝液で洗浄し、抗体を50mMの酢酸pH3.5で溶出した。プールされた抗体を、1MのTrisでpH7.4まで中和し、10mg/mLに濃縮し、PBSに透析濾過した。精製mAbを滅菌濾過し、-80°Cで保管した。実施例2本発明の抗CdifficileトキシンAおよび/またはトキシンBmAbの特異性およびトキシンAおよび/またはトキシンBに対する親和性A.トキシンAおよび/またはトキシンBのmAbの特異性を判断するためのELISAELISAプレートBDBiosciencesに50ng/ウェルのトキシンAListLaboratoriesまたは25ng/ウェルのトキシンBListLaboratoriesを4°Cで一晩コートした。プレートをPBS-カルシウムまたはマグネシウムなしのPBS、0.05Tween20で洗浄した後、ウェルを200μlのブロッキング緩衝液カルシウムまたはマグネシウムなしのPBS、0.1Tween20、2.5無脂肪乳で37°Cにて1時間ブロックした。洗浄ステップを繰り返し、ハイブリドーマ上清または精製mAbを37°Cで1時間加えた。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼHRP結合ヤギ抗マウスIgG-FcJacksonImmunoresearch,WestGrove,PAを用いて37°Cで1時間インキュベートした。ABTSペルオキシダーゼストップ溶液KPLを用いて、プレートをABTSペルオキシダーゼ基質システムKPL,Gaithersburg,MDでデベロップし、SpectraMaxプレートリーダーMolecularDevicesで405nmで読み取った。滴定データを図1Aから図1Cに示す。図1Aは、PA-38がトキシンAに結合し、トキシンBに結合しないことを示す。図1Bは、PA-39がトキシンAとトキシンBの両方に結合可能であることを示す。図1Cは、PA-41がトキシンBに結合し、トキシンAに結合しないことを示す。B.BiacoreにおけるトキシンAおよびBのmAbの反応性Biacore3000装置GEHealthcareを用いて、トキシンAおよび/またはトキシンBに対する本発明のmAbの結合特異性を判断した。MAbを、アミンカップリングの製造業者の指示に従って、約10,000レゾナンスユニットRUでCM5センサーチップGEHealthcareに固定化した。特異性が無関係のSouthernBiotechのアイソタイプマッチ抗体の参考表面を対照として用いた。HEPESベースのHPS-EP緩衝液GEHealthcareで25°Cで結合実験を実施した。精製トキシンAまたはトキシンB30nM;ListBiologicalLaboratoriesを対照フローセルと試験用フローセルに5μL/分の速度で通した。必要に応じて、追加のmAb100nMを5μL/分でフローセルに通し、多価または競合的結合について検討した。図2Aから図2Dに示すように、mAbPA-38図2AおよびmAbPA-50図2Cは、トキシンAに特異的に結合した。mAbPA-41図2Dは、トキシンBに特異的に結合した。mAbPA-39図2Bは、トキシンAに優先的に結合したが、トキシンBに対する結合も示した。これらのデータからの結果は、ELISAのデータ図1A~図1Cと一致し、トキシンAおよび/またはトキシンBに対する本発明のmAbの結合特異性を示している。C.結合親和性Biacore分析も利用して、それぞれのトキシンに対する本発明のmAbの結合活性を判断した。Biacoreのマウス抗体キャプチャーキットで準備したCM5センサーチップを用いて、mAbをキャプチャーした。次に、トキシンをさまざまな濃度0.4~100nM、2倍増大でフローセルに通した。すべてのトキシン濃度を二重に試験し、測定実施後に毎回、キットに指定された条件でチップ表面を再生した。トキシンに対するmAbのKDを算出するBiaEvaluationSoftware1:1Langmuir結合モデルを用いて、RUの変化を記録し、分析した。結合と解離データ、フィッティングを図3Aから図3Eに示す。トキシンAに対するmAbのKDをBiacore分析で判断したところ、PA-38で1.0nM、PA-39で0.16nM、PA-50で0.16nMであった。トキシンBに対するmAbのKDを判断したところ、PA-39で2.4nM、PA-41で0.59nMであった。これらの結果から、本発明のmAbが、ナノモルの親和性およびナノモル以下の親和性でトキシンAおよび/またはトキシンBに結合することが明らかになった。実施例3Invitro細胞ベースの中和アッセイCHO-K1細胞またはT-84細胞のいずれかを用いる細胞ベースの細胞毒性アッセイを用いて、標記の抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbの中和活性を評価した。A.CHO-K1細胞に対するトキシンA細胞傷害作用の中和アッセイプレート96ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレートPerkinElmerにCHO-K1細胞を播種した50μL/ウェルに細胞2,000個。処理の前に4時間、細胞を付着させた。等容量35μLの2μg/mLのトキシンAListBiologicalLaboratoriesと段階希釈mAbとを試薬希釈プレート96ウェルの丸底プレートFalconで37°Cにて1時間混合した後、混合物50μlをプレートの各ウェルに加えた。72時間のインキュベーション後、20μL/ウェルのCellTiter-BluePromegaを各ウェルに加えた。プレートをさらに4時間インキュベートした後、励起波長560nm、発光波長590nmで、SpectraMaxM5PlateReaderMolecularDevicesを用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。細胞生存率をmAbの濃度に対してプロットした。GraphPadPrismソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性cytoxicityを50中和するのに必要なmAbの濃度EC50を算出した。図4に示すように、mAbPA-39は、CHO-K1細胞でのトキシンAの活性をEC50が93pMで完全に中和した。B.CHO-K1細胞に対するトキシンBの細胞傷害作用の中和CHO-K1細胞毒性アッセイを用いて、抗トキシンB特異的mAbの中和活性を評価した。抗トキシンAmAbの評価と同様に、96ウェルのプレートでCHO-K12,000個/ウェルに加える前に、段階希釈mAbと一緒にトキシンB8pg/mL、TechLabを37°Cで1時間インキュベートした。72時間後、20μL/ウェルのCellTiter-BluePromegaを各ウェルに加えた。プレートをさらに4時間インキュベートした後、励起波長560nm、発光波長590nmで、SpectraMaxM5PlateReaderMolecularDevicesを用いて読み取った。CellTiter-Blueを用いて細胞生存度を判断し、処理培養と未処理培養とで細胞生存率を比較した。GraphPadPrismソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性cytoxicityを50中和するのに必要なmAbの濃度EC50を算出した。図5に示すように、PA-41は、CHO-K1細胞でトキシンBの細胞毒性を中和する際に高い度合いの活性を示したEC50が9.2pM。ELISAおよびBiacore分析では、mAbPA-39はトキシンBに対する結合を示したが、このmAbはCHO-K1および他の細胞ベースのアッセイではトキシンBに対してinvitro活性を持たなかった。トキシンAおよびトキシンBの両方に結合するが、invitroの細胞ベースのアッセイでのトキシンAまたはトキシンBの中和では機能的活性を持たない抗体が報告されている46、92、93。本発明は、トキシンAおよびトキシンBの両方に結合し、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン、すなわちトキシンAの細胞毒性を中和する二重の機能を有する新規なmAbを包含する。C.T-84細胞に対するトキシンAの細胞傷害作用の中和T-84細胞毒性アッセイを用いて、標記の抗トキシンAmAbの中和活性を評価した。アッセイプレート96ウェル、乳白色の壁、透明な平底のプレートPerkinElmerにT-84細胞を播種した50μL/ウェルに細胞15,000個。処理の前に4時間、細胞を付着させた。等容量35μLの240ng/mLのトキシンATechlabと段階希釈mAbとを試薬希釈プレート96ウェルの丸底プレートFalconで37°Cにて1時間混合した後、混合物50μlをアッセイプレートの各ウェルに加えた。72時間のインキュベーション後、20μL/ウェルのCellTiter-BluePromegaを各ウェルに加えた。プレートをさらに4時間インキュベートした後、励起波長560nm、発光波長590nmで、SpectraMaxM5PlateReaderMolecularDevicesを用いて読み取った。未処理培養とトキシン処理培養で細胞生存率を比較した。GraphPadPrismソフトウェアを用いて、阻害データを非線形回帰のシグモイド用量反応曲線にフィッティングし、細胞毒性cytoxicityを50中和するのに必要なmAbの濃度EC50を算出した。図6に示すように、mAbPA-38およびPA-50は、T-84細胞でトキシンAの活性を完全に中和し、EC50はそれぞれ175pMおよび146pMであった。T-84細胞アッセイで、mAbPA-39はトキシンAに対して最小活性を示し、PA-41は活性ではなかった。D.ウサギ赤血球RBCの血球凝集本発明のmAbが、細胞受容体に対するトキシンAの結合をブロックする機能を、血球凝集アッセイで評価した。このアッセイでは、等容量30μL/ウェルのトキシンA8μg/mL;TechLabと段階希釈したmAbとを試薬希釈プレート96ウェルの丸底プレートFalconで4°Cにて1時間混合した。ウサギ赤血球RBCColoradoSerumCo.,Denver,COをPBSで3回洗浄し、PBSに懸濁させた。1RBC懸濁液60μLを、トキシンA-mAb混合物の入った96ウェルのプレートのウェルに加え、プレートを4°Cで4時間インキュベートした。遊離トキシンAがRBCの血球凝集を引き起こす。したがって、トキシンAに結合する抗トキシンAmAbを加えると、血球凝集が防止されると思われる。ImageQuant400機器を用いて、血球凝集の度合いを判断した。完全血球凝集が起これば、懸濁液中のRBCよりもシグナルが強くなった。GraphPadPrism非線形回帰シグモイド用量反応曲線フィッティングを用いて、阻害データからEC50値を算出した。図7に示すように、mAbPA-38黒い正方形およびmAbPA-50黒い三角形がRBCでトキシンA活性を完全に中和し、EC50はそれぞれ30nMおよび1.8nMであった。PA-38およびPA-50は、受容体に対するトキシンAの結合をブロックすることで、トキシンAを中和するように見える。アッセイで、mAbPA-39およびPA-41は、不活性であることがわかった。E.Caco-2単層アッセイ96ウェルのMultiscreenCaco-2プレートMilliporeBillerica,MAの上部チャンバーでCaco-2細胞を播種し75μL/ウェルに25,000個、250μLの培地を下部チャンバ-に加えた。3~4日ごとに培地を定期的に交換しながら、細胞を10日間成長させた。10~14日間のインキュベーション後、上皮細胞抵抗測定器モデル:EVOMX、WorldPrecisionInstruments,Sarasota,FLを用いて経上皮電気抵抗TEERを測定して隙間なく形成された単層の形成を確認した。単層の完全性を確立して判断した後、等容量60μlのトキシンA50ng/mlおよび段階希釈したmAbを37°Cで1時間混合した後、アッセイプレートの上部チャンバーに加えた。プレートを18~24時間インキュベートした後、抵抗測定器を用いてTEER値を測定した。未治療のウェルとトキシン処理したウェルで単層の完全性を比較した。図8に示すように、GraphPadPrismソフトウェアを用いて阻害データを非線形回帰シグモイド用量反応曲線にフィッティングし、50中和EC50に必要なmAbの濃度を求めた。mAbPA-38およびPA-50は、トキシンAによるCaco-2単層の破壊を中和し、EC50がそれぞれ485pMおよび196pMであった。このアッセイで、他のmAbは不活性であることがわかった。理論に拘泥されるものではないが、細胞ベースのinvitroでの結果から、PA-38およびPA-50が、1つのクラスの抗トキシンAmAbを表し、PA-39が別のクラスの抗トキシンAmAbを表すように見えることがわかる。mAbPA-38およびPA-50は、受容体結合に重要なトキシンAのエピトープに結合するように見える。mAbPA-39は、invitroにてトキシンAの細胞傷害作用を一層直接的にブロックする形でトキシンに結合するように見える。実施例4マウスにおける本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAbのinvivoでの有効性の評価invivoでのマウスモデルを使用して、本明細書に記載のmAbが、動物で循環するクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンを中和する機能を測定した。単独または組み合わせで投与したmAbPA-38、PA-39、PA-41またはPA-50のinvivoでの中和活性を、被検動物での組み合わせでの全身クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBTechlabの作用について試験した。実験には、雌のSwissWebster4~6匹/群週齢:研究開始時に約6~8週;CharlesRiverLaboratoriesを使用した。設備でマウスを最低4日間順化し、使用する前に動物の健康をチェックした。IACUCが承認したプロトコールで動物実験を実施した。マウスで初期実験を実施して、トキシンAおよびトキシンBの毒性を判断した。動物に0、20、100、500、2500ngのトキシン/匹を腹腔内腹腔内投与し、以後の抗体中和実験で用いる、動物にとって致死的な用量を選択した。PBSを注射した対照マウスは未感染であった。中和実験には100ng用量のトキシンATechLabを選択した。この用量が、100のマウスが注射後24時間以内に致死的になる最低用量レベルであったためである。同様に、中和実験には100ng用量のトキシンBTechLabを選択した。この用量が、100のマウスが注射後24時間以内に致死的になる最低用量レベルであったためである。抗トキシンmAbの中和活性を評価するために、0日目に各mAbを異なる用量レベルでマウス1群あたり5匹に単回注射して腹腔内投与した後、1日目に100ng/200μlのトキシンAまたはトキシンBを腹腔内投与した。3日間は動物を毎日観察し、その後はトキシン投与後21日目まで毎週観察した。動物の生存が、研究の一次エンドポイントであった。中和実験では、すべての用量の抗体を、カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSPBS-、Invitrogen,Carlsbad,CAで配合した。0日目にmAbPA-38、PA-39、PA-41またはPA-50を異なる用量レベルでマウスに単回注射して腹腔内200μl/用量/動物投与した後、1日目にトキシンを注射抗体注射部位とは異なる腹腔内の部位。最初の3~4日間は動物の健康状態を毎日監視した後、トキシン投与後最大21日目まで1週間に2回監視した。動物のケージ側の観察猫背の姿勢、毛皮の艶がない、活発でないなどを、生存状態と一緒に記録した。異なる用量レベルのPA-38動物1匹あたり0.2μg~250μg、PA-50動物1匹あたり0.2μg~100μgとw、評価した。このモデルでは、PA-38およびPA-50が、100ng用量のトキシンAを中和し、図9Aおよび図9Bに示すように、動物1匹あたり2μgという低い用量レベルのmAbで100生存させられるすることが明らかになった。対照的に、本明細書ではCDA-1対照のmAbと呼ぶ対照のヒト抗トキシンAモノクローナル抗体国際公開第2006/121422号パンフレットおよび米国特許出願公開第2005/0287150号明細書は、動物1匹あたり5μgで、本発明のmAbのように動物をトキシン関連死から保護しなかった図9C。0.5μg~250μgというPA-41の用量を、評価し、動物1匹あたり5μgの単一用量のmAbで、図10に示すように、動物1匹あたり100ng用量のトキシンB毒性を完全に中和することが明らかになった。MAbPA-39動物1匹あたり100μgは、トキシンAまたはBのどちらでもマウスのトキシン関連死を遅延させることが観察されなかった。トキシンAPA-38、PA-50またはトキシンBPA-41に対する個々の抗体の中和活性がinvivoにて明らかになった後、同一のinvivoマウスモデルで、トキシンの合計での致死用量トキシンAを100ng、トキシンBを100ngに対する各mAbの用量レベル5μgおよび50μgでmAbPA-38PA-41の組み合わせを試験するための実験を実施した。また、個々のモノクローナル抗体を対照として含めた。図11に示すように、各mAb単独すべての動物がトキシン投与24時間以内に死亡したの場合の活性と比較して、PA-38およびPA-41mAbの組み合わせで、50μg/匹5匹のうち4匹が生存および5μg/匹5匹のうち1匹が生存の両方でトキシンの組み合わせから保護された。実施例5GoldenSyrianハムスターにおけるクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADモデルにおける本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAbの評価ハムスターでのCDADモデルが、ヒトにおけるCDAD疾患のカギになる態様を再現する。抗生剤での治療時、正常な結腸細菌叢が根絶し、ハムスターがクロストリジウムディフィシルC.difficileの感染に対して易感受性となった。感染によって、重症の下痢症、偽膜性大腸炎および死に至る。ハムスターのCDADモデルを利用して、生きたクロストリジウムディフィシルC.difficile細菌からの攻撃に関連した動物の疾患および死を防ぐ本発明のmAbの考えられる有効性を評価した。これらの実験を、IACUCが承認したプロトコールで実施した。A.薬物動態分析生きたクロストリジウムディフィシルC.difficile微生物に感染したハムスターを用いてハムスターのモデルで有効性の研究を実施する前に、正常な未感染のハムスターで薬物動態研究を実施した。GoldenSyrianハムスターHarlanに0.2mg/匹または1mg/匹の精製mAbPA-38またはmAbPA-41を腹腔内注射した。0.125日目、0.25日目、1日目、2日目、4日目、7日目、10日目、14日目、21日間目に、後眼窩または心臓の穿刺全血採血技術で、血液試料を回収した。血液試料を8000rpmで10分間遠心処理して、血清を得た。ELISAで血清中のmAb濃度を判断した。96ウェルのELISAプレートBDBiosciencesに、トキシンATechlabまたはトキシンBTechlabを250ng/ウェルで4°Cにて一晩コートした。プレートをPBS/0.05Tween-20登録商標PBS-Tで3回洗浄し、200μlのブロッキング緩衝液カルシウムまたはマグネシウムありのPBS、0.1Tween20登録商標、2.5無脂肪乳で室温にて1時間ブロックした。抗体参照標準精製mAbPA-38またはmAbPA-41を、1のプールした無感作ハムスター血清で希釈し、0.3~1000ng/mlの範囲の標準曲線を生成した。希釈した被験試料および標準を室温にて1時間、インキュベートした。プレートを洗浄し上記同様、HRP結合ヤギ抗マウスIgG、Fcγ特異的抗体JacksonImmunoresearchを用いて室温にて1時間インキュベートした。ABTSペルオキシダーゼ基質系KPLでプレートをデベロップし、ABTSペルオキシダーゼストップ溶液KPLで止めて、SpectraMaxプレートリーダーMolecularDevicesで405nmで読み取った。標準曲線を使用して、異なる時点での各ハムスターのmAb濃度を算出した。約10の試料で抗体力価が認められなかったが、これはおそらく注射ミスまたは吸収が起こらなかったことによるものと思われた。これらの試料はPKパラメータの計算には含めなかった。WinNonLin、バージョン4.0PharsightCorp.,MountainView,CAを用いてノンコンパートメントの薬物動態分析を実施した。データを表1および図12Aおよび図12Bに示す。図示のとおり、Cmaxおよび曲線下の面積AUCが用量依存性であった。各抗体の終末半減期が6日間を超えたが、これによって後述する有効性の研究のあいだ、抗体が確実に保持された。B.GoldenSyrianハムスターのクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADモデルにおける、組み合わせでの本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAbの評価有効性実験を実施して、本発明のマウスの抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbが、ハムスターのクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症のinvivoモデルで感染動物の生存性に影響する能力を評価した。雄のGoldenSyrianハムスター約90gCrl:LVGSYRCharlesRiverLaboratories,Inc.,Kingston,NYを、単回皮下用量のクリンダマイシンSigma,St.Louis、5mg/mLのPBS溶液として配合50mg/kgで前処理し、正常な結腸細菌叢を破壊した。翌日、関連の試験群のハムスターに経口用量0.5mLを1×107CFUのクロストリジウムディフィシルC.difficileATCC43596株懸濁液を与えた。株43596は、過去にハムスターモデルで抗体の中和に用いられていた。動物の体重を毎週計測し、健康状態と生存については毎日監視した。被検抗体は、本発明のマウスmAbの組み合わせ、すなわち、mAbPA-38およびPA-41の組み合わせまたはmAbPA-39およびPA-41の組み合わせからなるものであった。ヤギ抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBポリクローナル抗体Techlabを、陽性対照として含めた。mAbおよび対照試薬を表2に示したようにして投与した。群1のハムスターには研究の間、何の処理もしなかった。群2~7のハムスターは、単回皮下用量のリン酸クリンダマイシン50mg/kg-1日目で前処理した。群5~7のハムスターには、クリンダマイシン処理直後に表2に示すようなポリクローナルヤギ抗体群5またはmAbの組み合わせ群6および7を腹腔内投与した。24時間後、群3~7の各ハムスターに、クロストリジウムディフィシルC.difficileATCC43596106~107CFU/mL適切な懸濁液0.5mLを経口胃管栄養で与えた0日目。1日目の抗体での初期処理後、1日目、3日目、5日目に、これらの群での以後の3回の治療剤を1日おきに、1日あたり1回投与した。群4の動物に、1~5日目に1日2回、約6時間あけてバンコマイシン20mg/kgBIDを経口胃管栄養で投与した。バンコマイシン群4の動物の投与は、動物にクロストリジウムディフィシルC.difficileを接種した約20~24時間後に開始した。mAb処理群と対照群での生存結果を図13に示す。全群でのハムスターでの死亡率の概要を表3にあげておく。処理せずにクロストリジウムディフィシルCdifficileに感染したすべてのハムスター感染対照、群3は、研究の2日目または3日目に死亡したことがわかった。バンコマイシン処理群群4では、8匹のハムスターのうち7匹が15日目から19日目の間に死亡したことが明らかになった。このモデルで一般に観察されるように、ほとんど88のバンコマイシン処理ハムスターで、療法の中断後2週間以内にクロストリジウムディフィシルC.difficile感染が再発し、死亡した。対照的に、mAbPA-39PA-41群7の組み合わせで処理したすべてのハムスターならびに、mAbPA-38PA-41群6の組み合わせで処理した8匹のハムスターのうち7匹が、研究終了時まで生存した感染後37日目。また、研究終了時、ヤギポリクローナル抗体で処理した群のすべての動物群5が生きていた。生存したハムスターはいずれも、死後剖検時にGI管が正常であった図15A、図15Cおよび図15D参照。これらの結果から、最初と以後の疾患の再発時の両方で、mAbPA-39とPA-41の組み合わせならびに、mAbPA-38とPA-41の組み合わせが、ハムスターを重症の疾患から効果的かつ永続的に保護したことがわかる。mAb治療で利益が得られる期間37日間は、ハムスターモデルでクリンダマイシンでの治療後にクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症が確立されるウィンドウ2週間を有意に超えた。ポリクローナル処理群とmAb処理群、対照群での動物の体重を、図14に示す。未感染の対照群群1のハムスターは、研究の過程で13~29gから堅調に重量が増えた。感染対照動物はいずれも最初の接種後体重測定前に死亡した。バンコマイシン、ヤギポリクローナル抗体、PA-38PA-41mAbの組み合わせ、PA-39PA-41mAbの組み合わせで処理した動物の平均体重は、感染後の最初の週に有意に低下した。その後、mAb処理群ならびにポリクローナル抗体処理群での平均体重が、堅調に増えて、研究の終わりまでには未感染の対照と同様になったことから、毒性のイベントがないことがわかった。このハムスターでの研究全体として、本発明のmAbの組み合わせが、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の関連およびストリンジェントなハムスターモデルでハムスターを死亡率から効果的かつ永続的に保護したことが明らかになった。これらの所見は、未感染の動物と比較して、mAb処理動物で正常な腸細菌叢の自然な発達と再増殖が可能になる長期間にわたって、mAbの組み合わせが動物をクロストリジウムディフィシルC.difficile疾患から保護した機序を裏付けるものである図15A~図15D。このように、本発明のmAbを用いると、感染動物に対して治療的な保護が得られ、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患がなくなって、胃腸管の健康と生存が回復された。C.GoldenSyrianハムスターでのクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADモデルにおける本発明の個々の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよび/またはトキシンBmAbの評価ハムスターでの別の研究を実施し、組み合わせで投与したmAbの場合と比較して、感染動物に投与した本発明の個々のマウスmAbの有効性を評価した。この研究での処理群を表4に示す。この研究では、群1~7のハムスターに単回皮下用量のリン酸クリンダマイシンを50mg/kg1日目で与えて前処理した。群3~7の動物には、クリンダマイシン処理直後にmAbを腹腔内投与した。24時間後、前述のセクションBで説明したように、群1~7の各ハムスターにクロストリジウムディフィシルC.difficileの懸濁液0.5mLを経口胃管栄養で与えた0日目。1日目、3日目、5日目に、被検mAb治療剤を、群3~7の動物に単回用量で投与した。1~5日目に1日2回群2バンコマイシンを経口胃管栄養で投与した。ハムスターの生存度を1日2回監視した。1週間に1回、体重を記録した。死亡が確認された動物または研究時に安楽死させた動物については、剖検を実施した。研究終了時接種後40日目、残っていたすべてのハムスターについて最終剖検を実施した。mAb処理動物群および対照動物群での生存を図16Aに示し、すべての群のハムスターの死亡日を表5にまとめておく。感染対照群群1では、7匹のハムスターすべてが2日目に死亡したことが明らかになった。これらのハムスターはいずれも、死後の検査でGI管に炎症が生じていた。バンコマイシン処理群群2では、7匹のハムスターがすべて研究の12日目から19日目の間に死亡した。これらの死亡のタイミングは、このモデルのバンコマイシン処理で前に観察されたタイミングと同様であった。死後の検査で、すべてのハムスターに、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症を示すGI管の炎症があることが明らかになった。PA-39PA-41mAbの組み合わせ処理群3は、この研究では感染したハムスターを保護する上で極めて効果的であった。群3の7匹のうち6匹のハムスターが研究の終わりまで生存した。1匹のハムスターが、研究12日目に死亡したことが明らかになった。死後の検査で、このハムスターには、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に典型的なGI管の炎症があることがわかった。単一抗体での処理群4~7のうち、mAbPA-39単独群6で、処理動物でいくらか保護活性が示された。この群のハムスターは、2日目から12日目までに死亡したことがわかった。個々のmAbすなわちPA-41群4、PA-38群5、PA-50群7で処理した群では、ハムスターは2日目と3日目の間に死亡したことがわかった。最終剖検で、これらの群のすべてのハムスターにGI管の炎症が認められたが、これはクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症を示すものである。対照的に、生存したすべての処理ハムスターは正常なGI管であった。この研究の結果から、PA-39PA-41のmAbの組み合わせで処理すると、処理中断後1か月を超える期間にわたって、疾患の発症からハムスターを保護できることを示している。これは、PA-39PA-41の組み合わせで処理した8匹のハムスターのうち8匹がクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症から生存した実施例5Bの上述した研究で得られるものと同じである。この研究では、単一のmAb治療としてのmAbPA-39が、クロストリジウムディフィシルC.difficile疾患からクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症ハムスターを保護するにあたって、いくらかの活性を呈した。D.終末血での抗体濃度の判断ならびに、終末時ハムスター盲腸試料でのクロストリジウムディフィシルC.difficileの存在の評価研究時に瀕死であることが明らかになった動物から血液を採取した。研究終了時、生きたままであった動物から血液を採取した。以下において特に明記しないかぎり、血液試料を処理して血清を集めた。以後に有り得る分析のために、処理済みの試料を<-70°Cで冷凍した。上述したinvivoでの有効性ハムスター研究に続いて、研究時に動物から得た全血採血でmAbの存在を調べた。実施例5Bで説明したmAbの組み合わせ研究では、mAbPA-3950mg/kgmAbPA-4140mg/kgの組み合わせを投与2日ごと×4した群7の8匹の動物を、研究37日目に全血採血した。この全血採血から回収した血清で、3.3±3.4μg/mLのレベルでPA-39が検出され、2.4±1.7μg/mLのレベルでPA-41が検出された。実施例5Cで説明した個々のmAb研究では、mAbPA-3950mg/kgmAbPA-4150mg/kgのの組み合わせを投与2日ごと×4した群3の動物6匹を、研究40日目に全血採血し、血液試料を処理して血漿を得た。この全血採血から回収した血漿で、1.8±1.4μg/mLのレベルでPA-39が検出され、3.4±3.2μg/mLのレベルでPA-41が検出された。これらの分析での抗体の検出限界は、1.6ng/mLであった。このように、数週間の時間にわたって動物で検出可能なレベルのmAbを測定した。これは、これらのmAbが、治療計画の過程とmAbの最終用量を投与した後にで治療上の利点を与える作用様式を裏付けるものである。実施例5Cの群3での最後の剖検で、各ハムスターの盲腸を露出させたところ、いずれも正常に見えた。炎症または赤みは観察されず、盲腸の内容物も比較的しっかりして硬かった。各盲腸の壁を滅菌した使い捨てのメスで開いた。ハムスターごとに新しいメスを使って、相互汚染を防いだ。少量の糞便を滅菌した綿棒で盲腸から取り除き、滅菌した試験管に入れた。10μLの播種用ループを用いて、試験管から糞便の試料を回収し、ウマ血液培地Remel、ロット735065のCCFAの入った寒天プレートに試料を画線した。これは、クロストリジウムディフィシルC.difficile用に選択したものである。プレートを無気箱に入れ、37°Cで48時間インキュベートした。1枚のプレートに保存培養からクロストリジウムディフィシルC.difficileATCC43596を画線し、コロニー比較のために糞便の画線と一緒にインキュベートした。ハムスター6匹全部からのプレート上でクロストリジウムディフィシルC.difficileに似ているコロニーを観察した。これらの実験の結果から、本発明のmAbで処理した生存動物には依然としてクロストリジウムディフィシルC.difficileがいるが、正常な腸内微生物平衡を回復すべく正常な細菌叢が再集合して、これが全生存に寄与したことがわかる。E.GoldenSyrianハムスターのクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADモデルにおける本発明の抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよび/またはトキシンBヒト化mAbおよび対照の抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbの評価ハムスターでさらなる研究を実施して、本発明のヒト化抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbのの組み合わせのinvivoでの有効性を、ヒト抗トキシンA対照のmAb、CDA-1、ヒト抗トキシンB対照のmAb、CDB-1の組み合わせでの場合と比較して、それぞれの抗体の組み合わせをクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の動物に投与した場合について評価した。この研究の処理群を、表5Aに示す。被検抗体は、本発明のヒト化mAbすなわち、ヒト化抗トキシンAmAbPA-50とヒト化抗トキシンBmAbPA-41との組み合わせhPA-41hPA-50またはCDA-1対照のmAbと呼ぶ対照のヒト抗トキシンAmAbとCDB-1対照のmAbと呼ぶ対照のヒト抗トキシンBmAbとの組み合わせCDA-1CDB-1を表5Aに示す量で用いた組み合わせからなるものであった。本明細書に記載の方法で、3D8および124の公開された重鎖および軽鎖領域国際公開第2006/121422号パンフレットおよび米国特許出願公開第2005/0287150号明細書に基づいて、対照のmAbを合成DNA2.0し、全長IgG1発現ベクターpCON-γおよびpCON-κにクローニングし、CHO-KSV1細胞で発現させ、精製した。mAbの組み合わせと対照治療剤を表5Aに記載したようにして投与した。治療方法は、基本的に、この実施例のパートBで上述したとおりである。簡単に説明すると、この実施例5Eの研究では、GoldenSyrianハムスターCharlesRiverLaboratories,StoneRidge,NY、50日齢を用いた。対照群1のハムスターは未感染かつ未処理であった。群2~7の動物は単回皮下用量のリン酸クリンダマイシン50mg/kgで前処理し、正常な結腸細菌叢を破壊した1日目。群4~7の動物には、クリンダマイシン処理直後にIP投与した。24時間後、群2~7の各動物に0.5mLのクロストリジウムディフィシルC.difficileATCC43596、株545懸濁液を経口胃管栄養で与えた0日目すなわち経口用量。群4~7では、1日目、3日目、5日目に、動物に単一用量で被検治療剤をさらに投与した。群3の動物には、1~5日目に1日2回、約6時間あけてバンコマイシンを投与した。動物の体重を毎週計測し、健康状態と生存については39日間毎日監視した。終末に剖検を実施し、選択培地にて37°Cで48時間の嫌気培養後にクロストリジウムディフィシルC.difficile微生物の盲腸での力価を判断した。検出限界は、盲腸内容物1gあたり20CFUであった。この研究および上述したハムスターでの研究は、InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeのガイドラインに従って、RicercaBiosciencesConcord,OHで実施した。mAb処理群および対照群での生存結果を図16B-1に示す。研究の死亡率データを以下の表5Bに示す。ハムスターの生存での概要を以下の表5Cに示す。表5Bから明らかなように、未感染の対照ハムスター群14匹はいずれも研究の終わりまで生存した。感染対照群2動物はすべて2日目と3日目に死亡した。バンコマイシン処理群群3では、研究動物はいずれも13日目から22日目の間に死亡した。hPA-50hPA-4150、50mg/kg群4では、10匹の動物のうち9匹が研究の終わりまで生存した。この群の1匹のハムスターが8日目に瀕死であることがわかり、GI管が赤く変色していたのに対し、この群で残り9匹の生き残った動物はGI管が正常であった。群5の10匹のハムスターはすべて研究の終わりまで生存し、GI管も正常であった。対照のmAb群では、50mg/kg群6を投与した10匹の動物のうち9匹が、5日目から14日目の間に死亡し、1匹の動物が研究の28日目までに死亡した。対照のmAbの組み合わせ20mg/kgで処理した10匹のハムスター群7はいずれも、研究5日目から14日目の間に死亡した。表5Cから明らかなように、未感染の対照群1の動物4匹すべてが研究の終わりまで生存した40日間。処理なしでクロストリジウムディフィシルCdifficileに感染したすべてのハムスター感染対照、群2では、生存中央値が2日間であった。この群の動物は研究の終わりまで生存しなかった。バンコマイシン処理群群3では、生存中央値が20日間で、40日目まで生存した動物はいなかった。hPA-50hPA-41mAbの組み合わせでの処理はともに、この研究では感染動物を保護する上で効果的であった群4および5。ヒト化mAbPA-50PA-4120mg/kg各々;群5の組み合わせで処理したすべて100のハムスターと、ヒト化mAbPA-50PA-41各50mg/kg;群4の組み合わせで処理したハムスターの90が、研究の終わりまで生存した感染後40日。すべての生存したハムスターは、死後剖検で基本的にGI管が正常であった。対照的に、対照の抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbの組み合わせを与えた動物の生存中央値は、対照のmAbのどちらの用量でも同様であった。対照mAbの組み合わせで処理した2つの群では、すべての動物が死亡した。特に、CDA-1CDB-1各50mg/kg;群6組み合わせを与えた動物では、生存中央値が14日間だったのに対し、CDA-1CDB-1各20mg/kg;群7の組み合わせを与えた動物では、生存中央値が11日間であった。この研究での追加評価には、研究終了時における体重測定、肉眼での剖検、クロストリジウムディフィシルC.difficile微生物の盲腸力価が含まれていた。バンコマイシンまたはPA-50/PA-41の組み合わせで処理した動物の平均体重は、感染後の最初の週に減少した後、戻した図16B-2。39日目までに、PA-50/PA-41の組み合わせで処理した動物の平均体重は、並列に収容した健康で未感染の動物と同様になったP>0.05。CDA1/CDB1対照の抗体の組み合わせの組み合わせで処理した動物の平均体重は、研究の間、着実に減少した。39日目、PA-50/PA-41の組み合わせで治療して生存した19匹の動物の消化管は、未感染の動物と同様に見えた。クロストリジウムディフィシルC.difficileの盲腸力価は検出不能<1.3log10CFU、n=11または低い4.15±0.76log10CFU、n=8のいずれかであった。対照的に、他の処理群では、死亡時に数匹またはすべての動物で炎症の生じた消化管が観察された。4匹の未処理の動物のうち4匹と、盲腸の分析をした4匹のバンコマイシンで処理した動物のうち4匹PA-50/PA-41に対して平均CFU=6.01±0.93log10、P<0.017で、クロストリジウムディフィシルC.difficileが検出されPA-50/PA-41に対して平均CFU=8.96±0.59log10、P<0.0001。CDA1/CDB1対照の抗体の組み合わせで処理したほとんどのハムスターで、盲腸の内容物がわずかしかないかまったくなかったが、このためクロストリジウムディフィシルC.difficile力価の定量的な分析ができなかった。この研究および上記の研究での統計分析のために、GraphPadPrismv.4.0GraphPadSoftware,SanDiego,CAを用いて中和データを4パラメータのロジスティック方程式にフィッティングした。両側t検定またはlogランク検定を用いて、平均または生存データをそれぞれ比較した。研究の結果から、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の動物を、どちらの用量レベルのヒト化mAbPA-50とPA-41の組み合わせで処理しても、最初と以後の疾患の再発時のいずれも、ハムスターを重症の疾患から効果的かつ永続的に保護できることがわかる。ヒト化mAbの組み合わせ処理の利益がある期間40日間は、対照としてのバンコマイシンまたは対照の抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbでの処理と比較して、動物の長期生存を有意に改善した。invivoでの動物研究から明らかなように、ヒト化PA-50/PA-41mAbの組み合わせでの組み合わせ処理は、CDIおよび療法の十分に確立されたGoldenSyrianハムスターモデルでクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に対して非常に有効であった。PA-50/PA-41での短い処理期間でも、処理をしなかった動物、標準的な抗生剤療法の動物または対照のmAbの動物の生存が0だったのに対し、感染後39日目に95が生存した。感染後39日目に、PA-50/PA-41で処理した動物は体重が正常であり、明らかな胃腸管病変は認められなかった。未処理動物と比較して、クロストリジウムディフィシルC.difficileはほとんどの動物から回収できず、>7-log10クリアランスを反映していた。これらの所見に対して考えられる説明のひとつとして、抗生剤の非存在下におけるトキシンのmAbによる中和によって、動物の消化管で保護的な微生物細菌叢が再建できるようになったことがあげられる。トキシンAまたはトキシンB単独では、CDIのハムスターモデルにおいて致死的な疾患を引き起こせたことが報告され、これらのトキシンに対するmAbは通常、治療の有効性を最大にするのに必要とされる。上記の研究では、マウスmAbPA-50およびPA-41を個々に50mg/kgの用量でハムスターモデルに用いた場合に生存の利点が認められず、これが組み合わせ治療の要件を明確にしている。このハムスターでの研究全体として、マウスmAbの組み合わせを用いた上述の所見と同様に、本発明のヒト化mAbの組み合わせが、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症の厳しいハムスターモデルで効果的かつ永続的にハムスターを死亡率から保護したことが示された。理論に拘泥されるわけではないが、これらの所見は、ヒト化mAbの組み合わせが、ヒト化mAb処理動物の正常な腸細菌叢の自然な発達と再増殖を可能にするだけ長い期間にわたって、動物をクロストリジウムディフィシルC.difficile疾患から保護および/または動物にクロストリジウムディフィシルC.difficile感染症に対する反応を持たせ、よって、感染動物を治療的に保護し、クロストリジウムディフィシルC.difficile関連疾患を効果的になくし、胃腸管の健康と生存を回復させる作用機序を裏付けるものである。実施例6クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBの領域に対するmAbの結合本発明のmAbが結合したクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAおよびトキシンBのエピトープ領域を判断するための実験を実施した。クロストリジウムディフィシルC.difficileによって産生されるトキシンAおよびトキシンBはどちらも、約300kDaでかなりの配列と構造が相同である。どちらも、クロストリジウムの繰り返しオリゴペプチドCROPを含有するC末端受容体結合ドメインと、ポア形成を引き起こし、エンドソームの膜へのトキシンの挿入を媒介すると考えられている中央の疎水性のドメインと、N末端酵素ドメインを切断するタンパク質分解ドメインと、を有するため、グルコシルトランスフェラーゼが細胞質に入ることができる。クロストリジウムディフィシルC.difficileならびに他のクロストリジウムディフィシルC.difficileタンパク質のトキシンをコードする核酸配列は、公開されており、NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIデータベースすなわちwww.ncbi.nlm.nih.govでアクセスできる。たとえば、クロストリジウムディフィシルC.difficile株VPI10463の場合、トキシンAおよびトキシンBをコードするDNA配列は、NCBI受託番号x92982に見られる;また、NCBI受託番号NC_009089、領域795842-803975は、クロストリジウムディフィシルC.difficile630染色体完全ゲノム配列由来のトキシンAのDNA配列を提供するものであり、かたやNCBI受託番号NC_009089、領域787393-794493は、クロストリジウムディフィシルC.difficile630染色体配列由来のトキシンBをコードするDNA配列を提供するものである。A.クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンBの抗体結合ドメインマッピングクロストリジウムディフィシルC.difficileの全長トキシンBは、3つの主要ドメインすなわち、グルコシルトランスフェラーゼGT活性を処理するN末端酵素ドメイン63kDaと、推定上のトランスロケーションドメイン148kDaの片側にあるC末端細胞受容体結合59kDa図17Aおよび図17Cからなる。酵素カスパーゼ1を用いる全長トキシンBの酵素的な切断によって、いくつかのトキシンB断片を作製した図17C。トキシンBを37°Cで96時間、カスパーゼ1酵素/トキシン比約1U/μgトキシンで処理した後、SDS-PAGEで検出した場合に断片193および167kDaを含有する2つのC末端と断片103および63kDaを含有する2つのN末端を含む4つの主要な断片を作製した図17B。26および14kDaなど、他のこれよりも小さな断片も作製されたように見えるが、3~8トリス酢酸ゲル分析では検出可能でなかった。未処理またはカスパーゼ1で処理したトキシンBでSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実施した図18A~図18C。mAbPA-41は、カスパーゼ1処理トキシンBの103kDaと63kDaの両方の断片を認識した図18Bの右側のレーンことから、PA-41がトキシンBのN末端酵素ドメインに結合することがわかる。N末端シーケンシング分析で、PA-41がトキシンBの63kDaのN末端酵素ドメインに結合することを確認した。未処理トキシンBの63kDaのバンド左側のレーン、図18BがPA-41に認識されなかったのは興味深いが、これはレーンの分子量が同じ63kDa2つの断片異なるタンパク質に見えたことを示唆している。カスパーゼ1処理トキシンBのMAbPA-39結合167kDa断片図18C、右側のレーンならびに、未処理トキシンB調製物の63kDaのタンパク質図18C、左側のレーンは、PA-39がトキシンBのトランスロケーションドメインでエピトープに結合することを示唆している。よって、カスパーゼ1処理クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBでのSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析の結果に基づいて、mAbPA-41およびPA-39がトキシンBとは異なる形で相互作用することが観察された。mAbPA-41はトキシンBのN末端酵素ドメインでエピトープに結合することが明らかになったが、mAbPA-39は、トキシンのトランスロケーションドメインのエピトープアミノ酸850~1330に結合することが明らかになった。これらの所見は、エンテロキナーゼ消化を用いるトキシンB断片のSDS-PAGE/ウェスタンブロット分析でも確認された。Biacoreを用いて、トキシンBに対する抗トキシンBmAbの競合的結合も実施した。図19Aから図19Eにおいて示されるように、mAbPA-39およびPA-41は、トキシンBの異なるエピトープ領域に結合する。マウスmAbPA-39およびPA-41は、トキシンBの単一部位またはエピトープに結合することが観察された。これらのmAbは、C末端細胞受容体結合CRBドメインに結合することが見出されなかった。マウスPA-41では、結合トキシンBの親和性が0.59mMであった。さらに、PA-41に結合したトキシンB上の部位は、対照の抗トキシンBmAbCDB-1の結合をブロックしなかった国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号明細書図19D。これらの所見は、ウェスタンブロット分析の結果と一致する。図19Cおよび図19Eで観察されるように、対照の抗トキシンBmAbCDB-1は、mAbPA-39およびPA-41のものとは異なるエピトープでトキシンBに結合する。B.クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAの抗体結合ドメインマッピング全長クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAは、分子量が310kDa図20Aで、グルコシルトランスフェラーゼGT活性を有するN末端酵素処理ドメイン約63kDaと、疎水性ドメイン約144kDaの片側にあるC末端CRBドメイン約101kDaの3つの主要ドメインを含有する。酵素エンテロキナーゼEKを用いて、全長トキシンを酵素的に切断していくつかのトキシンA断片を作製した。25°Cで48時間のエンテロキナーゼ酵素/トキシン比:約3mU/μgトキシンでのトキシンAの処理後、4つのC末端断片約223kDa、約158~160kDa、約91kDa、約68kDaと3つのN末端断片約195kDa、約181kDa、約127kDaを含む9つの主要な断片を作製した。これよりも小さな断片約53および約42kDaも観察された。図20Bおよび図20C。未処理またはエンテロキナーゼで処理したトキシンAでSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を実施した図21A~図21C。全長トキシンAおよびその断片分子量約223kDa、約158~160kDa、約91kDa、約68kDaは、mAbPA-50に認識された図21B。N末端シーケンシングによって、68kDaの断片がC末端受容体結合CRBドメインの一部を含むことが確認された。mAbPA-50の結合パターンから、mAbがトキシンAの断片を含むC末端に結合することが示唆される。総合すれば、これらの結果から、mAbPA-50がトキシンAのC末端受容体結合エピトープに結合することがわかる。mAbPA-39は、C末端含有断片約223および約158~160kDaならびに約181kDaのN末端含有断片図21Cに結合したことから、mAbPA-39が、トキシンAの受容体結合ドメイン外の領域のエピトープに結合することがわかる。Biacoreアッセイを使用して、mAbPA-50およびトキシンAの相互作用研究で複数の結合部位少なくとも2つの結合部位を同定した図22A-1。Biacore分析を用いる比較研究では、固定化したマウスPA-50がトキシンAに親和性0.16nMで特異的に結合した。また、マウスmAbPA-50によってセンサーチップにキャプチャーされた後、トキシンAは、さらにPA-50に結合でき、その後、対照の抗トキシンAmAbCDA-1国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号パンフレットにも結合する図22A-2ことが見出された。また、Biacoreチップで対照の抗トキシンAmAbCDA-1にキャプチャーされたトキシンAは、別のCDA-1およびPA-50mAbにさらに結合したことから、対照のmAbCDA-1がトキシンAの複数の繰り返しに結合することがわかり、これらはトキシンAのPA-50mAb結合エピトープとは異なる図22B。このように、これらの結果から判断すると、トキシンAには複数のコピーでPA-50mAbエピトープが存在し、CDA-1のエピトープとは重ならない。さらに、PA-39mAbは、対照のCDA-1mAbが結合したトキシンAエピトープとは異なるトキシンAのエピトープに結合した図22C。MAbPA-39およびPA-50は、トキシンA上の異なるエピトープに結合することがわかった図22D。ウェスタンブロット分析では、PA-39および対照のmAbCDA-1がEK処理トキシンAとは異なる結合パターンを有するため、トキシンAに異なる結合ドメインおよび異なるエピトープがあることが示された図22E。ウェスタンブロット分析では、PA-50および対照のmAbCDA-1がEK処理トキシンAと同一ドメイン図22Fであるが、異なるエピトープに図22B結合することが示された。この実施例のAおよびBで説明したように、マウスmAbPA-50およびPA-41の結合部位は、トキシンの限られたタンパク質分解に続くウェスタンブロットで、トキシンの特異的な領域に局在していた。マウスmAbPA-50は全長トキシンAといくつかのエンテロキナーゼ切断産物を認識したことから、大きな223kDaの断片と、大きさが68kDa、91kDa、160kDaのカルボキシ末端断片がある図22Fことがわかる。N末端シーケンシングによって、68kDaの断片がトキシンAのカルボキシ末端ドメインに対応していることを確認した。CDA-1対照のmAbによって同一の断片が認識された。マウスmAbPA-41は、全長トキシンBならびに、カスパーゼ1消化によって生成された63kDaと103kDaのアミノ末端断片に結合し図18B、かたやCDB-1対照のmAbは、異なる組のカスパーゼ1切断産物を認識した。N末端シーケンシングによって、63kDaの断片がトキシンBのアミノ末端ドメインに対応していることを確認した。まとめると、データは、mPA-50がトキシンAの受容体結合ドメイン内の複数の部位に結合し、mPA-41がトキシンBの酵素ドメイン内の単一部位に結合することを示している。実施例7抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAb-作用機序の研究A.作用機序研究に用いられるInvitroでの細胞ベースのアッセイ抗トキシンmAbの作用機序を評価するために、異なる濃度のトキシンAまたはトキシンBを用いて、invitroでのアッセイを実施した。これらのアッセイでは、先の実施例3で説明したようにして、CHO-K1またはT-84細胞のいずれかを用いた。簡単に説明すると、CHO-K1アッセイを用いて、抗トキシンAおよび抗トキシンBmAbPA-39およびPA-41の中和効力を評価した。96ウェルのプレートにCHO-K1細胞を播種した2,000個/ウェル。処理の前に4時間、細胞を付着させた。異なる濃度60、30、15または6ng/mLのクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン株VPI10463を段階希釈mAbと一緒にインキュベートし、96ウェルの丸底プレートで37°Cにて1時間混合した後、混合物を細胞培養プレートに加えた。72時間のインキュベーション後、20μL/ウェルのCellTiter-Blueを加えた。混合物をさらに4時間インキュベートし、対照と比較した細胞生存率を測定した。T-84細胞毒性アッセイも使用して、抗トキシンAmAbの中和効力を評価し。T-84細胞ヒト結腸癌種細胞株を96ウェルのプレートに播種した15,000個/ウェル。処理の前に4時間、細胞を付着させた。異なる濃度240、120、60または30ng/mLのクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン株VPI10463を段階希釈mAbと一緒にインキュベートし、96ウェルの丸底プレートで37°Cにて1時間混合した後、混合物を細胞培養プレートに加えた。72時間のインキュベーション後、20μL/ウェルのCellTiter-Blueを加えた。混合物をさらに4時間インキュベートし、対照と比較した細胞生存率を測定した。B.抗トキシンAmAbがトキシンAの細胞への内部移行を防止することを示すELISA抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンmAbの作用機序をさらに評価するために設計された実験で、各被検抗体PA-39、PA-50、対照の抗トキシンAmAbCDA-1および抗トキシンAヤギポリクローナル抗体対照を混合し、そのEC90値の100倍でトキシンAの高い細胞傷害性濃度で完全な中和を保証するようVero細胞に対するトキシンAのCC90濃度で1時間インキュベートした。次に、混合物をVero細胞と一緒に37°Cで15分間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄し、固定し、透過処理した。被検抗体との結合と競合しない抗トキシンAホースラディッシュペルオキシダーゼHRP標識抗体PA-38を用いて、内部移行したトキシンAに対するプローブとし、化学発光を用いて検出した図31G。このアッセイでは、結合して細胞に内部移行したトキシンAだけがプローブによって検出されるため、HRP化学発光反応による化学発光シグナルが得られる。化学発光検出では、可視光の生成につながる過酸化物の存在下、酵素を用いてHRP酵素とその基質との間の反応を触媒するすなわち、過酸化物によるルミノールの触媒酸化。酸化したルミノールは、基底状態状態まで減衰する際に光を発する。基質がHRPによって触媒されたら、ルミノメーターAnalystGTで光シグナルを定量化する。C.中和活性およびMOA研究の結果抗トキシンAmAb抗トキシンA抗体の中和活性および作用機序の評価に用いた細胞毒性アッセイでは、この実施例のセクションAで説明したように、濃度を増しながら細胞にトキシンAを加えた。抗トキシンAmAbPA-39、PA-50および対照のmAbCDA-1によるトキシンAの中和を評価したこれらの実験の結果を、図31B~図31Dと以下の表Aに示す。表Aに示すデータから明らかなように、トキシン効力アッセイでのmAbPA-39のinvitroでの活性には、培養に加えるトキシンAの量を増やすと、EC50と最大阻害率の両方にシフトが認められることから、PA-39での阻害の混合-競合的機序があることがわかる。100倍過剰のPA-39で保護後のトキシンAのELISA検出によって、トキシンの内部移行と細胞毒cytocellulartoxinの作用を防止することで、PA-39によるトキシンの阻害が起こることが確認された。トキシン効力アッセイでのmAbPA-50のinvitroでの活性には、培養に加えるトキシンAの量を増やすと、EC50のシフトが認められることから、PA-50での阻害の競合的機序があることがわかる。100倍過剰のPA-50で保護後のトキシンAのELISA検出によって、トキシンの内部移行を防止することで、PA-50によるトキシンの阻害が起こることが確認された。抗トキシンBmAb抗トキシンB抗体の中和効力および作用機序の評価に用いた細胞毒性アッセイでは、この実施例のセクションAで説明したように、濃度を増しながら細胞にトキシンBを加えた。抗トキシンBmAbPA-41および対照のmAbCDB-1によるトキシンBの中和を評価した効力実験の結果を、図31Eおよび図31Fと以下の表Bに示す。表のデータからわかるように、トキシン効力アッセイでのPA-41のinvitro活性には、培養に加えるトキシンBの量を増やすと、EC50および最大阻害率の両方にシフトが認められることから、阻害PA-41の混合-競合的機序があることがわかる。この実施例での上述したアッセイに基づいて、単に阻害因子の濃度を増すだけで、トキシンAまたはトキシンBの濃度が増しても完全に中和できる阻害因子は、抗体の結合数が増えてより高い濃度のトキシンを中和する際にEC50のシフトが生じるため、競合的阻害因子であると考えられる。トキシンの濃度が増すと毒性作用に抗せない阻害因子は、阻害因子の濃度を増しても最大効果率が低くなるが、EC50にシフトは認められず、非競合的阻害因子であると考えられる。さらに、トキシンの濃度が高くなって阻害因子の濃度が増えた結果として、EC50のシフトと最大効果率の低下の両方が起こる阻害因子は、混合-競合的阻害因子であると考えられる。いくらかは、細胞毒性cytoxicityアッセイでの作用機序の評価は、アッセイの反復性と、阻害因子のない対照ウェルで観察されるバックグラウンドでの細胞毒性cytoxicityに伴う誤差を考慮して実施しなければならない。これは、最大阻害率の平坦域に影響する。結果として、トキシン濃度を高めると、これらの作用がゆえにEC50値のわずかに右よりのシフトが観察されることがある。上記によれば、トキシンAの中和およびMOAについて、PA-39細胞毒性cytoxicity曲線図31BでEC50のシフトが観察され、平坦域が低くなることならびに、表Aで算出した最大効果率の低下から、PA-39mAbを混合-競合的阻害因子とみなす。これらのデータは、高濃度のPA-39での細胞傷害作用の度合いを示すELISAでの結果図31Hで裏付けられ、PA-39のMOAの少なくともいくらかが細胞内で起こることがわかる。PA-50mAbは、細胞毒性cytoxicityアッセイ曲線図31Cに見られるEC50値の右側へのシフトから、さらには最大阻害率の最小変化を示す表Aに示すデータによって、競合的阻害因子として観察される。これらのデータは、高濃度のPA-50でのトキシンA結合と内部移行の完全な阻害を示すELISAでの結果図31Hで裏付けられる。図31Dからわかるように、対照のmAbCDA-1は、トキシンを増やすとEC50に最小のシフトが認められるが、最大効果率がかなり低下する。図31Dに示す結果を、表Aのデータと一緒に考慮すると、CDA-1対照のmAbは、非競合的作用機序を示す。なぜなら、その活性がすべて細胞外で観察されるからである。トキシン結合の立体障害および細胞内部移行は、図31Dにおけるデータプロットを生む原因になりやすく、CDA-1対照のmAbの非競合的MOAを裏付けている。トキシンBの中和およびMOAについての上記に従って、PA-41mAbは、EC50値の右方向へのシフトと、図31Eおよび表Bのデータの両方に見られる最大作用率の低下から、混合-競合的作用機序を呈するものとみなされる。mAbPA-41で観察される結果は、最大効果率が下がるがEC50シフトの度合いの少ない対照のmAbCDB-1で観察される結果とは対照的である。この場合、トキシンBに対する対照のmAbの活性の作用機序は、特に上述した誤差を考慮するとあまりはっきりしない。実施例8高病原性分離株または株を含むクロストリジウムディフィシルC.difficile分離株または株のパネルに対する本発明のmAbの試験本発明のクロストリジウムディフィシルC.difficile抗トキシンAおよび抗BmAbが、クロストリジウムディフィシルC.difficileの広い範囲にわたる関連分離株からのトキシンを中和する機能を評価するために、高病原性BI/NAP1/027分離株を含む20の毒素産生性臨床クロストリジウムディフィシルC.difficile分離株または株の集合に対してmAbの中和活性を試験した。クロストリジウムディフィシルC.difficileは、トキシンAおよびBをコードする遺伝子においてかなりの株間異種性を呈するため、標記のmAb、特にmAbPA-50およびPA-41によるトキシン中和の幅を判断するためにこれらの研究を実施した。地理的および遺伝的な多様性を得るために、TechLabBlacksburg,VAに維持されたクロストリジウムディフィシルC.difficile分離株または株の国際コレクションから、毒素タイプ、リボタイプおよび制限エンドヌクレアーゼ分析から、毒素産生性の臨床クロストリジウムディフィシルC.difficile分離株表6のパネルを選択した。表6で分類したように、クロストリジウムディフィシルC.difficileの株は3つの参考株VPI10463ATCC43255、630ATCCBAA-1382および545ATCC43596、6つの病院由来のBI/NAP1/027株CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、5、7.1、2つのトキシンA-/トキシンBtcdA-tcdB株F1470、8864、3つの外来患者分離株MH5、CCL13820およびCCL14402、他の臨床上、頻繁に分離される菌株Pitt2、CCL14137、UVA17、UVA30/TL42、Pitt102、Pitt7を含む。また、分離株13CCL13820および19Pitt102は、それぞれ表6の外来患者分離株と臨床上、頻繁に分離される菌株リボタイプ027以外に分類されるが、toxA-/toxB株でもある。これらのクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンを含む培養上清をTechLabで作製し、滅菌濾過し、4°Cで保管した。培養上清におけるトキシンの存在を、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン/抗トキシンキットTechLabおよび細胞毒性アッセイを用いて確認した。CHO-K1細胞培養上清のトキシンB活性の判断に使用およびT-84細胞培養上清のトキシンA活性の判断に使用に対する各トキシン含有培養上清の細胞傷害活性を、滴定済みの培養上清で細胞を処理して評価した。本発明のmAbの中和活性を試験するために、トキシン含有培養上清を細胞生存度の≧95喪失につながる最大希釈で用いた。トキシン上清をさまざまな濃度のmAbと1時間予備混合した後、細胞に加えて37°Cで72時間インキュベーションした。Cell-TiterBluePromegaを用いて細胞生存度を測定した。処理したウェルの生存率を未処理の対照ウェルでの生存率と比較し、グラフにしてmAbのinvitroでの中和活性EC50を算出した。最初の一連の実験では、図23Aは、CHO-K1細胞を用いてトキシン含有上清を中和する際のmAbPA-41の活性を示す。PA-41は、3種類のトキシンA-/トキシンB株だけが例外で、あとはすべての高病原性株を含む、クロストリジウムディフィシルC.difficileのすべての毒素産生性株の上清を強力にEC50範囲1.1-11Mから6.5-10M中和する。従来のクロストリジウムディフィシルC.difficile株由来のトキシンA-/トキシンBの酵素ドメインには有意な配列差があることが報告されている。PA-41はトキシンBの酵素ドメインに結合することから、このドメインの配列の多様性で、2つのトキシンA-/トキシンB株由来のトキシンBに対するPA-41の中和活性がそれほど効果的ではないことを説明できる。CHO-K1細胞株におけるクロストリジウムディフィシルC.diffiicleの高病原性株に対するhPA-41および対照のヒト抗トキシンBmAbCDB-1国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号明細書の両方の活性を評価するための実験を実施した。これらの研究では、hPA-41が6つのBI/NAP1/027株すべての上清に対して有意な中和活性を示し、かたや対照のmAbCDB-1は最小の活性を示す図23Bことが観察された。また、これらの研究では、hPA-41mAbの中和活性が、BI/NAP1/027株の毒性を中和するにあたって、対照のmAbCDB-1よりも>1,000倍高いようにみえる。2つの参考株VPI10463およびATCC43596および6つのBI/027/027株CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、Montreal5.1およびMontreal7.1に対するhPA-41およびCDB-1対照のmAbの中和活性を、図23Bに示す。これらの研究で、hPA-41が、トキシンA-/Bである3種類のリボタイプ017分離株表6に対して不活性であるが、hPA-41抗トキシンBmAbは対照のmAbよりもパネルの他の株に対して有意に高い中和活性を呈することがわかった。T-84細胞を用いるクロストリジウムディフィシルC.difficile培養のトキシンA含有上清を中和する際のmAbPA-50の活性は、図24Aに示すように、2.6-12Mから7.7-11Mの範囲であった。PA-50は、高病原性株を含めて、トキシンAを産生する入手可能なすべての株の上清を完全に中和した。PA-50は、4つのトキシンA-/トキシンB株F1470、8864、CCL13820、CCL14402を中和しなかった。これらの株は、トキシンAをまったく産生しないためである。また、hPA-50も、パネルにおける残りの株の活性を中和する際に、有意に一層効果的であった。他の比較研究で、トキシンA産生クロストリジウムディフィシルC.difficileの6つのBI/NAP1/027株すべてに対するhPA-50の中和活性は、対照のmAbCDA-1国際公開第2006/121422号パンフレット;米国特許出願公開第2005/0287150号明細書の場合よりも>100倍大きい図24Bことが見出された。hPA-50も、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンA産生参考株VPI10463および545に対して対照のmAbCDA-1より高い中和活性を呈した。同様に、mAbPA-39は、図25Aに示すように、クロストリジウムディフィシルC.difficile培養の上清のトキシンAを、EC50値7.7-12Mから4.8-8Mの範囲で中和した。mAbPA-50からわかるように、4つのトキシンA-/トキシンB株は、PA-39では中和されない。さらに、比較研究の結果は、6つのBI/NAP1/027株すべてに対するmAbPA-39の中和活性が、対照のヒト抗トキシンAmAbCDA-1の場合よりも>100倍大きく、PA-39もパネルの残りの株に対する中和活性が有意に大きい図25Bことを示していた。1つのトキシン株すなわちCCL14402では、アッセイでmAb中和活性の正確な測定ができるほどT-84細胞の生存度が十分には落ちなかった点に注意されたい。これらの研究では、CHO-K1細胞株、hPA-41が、6つのBI/NAP1/027株すべての上清に対して高いレベルの中和活性を示し、かたや対照のmAbCDB-1は最小の活性を示した。ヒト化PA-41は、クロストリジウムディフィシルC.difficileの高病原性BI/NAP1/027株を中和するにあたって、対照のmAbCDB-1よりも中和活性が>1,000倍高いように見えた。これらの研究における、2つの参考株VPI10463およびATCC43596および6つのBI/027/027株CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、Montreal5.1およびMontreal7.1に対するhPA-41およびCDB-1の中和活性を、図23Bに示す。同様に、hPA-41は、これらの研究で、パネルの他の株に対して対照のmAbCDB-1よりも有意に高い中和活性を示し、トキシンA-/Bの3つのリボタイプ017分離株が例外であった。同様の実験を実施して、T-84細胞でのhPA-39および対照のヒト抗トキシンAmAbCDA-1の中和活性を評価した。結果は、hPA-39による6つのBI/NAP1/027株すべての中和が、対照のmAbCDA-1の場合よりも>100倍高いことを示していた図25B。ヒト化PA-39は、研究で、パネルの残りの株に対して対照のmAbCDA-1よりも有意に高い中和活性を示した。このように、hPA-41およびhPA-39mAbは、試験したすべての株に対して高いレベルの抗クロストリジウムディフィシルC.difficile高病原性株中和活性を有する。これは、これらのヒト化mAbによって認識されるエピトープが、多種多様な株で高度に保存されることを示す。表6と同様に、表7も上述したinvitroでのクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン中和実験の結果を示し、北米および欧州から単離された毒素産生性クロストリジウムディフィシルC.difficile株のパネルと、ヒト化抗トキシンmAbおよび対照のmAbCDA-1およびCDB-1によって生成されるEC50値を示している。パネルは、リボタイプ001、002、003、012、014、017、027、078を、臨床的に観察されるレートに比例する適切な比率で含み94、95、パネルに過剰に現れたリボタイプ017tcdA-tcdB株が例外である。tcdA-tcdB株由来の上清をツールとして使用して、トキシンB単独で含む上清によって難治性から死亡までの細胞を同定した。これは、トキシンAに媒介される細胞毒性を調べるのに適していた。VPI10463をパネルに含め、得られた精製トキシンと未精製のトキシンで結果を比較できるようにした。これらの研究で、ヒト化mAbPA-50は、トキシンAを株非依存的に中和した。中央EC50値は32pM範囲:20~127pM、表7で、急唆な用量反応曲線が観察され、ヒル勾配は通常、2より大きい図25C。PA-50は、各被検分離株に対してCDA1よりも活性が高い。効力の差が最も大きいのは、高病原性027株で観察されており、これに対してPA-50ならびにパネルに含まれているリボタイプ078株は、CDA1P=0.0002よりも約1,000倍強かった。ヒト化mAbPA-41は、tcdAtcdB株各々を強力に阻害し、中央値EC50値は23pM範囲:7.7~129pM、表7であり、基本的に高い濃度での完全な中和が観察される図25D。PA-41は通常、tcdAtcdB株に対してCDB1よりも効果的であり、高病原性027株に対して約500倍強いP=0.003。CDB1は、リボタイプ017tcdA-tcdB株からのトキシンBを中和する際に効果的であるが、PA-41はそうでもない。最後に、PA-41およびPA-50は、トキシンの粗形態および精製形態で、参考株VPI10463表7および図25Cおよび25Dから同様の活性を呈した。この実施例で示すように、ヒト化mAbPA-50およびPA-41は、現在のCDI伝染病を代表する遺伝的に多種多様な株のクロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびBに対して、高いレベルの中和活性を示した。これらのmAbの活性の幅は、トキシン内の遺伝子型および表現型のばらつきに関して顕著である。特に、PA-50およびPA-41は、ピコモル活性で高病原性の抗生剤耐性027株によって産生されたトキシンを中和し、かたや対照のmAbは、ナノモル活性を持つことが観察された。この結果は、過去に報告があるように、027株のトキシンAに対するCDA-1の結合の低減に反映されることがある90。027株由来のトキシンBは他のクロストリジウムディフィシルC.difficile株に比して、顕著な配列の相違を呈する。配列差はカルボキシ末端受容体結合ドメインに集中し、invitroでの細胞毒性の増加に関連している。しかしながら、このような配列の相違は、PA-41の中和活性に影響しない。これは、トキシンBのアミノ末端ドメイン内のエピトープに結合する。PA-50およびPA-41は、ピコモル力価のパネルで、6つの027株すべてを中和し、これには最近027罹患率のリスクがあがっている株CD196も含む。全体としての所見から、PA-50およびPA-41のエピトープが、027の結合によって広く保存されることがわかる。CDIは一般に、トキシンAおよびBの両方を産生するクロストリジウムディフィシルC.difficileの株によって引き起こされる。しかしながら、tcdA-tcdB株も、この疾患に結び付いている。臨床的に関連したtcdA-tcdB株は、優先的にリボタイプ017である。リボタイプ017株は、ハムスターで病原性を低下させ、アミノ末端領域がVPI10463からのtcdBとクロストリジウムディフィシルC.difficileからの致死的なトキシンtcsLの両方に対して70~80配列相同性である非定型のtcdBをコードすることが報告されている。表現型では、リボタイプ017tcdBは、ハイブリッドの特徴を有し、一般的なtcdBおよびtcsLトキシンの受容体結合特性とグリコシル化特異性を呈する。017tcdBの非定型のアミノ末端領域は、なぜ、研究ではPA-41によってトキシンが中和されなかったのかを説明となろう。017の株が地域に広く流行し、CDIの局所的な流行を引き起こしたが、全体としては、CDIを治療するための調査的な治療法の最近の国際的なフェーズ3の臨床研究で遭遇した、株の<2を含むと判断された94、95。実施例9キメラmAbの生成親マウスmAbの可変領域とヒトIgG1の定常領域とを含むキメラモノクローナル抗体を作製してキャラクタライズした。正しい抗トキシン活性と結合特異性を有するマウス可変領域をクローニングし、ヒト定常領域でのマウス可変領域の構築によって各クローンmAbの結合特性および中和特性が有意に変化することはないことを保証するために、キメラmAbを作製した。キメラmAbは一般に、親マウスmAbと同一の結合活性を呈する。MAbPA-38、PA-39、PA-41およびPA-50はいずれも、κ軽鎖を含む。キメラmAbを作製するために、重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を、pCONγ1およびpCONκLonzaBiologics,Berkshire,UKなどであるがこれに限定されるものではない好適な発現ベクターに挿入した。好適なプラスミドが、ヒトκ軽鎖の定常領域またはヒトIgG1重鎖の定常領域をコードする。キメラmAbを作製するために、各mAbの重鎖の可変領域をpCONγ1プラスミドにクローニングした。完全重鎖遺伝子を、軽鎖遺伝子を含むプラスミドにサブクローニングし、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をコードする単一のプラスミドを作製した。EffecteneQiagen、Valencia、CAを使用して、製造業者が提案したプロトコールで、293F細胞をこの発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。分泌されたキメラmAbを含有する細胞上清を、トランスフェクションの7日後に回収し、プロテインAクロマトグラフィを用いて精製した。細胞毒性および血球凝集アッセイで、キメラmAbの力価および活性を、マウスmAbの場合と比較した。上記の手順に基づいて、親のマウスPA-39およびPA-41mAbからキメラmAbcPA-39およびcPA-41を作製した。粗細胞上清でのこれらのキメラmAbの濃度は、約2~11μg/mLの範囲であった。特に、cPA-39を産生するトランスフェクトした293F細胞培養由来の粗上清には、10.6μg/mLのキメラmAbが含まれていたのに対し、cPA-41を産生するいくつかのトランスフェクトした293F細胞培養由来の粗上清は、9.6~10.9μg/mLのキメラmAbを含有していた。上述したような実施例3細胞毒性アッセイcPA-39:CHO-K1細胞、cPA-41:CHO-K1細胞およびcPA-50:T-84細胞を実施して、キメラmAbを、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンのinvitroでの中和能について、それぞれの親のマウスmAbと比較した。図26PA-41、図27PA-39、図28PA-50に示すように、それぞれのマウス親mAbと比較すると、すべてのキメラmAbが、等しく効果的であることがわかった。これらの結果は、キメラ化と、親のマウスmAbに相当するトキシン中和力価を持つ機能的キメラmAbの産生の成功を示している。実施例10マウスmAbのヒト化とトキシン中和効力についてのinvitroでの本発明のヒト化mAbの試験従来技術において周知の方法で、ヒト化mAbを作製した。さまざまなヒト化mAbの例と説明が、たとえば、Zenapax65,66、Synagis67~69、Herceptin70~72、Mylotarg73、74、Xolair75~77、Raptiva78~80、Avastin81、82、Tysabri83に含まれている。ヒトのmAb活性が悪影響をおよぼさないようにして、免疫原を最小限にするのに効果的なヒト化モノクローナル抗体を作製可能である84~87。好ましくは、ヒト化mAbは、親マウスmAbの2倍以内のトキシン中和活性を示す。さらに、ヒト化mAbは、クロストリジウムディフィシルC.difficile感染症のハムスターモデルで強力な有効性を最適に示す。相補性決定領域CDRグラフティングの確立された方法を使用して、本明細書で説明するようなマウス抗トキシンAおよび/または抗トキシンBmAbのヒト化形態を作製した。トキシン中和活性について、invitroおよびinvivoで、ヒト化mAbを親マウスmAbと比較した。本発明によれば、ヒト化mAbは、親マウスmAbの抗トキシン活性を保持でき、ヒトでの繰り返し投与に適したものとなり得る。A.マウスmAbの重鎖および軽鎖遺伝子の分子クローニング確立された方法を使用して、抗体遺伝子をクローニングした。88簡単に説明すると、1×107ハイブリドーマ細胞から、TRIzol試薬Invitrogenを用いて、製造業者が提案したプロトコールに従って全RNAを精製した。オリゴ-dTプライマーを使うSuperScriptIIReverseTranscriptaseInvitrogenを用いて、5μgの全RNAを逆転写した。得られたcDNAをRNAseHで処理してRNAテンプレートを除去し、QIAquickPCR精製キットQiagenを用いてこれを精製して、遊離ヌクレオチドおよびプライマーを除去した。次に、製造業者が提案したプロトコールに従って、dGTPの存在下、酵素末端トランスフェラーゼNEBを用いて、グアニジンヌクレオチドの尾をcDNAの3’末端に加えた。得られた尾状のcDNAを、重鎖または軽鎖の定常領域にアニールした1つのプライマーと、cDNAのグアノシン尾にアニールした1つのユニバーサルプライマーとを用いて、PCR処理した。重鎖および軽鎖の両方に、ユニバーサルプライマー5’TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC3’配列番号11を用いた。軽鎖を増幅するために、プライマー5’TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC3’配列番号12を用いた。また、重鎖についてはプライマー5’TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCATGATGGGGGCTGTTCGTTTTGGC3’配列番号13を用いて増幅した。ここで、括弧内の配列は、塩基の縮重を示す。得られたPCR増幅DNAを、QIAquickPCR精製キットQiagenを用いて精製し、配列決定した。PCR反応を実施し、三重に配列決定して、約500塩基対のDNA断片の増幅時に誤差が含まれないようにした。B.mAb可変領域のヒト化ヒト化mAbの配列を作製するために、CDR構造に重要なフレームワークアミノ酸残基を、まず同定した。並行して、マウスVHおよびVLとそれぞれ高い相同性を有するヒトVHおよびVL配列を既知のヒト免疫グロブリン配列から選択した。マウスmAbのCDR配列を、必要であればCDRの構造を維持するのに重要なフレームワークアミノ酸残基と一緒に、選択したヒトフレームワーク配列にグラフトした。また、得られるヒト化mAbの潜在的な免疫原を抑えるために、対応するV領域サブグループで非定型であることが見出されるヒトフレームワークアミノ酸残基を、一般的な残基で置換した。これらのヒト化VHおよびVL領域をpCONγ1およびpCONκLonzaBiologics,Berkshire,UKなどであるが是に限定されるものではない発現ベクターに、それぞれクローニングした。これらのベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域をコードする。EffecteneシステムQiagen,Valencia,CAを使用して、293F細胞を一過的にこれらの発現ベクターでトランスフェクトした。分泌されたヒト化mAbを含む細胞上清をトランスフェクションの7日後に回収し、プロテインAクロマトグラフィを用いて精製した。C.ヒト化mAbを発現している安定したクローンCHO細胞の作製安定したCHO細胞/細胞株を作製することで、invitroでの細胞アッセイと、ゴールデンSyrianハムスターのクロストリジウムディフィシルC.difficile関連下痢症CDADモデルの両方で試験するだけの十分な量のmAbを産生できるようになる。一例として、安定したトランスフェクトCHO細胞を作製するためのグルタミンシンテターゼ選択および増幅システムGSを用いて、LonzaBiologicsBerkshire、UK由来のCHOK1SV細胞を使用することが可能である。LonzaGSシステムでは一般に、相当に大量のヒト化mAbを産生可能なCHO細胞株を高産生率で得られる。CHOK1SV細胞を、1×グルタミンInvitrogenおよび1×H/TSupplementInvitrogenを加えたCDCHO細胞培地Invitrogenで増やした。1×107個の生存可能な細胞を、290V、無限抵抗、960uFでで電気穿孔し、40μgの直線化プラスミドDNAを100μlの滅菌TE緩衝液に再懸濁させた。完全CDCHO培地50mlの入ったT-150フラスコに細胞を移し、37°C、8.0CO2下、約48時間インキュベートした。細胞を遠心処理し、100μMでのMSXSigmaの入ったGS選択培地CDCHO1XGSSupplementJRHBiosciences1XH/TSupplementに再懸濁させて最終密度を3.3×105個/mlとし、生存可能な細胞5000個/ウェルで96ウェルのプレートCorningに播種し、一次細胞コロニートランスフェクトした細胞のクローンが見え始めるまで約3~4週間インキュベートした。20μlの上清を慎重に除去して約300の細胞コロニークローンを組換えmAb作製用にサンプリングし、96ウェルフォーマットでELISAアッセイを実施した。簡単に説明すると、96ウェルのプレートにキャプチャー抗体ヤギ抗-ヒト抗体をコートした後、クローンCHOトランスフェクタント1:800に希釈由来の上清を加えて、プレートウェルに結合したキャプチャー抗体の結合を可能にした。洗浄後、二次抗体アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗-ヒト抗体をプレートに加え、試料のヒト抗体に結合させた上で、洗浄して非特異的な結合を除去した。その後、1ステップPNPPキットThermo,Rockford,ILを用いてアルカリホスファターゼ活性についてプレートをアッセイし、分泌抗体が最大量になるクローンを同定した。mAbの産生量が多いクローンを、1×グルタミンおよび1×H/TSupplementを加えたCDCHO細胞培地で増やした。分泌されたヒト化mAbを含む細胞上清を回収し、プロテインAを用いて精製した。産生率が最も高いクローンを限界希釈によってサブクローニングし、スケールアップしてグラム量の組換えヒト化モノクローナル抗体を得た。D.ヒト化mAbhPA-39、hPA-41、hPA-50分子クローニングしたヒト化mAbを上述したように単離し、キャラクタライズした以下のセクションEを参照のこと。各ヒト化抗体の軽L鎖定常領域CLがカッパκクラスのものであり、各ヒト化抗体の重H鎖定常領域CHはIgG1アイソタイプのものである。独特の可変V領域を含むヒト化mAbが、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはトキシンBの活性を結合および中和することがあきらかになった。ヒト化mAbのL鎖およびH鎖のV領域は、一般にジスルフィド結合でリンクした2つのH鎖ポリペプチドと2つのL鎖ポリペプチドからなる完全免疫グロブリンIgまたは抗体分子の一部をなすことがあり、あるいは、抗体の離散した一部または断片、特に、トキシンAおよび/またはトキシンBに結合および/またはトキシン活性を中和する抗体部分または断片のこともある。好適なV領域含有免疫グロブリン断片または部分の非限定的な例として、Fab断片、Fab’断片またはFab’2断片があげられる。ヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAおよびトキシンBmAbを上述した手順で作製した。ヒト化プロセスで、トキシンAに結合し、感受性細胞でトキシンA活性を中和するいくつかの抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAヒト化mAbhmAbを作製した。このようなhmAbの例として、配列番号1で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図32A、ヒトIgG1のC領域、配列番号3で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図33A、ヒトκC領域を含むヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAb;配列番号2で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図32B、ヒトIgG1のC領域、配列番号3で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図33A、ヒトκC領域を含む抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAhmAb;配列番号1で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図32A、ヒトIgG1のC領域、配列番号4で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド図33B、ヒトκC領域を含む抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAhmAb;および配列番号2で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図32B、ヒトIgG1のC領域、配列番号4で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図33B、ヒトκC領域を含む抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAhmAbがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、本発明のPA-39hmAbhPA-39を包含する。2つのL鎖と2つのH鎖を有する完全hPA-39免疫グロブリンを、本発明のVH領域たとえば、配列番号1;配列番号2と、たとえば、IgG1アイソタイプの好適なCH領域GenBank受託番号NW_001838121に含まれるものなどとからなるhPA-39H鎖ポリペプチドと、本発明のhPA-39VL領域たとえば、配列番号3;配列番号4と、たとえば、κサブタイプの好適なCL領域GenBank受託番号NW_001838785に含まれるものなどとからなるhPA-39のL鎖ポリペプチドとを同時発現し、分泌する宿主細胞で作製可能である。本発明のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbの他の例として、配列番号5で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図34A、ヒトIgG1のC領域、配列番号7で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図35、ヒトκC領域を含むヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAb;および配列番号6で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図34B、ヒトIgG1のC領域、配列番号7で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図35、ヒトκC領域を含むヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAmAbは、本発明のヒト化PA-50hPA-50mAbを包含する。2つのL鎖と2つのH鎖を有する完全hPA-50免疫グロブリンを、本発明のVH領域たとえば、配列番号5;配列番号6と、たとえばIgG1アイソタイプの好適なCH領域GenBank受託番号NW_001838121に含まれるものなどとからなるhPA-50H鎖ポリペプチドと、本発明のVL領域配列番号7と、たとえばκサブタイプのCL領域GenBank受託番号NW_001838785に含まれるものなどとからなるhPA-50のL鎖ポリペプチドとを同時発現して分泌する好適な宿主細胞で作製可能である。ヒト化プロセスでは、トキシンBに結合し、感受性細胞でinvitroにてトキシンB活性を中和する抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBヒト化mAbも得られた。このようなhmAbの例として、配列番号8で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図36A、ヒトIgG1のC領域、配列番号10で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図37、ヒトκC領域を含むヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAb;配列番号9で示すVH領域を含むH鎖ポリペプチド配列図36B、ヒトIgG1のC領域、配列番号10で示すVL領域を含むL鎖ポリペプチド配列図37、ヒトκC領域を含むヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAbがあげられる。このようなヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBmAbは、本発明のヒト化PA-41hPA-41mAbを包含する。2つのL鎖と2つのH鎖を有する完全hPA-41免疫グロブリンを、本発明のhPA-41VH領域たとえば、配列番号8;配列番号9と、たとえばIgG1アイソタイプの好適なCH領域GenBank受託番号NW_001838121で含まれるものなどとからなるhPA-41H鎖ポリペプチドと、本発明のhPA-41VL領域たとえば、配列番号10と、たとえばκサブタイプのCL領域GenBank受託番号NW_001838785に含まれるものなどとからなるhPA-41のL鎖ポリペプチドとを同時発現して分泌する好適な宿主細胞で作製可能である。また、クロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンAまたはトキシンBに結合し、トキシン活性を中和するヒト化クローンmAbhmAbを作製した。抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAhmAbPA-50が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む。配列番号14で示すhPA-50重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号15に示す図38B。配列番号16で示すhPA-50軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号17に示す図38A。抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンAhmAbPA-39が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む。配列番号18で示すhPA-39重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号19に示す図39B。配列番号20で示すhPA-39軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号21に示す図39A。抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンBhmAbPA-41が、2つの重鎖ポリペプチドと2つの軽鎖ポリペプチドとからなり、重鎖が各々、VH領域とヒトCH領域とを含み、軽鎖が各々、VL領域とヒトCL領域とを含む。配列番号22で示すhPA-41重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号23に示す図40B。配列番号24で示すhPA-41軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列またはcDNAを、配列番号25に示す図40A。対照のmAbとして使用するために、モノクローナル抗体CDA-1およびCDB17、89を調製した。3D8および124国際公開第2006/121422号パンフレットおよび米国特許出願公開第2005/0287150号明細書のIg重鎖および軽鎖可変領域をコードするDNA配列を合成しDNA2.0、ベクターpCON-γ1およびpCON-κにクローニングした。全長IgG1,κmAbを、安定的にトランスフェクトしたCHO-K1SV細胞で発現させ、上述したように精製した。BiacoreによってトキシンAおよびBに対する結合親和性、トキシンによる細胞傷害作用の阻害、血球凝集について刊行物に記載のある方法7で試験すると、CDA1およびCDB1調製物は想定レベルの活性を示した。E.ヒト化mAbのInVitroキャラクタリゼーションinvitroにてクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシンの中和実験を実施し、ヒト化mAbの機能的活性を親のマウスmAbの機能的活性と比較した。図29に示すように、ヒト化PA-41hPA-41mAbは、EC50が9pMであるマウスPA-41mAbmPA-41の場合と比較して、トキシンBの細胞毒性を強力に中和したEC50が6pM。同様に、hPA-39には図30、hPA-50には図31に示すように、CHO-K1細胞またはT-84細胞を用いてマウス親mAbと比較すると、トキシンAの中和にあたって、ヒト化PA-39mAbhPA-39およびヒト化PA-50mAbhPA-50は等しく強力であることが明らかになった。これらの結果から、親のマウスmAbのヒト化に成功し、ヒト化mAbが機能的かつ効果的であることがわかる。これらの研究で試験した抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンmAbのうち、PA-50が顕著な用量反応中和曲線を示し、ヒル係数が2つより典型的に大きかったことから、協同的阻害があることがわかった。協同的相互作用は、実際には一般的であり、急唆な用量反応曲線とヒル係数>1でキャラクタライズされることが多い。協同的活性を呈する医薬品は、ウイルス感染を治療する上での臨床活性の増大と関連していた。また、PA-50は、必要になることが多いが協同には十分でない条件である多価的にトキシンAに結合する。実施例11本発明のマウス抗トキシンmAbのFab断片の生成A.Fab断片の調製物マウスIgG1FabおよびFab’2調製キットPierceとキットに同梱されている試薬を用いて、製造業者の指示に従ってFab断片化を実施した。すべてのmAbすなわちPA-39、PA-41、PA-50で、断片化には同一のプロトコールを用いた。簡単に説明すると、固定化したフィチンスラリー750μlを消化緩衝液75mMシステイン、pH5.6で洗浄した後、約3mgのmAbを加え、コンスタントに転倒回転しながら混合物を37°Cで4時間インキュベートした。消化が終わったら、スラリーを遠心処理し、消化産物を回収した。スラリーをプロテインA結合緩衝液で3回洗浄し、洗浄材料を加えて消化を完了させた。NAbプロテインAカラムをプロテインA結合緩衝液で平衡化し、消化抗体試料を加えた。カラムおよび試料を室温にて10分間インキュベートした。カラムを1000gで1分間遠心処理し、Fab断片を含む通過画分を回収した。カラムをプロテインA結合緩衝液で3回洗浄した。通過画分を回収し、緩衝液をPBSに交換して、濃縮した。B.Fab断片のSDS-PAGENovexゲルシステムInvitrogenを用いてSDS-PAGEで試料を分析し、特に明記しないかぎり、以下に列挙する試薬はすべてInvitrogenから入手した。試料をNuPage試料緩衝液と混合し、DTTで還元した。還元試料と非還元試料を100°Cで10分間インキュベートした。試料4μgを4~12のBisTrisNuPageゲルにロードした後、MOPSランニング緩衝液を用いて180Vで60分間、電気泳動を実施した。電気泳動後、固定液40メタノール、10酢酸と一緒に20分間、ゲルをインキュベートし、水ですすぎ、コンスタントに回転しながらSimplyBlueStainで一晩染色した。C.FabのInvitroキャラクタリゼーションInvitroクロストリジウムディフィシルC.difficileのトキシン中和実験を実施して、結合部位数を基準にFab▲の機能的活性を完全mAb■の機能的活性と比較した。PA-39のFabは、完全PA-39よりもCHO-K1細胞でトキシンA細胞毒性を強く中和したそれぞれEC50が880pM、EC50が200pM図41A。PA-41のFabは、CHO-K1細胞でのトキシンB活性の中和にあたって完全PA-41と等しく強力なであることがわかったそれぞれEC50が88pM、EC50が80pM図41B。T-84細胞でのトキシンAの中和にあたっての完全PA-50mAbのEC50値100pMであったのに対し、PA-50のFabは、EC50値が1.8nMであった図41C。実施例12ヒト組織標本のヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンmAbの免疫組織化学的分析特定抗原の発現を研究する際の免疫組織化学検査IHCの値は、正常な組織と腫瘍組織における微小解剖の詳細と不均一性を評価できるようにするものである。IHCは、個々の細胞タイプにタンパク質を直接局在化できるので、他の分析方法よりも好都合である。正常な組織と腫瘍組織の遺伝子発現差を検出可能であり、同時に細胞数と組成の変化も把握できる。この技術の制約には、研究対象となる分子の低レベルの発現がゆえに偽陰性の結果が出る可能性があることと、同様のエピトープまたは他の抗原が共通のエピトープへの抗体結合がゆえに偽陽性の結果交差反応性が出ることである。これらの制約に対処するために、本研究は、陽性のトキシン特異的注射マウス対照標本で強く特異的な染色を示した各抗体で可能な限り最も低い濃度で実施した。ヒト化mAbPA-41およびPA-50をビオチン化し、副腎、膀胱、骨髄、乳房、小脳、大脳皮質、頸部、結腸、食道、目、ファロピウス管、心臓、回腸、空腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、卵巣、末梢神経、膵臓、上皮小体、脳下垂体、胎盤、前立腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、尿管、子宮、白血球を含む凍結ヒト組織の選択時に免疫組織化学的結合パターンを判断した。上述の37の異なるヒト組織タイプの各々の組織1つを、各抗体で染色した。両方の抗体にウォーキングWorkingIHCアッセイを開発した。無関係のヒトのIgG1,κ、アイソタイプ対照抗体を、すべての試料に含めた。組織調製で、OCT化合物に埋包した凍結標本OptimalCuttingTemperature埋包化合物;Sakura,Torrance,CAを5ミクロンに切片化し、正に荷電したスライドガラスに載せた。各抗体および組織標本のIHC染色方法と条件を開発し、試験し、最適化した。新たに切り出した未固定の凍結組織切片を用いて直接的なビオチン化IHC手順を実施した。スライドをクライオスタットから取り出し、室温で10分間空気乾燥させ、95エタノールで室温にて5分間固定した後、Tris緩衝生理食塩水/0.1Tween-20洗浄緩衝液TBST;DakoCytomationの3回連続浴で3分間洗浄した。以後の洗浄はいずれも同様にして実施した。室温にてすぐに使える状態のペルオキシダーゼブロックで5分間インキュベーションして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。緩衝液での洗浄後、アビジンに続いてビオチンで15分間インキュベーションして、内因性ビオチン活性をブロックした。このとき、ステップごとに緩衝液で洗浄した。PA-41では、スライドをBackgroundSniperタンパク質ブロッキング試薬で10分間、室温にてインキュベートし、その後の緩衝液での洗浄は実施しなかった。スライドを被検物品または負の対照試薬PA-41に対し1.25mg/mlおよびPA-50に対し10mg/mlと一緒に室温にて30分間インキュベートした。PA-50の一次抗体をDako希釈剤で1:350に希釈し、PA-41一次抗体については、プロリン250mM、0.576g、Genzyme,CAおよびヒスチジン15mM、0.046g、Genzyme,CAを20mlの希釈剤pH7.7に加えてDako希釈剤で1:3520に希釈した。TBSTでの洗浄後、両方の抗体アッセイでABC検出試薬TBST中1:50を組織切片に適用し、室温にて30分間インキュベートした後、緩衝液で洗浄した。3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩DAB溶液で室温にて5分間インキュベートして、免疫反応を可視化した。スライドを脱イオンDI水で各30~60秒、3回すすぎ、修飾MayersヘマトキシリンDakoCytomationで対比染色し、0.2アンモニアで青くして、等級アルコールで脱水し、キシレンでクリアにして、カバースリップを載せた。染色スライドの解釈を顕微鏡検査で実施した。概して、抗体染色後のスライド上の組織を形態学的に検査して、適切な量の組織が存在するか否か、指定の正常な組織要素が適宜現れたか否かを判断した。上記の標準を満たさなかった試料を、研究病理学者による分析から除外した。スコアリングシステムには、染色強度の半定量的な分析を含む。被検物品の染色強度を、負の対照抗体で染色した隣接する切片を含む組織対照スライドの強度に比して判断した。負の試薬対照で標識した切片の染色を、バックグラウンド染色とみなした。0のスコアはバックグラウンドに対して染色なしを示し、1が弱い染色、2が中程度の染色、3が強い染色を示した。病理学での標準的なやり方で、すべての組織要素で観察された強度の最高レベルとして染色強度を報告した。ヒト化PA-50およびPA-41mAbの両方でのIHC分析の結果は、試験したどのヒト組織標本でも陽性染色0が認められなかったというものである。トキシンを注射したマウスの脚筋肉対照組織PA-50にはトキシンA、PA-41にはトキシンBでは、研究全体で一貫した強い染色たとえば、3が示された。PA-50の場合、どの組織試料にも真の陽性染色が認められなかった。すなわち100の細胞が染色0だった。PA-41では、試験した37のヒト組織で真の陽性染色が認められなかったが、正常な肝臓リポクローム色素による、正常な肺異物のある肺マクロファージおよび正常な筋肉アーチファクト染色の反応と一貫するの最高染色強度で弱い1陽性染色が見られた。このようなPA-41の弱い染色値については、全対照と最小染色のばらつきからみれば、ささいであるとみなした。実施例13非ヒト霊長類におけるヒト化抗クロストリジウムディフィシルC.difficileトキシンmAbの薬物動態分析精製ヒト化mAbPA-41またはmAbPA-50を用いて未感作ではないカニクイザルでの薬物動態PK研究を実施した。この研究では、雄の未感作ではないカニクイザルMacacafascicularisに1mg/kg/匹または5mg/kg/匹の精製ヒト化mAbPA-41またはmAbPA-50を静脈内注射した。InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeIACUCのポリシーと手順に沿って研究を実施した。表8は、各mAb濃度10mg/kgを未感作ではない動物に2用量レベルで静脈内投与したことを示すPK研究フォーマットを示す。研究開始時に動物に研究抗体を1回静脈内注射した。その後、29日間の間に14の別々の時点ですなわち投与前;1日目に0.5時間、2時間、6時間、12時間、24時間投与後;3日目、4日目、7日目、9日目、12日目、15日目、22日目、29日目、各動物から末梢血管の静脈穿刺によって血液試料を得た。血液試料を血清分離管に回収し、凝固するまで湿った氷上に維持した。凝固後、血液試料を1800gで15分間、4°Cで遠心処理して血清を得た。血清試料を使用するまで-70°Cで保管した。ELISAで血清中のmAb濃度を求めた。96ウェルのELISAプレートThermoFisherScientific,Rochester,NYを、100ng/ウェルのトキシンATechlabまたはトキシンBTechlabで4°Cにて一晩コートした。プレートをPBS/0.05Tween-20登録商標PBS-Tで3回洗浄し、200μlのブロッキング緩衝液PBS、カルシウムまたはマグネシウムなし、0.1Tween20登録商標、1カゼインで室温にて1時間ブロックした。抗体参照標準精製mAbPA-41またはmAbPA-50を1のプールした未感作のカニクイザル血清Bioreclamationで希釈し、0.3~4000ng/mlの範囲の標準曲線を作成した。希釈した被験試料および標準を三重に試験し、室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBS-Tで6回洗浄し、HRP結合ヤギ抗-ヒトIgG1TheBindingSite,SanDiego,CAとともに室温で1時間インキュベートした。プレートをSureBlueTMB1-コンポーネントのペルオキシダーゼ基質KPLでデベロップし、1Nの塩酸ThermoFisherScientificで止めて、SpectraMaxプレートリーダーMolecularDevicesで450nmにて読み取った。標準曲線を用いて、異なる時点の各サルでのmAb濃度を算出した。WinNonLin、Version4.0PharsightCorp.,MountainView,CAを用いてノンコンパートメントの薬物動態分析を実施した。ヒト化mAbPA-50でのPKの結果を図42Aに示す。ヒト化mAbPA-41での結果を図42Bに示す。用量1mg/kgおよび5mg/kgのPA-50では、平均T1/2日は14.5±0.3および12.3±1.5であった。用量1mg/kgおよび5mg/kgのPA-41では、平均T1/2日は8.9±1.3および9.2±3.3であった。参考文献1BartlettJGTWChangMGurwithSLGorbachandABOnderdonk1978AntibioticassociatedpseudomembranouscolitisduetotoxinproducingclostridiaTheNewEnglandJournalofMedicine2985315342KyneLRJFarrellandCPKelly2001ClostridiumdifficileGastroenterolClinNorthAm307537773KellyCPandJTLaMont2008ClostridiumdifficilemoredifficultthaneverTheNewEnglandJournalofMedicine359193219404MacCannellDRTJLouieDBGregsonMLaverdiereACLabbeFLaingandSHenwick2006MolecularanalysisofClostridiumdifficilePCRribotype027isolatesfromEasternandWesternCanadaJClinMicrobiol44214721525McDonaldLCGEKillgoreAThompsonRCOwensJrSVKazakovaSPSambolSJohnsonandDNGerding2005AnepidemictoxingenevariantstrainofClostridiumdifficileTheNewEnglandJournalofMedicine353243324416WarnyMJPepinAFangGKillgoreAThompsonJBrazierEFrostandLCMcDonald2005ToxinproductionbyanemergingstrainofClostridiumdifficileassociatedwithoutbreaksofseverediseaseinNorthAmericaandEuropeLancet366107910847BabcockGJTJBroeringHJHernandezRBMandellKDonahueNBoatrightAMStackILowyRGrazianoDMolrineDMAmbrosinoandWDThomasJr2006HumanmonoclonalantibodiesdirectedagainsttoxinsAandBpreventClostridiumdifficileinducedmortalityinhamstersInfectImmun74633963478BartlettJG1981AntimicrobialagentsimplicatedinClostridiumdifficiletoxinassociateddiarrheaofcolitisJohnsHopkinsMedJ149699McFarlandLVMEMulliganRYKwokandWEStamm1989NosocomialacquisitionofClostridiumdifficileinfectionTheNewEnglandJournalofMedicine32020421010ZilberbergMDAFShorrandMHKollef2008IncreaseinadultClostridiumdifficilerelatedhospitalizationsandcasefatalityrateUnitedStates20002005EmergInfectDis1492993111RileyTVCoddeJPandRousILIncreasedlengthofhospitalstayduetoClostridiumdifficileassociateddiarrhoeaLancet345455456218199512OBrienJABJLahueJJCaroandDMDavidson2007TheemerginginfectiouschallengeofclostridiumdifficileassociateddiseaseinMassachusettshospitalsclinicalandeconomicconsequencesInfectControlHospEpidemiol281219122713RedelingsMDFSorvilloandLMascola2007IncreaseinClostridiumdifficilerelatedmortalityratesUnitedStates19992004EmergInfectDis131417141914LooVGLPoirierMAMillerMOughtonMDLibmanSMichaudAMBourgaultTNguyenCFrenetteMKellyAVibienPBrassardSFennKDewarTJHudsonRHornPReneYMonczakandADascal2005ApredominantlyclonalmultiinstitutionaloutbreakofClostridiumdifficileassociateddiarrheawithhighmorbidityandmortalityTheNewEnglandJournalofMedicine3532442244915WarnyMKC2003PathogenicityofClostridiumdifficiletoxinsWashingtonDCASMPress36650352416KellyCPCPothoulakisandJTLaMont1994ClostridiumdifficilecolitisTheNewEnglandJournalofMedicine33025726217LyerlyDMDELockwoodSHRichardsonandTDWilkins1982BiologicalactivitiesoftoxinsAandBofClostridiumdifficileInfectImmun351147115018McFarlandLVHWBenedaJEClarridgeandGJRaugi2007ImplicationsofthechangingfaceofClostridiumdifficilediseaseforhealthcarepractitionersAmJInfectControl3523725319DrudyDTQuinnROMahonyLKynePOGaoraandSFanning2006HighlevelresistancetomoxifloxacinandgatifloxacinassociatedwithanovelmutationingyrBintoxinAnegativetoxinBpositiveClostridiumdifficileJAntimicrobChemother581264126720RupnikMNKatoMGrabnarandHKato2003NewtypesoftoxinAnegativetoxinBpositivestrainsamongClostridiumdifficileisolatesfromAsiaJClinMicrobiol411118112521VothDEandJDBallard2005ClostridiumdifficiletoxinsmechanismofactionandroleindiseaseClinMicrobiolRev1824726322ReinekeJSTenzerMRupnikAKoschinskiOHasselmayerASchrattenholzHSchildandCEichelStreiber2007AutocatalyticcleavageofClostridiumdifficiletoxinBNature44641541923AslamSRJHamillandDMMusher2005TreatmentofClostridiumdifficileassociateddiseaseoldtherapiesandnewstrategiesLancetInfectDis554955724MusherDMSAslamNLoganSNallacheruIBhailaFBorchertandRJHamill2005RelativelypooroutcomeaftertreatmentofClostridiumdifficilecolitiswithmetronidazoleClinInfectDis401586159025PepinJMEAlaryLValiquetteERaicheJRuelKFulopDGodinandCBourassa2005IncreasingriskofrelapseaftertreatmentofClostridiumdifficilecolitisinQuebecCanadaClinInfectDis401591159726FeketyRandABShah1993DiagnosisandtreatmentofClostridiumdifficilecolitisJAMA269717527FeketyRLVMcFarlandCMSurawiczRNGreenbergGWElmerandMEMulligan1997RecurrentClostridiumdifficilediarrheacharacteristicsofandriskfactorsforpatientsenrolledinaprospectiverandomizeddoubleblindedtrialClinInfectDis2432433328PothoulakisCandJTLaMont1993ClostridiumdifficilecolitisanddiarrheaGastroenterolClinNorthAm2262363729McFarlandLVCMSurawiczRNGreenbergRFeketyGWElmerKAMoyerSAMelcherKEBowenJLCoxZNooraniand1994ArandomizedplacebocontrolledtrialofSaccharomycesboulardiiincombinationwithstandardantibioticsforClostridiumdifficilediseaseJAMA2711913191830McFarlandLVGWElmerandCMSurawicz2002Breakingthecycletreatmentstrategiesfor163casesofrecurrentClostridiumdifficilediseaseAmJGastroenterol971769177531KyneLMWarnyAQamarandCPKelly2000AsymptomaticcarriageofClostridiumdifficileandserumlevelsofIgGantibodyagainsttoxinATheNewEnglandJournalofMedicine34239039732KyneLMWarnyAQamarandCPKelly2001AssociationbetweenantibodyresponsetotoxinAandprotectionagainstrecurrentClostridiumdifficilediarrhoeaLancet35718919333LeavBBlairBLeneyMKnauberMReillyCLowyIKohbergerRGerdingDNKellyCKatcharKBaxterRandAmbrosinoD2008SerumantitoxinBantibodycorrelateswithprotectionfromrecurrentClostridiumdifficileassociateddiarrheaICAACIDSAPosterB1295200834WilcoxMHWNFawleyCDSettleandADavidson1998RecurrenceofsymptomsinClostridiumdifficileinfectionrelapseorreinfectionJHospInfect389310035JodlowskiTZROehlerLWKamandIMelnychuk2006EmergingtherapiesinthetreatmentofClostridiumdifficileassociateddiseaseAnnPharmacother402164216936MissaghiBAJValentiandRCOwensJr2008ClostridiumdifficileInfectionACriticalOverviewCurrInfectDisRep1016517337OptimerPharmaceuticalsNewsReleaseNovember10200838LouieTJJPeppeCKWattDJohnsonRMohammedGDowKWeissSSimonJFJohnJrGGarberSChasanTaberandDMDavidson2006TolevameranovelnonantibioticpolymercomparedwithvancomycininthetreatmentofmildtomoderatelysevereClostridiumdifficileassociateddiarrheaClinInfectDis4341142039LouieTGMGDeal2007ResultsofaphaseIIItrialcomparingtolevamervancomycinandmetronidazoleinpatientswithClostridiumdifficileassociateddiarrhea47thInterscienceConferenceonAntimicrobialAgentsandChemotherapy40KellyCPCPothoulakisJOrellanaandJTLaMont1992HumancolonicaspiratescontainingimmunoglobulinAantibodytoClostridiumdifficiletoxinAinhibittoxinAreceptorbindingGastroenterology102354041SalcedoJSKeatesCPothoulakisMWarnyICastagliuoloJTLaMontandCPKelly1997IntravenousimmunoglobulintherapyforsevereClostridiumdifficilecolitisGut4136637042LeungDYCPKellyMBoguniewiczCPothoulakisJTLaMontandAFlores1991TreatmentwithintravenouslyadministeredgammaglobulinofchronicrelapsingcolitisinducedbyClostridiumdifficiletoxinJPediatr11863363743MedarexandMassachusettsBiologicLaboratoriesNewsReleaseNovember3200844KamiyaSKYamakawaXQMengHOguraandSNakamura1991ProductionofmonoclonalantibodytoClostridiumdifficiletoxinAwhichneutralizesenterotoxicitybutnothaemagglutinationactivityFEMSMicrobiolLett6531131545KinkJAandJAWilliams1998AntibodiestorecombinantClostridiumdifficiletoxinsAandBareaneffectivetreatmentandpreventrelapseofCdifficileassociateddiseaseinahamstermodelofinfectionInfectImmun662018202546LyerlyDMCJPhelpsJTothandTDWilkins1986CharacterizationoftoxinsAandBofClostridiumdifficilewithmonoclonalantibodiesInfectImmun54707647HarlowEandLaneDAntibodiesalaboratorymanualColdSpringharborLaboratoryPressColdSpringharborNewYork198848ClarkGFHCKrivanTDWilkinsandDFSmith1987ToxinAfromClostridiumdifficilebindstorabbiterythrocyteglycolipidswithterminalGalalpha13Galbeta14GlcNAcsequencesArchBiochemBiophys25721722949AntonPMMOBrienEKokkotouBEisensteinAMichaelisDRothsteinSParaschosCPKellyandCPothoulakis2004RifalaziltreatsandpreventsrelapseofclostridiumdifficileassociateddiarrheainhamstersAntimicrobAgentsChemother483975397950BossSMCLGriesBKKirchnerGDSmithandPCFrancis1994UseofvancomycinhydrochloridefortreatmentofClostridiumdifficileenteritisinSyrianhamstersLabAnimSci44313751FreemanJSDBainesDJabesandMHWilcox2005ComparisonoftheefficacyoframoplaninandvancomycininbothinvitroandinvivomodelsofclindamycininducedClostridiumdifficileinfectionJAntimicrobChemother5671772552KinkJAandJAWilliams1998AntibodiestorecombinantClostridiumdifficiletoxinsAandBareaneffectivetreatmentandpreventrelapseofCdifficileassociateddiseaseinahamstermodelofinfectionInfectImmun662018202553KokkotouEACMossAMichosDEspinozaJWCloudNMustafaMOBrienCPothoulakisandCPKelly2008ComparativeefficaciesofrifaximinandvancomycinfortreatmentofClostridiumdifficileassociateddiarrheaandpreventionofdiseaserecurrenceinhamstersAntimicrobAgentsChemother521121112654KurtzCBEPCannonABrezzaniMPitruzzelloCDinardoERinardDWAchesonRFitzpatrickPKellyKShackettATPapoulisPJGoddardRHBarkerJrGPPalaceandJDKlinger2001GT160246atoxinbindingpolymerfortreatmentofClostridiumdifficilecolitisAntimicrobAgentsChemother452340234755McVayCSandRDRolfe2000InvitroandinvivoactivitiesofnitazoxanideagainstClostridiumdifficileAntimicrobAgentsChemother442254225856RazaqNSSambolKNagaroWZukowskiACheknisSJohnsonandDNGerding2007InfectionofhamsterswithhistoricalandepidemicBItypesofClostridiumdifficileJInfectDis1961813181957FernieDSROThomsonIBattyandPDWalker1983ActiveandpassiveimmunizationtoprotectagainstantibioticassociatedcaecitisinhamstersDevelopmentalBiologyStandard5332533258GiannascaPJZXZhangWDLeiJABodenMAGielTPMonathandWDThomasJr1999SerumantitoxinantibodiesmediatesystemicandmucosalprotectionfromClostridiumdifficilediseaseinhamstersInfectImmun6752753859KimPHJPIaconisandRDRolfe1987ImmunizationofadulthamstersagainstClostridiumdifficileassociatedileocecitisandtransferofprotectiontoinfanthamstersInfectImmun552984299260LyerlyDMEFBostwickSBBinionandTDWilkins1991PassiveimmunizationofhamstersagainstdiseasecausedbyClostridiumdifficilebyuseofbovineimmunoglobulinGconcentrateInfectImmun592215221861KellyCPCPothoulakisFVavvaICastagliuoloEFBostwickJCOKeaneSKeatesandJTLaMont1996AntiClostridiumdifficilebovineimmunoglobulinconcentrateinhibitscytotoxicityandenterotoxicityofCdifficiletoxinsAntimicrobAgentsChemother4037337962DelmeeMMHomelandGWauters1985SerogroupingofClostridiumdifficilestrainsbyslideagglutinationJClinMicrobiol2132332763DelmeeMVAvesaniNDelferriereandGBurtonboy1990CharacterizationofflagellaofClostridiumdifficileandtheirroleinserogroupingreactionsJClinMicrobiol282210221464BarbutFARichardKHamadiVChometteBBurghofferandJCPetit2000EpidemiologyofrecurrencesorreinfectionsofClostridiumdifficileassociateddiarrheaJClinMicrobiol382386238865CarswellCIGLPloskerandAJWagstaff2001DaclizumabareviewofitsuseinthemanagementoforgantransplantationBioDrugs1574577366WilandAMandBPhilosophe2004DaclizumabinductioninsolidorgantransplantationExpertOpinBiolTher472974067FentonCLJScottandGLPlosker2004PalivizumabareviewofitsuseasprophylaxisforseriousrespiratorysyncytialvirusinfectionPaediatrDrugs617719768WuHDSPfarrYTangLLAnNKPatelJDWatkinsWDHusePAKienerandJFYoung2005UltrapotentantibodiesagainstrespiratorysyncytialviruseffectsofbindingkineticsandbindingvalenceonviralneutralizationJMolBiol35012614469RomeroJRPalivizumabprophylaxisofrespiratorysyncytialvirusdiseasefrom1998to2002resultsfromfouryearsofpalivizumabusagePediatrInfectDis22S46S54200370CarterPLPrestaCMGormanJBRidgwayDHennerWLWongAMRowlandCKottsMECarverandHMShepard1992Humanizationofanantip185HER2antibodyforhumancancertherapyProcNatlAcadSciUSA894285428971EmensLA2005TrastuzumabtargetedtherapyforthemanagementofHER2neuoverexpressingmetastaticbreastcancerAmJTher1224325372FinnRSandDJSlamon2003MonoclonalantibodytherapyforbreastcancerherceptinCancerChemotherBiolResponseModif2122323373GilesFEEsteyandSOBrien2003GemtuzumabozogamicininthetreatmentofacutemyeloidleukemiaCancer982095210474SiemoneitKSCardosoMdaKKoernerAWolplandBKubanek1995HumanmonoclonalantibodiesfortheimmunologicalcharacterizationofahighlyconservedproteindomainofthehepatitisCvirusglycoproteinE1ClinExpImmunol1012788375CasaleTB2004OmalizumabaneffectiveantiIgEtreatmentforallergicasthmaandrhinitisDrugsToday4036737676HolgateSTRDjukanovicTCasaleandJBousquet2005AntiimmunoglobulinEtreatmentwithomalizumabinallergicdiseasesanupdateonantiinflammatoryactivityandclinicalefficacyClinExpAllergy3540841677PrestaLGSJLahrRLShieldsJPPorterCMGormanBMFendlyandPMJardieu1993HumanizationofanantibodydirectedagainstIgETheJournalofImmunology1512623263278JordanJK2005EfalizumabforthetreatmentofmoderatetosevereplaquepsoriasisAnnPharmacother391476148279WertherWATNGonzalezSJOConnorSMcCabeBChanTHotalingMChampeJAFoxPMJardieuPWBermanandLGPresta1996Humanizationofanantilymphocytefunctionassociatedantigen1monoclonalantibodyandreengineeringofthehumanizedantibodyforbindingtorhesusLFA1TheJournalofImmunology1574986499580LeonardiCL2004CurrentconceptsandreviewofefalizumabinthetreatmentofpsoriasisDermatolClin2242743581FerraraNKJHillanHPGerberandWNovotny2004DiscoveryanddevelopmentofbevacizumabanantiVEGFantibodyfortreatingcancerNatRevDrugDiscov339140082PrestaLGHChenSJOConnorVChisholmYGMengLKrummenMWinklerandNFerrara1997HumanizationofanantivascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibodyforthetherapyofsolidtumorsandotherdisordersCancerRes574593459983SteinmanL2005BlockingadhesionmoleculesastherapyformultiplesclerosisnatalizumabNatRevDrugDiscov451051884FagnaniR1994TheimmunogenicityofforeignmonoclonalantibodiesinhumandiseaseapplicationsproblemsandcurrentapproachesImmunolSer6132285MateoCEMorenoKAmourJLombarderoWHarrisandRPerez1997HumanizationofamousemonoclonalantibodythatblockstheepidermalgrowthfactorreceptorrecoveryofantagonisticactivityImmunotechnology3718186ReichertJMCJRosensweigLBFadenandMCDewitz2005MonoclonalantibodysuccessesintheclinicNatBiotechnol231073107887StephensSSEmtageOVetterleinLChaplinCBebbingtonANesbittMSopwithDAthwalCNovakandMBodmer1995ComprehensivepharmacokineticsofahumanizedantibodyandanalysisofresidualantiidiotypicresponsesImmunology8566867488CoMSNMAvdalovicPCCaronMVAvdalovicDAScheinbergandCQueen1992ChimericandhumanizedantibodieswithspecificityfortheCD33antigenJImmunol1481149115489LowyIetal2010TreatmentwithmonoclonalantibodiesagainstClostridiumdifficiletoxinsNEnglJMed36219720590BabcockGJetalHumanMonoclonalAntibodiesNeutralizeToxinsProducedbyEpidemicStrainsofClostridiumdifficiletheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica43rdAnnualMeetingOctober692005SanFranciscoCalifornia91OptimerPharmaceuticalsReportsPositiveDatafromitsNorthAmericanPhase3CDIStudyofOPT80OptimerPharmaceuticalsPressRelease92RothmanSWToxicon1988265839793WO2005US0047100toDiversa94CheknisAKetalDistributionofClostridiumdifficilestrainsfromaNorthAmericanEuropeanandAustraliantrialoftreatmentforCdifficileinfections20052007Anaerobe1523023395GerdingDetalRestrictionendonucleaseanalysistypingofClostridiumdifficileinaphase3treatmenttrialoffidaxomicinvsvancomycinDecreasedcurerateforepidemicBINAP1027strain49thInterscienceConferenceonAntimicrobialAgentsandChemotherapyAbstractL11642SanFranciscoCASeptember12152009以上、例示目的で本発明について詳細に説明してきたが、このような詳細は単に説明目的のものにすぎず、当業者であれば以下の特許請求の範囲に規定の本発明の意図および範囲を逸脱することなく改変可能であることは、理解されたい。本出願で引用したすべての参考文献、特許、公開公報の内容を、本明細書に援用する。参考文献の一覧は、その参考文献が従来技術であることを認めるものではない。"