"図1Aに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。CON6HIVgp160タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図1Dに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載の核酸。サブタイプC先祖HIVエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図6Aに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の核酸。サブタイプCコンセンサスHIVエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図6Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の核酸。図6C又は6Dに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。サブタイプCコンセンサスHIVgagタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図13Eに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項9に記載の核酸。サブタイプCコンセンサスHIVnefタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図13Fに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の核酸。グループMコンセンサスHIVエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図14Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の核酸。サブタイプAコンセンサスHIVエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図18Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の核酸。グループMコンセンサスHIVgagタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図19Aに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項17に記載の核酸。グループMコンセンサスHIVpolタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図19Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項19に記載の核酸。グループMコンセンサスHIVnefタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図19Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載の核酸。サブタイプCコンセンサスHIVpolタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図19Dに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項23に記載の核酸。サブタイプBコンセンサスHIVgagタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図20Aに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項25に記載の核酸。サブタイプBコンセンサスHIVエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列がヒト細胞中での発現のために最適化されているコドンを含む、核酸。前記核酸が図20Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項27に記載の核酸。図20C又は20Dに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。図26Aに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項30に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図26Bに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項31に記載の核酸。図28Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項33に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図28Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項34に記載の核酸配列。図29Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項36に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図29Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載の核酸配列。図30Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項39に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図30Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項40に記載の核酸配列。図31Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項42に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図31Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項43に記載の核酸配列。図32Bに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項45に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図32Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項46に記載の核酸配列。図33Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項48に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図33Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項49に記載の核酸配列。図34Bに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項51に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図34Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項52に記載の核酸配列。図35Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項54に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図35Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項55に記載の核酸配列。図36Bに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項57に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図36Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項58に記載の核酸配列。図37Bに記載されたアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項60に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図37Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項61に記載の核酸配列。図38Bに記されているアミノ酸の配列を含む単離されたタンパク質。請求項63に記載されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。前記核酸が図38Cに記されているヌクレオチド配列を含む、請求項64に記載の核酸配列。図39Aから127Aの何れか一つに記されているアミノ酸配列のCF又はCFI形態を含む単離されたタンパク質。図39Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図40Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図41Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図42Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図43Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図44Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図45Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図46Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図47Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図48Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図49Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図50Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図51Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図52Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図53Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図54Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図55Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図56Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図57Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図58Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図59Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図60Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図61Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図62Bに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図63Bから84B、65D、67D及び68Dの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図85Bから106B、88D、90D及び92Dの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。図107Bから127B、109D、111D及び112Dの何れか一つに記されているヌクレオチド配列を含む核酸。請求項2から7、9から28、31、32、34、35、37、38、40、41、43、44、46、47、49、50、52、53、55、56、58、59、61、62、64、65及び67から93の何れか一項に記載の核酸を含むベクター。請求項1から93の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質又は核酸と、担体とを含む組成物。哺乳動物に免疫応答を誘導するのに十分な量の、請求項1から93の何れか一項に記載の少なくとも一つのタンパク質及び/又は核酸を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に免疫応答を誘導する方法。人工HIV-1グループMコンセンサスエンベロープ実験の詳細組換えワクシニアウイルスVVにおけるCON6gp120及びgp140タンパク質の発現。分泌型のHIV-1CON6エンベロープタンパク質を発現及び精製するために、それぞれ、gp120切断部位REKRの後、及び膜貫通ドメインYIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVNの前に停止コドンを導入することによって、CON6gp120及びgp140CFプラスミドを構築した。140CFタンパク質中では、gp120/gp41切断部位及びgp41の融合ドメインを欠失した。CON6gp120及びgp140CFDNA構築物の両者を、pSC65ベクターBernardMoss,NIH,Bethesda,MDから購入中のSalI及びKpnI制限酵素部位にクローニングした。このベクターは、p7.5プロモーターによって調節されるlacZ遺伝子を含有する。CON6env遺伝子を発現するために、逆並列PE/Lプロモーターback-to-backPE/Lプロモーターを使用した。BSC-1細胞を、6ウェルプレート中の各ウェル中に、2×105個で播種し、0.1pfu/細胞のMOIで野生型ワクシニアウイルスWRで感染させ、感染の2時間後に、CON6env遺伝子を含有するpSC65由来のプラスミドをVV感染細胞中に形質移入し、記載どおりにMossandEarl,CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds,AusubeletalJohnWileySons,Inc.Indianapolis,INpp.16.15.1-16.19.91998、組換えrVVを選択した。PCR及び配列決定分析によって、CON6env遺伝子を含有する組換えVVを確認した。CON6エンベロープタンパク質の発現は、SDS-PAGE及びウェスタンブロットアッセイによって確認した。アガロースガランサスニヴァリスレクチンビーズVectorLabs,Burlingame,CAで、組換えCON6gp120及びgp140CFを精製し、使用するまで、-70°Cに保存した。組換えVV発現JRFLvCB-28又は96ZM651vT241Rgp160は、NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramBethesda,MDから入手した。モノクローナル抗体及びgp120野生型エンベロープgp120A32、gp120V3ループF39F及びCCR5結合部位17b上の高次構造決定基に対するヒトmabは、JameRobinsonから頂いたWyattetalJVirol6957235733。Mab2F5、447、bl2、2G12及び可溶性CD4は、NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramNyambietalJVirol7062356243PurtscheretalAIDSResHumRetroviruses1016511658TrkolaetalJVirol7011001108から入手した。T8は、gp120C1領域に位置するマウスのmapであるP.Earl,NIH,Bethesda,MDから頂いた。。BaLサブタイプB、96ZM651サブタイプC及び93TH975サブタイプEgp120は、QBI,Inc.及びNIHのAIDS部門によって提供された。92U037サブタイプA及び93BR029サブタイプFgpl40分泌及び非切断を発現するCHO細胞株は、イギリスのNICBSから入手した。表面プラズモン共鳴バイオセンサーSPR測定及びELISASPRバイオセンサー測定は、BIAcore3000装置BIAcoreInc.,Uppsala,Sweden装置上で行い、データ解析は、BIAevaluation3.0softwareBIAcoreInc,Upsaala,Swedenを用いて行った。タンパク質固定化に対する標準的なアミンカップリングプロトコールを用いて、10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.5中の抗gp120mabT8、A32、17b、2G12又はsCD4を、CM5センサーチップに直接固定した。FPLC精製されたCON6gp120単量体又はgp140CFオリゴマー組換えタンパク質を、それぞれ、100及び300μg/mLの濃度で、CM5センサーチップ上に流した。非特異的応答又は一括応答を差し引くために、アミンカップリングに対して活性化及び脱活性化された盲検の直列参照表面又は非結合mab対照を使用した。それぞれ、陽性対照及び陰性対照として、CON6Envタンパク質を注入する前に各mab表面の活性を確保するために、可溶性89.6gp120及び無関係のIgGを使用した。CON6エンベロープタンパク質の結合は、PBS150mMNaCl、0.005界面活性剤P20、pH7.4を、10から30μL/分で連続的に流して、25°Cでリアルタイムにモニターした。結合したタンパク質を除去し、5ないし10μLの再生溶液10mMグリシン-HCl、pH2.9を単回又は二回、短時間与えることによって、各結合サイクルの後に、センサー表面を再生した。記載のとおりHaynesetal,AIDSRes.Hum.Retroviruses11:211-2211995、CON6gp120及びgp140CFタンパク質に対する様々なのmabの反応性を決定するために、ELISAを行った。ヒトmabのrgp120又はgp140タンパク質への結合のアッセイの場合、終点力価は、mabが結合したCON6gp120及びgp140CFEnvタンパク質がバックグラウンド対照非結合ヒトmabに比べて3倍以上である、mabの最高力価20μg/mLで開始として定義した。感染性及び共同受容体使用アッセイHIV-1/SG3Δenv及びCON6又は対照envプラスミドをヒト293T細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、ろ過し、p24濃度を定量したDuPont/NENLifeSciences,Boston,MA。JC53-Bl細胞を感染させて、感染性を決定するために、各擬ビリオンに対して等量のp245ngを使用したDerdeynetal,J.Virol.74:8358-83672000,Weietal,AntimicrobAgentsChemother.46:1896-19052002。JC53-BL細胞は、CD4、CCR5及びCXCR4受容体を発現し、HIV-1末端反復配列LTRの転写調節下で安定的に組み込まれたβ-ガラクトシダーゼβ-gal遺伝子を含有する。これらの細胞は、β-gal発現を染色し、1μgの擬ビリオンのp24当たりの青い細胞の数感染単位IU/μgp24を計数することによって、擬ビリオン株の感染性力価を定量するために使用することができるDerdeynetal,J.Virol.74:8358-83672000,Weietal,AntimicrobAgentsChemother.46:1896-19052002。CON6env遺伝子の共同受容体の使用を決定するために、JC53BL細胞を、1.2AMAMD3100及び4μMTAK-799により、1時間37°Cで処理した後、等量の各Env偽型ウイルスのp245ngに感染させた。遮断効率は、遮断剤なしの対照培養から得たものと比較した、遮断実験由来の感染単位のパーセントとして表した。対照グループからの感染性遮断剤なしを任意に100として設定した。免疫化。全ての動物は、DukeUniversityAnimalUseandCareCommitteeによって認可された動物使用プロトコールを使用し、AALACガイドラインに基づいて、DukeUniversityAnimalFacility中で飼育した。メーカーSigmaChemicalCo.,St.Louis,MOによって提供されたプロトコールに基づき、RIBI-CWSアジュバントを加えた安定なエマルジョン中に、組換えCON6gp120及びgp140CF糖タンパク質を調合した。抗エンベロープ抗体を誘導するために、非近交系の4匹の各モルモットHarlanSprague,Inc.,Chicago,ILに、精製された100μgのCON6gp120又はgp140CFのうち何れかを3週ごとに皮下投与した計5回の免疫化。血清試料を熱で不活化し56°C、1時間、使用するまで-20°Cで保存した。抗エンベロープT細胞応答を誘導するために、6から8週齢の雌のBALB/cマウスFrederickCancerResearchandDevelopmentalCenter,NCI,Frederick,MDの大腿四頭筋に、3週の間隔を置いて、50μgのプラスミドDNAを3回筋肉内投与して免疫した。最後のDNA免疫から3週後、Envタンパク質を発現する107PFUのrVVでマウスに強化免疫を行った。強化免疫から2週後、全てのマウスを安楽死させ、脾細胞を単離するために脾臓を取り出した。中和アッセイ。中和アッセイは、Buresetal,AIDSRes.Hum.Retroviruses16:2019-20352000に記載されているMT-2アッセイ、HIV-1初代単離株のパネルを使用した、5.25.GPF.Luc.M7細胞中でのルシフェーラーゼを使用する多重複製サイクルHIV-1感染アッセイBuresetal,AIDSRes.Hum.Retroviruses16:2019-20352000,Buresetal,J.Virol.76:2233-22442002、又は不活化HIV-1ビリオンを用いた合胞体fusionfromwithout阻害アッセイRossioetal,J.Virol.72:7992-80011998のうち何れかを使用して行った。ルシフェラーゼを使用するアッセイでは、中和抗体は、NathanielR.Landau,SalkInstitute,LaJolla,CAから頂いた5.25.EGFP.Luc.M7細胞Brandtetal,J.Biol.Chem.277:17291-172992002中でのルシフェラーゼ活性の減少の関数として測定した。組織培養感染用量50TCID50が500の無細胞ウイルスを、96ウェルの平底培養プレート中、三つ組みで、150μL中の表記の血清希釈度でインキュベートした1時間、37°C。DEAEデキストラン10μg/mLを含有する培地中に、5×105/mL培地の密度で5.25.EGFP.Luc.M7.細胞を懸濁した。細胞100μLを添加し、対照ウェル検査血清試料なし中の10の細胞が、蛍光顕微鏡によって、GFP発現が陽性になるまで添加した。この時点で、培地の半分容量を除去することによって、細胞を2倍に濃縮した。Bright-GloTM基質Promega,Madison,WIを使用し、Wallac1420MultilabelCounterPerkinElmerLifeSciences,Boston,MA上でルシフェラーゼ活性を測定するために、50μLの細胞懸濁物を96ウェルの白色固体プレートCostar,Cambridge,MAに移した。MT-2及びルシフェラーゼアッセイでの中和力価とは、50以上のウイルス感染が阻害される力価であった。力価が1:20を超える値のみすなわち、>1:30を有意な陽性と考えた。合胞体阻害fusionfromwithoutアッセイでは、SupT1細胞に添加されたHIV-1サブタイプB株ADA及びAD8LarryArthurandJeffreyLifson,FrederickResearchCancerFacility,Frederick,MDから頂いたから得たHIV-1アルドリチオールー2AT-2不活化ビリオンを使用し、合胞体阻害力価は、予め出血された血清と比べて、90以上の合胞体が阻害される力価として測定した。酵素結合免疫スポットELISPOTアッセイ70μmのNylon細胞ろ過器BDLabware,FranklinLakes,NJを通して細分し、絞り取ることによって、免疫された各マウスから得た脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。CON6gp140の重複するEnvペプチド159ペプチド、11重複する15マーは、BostonBioscence,IncRoyalOak,MIから購入した。MNgp140の重複するEnvペプチドサブタイプB;170ペプチド、11重複する15マー及びChnl9gp140サブタイプC;69ペプチド、10重複する20マーは、NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramBethesda,MDから取得した。CON6、サブタイプB及びサブタイプCEnvタンパク質から得られた重複するENVペプチドのプールにより、各マウスから得た脾細胞5マウス/グループをインビトロで刺激した。96ウェルPVDFプレートMultiScreen-IP,Millipore,Billerica,MAを、抗IFNγmab5μg/ml,AN18;Mabtech,Stockholm,Swedenでコートした。完全なHepes緩衝化RPMI培地を用いて、37°Cで2時間、プレートをブロッキングし、50μLの前記プールされた重複するエンベロープペプチド13のCON6およびMNプール、各プール中に13から14のペプチド;9のChn19プール、各プール中に7から8のペプチドを、それぞれ5μg/mLの最終濃度でプレートに添加した。次いで、1.0×107/mLの濃度の脾細胞50μを二つ組みでウェルに添加し、5CO2を与え、16時間37°Cでインキュベートした。100μLの1:1000希釈のストレプトアビジンアルカリホスファターゼMabtech,Stockholm,Swedenとともにプレートをインキュベートし、100μLのBCIP/NBTPlusAlkalinePhosphataseSubstrateMoss,Pasadena,MDを使用して、紫色のスポットを発生させた。Immunospot計数システムCTLAnalyzers,Cleveland,OHを使用して、スポット形成細胞SFCを測定した。各エンベロープペプチドのプールに対する総応答は、106個の脾細胞当たりのSFCとして表される。結果CON6エンベロープ遺伝子の設計、構築及び発現。人工グループMコンセンサスenv遺伝子CON6は、LosAlamosHIVSequenceDatabase中の配列から各HIV-1サブタイプに対するenv遺伝子のコンセンサス配列を作製し、次いで、重度に配列決定されたサブタイプを避けるために、全てのサブタイプコンセンサスのコンセンサス配列を作製することによって構築したGaschenetal,Science296:2354-23602002,Korberetal,Science288:1789-17962000。CRF08_BC組換え株98CN006から得た5つの高度可変領域V1、V2、V4、V5及びgp41の細胞質ドメイン中の領域をCON6配列中の欠損領域中に充填するために使用した。CON6V3領域は、グループMコンセンサスである図1A。高レベルの発現を得るために、高度に発現されたヒト遺伝子に対するコドン使用に基づいて、CON6env遺伝子のコドンを最適化したHaasetal,Curr.Biol.6:315-3242000,Andreetal,J.Virol.72:1497-15031998図1D参照。コドンが最適化されたCON6env遺伝子を構築し、pcDNA3.1DNAのEcoRI及びBamHI部位中にサブクローニングしたGaoetal,AIDSRes.Hum.Retroviruses,19:817-8232003。293T細胞中への形質移入後、ウェスタンブロットアッセイを用いて、高レベルのタンパク質発現を確認した。性質決定のために組換えCON6Envタンパク質を取得し、免疫原として使用し、分泌されたgp120及び非切断gp140CFを発現するためにrVVを作製した図1B。還元条件下のクマシーブルーゲルによって測定したところ、各タンパク質に対する純度は90以上であった図1C。CD4結合ドメイン及びその他の野生型HIV-1エピトープは、CON6タンパク質上に保存される。CON6タンパク質がCD4に結合して、他の野生型HIV-1エピトープを発現するかどうかを決定するために、CON6gp120及びgp140CFが可溶性CD4を結合する能力、特性が十分に決定された幾つかの抗gp120mabを結合する能力、並びにCD4によって誘導される高次構造を変化させる能力をアッセイした。まず、sCD4又はmabのCON6Envタンパク質への結合活性をモニタリングするために、BIAcoreCM5センサーチップをコートした。単量体のCON6gp120及びオリゴマーのgp140CFは何れも、sCD4並びに抗gp120mabT8、2G12及びA32を効率的に結合するが、gp120のCCR5結合部位中のCD4誘導性エピトープを認識するmab17bを恒常的に結合しないことが見出された図2A及び図2B。sCD4及びA32は何れも、野生型gp120に結合した後、17b結合エピトープを露出することができるWyattetal,Nature393;705-7111998,Wyattetal,J.Virol.69:5723-57331995。sCD4又はA32の何れかによって、17bエピトープをCON6Envs上に誘導できるかどうかを決定するために、A32及びT8をセンサーチップ上にコートし、次いでCON6gp120又はgp140CFを捕捉し、mab17b結合活性をモニターした。sCD4又はmabA32を結合した後、CON6gp120及びgp140CFは何れも高次構造の変化を生じ、mab17bを結合するように誘発された図2C及び2D。これに対して、mabT8を結合した後には、17bエピトープは露出されなかった図2C及び2D。次に、gp120V3ロープ447、F39F、CD4結合部位b12及びgp41中和決定基2F5に対する一群のヒトmabの、CON6gp120及びgp140CFに対する反応性を決定するために、ELISAを使用した図2E。CON6rgp120及びrgp140CFタンパク質は、中和V3mabである447及びF39F、並びに強力な中和CD4結合部位mabb12に良好に結合した。C末端のgp41エピトープに結合することによってHIV-1初代単離株を中和するMab2F5も、CON6gp140CFに良好に結合した図2E。CON6env遺伝子は、生物学的に機能的であり、CCR5をその共同受容体として使用する。CON6エンベロープ遺伝子が生物学的に機能的であるかどうかを決定するために、env欠損SG3プロウイルスクローンとともに、293T細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、JC53BL細胞を感染させた。CON6Env偽型ウイルスに感染したJC53-BL細胞中に青い細胞が検出され、CON6Envタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された図3A。しかしながら、感染力価は、YU2又はNL4-3野生型HIV-1エンベロープを有する擬ビリオンの感染力価より1から2桁小さかった。次に、CON6env遺伝子に対して共同受容体の使用を決定した。CXCR4遮断剤AMD3100で処理すると、NL4-3Env擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、YU2又はCON6Env-擬ビリオンの感染性は阻害されなかった図3B。これに対して、CCR5遮断剤TAK-779で処理すると、NL4-3Env擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、YU2又はCON6Env-擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、CON6エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、CCR5共同受容体を使用していることを示している。CON6gp120の、異なるサブタイプの血清との反応。複数のサブタイプの直鎖エピトープがCON6gp120上に保存されているかどうかを決定するために、組換えEnvタンパク質パネルgp120及びgp140を作製した。等量の各Envタンパク質100ngをSDS-ポリアクリルアミドゲル上に与え、ニトロセルロースに転写し、ウェスタンブロットアッセイにおいて、サブタイプAからGの患者の血清及び抗CON6gp120モルモット血清1:1000希釈と反応させた。各HIV-1サブタイプについて、4から6人の患者血清を検査した。各サブタイプに対して代表的な一つの血清が図4に示されている。検査した全てのサブタイプ血清が、パネル中のEnvの中で可変的な反応性を示したが、全てのグループMサブタイプ患者血清はCON6gv120Envタンパク質と等しく良好に反応し、患者血清によって認識される野生型HIV-1EnvエピトープはCON6Envタンパク質上に良好に保存されることが実証された。次に、モルモット中に生じたCON6gp120抗血清が異なるサブタイプのEnvタンパク質に対して反応できるかどうかについて、検査を行った。サブタイプAEnvタンパク質を除き、CON6血清はそれ自身及び他のサブタイプEnvタンパク質に等しく良好に反応することが見出された図4。CON6、サブタイプB及びサブタイプCエンベロープ重複ペプチドに対するT細胞応答の誘導CON6Env免疫原によって誘導されるT細胞免疫応答を、サブタイプ特異的な免疫原によって誘導されたT細胞免疫応答と比較するために、さらに2つのマウスの群を、サブタイプB又はサブタイプCDNA及び対応するrVV発現サブタイプB又はCエンベロープタンパク質で免疫した。サブタイプBJRFL又はサブタイプC96ZM651Env免疫原で免疫したマウスは、主として、サブタイプ特異的なT細胞免疫反応を有した図5。サブタイプBMNペプチドプールで刺激した後には、JRFLサブタイプBで免疫されたマウスから得られたIFN-γSFC免疫原が検出されたが、サブタイプCChnl9又はCON6ペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。サブタイプCChnl9及びCON6ペプチドプールで刺激した後には、96ZM651サブタイプC免疫原で免疫されたマウスから得られたIFN-γSFCが検出されたが、サブタイプBMNペプチドプールで刺激した後には検出されなかった。これに対して、CON6ペプチドプール並びにサブタイプB又はCペプチドのプールで刺激すると、CON6Env免疫原で免疫されたマウスからIFN-γSFCが同定された。CON6gp140によって誘導されたT細胞応答は、CON6gp120によって誘導されたT細胞応答より強固であるように思われた。これらのデータを総合すると、CON6gp120及びgp140CF免疫原は、野生型サブタイプB及びCエンベロープのT細胞エピトープを認識するT細胞応答を誘導することができることが実証された。組換えCON6gp120及びgp140CFエンベロープによる、HIV-1サブタイプB及びC初代単離株を中和する抗体の誘導CON6エンベロープ免疫原が、HIV-1初代単離株を中和する抗体を誘導することができるかどうかを決定するために、CON6gp120又はgp140CFタンパク質でモルモットを免疫した。中和アッセイのために、4又は5回の免疫化の後に集めた血清を使用し、対応する出血前の血清と比較した。分胞体阻害アッセイ表5Aで、2つのAT-2不活化HIV-1単離株ADA及びAD8を検査した。2つのサブタイプBSHIV単離株、8つのサブタイプ初代単離株、4つのサブタイプC並びに1つの各サブタイプA、D及びE初代単離株を、MT-2又はルシフェラーゼを使用するアッセイの何れかで検査した表5B。分胞体阻害アッセイでは、CON6gp120及びgp140CFタンパク質によって誘導された抗体は、AT-2不活化ADA及びAD8によって誘導された分胞体を強力に阻害することが見出された表5A。MT-2アッセイでは、2つのSHIV単離株のうちの1つSHIVSF162P3が2つのgp120及び1つのgp140CF血清によって弱く中和されることが見出された表5B。ルシフェラーゼを利用するアッセイでは、8つのサブタイプB初代単離株のうち4つBX08、SF162、SS1196及びBALが全てのgp120及びgp140CF血清によって強力に中和されることが見出され、8つのサブタイプB単離株のうち2つ6101、0692が多くのgp120及びgp140CF血清によって弱く中和されることが見出された。HIV-1PAVOに対しては、中和は検出されなかった表5B。次に、CON6抗gp120及びgp140CF血清を4つのサブタイプCHIV-1単離株に対して検査すると、4つの単離株のうち3つDU179、DU368及びS080で、主として抗CON6gp120血清によって弱い中和が見られた。1つのgp140CF血清no.635は、DU179を強く中和し、S080を弱く中和した表5B。最後に、抗CON6Env血清は、サブタイプD単離株93ZR001を強く中和し、サブタイプECM244単離株を弱く中和したが、サブタイプA92W020単離株は中和しなかった。結論ウイルスの侵入を媒介するためにCCR5共同受容体を使用することができる機能的Envタンパク質をコードする人工HIV-1グループMコンセンサスenv遺伝子コード配列CON6及びCon-Sの作製について説明してきた。重要なことは、これらのグループMコンセンサスエンベロープ遺伝子が、サブタイプB及びCHIV-1初代単離株のエピトープを認識するT及びB細胞応答を誘導できるということである。さらに、Con-Sは、サブタイプC及びAHIV-1株を強力に中和する抗体を誘導する表3参照。HIV-1に対する保護の相関は、確定的には明らかとなっていない。動物モデル及びHIV-1感染患者での研究から得られた多くのデータは、HIV-1ワクチン開発の最終目標は、広い反応性を有するCD4及びCD8抗HIV-1T細胞応答Letvinetal,Annu.Rev.Immunol.20:73-992002及び複数のサブタイプのHIV-1初代単離株を中和する高レベルの抗体Mascolaetal,J.Virol.73:4009-40181999,Mascolaetal,Nat.Med.6:270-2102000を誘導べきことを示唆する。HIV-1の高レベルな遺伝的可変性のため、臨床的に有用なほど十分に幅広い免疫応答を誘導できる免疫原の設計は困難であった。エピトープをベースとするT細胞及びB細胞応答に対するワクチンMcMichaeletal,Vaccine20:1918-19212002,Sbaietal,Curr.DrugTargetsInfect,Disord.1:303-3132001,Haynes,Lancet348:933-9371996、融合中間体を反映する拘束されたエンベロープFoutsetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:11842-228472002並びに抗HIV-1中和抗体を誘導するための保存された高次構造の露出は、HIV-1の可変性を克服すると提案されてきたRobenetal,J.Virol.68:4821-48281994,Saphireetal,Science293:1155-11592001。しかしながら、増加し続けるHIV-1の多様性と急速な進化のため、ウイルスは急速に移動する厄介な標的であり、HIV-1の変化の複雑さの程度は、これらのアプローチを何れも問題のあるものとしている。HIV-1免疫原を設計するための現在最も一般的なアプローチは、野生型の野生HIV-1単離株を選択することであり、これは、ワクチンを検査すべき領域に由来してもよく、又は由来しなくてもよい複数のエンベロープ免疫原を取り込んだ多価エンベロープ免疫原が設計されているBartlettetal,AIDS12:1291-13001998,Choetal,J.Virol.75:2224-22342001。上記研究は、この候補免疫原と野生型の野生ウイルス株との遺伝的距離が減少したグループMコンセンサスenv遺伝子CON6を作製することによって、HIV-1免疫原を設計するための新しい戦略を試すものである。ほとんどの位置で最も一般的なアミノ酸を選択することによって、全てのサブタイプに対してCON6env遺伝子を作製したGaschenetal,Science296:2354-23602002,Korberetal,Science288:1789-17962000。最も一般的なアミノ酸のみを使用したので、抗体及びT細胞エピトープの大半は良好に保存された。重要なことは、グループMコンセンサスenv配列と任意のサブタイプenv配列の遺伝的距離は約15であって、これは、野生型サブタイプ間の遺伝的距離30の半分にすぎないということであるGaschenetal,Science296:2354-23602002。この距離は、同じサブタイプに属するウイルス間の距離と概ね同じである。さらに、CRFはサブタイプ間で総合的な遺伝的多様性を増加しないので、グループMコンセンサスenv遺伝子も、何れの組換えウイルスenv遺伝子から約15相違していた。1ラウンドの感染系を用いて、CON6-Env擬ビリオンの感染性を確認したが、感染性は減弱されており、人工エンベロープは最適な機能的高次構造ではないが、なお、ウイルスの侵入を媒介できることを示唆した。HIV-1に感染した患者の大半が、当初、R5ウイルスに感染するので、CON6エンベロープがCCR5R5をその共同受容体として使用したことは重要である。BIAcore分析によって、CON6gp120及びgp140CFが何れも、sCD4を結合し、野生型HIV-1Envタンパク質に結合する多数のmabを結合することが示された。野生型HIV-1エンベロープと抗原的に類似するCON6gp120及び140CFタンパク質の発現は、HIV-1免疫原の進行において重要な段階である。しかしながら、多くの野生型エンベロープタンパク質は強力な中和ヒトmabが結合するエピトープを発現しているが、免疫原自体として使用されたときには、中和ヒトmabの特異性を有する抗HIV-1中和抗体を広く誘導しない。中和抗体研究は、CON6gp120、CON6gp140CF及びCon-Sgp140CFIが、特定のサブタイプB、C及びDHIV-1初代単離株を中和する抗体を誘導した点で有望なものであり、このうちCon-Sgp140CFIが非サブタイプB初代HIV単離株の最も強固な中和を誘導する。しかしながら、最も中和が困難な初代単離株PAVO、6101、BG1168、92RW020、CM244は、抗CON-6gp120又はgp140血清によって、弱く中和されるにすぎないか、又は中和されないことが明らかである表4b。それにもかかわらず、非サブタイプBHIV単離株に対して、Con-Sサブユニットgp140CFIエンベロープタンパク質が与えた応答の広さに鑑みると、中和抗体を誘導するCon-Sエンベロープの免疫原性は有望である。gp120及びgp160を発現するポックスウイルス構築物を用いた従前の研究は、高レベルの中和抗体を生成しなかったPolacinoetalJVirol73618630OurmanovetalJVirol7429602965PaletalJVirol76292302ExclerandPlotkinAIDSllS127137。分泌型CON6gp120及びgp140を発現するrVVが構築され、HIV-1初代単離株を中和する抗体が誘導された。HIV中和抗体免疫原は、Con-Sgp140CFI又はそのサブユニットと、ほとんどのサブタイプB単離株を中和する免疫原との組み合わせであり得る。オリゴマーのgp140タンパク質の構造は、タンパク質の免疫原性を評価するときに極めて重要である。この点で、高性能液体クロマトグラフィーFPLC及び分析用超遠心による精製CON6gp140CFタンパク質の研究は、精製gp140ピークが主に三量体からなり、二量体が微少成分であることを実証した。このように、CON6、Con-S又は2003グループMなどの中心化されたエンベロープ又は本明細書に記載されているサブタイプコンセンサス若しくは先祖のコード配列は、CD4-Env複合体、拘束されたエンベロープ構造及び三量体オリゴマー形態など、潜在的に強化された様々なエンベロープ免疫原を調製するための魅力的な候補である。CON6によって誘導されたT細胞応答及びB細胞応答が、SHIV誘発モデルにおいて、HIV-1感染及び/又は疾病に対して保護する能力は、ヒト以外の霊長類で研究されるであろう。上記研究は、グループMコンセンサスenv遺伝子CON6及びCon-Sなどの中心化された人工のHIV-1遺伝子も、野生型サブタイプB及びCEnvタンパク質中のT細胞エピトープに対するT細胞応答並びにグループMコンセンサスEnvタンパク質上のT細胞エピトープに対するT細胞応答も誘導することができる図5。CON6gp140CF免疫原を用いたDNA初回刺激及びrVV強化刺激療法は、サブタイプB及びCエピトープを認識するIFN-γ産生性T細胞を明瞭に誘導したが、CON6エンベロープ中に見られるような中心化された配列が、野生型HIV-1遺伝子より、異なるクレード間にわたるT細胞応答を誘導する上で有意に優れているかどうかを決定するために、さらなる研究が必要とされるFerrarietalAIDSResHumRetroviruses1614331443。しかしながら、CON6及びCon-S;envコード配列を初回刺激及び追加免疫した脾細胞T細胞がHIV-1サブタイプB及びCのT細胞エピトープを認識したという事実は、CON6及びCONーSが臨床的に有用であり得るT細胞応答を誘導できることを実証する上で重要な段階である。中心化されたHIV-1遺伝子を作製するために、3つのコンピュータモデルコンセンサス、先祖及び樹形の中心COT;centerofthetreeが提案されているGaschenetal,Science296:2354-23602002,Gaoetal,Science299:1517-15182003,Nickleetal,Science299:1515-15172003,Korberetal,Science288:1789-17962000。それらは全て、サブタイプ内又はサブタイプ間の殆どのHIV-1配列について、星状の系統樹の根元に位置する傾向がある。実験的ワクチンとして、それらは全て、免疫原と野生ウイルス株間の遺伝的距離を減少させることができる。しかしながら、コンセンサス、先祖及びCOT配列には、それぞれ一長一短があるGaschenetal,Science296:2354-23602002,Gaoetal,Science299:1517-15182003,Nickleetal,Science299:1515-15172003。コンセンサス及びCOTは、サンプルとされた現行の野生型ウイルス中の配列又はエピトープを代表し、外れたHIV-1配列によって影響を受けにくいが、先祖は外れた配列によって著しい影響を受け得る先祖配列を代表する。しかしながら、現時点では、中心化された配列の何れが最高の免疫原としての役割を果たして、多様なHIV-1株に対する広い免疫応答を惹起することができるかは不明であり、これらの異なる戦略を調べるための研究が進行中である。総合すると、このデータは、HIV-1人工CON6及びCon-Sエンベロープは、野生型HIV-1エピトープに対するT細胞応答を誘導し、HIV-1初代単離株を中和する抗体を誘導することが可能なことを示しており、このため、HIV-1ワクチン設計において人工的の中心化されたHIV-1配列を使用することの実現可能性と有望性を実証している。HIV-1サブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープ糖タンパク質実験の詳細HIV-1サブタイプC先祖及びコンセンサスenv遺伝子をLosAlamosHIVMolecularImmunologyDatabasehttp://hiv-web.lanl.gov/immunology,から取得し、哺乳類細胞の発現に対してコドンの使用を最適化し、合成した図6。最適な発現を確保するために、Kozak配列GCCGCCGCCを、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長の遺伝子の他に、gp41膜貫通ドメインIVNR及びgp120/gp41切断部位REKRの直後に停止コドンを導入することによって、末端切断された2つのenv遺伝子を作製し、それぞれ、gp140及びgp120形態の糖タンパク質を得た図8。インビトロ転写/翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。先祖及びコンセンサスサブタイプCエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、gp160及びgp140遺伝子をHIV-1/SG3Δenvプロウイルスとともに同時形質移入し、JC53-BL細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した図7。JC53-BLアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。コドン使用が最適化されたrev依存性96ZAM651env遺伝子を、現サブタイプC対照として使用した。結果コドンを最適化されたサブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子gp160、gp140、gp120は、哺乳類細胞中で高レベルのenv糖タンパク質を発現する図9。コドンを最適化されたサブタイプCgp160及びgp140糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、rev依存性の現エンベロープ対照と比べて、コドンを最適化されたエンベロープのビリオン取り込みが10倍高いレベルであることが明らかである図10A。サブタイプCコンセンサスgp160又はgp140エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、対応するgp160及びgp140先祖エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高かった。さらに、gp160エンベロープは、それらの対応するgp140より一貫して感染性が高かった図10B。サブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープは何れも、ウイルス侵入を媒介するために、共同受容体としてCCR5を使用する。擬ビリオンを含有するサブタイプC先祖及びコンセンサスgp160の感染性は、サブタイプCに感染した患者から得た血漿によって中和された。このことは、これらの人工エンベロープが、固有のHIV-1env糖タンパク質と類似した構造を有すること、及び共通の中和エピトープが保存されていることを示唆している。サブタイプC先祖及びコンセンサスenv糖タンパク質gp160の間には、中和能に有意な差は見られなかった図12。結論HIV-1サブタイプCウイルスは、最も広く流行している単離株であり、世界中の新しい感染のうち約50を占める。世界的に流行しているHIV-1株における遺伝的多様性は、ワクチン設計に対して困難な問題を提起する。HIV-1Envタンパク質は可変性が高いが、感染した宿主中で液性免疫と細胞性免疫をともに誘導することができる。70のHIV-1完全サブタイプCenv配列を分析することによって、コンセンサス及び先祖サブタイプCenv遺伝子が作製された。両配列は、現サブタイプC株と概ね等距離にあり、このため、さらに優れた交叉保護免疫を誘導すると予想される。再構築された先祖又はコンセンサス配列由来の免疫原は、ワクチン候補と現単離株間の遺伝的差異の程度を最小限に抑える。しかしながら、コンセンサス及び先祖サブタイプCenv遺伝子は、アミノ酸配列が5異なる。コンセンサス配列と先祖配列の両方を分析のために合成した。コドンを最適化されたサブタイプC先祖及びコンセンサスエンベロープ遺伝子を構築し、発現された糖タンパク質のインビトロでの生物特性を決定した。合成サブタイプCコンセンサス及び先祖env遺伝子は、現サブタイプC野生型エンベロープ糖タンパク質と構造、機能及び抗原性が類似する糖タンパク質を発現する。サブタイプCgag及びnef遺伝子のコンセンサスC.con.gag及びC.con.nefのコドン使用の最適化サブタイプCウイルスは、グループMウイルスの全サブタイプ中、世界で最も多く蔓延しているウイルスとなった。現在、50を超えるHIV-1感染者が、HIV-1サブタイプCウイルスを保有している。さらに、サブタイプC内にかなりの可変性が存在する。すなわち、異なるサブタイプCウイルスは、Gag、Pol、Env及びNefタンパク質がそれぞれ10、6、17及び16も異なることがある。最も重要なことは、ある国から得られるサブタイプCウイルスは、世界の他の地域から単離されたウイルスと同程度に異なり得ることである。唯一の例外は、サブタイプCがより最近に導入されたインド/中国、ブラジル及びエチオピア/ジブチから得られるHIV-1株である。単一の国内でさえ、サブタイプCウイルスの遺伝的多様性は高いので、単一のウイルス単離株に基づく免疫原は、同じ地域中で流行する他の単離株に対して防御免疫を誘発しない場合がある。このため、サブタイプCウイルスのgag及びnef遺伝子配列を集め、50のコンセンサス閾値を使用することによって、両遺伝子に対するコンセンサス配列を作製した。創始ウイルスに対して生じ得る偏りを避けるために、インド/中国、ブラジル及びエチオピア/ジブチから、それぞれ一つだけ配列を使用して、サブタイプCコンセンサス配列C.con.gag及びC.con.nefを作製した。C.con.gag及びC.con.nef遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。293T細胞中への形質移入後のタンパク質発現が、図13に示されている。図から明らかなように、コンセンサスサブタイプCGag及びNefタンパク質は効率的に発現され、Gag及びNef特異的抗体によって認識された。C.con.gag及びC.con.nef両遺伝子のタンパク質発現レベルは、元のサブタイプenv遺伝子96ZM651のタンパク質発現レベルと同等である。コンセンサス可変領域を有するコンセンサスenv遺伝子の完全長コンセンサスCON-Sの合成合成されたコンセンサスenv遺伝子のコンセンサスCON6では、可変領域が、現サブタイプCウイルス由来の対応する領域98CN006で置換されている。さらに、コンセンサス可変領域も有するcon/con遺伝子CON-sも設計された。Con-Senv遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図14A及び14Bを参照。3’末端が20bp重複し、5’末端及び3’末端に不変の配列それぞれ、制限酵素部位EcoRI及びBbsI並びにBsmBI及びBamHIを含む。を含有する、対を成すオリゴヌクレオチド80マーを設計した。BbsI及びBamHIは、それらの認識配列の外側を切断するII型の制限酵素である。それらは、18bpの不変領域に隣接する最初の4つの残基を切断して、後続の連結工程のために各断片の末端に、4塩基の5’突出を残すように、オリゴマー中に配置された。PCR及び18bpの不変配列に相補的なプライマーを用いて、対をなす26のオリゴマーを個別に連結した。T/Aクローニング法を用いて、pGEM-TPromega中に各対をクローニングし、不慮の変異/欠失の不存在を確認するために配列を決定した。次いで、適切なインサートを含有するpGEM-Tサブクローンを消化し、1のアガロースゲルを走行させ、ゲル精製したQiagen。マルチ断片連結反応において、4つの各108マーをpcDNA3.1Invitrogen中に連結した。遺伝子の5’から3’末端へ、断片群の間で四方向の連結が段階的に起こった。遺伝子全体がpcDNA3.1ベクター中に再構築されるまで、このプロセスを繰り返した。コドン使用が最適化されたオリゴ対を一緒に連結することによって、完全なCon-S遺伝子を構築した。そのオープンリーディングフレームを確認するために、インビトロ転写及び翻訳アッセイを行った。翻訳工程の間に、S35-メチオニンによってタンパク質産物を標識し、10のSDS-PAGE上で分離し、ラジオオートグラフィーによって検出した。予想されたサイズの発現されたCon-Sgp160が、7つのクローンのうち4つで同定された図14C。ウェスタンブロットアッセイを用いた、293T細胞中に形質移入後の、哺乳類細胞中でのCONsEnvタンパク質発現図15。Con-SEnvタンパク質の発現レベルは、コンセンサス保存領域と98CN006ウイルス単離株から得られる可変ループとを含有する以前のCON6envクローンから観察されたものと極めて類似していた。Env-擬ビリオンは、Con-Senvクローンとenv欠損SG3プロウイルスクローンを293T細胞中に同時形質移入することによって作製された。形質移入から2日後に、擬ビリオンを採集し、JC53BL-13細胞中に感染させた。感染単位IUは、3つの独立した実験において、X-galで染色した後、青色の細胞を計数することによって決定した。CON6envクローンと比較したときに、Con-Senvクローンは、JC53BL-13細胞中で同じような数のIUを産生する図16。両者に対するIC力価は、SG3骨格クローン対照Envなしより約3桁高い。しかしながら、この力価も、陽性対照固有のHIV-1env遺伝子、NL4-3又はYU2より約2桁低い。これらのデータは、両コンセンサスグループMenvクローンが生物学的に機能であることを示唆している。しかしながら、それらの機能は低下していた。機能的コンセンサスenv遺伝子は、これらのEnvタンパク質が正しく折り畳まれ、固有のEnvタンパク質の基本的高次構造を保存しており、普遍的なEnv免疫原として発達できることを示唆する。次に、Con-SEnvがJC53-BL細胞中に侵入するためにどの共同受容体を使用しているかを決定した。CXCR4遮断剤AMD3100で処理すると、NL4-3Env擬ビリオンの感染性は遮断されたのに対して、YU2、Con-S又はCON6Env-擬ビリオンの感染性は阻害されなかった。これに対して、CCR5遮断剤TAK779で処理すると、NL4-3Env擬ビリオンの感染性は影響を受けなかったのに対して、YU2、Con-S又はCON6Env-擬ビリオンの感染性は阻害された。両遮断剤で処理すると、全ての擬ビリオンの感染性が阻害された。これらのデータを総合すると、Con-S及びCON6エンベロープは、標的細胞中に侵入するために、CCR5共同受容体を使用し、CXCR4共同受容体をしていないことを示している。次に、CON6又はCon-SEnvタンパク質が擬ビリオン中に等しく効率的に取り込まれ得るかどうかを決定した。Envタンパク質がいくつの擬ビリオン中に取り込まれたかを正確に比較できるようにするために、細胞可溶化液に対して、同じ濃度:5μg総タンパク質細胞培養上清では25ngのp24、又は精製されたウイルス株超高速遠心後の濃縮された擬ビリオンでは150ngのp24で各擬ビリオンをSDS-PAGE上に与える。何れの調製物においても、CON6又はCon-SEnv擬ビリオン中に取り込まれたEnvタンパク質の量に差は存在しなかった細胞可溶化液、細胞培養上清又は精製されたウイルス株図17。コンセンサスサブタイプA完全長envA.con.env遺伝子の合成サブタイプAウイルスは、70を超えるHIV-1感染が文献で報告されているアフリカ大陸において、二番目に多く広まっているHIV-1である。アフリカ及び世界で最も多く蔓延しているサブタイプCウイルスに対するコンセンサスgag、env及びnef遺伝子は既に作製された。サブタイプAとCウイルスの遺伝的距離は、env遺伝子中では、30にも達し、両サブタイプ間の交叉反応性又は保護は最適ではないであろう。全てのサブタイプに対して、2つのグループMコンセンサスenv遺伝子も作製した。しかしながら、サブタイプコンセンサス遺伝子と同じサブタイプから得られる野生ウイルス間の遺伝的距離は、グループMコンセンサス遺伝子とこれらの同じウイルス間の遺伝的距離より小さいので、特定のサブタイプウイルスを標的とするためには、サブタイプ特異的コンセンサス遺伝子がより効果的であろう。従って、サブタイプA特異的免疫原を開発するためには、コンセンサス遺伝子を作製することが必要である。A.con.env遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて最適化された。アミノ酸配列及び核酸配列については、それぞれ、図18A及び18Bを参照。オリゴの各対を増幅し、クローニングし、連結し、配列を決定した。A.conenv遺伝子のオープンリーディングフレームを、インビトロでの転写及び翻訳系によって確認した後、A.conenv遺伝子を293T細胞中に形質移入し、タンパク質の発現と特性をウェスタンブロットアッセイを用いて確認した図18。次いで、A.conエンベロープが生物学的に機能的であるか否かを決定した。これを、env欠損SG3プロウイルスクローンとともに、293T細胞中に同時形質移入した。偽型ウイルスを採集し、JC53BL細胞を感染させるために使用した。A.conEnv擬ビリオンに感染したJC53-BL細胞中に青い細胞が検出され、A.conEnvタンパク質が生物学的に機能的であることが示唆された表6。しかしながら、A.conEnv擬ビリオンの感染力価は、野生型サブタイプCエンベロープを有する擬ビリオンの約1/7であった表6。総合すると、生物学的に機能的なA.conEnvタンパク質は、A.conEnvタンパク質が正しく折り畳まれており、Env免疫原として使用されれば、直鎖及び高次構造のT及びB細胞エピトープを誘導し得ることを示唆する。完全長コンセンサスgag、pol及びnef遺伝子のコンセンサスM.con.gag、M.con.pol及びM.con.nef及びサブタイプCコンセンサスpol遺伝子C.con.polの設計グループMコンセンサス遺伝子については、ウイルス特異的な可変領域を有するenv遺伝子CON6とコンセンサス可変領域を有するenv遺伝子Con-Sという2つの異なるenv遺伝子を構築した。しかしながら、免疫又はワクチン接種された動物及びヒトでのT細胞免疫応答の解析は、env遺伝子が通常T細胞免疫応答に対する主要な標的ではないが、中和抗体を誘導し得る唯一の遺伝子であることを示している。代わりに、HIV-1Gag、Pol及びNefタンパク質が、強力なT細胞免疫応答を誘導するために重要であることが見出される。全てのサブタイプに対して、さらに広い液性及び細胞性免疫応答を誘導することができる免疫原のレパートリーを作製するためには、env遺伝子のみ以外に、他のグループMコンセンサス遺伝子を構築することが必要であるかもしれない。gag、pol及びnef遺伝子コンセンサスのコンセンサスM.con.gag、M.con.pol及びM.con.nefが設計された。サブタイプコンセンサスpol遺伝子を作製するために、サブタイプCコンセンサスpol遺伝子C.con.polも設計した。M.con.gag.、M.con.pol、M.con.nef及びC.con.po.遺伝子のコドンは、高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用に基づいて、最適化された。核酸配列及びアミノ酸配列については、図19を参照。合成サブタイプBコンセンサスgag及びenv遺伝子実験の詳細それぞれ、37及び137個の現HIV-1株から、サブタイプBコンセンサスgag及びenv配列を得て、哺乳類細胞発現に対してコドン使用を最適化し、合成した図20A及び20B。最適な発現を確保するために、Kozak配列GCCGCCGCCを、開始コドンのすぐ上流に挿入した。完全長のenv遺伝子に加えて、gp145遺伝子を作製するために、gp41膜貫通ドメインIVNRの直後に停止コドンを導入することにより、末端切断されたenv遺伝子を作製した。インビトロ転写/翻訳系で遺伝子の完全性を調べ、哺乳類細胞中で発現させた。サブタイプBコンセンサスGag及びEnv配列は、それぞれ、図20C及び20Dに記載されている。サブタイプBコンセンサスエンベロープが融合及び侵入を媒介できるかどうかを決定するために、gp160及びgp145遺伝子をHIV-1/SG3Δenvプロウイルスとともに同時形質移入し、JC53-BL細胞アッセイを用いて、得られた擬ビリオンの感染性を検査した。JC53-BL細胞は、高レベルのCD4並びにHIV-1共同受容体CCR5及びCXCR4を発現するHeLa細胞から派生した細胞である。JC53-BL細胞は、それぞれ、HIV-1LTRから発現されるルシフェラーゼとガラクトシダーゼのレポーターカセットも含有している。レポーター遺伝子の発現は、HIV-1Tatの産生に依存する。簡潔に述べると、細胞を24ウェルプレート中に播種し、37°Cで24時間インキュベートし、37°Cで30分間、DEAE-Dextranで処理した。1DMEM中にウイルスを系列希釈し、DEAE-デキストラン中でインキュベートしている細胞に加え、37°Cで3時間インキュベートした後、さらに500μLの細胞培地を各ウェルに添加する。37°Cで48時間、最終インキュベーションを行った後、細胞を固定し、X-Galを用いて染色し、青色の病巣を顕微鏡で計数するために、PBSを重層した。偽感染されたウェルに対するカウントバックグラウンドを決定するために使用を、試料ウェルに対するカウントから差し引く。JC53-BLアッセイを僅かに改変して、共同受容体の使用及びエンベロープの中和感受性も決定した。サブタイプBコンセンサスGagタンパク質が、Env糖タンパク質を取り込んだウイルス様粒子VLPを産生できるかどうかを決定するために、293T細胞をサブタイプBコンセンサスgag及びenv遺伝子で同時形質移入した。形質移入から48時間後に、VLPを含有する細胞上清を集め、卓上遠心機で清澄にし、0.2mMのフィルターを通してろ過し、20のショ糖クッションを通して沈降させる。VLPペレットをPBS中に再懸濁し、20から60の連続スクロース勾配上に転写した。100,000×gで一晩遠心した後、0.5mLの画分を集め、p24含量をアッセイした。各画分の屈折率も測定した。VLPに対する正しい密度を有し、最高レベルのp24を含有する画分をプールし、最後に沈降する。VLP含有ペレットをPBS中に再懸濁し、4から20のSDS-PAGEゲル上に載せた。タンパク質をPVDF膜に転写し、サブタイプBのHIV-1に感染した個体から得た血清でプローブした。結果コドン使用を最適化されたサブタイプBコンセンサスエンベロープgp160、gp145及びgag遺伝子は、哺乳類細胞中で高レベルの糖タンパク質を発現する図21。サブタイプCgp160及びgp145糖タンパク質は、ウイルス粒子中に効率的に取り込まれる。ショ糖精製された擬ビリオンのウェスタンブロット分析から、rev依存性の現エンベローの取り込みと比べて、コンセンサスBエンベロープの取り込みレベルは少なくとも5倍であることを示唆する図23A。サブタイプBコンセンサスgp160及びgp145エンベロープの何れかで偽型化されたビリオンは、rev依存性の現エンベロープを含有する擬ビリオンより感染性が高い図23B。サブタイプBコンセンサスエンベロープは、CD4を有する標的細胞中に侵入するための共同受容体としてCCR5を使用する図22。サブタイプBコンセンサスgp160エンベロープを含有する擬ビリオンの感染性は、HIV-1サブタイプBに感染した患者から得た血漿図24C及び中和モノクローナル抗体図24Aによって中和された。このことは、サブタイプB合成コンセンサスBエンベロープの全体的な構造が固有のNIV-1Env糖タンパク質と類似していること、及び共通する中和エピトープがそのままの状態を保っていることを示唆する。図24B及び24Dは、サブタイプB対照エンベロープNL4.3Envの中和プロファイルを示している。サブタイプBコンセンサスGagタンパク質は、細胞膜から出芽し、ウイルス様粒子を形成することができる図25A。コドンを最適化されたサブタイプBコンセンサスがgag及びがp160遺伝子の同時形質移入によって、取り込まれたエンベロープを有するVLPが産生される図25B。結論合成サブタイプBコンセンサスenv及びgag遺伝子は、現サブタイプBEnv及びGagタンパク質と構造、機能及び抗原性が類似するウイルスタンパク質を発現する。サブタイプBコンセンサス遺伝子を基礎とする免疫原は、幅広い一群のHIV-1単離株に対して保護的であるCTL及び中和免疫応答を惹起するであろう。上記に引用されている全ての文献及びその他の情報源は、参照により、それらの全体が本明細書に援用される。Liaoetal,J.Virol.78:52702004も、参照により援用される。"