"改変したジンクフィンガータンパク質DNA結合ドメインを含むタンパク質であって、そのDNA結合ドメインが、N末端からC末端に向けてF1~F4またはF1~F5の順番で並んだ4つまたは5つのジンクフィンガー認識領域を含み、iDNA結合ドメインが、5つのジンクフィンガー認識領域を含んでいるときには、F1~F5は、以下のアミノ酸配列:F1:QSGDLTR配列ID番号4F2:RSDVLSE配列ID番号5F3:DRSNRIK配列ID番号6F4:RSDNLSE配列ID番号7F5:QNATRIN配列ID番号8を含み;iiDNA結合ドメインが、4つのジンクフィンガー認識領域を含んでいるときには、F1~F4は、以下のアミノ酸配列:Fl:RSDSLSV配列ID番号10F2:TSGHLSR配列ID番号11F3:RSDHLSQ配列ID番号12F4:HASTRHC配列ID番号13を含む、タンパク質。野生型もしくは改変された開裂ドメインまたは開裂半ドメインをさらに含む、請求項1に記載のタンパク質。請求項1または2に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。請求項1または2に記載のタンパク、または請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。対象の血友病Bを治療する方法であって、少なくとも1つのジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、機能するIX因子FIXタンパク質をコードする配列を細胞のゲノムに組み込むことを含み、該対象は該細胞を含む、方法。前記配列を内在性遺伝子に組み込む、請求項5に記載の方法。前記内在性遺伝子が、FIX遺伝子およびセーフハーバー遺伝子からなる群より選択される、請求項5または6に記載の方法。前記細胞が肝細胞であり、前記配列を、傷のない動物の肝臓に静脈内投与することによって、または腹腔内投与することによって、または肝臓の柔組織に直接注入することによって、または肝動脈に注入することによって、または胆管を通じて逆行注入することによって、その細胞に送達する、請求項5~7のいずれか1項に記載の方法。対象の肝部分除去を実施するステップをさらに含む、および/または少なくとも1種類の二次剤で対象を治療するステップをさらに含む、請求項5~8のいずれか1項に記載の方法。前記二次剤が、ガンマ線照射、UV照射、トリチウム標識したヌクレオチド、シスプラチン、エトポシド、ヒドロキシ尿素、アフィジコリン、プレドニゾロン、アデノウイルス、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項9に記載の方法。請求項5~10のいずれか1項に記載の方法であって、前記細胞が単離された細胞であり、該方法が、その単離された細胞を対象に投与する操作をさらに含む、方法。前記対象が、胚、胎児、新生児、幼児、青年、成人からなる群より選択される、請求項5~11のいずれか1項に記載の方法。前記配列、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ、そのジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、これらの組み合わせのいずれかを、前記細胞の表面受容体に特異的に結合するホーミング剤と組み合わせる操作をさらに含む、請求項5~12のいずれか1項に記載の方法。前記ホーミング剤が、ガラクトースを含むか、AAVコートタンパク質とガラクトースのハイブリッドを含む、請求項13に記載の方法。前記細胞が、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、齧歯目細胞、ウサギ目細胞、食肉目細胞、偶蹄類細胞と、幹細胞である胚性幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、肝細胞、および肝幹細胞からなる群より選択される、請求項8~14のいずれか1項に記載の方法。この明細書には、血友病Bの患者を治療する組成物と方法が開示されている。特に、ヌクレアーゼを媒介とした標的組み込みを利用してFIXをコードする配列を生体内または生体外で対象の1つ以上の細胞のゲノムに挿入することで、細胞が生体内でFIXを産生する。いくつかの実施態様では、この方法は、例えば肝部分切除によって、および/または肝細胞に細胞周期を実行させる1種類以上の化合物の投与によって、対象の細胞特に肝細胞の増殖を誘導する操作をさらに含んでいる。対象には、ヒト、非ヒト霊長類、動物例えばネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが含まれるが、これらに限定されない。この明細書に記載する方法により、血友病Bの治療がなされる。メガヌクレアーゼを用いたヌクレアーゼ媒介遺伝子補正の生体内モデルにおいて以前に報告されている方法Gouble他2006年JGeneMed5月;第8巻:616~622ページとは異なり、動物モデルでヌクレアーゼを媒介としてFIX遺伝子を組み込んだ後に、毒性がほとんど、またはまったく観察されない。それに加え、本発明の方法と組成物は、新生児と成熟した動物でも機能するため、挿入されたIX因子導入遺伝子の機能的活性につながる。概略本明細書で開示する方法の実践、ならびに組成物の調製及び使用は、別段示さない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組み換えDNA、および関連分野における従来の技術を、当該分野の技術範囲内であるものとして使用する。これらの技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989および第3版,2001、Ausubelら、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWileySons,NewYork,1987および定期改訂版、METHODSINENZYMOLOGYシリーズ,AcademicPress,SanDiego、Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,第3版,AcademicPress,SanDiego,1998、METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,ChromatinP.M.WassarmanおよびA.P.Wolffe,編集,AcademicPress,SanDiego,1999、ならびにMETHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocolsP.B.Becker,編集HumanaPress,Totowa,1999を参照のこと。定義用語核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドは、互換的に使用され、線状または環状の高次構造で、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的に関しては、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖、および/またはリン酸部分例えば、ホスホロチオエート主鎖内で改変されるヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定ヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aのアナログは、Tと塩基対を形成する。用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基のポリマーを指して互換可能に用いられる。この用語はまた、1つ以上のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。結合とは、高分子間例えば、タンパク質と核酸との間の配列特異的で、非共有結合的な相互作用を指す。結合相互作用が全体として配列特異的であるかぎり、結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はない例えば、DNA骨格中のリン酸残基との接触。そのような相互作用は、一般に、106M1以下の解離定数Kdによって特徴付けられる。親和性とは、結合強度を指し:結合親和性の増加は、Kdの低下と相関する。結合タンパク質とは、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子DNA結合タンパク質、RNA分子RNA結合タンパク質、および/またはタンパク質分子タンパク質結合タンパク質に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合においては、それは、それ自体に結合するその結果、ホモ二量体、ホモ三量体などを形成することが可能であり、および/または異なるタンパク質複数可の1つ以上の分子に結合することが可能である。結合タンパク質は、2種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、DNA結合、RNA結合、およびタンパク質結合活性を有する。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質または結合ドメインとは、1つ以上のジンクフィンガーそれは、亜鉛イオンの配位によって安定化される構造を有する結合ドメイン内のアミノ配列の領域であるによって配列特異的な形でDNAを結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略称される。TALEDNA結合ドメインまたはTALEは、1つ以上のTALE反復ドメイン/ユニットを含むポリペプチドである。この反復ドメインは、TALEを対応するコグネイト標的DNA配列に結合させるのに関与する。単一の反復ユニット反復とも呼ばれるは、典型的には長さがアミノ酸33~35個であり、天然のTALEタンパク質に含まれる他のTALE反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。ジンクフィンガー結合ドメインとTALE結合ドメインを改変し例えば天然のジンクフィンガータンパク質またはTALEタンパク質の認識螺旋領域の改変1個以上のアミノ酸の変更を通じ、所定のヌクレオチド配列に結合させることができる。したがって改変されたDNA結合タンパク質ジンクフィンガーまたはTALEは、非天然タンパク質である。DNA結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、天然に存在しないタンパク質であり、その設計/組成は、主として合理的な基準からもたらされる。設計のための合理的基準としては、置換規則の適用、ならびに既存のZFP設計および結合データの情報を格納したデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が挙げられる。例えば、米国特許第6,140,081号、同第6,453,242号、および同第6,534,261号を参照のこと;また国際公開第98/53058号、同第98/53059号、同第98/53060号、同第02/016536号、および同第03/016496号、および米国特許出願第13/068,735号を参照のこと。選択されたジンクフィンガータンパク質またはTALEは、天然には見出されないタンパク質であり、その産生は、主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験的プロセスによってもたらされる。例えば、米国特許第5,789,538号、米国特許第5,925,523号、米国特許第6,007,988号、米国特許第6,013,453号、米国特許第6,200,759号、国際公開第95/19431号、国際公開第96/06166号、国際公開第98/53057号、国際公開第98/54311号、国際公開第00/27878号、国際公開第01/60970号、国際公開第01/88197号、および国際公開第02/099084号を参照のこと。組み換えは、2つのポリヌクレオチドの間で遺伝情報を交換するプロセスを意味し、非相同末端接合NHEJによるドナー捕獲や相同組み換えが含まれるが、これらに限定されない。本開示の目的では、相同組み換えHRは、例えば細胞における二本鎖切断を相同部指定修復メカニズムを通じて修復している間に起こるそのような交換の特別な形態を意味する。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、標的分子すなわち二本鎖切断を経験した分子を修復する鋳型としてドナー分子を利用する。このプロセスは、非交差遺伝子変換または短管遺伝子変換といったさまざまな呼び方で知られている。なぜならこのプロセスによってドナーから標的への遺伝情報の移動が起こるからである。いかなる特定の理論にも囚われることを望まないため、そのような移動には、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ補正、および/または標的の一部になるであろう遺伝情報の再合成にドナーが用いられる合成に依存する鎖アニーリング、および/または関連プロセスが含まれる可能性がある。このような特別なHRによって標的分子の配列が変化し、ドナーとなるポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれることがしばしばある。本発明の方法では、この明細書に記載した1つ以上の標的ヌクレアーゼが所定の部位において標的配列例えば細胞クロマチンに二本鎖切断を作り出し、切断領域においてヌクレオチド配列と相同なドナーポリヌクレオチドを細胞の中に導入することができる。二本鎖切断の存在によってドナー配列の組み込みが容易になることがわかっている。ドナー配列は、物理的に組み込んでもよいし、相同組み換えを通じた切断修復のための鋳型としてドナーポリヌクレオチドを用い、ドナーにおけるようにヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入してもよい。したがって細胞クロマチンの中の第1の配列を変更することができ、いくつかの実施態様では、その第1の配列をドナーポリヌクレオチドに存在する配列へと変換することができる。したがって置換するまたは置換という用語の使用は、1つのヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換することすなわち情報的な意味でのある配列の置換を表わすと理解でき、必ずしも1つのヌクレオチドを別のヌクレオチドで物理的または化学的に置換することを必要としない。この明細書に記載したどの方法でも、ジンクフィンガータンパク質またはTALENの別のペアを用いて細胞内で追加標的部位の別の二本鎖開裂を実現することができる。細胞クロマチンにおける興味の対象となる領域の配列を標的とした組み換え、および/または置換、および/または変更に関する方法のいくつかの実施態様では、外来性ドナーヌクレオチド配列を用いて染色体配列を相同組み換えによって変化させる。そのような相同組み換えは、細胞クロマチンに二本鎖切断が存在していて、その切断領域に相同な配列が存在している場合に促進される。この明細書に記載したどの方法でも、第1のヌクレオチド配列ドナー配列は、興味の対象となる領域においてゲノム配列と相同だが同じではない配列を含むことができるため、相同組み換えを促進して同じではない配列を興味の対象となる領域に組み込むことができる。例えばいくつかの実施態様では、ドナー配列で興味の対象となる領域にある配列と相同な部分は、約80~99またはこの間の任意の整数値が、置換されるゲノム配列と一致する。別の実施態様では、例えば100個を超える連続した塩基対からなるドナー配列とゲノム配列の間でヌクレオチドが1個だけ異なる場合には、ドナー配列とゲノム配列の間の相同性は、99超である。いくつかのケースでは、ドナー配列の非相同部が、興味の対象である領域に存在しない配列を含んでいる可能性があるため、新しい配列が興味の対象である領域に導入される。その場合には、非相同配列には、一般に、興味の対象である領域に含まれる配列と相同または同じである50~1000塩基対またはその間の任意の整数値、または1000を超える任意の数の塩基対からなる配列が隣接する。別の実施態様では、ドナー配列は第1の配列と相同ではなく、非相同組み換えメカニズムによってゲノムに挿入される。この明細書に記載したどの方法を利用しても、興味の対象である遺伝子を発現させないドナー配列の標的組み込みにより、細胞内の1つ以上の標的配列の部分的不活化または完全な不活化が可能である。部分的不活化または完全な不活化がなされた遺伝子を有する細胞系も提供される。さらに、この明細書に記載した標的組み込みの方法は、1つ以上の外来性配列を組み込むのにも利用できる。外来性核酸配列は、例えば1つ以上の遺伝子またはcDNA分子、または任意のタイプのコード配列または非コード配列のほか、1つ以上の制御エレメント例えばプロモータを含むことができる。それに加え、外来性核酸配列は、1つ以上のRNA分子例えば小さなヘアピンRNAshRNA、抑制性RNARNAi、マイクロRNAmiRNAなどを生成させることができる。開裂とは、DNA分子の共有結合骨格の破壊を指す。開裂は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるが、これらに限定されない、種々の方法によって開始することができる。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方とも可能であり、二本鎖開裂は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。DNA開裂は、平滑末端または互い違いのstaggered末端のいずれかの産生を生じ得る。特定の実施形態においては、融合ポリペプチドが、標的化二本鎖DNA開裂に用いられる。開裂ハーフドメインは、第二のポリペプチド同一または異なるいずれかと併せて、開裂活性好ましくは、二本鎖開裂活性を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。第1と第2の開裂半ドメイン、との開裂半ドメイン、右と左の開裂半ドメインという用語は、どれも同じ意味で用いられ、二量体になる開裂半ドメインのペアを意味する。改変された開裂半ドメインは、別の開裂半ドメイン例えば別の改変された開裂半ドメインとで必須のヘテロ二量体を形成するように改変された開裂半ドメインである。アメリカ合衆国特許出願公開第20050064474号、第20070218528号、第20080131962号も参照のことその内容は全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。用語配列は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それは、DNAまたはRNAであってもよく、線状、環状または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。ドナー配列という用語は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、2~10,000長またはそれらの間もしくはそれ以上の任意の整数のヌクレオチド、好ましくは、約100~1,000長またはそれらの間の任意の整数値のヌクレオチド、より好ましくは、約200~500長のヌクレオチドであってもよい。クロマチンとは、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、ならびに、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含めてタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームコアが、2つのヒストンH2A、H2B、H3およびH4のうちそれぞれ2つを含む八量体と会合した約150塩基対のDNAを含み;そしてリンカーDNA生物に依存して長さはさまざまがヌクレオソームコアの間に延在する。1分子のヒストンH1は、一般にリンカーDNAと会合する。本開示の目的に関して、クロマチンという用語は、原核性および真核性の両方のあらゆる種類の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。染色体とは、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含む全染色体の集合である、その核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、1つ以上の染色体を含んでもよい。エピソームとは、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体、または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよび一定のウイルスゲノムが挙げられる。標的部位または標的配列とは、結合にとって十分な条件が存在する条件下で結合分子が結合するであろう核酸の一部を規定する、核酸配列である。例えば、配列5’-GAATTC-3’は、EcoRI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。外因性分子とは、通常は細胞内に存在しないが、1つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入することができる分子である。通常は細胞内に存在とは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋の胚発生中のみに存在する分子は、成体筋細胞については外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞については外因性分子である。外因性分子は、例えば、任意のポリペプチドまたはそのフラグメントのコード配列、機能不全型内因性分子の機能性バージョンまたは正常機能性の内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。外因性分子はまた、内因性分子と同じ種類の分子であってもよいが、その内因性分子が由来する種とは異なる種に由来してもよい。例えば、ヒト核酸配列を、ハムスターまたはマウスに由来する細胞株中に導入してもよい。外因性分子は、とりわけ、低分子、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される低分子、または、高分子、例えば、タンパク質、核酸、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変誘導体、または1つ以上の上記分子を含む任意の複合体であってもよい。核酸としては、DNAおよびRNAが挙げられ、それは一本または二本鎖であってもよく、線状、分岐状または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成できる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第5,176,996号および同第5,422,251号を参照のこと。ゲノムへの挿入のために標的化され得る外因性の核酸分子はまた、ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる。タンパク質としては、限定するものではないが、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。外因性分子は、内因性分子と同じの種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞中に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含んでもよい。細胞中に外因性分子を導入するための方法は、当業者には公知であり、これには限定するものではないが、脂質媒介導入すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介導入およびウイルスベクター媒介性の移入が挙げられる。外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子でもよいが、細胞が由来する異なった種から得られるものものでもよい。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターからもともと得られる細胞株に導入することができる。対照的に、内因性分子とは、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞内に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラストもしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含んでもよい。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含んでもよい。融合分子は、2つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に連結されている分子である。サブユニット分子は、同一の化学種の分子であってもよいし、または異なる化学種の分子であってもよい。第一の種類の融合分子の例としては、限定するものではないが、融合タンパク質例えば、ZFPDNA結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物、および融合核酸例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。第二の種類の融合分子の例としては限定するものではないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、およびマイナーグルーブバインダーminorgroovebinderと核酸との間の融合物が挙げられる。細胞における融合タンパク質の発現は、細胞に融合タンパク質を送達することによって、または細胞に融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達し、そこで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて融合タンパク質を生成することによって、生じてもよい。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結はまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法を、本開示の他所に提示する。本開示の目的に関して、遺伝子とは、遺伝子産物以下参照のことをコードするDNA領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域を含み、そのような調節配列がコード配列および/または転写配列に隣接しているか否かは問わない。従って、遺伝子としては、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。遺伝子発現とは、遺伝子産物への遺伝子に含まれる情報の変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNAまたは他のあらゆる種類のRNA、またはmRNAの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物としてはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって改変修飾されたRNA、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリスチリル化、およびグリコシル化によって改変修飾されたタンパク質が挙げられる。遺伝子発現の調節とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。ゲノム編集例えば開裂、変更、不活化、ランダム突然変異を利用して発現を変化させることができる。遺伝子不活化は、この明細書に記載してあるように、ZFPを含まない細胞と比べて遺伝子の発現が低下していることを意味する。したがって遺伝子不活化は、一部または全体が可能である。興味の対象となる領域は、細胞クロマチンの中にあって外来性分子と結合することが望ましい任意の領域例えばある遺伝子、またはある遺伝子の中の非コード配列、ある遺伝子に隣接する非コード配列である。結合は、DNAの標的開裂および/または標的組み換えを目的とすることができる。興味の対象となる領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官例えばミトコンドリア、葉緑体のゲノム、感染するウイルスのゲノムに存在することができる。興味の対象となる領域は、ある遺伝子のコード配列の中、転写された非コード領域例えばリーダー配列、トレーラ配列、イントロンの中、コード領域の上流または下流の非転写領域の中にあってもよい。興味の対象となる領域は、長さが1つだけのヌクレオチド対という小さなものから2000ヌクレオチド対まで、すなわち任意の整数値のヌクレオチド対が可能である。真核細胞には、真菌細胞例えば酵母、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞例えばT細胞が含まれるが、これらに限定されない。機能する連結と機能するように連結したまたは機能可能に連結したという用語は、2つ以上の要素例えば配列エレメントの併置に関して同じ意味で用いられ、それら要素の両方が正常に機能するとともに、それら要素のうちの少なくとも1つが、それ以外の少なくとも1つの要素に対して及ぼす機能を媒介できるように配置されていることを意味する。例えば転写調節配列例えばプロモータは、その転写調節配列が1つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合には、コード配列に機能するように連結している。転写調節配列は、一般に、コード配列に対してシスで機能するように連結しているが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えばエンハンサは、コード配列と連続していない場合でさえ、そのコード配列に機能するように連結した転写調節配列である。融合ポリペプチドに関する機能するように連結したという用語は、それぞれの要素が、他の要素と連結した状態で、そのように連結していなければ実行したであろうのと同じ機能を実行するという事実を意味する。例えばZFPDNA結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関し、ZFPDNA結合ドメインと活性化ドメインは、その融合ポリペプチドにおいてZFPDNA結合ドメイン部が標的部位および/または結合部位に結合できる一方で、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節できる場合に、機能性連結である。ZFPDNA結合ドメインが開裂ドメインに融合している融合ポリペプチドでは、ZFPDNA結合ドメインと開裂ドメインは、その融合ポリペプチドにおいてZFPDNA結合ドメイン部が標的部位および/または結合部位に結合できる一方で、開裂ドメインが標的部位の近傍でDNAを開裂させることができる場合に、機能性連結である。タンパク質、ポリペプチド、核酸の機能性断片は、完全長のタンパク質、ポリペプチド、核酸と配列が同じではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチド、核酸である。機能性断片は、対応する元の分子と比べて多数の、または少数の、または同数の残基を持つこと、および/または1個以上のアミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能例えばコード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力を明らかにする方法は、従来技術において周知である。同様に、タンパク質の機能を明らかにする方法も周知である。例えばポリペプチドのDNA結合機能は、例えばフィルタ結合、電気泳動易動度シフト、免疫沈降アッセイによって明らかにすることができる。DNAの開裂は、ゲル電気泳動によって調べることができる。Ausbel他、上記文献参照。あるタンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば同時免疫沈降、または2ハイブリッドアッセイ、または相補性遺伝的相補性と生化学的相補性の両方によって明らかにすることができる。例えばFields他1989年Nature、第340巻:245~246ページ;アメリカ合衆国特許第5585245号、PCTWO9844350を参照のこと。ベクターは、遺伝子配列を標的細胞に運ぶことができる。典型的には、ベクターコンストラクト、発現ベクター、遺伝子導入ベクターは、興味の対象となる遺伝子を発現させることができて遺伝子配列を標的細胞に運ぶことのできるあらゆる核酸コンストラクトを意味する。したがってこの用語には、クローニング、発現ビヒクルのほか、組み込みベクターが含まれる。レポータ遺伝子またはレポータ配列は、定型的なアッセイにおいて容易に測定されるそうであることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよいタンパク質産物を産生させるあらゆる配列を意味する。適切なレポータ遺伝子として、抗生剤抵抗性例えばアンピリシン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、G418抵抗性、ピューロマイシン抵抗性を媒介するタンパク質をコードする配列、着色タンパク質、蛍光タンパク質、発光タンパク質例えば緑色蛍光タンパク質、増大した緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼをコードする配列、増大した細胞増殖および/または遺伝子増幅を媒介するタンパク質例えばジヒドロ葉酸レダクターゼなどがあるが、これらに限定されない。エピトープタグとして、例えばFLAG、His、myc、Tap、HAの1つ以上のコピーや、検出可能なあらゆるアミノ酸配列がある。発現タグには、興味の対象である遺伝子の発現をモニタするためその望む遺伝子の配列に機能可能に連結できるレポータをコードする配列が含まれる。セーフハーバー遺伝子座は、ゲノム内にあって、宿主に何ら悪影響を与えることなく遺伝子を挿入することのできる遺伝子座である。最も有利なのは、挿入された遺伝子配列の発現が隣にある遺伝子群からのいかなるリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座である。哺乳動物細胞におけるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例は、AAVS1遺伝子アメリカ合衆国特許出願公開第20080299580号参照、CCR5遺伝子アメリカ合衆国特許出願公開第20080159996号参照、Rosa遺伝子座WO2010065123参照である。ヌクレアーゼこの明細書には、血友病Bの患者からの細胞のゲノムに機能するFIXタンパク質をコードする配列を組み込む上で有用な組成物、特にヌクレアーゼが記載されている。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは天然のものである。別の実施態様では、ヌクレアーゼは天然のものでない。すなわち、DNA結合ドメインおよび/または開裂ドメインが改変されている。例えば天然のヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように改変することができる例えばコグネイト結合部位以外の部位に結合するように改変されたメガヌクレアーゼ。別の実施態様では、ヌクレアーゼは、異種性のDNA結合ドメインと開裂ドメインを含んでいる例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ;TALエフェクタドメインDNA結合タンパク質;異種性開裂ドメインを有するメガヌクレアーゼDNA結合ドメイン。A.DNA結合ドメインいくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼである。天然のメガヌクレアーゼは、15~40個の塩基対開裂部位を認識し、一般に4つのファミリーにまとめられる。すなわちLAGLIDADGファミリー、GIYYIGファミリー、HisCystボックスファミリー、HNHファミリーである。ホーミングエンドヌクレアーゼの例として、ISceI、ICeuI、PIPspI、PISce、ISceIV、ICsmI、IPanI、ISceII、IPpoI、ISceIII、ICreI、ITevI、ITevII、ITevIIIなどがある。これらの認識配列は公知である。アメリカ合衆国特許第5420032号;アメリカ合衆国特許第6833252号;Belfort他1997年NucleicAcidsRes、第25巻:3379~3388ページ;Dujon他1989年Gene、第82巻:115~118ページ;Perler他1994年NucleicAcidsRes、第22巻、1125~1127ページ;Jasin1996年TrendsGenet、第12巻:224~228ページ;Gimble他1996年JMolBiol、第263巻:163~180ページ;Argast他1998年JMolBiol、第280巻:345~353ページ;theNewEnglandBiolabsカタログも参照のこと。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、改変された天然ではないホーミングエンドヌクレアーゼメガヌクレアーゼを含んでいる。ホーミングエンドヌクレアーゼとメガヌクレアーゼの認識配列であるISceI、ICeuI、PIPspI、PISce、ISceIV、ICsmI、IPanI、ISceII、IPpoI、ISceIII、ICreI、ITevI、ITevII、ITevIIIは公知である。アメリカ合衆国特許第5420032号;アメリカ合衆国特許第6833252号;Belfort他1997年NucleicAcidsRes、第25巻:3379~3388ページ;Dujon他1989年Gene、第82巻:115~118ページ;Perler他1994年NucleicAcidsRes、第22巻、1125~1127ページ;Jasin1996年TrendsGenet、第12巻:224~228ページ;Gimble他1996年JMolBiol、第263巻:163~180ページ;Argast他1998年JMolBiol、第280巻:345~353ページ;theNewEnglandBiolabsカタログも参照のこと。それに加え、ホーミングヌクレアーゼとメガヌクレアーゼのDNA結合特異性は、天然でない標的部位に結合するように改変することができる。例えばChevalier他2002年MolecCell、第10巻:895~905ページ;Epinat他2003年NucleicAcidsRes、第31巻:2952~2962ページ;Ashworth他2006年Nature、第441巻:656~659ページ;Paques他2007年CurrentGeneTherapy、第7巻:49~66ページ;アメリカ合衆国特許出願公開第20070117128号を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼとメガヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体の文脈ですなわちヌクレアーゼがコグネイト開裂ドメインを含むように改変すること、または異種性開裂ドメインに融合させることができる。別の実施態様では、DNA結合ドメインは、天然の、または改変された非天然のTALエフェクタDNA結合ドメインを含んでいる。例えばアメリカ合衆国特許出願第13068735号を参照のことその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。ザントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物で多くの病気を引き起こすことが知られている。ザントモナスの病原性は保存されたタイプIII分泌T3S系に依存していて、その分泌系が、異なる25種類超のエフェクタタンパク質を植物細胞に注入する。注入されるこれらタンパク質の中に、植物の転写アクチベータをまねていて植物のトランスクリプトームを操作する転写アクチベータ様TALエフェクタがあるKay他2007年Science、第318巻:648~651ページを参照のこと。このタンパク質は、DNA結合ドメインと転写活性化ドメインを含んでいる。最もよく特徴がわかっているTALエフェクタの1つは、ザントモナスカンペストグリスpvヴェシカトリアからのAvrBs3であるBonas他1989年MolGenGenet、第218巻:127~136ページ、WO2010079430を参照のこと。TALエフェクタは、タンデム反復が集中したドメインを含んでおり、それぞれの反復は約34個のアミノ酸を含んでいて、それがこのタンパク質へのDNA結合特異性のカギとなっている。それに加え、TALエフェクタは、核局在化配列と酸性転写活性化ドメインを含んでいる概説に関しては、SchornackS他2006年JPlantPhysiol、第163巻:256~272ページを参照のこと。それに加え、植物病原性細菌ラルストニアソラナセアルムにおいて、2つの遺伝子brg11とhpx17と表記されるが、Rソラナセアルム次亜種1株GMI1000と次亜種4株RS1000ではザントモナスのAvrBs3ファミリーと相同であることが見いだされたHeuer他2007年ApplandEnvirMicro、第73巻:4379~4384ページを参照のこと。これらの遺伝子は互いにヌクレオチド配列が989一致しているが、hpx17の反復ドメインにおいて1575塩基対が欠失している点が異なっている。しかし両方の遺伝子産物は、ザントモナスのAvrBs3ファミリーのタンパク質との配列の一致が40未満である。例えばアメリカ合衆国特許出願第13068735号を参照のことその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。TALエフェクタの特異性は、タンデム反復の中に見いだされる配列に依存する。その反復配列は約102塩基対を含んでおり、反復は、典型的には互いに91~100相同であるBonas他、上記文献。反復の多型は通常は12位と13位に位置していて、12位と13位にあるそれら超可変性二残基のアイデンティティとTALエフェクタの標的配列に含まれる連続したヌクレオチドのアイデンティティの間には一対一対応が存在しているように見えるMoscouとBogdanove2009年Science、第326巻:1501ページ;Boch他2009年Science、第326巻:1509~1512ページを参照のこと。実験的には、TALエフェクタのDNA認識のための天然のコードは、12位と13位のHD配列がシトシンCに結合し、NGがTに結合し、NIがA、C、G、Tのいずれかに結合し、NNがAまたはGに結合し、INGがTに結合するように決定された。新たな配列と相互作用できて、植物細胞に含まれる非内在性レポータ遺伝子の発現を活性化することのできる人工的な転写因子を作るため、これらDNA結合反復がまとめられて、新しい組み合わせと反復数を持つタンパク質にされたBoch他、上記文献。改変されたTALタンパク質はFokI開裂半ドメインに連結され、酵母レポータアッセイにおいて活性を示すTALエフェクタドメインヌクレアーゼ融合体TALENを生成させる。例えばアメリカ合衆国特許出願第13068735号;Christian他2010年Genetics電子出版101534genetics110120717を参照のこと。いくつかの実施態様では、DNA結合ドメインはジンクフィンガータンパク質を含んでいる。そのジンクフィンガータンパク質は天然のものであり、それが改変されて選択した標的部位に結合することが好ましい。例えばBeerli他2002年NatureBiotechnol、第20巻:135~141ページ;Pabo他2001年AnnRevBiochem、第70巻:313~340ページ;Isalan他2001年NatureBiotechnol、第19巻:656~660ページ;Segal他2001年CurrOpinBiotechnol、第12巻:632~637ページ;Choo他2000年CurrOpinStructBiol、第10巻:411~416ページ;アメリカ合衆国特許第6453242号;第6534261号;第6599692号;第6503717号;第6689558号;第7030215号;第6794136号;第7067317号;第7262054号;第7070934号;第7361635号;第7253273号;アメリカ合衆国特許出願公開第2005006447420070218528号;第20050267061号を参照のことこれらはすべて、その全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。改変されたジンクフィンガードメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べて新たな結合特異性を持つことができる。改変法には、合理的な設計と、さまざまな種類の選択が含まれるが、それだけに限られない。合理的な設計には、例えば三連または四連ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを利用することが含まれる。それぞれの三連または四連のヌクレオチド配列には、特定の三連または四連の配列と結合するジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列が関係している。例えば共有のアメリカ合衆国特許第6453242号、第6534261号を参照のことその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示的選択法は、米国特許第5,789,538号;同第5,925,523号;同第6,007,988号;同第6,013,453号;同第6,410,248号;同第6,140,466号;第同6,200,759号;および同第6,242,568号;ならびに国際公開第98/37186号;国際公開第98/53057号;国際公開第00/27878号;国際公開第01/88197号、および英国特許第2,338,237号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば共同所有の国際公開第02/077227号に記載されている。それに加え、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性を増大させることが、例えば共有の国際公開第02/077227号に記載されている。それに加え、これらの参考文献と他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび/またはフィンガーが複数あるジンクフィンガータンパク質は、適切な任意のリンカー配列例えば長さが5個以上のアミノ酸からなるリンカーを用いて互いに連結することができる。長さが6個以上のアミノ酸からなるリンカー配列の例に関しては、アメリカ合衆国特許第6479626号;第6903185号;第7153949号も参照のこと。この明細書に記載したタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。標的部位の選択;融合タンパク質とそれをコードするポリヌクレオチドの設計と構成のためのZFPと方法は当業者には公知であり、アメリカ合衆国特許第61400815号;第789538号;第6453242号;第6534261号;第5925523号;第6007988号;第6013453号;第6200759号;WO9519431;WO9606166;WO9853057;WO9854311;WO0027878;WO0160970;WO0188197;WO02099084;WO9853058;WO9853059;WO9853060;WO02016536;WO03016496に詳細に記載されている。それに加え、これらの参考文献と他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび/またはフィンガーが複数あるジンクフィンガータンパク質は、適切な任意のリンカー配列例えば長さが5個以上のアミノ酸からなるリンカーを用いて互いに連結することができる。長さが6個以上のアミノ酸からなるリンカー配列の例に関しては、アメリカ合衆国特許第6479626号;第6903185号;第7153949号も参照のこと。この明細書に記載したタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。したがってヌクレアーゼは、FIXタンパク質をコードする配列を挿入することを望む任意の遺伝子の標的部位に特異的に結合するDNA結合ドメインを含んでいる。B.開裂ドメイン適切な任意の開裂ドメインをDNA結合ドメインに機能するように連結してヌクレアーゼを形成することができる。例えばZFPDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合させてZFN改変されたZFPDNA結合ドメインを通じて目的とする核酸標的を認識することができ、ヌクレアーゼ活性を通じてZFP結合部位の近くでDNAを切断する機能体が作り出されている。例えばKim他1996年ProcNatlAcadSciUSA、第93巻:1156~1160ページを参照のこと。より最近になり、さまざまな生物でZFNを用いたゲノム改変が実施されている。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20030232410号;第20050208489号;第20050026157号;第20050064474号;第20060188987号;第20060063231号;国際公開WO07014275を参照のこと。同様に、TALEDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合させてTALENが作り出されている。例えばアメリカ合衆国特許出願第13068735号を参照のこと。上に指摘したように、開裂ドメインは、DNA結合ドメインにとって異種であってもよい例えばジンクフィンガーDNA結合ドメインとヌクレアーゼからの開裂ドメイン、またはTALENDNA結合ドメインと開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼDNA結合ドメインと異なるヌクレアーゼからの開裂ドメイン。異種性開裂ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインの出所となることのできるエンドヌクレアーゼの例として、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどがあるが、これらに限定されない。例えば20022003CatalogueNewEnglandBiolabsビヴァリー、マサチューセッツ州;Belfort他1997年NucleicAcidsRes、第25巻:3379~3388ページを参照のこと。DNAを開裂させる別の酵素が知られている例えばS1ヌクレアーゼ;緑豆のヌクレアーゼ;膵臓DNアーゼI;球菌のヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linn他編、ヌクレアーゼ、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、1993年も参照のこと。これら酵素またはその機能性断片のうちの1つ以上を開裂ドメインおよび開裂半ドメインの供給源として用いることができる。同様に、上述のように開裂活性のために二量体化を必要とする開裂半ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来するものが可能である。一般に、融合タンパク質が開裂半ドメインを含んでいる場合には、開裂に2つの融合タンパク質が必要とされる。あるいは、2つの開裂半ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。2つの開裂半ドメインは、同じエンドヌクレアーゼまたはその機能性断片に由来するものが可能である。あるいは各開裂半ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼまたはその機能性断片に由来するものが可能である。それに加え、2つの融合タンパク質のための標的部位は、2つの融合タンパク質がそれぞれの標的部位に結合したとき、開裂半ドメインの空間的方向が、例えば二量体化によって開裂半ドメインが機能する開裂ドメインを形成できるような相互配置になることが好ましい。例えばいくつかの実施態様では、標的部位の近縁部は、5~8個のヌクレオチドまたは15~18個のヌクレオチドによって分離されている。しかし任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対例えば2~50個以上のヌクレオチド対が2つの標的部位の間に介在していてもよい。一般に、開裂の部位は標的部位の間に存在する。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素が多くの種に存在しており、認識部位においてDNAに配列特異的に結合し、その結合部位またはその近傍でDNAを開裂させることができる。いくつかの制限酵素例えばタイプIISは、認識部位から離れた部位においてDNAを開裂させ、分離可能な結合ドメインと開裂ドメインを有する。例えばタイプIISの酵素FokIは、DNAの二本鎖を、一方の鎖では認識部位からヌクレオチド9個の位置で、他方の鎖では認識部位からヌクレオチド13個の位置で開裂させる触媒となる。例えばアメリカ合衆国特許第5356802号;第5436150号;第5487994号のほか;Li他1992年ProcNatlAcadSciUSA、第89巻:4275~4279ページ;Li他1993年ProcNatlAcadSciUSA、第90巻:2764~2768ページ;Kim他1994年aProcNatlAcadSciUSA、第91巻:883~887ページ;Kim他1994年bJBiolChem、第269巻:31978~31982ページを参照のこと。例えば一実施態様では、融合タンパク質は、少なくとも1つのタイプIISの制限酵素からの開裂ドメインまたは開裂半ドメインと、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン改変されていてもいなくてもよいを有する。開裂ドメインを結合ドメインから分離できるタイプIISの制限酵素の一例はFokIである。この特別な酵素は二量体として活性を持つ。Bitinaite他1998年ProcNatlAcadSciUSA、第95巻:10570~10575ページ。したがって本開示の目的では、FokI酵素のうちで開示されている融合タンパク質で用いられる部分は開裂半ドメインであると見なされる。したがってジンクフィンガーFokI融合体を用いた二本鎖標的開裂および/または細胞配列の標的置換のためには、それぞれがFokI開裂半ドメインを有する2つの融合タンパク質を用い、触媒で活性化する開裂ドメインを再構成することができる。あるいはジンクフィンガー結合ドメインと2つのFokI開裂半ドメインを有する単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ジンクフィンガーFokI融合体を用いた標的開裂と標的配列改変のためのパラメータは、この明細書の別の箇所に提示されている。切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持している、または多量体化例えば、二量体化して機能性切断ドメインを形成する能力を保持しているタンパク質の任意の部分であってもよい。例示的IIS型制限酵素は、参照によってその全体が本明細書に援用されている、共同所有の国際公開第2007/014275号に記載されている。別の制限酵素も分離可能な結合ドメインと開裂ドメインを持ち、それらがこの明細書で考慮される。例えばRoberts他2003年NucleicAcidsRes、第31巻:418~420ページを参照のこと。いくつかの実施態様では、開裂ドメインは、ホモ二量体化を最少にするか阻止する1つ以上の改変された開裂半ドメイン二量体化ドメイン突然変異体とも呼ばれるを含んでいる。それは、例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20050064474号;第20060188987号;第20070305346号;第20080131962号に記載されているこれらはすべて、その全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。FokIの446位、447位、479位、483位、484位、486位、487位、490位、491位、496位、498位、499位、500位、531位、534位、537位、538位のアミノ酸残基はすべて、FokI開裂半ドメインの二量体化に影響を与える標的である。必須のヘテロ二量体を形成するFokIの改変された開裂半ドメインの例として、第1の開裂半ドメインがFokIの490位と538位のアミノ酸残基に突然変異を含み、第2の開裂半ドメインが486位と499位のアミノ酸残基に突然変異を含むペアが挙げられる。例えば一実施態様では、490位の突然変異によってGluEがLysKで置換され;538位の突然変異によってIsoIがLysKで置換され;486位の突然変異によってGlnQがGluEで置換され;499位の突然変異によってIsoIがLysKで置換される。この明細書に記載の改変された開裂半ドメインを作った。具体的には、1つの開裂半ドメインにおいて490位E→K、538位I→Lを突然変異させることによってE490K:I538Kと名付ける改変された開裂半ドメインを作り、別の開裂半ドメインにおいて486位Q→Eと499位I→LI→Lを突然変異させることによってQ486E:I499Lと名付ける改変された開裂半ドメインを作った。この明細書に記載の改変された開裂半ドメインは、異常な開裂が最少であるかなくなった必須のヘテロ二量体突然変異体である。例えばアメリカ合衆国特許出願公開20080131962号を参照のことその開示内容の全体があらゆる目的でこの明細書に組み込まれている。いくつかの実施態様では、改変された開裂半ドメインは、486位、499位、496位野生型FokIに対する位置に突然変異を含んでいて、例えば486位では野生型GlnQ残基がGluE残基で置換され、499位では野生型IsoI残基がLeuL残基で置換され、496位では野生型AsnN残基がAspD残基またはGluE残基で置換されるそれぞれELDドメイン、ELEドメインとも呼ばれる。別の実施態様では、改変された開裂半ドメインは、490位、538位、537位野生型FokIに対する位置に突然変異を含んでいて、例えば490位では野生型GluE残基がLysK残基で置換され、538位では野生型IsoI残基がLysK残基で置換され、537位では野生型HisH残基がLysK残基またはArgR残基で置換されるそれぞれKKKドメイン、KKRドメインとも呼ばれる。別の実施態様では、改変された開裂半ドメインは、490位と537位野生型FokIに対する位置に突然変異を含んでいて、例えば490位では野生型GluE残基がLysK残基で置換され、537位では野生型HisH残基がLysK残基またはArgR残基で置換されるそれぞれKIKドメイン、KIRドメインとも呼ばれる。アメリカ合衆国特許出願公開第20110201055号を参照のこと。別の実施態様では、改変された開裂半ドメインは、Sharkeyおよび/またはSharkey突然変異を含んでいるGuo他2010年JMolBiol、第400巻:96~107ページ参照。この明細書に記載の改変された開裂半ドメインは、適切な任意の方法を利用して例えば野生型開裂半ドメインFokIの位置指定突然変異誘発によって調製することができる。それは例えば、アメリカ合衆国特許出願公開第20050064474号;第20080131962号;第20110201055号に記載されている。あるいはヌクレアーゼは、いわゆる分割酵素技術例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20090068164号を参照のことを利用して生体内の核酸標的部位において組み立てることができる。そのような分割酵素の要素は、別々の発現コンストラクト上で発現させること、または個々の要素が例えば自己開裂2AペプチドすなわちIRES配列によって分離されている1つのオープンリーディングフレームの中で連結させることができる。要素として、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、または1つのメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインの複数のドメインが可能である。ヌクレアーゼは、例えばWO2009042163とWO20090068164に記載されているような酵母をベースとした染色体系の中で、使用前に活性をスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現コンストラクトは、従来技術で知られている方法を利用して容易に設計することができる。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20030232410号;第20050208489号;第20050026157号;第20050064474号;第20060188987号;第20060063231号;国際公開WO07014275を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモータまたは誘導的プロモータ例えばラフィノースおよび/またはガラクトースの存在下で活性化脱抑制され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモータの制御下に置くことができる。標的部位上に詳しく記載したように、DNAドメインを改変し、例えば内在性FIX遺伝子の中、または内在性セーフハーバー遺伝子の中、または挿入されたセーフハーバー遺伝子の中で、選択した任意の配列と結合させることができる。改変されたDNA結合ドメインは、天然のDNA結合ドメインと比べて新たな結合特異性を持つことができる。改変法には合理的な設計とさまざまな種類の選択が含まれるが、それだけに限られない。合理的な設計には、例えば三連または四連ヌクレオチド配列と個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを利用することが含まれる。それぞれの三連または四連のヌクレオチド配列には、特定の三連または四連の配列と結合する、ジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列が付随している。例えば共有のアメリカ合衆国特許第6453242号と第6534261号を参照のことその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。TALエフェクタドメインを合理的に設計することもできる。例えば2010年5月17日と2010年8月21日にそれぞれ出願されたアメリカ合衆国仮出願第61395836号と第61401429号を参照のこと。ファージ提示と2ハイブリッド系を含めてDNA結合ドメインに適用できる選択法の例が、アメリカ合衆国特許第5789538号;第5925523号;第6007988号;第6013453号;第6410248号;第6140466号;第6200759号;第6242568号のほか;WO9837186;WO9853057;WO0027878;WO0188197;イギリス国特許第2338237号に記載されている。それに加え、ジンクフィンガー結合ドメインに対する特異性の増大が、例えば共有のWO02077227に記載されている。標的部位の選択;ヌクレアーゼと、融合タンパク質と、それをコードするポリヌクレオチドの設計法と構造は、当業者には公知であり、アメリカ合衆国特許出願公開第20050064474号と第20060188987号に詳細に記載されているその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。それに加え、これらの参考文献と他の参考文献に開示されているように、DNA結合ドメインジンクフィンガードメインおよび/またはフィンガーが複数あるジンクフィンガータンパク質は、適切な任意のリンカー配列例えば長さが5個以上のアミノ酸からなるリンカーを用いて互いに連結することができる。長さが6個以上のアミノ酸からなるリンカー配列の例に関しては、アメリカ合衆国特許第6479626号;第6903185号;第7153949号を参照のこと。この明細書に記載したタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。アメリカ合衆国特許出願第13066735号も参照のこと。機能するFIXタンパク質をコードする配列の標的挿入によって血友病Bを治療するため、対象のゲノム中の望む任意の挿入部位をヌクレアーゼで開裂させる。するとFIXコード配列を有するドナーポリヌクレオチドの標的挿入が促進される。ヌクレアーゼのDNA結合ドメインの標的は、ゲノム中の望む任意の部位にすることができる。いくつかの実施態様では、例えばアメリカ合衆国特許出願第12798749号に記載されているように、ヌクレアーゼのDNA結合ドメインの標的を内在性FIXF9遺伝子にする。標的部位は、コード配列中の任意の場所でよく、コード配列の上流でも下流でもよい。いくつかの実施態様では、標的部位は、コード配列の3’末端の近くである。別の実施態様では、ヌクレアーゼDNA結合ドメイン要素の標的はセーフハーバー遺伝子座であり、その中には、単なる例示だが、AAVSl遺伝子アメリカ合衆国特許出願公開第20080299580号を参照のこと、CCR5遺伝子アメリカ合衆国特許出願公開第20080159996号を参照のこと、Rosa遺伝子座WO2010065123を参照のことが含まれる。ドナー配列血友病を治療するため、ドナー配列は、機能するFIXタンパク質をコードする配列またはその一部を含んでいるため、ドナーの組み込み後に、機能するFIXタンパク質をコードしていてそのタンパク質を発現する配列になる。ドナー分子を内在性遺伝子に挿入して、その内在性遺伝子のすべて、またはいくらかが発現するか、まったく発現しないようにすることができる。例えばこの明細書に記載した機能するFIX配列を含む導入遺伝子を内在性FIX遺伝子座に挿入し、そのFIX導入遺伝子を用いてその内在性FIXのいくらかを発現させること、またはその内在性FIXをまったく発現させないことができる例えばドナーは突然変異を補正して野生型内在性配列を発現させることができる。別の実施態様では、FIX導入遺伝子を任意の内在性遺伝子座例えば内在性の、または挿入されたセーフハーバー遺伝子座に組み込む。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20080299580号;第20080159996号;第201000218264号を参照のこと。FIXドナー配列は、融合タンパク質の発現の前に、または発現と同時に、または発現の後に細胞に導入することができる。FIXドナーポリヌクレオチドは、一般にゲノム配列と十分な相同性を持っているため、それと相同なゲノム配列との間の相同組み換えまたは相同部指定修復をサポートする。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第20050064474号;第20070134796号;第20090263900号を参照のこと。ドナー配列は、置換されるゲノム配列と一般には同じでないことが容易にわかるであろう。例えばドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列と十分な相同性が存在している限り、ゲノム配列に対して1つ以上の一塩基変化、挿入、欠失、逆位、再配列を含んでいる可能性がある。あるいはドナー配列は、相同性のある2つの領域に隣接した非相同配列を含んでいる可能性がある。それに加え、ドナー配列は、細胞クロマチン内の興味の対象となる領域とは相同でない配列を含むベクター分子を含んでいる可能性がある。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同ないくつかの不連続な領域を含んでいる可能性がある。例えば興味の対象となる領域に通常は存在しない配列の標的挿入のため、その配列をドナー核酸分子の中に存在させ、興味の対象となる領域の中の配列と相同な領域に隣接させることができる。FIXドナーポリヌクレオチドとしてDNAまたはRNA、一本鎖または二本鎖が可能であり、直線または円の形態で細胞の中に導入することができる。直線形態で導入された場合には、ドナー配列の両端を当業者に知られている方法で例えばエキソヌクレアーゼによる分解から保護することができる。例えば1つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直線分子の3’末端に付加する、および/または自己相補的オリゴヌクレオチドを一端または両端に連結する。例えばChang他1987年ProcNatlAcadSciUSA、第84巻:4959~4963ページ;Nehls他1996年Science、第272巻:886~889ページを参照のこと。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護する別の方法として、末端アミノ基の付加、改変されたヌクレオチド間連結の利用例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイト、Oメチルリボース残基、ジオキシリボース残基などがあるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、追加配列例えば複製起点、プロモータ、抗生剤抵抗性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として導入すること、またはリポソームやポロキサマーなどの物質との複合体にした核酸として導入すること、またはウイルス例えばアデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスによって送達することができる。FIXドナーは一般に、その発現が組み込み部位にある内在性プロモータドナーが患者の欠陥のあるFIXF9遺伝子座に組み込まれるときには例えば内在性FIXプロモータによって作動するように挿入される。しかしドナーが、プロモータおよび/またはエンハンサ例えば組み込まれたときにFIXタンパク質の機能の発現を駆動する構成的プロモータか、誘導的または組織特異的例えば肝臓特異的プロモータを含んでいてもよいことは明らかであろう。FIXドナー配列は、選択した任意の標的部位に特異的に組み込むことにより、従来の遺伝子治療におけるランダムな組み込みに付随する問題をなくすことができる。いくつかの実施態様では、ドナー配列が内在性FIX遺伝子座に組み込まれることで血友病Bの患者の欠陥が補正される。別の実施態様では、FIXドナー配列はセーフハーバー遺伝子座例えばCCR5遺伝子座、AAVSI遺伝子座などに組み込まれる。さらに、発現には必要ないが、内在性配列は、転写調節配列または翻訳調節配列例えばプロモータ、エンハンサ、インシュレータ、内部リボソームエントリー部位、2Aペプチドコード配列、ポリアデニル化シグナルも含んでいてよい。送達ヌクレアーゼ、そのヌクレアーゼをコードしているポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、この明細書に記載したタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、適切な任意の手段で生体内または生体外の送達ができる。本明細書に記載のヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第6,453,242号;同第6,503,717号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,607,882号;同第6,689,558号;同第6,824,978号;同第6,933,113号;同第6,979,539号;同第7,013,219号;および同第7,163,824号に説明されており、それらの全ての開示は、参照によってその全体が本明細書に援用される。この明細書に記載したヌクレアーゼおよび/またはドナーコンストラクトは、1つ以上のジンクフィンガータンパク質をコードする配列を含むベクターを用いて送達することもできる。任意のベクター系を用いることができる。ベクター系として、例えばプラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。アメリカ合衆国特許第6534261号;第6607882号;第6824978号;第6933113号;第6979539号;第7013219号;第7163824号も参照のことその全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。さらに、これらベクターのどれもが治療に必要な1つ以上の配列を含むことができることは明らかであろう。したがって1つ以上のヌクレアーゼと1つのドナーコンストラクトを細胞に導入するとき、そのヌクレアーゼおよび/またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクターまたは異なるベクターに載せて運ぶことができる。複数のベクターを用いるとき、それぞれのベクターは、1つまたは複数のヌクレアーゼおよび/またはドナーコンストラクトをコードする配列を含むことができる。ウイルスをベースにした、またはウイルスをベースにしない従来の遺伝子導入法を利用し、ヌクレアーゼとドナーコンストラクトをコードする核酸を細胞例えば哺乳動物の細胞と標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、送達用ビヒクル例えばリポソームやポロキサマーとの複合体となった核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAウイルスとRNAウイルスが含まれていて、そのウイルスは、これらは、細胞に送達された後にエピソーム状ゲノムまたは組み込まれたゲノムを有する。改変されたDNA結合タンパク質と、これら結合タンパク質を含む融合タンパク質の生体内送達の概説に関しては、例えばRebar2004年ExpertOpinionInvestDrugs、第13巻:829~839ページ;Rossi他2007年NatureBiotech、第25巻:1444~1454ページのほか、一般的な遺伝子送達に関する参考文献、例えばAnderson、Science、第256巻:808~813ページ1992年;NabelとFeigner、TIBTECH、第11巻:211~217ページ1993年;MitaniとCaskey、TIBTECH、第11巻:162~166ページ1993年;Dillon、TIBTECH、第11巻:167~175ページ1993年;Miller、Nature、第357巻:455~460ページ1992年;VanBrunt、Biotechnology、第6巻:1149~1154ページ1988年;Vigne、RestorativeNeurologyandNeuroscience、第8巻:35~36ページ1995年;KremerとPerricaudet、BritishMedicalBulletin、第51巻:31~44ページ1995年;DoerfierとBohm編のCurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyの中のHaddada他1995年;Yu他、GeneTherapy、第1巻:13~26ページ1994年を参照のこと。ウイルスによらない核酸の送達法として、電気穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリ化、脂質:核酸共役体、裸のDNA、人工ビリオン、薬剤によるDNAの取り込み増強などがある。例えばSonitron2000システムRichMar社を用いた超音波遺伝子導入を利用して核酸を送達することもできる。核酸送達系の別の例として、AmaxaBiosystems社ケルン、ドイツ国、Maxcyte社ロックヴィル、メリーランド州、BTXMolecularDeliverySystems社ホリストン、マサチューセッツ州、CopernicusTherapeutics社例えばアメリカ合衆国特許第6008336号を参照のことによって提供されるものがある。リポフェクションは、例えばアメリカ合衆国特許第5049386号;第4946787号;第4897355号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている例えばTransfectam登録商標、Lipofectin登録商標。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質として、FeignerのWO9117424、WO9116024に記載されているものなどがある。脂質:核酸複合体免疫脂質複合体などの標的リポソームが含まれるの調製は当業者には周知である例えばCrystalScience、第270巻:404~410ページ1995年;Blaese他、CancerGeneTher、第2巻:291~297ページ1995;Behr他、BioconjugateChem、第5巻:382~389ページ1994年;Remy他、BioconjugateChem、第5巻:647~654ページ1994年;Gao他、GeneTherapy、第2巻:710~722ページ1995年;Ahmad他、CancerRes、第52巻:4817~4820ページ1992年;アメリカ合衆国特許第4186183号;第4217344号;第4235871号;第4261975号;第4485054号;第4501728号;第4774085号;第4837028号;第4946787を参照のこと。別の送達法として、送達する核酸をEnGeneIC送達用ビヒクルEDVの中にパッケージングする方法がある。EDVは、二重特異的抗体を用いて標的組織に特異的に送達される。この二重特異的抗体は、抗体の1本のアームが標的組織に対する特異性を持ち、他方のアームがEDVに対する特異性を持つ。この抗体はEDVを標的細胞の表面に運ぶため、EDVはその後エンドサイトーシスによって細胞の中に運ばれる。EDVが一旦細胞の中に入ると、内容物が放出される例えばMacDiarmid他2009年NatureBiotechnology、第27巻:643ページを参照のこと。改変されたZFPをコードする核酸の送達にRNAウイルスまたはDNAウイルに基づく系を用いるというのは、ウイルスを体内の特定の細胞に向かわせてウイルスのペイロードを核に届けるための高度に進化した方法の利点を生かしている。ウイルスベクターは、患者に直接投与すること生体内、またはウイルスベクターを用いて試験管内で細胞を処理し、改変されたその細胞を患者に投与することができる生体外。ウイルスをベースとした従来のZFP送達系として、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。宿主のゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入法によって可能であり、その結果として挿入された導入遺伝子の長期にわたる発現がしばしば見られる。それに加え、異なる多くの種類の細胞と標的組織で大きな形質導入効率が観察されている。レトロウイルスの親和性は、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を大きくすることによって変えることができる。レンチウイルスベクターは、分裂しない細胞に形質導入するか分裂しない細胞に感染して、一般に大きなウイルス力価を生じさせるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、シス作動性の長い末端反復配列を含んでいて、外来配列を6~10kbまでパッケージングする能力を持つ。ベクターの複製とパッケージングには最小のシス作動性LTRで十分であり、それを用いて治療用遺伝子を標的細胞に組み込み、導入遺伝子を永続的に発現させる。広く用いられているレトロウイルスベクターとして、マウス白血病ウイルスMuLV、テナガザル白血病ウイルスGaLV、サル免疫不全ウイルスSIV、ヒト免疫不全ウイルスHIVや、これらの組み合わせをベースとしたベクターがある例えばBuchscher他、JVirol、第66巻:2731~2739ページ1992年;Johann他、JVirol、第66巻:1635~1640ページ1992年;Sommerfelt他、Virol、第176巻:58~59ページ1990年;Wilson他、JVirol、第63巻:2374~2378ページ1989年;Miller他、JVirol、第65巻:2220~2224ページ1991年;PCTUS9405700を参照のこと。一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスをベースとした系を利用できる。アデノウイルスをベースとしたベクターは、多くのタイプの細胞で非常に大きな形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて大きな力価と高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系の中で大量に作ることができる。例えば核酸とポリペプチドの試験管内産生や、生体内および生体外の遺伝子治療手続きにおいて細胞に標的核酸を用いて形質導入するのにアデノ随伴ウイルスAAVベクターも用いられる例えばWest他、Virology、第160巻:38~47ページ1987年;アメリカ合衆国特許第4797368号;WO9324641;Kotin、HumanGeneTherapy、第5巻:793~801ページ1994年;Muzyczka、JClinInvest、第94巻:1351ページ1994年。組み換えAAVベクターの構成は、多数の刊行物に記載されており、例えばアメリカ合衆国特許第5173414号;Tratschin他、MolCellBiol、第5巻:3251~3260ページ1985年;Tratschin他、MolCellBiol、第4巻:2072~2081ページ1984年;HermonatとMuzyczka、PNAS、第81巻:6466~6470ページ1984年;Samulski他、JVirol、第63巻:3822~3828ページ1989年を参照のこと。臨床試験で遺伝子の導入に少なくとも6種類のウイルスベクター法を現在利用でき、これらの方法では、形質導入剤を生成させるため、ヘルパー細胞系に挿入した遺伝子によって欠陥のあるベクターを補足する操作を含む方法が利用されている。pLASNとMFGSは、臨床試験で用いられてきたレトロウイルスベクターの例であるDunbar他、Blood、第85巻:3048~3050ページ1995年;Kohn他、NatMed、第1巻:1017~102ページ1995年;Malech他、PNAS、第94巻:2212133~12138ページ1997年。PA317pLASNは、遺伝子治療試験で最初に用いられた治療用ベクターであるBlaese他、Science、第270巻:475~480ページ1995年。MFGSでパッケージされたベクターで50以上という形質導入効率が観察されているEllem他、ImmunolImmunothez、第44巻:10~20ページ1997年;Dranoff他、HumGeneTher、第1巻:111~112ページ1997年。組み換えアデノ随伴ウイルスベクターrAAVは、欠損があって非病原性のパーボウイルスアデノ随伴型2ウイルスに基づく有望な別の遺伝子送達系である。どのベクターも、導入遺伝子発現カセットに隣接したAAV145bp逆方向末端反復配列だけを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムに組み込まれることによる効率的な遺伝子導入と安定な導入遺伝子送達が、このベクター系のカギとなる特徴であるWagner他、Lancet、第351巻:91171702~1703ページ1998年、Kearns他、GeneTher、第9巻:748~755ページ1996年。他のAAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10などと新規なあらゆるAAV血清型も本発明で使用できる。複製欠損性組み換えアデノウイルスベクターAdは大きな力価のものを作ることができ、異なる多くの種類の細胞に容易に感染させることができる。たいていのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、AdE1a遺伝子および/またはAdE1b遺伝子および/またはAdE3遺伝子と置換されるように改変され;その後、その複製欠損性ベクターは、失われた遺伝子機能をトランスで提供するヒト293細胞の中で増殖する。Adベクターは生体内で多くの種類の組織に形質導入することができる。そのような組織として、肝臓、腎臓、筋肉などに見られる分裂しない分化した細胞がある。従来のAdベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の一例として、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法があるSterman他、HumGeneTher、第7巻:1083~1089ページ1998年。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの別の例として、Rosenecker他、Infection、第24巻:15~10ページ1996年;Sterman他、HumGeneTher、第9巻:71083~1089ページ1998年;Welsh他、HumGeneTher、第2巻:205~218ページ1995年;Alvarez他、HumGeneTher、第5巻:597~613ページ1997年;Topf他、GeneTher、第5巻:507~513ページ1998年;Sterman他、HumGeneTher、第7巻:1083~1089ページ1998年などがある。パッケージング細胞を用い、宿主細胞に感染させることのできるウイルス粒子を形成する。そのような細胞として、アデノウイルスをパッケージする293細胞と、レトロウイルスをパッケージするψ2細胞またはPA317細胞がある。遺伝子治療で用いるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子の中にパッケージするプロデューサ細胞系によって生成される。ベクターは、一般に、パッケージングと可能ならば宿主への組み込みに必要な最小ウイルス配列を含んでいて、他のウイルス配列が、発現させるタンパク質をコードする発現カセットで置換される。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば遺伝子治療で用いるAAVベクターは、一般に、パッケージングと宿主のゲノムへの組み込みに必要なAAVゲノムからの逆方向末端反復配列ITRだけを備えている。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepとcapをコードするがITR配列を欠いているヘルパープラスミドを含む細胞系の中にパッケージされる。この細胞系にもアデノウイルスがヘルパーとして感染する。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製と、ヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列を欠いているために大量にはパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば熱処理によって減らすことができる。なぜならアデノウイルスのほうがAAVよりも熱処理に対する感受性が大きいからである。多くの遺伝子療法の用途では、遺伝子療法用ベクターが特定のタイプの組織に大きな特異性で送達されることが望ましい。したがってウイルスベクターは、ウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてのリガンドをウイルスの外面に発現させることにより、所定のタイプの細胞に対する特異性を持つように改変することができる。リガンドは、興味の対象であるタイプの細胞の表面に存在することが知られている受容体に対する親和性を持つように選択する。例えばHanらProcNatlAcadSciUSA、第92巻:9747~9751ページ1995年の報告によれば、モロニーマウス白血病ウイルスを改変してヒトgp70に融合したヒトヒレグリンを発現させることができ、その組み換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある種のヒト乳がん細胞に感染する。この原理を他のウイルス標的細胞のペアそのペアでは、標的細胞がある受容体を発現し、ウイルスが、その細胞表面受容体のためのリガンドを含む融合タンパク質を発現するに拡張することができる。例えば糸状ファージを改変し、選択したほぼすべての細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片例えばFABまたはFvを提示させることができる。上の説明は主にウイルスベクターに適用されるとはいえ、同じ原理を非ウイルスベクターにも適用することができる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを促進する特定の取り込み配列を含むように改変することができる。遺伝子治療用ベクターは、典型的には、以下に説明するように全身投与例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内の輸液または局所的塗布によって個々の患者に投与することで生体内に送達できる。あるいはベクターを生体外で細胞例えば、個々の患者から分離して培養した細胞例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織バイオプシー、または万能ドナー造血幹細胞に送達した後、通常はそのベクターを組み込んだ細胞を選択してからその細胞を患者に再び移植することができる。ヌクレアーゼおよび/またはドナーコンストラクトを含むベクター例えばレトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなどは、生物に直接投与して生体内で細胞に形質導入することもできる。あるいは裸のDNAを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるのに通常用いられる任意の経路でなされ、例えば注射、輸液、局所的塗布、電気穿孔などの経路があるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与するのに適切な方法を利用できる。そのような方法は当業者によく知られている。2つ以上の経路を利用して特定の組成物を投与することができるが、ある特定の経路では、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばある。この明細書に記載した例えばヌクレアーゼをコードする、および/またはFIXをコードするポリヌクレオチドの導入に適したベクターとして、非組み込みレンチウイルスベクターIDLVがある。例えばOry他1996年ProcNatlAcadSciUSA、第93巻:11382~11388ページ;Dull他1998年JVirol、第72巻:8463~8471ページ;Zuffery他1998年JVirol、第72巻:9873~9880ページ;Follenzi他2000年NatureGenetics、第25巻:217~222ページ;アメリカ合衆国特許出願公開第2009054985号を参照のこと。医薬として許容可能な担体は、投与する具体的な組成物と、その組成物の投与に用いる具体的な方法によって一部が決まる。したがって以下に記載するように、医薬組成物に関して利用可能なさまざまな製剤が存在している例えばレミントンの医薬科学、第17版、1989年参照。同じ系または異なる系を用いてヌクレアーゼをコードする配列とドナーコンストラクトを送達できることは明らかであろう。例えばドナーポリヌクレオチドをプラスミドで運び、1つ以上のヌクレアーゼをAAVベクターによって運ぶことができる。さらに、異なるベクターを同じ経路または異なる経路で投与することができる筋肉内注射、尾の静脈への注射、他の静脈内注射、腹腔内投与。ベクターは、同時に投与すること、または任意の順番で投与することができる。そこで本明細書には、ヌクレアーゼを媒介としたFIXコード配列の組み込みによる血友病Bの生体内または生体外での治療が含まれる。組成物は、治療用FIXポリペプチドが血清中で、または肝臓内で、または標的細胞内で望む濃度になる有効量でヒト患者に投与される。投与は、ポリヌクレオチドが望む標的細胞に送達される任意の手段で行なうことができる。例えば生体内と生体外の両方の方法が考えられる。門脈静脈への静脈内注射が好ましい1つの投与法である。他の生体内投与法として、例えば肝臓の葉または胆管への直接的な注入、肝臓の遠位からの静脈内注射肝動脈を通じた注入を含む、肝臓の柔組織への直接的な注入、肝動脈を通じた注入、胆管を通じた逆行注入などがある。生体外の投与法として、切除された肝細胞や肝臓の他の細胞に試験管内で形質導入した後、切除されて形質導入されたその肝細胞をヒト患者の門脈血管、肝臓柔組織、胆管に輸液する方法がある。例えばGrossman他1994年NatureGenetics、第6巻:335~341ページを参照のこと。投与するヌクレアーゼとFIXドナーの有効量は、患者ごとに異なるであろうし、興味の対象である治療用ポリペプチドが何であるかによっても異なるであろう。したがって有効量は、組成物を投与する医師が最もうまく決定することができ、適切な用量は、当業者が容易に決定することができる。組み込みと発現に十分な時間典型的には例えば4~15日が経過した後、治療用ポリペプチドの血清レベルまたは他の組織でのレベルを分析して投与前の初期レベルと比較すると、投与した量が少なすぎたか、適切な範囲内であったか、多すぎたかを判断できよう。初期投与とその後の投与のための適切な計画もさまざまだが、初期投与の後、必要な場合には投与を続けて行なうのが典型的である。あとからの投与はさまざまな間隔で行なうことができ、毎日から毎年、さらには数年ごとの範囲にわたる。当業者であれば、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の抑制または阻止を回避するため、適切な免疫抑制法が勧められることを理解できよう。例えばVilquin他l995年HumanGeneTher、第6巻:1391~1401ページを参照のこと。生体外投与と生体内投与両方のための製剤として、液体または乳化液体中の懸濁液がある。活性成分は、医薬として許容できてその活性剤と適合性のある賦形剤と混合されることがしばしばある。適切な賦形剤として、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどと、これらの組み合わせがある。それに加え、組成物は、少量の補助物質を含んでいてもよい。それは例えば、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、安定剤や、医薬組成物の有効性を増大させる他の試薬である。以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼZFNを含む本発明の実施態様に関するものである。これは例示だけを目的としており、他のヌクレアーゼを使用できることがわかるであろう。それは例えば、改変されたDNA結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼメガヌクレアーゼ、および/または天然または改変ホーミングエンドヌクレアーゼメガヌクレアーゼのDNA結合ドメインと異種開裂ドメインまたはTALENSの融合体である。実施例1:FIX特異的ZFNと、それを使用した標的組み込み遺伝子病を治療する戦略としての遺伝子導入は、疾患のさまざまなモデル動物で実施されて成功していて、最近ではヒトに応用されている例えばAiuti他2009年NEnglJMed、第360巻:447~458ページ;Maguire他2009年NEnglJMed、第358巻:2240~2248ページ;Carrier他2009年Science、第326巻:818~823ページを参照のこと。生体外で培養されたES様誘導万能幹細胞の補正に遺伝子ターゲティングが利用されているHanna他2007年Science、第318巻:1920~1923ページが、大半の遺伝子病は、現在は生体外操作が実現できない臓器系を冒している。そのような1つの臓器が、血漿タンパク質血液凝固因子を含むが合成される主要な部位である肝臓である。肝臓遺伝子治療のためのモデルとなる遺伝子病は、F9遺伝子がコードする血液凝固IX因子FIXの不足によって起こる血友病Bである。F9イントロン1への野生型エキソン2~8の標的組み込みTIによってエキソン1を有する野生型コード配列図1aのスプライシングが可能になり、野生型FIXの発現と、たいていのF9突然変異によって起こる欠陥の救済につながると考えられる。そこでわれわれは、野生型F9のエキソン2~8を載せた標的ベクターと組み合わせたZFNが生体内で遺伝子ターゲティングを誘導し、肝細胞のゲノム内において、突然変異したF9遺伝子をその場で補正できるかどうかを調べることを目指した。ヒトF9イントロン1を標的とするZFNペアを用い、それらZFNが特定の標的部位においてDSBを誘導する能力を調べた。CelIアッセイSurveyor登録商標、Transgenomics社。Perez他2008年NatBiotechnol、第26巻:808~816ページ;Guschin他2010年MethodsMolBiol、第649巻:247~256ページを利用して標的部位のPCR増幅がどこで起こるかを調べた後、ミスマッチ検出酵素CelIYang他2000年Biochemistry、第39巻、3533~3541ページを用いて挿入と欠失indelを定量した。それが、DSBの頻度の下限の評価値を与える。ZFN発現ベクターをトランスフェクトした3日後、DNイージーキットQiagen社を用いてゲノムDNAをK562細胞から単離した。hF9イントロン1をCelI分析するためのプライマーは、N2ForTCGGTGAGTGATTTGCTGAG、配列ID番号1とN2RevAACCTCTCACCTGGCCTCAT、配列ID番号2であった。hF9遺伝子のイントロン1を標的とする活性が最大のZFNペアN2と名付けるを以下の表に示すアメリカ合衆国特許出願公開第20110027235号も参照のこと。細胞培養トランスフェクションのためのN2ZEN発現プラスミドは、ゾセアアシグナウイルスからの2Aリンカーを両方のZFNのコード配列の間に挿入し、このカセットをCMVプロモータの下流に挿入することによって構成した。N2ZFNペアをヒトK562細胞にトランスフェクトすると、N2標的部位対立遺伝子の30が開裂したことがわかった図1c。N2ZFNがDSBを誘導することによって相同組み換えを促進する能力を調べるため、K562細胞の中にN2ZFNを、NheI制限部位を挿入する標的ベクターと同時にトランスフェクトした図1d。NheIドナープラスミドは、K562ゲノムDNAからの相同部の左右のアームをPCRで増幅することによって構成した。その後、NheI制限部位を含む短い配列を相同部の左右のアームの間に導入した。トランスフェクションの3日後と10日後、対立遺伝子のそれぞれ14と12がNheIによる消化に感受性を持っていた図1e。これは、相同組み換えを通じた標的組み込みTIが効率的な割合であることを示している。実施例2:ヒト血友病の生体内マウスモデルN2標的部位はhF9イントロン1に存在しているが、マウスF9遺伝子には欠けている。したがってN2ZFNを生体内でテストするため、血友病BHBのヒト化マウスモデルを作った。肝臓特異的プロモータの制御下にあるhF9ミニ遺伝子図2aを構成したShen他1989年DNA、第8巻:101~108ページ;Miao他2000年MolTher第1巻:522~532ページ。hF9のTIのためのプライマーは、N2TIForGGCCTTATTTACACAAAAAGTCTG、配列ID番号14とN2TIRevTTTGCTCTAACTCCTGTTATCCATC、配列ID番号15であった。このコンストラクトのイントロン1はヒトN2標的部位を含んでいる着陸パッド、LP。LPコンストラクトの中のF9配列の残部は以前に同定されたナンセンス突然変異Y155停止をまねており、その中にはFIX触媒ドメインをコードするエキソンよりも前に早すぎる停止コドンがあるため、循環するFIXタンパク質が存在しなくなる。LPコンストラクトは遺伝子合成によって構成しGenscript、pUC57プラスミドに連結した。次にLPコンストラクトをSwaIで消化させて切除し、適切なプラスミドのSwaI部位の中にあってリコンビナーゼを媒介としたカセット交換RCMETaconicArtemis社に適合したFLPリコンビナーゼ部位の間に連結してLPKIプラスミドを作り出した。そのLPKIプラスミドとFLPリコンビナーゼ発現プラスミドTaconicArtemis社を、RCMEに適合したFLPリコンビナーゼ部位を含むB6S6F1杯性幹ES細胞のROSA26遺伝子座にトランスフェクトしたZambrowicz他1997年ProcNatlAcadSci、第94巻:3789~3794ページ。標的組み込みが正しくなされたB6S6F1LPES細胞クローンをサザンブロットによって同定し、B6D2F1胚盤胞に注入した。B6S6F1LPマウスGOに由来する純粋なES細胞は自然な誕生によって供給され、キメラの子どもと野生型C57BL6JマウスJacksonLaboratories社の戻し交雑を5世代生体内開裂実験または7~10世代生体内TI実験にわたって行なった。プライマーとしてLPOligo1ACTGTCCTCTCATGCGTTGG、配列ID番号16、LPOligo2GATGTTGGAGGTGGCATGG、配列ID番号17、wtROSAOligo1CATGTCTTTAATCTACCTCGATGG、配列ID番号18、wtROSAOligo2CTCCCTCGTGATCTGCAACTCC、配列ID番号19を用い、LPマウスの遺伝子型を明らかにした図2b。LPマウスを、マウスF9遺伝子が欠失している既存のマウスモデルLin他1997年Blood、第90巻、3962~3966ページと交雑させ、生体内でN2ZFNの活性をテストできると考えられるLPHBマウスを作り出した。HBマウスを10世代超にわたってC57BL6JマウスJacksonLaboratories社と戻し交雑した。C57BL6JマウスJacksonLaboratories社を使用してLPネガティブTI実験を行なった。予想通り、LPマウスでは循環するhFIXを検出できなかった図2c。hFIXELISAキットAffinityBiologicals社を用いて血漿hFDの定量を実施し、プールした正常なヒト血漿TrinityBiotech社からの標準曲線と比較した。標準曲線15ngmlの最終値よりも低いすべての値に、検出限界である15ngmlという値を与えた。hFIXELISAのための血漿は、後眼窩から出血させてヘパリン処理した毛細管に入れることによって取得した。実施例3:FIX特異的ZFNの生体内標的送達N2ZFNをFIX産生の正常部位である肝臓に送達するため、肝臓特異的なエンハンサとプロモータからのN2ZFNを発現する肝臓親和性アデノ随伴ウイルスベクター血清型8AAV8N2を作ったShen他、上記文献と、Miao他、上記文献図2d。生体内におけるN2ZENの開裂活性をテストするため、le11vgAAV8N2発現ベクターを用いてLPマウスの尾の静脈に注射を行ない、注射後7日目に肝臓DNAを単離した。LPのPCR増幅とCelIアッセイから、34~47のLP対立遺伝子が開裂したことがわかった図2e。LPコンストラクトのCelIのためのプライマーは、LPN2ForCTAGTAGCTGACAGTACC、配列ID番号20とLPN2RevGAAGAACAGAAGCCTAATTATG、配列ID番号21であった。実施例4:ドナー核酸とFIX特異的ZFNの生体内同時送達スプライスアクセプタSAが前にある野生型エキソン2~8をLPコンストラクトのイントロン1に挿入すると、エキソン1を有する野生型コード配列のスプライシングが可能になる図3a。LPマウスの体内において、突然変異したF9遺伝子をその場で補正するため、遺伝子ターゲティングを目的として、相同部の両アームがSA野生型hF9エキソン2~8カセットに隣接したAAVドナー鋳型ベクターAAVドナーを作った図3a。ドナーベクター産生プラスミドは、LPマウスのゲノムDNAからの相同部の左右のアームをPCRで増幅することによって構成した。pAAVhFIX16プラスミドManno他2006年NatMed、第12巻:342~347ページからのPCR増幅によってスプライスアクセプタエキソン2~8コード配列ウシ成長ホルモンポリAシグナルカセットを取得し、相同部の左右のアームの間に連結した。HR相同組み換えは細胞周期のSG2期の間が好ましいため、N2ベクターとドナーベクターを新生マウスに送達した。そのマウスでは肝細胞が迅速に増殖し、細胞周期が進行してSG2期に入った。生後2日目のLPHBマウスに、AAVN25el0vgだけnl、またはAAVN25el0vgAAVドナー、またはAAVMock5el0vgAAVドナー25e11vgn5を注射した。Mockベクターでは、N2ZFNをウミシイタケのルシフェラーゼで置き換えた。生後10週間の時点でマウスを安楽死させて肝臓DNAを単離し、独立な2通りのPCR戦略を利用してドナーのTIを調べた。第1の戦略では、標的とするLP対立遺伝子のためのより小さなアンプリコンと、標的としないLP対立遺伝子のためのより大きなアンプリコンを生成させるプライマーを使用する図3a、プライマーP1、P2。第2の戦略は、標的とするLP対立遺伝子のためのより大きなアンプリコンと、標的としないLP対立遺伝子のためのより小さなアンプリコンを生成させるプライマーを使用する図3a、プライマーP1/P3。LPコンストラクトのTIのためのプライマーは、P1ACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCTAG、配列ID番号22、P2CACTGATCTCCATCAACATACTGC、配列ID番号23、P3GAATAATTCTTTAGTTTTAGCAA、配列ID番号24であった。両方のPCR分析を行なったとき、N2ドナーを受け取ったマウスでだけTIの証拠が見られた図3b。バンド強度の定量結果は、TIの頻度が1~7であることを示唆していた図3b。循環するhFIXがゲノム補正によって産生されているかどうかを確認するため、生後2日目のLPHBマウスに、AAVN2だけn7、またはAAVMockAAVドナーn6、またはAAVN2AAVドナーn7を注射した上と同じベクター投与量。N2だけ、またはMockドナーを受け取ったマウスの血漿hFIXのレベルは平均で15ngmlアッセイの検出の下限未満であったのに対し、N2ドナーを受け取ったマウスは平均が11~121ngmlであり正常値の2~3に対応図4a、N2だけを受け取ったマウスおよびMockドナーを受け取ったマウスよりも有意に大きかったあらゆる時点でp0006、両側t検定。安定なゲノム補正であることを確認するため、肝部分切除PHxを行なった。すると肝臓の再生中に肝細胞が増殖するにつれて余分な染色体エピソームが希釈されて失われたNakaietalJVirol7569696976図4a、図4b。肝部分切除は、以前に報告されているようにして実施した。動物のあらゆる処理手続きは、フィラデルフィアIACUCの小児病院によって承認された。N2ドナーで処理したマウスのhFIXのレベルの測定値は、肝部分切除後に肝臓が再生した後も変わらなかった。これは、安定な補正であったことを示している。N2だけ、またはMockドナーを受け取った対照マウスは、肝部分切除後に平均値が15ngml未満の状態が続いた図4a。これは、N2ドナーを受け取ったマウスよりも有意に低いあらゆる時点でp0004、両側t検定。hFIXの発現がLP特異的であってゲノムへのランダムなドナー組み込みの結果ではないことを確認するため、LP導入遺伝子を欠いた生後2日目の野生型マウスにAAVN2だけn8、またはAAVMockAAVドナーn6、またはAAVN2AAVドナーn9を注射した上と同じベクター用量。N2だけ、Mockドナー、N2ドナーを受け取ったマウスの血漿hFIXのレベルは、平均でそれぞれ15ngml未満、19ngml未満、27ngml未満であった。これは、LPマウスにおけるhFIX発現の大半がLP特異的補正に由来することを示している図4c。hFIXのレベルがHB表現型を補正するのに十分であったことを確認するため、生後2日目のLPHBマウスに、AAVN2だけn10、またはAAVMockAAVドナーn9、またはAAVN2AAVドナーn9を注射した上と同じベクター投与量。N2だけを注射したマウスの血漿hFIXのレベルはやはり平均で15ngml未満であった。Mockドナーを受け取ったマウスは平均で25ngml未満であり、N2ドナーを受け取ったマウスはhFIXのレベルが有意に高くMockドナーと比べてあらゆる時点でp004、平均で166~354ngmlであった正常な循環レベルの3~7図4d。hFIXmRNAのRTPCRによって肝臓特異的hFIXの発現が確認された図4e。凍結させたマウス組織からのRAをRNイージーキットQiagen社と無RNアーゼDNアーゼキットQiagen社を用いて単離した。iSCRIPTキットBioRad社を用いてcDNAを合成した。プライマーとしてhFIXGen1ForACCAGCAGTGCCATTTCCA、配列ID番号25とhFIXGen1RevGAATTGACCTGGTTTGGCATCT、配列ID番号26を用い、hFIX転写産物のRTPCRを実施した。HB表現型が補正されたかどうかを調べるため、活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTを測定した。これはフィブリン血栓形成のキネティックスの1つの指標であり、血友病において顕著に長くなる。血栓の形成は、25mMの塩化カルシウムの添加によって開始させた。aPTTのための血漿は、尾から出血させ、9:1の割合にしてクエン酸ナトリウムの中に入れることによって取得した。野生型マウスn5とHBマウスn12に関するaPTTの平均値は、それぞれ36秒と67秒であった図4f。Mockドナーを受け取ったマウスn3は平均値が60秒であったのに対してN2ドナーを受け取ったマウスn5はaPTTが有意に短く、平均で44秒であったMockドナーと比較してp00014、両側t検定図4f。実施例5:成体の動物への改変したヌクレアーゼとドナーの生体内同時送達次に、新生児に関して上に記載したようにして、成体の動物に対してヒトFIXLPのゲノム編集を行なった。6週目の成体LPマウスに1e11vgマウスAAVN2だけZFNだけ、または1e11vgマウスAAVN2と55e11vgマウスAAVドナーZFNドナー、または1e11vgマウスAAVMockと55e11vgAAVドナーMockドナーを静脈内注射した。図5Aに示したデータは、1つの群内のマウスを約20匹にして行なった3回の実験を表わしている。これらの実験では、野生型hFIXのレベルは約1000ngmlであった。同様に、図5Bは、生後6週目に、1e11vgマウスAAVN2だけZFNだけ、または1e11vgマウスAAVN2と55e11vgマウスAAVドナーZFNドナー、または1e11vgマウスAAVMockと55e11vgAAVドナーMockドナーを静脈内注射した後の成体LPマウスにおける血漿hFIXのレベルを示すグラフである。注射の2日後、図5Bの2つの群に肝部分切除を行なった。示したデータは、1つの群内のマウスを約20匹にして行なった3回の実験を表わしている。これらの実験では、野生型hFIXのレベルは約1000ngmlであった。このデータは、成体マウスに肝部分切除を行なった場合または行なわない場合にhFIXの発現が安定であることと、成体の動物でゲノム編集を実行できることを示している。この明細書で言及したあらゆる特許、特許出願、刊行物は、その全体が参考としてこの明細書に組み込まれている。明確に理解できるようにするため図と実施例によって開示内容をいくらか詳細に説明してきたが、当業者には、開示内容の精神または範囲を逸脱することなく、さまざまな変更や改変が可能であることが明らかであろう。したがって本発明が上記の説明と実施例に限定されると考えてはならない。"