"少なくとも4つかつ最大30のアミノ酸残基の合成ペプチドであって、aTLR1、2、4、または6から選択されるToll様受容体TLRによって媒介される細胞活性化を阻害することができるペプチドであって、TLR1、2、4、または6から選択されるTLRの膜貫通型ドメインの配列からなる、またはそれらのうちで見られる配列を含む、ペプチド、bαアミノ基またはαカルボキシル基を介して、前記TLR膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域または細胞外領域の配列を含む、さらなるオリゴペプチドに連結されるaのペプチド、caまたはbのペプチドの類似体、da、b、もしくはcのペプチドの塩または化学誘導体、eNおよびC末端のそれぞれに、1つ以上の正に荷電したアミノ酸残基をさらに含むa~dのペプチド、ならびにfa~dのペプチドの環状誘導体から選択される、合成ペプチド。前記TLRは、哺乳類のTLR1、2、4、または6である、請求項1に記載の合成ペプチド。前記哺乳類のTLRは、ヒトまたはマウスのTLR1、TLR2、TLR4、またはTLR6である、請求項2に記載の合成ペプチド。i前記ヒトTLR1は、配列番号1に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号2に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、ii前記ヒトTLR2は、配列番号3に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号4に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、iv前記ヒトTLR6は、配列番号5に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号6に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、v前記マウスTLR1は、配列番号7に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号8に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、vi前記マウスTLR2は、配列番号9に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号10に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、viii前記マウスTLR6は、配列番号11に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号12に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、ix前記マウスTLR4は、配列番号13に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号14に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、かつx前記ヒトTLR4は、配列番号15に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号16に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有する、請求項3に記載の合成ペプチド。前記ヒトまたはマウスTLRの21~30のアミノ酸残基の推定膜貫通型ドメイン内で見られる16~23のアミノ酸残基からなる、請求項3に記載の合成ペプチド。前記ペプチドは、配列番号17~配列番号23に記述される配列のペプチドから選択される、請求項5に記載の合成ペプチド。14~19のアミノ酸残基からなり、そのうちの4~17個は、前記ヒトまたはマウスのTLRの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、1~14個、好ましくは、3~9個は、前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質または細胞外領域内で見られる、請求項4に記載の合成ペプチド。前記ペプチドは、配列番号24~配列番号43に記述される配列のペプチドから選択される、請求項7に記載の合成ペプチド。前記類似体は、aまたはbのペプチドの1つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換、好ましくは、アラニンによる1~4つのアミノ酸残基の置換によって得られる、請求項1cに記載の合成ペプチド類似体。14~35個、好ましくは16個のアミノ酸残基からなり、そのうちの6~21個は、ヒトまたはマウスのTLRの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、1~14個は、前記膜貫通型ドメインの隣接細胞質または細胞外領域内で見られ、前記細胞質領域の1~4つのアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、もしくはセリンで置換されるか、または前記ペプチド類似体は、1つまたは2つのアミノ酸残基がアラニンで置換される前記推定膜貫通型ドメイン内のアミノ酸残基からなる、請求項9に記載の合成ペプチド類似体。前記ペプチド類似体は、配列番号44~配列番号74に記述される配列のペプチドから選択される、請求項10に記載の合成ペプチド類似体。化学誘導体、好ましくは、そのエステル、アミド、またはN-アシル誘導体の形態の、請求項1~11のいずれか1項に記載の合成ペプチド。前記正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはオルニチンである、請求項1eに記載の合成ペプチド。1つまたは2つ、好ましくは、2つのリジン残基が、ペプチド末端のうちの1つまたはその両方に付加される、請求項13に記載の合成ペプチド。前記ペプチドは、配列番号75~配列番号122に記述される配列のペプチドから選択される、請求項14に記載の合成ペプチド。リガンド活性化に応答してTLRタンパク質の活性を調節することができる、請求項1~15のいずれか1項に記載される合成ペプチド。請求項1~15のいずれか1項に記載の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列。請求項1~15のいずれか1項に記載の合成ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。TLR媒介疾患の治療に使用するための、請求項18に記載の薬学的組成物。前記TLR媒介疾患は、敗血症性ショック等の急性炎症、または前立腺癌等の癌である、請求項19に記載の薬学的組成物。前記TLR媒介疾患は、全身性炎症反応症候群SIRS;急性炎症例えば敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行力学的ショック、視神経炎、および敗血症症候群;虚血後の再潅流傷害、炎症性腸疾患例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎;不顕性または活動性感染症例えば、HIV、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、マラリア、慢性肝炎、カンジダ症、マイコバクテリア感染症、および髄膜炎の感染の増悪;うっ血性心不全;自己免疫疾患例えば、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス;慢性閉塞性肺疾患;肺細菌感染素因;肺性浮腫を伴ううっ血性心不全;リウマチ様疾患例えば、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節炎、および他の関節炎症状;変性疾患例えば、粥状動脈硬化、神経変性疾患例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病;線維性疾患;悪液質;移植片拒絶;放射線障害;喘息;ならびに胃癌、結腸癌、肝細胞癌、卵巣上皮癌、頚部扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、および神経芽細胞腫等の癌から選択される、請求項19に記載の薬学的組成物。TLR媒介疾患の治療のための、請求項1~15のいずれか1項に記載の合成ペプチドの使用。前記TLR媒介疾患に罹患する患者に請求項1~15のいずれか1項に記載の有効量の合成ペプチドを投与することを含む、TLR媒介疾患の治療のための方法。1990年代後半、ヒトにおけるそれらの発見以来、Toll様受容体TLRは、生来の免疫応答の開始および進行に必須であることが多数の研究で示された。これらの受容体は、脂質代謝、癌の進行、および神経発生等の、多くの他の生理学的プロセスにおいて最も重要であることも示されたHuangら、2007、Rollsら、2007、Shiら、2006。非常に多くの異なるプロセスにおけるそれらの本質的な役割の結果として、細胞質尾ならびに細胞外茎の両方に集中して、それらの作用および制御の様式が大規模に研究された。異なるTLRの細胞外ドメインおよび細胞質ドメインの両方において大規模な作業が行われたにも関わらず、これまで、これらのタンパク質の膜貫通型領域に対する作業はほとんど行われていない。しかしながら、過去20年の間、膜タンパク質の膜貫通型ドメインがそれらの活性化および制御に大きな役割を果たす大規模な証拠が示されてきた。最近の研究は、いくつかのTLRのTMドメインおよびそれらの隣接する疎水性領域がそれらの輸送および活性化に関与している可能性があることを示したKajitaら、2006、Nishiyaら、2006。本発明に従って、我々は、TLR1/6およびTLR2の膜貫通型TMドメインがこれらの受容体の活性化および制御に関与していることを示す証拠を提供する。N末端に対応する外因性ペプチドまたはこれらの領域の伸長したC末端は、LTA刺激に応答して、RAW264.7マクロファージによるTNFαの分泌を阻害することができた図1Aおよび1C。これらのペプチドがTLR4活性化因子であるLPSに応答するTNFαの分泌に影響を及ぼさないため、この阻害は、TLR2に特異的である図1Bおよび1D。これらのペプチドは、我々の実験条件下で、RAW264.7マクロファージに比較的非毒性であることが示され、全てのペプチドに対して50μΜを超えるLC50を示した表1。ペプチド間の相互作用は、真核生物膜を模倣するために通常使用される脂質環境を構成するPC:コレステロール大型単層小胞LUVにも見られた。TLR1TMペプチドは、ヘテロ二量体に対する高い性向を伴って、TLR2TMを有するヘテロ二量体ならびにホモ二量体を形成することができることが示された図2A~2Cおよび3A~3C。両方の場合において、蛍光共鳴エネルギー転移FRET強度は、関連のないTMペプチドであるCpTCRαのコアTMペプチドで観察された強度より高かった。これらの知見を支持するため、TLR2のTMドメインに基づくペプチドが物理的にTLR1タンパク質と相互作用し、TLR1、2、および4が相互に相互作用することができることを示すために、共免疫沈降co-IPが使用されたそれぞれ、図5Aおよび5B。これらのペプチドがオリゴマーを形成する能力の検査は、我々のFRET観察を支持し、TLR1TMペプチドがある程度までLUV中でホモ二量体を形成することができることを示した。留意することは、これらの実験は、TLR2TMペプチドは、その高い疎水性により溶液中で高度に凝集されるが、LUVを系に添加することにより、単量体状態に解離することができることを示す図7A~7B。加えて、mTLR2TMC’-CtoAペプチド配列番号86は、生体内で、TLR2の活性化を阻害することも示した。LTAによってもたらされる急性敗血症性ショックにマウスモデルを使用することにより、我々は、このペプチドの投与が、未処理のマウスの未生存率と比較して、60を超えるマウスを救出することができることを示した図8。死が過剰で不均衡なTLR2活性化に起因したという事実により、mTLR2TMC’-CtoAペプチドは、これらの動物において、TLR2の活性化の阻害にほぼ確実に直接関与している。死亡率がLTA注射後48時間以降安定していたという知見は、生き残った動物が、顕著な有害作用なく、完全に、かつ不可逆的に治癒したことを示唆する。本発明に従って、我々は、TLR4/6の膜貫通型TMドメインの配列を含むペプチドが、ヘテロ二量体を形成することができ、TLR6TM領域のN末端もしくはC末端に対応する外因性ペプチド、またはTLR4TM領域のC末端に対応するペプチドが、原線維βアミロイド刺激に応答してRAW264.7マクロファージによるTNFαの分泌を阻害することができたことを示す証拠をさらに提供する図16。数種類の前立腺癌系における様々なTLRの発現のmRNAレベルを検査すると、PC3およびDU145細胞の両方高度に転移性がほぼ全ての試験されたTLRを発現し、一方で、LNCaPおよび22RV1低転移性において、TLR1、2、および6のmRNA転写のみが検出されたことが見出された図9、PC3およびLNCaP細胞のみのデータを示す。PC3細胞におけるルシフェラーゼLuc発現アッセイは、LPSaTLR4活性化因子またはLTATLR2活性化因子を用いた活性化がLuc発現の著しい増加をもたらしたことを示した。ヒトTLR2TMC’ペプチド配列番号83の添加は、LTA活性化において、Luc発現の低下をもたらしたが、LPS活性化においては、Luc発現の低下をもたらさなかった図10。加えて、hTLR2TMC’ペプチド配列番号83と共に細胞をインキュベーションすることにより、PC3細胞の増殖の阻害をもたらした図11。PC3細胞高度に転移性およびLNCaP細胞低転移性におけるサイトカインTGFβおよびVEGFの発現のmRNAレベルは、LPSおよびLTAを用いた活性化により検査された。興味深いことに、刺激により、PC3細胞のみがサイトカインのmRNA発現において著明な増加を示した図12。加えて、hTLR2TMC’ペプチド配列番号83の存在下での発現レベルの降下が観察された図13。総合すると、我々の結果は、TLR2、1、および6のTMドメインに基づくペプチドが生体外および生体内の両方においてTLR2の活性化を阻害する、ヘテロ二量体を形成する、および天然の受容体と相互作用する能力を示す。よって、それらは、TLR2の阻害が必要である様々な病理において治療の有力な候補となる。我々の結果は、TLR4および6のTMドメインに基づくペプチドがTLR4/6の活性化を阻害する、ヘテロ二量体を形成する、および天然の受容体と相互作用する能力をさらに示す。これらのペプチドは、アルツハイマー病の原線維βアミロイドに起因する神経変性の治療の有力な候補となる。加えて、我々の結果は、前立腺癌細胞系上の特異的なTLRアレイの発現レベル、抗炎症性サイトカインを分泌するそれらの能力、および転移を生じるその能力の間の相関関係を示す。よって、特定の腫瘍細胞における特異的なTLRアレイの発現レベルは、癌の攻撃性すなわち、転移を生じる能力のマーカーとして診断に使用され得る。一部の実施形態では、TLRは、哺乳類のTLR1、2、4、または6である。他の実施形態では、哺乳類のTLRは、ヒトhTLRまたはマウスハツカネズミ、mTLRのTLR1、TLR2、TLR4、またはTLR6である。特定の実施形態では、本発明の合成ペプチドは、任意で、対応するTLRの細胞内もしくは細胞外領域またはその両方に隣接する、TLR1、2、4、および6から選択されるTLRの膜貫通型TMドメインからなる、またはその配列内に見られる配列を含み、i前記ヒトTLR1は、配列番号1に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号2に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、ii前記ヒトTLR2は、配列番号3に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号4に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、iv前記ヒトTLR6は、配列番号5に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号6に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、v前記マウスTLR1は、配列番号7に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号8に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、vi前記マウスTLR2は、配列番号9に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号10に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、viii前記マウスTLR6は、配列番号11に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号12に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、ix前記マウスTLR4は、配列番号13に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号14に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有し、かつx前記ヒトTLR4は、配列番号15に記述される配列の推定膜貫通型ドメイン、または前記推定膜貫通型ドメインならびに配列番号16に記述されるその細胞外および細胞質隣接領域を含む配列を有する。推定TMドメインは、UniProt/swissportデータベースから取得したが、他同一または類似するの推定TMドメインは、PasquierandHamodrakas,1999のニューラルネットワークAnhierarchicalartificialneuralnetworksystemfortheclassificationoftransmembraneproteins.ProteinEng1999Aug;128:631-4等の当業者に容易に利用可能な、あらゆる他の既知のアルゴリズムを使用して計算された可能性がある。よって、開示される推定TMドメイン配列は、可能な例であり、本発明のペプチドを開示される配列に限定するように解釈されるべきではない。例えば、異なるアルゴリズムを使用して推定されたTMドメインは、TLRポリペプチドのアミノ酸配列に沿ったいくつかのアミノ酸によって置換され得、異なる長さのものであり得る。特定の実施形態では、合成ペプチドは、前記ヒトまたはマウスTLRの21~30個のアミノ酸残基の推定膜貫通型ドメイン内で見られる16~23個のアミノ酸残基からなる。他の実施形態では、合成ペプチドは、配列番号17~配列番号23に記述される配列のペプチドから選択される。一部の実施形態では、合成ペプチドは、14~19個のアミノ酸残基からなり、そのうちの4~17個は、前記ヒトまたはマウスのTLRの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、1~14個、好ましくは、3~9個は、前記膜貫通型ドメインに隣接する細胞質領域内で見られる。他の実施形態では、合成ペプチドは、配列番号24~配列番号43に記述される配列のペプチドから選択される。本明細書で使用される類似体という用語は、1つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を指す。アミノ酸残基の置換により得られた類似体を調製するとき、置換は、累積的に、対応する非置換される親ペプチドの部分の容量、疎水性-親水性パターン、および電荷を実質的に変化させないものから選択されることが重要である。よって、疎水性残基は、総合効果が対応する非置換される親ペプチドの容量、疎水性-親水性パターン、および電荷を実質的に変化させない限り、すなわち、TLRの結合モチーフが保たれる限り、親水性残基で置換されるか、またはその逆であり得る。よって、特定の実施形態では、合成ペプチドの類似体は、1つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換、好ましくは、アラニンによる1~4つのアミノ酸残基の置換によって得られる。他の実施形態では、合成ペプチド類似体は、14~35個、好ましくは16個のアミノ酸残基からなり、そのうちの6~21個、好ましくは、そのうちの8つは、ヒトまたはマウスのTLRの推定膜貫通型ドメイン内で見られ、1~14個、好ましくは、8つは、前記膜貫通型ドメインの隣接細胞質または細胞外領域内で見られ、細胞質領域の1~4つのアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、もしくはセリンで置換されるか、またはペプチド類似体は、1つまたは2つのアミノ酸残基がアラニンで置換される前記推定膜貫通型ドメイン内のアミノ酸残基、好ましくは、18個のアミノ酸残基からなる。よって、特定の実施形態に従って、合成ペプチドは、配列番号44~配列番号74の配列から選択される配列を有する。これらの合成ペプチドの全てにおいて、システイン残基は、合成を容易にするためにアラニンに変異された。このアプローチが通常使用され、TMドメイン内のシステイン残基が、通常、膜タンパク質の活性に影響を及ぼさないという事実に基づくFrillingosら、1998、Heら、1996。D、L-アミノ酸類似体も、本発明の範囲に含まれる。これらの類似体は、水への良好な可溶性およびタンパク質分解酵素による制御された分解等の高度な薬学的特性を保有することができる。ペプチドおよびその類似体の他の修飾も、本発明によって想定されることを理解するべきである。よって、本発明のペプチドまたは類似体は、リガンド活性化に応答して、TLRタンパク質の活性を調節するその有用性を可能にするペプチドの機能の少なくとも一部分を保持する、その化学誘導体を含むことが意図される。本発明のペプチドまたは類似体の化学誘導体は、通常はペプチドの一部ではない、さらなる化学的部分を含有する。ペプチドの共有結合による修飾は、本発明の範囲内に含まれる。そのような修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることによって分子の中に導入され得る。多くのそのような化学誘導体およびそれらを作製するための方法は、当該技術分野において周知である。特定の実施形態では、化学誘導体は、合成ペプチドのエステル、アミド、またはN-アシル誘導体である。N-アシル誘導体は、任意で、C6-C18カルボン酸のアシル基、好ましくは、飽和または不飽和C6-C18脂肪酸のアシル基である。脂肪酸の例としては、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、トランス-ヘキサデカン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびエライジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチドの安定性を増加し、その投与後に対象から排除される速度を変化させるために、ポリエチレングリコールPEG等の非タンパク質ポリマーに共有結合的に連結される。PEGは、約1000~約5000Da以上の分子量を有する置換された、または非置換されたポリマーである。そのようなポリマーの他の非限定的な例は、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。本発明のペプチドおよび類似体の塩も、本発明の範囲に含まれる。本明細書で使用される塩という用語は、カルボキシル基の塩、およびペプチド分子のアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当該技術分野に公知の手段により形成され得、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩、または亜鉛塩等、および例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、またはリジン等のアミン類、ピペリジン、プロカイン等で形成されるもの等の有機塩基を付加する塩を含む。酸付加塩は、例えば、鉱酸例えば、塩酸または硫酸等を伴う塩、および有機酸例えば、酢酸またはシュウ酸を付加する塩を含む。安定性、可溶性等が考慮される限り、そのような化学誘導体および塩は、好ましくは、ペプチドの薬学的特性を修飾するために使用される。特定の実施形態では、N末端およびC末端のそれぞれに付加される、正に荷電したアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはオルニチンから選択される。他の実施形態では、1つ、または2つ、好ましくは2つのリジン残基が、ペプチド末端のうちの1つ、またはその両方、好ましくは、両方の末端に付加される。ペプチドの末端でのリジン残基の付加は、生理学的流体におけるそれらの可溶性を向上するのに役立つ。よって、好ましい実施形態では、合成ペプチドは、配列番号75~配列番号122から選択される配列を有する。環状ペプチドは、ペプチドのNおよびC末端の両方で、システイン残基を用いて、またはそれなしで、固相法によって合成され得る。システインのない環化は、N末端を保護し、C末端を活性化し、その後、N末端を脱保護し、なお樹脂に結合されたままであるが、CおよびN末端基を反応させることにより実行される。ペプチドがNおよびC末端でシステイン残基を含有するとき、HF切断およびRP-HPLC精製後、ペプチドは、低濃度でPBSpH7.3に可溶化され、12時間後に環化が完了する。環状ペプチドは、RP-HPLCでさらに精製され、それらの組成を確認するためにアミノ酸分析、およびそれらの単量体状態を確認するためにSDS-PAGEを受ける。特定の実施形態では、本発明の合成ペプチドは、リガンド活性化に応答して、TLRタンパク質の活性を阻害することができる。別の態様では、本発明は、本発明の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。さらに別の態様では、本発明は、本発明に従って、少なくとも1つの合成ペプチド、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物に関する。特定の実施形態に従って、薬学的組成物は、TLR媒介疾患の治療用である。別の態様では、本発明は、TLR媒介疾患の治療のための、本発明の合成ペプチドの使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、前記TLR媒介疾患に罹患する患者に、任意で、薬学的に許容される担体と共に、有効量の本発明の合成ペプチドを投与することを含む、TLR媒介疾患の治療のための方法に関する。一部の実施形態では、TLR媒介疾患は、敗血症性ショック等の急性炎症、または前立腺癌等の癌である。他の実施形態では、TLR媒介疾患は、全身性炎症反応症候群SIRS、急性炎症例えば敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、血行力学的ショック、視神経炎、および敗血症症候群、虚血後の再潅流傷害、炎症性腸疾患例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎、不顕性または活動性感染例えば、HIV、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、マラリア、慢性肝炎、カンジダ症、マイコバクテリア感染症、および髄膜炎の感染の増悪、うっ血性心不全、自己免疫疾患例えば、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、慢性閉塞性肺疾患、肺細菌感染素因、肺性浮腫を伴ううっ血性心不全、リウマチ様疾患例えば、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節炎、および他の関節炎症状、変性疾患例えば、粥状動脈硬化、神経変性疾患例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病、線維性疾患、悪液質、移植片拒絶、放射線障害、喘息ならびに胃癌、結腸癌、肝細胞癌、卵巣上皮癌、頚部扁平上皮癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、メラノーマ、および神経芽細胞腫等の癌から選択される。経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻孔内、くも膜下腔内、腹腔内、皮内、経皮、または経腸経路を含む他の既知の経路を含む、あらゆる適切な投与経路が本発明に包含される。好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたは類似体は、経口、鼻孔内、または皮下経路によって投与される。本発明の組成物の投与における用量範囲は、例えば、TLRの過剰発現または過剰活性化が制御され、さらに疾患が有意に治療される、所望の作用をもたらす程度に大きくなくてはならない。用量は、望まれない交差反応、全身性免疫抑制、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例および添付の図で、より詳細に説明される。本明細書の以下の実施例において、本発明のペプチドは、それらの配列番号によって表される。推定TMドメインは、UniProt/swissportデータベースから取得した。ペプチドのリスト:配列番号1-LLIVTIVATMLVLAVTVTSLC推定TMヒトTLR1;配列番号2-DFHMSELSCNITLLIVTIVATMLVLAVTVTSLCIYLDLPW推定TM隣接領域-ヒトTLR1;配列番号3-ALVSGMCCALFLLILLTGVLCH推定TMヒトTLR2;配列番号4-DVRLSVSECHRTALVSGMCCALFLLILLTGVLCHRFHGLW推定TM隣接領域-ヒトTLR2;配列番号5-LLIVTIGATMLVLAVTVTSLC推定TMヒトTLR6;配列番号6-DFHMSELSCNITLLIVTIGATMLVLAVTVTSLCIYLDLPW推定TM隣接領域-ヒトTLR6;配列番号7-VLLTVTIGATMLVLAVTGAFL推定TMマウスTLR1;配列番号8DFHMSPLSCDTVLLTVTIGATMLVLAVTGAFLCLYFDLPWYVR推定TM隣接領域-マウスTLR1;配列番号9-AALVSGVCCALLLLILLVGAL推定TMマウスTLR2;配列番号10-RLQDARPSVLECHQAALVSGVCCALLLLILLVGALCHHFHGLWYLR推定-TM隣接領域-マウスTLR2;配列番号11-VLLTITIGATMLVLAVTGAFL推定TMマウスTLR6;配列番号12-DFHMSPLSCDTVLLTITIGATMLVLAVTGAFLCLYFDLPWYVR推定TM隣接領域-マウスTLR6.配列番号13TIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILI推定TMmTLR4配列番号14TIISVSVVSVIVVSTVAFLIYHFYFHLILIAGCKKYSRGESIY推定TM隣接する領域-マウスTLR4配列番号15TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVY推定TMhTLR4配列番号16SLNITCQMNKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLL推定TM隣接領域-ヒトTLR4配列番号17-LLIVTIVATMLVLAVTV推定N-term-TMhTLRl;配列番号18-ALVSGMCCALFLLILLTG推定N-term-TMhTLR2;配列番号19-LLTVTIGATMLVLAVTGA推定N-term-TMmTLR1;配列番号20-ALVSGVCCALLLLILLVG推定N-term-TMmTLR2;配列番号21-TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVY推定C-term-TMhTLR4;配列番号22-VSVLSVLVVSVVAVLVY推定C-term-TMhTLR4;配列番号23-LIVTIGATMLVLAVTVT推定N-term-TMhTLR6;配列番号24-LAVTVTSLCIYLDLPWYLR推定C-term-TMCytohTLRl;配列番号25-LILLTGVLCHRFHGLW推定C-term-TMCytohTLR2;配列番号26-LAVTGAFLCLYFDLPW推定C-term-TMCytomTLR1;配列番号27-LILLVGALCHHFHGLW推定C-term-TMCytomTLR2;配列番号28-VVSVVAVLVYKFYFHLML推定C-term-TMおよび隣接する細胞質hTLR4;配列番号29-AFLIYHFYFHLILIAGC推定C-term-TMmTLR4cyto;配列番号30-VAFLIYHFYFHLILIAG推定C-term-TMmTLR4cyto;配列番号31-HFYFHLILIAGCKKY推定C-term-TMmTLR4cyto;配列番号32-SCDTVLLTVTIGATMLV推定N-term-TMmTLR6extra;配列番号33-SPLSCDTVLLTVTIGAT推定N-term-TMmTLR6extra;配列番号34-TVLLTVTIGATMLVLAV推定N-term-TMmTLR6extra;配列番号35-LVLAVTGAFLCLYFDLP推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号36-GAFLCLYFDLPWYVRML推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号37-TIGATMLVLAVTGAFLC推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号38-MLVLAVTGAFLCLYFDL推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号39-MLVLAVTGAFLALYFDL推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号40-LVLAVTGAFLCLYFDLP推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号41-GAFLCLYFDLPWYVRML推定C-term-TMmTLR6cyto;配列番号42-AVTVTSLCIYLDLPWY隣接する細胞質を伴う推定N-term-TMhTLR6;配列番号43-SELSCNITLLIVTIGATM隣接する細胞外を伴う推定N-term-TMhTLR6;配列番号44-LAVTGAFLALYFDLPWCからAへの置換を伴う推定C-term-TMCytomTLR1;配列番号45-LAVTGAFLALYFALPWCからA、およびDからAへの置換を伴う推定C-term-TMCytomTLR1;配列番号46-LAVTGAFLASYFDLPWCからAへ、およびL605Sの置換を伴う推定C-term-TMCytomTLR1;配列番号47-LILLVGALAHHFHGLWCからAへの置換を伴う推定C-term-TMCytomTLR2;配列番号48-LILLVGALAAAFAGLWCからA、および3HからAへの置換を伴う推定C-term-TMCytomTLR2配列番号49-ALVSGVAAALLLLILLVGCからAへの置換を伴う推定N-term-TMmTLR2.配列番号50-AFLIYHFYFHLILIAGAAFLIYHFYFHLILIAGXAXはAまたはScytoを示す、推定C-term-TMmTLR4;配列番号51-FLIYXFYFXLILIAGCXは、R、K、HまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR4;配列番号52-VAFLIYXFYFXLILIAGXは、R、K、H、またはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR4;配列番号53-XFYFXLILIAGCKKYXは、R、K、H、またはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR4;配列番号54-SADTVLLTVTACDTVLLTVTIGATMLVSはAextraに置換される、推定N-term-TMmTLR6;配列番号55-SXDTVLLTVTIGATMLVXは、AまたはSextraを示す、推定N-term-TMmTLR6;配列番号56-SCDAVLLAVAIGAAMLVTからAへの置換extraを伴う、推定N-term-TMmTLR6;配列番号57-APLACDTVLLTVTIGATSからAへの置換extraを伴う、推定N-term-TMmTLR6;配列番号58-TVLLTVTIGATILVLAVMからIへの置換extraを伴う、推定N-term-TMmTLR6;配列番号59-LVLAVTGAFLXLYFDLPXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号60-LVLAVTGAFLCLYFXLPXはEまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号61-GAFLXLYFDLPWYVRMLXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号62-GAFLCLYFDLPWYVRILMからIへの置換cytoを伴う、推定C-term-TMmTLR6;配列番号63-TIGATILVLAVTGAFLCMからIへの置換cytoを伴う、推定C-term-TMmTLR6;配列番号64-MLVLAVTGAFLXLYFDLXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号65-MLVLAVTGAFLALYFXLXはEまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号66-ILVLAVTGAFLALYFDLMからIへの置換cytoを伴う、推定C-term-TMmTLR6;配列番号67-LVLAVTGAFLCLYFXLPXはEまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号68-LVLAVTGAFLXLYFDLPXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号69-GAFLXLYFDLPWYVRMLXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号70-GAFLCLYFXLPWYVRMLXはEまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号71-GAFLCLYFDLPWYVXMLXはKまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6;配列番号72-GAFLCLYFDLPWYVRILMからIへの置換cytoを伴う、推定C-term-TMmTLR6;配列番号73-VVSVVAVLVYKXYXHLMLXがFまたはAを表す、推定C-term-TMhTLR4および隣接する細胞質;配列番号74-TIGATMLVLAVTVTALCISはAに置換される、推定C-term-TMhTLR6;配列番号75-KKLLIVTIVATMLVLAVTVKKkk推定N-term-TMhTLRlkk;配列番号76-KKALVSGMCCALFLLILLTGKKkk推定N-term-TMhTLR2kk;配列番号77-KKLLTVTIGATMLVLAVTGAKKkk推定N-term-TMmTLR1kk;配列番号78-KKALVSGVCCALLLLILLVGKKkk推定N-term-TMmTLR2kk;配列番号79-KKLAVTVTSLCIYLDLPWYLRKKkk推定C-term-TMCytohTLRlkk;配列番号80-KKLILLTGVLCHRFHGLWKKkk推定C-term-TMCytohTLR2kk;配列番号81-KKLAVTGAFLCLYFDLPWKKkk推定C-term-TMCytoマウスTLRlkk;配列番号82-KKLILLVGALCHHFHGLWKKkk推定C-term-TMCytomTLR2kk;配列番号83-KKLAVTGAFLALYFDLPWKKkkCからAへの置換を伴う、推定C-term-TMCytomTLR1kk;配列番号84-KKLAVTGAFLALYFALPWKKkkCからA、およびDからAへの置換を伴う、推定C-term-TMCytomTLR1kk;配列番号85-KKLAVTGAFLASYFDLPWKKkkCからAおよびL605Sへの置換を伴う、推定C-term-TMCytomTLR1kk配列番号86-KKLILLVGALAHHFHGLWKKkkCからAへの置換を伴う、推定C-term-TMCytomTLR2kk;配列番号87-KKLILLVGALAAAFAGLWKKkkCからA、および3HからAへの置換を伴う、推定C-term-TMCytomTLR2kk;配列番号88-KKALVSGVAAALLLLILLVGKKkkCからAへの置換を伴う、推定N-term-TMmTLR2kk;配列番号89-YHFYFHLILIAGSKKKKAFLIYXFYFXLIkkXは、R、K、H、Aを示す、推定C-term-TMmTLR4;配列番号90-YHFYFHLILIAGXSKKXはSまたはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR4kk;配列番号91-KKAFLIYXFYFXLIkkXは、R、K、H、Aを示す、推定C-term-TMmTLR4;C1;配列番号92-KKLLAVAIGAAMLVLAVAGKKkkTからAへの置換を伴う、推定N-term-TMmTLR6kk;配列番号93-KKLAVTGAFLXLYDLPWKKkkXは、C、S、またはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6kk;配列番号94-KKLAVTGAFLCLYXLPWKKkkXは、D、E、またはAcytoを示す、推定C-term-TMmTLR6kk;配列番号95-KKAFLIYHFYFHLIkk推定C-term-TMmTLR4;配列番号96-KKLLTVTIGATMLVLAVTGKKkk推定N-term-TMmTLR6kk;配列番号97-KLLTVTIGATMLVLAVTGKKk推定N-term-TMmTLR6kk;配列番号98-KKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKKkk推定TMhTLR4kk配列番号99-KKVSVLSVLVVSVVAVLVYKKkk推定C-term-TMhTLR4kk;配列番号100-KKVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLKKkk推定C-term-TMおよび隣接する細胞質hTLR4kk;配列番号101-KKAVTVTSLCIYLDLPWYKK隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk配列番号102-KKLIVTIGATMLVLAVTVTKKkkxxxxx推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号103-KKVXVLXVLVVXVVAVLVYKKkkXがSまたはAのいずれかを表す、推定C-term-TMhTLR4kk;配列番号104-KKVSVLSVLVVSVVAVLVAKKkkYはAに置換される、推定C-term-TMhTLR4;C5kk;配列番号105-KKVVAVVAVLVYKFYFHLMLKKkkSがAに置換される、推定C-term-TMhTLR4および隣接する細胞質kk;配列番号106-KKVVSVVAVLVXKFXFHLMLKKXがYまたはAを表す、推定C-term-TMhTLR4および隣接する細胞質;配列番号107-KKVVSVVAVLVYXFYFXLMLKKXが、H、もしくはK、もしくはR、もしくはAを表す、推定C-term-TMhTLR4および隣接する細胞質;配列番号108-KKSELSCNITLLIVTIGATMKKkk隣接する細胞外を伴う、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号109-KKVLAVTVTSLCIYLDLPWYKKkk推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号110-KKSELSANITLLIVTIGATMKKkkCがAに置換される、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号111-KKXELXCNITLLIVTIGATMLVKKkkXがSまたはAを表す、隣接する細胞外を伴う、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号112-KKSXLSCNITLLIVTIGATMKKkkXが、D、もしくはE、もしくはAを表す、隣接する細胞外を伴う、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号113-KKSELSCNIXLLIVXIGAXMKKkkXがTまたはAを表す、隣接する細胞外を伴う、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号114-KKSELSCNITLLIVTIGATAKKkkMがAに置換される、隣接する細胞外を伴う、推定N-term-TMhTLR6kk;配列番号115-KKVLAVTVTSLAIYLDLPWYKKkkCがAに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号116-KKVLAVTVTSLCIYLXLPWYKKkkXが、A、もしくはD、もしくはEを表す、隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号117-KKVLAVTVTSLCIYLDLAWYKKkkPがAに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号118-KKVLAVTVTALCIYLDLPWYKKkkSがAに置換される、隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号119-KKVLAVXVXSLCIYLDLPWYKKkkXがAまたはTを表す、隣接する細胞質を伴う、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号120-KKVLAVTVTSLCIYLDLPAYKKkkWがAに置換される、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号121-KKVLAVTVTSLCIYLDLPWAKKkkYがAに置換される、推定C-term-TMhTLR6kk;配列番号122-KKSVIVVSTVAFLI推定C-termTMmTLR4配列番号123-GLRILLLKVTCRαのコアTMペプチド材料および方法iペプチド合成および精製。ABI433A自動ペプチド合成機AppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して、9-フルオレニルメトキシルカルボニルFmoc固相法により、RinkアミドMBHA樹脂Calbiochem-novabiochem,SanDiego,California上でペプチドを合成した。ペプチド合成に続き、95TFA、2.5H20、および2.5トリエチルシランと共に、3時間インキュベートすることにより、樹脂からペプチドを切断した。VydacC4カラムGraceDiscoverySciences,Deerfield,IIで、RP-HPLC98超により粗ペプチドの精製を実施した。エレクトロスプレー質量分光法により、ペプチドの組成を確認した。ii細胞培養-マクロファージ。RAW264.7マウスマクロファージATCC登録商標番号-TIB-71で生体外アッセイを実施した。10FBS、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および抗生物質BiologicalIndustries,BeitHaemek,Israelで補足されたDMEM中で、細胞を成長させた。5のC02を含有する加湿雰囲気で、インキュベータを37°Cに設定した。iiiXTT細胞毒性アッセイ。1ウェル当り1×104細胞RAW264.7マウスマクロファージ、ATCC登録商標番号-TIB-71を、96ウェルプレート上で一晩成長させた。翌日、90μLの新しい培養培地、および異なる濃度の異なるペプチドmTLR2TMN’-CtoA配列番号88、mTLR2TMC’-CtoA配列番号86、mTLR1TMN’配列番号77、およびmTLR1TMC’-CtoA配列番号83を含有する10μLの緩衝液で培地を交換した。ペプチドの濃度は、0.78~100μΜの範囲である。その後、各ウェルに50μLの2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサリニド分子内塩XTT反応液BiologicalIndustriesを添加する前に、細胞を2時間インキュベートした。前述のように、生存率を判定したPapoら、2004およびPapoら、2006。各ペプチドのLC5050の細胞が死滅する濃度を、用量依存細胞生存率曲線から得た。ivTLR活性化に応答するRAW264.7によるTNFα分泌。1ウェル当り2×105細胞を、96ウェルプレートで一晩培養した。翌日、全ての補足物質を含む新しいDMEMで培地を交換した。TLRペプチドmTLR2TMN’-CtoA配列番号88、mTLR2TMC’-CtoA配列番号86、mTLR1TMN’配列番号77、およびmTLR1TMC’-CtoA配列番号83をDMSOに溶解し、異なる濃度で細胞に添加した。DMSOの最終濃度は、全群において1であった。ペプチドと共に、細胞を2時間インキュベートし、その後、2回洗浄し、LTATLR2活性化因子であるリポテイコ酸Sigma-AldrichまたはLPSTLR4活性化因子であるリポ多糖類Sigma-Aldrichを含有する新しい培地と共にインキュベートした。LTA濃度は、異なる実験間で変動した。細胞を37°Cで5時間インキュベートした後、各処理からの培地の試料を回収し、-20°Cで保管した。製造者のプロトコルに従って、マウスTNFα酵素結合免疫吸着アッセイキットBenderMedSystems,Almogを使用して、各試料のTNFα濃度を評価した。全ての実験は、三つ組で実施された。vペプチドの蛍光標識。蛍光標識において、我々は、以下のフルオロフォアを使用した:4-フルオロ-7-ニトロベンゾフラザンNBD-F,BioChemika、4-フルオロ-7-ニトロ-[2,1,3]-ベンゾキサジアゾールNBDApollo、56-カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシスクシンイミドエステルFluorescein,BioChemika、および56-カルボキシテトラメチルローダミンN-スクシンイミジルエステルTAMRA,BioChemika。樹脂結合ペプチドを、ジメチルホルムアミドDMFに溶解された列挙されるフルオロフォアのうちのいずれかで処理し、樹脂結合N末端フルオロフォアペプチドの形成を導いた。2のDIEASigma-AldrichをTAMRAおよびフルオレセイン溶液に添加した。1時間NBDまたは一晩TAMRAおよびフルオレセイン、インキュベーションを行った。インキュベーション後、樹脂をDMF、その後、塩化メチレンで十分に洗浄し、窒素流下で乾燥させ、その後、上のiに記載されるように精製した。viフルオレセイン/NBDおよびローダミンTAMRA標識されたペプチドの蛍光共鳴エネルギー転移FRET。前述の押出方法Cohenら、2008を使用して、ホスファチジルコリンPCおよびコレステロール10:1,w/wから構成される大型単層小胞LUVを調製した。ドナーとしてフルオレセイン標識されたペプチド、およびアクセプターとしてローダミン標識されたペプチドを使用した一対のペプチドで、蛍光実験を実施した。励起を494nm10nmスリットに設定し、発光を500~600nm10nmスリットで走査して、Caryeclipse蛍光分光光度計VarianInc.,PaloAlto,CAにより、室温で蛍光スペクトルを得た。典型的な実験では、フルオレセイン標識されたペプチドは、最初に、DMSO中の原液0.1μMのペプチドおよび0.25v/vのDMSOの最終濃度から、HEPES緩衝液中にPC:コレステロールLUV100μΜを含有する溶液に添加された。続いて、0.025~0.4μΜの範囲の最終濃度にローダミン標識されたペプチドを連続添加した。ローダミン標識されたペプチドを添加する前と添加した後に、蛍光スペクトルを得た。蛍光値は、HEPESのみを添加することによって得られた発光の変化を減算することによって修正された。最大FRET値は、521nmでのドナーペプチドの発光の変化を計算することによって得られた。vii膜結合アッセイ。PC:コレステロールLUVを、再蒸留水に溶解された0.1μΜのNBD標識されたペプチドに連続して添加した。系が平衡に達するまで、励起を467nm10-nmスリットに設定して、脂質/ペプチドモル比の機能として、NBD発光530nm;ΔFの変化を監視した。背景を考慮するため、同じ波長のLUVのみの発光を減算した。NBDは、疎水性環境でその発光を変化させることが知られているためRapaportら、1991、プローブ発光の変化は、疎水性界面に結合したペプチドの量を表し、従って、我々にとってLUVに結合するペプチドを評価することが可能になる。我々の系は、特定の脂質/ペプチド比で結合平衡Fmaxに達し、従って、親和定数は、定常状態親和性モデルを使用して、NBD標識されたペプチドの発光の平衡レベルと脂質濃度との間の関係から計算され得る。親和定数は、よって、非線形最小2乗NLLSQ分析によって判定された。NLLSQ適合は、以下のYx=KaXFmax/1KaX方程式1方程式を使用して行われ、式中、Xは、脂質濃度であり、Fmaxは、脂質の添加前と添加後のNBD標識されたペプチドの発光の最大差それは、最大脂質ペプチド結合、または平衡-結合応答を表すであり、Kaは、M-1の親和定数である。viii共免疫沈降アッセイ。2.5106RAW264.7マウスマクロファージ、ATCC登録商標番号-TIB-71細胞を、0、5、または10μΜのローダミン標識されたペプチドと共に、2時間、37°Cでインキュベートした。ペプチドを含む細胞を洗浄し、氷冷のRIPA緩衝液トリスpH7.4、20mM、NaCl137mM、グリセロール10、Triton-X1、デオキシコール酸ナトリウム0.5、SDS0.1、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル1:100希釈で溶解した。4°Cで、14,000RPMで15分間遠心分離した後、可溶性画分を分離し、異なるTLR抗体と共に2時間インキュベートした。さらに一晩インキュベーションするために、タンパク質GビーズSantaCruzを添加した。ビーズを冷PBSで5回洗浄し、SDSトリシン緩衝液Novex登録商標,invitrogenで1:2に希釈し、95°Cで10分間沸騰させた。試料を10のSDS-PAGEで処理した。標識されたペプチドの存在をTypoohn蛍光スキャナGEHealthcare,Waukesha,WIで検出した。励起を532nm、および発光を585nmに設定した。標準ECL溶液Pierceを用いて、ウエスタンブロット分析によりTLRタンパク質の検出を実施した。使用した一次抗体は、抗TLR1SantaCruz、抗TLR2eBioscience、および抗TLR4BioLegendであり、使用した二次抗体は、抗ラットSantaCruzであった。ix円偏光二色性CD分光法。Aviv202分光偏光計AvivInstruments,Lakewood,NJでCD測定を実施した。1mmの経路長の温度自動調節石英キュベットを使用して、スペクトルを走査した。全ての測定は、25°Cで行われた。各スペクトルの平均記録時間は、190~260nmの波長範囲で、1nmステップで20秒であった。1のリゾ-ホスファチジルコリン溶液SigmaAldrich中10μΜTLR1TMC’のみ50μΜの濃度で、ペプチドを走査した。x自己集合アッセイ。ローダミン標識されたペプチドをDMSOに溶解し、400μlのHEPESまたは0.1mMのPC:コレステロール溶液に添加し、平衡したペプチドの最終濃度は、0.1μΜ、DMSO0.025v/v。SLM-Aminco登録商標発光分光計SLM-Aminco,Rochester,NYを使用して、プロテイナーゼKSigmaAldrichの添加前と添加後の蛍光発光の強度の変化を追跡した。励起波長を530nm、発光を580nmに設定し、プロテイナーゼKの最終濃度は、62.5μg/mLであった。蛍光の増加は、ペプチドがオリゴマーとして存在することを示すPapoら、2002。全ての蛍光測定は、25°Cで実施された。xi生体内研究。TLR2過剰活性化により生じる急性敗血症性ショックに対するTLRTMペプチドの作用を検査するために、我々は、前述のマウスモデルを使用したMengら、2004。簡潔に、12週齢のC57の雌の黒マウスHarlanによって供給されたを、200μg/mLのD-ガラクトースアミンCalbiochemを含有する生理食塩水溶液pH6.5でIP注射される100μgのLTAで処理した。処理されたマウスは、1、5、および10mg/kgの用量のペプチドの注射を2回受けた。最初の注射は、LTA注射時に与えられ、2回目の注射は、2時間1mg/kgまたは12時間5および10mg/kg後に与えられた。LTA注射後96時間、動物の生存を監視した。生体内実験に使用したペプチドは、HPLC精製中に添加されたトリフルオロ酢酸陰イオンを交換するために、20の酢酸で2回処理された。全群において、n=8である。xii細胞系-前立腺癌。既知のアンドロゲン依存性の特徴、および転移を誘発する能力を有する数種類の前立腺癌系親切にもWeizmannInstituteofScienceのProf.ZeligEshharにより提供されたを使用した。PC3ATCC登録商標番号CRL-1435DおよびDU145ATCC登録商標番号HTB-8IDは、高度に転移性であり、アンドロゲン依存性であることが知られており、進行性前立腺癌の細胞系モデルと広く考えられている。22RV1ATCC登録商標番号CRL-2505D、アンドロゲン依存性およびLNCaPATCC登録商標番号CRL-1740D、アンドロゲン依存性は、低転移性として知られる。xiii前立腺癌細胞系におけるTLR発現。上のxiiに記載される4つの前立腺癌細胞系、つまり、PC3およびLNCaP高度に転移性ならびにLNCaPおよび22RV1低転移性におけるTLR1、2、および6のcDNAの存在を検査するために、PCR反応を実施した。TRIReagent登録商標全RNAの単離にすぐ使用可能な試薬一式,AppliedBiosystemsを使用し、製造者の指示に従って、細胞溶解物から全RNAを回収した。オリゴdTをアニーリングすることにより、RNAのこのプールからmRNAだけを確保し、その後、各TLR遺伝子に特異的なプライマーを使用した。プライマーは、PubMedツールおよびデータベースを使用して生成された。xiv前立腺癌細胞系におけるTLR活性化に応答するNFkB転写活性。NFkB応答要素は、広く研究されており、核内のNFkB分子の存在についての具体的な指標として機能することが知られている。そのような転位は、標的転写をもたらす、TLRのシグナル伝達カスケードの活性化により生じる。このDNA要素は、遺伝子の上流のルシフェラーゼ発現プラスミドの中に導入され、よって、核におけるNFkBの存在について、レポータープラスミドを生成する。細胞はプラスミドを形質移入され、24時間後、それぞれ、TLR4およびTLR2を通してシグナル伝達カスケードを誘発するために、LPS/LTAで処理された。活性化を確認するために、製造者の指示に従ってSteady-GloキットPromegaを使用して、Lucの発現レベルを評価した。実施例1.TLR2/1/6のTMドメインのNおよびC末端に対応するペプチドは、LTA活性化時、RAW264.7マクロファージによるTNFαの分泌を阻害することができる。TLR2およびTLR1/6の膜貫通型TMドメインの役割を検査するために、我々は、最初に、これらのタンパク質の推定TMドメインを同定した。本明細書において、配列番号1~配列番号16と称される配列を有するペプチドは、ヒトおよびマウスからのTLR1、2、および6について、それぞれ、推定TMドメイン、ならびに隣接する細胞質領域および細胞外領域を有する推定TMの配列を含む。推定TMドメインは、21~22のアミノ酸長である。短い疎水性領域は、細胞内側からTMドメインに隣接する。TLR1およびTLR6TMドメインのアミノ酸配列は、事実上同一である。TLR2の活性化におけるそれらの役割を検証するために、我々は、TLR2またはTLR1TMドメインのいずれかに対応する合成ペプチドを添加するアプローチを使用し、TLR2活性化因子であるリポテイコ酸LTAによるマクロファージ活性化に影響を及ぼすそれらの能力を試験した。この系は、外因的に添加されたTMペプチドが、そのTMドメインとの相互作用を通して特定のタンパク質の活性に影響を及ぼすことができることを示す大規模な証拠に基づくBennasrouneら、2004。最初に、我々は、TLR2およびTLR1の各TMドメインのために、1つがN末端TMに対応し、もう一方が伸長したC末端TMドメインに対応する、それぞれ、約20のアミノ酸を含有する2つの重複するペプチドを設計した表1。この領域は、このタンパク質の多量体化を制御することが示されたTLR4の類似領域に対応するため、我々は、C末端TMドメインを伸長することを選択した。加えて、我々は、様々な置換により、これらのペプチドの類似体を合成した。いくつかのペプチドにおいて、TMドメイン内のシステイン残基は、通常、膜タンパク質の活性に影響を及ぼさないため、合成を容易にするために、システイン残基をアラニンに変異させた表1。加えて、可溶性を向上させるために、これらのペプチドの端にリジンが付加された。我々の結果は、TLR2およびTLR1のTMドメインに由来する合成ペプチド、つまり、mTLR2TMN’-CtoA配列番号88、mTLR2TMC’-CtoA配列番号86、mTLR1TMN’配列番号77、およびmTLR1TMC’-CtoA配列番号83が、LTA活性化後、マクロファージからのTNFαの分泌を著しく阻害することができたことを示す図1A~1D。阻害は、10μΜのペプチド濃度で最高の用量依存性であり、低TLR2活性化下で実施された。活性化は、100ng/mLのLTAにより達成され、約50pg/mLのTNFα分泌をもたらした図1A。しかしながら、全てのペプチド濃度において、TLR4作動薬であるリポ多糖類LPSにより誘発されたTNFαの分泌に対する作用は見られなかった図1B。この阻害が高レベルのTLR2活性化下で起こることが可能であるかどうかを試験するために、マクロファージ細胞を500ng/mLのLTAで刺激し、これは約500pg/mLのTNFαレベルをもたらした。これらの条件下で、20μΜのTLRTMペプチドは、TNFαの分泌を40~60減少させた図1C。ペプチドは、それらの毒性濃度よりはるかに低い濃度で使用された表1。総合すると、これらの知見は、それらが密接に関連するタンパク質TLR4の活性化に影響を及ぼさないため、TLR2およびTLR1TMペプチドの作用がTLR2に対して特異的であることを示唆する図1D。これらの実験の結果を確認するために、さらに2つの対照を追加した。第1に、ペプチドのみの添加は、TNFα分泌の基底レベルを変化させなかった結果は示さず。第2に、ペプチドは、XTT毒性アッセイにおいて明らかにされるように、我々の実験条件下でマウスマクロファージに対して毒性ではなかった表1。実施例2.FRET実験は、TLRTMペプチドがホモ二量体よりヘテロ二量体を形成する傾向が高いことを明らかにする。大型単層小胞LUV内の合成TMペプチドの相互作用を探査するために、蛍光共鳴エネルギー転移FRET分析を使用した。哺乳類細胞の外葉を模倣するために、ホスファチジルコリンPCおよびコレステロール10:1LUVを使用した。フルオレセインで標識されたTLRlTMペプチドmTLR1TMN’配列番号77およびmTLR1TMC’-CtoA配列番号83をドナーとして、ローダミンで標識されたそれらの対応物であるTLR2TMペプチドmTLR2TMN’-CtoA配列番号88、mTLR2TMC’-CtoA配列番号86をアクセプターとして使用した。連続量のローダミン標識されたペプチドの添加後の、フルオレセイン接合ペプチドの発光の減少の測定は、対のペプチド間の相互作用についての指標として機能した。TLR1TM由来TMペプチドは、TLR2TMペプチドと共にホモ二量体ならびにヘテロ二量体の両方を形成することができた図2A~2Cおよび3A~3C。TLR1TMのC末端およびN末端ペプチドは、ホモ二量体よりヘテロ二量体の形成に非常に高い性向を示した。mTLR1TMC’ホモ二量体について計算されたFRETの最大は、16.1±1.9であった図2B。mTLR1TMN’ホモ二量体は、14.2±2.3のFRETを示し図3B、一方で、mTLR1/2C’およびmTLR1/2TMN’ヘテロ二量体は、それぞれ、20.6±1.7および25.3±2.0の最大のシグナル減少をもたらした図2Cおよび3C。TCRαのコアTMペプチドであるローダミン接合Cp配列番号123は、陰性対照として使用され、著しい蛍光シグナルの減少を示さなかった図2Aおよび3A。総合すると、これらの知見は、異なるTMが相互に相互作用する能力を示し、これらのタンパク質がそれらの活性化のためにヘテロ二量体化への変化を必要するという事実と一致する。我々のFRETの結果は、これらのタンパク質のTMドメインもこの遷移に関与する因子であることを示唆する。実施例3.TLR1TMペプチドは、高親和でモデル膜に結合する。この特性は、我々の計算されたFRETの結果に重要であるため、我々は、TLR1TMペプチドがモデル膜に結合する能力を判定した。LUVに結合するペプチドの画分は、観察されたFRETシグナルの強度と相関するため、このパラメータを定義することは重要である。従って、連続量のLUVの添加後の、4-フルオロ-7-ニトロベンゾフラザンNBD接合ペプチドの発光の増加の測定は、真核生物膜に対するそれらの親和性についての指標として機能する。NBDの発光は、疎水性環境の中に挿入されるとき、増加する。mTLR1TMC’-CtoAおよびmTLR1TMN’標識されたペプチドそれぞれ、配列番号83および配列番号77の両方は、PC:コレステロールリポソームに対して高い親和性を示し、Ka値は、それぞれ、7.8×l04M-1および1.5×l04M-1である図4Aおよび4B。これらの比較的高いKa値は、FRET実験において、ペプチドがリポソームに完全に結合したことを示す。実施例4.TLR2TMペプチドは、TLR2またはTLR4よりもTLR1タンパク質と物理的に相互作用することができる。我々の仮説を支持するために、我々は、TLRタンパク質のTLRTMペプチドとの相互作用を検出するために、共免疫沈降co-IP実験を実施した。この実験アプローチは、TLRTMペプチドに接合される蛍光プローブローダミンおよびTLRタンパク質に対する特異的抗体を使用する。ペプチドを含む細胞溶解物を、タンパク質Gビーズに結合された特異的TLR抗体と共にインキュベートした。これらの複合体は、次いで、SDS-PAGEを受けた。蛍光ペプチドの存在は、蛍光スキャナで確認され、沈殿したTLRの存在は、ウエスタンブロット分析を使用して確認された。10μΜで、mTLR2TMN’-CtoAおよびmTLR2TMC’-CtoAペプチドそれぞれ、配列番号88および配列番号86の両方は、TLR2およびTLR4抗体と比較して、TLR1抗体でより顕著に沈殿した図5A~5B。これらの結果は、FRETの結果と一致し、TLR1タンパク質が優先的にTLR2TMペプチドと会合することを示唆する我々のモデルを支持した。ウエスタンブロット分析は、ペプチドの添加の有無に関わらず、TLR2/1および4が一緒に共沈殿することを明らかにした図5B。これらの結果は、これらのタンパク質が原形質膜上に巨大複合体を形成し、少なくとも生体外で、相互に相互作用することができるという見解をさらに高める。実施例5.TLR2/1TMペプチドは、α-らせん体であり、緩衝液および脂質環境で複合体を形成するその能力が異なる。TLRTMペプチドの構造-機能関係のより良い理解を得るために、我々は、脂質界面におけるそれらの構造ならび自己集合するそれらの能力を判定した。円偏光二色性CD分光法を使用して、我々は、リソホスファチジルコリンLPCミセルにおけるそれらの構造を判定した。図6A~6Bに見られるように、mTLR1TMN’配列番号77ならびにmTLR2TMN’-CtoAおよびmTLR2TMC’-CtoAそれぞれ、配列番号88および配列番号86は、LPCミセルにおいて、αらせん構造を採用する。これらのペプチドにおいて得られたシグナルは、10μΜのペプチド濃度で、比較的強かった208および222nmで、θ=約15~20×10-3度×cm2/デシモル。mTLR1TMC’-CtoA配列番号83は、10μΜでシグナルを示さず、50μΜで弱いαらせんシグナルのみを生じた図6A。これは、このペプチドが検査した他のペプチドよりαらせん体含量が低いことを示唆する。しかしながら、我々は、低シグナルがさらなるβシート構造または低挿入率のためであったという可能性を排除することはできない。加えて、膜活性ペプチドのこの特性は、それらの活性に影響を及ぼすことが示されているためRosenfeldら、2006b、Rosenfeldら2006c、我々は、ホモオリゴマーにおけるこれらのペプチドが自己集合する能力を検査した。我々は、溶液中および膜界面上の両方で、この特徴を試験した。我々は、580nmで、溶液のみ、またはPC:コレステロールLUVを含有する溶液におけるローダミン標識されたペプチドの初期発光を測定し、プロテアーゼKを培地に添加した後、経時的に発光の増加を追跡した。経時的な蛍光の高く、かつ迅速な増加は、フルオロフォア接合ペプチドがオリゴマー急冷状態にあることを示した。陽性対称として、既知のオリゴマー抗菌ペプチドLL37Rosenfeldら、2006aを使用した。HEPES溶液において、mTLR1TMN’およびmTLR1TMC’-CtoAそれぞれ、配列番号77および配列番号83ならびにmTLR2TMC’-CtoA配列番号86は、経時的な蛍光の増加が非常に遅く、これらのペプチドが、ある程度、溶液中でオリゴマーを形成することを示唆する図7A。それらの比較的遅い発光の増加に見られることができるように、これらの自己オリゴマーは、プロテアーゼ処理によって解離され得る。逆に、このペプチドの低い初期発光速度により明らかにされることができるように、mTLR2TMN’-CtoA配列番号88は、溶液中で凝集体を形成する性向が非常に強いことを明らかにした。これらの凝集体は、プロテアーゼKを溶液に添加することにより解離されないが図7B、黒線、LUVを系に添加することにより部分的に溶解することが示され図7B、灰色線、脂質環境において、mTLR2TMN’-CtoAペプチドはモノマー形態を好むことを示唆する。LUVを含有する溶液において、異なる図式が見られた。TLR2TMペプチドは、プロテアーゼの処理前と処理後にいずれの変化も示さなかったが、TLR1TMペプチドは、ある程度解離することが示され、これらのペプチドがある程度膜にホモオリゴマーを形成することを示唆する図7C。これらの結果は、我々のFRET結果と明らかに一致し、mTLR1TMN’およびmTLR1TMC’-CtoAの両方がホモ二量体を形成するために自己集合することができることを示唆する。予想通り、陽性対称のLL37は、脂質環境において、高度なオリゴマーペプチドの特徴である、非常に高く、かつ迅速な蛍光の回復を示した図7D。実施例6.TLR2TMドメインに基づくペプチドは、生体内で、TLR2の過剰活性化を阻害することができる。生体内での我々のペプチドの活性を試験するために、我々は、TLR2の過剰活性化に起因する急性敗血症性ショックについて、マウスモデルを使用した。マウスは、100μgのLTAでi.p.注射され、その後、異なる治療計画で、mTLR2TMC’-CtoAペプチド配列番号86材料および方法のセクションxiを参照または生理食塩水のみで処理された。図8に見られるように、生理食塩水のみで処理されたマウスの生存率は、LTA注射後48時間内に0に降下した。逆に、1または5mg/kgのペプチドで処理されたマウスは、LTA注射後最大14日まで、それぞれ、50および62.5の生存率を示した。全ての実験中、ペプチドで処理されたマウスは、顕著な有害作用を示さなかった。実施例7.転移性および非転移性前立腺癌細胞系におけるTLRの特異的発現。我々は、数種類の前立腺癌細胞系におけるTLRの発現のmRNAレベルを判定した:高度に転移性であることが知られているPC3およびDU145、ならびに低転移性であることが知られている22RV1およびLNCaPデータは、PC3およびLNCaPについてのみ提示される。興味深いことに、PC3細胞は、全ての試験したTLR1、2、および6を発現し、一方で、LNCaPにおいては、TLR1、2、および6のmRNA転写物のみが検出された図9。次いで、我々は、これらの転写物がこれらの細胞上で実際に機能するかどうかを試験した。この目的を達成するために、我々は、核におけるNFkBの存在の基づくルシフェラーゼLuc発現アッセイを使用し、よって、TLR活性化のシグナル伝達カスケードの最終生成物を報告する。LPSTLR4活性化因子またはLTATLR2活性化因子の存在下で、PC3細胞をインキュベートすることにより、Luc発現が著しく増加した図10。実施例8.LR2のTMDに由来する合成ペプチドは、前立腺癌細胞系の活性化に影響を与える。我々は、ヒトTLR1、2、および5のTMドメインのN末端またはC末端ドメインのいずれかに対応するペプチドを合成した。各TMドメインは、2つの重複する配列に分割された表2。活性および毒性実験は、推定上の細胞内ドメインからの隣接する5つのアミノ酸を含む、ヒトTLR2のTMドメインのC末端ドメインに対応するペプチドで実施された配列番号83、下の表2のhTLR2-C、可溶性を増加させるために、その末端のそれぞれで2つのリジン残基で伸長された。ペプチドは、最大100μΜの濃度で最大濃度が試験された、データは示さず、PC3またはLNCaP細胞系のいずれに対して毒性ではなかった。次いで、LTAおよびLPSによるそれらの活性化時にTLRのシグナル伝達カスケードを阻害するその能力を試験するために、hTLR2TMC’ペプチド配列番号83を試験した。ペプチド20μΜの存在下で、LTAを用いて活性化されたとき、Luc発現は、PC3細胞において、40阻害された図10。重要なことに、細胞がLPSで活性化されたとき、ペプチドは、活性化を阻害することができず、阻害の特異性を指摘する図10。基底線の減少が存在するという事実に対する可能な説明は、正常な成長条件での培養細胞によるDAMPの分泌を通したTLRの活性化によるものかもしれない。重要な疑問は、図10に示されるペプチドにより誘発された細胞活性化の減少が、細胞成長速度の減少ももたらすかどうかということである。実際、20μΜのペプチドと共に細胞を72時間インキュベートすることにより新しく溶解したペプチドが24時間毎に添加された、増殖が20阻害された図11。実施例9.ペプチドによるサイトカインmRAの発現の阻害。転移性細胞の主な特色の1つは、様々なサイトカインの分泌によるそれらの環境に影響を与えるそれらの能力である。最も影響力のあるサイトカインの2つは、血管の形成を誘発するVEGF、および例えば、免疫細胞の耐性を誘発し、アポトーシスを阻害するTGFβである。従って、我々は、LPSおよびLTAによるそれらの活性化時の、細胞におけるそれらのサイトカインのmRNAの発現、および活性化に対するペプチドの作用を判定した。興味深いことに、刺激により、PC3細胞のみがサイトカインのmRNAの発現において著明な増加を示した図12。加えて、hTLR2TMC’ペプチド配列番号83の存在下での発現レベルの降下が観察された図13。これらの知見は、PC3細胞におけるTLRの存在が癌の重篤度攻撃性および転移を形成するその能力の一因となるという仮説に我々を導く。よって、本発明のTLRTMペプチドは、細胞の成長速度および細胞が転移を形成する能力を示すことができる、新しい診断バイオマーカーとして使用され得る。実施例10.前立腺癌細胞におけるTLR発現のレベル、それらの機能、および転移を生成するそれらの能力の間の相関関係。タンパク質レベルで、転移性および非転移性細胞系の両方で発現したTLRのレパートリーを、ウエスタンブロットにより検査した。様々なTLRの機能性、すなわち、抗炎症性サイトカインを分泌するそれらの能力は、対応するリガンドTLR1/2/6にはLTAによるそれらの活性化を介して試験され、ELISAアッセイにより判定された。実施例11.TLRの活性化は、それらの集合体またはヘテロ集合体TLR1、2、およびTLR6/2を必要とする。TLR1、2、および6の膜貫通型ドメインTMDの集合プロセスへの寄与は、生体細胞においてTMD-TMDホモ二量体およびヘテロ二量体集合体を検索することにより検査された。生細菌においてホモ二量体化を検出するためにToxR-TM-MalE系をLangoschら、1996、Gerberら、2001、そしてヘテロ二量体形成を検出するためにLexA-TM-MalE系を使用するLindnerら、2006、Korazimら、2006における実験詳細、Gerberら、2004、およびPapoら、2002。最小二量体化モチーフを同定するため、ならびに野生型集合体と競合する配列を同定するために、合成ペプチド実施例8に記載される、上の表2をToxR-TM-MaIEおよびLexA-TM-MaIE系の中に移植する。このような方法で、最も短い活性ペプチドを得る。ToxRおよびLexA系の結果に基づき、様々なTLRTMDペプチドおよびそれらの類似体切断型および脂肪酸接合された突然変異体を合成した。ホモおよびヘテロ集合体は、様々な生物物理学的方法を使用して判定された実験詳細は、Korazimら、2006、Gerberら、2004、およびPapoら、2002において得られる。ペプチドは、ToxRおよびLexA系内に挿入される野生型TMDの二量体化に干渉する能力について試験された。実施例12.TLR活性化を阻害する合成ペプチドの能力は、それらの天然リガンドLPS、LTAにより誘発された。ToxR-TM-MaIEおよびLexA-TM-MaIE構造体における野生型TMDの集合体に対して顕著な作用を示したペプチド実施例11、上記が使用された。合成ペプチドがそれらの天然リガンドLPS、LTAにより誘発されるTLR活性化を阻害する能力は、iNF-κΒNF-κB誘発性報告系の活性化状態における変化の測定、iiリアルタイムPCRRT-PCRまたはマイクロアレイ分析いくつかの具体的な場合においてのみによる、炎症誘発性/抗炎症関連分子の発現における変化の測定、およびiiiELISAによる炎症誘発性サイトカインTGF-β、IL-10、IL-8、およびVEGFの分泌の追跡によって検査される。結果は、TLR天然リガンドLPS、LTAの活性または非刺激細胞に標準化される。検査された前立腺癌細胞は、ヒトアンドロゲン依存性ADおよび非依存性AI細胞系:iCL1ヒトPC細胞ADLNCaPを培養することにより生成されたLNCaPのAIサブクローン;ii22RV1ヒトPC細胞ADCWR22のAIサブクローン:PSA、転移性、ATCC株;iiiPC-3:AI、PSA、転移性、ATCC株;ivDU-145:AI、PSA-、転移性、ATCC株;vCWR22:AD、PSA-、原発性前立腺癌細胞;viWISH-2:AI、PSA-、前立腺の小細胞癌を含む。正常なヒト前立腺および他の非癌細胞は、iCRL-11609:組織学的に正常なヒト成人前立腺細胞からの上皮細胞:AD、PSA;転移性、ATCC株;ii3T3正常線維芽細胞;iiiOL包皮線維芽細胞;ivヒトリンパ球;vヒトRBCを含む。実施例13.生体内での合成ペプチドの抗癌活性。腫瘍内、IP、またはIVでそれらを適用することによって合成ペプチド表2の抗癌活性を試験するために、ヌードマウスの前立腺異種移植片を生成する。微小環境に対する作用は、この領域で分泌された腫瘍なサイトカインおよびケモカインを検出すること、ならびに腫瘍周辺に侵入する細胞集団、例えばT-regs、MDSC等を特徴付けることにより試験される。実施例14.TLR4およびTLR6に由来する膜貫通型ペプチドは、ヘテロ二量体化が可能である。アルツハイマー病の場合において、作業仮説は、TLR4およびTLR6がヘテロ二量体化するため、我々は、それらの活性化におけるTMDの役割を検証した。これらの受容体のTMDに由来するペプチドは、標準的な手順により、我々の研究室で合成され、精製された。生体細胞の膜におけるヘテロ二量体化を検証する目的において、2つの異なるレポーター系を使用した。TMドメインのホモ二量体化を検出するために、我々の研究室で日常的に使用されるToxR系を採用した上記参照。我々は、ヘテロ二量体化TMセグメントを検出するための大腸菌の2-ハイブリッド系Schneider,D.,andEngelman,D.M.2003.GALLEX,ameasurementofheterologousassociationoftransmembranehelicesinabiologicalmembrane.JBiolChem278,3105-3111、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるであるGALLEXレポーター系により、TMドメイン内のヘテロ二量体化を検出するための新しい修飾系も構築した。この系およびそれを使用するための指針は、親切にも、UniversityMainz,GermanyのProfessorDirkSchneiderにより、我々に提供される。これらの系は、ヘテロ二量体化に重要であるTMD内に領域を同定するために、我々に、TLR4および6の様々なTM領域および突然変異体をスクリーニングすることを可能にする。これらのレポーター系を使用して、我々は、主としてヘテロ二量体化の一因となるアミノ酸残基、そして最終的に先天性免疫系細胞の活性化および炎症誘発性媒介物の分泌をもたらす二量体化を阻害するのに最も効率的なペプチドを同定することができる。ペプチドは、膜で共集合するその能力について検証された。その目的のため、我々は、TLRTMペプチドを4-クロロ-7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-フッ化ジアゾール[ApolloからのニトロベンズオキサジアゾールNBD-F]およびローダミンで標識した。膜環境を模倣するために、我々は、ホスファチジルコリンPCおよびコレステロールChol10:1,w/wから構成される大型単層小胞LUVを使用した。我々は、エネルギードナーとしてNBD標識されたTLR4ペプチド、およびエネルギーアクセプターとしてローダミン標識されたTLR6ペプチドを使用することにより、FRET実験を実施した。図14は、我々の作業仮説を支持する強いFRETを示す。図15は、大腸菌内膜における膜タンパク質のヘテロ二量体化を追跡するための2ハイブリッド系であるGALLEX集合系を使用した、異なるTLR4およびTLR6膜貫通型TMセグメントの二量体化活性を示す。本方法は、異なるDNA結合特異性を有する2つのLexADNA結合ドメインによるレポーター遺伝子活性の抑制に基づく。膜貫通型ドメインに結合されるとき、ヘテロ二量体会合がβ-ガラクトシターゼ合成の抑制により報告される。二量体化は、二量体を形成するその能力に欠ける変異体グリコフォリンA、GPAであるG83I、および陽性対照のGPAと比較して示された。このアッセイにおいて、低シグナルは、二量体化を示し左から最初の3つの棒と陽性対称GPA、比較的高いシグナルは、二量体を形成することができないことを示す。実施例16.TLR4およびTLR6に由来する膜貫通型ペプチドは、マクロファージTLRの活性化を阻害することができる。TLRは、ヘテロ二量体状態で活性化されることが示されてきた。よって、我々は、TLR4CI配列番号95、TLR4C2配列番号90、TLR6C9配列番号83、TLR6N6配列番号96のペプチドがTLR4およびTLR6のヘテロ集合を制御し、マウスマクロファージ細胞系の活性化をもたらす能力を研究した。マクロファージの活性化は、炎症誘発性サイトカインTNF-αの分泌レベルによって引き起こされた。アルツハイマー病における炎症誘発性媒介物の分泌におけるそれらの関与が既に開示されたため、この実験はマクロファージで行われた。図16に示されるように、可溶性TLR6およびTLR4TMペプチドの添加は、fAβで刺激した後のマクロファージ活性化を阻害した。実施例17.合成ペプチドの機能的研究。完全長受容体の活性を損ない、かつ原線維β-アミロイドによるマクロファージおよび/または小膠細胞活性化の新規阻害剤として機能するそれらの能力について、TLR4およびTLR6ペプチドをさらに分析した。これは、ペプチドの存在下および不在下で、いくつかの実験方法によって検査される。本方法は、1fAβで刺激した後の、NF-κΒの活性化状態における変化を追跡する。HEK293細胞は、TLR4、TLR6、およびNF-κΒルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時形質移入される。リガンドで刺激した後、細胞を溶解し、二重ルシフェラーゼアッセイレポーター系を使用して、レポーター遺伝子の活性を測定した。この系は、我々が、未処理細胞と比較して、ルシフェラーゼの減少をもたらす、異なるペプチドの活性化レベルを判定することを可能にする。さらに、異なる遺伝子型を伴う細胞を使用することにより、我々が、系の特異性を推定することを可能にする、2RT-PCRにより、炎症誘発性関連分子の発現における変化を追跡する、3ELISAにより、炎症誘発性サイトカインTNF-α、IL-1b、およびIL-6の分泌を追跡することを含む。全ての実験において、ペプチドの作用は、非刺激細胞に標準化される。我々は、最初にRAW264.7マウスマクロファージを使用し、その後、マウスBV-2小膠細胞を使用して、このアッセイを繰り返す。最後に、我々は、マウス神経細胞、野生型、およびノックアアウト小膠細胞TLR4-/-、TLR6-/-を使用して、小膠細胞誘発された神経毒性を評価するために、神経毒性アッセイを利用する。fABと共に72時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡を使用して、神経細胞の生存を計算する。ROSおよびNOの測定は、ニトロブルーテトラゾリウムNBT還元アッセイにより行われ、一酸化窒素は、Griess反応により測定される。TMD由来ペプチドがNO分泌を阻害する能力を検査するために、1ウェル当り1×105細胞を、96ウェルプレートで一晩培養した。翌日、全ての補足物を含む新しいDMEMで培地を交換し、DMSOに溶解したTLRペプチドを、異なる濃度で細胞に添加した。DMSOの最終濃度は、全群において1である。ペプチドと共に細胞を2時間インキュベートし、その後、各処理からの培地の試料を回収し、直ちにキットに使用した後、2回洗浄し、10μΜの原線維βアミロイドを含有する新しい培地と共に37°Cで5~24時間インキュベートした。Griess試薬系Promegaは、NO2を検出し、スルファニルアミドおよびN-1-ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリドを使用する化学反応に基づく。実施例18.アルツハイマー病のTgCRND8マウスモデルにおけるTL4およびTLR6Tmドメインのペプチドの治療有効性の評価。TgCRND8アミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウスを、最大24のIP、IV、および頭蓋内処理において、TLR4およびTLR6TMドメインに由来するペプチドで処理し、アミロイドコア斑点の形成および行動的研究により、アルツハイマー病の発達速度を監視し、加えて、生体内での小膠細胞活性化のレベルを評価するために、IL-Ιβ、TNFα、およびIL-6の免疫組織学染色を実施する。参考文献Bennasroune,A.,Fickova,M.,Gardin,A.,Dirrig-Grosch,S.,Aunis,D.,Cremel,G.Hubert,P.2004MolBiolCell15,3464-74.Cohen,T.,Pevsner-Fischer,M.,Cohen,N.,Cohen,I.R.Shai,Y.2008Biochemistry47,4826-4833.FassbenderK,WalterS,KuhlS,LandmannR,IshiiK,BertschT,StalderA,MuehlhauserF,LiuY,UlmerA,RivestS,LentschatA,GulbinsE,JuckerM,StafenbielM,BrechtelK,WalterJ,MulthaupG,PenkeB,AdachiY,HartmannT,BeyreutherK2004TheLPSreceptorCD14linksinnateimmunitywithAlzheimer’sdisease.FASEBJ18:203-205.Foster,S.L.Medzhitov,R.2009ClinImmunol130,7-15.Frillingos,S.,Sahin-Toth,M.,Wu,J.,andKaback,H.R.1998.Cys-scanningmutagenesis:anovelapproachtostructurefunctionrelationshipsinpolytopicmembraneproteins.FasebJ12,1281-1299.Gerber,D.Shai,Y.2001Invivodetectionofhetero-associationofglycophorin-Aanditsmutantswithinthemembrane.J.Biol.Chem.276,31229-31232.GerberD,PritskerM,Gunther-AusbornS,JohnsonB,BlumenthalR,ShaiY.2004InhibitionofHIV-lenvelopeglycoprotein-mediatedcellfusionbyaDL-aminoacid-containingfusionpeptide:possiblerecognitionofthefusioncomplex.JBiolChem,27946,48224-30.Hajjar,A.M.,O’Mahony,D.S.,Ozinsky,A.,Underhill,D.M.,Aderem,A.,Klebanoff,S.J.Wilson,C.B.2001.Cuttingedge:functionalinteractionsbetweentoll-likereceptorTLR2andTLR1orTLR6inresponsetophenol-solublemodulin.JImmunol166,15-9.He,M.M.,Sun,J.,andKaback,H.R.1996.Cysteine-scanningmutagenesisoftransmembranedomainXIIandtheflankingperiplasmicloopinthelactosepermeaseofEscherichiacoli.Biochemistry35,12909-12914.Huang,B.,Zhao,J.,Shen,S.,Li,H.,He,K.L.,Shen,G.X.,Mayer,L.,Unkeless,J.,Li,D.,Yuan,Y.,Zhang,G.M.,Xiong,H.Feng,Z.H.2007CancerRes67,4346-52.Huang,B.,Zhao,J.,Li,H.,He,K.L.,Chen,Y.,Chen,S.H.,Mayer,L.,Unkeless,J.C.Xiong,H.2005.Toll-likereceptorsontumorcellsfacilitateevasionofimmunesurveillance.CancerRes65,5009-14.Jin,M.S.,Kim,S.E.,Heo,J.Y.,Lee,M.E.,Kim,H.M.,Paik,S.G.,Lee,H.Lee,J.O.2007.CrystalstructureoftheTLR1-TLR2heterodimerinducedbybindingofatri-acylatedlipopeptide.Cell130,1071-1082.Kajita,E.,Nishiya,T.Miwa,S.2006BiochemBiophysResCommun343,578-84.Korazim,O.,K.Sackett,andY.Shai,2006FunctionalandstructuralcharacterizationofHIV-lgp41ectodomainregionsinphospholipidmembranessuggeststhatthefusion-activeconformationisextended.JMolBiol.3645,1103-17.Kundu,S.D.,Lee,C,Billips,B.K.,Habermacher,G.M.,Zhang,Q.,Liu,V.,Wong,L.Y.,Klumpp,D.J.Thumbikat,P.2008.Thetoll-likereceptorpathway:anovelmechanismofinfection-inducedcarcinogenesisofprostateepithelialcells.Prostate68,223-9.Langosch,D.,Brosig,B.,Kolmar,H.Fritz,H.J.1996.DimerisationoftheglycophorinAtransmembranesegmentinmembranesprobedwiththeToxRtranscriptionactivator.J.Mol.Biol.263,525-530.Lee,H.K.,Dunzendorfer,S.Tobias,P.S.2004.Cytoplasmicdomain-mediateddimerizationsoftoll-likereceptor4observedbybeta-lactamaseenzymefragmentcomplementation.JBiolChem279,10564-74.LehnardtS,MassillonL,FollettP,JensenFE,RatanR,RosenbergPA,VolpeJJ,VartanianT2003ActivationofinnateimmunityintheCNStriggersneurodegenerationthroughaToll-likereceptor4-dependentpathway.ProcNatlAcadSciUSA100:8514-8519Lindner,E.Langosch,D.2006.AToxR-baseddominant-negativesystemtoinvestigateheterotypictransmembranedomaininteractions.Proteins65,803-807.Mendrola,J.M.,Berger,M.B.,King,M.C.Lemmon,M.A.2002JBiolChem277,4704-12.Meng,G.,Rutz,M.,Schiemann,M.,Metzger,J.,Grabiec,A.,Schwandner,R.,Luppa,P.B.,Ebel,F.,Busch,D.H.,Bauer,S.,Wagner,H.Kirschning,C.J.2004JClinInvest113,1473-81.Mitchell,J.A.,Paul-Clark,M.J.,Clarke,G.W.,McMaster,S.K.Cartwright,N.2007JEndocrinol193,323-30.Nishiya,T.,Kajita,E.Miwa,S.2006BiochemBiophysResCommun341,1128-34.O’Neill,L.A.Bowie,A.G.2007NatRevImmunol7,353-64.Ozinsky,A.,Underhill,D.M.,Fontenot,J.D.,Hajjar,A.M.,Smith,K.D.,Wilson,C.B.,Schroeder,L.Aderem,A.2000.Therepertoireforpatternrecognitionofpathogensbytheinnateimmunesystemisdefinedbycooperationbetweentoll-likereceptors.ProcNatlAcadSciUSA97,13766-71Papo,N.,Seger,D.,Makovitzki,A.,Kalchenko,V.,Eshhar,Z.,Degani,H.Shai,Y.2006CancerResearch66,5371-5378.Papo,N.,Braunstein,A.,Eshhar,Z.Shai,Y.2004CancerResearch64,5779-5786.Papo,N.,Oren,Z.,Pag,U.,Sahl,H.G.Shai,Y.2002JournalofBiologicalChemistry277,33913-33921.Quintana,F.J.,Gerber,D.,Bloch,I.,Cohen,I.R.Shai,Y.2007Biochemistry46,2317-25.Rapaport,D.Shai,Y.1991JournalofBiologicalChemistry266,23769-23775.Rolls,A.,Shechter,R.,London,A.,Ziv,Y.,Ronen,A.,Levy,R.Schwartz,M.2007NatCellBiol9,1081-8.Rosenfeld,Y.,Papo,N.Shai,Y.2006aJBiolChem281,1636-43.Rosenfeld,Y.,Barra,D.,Simmaco,M.,Shai,Y.Mangoni,M.L.2006bJBiolChem281,28565-74.Rosenfeld,Y.Shai,Y.2006cBiochimBiophysActa1758,1513-22.Russ,W.P.Engelman,D.M.1999ProcNatlAcadSciUSA96,863-8.Saenz-Abad,D.,Letona-Carbajo,S.,Benito-Arevalo,J.L.,Sanioaquin-Conde,I.Ruiz-Ruiz,F.J.2008.Prostatictuberculosis:casereport.SaoPauloMedJ126,227-8.Sal-Man,N.,Gerber,D.Shai,Y.2005JBiolChem280,27449-57.Sal-Man,N.,Gerber,D.Shai,Y.2004Biochemistry43,2309-13.Sato,Y.,Goto,Y.,Narita,N.Hoon,D.S.2009.CancerCellsExpressingToll-likeReceptorsandtheTumorMicroenvironment.CancerMicroenviron2Suppl1,205-14Sfanos,K.S.Isaacs,W.B.2008.AnevaluationofPCRprimersetsusedfordetectionofPropionibacteriumacnesinprostatetissuesamples.Prostate68,1492-5.Shi,H.,Kokoeva,M.V.,Inouye,K.,Tzameli,I.,Yin,H.Flier,J.S.2006JClinInvest116,3015-25.Sung-ChunTanga,b,c,JustinD.Lathiaa,PradeepK.Selvarajf,Dong-GyuJoa,d,MohamedR.Mughala,AiwuChenga,DominicA.Silera,WilliamR.Markesberye,ThirumaV.Arumugamf,andMark.P.Mattsona,g,2008Toll-LikeReceptor-4MediatesNeuronalApoptosisInducedbyAmyloidβ-PeptideandtheMembraneLipidPeroxidationProduct4-Hydroxynonenal.ExpNeurol.2131:114-121StewartCR,StuartLM,WilkinsonK,vanGilsJM,DengJ,HalleA,RaynerKJ,BoyerL,ZhongR,FrazierWA,Lacy-HulbertA,ElKhouryJ,GolenbockDT,MooreKJ.20103.CD36ligandspromotesterileinflammationthroughassemblyofaToll-likereceptor4and6heterodimer.NatImmunol.112:155-61.WalterS,LetiembreM,LiuY,HeineH,PenkeB,HaoW,BodeB,ManiettaN,WalterJ,Schulz-SchaefferW,FassbenderK2007RoleoftheToll-likereceptor4inneuro-inflammationinAlzheimer’sdisease.CellPhysiolBiochem20:947-956"