"オゾン処理したカラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。カラム充填剤は、少なくとも表面に強カチオン性基を有することを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。強カチオン性基は、4級アンモニウム基であることを特徴とする請求項2記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。カラム充填剤は、更に、少なくとも表面に弱アニオン性基を有することを特徴とする請求項2又は3記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。弱アニオン性基は、カルボキシル基であることを特徴とする請求項4記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。カラム充填剤は、架橋重合体粒子からなることを特徴とする請求項1、2、3、4又は5記載の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法。本発明は、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法の提供を目的とする。本発明は、オゾン処理したカラム充填剤を用いる液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法である。本発明者らは液体クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤として、オゾン処理したカラム充填剤を用いることにより、核酸を短時間で高精度に分離検出できることを見出した。この分離性能を向上させる効果は、従来から行われているオゾン処理による非特異吸着の抑制効果とは異なり、核酸の分離検出時において認められる特有の効果である。以下に本発明を詳述する。本発明の液体クロマトグラフィーによる核酸の分離検出方法以下、本発明の分離検出方法ともいうに用いるカラム充填剤のオゾン処理は、カラム充填剤とオゾンとを接触させることにより行う。カラム充填剤と接触させるオゾンの形態は、オゾンガス、又は、オゾンガスを溶解した水以下、オゾン水というが好ましい。より好ましくはオゾン水による処理である。カラム充填剤とオゾンとを接触させる方法は、例えば、カラム充填剤をオゾン水に浸漬する方法、カラム充填剤をエンプティカラムに充填した後、得られたカラムにオゾン水を通液する方法等が挙げられる。オゾン水中のオゾン濃度の好ましい下限は20ppmである。オゾン濃度が20ppm未満であると、オゾン処理に長時間を要したり、オゾン処理の効果が不充分なため、カラム充填剤の分離性能が悪くなることがある。オゾン濃度のより好ましい下限は50ppmである。オゾン水の製造方法としては、例えば、特開2001-330969号公報に開示されている、原料水に透過膜を介してオゾンガスを溶解させる方法等が挙げられる。また、オゾン処理の際には、特開2007-178417号公報に開示されているオゾンによる酸化を促進する方法を併用してもよい。更に、カラム充填剤とオゾンとを接触させる時に、紫外線照射、超音波照射、アルカリ水添加等のオゾンの分解を促進する方法を併用できる。オゾン処理するカラム充填剤は、少なくとも表面に強カチオン性基を有することが好ましい。本明細書において強カチオン性基とは、pH1~14の全ての範囲で解離するカチオン性基を意味する。即ち、強カチオン性基は、水溶液のpHに影響を受けず解離したカチオン化した状態を保つことが可能である。強カチオン性基としては、4級アンモニウム基が好ましい。4級アンモニウム基としては、例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。強カチオン性基量の好ましい下限は、カラム充填剤の乾燥重量1gあたり1μeq、好ましい上限は、カラム充填剤の乾燥重量1gあたり500μeqである。強カチオン性基量が1μeq/g未満であると、カラム充填剤の保持力が弱く、分離性能が悪くなることがある。強カチオン性基量が500μeq/gを超えると、カラム充填剤の保持力が強くなりすぎ、短時間で溶出させることが困難になる。少なくとも表面に強カチオン性基を有するカラム充填剤は、1強カチオン性基を有する単量体を重合させたカラム充填剤、2強カチオン性基に変換可能な官能基以下、反応性基というを有する単量体を重合させた後、反応性基を強カチオン性基に変換させたカラム充填剤等が好ましい。より好ましくは1のカラム充填剤である。上記1のカラム充填剤を構成する強カチオン性基を有する単量体としては、4級アンモニウム基を有する単量体が好ましい。4級アンモニウム基を有する単量体としては、メタアクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタアクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタアクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタアクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、メタアクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタアクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等のアクリル系単量体が挙げられる。なお、本明細書においてアクリル系とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また本明細書においてメタアクリルとは、アクリル又はメタクリルであることを示す。上記2のカラム充填剤を構成する単量体が有する反応性基は、非イオン性の官能基が好ましく、例えば、エステル結合、疎水性基、環状構造基、水酸基、エポキシ基、1級アミノ基、2級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられる。なかでも、水酸基、エポキシ基、1級アミノ基、2級アミノ基が好ましい。これらの反応性基を有する単量体としては、例えば、水酸基を有するメタアクリレート類、エポキシ化メタアクリレート類、アミノ化メタアクリレート類、アルデヒド化メタアクリレート類、シアノ化メタアクリレート類等が挙げられる。なお、本明細書においてメタアクリレートとは、アクリレート又はメタクリレートであることを示す。水酸基を有するメタアクリレート類としては、例えば、エチレングリコールモノメタアクリレート、ジエチレングリコールモノメタアクリレート、トリエチレングリコールモノメタアクリレート、テトラエチレングリコールモノメタアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタアクリレート、メトキシトリポリエチレングリコールモノメタアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタアクリレート等のポリエチレングリコールモノメタアクリレート類や、プロピレングリコールモノメタアクリレート、ジプロピレングリコールモノメタアクリレート、トリプロピレングリコールモノメタアクリレート、テトラプロピレングリコールモノメタアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタアクリレート等のポリプロピレングリコールメタアクリレート類や、ポリエチレングリコールプロピレングリコールモノメタアクリレート、ポリエチレングリコールテトラメチレングリコールモノメタアクリレート、ポリプロピレングリコールテトラメチレングリコールモノメタアクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコールモノメタアクリレート等のアルキレングリコールモノメタアクリレート類や、グリセリンモノメタアクリレート、2-ヒドロキシエチルメタアクリレート、2-ヒドロキシプロピルメタアクリレート、2,3-ジヒドロキシルエチルメタアクリレート、2,3-ジヒドロキシルプロピルメタアクリレート等が挙げられる。エポキシ化メタアクリレート類としては、例えば、グリシジルメタアクリレート等が挙げられる。アミノ化メタアクリレート類としては、例えば、2-アミノエチルメタアクリレート、2,3-ジアミノエチルメタアクリレート、2-アミノプロピルメタアクリレート、2,3-ジアミノプロピルメタアクリレート、メタアクリルアミド等が挙げられる。アルデヒド化メタアクリレート類としては、例えば、メタアクロレイン等が挙げられる。シアノ化メタアクリレート類としては、例えば、シアノメタアクリレート、エチル-2-シアノアクリレート等が挙げられる。反応性基を強カチオン性基に変換する方法としては、例えば、反応性基がエポキシ基の場合、エポキシ基を有する重合体粒子を水又は有機溶媒中に分散し、エポキシ基を活性化した後、3級アミン類を反応させる方法等が挙げられる。反応させる3級アミン類としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジエタノールアミン、N-エチルジエタノールアミン、1-メチルピペリジン、1-メチルピロリジン、ピリジン、メチルピリジン類等が挙げられる。本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤は、強カチオン性基に加えて、弱アニオン性基を少なくとも表面に有することがより好ましい以下、強カチオン性基及び弱アニオン性基を合わせて、単にイオン交換基ともいう。弱アニオン性基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基等が挙げられる。なかでも、カルボキシル基が好ましい。弱アニオン性基量の好ましい下限は、カラム充填剤の乾燥重量1gあたり1μeq、好ましい上限は、カラム充填剤の乾燥重量1gあたり500μeqである。弱アニオン性基量が1μeq/g未満であると、弱アニオン性基によるイオン交換反応が弱く、分離性能が悪くなることがある。弱アニオン性基量が500μeq/gを超えると、弱アニオン性基が、強カチオン性基によるイオン交換反応を阻害し分離性能が悪くなることがある。少なくとも表面に弱アニオン性基を有するカラム充填剤は、3弱アニオン性基を有する単量体を重合させたカラム充填剤、4弱アニオン性基に変換可能な官能基を有する単量体を重合させた後、該弱アニオン性基に変換可能な官能基を弱アニオン性基に変換させたカラム充填剤等が好ましい。より好ましくは3のカラム充填剤である。上記3のカラム充填剤を構成する弱アニオン性基を有する単量体としては、弱アニオン性基を有するが強カチオン性基を有しない単量体が好ましく、弱アニオン性基としてカルボキシル基を有する単量体がより好ましい。このような単量体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸、メサコン酸、イソクロトン酸、シトラコン酸、β-カルボキシエチルアクリレート等が挙げられる。上記4の弱アニオン性基に変換可能な官能基は、上記2の反応性基と同様である。以下、弱アニオン性基に変換可能な官能基も反応性基という場合がある。反応性基を弱アニオン性基に変換する方法としては、例えば、アミノ基にカルボキシル基を有するシランカップリング剤を反応させる方法、水酸基にハロゲン化酢酸類やアルデヒド化合物を反応させる方法、エポキシ基にカルボキシル基を有する化合物を反応させる方法、エステル基を加水分解する方法、反応性基のエポキシ基を開環反応させる方法、不飽和結合等の疎水性基を紫外線やプラズマ照射等の公知の酸化処理反応によって酸化する方法等が挙げられる。反応性基が水酸基である場合、クロロ酢酸ナトリウム等のハロゲン化酢酸類を、水酸化アルカリ水溶液中で反応させることによりカルボキシル基を導入することができる。反応性基がアルデヒド基である場合、酸触媒下にてアセタール化反応により水酸基と反応させることにより、カルボキシル交換基を導入することができる。また、トリカルバリル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン酸化合物と水酸基の脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。反応性基がエポキシ基である場合、グリコール酸等のカルボン酸化合物を反応させる方法等によりカルボキシル基を導入することができる。反応性基がアミノ基である場合、エピクロルヒドリンやトリグリシジルエーテルのようなエポキシ化合物を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させてエポキシ化した後、上述した反応性基がエポキシ基の場合と同様の処理を行うことによりカルボキシル基を導入することができる。本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤が、少なくとも表面に強カチオン性基と弱アニオン性基とを有する場合、強カチオン性基と弱アニオン性基とは、両者とも重合反応により導入されてもよいし、両者とも変換により導入されてもよい。また、それぞれ別々の方法により導入されてもよい。即ち、強カチオン性基が重合反応により導入され、弱アニオン性基が変換による方法により導入されてもよいし、強カチオン性基が変換により導入され、弱アニオン性基が重合反応により導入されてもよい。本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤は、ポリアクリレート等の有機合成高分子系の架橋重合体粒子や、シリカ等の無機高分子系の架橋重合体粒子に、上記1~4等の方法によりイオン交換基を導入した充填剤であることが好ましい。なかでも、有機合成高分子系の架橋重合体粒子が好ましい。上記架橋重合体粒子は、少なくとも1種の架橋性単量体を重合した架橋重合体粒子、又は、少なくとも1種の架橋性単量体及び少なくとも1種の非架橋性単量体を共重合した架橋重合体粒子が好ましい。架橋性単量体としては、例えば、ポリエチレングリコールジメタアクリレート類、ポリプロピレングリコールジメタアクリレート類、アルキレングリコールジメタアクリレート類、ヒドロキシアルキルジメタアクリレート類、分子内に少なくとも2個のメタアクリル基を有するアルキロールアルカンメタアクリレート類、芳香族系架橋性単量体類等が挙げられる。ポリエチレングリコールジメタアクリレート類としては、例えば、エチレングリコールジメタアクリレート、ジエチレングリコールジメタアクリレート、トリエチレングリコールジメタアクリレート、テトラエチレングリコールジメタアクリレート、ポリエチレングリコールジメタアクリレート等が挙げられるポリプロピレングリコールジメタアクリレート類としては、例えば、プロピレングリコールジメタアクリレート、ジプロピレングリコールジメタアクリレート、トリプロピレングリコールジメタアクリレート、テトラプロピレングリコールジメタアクリレート、ポリプロピレングリコールジメタアクリレート等が挙げられる。アルキレングリコールジメタアクリレート類としては、例えば、ポリテトラメチレングリコールジメタアクリレート、ポリプロピレングリコール-テトラメチレングリコール-ジメタアクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール-ジメタアクリレート、1,3-ブチレングリコールジメタアクリレート、1,4-ブチレングリコールジメタアクリレート、1,6-ヘキサグリコールジメタアクリレート、1,9-ノナンジオールジメタアクリレート、ネオペンチルグリコールジメタアクリレート等が挙げられる。ヒドロキシアルキルジメタアクリレート類としては、例えば、2-ヒドロキシ-1,3-ジメタアクリロキシプロパン、2-ヒドロキシ-1-メタアクリロキシ-3-メタアクリロキシプロパン、2-ヒドロキシ-3-メタアクリロイルオキシプロピルメタアクリレート、グリセロールジメタアクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタンメタジアクリレート、イソシアヌル酸ジメタアクリレート、イソシアヌル酸トリメタアクリレート、1,10-ジメタアクリロキシ-4,7-ジオキサデカン-2,9-ジオール、1,10-ジメタアクリロキシ-5-メチル-4,7-ジオキサデカン-2,9-ジオール、1,11-ジメタアクリロキシ-4,8-ジオキサウンデガン-2,6,10-トリオール等が挙げられる。分子内に少なくとも2個のメタアクリル基を有するアルキロールアルカンメタアクリレート類としては、例えば、トリメチロールプロパントリメタアクリレート、テトラメチロールプロパントリメタアクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラメタアクリレート、テトラメチロールメタントリメタアクリレート、テトラメチロールメタンテトラメタアクリレート、トリメチロールエタントリメタアクリレート等が挙げられる。芳香族系架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等が挙げられる。これらの架橋性単量体は単独で用いてもよいし、2種以上を併用して用いてもよい。特にアクリル系単量体が好ましい。架橋重合体粒子を構成する非架橋性単量体としては、上記反応性基を有する単量体、メタアクリル酸アルキル類、芳香族系非架橋性単量体等が挙げられる。メタアクリル酸アルキル類としては、例えば、メタアクリル酸メチル、メタアクリル酸エチル、メタアクリル酸プロピル、メタアクリル酸ブチル、メタアクリル酸2-エチルヘキシル等が挙げられる。芳香族系非架橋性単量体としては、例えば、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体等が挙げられる。なかでも、アクリル系単量体が好ましい。架橋重合体粒子が、架橋性単量体と非架橋性単量体との共重合体からなる場合、該共重合体における架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は10重量である。架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合が10重量未満であると、架橋重合体粒子の耐圧性、耐膨潤性が低下し、カラム充填剤として用いた場合の分離性能が悪くなる。架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合のより好ましい下限は20重量である。本発明の分離検出方法に用いるカラム充填剤の平均粒子径の好ましい下限は0.1μm、好ましい上限は20μmである。平均粒子径が0.1μm未満の場合、カラム圧が高くなり分離性能が悪くなることがある。平均粒子径が20μmを超える場合、カラム内のデッドボリュームが大きくなり分離性能が悪くなることがある。本発明の分離検出方法は、ウイルス由来の核酸及びヒト由来の核酸を分離検出できる。例えば、ウイルス由来の核酸を分離検出し、ウイルスの存在や型を判別することができる。また、ヒト由来の核酸を分離検出し、ヒト遺伝子の一塩基多型を含む遺伝子多型を判別することができる。測定対象の核酸としては、公知の方法により抽出及び精製した核酸、又は、精製した核酸を公知のPCRPolymeraseChainReaction法等により増幅した増幅産物等が挙げられる。また、これらの核酸やPCR増幅産物を、制限酵素により切断した制限酵素断片等が挙げられる。本発明の分離検出方法に用いる溶離液は公知の溶離液を用いることができる。特に、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましい。例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス及びEDTAを含むTE緩衝液、トリス、酢酸、及びEDTAを含むTAE緩衝液、トリス、ホウ酸、及びEDTAを含むTBA緩衝液等が挙げられる。溶離液は塩類を含有してもよい。塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のアルカリ金属のハロゲン化物や、塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のアルカリ土類金属のハロゲン化物等が挙げられる。また、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。溶離液のpHの好ましい下限は5、好ましい上限は10である。pHが5未満であると、充填剤が弱アニオン性基を有する場合、弱アニオン性基の解離度が減少して分離性能が低下する。pHが10を超えると、クロマトグラムが変形し測定精度が低下する。溶離液のpHのより好ましい下限は6、より好ましい上限は9である。溶離液の塩濃度の好ましい下限は10mmol/L、好ましい上限は2000mmol/Lであり、より好ましい下限は100mmol/L、より好ましい上限は1500mmol/Lである。本発明によれば、核酸を短時間で高精度に分離検出できる液体クロマトグラフィーによる分離検出方法を提供できる。実施例1実施例1では、強カチオン性基として4級アンモニウム基を有するカラム充填剤を調製した。攪拌機付き反応器中の3重量ポリビニルアルコール日本合成化学社製水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート新中村化学工業社製300g、トリエチレングリコールジメタクリレート新中村化学工業社製100g、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド和光純薬工業社製、4級アンモニウム基を有する単量体100g、及び、過酸化ベンゾイルキシダ化学社製1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80°Cで12時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、4級アンモニウム基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、粒度分布測定装置ParticleSizingSystems社製、Accusizer780を用いて測定した結果、10μmであった。得られた架橋重合体粒子10gを、オゾン水製造システム積水化学工業社製により調製されたオゾン水オゾン濃度100ppm300mLに浸漬し、30分間攪拌した。攪拌後、遠心分離機日立製作所社製、HimacCR20Gを用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を2回繰り返して、オゾン処理したカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラムカラムサイズ:内径4.6mm×長さ20mmに充填し、カラムを得た。実施例2実施例2では、強カチオン性基として4級アンモニウム基を有するカラム充填剤を調製した。攪拌機付き反応器中の3重量ポリビニルアルコール水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート300g、トリエチレングリコールジメタクリレート100g、及び、過酸化ベンゾイル1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80°Cで1時間重合した。次に、50重量のメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液200gを反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80°Cで2時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、4級アンモニウム基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例1と同様の方法で測定した結果、10μmであった。実施例1と同様にオゾン処理をし、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラムカラムサイズ:内径4.6mm×長さ20mmに充填し、カラムを得た。実施例3実施例3では、強カチオン性基として4級アンモニウム基を、弱アニオン性基としてカルボキシル基を有するカラム充填剤を調製した。攪拌機付き反応器中の3重量ポリビニルアルコール水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート300g、トリエチレングリコールジメタクリレート100g、及び、過酸化ベンゾイル1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80°Cで1時間重合した。次に、50重量のメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液200g、及び、20gのメタクリル酸和光純薬工業社製、カルボキシル基を有する単量体を反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80°Cで2時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、4級アンモニウム基及びカルボキシル基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例1と同様の方法で測定した結果、10μmであった。実施例1と同様にオゾン処理をし、カラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤を、エンプティカラムカラムサイズ:内径4.6mm×長さ20mmに充填し、カラムを得た。比較例1オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例1と同様の操作を行い、カラムを得た。比較例2オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例2と同様の操作を行い、カラムを得た。比較例3オゾン水処理を行わなかったこと以外は実施例3と同様の操作を行い、カラムを得た。<評価1>1分離性能の評価1:DNAラダーマーカーの検出実施例1~3、及び、比較例1~3のカラムを用いて、下記の条件でDNAラダーマーカーを分離検出し、分離性能の比較を行った。システム:LC-20Aシステム島津製作所社製溶離液A:25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶離液B:1mol/LのNaClを含む25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶出条件:分離時間0分から30分にかけて、溶離液Bの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法0分溶離液A100→30分溶離液B100測定試料:20bpDNAラダーマーカータカラバイオ社製20bp、40bp、60bp、80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、200bp、300bp、400bp、500bpの断片が含まれる流速:1.0mL/min検出波長:260nm試料注入量:10μL実施例1で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図1に、実施例3で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図2に、比較例1で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図3に、比較例3で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図4に示す。なお、実施例2で得られたカラムを用いた場合は図1と同様のクロマトグラムが得られ、比較例2で得られたカラムを用いた場合は図3と同様のクロマトグラムが得られた。図1と図3、図2と図4とをそれぞれ比較した結果、オゾン処理したカラム充填剤を用いた場合は、オゾン処理をしなかったカラム充填剤を用いた場合に比べて、より短い分離時間で高い分離性能を示した。特に、オゾン処理によってピーク7~12の分離性能が向上した。2分離性能の評価2:インフルエンザウイルスの型判別検出実施例2で得られたカラムを用いて、下記の条件でインフルエンザウイルスのPCR増幅産物を分離検出し、ウイルスの型の判別を行った。システム:LC-20Aシステム島津製作所社製溶離液A:25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶離液C:1mol/Lの硫酸アンモニウムを含む25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶出条件:分離時間0分から5分にかけて、溶離液Cの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法0分溶離液A40、溶離液C60→5分溶離液C100測定試料:下記に示す3種類のインフルエンザウイルス株より精製したRNAの、RT-PCR増幅産物AH1型株A/NewCaledonia/20/1999、得られたPCR増幅産物のサイズ:431bpAH3型株A/Urugay/716/2007、得られたPCR増幅産物のサイズ:1141bpB型株B/Florida/4/2006、得られたPCR増幅産物のサイズ:329bpRNA精製用キット:QIAampViralRNAminiKitQuiagen社製RT-PCRキット:PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2タカラバイオ社製RT-PCRに使用したプライマー:AH1型、B型感染症学雑誌第71巻第6号<AH1型株用プライマー>5 ́-3 ́Forward;tgagggagcaattgagttca配列番号1Reverse;tgcctcaaatattattgtgt配列番号2<B型株用プライマー>5 ́-3 ́Forward;aatcttctcagaggatatga配列番号3Reverse;ttggcagatgaggtgaactt配列番号4AH3型インフルエンザ診断マニュアル平成14年4月版国立感染研究所発行<AH3型株用プライマー>5 ́-3 ́Forward;agcaaaagcaggggataattc配列番号5Reverse;tgcctgaaaccgtaccaacc配列番号6流速:1.5mL/min検出波長:260nm試料注入量:10μL得られたクロマトグラムを図5に示す。3種類のPCR増幅産物のピークは約5分間で分離でき、インフルエンザウイルスの型を判別できた。また、PCR増幅産物のピークは、PCR原料等に由来するピークから良好に分離できた。3分離性能の評価3:一塩基多型の測定実施例2で得られたカラムを用いて、下記の条件で、UDP-グルクロン酸転移酵素1A1UGT1A1の野生型遺伝子と変異型遺伝子のPCR増幅産物を分離検出し、一塩基多型の判別を行った。システム:LC-20Aシステム島津製作所社製溶離液A:25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶離液B:1mol/LのNaClを含む25mmol/Lトリス塩酸緩衝液pH7.5溶出条件:分離時間0分から5分にかけて、溶離液Bの混合比率を直線的に増加させるリニアグラジエント法0分溶離液A100→5分溶離液B100試料:UGT1A1の野生型遺伝子と変異型遺伝子野生型遺伝子の一塩基多型:UGT1A16の、変異領域のPCR増幅産物とその制限酵素断片PCRに用いたプライマー:5 ́-3 ́Forward;tggagaccgtcctcgtt配列番号7Reverse;aagacacgctgcaccaaataa配列番号8PCR増幅産物のサイズ:706bp使用した制限酵素:BsmBIBiolabs社製認識部位;5 ́cgtctcn3 ́配列番号93 ́gcagagnnnnn5 ́配列番号10上記nは、a又はt又はc又はgを表す流速:1.5mL/min検出波長:260nm試料注入量:10μL得られたクロマトグラムを図6に示す。UGT1A1の野生型遺伝子のPCR増幅産物を測定した場合は、制限酵素によって切断された235bpと471bpの二つの断片が検出された。変異型遺伝子UGT1A16のPCR増幅産物を測定した場合は、制限酵素の認識部位を持たないために切断されず、一つのピーク706bpとして検出された。この結果から、測定時間5分で一塩基多型を判別できることが分かった。また、PCR増幅産物と制限酵素断片のピークは、PCR原料等に由来するピークから良好に分離できた。以下の比較例4及び比較例5では、分離検出対象が核酸以外の場合において、オゾン処理がカラム充填剤の分離性能に及ぼす効果を確認するため、強アニオン性基以外のイオン交換基を有するカラム充填剤を調製した。比較例4攪拌機付き反応器中の3重量ポリビニルアルコール日本合成化学社製水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート新中村化学工業社製300g、トリエチレングリコールジメタクリレート新中村化学工業社製100g、及び、過酸化ベンゾイルキシダ化学社製1.0gの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて80°Cで1時間重合した。次に、50重量の2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸東亞合成社製、スルホン酸基を有する単量体水溶液200gを反応器中に添加し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて80°Cで2時間重合した。得られた重合物を水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基を有する架橋重合体粒子を得た。得られた架橋重合体粒子の平均粒子径を、実施例1と同様に測定した結果、10μmであった。得られた架橋重合体粒子10gを、実施例1と同様に操作してオゾン処理したカラム充填剤を得た。カラム充填剤を、エンプティカラムカラムサイズ:内径4.6mm×長さ20mmに充填し、カラムを得た。比較例5比較例4で得られた架橋重合体粒子を、オゾン処理せずに同様のエンプティカラムに充填し、カラムを得た。<評価2>1分離性能の評価4:ヘモグロビン類の検出比較例4及び比較例5で得られたカラムを用いて、下記の条件でヒト血液中のヘモグロビン類を分離検出し、分離性能の比較を行った。システム:LC-20Aシステム島津製作所社製溶離液D:30mmol/Lリン酸緩衝液pH5.8溶離液E:220mmol/Lリン酸緩衝液pH8.1溶出条件:溶離液D100から溶離液E100へのステップグラジエント試料:フッ化ナトリウム採血したヒト健常人血液を、0.05のTritonX-100Sigma-Aldrich社製を含むリン酸緩衝液pH6.7により180倍に溶血希釈したもの流速:1.5mL/分検出波長:415nm比較例4で得られたカラムを用いて得られたクロマトグラムを図7に示す。比較例4で得られたカラムは、45秒間でヘモグロビンA1cが良好に分離できた。比較例5で得られたカラムの場合も同様のクロマトグラムが得られた。即ち、オゾン処理による分離性能への影響は認められなかった。2分離性能の評価5:修飾ヘモグロビン類の検出比較例4及び比較例5で得られたカラム、並びに、分離性能の評価7の測定条件を用いて、人為的に調製した修飾ヘモグロビン類の分離を行った。修飾ヘモグロビン類を含む試料として、不安定型ヘモグロビンA1c含有試料試料L、アセチル化ヘモグロビン含有試料試料A、カルバミル化ヘモグロビン含有試料試料Cの3種類を、公知の方法により調製した。試料Lは、健常人血試料に、グルコースを2000mg/dLとなるように添加し、37°Cで3時間加温することにより調製した。試料Aは、健常人血試料に、アセトアルデヒドを50mg/dLとなるように添加し、37°Cで2時間加温することにより調製した。試料Cは、健常人血試料に、シアン酸ナトリウムを50mg/dLとなるように添加し、37°Cで2時間加温することにより調製した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンA1c値から、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血試料非修飾品のヘモグロビンA1c値を差し引いた値Δ値を算出して比較することにより評価した。結果を表1に示す。比較例4及び比較例5で得られたカラムは、ともにΔ値が0.2以下と小さく、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンA1cが分離できた。分離性能の評価4及び5の結果から、オゾン処理によるカラム充填剤の分離性能の向上効果は、核酸の分離検出時において認められる特有の効果であることが確認できた。"