Fc結合を破壊する少なくとも一つのアミノ酸置換およびVH3結合を破壊する少なくとも第二のアミノ酸置換およびSEQIDNO2のアミノ酸配列と少なくとも70同一であるアミノ酸配列を有する変種プロテインAを含む、単離ポリペプチド。変種SpAが、変種ドメインDセグメントを含む、請求項1記載の単離ポリペプチド。変種SpAが、SEQIDNO2のアミノ酸位置9または10の位置に一つまたは複数のアミノ酸置換を有し、かつSEQIDNO2のアミノ酸配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列を有する、請求項2記載の単離ポリペプチド。アミノ酸置換が、グルタミン残基に代えてリジン残基である、請求項3記載の単離ポリペプチド。SEQIDNO2のアミノ酸位置36および37にアミノ酸置換をさらに含む、請求項3記載の単離ポリペプチド。ドメインDのアミノ酸配列がSEQIDNO2のアミノ酸位置36および37にアラニン残基置換を含む、請求項5記載の単離ポリペプチド。SpAEドメイン、Aドメイン、BドメインまたはCドメインの一つまたは複数の変種をさらに含む、請求項2記載の単離ポリペプチド。二つまたはそれ以上のDドメインセグメントを含む、請求項2記載の単離ポリペプチド。非プロテインAセグメントをさらに含む、請求項1記載の単離ポリペプチド。非プロテインAセグメントが第二の抗原セグメントである、請求項9記載の単離ポリペプチド。第二の抗原セグメントがブドウ球菌抗原セグメントである、請求項10記載の単離ポリペプチド。ブドウ球菌抗原セグメントがEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびまたはSasFセグメントである、請求項11記載の単離ポリペプチド。薬学的に許容される組成物の中に、IgG、Fcγ、VH3F2、フォンウィルブランド因子および腫瘍壊死因子α受容体1とのプロテインAドメインDの結合を弱力化する一つまたは複数の変異を有する毒素非産生性の変種プロテインAペプチドを含むペプチド組成物であって、それを必要としている対象において免疫反応を刺激できる、前記組成物。SpA変種がSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10に一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項13記載の組成物。SpA変種がSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にリジンの置換を含む、請求項14記載の組成物。SEQIDNO2のアミノ酸位置36および37にアミノ酸置換をさらに含む、請求項14記載の組成物。SpA変種がSEQIDNO2と少なくとも70同一のアミノ酸配列を含む、請求項15記載の組成物。SpA変種がSEQIDNO8のアミノ酸配列を含む、請求項13記載の組成物。少なくとも第二のブドウ球菌抗原をさらに含む、請求項13記載の組成物。第二の抗原がEsaB、Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびまたはSasFペプチドから選択される、請求項19記載の組成物。プロテインAドメインDペプチドを含むペプチド以外のブドウ球菌成分の1重量未満を含む、請求項13記載の組成物。アジュバントをさらに含む、請求項13記載の組成物。SpA変種がアジュバントにカップリングされる、請求項22記載の組成物。SEQIDNO2のアミノ酸位置9、10、36および37にアミノ酸置換を有するプロテインA変種を含んだ単離ペプチドを含む免疫原性組成物。Emp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFからなる群より選択される少なくとも一つの他のブドウ球菌抗原またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項1~24のいずれか一項記載の組成物。PIA多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、請求項1~25のいずれか一項記載の組成物。黄色ブドウ球菌由来のV型およびまたはVIII型莢膜多糖類またはオリゴ糖をさらに含む、請求項1~26のいずれか一項記載の組成物。ブドウ球菌莢膜多糖類がタンパク質担体に結合される、請求項1~27のいずれか一項記載の免疫原性組成物。タンパク質担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、CRM197、インフルエンザ菌プロテインD、肺炎球菌溶血素およびαトキソイドからなる群より選択される、請求項28記載の免疫原性組成物。請求項1~29のいずれか一項記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含むワクチン。抗原を混合して請求項1~29のいずれか一項記載の組成物を作製する段階および薬学的に許容される賦形剤を添加する段階を含む、ワクチンを作製する方法。請求項30記載のワクチンを、それを必要としている患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染を予防または処置する方法。ブドウ球菌感染の処置または予防用のワクチンの製造における、請求項1~29のいずれか一項記載の組成物の使用。レシピエントを請求項30記載のワクチンで免疫する段階、およびレシピエントから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法。請求項34記載の方法によって調製される免疫グロブリン。請求項35記載の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。請求項36記載の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含む、ブドウ球菌感染の処置または予防のための方法。ブドウ球菌感染の処置または予防用の薬物の製造における、請求項36記載の薬学的調製物の使用。SEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するプロテインA変種を含む組成物の有効量を対象に提供する段階を含む、対象においてブドウ球菌に対する免疫反応を誘発するための方法。iSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する単離されたSpA変種、またはiiSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するSpA変種をコードする少なくとも一つの単離された組み換え核酸分子を含む組成物を対象に投与することにより、SpA変種の有効量を対象に提供する、請求項39記載の方法。組成物が単離されたSpA変種を含む、請求項40記載の方法。対象にアジュバントの投与もする、請求項39記載の方法。組成物がアジュバントを含む、請求項41記載の方法。SpA変種がアジュバントにカップリングされる、請求項41記載の方法。SpA変種がSEQIDNO2と少なくとも70同一であり、かつSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する、請求項39記載の方法。組成物が薬学的に許容される組成物中に処方される、請求項41記載の方法。ブドウ球菌が黄色ブドウ球菌である、請求項39記載の方法。ブドウ球菌が一つまたは複数の処置に対して耐性である、請求項39記載の方法。前記菌がメチシリン耐性である、請求項48記載の方法。組成物を二回以上対象に投与する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。組成物が経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内にまたは静脈内に投与される、請求項39記載の方法。第二のブドウ球菌抗原を含む組成物を対象に投与する段階をさらに含む、請求項39記載の方法。第二のブドウ球菌抗原がEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFの一つまたは複数である、請求項52記載の方法。組成物が、SpA変種をコードする組み換え核酸分子を含む、請求項40記載の方法。組成物が、SpA変種を発現する組み換え非ブドウ球菌を含む、請求項54記載の方法。組み換え非ブドウ球菌がサルモネラ菌である、請求項55記載の方法。対象が哺乳類である、請求項39記載の方法。対象がヒトである、請求項39記載の方法。免疫反応が防御免疫反応である、請求項39記載の方法。ブドウ球菌感染を有する、ブドウ球菌感染を有することが疑われる、またはブドウ球菌感染を発症するリスクがある対象に、SEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有するプロテインA変種を含む単離されたペプチドの有効量を提供する段階を含む、対象においてブドウ球菌感染を処置するための方法。対象が持続的ブドウ球菌感染と診断される、請求項60記載の方法。SpA変種が、対象においてプロテインAに結合する抗体の産生を誘発する、請求項60記載の方法。SpA変種がSEQIDNO2と少なくとも80同一であり、かつSEQIDNO2のアミノ酸位置9および10にアミノ酸置換を有する、請求項62記載の方法。SpA変種がSEQIDNO8のアミノ酸配列を有する、請求項62記載の方法。SpA変種がアジュバントとともに投与される、請求項62記載の方法。SpA変種がアジュバントにカップリングされる、請求項65記載の方法。SpA変種が薬学的に許容される組成物中に処方される、請求項60記載の方法。第二のブドウ球菌抗原を投与する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。第二のブドウ球菌抗原がSpA変種と同時に投与される、請求項68記載の方法。第二のブドウ球菌抗原およびSpA変種を、同一組成物で投与する、請求項69記載の方法。第二のブドウ球菌抗原がSpA変種と融合される、請求項69記載の方法。第二のブドウ球菌抗原がEmp、EsxA、EsxB、EsaC、Eap、Ebh、EsaB、Coa、vWbp、vWh、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、IsdC、ClfA、ClfBおよびSasFペプチドの一つまたは複数である、請求項68記載の方法。ブドウ球菌感染が黄色ブドウ球菌感染である、請求項60記載の方法。ペプチドが経口的に、非経口的に、経皮的に、経粘膜的に、皮下に、筋肉内にまたは吸入により投与される、請求項60記載の方法。ペプチドを二回以上対象に投与する段階をさらに含む、請求項60記載の方法。対象が哺乳類である、請求項60記載の方法。対象がヒトである、請求項60記載の方法。詳細な説明黄色ブドウ球菌は、ヒト皮膚および鼻孔の片利共生生物であり、血流、皮膚および軟組織感染の主因である。ブドウ球菌疾患の死亡率の最近の劇的な増加は、抗生物質に対して感受性を示さないことが多いメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株の広がりに起因する。大規模な遡及的研究において、米国ではMRSA感染の発生率が全入院の46であった。米国では94300人のMRSA感染個体のための年間医療費は24億ドルを超える。現在のMRSA流行病は、予防ワクチンの開発によって取り組む必要がある公衆衛生の危機を引き起こしている。これまでに、黄色ブドウ球菌疾患を予防するFDA認可済みワクチンは利用可能ではない。本発明者らは本明細書で、サブユニットワクチンとなりうる変種の作製のために、ブドウ球菌の細胞壁固定表面タンパク質であるプロテインAを用いることについて記述する。ブドウ球菌感染の発病は、外傷、手術創傷または医療装置を介して細菌が皮膚または血流に侵入する際に始まる。侵入病原菌は食菌され殺処理されうるが、ブドウ球菌は先天性免疫防御を回避し、器官組織において感染の種をまき、マクロファージ、好中球および他の食細胞を誘引する炎症反応を誘導することもできる。感染部位への免疫細胞の応答性浸潤には、宿主がブドウ球菌のまん延を阻止し壊死組織残屑の除去を可能にしようとするので、液化壊死が付随して起こる。そのような病変部は顕微鏡検査により壊死組織、白血球および中央の細菌病巣を含む富細胞性域として観察することができる。ブドウ球菌性膿瘍が外科手術で排出され、抗生物質で処置されなければ、播種性感染および敗血症が致命的結末をもたらす。IIブドウ球菌抗原Aブドウ球菌プロテインA黄色ブドウ球菌株はどれも、プロテインA、つまり細胞壁固定表面タンパク質産物がE、D、A、BおよびCと命名された5つの高度に相同的な免疫グロブリン結合ドメインを包含するよく特徴付けられた病毒性因子に対する構造遺伝子を発現する。これらのドメインはアミノ酸のレベルでおよそ80の同一性を示し、長さが56~61残基であり、縦列反復配列として組織化される。SpAは、N末端YSIRKGSシグナルペプチドおよびC末端LPXTGモチーフ選別シグナルを有する前駆体タンパク質として合成される。細胞壁固定プロテインAは、ブドウ球菌表面に非常に豊富に提示される。その免疫グロブリン結合ドメインの各々が、3ヘリックスバンドルへ集合しかつ免疫グロブリンGのFcドメインを結合する逆平行αヘリックス、IgMのVH3重鎖、そのA1ドメインのフォンウィルブランド因子vWFAIは血小板に対するリガンドである、および気道上皮の表面に提示される腫瘍壊死因子α受容体Iから構成される。SpAは、IgGのFc成分を結合するというその特質を通じて好中球によるブドウ球菌の食作用を妨げる。さらに、SpAはフォンウィルブランド因子AIドメインとのその結合を介して血管内凝固を活性化することができる。フィブリノゲンおよびフィブロネクチンのような血漿タンパク質は、ブドウ球菌と血小板インテグリンGPIIbIIIaとの間の、つまりvWFAIとのプロテインAの結び付きを通じて補完される活性の間の橋渡しの役目をし、これによってブドウ球菌はGPIbα血小板受容体を介して血小板を捕捉することができる。SpAはまた、TNFRIを結合し、この相互作用がブドウ球菌性肺炎の発病に寄与する。SpAはTNFR1を介したTRAF2、p38cJunキナーゼ、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼおよびRel転写因子NFKBの活性化を通じて炎症性シグナル伝達を活性化する。SpAの結合はTNFR1の切断、つまりTNF変換酵素を要するように思われる活性をさらに誘導する。上記のSpA活性の全てがその5つのIgG結合ドメインを通じて媒介され、プロテインAとヒトIgG1との間の相互作用に対するその必要によって最初に規定された、同じアミノ酸の置換によって撹乱されうる。SpAはまた、VH3を持つIgMのFab領域、B細胞受容体を捕捉することによりB細胞超抗原として機能する。静脈内投与の後、ブドウ球菌プロテインA変異は、器官組織においてブドウ球菌負荷の低減を示し、膿瘍形成能を劇的に弱めた。野生型黄色ブドウ球菌による感染の間に、膿瘍は48時間以内に形成され、ヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓組織の光学顕微鏡検査によって検出可能であり、病初では多形核白血球の流入が目立つ。感染5日目に、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団を含んでいた。病理組織診断によって、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかになった。本発明者らはまた、正常腎組織を感染病変部と区別する好酸球性の偽被膜に隣接する、膿瘍病変部周辺の壊死PMNの縁を観察した。プロテインAを欠いたブドウ球菌変種は、膿瘍の組織病理学的特徴を確立することができず、感染の間に除去される。過去の研究で、Cedergrenらは、SpAのBドメインのFc断片結合サブドメインにおいて5つの個別の置換L17D、N28A、I31AおよびK35Aを設計した。これらの著者らは、これらのタンパク質を作製して、SpAの一つのドメインとFc1との間の複合体の三次元構造から集められたデータを検証した。Cedergrenらは、安定性および結合に及ぼすこれらの変異の効果を判定したが、しかしワクチン抗原の産生のためにそのような置換を用いることを企図していなかった。Brownらは、親和性リガンドとして用いられた場合にいっそう好ましい溶出条件の使用を可能にするSpAに基づいた新しいタンパク質を操作するためにデザインされた研究について記述している。研究された変異には、Q13A、Q14H、N15A、N15H、F17H、Y18F、L21H、N32HまたはK39Hの単一変異が含まれた。Brownらは、Q13A、N15A、N15HおよびN32H置換が解離定数値に差異をほとんど生じなかったこと、ならびに、Y18F置換が野生型SpAと比べて結合親和性の2倍の減少をもたらしたことを報告している。Brownらは、L21HおよびF17H置換が結合親和性をそれぞれ5倍および100倍低減することも報告している。著者らは、二つのタンデムドメインにおける類似の置換についても研究している。このように、Brownらの研究は、より好ましい溶出プロファイルを有するSpAの作製、ゆえに結合親和性のpH感受性変化をもたらすためのHis置換の使用を対象としていた。Brownらは、ワクチン抗原としてのSpAの使用については何も語っていない。GrailleらはSpAのドメインDおよびヒトIgM抗体のFab断片の結晶構造について記述している。Grailleらは結晶構造の解析によって、ドメインDサブドメイン間で界面を形成するアミノ酸残基のほかに、残基Q26、G29、F30、Q32、S33、D36、D37、Q40、N43、E47またはL51として、Fab断片と相互作用するDドメインアミノ酸残基を規定している。Grailleらは、これらの二つのタンパク質の分子相互作用を規定しているが、しかしワクチン抗原の産生での相互作用残基における置換のいかなる使用に関しても何も語っていない。OSeaghdhaらは、ドメインDのどのサブドメインがvWFに結合するかの解明に向けた研究について記述している。著者らは、FcまたはVH3結合サブドメインのいずれかにおいて単一の変異、すなわち、アミノ酸残基F5A、Q9A、Q10A、F13A、Y14A、L17A、N28A、I31A、K35A、G29A、F30A、S33A、D36A、D37A、Q40A、E47AまたはQ32Aを作製した。著者らは、vWFが、Fcに結合する同じサブドメインに結合することを発見した。OSeaghdaらは、vWFの結合に関与するドメインDのサブドメインを規定しているが、しかしワクチン抗原の産生での相互作用残基における置換のいかなる使用に関しても何も語っていない。Gomezらは、F5A、F13A、Y14A、L17A、N21A、I31A、Q32AおよびK35Aの単一変異を用いることによりTNFR1の活性化に関与する残基を特定することについて記述している。Gomezらは、ワクチン抗原の産生での相互作用残基における置換のいかなる使用に関しても何も語っていない。組み換え親和性タグ付きのプロテインA、つまり5つのIgGドメインを含むがC末端の領域Xを欠くポリペプチドを組み換え大腸菌から精製し、ワクチン抗原として用いた。IgGのFc部分に結合する際のSpAの特質のため、プロテインAに対する特異的な体液性免疫反応を測定することができなかった。本発明者らは、SpADQ910KD3637Aの作製を通じてこの障害を克服した。組み換えプロテインAで免疫されたBALBcマウスは、黄色ブドウ球菌株の静脈内投与に対して顕著な防御を示した野生型と比べてブドウ球菌負荷の2951logの低下。SpA特異的抗体は膿瘍形成の前に食細胞除去を引き起こし、およびまたはブドウ球菌群集を免疫細胞と区別する膿瘍における前述の好酸球性障壁の形成に、これらがプロテインA変異体菌株の感染中には生じないことから、影響を与えうる。5つのSpAドメインの各々が類似の結合特性を及ぼす。プロテインAに異なる部位で非競合的に結合するFcおよびVH3リガンドの有る状態でも無い状態でも、ドメインDの溶液結晶構造が解析されている。IgG結合に関与することが知られている残基における変異も、vWFAIおよびTNFR1の結合に必要とされるが、VH3相互作用に重要な残基は他の結合活性に影響を与えないように思われる。SpAは、表面にVH3ファミリー関連のIgM、すなわち、VH3型B細胞受容体を発現するB細胞のサブセットを特異的に標的とする。SpAとの相互作用によって、これらのB細胞は増殖し、アポトーシスに傾倒し、先天性様Bリンパ球の選択的かつ持続的欠失を引き起こす。プロテインA表面提示および機能の分子基盤プロテインAは、細菌細胞質中で前駆体として合成され、そのYSIRKシグナルペプチドを介して隔壁、すなわち、ブドウ球菌の細胞分裂隔壁の位置で分泌される。C末端LPXTG選別シグナルの切断の後、プロテインAはソルターゼAによって細菌ペプチドグリカン架橋に固定される。プロテインAは最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質である。この分子はほぼ全ての黄色ブドウ球菌株によって発現される。ブドウ球菌は分裂周期1回につきその細胞壁の15~20を代謝する。ネズミヒドロラーゼはペプチドグリカンのグリカン鎖および壁ペプチドを切断し、それにより、付着されたC末端細胞壁二糖類テトラペプチドを有するプロテインAを細胞外培地へ放出する。このように、生理学的デザインによって、プロテインAは細胞壁に固定もされ、細菌表面に提示もされるが、宿主感染の間に周辺組織中に放出もされる。プロテインAは免疫グロブリンを細菌表面に捕捉し、この生化学的活性によって宿主先天性および後天性免疫反応からのブドウ球菌による回避が可能とされる。興味深いことに、プロテインAの領域X、つまりLPXTG選別シグナル細胞壁アンカーにIgG結合ドメインをつなぎ止める繰り返しドメインは、おそらく、ブドウ球菌ゲノムのなかで最も可変的な部分である。3つのヘリックスバンドルから形成され、E、D、A、BおよびCと命名された、プロテインAの5つの免疫グロブリン結合ドメインの各々が類似の構造的および機能的特性を及ぼす。プロテインAに異なる部位で非競合的に結合するFcおよびVH3リガンドの有る状態でも無い状態でも、ドメインDの溶液結晶構造が解析されている。結晶構造複合体において、Fabは、4本のVH領域β鎖から構成される表面を介してドメインDのヘリックスIIおよびヘリックスIIIと相互作用する。ドメインDのヘリックスIIの主軸は鎖の方向に対しておよそ50°であり、ドメインDのヘリックス間部分はC0鎖の最も近位にある。Fab上の相互作用の部位は、Ig軽鎖および重鎖定常領域から離れている。この相互作用には以下のドメインD残基が含まれるヘリックスIIのAsp36、ヘリックスIIとヘリックスIIIとの間のループ中のAsp37およびGln40およびいくつかの他の残基。どちらの相互作用表面も、極性側鎖から主に構成されており、相互作用によってドメインD上の3つの陰性荷電残基および2A2Fab上の2つの陽性荷電残基が沈み込み、二分子間の全体的な静電気引力をもたらす。FabとドメインDとの間で特定された5つの極性相互作用のうち、3つが側鎖間である。塩橋がArgH19とAsp36との間で形成され、二つの水素結合がTyrH59とAsp37との間でおよびAsnH82aとSer33との間で作製される。プロテインAの全5つのIgG結合ドメインにおけるAsp36およびAsp37の保存を理由に、本発明者らはこれらの残基を変異させた。Fab結合に関わるSpAD部位は、Fcγ結合を媒介するドメイン表面から構造的に離れている。FcγとドメインDとの相互作用には主に、ヘリックスI中の残基が関与し、ヘリックスIIの関与はもっと低い。両方の複合体における接触面積の狭い界面のGln32を除いて、Fcγ相互作用を媒介する残基のどれもFab結合には関与しない。これらの異なるIg結合部位の間の空間関係を調べるため、これらの複合体におけるSpAドメインを重ね合わせてFab、SpAドメインDおよびFcγ分子の間の複合体のモデルを構築した。この三成分モデルにおいて、FabおよびFcγはいずれの相互作用の立体障害の証拠なしにヘリックスIIの反対面周囲にサンドイッチを形成する。これらの所見は、SpAドメインが、その小さなサイズにもかかわらず、いかにして両方の活性を同時に示しうるかを例証し、Fabと個々のドメインとの相互作用が非競合的であるという実験的証拠を説明している。SpADとFcγとの間の相互作用のための残基はGln9およびGln10である。対照的に、ドメインD上でのIgGのFc部分の占有によって、vWFA1およびおそらく同様にTNFR1とのその相互作用が遮断される。IgGFc結合に不可欠な残基における変異はまた、vWFA1およびTNFR1の結合に必要であるのに対し、VH3相互作用に極めて重要な残基はIgGFc、vWFA1またはTNFR1の結合活性に影響を与えない。プロテインA免疫グロブリンFab結合活性は、表面にVH3ファミリー関連のIgMを発現するB細胞のサブセットを標的とし、すなわちこれらの分子はVH3型B細胞受容体として機能する。SpAとの相互作用によって、これらのB細胞は素早く増殖し、次いでアポトーシスに傾倒し、先天性様Bリンパ球の選択的かつ持続的欠失を引き起こす。40超の循環血中B細胞がプロテインA相互作用により標的化され、VH3ファミリーが、病原菌に対する防御体液性反応を与える最も大きなファミリーのヒトB細胞受容体に相当する。かくして、プロテインAはブドウ球菌超抗原に対しても同じように機能するが、これは後者のクラスの分子、例えばSEB、TSST1、TSST2がT細胞受容体と複合体を形成して宿主免疫反応を不適切に刺激し、それによってブドウ球菌感染に特有の疾患特徴を誘発するにもかかわらずである。総合して、これらの所見はブドウ球菌感染の樹立でのおよび宿主免疫反応の調節でのプロテインAの寄与を立証するものである。要するに、プロテインAドメインは宿主分子との結合のために二つの異なる界面を提示すると見なすことができ、プロテインAに基づくワクチンのいかなる開発であれ、宿主細胞シグナル伝達、血小板凝集、免疫グロブリンの分画またはB細胞増殖およびアポトーシスの誘導を撹乱しないワクチンの作製を考慮しなければならない。そのようなプロテインA変種はまた、前述のSpA活性を遮断しかつその二重の結合界面の5つの繰り返しドメインを占有する抗体を作製する能力についてワクチンを分析するうえで有用なはずである。この目標について本明細書で初めて明示かつ追跡し、ヒトのために安全なワクチンとして使用できるプロテインA変種の作製のための方法について詳細に記述する。IgGFcγ、vWFAIおよびTNFR1の結合を撹乱するために、グルタミン9および10Uhlenetal1984に記述されているSpAドメインDに由来する付番を変異させ、両方のグルタミンに代えてリジンの置換を作製したが、これらによって第一の結合界面でのリガンドの特質がなくされるという思惑からであった。IgMFabVH3結合を撹乱するために、B細胞受容体との結合に各々が必要なアスパラギン酸36および37を変異させた。D36およびD37をアラニンでともに置換した。Q910KおよびD3637A変異をここで、組み換え分子SpADQ910KD3637A中で組み合わせ、プロテインAの結合特質について試験した。さらにSpADおよびSpADQ910KD3637Aをマウスおよびウサギにおける免疫研究に供し、1特異的抗体の産生2プロテインAおよびその4つの異なるリガンドの間の結合を遮断するSpADAbの能力ならびに、3ブドウ球菌感染に対する防御免疫を生み出すSpADAbの特質について分析した。Bブドウ球菌コアグラーゼコアグラーゼはブドウ球菌によって産生される酵素であり、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。CoaおよびvWhは、タンパク質分解なしでプロトロンビンを活性化する。コアグラーゼプロトロンビン複合体はフィブリノゲンを特異的基質として認識し、フィブリノゲンを直接的にフィブリンへ変換する。活性複合体の結晶構造によって、D1およびD2ドメインのプロトロンビンとの結合ならびにそのIle1Val2N末端のIle16ポケットへの挿入、その結果、立体構造変化を通じた酵素前駆体における機能的な活性部位の誘導が明らかとなった。αトロンビンのエキソサイトI、フィブリノゲン認識部位、およびプロトロンビン上のプロエキソサイトIはCoaのD2によって遮断される。それにもかかわらず、四量体2複合体の結合により、高い親和性で新しい部位にてフィブリノゲンを結合する。このモデルから、コアグラーゼによる凝固性および効率的なフィブリノゲン変換が説明される。フィブリノゲンは、三量体の二量体を形成するように共有結合的に連結されたAα鎖、Bβ鎖およびγ鎖の3つの対によって形成される大きな糖タンパク質であり、ここでAおよびBは、トロンビン切断によって放出されるフィブリノペプチドを指し示す。この伸長分子は3つの別個のドメイン、つまり全6本の鎖のN末端を含む中央の断片EならびにBβ鎖およびγ鎖のC末端によって主に形成される2つの隣接断片Dに折り重なる。これらの球状ドメインは長い三重らせん構造によってつながれる。ヒトフィブリノゲンを自己重合性のフィブリンに変換するコアグラーゼプロトロンビン複合体は、循環血中トロンビン阻害剤によって標的化されない。かくして、ブドウ球菌コアグラーゼは生理学的な血液凝固経路を迂回する。全ての黄色ブドウ球菌株はコアグラーゼおよびvWbpを分泌する。以前の取り組みによって、ブドウ球菌感染の発病に対してのコアグラーゼの重要な寄与が報告されたが、分子遺伝学のツールを用いたもっと最近の研究ではマウスの心内膜炎、皮膚膿瘍および乳腺炎モデルで病毒性の表現型がないことを認めることにより、この考えに異議が唱えられている。十分に病毒性の臨床分離株である黄色ブドウ球菌Newmanの同質遺伝子変種の作製により、coa変異体が実際に、マウスの致死的菌血症および腎膿瘍モデルにおいて病毒性の欠損を呈することが本明細書において記述される。本発明者らの経験では、黄色ブドウ球菌83254は十分に病毒性ではなく、この菌株における変異病変がインビボで病毒性の欠損を明らかにできないかもしれないと推測される。さらに、CoaまたはvWbpに対して作製された抗体は、遺伝子欠失の影響を反映する程度にまで黄色ブドウ球菌Newman感染の発病を撹乱する。CoaおよびvWbpはブドウ球菌膿瘍形成および致死的菌血症に寄与し、サブユニットワクチンにおける防御抗原として機能することもできる。生化学的研究によってCoaおよびvWbpに対する抗体の生物学的価値が立証される。抗原との結合および凝固因子とのその会合の遮断によって、抗体はCoaプロトロンビンおよびvWbpプロトロンビン複合体の形成を阻止する。受動移入研究から、CoaおよびvWbp抗体による、ブドウ球菌性の膿瘍形成および致死的攻撃からの、実験動物の防御が明らかになった。かくして、CoaおよびvWbp中和抗体はブドウ球菌疾患に対する免疫防御を生み出す。以前の研究によって、血中での食作用に耐えるのにコアグラーゼが要求されることが明らかとなり、本発明者らは、レピルジン処理マウス血液にてΔcoa変異体に対して類似の表現型を認めた。vWbpはヒトプロトロンビンに対しマウス対応物よりも高い親和性を示すので、同じことがヒト血液中でのΔvWbp変種にも当てはまりうるのではないかと疑われる。さらに、膿瘍病変部におけるCoaおよびvWbpの発現、ならびにブドウ球菌膿瘍群集周囲の好酸球性の偽被膜または末梢フィブリン壁におけるその顕著な分布から、分泌されたコアグラーゼがこれらの病変部の樹立に寄与することが示唆される。この仮説について試験したところ、実際に、Δcoa変異体は膿瘍の樹立において不完全であった。特異的抗体でCoa機能を遮断する、対応した試験によって同じ効果が生み出された。その結果として、予防ワクチンの開発のために標的化されうるブドウ球菌膿瘍の樹立においてはフィブリンの凝固が極めて重要な事象であるものと提案される。CoaもvWbpもともに、ヒトプロトロンビンに対するその重複機能から、ワクチン開発のための優れた候補であるものと考えられる。C他のブドウ球菌抗原過去数十年の間にわたる研究から、重要な病毒性因子として黄色ブドウ球菌外毒素、表面タンパク質および調節分子が特定された。これらの遺伝子の調節に関して相当な進歩が達成された。例えば、ブドウ球菌は、同族受容体に閾値濃度で結合し、それによってリン酸リレイ反応の活性化および外毒素遺伝子の多くの転写活性化を行う自己誘導性ペプチドの分泌を介して細菌個体数の調査を行う。ブドウ球菌感染の発病はこれらの病毒性因子に依る。ブドウ球菌ワクチンの開発は、ブドウ球菌浸潤機構の多面性によって妨げられる。弱毒化生微生物は極めて効果的なワクチンであることが十分に確立されている。このようなワクチンによって誘発される免疫反応は多くの場合、複製しない免疫原によってもたらされる免疫反応よりも大きなものであり、長い作用時間のものである。これに対する一つの説明は、弱毒化生菌株が宿主において限定的な感染を樹立し、自然感染の初期段階を模倣するということでありうる。本発明の態様では、変種SpAポリペプチドおよびペプチド、ならびに感染に対しての軽減または免疫で用いるグラム陽性細菌の他の免疫原性細胞外タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含む、組成物および方法に関する。特定の態様において、細菌はブドウ球菌細菌である。細胞外タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドには、標的細菌の分泌タンパク質および細胞表面タンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。ヒト病原菌である黄色ブドウ球菌は細菌外被を越えて、EsxAおよびEsxB、二つのESAT6様タンパク質を分泌する。ブドウ球菌esxAおよびesxBは転写の順に6種の他の遺伝子esxAesaAessAesaBessBessCesaCesxBとクラスタ形成される。頭文字esa、essおよびesxは、コードされるタンパク質が分泌に関して補助的もしくは直接的な役割を果たすか、または細胞外環境中に分泌されるかどうかに依って、それぞれ、ESAT6分泌の補助、系および細胞外を表す。8種の遺伝子のクラスタ全体は本明細書においてEssクラスタといわれる。esxA、esxB、essA、essBおよびessCは全て、EsxAおよびEsxBの合成または分泌に必要とされる。EsxA、EsxBおよびEssCを産生できない変異体は、黄色ブドウ球菌によるネズミ膿瘍の発病の欠損を示し、この特化された分泌系がヒト細菌性病因の全般的戦略となりうることを示唆している。ESX1経路による非WXG100基質の分泌が、EspA、EspB、Rv3483cおよびRv3615cを含むいくつかの抗原について報告されている。代替的なESX5経路も病原性ミコバクテリアにおいてWXG100タンパク質と非WXG100タンパク質の両方を分泌することが示されている。黄色ブドウ球菌Ess経路は、特殊化した運搬成分、補助因子および同族分泌基質を備えた分泌モジュールと見なすことができる。EssA、EssBおよびEssCはEsxAおよびEsxBの分泌に必要とされる。EssA、EssBおよびEssCは膜貫通タンパク質であると予測されるので、これらのタンパク質は分泌装置を形成するものと考えられる。ess遺伝子クラスタにおけるタンパク質のなかには分泌基質を能動的に運搬するものもあるが、運搬を調節するものもある。調節は分泌ポリペプチドに対する転写機構もしくは翻訳後機構、特異的基質の規定部位への選別、または感染中の分泌事象のタイミングによって達成されうるが、これらに限定される必要はない。現時点では、分泌Esxタンパク質の全てが毒素として機能するか、または発病に間接的に寄与するかどうかは不明である。ブドウ球菌は免疫防御からの回避に向けた戦略として表面タンパク質を介した宿主細胞への接着または組織浸潤に依っている。さらに、黄色ブドウ球菌は感染中に表面タンパク質を利用して、宿主から鉄を隔離する。ブドウ球菌発病に関わる表面タンパク質の大部分はC末端局在化シグナルを保有しており、すなわち、それらはソルターゼによって細胞壁外膜に共有結合的に連結される。さらに、表面タンパク質の固定に必要な遺伝子、すなわち、ソルターゼAおよびBを欠くブドウ球菌株は、いくつかの異なる疾患マウスモデルにおいて病毒性の劇的な欠損を示す。このように、表面タンパク質抗原は、その対応遺伝子がブドウ球菌疾患の発現に不可欠であり、本発明のさまざまな態様において利用可能であるため、有効なワクチン標的になる。ソルターゼ酵素スーパーファミリーは、表面タンパク質病毒性因子をペプチドグリカン細胞壁層に固定するのに関わるグラム陽性トランスペプチダーゼである。黄色ブドウ球菌において2つのソルターゼアイソフォームSrtAおよびSrtBが同定されている。これらの酵素は基質タンパク質中のLPXTGモチーフを認識することが示されている。SrtBアイソフォームはヘム鉄獲得および鉄恒常性において重要であるように思えるが、SrtAアイソフォームは細胞壁ペプチドグリカンへの付着因子および他のタンパク質の共有結合的固定を介して細菌が宿主組織に付着する能力を修飾することによりグラム陽性細菌の発病において重要な役割を果たす。ある種の態様において、本明細書において記述されるSpA変種をCoa、Eap、Ebh、Emp、EsaC、EsaB、EsxA、EsxB、Hla、SdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdC、SasF、vWbpおよびまたはvWhタンパク質のような他のブドウ球菌タンパク質と組み合わせて用いることができる。本発明のある種の局面では、SpA変種および他のブドウ球菌抗原、例えばEss経路によって運搬される他のタンパク質、またはソルターゼ基質をコードするポリペプチド、ペプチド、または核酸を含んだタンパク質性組成物に関する方法および組成物を含む。これらのタンパク質は欠失、挿入およびまたは置換によって修飾されてもよい。Esxポリペプチドはブドウ球菌属における細菌由来のEsxタンパク質のアミノ酸配列を含む。Esx配列は黄色ブドウ球菌などの、特定のブドウ球菌種由来であってよく、Newmanなどの、特定の菌株由来であってよい。ある種の態様において、EsxA配列は菌株Mu50由来のSAV0282であり、参照により本明細書に組み入れられるGenbankアクセッション番号Q99WU4を用いてアクセスすることができる。他の態様において、EsxB配列は菌株Mu50由来のSAV0290であり、参照により本明細書に組み入れられるGenbankアクセッション番号Q99WT7を用いてアクセスすることができる。さらなる態様において、Ess経路により運搬される他のポリペプチドを用いることができ、当業者はデータベースおよびインターネットアクセス可能な情報源を用いてその配列を同定することができる。ソルターゼ基質ポリペプチドはブドウ球菌属における細菌由来のSdrC、SdrD、SdrE、IsdA、IsdB、ClfA、ClfB、IsdCまたはSasFタンパク質のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されることはない。ソルターゼ基質ポリペプチド配列は黄色ブドウ球菌などの、特定のブドウ球菌種由来であってよく、Newmanなどの、特定の菌株由来であってよい。ある種の態様において、SdrD配列は菌株N315由来であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP3737731を用いてアクセスすることができる。他の態様において、SdrE配列は菌株N315由来であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP3737741を用いてアクセスすることができる。他の態様において、IsdA配列は菌株Mu50由来のSAV1130であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP3716541を用いてアクセスすることができる。他の態様において、IsdB配列は菌株Mu50由来のSAV1129であり、参照により組み入れられるGenBankアクセッション番号NP3716531を用いてアクセスすることができる。さらなる態様において、Ess経路により運搬されまたはソルターゼによりプロセッシングされる他のポリペプチドを用いることができ、当業者はデータベースおよびインターネットアクセス可能な情報源を用いてその配列を同定することができる。本発明の関連において使用できるさまざまなタンパク質の例は、各々が参照により組み入れられるアクセッション番号NC002951、NC002758、NC002745、NC003923、NC002952、NC002953、NC007793、NC007795を含むが、これらに限定されない細菌ゲノムのデータベース寄託物の分析によって同定することができる。本明細書において用いられる場合タンパク質またはポリペプチドとは、少なくとも10個のアミノ酸残基を含む分子をいう。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドの野生型が利用されるが、しかし、本発明の多くの態様において、免疫反応を生じさせるために修飾されたタンパク質またはポリペプチドが利用される。上記の用語は互換的に用いることができる。修飾タンパク質もしくは修飾ポリペプチドまたは変種とは、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型のタンパク質またはポリペプチドに対して改変されているタンパク質またはポリペプチドをいう。いくつかの態様において、修飾変種タンパク質またはポリペプチドは少なくとも一つの修飾された活性または機能を有する。具体的には、修飾変種タンパク質またはポリペプチドは一つの活性または機能に関して改変されうるが、それでも免疫原性のような、その他の点では野生型の活性または機能を保持しているものと考えられる。ある種の態様において、タンパク質またはポリペプチドのサイズは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500もしくはそれ以上の、およびその中で導き出せる任意の範囲のアミノ分子、または本明細書において記述されるもしくは参照される対応アミノ配列の派生体を含むことができるが、これらに限定されることはない。ポリペプチドを切断によって突然変異させ、それらを、対応するその野生型よりも短くさせてもよいが、それらを特定の機能を有する異種タンパク質配列に融合または結合させることによって変化させることもできると考えられる。本明細書において用いられる場合、アミノ分子とは、当技術分野において公知の任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣体をいう。ある種の態様において、タンパク質性分子の残基は逐次的であり、アミノ分子残基の配列を中断するいかなる非アミノ分子も含まれない。他の態様において、その配列は一つまたは複数の非アミノ分子部分を含むことができる。特定の態様において、タンパク質性分子の残基の配列は一つまたは複数の非アミノ分子部分によって中断されることができる。したがって、タンパク質性組成物という用語は、天然に合成されたタンパク質における20種の共通アミノ酸の少なくとも一つ、または少なくとも一つの修飾もしくは異常アミノ酸を含むアミノ分子配列を包含する。タンパク質性組成物は、標準的な分子生物学的技術を通じたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質性化合物の単離、またはタンパク質性物質の化学的合成を含めて、当業者に公知の任意の技術により作製することができる。さまざまな遺伝子に対するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列がこれまでに開示されており、公認のコンピュータ化されたデータベースにおいて見出される可能性がある。そのようなデータベースの一つが全米バイオテクノロジー情報センターのGenbankおよびGenPeptデータベースである。これらの公知の遺伝子に対するコード領域は、本明細書において開示される技術を用いてまたは当業者に周知であるように、増幅されおよびまたは発現されうる。本発明のSpA、コアグラーゼおよび他のポリペプチドのアミノ酸配列変種は置換変種、挿入変種または欠失変種でありうる。本発明のポリペプチドの変化は野生型と比べて、ポリペプチドの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個またはそれ以上の非連続または連続アミノ酸に影響を与えうる。変種は、本明細書において提供または参照されるいずれかの配列、例えば、SEQIDNO2~8またはSEQIDNO11~30に対して、以下の間の全ての値および範囲を含め、少なくとも50、60、70、80または90同一であるアミノ酸配列を含みうる。変種は2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の置換アミノ酸を含みうる。本明細書において記述される組成物および方法で用いるために、Ess経路によってプロセッシングもしくは分泌されるポリペプチドまたは他の表面タンパク質あるいはいずれかのブドウ球菌種および株由来のソルターゼ基質が企図される。欠失変種は、典型的には、天然または野生型タンパク質の一つまたは複数の残基を欠損している。個々の残基を欠失させてもよく、またはいくつかの隣接アミノ酸を欠失させてもよい。終止コドンをコード化核酸配列に導入して、切断型タンパク質を作製することができる。挿入変異体は、典型的には、ポリペプチドにおける非末端点での物質の付加を伴う。これには一つまたは複数の残基の挿入を含めることができる。融合タンパク質と呼ばれる、末端付加体を作製することもできる。これらの融合タンパク質は、本明細書において記述または参照される一つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドの多量体または鎖状体を含む。置換変種は、典型的には、タンパク質内の一つまたは複数の部位での一つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換を含み、他の機能または特性を失うかまたは失うことなく、ポリペプチドの一つまたは複数の特性を修飾するようにデザインされてもよい。置換は保存的であってもよく、すなわち、一つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸に置換されてもよい。保存的置換は当技術分野において周知であり、これには、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリジンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩への、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタミン酸塩のアスパラギン酸塩への、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リジンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、およびバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。あるいは、置換はポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、非極性または非荷電アミノ酸の代わりに極性または荷電アミノ酸を用いるような、およびその逆のような、一つの残基を化学的に異なる残基に置換することを伴う。表2黄色ブドウ球菌株の例示的な表面タンパク質本発明のタンパク質は組み換えであっても、またはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組み換えまたは組み換えタンパク質を細菌から単離してもよい。そのような変種を含有する細菌を、本発明の組成物および方法のなかで実践できることも考えられる。結果的に、タンパク質は単離されなくてもよい。機能的に同等なコドンという用語は、アルギニンまたはセリンに対する6種のコドンのような、同じアミノ酸をコードするコドンをいうように本明細書において用いられ、同様に、生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンもいう。表3コドン表アミノ酸および核酸配列は、タンパク質の発現が関与している生物学的タンパク質活性の維持を含めて、上記の基準を満たす限り、それぞれ、さらなるN末端もしくはC末端アミノ酸、または5もしくは3配列のような、さらなる残基を含むこともあり、それでも本質的には、本明細書において開示されている配列の一つに記載の通りでありうることも理解されよう。末端配列の付加は核酸配列に特に当てはまり、例えば、コード領域の5または3部分のどちらかに隣接する種々の非コード配列を含むことができる。以下は、変種ポリペプチドまたはペプチドを作製するためにタンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。例えば、ある種のアミノ酸を、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能をかなり失うようにまたはさほど失わないようにタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いることができる。タンパク質の機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能および性質であることから、タンパク質配列の中に、およびその基礎となるDNAコード配列の中にある種のアミノ酸置換を施し、それでも、所望の特性を有するタンパク質を産生させることができる。このように、遺伝子のDNA配列において種々の変化を施すことができるものと本発明者らは企図している。本発明の組成物においては、1mlあたり約0001mg~約10mgの総ポリペプチド、ペプチド、およびまたはタンパク質が存在することが企図される。組成物中のタンパク質の濃度は約、少なくとも約またはせいぜい約0001、0010、0050、01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mgmlまたはそれ以上でありうる。このうち、約、少なくとも約、またはせいぜい約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100がSpA変種またはコアグラーゼであってよく、他の細菌ペプチドおよびまたは抗原のような、他のペプチドまたはポリペプチドと組み合わせて用いられてもよい。本発明は、ブドウ球菌病原菌による感染と関連する疾患または状態の発症に対する予防的治療または治療効果に影響を与えるための変種SpAポリペプチドまたはペプチドの投与を企図する。ある種の局面において、ブドウ球菌感染の処置または予防に有効である免疫原性組成物の作製においてブドウ球菌抗原の組み合わせが用いられる。ブドウ球菌感染はいくつかの異なる段階を経て進行する。例えば、ブドウ球菌の生活環には、片利共生定着、隣接する組織もしくは血流に接近することによる感染の開始、およびまたは血液中での嫌気的増殖が含まれる。黄色ブドウ球菌病原性決定因子と宿主防御機構との間の相互作用は、心内膜炎、転移性膿瘍形成および敗血症候群のような合併症を誘発しうる。細菌表面上の異なる分子が感染サイクルの異なる段階に関与する。ある種の抗原の組み合わせによって、多段のブドウ球菌感染を防御する免疫反応が引き起こされる可能性がある。免疫反応の有効性は動物モデルアッセイ法においておよびまたはオプソニン作用アッセイ法を用いて測定することができる。Dポリペプチドおよびポリペプチド産生本発明は、本発明のさまざまな態様で用いるためのポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片について記述する。例えば、特定のポリペプチドを、免疫反応を誘発するかアッセイし、または免疫反応を誘発するために用いる。特定の態様において、本発明のタンパク質の全部または一部を、従来の技術にしたがって溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。各種の自動合成機が市販されており、それらを公知のプロトコルにしたがって用いることができる。例えば、StewartandYoungTarnetalMerrifieldおよびBaranyandMerrifieldを参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。あるいは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、これを発現に適した条件の下で培養する組み換えDNA技術を利用することもできる。本発明の一つの態様では、ポリペプチドまたはペプチドの産生およびまたは提示のための、微生物を含む、細胞への遺伝子移入の使用を含む。関心対象のポリペプチドまたはペプチドに対する遺伝子を適切な宿主細胞に移入し、引き続いて適切な条件下での細胞の培養を行うことができる。組み換え発現ベクターの作製、およびそのベクターに含まれる要素は、当技術分野において周知であり、本明細書において手短に論じられている。あるいは、産生されるタンパク質は、単離かつ精製される細胞によって通常合成される内因性タンパク質であってもよい。本発明の別の態様では、免疫原産物、より具体的には、免疫原性活性を有するタンパク質を発現するウイルスベクターにより形質移入された、自己Bリンパ球細胞株を用いる。哺乳類宿主細胞株の他の例としては、VeroおよびHeLa細胞、CEM、721221、H9、Jurkat、Rajiなどの、他のBおよびT細胞株、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞株、W138、BHK、COS7、293、HepG2、3T3、RINおよびMDCK細胞が挙げられるが、これらに限定されることはない。さらに、挿入された配列の発現を調節する、または所望とされる様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のそのような修飾およびプロセッシングは、タンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の的確な修飾およびプロセッシングを確実とするために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。tk、hgprtまたはaprt細胞での、それぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない、いくつかの選択系を用いることができる。同様に、選択の基礎として抗代謝物耐性トリメトプリムおよびメトトレキサートに対する耐性を付与するdhfrミコフェノール酸に対する耐性を付与するgptアミノグリコシドG418に対する耐性を付与するneoならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroを用いることもできる。動物細胞はインビトロにおいて二つの様式で、つまり培養の大半を通じて浮遊状態で増殖する非足場依存性細胞として、または増殖のためには固体基材への付着を要する足場依存性細胞として増殖させることができるすなわち、単層型の細胞増殖。連続樹立細胞株由来の非足場依存性培養または浮遊培養は、細胞および細胞産物の、最も広く使われている大規模産生手段である。しかしながら、浮遊培養細胞には、腫瘍形成能および接着細胞よりも低いタンパク質産生のような制限がある。タンパク質を本明細書において具体的に述べる場合、それは、好ましくは、天然もしくは組み換えタンパク質、または場合により任意のシグナル配列が除去されたタンパク質への言及である。タンパク質は、ブドウ球菌株から直接単離されてもよく、または組み換えDNA技術によって産生されてもよい。タンパク質の免疫原性断片を本発明の免疫原性組成物に含めてもよい。これらは、タンパク質のアミノ酸配列から連続的に取り出される、少なくとも10アミノ酸、20アミノ酸、30アミノ酸、40アミノ酸、50アミノ酸、または100アミノ酸を、その間の全ての値および範囲を含めて、含む断片である。さらに、そのような免疫原性断片は、ブドウ球菌タンパク質に対して作製された抗体と免疫学的に反応性であり、またはブドウ球菌による哺乳類宿主の感染によって作製された抗体と免疫学的に反応性である。免疫原性断片はまた、有効量で投与される場合に、ブドウ球菌感染に対する防御的または治療的免疫反応を誘発する断片も含み、ある種の局面において、それは黄色ブドウ球菌およびまたは表皮ブドウ球菌感染を防ぐ。そのような免疫原性断片は、例えば、N末端リーダー配列、ならびにあるいは膜貫通ドメインおよびまたはC末端アンカードメインを欠損するタンパク質を含むことができる。好ましい局面において、本発明による免疫原性断片は、本明細書において記述または参照されるポリペプチドの配列選択セグメントに対し、少なくとも80の同一性、少なくとも85の同一性、少なくとも90の同一性、少なくとも95の同一性、または少なくとも97~99の同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的に全てを含む。本発明の免疫原性組成物の中に同様に含まれるのは、一つもしくは複数のブドウ球菌タンパク質、またはブドウ球菌タンパク質の免疫原性断片から構成される融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組み換えによって作製することができ、少なくとも1、2、3、4、5または6種のブドウ球菌タンパク質またはセグメントの一部分を含むことができる。あるいは、融合タンパク質は、少なくとも1、2、3、4または5種のブドウ球菌タンパク質の複数部分を含むこともできる。これらは、異なるブドウ球菌タンパク質およびまたは同一のタンパク質もしくはタンパク質断片の複数のもの、あるいは同一タンパク質における免疫原性断片を組み合わせることができる。あるいは、本発明はまた、T細胞エピトープまたは精製タグの供与体のような異種配列、例えばβガラクトシダーゼ、グルタチオンSトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、エピトープタグ、例えばFLAG、mycタグ、ポリヒスチジン、またはウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素、または細菌タンパク質、例えば破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドもしくはCRM197との融合タンパク質としての、ブドウ球菌タンパク質またはその免疫原性断片の個々の融合タンパク質も含む。II核酸ある種の態様において、本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドに関する。SpA、コアグラーゼおよび他の細菌タンパク質に対する核酸配列が含まれ、これらの全てが参照により組み入れられ、これらを用いてペプチドまたはポリペプチドを調製することができる。本出願において用いられる場合、ポリヌクレオチドという用語は、組み換えであるか、全ゲノム核酸がない状態で単離されているかのどちらかの核酸分子をいう。ポリヌクレオチドという用語のなかに含まれるのは、オリゴヌクレオチド、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む、組み換えベクターである。ポリヌクレオチドは、ある種の局面において、天然の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されている、調節配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよく、RNA、DNA、その類似体、またはその組み合わせであってよい。ポリヌクレオチドのなかにさらなるコーディングまたは非コーディング配列が存在してもよいが、存在しなくてもよい。この点において、遺伝子、ポリヌクレオチドまたは核酸という用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸をいうように用いられる。当業者に理解されるように、この用語はゲノム配列、発現カセット、cDNA配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するまたは発現するように適合されうる、遺伝子操作されたもっと小さな核酸セグメントを包含する。ポリペプチドの全部または一部をコードする核酸は、本明細書において記述または参照される一つまたは複数のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、以下の間の全ての値および範囲を含めて、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対の連続核酸配列を含むことができる。また、特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するが、それでも、同じまたは実質的に類似のタンパク質をコードする、変種を含んだ核酸によってコードされうることも考えられる。特定の態様において、本発明は、変種SpAまたはコアグラーゼをコードする核酸配列を組み入れた、単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。組み換えという用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとともに用いることができ、これは一般に、インビトロにおいて産生およびもしくは操作されているポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはこのような分子の複製産物であるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドをいう。他の態様において、本発明は、対象において免疫反応を生じさせる変種SpAまたはコアグラーゼポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列を組み入れた、単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。さまざまな態様において、本発明の核酸は遺伝子ワクチンに用いることができる。本発明において用いられる核酸セグメントは、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどのような、他の核酸配列と組み合わせることができ、したがってその全長はかなり変化することがある。それゆえ、ほぼすべての長さの核酸断片を利用することができ、その全長は精製の容易さおよび意図した組み換え核酸プロトコルでの用途によって制限されることが好ましいものと考えられる。場合によっては、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするための、または標的化もしくは効力のような治療的有用性を可能にするための、さらなる異種コード配列を有するポリペプチド配列をコードすることができる。先に論じられるように、タグまたは他の異種ポリペプチドを、修飾されたポリペプチドをコードする配列に付加することができ、ここで異種とは、修飾されたポリペプチドと同じものではないポリペプチドをいう。ある種の他の態様において、本発明は、配列内にSEQIDNO1もしくはSEQIDNO3由来の隣接核酸配列またはコアグラーゼもしくは他の分泌病毒性因子およびもしくは表面タンパク質、例えば、Ess経路により運搬され、ソルターゼによりプロセッシングされるタンパク質、もしくは参照により本明細書に組み入れられるタンパク質などをコードするその他任意の核酸配列を含んだ単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。ある種の態様において、本発明は、本明細書において開示される配列に対して実質的同一性を有するポリヌクレオチド変種、つまり本明細書において記述される方法を用い本発明のポリヌクレオチド配列と比べて、少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98もしくは99またはそれ以上の配列同一性を、その間の全ての値および範囲を含めて、含むものを提供する。本発明はまた、上述した全てのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの使用を企図する。Aベクター本発明のポリペプチドは、ベクター中に含まれる核酸分子によってコードされてもよい。ベクターという用語は、異種核酸配列を、複製され発現されうる細胞へ導入するために、挿入できる担体核酸分子をいうように用いられる。核酸配列は異種であってよく、これは文脈中で、ベクターが導入されている細胞にとって、または核酸配列が組み入れられる核酸にとって核酸配列が異質であることを意味し、これには、細胞または核酸中の配列と同種であるが、しかし通常は見られない、宿主細胞または核酸内の位置にある配列が含まれる。ベクターにはDNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス、ならびに人工染色体が含まれる。当業者は、標準的な組み換え技術を通じてベクターを構築するのに必要なものを十分に持っているであろう。変種SpAポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは一つまたは複数の他の細菌ペプチド、タグまたは免疫原性増強ペプチドのような他のポリペプチド配列をコードしてもよい。そのような融合タンパク質をコードする有用なベクターには、pINベクター、一続きのヒスチジンをコードするベクター、ならびに後の精製および分離または切断に向けたグルタチオンSトランスフェラーゼ可溶性融合タンパク質の作製で用いるpGEXベクターが含まれる。発現ベクターという用語は、転写されうる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターをいう。場合によっては、次にRNA分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳にとって必要な核酸配列をいう種々の制御配列を含みうる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たす、かつ本明細書において記述する核酸配列を含んでもよい。1プロモーターおよびエンハンサープロモーターは制御配列である。プロモーターは、典型的には、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である。これには、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような、調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝要素を含めてもよい。機能的に配置された、機能的に連結された、制御下および転写制御下という語句は、プロモーターが核酸配列との関連で、その配列の転写開始および発現を制御するのに正しい機能的位置およびまたは方向にあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関わるシス作用調節配列をいうエンハンサーとともに用いられても用いられなくてもよい。当然、発現用に選択された細胞種または生物においてDNAセグメントの発現を効率的に指令するプロモーターおよびまたはエンハンサーを利用することが重要でありうる。分子生物学の当業者は、タンパク質を発現させるためにプロモーター、エンハンサー、および細胞種の組み合わせを用いることを一般的に承知している。利用されるプロモーターは構成的、組織特異的または誘導的であってよく、ある種の態様において、組み換えタンパク質またはペプチドの大規模産生などの特定条件の下で、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指令しうる。遺伝子の発現を調節するために本発明との関連で種々の要素プロモーターが用いられてもよい。特定の刺激に反応して活性化されうる核酸配列の領域である、そのような誘導性要素の例としては、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、T細胞受容体、HLADQαおよびまたはDQβ、βインターフェロン、インターロイキン2、インターロイキン2受容体、MHCクラスII5、MHCクラスIIHLADRα、βアクチン、筋クレアチニンキナーゼ、プレアルブミン、エラスターゼI、メタロチオネイン、コラゲナーゼ、アルブミンαフェトプロテイン、γグロビン、βグロビン、cfos、cHaRas、インスリン、神経細胞接着分子α1アンチトリペインH2BヒストンマウスおよびまたはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA、トロポニンI、血小板由来増殖因子、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、乳頭腫ウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルスIE、テナガザル白血病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されることはない。誘導性要素にはMTIIホルボルエステル重金属MMTVグルココルチコイドβインターフェロンポリxポリアデノウイルス5E2E1AコラゲナーゼホルボルエステルストロメリシンホルボルエステルSV40ホルボルエステルネズミMX遺伝子インターフェロン、ニューカッスル病ウイルスGRP78遺伝子A23187α2マクログロブリンIL6ビメンチン血清MHCクラスI遺伝子H2κbインターフェロンHSP70E1ASV40ラージT抗原プロリフェリンホルボルエステルTPA腫瘍壊死因子PMAおよび甲状腺刺激ホルモンα遺伝子甲状腺ホルモンが含まれるが、これらに限定されることはない。本発明のペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を制御するために利用される特定のプロモーターは、標的細胞、好ましくは細菌細胞においてポリヌクレオチドを発現できる限り、決定的に重要であるものとは考えられない。ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチドコード領域を、ヒト細胞において発現されうるプロモーターの近傍かつ制御下に位置付けることが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターは細菌プロモーター、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含みうる。タンパク質の発現のため対象にベクターが投与される態様において、ベクターとともに用いるのに望ましいプロモーターは、サイトカインによって下方制御されないもの、またはたとえ下方制御されても、免疫反応を誘発するのに有効な量の変種SpAを産生するのに十分に強力なものであることが企図される。これらの非限定的な例はCMVIEおよびRSVLTRである。とりわけ、発現が樹状細胞またはマクロファージのような、抗原の発現が望ましい細胞におけるなら、組織特異的プロモーターを用いることができる。哺乳類MHCIおよびMHCIIプロモーターは、そのような組織特異的プロモーターの例である。2開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位特異的開始シグナルもコード配列の効率的な翻訳に必要とされうる。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要がありうる。当業者は容易にこれを決定して、必要なシグナルを提供することができるであろう。本発明のある種の態様では、内部リボソーム進入部位要素を用いて、多重遺伝子の、または多シストロン性の伝達暗号を作製する。IRES要素は、5メチル化Cap依存的翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる。IRES要素は異種の読み取り枠に連結させることができる。IRESによって各々が隔てられた多数の読み取り枠をともに転写し、多シストロン性の伝達暗号を作製することができる。単一のプロモーターエンハンサーを用いて多数の遺伝子を効率的に発現させ、単一の伝達暗号を転写させることができる。3選択可能およびスクリーニング可能なマーカー本発明のある種の態様において、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターの中にスクリーニング可能または選択可能なマーカーをコードすることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。転写され翻訳される場合、マーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含んだ細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択可能なマーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が可能になるものであるのに対し、陰性選択可能なマーカーは、マーカーが存在することでその選択が妨害されるものである。陽性選択可能なマーカーの例は、薬物耐性マーカーである。B宿主細胞本明細書において用いられる場合、細胞、細胞株および細胞培養物という用語は互換的に用いることができる。これらの用語の全てが、任意のおよび全ての次世代の、その子孫も含む。故意または偶然の変異により全ての子孫が同一ではないことがあると理解されよう。異種核酸配列を発現するという文脈において、宿主細胞とは、原核細胞または真核細胞をいい、これには、ベクターを複製できるまたはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現できる、任意の形質転換可能な生物が含まれる。宿主細胞はベクターまたはウイルスのレシピエントとして、使用されることができ、使用されている。宿主細胞は形質移入または形質転換されてもよく、それらは組み換えタンパク質をコードする配列などの、外因性の核酸が宿主細胞に移入または導入される過程をいう。形質転換細胞には、初代被験細胞およびその子孫が含まれる。ベクターの複製または核酸配列の一部もしくは全部の発現のための細菌、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含め、宿主細胞は原核生物または真核生物に由来することができる。多数の細胞株および培養物が宿主細胞用として利用可能であり、それらは、生きている培養物および遺伝物質のための保管庫としての機能を果たす機構であるアメリカンタイプカルチャーコレクションを通じて入手することができる。C発現系先に論じた組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。原核生物およびまたは真核生物に基づく系を本発明で用いるために利用して、核酸配列、またはその同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを産生することができる。そのような多くの系が市販されており、広く利用可能である。昆虫細胞バキュロウイルス系は、ともに参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5871986号、同第4879236号に記述されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現をもたらすことができ、例えば、INVITROGENからMAXBAC20の名称で、およびCLONTECHからBACPACKBACULOVIRUSEXPRESSIONSYSTEMの名称で購入することができる。本発明の開示の発現系に加え、発現系の他の例としては、合成エクダイソン誘導性受容体またはそのpET発現系、つまり大腸菌発現系を伴う、STRATAGENEのCOMPLETECONTROLInducibleMammalianExpressionSystemが挙げられる。誘導性発現系の別例はINVITROGENから入手可能で、TREX系、つまり全長CMVプロモーターを用いた誘導性の哺乳類発現系を有するものである。INVITROGENは、メチロトローフ酵母ピチアメタノリカにおける組み換えタンパク質の高レベル産生のためにデザインされた、PichiamethanolicaExpressionSystemと呼ばれる酵母発現系も提供している。当業者なら、発現構築体のようなベクターを発現させる方法、核酸配列またはその同源のポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドを産生する方法を承知しているであろう。III多糖類本発明の免疫原性組成物は、PIAの一つもしくは複数を含む莢膜多糖類、ならびにまたは黄色ブドウ球菌V型およびもしくはVIII型莢膜多糖類、ならびにまたは表皮ブドウ球菌I型およびもしくはII型およびもしくはIII型莢膜多糖類をさらに含むことができる。APIA現在では、PSA、PIAおよびSAAとして同定されたブドウ球菌表面多糖類の各種形態は同じ化学的実体、つまりPNAGであることが明らかである。それゆえ、PIAまたはPNAGという用語は、これらの全ての多糖類またはそれらに由来するオリゴ糖を包含する。PIAは多糖類細胞間付着因子であり、NアセチルおよびOスクシニル構成要素で置換されたβ結合グルコサミンの重合体から構成される。この多糖類は黄色ブドウ球菌にも表皮ブドウ球菌にもともに存在し、どちらの供給源からも単離することができる。例えば、PNAGは黄色ブドウ球菌株MN8mから単離することができる。表皮ブドウ球菌から単離されるPIAは、生物膜の複合的構成要素である。それは細胞間接着の媒介に関与しており、おそらく、成長中のコロニーを宿主の免疫反応から守る働きもする。ポリNスクシニルβグルコサミンとして既知の多糖類は、最近になって、Nスクシニル化の同定が間違いであったため、予想された構造を有するものではないことが示された。それゆえ、正式にはPNSGとして公知の、かつ現在では、PNAGであることが分かっている多糖類もPIAという用語に包含される。PIAは、400kDaを超えるものから、75~400kDaまで、10~75kDaまで、最大で30までの結合グルコサミンの反復単位から構成されるオリゴ糖まで、さまざまなサイズのものでありうる。任意のサイズのPIA多糖類またはオリゴ糖を本発明の免疫原性組成物に用いることができるが、一つの局面において多糖類は40kDa超である。サイジングは、当技術分野において公知の任意の方法により、例えばマイクロ流動化、超音波照射または化学的切断により行うことができる。ある種の局面において、PIAは少なくともまたはせいぜい40~400kDa、40~300kDa、50~350kDa、60~300kDa、50~250kDaおよび60~200kDaである。PIAは酢酸塩によるアミノ基上の置換によって異なるアセチル化度を持ちうる。インビトロで産生されるPIAは、アミノ基上でほぼ完全に置換されている。あるいは、60、50、40、30、20、10未満のアセチル化を有する脱アセチル化PIAを用いることができる。PNAGの非アセチル化エピトープはオプソニンによるグラム陽性細菌、好ましくは黄色ブドウ球菌およびまたは表皮ブドウ球菌の殺傷の媒介で効率的であるため、脱アセチル化PIAの使用が好ましい。ある種の局面において、PIAは、40kDa~300kDaのサイズを有し、60、50、40、30または20未満のアミノ基がアセチル化されているように脱アセチル化される。脱アセチル化PNAGという用語は、60、50、40、30、20または10未満のアミノ酸基がアセチル化されているPNAG多糖類またはオリゴ糖をいう。ある種の局面において、天然の多糖類を化学的に処理することにより、PNAGを脱アセチル化してdPNAGを形成する。例えば、天然PNAGを、pHが10超まで上昇するように塩基性溶液で処理する。例えば、PNAGを01~5M、02~4M、03~3M、05~2M、075~15Mまたは1MのNaOH、KOHまたはNH4OHで処理する。処理は、20~100°C、25~80°C、30~60°Cもしくは30~50°Cまたは35~45°Cの温度で少なくとも10~30分間、または1、2、3、4、5、10、15もしくは20時間である。dPNAGはWO0443405に記述されているように調製することができる。多糖類は担体タンパク質に結合されてもまたは結合されなくてもよい。B黄色ブドウ球菌由来の5型および8型多糖類ヒトでの感染を引き起こす黄色ブドウ球菌の大部分の菌株が5型または8型多糖類のいずれかを含む。およそ60のヒト菌株が8型であり、およそ30が5型である。5型および8型莢膜多糖類抗原の構造はMoreauらおよびFournierらに記述されている。どちらもその反復単位の中にFucNAcpと、スルフヒドリル基を導入するのに使用できるManNAcAとを有する。それらの構造は5型→4βDManNAcAαLFucNAcβDFucNAcβDManNAcAαLFucNAcβDFucNAcでは、NMR分光法によってそれらの構造は、5型→4βDManNAcAαLFucNAcβDFucNAcβDManNAcAαLFucNAcαDFucNAc、キーホールリンペットヘモシアニン、ならびにツベルクリン精製タンパク質誘導体、緑膿菌エキソプロテインA、インフルエンザ菌由来のプロテインD、肺炎球菌溶血素またはこれらのうちのいずれかの断片が挙げられる。用いるのに適した断片には、Tヘルパーエピトープを包含する断片が含まれる。特に、インフルエンザ菌由来のプロテインD断片は、そのタンパク質のN末端側の3分の1を含むことが好ましいであろう。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合タンパク質であり、潜在的な免疫原である。さらに、ブドウ球菌タンパク質を本発明の多糖類結合体における担体タンパク質として用いることができる。ブドウ球菌ワクチンに関して用いるのに特に有利であるものと考えられる担体タンパク質は、ブドウ球菌αトキソイドである。結合の過程で毒性が低減するので、この天然形態を多糖類と結合させてもよい。残留毒性がより低いことから、His35LeuまたはHis35Arg変種のような、遺伝学的に解毒されたα毒素が担体として用いられることが好ましい。あるいは、架橋試薬ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドでの処理によって、α毒素を化学的に解毒する。遺伝学的に解毒されたα毒素を、好ましくは架橋試薬、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドでの処理により任意で化学的に解毒して、毒性をさらに低減してもよい。多糖類は、いずれかの公知の方法によって担体タンパク質に連結させることができる。CDAP結合化学反応が行われることが好ましい。CDAPでは、シアニル化試薬1シアノジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレートが多糖類タンパク質結合体の合成に用いられることが好ましい。シアニル化反応は、アルカリ感受性多糖類の加水分解を回避するような比較的穏やかな条件の下で行うことができる。この合成により、担体タンパク質への直接的なカップリングが可能である。結合には担体タンパク質と多糖類との間の直接的な連結の作製が含まれることが好ましい。任意で、スペーサーなどが担体タンパク質と多糖類との間に導入されてもよい。IV免疫反応およびアッセイ法上記のように、本発明は、対象において変種SpAまたはコアグラーゼペプチドに対する免疫反応を惹起または誘導することに関係する。一つの態様において、免疫反応は、感染または関連する疾患、とりわけブドウ球菌に関連する疾患を有する、有することが疑われる、または発症するリスクがある対象を防御または処置することができる。本発明の免疫原性組成物の使い方の一つは、病院または感染のリスク増大を伴う他の環境において医療手当を受ける前に対象を予防接種することによって院内感染を予防することである。A免疫アッセイ法本発明は、本発明の組成物により免疫反応が誘導または惹起されるかどうか、およびどの程度まで誘導または惹起されるかを評価するための血清学的アッセイ法の実施を含む。実施されうる多くのタイプの免疫アッセイ法が存在する。本発明により包含される免疫アッセイ法には、米国特許第4367110号に記述されているものおよび米国特許第4452901号に記述されているものが含まれるが、これらに限定されることはない。他のアッセイ法には、インビトロおよびインビボの両方での、免疫細胞化学および標識リガンドの免疫沈降が含まれる。免疫アッセイ法は一般に、結合アッセイ法である。ある種の好ましい免疫アッセイ法は、当技術分野において公知のさまざまなタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ法および放射免疫アッセイ法である。組織切片を用いる免疫組織化学的検出もまた特に有用である。一例を挙げれば、抗体または抗原をポリスチレンマイクロタイタープレート中のウェル、ディップスティック、またはカラム支持体などの、選択した表面に固定化する。次いで、臨床サンプルなどの、所望の抗原または抗体を含有すると疑われる試験組成物をウェルに加える。結合および非特異的に結合した免疫複合体を除去するための洗浄の後、結合した抗原または抗体を検出することができる。検出は一般に、検出可能な標識に連結されている、所望の抗原または抗体に特異的な、別の抗体の添加によって達成される。このタイプのELISAはサンドイッチELISAとして公知である。検出は、所望の抗原に特異的な二次抗体の添加の後、該二次抗体に対して結合親和性を有する三次抗体であって、検出可能な標識に連結されている該三次抗体の添加によって達成することもできる。試験サンプルが既知量の標識抗原または抗体と結合で競合する、競合ELISAも実行の可能性がある。未知サンプル中の反応性種の量は、コーティングされたウェルとのインキュベーションの前または間に、該サンプルと既知の標識種とを混合することによって測定される。サンプル中の反応性種の存在は、ウェルへの結合に利用可能な標識された種の量を低下させるように作用し、したがって最終的なシグナルを減少させる。利用される形式に関係なく、ELISAはコーティング、インキュベーティングまたは結合、非特異的に結合された種を除去するための洗浄、および結合された免疫複合体の検出などの、ある種の特徴を共通して有する。抗原または抗体はプレート、ビーズ、ディップスティック、膜またはカラム基材の形態でのような、固体支持体に連結されてもよく、分析されるサンプルが、固定化された抗原または抗体に適用される。プレートを抗原または抗体のいずれかでコーティングする際に、一般的に、プレートのウェルは、一晩または特定の期間の間、抗原または抗体の溶液とともにインキュベートされる。次にプレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着された物質を除去する。次いで、ウェルに残存している任意の利用可能表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質でコーティングする。これらには、ウシ血清アルブミン、カゼインおよび粉乳の溶液が含まれる。コーティングは、固定性表面上での非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、したがって、該表面上への抗血清の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを低減する。B細菌感染の診断上記の感染を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチドおよびまたはペプチド、ならびにこれらのポリペプチド、タンパク質およびまたはペプチドに結合する抗体の使用に加え、本発明は、患者内であれ医療機器上であれ、同様に感染しうる感染症を診断するためのブドウ球菌の存在の検出を含む、種々の様式でのこれらのポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびまたは抗体の使用を企図する。本発明によれば、感染の存在を検出する好ましい方法は、個体から、例えば、個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚から採取されたサンプルのような、一種または複数種のブドウ球菌種または菌株に感染していることが疑われるサンプルを得る段階を含む。サンプルの単離に続き、本発明のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびまたは抗体を利用する診断アッセイ法を行ってブドウ球菌の存在を検出することができ、サンプル中でのそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技術は当業者に周知であり、放射免疫アッセイ法、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイ法などの方法を含む。概して、本発明によれば、ブドウ球菌に感染していることが疑われるサンプルを本発明によるポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗体またはモノクローナル抗体に加え、サンプル中の、ポリペプチド、タンパク質およびもしくはペプチドに結合する抗体、または抗体に結合するポリペプチド、タンパク質およびもしくはペプチドによってブドウ球菌が示される、感染を診断する方法が企図される。したがって、本発明による抗体は、ブドウ球菌の感染の予防のために、進行中の感染の処置のために、または研究ツール用として用いることができる。本明細書において用いられる抗体という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、サル化抗体およびヒト化抗体または霊長類化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現ライブラリの産物を含め、抗体の結合特異性を維持している断片のような、Fab断片を含む。したがって、本発明は、抗体の可変重鎖および軽鎖のような一本鎖の使用を企図する。これらのタイプのいずれの抗体または抗体断片の作製も当業者に周知である。細菌タンパク質に対する抗体の作製の具体例は、参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20030153022号のなかで見出すことができる。上記のポリペプチド、タンパク質、ペプチドおよびまたは抗体のいずれも、ブドウ球菌の同定および定量のために、検出可能な標識で直接的に標識することができる。免疫アッセイ法で用いるための標識は一般に、当業者に公知であり、コロイド金またはラテックスビーズのような着色粒子を含めて、酵素、放射性同位体、ならびに蛍光物質、発光物質および発色物質を含む。適当な免疫アッセイ法は酵素結合免疫吸着アッセイ法を含む。C防御免疫本発明のいくつかの態様において、タンパク質性組成物は対象に防御免疫を付与する。防御免疫とは、免疫反応が起こる作用因子を伴った特定の疾患または状態を対象が発症することを防ぐ特異的な免疫反応を開始する身体の能力をいう。免疫原性上有効な量は、対象に防御免疫を付与することができる。本明細書においておよび付随する特許請求の範囲において用いられる場合、ポリペプチドまたはペプチドという用語は、ペプチド結合を介して共有結合的に連結された一続きのアミノ酸をいう。異なるポリペプチドは、本発明による異なる機能性を有する。一つの局面によれば、ポリペプチドは、レシピエントにおいて能動免疫反応を誘導するようにデザインされた免疫原に由来するが、本発明の別の局面によれば、ポリペプチドは、例えば動物での、能動免疫反応の誘発後に生じる、かつレシピエントにおいて受動免疫反応を誘導する働きのできる、抗体に由来する。しかしながら、どちらの場合も、ポリペプチドは、任意の可能なコドン使用頻度にしたがってポリヌクレオチドによりコードされる。本明細書において用いられる場合、免疫反応またはその等価語免疫学的反応という語句は、レシピエント患者での本発明のタンパク質、ペプチド、炭水化物またはポリペプチドに向けられた体液性反応、細胞性反応、または体液性反応と細胞性反応の両方の発生をいう。そのような反応は、免疫原の投与によって誘導された能動反応または抗体、抗体を含有する材料もしくは初回抗原刺激を受けたT細胞の投与によって誘導された受動反応でありうる。細胞性免疫反応はクラスIまたはクラスIIMHC分子と結び付いたポリペプチドエピトープの提示により誘発されて、抗原特異的なCD4Tヘルパー細胞およびまたはCD8細胞傷害性T細胞を活性化する。反応には単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、好酸球または先天性免疫の他の成分も伴われうる。本明細書において用いられる場合、能動免疫とは、抗原の投与によって対象に付与される任意の免疫をいう。本明細書において用いられる場合、受動免疫とは、対象への抗原の投与なしで対象に付与される任意の免疫をいう。受動免疫はそれゆえ、免疫反応の細胞メディエータまたはタンパク質メディエータを含めた活性化免疫エフェクタの投与を含むが、これらに限定されることはない。モノクローナルまたはポリクローナル抗体組成物は、抗体によって認識される抗原を持った生物による感染の予防または処置のための受動免疫付与に用いることができる。抗体組成物は、さまざまな生物と関連しうる種々の抗原に結合する抗体を含むことができる。抗体成分はポリクローナル抗血清であることができる。ある種の局面において、抗体は動物または抗原を接種された第二の対象からアフィニティー精製される。あるいは、ブドウ球菌を含むがこれに限定されない、グラム陽性菌、グラム陰性菌などの、同一の、関連の、または別の微生物または生物に存在する抗原に対するモノクローナルおよびまたはポリクローナル抗体の混合物である、抗体混合物を用いることもできる。受動免疫は、免疫グロブリン、およびまたはドナーもしくは周囲の免疫反応性を有する他の非患者供給源から得られる他の免疫因子を患者に投与することによって、患者または対象に与えることができる。他の局面において、本発明の抗原組成物は、ブドウ球菌または他の生物に対して作製された抗体を含んだ、抗原組成物による攻撃に反応して産生されるグロブリンの供給源もしくはドナーとしての役割を果たす対象に投与することができる。このように処置された対象は、過免疫グロブリンを、従来の血漿分画法により得て、ブドウ球菌感染に対する耐性を与えるためにまたはブドウ球菌感染を処置するために別の対象に投与できる、血漿を提供することができる。本発明による過免疫グロブリンは、免疫不全の個体に、侵襲的処置を受けている個体に、または個体がワクチン接種に反応して自身の抗体を産生できる時間のない個体にとりわけ有用である。受動免疫に関連した例示的な方法および組成物は、米国特許第6936258号、同第6770278号、同第6756361号、同第5548066号、同第5512282号、同第4338298号、および同第4748018号を参照されたく、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書および添付の特許請求の範囲のためにエピトープおよび抗原決定基という用語は、BおよびまたはT細胞が反応するまたは認識する抗原上の部位をいうように互換的に用いられる。B細胞エピトープは、タンパク質の三次元の折り畳みが並置した隣接アミノ酸からも非隣接アミノ酸からも形成されることができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に曝されても保持されるのに対し、三次元の折り畳みによって形成されたエピトープは、通常、変性溶媒を用いた処理によって失われる。エピトープは、通常、固有の空間的構造の中に少なくとも3個、より通常には、少なくとも5個または8~10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法は、例えば、x線結晶学および2次元核磁気共鳴を含む。例えば、EpitopeMappingProtocolsを参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原への別の抗体の結合を遮断する能力を示す、単純な免疫アッセイ法において特定することができる。T細胞はCD8細胞の場合およそ9アミノ酸の、またはCD4細胞の場合およそ13~15アミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、エピトープに反応して、初回抗原刺激を受けたT細胞がする3Hチミジンの取り込みにより、抗原依存的な死滅化により、またはサイトカイン分泌により決定されるように、抗原依存的な増殖を測定するインビトロでのアッセイ法により特定することができる。細胞を介した免疫学的反応の存在は、増殖アッセイ法T細胞またはCTLアッセイ法により決定することができる。免疫原の防御効果または治療効果に対する体液性および細胞性反応の相対的寄与は、免疫した同系動物からIgGおよびT細胞を個別に単離し、第二の対象において防御効果または治療効果を測定することにより、識別することができる。本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、抗体または免疫グロブリンという用語は、互換的に用いられ、動物またはレシピエントの免疫反応の一部として機能する構造的に関連したタンパク質のいくつかのクラスのいずれかをいい、それらのタンパク質にはIgG、IgD、IgE、IgA、IgMおよび関連タンパク質が含まれる。正常な生理学的条件の下で、抗体は、血漿および他の体液中にならびにある種の細胞の膜中に見られ、B細胞と表示されるタイプのリンパ球またはその機能的同等物によって産生される。IgGクラスの抗体は、ジスルフィド結合によってともに連結された四本のポリペプチド鎖で構成されている。インタクトなIgG分子の四本の鎖は、H鎖といわれる二本の同一の重鎖およびL鎖といわれる二本の同一の軽鎖である。ポリクローナル抗体を産生するために、ウサギまたはヤギなどの宿主を、一般的にアジュバントとともにおよび、必要なら、担体にカップリングされた、抗原または抗原断片で免疫する。その後、抗原に対する抗体を宿主の血清から回収する。ポリクローナル抗体を単一特異性にする抗原に対して、ポリクローナル抗体を親和性精製することができる。モノクローナル抗体は、抗原での適切なドナーの過免疫により、または脾細胞の初代培養物もしくは脾臓に由来する細胞株の使用によりエクスビボで産生することができる。本明細書においておよび特許請求の範囲において用いられる場合、抗体の免疫学的部分という語句は、抗体のFab断片、抗体のFv断片、抗体の重鎖、抗体の軽鎖、抗体の重鎖および軽鎖からなるヘテロ二量体、抗体の軽鎖の可変断片、抗体の重鎖の可変断片、ならびにscFvとしても公知の、抗体の一本鎖変種を含む。さらに、この用語は、種の一つがヒトでありうる異なる種に由来する融合遺伝子の発現産物であるキメラ免疫グロブリンも含み、その場合、キメラ免疫グロブリンはヒト化されているといわれる。典型的には、抗体の免疫学的部分は、それを得たインタクトな抗体と、抗原への特異的結合で競合する。任意で、抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に抱合されても、またはその融合タンパク質として発現されてもよい。本明細書および添付の特許請求の範囲のために、そのような全ての融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義のなかに含まれる。本明細書において用いられる場合、免疫原性作用物質または免疫原または抗原という用語は、アジュバントとともに、単独で、またはディスプレイ媒体上に提示された状態で、レシピエントに投与することにより、それ自体に対する免疫学的反応を誘導できる分子を記述するよう互換的に用いられる。D処置方法本発明の方法は、ブドウ球菌病原菌によって引き起こされる疾患または状態の処置を含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、ブドウ球菌に罹患している者またはブドウ球菌に曝されていると疑われる者において免疫反応を誘導するために与えることができる。ブドウ球菌への曝露で陽性と判定された個体、または曝露の可能性に基づいて感染のリスクがあると思われる個体について、それらの方法を利用することができる。具体的には、本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染の処置の方法を包含する。本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、待期的手術の場合に用いるのに特に好都合である。そのような患者は、前もって手術日を承知しており、前もって予防接種することができよう。本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、医療従事者を予防接種するために用いるのに好都合である。いくつかの態様において、処置は、アジュバントもしくは担体または他のブドウ球菌抗原の存在下で投与される。さらに、いくつかの例において、処置は、一つまたは複数の抗生物質などの、細菌感染に対してよく使われる他の薬剤の投与を含む。ワクチン接種のためにペプチドを用いるには、B型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウシ血清アルブミンなどの、免疫原担体タンパク質とのペプチドの抱合が必要になりうるが、必ず必要になるわけではない。この抱合を行うための方法は、当技術分野において周知である。Vワクチンおよび他の薬学的組成物ならびに投与Aワクチン本発明は、ブドウ球菌感染、特に病院獲得型の院内感染を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、能動免疫と受動免疫の両方の態様で用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるのに適当であると提唱されている免疫原性組成物は、SpAドメインD変種または免疫原性コアグラーゼのような、免疫原性SpAポリペプチドから調製することができる。他の態様において、SpAまたはコアグラーゼを他の分泌病毒性タンパク質、表面タンパク質またはその免疫原性断片と組み合わせて用いることができる。ある種の局面において、抗原材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析され、およびまたは所望の媒体へのより容易な処方のために凍結乾燥される。タンパク質ペプチドに基づくワクチンのための他の選択肢は、DNAワクチンとしての、抗原をコードする核酸の導入を伴う。この点で、最近の報告によれば、隣接する10個の最小のCTLエピトープ、またはいくつかの微生物由来のB細胞、細胞傷害性Tリンパ球およびTヘルパーエピトープの組み合わせを発現する組み換えワクシニアウイルスの構築、ならびに防御免疫反応に抗原刺激を与えるためにそのような構築体を用いてマウスを免疫することの成功について記述されている。このように、文献の中には、防御免疫反応の効率的なインビボ抗原刺激のためにペプチド、ペプチドパルス抗原提示細胞、およびペプチドをコードする構築体を利用することの成功に関する十分な証拠が存在している。ワクチンとしての核酸配列の使用は、米国特許第5958895号および同第5620896号に例示されている。活性成分としてポリペプチドまたはペプチド配列を含むワクチンの調製は一般的に、米国特許第4608251号、同第4601903号、同第4599231号、同第4599230号、同第4596792号、および同第4578770号によって例示されるように、当技術分野において十分に理解されており、それらの特許の全てが参照により本明細書に組み入れられる。典型的には、そのようなワクチンは、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして注射用剤として調製される注射前の液体溶液または液体懸濁液に適した固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化されてもよい。活性な免疫原性成分は、薬学的に許容されるかつ活性成分と適合性である、賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような補助物質の量を含んでもよい。特定の態様において、ワクチンは、米国特許第6793923号および同第6733754号に記述されるように、物質の組み合わせを用いて処方され、それらの特許は参照により本明細書に組み入れられる。ワクチンは、通常、非経口的に、注射により、例えば、皮下または筋肉内のいずれかにより投与されうる。他の投与方法に適したさらなる処方物は、坐剤および、場合により、経口処方物を含む。坐剤の場合、従来の結合剤および担体は、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができそのような坐剤は、活性成分を約05~約10、好ましくは約1~約2の範囲内で含有する混合物から形成されることができる。経口処方物は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常利用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり、約10~約95の、好ましくは約25~約70の活性成分を含有する。ポリペプチドおよびポリペプチドをコードするDNA構築体は、中性型または塩型としてワクチンに処方することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩および、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成されるものを含む。典型的には、ワクチンは、投与処方物に適合する様式で、および治療的に有効かつ免疫原性であるような量で投与される。投与される量は、個体の免疫系の抗体合成能および望ましい防御の程度を含め、処置される対象に依る。投与されるのに必要な活性成分の的確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、適切な投与量範囲は、ワクチン接種1回あたり数百マイクログラムの活性成分の次数のものである。初回投与および追加免疫の接種に適したレジメも同様に多様であるが、初回投与後にその後の接種または他の投与を行うことが典型的である。適用の様式は広く異なってもよい。ワクチンの投与のための従来の方法のいずれも適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容される基剤内でのまたは生理学的に許容される分散液中での経口適用、非経口的に、注射により、などが含まれると考えられる。ワクチンの投与量は投与経路に依るであろうし、対象の大きさおよび健康状態によって異なるであろう。場合によっては、ワクチンの複数回の投与、例えば、2、3、4、5、6回またはそれ以上の投与が有ることが望ましいであろう。ワクチン接種は、以下の間の全ての範囲を含めて、1、2、3、4、5、6、7、8~5、6、7、8、9、10、11、12、12週間の間隔であってもよい。抗体の防御レベルを維持するには、1~5年の間隔での定期的な追加免疫が望ましいであろう。米国特許第3791932号同第4174384号および同第3949064号に記述されているように、免疫過程の後に、抗原に対する抗体のアッセイを行ってもよい。1担体所与の組成物はその免疫原性が異なる場合がある。それゆえ、宿主免疫系を追加免疫することが必要になることが多く、これはペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングさせることにより達成することもできる。例示的なかつ好ましい担体はキーホールリンペットヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンである。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンを担体として用いることもできる。ポリペプチドを担体タンパク質に抱合させるための手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、mマレイミドベンゾイルNヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスジアゾ化ベンジジンを含む。2アジュバントポリペプチドまたはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫反応の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適当なアジュバントはサイトカイン、毒素または合成組成物などの、許容される全ての免疫刺激性化合物を含む。変種SpAポリペプチドもしくはコアグラーゼ、または本明細書において企図されるその他任意の細菌タンパク質もしくは組み合わせに対する抗体反応を増強するために、いくつかのアジュバントを用いることができる。アジュバントは、抗原を体内に捕捉して持続放出を引き起こすこと免疫反応に関わる細胞を投与部位に引き付けること免疫系細胞の増殖もしくは活性化を誘導することまたは対象の体全体に抗原を広げるのを改善することができる。アジュバントは、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、無機塩類、ポリヌクレオチド、および天然物質を含むが、これらに限定されることはない。使用できる具体的なアジュバントはIL1、IL2、IL4、IL7、IL12、γインターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウムまたは他のアルミニウム化合物などのアルミニウム塩、thurMDPおよびnorMDPなどのMDP化合物、CGP、脂質A、ならびにモノホスホリル脂質Aを含む。細菌から抽出された三種の成分、つまりMPL、トレハロースジマイコレートおよび細胞壁骨格を2スクアレンTween80乳濁液中に含有する、RIBI。MHC抗原をさらに使用することができる。他のアジュバントまたは方法は、各々が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6814971号、同第5084269号、同第6656462号に例示されている。ワクチンのアジュバント作用を達成するさまざまな方法には、それぞれ、一般的に約005~約01のリン酸緩衝生理食塩水溶液として用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのような作用物質を用いること、約025の溶液として用いられる合成糖重合体とともに混合すること、約70°C~約101°Cの範囲の温度で30秒~2分間の熱処理によってワクチンにおけるタンパク質を凝集させることが含まれる。アルブミンに対するペプシン処理抗体での再活性化による凝集、細菌細胞、グラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合物、生理学的に許容される油性媒体中の乳濁液またはブロック代用物として用いられる20のペルフルオロカーボン溶液との乳濁液を利用して、アジュバント作用をもたらすこともできる。アジュバントの例かつ多くの場合に好ましいアジュバントには、フロイントの完全アジュバント死菌を含む免疫反応の非特異的な刺激物質、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムが含まれる。いくつかの局面において、Th1またはTh2型の反応のいずれかの選択的誘発物質となるようにアジュバントを選択することが好ましい。高レベルのTh1型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞性免疫反応の誘導に有利に働く傾向があるのに対し、高レベルのTh2型サイトカインは、抗原に対する体液性免疫反応の誘導に有利に働く傾向がある。Th1およびTh2型免疫反応の区別は絶対的ではない。実際には、個体は、主にTh1または主にTh2とされている免疫反応を支持する。しかし、多くの場合、MosmannおよびCoffmanによりネズミCD4T細胞クローンにおいて記述されているものに関してサイトカインのファミリーを考えることが好都合である。伝統的には、Th1型反応は、Tリンパ球によるINFγおよびIL2サイトカインの産生と関連している。IL12のような、Th1型免疫反応の誘導に直接関連することが多いその他のサイトカインは、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型反応は、IL4、IL5、IL6、IL10の分泌に関連する。アジュバントの他に、生体反応修飾物質を同時投与して、免疫反応を増強することが望ましいかもしれない。BRMは、T細胞免疫を上方制御するまたはサプレッサー細胞活性を下方制御することが示されている。そのようなBRMは、シメチジンまたは低用量シクロホスファミドおよびγインターフェロン、IL2もしくはIL12のようなサイトカイン、またはB7のような、免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されることはない。B脂質成分および部分ある種の態様において、本発明は、核酸またはポリペプチドペプチドと結び付いた一つまたは複数の脂質を含む組成物に関する。脂質は水に不溶な、かつ有機溶媒で抽出可能な物質である。本明細書において具体的に記述するもの以外の化合物は、当業者により脂質と理解され、本発明の組成物および方法によって包含される。脂質成分および非脂質は、共有結合的または非共有結合的に、互いに付着されてもよい。脂質は天然の脂質または合成脂質であってもよい。しかしながら、脂質は、通常、生物学的物質である。生物学的脂質は、当技術分野において周知であり、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテルかつエステル結合した脂肪酸を有する脂質および重合可能な脂質、ならびにその組み合わせを含む。脂質と結合した、核酸分子またはポリペプチドペプチドを、脂質を含有する溶液に分散させ、脂質によって溶解させ、脂質によって乳化させ、脂質と混合させ、脂質と組み合わせ、脂質に共有結合させ、脂質中の懸濁液として含有させ、または他の方法で脂質と結合させてもよい。本発明の脂質または脂質ポックスウイルス結合組成物は、任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらを単純に溶液中に散在させ、おそらくサイズまたは形状のどちらかが均一ではない凝集体を形成させてもよい。別の例において、それらは二層構造で、ミセルとして、または崩壊した構造で存在してもよい。別の非制限的な例において、リポフェクトアミンポックスウイルスまたはSuperfectポックスウイルス複合体も企図される。ある種の態様において、組成物は約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、約77、約78、約79、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、またはその間の任意の範囲の、特定の脂質、脂質型、あるいはアジュバント、抗原、ペプチド、ポリペプチド、糖、核酸または本明細書に開示されるもしくは当業者に公知であるような他の材料などの非脂質成分を含むことができる。非限定的な例において、組成物は約10~約20の中性脂質、および約33~約34のセレブロシド、および約1のコレステロールを含むことができる。別の非限定的な例において、リポソームは、ミセルの約1が特にリコペンであって、リポソームの約3~約11が他のテルペンを含んだままの、約4~約12のテルペン、ならびに約10~約35のホスファチジルコリン、および約1の非脂質成分を含むことができる。このように、本発明の組成物は、任意の組み合わせまたは百分率の範囲で脂質、脂質型または他の成分のいずれを含んでもよいと企図される。C併用療法本発明の組成物および関連する方法、特に、変種SpAポリペプチドもしくはペプチドを含む、分泌病毒性因子もしくは表面タンパク質、およびまたは他の細菌ペプチドもしくはタンパク質の患者対象への投与を従来の治療の施行と併せて用いることもできる。これらには、ストレプトマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、アンピシリン、テトラサイクリン、または抗生物質の各種組み合わせなどの抗生物質の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。一つの局面において、ポリペプチドワクチンおよびまたは治療を、抗細菌処置とともに用いることが企図される。あるいは、治療は数分から数週間に及ぶ間隔だけ、他剤での処置に先行するまたは続くこともできる。他の薬剤およびまたはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別々に投与される態様において、薬剤および抗原組成物が依然として、有利に組み合わさった効果を対象に及ぼすことができるように、一般に、各送達時と送達時との間でかなりの時間が経ってしまわないことを確実にする。そのような場合、双方の様式を互いに約12~24時間以内にまたは互いに約6~12時間以内に施すことができると企図される。場合によっては、投与の期間をかなり延ばすことが望ましい場合もあり、その場合には各投与の間隔は数日から数週間である。例えば抗生物質治療をAとし、抗原などの、免疫治療レジメの一部として投与される免疫原性分子をBとし、種々の組み合わせを利用することができる。ABABABBBAAABABBBAAABBBBABBBBBABBABAABBABABABBABBAABABABAABAAABBAAAABAAAABA患者対象への本発明の免疫原性組成物の投与は、SpA組成物、または本明細書において記述される他の組成物の、もしあれば、毒性を考慮に入れながらも、そのような化合物の投与に関する一般的なプロトコルに従う。処置周期は必要に応じて繰り返されるものと期待される。同様に、水和などの、種々の標準的な治療を記述の治療と併せて適用できるものと企図される。D一般的な薬学的組成物いくつかの態様において、薬学的組成物が対象に投与される。本発明の種々の局面では、対象に組成物の有効量を投与することを伴う。本発明のいくつかの態様において、ブドウ球菌抗原、Ess経路の成員、例えばEsaもしくはEsxクラスのポリペプチドもしくはペプチドなど、およびまたはソルターゼ基質の成員を患者に投与して、一種または複数種のブドウ球菌病原菌を防御することができる。あるいは、一つまたは複数のそのようなポリペプチドまたはペプチドをコードする発現ベクターを、予防的処置として患者に与えることもできる。さらに、そのような化合物を抗生物質または抗菌薬と併せて投与することもできる。そのような組成物は一般に、薬学的に許容される担体または水媒体中に溶解または分散される。静脈内注射または筋肉内注射のためのものなどの、非経口投与のために処方される化合物に加えて、他の薬学的に許容される形態には、例えば、錠剤または経口投与のための他の固形物徐放カプセルおよびクリーム、ローション、洗口液、吸入薬などを含む、現在用いられているその他任意の形態が含まれる。本発明の活性化合物は、非経口投与のために処方することができ、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、またはさらに腹腔内経路による注射のために処方することができる。MHCクラスI分子の発現を増大する化合物を含む水性組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知であろう。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして注射用剤として調製することができ注射前に液体を加えることで溶液または懸濁液を調製するために用いるのに適した固体剤形を調製することもできおよび調製物を乳化することもできる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液をヒドロキシプロピルセルロースなどの、界面活性剤と適当に混合された水の中で調製することができる。分散液を同様に、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物の中でならびに油中で調製することができる。保存および使用の通常の状況下では、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐよう保存剤を含む。注射可能な用途に適した薬学的形態は、無菌の水溶液または分散液ごま油、落花生油または水性プロピレングリコールを含む処方物および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌の粉末を含む。いかなる場合でも、この形態は無菌でなければならず、容易に注射可能となる程度に流動性でなければならない。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの、微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。タンパク質性組成物は、中性型または塩型で処方されてもよい。薬学的に許容される塩は、酸付加塩および、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成されるものを含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することができる。また、担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール、適当なそれらの混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防はさまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらすことができる。無菌の注射可能な溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒の中に、必要に応じて、上に列挙した種々の他の成分とともに組み入れ、その後ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散媒はさまざまな滅菌活性成分を、基礎の分散媒および上に列挙したものより必要とされるその他の成分を含む無菌の媒体の中に組み入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の付加的な望ましい成分の粉末を、予めろ過滅菌されたその溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥技術である。本発明による組成物の投与は、典型的には、任意の共通の経路によるであろう。これには、経口投与、鼻腔投与または口腔投与が含まれるが、これらに限定されることはない。あるいは、投与は同所性の、皮内の、皮下の、筋肉内の、腹腔内の、鼻腔内の、または静脈内の注射によるものであってもよい。ある種の態様において、ワクチン組成物は吸入することができる。そのような組成物は、通常、薬理学的に許容される担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。本明細書において用いられる場合、薬学的に許容されるという用語は、正しい医学的判断の範囲内にあり、妥当な損益比に応じて過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適した化合物、材料、組成物、およびまたは剤形をいう。薬学的に許容される担体という用語は、化学剤の運搬または輸送に関わる、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料のような、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液を、必要ならば、適当に緩衝化し、液体希釈剤を最初に、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にしなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、利用できる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、一投与量を等張NaCl溶液に溶解し、皮下注入液に加えるか、または提案される注入部位に注射してもよい。若干の投与量のばらつきは対象の状態に応じて必然的に生じると考えられる。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適した用量を判定すると考えられる。治療用または予防用組成物の有効量は、意図する目的に基づいて判定される。単位用量または投与量という用語は、対象での使用に適した物理的に異なる単位をいうが、各単位はその投与、すなわち、適切な経路および投与計画に関連する上記の所望の反応を生じるように算出された所定の量の組成物を含有する。処置回数および単位用量の両方によって投与される量は、望まれる防御に依る。また、組成物の的確な量は医師の判断に依り、各個体に特有のものである。用量に影響する要因には、対象の身体的および臨床的状態、投与経路、意図する処置の目的、ならびに特定の組成物の効力、安定性および毒性が含まれる。処方によって、溶液は、投与量処方物と適合する様式でおよび治療的にまたは予防的に有効であるような量で投与される。処方物は上記の注射可能な溶液のタイプなどの、種々の投与量形態で容易に投与される。Eインビトロ、エクスビボまたはインビボ投与本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養細胞を含むが、これに限定されない、対象から取り出されたまたは対象の体外の細胞に対して行われる操作をいう。エクスビボ投与という用語は、インビトロにおいて操作されており、その後で、対象に投与される細胞をいう。インビボ投与という用語は、対象の体内で行われる全ての操作を含む。本発明のある種の局面において、組成物はインビトロで、エクスビボで、またはインビボで投与することができる。ある種のインビトロの態様において、自己Bリンパ球細胞株を、本発明のウイルスベクターと24~48時間インキュベートするか、変種SpAおよびもしくはコアグラーゼならびにまたは本明細書において記述されるその他任意の組成物と2時間インキュベートする。次いで形質導入細胞を、インビトロでの分析に、あるいはエクスビボ投与に用いることができる。ともに参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4690915号および同第5199942号には、治療用途で用いるための血中単核細胞および骨髄細胞のエクスビボ操作のための方法が開示されている。F抗体および受動免疫本発明の別の局面は、レシピエントまたはドナーを本発明のワクチンで免疫する段階およびレシピエントまたはドナーから免疫グロブリンを単離する段階を含む、ブドウ球菌感染の予防または処置で用いる免疫グロブリンを調製する方法である。この方法によって調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる局面である。本発明の免疫グロブリンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、ブドウ球菌疾患の処置または予防のための薬物の製造において使用できる本発明のさらなる局面である。本発明の薬学的調製物の有効量を患者に投与する段階を含むブドウ球菌感染の処置または予防のための方法は、本発明のさらなる局面である。ポリクローナル抗体の産生のための接種材料は、典型的には、抗原組成物を、生理食塩水またはヒトへの使用に適した他のアジュバントなどの生理学的に許容される希釈剤に分散させて、水性組成物を形成することにより調製される。免疫刺激量の接種材料を哺乳類に投与し、接種を受けた哺乳類をその後、抗原組成物が防御抗体を誘導するのに十分な時間維持する。この抗体を親和性クロマトグラフィーなどの周知の技術によって所望とされる程度まで単離することができる。抗体には、種々の一般に用いられる動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラット、またはヒト由来の抗血清調製物を含めることができる。本発明によって産生される免疫グロブリンは、全抗体、抗体断片または抗体小断片を含むことができる。抗体は、いずれかのクラスの全免疫グロブリン、キメラ抗体または本発明の二種もしくはそれ以上の抗原に対して二重特異性を有するハイブリッド抗体であることができる。それらはハイブリッド断片を含む断片2、Fab、Fab、Fvなどであってもよい。免疫グロブリンはまた、特異的な抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質または遺伝子操作されたタンパク質も含む。本発明のワクチンをレシピエントに投与することができ、このレシピエントが、特定のワクチンによる曝露に応じて産生される免疫グロブリンの供給源として働く。このようにして処置された対象は、従来の血漿分画法によって過免疫グロブリンが得られうる血漿を提供するであろう。過免疫グロブリンは、ブドウ球菌感染に対する耐性を与えるためにまたはブドウ球菌感染を処置するために別の対象に投与されよう。本発明の過免疫グロブリンは、幼児、免疫不全個体におけるブドウ球菌疾患の処置もしくは予防に特に有用であり、または処置が必要とされ、かつワクチン接種に応じて抗体を産生する時間が個体にない場合に特に有用である。本発明のさらなる局面は、グラム陽性細菌、好ましくはブドウ球菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌による感染を処置または予防するために使用できる、本発明の免疫原性組成物の少なくとも二つの構成要素に対して反応性の二種またはそれ以上のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物は、本発明の二種またはそれ以上の抗原に対して特異性を有するいずれかのクラスの全免疫グロブリン、キメラ抗体またはハイブリッド抗体でありうるモノクローナル抗体を含む。それらはハイブリッド断片を含む断片2、Fab、Fab、Fvなどであってもよい。モノクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野において周知であり、脾細胞と骨髄腫細胞との融合を含むことができる。あるいは、適当なファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることによってモノクローナルFv断片を得ることもできる。モノクローナル抗体は、公知の方法によってヒト化され、または部分的にヒト化されてもよい。VI実施例以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を例証する目的で与えられており、いかなる形においても本発明を限定することを意図するものではない。本発明は本明細書の中にある目標、目的および利点のほかに、言及されている、目標を実行するために、かつ目的および利点を得るために十分に適していることを当業者は容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書において記述される方法とともに、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示するものであり、本発明の範囲に対する限定と意図するものではない。その変更および特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨のなかに包含されるその他の用途が、当業者には思い浮かぶであろう。実施例1黄色ブドウ球菌感染を予防するためのサブユニットワクチンとしての毒素非産生性プロテインA変種A結果黄色ブドウ球菌感染の動物モデルBALBcマウスに静脈内注射によって1×107CFUのヒト臨床分離株の黄色ブドウ球菌Newmanを感染させた。感染後6時間以内に、99999のブドウ球菌が血流から消失し、脈管構造を介して行き渡った。末梢組織へのブドウ球菌の播種は、腎臓および他の末梢器官組織における細菌負荷が最初の3時間以内に1×105CFUg1に達したことから、急速に起こった。腎臓組織におけるブドウ球菌の負荷は、24時間以内に15logCFU増加した。感染から48時間後に、マウスはヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓組織の光学顕微鏡検査によって検出可能な、多器官における播種性膿瘍を発現した。初期の膿瘍直径は524μMであった。病変部は病初では多形核白血球の流入が目立ち、識別可能なブドウ球菌組織化がなく、その大部分はPMN内に存在するものと思われた。感染5日目に、膿瘍はサイズが増大し、好酸球性の無形性物質の層および大きなPMNカフで囲まれた、中心のブドウ球菌集団を含んでいた。病理組織診断によって、膿瘍病変部の中心にあるブドウ球菌巣のすぐ近くでのPMNの大量壊死および一面の正常食細胞が明らかになった。正常腎組織を病変部と区別する好酸球性の無形性物質に隣接する、膿瘍病変部周辺の壊死PMNの縁が観察された。膿瘍は15または36日目に≧1524μMの直径に最終的に達した。もっと後の時間間隔で、ブドウ球菌負荷は104~106CFUg1まで増大し、成長中の膿瘍病変部は器官被膜の方へ移動した。末梢病変部は裂けやすく、それによって壊死物質およびブドウ球菌を腹膜腔または後腹膜腔へ放出した。これらの事象は菌血症および膿瘍の第二波を引き起こし、最終的には致死的転帰を招いた。腎組織における細菌負荷を数え上げるために、動物を殺処理し、その腎臓を切除し、コロニー形成のため組織ホモジネートを寒天培地上に広げた。感染5日目に、黄色ブドウ球菌Newmanに対して平均1×106CFUg1腎組織が観察された。膿瘍形成を定量化するために、腎臓を目視検査し、各個々の器官に1または0のスコアをつけた。最終の合計を腎臓の総数で割って表面膿瘍の割合を計算した。さらに、無作為に選択した腎臓をホルマリン中で固定し、包埋し、薄片を作り、およびヘマトキシリンエオシンで染色した。腎臓ごとに、200μMの間隔で4枚の矢状切片を顕微鏡で見た。病変部の数を切片ごとにカウントし平均して、腎臓内の膿瘍の数を定量化した。黄色ブドウ球菌Newmanは腎臓あたり4364±0889個の膿瘍を引き起こし、腎臓20個のうち14個で表面膿瘍が観察された。走査電子顕微鏡法によって調べた場合、黄色ブドウ球菌Newmanは、膿瘍の中心にある密に結び付いた菌叢に位置していた。ブドウ球菌は、細菌を膿瘍白血球のカフから分離していた無定形の偽被膜に被包されていた。これら中心のブドウ球菌巣の中に免疫細胞は認められなかったが、時折、赤血球が細菌の間に位置していた。ブドウ球菌膿瘍群集と名付けた、膿瘍中心の細菌集団は、均質に見え、電子密度の高い顆粒状物質によって被膜されていた。感染病変部の外観の動態および黄色ブドウ球菌Newmanによって形成された膿瘍の形態的特質は、黄色ブドウ球菌USA300、つまり米国において現在まん延している市中獲得型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌クローンによるマウスの感染後に観察されたものに類似していた。表4マウスにおける黄色ブドウ球菌Newmanの膿瘍形成に対する遺伝的要件a投与菌株あたりBALBcマウス15匹のコホートにおける感染から5日後のホモジナイズ腎組織でlog10CFUg1として計算された、ブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差が示してある。b統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録したP値005を有意と見なした。clog10CFUg1として計算された細菌負荷の低下。d感染から5日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査によって測定した。e動物8~10匹からヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓の病理組織診断腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均を目的に再び平均化した。f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録した。P値005を有意と見なした。黄色ブドウ球菌プロテインA変異体は非病原性であり、膿瘍を形成しえないソルターゼAは、黄色ブドウ球菌株Newmanの外膜中に19種の表面タンパク質を固定化するトランスペプチダーゼである。以前の研究では、多数の動物モデル系においてソルターゼAを病毒性因子と同定しているが、膿瘍の形成または存続へのこの酵素およびその固定表面タンパク質の寄与はまだ明らかにされていない。野生型の親株と比べて、同質遺伝子srtA変種は2、5または15日目に肉眼検査または病理組織学的検査のいずれに関しても膿瘍病変部を形成できなかった。strA変異体に感染したマウスでは、感染5日目に腎臓組織から1×104CFUg1しか回収されず、これは野生型の親株と比べて2046log10CFUg1の低下である。類似の欠陥はMRSA株USA300のsrtA変異体にも観察された。走査電子顕微鏡法から、srtA変異体が、その他の点では健常な腎組織において高度に分散し、多くの場合、白血球と結び付いていることが示された。感染後15日目に、srtA変異体は、腎組織から除去され、野生型と比べて≧35log10CFUg1の低下であった。このように、ソルターゼA固定表面タンパク質は、宿主組織において膿瘍病変部の形成および細菌の存続を可能にし、その場所でブドウ球菌は、細胞外マトリックスに埋め込まれ、かつ無定形の偽被膜により周囲の白血球から保護された群集として複製する。ソルターゼAは、LPXTGモチーフ選別シグナルを有する広範なタンパク質を細胞壁外膜に固定し、それによって多くの病毒性因子の表面提示を可能にする。ブドウ球菌膿瘍形成に必要な表面タンパク質を同定するために、LPXTGモチーフタンパク質を有するポリペプチドをコードする遺伝子の5コード配列の中にブルサアウレアリスの挿入を導入し、これらの変異を黄色ブドウ球菌Newmanへ形質導入した。プロテインAに対する構造遺伝子における変異は感染マウス腎臓組織におけるブドウ球菌負荷を1004log10低減した。本発明者らは、腎臓組織での膿瘍形成能を組織病理診断によって分析した場合に、spa変異体が野生型親菌株の黄色ブドウ球菌Newmanと比べて膿瘍を形成しえないことを認めた。プロテインAは先天性および適応性免疫反応を遮断する研究によって、プロテインAは黄色ブドウ球菌感染の発病の間の重要な病毒性因子と特定された。以前の取り組みによって、プロテインAは、免疫グロブリンのFc成分に結合することによりブドウ球菌の食作用を妨害し、フォンウィルブランド因子を介して血小板凝集を活性化し、VH3を持つIgMのF2領域を捕捉することによりB細胞超抗原として機能し、および、そのTNFR1活性化を通じて、ブドウ球菌性肺炎を引き起こしうることが実証された。プロテインAが免疫グロブリンを捕捉し、有毒な特質を呈するという事実によって、この表面分子がヒトでのワクチンとして機能しうる可能性は厳密には追求されてこなかった。本発明者らは初めて、プロテインA変種が免疫グロブリンにもはや結合できず、vWFおよびTNFR1はその毒素産生能が取り除かれ、ブドウ球菌疾患を防御する体液性免疫反応を刺激しうることを実証する。プロテインA表面提示および機能の分子基盤プロテインAは、細菌細胞質中で前駆体として合成され、そのYSIRKシグナルペプチドを介して隔壁、すなわち、ブドウ球菌の細胞分裂隔壁の位置で分泌される。C末端LPXTG選別シグナルの切断の後、プロテインAはソルターゼAによって細菌ペプチドグリカン架橋に固定される。プロテインAは最も豊富なブドウ球菌表面タンパク質であるこの分子はほぼ全ての黄色ブドウ球菌株によって発現される。ブドウ球菌は分裂周期1回につきその細胞壁の15~20を代謝する。ネズミヒドロラーゼはペプチドグリカンのグリカン鎖および壁ペプチドを切断し、それにより、付着されたC末端細胞壁二糖類テトラペプチドを有するプロテインAを細胞外培地へ放出する。このように、生理学的デザインによって、プロテインAは細胞壁に固定もされ、細菌表面に提示もされるが、宿主感染の間に周辺組織中に放出もされる。プロテインAは免疫グロブリンを細菌表面に捕捉し、この生化学的活性によって宿主先天性および後天性免疫反応からのブドウ球菌による回避が可能とされる。興味深いことに、プロテインAの領域X、つまりLPXTG選別シグナル細胞壁アンカーにIgG結合ドメインをつなぎ止める繰り返しドメインは、おそらく、ブドウ球菌ゲノムのなかで最も可変的な部分である。3つのヘリックスバンドルから形成され、E、D、A、BおよびCと命名された、プロテインAの5つの免疫グロブリン結合ドメインの各々が類似の構造的および機能的特性を及ぼす。プロテインAに異なる部位で非競合的に結合するFcおよびVH3リガンドの有る状態でも無い状態でも、ドメインDの溶液結晶構造が解析されている。結晶構造複合体において、Fabは、4本のVH領域β鎖から構成される表面を介してドメインDのヘリックスIIおよびヘリックスIIIと相互作用する。ドメインDのヘリックスIIの主軸は鎖の方向に対しておよそ50°であり、ドメインDのヘリックス間部分はC0鎖の最も近位にある。Fab上の相互作用の部位は、Ig軽鎖および重鎖定常領域から離れている。この相互作用には以下のドメインD残基が含まれるSpADによるいくつかの他の残基に加えて、ヘリックスIIのAsp36ならびにヘリックスIIとヘリックスIIIとの間のループ中のAsp37およびGln40。どちらの相互作用表面も、極性側鎖から主に構成されており、相互作用によってドメインD上の3つの陰性荷電残基および2A2Fab上の2つの陽性荷電残基が沈み込み、二分子間の全体的な静電気引力をもたらす。FabとドメインDとの間で特定された5つの極性相互作用のうち、3つが側鎖間である。塩橋がArgH19とAsp36との間で形成され、二つの水素結合がTyrH59とAsp37との間でおよびAsnH82aとSer33との間で作製される。プロテインAの全5つのIgG結合ドメインにおけるAsp36およびAsp37の保存を理由に、これらの残基を突然変異誘発のために選択した。Fab結合に関わるSpAD部位は、Fcγ結合を媒介するドメイン表面から構造的に離れている。FcγとドメインBとの相互作用には主に、ヘリックスI中の残基が関与し、ヘリックスIIの関与はもっと低い。両方の複合体における接触面積の狭い界面のGln32を除いて、Fcγ相互作用を媒介する残基のどれもFab結合には関与しない。これらの異なるIg結合部位の間の空間関係を調べるため、これらの複合体におけるSpAドメインを重ね合わせてFab、SpAドメインDおよびFcγ分子の間の複合体のモデルを構築した。この三成分モデルにおいて、FabおよびFcγはいずれの相互作用の立体障害の証拠なしにヘリックスIIの反対面周囲にサンドイッチを形成する。これらの所見は、SpAドメインが、その小さなサイズにもかかわらず、いかにして両方の活性を同時に示しうるかを例証し、Fabと個々のドメインとの相互作用が非競合的であるという実験的証拠を説明している。SpADとFcγとの間の相互作用のための残基はGln9およびGln10である。対照的に、ドメインD上でのIgGのFc部分の占有によって、vWFA1およびおそらく同様にTNFR1とのその相互作用が遮断される。IgGFc結合に不可欠な残基における変異はまた、vWFA1およびTNFR1の結合に必要であるのに対し、VH3相互作用に極めて重要な残基はIgGFc、vWFA1またはTNFR1の結合活性に影響を与えない。プロテインA免疫グロブリンFab結合活性は、表面にVH3ファミリー関連のIgMを発現するB細胞のサブセットを標的とし、すなわちこれらの分子はVH3型B細胞受容体として機能する。SpAとの相互作用によって、これらのB細胞は素早く増殖し、次いでアポトーシスに傾倒し、先天性様Bリンパ球の選択的かつ持続的欠失を引き起こす。40超の循環血中B細胞がプロテインA相互作用により標的化され、VH3ファミリーが、病原菌に対する防御体液性反応を与える最も大きなファミリーのヒトB細胞受容体に相当することに留意するのは重要である。かくして、プロテインAはブドウ球菌超抗原に対しても同じように機能するが、これは後者のクラスの分子、例えばSEB、TSST1、TSST2がT細胞受容体と複合体を形成して宿主免疫反応を不適切に刺激し、それによってブドウ球菌感染に特有の疾患特徴を誘発するにもかかわらずである。総合して、これらの所見はブドウ球菌感染の樹立でのおよび宿主免疫反応の調節でのプロテインAの寄与を立証するものである。毒素非産生性プロテインA変種本発明者らは、ブドウ球菌プロテインAの毒素非産生性の変種を開発し、この試薬を手にして、初めて、プロテインA免疫に対する動物の免疫反応を測定することを目標とした。さらに、本発明者らは、毒素非産生性プロテインA変種による動物の免疫が、ブドウ球菌感染に対する防御免疫を高める免疫反応を生じうるかどうかについて取り組む。プロテインAのIgGFc、vWFA1およびTNFR1結合活性を撹乱するために、グルタミン残基番号9および10ここで付番はSpAドメインDに対して設定されたものに由来するを、両方のグルタミンに代えてリジンまたはグリシンを用いて、修飾し、これらの置換が、野生型プロテインAとそのリガンドとの間で形成されるイオン結合をなくすことを期待した。二重のリジン置換の相加的効果は、これらの正電荷を持つ残基が反発性の電荷を免疫グロブリンに導入するということでありうる。IgMFabVH3結合を撹乱するために、本発明者らは、各々がプロテインAとB細胞受容体との結合に必要な、SpADのアスパラギン酸残基番号36および37を選択した。D36およびD37をアラニンでともに置換した。Q9、10KおよびD36、37A置換を組み換え分子SpADQ910KD3637Aにおいて組み合わせ、プロテインAの結合特性について調べた。手短に言えば、黄色ブドウ球菌N315のプロテインAゲノム配列をプライマーでPCR増幅し、pET15bベクターにクローニングし、組み換えプラスミドを大腸菌BL21に形質転換した。pYSJ1由来のプロテインA産物は、N末端Hisタグに融合されたSpA残基番号36265を持つ。IPTG誘導発現の後、組み換えN末端His6タグ付きSpAをNiNTA樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。SpAのドメインDを特異的プライマーの対でPCR増幅し、pET15bベクターにサブクローニングし、組み換えプラスミドを大腸菌BL21に形質転換して組み換えN末端His6タグ付きタンパク質を発現させ、精製した。SpADコード配列における変異を作製するために、二本のプライマー対のセットを合成した。プライマーをquickchange突然変異誘発プロトコルに用いた。突然変異誘発の後、DNA配列を組み換えタンパク質SpA、SpADならびにSpADQ910GD3637AおよびSpADQ910KD3637Aの各々について確認した。タンパク質は全て、NiNTAクロマトグラフィーを用いて組み換え大腸菌の溶解物から精製し、その後、PBSに対して透析し、4°Cで貯蔵した。免疫グロブリンとプロテインAおよびその変種との結合を測定するために、精製タンパク質200μgを、カラム用緩衝液を用いて1mlの容量に希釈し、次いで、予め平衡化されたNiNTAカラムに添加した。カラムをカラム用緩衝液10mlで洗浄した。精製ヒトIgG200μgを全量1mlのカラム用緩衝液に希釈し、次いでプロテインAおよびその変種を充填したカラムの各々にアプライした。カラムをその後、洗浄用緩衝液5mlおよびカラム用緩衝液5mlで洗浄した。タンパク質サンプルを溶出用緩衝液2mlで溶出し、画分を回収し、アリコットをSDSPAGEゲル電気泳動に供し、引き続いてクマシーブルー染色を行った。図3に示されるように、野生型プロテインAおよびそのSpAドメインDはともに、クロマトグラフィーの間に免疫グロブリンを保持した。対照的に、SpADQ910KD3637A変種は免疫グロブリンに結合しなかった。プロテインAおよびその変種と免疫グロブリンのFc部分およびFabのVH3ドメインとの結合を定量化するために、HRP結合されたヒト免疫グロブリンGhIgG、ヒトIgGのFc部分hFcおよびヒトIgGのF2部分hF2ならびにELISAアッセイ法を用いて、プロテインAおよびその変種との相対的な結合量を定量化した。図4中のデータは、SpAおよびSpADとhIgGおよびhFcとの結合を実証するのに対し、SpADQ910GD3637AおよびSpADQ910KD3637Aはバックグラウンドの結合活性しか示さなかった。SpAは類似の量のhFcおよびhF2を結合したが、SpADとhF2との結合は全長SpAと比べて低減された。この結果は、複数のIgG結合ドメインの存在がB細胞受容体に結合するプロテインAの能力を協調的に増大しうることを示唆している。hF2に対するSpADの結合力の低減と比べた場合、二つの変種のうちSpADQ910KD3637Aだけが免疫グロブリンのVH3ドメインを結合する能力の顕著な低減を示した。SpADおよびその変種の毒素産生特性について調べるために、精製タンパク質をマウスに注射し、これを4時間後に殺処理してその脾臓を切除した。器官組織をホモジナイズし、莢膜物質を除去し、B細胞を蛍光CD19抗体で染色した。脾臓組織中のB細胞の存在量を定量化するFACS分析を受けて、SpADが、モック対照と比べてB細胞数の5の減少を引き起こすことが認められた。対照的に、SpADQ910KD3637AはB細胞数の低減を引き起こさず、変異体分子がB細胞増殖および死を刺激するというその毒素産生特性を喪失したことを示すものであった。要約すれば、SpAD残基Q9、Q10、D36およびD37におけるアミノ酸置換は、プロテインAドメインが免疫グロブリンを結合する能力またはヒトおよび動物組織において毒素産生機能を及ぼす能力をなくした。毒素非産生性プロテインA変種はワクチン防御を誘発するプロテインAおよびその変種がワクチン抗原として機能できるかどうか試験するために、SpA、SpAD、SpADQ910KD3637AおよびSpADQ910KD3637Aを完全または不完全フロインドアジュバントで乳化し、1日目および11日目に精製タンパク質50μgで4週齢のBALBcマウスに免疫した。免疫スケジュールの前および後に動物から採血することにより免疫に対する体液性免疫反応について動物のコホートを分析した。表5は、免疫されたマウスが野生型プロテインAまたはそのSpADモジュールに対する体液性免疫反応をわずかしか生じなかったのに対し、SpADQ910KD3637AまたはSpADQ910KD3637Aによる免疫の後に引き起こされた抗体の量が4~5倍に増えたことを示す。1×107CFUの黄色ブドウ球菌Newmanによる静脈内投与の後、動物を4日目に殺処理し、その腎臓を切除し、ブドウ球菌負荷または組織病理診断のいずれかについて分析した。予想通り、モック免疫マウスは腎臓組織において646log10のCFUを持ち、感染病変部は器官あたり膿瘍37個へと組織化された。SpAによる動物の免疫は5日目に251log10のCFUの低減をもたらし、器官あたりの膿瘍は21個となった。後者のデータは、膿瘍形成に有意な低減がなかったことを示している。SpADによる免疫は類似の結果5日目に203log10のCFUの低減をもたらし、器官あたりの膿瘍は15個となった。対照的に、SpADQ910KD3637AまたはSpADQ910GD3637Aによる免疫は、防御の増大を生み出し、4日目に、それぞれ、307log10および303log10のCFUの低減を伴った。さらに、SpADQ910KD3637AおよびSpADQ910GD3637Aの両方による免疫は、器官あたり05および08個の感染病変部しか特定されなかったので、ブドウ球菌膿瘍形成からの顕著な防御を生じた。このように、毒素非産生性プロテインA変種による免疫は、プロテインAに対する体液性免疫反応の増大を生じ、ブドウ球菌の攻撃に対する防御免疫を与える。これらのデータは、プロテインAが、黄色ブドウ球菌疾患を予防するヒトワクチンの理想的な候補であることを示している。これらのエキサイティングな結果は、ヒトワクチンのデザインにいくつかの影響がある。第一に、単独でまたは二つもしくはそれ以上のドメインの組み合わせで、プロテインAの免疫グロブリン結合ドメインの能力に影響を与える置換変異の作製は、ワクチンの開発に適した毒素非産生性の変種を作製することができる。プロテインAの構造に酷似している変異体IgG結合ドメインの組み合わせは、SpAドメインD単独の場合に本明細書で報告されるようにさらに良好な体液性免疫反応を生み出せる可能性が高いように思われる。さらに、プロテインA特異的抗体の、可能性が高い特性は、抗原結合部位と微生物表面との相互作用によって、ブドウ球菌が免疫グロブリンを、そのFc部分を介して捕捉する能力またはB細胞受容体を、VH3結合活性を介して刺激する能力を中和できるということでありうる。表5黄色ブドウ球菌疾患を予防するワクチン抗原としての毒素非産生性プロテインA変種aBALBcマウス18~20匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10CFUg1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。平均の標準誤差が示してある。c統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録したP値005を有意と見なした。blog10CFUg1として計算された細菌負荷の低下。d感染から4日後の腎臓組織における膿瘍形成を巨視的検査によって測定した。e動物10匹からヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断腎臓あたりの膿瘍数を記録し、最終平均を目的に平均化した。f統計的有意性をスチューデントt検定で計算し、P値を記録したP値005を有意と見なした。SpAD1およびSpAD2は、それぞれ、SpADQ910KD3637AおよびSpADQ910GD3637Aを表す。ネズミ膿瘍、ネズミ致命的感染およびネズミ肺炎モデルにおけるワクチン防御三つの動物モデルは黄色ブドウ球菌感染性疾患の研究のために樹立された。これらのモデルをここで用いて、プロテインA特異的抗体の作製を介して提供される防御免疫のレベルを調べる。ネズミ膿瘍後肢への筋肉内注射により精製タンパク質でBALBcマウスを免疫する。精製SpA、SpADまたはSpADQ9、10KD36、37Aを0日目および11日目に投与する。血液サンプルを0、11および20日目に眼窩後部採血によって採血する。特異的なSpADおよびSpADQ9、10KD36、37A結合活性に対するIgGの力価についてELISAにより血清を調べる。黄色ブドウ球菌Newmanまたは黄色ブドウ球菌USA300懸濁液100μlの眼窩後部注射によって21日目に免疫動物を攻撃する。このため、黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養の培養物を新鮮なトリプトソイブロスに100分の1希釈し、37°Cで3時間増殖させる。ブドウ球菌を遠心分離し、二回洗浄し、PBS中で希釈してA60004を得る。寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって希釈を実験的に検証する。マウスを体重1キログラムあたり80~120mgのケタミンおよび3~6mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔し、眼窩後部注射によって感染させる。攻撃後5日目または15日目に、マウスを圧縮CO2の吸入によって安楽死させる。腎臓を切除し、1TritonX100中でホモジナイズする。cfuの3回繰り返しの判定のためアリコットを希釈し、寒天培地上にプレーティングする。組織診断のため、腎臓組織を24時間10ホルマリン中にて室温でインキュベートする。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンエオシンで染色し、顕微鏡検査する。ネズミ致命的感染後肢への筋肉内注射により精製SpA、SpADまたはSpADQ9、10KD36、37AでBALBcマウスを免疫する。ワクチンを0日目および11日目に投与する。血液サンプルを0、11および20日目に眼窩後部採血によって採血する。特異的なSpADおよびSpADQ9、10KD36、37A結合活性を有するIgGの力価についてELISAにより血清を調べる。黄色ブドウ球菌Newmanまたは黄色ブドウ球菌USA300懸濁液100μlの眼窩後部注射によって21日目に免疫動物を攻撃する。このため、黄色ブドウ球菌Newmanの終夜培養の培養物を新鮮なトリプトソイブロスに100分の1希釈し、37°Cで3時間増殖させる。ブドウ球菌を遠心分離し、二回洗浄し、PBS中で希釈してA60004を得てから、濃縮する。寒天上でのプレーティングおよびコロニー形成によって希釈を実験的に検証する。マウスを体重1キログラムあたり80~120mgのケタミンおよび3~6mgのキシラジンの腹腔内注射によって麻酔する。2×1010cfuの黄色ブドウ球菌Newmanまたは3~10×109cfuの臨床黄色ブドウ球菌分離株での腹腔内注射によって21日目に免疫動物を攻撃する。動物を14日間モニタリングし、致命的疾患を記録する。ネズミ肺炎モデル黄色ブドウ球菌株NewmanまたはUSA300をOD66005までトリプトソイブロス寒天中にて37°Cで増殖させる。50mlの培養物アリコットを遠心分離し、PBS中で洗浄し、死亡率研究の場合にはPBS750μlに懸濁し、または細菌負荷および組織病理学的実験の場合にはPBS1250μlに懸濁する。肺感染のため、7週齢のC57BL6Jマウスを左鼻孔への黄色ブドウ球菌懸濁液30μlの植菌の前に麻酔する。動物を回復のために背臥位で檻の中に入れ、14日間観察する。能動免疫の場合、4週齢のマウスに0日目にCFA中20μgのSpADまたはSpADQ910KD3637Aを筋肉内経路を介して投与し、引き続き10日目に不完全フロインドアジュバント中20μgのSpADまたはSPADQ910KD3637Aで追加免疫を行う。21日目に黄色ブドウ球菌で動物を攻撃する。血清を免疫前におよび20日目に回収して、特異的抗体の産生を評価する。受動免疫試験の場合、7週齢のマウスに攻撃24時間前に腹腔内注射を介してNRSまたはSpAD特異的なウサギ抗血清のいずれか100μlを投与する。肺炎の病理的相関を評価するために、両肺の除去前に強制CO2吸入によって感染動物を殺処理する。肺細菌負荷の計数のために右肺をホモジナイズする。左肺を1ホルマリンに入れ、パラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンエオシンで染色し、顕微鏡検査する。ウサギ抗体精製されたSpADまたはSpADQ910KD3637A200μgをウサギ抗血清の産生用の免疫原として用いる。0日目の時点で注射用にCFAでタンパク質200μgを乳化し、引き続き21日目および42日目にIFAで乳化されたタンパク質200μgで追加免疫を行う。ウサギ抗体の力価をELISAによって判定する。精製抗体をSpADまたはSpADQ910KD3637Aセファロース上でのウサギ血清のアフィニティークロマトグラフィーによって得る。溶出された抗体の濃度をA280での吸光度によって測定し、特異的抗体の力価をELISAによって測定する。SpAドメインD変種による能動免疫ワクチン効力を判定するために、動物を精製SpADまたはSpADQ910KD3637Aで能動免疫する。対照として、動物をアジュバントだけで免疫する。抗原としてSpADまたはSpADQ910KD3637Aを用いてプロテインA調製物に対する抗体の力価を判定するSpADQ910KD3637A変種はIgGのFcまたはFab部分を結合できないことに注意する。上記の感染性疾患モデルを用いて、細菌負荷のいずれかの低減、ブドウ球菌疾患の組織病理学的証拠ならびに致死的疾患からの防御を測定する。SpAドメインD変種に対して作製されたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体による受動免疫プロテインA特異的ウサギ抗体の防御免疫を判定するために、マウスを5mgkgの精製SpADまたはSpADQ910KD3637A由来ウサギ抗体で受動免疫する。これらの抗体調製物のどちらも、固定化されたSpADまたはSpADQ910KD3637Aを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。対照として、動物をrV10抗体で受動免疫する。この変種はIgGのFcまたはFab部分を結合できないので、SpADQ910KD3637Aを抗原として用いて、全てのプロテインA調製物に対する抗体の力価を判定する。上記の感染性疾患モデルを用いて、細菌負荷の低減、ブドウ球菌疾患の組織病理学的証拠ならびに致死的疾患からの防御を測定する。実施例2メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染のための毒素非産生性プロテインAワクチン黄色ブドウ球菌の臨床分離株はプロテインA、5つのIgBD、8残基ペプチドの可変的反復を有する領域XおよびSpAの細胞壁固定のためのC末端選別シグナルから構成されるを発現する。アミノ酸相同性、IgBDの三重αヘリックスバンドル構造およびFabVH3またはFcγとの原子相互作用による導きで、グルタミン9および10、ならびにアスパラギン酸36および37を、それぞれ、SpAと抗体またはB細胞受容体との結び付きに重要であるとして選択した。置換Gln9Lys、Gln10Lys、Asp36AlaおよびAsp37AlaをDドメインに導入して、SpADKKAAを作製した。ヒトIgGを結合する単離SpADまたはSpADKKAAの能力をアフィニティークロマトグラフィーによって分析した。ポリヒスチジンタグ付きSpADおよび全長SpAはヒトIgGをNiNTA上に保持したのに対し、SpADKKAAおよび陰性対照は保持しなかった。腫瘍壊死因子受容体1とともに、グルタミン9および10を介しプロテインAを同様に結合できる、フォンウィルブランド因子で類似の結果が認められた。ヒト免疫グロブリンは60~70のVH3型IgGを包含する。本発明者らは、IgのFcドメインおよびB細胞受容体活性化を区別し、ともに全長SpAまたはSpADに結合したが、SpADKKAAに結合しなかった、ヒトFcγおよびF2断片の結び付きを測定した。マウスの腹腔内へのSpADの注射はB細胞増加、その後BALBcマウスの脾臓組織におけるCD19リンパ球のアポトーシス崩壊を生じた。B細胞超抗原活性はSpADKKAAによる注射後に認められず、脾臓組織のTUNEL染色では、SpAまたはSpADの注射に続くアポトーシス細胞の増加を検出することができなかった。未処置の6週齢BALBcマウスに、CFA中で乳化された精製SpA、SpADまたはSpADKKAA各50μgを注射し、IFA中で乳化された同じ抗原を追加免疫した。SpADが活性化されたクローン性B細胞集団のアポトーシス崩壊を促進するという仮説に一致して、本発明者らは、B細胞超抗原と比べて毒素非産生性の変種によるマウスの免疫後にSpADKKAA特異的抗体の10倍高い力価を認めた。全長SpAによる免疫でもたらされた抗体の力価は、SpADで誘発されたものよりも高く、これはこの抗原のいっそう大きなサイズおよび反復ドメイン構造による可能性が高い。それにもかかわらず、SpAでさえもプロテインAの50アミノ酸しか含まない、SpADKKAAよりも低い抗体力価を誘発した。免疫マウスを黄色ブドウ球菌Newmanでの静脈内接種によって攻撃し、腎組織において膿瘍をまき散らすブドウ球菌の能力を攻撃から4日後に剖検によって調べた。モック免疫マウスのホモジナイズ腎組織において、646log10CFUg1の平均ブドウ球菌負荷が測定された。SpAまたはSpADによるマウスの免疫は、ブドウ球菌負荷の低下をもたらしたが、SpADKKAAワクチン接種動物は腎組織において黄色ブドウ球菌Newmanのさらに高い、307log10CFUg1の低下を呈した。腎臓における膿瘍形成を組織病理診断によって分析した。モック免疫動物は腎臓あたり平均37個の膿瘍を有していた。SpADKKAAによるワクチン接種は膿瘍の平均数を05にまで減らしたのに対し、SpAまたはSpADによる免疫は膿瘍病変部の数の顕著な低下を引き起こさなかった。SpADKKAAワクチン接種動物由来の病変部はサイズがさらに小さくなり、浸潤PMNがいっそう少なく、ブドウ球菌膿瘍群集を特徴的に欠いていた。SpAまたはSpADで免疫されていた動物における膿瘍は、モック免疫動物での同じ全体構造の病変部を呈した。本発明者らは、SpADKKAA免疫がMRSA菌株からマウスを防御できるかどうか調べ、動物への投与用にUSA300LAC分離株を選択した。この強毒性のCAMRSA菌株は全米中で急速に広まっており、ヒトでの顕著な罹患率および死亡率を引き起こしている。アジュバント対照マウスと比べて、SpADKKAA免疫動物は感染腎臓組織の細菌負荷の107log10CFUg1の低下を有していた。黄色ブドウ球菌USA300投与後の腎組織の組織病理検査は、膿瘍の平均数が404から16まで低減されることを明らかにした。対照的に、SpAまたはSpAD免疫は細菌負荷または膿瘍形成の有意な低下を引き起こさなかった。ウサギをSpADKKAAで免疫し、特異的抗体をSpADKKAAアフィニティーカラム上で精製し、その後SDSPAGEを行った。SpADKKAA特異的なIgGをペプシンで切断してFcγおよびF2断片を作製し、この後者をSpADKKAAカラム上でのクロマトグラフィーによって精製した。ヒトIgGまたはvWFとSpAまたはSpADとの結合は、SpADKKAA特異的なF2によって撹乱され、SpADKKAA由来の抗体がプロテインAのB細胞超抗原の機能およびIgとのその相互作用を中和することを示唆するものであった。毒素非産生性プロテインAのワクチン特性をさらに改善するため、本発明者らは、IgBDの5つのドメインのそれぞれの中に、4つのアミノ酸置換、つまりドメインDのGln9Lys、Gln10Lys、Asp36AlaおよびAsp37Alaに対応する置換を有する全5つのIgBDを含む、SpAKKAAを作製した。ポリヒスチジンタグ付きSpAKKAAをアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、クマシーブルー染色したSDSPAGEによって分析した。全長SpAとは異なり、SpAKKAAはヒトIgG、FcおよびF2またはvWFを結合しなかった。SpAKKAAは、BALBcマウスへのこの変種の注射が脾臓組織においてCD19B細胞の枯渇を引き起こさなかったので、B細胞超抗原活性を呈することができなかった。SpAKKAAワクチン接種は、SpADKKAA免疫よりも高い特異的抗体の力価を生じ、黄色ブドウ球菌USA300の攻撃からの防御増強をマウスに与えた。攻撃から4日後、SpAKKAAワクチン接種動物は腎組織において354log10CFUg1少ないブドウ球菌を有し、膿瘍病変部の数のさらに大幅な低下も引き起こした。SpAKKAAを用いてウサギを免疫した。SpADKKAAまたはSpAKKAAに特異的なウサギ抗体を、固定化された同種抗原を有する基材上でアフィニティー精製し、BALBcマウスの腹腔へ5mgkg1体重の濃度で注射した。24時間後に、特異的抗体の力価を血清中で判定し、動物を黄色ブドウ球菌Newmanの静脈内接種によって攻撃した。受動移入はSpADKKAAまたはSpAKKAA特異的抗体に対する腎臓組織でのブドウ球菌負荷を低減した。組織病理検査に関し、どちらの抗体も黄色ブドウ球菌Newmanで攻撃されたマウスの腎臓における膿瘍病変部の存在量を低減した。総合して、これらのデータは、SpADKKAAまたはSpAKKAAによる免疫後のワクチン防御が、プロテインAを中和する抗体によって与えられることを明らかにしている。表6プロテインAワクチンによるマウスの免疫a免疫1回あたりBALBcマウス15~20匹のコホートにおける感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10CFUg1として計算された、ブドウ球菌負荷の平均。2回の独立したかつ再現可能な動物実験の代表を示す。平均の標準誤差が示してある。b統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録したP値005を有意と見なした。clog10CFUg1として計算された細菌負荷の低下。d無作為に選択した5つの血清IgGの力価の平均をELISAによってブドウ球菌感染の前に測定した。e動物10匹からヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均を目的に再び平均化した。表7プロテインAに対する抗体によるマウスの受動免疫aアフィニティー精製された抗体を1×107CFUの黄色ブドウ球菌Newmanによる静脈内攻撃の24時間前にBALBcマウスの腹腔へ5mgkg1の濃度で注射した。b免疫1回あたりBALBcマウス15匹のコホートにおいて感染から4日後のホモジナイズ腎組織でlog10CFUg1として計算されたブドウ球菌負荷の平均。2回の独立したかつ再現可能な動物実験の代表を示す。平均の標準誤差が示してある。c統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定で計算し、P値を記録したP値005を有意と見なした。dlog10CFUg1として計算された細菌負荷の低下。e無作為に選択した5つの血清IgGの力価の平均をELISAによってブドウ球菌感染の前に測定した。f動物10匹からヘマトキシリンエオシン染色し、薄切片にした腎臓の組織病理診断腎臓あたりの平均膿瘍数を記録し、最終平均を目的に再び平均化した。病毒性の黄色ブドウ球菌による感染の後、マウスは同じ菌株によるその後の感染に対する防御免疫を発現しない。これらの動物におけるSpADKKAA特異的なIgGの平均存在量はドットブロットにより、菌株NewmanおよびUSA300LACに対して、それぞれ、020μgml1および014μgml1と判定された。SpAKKAAまたはSpADKKAAワクチン接種動物での疾患防御に必要なプロテインA特異的IgGの最小濃度は、405μgml1と計算された。成人健常ヒト志願者におけるSpA特異的IgGの平均血清濃度は、021μgml1であった。このように、マウスまたはヒトにおける黄色ブドウ球菌感染は、プロテインAに対して作製される中和抗体の有意なレベルのものを産生させる免疫反応と関係がなく、これはこの分子のB細胞超抗原特性によるものである可能性が高い。対照的に、ヒト志願者におけるジフテリア毒素に特異的なIgGの平均血清濃度0068μgml1は、ジフテリアに対する防御免疫の範囲内であった。臨床黄色ブドウ球菌分離株はプロテインA、すなわち、そのB細胞超抗原活性およびオプソニン作用による排除からの回避性は、ブドウ球菌膿瘍形成のために絶対必要な必須の病毒性因子を発現する。プロテインAはしたがって、防御免疫を達成するにはその分子特性が中和されなければならない、発病に不可欠な、毒素と考えられうる。FcγまたはVH3Fabドメインを介してIgを結合できない毒素非産生性の変種を作製することにより、本発明者らは本明細書で初めて、プロテインA中和免疫反応を、黄色ブドウ球菌感染からの防御免疫に相互に関連するものとして測定する。多くのメチシリン感受性菌株とは対照的に、CAMRSA分離株のUSA300LACは病毒性がはるかに高い。例えば、表面抗原IsdBでの実験動物の免疫は、黄色ブドウ球菌Newmanに対する防御を与える抗体を産生させるが、USA300による攻撃に対してはそうでない。使用した方法は以下を含む:細菌株および増殖黄色ブドウ球菌株NewmanおよびUSA300はトリプトソイブロスにて37°Cで増殖させた。大腸菌株DH5αおよびBL21は、100μgml1のアンピシリンを有するルリアベルターニブロスにて37°Cで増殖させた。ウサギ抗体黄色ブドウ球菌Newmanの鋳型DNAを用いて二つのプライマーでSpAのコード配列をPCR増幅した。二つのプライマーでSpADをPCR増幅した。Q9KQ10Kの場合にはならびにD36AD37Aの場合にはの二セットのプライマーでSpADKKAAの配列を突然変異誘発させた。SpAKKAAの配列はIntegratedDNATechnologiesIncによって合成された。PCR産物をpET15bにクローニングし、N末端His6タグ付き組み換えタンパク質を作製した。プラスミドをBL21に形質転換した。形質転換体の終夜培養の培養物を新鮮な培地中で100分の1倍に希釈し、37°CでOD60005まで増殖させ、この時点で培養物を1mMイソプロピルβD1チオガラクトピラノシドで誘導し、さらに3時間増殖させた。細菌細胞を遠心分離により沈降させ、カラム用緩衝液に懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機により14000psiで破壊した。溶解物から40000×gでの超遠心分離によって膜および不溶性成分を除去した。可溶性溶解物中のタンパク質をニッケルニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーに供した。連続的に高濃度のイミダゾールを含有するカラム用緩衝液中にタンパク質を溶出させた。ビシンコニン酸アッセイ法によってタンパク質濃度を判定した。抗体産生のため、ウサギに、完全フロインドアジュバント中で乳化されたタンパク質500μgを被膜下注射によって免疫した。追加免疫のため、タンパク質を不完全フロインドアジュバント中で乳化し、初回免疫から24日または48日後に注射した。60日目に、ウサギから採血し、血清を回収した。精製抗原をHiTrapNHS活性化HPカラムに共有結合的に連結させた。4°Cでのウサギ血清10~20mlのアフィニティークロマトグラフィーのために抗原基材を用いた。充填された基材を50カラム容量のPBSで洗浄し、抗体を溶出用緩衝液で溶出し、1MTrisHClpH85ですぐに中和した。精製抗体を4°CでPBSに対して終夜透析した。F2断片アフィニティー精製された抗体をペプシン3mgと37°Cで30分間混合した。反応液を1MTrisHClpH85でクエンチし、F2断片を、特異的抗原を結合させたHiTrapNHS活性化HPカラムでアフィニティー精製した。精製抗体を4°CでPBSに対して終夜透析し、SDSPAGEゲルに負荷し、クマシーブルー染色で可視化した。能動および受動免疫BALBcマウスに、完全フロインドアジュバント中で乳化されたタンパク質50μgを筋肉内注射によって免疫した。追加免疫のため、タンパク質を不完全フロインドアジュバント中で乳化し、初回免疫から11日後に注射した。免疫後20日目に、マウス5匹から採血して酵素結合免疫吸着アッセイ法による特異的抗体の力価を目的に血清を得た。黄色ブドウ球菌の投与の24時間前に、BALBcマウスの腹腔へ、実験動物の体重1kgあたり5mgの濃度で、PBS中のアフィニティー精製抗体を注射した。動物の血液を眼窩周囲静脈穿刺によって集めた。血液細胞をヘパリン処理したマイクロヘマトクリット毛細管で取り出し、Zゲル血清分離マイクロ管を用いて集め、ELISAにより抗原特異的な抗体の力価を測定した。マウス腎膿瘍黄色ブドウ球菌NewmanまたはUSA300の終夜培養の培養物を新鮮TSB中に100分の1希釈し、37°Cで2時間増殖させた。ブドウ球菌を沈降させ、洗浄し、OD60004でPBSに懸濁した。サンプルアリコットをTSA上に広げ、形成されたコロニーを数え上げることによって接種材料を定量化した。BALBcマウスを体重1キログラムあたり100mgml1のケタミンおよび20mgml1のキシラジンの腹腔内注射によって麻酔した。眼窩後部注射によって1×107CFUの黄色ブドウ球菌Newmanまたは5×106CFUの黄色ブドウ球菌USA300をマウスに感染させた。攻撃後4日目に、マウスをCO2の吸入によって殺処理した。両方の腎臓を切除し、一方の器官におけるブドウ球菌負荷を、PBS1TritonX100で腎組織をホモジナイズすることによって分析した。ホモジネートの連続希釈液をTSA上に広げ、コロニー形成のためにインキュベートした。残りの器官は組織病理診断によって調べた。手短に言えば、腎臓を室温にて24時間10ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、ヘマトキシリンエオシンで染色し、光学顕微鏡検査により検査して膿瘍病変部を数え上げた。全てのマウス実験は、シカゴ大学の施設内生物安全委員会および動物実験委員会による実験プロトコルの審査および承認に従う施設内ガイドラインによって実施された。プロテインA結合ヒトIgGの結合のため、NiNTAアフィニティーカラムにカラム用緩衝液中200μgの精製タンパク質を予め充填した。洗浄後、ヒトIgG200μgをカラムに負荷した。タンパク質サンプルを洗浄液および溶出液から回収し、SDSPAGEゲル電気泳動に供し、引き続いてクマシーブルー染色を行った。精製タンパク質を01M炭酸緩衝液中1μgml1の濃度で終夜4°CにてMaxiSorpELISAプレート上にコーティングした。プレートを次に、5全乳でブロッキングし、ペルオキシダーゼ結合ヒトIgG、FcまたはF2断片の連続希釈液とのインキュベーションを1時間行った。プレートを洗浄し、OptEIAELISA試薬を用いて発色させた。反応を1Mリン酸でクエンチし、A450の読み出しを用いて最大半量の力価および結合割合を計算した。フォンウィルブランド因子結合アッセイ法精製タンパク質を上記のようにコーティングし、ブロッキングした。プレートを2時間1μgml1の濃度のヒトvWFとともにインキュベートし、次いで洗浄し、さらに1時間ヒトIgGでブロッキングした。洗浄後、プレートを、ヒトvWFに対して作製されたペルオキシダーゼ結合抗体の連続希釈液とともに1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、OptEIAELISA試薬を用いて発色させた。反応を1Mリン酸でクエンチし、A450の読み出しを用いて最大半量の力価および結合割合を計算した。阻害アッセイ法のため、プレートをリガンド結合アッセイ法の前に1時間10μgml1の濃度のSpADKKAA特異的アフィニティー精製F2断片とともにインキュベートした。脾細胞アポトーシスアフィニティー精製されたタンパク質をBALBcマウスの腹腔へ注射した。注射から4時間後に、動物をCO2の吸入によって殺処理した。それらの脾臓を切除し、ホモジナイズした。細胞ろ過器を用いて細胞残屑を除去し、懸濁細胞をACK溶解用緩衝液に移入して、赤血球を溶解した。白血球を遠心分離により沈降させ、PBSに懸濁し、250分の1希釈されたRPE結合抗CD19モノクローナル抗体で氷上および暗所中にて1時間染色した。細胞を1FBSで洗浄し、4°Cにて終夜4ホルマリンで固定した。翌日、細胞をPBS中で希釈し、フローサイトメトリーによって分析した。組織病理診断を目的に、残りの器官を調べた。手短に言えば、脾臓を室温にて24時間10ホルマリン中で固定した。組織をパラフィン包埋し、薄片にし、Apoptosis検出キットで染色し、光学顕微鏡検査により検査した。抗体定量化血清を、30日間黄色ブドウ球菌NewmanもしくはUSA300で感染されていたか、または上記のようにSpADKKAASpAKKAAで免疫されていた健常ヒト志願者またはBALBcマウスから回収した。ヒトマウスIgG、SpAKKAAおよびCRM197をニトロセルロース膜上にブロットした。膜を5全乳でブロッキングし、引き続きヒトまたはマウス血清のいずれかとのインキュベーションを行った。IRDye700DX結合アフィニティー精製抗ヒトマウスIgGを用いてOdyssey赤外画像システムによりシグナル強度を定量化した。ヒト志願者由来の血液を用いた実験では、シカゴ大学の施設内治験審査委員会の規制監督下で審査され、承認され、実施されたプロトコルを伴った。統計解析両側スチューデントt検定を実施して、腎膿瘍、ELISAおよびB細胞超抗原のデータの統計的有意性を解析した。参考文献以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補完する例示的な手順またはその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に特に組み入れられる。