"組換え微生物であって、野生型生物と比較してケト酸フラックスが増加していること、および、発現すると野生型生物と比較してより多くの量の化学生成物の生成をもたらす酵素をコードするポリヌクレオチドを少なくとも1つ含むことを特徴とする組換え微生物。デヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、および/またはデアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の組換え微生物。前記デヒドロゲナーゼが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenaseE.C.1.4.1.2およびE.C.1.4.1.4、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamicdehydrogenaseE.C.1.4.1.3、バリンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.8、ロイシンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.9、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.20からなる群から選択される、請求項2に記載の組換え微生物。前記ロイシンデヒドロゲナーゼがLeuDHである、請求項3に記載の組換え微生物。前記ロイシンデヒドロゲナーゼLeuDHが、Thermoactinomycesintermedius由来である、請求項4に記載の組換え微生物。前記デアミナーゼが、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ4.3.1.1、L-セリンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.17、D-セリンアンモニアリアーゼ4.3.1.18、トレオニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.19、チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.23、フェニルアラニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.24、およびフェニルアラニン/チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.25からなる群から選択される、請求項2に記載の組換え微生物。前記デアミナーゼがセリンデアミナーゼSdaBである、請求項6に記載の組換え微生物。前記セリンデアミナーゼdeaminsaseSdaBが、Escherichiacoli、Rosebacteratrosepticum、Corynebacteriumdiphtheriae、Salmonellaenerica、Yersiniaenterocolitica、またはBurkholderiapseudomallei由来である、請求項7に記載の組換え微生物。前記トランスアミナーゼが、L-α-トランスアミナーゼE.C.2.6.1.X式中、Xは任意の数であるである、請求項2に記載の組換え微生物。前記L-α-トランスアミナーゼが、L-アスパラギン酸トランスアミナーゼE.C.2.6.1.1、L-アラニントランスアミナーゼE.C.2.6.1.12およびE.C.2.6.1.47、L-アスパラギントランスアミナーゼE.C.2.6.1.14、およびグリシントランスアミナーゼE.C.2.6.1.35からなる群から選択される、請求項9に記載の組換え微生物。前記L-アスパラギン酸トランスアミナーゼがAvtAである、請求項10に記載の組換え微生物。AvtAが、Escherichiacoli、Neisseriameningitidis、Pantoeaananatis、Amycolatopsismediterranei、Mannheimiasuccinicproducens、Salmonellaenterica、またはYersiniapestis由来である、請求項11に記載の組換え微生物。野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、オートインデューサー2再取り込み活性の低下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenase活性の低下、グルタミンシンターゼ活性の低下、グルタミン酸シンターゼ活性の低下、クオラムセンシング遺伝子活性の低下、および/または全体的な調節因子活性の低下をさらに特徴とする、請求項2から12のいずれかに記載の組換え微生物。前記クオラムセンシング活性の低下が、遺伝子luxSもしくはlsrAの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項13に記載の組換え微生物。前記アンモニア再取り込み活性の低下が、遺伝子gdhAおよびglnAの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項13に記載の組換え微生物。前記全体的な調節因子活性の低下が、遺伝子CRP、LRP、Fis、および/またはIHFの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する、請求項13に記載の組換え微生物。前記化学生成物が、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、およびS-アデノシル-メチオニンSAMからなる群から選択される、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記アルコールが、エタノール、1-プロパノールproponol、n-ブタノール、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノールおよび3-メチル-ブタノールからなる群から選択される、請求項17に記載の組換え微生物。前記化学生成物がピルベートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、2,3-ブタンジオール、L-乳酸、D-乳酸、芳香族物質、ポリヒドロキシブチレートPHB、メバロネート、イソプレノイド、エタノール、イソブタノール、n-ブタノール、および脂肪酸からなる群から選択される、請求項19に記載の組換え微生物。前記芳香族物質が、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、およびシキミ酸からなる群から選択される、請求項20に記載の組換え微生物。前記化学生成物が2-ケトグルタル酸から生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学生成物が、GABA4-アミノ酪酸、グルタミン酸、スクシネートおよびリンゴ酸からなる群から選択される、請求項22に記載の組換え微生物。前記化学物質がオキサロアセテートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、アスパラギン酸、リシン、カダベリンcadeverine、2-ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニンおよびS-アデノシル-メチオニンSAMからなる群から選択される、請求項24に記載の組換え微生物。前記化学物質が2-ケトブチレートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニン、および2-メチル-1-ブタノールである、請求項26に記載の組換え微生物。前記化学物質が2-ケトイソバレレートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、イソブチルアルデヒド、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソブタノール、3-メチル-1-ブタノール、およびバリンからなる群から選択される、請求項28に記載の組換え微生物。前記化学物質が2-ケトイソカプロエートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、ロイシン、および1-ブタノールからなる群から選択される、請求項30に記載の組換え微生物。前記化学生成物が2-ケト-3-メチルバレレートから生成する、請求項1から16までのいずれかに記載の組換え微生物。前記化学物質が、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシン、および2-メチル-1-ブタノールからなる群から選択される、請求項32に記載の組換え微生物。前記野生型生物が、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される、請求項1から33までのいずれかに記載の組換え微生物。前記野生型生物が、Clostridium、Zymonomas、Escherichia、Salmonella、Rhodococcus、Pseudomonas、Bacillus、Lactobacillus、Enterococcus、Alcaligenes、Klesiella、Paenibacillus、Arthrobacter、Corynebacterium、Brevibacterium、Pichia、Candida、Hansenula、Synechococcus、Synechocystis、Anabaena、Ralstonia、Lactococcus、Saccharomyces、Brevibacterium、Arthrobacter、およびMicrobacteriumからなる属から選択される、請求項34に記載の組換え微生物。前記野生型生物が、Escherichiacoli、Alcaligeneseutrophus、Bacilluslicheniformis、Zymonomasmobilis、Paenibacillusmacerans、Rhodococcuserythropolis、Pseudomonasputida、Bacillussubtilis、Lactobacillusplantarum、Corynebacteriumglutamicum、Enterococcusfaecium、Enterococcusgallinarium、Enterococcusfaecalis、Saccharomycescerevisiae、Synechocystissp.、Anabaenasp.、Ralstoniaeutropha、Lactococcuslactis、およびSynechococcuselongatusからなる群から選択される、請求項35に記載の組換え微生物。タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸を含むバイオマスを、請求項1から36までのいずれかに記載の組換え微生物と、化学生成物の生成を促す条件下で接触させることにより、前記バイオマスから化学生成物を生成するためのプロセスであって、生成された化学生成物の量が、野生型生物によって生成される量より多いプロセス。前記バイオマスが、藻類、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣DDGS;DriedDistillersGrainswithSolubles、細菌、動物残渣、植物、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの混合物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項37に記載のプロセス。前記バイオマスが、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリア、Escherichiacoli、またはBaccilussubtilisであった、請求項38に記載のプロセス。前記バイオマスが、Chorellavulgaris、Porphyridiumpurpureum、Spirulinaplatensis、またはSynechococcuselongatesであった、請求項39に記載のプロセス。前記バイオマスが、前記組換え微生物と接触させる前に部分的に分解されている、請求項37から40までのいずれかに記載のプロセス。前記バイオマスがプロテアーゼおよび/または熱で処理されたものである、請求項41に記載のプロセス。前記バイオマスが、60~100°Cにわたる温度で加熱し、プロテアーゼで処理することによって加水分解されたものである、請求項42に記載のプロセス。前記バイオマスを前記組換え微生物と接触させ、前記バイオマスを、リシン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを20種全てのアミノ酸残基の混合物に変換する第2の微生物と接触させることをさらに含む、請求項37から43までのいずれかに記載のプロセス。前記二次的な微生物を、前記組換え微生物と接触させる前に前記バイオマスと接触させる、請求項44に記載のプロセス。前記第2の微生物がPseudomonasおよび/またはBacillusである、請求項44または45に記載のプロセス。要旨本開示は、窒素に富む材料例えば、タンパク質性材料の、炭素ベースの燃料および化学物質などの種々の化学化合物を生成するための原料としての使用について記載する。種々の実施形態では、本開示は、任意の発酵の主要原料としてタンパク質を使用する方法に関し得る。該方法は、細胞バイオマスを加熱し、消化して、タンパク質を部分的に破壊し、次いで、処理した細胞バイオマスを、種々の微生物発酵において単一の炭素源として用いて、アルコール、有機酸および他の化学物質を含めた種々の生物由来物質bioproductを生成することを含み得る。別の実施形態では、本開示は、前記細胞バイオマスを効率的に利用するための特定の微生物株の開発を含み得る。細胞バイオマスは、タンパク質性バイオマス可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣DDGS;DriedDistillersGrainswithSolubles、藻類の粗粉または粕、細菌の発酵粕などを含有するあらゆる種類の細菌、酵母、真菌、シアノバクテリア、藻類、および任意の粗材料を含む。一実施形態では、アミノ酸を分解して、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ならびにそれらの混合物を含むタンパク質性バイオマスを単一の炭素源として利用することを可能にする強力な能力を有する特定の微生物株を開発する。種々のアミノ酸を消化するための代謝経路は、遺伝子突然変異誘発およびランダム突然変異誘発のどちらによっても工学的に操作される。ある特定の実施形態では、タンパク質およびポリペプチドを小さなペプチドに消化することができ、それらを組換え微生物に輸送し、アミノ酸に分解することができる。アミノ酸は種々の2-ケト酸に変換される。最後に、これらの2-ケト酸は、微生物に導入された種々の組換え経路を通じて、例えば、より長い鎖のアルデヒドまたはアルコールなどの所望の化学的実体に変換される。それらの中で、ロイシン、イソロイシン、およびバリンは、ロイシンデヒドロゲナーゼまたはこれらのアミノ酸を2-ケト酸に変換する他の酵素により、対応する2-ケト酸に直接変換される。セリン、システイン、トリプトファン、およびアラニンおよびグリシンは、ピルベートに変換され、それがさらに2-ケトイソバレレートに変換され、それはさらに、例えば、イソブタノールを合成するために使用され得る。グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびプロリンは、2-ケトグルタル酸に変換され、それがさらにトレオニンに変換され、それは、例えば、1-プロパノールの生成に使用され得る、またはリンゴ酸酵素により、またピルベートに変換され得る。ピルベートは、例えば、イソブタノールの生成に使用され得る。または、ピルベートに変換されるタンパク質性バイオマスは全てエタノールを生成するようにも変換され得る。残りのアミノ酸は、成長を支持する、またはエネルギーの供給源としての機能を果たすようにランダム突然変異誘発によって工学的操作をした。別の実施形態では、タンパク質性バイオマスを処理し、さまざまな種類の化学物質生成の重要な中間体、例えば、ピルビン酸、2-ケトグルタル酸などに変換する。前記化学物質は、例えば、これに限定するものではなく、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸およびガンマ-アミノ酪酸GABAを含み得る。本発明は列挙されている化学物質の生成のみに限定されない。本開示は、ある実施形態では、野生型生物と比較してケト酸フラックスが増加していること、および、発現すると野生型生物と比較して大量の化学生成物の生成をもたらす酵素をコードするポリヌクレオチドを少なくとも1つ含むことを特徴とする組換え微生物を提供する。より詳細には、組換え微生物は、デヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、および/またはデアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、デヒドロゲナーゼは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenaseE.C.1.4.1.2およびE.C.1.4.1.4、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamicdehydrogenaseE.C.1.4.1.3、バリンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.8、ロイシンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.9、またはフェニルアラニンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.20である。典型的な実施形態では、ロイシンデヒドロゲナーゼはLeuDHであってよく、これは、Thermoactinomycesintermediusから単離することができる。特定の他の実施形態では、組換え微生物は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ4.3.1.1、L-セリンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.17、D-セリンアンモニアリアーゼ4.3.1.18、トレオニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.19、チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.23、フェニルアラニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.24、およびフェニルアラニン/チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.25から選択されるデアミナーゼを含んでよい。より詳細には、デアミナーゼはセリンデアミナーゼSdaBであってよく、これは、例えば、Escherichiacoli、Rosebacteratrosepticum、Corynebacteriumdiphtheriae、Salmonellaenerica、Yersiniaenterocolitica、またはBurkholderiapseudomallei由来であってよい。さらに、組換え微生物は、L-α-トランスアミナーゼE.C.2.6.1.X、Xは任意の数であるであるトランスアミナーゼを含んでよい。特定の実施形態では、L-α-トランスアミナーゼは、L-アスパラギン酸トランスアミナーゼE.C.2.6.1.1、L-アラニントランスアミナーゼE.C.2.6.1.12およびE.C.2.6.1.47、L-アスパラギントランスアミナーゼE.C.2.6.1.14、またはグリシントランスアミナーゼE.C.2.6.1.35であってよい。ある特定の実施形態では、L-アスパラギン酸トランスアミナーゼはAvtAであってよく、これは、例えば、Escherichiacoli、Neisseriameningitidis、Pantoeaananatis、Amycolatopsismediterranei、Mannheimiasuccinicproducens、Salmonellaenterica、またはYersiniapestis由来であってよい。本開示は、野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、オートインデューサー2再取り込み活性の低下、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenase活性の低下、グルタミンシンターゼ活性の低下、グルタミン酸シンターゼ活性の低下、クオラムセンシング遺伝子quorumsensinggene活性の低下、および/または全体的な調節因子活性の低下をさらに特徴とする組換え微生物も提供する。ある特定の実施形態では、クオラムセンシング活性の低下は遺伝子luxSまたはlsrAの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来し、アンモニア再取り込み活性の低下は遺伝子gdhAおよびglnAの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来し、全体的な調節因子活性の低下は遺伝子CRP、LRP、Fis、および/またはIHFの欠失、またはその発現もしくは機能の低下に由来する。本発明の組換え微生物は、特に、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリンcadeverine、2-ケトアジピン酸、およびS-アデノシル-メチオニンSAMなどの化学生成物を生成することが開示されている。ある特定の実施形態では、アルコールは、エタノール、1-プロパノールproponal、n-ブタノール、イソブタノール、2-メチル-1-ブタノールおよび3-メチル-ブタノールからなる群から選択される。さらに、本開示は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、または酵母である野生型生物に由来し得る組換え微生物を提供する。より詳細には、野生型微生物は、例えば、Clostridium、Zymonomas、Escherichia、Salmonella、Rhodococcus、Pseudomonas、Bacillus、Lactobacillus、Enterococcus、Alcaligenes、Klesiella、Paenibacillus、Arthrobacter、Corynebacterium、Brevibacterium、Pichia、Candida、Hansenula、Synechococcus、Synechocystis、Anabaena、Ralstonia、Lactococcus、Saccharomyces、Brevibacterium、Arthrobacter、またはMicrobacteriumなどの属由来である。より詳細には、野生型生物は、例えば、Escherichiacoli、Alcaligeneseutrophus、Bacilluslicheniformis、Zymonomasmobilis、Paenibacillusmacerans、Rhodococcuserythropolis、Pseudomonasputida、Bacillussubtilis、Lactobacillusplantarum、Corynebacteriumglutamicum、Enterococcusfaecium、Enterococcusgallinarium、Enterococcusfaecalis、Saccharomycescerevisiae、Synechocystissp.、Anabaenasp.、Ralstoniaeutropha、Lactococcuslactis、およびSynechococcuselongatusであってよい。本開示は、2-ケト酸を含む代謝産物から、アミノ酸源を用いて所望の化学的実体を生成する組換え微生物も提供する。一実施形態では、微生物を、ロイシンデヒドロゲナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼからなる群から選択される活性を有するポリペプチドを発現または過剰発現するように改変する。さらに別の実施形態では、微生物を、それぞれ、GlyからL-Ser、それからピルベートへの変換;L-Cysからピルベートへの変換;L-AlaからD-Ala、それからピルベートへの変換に有用であるglyA、sda、tnaA、dadX、dadAと示される酵素を発現または過剰発現するように工学的に操作する。さらに別の実施形態では、微生物は、ybaS、yneH、putA、astABCDEから選択される酵素を発現または過剰発現し、これにより、グルタミン、プロリン、およびアルギニンがそれぞれグルタミン酸に変換され、今度はそれが酵素gdhAにより代謝されて2-ケトグルタル酸になる。一実施形態では、組換え微生物は、工学的に操作して微生物に入れた1つまたは複数のポリペプチドの発現によりアルファ-アジピン酸を生成する。グルタミン酸経路では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenasegdh活性を有するポリペプチドにより、グルタミン酸が2-KG2-ケトグルタル酸に変換される。ホモクエン酸シンターゼhcs活性およびホモアコニターゼhomoacornitasehacAB活性を有するポリペプチドの連続した反応により、2-KGがホモイソシトレートに変換され、それが、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼhicDH活性を有するポリペプチドにより還元的脱炭酸されてアルファケトアジピン酸になる。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Saccharomycescerevisiae、Thermusthermophilus、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、グルタミン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを、例えば、S.cerevisiaeおよびT.thermophilusを含む種々の生物からクローニングする。本開示のリシン経路では、リシンアミノトランスフェラーゼlat活性を有するポリペプチドによりリシンが脱アミノ化されて2-アミノアジピン酸-6-セミアルデヒドになる。次いで、ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcd活性を有するポリペプチドによりアルファアミノアジピン酸の形成が触媒される。次いで、2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadat活性を有するポリペプチドによりアミン基が脱アミノ化される。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Flavobacteriumlutescens、Streptomycesclavuligerus、Homosapiens、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、酵素をコードするポリヌクレオチドを、例えば、F.lutescens、S.clavuligerus、H.sapiensなどを含む種々の生物からクローニングすることができる。アジピン酸を中間体であるアルファケトアジピン酸から生成するために、図3に示されている通り、1つの化学的経路に加えて2つの生物学的経路CoA非依存性経路およびCoA依存性経路を工学的に操作した。生物学的変換については、アルファケトアジピン酸は、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼldhA活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼhdh活性を有するポリペプチドを含むデヒドロゲナーゼ活性を有する種々のポリペプチドによりアルファ-ヒドロキシアジピン酸に変換される。CoA非依存性経路では、嫌気的条件下で、オキサロアセテートを、マレートおよびフマレートを経由してスクシネートに変換する天然の還元的TCA回路の模倣経路を工学的に操作した。フマル酸レダクターゼfumAまたはfumBの突然変異誘発により、アルファ-ヒドロキシアジピン酸の脱水を促進するポリペプチドがもたらされ得る。Clostridiumacetobutyricum由来のクロトン酸エステルデヒドロゲナーゼの突然変異体により、さらなるステップを構築することができる。CoA依存性経路では、Clostridiumdifficilleにおけるイソカプロエート生成経路を用いて、アルファヒドロキシアジピン酸をアジピン酸に変換するポリペプチドを引き出すことができる。第1のステップは、R-2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAを生じるCoAトランスフェラーゼhadA活性を有するポリペプチドによって触媒される。次いで、デヒドラターゼ-活性化因子複合体例えば、hadBC-hadIによるR-2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAの脱水によって2-イソカプレノイル-CoAが生じ、これは、アシルCoAデヒドロゲナーゼacdB-etfBA活性を有するポリペプチドにより還元されてイソカプロイルCoAになる。最後に、CoA部分がCoAトランスフェラーゼhadAによって除去されて、アジピン酸を生成する。プラチナを含む種々の金属触媒を用いて、アルファケトアジピン酸を化学的還元してアジピン酸にすることも可能である。一実施形態では、本開示は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenasegdh活性を有するポリペプチド、ホモクエン酸シンターゼhcs活性を有するポリペプチド、ホモアコニターゼhacAB活性を有するポリペプチド、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼhicDH活性を有するポリペプチド、前述のポリペプチドの任意の組み合わせをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。別の実施形態では、本開示は、リシンアミノトランスフェラーゼlat活性を有するポリペプチド、ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcd活性を有するポリペプチド、2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadat活性を有するポリペプチド、前述のポリペプチドの任意の組み合わせをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。さらに別の実施形態では、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼldhA活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼhdh活性を有するポリペプチドを含む、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを発現させるために、同じ細菌または異なる細菌を組換えによって改変することができる。別の実施形態では、本開示は、アジピン酸がアルファケトアジピン酸から生成するように、CoAトランスフェラーゼhadA活性を有するポリペプチド、デヒドラターゼ-活性化因子複合体例えば、hadBC-hadO活性を有するポリペプチド、アシルCoAデヒドロゲナーゼacdB-etfBA活性を有するポリペプチド、CoAトランスフェラーゼhadA活性を有するポリペプチドおよび前述のポリペプチドの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドを導入することによって改変した組換え細菌を提供する。さらに、本開示は、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸を含むバイオマスを、上記の組換え微生物のいずれかを有するバイオマスと、化学生成物の生成を促す条件下で接触させることにより、バイオマスから化学生成物を生成するためのプロセスであって、生成された化学生成物の量が、野生型生物によって生成される量より多いプロセスを提供する。組換え微生物を成長させるために使用するバイオマスは、例えば、藻類、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣DDGS、細菌、動物残渣、植物、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの混合物、およびそれらの任意の組み合わせであってよい。本明細書に記載のある特定の実施形態では、バイオマスは、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリア、Escherichiacoli、またはBaccilussubtilisであってよい。記載されている特定の実施形態では、バイオマスはChorellavulgaris、Porphyridiumpurpureum、Spirulinaplatensis、またはSynechococcuselongatesであった。さらに、バイオマスは、組換え微生物と接触させる前に部分的に分解することができる。ある特定の実施形態では、バイオマスは、プロテアーゼおよび/または熱で処理することができる。例えば、バイオマスを加熱することによって、例えば、60~100°Cにわたる温度で加熱すること、およびプロテアーゼで処理することによって加水分解した。ある特定の実施形態では、バイオマスを、リシン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを20種全てのアミノ酸残基の混合物に変換する第2の微生物と接触させることができるプロセスが開示されている。具体的には、バイオマスを、組換え微生物と接触させる前に第2の微生物と接触させる。第2の微生物は、Pseudomonasおよび/またはBacillusであってよい。本開示の1つまたは複数の実施形態の詳細は、付属図および以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、および利点は、明細書および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書に組み入れられ、その一部を構成する付属図は、本開示の1つまたは複数の実施形態を例示し、発明を実施するための形態と共に、本発明の原理および実施を説明するのに役立つ。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形a1つのandおよび、およびtheそのは、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、a1つのポリヌクレオチドへの言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、theその微生物への言及は、1つまたは複数の微生物への言及を含む、などである。別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の方法および組成物の実施において用いることができるが、本明細書には典型的な方法、デバイスおよび材料が記載されている。上記および本文全体にわたって記載されている刊行物はいずれも、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書における全てが、本発明者らが、先行開示に基づいてそのような開示に先行する権限がないことを容認するものと解釈されるべきではない。本明細書において提供される特定の例を用いて、例えば、タンパク質性バイオマス、タンパク質加水分解物proteinhydrosylate、アミノ酸の混合物、および単一の遊離アミノ酸などを含む基質の、種々の2-ケト酸の生成における転換および使用を実証する。下により詳しく記載されている通り、2-ケト酸はその後、バイオ燃料に加えて追加的な化学的実体にさらに代謝され得る。植物および藻類は窒素を固定しないので、植物または藻類による大規模なバイオ燃料生成はいずれも、後で主にタンパク質および少量の核酸としてバイオマスに組み入れられるアンモニウムまたは硝酸の形態に固定された窒素を必要とする。生物学的窒素固定は、Rhizobiumなどの一部の共生細菌、およびAnabaenaなどの一部の自由生活微生物によって行われる、遅く、大量のエネルギーを消費するプロセスである。非生物学的窒素固定は、ハーバーボッシュHaber-Boschプロセスとして公知の触媒作用によるプロセスによって実現され、これもまた大量のエネルギーを消費し、環境的に都合が悪い。NH3を1モル生成するためには、生物学的窒素固定ではATP8モルおよび4還元当量、またはハーバーボッシュHaber-Boschプロセスでは0.8MJ窒素1kg当たり57MJが必要である。バイオ燃料を生成するために、植物バイオマスまたは藻類の脂質を炭素ベースの燃料に変換し、残りの窒素に富むバイオマスは動物用飼料として使用する図1Aおよび1B。これらの場合、ハーバーボッシュHaber-Boschプロセスを通じて固定された窒素の正味の投入が必要である図1C。現行の窒素肥料の化学合成はすでに1年当たり1億トンに達しており、全体的な一次エネルギー供給の約1.2を消費しており、バイオ燃料プロセスの規模を拡大すれば実質的に増加することになる。動物用飼料として使用される窒素に富む残渣は、動物の排泄物を通じて間接的に温室効果ガスGreenHouseGasesGHGを創出する。動物用飼料には現在のところ高値が付いているが、市場はすぐに飽和するであろう図1C。潜在的な米国の家畜への窒素に富むバイオ燃料残渣すなわち、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣、DDGSの需要の総量は約4,200万トンであり、これは植物ベースのバイオ燃料154億ガロンまたは藻類バイオ燃料43億ガロンの副生成物に対応し、これは、それぞれ、米国における液体燃料の使用総量のおよそ7.7、または2.1である。したがって、窒素を再利用しなければ、バイオ燃料の大規模生産は上記のレベルを越え、その結果、還元された窒素またはGHGが地球上に最終的に蓄積し、実施を持続できなくなる。2つの主要なバイオ燃料生成のスキーム図1Aおよび1Bの間で、一般には、藻類は植物より速く成長し倍加時間が24時間未満である、食物の生産と競合しない。しかし、藻類バイオマスは大量のタンパク質を含有し図5、大規模な正味の窒素投入を必要とする。さらに、成長が速い種は、多量のタンパク質および少量の液体を含有する。一般には、窒素制限を用いて、成長速度を犠牲にして脂質の蓄積を促進する。したがって、脂質生成種は、閉鎖バイオリアクター内で培養しなければならないか、または、タンパク質に富む天然種に占領される可能性に直面するかのいずれかである。この状況は、高価な閉鎖培養系を使用するか脂質含有量が低い種を利用するかのいずれかという逆説を創出する。この問題を解決するためには、ネイティブな成長が早い藻類種はその地方の塩度、温度、およびpHに気候順化するので、これらの種を開放池で用い、同時に窒素を再利用することが理想的である。成長が速い種は、一般には高タンパク質低脂質を含有するので、燃料を生成するためにタンパク質に富むバイオマスを利用すること、および固定された窒素を再利用することにより、低費用の開放培養系を活用しながら、アンモニア合成のためのエネルギー費および間接的なGHGの放出を著しく低下させることができる図1D。リグニンと不応性の複合物を形成するセルロースとは異なり、単細胞タンパク質は、プロテアーゼにより、短いペプチドおよびアミノ酸に容易に加水分解することができ、これはすでに種々の適用のために工業的に使用されている。ペプチド結合の解離エネルギー308KJ/molは、セルロースのβ-グリコシド結合より低く360KJ/mol、容易に破壊される。さらに、微生物は短いペプチドを利用することができるので、タンパク質の加水分解は完全である必要はない。Kcatがおよそ100~1000s-1であるプロテアーゼはセルラーゼKcatが、前処理した後の可溶性基質に対してさえ、およそ0.1~10s-1であるより有効な酵素であり、多くの微生物はプロテアーゼを自然に分泌することができ、これにより、一段階の最終的な強化されたバイオプロセシングの可能性がもたらされる。下により詳しく記載されている通り、本開示は、微生物タンパク質バイオマスを含む基質は、前処理および酵素による加水分解の単純なプロセスによって容易に加水分解することができることを実証している。例として、前処理は、水中で10分間煮沸することからなってよい。酵素による加水分解は、37°Cで4時間、プロテアーゼを最小限添加することによって実現することができる。このタンパク質バイオマスの加水分解プロセスは、セルロースの加水分解プロセスでは一般的である高圧、高温、化学物質の添加、より長い前処理、またはより長い酵素による加水分解時間のいずれも必要としない。ペプチドおよびアミノ酸を基質としてバイオ燃料に変換し、同時に窒素を再利用するために、デアミナーゼ、アミノトランスフェラーゼまたはデヒドロゲナーゼなどの酵素によって触媒される脱アミノ化反応を通じてアミノ酸からアミノ基を切断して、アンモニウムを形成することができる。これらの反応の生成物の多くは2-ケト酸であり、これは、種々の化学生成物に変換することができる。他のアミノ酸はTCA回路の中間体に分解され、これは、例えば、リンゴ酸酵素またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼなどの糖新生酵素によってピルベートに導き、その後、アセトヒドロキシ酸シンターゼ鎖伸長経路またはイソプロピルリンゴ酸シンターゼisopropylmalatesynthease鎖伸長経路によってより長いケト酸に導くことができる。アミノ酸は全て、種々の生物から集められた経路によって完全に分解することができ、個々のアミノ酸からのアルコールC2~C5の最大理論収量は35~84である表1A。この収量は、加水分解生成物ではなくタンパク質を算出の基準として用いた場合、または正味の収量の算出からアミノ基を排除した場合はさらに高い表1BおよびC。典型的な藻類のアミノ酸組成を用いることによって図5、藻類のタンパク質からの混合アルコールの最大理論収量は60図1E;表2AおよびBまたは73正味の収量、窒素を除いて算出であると算出され、これは、糖からのエタノールの最大理論収量50より高い]。微生物microbeは、生成物の形成より成長のためにアミノ酸を使用することを選ぶので、残念ながらペプチドまたはアミノ酸は発酵性が乏しい基質である。アミノ酸は、微生物microbeに炭素および窒素の両方をもたらす。そのようなものとして、細胞または微生物群集の利益になる栄養分の最適な消費を確実にするために種々の調節系が置かれている。アミノ酸を高級アルコールに変換するためのネイティブな経路は、少量生成物の形成のみを支持する。非能率は、アミノ酸生合成の方向に向かうアミノ基転移反応を駆動する好ましくない熱力学的勾配に大きく起因する。したがって、細菌におけるアミノ酸代謝ネットワークを工学的に操作する必要がある。本開示は、本開示の組換え微生物を全体的な化学生成系の一部分として利用する化学生成系を提供する。例えば、本開示は、バイオマスを生成するために藻類を開放池において太陽光の下で生成する、図4に記載のバイオ燃料生成系を提供する。バイオマスの脂質含分はバイオディーゼルを生成するために利用され、一方窒素に富むバイオマスは、本開示の組換え微生物の基質として加水分解される。次いで、加水分解された窒素に富むバイオマスは、本開示の組換え微生物を含む反応器系に供給される。組換え微生物は、窒素に富むバイオマスを代謝して、種々の化学物質を生成する特定の組換え経路、例えば、高級アルコールなどのアルコール、アジピン酸などを生成するための酵素経路に応じて。次いで、アンモニウム、CO2および副生成物を開放池において成長している藻類に戻して、藻類の成長を支持する。次いで、残留したタンパク質例えば、残留したNに富むバイオマスを、種々の代謝産物をさらに再利用するための第2のバイオリアクター系に供給することができる。図4の窒素と炭素が中立したバイオ燃料プロセスの概略図では、エネルギーの供給源として太陽光を利用し、炭素源はCO2である。窒素源および硫黄源はこのプロセスから再利用されるアンモニアおよび硫酸塩である。頻繁にまたは連続的に回収される状態の下での自然選択では、一般に、成長が速く頑強な生物が選ばれる。回収後、生成したバイオマスを、まず、従来のバイオディーゼル生成のための脂質を得るために加工する。タンパク質部分を加水分解し、第1段階の変換器に供給して高級アルコールを生成する。次いで、第1段階で残留したアミノ酸を第2段階に供給して、加水分解ユニットに戻して再利用することになる追加的なバイオマスを生成する。第二段階の変換において生成したCO2を藻類培養物に戻して、大気から得られたCO2を富化することができる。系の一実施形態では、藻類は、タンパク質に富む藻類またはタンパク質に富む任意の他の光独立栄養性微生物である。この設計の利益は、成長が早い藻類種およびNに富む成長条件を利用し、それにより高タンパク質および低脂質の蓄積を伴う成長が促進されることである図4B。理論的な導出によっても、高タンパク質をもたらす種の成長速度がより速いことが示される。実際に、高タンパク質種は、高脂質種の約10倍のバイオマス生産性を有し、これはタンパク質が指数関数的に複製する一方で脂質は直線的に増加することに主に起因する図4B。藻類のバイオマス生産性と脂質含有量と脂質の変換およびタンパク質の変換の両方の燃料の理論収量との間の相関を用いて、バイオ燃料の全体的な生産性を計算することができる図4C。藻類バイオマスの脂質部分のみを利用した場合、全体的な生産性は、脂質含有量が0~20増加するにつれて増大するが、脂質含有量が20を越えて増加すると横ばい状態になる図4C、破線。この結果は、藻類種の脂質含有量が増加することにより全体的な燃料生産性は実際には増加しないと考えた場合と一致する。藻類バイオマスの脂質部分およびタンパク質部分の両方を使用すると、全体的な生産性は、脂質含有量が増加するにつれて実際に減少し、これは、全体的な生産性の点でタンパク質プロセスが脂質プロセスより効率的であることを示している。本開示は、適切な基質、例えば、単一のアミノ酸残基、アミノ酸残基の混合物、ならびにNに富むバイオマスを含む基質などから種々の化学化合物を生成するための生化学的経路を含む、代謝的な工学的操作をした微生物、または代謝的組換え微生物を提供する。本開示の代謝的な工学的操作をした微生物は、その生物のゲノム内またはその生物内のゲノムの外に1つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを含む。微生物は、デヒドロゲナーゼ、デアミナーゼ、および/またはトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。微生物は、野生型生物と比較して、アンモニア再取り込み活性の低下、クオラムセンシング系の低下または攪乱、例えば、オートインデューサー-2AI-2の再取り込みの低下または攪乱など、全体的な調節因子活性の低下を有することをさらに特徴としてよい。この低下は、アンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー-2の再取り込み、および/または全体的な調節因子活性に関連する遺伝子の発現を低下させる、攪乱する、または遮断することによって実現することができる。そのようなものとして、微生物は、野生型生物に見いだされるglnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の低下、破壊またはノックアウトを含んでよく、また、異種ポリヌクレオチドの導入も含んでよい。一実施形態では、本開示は、親の微生物と比較して少なくとも1つの標的酵素の発現が上昇している、または親の生物においては見いだされない酵素をコードする組換え微生物を提供する。微生物は、glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、Lrp、Fis、IHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、アンモニアの再取り込み、オートインデューサー-2AI-2の再取り込み、全体的な調節因子、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenase、グルタミンシンターゼ、および/またはグルタミン酸シンターゼに関与するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子の低下、攪乱またはノックアウトを含んでよい。上記の実施形態の組換え微生物の生成するケト酸フラックスは増大し、それにより、野生型微生物と比較して化学化合物の生成レベルを上昇させるための生合成経路に関与する少なくとも1つの代謝産物を生成する。化学化合物は、例えば、これらに限定されないが、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒドisobutyaldehyde、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、S-アデノシル-メチオニンSAMなどであってよい。アルコールは、例えば、適切な基質由来の、イソブタノール、1-ブタノール、1-プロパノール、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノールおよび2-フェニルエタノールを含む高級アルコールであってよい。一般に、組換え微生物は、標的酵素を含む少なくとも1つの組換え代謝経路を含み、場合によっては、glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される酵素の活性または発現の低下をさらに含んでよい。該経路は、上で提供された化学組成物の生成における基質または代謝中間体を改変するように作用する。標的酵素は、適切な生物学的供給源に由来するポリヌクレオチドによりコードされ、発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌または酵母である供給源に由来する遺伝子を含み、組換え工学的操作により本開示の微生物に入れられる。本明細書で使用される場合、代謝的な工学的操作をしたまたは代謝的工学的操作という用語は、2-ケト酸などの所望の代謝産物におけるフラックスを増加させるための合理的な経路設計および生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントの組み立てを含む。追加的な経路を設計することができ、微生物における、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、S-アデノシル-メチオニンSAMなどを含む種々の化学化合物の生成を増加させるため、または新規に生成するための生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントを組み立てることができる。代謝的な工学的操作をしたとは、所望の経路につながる中間体と競合する競合代謝経路の低下、攪乱、またはノックアウトを含む遺伝子工学的操作および適切な培養条件を用いて、転写、翻訳、タンパク質の安定性およびタンパク質の機能性を調節し、最適化することによって代謝フラックスを最適化することをさらに含んでよい。生合成遺伝子は、宿主に対して外来であることによってか、または突然変異誘発、組換え、および/または内在性宿主細胞内の異種発現制御配列との結び付きによって改変されていることによって、宿主微生物に対して異種性であってよい。一態様では、ポリヌクレオチドが宿主生物に対して異種性である場合、ポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。生合成経路という用語は、代謝経路とも称され、ある化学種を別の化学種に変換する変質させるための生化学的な同化反応または異化反応のセットを指す。遺伝子産物は、それらが、平行してまたは順番に、同じ基質に対して作用し、同じ生成物を生成する、または同じ基質と最終代謝産物の間の代謝中間体すなわち、代謝産物に作用する、もしくは生成する場合、同じ代謝経路に属する。leuABCDオペロンは、例えば、leuA遺伝子、leuB遺伝子、leuC遺伝子およびleuD遺伝子を含む。それらの中で、leuAはα-イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードし、leuBは、β-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードし、leuCおよびleuDはα-イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードする。これらの酵素のうち、α-イソプロピルリンゴ酸シンターゼはα-ケトイソバレレートからα-イソプロピルマレートへの合成反応を触媒し、α-イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼは、α-イソプロピルマレートからβ-イソプロピルマレートへの異性化反応を触媒し、β-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、β-イソプロピルマレートからL-ロイシン生合成の最終的な中間体であるα-ケトイソカプロン酸への脱水素反応を触媒する。Escherichiaは、4種類のトランスアミナーゼ、すなわち、aspC遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼAアスパラギン酸-グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、ilvGMEDAオペロン内に含まれるilvE遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼBBCAAアミノトランスフェラーゼ、avtA遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼCアラニン-バリンアミノトランスフェラーゼおよびtyrB遺伝子によりコードされるトランスアミナーゼDチロシンアミノトランスフェラーゼを保有する。これらの酵素は、種々のアミノ化反応に関与する。これらの酵素のうち、トランスアミナーゼBおよびトランスアミナーゼDは上記のα-ケトイソカプロン酸からL-ロイシンへのアミノ化反応を触媒し、逆もまた同じである。トランスアミナーゼCおよびトランスアミナーゼDは、L-バリン生合成とL-ロイシン生合成の間で共通する経路を含む、L-バリン生合成経路の最終的なステップを触媒する。また、leuABCDオペロンの発現はL-ロイシンにより抑制される。アセトヒドロキシ酸シンターゼIをコードするilvBN遺伝子の発現は、L-バリンおよびL-ロイシンによる協奏的な抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIをコードするilvGM遺伝子の発現はL-イソロイシン、L-バリンおよびL-ロイシンによる協奏的な抑制を受け、アセトヒドロキシ酸シンターゼIIIをコードするilvIH遺伝子の発現はL-ロイシンによる抑制を受ける。基質または適切な基質という用語は、酵素の作用によって別の化合物に変換されるまたは変換されることを意味する任意の基質または化合物を指す。この用語は、単一の化合物だけでなく、化合物の組み合わせ、例えば、溶液、混合物および少なくとも1つの基質またはその誘導体を含有する他の材料なども含む。さらに、基質という用語は、出発材料として使用するのに適した炭素源をもたらす化合物、例えば、任意のバイオマス由来の糖またはCO2などだけでなく、本明細書に記載の代謝的な工学的操作をした微生物に関連する経路において使用される中間体および最終代謝産物も包含する。バイオマス由来の糖は、これらに限定されないが、グルコース、スクロース、マンノース、キシロース、およびアラビノースなどの分子を含む。バイオマス由来の糖という用語は、微生物によって通常使用される適切な炭素基質、例えば、これらに限定されないが、全てD型またはL型のいずれかのグルコース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトースおよびマンノースを含む6炭糖、またはグルコースとフルクトースなどの6炭糖の組み合わせ、ならびに/または、これらに限定されないが、2-ケト-L-グロン酸、イドン酸IA、グルコン酸GA、6-ホスホグルコネート、2-ケト-D-グルコン酸2KDG、5-ケト-D-グルコン酸、2-ケトグルコネートホスフェート、2,5-ジケト-L-グロン酸、2,3-L-ジケトグロン酸、デヒドロアスコルビン酸、エリソルビン酸EAおよびD-マンノン酸を含む6炭糖酸などを包含する。窒素に富むバイオマスとは、例えば、加水分解することができ、窒素が組み込まれているタンパク質、ペプチド、アミノ酸、アミノ酸の混合物、核酸または他の分子に富むバイオマスを指す。そのような窒素に富むバイオマスは、大きなタンパク質ならびに小さなペプチド例えば、ジペプチド、トリペプチドまたはそれより長いペプチド、アミノ酸およびアミノ酸の混合物も含む。アルコールという用語は、例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールを含む。本明細書において提供される組換え微生物は、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、S-アデノシル-メチオニンSAMなどを、適切な炭素基質および/または窒素源を使用することにより生成するための経路に関与する複数の標的酵素を発現することができる。特定の実施形態では、組換え微生物は、glnA、gdhA、lsrA、luxSまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログにノックアウトを含む。そのようなノックアウトにより、微生物の代謝フラックスが、アミノ酸の蓄積から、より多量のケト酸の生成、ケト酸フラックスの増加、それから、上記の所望の化学化合物の生成に転換する。したがって、代謝的な工学的操作をした、代謝的に改変した、または代謝的組換え微生物は、選択された宿主または親の微生物に遺伝物質を導入し、それにより、細胞の生理機能および微生物の生化学を改変することまたは変化させることより生成される。遺伝物質の導入を通じて、親の微生物は新規の性質、例えば、新規の、またはより多量の細胞内代謝産物を生成する能力を獲得する。例示的な実施形態では、親の微生物に遺伝物質を導入することにより、代謝を通じて所望の化学化合物を生成する、または窒素に富むバイオマスを2-ケト酸、および最終的に、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、S-アデノシル-メチオニンSAMなどにする新規の、または改変された能力がもたらされる。親の微生物に導入された遺伝物質は、例えば、上記の化学化合物のいずれかを生成するための生合成経路に関与する酵素のうちの1つまたは複数をコードする遺伝子複数可または遺伝子の部分を含有し、また、これらの遺伝子を発現させ、かつ/またはその発現を調節するための追加的なエレメント、例えば、プロモーター配列を含む場合もある。上記の通り、工学的操作をした、または改変した微生物は、宿主または親の微生物への遺伝物質の導入に加えて、細胞の生理機能および微生物の生化学を変化させる遺伝子またはポリヌクレオチドの攪乱、欠失またはノックアウトを含む。遺伝子またはポリヌクレオチドの低下、攪乱またはノックアウトを通じて、微生物は新規の、または改善された性質例えば、新規の、またはより大量の細胞内代謝産物を生成する能力、ケト酸などの代謝産物のフラックスを改善する能力、所望の経路を下げる能力、および/または望ましくない副生成物の生成を減少させる能力を獲得する。例えば、本開示は、異種性のkivd、yqhD、または他のアルコールデヒドロゲナーゼおよびilvA、leuA、leuB、leuC、leuDまたはLeuオペロン、例えば、leuABCD、ansB、aspC、rocG、putA、ybaS、ilvA、glyA、sdaA、tnaA、alsS、ilvCD、ilvEの過剰発現または異種発現を用いて、Nを含む、またはタンパク質性のバイオマスから高級アルコールを生成することができることを実証している。タンパク質性材料からの2-ケト酸の発生により、2-ケト酸から、例えば、アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、またはS-アデノシル-メチオニンSAMなどの他の対象の化学的実体の生成を導くこともできる。ある特定の実施形態は、アンモニアの再取り込み、クオラムセンシング遺伝子活性、例えば、オートインデューサー2AI-2の再取り込みなど、および/または全体的な調節因子遺伝子などの低下またはノックアウトを伴う上記の遺伝子の任意の1つまたは複数の発現または過剰発現を含んでよい。特定の実施形態では、上記の遺伝子の任意の1つまたは複数の発現または過剰発現は、glnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子または相同体の発現のノックアウトまたは低下も伴ってよい。アルコール、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、S-アデノシル-メチオニンSAMなどの生成は種々の2-ケト酸中間体を伴う。本開示は、1つまたは複数の異種ポリヌクレオチドの発現または下記のポリペプチドをコードする1つまたは複数の内在性ポリヌクレオチドの過剰発現が、任意の数の他の所望の化学化合物を生成するための代謝経路を生じるのに有用であることも実証している。例えば、グルタミン酸経路では、グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenasegdh活性を有するポリペプチドにより、2-KG2-ケトグルタレートに変換される。ホモクエン酸シンターゼhcs活性およびホモアコニターゼhacAB活性を有するポリペプチドの連続した反応により、2-KGがホモイソシトレートに変換され、それが、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼhicDH活性を有するポリペプチドにより還元的脱炭酸されてアルファケトアジピン酸になる。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、S.cerevisiae、T.thermophilusおよび当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、発現および/または活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、グルタミン酸経路に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドは、S.cerevisiae、およびT.thermophilusを含む種々の生物からクローニングする。本開示のリシン経路では、リシンアミノトランスフェラーゼlat活性を有するポリペプチドによりリシンが脱アミノ化されて2-アミノアジペート-6-セミアルデヒドになる。次いで、ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcd活性を有するポリペプチドによりアルファアミノアジピン酸の形成が触媒される。次いで、2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadat活性を有するポリペプチドによりアミン基が脱アミノ化される。本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、F.lutescens、S.clavuligerus、H.sapiens、および当技術分野で公知のその他の微生物を含む任意の数の微生物に由来してよい。ポリヌクレオチドは、供給源である生物から得、次いで、発現および/または活性が改善されるように改変したまたは工学的操作をした突然変異酵素または変異酵素であってよい。一実施形態では、酵素をコードするポリヌクレオチドは、Flavobacteriumlutescens、Streptomycesclavuligerus、Homosapiens、および当技術分野で公知のその他の生物を含む種々の生物からクローニングすることができる。例えば、アジピン酸を中間体であるアルファケトアジピン酸から生成するために、図3に示されている通り、1つの化学的経路に加えて2つの生物学的経路CoA非依存性経路およびCoA依存性経路を工学的に操作した。生物学的変換については、アルファケトアジピン酸は、種々の微生物由来のロイシンデヒドロゲナーゼldhA活性を有するポリペプチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh活性を有するポリペプチドおよびヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼhdh活性を有するポリペプチドを含むデヒドロゲナーゼ活性を有する種々のポリペプチドによりアルファ-ヒドロキシアジピン酸に変換される。CoA非依存性経路では、嫌気的条件下で、オキサロアセテートを、マレートおよびフマレートを経由してスクシネートに変換する天然の還元的TCA回路の模倣経路を工学的に操作した。フマル酸レダクターゼ遺伝子例えばfumAまたはfumBの突然変異誘発により、アルファ-ヒドロキシアジピン酸の脱水を促進するポリペプチドがもたらされ得る。Clostridiumacetobutyricum由来のクロトン酸エステルデヒドロゲナーゼの突然変異体により、さらなるステップを構築することができる。CoA依存性経路では、Clostridiumdifficilleにおけるイソカプロエート生成経路を用いて、アルファヒドロキシアジピン酸をアジピン酸に変換するポリペプチドを引き出すことができる。第1のステップは、R-2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAを生じるCoAトランスフェラーゼhadA活性を有するポリペプチドによって触媒される。次いで、デヒドラターゼ-活性化因子複合体例えば、hadBC-hadIによるR-2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAの脱水によって2-イソカプレノイル-CoAが生じ、これは、アシルCoAデヒドロゲナーゼacdB-etfBA活性を有するポリペプチドにより還元されてイソカプロイルCoAになる。最後に、CoA部分がCoAトランスフェラーゼhadAによって除去されて、アジピン酸を生成する。プラチナを含む種々の金属触媒を用いて、アルファケトアジピン酸を化学的還元してアジピン酸にすることも可能である。さらに別の実施形態では、微生物は、内在性グルタメート生成経路を含む。例えば、グルタメート生成経路を有する有用な生物としては、Brevibacterium、Arthrobacter、Microbacterium、Corynebacteriumなどの属の細菌種または酵母種などを含む。グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenasegdhを有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenase活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号1に記載されている。例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenaseは、GenBank受託番号CAQ53143参照により本明細書に組み込まれるに記載の配列を有する、S.cerevisiaeまたはCandidafamata変異体由来の配列番号2を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なグルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenaseは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ホモクエン酸シンターゼを有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ホモクエン酸シンターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号4に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号3に記載されている。例えば、ホモクエン酸シンターゼは、GenBank受託番号BAA33785参照により本明細書に組み込まれるに記載の配列を有する、S.cerevisiaeまたはT.thermophilus由来の配列番号4を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ホモアコニターゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知である、または、活性が増加したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む組換えによって生成することができる。ホモアコニターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号6に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号5に記載されている。例えば、ホモアコニターゼは、GenBank受託番号XP_002620204参照により本明細書に組み込まれるに記載の配列を有する、S.cerevisiaeまたはAjellomycesdermatitidis由来の配列番号6を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号8に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号7に記載されている。例えば、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、T.thermophilus由来の配列番号8を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なホモクエン酸シンターゼは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。リシンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。リシンアミノトランスフェラーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号10に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号9に記載されている。例えば、リシンアミノトランスフェラーゼポリペプチドは、Streptomycesclavuligerus由来の配列番号10を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なリシンアミノトランスフェラーゼは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcd活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcd活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号12に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号11に記載されている。例えば、ピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcdポリペプチドは、Flavobacteriumlutescens由来の配列番号12を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なピペリデイン6-カルボン酸デヒドロゲナーゼpcdは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadat活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadat活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号14に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号13に記載されている。例えば、2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadatポリペプチドは、Homosapiens由来の配列番号14を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な2-アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼaadatは、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ロイシンデヒドロゲナーゼldh活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ロイシンデヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号16に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号15に記載されている。例えば、ロイシンデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Geobacillusstearothermophilus由来の配列番号16を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なロイシンデヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号18に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号17に記載されている。例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、E.coli由来の配列番号18を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なリンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼhdh活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含み、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号20に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は配列番号19に記載されている。例えば、ヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、Aspergillusfumigatus由来の配列番号20を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なヒドロキシイソカプリル酸デヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。膜に結合しFADを含有する2種の酵素がフマレートとスクシネートの相互変換の触媒作用に関与する;嫌気的成長にはフマル酸レダクターゼが使用され、好気的成長にはコハク酸デヒドロゲナーゼが使用される。フマル酸レダクターゼは、多数のサブユニット例えば、E.coliのfrdA、frdB、およびfrdCを含む。サブユニットのうちの任意の1つを改変することにより、本明細書における所望の活性がもたらされ得る。例えば、frdB、frdCまたはfrdBCをノックアウトすることは本開示の方法において有用である。Frdホモログおよび変異体は公知である。例えば、ホモログおよび変異体としては、例えば、フマル酸レダクターゼサブユニットDフマル酸レダクターゼの13kDaの疎水性タンパク質gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD_ECOLI67463543;フマル酸レダクターゼサブユニットCフマル酸レダクターゼの15kDaの疎水性タンパク質gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC_PROVU1346037;フマル酸レダクターゼサブユニットDフマル酸レダクターゼの13kDaの疎水性タンパク質gi|120499|sp|P20924.1|FRDD_PROVU120499;フマル酸レダクターゼサブユニットCフマル酸レダクターゼの15kDaの疎水性タンパク質gi|67463538|sp|POA8Q0.1|FRDC_ECOLI67463538;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットEscherichiacoligi|145264|gb|AAA23438.1|145264;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットEscherichiacoligi|145263|gb|AAA23437.1|145263;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU37538290;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|120489|sp|P00363.3|FRDA_ECOLI120489;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU120490;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体フラボシトクロムcフラボシトクロムc3Fcc3gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA_SHEFN119370087;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットgi|81175308|sp|POAC47.2|FRDB_ECOLI81175308;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットフラボシトクロムcフラボシトクロムc3Fcc3gi|119370088|sp|POC278.1|FRDA_SHEFR119370088;Frdオペロンの特徴付けられていないタンパク質Cgi|140663|sp|P20927.1|YFRC_PROVU140663;frdオペロンの推測鉄-硫黄サブユニットAgi|140661|sp|P20925.1|YFRA_PROVU140661;フマル酸umarateレダクターゼ鉄-硫黄サブユニットgi|120493|sp|P20921.2|FRDB_PROVU120493;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|2494617|sp|006913.2|FRDA_HELPY2494617;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体鉄III誘導性フラボシトクロムC3Ifc3gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2_SHEFN13878499;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|54041009|sp|P64174.1|FRDA_MYCTU54041009;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|54037132|sp|P64175.1|FRDA_MYCBO54037132;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|12230114|sp|Q9ZMP0.1|FRDA_HELPJ12230114;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|1169737|sp|P44894.1|FRDA_HAEIN1169737;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットWolinellasuccinogenesgi|13160058|emb|CAA04214.2|13160058;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体フラボシトクロムcFLcytgi|25452947|sp|P83223.2|FRDA_SHEON25452947;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットWolinellasuccinogenesgi|2282000|emb|CAA04215.1|2282000;およびフマル酸レダクターゼシトクロムbサブユニットWolinellasuccinogenesgi|2281998|emb|CAA04213.1|2281998が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒドロキシイソカプリル酸CoA-トランスフェラーゼhadA活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。ヒドロキシイソカプリル酸CoA-トランスフェラーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号22に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は、配列番号21に記載されている。例えば、ヒドロキシイソカプリル酸CoA-トランスフェラーゼポリペプチドは、Clostridiumdifficille由来の配列番号22を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なヒドロキシイソカプリル酸CoA-トランスフェラーゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号24に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得対応するヌクレオチド配列は、配列番号23に記載されている、配列番号26に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は、配列番号25に記載されている。例えば、2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼポリペプチドは、Clostridiumdifficille由来の配列番号24または配列番号26を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。2-ヒドロキシイソカプロイル-CoA活性化因子ポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ活性化活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号27に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は、配列番号26に記載されている。例えば、2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ活性化ポリペプチドは、Clostridiumdifficile由来の配列番号27を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切な2-ヒドロキシイソカプロイル-CoAデヒドラターゼ活性化酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。アシル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、活性が増大したまたは改善された天然に存在しないポリペプチドを含む、当技術分野で公知である、または組換えによって生成することができる。アシル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する例示的なポリペプチドは、配列番号29に記載の配列に対して80~99の同一性を有し得る対応するヌクレオチド配列は、配列番号28に記載されている。例えば、アシル-CoAデヒドロゲナーゼポリペプチドは、Clostridiumdifficile由来の配列番号29を含んでよい。本開示の方法および組成物において有用な他の適切なアシル-CoAデヒドロゲナーゼ酵素は、例えば、BLASTアルゴリズムを使用することによって容易に同定することができる。本明細書において提供される微生物は、親の微生物では得ることができない量の代謝産物を生成するように改変されている。代謝産物とは、代謝により生成する任意の物質または特定の代謝プロセスに必要であるもしくはそれに関与する任意の物質を指す。代謝産物は、代謝の出発材料例えば、グルコース、タンパク質/ペプチド、アミノ酸、アミノ酸の混合物またはピルベート、代謝の中間体例えば、2-ケト酸、または代謝の最終産物例えば、アルコール例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールなど、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、および/またはS-アデノシル-メチオニンSAMである有機化合物であり得る。代謝産物は、より複雑な分子を構築するために使用することができる、または、より単純なものに分解することができる。中間代謝産物は、他の代謝産物から合成することができ、おそらくより複雑な物質を作製するために使用される、またはより単純な化合物に分解され、多くの場合、化学エネルギーの放出を伴う。例示的な代謝産物としては、タンパク質、ペプチド、窒素に富むバイオマテリアル、グルコース、ピルベート、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノール、および2-ケト酸が含まれる。図12に示されている通り、例示的な2-ケト酸中間体としては、2-ケトブチレート、2-ケトイソバレレート、2-ケトバレレート、2-ケト3-メチルバレレート、2-ケト4-メチル-ペンタノエート、およびフェニルピルベートが含まれる。図12に示されている例示的な2-ケト酸は、アルコール例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールなど、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、および/またはS-アデノシル-メチオニンSAMの生成において代謝中間体として使用することができる。例えば、Leuオペロン例えば、LeuABCDによりコードされる2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ酵素の発現の上昇をもたらすように代謝的な工学的操作をした組換え微生物により、2-ケトブチレートから2-ケトバレレートを生成する。2-ケトバレレート代謝産物を使用して、代謝的に改変した微生物によって生成する追加的な酵素により、1-ブタノールを生成することができる。さらに、例えば、ilvIHDC遺伝子、kdc遺伝子およびadh遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ、アルファ-ケト酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物により、2-ケトブチレートおよび2-ケト-3-メチル-バレレートから1-プロパノールおよび2-メチル1-ブタノールを生成することができる。さらに、代謝産物2-ケトイソバレレートは、例えば、ilvIHCD遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物によって生成することができる。次いで、この代謝産物は、イソブタノールまたは3-メチル1-ブタノールの生成において使用することができる。さらに、代謝産物2-ケトイソバレレートは、アミノ酸/タンパク質分解酵素に加えて、例えば、ilvIHCD遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物によって生成することができる。次いで、この代謝産物は、イソブチルアルデヒド、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、およびバリンの生成において使用することができる。代謝産物であるピルベートおよび/またはフェニルピルベートは、例えば、kdcおよびyqhDによりコードされるアルファ-ケト酸デカルボキシラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を発現または過剰発現するように代謝的な工学的操作をした組換え微生物による生成のために使用することができる。同様に、ピルベートは、2-フェニルエタノール、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、2,3-ブタンジオール、L-乳酸、D-乳酸、芳香族物質トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸、ポリヒドロキシブチレートPHB、メバロネート、イソプレノイド、および脂肪酸を生成するために使用することができる。したがって、本明細書では、例えば、イソブタノールなどのアルコールを生成する組換え微生物が提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは2-ケト酸に変換する酵素に加えて、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼisomeroreductase例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2またはYQHDなどの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスをアミノ窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pflB遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにglnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。一部の態様では、組換え微生物は、アセト乳酸シンターゼ例えば、alsS、アセトヒドロキシ酸acteohydroxyacidイソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDの発現の上昇を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。例えば、2-メチル1-ブタノールを生成する組換え微生物も提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは2-ケト酸に変換する酵素に加えて、トレオニンデヒドラターゼ例えば、ilvAまたはtdcB、アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvIHオペロン、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、および/またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDなどの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pflB遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにglnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。例えば、3-メチル1-ブタノールを生成する組換え微生物も提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは2-ケト酸に変換する酵素に加えて、アセト乳酸シンターゼ例えば、alsS、アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvIH、アセト乳酸シンターゼ例えば、ilvMGまたはilvNB、例えば、配列番号63および配列番号64、または配列番号65および配列番号66に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を有するilvNBなど、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼleuA、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ例えば、leuC、DまたはleuCDオペロン、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ例えば、leuB、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、kivd、PDC6、またはTHI3、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDなどの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pflB遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにglnA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、およびまたはIHF、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。さらに、本明細書では、アセテート、アセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド、n-ブチルアルデヒド、2,3-ブタンジオール、L-乳酸、D-乳酸、芳香族物質例えば、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸など、PHBポリヒドロキシブチレート、メバロネート、イソプレノイド、脂肪酸、GABA4-アミノ酪酸、グルタミン酸、スクシネート、リンゴ酸、アスパラギン酸ssparticacid、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニン、SAMS-アデノシル-メチオニン、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニン、イソブチルアルデヒド、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、バリン、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、ロイシン、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシンを生成する組換え微生物が提供され、一部の態様は、アミノ酸または中間体をピルベートまたは2-ケト酸に変換する酵素に加えて、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2またはYQHDなどの標的酵素の発現の上昇を含み得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスをアミノ窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pf1B遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、ginA、gdhA、lsrA、luxS、CRP、LRP、Fis、および/またはIHPからなる群から選択される遺伝子またはホモログ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアンモニアの再取り込み、オートインデューサー-2AI-2の再取り込み、および/または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。一部の態様では、組換え微生物は、アセト乳酸シンターゼ例えば、alsS、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDの発現の上昇を含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。さらに別の実施形態では、トレオニンデヒドラターゼ例えば、ilvAまたはtdcB、アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvIHオペロン、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、および/またはpdc、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDなどの標的酵素の発現の上昇も存在し得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pflB遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、glnA、gdhA、lsrA、luxSCRP、LRP、Fis、および/またはIHP、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログなどのアンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー-2AI-2の再取り込みなど、および/または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含有し得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。さらに別の実施形態では、アセト乳酸シンターゼ例えば、alsS、アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvIH、アセト乳酸シンターゼ例えば、ilvMGまたはilvNB、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼleuA、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ例えば、leuC、DまたはleuCDオペロン、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ例えば、leuB、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、kivd、PDC6、またはTHI3、およびアルコールデヒドロゲナーゼ例えば、ADH2、YQHDなどの標的酵素の発現の上昇が存在し得る。微生物は、ピルベートの利用可能性を増大させるため、または所望の生合成経路において代謝産物について競合する酵素を減少させるため、または代謝フラックスを窒素の蓄積から放出に転換させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ例えば、adhE遺伝子、ldh例えば、ldhA遺伝子、frd例えば、frdB、frdCまたはfrdBC遺伝子、fnr遺伝子、leuA遺伝子、ilvE遺伝子、poxB遺伝子、ilvA遺伝子、pflB遺伝子、またはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害、ならびに、例えば、glnA、gdhA、lsrA、luxSCRP、LRP、Fis、および/またはIHP、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子またはホモログなどのアンモニアの再取り込み、クオラムセンシング、例えば、オートインデューサー-2AI-2の再取り込みなど、および/または全体的な調節に関与するポリペプチドの発現の欠失または阻害をさらに含み得る。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、生合成経路において副生成物としてエタノールが合成されることは望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼの活性または発現の増大への言及では、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は具体的に排除される。上記の通り、本開示全体を通して記載されている標的酵素により、一般に代謝産物を生成する。例えば、酵素2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼleuA、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼleuB、およびイソプロピルリンゴ酸イソメラーゼleuC、leuDまたはleuCDオペロンにより、2-ケトブチレートを含む基質から2-ケトバレレートが生成し得る。さらに、本開示全体にわたって記載されている標的酵素は、ポリヌクレオチドによりコードされる。例えば、トレオニンデヒドラターゼは、ilvA遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ilvIHオペロンに由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、ilvC遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ilvD遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。2-ケト酸デカルボキシラーゼは、PDC6遺伝子、ARO10遺伝子、THI3遺伝子、kivd遺伝子、および/またはpdc遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。アルコールデヒドロゲナーゼは、ADH2またはYQHD遺伝子に由来するポリヌクレオチドによりコードされ得る。追加的な酵素および例示的な遺伝子は、本文書全体にわたって記載されている。種々のポリペプチドおよびポリヌクレオチドのホモログは、適切な酵素をコードする適切なポリヌクレオチドをもたらす任意の生物学的供給源に由来してよい。ホモログは、例えば、種々のデータベースを参照することによって同定することができる。本開示は、本開示の方法、組成物および生物において有用な特定の遺伝子を同定するが、そのような遺伝子との絶対的な同一性は必要ないことが認識されよう。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドの変化を行い、活性についてスクリーニングすることができる。一般には、そのような変化は、保存された突然変異およびサイレント突然変異を含む。そのような改変または突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、機能酵素活性の発現について当技術分野で公知の方法を用いてスクリーニングすることができる。遺伝暗号の固有の縮退に起因して、実質的に同じものをコードする他のポリヌクレオチドまたは機能的に等しいポリペプチドも、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、それを発現させるために使用することができる。当業者には理解される通り、コード配列を、特定の宿主におけるその発現が増強されるように改変することが有利であり得る。遺伝暗号は、64種の可能性のあるコドンを伴い余剰であるが、大多数の生物は、一般には、これらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も多く利用されるコドンは、最適コドンと称され、それほど利用されないコドンは、めったに使用されないコドンまたは低使用コドンに分類される。コドンは、宿主の好ましいコドンの使用を反映するように置換することができ、プロセスは、時にはコドン最適化または種によるコドンの偏りの制御と称される。例えば、翻訳の速度を増大させるため、または、最適化されていない配列から生成した転写物と比較して長い半減期などの望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成するために、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列Murrayら1989年Nucl.AcidsRes.17巻:477~508頁も参照されたいを調製することができる。翻訳終止コドンも、宿主による優先度を反映するように改変することができる。例えば、S.cerevisiaeおよび哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれUAAおよびUGAである。単子葉植物の典型的な終止コドンはUGAであり、一方、昆虫およびE.coliは、一般に、UAAを終止コドンとして使用するDalphinら1996年Nucl.AcidsRes.24巻:216~218頁。植物において発現させるためのヌクレオチド配列を最適化するための方法体系は、例えば、米国特許第6,015,891号、およびそこに引用されている参考文献において提供される。当業者には、遺伝暗号の縮退性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のDNA化合物が、本開示の所与の酵素をコードするために使用され得ることが理解されよう。上記の生合成酵素をコードするネイティブなDNA配列は、ただ単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されており、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のDNA化合物を含む。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性を損失または著しく損失することなく、そのアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容し得る。本開示は、改変または変異体ポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的な同化活性または異化活性を有する限りは、本明細書に記載の特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらに、本明細書において示されているDNA配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に本開示の複数の実施形態を例示するものである。さらに、代謝産物例えば、ケトチオラーゼ、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ、クロトナーゼ、クロトニルCoAレダクターゼ、ブチリルCoAデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼADHを発生させるために有用な酵素のホモログが本明細書において提供される微生物および方法に包含される。第1のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に関して使用されるホモログという用語は、別個の、第2のファミリーまたは種の酵素または遺伝子を指し、これは、第1のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に対応する第2のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であることが、機能解析、構造解析またはゲノム解析によって決定される。ほとんどの場合、ホモログは機能的、構造的またはゲノムの類似性を有する。酵素または遺伝子のホモログを、遺伝子プローブおよびPCRを用いて容易にクローニングすることができる技法が公知である。ホモログとしてクローニングされた配列の同一性は、機能アッセイを用いて、かつ/または遺伝子のゲノムマッピングによって確認することができる。タンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸配列が第2のタンパク質をコードする核酸配列と類似した配列を有する場合、第2のタンパク質との相同性を有する、またはそれと相同である。あるいは、タンパク質は、2つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有する場合、第2のタンパク質との相同性を有する。したがって、相同タンパク質という用語は、2つのタンパク質が類似したアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。本明細書で使用される場合、2つのタンパク質またはタンパク質のある領域は、アミノ酸配列が少なくとも約30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99の同一性を有する場合、実質的に相同である。2つのアミノ酸配列の同一性、または2つの核酸配列の同一性を決定するために、配列を最適に比較する目的でアラインメントする例えば、比較する目的で、最適なアラインメントのために、第1のアミノ酸配列または核酸配列および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、非相同配列を無視することができる。一実施形態では、比較する目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30、一般には、少なくとも40、より一般には、少なくとも50、さらに一般には、少なくとも60、およびさらに一般には、少なくとも70、80、90、100である。次に、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列のある位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置において同一である本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の同一性は、アミノ酸または核酸の相同性と等しい。2つの配列間の同一性は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。例えば、kivd遺伝子への言及は、実質的に類似した酵素活性を有する酵素をコードする、他の生物由来のホモログ例えば、pdc6、aro10、thI3、pdc、kdcA、pdc1、pdc5、ならびに言及されている遺伝子に対して少なくとも30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、または99の同一性を有する遺伝子および言及されている遺伝子と実質的に類似した酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を含む。例えば、Kluyveromyceslactisのピルビン酸デカルボキシラーゼはKivdに対してアミノ酸レベルで37の同一性を有し、kivdおよびthI3は核酸レベルで32同一であり、SchizosaccharomycespombeのアルコールデヒドロゲナーゼはSaccharomycescerevisiaeのADH2に対してアミノ酸配列レベルで52の同一性を有し、S.cerevisiaeadh2およびLactococcuslactisadhは49同一であり、KIVDLactococcuslactis配列番号31および32とPDC6Saccharomycescerevisiae配列番号33および34は、36の同一性を共有し類似度Positives=322/56257、ギャップGaps=24/5624、KIVDLactococcuslactisとTHI3Saccharomycescerevisiaeは32の同一性を共有し類似度Positives=307/57153、ギャップGaps=35/5716、kivdLactococcuslactisとARO10Saccharomycescerevisiae配列番号35および配列番号36は30の同一性を共有し類似度Positives=296/59849、ギャップGaps=65/59810、ARO10SaccharomycescerevisiaeとPDC6Saccharomycescerevisiaeは34の同一性を共有し類似度Positives=320/61651、ギャップGaps=61/6169ARO10SaccharomycescerevisiaeとTHI3Saccharomycescerevisiae配列番号37および配列番号38は30の同一性を共有し類似度Positives=304/59950、ギャップGaps=48/5998、ARO10Saccharomycescerevisiaeとピルビン酸デカルボキシラーゼClostridiumacetobutylicumATCC824は30の同一性を共有し類似度Positives=291/61347、ギャップGaps=73/61311、PDC6SaccharomycescerevisiaeとTHI3Saccharomycescerevisiaeは50の同一性を共有し類似度Positives=402/56171、ギャップGaps=17/5613、PDC6Saccharomycescerevisiaeとピルビン酸デカルボキシラーゼClostridiumacetobutylicumATCC824配列番号39および配列番号40は38の同一性を共有し類似度Positives=328/57057、ギャップGaps=30/5705、THI3Saccharomycescerevisiaeとピルビン酸デカルボキシラーゼClostridiumacetobutylicumATCC824は35の同一性を共有する類似度Positives=284/52154、ギャップGaps=25/5214。本明細書において列挙されている遺伝子およびポリペプチド/酵素のそれぞれの配列は、ワールドワイドウェブ上で利用可能なデータベースを使用して容易に同定することができる例えば、DepartmentofChemicalandBiomolecularEngineering、KoreaAdvancedInstituteofScienceandTechnologyにより維持されているE.coliProteinDatabaseを参照されたい。さらに、アミノ酸配列および核酸配列は、同一性について、当技術分野で周知の一般に使用されるアルゴリズムを使用して容易に比較することができる。タンパク質またはペプチドへの言及において相同が使用される場合、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換により異なることが理解される。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同様の化学的性質例えば、電荷または疎水性を持つ側鎖R基を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換では、タンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。2つ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合では、配列同一性または相同性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は当業者に周知である例えば、これにより、参照により本明細書に組み込まれるPearsonら1994年、Meth.Mol.Biol.25巻:365~389頁を参照されたい。以下の6群はそれぞれ、互いに保存された置換であるアミノ酸を含有する:1セリンS、トレオニンT;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR、リシンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、アラニンA、バリンV、および6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW。ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性とも称され、一般には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、SequenceAnalysisSoftwarePackageoftheGeneticsComputerGroupGCG、UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter、910UniversityAvenue、Madison、Wis.53705を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアでは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾に割り当てられた相同性の測定を用いて同様の配列をマッチさせる。例えば、GCGは、異なる種の生物由来の相同なポリペプチドまたは野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の相同なポリペプチドなどの、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するために初期状態のパラメータを用いて使用することができるGapおよびBestfitなどのプログラムを含有する。例えばGCGVersion6.1を参照されたい。分子配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するために使用する典型的なアルゴリズムはコンピュータプログラムBLASTAltschul1990年J.Mol.Biol.215巻:403~441頁;Gish1993年NatureGenet.3巻:266~272頁;Madden1996年Meth.Enzymol.266巻:131~141頁;Altschul1997年Nucl.AcidsRes.25巻:3389~3402頁;Zhang1997年GenomeRes.7巻:649~656頁、特にblastpまたはtblastnAltschul1997年Nucl.AcidsRes.25巻:3389~3402頁である。BLASTpの典型的なパラメータは、期待値Expectationvalue:10初期値;フィルターFilter:seg初期値;ギャップを入れるためのコストCosttoopenagap:11初期値;ギャップを延長するためのコストCosttoextendagap:1初期値;最大アラインメントMax.alignments:100初期値;ワードサイズWordsize:11初期値;記述数No.ofdescriptions:100初期値;ペナルティマトリックスPenaltyMatrix:BLOWSUM62である。表3および本開示は、当業者が利用可能なポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を有する遺伝子および各遺伝子のホモログの非限定的な例を提供する。本開示は、本明細書に記載の組換え微生物の作製において有用な種々の遺伝子、ホモログおよび変異体の受託番号を提供する。本明細書に記載のホモログおよび変異体は、例示的なものであり、限定するものではないことが理解されるべきである。当業者は、例えば、ワールドワイドウェブ上で利用可能なNationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIを含む種々のデータベースを使用して、追加的なホモログ、変異体および配列を利用可能である。エタノールデヒドロゲナーゼアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼとも称されるは、E.coliにおいてadhEによりコードされる。adhEは、アルコールデヒドロゲナーゼADH活性;アセトアルデヒド/アセチルCoAデヒドロゲナーゼACDH活性;ピルビン酸-ギ酸-リアーゼデアクチバーゼdeactivasePFLデアクチバーゼ活性の3つの活性を含み、PFLデアクチバーゼ活性は、鉄、NAD、およびCoA依存性反応におけるピルビン酸-ギ酸-リアーゼ触媒の消失を触媒する。ホモログは、当技術分野で公知である例えば、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼPolytomellasp.pringsheim198.80gi|40644910|emb|CAD42653.2|40644910;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumbotulinumAstr.ATCC3502gi|148378348|ref|YP_001252889.1|148378348;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisCO92gi|16122410|ref|NP_405723.1|16122410;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapseudotuberculosisIP32953gi|51596429|ref|YP_070620.1|51596429;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisCO92gi|115347889|emb|CAL20810.1|115347889;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapseudotuberculosisIP32953gi|51589711|emb|CAH21341.1|51589711;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼEscherichiacoliCFT073gi|26107972|gb|AAN80172.1|AE016760_3126107972;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001gi|45441777|ref|NP_993316.1|45441777;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001gi|45436639|gb|AAS62193.1|45436639;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumperfringensATCC13124gi|110798574|ref|YP_697219.1|110798574;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼShewanellaoneidensisMR-1gi|24373696|ref|NP_717739.1|24373696;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumbotulinumAstr.ATCC19397gi|153932445|ref|YP_001382747.1|153932445;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisbiovarAntiquastr.E1979001gi|165991833|gb|EDR44134.1|165991833;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumbotulinumAstr.Hallgi|153937530|ref|YP_001386298.1|153937530;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumperfringensATCC13124gi|110673221|gb|ABG82208.1|110673221;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼClostridiumbotulinumAstr.Hallgi|152933444|gb|ABS38943.1|152933444;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisbiovarOrientalisstr.F1991016gi|165920640|gb|EDR37888.1|165920640;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼYersiniapestisbiovarOrientaliss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ringensstr.13gi|18146197|dbj|BAB82237.1|18146197;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ、ADHE1ClostridiumacetobutylicumATCC824gi|15004739|ref|NP_149199.1|15004739;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ、ADHE1ClostridiumacetobutylicumATCC824gi|14994351|gb|AAK76781.1|AE001438_3414994351;アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ2アルコールデヒドロゲナーゼADH;アセトアルデヒド/アセチル-CoAデヒドロゲナーゼACDHを含むgi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI2492737;アルコールデヒドロゲナーゼSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphistr.CT18gi|16760134|ref|NP_455751.1|16760134;およびアルコールデヒドロゲナーゼSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphigi|16502428|emb|CAD08384.1|16502428参照されたい。受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。乳酸デヒドロゲナーゼD-乳酸デヒドロゲナーゼおよび発酵性デヒドロゲナーゼfermentivedehydrognaseとも称されるは、E.coliにおいてldhAによりコードされ、ピルベートからD-乳酸へのNADH依存性変換を触媒する。ldhAのホモログおよび変異体は公知である。実際には、NCBIを通じて入手可能な細菌の乳酸デヒドロゲナーゼは現在のところ1664種存在する。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、D-乳酸デヒドロゲナーゼD-LDH発酵性乳酸デヒドロゲナーゼFermentativelactatedehydrogenasegi|1730102|sp|P52643.1|LDHD_ECOLI1730102;D-乳酸デヒドロゲナーゼgi|1049265|gb|AAB51772.1|1049265;D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliAPECO1gi|117623655|ref|YP_852568.1|117623655;D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliCFT073gi|26247689|ref|NP_753729.1|26247689;D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliO157:H7EDL933gi|15801748|ref|NP_287766.1|15801748;D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliAPECO1gi|115512779|gb|ABJ00854.1|115512779;D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliCFT073gi|26108091|gb|AAN80291.1|AE016760_15026108091;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliK12gi|16129341|ref|NP_415898.1|16129341;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliUTI89gi|91210646|ref|YP_540632.1|91210646;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliK12gi|1787645|gb|AAC74462.1|1787645;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliW3110gi|89108227|ref|AP_002007.1|89108227;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliW3110gi|1742259|dbj|BAA14990.1|1742259;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliUTI89gi|91072220|gb|ABE07101.1|91072220;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼ、NAD依存性EscherichiacoliO157:H7EDL933gi|12515320|gb|AAG56380.1|AE005366_612515320;発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼEscherichiacoliO157:H7str.Sakaigi|13361468|dbj|BAB35425.1|13361468;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoli101-1gi|83588593|ref|ZP_00927217.1|83588593;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoli53638gi|75515985|ref|ZP_00738103.1|75515985;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoliE22gi|75260157|ref|ZP_00731425.1|75260157;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoliF11gi|75242656|ref|ZP_00726400.1|75242656;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoliE110019gi|75237491|ref|ZP_00721524.1|75237491;COG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoliB7Agi|75231601|ref|ZP_00717959.1|75231601;およびCOG1052:乳酸デヒドロゲナーゼおよび関連するデヒドロゲナーゼEscherichiacoliB171gi|75211308|ref|ZP_00711407.1|75211308が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。膜に結合しFADを含有する2種の酵素がフマレートとスクシネートの相互変換の触媒作用に関与する;嫌気的成長にはフマル酸レダクターゼが使用され、好気的成長にはコハク酸デヒドロゲナーゼが使用される。フマル酸レダクターゼは、多数のサブユニット例えば、E.coliのfrdA、B、およびCを含む。サブユニットのうちの任意の1つを改変することにより、本明細書における所望の活性がもたらされ得る。例えば、frdB、frdCまたはfrdBCをノックアウトすることは本開示の方法において有用である。Frdホモログおよび変異体は公知である。例えば、ホモログおよび変異体としては、例えば、フマル酸レダクターゼサブユニットDフマル酸レダクターゼの13kDaの疎水性タンパク質gi|67463543|sp|P0A8Q3.1|FRDD_ECOLI67463543;フマル酸レダクターゼサブユニットCフマル酸レダクターゼの15kDaの疎水性タンパク質gi|1346037|sp|P20923.2|FRDC_PROVU1346037;フマル酸レダクターゼサブユニットDフマル酸レダクターゼの13kDaの疎水性タンパク質gi|120499|sp|P20924.1|FRDD_PROVU120499;フマル酸レダクターゼサブユニットCフマル酸レダクターゼの15kDaの疎水性タンパク質gi|67463538|sp|P0A8Q0.1|FRDC_ECOLI67463538;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットEscherichiacoligi|145264|gb|AAA23438.1|145264;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットEscherichiacoligi|145263|gb|AAA23437.1|145263;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|37538290|sp|P17412.3|FRDA_WOLSU37538290;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|120489|sp|P00363.3|FRDA_ECOLI120489;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|120490|sp|P20922.1|FRDA_PROVU120490;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体フラボシトクロムcフラボシトクロムc3Fcc3gi|119370087|sp|Q07WU7.2|FRDA_SHEFN119370087;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットgi|81175308|sp|P0AC47.2|FRDB_ECOLI81175308;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットフラボシトクロムcフラボシトクロムc3Fcc3gi|119370088|sp|P0C278.1|FRDA_SHEFR119370088;Frdオペロンの特徴付けられていないタンパク質Cgi|140663|sp|P20927.1|YFRC_PROVU140663;Frdオペロンの推測鉄-硫黄サブユニットAgi|140661|sp|P20925.1|YFRA_PROVU140661;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットgi|120493|sp|P20921.2|FRDB_PROVU120493;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|2494617|sp|O06913.2|FRDA_HELPY2494617;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体鉄III誘導性フラボシトクロムC3Ifc3gi|13878499|sp|Q9Z4P0.1|FRD2_SHEFN13878499;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|54041009|sp|P64174.1|FRDA_MYCTU54041009;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|54037132|sp|P64175.1|FRDA_MYCBO54037132;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|12230114|sp|Q9ZMP0.1|FRDA_HELPJ12230114;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットgi|1169737|sp|P44894.1|FRDA_HAEIN1169737;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニットWolinellasuccinogenesgi|13160058|emb|CAA04214.2|13160058;フマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブユニット前駆体フラボシトクロムcFLcytgi|25452947|sp|P83223.2|FRDA_SHEON25452947;フマル酸レダクターゼ鉄-硫黄サブユニットWolinellasuccinogenesgi|2282000|emb|CAA04215.1|2282000;およびフマル酸レダクターゼシトクロムbサブユニットWolinellasuccinogenesgi|2281998|emb|CAA04213.1|2281998が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。酢酸キナーゼは、E.coliにおいてackAによりコードされる。AckAは、アセチルcoAからアセテートへの変換に関与する。具体的には、ackAは、アセチルホスフェートからアセテートへの変換を触媒する。AckAホモログおよび変異体は公知である。NCBIデータベースには、およそ1450種のポリペプチドが細菌の酢酸キナーゼとして列挙されている。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、酢酸キナーゼStreptomycescoelicolorA32gi|21223784|ref|NP_629563.1|21223784;酢酸キナーゼStreptomycescoelicolorA32gi|6808417|emb|CAB70654.1|6808417;酢酸キナーゼStreptococcuspyogenesM1GASgi|15674332|ref|NP_268506.1|15674332;酢酸キナーゼCampylobacterjejunisubsp.jejuniNCTC11168gi|15792038|ref|NP_281861.1|15792038;酢酸キナーゼStreptococcuspyogenesM1GASgi|13621416|gb|AAK33227.1|13621416;酢酸キナーゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32476009|ref|NP_869003.1|32476009;酢酸キナーゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32472045|ref|NP_865039.1|32472045;酢酸キナーゼCampylobacterjejunisubsp.jejuniNCTC11168gi|112360034|emb|CAL34826.1|112360034;酢酸キナーゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32446553|emb|CAD76388.1|32446553;酢酸キナーゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32397417|emb|CAD72723.1|32397417;AckAClostridiumkluyveriDSM555gi|153954016|ref|YP_001394781.1|153954016;酢酸キナーゼBifidobacteriumlongumNCC2705gi|23465540|ref|NP_696143.1|23465540;AckAClostridiumkluyveriDSM555gi|146346897|gb|EDK33433.1|146346897;酢酸キナーゼCorynebacteriumdiphtheriaegi|38200875|emb|CAE50580.1|38200875;酢酸キナーゼBifidobacteriumlongumNCC2705gi|23326203|gb|AAN24779.1|23326203;酢酸キナーゼAcetokinasegi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA_ECOLI67462089;およびAckABacilluslicheniformisDSM13gi|52349315|gb|AAU41949.1|52349315が含まれ、そのような受託番号に関連づけられる配列が参照により本明細書に組み込まれる。リン酸アセチルトランスフェラーゼは、E.coliにおいてptaによりコードされる。PTAは、アセテートからアセチルCoAへの変換に関与する。具体的には、PTAは、アセチルcoAからアセチル-リン酸への変換を触媒する。PTAのホモログおよび変異体は公知である。NCBI上で利用可能な細菌のリン酸アセチルトランスフェラーゼはおよそ1075種存在する。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、リン酸アセチルトランスフェラーゼPtaRickettsiafelisURRWXCal2gi|67004021|gb|AAY60947.1|67004021;リン酸アセチルトランスフェラーゼBuchneraaphidicolastr.CcCinaracedrigi|116256910|gb|ABJ90592.1|116256910;ptaBuchneraaphidicolastr.CcCinaracedrigi|116515056|ref|YP_802685.1|116515056;ptaWigglesworthiaglossinidiaendosymbiontofGlossinabrevipalpisgi|25166135|dbj|BAC24326.1|25166135;PtaPasteurellamultocidasubsp.multocidastr.Pm70gi|12720993|gb|AAK02789.1|12720993;PtaRhodospirillumrubrumgi|25989720|gb|AAN75024.1|25989720;ptaListeriawelshimeriserovar6bstr.SLCC5334gi|116742418|emb|CAK21542.1|116742418;PtaMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisK-10gi|41398816|gb|AAS06435.1|41398816;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaBorreliaburgdorferiB31gi|15594934|ref|NP_212723.1|15594934;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaBorreliaburgdorferiB31gi|2688508|gb|AAB91518.1|2688508;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaHaemophilusinfluenzaeRdKW20gi|1574131|gb|AAC22857.1|1574131;リン酸アセチルトランスフェラーゼPtaRickettsiabelliiRML369-Cgi|91206026|ref|YP_538381.1|91206026;リン酸アセチルトランスフェラーゼPtaRickettsiabelliiRML369-Cgi|91206025|ref|YP_538380.1|91206025;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaMycobacteriumtuberculosisF11gi|148720131|gb|ABR04756.1|148720131;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaMycobacteriumtuberculosisstr.Haarlemgi|134148886|gb|EBA40931.1|134148886;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaMycobacteriumtuberculosisCgi|124599819|gb|EAY58829.1|124599819;リン酸アセチルトランスフェラーゼPtaRickettsiabelliiRML369-Cgi|91069570|gb|ABE05292.1|91069570;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaRickettsiabelliiRML369-Cgi|91069569|gb|ABE05291.1|91069569;リン酸アセチルトランスフェラーゼptaTreponemapallidumsubsp.pallidumstr.Nicholsgi|15639088|ref|NP_218534.1|15639088;およびリン酸アセチルトランスフェラーゼptaTreponemapallidumsubsp.pallidumstr.Nicholsgi|3322356|gb|AAC65090.1|3322356が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ピルビン酸-ギ酸リアーゼギ酸アセチルトランスフェラーゼは、ピルベートからアセチル-coAおよびホルメートへの変換を触媒する酵素である。これは、pfl-活性化酵素により、嫌気条件下で有機遊離基の発生により誘導され、リン酸制限の間に著しく減少する。ギ酸アセチルトランスフェラーゼは、E.coliにおいてpflBによりコードされる。PFLBのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ピルビン酸ギ酸-リアーゼ1gi|129879|sp|P09373.2|PFLB_ECOLI129879;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisCO92gi|16121663|ref|NP_404976.1|16121663;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapseudotuberculosisIP32953gi|51595748|ref|YP_069939.1|51595748;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001gi|45441037|ref|NP_992576.1|45441037;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisCO92gi|115347142|emb|CAL20035.1|115347142;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001gi|45435896|gb|AAS61453.1|45435896;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapseudotuberculosisIP32953gi|51589030|emb|CAH20648.1|51589030;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphistr.CT18gi|16759843|ref|NP_455460.1|16759843;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarParatyphiAstr.ATCC9150gi|56413977|ref|YP_151052.1|56413977;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphigi|16502136|emb|CAD05373.1|16502136;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarParatyphiAstr.ATCC9150gi|56128234|gb|AAV77740.1|56128234;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigelladysenteriaeSd197gi|82777577|ref|YP_403926.1|82777577;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri2astr.2457Tgi|30062438|ref|NP_836609.1|30062438;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri2astr.2457Tgi|30040684|gb|AAP16415.1|30040684;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri5str.8401gi|110614459|gb|ABF03126.1|110614459;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigelladysenteriaeSd197gi|81241725|gb|ABB62435.1|81241725;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliO157:H7EDL933gi|12514066|gb|AAG55388.1|AE005279_812514066;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisKIMgi|22126668|ref|NP_670091.1|22126668;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1StreptococcusagalactiaeA909gi|76787667|ref|YP_330335.1|76787667;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisKIMgi|21959683|gb|AAM86342.1|AE013882_321959683;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1StreptococcusagalactiaeA909gi|76562724|gb|ABA45308.1|76562724;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Yersiniaenterocoliticasubsp.enterocolitica8081gi|123441844|ref|YP_001005827.1|123441844;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri5str.8401gi|110804911|ref|YP_688431.1|110804911;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliUTI89gi|91210004|ref|YP_539990.1|91210004;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigellaboydiiSb227gi|82544641|ref|YP_408588.1|82544641;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigellasonneiSs046gi|74311459|ref|YP_309878.1|74311459;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniaeMGH78578gi|152969488|ref|YP_001334597.1|152969488;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphiTy2gi|29142384|ref|NP_805726.1|29142384ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri2astr.301gi|24112311|ref|NP_706821.1|24112311;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliO157:H7EDL933gi|15800764|ref|NP_286778.1|15800764;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniaeMGH78578gi|150954337|gb|ABR76367.1|150954337;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisCA88-4125gi|149366640|ref|ZP_01888674.1|149366640;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1YersiniapestisCA88-4125gi|149291014|gb|EDM41089.1|149291014;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Yersiniaenterocoliticasubsp.enterocolitica8081gi|122088805|emb|CAL11611.1|122088805;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigellasonneiSs046gi|73854936|gb|AAZ87643.1|73854936;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliUTI89gi|91071578|gb|ABE06459.1|91071578;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphiTy2gi|29138014|gb|AAO69575.1|29138014;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1ShigellaboydiiSb227gi|81246052|gb|ABB66760.1|81246052;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1Shigellaflexneri2astr.301gi|24051169|gb|AAN42528.1|24051169;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliO157:H7str.Sakaigi|13360445|dbj|BAB34409.1|13360445;ギ酸アセチルトランスフェラーゼ1EscherichiacoliO157:H7str.Sakaigi|15830240|ref|NP_309013.1|15830240;ギ酸アセチルトランスフェラーゼIピルビン酸ギ酸-リアーゼ1Photorhabdusluminescenssubsp.laumondiiTTO1gi|36784986|emb|CAE13906.1|36784986;ギ酸アセチルトランスフェラーゼIピルビン酸ギ酸-リアーゼ1Photorhabdusluminescenssubsp.laumondiiTTO1gi|37525558|ref|NP_928902.1|37525558;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMu50gi|14245993|dbj|BAB56388.1|14245993;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMu50gi|15923216|ref|NP_370750.1|15923216;ギ酸アセチルトランスフェラーゼピルビン酸ギ酸リアーゼgi|81706366|sp|Q7A7X6.1|PFLB_STAAN81706366;ギ酸アセチルトランスフェラーゼピルビン酸ギ酸リアーゼgi|81782287|sp|Q99WZ7.1|PFLB_STAAM81782287;ギ酸アセチルトランスフェラーゼピルビン酸ギ酸リアーゼgi|81704726|sp|Q7A1W9.1|PFLB_STAAW81704726;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMu3gi|156720691|dbj|BAF77108.1|156720691;ギ酸アセチルトランスフェラーゼErwiniacarotovorasubsp.atrosepticaSCRI1043gi|50121521|ref|YP_050688.1|50121521;ギ酸アセチルトランスフェラーゼErwiniacarotovorasubsp.atrosepticaSCRI1043gi|49612047|emb|CAG75496.1|49612047;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusstr.Newmangi|150373174|dbj|BAF66434.1|150373174;ギ酸アセチルトランスフェラーゼShewanellaoneidensisMR-1gi|24374439|ref|NP_718482.1|24374439;ギ酸アセチルトランスフェラーゼShewanellaoneidensisMR-1gi|24349015|gb|AAN55926.1|AE015730_324349015;ギ酸アセチルトランスフェラーゼActinobacilluspleuropneumoniaeserovar3str.JL03gi|165976461|ref|YP_001652054.1|165976461;ギ酸アセチルトランスフェラーゼActinobacilluspleuropneumoniaeserovar3str.JL03gi|165876562|gb|ABY69610.1|165876562;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMW2gi|21203365|dbj|BAB94066.1|21203365;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusN315gi|13700141|dbj|BAB41440.1|13700141;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusstr.Newmangi|151220374|ref|YP_001331197.1|151220374;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMu3gi|156978556|ref|YP_001440815.1|156978556;ギ酸アセチルトランスフェラーゼSynechococcussp.JA-2-3B’a2-13gi|86607744|ref|YP_476506.1|86607744;ギ酸アセチルトランスフェラーゼSynechococcussp.JA-3-3Abgi|86605195|ref|YP_473958.1|86605195;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStreptococcuspneumoniaeD39gi|116517188|ref|YP_815928.1|116517188;ギ酸アセチルトランスフェラーゼSynechococcussp.JA-2-3B’a2-13gi|86556286|gb|ABD01243.1|86556286;ギ酸アセチルトランスフェラーゼSynechococcussp.JA-3-3Abgi|86553737|gb|ABC98695.1|86553737;ギ酸アセチルトランスフェラーゼClostridiumnovyiNTgi|118134908|gb|ABK61952.1|118134908;ギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMRSA252gi|49482458|ref|YP_039682.1|49482458;およびギ酸アセチルトランスフェラーゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMRSA252gi|49240587|emb|CAG39244.1|49240587が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。アルファイソプロピルリンゴ酸シンターゼEC2.3.3.13、時には2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、アルファ-IPMシンターゼと称されるは、アセチルCoAのアセチル基と3-メチル-2-オキソブタノエート2-オキソイソバレレートの縮合を触媒して、3-カルボキシ-3-ヒドロキシ-4-メチルペンタノエート2-イソプロピルマレートを形成する。アルファイソプロピルリンゴ酸シンターゼは、E.coliにおいてleuAによりコードされる。LeuAのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、例えば、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼCorynebacteriumglutamicumgi|452382|emb|CAA50295.1|452382;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼEscherichiacoliK12gi|16128068|ref|NP_414616.1|16128068;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼEscherichiacoliK12gi|1786261|gb|AAC73185.1|1786261;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼArabidopsisthalianagi|15237194|ref|NP_197692.1|15237194;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼArabidopsisthalianagi|42562149|ref|NP_173285.2|42562149;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼArabidopsisthalianagi|15221125|ref|NP_177544.1|15221125;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼStreptomycescoelicolorA32gi|32141173|ref|NP_733575.1|32141173;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32477692|ref|NP_870686.1|32477692;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32448246|emb|CAD77763.1|32448246;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼAkkermansiamuciniphilaATCCBAA-835gi|166241432|gb|EDR53404.1|166241432;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼHerpetosiphonaurantiacusATCC23779gi|159900959|ref|YP_001547206.1|159900959;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼDinoroseobactershibaeDFL12gi|159043149|ref|YP_001531943.1|159043149;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼSalinisporaarenicolaCNS-205gi|159035933|ref|YP_001535186.1|159035933;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼClavibactermichiganensissubsp.michiganensisNCPPB382gi|148272757|ref|YP_001222318.1|148272757;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼEscherichiacoliBgi|124530643|ref|ZP_01701227.1|124530643;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼEscherichiacoliCstr.ATCC8739gi|124499067|gb|EAY46563.1|124499067;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼBordetellapertussisTohamaIgi|33591386|ref|NP_879030.1|33591386;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼPolynucleobacternecessariusSTIR1gi|164564063|ref|ZP_02209880.1|164564063;2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼPolynucleobacternecessariusSTIR1gi|164506789|gb|EDQ94990.1|164506789;および2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼBacillusweihenstephanensisKBAB4gi|163939313|ref|YP_001644197.1|163939313が含まれ、受託番号に関連づけられる配列はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。BCAAアミノトランスフェラーゼは、分枝鎖アミノ酸BCAAの形成を触媒する。いくつものそのようなアミノトランスフェラーゼが公知であり、E.coliにおけるilvEにより例示される。例示的なホモログおよび変異体としては、以下の受託番号で示される配列が含まれる:ilvEMicrocystisaeruginosaPCC7806gi|159026756|emb|CAO86637.1|159026756;IlvEEscherichiacoligi|87117962|gb|ABD20288.1|87117962;IlvEEscherichiacoligi|87117960|gb|ABD20287.1|87117960;IlvEEscherichiacoligi|87117958|gb|ABD20286.1|87117958;IlvEShigellaflexnerigi|87117956|gb|ABD20285.1|87117956;IlvEShigellaflexnerigi|87117954|gb|ABD20284.1|87117954;IlvEShigellaflexnerigi|87117952|gb|ABD20283.1|87117952;IlvEShigellaflexnerigi|87117950|gb|ABD20282.1|87117950;IlvEShigellaflexnerigi|87117948|gb|ABD20281.1|87117948;IlvEShigellaflexnerigi|87117946|gb|ABD20280.1|87117946;IlvEShigellaflexnerigi|87117944|gb|ABD20279.1|87117944;IlvEShigellaflexnerigi|87117942|gb|ABD20278.1|87117942;IlvEShigellaflexnerigi|87117940|gb|ABD20277.1|87117940;IlvEShigellaflexnerigi|87117938|gb|ABD20276.1|87117938;IlvEShigelladysenteriaegi|87117936|gb|ABD20275.1|87117936;IlvEShigelladysenteriaegi|87117934|gb|ABD20274.1|87117934;IlvEShigelladysenteriaegi|87117932|gb|ABD20273.1|87117932;IlvEShigelladysenteriaegi|87117930|gb|ABD20272.1|87117930;およびIlvEShigelladysenteriaegi|87117928|gb|ABD20271.1|87117928、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。チロシンアミノトランスフェラーゼは、ジカルボキシルアミノ酸基質および芳香族アミノ酸基質の両方のアミノ基転移を触媒する。E.coliのチロシンアミノトランスフェラーゼは、遺伝子tyrBによりコードされる。TyrBのホモログおよび変異体は公知である。例えば、そのようなホモログおよび変異体としては、tyrBBordetellapetriigi|163857093|ref|YP_001631391.1|163857093;tyrBBordetellapetriigi|163260821|emb|CAP43123.1|163260821;アミノトランスフェラーゼgi|551844|gb|AAA24704.1|551844;アミノトランスフェラーゼBradyrhizobiumsp.BTAi1gi|146404387|gb|ABQ32893.1|146404387;チロシンアミノトランスフェラーゼTyrBSalmonellaentericagi|4775574|emb|CAB40973.2|4775574;チロシンアミノトランスフェラーゼSalmonellatyphimuriumLT2gi|16422806|gb|AAL23072.1|16422806;およびチロシンアミノトランスフェラーゼgi|148085|gb|AAA24703.1|148085が含まれ、その各配列は参照により本明細書に組み込まれる。ピルビン酸オキシダーゼは、ピルベートのアセテートおよびCO2への変換を触媒する。E.coliでは、ピルビン酸オキシダーゼは、poxBによりコードされる。PoxBおよびそのホモログおよび変異体としては、例えば、ピルビン酸オキシダーゼ;PoxBEscherichiacoligi|685128|gb|AAB31180.1||bbm|348451|bbs|154716685128;PoxBPseudomonasfluorescensgi|32815820|gb|AAP88293.1|32815820;poxBEscherichiacoligi|25269169|emb|CAD57486.1|25269169;ピルビン酸デヒドロゲナーゼSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphigi|16502101|emb|CAD05337.1|16502101;ピルビン酸オキシダーゼLactobacillusplantarumgi|41691702|gb|AAS10156.1|41691702;ピルビン酸デヒドロゲナーゼBradyrhizobiumjaponicumgi|20257167|gb|AAM12352.1|20257167;ピルビン酸デヒドロゲナーゼYersiniapestisKIMgi|22126698|ref|NP_670121.1|22126698;ピルビン酸デヒドロゲナーゼシトクロムYersiniapestisbiovarAntiquastr.B42003004gi|166211240|ref|ZP_02237275.1|166211240;ピルビン酸デヒドロゲナーゼシトクロムYersiniapestisbiovarAntiquastr.B42003004gi|166207011|gb|EDR51491.1|166207011;ピルビン酸デヒドロゲナーゼPseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000gi|28869703|ref|NP_792322.1|28869703;ピルビン酸デヒドロゲナーゼSalmonellatyphimuriumLT2gi|16764297|ref|NP_459912.1|16764297;ピルビン酸デヒドロゲナーゼSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphistr.CT18gi|16759808|ref|NP_455425.1|16759808;ピルビン酸デヒドロゲナーゼシトクロムCoxiellaburnetiiDugway5J108-111gi|154706110|ref|YP_001424132.1|154706110;ピルビン酸デヒドロゲナーゼClavibactermichiganensissubsp.michiganensisNCPPB382gi|148273312|ref|YP_001222873.1|148273312;ピルビン酸オキシダーゼLactobacillusacidophilusNCFMgi|58338213|ref|YP_194798.1|58338213;およびピルビン酸デヒドロゲナーゼYersiniapestisCO92gi|16121638|ref|NP_404951.1|16121638が含まれ、各受託番号の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼEC1.1.1.103は、L-トレオニンのL-2-アミノ-3-オキソブタノエートへの変換を触媒する。遺伝子tdhがL-トレオニン3-デヒドロゲナーゼをコードする。NCBIにおいて認識されている細菌生物由来のL-トレオニン3-デヒドロゲナーゼはおよそ700種存在する。tdhの種々のホモログおよび変異体としては、例えば、L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|135560|sp|P07913.1|TDH_ECOLI135560;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227854|sp|A4TSC6.1|TDH_YERPP166227854;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227853|sp|A1JHX8.1|TDH_YERE8166227853;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227852|sp|A6UBM6.1|TDH_SINMW166227852;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227851|sp|A1RE07.1|TDH_SHESW166227851;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227850|sp|A0L2Q3.1|TDH_SHESA166227850;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227849|sp|A4YCC5.1|TDH_SHEPC166227849;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227848|sp|A3QJC8.1|TDH_SHELP166227848;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227847|sp|A6WUG6.1|TDH_SHEB8166227847;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227846|sp|A3CYN0.1|TDH_SHEB5166227846;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227845|sp|A1S1Q3.1|TDH_SHEAM166227845;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227844|sp|A4FND4.1|TDH_SACEN166227844;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227843|sp|A1SVW5.1|TDH_PSYIN166227843;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227842|sp|A5IGK7.1|TDH_LEGPC166227842;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227841|sp|A6TFL2.1|TDH_KLEP7166227841;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227840|sp|A4IZ92.1|TDH_FRATW166227840;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227839|sp|A0Q5K3.1|TDH_FRATN166227839;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227838|sp|A7NDM9.1|TDH_FRATF166227838;L-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227837|sp|A7MID0.1|TDH_ENTS8166227837;およびL-トレオニン3-デヒドロゲナーゼgi|166227836|sp|A1AHF3.1|TDH_ECOK1166227836が含まれ、各受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvHおよびアセト乳酸シンターゼ例えば、alsS、ilvB、ilvIは、分岐鎖アミノ酸バリン、ロイシン、およびイソロイシンの合成を触媒する。E.coliではIlvHがアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする例えば、参照により本明細書に組み込まれる、アセトヒドロキシ酸シンターゼAHASIIIIlvHEscherichiacoligi|40846|emb|CAA38855.1|40846を参照されたい。配列番号45および配列番号46も参照されたい。ilvHを含むホモログおよび変異体ならびにオペロンは公知であり、それらとしては、例えば、ilvHMicrocystisaeruginosaPCC7806gi|159026908|emb|CAO89159.1|159026908;IlvHBacillusamyloliquefaciensFZB42gi|154686966|ref|YP_001422127.1|154686966;IlvHBacillusamyloliquefaciensFZB42gi|154352817|gb|ABS74896.1|154352817;IlvHXenorhabdusnematophilagi|131054140|gb|ABO32787.1|131054140;IlvHSalmonellatyphimuriumgi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227_27631124、ilvNListeriainnocuagi|16414606|emb|CAC97322.1|16414606;ilvNListeriamonocytogenesgi|16411438|emb|CAD00063.1|16411438;アセトヒドロキシ酸シンターゼCaulobactercrescentusgi|408939|gb|AAA23048.1|408939;アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニットSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphigi|16504830|emb|CAD03199.1|16504830;アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニットTropherymawhippleiTW08/27gi|28572714|ref|NP_789494.1|28572714;アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニットTropherymawhippleiTW08/27gi|28410846|emb|CAD67232.1|28410846;アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニットSalmonellaentericasubsp.entericaserovarParatyphiAstr.ATCC9150gi|56129933|gb|AAV79439.1|56129933;アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニット;アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニットgi|551779|gb|AAA62430.1|551779;アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニットSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphiTy2gi|29139650|gb|AAO71216.1|29139650;アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニットStreptomycescinnamonensisgi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526_15733116;アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット;およびアセトヒドロキシ酸シンターゼ、大サブユニットgi|400334|gb|AAA62429.1|400334が含まれ、受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。アセト乳酸シンターゼ遺伝子としては、alsSおよびilvIが含まれる。ilvIおよびalsSのホモログは公知であり、それらとしては、例えば、アセト乳酸シンターゼ小サブユニットBifidobacteriumlongumNCC2705gi|23325489|gb|AAN24137.1|23325489;アセト乳酸シンターゼ小サブユニットGeobacillusstearothermophilusgi|19918933|gb|AAL99357.1|19918933;アセト乳酸シンターゼAzoarcussp.BH72gi|119671178|emb|CAL95091.1|119671178;アセト乳酸シンターゼ小サブユニットCorynebacteriumdiphtheriaegi|38199954|emb|CAE49622.1|38199954;アセト乳酸シンターゼAzoarcussp.BH72gi|119669739|emb|CAL93652.1|119669739;アセト乳酸シンターゼ小サブユニットCorynebacteriumjeikeiumK411gi|68263981|emb|CAI37469.1|68263981;アセト乳酸シンターゼ小サブユニットBacillussubtilisgi|1770067|emb|CAA99562.1|1770067;アセト乳酸シンターゼアイソザイム1小サブユニットAHAS-Iアセトヒドロキシ酸シンターゼI小サブユニットALS-Igi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI83309006;アセト乳酸シンターゼ大サブユニットGeobacillusstearothermophilusgi|19918932|gb|AAL99356.1|19918932;およびアセト乳酸シンターゼ、小サブユニットThermoanaerobactertengcongensisMB4gi|20806556|ref|NP_621727.1|20806556が含まれ、受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれる。NCBIには、ilvBのホモログおよび変異体がおよそ1120種列挙されている。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成の平行経路における第2の酵素である。E.coliではIlvCがアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする例えば、配列番号47および配列番号48を参照されたい。ilvCのホモログおよび変異体は公知であり、それらとしては、例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼSchizosaccharomycespombe972h-gi|162312317|ref|NP_001018845.2|162312317;アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼSchizosaccharomycespombegi|3116142|emb|CAA18891.1|3116142;アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼSaccharomycescerevisiaeYJM789gi|151940879|gb|EDN59261.1|151940879;Ilv5p:アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼSaccharomycescerevisiaegi|609403|gb|AAB67753.1|609403;ACL198WpAshbyagossypiiATCC10895gi|45185490|ref|NP_983206.1|45185490;ACL198WpAshbyagossypiiATCC10895gi|44981208|gb|AAS51030.1|44981208;アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ;Ilv5xSaccharomycescerevisiaegi|957238|gb|AAB33579.1||bbm|369068|bbs|165406957238;アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ;Ilv5gSaccharomycescerevisiaegi|957236|gb|AAB33578.1||bbm|369064|bbs|165405957236;およびケトール酸レダクトイソメラーゼSchizosaccharomycespombegi|2696654|dbj|BAA24000.1|2696654が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成における第4のステップ、2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸isovaleicacidのアルファ-ケトイソ吉草酸への脱水を触媒する。例えば、E.coliにおけるIlvD配列番号49および配列番号50を参照されたいおよびilv3は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼのホモログおよび変異体は公知であり、それらとしては、例えば、IlvDMycobacteriumlepraegi|2104594|emb|CAB08798.1|2104594;ジヒドロキシ酸デヒドラターゼTropherymawhippleiTW08/27gi|28410848|emb|CAD67234.1|28410848;ジヒドロキシ酸デヒドラターゼMycobacteriumlepraegi|13093837|emb|CAC32140.1|13093837;ジヒドロキシ酸デヒドラターゼRhodopirellulabalticaSH1gi|32447871|emb|CAD77389.1|32447871;および推定ジヒドロキシ酸デヒドラターゼStaphylococcusaureussubsp.aureusMRSA252gi|49242408|emb|CAG41121.1|49242408が含まれ、受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。2-ケト酸デカルボキシラーゼは、2-ケト酸の、それぞれのアルデヒドへの変換を触媒する。例えば、2-ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼは、2-ケトイソバレレートのイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する。いくつもの2-ケト酸デカルボキシラーゼが公知であり、pdc遺伝子、pdc1遺伝子、pdc5遺伝子、pdc6遺伝子、aro10遺伝子、thI3遺伝子、kdcA遺伝子およびkivd遺伝子によって例示される。2-ケト酸をそれぞれのアルデヒドに変換するために有用な例示的なホモログおよび変異体は、以下の受託番号で示される配列および同定された酵素活性を含む:gi|44921617|gb|AAS49166.1|分岐鎖アルファ-ケト酸デカルボキシラーゼLactococcuslactis;gi|15004729|ref|NP_149189.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼClostridiumacetobutylicumATCC824;gi|82749898|ref|YP_415639.1|推測ピルビン酸デカルボキシラーゼStaphylococcusaureusRF122;gi|77961217|ref|ZP_00825060.1|COG3961:ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素thiaminepyrophosphate-requiringenzymesYersiniamollaretiiATCC43969;gi|71065418|ref|YP_264145.1|推定ピルビン酸デカルボキシラーゼPsychrobacterarcticus273-4;gi|16761331|ref|NP_456948.1|推定デカルボキシラーゼSalmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphistr.CT18;gi|93005792|ref|YP_580229.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼPsychrobactercryohalolentisK5;gi|23129016|ref|ZP_00110850.1|COG3961:ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素NostocpunctiformePCC73102;gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297_1ピルビン酸デカルボキシラーゼSarcinaventriculi;gi|15607993|ref|NP_215368.1|推測ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼpdcMycobacteriumtuberculosisH37Rv;gi|41406881|ref|NP_959717.1|pdcMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisK-10;gi|91779968|ref|YP_555176.1|推定ピルビン酸デカルボキシラーゼBurkholderiaxenovoransLB400;gi|15828161|ref|NP_302424.1|ピルビン酸またはインドールピルビン酸デカルボキシラーゼMycobacteriumlepraeTN;gi|118616174|ref|YP_904506.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼまたはインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼPdcMycobacteriumulceransAgy99;gi|67989660|ref|NP_001018185.1|hypotheticalproteinSPAC3H8.01Schizosaccharomycespombe972h-;gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847_1ピルビン酸デカルボキシラーゼPdcBRhizopusoryzae;gi|69291130|ref|ZP_00619161.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ:ピルビン酸デカルボキシラーゼKineococcusradiotoleransSRS30216;gi|66363022|ref|XP_628477.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼCryptosporidiumparvumIowaII;gi|70981398|ref|XP_731481.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼAspergillusfumigatusAf293;gi|121704274|ref|XP_001270401.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定AspergillusclavatusNRRL1;gi|119467089|ref|XP_001257351.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定NeosartoryafischeriNRRL181;gi|26554143|ref|NP_758077.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼMycoplasmapenetransHF-2;gi|21666009|gb|AAM73539.1|AF282846_1ピルビン酸デカルボキシラーゼPdcARhizopusoryzae。アルコールデヒドロゲナーゼadhは、アミノ酸異化の最終的なステップである、アルデヒドから長鎖または複雑なアルコールへの変換を触媒する。種々のadh遺伝子が当技術分野で公知である。本明細書で示されている通り、adh1のホモログおよび変異体としては、例えば、adh2、adh3、adh4、adh5、adh6およびsfa1が含まれる例えば、SFASaccharomycescerevisiaegi|288591|emb|CAA48161.1|288591を参照されたい;受託番号に関連づけられる配列は、参照により本明細書に組み込まれ、配列番号40および配列番号41も参照されたい。シトラマル酸シンターゼは、ピルビン酸と酢酸の縮合を触媒する。例えば、Methanocaldococcusjannaschii配列番号61および配列番号62またはLeptospirainterrogans配列番号73および配列番号74ではCimAがシトラマル酸シンターゼをコードする。ホモログおよび変異体が公知であり、それらとしては、例えば、シトラマル酸シンターゼLeptospirabiflexaserovarPatocgi|116664687|gb|ABK13757.1|116664687;シトラマル酸シンターゼLeptospirabiflexaserovarMonteraleriogi|116664685|gb|ABK13756.1|116664685;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarHebdomadisgi|116664683|gb|ABK13755.1|116664683;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarPomonagi|116664681|gb|ABK13754.1|116664681;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarAustralisgi|116664679|gb|ABK13753.1|116664679;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarAutumnalisgi|116664677|gb|ABK13752.1|116664677;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarPyrogenesgi|116664675|gb|ABK13751.1|116664675;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarCanicolagi|116664673|gb|ABK13750.1|116664673;シトラマル酸シンターゼLeptospirainterrogansserovarLaigi|116664671|gb|ABK13749.1|116664671;CimALeptospirameyeriserovarSemarangagi|119720987|gb|ABL98031.1|119720987;R-シトラマル酸シンターゼgi|2492795|sp|Q58787.1|CIMA_METJA2492795;R-シトラマル酸シンターゼgi|22095547|sp|P58966.1|CIMA_METMA22095547;R-シトラマル酸シンターゼgi|22001554|sp|Q8TJJ1.1|CIMA_METAC22001554;R-シトラマル酸シンターゼgi|22001553|sp|O26819.1|CIMA_METTH22001553;R-シトラマル酸シンターゼgi|22001555|sp|Q8TYB1.1|CIMA_METKA22001555;R-シトラマル酸シンターゼMethanococcusmaripaludisS2gi|45358581|ref|NP_988138.1|45358581;R-シトラマル酸シンターゼMethanococcusmaripaludisS2gi|44921339|emb|CAF30574.1|44921339;およびR-シトラマル酸シンターゼCandidatusKueneniastuttgartiensisgi|91203541|emb|CAJ71194.1|91203541の類似物が含まれ、前述の受託番号に関連づけられる各配列は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明のデアミナーゼとしては、例えば、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ4.3.1.1、L-セリンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.17、D-セリンアンモニアリアーゼ4.3.1.18、トレオニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.19、チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.23、フェニルアラニンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.24、およびフェニルアラニン/チロシンアンモニアリアーゼE.C.4.3.1.25が含まれる。ホモログおよび変異体が公知であり、それらとしては、例えば、Proteus、Sinorhizobium、Streptomyces、Bordetella、Gluconacetobacter、Acinetobacter、Pseudomonas、Ralstonia、Rhizobium、Ruegeria、Burkholderia、Roseobacter、Nocardia、Thioalkalivibrio、Kineococcus、Tsukamurella、Escherichiaなどから単離されたホモログおよび変異体が含まれる。特定の実施形態では、デアミナーゼ遺伝子はsdaBである。E.coliのsdaB遺伝子のヌクレオチド配列およびその対応するアミノ酸配列は、配列番号117および配列番号118に記載されている。本発明のデヒドロゲナーゼとしては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenaseE.C.1.4.1.2およびE.C.1.4.1.4、グルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamicdehydrogenaseE.C.1.4.1.3、バリンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.8、ロイシンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.9、および/またはフェニルアラニンデヒドロゲナーゼE.C.1.4.1.20が含まれる。特定の実施形態では、ロイシンデヒドロゲナーゼはLeuDHであり、それはThermoactinomycesintermedius由来であってよい配列番号119および配列番号120。追加的なホモログおよび変異体は当技術分野で周知である。本発明のトランスアミナーゼとしては、例えば、L-α-トランスアミナーゼE.C.2.6.1.X、Xは任意の数であるが含まれる。ある特定の実施形態では、L-α-トランスアミナーゼは、L-アスパラギン酸トランスアミナーゼE.C.2.6.1.1、L-アラニントランスアミナーゼE.C.2.6.1.12およびE.C.2.6.1.47、L-アスパラギントランスアミナーゼE.C.2.6.1.14、またはグリシントランスアミナーゼE.C.2.6.1.35である。特定の実施形態では、L-アスパラギン酸トランスアミナーゼはAvtAである。AvtA遺伝子は、Escherichiacoli、Neisseriameningitidis、Pantoeaananatis、Amycolatopsismediterranei、Mannheimiasuccinicproducens、Salmonellaenterica、またはYersiniapestis由来であってよい。E.coli由来のAvtAのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は配列番号121および配列番号122として提供されている。一実施形態では、本開示の微生物は、rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78lacIqを供給するためにXL-1blueから形質導入されたF’を有する、ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdBC、Δfnr、ΔptaおよびΔpflBを含み、プラスミドpSA55およびpSA69を含有するE.coliと特徴付けることができ、プラスミドpSA55は、pLlacO1およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下にある、kivd遺伝子Lactococcuslactis、配列番号31および配列番号32およびadh2遺伝子Saccharomycescerevisiae、配列番号41および42を有するColE1起点由来プラスミドであり、プラスミドpSA69は、pLlacO1およびカナマイシン耐性遺伝子の制御下にある、alsS遺伝子Bacillussubtilis;配列番号85および配列番号86、ilvC遺伝子E.coli;配列番号47および配列番号48およびilvD遺伝子E.coli;配列番号49および配列番号50を有するp15A起点由来プラスミドである。別の実施形態では、本開示の微生物は、rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33DrhaBADLD78lacIqを供給するためにXL-1blueから形質導入されたF’を有する、ΔmetA、Δtdh、ΔilvB、ΔilvIおよびΔadhEを含み、プラスミドpCS49、pSA62およびpSA55Iを伴うE.coliと特徴付けることができ、プラスミドpSA55Iは、pLlacO1およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下にあり、アンピシリン耐性遺伝子の後にlacIを伴う、kivd遺伝子Lactococcuslactisおよびadh2遺伝子Saccharomycescerevisiaeを有するColE1起点由来プラスミドを含み、プラスミドpSA62は、pLlacO1およびカナマイシン耐性遺伝子の制御下にあるilvA遺伝子E.coli;配列番号51および配列番号52およびleuABCDE.coli遺伝子leuA、leuB、leuCおよびleuDの個々のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は配列番号53~配列番号60、および配列番号75~80として提供されているを有するp15A起点由来プラスミドであり、プラスミドpCS49は、pLlacO1およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の制御下にあるthrAfbrBCE.coli遺伝子を有するpSC101起点由来プラスミドである。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する際には、アミノ酸配列を比較することが典型的である。アミノ酸配列を用いたデータベースの検索は、当技術分野で公知のblastp以外のアルゴリズムによって評価することができる。例えば、ポリペプチド配列は、GCGバージョン6.1のプログラムであるFASTAを使用して比較することができる。FASTAにより、クエリ配列と検索配列の間の最良のオーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性がもたらされるPearson1990年、Meth.Enzymol.183巻:63~98頁、これにより、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性は、これにより、参照により本明細書に組み込まれるGCGバージョン6.1において提供されるFASTAを、その初期状態のパラメータワードサイズwordsize2およびPAM250スコアリング行列で使用して決定することができる。さまざまな微生物を、例えば、種々の化学的実体の生成に適した組換え代謝経路を含むように改変することができることが理解される。種々の微生物が、本明細書において提供される組換え微生物において使用するために適した標的酵素をコードする遺伝物質の供給源としての機能を果たし得ることも理解される。微生物microorganismという用語は、古細菌、細菌およびユーカリアのドメイン由来の原核微生物種および真核微生物種を含み、真核微生物種は酵母および糸状菌、原生生物、藻類、または高等原生生物を含む。微生物細胞および微生物microbeという用語は、微生物microorganismという用語と互換的に使用される。原核生物という用語は当技術分野において認められており、核または他の細胞小器官を含有する細胞を指す。原核生物は、一般に、2つのドメイン、細菌および古細菌のうちの1つに分類される。古細菌ドメインの生物と細菌ドメインの生物の間の決定的な差異は、16SリボソームRNAにおけるヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。古細菌という用語は、一般には、普通でない環境において見いだされ、残りの原核生物とは、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準により区別されるメンドシクテス門の生物のカテゴリー化を指す。ssrRNA解析に基づいて、古細菌は、2つの系統学的に別個の群:クレンアーケオタ門およびユリアーケオタ門からなる。それらの生理機能に基づいて、古細菌は、3種:メタン生成菌メタンを生成する原核生物;高度好塩菌非常に高塩NaCl濃度で生存する原核生物;および高度超好熱菌非常に高温で生存する原核生物に組織化され得る。古細菌を細菌と区別する統一的な古細菌の特徴すなわち、細胞壁にムレインがないこと、エステル連結膜脂質などに加えて、これらの原核生物は、それらを特定の生息地に適合させる独特の構造的属性または生化学的属性を示す。クレンアーケオタ門は、主に超好熱性硫黄依存性原核生物からなり、ユリアーケオタ門は、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。細菌または真正細菌とは、原核生物のドメインを指す。細菌としては以下の少なくとも11種の別個の群が含まれる:1グラム陽性gram細菌、これには2つの主要な細区分:1高GC群放線菌類、マイコバクテリア、ミクロコッカス、およびその他2低GC群バチルス、クロストリジア、ラクトバチルス、ブドウ球菌、連鎖球菌、マイコプラズマが存在する;2プロテオバクテリア、例えば、紫色光合成非光合成グラム陰性細菌大多数の一般的なグラム陰性細菌を含む;3シアノバクテリア、例えば、酸素発生型光合成生物;4スピロヘータおよび関連する種;5プランクトミセス;6バクテロイデス、フラボバクテリア;7クラミジア;8緑色硫黄細菌;9緑色非硫黄細菌嫌気性光合成生物も;10放射線抵抗性の小球菌および類縁体;11サーモトガおよびThermosiphothermophiles。グラム陰性細菌は、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌を含む。グラム陰性細菌の属としては、例えば、Neisseria、Spirillum、Pasteurella、Brucella、Yersinia、Francisella、Haemophilus、Bordetella、Escherichia、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Proteus、Vibrio、Pseudomonas、Bacteroides、Acetobacter、Aerobacter、Agrobacterium、Azotobacter、Spirillum、Serratia、Vibrio、Rhizobium、Chlamydia、Rickettsia、Treponema、およびFusobacteriumが含まれる。グラム陽性細菌は、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌を含む。グラム陽性細菌の属としては、例えば、Actinomyces、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Erysipelothrix、Lactobacillus、Listeria、Mycobacterium、Myxococcus、Nocardia、Staphylococcus、Streptococcus、およびStreptomycesが含まれる。組換え微生物および組換え宿主細胞という用語は、本明細書では互換的に使用され、内在性ポリヌクレオチドを発現または過剰発現するように、または非内在性配列、例えば、ベクター内に含まれる配列などを発現するように遺伝子改変された微生物、または内在性遺伝子の発現が低下している微生物を指す。一般には、ポリヌクレオチドは、上記の所望の代謝産物を生成するための代謝経路に関与する標的酵素をコードする。したがって、本明細書に記載の組換え微生物は、親の微生物によって以前発現または過剰発現されていなかった標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。組換え微生物および組換え宿主細胞という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。親の微生物とは、組換え微生物を作製するために用いる細胞を指す。親の微生物という用語は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない野生型細胞を説明する。親の微生物という用語は、遺伝子改変されているが、標的酵素、例えば、所望の代謝産物を生成するための生合成経路に関与する酵素を発現または過剰発現しない細胞も説明する。例えば、野生型微生物は、チオラーゼなどの第1の標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子改変することができる。この微生物は、第2の標的酵素、例えば、ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼを発現または過剰発現するように改変された微生物の作製において親の微生物としての機能を果たし得る。今度は、例えば、チオラーゼおよびヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼを発現または過剰発現するように改変された微生物を、第3の標的酵素、例えば、クロトナーゼを発現または過剰発現するように改変することができる。したがって、親の微生物は、連続的な遺伝子改変事象の参照細胞として機能する。各改変事象は、参照細胞に核酸分子を導入することによって実現することができる。導入により、標的酵素の発現または過剰発現が容易になる。容易になるという用語は、例えば、親の微生物におけるプロモーター配列の遺伝子改変により、標的酵素をコードする内在性ポリヌクレオチドが活性化されることを含むことが理解される。さらに、容易になるという用語は、親の微生物に標的酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含むことが理解される。別の実施形態では、適切な炭素基質を、例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールに変換する組換え微生物を作出する方法が提供される。該方法は、例えば、アセトヒドロキシ酸シンターゼ例えば、ilvIHオペロン、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ例えば、leuA、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ例えば、leuB、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ例えば、leuCDオペロン、トレオニンデヒドラターゼ例えば、ilvA、アルファ-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ例えば、cimA、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ例えば、leuB、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ例えば、leuCDオペロン、トレオニンデヒドラターゼ例えば、ilvA、アセト乳酸シンターゼ例えば、ilvMGまたはilvNB、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ例えば、ilvC、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ例えば、ilvD、ベータ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ例えば、leuB、コリスミ酸ムターゼP/プレフェナートデヒドラターゼ例えば、pheA、例えば、配列番号81および配列番号82で示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列など、コリスミ酸ムターゼT/プレフェナートデヒドロゲナーゼ例えば、tyrA、例えば、配列番号83および配列番号84で示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列など、2-ケト酸デカルボキシラーゼ例えば、kivd、PDC6、またはTHI3、およびアルコール脱水素酵素活性を含むポリペプチドをコードする1つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを用いて微生物を形質転換することを含む。ホモログ、変異体、断片、関連する融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物を含む代謝産物を発生させるために有用な酵素をコードするポリヌクレオチドが、細菌細胞または酵母細胞などの適切な宿主細胞におけるそのようなポリペプチドの発現を導く組換え核酸分子に使用される。コードされるポリヌクレオチドの活性を変更しない配列の付加、例えば、非機能性配列または非コード配列の付加などは、基本的な核酸の保存された変形であることが理解される。酵素の活性とは、代謝産物をもたらす反応を触媒するその能力、すなわち、機能する能力の測定値であり、反応の代謝産物が生成する速度として表すことができる。例えば、酵素活性は、時間の単位当たりまたは酵素の単位当たり例えば、濃度または重量の、生成した代謝産物の量として、または親和性または解離定数を単位として示すことができる。特定の実施形態では、該方法は、glnA、gdhA、lsrA、luxSまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現をノックアウトすることも含む。さらに別の実施形態では、適切な炭素基質を、例えば、アジピン酸、ガンマ-アミノ酪酸aminobuytricacidに変換する組換え微生物を生成する方法が提供される。該方法は、1つまたは複数の組換えポリヌクレオチドを用いて微生物を形質転換することを含む。該方法は、ある特定の実施形態では、glnA、gdhA、lsrA、luxSまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現をノックアウトすることも含み得る。タンパク質またはポリペプチドという用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合と称される化学的な結合によって連結した、1つまたは複数のアミノ酸と称される化学的構成要素の鎖を含む。酵素とは、完全に、または大部分が、おおよそ具体的には、1つまたは複数の化学的反応または生化学的反応を触媒または促進するタンパク質で構成される任意の物質を意味する。酵素という用語は、触媒性ポリヌクレオチド例えば、RNAまたはDNAも指す場合がある。ネイティブなまたは野生型タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞とは、天然に存在するタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞を意味する。上記のポリヌクレオチドは遺伝子を含むこと、および上記の核酸分子はベクターまたはプラスミドを含むことが理解される。例えば、ケトチオラーゼをコードするポリヌクレオチドは、atoB遺伝子もしくはそのホモログ、またはfadA遺伝子もしくはそのホモログによりコードされ得る。したがって、構造遺伝子とも称される遺伝子という用語は、1つまたは複数のタンパク質または酵素の全部または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば遺伝子を発現させる条件を決定する、プロモーター配列などの調節性転写されないDNA配列を含んでもよい。遺伝子の転写領域は、イントロン、5’非翻訳領域UTR、および3’-UTR、ならびにコード配列を含む非翻訳領域を含んでよい。核酸または組換え核酸という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸DNA、および適切な場合にはリボ核酸RNAなどを指す。発現という用語は、遺伝子配列に関しては、遺伝子の転写、および必要に応じて、生じたmRNA転写物のタンパク質への翻訳を指す。したがって、文脈から明らかになる通り、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列が転写され、翻訳されることによってもたらされる。オペロンという用語は、共通のプロモーターにより単一の転写単位として転写される2種以上の遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、オペロンを含む遺伝子は連続した遺伝子である。共通のプロモーターを改変することによりオペロン全体の転写を改変するすなわち、増加させる、減少させる、または排除することができることが理解される。あるいは、オペロン内の任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせを改変して、コードされるポリペプチドの機能または活性を変更することができる。改変の結果、コードされるポリペプチドの活性を増大させることができる。さらに、改変により、コードされるポリペプチドに新規の活性を与えることができる。例示的な新規の活性は、代替基質の使用および/または代替環境条件において機能する能力を含む。ベクターは、生物、細胞、または細胞構成要素の間で核酸を伝播および/または伝達することができる任意の手段である。ベクターとしては、エピソームである、すなわち自律的に複製する、または宿主細胞に染色体に組み込まれ得るウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体、例えば、YAC酵母人工染色体、BAC細菌人工染色体、およびPLAC植物人工染色体などが含まれる。ベクターは、天然ではエピソームではない裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内のDNAおよびRNAの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンとコンジュゲートしたDNAまたはRNA、ペプチドとコンジュゲートしたDNAまたはRNA、リポソームとコンジュゲートしたDNAなどであってよい、または上記のポリヌクレオチド構築物のうちの1つまたは複数を含む生物、例えば、アグロバクテリウムまたは細菌などであってよい。形質転換とは、ベクターを宿主細胞に導入するプロセスを指す。形質転換または形質導入、またはトランスフェクションは、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃または粒子衝撃媒介性送達、またはアグロバクテリウム媒介性形質転換を含むいくつもの手段のうちの任意の1つによって実現することができる。当業者には、遺伝暗号の縮退性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のDNA化合物が、本開示の所与のアミノ酸配列をコードするために使用され得ることが理解されるであろう。上記の生合成酵素をコードするネイティブなDNA配列は、ただ単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されており、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のDNA化合物を含む。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性を損失または著しく損失することなく、そのアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容し得る。本開示は、代替のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、本明細書において示されているDNA配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に本開示の複数の実施形態を例示するものである。本開示は、下により詳細に記載されている、1つまたは複数の標的酵素をコードする、組換えDNA発現ベクターまたはプラスミドの形態の核酸分子を提供する。一般に、そのようなベクターは、宿主微生物の細胞質において複製することができるか、または宿主微生物の染色体DNAに組み込むことができる。いずれの場合も、ベクターは安定ベクターすなわち、ベクターは、たとえ選択圧力のみを伴うとしても、多くの細胞分裂を越えて存在するままであるであってよい、または一過性ベクターすなわち、ベクターは、細胞分裂の数が増えるにつれて宿主微生物から徐々に失われるであってよい。本開示は、DNA分子を、単離されすなわち、純粋ではないが、天然では見いだされない存在量/または濃度で調製物中に存在する、精製されたすなわち、混入材料を実質的に含まない、または天然で対応するDNAが一緒に見いだされる材料を実質的に含まない形態で提供する。本明細書では、アルコール例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールなど、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、および/またはS-アデノシル-メチオニンSAMなどの生合成に関与する生合成遺伝子のうちの1つまたは複数を異種発現させるための方法および該方法において有用な組換えDNA発現ベクターが提供される。したがって、そのような核酸を含む組換え発現ベクターは本開示の範囲内に含まれる。発現ベクターという用語は、宿主微生物または無細胞の転写および翻訳系に導入することができる核酸を指す。発現ベクターは、染色体DNA一部として、または微生物内もしくは任意の細胞区画内の他のDNA、例えば、細胞質内の複製性ベクターなどの一部としてのいずれにせよ、微生物内に恒久的にまたは一過性に維持することができる。発現ベクターはまた、一般に微生物または細胞抽出物においてポリペプチドに翻訳されるRNAの発現を駆動するプロモーターも含む。RNAのタンパク質への効率的な翻訳のために、発現ベクターは、一般には、発現される遺伝子のコード配列の開始コドンの上流に位置するリボソーム結合部位配列も含有する。他のエレメント、例えば、エンハンサー、分泌シグナル配列、転写終結配列、およびベクターを含有する宿主微生物を同定および/または選択することができる1つまたは複数のマーカー遺伝子なども発現ベクターに存在してよい。選択可能マーカー、すなわち、抗生物質耐性または感度を付与する遺伝子を使用し、形質転換された細胞に、細胞を適切な選択培地で成長させた際に選択可能な表現型を付与する。発現ベクターの種々の構成要素は、ベクターおよびベクターが複製することまたは発現を駆動することが意図された宿主細胞複数可の意図された使用に応じて広範に変動し得る。E.coli、酵母、Streptomyces、および他の一般に使用される細胞における遺伝子の発現およびベクターの維持に適した発現ベクターの構成要素は広く公知であり、市販されている。例えば、本開示の発現ベクターに含むための適切なプロモーターとしては、真核宿主微生物または原核宿主微生物において機能するプロモーターが含まれる。プロモーターは、宿主微生物の成長に対して発現の調節を可能にする、または化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節配列を含んでよい。E.coliおよび特定の他の細菌宿主細胞について、生合成酵素、抗生物質耐性付与酵素、およびファージタンパク質の遺伝子に由来するプロモーターを使用することができ、それらとしては、例えば、ガラクトースプロモーター、ラクトースlacプロモーター、マルトースプロモーター、トリプトファンtrpプロモーター、ベータ-ラクタマーゼblaプロモーター、バクテリオファージラムダPLプロモーター、およびT5プロモーターが含まれる。さらに、tacプロモーター米国特許第4,551,433号などの合成プロモーターも使用することができる。E.coli発現ベクターについては、E.coli複製開始点、例えば、pUC、p1P、p1、およびpBRなどを含むことが有用である。したがって、組換え発現ベクターは、少なくとも1つの発現系を含有し、そして、その発現系は、適合性宿主細胞におけるコード配列の発現に影響を及ぼすように作動するプロモーターおよび場合によって終結配列に作動可能に連結したPKSおよび/または他の生合成遺伝子のコード配列の少なくとも一部分で構成される。宿主細胞は、本開示の組換えDNA発現ベクターを用いて、発現系配列を染色体外エレメントとしてか、または染色体に組み込こんで含有するように形質転換によって改変する。本開示の核酸は、cDNA、mRNA、あるいは鋳型としてゲノムDNA、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準のPCR増幅技法および下の実施例の節に記載されている手順に従って増幅することができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴付けることができる。さらに、ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成法によって、例えば、自動DNA合成機を使用して調製することができる。本明細書に記載の酵素と相同なポリペプチドをコードする単離された核酸分子を、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に1つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創出することができることも理解される。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの標準の技法によってポリヌクレオチドに導入することができる。非保存的アミノ酸置換上記を参照されたいを行うことが望ましい位置とは対照的に、一部の位置では、保存的アミノ酸置換を行うことが好ましい。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖を有するアミノ酸例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、非極性側鎖を有するアミノ酸例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸例えば、トレオニン、バリン、イソロイシンおよび芳香族側鎖を有するアミノ酸例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが含まれる。別の実施形態では、例えば、アルコール例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールなど、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、および/またはS-アデノシル-メチオニンSAMなどを生成するための方法が提供される。該方法は、本明細書において提供される組換え微生物を適切な基質例えば、窒素に富むバイオマスの存在下、基質をアルコール例えば、1-プロパノール、イソブタノール、1-ブタノール、2-メチル1-ブタノール、3-メチル1-ブタノールまたは2-フェニルエタノールなど、アセトアルデヒド、アセテート、イソブチルアルデヒド、イソ酪酸、n-ブチルアルデヒド、n-酪酸、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、2-メチル-1-酪酸、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、3-メチル-1-酪酸、アンモニア、アンモニウム、グルタミン酸、トレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、2,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジオール、2-メチル-1,4-ブタンジアミン、イソブテン、イタコネート、アセトイン、アセトン、イソブテン、1,5-ジアミノペンタン、L-乳酸、D-乳酸、シキミ酸、メバロネート、ポリヒドロキシブチレートPHB、イソプレノイド、脂肪酸、ホモアラニン、4-アミノ酪酸GABA、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、アジピン酸、p-ヒドロキシケイ皮酸、テトラヒドロフラン、3-メチル-テトラヒドロフラン、ガンマ-ブチロラクトン、ピロリジノン、n-メチルピロリドン、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、および/またはS-アデノシル-メチオニンSAMなどに変換するために適した条件下で培養することを含む。該方法は、藻類の脂質からバイオディーゼルを生成することを含む、より大きな生成系の一部としてバイオリアクター系内の組換え微生物を含んでよい。本明細書において提供される微生物により生成される生成物は、当業者に公知の任意の方法によって検出することができる。本明細書において提供される組換え微生物の成長および維持に適した培養条件は下記の実施例に記載されている。当業者には、そのような条件は、各微生物の要件に適応させるために改変することができることが理解されよう。以前考察されている通り、ベクターの使用、プロモーターおよび多くの他の関連性のある題目を含む本明細書において有用な分子生物学的技法が記載されている一般的なテキストとしては、BergerおよびKimmel、GuidetoMolecularCloningTechniques、MethodsinEnzymology152巻AcademicPress,Inc.、SanDiego、Calif.Berger;Sambrookら、MolecularCloning-ALaboratoryManual、第2版、1~3巻、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、N.Y.、1989年Sambrook、およびCurrentProtocolsinMolecularBiology、F.M.Ausubelら編、CurrentProtocols、jointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWileySons,Inc.1999年中に捕捉されたAusubelが含まれる。当業者を、例えば、本開示の相同核酸を生成するための、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、Qβ-レプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼ媒介性技法例えば、NASBAを含むinvitro増幅方法に導くために十分なプロトコールの例は、Berger、Sambrook、およびAusubelにおいて、ならびにMullisら1987年米国特許第4,683,202号;Innisら編1990年PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressInc.SanDiego、Calif.Innis;ArnheimLevinson1990年10月1日CEN36~47頁;TheJournalofNIHResearch1991年3巻:81~94頁;Kwohら1989年Proc.Natl.Acad.Sci.USA86巻:1173頁;Guatelliら1990年Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA87巻:1874頁;Lomellら1989年J.Clin.Chem35巻:1826頁;Landegrenら1988年Science241巻:1077~1080頁;VanBrunt1990年Biotechnology8巻:291~294頁;WuおよびWallace1989年Gene4:560;Barringerら1990年Gene89:117;およびSooknananおよびMalek1995年Biotechnology13巻:563~564頁において見いだされる。invitroで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載されている。大きな核酸をPCRによって増幅するための改善された方法は、Chengら1994年Nature369巻:684~685頁およびそこに引用されている参考文献に要約されており、それによると最大40kbのPCRアンプリコンが発生する。当業者は、基本的にいかなるRNAも、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、PCR増大および配列決定のために適した二本鎖DNAに変換することができることを理解されたい。例えば、Ausubel、SambrookおよびBerger、全て上記を参照されたい。適切な培養条件とは、宿主微生物による、すなわち、微生物の代謝的作用による化合物の生成を可能にする培地のpH、イオン強度、栄養素含有量などの条件;温度;酸素/CO2/窒素の含有量;湿度;および他の培養条件である。宿主細胞としての機能を果たし得る微生物に対する適切な培養条件は周知である。2-ケト酸からアルコールを合成するために有用な方法、ベクターおよびポリヌクレオチドは、例えば、米国特許出願公開第20100221800号および同第20100209986号、同第20090081746号において開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、タンパク質性バイオマスから種々の有用な中間体を発生させる方法を提供し、これらの中間体は、その後、種々のアルコールおよび化学組成物に代謝され得る。本開示の組換え微生物を、下記の通りタンパク質性バイオマスなどの窒素含有バイオマスを種々の中間体に変換するように改変することができ、これらの中間体が今度は、追加的な化学物質および/またはバイオ燃料に変換され得る:セリン、グリシン、アラニン、システイン===>ピルベート;グルタミン酸、グルタミン、プロリン、アルギニン====>2-KG2-ケトグルタレート;アスパラギン酸、アスパラギン===>OAAオキサロアセテート;トレオニン===>2-KB2-ケトブチレート;バリン===>2-KIV2-ケトイソバレレート;ロイシン====>2-KIC2-ケトイソカプロエート;およびイソロイシン===>2-KMV2-ケト-3-メチルバレレート。バイオマスから上記の中間体を経由して生成した生成物は、組換え微生物または野生型微生物によって以下の通りさらに代謝され得る:ピルベートが、エタノール、アセテート、アセトアルデヒド、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、n-ブタノール、n-ブチルアルデヒド、2,3-ブタンジオール、L-乳酸、D-乳酸、芳香族物質トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、シキミ酸、PHBポリヒドロキシブチレート、メバロネート、イソプレノイド、脂肪酸および下に列挙されている全ての化学物質他の中間体由来に;2-KG2-ケトグルタレートが、GABA4-アミノ酪酸、グルタミン酸、スクシネート、リンゴ酸に;OAAオキサロアセテートが、アスパラギン酸、リシン、カダベリン、2-ケトアジピン酸、トレオニン、メチオニン、SAMS-アデノシルメチオニンに;2-KB2-ケトブチレートが、2-メチル-1-ブタノール、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシン、ホモアラニンに;2-KIV2-ケトイソバレレートが、イソブタノール、イソブチルアルデヒド、3-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、バリンに;2-KIC2-ケトイソカプロエートが、3-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブチルアルデヒド、ロイシンに;および2-KMV2-ケト-3-メチルバレレートが、2-メチル-1-ブタノール、2-メチル-1-ブチルアルデヒド、イソロイシンに。本開示は以下の実施例に例示されており、これは、例示のために提供され、限定することを意図するものではない。Escherichiacoliの多用性が実証されているので、これを工学的操作の宿主生物として選択した。藻類のアミノ酸の利用についてのE.coliの効率を試験するために、細胞を酵母抽出物または20種のアミノ酸の混合物中で成長させ、それを用いて藻類抽出物をシミュレートした。予想通り、E.coliはこれらの富栄養培地でよく成長した。しかし、アミノ酸の利用は、おそらくアミノ酸の不均衡および分枝鎖アミノ酸BCAAの分解経路の欠如に起因して、不完全であった。野生型E.coliは4種のアミノ酸Ala、Asp、ProおよびGlnのみを個々に、コロニーを形成するための唯一の炭素源として利用することができた。イソブタノール合成経路alsS遺伝子、ilvC遺伝子、ilvD遺伝子、KivD遺伝子およびAdhA遺伝子の過剰発現をE.coliに導入した場合、細胞は、M9塩を補充した4酵母抽出物を含有する培地からイソブタノールを0.17g/Lのみ生成することができ下記の表4、これは理論収量の2.3を示す。アミノ酸の利用を改善するために、一連の化学的突然変異誘発を実施し、その後、単一のアミノ酸または多数のアミノ酸のいずれかで成長させた。突然変異誘発、富化、および選択の複数ラウンドの後、13種に至るまでのアミノ酸を個々に唯一の炭素源として利用することができる株YH19を得た。この株は、イソブタノール経路遺伝子の存在下で、同じ経路遺伝子を有する野生型宿主と比較して高量のイソブタノールを生成することができた。アミノ酸の利用をさらに改善するために、E.coliにおいて個々のアミノ酸の分解遺伝子を過剰発現させることにより、炭素フラックス駆動性手法を使用した。しかし、この手法では、おそらく炭素および窒素のフラックスを制御する種々の制御機構が原因で、小さな成功しか実現されなかった図6Aおよび6B。E.coliにおけるネイティブな調節および競合する経路を非活性化してアミノ酸から高級アルコールをよりよく生成させることを可能にするために、さらなる遺伝子操作を実施した。炭素および窒素の代謝に対する潜在的な影響に基づいて標的遺伝子20種を選択してノックアウトし、生成の改善についてスクリーニングした図2A。これらのノックアウト株の中で、クオラムセンシング陰性突然変異体であるΔlsrAおよびΔluxSがイソブタノール経路の存在下で生成の増加を示した図2A。LuxSはオートインデューサー-2AI-2シンターゼであり、LsrAは、AI-2輸送体LsrABCDのサブユニットの1つである。この輸送体は、定常期への移行中の細胞外AI-2の再取り込みに関与する。YH19からLuxSまたはAI-2輸送体サブユニットをコードする遺伝子を欠失させることにより、バイオ燃料の生成が増加した図2Bおよび2C。AI-2の取り込みはグルコースによって阻害されるので、予測通り、グルコース培地ではこれらの欠失の影響はなかった。この欠失では、イソブタノール経路を有さない細胞においても有意な表現型は示されなかった。これらの結果は、後期成長期におけるAI-2の再取り込みが、炭素および窒素の調節に関与する可能性があることを示唆している。アミノ酸の利用および燃料の生成におけるAI-2系の役割は依然として特徴付けられていない。炭素フラックス駆動性戦略では限られた成功しか実現しなかったので、クオラムセンシングの非活性化に加えて、窒素中心の戦略について調査した。この戦略では、熱力学的勾配を所望の方向に駆動するために、炭素化合物の代わりにアンモニアの分泌を用いた。アンモニアの再取り込みを遮断するために、2種のアンモニウム同化遺伝子、gdhAおよびglnAを欠失させて、窒素フラックスを脱アミノ化に向けて駆動した。この手法では、分解中にアンモニアを直接発生するいくつかのアミノ酸Thr、Gly、Ser、Cys、Asn、ArgおよびGlnの分解が改善された図3A。実際に、gdhAおよびglnAの欠失により、イソブタノール経路の存在下でアルコールの生成が増加した表4。しかし、他のアミノ酸Asp、Ala、Leu、Ile、Valはアミノ基転移を介して分解され、アミノ基が2-ケトグルタレートに転移してグルタミン酸が形成される図3B。さらに、一部のアミノ酸の炭素骨格は、脱アミノ化または還元後にグルタミン酸に直接に変換されるGlnおよびPro図3A。グルタミン酸のアミノ基はさらにBCAAに再分布する。実際に、細菌培養cultivationの過程中、アミノ基転移の結果としてグルタミン酸およびBCAAが培地中に蓄積した。アミノ酸のこれらの群は、細胞において、還元された窒素を細胞の内部に保持するための窒素貯蔵器としての機能を果たすと思われる。細胞内の窒素貯蔵器を流出させるために、いくつかのアミノ基転移/脱アミノ化サイクルを設計した。第1に、IlvEおよびLeuDHにより、グルタミン酸プールAsp、およびAlaと一緒にを流出させて、LeuおよびIleを経由してアンモニアを排出するサイクル図3Cを形成する。第2に、IlvE、AvtA、DadXおよびDadAにより、グルタミン酸プールを流出させて、Val、L-Ala、およびD-Alaを経由してアンモニアにする別のサイクルを形成する図3D。最後に、SerC、SerB、SdaB、PpsA、Eno、およびGpmAにより、Serを経由してアンモニアを流出させるための第3のサイクルを形成する図3E。遺伝子ilvA図3A、ilvE図3CおよびsdaB図3Eは、Thr、GluおよびSerが枯渇している時は過剰発現される必要はなく、これは定常期への移行付近で起こる。したがって、これらの遺伝子は、σ70依存性プロモーターであり、定常期では、定常期におけるコアポリメラーゼ結合を支配するσsと競合するので完全には機能しないrrnBプロモーターにより発現される。この戦略により、バイオ燃料イソブタノール、2MB、3MBの収量が4.0g/L、理論収量の55.7まで首尾よく増加した表4;図10。残りのアミノ酸rAAは、Lys、Met、His、および3つの芳香族アミノ酸を含む。rAAを分解するための代謝条件は、14種の燃料に変換できるアミノ酸fcAAと比較して全く異なる。したがって、rAAを変換するためには別の戦略を用いることが有益であろう。この第2の戦略は、rAAを、20種のアミノ酸全てを含有するタンパク質に再分布させ、次いでタンパク質バイオマスの流れに戻して再利用することを伴う。これを行うために、rAAをPseudomonasなどの生物を成長させるための炭素源および窒素源として使用する。この細菌の成長プロセスにより、rAAが20種のアミノ酸全てに変換され、アンモニアおよびメタンチオールが発生し、それをプロセス後の藻類の成長を支持するためのN供給源およびS供給源として再利用することができる。Pseudomonasを成長させるために6種のrAAを用いた理論収量は41.4であり、これは77.9のfcAAを含有する表8。したがって、第1の生物例えば、E.coliにより14種のアミノ酸が燃料に変換され、第2の生物例えば、Pseudomonas、またはBacillusによりrAAが変換されて14種のfcAAに戻る。二段階変換の使用には、2つのプロセスに必要な通気量が異なるので、利点がある。さらに、rAAの一部を、化学的フィードストックとして、または他の適用のために使用することができる。プロセスを2つに分けることにより、柔軟性が増す。藻類の最小脂質含有量は約10であり、この筋書きを用いて、プロセスの完全な質量流量をマッピングした図4A。そのようなタンパク質に富む種の藻類のバイオマス生産性に基づいて600億ガロンのバイオ燃料を生成するために必要な開放池の最小サイズ図4Aは約21,420平方キロメートルであり、米国の農地の1.6と等しい。高タンパク質のネイティブな藻類種を使用することができるので、これらの生物は地方の塩度、温度、およびpHに順化し、閉鎖フォトバイオリアクターを必要としない。この筋書きでは、窒素5千630万トン、および硫黄210万トンが藻類の成長のために再利用される。生物変換および燃料の燃焼の間に生成される炭素は、最終的に藻類種により再補足される。植物プロセスの筋書きについての算出:1植物プロセスによりエタノール600億ガロンを生成するために必要な肥料-N=940万トン。600億エタノールのガロン数×3.7851ガロン当たりのリットル数×0.7891リットル当たりのkg数エタノール密度=植物による筋書きによって生成するエタノール1791.8億キログラム。1791.8億エタノールのキログラム数]を0.5グルコース1グラム当たりのエタノールのグラム数または50収量で割り、次いで、60トウモロコシのグルコース収率で割る=必要なトウモロコシ5972.7億キログラム。肥料投入量を算出するために、5972.73億トウモロコシのキログラム数に9.8トウモロコシのタンパク質含有量を掛け、次いで16タンパク質中の窒素の重量百分率を掛ける。この最終的な掛け算により窒素9.4×109キログラムが得られ、これは、940万トンと等しい。2940万トンの肥料-Nを生成するためのエネルギー費=536×1012キロジュール。9.4×109窒素のキログラム数×571キログラムの肥料-Nを生成するために必要なメガジュール数=536×1012キロジュール。3エタノールのエネルギー含有量に対するエタノールを生成するための肥料-Nのエネルギー投入量の比率=11.2。エタノールのエネルギー含有量は、600億エタノールのガロン数×79.9ガロン数当たりのメガジュール数エタノール加熱値が低いと等しく、これは4,794×1012キロジュールになる。536×1012肥料合成のために必要なキロジュール数÷この数=11.2。今日のエタノール生成の肥料-Nのエネルギー投入量は別の方法で算出される。肥料-Nのエネルギー費を57MJ/Kgとして算出し、Nの適用率は150kg/haである。これにより、肥料-Nのエネルギー費は8,550MJ/haになる。土地面積当たりのエタノールエネルギー収率を73,424MJ/haとして算出する。したがって、エタノールのエネルギー含有量に対するエタノール生成の肥料-Nのエネルギー投入量の比率は11.64である。この数は、我々による上記の算出と比較してわずかに高く、我々の仮定が妥当であることが確認される。4植物プロセスによってエタノール600億ガロンが生成する場合に蓄積するNに富むバイオマス=1億6400万トンのDDGS。600億エタノールのガロン数×2.73エタノール1ガロン当たりに生成されるDDGSのキログラム数=1億6400万トンのDDGS。5潜在的な米国における年間のDDGS市場に対するNに富むバイオマス1億6400万トンの比率=390。1億6400万DDGSのトン数÷4200万DDGSのトン数潜在的な米国における年間のDDGS市場=390。6潜在的な米国における年間のDDGS市場を満たすための年間のエタノール生産量=154億ガロン。600億年間のエタノールのガロン数÷390=米国におけるDDGS市場を満たすためのエタノール154億ガロン。7米国における年間の燃料消費に対する154億ガロンのエタノールの百分率=7.7。154億エタノールのガロン数÷2,000億ガロン米国における年間の燃料消費=7.7。窒素の再利用を伴わない藻類プロセスの筋書きの算出脂質含有量は30である。8藻類プロセスによってバイオディーゼル600億ガロンを生成するために必要な肥料-N=3550万トン。600億バイオディーゼルのガロン数×3.7851ガロン当たりのリットル数×0.881リットル当たりのキログラム数バイオディーゼルの密度=バイオディーゼル1998.48億キログラム。1998.48億バイオディーゼルのキログラム数÷90脂質のバイオディーゼルへの変換率=222.1脂質のキログラム数。窒素ストレス条件下では、脂質とタンパク質はどちらも、それぞれ藻類バイオマスの30重量を構成し、したがって、タンパク質222.1キログラムになる。2,221億タンパク質のキログラム数×16タンパク質中の窒素の重量百分率=窒素355億キログラムであり、これは、3550万トンと等しい。93550万トンの肥料-Nを生成するエネルギー費=2,024×1012キロジュール。355億窒素のキログラム数×571キログラムの肥料-Nを生成するために必要なメガジュール数=2,024×1012キロジュール。10バイオディーゼルのエネルギー含有量に対するバイオディーゼルを生成するための肥料-Nのエネルギー投入量の比率=25.8。バイオディーゼルのエネルギー含有量は、600億バイオディーゼルのガロン数×130.7ガロン数当たりのメガジュール数低バイオディーゼル加熱値と等しく、これは、7,842×1012キロジュールになる。2,024×1012肥料合成のために必要なキロジュール数÷この数=25.8。11藻類プロセスによってバイオディーゼル600億ガロンが生成する場合に蓄積されるNに富むバイオマス=5億8900万トンのDDGS。600億バイオディーゼルのガロン数に3.7851ガロン当たりのリットル数を掛け、次いで90脂質のバイオディーゼルへの変換率で割ると、脂質252.3リットルになる。252.3脂質のリットル数を30バイオマスの脂質含有量の百分率で割り、次いで、70バイオマスの窒素に富む含有量の百分率を掛けると、5,890億キログラムまたは5億8900万トンのDDGSになる。12潜在的な米国における年間のDDGS市場に対するNに富むバイオマス5億8900万トンの比率=1,402。5億8900万DDGSのトン数÷4200万DDGSのトン数潜在的な米国における年間のDDGS市場]=1,402。13潜在的な米国における年間のDDGS市場を満たすための年間のバイオディーゼルの生産量=43億ガロン。600億年間のバイオディーゼルのガロン数÷1,402=米国におけるDDGS市場を満たすためのバイオディーゼル43億ガロン。14米国における年間の燃料消費に対するバイオディーゼル43億ガロンの百分率=2.1。43億[バイオディーゼルのガロン数]÷2,000億ガロン米国における年間の燃料消費=2.1。15バイオ燃料600億ガロンを生成するために必要な開放池の最小サイズ=21,420平方キロメートル。2億5百万[トンバイオ燃料600億ガロンを生成するために必要な炭素]÷52.443バイオマスの炭素含有量の百分率=1年当たりバイオマス3億9100万トン。3億9100万1年当たりのバイオマスのトン数÷501日当たり平方メートル当たりのグラム数開放池における藻類のバイオマス生産性2により面積が得られ、それに日から年へ、グラムから百万トンへ、および平方メートルから平方キロメートルへの変換を掛けると、21,420平方キロメートルになる。16カリフォルニアの百分率は21,420平方キロメートル=1.6と等しい。21,420平方キロメートル÷1.3百万平方キロメートル米国の作付け地全体の面積=1.6。制限酵素およびAntarcticホスファターゼはNewEnglandBiolabsから入手した。KODDNAポリメラーゼはEMDChemicalsから入手した。急速DNAライゲーションキットはRocheから入手した。酵母抽出物はBDから入手した。アミノ酸、2-ケトブチレート、2-ケトイソバレレート、2-ケトバレレート、2-ケト-3-メチル-バレレートおよび2-ケト-4-メチル-ペンタノエートはSigmaから入手した。オリゴヌクレオチドはIDTから入手した。アミノ酸標準物質0.25nmol/μLおよびオルトフタルアルデヒドOPAはAgilentTechnologiesから入手した。JCL16株は、lacIqを供給するためにXL-1blueから形質導入されたF’を有するBW25113rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78誘導体である。Keioコレクション株20種を、図2Aに示されている通り使用した。N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンNTGによるゲノムワイドなランダム突然変異誘発を用いて、nBCAAから高級アルコールを生成することができる株を得た。NTG処理の各ラウンド後に、突然変異を、1種のnBCAAを唯一の炭素源として含有する寒天プレート上での成長についてスクリーニングした。さらに、ポリペプチドに組み込まれるので細胞に対して部分的に毒性である、L-バリン類似体であるDL-ノルバリンを加えた2g/L。一部の突然変異体株は、ポリペプチドを生合成するために、L-バリンを過剰生成して類似体に打ち勝つことにより、そのような攻撃を切り抜けることができた。L-バリンの前駆体である2-ケト-イソバレレートKIVは、イソブタノール生成の前駆体でもあり、特定のノルバリン耐性株は、イソブタノール経路遺伝子の存在下で、野生型株と比較して高濃度のイソブタノールを生成する能力を有する可能性がある。NTG突然変異誘発およびスクリーニングの複数ラウンドの後に、株YH19が得られた。特定の遺伝子欠失例えば、ΔluxS、ΔlsrA、ΔlsrD、ΔlsrB、ΔglnA、ΔgdhA、ΔilvEなどを有する株YH19誘導体を、P1形質導入によって創出した。ΔglnAとΔgdhAの両方を含有する株は、成長するための唯一の窒素源としてアミノ酸を使用することができるが、アンモニウム塩を使用することはできない。Keioコレクションからファージを調製した。プラスミドpCP20を、カナマイシン耐性マーカーを除去するために適切な欠失を含有する単一のコロニーに導入し、形質転換した。使用したプラスミドの一覧が表5に示されている。プラスミドの構築は下記の通りであり、使用したプライマーは表6に列挙されている。pYX41をクローニングするために、プライマーYX278配列番号97およびYX279配列番号98を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のyqhDを増幅した。PCR産物を、SphIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpSA65にクローニングした。適切な配向を有するコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX45をクローニングするために、プライマーYX340配列番号112およびYX341配列番号113を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のdadXを増幅した。PCR産物を、XbaIおよびAvrIIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX41にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。BamHIおよびSalIに対する制限部位を、プライマーYX341配列番号113によりpYX45に導入した。プライマーYX342配列番号114およびYX283配列番号99を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のdadAを増幅した。PCR産物を、BamHIおよびSalIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX45にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証し、pYX46を創出した。クローニングの結果として、pYX46ではT1ターミネーターが欠失した。プライマーYX344配列番号115およびYX345配列番号116を使用して、pYX45由来のT1ターミネーターおよびColE1を増幅した。このPCR産物を、SpeIおよびSalIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX46にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証し、pYX47を創出した。pYX51をクローニングするために、プライマーYXH01配列番号124およびYXH02配列番号125を使用して、ThermoactinomycesintermediusのゲノムDNA由来のleuDHを増幅した。PCR産物を、Acc65IおよびSalIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化した空のプラスミドpYKpSA40の誘導体にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX52をクローニングするために、プライマーYX274配列番号95およびYX275配列番号96を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のavtAを増幅した。PCR産物を、SalIおよびPstIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX51にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX54をクローニングするために、プライマーYX346配列番号117およびYX347配列番号118を使用して、pYX52由来のpLlac01:leuDH-avtAを増幅した。PCR産物を、SacIおよびSpeIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpKS103にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX60をクローニングするために、プライマーYX284配列番号100およびYX285配列番号101を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のilvEを増幅した。PCR産物を、Acc65IおよびNsiIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpSA74’にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX61をクローニングするために、プライマーYX326配列番号110およびYX327配列番号111を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のilvAを増幅した。PCR産物を、NsiIおよびPstIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX60にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX62をクローニングするために、プライマーYX288配列番号102およびYX289配列番号103を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のtdcBを増幅した。PCR産物を、PstIおよびBamHIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX61にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。XbaIおよびEagIに対する制限部位をプライマーYX289配列番号103によりpYX61に導入した。pYX64をクローニングするために、プライマーYX290配列番号104およびYX291配列番号105を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のtdcGを増幅し、プライマーYX292配列番号106およびYX293配列番号107を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のsdaBを増幅した。tdcGを含有するPCR断片を、XbaIおよびEagIを用いて消化し、sdaBを含有するPCR断片を、EagIおよびBamHIを用いて消化した。2つの消化された断片を、XbaIおよびBamHIを用いて消化したpYX62にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX67をクローニングするために、プライマーYX294配列番号108およびYX295配列番号109を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のrrnBプロモーターを増幅した。PCR産物を、XhoIおよびAcc65Iを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX64にクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX68をクローニングするために、プライマーYX382配列番号121およびYX293配列番号107を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のsdaBを増幅した。PCR産物を、PstIおよびBamHIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX67PstIおよびBamHIを用いてpYX67を消化することにより、pYX67からtdcB、tdcGおよびsdaBが除去されたにクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX75をクローニングするために、プライマーYX355配列番号119およびYX356配列番号120を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のilvAを増幅した。PCR産物を、Acc65IおよびPstIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX64Acc65IおよびPstIを用いてpYX64を消化することにより、pYX64からilvEおよびilvAが除去されたにクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX79をクローニングするために、プライマーYX382配列番号121およびYX293配列番号107を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のsdaBを増幅した。PCR産物を、PstIおよびBamHIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpYX75PstIおよびBamHIを用いてpYX75を消化することにより、pYX75からtdcB、tdcGおよびsdaBが除去されたにクローニングした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX90をクローニングするために、プライマーYX397配列番号122およびYX398配列番号123を使用して、E.coliK-12のゲノムDNA由来のavtAを増幅した。PCR産物を、MluIを用いて消化し、同じ酵素を用いて消化したpKS103にクローニングした。適切な配向を有するコロニーを選択し、配列決定により検証した。pYX97をクローニングするために、3つの断片を作製した。プラスミドpYX51を、Acc65IおよびSalIを用いて消化して、leuDHを含有する断片を得た。プライマーYXH03配列番号126およびYXH04配列番号127を使用して、pYX41由来のkivDおよびyqhDを増幅し、PCR断片を、SalIおよびBamHIを用いて消化した。プラスミドpSA40を、Acc65IおよびBamHIを用いて消化した。上記の3つの断片を一緒にライゲーションしてプラスミドを創出した。次いで、そのプラスミドを、AatIIおよびSpeIを用いて消化し、leuDH、kivD、yqhDおよびCo1E1を含有する断片を、同じ酵素を用いて消化したpSA55Iにクローニングし、pYX97を創出した。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。pKS103をクローニングするために、pSA69のKan耐性カセットを、AatII酵素およびSacI酵素による消化により除去した。pSA69の残りの部分を、同じ酵素を用いて消化したスペクチノマイシンカセットを用いてライゲーションした。適切なコロニーを選択し、配列決定により検証した。別段の指定のない限り、40g/LのBDbacto商標酵母抽出物21.64g/Lのアミノ酸、4.48g/Lの灰分、3.05g/Lの種々の塩、1.24g/LのH2Oならびに6.53g/LのE.coliにより分解されない炭水化物を含有するを含有する1×改変M9塩水1リットル当たり31.5g/LのNaHPO4、15g/LのKH2PO4、2.5g/LのNaCl、120mg/LのMgSO4、11mg/LのCaCl2および10mg/LのビタミンB1を、細胞を成長させるために使用した。アンピシリン100μg/ml、カナマイシン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/mlおよびスペクチノマイシン50μg/mlを必要に応じて加えた。培地3mlを含有する試験管における前培養を、回転式振とう機250r.p.m.において、37°Cで一晩実施した。一晩培養物を、250mlのねじ口三角フラスコ中の新鮮培地20mlに1:100希釈した。細胞を2時間37°Cで成長させた後、0.1mMのイソプロピル-β-d-チオガラクトシドIPTGを加えた。培養cultivationを、回転式振とう機250r.p.m.において37°Cで実施した。ある場合では、二相発酵をConnorら、2010年、Appl.Microbiol.Biotechnol.86巻:1155~1164頁に記載の通り実施して、Escherichiacoliの細胞に対する生成物の毒性の影響を低下させた。図8において使用するバイオマスを得るために、E.coliおよびB.subtilisを、LB培地で成長させた。ChlorellavulgarisATCC13482、PorphyridiumpurpureumATCC50161、SpirulinaplatensisUTEXLB2340およびSynechococcuselongatesPCC7942を、それぞれATCC培地5、ATCC培地1495、UTEXスピルリナ培地およびBG-11培地で成長させた。回収後、一部のバイオマスを、ミニビードビーターminibeadbeaterで1分間、または熱い0.5NのNaOHで30分間処理して、Bradfordアッセイによって濃度を測定するためにタンパク質を放出させた。タンパク質バイオマスの残りを、60°Cまたは80~100°Cの水中で10~20分加熱し、その後一晩50°Cでプロテアーゼ加水分解することにより、加水分解した。プロテアーゼの量はバイオマスの乾燥重量0.3~0.9mg/mlの1~3であった。プロテアーゼ処理の前後の遊離のアミン基の濃度をNinhydrinAssayKitSigmaによって測定した。次いで、プロテアーゼ処理したタンパク質バイオマスを全て、培地を調製するために濾過した。ガスクロマトグラフィー-質量分析GC-MS、ガスクロマトグラフィー-水素炎イオン化検出器GC-FIDおよび高速液体クロマトグラフィーHPLCを使用して、基質および生成物を分析した。我々の株によって生成されたアルコール化合物を、以前に記載されている通りAtsumiら、2008年、Nature451巻:86~89頁およびConnorら、2010年、Appl.Microbiol.Biotechnol.86巻:1155~1164頁GC-MSによって同定し、GC-FIDによって数量化した。アルコール化合物の分離をDB-FFAPキャピラリーカラム30m、内径0.32mm、薄膜の厚さ0.25μm;AgilentTechnologiesによって行った。GC乾燥器の温度は、最初40°Cで2分間保持し、1分当たり5°Cの勾配で45°Cまで上昇させ、4分間保持した。次いで、1分当たり15°Cの勾配で230°Cまで上昇させ、4分間保持した。担体ガスとしてヘリウムを入口圧力14p.s.i.で使用した。注射器および検出器を225°Cで維持した。試料0.5μlを注射した。1-プロパノールを内部標準として使用した。アミノ酸L-プロリン以外を、ZORBAXEclipseAAAカラムAgilentTechnologiesを使用し、OPAオルトフタルアルデヒド誘導体化法を用いて数量化した。L-プロリンは、FMOC9-フルオレニルメチルクロロホルメートを用いて誘導体化した。誘導体化されたアミノ酸を、HPLCのPDA検出器338nm、262nmL-Proを使用して分析した。バイオ燃料の生成の理論収量を算出するために、生成に関与する個々の代謝産物の物質収支衡を以下の通り示すことができる:Sv=B、ここでSは化学量論的行列であり、各列はネットワーク内の反応に対応し、各行は特定の反応における各代謝産物の化学量論的係数を含有する。ベクトルvは、各反応およびそれらの生成物についてのモル濃度フラックスを含有し、Bは、各代謝産物の蓄積/枯渇比を含有する。Sは、中心的な炭素代謝、アミノ酸の生合成、アミノ酸の分解、バイオ燃料の生成および生成物の移出の経路からなる代謝ネットワークを示すように構築し、Bは、一定のアミノ酸の流入があるが、定常状態である系を示すために、それらの移入フラックスの負数と等しいアミノ酸に対応する行を除いたゼロの列ベクトルになる。Sは、代謝産物より多くの反応を含有する行より列が多いので、決定し、したがって、解を見いだすために最適化することができる。バイオ燃料を生成するための系を最適化するために、目的関数を分fvと定義し、ここでfは、目的関数における各フラックスの係数を含有する行ベクターである。最大質量収量のバイオ燃料が望まれるので、fは、最適化されているバイオ燃料の移出反応に対応する係数を除いた全てのゼロに割り当てられ、その場合、対応するバイオ燃料の分子量の負数に割り当てられる。この線形最適化問題を定義し、系についての最適なモル濃度フラックス分布を出力するMATLAB関数linprogへの入力として使用した。さらに、不可逆的であることが公知である反応の下限はゼロであるが、他の反応は全て下限が-200である。アミノ酸の分解経路および高級アルコールの生合成経路が図9Aおよび表7に要約されている。表7:アミノ酸の分解経路L-アラニンユビキノン→ユビキノールアンモニアピルベートL-バリンピルベート→L-アラニン2-ケトイソバレレートL-ロイシンNAD→アンモニアNADH2-ケトイソカプロエート過剰発現したLeuDHを通じてL-イソロイシンNAD→アンモニアNADH2-ケト-3-メチル-バレレート過剰発現したLeuDHを通じてL-セリン→HアンモニアピルベートL-プロリンFAD2H2ONAD→FADH2NADHHL-グルタミン酸L-グルタミン酸オキサロアセテート→L-アスパラギン酸2-ケトグルタレートL-アスパラギン酸→HアンモニアフマレートL-システインH2O→アンモニアH2SHピルベートL-アルギニンサクシニル-CoA4H2O2-オキソグルタレートNAD→CoA3HCO22アンモニア2L-グルタミン酸NADHスクシネートL-グルタミンH2O→アンモニアHL-グルタミン酸L-アスパラギンH2O→アンモニアHL-アスパラギン酸L-トレオニン→アンモニアH2-ケトブチレートグリシン5,10メチレン-THFH2O→L-セリンテトラヒドロフォレート2HグリシンテトラヒドロフォレートHNAD→アンモニアCO2NADH5,10メチレン-THFL-フェニルアラニンHO2NADH→L-Tryrosine[チロシン]NADH2OL-チロシン2O2H2Oサクシニル-CoA2-オキソグルタレート→フマレートL-グルタミン酸CO22H2アセチル-CoAスクシネートL-トリプトファン3O23H2ONADHCoA→ホルメートアラニンNADCO2スクシネートアンモニア3HアセチルCoAL-ヒスチジン4H2O→L-グルタミン酸ホルメート2アンモニア2HL-メチオニンH2O→2-ケトブチレートメタンチオールアンモニアHL-リシンO2オキソグルタレートNADPNADATP2CoAFADH2O[H2O]→2CO2アンモニアL-グルタミン酸NADPHNADH2HFADH2ADPPi2アセチル-CoA。Pseudomonasによる、6種のrAAを20種のAAに戻す変換の理論収量を算出するために、上記の戦略を用いたが、Pseudomonas代謝ネットワークに適用した。このネットワークは、中心的な炭素の代謝、アミノ酸の生合成、アミノ酸の分解およびバイオマスの産出反応の経路からなる。単純にするために、アミノ酸の合成のエネルギー必要量に加えて、バイオマスを形成するための追加的なエネルギー必要量は課さなかった。バイオマス反応は、アミノ酸の消費反応からなり、Pseudomonasバイオマスにおけるアミノ酸のモル比として化学量論的係数を伴った。この場合、f行列は、-1の値が与えられるバイオマス反応に対応する係数を除いて全てゼロである。全体的なプロセス設計を通した理論的なフラックスを算出するために、図4Aに示されている通り、各ユニットをそれぞれ独立に考慮する。詳細な算出を必要とする4つの主要なサブユニットが存在し、それらが以下に示されている:処理される藻類バイオマスを、脂質C19H34O2およびタンパク質ペプチジルアミノ酸当たりの平均的な組成C4.51N1.24O1.49S0.02H7.10からなり、Scenedesmusobliquus由来のアミノ酸組成を有すると仮定する表5。Scenedesmus由来の藻類バイオマスは、10~17の炭水化物も含有するが、これらの炭水化物は、前処理後に糖に分解することができ、一般的なE.coliによる発酵の基質になる。簡単にするために、算出の間、Nに富むバイオマスは全てタンパク質であると仮定した。この主旨で、バイオマスのモル組成を以下の通り算出した:これらの数字およびデータを使用して、加水分解ユニットに入れられた池からのアミノ酸のモルフラックスを算出することができる。さらに、脂質フラックスを用いて、生成したバイオディーゼルの量を算出した。脂質のバイオディーゼルへの変換の効率を100とした。Nに富むバイオマスの加水分解このユニットでは、タンパク質ペプチジルアミノ酸を遊離アミノ酸または小さなペプチドに加水分解する。算出において、開放池の藻類バイオマスにおけるタンパク質とバイオリアクター2から再利用されるタンパク質の合計を示す。E.coliによる発酵14種のAAを高級アルコールにこのユニットでは、加水分解ユニットの産出を利用し、高級アルコールの最大理論収量の算出を理論的な生成収量に記載の通り実施する。各産出フラックスを、図中のその対応する流れに分離した。Pseudomonasによるバイオマスの発生このユニットでは、バイオリアクター1のアミノ酸の産出を利用し6種のrAA、タンパク質バイオマスの最大理論収量の算出を理論的な生成収量に記載の通り実施する。このプロセスにおける炭素フラックスはプロセス2における炭素フラックスの10未満であった。このプロセスの効率は、全体的な効率に対して有意に影響しない。単純にするために、アミノ酸の合成のエネルギー必要量に加えて、細胞にバイオマスを生成するためのエネルギー必要量は課さなかった。各単位を数学的に定義して、バイオマス1モル10の脂質を処理した場合の各流れを通るフラックスを算出した。プロセスは、流れを再利用することを含有するので、反復的な算出を用いた。反復的なプロセスは、バイオリアクター2から再利用する流れが空であると仮定して開始し、算出1、2、3および4を順番に進めた。各ユニットについてフラックスを算出した後、再利用の流れを通るフラックスを考慮し、ユニット2、3および4についての値を再算出した。このプロセスを、各流れを通るフラックスが収束するまでおよそ6反復繰り返した。全ての値を、各化合物の分子式および各要素の分子量を使用することによって基本的な質量フラックスに変換した。体積での年間の燃料の生成についてプロセスをスケールアップするために、次式を使用した:Cは、スケーリングする前のプロセスにおける特定の流れを通る炭素フラックスを示すために用いられ、MWは下付き文字の流れの分子量を示し、CWは下付き文字の流れの炭素原子のモル重量を示し、ρは密度を示す。この式を使用して、決定された必要な炭素フラックスと等しい総バイオマス炭素を得るために炭素の総質量必要量を決定し、全ての流れを同じ因子によってスケーリングした。得られたフローシートは、所望の量の燃料図4Aでは600億ガロンの生成を示す。我々の系における藻類の成長に最適な脂質含有量を算出するために、以下の変数を定義する:α=脂質バイオマス1グラム当たりの炭素のグラム数=0.7752β=タンパク質バイオマス1グラム当たりの炭素のグラム数=0.5244ρ=E.coliに供給されたタンパク質における炭素の質量当たりの生成されたアルコールにおける炭素の最大質量=0.46Y0=Y-バイオマス生産性の相関の切片=92.46図4B参照κ=バイオマス生産性の相関の指数関数的係数=0.0425図4B参照ε=プロセスが作動する最大収量のY=バイオマス生産性X=藻類バイオマスにおける脂質。これらの変数を使用して、バイオ燃料中の炭素の生産性図4を、と表すことができる。総バイオマス生成を、脂質の百分率指数関数であると仮定すると、これは、C燃料が最大になるXの値が、で生じることを意味し、したがって、である。変数をそれらの対応する値に代入し、εに応じてX最適を分析した後、アルコール収量が理論収量の61より高かった場合は、脂質含有量を最小に保つべきであると決定された。バイオ燃料中の炭素の生産性を、上記の開示された方法を組み込まずに算出するために、以下の表現を導出した:C燃料=YXα/100。バイオマス生産性のデータを組み入れたプロットはY=Y0e-kxを用い、一定のバイオマス生産性を仮定するプロットはY=Y0を用いる。図4Aでは脂質含有量を10と設定した。実施において、タンパク質から燃料への変換は、理論収量の100には到達しない。この不足を説明するために、実際に実現されるタンパク質から燃料への変換の理論収量に応じた最適な脂質含有量を算出し、脂質から燃料への変換は理論収量に保った図4D。結果は、最適な燃料の生産性を実現するためには、タンパク質から高級アルコールへの収量が理論値の38を超える限りは、脂質含有量は10未満藻類における最小の脂質含有量であってよいことを示している。本開示の方法および系により、理論最大値の50を超えるタンパク質から高級アルコールへの収量が実現されることに留意されたい表4。この結果は、現行の、理論値を下回るタンパク質から燃料への変換収量においてさえ脂質の生成は必要ないことを示唆している。このタンパク質から燃料への変換技術では、他のプロセス、例えば、CO2の燃料への直接変換、セルロース系のアルコール発酵、または任意の他の工業的な細胞全体でのバイオ反応などで生成したNに富む単細胞バイオマスも利用することができる。高級アルコール生成に加えて、エタノール、または他の燃料および化学物質を生成するためにもタンパク質の変換スキームを利用し、したがって、最終的に石油と交換する経路をもたらすことができる。いくつもの本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。"