明細書に記載の発明。発明の説明本発明は、異種移植された臓器のT細胞媒介拒絶を、レシピエントにおける異種反応性T細胞の活性化を予防するために、同時刺激シグナル2の送達を遮断することによって阻害するための方法および生物学的試薬を提供する。これは、図1に示される3つの局面において具体化される。これらの3つの局面は、単独で、または種々の組み合わせで使用され得る。さらに、従来の免疫抑制技術は、本発明の技術とともに使用され得る。以下は、第8頁から始まる定義と題された節と合わせて読まれるべきである。第1の局面第1の局面において、シグナル2による同時刺激は、臓器レシピエントに、異種ドナー臓器からの可溶性形態のCTLA-4を投与することによって防止される。例えば、ブタ臓器ドナーがヒトレシピエントに移植された場合、可溶性形態のブタCTLA-4以下を参照のことが、ヒトに投与される。ある生物例えば、ブタ由来のCTLA-4は、別の生物例えば、ヒト由来のB7に結合し得るが、最も高いアビディティーが、同種異系B7に対して見出される。従って、ドナー生物由来の可溶性CTLA-4は、レシピエントB7正常細胞上のおよびドナーB7異種移植された細胞上のの両方に結合し得るが、それは、優先的に異種移植片上のB7に結合する。これは、全身性の免疫抑制を導く傾向があるレシピエント生物からのCTLA-4の投与とは異なり、異種移植片特異的免疫抑制を生じる。異種ドナー細胞上のB7とレシピエントT細胞上のCD28との間の相互作用を遮断することにより、同時刺激シグナル2は、レシピエントのT細胞に送達されない。それゆえ、異種反応性レシピエントT細胞は、アネルギー性にされる。従って、本発明は、臓器レシピエントにおける異種移植片寛容を誘導する方法を提供し、この方法は、そのレシピエントに、異種ドナー生物由来の可溶性形態のCTLA-4タンパク質を投与する工程を包含する。可溶性形態のCTLA-4は、好ましくは、B7に結合する能力を維持しているドナー生物由来のCTLA-4のフラグメントを含む。このフラグメントは、好ましくは、CTLA-4の完全な細胞外ドメインである。好ましくは、可溶性タンパク質は、免疫グロブリンの定常ドメイン例えば、IgG1のCγ1鎖をさらに含む。好ましくは、これは、この分子のこの部分に対する免疫応答を予防するために、レシピエント生物由来である。それゆえ、ブタ対ヒト移植のための代表的な実施態様において、可溶性タンパク質は、ヒトCγ1配列に融合したブタCTLA-4の細胞外ドメインを包含し得る。他の生物由来のCTLA-4の可溶性形態は、例えば、参考文献8ヒトCTLA-4/ヒトIgγ1定常領域および9マウスCTLA-4/ヒトIgγ1に記載される。本発明はまた、臓器レシピエントにおいて異種移植片寛容を誘導するための医薬の調製における異種CTLA-4の可溶性形態の使用を提供する。タンパク質は、異種移植の前、間、または後に投与され得る。前異種移植投与は、レシピエントが異種細胞への曝露を包含する前移植免疫プログラムを実行しているとき、最も有用である。ドナー生物がブタの状況において、本発明は、ブタ細胞からクローニングされたCTLA-4である、配列番号1として図2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。これは、本発明における使用のためのCTLA-4の好ましい形態である。このタンパク質の細胞外ドメインはまた、図2に示される。本発明はまた、タンパク質配列番号1またはそのフラグメントをコードする核酸を提供する。これは、好ましくは、配列番号2として図3に示されるヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明は、本発明の核酸を包含するベクターおよびこのようなベクターで形質転換された細胞を提供する。第2の局面第2の局面において、シグナル2による同時刺激は、異種ドナー細胞上のCTLA-4についてのリガンドを発現することによってアンタゴナイズされる。このリガンドは、レシピエントの活性化されたT細胞上のCTLA-4に結合し、そしてドナーB7とレシピエントCD28との間の相互作用によって提供される同時刺激シグナルをアンタゴナイズする。これは、異種反応性T細胞をアネルギー性にする。従って、本発明は、CTLA-4に結合し得る膜結合タンパク質を提供する。これは、代表的には、CTLA-4結合領域および膜結合領域を含むキメラタンパク質すなわち、異なるタンパク質の領域を1つのタンパク質へ組み合わせることによって産生されるタンパク質である。従って、その最も単純な形態において、タンパク質は、このように、融合タンパク質である。膜結合タンパク質により、タンパク質は、その細胞外ドメインがCTLA-4に結合し得るように、細胞膜に結合していることを意味する。そのタンパク質を細胞膜に結合させるために、そのタンパク質は、例えば、膜タンパク質からの膜貫通配列、またはGPIアンカーを含み得る。好ましい膜貫通配列は、CD4またはCD8の膜貫通配列である。あるいは、そのタンパク質は、それをそのタンパク質自体が細胞膜に挿入されることなしに、膜タンパク質と細胞外で結合するようにする配列を含み得る。そのタンパク質が、細胞膜に標的化されるように、そのタンパク質がその膜貫通領域例えば、CD8細胞質ドメインと通常結合する細胞質ドメインを含むこともまた望ましいかもしれない。同様に、そのタンパク質が、CTLA-4結合ドメインが細胞膜から分離するために、細胞膜と直に並列する細胞外配列例えば、CD4ドメイン3および4を含むことは望ましいかもしれない。グリシンリンカーのような合成リンカーは、同じ目的で使用され得る。タンパク質のCTLA-4結合ドメインは、好ましくは、CTLA-4に対する特異性を有する抗体を含む。これは、好ましくは、1本鎖抗体sFvである。それは、好ましくは、レシピエント生物のCTLA-4に対して特異的である。従って、代表的な実施態様において、第2の局面のタンパク質は、リンカーを介してCD8の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合した1本鎖抗体を含み得る。本発明はまた、第2の局面のタンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、本発明のその核酸を含むベクター、およびそのベクターで形質転換された細胞を提供する。本発明はまた、本発明の第2の局面に従う核酸および/またはベクターを包含する送達システム、およびこの材料を標的細胞に送達する手段を提供する。さらに、本発明は、好ましくは、そのタンパク質が利用可能なCTLA-4に結合し得るように、その表面上に第2の局面のタンパク質を発現する細胞を提供する。細胞がレシピエントT細胞に結合し得るように、その細胞はまた、好ましくは、その表面上にMHCクラスIまたはクラスIIを発現する。従って、適切には、本発明の細胞は、ドナープロフェッショナルAPCである。しかし、抗CTLA-4タンパク質によって提供されるアンタゴニスト的シグナルのために、これらのプロフェッショナルAPCは、B7ネガティブ細胞として機能的に振る舞う。本発明はまた、このような細胞を含む生物学的組織を提供する。本発明はさらに、第2の局面に従う細胞および/または生物学的組織を含む動物を提供する。本発明はまた、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供し、このプロセスは、その生物学的組織を、それがその細胞の表面上の第2の局面に従う1つ以上のタンパク質を発現するように処理する工程を包含する。本発明はまた、ドナー動物例えば、ブタから異種レシピエント動物例えば、ヒトへ、本発明に従う生物学的組織を移植する工程を包含する移植の方法を提供する。さらに、本発明の細胞は、前移植投与に適切である。これは、異種移植片自体が移植される前にレシピエントT細胞において誘導される寛容をもたらす。このような前移植レジメンにおいて使用される細胞が、好ましくは、MHCクラスIIを発現するのに対し、その細胞はプロフェッショナルAPCである必要はないことが理解される。さらに、本発明は、医薬として使用するための第2の局面に従うタンパク質または核酸を提供する。本発明はまた、異種移植片レシピエントまたはドナーへの投与のための処方物の製造における、第2の局面に従うタンパク質、核酸、ベクター、または送達システムの使用を提供する。第3の局面第3の局面において、シグナル2による同時刺激は、異種ドナー臓器の細胞の表面上で、レシピエント生物MHCクラスIIを発現することによって防止される。例えば、ブタ臓器ドナーが、ヒトレシピエントに移植される場合、そのブタ臓器は、ヒトMHCクラスIIを発現する。レシピエントT細胞の直接的活性化が、例えば、上記の本発明の最初の2つの局面の一方または両方を利用することによって回避される場合でも、間接的活性化は、なお生じ得、レシピエントAPCによるMHCクラスIIに対する異種抗原のプロセシングおよび提示を包含する。レシピエントMHCクラスIIを異種ドナーの細胞上に発現することにより、ドナー細胞は、自己MHCクラスIIの状況において異種抗原をレシピエントT細胞に提示する。ドナー細胞がB7を発現しない場合、またはB7が遮断されている場合、異種反応性レシピエントT細胞は、同時刺激シグナル2を受けず、そしてそのレシピエントのAPCが異種抗原自体を提示する機会を有する前に、アネルギー性になる。従って、本発明は、その細胞表面上に、異なる生物のMHCクラスIIを発現する細胞を提供する。好ましくは、これは、その表面上にヒトMHCクラスIIを発現するブタ細胞である。MHCクラスIIは、好ましくは、HLA-DRファミリーのものである。MHCクラスIIは、好ましくは、細胞の表面上に構成的に発現される。同種異系抗MHCクラスII応答を防止するために、MHCクラスIIは、好ましくは、その特定のレシピエントと最大適合性の組織型である。これは、代表的には、例えば、異種ドナー細胞上に発現されるHLA-DRが、特定のレシピエントのHLA-DRと整合するはずであることを確実にすることを包含する。異種抗原が、プロフェッショナルAPC上に見出されるMHCクラスII分子ミラーの溝内に提示することを確実にするために、その細胞は、以下の3つのタンパク質そのそれぞれが、抗原プロセッシングにおいて重要な役割を有する不変鎖invariantchain、HLA-DRα、およびHLA-DRβの1つ以上をまた、発現するはずであることが好ましい。その細胞は、好ましくは、同時刺激分子例えば、B7をその表面上に発現しない。従って、代表的には、ドナー細胞は、プロフェッショナルAPCではない。しかし、トランスフェクトされた非免疫原性APC例えば、B7であり得る、未成熟樹状細胞であり得る。本発明はまた、第3の局面に従う細胞を含む生物学的組織を提供する。本発明はさらに、第3の局面に従う細胞および/または生物学的組織を含む動物を提供する。本発明はまた、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供し、そのプロセスは、それが異種MHCクラスIIをその細胞の表面上に発現するように、その生物学的組織を処置する工程を包含する。好ましくは、このプロセスは、異種生物由来の非免疫原性細胞すなわち、同時刺激シグナルを提供し得ない細胞、例えば、B7ネガティブ細胞を単離する工程、およびこれらの細胞をHLA-DRでトランスフェクトする工程を包含する。HLA-DRは、特定のレシピエントに対して好ましい組織型である。さらに、その細胞はまた、効率的な抗原プロセッシングのために必要とされる他のタンパク質でトランスフェクトされ得る。適切な非免疫原性細胞の例には、B7ネガティブであり、そして同種異系移植の齧歯類モデルにおける寛容を誘導することが示されている腎尿細管上皮細胞が含まれる。本発明はまた、ドナー動物例えば、ブタから異種レシピエント動物例えば、ヒトへ、第3の局面に従う生物学的組織を移植する工程を包含する移植の方法を提供する。さらに、本発明の細胞は、前移植投与に適切である。これは、異種移植片自体が移植される前にレシピエントT細胞において誘導される、寛容をもたらす。さらに、本発明は、医薬としての使用のための第3の局面に従う細胞を提供する。本発明はまた、異種移植レシピエントに投与するための処方物の製造における第3の局面に従う細胞または生物学的組織の使用を提供する。本発明はまた、異種移植ドナーに投与するための処方物の調製における異種MHCクラスIIまたは異種MHCクラスIIをコードする核酸の使用を提供する。定義上記のように、用語核酸には、DNAおよびRNAの両方が含まれるが、改変された核酸および合成核酸もまた、含まれる。例えば、核酸は、合成例えば、PNAであり得るか、または改変されたヌクレオチド間連結例えば、ホスホロチオエートを有し得る。さらに、その用語は、センスおよびアンチセンス核酸配列の両方、ならびに二本鎖配列を含む。好ましくは、核酸は、本発明に従うタンパク質の発現を制御するために適切な配列を含む。この発現は、好ましくは、細胞特異的制御、誘導性制御、または時間的制御のように、制御され得る。上記で使用されるように、用語ベクターは、核酸を宿主細胞に移入し得る分子を意味し、そして多数の適切なベクターが当該分野で公知である。好ましくは、そのベクターは、トランスジェニック動物の産生について適切である。例えば、トランスジェニックブタの生成のために適切なベクターは、参考文献13、14、15、16、および17に記載される。上記で使用されるように、用語送達システムは、遺伝子材料を標的細胞に送達するための手段をいう。上記の特定のベクターはまた、適切な送達システムとして機能し得る。同様に、特定の送達システムはまた、固有にベクターであり得るが、必ずしもそうであるとは限らない。例えば、ウイルスベクターはまた、送達システムとして機能し得るが、リポソーム送達システムは、ベクターではない。送達システムは、ウイルスであってもよく、またはウイルスでなくてもよい。リポソームのような非ウイルスシステムは、大規模産生の費用、発現の持続性の悪さ、安全性に関する懸念のような、ウイルスベースのシステムに関連するいくつかの困難性を回避する。好ましくは、送達システムは、遺伝子療法において使用するのに適している。多数の適切な送達システムが、当該分野で公知である。好ましくは、送達システムは、本発明に従う分子が、異種移植のために適切な細胞、または移植されている細胞によって取り込まれるように、標的化される。より好ましくは、送達システムは、これらの細胞に特異的である。例えば、送達システムは、特定の臓器例えば、心臓または腎臓、または特定の細胞型例えば、内皮細胞またはプロフェッショナルAPCに標的化され得る。これを達成するために、その送達システムは、例えば、標的細胞上に見出されるレセプターに標的化されたレセプター媒介送達システムであり得る。例えば、送達システムは、心臓細胞上に見出されるレセプター、好ましくは、心臓細胞上に独占的に見出されるレセプターに標的化され得るか、または内皮細胞上に見出されるレセプター、好ましくは、内皮細胞上に独占的に見出されるレセプターに標的化され得る。その送達システムは、好ましくは、トランスジェニック動物の作製に適している。例えば、送達システムは、配偶子、接合子、または胚幹細胞に標的化され得る。本発明のベクターおよび送達システムは、細胞をトランスフェクトして、本発明に従う細胞を生成するために使用され得る。トランスフェクションは、インビボまたはエキソビボで生じ得る。上記で使用される用語生物学的組織には、細胞、組織、および臓器の集団collectionが含まれる。従って、その定義には、例えば、線維芽細胞、角膜、神経組織、心臓、肝臓、または腎臓が含まれる。本発明の第2および第3の局面が動物を提供する場合、その動物は、好ましくは、異種移植のための臓器および/または本発明の細胞例えば、異種移植片レシピエントへの前異種移植片投与のための細胞の作製に適切である。好ましくは、その動物は哺乳動物であり、そしてより好ましくは、それはトランスジェニックブタまたはトランスジェニックヒツジである。その動物は、それがトランスジェニック生物学的組織を含むすなわち、遺伝子治療によって処置されるように、生存している間に処置され得る。好ましくは、生存動物は、トランスジェニック動物を産生するために、本発明に従うベクターでトランスフェクトされる。例えば、本発明に従うベクターは、異種移植のために適切な生物学的組織を産生するためにブタの心臓に特異的に送達され得る。あるいは、動物は、トランスジェニック動物として生まれ得る。このようなトランスジェニック動物を作製するための多くの適切なアプローチが、当該分野で公知である例えば、参考文献18、19、20。例えば、DNAのマイクロインジェクションによる接合子または初期胚の直接的操作は、周知であり、胚幹細胞のような多能性の細胞のインビトロ操作も同様である。初期胚のレトロウイルス感染は、種々の種で成功していることが証明されており、そして帯を含まないzona-free卵のアデノウイルス感染が報告されている。ヒツジの核移入による遺伝子導入およびクローニングがまた記載されている例えば、WO97/07668。本発明が、生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスを提供する場合、その生物学的組織は、インビボまたはエキソビボのいずれかでそのようにされ得る。例えば、動物の臓器は、本発明のベクターでインビボでトランスフェクトされ得るか、または臓器は、移植前にエキソビボでもしくは移植後にインビボでトランスフェクトされ得る。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1レシピエントにおいて異種反応性T細胞の活性化を防止するために同時刺激シグナル2の送達を遮断することによって、異種移植された臓器のT細胞媒介拒絶を阻害し得る、生物学的試薬。項目2異種移植された臓器のT細胞媒介拒絶を阻害するための方法であって、レシピエントにおける異種反応性T細胞の活性化を防止するために、同時刺激シグナル2の送達を遮断する工程を包含する、方法。項目3異種ドナー生物由来の可溶性形態のCTLA-4タンパク質を、前記レシピエントに投与することを包含する、請求項2に記載の方法。項目4前記可溶性タンパク質が、ヒトCγ1配列に融合したブタCTLA-4の細胞外ドメインを含む、請求項3に記載の方法。項目5医薬として使用するための、可溶性形態の異種CTLA-4。項目6配列番号1のアミノ酸配列を含む、タンパク質。項目7請求項6に記載のタンパク質をコードする、核酸。項目8前記試薬が、CTLA-4に結合し得る膜結合タンパク質である、請求項1に記載の生物学的試薬。項目9CTLA-4に特異的な一本鎖抗体を含む、請求項8に記載のタンパク質。項目10請求項8または請求項9に記載のタンパク質をコードする、核酸。項目11その表面に請求項8または請求項9に記載のタンパク質を発現する、細胞。項目12請求項11に記載の細胞を含む、生物学的組織。項目13請求項11に記載の細胞および/または請求項12に記載の生物学的組織を含む、動物。項目14ドナー動物から異種レシピエント動物へ、請求項12に記載の生物学的組織を移植する工程を包含する、移植法。項目15生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスであって、該生物学的組織が請求項8または請求項9に記載のタンパク質をその細胞表面上に発現するように、該生物学的組織を処置する工程を包含する、プロセス。項目16医薬として使用するための、請求項8もしくは請求項9に記載のタンパク質、または請求項10に記載の核酸。項目17異種移植片レシピエントまたはドナーに投与するための処方物の調製における、請求項8もしくは請求項9に記載のタンパク質、または請求項10に記載の核酸の、使用。項目18前記試薬が、異なる生物のMHCクラスIIをその表面上に発現する細胞である、請求項1に記載の生物学的試薬。項目19前記細胞が、ヒトMHCクラスIIをその表面に発現するブタ細胞である、請求項18に記載の細胞。項目20前記細胞が、その表面上にB7を発現しない、請求項18または請求項19に記載の細胞。項目21前記細胞が、トランスフェクトされた未成熟樹状細胞である、請求項18または請求項19に記載の細胞。項目22請求項18、19、20、または21のいずれか1項に記載の細胞を含む、生物学的組織。項目23請求項22に記載の生物学的組織を含む、動物。項目24ドナー動物から異種レシピエント動物へ、請求項22に記載の生物学的組織を移植する工程を包含する、移植法。項目25生物学的組織を異種移植に適切にするためのプロセスであって、該生物学的組織がその細胞の表面上に異種MHCクラスIIを発現するように、該生物学的組織を処置する工程を包含する、プロセス。項目26医薬として使用するための、請求項18、19、20、または21のいずれか1項に記載の細胞。項目27異種移植レシピエントに投与するための処方物の製造における、請求項22に記載の生物学的組織の使用。項目28異種移植ドナーに投与するための処方物の調製における、異種MHCクラスIIまたは異種MHCクラスIIをコードする核酸の、使用。実施態様の説明可溶性ブタCTLA-4ブタCTLA-4pCTLA4を、PHA活性化ブタT細胞からクローニングした。RNAを、標準的な技術を用いて調製し、そしてpCTLA-4を、以下のプライマーを用いてPCRによって増幅した:得られた700bpのフラグメントを、EcoRI/HindIII消化したpBluescriptにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なT3プライマーおよびT7プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を図3に示す。この図はまた、ヒトおよびウシのCTLA-4配列との比較を示す。pCTLA4の予測したアミノ酸配列を、ヒトおよびウシと比較しながら図2に示す。重要なことは、残基97における推定アミノ酸の差異であり、この残基はB7結合において重要であり、保存されたヘキサペプチドモチーフMYPPPYの一部である。pCTLA4において、残基97はロイシンであるLYPPPYとなるのに対し、ロイシンもまた、ウシCD28において見出さされているが21他の種はメチオニンを有する。この重要なアミノ酸差異は、pCTLA4のヒトおよびブタB7への有利に異なる結合の重要な鍵であると考えられる。pCTLA4の細胞外ドメインを、上記の5’プライマーおよび以下のプライマーを用いて増幅した:これを484位から増幅し、リンカーGGSGGAA配列下線を付したをコードする18塩基対のセグメントを導入し、そしてPstI部位太字を導入してヒトIgG1のヒンジ領域へのインフレーム連結を可能にした。得られた500bpのフラグメントを、HindIII/PstI消化したpBluescript-IgG1ゲノムDNAコードイントロン性配列ならびにPstI/Not1部位の間のヒトIgG1のヒンジ、CH2、CH3および3’非翻訳エキソンを含むにサブクローニングした。得られた可溶性pCTLA4-Igのアミノ酸配列を図4に示す。pCTLA4-Igの発現キメラpCTLA4-IgDNA配列を、HindIII/BstXIフラグメントとしてpBluescriptから遊離させ、そして発現ベクターpHOOK-3TMInvitrogenにサブクローニングした。これを使用して、標準的なリン酸カルシウム沈殿を用いてDAP.3細胞またはCHO-K1細胞をトランスフェクトした。G418耐性細胞を、CaptureTecTMシステムを用いて分離した。これらのトランスフェクト細胞を、組織培養フラスコ中でコンフルエントになるまで増殖させ、コンフルエントになった時点で、培地を交換し、そして細胞を培養物中でさらに3日間維持した。この段階で、培地を採取し、そしてプロテインGカラムを通して灌流した。pCTLA-4-Igを酸性条件下で溶出させた。この溶出したタンパク質の濃度を、ヒトIgG1に対する抗体および標準的なヒトIgG1骨髄腫タンパク質を用いるELISAを用いて計算した。pCTLA4-Igの結合特徴を、ヒトB7-1またはブタB7-2のいずれかでトランスフェクトしたヒト線維芽細胞を用いるフローサイトメトリー分析を使用して、ヒトCTLA4-Igの結合特徴と比較した。これらの実験に関して、ブタおよびヒトのCTLA4-Igの濃度は、ELISAによってアッセイしたとき、等しかった。図5に例示したように、ヒトおよびブタCTLA4-Igは、ブタB7を発現するヒト細胞において類似の結合特徴を有するようであった。しかし、ヒトCTLA4-Igとは異なり、pCTLA4-IgはヒトB7には結合しなかった。このことは、pCTLA4-IgがブタB7に優先的に結合し、そして種特異的試薬として有用であることを意味する。pCTLA4-Igを使用して、種々の刺激剤に対するヒトT細胞増殖応答を阻害した。これらのアッセイにおいて、T細胞応答の同時刺激は、プロフェッショナルAPCにおいてトランスフェクションまたは天然のいずれかによって発現された、ブタまたはヒトのいずれかのB7によって提供された。これらの実験を、図6および7において実証する。トランスフェクトした線維芽細胞刺激剤HLAクラスIIおよびヒトB7またはブタB7のいずれかを発現するを用いる実験について、hCTLA4-Igは全ての増殖応答を阻害した図6、白四角および白菱形。対照的に、pCTLA4-Igのみが、刺激剤がブタB7を発現した場合の応答を完全に阻害した白三角;ヒトB7を発現する細胞に対する増殖応答は、最小限に影響されたのみであった白丸。類似の実験において、pCTLA4-Igは、MHCクラスIIおよびヒトB7を発現するヒト細胞への増殖応答に対する有意な阻害効果を有しなかったが、ブタ刺激剤に対する応答は阻害した図7。これらの結果は、T細胞の同時刺激シグナルがブタB7によって提供された場合のpCTLA4-Igの有効な阻害特性を強調する。同時刺激がヒトB7によって媒介される場合にT細胞増殖を防止できないことはまた、種特異的作用を実証する。pCTAL4-Igは、ブタB7に対して種特異的結合を示し、ブタB7の機能的効果の阻害を示すが、ヒトB7に対しては種特異的結合を示さず、その機能的効果の阻害も示さないと、結論付け得る。pCTLA-4-Igの特性pCTLA4-Igのヒトおよびブタの両方のB7ファミリー分子に対する結合特徴は、例えば、以下の試験を用いて、hCTLA4-Igの結合特徴と比較され得る:iブタおよびヒトのAPCに対する結合、およびブタまたはヒトのB7を発現するトランスフェクタントに対する結合のフローサイトメトリー分析上記を参照のことiiBiacoreTMを用いる結合の定量的特徴づけiiiヒト抗ブタおよびヒト同種異系混合したリンパ球培養物に対するCTLA4-Igの効果の機能的分析ivpCTLA4-IgのB6マウスへの移植後のブタ島異種移植生存を延長する能力の機能的評価。CTLA-4に結合する膜結合型タンパク質1012の半合成可変配列を含むファージディスプレイライブラリーを、ヒトまたはマウスのCTLA4-IgおよびコントロールヒトIgG1骨髄腫タンパク質を用いてスクリーニングした。4回のスクリーニング後にヒトCTLA4-Igタンパク質への差示的な結合を提示するファージからsFvを単離し、そして標準的な技術を用いて精製した。そのヌクレオチド配列および推測したアミノ酸配列を、図8、9、10、および11に示す。sFvを、ヌクレオチド配列に基づく特異的プライマーを用いてPCRによって増幅した。プライマーの遠位部分は、pHOOK1内の配列に基づいた。5’プライマーはApaI部位を含み、そして3’プライマーはSalI部位を含んだ。これらは両方とも、独特であると予測された。得られたsFvを、配列決定のためにpBluescriptにサブクローニングして、忠実な増幅を決定した。次いでApaI/SalIフラグメントを、pHOOK1にサブクローニングした。ここでは、ApaI/SalIフラグメントは、上流ではマウスIgκ鎖からのインフレームのシグナル配列および血球凝集素Aエピトープ配列に、そして下流では2つのインフレームのmyc配列およびPDGFレセプターからの膜貫通配列に隣接する。pHOOK1からのmyc配列を、NotI部位下線を付したを含む以下の5’プライマー:およびPstI部位下線を付したを導入した以下の3’プライマー:を用いてPCRにより増幅した。得られた113塩基対のフラグメントを、NotI/PstI消化したpBluescriptにサブクローニングした。sFvを、pHOOK1からEcoRI/NotIフラグメントとして遊離させ、そしてEcoRI/PstI消化したpBluescript-IgG1に、NotI/PstIPCR産物とともに連結した図12。この構築物は、CTLA-4特異的sFvの可溶性Ig融合物をコードする。真核生物細胞における発現のために、この構築物を、pHOOK3にHindIII/BstXIフラグメントとしてサブクローニングした。sFvの細胞表面発現を確認するために、pHOOK構築物を、既にHLA-DR分子およびヒトB7を発現している細胞にトランスフェクトした。G418またはミコフェノール酸使用したベクターに依存するに耐性である細胞を、培養において増殖させた。その細胞表面上で抗CTLA4-sFv構築物を発現する細胞を、hCTLA4-Igを使用してフローサイトメトリー分析によって同定した。これらの細胞を、限定希釈によってクローニングし、そして5日間の培養におけるT細胞の増殖の刺激剤として使用した。1つの実験の結果を図13に示す。抗hCTLA4sFvを発現する細胞は、T細胞増殖を刺激しないが白四角、一方コントロールsFvを発現する細胞は、正常細胞と同じ方法で増殖を刺激した白丸。異なる実験において、図12に示した構築物のEcoRI/SalIフラグメントを、ヒトCD8の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインpBluescript-hCD8由来のSalI/BamHIフラグメントとして単離したとともに、EcoRI/BamHI消化したpBluescriptに同時連結した図14。pBluescriptからのEcoRI/BamHIフラグメントを、発現ベクターpHβApr-1-neoまたはシスターベクターpHβApr-1-gptにサブクローニングした。これらを、既にHLA-DR分子およびB7を発現している細胞にトランスフェクトし、そしてpHOOK構築物について上記のように選択した。膜結合型CTLA-4構築物活性化T細胞によるCTLA-4の発現は、一過性であるのみであり、それゆえ、抗CTLA4-sFvの機能的特徴を試験するために、ヒトまたはマウスのCTLA4の細胞外ドメインをコードするDNA配列、ならびにヒトCD8の膜貫通/細胞質配列を含むキメラ構築物を作製した。これらの構築物を発現する細胞を、抗CTLA4-sFvタンパク質の研究のために使用し得る。PHA活性化ヒトT細胞由来のRNAを、標準的な技術を用いて調製した。hCTLA4を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:HindIII部位を導入する5’プライマーEcoRI部位を導入する3’プライマー得られたフラグメントを、HindIII/EcoRI消化したpBluescriptにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なT3プライマーおよびT7プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を、図15に示す。これは、ヒトCTLA-4についてのGenBankリスト配列とは1つの塩基439位が異なる。hCTLA4の推定アミノ酸配列もまた示す。hCTLA-4の細胞外ドメインを、上記の5’プライマーおよび以下のプライマーを用いて増幅した:これは、457位から増幅され、そして可撓性GGSGGアミノ酸リンカーをコードする15塩基のセグメント下線を付したを、独特のSalI部位強調表示とともに含んでいだ。得られたフラグメントを、HindIII/SalI消化したpBluescriptにサブクローニングし、そして配列決定した。hCD8を、得られたT細胞から以下のプライマーを用いてPCR増幅した:HindIII部位を導入する5’プライマーEcoRI部位を導入する3’プライマー得られたフラグメントを、HindIII/EcoRI消化したpBluescriptにサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を、標準的なT3プライマーおよびT7プライマーを用いて決定した。単一のクローンの配列を、図16に示す。このクローンは、GenBankに登録された配列とは4つの位置で異なっていたが、これらはいずれも、続いて増幅した領域内では存在しなかった。hCD8の膜貫通TMドメインおよび細胞質Cドメインを、上記の3’プライマーおよび以下の5’プライマーを用いて増幅した:これは、532位から増幅され、そして可撓性GGSGGアミノ酸リンカーをコードする15塩基のセグメント下線を付したを、独特のSalI部位強調表示とともに含んでいた。得られたフラグメントを、HindIII/SalI消化したpBluescriptにサブクローニングし、そしてpBluescript-hCD8と称した。ヒトCTLA-4の細胞外ドメインを、pBluescriptからEcoRI/SalIフラグメントとして切り出し、そしてCD8のTM-ICドメインを、SalI/BamHIフラグメントとして切り出した。これらをともに、EcoRI/BamHI消化したpBluescriptに再び連結した。次いで、全CTLA-4-CD8キメラを単一のEcoRIフラグメントとして取り出し、そしてヒトT細胞白血病株J6への発現のための多数の発現ベクターにサブクローニングした。細胞表面抗CTLA4タンパク質の特性細胞表面抗CTLA-4タンパク質は、以下の機能性試験によってさらに特徴付けられ得る:i膜結合抗CTLA4-sFv-CD8タンパク質を発現する細胞と、可溶性ヒトCTLA4-Igを発現する細胞との間の相互作用のフローサイトメトリー評価iiBiacoreTMを用いる、可溶性抗CTLA4-sFv-Ig融合タンパク質と可溶性ヒトCTLA4-Igとの間の相互作用の定量的評価iii抗CTLA4-sFv-CD8融合タンパク質を発現するJ6トランスフェクタントへの可溶性ヒトCTLA4-Igの結合から生じるシグナル伝達事象についての分析iv同種異系混合リンパ球応答における刺激が、HLA-DRポジティブ、B7ポジティブ、抗CTLA4-sFv-CD8ポジティブ細胞株によって提供される場合のT細胞応答例えば、増殖、サイトカイン産生、アネルギー誘導の分析。マウスMHCクラスIIを発現するB7ネガティブブタ細胞50のクローニングした不死化した大動脈内皮細胞PAECを、PAECの単層から、pZipSVU19DNA22を用いる核内マイクロインジェクションにより生成した。不死化細胞IPECから、B7ネガティブクローンを、hCTLA4-IgおよびmCTLA4-Igを用いてフローサイトメトリースクリーニングによって同定した図17を参照のこと。次いで、これらを、プラスミド発現ベクターpcExV1-gptおよびpHβApr-1neo中のHLA-DRAおよびDRB10101をコードするcDNAでトランスフェクトし、そして細胞を、MXHおよびG418での選択下に置いた。比較のために、B7-ポジティブIPECコントロールを同様に生成した4。マウスMHCクラスII分子I-Abを発現するIPECトランスフェクタントの別のシリーズもまた、マウスにおける実験のために生成した。トランスフェクトIPEC細胞におけるMHCクラスIIの表面発現を、モノクローナル抗体L243HLA-DRに特異的図18またはM5-114マウスMHCクラスIIに特異的を用いて検出した。MHCクラスIIポジティブ細胞は、限界希釈によるクローニングの前に数回の蛍光活性化細胞ソーティングを受けた。トランスフェクタントの第2のバッチを、発現ベクターpCMU中のHLA-DMAおよびHLA-DMBおよびp31Ii不変鎖をコードするさらなるトランスフェクトcDNAを用いて正確に同じ方法で調製した。MHCクラスII発現細胞による同種異系T細胞におけるアネルギー誘導ヒトT細胞を、標準的なプロトコルを使用して精製した3。一次増幅アッセイのために、ガラス繊維フィルターへの採取の16時間前に1マイクロCi3H-チミジンの添加の前に、T細胞を、一定数の照射した刺激細胞stimulatorcellとともに5日間インキュベートした。このフィルターを、シンチレーションカウンターにおいて読み取った。B7ポジティブIPECは、有意な抗DR1特異的増殖応答を生じ、一方B7ネガティブIPECは任意の増殖応答を開始しなかった図19。2工程のアネルギー誘導アッセイを、標準的なプロトコルによって確立した23。一次寛容性誘導工程において、B7ポジティブIPECとともにインキュベートしたT細胞を、プライムされた二次免疫応答3日で最大の動力学を用いる二次工程における抗DR1増殖応答をマウントした。しかし、一次工程においてB7ネガティブIPECとともにインキュベートしたT細胞は、DR1に対して寛容になり、そしてB7ポジティブIPECにおいて発現されたDR1に対する続く曝露の際に、応答をマウントしなかった図20。DR1を発現するブタ細胞によるDR1拘束T細胞におけるアネルギー誘導DR1を発現する個体由来のCD4T細胞を、標準的な手順に従って精製した。一次増殖アッセイにおいて、それらは、HLA-DR1でトランスフェクトしたB7ポジティブIPECに増殖した。このことは、DR1が、ブタペプチド特異的T細胞についての制限エレメントとして機能し得ることを示す。B7ポジティブおよびB7ネガティブDR1トランスフェクタントに対する増殖応答を比較するアッセイを行っている。2工程のアネルギー導入アッセイもまた、DR1でトランスフェクトしたB7ネガティブブタ細胞がHLA-DR拘束ヒトT細胞においてアネルギーを誘導することを実証するために行い得る。HLA-DRにおける提示についてのプロフェッショナルヒトAPCによってプロセスされたブタペプチドと、HLA-DRでトランスフェクトしたIPECのMHCクラスIIにおいて提示されるものとの間の重複野生型IPECに対するヒトT細胞株を、ヒトPBMCから得た。この株の増殖応答は、ヒトAPCの存在に依存し、そしてHLA-DRに対する抗体によって阻害可能であり、これらのことは、この株が、ヒトAPCによって提示される、プロセスされたブタ異種抗原xenoantigenに対する間接的な特異性を有した。少なくともいくつかのプロセスされたブタペプチドがプロフェッショナルヒトAPCによって間接的に提示されることを意味する、B7ポジティブHLA-DR1でトランスフェクトされたIPECに対して増殖したこの株図21もまた、トランスフェクトされたブタ細胞によって提示された。ブタ島対マウスモデルにおける研究インビボでは、ブタ膵島細胞は、ストレプトゾトシンstreptozotocin処置した糖尿病マウスの腎臓被膜下に移植され得る。島異種移植片非血管性であるは、T細胞によって単に拒絶される。ブタ島を、末梢麻酔下でブタの膵臓から調製し、そしてレシピエントにおけるその生存を、正常血糖値の維持によって評価する。マウスに、ブタ島の移植前に、B7ネガティブのI-Abを発現するIPECを静脈内注射する。このストラテジーを、本発明の他の局面と組み合わせて、T細胞認識の直接経路を寛容化し、直接経路を介する拒絶が生じないことを確実にする。特定のストラテジーが特異的T細胞寛容性を誘導したか否かを評価するために、島保有腎臓の腎摘出を、同一のブタ島または第三者のブタ島の再移植の前に行う生存する腎臓の被膜下。本発明は、例示のみのために上に記載され、そして本発明の範囲および精神内に残る間は改変がなされ得ることが理解される。参考文献その内容を完全に援用する