"スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaであって、a上記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み;かつb該シグナル配列が、iXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片;およびiiスクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列;からなる群から選択され;かつc成熟スクロースインベルターゼをコードする上記ポリペプチド配列が、配列番号4と比較すると、CLUSTALWアライメント法に基づいて少なくとも80の配列同一性を有する、上記形質転換ヤロウィアリポリティカ。スクロースインベルターゼシグナル配列の前記2番目のアミノ酸が、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンからなる群から選択される、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が配列番号4で示される、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片が、ヤロウィアリポリティカに由来し、かつ前記スクロースインベルターゼシグナル配列が、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeに由来する、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片が、aアルカリ細胞外プロテアーゼ前駆体のN末端157個のアミノ酸を含むXpr2プレ/プロ領域;およびb成熟アルカリ細胞外プロテアーゼのN末端13個のアミノ酸を含むN末端Xpr2断片を含む、請求項4に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片が配列番号10で示される、請求項5に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記スクロースインベルターゼシグナル配列が配列番号8で示される、請求項4に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。スクロースインベルターゼコード配列に融合したシグナル配列を含む前記ポリペプチドが、配列番号12および配列番号20からなる群から選択される、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記形質転換ヤロウィアリポリティカが、スクロースを唯一の炭素源とする条件下で増殖することができる、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記形質転換ヤロウィアリポリティカが、少なくとも1つの目的の非天然生成物を産生することができる、請求項1に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記少なくとも1つの目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導化合物、ならびにレスベラトロールからなる群から選択される、請求項10に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。前記形質転換ヤロウィアリポリティカが、少なくとも80のスクロースインベルターゼを細胞外に分泌することができ、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖する、請求項1または請求項10に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカ。少なくとも1つの非天然生成物を生産する方法であって、aスクロース;およびbグルコース;からなる群から選択される少なくとも1つの炭素源を含有する培地中で請求項10に記載の形質転換ヤロウィアリポリティカを増殖させ、それによって、少なくとも1つの目的の非天然生成物を産生させるステップ、および場合によっては、少なくとも1つの目的の非天然生成物を回収するステップ、を含む上記方法。前記少なくとも1つの目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導化合物、ならびにレスベラトロールからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。前記形質転換ヤロウィアリポリティカが、少なくとも80のスクロースインベルターゼを細胞外に分泌することができる、請求項13に記載の方法。したがって、細胞外インベルターゼ活性を改善するためにY.リポリティカY.lipolyticaを操作することが、炭素源としてスクロースをより良く利用するために望ましい。一実施形態では、本発明は、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaであって、a前記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み;かつb前記シグナル配列が、iXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片;ならびにiiスクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸になりうるスクロースインベルターゼシグナル配列からなる群から選択され;かつc成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が、配列番号4m-ScSUC2と比較されるとき、CLUSTALWアライメント法に基づいて少なくとも80の配列同一性を有する形質転換されたヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaに関する。好ましくは、上記のスクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンからなる群から選択される。第2の実施形態では、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列は、配列番号4m-ScSUC2で示される。第3の実施形態では、Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片は、Y.リポリティカY.lipolyticaに由来し、かつ前記スクロースインベルターゼシグナル配列は、サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeに由来する。好ましくは、Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片は、iアルカリ性細胞外プロテアーゼ前駆体のN末端157個のアミノ酸を含むXpr2プレ/プロ領域;およびii成熟アルカリ性細胞外プロテアーゼのN末端13個のアミノ酸を含むN末端Xpr2断片を含む。好ましくは、Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片は、配列番号10[XPR2PP13]で示される。第4の実施形態では、スクロースインベルターゼシグナル配列は、配列番号8[Suc2SS]で示される。第5の実施形態では、スクロースインベルターゼのコード配列に融合したシグナル配列を含むポリペプチドは、配列番号12[Suc2SS/m-ScSUC2]および配列番号20[XPR2PP13/m-ScSUC2]からなる群から選択される。第6の実施形態では、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、スクロースが唯一の炭素源である条件下で増殖することができる。第7の実施形態では、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、目的の少なくとも1つの非天然生成物を産生することができる。好ましくは、目的の少なくとも1つの非天然生成物は、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールからなる群から選択される。第8の実施形態では、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖させた、本明細書で発明の形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaはいずれも、スクロースインベルターゼの少なくとも80を細胞外に分泌することができる。第9の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの非天然生成物を産生する方法であって、aスクロース;およびbグルコース;からなる群から選択される少なくとも1つの炭素源を含有する培地中で本発明の形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaを増殖させ、それによって、目的の少なくとも1つの非天然生成物を産生させるステップ、および場合によっては、目的の少なくとも1つの非天然生成物を回収するステップを含む方法に関する。好ましくは、目的の少なくとも1つの非天然生成物は、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールからなる群から選択される。第10の実施形態では、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、スクロースインベルターゼの少なくとも80を細胞外に分泌することができる。本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、それら全体を参照により組み込むものとする。本開示では、いくつの用語および略語を使用する。以下に定義を示す。翻訳領域はORFと略す。ポリメラーゼ連鎖反応はPCRと略す。米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionはATCCと略す。多価不飽和脂肪酸類はPUFA類と略す。トリアシルグリセロールはTAGと略す。総脂肪酸はTFAと略す。脂肪酸メチルエステルはFAMEと略す。乾燥細胞重量はDCWと略す。重量パーセントは重量と略す。単数形a、an、およびtheは、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、文脈上他に明示されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、1つの細胞acellと言及する場合、1つまたは複数の細胞および当業者に公知の等価物等が含まれる。用語分泌経路は、分泌過程において、細胞がタンパク質を細胞外に輸送する経路を指す。一般に、分泌されるタンパク質は、粗面小胞体[ER]に移行し、ゴルジ装置を介して輸送され、次いでエキソサイトーシスの過程で細胞膜と最終的に融合し、それによってタンパク質を放出する小胞に組み込まれる。分泌は、構成的または調節形式で起こりうる。シグナル配列当技術分野では、プレ配列領域、シグナルペプチド、ターゲティングシグナル、輸送ペプチド、または移行シグナルとも呼ばれるは、一般に、細胞内部におけるまたは細胞外環境へのポリペプチドの残りの部分の輸送および局在化を指示する短いペプチド配列すなわち、ポリペプチドの最もN末端の部分で長さが約3~60個のアミノ酸である。真核生物での平均長は22.6個のアミノ酸である。シグナル配列は、一般に、膜、例えばER膜を横切る移行を介してタンパク質をその機能部位にターゲティングするための定義されたペプチドモチーフを含む。移行後、続けて、シグナル配列は内因性シグナルペプチターゼにより通常切断される。シグナル配列を含むタンパク質はプレタンパク質と呼ばれる。コンセンサス配列は存在しないが、ほとんどすべてのシグナルペプチドは共通の構造、すなわち、短く、正に荷電したアミノ領域n-領域;中央の疎水性領域h-領域;およびシグナルペプチターゼにより切断される部位を含有するより極性な領域c-領域Nielsen,etal.,ProteinEngineering,10:1-61997を有する。用語プロタンパク質およびタンパク質前駆体は、本明細書において互換的に使用し、N末端プロ配列領域の切断により改変されうるポリペプチドを指す。通常はエンドプロテアーゼによるこのプロ配列領域の除去により、成熟タンパク質の形成がもたらされる。このプロ配列領域は、種々の翻訳後修飾を促進する原因となることも、成熟タンパク質の適切なフォールディングための必要条件となることも、またはそれが翻訳後に除去されるまで、成熟タンパク質の活性を阻害するように作用することもある。プレ/プロタンパク質は、プレ/プロ領域が除去されたときに成熟タンパク質になるものに結合したプレ/プロ領域を含有する。プレ/プロタンパク質は、プレ配列領域すなわち、N末端シグナル配列およびプロ配列領域すなわち、プレ配列とプレ/プロ領域が除去されたときに成熟タンパク質になるものとの間に並置された領域の両方を含む。用語インベルターゼおよびβ-フルクトフラノシダーゼは、加水分解反応を介してスクロースすなわち、アルファ-1、4-グリコシド結合により連結された、アルファ-D-グルコース分子およびベータ-D-フルクトース分子からなる二糖をグルコースおよびフルクトースに変換する能力を有するタンパク質EC3.2.1.26を指す。サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeでは、インベルターゼをコードする遺伝子はSuc2である。用語細胞外インベルターゼは、微生物細胞が増殖する培地に分泌されるインベルターゼを指す。したがって、細胞外インベルターゼ活性は、典型的には、培地自体のみで測定される。これに対して、全細胞インベルターゼは、細胞外に分泌されないが、その代りに細胞内部の細胞膜周辺腔に分泌されるインベルターゼを指す。典型的には、全細胞インベルターゼ活性は、全細胞のみで測定される。細胞外インベルターゼ活性対全細胞活性の相対量すなわち、パーセントは、以下のように決定される:100培地中のインベルターゼ活性/[全細胞のインベルターゼ活性培地中のインベルターゼ活性]。用語アルカリ性細胞外プロテアーゼまたはAEPは、Y.リポリティカY.lipolyticaのXPR2遺伝子によりコードされるタンパク質EC3.4.21.-を指す。AEPは、この酵母により分泌される主要な細胞外タンパク質培地1リットル当たり1グラム超であり、無細胞培地上清に存在するタンパク質の99を占める。完全長プロテアーゼのN末端は、成熟タンパク質のプロセシングおよび分泌に関与するプレ/プロ領域を含有する。用語目的の非天然生成物は、野生型微生物内で天然には産生されない任意の生成物を指す。典型的には、目的の生成物である異種タンパク質の発現を可能にするために、宿主微生物へ適切な異種遺伝子を導入する組換え手段によって、目的の非天然生成物は産生される。好ましい目的の非天然生成物の非限定例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールが挙げられる。用語目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子は、それが導入される宿主微生物とは異なる起源に由来する遺伝子を指す。異種遺伝子は、宿主微生物における目的の非天然生成物の産生を促進する。一部の場合では、中間段階または経路中間体をまったく経ずに、所望する目的の生成物への基質の直接変換を触媒する単一の異種遺伝子のみが、目的の生成物の産生を可能にするために必要となり得る。あるいは、所望する目的の非天然生成物を産生するための一連の反応が起こるように、新しい生合成経路をコードする一連の遺伝子を微生物へ導入することが望ましい場合もある。一般に、用語油性は、エネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指すWeete,In:FungalLipidBiochemistry,2ndEd.,Plenum,1980。この過程の間、油性微生物の細胞油含量は一般にシグモイド曲線に従い、脂質濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次いで、後期定常期および死滅期の間に徐々に減少するYongmanitchaiandWard,Appl.Environ.Microbiol.,57:419-251991。本出願の目的のためには、用語油性は、油としてそれらの乾燥細胞重量[DCW]の少なくとも約25を蓄積することができる微生物を指す。用語油性酵母は、油を製造することができる酵母として分類される油性微生物を指す。すなわち、この酵母では、それらのDCWの約25を上回る油を蓄積することができる。油性酵母の例としては、これらに限定する意図はないが、以下の属、すなわちヤロウィア属Yarrowia、カンジダ属Candida、ロドトルラ属Rhodotorula、ロドスポリジウム属Rhodosporidium、クリプトコックス属Cryptococcus、トリコスポロン属Trichosporon、およびリポマイセス属Lipomycesが挙げられる。酵母のDCWの約25を上回る油を蓄積する能力は、組換え工学の努力を介するものでも、または生物の天然の能力を介するものでもよい。用語炭素源は、エネルギーを得るために微生物が代謝する炭素を含む栄養素を指す。例えば、野生型Y.リポリティカY.lipolyticaは、グルコース、フルクトース、グリセロール、酢酸、アルコール、アルカン、脂肪酸、およびトリグリセリドを含む種々の炭素源を使用することができる;しかしながら、それは唯一の炭素源としてスクロースを使用することができないBarth,G.andC.Gaillardin,FEMSMicrobiol.Rev.,19:219-2371997。これに対して、本発明の組換えY.リポリティカY.lipolyticaは、唯一の発酵性炭素源として、または他の適切な炭素源と組み合わせてスクロースを使用することができる。用語微生物宿主細胞および微生物宿主生物は、本明細書で互換的に使用し、外来または異種遺伝子を受け入れることができ、それらの遺伝子を発現することができる微生物を指す。組換え微生物宿主細胞は、組換え操作された例えば、微生物宿主細胞が外因性ポリヌクレオチドで形質転換されたように微生物宿主細胞を指す。本明細書で使用する場合、単離核酸断片は、合成、非天然、または改変のヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーである。DNAポリマー形態の単離核酸断片は、cDNA、ゲノムDNA、または合成DNAの1つまたは複数のセグメントから構成されてもよい。アミノ酸またはヌクレオチド配列の実質的な部分とは、当業者による配列のマニュアル評価またはBLASTBasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.,etal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101993などのアルゴリズムを用いる、コンピュータによる自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、公知のタンパク質または遺伝子に相同なものとしてポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するためには、10個以上の連続したアミノ酸配列または30個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20~30個の連続したヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子の同定例えば、サザンハイブリダイゼーションおよび単離例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーションの配列依存的方法に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、12~15個の塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応PCRの増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および/または単離するのに十分な配列を含む。用語相補的は、逆平行の配向で並列したときにワトソン‐クリック型塩基対が可能なヌクレオチド塩基の2つの配列間の関係を述べる。例えば、DNAに関して、アデノシンはチミンと塩基対が可能であり、シトシンはグアニンと塩基対が可能である。コドン縮重は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示すコドンバイアスについて十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。合成遺伝子は、当業者に公知の手順を用いて、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを連結しアニールして遺伝子セグメントを形成した後、酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のための遺伝子を構築することができる。当業者は、宿主が好むコドンの方向へコドン使用をバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高まることを認識している。好ましいコドンは、配列情報が利用可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて決定することができる。例えば、Y.リポリティカY.lipolyticaのコドン使用プロフィールは、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,125,672号明細書に提供されている。遺伝子は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指すことも、またはコード配列の前5’非コード配列およびコード配列の後3’非コード配列に調節配列を含むこともある。天然遺伝子は、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。キメラ遺伝子は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。内因性遺伝子は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。外来遺伝子または外因性遺伝子は、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。導入遺伝子は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。コドン最適化遺伝子は、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計された遺伝子である。コード配列は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。適切な調節配列は、コード配列の上流5’非コード配列、内部、または下流3’非コード配列に位置し、転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、5’非翻訳リーダー配列例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を挙げることができる。プロモーターは、コード配列または機能RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することも、または天然に見出される様々なプロモーターに由来した様々なエレメントから構成されていることも、または合成DNAセグメントをさらに含んでいることもある。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示しうることを当業者は理解している。ほとんどの細胞型でほとんど常に遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、構成的プロモーターと一般に呼ばれる。ほとんどの場合で、調節配列の正確な境界が完全には画定されていないので、様々な長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を示しうることもまた認識されている。用語3’非コード配列および転写ターミネーターは、本明細書で互換的に使用し、コード配列の3’側下流に位置するDNA配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列およびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節配列をコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことを通常特徴とする。3’領域は、転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。用語作動可能に連結されるは、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が関連していることを指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぶすことができる場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。すなわち、そのコード配列はそのプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。本明細書で使用する用語発現は、センスmRNAまたはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。形質転換は、宿主生物への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよく、宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、トランスジェニックもしくは組換えもしくは形質転換された生物、または形質転換体と呼ばれる。安定な形質転換は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、核および細胞小器官のゲノムを含む、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指すすなわち、この核酸断片は安定に組み込まれる。これに対して、一時的な形質転換は、組込みまたは安定な遺伝を伴わない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核またはDNA含有細胞小器官への核酸断片の移入を指す。用語プラスミドおよびベクターは、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖DNA断片の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ、またはヌクレオチド配列であってよく、かつ線状であっても環状であってもよい。そこでは、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組み換えられて、細胞に発現カセットを導入することができるユニークな構成になっている。用語発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子生成物の発現に必要とされる、コード配列の前5’非コード配列および後3’非コード配列の調節配列とを含むDNAの断片を指す。したがって、発現カセットは、典型的には、1プロモーター配列、2コード配列すなわち、翻訳領域[ORF]、および3真核生物ではポリアデニル化部位を通常含有する3’非翻訳領域すなわち、ターミネーターから構成される。発現カセットは、クローニングおよび形質転換を容易にするためにベクター内に通常含まれる。それぞれの宿主のために適正な調節配列を使用する限り、種々の発現カセットを、細菌、酵母、植物、および哺乳類の細胞を含む種々の生物に形質転換することができる。用語配列分析ソフトウェアは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは市販のものでも、独自に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、1GCGプログラムスイートWisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WI;2BLASTP、BLASTN、BLASTXAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101990;3DNASTARDNASTAR,Inc.Madison,WI;4SequencherGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI;および5スミス-ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムW.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.]1994,MeetingDate1992,111-20.Editors:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NYが挙げられる。本出願の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合は、別段の定めがない限り、分析の結果は、参照プログラムのデフォルト値に基づくものであることを理解されたい。本明細書で使用するデフォルト値は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における配列同一性または同一性は、指定された比較ウィンドウにわたって最大の一致を得るようにアライメントすると同じになる、2つの配列内の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。したがって、配列同一性パーセントまたはパーセント同一性は、比較ウィンドウにわたって最適にアライメントされた2つの配列を比較して決定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、2つの配列の最適アライメントのために、参照配列付加または欠失を含まないとの比較で付加または欠失すなわちギャップを含んでもよい。パーセントは、両方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を判定してマッチした位置の数を得て、比較ウィンドウ内の位置の総数でマッチした位置の数を除し、配列同一性パーセントを得るためにその結果に100を乗じることにより計算することができる。パーセント同一性およびパーセント類似性を決定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。パーセント同一性およびパーセント類似性は、これらに限定されないが、1ComputationalMolecularBiologyLesk,A.M.,Ed.OxfordUniversity:NY1988;2Biocomputing:InformaticsandGenomeProjectsSmith,D.W.,Ed.Academic:NY1993;3ComputerAnalysisofSequenceData,PartIGriffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.Humania:NJ1994;4SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinje,G.,Ed.Academic1987;および5SequenceAnalysisPrimerGribskov,M.andDevereux,J.,Eds.Stockton:NY1991を含む、公知の方法によって容易に計算することができる。配列アラインメントおよびパーセント同一性またはパーセント類似性の計算は、相同配列を検出するように設計された種々の比較法を使用して求めることができる。配列の多重アライメントは、HigginsandSharp,CABIOS,5:151-1531989;Higgins,D.G.etal.,Comput.Appl.Biosci.,8:189-1911992により記載され、上記MegAlign商標バージョン8.0.2プログラムに見出される、ClustalVアライメント法およびClustalアライメントW法を含む、いくつかの種類のアルゴリズムを包含するClustalアライメント法を使用して実施することができる。いずれかのClustalプログラムを用いて配列アライメントをした後、プログラム中の配列距離表を見ることにより、パーセント同一性を得ることができる。本明細書で使用する標準の組換えDNAおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989これ以降Maniatis;Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1984;およびAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,Hoboken,NJ1987により記載されている。Y.リポリティカY.lipolyticaは、炭素源としてスクロースを使用するように組換え操作することができる。これには、グルコースおよびフルクトースへのスクロースの変換を触媒するインベルターゼをコードする遺伝子を発現するように生物を操作することが含まれた。しかしながら、スクロースは酵母が増殖する培地中に存在するので、細胞内インベルターゼによる加水分解に先だってスクロースを細胞内に輸送する必要がある、または培地中のスクロースを、その後細胞に輸送することができるグルコースおよびフルクトースに加水分解できる細胞外にインベルターゼを発現すべきである。インベルターゼが周辺培地中、細胞外に分泌されるように、シグナル配列を異種インベルターゼ遺伝子に融合することが好ましい。グルコースおよびフルクトースへのスクロースの変換を触媒する機能的インベルターゼEC3.2.1.26;β-フルクトフラノシダーゼとも呼ばれるの発現により、サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeはスクロースを発酵させる。S.セルビシアS.cerevisiaeの同じSUC2対立遺伝子から発現されるインベルターゼには2つの形態、すなわちグルコース抑制により調節される分泌型グリコシル化形態および構成的に産生する細胞内非グリコシル化形態がある。これらの2つの形態間の差は、分泌型グリコシル化インベルターゼの合成に必要な5’-シグナル配列の有無に起因する。このシグナル配列は、インベルターゼタンパク質の最初の19個のアミノ酸として定義されているPerlman,D.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79:781-7851982;CarlsonandBotstein,Cell,281:145-541982;TaussigandCarlson,NucleicAcidsRes.,11:1943-541983。したがって、完全長S.セルビシアS.cerevisiaeSUC2[ScSUC2]遺伝子配列番号1は、グリコシル化形態でS.セルビシアS.cerevisiaeの周辺質に分泌される、532個のアミノ酸の完全長インベルターゼ配列番号2をコードする、長さが1599個のヌクレオチドである。これに対して、成熟ScSUC2遺伝子[m-ScSUC2]は、配列番号1のヌクレオチド1~57によりコードされた、アミノ酸長が19個の5’シグナル配列を欠損しており、したがって、細胞内非グリコシル化形態のm-ScSUC2は、配列番号3配列番号1のヌクレオチド58~1599に相当するとして示される、1542bpのヌクレオチド配列によりコードされ、この配列が翻訳されて、513個のアミノ酸の短縮m-ScSUC2タンパク質配列番号4が生成する。細胞の膜を介して分泌されるタンパク質は、一般に、プレタンパク質として細胞内で生成される。その形態では、タンパク質は、その分泌および局在化をおそらく支援するが、分泌過程の間に分泌型成熟タンパク質から最終的に切断される付加的なシグナルポリペプチド配列に融合している。プレタンパク質のシグナルペプチドは、ある種の類似性を共有するものの、それらの一次構造は相当異なっている。これは、それぞれのタンパク質が、細胞膜を介して特定のそのタンパク質が移行するのに特によく適したシグナル配列と共に進化してきたことを示唆する。上記のように、Y.リポリティカY.lipolyticaは、培地中に大量のAEPを天然に分泌する。配列番号6長さが454個のアミノ酸の完全長Y.リポリティカY.lipolyticaAEPは、1365bpのXPR2遺伝子配列番号5によりコードされる。このプロテアーゼのN末端157個のアミノ酸残基は、成熟タンパク質のプロセシングおよび分泌に関与するシグナル配列およびプレ/プロ領域を含有する。詳細な研究により、AEPは、プレプロI-プロII-プロIIIのN末端領域を伴って合成されることが示され、AEPの4つの異なる前駆体が検出された。アミノ酸位置1~13は、分泌に関与するシグナル配列を含有し、その後の位置14~33には、典型的なジペプチジルアミノペプチターゼ認識部位である一連の-Xaa-Ala-および-Xaa-Pro-がある。アミノ酸位置54または60は、プロIおよびプロIIの領域間の切断部位と思われるが、位置129または131は、プロIIおよびプロIIIの領域間の別の切断部位である。最後に配列番号6のアミノ酸位置157は、プロIIIおよび成熟AEPの間の切断部位であるMatoba,S.etal.,Mol.CellBiol.,811:4904-49161988;米国特許第4,937,189号明細書および欧州特許第0220864B1号明細書も参照のこと。アミノ酸1~157に相当するプレ/プロ領域は、タンパク質フォールディング、効率的な分泌、早期活性化の防止等に関与することが示唆されている;プレ/プロ領域が切断されないと、AEPタンパク質は機能的にならない。Xpr2プレプロ領域は、Y.リポリティカY.lipolyticaにおける種々の異種タンパク質の分泌に使用されてきた;しかしながら、タンパク質分泌のためのXpr2プレプロ領域の使用では、様々な結果が得られているMadzak,C.,etal.,Microbiology,1451:75-871999。不満足なタンパク質発現の理由としては、不完全なタンパク質プロセシングPark,C.S.,etal.,J.Biol.Chem.,272:6876-68811997;Park,C.S.,etal.,Appl.Biochem.Biotechnol.,87:1-152000;Swennen,D.,etal.,Microbiology,148:41-502002および細胞外発現の欠如Hamsa,P.V.andB.B.Chattoo,Gene,143:165-701994;Tharaud,C.,etal.,Gene,121:111-1191992が挙げられる。したがって、プロ配列は、異種タンパク質の分泌には必要がない可能性またはむしろ有害である可能性が示唆されたMadzak,C.,etal.,J.Biotechnol.,109:63-812004;Park,etal.,J.Biol.Chem.上記;Tharaud,C.,etal.,上記。これは、Tabuchi,M.らJ.Bacteriol.,179:4179-41891997により示され、そこではカルボキシペプチダーゼYCPYのプレプロ領域がシゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe由来のSuc2の分泌に効果がなかった。ScSuc2シグナル配列配列番号1のヌクレオチド1~57[すなわち、ScSUC2のアミノ酸1~19]に相当するを発現するコンストラクトにPciI制限酵素部位を導入するために、アミノ酸位置2を変異させた。その結果、野生型Leu2残基がPhe2別の疎水性残基に変異し、それによりScSuc2の分泌過程に影響を及ぼさずに、シグナル配列の疎水性が維持されたKaiser,C.A.,etal.,Science,235:312-3171987。したがって、本発明の適切なScSuc2シグナル配列の1つすなわちSuc2SSを、配列番号7および8として本明細書に示す。Xpr2プレ/プロ領域を含むコンストラクトは、配列番号10のアミノ酸1~170をコードするように設計した。Xpr2プレ/プロ領域は、配列番号6のアミノ酸1~157のみを包含するとして本明細書に記載したが、融合物連結部の不正確なプロセシングが推定上の二次構造によるものとあらかじめ留意されていたのでPark,C.S.,etal.,J.Biol.Chem.,272:6876-68811997、Lys156-Arg157切断部位にXpr6エンドペプチダーゼが確実に到達するように、プレ/プロ領域の後に、プロテアーゼの追加の13個のアミノ酸すなわち、N末端Xpr2断片をリンカーとして含めた。したがって、本発明の適切なXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片の1つすなわちXPR2PP13を、配列番号9および10として本明細書に示す。下記の表2に要約し、図1に示す発現カセットについて、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaにおけるインベルターゼ発現を評価した。より具体的には、発現プラスミドpYRH68は、成熟SUC2をコードする遺伝子すなわち、配列番号3;m-ScSUC2に融合したSuc2SSシグナル配列を含み、発現プラスミドpYRH70は、配列番号3に融合したSuc2SSシグナル配列を2コピー含み、発現プラスミドpYRH69は、配列番号3に融合したXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片とSuc2SSシグナル配列の両方を含み、発現プラスミドpYRH73は、配列番号3のみを含みかつXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片も、分泌に関与するシグナル配列としてのSuc2SSシグナル配列も含まない、そして発現プラスミドpYRH74は、配列番号3に融合したXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片を含んだ。FBAINmプロモーター領域すなわち、fba1遺伝子[米国特許第7,202,356号明細書]によりコードされたフルクトース二リン酸アルドラーゼ酵素E.C.4.1.2.13のATG翻訳開始コドンの前の5’側上流にある非翻訳領域に由来を、インベルターゼ遺伝子コンストラクトに機能的に連結した。上記プラスミドコンストラクトのそれぞれを発現するY.リポリティカY.lipolytica形質転換体を、スクロースを唯一の炭素源とする培地上で増殖させた。成熟SUC2ScSuc2[すなわち、配列番号2]をコードする完全長遺伝子に事実上相当するをコードする遺伝子に融合したSuc2SSシグナル配列すなわち、pYRH68およびpYRH70または成熟SUC2をコードする遺伝子に融合したXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片すなわち、pYRH74を発現する形質転換体のみがインベルターゼを発現した、すなわち、SUC表現型であった。したがって、これは、それらの融合物がY.リポリティカY.lipolyticaにScSUC2の機能的な発現をもたらすことを示す。一態様では、本発明は、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaであって、a前記ポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含み;かつb前記シグナル配列が、iXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片;およびiiスクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列からなる群から選択され;かつc成熟スクロースインベルターゼをコードする前記ポリペプチド配列が、配列番号4m-ScSUC2と比較されるとき、CLUSTALWアライメント法に基づくと少なくとも80の配列同一性を有する形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaに関する。好ましい実施形態では、本発明の形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、炭素源として少なくともスクロースを含有する培地中で増殖させると、スクロースインベルターゼの少なくとも80を細胞外に分泌することができる細胞内[または周辺質]のインベルターゼ活性は、全インベルターゼ活性の20以下である。より好ましくは、細胞外インベルターゼ活性は、全インベルターゼ活性の少なくとも81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100である。上記に記載のように、配列番号4として本明細書に示す成熟ScSUC2タンパク質[m-ScSUC2]は、配列番号1のヌクレオチド1~57によりコードされる、19個のアミノ酸長の5’シグナル配列を欠如している。好ましくは、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列は、配列番号4m-ScSUC2で示される。代替実施形態では、成熟スクロースインベルターゼは、配列番号4と比較されるとき、CLUSTALWアライメント法に基づくと少なくとも80の配列同一性を有する、すなわち、配列番号4と比較されるとき、このポリペプチドは少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100の同一性を有しうる。一実施形態では、Y.リポリティカY.lipolyticaにおける発現のために、配列番号4をコドン最適化することが望ましいことがある。これは、Y.リポリティカY.lipolyticaのコドン使用プロフィールに関する以前の決定、好まれるコドンの同定、およびATG開始コドン周辺のコンセンサス配列の決定米国特許第7,238,482号明細書を参照のことに基づいて可能である。別の実施形態では、表14実施例8のインベルターゼ配列またはそれらの一部を本発明で使用することができる。あるいは、これらのいずれも、配列分析ソフトウェアを使用して、同種または他種のインベルターゼホモログを探索するために使用することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失、およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。低複雑性フィルターおよび以下のパラメーター:期待値=10、マトリックス=Blosum62Altschul,etal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-34021997を用いるBLASTPアライメント法などのソフトウェアアルゴリズムの使用は、核酸配列またはタンパク質配列のデータベースに対して、表14の任意のインベルターゼタンパク質を比較し、それによって好ましい生物の範囲内で類似の公知配列を同定するための手段として周知である。公知配列のデータベースを詳細に検索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表14に記載のものなど、公的に入手可能なインベルターゼ配列に対して比較的低いパーセント同一性を有するホモログの単離に特に適している。公的に利用可能なインベルターゼ配列に対して少なくとも約80~85同一であるインベルターゼホモログの単離は比較的容易であると予測できる。さらに、少なくとも約85~90同一の配列は、単離に特に適しており、少なくとも約90~95同一の配列は、最も容易に単離されよう。一部のインベルターゼホモログは、インベルターゼ酵素にユニークなモチーフの使用によっても単離されている。モチーフは、タンパク質ホモログファミリーのアライメントされた配列が高度に保存されていることにより同定される。ユニークなサインとしてのモチーフにより、新しく決定された配列が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するものか否かを決定することができる。これらのモチーフは、新規インベルターゼ遺伝子を迅速に同定するための診断ツールとして有用である。本明細書または公開文献に記載されているインベルターゼの任意の核酸断片または同定された任意のホモログを使用して、同種または他種由来のホモログタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを用いるホモログ遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、これらに限定されないが、1核酸ハイブリダイゼーション法;2ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]米国特許第4,683,202号明細書、リガーゼ連鎖反応[LCR]Tabor,S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:10741985、または鎖置換増幅[SDA]Walker,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:3921992などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるDNAおよびRNA増幅法;ならびに3相補性によるライブラリ構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。本発明の形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドであって、このポリペプチドが、成熟スクロースインベルターゼをコードする外因性ポリヌクレオチドに融合したシグナル配列を含み、前記シグナル配列が、1Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片、ならびに22番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよい、スクロースインベルターゼシグナル配列からなる群から選択される外因性ポリヌクレオチドを含む。Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片を含むシグナル配列に関して、当業者は、アルカリ性細胞外プロテアーゼEC3.4.21.-をコードする適切なXPR2遺伝子を分析して、成熟タンパク質をコードする配列に対してプレ/プロ領域をコードする配列を同定することができよう。例えば、SignalP4.0サーバーCenterforBiologicalSequenceAnalysis,DepartmentofSystemsBiology,TechnicalUniversityofDenmark,DK-2800Lyngby,Denmarkは、種々の生物に由来するアミノ酸配列におけるシグナルペプチド切断部位の存在および位置を予測するのに有用であるNielsen,H.,etal.,ProteinEngineering,10:1-61997;Petersen,T.N.,etal.,NatureMethods,8:785-7862011。この同定に続いて、完全長Xpr2プレ/プロ領域および成熟Xpr2タンパク質すなわち、AEPの追加のN末端断片をコードする適切な配列を単離することが容易に可能である。このN末端Xpr2断片は、プレ/プロ領域と成熟タンパク質の間の切断部位にXpr6エンドペプチダーゼが確実に到達するように、少なくとも成熟プロテアーゼのほぼアミノ酸1~10から最大で成熟プロテアーゼのほぼアミノ酸1~25をコードするただし、N末端断片の正確な長さは、利用した各XPR2遺伝子ごとに実験的に決定される必要があろう。より好ましくは、成熟プロテアーゼのN末端Xpr2断片は、成熟プロテアーゼのアミノ酸1~11、アミノ酸1~12、アミノ酸1~13、アミノ酸1~14、アミノ酸1~15、アミノ酸1~16、アミノ酸1~17、アミノ酸1~18、アミノ酸1~19、アミノ酸1~20、アミノ酸1~21、アミノ酸1~22、アミノ酸1~23、または成熟プロテアーゼのアミノ酸1~24をコードすることになる。Y.リポリティカY.lipolytica由来のXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片は、Xpr2プレ/プロ領域の少なくとも157個のアミノ酸すなわち、配列番号6のアミノ酸1~157および成熟プロテアーゼをコードする追加のN末端Xpr2断片すなわち、配列番号6のアミノ酸158~167、またはアミノ酸158~168、またはアミノ酸158~169、またはアミノ酸158~170、またはアミノ酸158~171、またはアミノ酸158~172、またはアミノ酸158~173、またはアミノ酸158~174、またはアミノ酸158~175、またはアミノ酸158~176、またはアミノ酸158~177、またはアミノ酸158~178、またはアミノ酸158~179、またはアミノ酸158~180、またはアミノ酸158~181、またはアミノ酸158~182を含むことになる。好ましいXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片すなわち、配列番号10で示すXPR2PP13は、配列番号6のアミノ酸1~170を含み、この断片は、Xpr6エンドペプチダーゼがLys156-Arg157切断部位に確実に到達するように、Xpr2プレ/プロ領域の後に追加の13個のアミノ酸すなわち、成熟プロテアーゼのアミノ酸1~13を含むものに相当した。したがって、Xpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片は、aAEP前駆体のN末端157個のアミノ酸を含むXpr2プレ/プロ領域;およびb成熟AEPのN末端13個のアミノ酸を含むN末端Xpr2断片を含む。Y.リポリティカY.lipolyticaに形質転換することができる、スクロースインベルターゼ活性を有するポリヌクレチドをコードする好ましい外因性ポリヌクレオチドの1つは、配列番号4m-ScSUC2の成熟スクロースインベルターゼに融合した、配列番号10のXpr2プレ/プロ領域およびN末端Xpr2断片のシグナル配列を含むもので、それによって、配列番号19として示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号20のタンパク質をコードするXPR2PP13/m-ScSUC2融合物が生成する。スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチドに融合したシグナル配列を含む外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、スクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸が任意の疎水性アミノ酸であってよいスクロースインベルターゼシグナル配列を代替的に利用することができる。当業者は、上記と同様の方法論を利用して、成熟インベルターゼタンパク質をコードする配列に対するインベルターゼシグナル配列をコードする配列を同定することができよう。いったん同定されれば、本明細書に記載のように、インベルターゼシグナル配列を単離して、スクロースインベルターゼ活性を有する融合ポリペプチドを構築することが容易に可能になる。明確さのために、スクロースインベルターゼシグナル配列および成熟スクロースインベルターゼを、単一種から単離することができそれによって、その種の完全長インベルターゼプレタンパク質と事実上同等である、あるいはスクロースインベルターゼシグナル配列を種Aから単離し、成熟スクロースインベルターゼを種Bから単離することができる。スクロースインベルターゼシグナル配列の2番目のアミノ酸は、任意の疎水性アミノ酸、例えば、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、またはメチオニンであってよい。インベルターゼシグナルペプチドを調べるこれまでの幾つかの研究では、本質的にランダムなアミノ酸配列の少なくとも20が、少なくとも部分的に、インベルターゼの排出シグナルとして機能しうることが示されてきた。排出シグナルの機能は、シグナルペプチドの定義された構造または長さではなく疎水性と関連する例えば、Kaiseretal.,Science,235:312-3171987;KaiserandBotstein,Mol.Cell.Biol.,6:2382-23911986を参照のこと。さらに、天然のScSUC2シグナル配列と成熟ScSUC2との間の連結部配列は、シグナルペプチドの適切な切断にとって重要であることが知られている。例えば、配列番号2の残基Ala19がValに変異すると、ScSUC2は不完全になるSchaueretal.,J.CellBiol.,100:1664-10751985。SUC2シグナル配列の改変に関するさらなる情報については、NgseeらMol.Cell.Biol.,9:3400-34101989を参照されたい。一実施形態では、スクロースインベルターゼシグナル配列はサッカロミセスSaccharomyces属の生物に由来するものであってよい。より好ましくは、スクロースインベルターゼシグナル配列は、例えば、配列番号8[Suc2SS]で示されるスクロースインベルターゼシグナル配列など、サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeから単離される。配列番号8の2番目のアミノ酸を代替の疎水性アミノ酸に置換することができすなわち、Phe2をLeu2、Ile2、Val2、またはMet2に変異させることができる、それによってインベルターゼの分泌過程に影響を及ぼさずに、シグナル配列の疎水性を維持するこができる。より具体的には、本明細書において、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaで使用されるスクロースインベルターゼシグナル配列は、分泌活性が実質的に維持される限り、配列番号8と比較されるとき、少なくとも51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100の同一性を有することができる例えば、KaiserandBotstein,Mol.Cell.Biol.,6:2382-23911986を参照のこと。Y.リポリティカY.lipolyticaへの形質転換を目的とする、スクロースインベルターゼ活性を有するポリヌクレチドをコードする好ましい外因性ポリヌクレオチドの1つは、配列番号4m-ScSUC2の成熟スクロースインベルターゼに融合した、配列番号8のスクロースインベルターゼシグナル配列を含むもので、それによって、配列番号11として示されるヌクレオチド配列を有し、配列番号12のタンパク質をコードするSuc2SS/m-ScSUC2融合物が生成する。配列番号12のSuc2SS/m-ScSUC2融合物は、例えば、Suc2SSシグナル配列が配列番号2のアミノ酸1~19に相当し、m-ScSUC2がアミノ酸20~532に相当する以上、配列番号2アミノ酸2の変異を例外としてで示される完全長インベルターゼプレタンパク質に事実上同等であると認識されるべきである。したがって、例えば、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号2に対して少なくとも80の配列同一性CLUSTALWアライメント法に基づいてを有することができる。ただし、このポリペプチドは、配列番号2と比較されるとき、少なくとも81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100の同一性を有することがより好ましい。当業者は、1DNA分子、プラスミド等の高分子の構築、操作、および単離のための特定の条件および手順;2組換えDNA断片および組換え発現コンストラクトの生成;ならびに3クローンのスクリーニングおよび単離を記載する標準の資料教材を承知している。Maniatis、Silhavy、およびAusubelを参照されたい。一般に、コンストラクトに含む配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案された手段に依存する。典型的には、ベクターは、少なくとも1つの発現カセット、選択可能マーカー、自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切な発現カセットは、典型的には、プロモーター、選択遺伝子のコード配列、およびターミネーターを含むすなわち、キメラ遺伝子。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが好ましい。Y.リポリティカY.lipolytica由来の転写および翻訳領域が具体的には有用であるが、実際は、スクロースインベルターゼ活性があるポリペプチドをコードするORFの発現を指示することができるいずれのプロモーターすなわち、天然、合成、またはキメラも適切であろう。発現の実行は誘導様式であっても構成様式であってもよい。誘導発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能プロモーターの活性を誘導することにより達成することができ、一方構成的発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用により達成することができる。ターミネーターは、プロモーターが得られた遺伝子の3’領域に由来しても異なる遺伝子に由来してもよい。多数のターミネーターが公知であり、それらが由来した属および種が同じおよび異なるいずれの場合にも、利用に際して種々の宿主で十分に機能する。ターミネーターは、通常、何らかの特定の性質のためではなく便宜上で選択されることが多い。好ましくは、ターミネーターは酵母遺伝子由来である。当業者はターミネーターを設計および合成するために入手可能な情報を利用することができるので、ターミネーターは合成であってもよい。ターミネーターは不必要なこともあるが、高度に好ましいものである。限定を意図するものではないが、組換えY.リポリティカY.lipolyticaで使用される好ましいプロモーターおよびターミネーターは、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書、米国特許出願公開第2010-0068789-A1号明細書、米国特許出願公開第2011-0059496-A1号明細書、米国仮特許出願第61/469,933号明細書代理人整理番号AttorneyDocketNumberCL4736USPRV、2011年3月31日に出願、米国仮特許出願第61/470,539号明細書代理人整理番号CL5380USPRV、2011年4月1日に出願、米国仮特許出願第61/471,736号明細書代理人整理番号CL5381USPRV、2011年4月5日に出願、および米国仮特許出願第61/472,742号明細書代理人整理番号CL5382USPRV、2011年4月7日に出願に教示のものであり、これらそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込むものとする。より具体的には、好ましいプロモーターとして、GPD、GPDIN、GPM、GPM/FBAIN、FBA、FBAIN、FBAINm、GPAT、YAT1、EXP1、DGAT2、EL1、ALK2、およびSPS19が挙げられる。多くの特殊化した発現ベクターが高い発現率を得るために作製されている。そのようなベクターは、転写、RNA安定性、翻訳、タンパク質の安定性および局在、ならびに宿主細胞からの分泌を統制する幾つかの性質を調整することにより作製される。これらの性質には、関係する転写プロモーター配列およびターミネーター配列の性質;クローン化遺伝子のコピー数そこでは、追加のコピーは単一発現コンストラクト内にクローニングされてもよく、かつ/または追加のコピーは、プラスミドコピー数の増加によりもしくはゲノムへのクローン化遺伝子の多重組込みにより宿主細胞に導入されてもよい;遺伝子がプラスミド担持であるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるか;宿主生物におけるタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率;宿主細胞内でのクローン化遺伝子のmRNAおよびタンパク質の固有の安定性;ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近い頻度でのクローン化遺伝子内のコドン使用が含まれる。Y.リポリティカY.lipolyticaでの発現に適したDNAカセット例えば、プロモーター、スクロースインベルターゼ活性を有するポリペプチドをコードするORF、およびターミネーターを含むキメラ遺伝子を含むがいったん得られれば、宿主細胞において自律複製が可能なプラスミドベクターに配置するか、またはキメラ遺伝子を含有するDNA断片をゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、Y.リポリティカY.lipolyticaゲノム内でランダムに起こさせてもよく、または特定の遺伝子座との組換えを目的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトを使用することにより標的設定してもよい。コンストラクトの標的を内因性遺伝子座にする場合、転写および翻訳の制御領域の全部または一部を内因性遺伝子座から得ることができる。目的のキメラスクロースインベルターゼ遺伝子を含むコンストラクトを、任意の標準手法によりY.リポリティカY.lipolyticaに導入することができる。これらの手法には、形質転換例えば酢酸リチウム形質転換[MethodsinEnzymology,194:186-1871991]、遺伝子銃衝撃bolisticimpact、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法が含まれる。Y.リポリティカY.lipolyticaに適用可能なより具体的な教示として、米国特許第4,880,741号明細書および米国特許第5,071,764号明細書、ならびにChen,D.C.らAppl.Microbiol.Biotechnol.,482:232-2351997が挙げられる。好ましくは、Y.リポリティカY.lipolytica宿主細胞の形質転換では、宿主ゲノムへの線状DNA断片の組込みが推奨される。高レベルの遺伝子発現が望ましい場合には、ゲノム内の複数の位置に組み込むことが具体的には有用となりうる。好ましい遺伝子座は、米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に教示のものを含む。用語形質転換された、形質転換体、および組換えは、本明細書において互換的に使用する。形質転換された宿主は、発現コンストラクトの少なくとも1つのコピーを有し、発現カセットがゲノムに組み込まれて増幅されるか否か、または複数のコピー数を有する染色体外エレメント上に存在するか否かに応じて2つ以上を有することになる。形質転換された宿主細胞は、導入コンストラクト上に含有されるマーカーに対する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換手法が多くのDNA分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時形質転換することができる。典型的には、形質転換された宿主は、選択培地上での増殖能力に対して選択され、選択培地は、抗生物質が組み込まれていることも、または栄養素例えば、スクロースもしくは増殖因子など、形質転換されていない宿主の増殖に必要な要素が欠損していることもある。導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を付与するか、または必須増殖因子もしくは酵素をコードし、そのため形質転換された宿主で発現されたとき選択培地上での増殖を可能にする。発現されたマーカータンパク質を直接的または間接的に検出することができる場合も、形質転換された宿主の選択が可能になる。さらなる選択手法については、米国特許第7,238,482号明細書、米国特許第7,259,255号明細書、および国際公開第2006/052870号パンフレットに記載されている。Y.リポリティカY.lipolyticaにおける組込みDNA断片の安定性は、個々の形質転換体、受容株、および使用されるターゲティングプラットフォームに依存する。したがって、特定の組換え微生物宿主の複数の形質転換体を、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るためにスクリーニングすべきである。DNAブロットのサザン解析Southern,J.Mol.Biol.,98:5031975、mRNA発現のノザン解析Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,6181-2:133-1451993、タンパク質発現のウエスタン解析、表現型解析、またはGC分析が適切なスクリーニング方法である。任意のY.リポリティカY.lipolyticaを、本発明による、成熟スクロースインベルターゼをコードする適切なポリペプチド配列で形質転換して、炭素源としてスクロースを利用することができる形質転換された株を生成することができる米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollection[ATCC]を通して得ることができる、容易に入手可能なY.リポリティカY.lipolytica株の例としては、例えば、8661、8662、9773、15586、16617、16618、18942、18943、18944、18945、20114、20177、20182、20225、20226、20228、20327、20255、20287、20297、20315、20320、20324、20336、20341、20346、20348、20363、20364、20372、20373、20383、20390、20400、20460、20461、20462、20496、20510、20628、20774、20775、20776、20777、20778、20779、20780、20781、20794、20795、20875、20241、20422、20423、32338、32339、32340、32341、34342、32343、32935、34017、34018、34088、34922、38295、42281、44601、46025、46026、46027、46028、46067、46068、46069、46070、46330、46482、46483、46484、60594、62385、64042、74234、76598、76861、76862、76982、90716、90811、90812、90813、90814、90903、90904、90905、96028、201241、201242、201243、201244、201245、201246、201247、201249または201847が挙げられる。同様に、HermanJ.PhaffYeastCultureCollection,UniversityofCaliforniaDavisDavis,CAから、Y.リポリティカY.lipolyticaの以下の株を入手することができる:Y.リポリティカY.lipolytica49-14、Y.リポリティカY.lipolytica49-49、Y.リポリティカY.lipolytica50-140、Y.リポリティカY.lipolytica50-46、Y.リポリティカY.lipolytica50-47、Y.リポリティカY.lipolytica51-30、Y.リポリティカY.lipolytica60-26、Y.リポリティカY.lipolytica70-17、Y.リポリティカY.lipolytica70-18、Y.リポリティカY.lipolytica70-19、Y.リポリティカY.lipolytica70-20、Y.リポリティカY.lipolytica74-78、Y.リポリティカY.lipolytica74-87、Y.リポリティカY.lipolytica74-88、Y.リポリティカY.lipolytica74-89、Y.リポリティカY.lipolytica76-72、Y.リポリティカY.lipolytica76-93、Y.リポリティカY.lipolytica77-12T、およびY.リポリティカY.lipolytica77-17。あるいは、LaboratoiredeMicrobiologieetGenetiqueMoleculaireofDr.Jean-MarcNicaud,INRACentredeGrignon,Franceから、例えば、Y.リポリティカY.lipolyticaJMY798Mlickova,K.etal.,Appl.Environ.Microbiol.,707:3918-242004,Y.lipolyticaJMY399Barth,G.,andC.Gaillardin.In,NonconventionalYeastsInBiotechnology;Wolf,W.K.,Ed.;Springer-Verlag:Berlin,Germany,1996;pp313-388およびY.リポリティカY.lipolyticaJMY154Wang,H.J.,etal.,J.Bacteriol.,18117:5140-81999を含む株を入手することができる。Y.リポリティカY.lipolytica宿主細胞は油性、すなわち、油の合成および蓄積ができることが好ましく、そこでは、総油含有量は、乾燥細胞重量[DCW]の約25超、より好ましくはDCWの約30超、および最も好ましくはDCWの約40超含むことができる。一実施形態では、ATCC番号20362、ATCC番号8862、ATCC番号18944、ATCC番号76982、および/またはLGAMS71PapanikolaouS.,andAggelisG.,Bioresour.Technol.,821:43-92002として指定されるY.リポリティカY.lipolytica株が具体的に適している。本発明はまた、スクロースインベルターゼ活性があるポリペプチド前記ポリペプチドは、成熟スクロースインベルターゼをコードするポリペプチド配列に融合したシグナル配列を含むをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaであって、さらに、目的の少なくとも1つの非天然生成物を産生することができる形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaに関する。炭素源としてスクロースまたはその混合物を使用して、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaを増殖させる場合、目的のこの少なくとも1つの非天然生成物を産生させることが好ましい。Y.リポリティカY.lipolyticaを異種遺伝子で形質転換する順序は重要ではない。そのような形質転換はまた、同時であってもよい。目的の適切な非天然生成物の例としては、これは本明細書において限定することを意図するものではないが、例えば、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステル、キノン誘導体化合物、ならびにリスベラトロールが挙げられる。多価不飽和脂肪酸またはPUFA特にオメガ-3およびオメガ-6PUFAに関連した健康有益性は、十分実証されている。より具体的には、PUFAは、本明細書では、少なくとも18個の炭素原子および2つ以上の二重結合を有する脂肪酸を指す。用語脂肪酸は、より長い鎖長の酸およびより短い鎖長の酸の両方が知られているが、約C12~C22の種々の鎖長の長鎖脂肪酸アルカン酸を指す。主な鎖長はC16~C22の間である。脂肪酸の構造はX:Yの単純な表記法で表し、ここで、Xは、特定の脂肪酸における炭素[C]原子の総数、Yは二重結合の数である。飽和脂肪酸対不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸対多価不飽和脂肪酸[PUFA]、およびオメガ-6脂肪酸[n-6]対オメガ-3脂肪酸[n-3]の間の差異に関するさらなる詳細は、参照によって本明細書に組み込む米国特許第7,238,482号明細書に提供されている。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書表3には、オメガ-3およびオメガ-6PUFAとそれらの前駆体の化学名および一般名、ならびに一般に使用される略語について詳細にまとめられている。しかしながら、PUFA例の一部として、これらに限定されないが、リノール酸[LA、18:2ω-6]、ガンマ-リノレン酸[GLA、18:3ω-6]、エイコサジエン酸[EDA、20:2ω-6]、ジホモ-ガンマ-リノレン酸[GLA、20:3ω-6]、アラキドン酸[ARA、20:4ω-6]、ドコサテトラエン酸[DTA、22:4ω-6]、ドコサペンタエン酸[DPAn-6、22:5ω-6]、アルファ-リノレン酸[ALA、18:3ω-3]、ステアリドン酸[STA、18:4ω-3]、エイコサトリエン酸[ETA、20:3ω-3]、エイコサテトラエン酸[ETrA、20:4ω-3]、エイコサペンタエン酸[EPA、20:5ω-3]、ドコサペンタエン酸[DPAn-3、22:5ω-3]、およびドコサヘキサエン酸[DHA、22:6ω-3]が挙げられる。PUFA産生のためのY.リポリティカY.lipolytica株の操作に向けて、多大な努力が捧げられてきた。例えば、米国特許第7,238,482号明細書では、酵母におけるオメガ-6およびオメガ-3脂肪酸産生の実現可能性が実証された。米国特許第7,932,077号明細書では、総脂肪酸の28.1のEPAの組換え産生が実証された;米国特許第7,588,931号明細書では、総脂肪酸の14のARAの組換え産生が実証された;米国特許第7,550,286号明細書では、総脂肪酸の5のDHAの組換え産生が実証された;そして米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書では、EPA産生のために最適化された組換え株が記載され、総脂肪酸の最大55.6のEPAの産生が実証された。米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書では、TFAの最大50のEPAを含み、かつTFAの重量パーセントとして測定されたEPAとTFAの重量パーセントとして測定されたリノール酸との比が少なくとも3.1である微生物油を産生する、さらに最適化された組換えY.リポリティカY.lipolytica株について記載されている。形質転換体のY.リポリティカY.lipolyticaは、PUFA産生を目的とした、デサチュラーゼすなわち、デルタ-12デサチュラーゼ、デルタ-6デサチュラーゼ、デルタ-8デサチュラーゼ、デルタ-5デサチュラーゼ、デルタ-17デサチュラーゼ、デルタ-15デサチュラーゼ、デルタ-9デサチュラーゼ、デルタ-4デサチュラーゼ遺伝子とエロンゲースすなわち、C14/16エロンゲース、C16/18エロンゲース、C18/20エロンゲース、C20/22エロンゲース、およびデルタ-9エロンゲース遺伝子との種々の組合せを発現する。しかしながら、これらの方法すべてにおいて、PUFA産生は炭素源としてグルコースを使用して増殖させた油性酵母を使用して実証された。表3に、デサチュラーゼとエロンゲースの種々の組合せを有する、上記に引用の参考文献に記載された特定のY.リポリティカY.lipolytica株の一部について情報を提供する。ただし、特定の株および産生される特定のPUFAが、本明細書の発明を限定するものでは決してないことは認識されるべきである。炭素源としてスクロースを用いて増殖させる場合、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaで産生することができる目的の適切な非天然生成物としてカロテノイドも考えられる。本明細書で使用する用語カロテノイドは、イソプレンから形式的に誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスを指す。このクラスの分子は、トリテルペン[C30ジアポカルテノイドdiapocarotenoid]およびテトラテルペン[C40カロテノイド]ならびにそれらの酸化誘導体から構成され、典型的には、これらの分子は強い光吸収特性を有し、長さがC200を超えることもある。長さが、例えばC35、C50、C60、C70、およびC80である他のカロテノイド化合物が知られている。用語カロテノイドには、カロテンおよびキサントフィルの両方が含まれうる。カロテンは、炭化水素カロテノイド例えば、フィトエン、β-カロテン、およびリコペンを指す。これに対して、用語キサントフィルは、1つまたは複数の酸素原子を、ヒドロキシ-、メトキシ-、オキソ-、エポキシ-、カルボキシ-、またはアルデヒドの官能基形態で含有するC40カロテノイドを指す。キサントフィルはカロテンより極性であり、この性質により、脂肪および脂質へのそれらの溶解性が劇的に低下する。したがって、カロテノイドの適切な例として、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチンすなわち、3,3’-ジヒドロキシ-β、β-カロテン-4、4’-ジオン、カンタキサンチンすなわちβ,β-カロテン-4、4’-ジオン、カプソルブリンcapsorubrin、β-クリプトキサンチン、α-カロテン、β,ψ-カロテン、δ-カロテン、ε-カロテン、β-カロテンケト-γ-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、γ-カロテン、ψ-カロテン、ζ-カロテン、ゼアキサンチン、アドニルビン、テトラヒドロキシ-β、β’-カロテン-4、4’-ジオン、テトラヒドロキシ-β、β’-4-オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、3-ヒドロキシ-γ-カロテン、3-ヒドロキシ-4-ケト-γ-カロテン、バクテリオルビキサンチン、バクテリオルビキサンチナール、4-ケト-γ-カロテン、α-クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、7,8-ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β-イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、4-ケト-ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン-β-ジグルコシド、およびそれらの組合せが挙げられる。野生型Y.リポリティカY.lipolyticaは、通常カロテン産生性ではない。しかしながら、国際公開第2008/073367号パンフレットおよび国際公開第2009/126890号パンフレットは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼをコードするcrtB、フィトエンデサチュラーゼをコードするcrtI、リコペンシクラーゼをコードするcrtY、カロテノイドヒドロキシラーゼをコードするcrtZ、および/またはカロテノイドケトラーゼをコードするcrtWなどのカロテノイド生合成経路遺伝子の導入による、組換えY.リポリティカY.lipolyticaの一連のカロテノイド産生について記載している。炭素源としてスクロースを用いて増殖させた場合に、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaで産生されうる目的の他の非天然生成物としては、例えば、キニーネ誘導体化合物、ステロール、およびリスベラトロールが挙げられる。用語少なくとも1つのキノン誘導体化合物は、酸化還元活性のあるキノン環構造を有する化合物を指し、CoQ系列すなわち、Q6、Q7、Q8、Q9、およびQ10のキノン、ビタミンK化合物、ビタミンE化合物、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される化合物を含む。例えば、補酵素Q10[CoQ10]という用語は、ユビキノン10としても知られる2,3-ジメトキシ-ジメチル-6-デカプレニル-1,4-ベンゾキノンCAS登録番号303-98-0を指す。CoQ10のベンゾキノン部分はチロシンから合成されるが、イソプレン側鎖はメバロン酸経路を介してアセチルCoAから合成される。したがって、CoQ10などのCoQ化合物の生合成はNADPHを必要とする。ビタミンK化合物には、例えばメナキノンまたはフィロキノンが含まれるが、ビタミンE化合物には、例えばトコフェロール、トコトリエノール、またはα-トコフェロールが含まれる。用語リスベラトロールは、3’,4,5-トリヒドロキシスチルベンを指す。米国特許出願公開第2009/0142322-A1号明細書および国際公開第2007/120423号パンフレットは、補酵素Q10を産生するためのデカプレニルピロリン酸シンターゼをコードするddsA、ビタミンK化合物を産生するためのMenF、MenD、MenC、MenE、MenB、MenA、UbiE、および/またはMenGのポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにビタミンE化合物を産生するためのtyrA、pdslhppd、VTEl、HPT1VTE2、VTE3、VTE4、および/またはGGHのポリペプチドをコードする遺伝子などの異種のキノン生合成経路遺伝子の導入による、Y.リポリティカY.lipolyticaにおける種々のキノン誘導体化合物の産生について記載している。国際公開第2008/130372号パンフレットは、スクアレンシンターゼをコードするERG9/SQS1およびスクアレンエポキシダーゼをコードするERGlの導入による、Y.リポリティカY.lipolyticaのステロール産生について記載している。また、米国特許第7,772,444号明細書は、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子の導入による、Y.リポリティカY.lipolyticaのリスベラトロール産生について記載している。形質転換された宿主細胞は、キメラ遺伝子例えば、インベルターゼをコードする遺伝子、目的の非天然生成物の生合成を可能にする遺伝子等の発現を最適にする条件下で増殖させる。一般に、最適化可能な培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、pH、バイオマス生産段階の期間、油蓄積段階の期間、ならびに細胞採取の時期および方法が挙げられる。油性酵母は、複合培地例えば、酵母抽出物-ペプトン-デキストロースブロス[YPD]、または増殖に必要な成分を欠損し、それによって所望の発現カセットの選択を引き出す合成最少培地例えば、YeastNitrogenBaseDIFCOLaboratories,Detroit,MIの中で増殖させることが多い。本発明における発酵培地は発酵性の炭素源を含む。発酵性の炭素源は、例えば、スクロース、転化スクロース、グルコース、フルクトース、およびこれらの組合せとすることができる。転化スクロースは、本明細書では、スクロースの加水分解から生じるフルクトースとグルコースをほぼ等量含む混合物を指す。転化スクロースは、加水分解度にその量が依存するスクロースを含むこともあるが、25~50のグルコースと25~50のフルクトースを含む混合物とすることができる。転化スクロースは、サトウキビまたはサトウダイコンなどの種々の供給源から入手可能なスクロースの加水分解により得ることができる。当技術分野で公知のように、グルコースおよびフルクトースへのスクロースの加水分解は、酸例えば、クエン酸またはアスコルビン酸の添加により、または酵素例えば、インベルターゼまたはβ-フルクトフラノシダーゼにより触媒することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示のY.リポリティカY.lipolyticaは、他の糖の存在下混合糖、スクロース含有培地中で増殖させる。混合糖は、スクロースに加えて少なくとも1つの追加の糖を含む。Y.リポリティカY.lipolytica細胞の代謝のためにエネルギー源を提供することができる任意の糖、またはスクロースを含有する混合物中に存在する任意の糖が含まれてもよい。しかしながら、野生型Y.リポリティカY.lipolytica細胞のように、本明細書で開示された、スクロースを利用するY.リポリティカY.lipolyticaは、依然として唯一の炭素源としてグルコースを使用することができる。さらに、発酵培地は適切な窒素源を含む。窒素は、無機例えば、NH42SO4または有機例えば、尿素、グルタミン酸、または酵母抽出物の供給源から補充することができる。スクロースおよび窒素源に加えて、発酵培地はまた、微生物の増殖に適した、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミン、および他の成分を含有する。本発明における好ましい増殖培地は、YeastNitrogenBaseDIFCOLaboratories,Detroit,MIなどの一般の商業的調製培地である。他の合成defined増殖培地または合成synthetic増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知である。発酵に適したpH範囲は、典型的には、約pH4.0~pH8.0の間であり、その中では初期増殖条件の範囲としてpH5.5~pH7.5が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で行うことができ、その中では微好気条件が好ましい。典型的には、増殖と脂肪の合成/貯蔵との間で代謝状態のバランスを取らなければならないため、油性酵母細胞における高レベルのPUFAの蓄積には、二段階発酵工程が必要である。したがって、二段階発酵工程を油性酵母におけるPUFAの産生に使用することが最も好ましい。この方法は米国特許第7,238,482号明細書に種々の適切な発酵工程設計すなわち、バッチ、フェドバッチおよび連続および増殖中の検討事項として記載されている。本発明を以下の実施例の中でさらに詳細に説明する。これらの実施例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方、例示としてのみ示されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修正をなして、様々な使用および条件に本発明を適合させることができる。略語の意味は以下のとおりである:secは秒を意味し、minは分を意味し、hは時間を意味し、dは日を意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、μMはマイクロモル濃度を意味し、mMはミリモル濃度を意味し、Mはモル濃度意味し、mmolはミリモルを意味し、μmoleはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、Uは単位を意味し、bpは塩基対を意味し、kBはキロベースを意味する。発現カセットの命名法発現カセットの構造はX::Y::Zの単純な表記法により表され、ここでXはプロモーター断片を記述し、Yは遺伝子断片を記述し、Zはターミネーター断片を記述し、これらはすべて互いに作動可能に連結されている。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの形質転換および培養Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362株は米国培養細胞系統保存機関Rockville,MDから購入した。Y.リポリティカY.lipolytica株は、下記の処方に従った数種の培地中で28~30°Cにてルーチン的に増殖させた。高グルコース培地[HGM]1リットル当たり:80グルコース、2.58gのKH2PO4、および5.36gのK2HPO4、pH7.5調整不要。高スクロース培地[HSM]1リットル当たり:80スクロース、2.58gのKH2PO4、および5.36gのK2HPO4、pH7.5調整不要。合成デキストロース培地[SD]1リットル当たり:硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有の6.7gのYeastNitrogenbase;20gのグルコース。合成スクロース培地[SS]1リットル当たり:硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有の6.7gのYeastNitrogenbase;20gのスクロース。発酵培地[FM]1リットル当たり:アミノ酸非含有の6.7g/LのYNB;6g/LのKH2PO4;2g/LのK2HPO4;1.5g/LのMgSO4-ヘプタハイドレード;5g/Lの酵母抽出物;2の炭素源炭素源はグルコースまたはスクロースのいずれかである。参照によって本明細書に組み込む米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に記載のように、Y.リポリティカY.lipolyticaの形質転換を実施した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの脂肪酸分析脂肪酸[FA]分析のために、細胞を遠心分離により回収し、Bligh,E.G.およびDyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-9171959に記載のように脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル転移反応により脂肪酸メチルエステル[FAME]を調製しRoughan,G.,andNishidaI.,ArchBiochemBiophys.,2761:38-461990、次いで、30m×0.25mm内径のHP-INNOWAXHewlett-Packardカラムを装着したHewlett-Packard6890GCで分析した。オーブン温度は、3.5°C/分で170°C25分間保持から185°Cとした。直接の塩基エステル転移反応のために、ヤロウィアYarrowia細胞0.5mL培養物を回収し、蒸留水で1回洗浄し、Speed-Vacで5~10分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド1の100μlおよび既知量のC15:0トリアシルグリセロールC15:0TAG;カタログ番号T-145,Nu-CheckPrep,Elysian,MNを試料に加え、次いで試料を50°Cで30分間、攪拌揺動した。1MNaClを3滴およびヘキサンを400μl添加した後、試料を攪拌回転した。上層を取り出し、GCにより分析した。代替的に、LipidAnalysis,WilliamW.Christie,2003に記載の塩基触媒エステル転移反応法を修正して、発酵またはフラスコ試料のいずれかに由来するブロス試料のルーチン分析に使用した。具体的には、ブロス試料を室温水で迅速に解凍し、次いで0.22μmのCorning登録商標Costar登録商標Spin-X登録商標遠心管フィルターカタログ番号8161を備えた、タール被覆の2mL微量遠心チューブに秤量した0.1mg。試料75~800μlは、あらかじめ測定したDCWに応じて使用した。エッペンドルフ5430遠心分離機を使用して、試料を14,000rpmで5~7分間またはブロスを除去するのに必要な限り、遠心分離した。フィルターを取り出し、液体を排水し、試料を洗浄するために約500μlの脱イオン水をフィルターに加えた。遠心分離して水を除去した後、フィルターを再び取り出し、液体を排水し、フィルターを再挿入した。次いで、チューブを遠心分離機に再挿入し、今度は乾燥させるために約3~5分間上部を開けた状態にした。次いで、フィルターをチューブのほぼ中段で切断し、新たな2mL丸底エッペンドルフチューブカタログ番号2236335-2に挿入した。カットフィルター容器の縁に接触するのみで、試料またはフィルター材料には接触しない適切な道具を用いてチューブの底にフィルターを押しつけた。トルエン中の既知量のC15:0TAG上記を加え、新たに調製した1ナトリウムメトキシドのメタノール溶液500μlを加えた。試料ペレットを、適切な道具で強く粉砕し、チューブを閉じて、50°C加熱ブロックVWRカタログ番号12621-088中に30分間静置した。次いで、チューブを少なくとも5分間放冷した。次いで、400μlのヘキサンおよび500μlの1MNaCl水溶液を加え、チューブを2×6秒間攪拌し、1分間遠心分離した。約150μlの上部有機層を、インサートを備えたGCバイアルに入れ、GCにより分析した。GC分析により記録されたFAMEピークは、それらの保持時間を既知脂肪酸の保持時間と比較して同定し、FAMEピーク面積を既知量の内部標準C15:0TAGと比較して定量した。したがって、任意の脂肪酸FAMEの概算量μg[μgFAME]は以下の式に従って計算し:特定の脂肪酸についてのFAMEピーク面積/標準FAMEピーク面積標準C15:0TAGのμg、一方任意の脂肪酸の量μg[μgFA]は、1μgのC15:0TAGが0.9503μgの脂肪酸に等しいので、以下の式に従って計算する:特定の脂肪酸についてのFAMEピーク面積/標準FAMEピーク面積標準C15:0TAGのμg0.9503。0.9503の変換係数は、大部分の脂肪酸について決定された値0.95~0.96の範囲にあるの近似であることに留意されたい。TFAの重量としてそれぞれ個々の脂肪酸の量をまとめた脂質プロフィールは、すべてのFAMEピーク面積の合計で個々のFAMEピーク面積を除し、そして100を乗じて決定した。フラスコアッセイによる、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaにおける総脂質含量および組成の分析特定のY.リポリティカY.lipolytica株における全脂質含量及び組成を詳細に分析するために、以下のようにフラスコアッセイを実施した。具体的には、新たに画線した細胞の1つのループを3mLのFM培地に接種し、250rpm及び30°Cで一晩増殖させた。OD600nmを測定し、125mLフラスコ中の25mLのFM培地に0.3の最終OD600nmまで細胞のアリコートを加えた。250rpmで30°Cの振盪インキュベーター中で2日後、遠心分離により6mLの培養物を回収し、125mLフラスコ中の25mLのHGM中に再懸濁した。250rpmで30°Cの振盪インキュベーター中で5日後、1mLのアリコートを用いて脂肪酸分析上記を行い、10mLを乾燥させて乾燥細胞重量[DCW]を測定した。DCWを決定するために、BeckmanGS-6R遠心分離機のBeckmanGH-3.8ロータにおいて4000rpmで5分間遠心分離することにより、10mLの培養物を回収した。ペレットを25mLの水に再懸濁し、上記のとおりに再度回収した。洗浄したペレットを20mLの水に再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブン中、80°Cで一晩乾燥させた。細胞の重量を測定した。細胞の総脂質含量[TFADCW]を計算し、TFAの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度[TFA]および乾燥細胞重量のパーセントとしてのEPA含量[EPADCW]を表にしたデータと併せて検討する。実施例1ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica細胞外インベルターゼ発現プラスミドpZSUCの構築および発現本実施例は、CurrentGenetics16:253-2601989におけるNicaudらの報告と同様の方法による、XPR2プロモーターおよびシグナル配列とインベルターゼをコードするサッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeSUC2[m-ScSuc2]遺伝子の短縮変異体との融合物を含むプラスミドpZSUC配列番号22の構築について記載する。より具体的には、Nicaudらは、Y.リポリティカY.lipolyticaXPR2遺伝子のプロモーターおよびN末端アミノ酸シグナル配列の制御下でS.セルビシアS.cerevisiaeSUC2遺伝子を発現する場合における、Y.リポリティカY.lipolyticaの周辺質へのインベルターゼの分泌を報告した。その中257頁には、融合物では、アミノ酸11から開始するインベルターゼの前に、XPR2遺伝子由来の23個のN末端アミノ酸を配置することが記載されているすなわち、このようにして、完全長インベルターゼの最初の10個のアミノ酸が短縮される一方、シグナル配列のアミノ酸11~19が、発現される成熟タンパク質と共に含まれた。しかしながら、Nicaudらの図1B255頁によると、そうではなくて、融合コンストラクトは、アミノ酸5から開始するインベルターゼに融合した、シグナル配列としてのXPR2遺伝子由来の23個のN末端アミノ酸を含んでいたように見えるすなわち、このようにして、完全長インベルターゼの最初の4個のアミノ酸が短縮される一方、シグナル配列のアミノ酸5~19が、発現される成熟タンパク質と共に含まれた。融合物に関して明瞭さが欠けてはいるものの、Nicaudらは、インベルターゼの発現が、形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaにスクロース利用Suc表現型を付与すると報告した。上記のNicaudらと同様の方法で、XPR2::SUC2融合コンストラクトを作製したpZSUC;図2。最初に、369bpのXPRプロモーター-369~-1および63bpのコード領域1~63を含有する432bpのDNA断片を、鋳型としてヤロウィアYarrowiaゲノムDNAを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチドYL427およびYL428配列番号:36および37を使用して、PCRにより増幅した。設計したPCR断片配列番号38の5’末端にClaI部位を加え、3’末端にHindIII部位を加えた。PCR増幅は、以下のものを含む全容積50μlで実施した;PCR緩衝液10mMKCl、10mMNH42SO4、20mMTris-HClpH8.75、2mMMgSO4、0.1TritonX-100を含有する、100μg/mLのBSA最終濃度、200μMの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、10pmoleの各プライマー、50ngのY.リポリティカY.lipolyticaATCC番号76982ゲノムDNA、および1μlのTaqDNAポリメラーゼEpicentreTechnologies。サーモサイクラー条件は、95°Cで1分間を35サイクル、56°Cで30秒間、および72°Cで1分間の後、最終伸長を72°Cで10分間に設定した。PCR生成物は、QiagenPCR精製キットValencia,CAを使用して精製し、次いでClaI/HindIIIで消化した;消化生成物は、1w/vアガロース中でゲル電気泳動法により分離し、ClaI/HindIII断片をpZSUC下記の構築に使用した。最初の10個のアミノ酸以外のS.セルビシアS.cerevisiaeSUC2コード領域を含有する1569bpのDNA断片を、鋳型としてS.セルビシアS.cerevisiaeゲノムDNAを、またプライマーとしてオリゴヌクレオチドYL429およびYL430配列番号:39および40を使用して、PCRにより増幅した。SUC2コード領域と同じ読み枠で5’末端にHindIII部位を加え、SUC2コード領域配列番号41の停止コドンの後にBsiWI部位を加えた。PCR増幅は、50ngのY.リポリティカY.lipolyticaゲノムDNAATCC番号76982の代わりに、50ngのS.セルビシアS.cerevisiaeゲノムDNAを使用したことを除いて、上記に示す成分を含む全容積50μlで実施した。サーモサイクラー条件は、95°Cで1分間を35サイクル、56°Cで30秒間、および72°Cで2分間の後、最終伸長を72°Cで10分間に設定した。PCR生成物は、QiagenPCR精製キットValencia,CAを使用して精製し、次いでHindIII/BsiWIで消化した;消化生成物は、1w/vアガロース中でゲル電気泳動法により分離し、HindIII/BsiWI断片をpZSUC下記の構築に使用した。したがって、プラスミドpZSUC2は下記の構成要素を含有する。次いで、発現プラスミドpZSUC配列番号22をY.リポリティカY.lipolyticaATCC番号76982に形質転換して、インベルターゼ発現について試験した。形質転換体を合成スクロース培地[SS]上で増殖させた。しかしながら、形質転換されたY.リポリティカY.lipolytica株は、スクロース培地上で増殖することができなかった。pZSUC内のXPR2::SUC2融合コンストラクトでは、XPR2コード配列の最初の63bpすなわち、プレ/プロ領域は、シグナル配列として使用され、SUC2遺伝子には最初の30個のヌクレオチドがなかったすなわち、SUC2シグナル配列の最初の10個のアミノ酸が除去されている。Nicaudらによる記載を注意深く調査したところ、操作された株の増殖を試験するために、高圧蒸気滅菌されたスクロース培地が使用されたことが判明した。高圧蒸気滅菌工程により、Y.リポリティカY.lipolyticaが炭素源として使用することができるフルクトースおよびグルコースに、スクロースの一部が加水分解される可能性があるデータを示さず。本実施例において示されたデータにより、Nicaudらが記載のような、ScSuc2の短縮変異体と融合したY.リポリティカY.lipolyticaXPR2のN末端21個のアミノ酸の融合物を発現する形質転換されたY.リポリティカY.lipolyticaは、炭素源としてスクロースを使用することができないことが実証された。Suc2シグナル配列の疎水性コアは、適切な分泌過程と関連しており、その破壊はインベルターゼの細胞内蓄積をもたらすことが報告されたKaiserandBotstein,Mol.CellBiol.,6;2382-23911986;Perlman,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:5033-50371986。実施例2ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica細胞外インベルターゼ発現プラスミド:pYRH68、pYRH69、pYRH70、pYRH73、およびpYRH74の構築本実施例は、インベルターゼをコードする成熟サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeSUC2[m-ScSuc2]遺伝子に融合した、XPR2プレプロ領域[XPR2PP13]および/またはSUC2シグナル配列[Suc2SS]の種々異なる組合せを含む一連のプラスミドの構築について記載する。各コンストラクト中の異種遺伝子は、強力なY.リポリティカY.lipolyticaプロモーターFBAINm;米国特許第7,202,356号明細書を参照のことおよびY.リポリティカY.lipolyticaPex20ターミネーター配列により挟まれた。SucSS/m-ScSUC2を含むpYRH68の構築プラスミドpYRH68は、インベルターゼをコードする成熟ScSUC2遺伝子m-ScSUC2;配列番号4に融合したSuc2シグナル配列SucSS;配列番号8を高発現させるために構築した。しかしながら、SucSS/m-ScSUC2として本明細書に記載のこの人為的な融合物は、5’-シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ScSUC2遺伝子に事実上相当する。ScSUC2ORFをコードする1.6kB断片を、プライマーSc.SUC2-5’配列番号23およびSc.SUC2-3’配列番号24を使用して、S.セルビシアS.cerevisiaeBY4743OpenBiosystems,Huntsville,ALのゲノムDNAから増幅した。これらのプライマーは、アミノ酸位置2でPciI制限酵素部位を導入するように設計したそれによって、野生型Leu2残基がPhe2に変更されるが、Suc2の分泌過程に影響を及ぼさずにシグナル配列の疎水性が維持される[Kaiser,etal.,Science,235:312-3171987]。反応混合物には、1μlのゲノムDNA、1μlの各プライマー、2μlの水、および45μlのAccuPrime商標PfxSuperMixInvitrogen;Carlsbad,CAが含まれた。増幅は以下のように実施した:94°Cで5分間の初期変性、続いて94°Cで15秒間の変性を35サイクル、55°Cで30秒間のアニーリング、および68°Cで2分間の伸長。68°Cで7分間の最終伸長サイクルを実施した後、4°Cで反応を終了させた。次いで、ScSUC2ORFをPciII/NotI制限酵素で消化し、下記の構成要素NcoIおよびPciIはイソ制限酵素であるを含有するプラスミドpYRH68図3A;配列番号13を作製するために利用した:2コピーのSucSS/m-ScSUC2を含むpYRH70の構築プラスミドpYRH70は、5’-シグナル配列を天然に含有する、2コピーの野生型完全長ScSUC2遺伝子に相当する、2コピーのSucSS/m-ScSUC2配列番号12を高発現させるために構築した。プラスミドpYRH68配列番号13をSalI/SwaIで切断して、第2のコピーとなる1.6kBのPciII/NotIScSUC2断片を挿入した。具体的には、以下のものを含む4方向連結反応を準備した:1pYRH68ベクター骨格;2PciII/NotI消化ScSUC2断片;3プラスミドpZKLY-PP2配列番号25;米国特許出願公開第2011-0244512-A1号明細書に記載から切り取られたY.リポリティカY.lipolyticaFBAプロモーター米国特許第7,202,356号明細書を含む533bpのSalI/NcoI断片;および4さらにpZKLY-PP2配列番号25から切り取られた、ヤロウィアYarrowiaLip1遺伝子GenBank受託番号Z50020由来のLip1ターミネーター配列を含む322bpのNotI/SwaI断片。これにより、pYRH70図3B;配列番号14の合成物が得られた。XPR2PP13もSUC2SSも含有しないm-ScSUC2を含むpYRH73の構築プラスミドpYRH73は、Suc2シグナル配列SucSS;配列番号8を欠損する、インベルターゼをコードする成熟ScSUC2遺伝子m-ScSUC2;配列番号4を高発現させるために構築した。したがって、5’-シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ScSUC2遺伝子からSucSSの5’-シグナル配列配列番号2のヌクレオチド1~57に相当するを切断した。成熟ScSUC2遺伝子にまたがる1.55kB断片を、プライマーSc.SUC2-5’配列番号23およびnSc.SUC2-3’配列番号26を使用して、S.セルビシアS.cerevisiaeBY4743のゲノムDNAから増幅した。次いで、この断片をPciII/NotIで切断し、上記と同じ方法でY.リポリティカY.lipolyticaベクターにクローニングしてプラスミドpYRH73図4A;配列番号15を作製した。XPR2PP13/SucSS/m-ScSUC2を含むpYRH69の構築プラスミドpYRH69は、インベルターゼをコードする成熟ScSUC2遺伝子m-ScSUC2配列番号4に融合したSUC2シグナル配列[Suc2SS;配列番号8]に融合したXPR2プレプロ領域[XPR2PP13;配列番号10]を高発現させるために構築した。しかしながら、pYRH68に関し上記したように、SucSS/m-ScSUC2として本明細書に記載の人為的な融合物は、5’-シグナル配列を天然に含有する野生型完全長ScSUC2遺伝子に相当する。したがって、XPR2PP13/SucSS/m-ScSUC2として本明細書に記載し、また配列番号16および17として示した、この特定のコンストラクトは、事実上、完全長ScSUC2遺伝子にXPR2PP13を融合したものである。上記に論述したように、配列番号10のXPR2PP13領域は、配列番号6のアミノ酸1~170をコードするように設計されており、そのためLys156-Arg157切断部位にXpr6エンドペプチダーゼが確実に到達するように、プレプロ領域の後にXpr2の追加の13個のアミノ酸をコードしている。最初に、完全長ScSUC2ORFをコードする1.6kB断片を増幅し、上記のプラスミドpYRH68構築中に利用した同一の方法でPciI/NotIを用いて切断した。次いで、Y.リポリティカY.lipolyticaXPR2遺伝子のN末端170個のアミノ酸すなわち、157個のアミノ酸のプレプロ領域および成熟AEPタンパク質のN末端13個のアミノ酸を含むすなわち、配列番号9およびNcoIおよびPciI制限酵素に対応するフランキング配列をコードする断片を、プライマーYl.XPR2-5’配列番号27およびYl.XPR2-3’配列番号28を使用してY.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362のゲノムDNAから増幅した。消化に続いて、PciI/NcoI消化による513bpのXPR2PP13断片が生成した。PciIおよびNcoI消化末端が適合するので、PciI/NcoI消化による513bpのXPR2PP13断片およびPciI/NotI消化による1.6kBのScSUC2断片を、PciI/NotI消化によるpYRH68骨格に挿入して、pYRH69図4B;配列番号18を作製した。PciI/NcoI消化による513bpのXPR2PP13断片の配向を確認した。プライマーYl.XPR2-5’配列番号27およびYl.XPR2-3’配列番号28によるpYRH69の配列決定により、Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362の配列番号9で示されるXPR2PP13配列が公表されたXPR2配列Matoba,S.etal.,Mol.CellBiol.,8:4904-49161988に100同一であることが確認された。XPR2PP13/m-ScSUC2を含むpYRH74の構築プラスミドpYRH74は、インベルターゼをコードする成熟ScSUC2遺伝子m-ScSUC2;配列番号4に融合したXPR2プレプロ領域[XPR2PP13;配列番号10]を高発現させるために構築した。成熟ScSUC2遺伝子にまたがる1.55kB断片を、プライマーSc.SUC2-5’配列番号23およびnSc.SUC2-3’配列番号24を使用して、S.セルビシアS.cerevisiaeBY4743のゲノムDNAから増幅した。具体的には、成熟ScSUC2遺伝子を含む1.55kBのPciI/NotI断片および513bpのPciI/NcoIXPR2PP13断片を、それぞれプラスミドpYRH73およびプラスミドpYRH69のために上記のように調製した。これらの断片をpYRH68骨格と連結して、プラスミドpYRH74図5;配列番号21を作製した。実施例3唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを用いて増殖させたヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaにおける、プラスミドpYRH68、pYRH69、pYRH70、pYRH73、およびpYRH74の形質転換および発現プラスミドpYRH68、pYRH69、pYRH70、pYRH73、およびpYRH74を、Y.リポリティカY.lipolyticaY4184U株実施例5およびY.リポリティカY.lipolyticaZ1978U株実施例6両方とも大量のEPATFAを産生させるために遺伝子操作された株に形質転換するためにAscI/SphIで別々に消化した。形質転換体は、唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを含む種々の培地上で増殖させた。具体的には、形質転換体を、ウラシルを欠損するSD培地プレート上で最初に選択した全般的方法。下記の表6に記載のように、種々のY4184UおよびZ1978Uの形質転換体株が生成した。Y4184USuc2SS/m-ScSUC2株およびY4184株対照の増殖を、SDすなわち、グルコースおよびSSすなわち、スクロース培地で比較した。スクロースの加水分解を回避するために、培地は高圧蒸気滅菌の代わりに濾過により滅菌した。具体的には、細胞を0.03のOD600で接種し、30°Cで増殖させた。図6に示すように、Y4184USuc2SS/m-ScSUC2株はスクロースで極めて良好に増殖したが、対照Y4184株は唯一の炭素源としてのスクロース上で増殖しなかった。唯一の炭素源としてグルコースが供給された場合には、両株とも同様に増殖した。Y4184UXPR2PP13/Suc2SS/m-ScSUC2株もスクロースで増殖しなかったデータを示さず;2つの異なるシグナル配列が互いに干渉し、分泌過程を妨害しうることが仮定される。次に、Z1978USuc2SS/m-ScSUC2株、Z1978U2_Suc2SS/m-ScSUC2株、Z1978Um-ScSUC2株、Z1978UXPR2PP13/Suc2SS/m-ScSUC2株、Z1978XPR2PP13/m-ScSUC2株、およびZ1978株対照の増殖を、唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかを含むFMで比較した。スクロースの加水分解を回避するために、培地は高圧蒸気滅菌の代わりに濾過により滅菌した。細胞を0.03のOD600で接種し、30°Cで増殖させた。すべての株が、唯一の炭素源としてグルコースを含有するFMでは同等に増殖した図7A。唯一の炭素源としてスクロースを含有するFMでは図7B、Z1978USuc2SS/m-ScSUC2株、Z1978U2_Suc2SS/m-ScSUC2株、およびZ1978XPR2PP13/m-ScSUC2株は極めて良好に増殖したが、Z1978Um-ScSUC2株、Z1978UXPR2PP13/Suc2SS/m-ScSUC2株、およびZ1978株対照はほとんど増殖しなかった;実際、残存する増殖は炭素源として酵母抽出物を使用する細胞の能力による可能性がある。したがって、Suc2SS/m-ScSUC2配列番号12およびXPR2PP13/m-ScSUC2配列番号20の両方の高発現は、唯一の炭素源としてスクロースを含有する培地で増殖することができる、形質転換されたY.リポリティカY.lipolytica株をもたらした。実施例4唯一の炭素源としてスクロースまたはグルコースのいずれかで増殖させた形質転換体ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaにおける脂質含量および組成本実施例は、唯一の炭素源としてスクロースを含有する培地で増殖させる場合における、S.セルビシアS.cerevisiae細胞外インベルターゼを高発現するZ1978株すなわち、Z1978USuc2SS/m-ScSUC2株、Z1978U2_Suc2SS/m-ScSUC2株、およびZ1978XPR2PP13/m-ScSUC2株の脂質含量および組成について検討する。これらの株で蓄積された脂質のレベルおよび組成は、グルコースを唯一の炭素源として増殖させた対照株と同等であった。Z1978USuc2SS/m-ScSUC2株における総脂質含量および脂肪組成に対するスクロース利用の影響を評価するために、全般的方法に記載のように、株の重複培養物を、HSM唯一の炭素源としてスクロース中の同等油性条件下で増殖させた。したがって、HGM唯一の炭素源としてグルコース中の同等油性条件下で増殖させて、Z1978USuc2SS/m-ScSUC2の2つの培養物それぞれ培養物RHY243およびRHY244と命名を対照Z1978株の二つ組試料と比較した。より具体的には、最初に25mLのSDまたはSS培地中にて30°Cで48時間、好気的に培養物を増殖させることにより油性条件を達成し、次いで遠心分離により回収した。次いで、ペレットを25mLのHGMまたはHSMのいずれかに再懸濁し、これらの培養物を振盪インキュベーターにおいて250rpmおよび30°Cで5日間さらにインキュベートした。これらの株についての乾燥細胞重量[DCW]、細胞の総脂質含量[TFADCW]、TFAの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度[TFA]、およびEPA生産性すなわち、乾燥細胞重量のパーセントとしてのEPA含量[EPADCW]を下記の表7に示す。ここでは、平均を灰色で強調し、平均として示す。脂肪酸の略語は以下のとおりである:オレイン酸18:1、リノール酸18:2、およびエイコサペンタエン酸EPA、20:5。表7の結果より、スクロース上で増殖させたZ1978USuc2SS/m-ScSUC2株におけるTFADCWがグルコース上で増殖させたZ1978株と同様であることが示された。しかしながら、スクロースを唯一の炭素源とした場合、平均のEPADCWが約10減少することが観察された。Z1978USuc2SS/m-ScSUC2株における株性能に何らかの変化があるか否かを判定するために、グルコースまたはスクロースのいずれかを唯一の炭素源として、RHY243表7を二つ組で増殖させた。表8に、表7で使用したのと同様のフォーマットで、DCW、TFADCW、TFAとしての各脂肪酸の濃度、およびEPADCWを要約する。表8の結果より、スクロース上で増殖させたZ1978USuc2SS/m-ScSUC2株のTFADCWが、グルコース上で増殖させた場合の同株の脂質含量と同様であることが示された。しかしながら、スクロースを唯一の炭素源とした場合、平均のEPADCWが約10減少することが観察された。さらに、全般的方法に記載のように、HSM唯一の炭素源としてスクロース中の同等油性条件下で増殖させたときの、Z1978USuc2SS/m-ScSUC2の2つの培養物すなわち、RHY243およびRHY244、Z1978U2_Suc2SS/m-ScSUC2の3つの培養物RHY248、RHY249、およびRHY250と命名、およびZ1978XPR2PP13/m-ScSUC2の3つの培養物RHY257、RHY258、およびRHY259と命名の総脂質含量および脂肪酸組成を比較した。これらの株を、HGM唯一の炭素源としてグルコース中の同等油性条件下で増殖させた対照Z1978株の二つ組試料と比較した。表9に、表7で使用したのと同様のフォーマットで、DCW、TFADCW、TFAとしての各脂肪酸の濃度、およびEPADCWを要約する。上記の結果より、スクロースを唯一の炭素源として増殖させたZ1978USuc2SS/m-ScSUC2株、Z1978U2_Suc2SS/m-ScSUC2株、およびZ1978XPR2PP13/m-ScSUC2株のTFADCWおよびEPADCWは、グルコースで増殖させた対照株Z1978のTFADCWおよびEPADCWとの差が10未満であることが示された。3つのSUC2操作株のうち、Z1978XPR2PP13/m-ScSUC2株がEPADCWについて最良の性能を示した。3つのSUC2発現株はすべて、対照Z1978株よりも、最大14高い最終DCWg/Lを一貫して示した。したがって、EPAの容積生産性は、対照Z1978株と操作されたスクロース利用株との間で同様である。実施例5高EPA生産性のためのヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4184株およびY4184U株の生成Y.リポリティカY.lipolyticaY4184U株は、上記の実施例3で宿主として使用した。Y4184U株は、Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に由来し、デルタ-9エロンゲース/デルタ-8デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対してEPAを高く産生することができる。この株はUra-表現型を示し、その構築は、参照により本明細書に組み込むPCT国際公開第2008/073367号パンフレットの実施例7に記載されている。Y4184U株の開発は、Y2224株、Y4001株、Y4001U株、Y4036株、Y4036U株、Y4069株、Y4084株、Y4084U1株、Y4127株2007年11月29日に受託番号ATCCPTA-8802で米国培養細胞系統保存機関に寄託された、Y4127U2株、Y4158株、Y4158U1株、およびY4184株の構築を必要とした。野生型Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に対するY4184株総脂質の30.7のEPAを産生するの最終的な遺伝子型は、未知1-、未知2-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex202コピー、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip12コピー、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、GPD::YlCPT1::Acoであった。上記略語は以下のとおりである:ME3Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpina[米国特許第7,470,532号明細書]に由来するコドン最適化C16/18エロンゲース遺伝子であり;EgD9eは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisデルタ-9エロンゲース遺伝子[米国特許第7,645,604号明細書]であり;EgD9eSは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilis[米国特許第7,645,604号明細書]に由来する、コドン最適化デルタ-9エロンゲース遺伝子であり;EgD8Mは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilis[米国特許第7,256,033号明細書]に由来する合成変異体デルタ-8デサチュラーゼ[米国特許第7,709,239号明細書]であり;FmD12は、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliformeデルタ-12デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,504,259号明細書]であり;FmD12Sは、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliforme[米国特許第7,504,259号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-12デサチュラーゼ遺伝子であり;EgD5は、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisデルタ-5デサチュラーゼ[米国特許第7,678,560号明細書]であり;EgD5Sは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilis[米国特許第7,678,560号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-5デサチュラーゼ遺伝子であり;RD5Sは、ペリディニウムPeridinium種CCMP626[米国特許第6,255,497号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-5デサチュラーゼであり;PaD17は、ピチウムアファニデルマツムPythiumaphanidermatumデルタ-17デサチュラーゼ[米国特許第7,556,949号明細書]であり;PaD17Sは、ピチウムアファニデルマツムPythiumaphanidermatum[米国特許第7,556,949号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-17デサチュラーゼであり;YlCPT1は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaジアシルグリセロールコリンホスホトランスフラーゼ遺伝子[米国特許第7,932,077号明細書]である。最終的に、Y4184株におけるUra3遺伝子を破壊するために、コンストラクトpZKUE3SPCT国際公開第2008/073367号パンフレットおよびその中の配列番号78を使用して、EXP1::ME3S::Pex20キメラ遺伝子をY4184株のUra3遺伝子に組み込み、Y4184U1株総脂質の11.2のEPA、Y4184U2株総脂質の10.6のEPA、およびY4184U4株総脂質の15.5のEPAまとめてY4184Uをそれぞれ得た。国際公開第2008/073367号パンフレットが、異なる増殖条件による、Y418430.7対Y4184U平均12.4における、定量化されたEPATFAの差異について記載していることに留意されたい。実施例6高EPA生産性のためのヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ1978株およびZ1978U株の生成Y.リポリティカY.lipolyticaZ1978U株は、上記の実施例3で宿主として使用した。Z1978U株は、Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に由来し、デルタ-9エロンゲース/デルタ-8デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対してEPAを高く産生することができる。この株はUra-表現型を示し、その構築は、参照により本明細書に組み込む米国特許出願第13/218,708号明細書2011年8月26日に出願されたE.I.duPontdeNemoursCo.,Inc.,代理人整理番号CL5411USNAの実施例2に記載されている。Z1978U株の開発は、Y2224株、Y4001株、Y4001U株、Y4036株、Y4036U株、L135株、L135U9株、Y8002株、Y8006株、Y8006U株、Y8069株、Y8069U株、Y8154株、Y8154U株、Y8269株、Y8269U株、Y8412株2009年5月14日に受託番号ATCCPTA-10026で米国培養細胞系統保存機関に寄託された、Y8412U株、Y8647株、Y8467U株、Y9028株、Y9028U株、Y9502株、Y9502U株、およびZ1978株の構築を必要とした。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY9502株の遺伝子型Y9502株の生成は、米国特許出願公開第2010-0317072-A1号明細書に記載されている。Y9502株は、Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に由来し、デルタ-9エロンゲース/デルタ-8デサチュラーゼ経路の発現により、総脂質に対して約57.0のEPAを産生することができた。野生型Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に対するY9502株の最終的な遺伝子型は、Ura、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex162コピー、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16であった。上記で使用され、実施例5で記載されなかった略語は以下のとおりである:EaD8Sは、ユーグレナアナベーナEuglenaanabaena[米国特許第7,790,156号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-8デサチュラーゼ遺伝子であり;E389D9eS/EgD8Mは、ユートレプチエラEutreptiella種CCMP389米国特許第7,645,604号明細書に由来するコドン最適化デルタ-9エロンゲース遺伝子E389D9eSを、デルタ-8デサチュラーゼEgD8M上記[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]に連結することにより作製されたDGLAシンターゼであり;EgD9eS/EgD8Mは、デルタ-9エロンゲースEgD9eS上記を、デルタ-8デサチュラーゼEgD8M上記[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]に連結することにより作製されたDGLAシンターゼであり;EaD9eS/EgD8Mは、E.アナベーナE.anabaena[米国特許第7,794,701号明細書]に由来するコドン最適化デルタ-9エロンゲース遺伝子EaD9eSを、デルタ-8デサチュラーゼEgD8M上記[米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書]に連結することにより作製されたDGLAシンターゼであり;EgD5MおよびEgD5SMは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilis[米国特許第7,678,560号明細書]に由来する、変異HPGモチーフ[米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書]を含む合成変異体デルタ-5デサチュラーゼ遺伝子であり;EaD5SMは、E.アナベーナE.anabaena[米国特許第7,943,365号明細書]に由来する、変異HaGGモチーフ[米国特許出願公開第2010-0075386-A1号明細書]を含む合成変異体デルタ-5デサチュラーゼ遺伝子であり;MCSは、リゾビウムレグミノサルムビーブイビシアエRhizobiumleguminosarumbv.viciae3841[米国特許出願公開第2010-0159558-A1号明細書]に由来する、コドン最適化マロニルCoA合成酵素遺伝子であり、MaLPAAT1Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpina[米国特許第7,879,591号明細書]に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である。Y9502株における総脂質含量および組成の詳細な分析のために、細胞を合計7日間、2段階で増殖させるフラスコアッセイを実施した。分析に基づくと、Y9502株は、3.8g/LのDCW、37.1のTFADCW、21.3のEPADCWを産生し、脂質プロフィールは以下のとおりであった各脂肪酸の濃度はTFAの重量パーセント[TFA]として示す:16:0パルミチン酸-2.5、16:1パルミトレイン酸――0.5、18:0ステアリン酸――2.9、18:1オレイン酸――5.0、18:2LA-12.7、ALA-0.9、EDA-3.5、DGLA-3.3、ARA--0.8、ETrA--0.7、ETA-2.4、EPA-57.0、その他-7.5。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaZ1978株の生成Y9502株からのZ1978株の開発は、参照により本明細書で組み込む米国仮特許出願第61/377248号明細書米国特許出願第13/218,591号明細書に対応するおよび米国仮特許出願第61/428,277号明細書米国特許出願第13/218,673号明細書に対応するに最初に記載された。具体的には、Y9502株におけるUra3遺伝子を破壊するために、全般的方法に従って、SalI/PacI消化コンストラクトpZKUM米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書、その中の表15、配列番号133、および図8Aを参照のことを使用して、Ura3変異遺伝子をY9502株のUra3遺伝子に組み込んだ。合計27の形質転換体8つの形質転換体を含む第1群、8つの形質転換体を含む第2群、および11の形質転換体を含む第3群から選択されたを、最少培地5-フルオロオロチン酸[MM5-FOA]選択プレート上で増殖させ、30°Cで2~5日間維持した。MM5-FOAは以下のものを含む1リットル当たり:20gのグルコース、6.7gの酵母窒素基礎培地、75mgのウラシル、75mgのウリジン、および100mg/L~1000mg/Lの濃度範囲に対するFOA活性試験に基づいた供給業者から入手した各バッチ内で変動があるので適正量のFOAZymoResearchCorp.,Orange,CA。さらなる実験により、第3群の形質転換体のみが実際のUra-表現型を示すことが決定された。全般的方法に従って、Ura-細胞をMM5-FOAプレートから掻き取り、脂肪酸分析に付した。このようにして、GC分析より、MM5-FOAプレート上で増殖させた第3群のpZKUM-形質転換体1、3、6、7、8、10、および11において、それぞれTFAの28.5、28.5、27.4、28.6、29.2、30.3、および29.6のEPAが存在することが示された。これら7株はそれぞれ、Y9502U12株、Y9502U14株、Y9502U17株、Y9502U18株、Y9502U19株、Y9502U21株、およびY9502U22株まとめてY9502Uと命名した。次いで、コンストラクトpZKL3-9DP9N図9;配列番号29を生成して、1つのデルタ-9デサチュラーゼ遺伝子、1つのコリンリン酸シチジルトランスフェラーゼ遺伝子、および1つのデルタ-9エロンゲース変異遺伝子を、Y9502U株のヤロウィアYarrowiaYALI0F32131p遺伝子座GenBank受託番号XM_506121に組み込んだ。したがって、pZKL3-9DP9Nプラスミドは下記の構成要素を含有した:pZKL3-9DP9NプラスミドをAscI/SphIで消化し、次いでY9502U17株の形質転換に使用した。形質転換細胞を最少培地[MM]プレート上に播種し、30°Cで3~4日間維持した。MMプレートは以下のものを含んだ1リットル当たり:20gのグルコース、1.7gのアミノ酸非含有yeastnitrogenbase、1.0gのプロリン、およびpH6.1調整不要。単一コロニーをMMプレート上に再画線し、次いで30°Cで液体MMに接種して250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心分離により回収してHGMに再懸濁し、次いで250rpm/分で5日間振盪した。細胞を上記の脂肪酸分析に付した。GC分析により、pZKL3-9DP9Nを含有するY9502U17から選択された96株の大部分がTFAの50~56のEPAを産生することが示された。TFAの約59.0、56.6、58.9、56.5、および57.6のEPAを産生する5株すなわち、31、32、35、70、および80を、それぞれZ1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株と命名した。野生型Y.リポリティカY.lipolyticaATCC番号20362に対して、これらのpZKL3-9DP9N形質転換株の最終的な遺伝子型は、Ura、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、未知11-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex162コピー、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPDIN::YlD9::Lip1、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16、EXP1::YlPCT::Pex16であった。Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株におけるYALI0F32131p遺伝子座GenBank受託番号XM_50612のノックアウトは、pZKL3-9DP9Nによる形質転換により生成した、これらのEPA株のいずれにも確認されなかった。Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株、およびZ1981株のYPDプレートからの細胞を増殖させて、総脂質含量および組成について分析した。具体的には、全般的方法に記載のように、フラスコアッセイを実施した。下記の表11に、これらの株のそれぞれにおける総脂質含量および組成を要約するすなわち、総DCW、TFADCW、TFA[TFA]の重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度、およびEPADCW。脂肪酸は、16:0パルミチン酸、16:1パルミトレイン酸、18:0ステアリン酸、18:1オレイン酸、18:2リノール酸、ALAアルファ-リノレン酸、EDAエイコサジエン酸、DGLAジホモ-ガンマ-リノレン酸、ARAアラキドン酸、ETrAエイコサトリエン酸、ETAエイコサテトラエン酸、EPAエイコサペンタエン酸、およびその他である。Z1978株は、続いて部分的なゲノム配列決定に付された。この研究により、米国特許出願第13/218,673号明細書に記載のように、ヤロウィアYarrowiaゲノムに組み込まれた6つのデルタ-5デサチュラーゼ遺伝子すなわち、キメラ遺伝子EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Octの代わりに、実際には4つのデルタ-5デサチュラーゼ遺伝子すなわち、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、EXP1::EgD5SM::Lip1、およびYAT1::EaD5SM::Octのみを操作された株が含有していることが判明した。Z1978株におけるUra3遺伝子を破壊するために、コンストラクトpZKUM米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書、その中の表15、配列番号133、および図8Aを参照のことを使用して、Y9502株のpZKUM形質転換についての記載上記と同様の方法で、Ura3変異遺伝子をZ1978株のUra3遺伝子に組み込んだ。合計16の形質転換体8つの形質転換体を含む第1のB群および8つの形質転換体を含む第2のC群から選択されたを増殖させ、Ura-表現型を有することを確認した。GC分析により、MM5-FOAプレート上で増殖させたB群pZKUM-形質転換体株1、2、3、および4に、それぞれTFAの30.8、31、30.9、および31.3のEPAが存在することが示された。これらの4株を、それぞれZ1978BU1株、Z1978BU2株、Z1978BU3株、およびZ1978BU4株と命名した。GC分析により、MM5-FOAプレート上で増殖させたC群pZKUM-形質転換体株1、2、5、および6に、それぞれTFAの34.4、31.9、31.2、および31のEPAが存在することが示された。これらの4株を、それぞれZ1978CU1株、Z1978CU2株、Z1978CU3株、およびZ1978CU4株と命名した。Z1978BU1株、Z1978BU2株、Z1978BU3株、Z1978BU4株、Z1978CU1株、Z1978CU2株、Z1978CU3株、およびZ1978CU4株を、まとめてZ1978U株と命名した。実施例7ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica形質転換体における分泌されたインベルターゼの局在プラスミドpYRH68配列番号13、Suc2SS/m-ScSUC2融合物を含む、pYRH73配列番号15、m-ScSUC2のみを含む、pYRH69配列番号18、XPR2PP13/Suc2SS/m-ScSUC2融合物を含む、および/またはpYRH74配列番号21、XPR2PP13/m-ScSUC2融合物を含むを、Y.リポリティカY.lipolyticaY2224U株野生型ヤロウィアYarrowiaATCC番号20362株のUra3遺伝子の自律変異からの5-フルオロオロチン酸[FOA]抵抗性変異体またはY.リポリティカY.lipolyticaZ1978U株実施例6のいずれかへの形質転換のために、BsiWI/PacIで別々に消化した。インベルターゼ活性は、形質転換体全細胞およびその培地で測定した。インベルターゼ活性のアッセイインビボでのインベルターゼ活性を、SilveiraらAnal.Biochem.,238:26-281996の記載を若干修正して、全細胞を使用して測定した。手短に言えば、SDまたはSS培地中で指数関数的に増殖している細胞1.4~1.8のOD60040mg乾燥細胞重量を4°Cで遠心分離して回収し、冷酢酸ナトリウム緩衝液50mM、pH5.0で3回洗浄した。細胞を30°Cで15分間、100mMNaF8mL中で撹拌しながらインキュベートした。50mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0中の300mMスクロース溶液を4mL添加した後、10分までの種々の時間間隔でインベルターゼ活性を、NanosepMF0.2μPallLifeSciences;PortWashington,NYを使用して濾過した後にグルコースアナライザーYSILifeSciencesで測定した。酵素活性の1単位Uを1分当たりに生成されるグルコースのμmolと定義し、生成量を計算してDCW1グラム当たりのインベルターゼ活性単位を得た。培地からのインベルターゼ活性は、濾過した培地1.5mLで測定した。試料中の残存した糖をすべて除去するために、試料を4°Cで一晩、0.1M酢酸緩衝液pH5.0に対して透析した。透析試料200μlを、50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中の300mMスクロース溶液100μlと共に最大30分間インキュベートした。50μlのK2HPO4を加え、直ちに95°C加熱ブロックに10分間置いて反応を停止した。インベルターゼ活性をグルコースアナライザーYSILifeSciencesで測定した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、CoomassiePlusBradfordAssayキットThermoScientific;Rockford,ILにより測定した。培地1リットル当たりのインベルターゼ活性単位として活性を計算し、タンパク質1mg当たりの単位として比活性を計算した。生成量を計算して、培養物のDCW1グラム当たりのインベルターゼ活性単位を得た。形質転換体Y.リポリティカY.lipolyticaY2224USUC株における細胞外および全細胞のインベルターゼ活性細胞外および全細胞のインベルターゼ活性は、それぞれ培養上清および全細胞を使用して、指数関数的に増殖する細胞で測定した。下記の表12に示すように、2つの独立した実験から少なくとも4つのアッセイを実施して、平均値を報告する。増殖研究の結果と一致して、インベルターゼ活性は、pYRH68またはpYRH74で形質転換されたY.リポリティカY.lipolytica株の培養上清および全細胞で観察された。Y.リポリティカY.lipolytica形質転換体のpRH69およびpRH73はスクロース培地上で増殖せず、グルコース培地で増殖させた細胞培養物には、検出可能な細胞外または全細胞のインベルターゼ活性はなかった。インベルターゼ活性は、XPR2PP13/m-ScSuc2に対してSuc2SS/m-ScSuc2の形質転換体において若干高くなった。成熟Xpr2の13個のアミノ酸を追加しても、分泌シグナルプロセシングに必要なエンドペプチダーゼへの到達には依然として何らかの二次構造上の障害が存在した可能性がある。しかしながら、両方のSUC株について98超のインベルターゼ活性が培地に検出され、培養上清中のバイオマス当たりの細胞外インベルターゼ活性が、以前の報告よりも高いことが観察された。形質転換体Y.リポリティカY.lipolytica株Y1978USUC株における細胞外および全細胞のインベルターゼ活性インベルターゼ活性は、形質転換体の全細胞およびその培地で測定した。唯一の炭素源としてグルコースまたはスクロースを含有するYP10g/LのBacto酵母抽出物および20g/LのBactoペプトン培地で培養物を増殖させた。下記の表13に示すように、2つの異なる形質転換体についてSUC2コンストラクトのそれぞれを試験し、平均値を報告する。YPベースの培地のタンパク質濃度は、合成ベースの培地よりも顕著に高く表12、インベルターゼ比活性U/mgタンパク質を低下させた。これにもかかわらず、pRHY68形質転換体は、グルコースとスクロースの培養物間で同様のインベルターゼ活性を示し、90超のインベルターゼ活性が培地中に検出された。pYRH74形質転換体については、一方の形質転換体が、他方の形質転換体よりも、すべての試験条件において、はるかに高いインベルターゼ活性を示した。したがって、平均インベルターゼ活性は大きな標準誤差を伴って上昇した。それでも、90超のインベルターゼ活性が、唯一の炭素源としてグルコースまたはスクロースのいずれかを含有した培地中で検出された。実施例8インベルターゼをコードする公的に入手可能な遺伝子の同定サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeインベルターゼは、配列番号1として本明細書に示すSUC2遺伝子によりコードされる。この1599bpの遺伝子は、グリコシル化形態でS.セルビシアS.cerevisiaeの周辺質に分泌される、532個のアミノ酸の完全長インベルターゼ配列番号2をコードする。これに対して、19個のアミノ酸長の5’シグナル配列すなわち、配列番号1のヌクレオチド1~57によりコードされるを欠損する成熟ScSUC2遺伝子[m-ScSUC2]は、配列番号3として示され、配列番号4のタンパク質をコードする。m-ScSUC2をコードするタンパク質配列配列番号4を使用して、BLASTnrデータベース全ゲノムショットガンwholegenomeshotgun[WGS]プロジェクトからの環境試料を除く、非重複性GenBankCDS翻訳、プロテインデータバンク[PDB]タンパク質配列データベース、SWISS-PROTタンパク質配列データベース、ProteinInformationResource[PIR]タンパク質配列データベース、および蛋白質研究奨励会[PRF]タンパク質配列データベースをすべて含む内の類似性を有する配列を同定するために、国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformation[NCBI]BLASTP2.2.26BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.,etal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-34021997;Altschul,S.F.,etal.,FEBSJ.,272:5101-51092005検索を実施した。配列番号4が最大の類似性を有する配列を要約したBLASTP比較の結果を、同一性、類似性、および期待値に従って報告する。同一性は、2つのタンパク質間で同一のアミノ酸のパーセントとして定義される。類似性は、2つのタンパク質間で同一または保存のアミノ酸のパーセントとして定義される。期待値は、このサイズのデータベース検索においてまったく偶然に期待されるマッチの数を特定し、所与のスコアを用いてマッチの統計的有意性を評価する。多くのタンパク質が、m-ScSUC2配列番号4と有意な類似性を共有するとして同定された。表14に、期待値が4e-90以上で、インベルターゼまたはベータ-フルクトフラノシダーゼのいずれかとして具体的にタンパク質を同定したアノテーションを有するヒットの部分的な要約を示す。ただし、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeに対するヒットはすべて、以下に報告の結果から除外した。表14のタンパク質は、配列番号4と91~99の間のクエリーカバレッジquerycoverageを共有した。"