"微生物細胞組成物から脂質を得る方法であって、前記細胞組成物のpHを8以上に上昇させるステップと、前記細胞組成物から脂質を分離するステップと、を含み、前記脂質が5重量未満の有機溶媒を含有する、方法。前記pHを上昇させるステップにより前記細胞組成物が溶解する、請求項1に記載の方法。前記pHを上昇させるステップにより前記細胞組成物が解乳化する、請求項1に記載の方法。前記細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記塩を添加するステップが前記pHを上昇させるステップの後に行われる、請求項4に記載の方法。前記細胞組成物を加熱するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記加熱するステップが、前記pHを上昇させるステップの後に行われる、請求項6に記載の方法。前記細胞組成物のpHを2度目に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記pHを2度目に上昇させるステップが、前記塩を添加するステップまたは前記加熱するステップの後に行われる、請求項8に記載の方法。細胞から脂質を得る方法であって、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、前記溶解細胞組成物のpHを8以上に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、前記溶解細胞組成物に塩を添加するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、を含み、前記脂質が5重量未満の有機溶媒を含有する、方法。細胞組成物から脂質を得る方法であって、前記細胞組成物のpHを8以上に上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を溶解し、且つ前記細胞組成物を解乳化するステップと、前記細胞組成物に塩を添加するステップと、前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、を含み、前記脂質が5重量未満の有機溶媒を含有する、方法。前記溶解細胞組成物を加熱するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項10または11に記載の方法。前記加熱するステップが、前記塩を添加するステップの後に行われる、請求項12に記載の方法。前記溶解細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。前記溶解細胞組成物のpHを上昇させるステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップをさらに含む、請求項10~14のいずれか一項に記載の方法。前記溶解細胞組成物のpHを上昇させるステップが、前記塩を添加するステップまたは前記加熱するステップの後に行われる、請求項15に記載の方法。前記pHを上昇させるステップが、塩基の添加を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。前記塩基が1~12のpKbを有する、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。かき混ぜるか、混ぜ合わせるか、ブレンドするか、振盪するか、振動させるか、またはそれらの組み合わせにより、前記溶解細胞組成物を撹拌するステップを含む、請求項14~18のいずれか一項に記載の方法。前記溶解するステップが、機械的処理、物理的処理、化学的処理、酵素的処理、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。前記機械的処理がホモジナイゼーションである、請求項20に記載の方法。前記塩が前記溶解細胞組成物の0.1重量~20重量の量で添加される、請求項4~21のいずれか一項に記載の方法。前記塩が、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、硫酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4~22のいずれか一項に記載の方法。前記分離するステップが遠心を含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。少なくとも50重量のトリグリセリドを含む脂質を提供する、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。26以下のアニシジン価を有する脂質を提供する、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が微生物細胞である、請求項10~26のいずれか一項に記載の方法。前記微生物細胞を含む発酵ブロスを濃縮するステップをさらに含む、請求項1~9および27のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が油糧種子である、請求項10~26のいずれか一項に記載の方法。前記油糧種子が、ヒマワリ種子、キャノーラ種子、菜種、亜麻仁、ヒマシ油種子、コエンドロ種子、キンセンカ種子、およびその遺伝子修飾変異体からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。前記細胞または細胞組成物を洗浄するステップをさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。前記細胞または細胞組成物を低温殺菌するステップをさらに含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の方法。前記溶解細胞組成物を濃縮するステップをさらに含む、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。前記脂質を精製するステップをさらに含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の方法。前記精製するステップが、精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、冷却、加熱、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。前記脂質を回収するステップをさらに含み、前記回収するステップが、撹拌なしに前記脂質をポンピングすることを含む、請求項1~35のいずれか一項に記載の方法。細胞から脂質を得る方法であって、細胞を溶解するステップであって、それにより溶解細胞組成物を形成するステップと、前記細胞組成物を撹拌するステップであって、それにより前記細胞組成物を解乳化するステップと、前記解乳化細胞組成物から脂質を分離するステップと、を含み、前記脂質が5重量未満の有機溶媒を含有する、方法。前記撹拌するステップが、350センチメートル毎秒~900センチメートル毎秒の先端速度を有するインペラで前記細胞組成物を撹拌することを含む、請求項37に記載の方法。請求項1~38のいずれか一項に記載の方法により得られる脂質。1つ以上の多価不飽和脂肪酸を含む、請求項39に記載の脂質。少なくとも35重量のドコサヘキサエン酸を含む、請求項39または40に記載の脂質。3以下の全体的なアロマ強度を有する、請求項39~41のいずれか一項に記載の脂質。2以下の全体的な芳香強度を有する、請求項39~41のいずれか一項に記載の脂質。26以下のアニシジン価を有する、請求項39~43のいずれか一項に記載の脂質。100ppm以下のリン含量を有する、請求項39~44のいずれか一項に記載の脂質。5以下の過酸化物価を有する、請求項39~45のいずれか一項に記載の脂質。少なくとも20重量のエイコサペンタエン酸と、各5重量未満のアラキドン酸、ドコサペンタエン酸n-6、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコセン酸、エルカ酸、およびステアリドン酸とを含む、請求項39に記載の脂質。少なくとも10重量のトリアシルグリセロール画分を含み、前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも12重量がエイコサペンタエン酸であり、前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の少なくとも25重量がドコサヘキサエン酸であり、および前記トリアシルグリセロール画分中の脂肪酸の5重量未満がアラキドン酸である、請求項39に記載の脂質。5以下の過酸化物価を有する、請求項47または48に記載の脂質。粗油である、請求項39~49のいずれか一項に記載の脂質。26以下のアニシジン価、5以下の過酸化物価、100ppm以下のリン含量、および5重量未満の有機溶媒を有する粗微生物脂質。少なくとも70重量のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも50重量であり、前記トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸n-6含量が少なくとも0.5重量~6重量であり、および前記油が26以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。少なくとも70重量のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも40重量であり、前記トリグリセリド画分のドコサペンタエン酸n-6含量が少なくとも0.5重量~6重量であり、ドコサヘキサエン酸のドコサペンタエン酸n-6との比が6:1より大きく、および前記油が26以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。少なくとも約70重量のトリグリセリド画分を含む抽出微生物脂質であって、前記トリグリセリド画分のドコサヘキサエン酸含量が少なくとも60重量であり、および前記油が26以下のアニシジン価を有する、抽出微生物脂質。前記油が5以下の過酸化物価を有する、請求項52~54のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。前記油が100ppm以下のリン含量を有する、請求項52~55のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。前記脂質が粗油である、請求項52~56のいずれか一項に記載の抽出微生物脂質。脂質を得る方法であって、請求項50、51、または57のいずれか一項に記載の粗脂質を精製するステップを含む方法。前記精製するステップが、苛性精製、脱ガム、酸処理、アルカリ処理、脱色、脱臭、脱酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項58に記載の方法。[実施例][実施例1]0210微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む細胞ブロス20,000kgを60°Cに加熱した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を、最初に第1の塩基NaOH、50w/w溶液の250kgで処理して、溶解細胞組成物のpHを10.4から10.6にした。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を85°C~102°Cの温度に加熱し、24時間~70時間にわたりその温度レベルに保持した。次に第2の塩基NaOH、50w/w溶液、40kgを、pHが8を上回るまで溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を遠心して溶解細胞組成物を3相に分離した:脂質層を含む上相、乳濁液層を含む中間相、および固体層を含む下相。次に溶解細胞組成物を、WestfaliaRSE110遠心機WestfaliaSeparatorIndustryGmbH,独国を使用し、6,000rpm、30kg/分の送り速度で運転して40°C~80°Cで遠心することにより、溶解細胞組成物から脂質を分離した。この遠心により3相が提供された:脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体/液体乳濁液を含む下相。遠心中、溶解細胞組成物のpHは7.5~8.5に維持した。20,000kgバッチ全体の総遠心時間は約10~11時間であった。脂質層を分離し、その含水率は約1重量であった。[実施例2]0211微生物細胞クリプテコディニウムコーニイCrypthecodiniumcohniiを含む細胞ブロス500gを、ブロスの約7重量のバイオマスから13.5重量のバイオマスに濃縮した。このブロスを、10,000psiの圧力で2パスホモジナイズし、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を塩基すなわちNaOH、50w/w溶液の10gで処理して、溶解細胞組成物のpHを10.4~10.6にした。塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を85°C~92°Cの温度に加熱し、15分間~2時間にわたりその温度範囲に保持した。次に溶解細胞組成物を、BenchTopSigma6K15遠心機SIGMALaborzentrifugenGmbH,独国を使用して、5,400rpmで運転して70°C~90°Cの温度で遠心することにより、溶解細胞組成物を3相に分離した:脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体/液体乳濁液を含む下相。遠心中、溶解細胞組成物のpHは6.5~8.5に維持した。総遠心時間は5分であった。脂質層を分離し、その含水率は約1重量であった。[実施例3]0212微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む細胞ブロス20,000kgを60°Cに加熱した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、溶解細胞組成物を形成した。次に、塩固形Na2SO4、2,000kg、または溶解細胞組成物の10重量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を室温で24時間~48時間撹拌した。次に溶解細胞組成物を、WestfaliaRSE110遠心機WestfaliaSeparatorIndustryGmbH,独国を使用して、6,000rpm、40kg/分の送り速度で運転して40°C~75°Cで遠心することにより、溶解細胞組成物から脂質を分離した。この遠心により3相が提供された:脂質を含む上相、乳濁液を含む中間相、および固体/液体乳濁液を含む下相。20,000kgバッチ全体の総遠心時間は約8~9時間であった。遠心した溶解細胞組成物から脂質層を分離した。[実施例4]0213微生物細胞ATCC受託番号PTA-10208を含む低温殺菌した細胞ブロス500gを提供した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第1の塩基すなわち、25NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHを10.5に調整した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を95°Cの温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら2時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第2の塩基すなわち、25NaOH溶液を添加してpHを8.3とした。次に溶解細胞組成物を5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層および少量の乳濁液層を得た。[実施例5]0214微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695を含む濃縮および低温殺菌した細胞ブロス500gを提供した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基すなわち、25NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHを10.5に調整した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を95°Cの温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら1時間にわたりその温度レベルに保持すると、pHが8.5に降下した。合計10mlの発酵ブロス中で1時間後、約1mlの油脂質層および約6mlの乳濁液層が存在した。溶解細胞組成物を合計220分間加熱すると、乳濁液層が消失し始めた。次に溶解細胞組成物を5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離した。脂質の抽出収率は58.8重量であった。粗油のアニシジン価AVは11.3であった。細胞破壊収率は93重量~95重量の範囲であった。[実施例6]0215ATCC受託番号PTA-9695として寄託された単離ヤブレツボカビthraustochytridの微生物細胞を含む低温殺菌した細胞ブロス473gを提供した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第1の塩基すなわち、25NaOH溶液で処理することにより溶解細胞組成物のpHを10.62に調整した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を95°Cの温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら3時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第2の塩基すなわち、NaOHの25苛性溶液を添加してpHを8.13とした。次に溶解細胞組成物を5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、等量の脂質層および乳濁液層を得た。pHを上昇させると脂質層の収率が上がるかどうかを決定するため、分離した溶解細胞組成物にさらなる第2の塩基すなわち、25NaOH溶液を添加してpHを9.02とし、その溶解細胞組成物を再び5,100rpmで5分間遠心した。これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。分離した溶解細胞組成物に再びさらなる第2の塩基を添加してpHを10.12とし、その溶解細胞組成物を再び5,100rpmで5分間遠心した。再び、これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。[実施例7]0216微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695を含む低温殺菌した細胞ブロス470gを提供した。細胞バイオマスを機械的にホモジナイズして細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を第1の塩基すなわち、25NaOH溶液で処理することにより溶解細胞組成物のpHを10.5に調整した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を95°Cの温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら3時間にわたりその温度レベルに保持した。次に溶解細胞組成物に第2の塩基すなわち、25NaOH溶液を添加してpHを8.07とした。次に溶解細胞組成物を5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、脂質層および乳濁液層が得られ、ここでは乳濁液層が脂質層より多かった。pHを上昇させると脂質層の収率が上がるかどうかを決定するため、分離した溶解細胞組成物にさらなる第2の塩基を添加してpHを9.11とし、その溶解細胞組成物を再び5,100rpmで5分間遠心した。これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。分離した溶解細胞組成物に再びさらなる第2の塩基を添加してpHを10.09とし、その溶解細胞組成物を再び5,100rpmで5分間遠心した。再び、これにより得られた脂質層の収率は同程度であった。[実施例8]0217ビオチン抑制試験発酵槽において微生物細胞クリプテコディニウムコーニイCrypthecodiniumcohniiを含む細胞ブロスを使用した。20,000kgの洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌したブロスを回収した。これは低温殺菌の開始時に抜き出した。それを約1日間保持してから、移し替えてホモジナイズした。この材料を813バール/1パスでホモジナイズし、処理タンクに集め戻した。顕微鏡で調べることにより、細胞の約80が溶解したと推定された。0218ブロスを約40°Cに加熱した後、処理を開始した。pHを10.5に調整し、2NaClを添加して66°Cに加熱した。この時点で既に多量の油層が形成され、1~2時間後にはpHが9.5に降下していた。ブロスは66°Cで一晩保持した。0219翌日、155mmの環状ダムが設置されたWestfaliaRSE-110でブロスを遠心した。粘度は40°Cで約180cPであった。遠心機には48kg/分で供給し、軽量相で5~10psiの背圧および重量相で30psiの背圧とした。供給温度は70°Cに維持した。廃棄相に油は存在せず、イソプロピルアルコールの添加後にわずか数滴が認められた。0220表1は、この手順から得られた粗油に関して実施した分析の結果を示す。0221提供した20,000kgのブロスのうち10.5重量2,100kgがバイオマスであった。このバイオマスのうち50重量が油1,050kgであった。この油のうち58.9重量がDHA618kgであった。上記に記載される方法の実行後、脂質層に592.5kgの材料が存在し、そのうち約87.8重量520.2kgが油であった。従って、このバイオマスからの油の抽出収率は49.5であった。当該の油のうち60.5重量314.6kgがDHAであったため、バイオマスからのDHAの抽出収率は51重量となった。[実施例9]0222微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、25NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが5.8から11.2に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩固形Na2SO4、溶解細胞組成物の5重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を90°C~95°Cの範囲の温度に加熱し、90分間にわたりその温度レベルに保持すると、溶解細胞組成物のpHが9.7に降下した。90分後、45mlの発酵ブロス当たり約2.5mlの油層が存在し、および水分損失はなかった。3時間後、pHは9.2に降下していた。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は81重量であった。粗油のアニシジン価AVは20.1であった。細胞破壊収率は92重量~98重量の範囲であった。[実施例10]0223微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、25NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが4.8から11に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を90°C~95°Cの範囲の温度に加熱し、3.5時間にわたりその温度レベルに保持すると、溶解細胞組成物のpHが8.7に降下し、および水分損失はなかった。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。3.5時間後の脂質の抽出収率は92重量であった。0224溶解細胞組成物の一部分を6時間保持すると、溶解細胞組成物のpHが8.6に降下した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。6時間後の脂質の抽出収率は89重量であった。粗油のアニシジン価AVは14.4であった。細胞破壊収率は95重量であった。[実施例11]0225微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、50NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが5.8から11.2に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を真空下で70°Cに加熱して含水量を88.7から85.5に低下させた。蒸発中、pHが10.36に降下した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は83.9重量であった。粗油のアニシジン価AVは10.5であった。細胞破壊収率は93.17重量であった。0226溶解細胞組成物を真空下で70°Cに加熱して含水量を88.7から79.2に低下させたことを除き、この方法を繰り返した。含水量を79.2まで低下させたとき、脂質の抽出収率は87.5重量であり、および細胞破壊収率は92.3重量であった。またこの方法を繰り返し、含水量を88.7から80.8まで低下させた。含水量を80.8まで低下させたとき、脂質の抽出収率は90重量であり、および細胞破壊収率は95.9重量であった。[実施例12]0227微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、50NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが5.6から11.1に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物をクローズドシステムにおいて40分間、90°Cに加熱した。40分後、発酵ブロス40ml当たり約1mlの油脂質の層が存在した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は85.1重量であった。粗油のアニシジン価AVは16.3であった。細胞破壊収率は97.6重量であった。[実施例13]0228微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、50NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが4.9から11.2に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を室温で4時間混合した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、少量の脂質層が得られた。0229溶解細胞組成物の一部分を室温で約96時間混合した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、多量の脂質層が得られた。脂質の抽出収率は61.4重量であった。粗油のアニシジン価AVは22.6であった。[実施例14]0230微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695を含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、50NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが5.6から11.1に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に溶解細胞組成物を70°C~75°Cの範囲で3時間加熱した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は84.4重量であった。0231溶解細胞組成物の一部分を合計5時間加熱した。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、同様の脂質層が得られた。脂質の抽出収率は87.3重量であった。細胞破壊収率は89.1重量であった。[実施例15]0232微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス約500gを提供した。このブロスを、事前の細胞溶解ステップなしに、塩基すなわち、50NaOH溶液で化学的に処理した。塩基の添加によりブロスのpHが7.3から11に上昇した。塩基の添加およびpHの上昇により細胞が溶解され、溶解細胞組成物が形成された。次に、塩固形Na2SO4、溶解細胞組成物の5重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を90°Cの温度に加熱し、2時間にわたりその温度レベルに保持した。90°Cの温度をさらに2~4時間維持しながら、溶解細胞組成物が入ったベッセルを開放して水を蒸発させた。次に溶液を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、脂質層を得た。脂質の抽出収率は70重量超であった。粗油のアニシジン価AVは11.6であった。[実施例16]0233微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695を含む細胞ブロス9,925kgを提供した。細胞ブロスを水によって1:1の重量比で希釈し、20,000kgの希釈ブロスを形成した。希釈前のブロスの固形分含量は16.13重量であり、希釈後は8.25重量であった。希釈ブロスを混合し、スラッジ除去用遠心機により6,400rpmで遠心して、細胞外水溶性または水分散性化合物を取り除いた。遠心機からの濃縮物10,250kgを収集し、その固形分含量は10.5重量であった。収集した濃縮物を62°C~64°Cに加熱して濃縮物を低温殺菌した。低温殺菌した濃縮物に酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基すなわち、25NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHを11に調整した。次に、塩固形Na2SO4、溶解細胞組成物の5重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を95°Cの温度に加熱し、溶解細胞組成物を撹拌しながら10時間~12時間にわたりその温度レベルに保持した。撹拌後、溶解細胞組成物のpHは8.6となり、極めて少量の乳濁液層が存在した。撹拌タンクを60°Cに放冷し、冷却する間に溶解細胞組成物のpHは9.6に上昇した。リン酸を添加することにより溶解細胞組成物のpHは8.2に降下した。リン酸の添加が脂質層と極めて少量の乳濁液層との分離を阻害することはなかった。次に溶解細胞組成物を、5,100rpm、48kg/分の送り速度で5分間、60°C~63°Cで遠心することにより溶解細胞組成物を分離すると、1.7重量~2.3重量の含水率を有する脂質層が得られた。[実施例17]0234微生物細胞クリプテコディニウムコーニイCrypthecodiniumcohniiを含む、洗浄し、濃縮し、且つ低温殺菌した細胞ブロス500gを提供した。ブロスを8,000~12,000psiの圧力で2パスホモジナイズすることにより、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を塩基すなわち、12.5NaOH溶液で処理すると、溶解細胞組成物のpHは7.8~8.2に達した。塩固形Na2SO4、溶解細胞組成物の5重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を60°Cの温度に加熱し、その温度に保持した。溶解細胞組成物のpHは、塩基すなわち、12.5NaOH溶液を添加することにより、クローズドシステムにおいて水分損失はほとんど乃至まったくなしに、10~15時間にわたり7.8~8.2レベルに維持した。次に溶解細胞組成物を約5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物を分離し、油層を得た。これにより40mlの試料において約2mlの油層がもたらされた。油の抽出収率は73重量であった。粗油のアニシジン価AVは13.5であった。細胞破壊収率は82重量~86重量であった。[実施例18]0235微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む低温殺菌した細胞ブロス1,000gを提供した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基すなわち、12.5NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHを7.21から10.52に調整した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次にこのブロスを4つの部分量に分け、各部分量を4つの異なる温度および時間で保持した:1試験1は90°Cで22時間保持した;2試験2は90°Cで2時間保持し、次に25°Cで20時間保持した;3試験3は60°Cで22時間保持した;および4試験4は25°Cで22時間保持した。次に個々の試験材料を、それ以上pH調整することなく遠心した。試験1、2、および3について、ブロスは約6,600rpm4,800のg力で5分間遠心して溶解細胞組成物を分離した。試験4は4,800のg力では良好に分離されなかった<20ため、g力を15,000に上げ、ブロスを15,000のg力で5分間スピンした。重量パーセントとしての脂質の抽出収率およびアニシジン価AVを以下の表に掲載する。0236表2のアニシジン価は予想より高かった。先述の例と本例との一つの違いは、脂質の抽出前に溶解細胞組成物を長時間静置させたことであった。抽出前のこの長い時間により、溶解細胞組成物中に存在する溶存酸素の酸化が生じると仮定される。次に酸化が増すことによりアニシジン価の上昇が生じる。一般に溶解細胞組成物の溶存酸素含量は温度が上昇すると低下するため、最も高い温度で最も長い時間にわたり加熱した試験材料試験1が最も低いアニシジン価を有したという事実が、この仮説を裏付ける。従ってアニシジン価の上昇は例外的で、溶解細胞組成物からの脂質の抽出が遅延した結果であったと考えられる。生産時には、溶解細胞組成物からの脂質の抽出に遅延時間はないものと思われ、そのアニシジン価は、26以下のアニシジン価という先の結果と一致するものと思われる。[実施例19]0237微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む低温殺菌した細胞ブロス1,000gを提供した。次にこのブロスを3つの部分量に分け、以下のとおり希釈した:1試験1は一切希釈せず、対照部分量として供した;2試験2は水で25希釈した;および3試験3は水で50希釈した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加することにより細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を塩基すなわち、12.5NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHを6.8から10.6に調整した。次に、溶解細胞組成物に塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を添加した。次にブロスを90°Cに加熱して20時間保持した。保持時間の後、各試験材料のブロスを2つに分け、一方の半分量はそのまま遠心し、他方の半分量はそのpHを約8.5に調整してから遠心した。次に双方の部分量とも約8,545rpm8,000のg力で5分間遠心した。重量パーセントとしての脂質の抽出収率およびアニシジン価AVを以下の表に掲載する。0238表3のアニシジン価は予想より高かった。先述の例実施例18を除くと本例との一つの違いは、脂質の抽出前に溶解細胞組成物を長時間静置させたことであった。抽出前のこの長い時間により、溶解細胞組成物中に存在する溶存酸素の酸化が生じると仮定される。次に酸化が増すことによりアニシジン価の上昇が生じる。従ってアニシジン価の上昇は例外的で、溶解細胞組成物からの脂質の抽出が遅延した結果であったと考えられる。生産時には、溶解細胞組成物からの脂質の抽出に遅延時間はないものと思われ、そのアニシジン価は、26以下のアニシジン価という先の結果と一致するものと思われる。[実施例20]0239様々な発酵ロットから得られた細胞ブロスを、実施例2に記載される方法を用いて処理し、但し塩を添加するタイミング例えば、ホモジナイゼーションの前および後および塩の量は変更した。得られた分離後の脂質を分析した。この分析を表4に提供する。0240表4に提供するデータは、ホモジナイゼーション後に塩を添加すると、ホモジナイゼーション前に塩を添加するより脂質値が高くなることを示している。表4に提供するデータはまた、試料を希釈すると脂質値が低くなることも示している。[実施例21]0241微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumから得られたアルカーゼAlcalase酵素処理済み溶解細胞組成物の試料を使用した。この試料のpHは約5.5であった。試料を4つのより少量の試料に分割し、それらのうち3つの試料のpHを、水酸化ナトリウムを添加することによってそれぞれ約7.4、約10.5、および約12に調整した。試料を脱イオン水により1:1比で希釈した。各0.5gの希釈試料に、POBNα-4-ピリジル1-オキシド-N-tert-ブチルニトロン、1.25M;50μLをスピントラップ化学剤として添加した。BrukerBioSpine-scanEPR電子常磁性共鳴分光計システム番号SC0274BrukerBioSpin,Billerica,MAで試料を計測して脂質酸化により存在するフリーラジカルの量を計測した。試料を室温20°Cでインキュベートし、および各50μLのPOBN含有試料をpHの調整後1時間毎に4時間にわたり、以下の分光計パラメータを使用して試験した:変調周波数86Hz、変調振幅2.11ガウス、マイクロ波出力5.19mW、時定数20.48秒、掃引時間10.49秒、掃引幅100ガウス、および走査回数8。EPR分光計の測定値の結果を図5に提供する。0242図5のデータは、当初、フリーラジカルのレベルがpH5.5の試料について最も高く、pH10.5および12の試料について最も低かったことを示している。このデータはまた、4時間にわたり、ラジカルの形成速度がpH10.5の試料について最も遅く、pH5.5の試料について最も速かったことも示している。このデータはまた、溶解細胞組成物に塩基を添加すると脂質酸化が阻害され、そのため粗脂質および精製油の低いAVがもたらされることも示している。[実施例22]0243油糧種子はナタネ植物から抽出され、次に粉砕ミルに通されることで油糧種子の外殻が割られ、壊される。次に油糧種子は、吸引によるなど、公知の手段により脱皮され、油糧種子の外皮から種子の肉部内部が取り出される。次に脱皮された油糧種子を圧搾機に通すことによりホモジナイズしまたは搾り出すと、脱皮された油糧種子はケーキ状に粉砕され、それにより油糧種子の細胞が溶解される。水を添加することにより乳化した溶解細胞組成物が形成される。乳化した溶解細胞組成物はろ過され、溶解細胞組成物からあらゆる余分な皮片が取り除かれる。乳化した溶解細胞組成物は塩基すなわち、25NaOH溶液で処理して溶解細胞組成物のpHが11に調整される。次に溶解細胞組成物に塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量が添加される。次に溶解細胞組成物は90°Cの温度に加熱され、溶解細胞組成物を撹拌しながら6時間~48時間にわたりそのレベルに保持される。次に溶解細胞組成物を5,100rpmで5分間遠心することにより溶解細胞組成物が分離され、脂質層および乳濁液層が得られる。[実施例23][ヘキサン抽出により得られる粗脂質の比較分析]0244実施例2に記載される方法を用いるロットから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。実施例2で利用した同じ微生物細胞に対し典型的なヘキサン抽出法を用いて、さらなる粗脂質を得た。ヘキサン抽出法には、発酵ブロスを噴霧乾燥し、その噴霧乾燥バイオマスにヘキサンを添加して15重量~20重量固形分の溶液を得ることが含まれた。次に溶液をホモジナイズして細胞を溶解し、溶解細胞組成物を形成した。溶解細胞組成物を遠心し、脂質およびヘキサンを含む層を取り出した。次に脂質からヘキサンを除去した。分析の結果を表5に提供する。0245表5に提供するデータは、本発明の方法により得られる粗脂質が、典型的なヘキサン抽出法により調製される脂質と比較して、優れたアニシジン価、脂質率、DHA量およびDHA率を呈することを示している。[FRIOLEX登録商標法により得られる粗脂質の比較分析][実施例24]0246実施例1および実施例3に記載される方法を用いる様々な発酵ロットから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。米国特許第5,928,696号明細書並びに国際公開第01/76385号パンフレットおよび国際公開第01/76715号パンフレットに記載されるとおり水溶性有機溶媒で脂質を抽出する方法であるFRIOLEX登録商標法WestfaliaSeparatorAG,独国を用いて、さらなる粗脂質を得た。分析の結果を表6に提供する。0247表6に提供するデータは、本発明の方法から得られる粗脂質が溶解細胞組成物を加熱しなかったときに得られた脂質を除き、FRIOLEX登録商標法により調製される脂質と比較して優れたアニシジン価を呈することを示している。本発明の方法により調製される脂質は、FRIOLEX登録商標法を用いて調製される脂質のアニシジン価の4.4~19.7であるアニシジン価を呈する。0248本発明の方法により調製される脂質は高い安定性を有すると考えられる。例えば、表6に示されるとおり、本発明の方法を用いて溶解細胞組成物から脂質を抽出したが、ここで溶解細胞組成物は抽出プロセス前に3週間静置させた。溶解細胞組成物における脂質のアニシジン価は時間の経過に伴い高くなると考えられ、従って3週間を経た溶解細胞組成物から抽出される脂質はより高いアニシジン価を有すると予想され得る。しかしながら、表6に示されるとおり、3週間を経た溶解細胞組成物から本発明の方法を用いて得られる脂質は、FRIOLEX法により調製される脂質のアニシジン価の19.7であるアニシジン価を有した。[実施例25]0249実施例16に記載する方法を用いて微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695のブロスから得られた粗脂質を分析し、様々な仕様を決定した。微生物細胞ATCC受託番号PTA-9695のブロスからFRIOLEX登録商標法WestfaliaSeparatorAG,独国を用いてさらなる粗脂質を得た。FRIOLEX登録商標法は、米国特許第5,928,696号明細書並びに国際公開第01/76385号パンフレットおよび国際公開第01/76715号パンフレットに記載されるとおり水溶性有機溶媒例えば、イソプロピルアルコールで脂質を抽出する方法である。分析の結果を表7に提供する。0250表7に提供するデータは、本発明の方法により得られる粗脂質が、FRIOLEX登録商標法により調製される脂質と比較して優れたアニシジン価AVおよび過酸化物価PVを呈することを示している。このデータはまた、本発明の方法により得られる脂質の抽出収率が、FRIOLEX登録商標法により得られる脂質の抽出収率と比較して優れていることも示している。[実施例26][粗脂質の精製]0251実施例1に概説する方法およびFRIOLEX登録商標法を用いて粗脂質を得た。粗脂質を、以下を逐次的に行うことによってさらに処理した:1脱ガムおよび苛性精製;2脱色;3チルドろ過;および4抗酸化剤による脱臭。粗脂質、苛性精製した脂質、脱色した脂質、および脱臭した脂質のデータを表8aおよび表8bに提供する。精製油の比較を表9に提供する。0252表8a、表8b、および表9に提供するデータは、本発明の方法により調製される精製油が、FRIOLEX登録商標法により調製される精製油と比較してより低いアニシジン価を呈することを示している。[実施例27][官能プロファイル比較]0253実施例26において得られた精製油を、8~12名の官能分析の専門家パネルが分析した。官能分析の専門家は、アロマ、芳香、および後味に基づき様々な脂質仕様を格付けし、各脂質についての全体的なアロマ強度を提供した。ユニバーサルスペクトルの記述的分析方法を用いて試料のアロマおよび芳香特性を評価した。この方法では、0~15の強度スケール0=検出なし、および15=極めて高強度を使用して油のアロマおよび芳香属性が計測される。官能データの結果を表10に提供する。0254表10に提供するデータは、本発明の方法により調製される精製油が、FRIOLEX登録商標法により調製される精製油と比較して優れた官能データを呈することを示している。上記に示すとおり、本発明により提供される脂質は、それぞれ3および2の全体的なアロマ強度を有したが、一方、FRIOLEX登録商標の脂質は4および3の全体的なアロマ強度をもたらした。[実施例28][比較例]0255有機溶媒を使用することなしに微生物から脂質を得るための抽出法が、米国特許第6,750,048号明細書に記載されている。本発明の方法により調製される粗脂質から得られる精製油と、米国特許第6,750,048号明細書に開示される抽出法により調製される粗脂質から得られる精製油との比較を表11に提供する。0256表11に提供するデータは、本発明の方法により調製される粗脂質から得られる精製油が、米国特許第6,750,048号明細書に開示される抽出法により調製される粗脂質から得られる精製油と比較して優れた特性を呈することを示している。[実施例29]0257単離ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695を、分類学上の分類について特徴付けた。0258干潮時に潮間生息地から試料を採取した。水、堆積物、生きている植物材料および死滅した植物/動物の残骸を滅菌した50ml管に入れた。水と共に各試料の部分量を、単離培地の固形寒天プレートに塗布した。単離培地は以下からなった:500mの人工海水、500mlの蒸留水、1gのグルコース、1gのグリセロール、13gの寒天、1gのグルタミン酸塩、0.5gの酵母エキス、0.5gのカゼイン加水分解物、1mlのビタミン溶液100mg/Lのチアミン、0.5mg/Lのビオチン、0.5mgのB12、1mlの微量ミネラル溶液PII金属、1リットル当たり6.0gのFeCl36H2O、6.84gのH3BO3、0.86gのMnCl24H2O、0.06gのZnCl2、0.026のCoCl26H2O、0.052gのNiSO4H2O、0.002gのCuSO45H2Oおよび0.005gのNa2MoO42H2Oを含有、並びに各500mgのペニシリンGおよび硫酸ストレプトマイシン。寒天プレートを暗所において20~25°Cでインキュベートした。2~4日後、寒天プレートを顕微鏡下で調べ、細胞のコロニーを滅菌したつまようじで取り、新鮮な培地プレートに再びストリークした。汚染生物が除去されるまで、細胞を新鮮な培地に繰り返しストリークした。0259寒天プレートからのコロニーを、半分の強度の海水および加圧滅菌した新しく孵化した幼生ブラインシュリンプの懸濁液1mlと共にペトリ皿に移した。2~3日後、幼生ブラインシュリンプは胞子嚢の塊がひどく生い茂った状態となった。放出される遊走子は放たれるときに双鞭毛であり、成熟胞子嚢から遊離して活動的に泳ぎ出す。その残された壁は胞子放出後位相差法で明確に確認することができる。胞子嚢の直径は12.5μm~25μmであり、遊走子は2.5μm~2.8μm×4.5μm~4.8μmのサイズであった。個々の胞子嚢につき8~24個の胞子があった。定着した遊走子は大きくなり、急速に二分裂を起こし、四分子、八分子、および最終的に胞子嚢の塊を生じた。四分子の形成は胞子嚢の成熟前の極めて早い段階で始まった。これらの特徴はシゾキトリウム属Schizochytriumに一致している。0260単離ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695を、18srRNA遺伝子についての既知の種との類似性に基づきさらに特徴付けた。ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695からの全ゲノムDNAを標準的手順SambrookJ.andRussellD.2001.Molecularcloning:Alaboratorymanual,3rdedition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYorkにより調製し、18sRNA遺伝子のPCR増幅に使用した。18srRNA遺伝子のPCR増幅は以前に記載されているプライマーHondaetal.,JEukaryot.Microbiol.4661999で実行した。染色体DNA鋳型を含むPCR条件は、以下のとおりとした:0.2μMのdNTP、各0.1uMのプライマー、8DMSO、200ngの染色体DNA、2.5UのPfuUltra登録商標II融合HSDNAポリメラーゼStratagene、および1XPfuUltra登録商標緩衝液Stratageneで50μLの総容量。PCRプロトコルは以下のステップを含んだ:195°Cで2分間;295°Cで45秒間;355°Cで30秒間;472°Cで2分間;5ステップ2~4を40サイクル繰り返し;672°Cで5分間;および76°Cで保持。0261PCR増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なDNA産物が得られた。このPCR産物をベクターpJET1.2/平滑端Fermentasに製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用してインサート配列を決定した。0262表12は、ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695由来の18srRNA配列の、NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI電子データベースのDNA配列との比較を示す。簡潔に言えば、DNAアラインメントの標準である、VectorNTIプログラムInvitrogenのAlignXプログラムに含まれるスコアリング行列swgapdnamtにより、同一性を決定した。NCBI電子データベースによるBasicLocalAlignmentSearchToolBLASTの計算結果からカバレッジを取った。これはアラインメントした区間に含まれる問い合わせ配列の長さの割合である。0263表12に示すとおり、同一性の点でヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695由来の18srRNA遺伝子配列は、Honda,D.etal.,J.Euk.Micro.466:637-6471999に提供されるT.アグレガツムT.aggregatumの18srRNA遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。トラウストキトリウムアグレガツムThraustochytriumaggregatumについて発表されている18srRNA配列は部分配列であり、配列の中央に約71DNAヌクレオチドのギャップを含む。カバレッジ率に関して、本発明の単離物の18srRNA遺伝子配列は、T.アグレガツムT.aggregatumよりもシゾキトリウムエスピーSchizochytriumsp.ATCC20888とより近縁の関係にある。0264アクチンおよびβ-チューブリンなどの高度に保存されたタンパク質が、生物間の系統発生的な関係を評価するためのマーカーとして18srRNA遺伝子と共に広く用いられているBaldauf,S.M.Am.Nat.154,S1781999。ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695由来の全ゲノムDNAをまた、アクチンおよびβ-チューブリンの双方の遺伝子のPCR増幅用鋳型として使用した。PCR増幅は、T.アグレガツムT.aggregatum由来のアクチンおよびβ-チューブリンDNA配列の保存領域用に設計されたプライマーで実施した。0265染色体DNA鋳型を含むPCR条件は以下のとおりであった:0.2μMのdNTP、各0.1uMのプライマー、8DMSO、200ngの染色体DNA、2.5UのHerculase登録商標II融合DNAポリメラーゼStratagene、および1×Herculase登録商標緩衝液Stratageneで50μLの総容量。PCRプロトコルは以下のステップを含んだ:195°Cで2分間;295°Cで30秒間;355°Cで30秒間;472°Cで2分間;5ステップ2~4を40サイクル繰り返し;672°Cで5分間;および76°Cで保持。0266PCR増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なDNA産物が得られた。それぞれのPCR産物をベクターpJET1.2/平滑端Fermentasに製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用して各々のインサート配列を決定した。0267表13は、公開データベースで利用可能なアクチン配列と比較したときの、ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695由来のアクチンアミノ酸配列の同一性を示す。同一性は、タンパク質アラインメントの標準である、VectorNTIプログラムのAlignXプログラムに含まれるスコアリング行列blosum62mt2を使用して決定した。0268表14は、公開データベースで利用可能なβ-チューブリン配列と比較したときの、ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695由来のβ-チューブリンアミノ酸配列の同一性を示す。同一性は、タンパク質アラインメントの標準である、VectorNTIプログラムのAlignXプログラムに含まれるスコアリング行列blosum62mt2を使用して決定した。0269上記の特徴に基づけば、単離されたヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695は新しいシゾキトリウム属Schizochytriumの種に相当すると考えられ、従ってまたシゾキトリウムエスピーSchizochytriumsp.ATCCPTA-9695と命名される。[実施例30]0270単離ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695は、以下に記載するとおり、様々な培養条件下で高レベルの細胞成長を生じた。典型的な培地および培養条件を表15に示す。また、高レベルの脂肪酸およびDHAが認められたすなわち、乾燥細胞重量の50重量超が脂肪酸であり、脂肪酸メチルエステルの50重量超がDHAであった。0271pH7.0で20溶存酸素を有し22.5°Cで8200ppmCl-を含む炭素および窒素供給培養液において、培養7日後に単離株から140g/Lの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は70重量であった。閉ループアンモニア供給を用い、pHは7.0に維持した。これらの条件下でω-3産生能力は8.92g/L日であり、7日で4.7g/LのEPA脂肪酸の5重量および56.3g/LのDHA脂肪酸の57重量であった。0272pH7.0で20溶存酸素を有し22.5°Cで3640ppmCl-を含む炭素および窒素供給培養液において、培養7日後に単離株から82g/Lの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は58重量であった。これらの条件下でω-3産生能力は4.5g/L日であり、7日で2.1g/LのEPA脂肪酸の4.3重量および28.5g/LのDHA脂肪酸の58.7重量であった。0273pH7.0で20溶存酸素を有し22.5°Cで980ppmCl-を含む炭素および窒素供給培養液において、培養7日後に単離株から60g/Lの乾燥細胞重量が生じ、脂肪酸含量は53重量であった。これらの条件下でω-3産生能力は2.8g/L日であり、7日で1.1g/LのEPA脂肪酸の3.4重量および18.4g/LのDHA脂肪酸の56.8重量であった。[実施例31]0274単離ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695のバイオマス試料試料Aから油を抽出した。このバイオマス試料は、pH7.0で20溶存酸素を有し22.5°Cで980ppmCl-を含む炭素および窒素供給培養液で産生された。バイオマス試料Aからヘキサン抽出法により油を抽出して微生物油試料A1を得た。簡潔に言えば、乾燥バイオマスをヘキサンと共に、ステンレス鋼製の管およびステンレス鋼製のボールベアリングを使用して約2時間粉砕した。スラリーを真空ろ過し、ろ液を回収した。ロータリーエバポレータを使用してヘキサンを除去した。また、FRIOLEX登録商標法GEAWestfaliaSeparatorUKLtd.,MiltonKeynes,英国を用いてバイオマス試料Aから油を抽出し、微生物油試料A2を得た。微生物油試料A1およびA2から低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて個々の脂質クラスを単離し、各クラスの重量パーセントを決定した。水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィーGC-FIDを用いて各クラスの脂肪酸プロファイルを脂肪酸メチルエステルFAMEとして決定した。0275フラッシュクロマトグラフィー-フラッシュクロマトグラフィーを用いて粗油中に存在する脂質クラスを分離し、油中に存在する各クラスの重量パーセントを決定した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル60EMDChemical,Gibbstown,NJを利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、3mL/分であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は100石油エーテルから開始し、50酢酸エチルで終了したその後100メタノールで洗浄した。GilsonFC204ラージベッドlarge-bedフラクションコレクターGilson,Inc.,Middleton,WIを使用して画分を10mL試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィーTLCにより分析し、個々の脂質クラスが入った管予想保持係数Rfを有するTLCプレート上のシングルスポットにより判断するときをプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。0276TLC分析-シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル:エチルエーテル:酢酸80:20:1からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのRf値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。0277脂肪酸分析-バイオマスの試料および単離した脂質クラスを脂肪酸組成についてFAMEとして分析した。試料をねじ口試験管に直接量り取り、1mLのトルエン中C19:0内部標準NuCheck,Elysian,MNおよび2mLのメタノール中1.5NHClを各管に加えた。管を短時間ボルテックスし、加熱ブロックに100°Cで2時間置いた。管を加熱ブロックから取り出して放冷し、1mLの水中飽和NaClを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、上層有機層の一部分をGCバイアルに入れてGC-FIDにより分析した。Nu-Chek-PrepGLC参照標準Nu-ChekPrep,Inc.,Elysian,MNを使用して作成した3点内部標準校正曲線を用いてFAMEを定量化し、保持時間に基づき仮に同定した。脂肪酸の存在量は全FAMEに対するmg/gおよびとして表現した。0278粗油をヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料A1を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、粗油の1.2重量をステロールエステル画分が占め、82.7重量をトリアシルグリセロールTAG画分が占め、0.9重量を遊離脂肪酸FFA画分が占め、および2.9重量をジアシルグリセロールDAG画分が占めた。試料A1粗油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれmg/gおよびFAMEとして計算した以下の表16および表17に示す。0279粗油をヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料A2を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、粗油の0.8重量をステロールエステル画分が占め、83.4重量をトリアシルグリセロールTAG画分が占め、1.8重量を遊離脂肪酸FFA画分が占め、および5.6重量をジアシルグリセロールDAG画分が占めた。試料A2粗油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれmg/gおよびFAMEとして計算した以下の表18および表19に示す。0280試料A1およびA2は、それぞれ典型的なヘキサン抽出およびFRIOLEX登録商標法を用いて抽出した点が注記される。表16~表19の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料が抽出された場合に実質的に同じになることが予想される。[実施例32]0281実施例31に記載されるとおり、Friolex法を用いて発酵ブロスから油を抽出した後、精製、脱色、および脱臭ステップによって粗油をさらに処理して最終油を得た。この最終油を高オレイン酸ヒマワリ油で希釈し、DHA含量が約400mg/gの完成した市販品の油を得た。個々の脂質クラスを単離し、水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィーGC-FIDを用いて各クラスの脂肪酸プロファイルを脂肪酸メチルエステルFAMEとして決定した。0282フラッシュクロマトグラフィー-フラッシュクロマトグラフィーを用いて最終油中に存在する脂質クラスを分離し、油中に存在する各クラスの重量パーセントを決定した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル60EMDChemical,Gibbstown,NJを利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、3mL/分であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は100石油エーテルから開始し、50酢酸エチルで終了したその後100メタノールで洗浄した。GilsonFC204ラージベッドlarge-bedフラクションコレクターGilson,Inc.,Middleton,WIを使用して画分を10mL試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィーTLCにより分析し、個々の脂質クラスが入った管予想保持係数Rfを有するTLCプレート上のシングルスポットにより判断するときをプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。0283TLC分析-シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル:エチルエーテル:酢酸80:20:1からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのRf値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。0284脂肪酸分析-最終油の試料および単離脂質クラスを脂肪酸組成についてFAMEとして分析した。試料をねじ口試験管に直接量り取り、1mLのトルエン中C19:0内部標準NuCheck,Elysian,MNおよび2mLのメタノール中1.5NHClを各管に加えた。管を短時間ボルテックスし、加熱ブロックに100°Cで2時間置いた。管を加熱ブロックから取り出して放冷し、1mLの水中飽和NaClを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、上層有機層の一部分をGCバイアルに入れてGC-FIDにより分析した。Nu-Chek-PrepGLC参照標準Nu-ChekPrep,Inc.,Elysian,MNを使用して作成した3点内部標準校正曲線を用いてFAMEを定量化し、保持時間に基づき仮に同定した。脂肪酸の存在量は全FAMEのmg/gおよびとして表現した。0285250mgの最終油を600μLのヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより試料を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、最終油の1.2重量をステロールエステル画分が占め、92.1重量をトリアシルグリセリドTAG画分が占め、2.1重量を遊離脂肪酸FFA画分が占め、1.1をステロール画分が占め、2.8重量をジアシルグリセリドDAG画分が占めた。0286プールした画分のTLC分析から、FFA画分およびステロール画分はそれぞれTAGおよびDAGと混合していることが分かった。FRIOLEX登録商標の最終油および単離画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれmg/gおよびFAMEとして計算した以下の表20および表21に示す。0287表20および表21の脂肪酸プロファイルは、FRIOLEX登録商標法を用いて抽出した試料から得られた点が注記される。表20および表21の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料が抽出された場合に実質的に同じになることが予想される。[実施例33]0288980ppmCl-を含む炭素および窒素供給培養液ヤブレツボカビthraustochytrid培地において単離ヤブレツボカビthraustochytridATCC受託番号PTA-9695の2日経過播種フラスコを調製した。0289突然変異生成を以下の手順に従い実施した:0290滅菌したT=2日経過フラスコ、約50mlを、滅菌した40mlガラスホモジナイザーに注ぎ入れた。ホモジナイザーにおいて培養物に50回のプランジを与えた。培養物をピペットで取り出し、50ml滅菌管に置かれた滅菌50ミクロンメッシュフィルターでろ過したメッシュは、より小さい塊および単一の細胞をl0ミクロンメッシュに通過させる一方で、より大きいコロニー群を保持する手段として使用した。濃縮された浸軟物macerateの全体を滅菌50ml管に回収した。浸軟した培養物をボルテックスし、ヤブレツボカビthraustochytrid培地が入った管に最高1:100倍レベルの希釈液を作製した。希釈した浸軟試料をボルテックスした後、4~5個のガラスビーズ3mmガラスビーズが入ったヤブレツボカビthraustochytrid培地の寒天ペトリ皿100×15mmに200μlの播種材料を添加した。ビーズによって播種材料をプレート全体に均等に広げるようにして、各プレートを穏やかに撹拌した。ビーズをプレートから空け、プレートを、蓋をして約5分間静置し、乾燥させた。手順は薄暗い所で行うため、滅菌フードおよび隣接領域の双方の照明を消した。手順を実行可能とするための最小限の光は利用できたが、間接的な薄暗いもののみであった。02915枚の複製プレートをXLクロスリンカーSpectronicsCorporation,NewYorkの底に置き、試料を照射する間、蓋は外した。このクロスリンカーはマイクロジュール単位で出力を送り、90~95死滅を達成するレベルを求めた。同じプロトコルを用いて5枚の複製対照プレートに突然変異を誘発されていない細胞を播種した。これらの細胞カウントを使用して死滅を計算した。照射の終了後プレートを取り出し、蓋を交換し、プレートをパラフィルムparafilmで包み、続いてアルミニウム箔で包んだ。最初の週はプレートを暗所で増殖させることで、損傷した遺伝子を修復できないようにすることが不可欠であった。0292プレートを22.5°Cの室内に約10日置いてからコロニーを計数した。最終的な計数を行ったとき、個々のコロニーを滅菌した播種用ループで選び取り、新しいヤブレツボカビthraustochytrid培地プレートに再度ストリークした。各コロニーを個々のプレートに植えた。プレートが密に増殖したところで播種用ループを使用して試料を採取し、50mlのヤブレツボカビthraustochytrid培地が入った滅菌250ml振盪フラスコに播種した。このフラスコを22.5°Cの室内において200rpmの振盪機に置いた。T=7日目に振盪フラスコ培養物を50ml滅菌管に回収した。pHをとり、試料をスピンダウンしてバイオマスペレットを回収した。各試料をリンスし、イソプロピルアルコールと蒸留水との50:50混合物中に再懸濁した後、再度スピンした。回収したペレットを凍結乾燥して秤量し、FAME分析を実施した。表22~表28のデータは、上記の方法で産生した突然変異体を表す。[実施例34][微生物の単離]0293米国西海岸カリフォルニア州California、オレゴン州Oregon、およびワシントン州Washingtonおよびハワイ州Hawaiiに沿った入り江および河口域を含む潮間生息地から、干潮時に試料を採取した。水、堆積物、生きている植物材料、および死滅した植物/動物の残骸を滅菌した50ml管に入れた。水と共に各試料の部分量を、単離培地の固形寒天プレートに塗布した。単離培地は以下からなった:500mlの人工海水、500mlの蒸留水、1gのグルコース、1gのグリセロール、13gの寒天、1gのグルタミン酸塩、0.5gの酵母エキス、0.5gのカゼイン加水分解物、1mlのビタミン溶液100mg/Lのチアミン、0.5mg/Lのビオチン、0.5mgのB12、1mlの微量ミネラル溶液PII金属、1リットル当たり6.0gのFeCl36H2O、6.84gのH3BO3、0.86gのMnCl24H2O、0.06gのZnCl2、0.026のCoCl26H2O、0.052gのNiSO4H2O、0.002gのCuSO45H2Oおよび0.005gのNa2MoO42H2Oを含有、並びに各500mgのペニシリンGおよび硫酸ストレプトマイシン。寒天プレートを暗所において20~25°Cでインキュベートした。2~4日後、寒天プレートを顕微鏡下で調べ、細胞のコロニーを滅菌したつまようじで取り、新鮮な培地プレートに再びストリークした。汚染生物が除去されるまで、細胞を新鮮な培地に繰り返しストリークした。単離した微生物のうち2つをATCC受託番号PTA-10212およびPTA-10208のもとに寄託した。[ATCC受託番号PTA-10212として寄託した単離微生物の分類学上の特性決定]0294ATCC受託番号PTA-10212として寄託した単離微生物PTA-10212の培養物は、白色の、湿潤した、塗抹されたコロニーのように見え、目に見える独立した胞子嚢群はなかった。0295PTA-10212を固形および液体FFM、固形KMV、KMVスラッシュ1、KMVブロス、およびMHブロスで増殖して増殖特性をさらに調べた。PTA-10212はKMVおよびMHで急速に増殖することが観察された。例えば、PorterD.,1989.PhylumLabyrinthulomycota.InMargulis,L.,Corliss,J.O.,Melkonian,M.,Chapman,D.J.Eds.HandbookofProtoctista,JonesandBartlett,Boston,pp.388-398KMV;Hondaetal.,Mycol.Res.102:439-4481998MH;および米国特許第5,130,242号明細書FFMを参照のこと。0296以下の観察は、PTA-10212の数日間にわたる固形FFM培地での増殖後、72時間のKMV培地、およびMHブロスにおける増殖後に行った。胞子嚢はいずれの培地中/培地上においても集塊せず、極めて小さかった5~10μm。PTA-10212はシゾキトリウム属Schizochytriumの分割パターンに特徴的な多量の四分子を示さなかった。新鮮な固形培地に移して約24時間後、アメーバ状細胞が現れた。このアメーバ状細胞は数日後に消え、および液体培地またはスラッシュ培地では明白でなかった。Yokoyama,R.etal.,Mycoscience486:329-3412007によって、液体培地で増殖したときフラスコの底にある細かい砂粒の外観を有するものとして記載されるオーランチオキトリウム属Aurantiochytriumと異なり、PTA-10212はフラスコの底に沈降することなく、KMVおよびMHの双方の液体培地に懸濁された。胞子嚢は、PTA-10212に存在しなかった外質の網目も有するシゾキトリウム属Schizochytriumまたはオリゴキトリウム属Oligochytriumに典型的なものほど密ではなかった。ほとんどの種は、大きい胞子嚢が数時間かけて分裂することによる小さい胞子嚢または同化細胞の栄養分割を行うが、PTA-10212はダンベル形の細長い同化細胞を形成し、次にはそれがダンベルの端部の分離に伴い引き離される細い峡部を形成した。得られた細胞は小さい同化細胞のように見えた。アメーバ状細胞がダンベル形同化細胞に直接変化した例は観察されなかった。典型的な双鞭毛遊走子は遊泳が観察されたが、比較的まれであった。PTA-10212は多産でなく、栄養分割により分裂した。遊走子の直接放出は観察されなかったが、遊走子は遊泳が観察された。栄養細胞は極めて小さかった2μm~5μm。0297フロースルー技法を用いてPTA-10212をさらに調べ、ここでは半分の強度の一滴の海水に少量の寒天増殖コロニーを懸濁することにより、顕微鏡スライドを調製した。この技法により、一次胞子嚢が球形で直径約10μmであることが観察された。壁は極めて薄く、プロトプラストの二分裂の開始時に残存物は観察されなかった。二分裂の繰り返しによって8~16個のより小さい直径4~5μmの二次胞子嚢が生じた。この二次胞子嚢は数時間休眠状態にとどまり、その後再び無定形のプロトプラストを放出した。無定形のプロトプラストは挟みつぶして引きちぎるように分割すると、最初は典型的なダンベル形の中間段階を生じ、最終的に直径2.5~2.8μmの4~8個の小さい球状体になった。それらは数分間から最長1~2時間までそのままの状態にあり、次に形を細長く変化させて、2.3~2.5×3.7~3.9μmの双鞭毛遊走子になった。遊走子は多量にあり、それらが静止したときに正確に計測することができた。次に遊走子は丸くなり、新しい成長サイクルを開始した。遊走子はシシオイドキトリウムミヌツムSicyoidochytriumminutumより大きく、ウルケニアウィスルゲンシスUlkeniavisurgensisより小さかった。0298PTA-10212を、18srRNA遺伝子についての既知の種との類似性に基づきさらに特徴付けた。標準的手順によりPTA-10212からゲノムDNAを調製した。例えば、SambrookJ.andRussellD.2001.Molecularcloning:Alaboratorymanual,3rdedition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYorkを参照のこと。簡潔には:1対数期中期培養物から500μLの細胞を遠心した。細胞を再度遠心し、細胞ペレットから小口径の先端部で痕跡量の液体を全て除去した;2200μLの溶解緩衝液20mMのトリスpH8.0、125μg/mLのプロテイナーゼK、50mMのNaCl、10mMのEDTApH8.0、0.5SDSでペレットを再懸濁した;3細胞を50°Cで1時間溶解した;4溶解混合物をピペットでフェーズロックゲルPLG-Eppendorf2mLチューブに移した;5等容量のP:C:Iを添加し、1.5時間混合した;6チューブを12,000×gで5分間遠心した;7PLGチューブ内のゲルの上側から水相を取り出し、その水相に等容量のクロロホルムを添加して30分間混合した;8チューブを14,000×gで約5分間遠心した;9最上層水相をピペットでクロロホルムから取り、新しいチューブに入れた;100.1容量の3MNaOACを添加して混合した数回反転させた;112容量の100EtOHを添加して混合し数回反転させた、この段階でゲノムDNAの沈殿が形成された;12微量遠心機において14,000×gで約15分間、チューブを4°Cで遠心した;13その液体を静かに流し捨てると、チューブの底にゲノムDNAが残った;14そのペレットを0.5mLの70EtOHで洗浄した;15微量遠心機において14,000×gで約5分間、チューブを4°Cで遠心した;16EtOHを静かに流し捨て、ゲノムDNAペレットを乾燥させた;および17好適な容量のH2OおよびRNアーゼをゲノムDNAペレットに直接添加した。18srRNA遺伝子のPCR増幅は、以前に記載されているプライマーで実施したHondaet.al.,JEukMicro.466:637-6471999。染色体DNA鋳型を含むPCR条件は以下のとおりであった:0.2μMのdNTP、各0.1μMのプライマー、8DMSO、200ngの染色体DNA、2.5UのHerculase登録商標II融合DNAポリメラーゼStratagene、およびHerculase登録商標緩衝液Stratageneで合計容量50μL。PCRプロトコルは以下のステップを含んだ:195°Cで2分間;295°Cで35秒間;355°Cで35秒間;472°Cで1分間および30秒間;5ステップ2~4を30サイクル繰り返し;672°Cで5分間;および74°Cで保持。0299PCR増幅により、上記に記載される染色体鋳型を使用して予想されたサイズを有する明確なDNA産物が得られた。PCR産物をベクターpJET1.2/平滑端Fermentasに製造者の指示に従いクローニングし、供給された標準プライマーを使用してインサート配列を決定した。0300系統発生解析では、PTA-10212は、適度の裏付けをもって、トラウストキトリウムパキデルムムThraustochytriumpachydermumおよびトラウストキトリウムアグレガツムThraustochytriumaggregatumを含む系統内に位置付けられる。T.パキデルムムT.pachydermumの胞子嚢は極めて厚い細胞壁を有する。T.アグレガツムT.aggregatumは、明確に視認可能な、不透明な胞子嚢群の塊を形成する。PTA-10212はこれらの特徴のいずれも示さない。多くのアメーバ状細胞の存在は、ウルケニア属Ulkenia、T.ガエルトネリウムT.gaertnerium、A.リマシヌムA.limiacinum、およびS.マングロベイS.mangroveiなどの他の分類群で記載されている;しかしながら、これらの分類群に関連する記載は、本単離物に観察される特徴と異なる。さらに、PTA-10212は、これらの分類群のいずれに対しても系統発生的な類縁性を示さない。0301表29は、ATCC受託番号PTA-10212として寄託された微生物由来の18srRNA配列の、NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI電子データベースのDNA配列との比較を示す。2つの異なる計算を用いて同一性パーセントを決定した。計算1は、非相同領域または部分配列のいずれからも、配列に出現する任意のギャップを考慮するAlignX-VectorNTI初期設定。計算2は、ギャップの計算ペナルティを含まないAlignX-VectorNTIIDENTITY行列設定。0302表29に示すとおり、同一性の点で、受託番号PTA-10212として寄託された微生物由来の18srRNA遺伝子配列は、NCBIデータベースで利用可能な18srRNA遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。一般に、生物は異なる属または種に属しながらより近縁の関係にある18srRNA遺伝子配列を有し得ることが認識されている。0303上記の特徴付けに基づけば、単離された微生物ATCC受託番号PTA-10212は新しいトラウストキトリウム属Thraustochytriumの種に相当すると考えられ、従ってまたトラウストキトリウムエスピーThraustochytriumsp.ATCCPTA-10212と命名される。[ATCC受託番号PTA-10208として寄託された単離微生物の分類学的特徴]0304ATCC受託番号PTA-10208として寄託された微生物PTA-10208は、米国特許出願公開第2010/0239533号明細書および国際公開第2010/107415号パンフレットに記載されるATCC受託番号PTA-9695として寄託された微生物PTA-9695のサブ単離株培養物から単離され、新しい別個の明確に異なる培養物として維持される個々の細胞として同定された。0305PTA-10208はPTA-9695と分類学的特徴を共有する。PTA-9695は放出時に双鞭毛遊走子を有し、それが活動的に泳ぎ出して成熟胞子嚢から遊離し、その残された壁は胞子放出後位相差法で明確に確認できることが分かった。PTA-9695胞子嚢の直径は12.5μm~25μmであり、遊走子は2.5μm~2.8μm×4.5μm~4.8μmのサイズであった。個々のPTA-9695胞子嚢につき8~24個の胞子があった。定着したPTA-9695遊走子は大きくなり、急速に二分裂を起こし、四分子、八分子、および最終的に胞子嚢の塊を生じた。四分子の形成は胞子嚢の成熟前の極めて早い段階で始まった。これらの特徴はシゾキトリウム属Schizochytriumに一致している。同一性の点で、PTA-10208が共有するPTA-969518srRNA遺伝子配列は、Honda,D.etal.,JEuk.Micro.466:637-6471999に提供されるT.アグレガツムT.aggregatumの18srRNA遺伝子配列と、全く同じではないものの、近縁関係にあることが分かった。トラウストキトリウムアグレガツムThraustochytriumaggregatumについて発表されている18srRNA配列は部分配列であり、配列の中央に約71DNAヌクレオチドのギャップがある。PTA-9695は新しいシゾキトリウム属Schizochytriumの種に相当すると考えられる。従って、サブ単離株PTA-10208もまた、シゾキトリウムエスピーSchizochytriumsp.ATCCPTA-10208として命名される。[実施例35][ATCC受託番号PTA-10212として寄託された単離微生物の増殖特性]0306単離微生物ATCC受託番号PTA-10212を、以下に記載するとおり、個別の発酵ランで増殖特性について調べた。典型的な培地および培養条件を表30に示す。0307pH7.3で20溶存酸素を有し22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グリセロールおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で138時間の培養後、PTA-10212は26.2g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は7.9g/Lであり;ω-3収率は5.3g/Lであり;EPA収率は3.3g/Lであり;およびDHA収率は1.8g/Lであった。脂肪酸含量は30.3重量であり;EPA含量は脂肪酸メチルエステルFAMEの41.4であり;およびDHA含量はFAMEの26.2であった。これらの条件下で脂質産生能力は1.38g/L/日であり、およびω-3産生能力は0.92g/L/日であり、0.57g/L/日のEPA産生能力および0.31g/L/日のDHA産生能力であった。0308pH7.3で20溶存酸素を有し22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グリセロールおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で189時間の培養後、PTA-10212は38.4g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は18g/Lであり;ω-3収率は12g/Lであり;EPA収率は5g/Lであり;およびDHA収率は6.8g/Lであった。脂肪酸含量は45重量であり;EPA含量はFAMEの27.8であり;およびDHA含量はFAMEの37.9であった。これらの条件下で脂質産生能力は2.3g/L/日であり、およびω-3産生能力は1.5g/L/日であり、0.63g/L/日のEPA産生能力および0.86g/L/日のDHA産生能力であった。0309pH6.8~7.7で20溶存酸素を有し22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グリセロールおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で189時間の培養後、PTA-10212は13g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は5.6g/Lであり;ω-3収率は3.5g/Lであり;EPA収率は1.55g/Lであり;およびDHA収率は1.9g/Lであった。脂肪酸含量は38重量であり;EPA含量はFAMEの29.5であり;およびDHA含量はFAMEの36であった。これらの条件下で脂質産生能力は0.67g/L/日であり、ω-3産生能力は0.4g/L/日であり、0.20g/L/日のEPA産生能力および0.24g/L/日のDHA産生能力であった。0310pH6.6~7.2で20溶存酸素を有し22.5~28.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グリセロールおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で191時間の培養後、PTA-10212は36.7g/L~48.7g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は15.2g/L~25.3g/Lであり;ω-3収率は9.3g/L~13.8g/Lであり;EPA収率は2.5g/L~3.3g/Lであり;およびDHA収率は5.8g/L~11g/Lであった。脂肪酸含量は42.4重量~53重量であり;EPA含量はFAMEの9.8~22であり;およびDHA含量はFAMEの38.1~43.6であった。これらの条件下で脂質産生能力は1.9g/L/日~3.2g/L/日であり、ω-3産生能力は1.2g/L/日~1.7g/L/日であり、0.31g/L/日~0.41g/L/日のEPA産生能力および0.72g/L/日~1.4g/L/日のDHA産生能力であった。[ATCC受託番号PTA-10208として寄託された単離微生物の増殖特性]0311単離微生物ATCC受託番号PTA-10208を、以下に記載するとおり、個別の発酵ランで増殖特性について調べた。典型的な培地および培養条件を表31に示す。0312窒素供給中は20溶存酸素およびその後10溶存酸素を有し、pH7.0、22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グルコースおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で200時間の培養後、PTA-10208は95g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は53.7g/Lであり;ω-3収率は37g/Lであり;EPA収率は14.3g/Lであり;およびDHA収率は21g/Lであった。脂肪酸含量は57重量であり;EPA含量はFAMEの27.7であり;およびDHA含量はFAMEの39.1であった。これらの条件下で脂質産生能力は6.4g/L/日であり、およびω-3産生能力は4.4g/L/日であり、1.7g/L/日のEPA産生能力および2.5g/L/日のDHA産生能力であった。0313窒素供給中は20溶存酸素およびその後10溶存酸素を有し、pH7.5、22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グルコースおよび窒素供給培養液において、10Lの発酵槽容量で139時間の培養後、PTA-10208は56g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は53g/Lであり;ω-3収率は34g/Lであり;EPA収率は11.5g/Lであり;およびDHA収率は22g/Lであった。脂肪酸含量は58重量であり;EPA含量はFAMEの21.7であり;およびDHA含量はFAMEの41.7であった。これらの条件下で脂質産生能力は9.2g/L/日であり、およびω-3産生能力は5.9g/L/日であり、2g/L/日のEPA産生能力および3.8g/L/日のDHA産生能力であった。0314窒素供給中は20溶存酸素およびその後10溶存酸素を有し、pH7.0、22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グルコースおよび窒素供給培養液において、2000Lの発酵槽容量で167時間の培養後、PTA-10208は93.8g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は47.2g/Lであり;ω-3収率は33.1g/Lであり;EPA収率は10.5g/Lであり;およびDHA収率は20.4g/Lであった。脂肪酸含量は50.6重量であり;EPA含量はFAMEの23であり;およびDHA含量はFAMEの42.6であった。これらの条件下で脂質産生能力は6.8g/L/日であり、およびω-3産生能力は4.7g/L/日であり、1.5g/L/日のEPA産生能力および2.9g/L/日のDHA産生能力であった。0315窒素供給中は20溶存酸素およびその後10溶存酸素を有し、pH7.0、22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グルコースおよび窒素供給培養液において、2000Lの発酵槽容量で168時間の培養後、PTA-10208は105g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は46.4g/Lであり;ω-3収率は33g/Lであり;EPA収率は10.7g/Lであり;およびDHA収率は20.3g/Lであった。脂肪酸含量は43.9重量であり;EPA含量はFAMEの24であり;およびDHA含量はFAMEの43.7であった。これらの条件下で脂質産生能力は6.6g/L/日であり、およびω-3産生能力は4.7g/L/日であり、1.5g/L/日のEPA産生能力および2.9g/L/日のDHA産生能力であった。0316窒素供給中は20溶存酸素およびその後10溶存酸素を有し、pH7.0、22.5°Cで1000ppmCl-を含む炭素グルコースおよび窒素供給培養液において、2000Lの発酵槽容量で168時間の培養後、PTA-10208は64.8g/Lの乾燥細胞重量を生じた。脂質収率は38.7g/Lであり;ω-3収率は29.9g/Lであり;EPA収率は8.5g/Lであり;およびDHA収率は16.7g/Lであった。脂肪酸含量は59.6重量であり;EPA含量はFAMEの23であり;およびDHA含量はFAMEの42.3であった。これらの条件下で脂質産生能力は5.53g/L/日であり、およびω-3産生能力は3.8g/L/日であり、1.2g/L/日のEPA産生能力および2.3g/L/日のDHA産生能力であった。[実施例36][微生物株ATCCPTA-10208およびPTA-10212の脂肪酸プロファイル]03174つのバイオマス試料PTA-10208試料1;PTA-10208試料2;PTA-10212試料1;およびPTA-10212試料2を溶媒抽出により総粗油含量について分析し、高速液体クロマトグラフィー/蒸発光散乱検出HPLC/ELSDにより脂質クラスを決定し、HPLC/質量分析法HPLC/MSによりトリアシルグリセロールTAGを分析し、および水素炎イオン化検出ガスクロマトグラフィーGC-FIDにより脂肪酸FAプロファイルを決定した。各凍結乾燥バイオマスの粗脂質含量を、ヘキサンによる溶媒粉砕solventgrindingを用いて決定し、直接エステル交換反応により生成したFAMEの合計mg/gと比較し、得られた脂肪酸メチルエステルFAMEをGC/FID分析により定量化した。抽出された粗脂質中の脂肪酸もまたエステル交換反応により定量化し、得られたFAMEのGC/FID分析を用いて定量化した。抽出された粗脂質において、ELSDを伴う順相HPLCおよび大気圧化学イオン化MSAPCI-MS同定法を用いて全ての中性脂質NLおよび遊離脂肪酸FFAの重量パーセントを決定した。この方法は、ステロールエステルSE、TAG、遊離脂肪酸FFA、1,3-ジアシルグリセロール1,3-DAG、ステロール、1,2-ジアシルグリセロール1,2-DAG、およびモノアシルグリセロールMAGを分離し、定量化する。結果を以下の表32および表33に示す。表32および表33の脂肪酸プロファイルは、溶媒を使用して抽出した試料から得られたことが注記される。表32および表33の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。03184つのバイオマス試料PTA-10208試料1;PTA-10208試料2;PTA-10212試料1;およびPTA-10212試料2から抽出した粗油から、TAGおよびリン脂質PLを単離した。TAGは低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて単離し、およびPLは固相抽出SPEを用いて単離した。各単離された画分の同一性を薄層クロマトグラフィーTLCによって確認した。単離したTAG画分およびPL画分の脂肪酸プロファイルは、GC-FIDを用いて直接エステル交換反応後にFAMEとして決定した。結果を以下の表34および表35に示す。0319微生物株ATCCPTA-10212に由来するバイオマスのさらに2つの試料PTA-10212試料3およびPTA-10212試料4についての総粗油含量および単離した脂質クラスの脂肪酸プロファイルもまた決定した。粗油は各試料からヘキサン抽出により得て、個々の脂質クラスは低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて単離した。バイオマス、粗油、および単離画分の脂肪酸プロファイルをGC-FIDを用いてFAMEとして決定した。結果を以下の表36~表39に示す。表36~表39の脂肪酸プロファイルは、典型的なヘキサン抽出を用いて抽出した試料から得られたことが注記される。表36~表39の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。0320先にFRIOLEX登録商標法を用いて抽出した微生物株ATCCPTA-10212由来の粗油の試料PTA-10212試料5から個々の脂質クラスを単離し、GC-FIDを用いて各クラスの脂肪酸プロファイルをFAMEとして決定した。結果を以下の表40および表41に示す。表40および表41の脂肪酸プロファイルは、FRIOLEX登録商標法を用いて抽出した試料から得られたことが注記される。表40および表41の脂肪酸プロファイルは、本発明の方法を用いて試料を抽出した場合に実質的に同じになることが予想される。0321微生物株ATCCPTA-10208由来の粗油の試料PTA-10208試料3から、ELSDを伴う順相HPLCおよびAPCI-MS同定法を用いて個々の脂質クラスを単離した。[実験手順]0322粗油抽出-粗油は凍結乾燥バイオマスの試料から溶媒粉砕を用いて抽出した。例えば、約3グラムのバイオマスをスウェーデン管Swedishtubeに秤量した。スウェーデン管に3個のボールベアリングおよび30mLのヘキサンを加え、それをネオプレン栓で密閉し、振盪機に2時間置いた。得られたスラリーを、ブフナー漏斗およびワットマンろ紙を使用してろ過した。ろ過された液体を回収して溶媒を真空下で除去し、残った粗脂質の量を重量測定法で決定した。0323脂肪酸分析-バイオマス、抽出した粗脂質、および単離した脂質クラスの試料を、脂肪酸組成についてFAMEとして分析した。簡潔に言えば、凍結乾燥したバイオマスおよび単離した脂質クラスをねじ口試験管に直接量り取り、一方で粗油の試料を約2mg/mLの濃度となるようヘキサンに溶解した。内部標準を含むトルエン、およびメタノール中1.5NHClを各管に加えた。管をボルテックスし、次に蓋をして100°Cに2時間加熱した。管を放冷し、水中飽和NaClを添加した。管を再びボルテックスし、遠心して層を分離させた。次に有機層の一部分をGCバイアルに入れ、GC-FIDにより分析した。Nu-Check-PrepGLC参照標準NuCheck,Elysian,MNを使用して作成した3点校正曲線を用いてFAMEを定量化した。抽出物中に存在する脂肪酸は、mg/gおよび重量パーセントとして表現した。GC-FIDにより分析したときの内部標準と等しい反応を仮定して、試料中の脂肪含量を推定した。0324HPLC/ELSD/MS方法-0325固相抽出-粗脂質から、VacElut装置VarianInc,PaloAlto,米国に置いた2gのアミノプロピルカートリッジBiotage,Uppsala,スウェーデンを使用して固相抽出SPEによりPL画分を分離した。カートリッジは15mgのヘキサンでコンディショニングし、約60mgの各試料を1mLのCHCl3に溶解してカートリッジに適用した。カラムを15mLの2:1CHCl3:イソプロピルアルコールで洗浄して全ての中性脂質を溶出し、それを廃棄した。次に15mLのエーテル中2酢酸HOAcで脂肪酸を溶出し、それを廃棄した。PL部分を15mLの6:1のメタノール:クロロホルムで溶出し、それを回収して窒素下で乾燥し、秤量した。0326フラッシュクロマトグラフィー-フラッシュクロマトグラフィーを用いて粗油中に存在する脂質クラスを分離した。ヘキサンに溶解した約200mgの粗油をカラムのヘッドに注入した。クロマトグラフィーシステムはシリカゲル60EMDChemical,Gibbstown,NJを利用し、その移動相は石油エーテルおよび酢酸エチルからなり、5mL/分表6~表7または3mL/分表8~表13であった。段階的勾配を用いてカラムから各脂質クラスを選択的に溶出した。移動相勾配は100石油エーテルから開始し、50酢酸エチルで終了した。GilsonFC204ラージベッドlarge-bedフラクションコレクターGilson,Inc.,Middleton,WIを使用して画分を10mL試験管に回収した。各管を薄層クロマトグラフィーTLCにより分析し、個々の脂質クラスが入った管予想保持係数Rfを有するTLCプレート上のシングルスポットにより判断するときをプールし、濃縮乾固して秤量した。次に総画分含量を重量測定法で決定した。0327TLC分析-シリカゲルプレートで薄層クロマトグラフィーを実施した。石油エーテル:エチルエーテル:酢酸80:20:1からなる溶媒系を使用してプレートを溶出し、ヨウ素蒸気を用いて可視化した。次に各スポットのRf値を各脂質クラスについて既報の文献値と比較した。0328TAG画分およびPL画分の分析-単離したTAG画分およびPL画分を、脂肪酸組成について脂肪酸メチルエステルFAMEとして分析した。TAG画分を約1~2mg/mLの濃度となるようヘキサンに溶解した。その溶液の1mLアリコートを窒素下で濃縮乾固した。内部標準を含むトルエン、およびメタノール中1.5NHClを各管に加えた。管をボルテックスし、次に蓋をして100°Cに2時間加熱した。内部標準およびHClメタノールは、PL画分が入った管に直接添加して加熱した。管を放冷し、水中飽和NaClを添加した。管を再びボルテックスして遠心し、層を分離させた。次に有機層の一部分をGCバイアルに入れ、GC-FIDにより分析した。Nu-Check-PrepGLC502B参照標準NuCheck,Elysian,MNを使用して作成した3点校正曲線を用いてFAMEを定量化した。抽出物中に存在する脂肪酸は、FAMEのmg/gおよびとして表現した。[結果][PTA-10208試料1]0329PTA-10208試料1についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、GC/FIDを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、28.6mgのバイオマスをFAME管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、55.0mgの粗脂質を50mLメスフラスコに量り取り、且つ1mlを別のFAME管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、FID検出によるGCを用いて53.2FAMEの合計としてと決定され、一方、乾燥バイオマスから52.0wt/wtの脂質が抽出され、97.8の総脂質回収率が得られた。粗脂質はGC/FIDを用いて91.9脂肪酸FAMEの合計としてと決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、C16:0182.5mg/g、C20:5n-3186.8mg/g、およびC22:6n-3423.1mg/gであった。0330抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、55.0mgの粗脂質を50mLメスフラスコに秤量し、且つアリコートをHPLC/ELSD/MS分析用のHPLCバイアルに移すことにより決定した。HPLC/ELSD/MS分析によれば、粗脂質は0.2のステロールエステルSE、95.1のTAG、0.4のステロール、および0.5の1,2-ジアシルグリセロールDAGを含有した。TAG画分の5はTAGピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。0331フラッシュクロマトグラフィーにより決定されたとおりのこの試料からの単離TAGは、粗油の約92.4を構成した。PLはSPE単離後の重量またはTLCによっては検出されなかった。TAGに含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:0189mg/g、C20:5n-3197mg/g、およびC22:6n-3441mg/gであった。[PTA-10208試料2]0332PTA-10208試料2についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、GC/FIDを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、32.0mgのバイオマスをFAME管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、60.1mgの粗脂質を50mLメスフラスコに量り取り、且つ1mlを別のFAME管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、FID検出によるGCを用いて52.4FAMEの合計としてと決定され、一方、乾燥バイオマスから48.0wt/wtの脂質が抽出され、91.7の総脂質回収率が得られた。粗脂質はGC/FIDを用いて95.3脂肪酸FAMEの合計としてと決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、C16:0217.5mg/g、C20:5n-3169.3mg/g、およびC22:6n-3444.1mg/gであった。0333抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、60.1mgの粗脂質を50mLメスフラスコに秤量し、且つアリコートをHPLC/ELSD/MS分析用のHPLCバイアルに移すことにより決定した。HPLC/ELSD/MS分析によれば、粗脂質は、0.2のSE、95.7のTAG、0.3のステロール、および0.7の1,2-DAGを含有した。TAG画分の5.1はTAGピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。0334この試料からの単離TAGは、粗油の約93.9を構成した。PLはSPE分離後の重量またはTLCによっては検出されなかった。TAGに含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:0218mg/g、C20:5n-3167mg/gおよびC22:6n-3430mg/gであった。[PTA-10208試料3]0335ATCC受託番号PTA-10208として寄託された微生物由来の粗油の試料試料PTA-102083を、HPLC/ELSD/MSを用いて分析した。合計98.38の脂質が回収され、ステロールエステルSE画分が0.32を占め、TAG画分が96.13を占め、1,3-ジアシルグリセロールDAG画分が0.22を占め、1,2-DAG画分が0.78を占め、およびステロール画分が0.93を占めた。[PTA-10212試料1]0336PTA-10212試料1についてのバイオマスおよび抽出した粗脂質の脂肪酸プロファイルを、GC/FIDを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、27.0mgのバイオマスをFAME管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、52.5mgの粗脂質を50mLメスフラスコに量り取り、且つ1mlを別のFAME管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、FID検出によるGCを用いて38.3FAMEの合計としてと決定され、一方、乾燥バイオマスから36.3wt/wtの脂質が抽出され、94.6の総脂質回収率が得られた。粗脂質はGC/FIDを用いて83.2脂肪酸FAMEの合計としてと決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、C16:0328.5mg/g、C20:5n-390.08mg/g、およびC22:6n-3289.3mg/gであった。0337抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、52.5mgの粗脂質を50mLメスフラスコに秤量し、且つアリコートをHPLC/ELSD/MS分析用のHPLCバイアルに移すことにより決定した。HPLC/ELSD/MS分析によれば、粗脂質は、0.2のSE、64.2のTAG、1.9のFFA、2.8の1,3-DAG、1.4のステロール、18.8の1,2-DAG、および0.5のMAGを含有した。TAG画分の3.4はTAGピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。0338この試料からの単離TAGは、粗油の約49.8を構成した。単離PLは粗油の約8.1を構成した。TAG画分に含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:0400mg/g、C20:5n-391mg/g、およびC22:6n-3273mg/gである。PL画分に含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:098mg/g、C20:5n-333mg/g、およびC22:6n-3227mg/gである。[PTA-10212試料2]0339バイオマスおよび抽出した粗脂質PTA-10212試料2の脂肪酸プロファイルを、GC/FIDを用いて決定した。バイオマス中の脂肪酸は、29.5mgのバイオマスをFAME管に直接量り取ることによりインサイチュでエステル交換し、一方、抽出した粗脂質の試料は、56.5mgの粗脂質を50mLメスフラスコに量り取り、且つ1mlを別のFAME管に移すことにより調製した。バイオマスの推定粗脂質含量は、FID検出によるGCを用いて40.0FAMEの合計としてと決定され、一方、乾燥バイオマスから41.3wt/wtの脂質が抽出され、106.1の総脂質回収率が得られた。粗脂質はGC/FIDを用いて82.8脂肪酸FAMEの合計としてと決定された。粗脂質に含まれる主要な脂肪酸は、C16:0327.3mg/g、C20:5n-392.5mg/g、およびC22:6n-3277.6mg/gであった。0340抽出した粗脂質の脂質クラスプロファイルを、56.5mgの粗脂質を50mLメスフラスコに秤量し、且つアリコートをHPLC/ELSD/MS分析用のHPLCバイアルに移すことにより決定した。HPLC/ELSD/MS分析によれば、粗脂質は、0.2のSE、58.2のTAG、2.3のFFA、3.4の1,3-DAG、1.7のステロール、23.4の1,2-DAG、および0.6のMAGを含有した。TAG画分の3.3はTAGピークのすぐ後に溶出したピークを含んだが、これは認識可能な質量スペクトルを提供しなかった。0341この試料からの単離TAGは、粗油の約51.9を構成した。単離PLは粗油の約8.8を構成した。TAG画分に含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:0402mg/g、C20:5n-392mg/g、およびC22:6n-3245mg/gである。PL画分に含まれた主要な脂肪酸>50mg/gは、C16:0121mg/g、C20:5n-348mg/g、およびC22:6n-3246mg/gである。[PTA-10212試料3]0342PTA-10212試料3についてのバイオマスの脂質含量は、FAME合計として34であると推定され、溶媒抽出後に得られた粗油の量は37重量であり、バイオマス中に存在する脂質の109の回収率が得られた。フラッシュクロマトグラフィーを用いた分画後、粗油の約46がTAGとして単離され、28がDAGとして単離された。粗油は309mg/gのDHAおよび264mg/gのEPAを含有した。単離TAGは、341mg/gのDHAおよび274mg/gのEPAを含有した。単離DAG画分は、262mg/gのDHAおよび237mg/gのEPAを含有した。バイオマス、抽出した粗油、および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを、それぞれmg/gおよびFAMEとして計算した以下の表36および表37に示す。[PTA-10212試料4]0343PTA-10212試料4は、FAME合計として決定される約23の脂質を含有し、そのうち107がヘキサン抽出を用いて回収された。フラッシュクロマトグラフィーを用いた分画後、粗油の約42がTAGとして単離され、18がDAGとして単離された。粗油は、275mg/gのDHAおよび209mg/gのEPAを含有した。単離TAGは296mg/gのDHAおよび205mg/gのEPAを含有した。単離DAG画分は245mg/gのDHAおよび219mg/gのEPAを含有した。バイオマス、抽出した粗油、および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを以下の表38mg/gおよび表39FAMEに示す。[PTA-10212試料5]0344PTA-10212のバイオマスからFRIOLEX登録商標法GEAWestfaliaSeparatorUKLtd.,MiltonKeynes,英国を用いて粗油の試料を抽出し、微生物油PTA-10212試料5を得た。PTA-10212試料5から低圧フラッシュクロマトグラフィーを用いて個々の脂質クラスを単離し、各クラスの重量パーセントを決定した。各クラスの脂肪酸プロファイルを、GC-FIDを用いて決定した。0345簡潔に言えば、240mgの粗油を600μLのヘキサンに溶解してカラムのヘッドに適用することにより、試料を調製した。フラッシュクロマトグラフィーを用いて試料を分画したところ、全ての画分の合計重量は240mgであり、100の回収率が得られた。ステロールエステル画分が0.9を占め、TAG画分が42.6を占め、遊離脂肪酸FFA画分が1.3を占め、ステロール画分が2.2を占め、およびDAG画分が41.6を占めた。それぞれmg/gおよびFAMEとして計算したFRIOLEX登録商標粗油および単離した画分の全脂肪酸プロファイルを、以下の表40および表41に示す。[実施例37]0346粗油を、精製、脱色および脱臭によってさらに処理して精製油を得た。この精製油を高オレイン酸ヒマワリ油で希釈して、DHA含量が約400mg/gの最終油を得た。個々の脂質クラスを単離し、各クラスの脂肪酸プロファイルをGC-FIDを用いてFAMEとして決定した。[PTA-10208最終油]0347単離したTAG画分表44~表45および単離したステロール/DAG画分表46~表47に関連するプロファイルを含めた、PTA-10208最終油1~5についての脂肪酸プロファイルを、表42~表43に要約する。0348最終油における個々の脂質クラスもまた、フラッシュクロマトグラフィー表48およびELSDによる順相HPLCおよびAPCI-MSの確認表49を用いて決定した。[PTA-10212最終油]0349DHAはPTA-10212最終油中に41.63で366.9mg/g存在し、一方、EPAは16.52で存在した。個々の脂肪酸プロファイルを決定した。それを表50に要約する。[実施例38]0350ATCC受託番号PTA-10208および10212として寄託された単離微生物の2日経過した播種フラスコを、表30および表31による培地中の炭素および窒素供給培養物として調製した。0351突然変異生成を以下の手順に従い実施した:0352滅菌したT=2日経過フラスコ、約50mlを、滅菌した40mlガラスホモジナイザーに注ぎ入れた。ホモジナイザーにおいて培養物に50回のプランジを与えた。培養物をピペットで取り出し、滅菌50ミクロンメッシュフィルターでろ過し、それを50ml滅菌管に入れたメッシュは、より小さい塊および単一の細胞を50ミクロンメッシュに通過させる一方で、より大きいコロニー群を保持する手段として使用した。濃縮された浸軟物の全体を滅菌50ml管に回収した。浸軟した培養物をボルテックスし、最高1:100倍レベルの希釈液を作製した。希釈した浸軟試料をボルテックスした後、4~5個のガラスビーズ3mmガラスビーズが入った培地寒天プレート100×15mmに200μlの播種材料を添加した。ビーズによって播種材料をプレート全体に均等に広げるようにして、各プレートを穏やかに撹拌した。ビーズをプレートから空け、プレートを、蓋をして約5分間静置し、乾燥させた。手順は薄暗い所で行うため、滅菌フードおよび隣接領域の双方の照明を消した。手順を実行可能とするための最小限の光は利用できたが、間接的な薄暗いもののみであった。03535枚の複製プレートをXLクロスリンカーSpectronicsCorporation,NewYorkの底に置き、試料を照射する間、蓋は外した。このクロスリンカーはマイクロジュール単位で出力を送り、90~95死滅を達成するレベルを求めた。同じプロトコルを用いて5枚の複製対照プレートに突然変異を誘発されていない細胞を播種した。これらの細胞カウントを使用して死滅を計算した。照射の終了後プレートを取り出し、蓋を交換し、プレートをパラフィルムparafilmで包み、続いてアルミニウム箔で包んだ。最初の週はプレートを暗所で増殖させることで、損傷した遺伝子を修復できないようにすることが不可欠であった。0354プレートを22.5°Cの室内に約10日置いてからコロニーを計数した。最終的な計数を行ったとき、個々のコロニーを滅菌した播種用ループで選び取り、新しい培地プレートに再度ストリークした。各コロニーを個々のプレートに植えた。プレートが密に増殖したところで播種用ループを使用して試料を採取し、50mlの培地が入った滅菌250ml振盪フラスコに播種した。このフラスコを22.5°Cの室内において200rpmの振盪機に置いた。T=7日目に振盪フラスコ培養物を50ml滅菌管に回収した。pHをとり、試料を遠心してバイオマスペレットを回収した。各試料をリンスし、イソプロピルアルコールと蒸留水との50:50混合物中に再懸濁した後、再度遠心した。回収したペレットを凍結乾燥して秤量し、FAME分析を実施した。表51および表52のデータは、それぞれPTA-10208株およびPTA-10212株から上記の方法で産生した突然変異体を表す。[実施例39]0355微生物細胞シゾキトリウム属Schizochytriumを含む2つの細胞ブロス約13.3kgを20リットル発酵槽において60°Cに加熱した。発酵槽は直径15cmの6ブレードラシュトンRushtonインペラを2つ有した。上のインペラは12リットル標線に位置し、下のインペラは上のインペラの10cm下方に位置した。第1の細胞ブロスは307センチメートル/秒で連続撹拌した。第2の細胞ブロスは464センチメートル/秒で連続撹拌した。酵素すなわち、アルカラーゼAlcalase2.4LFG0.5を細胞バイオマスに添加して細胞を溶解し、乳化した溶解細胞組成物を形成した。この乳化した溶解細胞組成物を、最初に、溶解細胞組成物のpHが10.4から10.6になるまで塩基NaOH、50w/w溶液の250kgで処理した。次に、塩固形NaCl、溶解細胞組成物の2重量の量を溶解細胞組成物に添加した。次に溶解細胞組成物を90°Cの温度に加熱し、20時間にわたりその温度レベルに保持した。各細胞ブロスの試料を取り、pHを8.0に調整して50ml試験管に入れた。試験管を遠心し、油抽出データを計測した。油抽出データを表53に提供する。0356表53に提供するデータは、撹拌速度が高いほど、回収される油の質量が大きくなり、ブロスからの油の収率が高くなり、および未処理の低温殺菌ブロスの固形分含量からの油の収率が高くなることを示している。[結論]0357本明細書に記載される様々な実施形態または選択肢は全て、いかなる変形例にも組み合わせることができる。本発明は、そのいくつかの実施形態を参照して詳細に図示および記載されているが、当業者は、それらが単に例として、且つ限定としてではなく提示されているもので、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくそこに形態および詳細の様々な変更を加え得ることを理解するであろう。従って、本発明の広さおよび範囲は上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されてはならず、以下の特許請求の範囲およびその均等物に従ってのみ定義されるべきである。0358本明細書に引用される全ての文献は、学術誌論文または抄録、公開済みまたは対応する米国または外国の特許文献、発行済みのまたは外国の特許、または任意の他の文献を含めて、各々が、引用される文献中にある全てのデータ、表、図、およびテキストを含め、全体として参照により本明細書に援用される。"