"サンプル中の定量的LPSレベルを測定する方法であって、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bi.タグ;ii.代謝標識;iii.タンパク質標識;iv.タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体;v.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体;vi.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド;vii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド;viii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体;ix.A1アデノシン受容体リガンド;x.シグナル伝達分子;xi.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子;xii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体;およびxiii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子を含む群から選択される部分と結合した少なくとも1つのTRFフルオロフォアを選択すること;ならびにcA1アデノシン受容体タンパク質源;結合した少なくとも1つのTRFフルオロフォア;およびサンプルを利用して、蛍光の測定がLPSの定量的レベルと相関する様式にてTRFアッセイを行うことを含むA1アデノシン受容体TRFアッセイを用いる方法。フルオロフォアがランタニドフルオロフォアである、請求項1に記載の方法。ランタニドフルオロフォアがユーロピウムである、請求項2に記載の方法。フルオロフォアがGTPにキレートされている、請求項2または3に記載の方法。アッセイがGTP結合アッセイである、請求項1に記載の方法。フルオロフォアがGTP、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体、タグ、タンパク質標識、タグまたはタンパク質標識に対する抗体、トロンボキサン、およびcAMPから選択される部分と結合している、請求項1に記載の方法。A1アデノシン受容体タンパク質が細胞または細胞膜内で発現している、請求項1に記載の方法。アッセイが不均一TRFアッセイである、請求項1に記載の方法。アッセイが均一TRFアッセイである、請求項1に記載の方法。サンプルが生物学的サンプルである、請求項1に記載の方法。サンプルが非生物学的サンプルである、請求項1に記載の方法。請求項1のTRFアッセイによって作成されたLPSの標準曲線からサンプル中のLPSの量を測定することを含む、患者の敗血症、グラム陰性細菌感染、およびLPS関連状態を含む群から選択される疾患の存在または活性を診断することをさらに含む、請求項1に記載の方法。サンプル中の定量的LPSレベルを測定する方法であって、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bi.タグ;ii.代謝標識;iii.タンパク質標識;iv.タグ、代謝標識、またはタンパク質標識についての抗体;v.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体;vi.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド;vii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド;viii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体;ix.A1アデノシン受容体リガンド;x.シグナル伝達分子;xi.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子;xii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体;およびxiii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子;を含む群から選択される異なる部分とそれぞれ結合した第1および第2TRFフルオロフォアを選択することであって、2つのフルオロフォア間に、TRFアッセイにおける励起後、測定されうるエネルギー移動があるように選択すること;ならびにcA1アデノシン受容体タンパク質源;結合した第1および第2TRFフルオロフォア;ならびにサンプルを利用して、蛍光の測定がLPSの定量的レベルと相関する様式にてTRFアッセイを行うことを含むA1アデノシン受容体TRFアッセイを用いる方法。フルオロフォアがGTP、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体、タグ、タンパク質標識、タグまたはタンパク質標識に対する抗体、トロンボキサン、およびcAMPから選択される部分と結合している、請求項13に記載の方法。A1アデノシン受容体が細胞または細胞膜内で発現している、請求項13に記載の方法。サンプルが生物学的サンプルである、請求項13に記載の方法。サンプルが非生物学的サンプルである、請求項13に記載の方法。請求項13のTRFアッセイによって作成されたLPSの標準曲線からサンプル中のLPSの量を測定することを含む、患者の敗血症、グラム陰性細菌感染、およびLPS関連状態を含む群から選択される疾患の存在または活性を診断することをさらに含む、請求項13に記載の方法。敗血症、グラム陰性細菌感染、またはLPS関連状態の存在について患者を診断する方法であって、患者から採取した生物学的サンプル中のLPSを測定することを含む方法であり、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bアッセイがLPSについて定量的である、少なくとも1つのTRFフルオロフォアを利用する定量的TRFアッセイを選択すること;cサンプルでアッセイを行うこと;dアッセイにおいてサンプルについての蛍光の量を測定すること;e該サンプルについての蛍光測定と、既知量のLPSを添加したサンプルを使用したステップa~dのアッセイによって作成されたLPSについての標準曲線を比較することによって、蛍光の量から該サンプル中のLPSの量を決定すること;およびf患者から採取した生物学的サンプル中のLPSの量から患者の状態を診断することを含む方法。アッセイが不均一TRFアッセイである、請求項19に記載の方法。アッセイが均一TRFアッセイである、請求項19に記載の方法。アッセイがGTP結合アッセイである、請求項19に記載の方法。フルオロフォアがGTP、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドについての抗体、タグ、タンパク質標識、タグまたはタンパク質標識についての抗体、トロンボキサンおよびcAMPから選択される部分と結合している、請求項19に記載の方法。A1アデノシン受容体が細胞または細胞膜内で発現している、請求項19に記載の方法。サンプル中のLPSレベルを決定するためのキットであって、a少なくとも1つのフルオロフォアを利用する選択されたTRFアッセイ;bA1アデノシン受容体タンパク質源;およびcLPS標準を含むキット。フルオロフォアがGTPまたはGTP結合アッセイ用に設計されたストレプトアビジンにキレートされているランタニドフルオロフォアである、請求項25に記載のキット。TRFアッセイが不均一アッセイである、請求項25に記載のキット。TRFアッセイが均一アッセイである、請求項25に記載のキット。発明の概略現在では、A1アデノシン受容体のLPS活性化は、明確なシグナルをTRFベースのアッセイにおいて誘導し、それは生物学的および非生物学的溶液の両方、例えば水、緩衝液、他の工業溶液、血液製剤から採取したサンプル、ならびに血漿、他の体液、または感染が疑われる臨床現場から採取したサンプル、敗血症の危険性または敗血症を有する患者から採取したサンプル中のLPSを測定するために、十分に高感度で、正確で、信頼できるものであることが発見されている。さらに、TRFアッセイで測定されたLPSは、敗血症の危険性を有し、または敗血症を患う患者を特異的治療、例えば抗敗血症治療薬について階層化するための、高感度で信頼できるバイオマーカーおよび定量的な決定要因としての機能を果たすであろう。さらに、TRFアッセイで測定されたLPSは、LPS関連状態を治療するための抗LPS治療薬について患者を階層化するための、高感度で特異的なバイオマーカーとしての機能を果たすであろう。1つの特定の実施態様は、LPSについてのTRFベースの結合アッセイにおける、グアノシン三リン酸GTPランタニドキレートおよびA1アデノシン受容体タンパク質源の使用を含む。したがって、本発明の1つの実施態様では、サンプル中の定量的LPSレベルを測定する方法であって、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bi.タグ;ii.代謝標識;iii.タンパク質標識;iv.タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体;v.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体;vi.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド;vii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド;viii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体;ix.A1アデノシン受容体リガンド;x.シグナル伝達分子;xi.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子;xii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体;およびxiii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子を含む群から選択される部分と結合した少なくとも1つのTRFフルオロフォアを選択すること;ならびにcA1アデノシン受容体タンパク質源;結合した少なくとも1つのTRFフルオロフォア;およびサンプルを利用して、蛍光の測定がLPSの定量的レベルと相関する様式にてTRFアッセイを行うことを含む、A1アデノシン受容体TRFアッセイを用いる方法がある。さらに別の実施態様では、サンプル中の定量的LPSレベルを測定する方法であって、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bi.タグ;ii.代謝標識;iii.タンパク質標識;iv.タグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体;v.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体;vi.A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド;vii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド;viii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体;ix.A1アデノシン受容体リガンド;x.シグナル伝達分子;xi.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子;xii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体;およびxiii.A1アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子;を含む群から選択される異なる部分とそれぞれ結合した第1および第2TRFフルオロフォアを選択することであって、2つのフルオロフォア間に、TRFアッセイにおける励起後、測定されうるエネルギー移動があるように選択すること;ならびにcA1アデノシン受容体タンパク質源;結合した第1および第2TRFフルオロフォア;ならびにサンプルを利用して、蛍光の測定がLPSの定量的レベルと相関する様式にてTRFアッセイを行うことを含むA1アデノシン受容体TRFアッセイを用いる方法がある。別の実施態様では、敗血症、グラム陰性細菌感染、またはLPS関連状態の存在について患者を診断する方法であって、患者から採取した生物学的サンプル中のLPSを測定することを含む方法であり、aA1アデノシン受容体タンパク質源を選択すること;bアッセイがLPSについて定量的である、少なくとも1つのTRFフルオロフォアを利用する定量的TRFアッセイを選択すること;cサンプルでアッセイを行うこと;dアッセイにおいてサンプルについての蛍光の量を測定すること;e該サンプルについての蛍光測定と、既知量のLPSを添加したサンプルを使用したステップa~dのアッセイによって作成されたLPSについての標準曲線を比較することによって、蛍光の量から該サンプル中のLPSの量を決定すること;およびfサンプル中のLPS量から患者の状態を診断することを含む方法がある。さらに別の実施態様では、サンプル中のLPS量を決定するためのキットであってa少なくとも1つのフルオロフォアを利用する選択されたTRFアッセイ;bA1アデノシン受容体タンパク質源;およびcLPS標準を含むキットがある。発明の詳細な記載この発明は多くの異なる形態において実施態様の影響を受けやすく、図面において示され、本明細書で詳細な特定の実施態様に記載されている一方、該実施態様の開示は原理の一例として考えられるべきであり、示され、記載されている特定の実施態様に本発明を限定することは意図していないと理解されたい。この詳細な記載は本明細書で用いられる用語の意味を定義しており、当業者が本発明を実施するために実施態様を具体的に記載している。定義本明細書で用いられている用語aまたはanは、1または2以上を意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語複数は、2または3以上を意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語別のは、少なくとも第2またはそれ以上のものを意味するものとして定義されている。本明細書で用いられている用語含むおよび/または有するは、含むことすなわち、オープンランゲージとして定義されている。本明細書で用いられている用語共役したは、必ずしも直接的ではなく、必ずしも機械的ではないが、結合しているものとして定義されている。用語約は、±10パーセントを意味する。この文書の全体を通して、1つの実施態様、特定の実施態様、および実施態様または類似の用語への言及は、実施態様に関連して記載される特定の特色、構造、または特徴が本発明の少なくとも1つの実施態様に含まれることを意味する。それゆえ、この明細書を通じた様々な場所における該語句の出現は、必ずしも全て同一の実施態様を指すわけではない。さらに、特定の特色、構造、または特徴は、1つ以上の実施態様で限定されることなく、いずれかの適切な様式で組み合わせられてよい。本明細書で用いられている用語またはは、いずれか1つまたはいずれかの組み合わせの意味が含まれるものと解釈されたい。それゆえ、A、BまたはCは、以下のいずれかを意味する:A;B;C;AおよびB;AおよびC;BおよびC;A、BおよびC。この定義の例外は、要素、機能、ステップまたは作用の組み合わせが何らかの本質的に相互排他的なものである場合にのみ生じるであろう。図面で特徴付けられている図は、本発明の特定の好都合な実施態様を説明する目的で提供されており、それに限定されるものとして考えられるべきではない。動作の現在分詞に先行する用語意味するは所望の機能を示し、そのために所望の機能を達成するための1つ以上の実施態様、すなわち、1つ以上の方法、装置、または器具があり、当業者は本明細書の開示を考慮してこれらまたはそれらの均等物から選択することができ、用語意味するの使用は限定すること意図していない。本明細書で用いられているリポ多糖LPSエンドトキシンとしても知られているは、グラム陰性細菌の外壁の主要な成分である糖脂質を指す。それは通常、動物の血中に低濃度で見られる。それは、レベルが血中で上昇し、他の体液に低濃度でも存在している場合、疾患状態の指標として知られる。それは、炎症性サイトカインの放出を含む免疫応答を誘導することができる。十分に高い濃度では、LPSは敗血症、敗血症ショック、および臓器障害、ならびに不全症を生じるメディエーターの放出を誘導することができる。さらに、LPSは発熱物質、すなわち、熱誘発物質として作用しうる。さらに、臓器、例えば眼、膀胱、耳の中のグラム陰性細菌感染から放出されたLPS、または腸内のグラム陰性細菌から放出された血漿中に循環しているLPSは、LPS関連状態の原因となりうる。したがって、LPSは発熱物質、グラム陰性細菌感染、敗血症、およびLPS関連状態の存在または活性の指標として知られている。本明細書で用いられている用語タンパク質は、アミノ酸を含有するいずれかの分子を含み、RNA、RNAi、siRNA、shRNA、miRNA、RNAポリメラーゼ、DNA、dsDNA、DNAベクター、DNA断片、DNAプロモーター、単一ヌクレオチド多型SNPs、クロマチン、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、エピトープ、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、および酵素などを含む。タンパク質は自然に生じたものでもよく、自然に組換えられたものでもよく、または遺伝的に操作されたものでもよい。タンパク質は可溶化または精製されていてよい。タンパク質は糖または脂質に抱合されていてよい。それは、別のタンパク質に結合してタンパク質複合体または融合タンパク質を形成していてよい。タンパク質にはタグがつけられていてよい。タンパク質は二量体またはタンパク質のサブユニット、例えばGタンパク質のサブユニットであってよい。さらに、タンパク質はナノ粒子に結合していてよい。タンパク質源は、限定されるものではないが哺乳類、魚類、爬虫類、植物、昆虫、細菌、酵母、および真菌を含む。タンパク質源は、植物、酵母、昆虫、または哺乳類に由来する組織および細胞または組織もしくは細胞から調製された膜、例えば最適なタンパク質、例えばA1アデノシン受容体タンパク質を発現しているチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞またはSf9昆虫細胞を含む。本明細書で用いられている用語シグナル伝達分子は、限定されるものではないが、タグを有しまたは有さないいずれかの物質を含み、A1アデノシン受容体の活性化後に測定されうるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、エピトープ、酵素、キナーゼ、DNA、RNA、アンチセンス分子、ホスファターゼ、トロンボキサン、インターロイキン、サイトカイン、環状アデノシン一リン酸cAMP、GTP、核内因子κβNF-κβ、NF-κβのサブユニット、イノシトール三リン酸IP3、タンパク質キナーゼCPKC、ジアシルグリセロールDAG、熱ショックタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼmatrixmetaloproteinanses、増殖因子、および他の分子を含む。本明細書で用いられている用語敗血症sepsisは、敗血症sepsis、敗血症septicemia菌血症/内毒血症、重度敗血症、敗血症ショック、および関連状態、ならびにこれらの状態のそれぞれと関連する臨床症状および合併症を含む。用語LPS関連状態は、サンプル中のLPSのレベルが状態の存在と相関する状態を含む。例えば、1羊水において、LPSのレベルは妊娠中の早期破水の発生率と相関するHazanetalActaOstetGynecolScand742752801995;2術後の患者の血中において、LPSレベルは呼吸器および腎臓合併症の発生率と相関するBergeretalESurgRes281301391996;3喘息において、ハウスダスト中のLPSレベルは喘息の重症度と相関するMicheletalAmJRespCritCareMed154164116461996;4壊死性腸炎を患う新生児の便において、LPSレベルは腸粘膜疾患の重症度と相関するDuffyetalDigestiveDisandSci423593651997;5尿中において、LPSレベルはグラム陰性感染の存在と相関するHurleyandTosoliniJMicrobiolMethods1691991992;6インビトロ受精についての培地において、LPSレベルは胚の生存と相関するNagattaandShirakawaFertilityandSterility656146191996;ならびに、7持続的携帯型腹膜透析CAPD患者の腹水において、LPSレベルはグラム陰性腹膜炎の診断について100の感度および特異性を有するIshizakietalAdvancesinPeritonealDialysis121992021996。血漿または他の患者サンプル中のLPSレベルは、他の状態、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病もしくはパーキンソン病、または線維症および硬化症をもたらす疾患、例えば炎症および自己免疫疾患と関連しうるJaegeretalBrainBehavImmun235075172009VillaranetalJNeurochem114168717002010。さらなる例およびLPS関連状態の言及については、米国特許第6,117,445号参照することによって本明細書に援用されるを参照のこと。血液または体内の感染が疑われる部位から採取したサンプルについて細菌培養報告を得るには24~48時間を要するため、LPSの検出および測定についての高感度で特異的な適時アッセイは多数の臨床状態および状況において貴重である。血液、体液、腔、および組織中のLPSの測定は、医師がグラム陰性細菌感染の存在を診断し、広域スペクトル抗生物質の使用を避けながらグラム陰性細菌感染に対するより特異的な治療をより早く処方することを可能にするであろう。さらに、耳の細菌培養が陰性である場合、耳の中のLPSレベルはグラム陰性細菌感染および中耳炎の存在を示唆しうる。さらに、脳脊髄液CSF中のLPSレベルは、CSF細菌培養が陰性である場合、グラム陰性細菌感染および髄膜炎の存在を示しうる。また、腹部大手術後の腹水中にLPSレベルが検出された場合、これは外科的ドレナージを必要とする腹腔内感染の存在を示唆しうる。最終的に、特定の抗生物質または抗生物質の組み合わせがグラム陰性細菌からのLPSの放出を誘導することが報告されているHurleyDrugSafety121831951995。LPSの検出および測定のための高感度で特異的なアッセイは、この重要な医薬の分野および抗生物質処方の実施についての研究を可能にし、おそらく抗生物質治療の開発に影響を与えるであろう。LPSを検出および測定するためのTRFアッセイを使用する臨床分野は、限定されるものではないが、敗血症、グラム陰性細菌感染、LPS関連状態についての臨床診断、心肺バイパス手術、手術前にサンプル、例えば血液中のLPSのレベルを決定する手術前試験、血液製剤のスクリーニング、妊娠の尿路感染および無症候性細菌尿を診断するポイントオブケア試験、透析液肝臓および腹膜のスクリーニング、低pg/mlLPSレベルが胚の死と相関するインビトロ受精上記のNagattaandShirakawa;ならびにLPSレベルが臓器移植の不全と相関しうる臓器移植バスを含む。LPSを検出および測定するTRFアッセイを使用する非臨床分野は、限定されるものではないが、研究使用限定RUOおよび工業使用を含む。工業使用は:ヒト使用のためにFDAに要求されるLPSレベルについて薬物、医療機器、および生物製剤をスクリーニングすること、レジオネラについて冷却システム中の水を試験すること、加湿器、例えば換気装置を接続されたものの中の水を試験すること、半導体製造施設についての水を試験すること、飲料水を試験すること、コンタクトレンズ液をモニターすること、ならびにLPS混入について化粧品を試験することを含む。したがって、本発明の方法およびキットは、動物におけるLPSのレベルを決定し、これらの状態を診断するために用いられうる。動物は限定されるものではないが、哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および有袋類を含むことを意味し、1つの実施態様ではヒトである。それゆえ、動物由来のサンプル中のLPSの存在およびレベルを測定することによって、上記の状態を迅速かつ正確に診断することができる。本明細書で用いられている用語サンプルは、限定されるものではないが、動物に由来する生物学的サンプル、例えば全血、血漿、血清、CSF、尿、唾液、耳液、子宮液、眼液、胸水、腹水、気管支肺胞洗浄液、心膜液、滑液、洞液、および嚢胞からの液、胚培地、ならびに非生物学的サンプル、例えば臓器バス、医薬溶液および製剤、血液製剤、医療機器、透析液、ならびに工業溶液および製剤を指す。本発明のサンプルはTRFアッセイにて試験することが可能な状態になければならず、それゆえ一般的にサンプルは液体状態、例えば溶液または懸濁液の状態であろう。時間分解蛍光アッセイは、時間分解検出励起と発光検出の間の遅延と組み合わせた1つ以上の長寿命フルオロフォアの使用を含み、大きな蛍光干渉なく検出することを可能にする。これらのアッセイは、現在、不均一または均一のいずれかの性質を有する。本発明のアッセイは、A1アデノシン受容体の使用を含む。A1アデノシン受容体を用いたTRFアッセイを調整することは、当業者の技術の範囲内である。全てのGPCRsは、最適な結合のために、例えばGTP結合のために異なる条件を必要とする。それゆえ、当業者は、特異的GPCR、例えば本発明で利用されるA1アデノシン受容体のための緩衝液条件を最適化するであろう。これらの緩衝液条件は、当該技術分野で知られているように、A1アデノシン受容体のタンパク質源、例えば細胞もしくは細胞、組織、植物、もしくは細菌に由来する膜内で安定に発現し、または細胞、組織、植物、もしくは細菌に由来する膜から可溶化もしくは精製された組換えA1アデノシン受容体に基づいて異なってよい。TRFアッセイは全て、部分、例えばタンパク質またはリガンドと結合した少なくとも1つのフルオロフォアを有する。本発明に有用なフルオロフォアは周知であり、適合するように容易に選択されうる。フルオロフォアが選択されると、例えば、タグ、代謝標識、A1アデノシン受容体タンパク質についてのA1アデノシン受容体タンパク質もしくはペプチドに対する抗体、またはA1アデノシン受容体タンパク質もしくはペプチド、またはアッセイのタイプと一貫性があるものなどにキレート化することによって結合することができる。1つの実施態様では、フルオロフォアはGTPにキレートされている。1つの周知のTRF結合アッセイは、不均一および均一TRFアッセイの両方で利用されうるGTP結合アッセイである。GTP-ランタニド部分を利用すると、典型的には、蛍光は620nmで測定されうる。該部分の1つの実施態様は、ユーロピウムにキレートされているGTPEu-GTPである。GTP結合アッセイは一般的に周知であり、A1アデノシン受容体およびLPSを用いる本発明への適用は、この開示を考慮すると、当業者の技術の範囲内である。本明細書で用いられているように、フルオロフォアと結合するように選択される部分は、aタグ;b代謝標識;cタンパク質標識;dタグ、代謝標識、またはタンパク質標識に対する抗体;eA1アデノシン受容体タンパク質またはペプチドに対する抗体;fA1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド;gA1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチド;hA1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質またはペプチドに対する抗体;iA1アデノシン受容体リガンド;jシグナル伝達分子;kA1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子;lA1アデノシン受容体シグナル伝達経路の分子に対する抗体;およびmA1アデノシン受容体シグナル伝達経路において測定されうる分子を含む群から選択される。不均一アッセイはフルオロフォアでタグ付けした1つの試薬を利用し、それゆえ分析物、例えばLPSを測定するために用いられる。このアッセイは、非結合標識パートナーunboundlabeledpartnerから結合標識パートナーboundを分離するために、洗浄および濾過ステップを必要とする。これらのタイプのアッセイは、多くの場合において、ランタニド系列の希土類元素の蛍光特性を利用する。これらのアッセイに通常用いられるランタニドは、サマリウム、ユーロピウム、テルビウム、およびジスプロシウムである。これらの実施態様は、他のフルオロフォアと比較して大きなストークシフトおよび極度に長い発光半減期を有するため、利用される。これらのアッセイのタイプは、競合性の、または結合性のタイプになる傾向がある。A1アデノシン受容体についてのTRFアッセイにおいて、フルオロフォアは次のようなタグにキレートされ、共役し、抱合され、または結合していてよい:例えばS-ニトロソ-N-アセチルペニシラミンSNAP、クラスII関連インバリアント鎖ペプチドCLIP、キチン結合タンパク質CBP、マルトース結合タンパク質MBP、もしくはACP/MCPタグ、緑色蛍光タンパク質GFP、FLAG、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、ヒスチジンHIS、酸アジドホモアラニンAHAまたはHPGタグ、もしくは代謝標識、例えばアジドもしくはアルキンタグを有する生体分子で、A1アデノシン受容体タンパク質、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体もしくはサブユニット、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体もしくはサブユニットについてのペプチド、A1アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイ、例えばGTP結合アッセイに関与する他のタンパク質、またはこれらのタンパク質についてのペプチド、オリゴヌクレオチドまたはエピトープに挿入されているもの。あるいは、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアはA1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質または分子、例えば限定されるものではないが、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体もしくはサブユニット、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体もしくはサブユニットについてのペプチド、これらのタンパク質についての他のタンパク質、融合タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、もしくはA1アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイに関与する分子、またはこれらのタンパク質または分子に挿入または共役したタグにキレートされ、抱合され、結合し、または共役していてよい。あるいは、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアはA1アデノシン受容体シグナル伝達経路のタンパク質または分子、例えば限定されるものではないが、A1アデノシン受容体タンパク質またはペプチド、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体、もしくはサブユニット、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体、もしくはサブユニットのペプチド、これらのタンパク質についての他のタンパク質、融合タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、もしくはA1アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイに関与する分子、またはこれらのタンパク質もしくは分子に挿入または共役したタグに対する抗体にキレートされ、抱合され、結合し、または共役していてよい。TRFアッセイにおいて使用するためのフルオロフォアを結合またはキレートするために用いられうる付加的タグは、可溶化タグ、チオレドキシンおよびポリNANPを含み、細菌内で発現している組換えタンパク質用に用いられうる。TRFアッセイのためのフルオロフォアを結合またはキレートするのに有用な他のタグは、エピトープタグ、例えばV5タグ、c-mycタグ、およびHAタグを含む。TRFアッセイにおいてフルオロフォアをタンパク質、ペプチド、分子、エピトープ、またはオリゴヌクレオチドに共役、結合、またはキレート化するための付加的タグは、イソペプタグisopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質BCCP、カルモジュリンタグ、nusタグ、Sタグ、ソフタグ1Softag1、ソフタグ2Softag2、ストレプタグstreptag、SBTタグ、およびTyタグを含む。あるいは、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアは、他のタンパク質、例えばストレプトアビジン、例えばLanthaScreen登録商標製品に見られるタンパク質にキレートされ、共役し、抱合され、または結合していてよく、それは、ビオチンに対するその高親和性のために、ビオチンタグ付けしたタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープ、ビオチンタグ付けしたタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくはエピトープに対する抗体、ビオチンタグ付けしたタグに対する抗体、またはビオチンタグ付けしたA1アデノシン受容体結合またはシグナル伝達経路に関与するこれらの分子についての他の分子または抗体と反応しうる。例えば、1つのそのようなTRFアッセイにおいて、フルオロフォアはストレプトアビジンに結合し得、ついでGαiサブユニットタンパク質についてのビオチン化ペプチドに結合しうる。あるいは、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアはELISAsに通常用いられ、アッセイ開発の当業者に知られている酵素または酵素についての基質にキレートされ、共役し、または結合していてよい。酵素のいくつかの例は、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、α-グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、アスパラギナーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-V-ステロイドイソメラーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ウレアーゼ、および酵母アルコールデヒドロゲナーゼを含む。酵素についての基質のいくつかの例は、限定されるものではないが、テトラメチルベンゼンTMB、o-フェニレンジアミンOPD、クマリン基質、例えば7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン4-メチルウンベリフェロン、4-MUの有機および無機エステルならびにグリコシドならびに7-アミノ-4-メチルクマリンAMCのアミド、フルオレセイン基質、ナフチル基質、およびレゾルフィンに由来する基質などを含む。例えば、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアは、NF-κβサブユニット、p65組換えタンパク質に挿入されたタグ、例えばGSTタグに対する抗体にキレートされていてよい。別のTRFアッセイでは、第1結合パートナーフルオロフォアにキレートされている抗GST抗体は、NF-κβサブユニット、p65組換えタンパク質に挿入されたGSTタグと相互作用し、次いで第2結合パートナーフルオロフォアで標識されたストレプトアビジンと結合したビオチン化NF-κβ特異的dsDNAと相互作用する。あるいは、TRFアッセイにおいて、フルオロフォアは、A1アデノシン受容体に結合するアンタゴニストおよびアゴニストを含むA1アデノシン受容体リガンド、例えばLPSにキレートされ、抱合され、結合し、共役し、またはタグ付けされていてよい。あるいは、TRFアッセイ形式において、フルオロフォアは、A1アデノシン受容体についてのシグナル伝達経路アッセイでA1アデノシン受容体の活性化後に測定されうるシグナル伝達分子、GTP、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体、もしくはサブユニット、Gタンパク質またはGタンパク質の二量体もしくはサブユニットのペプチド、タンパク質、例えばインターロイキン-6IL-6もしくはNF-κβについてのサブユニット、または他のシグナル伝達経路分子、例えばcAMPもしくはトロンボキサンにキレートされ、共役し、またはタグ付けされていてよい。あるいは、TRFアッセイ形式において、フルオロフォアは、タンパク質、例えばIL-6もしくはNF-κβについてのサブユニット、該タンパク質についてのペプチド、エピトープ、もしくはオリゴヌクレオチド、該タンパク質に挿入されたタグ、またはシグナル伝達分子、GTP、もしくは他のシグナル伝達経路分子、例えばcAMPまたはトロンボキサンに対する抗体にキレートされ、またはタグ付けされていてよい。A1アデノシン受容体TRFアッセイにおいてフルオロフォアと共役しうるA1アデノシン受容体リガンドのリストは、限定されるものではないが、A1アデノシン受容体を活性化するアゴニスト、例えばN6シクロペンチルアデノシンCPA、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシンCCPA、2-クロロ-N6-[R-[2-ベンゾチアゾリルチオ]-2-プロピル]-アデノシンNNC-21-0136、2’-O-メチル-N6-シクロヘキシルアデノシンSDZWAG94、[1S-[1α,2β,3β,4αS]]-4-[7-[[1-[3-クロロチエン-2-イルメチル]プロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリド-3-イル]N-エチル2,3-ジヒドロキシシクロペンタンカルボキサミドAMP579、テカデノソン2R,3S,4R-2-ヒドロキシメチル-5-6-R-テトラヒドロフラン-3-イルアミノ-9H-プリン-9-イルテトラヒドロフラン-3,4-ジオール、セロデノソン2S,3S,4R-5-6-シクロペンチルアミノ-9H-プリン-9-イル-N-エチル-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-カルボキサミドおよびPJ-875、2S,3S,4R-2-2-フルオロフェニルチオメチル-5-6-1R,2R-2-ヒドロキシシクロペンチル-アミノ-9H-プリン-9-イルテトラヒドロフラン-3,4-ジオールCVT-3619、3R,4S,5R-2-6-1S,2S-2-ヒドロキシシクロペンチルアミノ-9H-プリン-9-イル-5-ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン-3,4-ジオールGR79236、1S,2R,3R-3-トリフルオロメトキシメチル-5-6-1-5-トリフルオロメチルピリジン-2-イルピロリジン-3-イルアミノ-9H-プリン-9-イルシクロペンタン-1,2-ジオールARA、カパデノソン2-アミノ-6-2-4-クロロフェニルチアゾール-4-イルメチルチオ-4-4-2-ヒドロキシエトキシフェニルピリジン-3,5-ジカルボニトリル、Bay-68-4986、2-アミノ-4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[b]チオフェン-3-イル4-クロロフェニルメタノンT-62またはLPSを含む。A1アデノシン受容体TRFアッセイにおいてフルオロフォアと共役しうるA1アデノシン受容体リガンドのこのリストは、限定されるものではないが、A1アデノシン受容体アンタゴニスト、例えば1、3ジプロピル-8-シクロペンチルアデノシンDPCPX、1,3-ジプロピル-8-2-5,6-エポキシノルボルニルキサンチンBG-9719、3-[4-2,6-ジオキソ-1,3-ジプロピル-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H-プリン-8-イル-ビシクロ[2.2.2]オクト-1-イル]-プロピオン酸BG-9928、8-ノルアダマンチル-1,3-ジプロピルキサンチンKW3902、3-[2-4-アミノフェニル-エチル]-8-ベンジル-7-{2-エチル-2-ヒドロキシ-エチル-アミノ]-エチル}-1-プロピル-3,7-ジヒドロ-プリン-2,6-ジオンL-97-1、4-2-フェニル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イルアミノシクロヘキサノールSLV320、3-4-アミノフェネチル-1-プロピル-8-シクロペンチルキサンチンBWA844U、8-シクロペンチル-3-3-4-フルオロスルホニルベンゾイル-オキシプロピル-1-プロピルキサンチンFSCPX、バミフィリン、N6エンドノルボルナン-2-イル-9-メチルアデニンN-0861、およびC8-N-メチルイソプロピル-アミノ-N6-5’-エンドヒドロキシ-エンドノルボルナン-2-イル-9-メチルアデニンWRC-0571も含む。当該技術分野で知られているA1アデノシン受容体アンタゴニストは、例えば、米国特許第5,786,360号、米国特許第6,489,332号、米国特許第7,202,252B2号、米国特許第7,247,639B2号、および同時係属の米国出願第10/560,853号、タイトルA1アデノシン受容体アンタゴニスト2004年6月7日出願、米国出願第13/010,152号、タイトルA1アデノシン受容体診断プローブ2011年1月20日出願、およびPCT/US2008/087638、タイトルA1アデノシン受容体アンタゴニスト2008年12月19日出願に記載されている化合物を含むこれらの全ては参照することによって本明細書で援用される。A1アデノシン受容体TRFアッセイとしての開発に適切なA1アデノシン受容体シグナル伝達経路のリストは、限定されるものではないが、GTP、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼCPLC、ホスホイノシチド-3キナーゼPI3K、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼMAPKs、細胞外受容体シグナル誘導キナーゼERK、ホスホリパーゼA2PLA2、およびタンパク質キナーゼCPKCを含む。フルオロフォアにタグ付けするのに適切なA1アデノシン受容体シグナル伝達経路と関連する分子は、限定されるものではないが、Gタンパク質、Gタンパク質の二量体、サブユニット、およびペプチド、Gタンパク質の二量体、およびサブユニット、cAMP、NF-κBおよびNF-κBのサブユニット、IP3、DAG、インターロイキン-6IL-6、p38、熱ショックタンパク質、トロンボキサン、マトリックスメタロプロテアーゼmatrixmetaloproteinanses、ならびに増殖因子を含む。さらに、フルオロフォアでタグ付けするのに適切なA1アデノシン受容体シグナル伝達経路と関連する他のエフェクターは、カリウムチャネルおよびカルシウムチャネルについてのタンパク質、ならびにイオン、例えばカリウムおよびカルシウムを含む。均一TRFアッセイ、例えばTR-FRET技術は、ドナーおよびアクセプターフルオロフォア対合、すなわち複数のフルオロフォアを含み、GPCRs、例えばA1アデノシン受容体についてのリガンド結合アッセイおよび機能アッセイの両方を含み、不均一アッセイの洗浄および濾過または洗浄ステップを必要としない均一アッセイ形式において、バックグラウンドノイズが低く、高感度および特異性を有する。均一TR-FRETHTRFアッセイにおいて、フルオロフォアを有する2つの標識パートナーがエネルギー移動に要求される。このエネルギー移動は、2つの分子が互いに直接近接している場合にのみ生じる。第1フルオロフォアはエネルギードナーとして作用し、第2フルオロフォアはエネルギーアクセプターとして作用する。エネルギー移動の効率は、長寿命蛍光ドナー色素と短寿命蛍光アクセプター色素の間の距離の関数である。TR-FRETアッセイにおいて最もよく用いられるドナーランタニドは、ユーロピウムおよびテルビウムである。他のドナーランタニドは、サマリウムおよびジスプロシウムを含む。多数の共鳴エネルギーアクセプターがあり、XL665アロフィコシアニン、d2、フィコビリタンパク質、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、チオニン、Rフィコシアニン、フィコエリトロシアニン、およびCフィコエリトリンなどを含む。本発明における使用に適切なさらなる例は、米国特許第6,908,769号その全体において参照することによって本明細書に援用されるに見ることができる。HTRFアッセイにおいて最もよく用いられるエネルギー移動アクセプターは、d2またはXL665である。337nmの励起で高FRET効率を生じるHTRFアッセイにおける典型的なドナー/アクセプターペアは、620nmの発光を有するドナーとしてのユーロピウムクリプテートおよび665nmの発光を有するアクセプターとしてのXL665である。エネルギー移動過程における長寿命発光ドナーとしてのユーロピウムクリプテートの長蛍光寿命のためにと比較した遊離アクセプター、XL665の自然な短寿命蛍光発光は、結合XL665XL665でタグ付けした分子が、ユーロピウムクリプテートでタグ付けした分子と非常に近接したときに、エネルギー移動の間に生じると遊離XL665の間の明確な区別を可能にする。HTRF/TR-FRETアッセイと関連する多数の利点、例えば均一アッセイ形式、迅速性、高感度および特異性、低バックグラウンドノイズ、培地バックグラウンド、例えば血漿からの干渉が少ないという頑健性、膜内で発現しているGPCRsでの使用において適切なこと、二価イオン、例えばMg2または他のアッセイ添加物、例えばDMSOおよびEDTAに対する認容性、ならびにアッセイの適応性、例えばハイスループットスクリーニング、自動液体ハンドリング、および小型化への適応可能性がある。さらに、HTRFアッセイは、特定のGPCRsおよびタンパク質で実施することを一度開発および決定すると容易に行うことができ、それゆえ使いやすく、通常、結果が2時間以内に入手できる。HTRF、TR-FRETアッセイの例は、米国特許第7,674,584号、米国特許第5,998,146号、米国特許第5,512,493号、米国特許第5,527,684号、米国特許第6,352,672号、米国特許第5,220,012号、米国特許第5,432,101号、米国特許第5,457,185号、米国特許第5,534,622号、米国特許第5,346,996号、米国特許第5,162,508号、米国特許第5,512,493号、米国特許第5,627,074号、米国特許第5,527,684号、米国特許第6,515,113号、米国特許第6,864,103号、米国特許第7,442,558号、米国特許第6,406,297号、米国特許第7,018,850号、および米国特許第7,404,912号、ならびに米国特許出願第20040115130号、米国特許出願第20060024775号、米国特許出願第20060292651号、米国特許出願第20070243568号、および米国特許出願第20070207532号に見ることができるそれらの全体において参照することによって本明細書に援用される。A1アデノシン受容体タンパク質源は、本発明のアッセイと適合するいずれかの形態で提供することができる。A1アデノシン受容体は、細胞、例えば限定されるものではないが、植物、酵母、CHO、またはSf9細胞に安定にトランスフェクトされた組換えタンパク質であってよい。これらの細胞などに由来する膜は、TRFアッセイのためのA1アデノシン受容体タンパク質源を提供するために利用することができる。他のA1アデノシン受容体タンパク質源は、他の細胞型、組織、植物、細菌、酵母、およびA1アデノシン受容体タンパク質を安定に発現している細胞、組織、植物、細菌、もしくは膜から単離された、可溶化もしくは精製されたA1アデノシン受容体タンパク質、または組換えA1アデノシン受容体タンパク質を含む。アッセイの当業者であれば、許容される形態のA1アデノシン受容体タンパク質を容易に決定および提供することができるであろう。アッセイを行うにあたって、選択されたTRFアッセイは、不均一であっても均一であっても、試験の製造者からのプロトコール、ならびにA1アデノシン受容体およびLPSを用いるこれらのアッセイの熟練の使用者によって決定されなければならない緩衝液および溶液特性を用いて調整される。一度開発されると、試験サンプルはサンプル中に存在しているLPSの量の定量についてのアッセイに導入される。その結果は、アッセイにおいて既知量のLPSを含有するサンプルで作成されたLPSについての標準曲線から決定することができる。サンプル中のLPSの存在および量またはレベルの決定は、動物の敗血症、グラム陰性感染、またはLPS関連状態の診断に用いられうる。本発明は、サンプル中のLPSの検出および測定のためのキット、ならびに動物の敗血症、グラム陰性感染、またはLPS関連状態の診断のための使用方法も提供する。キットは、サンプル中のLPSレベルを測定するために提供される。これらのキットは、A1アデノシン受容体タンパク質源、少なくとも1つのフルオロフォア、A1アデノシン受容体TRFアッセイおよびLPSに特異的な緩衝液、ならびにLPS標準を含む。1つの実施態様では、キットはA1アデノシン受容体TRFGTP結合アッセイを行うために、フルオロフォアとしてGTP-ランタニド、例えばユーロピウムにキレートされているGTPEu-GTPを提供する。以下の非限定的実施例は、本発明の実施態様をさらに説明するために提供されている。実施例1.組換えラットA1アデノシン受容体を発現しているCHO細胞からの膜の調製1.170xgで10分間遠心分離することによって懸濁液からCHO細胞を収集する。2.1容積50mLのPBSで細胞を2回洗浄する。残りのステップは全て氷上または4°Cで実施される3.冷却した緩衝液Aにペレットを再懸濁する元々の培養容積50mL当たり5mL。4.細胞をポリトロンブリンクマン社で20秒間ホモジナイズする。5.ホモジネートを1000xgで、4°Cで10分間遠心分離する。6.上清を収集し、30,000xgで30分間遠心分離する。7.上清を捨て、ペレットを保存する。8.緩衝液Aでペレットを2回洗浄する。9.ペレットを緩衝液B中でピペッティングすることによって穏やかに再懸濁し、2mgタンパク質/mLの最終濃度を達成する10.膜懸濁液を25μL単位の一定分量に分注し、急速凍結snapfreezeする。11.膜懸濁液の一定分量を-80°Cで保存する。実施例2.CHO細胞内で発現している組換えラットA1アデノシン受容体についての、[3H]1,3ジプロピル-8-シクロペンチルキサンチンDPCPXの親和性を決定するための飽和結合研究飽和結合アッセイのために、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させた[3H]-DPCPXパーキンエルマー社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州0.01nM~10nMと共に、200μLの最終アッセイ容積でインキュベートする。各濃度の[3H]-DPCPXについて、全結合および非特異的結合を3回決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はDPCPXシグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州10μMの存在下で決定される。DPCPXストック溶液はDMSO中で調製されるアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦0.01である。アッセイ緩衝液は、50mMTrisHClpH7.4、10mMMgCl2、およびアデノシンデアミナーゼシグマアルドリッチ社0.2ユニット/mLからなる。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートし、次いで、自動真空マニホールドMachIII、トムテック社、ハムデン、コネチカット州を用いて、GF/B濾過マットパーキンエルマー社に通す迅速濾過によってアッセイを終結させる。各ウェルを、300μLの氷冷洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で迅速に4回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラントscintillantパーキンエルマー社にはめ込み、シンチレーションカウンター1450Microbeta、パーキンエルマー社を用いて3時間計数する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてBSAを用いるBCAアッセイサーモフィッシャーサイエンティフィック社を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。[3H]-DPCPXの各濃度について、データを、特異的CPM結合CPMbound全CPM結合と非特異的CPM結合の間の差異として表し、次いでfmol/mgタンパク質に変換する。データは[3H]-DPCPXの濃度に対する特異的結合fmol/mgタンパク質としてプロットし、次いでワンサイトモデルonesitemodelを用いる非線形回帰曲線適合によって分析し、KDおよびBmaxGraphPadPrism、バージョン5.01、ラホーヤ、カリフォルニア州を決定する。最低でも3つの独立した実験からの最終データを、平均値±SEMとして表す。実施例3.[3H]-DPCPXで標識されたCHO細胞由来の膜内で発現している組換えラットA1アデノシン受容体についての、BWA844U-Euの親和性Kiを決定するための競合結合研究競合結合アッセイ用に、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞から調製された膜を、[3H]-DPCPX飽和結合研究で定義されているKDでと共に、200μLの最終アッセイ容積でインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はDPCPX10μMの存在下で決定される。アッセイ緩衝液は、50mMTrisHClpH7.4、10mMMgCl2、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLからなる。ユーロピウムと共役したBWA844UBWA844U-Euを、0.01nM~10μMの範囲の濃度で評価する。BWA844U-Euストック溶液をDMSO中で調製するアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦0.01である。コントロールリガンドはCPAN6-シクロペンチルアデノシンシグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州0.01nM~10μMおよびDPCPX0.01nM~10μMである。DPCPXおよびCPAのストック溶液は、DMSO中で調製するアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦0.01である。各アッセイポイントを3回評価する。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック社に添加し、プレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは、無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートし、次いで真空マニホールドMachIII、トムテック社、ハムデン、コネチカット州を用いて、GF/B濾過マットパーキンエルマー社に通す迅速濾過によってアッセイを終結させる。各ウェルを300μLの氷冷洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で迅速に4回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラントscintillantパーキンエルマー社にはめ込み、次いでシンチレーションカウンター1450Microbeta、パーキンエルマー社を用いて3時間計数する。各濃度の試験リガンドについて、パーセント特異的結合を、[結合-非特異的結合/全結合-非特異的結合]100として計算する。データを競合リガンドのlog濃度に対するパーセント特異的結合としてプロットする。競合的結合モデルを用いる非線形回帰曲線適合によってデータを分析し、KiGraphPadPrism、バージョン5.01を決定する。最低でも3つの独立した実験からの最終データを、平均値±SEMとして表す。実施例4.CHO細胞由来の膜内で発現している組換えラットA1アデノシン受容体についての、BWA844U-Euに対する親和性KDを決定するための時間分解蛍光TRF飽和結合研究TRF飽和結合アッセイのために、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させたBWA844U-Eu0.01nM~1μMと共に200μLの最終アッセイ容積でインキュベートする。BWA844U-Euストック溶液をDMSO中で調製するアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦0.01である。BWA844U-Euの各濃度について、全結合および非特異的結合を決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はN6-R-フェニルイソプロピルアデノシンR-PIA、シグマアルドリッチ社100μMの存在下で決定される。R-PIAストック溶液は、エンドトキシンを含まない水で調製する。アッセイ緩衝液は、50mMTrisHClpH7.4、10mMMgCl2、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLからなる。各アッセイポイントは3回評価する。全アッセイ成分をAcrowell商標96ウェルフィルタープレートポールライフサイエンス社、アナーバー、ミシガン州に添加し、プレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートし、次いで真空マニホールドポールライフサイエンス社を用いるAcrowell商標フィルタープレートのBioTraceポリビニリデンフルオライドフィルターを通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを300μLの氷冷洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で迅速に4回洗浄する。各ウェルの蛍光は、TRFが可能なマイクロプレートリーダーInfiniteF-200PRO、テカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起および620nmの発光で測定する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてBSAを用いるBCAアッセイサーモフィッシャーサイエンティフィック社を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。BWA844U-Euの各濃度について、データは特異的結合全結合と非特異的結合の間の差異として表し、次いでfmol/mgタンパク質に変換する。データをBWA844U-Euの濃度に対する特異的結合fmol/mgタンパク質としてプロットし、次いで、ワンサイトモデルonesitemodelを用いる非線形回帰曲線適合によって分析し、KDおよびBmaxを決定するGraphPadPrism、バージョン5.01。少なくとも3つの独立した実験からの最終データは、平均値±SEMとして表す。実施例5.リポ多糖LPS/エンドトキシンについてのA1アデノシン受容体TRF競合結合アッセイ競合結合アッセイのために、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞から調製された膜を、BWA844U-Euと共に、上記の飽和結合研究によって決定されたKDでインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はN6-R-フェニルイソプロピルアデノシンR-PIA100μMの存在下で決定される。R-PIAストック溶液はエンドトキシンを含まない水で調製される。アッセイ緩衝液は、50mMTrisHClpH7.4、10mMMgCl2、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLからなる。試験リガンドはLPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州001-750ng/mL[またはポジティブコントロールとしてのCPA001nM-1μM]である。LPSストック溶液は、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を、333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。CPAストック溶液は、DMSO中で調製されるアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦001である。最終アッセイ容積は200μLである。各アッセイポイントを3回評価する。全アッセイ成分をAcrowell商標96ウェルフィルタープレートポールライフサイエンス社に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。アッセイ成分を60分間25°Cでインキュベートし、次いで真空マニホールドポールライフサイエンス社を用いるAcrowell商標フィルタープレートのBioTraceポリビニリデンフルオライドフィルターを通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを300μLの氷冷洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で迅速に2~4回洗浄する。各ウェルの蛍光を、TRFが可能なマイクロプレートリーダーInfiniteF-200PRO、テカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起および620nmの発光で測定する。各濃度の試験リガンドについて、パーセント特異的結合を、[結合-非特異的結合/全結合-非特異的結合]100として計算する。データは競合リガンドの濃度[logモル濃度CPAおよびlogg/mLLPS]に対するパーセント特異的結合としてプロットし、次いで競合的結合モデルを用いた非線形回帰曲線適合によって分析し、KiGraphPadPrism、バージョン5.01を決定する。最低でも3つの独立したアッセイからの最終データは、平均値±SEMとして表す。実施例6.フルオロフォア、U-Lightでタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体アクセプターについてのポリクローナル抗体の、[3H]DPCPXの結合に対する効果を測定するためのA1アデノシン受容体飽和結合研究組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルで安定にトランスフェクトされたCHO細胞から調製された膜を、ウェル毎に濃度を増加させた[3H]-DPCPXパーキンエルマー社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州0.01nM~10nMと共に、アクセプターフルオロフォア、ULightパーキンエルマー社でタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体1:10~1:10,000の存在下または非存在下でインキュベートする。各濃度の[3H]-DPCPXについて、抗体有りおよび無しで、全結合および非特異的結合を決定する。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はDPCPXシグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州10μMの存在下で決定される。DPCPXストック溶液はDMSO中で調製されるアッセイ中のDMSOの最終濃度は、≦0.01である。アッセイ緩衝液は、50mMTrisHClpH7.4、10mMMgCl2、およびアデノシンデアミナーゼシグマアルドリッチ社0.2ユニット/mLからなる。全アッセイ容積は200μLである。各アッセイポイントは3回評価する。全アッセイ成分をポリプロピレン製の、ディープウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州に添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートし、次いで、自動真空マニホールドMachIII、トムテック社、ハムデン、コネチカット州を用いてGF/B濾過マットパーキンエルマー社を通す迅速濾過によって、アッセイを終結させる。各ウェルを300μLの氷冷洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で迅速に4回洗浄する。濾過マットを乾燥し、固体シンチラントscintillantパーキンエルマー社にはめ込み、シンチレーションカウンター1450Microbeta、パーキンエルマー社を用いて3時間計数する。アッセイ用に希釈した膜サンプルの一定分量を、基準としてBSAを用いるBCAアッセイサーモフィッシャーサイエンティフィック社を用いて全タンパク質を定量化するために用いる。データは特異的CPM結合全CPM結合と非特異的CPM結合の間の差異として表し、[3H]-DPCPXの濃度に対する特異的結合fmol/mgタンパク質としてプロットし、次いでワンサイトモデルonesitemodelを用いる非線形回帰曲線適合によって分析し、KDおよびBmaxGraphPadPrism、バージョン5.01、ラホーヤ、カリフォルニア州を決定する。最低でも3つの独立した実験からの最終データKDおよびBmaxは、平均値±SEMとして表す。アクセプターフルオロフォア、ULightでタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体の、A1アデノシン受容体リガンド認識部位に対する効果を評価するために、独立データunpaireddataについてのスチューデントt-検定を用い、[3H]-DPCPXのKDおよびBmaxを抗体の非存在下および存在下で比較する。P値<0.05であれば、有意に異なると考えられる。実施例7.リポ多糖LPS/エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のLPSのレベルを測定するための、A1アデノシン受容体均一時間分解蛍光HTRF競合アッセイ標準LPS/エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルを発現しているCHO細胞膜を、アクセプターフルオロフォア、ULightパーキンエルマー社でタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体1:10~1:10,000およびBWA844U-Eu0.5~20nM上記の飽和結合研究によって決定されたおおよそのKDの存在下で、Greinerwhite96ウェルプレートグライナーバイオワンノースアメリカ社、モンロー、ノースカロライナ州内でインキュベートする。全結合は試験リガンドの非存在下で定義され、非特異的結合はR-PIA100μMの添加によって定義される。活性化リガンド、LPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州は、0.01~750ng/mLの範囲の8つの濃度で評価される。LPS/エンドトキシンストック溶液は、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLを含む。全アッセイ容積は200μLである。各アッセイポイントは3回評価する。全アッセイ成分をプレートに添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートする。インキュベーション後、HTRFが可能なマイクロプレートリーダーInfiniteF-200PRO、テカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起ならびに665および620nmでの発光で、蛍光を測定する。全測定total、非特異的測定nonspecific、およびLPSについてのデータは、665と620での測定の比665/620として表す。次いで、基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。LPSについてのパーセント基礎活性は、以下のように計算する:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。LPSについての濃度反応曲線は、LPSg/mLのlog濃度に対する基礎活性の関数としてプロットする。この曲線を、勾配変化のある法面variableslopeを有するS字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰GraphPadPrism、バージョン504、グラフパッドソフトウェア社、ラホーヤ、カリフォルニア州によって分析し、EC50を決定する。各標準曲線は、最低でも3つの独立した実験を表し、最終データは平均値±SEMとして表す。試験サンプル中のLPS/エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットA1アデノシン受容体5~20μgタンパク質/ウェルを発現しているCHO細胞膜を、アクセプターフルオロフォア、ULightパーキンエルマー社でタグ付けしたラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体1:10~1:10,000およびBWA844U-Eu0.5~20nM上記の飽和結合研究によって決定されたおおよそのKDならびに試験サンプルまたはLPS10pg/mL1ng/mL、10ng/mL、および100ng/mLを含むポジティブコントロールの存在下で、Greinerwhite96ウェルプレートグライナーバイオワンノースアメリカ社、モンロー、ノースカロライナ州内でインキュベートする。全結合は競合リガンドの非存在下で定義される。非特異的結合はN6-R-フェニルイソプロピルアデノシンR-PIA100μMの存在下で決定される。R-PIAストック溶液はエンドトキシンを含まない水で調製される。ポジティブLPSコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLを含む。全アッセイ容積は200μLである。各アッセイポイントは3回評価する。全アッセイ成分をプレートに添加し、次いでプレートを穏やかに攪拌し、成分を混合する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。膜を60分間25°Cでインキュベートする。インキュベーション後、HTRFが可能なマイクロプレートリーダーInfiniteF-200PRO、テカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起ならびに665および620nmでの発光で蛍光を測定する。全測定total、非特異的測定nonspecific、試験サンプル、およびポジティブLPSコントロールについてのデータは、665と620での測定の比665/620として表す。次いで、基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。試験サンプルまたはポジティブLPSコントロールについてのパーセント基礎活性は、次のように計算する:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のLPSのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての基礎活性の単位で表した蛍光測定を、上記のHTRF競合アッセイでLPSについての標準曲線を作成するための既知濃度のLPSを添加されたサンプルについての基礎活性測定と比較することによって、LPSについての標準曲線から決定される。実施例8.リポ多糖LPS/エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のLPSのレベルを測定するための、A1アデノシン受容体TRFEu-GTP結合アッセイ標準LPS/エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットA1アデノシン受容体を発現しているCHO細胞1ユニット/ウェル、およそ20μgタンパク質/ウェルに相当;パーキンエルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州から調製された膜を、Acrowellフィルタープレートポールライフサイエンス社、アナーバー、ミシガン州内で、LPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州0.01~750ng/mLの存在下でプレインキュベートする。エンドトキシンストック溶液は、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、NaCl[100mM]、GDP10μM、サポニン125μg/mL、およびアデノシンデアミナーゼ02ユニット/mLを含む。全試薬および緩衝液は、エンドトキシンを含まない水を用いて調製される。60分間プレインキュベーションされる全容積は150μLである。25°Cでのプレインキュベーション後、50μLのEu-GTPパーキンエルマー社を添加し、10nMの最終Eu-GTP濃度を200μLの全容積で達成する。各アッセイポイントは3回評価する。全結合はLPSの非存在下で定義され、非特異的結合はGTPγS10μMの添加によって定義される。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。25°Cで30分間インキュベーションした後、真空マニホールドポールライフサイエンス社、アナーバー、ミシガン州を用いる濾過によってアッセイを終結させる。フィルタープレートのBioTraceポリビニリデンフルオライドフィルターで膜を捕捉する。各ウェルを、300μLの洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で2~4回洗浄する。各ウェルの蛍光は、InfiniteF-200PROテカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起波長、620nmの発光波長、および109のゲインセッティングで蛍光トップリードtopreadを用いて決定する。Eu-GTP基礎活性は、全Eu-GTP結合および非特異的Eu-GTP結合の間の差異として計算する。パーセント基礎は、次のように計算される:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。LPSについての濃度反応標準曲線を、LPSg/mLのlog濃度に対するEu-GTP基礎活性の関数としてプロットする。勾配変化のある法面variableslopeを有するS字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰GraphPadPrism、バージョン5、グラフパッドソフトウェア社、ラホーヤ、カリフォルニア州によって標準曲線を分析し、EC50を決定する。各標準曲線は最低でも3つの独立した実験を表し、最終データは平均値±SEMとして表す。試験サンプル中のLPS/エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットA1アデノシン受容体を発現しているCHO細胞1ユニット/ウェル、およそ20μgタンパク質/ウェルに相当;パーキンエルマー社、ウォルサム、マサチューセッツ州から調製された膜を、Acrowellフィルタープレートポールライフサイエンス社、アナーバー、ミシガン州内で、試験サンプルまたはLPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州10pg/mL1ng/mL、10ng/mL、および100ng/mLを含むポジティブコントロールの存在下でプレインキュベートする。ポジティブLPSコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、NaCl[100mM]、GDP10μM、サポニン125μg/mL、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLを含む。全試薬および緩衝液は、エンドトキシンを含まない水を用いて調製される。60分間プレインキュベーションする全容積は150μLである。25°Cでのプレインキュベーション後、50μLのEu-GTPパーキンエルマー社を添加し、10nMの最終Eu-GTP濃度を200μLの全容積で達成する。各アッセイポイントは3回評価する。全結合はLPSの非存在下で定義され、非特異的結合はGTPγS10μMの添加によって定義される。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。25°Cで30分間インキュベーションした後、真空マニホールドポールライフサイエンス社、アナーバー、ミシガン州を用いる濾過によってアッセイを終結させる。フィルタープレートのBioTraceポリビニリデンフルオライドフィルターで膜を捕捉する。各ウェルを、300μLの洗浄緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]およびMgCl2[10mM]で2~4回洗浄する。各ウェルの蛍光は、320nmの励起波長、620nmの発光波長、および109のゲインセッティングで蛍光トップリードtopreadを用いるInfiniteF-200PROテカン社、グレーディヒ、オーストリアで決定する。Eu-GTP基礎活性は、全Eu-GTP結合と非特異的Eu-GTP結合の間の差異として計算される。パーセント基礎活性は、次のように計算される:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のLPSのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての基礎活性の単位で表している蛍光測定を、上記のTRFEu-GTP結合アッセイでLPSについての標準曲線を作成するための既知濃度のLPSを添加されたサンプルについての基礎活性測定と比較することによって、LPSについての標準曲線から決定される。図1は、LPSg/mLのlog濃度に対する基礎活性の関数としてプロットした、TRFEu-GTP結合アッセイに由来するLPSについての濃度反応標準曲線を示す。TRFEu-GTP結合アッセイについての詳細は、実施例8に記載されている。この標準曲線を、勾配変化のある法面variableslopeを有するS字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰GraphPadPrism、バージョン5、グラフパッドソフトウェア社、ラホーヤ、カリフォルニア州によって分析し、EC50を決定する。標準曲線は、LPSの濃度10pg/mL~100ng/mLについての8~10個の独立したアッセイの平均値を表している。このアッセイの感度は10pg/mLである。実施例9.リポ多糖LPS/エンドトキシンについての標準曲線を作成し、試験サンプル中のLPSのレベルを測定するための、A1アデノシン受容体HTRFGTP結合アッセイ標準LPS/エンドトキシン標準曲線を作成するために、組換えラットA1アデノシン受容体を発現しているCHO細胞膜インビトロジェン社5~20μgタンパク質/ウェルを、LPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州0.01-750ng/mLと共に、Greinerwhiteマイクロタイター96ウェルプレート内でインキュベートする。LPSストック溶液は、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。全結合はLPSの非存在下で定義され、非特異的結合はGTPγS10μMの添加によって定義される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、NaCl[100mM]、GDP10μM、サポニン125μg/mL、およびアデノシンデアミナーゼ02ユニット/mLを含む。30~60分間25°Cでインキュベーション後、ULightパーキンエルマー社でタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体1:10~1:10,000およびEu-GTPパーキンエルマー社5~20nMをアッセイに添加する。全アッセイ容積は200μlである。各アッセイポイントは3回評価する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。さらに30~60分間インキュベーションした後、蛍光を、テカン社製InfiniteF-200PROテカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起ならびに665および620nmでの発光で測定する。全測定total、非特異的測定nonspecific、およびLPSについてのデータは、665と620での測定の比665/620として表す。次いで、Eu-GTP基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。LPSについてのパーセント基礎活性は、次のように計算する:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。LPSについての濃度反応曲線は、LPSg/mLのlog濃度に対する基礎活性の関数としてプロットする。この曲線を、勾配変化のある法面variableslopeを有するS字型の用量反応曲線を用いる非線形回帰GraphPadPrism、バージョン5.04、グラフパッドソフトウェア社、ラホーヤ、カリフォルニア州によって分析し、EC50を決定する。各標準曲線は最低でも3つの独立した実験を表し、最終データは平均値±SEMとして表す。試験サンプル中のLPS/エンドトキシンレベルを測定するために、組換えラットA1アデノシン受容体を発現しているCHO細胞膜インビトロジェン社5~20μgタンパク質/ウェルを、試験サンプルまたはLPS/エンドトキシンUSP社、ロックビル、メリーランド州10pg/mL1ng/mL、10ng/mL、および100ng/mLを含むポジティブコントロールと共に、Greinerwhiteマイクロタイター96ウェルプレート内でインキュベートする。ポジティブLPSコントロール用に、エンドトキシンストック溶液を、10,000エンドトキシンユニット1000ngに相当を333μLのエンドトキシンを含まない水に溶解することによって調製する。全結合はLPSの非存在下で定義され、非特異的結合はGTPγS10μMの添加によって定義される。付加的アッセイ成分は、アッセイ緩衝液Tris-HCl[50mM、pH7.4]、MgCl2[10mM]、NaCl[100mM]、GDP10μM、サポニン125μg/mL、およびアデノシンデアミナーゼ0.2ユニット/mLを含む。30~60分間25°Cでインキュベーションした後、ULightパーキンエルマー社でタグ付けした組換えラットA1アデノシン受容体についてのポリクローナル抗体1:10~1:10,000およびEu-GTPパーキンエルマー社5~20nMをアッセイに添加する。全アッセイ容積は200μlである。各アッセイポイントは3回評価する。アッセイは無菌技術、無菌試薬、および無菌消耗品を用いて行われる。さらに30~60分間インキュベーションした後、蛍光を、テカン社製InfiniteF-200PROテカン社、グレーディヒ、オーストリアで、320nmの励起ならびに665および620nmでの発光で測定する。全測定total、非特異的測定nonspecific、試験サンプル、およびポジティブLPSコントロールについてのデータは、665と620での測定の比665/620として表す。次いで、Eu-GTP基礎活性を、全比測定と非特異的比測定の間の差異として計算する。試験サンプルまたはポジティブLPSコントロールについてのパーセント基礎活性は、次のように計算する:[試験条件-非特異的/基礎活性]100。試験サンプルまたはポジティブコントロール中のLPSのレベルは、サンプルまたはポジティブコントロールについての基礎活性の単位で表した蛍光測定を、上記のHTRFGTP結合アッセイでLPSについての標準曲線を作成するための既知濃度のLPSを添加されたサンプルについての基礎活性測定と比較することによって、LPSについての標準曲線から決定される。実施例10.腸管穿孔モデルCLP誘導性敗血症を患うラットの血中LPSを測定するための、エンドトキシンアッセイアクティビティEAA商標アッセイの感度および特異性と比較したA1アデノシン受容体HTRFGTP結合アッセイについての感度および特異性CLP誘導性敗血症のラットモデル:動物の外科手術および毎日のモニタリング全ての外科手術および動物管理はNIHガイドラインに従い、動物管理委員会によって認可されている。雄性で無菌のスプラーグドーリーラット275~325g、ハーラン社、インディアナポリス、インディアナ州を、実験前に食物および水に自由にアクセスできる陽圧隔離キャレルcarrels内で飼育し、その後BSL-2バイオハザード実験室内で飼育する。実験を通して一般的な麻酔3イソフルラン、97O2下におき、無菌技術を用い、腹側の頸部中央部midventralneckに2cmの切開を施し、左頸動脈および右頸静脈を露出させ、カテーテル処置をするPE-50;クレイアダムス、パーシッパニー、ニュージャージー州。ベースラインの生命徴候直腸温度、脈動および平均動脈圧、頸動脈の脈拍数、呼吸頻度、立毛の程度、存在presenceもしくは眼窩周囲出血または鼻汁を決定し、血液学、血液ガス、血漿サンプル、および培養のために初期動脈血サンプルを得る1.0mL。採取された血液を3x容積の無菌0.9NaCl生理食塩水、NSと交換する。外科的切開を閉じ、麻酔を中止し、意識が戻るまで典型的には3~5分動物をモニターし、次いでそのケージに戻す。カテーテルをステンレス鋼バネ内で遮蔽し、ケージの蓋に固定したスイベルインステック社に乗せ、自由に動き、食物および水にアクセスできるようにする。翌朝18~24時間後、動物に再度麻酔をかけ、腹側中央部midventralabdominalに無菌で4cmの切開を施し、腸を露出させる。3-0絹糸を有する回盲弁の下に腸を穏やかに格納し、次いでその腸間膜表面および腸間膜反対側表面の両方にA19-ゲージ針で、その徹底的なthroughandthrough穿通によって盲腸内に2つの穿孔を空ける。穿孔処理した盲腸を、少なくとも50μLの糞便が穿通された表面のそれぞれに押し出されるまで穏やかに圧迫し、次いで腸を穏やかに腹部に再挿入し、切開を閉じる。液体サポートのために、1回の術後NS急速投与を提供する50mL/kg皮下注射。血行動態のための動物のモニタリングは、CLP後、少なくとも0、3、6、24、および32時間で記録される。CLPを乗り切った全動物をイソフルラン過量投与によって人道的に屠殺し、気胸を観察し、32時間での最終出血の直後に検視する。LPS測定用の血漿サンプル頸動脈の動脈血サンプルをCLP直前t=0時間、ならびにCLP後t=6時間、24時間、および32時間、または死亡が観察された時TODこのTODがCLP後32時間よりも早い場合に得る。頸動脈の動脈血サンプルは、正常なコントロールCLP無しで同一時点にて得る。これらの動脈サンプルは、正常なコントロールCLP無しn=25およびCLPを有する動物n=25でのLPS測定のために用いられる。計画案についてのサンプルサイズ評価へのアプローチは、良性の診断特性を示す0.75のROC曲線下面積AUCを有する新たな試験HTRFLPSアッセイに基づいた。陽性群由来の25および陰性群由来の25のサンプルサイズは、0.05の有意水準で両側z-検定を用いた0.5のAUC例えば、偶然のみの基準と比較すると、92検出力powerを達成する。陽性および陰性群応答に由来する測定の標準偏差は等しいと想定される。AUCが0.8まで増加すると、検出力Powerはより高くなる98。サンプリングする前に、頸動脈の動脈カテーテルポートをベタジンで調製する。上で示した各時点で、1.0mLの動脈血を採取し、EAAアッセイについての製造者の使用説明書によりバイアルに添加し、全血中のLPSを測定する。全血サンプルを、製造者の使用説明書に従ってEAAで試験する。同一時点での04mLの第2の動脈血arterialbleedを、K3EDTAを含有する1mLのシリンジ内に収集し、すぐに氷上または冷蔵庫内に置く4°Cで1時間以下。この血液を3000rpmで15分間、4°Cで遠心分離し、少なくとも0.2mLの血漿を得る。血漿を無菌的に無菌ピペットで無菌クライオバイアルに移し、HTRFLPSアッセイで血漿中のLPSを測定する。HTRFLPSアッセイのために、過塩素酸法を用いて血漿からLPSを抽出するObayashiJLabClinMed1043213301984。各動脈サンプリング後、採取された血液の3x容積を頸静脈カテーテルで無菌NSと交換する。HTRFLPSアッセイ対EAALPSアッセイについての診断感度および特異性LPS測定は、各アッセイについて、すなわちHTRFまたはEAAアッセイについて作成されたLPSについての標準曲線から決定される。真陰性、真陽性、偽陰性、および偽陽性測定は、動物についてCLP有りおよび無しで決定される。診断感度、および診断特異性は、HTRFおよびEAAアッセイについて計算され、独立データunpaireddataについてのスチューデントt検定を使用して分析しされる。統計的有意性:データは独立データunpaireddataについてのスチューデントt検定で分析される;有意水準はP<0.05で設定される。本発明が属する分野の当業者であれば、本発明の原理を利用してその精神または特徴から逸脱することなく、特に前述の教示を考慮して、他の実施態様をもたらす修正をなしうるであろう。したがって、記載された実施態様は全ての点において説明のためにのみ提供されており、限定する意図はないと考えられるべきであり、それゆえ本発明の範囲は、前述の記載または図面よりも、むしろ添付の特許請求の範囲によって示される。結果的に、本発明は特定の実施態様を参照して記載されている一方、当業者に明らかな構造、配列、および材料などの修正もまた出願人が特許請求の範囲に記載している本発明の範囲内に含まれる。"