中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に鼻腔内投与するステップを含み、前記虚血性損傷がそれにより治療される方法。アポトーシス標的阻害剤が細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされている、請求項1に記載の方法。細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。細胞透過性ペプチドがペネトラチン1である、請求項3に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ阻害剤である、請求項1に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14の阻害剤からなる群から選択されるカスパーゼ阻害剤である、請求項5に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択される1種のカスパーゼを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤である、請求項6に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ6を特異的に阻害する、請求項7に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ9を特異的に阻害する、請求項7に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、アポトーシス標的が発現されているか、又は活性であるかのいずれかである時間域の間に投与される、請求項1に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ9阻害剤であり、投与が虚血性損傷の発症と再灌流の24時間後の間に行われる、請求項10に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ6阻害剤であり、投与が再灌流の12時間後と24時間後の間に行われる、請求項10に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたXBIR3である、請求項7に記載の方法。細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、Pen1XBIR3である、請求項13に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤が、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたカスパーゼのドミナントネガティブ型である、請求項7に記載の方法。細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。アポトーシス標的阻害剤がPen1C6DNである、請求項16に記載の方法。前述を踏まえて、切断カスパーゼなどの特定のアポトーシス標的の活性の特定の持続期間を同定すれば、虚血性損傷に関連するアポトーシス活性を阻害するための治療標的としてのそれらの有用性をさらに規定するのに有利となるだけではなく、脳卒中に関する現在の治療域を拡張することも可能となる。3発明の要旨特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここで虚血性損傷がこのような投与により治療される方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤が細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされている方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ここで細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される方法を対象とする。本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤はカスパーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択されるカスパーゼの阻害剤である。ある特定の、限定されない実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、このような治療を必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ9阻害剤であり、その投与が虚血性損傷の発症と再灌流の24時間後の間に行われる方法を対象とする。再灌流の開始につながる閉塞のクリアランスは、医療介入又は天然破壊により臨床的虚血において一般的である。再灌流損傷は、脳においてアポトーシスを誘発することにより疾病負荷に寄与する閉塞除去の直接的かつ頻繁に起こる結果である。このことを踏まえて、本明細書に記載の一時的閉塞モデルは、再灌流により引き起こされるダメージを考慮しており、したがって本研究は、それらの再灌流時点で標識される。しかし、タイミングは、例えば、限定するものではないが、虚血性損傷の発症から測定する他の手段により、同等に決定できる。特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系における虚血性損傷を治療する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、このような治療を必要とする対象に投与するステップを含み、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ6阻害剤であり、投与が再灌流の12時間後と24時間後の間に行われる方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、中枢神経系におけるアポトーシスを阻害する方法であって、鼻腔内に、有効量のアポトーシス標的阻害剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を対象とする。例えば、このような阻害は、中枢神経系におけるアポトーシスに関連する神経変性状態、例えば、アルツハイマー病、軽度認識傷害、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病などを治療する様式である。さまざまな関連する限定されない実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は細胞透過性ペプチド、例えば、限定するものではないが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP若しくはMTSにコンジュゲートされており、及び又はアポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択されるカスパーゼの阻害剤である。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、ここで細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン1、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP及びMTSからなる群から選択される組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ阻害剤である組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、ここでアポトーシス標的阻害剤がカスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14の阻害剤からなる群から選択される組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤が、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択される1種のカスパーゼを特異的に阻害するカスパーゼ阻害剤である組成物を対象とする。特定の実施形態において、本発明は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされたアポトーシス標的阻害剤を含む組成物であって、アポトーシス標的阻害剤が、低分子阻害剤、ポリペプチド阻害剤及び核酸阻害剤からなる群から選択される組成物を対象とする。4図面の簡単な説明5発明の詳細な説明本発明は、中枢神経系における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための組成物及び方法に関する。例えば、本発明は、特定の実施形態において、CNS虚血性損傷の発生後の特定の時点に発現又は活性化される特定のアポトーシス標的を阻害することによるCNS虚血性損傷に関連する治療域の拡張に有用な組成物及び方法に関する。51アポトーシス標的阻害剤組成物511カスパーゼ阻害剤特定の実施形態において、本発明は、限定するものではないが、特定のアポトーシス誘導標的のアポトーシス活性を阻害する組成物などのアポトーシスの阻害剤に関する。このようなアポトーシス標的は、限定するものではないが、タンパク質のカスパーゼファミリーのメンバーを含む。カスパーゼは、イニシエーター群を誘発する、外因性又は内因性アポトーシスシグナルから出発する活性化の階層的順序に従って出現し、イニシエーター群は順番にエクセキューショナーカスパーゼを処理する。カスパーゼのイニシエーター若しくはエクセキューショナー又は両方のクラスは、本発明に従って阻害され得る。例えば、決して限定するものではないが、本発明の阻害剤は、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14の一種以上を標的とする。特定の実施形態において、この阻害剤は、カスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14の一種以上の非特異的阻害剤である。代替の実施形態において、この阻害剤は、単一のカスパーゼの特異的阻害剤又はカスパーゼ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択されるカスパーゼの特定のサブセットの特異的阻害剤である。特定の実施形態において特異的阻害剤は、カスパーゼ9の阻害剤又はカスパーゼ6の阻害剤である。特定の実施形態において、限定するものではないが、カスパーゼ阻害剤を含む本発明のアポトーシス標的阻害剤は、低分子阻害剤、ペプチドタンパク質阻害剤及び核酸阻害剤からなる群から選択される。このような阻害剤は、アポトーシス標的の発現又は活性のいずれかを阻害することによって、それらの機能を発揮できる。特定の実施形態において、本発明のアポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼの低分子阻害剤を含む。特定の実施形態において、カスパーゼの低分子阻害剤は、限定するものではないが、イサチンスルホンアミドNuttallら、DrugDiscovToday685~91頁、アニリノキナゾリン433~440頁および米国特許第6878743号に開示の一種以上の低分子カスパーゼ阻害剤を包含する。特定の実施形態において、本発明アポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼのペプチド阻害剤である。特定の実施形態において、カスパーゼのペプチド阻害剤は、限定するものではないが、EGZVEIDFMKZVADFMK、CrmA及びZVADを包含する。代替の好ましい実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、限定するものではないが、アポトーシスの阻害剤として同定されるタンパク質阻害剤のクラスを含む。IAPは、概して、それぞれがおよそ70アミノ酸残基からなる、一つから三つのBIRドメインを含有する。加えて、特定のIAPはまた、二つの亜鉛原子を配位させることができる7つのシステイン及び一つのヒスチジンにより規定されるRINGフィンガードメインを有する。限定するものではないが、cIAP1、cIAP2及びXIAPなどの例示的哺乳動物IAPは、それぞれが、分子のN末端部分に三つのBIR及びC末端にRINGフィンガーを有する。対照的に、別の例示的哺乳動物IAPであるNAIPは、三つのBIRを含有するがRINGを含有せず、また二つの追加の例示的IAPであるサバイビン及びBRUCEは、それぞれ一つだけのBIRを有する。特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型である。例えば、決して限定するものではないが、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型は、カスパーゼ6のドミナントネガティブ型であってもよい。特定の実施形態において、カスパーゼ6のドミナントネガティブ型は、DenaultJB及びGSSalvesen、ExpressionpurificationandcharacterizationofcaspasesCurrProtocProteinSci、2003年21章pUnit2113においてC6DNと呼ばれているポリペプチドである。代替の実施形態において、カスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型は、カスパーゼ1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12及び14からなる群から選択されるカスパーゼのドミナントネガティブ型である。ポリペプチドアポトーシス標的阻害剤は、同定されたアポトーシス標的阻害剤ポリペプチドの特定の構造的及び機能的特徴を保持するが、その同定された阻害剤のアミノ酸配列と一つ又は複数の位置において異なるアミノ酸配列を、包含する。このようなポリペプチド変異体は、当分野において公知の方法により、元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって調製できる。特定の実施形態において、このような実質的に類似の配列は、保存的アミノ酸置換を組み込んだ配列を含む。本明細書において使用する場合、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換を含むことを意図する。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野において定義されており、塩基性側鎖酸性側鎖非荷電性極性側鎖非極性側鎖β分枝型側鎖及び芳香族側鎖を含む。他の一般に好ましい置換は、アミノ酸残基と、アラニン又はグリシンなどの小型の側鎖を有する別の残基との置き換えを伴う。アミノ酸置換されたペプチドは、自動化化学合成などの標準技術により調製され得る。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、例えばIAPなどの元のアポトーシス標的阻害剤のアミノ酸配列と、少なくとも、約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99相同であり、かつアポトーシス標的を阻害できる。本明細書において使用する場合、二つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、BLAST又はFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して決定できる。合成されたポリペプチドのアポトーシス標的を阻害する能力についてのアミノ酸置換の効果は、下記の実施例の項に開示された方法を使用して試験できる。例えば、決して限定するものではないが、核酸である本発明のアポトーシス標的阻害剤は、限定するものではないが、標的の発現を阻害することによって機能する阻害剤、例えばリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤及びsiRNA阻害剤を含む。リボザイムは、特定の核酸配列を切断できる核酸を指す。いくつかの実施形態において、リボザイムは、特異的認識のためのアンチセンス配列及びRNA切断酵素活性を含有するRNA分子を指すと理解するべきであり、例えば、米国特許第6770633号を参照されたい。対照的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、概して、その遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子部分に相補的な低分子オリゴヌクレオチドである。遺伝子発現は、オリゴヌクレオチドと特異的遺伝子又はそれらのメッセンジャーRNAとのハイブリダイゼーションにより阻害できる。ある場合には、治療戦略を、炎症を開始する、又は加速すると考えられている1種又は複数の遺伝子の発現を弱めるために適用でき、例えば、米国特許第6822087号及びWO2006062716を参照されたい。低分子干渉RNA若しくは短鎖干渉RNA若しくはsiRNA又は短鎖ヘアピンRNA若しくはshRNAは、RNA干渉の形態である。干渉RNAは、標的核酸配列、例えば、カスパーゼ6又はカスパーゼ9に相補的な二本鎖RNA又は部分的二本鎖RNA分子であってよい。マイクロ干渉RNAもまた、このカテゴリーに納まる。二本鎖RNA分子は、分子内の第1のRNA部分と第2のRNA部分との間の相補的ペアリングによって形成される。各部分の長さは、概して、30ヌクレオチド未満長である。いくつかの実施形態において、各部分の長さは19~25ヌクレオチド長である。いくつかのsiRNA分子において、RNA分子の相補的な第1及び第2の部分は、ヘアピン構造のステムである。二つの部分は連結配列により接合されてよく、これはヘアピン構造のループを形成できる。連結配列は長さが変動してよい。いくつかの実施形態において、連結配列は、5、6、7、8、9、10、11、12又は13ヌクレオチド長であってよい。連結配列は、第1及び第2の部分を接合するために使用でき、当分野において公知である。ヘアピン構造は3又は5オーバーハングヌクレオチドを含有できるので、第1及び第2の部分は相補的であるが、完全に対称でなくてもよい。本発明のRNA分子は、ベクターから発現させてもよく、又は化学的若しくは合成的に作製してもよい。512アポトーシス阻害剤細胞透過性ペプチドのコンジュゲート本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされ、アポトーシス阻害剤細胞透過性ペプチドコンジュゲートを形成する。AICPPコンジュゲートは、アポトーシスを防止することが望ましい細胞内への阻害剤の送達を容易にする。本明細書において使用する場合、細胞透過性ペプチドとは、細胞の細胞膜及び又は核膜を横断する膜透過性複合体輸送に関連するエネルギー非依存性移行特性をもたらす、短鎖ののアミノ酸配列又は機能的モチーフを含むペプチドである。特定の実施形態において、本発明の膜透過性複合体に使用される細胞透過性ペプチドは、好ましくは、少なくとも一つの非機能的システイン残基を含み、その非機能的システイン残基は遊離又はアポトーシス標的阻害剤とジスルフィド結合を形成するように誘導体化されており、これはこのような結合のために改変されている。このような特性をもたらす代表的アミノ酸モチーフは、米国特許第6348185号に記載されており、この内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる。本発明の細胞透過性ペプチドは、好ましくは、限定するものではないが、ペネトラチン1、トランスポータン、pIsl、TAT、pVEC、MTS及びMAPを包含する。本発明の細胞透過性ペプチドは、同定された細胞透過性ペプチドの特定の構造的特徴及び機能的特徴を保持するが、同定されたペプチドのアミノ酸配列と一つ又は複数の位置において異なる配列を包含する。このようなポリペプチド変異体は、当分野において公知の方法により、元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することによって調製できる。特定の実施形態において、このような実質的に同様の配列は、ポリペプチドアポトーシス標的阻害剤に関連して上述されるように、保存的アミノ酸置換を組み込んだ配列を含む。特定の実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、同定されたペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも、約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99相同であり、かつ細胞浸透を媒介できる。合成されたペプチドの細胞浸透媒介能力に対するアミノ酸置換の効果は、下記の実施例の項に開示の方法を使用して試験できる。本発明の特定の実施形態において、膜透過性複合体の細胞透過性ペプチドは、ペプチド配列RQIKIWFQNRRMKWKK又はそれらの保存的変異体を含む、ペネトラチン1である。本明細書において使用する場合、保存的変異体は、一以上のアミノ酸置換を有するペプチドであって、その置換が、細胞透過性ペプチドの形状、すなわち、生物学的活性又は膜毒性、に悪影響を与えないものである。ペネトラチン1は、ショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメインの第3のαへリックス由来の16アミノ酸のポリペプチドである。その構造及び機能は十分研究され、特徴付けられているDerossiら、TrendsCellBiol、884~87頁、1998年Dunicanら、Biopolymers、6045~60頁、2001年Hallbrinkら、BiochimBiophysActa、1515101~09頁、2001年Boltonら、EurJNeurosci、122847~55頁、2000年Kilkら、BioconjugChem、12911~16頁、2001年BelletAmalricら、BiochimBiophysActa、1467131~43頁、2000年Fischerら、JPeptRes、55163~72頁、2000年Thorenら、FEBSLett、482265~68頁、2000年。ペネトラチン1が63kDaのタンパク質であるアビジンを、ヒトBowesメラノーマ細胞に有効に運搬することが示されている911~16頁、2001年。さらに、ペネトラチン1及びそのカーゴの輸送は非エンドサイトーシス及びエネルギー非依存性であり、受容体分子又は輸送分子に依存しないことが示されている。さらに、ペネトラチン1が、純粋な脂質二分子層を横切ることができることは公知である265~68頁、2000年。この特徴は、ペネトラチン1がそのカーゴを輸送可能にし、細胞表面受容体細胞表面輸送体の利用可能性の制限から解放する。送達ベクターは、すべての細胞型に侵入すること84~87頁、1998年及びペプチドに有効に送達すること又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに有効に送達することがすでに示されている。本発明の他の限定されない実施形態は、下記の例示的細胞透過性分子RL16、物理学的特性がわずかに異なる、ペネトラチン1由来の配列948~59頁及びニューロンを標的とする狂犬病ウイルス配列であるRVGRRRRRRRRRの使用を伴う。PKumarHWuJLMcBrideKEJungMHKimBLDavidsonSKLeePShankar及びNManjunathTransvasculardeliveryofsmallinterferingRNAtothecentralnervoussystemNature448、39~43頁を参照されたい。本発明の特定の代替的な限定されない実施形態において、膜透過性複合体の細胞透過性ペプチドは、トランスポータン、pISl、Tat、pVEC、MAP、及びMTSからなる群から選択される細胞透過性ペプチドである。トランスポータンは、神経ペプチドであるガラニンのアミノ末端から12個の機能性アミノ酸、及びマストパランのカルボキシ末端の14残基配列がリジンにより連結されたものを含む27アミノ酸長のペプチドである67~77頁、1998年。トランスポータンは、アミノ酸配列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL又はそれらの保存的変異体を含む。pIslは、ラットインスリン1遺伝子エンハンサータンパク質のホメオドメインの第3へリックスに由来する77~89頁、2001年Kilkら、BioconjugChem、12911~16頁、2001年。pIslは、アミノ酸配列PVIRVWFQNKRCKDKK又はそれらの保存的変異体を含む。Tatは、HIV感染細胞の細胞膜を横切る移行を可能にし、ウイルスゲノムを転写活性化する86~102アミノ酸の転写活性化因子である101~09頁、2001年Suzukiら、JBiolChem、2772437~43頁、2002年Futakiら、JBiolChem、2765836~40頁、2001年。残基48~60に及ぶ小型のTat断片は、核内輸入に関与することが決定されており16010~017頁、1997年、アミノ酸配列GRKKRRQRRRPPQ又はそれらの保存的変異体を含む。pVECは、アミノ酸615~632に及ぶ、細胞接着分子である血管内皮のカドヘリンのネズミ配列に由来する18アミノ酸長のペプチドである237~44頁、2001年。pVECは、アミノ酸配列LLIILRRRIRKQAHAH又はそれらの保存的変異体を含む。MTS又は膜移行配列は、さらなるプロセシングのための、新生翻訳産物の適切な細胞器官への指示に関与するアクセプタータンパク質により認識される特定のペプチドの一部である99~103頁、2000年BrodskyJLIntRevCyt、178277~328頁、1998年Zhaoら、JImmunolMethods、254137~45頁、2001年。特に関連のあるMTSは、ウイルスgp41タンパク質の疎水性末端ドメインとシミアンウイルス40ラージ抗原由来の核局在化シグナルとのキメラであるMPSペプチドであり、これは、核局在化シグナルと、温度に無関係に内部移行し、オリゴヌクレオチドの担体として機能する膜転移配列との一つの組み合わせを表す99103頁、2000年Morrisら、NucleicAcidsRes、252730~36頁、1997年。MPSは、アミノ酸配列GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV又はそれらの保存的変異体を含む。モデル両親媒性ペプチドすなわちMAPは、それらの本質的特徴として、へリックス両親媒性及び少なくとも四つの完全なヘリカルターンの長さを有する一群のペプチドを形成する185~94頁、1999年Hallbrinkら、BiochimBiophysActa、1515101~09頁、2001年。例示的MAPは、アミノ酸配列KLALKLALKALKAALKLAアミド又はそれらの保存的変異体を含む。特定の実施形態において、細胞透過性ペプチド及び上記のアポトーシス標的阻害剤は共有結合し、AICPPコンジュゲートを形成する。特定の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、ペプチドアポトーシス標的阻害剤と、組換えDNA技術により動作可能に連結される。例えば、アポトーシス標的阻害剤がペプチド又はポリペプチド配列である実施形態において、そのアポトーシス標的阻害剤をコードする核酸配列は、対象となるアポトーシス標的阻害剤をコードする核酸配列の上流若しくは下流のいずれか、又は両方に導入することができる。アポトーシス標的阻害剤コード核酸配列と細胞透過性ペプチドコード核酸配列との両方を含むこのような融合配列は、当分野において周知の技術を使用して発現させることができる。特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、非共有結合を介して細胞透過性ペプチドに動作可能に連結され得る。特定の実施形態において、このような非共有結合は、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合又はファンデルワールス力により媒介される。特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、化学的リンカーを介して細胞透過性ペプチドに動作可能に連結される。このような連結の例は、通常、C、N、O、S及びPからなる群から選択される1~30個の非水素原子を含む。例示的リンカーは、限定するものではないが、置換されたアルキル又は置換されたシクロアルキルを含む。代替的には、異種部分を、細胞透過性ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に直接結合することができる。リンカーが一重共有結合でない場合、リンカーは、場合により一重、二重、三重又は芳香族炭素炭素結合並びに炭素窒素結合、窒素窒素結合、炭素酸素結合、イオウイオウ結合、炭素イオウ結合、リン酸素結合、リン窒素結合及び窒素プラチナ結合を含む、安定した化学結合の任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態において、リンカーは20個未満の非水素原子を有し、エーテル、チオエーテル、尿素、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジド結合及び芳香族結合又はヘテロ芳香族結合の任意の組み合わせから構成される。特定の実施形態において、リンカーは、一重炭素炭素結合及びカルボキサミド、スルホンアミド又はチオエーテル結合の組み合わせである。コンジュゲーションの一般戦略は、細胞透過性ペプチド及びアポトーシス標的阻害剤成分を別々に調製し、それぞれを適切な反応基を用いて改変又は誘導体化し、二つの間を連結させるステップを伴う。改変されたアポトーシス標的阻害剤を、その後、連結用に調製された細胞透過性ペプチドと一緒に、細胞透過性ペプチドとアポトーシス標的阻害剤分子との間に共有結合が生じるように、十分な時間インキュベートする。コンジュゲーションの多数の方法及び戦略は、当業者には容易に明らかであり、有効なコンジュゲーションに必要とされる条件も当業者には容易に明らかであろう。単に例示の目的で、このようなコンジュゲーションのための戦略の一つを以下に記載するが、融合タンパク質の作製又は化学リンカーの使用などの他の技術もまた本発明の範囲内である。特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤分子と本発明の細胞透過性ペプチドとの間にジスルフィド結合を作製する場合、アポトーシス標的阻害剤分子は、チオール基を含有するように改変でき、ニトロピリジル脱離基を、細胞透過性ペプチドのシステイン残基上に作製できる。任意の適切な結合は、当分野において一般的かつ周知の方法に従って作り出すことができる。誘導体化又は改変された細胞透過性ペプチド及びチオール含有アポトーシス標的阻害剤の両方を、RNaseDNase滅菌水中で再構成し、その後コンジュゲーションに適切な量で相互に加える。コンジュゲーション混合物を、その後15分間、65°Cにおいてインキュベートし、次いで60分、37°Cにおいてインキュベートし、その後4°Cにおいて保存する。連結は、ベクター連結アポトーシス標的阻害剤分子を、DTTにより還元させたアリコートを15非変性PAGEにおいて泳動させることによって確認できる。アポトーシス標的阻害剤分子を、その後適切な染色により可視化できる。特定の実施形態において、AICPPは、細胞透過性ペプチドにコンジュゲートされた二本鎖核酸を含む。このような実施形態の特定の実施において、少なくとも二本鎖リボ核酸分子の一方の鎖は、細胞透過性ペプチドとの連結のために改変し、改変された鎖と細胞透過性ペプチドとを共有結合が連結するようにしてもよい。細胞透過性ペプチドがカップリングのために遊離のチオール基を有する場合と同様に、鎖がチオール基で改変される場合、細胞透過性ペプチドとリボ核酸分子の改変された鎖を連結する共有結合は、ジスルフィド結合であってよい。しかし、広範囲の共有結合が適用可能になるように、広範囲の官能基がリボ核酸の改変に使用できることは当業者には明らかであろう。さらに、本発明の膜透過性複合体は、標的細胞特異性を複合体にもたらす部分をさらに含むことができる。特定の実施形態において、本発明は、ペネトラチン1XBIR3コンジュゲートを対象とする。特定のこのような実施形態において、ペネトラチン1XBIR3配列の配列は、PEN1XBIR3RQIKIWFQNRRMKWKKssNTLPRNPSMADYEARIFTFGTWIYSVNKEQLARAGFYALGEGDKVKCFHCGGGLTDWRPSEDPWEQHARWYPGCRYLLEQRGQEYINNIHLTHSである。特定の実施形態において、本発明は、ペネトラチン1とカスパーゼポリペプチドのドミナントネガティブ型とのコンジュゲートを対象とする。特定のこのような実施形態において、カスパーゼ6のドミナントネガティブ型は、DenaultJBandGSSalvesenExpressionpurificationandcharacterizationofcaspasesCurrProtocProteinSci、2003年21章pUnit2113においてC6DNと呼ばれているポリペプチドであり、ペネトラチン1C6DNの配列は、RQIKIWFQNRRMKWKKssMASSASGLRRGHPAGGEENMTETDAFYKREMFDPAEKYKMDHRRRGIALIFNHERFFWHLTLPERRGTCADRDNLTRRFSDLGFEVKCFNDLKAEELLLKIHEVSTVSHADADCFVCVFLSHGEGNHIYAYDAKIEIQTLTGLFKGDKCHSLVGKPKIFIIQAARGNQHDVPVIPLDVVDNQTEKLDTNITEVDAASVYTLPAGADFLMCYSVAEGYYSHRETVNGSWYIQDLCEMLGKYGSSLEFTELLTLVNRKVSQRRVDFCKDPSAIGKKQVPCFASMLTKKLHFFPKSNLEHHHHである。513医薬組成物特定の実施形態において、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体は、経鼻投与のために製剤化される。経鼻投与のために、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体を含む溶液又は懸濁液は、従来の手段、例えば、点滴器、ピペット又はスプレーにより鼻腔に直接適用するために製剤化することができる。経鼻スプレー組成物を送達するための他の手段、例えば定量噴霧式吸入器を介した吸入もまた、本発明に従って使用できる。MDIのいくつかの型が、吸入による投与のために定期的に使用される。これらの型の装置は、呼吸作動式MDI、ドライパウダー吸入器、スペーサーホールディングチャンバーとMDIとの組み合わせ及び噴霧器を含むことができる。本明細書において使用する場合、MDIという用語は、例えば、任意選択で1種以上の賦形剤とともに高圧ガスに溶解又は懸濁された活性薬剤を含有するキャニスター、定量噴霧式バルブ、アクチュエーター及びマウスピースを含む吸入送達系を指す。キャニスターは、通常経鼻スプレー組成物などの活性薬剤の溶液又は懸濁液及び一種以上のハイドロフルオロアルカンなどの高圧ガスを充填されている。アクチュエーターを押し下げると、溶液の定量噴霧が吸入用にエアゾール化される。活性薬剤を含む粒子がマウスピースに向かって推進され、その後活性薬剤が対象により吸入される。製剤は、単回投与又は複数回投与形態で提供される。例えば、点滴器又はピペットの場合、これは、患者が適切な所定の体積の溶液又は懸濁液を投与することにより達成され得る。スプレーの場合、これは、例えば、定量式噴霧スプレーポンプを用いて達成され得る。経鼻送達及び保持を好転させるために、本発明に従った成分は、シクロデキストリンを用いたカプセル化、又は経鼻粘膜における送達及び保持を強化することが期待される薬剤とともに製剤化することができる。本発明の組成物の経鼻投与に使用される、又は適用できる市販の投与装置としては、AERONEB、AERONEBGOPARILCPLUS、PARIBOYN、PARIeflow、PARILCSINUS、PARISINUSTAR、PARISINUNEB、VibrENT及びPARIDURANEBMICROAIR、HALOLITE、RESPIMAT、AERODOSE、OMRONELITE、OMRONMICROAIR、MABISMISTII、LUMISCOPE6610、、AIRMYSTIQUE、、ACORN1及びACORNII、AQUATOWER、AVANEB、AEROCELL使い捨てカートリッジを利用するAEROCURRENT、CIRRUS、DART、DEVILBISSPULMOAIDE、DOWNDRAFT、FANJET、MB5、MISTYNEB、SALTER8900、SIDESTREAM、UPDRAFTII、WHISPERJET、AIOLOS、INSPIRON、OPTIMIST、PRODOMO、SPIRA、AERxEssence及びUltra、、SONIKLDINebulizer、ACCUSPRAY、ViaNaseID、OptiMist装置又はOPTINOSE、MADNasal、Freepod、Dolphin、Monopowder、Equadel、VP3及びVP7、VP6Pump、StandardSystemsPumps、AmPump、CountingPump、AdvancedPreservativeFreeSystem、UnitDoseSystem、BidoseSystem、BidosePowderSystem、SinusScience、ChiSys、FitLizer、SwordfishV、DirectHalerNasal及びSWIRLERRadioaerosolSystemを含む。細胞、組織又は対象への送達を容易にするために、本発明のアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体は、さまざまな組成物中に、医薬として許容される担体、賦形剤又は希釈剤とともに製剤化され得る。本明細書において使用する場合、医薬として許容されるという用語は、選択される担体、賦形剤又は希釈剤が、アポトーシス標的阻害剤若しくは膜透過性複合体の生物学的活性又は組成物のレシピエントの生物学的活性に悪影響を与えないことを意味する。本発明に使用する適切な医薬担体、賦形剤及び又は希釈剤は、限定するものではないが、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、タルク粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、アカシアゴム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ポリビニルピロリドン及び又はポリビニルアルコール、生理食塩水並びに水を含む。治療的治療のための化合物の特定の製剤は、HooverJERemingtonsPharmaceuticalSciences並びにLiberman及びLachman編、PharmaceuticalDosageFormsで論じられている。本発明の方法によれば、細胞、組織又は対象に投与されるアポトーシス標的阻害剤又は膜透過性複合体の量は、組織又は対象内でアポトーシス標的を阻害するために有効な量でなければならない。この量は、当業者により容易に決定される。本発明の任意の実施形態に関連して用いられる具体的投薬量は、使用される阻害剤の型、阻害されるアポトーシス標的及び標的を発現する細胞型を含む多数の因子に依存するものである。量は、対象の体重及び標的とされる特定の疾患又は状態によって調整される。52治療方法特定の実施形態において、本発明は、CNS虚血性損傷の影響を改善し、又は神経変性疾患の危険性若しくは兆候を減少させる方法を対象とする。例えば、特定の実施形態において、本発明は、虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害しそれによって虚血性損傷の影響を改善するために有効量のAICPPコンジュゲートを投与する方法を対象とする。特定の実施形態において、本発明の方法は、中枢神経系における虚血性損傷に関連するアポトーシスを阻害するための、アポトーシス標的阻害剤の鼻腔内投与を対象とする。本発明の特定の限定されない実施形態において、AICPPコンジュゲートを、虚血の発症において開始され次の48時間に及ぶ治療域の間に投与し、治療は、好ましくは虚血性事象の約24時間以内又は約12時間以内に投与される。したがって、特定の実施形態において、本発明は、従来の治療域を用いた治療は、一般に、虚血性損傷の発症の3時間以内に投与されなければならないを越えて実施できる、虚血性損傷の影響を改善する方法を提供する。追加の限定されない実施形態において、本発明の方法は、脳梗塞又は一時的虚血性発作の診断に一致する神経学的欠損の突然の発症を経験をした患者の治療に使用することができ例えば、その神経学的欠損は言語機能、感覚機能又は運動機能の障害であり得る。虚血の効果の治療改善、又は神経変性疾患の治療のいずれかに使用する場合、治療は、単回投与又は複数回投与として投与することができ、複数回投与を投与する場合、それらは、6回24時間又は4回24時間又は3回24時間又は2回24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。本発明のある特定の限定されない例において、限定するものではないが、Pen1XBIR3又はカスパーゼのドミナントネガティブ型などのポリペプチドアポトーシス標的阻害剤は、虚血の治療に用いられる。特定のこのような例において、Pen1XBIR3又はカスパーゼAICPPコンジュゲートのドミナントネガティブ型は、虚血性損傷を患う患者に単回投与又は複数回投与のいずれかとして投与される。複数回投与を投与する場合、それらは、6回24時間又は4回24時間又は3回24時間又は2回24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。投与されるPen1XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型の濃度は、特定の実施形態において、001μM~1000μM1μM~500μM又は10μM~100μMである。Pen1XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型は、特定の実施形態において、01μl~1000μl、10μl~500μl又は10μl~100μlの液滴を、30秒~5分ごと、1分~4分ごと又は2分ごとに10~60分、15~30分ごと又は20分ごとに交互の鼻孔に投与することによって経鼻的に送達される。特定の実施形態において、具体的なヒト等価投薬量が、ReaganShawら、FASEBJ、22659~661頁に概説された、体表面積比較を介した動物研究から計算できる。本発明のある特定の限定されない例において、Pen1XBIR3又はカスパーゼのドミナントネガティブ型は、神経変性疾患を治療するために用いられる。特定のこのような例において、Pen1XBIR3又はカスパーゼAICPPコンジュゲートのドミナントネガティブ型は、神経変性疾患を患う患者に単回投与又は複数回投与のいずれかとして投与される。複数回投与を投与する場合、それらは、6回24時間又は4回24時間又は3回24時間又は2回24時間の間隔で投与することができる。初期投与量は、その後の投与量より多くてもよく、又はすべての投与量が同じであってもよい。投与されるPen1XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型の濃度は、特定の実施形態において、001μM~1000μM1μM~500μM又は10μM~100μMである。Pen1XBIR3又はカスパーゼAICPP組成物のドミナントネガティブ型は、特定の実施形態において、01μl~1000μl、10μl~500μl又は10μl~100μlの液滴を、30秒~5分ごと、1分~4分ごと又は2分ごとに10~60分、15~30分ごと又は20分ごとに交互の鼻孔に投与することによって経鼻的に送達される。特定の実施形態において、具体的なヒト等価投薬量が、ReaganShawら、FASEBJ、22659~661頁に概説された、体表面積比較を介した動物研究から計算できる。本発明の特定の実施形態において、アポトーシス標的阻害剤は、単独で又は膜透過性複合体との関連で、一種以上の追加の治療薬と併用投与される。特定のこのような実施形態において、追加の治療薬は、限定するものではないが、tPA又はヘパリンなどの抗血液凝固剤、フリーラジカルスカベンジャー、抗グルタミン薬などを含む329~341頁を参照されたい。特定の実施形態において、本方法は、一種以上の追加のアポトーシス標的阻害剤を、単独で又は膜透過性複合体との関連で、投与することを伴う。6実施例61軸索喪失及び神経変性におけるカスパーゼ6本実施例は、カスパーゼ6が、脳虚血後の軸索変性及びニューロン喪失のメディエーターであり、カスパーゼ6の活性の阻害がインビボで神経保護することを立証する。下記の62項に概説するように、活性カスパーゼ6は、ラット及びマウスの両方において、虚血後、細胞体及びニューロン突起において一時的に誘導される。カスパーゼ6の遺伝的ノックアウトが、脳卒中に対して神経保護的であり、脳卒中に関連する神経機能の欠損を改善することを、63項に示す。さらに、カスパーゼ6の活性化の時間経過は、ヒト脳卒中及び他のげっ歯類モデルにおいて観察された軸索変性の時間経過と一致し、12~24hprの軸索及び樹状突起におけるカスパーゼ6のこの活性化が、神経保護のための魅力的な分子標的となる。下記の64項に概説するように、インビボで使用するための活性カスパーゼを捕捉するインビトロ技術、72~77頁が用いられており、カスパーゼ9が1hpr及び4hprにおいて活性であることが見出されている。、88948904頁。カスパーゼ9の活性化がカスパーゼ6の切断につながるかどうかを決定するために、カスパーゼ9の活性を、タンパク質のアポトーシスファミリーの阻害剤のメンバーである、XIAPのBIR3ドメインで阻害した。カスパーゼ9の高度に特異的な阻害剤であるこのタンパク質ドメインを、細胞膜を横切って送達するために、細胞導入ペプチドであるペネトラチン1に連結した、988~994頁。実質内対流増加送達戦略及びPen1XBIR3の鼻腔内送達はカスパーゼ6の活性化をニューロン突起において阻害することから、神経保護的である。さらに、66項に概説するように、Pen1XBIR3の鼻腔内送達は、機能的神経保護をインビボで提供する。要約すると、これらの例は、カスパーゼ6及びカスパーゼ9が、脳卒中における軸索変性及びニューロン死において活性であり、それらの阻害により、虚血性損傷の影響を改善させ得ることを立証する。62カスパーゼ6は、脳卒中後、ニューロン突起及び細胞体において活性である多くのカスパーゼが、脳卒中における神経変性の進行に関与するが、個々のカスパーゼの具体的な役割に関する明確な証拠は、依然として見つけるのが難しいままである。、165~182頁。本実施例は、カスパーゼ6が、インビボの虚血後にニューロン突起において活性化されたかどうかを試験する。ラットを、2時間の一時的中大脳動脈閉塞に供し、脳を、切断カスパーゼ6に関して、再灌流後経時的に画像化した。大型及び小型のサブユニットの間のカスパーゼ6の切断は、このプロテアーゼを完全に活性化するので、切断により生み出されたネオエピトープに対する抗血清反応性は、活性化の真の読み出しである。、313319頁。前脳のペナンブラ領域、特に顆粒性島の皮層第I~IV層、体性感覚皮質、脊椎運動皮質は、clC6に関する染色の一時的増加が明らかになった。clC6は、対照の非虚血性動物において検出されなかった。4hprまで、ペナンブラでは最小染色であったが、12hprまでに、帯状皮質、一次運動皮質、一次及び二次体性感覚皮質並びに顆粒性島皮質中の突起及び細胞体において大量のclC6染色が認められれた。24hprまでに、核においてC6の活性化の進行が認められ、それは再灌流後3日にわたり続いた。7dprに、clC6は核においてのみ見られた。tMCAoに供された野生型マウスにおいて、染色パターンは、24hpr及び3dprにおいて検出された細胞体及び突起の染色と同様であった。神経学的にこの時間経過は、最初の3日にわたる梗塞の拡大及び軸索変性を伴う梗塞の進行の両方と一致する。NeuNとの共染色は、clC6がニューロンに位置することを示し、一方、星状膠細胞のマーカーであるGFAPとの共局在化はなかった。clC6が、軸索又は樹状突起に存在したかどうかを同定するために、切片を、clC6及びTuj1若しくはNFL又はMAP2に関して共染色した。24hprに、Tuj1及びclC6は、単一のニューロン突起に見出された。これらの突起は、連続しておらず、突起中のギャップはclC6に関して陽性であった。興味深いことに、ADにおける先の作業は、カスパーゼ6がチューブリン及びタウを切断することを示唆しており、このことが微小管及び軸索の安定性を破壊すると思われる。、1541~1555頁Guoら、AmJPathol165、523~531頁。clC6はまた、NFL又はMAP2を含有する単一の突起に見出され、突起染色においてclC6の詰まった同様のギャップが認められた。このような機能は、カスパーゼ6が、これらのタンパク質又はそれらのポリマー化を安定化させる結合タンパク質を直接切断している結果であり得る。63カスパーゼ6の遺伝的ノックアウトは神経保護的であるカスパーゼヌルマウスは、脳虚血におけるこれらのプロテアーゼの役割を研究する上で強力な道具である。野生型及びカスパーゼ6マウスをtMCAoに供し、カスパーゼ6マウスは、28ポイント試験に基づき野生型マウスと比較して、24hprにおいて有意に優れた神経学的機能を示した。、641~648頁。同様の神経保護は、tMCAoに供されたカスパーゼ3ヌルマウスにおいても以前に観察された。、15188~15193頁。梗塞体積の一般的な測定である、235トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色は、神経機能における有意差にもかかわらず、24hprにおいて有意差を示さなかった。このことをさらに研究するために、ニューロン数及び突起数を定量した。1時間のtMCAoに供された野生型マウスはその後24hprに、非脳卒中野生型マウスと比較してニューロン数が47の減少を示し、この減少は、カスパーゼ6マウスにおいて部分的に回復した。蛍光nissl染色も同様の結果をもたらした。このことは、細胞の計数及び神経機能試験が、この時点においてTTCよりさらに高感度な測定を提供したことを示した。さらに、tMCAoに供された野生型マウスは、カスパーゼ6マウスと比較して、より少ないNFL陽性突起を有した。野生型マウス由来の突起はより短く、より多くの断片化NFL染色を示し、これは軸索の断片化及び変性を示唆する。脳卒中野生型マウスにおいてMAP2を含む突起もまた、カスパーゼ6と比較してより少なかった。タウは、カスパーゼ6の推定上の軸索基質であり、タウのN末端及びC末端領域に潜在的な切断部位を有する。、523~531頁Horowitzら、JNeurosci24、7895~7902頁。タウのC末端領域に特異的な抗体を用いた分析は、24hprにおいてカスパーゼ6脳が、野生型脳より多くの無傷のタウを保持していたことを明らかにした。このことは、カスパーゼ6が、脳卒中の際にタウレベルを減少させることを示唆する。タウのこの喪失は、微小管の不安定性、及び突起の完全性の喪失につながり得る。64カスパーゼのイニシエーターであるカスパーゼ9は、脳卒中の早期に活性であるカスパーゼ6は、エフェクターカスパーゼであり、先行する研究は、イニシエーターカスパーゼのカスパーゼ9が、カスパーゼ6の活性化につながることを示した。、21777~21781頁。12hprまでの検出可能な切断カスパーゼ6の誘導は、イニシエーターカスパーゼの活性化がこの時点の前に起こっているはずであることを示唆した。エフェクターカスパーゼの活性化は切断を必要とし、それにより切断部位特異的抗体を使用して活性化状態を判定することが可能になる一方、イニシエーターカスパーゼは活性化のために切断を必要としないが、二量化により活性化され得る。、165182頁。現在のところ、カスパーゼ活性に基づくプローブであるビオチンVADfmkが、イニシエーターカスパーゼが、死刺激後に活性であるかどうかを決定するための最善の方法である。bVADは、さまざまな死刺激後のカスパーゼ活性化を同定するためにインビトロで使用されている、不可逆的汎用カスパーゼ阻害剤である。、72~77頁DenaultSalvesen、JBiolChem278、34042~34050頁Tizonら、JAlzheimersDis19、885~94頁。bVADは、任意の活性カスパーゼに不可逆的に結合し、下流事象を阻害するものである。最終的には、イニシエーターカスパーゼは切断されるが、このことはそれらの活性化の下流結果である。、1916~1925頁DenaultSalvesen、MethodsMolBiol414191~220頁Srinivasulaら、Nature410、112~116頁。この方法は、培養初代ニューロンにおける使用のために適合化されており、現在、CNSにおけるインビボでの使用のためにさらに適合化されている。、885~94頁。イニシエーターカスパーゼが、脳卒中において初期に活性化されたかどうかを決定するために、ラットに、200ナノモルのbVADをtMCAoの1時間前に線条体に対流増加送達により注射し、1hprに屠殺した。注射領域を切り取り、bVADカスパーゼ複合体を、ストレプトアビジンアガロースビーズ上に単離し、ウエスタンブロッティングにより分析した。bVADにより捕捉されたカスパーゼ9及びカスパーゼ8は、これらのイニシエーターカスパーゼの活性化が脳卒中の早期事象であることを示す。カスパーゼ1及び2は、bVADにより単離されなかった。カスパーゼ9が活性であり続けているかどうかを決定するために、動物を、3aのように処置し、4hprに屠殺した。bVADにより捕捉されたカスパーゼ9は、カスパーゼ9が、脳卒中の進行とともに活性化され続けていることを示した。さらに、24hprにおいて、clC6に関して陽性の細胞は、カスパーゼ9に関しても陽性であったことが観察された。カスパーゼ9は、突起においてclC6とともに観察された。これらのデータに基づいて、カスパーゼ9はカスパーゼ6の活性を制御できると考えられることから、したがってこの関係をさらに探求した。65カスパーゼ9は、ニューロンの突起及び細胞体においてカスパーゼ6を活性化するカスパーゼ9及びclC6の共局所化は、カスパーゼ9がカスパーゼ6を活性化する機序を支持する。カスパーゼ9がカスパーゼ6を活性化していたかどうかを決定するために、カスパーゼ9の阻害が、カスパーゼ6の活性化を遮断するものかどうかを調べる試験に取り組んだ。現在利用可能な低分子阻害剤は、個々のカスパーゼの寄与を分析するために十分に特異的ではなく、それ故、カスパーゼ9を明確に阻害するための代替的な試みを開発した。、322~331頁。哺乳動物は、IAPとして知られる細胞死阻害タンパク質のファミリーを発現する。このファミリーの一員であるX連鎖IAPは、活性カスパーゼ9、3、7の強力な特異的阻害剤である。IAPは、バキュロウイルスIAPリピートドメインを含有し、XIAPに関して、カスパーゼ阻害特異性は、特異的BIRドメインに依存し、BIR3ドメインは活性カスパーゼ9を特異的に標的とする。、988~994頁。XIAPBIR3の細胞内への取り込みを促進するために、そのペプチドを、細胞導入ペプチドであるペネトラチン1にジスルフィド結合させた。、1004010046頁。細胞への進入において、ジスルフィド結合は細胞質の還元環境により破壊され、ペプチドカーゴ積荷を放出し、それをその標的に作用させる。この構築物の機能的有効性を、カスパーゼ9依存的死である4ヒドロキシノネナール媒介性死を被った海馬のニューロン培養物を使用して確認した。、1057~1066頁。Pen1XBIR3及びHNEを用いた培養物の処理は死を取り消した。Pen1ペプチドを脳に送達できることを確保するために、Pen1を、FITC標識対照ペプチドに連結し、対流増加送達を使用して線条体に送達した。送達の24時間後に脳を採取し、切片にし、画像化した。FITCペプチドは同側半球全体に分布し、より高性能の画像により細胞の取り込みが明らかにされた。Pen1XBIR3は、ICCを使用したtMCAoの1時間前に線条体に送達された。動物を24hprにて採取し、カスパーゼ9及びclC6に関して免疫染色した。Pen1XBIR3は、細胞体及び突起においてclC6及びカスパーゼ9の出現を阻害した。したがって、カスパーゼ9の活性は、ラットにおける一時的虚血性事象後のニューロンの細胞体及び突起においてカスパーゼ6の活性化に必要である。前述の知見は、Pen1XBIR3の実質内送達がカスパーゼ6の活性化を防止することを実証している。下記の実験を実施して、別の送達技術によりPen1XBIR3が血液脳関門を迂回することもできるかどうかを確認した。ニューロトロフィン及び他の化合物の鼻腔内送達は、CNSへの接近を提供し、脳卒中を含む多数のモデルにおいて神経変性を防止することが実証されている。、1654~1673頁Liuら、JStrokeCerebrovascDis13、16~23頁Liuら、JNeurolSci187、91~97頁。この送達方法は、血液脳関門を迂回するのに嗅覚路を利用するが、現在のところ、この方法により送達されたタンパク質及び化合物は、げっ歯類モデルにおいて、細胞表面受容体などの細胞外標的を標的としている。細胞内タンパク質であるカスパーゼをこの実験において標的としているため、カーゴは、細胞内に送達される必要がある。上記のように、ペネトラチン1は、必要な、連結ペプチドの細胞内取り込みを提供する。Pen1XBIR3は、ラットに鼻腔内送達され、その後、脳を冠状に薄切し、CNSにおけるXBIR3の存在を、ウエスタンブロッティングにより決定した。Pen1XBIR3は、脳のすべての薄片に送達され、IGF41の送達パターンと同様であった。Pen1XBIR3の鼻腔内送達もまた、カスパーゼ6の活性、軸索樹状突起の喪失を減少させ、脳卒中からの神経保護を提供するかどうかを決定するために、動物を、tMCAoの1時間前にPen1XBIR3を用いて処置し、示されている再灌流時間に採取した。脳を、12hpr及び24hprにおいて、活性化カスパーゼ6、NFL、MAP2及びNeuNの発現に関して分析した。Pen1XBIR3は、突起において、12hprまでにカスパーゼ6の活性化を有意に減少させなかったが、この時点において低下に向かう傾向があった。24hprまでに、生理食塩水を用いて処置したラットと比較して、突起において24hprまでにclC6の有意な減少があった。したがって、この送達技術を使用するカスパーゼ9阻害は、カスパーゼ6の活性を減少させた。さらに、24hprにおいて、Pen1XBIR3は、ニューロン喪失に対して有意な保護を提供し、12hprにおいていずれの群においても明らかなニューロンの喪失はなかった。ニューロン密度とは対照的に、NFL陽性神経突起の数は12hprにおいて有意に低下し、これは、軸索の喪失がニューロンの細胞体の喪失の前に起こっていることを示唆している。これは、脳卒中において軸索変性がニューロン死に先行することを示唆しており、それは他の神経変性疾患に関してもすでに提示されている。、889~898頁。鼻腔内Pen1XBIR3による軸索保護は、24hprまで続いた。軸索密度とは異なり、樹状突起レベルは、12及び24hprにおいて影響を受けず、これは、樹状変性の時間経過がより緩慢であるか又は変性の機序が異なることを示している可能性がある。カスパーゼ6が、ヒト脳卒中において活性であるかどうかを決定するために、虚血性脳卒中後に死亡した患者の脳由来の死後組織を、clC6に関して免疫染色した。DABの発色は、梗塞組織における細胞体及び突起の染色を示し、隣接する切片のNFL染色は、突起密度の減少を示した。clC6が、突起に対するマーカーと共局在するかどうかを決定するために、切片を、clC6及びTuj1に対して共染色した。clC6は、虚血性組織中の突起に見出され、Tuj1との共局在化のパターンは、虚血のげっ歯類モデルにおいて観察されたパターンと非常に類似していた。66鼻腔内Pen1XBIR3は、インビボで機能的神経保護を提供するPen1XBIR3の、脳卒中により引き起こされる感覚運動障害を防止する効果を、ラットに、予防的又は治療的な、ビヒクル又はPen1XBIR3の鼻腔内ボーラス注入を施すことにより試験した。げっ歯類を、24ポイントの神経機能的スケールにより、虚血の1日後に開始して虚血性事象後1日おきに3週間試験することにより、アッセイした。予防的又は再灌流の4時間後にPen1XBIR3を用いて処置された動物は、それらのビヒクル処置対応動物よりも脳卒中関連障害が少ないことを示した。図3bに示すように、Pen1XBIR3による治療的保護は、カスパーゼ9の活性化が脳卒中の際、再灌流後少なくとも4時間まで持続すること及びこの経路が、脳卒中により引き起こされた急性神経変性にとって重要であることを示す。67鼻腔内Pen1C6DNはカスパーゼ6基質の切断を防止するカスパーゼ6の直接阻止が、虚血後の保護を提供するかどうかを決定するために、Pen1連結カスパーゼ6のドミナントネガティブ構築物を利用した。Pen1C6DNを、tMCAoの1時間前にマウスに鼻腔内ボーラスにより送達し、マウスを、その後1時間のMCAo、次いで再灌流に供した。動物を、24hprに屠殺し、脳のコア及びペナンブラ領域を、ウエスタンブロッティング用に調製した。図7に表したように、脳卒中梗塞のコア及びペナンブラ領域由来のタンパク質溶解液を単離した。ビヒクルのみで処置した場合、同側半球は、カスパーゼにより切断されたタウを豊富に含有した。Pen1C6DNは、カスパーゼにより切断されたタウの切断を減少させ、鼻腔内Pen1C6DNが、脳卒中の際のカスパーゼ6基質の切断を防止し得ることを示している。68データ分析これらのデータは、カスパーゼ6及び9が、脳虚血における軸索変性及びニューロンの喪失の制御因子であることを示す。図8は、虚血におけるカスパーゼ9及び6の活性化並びにこの活性化への介入の効果を示す概略図を提供する。カスパーゼ6は、ラット及びマウスモデルの両方並びにヒト梗塞組織周囲において、ニューロンの突起及び細胞体中のペナンブラ領域において活性化される。カスパーゼ6の遺伝的切除は、構造レベル及び機能レベルで神経保護を提供する。ニューロンにおけるカスパーゼ6に関する機能は、ハンチントン舞踏病における神経変性に関連するハンチンチンのプロセシングを含む。、1179~1191頁。カスパーゼ6はタウを切断し、微小管を安定化させるその能力に影響を及ぼす可能性があり、タウのカスパーゼ6媒介性切断は、ADの病因に関与し得る。、7895~7902頁Klaimanら、MolCellProteomics7、1541~1555頁Guoら、AmJPathol165、523~531頁。脳虚血の上記のモデルにおいて、61~65項を参照すると、活性カスパーゼ6は、軸索マーカー及び樹状マーカーと共局在化し、このカスパーゼがニューロン突起の変性に関与している。同じ突起に存在するが、活性カスパーゼ6を含むいくつかのエリアは突起マーカーを欠如しており、そのことはカスパーゼ6がこのマーカーを切断することを示唆している。脳卒中におけるカスパーゼ6のこの機能を支持するように、カスパーゼ6マウスと比較した、tMCAoに供された野生型マウスにおけるタウの減少が観察された。カスパーゼ6阻害剤であるPen1C6DNの鼻腔内送達は、カスパーゼにより切断されたタウの出現を減少させ、脳卒中におけるカスパーゼ6の標的化が機能的神経保護を提供するものであることを示している。さらに、カスパーゼ6及び野生型マウス由来の梗塞組織の組織溶解液のプロテオーム解析を使用して、脳卒中の際にカスパーゼ6により切断された広範なタンパク質を明らかにでき、その多くは軸索安定性を制御する可能性がある。さらに、カスパーゼ6は、栄養因子の欠乏を被った解離DRGニューロンにおける突起変性に関与し、981~989頁、その研究は、カスパーゼ6が突起変性に関与するだけでなく、ニューロン死にも関与することを提示した。本研究は、カスパーゼ6が、虚血の際の突起変性及びニューロン死の両方を媒介していることを見出している。脳卒中のペナンブラにおけるカスパーゼ6の一時的活性化は、軸索変性の進行と対応する。神経変性の他の形態に関して、軸索変性は、細胞死への主要な寄与因子であり、標的由来の栄養因子の除去による死を引き起こし得る。、669~673頁Fischerら、ExpNeurol185、232~240頁Stokinら、Science307、1282~1288頁。この事例において、軸索変性が細胞死に先行した。脳虚血の臨床的症例において、軸索変性は、虚血後2日という早期に観察されるが、1767~1774頁、軸索変性を誘発する分子事象は、より早期に始まっていると思われる。ペナンブラ領域において、軸索の喪失がニューロンの喪失に先行することが見出され、これが、軸索変性が虚血性事象後のニューロン喪失に先行することを間接的に示唆している。カスパーゼ6は、カスパーゼ9により活性化されるエフェクターカスパーゼである。、21777~21781頁。カスパーゼ活性をアッセイするために短鎖ペプチドのカスパーゼ基質を使用することは一般的なやり方であるが、これらのペプチドは非常に雑多であり、したがって紛らわしいデータを生じることがあり得る。、322~331頁。不可逆的汎用カスパーゼ阻害剤であるビオチンVADfmkは、活性カスパーゼ複合体の生化学的プルダウンを介してカスパーゼ活性の信頼できる測定を提供する。元は細胞系においてカスパーゼ活性をアッセイするために使用され、最近では、初代ニューロン培養物で使用されており、この手順は、CNSにおけるインビボ使用に適合化されている。、72~77頁Tizonら、JAlzheimersDis19、885~94頁。本研究において、カスパーゼ9が、梗塞進行の早期に、コア領域において活性であることが、ビオチンVADfmkにより活性カスパーゼ9複合体を単離することによって実証されている。どのようにカスパーゼ9が脳卒中において活性化され、カスパーゼ6の切断につながるかに関する、2~3の推定上の機序が存在する。第1に、低酸素症により生じた活性酸素種が、DNAの損傷及びp53の活性化をもたらし得る。。アポトーシスの際、活性化されたp53はミトコンドリア外膜に移行し、そこで、p53はBcl2結合Xタンパク質及び他のプロアポトーシスタンパク質を動員する。この動員がミトコンドリア外膜の透過化につながり、チトクロームcをサイトゾルに放出させ、それがカスパーゼ9の活性化につながる。あるいは、虚血におけるカスパーゼ9の活性化及び得られたカスパーゼ6の活性化が、受容体により媒介され得る。p75ニューロトロフィン受容体及び死受容体6刺激の両方が、カスパーゼ6の活性化をもたらし、DR6が軸索変性をもたらす。、34295~34302頁Nikolaevら、Nature457、981~989頁。p75NTRの多数の下流標的の一つはp53であり、これがカスパーゼ6の活性化につながり得る。DR6の一つの相互作用パートナーは腫瘍壊死因子1型受容体関連デスドメインであり、これがシグナルトランスデューサーTRAF2に結合し、NFカッパBを活性化する。細胞死機能に関して、NFカッパBは、アポトーシス促進性及び抗アポトーシス機能の両方を有するが、脳卒中におけるNFカッパBの持続的活性化は、アポトーシス促進性運命の駆動に関連すると考えられている。、995~1006頁。NFカッパBは、Bcl2ファミリーメンバーを制御し、ミトコンドリア膜の安定性、チトクロームcの放出及び続くカスパーゼ9活性化をもたらす。、995~1006頁。カスパーゼ9の活性が脳卒中の早期に刺激され、カスパーゼ9の上昇がclC6を含む細胞において観察され、カスパーゼ9は、脳卒中の際のカスパーゼ6の活性化につながると考えられる。カーゴを細胞に効率よく送達する導入ペプチドであるペネトラチン1に連結された、XIAP由来のBIR3ドメインは、カスパーゼ9の活性を阻害するために使用された。、10040~10046頁Gueganら、NeurobiolDis22、177~186頁Fanら、NeurochemInt48、5059頁。先行する研究は、PTDXBIR3Ringの融合タンパク質の腹腔内送達が、tMCAo後の梗塞体積を減少させることを示した。、72~77頁Gueganら、NeurobiolDis22、177~186頁Fanら、NeurochemInt48、50~59頁。上記の研究においては、二つの異なる送達戦略を用い、この阻害剤を脳に送達した。対流増加送達は、梗塞領域への直接送達を提供し、脳卒中前のこの阻害剤のCEDは、ニューロンの細胞体及び突起におけるカスパーゼ6の活性化を消失させた。したがって、カスパーゼ9の活性は、脳卒中においてカスパーゼ6の活性を制御する。治療的見地から、CNS障害に関して、鼻腔内送達は、脳への直接接近を提供するので、非常に魅力的な治療戦略である。細胞透過性ペプチドのペネトラチン1と組み合わせたこの送達は、CNSへの細胞内送達を提供する。Pen1とカーゴペプチドとのジスルフィド結合の使用により、いったんカーゴペプチドが細胞に輸送され、Pen1から放出されれば、確実にカーゴペプチドは機能的になりうる。本研究において、Pen1XBIR3の鼻腔内送達は、カスパーゼ6の活性化を阻害し、軸索変性を減少させ、神経保護的であった。XBIR3は、カスパーゼ9を遮断することによって間接的にカスパーゼ6の阻害を提供するが、カスパーゼ6の結晶構造の最近の公開は、より特異的なカスパーゼ6阻害剤の作製につながるはずである。、429~439頁。さらに、Pen1C6DNを使用して提示されたデータは、この方法が、カスパーゼ6の直接阻害を提供することを示す。本データは、カスパーゼ6の活性化が脳卒中における軸索変性と対応することを明らかにし、この過程がどのように虚血において起こるかに対する洞察を提供する。カスパーゼ6の活性化は、虚血発症後比較的遅いので、脳卒中におけるカスパーゼ6の有効な阻害は、実質的な虚血後の機能的神経保護及び脳虚血に関する価値のある治療的戦略を提供できる。68材料及び方法抗体。免疫組織化学用、抗Tuj1抗体、抗神経フィラメントL、抗MAP2、抗GFAP、抗完全長及び切断カスパーゼ9、抗切断カスパーゼ6、抗切断カスパーゼ3及び抗切断カスパーゼ7抗体。ウエスタンブロッティング用、THE抗His、抗カスパーゼ8、抗カスパーゼ6、タウV20、ラミンAC。マウス及びラット脳卒中モデル。C57Bl6バックグラウンドのカスパーゼ6ヌルマウス4849を、野生型C57Bl6マウスと交配し、C6ヘテロ接合体を作製し、それらを交配させ、研究用のC6及び野生型同腹子を作製した。2~3月齢の雄C6及び野生型の同腹子マウス及び成体Wistar雄ラット250~300gを、先に公開のように一時的中大脳動脈閉塞に供した。、523~531頁discussion532Komotarら、NatProtoc2、2345~2347頁。脳を採取し、ウエスタンブロッティング又は免疫組織化学用に、下記のように処理した。マウス神経機能的分析のため、28ポイント神経学的機能性試験を、前記のように実施した。、641~648頁。さらに、単一マウスを各時点において新しいケージに入れ、各マウスの代表的自発活動について短いビデオを記録し、マウス脳卒中モデルにおける運動欠損を示した。ビオチンVADfmk又はPen1XBIR3の対流増加送達。成体雄Wistarラットに、定位固定装置用麻酔マスクにより送達されたイソフルランを使用して麻酔をかけ、定位固定フレームに配置した。CEDを、下記の定位座標を用いて前記のように実施した。、683~691頁。治療薬の注入を、その後05μl分の速度で始めた。注入後、カニューレを1mm分の速度で取り外し、穿頭孔を骨ろうで密閉し、皮膚切開を皮膚接着剤で閉鎖した。術後、ラットを、37°Cの手術後インキュベーターに配置し、正常体温で1時間維持した。Pen1XBIR3。XIAP由来のBIR3ドメインを前記のように精製した。、33777~33781頁。ペネトラチン1を、等モル比で精製XBIR3と混合し、一晩、37°Cにおいてインキュベートし、ジスルフィド結合されたPenBIR3を作製した。連結を、20SDSPAGE及び抗His抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した。30μlのPen1XBIR3を、虚血の誘導の直前にICCにより注入した。動物を室温において飼育し、安楽死させ、脳免疫組織化学又はタンパク質の単離のために処理した。等体積の生理食塩水を、陰性対照として注入した。インビボのカスパーゼ活性アッセイ。ビオチンValAlaAspフルオロメチルケトンを、インビボの活性化カスパーゼ分子トラップとして使用した。200nモルのbVADfmkを30μlの滅菌生理食塩水で希釈し、脳卒中の前にICCにより注入した。脳組織を、bVADfmkを用いた治療及びtMCAo後にラット又はマウスから採取し、液体窒素で瞬間凍結した。組織を、プロテアーゼ阻害剤を含有する冷CHAPSバッファー中で乳鉢破壊することによって溶解させた。bVADfmkカスパーゼ複合体のプルダウンのために、タンパク質溶解液を、セファロースビーズで10時間、4°Cにおいて揺らすことによって、あらかじめ清澄にした。あらかじめ清澄にした溶解液を遠心分離機にかけ、上清を、30μlのストレプトアビジンアガロースビーズに移し、穏やかに一晩、4°Cにおいて揺らした。ビーズを、CHAPSバッファーを用いて15回、洗浄遠心分離した。最終の洗浄ペレット化の後で、ストレプトアビジンビーズのカスパーゼbVADfmk複合体を、1×SDS試料バッファーwo還元剤中に加熱脱離させた。ビーズを、14000rpmにおいて10分間ペレット化し、上清を新しいチューブに移し、SDSPAGEにより分離した。生理食塩水を、bVADfmkに関するビヒクル対照として使用した。Pen1XBIR3の鼻腔内送達。イソフルラン麻酔下で仰向けにねかせながら、Pen1XBIR3を、6μlの液滴を交互の鼻孔に2分ごとに20分間投与することによってラットに送達した。、481~496頁。鼻腔内治療を、脳卒中の誘導前に実施した。生理食塩水を、陰性対照として使用した。脳を、免疫組織化学又はウエスタンブロッティング用に採取した。免疫組織化学、細胞突起の定量化及び統計解析。ラット及びマウスを安楽死させ、ヘパリンで灌流し、次いで4のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片を、10の正常なヤギ血清1BSAを用いて1時間ブロックし、一次抗体とともに一晩、4°Cにおいてインキュベートし、PBSTritonX100で洗浄し、その種に適したAlexaFluorコンジュゲート二次抗体とともに2時間、室温においてインキュベートした。スライドをさらにHoechst33342を用いて15分、RTにおいて、又は核の染色にはNeuroTrace蛍光Nissl染色を用いて30分染色した。ヒト試料をさらに、SudanBlackを用いて5分間RTにおいて処置し、3回交換してPBSで洗浄した。蛍光染色の検出のために、切片を、正立Nikon蛍光顕微鏡を用いてSPOTデジタルカメラ及びPerkinElmerSpinningDiscConfocalImagingSystemを使用して画像化した。ニューロン及び軸索の定量をCellCounterプラグインImageJを使用して達成した。ラットの脳における定量化のために、20倍拡大画像を背側運動皮質及びS1体性感覚皮質の前肢領域から取得したが、両方の領域は梗塞ペナンブラ内に含まれる。突起又はニューロンの単一のブラインド計数を対象となる両方の領域において実施し、その後各個別の動物に関してプールした。3匹の動物コホートを使用した。マウスの脳に関して、20倍拡大画像を、S1体性感覚皮質の前肢領域において取得し、同様の計数を下記のように実施した。計数を、NFLMAP2陽性突起及びNeuN陽性細胞体に関して実施した。グループ間の比較はスチューデントt検定、p値005を使用した。ヒト試料を、DAB染色によりさらに分析した。試料を、03のH2O2とともに30分間インキュベートし、次いで10の正常ヤギ血清PBS中1BSAを用いてブロックし、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体インキュベーションを一晩、4°Cにおいて実施した。PBSで洗浄後、スライドを、その種に適したビオチンコンジュゲート二次抗体とともに30分、RTにおいてインキュベートした。試料を、その後ABC試薬とともに30分インキュベートし、DAB染色を10分間行った。試料を、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、続いてエタノールを用いて脱水し、キシレンの2回洗浄で清澄にした。ラットの海馬培養物。E18ラット胚由来の海馬ニューロンを切り取り、規定の無血清培地に分散させ、ポリDリジンをコーティングした組織培養ウェルにプレーティングした。ニューロンを、グルコース、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、トランスフェリン、セレン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するEagleMEM及びHamF12を用いた、無血清環境において維持した。グリア細胞が、培養物の2未満を構成した。すべての細胞を、治療前に8~10日間培養した。ニューロン生存アッセイ。前記のように4ヒドロキシノネナール3μMを、Pen1XBIR3を含む培養物及び含まない培養物三連に加えた。、1057~1066頁。治療の1日後、細胞数を前記のように定量した。、1057~1066頁。簡潔に言うと、細胞をカウンティングバッファーに溶解させ、無傷の核を、血球計を使用して計数した。健康な細胞の核は明るく現れ、明らかに画定された核膜を有するが、一方死細胞の核は崩壊し、不規則な形状で現れた。細胞計数を三連のウェルにおいて実施し、平均した。生存は対照ウェルと比較した。鼻腔内Pen1C6DNは、カスパーゼ6基質の切断を防止する。カスパーゼ6触媒ドミナントネガティブを、前記のように単離し、精製した。DenaultJB及びGSSalvesen、ExpressionpurificationandcharacterizationofcaspasesCurrProtocProteinSci、2003年。21章pUnit2113。Pen1を、等モル比で精製C6DNと混合し、一晩、37°Cにおいてインキュベートし、ジスルフィド結合されたPen1C6DNを作製した。連結を、20SDSPAGE及び抗His抗体及び抗カスパーゼ6抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した。雄C57BL6マウスに、麻酔マスクを介して送達されたイソフルランを使用して麻酔をかけた。Pen1C6DNを、2μlの液滴を交互の鼻孔に、1分ごとに10分間投与することによって送達した。ThorneRGら、DeliveryofinsulinlikegrowthfactorItotheratbrainandspinalcordalongolfactoryandtrigeminalpathwaysfollowingintranasaladministrationNeuroscience、2004年127481~96頁。鼻腔内治療を、1時間の一時的中大脳動脈閉塞の前に実施した。ConnollyESJrら、Proceduralandstrainrelatedvariablessignificantlyaffectoutcomeinamurinemodeloffocalcerebralischemia。Neurosurgery1996年38523~31頁discussion532andKomotarRJら、NeurologicassessmentofsomatosensorydysfunctionfollowinganexperimentalrodentmodelofcerebralischemiaNatProtoc2007年22345~7頁。生理食塩水を陰性対照として使用した。脳を、ウエスタンブロッティング用に採取した。微小管結合タンパク質であるタウは、カスパーゼ6の分子基質として同定されている。タウのカスパーゼ6切断により生じるネオエピトープと結合する抗体を使用して、インビボでアポトーシスの際のPen1C6DNによるカスパーゼ6阻害に関してアッセイした。抗アルファチューブリンをローディング対照として使用した。さまざまな出版物が本明細書で引用されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アミノ酸配列cIAP1アミノ酸配列cIAP2アミノ酸配列XIAPアミノ酸配列NAIPアミノ酸配列サバイビンアミノ酸配列BRUCE