"少なくとも100個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含有してなる単鎖アルファボディーライブラリーであって、前記アルファボディーポリペプチドが、5~20個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも1つにおいて互いに異なり、前記多様化されるアミノ酸残基位置のすべてではなく、少なくとも70の多様化されるアミノ酸残基位置が、i前記アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位、任意に、前記アルファボディーポリペプチドの前記第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位および/または前記アルファボディーポリペプチドの前記第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位、またはii前記アルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、c位およびf位、またはiiiアルファボディーポリペプチドの2個の連続するα-ヘリックスを連結するリンカー断片における位置のいずれかに位置する、単鎖アルファボディーライブラリー。前記少なくとも100個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドそれぞれの定常の非多様化部分が、非天然物由来である、請求項1に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。前記多様化されるアミノ酸残基位置が、天然アミノ酸型によって独占的に占められている、請求項1または2に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。2~6個の異なる構成ライブラリーを含有してなる、請求項1~3のいずれか1項に記載のアルファボディーライブラリーの混合物。請求項1~3のいずれか1項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーをコードするか、もしくは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする、核酸またはベクターのライブラリー。宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が、請求項5に記載の前記核酸またはベクターのライブラリーのメンバーを含有してなる、ライブラリー。ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイもしくはmRNAディスプレイなどのインビトロタンパク質ディスプレイのための、請求項1~3のいずれか1項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物の使用。単鎖アルファボディーライブラリーの製造方法であって、a請求項1~3に記載の単鎖アルファボディーライブラリーをコードするか、もしくは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸またはベクターのライブラリーを製造するステップ、およびb前記単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下で、前記核酸またはベクターのライブラリーによってコードされるアルファボディーポリペプチドを発現させるステップを少なくとも含む、製造方法。前記核酸またはベクターのライブラリーによってコードされる前記アルファボディーポリペプチドを発現させるステップbが、前記核酸またはベクターのライブラリーのメンバーを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を、前記単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下の培地中で培養するステップを含む、請求項8に記載の方法。前記宿主細胞および/または前記培地から、ステップbにおいて製造された単鎖アルファボディーライブラリーを単離するステップをさらに含む、請求項8または9に記載の方法。目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドの製造方法であって、a請求項1~3のいずれか1項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を製造するステップ、b目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択するステップ、およびc前記1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを単離するステップを少なくとも含む、製造方法。目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択する前記ステップが、a前記目的の標的分子を、請求項1~3に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物に接触させるステップ、b前記目的の標的分子に接触させた前記単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを同定するステップ、および任意に、c前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する前記1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップを含む、請求項11に記載の方法。ステップaおよびbを繰り返し行なうことによって、前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーポリペプチドについて、前記アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物をさらに濃縮する、請求項12に記載の方法。目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択する前記ステップが、a1前記目的の標的細胞中で、請求項1~3のいずれかに記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を発現させるステップまたはa2請求項1~3のいずれか1項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項4に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を前記目的の標的細胞に接触させるステップ、b前記発現された単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、前記目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーを同定するステップ、および任意に、c前記目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する前記1つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップを含む、請求項11に記載の方法。請求項11~14のいずれか1項に記載の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーポリペプチド。請求項15に記載の単鎖アルファボディーポリペプチドをコードしてなる核酸。請求項16に記載の核酸を含有してなるベクター。請求項16に記載の核酸または請求項17に記載のベクターを含有してなる宿主細胞。発明の詳細な説明本明細書において、単数形a、anおよびtheは、特に明記されない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。本明細書において、含有しているcomprising、含有するcomprisesおよびから構成されるcomprisedofという用語は、含んでいるincluding、含むincludesまたは含有している含んでいるcontaining、含有する含むcontainsと同じ意味であり、包括的または非限定的であり、追加の、記載されていないメンバー、要素または方法のステップを排除するものではない。端点による数値範囲の記載は、各範囲内に包含されたすべての数および有理数、ならびに記載されている端点を含む。本明細書において、約という用語は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間の持続期間などについて言及する場合、特定の値の、および特定の値から/-10以下、好ましくは/-5以下、より好ましくは/-1以下、さらにより好ましくは/-0.1以下の変動を、このような変動が開示の発明を実施するうえで適切である限り、包含することを意味する。就職語句約が言及する値は、それ自体も明確に好ましく開示されていることは理解されるべきである。本明細書において、本発明のアルファボディーAlphabodyまたは本発明のアルファボディーAlphabodiesは、一般に、自己フォールディングしており、単鎖の三本鎖の、α-ヘリックスコイルドコイルを主に有するアミノ酸配列と定義され得る。したがって、単鎖アルファボディーにおける単鎖という用語は、重複しているが、多くの公知のオリゴマー例えば、トリマーのペプチド性コイルドコイルの存在とは対照的に、単一のポリペプチド鎖としてのアルファボディーの組成を強調するために通常は含まれている。より具体的には、本発明との関係において使用する場合、アルファボディーは、一般式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3式中、HRS1、HRS2およびHRS3は、それぞれ独立して、2~7個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列HRSであり、すべてのヘプタッドのa位およびd位の少なくとも50は、イソロイシン残基によって占められており、各HRSは、ヘプタッドのa位またはd位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、HRS1、HRS2およびHRS3は、ともに三本鎖のα-ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており;かつL1およびL2は、それぞれ独立して、HRS1とHRS2とを共有結合的に連結し、HRS2とHRS3とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも4個のアミノ酸残基からなり、好ましくは当該アミノ酸残基の少なくとも50がプロリン、グリシンおよびセリンからなる群より選択されるリンカー断片であるを有するアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質と定義され得る。本明細書において、平行アルファボディーは、三本鎖のα-ヘリックスコイルドコイル構造のα-ヘリックスが、平行コイルドコイル構造、すなわち、3個のα-ヘリックスのすべてが平行であるコイルドコイルをともに形成する本発明のアルファボディーの意味を有するものとする。本明細書において、逆平行アルファボディーは、三本鎖のα-ヘリックスコイルドコイル構造のα-ヘリックスが、逆平行コイルドコイル構造、すなわち、2個のα-ヘリックスが平行であり、かつ第3のα-ヘリックスがこれらの2個のヘリックスに対して逆平行であるコイルドコイルをともに形成する本発明のアルファボディーの意味を有するものとする。本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、本発明は、一般式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3を有する配列を含有する複数のポリペプチドも想定するが、ある特定の実施形態において、これらのポリペプチドは、さらなる基、部分および/または残基を含有し、これらは式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3を有する基本アルファボディー構造に共有結合的に連結され、より具体的には、N末端および/またはC末端が共有結合的に連結される。これらは、本明細書において本発明のアルファボディーポリペプチドと称される。ヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書においては、アルファボディーの各ヘプタッド反復配列内で2回以上反復され、abcdefgまたはdefgabcで表わされる7残基のポリペプチド断片という意味を有するものとし、a~gという記号は、通常のヘプタッドの位置を意味する。通常のヘプタッドの位置は、例えば、ルパスLupasらサイエンスScience、1991、252:1162-1164;http://www.russell.embl-heidelberg.de/cgi-bin/coils-syr.plのCOILS法などの専門のソフトウェアを使用することによって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物中に存在するヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位内の特定のアミノ酸残基に割り当てられる。しかしながら、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、アルファボディー中に存在するヘプタッドまたはヘプタッド単位は、厳密には、上記表記すなわち、abcdefgまたはdefgabcに限定されるものではなく、それらの最も広い意味において、少なくとも割り当て可能なヘプタッドのa位およびd位を含有する7残基のポリペプチド断片それ自体を構成することに留意するべきである。ヘプタッドのa位、ヘプタッドのb位、ヘプタッドのc位、ヘプタッドのd位、ヘプタッドのe位、ヘプタッドのf位およびヘプタッドのg位という用語は、それぞれ、アルファボディーのヘプタッド、ヘプタッド反復またはヘプタッド反復単位における通常のa、b、c、d、e、fおよびgのアミノ酸位置を指す。本明細書において、ヘプタッドモチーフは、7残基のポリペプチドパターンという意味を有するものとする。abcdefg型のヘプタッドモチーフは、通常、HPPHPPPと表わされ得るが、defgabc型のヘプタッドモチーフは、通常、HPPPHPPと表わされ得、式中、記号Hは、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を意味し、記号Pは、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を意味する。しかしながら、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、アルファボディー中に存在するヘプタッドモチーフは、厳密には、上記表記すなわち、abcdefg、HPPHPPP、defgabcおよびHPPPHPPに限定されるものではないことに留意するべきである。本明細書において、ヘプタッド反復配列HRSは、n個の連続するヘプタッドからなるアミノ酸配列または配列断片の意味を有するものであり、nは、2以上の数である。アルファボディー本明細書において定義されるの単鎖構造との関連において、リンカー、リンカー断片またはリンカー配列という用語は、本明細書において互換的に使用され、単鎖モノマーアルファボディーの近接するアミノ酸配列の一部であり、そのアルファボディーのHRS配列を相互に共有結合的に連結するアミノ酸配列断片を指す。本発明との関連において、コイルドコイルまたはコイルドコイル構造は、本明細書において互換的に使用され、当業者であれば、共通の一般常識および本明細書において引用されるさらなる参考文献に基づいて明らかであろう。これに関する具体的な参考文献は、コイルドコイル構造に関する総説、例えば、コーヘンCohenおよびパリーParry、Proteins1990,7:1-15;コーンKohnおよびホッジHodges、TrendsBiotechnol,1998,16:379-389;シュナイダーSchneiderら、FoldDes1998,3:R29-R40;ハーブリーHarburyら、Science1998,282:1462-1467;メーソンMasonおよびアーントArndtChemBioChem2004,5:170-176;ルパスLupasおよびグリューバーGruber、AdvProteinChem2005,70:37-78;ウールフソンWoolfson、AdvProteinChem2005,70:79-112;パリーParryら、JStructBiol2008,163:258-269;マクファーレンMcFarlaneら、EurJPharmacol2009,625:101-107などを特に参照のこと。アルファボディーのα-ヘリックス部分は、本明細書において、α-ヘリックス二次構造を有するアルファボディーの一部という意味を有するものとする。さらに、α-ヘリックス二次構造を有するアルファボディー全体の任意の部分も、アルファボディーのα-ヘリックス部分とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーのα-ヘリックス部分に位置する1つ以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、当該結合部位は、アルファボディーのα-ヘリックス部分によって形成されているとみなされる。アルファボディーのα-ヘリックスの溶媒配向solvent-oriented領域または溶媒曝露領域は、本明細書において、それが存在する溶媒、環境、周囲または周辺milieuに直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディーの部分の意味を有するものである。さらに、溶媒に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディー全体のうちの任意の一部も、アルファボディーの溶媒配向領域または溶媒曝露領域とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーの溶媒配向部分に位置する1つ以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、結合部位は、アルファボディーの溶媒配向部分によって形成されているとみなされる。アルファボディーの溝という用語は、本明細書において、アルファボディー内の空間的に隣接したα-ヘリックスの任意の対によって形成される、くぼんだ溝様の局所的形状に対応するアルファボディーの部分の意味を有するものとする。本明細書において、アミノ酸残基は、それらの正式名称によって示されるか、または標準的な3文字もしくは1文字のアミノ酸コードにしたがって示されるであろう。本明細書において、相同性という用語は、同じ分類群または異なる分類群に由来する2つの高分子間、具体的には、2つのポリペプチド間または2つのポリヌクレオチド間の少なくとも一次構造の類似性を表わし、前記類似性は、共通の祖先に起因する。好ましくは、相同ポリペプチドは、二次構造または三次構造の類似性も示すであろう。したがって、ホモログという用語は、前記一次構造の類似性、および任意に、タンパク質高分子については二次構造または三次構造の類似性を有する非常に関連する高分子を表わす。2つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列との間の配列同一性のパーセンテージは、当業者に公知の方法を使用することによって、例えば、第1のヌクレオチド中のヌクレオチドであって、第2のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの数を、第1のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で割り、100を乗じることによって、またはシーケンスアライメントのための公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、NCBIBlastなどを使用することによって計算され得る。2つのアルファボディー間の配列同一性の程度を決定する際、当業者であれば、いわゆる保存的アミノ酸置換を考慮することができ、保存的アミノ酸置換は、一般に、あるアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性またはその他の生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないか、あるいは本質的にはまったく影響を及ぼさないアミノ酸置換として説明され得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者に明らかであると思われる。2つ以上のアルファボディーまたは2つ以上の核酸配列は、それらがそれらの全長にわたって100の配列同一性を有する場合、まったく同じものであると言われる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が特定の標的に対し、または、少なくとも1つのその部分または断片に対し、親和性を有するか、特異性を有するか、および/またはそれに対して特異的なものである場合、その標的に特異的に結合すると言われる。本明細書において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の特異性は、親和性および/またはアビディティに基づいて決定され得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の親和性は、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、それが結合する対象となる標的タンパク質との解離平衡定数によって表わされる。KD値が低いほど、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、それが結合する対象となる標的タンパク質との間の結合力がより強くなる。代替的には、親和性は、1/KDに対応する親和定数KAとしても表わされ得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の結合親和性は、具体的な目的の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で決定され得る。KDは、kOff秒-1またはs-1で表わされるで示される複合体の解離速度定数の、kOnモル-1秒-1またはM-1s-1で表わされるで示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般に公知である。約1ミリモルよりも大きいKD値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のアビディティは、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、目的の関連標的タンパク質との間の結合力の大きさの尺度である。アビディティは、目的の標的タンパク質の結合部位と、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の結合部位との間の親和性、および本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物に存在する関連結合部位の数の両方に関係するものである。結合親和性、すなわち、kOffとkOnとの比は、当業者に公知の方法によって決定され得る。これらの方法としては、限定されないが、RIA放射免疫測定法、ELISA酵素結合免疫測定法、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫電気泳動アッセイ、等温滴定熱量測定法、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化細胞分類分析などが挙げられる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が目的の第2の標的タンパク質に結合する親和性に対し、少なくとも5倍、例えば、少なくとも10倍、例えば、少なくとも100倍、好ましくは少なくとも1000倍高い親和性で目的の第1の標的タンパク質に結合する場合、目的の第2の標的タンパク質にではなく目的の第1の標的タンパク質に対して特異的であると言われる。したがって、ある実施形態において、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が目的の第2の標的タンパク質ではなく目的の第1の標的タンパク質に対して特異的であると言われる場合、当該アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、目的の第1の標的タンパク質に本明細書において定義されるように特異的に結合するが、目的の第2の標的タンパク質とは結合しないであろう。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、限定されないが、RIA放射免疫測定法、ELISA酵素結合免疫測定法、サンドイッチ免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫電気泳動アッセイ、等温滴定熱量測定法、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化細胞分類分析などの方法のいずれかの検出限界よりも高い親和性で目的のタンパク質に結合する場合、目的のタンパク質に対する検出可能な結合親和性を有すると言われる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは化合物の半減期は、一般に、アルファボディー、ポリペプチドまたは化合物のインビボの血清濃度または血漿濃度が50減少するまでに必要な時間と定義することができる。本発明のアルファボディー、化合物またはポリペプチドのインビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、薬物動態分析などによって決定され得る。当業者に明らかであるように、半減期は、t1/2-α、t1/2-βおよび曲線下面積AUCなどのパラメータを使用して表わされ得る。インビボ半減期の増加は、一般に、t1/2-α、t1/2-βおよび曲線下面積AUCの1つ以上のパラメータの増加、好ましくは3つすべてのパラメータの増加によって特徴付けられる。本明細書において、阻害、減少および/または抑制という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、当該目的の標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、減少および/または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用を指し得る。阻害、減少および/または抑制という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたはインビボアッセイを使用して測定した場合、当該目的の標的タンパク質の生物学的活性を阻害、減少および/または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も指し得る。したがって、阻害、減少および/または抑制は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する1つ以上の生物学的または生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を阻害、減少および/または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も指し得る。アンタゴニストとしての本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のこのような作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および/または当該技術分野において公知の任意の適切なインビトロおよび通常は細胞またはインビボアッセイを使用して決定され得る。これに関連して、任意の適切な方法で、および/または当該技術分野において公知の任意の適切なインビトロアッセイを使用して決定される、アンタゴニストとしてのアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のインビトロ作用は、本明細書において、目的の標的タンパク質に対する検出可能なインビトロアンタゴニスト活性とも称される。本明細書において使用される増強、増加および/または活性化という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、その目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用を増強、増加および/または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用を指し得る。増強、増加および/または活性化という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたはインビボアッセイを使用して測定した場合にその目的の標的タンパク質の生物学的活性を増強、増加および/または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も指し得る。したがって、増強、増加および/または活性化は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する1つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を増強、増加および/または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も指し得る。アゴニストとしての本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のこのような作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および/または当該技術分野において公知の任意の適切なインビトロおよび通常は細胞またはインビボアッセイを使用して決定され得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドもしくは組成物の阻害活性もしくはアンタゴニスト活性または増強活性もしくはアゴニスト活性は、可逆的であってもよく、不可逆的であってもよいが、医薬的用途および薬理学的用途においては、通常、可逆的に起こるであろう。本発明のアルファボディー、ポリペプチド、組成物または核酸配列は、それが産生される宿主細胞および/または培地から抽出または精製されている場合、本明細書においては、アルファボディーに対応する本質的に単離された形態であるとみなされる。アルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物については、アルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物に存在する結合領域、結合部位または相互作用部位という用語は、本明細書において、アルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物に存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチであって、標的分子との結合に関与する特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチの意味を有するものとする。このような結合領域は、標的分子と接触するアルファボディーの特定のアミノ酸残基から本質的に構成される。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、それが2つの異なる目的の標的タンパク質の両方に対して特異的本明細書において定義されるである場合、これらの異なる目的の標的タンパク質に対する交差反応性を示すと言われる。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、アルファボディーが、目的の標的のアミノ酸残基の部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対する1個の結合部位またはそれらに特異的に結合する1個の結合部位を含有する場合、一価であると言われる。アルファボディーの2個以上の結合部位が、目的の標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するものであるか、またはそれらに特異的に結合する場合、アルファボディーは、二価アルファボディー上に2個の結合部位がある場合または多価アルファボディー上に3個以上の結合部位がある場合、例えば、三価などであると言われる。アルファボディーについて言及する場合、二重特異性という用語は、aアルファボディーの2個以上の結合部位が、同じ目的の標的に対するものであるか、または当該標的に特異的に結合するが、その標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するものではなくすなわち、異なる部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するもの、またはそれらに特異的に結合しないこと、またはbアルファボディーの2個以上の結合部位が目的の異なる標的分子に対するものであるか、またはそれらに特異的に結合することのいずれかを意味する。多重特異性という用語は、3個以上の結合部位がアルファボディーに存在する場合に使用される。したがって、本明細書において、二重特異性アルファボディーまたは多重特異性アルファボディーは、それぞれ、2個または少なくとも2個の結合部位を含む式N-HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3-Cの単鎖アルファボディーであって、これらの2個以上の結合部位が異なる結合特異性を有する単鎖アルファボディーの意味を有するものとする。したがって、本明細書において、それぞれ2個または3個以上の異なる結合領域が同じモノマーの単一ドメインアルファボディー中に存在する場合、アルファボディーは、二重特異性または多重特異性とみなされる。本明細書において、予防および/または治療という用語は、特定の疾患および/または障害を予防および/または治療すること、特定の疾患および/または障害の発症を予防すること、特定の疾患および/または障害の進行を遅延または回復させること、特定の疾患および/または障害に伴う1つ以上の症状の発症を予防または遅延させること、特定の疾患および/または障害に伴う1つ以上の症状を軽減および/または緩和すること、特定の疾患および/または障害の重症度および/または持続期間を軽減すること、ならびに一般には、治療されている被験体または患者にとって有益な本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの任意の予防効果または治療効果を含む。本明細書に引用されるすべての文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特に定義されない限り、専門用語および科学用語などの本発明を開示するのに使用されるすべての用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより理解するために包含される。本発明者らは、異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含有する単鎖アルファボディーライブラリー[本明細書において、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明のライブラリーと称される]を作製すなわち、構築、製造、生成するための方法を特定した。より具体的には、本発明のアルファボディーライブラリーは、本質的にはランダムなアミノ酸残基が配置される多様化位置を含有するという点において、本質的にはランダムライブラリーである。本発明のライブラリーは、異なる目的の標的タンパク質に結合する良質なアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをもたらす本質的な可能性を有する。本発明者らは、アミノ酸配列変異がアルファボディーの定義された特定領域内に導入されているランダム化アルファボディーライブラリーの使用をさらに検討した。このようなアルファボディーの定義された特定領域は、本質的には、アルファボディー本明細書において定義される内の溝、ヘリックス表面またはリンカー断片のいずれかに対応する。対応するアルファボディーライブラリーは、本明細書において、それぞれ溝ライブラリー、ヘリックスまたはヘリックス表面ライブラリーまたはリンカーまたは任意にループライブラリーと称される。本発明の重要な態様は、アミノ酸配列変異を導入するために選択されるアルファボディー領域すなわち、多様化されるアルファボディー領域がそれぞれ、折り畳みアルファボディー骨格構造中にそれぞれ本質的な三次元3-D形状を有するという事実である。例えば、アルファボディーの溝は細長い凹形状を本質的に有し、ヘリックス表面は細長い凸形状を本質的に有し、リンカー断片は柔軟性のある変化する形状を本質的に有するであろう。アルファボディーは、1個の同じ骨格構造において溝、ヘリックス表面および柔軟性のあるリンカー断片またはループが一体化uniteする唯一の骨格分子であるので、この点において独特である。この独特の特徴を考慮して、本発明者らは、導入された配列変異が特定の一領域のみに限定されないアルファボディーライブラリーの構築を検討している。例えば、リンカーまたはループのライブラリーを構築する場合、限定的な配列変異は、ヘリックス表面に導入され得る。あるいは、限定的な配列変異は、溝ライブラリーにおける多様化される位置に隣接する完全に曝露されたヘリックス残基の位置に導入され得る。あるいは、限定的な配列変異は、溝ライブラリーまたはヘリックス表面ライブラリーにおける多様化されるα-ヘリックスに隣接するリンカー断片内に導入され得る。多様化される残基位置の大部分が位置する典型的には、すべての多様化される位置の少なくとも70が溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置するであろう特徴的な領域の凹形状、凸形状または変化する形状形状特性を維持するために、定義された特徴的な領域の外側の前記限定的な配列変異は、溝、ヘリックス表面またはリンカー断片などの定義された特徴的な領域内の配列変異と組み合わせて典型的には、すべての多様化されるアミノ酸残基位置の30未満に制限されるであろう。また、本発明者らは、本発明のアルファボディーライブラリーが、目的の標的分子に特異的に結合する1つ以上のアルファボディーもしくはアルファボディーポリペプチドのスクリーニングおよび/または選択に使用され得ることも見出している。同定および/または単離された標的結合アルファボディーおよびアルファボディーポリペプチドであって、本発明のアルファボディーライブラリーを使用して得られたアルファボディーおよびアルファボディーポリペプチドが、従来技術の標的結合分子の不利な点の1つ以上を克服することがさらに実証されている。実際、本発明のライブラリーから単離された標的結合アルファボディーは、従来の結合剤に少なくとも匹敵する親和性、多くの場合はそれよりも優れた親和性で標的に結合できることが見出されている。また、本発明のライブラリーから選択および単離され得る標的結合アルファボディーは、例えば、国際公開第2010/066740号および欧州特許公開第2161278号明細書で提供されているアルファボディー骨格などの基本的なアルファボディー骨格構造について最初に同定された利点、限定されないが、小さいサイズ10~14kDa、極めて高い耐熱性、高いプロテアーゼ耐性、それらの正確かつ安定な折り畳みは、一般に、複数の置換によっても消失しないという意味において高いエンジニアアビリティengineerability、および天然のモチーフに基づいており、タンパク質工学技術により再設計された構造などを維持している。最後に、異なる本質的な形状を有するアルファボディー骨格ライブラリーの利用可能性は、骨格ライブラリーこれから、良い結合剤を取り出す必要があると一般的な標的分子これは、非常に多様な形状であり得るとの間の本質的な形状相補性の欠如についての技術的問題を解決する。また、異なる本質的な形状のアルファボディーライブラリーの組み合わせまたは混合物を任意に使用することは、目的の標的分子との本質的な形状相補性の欠如についての技術的問題を解決する助けになり得る。主な目的として、本発明は、単鎖アルファボディーライブラリーを提供する。本発明のこれらの単鎖アルファボディーライブラリーは、それらが異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドの集合体を含有することを特徴とする。本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、これらのポリペプチドが、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて互いに相違することを特徴とする。したがって、異なる配列という用語は、本発明のライブラリーの2つ以上のアルファボディーポリペプチドの間で、アミノ酸残基位置の所定のセットに配列変異または配列差異が存在することを指す。アルファボディー配列のライブラリーまたは集合体は、任意の適切な数の異なるアルファボディー配列、例えば、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個またはそれ以上の異なる配列の単鎖アルファボディーを含むことができる。より具体的には、本発明の異なるアルファボディー配列のライブラリーまたは集合体は、少なくとも100個の異なる配列のアルファボディーポリペプチド、例えば、少なくとも200個、少なくとも300個、少なくとも400個、少なくとも500個、例えば、少なくとも1000個、少なくとも10000個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個またはそれ以上の配列を含有する。特定の実施形態において、本発明のアルファボディー配列のセット、集合体またはライブラリー本明細書において互換的に使用されるは、少なくとも100個の異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含有する。加えて、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーは、そのライブラリーに含まれる異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドが、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも1つにおいて互いに相違することを特徴とする。したがって、特定の実施形態において、本発明のライブラリーに含まれる異なるアルファボディー配列本明細書において、異なる配列の単鎖アルファボディーとも称されるは、アミノ酸残基位置の規定の、すなわち、一定のまたは所定のセットにおいてのみ互いに相違する。製造されたライブラリー内の異なる配列の単鎖アルファボディーを互いに比較すると、多様化されるアミノ酸残基位置のこのような所定のセットは、アミノ酸残基の種類の多種性または多様性を特徴とする多数の特定アミノ酸残基位置からなるものである。多様化されるアミノ酸残基位置という概念は、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記アルファボディーのライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーのアミノ酸配列の少なくとも2つを互いに比較した場合、少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸残基定義された種類のアミノ酸残基、例えば、天然型のアミノ酸残基などが位置するアミノ酸残基位置これらの位置は、ライブラリーの任意の2個の異なる配列のアルファボディーについては相違しないが、ライブラリーは、このアミノ酸残基位置が相違する少なくとも2個の異なる配列のアルファボディーを含有することに留意するべきであるを指す。多様化されるアミノ酸残基位置のセットは、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記アルファボディーのライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーのアミノ酸配列の少なくとも2つを互いに比較すると、少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置のセットこれらの位置は、ライブラリーの任意の2個の異なる配列のアルファボディーについては相違しないことに留意するべきであるを指す。多様化されるアミノ酸残基位置の規定のセットdefinedsetは、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記異なる配列のアルファボディーのライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列を互いに同時比較すると、少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置の特定のセットを指す。したがって、前記異なる配列のアルファボディーのライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列を同時比較すること、およびこのような同時比較において、少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置を同定することにより、アルファボディーライブラリーにおける前記多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットを同定することが可能になる。本明細書では、当業者であれば、単鎖アルファボディーライブラリーなどの配列ライブラリー中の配列を決定する方法を知っているものと考える。さらに、本明細書では、アルファボディー配列は、アミノ酸配列レベル、またはこれらのアミノ酸配列を表わすコードするヌクレオチド配列レベルの両方で比較され得ると理解される。2個以上の異なる配列のアルファボディーを比較するのに好ましい方法は、自動化シーケンスアライメントのための公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、NCBIBlastによって生成されるペアワイズシーケンスアライメントまたはマルチプルシーケンスアライメントに基づくものである。あるいは、2個以上の異なる配列のアルファボディーは、熟練ユーザーによって生成されるペアワイズシーケンスアライメントまたはマルチプルシーケンスアライメントに基づいて比較され得るが、このようなアライメント方法は、マニュアルシーケンスアライメントとしても公知である。異なる配列のアルファボディーに適用される自動化シーケンスアライメントおよびマニュアルシーケンスアライメントの技術は両方とも、全般的な配列同一性もしくは全般的な配列類似性または相同性もしくは一致性を最大化すること、または異なる配列のアルファボディーのコアアミノ酸位置すなわち、本明細書において定義されるヘプタッドのa位およびd位の配列同一性もしくは配列類似性を最大化することに基づくものであり得る。したがって、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、アルファボディーライブラリーにおけるすべての異なる配列のアルファボディーのすべてもしくは少なくとも代表的なサブセットのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の比較から推定され得る。アルファボディーライブラリーを生成する際に、いわゆる意図されたものでない突然変異、挿入または欠失が起こり得ることも一般に認められている。このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、前記アルファボディーライブラリーを設計または生成する際に多様化することを意図していなかった位置に起こるヌクレオチドもしくはアミノ酸の突然変異、挿入または欠失である。当業者によって一般に認められているように、前記アルファボディーライブラリーを最先端の技術で生成した条件では、このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、アルファボディーライブラリー配列内において、散在的な形式ですなわち、異なる位置で散発的にしか起こらないであろう。好ましくは、このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、10未満、より好ましくは5未満、より好ましくは2未満、1または1よりもさらに少ない頻度で、任意の所定位置において起こるであろう。したがって、アルファボディーライブラリー内の意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、意図的な配列変異を示す位置で観察される変動性と比較してそれらが低頻度であることに基づいて同定され得る。したがって、前記ライブラリーの設計または製造についての知識を持たずに、本発明のアルファボディーライブラリー内の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットを決定するのに好ましい方法は、このライブラリー内に含まれる配列の少なくとも代表的なサブセットのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定し、その後、すべての決定した配列を好ましくはマルチプルアライメントで比較し、その後、配列変異が観察される位置を特定し、その後、各可変位置で観察されるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の種類の頻度を特定し、その後、所定のカットオフパーセンテージよりも高頻度で突然変異、挿入または欠失を有する位置を特定することであり、このカットオフパーセンテージは、10、5、2、1またはさらに1未満、例えば、0.5、0.1または0この場合、観察される変異はすべて、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットに含まれるに設定する。あるいは、単鎖アルファボディーライブラリーの元の設計または製造についての知識が利用可能である場合、このライブラリーの多様化されるアミノ酸残基位置のセットは、好ましくは、ライブラリーそれ自体の分析ではなく前記知識に基づくものである。多様化される位置の選択を含む単鎖アルファボディーライブラリーの設計方法は、以下に記載される。本発明のライブラリーにおいて、このような所定のセットにおける多様化されるアミノ酸残基位置の数は、5~20個のアミノ酸残基位置の範囲であり得る。したがって、本発明のライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、5~20個、例えば、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個または20個の定義された多様化されるアミノ酸残基位置を含有し得る。本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、このような所定のセットの5~20個の位置のうちの少なくとも1個のアミノ酸残基位置において互いに相違し得る。したがって、例えば、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットが、13個の多様化されるアミノ酸残基位置のセットを含有する場合、本発明のライブラリーにおける異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、これらのアミノ酸残基位置の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個または13個すべてにおいて互いに相違し得る。したがって、好ましくは散発的かつ意図されたものでない突然変異、挿入または欠失が、多様化される位置の所定のセットの位置以外の位置においてさらに起こり得るという条件下で、本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチド配列は、5~20個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットに存在する配列の差異によって互いに区別され得ることが明らかである。本発明のライブラリーの構築のための基盤としてすなわち、参照または鋳型構造として使用されるアルファボディー骨格は、HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3で表わされる単鎖三重α-ヘリックスコイルドコイル構造を形成する。ヘプタッド反復配列HRS1、2および3はそれぞれ、α-ヘリックスコンフォメーションをとり、アルファボディーのα-ヘリックスと称される。アルファボディー中に存在するこれらの3つのヘリックスは、典型的には、それぞれヘリックスA、BおよびCと称される。異なる種類のアルファボディーライブラリーは、アルファボディー単鎖コイルドコイル骨格を使用して、多様化されるアミノ酸残基位置のセットが位置するアルファボディー構造内の場所に応じて生成され得る。多様化されるアミノ酸のセットの位置は、本発明の方法を適用することによってアルファボディー上に生成される結合部位の種類および位置を決定する。これに関し、溝ライブラリー結合部位は、アルファボディーの3個のヘリックスのうちの2個のヘリックスの間の溝に位置するアミノ酸残基によって主に形成される、ヘリックスライブラリー結合部位は、アルファボディーの3個のα-ヘリックスのうちの1個のヘリックスの溶媒配向側面に位置するアミノ酸残基によって主に形成される、またはループライブラリー結合部位は、ループの役割を果たすアルファボディーリンカー配列の1つ以上の中に位置するアミノ酸残基によって主に形成されるを参照し得る。多様化されるアミノ酸残基位置がアルファボディーの溝、表面またはリンカーのいずれかに、独占的にすなわち、100位置するライブラリーは、本明細書において、純粋な溝、純粋な表面または純粋なループのライブラリーと称される。しかしながら、本明細書において以下に詳細に記載されるように、本方法は、純粋な溝、表面またはループのライブラリーである必要がないアルファボディーライブラリーの使用を想定する。本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの3個のヘリックスのうちの2個のヘリックスの間の溝に主に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。これらの実施形態では、本発明のライブラリーに含まれるアルファボディーにおいて、標的タンパク質に結合するための結合部位は、アルファボディーの3個のα-ヘリックスのうちの2個のヘリックスの間の溝に位置するアミノ酸残基位置によって主に形成される。アルファボディーにおける2個の隣接するα-ヘリックスの間の溝の表面の形成に関与する残基は、一般に、ヘプタッドのe位およびg位に位置するが、より曝露されているb位およびc位のいくつかならびに大部分が埋まっているコアa位およびd位も、溝表面に寄与する可能性がある;このようなことは、本質的には、これらの位置に配置されるアミノ酸側鎖の大きさに依存するであろう。平行または逆平行の単鎖コイルドコイルのいずれかに折り畳まれるという生成されるアルファボディーの性質に応じて、溝ライブラリーを得るために多様化する必要があるアルファボディー配列内の位置は、変化するであろう。平行アルファボディーにおけるすべてのヘリックスペアの場合ならびに逆平行アルファボディーにおけるヘリックスAおよびCの場合のように、アルファボディーの2個の空間的に隣接するα-ヘリックスすなわち、結合のための溝がその間に位置するα-ヘリックスは平行に走っているため、溝に位置する結合部位は、第1のヘリックスのe残基の少なくとも数個かおよび平行な第2のヘリックスのg残基の少なくとも数個を多様化することによって形成され得る。これらの残基に加えて、結合部位は、任意に、第1のヘリックスにおけるb位の残基および/または平行な第2のヘリックスにおけるc位の残基を多様化することによってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、結合部位がe/g-溝に位置するアルファボディーを得るために、標的特異的なアルファボディーの生成に使用されるアルファボディーライブラリーの多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および第1のα-ヘリックスに平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位、任意に、さらに、第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位に位置する。特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および任意に、さらにb位および第1のα-ヘリックスに平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位および任意に、さらにc位に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。代わりにまたは加えて、逆平行に位置する2個の空間的に隣接するα-ヘリックスを含有するアルファボディー骨格が使用され得るこれらの逆平行ヘリックスの間の溝に位置する結合部位が想定される場合。これは、典型的には、逆平行アルファボディーにおけるヘリックスAおよびBまたはヘリックスBおよびCの場合である。これらの実施形態において、典型的には、結合部位が逆平行ヘリックスの間の溝によって形成されることを保証するために多様化する必要がある多様化されるアミノ酸残基位置の種類について、2つの可能性がある。第1の可能性において、2個の逆平行ヘリックスの間の溝は、第1のヘリックスのe残基の少なくとも数個および逆平行な第2のヘリックスのe残基の少なくとも数個によって形成される。したがって、このようなe/e-溝内に形成される結合部位を得るために、少なくともこれらのアミノ酸残基位置が多様化される。これらの残基に加えて、このような結合部位は、任意に、第1のヘリックスにおけるb位の残基および/または逆平行な第2のヘリックスにおけるb位の残基によってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、目的の標的タンパク質に対するアルファボディーであって、結合部位がe/g-溝に位置するアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位、任意に、さらに、第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位に位置する。本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および任意に、さらにb位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および任意に、さらにb位に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。第2の可能性において、2個の逆平行ヘリックスの間の溝は、第1のヘリックスのg残基の少なくとも数個および逆平行な第2のヘリックスのg残基の少なくとも数個によって形成される。したがって、このようなg/g-溝内に形成される結合部位を得るために、少なくともこれらのアミノ酸残基位置が多様化される。これらの残基に加えて、このような結合部位は、任意に、第1のヘリックスにおけるc位の残基および/または逆平行な第2のヘリックスにおけるc位の残基によってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、結合部位がg/g-溝に位置するアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位、任意に、さらに、第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位に位置する。本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位および任意に、さらにc位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位および任意に、さらにc位に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。したがって、それぞれが互いに平行な3個のα-ヘリックスを有する平行アルファボディーは、3個のe/g-溝を含むことが明らかであろう。一方、互いに平行な2個のα-ヘリックスと、逆平行に伸びる1個のα-ヘリックスとを含む逆平行アルファボディーは、1個のe/g-溝、1個のe/e-溝および1個のg/g-溝を含む。アルファボディーの溝の任意の部分も、溝領域とみなされる。原則として、純粋な溝ライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置がすべて、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位ならびにアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく単に大部分、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位ならびにアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生成することが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明の方法は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく大部分すなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位ならびにアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも70が溝を形成する指定位置に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも1個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位に対応する位置ならびにアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位およびb位またはg位およびc位に対応する位置の外側に位置する。加えてまたは代わりに、結合部位が、主に、アルファボディーの3個のヘリックスのうちの1個の表面によって形成されるアルファボディーライブラリーが提供される。したがって、これらの実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に、アルファボディーポリペプチドの3個のヘリックスのうちの1個のヘリックスの溶媒配向側に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。このようなアルファボディーライブラリーは、本明細書において、ヘリックス表面ライブラリーまたはヘリックスライブラリーと称される。アルファボディーの表面にあると考えられるアミノ酸残基位置は、ヘリックスA、BまたはCのいずれかに位置し得る。特定の実施形態において、アルファボディーライブラリーは、多様化されるアミノ酸残基が、ヘリックスCの完全に溶媒に曝露されているアミノ酸残基に対応するアルファボディーを含む。最も突出しており、したがって溶媒配向性である残基は、アルファボディーの各α-ヘリックスにおけるb位、c位およびf位に位置する。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーは、アルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、c位およびf位に位置する多様化されるアミノ酸残基位置を含有する。原則として、純粋なヘリックス表面のライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置がすべて、アルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、c位およびf位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく、単に、アルファボディーポリペプチドのα-ヘリックスのヘプタッドのb位、c位およびf位に主に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生み出すことが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく、主にすなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドのα-ヘリックスのヘプタッドのb位、c位およびf位に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも70が溶媒に曝露している指定位置に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも1個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドのα-ヘリックスのヘプタッドのb位、c位およびf位に対応する位置の外側に位置する。加えてまたは代わりに、アルファボディー上の結合部位が、主に、α-ヘリックスを相互に結合するアルファボディーリンカー配列のうちの1個の中に位置するアミノ酸残基位置によって形成されるアルファボディーライブラリーが提供される。平行アルファボディーにおいて、2個のリンカーは、コイルドコイル構造の末端部を相互に連結するすなわち、それらは、ヘリックスC末端と、反対側に位置するヘリックスN末端との間の結合を形成する。逆平行アルファボディーにおいて、2個のリンカーは、コイルドコイル構造の近接端部を相互に結合するすなわち、それらは、ヘリックスC末端と、同じ側に位置するヘリックスN末端との間の結合を形成する。両方の種類のアルファボディーにおいても、リンカーは、立体構造的に柔軟であると考えられる。加えて、両方の種類のアルファボディーにおけるリンカーも、それらのアミノ酸配列に関して柔軟であると考えられる。したがって、いずれの種類のアルファボディーにおけるリンカーも、アルファボディーのコイルドコイル骨格の折り畳みおよび安定性に対する重大な影響を伴わずに、アミノ酸配列変異に供され得る。その結果として、配列多様性が、平行型アルファボディーまたは逆平行型アルファボディーのいずれかにおけるリンカー断片のいずれかのアミノ酸位置内に導入されるアルファボディーのループまたはリンカーライブラリーが提供される。特定の実施形態において、1個のリンカー断片のアミノ酸残基位置のすべてが多様化されるライブラリーが提供される。さらに特定の実施形態において、リンカー断片の中央付近に位置する残基位置の選択が多様化されるα-ヘリックス末端の障害とならないために。さらに特定の実施形態において、リンカー断片の末端のうちの1個の付近にある選択残基位置が変化し得る;これは、α-ヘリックス末端の障害となるリスクを増加させるが、アルファボディーは、一般に、このような潜在的障害を許容するのに十分安定であろう。さらにさらなる特定の実施形態において、部分長または全長のループ配列に対して残基位置の変化が多様化され得る。純粋なリンカーまたはループのライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、すべて、アルファボディーポリペプチドのリンカー断片内に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく単に大部分、アルファボディーポリペプチドにおけるリンカーの位置に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生み出すことが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく大部分すなわち、少なくとも70、アルファボディーポリペプチドのリンカーのうちの1個の中に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、提供されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも70がアルファボディーリンカー断片のうちの1個の中に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも1個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドのリンカー断片のアミノ酸残基位置の外側に位置する。上記のように、本発明の方法の特定の実施形態において、結合部位が、主に、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片によってそれぞれ形成されるように、多様化されるアミノ酸のセットが、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片の外側にそれぞれ位置する少なくとも1個、より具体的には2個以上のアミノ酸残基位置を含有することを特徴とするアルファボディーライブラリーが提供される。これらの実施形態において、その溝、ヘリックス表面またはリンカー断片によって、主に形成される結合部位を有するアルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内の多様化されるアミノ酸位置のパーセンテージは、100未満である。しかしながら、溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置する多様化されるアミノ酸位置のパーセンテージは、典型的には、少なくとも70である。したがって、本発明の特定の実施形態において、アルファボディーライブラリーは、純粋な溝、純粋な表面または純粋なループのライブラリーではない。より具体的には、少なくとも70であるが、すべてではない多様化されるアミノ酸位置、例えば、多様化されるアミノ酸位置の95未満、例えば、90未満または85未満が、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置する。多様化されるアミノ酸残基位置の数に応じて、上記パーセンテージは、様々な数の実際のアミノ酸残基位置に対応するであろう。したがって、上記から明らかであるように、本発明の方法の特定の実施形態において、例えば、これらの5~20個の位置の少なくとも5すなわち、5~20個の多様化される位置の少なくとも1個の位置、または特に少なくとも10すなわち、少なくとも1個または少なくとも2個の位置、または特に少なくとも15すなわち、少なくとも1個~少なくとも3個の位置、または特に少なくとも20すなわち、少なくとも1個~少なくとも4個の位置、または特に少なくとも25すなわち、少なくとも2個~少なくとも5個の位置、または特に30すなわち、2~6個の位置の位置が、iアルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位またはg位および第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位またはg位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位もしくはc位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位もしくはc位、例えば、i1アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および第1のα-ヘリックスに平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位、またはi2アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、またはi3アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位および第1のα-ヘリックスに逆平行の第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのg位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位またはiiアルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、c位およびf位、またはiiiアルファボディーポリペプチドの2個の連続するα-ヘリックスを連結するリンカー断片における位置以外の位置に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。したがって、ライブラリーにおける異なる配列の単鎖アルファボディーは、5~20個のアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて相違し、各ライブラリーについて、これらの5~20個の位置の少なくとも70すなわち、少なくとも4個~少なくとも14個の位置、例えば、少なくとも75すなわち、少なくとも4個~少なくとも15個の位置、少なくとも80すなわち、少なくとも4個~少なくとも16個の位置、少なくとも85すなわち、少なくとも4個~少なくとも17個の位置、例えば、少なくとも90すなわち、少なくとも5個~少なくとも18個の位置、例えば、少なくとも95すなわち、少なくとも5個~少なくとも19個の位置またはそれ以上、例えば、100すなわち、5個~20個の位置すべてが、ライブラリーにおける各アルファボディーポリペプチドのi2個の隣接するα-ヘリックスによって形成されるか、もしくはそれらの間の溝、またはii1個のα-ヘリックスの溶媒配向表面、またはiii2個のα-ヘリックスを相互に連結するリンカー断片のうちの1個の中のいずれかに位置する;より具体的には、これらの多様化される位置は、上記各選択肢について記載した位置に位置する。多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70溝に位置するアルファボディーライブラリーについて、前記ヘプタッドのe、g、bまたはc位以外の場所に位置する残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのa位、ヘプタッドのd位、ヘプタッドのf位またはアルファボディーのリンカーにおけるアミノ酸残基位置に位置し得ることに留意するべきである。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド反復配列におけるa位およびd位コア残基とも称されるは、アルファボディーの溶媒遮蔽すなわち、埋まっている部分を本質的に形成するコイルドコイル構造のアミノ酸残基位置である。ほとんどの本発明のアルファボディー溝ライブラリーにおいて、アルファボディーの安定性を維持するために、これらのコア残基のすべてまたは数個は保存されることが想定される。これらの実施形態において、残りの多様化される位置は、例えば、リンカー残基位置またはヘプタッドのf位に位置し得る。同様に、多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70アルファボディーヘリックスの溶媒配向表面に位置するアルファボディーライブラリーについて、前記ヘプタッドのb位、c位またはf位に位置しない残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのe位、g位、a位もしくはd位またはアルファボディーのリンカーにおけるアミノ酸残基位置に位置し得る。上に詳細に記載されるように、ほとんどの本発明のアルファボディーヘリックス表面ライブラリーにおいて、アルファボディーの安定性を維持するために、コア残基a位およびd位のすべてまたは数個は保存されることが想定される。これらの実施形態において、残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのe位もしくはg位またはリンカー残基位置に位置し得る。最後に、多様化されるアミノ酸残基位置が、主にすなわち、少なくとも70アルファボディーのリンカー断片内に位置するアルファボディーライブラリーについて、リンカー断片内に位置しない残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのe位、g位、f位、b位、c位、a位もしくはd位またはアルファボディーの2個のリンカー断片とは別の部分のアミノ酸残基位置に位置し得る。先と同様に、いくつかの実施形態において、安定性を確保するために、アルファボディーの各ヘプタッド単位におけるa位およびd位は、変化されないであろう。これらの実施形態において、残りの多様化されるアミノ酸残基位置は、ヘプタッドのe位、g位、f位、b位もしくはc位またはアルファボディーの2個のリンカー断片とは別の部分のアミノ酸残基位置に位置し得る。各アルファボディーポリペプチドの2個の隣接するα-ヘリックスによって形成されるかまたはそれらの間の溝内に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、1個の同じ溝、すなわち、2個の同じ隣接するα-ヘリックスによって形成される溝内に位置することを意味する。同様に、アルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックス内に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、1個の同じα-ヘリックス内に位置することを意味する。また、2個の連続するα-ヘリックスを相互に連結するリンカー断片内の位置に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、2個の連続するα-ヘリックスを相互に連結する1個の同じリンカー断片内に位置することを意味する。しかしながら、例えば、特定の標的に対するアルファボディーの開発に使用するために、異なる溝、表面またはループのライブラリーが組み合わせられることが想定され得る。より具体的には、ヘリックスCの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーは、ヘリックスAの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーおよび/またはヘリックスBの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。同様に、e/g-溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリーは、e/e-溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリー、および/またはg/g-溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。同様に、第1のリンカー断片内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するリンカーライブラリーは、第2のリンカー断片内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するリンカーライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。最後に、1つ以上のヘリックス表面ライブラリーは、1つ以上の溝ライブラリー、および/または1つ以上のリンカーライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。単鎖アルファボディーライブラリーを組み合わせる実用的な方法は、例えば、異なるライブラリーをほぼ等量で混合することによって達成され得る。本発明のアルファボディーライブラリーは、様々な形態で提供され得、以下に限定されないが、タンパク質のライブラリー、核酸のライブラリー、ベクターのライブラリーまたは宿主細胞のライブラリーであり得る。特定の実施形態において、本発明のライブラリーは、宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が核酸またはベクターのライブラリーの最大1個のメンバーを含有し、このような核酸またはベクターのライブラリーの各メンバーが本発明の単鎖アルファボディーポリペプチドをコードするライブラリーである。より具体的には、ライブラリーは、アルファボディーが発現される宿主細胞のライブラリーである。特定の実施形態において、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有する所望のアルファボディー配列を単離するためのスクリーニングまたは選択を容易にするために、ライブラリーのアルファボディーは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞または任意のその他の適切な微生物の表面上に提示される。したがって、特定の実施形態において、本発明のライブラリーは、タンパク質配列のセットまたは集合体を表わすので、アルファボディータンパク質のライブラリーである。ライブラリーのアルファボディーメンバーは、ライブラリーにおいて別々のアルファボディー配列として提示され得るか、または異なるアルファボディー配列の混合物として提供され得る。さらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディーポリペプチドまたはタンパク質ライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸およびベクターのライブラリーを提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの製造方法を提供する。したがって、これらの方法は、ポリペプチド、核酸またはベクターのライブラリーを製造するステップを含む。当業者であれば、本発明のアルファボディーライブラリーは、典型的には、組換えDNA技術によって生成されることを理解するであろう。より具体的には、特定のアミノ酸位置がそれぞれ相違するアルファボディーをコードする核酸配列のライブラリーは、鋳型配列の部位特異的変異導入またはランダム変異導入によって得られる。当業者によって一般に認められているように、ランダムなアミノ酸残基は、例えば、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における対応する位置のNNKまたはNNSコドンを選択導入することによって、前記アミノ酸配列における特定の位置に導入され得る。したがって、部分的にランダム化された単鎖アルファボディーライブラリーの生成は、鋳型または基準または参照のアルファボディー骨格配列内の特定の位置の部分的なランダム化を必要とする。このようなライブラリーの製造方法は当業者に公知であり、このようなライブラリーを生成するために商業的なサービスを利用できる。目的の位置の関連するアミノ酸残基を決定するヌクレオチドは、例えば、異なるアルファボディーをコードするヌクレオチド配列のライブラリーを得るための様々な方法で突然変異される。本発明の特定の実施形態において、単鎖アルファボディーライブラリーに存在する単鎖アルファボディーポリペプチドの定常の非多様化部分theconstantnonvarigatedpartは、天然に存在するタンパク質配列に対応していないので、骨格の非多様化部分を表わす配列は、非天然物由来である。実際、典型的には、本発明のライブラリーにおけるアルファボディーポリペプチドの定常の非多様化部分は、人工的な配列である。鋳型アルファボディー骨格の配列は、そのほぼ最適な物理化学的特性に基づいて選択された参照アルファボディーの配列である。国際公開第2010/066740号の実施例で実証されているように、単鎖アルファボディーは、一般に、高温すなわち、熱力学的安定性、高溶解度、pH変化に対する高い耐性、および重要なことにアミノ酸配列変異に対する高い許容性を有する。このような単鎖アルファボディー、または適切な物理化学的特性、例えば、アミノ酸配列変異に対する高い許容性を有するその他の単鎖アルファボディーは、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの生成のための参照または鋳型アルファボディー骨格または骨格配列として選択され得る。本発明のライブラリーにおいて想定される多様化は、天然に存在するアミノ酸残基および合成アミノ酸残基の両方を包含すると想定される。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置は、天然に存在する種類のアミノ酸、例えば、限定されないが、例えば、グリジン、アラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン、トレオニン、セリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリンなどの天然型のアミノ酸によって独占的に占められている。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドライブラリーの製造は、少なくとも100個のメンバーの核酸またはベクターのライブラリーであって、各メンバーが単鎖アルファボディーを含有するポリペプチドをコードし、コードされる異なる配列のアルファボディーポリペプチドが、5~20個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも1つにおいて互いに相違するライブラリーを製造するステップを含む。特定の実施形態において、これらの少なくとも70であるが、すべてではない多様化されるアミノ酸残基位置は、iアルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位またはg位および第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのe位またはg位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第1のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位もしくはc位および/またはアルファボディーポリペプチドの第2のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位もしくはc位、またはiiアルファボディーポリペプチドの1個のα-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位、c位およびf位、またはiiiアルファボディーポリペプチドの2個の連続するα-ヘリックスを連結するリンカー断片における位置のいずれかに位置する。これらのアルファボディー配列が宿主細胞中で発現すると、アルファボディーポリペプチドライブラリーが得られる。当業者に公知であるように、ランダムライブラリーの製造は、様々な方法で達成され得る。一般に、本発明のアルファボディーライブラリーの製造方法は、典型的には、単鎖アルファボディーライブラリーをコードする核酸もしくはベクターのライブラリーまたは感染性粒子で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするステップを含む。さらに、アルファボディーライブラリーの製造方法は、典型的には、前記宿主細胞の増殖増加、成長に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、およびコードされる単鎖アルファボディーの製造発現、合成に適した条件下で培養するステップを含む。増殖または発現に適した条件下における宿主細胞の培養は、典型的には、細胞成長または発現誘導に適切な成分を含有する培地の存在下で達成される。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーの製造方法は、宿主細胞または培地から、製造された単鎖アルファボディーを単離するステップをさらに含む。発現されたアルファボディーライブラリーは、異なる配列のポリペプチドに加えて、同一のポリペプチドの複数コピーも含有することにさらに留意するべきである。さらにさらなる態様において、本発明は、目的の標的タンパク質に対するアルファボディーの製造のための、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの使用を提供する。より具体的には、本発明は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイもしくはmRNAディスプレイなどのインビトロディスプレイ法のための、本発明のアルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物の使用を提供する。したがって、本発明は、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性本明細書において定義されるまたは検出可能なインビトロ活性本明細書において定義される、例えば、検出可能なインビトロアンタゴニストまたはアゴニスト活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーの生成方法をも提供する。これらの方法は、ランダムライブラリーの製造、および目的の標的分子に対する結合または活性についてのスクリーニングの概念に基づくものである。標的特異的なアルファボディーを得るために、標的特異的なアルファボディーの生成方法は、a本発明の単鎖アルファボディーライブラリーを生成するステップ、およびbこのような本発明の単鎖アルファボディーライブラリーから、目的のタンパク質もしくは細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有する少なくとも1つの単鎖アルファボディーを選択するステップを含む。したがって、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーの本発明の製造方法は、a本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を製造するステップ、b目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーを選択するステップ、および任意に、c1つ以上の単鎖アルファボディーを単離するステップを少なくとも含む。目的の標的分子もしくは標的タンパク質に特異的に結合するか、または目的の標的分子もしくは標的タンパク質に対するものであるか、または目的の標的分子もしくは標的タンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーを選択するステップは、様々な方法で、例えば、選択方法として一般に公知の方法によって、またはスクリーニング方法として一般に公知の方法によって実施され得る。両方法は、所望の成分および所望ではない成分の両方を含む元の集合体すなわち、アルファボディーライブラリーから、所望の成分すなわち、アルファボディーライブラリーメンバーを同定し、続いて単離することすなわち、選択ステップを想定する。選択方法の場合、ライブラリーメンバーは、典型的には、所望の特性を適用して所望の目的を得るステップによって単離されるであろう;このような場合、所望の特性は、通常、目的の所定標的分子に対する高親和性の特性に限定され、所望の目的は、通常、その他のものからこのような高親和性のライブラリーメンバーを単離することに限定される。このような方法は、一般に、親和性選択方法として公知であり、本発明との関連において、このような親和性選択方法は、目的のタンパク質またはそのサブドメインもしくはサブ領域に対する高親和性を有するアルファボディーを選択する目的のために、単鎖アルファボディーライブラリーに適用されるであろう。あるいは、スクリーニング方法の場合、ライブラリーメンバーは、典型的には、すべてのライブラリーメンバー、またはライブラリーメンバーの少なくとも実質的な集合体が、所望の所定特性に関して個々に検査されて、このような所望の特性を有するメンバーは保持されるが、このような所望の特性を有しないメンバーは破棄されるステップによって単離されるであろう;このような場合、本発明との関連において、所望の特性は、目的のタンパク質またはそのサブドメインもしくはサブ領域に対する高親和性、または目的の標的タンパク質の活性の阻害、減少および/または抑制などの機能活性のいずれかに関するものであり得る。したがって、本発明の方法の選択ステップは、親和性選択技術によって、または親和性に基づくもしくは活性に基づく機能スクリーニング技術によって達成され得、いずれの技術によっても、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの選択されなかったアルファボディーと比較して有益な有利な、所望の、優れた親和性特性または活性特性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーの選択をもたらすと考えられる。したがって、特定の実施形態において、選択ステップは、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を目的の標的分子に接触させるステップ、および標的分子と、ライブラリーに存在するアルファボディーとの間の結合を測定するステップを含む。目的の標的分子または標的タンパク質へのアルファボディーの特異的結合は、それ自体が公知の任意の適切な方法、例えば、バイオパニング、スキャチャード解析および/または競合結合アッセイ、例えば、放射免疫測定法RIA、酵素免疫測定法EIAおよびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当該技術分野において公知のそれらの様々な変法などで測定され得る。アルファボディーライブラリーの選択またはスクリーニングが様々な方法で実施され得ること、およびこのような方法がアルファボディーライブラリーが提供される形態に調整されるであろうことを留意するべきである。多様化されるポリペプチド配列またはこのような多様化されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列のセット、集合体またはライブラリーを提示および選択またはスクリーニングするのに適切であり、アルファボディーに適用され得る方法、技術ならびに宿主生物は、当業者に公知である。このような方法は、例えば、ジョルジョーGeorgiouら、NatBiotechnol1997,15:29-34;ウィットラップWittrup、CurrOpinBiotechnol2001,12:395-399;リポセックLipovsekおよびプラックトゥーンPluckthun、JImmunolMethods2004,290:51-67;レイアセンReiersenら、NuclAcidsRes2005,33:e10;レビンLevinおよびワイスWeiss、MolBioSyst2006,2:49-57;ブラトコビッチBratkovic、CellMolLifeSci2010,67:749-767に記載されている。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーは、ファージライブラリーとして提供され、結合アルファボディーは、ファージを標識標的分子に接触させ、その後、標識結合標的の検出または選択的な回収により結合ファージを取り出すことによって同定される。特定の実施形態において、バイオパニング法が使用される。直接的バイオパニングのプロトコールにおいて、標的は、固体支持体上に固定化される。固体支持体の例は、マイクロタイタープレートもしくはチューブ例えば、Maxisorpplates,Maxisorptubes,Nuncまたは磁気ビーズDynabeads,Invitrogenである。標的は、プラスチックまたはビーズ表面活性化Dynabeads、例えば、DynabeadsM270Epoxy,Invitrogen上に直接的にコーティングされ得るか、または標的がビオチン化される場合はストレプトアビジンを介してコーティングされ得る例えば、DynabeadsMyOneストレプトアビジンT1,Invitrogen。His-タグなどのその他のタグは、標的を捕捉するのに使用され得、あるいは標的に対する抗体も、支持体上の標的を捕捉するのに使用され得る。これらの代替的なタグは、DynabeadsDynabeadsHis-tagisolationandpulldown,Invitrogen、およびプロテインAまたはプロテインGが結合したDynabeadsDynabeads-プロテインA/G,Invitrogenとも適合する。標的を磁気ビーズ上に固定化するために、具体的なビーズの各種類については製造業者の推奨に従う。加えて、可溶性バイオパニングのプロトコールが使用され得る。これは、ファージライブラリーとのインキュベーション後に、標的が固体支持体上に捕捉されることを意味する。標的-ファージの相互作用は、溶液中で行われる。未結合ファージを洗い流すために、標的は、固体支持体上に固定化される必要がある。可溶性バイオパニング法における標的の固定化は、直接的バイオパニングのプロトコールにおける固定化の方法と同じである。特定の実施形態において、ビオチン化標的が使用され、それにより、標的に結合するアルファボディーを提示するファージは、ストレプトアビジンでコーティングされた支持体すなわち、磁気ビーズで捕捉される。ファージライブラリーディスプレイの技術、およびファージディスプレイ技術による選択は、最も強く、かつ多目的である利用可能な選択技術の中の1つなので、標的特異的な結合剤のハイスループット同定方法として選択され得るスコットScottおよびスミスSmith、Science1990,249:386-390;バラトコビッチBratkovic、CellMolLifeSci2010,67:749-767。この技術の主な利点は、遺伝子型すなわち、提示されるタンパク質をコードするカプセル化されたDNAと表現型すなわち、提示されるタンパク質、例えば、本発明のアルファボディーとのカップリングであり、比較的簡単なインビトロアッセイにおいて、何百万から何兆個のポリペプチド変異体を有する大きなライブラリーから親和性に基づいて選択することが可能になる。アルファボディーポリペプチド配列のセット、集合体またはライブラリーに含まれるアルファボディーポリペプチド配列が、適切な細胞またはファージまたは粒子上に提示される場合、前記細胞またはファージまたは粒子から、そのアルファボディーポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を単離することも可能である。次いで、選択されたアルファボディーライブラリーメンバーのヌクレオチド配列は、通常の配列決定法によって決定され得る。最後に、実際の所望のアルファボディーポリペプチド配列は、当業者に公知であるように、適切な条件下の宿主生物中で前記ヌクレオチド配列を発現させることによって得られ得る。本発明の方法は、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有する少なくとも1つの単鎖アルファボディーを増幅するステップをさらに含み得る。例えば、本発明の方法の選択ステップから得られたファージクローンであって、特定の単鎖アルファボディーを提示するファージクローンは、宿主細菌の再感染および成長培地中でのインキュベーションによって増幅され得る。加えて、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有する得られたアルファボディー配列は、任意にそれらの配列が同定された後に、可溶性タンパク質構築物として合成され得る。例えば、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーは、当該技術分野において公知の組換え合成方法または化学合成方法を使用して合成され得る。また、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーは、遺伝子工学技術によって製造され得る。したがって、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーの合成方法は、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有するアルファボディー配列をコードする核酸またはベクターで、宿主細胞を形質転換または感染することを含み得る。したがって、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なインビトロ活性を有するアルファボディー配列は、組換えDNA法によって作製され得る。アルファボディーをコードするDNAは、従来の手法を使用して容易に合成され得る。DNAは、調製されるとすぐに発現ベクターに導入され得、次いで発現ベクターは、組換え宿主細胞および/またはこれらの組換え宿主細胞が存在する培地中でアルファボディーの発現を得るために、E.coliなどの宿主細胞または任意の適切な発現系に形質転換またはトランスフェクションされ得る。宿主細胞への核酸もしくはベクターの形質転換またはトランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿法、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および遺伝子銃biolistics法などの当業者に公知の様々な手段によって達成され得る。所望のアルファボディーの発現に適切な宿主細胞は、インビトロに存在するかまたはインビボに存在するかにかかわらず、任意の真核細胞または原核細胞例えば、E.coliなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に存在し得る。本発明の特定の実施形態において、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性本明細書において定義されるを有する1つ以上の単鎖アルファボディーの製造方法の選択ステップは、目的の標的分子を本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物に接触させるステップ、および続いて目的の標的分子に接触している単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する1つ以上の単鎖アルファボディーを同定するステップを繰り返し行なうことによって、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーについて、アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物をさらに濃縮することを含み得る。本発明は、本発明のアルファボディーライブラリーを使用して得られた標的特異的なアルファボディーの結合特異性および/または有効性を改善または最適化こととの関連で製造され得る専用アルファボディーライブラリーをさらに提供する。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーに基づいて1つ以上の標的結合アルファボディーを製造するための上記方法の後に、得られたアルファボディー配列もしくは製造されたアルファボディー配列の合理化を含むステップまたは方法がさらに行われ得る。このような配列合理化ステップは、目的の特定標的分子に対するすなわち、結合する異なるアルファボディーの間でもしくはアルファボディーの中で保存されている特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンの同定または決定を含み得る。したがって、この合理化ステップは、目的の標的タンパク質に結合すると同定された異なるアルファボディー配列を比較することによって、およびこれらの配列の間の配列保存を同定することによって行われ得る。このようなステップは、任意に、分子モデリングおよび相互リガンドドッキングの技術を使用することによって支援され得るか、または実施され得る。目的の特定標的分子に対する異なるアルファボディーの間でもしくはそれらの中で保存されていると同定される特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンは、標的特異的なアルファボディーの結合または活性に有意に寄与すると考えられ得る。特定の実施形態において、上記配列合理化ステップの後に、目的の標的分子に対して特異的であると同定され、本発明の方法を使用して製造された異なるアルファボディー配列のセットから、アルファボディー配列の新たなライブラリーがさらに作製され得る。このような実施形態において、アミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置であって、異なる標的結合アルファボディーの間でまたはそれらの中で保存されている位置が一定に維持されており、アルファボディー配列が多様化されるアミノ酸残基位置の新たな所定のセットにおいて変化する。この新たな所定のセットにおいて、多様化される位置は、アミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置であって、異なる標的結合アルファボディーの間でまたはそれらの中で保存されている位置の外側に位置する。このようにして得られたアルファボディーライブラリーは、アルファボディーの専用ライブラリーと称される。次いで、これらの専用ライブラリーを再度スクリーニングして、最良の標的結合アルファボディーが同定され得る。したがって、本発明は、目的の標的タンパク質の専用ライブラリーの製造方法であって、上記標的結合アルファボディーを生成するための方法ステップに加えて、ランダムライブラリーから2つ以上の標的結合アルファボディーを同定した後に、-目的の標的タンパク質に結合する製造されたアルファボディー配列を比較するステップ、-これらの異なるアルファボディー配列の間でまたはそれらの中で保存されているアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンを同定するステップ、および:-比較された2つ以上のアルファボディー配列の少なくとも1つから開始し、異なる標的結合アルファボディー配列の間でまたはそれらの中で保存されているアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンではないアミノ酸位置のセットにおいて多様化される異なるアルファボディー配列を含む専用ライブラリーを製造するステップを含む製造方法をさらに提供する。これらの専用ライブラリーは、改善された特性を有するアルファボディーを得るのに使用され得る。より具体的には、これは、-専用ライブラリーから、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および/またはインビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択および/または同定するステップ、ならびに任意に、-目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および/またはインビトロ活性を有するこれらのアルファボディー配列を単離するステップを含む。専用ライブラリーを製造し、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および/またはインビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択、同定および単離するための方法に含まれるステップは、本発明の標的結合アルファボディーの製造方法の対応するステップについて記載したのと同様の方法で実施され得ることが理解されるであろう。本明細書においてさらに記載されるように、本発明のアルファボディーにおけるアミノ酸残基の総数は、主に、ヘプタッド反復配列あたりのヘプタッドの数、およびヘプタッド反復配列を相互に連結する柔軟性のあるリンカーの長さに応じて、約50~約210個の範囲であり得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドもしくは組成物の部分、断片、類似体または誘導体は、このような部分、断片、類似体または誘導体が、それらが由来する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の生物学的機能を依然として有しており、想定される薬理学的目的に依然として使用され得る限り、それらの長さおよび/または大きさについては特に限定されない。さらなる態様において、本発明は、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なインビトロ活性を有する単鎖アルファボディーであって、本発明のアルファボディーライブラリーを伴う方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをも提供する。これらの標的特異的なアルファボディー、ならびにこれらの標的特異的なアルファボディーを含有するむポリペプチドおよび組成物は、本明細書において、それぞれ本発明のアルファボディーおよび本発明のポリペプチドおよび組成物とも称される。したがって、本発明は、目的の標的分子および標的タンパク質に特異的に結合するアルファボディー、ならびに1つ以上のこのようなアルファボディーを含有するかまたは1つ以上のこのようなアルファボディーから本質的になるポリペプチドおよび医薬組成物、ならびに予防目的、治療目的もしくは診断目的のためのこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も提供する。したがって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、当該アルファボディー、ポリペプチドおよび/または組成物が対象とする目的の標的分子が関与する生物学的経路によって媒介される疾患および障害の予防ならびに治療に使用され得る。特定の実施形態によれば、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物は、1つ以上の目的の特定標的分子に結合することによって、1つ以上の目的の標的分子と、それらの対応する受容体または天然の結合パートナーとの間の相互作用を抑制または阻害し、それにより、その目的の標的分子によって媒介されるシグナル伝達経路を抑制、阻害または減少するか、および/またはその目的の標的分子が関与する生物学的な経路および機序を調節するのに使用され得る。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的分子、より具体的にはその目的の標的分子上の受容体結合部位に特異的に結合する。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的分子に対するものである。目的の標的分子へのアルファボディーの結合の結果は、目的の標的分子に結合するとアルファボディーが、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下で目的の標的分子がその受容体に結合するのと比較して、目的の標的分子がその受容体もしくはその少なくとも1つのサブユニットに結合することを、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも20、例えば、少なくとも50、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものであり得る。あるいは、目的の標的分子へのアルファボディーの結合は、目的の標的分子がその受容体に結合することを依然として許容するが、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下で目的の標的分子がその受容体に結合する場合のシグナル伝達と比較して、目的の標的分子がその受容体またはその少なくとも1つのサブユニットに結合することによって引き起こされ得るシグナル伝達を、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも20、例えば、少なくとも50、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものである。さらに特定の実施形態において、目的の標的分子へのアルファボディーの結合は、すなわち、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が存在しない場合における目的の標的分子によって媒介される受容体の結合と比較して、受容体の活性化および/または結合、特に目的の標的分子によって媒介される受容体の結合を、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも20、例えば、少なくとも50、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものである。特定の実施形態において、本発明のライブラリーを使用して得られたアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、減少および/または抑制するpreventiか、あるいは目的の標的タンパク質の活性を阻害、減少reducおよび/または抑制するか、あるいは目的の標的タンパク質が関与する1つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能経路もしくは活性を阻害、減少および/または抑制し、これらの阻害、減少および/または抑制は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物を使用しない場合の同じ条件下の同じアッセイにおける目的の標的タンパク質の活性と比較して、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたはインビボアッセイを使用して測定した場合に例えば、少なくとも10、しかし好ましくは少なくとも20、例えば、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95またはそれ以上阻害、減少および/または抑制するものである。加えて、阻害、減少および/または抑制は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が存在しない場合の同じ条件と比較して、その天然の結合パートナーの1つ以上に対する目的の標的タンパク質の親和性、アビディティ、特異性および/または選択性の低下を誘導すること、および/または目的の標的タンパク質が存在する培地もしくは環境の1つ以上の条件例えば、pH、イオン強度、補因子の存在などに対する目的の標的タンパク質の感受性の低下を誘導することをも意味し得る。本発明との関連において、阻害、減少および/または抑制は、目的の標的タンパク質の活性のアロステリックな阻害、減少および/または抑制をも含み得る。当業者に公知であるように、本発明の上記アルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、一般に、目的の標的分子によって媒介されるシグナル伝達すなわち、目的の標的分子がその受容体に結合することによって引き起こされるシグナル伝達、ならびにこのようなシグナル伝達によって誘導される生物学的な機序および効果のアンタゴニストとして作用するであろう。ある非限定的な実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は目的の標的分子に特異的に結合し、それにより、目的の標的分子とその受容体との間の相互作用を増強、増加および/または活性化し得る。あるいは、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、天然のリガンドを模倣して受容体に直接的に結合し、それにより、その受容体の生物学的機能をも増強、増加および/または活性化し得る。それにより、このような本発明の作動的なアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたはインビボアッセイを使用して測定した場合に目的の標的分子の生物学的活性および/または1つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能もしくは経路を増強、増加および/または活性化し得る。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の1つ以上が結合する目的の標的分子が関与する被験体における1つ以上の特定の細胞応答を増加させるのに使用され得る。目的の特定標的分子に結合する本発明の作動的なアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物は、例えば、免疫系の障害を特徴とする疾患、または免疫系の障害を有する結果として起こり得る疾患の予防および/または治療のために、被験体における1つ以上の免疫応答を刺激または増強するのに使用され得る。さらなる態様において、本発明は、目的のタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの本発明のアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるポリペプチド本明細書において、本発明のポリペプチドとも称されるを提供する。本発明のポリペプチドは、少なくとも1つの本発明のアルファボディーと、任意に、1つ以上のリンカーを介して任意に結合された1つ以上のさらなる基、部分、残基とを含有し得る。したがって、本発明のポリペプチドは、任意に、その他の目的の標的または標的タンパク質に結合するための1つ以上のさらなる基、部分または残基を含有し得る。このようなさらなる基、残基、部分および/または結合部位が、さらなる機能性を本発明のアルファボディーにおよび/または、それが存在するポリペプチドまたは組成物に提供してもしなくてもよく、本発明のアルファボディーの特性を改変してもよいし改変しなくてもよいことは明らかである。このような基、残基、部分または結合単位は、例えば、生物学的および/または薬理学的に活性であり得る化学基でもあり得る。特定の実施形態において、これらの基、部分または残基は、N末端またはC末端でアルファボディーに結合される。しかしながら、特定の実施形態において、1つ以上の基、部分または残基は、例えば、α-ヘリックス中のシステインへのカップリングによりアルファボディーの本体に結合される。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、化学的に修飾されたアルファボディーを含有する。例えば、このような修飾は、1つ以上の官能基、残基または部分を本発明のアルファボディー上に導入または結合することを含み得る。これらの基、残基または部分は、1つ以上の所望の特性または機能性を本発明のアルファボディーに付与し得る。このような官能基の例は、当業者に明らかであり、限定されないが、精製タグ、検出タグ、蛍光タグ、グリカン部分、PEG部分などが挙げられる。また、本発明のアルファボディーへの官能基の導入または結合は、本発明のアルファボディーの半減期、溶解度および/または安定性を増加させる効果を有し得るか、あるいは本発明のアルファボディーの毒性を減少させる効果を有し得るか、あるいは本発明のアルファボディーの任意の望ましくない副作用を排除または軽減する効果を有し得るか、および/またはその他の有利な特性の効果を有し得る。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、例えば、PEG化によって、血清タンパク質に結合する基または血清タンパク質例えば、血清アルブミンもしくは血清タンパク質ドメインを付加することによって、または一般には、本発明のアルファボディーの半減期を増加させる部分にアルファボディーを結合させることによって修飾されて、その半減期が明確に増加したアルファボディーを含有する。典型的には、半減期が増加した本発明のポリペプチドは、前記化学修飾を持たない対応する本発明のアルファボディーの半減期よりも少なくとも2倍、例えば、少なくとも3倍、例えば、少なくとも5倍、例えば、少なくとも10倍またはそれ以上長い半減期を有する。本発明のアルファボディーの特定の修飾は、標識アルファボディーの使用目的に応じて、1つ以上の検出可能な標識またはその他のシグナルを生成する基もしくは部分を導入することを含み得る。さらにさらなる特定の修飾は、キレート基を導入して、例えば、1つ以上の金属または金属カチオンをキレートすることを含み得る。特定の修飾は、特定の結合ペア、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン結合ペアの一方の部分である官能基を導入することを含み得る。その他の化学的および酵素的な修飾の候補は、当業者に明らかであろう。特定の実施形態において、1つ以上の基、残基、部分は、1つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーによりアルファボディーに結合される。さらに特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、2つ以上の標的特異的なアルファボディーを含む。このような特定の実施形態において、2つ以上の標的特異的なアルファボディーは、直接的または間接的な方法のいずれかで互いに結合カップリング、連結、相互に結合、融合され得る。2つ以上のアルファボディーが互いに直接的に結合される実施形態において、それらは、スペーサーまたはリンカー断片または部分の補助なしで結合される。代替的には、2つ以上のアルファボディーが互いに間接的に結合される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分により連結される。2つ以上のアルファボディーが直接的に連結される実施形態において、それらは、単鎖融合構築物としてすなわち、2つ以上のアルファボディー配列が、単一の近接するアミノ酸配列中で互いに直接的に続いている単鎖タンパク質構築物として製造され得る。代替的には、アルファボディーの直接的な結合も、2つのアルファボディーの間にジスルフィド架橋を形成するシステインにより達成され得るすなわち、酸化条件などの適切な条件下で、遊離システインをそれぞれ含有する2つのアルファボディーは互いに反応して、構成モノマーがジスルフィド架橋を介して共有結合的に結合されているダイマーを形成し得る。あるいは、2つ以上のアルファボディーが間接的に連結される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分を介して互いに連結され得る。このような実施形態において、それらも、単鎖融合構築物としてすなわち、2つ以上のアルファボディー配列が、単一の近接するアミノ酸配列中で互いに続いているが、アルファボディーは、スペーサー断片として作用する適切に選択されたアミノ酸配列断片の存在によって分離されたままである単鎖タンパク質構築物として製造され得る。代替的には、アルファボディーの間接的な結合も、アミノ酸側基を介して、またはアルファボディーのN末端もしくはC末端を介して達成され得る。例えば、適切に選択された条件下で、遊離システインをそれぞれ含有する2つのアルファボディーは、ホモ二官能性化合物と反応し、構成アルファボディーが、前記ホモ二官能性化合物によって共有結合的に架橋されているアルファボディーダイマーを生成し得る。同様に、1つ以上のアルファボディーは、反応性の側基または末端と、タンパク質の架橋のために適切に選択されたホモ二官能性化合物またはヘテロ二官能性化合物との任意の組み合わせにより架橋され得る。結合されたアルファボディーの特定の実施形態において、2つ以上の結合されたアルファボディーは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。2つ以上の結合されたアルファボディーも、同じ結合特異性または異なる結合特異性を有し得る。2つ以上の結合されたアルファボディーも、同じ結合親和性または異なる結合親和性を有し得る。本発明の異なるアルファボディーのカップリングに使用するのに適切なスペーサーまたはリンカーは当業者に明らかであり、一般に、ペプチドおよび/またはタンパク質を結合するのに当該技術分野において使用される任意のリンカーまたはスペーサーであり得る。特に、このようなリンカーまたはスペーサーは、医薬用途を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適切である。単鎖アミノ酸配列におけるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されないが、ポリペプチドリンカー、例えば、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン/セリンリンカー、グリシン-およびセリン-リッチなリンカー、または大部分が極性ポリペプチド断片から構成されるリンカーなどが挙げられる。化学架橋によるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されないが、ホモ二官能性化学架橋化合物、例えば、グルタルアルデヒド、イミドエステル、例えば、アジプイミド酸ジメチルDMA、スベルイミド酸ジメチルDMSおよびピメルイミド酸ジメチルDMP、またはN-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステル、例えば、ジチオビスプロピオン酸スクシンイミジルDSPおよびジチオビスプロピオン酸スルホスクシンイミジルDTSSPが挙げられる。架橋のためのヘテロ二官能性試薬の例としては、限定されないが、一方がアミン反応性末端であり、他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋剤、または一方の末端にNHSエステルを有し、他方の末端にSH反応性基例えば、マレイミドまたはピリジルジスルフィドを有する架橋剤が挙げられる。単鎖連結アルファボディー構築物に使用するためのポリペプチドリンカーまたはスペーサーは、1~50個のアミノ酸の長さ、例えば、1~30個、特に1~10個のアミノ酸残基を有する任意の適切な例えば、グリシンリッチなアミノ酸配列であり得る。スペーサーの長さ、柔軟性の程度および/またはその他の特性は、最終的な本発明のポリペプチドの特性、限定されないが、目的の標的タンパク質に対する親和性、特異性またはアビディティなどに対していくらかの影響を与え得ることが明らかである。2個以上のスペーサーが本発明のポリペプチドに使用される場合、これらのスペーサーは同じものでもよいし異なるものでもよいことが明らかである。本発明の文脈および開示において、当業者であれば、いかなる過度の実験的な負担も伴わずに、本発明のアルファボディーをカップリングする目的のために最適なスペーサーを決定できるであろう。本発明の結合されたアルファボディーポリペプチドは、一般に、任意に1つ以上の適切なリンカーを介して、1つ以上の本発明のアルファボディーを1つ以上のさらなる基、残基、部分および/またはその他の本発明のアルファボディーに適切に結合して、本発明のポリペプチドを提供する少なくとも1つのステップを含む方法によって調製され得る。また、本発明のポリペプチドは、i適切な宿主細胞または発現系において、本発明のポリペプチドを発現させるステップ、およびii本発明のポリペプチドを単離および/または精製するステップを少なくとも含む方法によって製造され得る。上記ステップを実施するための技術は、当業者に公知である。また、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの一部、断片、類似体、突然変異体、変異体および/または誘導体、および/またはこのような一部、断片、類似体、変異体、バリアントおよび/または誘導体の1つ以上を含むかまたはそれらから本質的になるポリペプチドをも包含する。このような本発明の一部、断片、類似体、変異体、バリアントおよび/または誘導体は、依然として、目的の標的分子に特異的に結合できるものであり得る。特定の実施形態において、本発明は、本発明のアルファボディーの標的結合断片、バリアントまたは誘導体を提供する。本発明のライブラリー、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物または、それらを発現させるのに使用される本発明のヌクレオチド配列は、天然に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列ではないことに留意するべきである。典型的には、本発明のアルファボディーは、組換え、合成もしくは半合成のアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質またはヌクレオチド配列である。本発明によって提供されるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、本質的に単離された形態本明細書において定義されるであり得るか、あるいは少なくとも1つの本発明のアルファボディーを含有し得るかまたは当該アルファボディーから本質的になり得、任意に、1つ以上のその他の基、部分または残基これらはすべて、任意に、1つ以上の適切なリンカーにより連結されるをさらに含有し得る本発明のポリペプチドまたは組成物の一部を形成し得る。予防用途、治療用途および/または診断用途のために、本発明のライブラリーを使用して得られ得るアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、原則として、目的のヒト標的分子に対するものであるか、またはそれに特異的に結合することが、本明細書における開示に基づいて理解されるであろう。しかしながら、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が獣医用途を目的とするものである場合、それらは、治療しようとする種に由来する目的の標的分子に対するものであるか、あるいは当該標的分子に特異的に結合するか、あるいは当該標的分子が治療されるべき種に由来する目的の標的分子と少なくとも交差反応性であろう。したがって、1つの被験種に由来する目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、1つ以上のその他の被験種に由来する目的の標的分子と交差反応性を示してもよいし、示さなくてもよい。当然のことながら、ヒトまたは動物において使用するためのアルファボディーの開発の文脈では、研究および実験室試験で使用するために取り扱われるものとは別の種に由来する目的の標的分子に結合するアルファボディーが開発され得ることが想定される。本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、目的の標的分子のいくつかの天然または合成の類似体、バリアント、変異体、アレル、一部および断片に結合し得ることも予想される。より具体的には、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、天然/野生型の目的の標的分子、および/またはそのアルファボディーおよびポリペプチドが結合する目的の標的分子の結合部位、一部またはドメインを依然として含有する目的の標的分子の類似体、変異体、突然変異体、アレル、一部および断片に少なくとも結合することが予想される。特定の実施形態において、目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的タンパク質以外の天然に存在するタンパク質と交差反応性を示さない。さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって選択および/または製造された単鎖アルファボディーをコードする核酸を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸本明細書において、本発明の核酸または核酸配列とも称される、ならびにこのような核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。核酸配列は、ベクターまたは遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの形態でもあり得る。本発明の核酸配列は、合成または半合成の配列、ライブラリー特に、発現ライブラリーから単離されたヌクレオチド配列、オーバーラッピングプライマーを使用してPCRによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のDNA合成技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。本発明の遺伝子構築物は、DNAでもよいしRNAでもよく、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝子構築物は、目的の宿主細胞または宿主生物の形質転換に適切な形態、目的の宿主細胞のゲノムDNAへの組み込みに適切な形態、または目的の宿主生物における自律複製、保持および/または継代に適切な形態でもあり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクターの形態、例えば、プラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどであり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、インビトロおよび/またはインビボ例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および/または発現系における発現を提供できるベクターであり得る。本発明の遺伝子構築物は、発現されたアルファボディーを目的の細胞内分画または細胞外分画に導くのに適切なリーダー配列を含み得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、適切なベクターのpelBリーダー配列部位に挿入されて、発現されたアルファボディーを細菌のペリプラズム空間に導き得る。また、ベクターは、例えば、アルファボディーの産生を最適化するのに適切なプロモーター系を備え得る。さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸を含むベクターを提供する。さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸またはこれらの核酸を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供する。したがって、本発明の特定の実施形態は、本発明の方法によって得られ得るアルファボディーをコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクションまたは形質転換され、アルファボディーを発現できる宿主細胞である。本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの発現に適切な宿主または宿主細胞の例は当業者に明らかであり、インビトロに存在するかまたはインビボに存在するかにかかわらず、任意の適切な真核細胞または原核細胞例えば、E.coliなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞が挙げられる。さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る1つ以上のアルファボディー、ポリペプチドおよび/または核酸配列と、任意に少なくとも1つの薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物本明細書において、本発明の医薬組成物とも称されるを提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも1つのその他の薬学的に活性な化合物をさらに含有し得る。本発明の医薬組成物は、目的の標的分子に関連する疾患および障害の診断、予防および/または治療に使用され得る。特に、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有し、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける予防用途、治療用途および/または診断用途に適切な医薬組成物を提供する。また、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有し、目的の標的分子に関連するか、および/またはそれによって媒介される1つ以上の疾患、障害もしくは病態の予防および/または治療における獣医用途に使用され得る医薬組成物を提供する。一般に、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つの本発明のアルファボディーまたはポリペプチドと、少なくとも1つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および/またはアジュバントと、任意に1つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび/または化合物とを含有する医薬調製物または医薬組成物として製剤化され得る。このような製剤は、経口投与、非経口投与、局所投与または吸入投与に適切であり得る。したがって、本発明のアルファボディーもしくはポリペプチド、および/またはそれらを含む組成物は、例えば、先と同様に使用されるべき特定の医薬製剤または医薬組成物に応じて、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、局所投与、坐剤投与、吸入投与され得る。臨床医であれば、適切な投与経路、およびこのような投与に使用されるのに適切な医薬製剤または医薬組成物を選択できるであろう。また、医薬組成物は、適切な結合剤、崩壊剤、甘味剤または香味剤を含有し得る。錠剤、丸剤またはカプセル剤は、例えば、ゼラチン、ワックスまたは糖などでコーティングされ得る。加えて、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、持続放出調製物または持続放出装置に組み込まれ得る。注射または点滴に適切な医薬剤形としては、滅菌注射液もしくは滅菌点滴液または滅菌分散液の即時調製に適合されている有効成分であって、任意にリポソーム中にカプセル化される有効成分を含有する滅菌水溶液もしくは滅菌分散液または滅菌粉末を挙げることができる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および保存の条件下で安定な滅菌液でなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または液体分散媒であり得る。抗菌剤または抗真菌剤なども、任意に追加され得る。本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの有用な投与量は、動物モデルでそれらのインビトロ活性およびインビボ活性を測定することによって決定され得る。マウスおよびその他の動物における有効投与量からヒトのものを推定するための方法は、当業者に公知である。予防および/または治療に使用するのに必要な本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの量は、選択された特定のアルファボディーまたはポリペプチドだけではなく投与経路、治療されている病態の性質ならびに患者の年齢および状態により変化し得、最終的には担当の医師または臨床医の判断であろう。また、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの投与量は、標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片もしくは器官、または標的分子の血漿濃度に応じて変化し得る。本発明のアルファボディーもしくはポリペプチドおよび/またはそれらを含む組成物は、予防もしくは治療されるべき疾患または障害を予防および/または治療するのに適切な治療計画にしたがって投与される。臨床医は、一般に、適切な治療計画を決定できるであろう。一般に、治療計画は、1つ以上の薬学的に有効な量または用量で、1つ以上の本発明のアルファボディーおよび/またはポリペプチド、またはそれらを含有する1つ以上の組成物を投与することを含むであろう。所望用量は、便宜上、単回用量、または適切な間隔で投与される分割用量これは、さらにサブ用量化され得るで提示され得る。投与計画としては、長期すなわち、少なくとも2週間、例えば、数カ月間または数年間または1日の治療が挙げられ得る。本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、とりわけ病態の重症度および治療されるべき患者に基づいて医師によって決定される量で投与されるであろう。典型的には、各疾患の兆候について、最適用量opticaldosageは、単回1日用量として、または1日の間の複数回分割用量として連続的に例えば、点滴によってkg体重/日あたりに投与されるべき量を特定して決定されるであろう。臨床医であれば、一般に、本明細書において記載されるファクターに応じて適切な1日用量を決定できるであろう。特定の場合、臨床医であれば、例えば、上記要因および専門家としての判断に基づいてこれらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかであろう。特に、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、目的の標的分子が関与する疾患および障害の予防および/または治療に使用されるか、あるいは使用され得るその他の薬学的に活性な化合物または成分と併用してもよく、その結果として、相乗効果が得られてもよいし、得られなくてもよい。このような化合物および成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医に明らかであろう。さらなる態様によれば、本発明は、目的の標的分子が関与し、目的の標的分子によって媒介される少なくとも1つの疾患および/または障害の予防および/または治療のための薬剤の調製のための、目的の標的分子に特異的に結合する本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの使用を提供する。したがって、本発明は、前記目的の標的分子が関与し、目的の標的分子によって媒介される少なくとも1つの疾患および/または障害の予防および/または治療に使用するための、目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、目的の標的分子によって媒介される少なくとも1つの疾患および/または障害を予防および/または治療するための方法であって、1つ以上の本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび/または医薬組成物の薬学的に有効な量を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法をも提供する。特に、薬学的に有効な量は、目的の標的分子が関与する生物学的活性および/または生物学的な経路もしくはシグナル伝達を阻害、抑制または低下させるためのアルファボディーまたはポリペプチドの循環レベルを作り出すのに十分な量であり得る。本発明のアルファボディーまたはポリペプチドを用いて治療されるべき被験体または患者は任意の温血動物であり得るが、特に、本発明のアルファボディーまたはポリペプチドが特異的に結合する目的の標的分子が関与する疾患および障害に罹患しているか、またはそれらのリスクがある哺乳動物、より具体的にはヒトである。本発明のアルファボディーおよびポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患または障害に応じて、それ自体が公知の任意の適切なインビトロアッセイ、細胞系アッセイ、インビボアッセイおよび/または動物モデル、またはそれらの任意の組み合わせを使用して試験され得る。適切なアッセイおよび動物モデルは、当業者に明らかであろう。関与する目的の標的分子に応じて、当業者であれば、一般に、適切なインビトロアッセイ、細胞アッセイまたは動物モデルを選択して、これらの目的の標的分子の活性、および/またはこれらが関与する生物学的機序に影響を与える能力について;ならびに目的の標的分子に関連する1つ以上の疾患および障害に関する治療効果および/または予防効果について、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを試験できるであろう。次に、以下の非限定的な実施例および図面によって、本発明をさらに説明する。実施例1.単鎖アルファボディーライブラリーの生成本実施例は、ファージ上に十分に提示されており、目的の標的タンパク質に結合する単鎖アルファボディー配列を得るのに潜在的に有用な単鎖アルファボディーライブラリーを取得できることを実証する。アノテーションされたアミノ酸配列とscAB013_L16という名称の参照アルファボディーの3-Dモデルとから、単鎖アルファボディーランダムライブラリーを設計した。この参照アルファボディーの簡略な3-Dモデルを図1に示す。さらに、scAB013_L16のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号:1として提供される。当該配列は、図2にさらに示され、通常のヘプタッドのコア位置も示される。アルファボディーの溝は、折り畳まれたアルファボディータンパク質の2個の空間的に隣接するα-ヘリックスによって形成される図1。このような溝は、細長い凹形状を特徴とする。アルファボディー1つあたり3個のα-ヘリックスがあるので、原則として、ランダム化し得る3個の溝の候補がある。前記3-Dモデルを調べて、ランダム化に最も適切な溝を最初に選択した。3-Dモデルで平行する第1のα-ヘリックスA-ヘリックスと第3のα-ヘリックスC-ヘリックスとの間の溝を選択することを決定した。次いで、このモデルをさらに調べて、各α-ヘリックスにおいてランダム化する多様化する、変化させるのに最も適切なアミノ酸残基位置を同定した。前記溝は、A-ヘリックスにおけるヘプタッドのc位およびg位ならびにC-ヘリックスにおけるヘプタッドのb位およびe位に位置する残基によって実際に形成されることが観察された。g位およびe位がこの溝に最もすなわち、最も直接的に寄与することが見出されたので、主要な溝の位置と表示される。c位およびb位は溝の中央から少し離れて位置するので、副次的な溝の位置と示す。これらの主要なおよび副次的な溝の位置に加えて、溝の底は、数個のコアaおよびd位によって形成される;具体的に、前記モデルは、特に、主要な溝の位置が小さいアミノ酸残基、例えば、グリシン、アラニンまたはセリンなどによって占められる場合、A-ヘリックスのコアd位およびC-ヘリックスのコアa位は、溝の形状にも寄与する可能性があることを示した。溝の形状に条件付きで寄与し得るこのようなコアa位およびd位は、本明細書において、溝のコア位置と表示される。図1は、scAB013_L16アルファボディーモデルのコイルドコイル部分内に、3個の主要なe位、およびさらに3個の主要なg位があることを示す。副次的な溝の位置に、4個のb位および4個のc位があることがさらにわかる。さらに、溝に潜在的に寄与し得る4個のコアd位および4個のコアe位がある。したがって、多様化されると溝の形状に影響を与え得る位置が合計22個ある。22個すべてを20個の天然アミノ酸残基に完全にランダム化する場合、これは、2022個または約4×1028個の異なる配列の配列スペースすなわち、可能な組み合わせの総数に対応する。明らかに、すべての異なる配列が物理的に存在する形態で、このような巨大なライブラリーを作製することはできないすなわち、このようなライブラリーは完全であることはできない。その結果として、想定されるライブラリーを完全またはほぼ完全にするのを目的とする場合、可変位置の数を大幅に減らすべきである。したがって、溝のコア位置はいずれも変化させないことを決定した。この決定は、コイルドコイルにおける突然変異コア位置に関連するリスクの回避によって動機づけられた:このような置換の多くは、各アルファボディー構築物の安定性および/または正確な折り畳みに有害であろう。さらに、2個の副次的な溝の位置も変化させないことを決定した。具体的には、A-ヘリックスにおける第1のc位およびC-ヘリックスにおける第1のb位は、一定に維持した。最後に、C-ヘリックスにおける第1の主要な溝のe位も同様に固定した。この結果、参照アルファボディーscAB013_L16のなかで、多様化する位置を11個選択した。したがって、このようなライブラリーの理論上の配列スペースは、完全にランダム化する場合、2011個または約2×1014個の異なる配列である。多様化する位置に加えて、参照アルファボディーscAB013_L16に対して、その他の2種類の改変を行なった。第1に、リジンからグルタミン酸への2個の変異、すなわち、ヘリックスAおよびCそれぞれにおける第2のヘプタッドのf位における1個の変異を導入した。第2に、アルギニンからアラニンへの2個の変異、すなわち、ヘリックスBおよびCそれぞれにおける第4のヘプタッドのc位における1個の変異を導入した。多様化対象の位置がxという記号によって示されるこの改変単鎖アルファボディーの配列を図3に示す。また、この配列は、配列番号:2として提供される。この設計に基づいて構築された単鎖アルファボディーライブラリーを以下scLib_AC11と称する。すべての多様化する位置は、アルファボディーの溝に位置するので、このライブラリーは、純粋な溝ライブラリーとも称する。第2の単鎖アルファボディーの純粋な溝ライブラリーは、scAB140_L14という名称のより小さなアルファボディー参照構築物の3-Dモデルから設計された。後者は、各α-ヘリックスにおける第3のヘプタッドが削除されており、グリシン/セリンリンカー配列が16残基から14残基に減らされており、N末端α-ヘリックスキャッピング残基が弱い負電荷の別のモチーフで置換されたscAB013_L16構築物に本質的に対応している。ライブラリーを設計する際に、これらの差異以外は、多様化対象の主要な、副次的なおよびコアの溝の位置に関してまったく同じものを選択した。ヘリックスそれぞれにおける1個のヘプタッド単位の欠失を考慮すると、このライブラリーは、7個の可変残基位置のみを含有する。したがって、完全なランダム化のための理論上の配列スペースは207個または約109個であり、これにより、実際に製造されるライブラリーがほぼ完全であることが保証されるはずである。scLib_AC7という名称のこの単鎖アルファボディーの溝ライブラリーの配列を図3に示す。また、この配列は、配列番号:3として提供される。実際のところ、scLib_AC11ライブラリーの改変である第3の単鎖アルファボディーの純粋な溝ライブラリーを設計した。scLib_AC11bという名称のこのライブラリーは、同じ11個の多様化される溝の残基位置を含有するが、N末端ヘリックスキャッピング領域内およびリンカー領域内において、いくつかの改変がなされた。第1に、α-ヘリックスのヘプタッド反復配列の前のメチオニンをグリシンに変異させた。これらの変異は、これらのメチオニンがヘリックスをキャッピングする役割を果たすこと、およびscLib_AC11ライブラリーの構築に使用した3-Dモデルがメチオニンが溝に位置すると示していることが理由である;溝におけるこのような位置は、溝を占有するリガンドに対する立体的な障害を形成し得るので、可能な限り最小でかつ構造的により柔軟性のある種類のアミノ酸残基、すなわち、グリシンでそれらを置換した。加えて、各ヘリックスのN末端部の負電荷を減少させ、それにより、このような負電荷から生じる潜在的な静電気的偏りを減少させるために、各α-ヘリックスの第1のヘプタッドにおけるc位のグルタミン酸をグルタミンに置換した。第3に、反復特性を低下させるために、リンカー断片におけるグリシンおよびセリンの配分を変化させた。scLib_AC11bライブラリーの配列を図4に示し、配列番号:4としても提供する。第4の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、単一のα-ヘリックス上の溶媒曝露領域を介して標的に結合するアルファボディーを生成する可能性を調査した。このような溶媒曝露α-ヘリックス領域は、細長い凸形状を特徴とする。換言すれば、この設計の目的は、配列多様性が単一のアルファボディーヘリックスの凸状の溶媒配向領域内に導入される溝ライブラリーであるscLib_AC11ライブラリーおよびscLib_AC7ライブラリーとは対照的にアルファボディーのヘリックスライブラリーを生成することであった。多様化対象の位置の選択を導くための鋳型構造として、scAB013_L16の3-Dモデルを再度使用した。多様化対象のものとして、この構造のC-ヘリックスを選択することを決定した。このモデルをさらに調べたところ、b位、c位およびf位は、細長い凸形状の近接するリムをともに形成することが示されている。このα-ヘリックスにおいて、識別可能な11個のこのような表面位置がある。原則として、いくつかの隣接するe位およびg位は近接する結合表面の形成を潜在的に支援し得ることが観察されたが、アルファボディーを不安定化させるリスクを考慮して、および可変位置の数が過度に急増するという理由で、このオプションを放棄した。したがって、当初は、C-ヘリックスにおける11個のb位、c位およびf位すべてについて多様化を検討したが、キャッピング機能を無効化しないため、および妥当な範囲内でライブラリーの完全性を維持するために、最終的には、2個のN末端グルタミン酸は変化させなかった。この結果、最終的には、ライブラリーにおける多様化対象の9個のb位、c位およびf位をもたらした。したがって、このライブラリーをscLib_C9と命名した。すべての多様化する残基位置は、単一のα-ヘリックスにおける完全に溶媒に曝露されている残基位置に位置するので、このライブラリーは、純粋なヘリックス表面ライブラリーの一例である。このライブラリーの配列を図3に示す。また、この配列は、配列番号:5として提供される。第5の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、溝のみに限定されない配列多様性を含有するアルファボディーライブラリーの可能性を調査した。このような純粋ではない溝ライブラリーを設計して、溝の外側にあるがこの溝領域のすぐ隣の多様化される残基位置も、特定の標的に結合するアルファボディーの発見に良い意味で寄与するか否かを調べた。この戦略は、多様化を溝の外側にこのように拡大することにより、細長い溝の形状とは異なる本質的な立体構造的形状を有する多様化される表面領域が生じるという事実によって動機づけられた。拡大された多様化される表面を含有するライブラリーに含まれるアルファボディーは、純粋な溝と最適に適合するエピトープとは異なる目的の標的分子上の形状相補的なエピトープ表面領域に潜在的に結合し得る。したがって、このような拡大されたライブラリーを設計して、それらが、様々な形状の標的分子およびその上の表面領域に対処するすなわち、それに対する結合剤を生成するのに本質的により適しているか否かを調べた。このようなライブラリーの具体的な設計は、scLib_AC11ライブラリーから、前記scAB013_L16アルファボディーモデルを再度使用して行なった。第1の改変は、リンカー断片の長さの減少を含む両リンカーとも8残基短くした。可変位置に関して、1個の副次的な溝の位置ヘリックスAの第4のヘプタッドにおけるc位はもはや多様化せずに、アラニンに固定した。ヘリックスCでは、scLib_AC11ライブラリーで多様化している溝の位置に加えて、溝ではない2個のf位を選択して多様化したこれらの溝ではない位置は、ヘリックスCの第2および第3の両ヘプタッドのf位にある。前記モデルは、12個の多様化する残基位置の新たな選択が、より凝縮されたパッチ様の可変表面をもたらすことが示された;この表面の本質的な形状は、純粋な溝ライブラリーの形状と比較して、あまり細長くも幅広でもなく、凹状の領域には、新たに選択されたf位によって主に形成された小さな凸状のサブ領域が付加されている。したがって、このライブラリーをscLib_AC12と命名した。このライブラリーの配列を図4に示し、配列番号:6としても提供する。第6の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、単一のヘリックス表面のみに限定されない配列多様性を含有するアルファボディーライブラリーの可能性を調査した。このような純粋ではないヘリックスライブラリーを設計して、ヘリックス表面の外側にあるがこのヘリックス表面領域のすぐ隣の多様化される残基位置も、特定の標的に結合するアルファボディーの発見に良い意味で寄与するか否かを調べた。先と同様に、この戦略は、多様化をヘリックス表面の外側にこのように拡大することにより、ヘリックス表面残基の細長いリムとは異なる本質的な立体構造的形状を有する多様化される表面領域が生じるという事実によって動機づけられた。このようなライブラリーに含まれるアルファボディーは、単一のヘリックスと最適に適合するエピトープとは異なる目的の標的分子上の形状相補的なエピトープに潜在的に結合し得る。したがって、このような拡大されたライブラリーを設計して、それらが、様々な形状の標的分子およびその上の表面領域に対処するのに本質的により適しているか否かを調べた。このようなライブラリーの具体的な設計は、scLib_C9ライブラリーから、前記scAB013_L16アルファボディーモデルを再度使用して行なった。第1の改変は、リンカー断片の選択を含み、scLib_AC11bライブラリーにおけるリンカー断片と同じように選択した。第2の改変は、ランダム化対象のヘリックスの選択を含んだ:ここでは、配列変異をscLib_C9のようにC-ヘリックスではなくB-ヘリックスに導入することを選択した。可変位置の実際の選択に関して、先に改変された位相的に同等の2個のヘリックス表面位置は一定に維持されたヘリックスBの第1および第2のヘプタッドにおけるf位およびb位は、それぞれリジンおよびアラニンに固定された。次いで、scLib_C9のC-ヘリックスで多様化しているヘリックス表面の位置に加えて、B-ヘリックスにおける溝のg位を2個選択して多様化したこれらの溝の位置は、ヘリックスBの第2および第3のヘプタッドの両方のg位にある。最終的には、前記モデルは、C-ヘリックスの位置C-ヘリックスの第1のヘプタッドにおけるg位が、その他の多様化される位置に直接的に隣接することを示唆したので、この位置も可変のままにした。つまり、前記モデルは、10個の多様化する残基位置の新たに選択が、より凝縮されたパッチ様の可変表面をもたらすことが示された;この表面の本質的な形状は、純粋なヘリックス表面ライブラリーの形状と比較して、あまり細長くも幅広でもなく、凸状の領域には、新たに選択した溝のg位によって主に形成された小さな凹状のサブ領域が付加されている。したがって、このライブラリーをscLib_B10と命名した。このライブラリーの配列を図4に示し、配列番号:7としても提供する。実際の単鎖アルファボディーライブラリーは、GeneartAGRegensburg,Germanyに発注した。pHEN由来ファージミドであるpCxlベクターを使用して、33一価ディスプレイ形式Smith,Gene128:1-21993を採用した。ライブラリーscLib_AC11、scLib_AC7およびscLib_C9は、108個の独自のクローンが最低保証された形質転換E.coliTG1細胞として供給された。ライブラリーscLib_AC11b、scLib_AC12およびscLib_B10は、109個の独自のクローンの最低保証付きで供給された。アルファボディー配列は、M13ファージのpIIIコートタンパク質と融合されていた。それらは、それらのC末端により、アンバーコドン遺伝子レベルでおよびHis6タグを含むリンカー配列を介してpIIIコートタンパク質に結合されていた。ペリプラズムへの融合アルファボディーの輸送は、N末端のPelBリーダー配列の存在によって保証された。ウェスタンブロッティングを使用してファージ上の提示レベルが調べられ、適切な高さであることが分かった。分析により、一般に、ファージの3分の1がアルファボディーを提示することが示された図5。実施例2.標的特異的なアルファボディーを生成するための本発明のアルファボディーライブラリーの使用上記アルファボディーライブラリーなどのアルファボディーライブラリーを使用して、ヒトIL-23用の結合剤を生成した。インターロイキン-23IL-23は、2個のサブユニット、すなわちそれぞれがβ鎖によって形成される3個のドメインからなるp40と、4個のヘリックスの束状組織を有する別のp19とからなるヘテロ二量体サイトカインである。p40サブユニットは、IL-12にも見られる。したがって、IL-23に対して特異的なアルファボディーを得るために、バイオパニングのプロトコールをわずかに調整して、P19サブユニットに結合するアルファボディーをさらに選択した。ライブラリー実施例1に記載したように入手したファージライブラリーscLib_AC12およびscLib_B10を使用した。これらのファージライブラリーは、ウイルスのpIIIタンパク質を有する融合タンパク質としてランダム化アルファボディー配列を提示した。scLibB10は、ヘリックスライブラリーであるが、scLibAC12は溝ライブラリーである。ライブラリーの定義を図7に示す。ファージライブラリーのレスキューライブラリーストックの接種材料それぞれ0.608mlおよび1.157mlを、0.1mg/mlのアンピシリンと2のグルコースとを補充した2×TY2×TY-AGからなる計算容量それぞれ933mlおよび1466mlの成長培地に移した。OD600nmが0.5対数増殖期中期mid-logphaseに達するまで細菌培養液を、バッフルフラスコ中で振盪300rpmさせながら37°Cで生育させた。細菌培養液を、ヘルパーファージM13K07GEHealthcareで重複感染させるのに使用して、ファージ粒子を製造した。重複感染に適用したヘルパーファージ/細菌の比は、20:1であった。感染培養液を、振盪せずに37°Cで30分間インキュベーションして、細菌を感染させた。インキュベーション後、感染培養液のサンプルを2×TY-AG寒天プレートおよび2×TY-AGKKは、カナマイシン25マイクログラム/mlを意味する。ヘルパーファージは、カナマイシン耐性であるため寒天プレートで力価測定して、生菌数および感染細菌数をそれぞれ測定した。次いで、感染培養液を、振盪しながら37°Cでさらに30分間インキュベーションした。インキュベーション後、培養液を室温、4000rpmで10分間の遠心分離によって、細菌細胞ペレットを得た。細菌ペレットを、最初の開始容量と同容量の予め加温した2×TY-AK培地に再懸濁した。培養液を、振盪300rmpしながら30°Cで一晩生育させた。一晩のインキュベーション後、培養液のサンプルを、2×TY-AGK寒天プレートで力価測定して、生細胞を測定した。培養液を氷上で5分間冷却し、細菌を7000rpmで20分間ペレット化した。5分の1の容量の20PEG4000/2.5MのNaClの溶液を添加することによって上清を回収して、ファージを沈殿させ、氷上で1~2時間インキュベーションした。インキュベーション後、4°C、7000rpmで20分間の遠心分離によって、ファージを回収した。ファージペレットを35mlのリン酸緩衝生理食塩水PBS/900mlの細菌培養液に溶解させ、12000rpmで10分間の遠心分離によって、細菌のデブリスを除去した。2回目のPEG/NaCl沈殿を1時間実施し、その後に細菌のデブリスを除去した。最終的に、ライブラリーに対応する精製ファージを得た10ml/最初の細菌培養液900ml。15のグリセロールをファージに添加して、-80°Cで保存した。ライブラリーに対応するファージ調製物の力価は、精製ファージの段階希釈物で細菌E.coliTG1株を感染させ、これらの希釈物を2×TY-AG寒天プレート上にプレートすることによって測定した。この力価測定により、感染ファージ粒子コロニー形成単位cfuまたは形質導入単位TUの数を測定できた。ライブラリーは、形質転換E.coliER2738細菌として提供されたが、さらなるファージの繁殖はすべて、ファージディスプレイ技術に使用される一般的な株であるE.coliTG1株Stratageneを使用して実施した。アルファボディーの発現は、野生型pIIIタンパク質およびアルファボディー融合pIIIタンパク質の存在を決定するための抗pIII抗体を使用して、ウエスタンブロット分析で評価した。融合pIIIタンパク質の分子量は、野生型pIIIタンパク質よりも大きいので、SDS-PAGEゲル中ではより遅く移動するであろう。融合タンパク質が存在する場合、抗pIII抗体を使用して、2個のバンドが可視化されるはずである。この特定の実施例の回収したライブラリーの力価を表1に示す。ライブラリーscLib013APL8_AC12、scLib013APL16_B10の場合、ライブラリーのサイズの14倍および8倍の力価がそれぞれ得られた。ウエスタンブロット分析により、すべてのライブラリーについて、アルファボディー-融合pIIIタンパク質が存在することが示された図6。2個のバンドが可視化された。下方のバンドは、野生型pIIIに対応し、より高分子量の上方のバンドは融合pIIIタンパク質に対応する図6。結論としては、ライブラリーの回収は成功した。開始ライブラリーのサイズの10倍超の力価が得られ、ウエスタンブロットによれば、すべてのライブラリーが融合pIIIタンパク質を提示した。バイオパニングのプロトコール可溶性バイオパニングのプロトコールを使用した。サイトカインIL-23のサブユニットp40を認識するビオチン化抗p40IL-23抗体Biolegend,508802,cloneC8.6を使用して、ファージライブラリーと相互作用させた後に、標的IL-23の捕捉を実施した。ライブラリーとともにインキュベーションする前に、サイトカインIL-23eBioscience,34-8239-85,lotE034049を抗p40抗体とともにインキュベーションした。この戦略は、p40ユニットを抗体でブロッキングすることによって、IL-23のp19サブユニットの結合剤に対する選択を促進するために開発した。次いで、この特定の抗体をまた使用して、洗浄目的のためにIL-23を固体支持体上に固定化した。具体的には、PBSリン酸緩衝生理食塩水、pH7.2緩衝液に溶解させた0.1BSA中で、可変濃度のIL-23を、2倍濃度のビオチン化抗IL-23p40抗体で1時間インキュベーションした。選択ストリンジェンシーを調節して、より標的特異的なファージを得るために、IL-23の濃度を、選択ラウンドの関数として変化させた。それぞれ200nM、100nM、50nM、25nMおよび12.5nMのIL-23を使用して、5ラウンドを実施した。対照的に、インプットファージ、すなわち、各選択ラウンドで標的に添加するファージの濃度を一定に保った。IL-23に結合するために抗p40抗体を使用したので、IgG-Fc結合剤の選択を防ぐために、2回目のラウンドから、20マイクロモルの全IgGSanguin,TheNetherlandsをIL-23/抗p40抗体/ファージ混合物に添加した。前記ファージを標的抗p40IL-23とともに室温で1時間インキュベーションし、その後、0.1mlのストレプトアビジンをコーティングした磁気DynabeadsDynabeadsM280Streptavidin,Invitrogen上に30分間捕捉した。使用前に、製造業者が推奨するように磁気ビーズを洗浄し、回転ホイール上で、PBSに溶解させた0.1BSAを用いて室温で1時間ブロッキングした。捕捉後、次いで、磁気ビーズを、0.1のTween20を含む1mlのPBSで10回洗浄して、非特異的なファージを排除した。バイオパニングの分野の当業者に公知であるように、磁気ビーズは、磁石を使用して容易に洗浄できる。0.2mlのグリシン-HCl緩衝液pH2を使用して、標的特異的なファージをビーズから5分間かけて溶出し、その後に0.05mlのTris緩衝液pH8で中性にした。対数増殖期中期の細菌を磁気ビーズに直接的に添加することによって、追加の画分を回収した。対数増殖期中期OD600nm=0.5まで生育させたE.coliTG1細菌の感染による力価測定のために、溶出させたファージのサンプルを使用して、溶出したファージの10倍希釈物1E-1~1E-4を2×TYで調製した。また、各選択ラウンドでインプットとして使用したファージの小サンプルから、同じ希釈物1E-7~1E-9を調製した。これらの力価測定結果により、上記式を使用して選択ラウンドの収量を計算できるであろう。本実施例では、0.9mlの細菌を0.1mlのファージ希釈物に添加して、37°Cで30分間インキュベーションした。コロニー計算および力価測定のために、0.1mlの感染培養液を2×TY-AG寒天プレート上にプレートする。溶出したファージを使用して、20mlの対数増殖期中期mid-logphageのE.coliTG1細菌に37°Cで30分間感染させた。インキュベーション後、4000rpmで10分間の遠心分離によって、細菌ペレットを得た。ペレットを2mlの2×TYに再懸濁し、2個の大きな2×TY-AG寒天プレート25X25cm上にプレートした。0.25ml容量の対数増殖期中期の細菌を磁気ビーズ上に直接的に添加し、37°Cで30分間インキュベーションした。前述のように、サンプルを力価測定した。感染培養液を2個の大きな2×TY-AG寒天プレート上にプレートした。翌日、各プレート上のコロニーを計算し、収量計算のために、インプットファージおよびアウトプットファージの力価を測定した。大量の感染培養液に対応する大きな寒天プレート上の細菌を、LBを使用してプレートから擦り取り、OD600nmで測定することによって細菌数を測定し、15グリセロールを添加して、-80°Cで保存した。前述のように、これらのグリセロールストックからファージを回収して、連続選択ラウンドのための精製ファージを得た。1E12ファージを次の選択ラウンドに用いた。IL-23に対するプールした個々のライブラリーを用いて5回の選択ラウンドで得られた力価を表2に示す。AC12ライブラリーを用いるバイオパニングの場合、4回の選択ラウンドの後に、最高収量が得られた表2。B10ライブラリーを用いるバイオパニングでは、5回のラウンドの後に、最高収量が得られた表2。バイオパニングキャンペーンにより、アウトプット力価が48~100倍増加したので、濃縮が観察された。異なる選択ラウンドから標的陽性クローンを単離するために、およびバイオパニングの有効性をさらに決定するために、ELISAアッセイによるスクリーニングを実施した。このアッセイでは、小容量の細菌培養液からの上清を試験した。これらの細菌培養液は、異なる選択ラウンドの力価測定プレートからランダムに選択された個々のクローン=個々のファージに対応する。これらの細菌クローンは、0.12mlの2×TY-AG入りの96ディープウェルプレートにおいて、振盪180rpmしながら30°Cで一晩生育させたマスタープレート。翌日、0.002mlのこのプレートを使用して、グルコースを含まない0.1ml/ウェルの2×TY-Aを接種し、M13K07ヘルパーファージをすぐに添加した2×1092x109プラーク形成単位/0.02μl/ウェル。振盪180rpmしながら37°Cで2.5時間インキュベーションした後、0.030mlの2×TY-AKアンピシリンAmp:0.1mg/mlおよびカナマイシンKan:0.05mg/mlを培養液に添加し、ファージを繁殖させるために、振盪180rpmしながら30°Cでさらに一晩インキュベーションした。マスタープレートについて、-80°Cでの保存のために、0.020mlの80グリセロールを添加した。個々の陽性クローンの標的相互作用をさらに特性決定するために、マスタープレートは、個々の陽性クローンを生育させ、続いてファージを精製するのに役立つ。本実施例では、4回のバイオパニングキャンペーンの選択ラウンドあたり44個のクローンをスクリーニングした。1回目の選択ラウンドから標的特異的なクローンを単離する期待は低いので、1回目の選択ラウンドからはクローンをスクリーニングしなかった。ELISAの準備は以下のようにした。ニュートラアビジンを室温RT、0.010mg/mlPBS0.100ml中の濃度でプレート上に1時間固定化した。プレートを、0.05Tween20含有PBSPBSTで5分間かけて5回洗浄した。続いて、0.1mlのビオチン化抗p40抗体100nMを、0.1BSA含有PBS入りのプレートに添加し、4°Cで一晩または室温で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートをPBSTで5回洗浄し、0.1BSAおよび0.5ゼラチン0.120ml/ウェル含有PBSを用いて、室温で少なくとも1時間または4°Cで一晩ブロッキングした。PBSTで5回洗浄した後、100nMのIL-23を0.1mlのPBS、0.1BSAに添加した=標的。個々の陰性対照については、IL-23を添加しなかった=バックグラウンド。一方、細菌プレートを1700rpmで10分間遠心分離して、細菌をペレット化した。IL-23を固定化したプレートをPBSTで5回洗浄し、ファージを含有する0.050mlの細菌培養上清とともに、0.050mlの0.2BSA含有PBSをプレートに添加した。プレートを、振盪しながら室温で1~1.5時間インキュベーションした。プレートを振盪することにより、ELISAのシグナルを増幅した。インキュベーション後、プレートをPBSTで5回洗浄し、0.1BSA0.1ml/ウェル含有2PBSで1:5000に希釈したHRP標識抗M13抗体とともに、振盪しながら室温で40分間インキュベーションした。プレートを5回洗浄し、TMBHRPの基質溶液0.1ml/ウェルを添加し、プレートを暗所で5~30分間インキュベーションした。0.05mlの2N硫酸H2SO4を各ウェルに添加することによって反応を停止させ、プレートを450nmで読み取った。陽性クローンの同定標的上のシグナルがバックグラウンドの少なくとも3倍超であった場合、クローンを陽性であるとみなした。AC12のバイオパニングキャンペーンは、ELISAにより測定した陽性クローンのパーセンテージと、選択ラウンドの増加との間に正の相関関係をもたらした。ライブラリーB10のパフォーマンスはあまり十分ではなく、このライブラリーからは、少数の陽性クローンしか回収されなかった。AC12ライブラリーの場合、陽性クローンの90超が4回の選択ラウンド後に得られた。また、ELISAは、ファージ上に提示されたアルファボディーの代わりに可溶性アルファボディーを使用して実施することができる。可溶性アルファボディーの製造は、グルコースを含まない条件を使用することによるlacZプロモーターの異化抑制、および細菌ゲノム上のlaclqリプレッサーを不活性化することによるイソプロピルチオ-β-ガラクトシダーゼIPTGの転写誘導に基づくものである。アルファボディーをコードする遺伝子が転写され、可溶性アルファボディーが製造される。選択ラウンドの滴定プレートから細菌コロニーをランダムに選択して、0.12mlの2×TY-AG入りの96ウェルプレートにおいて、振盪180rpmしながら30°Cで一晩生育させる。翌日、0.002mlのこのプレートを使用して、0.1ml/ウェルの0.1グルコース含有2×TY-Aを接種し、OD600nmが0.9になるまで約2~3時間、37°Cでさらに生育させる。次いで、0.03mlの3.3mMIPTG含有2×TY-Aを培養液に添加し、振盪180rpmしながら30°Cでさらに16~18時間インキュベーションする。IPTGで発現を誘導した後、新たに調製した0.014mlのB-perPierceをウェルごとに添加し、混合しながら室温で15分間インキュベーションする。次いで、上清をELISAアッセイに使用する。配列決定AC12バイオパニングからのIL-23に結合するすべての陽性クローン異なるバイオパニングラウンドから選択されたものについて、アルファボディーの配列を決定した。これらの配列は、サンガー配列決定法およびM13RSシークエンシングプライマーを使用して、VIBGeneticServiceFacility,UniversityofAntwerpBelgiumの標準的なDNA配列決定サービスによって決定された。表3図8は、IL-23に対するAC12ライブラリーから得られた77個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。また、これらのアルファボディーは、上記のように可溶性アルファボディーすなわち、ファージフォーマットの外側で容易に製造され、続いて、タンパク質精製の分野の当業者に公知の標準的なNi-NTA/SEC法によって精製され得る。通常、可溶性アルファボディーは、アルファボディーのC末端部アルファボディーライブラリーフォーマットAC12、B10の場合に、または所定のアルファボディー遺伝子がそのファージコンテクストから標準的な分子生物学技術によって切り出され、適切な発現ベクター例えば、hisタグおよびプロテアーゼ切断部位がアルファボディー遺伝子の前にあるpET16などに挿入される再クローニングステップの結果としてN末端にHisタグを含むので、Ni-NTA精製は、簡単な最初の精製ステップである。IL-23への結合のKd解離定数を決定するために、可溶性アルファボディーを動態Biacore分析もしくはFriguet間接ELISA分析Friguetetal.,1985、または結合力測定の分野の当業者に公知の別の適切な方法に供する。マウスIL-23との交差反応性マウスIL-23との交差反応性は、ヒトIL-23戦略と同様に、マウス抗p40抗体によってマウスIL-23を捕捉するELISA分析を使用して研究した。ELISA分析は前述のように実施し、標的上のシグナルがバックグラウンドのシグナルの少なくとも2.5倍超であった場合、クローンを陽性であるとみなした。AC12ライブラリーから得られたIL-23陽性クローンについて、分析されたクローンの26は、マウスIL-23と交差反応性であることが観察されたT/B>2.5。IL-12との交差反応性また、127個の異なるクローンのドメイン特異性も、ヒトIL-12で試験された。IL-23について記載されたように、ELISAを実施した。ヒトIL-12を抗ヒトp40抗体によってプレート上に捕捉し、前述のようにELISAを実施した。ELISAの結果により、クローンは、それぞれAC12ライブラリーからは5個/76個およびB10ライブラリーからは0個がヒトIL-12と交差反応性であることが示された。AC12ライブラリーについては、5個のヒトIL-12陽性クローンのうちの4個は、マウスIL-23とも交差反応した。"