"図6に規定したアミノ酸配列に対して少なくとも約95のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼであって、His-29の位置にアミノ酸置換を含み、イミダゾールの非存在時には酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在時には活性化可能である、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。アミノ酸置換がHis29からAla29への置換である、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。検出可能なシグナルを提供する部分を含む、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。検出可能なシグナルを提供する部分が、フルオロフォア、量子ドット、エンドリボヌクレアーゼ以外の酵素、またはナノ粒子である、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。不溶性支持体上に固定化されている、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。不溶性支持体がビーズである、請求項5に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。ヌクレオチド配列5’-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3’配列ID番号:1を含むRNA基質に結合する、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ。請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項9に記載の組換え発現ベクター。プロモーターが誘導プロモーターである、請求項10に記載の組換え発現ベクター。請求項9に記載の組換え発現ベクターを含む、invitroで遺伝子修飾された宿主細胞。核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的RNAを精製するためのキットであり、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼを含むキット。5’から3’の順番で、操作可能な結合で:a請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるRNA基質をコードするヌクレオチド配列;b標的RNAをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイトを含む組換え発現ベクターをさらに含む、請求項13に記載のキット。RNA基質をコードするヌクレオチド配列がプロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項14に記載のキット。プロモーターが誘導プロモーターである、請求項15に記載のキット。RNA基質がヌクレオチド配列5’-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3’配列ID番号:1を含む、請求項14に記載のキット。組換え発現ベクターが、多重クローニングサイトに挿入された、標的RNAをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項14に記載のキット。さらにイミダゾールを含む、請求項13に記載のキット。1つまたは複数の洗浄緩衝剤をさらに含む、請求項13に記載のキット。ポジティブコントロール発現ベクターをさらに含む、請求項13に記載のキット。変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼが不溶性支持体上に固定化されている、請求項13に記載のキット。核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的RNAを単離する方法であって、a核酸の混合ポピュレーションを、請求項1に記載の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼに接触させ、タグ付けされた標的RNA-固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ複合体を形成すること、ここで、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは不溶性支持体上に固定化されていて、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含む、タグ付けされた標的RNAを含んでおり、前記接触はイミダゾールを含まない結合溶液中で実行される;b結合溶液に最終濃度が約100mMから約500mMになるようにイミダゾールを添加し、それにより、固定化した変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化する再活性化溶液を形成し、再活性化され、固定化された変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによりタグから標的RNAを開裂すること;およびc放出された標的RNAを回収することを含む方法。ステップaの後で、かつステップbの前に実行される洗浄ステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。標的RNAに結合するポリペプチドを単離する方法であって、a固定化された複合体を標的RNAに結合するポリペプチドを含む溶液に接触させること、ここで、前記固定化された複合体は、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼと、当該変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼが特異的に結合する認識ヌクレオチド配列を含むタグ付けされた標的RNAとを含み、前記接触によってポリペプチドが標的RNAに結合し、前記接触がイミダゾールを含まない結合溶液で実施されるものとする;およびb結合したポリペプチドを溶出することを含む方法。真核細胞における標的RNAの産生を調節する方法であって、遺伝子修飾された宿主細胞と誘導プロモーターを活性化する薬剤とを接触させることを含み、ここで、前記遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおける配列特異的な開裂部位での開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子修飾されており、前記酵素をコードするヌクレオチド配列は誘導プロモーターに操作可能な形で結合されており、誘導プロモーターの活性化により、酵素が細胞内で産生され、前記標的RNAが前駆体RNAから開裂される、方法。標的RNAの種類が調節RNAである、請求項26に記載の方法。前駆体RNAからの前記標的RNAの開裂により、前駆体RNAが不活性化される、請求項26に記載の方法。標的ポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する方法であって、aオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの二本鎖形成に有利な条件下において、標的ポリリボヌクレオチドを、前記特定配列を含むオリゴヌクレオチドプローブおよび酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼに接触させること、ただし、ここで前記二本鎖はCsy4エンドリボヌクレアーゼにより開裂される;およびbオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること、ただし、ここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出が、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定配列が存在することを表す;を含む方法。オリゴヌクレオチドプローブがペプチドに結合され、前記ペプチドがCsy4エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂時に放出され、検出ステップが放出されたペプチドの検出を含む、請求項29に記載の方法。放出されたペプチドがそのペプチドに対して特異的な抗体への結合によって検出される、請求項29に記載の方法。抗体が固定化されている、請求項31に記載の方法。標的ポリリボヌクレオチドが固体支持体上に固定化されている、請求項29に記載の方法。標的ポリリボヌクレオチドが病原体のポリリボヌクレオチドである、請求項29に記載の方法。酵素的に活性なCsy4エンドリボヌクレアーゼが、図5に示されるCsy4アミノ酸配列のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。定義本明細書で用いられる場合、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドの重合形態を指し、RNA、RNAを含有するデオキシリボヌクレオチド、DNAを含有するリボヌクレオチドを含む。ポリリボヌクレオチドは、場合によっては、1つまたは複数の修飾ヌクレオチド例えば、デオキシノシン、デオキシウリジンまたはヒドロキシメチルデオキシウリジンを含む。場合によっては、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドのみから成るすなわち、デオキシリボヌクレオチドを含まない。場合によっては、ポリリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよび1つまたは複数の修飾リボヌクレオチドを含むが、デオキシリボヌクレオチドは含まない。その他の場合には、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドを含み、1つまたは複数の修飾リボヌクレオチドおよび1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド修飾デオキシリボヌクレオチドも含むを含んでもよい。場合によっては、ポリリボヌクレオチドが1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含むとき、そのポリリボヌクレオチドにおいて、デオキシリボヌクレオチドは全部で約50から約40、約40から約30、約30から約20、約20から約10、約10から約1または1未満のヌクレオチドを含む。核酸およびポリヌクレオチドという用語は同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体である任意長のヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、線形または環状の核酸、メッセンジャーRNAmRNA、cDNA、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブおよびプライマーが挙げられる。生物学的試料は細胞、細胞外物質、組織または多細胞生物から得た多種多様な試料タイプを包含する。この定義は、生体起源の血液およびその他の液体試料、生検標本もしくは組織培地またはこれらに由来する細胞などの固体組織試料およびこれらの子孫を含有する。この定義は、調達後、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮などにより、何らかの方法で操作された試料も含む。生物学的試料という用語は臨床試料を包含し、さらに、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液例えば、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、尿、血液、血液分画例えば、血漿;血清、痰などおよび組織試料も含む。場合によっては、生物学的試料は細胞を包含する。その他の場合は、生物学的試料は細胞を含まない。操作可能な形で結合されたという用語は、所望の機能を提供するための分子間の機能的結合を指す。例えば、核酸の文脈での操作可能な形で結合されたは、転写、翻訳などの所望の機能を提供するための核酸間の機能的結合、例えば、核酸発現制御配列例えば、プロモーター、シグナル配列または転写因子結合部位のアレイと第2のポリヌクレオチドとの機能的結合を指し、ここでこの発現制御配列は、第2のポリニクレオチドの転写および/または翻訳に影響を与える。ポリペプチドの文脈での操作可能な形で結合されたは、ポリペプチドの所望の活性を提供するための例えば、異なる領域のアミノ酸配列間の機能的結合を指す。単離されたは、タンパク質または核酸が天然に発生したものである場合、天然で発生し得る環境から異なる環境にあるタンパク質または核酸を指す。単離されたは、関心対象のタンパク質または核酸について実質的に濃縮されているおよび/または関心対象のタンパク質または核酸が部分的にまたは実質的に精製されている試料中のタンパク質または核酸を含むものとする。タンパク質または核酸が天然に生じたものでない場合、単離されたはタンパク質または核酸が合成または組換え手法のいずれかによって作成された環境から分離されたことを意味する。実質的に純粋なは、ある物質entity例えば、ポリペプチドまたは核酸が組成物の全含有量例えば、組成物中の全タンパク質量の約50より多く、一般的には、合計タンパク質含有量の約60より多くを占めることを意味する。一部の実施形態においては、実質的に純粋なは、組成物全体の少なくとも75、少なくとも85、少なくとも90またはそれ以上が関心対象物質である組成物を指す例えば、全タンパク質の95。一部の実施形態においては、関心対象のタンパク質または核酸が組成物中の全タンパク質または確信に占める割合は、約90を超える、約95を超える、約98を超えるまたは約99を超える。本発明をさらに記述する前に、本発明は、記述される特定の実施形態に限定されず、したがって当然ながら変化してもよいことが理解されるべきである。さらに、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定を意図するものでなないことも理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。ある範囲の値が示されている場合、各々の間に存在する値は、文脈が明確に他を示すのでない限り下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限と下限との間、そしてその言及される範囲における任意の他の言及される値または間に存在する値が本発明に包含されることが理解される。これらのさらに小さい範囲の上限および下限は、独立して、さらに小さい範囲に含まれてもよく、そしてまた、言及される範囲における任意の特に包含される限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。言及される範囲がその限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。特に他に定義されているのでない限り、本明細書で用いられる技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する分野の専門家により共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な任意の方法および材料も本発明の実践または試験に使用することが可能であるが、好ましい方法および材料がここでは記述されている。本明細書で言及される刊行物はすべて、その刊行物が引用されている内容に関連する方法および/または材料を開示および記述する目的で、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書および添付された特許請求の範囲内で使用される際には、単数形a、an、およびtheは、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の指示対象も包含することに注意すべきである。それゆえ、例えば、部位特異的エンドリボヌクレアーゼと言及されている場合には、複数のそのような部位特異的エンドリボヌクレアーゼも包含し、標的ポリリボヌクレオチドと言及されている場合には、1つまたは複数の標的ポリリボヌクレオチドおよび当業者に既知のこれらの相当品なども包含する。特許請求の範囲は任意の要素をすべて除外するように起草されている可能性もあることにさらに注意すべきである。したがって、この声明は、のみだけなどの排他的な用語を請求要素の列挙と関連して使用する場合、または否定的な制約を使用する場合の先の記載としての役割を果たすことを意図している。本明細書で論じられる文献は、本発明の出願日に先立つ、それらの開示に関してのみ示される。本明細書のいかなる記述も、先行発明という理由で、かかる文献よりも本発明が先行しているとする権利はないことの容認であるとはみなすべきでない。さらに、示されている文献の日付は実際の発行日付とは異なる可能性もあり、独立して確認する必要があり得る。詳細な説明本開示は、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードする核酸およびその核酸によって遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、多種多様な用途に使い道があり、それらについても提供される。本開示は、さらに標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出する方法;および真核細胞における標的RNAの産生を調節するための方法も提供する。標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出方法本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおいて配列を検出する方法を提供する。本方法は、ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列の存在を検出する目的に有用であり、したがって、特定の配列を含むポリリボヌクレオチドを検出する目的に利用することができる。例えば、本方法は、試料中例えば、生物学的試料中の病原体のポリリボヌクレオチドの有無を検出する目的に利用することができる。主題方法は、標的ポリリボヌクレオチドのコピーをわずか100、最小は1つまで検出することができる。したがって、例えば、主題方法は試料中例えば、単一の細胞中、単一の胚中またはその他の生物学的試料にある標的ポリリボヌクレオチドの1から約5、約5から約10、約10から約50、約50から約100または100を超える数のコピーを検出することができる。したがって主題方法は多種多様な法医学的、研究および診断の用途に有用である。一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出する主題方法は、aオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成に有利な条件下で、標的ポリリボヌクレオチドを特定の配列および酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼを含むオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、二本鎖がCsy4エンドリボヌクレアーゼによって開裂されるようにすること;およびbオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出することここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出は、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列が存在することを表すを含む。場合によってはオリゴヌクレオチドプローブはペプチドに結合され、結合されたペプチドはCsy4エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂と同時に放出される;このような場合、検出ステップは放出されたペプチドの検出を伴う。例えば、放出されたペプチドは、そのペプチドに対して特異的な抗体に結合し、例えば、その抗体が固定化することにより検出される。一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドは固体支持体上に固定化される。標的ポリリボヌクレオチドには、多種多様なポリヌクレオチドのいずれもが含まれ、例えば、標的ポリリボヌクレオチドは病原体のポリリボヌクレオチドとすることができる。上述のとおり、一部の実施形態においては、抗体または標的ポリヌクレオチドは固体支持体不溶性支持体上に固定化される。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は多種多様な物質ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含むことができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供され得る。一部の実施形態において、本方法は、一般に、a標的ポリリボヌクレオチドを配列特異的なエンドリボヌクレアーゼに接触させること;およびb標的ポリリボヌクレオチドの部位特異的開裂により産生された開裂フラグメントを検出することここでポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列での開裂時に予期される開裂フラグメントの産生は、特定の配列が存在することを意味するを含む。他の実施形態において、標的ポリリボヌクレオチドにおけるある配列を検出する主題方法は以下を伴う:a標的ポリリボヌクレオチドをi配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ;およびii結合された検出部分を含むオリゴヌクレオチドプローブに接触させることただし、該オリゴヌクレオチドプローブは特定の既知のヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブに存在する既知のヌクレオチド配列を標的ポリリボヌクレオチド内の相補配列に結合させることに基づき、オリゴヌクレオチドプローブは標的ポリリボヌクレオチド内の相補配列との間に二本鎖を形成し、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは配列に特異的な形でその二本鎖を開裂し、それにより、オリゴヌクレオチドプローブから検出部分を放出させるおよびb検出部分の放出は特定配列の存在を意味する状況において、放出された検出部分を検出すること。一部の実施形態においては、各々が異なる特定の既知のヌクレオチド配列を含む、2つまたはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブが使用される。一部の実施形態において、検出部分はポリペプチドである。該ポリペプチドは免疫アッセイ例えば、酵素免疫測定法ELISA;放射免疫測定RIA;などを使用して、ポリペプチド検出部分に特異的な抗体を使用することで、検出することができる。ポリペプチド検出部分に特異的な抗体は、検出可能な標識を含むことができる。免疫アッセイは、テストストリップ例えば、側方流動測定においてまたはマルチウェルプレートなどのその他の適切な媒体上で実施することができる。一部の実施形態においては、検出部分は蛍光タンパク質であり、適切な蛍光タンパク質は本明細書の記述に従う。他の実施形態においては、検出部分はルシフェリンまたはその他の発光酵素物質である。適切なルシフェリンまたはその他の発酵酵素物質としては、例えば、ルシフェリン例えば、蛍ルシフェリン;アミノルシフェリン;セレンテラジン;米国特許第7,537,912号に記載の修飾セレンテラジン;米国特許公開第2009/0081129号に記載のセレンテラジン類似体例えば、米国特許公開第2009/0081129号に記載の膜透過セレンテラジン類似体、例えば、米国特許公開第2009/0081129号の構造体II、III、IV、VおよびVIのどれか;アミノルシフェリン;デヒドロルシフェリン;ルシフェリン6’メチルエーテル;またはルシフェリン6’クロロエチルエーテルが挙げられる。例えば、Branchini,B.R.ら,Anal.Biochem.2010,396,290-296;およびMezzanotte.L.ら,Invivobioluminescenceimagingofmurinxenograftcancermodelswithared-shiftedthermostableluciferase.Mol.ImagingBiol.2009年11月9日、オンライン;PubMedID:19937390を参照されたい。主題の検出方法の非制限的な例を、図7に模式的に示してある。図7に示した例では、標的ポリヌクレオチドの不連続領域例えば、ウイルスRNAを結合する小オリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと接触させるが、ここで該オリゴヌクレオチドには検出可能部分例えば、リガンド、ペプチドなどが含まれている。オリゴヌクレオチド/ウイルスRNAの二本鎖を標的とする酵素的に活性で配列特異的制限エンドヌクリアーゼRREが添加される。酵素はオリゴヌクレオチド/ウイルスRNAの二本鎖を開裂し、リガンドが検出のために放出される。酵素はさらに二本鎖を開裂し、それによりシグナルを増幅する。放出されたリガンドは、側方流動、例えば、テストストリップまたは免疫学的測定例えば、ELISAを使って検出される。適切な配列特異的なエンドリボヌクレアーゼは、酵素的に活性な配列特異的なエンドリボヌクレアーゼである。主題の検出方法において使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合および開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含有し、図4に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。主題の検出方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図5に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。図5に、多種多様なエンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される配列を示す。場合によっては、適切な酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼは、図5に示されているCsy4アミノ酸配列のアミノ酸配列を含むことができる。主題の検出方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、1から20すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のアミノ酸置換および/または挿入および/または欠失により、図4または図5のいずれか1つにより規定されたアミノ酸配列から異なるエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、試料中、例えば、血液、血液製剤例えば、血漿、尿、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、唾液、組織、細胞など生物学的試料中に存在することができる。標的ポリリボヌクレオチドは単離または精製することができる。標的ポリリボヌクレオチドは、メッセンジャーRNAmRNA、ウイルスRNA、またはその他のRNA種とすることができる。ウイルスRNAとしては、以下に限定されないが、例えば、C型肝炎ウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルスなど;レトロウイルス科に属す任意のメンバー;免疫不全ウイルス例えば、ヒト免疫不全ウイルス;など、フラビウイルス科の任意のメンバーが挙げられる。検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、多細胞生物の細胞に存在することができるまたは多細胞生物の細胞から得ることができる。検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、以下に限定されないが、任意の6つの界、例えば、細菌例えば、真正細菌;古細菌;原生動物;真菌;植物界;および動物界の細胞または生物体が挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、以下に限定されないが、藻類例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、藍藻を含む、原生動物界の植物様のメンバー;原生動物の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌類など;原生動物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫例えば、ユーグレナ属Euglena、アメーバ類例えば、アメーバ、胞子虫類例えば、アピーコンプレクサApicomplexa、ミクソゾアMyxozoa、微胞子虫Microsporidia、および繊毛虫例えば、ゾウリムシ属Parameciumが挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、真菌界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが任意の門のメンバー:担子菌門Basidiomycotaホウキタケ;例えば、ハラタケ属Agaricus、テングタケ属Amanita、ヤドリタケ属Boletus、カンテレラスCantherellusなど;子嚢菌門Ascomycota子嚢菌、例えば、酵母属菌を含む;ミコフィコフィタMycophycophyta地衣類;接合菌門Zygomycota接合真菌類;および不完全菌門Deuteromycotaが挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、植物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、任意の以下の門のメンバーが挙げられる:コケ植物門Bryophyta例えば、コケ類、ツノゴケ門Anthocerotophyta例えば、マツモ類、ヘパティコフィタHepaticophyta例えば、ゼニゴケ類、リコフィタLycophyta例えば、ヒカゲノカズラ類、スフェノフィタSphenophyta例えば、トクサ類、プシロフィタPsilophyta例えば、マツバランwhiskferns、シダ植物門Ophioglossophyta、シダ門Pterophyta例えば、シダ、ソテツ植物CYCadophyta、イチョウ門Gingkophyta、マツ植物門Pinophyta、マオウ門Gnetophytaおよび被子植物門Magnoliophyta例えば、顕花植物。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、動物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、以下の任意の門のメンバーが挙げられる:海綿動物門海面動物;板形動物門Placozoa;直遊動物門海洋無脊椎動物の寄生生物;菱型動物門Rhombozoa;刺胞動物門Cnidariaサンゴ、アネモネ、クラゲ、シーペン、ウミシータケ、有毒クラゲseawasps;有櫛動物門クシクラゲ;扁形動物門Platyhelminthes扁形動物;紐形動物門Nemertina紐形動物;NガソストムリダNgathostomulidaジャウドワームjawedworms腹毛動物;輪形動物門Rotifera;鰓曳動物門Priapulida;動吻動物門Kinorhyncha;胴甲動物門Loricifera;鉤頭動物門Acanthocephala;内肛動物門Entoprocta;線形動物門Nemotoda;類線形動物門Nematomorpha;有輪動物門CYCliophora;軟体動物門Mollusca軟体動物;星口動物門Sipunculaピーナッツワームpeanutworms;環形動物門Annelida環形動物;緩歩動物門Tardigradaクマムシ;有爪動物門Onychophoraカギムシ類velvetworms;節足動物門Arthropoda以下の亜門を含む。鋏角亜門Chelicerata、多足亜門Myriapoda、六脚亜門Hexapodaおよび甲殻亜門Crustacea、ここで鋏角亜門は例えば、クモ綱、節口綱Merostomata、およびウミグモ綱を含み、多足亜門は、例えば、唇脚綱ムカデ類、倍脚綱ヤスデ類、エダヒゲムシ綱Paropodaおよびコムカデ綱Symphylaを含み、六脚亜門は、昆虫を含み、そして甲殻亜門は、エビ、オキアミ、フジツボエボシガイなどを含む;箒虫動物門Phoronida;外肛動物門Ectoproctaコケムシ類mossanimals;腕足動物門Brachiopoda;棘皮動物Echinodermata例えば、ヒトデ、シャリンヒトデseadaisies、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリトルバスケットbrittlebasketsなど;毛顎動物門ヤムシ;半索動物ギボシムシ;および脊索動物門Chordata。脊索動物門の適切なメンバーとしては、以下:尾索動物亜門ホヤ類;これにはホヤ綱Ascidiacea、サルバ綱Thaliaceaおよびオタマボヤ綱Larvaceaが挙げられる;頭索動物亜門Cephalochordataナメクジウオ;メクラウナギ綱Myxiniメクラウナギhagfish;および脊椎動物亜門Vertebrataの亜門の任意のメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えば、ヤツメウナギ目のメンバーヤツメウナギ、軟骨魚綱Chondrichthyces軟骨魚類、条鰭亜綱Actinopterygii条鰭類、シーラカンスActinista、肺魚亜綱Dipnoi肺魚、爬虫綱Reptilia爬虫類、例えば、ヘビ、アリゲ-タ、クロコダイル、トカゲなど、鳥類トリ類;および哺乳綱哺乳動物が挙げられる。適切な植物としては、任意の単子葉植物および任意の双子葉植物が挙げられる。例えば、標的ポリリボヌクレオチドは、以下に限定されないが、原生動物、植物、真菌、藻細胞、酵母、爬虫類、両生類、哺乳類、海洋微生物、海生無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ形類動物、古細菌および真正細菌を含む有機体の細胞に存在するか、または有機体の細胞から得ることができる。標的ポリリボヌクレオチドはヒト以外の胚、例えば、ショウジョウバエ胚;ゼブラフィッシュ胚;マウス胚;などに存在するか、ヒト以外の胚から得ることができる。標的ポリリボヌクレオチドは、幹細胞、例えば、invitro幹細胞;ヒト以外の幹細胞;などに存在するか、幹細胞から得ることができる。適切な幹細胞としては、胚幹細胞、成人幹細胞および人工多能性幹iPSの細胞が挙げられる。例えば、生物体が植物である場合、一部の実施形態において、標的ポリリボヌクレオチドは木質部、師部、形成層、葉、根などから単離される。生物体が動物である場合、標的ポリリボヌクレオチドは、一部の実施形態において、特定の組織例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織などから、または特定の細胞タイプ例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、島細胞、Tリンパ球、Bリンパ球などから単離される。標的RNAの産生を調節する方法本開示は、細胞における標的RNAの産生を調節する方法を提供する。本方法は、一般には、遺伝子修飾された宿主細胞を誘導プロモーターを活性化する薬剤と接触させることを伴うが、ここで、その遺伝子修飾された宿主細胞は、一般に、基質ポリリボヌクレオチドにおいて配列特異的な開裂部位で開裂を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターによって遺伝子修飾され、酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに操作可能な形で結合され、誘導プロモーターが活性化すると、酵素が細胞で産生され、前駆体RNAから前記標的RNAを開裂する。図10は標的RNAの産生を調節する代表的な方法の概略図を示している。図10では、内因性標的RNAは、Csy4RNA基質例えば、GUUCACUGCCGUAUAGGCAG配列ID番号:103;または配列ID番号:1を3’非翻訳領域3’UTRに含むように修飾される。宿主細胞でのCys4発現は、RNA基質の結合および開裂に通じる。開裂されたRNAは、そのpolyA尾部を失い、分解される。例えば、一部の実施形態においては、本開示は、真核細胞における標的RNAの産生を調節する方法を提供し、該方法は遺伝子修飾された宿主細胞を、誘導プロモーターを活性化する薬剤に接触させることを伴うが、ここでこの遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおいて配列特異的な開裂部位で開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Csy4エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターによって遺伝子修飾され、この酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに操作可能な形で結合され、誘導プロモーターが活性化すると、酵素が細胞内で産生され、前駆体RNAから前記標的RNAを開裂する。場合によっては、標的RNAの種類は調節RNAである。場合によっては、前駆体RNAからの前記標的RNAの開裂は前駆体RNAを不活性化する。適切な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、酵素液に活性で、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼである。標的RNAの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼには、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図4に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが含まれる。標的RNAの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図5に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。図5に多様なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される配列を示す。標的RNAの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼには、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図4または5のいずれか一方で規定されたアミノ酸配列とは1から20例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸置換および/または挿入および/または欠失により異なるエンドリボヌクレアーゼが含まれる。適切な誘導プロモーターには、真核細胞において機能できるプロモーターが含まれる。適切な誘導プロモーターは当分野で公知である。例えば、適切な誘導プロモーターとしては、以下に限定されないが、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PH05プロモーター、CUP1プロモーター、GAL7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーターおよびAOX1が挙げられる。適切な誘導プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導プロモーター;メタロチオネインプロモーター;テトラサイクリン誘導プロモーター、メチオニン誘導プロモーター;およびガラクトース誘導プロモーターが挙げられ、これらのプロモーターはすべて当業で公知である。その他の適切なプロモーターには、ADH2アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターグルコース中では抑制され、グルコースが消耗され、エタノ-ルが作られると誘導されるおよびCUP1メタロチオネインプロモーターCu2、Zn2の存在下で誘導されるが含まれる。任意の所定の誘導プロモーターを誘導する薬剤は当分野で公知である。例えば、テトラサイクリン調節可能プロモーターはテトラサイクリンまたはドキシーサイクリンによって調節することができる;炭水化物は、炭水化物誘導プロモーターを誘導するのに使用することができる例えば、ガラクトース誘導プロモーターの場合はガラクトース;メチオニンは、メチオニン誘導プロモーターを誘導するのに使用することができる;金属は、メタロチオネインプロモーターを誘導するのに使用することができる。標的RNAは調節RNAとすることができる。調節RNAは当業では公知であり、例えば、マイクロRNA、低分子ヘアピン型RNAshRNAなどが挙げられる。一部の実施形態においては、前駆体RNAからの標的RNAの開裂は、前駆体RNAを不活性化する。遺伝子修飾された宿主細胞は、invitro細胞とすることができ、例えば、原核細胞または真核細胞例えば、初代細胞、形質転換された細胞株などを含む哺乳類細胞である。遺伝子修飾された宿主細胞は、invivo細胞とすることができる。一部の実施形態においては、invivo細胞はヒト以外の細胞である。遺伝子修飾された宿主細胞は、多細胞生物の細胞とすることができるまたは多細胞生物の細胞から得ることができる。遺伝子修飾された宿主細胞は、任意の6つの界、例えば、細菌例えば、真正細菌;古細菌;原生動物;真菌;植物界;および動物界の生物体から得るまたはこれらの生物体に存在することができる。適切な生物体としては、以下に限定されないが、藻類例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、藍藻を含む、原生動物界の植物様のメンバー;原生動物の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌類など;原生動物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫例えば、ユーグレナ属Euglena、アメーバ類例えば、アメーバ、胞子虫類例えば、アピーコンプレクサApicomplexa、ミクソゾアMyxozoa、微胞子虫Microsporidia、および繊毛虫例えば、ゾウリムシ属Parameciumが挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、真菌界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが任意の門のメンバー:担子菌門Basidiomycotaホウキタケ;例えば、ハラタケ属Agaricus、テングタケ属Amanita、ヤドリタケ属Boletus、カンテレラスCantherellusなど;子嚢菌門Ascomycota子嚢菌、例えば、酵母属菌を含む;ミコフィコフィタMycophycophyta地衣類;接合菌門Zygomycota接合真菌類;および不完全菌門Deuteromycotaが挙げられる。適切な生物体としては、植物界のメンバーが挙げられ、これに限定はしないが、任意の以下の門のメンバーが挙げられる:コケ植物門Bryophyta例えば、コケ類、ツノゴケ門Anthocerotophyta例えば、マツモ類、ヘパティコフィタHepaticophyta例えば、ゼニゴケ類、リコフィタLycophyta例えば、ヒカゲノカズラ類、スフェノフィタSphenophyta例えば、トクサ類、プシロフィタPsilophyta例えば、マツバランwhiskferns、シダ植物門Ophioglossophyta、シダ門Pterophyta例えば、シダ、ソテツ植物CYCadophyta、イチョウ門Gingkophyta、マツ植物門Pinophyta、マオウ門Gnetophytaおよび被子植物門Magnoliophyta例えば、顕花植物。適切な生物体としては、動物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、以下の任意の門のメンバーが挙げられる:海綿動物門海面動物;板形動物門Placozoa;直遊動物門海洋無脊椎動物の寄生生物;菱型動物門Rhombozoa;刺胞動物門Cnidariaサンゴ、アネモネ、クラゲ、シーペン、ウミシータケ、有毒クラゲseawasps;有櫛動物門クシクラゲ;扁形動物門Platyhelminthes扁形動物;紐形動物門Nemertina紐形動物;NガソストムリダNgathostomulidaジャウドワームjawedworms腹毛動物;輪形動物門Rotifera;鰓曳動物門Priapulida;動吻動物門Kinorhyncha;胴甲動物門Loricifera;鉤頭動物門Acanthocephala;内肛動物門Entoprocta;線形動物門Nemotoda;類線形動物門Nematomorpha;有輪動物門CYCliophora;軟体動物門Mollusca軟体動物;星口動物門Sipunculaピーナッツワームpeanutworms;環形動物門Annelida環形動物;緩歩動物門Tardigradaクマムシ;有爪動物門Onychophoraカギムシ類velvetworms;節足動物門Arthropoda以下の亜門を含む。鋏角亜門Chelicerata、多足亜門Myriapoda、六脚亜門Hexapodaおよび甲殻亜門Crustacea、ここで鋏角亜門は例えば、クモ綱、節口綱Merostomata、およびウミグモ綱を含み、多足亜門は、例えば、唇脚綱ムカデ類、倍脚綱ヤスデ類、エダヒゲムシ綱Paropodaおよびコムカデ綱Symphylaを含み、六脚亜門は、昆虫を含み、そして甲殻亜門は、エビ、オキアミ、フジツボエボシガイなどを含む;箒虫動物門Phoronida;外肛動物門Ectoproctaコケムシ類mossanimals;腕足動物門Brachiopoda;棘皮動物Echinodermata例えば、ヒトデ、シャリンヒトデseadaisies、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリトルバスケットbrittlebasketsなど;毛顎動物門ヤムシー;半索動物ギボシムシ;および脊索動物門Chordata。脊索動物門の適切なメンバーとしては、以下:尾索動物亜門ホヤ類;これにはホヤ綱Ascidiacea、サルバ綱Thaliaceaおよびオタマボヤ綱Larvaceaが挙げられる;頭索動物亜門Cephalochordataナメクジウオ;メクラウナギ綱Myxiniメクラウナギhagfish;および脊椎動物亜門Vertebrataの亜門の任意のメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えば、ヤツメウナギ目のメンバーヤツメウナギ、軟骨魚綱Chondrichthyces軟骨魚類、条鰭亜綱Actinopterygii条鰭類、シーラカンスActinista、肺魚亜綱Dipnoi肺魚、爬虫綱Reptilia爬虫類、例えば、ヘビ、アリゲ-タ、クロコダイル、トカゲなど、鳥類トリ類;および哺乳綱哺乳動物が挙げられる。適切な植物としては、任意の単子葉植物および任意の双子葉植物が挙げられる。したがって、例えば、遺伝子修飾された宿主細胞は、原生動物、植物、真菌、藻細胞、酵母、爬虫類、両生類、哺乳類、海洋微生物、海生無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ形類動物、古細菌および真正細菌から入手した細胞またはこれらに存在する細胞とすることができる。適切な哺乳類細胞としては、初代細胞および不死化細胞株が挙げられる。適切哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、ヒト以外の霊長類の細胞株、齧歯動物例えば、マウス、ラットの細胞株などが挙げられる。適切な哺乳類細胞株は、以下に限定されないが、HeLa細胞例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC番号CCL-2、CHO細胞例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096、293細胞例えば、ATCC番号CRL1573、ベロ細胞、NIH3T3細胞例えば、ATCC番号CRL-1658、Huh-7細胞、BHK細胞例えば、ATCC番号CCL10、PC12細胞ATCC番号CRL1721、COS細胞、COS-7細胞ATCC番号CRL1651、RATI細胞、マウスL細胞ATCC番号CCLI.3、ヒト胎児腎臓HEK細胞ATCC番号CRL1573、HLHepG2細胞などが挙げられる。遺伝子修飾された宿主細胞は、ヒト以外の胚、例えば、ショウジョウバエ胚;ゼブラフィッシュ胚;マウス胚などから得たまたはそれらの胚に存在する細胞とすることができる。遺伝子修飾された宿主細胞は、幹細胞、例えば、invitro幹細胞;ヒト以外の幹細胞などとすることができる。適切な幹細胞としては、胚幹細胞、成人幹細胞および人工多能性幹iPS細胞が挙げられる。標的核酸の単離方法本開示は、核酸の混合ポピュレーションから標的核酸を単離する方法を提供する。本方法は一般に以下のステップを伴う:a核酸の混合ポピュレーションを固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと接触させるステップであって、ここで、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるタグまたは認識ヌクレオチド配列を含む標的核酸を含んでいるため、タグヌクレオチド配列タグ付けされた標的核酸を含む標的核酸は、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼに結合し、タグ付けされた標的核酸/固定化された配列特異的な、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ複合体を形成し、接触ステップは溶液結合溶液中で進行するステップ;およびb溶液に最終濃度が約100mMから約500mM例えば、約100mMから約150mM、約150mMから約200mM、約200mMから約250mM、約250mMから約300mM、約300mMから約350mM、約350mMから約400mM、約400mMから約450mMまたは約450mMから約500mMになるようにイミダゾールを添加し、それにより、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化し、エンドリボヌクレアーゼが酵素的に活性となって、タグヌクレオチド配列から標的核酸を開裂し、それにより標的核酸が放出されるようにする反応溶液を形成するステップ。図9は標的RNAを単離するための主題方法の代表的な実施形態の概略図である。本方法はさらに、1つまたは複数の洗浄ステップを含むこともできる。例えば、ステップaの後で、ステップbの前に、タグヌクレオチド配列を含む結合した標的核酸を含んでいる固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを、結合溶液で1回または複数回洗浄し、標的核酸は配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼに結合したままの状態で留まり、結合していない核酸はすべて洗い流されるようにすることができる。核酸の混合ポピュレーションはRNAおよびDNAを含むことができる。標的核酸は、配列特異的エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合されるタグまたは認識ヌクレオチド配列を含むRNAである。その酵素的に不活性な状態非誘導状態では、エンドリボヌクレアーゼはタグ付けされた標的RNAを結合することはできるが、開裂することはできない。その酵素的に活性な状態誘導状態例えば、約100mMから約500mMの濃度のイミダゾールの存在下では、エンドリボヌクレアーゼは、タグ付けされた標的核酸内の認識ヌクレオチド配列の結合と開裂の両方を行うことができ、その結果、タグから標的核酸が放出される。結合溶液は、緩衝剤および塩を含むことができ;イミダゾールは含んでいない。再活性化溶液は、約100mMから約500mM、例えば、約100mMから約150mM、約150mMから約200mM、約250mMから約350mM、約350mMから約400mMまたは約400mMから約500mMの最終濃度でイミダゾールを含有することができる。イミダゾールが存在すると、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは再活性化され、エンドリボヌクレアーゼは酵素的に活性となり、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95または95より多い野生型配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、図5例えば、配列ID番号:6、8または9に示されているアミノ酸配列を示す。1つの非限定的な例としては、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは以下に記述し、図6に示されるCsy4のH29A変異体である;Csy4H29A変異体をイミダゾールと接触させると、上述したように、エンドリボヌクレアーゼは再活性化され、配列に特異的な形で、標的リボ核酸内の認識配列を開裂することが可能になる。後述するCsy4の二重変異体、H29A、S50Cも使用に適している。一部の実施形態においては、タグ、すなわち、認識配列はヌクレオチド配列の5’-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3’配列ID番号:1を含む。タグまたは認識ヌクレオチド配列は、標準的な組換え方法を使って核酸に導入することができる。したがって、タグ付けされた標的核酸には、酵素的に開裂され、その結果、標的核酸が放出されるタグが含まれる。一部の実施形態においては、タグ付けされた標的核酸RNAはそれに結合された1つまたは複数のポリペプチドを有する。1つまたは複数のポリペプチドが結合されているタグ付けされたRNAは、本明細書では、RNAタンパク質複合体と称する。したがって、一部の実施形態においては、主題方法を使用して単離される標的RNAは、RNAタンパク質複合体である。一部の実施形態においては、主題方法はさらに、単離された標的RNAに結合されたポリペプチドを分析することも含むことができる。主題方法は標的RNAまたはRNAタンパク質複合体の単離を提供する。一部の実施形態においては、主題方法は、標的RNAまたはRNAタンパク質複合体が少なくとも純度約50、少なくとも純度約60、少なくとも純度約70、少なくとも純度約80、少なくとも純度約90、少なくとも純度約95、少なくとも純度約98または純度98を超えるように、標的RNAまたはRNAタンパク質複合体の精製を提供する。一部の実施形態においては、標的RNAタンパク質複合体内の標的RNAに結合したタンパク質をRNAタンパク質複合体から溶出することができる。溶出されたタンパク質は、例えば配列決定、酵素消化、機能解析などにより、さらに特徴を明らかにすることができる。核酸の混合ポピュレーションは細胞溶解物中に存在することができる。例えば、タグ付けされたRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは細胞に例えば、invitroまたはinvivoで導入され、細胞がタグ付けされたRNAを合成できるようにする。溶解物は細胞から作られ、作られた溶解物は任意で核酸の濃縮のための1つまたは複数のステップにかけられ固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼに加えられる。配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは、多種多様な不溶性支持体のいずれかの上に固定することができる。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は多種多様な物質ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱を含むことができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シート、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供され得る。本開示は、さらに、標的RNAに結合するポリペプチドを単離する方法も提供し、ここで、本方法は以下のステップを含む:a固定化された複合体を標的RNAを結合するポリペプチドを含む溶液に接触させるステップであって、ここで、固定化された複合体は、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含んでいる変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼおよびタグ付けされたRNAを含み、前記接触により、ポリペプチドが標的RNAに結合され、前記接触はイミダゾールを含んでいない結合溶液で実施されるステップ;およびb結合したポリペプチドを溶出するステップ。エンドリボヌクレアーゼ本開示は、配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態において、本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に不活性である。一部の実施形態において、本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合し、該認識配列内または付近にある標的ポリリボヌクレオチドを開裂する配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に活性である。一部の実施形態において、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、不溶性基質上に固定化される。適切な不溶性基質としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性基質は、多種多様な物質ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供されることがあり得る。酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ本開示は、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供し、ここで、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形でポリリボヌクレオチド内の標的配列に結合する。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形で標的ポリリボヌクレオチドに結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、前述したように、標的RNAを核酸の混合ポピュレーションから単離するのに有用である。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、天然に発生する酵素的に活性なCsy4、CasEまたはCas6のポリペプチドに比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、Csy4ポリペプチドのHis-29の位置またはCasEもしくはCas6ポリペプチドの相当する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、Csy4ポリペプチドのSer-148の位置またはCasEもしくはCas6ポリペプチドの相当する位置にアミノ酸置換を含む。図6は、適切な酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列の非制限的な例を示している。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、図6に示されたアミノ酸配列と少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、His-29、Ser-50またはHis-29およびSer-50の両方の位置に置換を含む。例えば、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、H29AHis-29からAla-29への置換、S50CSer-50からCys-50への置換、またはH29AおよびS50C置換の両方を含むことができる。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼである。場合によっては、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、図6に規定したアミノ酸配列に対して少なくとも約95のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、エンドリボヌクレアーゼは、His-29の位置にアミノ酸置換を含み、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、イミダゾールが存在しないときには酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在下で活性化可能になる。場合によっては、アミノ酸置換は、His29からAla29への置換である。場合によっては、変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、Ser-50置換も含む。場合によっては、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列5’-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3’配列ID番号:1を含むRNA基質に結合する。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、条件付きで酵素的に不活性であり、例えば、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、イミダゾールが存在しないときには酵素的に不活性である;そして、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、イミダゾールによって活性化可能になる。例えば、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、約100mMから約500mMの濃度のイミダゾールにエンドリボヌクレアーゼを接触させることにより、酵素的に活性化することができる。例えば、約100mMから約500mMの濃度範囲でのイミダゾールの存在は、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼを再活性化し、エンドリボヌクレアーゼは、酵素的に活性となり、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、少なくとも約50少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95または95より多い野生型配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、図5に示されたアミノ酸配列例えば、配列ID番号:6、8または9を示す。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、検出可能なシグナルを提供する部分も含め、検出可能な標識を含む。適切な検出可能な標識および/または検出可能なシグナルを提供する部分としては、以下に限定されないが、酵素、放射性同位体FRET対のメンバー、特定の結合対のメンバー;フルオロフォア;蛍光タンパク質;量子ドットなどが挙げられる。使用するのに適したFRET対ドナー/アクセプターとしては、以下に限定されないが、EDANS/フルオレセインIAEDANS/フルオレセイン、フルオレセイン/テトラメチルローダミン、フルオレセイン/Cy5、IEDANS/DABCYL、フルオレセイン/QSY-7、フルオレセイン/LCRed640、フルオレセイン/Cy5.5およびフルオレセイン/LCRed705が挙げられる。さらに、フルオロフォア/量子ドットのドナー/アクセプターの対を使用することもできる。適切なフルオロフォア蛍光標識には、その内在する蛍光特性を通じて検出され得る任意の分子を含むことができ、励起時に検出可能な蛍光発光を含む。適切な蛍光標識は、以下に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー商標、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705およびオレゴングリーンが挙げられる。適切な光色素は、参照により本明細書に明確に組み込まれるRichardP.Hauglandによる2002MolecularProbesHandbook、第9版に記載されている。適切な酵素としては、以下に限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなどが挙げられる。適切な蛍光タンパク質としては、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質GFP、例えば、オワンクラゲに由来するGFPもしくはその変異体またはこれらの誘導体、例えば、米国特許第6,066,476号;第6,020,192号;第5,985,577号;第5,976,796号;第5,968,750号;第5,968,738号;第5,958,713号;第5,919,445号;第5,874,304号に記載のもの;赤色蛍光タンパク質;黄色蛍光タンパク質;花虫類に由来する多種多様な蛍光有色タンパク質の任意のいずれか、例えば、Matzら1999、NatureBiotechnol.17:969-973に記載されているもの;などが挙げられる。適切なナノ粒子としては、例えば、量子ドットQD、蛍光性または発光性ナノ粒子および磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子の光学特性または磁性または特性はいずれも検出されることができる。各種QDおよびそれらの合成の方法は、当業では公知である例えば、米国特許第6,322,901号;第6,576,291号;および第6,815,064号を参照されたい。QDは、多種多様な異なる材料例えば、米国特許第6,423,551号;第6,251,303号;6,319,426号;第6,426,513号;第6,444,143号;および第6,649,138号を参照されたいから成るコーティング層を塗布することにより、水溶性にすることができる。例えば、QDは、両親媒性高分子を使用して可溶化することができる。使用されてきた例示的な高分子としては、オクチルアミン修飾された低分子量ポリアクリル酸、ポリエチレングリコールPEG誘導体化されたリン脂質、ポリ無水物、ブロック共重合体などが挙げられる。QDは、コーティング層に直接的または間接的にリンクすることのできる多数の異なる官能基または結合剤のいずれかを通じてポリペプチドに共役させることができる例えば、米国特許第5,990,479号;第6,207,392号;第6,251,303号;第6,306,610号;第6,325,144号;および第6,423,551号を参照されたい。多様な吸収および発光スペクトルを有するQDが、例えば、QuantumDotCorp.カリフォルニア州Hayward;Invitrogenが現在所有またはEvidentTechnologiesニューヨーク州Troyから市販されている。例えば、およそ525、535、545、565、585、605、655、705および800nmのピーク発光波長を有するQDが入手可能である。したがって、QDは、スペクトルの可視部全域および場合によっては、可視部を越えて、様々な異なる色を有することができる。適切な放射性同位体としては、以下に限定されないが、14C、3H、32P、33P、35S、125Iおよび131Iが挙げられる。放射性同位体の標識としての使用は当業で公知である。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、不溶性基質上に固定化される。適切な不溶性基質としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性基質は、多種多様な物質ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、プラスチックチューブなどを含め、多種多様な形態で提供され得る。一部の実施形態においては、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは精製され、例えば、少なくとも純度80、少なくとも純度85、少なくとも純度90、少なくとも純度95、少なくとも純度98、少なくとも純度99、または純度99を超える。組成物本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、1つまたは複数の:塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジンN’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど;可溶化剤;洗浄剤、例えば、Tween-20などの非イオン性洗浄剤;プロテアーゼ阻害剤;などを含むことができる。酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ一部の実施形態においては、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする部分を含む。例えば、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする共有または非共有結合された部分を含むことができる。適切な検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。検出を可能にする部分としては、以下に限定されないが、蛍光性分子;量子ドット;酵素が基質の検出可能な産生物への変換を触媒し、産生物は直接検出可能であるものとする、酵素エンドリボヌクレアーゼ以外;ナノ粒子などが挙げられる。適切な蛍光タンパク質としては、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質GFP、例えば、オワンクラゲに由来するGFPもしくはその変異体またはこれらの誘導体、例えば、米国特許第6,066,476号;第6,020,192号;第5,985,577号;第5,976,796号;第5,968,750号;第5,968,738号;第5,958,713号;第5,919,445号;第5,874,304号に記載のもの;赤色蛍光タンパク質;黄色蛍光タンパク質;花虫類に由来する多種多様な蛍光有色タンパク質の任意のいずれか、例えば、Matzら1999、NatureBiotechnol.17:969-973に記載されているもの;などが挙げられる。適切なナノ粒子としては、例えば、量子ドットQD、蛍光性または発光性ナノ粒子および磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子の光学特性または磁性または特性はいずれも検出されることができる。各種QDおよびそれらの合成の方法は、当業では公知である例えば、米国特許第6,322,901号;第6,576,291号;および第6,815,064号を参照されたい。QDは、多種多様な異なる材料例えば、米国特許第6,423,551号;第6,251,303号;6,319,426号;第6,426,513号;第6,444,143号;および第6,649,138号を参照されたいから成るコーティング層を塗布することにより、水溶性にすることができる。例えば、QDは、両親媒性高分子を使用して可溶化することができる。使用されてきた例示的な高分子としては、オクチルアミン修飾された低分子量ポリアクリル酸、ポリエチレングリコールPEG誘導体化されたリン脂質、ポリ無水物、ブロック共重合体などが挙げられる。QDは、コーティング層に直接的または間接的にリンクすることのできる多数の異なる官能基または結合剤のいずれかを通じてポリペプチドに共役させることができる例えば、米国特許第5,990,479号;第6,207,392号;第6,251,303号;第6,306,610号;第6,325,144号;および第6,423,551号を参照されたい。多様な吸収および発光スペクトルを有するQDが、例えば、QuantumDotCorp.カリフォルニア州Hayward;Invitrogenが現在所有またはEvidentTechnologiesニューヨーク州Troyから市販されている。例えば、およそ525、535、545、565、585、605、655、705および800nmのピーク発光波長を有するQDが入手可能である。したがって、QDは、スペクトルの可視部全域および場合によっては、可視部を越えて、様々な異なる色を有することができる。一部の実施形態においては、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは精製され、例えば、少なくとも純度80、少なくとも純度85、少なくとも純度90、少なくとも純度95、少なくとも純度98、少なくとも純度99、または純度99を超える。組成物本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、1つまたは複数の:塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジンN’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど;可溶化剤;洗浄剤、例えば、Tween-20などの非イオン性洗浄剤;プロテアーゼ阻害剤;などを含むことができる。本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼ以外に、1つまたは複数の:塩、例えば、NaCl、MgCl、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-2-ヒドロキシエチルピペラジンN’-2-エタンスルホン酸HEPES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、2-N-モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩MES、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸TAPSなど;可溶化剤;洗浄剤、例えば、Tween-20などの非イオン性洗浄剤;プロテアーゼ阻害剤;などを含むことができる。一部の実施形態においては、組成物はイミダゾールを含まない。一部の実施形態においては、組成物は約100mMから約500mMの濃度でイミダゾールを含む。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの産生方法主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法;組換えDNA方法;などによって産生することができる。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼが化学的に合成される場合、合成は液相または固相で進めることができる。固相ペプチド合成SPPSは、不溶性の支持体に配列のC末端アミノ酸を付着させた後、配列中の残りのアミノ酸を順次付着させていくもので、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの化学合成のための適切な方法の例の1つである。FmocおよびBocなどの様々な形態のSPPSが、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの合成に利用可能である。固相ペプチド合成法は、BaranyおよびMerrifieldらSolid-PhasePeptideSynthesis;ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2巻SpecialMethodsinPeptideSynthesisパ-トA、3-284ペ-ジ:Merrifieldら、J.Am.Chem.Soc.,85:2149-21561963;Stewartら、SolidPhasePeptideSynthesis,第2版PierceChem.Co.,イリノイ州Rockford1984;ならびにGanesanA.2006MiniRev.MedChem.6:3-10およびCamareroJAら、2005ProteinPeptLett.12:723-8によって記述されている。標準的な組換え法を主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの産生に用いることができる。例えば、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする核酸が発現ベクターに挿入される。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするDNAセグメントは、コードされたポリペプチドが確実に発現するようにする発現ベクター中の制御配列に操作可能な形で結合される。発現制御配列としては、以下に限定されないが、プロモーター例えば、天然で対応しているプロモーターまたは異種プロモーター、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終結配列が挙げられる。発現制御配列は、真核宿主細胞例えば、COSまたはCHO細胞を形質転換またはトランスフェクトすることのできるベクター内の真核プロモーター系とすることができる。ひとたびベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主はヌクレオチド配列の高度な発現、ならびにエンドリボヌクレアーゼの回収および精製に適した条件下で維持される。核酸および宿主細胞本開示は、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含む核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は発現ベクターであり、該発現ベクターは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼの、例えば、細胞内での産生をもたらす。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、意図した標的細胞例えば、コードされたエンドリボヌクレアーゼを合成するように遺伝子修飾された細胞においてヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーなどの1つまたは複数の調節要素に操作可能な形で結合され得る。一部の実施形態において、主題の核酸は、図4または図5に規定されたアミノ酸配列と少なくとも75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、主題の核酸は、上述の変異型Csy4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、転写制御要素例えば、プロモーター、エンハンサーなどに操作可能な形で結合され得る。適切なプロモーターおよびエンハンサー要素は、当業で公知である。細菌性細胞での発現の場合、適切なプロモーターとしては、以下に限定されないが、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、lambdaPおよびtrcが挙げられる。真核細胞での発現の場合、適切なプロモーターとしては、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス前初期プロモーター;単純ヘルペスウイルスチミジンキナ-ゼプロモーター;前記および後期SV40プロモーター;レトロウイルス由来の長い末端反復に存在するプロモーター;マウスメタロチオネイン-Iプロモーター;および多種多様な当業で公知の組織特異的プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、例えば、酵母細胞での発現のためには、適切なプロモーターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1プロモーターなどの構成的プロモーター;GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、ADH2プロモーター、PH05プロモーター、CUP1プロモーター、GAL7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモーター、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、LEU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーターおよびAOX1例えば、Pichiaでの使用向けなどの調節可能プロモーターである。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの十分に範囲内である。原核宿主細胞での使用に適したプロモーターは、以下に限定されないが、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;lacオペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えば、lac/tacハイブリッドプロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーターなど;araBADプロモーター;invivoで調節されたプロモーター、例えば、ssaGプロモーターまたは関連するプロモーターなど例えば、米国特許公開第20040131637号を参照されたい、pagCプロモーターPulkkinenおよびMiller.J.Bacteriol.、1991:1731:86-93;Alpuche-Arandaら、PNAS、1992;8921:10079-83、nirBプロモーターHarborneら1992Mol.Micro.6:2805-2813など例えば、Dunstanら1999Infect.Immun.67:5133-5141;McKelvieら2004Vaccine22:3243-3255;およびChatfieldら1992Biotechnol.10:888-892を参照されたい;sigma70プロモーター、例えば、コンセンサスsigma70プロモーター例えば、GenBankアクセッション番号AX798980、AX798961およびAX798183を参照されたい;静止期プロモーター、例えば、dpsプロモーター、spvプロモーターなど;病原性アイランドSPI-2由来プロモーター例えば、W096/17951号を参照されたい;actAプロモーター例えば、Shetron-Ramaら2002Infect.Immun.70:1087-1096を参照されたい;rpsMプロモーター例えば、ValdiviaおよびFalkow1996、Mol.Microbiol.22:367を参照されたい;tetプロモーター例えば、Hillen,W.およびWissmann,A.1989Saenger,WおよびHeinemann,U.編集、TopicsinMolecularandStructuralBiology,タンパク質-NucleicAcid相互作用.Macmillan、英国ロンドン、第10巻、143-162頁を参照されたい;SP6プロモーター例えば、Meltonら1984Nucl.AcidsRes.12:7035を参照されたい;などが挙げられる。大腸菌などの原核細胞で使用するのに適切な強いプロモーターは、以下に限定されないが、Trc、Tac、T5、T7およびPLambdaが挙げられる。細菌性宿主細胞で使用するためのオペレーターの非限定的な例としては、ラクトースプロモーターオペレーターLacIリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触すると、立体構造を変化させて、これによってLacIリプレッサータンパク質がオペレーターと結合するのを防ぐ、トリプトファンプロモーターオペレータートリプトファンと複合体を形成するとき、TrpRリプレッサータンパク質はオペレーターに結合する立体構造を有する;トリプトファンの非存在下では、TrpRリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を有するおよびtacプロモーターオペレーター例えば、deBoerら1983Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:21-25を参照されたいが挙げられる。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼは、発現ベクターおよび/またはクローニングベクターに存在することができる。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製の起点ならびにベクターの複製および/または維持を提供するその他の機能を含み得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、多くが主題の組換え構築体の生成のために市販されている。以下のベクターは、例示として記載される:細菌性細胞:pBs、phagescript、PsiX174、pBluescriptSK、pBsKs、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46aStratagene、米国カリフォルニア州LaJolla;pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5Pharmacia、スウェ-デンUppsala。真核細胞:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSGStratagenepSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLPharmacia。発現ベクターは、一般に異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能にするようにプロモーター配列の近くに位置した好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作用する選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターは、以下に限定されないが、ウイルスベクター例えば、種痘ウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス例えば、Liら、InvestOpthalmolVisSci35:2543-2549,1994;Borrasら、GeneTher6:515~524,1999;LiおよびDavidson、PNAS92:7700-7704,1995、Sakamotoら、HGeneTher5:1088-1097,1999、国際公開第94/12649号、国際公開第93/03769号、国際公開第93/19191号、国際公開第94/28938号、国際公開第95/11984号、および国際公開第95/00655号を参照されたい、アデノ随伴ウイルス例えば、Aliら、HumGeneTher9:81-86,1998、Flanneryら、PNAS94:6916-6921,1997、Bennettら、InvestOpthalmolVisSci38:2857-2863,1997、Jomaryら、GeneTher4:683-690,1997、Rollingら、HumGeneTher10:641-648,1999、Aliら、HumMolGenet5:591-594,1996、Srivastavaの国際公開第93/09239号、Samulskiら、J.Vir.198963:3822-3828、Mendelsonら、Virol.1988166:154-165、およびFlotteら、PNAS199390:10613-10617を参照されたい、SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト免疫不全ウイルス例えば、Miyoshiら、PNAS94:10319-23,1997、Takahashiら、JVirol73:7812-7816,1999を参照されたい;およびレトロウイルスベクター例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハ-ベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスから得られるベクターなどが挙げられる。本開示は、主題の核酸によって遺伝子修飾された、単離された遺伝的修飾を加えた宿主細胞例えば、invitro細胞を提供する。一部の実施形態において、主題の単離された、遺伝的修飾を加えた宿主細胞は、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ;主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを産生することができる。適切な宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞などの真核宿主細胞;および細菌性細胞などの原核細胞が挙げられる。主題の核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストランが仲介するトランスフェクション、リポソ-ムが仲介するトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の既知の方法によって実施することができる。適切な哺乳類細胞としては、初代細胞および不死化細胞株が挙げられる。適切哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、ヒト以外の霊長類の細胞株、齧歯動物例えば、マウス、ラットの細胞株などが挙げられる。適切な哺乳類細胞株は、以下に限定されないが、HeLa細胞例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC番号CCL-2、CHO細胞例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096、293細胞例えば、ATCC番号CRL1573、ベロ細胞、NIH3T3細胞例えば、ATCC番号CRL-1658、Huh-7細胞、BHK細胞例えば、ATCC番号CCL10、PC12細胞ATCC番号CRL1721、COS細胞、COS-7細胞ATCC番号CRL1651、RAT1細胞、マウスL細胞ATCC番号CCLI.3、ヒト胎児腎臓HEK細胞ATCC番号CRL1573、HLHepG2細胞などが挙げられる。適切な酵母細胞としては、以下に限定されないが、ピチアパストリスPichiapastoris、ピチアフィンランディカPichiafinlandica、ピチアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピチアコクラメPichiakoclamae、ピチアメンブラネファシーエンスPichiamembranaefaciens、ピチアオプンチエPichiaopuntiae、ピチアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピチアサリクタリアPichiasalictaria、ピチアグエルクウムPichiaguercuum、ピチアピエペリPichiapijperi、ピチアスチピーチスPichiastipitis、ピチアメタノリカPichiamethanolica、ピチア属種Pichiasp.、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス属種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセス属種Kluyveromycessp.、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペルギルスニジューランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillusoryzae、トリコデルマレーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムルクノウェンスChrysosporiumlucknowense、フザリウム属種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、ニューロスポラクラッサNeurosporacrassa、緑藻クラミドモナスChlamydomonasreinhardtiiなどが挙げられる。適切な原核細胞は、以下に限定されないが、大腸菌、乳酸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種などの任意の多種多様な実験室株が挙げられる。例えば、Carrierら1992J.Immunol.148:1176-1181;米国特許第6,447,784号;およびSizemoreら1995Science270:299-302を参照されたい。本発明で使用することができるサルモネラ株の例は、以下に限定されないが、チフス菌SalmonellaTyphiおよびネズミチフス菌S.typhimuriumが挙げられる。適切な赤痢菌株としては、以下に限定されないが、シゲラフレクスネリShigellaflexneri,シゲラソンネイShigellasonnei、およびシゲラディセンテリアエShigelladisenteriaeが挙げられる。典型的には、実験室株は、非病原性の株である。他の適切な細菌の非制限的な例としては、以下に限定されないが、枯草菌Bacillussubtilis、シュードモナスプディタPseudomonaspudita、シュードモナスアエルジノーサPseudomonasaeruginosa、シュードモナスメバロニイPseudomonasmevalonii、ロドバクタースファエロイデスRhodobactersphaeroides、ロドバクターカプスラトゥスRhodobactercapsulatus、ロドスポリリウムルブラムRhodospirillumrubrum、ロドコッカス属種Rhodococcussp.などが挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。キット本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのキットも提供する。本開示は、基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおけるRNA配列の検出を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的RNAの単離を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的RNAに結合するポリペプチドの単離を実施するためのキットを提供する。ポリリボヌクレオチドの直接配列決定を実施するためのキットポリリボヌクレオチドの直接配列決定を実施するための主題のキットには、少なくとも主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが含まれ、該配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは精製されている。一部の実施形態において、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、FRET検出のためにアクセプター分子またはドナー分子に結合される。ポリリボヌクレオチドの直接的な配列決定を実施するための主題のキットには、少なくとも主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが含まれ;そして、1つまたは複数の追加成分を含むことができ、該1つまたは複数の追加成分は以下とすることができる:1緩衝剤;2所定の配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;3所定の配列を含むプローブオリゴヌクレオチドであり、FRET検出のためにアクセプター分子またはドナー分子に結合されているプローブオリゴヌクレオチド;4標的ポリリボヌクレオチドに結合するための不溶性支持体;5ポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドであって、既知のヌクレオチド配列を含むポジティブコントロールのポリリボヌクレオチド;6該ポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドの既知の配列に結合し、二本鎖を形成するポジティブコントロールのプローブオリゴヌクレオチド。上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識すなわち包装または副次的な包装subpackagingと関連付けてなどの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、CD-ROMディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ-ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および/または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するためのキット基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、少なくとも精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼおよび/または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が含まれる。基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼおよび/または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、1つまたは複数の追加成分を含むことができる。適切な追加成分としては、例えば、緩衝剤;ポジティブコントロールとしての役割を果たすポリリボヌクレオチド基質;ポリリボヌクレオチドのサイズ標準;ネガティブコントロールの基質;などが挙げられる。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。キットは1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識すなわち包装または副次的な包装subpackagingと関連付けてなどの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、CD-ROMディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ-ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および/または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出を実施するためのキット標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出を実施するための例えば、ポリリボヌクレオチドの検出を実施するための主題のキットには、既知の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。一部の実施形態において、キットには、既知の配列を含み、検出可能部分、例えば、免疫アッセイ;蛍光タンパク質;ルシフェリン;などを使って検出可能なポリペプチド、を含むオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成することが可能なヌクレオチド配列を含むポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドをさらに含むことができる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブおよび標的ポリリボヌクレオチドによって形成された二本鎖を特異的に検出して開裂する酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数の緩衝剤;検出可能部分を検出するための成分;テストストリップ;などをさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識すなわち包装または副次的な包装subpackagingと関連付けてなどの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、CD-ROMディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ-ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および/または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。標的RNAの単離を実施するためのキット標的RNAの単離例えば、精製を実施するための主題のキットは、以下を1つまたは複数含むことができる:1主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ;2タグヌクレオチド配列、すなわち配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合されるヌクレオチド配列を含む発現構築体ここで選択した標的RNAをコードするヌクレオチド配列は、タグヌクレオチド配列挿入された3’とすることができる;および3イミダゾール。配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは、不溶性支持体上に固定化することができる。キットは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと核酸の混合ポピュレーションを接触させるための液体組成物をさらに含むことができる。キットは、洗浄緩衝剤をさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。ポジティブコントロールは、タグ付けされたRNAをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができ、タグは、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。例えば、主題のキットは、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含むことができる。主題のキットは、5’から3’の順で、操作可能な結合で、以下を含む組換え発現ベクターをさらに含むことができる:a主題の変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるRNA基質をコードするヌクレオチド配列;およびb標的RNAをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイト。RNA基質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能な形で結合され得る。場合によっては、プロモーターは、誘導プロモーターである。RNA基質は、ヌクレオチド配列の5’-GUUCACUGCCGUAUAGGCAGCUAAGAAA-3’配列ID番号:1を含むことができる。場合によっては、組換え発現ベクターは、多重クローニングサイトに挿入され、標的RNAをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。キットは、イミダゾールを含んでいない緩衝剤をさらに含むことができる。キットは、イミダゾールまたはイミダゾール溶液をさらに含むことができる。キットは、1つまたは複数の洗浄緩衝剤をさらに含むことができる。場合によっては、キットはポジティブコントロール発現ベクターを含む。変異型Csy4エンドリボヌクレアーゼは、不溶性支持体上に固定化することができ、ここで適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は、多種多様な物質ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シート、反応トレイのウェル例えば、マルチウェルプレート、プラスチックチューブなどを含め、多種多様な形態で提供され得る。上記の成分に加えて、主題のキットは、主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識すなわち包装または副次的な包装subpackagingと関連付けてなどの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、CD-ROMディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ-ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および/または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。標的ポリリボヌクレオチドの配列を直接決定する方法本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を直接決定するための方法を提供する。したがって、例えば、本方法は標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために、標的ポリリボヌクレオチドのポリデオキシリボヌクレオチドの相補対の合成を必要としない。ウイルス診断、オーダーメイド医療、単一細胞転写解析、翻訳プロファイリングは、すべて直接的なRNA検出および配列決定の用途がある分野である。主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法、およびポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する主題方法は、これらの多種多様な分野で用途がある。主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法は、一般に以下を伴う:aオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成に有利な条件下で、特定の既知の配列および酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを含むオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドを接触させ、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを二本鎖中で特定の配列と結合させる;およびbオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出することここで、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが二本鎖に特異的に結合することは、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列が存在することを意味する。場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、放射性標識に共有または非共有結合される。放射性標識は、その内在する発光特性を通じて検出される任意の分子を意味し、励起時に検出可能な発光も含む。適切な放射性標識としては、以下に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー商標、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705およびオレゴングリーンが挙げられる。適切な光色素は、RichardP.Hauglandによる2002MolecularProbesHandbook、第9版に記載されている。場合によっては、主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法で使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、ドナー分子に結合され、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、アクセプター分子に結合され、二本鎖形成の検出は、蛍光共鳴エネルギー移動またはフェルスター共鳴エネルギー移動もしくはFRETとも呼ばれるによる。フェルスター共鳴エネルギー移動FRETは、1つの蛍光色素の励起が、光子の発光を伴わずに別の蛍光色素に移動する、当業で公知の現象である。FRET対は、ドナー発色団およびアクセプター発色団アクセプター発色団はクエンチャー分子であってもよいから成る。ドナーの発光スペクトルおよびアクセプターの吸収スペクトルはオーバーラップしなければならず、2つの分子は引接していなければならない。ドナーの50が不活性化されるエネルギーをアクセプターに移動するドナーとアクセプターとの距離は、フェルスター半径によって定義され、通常は、10~100オングストロームである。FRET対を含む発光スペクトルの変化は、検出することができ、近接位置すなわち、互いの100オングストローム以内にあるFRET対の数の変化を表す。これは、通常、2つの分子の結合または解離の結果として起こり、2つの分子の一方はFRETドナーと標識され、他方はFRETアクセプターと標識され、かかる分子の結合によって、FRET対は近接に位置するようになる。かかる分子の結合によって、アクセプターの発光および/またはドナーの蛍光発光のクエンチングが増加する。使用するのに適したFRET対ドナー/アクセプターは、以下に限定されないが、EDANS/フルオレセイン、IAEDANS/フルオレセイン、フルオレセイン/テトラメチルローダミン、フルオレセイン/Cy5、IEDANS/DABCYL、フルオレセイン/QSY-7、フルオレセイン/LCRed640、フルオレセイン/Cy5.5およびフルオレセイン/LCRed705が挙げられる。加えて、フルオロフォア/量子ドットのドナー/アクセプターの対も使用することができる。EDANSは、5-2-アミノエチルアミノナフタレン-1-スルホン酸であり;IAEDANSは、5-{2-[ヨ-ドアセチルアミノ]エチル}ナフタレン-1-スルホン酸であり;DABCYLは、4-4-ジメチルアミノフェニルジアゼニル安息香酸である。Cy3、Cy5、Cy5.5などは、シアニンである。例えば、Cy3およびCy5は、シアニン染料ファミリ-の反応性のある、水溶性蛍光染料である。Cy3染料は赤色~550nm励起、~570nm発光であるため、緑に見えるであり、Cy5は赤色領域~650/670nmで蛍光するが、オレンジの領域~649nmで吸収する。AlexaFluor色素、Dylight色素、IRIS色素、Seta色素、SeTau色素、SRfluor色素およびSquare色素も使用することができる。FRETのもう1つの態様では、発光ドナー分子および非発光アクセプター分子クエンチャーが使用され得る。この用途では、ドナーの発光は、クエンチャーがドナーの近接位置から離れた位置にあるときに増加シー、クエンチャーがドナーの近接位置に近づくと、発光は減少する。有用なクエンチャーとしては、以下に限定されないが、DABCYL、QSY7およびQSY33が挙げられる。有用な蛍光ドナー/クエンチャーの対としては、以下に限定されないが、EDANS/DABCYL、テキサスレッド/DABCYL、BODIPY/DABCYL、ルシファーイエロー/DABCYL、クマリン/DABCYLおよびフルオレセイン/QSY7色素が挙げられる。場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標識酵素に共有的または非共有的に結合される。標識酵素とは、検出可能産生物を産生する標識酵素の基質の存在下で、反応し得る酵素を指す。適切な標識酵素には、光学的に検出可能な標識例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼHRPの場合も含まれる。適切な標識酵素としては、以下に限定されないが、HRP、アルカリ性ホスファタ-ゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。かかる基質を使用するための方法は、当業で公知である。標識酵素の存在は、一般に、標識酵素の基質との反応の酵素による触媒作用を通じて明らかになり、識別可能な産生物が産生される。この種の産生物は、テトラメチルベンジジンとの西洋ワサビペルオキシダーゼの反応などのように、不透明であることがあり得、多種多様な色を有することがあり得る。LuminolPierceChemicalCo.から入手可能など、蛍光反応産生物を産生する他の標識酵素の基質が開発された。標識酵素の基質を使って標識酵素を同定するための方法は、当業では公知であり、商用キットが数多く市販されている。多種多様な標識酵素の使用例および使用方法は、Savageら、Previews247:6-91998、Young,J.Virol.Methods24:227-2361989に記述されている。場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、放射性同位体を含む。放射性同位体とは、任意の放射性分子を意味する。本発明で使用するのに適した放射性同位体としては、以下に限定されないが、14C、3H、32P、33P、35S、125I、131Iが挙げられる。標識としての放射性同位体の使用は、当業では公知である。場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、特定の結合対のメンバー結合対の相手に共有的または非共有的に結合される。結合対の相手または結合対のメンバーとは、第1および第2の部分のどちらか一方を指し、ここで第1および第2の部分は互いに対して特異的な結合親和性を有する。適切な結合対としては、以下に限定されないが、抗原/抗体例えば、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルDNP/抗DNP、ダンシル/抗ダンシル、フルオレセイン/抗フルオレセイン、ルシファーイエロー/抗ルシファーイエロー、およびローダミン/抗ローダミン、ビオチン/アビジンまたはビオチン/ストレプトアビジン、およびカルモジュリン結合タンパク質CBP/カルモジュリンが挙げられる。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブは、非特異的な加水分解に対する抵抗性の増加を提供する修飾を含む。かかる修飾は、当業で公知であり、例えば、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合、修飾された骨格、塩基修飾、塩基置換、糖修飾などが含まれる。そこにリン原子を含む適切な修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-アルキレンホスホネート、5’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイトを含むホスホラミダイト、ホスホロジアミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常3’-5’結合を有するセレノリン酸およびボラノリン酸、これらの2’-5’結合類似体、および逆位極性を有するそれらを含み、ここにおいて1もしくは複数のヌクレオチド間結合は3’-3’、5’-5’、または2’-2’結合である。逆位極性を有する適切なオリゴヌクレオチドは、最も3’側のヌクレオチド間結合、すなわち脱塩していてもよい単一の逆位ヌクレオシド残基において単一の3’-3’結合を有することができる核酸塩基が欠損またはその場所にヒドロキシル基を有する。様々な塩類例えば、カリウムまたはナトリウム、混合塩類、および遊離酸形態も含まれる。修飾されたオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のホスホロチオエートおよび/またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に、-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-NCH3-O-CH2-メチレンメチルイミノまたはMMI骨格として知られる、-CH2-O-NCH3-CH2-、-CH2-NCH3-NCH3-CH2-および-O-NCH3-CH2-CH2-ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、-O-P=OOH-O-CH2-として表現されているを含むことができる。MMIタイプのヌクレオシド間結合は、上で参照した米国特許第5,489,677号に開示されている。適切なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第5,602,240号に開示されている。修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第5,034,506号に記述されているように、1つまたは複数のモルホリノ骨格を含むことができる。例えば一部の実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、リボース環の代わりに、6員モルホリノ環を含む。これらの実施形態の一部では、ホスホロジアミダイトまたはその他のホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合に取って代わる。モルホリノ核酸モルホリノは、デオキシリボース環の代わりに、モルホリン環に結合された塩基を含む;加えて、リン酸骨格は、リン酸の代わりに、リン酸基以外の基、例えば、ホスホロジアミダイト基を含むことができる。Summerton1999Biochim.Biophys.Acta1489:141;Heasman2002Dev.Biol.243:209;SummertonおよびWeller1997AntisenseNucl.AcidDrugDev.7:187;Hudziakら1996AntisenseNucl.AcidDrugDev.6:267;Partridgeら1996AntisenseNucl.AcidDrugDev.6:169;Amantanaら2007Bioconj.Chem.18:1325;Morcosら2008BioTechniques45:616。修飾されたオリゴヌクレオチドは、修飾骨格を含むことができる。リン原子を含まない修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子アルキルもしくは混合へテロ原子シクロアルキルのヌクレオシド間結合、1個もしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間結合により形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合ヌクレオシドの糖部分から部分形成されるを有する骨格;シロキサン骨格;スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;リボアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジン骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;ならびに混合N、O、SおよびCH2構成成分部分を有するその他のものが含まれる。修飾されたオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換された糖部分を含むことができる。適切なオリゴヌクレオチドは、OH;F;O-、S-もしくはN-アルキル;〇-、S-、N-もしくはN-アルケニル;〇-、S-、もしくはN-アルキニル;または〇-アルキル-〇-アルキルから選択される糖置換基を含み、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のC1~C10アルキルまたはC2~C10アルケニルおよびアルキニルとすることができる。OCH2nOmCH3、OCH2nOCH3、OCH2nNH2、OCH2nCH3、OCH2nONH2、およびOCH2nONCH2nCH32も適切であり、ここでnおよびmは1から約10である。他の適切なオリゴヌクレオチドは、C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリルアラアルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S〇2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA脱離基、レポーター基、挿入剤などから選択される糖置換基を含む。適切な修飾の1つは、2’-メトキシエトキシ2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-2-メトキシエチルまたは2’-MOEとしても知られているMartinら、Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。もう1つの適切な修飾は、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、OCH22ONCH32基2’-DMAOEとしても知られている、および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ2’-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2’-DMAEOEとしても知られている、すなわち2’-O-CH2-O-CH2―NCH32を含む。修飾されたオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の核酸塩基しばしば当業では単に塩基と称されるの修飾または置換を含むことができる。本明細書で用いられる場合、非修飾または天然の核酸塩基には、プリン塩基のアデニンAおよびグアニンG、ならびにピリミジン塩基のチミンT、シトシンCおよびウラシルUが含まれる。修飾核酸塩基には、5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、およびアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、2-プロピルおよびアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル-C=C-CH3ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシルプソイドウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾された核酸塩基には、フェノキサジンシチジン1H-ピリミド5,4-b1,4ベンゾオキサジン-23H-オン、フェノチアジンシチジン1H-ピリミド54-b1,4ベンゾチアジン-23H-オンなどの三環系ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン例えば、9-2-アミノエトキシ-H-ピリミド54-b1,4ベンゾオキサジン-23H-オン、カルバゾールシチジン2H-ピリミド4,5-bインドール-2-オン、ピリドインドールシチジンH-ピリド3’、2’:4、5ピロロ2,3-dピリミジン-2-オンなどのG-クランプGclampsを含む。複素環塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、7-デアザアデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンによって置換されたものも含んでよい。適切な酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼには、本明細書で以下に記述する酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが含まれる。例えば、図6に示す酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを使用することができる。一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドは、固体支持体不溶性支持体に共有または非共有結合される。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、ビーズ、プレート例えば、マルチウェルプレート、ストリップなどが挙げられ、不溶性支持体は、これに限定されないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロースなどを含む多種多様な物質を含有することができる。オリゴヌクレオチドプローブ検出ヌクレオチドは、RNA、DNAまたは任意のRNAまたはDNAの化学修飾されたもの、例えば、ペプチド核酸PNA、ロックド核酸LNAなどとすることができる。主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法は、1つまたは複数の洗浄ステップ、例えば、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドプローブ、任意の非特異的に結合された検出可能部分などの非特異的に結合された構成成分の除去を含むことができる。主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法の実施方法の非限定的な例は以下の通りである。標的ポリリボヌクレオチドが固体支持体に結合される。標的ポリリボヌクレオチドは未知の配列から成り、配列決定の対象となるRNAである。4種類の異なる既知のヌクレオチド配列の4本のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、異なるフルオロフォアフルオロフォア1~4を含む。これらのフルオロフォアは、FRET対のメンバーである。FRET対の相手となるメンバーは、量子ドットである。量子ドットは、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに結合される。酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間に形成された二本鎖に結合するが、開裂はしない。4本のオリゴヌクレオチドプローブのうち1本だけが、標的ポリリボヌクレオチドに結合して、標的ポリリボヌクレオチドとの間に二本鎖を形成する。洗浄ステップは、結合していないオリゴヌクレオチドプローブをすべて除去する。オリゴヌクレオチドプローブ-フルオロフォア2の結合の結果、標的ポリリボヌクレオチドとの間に二本鎖が形成される。フルオロフォア2は、したがって、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに結合された量子ドットに近接する位置に引っ張られ、蛍光はクエンチされる。ポリリボヌクレオチドの開裂方法本開示は、ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する方法を提供する。本方法は、一般に、ポリリボヌクレオチド基質の配列特異的な開裂に有利な条件下で、酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ例えば、Csy4エンドリボヌクレアーゼと基質ポリリボヌクレオチドを接触させることを伴う。ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する主題方法は、1基質ポリリボヌクレオチドから親和性タグを欠失する;25’端、例えば、基質ポリリボヌクレオチドがinvitroでmRNAに転写された位置に均一性を有する産生ポリリボヌクレオチドのポピュレーションを生成する;および3invitroまたはinvivoで細胞の遺伝子発現を調節する目的に利用することができる。基質ポリリボヌクレオチド基質ポリリボヌクレオチドおよび標的ポリリボヌクレオチドという用語は、本明細書では同義的に用いられ、配列特異的エンドリボヌクレアーゼによって、配列に特異的な形で結合されるポリリボヌクレオチドを指す。基質ポリリボヌクレオチドは、一本鎖とすることができる。場合によっては、基質ポリリボヌクレオチドは二本鎖である。エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂を行う。したがって、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、本明細書で認識配列または認識部位と呼称する特定の配列で、基質ポリリボヌクレオチドを結合および開裂する。認識配列は、テトラヌクレオチド配列、ペンタヌクレオチド配列、ヘキサヌクレオチド配列、ヘプタヌクレオチド配列、オクタヌクレオチド配列またはオクタヌクレオチドより長くすることができる。例えば、一部の実施形態においては、認識配列は配列長が9のリボヌクレオチド、10のリボヌクレオチド、11のリボヌクレオチド、12のリボヌクレオチド、13のリボヌクレオチド、14のリボヌクレオチド、15のリボヌクレオチド、16のリボヌクレオチド、17のリボヌクレオチド、18のリボヌクレオチド、19のリボヌクレオチドまたは20のリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、認識配列の5’の直近から開裂する。一部の実施形態においては、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、認識配列の3’の直近から開裂する。一部の実施形態において、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは認識配列内を開裂する。場合によっては、認識配列は二次的構造体の5’の直近である。場合によっては、認識配列は二次構造体の5’であり、その二次構造体から1ヌクレオチドnt、2nt、3nt、4nt、5ntまたは5nt~10nt以内に位置する。場合によっては、認識配列は二次構造体の3’の直近である。場合によっては、認識配列は、二次構造体の3’であり、その二次構造体から1ヌクレオチドnt、2nt、3nt、4nt、5ntまたは5nt~10nt以内に位置する。一部の実施形態において、基質ポリリボヌクレオチドは、XxX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15の構造体を含み、ここで、ヌクレオチドX1-X5はX11-X15と塩基対を組み、X1およびX15は、ステム構造のベースを形成し、X6、X7、X8、X9およびX10はループを形成し;構造は、例えば、通常のA型の螺旋構造である。一部の実施形態において、基質ポリリボヌクレオチドは親和性タグを含み;主題方法は、基質ポリリボヌクレオチドからの親和性タグの欠失を可能にする。配列特異的エンドリボヌクレアーゼ配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼとしては、金属イオンに依存しない形で基質ポリリボヌクレオチドを開裂加水分解する酵素的に活性なポリペプチドが挙げられる。配列特異的かつ金属イオンに依存しない形で、基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼの構造的特徴には、以下の1つまたは複数を含むことができる:1RNAのメジャーグルーブを通じた、RNAのリン酸骨格の配列非特異的認識のための塩基性の高いαヘリックス、例えば、R114、R115、R118、R119またはこれらに相当するもの;2RNAステムのメジャーグルーブと水素結合接触をする、R102および/もしくはQ104、またはこれらに相当するもの;3触媒作用に関与するHis29、Serl48およびTyrl76またはこれらに相当するものの1つまたは複数;および4F155またはこれに相当するもの。配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、図4に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有する、酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、図5に規定されたアミノ酸配列Csy4アミノ酸配列に対して、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有する、酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、Cas6アミノ酸配列に対して、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有する酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、CasEアミノ酸配列に対して、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98、少なくとも約99または100のアミノ酸配列同一性を有する酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、1~20例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のアミノ酸置換および/または挿入および/または欠失によって、図4または5のいずれか一方で規定されたアミノ酸配列とは異なる酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。反応条件配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、約15°Cから約100°Cの範囲、例えば、約15°C~約17°C、約17°C~約20°C、約20°C~約25°C、約25°C~約30°C、約30°C~約40°C、約40°C~約50°C、約50°C~約60°C、約60°C~約70°C、約70°C~約80°C、約80°C~約90°C、約90°C~約100°Cの範囲の温度で、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドを加水分解することができる。配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、約4.0から約8.0のpH範囲、例えば、pH約4.0~約45、pH約4.5~約5.0、pH約5.0~約5.5、pH約5.5~約6.0、pH約6.0~約6.5、pH約6.5~約7.0、pH約7.0~約7.5、pH約6.5~約7.5、pH約7.5~約8.0、pH約6.5~約8.0またはpH約5.5~約7.5のpH範囲で、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドを加水分解することができる。以下の実施例は、本発明を実施および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定する意図はなく、以下の実験が行なわれる実験の全てまたは唯一のものであるということを示すことも意図していない。用いられる数値例えば、量、温度などに関する正確性を保証する努力が払われているが、ある程度の実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。別段の表記がない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の温度であり、圧力は大気圧であるかその近辺である。標準的な略語、例えば、bp、塩基対単数または複数;kb、キロベース単数または複数;pl、ピコリットル単数または複数;sまたはsec、秒単数または複数;min、分単数または複数、hまたはhr、時間単数または複数;aa、アミノ酸単数または複数;kb、キロベース単数または複数;bp、塩基対単数または複数;nt、ヌクレオチド単数または複数;i.m.、筋肉内に;i.p.、腹腔内に;s.c.、皮下に;などが用いられていることもある。実施例1:Csy4ファミリーのタンパク質を使用した直接RNA検出および配列決定材料および方法野生型Csy4、点変異体およびセレノメチオニンSeMet置換Csy4を、Rosetta2DE3細胞で、His6-マルトース結合タンパク質MBP融合タンパク質またはHis6融合タンパク質のいずれかとして発現させ、Niアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、HisMBPタグのタンパク質分解による除去を行い、さらなるNi-アフィニティーステップを実施し、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。pre-crRNAをinvitroで、T7ポリメラ-ゼを使って転写し、変性ゲル上で精製した。30°Cで30分間、RNAをCsy4と一緒に2:1の割合でインキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにかけて複合体を形成した。複合体をハンギングドロップ法を使って、200mMクエン酸ナトリウムpH5.0、100mM塩化マグネシウム、20w/vポリエチレングリコールPEG-4000野生型WT複合体または150mM酢酸ナトリウムpH4.6、17PEG4000または160mM酢酸ナトリウムpH4.6、18PEG4000S22C含有複合体で結晶化した。SeMet置換結晶を使って、WTCsy4-RNA複合体の構造を、多波長異常分散MAD法により決定した。Csy4S22C-RNA複合体の構造を、分子置換により決定した。遺伝子注釈、クローニング、タンパク質の発現および精製。複数種間のCsy4遺伝子の比較配列解析は、PA14ゲノム中の注釈付き開始コドンの上流20コドンに保存領域があることを明らかにした。Leeら、GenomeBiol7,R902006。保存Csy4PA14_33300配列を、Pa14Csy4_fwd:caccatggaccactacctcgacattcgおよびPa14Csy4_rev:gaaccagggaacgaaacctccを使って、シュードモナスアエルジノーサPseudomonasaeruginosaUCBPP-PA14ゲノムDNAから、PCR増幅した。ポリメラ-ゼ連鎖反応PCRの産生物をGatewayシステムを使って、pENTR/TEV/D-TOPOエントリーベクターInvitrogen社にクローニングした後、部位特異的組換えにより、発現ベクターpHGWAまたはpHMGWAを得た。Bussoら、AnalyticalBiochemistry343,313-3212005。QuikChangeSite-DirectedMutagenesisキットStratagene社を使って、Csy4に点変異を導入した。Pa14Csy4発現プラスミドをE.coli大腸菌Rosetta2DE3細胞Novagen社に形質転換するか、またはGeneartドイツ、Regensburgを使って合成されたCRISPRRNAを発現するpMKベクターと同時形質転換した。Rosetta2DE3細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補給したL培地LBで培養した。タンパク質発現を、~05ODの細胞密度で、05mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGAffymetrix社を使って誘導した後、18°Cで16時間振とうした。細胞をペレットし、溶解緩衝液15.5mMリン酸水素二ナトリウム、45mMリン酸二水素ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、10mMイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤、5グリセロール、0.01TritonX-100、100μ/mlDNaseI、1mMTris[2-カルボキシエチル]ホスフィン塩酸塩TCEP、05mMフッ化フェニルメチルスルホニル、pH7.4で再懸濁し、10秒のバーストで2分間、氷上で超音波分解した。溶解物を遠心分離24,000xg、30分して清澄化し、ニッケル-ニトリロ三酢酸Ni-NTAアフィニティー樹脂でインキュベートし、バッチQiagen社に結合した。結合したタンパク質を高イミダゾール緩衝液155mMリン酸水素二ナトリウム、4.5mMリン酸二水素ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、300mMイミダゾール、1mMTCEP、5グリセロール、pH74を使って溶出し、透析緩衝液イミダゾールをわずか20mM含む溶出緩衝液中でタバコエッチ病ウイルスTEVの存在下で一夜透析し、His6またはHis6MBPタグを開裂した。タンパク質を濃縮しAmicon社、ニッケルアフィニティーカラムGEで精製した後、ゲル濾過緩衝液100mMHEPESpH7.5、500mMKCl、5グリセロール、1mMTCEP中でタンデムSup7516/60カラムにかけた。続いて試料を150mM塩化カリウムのみを含むゲル濾過緩衝液に対して透析した。セレノメチオニンSeMet誘導体化タンパク質の調製にも同様のプロトコルを使用したが、唯一留意すべき違いは発現培地であった。簡単に説明すると、WiedenheftらのStructure17,904-9122009で既に記述されていたように、Csy4pHGWA発現ベクターを使って形質転換したBL21DE3細胞をアンピシリンを補充したM9最小培地で培養した。ヌクレアーゼ活性アッセイ。75pmolの野生型または変異型Csy4を、5pmolのinvitroで転写されたPa14pre-crRNA上記のWiedenheft2009の文献の記述に従って調製したと一緒に20mMHEPESpH7.5、100mM塩化カリウム緩衝液を含有する10μl反応液で5分間、25°Cでインキュベートした。50μl酸性フェノールクロロホルムAmbion社を添加して、反応をクエンチした。10μlの追加反応緩衝液を添加し、試料を遠心分離し16000xg、30分、16μl水性試料を除去し、2Xホルムアミドローディング緩衝液と1:1で混合し、15変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。SYBRGold染色Invitrogen社でRNAを可視化した。結晶化。結晶化実験は全て等量1μl1μlの複合体とリザーバー溶液を混合することにより、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使って、18°Cで実施した。野生型Csy4-RNA複合体の円盤状の結晶を、200mMクエン酸ナトリウムpH5.0、100mM塩化マグネシウム、20w/vポリエチレングリコール-4000PEG4000中で培養した。これらの結晶は、空間群C2に属し、非対称単位中に複合体1個を含み、シンクロトロンX線源において、分解能23Åの回折を示した。Csy4S22C点変異体を用いて再構成した複合体を使って、150mM酢酸ナトリウムpH46、17w/vPEG4000および160mM酢酸ナトリウムpH4.6、18PEG4000中でさらに2つの結晶形を得た。最初に、六角形の結晶が24時間以内に現れた。これらの結晶は、分解能2.6Åの回折を示し、空間群P61に属し、非対称単位中に複合体1個を含んでいた。48時間後に、同一の結晶化条件から、空間群P212121に属し、複合体を2個含み、分解能最大1.8Åの回折を示す針状の結晶が生じた。データ収集のために、全ての結晶形を、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、30グリセロールを補充したそれぞれの母液に浸漬することにより、凍結保護した。構造決定。我々は全ての回折データをAdvancedLightSourceLawrenceBerkeleyNationalLaboratoryのビームライン8.2.2および8.3.1で100Kで収集した。データはXDSを使って処理した。Kabsch,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,125-1322010。実験フェーズはセレノメチオニン置換野生型Csy4を含む単斜晶系Csy4-RNA結晶を使って、3波長多波長異常分散MAD実験ピーク、屈曲およびリモートデータセットから確定した。PhenixパッケージのHybridSubstructureSearchHySSモジュールを使って、2つのセレン部位を特定した。Grosse-KunstleveおよびAdams.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr59,1966-19732003。下部構造の精密化、フェージングおよび密度修正は、AutoSHARPを使って実行した。Vonrheinら、MethodsMolBiol364,215-2302007。出来上がった電子密度マップは、c軸上で交互に現れるタンパク質とRNAとに拠る明確な密度の層を示し、RNA層は、キッシングループkissingloop相互作用に関与している2つの同軸にスタックしたRNA螺旋で構成されている。Csy4タンパク質の初期の原子モデルは、PhenixAutoBuildモジュールを使って自動作成により得た。Terwilligerら、ActaCrystallogrDBiolCrystallogr64、61-692008。複合体モデルは、COOTで手動作成の反復サイクルによって完成されEmsleyおよびCowtan,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60,2126-21322004、精密化は、ネイティブ2.33Å分解能データセットに対照して、Phenix.refine36Adamsら、ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,213-2212010を使って行い、結晶学的Rwork因子が21.4およびRfree因子が26.4の最終モデルを得た表1。このモデルには、RNAヌクレオチドC1~G15およびヌクレオチドC16のリン酸基およびタンパク質残基1~104、109~120および139~187が含まれる。結晶格子におけるタンパク質およびRNAの階層化された配列ならびにRNA層内での横方向結晶接触の欠如が原因で、著しく上昇した温度因子100Å2およびU9のヌクレオチド塩基に対する解釈可能な密度の欠如により証拠づけられているように、RNAの無秩序さは顕著である。この無秩序さは、RNAのメジャーグルーブに挿入されたアルギニンの豊富な螺旋に対応している、タンパク質残基109~120でも明白であり、ここに対してはポリペプチド骨格のみを作成することができた残基Arg115およびArg118を除く。六角形および斜方晶系の結晶形におけるCsy4S22C-RNA複合体の構造を、アルギニン豊富な螺旋を有さないCsy4タンパク質および単斜晶系結晶形からのRNAモデルを別個の検索アンサンブルとして使い、PhaserMcCoyら、JApplCrystallogr40,658-6742007で、分子置換によって確定した。どちらの結晶形でも、アルギニン豊富な螺旋およびCsy4残基105~108から成るリンカー領域の電子密度は、分子置換解から得た2Fo-Fcマップソリューションでも即座に認識できた。六角形のCsy4S22C-RNA複合体の構造は、2.6Åの分解能にてRwork因子25.5およびRfree27.9に精密化した。最終モデルには、Csy4残基1~120および139~187ならびにRNAヌクレオチドC1~G15、これらに加えて、ヌクレオチドC16のリン酸基が含まれる。優れた立体化学により、Csy4S22C-RNA複合体の斜方晶系の結晶形を18Å分解能で解明し、Rwork因子187およびRfree220に精密化した。非対称単位内の2つの複合体のうち、複合体1鎖AおよびCには、Csy4残基1~187およびRNAヌクレオチドC1~G15、これらに加えてヌクレオチドC16のリン酸基が含まれるのに対し、より無秩序な複合体2鎖BおよびDは、残基13~15および135~138これらは秩序だった電子密度を示さないを除き、Csy4残基1~187、およびRNAヌクレオチドC1~G15およびヌクレオチドC16のリン酸基を含む。2個のCsy4は、179のCα原子の上で1.15Åのrmsdと重なるが、最大の違いはアルギニン豊富な螺旋のわずかに異なる位置から生じている。非対称単位内の2つのRNA分子は、1.49Åのrmsdと重なるが、最大偏差は突き出したヌクレオチドU9が原因であり、これは2つのRNAで異なる配座を取る。この原稿全体を通して、構造の説明は斜方晶系の複合体1に基づいている。全てPymolhttpwwwドットpymolドットorgを使って生成した。結果CRISPRが媒介する免疫は、配列決定されたゲノムにおいてCRISPR遺伝子座が存在することから、古細菌ゲノムの約90および細菌ゲノムの約40で発生すると考えられている。HorvathおよびBarrangou,Science327,167-1702010;Jansenら、MolecularMicrobiology43,1565-15752002;Sorekら、NatRevMicrobiol6,181-1862008;MarraffiniおよびSontheimer,NatRevGenet11,181-1902010。既知の8種のCRISPR/Casサブタイプに属すCRISPR系Casタンパク質は、1次配列レベルで非常に相違しているため、機能的相同体を識別しにくくしている。Haftら,PLoSComputBiol1,e602005;Makarovaら,BiologyDirect1,1-262006。シュードモナスアエルジノーサPseudomonasaeruginosaUCBPP-PA14以降、Pa14は、エルシニア属のCRISPR/Cas系が潜んでいるグラム陰性日和見病原体であり、2個のCRISPR要素が両側に位置する6個の遺伝子を含む図1A。Cas1は、CRISPR含有生物体の間で普遍的に見出せ、Cas3は、ほとんどのサブタイプで顕著であるが、Csy1~4は、エルシニア属に特有である。どちらのCRISPR要素も、~32のヌクレオチド固有のスペーサーその一部は、バクテリオファ-ジまたはプラスミドに見られる配列と一致するが間に挿入されている、どちらのCRISPR内でも1個のヌクレオチドを除き同一の28ヌクレオチド反復の特徴的な配列を含む。Grissaら,BMCBioinformatics8,1722007。多くの生物体では、CRISPR遺伝子座は、長い単一単位として転写され、転写後に処理されて、各々が反復要素から派生した配列が両側を占める1つの固有配列を含むcrRNAを作り出していることが明らかにされた。Brounsら,Science321,960-9642008;Carteら,GenesandDevelopment22,3489-34962008;Tangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,7536-75412002;Lillestolら,Archaea2,59-722006;Lillestolら,MolMicrobiol72,259-2722009;Tangら,MolecularMicrobiology55,469-4812005。エルシニア属における長いCRISPR転写産物pre-crRNA由来のcrRNAの産生に関与するタンパク質を同定するために、Pa14由来の6種類のCasタンパク質の各々を組換えにより発現させ、組換えで発現したタンパク質を、invitroで転写したpre-crRNAを使って、エンドリボ核酸分解機能の有無についてテストした。配列特異的pre-crRNA処理活性に基き、Csy4は、crRNA反復発生に関与するエンドリボヌクレアーゼであることが明らかになった。2つの他のCRISPR/Casサブタイプ内でのcrRNA処理について洞察されているように上記のBrounsら2008;上記のCarteら2008、CRISPR転写産物の開裂は急速で金属イオンに依存しない反応である。Csy4は、5’端および3’端で両側を反復配列のそれぞれ8個または20個のヌクレオチドが占める32ヌクレオチドの固有ファージ誘導配列から成る~60ヌクレオチドのcrRNAを生成する予測されたステムループ構造のベースとなる反復要素内でpre-crRNAを開裂する図1A。Csy4が効果的であるためには、そのRNA認識機構はCRISPR誘導転写産物だけを標的とし、ヘアピンおよび/または関連配列を含むその他の細胞RNAは標的としないように、高度に特異的でなければならないという仮説が立てられた。これを試験するために、Csy4を大腸菌E.coliのみで発現させるか、またはPa14CRISPRRNAと共発現させた。高い等電点PI=102にも関わらず、Csy4は細胞核酸には結合しない;しかし、PA14CRISPR共発現させると、このタンパク質は、crRNAと結合する図1B、C。このような洞察は、Csy4認識の特異性を強調するものだったので、我々はCsy4基質の認識および開裂に必要とされるタンパク質/RNA相互作用を探求することにした。Csy4の結合および活性アッセイを、28ヌクレオチドPA14CRISPR反復配列の異なる領域に対応するRNAオリゴヌクレオチドを使って、invitroで実行した。このアプローチを使って、反復誘導ステムループおよび1個の下流ヌクレオチドから成る、Csy4により認識される最小RNAフラグメントを同定した。この最小RNAを基質として活用する開裂アッセイでは、Csy4活性には、開裂部位のすぐ上流のリボースに2’OHを必要とすることが明らかになった。この位置にある2’デオキシリボースは、開裂を完全に無効にするが、Csy4の結合を分断することはない。crRNAの認識および開裂について構造的な識見を得るために、Csy4を最小RNA基質と複合して共結晶化した。構造解析のための安定した複合体を生成するために、開裂部位の直前のヌクレオチドが2’デオキシヌクレオチドである、上述の開裂できない16ヌクレオチドの最小RNA基質にCsy4を結合させた。複合体の結晶を、それぞれが異なる結晶充填を示す3つの固有の空間群として得た;1つには、野生型Csy4が含まれ、2つにはCsy4点変異体が含まれた。Csy4-RNA複合体の結晶構造を、1.8Åの分解能まで解明し図2A、表1、CRISPRRNAがCRISPRが媒介するサイレンシングマシナリーにより認識され、使用に備えて処理される予想外の機構を明らかにした。Csy4は、CRISPR反復配列のステムループのメジャーグルーブで配列特異的接触を行い、RNAステムのリン酸骨格と追加の配列非特異的接触を行う。特徴付けられたタンパク質/RNA相互作用の大半は、RNA螺旋のマイナーグルーブを介して媒介される;Csy4によるRNAメジャーグルーブの認識は、タンパク質/RNA相互作用の極めて異例な機構である。1次配列レベルにおいて、Csy4は、crRNA生合成に関与するほかの既知のエンドリボヌクレアーゼサーマスサーモフィルスThermusthermophiles由来のCasEEbiharaら,ProteinSci15,1494-14992006およびピュロコックスフリオススPyrococcusfuriosus由来のCas6Carteら2008前記参照とは非常に異なっており、わずか~10しか同一性を共有していない。CasEおよびCas6のどちらの結晶構造も、これらのタンパク質がタンデムなフェレドキシン様フォールドを採用していることを示している。特筆すべきことに、Csy4は、これらの酵素とこのフォールドを共用している;Csy4-RNA複合体では、Csy4のN末端ドメイン残基1~94は、実際に、フェレドキシン様フォールドを採用している。しかし、C末端ドメイン残基95~187は、フェレドキシン様フォールドと同一の二次構造結合性を共有しているが、その配座は著しく異なっている。際立っているのは、推定上のC端末フェレドキシンドメインからのアルギニン豊富な螺旋残基108~120がヘアピンRNAのメジャーグルーブに挿入される。DALIサーバーを使った構造の重ね合わせHolmおよびSander,JMolBiol233,123-1381993は、そのRNA座位でのCsy4は、CasEおよびCas6と、それぞれCa原子111個に渡って3.8Åの標準偏差rmsdとCa原子104個に渡って3.9Åの標準偏差で重なり合うことを示している。Csy4、CasEおよびCas6は、類似のタンパク質フォールドを維持しながら、CRISPR座位の反復配列と共進化したので、配列レベルで著しく分岐した単一の先祖エンドリボヌクレアーゼの子孫かもしれない。crRNA基質は、このサブクラスのcrRNA反復に対して予測されていたKuninら,GenomeBiol8,R612007ように、ヌクレオチド1~5および11~15の塩基対によって正規のA型螺旋ステムを作り出し、ヘアピン構造を形成する。GUAUAペンタループは、せん断されたG6-A10塩基対および突出したヌクレオチドU9を含んでおり、その構造は酵母U6核内低分子RNA分子内ステムループHupplerら,NatStructBiol9,431-4352002内およびバクテリオファ-ジラムダBoxBRNALegaultら,Cell93,289-2991998に見られるGNRNAペンタループを連想させる。Csy4-RNA複合体では、RNAステムループは、Csy4のβ7~β8のストランドによって形成されたβヘアピンをまたがっており、C1-G15塩基対は、Phel55の芳香族側鎖に直接スタックしている図2B。これはRNAステムを固定し、適切な角度に方向付けて、メジャーグルーブでの配列特異的相互作用を可能にする。Csy4の本体をアルギニン豊富な螺旋、Arg102およびGln104に連結するリンカーセグメント内の2つの残基は、RNAステムのメジャーグループ内で水素結合接触し、配列特異的にそれぞれG15およびA14を認識する図2B。Csy4-crRNA相互作用は、突出したヌクレオチドU9の近接位置で、アルギニン豊富な螺旋がRNAヘアピンのメジャーグルーブに挿入されることにより、さらに安定化される図2C。Arg114、Arg115、Arg118およびArg119の側鎖はヌクレオチド2~6のリン酸基に接触する。さらに、Arg115の側鎖は、アルギニン豊富な螺旋とRNAヘアピンとの間の唯一の配列特異的相互作用として、G6塩基と会合する。興味深いことに、この相互作用は、特定のウイルスタンパク質が、dsRNA分子のメジャーグルーブと相互作用する方法、例えばtheinヒト免疫不全ウイルスHIV23におけるTat/Tar相互作用およびラムドイドファージにおけるラムダ-N/boxA複合体などを、非常に連想させるCaiら,NatureStructuralBiology5,203-2121998。どちらのCasEも、塩基性の高いα螺旋が、RNAのメジャーグルーブを通して、RNAのリン酸骨格による配列非特異的認識に使われている。Csy4は、CRISPR反復配列のヘアピン要素を認識し、そのすぐ下流を開裂する。この実施例に記述した構造には、基質擬態RNAが含まれており、これは開裂には不適である。活性部位において、最後から2番目のヌクレオチドのリン酸基3’についてのみ、密度が観察されたが、恐らくはこのヌクレオチドの柔軟性が原因で、末端の糖または塩基には密度は観察されなかった図3A。解離しやすいリン酸塩は、一方の側のβ7-β8ヘアピンのβターンと、もう一方の側の以前にCas6およびCasEで識別されていた螺旋α1とグリセリン豊富なループとの間に位置するポケットに結合する。そのリン酸基に近接する3つの残基、His29、Ser148およびTyr176は、触媒作用に参加する可能性が高い。これらの残基は、BLAST検索Altschulら,NucleicAcidsResearch25,3389-34021997を使い、近傍のCRISPR座位の手動による検証Grissaら,BMCBioinformatics8,1722007を併用して同定した12のCsy4配列間で不変である図4。構造は、Csy4内の複数の残基が、基質の認識/結合および触媒作用の媒介に重要であることを示唆している。これらの残基の各々の点変異体を生成し、それらの開裂活性を生化学的に試験した図3B。推定上の触媒部位の残基His29またはSer148の変異は、開裂活性を無効化する。ただし、Tyr176がフェニルアラニンに変異しても、活性は中断しない。これはTyr176が、触媒作用には直接関与しないが、His29の方向付けに重要な役割を担っている可能性を示唆している。Arg102がアラニンに変異すると、crRNAの蓄積が止まるが、Gln104がアラニンに変異しても活性はほとんど中断されない。これはArg102が末端の塩基対を認識し、RNA基質の適切な方向付けに重要であるが、Gln104はinvitro活性に必要とされていないことを示唆している。Phe155は、RNA基質の適切な方向付けに大きな役割を担っているように見える。この残基でのアラニンの変異はcrRNA生合成を大きく阻害するからだ。RNA開裂の媒介に関与しているセリンの同定は、予測外である。His29がアラニンに変異すると、Csy4は触媒活性が不活性になるが、リジンに変異すると、活性は部分的に回復する。これはHis29が、求核攻撃によって開裂を開始するのではなく、プロトンドナーとして動作していることを強く示唆している。CRISPRは、侵入してくる遺伝的要素に対応する同種の配列に免疫系を誘導することを低分子CRISPR誘導RNAに依存している核酸を基礎とする免疫系の遺伝記憶である。CRISPR反復配列の系統発生解析によって、Cas遺伝子の特定のセットと相関する明確なCRISPRカテゴリーが識別されたKuninら,GenomeBiol8,R612007。特定のCRISPR反復配列タイプと一緒にCas遺伝子が変動することは、CRISPR反復は、CRISPRの適合、crRNAの生成および侵入遺伝要素のサイレンシングに関与するCas遺伝子と共進化したことを示唆している。ここに記述した構造は、配列特異性および構造特異性の両方に基いて、crRNA基質を区別する異例な認識機構の詳細を示し、Csy4およびその同位種が全ての細胞RNAの中で基質RNAを容易に区別できる能力について大きな洞察を与えてくれる。図1A~C。Pa14Csy4は、そのpre-crRNA基質のみを特異的に認識する。aPa14におけるCRISPR/Cas座位の概略図。6個のCas遺伝子は両側をCRISPR遺伝子座によって占められている。拡大図は32ヌクレオチドスペーサー配列青によって分離された28ヌクレオチド直接反復黒い文字の予測ステムループを示す概略図である。赤い矢印は、Csy4により開裂された結合を指している。b,cPA14CRISPR座位を含むプラスミドのある場合とない-場合での大腸菌E.coliでのPa14Csy4発現後のタンパク質bおよびRNAの内容cの比較。どちらの調製物からも精製したCsy4を2つのプールに分割した。半分はSDS-PAGE上で分解し、クマシーブルー染色で可視化した;半分は酸性フェノールクロロホルム抽出し、UREA-PAGE上で分解し、SYBRGoldInvitrogen社を使って可視化した。図2A~2C。RNA基質に結合したCsy4の結晶構造。a複合体の前面図および背面図。Csy4を青色で示し、RNA骨格をオレンジ色で示してある。b残基R102とQ104およびヌクレオチドA14とG15との間の詳細相互作用。水素結合を点線で示してある。cアルギニン豊富なαヘリックスとRNA骨格とG6との間の詳細相互作用。図3Aおよび3B。推定の活性部位。a触媒中心の詳細図。bCsy4の開裂活性。野生型WTCsy4および一連の単一点変異体をinvitroで転写したpre-crRNAと一緒に、25°Cで5分間、インキュベートした。C産生物を酸性フェノールクロロホルム抽出し、UREA-page上で分解し、SYBRGold染色により可視化した。実施例2:直接RNA配列決定フェルスター共鳴エネルギー移動FRETを使って、単一分子レベルでRNAの配列を決定することができる。配列決定の対象RNAは、その3’リボースを通じて、固体表面に付着される。RNAは、単一分子レベルでの検出を可能にするのに十分なだけの間隔を、表面上で、近隣のRNA分子から取られなければならない。間隔は、放射光の波長に応じて、回折を制限する方法により決定される。あるいは、超分解能イメージング法を使用する場合、RNA間隔は、回折の限界よりも接近させることができる。第1の配列検出ステップでは、既知の核酸結合特異性のCsy4ファミリータンパク質を、検出ヌクレオチドのプールと一緒に配列決定の対象RNAに添加する。検出ヌクレオチドの1つが、配列決定の対象RNAとの間に4塩基対の二重螺旋を形成できる場合、Csy4タンパク質は、配列決定の対象RNAにのみ結合する。さらに、検出ヌクレオチドは、Csy4タンパク質が安定して結合するためには、配列決定の対象RNA中の4塩基対認識配列の追加の3ヌクレオチド3’と塩基対を形成しなければならない。検出ヌクレオチドには、4ヌクレオチド認識配列の3ヌクレオチドの3’の拡張子が含まれる。検出ヌクレオチドのプールでは、3ヌクレオチド拡張子は、定義された5’ヌクレオチドを有し、その後ろに2つのランダムなヌクレオチド配列部位が続く;または5’の配列部位にランダムなヌクレオチドを有し、その後ろに定義されたヌクレオチドおよびランダムなヌクレオチドが続く;または5’末端に2つのランダムなヌクレオチドを有し、その後に定義されたヌクレオチドが続く。これらのプールのいずれにおいても、定義されたヌクレオチドは、付着した蛍光性分子その発光または励起スペクトルはヌクレオチドによって定義されているに基いて既知である。Csy4タンパク質を、検出ヌクレオチドに付着した蛍光性分子の発光スペクトルとオーバーラップする励起スペクトルを有する量子ドットに付着させる。検出ヌクレオチドとCsy4が結合した後、過剰な試薬を洗い流す。検出ヌクレオチドが配列決定の対象RNAとの間に7ヌクレオチドの二重螺旋を形成した場合に限り、陽性結合事象が検出される。結合が発生した場合、配列決定の対象RNA、検出ヌクレオチドおよびCsy4タンパク質の3要素から成る複合体を、検出ヌクレオチドに付着させた蛍光分子からCsy4タンパク質に付着させた量子ドットへのFRETにより検出することができる。結合のサイクルが終わるごとに、Csy4タンパク質および検出ヌクレオチドを、化学変性および/または熱変性ならびに洗浄を使って試料から除去する。以降の配列決定ステップでは、異なる配列特異性の他のCsy4タンパク質およびそれらに対応する検出ヌクレオチドを同様の方法で配列決定の対象RNAと一緒にインキュベートする。検出ヌクレオチド上での3ヌクレオチド拡張子の差異は、検出ヌクレオチドの5’末端または3’末端のいずれかでの異なる長さの拡張子など、想定することができる。検出ヌクレオチドは、RNA、DNAまたはこれらのポリマーの化学修飾型、例えば、PNAまたはLNAであってもよい。実施例3:誘導配列特異的エンドリボヌクレアーゼ生化学的および構造的技法を通じて、基質結合活性は維持しながら、開裂活性を欠くCsy4の点変異体を生成した。1つの例は上述したCsy4H29A変異体である。そのままでは触媒的に不活性な異性体Csy4H29A変異体を外因性イミダゾールの存在下では、再活性化させることができる。150mMから300mMの間でイミダゾールを反応緩衝液に添加するだけで、野生型に近い開裂活性を刺激するのに十分である。結果を図8に示す。図8は、イミダゾールによる救済を示す開裂活性アッセイである。Csy4H29Aは、kdが1nM未満で、RNA基質に対する結合能は維持しているCsy4の酵素的に不活性な変異体である。反応の詳細:各10μlの反応液は、5pmolのinvitroで転写したpre-crRNA基質、100pmolのCsy4図8に示されているように、WTまたはH29A、20mMHEPESpH7.5、100mMKClおよび前記のように、150~300mMイミダゾールを含有する。反応は25°Cで30分間実施した。産生物を酸性フェノールクロロホルム抽出し、15変性ゲルで分離し、SYBRGoldを使って可視化した。Csy4H29Aの生化学的特性は、1nM未満の親和性でそのRNA基質と結合することを示している。Csy4H29Aは、現在、代わりになるアプローチが存在していないinvivoおよびinvitroのどちらの用途にも、有用である。Csy4H29A本明細書では誘導Csy4とも称するは、RNAおよびRNPの複合混合物RNAタンパク質複合体由来の特定のRNAタンパク質複合体RNPを精製する場合に有用である。例えば、研究者はどのタンパク質がある特定のRNA転写産物に結合するのか理解することに関心を持っているかもしれない。この系を使用すれば、研究者はステムループCsy4標的配列から成る5’タグを含む、選択したRNAのための発現構築体を操作することができる。続いて、研究者がこの発現構築体を選んだ細胞種別に導入すれば、多くのRNAおよびRNPが生成される。続いて細胞を溶解し、溶解物をアガロースビーズビースに固定化された誘導Csy4を含むカラムに注入する。Csy4標的配列を有するRNAまたはRNPが結合する。以降の洗浄ステップでは、非特異的に結合したRNAを洗浄する。イミダゾール~300mMで洗浄すると、誘導Csy4が活性化し、標的配列を開裂し、結合したRNA/RNPが解放される。この方法は図9に概略が示されている。同様の方法が、invitroでRNPを組み立てる場合にも有用になり得る。例えば、上記の実験のために設計した発現プラスミドと類似の構築体を使って、選択したRNPをinvitroで転写することもできる。構築体は転写したRNAの5’末端にてCsy4ステムループ標的配列を導入しなければならない。続いて、このinvitroで転写した産生物を既知のタンパク質と一緒にインキュベートするか、または懸濁して、特定の転写産物と結合させることができる。誘導Csy4含有カラムは、invitroで形成されたRNPを遊離タンパク質から除去する目的にも使用することができる。実施例4大半の細菌および古細菌に存在するCRISPR免疫系の必須成分vanderOostら,TrendsBiochemSci.34,401-72009、エンドリボヌクレアーゼCasEによる特異的基質認識のための機構を確定した。構造的および生化学的方法を使って、最適な基質開裂のために必要とされる最小RNA配列、7個の塩基対ステムループの後に2つの不対ヌクレオチドが続く20ヌクレオチド配列5~24のCRISPR反復配列を同定した。サーマスサーモフィルスThermusthermophilus由来のCasEに結合したこのRNAの構造をX線結晶学を使って、2.0Åの分解能で解明した。この構造は、RNAのメジャーグルーブにおける複数の相互作用も含めて、タンパク質とRNAとの間の数多くの配列特異的接触を明らかにした。ステムループの末端塩基対は分断され、A22は螺旋から飛び出し、U23によって塩基がスタックしている。この座位は、S34およびE38との相互作用により部分的に安定化され、基質認識のための配列特異性も与えている。末端ヌクレオチド、G24を配置して、元に戻るように反転させ、ステムループと一致するが、残基D18、E24およびK31で構成される結合ポケット内の螺旋のずっと下に常駐し、R27がU23とG24との間にある骨格に接触するようにすることで、cA22およびU23座位はさらなる安定化する。A22を配置すると、解離しやすいリン酸塩の位置でRNAの骨格が伸張し、2つの活性部位残基、Y23とH26との間で広がる。この洞察およびG24結合によりこのRNA座位が安定化したように見えることから、触媒座位にRNAを配置するためには、G24が必要とされる可能性があるという仮説を立てた。G24結合に関与するタンパク質残基が変異した場合と同様、G24が欠失または変異すると、開裂活性が著しく低下することは、この仮説と一致している。G24の触媒RNA座位を誘導する際のG24の役割を確認するために、端末G24残基を持たない19ヌクレオチドRNAに結合したCasEの構造を確定した。この複合体は2種類の異なる形に結晶化し、2つの異なるRNA座位タンパク質の活性部位を示した。1つの結晶形P21において、2.5Å構造には、非対称単位に8分子が含まれた。8分子の全てにおいて、ステムループの残りと一緒にA型形状を維持しながら、A22塩基はG21によってスタックしていることが明らかになった。RNA構造の変化に加えて、タンパク質構造も2.0Å構造で観察された触媒座位から異なっている。この構造では、R158およびK160を含むループは、活性部位と並置しており、これらの残基が触媒作用においてまたは遷移状態中間の安定化において役割を果たしている可能性を示唆している。2.5Å構造では、このループは活性部位から遠位にあり、部分的に無秩序化している。これはループの配置に柔軟性があることを示唆している。興味深いことに、このループは、CasEのアポ構造でも無秩序でありEbiharaら,ProteinSci.15,1494-92006、このループの安定化のためには、正確なRNA座位が必要であることを示唆している。CasE/19ヌクレオチドRNA複合体に対して得た第2の結晶形P212121を使って、1.5Å構造を確定した。これはA22およびU23が螺旋から飛び出した触媒配座でRNAが結合していることを明らかにした。しかし、R158およびK160を含むループは、この構造中に無秩序状態で留まった。これは、このタンパク質構造の安定化に、G24の結合も必要である可能性を示唆している。同一の複合体に対する2つの異なるRNA配座の洞察は、RNAが複数の構造状態をサンプリングする可能性およびG24が触媒的に適切な座位にロックされることを必要とする可能性を示唆している。本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、種々の変化を加えることが可能であり、そして等価物が本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の目的、精神および範囲に対して、特定の状況、物質、組成物、プロセス、工程段階または工程に多くの改変を適合させることが可能である。このような改変の全てが本明細書に添付される特許請求の範囲内であるものとする。"