"細菌及び界面活性剤Aを含有する培養液を用いて成長因子を分泌生産する成長因子の生産方法。細菌と界面活性剤Aとを共存させる時間が1~70時間である請求項1に記載の成長因子の生産方法。培養液の体積を基準とした乾燥菌体密度が0.1g/L~11.5g/Lである請求項1又は2に記載の成長因子の生産方法。本発明は、エンドトキシンが少ない成長因子の生産方法を提供することを目的とする。本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に至った。すなわち、本発明は細菌及び界面活性剤Aを含有する培養液を用いて成長因子を分泌生産する成長因子の生産方法である。本発明の成長因子の生産方法は、生産した成長因子1g当たりのエンドトキシンが少ない成長因子を生産することが可能である。本発明の成長因子の生産方法は、細菌及び界面活性剤Aを含有する培養液を用いて成長因子を分泌生産する生産方法である。本発明における細菌として、以下に例を挙げるがこれに限定するものではない。細菌は、真正細菌及び古細菌が含まれる。真正細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌Escherichia、サーマス属菌Thermus、リゾビウム属菌Rhizobium、シュードモナス属菌Pseudomonas、シュワネラ属菌Shewanella、ビブリオ属菌Vibrio、サルモネラ属菌Salmonella、アセトバクター属Acetobacter、シネコシスティス属Synechocystis属等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属Bacillus、ストレプトマイセス属Streptmyces、コリネバクテリウム属Corynebacterium、ブレビバチルス属Brevibacillus、ビフィドバクテリウム属Bifidobacterium、ラクトコッカス属Lactococcus、エンテロコッカス属Enterococcus、ペディオコッカス属Pediococcus、リューコノストック属Leuconostoc及びストレプトマイセス属Streptomyces等に含まれる細菌が挙げられる。これらのうち、成長因子の生産性の観点から、グラム陰性菌が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属であり、より好ましくは大腸菌である。本発明の成長因子の生産方法で使用される界面活性剤Aは、両性界面活性剤A1、アニオン性界面活性剤A2、ノニオン性界面活性剤A3及びカチオン界面活性剤A4からなる群より選ばれる少なくとも1種の界面活性剤が含まれる。両性界面活性剤A1としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤A1-1、硫酸エステル塩型両性界面活性剤A1-2、スルホン酸塩型両性界面活性剤A1-3及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤A1-4等が含まれる。カルボン酸塩型両性界面活性剤A1-1としては、アミノ酸型両性界面活性剤A1-1-1、ベタイン型両性界面活性剤A1-1-2及びイミダゾリン型両性界面活性剤A1-1-3等が挙げられる。アミノ酸型両性界面活性剤A1-1-1としては、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、下記一般式1で示される化合物等が挙げられる。[R-NH-CH2n-COO]mM1一般式1中、Rは炭素数1~20の1価の炭化水素基である。nは1以上の整数である。mは1又は2の整数である。Mはプロトン;又はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムアミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む及び第4級アンモニウム等の1価又は2価のカチオンである。また、A1-1-1として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等;アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等及びN-ラウロイル-N’-カルボキシメチル-N’-ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。ベタイン型両性界面活性剤A1-1-2は、分子内に第4級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤である。A1-1-2は下記一般式2で示される化合物が挙げられる。A1-1-2として具体的には、アルキルジメチルベタインステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等、アミドベタインヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等及びアルキルジヒドロキシアルキルベタインラウリルジヒドロキシエチルベタイン等、硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等が挙げられる。R-NCH32-CH2COO2一般式2中、Rは炭素数1~20の1価の炭化水素基である。イミダゾリン型両性界面活性剤A1-1-3としては、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤;ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤;コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸CHAPS、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ2-ヒドロキシプロパンスルホン酸CHAPSO;ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。アニオン性界面活性剤A2としては、エーテルカルボン酸A2-1及びその塩、硫酸エステルA2-2又はその塩、エーテル硫酸エステルA2-3及びその塩、スルホン酸塩A2-4、スルホコハク酸塩A2-5、リン酸エステルA2-6及びその塩、エーテルリン酸エステルA2-7及びその塩、脂肪酸塩A2-8、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等等が挙げられる。エーテルカルボン酸A2-1又はその塩としては炭化水素基炭素数8~24を有するエーテルカルボン酸及びその塩が含まれる。A2-1又はその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。硫酸エステルA2-2及びその塩としては、炭化水素基炭素数8~24を有する硫酸エステル及びその塩が含まれる。A2-2及びその塩として具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。エーテル硫酸エステルA2-3及びその塩としては、炭化水素基炭素数8~24を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が含まれる。A2-3及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。スルホン酸塩A2-4としては、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。スルホコハク酸塩A2-5としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。リン酸エステルA2-6又はその塩としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。エーテルリン酸エステルA2-7又はその塩としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。脂肪酸塩A2-8としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。ノニオン性界面活性剤A3としては、アルコールアルキレンオキサイド以下、アルキレンオキサイドはAOと略記付加物A3-1、アルキルフェノールAO付加物A3-2、脂肪酸AO付加物A3-3及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤A3-4等が含まれる。ノニオン性界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度としてHLBが知られている。HLBの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるHLBとは下記式1で計算される数値である藤本武彦著、界面活性剤入門、142頁、三洋化成工業株式会社発行。HLB=20×{親水基の分子量/界面活性剤の分子量}1ノニオン性界面活性剤A3のHLBは、分泌効率の観点から、0~13が好ましく、さらに好ましくは5~12であり、次にさらに好ましくは8~12である。アルコールAO付加物A3-1としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含まれる。A3-1として具体的には、炭素数8~24の高級アルコールデシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等のエチレンオキサイド以下、エチレンオキサイドはEOと略記0~20モル及び/又はプロピレンオキサイド以下、プロピレンオキサイドはPOと略記1~20モル付加物ブロック付加物及び/又はランダム付加物を含む。以下同様[例えば、デシルアルコールのEO8モル/PO7モルブロック付加物]が含まれる。A3-1としてさらに具体的には、ラウリルアルコールEO7モル付加物HLB=12.4、オレイルアルコールEO5モル付加物HLB=9.0、オレイルアルコールEO6モル付加物HLB=10.2、オレイルアルコールEO7モル付加物HLB=11.0及びオレイルアルコールEO10モル付加物HLB=12.4、1,2-ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物等が挙げられる。アルキルフェノールAO付加物A3-2としては、炭素数6~24のアルキル基を有するアルキルフェノールAO付加物が含まれる。A3-2として具体的には、オクチルフェノールのEO1~20モル及び/又はPO1~20モル付加物並びにノニルフェノールのEO1~20モル及び/又はPO1~20モル付加物等が挙げられる。また、TRITONTMX-114HLB=12.4、igepalTMCA-520HLB=10.0及びigepalTMCA-630HLB=13.0等が市場から容易に入手できる。脂肪酸AO付加物A3-3としては、炭素数8~24の脂肪酸デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等のEO1~20モル及び/又はPO1~20モル付加物が含まれる。A3-3として具体的には、オレイン酸EO9モル付加物HLB=11.8、ジオレイン酸EO12モル付加物HLB=10.4、ジオレイン酸EO20モル付加物HLB=12.9及びステアリン酸EO9モル付加物HLB=11.9等が挙げられる。多価アルコール型ノニオン性界面活性剤A3-4としては、炭素数2~36の2~8価の多価アルコールグリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等のEO及び/又はPO付加物;前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのEO付加物、並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミドヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等及びこれらのAO付加物が含まれる。A3-4として具体的には、ソルビタンテトラオレイン酸エステルEO付加物HLB=11.4及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルEO付加物HLB=10.2等が挙げられる。カチオン界面活性剤A4としては、アミン塩型カチオン界面活性剤A4-1及び第4級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤A4-2等が含まれる。アミン塩型カチオン界面活性剤A4-1としては、1~3級アミンを無機酸塩酸、硝酸、硫酸、ヨウ化水素酸などまたは有機酸酢酸、ギ酸、蓚酸、乳酸、グルコン酸、アジピン酸、アルキル燐酸などで中和したものが含まれる。例えば、第1級アミン塩型のものとしては、脂肪族高級アミンラウリルアミン、ステアリルアミン、セチルアミン、硬化牛脂アミン、ロジンアミンなどの高級アミンの無機酸塩または有機酸塩;低級アミン類の高級脂肪酸ステアリン酸、オレイン酸など塩などが挙げられる。第2級アミン塩型のものとしては、例えば脂肪族アミンのエチレンオキサイド付加物などの無機酸塩または有機酸塩が挙げられる。また、第3級アミン塩型のものとしては、例えば、脂肪族アミントリエチルアミン、エチルジメチルアミン、N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミンなど、脂肪族アミンのエチレンオキサイド2モル以上付加物、脂環式アミンN-メチルピロリジン、N-メチルピペリジン、N-メチルヘキサメチレンイミン、N-メチルモルホリン、1,8-ジアザビシクロ5,4,0-7-ウンデセンなど、含窒素ヘテロ環芳香族アミン4-ジメチルアミノピリジン、N-メチルイミダゾール、4,4’-ジピリジルなどの無機酸塩または有機酸塩;トリエタノールアミンモノステアレート、ステアラミドエチルジエチルメチルエタノールアミンなどの3級アミン類の無機酸塩または有機酸塩などが挙げられる。第4級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤A4-2としては、3級アミン類と4級化剤メチルクロライド、メチルブロマイド、エチルクロライド、ベンジルクロライド、ジメチル硫酸などのアルキル化剤;エチレンオキサイドなどとの反応で得られるものが含まれる。例えば、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロマイド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド塩化ベンザルコニウム、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレントリメチルアンモニウムクロライド、ステアラミドエチルジエチルメチルアンモニウムメトサルフェートなどが挙げられる。界面活性剤Aとしては、分泌効率の観点から、両性界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びHLBが0~13のノニオン系界面活性剤が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸塩型両性界面活性剤A1-1、エーテルカルボン酸A2-1、スルホン酸塩A2-4、高級アルコールAO付加物A3-1及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤A3-4であり、特に好ましくはポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸A2-1のナトリウム塩、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミドA3-4、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインA1-1-2、1,2-ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物A3-1、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインA1-1-2、硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインA1-1-2、コカミノプロピオン酸ナトリウムA1-1-1、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩A2-4、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸A2-1のナトリウム塩、高級アルコールEO付加物A3-1、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸A2-3のナトリウム塩、デシルアルコールEO付加物A3-1である。本発明において界面活性剤Aは、界面活性剤Aをそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液水溶液状又は水分散液状として用いてもよい。水性希釈液における、界面活性剤Aの合計濃度は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、成長因子の分泌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、0.1~99重量が好ましく、好ましくは1~50重量である。本発明の界面活性剤を用いて成長因子の生産を行った場合の分泌効率は、生産性の観点から、1~100が好ましく、さらに好ましくは5~100、次にさらに好ましくは10~100、特に好ましくは50~100である。界面活性剤の分泌効率とは、界面活性剤により細菌内の成長因子が細菌外培養液中へ分泌されること示している。なお、本発明においては、下記式によって定義される。分泌効率=100×{X/Y-Z}X:遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の成長因子Y:培養液中の全成長因子Z:溶菌した細菌の割合を示し、下記の式によって定義される。Z=Z1/Z2Z1:遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の細胞質内局在物質Z2:培養液中の全細胞質内局在物質なお細胞質内局在物質とは、細胞質内に存在している物質であり、溶菌によって培養液中に溶出される物質をさす。分泌効率は、例えば細菌内で生産された成長因子がよりペリプラズム移行するようにすれば分泌効率は上がり、よりペリプラズム移行しないようにすれば分泌効率は下がる。また、スクリーニングによって分泌効率の高い界面活性剤を選定することにより分泌効率を上げることができる。本発明の成長因子の生産方法で使用される界面活性剤Aの使用量重量は、対象となる微生物、生産される成長因子の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、分泌効率及び成長因子の変性のさせにくさの観点から、0.0001~10が好ましく、さらに好ましくは0.005~10、次にさらに好ましくは0.1~5である。界面活性剤Aはあらかじめ培養液と混合して使用する以外に、微生物を懸濁させた培養液に後から添加しても良い。培養液との混合は、4°C~99°Cで培養液に界面活性剤Aを添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。後から混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。界面活性剤Aの使用にあたっては、上記界面活性剤を単独で用いる以外に、数種類を混合して用いても良い。本発明の成長因子の生産方法において、エンドトキシン量を少なくする及び成長因子を大量に得る観点から、細菌と界面活性剤Aとを共存させる時間は1~70時間が好ましく、さらに好ましくは3~30時間であり、特に好ましくは5~10時間である。成長因子としては、上皮成長因子EGF、塩基性繊維芽細胞成長因子bFGF、酸性繊維芽細胞成長因子aFGF、ケラチノサイト成長因子KGF、血小板由来成長因子PDGF、血管内皮細胞成長因子VEGF、幹細胞因子SCF、形質転換増殖因子TGF-α、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、胎盤成長因子PIGF、脳由来神経栄養因子BDNF、毛様体神経栄養因子CNTF、皮膚由来T細胞誘因ケモカインCTACKインターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン1~12、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子G-CSF、ソマトメジン、グルカゴン及び成長ホルモン放出因子等が挙げられる。成長因子のうち、エンドトキシンを少なくする観点から、上皮成長因子EGF、塩基性繊維芽細胞成長因子bFGF、酸性繊維芽細胞成長因子aFGF、ケラチノサイト成長因子KGF、血小板由来成長因子PDGF、血管内皮細胞成長因子VEGF、幹細胞因子SCF、インスリン、ソマトメジンが好ましく、さらに好ましくは上皮成長因子EGF、塩基性繊維芽細胞成長因子bFGF、酸性繊維芽細胞成長因子aFGF、ケラチノサイト成長因子KGFインスリン、ソマトメジンであり、特に好ましくはインスリン、ソマトメジン及び上皮成長因子EGFである。成長因子が細菌内で発現した後、一部又は全てがペリプラズムへ移行する性質を成長因子が有している事が好ましい。さらに好ましくはペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列をORF中にコードしている成長因子である。ペリプラズムとは、細菌の細胞質膜より外側で細菌の最表面までの空間の事である。ペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列としては、Sec分泌シグナル配列やTAT分泌シグナル等が挙げられる。本発明において乾燥菌体密度とは、成長因子の分泌生産において、培養開始時から培養終了時までのいずれかの時点における培養液1L中に含まれる細菌の重量を表す。なお、この細菌の重量は、乾燥させた状態の細菌の重量である。乾燥菌体密度は、次の手順1~5により求める。手順1:あらかじめ容器遠心チューブの重量を測定しておく。手順2:培養液100mlを手順1で重量を測定した容器に入れ、遠心分離4,000G、15分、4°Cして、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。手順3:容器中の集菌した細菌を、0.9重量NaCl水溶液[手順2で使用した培養液と同じ体積]で洗い、再度遠心分離4,000G、15分、4°Cして、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。手順4:手順3で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、105°Cで10時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定する。手順5:手順4の後さらに105°Cで2時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認する。さらに重量が減少するなら重量変化が無くなるまで105°Cで乾燥を持続する。手順5と手順1の測定値と手順2で使用した培養液の体積Lを下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求める。乾燥菌体密度g/L=[手順5の測定値]-[手順1の測定値]/0.1本発明の成長因子の生産方法における乾燥菌体密度は、培養液の体積を基準として0.1~11.5g/Lが好ましく、さらに好ましくは1g/L~8g/Lであり、特に好ましくは1.8~6g/Lである。乾燥菌体密度が0.1g/L以上であることで成長因子を効率よく生産することができ、11.5g/L以下であることでエンドトキシン量がさらに少なくなる。本発明において、培養開始時とは、前培養した細菌を、本培養する培養液へ添加した時点をいう。本発明において、培養終了時とは、培養液から菌体を除いた時点をいう。本発明の成長因子の生産方法において、成長因子を効率よく生産する及びエンドトキシンの量を少なくする観点から、乾燥菌体密度が上記範囲内である時間が、成長因子を分泌させる工程に要する時間の10以上であることが好ましく、さらに好ましくは50以上、特に好ましくは90以上、最も好ましくは100である。また本発明の生産方法において、乾燥菌体密度は、エンドトキシンの量を少なくする観点から、成長因子を分泌させる工程に要する時間の100において、培養液の体積を基準として11.5g/L以下であることが好ましい。乾燥菌体密度は、例えば十分な通気条件下で半回分培養法を用いて適切な速度で流加を行うことによって増加させることができ、制限した通気条件下で回分培養を行うことによって減らすことができる。また、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間を長くすることによって増加し、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間を短くすることによって減らすことができる。本発明の成長因子の生産方法としては、タンパク質として成長因子を生産する以外は、従来の細菌及び界面活性剤Aを含有する培養液を用いてタンパク質を分泌生産する生産方法を使用することができる。本発明の成長因子の生産方法には、下記工程a及びbを含む細胞外分泌生産方法が含まれる。下記工程において、成長因子を分泌させる工程は工程aである。工程a:成長因子を生産する細菌グラム陰性細菌等を培養する培養液と界面活性剤Aを同時に存在させて成長因子を細胞外培養液中に分泌させる工程。工程b:工程aの後、培養液から成長因子を分離する工程。以下に本発明の界面活性剤を使用する成長因子の生産方法の一例を示す。i遺伝子組み換えi-1目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーRNAmRNAを分離し、該mRNAから単鎖のcDNAを、次に二重鎖DNAを合成し、該二本鎖DNAをファージDNA又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主大腸菌に形質転換しcDNAライブラリーを作成する。i-2目的とするDNAを含有するファージDNA又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージDNA又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。i-3スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化DNA又はその一部を切りだし、該クローン化DNA又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列をコードするDNAを同時に連結することもできる。i-4目的とするDNA配列は合成し、発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列をコードするDNAを同時に連結することもできる。ii培養ii-1宿主細菌を発現ベクターで形質転換して組み換え細菌を作成し、組み換え細菌を前培養する。前培養は寒天培地上で通常15~43°Cで3~72時間行う。ii-2成長因子の生産に用いる培養液を121°C、20分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え細菌を培養する。培養は、通常15~43°Cで3~100時間行う。なお、培養開始と同時に界面活性剤Aを使用する場合は、界面活性剤Aと培養液を混合し均一化したものを、培養液として用いて同様の操作を行う。また、培養後3~72時間後に界面活性剤Aを加える場合は、界面活性剤を加えてから0.5~100時間培養を継続する。本工程において、細菌と界面活性剤Aとを共存させる時間は、エンドトキシン量を少なくする及び成長因子を大量に得る観点から、1~70時間が好ましく、さらに好ましくは3~30時間であり、特に好ましくは5~10時間である。iii精製iii-1培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。iii-2成長因子を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。iii-1で分離された宿主細胞は、その後、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらにiiiの工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、成長因子の連続生産を行うことができる。上記のiiiの成長因子の分離取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではSephadexシリーズ、Sephacrylシリーズ、Sepharoseシリーズ以上、Pharmacia社、Bio-GelシリーズBio-Rad社等がある。本発明の成長因子の生産方法を使用することにより、低エンドトキシンの成長因子を得ることができる。また、本発明の成長因子の生産方法は、成長因子が培養液中に分泌されるため、成長因子の精製が容易である。本発明の生産方法で得られる成長因子は、上記の方法で得られるため、従来よりもエンドトキシンの混入が少ない。本発明の成長因子生産方法は、細菌内で作成した有用物質が細菌のペリプラズムに移行している場合に特に有効である。有用物質がペリプラズムに移行していることによって、成長因子が培養液中に分泌されやすくなり、かつエンドトキシンが低減される。以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り、部は重量部を意味する。株の作成、菌体重量の測定、ELISAアッセイ及びSDS-PAGE等は当業者が行う標準的な方法に基づいて行った。<製造例1>pMXベクターに組み込まれた合成ヒト由来上皮成長因子hEGF遺伝子Invitrogen社をpET-22bプラスミドNovagen社のNdeI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後λDE3LysogenizationKitNovagen社を用いて、大腸菌株AG1ToYoBo社を改変して作成したAG1DE3大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してヒト由来上皮成長因子発現株αを作成した。発現したヒト由来上皮成長因子がペリプラズム画分に局在することをMETHODSINENZYMOLOGY353巻2002年121頁の方法に基づいて解析し確認した。<製造例2>pMXベクターに組み込まれた合成ヒト由来インスリン様成長因子1hIGF-1遺伝子Invitrogen社をpET-22bプラスミドNovagen社のNdeI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後λDE3LysogenizationKitNovagen社を用いて、大腸菌株AG1ToYoBo社を改変して作成したAG1DE3大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してヒト由来インスリン様成長因子1発現株βを作成した。発現したヒト由来インスリン様成長因子1がペリプラズム画分に局在することをMETHODSINENZYMOLOGY353巻2002年121頁の方法に基づいて解析し確認した。<乾燥菌体密度の測定>培養終了時の乾燥菌体密度は、次の手順1~5により求めた。手順1:あらかじめ容器遠心チューブの重量を測定した。手順2:培養液100mlを手順1で重量を測定した容器に入れ、遠心分離4,000G、15分、4°Cして、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。手順3:容器中の集菌した細菌に、手順2で使用した培養液と等量の体積の0.9NaCl水溶液で洗い、再度遠心分離4,000G、15分、4°Cして、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。手順4:手順3で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、105°Cで10時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定した。手順5:手順4の後、さらに105°Cで2時間乾燥させ、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認した。重量が減少する場合は、重量変化が無くなるまで乾燥を持続した。手順5と手順1の測定値と手順2で使用した培養液の体積0.1Lを下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求めた。乾燥菌体密度g/L=[手順5の測定値]-[手順1の測定値]/0.1この方法は数回行い培養液の濁度と乾燥菌体密度が比例関係にあることが明らかになったので培養液の濁度から乾燥菌体密度を算出した。<培養液の濁度の測定>乾燥菌体密度を測定した培養液と同じ培養液を用いて、濁度計島津社製、UV-1700を用いて、1mlの石英セルを用いて濁度の測定を行った。培養液は、適切な吸光度になるように生理食塩水で希釈して測定を行った。細菌を含まないこと以外は同じ培養液を、上記と同じ希釈率で希釈して吸光度を測定してブランクとした。培養液の濁度は下記式によって算出した。培養液の濁度=[希釈した培養液の濁度測定値-ブランクの濁度測定値]×希釈倍率乾燥菌体密度と培養液の濁度をプロットし、図1を得た。図1から、乾燥菌体密度と培養液の濁度の関係を表す次式を導いた。乾燥菌体密度=0.28×培養液の濁度<エンドトキシン量の測定>ToxinSensorChromogenicLALEndotoxinAssayKitGenScript社を用いて、実施例及び比較例の各サンプリングの時間におけるエンドトキシン量を測定した。<成長因子の生産量の測定>比較例1~2および実施例1~4で得られた成長因子抽出液もしくは培養上清を当業者が行うSDS-PAGEで解析し、タンパク質バンドの定量から生産した成長因子を定量した。<エンドトキシンと成長因子との比>上記により得られたエンドトキシン量及び成長因子の生産量から、エンドトキシン量と成長因子の量との比エンドトキシン/成長因子KEU/gを求めた。<比較例1>製造例1で得た大腸菌αの終夜培養液1mlをそれぞれ作成し、0.5mlをLB培養液アンピシリン100mg/L含有5mlに植菌して30°C3時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を50mLの培養液酵母エキス日本製薬社製1.2g、ポリペプトン日本製薬社製0.6g、リン酸2カリウム0.47g、リン酸1カリウム0.11g、硫酸アンモニウム0.35g、リン酸2ナトリウム12水和物0.66g、クエン酸ナトリウム2水和物0.02g、グリセロール0.2g、ラクトアルブミン水解物1.5g、消泡剤信越シリコーン製、KM-700.3g、1mM硫酸マグネシウム、微量金属溶液塩化カルシウム18.9μg、塩化鉄III500μg、硫酸亜鉛7水和物9.0μg、硫酸銅5.1μg、塩化マンガン4水和物6.7μg、塩化コバルト4.9μg、エチレンジアミン4酢酸4ナトリウム200μg、100mg/Lアンピシリンに植菌し微生物培養装置エイブル社製、製品名BioJr.8を用いてpH6.8、30°Cを維持したまま培養を開始した。培養開始3時間後1MIPTGイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドを0.15mLを加えた。培養開始14時間後から、グリセリン/タンパク質溶液50グリセリン、50g/Lラクトアルブミン水解物、33g/L消泡剤信越シリコーン製、KM-70、100mg/Lアンピシリンの滴下を開始し、培養を開始した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、9時間で乾燥菌体密度が1g/Lになったので、培養液を回収した。培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。集菌した細菌を当業者が行う一般的な超音波破砕法によって破砕し、成長因子抽出液X’-1を得た。X’-1を用いて、エンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定した。結果を表1にまとめた。<比較例2>比較例1において、培養開始後、9時間で乾燥菌体密度が1g/Lになったを培養開始後、20時間で乾燥菌体密度が10g/Lになったとする以外は同様に実施して、成長因子抽出液X’-2を得た。測定したエンドトキシン量及び生産した成長因子の量の結果を表1にまとめた。<比較例3>比較例1において、製造例1で得た大腸菌αに変えて、製造例2で得た大腸菌βを用いる以外は比較例1と同様に実施して成長因子抽出液X’-3を得た。測定したエンドトキシン量及び生産した成長因子の量の結果を表1にまとめた。<比較例4>比較例1において、製造例1で得た大腸菌αに変えて、製造例2で得た大腸菌βを用いて、培養開始後、9時間で乾燥菌体密度が1g/Lになったを培養開始後、20時間で乾燥菌体密度が10g/Lになったとする以外は同様に実施して成長因子抽出液X’-4を得た。測定したエンドトキシン量及び生産した成長因子の量の結果を表1にまとめた。<実施例1>培養を開始するまでは比較例1と同様に実施した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、9時間で乾燥菌体密度が1g/Lになったので、培養液の重量を基準として1重量になるように界面活性剤Aとしてラウリン酸ジメチルアミノプロピルアミドを加えた。界面活性剤を加えて1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、30時間、70時間に培養液のサンプリングを行い、培養液の濁度、エンドトキシンの量及び生産した成長因子の量を測定した。エンドトキシン量及び生産した成長因子の量は、サンプリングした培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、培養上清X-1-1~X-1-7を得て、培養上清X-1-1~X-1-7中のエンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定することにより求めた。結果を表2にまとめた。<実施例2>培養を開始するまでは比較例1と同様に実施した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、14時間で乾燥菌体密度が5g/Lになったので、培養液の重量を基準として1重量になるように界面活性剤Aとしててラウリン酸ジメチルアミノプロピルアミドを加えた。界面活性剤を加えて1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、30時間、70時間に培養液のサンプリングを行い、培養液の濁度、エンドトキシンの量及び生産した成長因子の量を測定した。エンドトキシン量及び生産した成長因子の量は、サンプリングした培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、培養上清X-2-1~X-2-7を得て、培養上清X-2-1~X-2-7中のエンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定することにより求めた。結果を表2にまとめた。<実施例3>培養を開始するまでは比較例1と同様に実施した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、20時間で乾燥菌体密度が10g/Lになったので、培養液の重量を基準として1重量になるように界面活性剤Aとしてラウリン酸ジメチルアミノプロピルアミドを加えた。界面活性剤を加えて1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、30時間、70時間に培養液のサンプリングを行い、培養液の濁度、エンドトキシンの量及び生産した成長因子の量を測定した。エンドトキシン量及び生産した成長因子の量は、サンプリングした培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、培養上清X-3-1~X-3-7を得て、培養上清X-3-1~X-3-7中のエンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定することにより求めた。結果を表2にまとめた。<実施例4>比較例1において、製造例1で得た大腸菌αに変えて、製造例2で得た大腸菌βを用いて、培養を開始するまでは比較例1と同様に実施した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、9時間で乾燥菌体密度が1g/Lになったので、培養液の重量を基準として1重量になるように界面活性剤Aとしてラウリン酸ジメチルアミノプロピルアミドを加えた。界面活性剤を加えて1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、30時間、70時間に培養液のサンプリングを行い、培養液の濁度、エンドトキシンの量及び生産した成長因子の量を測定した。エンドトキシン量及び生産した成長因子の量は、サンプリングした培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、培養上清X-4-1~X-4-7を得て、培養上清X-4-1~X-4-7中のエンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定することにより求めた。結果を表2にまとめた。<実施例5>比較例1において、培養を開始するまでは比較例1と同様に実施した。培養開始後、培養液をサンプリングし、濁度を測定し、乾燥菌体密度を算出した。培養開始後、35時間で乾燥菌体密度が20g/Lになったので、培養液の重量を基準として1重量になるように界面活性剤Aとしてラウリン酸ジメチルアミノプロピルアミドを加えた。界面活性剤を加えて1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、30時間、70時間に培養液のサンプリングを行い、培養液の濁度、エンドトキシンの量及び生産した成長因子の量を測定した。エンドトキシン量及び生産した成長因子の量は、サンプリングした培養液を遠心分離4,000G、15分、4°Cして、培養上清X-5-1~X-5-7を得て、培養上清X-5-1~X-5-7中のエンドトキシン量及び生産した成長因子の量を測定することにより求めた。結果を表2にまとめた。表1及び表2の結果から、本発明の成長因子の生産方法は、従来の菌体破砕による成長因子抽出法に比べて、生産した成長因子1g当たりのエンドトキシンの量が極めて少ないことが分かる。"