"個体が肺癌を有するか又は有さないかを診断するための方法であって:個体からの生体試料において、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここで前記個体は、前記バイオマーカー値に基づいて、肺癌を有するもの又は有さないものとして分類されて、ここでN=2~86である、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項1の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項2の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項3の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項2の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項1の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項1の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項1の方法。生体試料が血清である、請求項1の方法。個体がヒトである、請求項1の方法。N=2~15である、請求項1の方法。N=2~10である、請求項1の方法。N=3~10である、請求項1の方法。N=4~10である、請求項1の方法。N=5~10である、請求項1の方法。個体が喫煙者である、請求項1の方法。個体が肺結節を有する、請求項1の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項1の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータにより実行される方法であって:コンピュータ上でバイオマーカー情報を個体のために検索すること、ここで該バイオマーカー情報は、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む;前記バイオマーカー値のそれぞれの分類をコンピュータで実施すること;及び複数の分類に基づいて、前記個体が肺癌を有する可能性を示すことを含んでなり、そしてここでN=2~86である、前記方法。個体が肺癌を有する可能性を示すことがその可能性をコンピュータディスプレイ上に表示することを含む、請求項19の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータプログラム製品であって:計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体を含んでなり、該プログラムコードは:個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード、ここで、該データは、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含み、ここで前記バイオマーカーは、該生体試料において検出されたことがある;及び個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなり;そしてここでN=2~86である、前記コンピュータプログラム製品。前記分類法が確率密度関数を使用する、請求項21のコンピュータプログラム製品。前記分類法が2以上のクラスを使用する、請求項22のコンピュータプログラム製品。個体が肺癌を有するか又は有さないかを診断するための方法であって:個体からの生体試料において、表20より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここで前記個体は、前記バイオマーカー値に基づいて、肺癌を有するもの又は有さないものとして分類されて、ここでN=2~25である、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項24の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項25の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項26の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項25の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項24の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項24の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項24の方法。生体試料が血清である、請求項24の方法。個体がヒトである、請求項24の方法。N=2~15である、請求項24の方法。N=2~10である、請求項24の方法。N=3~10である、請求項24の方法。N=4~10である、請求項24の方法。N=5~10である、請求項24の方法。個体が喫煙者である、請求項24の方法。個体が肺結節を有する、請求項24の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項24の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータで実行される方法であって:コンピュータ上でバイオマーカー情報を個体のために検索すること、ここで該バイオマーカー情報は、表20より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む;前記バイオマーカー値のそれぞれの分類をコンピュータで実施すること;及び複数の分類に基づいて、前記個体が肺癌を有する可能性を示すことを含んでなり、そしてここでN=2~25である、前記方法。個体が肺癌を有する可能性を示すことがその可能性をコンピュータディスプレイ上に表示することを含む、請求項42の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータプログラム製品であって:計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体を含んでなり、該プログラムコードは:個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード、ここで、該データは、表20より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含み、ここで前記バイオマーカーは、該生体試料において検出されたことがある;及び個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなり;そしてここでN=2~25である、前記コンピュータプログラム製品。前記分類法が確率密度関数を使用する、請求項44のコンピュータプログラム製品。前記分類法が2以上のクラスを使用する、請求項44のコンピュータプログラム製品。個体が肺癌を有するか又は有さないかを診断するための方法であって:個体からの生体試料において、表18より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここで前記個体は、前記バイオマーカー値に基づいて、肺癌を有するもの又は有さないものとして分類されて、ここでN=2~36である、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項47の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項48の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項49の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項48の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項47の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項47の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項47の方法。生体試料が血清である、請求項47の方法。個体がヒトである、請求項47の方法。N=2~15である、請求項47の方法。N=2~10である、請求項47の方法。N=3~10である、請求項47の方法。N=4~10である、請求項47の方法。N=5~10である、請求項47の方法。個体が喫煙者である、請求項47の方法。個体が肺結節を有する、請求項47の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項47の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータで実行される方法であって:コンピュータ上でバイオマーカー情報を個体のために検索すること、ここで該バイオマーカー情報は、表18より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む;前記バイオマーカー値のそれぞれの分類をコンピュータで実施すること;及び複数の分類に基づいて、前記個体が肺癌を有する可能性を示すことを含んでなり、そしてここでN=2~36である、前記方法。個体が肺癌を有する可能性を示すことがその可能性をコンピュータディスプレイ上に表示することを含む、請求項65の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータプログラム製品であって:計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体を含んでなり、該プログラムコードは:個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード、ここで、該データは、表18より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含み、ここで前記バイオマーカーは、該生体試料において検出されたことがある;及び個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなり;そしてここでN=2~36である、前記コンピュータプログラム製品。前記分類法が確率密度関数を使用する、請求項67のコンピュータプログラム製品。前記分類法が2以上のクラスを使用する、請求項68のコンピュータプログラム製品。個体中の肺癌に関する情報を判定するための方法であって:個体からの生体試料において、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここでN=2~86であり;そしてここで前記バイオマーカー値は、該個体中の肺癌に関する情報を提供する、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項70の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項71の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項72の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項71の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項70の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項70の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項70の方法。生体試料が血清である、請求項70の方法。個体がヒトである、請求項70の方法。N=2~15である、請求項70の方法。N=2~10である、請求項70の方法。N=3~10である、請求項70の方法。N=4~10である、請求項70の方法。N=5~10である、請求項70の方法。個体が喫煙者である、請求項70の方法。個体が肺結節を有する、請求項70の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項70の方法。情報が、予後判定、癌分類、疾患リスクの予測、又は治療法の選択を含む、請求項70の方法。個体中の肺癌に関する情報を判定するための方法であって:個体からの生体試料において、表18より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここでN=2~36であり;そしてここで前記バイオマーカー値は、該個体中の肺癌に関する情報を提供する、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項89の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項90の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項91の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項90の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項89の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項89の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項89の方法。生体試料が血清である、請求項89の方法。個体がヒトである、請求項89の方法。N=2~15である、請求項89の方法。N=2~10である、請求項89の方法。N=3~10である、請求項89の方法。N=4~10である、請求項89の方法。N=5~10である、請求項89の方法。個体が喫煙者である、請求項89の方法。個体が肺結節を有する、請求項89の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項89の方法。情報が、予後判定、癌分類、疾患リスクの予測、又は治療法の選択を含む、請求項89の方法。個体中の肺癌に関する情報を判定するための方法であって:個体からの生体試料において、表20より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここでN=2~25であり;そしてここで前記バイオマーカー値は、該個体中の肺癌に関する情報を提供する、前記方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項108の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項109の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項110の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項109の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項108の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項108の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項108の方法。生体試料が血清である、請求項108の方法。個体がヒトである、請求項108の方法。N=2~15である、請求項108の方法。N=2~10である、請求項108の方法。N=3~10である、請求項108の方法。N=4~10である、請求項108の方法。N=5~10である、請求項108の方法。個体が喫煙者である、請求項108の方法。個体が肺結節を有する、請求項108の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項108の方法。情報が、予後判定、癌分類、疾患リスクの予測、又は治療法の選択を含む、請求項108の方法。個体が肺癌を有するか又は有さないかを診断するための方法であって:個体からの生体試料において、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここで前記個体は、前記バイオマーカー値に基づいて、肺癌を有するもの又は有さないものとして分類されて、ここでN=2~86であり、そしてここで、前記バイオマーカーの少なくとも1つは表20より選択される、前記方法。表20より選択される前記バイオマーカーの少なくとも1つがMMP-12である、請求項127の方法。バイオマーカー値を検出することがinvitroアッセイを実施することを含む、請求項127の方法。前記invitroアッセイが前記バイオマーカーのそれぞれに対応する少なくとも1つの捕捉試薬を含み、そして前記少なくとも1つの捕捉試薬をアプタマー、抗体、及び核酸プローブからなる群より選択することをさらに含んでなる、請求項129の方法。前記少なくとも1つの捕捉試薬がアプタマーである、請求項130の方法。前記invitroアッセイが、イムノアッセイ、アプタマーベースのアッセイ、組織学的又は細胞学的アッセイ、及びmRNA発現レベルアッセイからなる群より選択される、請求項129の方法。それぞれのバイオマーカー値を既定値又は既定値範囲に基づいて評価する、請求項127の方法。生体試料が肺組織であって、ここでバイオマーカー値は、前記肺組織の組織学的又は細胞学的分析より導かれる、請求項127の方法。生体試料が、全血、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項127の方法。生体試料が血清である、請求項127の方法。個体がヒトである、請求項127の方法。N=2~15である、請求項127の方法。N=2~10である、請求項127の方法。N=3~10である、請求項127の方法。N=4~10である、請求項127の方法。N=5~10である、請求項127の方法。個体が喫煙者である、請求項127の方法。個体が肺結節を有する、請求項127の方法。肺癌が非小細胞肺癌である、請求項127の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータにより実行される方法であって:コンピュータ上でバイオマーカー情報を個体のために検索すること、ここで該バイオマーカー情報は、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含み;ここで前記N個のバイオマーカーの少なくとも1つは、表20より選択される;前記バイオマーカー値のそれぞれの分類をコンピュータで実施すること;及び複数の分類に基づいて、前記個体が肺癌を有する可能性を示すことを含んでなり、そしてここでN=2~86である、前記方法。表20より選択される前記バイオマーカー単数または複数の少なくとも1つがMMP-12である、請求項146の方法。個体が肺癌を有する可能性を示すことがその可能性をコンピュータディスプレイ上に表示することを含む、請求項146の方法。肺癌の可能性を示すためのコンピュータプログラム製品であって:計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体を含んでなり、該プログラムコードは:個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード。ここで、該データは、表21より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含み、ここで前記N個のバイオマーカーの少なくとも1つは表10より選択され、そしてここで前記バイオマーカーは、該生体試料において検出されたことがある;及び個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなり;そしてここでN=2~86である、前記コンピュータプログラム製品。表20より選択される前記バイオマーカー単数または複数の少なくとも1つがMMP-12である、請求項149のコンピュータプログラム製品。前記分類法が確率密度関数を使用する、請求項149のコンピュータプログラム製品。前記分類法が2以上のクラスを使用する、請求項149のコンピュータプログラム製品。00150本明細書に開示する本発明の実施では、他に示さなければ、当該技術分野の技量レベル内にある化学、微生物学、分子生物学、及び組換えDNA技術の慣用法を利用する。このような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Sambrooketal分子クローニング:実験マニュアルMolecularCloningALaboratoryManual現行版;DNAクローニング:実践アプローチDNACloningAPracticalApproach第I及びII巻DGlover監修;オリゴヌクレオチド合成OligonucleotideSynthesis;核酸ハイブリダイゼーションNucleicAcidHybridizationBHamesSHiggins監修、現行版;転写及び翻訳TranscriptionandTranslationを参照のこと。00203バイオマーカーレベルを独立した診断検査項目として検査することに加えて、バイオマーカーレベルはまた、CTスクリーニングと一緒に使用することもできる。例えば、バイオマーカーは、肺癌のリスクがある無症状の大集団例、喫煙者についてスクリーニングするように、CTスクリーニングを実行することの医学的及び経済的な正当化を容易にする場合がある。例えば、バイオマーカーレベルのCT前検査を使用すれば、そのバイオマーカーレベルに基づけば肺癌の最高リスク状態にあり、CTスクリーニングについて優先されるべき個体を同定することのように、CTスクリーニングのために高リスク個体を層別化することができよう。CT検査が実行されれば、1以上のバイオマーカーのバイオマーカーレベル例えば、血清又は血漿試料のアプタマーアッセイによって定量されるようなを測定することができて、その診断スコアを追加の生物医学情報例、CT検査によって決定される腫瘍パラメータと一緒に評価して、CT又はバイオマーカー検査単独に優って、陽性予測値PPVを高めることができよう。バイオマーカーレベルを決定するためのCT後アプタマーパネルを使用して、CT又は他の造影モダリティによって観察される肺結節が悪性又は良性である可能性を決定することができる。00204本明細書に記載のバイオマーカーのいずれもの検出は、CT後検査に有用であり得る。例えば、バイオマーカー検査は、CT単独に優って、有意数の偽陽性検査を一掃又は減少させるかもしれない。さらに、バイオマーカー検査は、患者の治療を容易にするかもしれない。例として、肺結節のサイズが5mm未満であれば、バイオマーカー検査の結果により、患者を経過観察からより早期での生検へ進ませるかもしれない;肺結節が5~9mmであれば、バイオマーカー検査により、偽陽性スキャンに基づいた生検又は開胸術の使用を無くせるかもしれない;そして、肺結節が10mmより大きければ、バイオマーカー検査によって、良性結節のあるこれら患者の亜集団への外科手術が一掃されるかもしれない。バイオマーカー検査に基づいて、一部の患者での生検の必要性を無くすことは、結節生検に関連した有意な罹病率があることと、結節の位置によっては結節組織を入手することが困難であることから、有益であろう。同様に、その結節が実は良性である患者のような、一部の患者において外科手術の必要性を無くすことは、不要なリスクと外科手術に関連したコストを回避することになろう。00205CTスクリーニングと一緒にバイオマーカーレベルを検査すること例えば、CTスキャンで観測される肺結節のサイズや他の特性と一緒にバイオマーカーレベルを評価することに加えて、バイオマーカーに関する情報は、他の種類のデータ、特に個体の肺癌へのリスクを示すデータ例、患者の臨床歴、症状、癌の家族歴、その個体が喫煙者であるかないかといったリスク因子、及び/又は他のバイオマーカーの状況、等と一緒に評価することもできる。これらの様々なデータは、コンピュータ又は他の機器/デバイスにおいて具現化され得る、コンピュータプログラム/ソフトウェアのような自動化された方法によって評価することができる。00206記載のバイオマーカーのいずれも、造影検査において使用してもよい。例えば、記載のバイオマーカーのいずれへも造影剤を結合させることができて、これを使用して、他の使用の中でも特に、肺癌診断に役立てる、疾患の進行/寛解又は転移を監視する、疾患の再発を監視する、又は療法への応答を監視することができる。バイオマーカーの検出とバイオマーカー値の定量00207本明細書に記載のバイオマーカーのバイオマーカー値は、多様な既知の分析法のいずれを使用しても分析することができる。1つの態様では、捕捉試薬を使用して、バイオマーカー値を検出する。本明細書に使用するように、捕捉剤又は捕捉試薬は、バイオマーカーへ特異的に結合することが可能である分子を意味する。様々な態様において、捕捉試薬は、溶解したバイオマーカーへ曝露することができるか、又は捕捉試薬が固体支持体上に固定化されている間に、バイオマーカーへ曝露することができる。他の態様において、捕捉試薬は、固体支持体上の二次特徴と反応する特徴を含有する。これらの態様において、捕捉試薬は、溶解したバイオマーカーへ曝露することができて、それから捕捉試薬上の特徴を固体支持体上の二次特徴と一緒に使用して、バイオマーカーを固体支持体に固定化することができる。捕捉試薬は、実施する分析の種類に基づいて選択する。捕捉試薬には、限定されないが、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体模倣体と他のスカフォールドタンパク質、自己抗体、キメラ抗体、低分子、Fab’2断片、単鎖抗体断片、Fv断片、単鎖Fv断片、核酸、レクチン、リガンド結合性受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、並びにこれらの修飾物及び断片が含まれる。00208いくつかの態様では、バイオマーカー/捕捉試薬複合体を使用して、バイオマーカー値を検出する。00209他の態様において、バイオマーカー値は、バイオマーカー/捕捉試薬複合体より導かれて、例えば、バイオマーカー/捕捉試薬相互作用に後続するが、バイオマーカー/捕捉試薬複合体の形成に依存する反応の結果としてのように、間接的に検出される。00210いくつかの態様において、バイオマーカー値は、生体試料中のバイオマーカーより直接的に検出される。002111つの態様において、バイオマーカーは、生体試料中の2以上のバイオマーカーの同時検出を可能にする多重化フォーマットを使用して検出される。多重化フォーマットの1つの態様では、捕捉試薬を固体支持体上の別々の位置に直接的又は間接的に、共有結合的又は非共有結合的に固定する。別の態様では、多重化フォーマットが別々の固体支持体を使用して、ここでそれぞれの固体支持体は、例えば量子ドットのような、固体支持体と結合した独自の捕捉試薬を有する。別の態様では、生体試料中で検出される多数のバイオマーカーのそれぞれ1つの検出のために個々のデバイスを使用する。個々のデバイスは、生体試料中の各バイオマーカーが同時に処理されることを可能にするように配置することができる。例えば、マイクロタイタープレート中の各ウェルを使用して生体試料中で検出される多数のバイオマーカーの1つを独自に分析するように、そのプレートを使用することができる。00212上述の態様の1以上では、バイオマーカー/捕捉複合体の成分を標識して、バイオマーカー値の検出を可能にするために、蛍光タグを使用することができる。様々な態様において、既知の技術を使用して、本明細書に記載のバイオマーカーのいずれかへ特異的な捕捉試薬へ蛍光標識を共役させることができて、次いでこの蛍光標識を使用して、対応するバイオマーカー値を検出することができる。好適な蛍光標識には、希土類キレート、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、PBXL-3、Qdot605、リサミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、及び他のそのような化合物が含まれる。002131つの態様において、蛍光標識は、蛍光色素分子である。いくつかの態様において、蛍光色素分子には、インドリウム環の3位炭素上の置換基が化学反応基又は共役基質を含有する、少なくとも1つの置換インドリウム環系が含まれる。いくつかの態様において、この色素分子には、例えば、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor647、AlexaFluor680、又はAlexaFluor700のようなAlexFluor分子が含まれる。他の態様において、色素分子には、例えば、2つの異なるAlexaFluor分子のような、第一種及び第二種の色素分子が含まれる。他の態様において、色素分子には、第一種及び第二種の色素分子が含まれて、この2つの色素分子は、異なる発光スペクトルを有する。00214蛍光は、広範囲のアッセイフォーマットと適合可能な多様な計測手段で測定することができる。例えば、分光蛍光計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、印字アレイ、キュベット、等を分析するように設計されている。蛍光分光法の原理PrinciplesofFluorescenceSpectroscopyJRLakowicz著、SpringerScienceBusinessMedia社2004;生物発光と化学発光:進歩と現行の応用例BioluminescenceChemiluminescenceProgressCurrentApplications;PhilipEStanleyandLarryJKricka監修、WorldScientificPublishingCompany2002年1月を参照のこと。00215上述の態様の1以上では、バイオマーカー/捕捉複合体の成分を標識して、バイオマーカー値の検出を可能にするために、化学発光タグを使用してもよい。好適な化学発光材料には、塩化オキサリル、ローダミン6G、Rubipy32、TMAEテトラキスジメチルアミノエチレン、ピロガロール1,2,3-トリヒドロキシベンゼン、ルシゲニン、ペルオキシシュウ酸エステル、シュウ酸アリール、アクリジニウムエステル、ジオキセタン、他のいずれもが含まれる。00216なお他の態様において、検出法には、バイオマーカー値に対応する検出可能なシグナルを産生する酵素/基質の組合せが含まれる。一般的に、酵素は、分光測光法、蛍光、及び化学発光が含まれる様々な技術を使用して測定され得る、発色基質の化学変化を触媒する。好適な酵素には、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼHRPO、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、等が含まれる。00217なお他の態様において、検出法は、測定可能なシグナルを産生する、蛍光、化学発光、放射性核種の組合せ、又は酵素/基質の組合せであり得る。バイオマーカーアッセイフォーマットでは、多様式のシグナル産生signallingが独自の有利な特性を有する可能性がある。00218より具体的には、本明細書に記載のバイオマーカーのバイオマーカー値は、以下に詳述する、シングルプレックスアプタマーアッセイ、多重化アプタマーアッセイ、シングルプレックス又は多重化イムノアッセイ、mRNA発現プロファイリング、miRNA発現プロファイリング、質量分析法の分析、組織学的/細胞学的方法、等が含まれる、既知の分析法を使用して検出することができる。アプタマーベースのアッセイを使用するバイオマーカー値の定量00219生体試料や他の試料中の生理学的に重要な分子の検出及び定量へ指向されるアッセイは、科学研究と医療の分野において重要なツールである。そのようなアッセイの1群は、固体支持体上に固定化された1以上のアプタマーが含まれるマイクロアレイの使用を伴う。アプタマーは、きわめて特異的なやり方で、そしてきわめて高いアフィニティーで標的分子へ結合することがそれぞれ可能である。例えば、核酸リガンドNucleicAcidLigandsと題した米国特許第5,475,096号を参照のこと;また、いずれも核酸リガンド診断バイオチップNucleicAcidLigandDiagnosticBiochipと題した米国特許第6,242,246号、米国特許第6,458,543号、及び米国特許第6,503,715号を参照のこと。マイクロアレイが試料と接触するとすぐに、アプタマーは、試料中に存在するそのそれぞれの標的分子へ結合して、それによりバイオマーカーへ対応するバイオマーカー値の定量が可能になる。00220本明細書に使用するように、アプタマーは、標的分子への特異的な結合アフィニティーを有する核酸を意味する。アフィニティー相互作用は、程度の問題であると認められているが、本文脈では、その標的へのアプタマーの特異的な結合アフィニティーは、そのアプタマーが、概して、それが検査試料中の他の成分へ結合するよりずっと高い度合いのアフィニティーでその標的へ結合することを意味する。アプタマーは、特別なヌクレオチド配列を有する、1つの型又は種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーには、任意数の化学修飾ヌクレオチドを含めて、好適な任意数のヌクレオチドを含めることができる。アプタマーは、1より多いそのような分子のセットへ言及する。異なるアプタマーは、同じ数又は異なる数のヌクレオチドを有してよい。アプタマーは、DNA又はRNAであっても、化学修飾された核酸であってもよく、一本鎖又は二本鎖であっても、二本鎖領域を含有しても、より高次の秩序だった構造が含まれてもよい。アプタマーは、光アプタマーであってもよく、ここでは、光反応性又は化学反応性の官能基がアプタマーに含まれて、その対応する標的へそれが共有的に結合されることを可能にする。本明細書に開示されるアプタマー方法のいずれにも、同じ標的分子へ特異的に結合する2以上のアプタマーの使用を含めることができる。下記にさらに記載するように、アプタマーには、タグが含まれる場合がある。アプタマーにタグが含まれるならば、アプタマーのすべてのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーにそれぞれタグが含まれるならば、これらの異なるアプタマーは、同じタグを有しても、異なるタグを有してもよい。00221アプタマーは、SELEX法を含めて、既知の方法を使用して同定することができる。同定されたならば、アプタマーは、化学合成法と酵素合成法を含めて、どの既知の方法に拠っても、製造又は合成することができる。00222SELEX及びSELEX法という用語は、本明細書において可換的に使用されて、1標的分子と望ましいやり方で相互作用する例えば、高いアフィニティーでタンパク質へ結合するアプタマーの選択物の2そのような選択される核酸の増幅との組合せを一般的に意味する。SELEX法を使用して、特定の標的又はバイオマーカーへの高いアフィニティーがあるアプタマーを同定することができる。00223SELEXには、一般に、核酸の候補混合物を製造すること、この候補混合物を所望の標的分子へ結合させてアフィニティー複合体を生成すること、このアフィニティー複合体を未結合の候補核酸より分離させること、アフィニティー複合体より結合核酸を分離して単離すること、その核酸を精製すること、及び特異的なアプタマー配列を同定することが含まれる。この方法には、選択されたアプタマーのアフィニティーをさらに純化させるために、多数のラウンドを含めてよい。この方法には、この方法中の1以上の時点で増幅工程を含めることができる。例えば、核酸リガンドNucleicAcidLigandsと題した米国特許第5,475,096号を参照のこと。SELEX法を使用して、その標的へ共有結合するアプタマーだけでなく、その標的へ非共有的に結合するアプタマーも産生することができる。例えば、指数的濃縮による核酸リガンドの系統進化法:化学SELEXSystematicEvolutionofNucleicAcidsLigandsbyExponentialEnrichmentChemiSELEXと題した、米国特許第5,705,337号を参照のこと。00224SELEX法を使用して、例えば、改善されたinvivo安定性又は改善された送達特性のような改善された特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティーアプタマーを同定することができる。そのような修飾の例には、リボース及び/又はリン酸及び/又は塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、SELEX法で同定されるアプタマーについては、ピリミジンの5’位及び2’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載する、修飾ヌクレオチドを含有する高アフィニティー核酸リガンドHighAffinityNucleicAcidLigandsContainingModifiedNucleotidesと題した米国特許第5,660,985号に記載されている。米国特許第5,580,737号上記参照は、2’-アミノ2’-NH2、2’-フルオロ2’-F、及び/又は2’-O-メチル2’-OMeで修飾された1以上のヌクレオチドを含有するきわめて特異的なアプタマーについて記載する。拡張された物理及び化学特性を有する核酸ライブラリーとSELEX及び光SELEXにおけるそれらの使用について記載する、SELEXと光SELEXSELEXandPHOTOSELEXと題した米国特許出願公開公報20090098549も参照のこと。00225SELEXはまた、望ましいオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。標的分子へ結合し得るアプタマーを産生するための改善されたSELEX法について記載する、オフ速度が改善されたアプタマーを産生するための方法MethodforGeneratingAptamerswithImprovedOffRatesと題した米国特許出願公開公報20090004667を参照のこと。そのそれぞれの標的分子からの解離速度がより遅いアプタマー及び光アプタマーを産生するための方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸-標的複合体の形成が生じることを可能にすること、及び遅いオフ速度濃縮法を実施することを伴うが、ここでは解離速度が速い核酸-標的複合体が解離して再形成されない一方で、解離速度が遅い複合体はインタクトなままである。その上、この方法には、オフ速度性能が改善されたアプタマーを産生する候補核酸混合物の産生における、修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。00226このアッセイの変法variationは、アプタマーがその標的分子へ共有結合するか又は光架橋することを可能にする光反応性の官能基が含まれるアプタマーを利用する。例えば、核酸リガンド診断バイオチップNucleicAcidLigandDiagnosticBiochipと題した米国特許第6,544,776号を参照のこと。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも呼ばれる。例えば、そのいずれも指数的濃縮による核酸リガンドの系統進化法:核酸リガンドの光選択と溶液SELEXSystematicEvolutionofNucleicAcidLigandsbyExponentialEnrichmentPhotoselectionofNucleicAcidLigandsandSolutionSELEXと題した、米国特許第5,763,177号、米国特許第6,001,577号、及び米国特許第6,291,184号を参照のこと;また、例えば、核酸リガンドの光選択PhotoselectionofNucleicAcidLigandsと題した米国特許第6,458,539号を参照のこと。マイクロアレイを試料と接触させて、光アプタマーにその標的分子へ結合させる機会を与えた後で、光アプタマーを光活性化して、固体支持体を洗浄して、非特異的に結合したあらゆる分子を除去する。光アプタマーへ結合している標的分子は、光アプタマー上での光活性化官能基複数によって創出される共有結合により、概して除去されないので、厳しい洗浄条件を使用してよい。このやり方では、このアッセイにより、検査試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値の検出が可能になる。00227これらのアッセイフォーマットのいずれでも、試料と接触させることに先立って、アプタマーを固体支持体上に固定化する。しかしながら、ある状況の下では、試料との接触に先立つアプタマーの固定化が最適なアッセイを提供しない場合がある。例えば、アプタマーのプレ固定化により、固体支持体の表面上での標的分子とアプタマーの非効率的な混合が生じる場合があり、アプタマーがその標的分子へ効率的に結合することを可能にするのに、冗長な反応時間と、それ故に延長されるインキュベーション時間をもたらすだろう。さらに、光アプタマーをこのアッセイに利用するときには、固体支持体として利用される材料に依存して、固体支持体は、光アプタマーとその標的分子の間での共有結合の形成に奏効するのに使用される光を分散させるか又は吸収する傾向があり得る。さらに、利用する方法に依存して、そのアプタマーへ結合した標的分子の検出は、固体支持体の表面が使用されるあらゆる標識剤へ曝露されてそれによって影響を受ける場合があるので、不正確性になる可能性がある。最後に、固体支持体上でのアプタマーの固定化は、一般に、アプタマーの試料への曝露に先立つアプタマー製造工程即ち、固定化を伴うので、この製造工程は、アプタマーの活性又は機能性に影響を及ぼす場合がある。00228アプタマーが溶液中のその標的を捕捉することを可能にしてから、アプタマー-標的混合物の特定成分を検出に先立って除去するように設計された分離工程を利用するアプタマーアッセイについても記載されている検査試料の多重化分析MultiplexedAnalysesofTestSamplesと題した米国特許出願公開公報20090042206を参照のこと。記載のアプタマーアッセイ法は、核酸即ち、アプタマーを検出して定量することによって、検査試料中の非核酸標的例、タンパク質標的の検出及び定量を可能にする。記載の方法は、非核酸標的を検出及び定量するための核酸代用物即ち、アプタマーを創出することによって、増幅が含まれる多種多様な核酸技術が、タンパク質標的が含まれる、より広範囲の所望される標的へ適用されることを可能にする。00229アプタマーを構築して、アプタマーバイオマーカー複合体又は、光アプタマーバイオマーカー共有複合体からのアッセイ成分の分離を促進して、検出及び/又は定量のためのアプタマーの単離を可能にすることができる。1つの態様において、これらの構築体には、切断可能又は放出可能な要素をアプタマー配列の内部に含めることができる。他の態様では、追加の機能性、例えば、標識されたか又は検出可能な成分、スペーサー成分、又は特異的な結合タグ、又は固定化要素をアプタマー中へ導入することができる。例えば、アプタマーには、切断可能な部分を介してアプタマーへ連結されるタグ、標識、標識を分離するスペーサー成分、及び切断可能な部分を含めることができる。1つの態様において、切断可能な要素は、光切断可能なリンカーである。光切断可能なリンカーは、ビオチン部分とスペーサー切片へ付けることができて、アミンの誘導化のためのNHS基が含まれて、それを使用してビオチン基をアプタマーへ導入することができて、それによってアッセイ法の後でのアプタマーの放出を可能にする。00230すべてのアッセイ成分が溶液中で処理される均質アッセイは、シグナルの検出に先立つ試料及び試薬の分離を必要としない。これらの方法は、迅速で使用が容易である。これらの方法は、その特異的な標的と反応する分子捕捉又は結合試薬に基づいて、シグナルを産生する。肺癌では、分子捕捉試薬は、アプタマー又は抗体、等であろうし、特異的な標的は、表20の肺癌バイオマーカーであろう。002311つの態様において、シグナル産生の方法は、フルオロフォア標識した捕捉試薬のその特異的なバイオマーカー標的との相互作用による異方性シグナル変化を利用する。この標識した捕捉試薬がその標的と反応するとき、分子量の増加により、複合体へ付いたフルオロフォアの回転運動が引き起こされて、異方性の数値がずっとより遅く変化する。この異方性の変化を監視することによって、結合イベントを使用して、溶液中のバイオマーカーを定量的に測定することができる。他の方法には、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー転移、等が含まれる。00232生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するために使用し得る例示の溶液ベースのアプタマーアッセイには、以下が含まれる:a第一タグが含まれて、バイオマーカーに特異的なアフィニティーを有するアプタマーと生体試料を接触させることによって混合物を調製することここでは、バイオマーカーが試料中に存在するときに、アプタマーアフィニティー複合体が形成される;b上記混合物を第一捕捉要素が含まれる第一固体支持体へ曝露して、第一タグが第一捕捉要素と会合することを可能にすること;c第一固体支持体と会合しない混合物のあらゆる成分を除去すること;d第二タグをアプタマーアフィニティー複合体のバイオマーカー成分へ付けること;e第一固体支持体からアプタマーアフィニティー複合体を放出させること;f放出されたアプタマーアフィニティー複合体を第二捕捉要素が含まれる第二固体支持体へ曝露して、第二タグが第二捕捉要素へ会合することを可能にすること;gアプタマーアフィニティー複合体より非複合化アプタマーを分割することによって、上記混合物よりあらゆる非複合化アプタマーを除去すること;h当該アプタマーを固体支持体より溶出させること;及びiアプタマーアフィニティー複合体のアプタマー成分を検出することによって、そのバイオマーカーを検出すること。イムノアッセイを使用するバイオマーカー値の定量00233イムノアッセイ法は、その対応する標的又は分析物への抗体の反応に基づいて、特定のアッセイフォーマットに依存して、試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異度及び感度を向上させるために、その特異的なエピトープ認識の故に、モノクローナル抗体がしばしば使用される。モノクローナル抗体と比較したときの標的へのアフィニティーの増加の故に、ポリクローナル抗体も様々なイムノアッセイにおいて成功裡に使用されてきた。イムノアッセイは、広範囲の生体試料マトリックスと一緒の使用のために設計されてきた。イムノアッセイフォーマットは、定性的、半定量的、及び定量的な結果をもたらすように設計されている。00234検出される特異的な分析物の既知濃度で創出される標準曲線の使用により、定量的な結果が得られる。未知の試料からの応答又はシグナルを標準曲線上へプロットして、未知試料中の標的へ対応する量又は数値を確定する。00235数多くのイムノアッセイフォーマットが設計されてきた。ELISA又はEIAは、分析物の検出について定量的であり得る。この方法は、分析物又は抗体のいずれかへの標識の付着に依存して、標識成分には、直接的又は間接的に、酵素が含まれる。ELISA検査は、分析物の直接的、間接的、競合的、又はサンドイッチ検出用にフォーマット化することができる。他の方法は、例えば、放射性核種I125又は蛍光のような標識に依存する。追加の技術には、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ、その他が含まれるイムノアッセイ:実践ガイドImmunoAssayAPracticalGuide、BrianLaw監修、出版元:TaylorFrancis社2005年版を参照のこと。00236例示のアッセイフォーマットには、酵素結合免疫吸着法ELISA、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー転移FRET、又は時間分割FRETTR-FRETイムノアッセイが含まれる。バイオマーカーを検出するための手順の例には、バイオマーカーの免疫沈降に続いて、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、平面電気クロマトグラフィー、等のような、サイズ及びペプチドレベルの区別を可能にする定量的な方法が含まれる。00237検出可能な標識又はシグナル発生材料を検出する、及び/又は定量する方法は、標識の性質に依存する。適正な酵素によって触媒される反応の産物ここで、検出可能な標識は酵素である;上記参照は、制限なしに、蛍光性、発光性、又は放射活性であっても、可視光線又は紫外線を吸収してもよい。そのような検出可能な標識を検出するのに適した検出器の例には、制限なしに、X線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、熱量計、蛍光光度計、ルミノメーター、及び濃度計が含まれる。00238上記の検出方法のいずれも、反応物のどの好適な調製、処理、及び分析も可能にする任意のフォーマットにおいて、実施することができる。このことは、例えば、マルチウェルアッセイプレート例、96ウェル又は386ウェル中であっても、又はどの好適なアレイ又はマイクロアレイを使用してもよい。様々な薬剤のストック溶液をマニュアル又はロボットで作製することができて、その後のすべてのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料読出し、データ採取、及び分析は、検出可能な標識を検出することが可能な市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出機器を使用して、ロボットで行うことができる。遺伝子発現プロファイリングを使用するバイオマーカー値の定量00239生体試料中のmRNAを測定することは、生体試料中の対応するタンパク質のレベルの検出の代用法として使用してよい。従って、本明細書に記載のバイオマーカー又はバイオマーカーパネルのいずれも、適正なRNAを検出することによって検出することができる。00240逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRにqPCRを続けるによってmRNA発現レベルを測定する。RT-PCRを使用して、mRNAよりcDNAを創出する。このcDNAをqPCRアッセイに使用すると、DNA増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線への比較により、qPCRは、細胞あたりのmRNAのコピー数といった、絶対測定値を産生することができる。試料中のmRNAの発現レベルを測定するために、ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーInvaderアッセイ、及びキャピラリー電気泳動法と組み合わせたRT-PCRがいずれも使用されている。遺伝子発現プロファイリング:方法とプロトコールGeneExpressionProfilingMethodsandProtocols、RichardAShimkets監修、ヒュマナプレス2004を参照のこと。00241miRNA分子は、非翻訳領域noncodingであるが、遺伝子発現を調節する可能性がある低分子RNAである。mRNA発現レベルの測定に適した方法のいずれも、対応するmiRNAに使用することができる。最近、多くの研究室が、疾患のバイオマーカーとしてのmiRNAの使用を検討している。多くの疾患には広範囲の転写調節が関わるので、バイオマーカーとしての役割をmiRNAに見出したとしても驚きではない。miRNA濃度と疾患の間の関連は、タンパク質レベルと疾患の間の関連よりずっと明らかでないことが多いが、それでもmiRNAバイオマーカーの価値は、実質的であるかもしれない。当然ながら、疾患の間に差示的に発現されるどのRNAとも同じように、invitro診断製品の開発が直面する課題には、miRNAが疾病細胞においても存続して、分析のために容易に抽出される、又はmiRNAが血液又は他のマトリックス中へ放出されて、そこで測定されるのに十分長く存続しなければならないという必要条件が含まれるものである。タンパク質バイオマーカーにも同様の必要条件があるが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、疾患の間に、病態及び機能の部位で、傍分泌の形式で意図的に分泌される。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、その内部でこれらのタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計されている。invivo分子造影技術を使用するバイオマーカーの検出00242記載のバイオマーカー表20を参照のことのいずれも、分子造影検査で使用される可能性がある。例えば、記載のバイオマーカーのいずれへも造影剤を共役させることができて、これを使用して、他の使用の中でも、肺癌診断に役立てる、疾患の進行/寛解又は転移を監視する、疾患再発を監視する、又は療法への応答を監視することができる。00243invivo造影技術は、個体の身体中の特別な疾患の状態を判定するための非侵襲性の方法を提供する。例えば、身体の全部分、又は全身でさえ、三次元画像として視ることができて、それによって身体中の形態及び構造に関する貴重な情報が提供される。そのような技術を本明細書に記載のバイオマーカーの検出と組み合わせて、個体の癌の状態、特に肺癌の状態に関する情報を提供することができる。00244invivo分子造影技術の使用は、技術における様々な進歩により、広がっている。これらの進歩には、身体内部の強いシグナルを提供することができる、新たな造影剤又は標識放射標識及び/又は蛍光標識のようなの開発;及び、有用な情報を提供するのに十分な感度及び精度を伴って、上記シグナルを身体の外側から検出及び分析することができる、強力な新しい造影技術の開発が含まれる。造影剤は、適正な造影システムで可視化することができて、それにより造影剤が定位される身体の単数又は複数の部分の画像が提供される。造影剤は、捕捉試薬例えば、アプタマー又は抗体のようなと、及び/又はペプチド又はタンパク質、又はオリゴヌクレオチド例えば、遺伝子発現の検出のために、又は上記のいずれも含有する複合体と1以上の巨大分子及び/又は他の粒状形態で結合又は会合させてよい。00245造影剤はまた、造影法に有用である放射活性原子を特徴とする場合がある。好適な放射活性原子には、シンチグラフィー試験用のテクネチウム-99m又はヨウ素-123が含まれる。他の容易に検出可能な部分には、例えば、再びヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、又は鉄のような、例えば、磁気共鳴造影法MRIのためのスピン標識が含まれる。そのような標識は、当該技術分野でよく知られていて、当業者によって容易に選択され得る。00246標準造影技術には、限定されないが、磁気共鳴造影法、コンピュータ断層撮影スキャニング、陽電子放射断層撮影法PET、単一光子放射コンピュータ断層撮影法SPECT、等が含まれる。診断invivo造影法では、所与の放射性核種のような所与の造影剤と、標的指向するのに使用される特別なバイオマーカータンパク質、mRNA、等を選択するの重要な要因となるのは、利用可能な検出機器の種類である。選択される放射性核種は、典型的には、所与の種類の機器によって検出可能である、崩壊のタイプを有する。また、invivo診断用に放射性核種を選択するときには、その半減期は、標的組織による最大取込みの時間での検出を可能にするほどに長いが、宿主の有害な放射が最小化されるほどに短くあるべきである。00247例示の造影技術には、限定されないが、放射性核種が合成的又は局所的に個体へ投与される造影技術である、PETとSPECTが含まれる。放射性トレーサーの後続の取込みを経時的に測定して使用して、標的指向された組織とバイオマーカーについての情報を入手する。利用する特定の同位体の高エネルギーγ線放出とそれらを検出するために使用する機器の感度と洗練性sophisticationのために、放射活性の二次元分布は、身体の外側より推測される場合がある。00248PETにおいて一般的に使用されている陽子放出核種には、例えば、炭素-11、窒素-13、酸素-15、及びフッ素-18が含まれるSPECTでは、電子捕捉及び/又はγ線放出によって崩壊する同位体が使用されて、例えば、ヨウ素-123及びテクネチウム-99mが含まれる。アミノ酸をテクネチウム-99mで標識するための例示の方法は、キレート形成前駆体の存在下に過テクネチウム酸イオンを還元して、不安定なテクネチウム-99m-前駆体複合体を形成することであり、次いで、これが二官能性修飾された走化性ペプチドの金属結合基と反応して、テクネチウム-99m-走化性ペプチドコンジュゲートを形成する。00249抗体は、このようなinvivo造影診断法に頻繁に使用される。invivo診断用の抗体の調製及び使用は当該技術分野でよく知られている。個体の疾患状態を診断又は評価する目的のために、使用する特別なバイオマーカーに従って検出可能なある種の癌例、肺癌を有することが疑われる個体へ、表20のバイオマーカーのいずれへも特異的に結合する標識化抗体を注射することができる。使用する標識は、先に記載のように、使用する造影モダリティに従って選択される。この標識の局在定位により、癌の拡がりの判定が可能になる。臓器又は組織内の標識の量はまた、その臓器又は組織における癌の存在又は非存在の判定を可能にする。00250同様に、このようなinvivo造影診断法にアプタマーを使用してよい。例えば、個体の肺癌状態を診断又は評価する目的のために、表20に記載の特別なバイオマーカーを同定するのに使用したそれ故に、その特別なバイオマーカーへ特異的に結合するアプタマーを適正に標識して、その特別なバイオマーカーに従って検出可能な肺癌を有することが疑われる個体へ注射することができる。使用する標識は、先に記載のように、使用する造影モダリティに従って選択される。この標識の局在定位により、癌の拡がりの判定が可能になる。臓器又は組織内の標識の量はまた、その臓器又は組織における癌の存在又は非存在の判定を可能にする。アプタマー指向性の造影剤は、他の造影剤に比べて、組織浸透、組織分布、動態、消失、効力、及び選択性に関して独自の有利な特徴を有する可能性がある。00251このような技術はまた、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドでの造影法による遺伝子発現の検出のために、標識化オリゴヌクレオチドで実施してもよい。これらの方法は、例えば、蛍光分子又は放射性核種を標識として、insituハイブリダイゼーションのために使用する。遺伝子発現の検出のための他の方法には、例えば、レポーター遺伝子の活性の検出が含まれる。00252別の一般的な種類の別の造影技術は、被検者の外側にある光学機器によって被検者内の蛍光シグナルが検出される、光造影法である。これらのシグナルは、実際の蛍光、及び/又は生物発光による場合がある。光検出デバイスの感度の向上により、光造影法のinvivo診断アッセイへの有用性が増してきた。00253臨床試験を含めて、例えば、新たな癌治療法の治験での臨床効果をより迅速に測定するために、及び/又はそのような長期化した治療が倫理的に疑問視されるとみなされる場合がある、多発性硬化症のような疾患へのプラセボでの長期化治療を回避するために、invivo分子バイオマーカー造影法の使用が増えている。00254他の技術の概説については、NBlowNatureMethods64654692009を参照のこと。組織学/細胞学の方法を使用するバイオマーカー値の定量00255肺癌の評価では、多様な組織試料を組織学的又は細胞学的な方法において使用することができる。試料選択は、原発腫瘍の位置と転移の部位に依存する。例えば、組織学には、気管支内生検及び経気管支生検、微細針吸引、角針、及びコア針生検を使用することができる。細胞学には、気管支洗浄及び擦過、胸膜吸引、及び喀痰を使用することができる。肺癌の診断には、細胞学的分析が依然として使用されているが、組織学的方法は、癌の検出のためにより良好な感度を提供することが知られている。肺癌のある個体において上方調節されていることが示された、本発明で同定されたバイオマーカー表19を参照のことのいずれを使用しても、組織学的標本を疾患の指標として染色することができる。002561つの態様では、対応するバイオマーカー複数に特異的な1以上の捕捉試薬複数を肺細胞試料の細胞学的評価に使用して、以下の1以上が含まれる場合がある:細胞試料を採取すること、細胞試料を固定すること、細胞試料を顕微鏡スライド上で脱水、洗浄、固定化すること、細胞試料を透過処理すること、分析物の検索のために処理すること、染色、脱色、洗浄、ブロッキングして、緩衝化溶液中で1以上の捕捉試薬複数と反応させること。別の態様において、細胞試料は、細胞ブロックより産生する。00257別の態様では、対応するバイオマーカーに特異的な1以上の捕捉試薬複数を肺組織試料の組織学的評価に使用して、以下の1以上が含まれる場合がある:組織試料を採取すること、組織試料を固定すること、組織試料を顕微鏡スライド上で脱水、洗浄、固定化すること、組織試料を透過処理すること、分析物の検索のために処理すること、染色、脱色、洗浄、ブロッキング、再水和させて、緩衝化溶液中で捕捉試薬複数と反応させること。別の態様では、固定と脱水を凍結に換える。00258別の態様では、対応するバイオマーカー複数に特異的な1以上のアプタマーを組織学的又は細胞学的試料と反応させて、核酸増幅法における核酸標的として役立てることができる。好適な核酸増幅法には、例えば、PCR、qβレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存性増幅、ループ媒介等温増幅、リガーゼ連鎖反応、並びに、制限及び循環化支援ローリングサークル増幅が含まれる。002591つの態様では、組織学的又は細胞学的評価に使用の対応するバイオマーカーに特異的な1以上の捕捉試薬複数を緩衝化溶液中で混合して、それには以下のいずれも含めることができる:ブロッキング材料、競合剤、界面活性剤、安定化剤、担体核酸、ポリアニオン材料、等。00260一般に、細胞学プロトコールには、試料採取、試料固定、試料固定化、及び染色が含まれる。細胞調製には、試料採取後のいくつかの処理工程を含めることができて、1以上の遅いオフ速度アプタマーを調製済み細胞の染色に使用することが含まれる。00261試料採取には、試料を未処理の運搬容器に直接入れること、ある種の媒体を含有する運搬容器に試料を入れること、又は試料を処理又は固定せずにスライド上へ直接置くこと固定化を含めることができる。00262採取した標本の一部を、ポリリジン、ゼラチン、又はシランで処理したスライドガラスへ塗布することによって、試料固定化を高めることができる。薄くて平坦な層の細胞をスライド全体に塗布することによってスライドを調製することができる。一般的には、機械的な歪みや乾燥での人為的結果を最小化するように配慮する。液体標本は、細胞ブロック法において処理することができる。また、あるいは、液体標本は、固定溶液と室温で約10分間、1:1で混合することができる。00263細胞ブロックは、残留胸水、喀痰、尿沈渣、胃腸液、細胞擦過物、又は微細針吸引物より調製することができる。遠心分離又は膜濾過によって細胞を濃縮又は圧縮する。細胞ブロック調製用のいくつかの方法が開発されてきた。代表的な手順には、固定沈積、細菌寒天、又は膜濾過の方法が含まれる。固定沈積法では、細胞沈積物をブアン固定液、ピクリン酸、又は緩衝化ホルマリンのような固定液と混合してから、この混合物を遠心分離して固定細胞をペレット化させる。上清を除き、細胞ペレットを可能な限り完全に乾燥させる。このペレットを採取して、レンズペーパーに包んでから、組織カセットに入れる。この組織カセットを追加固定液とともに広口瓶に入れて、組織試料として処理する。寒天法はきわめて似ているが、ペレットを取り出して、ペーパータオル上で乾燥させてから半分に切る。スライドガラス上で融かした1滴の寒天にカット側を入れてから、ペレットを寒天で覆って、寒天中に泡が形成されないことを確実にする。この寒天をそのまま固めてから、余分な寒天を切り取る。これを組織カセットに入れて、この組織法を完了させる。あるいは、ペレットを65°Cで2液体寒天に直接懸濁させて、試料を遠心分離させてよい。この寒天細胞ペレットをそのまま4°Cで1時間固化させる。この固体寒天を遠心分離管より取り出して、半分にスライスしてよい。この寒天を濾紙に、次いで組織カセットに包む。この時点から先の処理は、上記に記載した通りである。上記のどの手順でも、遠心分離を膜濾過に換えてよい。上記方法のいずれを使用しても、細胞ブロック試料を産生することができる。00264細胞ブロックは、Lowicryl樹脂、LRWhite、LRGOLD、Unicryl、及びMonoStepが含まれる特殊樹脂を使用して調製することができる。これらの樹脂は、低密度を有していて、低温で、そして紫外UV光線で重合化することができる。この包埋法は、脱水の間に試料を漸次冷やすこと、その試料を樹脂へ移すこと、及び最後の低温と適正なUV波長でブロックを重合させることに依拠する。00265細胞ブロック切片は、細胞形態学的検査のためにヘマトキシリン-エオジンで染色することができる一方、追加の切片は、特異的マーカーの検査に使用する。00266方法が細胞学的であれ組織学的であれ、試料は、試料劣化を防ぐための追加の処理に先立って固定することができる。この方法は、固定法と呼ばれて、可換的に使用し得る広範囲の材料及び手順について記載する。この試料固定法のプロトコール及び試薬は、検出すべき標的と分析すべき特定の細胞/組織種に基づいて、最もよく経験的に選択される。試料固定法は、エタノール、ポリエチレングリコール、メタノール、ホルマリン、又はイソプロパノールのような試薬に依拠する。試料は、採取とスライドへの付着後できるだけすぐに固定すべきである。しかしながら、選択される固定液は、様々な分子標的へ構造変化をもたらして、その後続の検出をより難しくする可能性がある。固定と固定化の方法とそれらの順序は、細胞の外観を変化させる可能性があるので、細胞技術者には、これらの変化が予期されて認識されなければならない。固定液は、ある細胞種の縮化を引き起こして、細胞質が粒状又は網状に見えることを引き起こす可能性がある。多くの固定液は、細胞成分と架橋結合することによって機能する。このことは、特異的エピトープを棄損するか又は変化させる、新しいエピトープを産生する、分子会合を引き起こす、そして膜透過性を低下させる可能性がある。ホルマリン固定法は、最も一般的な細胞学的/組織学的アプローチの1つである。ホルマリンは、近隣タンパク質の間で、又はタンパク質の内部でメチル架橋を形成させる。固定法には沈降又は凝集も使用されて、この種の固定法にはエタノールが頻繁に使用される。固定法には、架橋結合と沈降の組合せも使用することができる。形態学的な情報を保存するときには強い固定法が最良であるが、分子標的の保存には、より弱い固定法が最良である。00267代表的な固定液は、50無水エタノール、2mMポリエチレングリコールPEG、1.85ホルムアルデヒドである。この製剤の変形には、エタノール50~95、メタノール20~50、及びホルマリンホルムアルデヒドのみが含まれる。別の一般的な固定液は、2PEG1500、50エタノール、及び3メタノールである。スライドを室温で約10~15分間固定液に入れてから取り出して、そのまま乾燥させる。スライドを固定したならばすぐに、それらをPBSのような緩衝化溶液で濯ぐことができる。00268広範囲の色素を使用して、細胞、亜細胞、及び組織の特徴又は形態学的構造を差示的に強調して対比させるか又は染色することができる。ヘマトキシリンは、核を青色又は黒色に染色するために使用する。オレンジG-6とエオジンアズールは、細胞の細胞質をともに染色する。オレンジGは、ケラチン及びグリコゲン含有細胞を黄色に染色する。エオジンYは、核小体、繊毛、赤血球、及び表層上皮扁平細胞を染色するために使用する。ロマノフスキー染色は、空気乾燥スライドに使用して、多形性を高めて、細胞外物質を細胞内物質より区別するのに有用である。00269染色法には、細胞の染色剤への透過性を高めるための処理を含めることができる。界面活性剤での細胞の処理を使用して、透過性を高めることができる。細胞及び組織の透過性を高めるために、固定化した試料を、溶媒、サポニン、又は非イオン性界面活性剤でさらに処理することができる。酵素消化はまた、組織試料中の特異的な標的の到達性を向上させることができる。00270染色後、アルコール濃度を高める一連のアルコール洗浄を使用して、試料を脱水する。最終洗浄は、スライドガラスへ適用されるカバーガラスに近い屈折率を有する、キシレン又は柑橘テルペンのようなキシレン代用物で行う。この最終工程は、清浄と呼ばれる。試料を脱水して清浄したらすぐに、封鎖剤を適用する。封鎖剤は、ガラスに近い屈折率を有するように選択されて、カバーガラスをスライドへ結合することが可能である。それはまた、細胞試料のさらなる乾燥、縮化、又は退色を阻害する。00271使用する染色液又は手順にかかわらず、肺の細胞学的標本の最終評価は、形態の目視検査とマーカーの存在又は非存在の判定を可能にする、ある種の顕微鏡法によってなされる。例示の顕微鏡法には、明視野、位相差、蛍光、及び微分干渉コントラストが含まれる。00272検査後の試料に対して二次検査が求められるならば、カバーガラスを外して、スライドを脱染してよい。脱染は、スライドを初めに染色するときに使用した元の溶媒系を追加色素なしに、そして元の染色手順とは逆の順序で使用することを伴う。脱染はまた、細胞が無色になるまで、スライドを酸性アルコールに浸すことによって完了させてよい。無色になったらすぐにスライドを水浴中でよく濯いで、二次染色手順を適用する。00273加えて、抗体又は核酸プローブ又はアプタマーのような特異的な分子試薬の使用により、細胞の形態学的分析と一緒にした、特異的な分子差別化が可能であり得る。これにより、診断細胞学の精度が向上する。顕微解剖を使用して、細胞のサブセットを追加の評価、特に、異常染色体、遺伝子発現、又は突然変異の遺伝評価のために単離することができる。00274組織試料の組織学的評価用の調製は、固定、脱水、浸透、包埋、及び切出しを伴う。組織学で使用する固定試薬は、細胞学で使用するものときわめて似ているか又は同一であり、個別タンパク質のような分子の特徴を犠牲にして形態学的な特徴を保存するのと同じ課題を有する。組織試料を固定及び脱水しない代わりに凍結させてから、凍結している間に切り出せば、時間を節約することができる。これは、より穏やかな処理手順であって、より多くの個別マーカーを保存することができる。しかしながら、凍結は、氷晶の導入により細胞内の情報が失われるので、組織試料の長期保存には許容されない。凍結した組織試料中の氷はまた、切出し法によりごく薄いスライスを作製することを妨げるので、亜細胞構造のある微視的な解像及び造影が失われる可能性がある。ホルマリン固定に加えて、四酸化オスミウムを使用して、リン脂質膜を固定及び染色する。00275組織の脱水は、アルコール濃度が増加する連続洗浄で達成される。清浄は、アルコールと混和する材料と包埋材料を利用して、50:50のアルコール:清浄試薬で始めてから、100清浄剤キシレン又はキシレン代用物への段階法を伴う。浸透は、液体型の包埋剤温ワックス、ニトロセルロース溶液とともに、初めに50:50の包埋剤:清浄剤、次いで100包埋剤で組織をインキュベートすることを伴う。包埋は、組織を型又はカセットに入れて、ワックス、寒天、又はゼラチンのような融けた包埋剤で充填することによって完了する。包埋剤は、そのまま硬化させる。次いで、硬化した組織試料は、染色と後続の検査のために薄片へスライスすることができる。00276染色に先立って、組織切片を脱ワックスdewaxedして、再水和させる。キシレンを使用して切片を脱ワックスするが、1回以上のキシレン交換を使用してよく、濃度が減少するアルコール中での連続洗浄によって組織を再水和させる。脱ワックスに先立って、組織切片は、約80°Cで約20分間、スライドガラスへ加熱固定化してよい。00277レーザー捕捉顕微解剖により、組織切片からのさらなる分析のために、細胞のサブセットの単離が可能になる。00278細胞学におけるように、微視的な特徴の可視化を高めるために、組織切片又はスライスを多様な染色液で染色することができる。市販染色液の大きなメニューを使用して、特異的な特徴を強調するか又は同定することができる。00279細胞学的/組織学的試料と分子試薬の相互作用をさらに高めるために、分析物検索用のいくつかの技術が開発されてきた。第一のそのような技術は、固定化試料の高温加熱を使用する。この方法は、加熱誘導エピトープ検索又はHIERとも呼ばれる。多様な加熱技術が使用されていて、蒸気加熱、マイクロ波加熱、オートクレーブ処理、水浴、及び圧力鍋、又はこれらの加熱法の組合せが含まれる。分析物検索溶液には、例えば、水、クエン酸塩溶液、及び生理食塩水緩衝液が含まれる。分析物検索の鍵となるのは高温での時間であるが、より低温でより長い時間も成功裡に使用されている。分析物検索のもう1つの鍵となるのは、加熱溶液のpHである。低いpHは、最良の免疫染色を提供することが見出されているが、バックグラウンドも生じるので、第二の組織切片を陰性対照として使用することが頻繁に求められる。最も一貫性がある利益バックグラウンドの増加を伴わない、免疫染色の増加が概して得られるのは、緩衝液の組成を問わず、高いpH溶液を用いる場合である。特異的な標的への分析物検索法は、経験的に、加熱、時間、pH、及び緩衝液組成をプロセス最適化の変数として使用して、その標的に最適化される。マイクロ波の分析物検索法を使用すると、異なる標的の抗体試薬での連続染色が可能になる。しかし、染色工程の間に抗体及び酵素複合体を完成させるのに求められる時間はまた、細胞膜の分析物を劣化させることが示された。マイクロ波加熱法は、insituハイブリダイゼーションの方法も改善してきた。00280分析物検索法を開始するには、初めに切片を脱ワックスして、水和させる。次いで、スライドをディッシュ又は広口瓶中の10mMクエン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に入れる。代表的な手順は、1100Wマイクロ波を使用して、スライドを電力100で2分間マイクロ波加熱することに続けて、スライドが液体に覆われていることを確認した後で、このスライドを、電力20を18分間使用してマイクロ波加熱する。次いで、スライドを蓋のない容器中でそのまま冷やしてから、蒸留水で濯ぐ。HIERは、標的の免疫化学試薬への反応性を高めるために、酵素消化と組み合わせて使用してよい。002811つのこのような酵素消化プロトコールは、プロテイナーゼKを使用する。50mMトリス塩基、1mMEDTA、0.5TritonX-100pH8.0緩衝液で20μg/ml濃度のプロテイナーゼKを調製する。この方法は、初めに、2交換のキシレン、各5分で切片を脱ワックスすることを伴う。次いで、試料を2交換の100エタノールで各3分間、95及び80エタノールで各1分間水和させてから、蒸留水で濯ぐ。切片をプロテイナーゼK希釈標準溶液で覆って、加湿チャンバにおいて37°Cで10~20分インキュベートする最適なインキュベーション時間は、組織の種類と固定の度合いに依存して変えてよい。この切片を室温で10分間冷やしてから、PBSTween20中で2x2分間濯ぐ。望まれるならば、切片をブロックして、内因性の化合物及び酵素からの潜在的な干渉を無くすことができる。次いで、この切片を一次抗体希釈緩衝液で適正に希釈した一次抗体とともに室温で1時間、又は4°Cで一晩インキュベートする。次いで、この切片をPBSTween20で2x2分間濯ぐ。特別な応用のために求められるならば、追加のブロッキングを実施することができて、PBSTween20で3x2分の追加の濯ぎを続けてから、最後に免疫染色プロトコールを完了する。00282室温、1SDSでの簡単な処理も、免疫組織化学染色を向上させることが実証されてきた。分析物検索法は、スライドに載せた切片だけでなく、自由浮遊性の切片にも適用されている。別の処理オプションは、クエン酸及び0.1ノニデントP40をpH6.0で含有する広口瓶にスライドを入れて、95°Cまで加熱することである。次いで、このスライドをPBSのような緩衝溶液で洗浄する。00283組織の免疫学的染色では、血清又は無脂肪乾燥乳のようなタンパク溶液に切片を浸漬することによって、抗体の組織タンパク質との非特異的な会合を阻止することが有用であり得る。00284反応を阻止することには、内因性ビオチンのレベルを低下させる;内因性の帯電効果を消失させる;内因性ヌクレアーゼを不活性化する;及び/又は、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼのような内因性酵素を不活性化する必要性が含まれる場合がある。内因性ヌクレアーゼは、プロテイナーゼKでの分解によって、加熱処理、EDTA又はEGTAのようなキレート剤の使用、担体DNA又はRNAの導入、尿素、チオ尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸リチウム、等、又はピロ炭酸ジエチルのようなカオトロープでの処理によって不活性化することができる。アルカリホスファターゼは、0.1NHClで、室温で5分間の処理、又は1mMレバミゾールでの処理によって不活性化することができる。ペルオキシダーゼの活性は、0.03過酸化水素での処理によって消失させることができる。内因性ビオチンは、スライド又は切片をアビジンストレプタビジン、ニュートラアビジンを代用してよい溶液に室温で少なくとも15分間浸漬することによって、阻止することができる。次いで、このスライド又は切片を緩衝液中で少なくとも10分間洗浄する。これは、少なくとも3回繰り返してよい。次いで、スライド又は切片をビオチン溶液に10分間浸漬する。これは、毎回新鮮なビオチン溶液で、少なくとも3回繰り返してよい。この緩衝液洗浄手順を繰り返す。阻止プロトコールは、細胞又は組織構造、又は目的の単数又は複数の標的のいずれかを棄損することを防ぐために最小化すべきであるが、上記プロトコールの1以上を組み合わせると、1以上の遅いオフ速度アプタマーとの反応に先立って、スライド又は切片をブロックすることができる可能性がある。基礎医科組織学:細胞、組織、及び臓器の生物学BasicMedicalHistologytheBiologyofCellsTissuesandOrgansRichardGKessel著、オックスフォード大学出版局1998を参照のこと。質量分析法を使用するバイオマーカー値の定量00285多様な配置の質量分析計を使用して、バイオマーカー値を検出することができる。数種の質量分析計が利用可能であるか、又は様々な配置で製作することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素を有する:試料注入口、イオン発生源、質量分析計、検出器、真空システム、及び機器制御システム、及びデータシステム。一般に、試料注入口、イオン発生源、及び質量分析計の違いにより、機器の種類とその能力が決定される。例えば、注入口は、毛細管-カラム液体クロマトグラフィー源であり得るか、又はマトリックス支援レーザー脱離に使用されるような直接プローブ又はステージであり得る。一般的なイオン発生源は、例えば、ナノスプレー及びマイクロスプレーが含まれるエレクトロスプレー、又はマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析計には、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析計、及び飛行時間型質量分析計が含まれる。当該技術分野では、さらなる質量分析法の方法がよく知られているBurlingameetalAnalChem70647R716RKinterandShermanタンデム質量分析法を使用するタンパク質の配列決定及び同定Proteinsequencingandidentificationusingtandemmassspectrometryニューヨーク、ウィリーインターサイエンス2000を参照のこと。00286タンパク質バイオマーカーとバイオマーカーの数値は、以下のいずれによっても検出して測定することができる:エレクトロスプレーイオン化質量分析法ESI-MS、ESI-MS/MS、ESI-MS/MSn、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法MALDI-TOF-MS、表面増強レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法SELDI-TOF-MS、シリコン上の脱離/イオン化DIOS、二次イオン質量分析法SIMS、四重極飛行時間型Q-TOF、ウルトラフレックスIIITOF/TOFと呼ばれるタンデム飛行時間型TOF/TOF技術、大気圧化学イオン化質量分析法APCI-MS、APCI-MS/MS、APCI-MSN、大気圧光イオン化質量分析法APPI-MS、APPI-MS/MS、及びAPPI-MSN、四重極質量分析法、フーリエ変換質量分析法FTMS、定量的な質量分析法、及びイオントラップ質量分析法。00287質量分析法によるタンパク質バイオマーカーの特定決定とバイオマーカー値の定量の前に、試料調製戦略を使用して試料を標識して濃縮する。標識法には、限定されないが、相対及び絶対定量用等圧タグiTRAQと細胞培養中のアミノ酸での安定同位体標識化SILACが含まれる。質量分析法の分析に先立って、候補バイオマーカータンパク質のために試料を選択的に濃縮するのに使用する捕捉試薬には、限定されないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子、Fab’2断片、単鎖抗体断片、Fv断片、単鎖Fv断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体スカフォールド例、ダイアボディ、等、印字ポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、並びに上記の修飾物及び断片が含まれる。00288上述のアッセイは、肺癌を診断するための方法に有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、ここで該方法は、個体からの生体試料において、表18、20、又は21に提供されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともN個のバイオマーカー値を検出することを含み、ここでは、バイオマーカー値を使用する、以下に詳しく記載するような分類により、その個体が肺癌を有するかどうかが示される。記載した肺癌バイオマーカーのあるものは、肺癌を検出及び診断するのに単独で有用であるが、本明細書では、3以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用である肺癌バイオマーカーの複合サブセットの群分けの方法についても記載する。このように、本出願の様々な態様は、N個のバイオマーカーを含んでなる組合せを提供し、ここでNは、少なくとも3個のバイオマーカーである。他の態様では、2~86の任意数のバイオマーカーであるようにNを選択する。上記に記載の範囲のいずれかだけでなく、同様の、しかしより高い次数の範囲の任意数であるようにNを選択することができると理解されよう。本明細書に記載の方法のいずれにも従って、バイオマーカー値を個別に検出して分類することができるか、又はそれらは、例えばマルチプレックスアッセイフォーマットにおけるように、集合的に検出して分類することができる。00289別の側面では、肺癌の非存在を検出するための方法を提供し、該方法は、個体からの生体試料において、表18、20、又は21に提供されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともN個のバイオマーカー値を検出することを含んでなり、ここでは、以下に詳しく記載するようなバイオマーカー値の分類が個体における肺癌の非存在を示す。記載した肺癌バイオマーカーのあるものは、肺癌の非存在を検出及び診断するのに単独で有用であるが、本明細書では、3以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用である肺癌バイオマーカーの複合サブセットの群分けの方法についても記載する。このように、本出願の様々な態様は、N個のバイオマーカーを含んでなる組合せを提供し、ここでNは、少なくとも3個のバイオマーカーである。他の態様では、2~86の任意数のバイオマーカーであるようにNを選択する。上記に記載の範囲のいずれかだけでなく、同様の、しかしより高い次数の範囲の任意数であるようにNを選択することができると理解されよう。本明細書に記載の方法のいずれにも従って、バイオマーカー値を個別に検出して分類することができるか、又はそれらは、例えばマルチプレックスアッセイフォーマットにおけるように、集合的に検出して分類することができる。バイオマーカーの分類と疾患スコアの計算00290所与の診断検査用のバイオマーカーサインsignatureは、マーカーのセットを含有して、各マーカーは、目的の集団において異なるレベルを有する。異なるレベルは、この文脈において、2以上の群の個体についてのマーカーレベルの異なる平均値、又は2以上の群における異なる分散、又は両者の組合せを意味する場合がある。診断検査の最も単純な形式では、これらのマーカーを使用して、個体からの未知試料を疾患群か非疾患群の2群の1つへ帰属させることができる。2以上の群の1つへ試料を帰属させることは、分類として知られていて、この帰属を達成するために使用される手順は、分類器又は分類法として知られている。分類法は、スコア化法と呼ばれる場合もある。バイオマーカー値のセットより診断分類器を構築するために使用することができる、多くの分類法がある。一般に、分類法は、教師付き学習技術を使用して最も容易に実施されて、ここでは、区別することが望まれる2つ又は、複合分類状態では、より多くの別個の群内の個体より入手した試料を使用して、データセットを採取する。各試料が属するクラス群又は集団は、各試料について前もって知られているので、分類法を訓練して、所望の分類応答を得ることができる。また、教師付き学習技術を使用して、診断分類器を産生することが可能である。00291診断分類器を開発するための一般的なアプローチには、決定木;バッギングブースティングランダム森;推論ルールに基づく学習;パルザン窓;線形モデル;記号論理学;ニューラルネットワーク方法;教師なしクラスタリング;K平均法;階層上昇/下降;半教師付き学習;プロトタイプ手法;最近隣法;カーネル密度推定;サポーティブベクターマシーン;隠れマルコフモデル;ボルツマン学習が含まれて、分類器を単純に組み合わせても、特別な目的関数を最小化するやり方で組み合わせてもよい。概説については、例えば、パターン分類PatternClassification、RODudaetal監修、ジョンウィリーアンドサンズ、第2版2001を参照のこと;統計学習の基本:データマイニング、推論、及び予測TheElementsofStatisticalLearningDataMiningInferenceandPredictionTHastieetal監修SpringerScienceBusinessMediaLLC第2版2009も参照のこと;これらのいずれもその全体が参照により組み込まれる。00292教師付き学習技術を使用して分類器を作成するには、訓練データと呼ばれる試料のセットを入手する。診断検査の文脈において、訓練データには、未知試料が後に帰属される別個の群クラスからの試料が含まれる。例えば、対照集団の個体と特別な疾患集団の個体より採取される試料が、未知試料又は、より特別には、試料を入手した個体を、疾患を有するもの又は疾患がないもののいずれかとして分類し得る分類器を開発するための訓練データを構成することができる。訓練データからの分類器の開発は、分類器を訓練することとして知られている。分類器訓練に関する具体的な詳細は、教師付き学習技術の性質に依存する。例解の目的のために、単純ベイズ分類器を訓練する例について以下に記載する例えば、パターン分類PatternClassification、RODudaetal監修、ジョンウィリーアンドサンズ、第2版2001を参照のこと;統計学習の基本:データマイニング、推論、及び予測TheElementsofStatisticalLearningDataMiningInferenceandPredictionTHastieetal監修SpringerScienceBusinessMediaLLC第2版2009も参照のこと。00293典型的には、訓練セットの試料より潜在的な多くのバイオマーカー値があるので、過剰適合を回避するように配慮を用いなければならない。過剰適合が起こるのは、統計モデルが基本的なunderlying関係の代わりにランダム誤差又はノイズを記載するときである。過剰適合は、例えば、分類器を開発するのに使用するマーカーの数を制限すること、マーカーの応答が互いに独立していると仮定すること、利用する基本的な統計モデルの複雑性を制限すること、及びこの基本統計モデルがデータに一致することを確実にすることが含まれる、多様なやり方で回避することができる。00294バイオマーカーのセットを使用する診断検査法の開発の具体例には、バイオマーカーの厳密な独立処理を伴う、単純ベイズ分類器、ベイズ理論に基づいた単純な確率的分類器の適用が含まれる。各クラスの測定RFU値又は対数RFU相対蛍光単位値のクラス依存確率密度関数pdfによってそれぞれのバイオマーカーを記載する。1つのクラスのマーカーセットについての同時pdfは、各バイオマーカーの個別のクラス依存pdfの積であると仮定する。単純ベイズ分類器をこの文脈で訓練すると、クラス依存pdfを特性決定するためのパラメータを帰属させることパラメータ化になる。クラス依存pdfのどの基本モデルも使用してよいが、モデルは、訓練セットで観測したデータに概ね一致すべきである。00295具体的には、バイオマーカーiの数値xiを疾患クラスにおいて測定するクラス依存確率をpxi|dと書いて、n個のマーカーを数値で観測する全体的な単純ベイズ確率を[式中、個々のχiは、RFU又は対数RFUで測定されたバイオマーカーレベルである]と書く。未知試料の分類帰属は、測定値を有して疾患状態にある確率を同じ測定値で疾患がない対照確率に対して計算することによって容易になる。これらの確率の比は、ベイズの定理、即ち[ここでPdは、検定に適した集団における疾病の罹患率である]の適用によってクラス依存pdfより計算される。この比の両辺の対数を取って、上記からの単純ベイズクラス依存確率を代入して、を得る。この形式は、対数尤度比として知られていて、特別な疾患がないこと対疾患を有することの対数尤度を単に述べるものであり、n個の個別バイオマーカーの個々の対数尤度比の総和から主に構成される。この最も単純な形式において、未知試料又は、より特別には、試料を入手した個体を、上記の比が0より大きければ疾患がないとして、そしてその比が0未満であれば疾患を有するとして分類する。002961つの例示の態様において、クラス依存バイオマーカーのpdf:pxi|c及びpxi|dは、測定RFU値xiが正規分布又は対数正規分布である、即ち、であると仮定するpxi|dは、μd,i及びσ2d,iを用いて同様の式とする。このモデルのパラメータ化には、それぞれのクラス依存pdfについての2つの変数、平均値のμと分散のσ2を訓練データより推定することが求められる。このことは、例えば、最大尤度推定法、最小二乗法、並びに当業者に知られた他のあらゆる方法が含まれるいくつかのやり方で達成することができる。pxi|c及びpxi|dの正規分布を上記に定義した対数尤度比へ代入して、以下の式:を得る。各クラスの各pdfについて訓練データよりμ及びσ2のセットを決定して、その集団中の疾病罹患率を特定したならば、ベイズ分類器を完全に決定して、これを使用して測定値xの未知試料を分類することができる。00297単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築して訓練するのに使用するバイオマーカーの数及び質に依存する。単一のバイオマーカーは、以下の実施例3に定義されるようなKS距離コルモゴロフ-スミルノフに従って機能する。分類器の性能計量を感度真陽性率、∫TP及び特異度1-偽陽性率、1-∫FPの和として定義すれば、完全分類器は2のスコアを有して、ランダム分類器は、平均して1のスコアを有する。KS距離の定義を使用して、px|c=px|dをもたらす、即ちクラス依存pdfが交差する場合のKS距離が生じるxについて、を解くことによって、cdf関数の差を最大にする値xを見出すことができる。このx値をKS距離の式へ代入して、以下のKSの定義:を得る。KS距離は、xでのカットオフの検定、本質的には単一分析物のベイズ分類器を使用して、1-合計過誤率である。感度特異度のスコアは、KS距離の上記定義を組み合わせて、2-∫FP-∫FNであると定義されるので、感度特異度=1KSとなることがわかる。我々は、単純ベイズ分類器を構築するのに本来適している統計数字のあるバイオマーカーを選択する。00298一般に、良好なKS距離例えば、>0.3がある後続のマーカーを加えることは、後続して加えられるマーカーが第一のマーカーから独立しているならば、分類性能を高めるものである。感度特異度を分類器スコアとして使用すると、貪欲アルゴリズムの変法で多くの高スコア化分類器を作成することが直接的になる貪欲アルゴリズムとは、全体最適を見出すことを期待して、各段階での局所最適選択をする問題解決メタヒューリスティクスに従うアルゴリズムである。00299ここで使用するアルゴリズムアプローチについては、実施例4で詳しく記載する。簡潔に言えば、潜在的なバイオマーカーの表よりすべての単一分析物分類器を作成して、リストへ加える。次に、このスコア化した単一分析物分類器のそれぞれへ第二の分析物のすべての可能な追加を実施して、新しいリストで、最良スコアペアの所定数、例えば、1000をとっておく。この最良の2マーカー分類器の新しいリストを使用してすべての可能な3マーカー分類器を探して、再びこのうちで最良の1000をとっておく。スコアがプラトーに達するか又は追加のマーカーを加えるたびに悪化し始めるまで、この方法を続ける。収束後に残るこの高スコア化分類器について、企図される使用に望まれる性能を評価することができる。例えば、1つの診断適用では、高い感度と中程度の特異度の分類器が中程度の感度と高い特異度より望ましい場合がある。別の診断適用では、高い特異度と中程度の感度の分類器がより望ましいかもしれない。一般に、所望される性能のレベルは、特別な診断適用のためにそれぞれ忍容され得る偽陽性と偽陰性の数の間でなさざるを得ないトレードオフに基づいて選択される。一般に、このようなトレードオフは、偽陽性又は偽陰性のいずれかの過誤の医療結果に依存するものである。00300当該技術分野では他の様々な技術が知られていて、バイオマーカーのリストより単純ベイズ分類器を使用して多くの潜在的な分類器を作成するのに利用することができる。1つの態様では、遺伝アルゴリズムと呼ばれるものを使用して、上記に定義されるような適合スコアを使用して異なるマーカーを組み合わせることができる。遺伝アルゴリズムは、潜在的な分類器の多種多様な集団を探すのに特によく適している。別の態様では、いわゆる蟻コロニー最適化を使用して、分類器のセットを作成することができる。例えば、他の進化戦略、並びに焼きなまし法や他の確率的stochastic探索法が含まれる、当該技術分野で知られている他の戦略も利用することができる。例えば、ハーモニー探索法のようなメタヒューリスティクス法も利用してよい。00301例示の態様は、表18、20、又は21に収載した任意数の肺癌バイオマーカーを様々な組合せで使用して、肺癌を検出するための診断検査法を産生するこれらのバイオマーカーを同定した方法の詳しい記載については、実施例2及び6を参照のこと。1つの態様において、肺癌を診断する方法は、単純ベイズ分類法を表18、20、又は21に収載した任意数の肺癌バイオマーカーと一緒に使用する。具体例実施例3において、無症状喫煙者の集団より肺癌を検出するための最も単純な検査法は、単一のバイオマーカー、例えば肺癌において下方調節されていて、KS距離が0.37である1KS=1.37SCFsRを使用して構築することができる。表15からのSCFsRのパラメータ、μc,j、σc,i、μd,j、及びσd,iと上記に記載の対数尤度の等式を使用して、63の感度と73の特異度感度特異度=1.36の診断検査法を産生することができる表14を参照のこと。この検査法のROC曲線は、図2に表示されて、0.75のAUCを有する。00302例えば、KS距離が0.5であるバイオマーカーHSP90aを加えると、分類器の性能が76の感度と75の特異度感度特異度=1.51そしてAUC=0.84へと有意に向上する。2つのバイオマーカーより構築した分類器のスコアがKS距離の単純和でないことに留意されたい;KS距離は、バイオマーカーを組み合わせるときに相加的でなく、強いマーカーと同じレベルの性能を達成するには、多くのより弱いマーカーが必要となる。例えば、第三のマーカー、ERBB1を加えると、分類器の性能は、78の感度と83の特異度、そしてAUC=0.87へ押し上げられる。例えば、PTN、BTK、CD30、カリクレイン7、LRIG3、LDH-H1、及びPARCのような追加のバイオマーカーを加えると、表14に要約されて、図3において一連のROC曲線として表示される一連の肺癌検査法が産生される。分類器構築に使用される分析物の数の関数としての分類器のスコアを図4に表示する。この例示の10マーカー分類器の感度及び特異度は>87であって、AUCは0.91である。00303表18、20、又は21に収載したマーカーは、多くのやり方で組み合わせて、肺癌を診断するための分類器を産生することができる。いくつかの態様において、バイオマーカーのパネルは、選択される特定の診断性能基準に依存して、異なる数の分析物より構成される。例えば、バイオマーカーのある組合せは、他の組合せより高感度である又はより特異的である検査法を産生する。00304表18、20、又は21からのバイオマーカーの特別なセットが含まれるようにパネルを決定して、訓練データのセットより分類器を構築したならば、診断検査法の定義が完了する。1つの態様では、未知試料を分類するために使用する手順を図1Aに概略する。別の態様では、未知試料を分類するために使用する手順を図1Bに概略する。生体試料を適正に希釈してから、1以上のアッセイで処理して、分類に使用する、関連性のある定量的なバイオマーカーレベルを産生する。測定されたバイオマーカーレベルは、クラス帰属の信頼性を反映する試料の分類と自由選択スコアを出力する分類法のためのインプットとして使用される。00305表21は、組織と血液の両方の試料において肺癌を診断するのに有用である86種のバイオマーカーを同定する。表20は、組織試料中に同定されたが、血清及び血漿の試料でも同様に有用である25種のバイオマーカーを同定する。これは、バイオマーカー探索の努力の間に典型的に見出されるものと比較するときに予期されるよりも驚くほど多い数であって、数百の個別試料において、ある場合は低いフェントモル濃度の範囲の濃度で測定される800を超えるタンパク質が含まれる、記載の試験の規模に起因する可能性がある。おそらく、探索バイオマーカーの数が多いことは、腫瘍の生物学と腫瘍の存在に対する身体の応答の両方で意義がある多様な生化学経路を反映している。つまり、それぞれの経路及びプロセスに多くのタンパク質が関与するのである。この結果は、そのような複雑なプロセスに関して独自に情報価値がある単一のタンパク質もタンパク質の小集団もなく、むしろ、例えば、アポトーシスや細胞外マトリックス修復のような関連したプロセスに多数のタンパク質が関与していることを示している。00306記載の試験の間に同定された数多くのバイオマーカーを仮定すれば、様々な診断法において使用し得る多数の高機能性の分類器を導くことができると期待されよう。この考えを検証するために、表1のバイオマーカーを使用して、1万もの分類器について評価した。実施例4に記載するように、表1に提示されるバイオマーカーの多くのサブセットを組み合わせて、有用な分類器を作成することができる。例として、2つの使用高リスク状態の喫煙者の肺癌スクリーニングとCTによって検出可能である肺結節を有する個体の診断のそれぞれについて、1、2、及び3個のバイオマーカーを含有する分類器についての記載を提供する。実施例4に記載されるように、表1のバイオマーカーを使用して構築したすべての分類器は、非マーカーを使用して構築した分類器より顕著に優れて機能する。00307表1のマーカーのいくつかを無作為に除外することこのことは、分類器を構築するためのより小さなサブセットをもたらしたによって入手される分類器の性能についても検証した。実施例4、パート3に記載されるように、表1のマーカーのランダムサブセットより構築した分類器は、表1のマーカーの全リストを使用して構築した最適分類器と同様に機能した。0030810マーカー集合体より最良の個別マーカーを除外することによって入手される10マーカー分類器の性能も検証した。実施例4、パート3に記載されるように、表1の最良マーカーなしで構築した分類器も、良好に機能した。表1に収載したバイオマーカーの多くのサブセットは、この表に収載したマーカーの上位15種を除外した後でも、最適に近く機能した。このことは、どの特別な分類器の性能特性も、バイオマーカーのある小さなコア集団によるという可能性が低いこと、そして疾患プロセスがおそらくは数多くの生化学経路に影響を及ぼして、それが多くのタンパク質の発現レベルを改変させることを示唆している。00309実施例4からの結果は、いくつかのあり得る結論を示唆する:第一に、多数のバイオマーカーの同定により、同様に高い性能を提供する膨大数の分類器へのその集合化が可能になること。第二に、根源的な疾患プロセスの複雑性に疑いなく充満する冗長度を反映するやり方で、特別なバイオマーカーを他のバイオマーカーで代用し得るように、分類器を構築することができること。つまり、表1に同定されるどの個別バイオマーカーによっても寄与される疾患に関する情報も、他のバイオマーカーによっても寄与される情報と重複するので、表1のどの特別なバイオマーカー又はバイオマーカーの小集団でも、ある分類器に含めなければならないものはないであろうこと。00310例示の態様は、表38及び39のデータより構築した単純ベイズ分類器を使用して、未知試料を分類する。この手順を図1A及びBに概略する。1つの態様では、生体試料を任意選択的に希釈して、多重化アプタマーアッセイで処理する。実施例3に概略されるように、このアッセイからのデータを正規化及び較正して、得られるバイオマーカーレベルをベイズ分類スキームへのインプットとして使用する。それぞれの測定バイオマーカーについて対数尤度比を個別に計算してから合計して、診断スコアとも呼ばれる、最終分類スコアを産出する。得られる帰属、並びに全体分類スコアを報告することができる。それぞれのバイオマーカーレベルについて計算される個別の対数尤度リスク因子も同様に報告してもよい。分類スコア計算の詳細は、実施例3に提示する。00311本明細書に記載のアプタマーベースのプロテオミック技術の、組織由来の疾患関連バイオマーカーの探索における使用への有用性を実証するために、8名の非小細胞肺癌NSCLC患者より入手した、外科摘出由来の均質化した組織試料について実施例6に記載のように分析した。NSCLC患者はいずれも47~75歳の範囲に及ぶ喫煙者であって、NSCLC病期1A~3Bが含まれた表17。それぞれの摘出試料より3つの試料:腫瘍組織試料、隣接非腫瘍組織を入手した。プロテオミックプロファイリングのために、各ホモジェネート中の総タンパク濃度を補正して正規化して、DNAマイクロアレイプラットフォームの分析を続けて、800種を超えるヒトタンパク質の濃度を測定したGoldetalNaturePrecedingshttpprecedingsnaturecomdocuments4538version1を参照のこと。00312相対蛍光単位RFUとして表されるタンパク濃度測定値により、試料間のタンパク質サインの大規模比較が可能になる図21を参照のこと。図21を参照にすると、初めに、それぞれの患者試料について、対照隣接組織と遠位組織の間でタンパク質発現のレベルを比較した図21A。この比較では、ただ1つの分析物フィブリノゲンが試料の間で2倍以上の差を明示した。全体的には、ほとんどの分析物によって産生されるシグナルは、隣接組織と遠位組織の間で同様であった。00313対照的に、非腫瘍組織隣接又は遠位と腫瘍組織の比較により、4倍より大きい差がある11種1.3のタンパク質と2倍より大きい差がある53種6.5のタンパク質が同定された図21B及び21Cを参照のこと。残る767種93.5のタンパク質は、腫瘍組織と非腫瘍組織の間で相対的により小さな差を示した。腫瘍組織では、隣接又は遠位組織に比べて、実質的に抑制されているタンパク質もあれば、上昇しているものもあった。タンパク質の差示的な発現は、隣接組織と腫瘍組織の間、又は遠位組織と腫瘍組織の間で概ね同様であった。全般的には、遠位組織での変化の方がより大きかった図21が、このことは、ほとんどのタンパク質の変化が局所の腫瘍環境に特異的であることを実証する。00314NSCLC組織バイオマーカーを同定するために、OstroffetalNaturePrecedingshttpprecedingsnaturecomdocuments4537version1に記載のように、マンホイットニー検定を使用して、腫瘍、隣接、及び遠位組織の試料間のタンパク質発現レベルを比較した。腫瘍と非腫瘍組織の間で最大の倍率変化があって、統計的に有意な差がある36種のタンパク質を、有意水準q<0.05の偽発見率カットオフで同定した図23及び24と表18。腫瘍組織では、これらのタンパク質のうち20種が上方調節されていて、16種が下方調節されていた。本研究で使用した試料の数は相対的に小さかったが、それぞれの腫瘍試料がそれ自体の健常組織対照を有する、強力な個体ベースの試験デザインを利用した。これにより、集団ベースの試験デザインに付随する母集団分散が消去される。適正に選択される参照試料が利用可能であることは、バイオマーカー探索研究において決定的に重要な構成要素としてますます認知されているBossuytJAmMedAssoc305222930IoannidisandPanagiotouJAmMedAssoc305220010DiamandisJNatlCancerInst10214627。00315本発明で同定されたNSCLC組織バイオマーカーのほぼ1/313/36は、新規であると考えられている。残る2/323/36については、NSCLC腫瘍組織において差示的に発現されるタンパク質又は遺伝子としてすでに報告されている表18。00316実施例6の方法に従って同定されたバイオマーカーは、表19に示すように、腫瘍生物学の重要な特徴に関連した4つの生物学的プロセス:1血管新生、2成長と代謝、3炎症とアポトーシス、及び4浸潤と転移へ大まかに分類することができるHanahanWeinbergCell14464674。認められるように、これらは、上記の分子がしばしば多重的で微妙な役割を担うきわめて複雑で動的なシステムに近似する、簡便であるが不正確な分類である。故に、どの特別な分子の発現及び機能にも最終的に影響を及ぼすのは、所与の系の特異的な状態である。これらの系の生物学的な理解は、完全から程遠い。SOMAスキャンプラットフォームを用いると、様々な組織及び疾患プロセス中での多数のタンパク質の定量的な表現が可能になる。これらのデータは、上記の系の動態をマップするのに役立つ新たな座標を提供し、次いで肺癌だけでなく他の疾患の生物学のより完全な理解を提供するだろう。現行の研究からの諸結果は、馴染みの要素と新たな要素がともにある、NSCLC腫瘍生物学に関する新たな見方をもたらすはずである。血管新生00317血管新生は、腫瘍の成長及び代謝を支える新たな血管の成長を推進する。血管新生の調節は、正のシグナルと負のシグナルの両方によって制御される複雑な生体現象であるHanahanWeinbergCell14464674。本研究で同定されたNSCLC組織バイオマーカーには、よく知られた正の血管新生レギュレータと負の血管新生レギュレータがあって図23及び24と表19、このいずれもNSCLC腫瘍組織においてすでに観測されたことがあるFontaninietalBritishJournalofCancer79363369ImotoetalJThoracCarciovascSurg11510071011OhtaetalAnnThoracSurg8211801184IizasaetalClinicalCancerResearch1053615366。これらには、プロトタイピックprototypic血管新生誘導剤のVEGFと阻害剤のエンドスタチン及びトロンボスポンジン-1TSP-1が含まれる。VEGFは、新たな血管成長を促進する強力な成長因子であって、これまでの観測結果ImotoetalJThoracCarciovascSurg11510071011に一致して、そしてNSCLC患者からの血清試料についての我々の研究OstroffetalNaturePrecedingshttpprecedingsnaturecomdocuments4537version1を含めて、NSCLC腫瘍組織において強く上方調節されていた。エンドスタチンは、コラーゲンXVIIIのタンパク分解断片であって、内皮細胞増殖と血管新生の強力な阻害剤であるIizasaetalClinicalCancerResearch1053615366。NSCLC腫瘍組織では、TSP-1と関連のトロンボスポンジン-2TSP-2が実質的に上方調節されていた。TSP-1とTSP-2は、細胞表面受容体、成長因子、サイトカイン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、及び他の分子との様々な相互作用を介して変調される、複雑で状況依存的な効果がある細胞外マトリックスタンパク質である。モデル系において、原型的には、TSP-1とTSP-2は、CD47受容体を介して内皮細胞増殖を阻害することと、CD36受容体を介して内皮細胞アポトーシスを誘導することによって血管新生を阻害する。TSP-1とTSP-2については、好血管新生性の影響への証拠もあるBornsteinJCellCommunSignal3189200。最後に言えば、報告されたNSCLC組織中のTSP-1及びTSP-2の相対的及び絶対的な発現レベルは、おそらくはそれらの複雑な機能のために、まちまちであるChijiwaetalOncologyReports22279283ChenetalJIntMedRes37551556Oshika1998FontaninietalBritishJournalofCancer79363369。本研究では、NSCLC腫瘍組織においてCD36が下方調節されていることが見出されて、このことは、腫瘍細胞の適応によりTSP-1及びTSP-2媒介性アポトーシスへの感受性が低下することを示す可能性がある。成長と代謝00318同定されたNSCLCバイオマーカーのうち10種が成長機能と代謝機能に関連している。これらバイオマーカーの半数は、細胞の成長とエネルギー代謝の複雑なホルモン調節に関与している。NSCLC腫瘍では、インスリン様成長因子IGFの活性を調節する3種のインスリン様成長因子結合タンパク質IGFBPIGFBP-2、5、及び7が上方調節されていた。いくつかの報告では、NSCLC中のIGFBP-2、5、及び7が定量的に評価されて表18、正常組織中よりNSCLC組織中でのより高い発現が示唆されている。インスリンとIGFは、細胞の成長及び代謝に強く影響を及ぼすホルモンであって、癌細胞は、成長と増殖をこれらの分子に依存することが多いRobertetalClinicalCancerResearch520942102LiuetalLungCancer56307317SinghaletalLungCancer60313324。一方、これらのホルモンは、インスリジンによって分解されるが、我々は、これがNSCLC腫瘍組織中で上方調節されていることを見出している。ホルモンのアジポネクチンは、脂質代謝とインスリン感受性を制御して、我々は、アジポネクチンがNSCLC腫瘍中で下方調節されていることを見出した。残る5種のバイオマーカー、炭酸脱水酵素III、NAGK、TrATPアーゼ、トリプターゼβ-2、及びMAPK13は、細胞の代謝に種々の役割がある酵素である表17。炎症とアポトーシス00319炎症とアポトーシスは、癌生物学の特徴であって、上記プロセスに関連した数多くの潜在的なバイオマーカーがすでにNSCLCと関連づけられてきた表19。転移と関連づけられたカスパーゼ-3ChenetalLungCancerNeoplasma575561BartlingetalCarcinogenesis26293301。この知見は、非悪性腫瘍組織中より腫瘍中でより低いタンパク質について観測された最大の変化をsRAGEが有した、本明細書に開示される測定値に一致している。理論によって制限されずに言えば、1つの仮説は、RAGEが上皮の組織化においてある役割を担っていて、肺腫瘍中でのRAGEのレベルの低下が上皮組織構造の損失の原因となって、悪性の形質転換を潜在的にもたらす可能性がある、ということであるBartlingetalCarcinogenesis26293301。BCA-1、CXCL16、IL-8、及びNAP-2のようないくつかのサイトカインも変化していて表18、先天性及び適応性の免疫系アームに由来する細胞を伴う腫瘍の浸潤が増殖性及び血管新生性のシグナルに影響を及ぼす生理活性分子をもたらすとする仮説と一致しているHanahanWeinbergCell14464674。浸潤と転移00320潜在的なバイオマーカーの最大群は、細胞-細胞及び細胞-マトリックスの相互作用に機能して、浸潤及び転移に関与するタンパク質を含有する。これまでに、その多くがNSCLCと関連していることが報告されてきた。最も注目すべきは、細胞外マトリックス成分のタンパク分解的な破壊と成長因子のような基質のプロセシングに寄与する、マトリックスメタロプロテアーゼの2つ、MMP-7とMMP-12である例えば、SuetalChineseJournalofClinicalOncology1126130WegmannetalEurJCancer29A15781584を参照のこと。このようなプロセスは、腫瘍のミクロ環境を創出する上である役割を担うことがよく知られている。MMP-7とMMP-12はともにNSCLC組織中で上方調節されていることが見出され表18、これは、抗体ベースの測定値を使用した同様の研究結果と一致しているShahetalTheJournalofThoracicandCardiovascularSurgery139984990。MMP-7及びMMP-12の過剰発現は、NSCLCの不良な予後と関連づけられてきたShahetalTheJournalofThoracicandCardiovascularSurgery139984990。MMP-12レベルは、局所再発と転移疾患に相関していたHofmannetalClinCancerRes11108692HoffmanetalOncolRep1658795。研究された8名の被検者のうち2名は、正常レベルのMMP-12を有したが、他の6名は、非腫瘍組織に比べて腫瘍組織中でMMP-12が15~50倍上昇していた。NSCLCバイオマーカーの組織化学プローブとしての性能00321腫瘍組織と非腫瘍組織の間でのタンパク質発現における差に関する理解を使用して、新規の組織化学プローブを同定することができる。このようなプローブは、腫瘍と周囲ストローマに対するその作用のより正確な分子特性決定を可能にすることができる。図25は、上記バイオマーカーの探索に使用した同一の腫瘍摘出試料より得られた新鮮凍結組織を染色する、同定したSOMAマーの2つの能力を実証する。トロンボスポンジン-2TSP2は、腫瘍組織ホモジェネート中で増加していることが見出されたが、一方、マクロファージマンノース受容体MRC1は、減少していた。これらSOMAマーでの組織染色は、プロファイリング結果と一致していた。追加の実施例、並びに染色パターンの抗体による確定を図27に示す。NSCLCの組織バイオマーカーと血清バイオマーカーの比較00322無癌対照に比べたNSCLC患者の血清中でのタンパク質の差示的な発現を、NSCLC組織試料のそれと比較すると、有用な洞察が得られる図26。最も衝撃的な観測は、タンパク質発現の相対的な変化が、血清中より組織中でより大きいことである。この結果は、腫瘍組織がタンパク質発現の変化の源泉であって、たとえ循環中へ完全に放出されたとしても、全量の血液中で何倍にも希釈されてしまうので、予測され得ることである。この傾向は、図26のx軸に沿ったデータ点の伸長された分布において明白であるこの図では、両軸を同じスケールで引いて、この論点を明示する。腫瘍組織中で変化するような、図23及び24に示した分析物のうち12種は、NSCLC患者由来の血清中でも、対照に対して差示的に発現されている図26中の赤塗り円。この一方的な変化のほとんどは、組織と血清の間で同じであるが、同じでないものも2、3種ある。明らかに、タンパク質の組織ホモジェネート中の局所濃度がそのタンパク質の循環レベルと相関する必要はないが、逆相関は、ある種のバイオマーカーの疾病組織対正常組織中での再分布に関するヒントを提供する可能性がある。00323近年、実証可能な診断又は臨床上の有用性がある新規バイオマーカーの発見は、重大な挑戦課題となっているDiamandisJNatlCancerInst10214627。この理由には、分析前及び分析中での人為的結果の遍在性、好適な健常状態対照の入手不可能性、洗練されてない試験設計、及びごく低い濃度でのタンパク質レベルのわずかな変化を検出することの困難さが含まれる。この課題は、しばしばその目的が相対的に大きな人体中のわずかな悪性腫瘍を早期に同定することにある、癌バイオマーカーで特に顕著である。後者の論点に関して言えば、真の癌バイオマーカーを発見するチャンスを高める1つのやり方は、腫瘍組織のような疾患の源泉からだけでなく、循環からのタンパク質発現データも入手することである。この結果を合わせることで、潜在的なバイオマーカーの正当性を一部確証することができる。本出願は、開示した高度に多重化されて高感度のプロテオミックアッセイでこのことが可能であることを実証する。組織も、血漿又は血清のように、SOMAスキャンに適用可能であることが示されて、NSCLC腫瘍組織中のタンパク質発現の周囲の健常肺組織中でのそれとの比較分析で得られる結果は、血清試料より同定された潜在的なNSCLCバイオマーカーの既存のデータセット米国特許出願公開公報2010/0070191号を参照のことへの補完物を提供する。本事例では、本明細書で報告した36種の組織バイオマーカーの1/3、又は12種BCA-1BCL、カドヘリン-1カドヘリン-E、カタラーゼ、エンドスタチン、IGFBP-2、MRC1マクロファージマンノース受容体、MAPK-13MK13、MMP-7、MMP-12、NAGK、VEGF、及びYESがすでに血清中で同定されていた。まとめると、上記のデータは、NSCLCに付随する変化の複雑性のさらなる理解に貢献して、この命取りの病気の早期検出への追加の潜在的なバイオマーカーを提供するものである。キット00324表20のバイオマーカー並びに、追加の生物医学情報のどの組合せも、本明細書に開示する方法を実施するときの使用のためのように、好適なキットを使用して検出することができる。さらに、どのキットも、蛍光部分、等のような本明細書に記載の1以上の検出可能な標識を含有することができる。003251つの態様において、キットには、a生体試料中の1以上のバイオマーカーを検出するための1以上の捕捉試薬例えば、少なくとも1つのアプタマー又は抗体のような[ここでバイオマーカーには、表18、20、又は21に示されるバイオマーカーのいずれも含まれる]と、任意選択的にb本明細書にさらに記載されるように、生体試料が入手された個体を、肺癌を有するか又は有さないとして分類するため、又はその個体が肺癌を有する可能性を決定するための1以上のソフトウェア又はコンピュータプログラム製品が含まれる。あるいは、1以上のコンピュータプログラム製品というより、上記の工程をヒトがマニュアルで実施するための1以上の説明書を提供することができる。00326本明細書では、対応する捕捉試薬及びシグナル産生物質と固体支持体の組合せを検出デバイス又はキットと呼ぶ。キットには、そのデバイスと試薬を使用すること、試料を取り扱うこと、及びデータを分析することのための説明書も含めることができる。さらに、キットは、生体試料について分析して、分析の結果を報告するためのコンピュータシステム又はソフトウェアとともに使用してよい。00327キットは、生体試料を処理するための1以上の試薬例、可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、又は緩衝液も含有することができる。本明細書に記載するキットのいずれにも、例えば、緩衝液、ブロッキング剤、質量分析法マトリックス材料、抗体捕捉剤、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェアとプロトコール、ガイダンス、及び参照データのような情報も含めることができる。003281つの側面において、本発明は、肺癌状態の分析のためのキットを提供する。キットには、表18、20、又は21より選択される1以上のバイオマーカー用のPCRプライマーが含まれる。キットには、使用と、バイオマーカーの肺癌との相関性についての説明書をさらに含めてよい。キットには、表20より選択されるバイオマーカーの1以上の相補体を含有するDNAアレイ、試薬、及び/又は試料DNAを増幅又は単離するための酵素も含めてよい。キットには、リアルタイムPCR用の試薬、例えば、TaqManプローブ及び/又はプライマーと酵素を含めてよい。00329例えば、キットは、a検査試料中の1以上のバイオマーカーを定量するための捕捉試薬を少なくとも含んでなる試薬[ここで前記バイオマーカーは、表18、20、又は21に示すバイオマーカー、又は本明細書に記載の他のあらゆるバイオマーカー又はバイオマーカーパネルを含む]と、任意選択的にb検査試料において定量される各バイオマーカーの量を1以上の所定カットオフと比較して、定量した各バイオマーカーのスコアを前記比較に基づいて帰属させる工程、定量した各バイオマーカーの帰属スコアを足し合わせて総スコアを得る工程、この総スコアを所定のスコアと比較する工程、及び前記比較を使用して個体が肺癌を有するかどうかを判定する工程を実施するための1以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを含むことができる。あるいは、1以上のアルゴリズム又はコンピュータプログラムというより、上記の工程をヒトがマニュアルで実施するための1以上の説明書を提供することができる。コンピュータの方法及びソフトウェア00330バイオマーカー又はバイオマーカーパネルを選択したらすぐに、個体を診断するための方法は、以下を含むことができる:1生体試料を採取するか又は他のやり方で入手する;2分析法を実施して、パネル中の単数又は複数のバイオマーカーを生体試料において検出及び測定する;3バイオマーカー値を収集するために使用する方法に求められるあらゆるデータの正規化又は標準化を実施する;4マーカースコアを計算する;5マーカースコアを足し合わせて総診断スコアを入手する;及び、6個体の診断スコアを報告する。このアプローチにおいて、診断スコアは、すべてのマーカー計算の合計より決定される単一数であってよく、これを疾患の存在又は非存在の指標である予め設定された閾値と比較する。又は、診断スコアは、バイオマーカー値をそれぞれ表す一連の棒グラフbarsであってよく、この応答のパターンを、疾患の存在又は非存在の判定のための予め設定されたパターンへ比較してよい。00331本明細書に記載の方法の少なくともいくつかの態様は、コンピュータの使用で実行することができる。コンピュータシステム100の例を図6に示す。図6を参照すると、システム100は、プロセッサー101、入力デバイス102、出力デバイス103、保存デバイス104、コンピュータ-読み取り可能保存媒体リーダー105a、通信システム106、加速処理システム例、DSP又は特殊用途プロセッサー107、及びメモリー109が含まれる、バス108を介して電気的に接続した、ハードウェア要素から構成されることが示される。コンピュータ-読み取り可能保存媒体リーダー105aは、コンピュータ読み取り可能保存媒体105bへさらに接続されて、この組合せは、コンピュータ読み取り可能情報を一時的に、及び/又はより永続的に含有するための遠隔、局所、固定、及び/又は取り外し可能保存デバイス保存媒体、メモリー、等を包括的に表して、これには、保存デバイス104、メモリー109、及び/又はそのような他のあらゆるアクセス可能システム100リソースを含めることができる。システム100はまた、オペレーティングシステム192と、プログラム、データ、等のような他のコード193が含まれるソフトウェア要素現行では、ワーキングメモリー191の内部に位置しているものとして示すを含む。00332図6に関して言えば、システム100は、広汎な柔軟性及びコンフィギュアビリティを有する。従って、例えば、単一のアーキテクチャを利用して、現行で望まれるプロトコール、プロトコール変更、拡張、等に従ってさらに設定され得る1以上のサーバーを実行することが可能であろう。しかしながら、当業者には、より特定の応用要求性に従って諸態様を利用できることも明らかであろう。例えば、1以上のシステム要素をシステム100コンポーネント内部の例えば、通信システム106内部のサブ要素として実行することができよう。カスタマイズされたハードウェアも利用することができる、及び/又は特別な要素でもハードウェア、ソフトウェア、又はその両方において実行することができよう。さらに、ネットワーク入力/出力デバイス示さずのような他の計算デバイスへの接続が利用し得る一方で、他の計算デバイスへの有線、無線、モデム、及び/又は他の単数又は複数の接続も利用し得ることを理解されたい。003331つの側面において、システムは、肺癌に特徴的なバイオマーカーの特徴を含有するデータベースを含むことができる。バイオマーカーデータ又はバイオマーカー情報は、コンピュータ実行法の一部としての使用のためにコンピュータへの入力として利用することができる。バイオマーカーデータには、本明細書に記載のようなデータを含めることができる。003341つの側面において、システムは、入力データを1以上のプロセッサーへ提供するための1以上のデバイスをさらに含む。00335システムは、付番データ要素のデータセットを保存するためのメモリーをさらに含む。00336別の側面において、入力データを提供するためのデバイスは、データ要素の特徴を検出するための検出器例えば、質量分析計又は遺伝子チップリーダーのようなを含む。00337システムは、データベース管理システムを追加的に含んでよい。ユーザーの要求又は質問は、その質問を処理して、訓練セットのデータベースより関連情報を抽出するデータベース管理システムによって理解される適正な言語へフォーマット化することができる。00338システムは、ネットワークサーバーと1以上のクライエントが接続するネットワークへ接続可能であり得る。ネットワークは、当該技術分野で知られているように、構内ネットワークLAN又は広域ネットワークWANであってよい。好ましくは、サーバーには、ユーザー要求を処理するためにデータベースデータへアクセスするためのコンピュータプログラム製品例、ソフトウェアを作動させるのに必要なハードウェアが含まれる。00339システムには、データベース管理システムからの指示を実行するためのオペレーティングシステム例、UNIX登録商標又はLinux登録商標が含まれる場合がある。1つの側面において、オペレーティングシステムは、インターネットのようなグローバル通信ネットワーク上で作動し、グローバル通信ネットワークサーバーを利用して、そのようなネットワークへ接続することができる。00340システムには、当該技術分野で知られているグラフィカルユーザーインターフェイスに定型的に見出される、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールド、等のようなインターフェイス要素を含んでなるグラフィカルディスプレイインターフェイスを含む1以上のデバイスを含めてよい。ユーザーインターフェイスで入力される要求は、システムデータベースの1以上において関連情報について検索するためにフォーマット化するためのシステム中のアプリケーションプログラムへ伝送することができる。ユーザーによって入力される要求又は質問は、どの好適なデータベース言語でも構築されてよい。00341グラフィカルユーザーインターフェイスは、グラフィカルユーザーインターフェイスコードによってオペレーティングシステムの一部として作成され得て、データを入力する、及び/又は入力済みデータを表示するために使用することができる。処理されたデータの結果は、インターフェイスに表示する、システムと通信したプリンター上に印刷する、メモリーデバイスに保存する、及び/又はネットワーク全体に伝送することができるか、又はコンピュータ読み取り可能媒体の形式で提供することができる。00342システムは、データ要素に関するデータ例、発現値をシステムへ提供するための入力デバイスと通信した状態であり得る。1つの側面において、入力デバイスには、遺伝子発現プロファイリングシステム例えば、質量分析計、遺伝子チップ、又はアレイリーダー、等が含まれるを含めることができる。00343肺癌バイオマーカー情報を様々な態様に従って分析するための方法及び装置は、どの好適なやり方でも実行してよく、例えば、コンピュータシステムで作動するコンピュータプログラムを使用する。リモートアクセスアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータ、又はワークステーションのような、プロセッサーとランダムアクセスメモリーを含んでなる慣用のコンピュータシステムを使用してよい。追加のコンピュータシステムコンポーネントには、大容量記憶システムとユーザーインターフェイス例えば、慣用のモニター、キーボード、及びトラッキング装置のような、メモリーデバイス又は情報保存システムを含めてよい。コンピュータシステムは、スタンドアローンシステムであっても、サーバーと1以上のデータベースが含まれるコンピュータのネットワークの一部であってもよい。00344肺癌バイオマーカー分析システムは、データ収集、処理、解析、報告、及び/又は診断のような、データ分析を完了するための機能及び操作を提供することができる。例えば、1つの態様において、コンピュータシステムは、肺癌バイオマーカーに関連する情報を受容、保存、検索、解析、及び報告し得るコンピュータプログラムを実行することができる。コンピュータプログラムは、生データを処理して補足データを作成するための処理モジュールと、生データ及び補足データを分析して肺癌状態及び/又は診断を作成するための分析モジュールのように、様々な機能及び操作を実施する多数のモジュールを含む場合がある。肺癌状態を診断することは、その疾患に関連した個体の状態に関する追加の生物医学情報が含まれる他のあらゆる情報を作成又は収集すること、さらなる検査が望まれ得るかどうかを確定すること、又はその個体の健康状態を他のやり方で評価することを含む場合がある。00345図7へ言及すると、開示の態様の原理に従ってコンピュータを利用する方法の例を見ることができる。図7に、フローチャート3000を示す。ブロック3004では、バイオマーカー情報を個体のために検索することができる。バイオマーカー情報は、例えば、個体の生体試料の検査を実施した後で、コンピュータデータベースより検索することができる。バイオマーカー情報は、表18ここでは、N=2~36、表20ここでは、N=2~25、又は表21ここでは、N=2~86に提供されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む可能性がある。ブロック3008では、コンピュータを利用して、バイオマーカー値のそれぞれを分類することができる。そして、ブロック3012では、個体が肺癌を有する可能性について、複数の分類に基づいて判定を下すことができる。その表示は、ヒトが見ることができるように、ディスプレイ又は他の表示デバイスへの出力であり得る。このように、例えば、それは、コンピュータのディスプレイスクリーン又は他の出力デバイス上に表示することができる。00346図8へ言及すると、別の態様に従ってコンピュータを利用する代わりの方法をフローチャート3200より図解することができる。ブロック3204では、コンピュータを利用して、バイオマーカー情報を個体のために検索することができる。バイオマーカー情報は、表18、20、又は21に提供されるバイオマーカーの群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む。ブロック3208では、バイオマーカー値の分類をコンピュータで実施することができる。そして、ブロック3212では、個体が肺癌を有する可能性について、その分類に基づいて表示をすることができる。その表示は、ヒトが見ることができるように、ディスプレイ又は他の表示デバイスへの出力であり得る。このように、例えば、それは、コンピュータのディスプレイスクリーン又は他の出力デバイス上に表示することができる。00347本明細書に記載のいくつかの態様は、コンピュータプログラム製品が含まれるように実行することができる。コンピュータプログラム製品には、アプリケーションプログラムをデータベース入りのコンピュータで実行させるためのコンピュータ読み取り可能プログラムコードがその中で具現化されるコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ得る。00348本明細書に使用するように、コンピュータプログラム製品は、あらゆる種類の物理媒体例、書面、電子、磁気、光、又は他の媒体に含有されて、コンピュータ又は他の自動化データ処理システムで使用され得る、自然言語又はプログラミング言語の陳述の形式で組織化された指令のセットを意味する。このようなプログラミング言語の陳述は、コンピュータ又はデータ処理システムによって実行されるとき、コンピュータ又はデータ処理システムがその陳述の特別な内容に従って作動することを引き起こす。コンピュータプログラム製品には、制限なしに、ソースコード及び目的コードのプログラム、及び/又はコンピュータ読み取り可能媒体に埋め込まれたテスト又はデータライブラリーが含まれる。さらに、コンピュータシステム又はデータ処理機器デバイスが予め選択されたやり方で作用することを可能にするコンピュータプログラム製品は、限定されないが、元のソースコード、アセンブリーコード、目的コード、機械言語、上記の暗号化又は圧縮バージョン、及び、ありとあらゆる同等物が含まれるいくつかの形式で提供され得る。003491つの側面では、肺癌の可能性を示すためにコンピュータプログラム製品を提供する。このコンピュータプログラム製品には、計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、該プログラムコードは、個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード[ここで、該データは、表18ここでは、N=2~36、表20ここでは、N=2~25、又は表21ここでは、N=2~86に提供されるバイオマーカーの群より選択される、生体試料中の少なくともN個のバイオマーカーの1つにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む;ここでN=2~86である]と、個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなる。00350なお別の側面では、肺癌の可能性を示すためにコンピュータプログラム製品を提供する。このコンピュータプログラム製品には、計算デバイス又はシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピュータ読み取り可能媒体が含まれ、該プログラムコードは、個体からの生体試料へ帰属されるデータを検索するコード[ここで、該データは、表18ここでは、N=2~36、表20ここでは、N=2~25、又は表21ここでは、N=2~86に提供されるバイオマーカーの群より選択される、生体試料中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む]と、個体の肺疾患状態を前記バイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含んでなる。00351様々な態様を方法又は装置として記載してきたが、諸態様は、コンピュータと連結したコード例えば、コンピュータに常駐のコード、又はコンピュータによってアクセス可能なコードを介して実行し得ると理解されるべきである。例えば、ソフトウェアとデータベースを利用して、上記に考察した方法の多くを実行することができる。従って、ハードウェアによって達成される態様に加えて、上記の態様が、コンピュータ読み取り可能プログラムコードがその中で具現化されるコンピュータ使用可能媒体からなる製造品の使用を介して達成され得て、それにより本記載に開示される諸機能が可能化されることも注目される。故に、諸態様も、本特許によって、そのプログラムコード手段においても保護されるとみなされることが望ましい。さらに、本態様は、制限なしに、RAM、ROM、磁気媒体、光学式媒体、又は磁気光学式媒体が含まれる、ほとんどあらゆる種類のコンピュータ-読み取り可能メモリーに保存されるそのコードとして具現化され得る。なおより一般的には、本態様は、ソフトウェアにおいて、又はハードウェアにおいて、又はそのあらゆる組合せ限定されないが、汎用プロセッサーで実行されるソフトウェア、マイクロコード、PLA、又はASICが含まれるにおいて実行することができる。00352また、諸態様は、搬送波、並びに伝送媒体を介して伝播されるシグナル例、電気及び光シグナルにおいて具現化されるコンピュータシグナルとして達成され得ると想定される。従って、上記に考察した様々な種類の情報は、データ構造のような構造においてフォーマット化されて、伝送媒体を介して電気シグナルとして伝送されるか又はコンピュータ読み取り可能媒体上に保存することができる。00353また、本明細書に引用した構造、材料、及び行為の多くがある機能を実施するための手段又はある機能を実施するための工程として引用され得ることが注目される。故に、そのような言語により、参照により組み込まれる内容が含まれる、本明細書内で開示されるすべてのそのような構造、材料、又は行為とそれらの均等物が網羅され得ると理解されるべきである。00354以下の実施例は、例解の目的のためにのみ提供されるのであって、付帯の特許請求項によって規定されるような本出願の範囲を制限することを企図しない。本明細書に記載のすべての実施例は、当業者によく知られていて定型的である標準技術を使用して行った。以下の実施例に記載される定型的な分子生物学の技術は、Sambrooketal分子クローニング:実験マニュアルMolecularCloningALaboratoryManual第3版、コールドスプリングラボラトリープレス、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー2001のような標準実験マニュアルに記載のように行うことができる。実施例1.肺癌バイオマーカー選択用試料の多重化アプタマー分析00355本実施例は、表1、カラム2に示すバイオマーカーの同定のために試料及び対照を分析するのに使用するマルチプレックスアプタマーアッセイについて記載する図9を参照のこと。この事例において、多重化分析は、特異的な標的にそれぞれ独自である820種のアプタマーを利用した。00356この方法では、溶液の添加の度にピペット先端を交換した。00357また、他に示さなければ、ほとんどの溶液移動と洗液追加には、BeckmanBiomekFxPの96ウェルヘッドを使用した。マニュアルでピペット操作する方法の工程では、他に示さなければ、12チャンネルP200PipettemanRaininInstruments,LLC,カリフォルニア州オークランドを使用した。40mMHEPES,100mMNaCl,5mMKCl,5mMMgCl2,1mMEDTAをpH7.5で含んでなるSB17と呼ぶカスタム緩衝液を自前で調製した。他に示さなければ、すべての工程を室温で実施した。1.アプタマーストック溶液の調製00358光切断可能ビオチンリンカーを含まないアプタマーのために、10、1、及び0.03血清用のカスタムストックアプタマー溶液を適正な光切断可能ビオチニル化プライマーとともに1xSB17,0.05Tween-20において8倍の濃度で調製した。ここで得られるプライマー濃度は、関連するアプタマーの濃度の3倍であった。このプライマーは、対応するアプタマーの全部又は一部へハイブリダイズした。003593つの8xアプタマー溶液のそれぞれを1xSB17,0.05Tween-20で別々に4倍希釈して1500μLの8xストックを4500μLの1xSB17,0.05Tween-20へ希釈する、2x濃度とした。次いで、それぞれの希釈アプタマーマスターミックスのそれぞれ1500μLを4つの2mLネジ蓋試験管へ分けて、95°Cまで5分間処理して、37°Cで15分間のインキュベーションを続けた。インキュベーションの後で、特別なアプタマーマスターミックスへ対応する4つの2mL試験管を試薬槽へ合わせて、55μLの2xアプタマーミックスを全部で3つのミックスについて96ウェルHybaidプレートへマニュアルでピペット注入して、プレートホイルを密封した。最終結果は、3つの96ウェル、ホイル密封Hybaidプレートであった。個々のアプタマー濃度は、表2に示すように0.5~4nMの範囲に及んだ。2.アッセイ試料調製00360-80°Cで保存した100血清の凍結アリコートを25°Cの水浴に10分間入れた。融解した試料を氷上に置いて、穏やかに4に設定8秒間振り混ぜてから、氷上に再び置いた。0036150μLの8チャンネルスパニングピペッターを使用して16μLの試料を96ウェルHybaidプレートへ移すことによって20試料溶液を調製すると、各ウェルは、64μLの適正な試料希釈液を4°Cで含有した血清に対して0.8xSB17,0.05Tween-20,2μMZ-ブロック_2,0.6mMMgCl2。このプレートを、次の試料希釈工程を開始するまで、氷上で保存した。00362試料及びアプタマーの平衡化を開始するために、20試料プレートを少しの間遠心分離させて、BeckmanFX上に置いて、ここで96ウェルピペッターを用いて上下にピペット操作することによってこれを混合した。次いで、10μLの20試料を90μLの1xSB17,0.05Tween-20へ希釈することによって2試料を調製した。次に、得られる2試料の6μLを194μLの1xSB17,0.05Tween-20へ希釈することによって、0.06試料プレートを作製した。希釈操作は、BeckmanBiomekFxPで行った。それぞれの移動後には、上下にピペット操作することによって、溶液を混合した。次いで、55μLの試料を55μLの適正な2xアプタマーミックスへ加えることによって、3つの試料希釈プレートをそのそれぞれのアプタマー溶液へ移した。この試料とアプタマー溶液を、上下にピペット操作することによって、ロボット上で混合した。3.試料平衡結合00363試料/アプタマープレートをホイル密封して、37°Cのインキュベーターへ3.5時間入れた後で、Catch1工程へ進めた。4.Catch2ビーズプレートの調製00364MyOneInvitrogen社、カリフォルニア州カールスバッドストレプタビジンC1ビーズの11mLアリコートを等量の20mMNaOHで2回洗浄し各洗浄につき5分のインキュベーション、等量の1xSB17,0.05Tween-20で3回洗浄して、11mLの1xSB17,0.05Tween-20に再懸濁させた。12スパンマルチチャンネルピペッターを使用して、この溶液の50μLを96ウェルHybaidプレートの各ウェルへマニュアルでピペット注入した。次いで、このプレートをホイルで覆って、アッセイでの使用のために4°Cで保存した。5.Catch1ビーズプレートの調製003653つの0.45μmミリポアMilliporeHVプレートDurapore膜、カタログ番号:MAHVN4550を100μLの1xSB17,0.05Tween-20と少なくとも10分間平衡化した。次いで、この平衡緩衝液をプレートに通して濾過して、133.3μLの7.5ストレプタビジン-アガロースビーズスラリー1xSB17,0.05Tween-20中を各ウェルへ加えた。このストレプタビジン-アガロースビーズを懸濁状態に保つために、それらをフィルタープレートへ移す間、ビーズ溶液は、200μLの12チャンネルピペッターで15回、マニュアルで混合した。このビーズを3つのフィルタープレート全体に分配した後で、真空をかけて、ビーズ上清を除去した。最後に、ビーズをフィルタープレートにおいて200μLの1xSB17,0.05Tween-20で洗浄してから、200μLの1xSB17,0.05Tween-20に再懸濁させた。フィルタープレートの底を拭って、プレートをアッセイでの使用のために保存した。6.Cytomatへの装填00366すべてのチップ、プレート、槽中のすべての試薬プレートへの添加の直前に用時調製するNHS-ビオチン試薬以外、3つの調製済みCatch1フィルタープレート、及び1つの調製済みMyOneプレートをCytomatに装填した。7.Catch1003673.5時間の平衡時間の後で、インキュベーターより試料/アプタマープレートを取り出し、約1分間遠心分離させ、ホイルを外して、BeckmanBiomekFxPのデッキ上に置いた。BeckmanBiomekFxPプログラムを開始した。Catch1でのすべての後続工程は、他に注記しなければ、BeckmanBiomekFxPロボットによって実施した。このプログラム内で、Catch1フィルタープレートへ真空をかけて、ビーズ上清を除去した。10、1、及び0.03の平衡結合反応液のそれぞれの100マイクロリットルをそのそれぞれのCatch1濾過プレートへ加えて、デッキ上ondeckオービタルシェーカーを800rpmで10分間使用して、各プレートを混合した。00368真空濾過により非結合溶液を除去した。この溶液を分注して、すぐに真空を引いてこの溶液をプレートに通して濾過することによって、Catch1ビーズを1xSB17,0.05Tween-20中100μMビオチンの190μLに続いて、1xSB17,0.05Tween-20の190μLで洗浄した。00369次に、Catch1プレートへ190μLの1xSB17,0.05Tween-20を加えた。デッキ上ブロットステーションを使用してプレートを拭って液滴を除去してから、オービタルシェーカーを用いて、25°C、800rpmで10分間インキュベートした。00370ロボットにより、真空濾過によりこの洗浄液を除去して、デッキ上ブロットステーションを使用して、フィルタープレートの底を拭って液滴を除去した。8.タグ付け00371NHS-PEO4-ビオチンアリコートを37°Cで6分間融かしてから、タグ付け緩衝液SB17,pH=7.25で0.05Tween-20で100倍希釈した。NHS-PEO4-ビオチン試薬を無水DMSOに100mM濃度で溶かして、-20°Cで凍結保存しておいた。ロボット起動時にすぐ、この希釈したNHS-PEO4-ビオチン試薬をデッキ槽へマニュアルで加えて、ロボットプログラムをマニュアルで再始動させて、100μLのNHS-PEO4-ビオチンをそれぞれのCatch1フィルタープレートの各ウェルへ分注した。この溶液を、オービタルシェーカー上で、800rpmで5分間振り混ぜて、そのままCatch1ビーズとともにインキュベートした。9.動的チャレンジと光切断00372NHSタグをまだ含有する間に1xSB17,0.05Tween-20中20mMグリシンの150μLをCatch1プレートへ添加することによって、タグ付け反応を止めた。次いで、プレートをオービタルシェーカー上にて800rpmで1分間インキュベートした。NHS-タグ/グリシン溶液を真空濾過により除去した。次に、190μLの20mMグリシン1xSB17,0.05Tween-20を各プレートへ加えて、オービタルシェーカー上にて800rpmで1分間インキュベートした後で、真空濾過により除去した。00373各プレートへ190μLの1xSB17,0.05Tween-20wを加えて、真空濾過によって除去した。00374引き続き、190μLの1xSB17,0.05Tween-20を加え、そのプレートをオービタルシェーカー上に800rpmで1分間置いて、真空濾過を続けることによって、Catch1プレートのウェルを3回洗浄した。最後の洗浄の後で、プレートを1mLのディープウェルプレートのトップに置いて、デッキより外した。このCatch1プレートを1000rpmfで1分間遠心分離させて、溶出前のアガロースビーズより可能な限り多くの余剰量を除去した。00375プレートをBeckmanBiomekFxP上へ戻して、1xSB17,0.05Tween-20中10mMDxSO4の85μLをこのフィルタープレートの各ウェルへ加えた。00376フィルタープレートをデッキより取り出し、BlackRayTedPella社、カリフォルニア州レディング光源下にVariomagThermoshakerThermoFisherScientific社、マサチューセッツ州ウォルサム上へ置いて、800rpmで振り混ぜながら、10分間照射した。00377初めに10Catch1フィルタープレートを1mLディープウェルプレートのトップに置いて、1000rpmで1分間遠心分離させることによって、この光切断した溶液をそれぞれのCatch1プレートから共通ディープウェルプレートへ連続的に溶出させた。次いで、1及び0.03のCatch1プレートを同じディープウェルプレート中へ連続的に遠心分離させた。10.Catch2ビーズ捕捉00378Catch1の合わせた溶出物を含有する1mLディープウェルブロックをCatch2用のBeckmanBiomekFxPのデッキの上に置いた。00379ロボットにより、光切断溶出物のすべてを1mLディープウェルプレートより、先に調製したCatch2MyOne磁気ビーズを含有するHybaidプレート上へ移した磁気分離によるMyOne緩衝液の除去後。00380この溶液を、VariomagThermoshakerThermoFisherScientific社、マサチューセッツ州ウォルサム上にて、1350rpmで振り混ぜながら、25°Cで5分間インキュベートした。00381ロボットにより、先のプレートをデッキ上磁気分離ステーションへ移した。このプレートを磁石上で90秒間インキュベートした後で、上清を取り出して捨てた。11.37°C30グリセロール洗浄00382Catch2プレートをデッキ上サーマルシェーカーへ動かして、75μLの1xSB17,0.05Tween-20を各ウェルへ移した。このプレートを1350rpm及び37°Cで1分間混合して、ビーズを再懸濁させて温めた。Catch2プレートの各ウェルへ75μLの60グリセロールを37°Cで移して、プレートを1350rpm及び37°Cでもう1分間混合し続けた。ロボットによりこのプレートを37°Cの磁気分離器へ移して、ここでそれを磁石上で2分間インキュベートしてから、ロボットにより上清を取り出して捨てた。上記の洗浄をさらに2回繰り返した。00383第三の30グリセロール洗浄液のCatch2ビーズからの除去の後で、150μLの1xSB17,0.05Tween-20を各ウェルへ加えて、1350rpmで振り混ぜながら37°Cで1分間インキュベートした後で、37°Cの磁石上での磁気分離によって除去した。00384磁気分離に先立って、Catch2ビーズを、150μLの1xSB19,0.05Tween-20を使用して、1350rpmで振り混ぜながらの1分間のインキュベーションで最終洗浄した。12.Catch2ビーズの溶出及び中和003851MNaCl,0.05Tween-20を含む105μLの100mMCAPSOを各ウェルへ加えることによって、Catch2ビーズよりアプタマーを溶出させた。ビーズをこの溶液とともに1300rpmで振り混ぜながら5分間インキュベートした。00386次いで、Catch2プレートを磁気分離器上に90秒間置いた後で、溶出液の90μLを、10μLの500mMHCl,500mMHEPES,0.05Tween-20を各ウェルに含有する新しい96ウェルプレートへ移した。移した後で、この溶液の90μLをロボットにより、上下に5回ピペット操作することによって混合した。13.ハイブリダイゼーション00387BeckmanBiomekFxPにより、中和したCatch2溶出液の20μLを新鮮なHybaidプレートへ移して、10倍スパイクのハイブリダイゼーション対照を含有する10xAgilentブロックの5μLを各ウェルへ加えた。次に、25μLの2xAgilentハイブリダイゼーション緩衝液を、中和した試料とブロッキング緩衝液を含有するプレートの各ウェルへマニュアルでピペット注入して、この溶液の25μLを、広汎な泡形成を避けるためにゆっくり上下に15回ピペット操作することによって混合した。このプレートを1000rpmで1分間スピンした。00388Agilentハイブリダイゼーションチャンバ中へガスケットスライドを入れて、ハイブリダイゼーション及びブロッキング溶液を含有する試料のそれぞれの40μLをマニュアルで各ガスケットへピペット注入した。8チャンネル可変スパニングピペッターを、泡形成を最小化するように企図されたやり方で使用した。次いで、カスタムAgilentマイクロアレイスライドAgilentTechnologies社、カリフォルニア州サンタクララを、その番号バーコードNumberBarcodeを上に向けた状態で、ガスケットスライド上へゆっくり下ろした詳しい記載についてはAgilentのマニュアルを参照のこと。00389ハイブリダイゼーションチャンバのトップをスライド/バッキングのサンドイッチ上へ置いて、締め付けブラケットをアセンブリー全体に滑らせた。上記のアセンブリーは、ネジを確実に回すことによってしっかり締め付けた。00390それぞれのスライド/バッキングスライドサンドイッチを目視で視察して、溶液の泡が試料内部で自由に動くことが可能であることを確かめた。この泡が自由に動かなければ、ハイブリダイゼーションチャンバのアセンブリーを穏やかに叩いて、ガスケット近くに留まった泡を解放した。00391組み立てたハイブリダイゼーションチャンバを、Agilentハイブリダイゼーションオーブンにおいて、20rpmで回転させながら、60°Cで19時間インキュベートした。14.ハイブリダイゼーション後の洗浄00392ほぼ400mLのAgilent洗浄緩衝液1を2つの別々のガラス染色皿のそれぞれへ入れた。この染色皿の1つを磁気撹拌プレートの上に置いて、スライドラックと撹拌子をこの緩衝液中へ入れた。00393空のガラス染色皿の中へ撹拌子を入れることによって、Agilent洗浄液2用の染色皿を調製した。00394第四のガラス染色皿を最後のアセトニトリル洗浄のために取っておいた。003956つのハイブリダイゼーションチャンバのそれぞれを解体した。スライド/バッキングサンドイッチを1つずつそのハイブリダイゼーションチャンバより取り出して、洗浄液1を含有する染色皿の中へ浸した。このマイクロアレイスライドをまだ浸している間に、1対のピンセットを使用して、スライド/バッキングサンドイッチをこじ開けた。このスライドを、磁気撹拌プレート上の洗浄液1染色皿のスライドラックの中へ速やかに移した。00396スライドラックを穏やかに5回上げ下げした。磁気撹拌子を低い設定で始動させて、スライドを5分間インキュベートした。00397洗浄1がまだ1分残っているときに、インキュベーターにおいて37°Cまで予め温めた洗浄緩衝液2を第二の調製済み染色皿へ加えた。スライドラックを洗浄緩衝液2へ速やかに移して、染色皿のトップでそれを削り取ることによって、ラックの底にある過剰な緩衝液を除去した。スライドラックを穏やかに5回上げ下げした。磁気撹拌子を低い設定で始動させて、スライドを5分間インキュベートした。00398スライドラックを洗浄液2よりゆっくり引き出して、ほぼ15秒かけて、このスライドを溶液より取り出した。00399洗浄2が1分残っているときに、第四の染色皿へアセトニトリルCANを加えた。スライドラックをアセトニトリル染色皿へ移した。スライドラックを穏やかに5回上げ下げした。磁気撹拌子を低い設定で始動させて、スライドを5分間インキュベートした。00400スライドラックをACN染色皿よりゆっくり引き出して、吸収タオル上に置いた。スライドの下端を速やかに乾燥させて、このスライドを清浄なスライドボックス中へ入れた。15.マイクロアレイ造影法00401製造業者の説明書に従って、先のマイクロアレイスライドをAgilentスキャナースライドホルダーの中へ入れて、Agilentマイクロアレイスキャナーの中へロードした。00402このスライドをCy3チャンネルにおいて、100PMT設定と0.05で可能になるXRDオプションで、5μmの解像で造影した。得られたタグイメージファイル形式tiffの画像を、Agilent特徴抽出ソフトウェアバージョン10.5を使用して処理した。実施例2.バイオマーカー同定00403潜在的な肺癌バイオマーカーの同定は、疑わしい結節のCTスキャンからの診断、無症状喫煙者について肺癌をスクリーニングすること、及び肺癌のある個体を診断することという、3つの異なる診断応用について実施した。上記3つの応用に協力する4つの異なる施設より血清試料を採取して、それには、48のNSCLC症例、重度喫煙者と良性結節の患者からなる218の高リスク対照が含まれる。実施例1に記載のような多重化アプタマーアフィニティーアッセイを使用して、上記264の試料のそれぞれで820種の分析物についてのRFU値を測定して報告した。次いで、それぞれの分析物に対してKS検定を適用した。2つの試料セットからの数値の間のKS距離コルモゴロフ-スミルノフ統計は、1つのセットセットA由来の数値の経験分布が他のセットセットB由来の数値の分布より異なる程度のノンパラメトリック測定値である。閾値Tのどの数値についても、セットA由来の数値のある比率はTより小さくて、セットB由来の数値のある比率はTより小さい。KS距離は、Tのある選択値についての2つのセット由来の数値の比率の間の最大の符号無しの差を測定する。00404バイオマーカーのセットを使用して、試料を対照群又は疾患群のいずれかへ帰属させる分類器を組み立てることができる。実際、上記のバイオマーカーのセットより多くのそのような分類器を作成して、どのバイオマーカーでも良好なスコア化分類器として使用される頻度を決定した。上位のスコア化分類器の間で最も頻繁に生じるバイオマーカーは、診断検査法を創出するのに最も有用であった。本実施例では、分類空間を探索するのにベイズ分類器を使用したが、この目的には、多くの他の教師付き学習技術を利用してよい。個々の分類器のスコア化適合性は、疾病罹患率を0.5と仮定して、分類器のベイズ表面での受信者動作特性曲線下面積ROCのAUCを使用して測定した。このスコア化計量は、0~1へ変動して、1は過誤のない分類器である。バイオマーカー集団の測定値よりよりベイズ分類器を構築することの詳細を実施例3に記載する。実施例3.肺癌の単純ベイズ分類00405NSCLCと高リスク対照群を区別するのに有用として同定したバイオマーカーのリストより、5個のバイオマーカーのパネルを選択して、単純ベイズ分類器を構築した。表14を参照のこと。クラス依存性の確率密度関数pdf:pxi|c及びpxi|d[ここでxiは、バイオマーカーiの測定RFU値の対数であって、cとdは、対照集団と疾患集団を意味する]は、平均μと分散σ2によって特徴付けられる正規分布関数としてモデル化した。5個のバイオマーカーのpdfのパラメータを表15に収載して、正規pdfへのモデル適合に沿った生データの例を図5に表示する。基本仮説は、図5によって裏付けられるように、このデータときわめてよく適合しているように見える。00406このようなモデルの単純ベイズ分類を、検定に適正な以下の式:[ここでPdは、集団における疾病の罹患率である]によって示して、ここではn=5である。総和中の項のそれぞれは、個別マーカーの対数尤度比であり、注目の疾患即ち、この場合はNSCLCがないこと対その疾患を有することの試料の対数尤度比の合計は、単に、上記各項の和その疾病の罹患率の説明となる項である。簡単にするために、Pd=0.5と仮定すると、となる。00407未知試料の対数RFU測定値が10個のバイオマーカーのそれぞれで与えられる場合。対照対疾患群の対数尤度比を含んでなる個々の構成要素を作表して、表15のパラメータとxの値より計算することができる。個々の対数尤度比の合計は3.47である、又は疾患がないこと対その疾患を有することの尤度は、32:1ここで尤度=e3.47=32である。全5個のバイオマーカーは、いずれも一貫して対照群に有利である。尤度を一緒に掛けると、上記に示したのと同じ結果が得られる、即ち未知試料に疾患がない尤度は32:1である。事実、この試料は、訓練セットの対照集団に由来した。本実施例は、表15中のバイオマーカーを使用する血清試料の分類を実証するが、表21からのどのバイオマーカーのセットを用いて、どの組織タイプでも同じアプローチを使用することができる。実施例4.分類器用バイオマーカーパネルを選択するための貪欲アルゴリズムパート100408本実施例は、本明細書に記載の方法のいずれにおいても分類器として使用し得るパネルを形成するための表21からのバイオマーカーの選択について記載する。MMP-12と表21中のバイオマーカーのサブセットを含有するバイオマーカーのパネルを選択して、良好な性能のある分類器を構築した。また、この方法を使用して、実施例2のバイオマーカーとしてどの潜在的なマーカーを含めるかを決定した。00409ここで使用する分類器性能の評価尺度は、ROC曲線下面積AUCであるので、0.5の性能は、ランダムコイントス分類器のベースライン期待値であり、ランダムより悪い分類器は、0.0と0.5の間のスコアを得て、ランダムより良好な性能がある分類器は、0.5と1.0の間のスコアを得るだろう。過誤のない完璧な分類器ならば、1.0の感度、1.0の特異度、及び1.0のAUCを有するはずである。実施例4に記載の方法は、F値、感度と特異度の和、又は感度と特異度の積といった、他の一般的な性能評価尺度へ適用することができる。具体的には、感度を犠牲にしてより高い特異度で機能する分類器を選択するように、又は特異度を犠牲にしてより高い感度で機能する分類器を選択するように、感度と特異度を異なる重みで処理することが望まれるかもしれない。本明細書に記載の方法は、性能の評価尺度にのみ関連するので、単一の性能評価尺度をもたらすどの重み付けスキームも使用することができる。異なる適用は、真陽性及び真陰性の所見についての異なる利益と、また偽陽性所見と偽陰性所見に関連した異なるコストを有する。例えば、無症状喫煙者のスクリーニングとCTで見出される良性結節の鑑別診断は、一般的には、特異度と感度の間で同じ最適のトレードオフを有さない。この2つの検査の異なる要求は、一般に、性能の評価尺度に反映される、陽性及び陰性の誤分類に対して異なる重み付けを設定することを必要とする。一般に、性能の評価尺度を変えると、所与のデータのセットについて、表21より選択されるマーカーの正確なサブセットを変えるものである。00410実施例3に記載される、肺癌試料の対照試料からの区別に対するベイズアプローチでは、疾患及び良性の訓練試料におけるバイオマーカーの分布によって分類器を完全にパラメータ化して、バイオマーカーのリストを表21より選択した。即ち、包含用に選択したマーカーのサブセットより、訓練データのセットを与えて、1対1のやり方で分類器を決定した。00411ここで利用する貪欲法を使用して、表21由来のマーカーの最適サブセットを検索した。少数のマーカー又は比較的少数のマーカーがある分類器では、すべての可能なマーカーのサブセットを数え上げて、その特別なマーカーのセットで構築した分類器の性能に関して評価した実施例4、パート2を参照のこと。このアプローチは、統計学の技術分野において最適サブセット選択法としてよく知られている;例えば、統計学習の基本:データマイニング、推論、及び予測TheElementsofStatisticalLearningDataMiningInferenceandPredictionTHastieetal監修SpringerScienceBusinessMediaLLC第2版2009を参照のこと。しかしながら、本明細書に記載の分類器では、多重マーカーの組合せの数がきわめて大きくなり得て、例えば、86個のマーカーのリスト表21より5個のマーカーのあらゆる可能な組合せ即ち、34,826,302通りの組合せを評価することは、実行可能でなかった。マーカーのあらゆるサブセット全体を検索することの実行不能性のために、単一の最適サブセットを見出し得ないとしても、このアプローチを使用することによって、多くの優秀なサブセットを見出して、そして多くの場合、これらサブセットのいずれも、最適なサブセットの代表であり得る。00412あらゆる可能なマーカーのセットを評価する代わりに、貪欲な前方段階的アプローチに従うことができる例えば、DabneyARStoreyJDゲノムデータからの、最適性に導かれる最近隣重心分類法OptimalityDrivenNearestCentroidClassificationfromGenomicdataPloSONE2e1002doi101371journalpone0001002を参照のこと。この方法を使用して、個別マーカーのKS距離に基づく最良の単一マーカーで分類器を開始して、その時点では分類器のマーカーのセットのメンバーではない、マーカーリストの各メンバーを順に試みることによって、各工程で成長させる。既存の分類器との組合せにおいて最良のスコアが得られる1つのマーカーを分類器へ加える。性能のさらなる改善が達成されなくなるまで、これを繰り返す。残念ながら、このアプローチでは、このプロセスを終える前に、個別マーカーのいくつかがすべて選択されるわけではない、貴重なマーカーの組合せを逃す場合がある。00413本発明で使用した貪欲法は、検索を広げるために、各工程で単一の候補分類器マーカーサブセットだけを残すのではなく、候補分類器のリストを残した点で、先述の前方段階的アプローチの改善法elaborationであった。このリストは、表中のあらゆるマーカーを独自に使用してあらゆる単一マーカーサブセットを種とした。新たな分類器マーカーサブセットを現時点でリスト上にあるものより導いて、それらをリストへ加えることによって、工程においてリストを大きくした。現時点でリスト上にあるそれぞれのマーカーサブセットを、その分類器の一部ではまだなくて、サブセットへのその追加時に、既存のサブセットと決して重複しない、表1由来のあらゆるマーカーこれらを許容マーカーと呼ぶを加えることによって拡張した。あらゆる既存のマーカーサブセットを、リストからのあらゆる許容マーカーによって拡張した。明らかに、そのようなプロセスは、最終的にあらゆる可能なサブセットを産生して、そのリストは、スペースの不足を生じるはずである。故に、産生される分類器をすべて残したのは、そのリストがある所定のサイズしばしば、すべての3マーカーサブセットを保持するのに十分であるより小さい間だけである。リストが所定サイズの限界に達したならば、それは選ばれた物elitistとなった、即ち、そのリストには、かなりのレベルの性能を示す分類器だけが残って、他のものはリストの端から落ちて、失われたわけである。このことは、リストを分類器性能の順に層別化することによって達成された。つまり、リスト上の現時点で最低の分類器と少なくとも同等である新たな分類器を挿入して、その時点で底にある成績不良者underachieverの放校を強いたのである。1つのさらなる実行の詳細は、リストをそれぞれの産生工程で完全に置き換えたことである。故に、リスト上のあらゆる分類器は同数のマーカーを有して、各工程で、分類器ごとのマーカーの数を1つだけ増やした。00414この方法は、異なるマーカーの組合せを使用して候補分類器のリストを産生したので、この分類器を組み合わせれば、最良の単一分類器によっても、あるいは最良分類器の少数派によっても犯される可能性がある過誤を回避することができるのではないかと問われるかもしれない。このようなアンサンブル及び専門委員会法は、統計学や機械学習の技術分野でよく知られていて、例えば、平均化Averaging、投票Voting、スタッキングStacking、バッギングBagging及びブースティングBoostingが含まれる例えば、統計学習の基本:データマイニング、推論、及び予測TheElementsofStatisticalLearningDataMiningInferenceandPredictionTHastieetal監修SpringerScienceBusinessMediaLLC第2版2009を参照のこと。これらの単純分類器の組合せは、いくつかの異なる分類器を含めることによって、どの特別なマーカーのセットにもあるノイズによる分類時の変動を抑えるための方法と、それ故に、分類器の間で効果的に平均化された、バイオマーカーの表からのマーカーのより大きなセットからの情報を提供する。このアプローチの有用性の1例は、単一マーカー中の異常値が単一試料の分類に悪影響を及ぼすことを防ぐことができることである。より多くのシグナル数を測定することの必要性は、慣用の1時点で1つのマーカー抗体アッセイにおいては実行不能であろうが、完全多重化アプタマーアッセイでは、否定的なものではない。このような技術は、より広汎なバイオマーカーの表より利益を得て、疾患プロセスに関する多数の情報源を使用して、より確実な分類を提供する。パート200415表1で選択したバイオマーカーは、非マーカー即ち、表1中の包含基準実施例2に記載するようなに合致しないシグナルを有するタンパク質で組み立てた分類器よりよく機能する分類器を生じた。00416唯1個、2個、又は3個のマーカーを含有する分類器では、表1のバイオマーカーを使用して得られるすべての可能な分類器を列挙して、無作為に選択した非マーカーシグナルの同様の表より組み立てられる分類器と比較して、性能の分布を検証した。00417図17及び図18では、感度と特異度の合計を性能の評価尺度として使用した。1.0の性能は、ランダムコイントス分類器のベースライン期待値である。分類器性能のヒストグラムを、40個の非マーカーシグナルの非マーカー表より組み立てられる分類器の同様の網羅的列挙からの性能のヒストグラムと比較した。この40のシグナルは、対照集団と疾患集団の間で差示的なシグナルを明示しないKS距離<1.4400のアプタマーより無作為に選択した。00418図17は、良性結節とNSCLCの間で区別することができるバイオマーカーについて表13のバイオマーカーパラメータより組み立てた、すべての可能な1、2、及び3個のマーカーの分類器の性能のヒストグラムを示して、これらの分類器を40個の非マーカーアプタマーRFUシグナルを使用して組み立てた、すべての可能な1、2、及び3個マーカー分類器と比較する。図17Aは、単一マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、図17Bは、2マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、そして図17Cは、3マーカー分類器の性能のヒストグラムを示す。00419図17において、実線は、表13の良性結節及びNSCLCのバイオマーカーデータを使用する、すべての1、2、及び3マーカー分類器の分類器性能のヒストグラムを表す。点線は、良性結節及びNSCLCのデータを使用するが、ランダムな非マーカーシグナルのセットを使用する、すべての1、2、及び3-マーカー分類器の分類器性能のヒストグラムである。00420図18は、無症状喫煙者とNSCLCの間で区別することができるバイオマーカーについて表12のバイオマーカーパラメータより組み立てた、すべての可能な1、2、及び3マーカー分類器の性能のヒストグラムを示して、これらを40個の非マーカーアプタマーRFUシグナルを使用して組み立てた、すべての可能な1、2、及び3マーカー分類器と比較する。図18Aは、単一マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、図18Bは、2マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、そして図18Cは、3マーカー分類器の性能のヒストグラムを示す。00421図18において、実線は、表12の無症状喫煙者及びNSCLCのバイオマーカーパラメータを使用する、すべての1、2、及び3マーカー分類器の分類器性能のヒストグラムを表す。点線は、無症状喫煙者及びNSCLCのデータを使用するが、ランダムな非マーカーシグナルのセットを使用する、すべての1、2、及び3マーカー分類器の分類器性能のヒストグラムである。00422表1に収載したマーカーより組み立てた分類器は、すべての1マーカー、2マーカー、及び3マーカー比較について、非マーカーからのシグナルで組み立てた分類器より十分に分離された、明瞭なヒストグラムを形成する。表1中のバイオマーカーより組み立てた分類器の性能及びAUCスコアはまた、マーカーの個数とともに、非マーカーより組み立てた分類器より速やかに増加して、分類器あたりのマーカーの個数が増加するにつれて、マーカー分類器と非マーカー分類器の間の隔たりseparationは増加する。表38及び39に収載したバイオマーカーを使用して組み立てたすべての分類器は、非マーカーを使用して組み立てた分類器より顕著によく機能する。パート300423上記の分類器の良好な性能をマーカーのコアサブセットで説明できるのかどうかを検定するために、このマーカーの半分を表38及び39のバイオマーカーのリストより無作為に落とした。感度特異度によって測定される、良性結節を悪性結節より区別するための分類器の性能は、わずかに0.07低下して1.74から1.67へ、癌を有する喫煙者を有さない喫煙者から区別する分類器の性能も、わずかに0.06低下した1.76から1.70へ。このバイオマーカー表のサブセットの性能特性から示唆されることは、収載したバイオマーカーの複合サブセットが診断検査法を組み立てるのに有効であって、分類器の性能を支配する、マーカーの特別なコアサブセットはないということである。00424上記の結果に照らして、表12及び13より最良のマーカーを除外した分類器について検定した。図19は、表12及び13のバイオマーカーの完全リストで組み立てた分類器の性能を、表38及び39より最上位のマーカーを排除したバイオマーカーのセットで組み立てた分類器の性能と比較する。00425図19は、最良のマーカーなしで構築した分類器が十分に機能することを実証して、この分類器の性能があるマーカーの小さなコア群によらないこと、そして疾患に関連した根源的なプロセスにおける変化が多くのタンパク質の活性に反映されることを示唆する。表1のバイオマーカーの多くのサブセットは、表1由来の40個のマーカーの上位15個を除いた後でも、最適に近いほどに機能した。00426図19Aは、2~10個のマーカーで組み立てた、良性結節をNSCLCより区別するための分類器に対する効果を示す。表13からの15個の最上位マーカーKS距離によって順位付けるを落とした後でも、良性結節対NSCLCの性能は、表より選択されるマーカーの個数に伴って増加して、1.65感度特異度以上に達した。00427図19Bは、2~10個のマーカーで組み立てた、無症状喫煙者をNSCLCより区別するための分類器に対する効果を示す。表12からの15個の最上位マーカーKS距離によって順位付けるを落とした後でも、無症状喫煙者対NSCLCの性能は、表より選択されるマーカーの個数に伴って増加して、1.7感度特異度以上に達して、表12中のバイオマーカーの完全リストより選択した最良の分類器の性能の近くまで接近した。00428最後に、図20は、実施例3に従って表12及び13のパラメータのリストより構築した典型的な分類器のROC性能について示す。図20Aは、実施例3にあるマーカーの独立性を前提とすることからのモデル性能を示して、図20Bは、表12及び13のパラメータを産生するのに使用したアッセイデータセットを使用する、実際のROC曲線を示す。所与数の選択マーカーの性能が定性的に一致していること、そしてマーカーの個数が増加するにつれて定量的な一致が崩れたことを見ることができる。このことは、疾患プロセスに関してある特別なバイオマーカーによって付与される情報は、表12及び13に提供される他のバイオマーカーによって付与される情報と重複するという考えと矛盾しない。このように、図20は、表12及び13が、実施例3に記載の方法との組合せにおいて、NSCLCの良性結節からの区別と、NSCLCを有する無症状喫煙者の、NSCLCを有さないものからの区別に有用な非常に多くの分類器の構築及び評価を可能にすることを示している。実施例5.プルダウンアッセイにおけるアプタマー特異性の実証00429マルチプレックスアッセイでの最終の読出しは、本アッセイでの連続捕捉工程の後で回収されるアプタマーの量に基づく。マルチプレックスアッセイは、アッセイの最後に回収されるアプタマーの量が元の複雑な混合物例、血漿中のタンパク質の量に比例するという前提に基づく。このシグナルが、本当に、血漿中で非特異的に結合したタンパク質に由来するのではなくて、企図される分析物に由来することを実証するために、我々は、血漿中のゲルベースのプルダウンアッセイを開発した。このアッセイを使用して、所望のタンパク質がアプタマーとの平衡状態の後で実際に血漿より引き出せることを視覚的に実証して、その企図されるタンパク質標的へ結合したアプタマーがこのアッセイ中の動的チャレンジ工程を通して複合体として存続し得ることを実証することができる。本実施例に記載の実験において、このプルダウンアッセイの最後でのタンパク質の回収には、平衡状態後ほぼ2時間の間、そのタンパク質がアプタマーへ非共有的に結合したままであることが求められる。重要にも、本実施例において、我々はまた、非特異的に結合したタンパク質が上記の工程の間に解離して、最終シグナルへ有意には寄与しないことの裏付けを提供する。本実施例において記載されるプルダウン手法には、上記に記載のマルチプレックスアッセイの重要工程がすべて含まれることに留意されたい。血漿プルダウンアッセイ0043050μLEDTA-血漿を、0.05Tween-20SB18T及び2μMZ-Blockを含むSB18において100μLへ希釈することによって血漿試料を調製した。この血漿溶液を、150μLの最終容量において、37°Cで2時間、10ピコモルのPBDC-アプタマーと平衡化した。平衡状態の後で、Duraporeフィルタープレートにおいて、室温で5分間振り混ぜながらインキュベートすることによって、複合体と非結合アプタマーを133μLの7.5ストレプタビジン-アガロースビーズスラリーで捕捉した。実施例1に記載のように、ビーズへ結合した試料を真空下にビオチンで、そして緩衝液で洗浄した。洗浄後、結合したタンパク質を、振り混ぜながら室温で5分間、ビオチン希釈液中の0.5mMNHS-S-S-ビオチン、0.25mMNHS-Alexa647で標識した。この染色工程は、ストレプタビジンビーズ上でタンパク質を捕捉するためのビオチニル化だけでなく、ゲル上での検出のための高感度染色を可能にする。実施例1に記載のように、試料をグリシンで、そして緩衝液で洗浄した。BlackRay光源を振り混ぜながら室温で10分間使用する光切断によって、アプタマーをビーズより遊離させた。この時点で、室温で5分間振り混ぜることによって、ビオチニル化タンパク質を0.5mgMyOneストレプタビジンビーズ上で捕捉した。この工程により、アプタマーへ結合したタンパク質だけでなく、最初の平衡状態以後にアプタマーより解離した可能性があるタンパク質も捕捉される。実施例1に記載のようにビーズを洗浄した。SB17T中50mMDTTとともに振り混ぜながら37°Cで25分間インキュベートすることによって、MyOneストレプタビジンビーズよりタンパク質を溶出させた。次いで、この溶出液を、そのアプタマーの3’一定領域へ相補的な配列でコートされたMyOneビーズへ移して、振り混ぜながら37°Cで25分間インキュベートした。この工程により、残存するアプタマーのすべてが捕捉される。このビーズを100μLSB17Tで1分間2回、そして100μLSB19Tで1分間1回洗浄した。45μLの20mMNaOHとともに振り混ぜながら2分間インキュベートすることによって上記の最終ビーズからアプタマーを溶出させて、ハイブリダイズした鎖を壊した。この溶出液の40μLを、0.05Tween-20を含有する80mMHClの10μLで中和した。第一のビーズセットからの溶出物アプタマーへ結合したすべての血漿タンパク質を表すの5を表すアリコートと最終のビーズセットからの溶出物我々の臨床アッセイの最後に結合したままであるすべての血漿タンパク質を表すの20を表すアリコートを、還元及び変性の条件下にNuPAGE4~12Bis-TrisゲルInvitrogen上で泳動させた。AlphaInnotechFluorChemQスキャナーでCy5チャンネルにおいてゲルを造影して、タンパク質を造影した。00431アプタマー用のプルダウンゲルは、それぞれ、LBP血漿中約1x10-7M,ポリペプチド分子量:約60kDa、C9血漿中約1x10-6M,ポリペプチド分子量:約60kDa、及びIgM血漿中約9x10-6M,分子量:約70kDa及び23kDaに対して選択した図16を参照のこと。00432それぞれのゲルで、レーン1は、ストレプタビジン-アガロースビーズからの溶出物であり、レーン2は、最終溶出物であり、レーン3は、分子量マーカーレーン主要なバンドが上から下へ110、50、30、15、及び3.5kDaにあるである。これらのゲルより、最初の平衡状態では、血漿タンパク質の少量の非特異的な結合があるが、本アッセイの捕捉工程を実施した後では標的だけが残ることが明白である。その企図した分析物を捕捉するには、血漿を予め消費depletion及び分画化することなしに単一のアプタマー試薬で十分であることが明らかである。従って、上記工程の後で残存するアプタマーの量は、最初の試料中の分析物の量に比例している。実施例6.NSCLCの外科摘出物の分析00433組織由来の疾患関連バイオマーカーを同定する、本明細書に記載のプラットフォームベース技術の有用性を実証するために、8名のNSCLC患者より入手した、外科摘出由来の均質化した組織試料について分析した。NSCLC患者はいずれも47~75歳の範囲に及ぶ喫煙者であって、NSCLC病期1A~3Bが含まれた表17。外科的切除の後でその組織をOCT培地10.24ポリビニルアルコール、4.26ポリエチレングリコール、及び85.5非反応性成分に入れてから5~10分以内に該組織を凍結させることによってすべての組織試料を入手した。これらの試料は、それぞれの摘出より3種の試料:腫瘍組織、隣接健常組織腫瘍の1cm以内、及び遠位の非関与肺組織を入手した。この試料を常に凍結させながら、5つの10μm厚の切片を切り出し、その組織周囲の過剰なOCTをトリミングして、凍結した1.5mLミクロ遠心管の中へ入れた。200μLの均質化緩衝液SB18緩衝液PIカクテルマグネシウムを含まない、PierceHALTプロテアーゼ阻害剤の添加の後で、この試料を氷上のミクロ遠心管において回転ペストルで30秒間ホモジェナイズすると、組織断片が見えなくなった。次いで、この試料を遠心分離機において21,000gで10分間スピンさせて、0.2μmのマルチウェルプレートフィルターに通して無菌のマルチウェルプレートの中へ濾過した。5μLのアリコートをBCAタンパク質アッセイ用に取って、試料の残りは96ウェルプレートにおいて-70°Cで凍結保存して密封した。00434試料の全タンパク質をSB17T緩衝液0.05Tween20を含有するSB17緩衝液中16μg/mLへ補正した。このやり方で調製した試料を、上記に注目したように、先に記載のように800種を超えるタンパク質を測定するマルチプレックスアプタマーアッセイOstroffetalNaturePrecedingshttpprecedingsnaturecomdocuments4537version1で処理した。測定した分析物の中で、ほとんどは腫瘍、隣接組織、及び遠位組織の間で不変であった。しかしながら、隣接組織と遠位組織に比較して、腫瘍組織中で明らかに抑制されているタンパク質もあれば図24、実質的に上昇しているタンパク質もあった図23。00435上述の態様及び実施例は、例としてのみ企図されている。どの特別な態様も、実施例も、そして特別な態様又は実施例の要素も、特許請求項のいずれもの決定的、必須的、又は本質的な要素又は特徴として解釈してはならない。さらに、本明細書に記載のどの要素も、本質的又は決定的と明確に記載されなければ、付帯の特許請求項の実施に必須ではない。開示の態様に対しては、付帯の特許請求項によって規定される、本出願の範囲より逸脱することなく、様々な改変、修飾、代替、及び他の変更を施すことができる。図面及び実施例が含まれる本明細書は、制限的なやり方ではなくて、例示的なやり方で考慮されるべきなので、そのようなすべての変更態様及び代替態様が本出願の範囲内に含まれると企図される。従って、本出願の範囲は、上記に示した実施例によってではなくて、付帯の特許請求項とその法的等価物によって決定されるべきである。例えば、方法又はプロセスの特許請求項のいずれでも引用される工程は、どの実行可能な順序で実行してもよく、態様、実施例、又は特許請求項のいずれでも提示される順序に限定されるものではない。さらに、上記の方法のいずれにおいても、表18、表20、又は表21の1以上のバイオマーカーは、個別のバイオマーカーとして、又はあらゆるパネル由来のバイオマーカーとして具体的に排除することができる。"