"医薬上許容される担体、安定化剤、および1回分用量のダルババンシンを含む医薬組成物であって、1回分用量が、個体において少なくとも5日間治療上有効な血漿レベルを提供するに十分なダルババンシンの量である医薬組成物。滅菌されている請求項1記載の医薬組成物。凍結乾燥されている請求項1記載の医薬組成物。個体に投与するための医薬上許容される形態である請求項1記載の医薬組成物。医薬上許容される水性処方である請求項1記載の医薬組成物。個体が哺乳動物である請求項4記載の医薬組成物。個体がヒトである請求項6記載の医薬組成物。ダルババンシンでない抗生物質をさらに含む請求項1記載の医薬組成物。ダルババンシンでない抗生物質がグラム陰性細菌に対して有効なものである請求項8記載の医薬組成物。細菌感染の治療を要する個体における細菌感染の治療方法であって、1回分用量のダルババンシンおよび医薬上許容される担体を個体に投与することを含み、1回分用量が、少なくとも5日間個体において治療上有効な血漿レベルを提供するに十分なダルババンシンの量を含む、方法。1回分用量が約100mgないし約4000mgのダルババンシンを含む請求項10記載の方法。1回分用量が約3000mgのダルババンシンを含む請求項11記載の方法。治療上有効な血漿レベルが、血漿1リットルあたり少なくとも約4mgのダルババンシンである請求項10キシ開の方法。ダルババンシンの投与が非経口投与である請求項10記載の方法。非経口投与が静脈投与を含むものである請求項14記載の方法。静脈投与が少なくとも約30分かけて行われる請求項15記載の方法。細菌感染がグラム陽性細菌を含むものである請求項10記載の方法。グラム陽性細菌がペニシリン耐性細菌である請求項17記載の方法。グラム陽性細菌が多剤耐性細菌である請求項17記載の方法。細菌感染が皮膚および軟組織感染SSTIを含む請求項10記載の方法。SSTIがスタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus感染を含む請求項20記載の方法。SSTIがスタフィロコッカスピオゲネスStaphylococcuspyogenes感染を含む請求項20記載の方法。個体がヒトである請求項10記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質を個体に投与することをさらに含む請求項10記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質がグラム陰性細菌に対して有効なものである請求項24記載の方法。細菌感染の治療を必要とする個体における細菌感染の治療方法であって、1回目の1回分用量のダルババンシンおよび2回目の1回分用量のダルババンシンおよび医薬上許容される担体を個体に投与することを含み、治療上有効な血漿レベルのダルババンシンが、少なくとも5日間個体において維持されるものである、方法。1回目と2回目の用量が約5日ないし約10日間隔で投与される請求項26記載の方法。1回目と2回目の用量が約1週間間隔で投与される請求項27記載の方法。個体が、2回目のダルババンシン投与の前に血漿1リットルにつき少なくとも約4mgの血漿最小レベルtroughlevelを有する、請求項26記載の方法。1回目の1回分用量が約500mgないし約5000mgのダルババンシンを含み、2回目の1回分用量が約250mgないし約2500mgのダルババンシンを含む請求項26記載の方法。1回目の1回分用量が2回目の1回分用量の約1.5ないし約3倍のダルババンシンを含む請求項26記載の方法。1回目の1回分用量が約1000mgのダルババンシンを含み、2回目の1回分用量が約500mgのダルババンシンを含む請求項31記載の方法。ダルババンシンの投与が非経口投与である請求項26記載の方法。非経口投与が静脈投与を含むものである請求項33記載の方法。静脈投与が少なくとも約30分かけて行われる請求項34記載の方法。細菌感染がグラム陽性細菌を含むものである請求項26記載の方法。グラム陽性細菌がペニシリン耐性細菌である請求項36記載の方法。グラム陽性細菌が多剤耐性細菌である請求項36記載の方法。細菌感染が皮膚および軟組織感染SSTIを含む請求項26記載の方法。SSTIがスタフィロコッカスアウレウスStaphylococcusaureus感染を含む請求項39記載の方法。SSTIがスタフィロコッカスピオゲネスStaphylococcuspyogenes感染を含む請求項39記載の方法。個体がヒトである請求項26記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質を個体に投与することをさらに含む請求項26記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質がグラム陰性細菌に対して有効なものである請求項34記載の方法。細菌感染の治療を必要とする個体における細菌感染の治療方法であって、1回目の1回分用量のダルババンシンおよび2回目の1回分用量のダルババンシンおよび医薬上許容される担体を個体に投与することを含み、1回目の1回分用量が約1週間にわたり個体において治療上有効な血漿レベルのダルババンシンを提供するに十分なダルババンシンの量を含み、1回目の1回分用量が2回目の1回分用量に含まれるダルババンシンの量の約2倍を含み、1回目と2回目の用量が約1週間間隔で投与され、個体が2回目のダルババンシン用量の投与前に血漿1リットルあたり少なくとも約20mgのダルババンシンである血漿最小レベルを有する、方法。1回目の1回分用量が約1000mgのダルババンシンを含み、2回目の1回分用量が約500mgのダルババンシンを含む請求項45記載の方法。個体における細菌感染の発症を予防する方法であって、1回分用量のダルババンシンおよび医薬上許容される担体を個体に投与することを含み、1回分用量が個体において少なくとも5日間予防上有効な血漿レベルのダルババンシンを提供するに十分なダルババンシンの量を含む、方法。1回分用量が医学的処置の前、処置中、あるいは処置後に投与される請求項47記載の方法。1回分用量が入院前、入院中、あるいは退院後に投与される請求項47記載の方法。1回分用量が約100mgないし約1000mgのダルババンシンを含む請求項47記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質を投与することをさらに含む、請求項47記載の方法。ダルババンシンでない抗生物質がグラム陰性細菌に対して有効である請求項51記載の方法。少なくとも5日間個体において治療上有効な血漿レベルのダルババンシンを提供するに十分な量のダルババンシンの少なくとも1回分用量、ならびに説明書を含む、細菌感染の治療方法に使用されるキット。1回目の1回分用量のダルババンシンおよび2回目の1回分用量のダルババンシンを含み、1回目の1回分用量が2回目の1回分用量に含まれるダルババンシンの約3倍の量を含む、請求項53記載のキット。個体において少なくとも5日間予防上有効な血漿レベルのダルババンシンを提供するに十分な量のダルババンシンの1回分用量、ならびに説明書を含む、細菌感染の発症を予防する方法に使用されるキット。個体が、2回目のダルババンシン用量の投与前に、血漿1リットルあたり少なくとも約20mgのダルババンシンであるダルババンシン血漿最小レベルを有する、請求項26記載の方法。実施例1.皮膚深部および軟組織感染における1週間に1回のダルババンシンの有効性および安全性このランダム化されコントロールされた研究は、ダルババンシンの2つの投与規則の安全性および有効性を評価するものであった。皮膚および皮膚深部構造を含む軟組織の感染SSTIを有する、あるいは外科的介入を必要とする成人患者を、3つの群にランダマイズした:研究アームstudyarm1には1日目に1100mgのダルババンシンを静脈注射により与えた;研究アーム2には1日目の1gのダルババンシンIVそして8日目に500mgのダルババンシンIVを与えた;研究アーム3には標準のケアstandardofcareを与えた。臨床的および微生物学的応答ならびに不利なイベントを評価した。分析のための集団62人の患者が研究に参加した。すべての患者に少なくとも1の試験医薬用量を与えた。安全性および有効性に関して4つの研究集団を評価し、それらの集団は以下のように定義された:治療意図ITT集団は、研究医薬の少なくとも1の用量を与えられたすべての患者を包含したすべてのランダム化されて研究対象。微生物学的治療意図MITT集団は、ベースラインにおいて培養により確認されたグラム陽性病原体を有するすべてのITT患者であった。臨床的に評価可能な集団を、1すべての研究エントリー基準を満たす者、2経口ステップダウン療法ケア群の標準に適用されただけを除き、4日目以降にグラム陽性感染に対する抗微生物剤療法を変更しなかった者、3フォローアップFU評価通院のために戻った者、および4プロトコル承認されていない同時投与抗微生物剤を与えられなかった者と定義した治療が失敗しない場合。微生物学的に評価可能な集団は、ベースラインにおいて培養により確認されたグラム陽性病原体を有する臨床的に評価可能な患者の部分集合であった。研究集団を表2に示す。ITT治療意図MITT培養により確認されたグラム陽性感染を有するITT集団の部分集合EOT治療終了時FUフォローアップ対象のメジアン年齢は50~55歳18~86歳の範囲であった。治療アームを越えた年齢の明かな差はなかった。治療アームを越えた性差はあったが、全体として研究に同数の男女が参加した。患者集団は主に白人であった。これらの結果はITTおよび臨床的に評価可能な集団の両方と矛盾しなかった。62人の患者が参加し、研究アーム1には20人、研究アーム2および3には各21人参加した。標準のケアに関する最も通常のコンパレーターはクリンダマイシン、セフトリアクソン、バンコマイシンおよびセファゾリンであった。研究アーム3における治療の平均期間は15日であった。62人のITT患者のうち、66ダルババンシン1回投与14人、ダルババンシン2回投与13人、標準のケア14人は、単離されたグラム陽性病原体の前治療を受けていたMITT集団。最も通常の病原体はエスアウレウスSaureusであった。ベースラインにおける病原体の分布を表3に示す。臨床的および微生物学的応答患者の臨床的応答ならびに明らかになったあるいは推定された微生物学的応答を評価することにより3つの治療規則の有効性を決定した。第1の有効性のエンドポイントは、臨床的に評価可能な集団に関するフォローアップ来院時における臨床的応答であった。EOTおよびFUの両方に関する臨床的応答を、成功治癒または改善または失敗決定されない結果を包含に分類した。成功に分類された患者には、感染に対するさらなる抗細菌剤での全身的処置を受けた者であってはならない。失敗は、1またはそれ以上の局所あるいは全身的なSSTIの徴候の継続と定義され、その結果、SSTIに対する新たなあるいはさらなる全身的な抗微生物剤治療が必要であった。第2の有効性の変数である微生物学的結果を、微生物学的に明らかになったSSTIすなわち、少なくとも1の同定されたベースライン病原体を有する患者の部分集合において評価した。ベースラインにおいて同定された各グラム陽性病原体に関して微生物学的応答を評価したすなわち、根絶、根絶と推定、継続して存在、継続して存在と推定。フォローアップ培養が行われなかった患者については、ベースライン病原体に関する微生物学的応答を、臨床的応答を基礎として推定した。EOTおよびFU来院時の患者による微生物学的応答を、成功すなわち、すべてのグラム陽性生物が根絶され、あるいは根絶したと推定されるまたは失敗すなわち、少なくとも1のグラム陽性生物が継続して存在する、あるいは継続して存在していたと推定される、複数の病原体のうち部分的に根絶されたものがあるとしてグレード分けした。EOTおよびFUの両方において、コロニー形成および重感染を評価した。FU来院時に、患者の細菌学的応答は再発をも包含し得た。臨床的有効性臨床的成功率を表4に示す。臨床的に評価可能な集団において、ダルババンシン1回投与の患者の61.5、ダルババンシン2回投与の患者の94.1、および標準のケア群の76.2の患者がFU評価の時点で成功に分類された。ベースラインにおいて深部または合併症のSSTIに分類された患者に関する実地のサブ分析においても、ダルババンシン2回投与療法は、ダルババンシン1回投与療法成功率58.3および標準のケアの療法73.7と比較して、高い臨床的成功率93.8を示した。EOTおよびFU評価の両方における類似の成功率は、支持的なITTおよび微生物学的に評価可能な集団において見られ、ダルババンシン2回投与での治療後のより好ましい応答の傾向と矛盾しなかった表3。MITT集団に関して、メチシリン耐性エスアウレウスMRSAに関するFU評価における臨床的成功率は、ダルババンシン1回投与の場合503/6、ダルババンシン2回投与の場合804/5、そして標準のケア規則で治療された患者の場合501/2であった。微生物学的有効性異なる病原体に関する異なる治療規則の成功率を表5に示す。微生物学的に評価可能な集団に関し、FU評価における根絶/推定上根絶の割合は、ダルババンシン1回投与の場合58.37/12、ダルババンシン2回投与の場合92.37/12、および標準のケア群の患者の場合70.612/17であった。継続して存在した単離体に関し、ダルババンシンMICにおいては変化がなかった。FUにおいて、エスアウレウス根絶率は、ダルババンシン1回投与50および標準のケア60と比較すると、ダルババンシン2回投与の場合に高かった。MITT集団に関して同様の知見が観察された。ダルババンシン2回投与によりMRSA単離体の80が根絶された表5。微生物学的に評価可能な集団およびMITT集団に関し、EOTおよびFUにおける微生物学的成功率を表6にまとめる。比較可能な微生物学的成功率が、ダルババンシン2回投与で治療された患者および標準のケア規則で治療された患者の両方の来院時において報告された64ないし77が、ダルババンシン1回投与された患者の成功率はより低かった<40。微生物学的に評価可能な集団におけるEOT/FU時点での微生物学的成功率は、臨床的応答の知見とパラレルな関係を有していた:ダルババンシン1回投与の場合38.5/27.3、ダルババンシン2回投与の場合72.7/72.7、標準のケアの療法の場合71.4/64.3。MITT集団に関しても同様の知見が観察されたデータ示さず。薬物動力学的分析ダルババンシン治療群にランダム化された患者に関し、ダルババンシン血漿濃度を調べるために8日目に5mlの血液を採取した。8日目に500mgのダルババンシンを投与されるべきランダム化された患者から、2回目の投与直前に血液を得た。ダルババンシン1回投与群にランダム化された患者から10日目および24日目にさらに5mlの血液試料を得、ダルババンシン2回投与群にランダム化された患者から20日目および34日目にさらに5mlの血液試料を得た。有効性を確認されている液体クロマトグラフィーおよび質量スペクトル法を用いてダルババンシン血漿濃度を調べた。定量下限は結晶1mlあたり500ngであった。1回投与規則による研究8、10および24日目の平均ダルババンシン濃度はそれぞれ31.1±7.1、25.2±4.8、および10.2±3.5mg/l平均±SDであった。2回投与規則による82回目の投与の前、20および34日目のダルババンシン濃度はそれぞれ30.4±8.2、21.2±10.0、および9.0±4.4mg/lであった。予想されたように、すべての患者は1回目の投与後の最初の1週間は20mg/mlよりも高いダルババンシン濃度を有しており、8日目に500mgIVをさらに投与した場合にさらに1週間にわたり20mg/mlより高いレベルが維持された。一般的には、最小殺細菌濃度は約4ないし10mg/mlである。安全性評価研究薬剤を少なくとも1回投与された各患者ITT群を、異常な臨床試験結果およびバイタルサインを含む不利なイベントAEのモニタリングにより薬剤安全性に関して評価した。重篤度軽度、中度、重度、生命を脅かす程度ならびに研究薬剤との関連性関連性なし、関連性がありそうもない、関連している可能性あり、あるいはおそらく関連しているに関して研究者によりAEが評点付けされた。AEデータのまとめを表7に示す。不利な反応の大部分90は軽度および中度と考えられた。すべての重度の不利な反応5人の患者において8イベントは研究薬剤での治療に関連していなかった。少なくとも1回の緊急治療を要するAEが報告されたすべての患者の約59ダルババンシン1回投与では19人、ダルババンシン2回投与では16人、標準のケアでは21人が、研究者により研究薬剤と関連している可能性あり、あるいはおそらく関連していると分類されたイベントを経験した。特に、薬剤に関連したAEsが、11人55のダルババンシン1回投与患者において、10人48のダルババンシン2回投与患者、および12人57の標準のケアの患者において報告された。ダルババンシンおよび標準のケアの両方の治療群において最も頻繁に報告された薬剤関連AEは下痢および吐き気であった。異なる治療群において観察されたAEsのタイプを表8に示す。非ダルババンシン治療患者はAEのために未完のまま治療を中断した。標準のケア規則による21人の患者うち3人14がAEのために未完のまま治療を中断し、その中には、1日目におそらく薬剤に関連したじんましんを発症した1人の患者および研究薬剤に関係のないAEを有していた2人の患者Paeruginosaとの重感染およびバンコマイシン耐性レベル上昇が含まれていた。議論このオープン-ラベルランダム化されたフェーズIIの試験は、ダルババンシンがSSTIを有する成人の治療に有効であることを示す。参加した患者の大部分は深部または合併症のある感染を有し>90、外科的介入を要する感染を有していた~70が、約45は糖尿病も有していた。2回の毎週用量のダルババンシンは、ダルババンシン1回投与または標準のケア規則のいずれよりも数値的に高い臨床応答を有していた。ITTおよび臨床的に評価可能な集団両方からのデータは、2回の逐次の毎週用量のダルババンシンの投与規則毎週1000mg、500mgがSSTIsの治療において有効であることを示唆する。標準のケアの群はメジアン期間13日で治療された。フォローアップにおいて、ダルババンシン2回投与にて治療された臨床的に評価可能な患者の94が臨床的に成功と考えられたが、対照的に、標準のケア規則を施した患者の76およびダルババンシン1回投与を受けた患者の61.5が臨床的に成功と考えられた。エスアウレウスはベースラインにおいて最も頻繁に単離される生物であった。この試験において、約83の患者がエスアウレウスに感染しており、すべてのエスアウレウス株の38がMRSAであった。大部分の感染80は単一の病原体により引き起こされた。MRSAを含むグラム陽性単離体に対するダルババンシンのMICsは0.016ないし0.25mg/Lの範囲であった。微生物学的成功率は臨床的に評価可能な集団に関する臨床的応答に成功率とパラレルであった。混合されたすべての生物に関して、ダルババンシンを1週間おきに2回投与する規則での治療は、2週間目の治療前評価において、ダルババンシン1回投与58および標準のケア療法71よりも高い根絶率92を示した。結局、エスアウレウス根絶はそれぞれ90、50および60の患者において観察された。MITT集団に関しては、MRSAの根絶率はダルババンシン2回投与の場合80であったのに対し、ダルババンシン1回投与および標準のケア療法ではいずれも50であった。1回投与および毎週2回投与により治療期間の終わりそれぞれ10日目および20日目に得られたダルババンシン濃度は同様であり、2回目の1週間分の投与後における少量の薬剤の蓄積が示唆された。2回投与規則にて観察されたより高い臨床的成功率は時間依存性の殺菌を示唆するものであり、薬剤または薬剤への曝露の持続したレベルが、一週間間隔での2回のダルババンシン投与により提供された。1週間の投与間隔の終わりにおいて測定されたダルババンシン血漿レベルは、この試験において見出された病原体も含めて大部分のSSTIsの原因である病原体に関して報告されているMIC90よりも実質的に高かった<0.03ないし0.5mg/mL。これらのレベルは最小殺細菌濃度4ないし10mg/mlよりも高かった。不利な反応の全体的な割合はダルババンシン投与規則の群と標準のケアの群の両方に関して同様であった。胃腸の薬剤に関連した不利なイベントすなわち、下痢および吐き気は3つの治療群において最も普通に報告された。これらのイベントの大部分は中程度であり自己限定性であった。ダルババンシンにより治療された患者のうち、不利な反応のため早くに研究から離脱した者はなく、グリコペプチドに起因する重大な不利なイベントも報告されなかったが、標準のケア群の14は不利な効果のために離脱した。かくして、本発明の新規投与規則は標準的なケアと比較して不利な効果を減少させた。この試験で得られたデータからは、ダルババンシンがいずれかの程度の臨床的に有意な肝臓毒性または腎臓毒性を誘発したという証拠は見出されなかった。ダルババンシン2回投与規則は合併症を有するSSTIsの患者の治療に有効であると思われる。両方の用量のダルババンシンともこの臨床試験において十分に耐えうるものであり、標準のケア群の不利なイベントのプロファイルと同様の不利なイベントのプロファイルを伴っていた。実施例2.健康対象におけるダルババンシンの薬物動力学および腎臓での排泄この研究の第1の目的は、ダルババンシンの薬物動力学を特徴付けて、治療用量の薬剤を投与される健康対象における腎臓での排泄の程度を計算することであった。これはオープンラベルで比較ではないopenlabelnoncomparative研究であった。研究薬剤での処置年齢18歳から65歳までの健康な男性または女性の対象に、30分かけて輸液することにより1000mgIV用量のダルババンシンを1回投与した。女性1人および男性5人である6人の対象が投薬研究に参加し、研究のすべての段階を終えた。3人の対象は白人であり、3人の対象はアフリカ-アメリカ系であった。平均年齢は29.8歳22歳から63歳までの範囲であった。平均身長は68.6インチ63インチから75インチの範囲であり、平均体重は179.6ポンド140ないし244ポンドの範囲であった。薬物動力学研究1、2、3、4、5、6、7、14、21、28および42日目に血液および尿24時間収集を集めた。血液試料をヘパリン処理チューブ中に得て、遠心分離した。血漿を分離し、アッセイ時まで-20°Cで保存した。有効性が確認されているLC/MS/MS法を用いて血漿および尿試料をダルババンシンに関してアッセイした。尿および結晶に関するアッセイの定量の下限は500ng/mLであった。WinNonlinTMソフトウェアPharsightCorporationを用いる非コンパートメント的方法によりダルババンシン薬物動力学パラメーターを評価した。観察されたデータからピーク濃度Cmax値を直接得た。結晶濃度-時間曲線下の面積AUCを、線形台形ルールlineartrapezoidalruleを用いて計算した。クリアランスCLを用量/AUCとして計算した。時間曲線対対数濃度の対数-直線部分の線形回帰により、除去半減期eliminationhalflifet1/2を評価し、第1モーメント曲線下の面積AUMCに用量をかけ、AUCで割ることにより、定常状態における分配体積Vssを計算した。尿中に排泄されたダルババンシン積算量を、尿排泄速度の積分として決定したAURC。CLRまたは腎臓クリアランスを次の割合として計算した:CLR=AURC/AUC。すべての対象に関する時間に対するダルババンシンの血漿濃度を図1に示す。薬物動力学的パラメーターを表9に示す。濃度はすべての対象において同様であった。ピーク血漿濃度は約300mg/Lであり、輸液直後に達成された。ダルババンシンは10Lよりも多い見かけの分配体積を示し、細胞外液体中に十分に分配されたと考えられる。ダルババンシンは9~12日のt1/2でゆっくりと除去された。全薬剤クリアランスは0.0431±0.0074L/時であった。変化せずに尿中に排泄された薬剤のフラクションは投与量の42と評価され、腎臓でのクリアランスは0.018L/時であると評価された。対象間の変動は少なく、変動係数はすべての薬物動力学的パラメーターにおいて22よりも小さかった。安全性の評価不利なイベントを記録し、重篤度および研究薬剤との関連性について評価した。研究室のデータ化学パネル、差分CBC、尿分析を集め、ベースラインからの変化および範囲外の値を評価した。ECG、身体検査およびバイタルサインを得て、ベースラインからの変化を評価した。この研究においてダルババンシンは十分に耐えられるものであった。この研究期間中に死亡した対象あるいは重大な不利なイベントの対象は報告されず、AEのために研究完遂前に脱退した対象はいなかった。すべてのボランティアは少なくとも1のAEを報告し、すべて軽度であった。3人のボランティアは、研究投薬に関連している可能性のあるAEsを報告した:1人の対象において上昇したALT46IU/Lの値、正常の上限40IU/L;すべての対象において好酸球増加0.5x103/μLの値、正常の上限0.4x103/μL、上昇したLDH303IU/Lの値、正常の上限90IU/L、上昇したALT46IU/Lの値、正常の上限40IU/L、上昇したAST42IU/Lの値、正常の上限40IU/L;1人の対象において耳鳴り。ベースライン後の血液学的結果、化学的結果、バイタルサインおよびECGの結果には何の傾向も見られなかった。議論ダルババンシン1000mgIVの1回投与は十分に耐えられるものであった。1000mgの1回静脈輸液後、45mg/lよりも高いダルババンシン血漿濃度が少なくとも7日間維持された。これは殺細菌的であることが知られている濃度4~32mg/lよりも高い。このことは、ダルババンシンの1週間に1回の投与規則での使用を支持する。尿での除去プロファイルは、腎臓での排泄が重要な除去経路であり、約40が尿中に排泄されることを示す。この知見は動物での観察結果と矛盾しない。腎臓経路のみが除去経路ではないので、ダルババンシンの用量調節は腎臓に障害のある患者において必要でないかもしれない。実施例3.等温滴定微小熱量測定を用いるダルババンシンの蛋白結合蛋白へのダルババンシンの結合を、MicrocalVPITC装置を用いて、20mMホスフェート、150mMNaCl,pH7.4中、25°Cおよび37°Cにて等温滴定微小熱量測定ITCにより測定した。典型的な実験において、25x10μlの蛋白約150μMを、ダルババンシン溶液約5μMの入った熱量計セルに注入した。280nmにおける吸光度を測定することにより、実際の蛋白およびダルババンシン濃度を決定した。対照実験は蛋白をバッファーダルババンシン不存在に注入して、同一条件下での蛋白の希釈熱を調べることを含んでいた。比較のために、いくぶんかの必要な修飾を行って、テイコプラニンを用いて同様の実験を行った。下記の各蛋白を用いて、ダルババンシンで実験を行った:ヒトアルブミン;イヌアルブミン;ラットアルブミン;ウシアルブミン;およびヒトα-グリコプロテイン。ヒトアルブミンおよびα-グリコプロテインを用いてテイコプラニンを研究した。2つの異なる温度での結合アフィニティーの比較を表10に示す。カッコ内の±誤差はフィッティングルーチンfittingroutineから得られた標準偏差である。希釈熱に関する補正を行った後の総合熱効果integratedheateffectsを、MicrocalORIGINソフトウェアパッケージを用いる単純な単一部位結合モデルを用いて非線形回帰により分析した。各注入物質に関する生データμcal/秒を総合して、添加1回あたりの全熱効果を得て、次いで、注入物質の量で割って注入物質のkcal/moleを得た。同じ総合を対照希釈効果に適用し、これを実際の測定データから差し引いた。これにより、結合曲線の相違が提供され、結合の程度は全放出熱あるいは吸収熱に比例している。次いで、これを種々の標準結合モデルに関して非線形回帰法により分析した。最も単純なモデルは単純な非競争的結合平衡を仮定するものであり、3つのパラメーターを与える:Kaは結合定数であるΔH結合エンタルピーN結合部位数非競争的結合と仮定して、Nは、試料中のすべての利用可能な結合部位を飽和させるのに必要な注入物質のモル数相対数である。ダルババンシンでの実験に関し、ダルババンシンは試料であり、蛋白HSA等は注入物質である。これらの予備的な結果は、結合が比較的弱いこと、ダルババンシンの溶解度が低いので、結合化学量論Nを明確に決定することは困難であることを示す。しかしながら、図2からわかるように、すべての場合において、データはN<1でうまく適合するすなわち、ダルババンシンに対して1個未満ないし1個の蛋白。結果として、N=0.5の値は、すべてのダルババンシンに結合するのは予想した蛋白のわずか半分のモル数の蛋白であることを意味する。言い換えると、1分子の蛋白は見かけ上2個のダルババンシン分子と結合する。ダルババンシンが1:1の割合で蛋白と結合する二量体を形成することがあり得る。結合化学量論モデリングの結果は、2個のダルババンシン分子が1個の蛋白分子に結合することを示唆し、それは1:1の結合を示すテイコプラニンとは異なる。表11は、ヒト血清アルブミン6x10-4Mおよびα-グリコペプチド1.5x10-5Mの生理学的濃度を仮定した場合の、1~500μMの範囲の濃度の抗生物質の結合パーセント数を計算したものである。これを臨床的状態と関連づけるためには、ヒトにおけるダルババンシンのピーク濃度は300mg/Lまたは165μMである。ND計算せずこれらの実験において、ヒト血清アルブミンに対するダルババンシンの結合は98を超える。結合割合は、選択されたダルババンシン濃度間でかなり一定であり、すなわち1~500μMである。この範囲はヒトにおける治療濃度を包含する。α-グリコプロテインへのダルババンシンの結合はテイコプラニンのそれよりもはるかに強い。ダルババンシンは高い能力と異なる起源の血漿蛋白に対する低い親和性を示し、試験したすべての種由来の蛋白間で同様のKa値を有している。これらの結果は、ダルババンシンのユニークな薬物動力学的特性のいくつかを説明するのに役立つ。結合および2:1のダルババンシン:蛋白複合体の形成もまた、長い半減期およびほぼ細胞外水分体積である見かけの体積分布の説明となる。低い親和性は、遊離フラクションを用いた場合に化合物に関して期待される活性1付近を大きく超える、観察されたインビボ活性を説明するのに役立つ。血漿蛋白に対する高い容量は、生理学的pHにおける化合物の乏しい溶解度にもかかわらず達成された比較的高い血漿濃度を説明するのに役立つ。実施例4.ラットにおけるダルババンシンの薬物動力学的貢献および組織分布20mg/kgの[3H]-ダルババンシンを1回静脈輸液されたラットにおいて2つの研究を行った。投与後70日間にわたり排泄物および40個の異なる組織を集め、薬剤に由来する放射活性の組織分布および薬物動力学を調べた。HPLCにより精製された[3H]-ダルババンシンをこれらの研究に使用した。トリチウム交換により放射性標識薬剤を得て、HPLCにより精製した。ラット物質収支の研究オスのラットにおいて物質収支の研究を行って、ダルババンシン1回静脈IV輸液後のダルババンシンの排泄パターンを調べた。15匹のオスのSpragueDawleyラットに3H-ダルババンシン20mg/kg,100μCi/ラットを1回IV投与した。投与後、尿および便を24時間間隔で14、36、および70日目まで集めた最終収集時に3匹。水およびメタノールでのケージ洗浄液も集めた。収集期間の終わりに死体を分析した。液体シンチレーション計数LSCにより全放射活性量に関してすべての試料を分析した。ラットに3H-ダルババンシンをIV投与した後、薬剤に由来する放射活性が尿排泄された放射活性の約2/3および便排泄された放射活性の約1/3の両方に排泄された。投与された放射活性の約半分が1週間以内に除去され、そのことは約1週間の血漿t1/2と一致した。投与後70日目で、死体には投与量のわずか4.5しが残存していなかった。無視できる放射活性がケージ洗浄液中に回収された。実質的に投与されたすべての放射活性が研究期間中に説明された尿、便、ケージ洗浄液、およびトリチウム交換。ラット定量的組織分布QTDの研究オスのラットにダルババンシンをIV投与した後の組織分布を評価するために定量的組織分布の研究を行った。41匹のオスのSpragueDawleyラットに3H-ダルババンシン20mg/kg,100μCi/ラットを1回IV投与した。投与後12、24、48、72、96、120、144、168、336、840、1176および1680時間目にラット各時点につき3匹を安楽死させて、血液、血漿、および組織死体を包含を集めた。すべての試料をLSCにより分析した。皮膚を含む組織中の薬剤由来の放射活性の濃度およびt1/2値は、血漿中で観察された値と比較した。投与12時間以内に定量可能な濃度の薬剤由来の放射活性を有するダルババンシンがすべての組織に迅速かつ広く分布することがわかった。大部分の組織は投与24時間以内に最大濃度Cmaxに達した。5日後に回収された放射活性はいずれの組織においても投与量の5未満であった。投与後70日目までに、死体のみ投与放射活性の12.34を上回る放射活性を保持していた。かくして、ダルババンシンはどの単一組織、器官、または血液細胞コンパートメントにも蓄積しなかった。この健康な動物モデルにおいてCNS中の放射活性の濃度は低かったが、検出可能であった。ダルババンシンは、血漿中の濃度と同等またはそれ以上の薬剤由来の放射活性の濃度で皮膚に浸透することがわかった。薬剤由来の放射活性の血漿中対血液中の割合は時間経過しても比較的一定であり、1未満であった。QTDの研究の一部として、投与後384時間16日にわたり胆管カニューレを挿入したラット4匹から胆汁試料を集めた。投与から384時間後に投与量のほぼ11が胆汁中に回収された。このことは、薬剤由来の放射活性の大部分が便中に見出されたことを示す。実施例5HPLC-MS/MSによる血漿中のダルババンシンの定量下記のような、血漿中のダルババンシンの定量的測定のためのHPLC-MS/MS法を開発した。ダルババンシンの校正用標準および品質管理標準の調製ダルババンシンを脱イオン水に溶解させて1000μg/mLの溶液を調製することによってダルババンシンの原液を調製し、次いで脱イオン水で連続的に希釈して500、50および10μg/mLの溶液を調製した。ヒトの血漿を、上記のように調製した1000μg/mLのダルババンシンの原液の適切な量でスパイクすることによって、100、60、および40μg/mLのダルババンシン濃度の校正用標準を調製した。ヒトの血漿を、500μg/mLのダルババンシンの原液の適切な量でスパイクすることによって、20および10μg/mLの濃度の校正用標準を調製し、ヒトの血漿を、10μg/mLの原液の適切な量でスパイクすることによって、0.5μg/mLの校正用標準を調製した。ヒトの血漿を、上記のように調製した1000μg/mLのダルババンシンの原液の適切な量でスパイクすることによって、90および30μg/mLのダルババンシンの品質管理標準を調製した。ヒトの血漿を、50μg/mLの溶液の適切な量でスパイクすることによって、1.5μg/mLの品質管理標準を調製した。内部標準使用溶液の調製内部標準のBI-K0098、これはA-40926のジエチル-アミノ-プロピル-アミノ誘導体である、の30μg/mLの使用溶液を次のように調製した。約10mgのBI-K0098を、約10mLの移動相A80の10mMギ酸アンモニウム/ギ酸、pH3v/v、10のアセトニトリルv/v、および10の2-プロパノールv/vに溶解させて、1000μg/mLの内部標準の原液を作製した。次いで、この原液300μLを移動相Aで10mLの量に希釈して、30μg/mLの内部標準溶液を作製した。分析のためのサンプルの調製血漿中のダルババンシンの濃度を定量するためのサンプルを次のように調製した。上記のように調製した50μlの校正用標準または品質管理標準に、100μLの内部標準使用標準溶液を添加して混合した。この混合物を室温で五分間平衡化させ、次いで250μLのアセトニトリルを添加した。次いで、この混合物をボルテックスで10秒間撹拌し、次いでALCmicrocentrifugette4214で約10,000rpmにて1分間遠心分離した。上清をきれいな試験管に移し、SavantSpeedVacSystemで、約40°Cにて蒸発乾固させた。次いで、サンプルを150μLの移動相Aに再懸濁させた。分析方法分析のために上記のようにして調製した50μLのサンプルをPhenomenexJupiterC18カラム50×2mm、C185μm300A内に注入し、0.3mL/minの流速の勾配HPLCの条件下で分析した。この勾配の条件は:最初が80の移動相A/20の移動相B20の10mMギ酸アンモニウム/ギ酸、pH3v/v、40のアセトニトリルv/v、40の2-プロパノールv/v;1分目に20の移動相A/80の移動相B;2分目に20の移動相A/80の移動相B;2.5分目に最初の条件に戻る、というものであった。このHPLCシステムを、陽イオン化モードで操作する、ターボイオンスプレーを伴うPESCIEXAPI-2000三連四重極質量分析計と連結した。イオン源におけるスプレーを生じさせるために、空気を用いた。カーテンガスとして窒素を用いてプローブ温度を500°Cに設定した。コリジョンガスとして窒素を用いるマルチプルリアクションモニタリングMRMを採用した。次のイオンの移行:ダルババンシンについて909.3Da→1429.3Da、および内部標準BI-K0098について923.3Da→1457.3Daをモニタリングすることによって、分析対象物を検出した。質量分析計の汚染を避けるために、最初の1分間において、およびクロマトグラフィーの実施開始から2.5分間において、ポストカラムの流れを迂回させた。データを収集し分析するためにSoftwafeSampleControl14を用い、クロマトグラフィーでのピークと統計データの評価とを統合するためのソフトウェアのMacQuan16を用いた。校正曲線測定方法の直線性を、校正曲線を作成するための校正用標準を検定することによって評価した。血漿サンプル中のダルババンシンの濃度を、ダルババンシンと内部標準との間のピーク面積の比率を計算することによって測定した。0.5~100μgのダルババンシン/ヒトの血漿1mLという分析範囲の全体にわたるダルババンシンの濃度についての校正曲線を、1/xの加重がかけられた方程式y=ABxを用いて作図した。ここで、Aは曲線の切片を示し、Bは曲線の傾きを示し、xは校正用標準μg/mLのダルババンシンの濃度を示し、yは内部標準に対するダルババンシンのピーク面積の比率を示す。三種の異なる校正曲線を作図した。この結果から、ダルババンシン/内部標準の面積の比率およびダルババンシンの濃度は分析範囲の全体にわたって直線的に変化することが示された。定量の下限値LLOQは、1mLのヒトの血漿あたり0.5μgのダルババンシンであった。校正曲線についての傾きは再現性があり、それらの相関係数は0.9995より大きいものであった。血漿中のダルババンシンの安定性血漿サンプル中のダルババンシンの安定性を、上記のように調製したヒトの血漿サンプルの、二種の異なる濃度、1.5および90μg/mLの品質管理標準を三回繰り返して分析することによってテストした。検出可能なダルババンシンの濃度は、凍結-融解処理を三サイクル行った後でも安定していた。処理されたサンプル中のダルババンシンの濃度は、室温にて24時間後でも安定していた。0時間のサンプルに関して、ダルババンシンの濃度の低下は見られなかった。実施例6ダルババンシンの質量分析。溶液中のダルババンシンの多量体の性質を詳細に調べ、ダルババンシンの単量体に対するダルババンシンの多量体の集団の比率に影響を与える条件を、エレクトロスプレーイオン質量分析ESI-MSによって決定した。三連四重極分析計であって、陽イオンモードで操作する、ターボイオンスプレー源を備えたAppliedBiosystemAPIIII質量分析計を用いて実験を行った。最適条件を下記の表12に記録する。溶液中のダルババンシン機器のパラメータを、8:2の水:イソプロパノール溶液に溶解した、0.1mg/mLのダルババンシンを含むダルババンシン溶液に合わせた。この溶液を直接注入した後、溶液中のダルババンシンの、500~2000amuの範囲のスペクトルを得た。図3に見られるように、得られたスペクトルから、ダルババンシンの多量体が存在することが示される。非限定的な例として、このスペクトルの一つの痕跡はB0のホモ多量体に起因し、このものは2nMy3のイオン種として存在する。ここで、nはホモ多量体の多重度を示す正の整数であり、たとえば、多量体がホモ二量体の場合はn=1であり、多量体がホモ四量体の場合はn=2であり、Mは単量体の質量を示し、y=nであり、3は3価の陽イオンの電荷を示す。具体的には、n=1、y=1、およびM=B0の質量の場合、B0のホモ二量体が与えられる。このホモ二量体の種を、質量スペクトルにおいて2M3イオンの痕跡とする。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率に与えるダルババンシンの濃度の影響単量体に対する多量体の集団の比率に与えるダルババンシンの濃度の影響を、上記の条件を用いた質量分析によって評価した。ダルババンシン溶液を20、40、60、および80μg/mLの濃度で直接注入することによってスペクトルを得た。図4に示されるように、ダルババンシンの濃度の関数として主なピークの強度を記録し、ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率を測定した。このデータから、ダルババンシンの単量体に対するダルババンシンの多量体の集団の比率が、上昇する濃度に伴って増加することが示される。このことは、個体に投与され得る薬剤の負荷能力が高いことを説明するのに役立ち得る。単量体の貯蔵物としての多量体の機能によって、より高濃度のサンプルが沈殿を生成させる傾向を弱めることができ、個体に投与できる濃度を上昇させることができる。多量体が存在することによって、ダルババンシンの用量の個体への迅速な投与も可能となり得る。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率を測定する方法の非限定的な例が提供され、具体的には、図3に示されるように、イオンAとイオンBとの間のピークの強度の比率を測定することによる。ピークAの強度をピークBの強度で割ることで、ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率の一つの指標が与えられる。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率に与えるpHの影響ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率に与える溶液のpHの影響を、上記の機器の条件および次のpH値の溶液:2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、および5.5にて評価した。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率をそれぞれのpH値で測定し、図5に見られるように、pHに対してプロットした。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率が、上昇するpHに伴って増加することが確定した。理論に制限されないとはいえ、イオン性基、たとえば第一のダルババンシンの単量体上のカルボキシル基が、逆に荷電したイオン、たとえば第二のダルババンシンの単量体上の第三窒素基のせいで形成されるイオン性相互作用によるダルババンシンの多量体の安定化に役立つと考えられる。このようなイオン性相互作用は、pHに影響される可能性がある。ダルババンシンがより高いpHで多量体として存在する傾向が強くなることは、イオン性相互作用が多量体の安定化に重要であることを示すものと考えられる。とりわけ、特定の官能基、たとえばカルボキシル基はより低いpH値においてプロトン化し得るので、恐らくは多量体の安定性に寄与するイオン性相互作用が妨害されることによって、ダルババンシンの多量体はより低いpHで不安定になると考えられる。ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率に与える溶液のイオン強度の影響ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率に与える溶液のイオン強度の影響を、質量分析法によって測定した。Ultramark1621、カフェインおよびMRFAL-メチオニル-アルギニル-フェニルアラニル-アルギニンを用いてエレクトロスプレーモードで予め合わせて校正しておいたFinniganLCQDecaイオントラップ装置で、エレクトロスプレーのポジティブモードにて、この質量スペクトルを得た。表13に列挙した条件を用いてすべての質量スペクトルを記録した。詳細に調べたこのサンプルのパラメータを、表14に列挙する。サンプルの水溶液をHarwardシリンジポンプによって10μL/minで注入し、図6~図8に見られるような質量スペクトルを得た。得られたスペクトルから、ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率がイオン強度に影響されることが示される。緩衝液の濃度の上昇が多量体の質量の痕跡の減少に対応することが分かったので、ダルババンシンの単量体に対する多量体の集団の比率が減少する。記載のように、イオン性相互作用はダルババンシンの多量体の安定性に重要であることが考えられる。上昇するイオン強度が、減少する多量体の質量の痕跡の強度と相関したという事実から、多量体の安定性におけるイオン性相互作用の機能が立証される。しかしながら、より高いイオン強度においてさえ多量体の質量の痕跡が存在するので、別の第二の相互作用が多量体の安定化に関与するのかもしれない。あらゆる理論に束縛されないとはいえ、疎水性相互作用がダルババンシンの多量体の種の安定化に重要であると考えられる。これらの非共有的なダルババンシンの多量体の安定化がイオン性相互作用だけによるものだった場合、イオン強度の上昇の結果、多量体の質量の種類の全てが失われることが予想されただろう。すなわち、溶液のイオン強度が上昇するのにつれて、多量体を安定化させるイオン性相互作用が、増加した溶液中のイオン集団によって崩壊させられ、そのイオン集団によって単量体がより容易に会合することが予想された。従って、溶液のイオン強度が多量体の単量体成分への解離を促進し、得られた質量スペクトルにはいずれの多量体の質量の痕跡も存在しないだろう。しかしながら、イオン強度が高い溶液たとえば100mMのギ酸アンモニウムにおいてさえ、ダルババンシンの多量体が存在することが、質量スペクトルにおいて認められている。従って、ダルババンシンの多量体は、疎水性相互作用によって少なくとも部分的に安定化させられたとみなされる。構造が類似した化合物ダルババンシンの効果の改善は、多量体を形成する能力が、少なくとも部分的な原因であると考えられる。このユニークな特徴は、構造が極めて類似した化合物によってでさえ共有されていないと思われる。ダルババンシンと化学構造が類似する化合物が多量体を形成するその能力について、質量分析によって詳細に調べた。Ultramark1621、カフェインおよびMRFAL-メチオニル-アルギニル-フェニルアラニル-アルギニンを用いてエレクトロスプレーのモードに予め合わせて校正しておいたFinniganLCQDecaイオントラップ装置で、エレクトロスプレーのポジティブモードにて、この質量スペクトルを得た。表15に列挙した条件を用いてすべての質量スペクトルを記録した。詳細に調べたサンプルのパラメータを、表16に列挙する。サンプルの水溶液をHarwardシリンジポンプによって10μL/minで注入し、図9および図10に見られるような質量スペクトルを得た。na=調整せず類似の糖ペプチド抗生物質テイコプラニンは、種々の濃度の溶液中で多量体性の複合体を示さない。このことは、構造が類似した化合物は溶液中で多量体の種を形成できないという指摘、およびこの現象はダルババンシンの活性において重要な機能を果たし得るという指摘を支持する。実施例7タンパク質-ダルババンシン複合体のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間MALDI-TOF型質量分析10μLのHSA、0.150mMを10μLの0.075mM、0.15mM、0.3mMおよび1.5mMからのダルババンシン溶液と混合し、37°Cで60分間インキュベートした。このサンプルを、ドライドドロップレットテクニックを用いる分析のために調製した。200のレーザーショットによって生じたスペクトルを得て平均化した標準のウシ血清アルブミンを用いて、予め合わせて校正しておいたtof質量分析計であるBRUKERFLEXIIIでスペクトルを得た。マトリックス:アセトニトリル/H2O50:50中で飽和したDHB-92,5-ジヒドロキシ安息香酸が9部、アセトニトリル/H2O50:50中で飽和したシナピン酸が1部。0.5μLのサンプル溶液および0.5μLのマトリックス溶液を混合し、レーザーターゲット上に置いた。ダルババンシンは単量体としてタンパク質と結合する1HSA1ダルババンシン。タンパク質に対するダルババンシンの比率が非常に高い1:2、1:10場合、タンパク質分子あたり2分子のダルババンシンを含む複合体の存在が観測できる。実施例8ヒトの血清アルブミン存在下でのダルババンシンのN,N’-ジアセチル-Lys-D-Ala-D-Alaとの結合の等温滴定熱量測定ダルババンシンの細胞壁のターゲットのペプチドアナログである、N-N’-ジアセチル-Lys-D-Ala-D-Alaとの、ダルババンシンの結合を、600μMまでの濃度範囲にわたるHSAの存在下、25°Cにて、いくらかの37°Cでの追加的な測定を含めて、等温滴定熱量測定ITCによって詳細に調べた。HSAはダルババンシンの溶解性を高め、トリペプチドリガンドに対するその結合親和性を低下させた。結果を、バンコマイシンについての結果と比較した。観測された効果は、比較的低いHSA濃度にて頭打ちとなった。これは、リガンドの、溶液中で遊離しているダルババンシンとの結合、およびダルババンシン-HSA複合体とのより弱い結合の両方を可能とする非競合的な結合モデルと一致した。予備的な実験から、血清タンパク質が無い場合、ダルババンシンおよびバンコマイシンは、類似の結合特性:両者はN-N’-ジアセチル-Lys-D-Ala-D-Alaに対して発熱性の結合を行うが、ジペプチドD-Ala-D-AlaまたはLys-D-Ala-D-乳酸塩に対して結合した証拠は無いことを示すことが実証された。ダルババンシン/トリペプチド相互作用については、これらのデータはKdiss=1~10μMでの温度依存的な結合と一致し、同じ条件下でのバンコマイシンと類似していた。HSAが存在する場合、ダルババンシンの溶解性は有意に上昇し、トリペプチドに対する結合親和性は、HSAによる抗生物質に対する競合的な結合または非競合的な結合と一致する様式で低下した。本実施例において記述された実験は、a異なる温度25および37°Cおよび異なるHSA濃度でのダルババンシン/トリペプチドの測定の比較;b観測された数を比較するための結合モデルを構築するための、これらのデータの使用を目的として設計された。ダルババンシンはBiosearchItaliaから供給を受けた。その他の試薬はSigmaからのものであった:塩酸バンコマイシンSigmaV2002fw14857、N,N’-ジアセチル-Lys-D-Ala-D-AlaSigmaD9904fw3724、ヒトアルブミンHSA;SigmaA3782mw69366。抗生物質およびペプチドを、HSAを含む緩衝水溶液20mMリン酸Na、150mMNaCl、pH7.4に溶解させ、それぞれの実験の直前に緩やかに撹拌した。ペプチドの濃度を重量で測定した。ダルババンシンの濃度を、重量、またはモル吸光係数ε=12430ダルババンシン、A2801=68.42、ε280=6690バンコマイシンを利用するUV吸光度のいずれかで測定した。HSAの濃度をUV吸光度HSA、ε280=37,700;A2801=5.44によって測定した。ShimadzuUV-160AまたはUV-1601分光光度計を用いて、1cmの光路長の石英キュベット内で室温にてスペクトルを記録し、必要に応じて、吸光度を0.1~1Aの範囲とするために、サンプルを緩衝液で定量的に希釈した。MicrocalVP-ITC装置を用いて、標準的な操作手順を採用して25°Cおよび37°Cにて等温滴定熱量測定を実施した。たとえば、Wisemanら、AnalBiochem179131137Cooperら、PhilosTransRSocLondSerAMathPhysEngSci3452335CooperAIsothermalTitrationMicrocalorimetryinCJonesBMulloyandAHThomas、MicroscopyOpticalSpectroscopyandMacroscopicTechniquesHumanaPressTotowaNJp137150CooperAMicrocalorimetryofProteinproteinInteractionsinJELadburyandBZChowdhryBiocalorimetryTneApplicationsofCalorimetryintheBiologicalSciencesWileyp103111およびCooperACurrOpinChemBiol3557563を参照すること。熱量計のセル内での泡の形成を抑えるために、添加前にサンプルの脱気を穏やかに行った。それぞれの実験は、通常、抗生物質溶液約20~100μMを含む熱量計のセル容積は約1.4mL内に、25×10μLのペプチド溶液約1mMを注入することを含んでいた。コントロールの実験では、ペプチドの希釈熱を測定するために、同一の条件下でリガンドを緩衝液に注入する必要があり、そしてこれらの値を、分析前の生の結合データを補正するために用いた。ダルババンシン/トリペプチドの結合実験を、それぞれの温度で数回繰り返した。標準的なMicrocalORIGIN商標ソフトウェアを用いてITCの結合データを分析し、結合部位の見かけの数N、結合親和性Kass=1/Kdissおよび結合エンタルピーΔHを決定した。HSAが無い場合のトリペプチドのダルババンシンとの結合に関するITC実験から、10、25、および37°Cでの平均Kdissがそれぞれおよそ1.4、3.1、および8.4μMである結合親和性についての矛盾がないデータが得られる表17。結合は発熱性である。ここでの濃度の計算から、これらの条件下ではNはほぼ0.5であることが示される。このことは、これらの条件下ではダルババンシン二量体あたりトリペプチド一分子が結合することと一致する。これらの結合親和性および結合エンタルピーは、同一の条件下でのバンコマイシンで観測される結合親和性および結合エンタルピーに匹敵する表17およびDMcPhailACooperJChemSocFaradayTrans9322832289。ここでまた留意すべきことは、バンコマイシンは、より高濃度ではリガンドに誘導される二量体化が生じることである。ダルババンシン混合物にHSAを添加すると、トリペプチドとダルババンシンとの間の見かけの結合親和性が低下するが、結合の発熱性は明らかにより強まる表17。これについての25°CでのHSAの濃度依存性を図11に示す。見かけのKdissが最大で35μMHSAという弱い立ち上がりの後は、生理学的なレベル600μMに近づくより高いHSA濃度に対して比較的一定であり続ける。高濃度のHSAにおける頭打ちとなるレベルKdissがほぼ35μMは、HSAが無い場合よりも約10~12倍弱い結合親和性に相当する。類似の低下は37°Cで見られる。HSAの効果は、トリペプチドとの相互作用によるものではなかった。HSAが存在する場合のバンコマイシンのトリペプチドとの結合についてのコントロールのITC実験から、HSAが無い場合に見られる結果に匹敵する結果が得られた表17を参照すること。このことは、ペプチドおよび関連性が強い抗生物質、バンコマイシンのどちらも、溶液中のHSAと相互作用しないことを示す。要するに、HSAがダルババンシン/トリペプチドの相互作用に与えるあらゆる影響は、HSAとダルババンシンとの間の相互作用が原因となるはずである。理論に束縛されるつもりはないとはいえ、上記のデータは非競合的な結合モデルと一致する。このモデルは、トリペプチドリガンドLが、遊離状態のダルババンシンDと、親和性が異なるかもしれないがダルババンシン-HSA複合体状態のものとの両方に結合することが可能であると仮定している。DL←→DL;KL=[D][L]/[DL]DHSA←→DHSA;KHSA=[D][HSA]/[DHSA]DHSAL←→LDHSA;KLDHSA=[DHSA][L]/[LDHSA]見かけの観測されたリガンドの結合解離定数非競合的:KappL=[すべてのD][L]/[すべてのDL複合体]=[D][DHSA][L]/[DL][LDHSA]=KL{1[HSA]/KHSA}/{1[HSA]KL/KHSAKLDHSA}このことから、Kapp,Lは、観測されたデータとよく一致する遊離のHSA濃度に双曲線的に依存することが示される図11。[HSA]が高い場合、これは漸近頭打ちの値に達する。Kapp,L=KLDHSA大きい[HSA]に対してこのことは、遊離のダルババンシンについては3μMであることと比べると、ダルババンシンがHSAと結合する場合のトリペプチドに対する結合親和性は約35μMであることを示唆する25°Cの図。ペプチドまたはタンパク質との相互作用において、ダルババンシンが単量体としてまたは二量体として振舞うのかどうかについて、さらなるメカニズムが示唆され得る。ダルババンシンをこれらの低濃度では1:1で結合することが明示されているバンコマイシンと直接比較したことから、ダルババンシンについてのモル比がより小さいNがより小さい場合、結合は完全であることが示される図12。このことは、ダルババンシン:ペプチド複合体が2:1であることと一致する。しかしながら、HSAが存在する場合、見かけのN値が増加し表17、この値は1:1の複合体形成にさらに一致し得る。理論に束縛されるつもりはないとはいえ、図13に示されるモデル、このモデルはダルババンシンの単量体および二量体とトリペプチドリガンドおよびHSAとの予想される相互作用を示す、はこれらの観測結果と一致する。図13Aは、溶液中では単量体-二量体の平衡状態として大部分は二量体としてのダルババンシンであるが、HSA上の二つの別個の部位へは単量体として結合するダルババンシンを表現している。このことは、血清タンパク質のダルババンシンへの結合についてITCによって観測される、N=0.5の値と一致する実施例3。図13Bは、溶液中ではダルババンシンの二量体に結合し、HSAに付着するダルババンシンの単量体により弱く結合するリガンドを表現している。このことは、ダルババンシンがトリペプチドおよびHSAの両者と、可変の見かけの化学量論で非競合的に結合することと一致する。要するに、本実施例から、HSAがダルババンシンのトリペプチドリガンドに対する、非競合的なメカニズムと一致する様式での結合親和性を低下させること、およびHSAに結合するダルババンシンが、親和性が低下したにもかかわらず、トリペプチドリガンドと結合するその能力を保持することが示される。これらの結果も、ダルババンシンが溶液中で単量体-多量体の平衡状態にあり、ペプチドリガンドに対する多量体の強い親和性を有し、大部分が多量体であるモデルと一致する。ダルババンシンの単量体、遊離のものおよび血清アルブミンに結合したものの両者、も低下した親和性でペプチドと結合し得る。実施例9A-40926およびダルババンシンの調製A-40926の調製A-40926、発酵によって生じる天然の糖ペプチド、をダルババンシンを生産するための出発物質とした。このものは、NonomuriaspATCC39727によって、A-40926とそのアセチル誘導体との混合物として生産された米国特許第4,935,238号およびBGolstainら、AntimicrobialAgentandChemotherapyDec1987p19611966を参照すること。最初にこのアセチル誘導体を脱アセチル化してA-40926とした。脱アセチル化後、下記のポリアミドでのカラムクロマトグラフィーによって、A-40926を精製した。次の記述は現在の生産方法の代表例である。ここで記録された量は、工業的な調製で通常作業する量の約1/4である。A-40926の脱アシル化総量が約1g/LのA-40926およびそのアセチル誘導体を含む10m3の発酵ブロス23°Cを、撹拌しながら30のNaOHでpH11.4に調整した。撹拌を6時間継続し、次いで、温度を15°Cに低下させ、そのブロスを精密ろ過にかけた0.12m2のセラミック膜、0.1μのKochProtosepIVMicrofilter。このプロセスの最後に20~25m3のろ液および4.5~5m3のろ過残渣出発時の値の半分を得るために、精密ろ過の間、絶えず水をろ過残渣に添加した。このろ液、このものはA-40926を含んでいた、をHPLCで分析した。脱アセチル化を終えた時、ろ過された溶液のpHを20°Cで保存した30の硫酸でpH7に調整した。本実施例において、6.62KgのA-40926268mg/Lを含む25m3のろ過されたブロスを得た。脱アセチル化の収率は66.2であった。このプロセスにおいて採用された時間および抽出量よりも長い時間および多量の抽出量で精密ろ過プロセスを実施すれば、収率は最大で90まで上昇することが可能である。ポリアミドカラムでのA-40926の精製抽出後、ろ過されたブロスに含まれるA-40926を、ポリアミドカラムで下記のようにして精製した。この記述に記録された量は、工業的な調製で通常作業する量の約1/10であり、現在の生産方法の代表例である。500LのMachereyNagelからのポリアミド樹脂SC6を脱塩水に懸濁させ、カラムに添加した。次いで、800Lの水に4Kgの炭酸ナトリウムを溶解させ、得られた溶液のpHを酢酸で調整して調製した少なくとも2BVベッドボリュームの緩衝溶液でカラムを溶出することによって、この樹脂をpH6~6.5の状態とした。ろ過されたA-40926のブロス9000L;分析値は0.275mg/L;A-40926は2475g;pHは6±0.2;温度は10±3°Cを、1リットルの樹脂あたり約5gの活性にて、このカラム内に添加した5~8g/Lという活性/樹脂の比率が通常用いられた。このカラムを次の溶液で洗浄した:3BV1500LのpH6の溶液を、1500Lの脱塩水に7.5Kgの炭酸ナトリウムを溶解させ、pHを酢酸で調整して調製した;4BV2000LのpH8の溶液を、2000Lの脱塩水に10Kgの炭酸ナトリウムを溶解させ、pHを酢酸で調整して調製した;1.5BV750LのpH9の溶液を、750Lの脱塩水に4Kgの炭酸ナトリウムを溶解させ、pHを酢酸で調整して調製した。2000Lの脱塩水に10Kgの炭酸ナトリウムを溶解させ、pHを酢酸で調整して調製した4BV2000LのpH10の緩衝溶液で溶出することによって、このカラムからA-40926を回収した。精製A-40926A-40926の濃度は0.5g/Lを超え、主成分B0B1のHPLCでの面積は80を超えているを含む画分を集め、1NのHClで中和してHPLCで分析した。約2000Lの最終の清澄な溶液を得た。精製のために用いた樹脂を、1.5BVのイソプロパノール/5のNaOHの1:1混合物で再生し、次いで5BVの脱塩水で洗浄した。A-40926の濃縮このカラムに由来する溶液を希釈/濃縮工程にかけることを数回繰り返して、溶液中の無機塩類のほとんどを除去した。この溶液を、カットオフが250Dの膜を用いるナノろ過によって80Lに濃縮し、80Lの脱塩水で希釈し、ナノろ過によって出発時の量の80Lに再濃縮した。この操作を少なくとも5回繰り返した。最終溶液80L、pH7.5のpHを23のHClでpH6.3に調整した。次いで、この溶液を80Lのアセトンで希釈し、そのpHを23のHClで再びpH2.6に調整した。脱色680gの木炭PA200C約0.3g/gA-40926を、撹拌下上記の工程において得られた溶液160Lに添加した。撹拌を室温で少なくとも30分間継続し、次いで、約0.5~0.6Kgのろ過助剤DIF-BOを添加した。この混合物を、フィルターカートリッジを通してろ過した。アセトンを10未満に減少させるために、得られた清澄な溶液を減圧下45°Cで濃縮した。最終量は約100Lであった。次いで、そのpHをNaOH水溶液で6.7に調整し、A-40926の濃度が100g/L程度になるまで、通常のナノフィルターを用いて濃縮工程を継続した。20Lの濃縮溶液を得たA-409261884g,94.2g/L。沈降および乾燥先の溶液を、撹拌下20Lのアセトンで希釈し、そのpHを10のHClで5.1に調整した。この溶液に、追加の5倍量のアセトン100Lを添加してA-40926の沈降を完結した。この時点での水の含量が15未満でなければ、追加のアセトンを添加した。2時間後、この懸濁液を遠心分離し、固形物を3×10Lの新たなアセトンで洗浄した。母液を分析し、生成物が無いことを確認した後で廃棄した。固体のA-40926をスタティックドライヤー内で減圧下、30~35°Cにて残りのアセトンが2未満に、および水が10未満になるまで乾燥させた。次いで、生成物を50メッシュの篩を通して篩い分けして、2.08Kgの精製A-40926HPLC分析では81.4;水は6.2;硫酸灰分は4.8を得た。カラムに添加した活性物から出発して、収率は68.4であった。ダルババンシンの合成ダルババンシンBI-397を、MalabarbaandDonadioDrugsoftheFuture24839846に記載されたような三工程の合成を経て天然の糖ペプチドA-40926から調製した。具体的に言えば、最初にA-40926をエステル化工程に付してMAを作製し、次いでこのものをアミド化工程に付してMA-A-1を作製した。次いで、最後の加水分解工程によってMA-A-1をダルババンシンに変換した。エステル化工程工程1次の記述は現在用いられている方法の代表例である。96のH2SO4/MeOH溶液Aの調製メカニカルスターラーおよび温度計を備えた15Lの丸底フラスコ内にて、2.28Lの96のH2SO41KgのA-40926粉末あたり約300mLの96のH2SO4を7.9LのMeOHに滴下した。外側で氷浴を用いて温度を0~5°Cの間に維持した。反応の手法出発物質A-409267.6kg;バッチ019、分析値は85.09;活性は6.46kg;3.73molを、140Lのガラスで裏打ちした反応容器内にてMeOH46Lに懸濁させ、得られた懸濁液を0°C±2°Cで冷却した。この温度で、懸濁液を、予め調製しておいた溶液AH2SO4/MeOHで処理した。得られた溶液を0°Cで22~26時間撹拌すると同時に、この反応1:1のアセトニトリル/水の混合物で100倍に希釈した反応のアリコートを二時間ごとのHPLC分析によってモニタリングした。A-40926の残りが5未満であり、ジエステルがHPLCでの面積として10以下となった時、このエステル化が完了したものとみなした。エステルMAの単離この反応が完結した時、この混合物を-5°C/-2°Cで冷却し、温度を5°C未満に維持しながら同量の冷水54Lで希釈した。10.2LのトリエチルアミンTEAをゆっくり添加して溶液のpHを5.5/-0.2に調整することによって、この生成物MAを沈降させた。撹拌を0~2°Cでさらに1時間継続した。次いで、得られた固形物を遠心分離にかけ、1KgのA-40926あたり10Lの水で洗浄し、最後に予め10~15°Cに冷却しておいたMeOH1Kgの出発時のA-40926あたり3LのMeOHで洗浄した。水での洗浄を主に行って、MAに由来する硫酸塩を除去した。母液および洗浄液を別々に分析し、1~2未満の活性しか含まれていない場合は廃棄した。残りの水が10未満となるまで、生成物を減圧50mmHg下35~40°C外部の温度で乾燥させた。7.6KgのMA5.63kgの活性、3.23molを茶色がかった粉末として得た。この分析から、次のHPLCでの面積の値が示された:MAは89.8、A-40926は3.2、ジエステル誘導体は5.9。HPLC分析では74.2であり、活性は5.637Kg;3.23mol;収率=86.5。さらなる精製を行わずに、この物質を次の工程に用いた。アミド化工程工程2次の記述は現在の生産方法の代表例である。DMSO/HCl混合物溶液Bの調製DMSO1.6Lをメカニカルスターラーおよび温度計を備えた10Lの丸底フラスコ内に入れ、氷浴で10°C未満に冷却した。次いで、この混合物の温度を25°C未満に維持しつつ、37のHCl1Lを撹拌下、ゆっくり添加した。アミド化の手法MA-A-1の生成出発物質のMAの5.95kg分析値は76.3、KFは8.9;2.68molを、19.2Lの1:1DMSO/MeOH混合物1KgのMA粉末あたり約1.6LのDMSOおよび約1.6LのMeOHに撹拌下室温にてゆっくりと溶解させた。1時間の撹拌後、709mLの3-ジメチルアミノ-プロピルアミンDMEPA、MW102.1;密度=0.812g/mL;5.63mol;出発時のMAの1molあたり1.96molおよび325gの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物HOBTH2O;MW153.1;2.04mol;出発時のMAの1molあたり0.71molを反応混合物に添加した。完全な溶液が得られるまで撹拌を継続し、次いで、この混合物を約2.0Lの溶液BDMSO/HClをゆっくり添加することによって、pH3~3.1に調整した反応のアリコートを10倍の水で希釈した後で測定した。4.1Lの1:1DMSO/MeOH混合物に1.03KgのジシクロヘキシルカルボジアミドDCC4.99mol;MW206.3;1molのMAあたり1.74molを溶解させて調製したDCC溶液を、撹拌した反応混合物に10分間以内に添加した。撹拌を5時間継続し、次いで、残りのMAを5未満に低下させてイソ尿素のレベルを4~5未満に維持するために、追加の51.5gの固体のDCC0.25molを反応混合物に添加した。イソ尿素は、ダルババンシンと過剰のDCCとのさらなる反応によって生じる副産物のグループの一つである。通常はさらに2時間合計7時間後に、この反応を完結させた。最後に、混合物を水60Lで希釈してDMSO濃度を15v/vに低下させ、1NのHCl0.85LでpHを2.3に調整して残りのDCCを分解させた。MA-A-1のダルババンシンへの加水分解30分後、この混合物を15のNaOH8LでpH12.0~12.1に調整した。15のNaOHを少量添加して混合物をこのpHに維持しながら、撹拌を4時間継続した。この後、残りのMA-A-1はHPLCでの面積として0.2未満となった。次いで、この混合物を1NのHCl19LでpH3.0の酸性にし、懸濁液をろ過して形成されたジシクロヘキシル尿素を除去した。固体のケーキをフィルター上で脱塩水2×20Lで洗浄した。洗浄液およびろ液を一つにまとめ、HPLCで分析する清澄な溶液を得た。21.74g/Lのダルババンシンを含む152.8Lの溶液すべての活性3322g;1.828mol、収率=68.2を得た。ダルババンシンの精製次の記述は現在の生産方法の代表例である。加水分解工程から得られ、3322gのダルババンシン活性を含む152.8Lの溶液を二部に分割し、それぞれのものを、400Lのポリアミドを含む同一のクロマトグラフ用カラムで別個に精製した。これらの二つの精製操作において、活性/樹脂の比率はそれぞれ4.3および4.0g/Lであった。ポリアミドカラムの作製400Lのポリアミド樹脂を含むガラスで裏打ちしたカラム内径=40cm、h=320cmを、樹脂の再生手法下記を参照することにしたがって洗浄し、4LのAcOHで酸性にした2BV800Lの脱塩水pH=3.2で調整した。第一部の精製76.4Lの出発溶液である第一部を、DMSOの含量を5v/v未満に低下させるためにH2O56Lで希釈し、1NのHCl3.4LでpH2.78の酸性にした。次いで、この溶液を150L/hの流速でカラム上に添加した。添加後、樹脂を次の溶液で洗浄した:AcOH8Lで酸性にした4BV1600LのH2O、pH=3.2;5BV2000Lの0.1MのAcONa、pH=8.2;AcOH1Lで酸性にした1BV400LのH2O、pH=3.2。ダルババンシンを、AcOH6Lで酸性にした4BV2400LのH2O/MeOH8:2、pH=3.4で溶出した。溶出工程の間、それぞれが50~60Lの22画分を集め、HPLCで分析した。9~25の画分ダルババンシンの濃度は0.5g/Lを超え、B0B1のHPLCでの面積は≧80であるをまとめて集め、1.56Kgのダルババンシンを含む969Lの溶液を得た収率=93.9。次いで、この溶液をナノろ過で濃縮し、1.38Kgのダルババンシンを含む125.7Lの溶液を得た。145gの不純なダルババンシン8.7を含む850Lのろ液を中和して廃棄した。樹脂の再生再利用する前に、樹脂を次の溶液で洗浄した:酢酸2.5mL/Lで酸性にした2.5BV1000Lの1:1MeOH/水;2.5BV1000Lの1:1の0.5のNaOH/イソプロパノール;10BV4000Lの脱塩水。次いで、この樹脂を、酢酸2.5mL/Lで酸性にした1BV800Lの水で再平衡化した。第二部の精製加水分解工程76.5Lに由来する第二部の出発溶液を、H2O56Lで希釈してDMSOの含量を5v/v未満に低下させ、3.0Lの1NのHClでpH2.87の酸性とした。次いで、この部分を、第一部の精製にて既述したようにして精製した。集めた画分量=972L、ダルババンシンは1.54Kg、収率=92.7をナノろ過によって濃縮し、1.46Kgの活性を有する133Lの溶液を得た。73gのダルババンシン4.3を含む850Lのろ液を廃棄した。二つの精製工程に由来する濃縮溶液を再び分析し、まとめて集めて2840gの精製ダルババンシンを含む258Lの溶液を得た。精製の収率は86であった。MAから出発した全収率は58.3であった。最終のポリアミドの再生第二の精製操作の後、ポリアミドを、AcOH2.5Lで酸性にした2.5BVの1:1のMeOH-水、pH=3.4;2.5BVの1:1の0.5のNaOH-イソプロパノール;10BVの脱塩水、を用いて再生した。ダルババンシンの脱色および沈降1molのダルババンシンあたり1.5molの1NのHCl、および1グラムのダルババンシンあたり0.3gの木炭CG10.85Kg、NORITよりを、上記で得られた258Lの溶液に添加した。この混合物を室温で少なくとも45分間撹拌した。このpHは3.1であった。次いで、この懸濁液をSEITZSCHENKからのSUPRADISCcartridgemodSDPEK1でろ過し、ケーキを50Lの8:2のH2O/MeOHで洗浄した。このろ液を分析し、カットオフが250DのMPS44膜を用いるナノろ過によって再び濃縮した。119g/LのダルババンシンpH4.1;MeOH1.9、GCを含む21.3Lの濃縮溶液を得た。最後に、909mLの1NHClを添加してpHを2.63に調整した。この値は、1.65mol塩酸/molダルババンシンの塩化割合salificationratioに相当する。この溶液22.2Lを撹拌下、200Lのアセトン中に注いだ。デカンテーション後に得られる固形物を遠心分離にかけ、14Lの新たなアセトンで洗浄した。次いで、この生成物を減圧下50mmHg、35°Cで乾燥させ、内部の温度が30°C未満で17時間維持した。乾燥プロセスの間、1Lの発熱物質を含まない水<250EU/mL、それぞれ0.5Lに二分割し、その他の方法では除くことが難しい残りのアセトンを除去するために、三時間および五時間後にこの固形物上に噴霧した。次いで、この生成物を篩い分け50メッシュして、2592gのダルババンシンHPLC分析では82.4;水KF14;Cl-3.0を得た。実施例10A-40926およびダルババンシンを調製するための別の方法下記の方法は、A-40926およびダルババンシンの調製プロセスに用いることができる代替法である。X4D-7HPでのA-40926の調製脱アセチル化および菌糸体での精密ろ過A-40926pH7を含む150Lの発酵ブロスを適切な反応容器内で室温24°Cにて撹拌し、2.5NのNaOH溶液2.5LでpH11.5に調整した。撹拌を4時間続けた後、このブロスを15のHClでpH10.6に調整し、0.2ミクロンの膜を通して精密ろ過にかけた。439Lの清澄なろ液を集め、次いでカットオフが250DのMPS44膜を用いるナノろ過で濃縮した。得られたA-40926濃縮溶液58.6L;3.89g/LをpH6.4に調整し、使用時まで4°Cで保存した。カラムの調製と精製XAD-7HP樹脂8Lを1:1の水/メタノール溶液に懸濁させ、ろ過し、ぜん動ポンプを用いて適切なガラス製のカラム内径12cmに充填した。次いで、この樹脂を水で洗浄し、1リットルの水につき5gの炭酸ナトリウムを溶解させ、そのpHを酢酸で調整して調製した6BVのpH6の緩衝化炭酸ナトリウム水溶液で平衡化した。194gのA-40926を含む濃縮ブロスの一部をXAD-7HPカラムに添加した。次いで、親水性の部分と存在する着色物質を除去するために、この樹脂を次の二種の緩衝溶液で、1/2BV/時間の流速にて洗浄した:30の水酸化ナトリウムでpH5に調整した3BV24Lの0.5酢酸水溶液;1Lの水あたり5mLの酢酸を含む5BV40Lの水/アセトンの8:2混合物。A-40926を、1Lの水あたり5mLの酢酸で酸性にした8BV64Lの1:1の水/アセトン混合物で最終的に溶出した。それぞれ4Lの16画分を集めた。A-40926の濃度が0.5g/Lより高い濃厚な画分5~15をまとめて集め、163.4gのA-4092643L,3.8g/Lを含む溶液を得た。このカラムの収率は81.3であった。0.23g/L45.3g;22.2の純度の低いA-40926を含むその他の画分200Lを廃棄した。溶出後、樹脂を、6BV55Lの0.5のNaOH/イソプロパノール1:1混合物を用いて再生し、最終的に、10BVの水で洗浄して中和した。木炭処理集めた画分を37のHCl70mLでpH2.5に調整し、次いで50gの木炭タイプPA2001gのA-40926あたり0.3gで脱色した。得られた懸濁液を室温で2時間撹拌し、次いでKS50フィルターd=25cm、時間=2.5時間を通してろ過し、45.6Lの淡い黄色のA-40926溶液3.5g/L;収率=96.4を得た。濃縮脱色した溶液を30のNaOH230mLでpH7に調整し、ナノろ過および限外ろ過によって濃縮した。これらの技術を用いることはRt=2~4分間でHPLCクロマトグラムに検出される親水性物質を除去するために重要であった。ろ過残渣を出発時の量4Lの1/10に濃縮した場合、同量の水を添加して、得られた溶液を再び濃縮した。残りのアセトンを0.25に減少させるために、この濃縮/希釈工程を三回繰り返した。最終溶液2.2L、146.3gのA-40926、66.5g/L、収率=91.5をHPLCで分析した。精製の収率は75.4であった。A-40926の結晶化A-40926溶液の一部の300mL19.9gのA-40926を、実験室の規模の限外ろ過装置を用いてさらに100mLに濃縮し、次いで60~65°Cに加熱した。この溶液のpHを30NaOHで7に調整し、1mLの濃縮溶液あたり1.2mLの5:1のアセトン/イソプロパノール混合物を、この温度で滴下した。得られた混合物を放置して20°Cに冷却した。1.5時間後、得られた固形物をろ過し、フィルター上でアセトンで洗浄し、40°Cで15時間かけて乾燥させた。20.6gの生成物HPLC分析では82.0;A-40926は16.9gを得た。精製の収率は84.9であった。ろ過されたブロスから出発する全体の収率は約64であった。CG-71でのA-40926の精製カラムの調製CG-71樹脂350mLをガラス製のカラム内径=4cm内に注ぎ、水で洗浄した。5gの炭酸ナトリウムを水で溶解させて酢酸でpH6として調製した3BVの炭酸ナトリウム溶液で、この樹脂を平衡化した。14.7gのA-40926を含む250mLの発酵ブロスpH7をこのカラム樹脂1Lあたり42gに添加した。この樹脂を次の三種の溶液で洗浄した:酢酸でpH6に調整した1050mL3BVの炭酸ナトリウム水溶液5g/L;酢酸でpH8に調整した1750mL5BVの炭酸ナトリウム水溶液5g/L;酢酸でpH9に調整した3150mL9BVの炭酸ナトリウム水溶液5g/L。次いで、10BVの脱塩水で活性部を溶出した。それぞれが500mLの20画分を集めた。画分12~15をまとめて集め、11.7gのA-40926収率=79.6を含む2.2Lの精製溶液を得た。次いで、この溶液を限外ろ過で濃縮し、さらにこの濃縮溶液を脱塩水で希釈して再び限外ろ過を行った。得られた溶液を減圧下でさらに50mLに濃縮した。A-40926の結晶化この濃縮溶液を60°Cで加熱し、撹拌下にて5:1のアセトン/IPA混合物60mLで処理した。次いで、この混合物を室温でゆっくりと冷却した。得られた固形物をろ過し、フィルター上でアセトンを用いて洗浄し、減圧下、35°Cで80時間かけて乾燥させた。8.9gの精製A-40926HPLC分析では84.2を得た。全体の収率は51であった。N-メチル-2-ピロリジンNMPを溶媒として用いる、ダルババンシン合成における代替的アミド化工程MA混合物を1:1のNMP/MeOH混合物64mLに撹拌しながら一部分ずつ添加した。撹拌を20~25°Cで完全な溶液となるまで継続し、次いでDMEPA2.42mL;1.96mol/eqMAおよびHOBT1.06g;0.71mol/eqMAを添加した。反応混合物水で1:10に希釈したサンプルを確認したのpHを、57.7mLのNMPで34.0mLの37のHClを溶解したものから予め調製しておいたNMP中の9.37mLの15HClで、3.0に調整した。次いで、DCC3.17g;1.57mol/eqMAの1:1のNMP/MeOH溶液12.7mLを撹拌下で添加した。この反応をHPLCでモニタリングした。約6時間後に、この反応が完結したMA-A-1は88.9、MAは7.3、ISOは3.7。この実験から、NMPは、アミド化反応のためのDMSOに代わる使いやすいものとなり得ることが示唆される。全体のプロセスは、この溶媒の変更に影響されなかった。そして得られた最終のダルババンシンは、その他のバッチと化学的に等価なものであった。ダルババンシン調製の代替法:ワンポット手法10gのA-40926複合体HPLC力価は80.66、4.6mmoleを100mLのガラス製反応容器内で、撹拌下、室温にて24mLのMeOHに懸濁させた。この混合物を0°Cに冷却し、16.4mLのMeOHに4gのHClgを含む溶液を添加して、生成物の可溶化を完結した。次いで、撹拌をさらに24時間継続しながら、温度そのまま20°Cに高めた。この後、40mLのDMSOおよび0.4gのHOBTを反応混合物に添加した。次いで、1,1-ジメチルアミン=プロピルアミンを添加し、得られた反応混合物の水でサンプルを9:1に希釈した後に測定したpHを3~3.1の間に調整した。次いで、1.8gの固体のDCCを添加し、撹拌をさらに15時間継続した。この後、反応混合物を1Lのガラス製反応容器内に移し、80mLの水で希釈した。次いで、240mLの15NaOHを添加してpHを12とした。撹拌をさらに60分間継続し、この混合物を260mLの15の塩酸水溶液でpH2.8の酸性にした。6.4gのダルババンシンを含む約800mLの最終の清澄な溶液を得た収率=76。HPLC分析から、得られた生成物の特性は、その他の製造プロセスで得られたものと同等であることが示された。明瞭な理解のために、前記の発明を図解および実施例によっていくらか詳細に記述したが、当業者にとって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変を実施し得ることは自明であろう。したがって、この記述は、添付の請求の範囲によって描写される、本発明の範囲を制限するものとみなすべきではない。本明細書に列挙した刊行物、特許および特許出願のすべては、すべての目的のために、および個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが引用によってそのように組み込まれ具体的にかつ個別に示されるのとまるで同じ程度に、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。"