"Fab第1鎖コード配列とFab第2鎖コード配列を含み、リボゾームを含む無細胞翻訳系に導入されたときに自身がコードするFabを解離させることなく発現し、該Fabとの複合体を維持しうるポリヌクレオチド構築物。リボゾーム結合配列、Fab第1鎖コード配列、リンカーペプチドコード配列、Fab第2鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含む請求項1に記載のポリヌクレオチド構築物であって、その3’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。リボゾーム結合配列、Fab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含む、Fab第1鎖発現シストロンおよびFab第2鎖発現シストロンを含む請求項1に記載のポリヌクレオチド構築物であって、Fab第1発現シストロンはその3’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab第2鎖発現シストロンはその3’末端に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有するポリヌクレオチド構築物。自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造は、リボゾームストール配列、ピューロマイシンもしくはその誘導体、またはDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、請求項2または3に記載のポリヌクレオチド構築物。自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、リボゾームストール配列である、請求項4に記載のポリヌクレオチド構築物。リボゾームストール配列がSecM配列、ジプロリン配列、またはこれらの両方である、請求項5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。リボゾームストール配列がSecM配列の2~4個の繰り返しである、請求項5または6に記載のポリヌクレオチド構築物。リボゾームストール配列の3’側に終止コドンが存在する、請求項4~7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、ピューロマイシンもしくはその誘導体である、請求項4に記載のポリヌクレオチド構築物。自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造が、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列である、請求項4に記載のポリヌクレオチド構築物。DNA結合蛋白質が、転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と、転写翻訳反応中に一度も解離することなく、同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合するシス型結合蛋白質である、請求項10に記載のポリヌクレオチド構築物。DNA結合蛋白質が大腸菌R1PlasmidにコードされるRepAであり、該DNA結合蛋白質の結合配列が同ポリヌクレオチド上でRepAコード配列の下流に存在するCISori配列である、請求項10に記載のポリヌクレオチド構築物。Fab第1鎖コード配列およびFab第2鎖コード配列がランダム配列を含むライブラリーである、請求項1~12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物。ランダム配列を含むライブラリーが、ナイーブライブラリーまたはフォーカスドライブラリーである、請求項13に記載のポリヌクレオチド構築物。ランダム配列を含むライブラリーが、Fab第1鎖および/またはFab第2鎖の相補性決定領域CDR内に1アミノ酸置換を含むライブラリーである、請求項13または14に記載のポリヌクレオチド構築物。i請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を無細胞翻訳系に導入してFabを合成し、合成されたFabをそれをコードするポリヌクレオチド上に提示する工程、iiポリヌクレオチド上に提示されたFabを抗原と接触させる工程、iii抗原と反応する目的Fabを選択する工程、およびiv目的Fabをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を含む、Fabのスクリーニング方法。IFab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列が、親抗体のFab第1鎖またはFab第2鎖のアミノ酸配列においてCDR内の1つの位置に対して1アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードする、請求項15に記載のポリヌクレオチド構築物を、Fab第1鎖およびFab第2鎖のCDR内の複数の位置に対して1アミノ酸置換が含まれるように複数種類用意する工程、II該複数種類のポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程i~ivを繰り返して高親和性Fabを複数スクリーニングする一次スクリーニング工程、III一次スクリーニング工程で選択された複数のFabにおけるFab第1鎖およびFab第2鎖のCDR内の各位置での1アミノ酸置換を解析する工程、IVFab第1鎖コード配列およびFab第2鎖コード配列が、親抗体のFab第1鎖およびFab第2鎖の配列においてCDR内の各位置に一次スクリーニングで同定された1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列をコードする、請求項15に記載のポリヌクレオチド構築物を用意する工程、V該ポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程i~ivを繰り返して高親和性Fabをスクリーニングする二次スクリーニング工程を含む、請求項16に記載のFabのスクリーニングを行う方法。インビトロ翻訳系が、独立に精製された因子からなる、請求項16または17に記載の方法。インビトロ翻訳系が、開始因子、伸長因子、アミノアシルtRNA合成酵素、およびメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼからなる群から選択される少なくとも1つの成分を含む、請求項18に記載の方法。インビトロ翻訳系が解離因子を含まない、請求項18または19に記載の方法。インビトロ翻訳系が、リボゾームを含む細胞抽出液である、請求項16または17に記載の方法。請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物をインビトロ翻訳系に導入してFabを生成させる工程を含む、Fabの製造方法。請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド構築物を含む、Fabを製造またはスクリーニングするためのキット。I標的物質結合蛋白質における標的物質結合部位を構成する全アミノ酸ポジションについて、1アミノ酸ポジションごとに天然アミノ酸全20種類にランダム化する1ポジションライブラリーを、アミノ酸ポジションの数だけ構築する工程、IIこれらの1ポジションライブラリーを全てあるいは適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する工程、III蛋白質ディスプレイ系を用いて1次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、IV1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程、V塩基配列情報から高頻度に観察される1アミノ酸置換を抽出する工程、VI高頻度に観察される1アミノ酸置換の組み合わせを含む2次ライブラリーを構築する工程、およびVII蛋白質ディスプレイ系を用いて2次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、を含む、標的物質結合蛋白質の標的物質親和性を最大化する方法。1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程が次世代シークエンサーを用いて行われる、請求項24に記載の方法。標的物質結合蛋白質が完全長抗体あるいは抗体断片であり、標的物質結合部位がCDR領域である、請求項24または25に記載の方法。蛋白質ディスプレイ系が、リボゾームディスプレイ、CISディスプレイ、mRNAディスプレイ、ファージディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、酵母細胞表面ディスプレイ、または高等真核生物の細胞表面ディスプレイである、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。<ポリヌクレオチド構築物>本発明のポリヌクレオチド構築物は、Fab第1鎖コード配列とFab第2鎖コード配列を含み、リボゾームを含む無細胞翻訳系に導入されたときに自身がコードするFabを解離させることなく発現し、該Fabとの複合体を維持しうるポリヌクレオチド構築物である。ここで、Fab第1鎖およびFab第2鎖とは、Fabを構成する2つの鎖を意味し、通常は一方がFabH鎖であり、他方がFabL鎖であるが、それぞれH鎖とL鎖のキメラ鎖であってもよい。なお、FabH鎖とはH鎖可変領域VHおよびH鎖定常領域1CH1を含む蛋白質を意味し、FabL鎖とはL鎖可変領域VLおよびL鎖定常領域CLを含む蛋白質を意味する。また、Fabとの複合体を維持するとは、Fabがポリヌクレオチド構築物とリンクした状態で発現され、その複合体が維持されることを意味する。なお、ポリヌクレオチド上にFabが提示されるともいう。ポリヌクレオチド構築物モノシストロニック本発明の第1の態様にかかるポリヌクレオチド構築物は、リボゾーム結合配列、Fab第1鎖コード配列、リンカーペプチド配列、Fab第2鎖コード配列、および足場コード配列をこの順にモノシストロニックに含む。そして、該ポリヌクレオチド構築物はコード領域シストロンの3’末端に、自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有する。リボゾーム結合配列とは翻訳を開始するためにリボゾームが結合する開始コドン上流の配列を意味するが、無細胞翻訳系として大腸菌由来のリボゾームを利用する場合には、リボゾーム結合配列としてShineDalgarnoSD配列を用いることが好ましい。SD配列としてはAGGAGGTが一般に知られているが、リボゾームが結合できる限り、改変した配列でもよい。なお、リボゾーム結合配列は宿主に応じて適宜選択することができ、SD配列には限定されない。Fab鎖コード配列は、Fab共通領域の配列が開示されておりvol286p676EllisonetalNucleicAcidsResvol10p4071HucketalNucleicAcidsResvol14p1779HieteretalJBiolChemvol257p1516およびMaxetalCellvol22p197、これらの配列に基づいてプライマーを設計し、FabH鎖コード配列とFabL鎖コード配列を増幅することにより取得することができる。抗体の可変領域および定常領域のクローニング用プライマーは公知であるMarksetalJMolBiolvol222p581WelschofetalJImmunolMethodsvol179p203CampbelletalMolImmunolvol29p193。また大量発現の際に利用を予定している宿主のコドンバイアスやRNAプロセッシングを考慮して、Fab鎖コード配列を人工合成することもできる。なお、特定のFabを発現させる場合は目的の鋳型から配列を増幅して用いればよい。また、目的抗原に対するFabをスクリーニングする場合はランダムなFab鎖コード配列を含むライブラリーを使用すればよい。目的抗原に結合するFabを新規に取得したい場合は、ナイーブライブラリーを使用することができる。また既に取得済みの特定のFabを何らかの目的で最適化したい場合は、フォーカスドライブラリーを使用することができる。ナイーブライブラリーは目的抗原に結合するFabを新規に取得するために、非常に広範な探索空間を提供することを目的とし、以下に例を示すように様々な形式のものを構築することができる。例えばB細胞から採取したmRNAを出発材料とした逆転写PCRでFabを構成するVH領域および/またはVL領域のcDNA断片を増幅して使用することで、天然B細胞が作り出す抗体多様性を利用した天然ナイーブライブラリーvol352p624628を構築できる。また、VH領域および/またはVL領域のうちフレームワーク部分を人工的に合成し、CDR領域に多様な天然のCDR配列を組み込むことで半合成ナイーブライブラリーvol18p852856を構築できる。あるいはFabのL鎖VLCLに天然配列、H鎖のCDR12に人工配列、CDR3に天然配列を組み込むことで半合成ナイーブライブラリーvol23p344348を構築することもできる。さらにCDRに多様性を与えつつコード配列の全領域を人工合成する完全人工ナイーブライブラリーvol296p5786を構築することもできる。CDR配列を人工合成する場合は、天然のCDR配列の解析結果に基づき、CDRの長さごとに、各アミノ酸ポジションに出現するアミノ酸の頻度を調整することもできる。フォーカスドライブラリーは既に取得済みの特定の親Fabの配列を基本とし、これと似て非なる変異体を主な成分として含む様々な形式のものを構築することができる。フォーカスドライブラリーは親Fabの抗原結合特性を維持しながら、親和性の向上、特異性の最適化、動物由来抗体のヒト化、不都合なアミノ酸あるいは配列の除去、安定性向上、物性改善、等の目的で最適化する場合に使用できる。例えばVH領域および/またはVL領域全体に、ランダムかつ散発的に1個~数個程度の1アミノ酸置換を導入するためにエラープローンPCRErrorPronePCRを用いることができるvol97p1070110705。エラープローンPCRは、基質である4種類のデオキシヌクレオチドの濃度や、添加する二価カチオンの種類や濃度を調節することによってエラーが起こり易くなる現象を利用している。人工的に設計した変異導入プライマーを用いて、Fabを構成する特定のアミノ酸だけを狙って、アミノ酸組成に考慮しながら1個~数個程度の1アミノ酸置換を導入することもできるvol102p84668471。また人工的に設計した変異導入プライマーを用いて、合計6個のCDRのうち、3~5個程度のCDR配列を維持したまま、1~3個程度のCDRの配列を、1アミノ酸単位ではなくCDR配列単位でランダム化することもできるvol108p31033111。またL鎖とH鎖のうち片方を固定し、多様な天然配列を利用して他方をランダム化することもできるvol88p1112011123。本発明のポリヌクレオチド構築物としては、Fab第1鎖および/またはFab第2鎖の相補性決定領域CDR内の1またはそれ以上のアミノ酸に1アミノ酸置換を含むライブラリーが好ましい。このようなライブラリーは1アミノ酸置換が導入されるように設計されたプライマーを用いたPCRなどによって作製することができる。このようなポリヌクレオチド構築物のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことにより、目的の抗原に対する抗体を得ることができる。Fab第1鎖コード配列とFab第2鎖コード配列をつなぐリンカーペプチドをコードする配列としては、15~120残基程度のアミノ酸からなる水溶性ポリペプチドをコードする配列であることが好ましく、ライブラリーのスクリーニング効率の観点から20~30のアミノ酸からなる水溶性ポリペプチドをコードする配列がより好ましい。例えば、水溶性を高めるためArgを導入したアミノ酸配列を例示することができるが、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーをコードする配列でもよい。前記リンカーペプチドをコードする配列はプロテアーゼ認識配列に挟まれていてもよく、それにより、前記ポリヌクレオチド構築物がアミノ酸配列に翻訳された後にプロテアーゼによってリンカーペプチドが切断され、天然型Fabが提示される。プロテアーゼ認識配列としては、エンテロキナーゼ認識配列であるDDDDK配列番号31、ファクターXa認識配列であるIEGR配列番号32などが例示される。Fab鎖コード配列の3’側に連結される足場コード配列としては、リボゾーム、DNAおよび/またはmRNA上でFabの第1鎖および第2鎖が翻訳されて正確に折り畳まれて複合体を形成し、抗原と反応しうるための足場としての十分な長さを持ったアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。足場コード配列は、少なくとも15アミノ酸をコードする配列であることが好ましく、15~120のアミノ酸をコードすることがより好ましい。コードされる足場配列は水溶性が高く、特殊な3次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。自身がコードするFab鎖との複合体を維持するために必要な構造としては、例えば、シストロンの3’末端に、リボゾームストール配列を有するこの場合はリボゾームディスプレイか、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を有するかこの場合はCISディスプレイ、または3’末端に付加されたピューロマイシンまたはその誘導体を有するこの場合はmRNAディスプレイことができ、それにより発現したFab鎖がポリヌクレオチドと複合体を形成し、第1及び第2のFab鎖コード配列の塩基配列とコードされるアミノ酸配列が物理的に対応付けられる。リボゾームディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物モノシストロニックリボゾームストール配列としては、大腸菌のSecMをコードする配列が例示される。SecM配列は、SecMstall配列とも呼ばれ、リボゾーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されている配列であるFXXXXWIXXXXGIRAGP:配列番号30。この配列を導入することで、mRNA、リボゾーム、融合蛋白質の複合体を効率よく維持できるNakatogawaetalMolCellvol22p545552ので、Fab鎖とそれをコードする塩基配列の対応付けができる。SecM配列は2個以上連結してもよく、2~4個が好ましく、2個がより好ましい。また、ジプロリンなどのポリプロリン配列もリボゾームストール配列として使用することができ、単独で用いてもよいし、SecM配列と組み合わせてもよい。リボゾームストール配列の3’側には終止コドンが読み枠を合わせて配置されることが好ましい。なお、リボゾームストール配列を採用する代わりに単に終止コドンを欠落させてリボゾームディスプレイを行うことも可能である。なお、Fab第1鎖コード配列、リンカーコード配列、Fab第2鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列は、読み枠を合わせて連結される。ここで、読み枠を合わせて連結されるとは、これらの各要素が融合蛋白質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、Fab第1鎖コード配列、リンカーコード配列、Fab第2鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列はそれぞれ直接連結されてもよいし、間や前後にタグ配列や任意のポリペプチド配列を介して連結されてもよい。本発明の第1の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、リボゾームディスプレイを利用する態様の一例を図1に示す。配列番号19に、プロモーター配列塩基番号9~31と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号81~87と、抗Her2FabL鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列GSリンカー、FLAGタグ、抗Her2FabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗Her2FabLH鎖発現シストロン塩基番号94~2220;アミノ酸配列は配列番号20を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。配列番号21に、プロモーター配列塩基番号9~31と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号81~87と、抗TNFαRFabL鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列GSリンカー、FLAGタグ、抗TNFαRFabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗TNFαRFabLH鎖発現シストロン塩基番号94~2226;アミノ酸配列は配列番号22を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことは言うまでもない。mRNAディスプレイ方法に供するポリヌクレオチド構築物モノシストロニックまた、リボゾームストール配列の代わりに、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用してFabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよいmRNAディスプレイ。すなわち、ポリヌクレオチド構築物の3’末端にスペーサーを介してピューロマイシンまたはその誘導体を結合させ、翻訳産物のC末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合することによりFabとポリヌクレオチドとの複合体が形成され、Fab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。ここで、ピューロマイシンまたはその誘導体としては、ピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。ポリヌクレオチド構築物の3’末端にピューロマイシンまたはその誘導体を結合させるために使用するスペーサーとしては、例えば、WO9816636号公報に記載されているポリエチレンまたはポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質などが用いられる。これらのうち、ポリエチレングリコールが好ましい。なお、mRNAディスプレイの別の態様として、ポリヌクレオチド構築物の3’末端側にストレプトアビジンコード配列を連結させ、さらに、3’末端にビオチンを結合させて、翻訳された蛋白質のストレプトアビジン部分がビオチンと結合することにより、Fabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよい。本発明の第1の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、mRNAディスプレイを利用する態様の一例を図2に示す。CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物モノシストロニックまた、リボゾームストール配列の代わりに、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を利用してFabとポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよいCISディスプレイ:WO200422746。具体的には、ポリヌクレオチド構築物の足場配列の下流にDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を連結させ、Fabと足場配列とDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質が3’側シストロン下流のDNA結合蛋白質結合配列に結合することによりFabとポリヌクレオチドとの複合体が形成されFab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。ここで、DNA結合蛋白質としては、DNA結合蛋白質が転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と転写翻訳反応中に一度も解離することなく同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合する、シス型の結合様式をもつRepA蛋白質が挙げられ、RepA結合配列としてはCIS配列とそれに続くori配列が挙げられるProcNatlAcadSciUSAvol101p280628102004および特表2005537795。シス型の結合様式をもつ他のDNA結合蛋白質として、大腸菌TiplasmidにコードされるRecC蛋白質vol81p15931606、φX174ファージのA蛋白質vol69p475479、λファージのQ蛋白質vol83p510等を、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。また、転写と翻訳がよく共役する無細胞翻訳系を用いる場合は、合成された蛋白質が転写終結部位の近傍でリリースされるため、エストロゲン受容体などの核内受容体のDNA結合ドメイン、TwoHybridSystemに使用されるLexAやGal4のDNA結合ドメインのように、一般的にトランス型の結合様式を持つDNA蛋白質と考えられているものを、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。本発明の第1の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、CISディスプレイを利用する態様の一例を図3に示す。配列番号70に、プロモーター配列塩基番号612~639と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号672~675と、抗Her2FabL鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列GSリンカー、FLAGタグ、抗Her2FabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびRepAコード配列を含む抗Her2FabLH鎖発現シストロン塩基番号689~3322;アミノ酸配列は配列番号71、CISori塩基番号3326~4100を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。配列番号72に、プロモーター配列塩基番号612~639と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号672~675と、抗TNFαRFabL鎖コード配列、FLAGタグ、リンカー配列GSリンカー、FLAGタグ、抗TNFαRFabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびRepAコード配列を含む抗TNFαRFabLH鎖発現シストロン塩基番号689~3328;アミノ酸配列は配列番号73、CISori塩基番号3332~4106を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことは言うまでもない。ポリヌクレオチド構築物バイシストロニック本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド構築物は、リボゾーム結合配列、Fab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列、および足場コード配列をこの順に含むFab第1鎖発現シストロンおよびFab第2鎖発現シストロンを含む。そして、Fab第1鎖発現シストロン5側のFab鎖発現シストロンはその3’末端にリボゾームストール配列を有し、Fab第2鎖発現シストロン3側のFab鎖発現シストロンはその3’末端側に自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造を有する。ここで、自身がコードするFabとの複合体を維持するために必要な構造としては、上記のようなリボゾームストール配列、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列、またはピューロマイシンもしくはその誘導体が例示される。すなわち、Fab第1鎖発現シストロンは、リボゾーム結合配列の3側にFab第1鎖コード配列および足場コード配列をこの順で含み、Fab第2鎖発現シストロンは、リボゾーム結合配列の3側にFab第2鎖コード配列および足場コード配列をこの順で含む。Fab第1鎖とFab第2鎖は、H鎖、L鎖の順でもよいし、L鎖、H鎖の順でもよいし、それぞれH鎖とL鎖のキメラ鎖であってもよい。なお、Fab第1鎖発現シストロンとFab第2鎖発現シストロンとの間の長さは、Fab第1鎖発現シストロンで翻訳が一旦終了し、リボゾームがストールされている状態で、Fab第2鎖発現シストロンのリボゾーム結合配列にリボゾームが結合できる程度の間隔があればよいが、好ましくは50~200bpである。リボゾーム結合配列、Fab鎖コード配列については上述したものを用いることができる。各Fab鎖コード配列の3’側に連結される足場コード配列としては、リボゾーム、DNAおよび/またはmRNA上でFabのH鎖およびL鎖が翻訳されて正確に折り畳まれて複合体を形成し、抗原と反応しうるための足場としての十分な長さを持ったアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。足場コード配列は、少なくとも15アミノ酸をコードする配列であることが好ましく、より好ましくは、15~120のアミノ酸をコードすることがより好ましい。コードされる足場配列は水溶性が高く、特殊な3次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるGSリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。リボゾームディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物バイシストロニック本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド構築物においては、リボゾーム上で、mRNAとポリペプチドFabの第1鎖または第2鎖の複合体を形成させるため、Fab第1鎖発現シストロンの3’末端に上述したようなリボゾームストール配列を配置する。なお、リボゾームストール配列の3’側には終止コドンが読み枠を合わせて配置されることが好ましい。リボゾームストール配列を採用する代わりに単に終止コドンを欠落させてリボゾームディスプレイを行うことも可能である。なお、Fab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列は、読み枠を合わせて連結される。ここで、読み枠を合わせて連結されるとは、これらの各要素が融合蛋白質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、Fab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列、足場コード配列およびリボゾームストール配列はそれぞれ直接連結されてもよいし、間や前後にタグ配列や任意のポリペプチド配列を介して連結されてもよい。本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第1鎖発現シストロンおよびFab第2鎖発現シストロンともにリボゾームディスプレイを利用する態様の一例を図4に示す。配列番号13に、プロモーター配列塩基番号9~31と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号81~87と、抗Her2FabL鎖コード配列、FLAGタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗Her2FabL鎖発現シストロン塩基番号94~1158;アミノ酸配列は配列番号14と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号1191~1197と、抗Her2FabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗Her2FabH鎖発現シストロン塩基番号1264~2364;アミノ酸配列は配列番号15を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。配列番号16に、プロモーター配列塩基番号9~31と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号81~87と、抗TNFα受容体TNFαRFabL鎖コード配列、FLAGタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗TNFαRFabL鎖発現シストロン塩基番号94~1158;アミノ酸配列は配列番号17と、リボゾーム結合配列SD配列;塩基番号1191~1197と、抗TNFαRFabH鎖コード配列、Hisタグ、足場配列GSリンカーおよびリボゾームストール配列secMジプロリンを含む抗TNFαRFabH鎖発現シストロン塩基番号1264~2370;アミノ酸配列は配列番号18を含むポリヌクレオチド構築物の塩基配列を示す。ただし、本発明のポリヌクレオチド構築物はこれらに限定されないことはいうまでもない。mRNAディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物バイシストロニックなお、Fab第2鎖発現シストロン3側のFab鎖発現シストロンについては、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用してFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよいmRNAディスプレイ。すなわち、3側のシストロンの末端、すなわち、ポリヌクレオチド構築物の3’末端にスペーサーを介してピューロマイシンまたはその誘導体を結合させ、3側のシストロンが翻訳されたときに、翻訳産物のC末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合することによりFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、Fab鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第1鎖発現シストロンがリボゾームディスプレイを利用し、Fab第2鎖発現シストロンがmRNAディスプレイを利用する態様の一例を図5に示す。CISディスプレイ法に供するポリヌクレオチド構築物バイシストロニックまた、Fab第2鎖発現シストロン3側のFab鎖発現シストロンについては、DNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を利用してFab鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、アミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の物理的対応付けをしてもよいCISディスプレイ:WO200422746。具体的には、Fab第2鎖発現シストロンの3末端側、すなわち、Fab第2鎖発現シストロンのFab第2鎖コード配列と足場配列の下流にDNA結合蛋白質コード配列と該DNA結合蛋白質の結合配列を連結させ、Fab第2鎖発現シストロンをFab第2鎖と足場配列とDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質がFab第2鎖発現シストロン下流のDNA結合蛋白質結合配列に結合することによりFab第2鎖とポリヌクレオチドの複合体を形成させ、Fab第2鎖のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列の対応付けが可能となる。ここで、DNA結合蛋白質としては、DNA結合蛋白質が転写翻訳時に鋳型となったDNA分子と転写翻訳反応中に一度も解離することなく同一DNA分子上に存在する該DNA結合蛋白質の結合配列と結合する、いわゆるシス型の結合様式をもつRepA蛋白質などが挙げられ、RepA結合配列としてはCIS配列とそれに続くori配列が挙げられるProcNatlAcadSciUSAvol101p280628102004および特表2005537795。シス型の結合様式をもつ他のDNA結合蛋白質として、大腸菌TiplasmidにコードされるRecC蛋白質vol81p15931606、φX174ファージのA蛋白質vol69p475479、λファージのQ蛋白質vol83p510等を、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。また、転写と翻訳がよく共役する無細胞翻訳系を用いる場合は、合成された蛋白質が転写終結部位の近傍でリリースされるため、エストロゲン受容体などの核内受容体のDNA結合ドメイン、TwoHybridSystemに使用されるLexAやGal4のDNA結合ドメインのように、一般的にトランス型の結合様式を持つDNA蛋白質と考えられているものを、該DNA結合蛋白質それぞれに対する結合配列と組み合わせて用いてもよい。本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド構築物において、Fab第1鎖発現シストロンがリボゾームディスプレイを利用し、Fab第2鎖発現シストロンがCISディスプレイを利用する態様の一例を図6に示す。なお、本発明のポリヌクレオチド構築物はmRNAでもよいし、mRNAを転写するDNAでもよい。ポリヌクレオチド構築物がmRNAの場合、Fabを発現させるとはmRNAからFab蛋白質への翻訳を意味し、ポリヌクレオチド構築物がDNAの場合、Fabを発現させるとはDNAからmRNAへの転写およびmRNAからFab蛋白質の翻訳を意味する。なお、ポリヌクレオチド構築物がDNAの場合は、mRNAを転写するためのRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列をさらに含むことが好ましい。プロモーターは、使用する発現系に応じて適宜、選択することができる。例えば、大腸菌細胞や大腸菌由来の無細胞翻訳系を用いる場合、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、あるいは大腸菌ゲノム中の内因性プロモーター等の大腸菌で機能するプロモーターが例示される。上記ポリヌクレオチド構築物は、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどに組み込まれてもよい。ベクターの種類は、用いる翻訳系やスクリーニング系にしたがって適宜選択することができる。上記ポリヌクレオチド構築物およびそれを含むベクターはMolecularCloningColdspringHarborLaboratoryPressColdspringHarbor2001などに記載されている公知の遺伝子学的手法によって作製することができる。なお、上記第1の態様及び第2の態様において、FabH鎖コード配列とFabL鎖コード配列はどちらが先に配置されてもよい。FabH鎖コード配列を先5’側に配置し、先にH鎖を翻訳させて近くで待たせておき、L鎖の翻訳が完了したら直ちにペアリングさせると、H鎖同士のペアリングよりも起こりやすいと言われているL鎖同士のペアリングのリスクを低減できるという利点がある。一方、FabL鎖コード配列を先5’側に配置し、先にL鎖を翻訳させ近くで待たせておき、H鎖の翻訳が完了したら直ちにペアリングさせると、一般的にL鎖よりも物性が悪くアグリゲーションするリスクが高いと言われているH鎖がアグリゲーションに進むリスクを低減できる。<Fabの製造方法>本発明のFabの製造方法は上記ポリヌクレオチド構築物をリボゾームを含む無細胞翻訳系に導入してFabを生成させる工程を含む。無細胞翻訳系としては大腸菌、酵母、哺乳動物細胞等の細胞から得られた無細胞翻訳系が例示されるが、大腸菌由来の無細胞翻訳系が好ましい。そして、無細胞翻訳系は、リボゾームを含む画分を細胞から抽出して得られる細胞抽出液でもよいし、個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系でもよい。細胞抽出液型の無細胞翻訳系は、一般的には細胞を破砕し、30000g程度の超遠心等で不要物を除いたS30と呼ばれる細胞抽出液に、適切な処理を加えて調製する。S30の出発材料としてこれまで様々な生物の細胞が試されてきたが、現在では、大腸菌vol7p267287、コムギ胚芽vol70p23302334、ウサギ網状赤血球vol67p247256の3種類が一般的に利用されている。また大腸菌を出発材料とする場合は、目的に応じて様々な変異株を用いてS30を調製することもできる。例えば、鋳型として用いる直鎖状の二本鎖DNAを反応液中で安定化させたい場合は、RecBCD複合体ExonucleaseVのサブユニットであるRecDの欠損変異株であるSL119株vol266p26322638を用いることができる。個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系としては、例えば、特開2003102495や特開2008271903に記載のPUREシステムを挙げることができる。この再構成型無細胞翻訳系は、細胞抽出液を使用する無細胞翻訳系よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるので、mRNAからポリペプチドへ翻訳する効率を高めることができる。上記CISディスプレイの場合は遺伝媒体として細胞抽出液中でも比較的安定な二本鎖DNAを用いるのでリボゾームを含む画分を細胞から抽出して得られる細胞抽出液を用いることも可能である。リボゾームディスプレイの場合は、細胞抽出液中に大量に存在するRNA分解酵素により遺伝媒体であるRNAが分解される危険性があるため、個別に精製された因子から構成された再構成型の無細胞翻訳系が好ましい。このようなPUREシステムを用いたリボゾームディスプレイはPUREribosomedisplayPRDと呼ばれている。各因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を挙げることができる。リボゾームとそれ以外の因子をそれぞれ精製し、再構成型の無細胞翻訳系を調製することがより好ましい。リボゾームは、リボゾームRNAと種々のリボゾーム蛋白質とで構成される巨大な複合体であり、大小2つのサブユニットからなる。リボゾームやそれを構成するサブユニットは、ショ糖密度勾配などによって相互に分離することができ、その大きさは、沈降係数によって表される。具体的には、原核生物においては、リボゾームとそれを構成するサブユニットは、それぞれ次のような大きさを有する。大腸菌などの原核生物は容易に大量培養することができるので、大腸菌などの原核生物は、リボゾームを大量に調製するうえで、好ましい生物である。リボゾーム70S=大サブユニット50S小サブユニット30S分子量:約25x106約16x106約09x106更に細かく見ると、50Sサブユニットと30Sサブユニットは、それぞれ次のような成分で構成されていることが明らかにされている。50Sサブユニット;L1~L34の34種類の蛋白質リボゾーム蛋白質23SRNA約3200ヌクレオチド5SRNA約120ヌクレオチド30Sサブユニット;S1~S21の21種類の蛋白質リボゾーム蛋白質16SRNA約1540ヌクレオチドつまり各サブユニットは、これらの成分からなる複合体として単離されうる。更にリボゾームは、各サブユニットの複合体として単離されうる。精製されたリボゾームとは、たとえば原核生物由来のリボゾームにおいては、大小のサブユニットからなる70Sリボゾームとして精製された複合体、または、それぞれ精製された50Sサブユニットと30Sサブユニットを混合してできた複合体を指す。一方、真核細胞においては、リボゾームとそれを構成するサブユニットは、それぞれ次のような大きさを有する。リボゾーム80S=大サブユニット60S小サブユニット40Sしたがって、無細胞翻訳系を真核細胞由来のリボゾームで構成する場合には、80Sリボゾームとして精製されたリボゾームを利用することができる。無細胞翻訳系に加えられるリボゾーム以外の因子としては、例えば、以下のような因子が挙げられる。これらの因子は、大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来のものも使用できる。なお、これらの因子および因子の精製方法は公知である特開2003102495。開始因子、伸長因子、アミノアシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼMTFなお、解離因子も含んでよいが、リボゾーム上で蛋白質とポリヌクレオチドの複合体を安定に維持するためには解離因子を含まないことが好ましい。開始因子とは、翻訳開始複合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進する因子であり、大腸菌由来のものとして、IF1、IF2及びIF3が知られているClaudioOetalBiochemistryvol29p58815889。開始因子IF3は、翻訳の開始に必要な段階である、70Sリボゾームの30Sサブユニットと50Sサブユニットへの解離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォルミルメチオニルtRNA以外のtRNAのP部位への挿入を阻害する。開始因子IF2は、フォルミルメチオニルtRNAと結合し、30SリボゾームサブユニットのP部位へフォルミルメチオニルtRNAを運び、翻訳開始複合体を形成する。開始因子IF1は開始因子IF2,IF3の機能を促進する。例えば、大腸菌由来の開始因子を使用した場合、例えば、001μM~300μM、好ましくは、004μM~60μMで使用できる。伸長因子としては、大腸菌由来のものとして、EFTu、EFTs及びEFGが知られている。伸長因子EFTuは、GTP型とGDP型の2種類があり、GTP型はアミノアシルtRNAと結合してこれをリボゾームのA部位へ運ぶ。EFTuがリボゾームから離れる際にGTPが加水分解され、GDP型へ転換する。PapeTetalEMBOJvol17p74907497。伸長因子EFTsは、EFTuGDP型に結合し、GTP型への転換を促進するHwangYWetalArchBiochemBiophysvol348p157162。伸長因子EFGは、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反応の後の転位translocation反応を促進するAgrawalRKetalNatStructBiolvol6p643647RodninaMWetalFEMSMicrobiologyReviewsvol23p317333。例えば、大腸菌由来の伸長因子を使用した場合、例えば、0005μM~200μM、好ましくは、002μM~50μMで使用できる。アミノアシルtRNA合成酵素aminoacyltRNAsynthetasesAARSは、ATPの存在下でアミノ酸とtRNAを共有結合させ、アミノアシルtRNAを合成する酵素であり、各アミノ酸に対応したアミノアシルtRNA合成酵素が存在しているFrancklynCetalRNAvol3p954960蛋白質核酸酵素vol39p12151225。例えば、大腸菌由来のアミノアシルtRNA合成酵素を使用した場合、例えば、001μgml~10000μgml、好ましくは、005μgml~5000μgmlで使用できる。メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼMTFは、原核生物における蛋白質合成においてメチオニル開始tRNAのアミノ基にフォルミル基がついたNフォルミルメチオニル開始tRNAを合成する酵素である。即ち、メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼは、FDのフォルミル基を、開始コドンに対応するメチオニル開始tRNAのアミノ基に転移させ、fMet開始tRNAにするRameshVetalProcNatlAcadSciUSAvol96p875880。付加されたフォルミル基は開始因子IF2により認識され、蛋白質合成の開始シグナルとして作用する。真核生物の細胞質における蛋白質合成系にはMTFが存在していないが、真核生物のミトコンドリア及び葉緑体における蛋白質合成系には存在する。MTFの好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるものである。大腸菌由来のMTFを使用した場合、例えば、100Uml~1000000Uml、好ましくは、500Uml~400000Umlで使用できる。ここで、1分間に1pmolのfMet開始tRNAを形成する活性を1Uとする。また、MTFの基質であるフォルミルドナーは、例えば、01μgml~1000μgml、好ましくは、1μgml~100μgmlで使用できる。更に反応液に添加されるポリヌクレオチドがDNAの場合には、mRNAに転写するためのRNAポリメラーゼを含むことができる。具体的には、次のようなRNAポリメラーゼを利用することができる。これらのRNAポリメラーゼは市販されている。T7RNAポリメラーゼT3RNAポリメラーゼSP6RNAポリメラーゼT7RNAポリメラーゼを使用した場合、例えば、001μgml~5000μgml、好ましくは、01μgml~1000μgmlで使用できる。またCISディスプレイにおいて再構築型の無細胞翻訳系を用いることで、FabとDNAの複合体形成の効率を追及する場合には、NucleicAcidResearch2010vol38No13e141に記載されているように、精製された大腸菌の内因性RNAポリメラーゼを添加することもできる。また、NucleicAcidResearch1988vol16No146493に記載されているように、精製された大腸菌の転写終結因子であるrho蛋白質を添加することもできる。無細胞翻訳系は、転写や翻訳のための因子に加え、更に付加的な成分を含むことができる。付加的な成分として、たとえば、次のような成分を示すことができる。反応系においてエネルギーを再生するための酵素:クレアチンキナーゼ;ミヨキナーゼ;およびヌクレオシドジフォスフェートキナーゼなど転写翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素:無機ピロフォスファターゼなど上記酵素は、例えば、001μgml~2000μgml、好ましくは、005μgml~500μgmlで使用できる。無細胞翻訳系は、アミノ酸、ヌクレオシド三リン酸、tRNA、塩類を含むことが好ましい。さらに、大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は、上記メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼおよび10フォルミル5678テトラヒドロ葉酸FDを含むことが好ましい。アミノ酸としては、天然型アミノ酸に加え、非天然型アミノ酸も用いることができる。これらのアミノ酸は、無細胞翻訳系を構成するアミノアシルtRNA合成酵素の作用によってtRNAに保持される。あるいは、予めアミノ酸をtRNAにチャージして無細胞翻訳系に加えることができる。ここで、tRNAへのアミノ酸のチャージとは、tRNAにアミノ酸を保持carryさせ、リボゾームにおける翻訳反応に利用される状態にすることをいう。非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシル合成酵素存在下で非天然アミノ酸を添加したり、非天然アミノ酸でチャージされたtRNAを用いたりすることで、蛋白質の特定のコドンの部位に非天然アミノ酸を導入することが可能となる。天然のアミノ酸を使用した場合、例えば、0001mM~10mM、好ましくは、001mM~2mMで使用できる。tRNAとしては、大腸菌、酵母等の細胞から精製したtRNAを用いることができる。またアンチコドンやその他の塩基を任意に変更した人工tRNAも用いることができるHohsakaTetalJAmChemSocvol121p3440HiraoIetalNatBiotechnolvol20p177182。例えば、CUAをアンチコドンとして持つtRNAに非天然のアミノ酸をチャージすることで、本来終止コドンであるUAGコドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能である。また,4塩基コドンをアンチコドンとして持つtRNAに非天然アミノ酸をチャージした人工アミノアシルtRNAを用いることにより、天然には存在しない4塩基コドンを非天然アミノ酸に翻訳することが可能であるHohsakaetalJAmChemSocvol121p1219412195。このような人工tRNAを作製する方法としては,RNAを用いる方法も使用できる特表2003514572。これらの方法により部位特異的に非天然アミノ酸を導入した蛋白質を合成することができる。大腸菌tRNA混合液を使用した場合、例えば、01A260ml~1000A260ml、好ましくは、1A260ml~500A260mlで使用できる。上記再構成型無細胞翻訳系は、各因子を転写や翻訳に好適なpH78を維持する緩衝液に加えることによって調製することができる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液pH73、HepesKOHpH76などを挙げることができる。HepesKOHpH76を使用した場合、例えば、01mM~200mM、好ましくは、1mM~100mMで使用できる。無細胞翻訳系は、因子の保護や活性の維持を目的として塩類を含むこともできる。具体的には、グルタミン酸カリウム、酢酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどがあげられる。これらの塩類は、通常、001mM~1000mM、好ましくは、01mM~200mMで使用される。無細胞翻訳系は、酵素の基質として、また、活性の向上、維持を目的として、その他の低分子化合物を含むことができる。具体的には、ヌクレオシド三リン酸ATPGTPCTPUTPなどなどの基質、プトレシンputrescine、スペルミジンspermidineなどのポリアミン類、ジチオトレイトールDTTなどの還元剤、およびクレアチンリン酸などのエネルギー再生のための基質などを無細胞翻訳系に加えることができる。これらの低分子化合物は、通常、001mM~1000mM、好ましくは、01mM~200mMで使用できる。無細胞翻訳系の具体的な組成は、ShimizuらShimizuetalNatBiotechnolvol19p751755、ShimizuetalMethodsvol36p299304、あるいはYingらYingetalBiochemBiophysResCommunvol320p13591364の記載を元に調製することができる。ただし、各因子の濃度は、精製した因子の比活性や目的などに応じて適宜増減できる。たとえば、エネルギー消費が大きくなる場合はATPを増やすことができる。また、翻訳されるmRNAのコドンの使用頻度に応じて、特定のtRNAを添加することも可能である。無細胞翻訳系は、高次構造を形成しにくい蛋白質の場合、分子シャペロンと呼ばれる一群の蛋白質を含むこともできる。具体的には、Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10、低分子量Hspおよび、それらのホモログ、さらに大腸菌のトリガーファクターなどを添加した無細胞翻訳系があげられる。分子シャペロンは、細胞内で蛋白質の高次構造形成を助け、蛋白質の凝集を防ぐことが知られている蛋白質であるBukauandHorwichCellvol92p351366、YoungetalNatRevMolCellBiolvol5p781。また、Fabを発現させる場合は、分子内でジスルフィド結合を形成するので、反応液の酸化還元電位が重要である。そのため、反応液から、還元剤であるDTTを除去したり、さらには、グルタチオンを添加した無細胞翻訳系を使用することもできる。さらには、ジスルフィド結合を促進したり、正しい結合に組み替える酵素を添加した無細胞翻訳系を使用することができる。具体的には、このような酵素としては、真核細胞のERに存在するプロテインジスルフィドイソメラーゼPDIや、大腸菌のDsbA、DsbC等があげられる。上記のような無細胞翻訳系にポリヌクレオチド構築物を導入し、翻訳反応を行うことにより、Fabを得ることができる。なお、得られたFabはアフィニティカラム等を用いて精製することもできる。<スクリーニング方法>本発明のスクリーニング方法は、iFabのライブラリーをコードするポリヌクレオチド構築物を無細胞翻訳系に導入してFabを合成し、合成されたFabをそれをコードするポリヌクレオチド上に提示する工程、iiポリヌクレオチド上に提示されたFabを抗原と接触させる工程、iii抗原と反応する目的Fabを選択する工程、およびiv目的Fabをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程を含む。上記のような無細胞翻訳系を使用し、与えられた遺伝情報に基づいてFabがリボゾーム及び/又はmRNA上に提示される。リボゾームディスプレイにおいては、Fabを含むポリペプチドは、3’末端のリボゾームストール配列の存在によりmRNA上にリボゾームがストールされて、それをコードする遺伝情報mRNAを伴ったまま維持される。すなわち、mRNA-リボゾーム-ポリペプチドの3つの要素の複合体が形成される。一方、ピューロマイシンまたはその誘導体を利用したmRNAディスプレイでは、ポリヌクレオチド構築物mRNAの3’末端のピューロマイシンまたはその誘導体の存在により、Fabを含むポリペプチドのC末端がピューロマイシンまたはその誘導体に共有結合し、Fabを含むポリペプチドとそれをコードするmRNAのリンクが維持される。またCISディスプレイではFabを含むポリペプチドをDNA結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、DNA結合蛋白質がDNA上の標的配列に結合することにより、Fabを含むポリペプチドとそれをコードするDNAのリンクが維持される。いずれの方法でも抗原に結合したFabを選択し、それに結合したmRNAを回収することによって、その遺伝情報も回収される。標的抗原と結合したFabとmRNAを含む複合体中のmRNAからcDNAを合成し、PCRにより増幅させた後、再び転写翻訳反応を行なう。これらの工程を繰り返すことにより目的抗原に対する抗体を得ることができる。以下、より具体的に説明する。Fab遺伝子ライブラリーの規模は、通常1×108以上、好ましくは1×109以上、より好ましくは1×1010以上、さらに好ましくは1×1012以上である。標的物質抗原に前記Fab遺伝子ライブラリーから発現したFabライブラリーを接触させ、Fabライブラリーから標的物質に結合するFabを選択し、それをコードするポリヌクレオチドを増幅する。標的物質に結合したFabを選択するには、標的物質と結合したFabを、標的物質と結合していない多数のFabの中からスクリーニングする必要がある。これはパニングとよばれる既知の方法に従って行うCoomberMethodMolBiolvol178p133145。パニングの基本的なプロトコルは以下のとおりである。1標的物質にFabライブラリーを接触させる。ビーズ、プレートやカラム等の担体に標的物質を結合させ、ここにFabとポリヌクレオチドの複合体を含む試料を接触させてもよい固相選択。また、標的物質をビオチン化し、これをFabと結合させ、標的物質とFabの複合体をストレプトアビジン磁気ビーズビーズで回収するような、液相での選択も可能である。また、固相選択と液相選択を組み合わせてもよい。スクリーニングを複数ラウンド行い、前半は固相選択、後半は液相選択を行うことで、高親和性抗体を効率よく選択することができる。2標的物質に結合しなかった、ライブラリーに含まれていたその他のFabを除去する。例えば、洗浄により除去することができる。洗浄は通常の抗原抗体反応の洗浄に使用される洗浄液を使用することができるが、後述するような親Fabより親和性の高いFabを得るためのスクリーニングを行う場合には、親Fabと抗原との結合が維持され、それより弱い結合が除かれるような条件で洗浄を行うことが好ましい。3除去されなかったFab、すなわち標的物質に特異的に結合していたFabを回収する。4必要に応じ1から3の操作を複数回繰り返す。リボゾームディスプレイやmRNAディスプレイ、CISディスプレイの場合、一連の工程を繰り返す場合には、1の工程の前に、回収されたポリペプチドポリヌクレオチドを含む複合体中のポリヌクレオチドを増幅する。例えば、mRNAはRTPCRによって増幅することができる。RTPCRによって、mRNAを鋳型としてDNAが合成される。DNAを再びmRNAに転写し、複合体の形成のために利用することができる。図7、8に、DNAからmRNAを転写し、翻訳してFabを生成させ、抗原と結合したFabを選択してmRNAそこからを回収して増幅するという一連の操作を示したFabのスクリーニング法の一例に関する模式図を示す。以上の操作により、目的抗原に特異的に結合するFabをコードするポリヌクレオチドが濃縮される。目的のFabのアミノ酸配列情報は、得られたポリヌクレオチドの配列を解析することにより同定することができる。また、目的の抗原に対する抗体が既に得られており、その抗体におけるCDRの配列が公知であるときは、本発明のスクリーニング法を利用して、親和性がさらに高まった抗体を得ることもできる。すなわち、本発明においては、IFab第1鎖コード配列またはFab第2鎖コード配列が、親抗体のFab第1鎖またはFab第2鎖のアミノ酸配列においてCDR内の1つの位置に対して1アミノ酸置換を含むアミノ酸配列をコードする、本発明のポリヌクレオチド構築物を、Fab第1鎖およびFab第2鎖のCDR内の複数の位置に対して1アミノ酸置換が含まれるように複数種類用意する工程、II該複数種類のポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程i~ivを繰り返して高親和性Fabを複数スクリーニングする一次スクリーニング工程、III一次スクリーニング工程で選択された複数のFabにおけるFab第1鎖およびFab第2鎖のCDR内の各位置での1アミノ酸置換を解析する工程、IVFab第1鎖コード配列およびFab第2鎖コード配列が、親抗体のFab第1鎖およびFab第2鎖の配列においてCDR内の各位置に一次スクリーニングで同定された1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列をコードする、本発明のポリヌクレオチド構築物を用意する工程、V該ポリヌクレオチド構築物を用いて前記工程i~ivを繰り返して高親和性Fabをスクリーニングする二次スクリーニング工程を含む、Fabのスクリーニングを行う方法が提供される。なお、工程Iにおける複数とは2以上であればよいが、好ましくはCDR内の全てのアミノ酸である。以下、Fabの親和性を高めるためのスクリーニング方法について具体的に説明する。ただし、本発明のスクリーニング方法はこの態様に限定されない。まず、目的の抗原に対する抗体親抗体のアミノ酸配列親配列を用意する。そして、図24のように、このアミノ酸配列において、H鎖のCDRのアミノ酸CDRH18個、CDRH211個、CDRH312個、合計31個のうちの1つにおいて1アミノ酸置換好ましくは親アミノ酸を含めた天然20アミノ酸全てが出現する1アミノ酸置換を有するようなH鎖コード配列と親抗体のL鎖コード配列を含む本発明のポリヌクレオチド構築物をH鎖のCDRのアミノ酸合計31個の数だけ用意するH鎖ライブラリー。また、親抗体のアミノ酸配列において、L鎖のCDRのアミノ酸CDRL17個、CDRL26個、CDRL36個、合計19個のうちの1つにおいて、1アミノ酸置換好ましくは親アミノ酸を含めた天然20アミノ酸全てが出現する1アミノ酸置換を有するようなL鎖コード配列と親抗体のH鎖コード配列を含むポリヌクレオチド構築物をL鎖のCDRのアミノ酸合計19個の数だけ用意するL鎖ライブラリー。上記H鎖ライブラリーとL鎖ライブラリーを一次ライブラリーとし、これを用いて工程i~ivを繰り返し、高親和性抗体のスクリーニングを行う1次スクリーニング。1次スクリーニングによって高親和性抗体をコードするポリヌクレオチド配列が濃縮されているので、濃縮された複数の配列を解析し、H鎖およびL鎖のCDRの各位置について高頻度に観察されるアミノ酸置換を、親和性向上のために好ましいアミノ酸置換として選択する。ポリヌクレオチドの配列解析は通常のシークエンシングによって行うことができるが、スクリーニングによって増幅されたFabコード配列をクローン化することなく、大量に網羅的に配列解析でき、スクリーニング時間が大幅に短縮できるという点で、次世代シークエンサーを用いることが好ましい。ここで、Sangerシークエンシング法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーに代表される第1世代シークエンサーと対比させて使われている次世代シークエンサーという用語は、実際には多様な機器や技術を含み、今後も様々な形態のものが考案されると考えられるMardisAnnuRevGenomHumanGenetvol9p387402およびPerssonetalChemSocRevvol39p985999。第1世代シークエンサーが一般にベクター宿主システムを用いてクローン化したDNAの配列決定に利用されるのに対し、次世代シークエンサーは多様な配列をもつDNAサンプルを解析対象としながらも、ベクター宿主システムを用いてDNAのクローン化をすることなく、サンプル中に存在するDNA配列を高速に解読できる。第1世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、プラスミド等のベクターへのDNA断片の組み込みと大腸菌等の宿主の形質転換、宿主コロニーの単離によるクローン化、解析規模に応じた数のクローンの培養およびプラスミドの抽出、プラスミド等を鋳型としたPCR等によるシークエンス反応、キャピラリー電気泳動等を用いたシークエンス反応産物の分離検出解析、という過程を経て個々のクローンのDNA配列を決定する。多数のクローンのDNA配列を一度に決定する場合は、クローン化以降の~の工程で、クローンごとに独立した反応処理が必要となり、解析クローン数の規模に比例した作業量が必要となる。一方、次世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、多様な配列を含むDNA断片を、EmulsionPCRやBridgePCRといった単分子PCR法等の増幅技術、あるいは1分子観察等の高感度検出技術、を応用することで解析用基板上に大規模数存在する個々の解析スポット上にクローン化して超並列的に配列解析する。このため、解析クローン数の規模に関わらず単一の反応処理で、例えば1つの解析用基板上に形成された106~109のクローンの配列を決定できる。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光発光など光検出により超並列的に塩基配列を決定する原理のものである。DNAポリメラーゼを用いる方法として、GSFLXRocheDiagnostics、Solexa等が、またDNAリガーゼを用いる方法としてSOLiDAppliedBiosystems、PolonatorDoverSystems等が知られている。また、DNA1分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、1塩基ごとの反応を蛍光発光などの光で検出することにより、1分子リアルタイム観察により塩基配列を決定するHeliScope、SMRT等が知られている。その他に、Postlightシークエンシングと称される蛍光発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する原理も報告されており、半導体チップを用いて、DNAポリメラーゼにより各塩基が取り込まれるときに放出される水素イオンを検出することで塩基配列を決定する、IonTorrentSystems等がこれに該当する。他にもNanoporeOxfordNanoporeTechnologies等が知られている。1次スクリーニングで得られたH鎖およびL鎖のCDRの各アミノ酸の1アミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を二次ライブラリーとする。例えば、1次スクリーニングにおいて、H鎖の1番目のCDRH1の一番目のアミノ酸はAlaまたはThrに置換されていることが好ましく、二番目のアミノ酸はIleまたはLeuに置換されていることが好ましいという結果が得られたら、二次スクリーニングに使用するライブラリーは一番目のアミノ酸がAlaまたはThrであり、二番目のアミノ酸がIleまたはLeuであり、その他のアミノ酸も1次スクリーニングで得られた好ましいアミノ酸の組み合わせになるよう塩基配列を設計して2次ライブラリーを作製する。なお、1次スクリーニングで得られた好ましい変異アミノ酸と親配列のアミノ酸の組み合わせを二次ライブラリーとしてもよい。このようにして得られた二次ライブラリーを用いて、工程i~ivを繰り返し、2次スクリーニングを行うことにより、親抗体よりも抗原に対する親和性が顕著に向上した抗体を多数取得することができる。親抗体よりも抗原に対する親和性が顕著に向上したことは、SPRやELISAなどによって解析することができる。なお、本発明のポリヌクレオチド構築物は、Fabを製造したり、スクリーニングしたりするためのキットの構成成分とすることができる。本発明のYmacs法における、1次ライブラリーによるポテンシャルな有用1アミノ酸置換の検索、2次ライブラリーによるこれら有用1アミノ酸置換の最適な組合せ検索、からなる2段階親和性成熟の原理は抗体のFab断片に限らず、scFvや完全長抗体、その他の標的結合性蛋白質における標的親和性の向上のために、幅広い蛋白質ディスプレイ系と組み合わせて応用できる。すなわち、本発明では、I標的物質結合蛋白質における標的物質結合部位を構成する全アミノ酸ポジションについて、1アミノ酸ポジションごとに天然アミノ酸全20種類にランダム化する1ポジションライブラリーを、アミノ酸ポジションの数だけ構築する工程、IIこれらの1ポジションライブラリーを全てあるいは適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する工程1次ライブラリーポリヌクレオチド構築物を用意する工程、III蛋白質ディスプレイ系を用いて1次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、IVIIIで得られた1次ライブラリー濃縮サンプルのポリヌクレオチド配列情報を決定する工程、V塩基配列情報から高頻度好ましくは2以上に観察される1アミノ酸置換を抽出する工程、VI高頻度に観察される1アミノ酸置換の組み合わせを含む2次ライブラリーを構築する工程2次ライブラリーポリヌクレオチド構築物を用意する工程、およびVII蛋白質ディスプレイ系を用いて2次ライブラリーを標的親和性で濃縮する工程、を含む、標的物質結合蛋白質の標的物質親和性を最大化する方法標的物質親和性が向上した変異型標的物質結合蛋白質を得る方法が提供される。なお、工程IIで適当な単位で統合して1次ライブラリーを構築する場合、工程Iで構築した1ポジションライブラリーを2群以上に分けて、1次ライブラリーを2種類以上使用してもよい。またVIで構築する2次ライブラリーには、高頻度に観察される1アミノ酸置換に加え、親抗体がコードしていた親アミノ酸を追加してもよい。ここで、標的物質結合蛋白質としては、抗原結合蛋白質やサイトカインなどが挙げられる。抗原結合蛋白質としては、Fab、scFv、完全長抗体などの抗体が挙げられるが、抗原に特異的に結合するものである限り、抗体に分類されない蛋白質であってもよい。また、サイトカインに変異を導入し、受容体に対する結合性を高めることもできる。蛋白質ディスプレイ系としては、蛋白質とそれをコードするポリヌクレオチドが対応付けられるものである限り特に制限されず、上述したようなリボゾームディスプレイ、mRNAディスプレイ、CISディスプレイなどの無細胞系のみならず、ファージディスプレイ非特許文献1やバクテリア表面ディスプレイvol69p607614、酵母表面ディスプレイvol21p16370、または高等真核生物の細胞表面ディスプレイ等、その他の蛋白質ディスプレイ系であってもよい。1ポジションライブラリーポリヌクレオチドの標的物質結合蛋白質コード領域以外の部分は、公知の各蛋白質ディスプレイ用のベクターに準じた構成とすることができる。ライブラリーポリヌクレオチドに含まれる標的物質結合蛋白質コード領域は、標的物質結合蛋白質の全長をコードしてもよいし、標的物質結合蛋白質のうち標的物質結合部位を含む一部をコードしてもよい。以下、一例を挙げてより具体的に説明する。例えば、標的物質結合蛋白質野生型において、標的物質結合部位が10アミノ酸からなる領域である場合、1~10のうちの1つのポジションに20アミノ酸が出現する1ポジションライブラリーを合計10種類用意する。この10種類の1ポジションライブラリーを合わせて1次ライブラリーとし、これを用いて、標的物質親和性で濃縮する。具体的には、下記の工程i~ivを繰り返して標的物質に高親和性の配列を濃縮する。iライブラリーを蛋白質ディスプレイ系に導入して標的物質結合蛋白質を発現させ、該標的物質結合蛋白質をコードするポリヌクレオチド上で提示させる工程、ii標的物質と標的物質結合蛋白質を接触させる工程、iii標的物質と反応する目的標的物質結合蛋白質を選択する工程、およびiv目的標的物質結合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅する工程、を繰り返す1次スクリーニング。これらの工程は、通常の蛋白質ディスプレイにおける操作と同様にして行うことができる。工程iiは、ビーズ、プレートやカラム等の担体に標的物質を結合させ、ここに標的物質結合蛋白質とポリヌクレオチドの複合体を含む試料を接触させてもよい固相選択。また、標的物質をビオチン化し、これを標的物質結合蛋白質と結合させ、標的物質と標的物質結合蛋白質の複合体をストレプトアビジン磁気ビーズビーズで回収するような、液相での選択も可能である。また、固相選択と液相選択を組み合わせてもよい。スクリーニングを複数ラウンド行い、前半は固相選択、後半は液相選択を行うことで、高親和性蛋白質を効率よく選択することができる。非特異的結合を除くため、iiとiiiの間に洗浄項操作を行うことが好ましい。洗浄は、野生型標的物質結合蛋白質と標的物質との結合が維持され、それより弱い結合が除かれるような条件で行うことが好ましい。1次スクリーニングによって標的物質高親和性蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列が濃縮されるので、濃縮された複数の標的物質結合部位の配列を解析し、H鎖およびL鎖のCDRの各位置について高頻度に観察されるアミノ酸置換を、親和性向上のために好ましいアミノ酸置換として選択する。ポリヌクレオチドの配列解析は通常のシークエンシングによって行ってもよいが、スクリーニングによって増幅された標的物質結合蛋白質コード配列をクローン化することなく、大量に網羅的に配列解析でき、スクリーニング時間が大幅に短縮できるという点で、次世代シークエンサーを用いることが好ましい。ここで、Sangerシークエンシング法を利用した蛍光キャピラリーシークエンサーに代表される第1世代シークエンサーと対比させて使われている次世代シークエンサーという用語は、実際には多様な機器や技術を含み、今後も様々な形態のものが考案されると考えられるMardisAnnuRevGenomHumanGenetvol9p387402およびPerssonetalChemSocRevvol39p985999。第1世代シークエンサーが一般にベクター宿主システムを用いてクローン化したDNAの配列決定に利用されるのに対し、次世代シークエンサーは、多様な配列をもつDNAサンプルを解析対象としながらも、ベクター宿主システムを用いてDNAのクローン化をすることなく、サンプル中に存在するDNA配列を高速に解読できる。第1世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、プラスミド等のベクターへのDNA断片の組み込みと大腸菌等の宿主の形質転換、宿主コロニーの単離によるクローン化、解析規模に応じた数のクローンの培養およびプラスミドの抽出、プラスミド等を鋳型としたPCR等によるシークエンス反応、キャピラリー電気泳動等を用いたシークエンス反応産物の分離検出解析、という過程を経て個々のクローンのDNA配列を決定する。多数のクローンのDNA配列を一度に決定する場合は、クローン化以降の~の工程で、クローンごとに独立した反応処理が必要となり、解析クローン数の規模に比例した作業量が必要となる。一方、次世代シークエンサーを用いたDNA配列決定では、多様な配列を含むDNA断片を、EmulsionPCRやBridgePCRといった単分子PCR法等の増幅技術、あるいは1分子観察等の高感度検出技術、を応用することで解析用基板上に大規模数存在する個々の解析スポット上にクローン化して超並列的に配列解析する。このため、解析クローン数の規模に関わらず単一の反応処理で、例えば1つの解析用基板上に形成された106~109のクローンの配列を決定できる。現時点で最も普及している次世代シークエンサーは、DNAポリメラーゼまたはDNAリガーゼによる逐次的DNA合成法を用いて、蛍光発光など光検出により超並列的に塩基配列を決定する原理のものである。DNAポリメラーゼを用いる方法として、GSFLXRocheDiagnostics、Solexa等が、またDNAリガーゼを用いる方法としてSOLiDAppliedBiosystems、PolonatorDoverSystems等が知られている。また、DNA1分子を鋳型としてDNAポリメラーゼによるDNA合成を行い、1塩基ごとの反応を蛍光発光などの光で検出することにより、1分子リアルタイム観察により塩基配列を決定するHeliScope、SMRT等が知られている。その他に、Postlightシークエンシングと称される蛍光発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する原理も報告されており、半導体チップを用いて、DNAポリメラーゼにより各塩基が取り込まれるときに放出される水素イオンを検出することで塩基配列を決定する、IonTorrentSystems等がこれに該当する。他にもNanoporeOxfordNanoporeTechnologies等が知られている。1次スクリーニングで得られた配列を次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析することで、各配列をクローニングベクターにクローン化して個々に発現させるすることなく2次スクリーニングに使用することができるので、スクリーニング時間を大幅に短縮できる利点がある。ただし、1次スクリーニングの効率を確かめるなどの目的で一部クローン化し、結合性を調べてもよい。次に、1次スクリーニングでの配列解析により得られた標的物質結合部位の各アミノ酸における1アミノ酸置換を組み合わせて二次ライブラリーとする。例えば、1次スクリーニングにおいて、標的物質結合部位の一番目のアミノ酸はAlaまたはThrに置換されていることが好ましく、二番目のアミノ酸はIleまたはLeuに置換されていることが好ましいという結果が得られたら、二次スクリーニングに使用するライブラリーは一番目のアミノ酸がAlaまたはThrであり、二番目のアミノ酸がIleまたはLeuであり、その他のアミノ酸も1次スクリーニングで得られた好ましいアミノ酸になるよう塩基配列を設計して2次ライブラリーを作製する。なお、1次スクリーニングで得られた好ましい変異アミノ酸と親配列のアミノ酸の組み合わせを二次ライブラリーとしてもよい。この二次ライブラリーを用いて、工程i~ivを繰り返し、2次スクリーニングを行うことにより、親蛋白質よりも標的物質に対する親和性が顕著に向上した蛋白質を多数取得することができる。親蛋白質よりも標的物質に対する親和性が顕著に向上したことは、SPRやELISAなどによって解析することができる。以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。実施例1モデルFabの調製:無細胞Fabディスプレイ系で用いるFabのフレームワークとして、ヒトにおける主要な抗体サブクラスのひとつであり、大腸菌での発現効率に優れKanappiketalJMolBiolvol296p5786、無細胞scFvディスプレイ系での実績が報告されたShibuietalApplMicrobiolBiotechnolvol84p725732、VLksubgroupIおよびVHsubgroupIIIの組合せを選択した。無細胞Fabディスプレイ系の動作確認に用いる上記フレームワークをもつモデルFabとして、Carterらが報告したヒトEGFR2Her2反応性のFabCarteretalProcNatlAcadSciUSAvol89p42854289を選択し、FabHHとした。もうひとつのモデルFabとしてFabHHのL鎖およびH鎖のCDR13領域を、渋井らの無細胞scFvディスプレイ系で見出されたTNFαR反応性scFvの配列ShibuietalBiotechnolLettvol31p11031110で置換し、FabTTとした。これら2種類のモデルFabのVLドメインおよびVHドメインをコードするcDNAを人工合成した。またCLドメイン、CH1ドメインをコードするcDNAをヒト癌細胞株のゲノムDNAを鋳型としたPCRで取得した。得られたcDNA断片を、大腸菌発現ベクターpTrc99Aに組み込み、モデルFabをBicistronicに分泌発現するベクターとして、pTrcFabHH、pTrcFabTTを構築した。また本来のL鎖とH鎖の組合せを意図的に変更してFabHTHer2反応性のL鎖とTNFαR反応性のH鎖の組合せおよびFabTHTNFαR反応性のL鎖とHer2反応性のH鎖の組合せとし、これらを発現するpTrcFabHTおよびpTrcFabTHを合わせて構築した。このとき、L鎖のC末端にmycタグを、H鎖のC末端に2連続FLAGタグおよびHisタグを付加した。pTrcFabベクター中のBicistronicにFabを発現するユニットの概略構造を図9に示す。pTrcFabHHの塩基配列を配列番号1に、コードされるアミノ酸配列を配列番号2,3に示す。pTrcFabTTの塩基配列を配列番号4に、コードされるアミノ酸配列を配列番号5,6に示す。pTrcFabHTの塩基配列を配列番号7に、コードされるアミノ酸配列を配列番号8,9に示す。pTrcFabTHの塩基配列を配列番号10に、コードされるアミノ酸配列を配列番号11,12に示す。pTrcFabベクターを保有する大腸菌DH5α株を100μgmlのアンピシリンを含むLB培地中で培養し、対数増殖期に終濃度01mMのIPTGを添加することで培養上清中にモデルFabを発現させた。IPTGを添加してから18時間培養した後に培養上清を回収し、この中に含まれるモデルFabをH鎖のC末端に付加したHisタグを利用してNiNTAアガロースビーズQIAGEN社に結合させた。ビーズを洗浄後、終濃度250mMのイミダゾールを含むPBSで溶出した。溶出画分をPBSで透析し高純度のモデルFabを調製した。モデルFabの濃度は280nmの吸光度から1OD1mgmlとして算出した。サンプルを520グラジエントゲルSDSPAGEで分離後、クマシーブルーで染色した。結果を図10に示す。調製したモデルFabの純度が十分であることがわかる。実施例2モデルFabの活性、特異性、L鎖H鎖相互依存性の評価:モデルFabの抗原蛋白質である、Her2およびTNFαRRDsystems社をPBSで1μgmlに希釈した。これをELISAプレートに添加し4°Cで一晩放置することでプレートに固定した。ウェルを洗浄後、モデルFabを添加し抗原に結合させた。ウェルを洗浄後、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体シグマ社を添加し、モデルFabに付加したFLAGタグに結合させた。ウェルを洗浄後、HRP用発色基質を添加した。適度な発色が得られたところで停止液を添加し、OD405nmにて吸光度を測定した。抗原蛋白質にHer2を用いて4種類のモデルFabを広い濃度域でタイトレーションした結果を図11に示す。FabHHがHer2に強く結合ED502nMすることがわかる。次に2種類の抗原蛋白質に4種類のモデルFabを高濃度HH、TT、HT、THの順に71、18、29、58μMで接触させた結果を図12に示す。FabHHがHer2には結合するがTNFαRには結合しないこと、またFabTTがTNFαRには結合するがHer2には結合しないことがわかる。さらにハイブリッドFabであるFabHTおよびFabTHがどちらの抗原にも結合しないことから、FabHHのHer2に対する結合およびFabTTのTNFαRに対する結合は、L鎖H鎖相互依存的であり、正しいL鎖とH鎖の組み合わせが抗原蛋白質との結合に必要であることがわかる。実施例3Bicistronic型FabPRD用のベクター構築:上記のFabHHと酷似したアミノ酸配列をもち、FellouseらFellouseetalJMolBiolvol373p924940により大腸菌での発現効率がさらに向上すると報告された配列をFabSSとした。この配列を無細胞ディスプレイ系で提示するために、大腸菌最適化コドンを用いてBicistronic型FabPRD用のDNA断片を人工合成した。これを汎用ファージミドベクターpBluescriptSKに組み込むことでpGAv2SSを構築した。次にpGAv2SSのL鎖CDR13領域およびH鎖CDR13領域を、pTrcFabHHの対応する領域と置換することでpGAv2HHを構築した。同様にpGAv2SSとpTrcFabTTを用いてpGAv2TTを構築した。次にpGAv2HHのL鎖下流のGSリンカー最下流部位にアミノ酸配列を変えずにXhoI認識部位を導入することでpGAv2HHxhoIを構築した。Bicistronic型FabPRD用のDNA断片の概略構造を図13に示す。実施例4Monocistronic型FabPRD用のベクター構築:Bicistronic型FabPRD用のpGAv2HHxhoIとpGAv2TTの中の、L鎖下流のリボゾームストール配列の先頭アミノ酸からH鎖の最初のメチオニンまでの領域を、FLAGタグをコードする配列に置換し、FLAGタグを介してL鎖下流GSリンカーのC末端をインフレームでH鎖と接続した構造をもつ、Monocistronic型FabPRD用のベクター、pGAv6HHxhoIとpGAv6TTを構築した。Monocistronic型FabPRD用のDNA断片の概略構造を図14に示す。実施例5鋳型DNAの調製:Bicistronic型FabPRD用にpGAv2HHxhoIおよびpGAv2TT、Monocistronic型FabPRD用にpGAv6HHxhoIおよびpGAv6TTを鋳型として、PCR反応によりinvitro転写用鋳型DNA断片を増幅した。PCR用酵素としてPrimeStarMaxタカラ社を使用し、プライマーとしてPURErt1FおよびPURE3Rの組合せ、またはSL1FおよびSL2Rの組合せを使用した。増幅したinvitro転写用鋳型DNA断片はフェノールクロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿で精製した。invitro転写用鋳型DNAの濃度は260nmの吸光度から1OD50μgmlとして算出した。4種類のベクターからSL1FおよびSL2Rのプライマーセットで増幅したinvitro転写用鋳型DNA断片の配列は以下のとおりである。Bicistronic型FabPRD用pGAv2HHxhoI配列番号13アミノ酸配列は配列番号14L,15HpGAv2TT配列番号16アミノ酸配列は配列番号17L,18HMonocistronic型FabPRD用pGAv6HHxhoI配列番号19アミノ酸配列は配列番号20pGAv6TT配列番号21アミノ酸配列は配列番号22なお、使用したプライマーの配列を以下に示す。PURErt1F:caatttcggtaatacgactcactatagggagaatttaggtgacactatagaagtg配列番号23PURE3R:caggtcagacgattggccttg配列番号24SL1F:caatttcggtaatacgactcactatagggagaccacaacggtttcccatttaggtgacactatagaagtg配列番号25SL2R:ccgcacaccagtaaggtgtgcggcaggtcagacgattggccttgatattcacaaacg配列番号26実施例6mRNA合成:mRNA合成は500ngの鋳型DNA断片と27μgの精製T7RNApolymeraseを用いて50μlスケールで実施した。37度60分の合成反応の後、RNasefreeDNasePromega社を1μl添加し、37度10分の反応で鋳型DNAを分解した。mRNAはフェノールクロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿で精製した後、30μlのNucleasefreewaterPromega社で溶解した。mRNAの濃度は260nmの吸光度から1OD40μgmlとして算出した。実施例7再構築型無細胞翻訳系PUREシステムによるmRNAの翻訳:PUREシステムを構成する翻訳因子群およびリボゾームは、清水ShimizuetalNatBiotechnolvol19p751755や大橋OhashietalBiochemBiophysResCommunvol352p270276らの報告に記載の方法で調製した。翻訳反応は2pmoleのmRNAと20pmoleのリボゾームを用いて20μlスケールとした。酸化還元条件に関しては、酸化型および還元型グルタチオン、蛋白質ジスルフィドイソメラーセを除き、1mMのDTTを添加し還元条件下での翻訳反応とした。37度20分の翻訳反応の後に終濃度25mMの酸化型グルタチオンを添加してDTTを中和した。実施例8抗原のビオチン化と品質確認:Her2およびTNFαRRDsystems社をPBSで各々05mgmlに溶解した。ビオチン化試薬としてSulfoNHSSSBiotinサーモサイエンティフィック社をPBSで06mgmlHer2用および40mgmlTNFαR用にて調製し、11μlHer2用および36μlTNFαR用を抗原溶液100μlに添加して室温で1時間反応させた。反応産物をゲル濾過スピンカラムに通して未反応のビオチン化試薬を除去した。アビジンカルビオケム社をPBSで2μgmlに希釈した。これをELISAプレートに添加し4°Cで一晩放置することでプレートに固定した。ウェルを洗浄後、ビオチン化抗原を添加しアビジンに結合させた。ウェルを洗浄後、実施例1で調製した高純度モデルFabを添加しビオチン化抗原に結合させた。ウェルを洗浄後、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体シグマ社を添加し、モデルFabに付加したFLAGタグに結合させた。ウェルを洗浄後、HRP用発色基質を添加した。適度な発色が得られたところで停止液を添加し、OD405nmにて吸光度を測定した。得られた結果を図15に示す。2種類のビオチン化抗原がアビジンと対応するモデルFabに同時反応性をもつことがわかる。実施例9PRDによるFabの選択FabPRD:大橋らが報告した方法OhashietalBiochemBiophysResCommunvol352p270276を参考に、PUREシステムによるribsomedisplay法PRDによるFabのinvitro選択を実施した。M280ストレプトアビジン磁気ビーズDYNAL社30μlを洗浄し、実施例8で調製したビオチン化抗原蛋白質を5pmole加えて室温で30分反応させ、磁気ビーズにベイト蛋白質を固定した。磁気ビーズを洗浄し選択用ビーズとした。同様の操作でベイト蛋白質を固定しないプレクリア用ビーズを調製した。鋳型DNAあるいはmRNAとしてFabTTの中に少量のFabHHxhoを任意の含有率で添加し、選択前サンプルとした。これを用いて実施例7に記載した方法でinvitro翻訳産物を調製した。これをプレクリア用ビーズと混合し、4°Cで30分反応させ上清を回収した。上清を選択用ビーズと混合し、4°Cで30分反応させ磁気ビーズを回収した。磁気ビーズを洗浄した後、溶出液を100μl加え、室温で10分反応させた。溶出液は50mMTrisClpH76、150mMNaCl、10μgml出芽酵母RNAをベースとし、還元溶出の場合は終濃度100mMのDTTを、キレート溶出の場合は終濃度50mMのEDTAを添加した。還元溶出はビオチンリンカー中のSS結合を還元切断することで、またキレート溶出はマグネシウムイオン依存的なディスプレイ分子複合体mRNAリボゾームポリペプチド三者複合体を解離させることで、Fabを介して磁気ビーズに結合したmRNAを溶出するものである。溶出サンプルからフェノールクロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿、あるいはRNaeasyRNA精製キットQIAGEN社でmRNAを精製した。逆転写酵素としてSuperScriptIIIInvitrogen社を用いた反応で溶出mRNAをcDNAに変換した。逆転写反応用プライマーとしてPURE2RまたはPURE3Rを用いた。PrimeStarMaxタカラ社を用いたPCR反応でcDNAを増幅後、フェノールクロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿で精製し、選択後DNAサンプルとした。mRNA全長配列を増幅するPCRプライマーとしてPURErt1FおよびPURE3Rの組合せ、またはSL1FおよびSL2Rの組合せを使用した。また、L鎖CDR3からH鎖CDR1までの部分断片を増幅するPCRプライマーとしてLCDRex1FおよびHCDRex2Rの組合せを使用した。使用したプライマーの配列を以下に示す。PURE2R:gacgattggccttgatattcacaaacg配列番号27LCDRex1F:attaaacgtaccgttgcagcaccgagc配列番号28HCDRex2R:tgagcctccaggctgaaccagaccac配列番号29実施例10FabPRDによる特異的濃縮の確認:選択前と選択後のDNAサンプルをXhoIで消化し、1アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイドで染色した。選択前のDNAサンプルはFabTTが主成分となるためXhoIでほとんど切断されないが、選択後のDNAサンプルはFabHHxhoの含有率が上がるため、XhoI感受性が増すと考えられる。このようにDNAサンプルのXhoI感受性の増加によりFabHHの濃縮を確認した。以下、Her2をベイト蛋白質としたシングルラウンドのBicistronic型あるいはMonocistronic型FabPRDでFabHHを選択した結果を示す。TTHH比10からBicistronic型FabPRDでFabHHを選択し、L鎖CDR3からH鎖CDR1までの部分断片を増幅して、XhoI感受性を評価した結果を図16に示す。選択前のDNAサンプルと比較し、ビオチン化Her2未処理の磁気ビーズで選択を実施した場合、またビオチン化Her2処理した磁気ビーズで選択を実施した場合でも、DTTやEDTAのような特異的溶出に必要な成分を含まない溶出液WBを用いた場合は、XhoI感受性の増加は認められなかった。一方で、ビオチン化Her2処理した磁気ビーズで選択を実施し、DTTやEDTAを含む溶出液を用いた場合はXhoI感受性の増加が認められた。これらの結果から、FabHHが特異的に濃縮されたことがわかる。同様に、TTHH比10および100のDNAサンプルからBicistronic型FabPRDでFabHHを選択し、DTTで溶出後mRNA全長配列を増幅して、XhoI感受性を評価した結果を図17に示す。TTHH比10および100のどちらの場合も、XhoI感受性の増加が認められ、FabHHが特異的に濃縮されたことがわかる。一方でTTHH比100~100000のDNAサンプルからMonocistronic型FabPRDでFabHHを選択した結果を図18に示す。TTHH比100~1000の場合はXhoI感受性の増加が認められ、FabHHが特異的に濃縮されたことがわかる。実施例11MonocistronicFabのinvitro翻訳産物の確認:実施例7に記載した方法でMonocistronic型FabPRD用のmRNAを用いて無細胞翻訳産物を調製した。翻訳産物を520グラジエントゲルSDSPAGEで分離後、PVDF膜に転写し、検出用抗体として1000倍希釈したHRP標識抗FLAG抗体シグマ社を用いてウエスタンブロッティングを実施した。結果を図19に示す。scFabTTの全長翻訳産物が確認できるが、全長翻訳産物の比率が陽性対照に使用したscFvTTの翻訳量に比べて極端に少ないことがわかる。実施例12SecMのコピー数と回収率の関係:pGAv6HHxhoIを鋳型としたPCRでリボゾームストール配列SecM配列を2コピーに増やしたDNA断片を合成し、v65断片とした。同様のPCRで、SecM配列を3コピーもつv65S3断片、SecM配列を4コピーもつv65S4断片を調製した。調製した鋳型DNA断片を用いて、Monocistronic型FabPRDによるFabHHの回収率を測定した。Monocistronic型FabPRDは実施例9に記載の固相選択にて実施し、回収した逆転写産物の定量は、濃度既知の鋳型DNA断片を検量線用サンプルとした定量PCRにて実施した。定量PCRに用いる検出用プライマーとして上流域プライマーと下流域プライマーの2種類を準備し、CDRL1付近の上流域とCDRH3付近の下流域における回収率1ststrandcDNAの分子数投入したRNAの分子数をそれぞれ求めた。結果を図20に示す。SecM配列を2コピーに増やすことでFabPRDによるFabHHの回収率が約10倍向上した。本実験ではSecM配列を3コピー以上に増やしても更なる回収率の向上は認められなかったが、翻訳反応時間を長くするなど実験条件を変更した場合は、SecMを3コピー以上にすることで回収率が更に上昇する可能性もあると考えられる。定量PCRで使用したプライマーを以下に示す。FabHH用上流域プライマーRT1F:gatattcagatgacccagagcccgagc配列番号33RT1R:cagcttcggggcttttcctgg配列番号34FabHH用下流域プライマーHH4F:ccagggaactttggttactgtttc配列番号35Model4R:ctttaaccagacaacccagtgc配列番号36FabPRDに使用した、v65、v65S3、v65S4、DNA断片のSecM領域以降の配列を、それぞれ配列番号37、40、44に示す。実施例13リンカー長と濃縮倍率の関係:Monocistronic型FabPRDで使用する鋳型DNAにはL鎖H鎖間とH鎖SecM間に計2つのリンカー配列が存在し、実施例12のv65断片ではL鎖H鎖間リンカー長が128アミノ酸、H鎖SecM間リンカー長が123アミノ酸となっている。Monocistronic型FabPRDの濃縮倍率に与えるリンカー長の影響を検討するために、FabHHxhoIとFabTTについてSecM配列を2コピーもつv65断片を基本構造とし、H鎖SecM間リンカー長を最小化したv7断片と、L鎖H鎖間リンカー長を最小化したv81断片を調製した。v7断片におけるH鎖SecM間リンカー長は、H鎖の最終アミノ酸のシステインからSecMの先頭アミノ酸のアラニンの間のアミノ酸数を20とした。v81断片におけるL鎖H鎖間リンカー長はL鎖のC末端のシステインからH鎖のN末端のグルタミン酸の間のアミノ酸数を30とした。それぞれの構造で鋳型DNAをTTHH比100で混合し、実施例9に記載の固相選択によるFabPRDでFabHHxhoIを選択した。得られた逆転写産物をサンプルとしてFabHHおよびFabTTの回収率をそれぞれ定量PCRで測定し、濃縮倍率FabHHの回収率FabTTの回収率を求めた。定量PCRに用いる検出用プライマーはCDRH3付近の下流域プライマーを使用した。結果を図21に示す。H鎖SecM間リンカーおよびL鎖H鎖間リンカーのいずれを最小化した場合でも、実用的な濃縮倍率が確認されたことから、リンカー長に関しては状況に応じて幅広い選択が可能と考えられる。定量PCRで使用したプライマーを以下に示す。FabHH用下流域プライマーHH4F:ccagggaactttggttactgtttc配列番号35Model4R:ctttaaccagacaacccagtgc配列番号36FabTT用下流域プライマーTT5F:gcaccctggttaccgtgag配列番号49Model4R:ctttaaccagacaacccagtgc配列番号36FabPRDに使用した、v7、v81、DNA断片のリンカー部分の配列をそれぞれ配列番号50、52に示す。実施例14Monocistronic型FabPRDにおける必要最低コピー数の検討:FabHHxhoIとFabTTのv7断片実施例13を鋳型DNAとして調製し、0125mgmlyeastRNAと7x109分子μlのFabHH鋳型DNAを含むキャリア溶液でFabTT鋳型DNAの10倍希釈系列を調製した。1x106FabTT分子の鋳型DNAμlから1x105FabTT分子の鋳型DNAμlのDNAサンプルをFabTT特異的プライマーを用いた1分子PCRで増幅し、PCR産物を520グラジエントPAGEで分離した。鋳型DNAとしてFabTT分子が1分子以上含まれるPCRからはFabTT特異的なバンドが検出され、FabTT分子が01分子以下のPCRからはFabTT特異的なバンドが検出されないことを確認した。1分子PCRによる品質確認済みFabTT鋳型DNAの希釈サンプルから400分子相当を分取し、1x1012分子のFabHH鋳型DNAに加えた。ここからRNAを合成し、選択前RNAとした。選択前RNAをFabPRDに投入し、400分子相当のFabTTの回収を試みた。翻訳反応は20μlスケールで30°C40分とし、反応後1μMのビオチン化TNFαRを含むWBTBRbuffer50mMTrisHClpH7690mMNaCl50mMMg25mgmlBSA125mgmlyeastRNA05Tween20004UμlRNaseInhibitorを等量混合し、4°Cで一晩静置した。これに25μl分のM280ストレプトアビジン磁気ビーズビーズペレットを添加しFabTTを回収した。M280ビーズからDTTで溶出したRNAを選択後RNAとした。FabPRDによる選択前と選択後のRNAを逆転写し、FabTT特異的なCDRH3付近のプライマーでFabTT断片図22のレーン1と2を、さらにFabHHとFabTT双方の共通DNA配列を認識するプライマーでCDRL1からCDRH3までの重要な遺伝情報を含むコア断片図22のレーン4と5を、それぞれRTPCRで増幅した。コアDNA断片のバンドを520グラジエントゲルから回収し2ndPCRで再増幅した図22のレーン7と8。2ndPCRで得たコアDNA断片を鋳型とし、FabTT特異的プライマーを用いたPCRでFabTT断片を増幅したところ、選択前サンプルのみならず、選択後サンプルからもFabTT断片が検出されたことから、400分子のFabTTからコア断片の回収に成功したと考えた。次にこの回収がFab-PRDによる特異的なものであることを確認するために、FabTTの濃縮倍率を定量PCRで測定した。FabTT断片とコア断片を独立して定量し、濃縮倍率選択後サンプル中FabTT相対量選択前サンプル中FabTT相対量を算出した結果、選択後コアDNA断片図22のレーン7では選択前コアDNA断片図22のレーン8に対しFabTTの含量が582倍上昇していた濃縮倍率582倍。これらの結果から、ライブラリー中に存在する標的結合クローンは少なくとも400分子以上あればFabPRDで特異的に回収できることが示唆された。この回収率はファージディスプレイ系に匹敵すると考えられる。使用したプライマーを以下に示す。FabTT特異的プライマーT1PF:gttttactattgaacgttatgcgatgggt配列番号54T1PR:cgtagtacataccgttcgggtagttag配列番号55FabHHとFabTTに共通のコア領域増幅用プライマーCore1F:gcgcaagcgttggtgatc配列番号56Core1R:gctcggacctttggtgcttg配列番号57実施例15Ymacs1次ライブラリーの構築親和性成熟の第一段階前半:FabPRDの応用例として、モデルFabの一つであるFabTTの親和性成熟を試みた。抗原抗体の結合界面は100個以上のファンデルワールス力、数個の水素結合や塩橋が存在する。これらの相互作用ネットワークの全体最適化を実現するために、第一段階で親和性向上に有用と思われるCDR中の変異を検索し、第二段階でこれらの変異の最適な組み合わせを検索する、Ymacsと呼ぶ本来的二段階戦略を採用した。第一段階前半の作業として、FabTTのCDRを構成する全50のアミノ酸の1つ1つを20種類のアミノ酸にランダム化しながら、50アミノ酸分のCDRポジションをマトリクススキャンするためのライブラリーYmacs1次ライブラリーを構築した。まずFabTTのCDRを構成する全50のアミノ酸を1つずつNNKコドンで置換するための1アミノ酸置換導入forwardプライマーを全50種類合成した。これら1アミノ酸置換導入forwardプライマーはNNKコドンの上流に15bp、下流に12bpのアニーリング領域をもつよう設計した。例として50箇所の1アミノ酸置換導入部位の最上流部位と最下流部位に対応するプライマーを以下に示す。FabTTYmacs1L11:tgtcgtgcaagccagNNKattaaaaattat配列番号58L鎖CDR1の1番目のアミノ酸に1アミノ酸置換を入れるためのプライマーFabTTYmacs1H312:atgtactacgttatgNNKtattggggtcag配列番号59H鎖CDR3の12番目のアミノ酸に1アミノ酸置換を入れるためのプライマーpGAv65FabTTを鋳型とし上記50種類の1アミノ酸置換導入forwardプライマーをPURE3Rプライマーと組み合せたPCRで50種類の変異導入下流DNA断片を独立して合成した。PCR産物を1アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。次に変異導入下流DNA断片のreverse鎖を上流方向に伸長させて全長化する反応で鋳型となる、共通の定常配列上流DNA断片をPCRで合成した。定常配列上流DNA断片は、自身のforward鎖が全長化するのを回避する目的で3末端側にミスアニール領域をもつよう、PURErt1FとH3checkRNotTA6をプライマーとしたPCRで合成し、PCR産物を1アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。PURErt1F:caatttcggtaatacgactcactatagggagaatttaggtgacactatagaagtg配列番号60H3checkRNotTA6:tatatatatatagcggccgcagaactgccggaaaggtatg配列番号611ポジション1アミノ酸置換ライブラリーの合成の概要を図23に示す。1アミノ酸置換導入部位が最上流と最下流の2つを例示した。定常配列上流DNA断片図中A、Bと変異導入下流DNA断片図中C、Dを混合し、PURErt1Fプライマー図中Eの存在下で非対称PCRを行った。これにより変異導入下流DNA断片のreverse鎖であるC鎖が上流方向に伸長して全長化され、全長化されたC鎖はPURErt1Fによって二本鎖化される。個々の変異導入下流DNA断片4μlを定常配列上流DNA断片06μlと混合し、50μlのスケールで非対称PCRを行い、50種類の1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーを合成した。得られたPCR産物を1アガロースゲルで分離後、エチジウムブロマイド染色でバンドを確認した。1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーをL鎖とH鎖にグループ化して等量混合し、L鎖Ymacs1次ライブラリー、H鎖Ymacs1次ライブラリーとした。図24に示すように、Ymacs1次ライブラリーはそれぞれL鎖は19種類、H鎖は31種類の1ポジション1アミノ酸置換ライブラリーから構成される。実施例16Ymacs1次ライブラリーの濃縮と次世代シークエンス解析親和性成熟の第一段階後半:第一段階後半の作業として、L鎖とH鎖のYmacs1次ライブラリーを独立してFabPRDで濃縮し、得られたDNAサンプルの次世代シークエンス解析結果から、CDR中の有用と思われる変異を同定した。FabPRDによるYmacs1次ライブラリーの濃縮は実施例9で示した固相選択と実施例14で示した液相選択を併用した。ラウンド1では固相選択を実施し、ラウンド2では固相選択後、長時間13hの洗浄を実施した。最終ラウンドのラウンド3ではベイト濃度1nMで液相選択を実施した。全ラウンド1x1012分子のRNAを20μlスケールで翻訳した。逆転写PCRでは実施例14で示したコアDNA断片を回収した。コアDNA断片に適当な上流断片、下流断片を加え、PURErt1FとPURE3RをプライマーとしたoverlappingextensionPCRで全長DNA断片を合成し、これを精製後に次のラウンドの鋳型DNAとして使用した。ラウンド3で得られたコアDNA断片のL鎖、H鎖それぞれのCDR13領域の塩基配列をRocheGSFLX次世代シークエンサーで解析し、L鎖ライブラリー由来サンプルからL鎖CDR13配列1812リード、H鎖ライブラリー由来サンプルからH鎖CDR13配列2288リードの塩基配列データを回収した。この中から、CDR13領域において連続したORFをもつ、L鎖468リード、H鎖1293リードを有効リードとして選抜し、CDRを構成するL鎖19アミノ酸、H鎖31アミノ酸、合計50アミノ酸分のCDRポジションにおける変異を集計した。各変異のカウント数を、20種類のアミノ酸を縦方向、合計50のCDRポジションを横方向に配したマトリクス表にまとめ図25に示した。各CDRポジションにおける親アミノ酸は除外し、カウント数が大きい変異をポテンシャルな有用変異とした。実施例17Ymacs2次ライブラリーの構築親和性成熟の第二段階前半:第二段階前半の作業として、実施例16で同定した有用変異を組み合わせることで、Ymacs2次ライブラリーを構築した。有用変異として計12のCDRポジションにおける計21の変異を採用し、各CDRポジションで親アミノ酸と有用変異アミノ酸をコードできる混合塩基コドンを決定した。混合塩基コドンによっては、親アミノ酸と有用変異アミノ酸以外の意図しないアミノ酸が入る。採用した有用変異と混合塩基コドンを図26にまとめた。Ymacs2次ライブラリーの理論多様性は核酸レベルで19x107、蛋白質レベルで49x106となる。12のCDRポジションは6つのCDR全てに分散したため、1つのCDRごとに計6つの変異導入forwardプライマーを合成した。これらを用いて図27に示す断片2から断片7の計6本の変異導入DNA断片を合成し、これに断片1を加えた計7本のDNA断片をoverlappingextension反応による連結で全長化し、PCR反応で増幅した。得られたPCR産物を精製後、設計通りの混合塩基で変異導入部位がランダム化されていることを確認し、Ymacs2次ライブラリーとした。以下に変異導入forwardプライマーを示した。FabTTYmacs2L1Fwd:tgtcgtgcaagccaggatattaaaaattatttgWCTtggtatcaacaacaa配列番号62L鎖CDR1FabTTYmacs2L2Fwd:gccccgaagccactgatttatGSTggttctaaccgccaatctggagttcct配列番号63L鎖CDR2FabTTYmacs2L3Fwd:acctattattgccaacaaactKMTRNMtaccctatcacctttggccag配列番号64L鎖CDR3FabTTYmacs2H1Fwd:agctgtgcagcaagcggttttASAattGRGcgttatgcgatgRSTtgggtgcgtcaggct配列番号65H鎖CDR1FabTTYmacs2H2Fwd:ggcctggaatgggttggtacgatttatcctKDSRSCgattatRBYgattatgccgatagc配列番号66H鎖CDR2FabTTYmacs2H3Fwd:tactactgcgctcgctctaactacccgaacggtMTGKRCtacgttatggaatat配列番号67H鎖CDR3実施例18Ymacs2次ライブラリーの濃縮とクローンの親和性解析親和性成熟の第二段階後半:第二段階後半の作業として、Ymacs2次ライブラリーをFabPRDで濃縮し、得られたDNAを大腸菌の分泌発現ベクターにクローン化した。ELISAおよびSPRProteOnXPR36、BioRad社で高親和性クローンを絞込み、FabTT変異体の代表2クローン図29~32中のYmacs10、19のKDをKinExAKinExA3200、Sapidyne社で測定した。FabPRDによるYmacs2次ライブラリーの濃縮は全5ラウンドを液相選択にて実施した。ラウンド1から5にかけてベイト濃度を、100nM、60nM、20nM、1nM、100pMまたは10pMと徐々に下げることで、選択圧を上げていった。ラウンド5で回収したコアDNA断片を、monocistronicなscFabHH発現ベクター中のFabHHのコア領域と置換する形でクローン化した図28。ランダムにピックアップした48クローンの培養上清を用いてTNFαRを抗原としたELISAを実施した。ELISAのヒット率が50程度であることを確認した後、残りの数百コロニーをポリクローナルな状態で一括して回収しプラスミドを精製した。このプラスミドがコードするscFabTT変異体のL鎖H鎖間のGSリンカーの領域を、Bicistronic発現用の非翻訳配列分泌シグナル断片で置換することで、発現様式をmonocistronic型からBicistronic型に変換した図28。この操作によりscFabではなく天然型FabとしてFabTT変異体を発現するベクターを構築し、再度クローン化した。ランダムにピックアップした96クローンの培養上清を用いてTNFαRを抗原としたELISAを実施し、ELISAのヒットクローンについてCDRの配列を決定した図29。ELISAヒットクローンについては結合時間1分、解離時間30分のSPRによるスクリーニングを実施し、Koffを指標に高親和性クローンを絞り込んだ図30。親FabのFabTTと、親和性向上変異体であるYmacs10について、SPRによる親和性測定を試みた結果、FabTTがKD728x109、Ymacs10がKD157x1011とそれぞれ算出され、約460倍の親和性向上が観察された図31。次に高度に親和性が向上しているYmacs10およびYmacs19の2クローンについてKinExAでの親和性測定を試みた結果、Ymacs10がKD187x1011、Ymacs19がKD345x1012とそれぞれ算出され、Ymacs19で約2100倍の親和性向上が観察された図32。KinExAによるYmacs19のKD測定実験は、35pMと350pMの2つのFab濃度で実施した。抗原であるTNFαRの濃度は35pMのFabに対し2nMから976fMまでの2倍希釈系列、また350pMのFabに対し5nMから244pMまでの2倍希釈系列とした。抗原抗体反応が平衡に達するまでサンプルを室温で48時間インキュベートし、TNFαR固相化アズラクトンビーズを用いたKinExAで平衡到達後のフリーのFabの存在率を定量した。フリーのFabの存在率縦軸を抗原濃度横軸に対してプロットし、Fabの濃度ごとに2本の用量反応曲線を描いた。これをKinExAProSoftwareでグローバルフィッティング処理しKDを算出した。実施例19CISディスプレイ法によるFabの選択FabCISOdegripらの報告OdegripetalProcNatlAcadSciUSAvol101p28062810を参考にCISディスプレイ法によるFabの選択を試みた。図8のように、v7断片中のscFabコード領域の上流および下流にそれぞれ、大腸菌RNAポリメラーゼ用プロモータ配列およびRepACISori配列をoverlappingextensionPCRで付加しv101断片とした。RepAコード配列はOdegripらが報告した配列とGenBankV00351の配列が異なっていたため、V00351の配列を採用した。FabHHxhoIとFabTTのv101断片をTTHH比10で混合したものをinvitro転写翻訳反応の鋳型DNAとした。精製済み鋳型DNA12μgを大腸菌由来S30ベースの転写翻訳系25μL、大腸菌SL119株由来、直鎖DNA用、L1030、Promega社に投入し、30°C40分でディスプレイ分子複合体を合成した。翻訳反応後はOdegripらの報告を参考に、実施例14と同様の液相選択でFabHHを回収し、溶出したDNAを鋳型とし、Cis1FとCis6RをプライマーとしたPCRで全長断片を増幅した。XhoI感受性を指標とした実施例10と同様の評価系で、CISディスプレイ法によるFabHH選択系の動作確認を実施した。結果を図33に示す。選択前のDNAサンプルと比較し、ビオチン化Her2を添加せずに選択を実施した場合はXhoI感受性の増加が認められなかった。一方で、ビオチン化Her2を添加して選択を実施した場合、XhoI感受性の増加が認められた。これらの結果から、FabHHが特異的に濃縮されたことがわかる。さらに、FabHHxhoIとFabTTのv101断片をTTHH比100で混合したものを用いて同様の実験を実施し最適な転写翻訳時間を検討した。結果を図34に示す。検討した全ての転写翻訳時間においてFabHHの特異的な濃縮は認められたが、転写翻訳時間10分では不十分であった濃縮倍率が転写翻訳時間20分~40分にかけて十分高まり、転写翻訳時間80分~120分にかけて次第に低下する傾向を示した。これらの結果から、転写翻訳時間として20分~40分が最適と考えられた。v101断片の全長増幅用プライマーの配列を以下に示す。Cis1Fcagttgatcggcgcgagatttaatcgccgc配列番号68Cis6Rcgtaagccggtactgattgatagatttcaccttacccatc配列番号69"