"本願明細書に記載された発明。本発明は、CUR813配列番号11よりもさらに強力なLNAオリゴヌクレオチドを開示した。また、本発明によると、特異的なLNAオリゴヌクレオチドはアポトーシスを誘導し、増殖を阻害する。さらに、マウスHIF-1aと100同一な配列を有するLNAオリゴヌクレオチドは、マウスにおいて肝臓、結腸、腎臓でHIF-1aの発現を下方調節する。発明の要旨本発明は、HIF-1aの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、二つ以上の特異的なモチーフがHIF-1aを標的としているLNAオリゴヌクレオチドに関する。これらのモチーフは、配列番号3と4として開示される。特に好ましいLNAオリゴヌクレオチドは、配列番号1と配列番号2である。本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、HIF-1αmRNAの発現とタンパク質レベルの強力な阻害剤である。より具体的には、本発明は5’-TxGxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3’配列番号3および5’-GxTxTxascstsgscscststscsTxTxA-3’配列番号4からなる群から選択される配列からなるLNAオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、大文字はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2-デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログまたは2-デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字sは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字xは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、T、またはGx、Aはそれぞれ任意のユニットを表し、また、ここで、配列は任意で2-デオキシヌクレオチド5ユニットまで延長される。本発明のLNAヌクレオチドを含む薬学的組成物も提供される。さらに提供されるのは、細胞または組織と一つ以上のLNAオリゴヌクレオチドまたは本発明の組成物との接触を包含する、細胞内または組織内のHIF-1aの発現調節の方法である。また、開示されるのは、医薬的または予防的な有効量の一つ以上のLNAオリゴヌクレオチドまたは発明の組成物の投与によるHIF-1aの発現と関連した疾患または状態の傾向を経験している、またはその傾向にあると疑われる動物またはヒトの治療方法である。さらに、HIF-1aの発現阻害のための、およびHIF-1aの活性と関連した疾患治療のためのLNAオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。例えば、本願発明は以下の項目を提供する。項目1LNAオリゴヌクレオチドであって、5’-TxGxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3’配列番号3および5’-GxTxTxascstsgscscststscsTxTxA-3’配列番号4からなる群から選択される配列からなり、ここで、大文字はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2-デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログまたは2-デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字sは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字xは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、任意のユニットを表し、ここで、該配列は、5個の2-デオキシヌクレオチドユニットまで必要に応じて延長される、LNAオリゴヌクレオチド。項目2前記括弧内のヌクレオチドユニットTxまたはGxがそれぞれ存在する、項目1に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目3前記下線のヌクレオチドユニットが、β-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示す、項目1および2のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目4前記LNAオリゴヌクレオチドが、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドユニットからなる、項目1~3のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目5前記LNAオリゴヌクレオチドが、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される16個のヌクレオチドユニットからなる、項目4に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目6前記配列が、3’末端において、1個の2-デオキシヌクレオチドユニットにより延長されている、項目1~5のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目7前記配列における全てのヌクレオチドユニットが、ホスホロチオエート基によって結合されている、項目1~6のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチド。項目8項目1に記載のLNAオリゴヌクレオチドであって、5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’配列番号15’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsT-3’配列番号15、および5’-GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3’配列番号16からなる群から選択される、LNAオリゴヌクレオチド。項目9項目8に記載のLNAオリゴヌクレオチドであって、5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’配列番号1である、LNAオリゴヌクレオチド。項目10項目1に記載のLNAオリゴヌクレオチドであって、5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3’配列番号25’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA-3’配列番号17、および5’-TsTsascstsgscscststscsTsTsa-3’配列番号18からなる群から選択される、LNAオリゴヌクレオチド。項目11項目10に記載のLNAオリゴヌクレオチドであって、5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3’配列番号2である、LNAオリゴヌクレオチド。項目12結合体であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチド、および該LNAオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む、結合体。項目13項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体と、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはアジュバントとを含む、薬学的組成物。項目14水性キャリアを含む、項目13に記載の薬学的組成物であって、該キャリアが、pHを4.0~8.5の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ20~2000mMのイオン強度を有する、薬学的組成物。項目15眼内投与に適合した、項目13~14のいずれか一項に記載の薬学的組成物。項目16少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む、項目13~15のいずれか一項に記載の薬学的組成物。項目17医薬として使用するための、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体。項目18癌の処置のための医薬の製造のための、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体の使用。項目19前記癌が固形腫瘍の形態にある、項目18に記載の使用。項目20前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目18に記載の使用。項目21癌を処置するための方法であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。項目22前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目21に記載の方法。項目23アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための医薬の製造のための、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体の使用。項目24前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチからなる群から選択される、項目23に記載の使用。項目25アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。項目26前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される、項目25に記載の方法。項目27異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患っているかまたは該疾患に罹患しやすい哺乳動物を処置するための方法であって、治療有効量の項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。項目28新脈管形成を阻害する方法であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。項目29細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。項目30細胞増殖を予防する方法であって、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。項目31新脈管形成疾患の処置方法であって、新脈管形成疾患に関連した新脈管形成が阻害されるように、項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体または項目13~16のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。項目32前記新脈管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症および炎症性疾患からなる群から選択される、項目31に記載の方法。項目33前記新脈管形成疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される炎症性疾患である、項目32に記載の方法。項目34前記新脈管形成疾患が、黄斑変性症および糖尿病性網膜症である、項目32に記載の方法。項目35キットであって、a固形形態の項目1~11のいずれか一項に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは項目12に記載の結合体を含む第一の構成要素、およびb該LNAオリゴヌクレオチドの再構成に適した食塩水または緩衝液を含む第二の構成要素を備える、キット。発明の説明本発明は、特定のLNAオリゴヌクレオチド、すなわち、HIF-1aをコードする核酸分子の機能調節に用いる配列番号3と配列番号4の配列を含むLNAオリゴヌクレオチドを採用する。その調節は、最終的にHIF-1a産物の量の変化である。ある実施形態では、HIF-1aをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスLNAオリゴヌクレオチドを提供することでこれは達成される。調節は、好ましくは生成される機能的なHIF-1aタンパク質の数の減少を引き起こすHIF-1aの発現阻害である。LNAオリゴヌクレオチドより具体的には、本発明は5’-TxGxGxCsasasgscsastscscsTxGxT-3’配列番号3および5’-GxTxTxascstsgscscststscsTxTxA-3’配列番号4からなる群から選択される配列からなるLNAオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、大文字はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示し、小文字は2-デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログまたは2-デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字sは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字xは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、T、またはGx、Aはそれぞれ任意のユニットを表し、また、ここで、配列は任意で2-デオキシヌクレオチド5ユニットまで延長される。本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチド、発明によるLNAオリゴヌクレオチドなどの語は、以下に規定される実施形態、変形、塩、プロドラッグなどに加えて前述に記載のLNAオリゴヌクレオチドを意味する。配列番号3と配列番号4に基づく前述に記載のLNAオリゴヌクレオチドは、13~20ヌクレオチドユニットの長さを有する。最低配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、TまたはGx、Aがそれぞれ欠けている場合に13ヌクレオチドであり、最大配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、TまたはGx、Aがそれぞれ存在し、かつ配列番号3または配列番号4が2-デオキシヌクレオチド5ユニットまで延長される場合に20ヌクレオチドである。ある実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、TまたはGx、Aがそれぞれ欠けており、また現在のところより望ましい別の実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、Tx、TまたはGx、Aがそれぞれ存在している。また興味深いのは、5’末端の任意のユニット、TxまたはGxがそれぞれ存在し、かつ3’末端の任意のユニット、TまたはAがそれぞれ欠けている実施形態であり、また5’末端の任意のユニットTxまたはGxがそれぞれ欠けており、かつ3’末端の任意のユニット、TまたはAがそれぞれ存在している実施形態である。上記の配列番号3と配列番号4における、下線のヌクレオチドユニットでのβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログまたは2-デオキシヌクレオチドの選択は、比較的重要でないようである。しかし、ある実施形態では、両方の下線のヌクレオチドユニットが2-デオキシヌクレオチドを示す。現在のところより望ましい別の実施形態では、一つまたは両方の下線のヌクレオチドユニットがβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示す。ある改変例では、括弧内の5’末端のヌクレオチドユニット、TxまたはGxがそれぞれ欠けており、かつ3’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、TまたはAがそれぞれ2-デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示す。別の改変例では、括弧内の5’末端のヌクレオチドユニット、TxまたはGxがそれぞれ2-デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを指定し、かつ3’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、TまたはAがそれぞれ欠けている。別の改変例では、括弧内のヌクレオチドユニットが存在し、また下線のヌクレオチドユニットの一つあるいは両方がβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示す。即ち、i5’末端の下線のヌクレオチドがβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを指定し、かつ3’末端の下線のヌクレオチドが2-デオキシヌクレオチドを示す、または、ii3’末端の下線のヌクレオチドがβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを指定し、かつ5’末端の下線のヌクレオチドユニットが2-デオキシヌクレオチドを示す、または、iii5’末端だけでなく3’末端の下線のヌクレオチドがβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログを示す。さらなる改変例では、括弧内のヌクレオチドユニット、TxまたはGxがそれぞれ存在し、また下線のヌクレオチドユニットの両方が2-デオキシヌクレオチドを示す。配列番号3と配列番号4と呼ばれる配列また、より具体的には、配列番号1と配列番号2と呼ばれる配列さらには下記参照は、定義されたLNAオリゴヌクレオチドの全ての機能性を実質的に表すと考えられているが、配列番号3と配列番号4の2-デオキシヌクレオチド5ユニットまでの延長は、たとえば1ユニット、2ユニット、3ユニット、4ユニット、または5ユニットでさえ、基本配列である配列番号3と配列番号4の有益な特性に対する有害な作用がない可能性があると考えられている。配列が3’末端、5’末端、または5’末端だけでなく3’末端で延長することができる当該存在は、総計5以下の2-デオキシヌクレオチドユニットをもたらした。従って、前述と組合せ可能なある実施形態ではLNAオリゴヌクレオチドは、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される16個のヌクレオチドユニットからなるLNAオリゴヌクレオチドである。前述と組合せ可能な別の実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される13、14、15または16個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、2-デオキシヌクレオチドおよびβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログから選択される14または15個のヌクレオチドユニットからなるLNAオリゴヌクレオチドである。少なくともLNAオリゴヌクレオチド調製の利便性のために、3’末端の2-デオキシヌクレオチド1ユニットでの配列延長がしばしば行われる参考:例えば、下記の配列番号1と配列番号2。最も好ましくは、配列番号3が3’末端のアデノシン2-デオキシヌクレオチドユニットで延長され、配列番号4が3’末端のシトシン2-デオキシヌクレオチドユニットで延長される。上述の、下付き文字sは隣接するヌクレオチドとLNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合-O-PO,S-O-を示し、下付き文字xは隣接するヌクレオチド/LNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合-O-PO,S-O-またはホスホロジエステル結合-O-PO2-O-のいずれかを指す。結果的に配列を延長する任意の2-デオキシヌクレオチドがホスホロチオエート結合-O-PO,S-O-またはホスホロジエステル結合-O-PO2-O-のいずれかで結合され得る。配列番号3のcsasasgscsastscscsTのサブシークエンスと配列番号4のascstsgscscststscsTのサブシーケンスは、完全にホスホロチオエート化されている、つまり下付き文字sで示されていることに気付く。現在のところ望ましくないが、LNAオリゴヌクレオチドの安定性を著しく損なうことなく、一つか場合によっては二つのホスホロチオエート結合は他の結合、特にホスホロジエステル結合で置き換えられ得る。従って、一つまたは二つのホスホロチオエート結合が他の結合、例えばホスホロジエステル結合で置き換えられ得る当該改変体も本発明の対象範囲内に含まれる。しかし、現在のところ好ましいある実施形態では、配列中の全てのヌクレオチドユニットがホスホロチオエート基によって結合されている。特に関心があるLNAオリゴヌクレオチドのあるサブグループは、5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’配列番号15’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsT-3’配列番号15、および5’-GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3’配列番号16からなる群から選択され、これらのなかでは、5’-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’配列番号1が現在のところ最も望ましい。特に関心があるLNAオリゴヌクレオチドの別のサブグループは、5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3’配列番号25’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA-3’配列番号17、および5’-TsTsascstsgscscststscsTsTsa-3’配列番号18からなる群から選択され、これらのなかでは、5’-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3’配列番号2が現在のところ最も望ましい。本発明の情況では、ヌクレオシドという用語は通常の意味、即ち1位の炭素原子を通じてアデニンA、シトシンC、チミンT、ウラシルU、またはグアニンGの窒素含有塩基の一つと結合する2-デオキシリボースまたはリボースユニットを含む。同様に、ヌクレオチドという用語は、1位の炭素原子を通じてアデニンA、シトシンC、チミンT、ウラシルU、またはグアニンGの窒素含有塩基の一つと結合し、5位の炭素原子を通じてヌクレオシド間のリン酸基または末端基と結合する2-デオキシリボースまたはリボースユニットを意味する。核酸という用語は、二つ以上のヌクレオチドの共有結合で形成される分子と定義される。核酸とポリヌクレオチドという用語は、ここでは置き換え可能である。核酸アナログという用語は、非天然の核酸結合化合物を指す。LNAモノマーという用語は、全て文献としてここに組み込まれた国際特許出願、国際公開第99/14226号、およびそれに続く出願、国際公開第00/56746号、国際公開第00/56748号、国際公開第00/66604号、国際公開第00/125248号、国際公開第02/28875号、国際公開第2002/094250号および国際公開第03/006475号に記載の、一般的には二環式ヌクレオシドアナログを指す。β-D-オキシ-LNAが、本発明のLNAオリゴヌクレオチドに用いられるβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログである、およびモノマー構造ヌクレオシドをスキーム1に示す。スキーム1スキーム1で、ZおよびZは隣接したヌクレオチドまたは末端基即ち、5’末端基か3’末端基のいずれかへのヌクレオチド間結合の位置を示す。β-D-オキシ-LNAモノマーのある特定の実施例は、チミジンLNAモノマーLNAヌクレオシドアナログ1S,3R,4R,7S-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-5-メチル-3-チミン-1イル-2,5-ジオキサ-ビシクロ[2:2:1]ヘプタン、つまりT-β-D-オキシ-LNAである。オリゴヌクレオチドという用語は、本発明の情況では、オリゴマーオリゴとも呼ばれるまたは核酸ポリマー例えば、リボ核酸RNAまたはデオキシリボ核酸DNA、または当業者に知られている核酸アナログ、好ましくは固定核酸LNA、あるいはその混合物を指す。この用語は、自然に生じたものと同様に機能する、または特異的な機能を改善した人工的に作成した部分を有するオリゴヌクレオチドだけでなく、自然に生じた核酸塩基、糖類、およびヌクレオシド間バックボーン結合からなるオリゴヌクレオチドを含む。完全に、または部分的に修飾、または置換したオリゴヌクレオチドは、例えば細胞膜への浸透能、細胞外、細胞内のヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的への高い親和性と特異性などのいくつかの好ましい特性があるため、自然の形よりも多くの場合望ましい。本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、上述の特性を示す。ユニットまたはヌクレオチドユニットは、モノマー、即ち2-デオキシヌクレオチドまたはβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログであると解釈される。1以上という用語は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17などの、1より大きいか等しい整数を含む。ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などに使われるa冠詞という用語は、一つかそれ以上を意味するよう意図されている。特に、.....からなる群から選択されるヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などといった構成要素という表現は、一つかそれ以上の、言及された構成要素が選択され得ることを意味するよう意図されている。従って、A、B、およびCからなる群から選択される構成要素の表現は、A、BおよびCの全ての組合せ、即ちA、B、C、AB、AC、BC、およびABCを含むことが意図されている。本明細書を通して、を含むまたはを含んでいるといったそのバリエーションは、記載の要素、整数、または段階、あるいは要素、整数、または段階の群を意味すると理解されるが、その他の要素、整数、または段階の除外、あるいは要素、整数、または段階の群の除外は意味しない。LNAオリゴヌクレオチドの調製LNAヌクレオチドアナログ結合ブロックβ-D-オキシ-LNAは、公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製可能である。例えば、国際公開第03/095467A1号、D.S.Pedersen,C.Rosenbohm,T.Koch2002PreparationofLNAPhosphoramidites,Synthesis6,802-808、および国際公開第2004/069991A2号を参照。LNAオリゴヌクレオチドは、国際公開第99/14226号、国際公開第00/56746号、国際公開第00/56748号、国際公開第00/66604号、国際公開第00/125248号、国際公開第02/28875号、国際公開第2002/094250号、および国際公開第03/006475号の実施例の記載どおりに調製することが出来る。従って、LNAオリゴヌクレオチドは、有機化学の当該分野の通常の技量の人物によく知られた核酸化学のオリゴマー化技術を用いて作成可能である。一般的に、ホスホルアミダイト手法の標準的なオリゴマー化サイクルS.L.BeaucageandR.P.Iyer,Tetrahedron,1993,49,6123;S.L.BeaucageandR.P.Iyer,Tetrahedron,1992,48,2223が用いられるが、例えばH-ホスホン酸化学、ホスホトリエステル化学も利用され得る。一部のモノマーについては、より長いカップリング時間および/また反復カップリングおよび/また、より濃縮したカップリング試薬の使用が必要、あるいは有益であり得る。ホスホルアミダイトは、一般的に>95の段階的収量を満たす対を使用した。亜リン酸IIIから亜リン酸Vへの酸化は、通常、例えばヨウ素、ピリジン、水で行う。このことが脱保護後に、天然のホスホロジエステルヌクレオシド間結合をもたらす。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がチオール化段階で調製される場合は、ADTT試薬キサンタンハイブリッドアセとニトリル:ピリジン、9:1、v/v中の0.01M溶液を用いる酸化と共にホスホロジエステルヌクレオシド間結合の合成に用いられる、通常の、例えばヨウ素、ピリジン、水の酸化の交換によって行われる。その他のBeaucageおよびPADSなどのチオール化試薬も使用され得る。ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドは、段階的カップリングで≧98の収量で効果的に合成される。LNAオリゴヌクレオチドの精製は、ディスポーザブルの逆相精製カートリッジおよび/または逆相HPLCおよび/またはエタノールまたはブタノール沈殿を用いて達成され得る。キャピラリーゲル電気泳動、逆相HPLC、MALDI-MSおよびESI-MSが、合成LNAオリゴヌクレオチドの精製の検証に用いられた。塩LNAオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な様々な塩が使用され得る。本明細書で使用される場合、その用語はLNAオリゴヌクレオチドの生物学的活性を保持し、最低限の望ましくない毒性効果を示す塩を指す。当該塩の限定されない実施例は、有機アミノ酸、および、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミ、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンで形成された、あるいはアンモニア、N,N-ジベンジルエチレン-ジアミン、D-グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから形成されるカチオンで形成される塩基添加塩、あるいは、例えば亜鉛タンニン酸などの組合せで形成され得る。このような塩は、ホスホジエステル基および/またはホスホロチオエート基を有するLNAオリゴヌクレオチドから形成され、例えば適切な塩基を有する塩でもある。これらの塩は、例えば元素周期律表のIa、Ib、IIa、およびIIbの金属グループ由来の非毒性の金属塩を含み、特に、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩などのアルカリ金属塩、あるいは例えばマグネシウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ土類金属が適している。さらに、亜鉛塩、アンモニウム塩、および、置換されていない、またはヒドロキシル置換された、モノ-、ジ-、またはトリ-アルキルアミンなど、特に、モノ-、ジ-、またはトリ-アルキルアミン、などの適切な有機アミンで形成された塩、あるいは、例えばN-メチル-N-エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンや、モノ-、ビス-、またはトリス-2-ヒドロキシエチルアミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミン、またはトリス-ヒドロキシメチルメチルアミンなどのモノ-、ビス-、またはトリス-2-ヒドロキシ-低級アルキルアミン類、N,N-ジメチル-N-2-ヒドロキシエチル-アミンまたはトリ-2-ヒドロキシエチルアミン、またはN-メチル-D-グルコサミンなどの、N,N-ジ-低級アルキル-N-ヒドロキシ低級アルキルアミン類、またはテトラブチルアンモニウム塩などの第4級アンモニウム化合物など、第4級アンモニウム化合物で形成された塩も含む。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、またはカリウム塩が望ましく、ナトリウム塩は特に好ましい。プロドラッグある実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形である場合がある。オリゴヌクレオチドは、陰性に荷電したイオンである。細胞膜の親油性のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の相当物と比較して低くなる。この極性の障害物は、プロドラッグ手法例えば、Crooke,R.M.1998inCrooke,S.T.AntisenseresearchandApplication.Springer-Verlag,Berlin,Germany,vol.31,pp.103-140を参照の利用によって回避可能である。この手法で、LNAオリゴヌクレオチドは投与した際に中性であるように保護された方法で調製される。これらの保護基はLNAオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれた後に除去され得る方法で設計される。当該保護基の例は、S-アセチルチオエチルSATEまたはS-ピバロイルチオエチルt-ブチル-SATEである。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。結合体本発明のさらなる局面は、少なくとも一つの非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分が共有的に前述のLNAオリゴヌクレオチドと結合している、と本明細書で定義されるLNAオリゴヌクレオチドを含む結合体に関する。本発明の関連する局面では、本発明のLNAオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合しており、リガンドはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込みの増加を目的としている。本明細書の情況において、結合体という用語は本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチド即ち、ヌクレオシド配列とLNAヌクレオチドアナログを含むLNAオリゴヌクレオチドと一つ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の共有結合によって形成された外来分子を示すよう意図されている。従って、LNAオリゴヌクレオチドはダイマーまたは樹状構造に配置され得ると同時に、例えば、ペプチド核酸PNA、タンパク質例えば、標的タンパク質に対する抗体、高分子、低分子量の医薬品成分、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー例えばポリエチレングリコール、ミセル形成基、抗体、炭水化物、受容体結合基、コレステロールなどのステロイド、ポリペプチド、アクリジン誘導体などの挿入剤、長鎖アルコール、デンドリマー、リン脂質、およびその他の親油基、またはその組合せなどの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分と結合する、あるいはキメラを形成し得る。本発明のLNAオリゴヌクレオチドまたは結合体は、結合、あるいは例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法剤、または抗生物質といった活性医薬品成分とさらに結合され得る。このようにした結合は、LNAオリゴヌクレオチドの薬物動態特性に関する有利な特性を付与し得る。特に、当該方法の結合は細胞への取り込みの増加を達成する。ある実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合され、リガンドはアンチセンスLNAオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込み増加を目的としている。この結合は、5’/3’-OHの末端位置で行われ得るが、リガンドは糖および/または塩基でも行われ得る。特に、アンチセンスLNAオリゴヌクレオチドを結合し得る成長因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含む場合がある。高濃度でトランスフェリン受容体または葉酸受容体を発現している細胞による取り込みのために、トランスフェリン-ポリリジン-オリゴヌクレオチド結合体、または葉酸-ポリリジン-オリゴヌクレオチド結合体が調製され得る。結合体/リガンドの別の実施例は、コレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖の挿入基duplexintercalator、ポリ-L-リジン、一つ以上のヌクレアーゼ耐性結合基を有するホスホロモノチオエートなどの末端キャッピングなどである。オリゴヌクレオチドの細胞取り込みのためのキャリアとしてのトランスフェリン結合体の調製は、Wagneretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,3410-34141990に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を含む葉酸受容体エンドサイトーシスを介した葉酸-巨大分子結合体の細胞送達は、Lowetal.,U.S.米国特許第5,108,921号に記載されている。Leamonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.88,55721991も参照のこと。薬学的組成物本発明の特に関心がある特徴は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含む薬学的組成物を対象にしている。薬学的組成物は、好ましくは注入、局所投与、または眼内投与に適切である下記参照。薬学的組成物の調製についての指示は、AlfonsoR.Gennaro著Remington:TheScienceandPracticeofPharmacyおよび下記で入手できる。薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントは薬学的組成物の一部である。カプセル、タブレット、丸薬などは、例えば以下の化合物、微結晶性セルロース、結合剤としてゴムまたはゼラチン、賦形剤としてデンプンまたは乳糖、潤滑剤としてステアリン酸、様々な甘味料または香料を含み得る。カプセルでは、用量ユニットは脂肪油などの油脂キャリアを含む場合がある。同様に、糖または腸溶性の被覆材が用量ユニットの一部であり得る。薬学的組成物はLNAオリゴヌクレオチドを含む活性薬剤成分の乳液と脂質形成ミセル乳液である可能性もある。LNAオリゴヌクレオチドは、目的とする作用を損なわない任意の原料、あるいは目的とする作用を補う材料と混合される場合がある。これらは、他のオリゴヌクレオシド化合物を含む他薬剤を含み得る。非経口投与、皮下投与、皮内投与、または局所投与のため、製剤は滅菌した希釈剤例えば水、緩衝液、張性調節剤またはイオン強度調整剤、および抗菌剤を含む場合がある。活性LNAオリゴヌクレオチドは、取り込み、分解に対する保護、または体外への迅速な排出に対する保護を行い易くする、放出制御特性があるインプラントまたはマイクロカプセルを含むキャリアと共に調製され得る。静脈内投与のために、望ましいキャリアは生理食塩水0.9、または緩衝食塩水例えば、リン酸緩衝食塩水である。好ましい実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドの注射または輸液は新血管形成部位またはその近くに与えられる。例えば、本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、目の網膜色素上皮細胞に送達され得る。好ましくは、LNAオリゴヌクレオチドは目に、例えば液体またはゲルの形で下瞼または結膜円蓋に、当業者が行っているように局所的に投与される例えば、AcheampongAAetal.,2002,DrugMetabol.andDisposition30:421-429、本明細書に参考文献によって盛り込まれた開示全体を参照。本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが目的か、また治療する領域によって、複数の方法で投与され得る。投与は、a経口投与、b例えば、噴霧器、気管内投与、経鼻投与による、粉末またはエアロゾルの吸入または噴霧による肺投与、c表皮投与、経皮投与、目、および膣内投与と直腸送達などの粘膜への投与などの局所投与、または、d静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または輸液、あるいは例えばくも膜下腔投与または脳室内投与といった頭蓋内投与などの非経口投与であり得る。ある実施形態では、活性LNAオリゴヌクレオチドは静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、局所投与、または静脈内ボーラスとして、あるいは直接的に標的器官に投与される。現在、大部分の適切な投与形態は静脈内注射または経口投与であると考えられている。局所投与用の薬学的組成物と製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴剤、スプレー、坐薬、液体および粉末を含み得る。従来の水性、粉末またはオイルベースの医薬的キャリア、増粘剤などが必要または所望され得る。コーティングを施したコンドーム、手袋などもまた有用である。本発明のオリゴヌクレオチドを含む望ましい局所用製剤は、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤との混合剤である。経口投与用の薬学的組成物と製剤は、粉末、または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水媒体中の懸濁液、または溶液、カプセル、ジェルカプセル、小袋、タブレット、またはミニタブレットを含むがこれに限定されない。非経口投与、くも膜下腔内投与、または脳室内投与用の薬学的組成物と製剤は、緩衝剤、希釈剤、および、浸透促進剤、キャリア化合物またその他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤など、しかしそれに限定されないその他の適切な添加物も含み得る滅菌した水溶液を含み得る。本発明の薬学的組成物は溶液、乳液、およびリポソーム含有製剤を含むがそれに限定されない。これらの組成物は、予め生成された脂質、自己乳化固体、自己乳化半固形を含むがそれに限定されない様々な組成物から生成され得る。腫瘍組織への薬剤送達は、陽イオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子、および微粒子を含むがそれに限定されないキャリアを介した送達により増強される場合があるDassCR.JPharm.Pharmacol.2002,541:3-27。特に好ましい非経口投与経路は眼内投与である。本LNAオリゴヌクレオチドの眼内投与は、その投与経路によりLNAオリゴヌクレオチドの目への進入が可能である限り、目への注入または直接例えば局所的投与により達成され得ると理解される。上述の目への局所的経路投与に加え、適切な眼内投与経路は硝子体内投与、網膜内投与、網膜下投与、テノン嚢下投与、眼窩周囲投与、眼窩後方投与、経隔膜投与、および経強膜投与を含む。眼内投与用に、薬学的組成物は例えばパッチまたは目への塗布、あるいはイオン泳動によって直接局所的に投与される場合がある。軟膏、スプレー、または点滴用液体は、アプリケーターまたは点眼器などの当業者に知られた目への送達システムによって送達され得る。組成物は、目の表面または瞼の内側に直接的に投与される場合がある。当該組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルアルコールなどのムチン模倣剤、アスコルビン酸、EDTAまたは塩化ベンジルクロニウム等の防腐剤、および通常量の希釈剤および/またはキャリアを含み得る。本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第5,672,659号および第5,595,760号に記載の徐放性配合で提供され得る。即時性放出配合または徐放性配合の使用は、治療される状態の性質に依存する。状態が急性疾患、または過急性疾患である場合には、即時放出型での治療が徐放性配合よりも望ましいだろう。あるいは、特定の予防または長期治療には、徐放性配合が適切であり得る。LNAオリゴヌクレオチドは、針またはその他の送達機器を用いて目の内部に注入可能である。ある実施形態では、薬学的組成物は生理的に許容可能なキャリア媒体と混合した本発明のLNAオリゴヌクレオチド例えば、重量で0.1から90、またはその生理的に許容可能な塩を含む。好ましくは、生理的に許容可能なキャリア媒体は水、緩衝水溶液、生理食塩水、0.4食塩水、0.3グリシン、ヒアルロン酸などである。本発明の薬学的組成物は、従来の医薬的賦形剤および/または添加物も含み得る。適切な医薬的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、およびpH調節剤を含む。適切な添加物は、生理的生体適合性緩衝剤例えば、塩酸トロメタミン、キレート剤の添加例えば、DTPAまたはDTPA-ビスアマイドなどまたはカルシウムキレート錯体例として、カルシウムDTPA、カルシウムナトリウムDTPA-ビスアマイドあるいは、任意で、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウムを含む。本発明の薬学的組成物は、液体形態用に梱包される可能性、あるいは凍結乾燥され得る。固形組成物に関しては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの従来の非毒性の固体キャリアが用いられ得る。好ましくは、LNAオリゴヌクレオチドは患者の治療において重篤な副作用を引き起こさない治療有効量を患者に送達するに十分な量の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤などのユニット製剤中に含まれる。ユニット用量の形で簡便に与えることができる本発明の医薬的製剤は、製薬業界でよく知られた従来技術に従って調製され得る。当該技術は、有効成分を医薬的キャリアまたは賦形剤と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は均一にまた密接に有効成分を液体キャリアまたは細かく分けられた固体キャリア、あるいはその両方と会合させ、次いで、必要であれば製品を成形することで調製される。本発明の組成物は、タブレット、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、ソフトジェル、および坐薬などの、しかしそれに限定されない任意の多くの見込まれる剤形に製剤され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液としても製剤され得る。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増す、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランなどの物質をさらに含む場合がある。懸濁液は安定剤も含む場合がある。薬学的組成物の好ましい実施形態では、LNAオリゴヌクレオチドは水性のキャリアで、特にpHを4.0~8.5の範囲に保ち、またイオン強度が20~2000mMの緩衝剤を含む水性キャリアで製剤される。水性キャリアという用語は、問題の薬学的組成物が液体形態であり、その液体キャリアは主に水を含む、つまり少なくとも80w/w、または少なくとも90w/w、またはさらに少なくとも95w/wのキャリアが水で構成されることを意味する。例えばエタノール、DMSO、エチレングリコールなどのその他の液体成分も使用され得る。水性キャリアは好ましくは食塩水、またはpHを4.0~8.5の範囲に保つ緩衝剤を含む。好ましくは緩衝剤は、例えばリン酸緩衝食塩水PBSといった緩衝食塩水などであり、pH6.0~7.5といったpHを5.0~8.0の範囲に保つ。薬学的組成物のイオン強度/等張性も重要である。従って、一般的には、液体薬学的組成物は50~1500mMの範囲、または100~1000mMの範囲といった20~2000mMの範囲のイオン強度である。併用薬剤本発明に従う薬学的組成物は任意でさらにアンチセンス化合物、化学療法剤、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達調節因子、キナーゼ阻害剤および/または免疫調節化合物を含むということを理解する必要がある。現在、LNAオリゴヌクレオチドと一つ以上の化学療法剤の組合せが特に関心を引くと考えられる。上述の本発明の薬学的組成物は、一つ以上の化学療法剤をさらに含み得る。化学療法化合物は一般的に、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン、アルトレタミンヘキサレン、ヘキサメチルメラニンHMM、アミフォスチンエチヨル、アミノグルテチミドシタドレン、アムサクリンM-AMSA、アナストロゾールアリミデックス、テストステロンなどといったアンドロゲン、アスパラギナーゼElspar、アバスチン、バチルスカルメットゲラン菌、ビカルタミドカソデックス、ビスフォスフォネート、ブレオマイシンブレノキサン、ボルテゾミブ、ブスルファンミレラン、カルボプラチンパラプラチン、カルムスチンBCNU、BiCNU、クロラムブシルロイケラン、クロロデオキシアデノシン2-CDA、クラドリビン、ロイスタチン、シスプラチンプラチノール、シクロホスファミド、シトシンアラビノシドシタラビン、ダカルバジンDTIC、ダクチノマイシンダクチノマイシンD、コスメゲン、ダウノルビシンCerubidine、ドセタキセルタキソテール、ドキソルビシンアドリアマイシン、エピルビシン、エストラムスチンemcyt、ジエチルスチルベストロールDESなどといったエストロゲン、エトポシドVP-16、VePesid、etophos、フルダラビンフルダラ、フルタミドeulexin、5-FUDRフロクスウリジン、5-フルオロウラシル5-FU、ジェムシタビンジェムザール、ゴセレリンzodalex、ハーセプチンTrastuzumab、ヒドロキシウレアハイドレア、イダルビシンイダマイシン、イホスファミド、IL-2プロリュウキン、アルデスロイキン、インターフェロンαイントロンA、ロフェロンA、イリノテカンカンプトサール、ロイプロリドリュープロン、レバミゾールergamisole、ロムスチンCCNU、Mechlorathamineマスタージェン、ナイトロジェンマスタード、メルファランアルケラン、メルカプトプリンプリネトール、6-MP、メトトレキサートMexate、2-メトキシエストラジオール2ME2、パンゼム、マイトマイシンCmutamucin、ミトキサントロンノバントロン、オクトレオチドサンドスタチン、ペントスタチン2-デオキシコホルマイシン、Nipent、プリカマイシンミトラマイシン、Mithracin、プロカルバジンMatulane、ストレプトゾシン、タモキシフィンノルバデックス、タキソールパクリタキセル、テニポシドvumon、VM-26、サリドマイド、チオテパ、トポテカンハイカムチン、トレチノインベサノイド、オールトランス型レチノイン酸、ビンブラスチンvalban、ビンクリスチンオンコビンおよびビノレルビンナベルビン。などの副腎皮質ステロイドからなる群から選択される。多発性骨髄腫の処置のためには、メルファラン、シクロホスファミド、プレドニゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、カルムスチン、デキサメタゾン、サリドマイド、ボルテゾミブ、およびビスフォスフォネートなどの化学療法剤が望ましい。腎臓癌の処置のためには、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル5-FU、5-フルオロデオキシウリジン、パクリタキセル、カルボプラチン、イホスファミド、ドキソルビシン、ビンブラスチン、IFN-α、およびIL-2などの化学療法剤が望ましい。ある改変例では、本発明はa一つ以上のLNAオリゴヌクレオチドとb非アンチセンス機構で機能する一つ以上の化学療法化合物を含む薬学的組成物を提供する。LNAオリゴヌクレオチドと共に使用した場合、当該化学療法化合物は独立に例えば、ミトラマイシンとオリゴヌクレオチド、連続的に例えば、一定期間のミトラマイシンとオリゴヌクレオチド使用の後に続けて別の薬剤とオリゴヌクレオチド、あるいは一つ以上の別の当該化学療法化合物との組合せまたは放射線療法との組合せで使用される場合がある。前記で明確に記載されたそれらを含む当業者に知られている全ての化学療法化合物は、本発明によるLNAオリゴヌクレオチドとの複合治療として取り入れられる。ある実施形態では、薬学的組成物はタキサン化合物との組合せで投与される。タキサン化合物という用語は、パクリタキセルTaxol[登録商標]、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、タキソテール、修飾タキサン、およびタキソイドアナログを含むよう意図されている。パクリタキセルTaxol[登録商標]はイチイの一種Westernpacificyew、Taxusbreifoliaの樹皮から単離されたジテルペンで、タキサン環系を有する治療剤の1分野の代表である。パクリタキセルとそのアナログは、イチイの針葉と枝から得られた前駆物質、10-デアセチルバッカチンIIIから部分合成により、また完全合成により生成されてきた。Holton,etal.,J.Am.Chem.Soc.116:1597-16011994とNicolaou,etal.,Nature367:6301994を参照。パクリタキセルは臨床試験でいくつかのヒトの腫瘍における有効性が証明された。McGuire,etal.,Ann.Int.Med.111:237-2791989、Holmes,etal.,J.Natl.CancerInst.83:1797-18051991、Kohnetal.,J.Natl.CancerInst.86:18-241994、およびKohn,etal.,AmericanSocietyforClinicalOncology121993を参照。修飾タキサンまたはタキソイドアナログは修飾された側鎖を持つタキサン環を有する化合物である。多くのこれらのアナログは、自然に生じるパクリタキセルより高い水溶解性や安定性といった向上した特性を有する。これらのアナログは、当業者に知られており、参考文献によって本明細書中に援用される開示である例えば米国特許第5,278,324号、第5,272,171号、第5,254,580号、第5,250,683号、第5,248,796号、および第5,277,400号に開示されている。パクリタキセルおよびタキソテールは、参考文献によって本明細書中に援用される開示である、国際公開第93/18210号、欧州特許第0253739号、欧州特許第0253739号、および国際公開第92/09589号の方法により調製することができる。特定の実施形態では、タキサン化合物はパクリタキセルまたはタキソテールである。上述の組成物中のタキサン化合物とLNAオリゴヌクレオチドの重量比は、25:1~1:25の範囲、または10:1~1:25の範囲、または1:1~1:25の範囲、または50:1~1:10の範囲、または1:1~1:50の範囲、または25:1~1:10の範囲といった、一般的には50:1~1:25の範囲である。さらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物は一つ以上のLNAオリゴヌクレオチドと第二の核酸標的を標的とする一つ以上の追加のアンチセンス化合物を含む場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物が同時にまたは連続的に使用される場合がある。非ステロイド抗炎症剤と副腎皮質ステロイド、抗ウイルス剤、および免疫調節剤を含む、しかしこれに限定されない抗炎症剤も、本発明の組成物に組み込まれる場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物を同時にまたは連続的に使用される場合がある。さらに、LNAオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物は、放射線療法などと組み合わせて使用される場合がある。医療処置本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の多くの治療上の応用に有用である。一般的に、本発明の治療方法は治療有効量のLNA修飾オリゴヌクレオチドのほ乳類、特にヒトへの投与を含む。従って、本発明は、投薬治療として使用するために本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチド、あるいは本明細書に記載の結合体とも関連する。投薬は治療対象の疾患の重篤度と反応性に依存し、数日から数ヶ月、あるいは治癒するまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く治療過程である。至適な投薬計画は、患者の体内の薬剤または代理マーカーの測定によっても評価可能である。至適投薬量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して様々であり得る。一般的に、動物モデルでインビトロとインビボで有効であると見いだされたEC50に基づいて概算できる。一般的に、用量は体重kgあたり0.01μgから1gであり、1日、週、月、年1回以上、あるいは2から10年毎に一回投与される、または数時間から数ヶ月間まで継続的な輸液によって投与され得る。投薬の繰り返し率は測定された滞留時間と体液中または組織中の薬剤濃度に基づいて概算することができる。成功した治療後、患者は疾患状態の再発防止のための維持療法を受けるのが所望され得る。現在、当該用量の大部分は、例えば体重kgあたり0.1mgから40mg、または0.5mgから10mgなど、0.01mgから100mgであると考えられている。当該1回分は、1日1回であり得るが、より好ましくは、例えば週に1~3回のより低頻度で、1~4週の期間であり得る。維持療法は、例えば月に1~4回、または年に1~10回といったさらに低頻度で継続され得る。当業者は、LNAオリゴヌクレオチドが本発明の精神の範囲に含まれる様々な数多くの原理によってHIF-1a関連疾患と闘うのに使用可能であることを正しく理解するだろう。本明細書で使用される場合標的核酸という用語は、HIF-1aをコードするDNA、当該DNAから転写されたRNAmRNA前駆体とmRNAを含む、および当該RNAに由来するcDNAも含む。本明細書で使用される場合遺伝子という用語は、エキソン、イントロン、5’また3’非コーディング領域、および調節因子を含む遺伝子を意味し、現在知られているその全ての改変体と解明され得るそれ以外の改変体を意味する。本明細書で使用される場合LNAオリゴヌクレオチドという用語は、例えば、標的遺伝子のキメラプラストとTFO、標的遺伝子のRNA転写物のアンチセンス阻害因子siRNAmiRNAリボザイムおよびオリゴザイム、または標的遺伝子がコードするタンパク質のアプタマーシュピーゲルマーデコイのいずれへの水素結合によって結合することでヒトにおいて望ましい治療効果を誘導可能なオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合mRNAという用語は、現在知られている標的遺伝子のmRNA転写物、および特定され得るそれ以外の転写物を意味する本明細書で使用される場合調節という用語は、遺伝子発現における増加刺激または減少阻害のどちらかを意味する。本発明では阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、mRNAが好ましい標的である。本明細書で使用される場合、アンチセンス化合物から特定の標的核酸までを標的にするという語は、細胞、動物、またはヒトにアンチセンス化合物がその意図された標的に結合し機能を調節出来るような方法でアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを意味する。LNAオリゴヌクレオチドは、現在のところほとんどわかっていないアンチセンス様の機構による特定の内因性または外因性遺伝子のサイレンスに細胞が利用する小分子の二本鎖RNA分子であるsiRNAとして設計される場合がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、例えば吸収、分配、細胞による取り込み、代謝および排出などの薬物動態に大いに依存する。言い換えると、これらのパラメーターは、オリゴヌクレオチドの根本的な化学的性質とサイズ、三次元構造によって大いに左右される。本発明によるLNAオリゴヌクレオチドの薬物動態特性の調節は、様々な異なる部分の結合によってさらに達成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を通過する能力は、例えばコレステロール部分、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはポリアミンなどといった脂質部分のオリゴヌクレオチドへの結合によって向上し得る。同様に、LNAオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、細胞質への輸送を仲介する膜中の分子と相互作用するオリゴヌクレオチドへの部分の結合により向上し得る。本発明による薬物動態特性は、LNAオリゴヌクレオチドの取り込みを向上させ、LNAオリゴヌクレオチドの分解に対する耐性などといった生理的安定性を向上させ、および/または、オリゴヌクレオチドの例えばmRNA配列といった標的配列とのハイブリダイゼーション特性の特異性と親和性を増加させる基で向上し得る。本発明による薬学的組成物は、多くの様々な疾患の治療に利用可能である。癌細胞の増殖のように、血管内皮細胞はHIF-1a発現の下方調節に感受性である。従って、本発明による薬学的組成物は、新脈管形成を引き起こす異常な疾患を特徴とする疾患の治療に利用可能である。当該疾患の例は、一般的に癌であり、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、およびカポジ肉腫である。一般的に述べられた、本発明の一つの特徴は、治療有効量のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体のほ乳動物への投与を含む、異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患った、またはその疾患に罹患しやすい哺乳動物の治療方法を対象にしている。さらに、本発明は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を包含する新脈管形成の阻害方法にも関連する。本発明の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、またはその他の皮膚関連疾患から選択される疾患の治療のための薬剤調製への本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の使用を対象にしている。本発明による薬学的組成物は、炎症性疾患、皮膚炎または例えば乾癬や関節リウマチといったその他の皮膚疾患または障害などといった炎症の治療にも利用可能である。同様に、本発明の別の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、からなる群から選択される疾患の治療のための方法を対象とし、上述の方法は本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含する。特に興味深いのは、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、およびその他の炎症性疾患を含む新脈管形成疾患である。これらの疾患は、新脈管形成領域での新しく形成された血管による正常組織の破壊に特徴づけられる。例えば、黄斑変性症では、毛細血管が脈絡膜に侵入し破壊する。黄斑変性症における新脈管形成による脈絡膜の破壊は、最終的には部分的または完全な失明を引き起こす。本発明の方法は、好ましくは癌により引き起こされる疾患に対する治療または予防、特に肺、乳房、結腸、前立腺、膵臓、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸、腸管、脊髄、副鼻洞、膀胱、尿道、卵巣癌などといった組織で生じ得る癌の治療に用いられる。さらに、本明細書に記載の本発明は、当該治療が必要なヒトへのLNAオリゴヌクレオチドの高用量を含むがそれに限定されない、治療有効量のHIF-1a調節LNAオリゴヌクレオチドを含む癌の予防または治療の方法を含む。本発明はさらにHIF-1a調節LNAオリゴヌクレオチドの短期間投与の利用を含む。正常、非癌性細胞は、特定の細胞タイプの頻度の特性で分類する。細胞が癌状態に変化した場合、制御不良の細胞増殖と細胞死の減少が生じ、従って、乱雑な細胞分裂または細胞増殖は癌性細胞タイプの顕著な特徴である。癌のタイプの例は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫などの急性白血病、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頸部癌、脳の癌、原発部位不明の癌、新生物、末梢神経の癌、中枢末梢神経系の癌、腫瘍例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、および網膜芽細胞腫、重鎖病、転移、または無制御あるいは異常な細胞増殖で特徴づけられる任意の疾患または障害を含むがそれに限定されない。癌腫という用語は、上皮性起源の悪性腫瘍を示すよう意図されている。上皮組織は体の内部と外部の体表面を覆う、あるいは内側を覆う。上皮組織の例は、皮膚、粘膜、および体腔と腸、膀胱、子宮などといった内臓を裏打ちする漿膜である。上皮組織は、粘液分泌腺などの腺から深部組織層にまで拡大される場合もある。肉腫という用語は、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨などといった結合組織から増殖した悪性腫瘍を示すよう意図されている。本明細書で使われた場合、神経膠腫という用語はグリア細胞起源の悪性腫瘍を対象とするよう意図されている。癌治療用の薬剤製造のための本発明のLNAオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体の使用では、前述の癌は適宜、固形癌のタイプである。さらに、前述の癌は適宜、癌腫でもある。癌腫は一般的に悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選択される。より一般的には、上記の癌腫は悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および腎細胞癌からなる群から選択される。悪性黒色腫は、一般的に表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端部黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および線維硬化性黒色腫からなる群から選択される。あるいは、癌は適宜、肉腫である場合がある。肉腫は一般的には、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選択されるタイプである。あるいは、癌は神経膠腫である場合がある。本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドと結合体は、多発性骨髄腫、腎臓、子宮頸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される癌疾患の治療にも特に有用であると考えられている。本発明は、癌の治療方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を含む。ある改変例では、癌は固形癌タイプである。固形癌は適宜、上述などの癌腫または肉腫または神経膠腫である。従って、本発明のさらなる特徴は、癌治療のための薬剤の製造のための本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体の使用を対象としており、当該薬剤はさらに、複合薬の項で上述された群から選択される化学療法剤を含む。適宜、追加の化学療法剤は、タキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルなどのタキサンから選択される。代わりになるべきものとして述べられた、本発明は、さらに癌の治療方法を対象としており、当該方法は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含し、さらに、さらなる化学療法剤の投与を包含する。さらなる当該投与は、さらなる化学療法剤が本発明のLNAオリゴヌクレオチドに結合されるものが薬学的組成物中に存在しているか、あるいは別の製剤中で投与される。好ましい実施形態では、本発明はa一つ以上のアンチセンス化合物とb姉妹染色分体の動原体でのマイクロチューブの脱重合化と張力形成を阻害するが、マイクロチューブは動原体に結合しない一つ以上のその他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。当該化学療法剤は、上記に記載のタキサンを含み、特にタキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルである。本発明のLNAオリゴヌクレオチドと共に使用する場合、当該化学療法剤は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のHIF-1aタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。別の好ましい実施形態では、本発明によるLNAオリゴヌクレオチドを用いる治療法は、放射線療法と組み合わされる。本発明のLNAオリゴヌクレオチドと共に使用された場合、放射線療法は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のHIF-1aタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。本発明のLNAオリゴヌクレオチドは、診断、治療法、予防のための研究試薬として利用することも可能である。研究ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の機能的解析または治療的介入のための標的として有用性の評価を行い易くする細胞内と実験動物のHIF-1a遺伝子の合成を特異的に阻害する為に使用され得る。診断においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の手法により細胞または組織内のHIF-1a発現の検出と定量に利用され得る。治療法では、HIF-1aの発現調節で治療され得る疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトが、本発明によるアンチセンスLNAオリゴヌクレオチド投与により治療される。さらに提供されるのは、HIF-1aの発現に関連する疾患または状態を有する、またはその傾向があると疑われる動物、特にマウス、ラット、およびヒトの、医薬的、または予防的な有効量の一つ以上の本発明のLNAオリゴヌクレオチドまたは結合体または薬学的組成物の投与による治療方法である。本発明のさらなる特徴は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含むアポトーシスの誘導方法を対象としている。アポトーシスの誘導は、インビトロまたはインビボである場合がある。誘導は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。本発明に関連した特徴は、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む細胞増殖の予防方法を対象としている。増殖の予防は、インビトロまたはインビボである場合がある。予防は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。一層さらに、本発明は、新脈管形成疾患と関連した新脈管形成が阻害されるように、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む新脈管形成疾患の治療方法とも関連する。ある実施形態においては、新脈管形成疾患は癌と関連する腫瘍を含む。上記参照。癌は好ましくは、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳の癌、腹腔内の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、および血液癌からなる群から選択される。あるいは、癌は多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される。新脈管形成疾患も糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および炎症性疾患からなる群からも選択される。特に、新脈管形成疾患は炎症性腸疾患、乾癬、および関節リウマチからなる群から選択される炎症性疾患である。黄斑変性症の治療は特に本発明のLNAオリゴヌクレオチドと関連していると考えられている。キット薬学的組成物が液体である場合、LNAオリゴヌクレオチドの安定性を妥協する状況の対象になる危険があり、例えば凍結乾燥した原料として固形のLNAオリゴヌクレオチドを含む最終製品を製造し、当該固形状態で製品を保存するのが所望され得る。製品は投与前に、食塩水中または緩衝食塩水中で再構成され例えば溶解されるかまたは懸濁される、使用できる状態にされ得る。従って、本発明はa本明細書の上記に記載の、固形状態のLNAオリゴヌクレオチドまたは結合体を含む第一の構成要素、およびb当該LNAオリゴヌクレオチドの再構成例えば、溶解または懸濁に適した食塩水または緩衝液例えば、緩衝食塩を含む第二の構成要素、を備えるキットも提供する。好ましくは当該食塩水または緩衝食塩水は4.0~8.5の範囲のpHであり、20~2000mMのモル濃度である。好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は6.0~8.0の範囲のpHであり、100~500mMのモル濃度である。最も好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は7.0~8.0の範囲のpHであり、120~250mMのモル濃度である。このようなキットでは、LNAオリゴヌクレオチドは好ましくは配列番号1、配列番号2、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18からなる群から選択される。より具体的には、LNAオリゴヌクレオチドは配列番号1と配列番号2からなる群から選択される。本発明はさらに限定されない方法で以下の実施例に例証される。実験実施例1:モノマー合成LNAモノマーの基礎ユニットとその派生物は、以下の公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製された。例として、国際公開第03/095467号、およびD.S.Pedersen,C.Rosenbohm,T.Koch2002PreparationofLNAPhosphoramidites,Synthesis6,802-808を参照。実施例2:オリゴヌクレオチド合成オリゴヌクレオチドは、Expedite8900/MOSS合成機MultipleOligonucleotideSynthesisSystemでホスホルアミダイト手法を用いて1μmolまたは15μmolスケール合成した。より大規模な合成には、AektaOligoPilotを用いた。合成の最後DMT-onに、アンモニア水で1~2時間室温で処理してオリゴヌクレオチドを固形支持体から解離させ、さらに65°Cで4時間脱保護を行った。オリゴヌクレオチドを逆相HPLCRP-HPLCで精製した。DMT基の除去後、オリゴヌクレオチドは、AE-HPLC、RP-HPLCおよびCGEの性質を持ち、分子量をさらにESI-MSで確認した。詳細は下記参照のこと。LNA固形支持体の調製:LNAスクシニルヘミエステルの調製5’-O-Dmt-3’-ヒドロキシ-LNAモノマー500mg、無水スクシニル1.2等量、およびDMAP1.2等量をDCM35ml中に溶解した。反応は、撹拌して室温で一晩行った。0.1MのNaH2PO4pH5.52回とブライン1回で抽出後、有機層を無水Na2SO4でさらに乾燥させ、濾過して蒸発させた。ヘミエステル誘導体が95の収量で得られ、さらなる精製なしに使用した。LNA支持体の調製上記で調製されたヘミエステル誘導体90μmolを最低量のDMF中に溶解し、DIEA、およびpyBOP90μmolを添加して1分間混合した。この前活性化混合液を手動合成機中でLCAA-CPG500A、80~120メッシュサイズ、300mgと混合し、撹拌した。室温で1.5時間後、支持体を濾過し、残留物をDMF、DCMおよびメタノールで洗浄した。乾燥後、ローディングは57μmol/gであると測定されたTomBrown,DorcasJ.S.Brown.Modernmechine-aidedmethodsofoligodeoxyribonucleotidesynthesis.In:F.Eckstein編OligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproach.Oxford:IRLpress,1991:13-14を参照。オリゴヌクレオチドの伸長ホスホルアミダイトのカップリングAbz、Gibu、5-メチル-CbzまたはT-β-シアノエチル-ホスホルアミダイトを、0.1Mの5’-O-DMTで保護されたアミダイトのアセトニトリル溶液と活性剤としてDCI4,5-dicyanoimidazoleのアセトニトリル溶液0.25Mで行う。チオール化は、塩化キサンタンアセトニトリル:ピリジン10の0.01M溶液を用いることで行われる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に一般的に用いられるものである。供給業者が提供するプロトコルを都合良く至適化した。RP-HPLCによる精製:カラム:XterraRP18流速:3ml/分緩衝液:0.1M酢酸アンモニウム、pH8およびアセトニトリル。略語DMT:ジメトキシトリチルDCI:4,5-ジシアノイミダゾールDMAP:4-ジメチルアミノピリジンDCM:ジクロロメタンDMF:ジメチルホルムアミドTHF:テトラヒドロフランDIEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミンPyBOP:ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイトBz:ベンゾイルIbu:イソブチリル。実施例3:LNAオリゴヌクレオチドの設計表1では、大文字がβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログβ-D-オキシ-LNAを示し、小文字が2-デオキシヌクレオチドを示し、下線がβ-D-オキシ-LNAヌクレオチドアナログまたは2-デオキシヌクレオチドのどちらかを示し、下付き文字sが隣接するヌクレオチドとLNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、隣接するヌクレオチドとLNAヌクレオチドアナログの間に下付き文字がない場合はホスホロジエステル結合を示し、下付き文字xが隣接するヌクレオチドとLNAヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、例えばTxまたはGxはそれぞれ任意のユニットを表す。全てのLNA-Cモノマーは5-メチル-CMeCである。化合物の融解温度Tmの測定3μMの配列番号1の10mMリン酸ナトリウム/100mMのNaCl/0.1nMのEDTA溶液、pH7.0を、配列番号1と相補的なDNA/RNA3μMの10mMリン酸ナトリウム/100mMのNaCl/0.1nMのEDTA溶液、pH7.0を、90°C、1分で混合し、室温まで冷却させる。二本鎖のTmは、1°C/分の25から95°Cまでの温度上昇で測定した。配列番号1のTmを下の表2に示す。実施例4:ヒトまたはラットの血漿におけるLNAオリゴヌクレオチドの安定性LNAオリゴヌクレオチドの安定性をヒトまたはラットの血漿マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もあるで試験した。45μlの血漿に5μlのLNAオリゴヌクレオチドを加える終濃度20μM。LNAオリゴヌクレオチドを血漿中で0から96時間の範囲で37°Cでインキュベートする血漿は、ヌクレアーゼ活性を96時間までテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された。指示された時間に、試料を液体窒素中で急速凍結した。血漿中の2μl40pmol相当のLNAオリゴヌクレオチドを水15μlと3μlの6xloadingdyeInvitrogenを加えることで希釈した。マーカーとして、10bpラダーInvitrogen10821-015を用いる。1μlのラダーに対して1μlの6xloadingdyeと4μlの水を添加する。試料を混合し、65°Cで10分間加熱し、プレランゲル16アクリルアミド、7M尿素、1xTBE、50ワットで1時間プレランにローディングし、50~60ワットで2時間半泳動する。その後、ゲルを1xTBE中の1xSyBRgoldMolecularProbesで15分間染色する。バンドは、BioRadのホスホイメージャーで可視化した。ラット血漿は図1Aを、ヒトとラット血漿は図1Bを参照。LNAオリゴヌクレオチドの安定性をヒトの血漿ラット、マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もあるで試験した。終濃度20μMのLNAオリゴヌクレオチド1から5μlの間を全体量20μlの血漿に加え、0から24時間の範囲でインキュベートした72時間までであり得る。血漿は72時間までヌクレアーゼ活性をテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された。指示された時間に、試料を-80°Cで保存した。血漿中の1μl20pmol相当のLNAオリゴヌクレオチドを水で10倍に希釈し、10bpラダーInvitrogenカタログ番号:10821-015と共に16アクリルアミド7M尿素ゲルで泳動した。1xTBE中の1xSyBRgoldMolecularProbesで15分間の染色前に、ゲルを約40ワットで2~3時間泳動した。バンドは、BioRadのホスホイメージャーで可視化した。図1を参照。実施例5:インビトロモデル:細胞培養標的核酸の発現に対するLNAオリゴヌクレオチド作用は、標的核酸が測定可能な濃度で存在するなら、様々な任意の細胞タイプで試験可能である。標的は当該核酸をコードする各線の内因的、あるいは一時的または安定な形質移入で発現させることができる。標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット解析や定量PCR、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイなどを用いてごく普通に測定可能である。以下の細胞タイプを実例の目的で挙げるが、選択した細胞タイプで標的が発現されるなら、その他の細胞の種類が普通に使用され得る。細胞を以下に記載の適切な培地で培養し、37°C、95~98の湿度と5CO2で維持した。低酸素または酸素欠乏条件下で培養する場合、O2濃度はそれぞれ1~2または0~0.5に保った。細胞は普通に週に2~3回継代した。15PC3:ヒト前立腺癌細胞株15PC3は、オランダ、AMC、Neurozintuigen研究室のDr.F.Baasのご好意で提供され、10ウシ胎仔血清FBS、GlutamaxI、ゲンタマイシンを加えたDMEMSigma培地中で培養した。PC3:ヒト前立腺癌細胞株PC3をATCCから購入し、グルタミンGibcoと10FBS、ゲンタマイシンを加えたF12Coonの培地で培養した。518A2:ヒトメラノーマ癌細胞株518A2を、ウィーン大学の臨床薬学部、分子薬学、実験腫瘍学部門のDr.B.Jansenのご好意で提供され、10ウシ胎仔血清FBS、GlutamaxI、ゲンタマイシンを加えたDMEMSigma培地中で培養した。U373:膠芽腫細胞U373を、10ウシ胎仔血清とGlutamaxI、NEAA、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシンを含むEMEMSigma培地中で、37°C、95の湿度、5CO2で培養した。HeLa:子宮頸癌細胞株Helaを、10ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを含むMEMSigma培地中で、37°C、95の湿度、5CO2で培養した。MPC-11:マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11をATCCより購入し、4mMのGlutamaxと10ウマ血清を加えたDMEM培地で維持した。DU-145:ヒト前立腺癌細胞株DU-145をATCCより購入し、Glutamaxと10FBSを加えたRPMI培地で維持した。RCC-4/-VHL:VHLを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定に形質移入したヒト腎臓癌細胞株RCC4をECACCから購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。786-0:ヒト腎臓癌細胞株786-0をATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って細胞を維持した。HUVEC:ヒト臍静脈内皮細胞株HUVECをCamcrexから購入し、EGM-2培地で維持した。K562:ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562をECACCより購入し、Glutamaxと10FBSを加えたRPMI培地で、維持した。U87MG:ヒトグリア芽細胞腫細胞株U87MGをATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。B16:マウス黒色腫細胞株B16はATCCより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。LNCap:ヒト前立腺癌細胞株LNCapはATCCより購入し、Glutamaxと10FBSを加えたRPMI培地で維持した。実施例6:インビトロモデル:アンチセンスオリゴヌクレオチド処理細胞培養と形質移入:U373またはHeLa細胞を12穴プレートに、10FBSとGlutamaxI、ゲンタマイシンを添加したD培地中に37°C5のCO2で播種した。細胞が60~70コンフルエントの時に、Lipofectamine20002.5~5μg/mlを用いて様々な濃度のオリゴヌクレオチド0.2~100nMで二組みで形質移入した。形質移入は、基本的にDaanetal.1994,JBC269:16416-16424に記載のとおりに行った。つまり、細胞をOptiMEM中のLipofectamineで10分間インキュベートし、ウェル当たり総量0.5mLの形質移入混合液にオリゴヌクレオチド添加した。4時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、正常酸素または低酸素のいずれかの間に37°Cで約20時間mRNA解析とタンパク質解析増殖させた。実施例7:インビトロモデル:RNA抽出とcDNA合成全RNAの単離全RNAは、RNeasyminikitQiagen、カタログno.74104を用いるか、Trizol試薬Lifetechnologies、カタログno.15596を用いて単離した。RNeasyminikitQiagenで全RNA単離する場合は、細胞をPBSで洗浄し、1メルカプトエタノールを添加したCellLysisBufferRTL、Qiagenを壁に直接添加した。数分後、製造会社の取扱説明に従って試料を処理した。組織試料は、Retsch300MMホモジナイザーでホモジナイズし、全RNAをTrizol試薬またはRNeasyminikitを用いて製造会社の記載どおりに単離した。一本鎖合成一本鎖合成は、OmniScriptReverseTranscriptasekitまたはM-MLVReverseTranscriptase基本的に、製造会社Ambionの記載どおりのいずれかを用いて、製造会社の取扱説明Qiagenに従って行った。OmniScriptReverseTranscriptaseを使用する場合、各試料あたり0.5μgの全RNAを12μlに調節し、0.2μlのポリdT12-180.5μg/μlLifeTechnologies、2μlのdNTPミックス各5mM、2μlの10xRT緩衝液、0.5μlのRNAguardTMRNaseInhibitor33unit/ml、Amersham、および1μlのOmniScriptReverseTranscriptaseと混合し、次いで37°Cで60分インキュベートし、93°Cで5分間の加熱不活性化を行った。ランダムデカマーとM-MLV-ReverseTranscriptase基本的に、製造会社Ambionの記載どおりを用いて一本鎖合成を行った場合、各試料の全RNAの0.25μgを水で10.8μlに調節し、2μlデカマーと2μlのdNTPミックス各2.5mMを添加した。試料を70°Cで3分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、2μlの10xRT緩衝液、1μlのM-MLV-ReverseTranscriptase、0.25μlのRNase阻害剤を含む3.25μlの混合物を添加した。cDNAは、42°Cで60分間合成し、次いで95°Cで10分間の加熱不活性化を行い、最後に4°Cに冷却した。実施例8:インビトロおよびインビボモデル:HIF-1a発現のオリゴヌクレオチド阻害のリアルタイムPCRによる解析HIF-1a発現のアンチセンス調節は、当該技術分野に周知の様々な方法でアッセイ可能である。例えば、HIF-1amRNA濃度は、例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法RPA、またはリアルタイムPCRで定量可能である。リアルタイム定量PCRが現在好ましい。RNA解析は、細胞の全RNAまたはmRNAを対象に行うことができる。RNAの単離方法とノーザンブロット解析などのRNAの解析方法は、当該技術分野で日常的な方法であり、例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSonsに説明されている。リアルタイム定量PCRは、BioRADから入手可能な市販のiQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystemを用いて簡便に行うことができる。HIF-1amRNA濃度のリアルタイム定量PCR解析mRNA濃度の定量は、iQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystemBioRADを用いたリアルタイム定量PCRで製造会社の取扱説明書に従って測定した。リアルタイム定量PCRは、当該技術分野でよく知られた技術であり、例えば、Heidetal.RealtimequantitativePCR,GenomeResearch1996,6:986-994に説明されている。PlatinumQuantitativePCRSuperMixUDG2xPCRマスターミックスをInvitrogenカタログno.11730から入手した。プライマーとTaqMan登録商標プローブをMWG-BioteckAG,Ebersberg,Germanyより入手した。グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素GAPDH、18SRNAまたはβ-アクチンmRNAの量を試料調製の変動の正規化に内部コントロールとして用いた。試料中のヒトGAPDHmRNA含量は、ヒトGAPDHABIPrismPre-DevelopedTaqManAssayReagentAppliedBiosystems、カタログno.4310884Eを用いて製造会社の取扱説明書に従って定量した。ヒトHIF-1aでは、PCRプライマーはフォワードプライマー:5’-CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT-3’配列番号21アッセイでの終濃度、0.9μM、リバースプライマー:5’-GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3’配列番号22アッセイでの終濃度、0.9μM、およびPCRプローブ:5’FAM-CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACA-TAMRA3’配列番号23アッセイでの終濃度、0.1μMだった。カニクイザルHIF-1aでは、PCRプライマーはIフォワードプライマー:5’-GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG-3’配列番号24アッセイでの終濃度、0.9μM、リバースプライマー:5’-GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC-3’配列番号25アッセイでの終濃度、0.9μM、およびPCRプローブ:5’FAM-TCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG-TAMRA3’配列番号26アッセイでの終濃度、0.1μMだった。18SリボソームRNAの定量では、TaqManEukaryotic18SrRNAEndogenousControl試薬PART4310875、AppliedBiosystemsを製造会社の取扱説明書にしたがって用いた。マウスGAPDHmRNAの定量では、以下のプライマーとプローブを設計した。センスプライマー:5’-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’配列番号27アッセイでの終濃度、0.3μM、アンチセンスプライマー:5’-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3’配列番号28アッセイでの終濃度、0.6μM、TaqManプローブ:5’FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC-TAMRA-3’配列番号29アッセイでの終濃度、0.2μMだった。TaqManプローブを用いたリアルタイムPCR実施例6の記載どおりに行われた一本鎖合成のcDNAは、2~20倍に希釈し、リアルタイム定量PCRで解析した。プライマーとプローブを2xPlatinumQuantitativePCRSuperMixUDGカタログno.11730、Invitrogenと混合し、3.3μlのcDNAに最終量25μlになるよう添加した。各試料を3つ組で解析した。対象のRNAを発現している細胞株から精製した材料で調製したcDNAの2倍希釈物のアッセイで、アッセイの標準曲線を作成した。鋳型を用いないコントロールではcDNAの代わりに滅菌水を用いた。PCRプログラム:50°Cで2分、95°Cで10分、次いで95°Cで15秒を40サイクル、60°Cで1分。標的mRNAの相対量は、iCycleriQReal-timeDetectionSystemソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した図2参照。SyBRGreenリアルタイムPCRマウスHIF1αmRNAの相対レベルを決定するため、cDNAをBioRADのiCyclerを用いた定量PCR解析に用いた。5倍希釈したcDNA8μlに、29.5μlのPlatinumqPCRSupermix-UDGInvitrogen、各1030nMのプライマー、0.57×SYBRGreenMolecularProbes、および11.4nMのフルオロセインMolecularProbesを含む52μlの混合液を添加した。25μlの二組をQ-PCRに用いた。50°Cで120秒、95°Cで120秒、95°Cで30秒と60°Cで60秒を40サイクル。HIF1amRNAの発現は、同様にQ-PCRで定量したマウスβ-アクチンmRNAで正規化した。プライマー:mHIF1a:5’-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3’配列番号30、および5’-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3’配列番号31mβ-アクチン:5’-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3’配列番号32、および5’-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3’配列番号33mVEGF:5’-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3’配列番号34、および5’-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3’配列番号35BCL-2:フォワード:5’-gccctgtggatgactgagta-3’配列番号36、およびリバース:5’-cagccaggagaaatcaaacag-3’配列番号37無処理のマウス線維芽細胞Ltk細胞5倍に希釈され、HIF1αとβ-アクチンの両方を発現しているから合成したcDNAの2倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。HIF1αmRNAの相対量は、iCycleriQRealTimeDetectionSystemソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。実施例9:インビトロ解析:HIF-1aタンパク質レベルのウェスタンブロット解析形質移入した細胞におけるHIF-1aLNAオリゴヌクレオチドのHIF-1aタンパク質レベルに対するインビトロ作用をウェスタンブロットで測定した。プロテアーゼ阻害剤カクテルRocheを添加した50mMのTris-HClpH6.8、10グリセロール、2.5のSDS、5mMのDTTおよび6M尿素中に細胞を回収し、溶解した。総タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキットPierceを用いて測定した。20~100μgの総タンパク質をMOPS緩衝液の10~12のビス-トリスゲル、または3~8のトリス酢酸ゲルで泳動し、PVDF膜に製造会社Invitrogenの取扱説明書に従ってブロットした。ブロッキング緩衝液5脱脂粉乳を添加したPBS-T中での一晩のインキュベーションの後、膜を一晩抗HIF-1a抗体、Bcl-2抗体、VEGF抗体、またはその他のHIF-1a下流を検出する抗体でインキュベートした。ローディングコントロールとして、チューブリンまたはアクチンをNeomarkerのモノクローナル抗体を用いて検出した。次に、膜を2次抗体でインキュベートし、HIF-1aを発色免疫検出キットInvitrogenまたは化学発光ECL検出キットAmershamを用いて可視化した。図2Aおよび図2B参照実施例10:インビトロ解析:アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトHIF-1a発現のアンチセンス阻害とその下流標的のVEGFAとMMP-2への作用LNAオリゴヌクレオチドは、U373細胞由来の培地中の下流標的VEGFAおよびMMP-2への作用もある。U373細胞はT25フラスコ中0.3×106細胞で時間実験またはT80フラスコ中0.6×106細胞で48時間濃縮実験播種した。U373細胞を10FBS、GlutamaxIおよびゲンタマイシンを添加した増殖培地中で37°C5のCO2に置く。播種の翌日、様々な濃度のオリゴヌクレオチド0.2~10nMを用い、Lipofectamin20002.5μg/mlを用いて、二組または三つ組みで細胞にLNAオリゴヌクレオチドを形質移入した。形質移入は、基本的にDeanetal.1994,JBC269:16416-16424の記載どおりに行った。つまり、細胞をOptiMEM中のLipofectamineで10分間インキュベートし、次いでオリゴヌクレオチド添加した。4時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、酸素欠乏または低酸素のいずれかの間に37°Cで約20時間mRNA解析とタンパク質解析増殖させた。示された時間に細胞の上清を回収した。プロテアーゼ阻害剤の添加を、-80°Cでの保存前に加えた。RDsystemsのヒトVEGFAELISAカタログno.DVE-00およびMMP-2ELISAカタログno.DMP-200を製造会社に従って用いた。回収時間によって、上清を測定前に5~50倍に希釈した。図12A-Eを参照。実施例11:LNAオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導細胞培養膠芽細胞腫細胞株U373ATCCは、10ウシ胎仔血清、GlutamaxI、NEAA、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシンを添加したMEM培地Sigmaで、37°C、湿度95、5CO2で培養した。細胞が60~70コンフルエントに達した時、細胞をLipofectamine20002.5μg/mlを用いて形質移入した。子宮頸癌細胞株HeLaは、10ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを添加したMEM培地Sigmaで、37°C、湿度95、5CO2で培養した。細胞が60~70コンフルエントに達した時、細胞をLipofectamine20005μg/mlを用いて形質移入した。活性型カスパーゼ3/7活性の測定形質移入の前日に、96穴プレートNunc136101にウェルあたり7000細胞の密度でMEM完全培地中にU373細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたOptiMEMで1回洗浄し、次にLipofectamine2000Invitrogen2.5μg/mlを含む72μlのOptiMEMを加えた。OptiMEMで希釈した18μlのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、0.2nMから100nMの範囲だった。処理6時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含む100μlのDMEMを加えた。処理済みのU373細胞の同様の96穴プレートを、回収時間までAnaerocultバッグMerck中に96穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧/酸素欠乏下で培養した。プレートを示した時間に15分間室温に平衡化させた。100μlの高感度Caspase3/7-GloTM試薬Promegaを直接96穴中の細胞に添加し、プレートを1時間インキュベートし、ThermoLabsystemsのLuminoskanAscent機でさらに1分の誘導期間後にルミネセンスルシフェラーゼ活性を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光ユニットRLU/sとして測定する。データをAscentソフトウェア2.4.2.で処理し、誘導倍率のグラフをコントロールに対する相対値としてエクセルで描いた。形質移入した細胞を活性型カスパーゼ3/7の活性を阻害するカスパーゼ3/7阻害剤でインキュベートし、アポトーシス反応の特異性を実証するために用いた。さらに、スタウロスポリン、カンプトセシンまたはタキソールで誘導される細胞は、ポジティブコントロールとして役目を果たす。図3Aおよび図3Bを参照アネキシンV-FITCフローサイトメトリー解析1×106のHeLa細胞を形質移入前日にT75フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を37°CのOptiMEMで1回洗浄し、次に2.5μg/mlのLipofectamine2000Invitrogenを含むOptiMEM7mlを加えた。細胞を7分間インキュベートし、OptiMEMで終濃度1~25nMに希釈した1700μlのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理4時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、10mLの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を24~72時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、PBSで2回洗浄した。2×105細胞を5μlのアネキシンV-FITCと10μlのヨウ化プロピジウムヨウ化プロピジウム-10mg/mlで15分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンV-FITC添加前の精製した組み換えアネキシンV-FITC10μgでの形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、TRAILApo2Lを誘導したHeLa細胞0.5μg/mlをポジティブコントロールとして用いた。0.6×106のU373細胞を形質移入前日にT75フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を37°CのOptiMEMで1回洗浄し、次に2.5μg/mlのLipofectamine2000Invitrogenを含むOptiMEMの7mlを加えた。細胞を7分間インキュベートし、OptiMEMで終濃度1~25nMに希釈した1700μlのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理6時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、10mLの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を24~48時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、PBSで2回洗浄した。2×105細胞を5μlのアネキシンV-FITCと10μlのヨウ化プロピジウムヨウ化プロピジウム-10mg/mlで15分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンV-FITC添加前の精製した組み換えアネキシンV-FITC10μgでの形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、U373細胞を誘導したスタウロスポリン0.2μg/mlをポジティブコントロールとして用いた。図4Aと図4Bを参照実施例12:LNAオリゴヌクレオチドによる増殖阻害細胞を、実施例11に従って処理した。増殖中の生細胞の測定MTSアッセイ形質移入の前日に、透明な96穴プレートScientificOrangeno.1472030100にウェルあたり7000細胞の密度でDMEM培地中にU373細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたOptiMEMで1回洗浄し、次にLipofectamine2000Invitrogen2.5μg/mlを含む72μlのOptiMEMを加えた。OptiMEMで希釈した18μlのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を7分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、5nMから100nMの範囲だった。処理6時間後、細胞をOptiMEMで洗浄し、血清を含む100μlのDMEMを加えた。処理済みのU373細胞の同様の96穴プレートを、回収時間までAnaerocultバッグMerck中に96穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧/酸素欠乏下で培養した。生細胞は、示された時間に20μlのテトラゾリウム化合物[3-4,5-ジメチル-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム、内塩、MTS]と電子結合試薬フェナジンエトサルフェート、PESCellTiter96登録商標AqueousOneSolutionCellProliferationAssay、Promegaを加えることで測定した。生細胞は、PowerwaveBiotekInstrumentsで490nmと650nmで測定した。増殖率の阻害ΔOD490~650nm/hを模擬物100として比較してLNAオリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。図5Aと図5Bを参照実施例13:LNAオリゴヌクレオチドのインビボでの取り込みと標的の下方調節有毛マウスを14日間の期間中、毎日または週2回5回のいずれかで、食塩水または配列番号1またはその様々なチオール化物を腹腔内注入した。配列番号5は部分的にチオール化されておりギャップ内、一方、配列番号6はホスホジエステル骨格がチオール化されている。マウスを所定の毎日または毎週2回、総用量10mg/kg/14日、50mg/kg/14日、または250mg/kg/14日で処置した。組織からのRNA精製とcDNA合成約10mgの組織を1のメルカプトエタノールを添加した400μlのRTL緩衝液Qiagen中でホモジナイズした。全RNAはRNeasyminikitQiagenを用いて製造会社の取扱説明書に従って単離した。ランダムデカマーとM-MLV-ReverseTranscriptase基本的に、製造会社Ambionの記載どおりを用いて一本鎖合成を行った。各試料の全RNA0.25μgを10.8μlに水で調節し、2μlデカマーと2μlのdNTPミックス各2.5mMを添加した。試料を70°Cで3分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、2μlの10xRT緩衝液、1μlのM-MLV-ReverseTranscriptase、0.25μlのRNase阻害剤を含む3.25μlの混合物を添加した。cDNAは、42°Cで60分間合成し、次いで95°Cで10分間の加熱不活性化を行い、最後に4°Cに冷却した。定量リアルタイムPCR解析処置済みおよび無処置のマウスのHIF1αmRNAの相対濃度を決定するため、cDNAをBioRADのiCyclerを用いた定量PCR解析に用いた。5倍希釈したcDNA8μlに、29.5μlのPlatinumqPCRSupermix-UDGInvitrogen、各1030nMのプライマー、0.57×SYBRGreenMolecularProbes、および11.4nMのフルオロセインMolecularProbesを含む52μlの混合液を添加した。25μlの二組をQ-PCRに用いた。50°Cで120秒、95°Cで120秒、95°Cで30秒と60°Cで60秒を40サイクル。HIF1amRNAの発現は、同様にQ-PCRで定量したマウスβ-アクチンmRNAで正規化した。mHIF1a:5’-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3’配列番号30、および5’-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3’配列番号31mβ-アクチン:5’-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3’配列番号32、および5’-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3’配列番号33mVEGF:5’-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3’配列番号34、および5’-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3’配列番号35mGAPDH:5’-AGCCTCGTCCCGTAGCAAAAT-3’配列番号38、および5’-GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT-3’配列番号39BCL-2:フォワード:5’-gccctgtggatgactgagta-3’配列番号36、およびリバース:5’-cagccaggagaaatcaaacag-3’配列番号37。無処置のマウス線維芽細胞Ltk細胞5倍に希釈され、HIF1αとβ-アクチンの両方を発現しているから合成したcDNAの2倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。HIF1αmRNAの相対量は、iCycleriQRealTimeDetectionSystemソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。組織からのLNAオリゴヌクレオチド抽出約100mgの組織を500μlの抽出緩衝液1mg/mlのRNaseAを含む、0.5のIGEPALCA-630、25mMトリスpH8.0、25mMのEDTA、100mMのNaCl中で機械的にホモジナイズし、37°Cで一晩インキュベートした。500μlに基準オリゴヌクレオチドを加え、フェノール-イソアミル-クロロホルム25:1:24v/v/v1mlを加えて抽出した。水層を新しいチューブに写し、再度抽出した。必要であれば、抽出物を凍結乾燥した。抽出したLNAオリゴヌクレオチドのIEXHPLC解析試料50μlをguardcolumnDNAPacPA-1002×250mm、Dionexを備えたDNAPacPA-1002×50mm、Dionexカラムにかけて分離した。カラムを40°Cに加熱した。流速は0.25mL/分で、検出波長は260nmだった。移動相の勾配は、A:トリス20mM、EDTA1mMおよび過塩素酸ナトリウム10mMpH7.6。B:トリス20mM、EDTA1mMおよび過塩素酸ナトリウム1MpH7.6。0-13分、A:20、B:20。14-18分、A:40、B:60。22-28分、A:0、B:100。33-38分、A:80、B:20。図6Aおよび図6Bは、インビボの取り込み組織gあたりμgと標的の下方調節上述どおり配列番号1の毎日または週2回、14日間の投与後の食塩水処置マウスに対するβ-アクチンの発現と関連づけたHIF-1amRNA発現の阻害を示す。図6Cは、配列番号1を有毛マウス腹腔内への14日間連日注入後のインビボでの内因性の腎臓標的の下方調節を示す。図7Aは、配列番号1が連日の投与でHIF-1a発現をQ-PCRで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。図7Bは、配列番号1が週2回の投与でHIF-1a発現をQ-PCRで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。図7Cは、配列番号1が連日の投与でHIF-1a発現をQ-PCRで測定した場合の腎臓における有力な阻害剤であることを示す。実施例14:U373異種移植腫瘍を有するマウスにおける配列番号1のインビボでの有効性ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するオリゴヌクレオチド治療の作用は、様々な腫瘍細胞株を用いて可能である。当該細胞株の例は、ヒト腫瘍細胞株U87膠芽細胞腫、U373膠芽細胞腫、15PC3前立腺癌、PC3前立腺癌、DU145前立腺癌、LNCap前立腺癌およびマウス腫瘍細胞株B16黒色腫である。ヌードマウスにおけるLNAオリゴヌクレオチドを用いた皮下腫瘍異種移植片の処置。腫瘍細胞を皮下に移植し、その後、3回の連続移植により連続的に継代した。1mmの腫瘍小部分をNMRIヌードマウスに外套針で皮下に移植した。あるいは、300μlのMatrigelBDBioscienceに一般的には106~107で懸濁した癌細胞をNMR1ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。マウスを5mg/kg/日で腹腔内注射した。個別のマウスの処置は、腫瘍体積が50mm3に達した時に開始した。PBSでの処置は、コントロール群食塩水処置の平均腫瘍体積が50mm3に達した時に開始した。実験は、任意の群の腫瘍が最大許容サイズに達した時に収量した。全マウスの腫瘍サイズをキャリパーで毎日測定した。処置の効果は、腫瘍サイズと腫瘍成長速度として測定した。配列番号1を使った別の検討では、U373ドナーマウス由来の致命的な腫瘍片を、ヌードマウスの卵巣の脂肪組織上に移植する0日目。移植後4日目と9日目に、マウスを50mg/kg腹腔内でLNAオリゴヌクレオチドで処置する。マウスを最後の投与11日目の2日後に屠殺し、腫瘍の重量測定とCD-31抗体による腫瘍の染色を行う図8Aと図8Cを参照。図8Bおよび8Cは、配列番号1で処理した異種移植片由来のU373における血管密度を示す。図10Dは、QPCRで測定したU373腫瘍におけるHIF-1αmRNA発現を示す。配列番号1を、50mg/kgで週2回、1週間、卵巣に移植されたU373異種移植マウスに投与した。最後の投与2日後、動物を屠殺した。血管密度はCD31染色後に総面積と関連づけて計算した。食塩水群とスクランブルコントロール配列番号12処置したマウスとの間に統計的有意差P=0.005があった。実施例15:肝臓と腎臓における配列番号1の組織半減期と標的ノックダウンメスのNMRIマウス60匹約25gを5群に分け、30mg/kgの配列番号110ml/kg、2.5g/mlを0、3、7、10および14日目に腹腔内投与した。14日目に群を屠殺した。コントロール群には0.9食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。図11は、30mg/kgの配列番号1の腹腔内投与5回後のマウスのインビボでの取り込み組織gあたりμgと標的の下方調節β-アクチンの発現と関連づけたHIF-1aおよびVEGFmRNA発現の阻害を示す。実施例16:インビボにおける作用の持続時間とLNAオリゴヌクレオチドの取り込み作用の持続時間:メスのBalb/cA-nuマウス20匹約25g、前立腺癌細胞株PC3ECACC90112714を5群に分け、25mg/kgの配列番号710ml/kg、2.5g/mlを7から13日目まで毎日、腹腔内投与した。投与1日後と5日目に群を屠殺した。コントロール群には0.9食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。図10Aは、処置後1日目と5日目のmRNA発現の作用持続時間を示す。LNAオリゴヌクレオチドの取り込み:ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。組織をホルトHolt溶液スクロース30g、アカシアゴム1g、チモール15mg、蒸留水100ml中に一晩置き凍結した。4my’sの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、DAPI溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化した。図10Bは、Fam標識した配列番号1で25mg/kg/日、7日間処置して最後の処置後5日目に屠殺したマウスの肝臓、腎臓および腫瘍の組織の組織学的結果を示す。皮膚の写真は同じ方法で処置したマウスのものであるが、最後の処置後、その日に屠殺し、皮膚の基底細胞の弱い染色を見るために下の青線露出オーバーにした。これらの結果は以下を示唆する:肝臓:肝細胞の染色は主に細胞質に局在した。腎臓:近位細管の非常に強い染色と遠位尿細管のより弱い染色。腫瘍:内皮細胞、マクロファージが染色されたマウス細胞。皮膚:真皮内皮細胞およびマクロファージ、ならびに表皮の基底層の細胞質に強い染色。実施例17:インビボにおけるLNAオリゴヌクレオチドの取り込みと有効性当日、0.3×10-6細胞PC3とHT29を300μlのMatrigelと混合し、メスのBalb/cA-nuマウス約25gに移植した。7、10、13、17日目、食塩水、fam標識した配列番号1配列番号7、またはfam標識した配列番号8配列番号20を5mg/kg/日でマウスに腹膜注射した。最後の投与の3日後20日目または10日後27日目、動物を屠殺した。食塩水コントロール群には0.9食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日RNAを調製し、HPLC解析によるLNAオリゴヌクレオチド含量の測定またはHIF-1amRNAの下方調節を解析した図10C-Eを参照。LNAオリゴヌクレオチドの可視化:ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。組織をホルトHolt溶液スクロース30g、アカシアゴム1g、チモール15mg、蒸留水100ml中に一晩置き凍結した。4my’sの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、DAPI溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化したデータは図10Bと同じ生体内分布を示している。データは示さず。。実施例18:HIF-1αとVEGFのインビボでのLNAオリゴヌクレオチドの特異性の検討ミスマッチの検討:メスのNMRIマウス15匹約25gを5群に分け、30mg/kgの配列番号1または配列番号910ml/kg、3.0g/mlを0、3、7、10および14日目に30秒にわたって腹腔内投与した。コントロール群には0.9食塩水を投与した。最後の注入の3~4時間後、群を屠殺した。組織試料を採取し、後日RNAを調製した。図11は、3日毎の30mg/kgでの配列番号1の5回投与後のHIF-1aとVEGFのインビボでの肝臓の内因性の標的下方調節を、1ミスマッチコントロールの配列番号9と比較して示す。実施例19:配列番号1の14量体版のインビボでの有効性メスのNMRIマウス0.025kgを5mg/kg/日の配列番号1で腹腔内注射により処置した。5群に分け、食塩水動物はコントロール動物の役目を果たし、0.9食塩水を投与した。投与1日後と10日目に5匹を屠殺した。方法と材料の記載どおりに、組織試料を採取し、後日RNAを調製し、QPCRによりHIF-1amRNA発現を測定してβ-アクチンで正規化した。実施例20:大動脈輪の3次元培養の調製新脈管形成は、当初ラットの大動脈で報告された方法Massonetal.,2002BiolPreocedOnline41p.24-31を改変して、マウスの大動脈の輪を3次元コラーゲンゲル中で培養することで検討した。有毛マウスを10mg/kgから50mg/kgの範囲の用量のLNAオリゴヌクレオチドで1回静脈投与した。投与後3日目に、マウスから胸大動脈を除去し、頸椎脱臼により屠殺し、直ちに、10ウシ胎仔血清を含む氷冷したRPMI培地Invitrogenを入れた培養皿に移した。精密な顕微解剖用鉗子と虹彩切除用の剪刀を用いて、大動脈壁を損傷しないよう特別の注意を払って大動脈周辺の線維脂肪組織を注意深く除去した。1mm長の大動脈の輪大動脈あたり約15、最大大動脈の1.5cmを薄切し、FBSを含むRPMIの3回の連続洗浄で広範囲に洗浄した。次に、マウス大動脈のリング形の移植片を96穴プレートのウェル内の60μlのmatrigelBDBiosciences、Matrigel:356234に埋め込んだ。大動脈を挿入後、さらに40μlのmatrigelを加え、37°Cで10分間おいて凝固させた。成長因子を含む、また含まない100μlのEGM2Cambrixをウェルに加える。コントロールとして、大動脈の輪を10μMのシスプラチンを含むさらにEGM2培地で覆った。培地は、2日ごとに交換した。実施例21:3H標識した配列番号1の単回静脈内投与後のマウスにおける定量的全身オートラジオグラフィー研究メスのC57B1/6Jマウス9匹8週、Taconic,DKに1.5mCi/kgの3H-配列番号1を50mg/kgで各試験品目を尾静脈に静脈内投与した。3H-配列番号1は155μCi/mLの比活性を有した。各動物に投与した容量は、試験製剤10mL/kgだった。個別のマウスを、各試験品目の投与後5分、15分、1時間、4時間、24時間、2日、4日、7日および18日目に屠殺した。全身オートラジオグラフィーのために、マウスをイソフルランで麻酔し、次にドライアイスで-80°Cに冷却したヘキサンに直ちに浸したABR-SOP-0130/04。凍結した死体を含水カルボキシメチルセルロースCMCゲルに包埋し、ドライアイス-80°Cで冷却したエタノールで凍結し、標準的な方法に従って全身オートラジオグラフィー用に矢状に切断したABR-SOP-0131/04。約-20°Cの温度で凍結ミクロトームLeicaCM3600で、異なる水平面の20μmの切片を各動物から切り出した。得られた切片をテープMinnesotaMiningandManufacturingCo.,No.810で固定し、放射性のインクで連続的に番号を付けた。-20°Cで約24時間凍結乾燥した後、選択した切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレートFuji,Japan上に置いた。対象の組織と器官を最も良く示す切片をホスホイメージャー用に選択した。3Hの較正基準のセットと共に、切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレート上に置いた。3Hが低エネルギーであるため、タルク粉末をイメージングプレートを保護するプラスチックフォイルの代わりに用いた。イメージングプレートを遮光カセットに入れ、環境放射から保護するために鉛の遮蔽箱中で3~7日間、室温で露出した。露出後、イメージングプレートをBAS2500FujiFilmSverigeAB,Swedenを用いてピクセルサイズ50μmでスキャンした。対象の組織と器官をAIDA、バージョン2.43Raytest,Germanyを用いて定量した。3Hの放射活性の水溶性標準試験液を全血と混合し、較正尺度の作成に用いた。標準系列は、65.44から0.30nCi/mgまでの10希釈段階で構成される。定量の目的のため、全ての組織は全血と同様の密度とクエンチング特性を有すると見なした。組織密度は、1g/mlと決めた。定量限界は、バックグラウンドの8回の測定の平均濃度値とこれらの測定の標準偏差値の3倍の和と定義した。様々な組織および器官が、オートラジオグラフィー上または相当する組織切片上のいずれかで特定された。本研究で使用されるブドウ膜という用語は、構造、脈絡膜、眼の強膜を含むメラニンを示す網膜色素上皮を含む。図14Aおよび14Bを参照実施例22:配列番号1を形質移入したHUVEC細胞のウェスタンブロット正常なヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECは、Cambrix-EGM2培地中で培養し、実施例の記載どおりに2nMまたは5nMの配列番号1あるいは5nMの配列番号8を形質移入した。形質移入後、細胞を低酸素1酸素に16時間曝した。実施例の記載どおり回収時に細胞をPBSで洗浄し、SDSを含む溶解緩衝液中で溶解した。50μgをトリス-酢酸ゲルにローディングし、150Vで1時間泳動した。ウェスタンブロットを実施例の記載どおりに行い、ブロットを抗ヒトHIF-1a1:500中でインキュベートし、高感度化学発光で可視化した。配列番号1による強力な下方調節が見られたが、一方スクランブルコントロールの配列番号8は、HUVEC細胞においてHIF-1a発現を下方調節しなかった。実施例23:インビトロでの管形成/毛細管様構造形成アッセイMatrigelを用いて、管形成の誘導を行ったVenetsanakosE,MirzaA,FantonCetal.,Inductionoftubulogenesisintelomerase-immortalizaedhumanmicrovascularendothelialcellsbyglioblastomacells.ExpCellRes2002;273:21-33。早過ぎる重合を防ぐためにMatrigelを氷上で解凍し、50μlの小分注を96穴の組織培養プレートNuncの個別のウェルに入れ、37°Cで少なくとも30分間重合させた。形質移入したHUVEC細胞をトリプシン0.05-EDTA処理で剥離した。細胞を血清を含む培地で洗浄し、次いで2-×105細胞/mlに再懸濁した。各培養ウェルに形質移入した、または形質移入されていない100μlのHUVEC細胞懸濁液を増殖因子FBS2と共にVEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、hEGFおよびヘパリンを含む培養液に加えたn=10。スクランブルコントロールオリゴ配列番号8で形質移入したHUVEC細胞だけでなく、無処理の偽形質移入細胞をコントロールとして用いた。コントロールまたは試験化合物の用量は、6~10の個別のウェルでアッセイし、実験は少なくとも3回行った。管形成の定量のため、ウェルの写真を撮影した。図13参照実施例24:脾臓、骨髄および末梢血の細胞への取り込みのFACS解析メスのNMRIマウス0.025kgをFam標識した配列番号1、配列番号750mg/kgまたは同等の分子数のFamアミダイト3mg/kgで、または0.9食塩水で処置した。細胞を注射1時間後に殺し、脾臓、末梢血0.1アザイドナトリウムと50mlヘパリン硫酸を含む1mlのPBSに1mlを添加し、氷上に置く、または骨髄由来の細胞を回収した。脾臓脾臓を金属メッシュ上に置き、アザイドを含む1mlのR1010FCSを含むR10組織培養培地で湿らせる。組織をメッシュに押しつけ、合計4mlのR10アザイドで洗い流す。0.5mlの組織懸濁液を取り、残りを廃棄する。50mlの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて室温で10分間放置して赤血球を溶解させる。2000rpmで10分遠心。必要であれば、残りの赤血球を除去するために、この工程を反復する。細胞を数え、ブロッキングする。細胞を遠心して沈殿させ、アザイドを含む1.0mlのFACS緩衝液に再懸濁する。ブロッキングのために脾臓当たりの細胞数を5×106と見なし、細胞100万個あたり5μlのマウスCD16/D32を加える25μlのブロッキングを添加する。末梢血50mlの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて赤血球を溶解させる。細胞を遠心沈殿させ、必要であれば工程を反復する。細胞をPBSで1回洗浄し、再懸濁して細胞数を数える。非特異的な抗体の結合は、細胞100万個あたり5μlの割合でマウスCD16/D32を加えることによりブロックする。室温に10分間放置し、次に染色を続けて行った。骨髄滅菌した剪刀を用いて、できるだけ各端に近いところで骨を切断する。1mlの滅菌PBSを25ゲージの針を付けた1mlシリンジに吸い上げる。針を骨の一端に挿入する。通常、膝で最も容易である。PBSを骨の中に勢いよく流し入れる。骨がきれいになるまで繰り返す。髄を粉砕するために、骨髄を針で数回吸い上げる。赤血球の数が気になる場合は、上述の様に溶解の工程を用いることが出来る。細胞を数え、上述どおりにブロッキングする。骨髄培養のために、150,000細胞を氷上の滅菌したエッペンドルフチューブに入れる。FACS染色特異的マーカーを用いて系統染色を行う。以下に記載の通り:染色1.CD4APC、CD8PEFITC、7AADT細胞2.Gr-1PE、f4/80APC好中球、マクロファージ3.Gr-1PE、Mac-1APC脊髄単球4.CD34PE系統APC幹細胞5.B220APC、CD19PEB細胞6.CD11bPE、CD11cAPC樹状細胞アイソタイプ7.アメリカンハムスターIgG1APCCD11c8.ラットIgG2aAPCCD4、B2209.ラットIgG2aPEcd8a、CD19、CD3410.ラットIgG2gPEGr-1CD11b。染色を96穴ウェル内で行い、100μlのブロッキングした細胞の総数を100μl染色ミックスアイソタイプコントロールまたは特異的系統マーカーのいずれかで染色する。染色は氷上で行い、30分間放置した。細胞を2000rpmで2分間遠心する。上清を吸い取り、細胞を200μlのFACS緩衝液で洗浄し、遠心のステップを反復する。合計3回洗浄する。最後に、細胞を200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、既に200μlのFACS緩衝液と5μlの7AADが入っているFACSチューブに加える。BectonDickinsonFACSCaliburを用いてFACS解析を行った図15を参照。配列番号7の投与後5日目に、内皮細胞、顆粒球、およびCD4リンパ球および末梢血のマクロファージ、骨髄の樹状細胞と顆粒球、脾臓の顆粒球はfam標識に染色陽性であることが示された。実施例25:カニクイザル組織におけるHIF-1αと配列番号1の内容のオリゴヌクレオチド肝臓、腎臓を含むカニクイザル組織における主要な毒性研究では、試料を急速凍結し-70°Cでその後の解析のために保存した。図16Aと16Bを参照サルは、0、6、10、40mg/kg/回で週2回4週間、静脈注射で処置された。0、10、40mg/kg/回の投与を受ける動物の群では、一部の動物はその後に4週間の処置なしの回復期間を設けた。実施例13の記載の試料からRNAを抽出してHIF-1amRNA含量を実施例8の記載どおりに測定した図16A参照。オリゴヌクレオチド含量は、以下の記載どおりに測定した図16B参照。試料調製:肝臓と腎臓組織からの抽出化学薬品と試薬:プロテイナーゼK25.1mg/ml:SigmaP4850。フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール25:24:1v/v/v、10mMトリス、pH8.0、1mMのEDTA:SigmaP2069。IgepalCA-630:Sigma,I8896。抽出緩衝液:0.5のIgepalCA-630、25mMトリスpH8.0、25mMのEDTA、100mMのNaCl、pH8.01NのNaOHで調整。1mg/mlのプロテイナーゼKを含む抽出緩衝液:毎回の抽出前に調製。組織約100mgを測り取る組織は秤量前後はドライアイス上に置く。500μlのプロテイナーゼK含有1mg/ml抽出緩衝液を加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを37°Cで一晩インキュベートする。基準試料は、配列番号2を抽出緩衝液に溶解して調製する。無処置の動物からちょうど100mgの肝臓組織を測り取る組織は秤量前後はドライアイス上に置く。基準材料を含む抽出緩衝液プロテイナーゼK含有、1mg/mlを総量0.5mlの組織試料に加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを37°Cで一晩インキュベートする。これらの試料からの配列番号2のシグナル検出は、処置した動物で認められる最低と最高の濃度に及ぶ標準曲線を作成するのに用いる。組織試料をスクリューキャップ付きの2mlのマイクロチューブに移す。1mlのフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール25:24:1v/v/vを加え、5分間激しく振る。4000rpmで15分間の遠心で、相の分離を行う。水相上相を新しいチューブエバポレーター適合に移し、500μlのミリQ水を有機層に加える最初の抽出の残り。チューブを再び5分間激しく撹拌し、次に4000rpmで15分間遠心115号室のSAN039する。水相1.抽出と洗浄からの水相をプールし、乾燥するまで蒸発させる80°C、窒素下。残留物を200μlのミリQ水でもどし、次に4000rpmで15分間の遠心を行う。解析のために、試料をHPLCバイアルに移す。肝臓および腎臓組織中のオリゴヌクレオチドのHPLC解析:抽出後、イオン交換HPLCで配列番号2を解析した。カラム:Dinex,DNApacPA100:2×50mm保護カラム,2×250mm分析カラムカラム温度:42°C注入量:50μl洗浄用溶媒:ミリQ水パージ用溶媒:ミリQ水検出UV:260nm。溶媒:緩衝液A:1mMのEDTA,20mMのトリス塩酸、10mMのNaClO4,pH7.61NNaOH緩衝液B:1mMのEDTA,20mMのトリス塩酸、1MのNaClO4,pH7.61NのNaOH実施例26:配列番号1を用いたインビボでの処置の作用持続時間有毛マウスを50mg/kgの配列番号1で単回腹腔内注射で処置した。各群5匹の動物を投与後1日目と10日目図9C参照、または投与後1、2、3、4、5、10日目図9Bを参照に屠殺した。HIF-1amRNA発現をリアルタイムQPCRで解析し、GAPDHAで正規化した。実施例27:目の疾患のインビボ角膜モデルマウスおよび麻酔:BALB/cマウス、6~8週齢。ケタミンとキシラジンの混合物それぞれ、120mg/体重kgと20mg/体重kgを用いてマウスを麻酔した。縫合で誘導した炎症性角膜新脈管形成のマウスモデル:過去に、StreileinJW,BradleyD,SanoY,SonodaY.Immunosuppressivepropertiesoftissuesobtainedfromeyeswithexperimentallymanipulatedcorneas.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996;37:413-424に記載の炎症性角膜新脈管形成CNVのマウスモデルを用いた。簡単に、直径2mmの角膜トレフィンを麻酔したマウスの角膜の中央に優しく置き、単に角膜中央領域に印を付ける。次に、3本の11-0縫合糸二本を基質に侵入させ、角膜外周の120°に渡って基質内に置いた。縫合糸を配置する外側の点は、正規化された新脈管形成反応を得るために、縁と2mmの角膜トレフィンで輪郭を描いた線の間の中間を選び、内側の点は2mmの角膜トレフィンの線から同じ距離だった。7日間同じ場所に残した。マウスを安楽死させ、角膜縁を摘出し、平面マウント二重免疫組織化学分析を行った。正常な角膜中の炎症性細胞の存在と角膜への動員を縫合1週間後に、摘出後10パラフォルムアルデヒド中で固定し、プラスチック包埋した角膜の連続切片をヘマトキシリンとエオジン染色して定量した。また、角膜に動員された炎症性細胞の特徴をさらに解析するため、角膜ホールマウントし、マクロファージマーカーCD11bで凍結切片の二重免疫組織化学分析を行った。切片はさらに内皮細胞CD31による血管、VEGFとVEGFRのマーカーで染色した。実施例28:角膜マイクロポケットアッセイ過去に記載のCaoY,etal.,VascularendothelialgrowthfactorCinducesangiogenesisinvivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998;95:14389-14394で、角膜マイクロポケットアッセイを行った。簡潔に、角膜マイクロポケットは、改良型vonGraefeナイフを用いて作成し、200ngのVEGF-A164RDまたは200ngの組み換えbfgfRDI,Flanders,NewJersey,USAを含むヒドロンポリマーで被覆したスクロースアルミニウム硫酸のマイクロペレット0.4×0.4mmを各ポケットに埋め込んだ。ペレットは、縁から0.6~0.8mmの場所に置き、抗生剤軟膏エリスロマイシンでその部位を覆い、そのままの場所で10日間放置したそれぞれ、n>5~10マウス。新脈管形成反応とリンパ管形成反応は、上述のCD31/LYVE-1の二重免疫染色を用いて定量した。下部の縁とペレットの間の血管対リンパ管の伸長は、両方の管のタイプに対して半定量的に4つのカテゴリーに等級付けした。0:管の伸長なし、1:下部の縁とペレットの間の距離の1/3未満の伸長、2:下部の縁とペレットの間の距離の1/3と2/3の間の伸長、3:管がペレットに達している。実施例29:乾癬のインビボモデルインビボでのヒト皮膚/SCIDマウスキメラヒトの皮膚の異種移植片は、以前Wrone-SmithT,NickoloffBJ:DermalInjectionofimmunocytesinducespsoriasis.JClin.Invest.1996,98:1878-1887で記載の方法に従って、7~8週齢のSCIDマウスTaconic,DKに同所的に移植した。簡潔に、1.5×1.5×0.5cmサイズのヒトの皮膚異種移植片をSCIDマウスの脇腹に吸収性5-0VicrylRapide縫合糸Ethicon,Somerville,NJで縫合し、Xeroform包帯剤KendallCo.,Mansfield,MAで覆った。付帯剤は1週間後にとりのぞき、動物は研究を通じて病原体なしで維持した。マウスは移植1~3週間後に配列番号1と配列番号7で50mg/kgで週2回、処置を行った。ヒト皮膚/SCIDマウスキメラは、2~3週間の処置後屠殺し、4mmのパンチ生検Bakerのパンチ生検、ComminsDerm,Miami,FLを各異種移植片から得た。生検は中性に緩衝されたホルマリンで固定し、パラフィン包埋および/またはトラガカントゴムSigmaChemicalCo.,St.Louis,MO上にマウントし、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結し、-80°Cで保存した。免疫染色皮膚のクリオスタット切片を、内皮細胞CD31/CD34、マクロファージcd11b、VEGF、VEGFRまたはHIF-1aなどの適切なマーカーで染色した。前述の切片をヘマトキシリン-エオジンで逆染色した。全てのスライドを検鏡し、写真撮影を行った。"