"着目のポリペプチドの生産方法であって、親のアスペルギルス細胞の変異体を培養し、ここで前記変異体は前記ポリペプチドをコードする第一の核酸配列を含んでなり、そして前記変異体は同一条件下で培養した時に少なくとも1つの着目の毒素を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産し;そして培地から前記ポリペプチドを単離することを含んでなる方法。前記変異体が、1または複数の毒素の生合成または分泌の原因となる少なくとも1つの遺伝子の変更の結果として前記毒素を少量生産する、請求項1に記載の方法。前記変異体が同一条件下で培養した時に前記毒素を親細胞よりも少なくとも約90少なく生産する、請求項1または2に記載の方法。前記毒素がシクロピアゾン酸、コウジ酸、3-ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記変異体が同一条件下で培養した時にシクロピアゾン酸と少なくとも第二の毒素を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記第二の毒素がコウジ酸またはアフラトキシンである、請求項5に記載の方法。前記変異体が同一条件下で培養した時に更に3-ニトロプロピオン酸を親のアスペルギルス細胞よりも少量生産する、請求項5または6に記載の方法。前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス亜群ユーロチウム、ケトサルトリア、スクレロクレイスタ、サトイア、ネオサルトリア、ヘミカーペンテレス、ペトロミセス、エメリセラおよびフェネリアからなる群より選ばれる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記着目のポリペプチドがアスペルギルス宿主細胞にとって生来である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記着目のポリペプチドが、同一条件下で培養した時に、親のアスペルギルス宿主細胞による発現に比較してアスペルギルス変異体宿主細胞により過剰発現される、請求項9に記載の方法。前記着目のポリペプチドがアスペルギルス宿主細胞にとって非相同である、請求項10に記載の方法。前記ポリペプチドが、ホルモンまたはそれの前駆体形、酵素もしくは酵素変異体またはそれの前駆体形、抗体またはそれの機能性断片、レセプターまたはそれの機能性断片、およびレポーターからなる群より選ばれる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。前記酵素がアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ペクチナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼおよびキシラナーゼからなる群より選ばれる、請求項12に記載の方法。着目の非相同ポリペプチドの生産に有用な毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞であって、同一条件下で培養した時にアスペルギルス親細胞に比較して少なくとも1つの毒素をより少量生産させるために該細胞が遺伝的に変更されていることを特徴とする変異体細胞。着目のポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、前記毒素の生合成または分泌の原因となる少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる第二の核酸配列とを含んでなる、請求項14に記載の変異体細胞。前記細胞が前記第一の核酸配列の少なくとも2コピーを含んでなる、請求項14または15に記載の変異体細胞。前記着目のポリペプチドが前記変異体細胞にとって生来である、請求項14~16のいずれか一項に記載の変異体細胞。前記着目のポリペプチドが前記変異体細胞にとって非相同である、請求項14~16のいずれか一項に記載の変異体細胞。前記毒素がシクロピアゾン酸、コウジ酸、3-ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる、請求項13~18のいずれか一項に記載の変異体細胞。前記毒素が、シクロピアゾン酸である第一の毒素と、コウジ酸、3-ニトロプロピオン酸およびアフラトキシンからなる群より選ばれる第二の毒素とを含んでなる、請求項13~19のいずれか一項に記載の変異体細胞。請求項13~20のいずれか一項に記載の毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞を獲得する方法であって、前記細胞は少なくとも1つの着目の毒素の生産を欠いており、親細胞を突然変異誘発にかけそして着目の毒素の生産が減少または除去されている変異体細胞についてスクリーニングすることを含んでなる方法。前記突然変異誘発がランダムである、請求項21に記載の方法。前記突然変異誘発が特異的であり、そして前記着目の毒素の生産または分泌に関係しており且つそれに必要であるヌクレオチド配列を変更するように行われる、請求項22に記載の方法。前記毒素の生合成または分泌の原因である少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる核酸配列を、アスペルギルス宿主細胞中の対応する生来の遺伝子との相同組換えを媒介する条件下で、前記遺伝子を不活性化するようにアスペルギルス宿主細胞中に導入し、それにより前記生来の遺伝子と不活性な変更遺伝子との置換を引き起こす、請求項23に記載の方法。着目のポリペプチドをコードする核酸配列をアスペルギルス親宿主細胞中に導入することを更に含んでなる、請求項21~24のいずれか一項に記載の方法。前記着目のポリペプチドがアスペルギルス細胞にとって生来である、請求項25に記載の方法。前記着目のポリペプチドがアスペルギルス細胞にとって非相同である、請求項25に記載の方法。請求項13~20のいずれか一項に記載の毒素欠失アスペルギルス変異体宿主細胞を獲得する方法であって、着目のポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、少なくとも1つの毒素の生合成または分泌の原因である少なくとも1つの遺伝子の変更を含んでなる第二の核酸配列とを、アスペルギルス親宿主細胞中に導入し;そして段階から前記第一および第二の核酸配列を含んでなる変異体を同定することを含んで成る方法。前記第一および第二の核酸配列の導入の前または後にアスペルギルス親宿主細胞を突然変異誘発にかけることを更に含んでなる、請求項28に記載の方法。前記突然変異誘発が、特異的もしくはランダム突然変異誘発、PCR作製突然変異誘発、部位特異的DNA欠失、挿入および/または置換、遺伝子破壊または置換技術、並びにアンチセンス技術からなる群より選ばれる1または複数の方法により達成される、請求項29に記載の方法。配列番号1に記載のものと実質的に同じ、ジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼをコードする核酸配列。糸状菌宿主株における類似遺伝子の破壊のための、請求項31に記載の核酸配列またはそれの活性断片の使用。前記糸状菌宿主株がアスペルギルス、トリコデルマ、ペニシリウムおよびフザリウム種からなる群より選ばれる、請求項32に記載の使用。アスペルギルスオリゼAspergillusoryzae株より得られる単離されたジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼであって、実質的に配列番号2のアミノ酸配列を有するジメチルアリル-シクロアセチル-L-トリプトファンシンターゼ;の対立遺伝子変異体;およびジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼ活性を有する、またはの断片からなる群より選ばれる、単離されたジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼ。1または複数のサイレント毒素遺伝子が除去されている、非相同ポリペプチドの発現に適当な変異体アスペルギルス細胞。前記1または複数の毒素遺伝子の全部または一部の不可逆的欠失または破壊により1または複数の毒素遺伝子が除去されている、請求項35に記載の変異体。前記アスペルギルス細胞がアスペルギルス亜群ユーロチウム、ケトサルトリア、スクレロクレイスタ、サトイア、ネオサルトリア、ヘミカーペンテレス、ペトロミセス、エメリセラおよびフェネリアからなる群より選ばれる、請求項35または36のいずれか一項に記載の変異体。前記毒素遺伝子が、シクロピアゾン酸、コウジ酸、3-ニトロプロピオン酸、エモジン、マルフォルミン、アフラトキシン、オクラトキシンおよびセカロン酸からなる群より選ばれる1または複数の毒素をコードする、請求項35~37のいずれか一項に記載の変異体。問題の前記毒素遺伝子がアフラトキシンをコードする、請求項35~38のいずれか一項に記載の変異体。前記毒素遺伝子がA.オリゼのアフラトキシンクラスターからの遺伝子であり、特にomtAaflRpksANor1fasbetafasalphavber1avnAord2からなる群より選ばれる、請求項35~39のいずれか一項に記載の変異体。親のアスペルギルス細胞がA.オリゼ、特にA.オリゼA1560である、請求項40に記載の変異体。前記アフラトキシン遺伝子がomtAおよびaflRから成る群より選ばれる、請求項41に記載の変異体。実験材料と方法1.菌株アスペルギルスオリゼAspergillusoryzaeA1560はIFO04177と同一である下記参照。アスペルギルスオリゼIFO4177:InstituteforFermentationOsaka財団法人発酵研究所;大阪府淀川区十三本町2丁目17-25より入手可能。WO9812300参照。JaL228:中性メタロプロテアーゼNpI遺伝子が破壊されているアスペルギルスオリゼ株;この株の作製はWO9812300に記載されている。BECh1:このCPA陰性アスペルギルスオリゼ株の作製は実施例1に記載される。BECh2:このCPA陰性KA陰性アスペルギルスオリゼ株の作製は実施例1に記載される。BECh3:このCPA陰性KA陰性アスペルギルスオリゼ株の作製は実施例1に記載される。BZ14:WO9217573に記載の通りToC90とphD450により同時形質されたアスペルギルスオリゼの株。JaL250:このアスペルギルスオリゼ株の作製は実施例6に記載される。寄託:プラスミドpJaL499を含有するE.コリ株は、1999年1月13日にDSMZDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH;MascheroderWeg1bD38124Brauschweigに寄託され、そして寄託番号DSM12622を付与された。2.遺伝子DMATS:この遺伝子は、麦角アルカロイドの生合成に関与する酵素であるジメチルアリル-L-トリプトファンシンターゼをコードする。DCATS:この遺伝子は、シクロピアゾン酸CPA生合成に関与する酵素であるジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼをコードする。pyrG:この遺伝子は、ウリジン生合成に関与する酵素であるオロチジン-5′-リン酸デカルボキシラーゼをコードする。3.プラスミドpAHL:このプラスミドはWO9707202に記載されている。pCaHj483:このプラスミドはWO9800529に記載されている。pCaHj493:このプラスミドは実施例2に記載される。pJaL335:このプラスミドはWO9812300に記載されている。pJaL499:このプラスミドは実施例4に記載される。4.培地と溶液緩衝液および基質として使用する薬品は少なくとも試薬用品質のものであった。スクリーニング培地11リットルあたりマンニトール30gグルコース10gコハク酸10gカザミノ酸3gKH2PO41gMgSO47H2O03gFeSO47H2O02g2,6-ジクロロ-4-アニリン2ppm寒天20g14NH4OHで最終pH56に調整。CoveNCove塩溶液50mlソルビトール218gデキストロース10g硝酸カリウム202g寒天35g脱イオン水1000mlCove塩溶液1リットルあたりKCl26gMgSO426gKH2PO476g微量金属溶液50mlCHCl32ml微量金属溶液1リットルあたりNa2B4O710H2O40mgCuSO45H2O400mgFeSO47H2O800mgMnSO42H2O800mgNa2MoO42H2O800mgZnSO47H2O8000mgG1gly酵母エキス18gグリセロール8724mlプルロニックPE61001ml水道水で1000mlに15MDU2BPマルトース9gMgSO47H2O02gNaCl02gK2SO404gKH2PO424g酵母エキス14gAMG微量金属01mlプルロニックPE6100002ml脱イオン水1000mlに最終pH50;接種前に10mlの50尿素を添加する。MDUIB1リットルあたりマルトデキストリンMD01450gMgSO47H2O10gNaCl10gK2SO420gKH2PO4120g酵母エキス70gAMG微量金属05mlプルロニックPE61001ml最終pH50;接種前に100ml培地あたり13mlの50尿素を添加する。AMG微量金属溶液1リットルあたりFeSO47H2O139gMnSO4H2O845gZnCl268gCuSO45H2O25gNiCl26H2O25gクエン酸≧30g微量金属溶液1mlKM2培地1リットルあたり酵母エキス25gKH2PO410gMgSO47H2O05gKCl05gFeSO4001gグルコース100g最終pHを60に調整固形プレートで使用する前に、KMZ培地を20gl寒天で凝固させる。コロニー増殖制限剤として300μllのTritonX100を添加する。ナカムラ培地1リットルあたりショ糖50gペプトン20gKH2PO45gCaHPO425gMgSO425g最終pHを60に調整。5.アッセイA.HPキャピラリー電気泳動によるCPAについてのアッセイ方法SupelcleanLC18SPEチューブ2mlのメタノールと2mlのMilliQ水でコンディショニングした、カタログNo57012のSupelco社製プレパック3mlカラム上での固相抽出により、キャピラリー電気泳動CE用に試料の1mlアリコートを調製する。溶液をカラムに強制的に流すために吸引マニホールドを使用する。3mlのMilliQ水で洗浄した後、3mlのメタノールを用いて試料を溶離させる。更に後処理せずに、溶出液をCE分析にかける。場合により形成した沈澱を遠心により除去する。CE分析は、HewletPackardフォトダイオードアレイCE装置3D-CEを使って行う。試料を10秒間かけて3400Pa34mbarの静水圧下で注入する。30°Cで50mmのキャピラリー有効長さ56cmを使用し、それを01MNaOHで1分間、次いで100mMホウ酸/NaOHpH91で5分間コンディショニングしておく。電圧を17kVに設定する。ピークを同定するのにUVスペクトルを常時収集するが、280nmで泳動を追跡する。標準試料として市販のシクロピアゾン酸を使用するSigmaCoStLouisMOUSAカタログNoC1530最低98純度。この方法の感度の下限は約1ppmである。B.薄層クロマトグラフィーTLCによるCPAについてのアッセイ方法1.平板培養物の分析寒天プラグはFiltenborgOFrisvadJCSvendsenJASimpleScreeningMethodforMoldProducingIntracellularMycotoxinsinPureCulturesAppliedandEnvironmentalMicrobiology45581585に記載された通りに分析する。2.液体培養物の分析上清の10μl試料をTLCプレートMerckSilicaGel60の対角の縁に適用する。メタノール:クロロホルム容量で1:2混合物中に50ppm25ppm5ppmおよび25ppmに溶解希釈したシクロピアゾン酸SigmaC1530を標準として使用する。まずプレートをCAPクロロホルム:アセトン:プロパン-2-オール=容量で851520中で15分間展開し、乾燥し、次いで上下逆反転して、もう半分をTEFトルエン:酢酸エチル:蟻酸=容量で5:4:1中で15分間展開する。あるいは、プレートをEMA酢酸エチル:メタノール:25水酸化アンモニウム=容量で16:8:2中とTEF中で各々15分間ずつ上記と同様に展開する。プレートをヒュームフード中で完全に1時間乾燥させた後、エールリッヒ試薬85mlの96エタノール中に溶かした2gの4-ジメチルアミノベンズアルデヒドに、37塩酸を添加したものを噴霧する。CPAは、CAP系中性系の場合は典型的な低い泳動度を有し、青紫色のマッシュルーム型スポットとして観察され、一方で酸性TEF系の場合は適用位置と展開剤の最前線の中間に細長く伸びた典型的なスミアを生じる。EMA系塩基性/アルカリ性系では、シクロピアゾン酸は小さい濃厚なスポットに集約される。プレートの直接外観検査によれば、≧25ppmのCPA濃度は紫色の帯状スミアまたはスポットとして展開系による観察することができる。卓上フラットベッドスキャナ-上でTLCプレートをスキャンし、次いで適当な画像処理プログラム本件ではPaintShopPro4を使って電子画像を加工および強調処理することにより、感度が5~10倍高められる。この分析の全感度は抽出なしで約05~1ppmCPAであり;抽出を使うと感度が少なくとも10倍高まる。C.キャピラリー電気泳動によるコウジ酸についてのアッセイ方法メタノールと10mMホウ酸/NaOH4MKClpH91でコンディショニングしたSupelcleanLC18SPEチューブカタログNo57012のSupelco社製プレパック3mlカラム上での固相抽出により、CE分析用に試料の1~3mlアリコートを調製する。溶液をカラムに強制的に流すために吸引マニホールドを使用する。3mlの10mMホウ酸/NaOH4MKClpH91と03mlの10mMホウ酸/NaOHpH91で洗浄した後、75mlの10mMホウ酸/NaOHpH91を用いて試料を溶離させる。更に後処理せずに、シクロピアゾン酸について上述した手順に準じて溶出液をCE分析にかける。場合により形成した沈澱を遠心により除去する。この方法の感度の下限は約6ppmである。D.薄層クロマトグラフィーによるコウジ酸についてのアッセイ方法試料のアリコートをCPAについて上述したのと同様にTLCプレートの対角の端に適用し、CPAと同じ溶媒系を使って展開する。乾燥したプレートに01MHCl中の1FeCl3を噴霧する。試料中のコウジ酸の存在は赤色スポットにより示され、対照として適用した純粋なコウジ酸によって生じた赤色スポットの強度と比較される。検出の下限は50ppmである。E.キャピラリー電気泳動による3-NPAについてのアッセイ方法キャピラリー電気泳動CE分析への準備としての試料精製の必要性は試料の伝導度に依存する。伝導度が10mS未満である場合、溶出緩衝液として01MKClを使ったVarianSAXアニオン交換体VarianInstrumetnsPaloAltoCA上でのイオン交換により試料を精製する。伝導度が100mSより大きい場合、2-ブタノールを使って試料を抽出する。その場合、酸性化/高塩処理による沈澱形成と、10mMTrisHClpH70中への沈澱の再溶解の後、2mlの試料を6mlのブタノールで抽出する。30°Cの温度でおよび25mMホウ酸/リン酸pH76のコンディショニング緩衝液を使う直径50μmで有効長さ56cmの未コーティングシリカのキャピラリーを使用するHP-CE装置ダイオードアレイ検出を用いる。試料を20秒間かけて静水圧下で注入する。電圧を30kVに設定する。この方法の検出の下限は6ppmである。F.薄層クロマトグラフィーによる3-NPAについてのアッセイ方法CPAについて記載したのと同様にTLCプレートに発酵液のスポットを適用しそして展開する。次いでWMajakRJBoseChromatographicmethodsfortheisolationofmiserotoxinandthedetectionofaliphaticnitrocompoundsPhytochemistry1310051010により記載された通りに、それらにジアゾ化p-ニトロアニリンを噴霧する。対照物質に対比したスポットの強度と位置が3-NPA濃度の尺度である。TLCプレート上での検出レベルは25~50ppmである。あるいは、100μl試料に50μlの1MNaOHと70μlのジアゾ化p-ニトロアニリンを添加することにより3-NPAを分光光度的にλ=540nm分析する。検出レベルは5~10ppmである。実施例1A.A.オリゼBZ14由来のCPA陰性株の作製アスペルギルスオリゼBZ14株の凍結乾燥胞子に1000Gy~1250Gyの最適線量でγ線を照射し、次いでその胞子を25~50コロニー/9cmプレートの密度においてスクリーニング培地1上に接種した。シクロピアゾン酸を生産するコロニーは、赤色の不溶性CPA-Fe錯体を形成するためスクリーニング培地1上に赤色の裏面コロニーの下側を生成する。照射した胞子から約50000個のコロニーをスクリーニングし、そして乳白色クリーム/白外観により特徴づけられる154のCPA欠失コロニーを分離した。再分離後、64の株がスクリーニング培地1のプレート上で非赤色裏面を保持した。TLCプラグアッセイにより、52個の株でCPAが検出されなかった。次いでそれらの株を、毒素誘発34°C、250rpmで5日間振盪フラスコ発酵条件下で、MDU1B培地中で培養した。36個の株がTLCにより測定した時に上清中に検出可能レベルのCPAを示さなかった。B.A.オリゼJaL228由来のCPA陰性株BECh1の作製JaL228の凍結乾燥胞子を上記と同様にγ線照射しそしてスクリーニングした。推定上のCPA欠失分離株を毒素誘発条件34°C、250rpmで5日間下でMDU1B培地上で振盪フラスコ培養し、そして上清をTLC法によりCPAについて分析した。上清はそのままでまたは抽出液として試験した。抽出用には、全試料のうちの50mlを10mlの01MHClで酸性化した。次いでこの混合物を70mlメタノール/クロロホルム1:2と共に3~5分間激しく振盪した。相分離後約3時間後、下層約25mlを300mlビーカーに移し、クロロホルムを蒸発させた。残渣を5mlのクロロホルム中に再溶解し、25mlビーカーに移し、そしてクロロホルムを蒸発させた。残渣を100μlのクロロホルム中に溶かした。上清またはクロロホルム抽出液10μlを20cm×20cmのTLCプレートの対角の縁に適用し、そしてアッセイに関する前掲の項目に記載した通りに処理した。BECh1を含む3つの株分離株がCPAを生産しなかった。C.CPA陰性KA陰性の株BECh2およびBECh3の作製BECh1をCoveN斜面上で培養した。胞子を001Tween中に35×106の密度に懸濁し、短波UV照射殺菌灯からの254nmにかけた。1~5生存率を生じるUV線量で照射した胞子をその後のスクリーニングに使用した。照射済胞子をKM2培地中に約07胞子/100μlの密度に希釈し、その100μlを96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに接種した。培養物を湿潤チャンバーの中に入れ、静止状態で34°Cにて5~7日間インキュベートした。次いで、増殖徴候を有する各ウエルに40μlの1FeCl3/01MHClを添加した。濃赤色の発色はコウジ酸KA生産を示し;発色がないのはコウジ酸生産を欠くコロニーを示す。あるいは、凝固させたKM2培地TritonX100により増殖制限上に胞子をまき、成熟コロニーが観察されたら、プレートを01MHCl中の1FeCl3で潅水させた。コロニーの周囲に赤色域がないものは、推定上の非コウジ酸生産株を示す。約7000のマイクロタイター培養物の中から、132個の推定KA陰性コロニー、すなわちFeCl3と発色反応を示さないものが単離された。しかしながら、一次KM2スクリーニング寒天プレート上で試験すると、該コロニーのうち1つもKA陰性であると確認されなかった。固形培地上と静止液体KM2培地中30°の両培地を使用したKA誘発条件下での陰性コロニーの再試験は、KA陰性変異体の数を11にまで絞り込んだ。それらの株を振盪フラスコ中で試験すると、8つの株でKAが生産された。残りの3つは、TLCにより調べたときにも直接上清をアッセイしたときにもどちらも発色反応を与えなかった。同様な並行培養において増殖させると、予想通り、対照株BECh1によりKAは生産された。分離株のうちの1つは異常な形態を示した。MDU1B上での長期増殖後、残りの2つの分離株をCPAとKAの両方について試験した。CPAもKAもどちらも検出されなかった。この2つの株をBECh2およびBECh3と命名した。D.既にCPA陰性で且つKA陰性である3-NPA陰性A.オリゼ株の作製BECh2株とBECh3株それぞれを上述したようなUV変異誘発にかけた。照射した胞子を96ウエルマイクロタイタープレート中で07生存胞子/100μlナカムラ培地の密度に希釈した。湿潤チャンバー中で30°Cにて5~7日間インキュベートした。増殖を示すウエルからの発酵ブロス試料を新たなマイクロウエルプレートに移して分光光度分析するかまたはTLCプレートに適用した。3-NPA陰性である株をナカムラ培地の入った振盪フラスコ中で再培養し、そして3-NPAについて分析した。3-NPA陰性である株を実施例2に記載の通りにpCaHj493により形質転換せしめ、そして形質転換体を実施例3に記載の通りに処理した。実施例2A.オリゼ株JAL228およびBECh1中でのリパーセ遺伝子の発現A.プラスミドpCaHj493の作製リパーゼプラスミドpAHLをBamHIとSalIで消化し、得られたリパーゼをコードする916bp断片を単離した。WO9800529に記載のpCaHj483をBamHIとXhoIで消化し、6757bpベクター断片を上記リパーゼ断片と連結せしめた。その連結混合物を用いてE.コリDH5α細胞を形質転換せしめ、そして所望のプラスミドを含有する形質転換体を単離した。得られたプラスミドをpCaHj493と命名した。B.JaL228およびBECh1中へのpCaHj493の形質転換ヨーロッパ特許出願第0531372号に記載のようなアセトアミド上での選択を使って、pCaHj493によりアスペルギルスオリゼ株JaL228およびBECh1を形質転換せしめた。形質転換体を2回胞子再分離した。各形質転換体の2回目の再分離からの胞子を、振盪フラスコ中とマイクロタイター皿培養においてリパーゼ生産について試験した。実施例3A.CPA陰性A.オリゼ株とCPA陽性A.オリゼ株におけるリパーゼ生産実施例2に記載のように調製した18個のJaL228形質転換体と30個のBECh1形質転換体を振盪フラスコ培養においてリパーゼ生産について調べた。形質転換体のCoveN斜面培養物を、10mlの01Tween溶液を使って収得し、胞子懸濁液を500mlのツーバッフルtwobaffled振盪フラスコに入れた100mlのG1Gly培地への接種材料として使用した。培養物を回転式振盪器上で34°Cにて250rpmで24時間インキュベートした。次いでG1Gly培養物の10mlを500mlの振盪フラスコに入った100mlの15MDU2BPに移し入れ、更に34°Cにて250rpmでインキュベートした。50時間後に試料を採取し、ミラクロスを通して濾過し、遠心分離した4000×g。単純放射状免疫拡散法ScandJImmunolVol17suppl104156HandbookofImmunoprecipitationinGelTechniquesNHAxelsen編、BlackwellScientificPublications1983を使って、上清中のリパーゼ濃度LUmlで表すを検出した。30個のCPA陰性BECh1形質転換体は、18個のCPA陽性JaL228形質転換体と同じかそれより高いリパーゼ収量を有した。表2はその分布の概観を与える。B.CPA陰性A.オリゼ株とCPA陽性A.オリゼ株によるキシラナーゼ生産検出可能なCPA生産を示さない10個の株実施例1Aで調製したものとCPAが検出可能である3個の株をキシラナーゼ生産について評価した。その結果を下記の表1に要約する。2列目の欄は、単純放射状免疫拡散法ScandJImmunolVol17suppl104156HandbookofImmunoprecipitationinGelTechniquesNHAxelsen編、BlackwellScientificPublications1983によりアッセイした時の真菌キシラナーゼ単位FXUで測定した振盪フラスコ培養で生産されたキシラナーゼの量を示す。この結果は、CPA陰性株がCPA陽性株に匹敵する量でキシラナーゼを生産できることを示す。C.CPA陰性KA陰性の株におけるリパーゼ生産2つのCPA陰性KA陰性株、BECh2とBECh3を実施例2に記載の通りにプラスミドpCaHj493により形質転換せしめた。得られた形質転換体を2回胞子分離した。各形質転換体の2回目の再分離からの胞子を実施例2に記載の通りにリパーゼ生産について試験した。表2は、それらの2つの株からの形質転換体のリパーゼ収量の度数分布を示す。その結果は、A.オリゼ株BECh1およびJaL228について与えられた値に比較して、得られる発現能力に何ら損傷がないことを示す。リパーゼ生産培養に使用したのと同じ胞子懸濁液から、CPA生産用のMDU1B振盪フラスコに接種を行い、そして上述したのと同様に5日間インキュベートした。項目5B2に従ってDPA分析を行った。BECh1株はいずれもCPAを生産しなかったが、一方で18個のJaL228株のうちの17個は25ppm超のCPAを生産し、大部分は100ppm超のCPAを生産した。実施例4A.オリゼDCATS遺伝子の同定およびゲノムクローニングA.A.オリゼのジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼDCATS遺伝子の同定cDNAクローンpJaL499は配列番号1に示すDNA配列を含有する。それはクラビセプスプルプレアClavicepspurpureaのジメチルアリルトリプトファンシンターゼDMATS遺伝子に対する相同性により、CPA生合成に関連することが同定されている。A.オリゼcDNAクローンの配列決定は、それが長さ1393塩基対配列番号1であり、クラビセプスプルプレア由来のDMATSと421同一である473アミノ酸ポリペプチド配列番号2をコードすることを示した。A.オリゼDCATSポリペプチドは、シクロアセトアセチル-L-トリプトファンからのβ-CPA生合成に関与しているNethlingDCMcGrathCanJMicrobiol23856872。JaL228株とBECh1株から染色体DNAを調製した。DNAをBglIINcoIXhoIおよびSpeIで消化し、そしてプローブとしてDCATS遺伝子を含むpJaL499由来の1kb32P標識BglIIDNA断片を使ってサザンブロッティングにより分析した。サザンブロット分析は、CPA生産株JaL228が1つのDCATS遺伝子を有し、一方でBECh1ではそのDCATS遺伝子が染色体から欠失していることを示した。B.DCATS遺伝子のゲノムクローンのクローニング次の制限酵素:EcoRISalIBbuIXhoIおよびXbaIを使って、プローブとしてDCATS遺伝子を含むpJaL499由来の1kb32P標識BglIIDNA断片を使って、A.オリゼDCATS遺伝子のゲノム制限地図作成を行った図1。これは、DCATS遺伝子の唯一のコピーが存在することを示す。JaL228のゲノムDNAをTsp509Iで部分消化するかまたは07アガロースゲル上で泳動した。7kbと10kbの間のサイズを有する断片を精製した。次いで精製済DNAを製造業者StratageneRにより提供されたプロトコルを使ってLambdaZAPII中にクローニングした。製造業者により与えられる教示に従って、λベクター内に含まれる任意のクローン挿入断片を生体内切除し、再環化せしめて、DNAライブラリー用にクローン化挿入断片を含むファジミドを作製した。標準方法の参考書例えばJSambrookEFFritschTManiatis編MolecularCloningALaboratoryManual第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYorkに概説されるように、プローブとしてDCATS遺伝子を含むpJaL499からの1kb32P標識DNABglII断片を使ったコロニーハイブリダイゼーションにより、DCATS遺伝子をコードするクローンについてスクリーニングを行った。実施例5アスペルギルスオリゼのジメチルアリル-シクロアセトアセチル-L-トリプトファンシンターゼDCATSの遺伝子破壊によるアスペルギルスオリゼCPA陰性株の作製選択マーカーとしてA.オリゼpyrG遺伝子を使って、A.オリゼのpyrG陰性株中のDCATS遺伝子を一段階遺伝子置換法BLMiller他,MolCellBiol517141721;GMayAppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi125頁JRKinghornGTurner編BlakieAcademicandProfessional1992により破壊した。A.DCATS破壊プラスミドの作製プラスミドpJaL499をSacIIで消化し、クレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、そして製造業者BoehringerMannheimの教示に従って細菌アルカリ性ホスファターゼで処理して5′リン酸基を除去し、次いでフェノール抽出しそして沈澱させた。WO9812300に記載のプラスミドpJaL335をHindIIIで消化してA.オリゼpyrG遺伝子を含む35kb断片を得、それをクレノウポリメラーゼで処理して平滑末端にし、ゲル電気泳動により単離し、そして精製した。次いで2つの断片を一緒に混合し、連結せしめた。E.コリ中への形質転換後、正しいプラスミドを担持しているコロニーをミニプラスミド調製物の制限酵素消化により同定した。破壊プラスミドpDCATSpyrGの作製を図2に要約する。B.pyrG陰性A.オリゼ株JaL250の単離A.オリゼ株JaL228を5-フルオロオロト酸に対する耐性についてスクリーニングし、自然pyrG変異体を同定した。JaL250と命名した1つの株がpyrG陰性であると同定された。この変異体はウリジン依存性であるので、それを野生型pyrG遺伝子を用いて形質転換し、そしてウリジンの非存在下での増殖能力により形質転換体を選択することができる。C.アスペルギルスオリゼDCATS欠失株の作製プラスミドpDCATSpyrGの49kbNotIEcoRI断片をゲル精製し、Christensen他、Biotechnology614191422により記載された通りA.オリゼ株JaL250を形質転換せしめるのに使った。次いでウリジン非存在下でのそれの増殖能力により形質転換体を選択した。2回再分離した後、実施例1に記載の通りにCPAを生産する能力について形質転換体をスクリーニングした。DCATS遺伝子が破壊されていることを確かめるために、CPAを生産しない形質転換体から染色体DNAを調製した。該DNAをEcoRIで消化し、DCATS遺伝子を含むpJaL499からの1kb32P標識DNABglII断片をプローブとして使ってサザンブロッティングにより分析した。DCATS遺伝子の破壊を有する形質転換体は、63kb上の野生型EcoRIバンドが98kb上のEcoRIバンドの方へ移動することにより識別される。実施例6BECh1とBECh2がアフラトキシン生合成経路クラスターからの2つの遺伝子を欠くことの確証A.オリゼIFO4177およびそれの多数の誘導体においてアフラトキシン生合成経路クラスター由来のaflRおよびomtAアフラトキシン遺伝子の存在を探求した。プライマー59565GGATCCAGGGCTCCCTGGAG3配列番号3と59555CCTGACCAGCCAGATCTCCT3配列番号4を使ったPCRにより、A.オリゼIFO4177のゲノムDNAからaflR相同体を単離した。09kbPCR断片を獲得し、それをInvitrogenから入手したベクターpCR2中にクローニングした。M13正40プライマーと逆プライマーを使って、得られたプラスミドpToC280を配列分析することにより、クローン化断片の素性を確認した。また、プライマー61205AGTGAGAGAACTCCCTCCTC3配列番号5と61215CCATATCTTCTCAGTCTCCA3配列番号6を使ったPCRにより、ゲノムIFO4177DNAからomtA相同体を単離した。12kb断片を得、それをInvirtogenからのベクターpCR2中にクローニングし、そして得られたプラスミドpToC276をM13正および逆プライマーを使って配列分析することにより、クローン化断片の素性を確認した。上記aflRおよびomtAのクローン化断片をハイブリダイゼーション実験における32P標識プローブとして使用した。IFO4177JaL228BECh1およびBECh2からのゲノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、生じた断片を07アガロースゲル上で分離した。DNAを膜上にブロッティングし、上記2つの32P標識プローブを一つずつ用いて緊縮条件下でハイブリダイズさせた方法はSambrookEFFritschTManiatis編MolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborNewYorkに記載されている。ブロットは、IFO4177とJaL228からの両プローブを用いたとき陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示し、一方でBECh1とBECh2DNAを含むレーンでは全くバンドが検出されなかった。IFO4177とJaL228レーンでは、omtAプローブを使って1つの約38kb断片が観察でき、aflRプローブを使った場合は約05kbと43kbの2つのバンドが観察できた。従って、A.オリゼIFO4177は、アフラトキシン生合成経路からの少なくとも2つの遺伝子、すなわちaflR遺伝子とomtA遺伝子を含有する。A.フラーブスおよびA.パラシチクスでは、この2つの遺伝子は約32kbだけ離れているWoloshukCPPrietoRFEMSMicrobiologyLetter160169176。IFO4177誘導体であるBECh1とBECh2には、それらの遺伝子のいずれも存在しない。本発明は、本明細書中に開示される特定の態様によりその範囲が限定されるものではなく、それらの態様は本発明の幾つかの面の例示として与えられるものである。任意の同等な態様も本発明の範囲内に含めることができる。実際、上記に例示および記載されたものに加えて、上記説明より本発明の様々な変更が当業者には明らかであろう。そのような変更は特許請求の範囲内に含まれるものである。様々な参考文献を本明細書中に引用したが、その開示の全内容が参考として組み込まれる。"