"2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートを産生するに十分な量にて発現された2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む、2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路を有する微生物を含み、上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼを含む、非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼまたは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼをさらに含む、請求項1に記載の非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼをさらに含む、請求項1に記載の非天然の微生物。3個の外因性核酸を含み、該3個の外因性核酸の各々が2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路酵素をコードする、請求項1に記載の非天然の微生物。上記3個の外因性核酸が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする、請求項4に記載の非天然の微生物。上記少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項1に記載の非天然の微生物。実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項1に記載の非天然の微生物。2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートを製造するための条件下で2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートを製造するに十分な期間にわたって、請求項1に記載の非天然の微生物を培養する工程を含む、2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートを製造する方法。上記非天然の微生物が実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項8に記載の方法。上記微生物が3個の外因性核酸を含み、該3個の外因性核酸の各々が2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路酵素をコードする、請求項8に記載の方法。上記3個の外因性核酸が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする、請求項10に記載の方法。上記少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項8に記載の方法。p-トルイル酸を産生するに十分な量で発現されたp-トルイル酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む、p-トルイル酸経路を有する微生物を含み、上記p-トルイル酸経路が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;またはコリスメートリアーゼを含む、非天然の微生物。2個の外因性核酸を含み、該2個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。3個の外因性核酸を含み、該3個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。4個の外因性核酸を含み、該4個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。5個の外因性核酸を含み、該5個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。6個の外因性核酸を含み、該6個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。7個の外因性核酸を含み、該7個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。8個の外因性核酸を含み、該8個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項13に記載の非天然の微生物。上記8個の外因性核酸が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼをコードする、請求項19に記載の非天然の微生物。2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路をさらに含む、請求項13に記載の非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼまたは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項22に記載の非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項23に記載の非天然の微生物。少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項13に記載の非天然の微生物。実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項13に記載の非天然の微生物。p-トルイル酸を製造するための条件下でp-トルイル酸を製造するに十分な期間にわたって請求項13に記載の非天然の微生物を培養する工程を含む、p-トルイル酸を製造する方法。上記微生物が実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項27に記載の方法。上記微生物が7個の外因性核酸を含み、該7個の外因性核酸の各々がp-トルイル酸経路酵素をコードする、請求項27に記載の方法。上記7個の外因性核酸が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼをコードする、請求項29に記載の方法。上記微生物が2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路をさらに含む、請求項27に記載の方法。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼまたは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項31に記載の方法。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項32に記載の方法。上記少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項27に記載の方法。テレフタル酸を産生するに十分な量で発現されたテレフタル酸経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含む、テレフタル酸経路を有する微生物を含み、上記テレフタル酸経路が、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;または4-カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含み、上記微生物が、p-トルイル酸経路をさらに含み、上記p-トルイル酸経路が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;またはコリスメートリアーゼを含む、非天然の微生物。2個の外因性核酸を含み、該2個の外因性核酸の各々がテレフタル酸経路酵素をコードする、請求項35に記載の非天然の微生物。3個の外因性核酸を含み、該3個の外因性核酸の各々がテレフタル酸経路酵素をコードする、請求項35に記載の非天然の微生物。上記3個の外因性核酸が、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;および4-カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、請求項37に記載の非天然の微生物。上記p-トルイル酸経路が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼを含む、請求項35に記載の非天然の微生物。2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路をさらに含む、請求項35に記載の非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼまたは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項40に記載の非天然の微生物。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項41に記載の非天然の微生物。上記少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項35に記載の非天然の微生物。実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項35に記載の非天然の微生物。テレフタル酸を製造するための条件下でテレフタル酸を製造するに十分な期間にわたって請求項35に記載の非天然の微生物を培養する工程を含む、テレフタル酸を製造する方法。上記非天然の微生物が実質的に嫌気性である培養媒体中にある、請求項45に記載の方法。上記微生物が3個の外因性核酸を含み、該3個の外因性核酸の各々がテレフタル酸経路酵素をコードする、請求項45に記載の方法。上記3個の外因性核酸が、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼ;4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ;または4-カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、請求項47に記載の方法。上記p-トルイル酸経路が、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;3-デヒドロキネートシンターゼ;3-デヒドロキネートデヒドラターゼ;シキミ酸デヒドロゲナーゼ;シキミ酸キナーゼ;3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;コリスメートシンターゼ;およびコリスメートリアーゼを含む、請求項45に記載の方法。上記微生物が2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路をさらに含む、請求項45に記載の方法。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼまたは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項50に記載の方法。上記2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート経路が、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートデヒドラターゼ、1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼおよび1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼを含む、請求項51に記載の方法。上記少なくとも1つの外因性核酸が異種性の核酸である、請求項45に記載の方法。実施例12-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートを生成するための例示的経路本実施例は、テレフタル酸PTA前駆体2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート2H3M4OPを生成するための例示的経路を記載する。p-トルイル酸経路およびPTA経路に対する前駆体は2H3M4OPである。この化学物質は、図1に示すような3つの酵素ステップにおける主要な代謝物であるグリセルアルデヒド-3-ホスフェ-トG3Pおよびピルビン酸から誘導され得る。最初の2つのステップは、Ecoli、および他の生物に対して天然であり、上記生物は、イソプレンの生合成のためのメチルエリトリトールホスフェート非メバロン酸経路を利用する。ピルビン酸およびG3Pは、まず、DXPシンターゼによって1-デオキシ-D-キシルロース5-ホスフェートDXPを形成するために縮合される。その後の炭素骨格の還元および再構成は、DXPレダクトイソメラーゼによって触媒される。最後に、新規なジオールデヒドラターゼは、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートをp-トルイル酸前駆体である2H3M4OPへ転換する。A.1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートDXPシンターゼ。ピルビン酸およびG3Pは、DXPシンターゼEC2.2.1.7によってDXPを形成するため縮合される。この酵素は、イソプレンの生合成のための非メバロン酸経路における最初のステップを触媒する。上記酵素は、補因子としてチアミンジホスフェートを必要とし、正価レドックス変化は存在しないが、還元型FADもまた必要とする。Ecoli酵素の結晶構造は利用可能である。M.tuberculosisBaileyetalGlycobiology12813820およびAgrobacteriumtumefaciensLeeetalJBiotechnol128555566009667pii101016jjbiotec200611009doiにおいて、他の酵素がクローニングされ、特徴付けられている。BsubtilisおよびSynechocystissp.PCC6803由来のDXPシンターゼ酵素が、Ecoliにクローニングされている003609pii。B.1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートレダクトイソメラーゼEC1.1.1.267。第2のステップにおいて、1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートDXPの2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートへのNADPH依存性の還元および再構成は、DXPレダクトイソメラーゼDXR,EC1.1.1.267によって触媒される。NADPH依存性のE.coli酵素はdxrによってコードされる。Ecoliにおいて、Arabidopsisthaliana由来のリコンビナント酵素は、機能的に発現させられた。ZymomonasmobilisおよびMycobacteriumtuberculosis由来のDXR酵素は特徴付けられ、結晶構造が利用可能である003827piiHenrikssonetalActaCrystallogrDBiolCrystallogr62807813。特徴付けられたDXR酵素のほとんどが、厳密にNADPH依存性である。しかし、A.thalianaおよびM.tuberculosisからの酵素は、低減した速度でNADHと反応するRohdichetalFEBSJ27344464458。この変換は、実験的に実証されていないが、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼEC4.2.1.9、プロパンジオールデヒドラターゼEC4.2.1.28、グリセロールデヒドラターゼEC4.2.1.30およびミオイノシトースデヒドラターゼEC4.2.1.44を含むいくつかの酵素が、同様の転換を触媒する。二級ジオール2,3-ブタンジオールを2-ブタノンへ転換し得るジオールデヒドラターゼまたはプロパンジオールデヒドラターゼ酵素EC4.2.1.28は、この転換のための優秀な候補である。アデノシルコバラミン依存性のジオールデヒドラターゼは、αサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットを含む。これらのサブユニットの全てが、酵素機能に必要とされる。例示的な遺伝子候補は、KlebsiellapneumoniaeTorayaetalBiochemBiophysResCommun69475480、Salmonellatyphimurium、KlebsiellaoxytocaおよびLactobacilluscollinoidesに見出される。他の生物におけるジオールデヒドラターゼ遺伝子候補を単離するための方法は、当該分野にて周知である例えば、米国特許第5,686,276号参照。グリセロールデヒドラターゼファミリーにおける酵素EC4.2.1.30はまた、2-C-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートを脱水するために使われ得る。例示的な遺伝子候補は、KlebsiellapneumoniaeにおいてgldABCおよびdhaB123WO2008/137403および、ClostridiumpasteuranumにおいてdhaBCEならびにCitrobacterfreundiiにおいてdhaBCEによってコードされる。K.pneumoniaeに由来する、80倍~336倍増強された活性を有するB12依存性ジオールデヒドラターゼの改変体は、最近、βサブユニットの2残基に変異を導入することによって操作された002582pii101016jjbiotec200906015doi。不活性化の動力学を減少させられたジオールデヒドラターゼ酵素が、error-pronePCRを用いて、デュポンDuPontによって開発したWO2004/056963。B12依存性ジオールデヒドラターゼを利用する場合、対応する再活性化因子の異種性の発現が推奨される。B12依存性ジオールデヒドラターゼは、基質およびいくつかの下流産物による、メカニズムベースの自殺活性に供される。不活性化コバラミンとの強い結合によって生じる不活性化は、ATP依存的なプロセスにおけるジオールデヒドラターゼ再活性化因子によって部分的に克服され得る。B12補因子の再生は、さらなるATPを必要とする。ジオールデヒドラターゼ再生因子は、2つのサブユニットのタンパク質である。Klebsiellaoxytoca、SalmonellatyphimuriumChenetalJBacteriol17654745482、LactobacilluscollinoidesおよびKlebsiellapneumoniaWO2008/137403において例示的な候補が見出される。B12依存性ジオールデヒドラターゼ酵素は、補因子としてS-アデノシルメチオニンSAMを利用する。グリセロールデヒドロゲナーゼ、およびClostridiumbutyricumの対応する活性化因子dhaB1およびdhaB2にコードされるが、十分に特徴付けられているRaynaudetalProcNatlAcadSciUSA10050105015。この酵素は、最近、E.coliの1,3-プロパンジオールを過剰に産生する系統において使用され、産物の非常に高い力価を達成し得た。Roseburiainulinivorans由来のさらなるB12非依存性ジオールデヒドラターゼ酵素および活性化因子が、2,3-ブタンジオールの2-ブタノンへの転換を触媒することが示された米国特許公開US2009/09155870号。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHAD,EC4.2.1.9は、分枝鎖アミノ酸の生合成に関与するB12非依存性の酵素である。この酵素の天然の役割において、2,3-ジヒドロキシ-3-メチルバレラートをイソロイシンの前駆体である2-ケト-3-メチル-バレラートへ転換する。バリンの生合成において、上記酵素は、2,3-ジヒドロキシ-イソバレラートの2-オキソイソバレラートへの脱水を触媒する。Sulfolobussolfataricus由来のDHADは、広い基質範囲を有する。E.coliに発現されたリコンビナント酵素の活性が、種々のアルドン酸に対して実証された。S.solfataricusの酵素は、多くのジオールデヒドラターゼ酵素と異なり、酸素に耐性である。E.coli酵素ilvDにコードされたは、酸素に感受性であり、その鉄-硫黄クラスターを不活性化する。同様の酵素が、NeurosporacrassaおよびSalmonellatyphimuriumにおいて特徴付けられている。ジオールデヒドラターゼmyo-イノソース-2-デヒドラターゼEC4.2.1.44は別の例示的候補である。myo-イノソースは、近接したアルコール基を含む六員環である。myo-イノソース-2-デヒドラターゼをコードする精製された酵素は、myo-イノソースの崩壊の観点で、Klebsiellaaerogenesにおいて機能的に研究されているが、今日まで、遺伝子と関連付けられていない。Sinorhizobiumfrediiのmyo-イノソース-2-デヒドラターゼがクローニングされており、E.coliに機能的に発現されている。B.subtilis由来の同様の酵素iolEにコードされるもまた、研究されている。実施例2シキミ酸経路酵素によって2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネートからp-トルイル酸を合成するための例示的経路。本実施例は、シキミ酸経路酵素を用いたp-トルイル酸の合成のための例示的な経路を記載する。p-トルイル酸の化学構造は、p-ヒドロキシ安息香酸電子キャリアユビキノンの前駆体と非常に近似している。4-ヒドロキシ安息香酸は、シキミ酸経路における酵素によって主要代謝性前駆体から合成され、細菌、植物および真菌に見出される。シキミ酸経路は、D-エリトロース-4-ホスフェートE4Pおよびホスホエノールピルビン酸PEPをコリスメートに転換する7つの酵素ステップから構成される。経路酵素としては、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼDAHPシンターゼ、デヒドロキネートDHQシンターゼ、DHQデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、5-エノルピルビニルシキミ酸-3-リン酸EPSPシンターゼおよびコリスメートシンターゼが挙げられる。上記経路の最初のステップにおいて、DAHPシンターゼによってD-エリトロース-4-ホスフェートおよびホスホエノールピルビン酸が結合されて、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロン酸-7-ホスフェートが形成される。この化合物は、次いで、脱リン酸、脱水および還元されて、シキミ酸が形成される。シキミ酸は、以下の3つの酵素の作用によってコリスメートに転換される:シキミ酸キナーゼ、3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼおよびコリスメートシンターゼ。引き続く、コリスメートの4-ヒドロキシ安息香酸への変換は、コリスメートリアーゼによって触媒される。p-トルイル酸の合成は、図2に示すような類似した様式で進行する。この経路は、PEPおよび2H3M4OPE4Pの3-ヒドロキシル基の代わりにメチル基を有するE4Pに類似した化合物を用いて開始する。E4Pのヒドロキシル基は、シキミ酸経路の反応の化学作用に直接的に関与しない。よって、メチルに置換された2H3M4OP前駆体は、代替の基質として反応することが予想される。有向進化すなわち適応性進化を用いて、基質としての2H3M4OPおよび下流の派生物に対する嗜好を改良し得る。このような方法は、当該分野において周知である。シキミ酸経路酵素を介したフラックスの効率を改善するための系統操作戦略もまた、本実施例において適用可能である。経路前駆体であるPEPのアベイラビリティを、グルコース輸送システムを変更することにより、増加し得る。フィードバック非感受性アイソザイムである3-デオキシ-D-アラビノヘプツロン酸-7-ホスフェートシンターゼの過剰発現によって、4-ヒドロキシ安息香酸過剰産生系統を操作して、シキミ酸経路を介したフラックスを改良した。さらに、シキミ酸経路酵素およびコリスメートリアーゼの発現レベルを増強した。同様の戦略が、p-トルエン酸の過剰産生のための系統において使用され得る。A.2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプツロン酸シンターゼEC2.5.1.54。D-エリトロース-4-ホスフェートおよびホスホエノールピルビン酸の縮合は、2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプツロン酸DAHPシンターゼEC2.5.1.54によって触媒される。この酵素の3つのイソ酵素は、E.coliのゲノムにおいて、aroG、aroFおよびaroHによってコードされ、それぞれフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンによってフィードバック阻害を受ける。最小限の培地上にて増殖された野生型細胞において、aroG、aroFおよびaroHの遺伝子産物はそれぞれ、DAHPシンターゼ活性の80、20および1に寄与した902699pii。AroGの2つの残基は、フェニルアラニンによる阻害を除去することが見出された。チロシンによるAroFのフィードバク阻害が、1塩基対交換によって除去された。E.coliの4-ヒドロキシ安息香酸を過剰産生する系統において、チロシン非感受性DAHPシンターゼを過剰発現させた。aroG遺伝子産物が、種々の代替の4-炭素鎖carbonlength基質および5-炭素鎖基質を受容することが示された1102711032WilliamsonetalBioorgMedChemLett1523392342002738pii101016jbmcl200502080doi。上記酵素は、D-エリトロース-4-ホスフェートと類似した基質しかし2位におけるアルコールを欠く。である3S-2-デオキシエリトロース-4-ホスフェートと効率的に反応する。HelicobacterpyloriおよびPyrococcusfuriosusに由来する酵素もまた、この代替の基質を受容し、E.coliにおいて発現されている。DAHPシンターゼの進化した改変体野生種E.coliのAroG酵素と7つのアミノ酸異なる。は、Kcat/KMが60倍改善することを示すことが示されている。B.3-デヒドロキネートシンターゼEC4.2.3.4。図2に示すような基質22,4-ヒドロキシ5-メチル-6-[ホスホノオキシメチル]オキサン-2-カルボキシレートの基質31,3-ジヒドロキシ-4-メチルシクロヘキサ-1-エン-1-カルボキシレートへの脱リン酸化は、3-デヒドロキネートシンターゼによる3-デオキシ-アラビノ-ヘプツロン酸-7-ホスフェートの脱リン酸化に類似している。上記酵素は、E.coli、B.subtilis、およびMycobacteriumtuberculosisH37Rvにおいて特徴付けられている。上記E.coli酵素は、L-チロシンによって阻害を受ける。C。3-デヒドロキネートデヒドラターゼEC4.2.1.10。3-デヒドロキネートデヒドラターゼ3-デヒドロキナーゼDHQaseとも称される。は、図2のp-トルエンサン経路におけるステップCに類似する、3-デヒドロキネートの3-デヒドロシキミ酸への脱水を天然に触媒する。DHQase酵素は、メカニズム、立体化学および配列相同性に基づいて2つのクラスに分けられ得る。一般に、1型酵素が生合成に関与し、2型酵素が逆崩壊的方向に作用する。E.coliKinghornetalGene1473801981901499pii、Salmonellatyphi、およびB.subtilis900325piiに由来する1型酵素が、クローニングされ、特徴付けられている。例示的な3-デヒドロキネートデヒドラターゼ2型酵素は、Mycobacteriumtuberculosis、StreptomycescoelicolorおよびHelicobacterpyloriに見出される。D.シキミ酸デヒドロゲナーゼEC1.1.1.25。シキミ酸デヒドロゲナーゼは、図2のステップDに類似した、3-デヒドロシキミ酸のシキミ酸へのNADPH依存性の還元を触媒する。E.coliのゲノムは、シキミ酸デヒドロゲナーゼの2つのパラログをコードし、これらは異なる補因子特性を有する。aroEによってコードされる酵素は、NADPH特異的であり、ydiB遺伝子産物は補因子としてNADHまたはNADPHを利用するキネート/シキミ酸デヒドロゲナーゼであり、ここで補因子としてNADHが好ましい。Mycobacteriumtuberculosis、Haemophilusinfluenzae、およびHelicobacterpyloriに由来するNADPH依存性酵素が、E.coliにおいて機能的に発現されている。E.シキミ酸キナーゼEC2.7.1.71。シキミ酸キナーゼは、図2のステップEに類似した、シキミ酸の3-ヒドロキシル基のATP依存性のリン酸化を触媒する。E.coliにおいて、2つのシキミ酸キナーゼ酵素が、aroKSK1およびaroLSK2によってコードされるLobnerOlesenandMarinusJBacteriol174525529。aroLによってコードされるSK2のKmは、SK1のKmよりも100倍低い。このことは、この酵素が芳香族の生合成を担っているということを示している。Mycobacteriumtuberculosis00339XdoiS0022283600339XpiiOliveiraetalProteinExprPurif22430435914573piiHelicobacterpylori、およびErwiniachrysanthemiに由来するさらなるシキミ酸キナーゼ酵素が、E.coliにおいてクローニングされている。F.3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼEC2.5.1.19。3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ5-エノルピルビニルシキミ酸-3-リン酸シンターゼEPSPSとしても知られている。は、ホスホエノールピルビン酸のエノールピルビン酸部分を、シキミ酸-3-リン酸の5-ヒドロキシルへの移動を触媒する。上記酵素は、E.coliにおいてaroAによってコードされる。Mycobacteriumtuberculosis914573pii、Dunaliellasalina、およびStaphylococcusaureus000128pii101016jfebslet200412057doiに由来するEPSPS酵素は、E.coliにおいてクローニングされ、機能的に発現されている。G.コリスメートシンターゼEC4.2.3.5。コリスメートシンターゼは、シキミ酸経路における7番目の酵素であり、5-エノルピルビニルシキミ酸-3-リン酸のコリスメートへの変換を触媒する。上記酵素の正価反応は、レドックスの変化を含まないが、上記酵素は、補因子として還元型フラビンモノヌクレオチドFMNを必要とする。植物および細菌においてみられる酵素とは対照的に、真菌におけるコリスメートシンターゼはまた、NADPHを消費してFMNを還元し得る。E.coli、およびStreptococcuspneumoniaeのaroCによって、代表的な一官能性の酵素がコードされる。NeurosporacrassaおよびSaccharomycescerevisiaeにおいて、二官能性の真菌酵素が見出される。H.コリスメートリアーゼEC4.1.3.40。コリスメートリアーゼは、ユビキノン生合成の最初の重要なcommittedステップを触媒する:4-ヒドロキシ安息香酸を形成するためのコリスメートからのピルビン酸の除去。この酵素反応は、4-ヒドロキシ安息香酸生成物の徐放によって速度が制限されている。これは、下流の膜結合酵素へ4-ヒドロキシ安息香酸を送達する役割を担っていると考えられる。E.coliのコリスメートリアーゼが、クローニングされ、特徴付けられており、上記酵素は、結晶化されている80710Xpii。構造面での研究は、G90残基を生成物阻害に寄与するものとして関連付けている004467pii101016jabb200510026doi。表面活性な2つのシステイン残基の改変は、タンパク質の凝集を低減する。Mycobacteriumtuberculosisのコリスメートリアーゼのリコンビナント形態が、E.coliにおいてクローニングされ、特徴付けられている。B~F.多機能性AROMタンパク質。ほとんどの細菌において、シキミ酸経路の酵素は、別々のポリペプチドによってコードされる。真核生物の微生物において、5つの酵素機能が、5官能性の超遺伝子supergeneによってコードされる多機能性タンパク質によって触媒される。多機能性のAROMタンパク質複合体は、図2の反応B~Fに類似した反応を触媒する。AROMタンパク質複合体は、Aspergillusnidulans、Neurosporacrassa、Saccharomycescerevisiae、およびPneumocystiscariniiを含む真菌において特徴付けられているCharlesetalNucleicAcidsRes1422012213CogginsetalMethodsEnzymol142325341DuncanKBiochemJ246375386。AROMのいくつかの成分が、個々のポリペプチドとして独立して機能することを示している。例えば、デヒドロキネートシンターゼDHQSは、AROMのアミノ末端ドメインを形成し、E.coliにクローニングされると、独立して機能し得る297304。Aspergillusnidulans由来のAROMの成分のいくつかの結晶構造は、触媒機構に対する洞察を提供する。実施例3p-トルイル酸のテレフタル酸への酵素的な転換のための例示的経路。本実施例は、p-トルイル酸のテレフタル酸PTAへの転換のための例示的経路を記載する。図3に示すように、p-トルイル酸は、3つの酵素ステップにおいて、メチル基の酸への酸化によってPTAへ、さらに転換され得る。上記経路は、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼ、4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよび4-カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼから構成される。最初のステップにおいて、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼは、O2の存在下でp-トルイル酸を4-カルボキシベンジルアルコールに酸化する。Comamonastestosteroni酵素tsaBMこの酵素は基質としての4-トルエンスルホナートとも反応する。が精製されており、特徴付けられている。4-カルボキシベンジルアルコールは、引き続いて、4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼtsaCによってアルデヒドに変換される。酸転換に対するアルデヒドは、4-カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼtsaDによって触媒される。これらの反応を触媒する酵素は、ComamonastestosteroniT-2炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてp-トルイル酸を利用し得る生物において見出されるJunkeretalJBacteriol179919927。p-トルイル酸をPTAに転換するためのさらなる遺伝子は、特に、Burkholderia属、Alcaligenes属、Pseudomonas属、Shingomonas属およびComamonas属のプロテオバクテリアにおいて、配列相同性によって見出され得る米国特許第6,187,569および米国特許公開US2003/0170836号。Comamonastestosteroni酵素に関連するGenbankの識別子を以下にリスト化する。本願を通して、種々の刊行物が参照されている。本発明に関与する技術水準をより十分に記載するために、これらの刊行物の開示GenBankおよびGI番号の公開を含む。は、その全体が参考としてこの出願にて援用される。本発明は、上記にて提供された実施例を参照して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。グリセルアルデヒド-3-ホスフェ-トおよびピルビン酸から2-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート2H3M4OPへの例示的な経路の概略図を示している。G3Pはグリセルアルデヒド-3-ホスフェ-トであり、DXPは1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェートであり、2ME4PはC-メチル-D-エリトリトール-4-ホスフェートである。酵素は、ADXPシンターゼ;BDXPレダクトイソメラーゼおよびC2ME4Pデヒドロラターゼである。p-トルイル酸へのシキミ酸経路の例示的な代替の概略図を示している。酵素は、A2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸シンターゼ;B3-デヒドロキネートシンターゼ;C3-デヒドロキネートデヒドラターゼDシキミ酸デヒドロゲナーゼ;Eシキミ酸キナーゼ;F3-ホスホシキメート-2-カルボキシビニルトランスフェラーゼ;Gコリスメートシンターゼ;およびHコリスメートリアーゼである。化合物は12-ヒドロキシ-3-メチル-4-オキソブトキシホスホネート;22,4-ヒドロキシ-5-メチル-6-[ホスホノオキシメチル]オキサン-2-カルボキシレート;31,3-ヒドロキシ-4-メチル-5-オキソシクロヘキサン-1-カルボキシレート;45-ヒドロキシ-4-メチル-3-オキソシクロヘキサ-1-エン-1-カルボキシレート;53,5-ジヒドロキシ-4-メチルシクロヘキサ-1-エン-1-カルボキシレート;65-ヒドロキシ-4-メチル-3-ホスホノオキシシクロヘキサ-1-エン-1-カルボキシレート;75-[1-カルボキシエ-1-エン-1-イルオキシ]-4-メチル-3-ホスホノオキシシクロヘキサ-1-エン-1-カルボキシレート;83-[1-カルボキシエ-1-エン-1-イルオキシ]-4-メチルシクロヘキサ-1,5-ジエン-1-カルボキシレート;および9P-トルイル酸である。p-トルイル酸をテレフタル酸PTAへ転換するための例示的な経路を示している。反応A、BおよびCはそれぞれ、p-トルエートメチル-モノオキシゲナーゼレダクターゼ、4-カルボキシベンジルアルコールデヒドロゲナーゼおよび4-カルボキシルベンジルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒される。示されている化合物は、1p-トルイル酸;24-カルボキシベンジルアルコール;34-カルボキシベンズアルデヒドおよび4テレフタル酸である。"