"BLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含む動物であって、前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンであり、BLA-CeLにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が誘発される、動物。前記オプシンが、NpHR、BR、ARおよびGtR3からなる群より選択される、請求項1に記載の動物。BLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する第2の光反応性オプシンをさらに含み、前記第2オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであり、BLA-CeLにおける前記第2オプシンの選択的照明により不安感が軽減される、請求項1に記載の動物。前記第2オプシンが、ChR2、VChR1およびDChRからなる群より選択される、請求項3に記載の動物。BLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含む動物であって、前記オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであり、BLA-CeLにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が軽減される、動物。前記オプシンが、ChR2、VChR1およびDChRからなる群より選択される、請求項5に記載の動物。個体のBLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達するためのベクターであって、光反応性オプシンをコードし、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含む、ベクター。前記オプシンをコードする前記核酸がCaMKIIαプロモーターに機能的に連結した、請求項7に記載のベクター。前記ベクターがAAVベクターである、請求項7に記載のベクター。前記オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであって、BLA-CeLにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を軽減する、請求項7に記載のベクター。前記オプシンが、ChR2、VChR1およびDChRからなる群より選択される、請求項10に記載のベクター。前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンであって、BLA-CeLにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を誘発する、請求項7に記載のベクター。前記オプシンが、NpHR、BR、ARおよびGtR3からなる群より選択される、請求項12に記載のベクター。前記個体がマウスまたはラットである、請求項7に記載のベクター。個体のBLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達する方法であって、光反応性オプシンをコードし、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を前記個体に投与することを含む、方法。BLA、CeLおよびCeMを含む冠状断脳組織薄片であって、前記BLAの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて光反応性オプシンが発現する、冠状断脳組織薄片。不安感を軽減する化合物をスクリーニングする方法であって、aBLAの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現するオプシンの選択的照明により誘発される不安感を有する動物に化合物を投与すること、このとき前記動物はBLAの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含み、前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンである;およびb前記動物における不安感のレベルを判定することを含み、前記不安感のレベルの低下が、その化合物が不安感の治療に有効であり得ることを示す、方法。前記オプシンが、NpHR、BR、ARおよびGtR3からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。個体における不安感を軽減する方法であって、a光反応性オプシンをコードし、BLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を個体に投与すること、このとき前記オプシンがBLAの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光による脱分極を誘導するオプシンである;およびb不安感を軽減するためにBLA-CeLの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明することを含む、方法。前記オプシンが、ChR2、VChR1およびDChRからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。個体において不安感を誘発させる方法であって、aオプシンをコードし、BLAのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を個体に投与すること、このとき前記オプシンが前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光による脱分極を誘導するオプシンである;およびb不安感を誘発するためにBLA-CeLの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明することを含む、方法。不安感を治療または研究するためのBLA-CeMの修飾活性に関連する装置または方法。修飾活性がBLA-CeLの選択的刺激を含む、請求項22に記載の装置または方法。修飾活性が光反応性オプシンのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける標的発現によるBLA-CeLの選択的刺激を含む、請求項22に記載の装置または方法。修飾活性が、BLA細胞体の照明に対して、CeAの選択的照明をさらに含む、請求項24に記載の装置または方法。BLAへの光の送達を妨げ、そして、CeAの選択的照明を可能にするために斜めに切ったガイドカニューレをCeLに埋め込むことをさらに含む、請求項24に記載の装置または方法。薬理学的薬剤、電気刺激、磁気刺激、外科的手段または光遺伝学的刺激のうちの1つ以上を含むが、これらに限定されない治療法をスクリーニングすることをさらに含む、請求項22に記載の装置または方法。BLA-CeM回路を標的とする治療法であって、薬理学的薬剤、電気刺激、磁気刺激、外科的手段または光遺伝学的刺激のうちの1つ以上を含むが、これらに限定されない前記方法を提供することをさらに対象とする、請求項22から27のいずれか1項に記載の装置または方法。不安感および/または関連の障害の研究および厳密な調査のための本開示の回路モデルを使用する装置または方法。表現型を特定すること、エンドフェノタイプを特定することおよび治療標的を特定することのうちの1つ以上をさらに含む、請求項22から29のいずれか1項に記載の装置または方法。実施例に記載される実施形態を含む、本開示の実施形態のいずれか1つに記載の装置または方法。詳細な説明本開示は、本明細書において記載されるような、不安感および不安症状を伴う障害などの神経系障害の制御に関連する。本開示は、必ずしも、これらの状況に限定されないが、これらの状況および他の状況を用いて実施例を考察することにより、本発明の様々な態様を理解することができる。本開示の様々な実施形態が、神経回路の時間的制御を測定可能な評価指数と関係づける光遺伝学的システムまたは方法に関連する。例えば、様々な不安感の症状を示す神経障害に様々な評価指数または症状を関連づけることができる。光遺伝学的システムは患者の神経回路をその選択的制御のために標的とする。光遺伝学的システムは、神経障害に関連する評価指数または症状を求めて患者をモニターすることを含む。この方法で、光遺伝学的システムは神経回路、その機能および/または神経障害についての詳細な情報を提供することができる。本明細書において考察される実施形態と一致するが、特定の実施形態が傷害の研究と厳密な調査に関連する。他の実施形態は表現型およびエンドフェノタイプの特定および/または研究に関連する。さらに他の実施形態は治療標的の特定に関連する。本開示の態様は、本来は健康である動物での不安感の研究のために、人工的に誘発した不安状態を用いることを対象とする。これは、理解が不十分であり、そして、生きている動物で正確にモデル化することが本来難しい症状および態様をモニターするのに特に有用であり得る。例えば、不安状態を示す入手可能な動物が無いため、不安状態の試験および/または研究が困難であることがある。さらに、ある実施形態は可逆的な不安状態を考慮に入れており、それは、不安状態を示しているときと不安状態を示していないときの同じ動物の試験および/またはその同じ動物への治療の効果の試験のためのベースライン/対照点を構築するのに特に有用であり得る。ある実施形態の可逆的な不安状態はまた、同じ動物への異なる治療の効果の試験と試験の間にベースラインにリセットすることを考慮にいれることが可能である。本開示のある態様は、生きている動物での不安感および/または不安症状の制御に関連した方法を対象とする。あるさらに特異的な実施形態において、症状のモニタリングにはまた、不安症状の緩和における刺激の有効性を評価することも含まれる。他の様々な方法および応用が存在し、それらのいくつかは本明細書においてより詳細に考察される。本発明において使用され得る光反応性オプシンには、光によってニューロンで過分極を誘導するオプシン、および光によってニューロンで脱分極を誘導するオプシンが挙げられる。オプシンの例は下記の表1および2に示される。表1は、可視光のスペクトルでの細胞活性の抑制に働く特定されたオプシンを示す。表2は、可視光のスペクトルでの興奮と変調に働く特定されたオプシンを示す。本明細書において使用される場合、光反応性オプシンNpHR、BR、AR、GtR3、Mac、ChR2、VChR1、DChRおよびChETAなどには天然型タンパク質および機能性異型体、断片、断片または全長タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。例えば、シグナルペプチドを欠失することが可能である。異型体は天然型タンパク質の配列と少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100のいずれかだけ同一であるアミノ酸配列を有することが可能である。機能性異型体は天然型タンパク質と同じ、または類似の過分極機能または脱分極機能を有し得る。いくつかの実施形態において、NpHRはeNpHR3.0またはeNpHR3.1であるwwwstanfordedugroupdlaboptogeneticssequenceinfohtmlを参照のこと。いくつかの実施形態において、光反応性オプシンはC1V1キメラタンパク質またはaC1V1-E162配列番号10、C1V1-E122配列番号9、またはC1V1-E122/E162配列番号11変異キメラタンパク質であるYizharetalNature201147717178およびwwwstanfordedugroupdlaboptogeneticssequenceinfohtmlを参照のこと。いくつかの実施形態において、光反応性オプシンはSFO配列番号6またはSSFO配列番号7であるYizharetalNature201147717178BerndtetalNatNeurosci1222934およびwwwstanfordedugroupdlaboptogeneticssequenceinfohtmlを参照のこと。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号1に示される配列と少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99または100同一なアミノ酸配列を含むNpHRオプシンである。いくつかの実施形態において、NpHRオプシンはシナプス小胞体ER搬出シグナルおよび/または膜輸送シグナルをさらに含む。例えば、NpHRオプシンは、配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列とシナプス小胞体ER搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列はリンカーを介してER搬出シグナルと連結される。いくつかの実施形態において、ER搬出シグナルはアミノ酸配列FXYENEを含み、Xは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ER搬出シグナルはアミノ酸配列VXXSLを含み、Xは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ER搬出シグナルはアミノ酸配列FCYENEVを含む。いくつかの実施形態において、NpHRオプシンは、配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列、ER搬出シグナルおよび膜輸送シグナルを含む。他の実施形態において、NpHRオプシンは、N末端からC末端に向けて、配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列、ER搬出シグナルおよび膜輸送シグナルを含む。他の実施形態において、NpHRオプシンは、N末端からC末端に向けて、配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列、膜輸送シグナルおよびER搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはヒト内向き整流性カリウムチャンネルKir2.1のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはアミノ酸配列KSRITSEGEYIPLDQIDINVを含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはリンカーによって配列番号1に示される配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列に連結される。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはリンカーを介してER搬出シグナルに連結される。リンカーは、5、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400または500アミノ酸のいずれかの長さのアミノ酸を含み得る。リンカーは蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青色蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、光活性化オプシンはN末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、光活性化オプシンは配列番号2のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は配列番号3のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化オプシンは、ボルボックスカルテリVolvoxcarteriのVChR1とコナミドリムシChlamydomonasreinhardtiのChR1に由来するキメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、VChR1の少なくとも第1および第2膜貫通ヘリックスがChR1の対応する第1および第2膜貫通ヘリックスで置換されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、キメラタンパク質は、VChR1の少なくとも第1および第2膜貫通ヘリックスがChR1の対応する第1および第2膜貫通ヘリックスで置換されたアミノ酸配列を含み、そして、ChR1の対応する部分によって置換される第2および第3膜貫通ヘリックスの間に位置する細胞内ループドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ光活性化タンパク質の第2および第3膜貫通ヘリックスの間の細胞内ループドメイン全体がChR1の対応する細胞内ループドメインによって置換され得る。いくつかの実施形態において、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を持たない配列番号8に示される配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化キメラタンパク質は、配列番号8に示される配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100同一であるアミノ酸配列を含む。前記キメラポリペプチドのVChR1部分のレチナール結合ポケット内の重要な位置での特定のアミノ酸置換を有することができるC1V1キメラ光活性化オプシン。いくつかの実施形態において、C1V1タンパク質は配列番号8のアミノ酸残基E122に変異を有する。いくつかの実施形態において、C1V1タンパク質は配列番号8のアミノ酸残基E162に変異を有する。他の実施形態において、C1V1タンパク質は配列番号8のアミノ酸残基E162とE122の両方に変異を有する。いくつかの実施形態において、本開示の変異型C1V1キメラタンパク質のそれぞれが、光に反応した動物の細胞膜の脱分極に使用される特定の性質と特徴を有し得る。本明細書において使用される場合、ベクターは、本明細書において記載される光反応性オプシンをコードする核酸であって、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発言を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む。核酸のグルタミン酸作動性錐体ニューロンへの送達に有用な任意のベクターを使用することができる。ベクターには、AAVベクター、レトロウイルス性ベクター、アデノウイルス性ベクター、HSVベクター、およびレンチウイルス性ベクターなどのウイルス性ベクターが含まれる。AAVベクターの例はAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15およびAAV16である。CaMKIIαプロモーターおよび前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの発現を制御することができる他の任意のプロモーターを使用することができる。個体はヒトなどの哺乳類動物である。哺乳類動物には、家畜、競技用動物、愛玩動物ネコ、イヌ、ウマなど、霊長類、マウスおよびラットも含まれる。動物は非ヒト哺乳類動物である。本明細書において使用される場合、治療treatmentまたは治療することtreatingまたは軽減alleviationは、臨床結果を含み、好ましくは臨床結果である有益な、または所望の結果を得るためのアプローチのことである。本発明の目的にとって、有益な、または所望の臨床結果には、これらに限定されないが、次のもののうちの1つ以上が含まれる:観察可能および/または測定可能な前記疾患の1つ以上の徴候不安感などの軽減を示すこと、前記疾患の結果生じる症状を減らすこと、前記疾患を患う人の生活の質を向上させること、前記疾患を治療するために必要な他の医薬の用量を低下させること、および/または前記疾患の進行を遅滞させること。本明細書において使用される場合、薬品、化合物または医薬組成物の有効投薬量または有効量は有益な、または所望の結果をもたらすのに充分である量である。治療上の使用について、有益な、または所望の結果には、前記疾患の結果生じる1つ以上の症状を減らすこと、前記疾患を患う人の生活の質を向上させること、前記疾患を治療するために必要な他の医薬の用量を低下させること、ターゲティングを介するなどにより別の医薬の効果を向上させること、および/または前記疾患の進行を遅滞させることなどの臨床結果が含まれる。臨床上の背景で理解されるように、薬品、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は別の薬品、化合物、医薬組成物、または別の治療と併せて到達してもしなくてもよい。したがって、1つ以上の治療薬または治療を施す上で、有効投薬量が考慮される場合があり、所望の結果が達成され得る、または達成される場合、1つ以上の他の薬剤と併せて、有効量の単一の薬剤が投与されたと考えることができる。上記の大要は、本開示の説明される実施形態の各々または全ての実施の記載を意図するものではない。詳細な説明および例示的実験実施形態本開示は不安状態および/または不安症状の制御に有用であると考えられる。本発明の具体的な応用は、不安状態および/または不安症状に関係した神経回路の時間的制御、空間的制御および/または細胞種的制御を関連付ける光遺伝学的システムまたは方法に関連する。本明細書において開示される例示的実施形態の多くの態様がこの分野のこれまでの発展に関連し、顕著にもそれをもとにしているので、実施例において見いだされるものを含む、発明の実施の詳細と変更を引き出し得る基礎と基礎をなす教示についてのしっかりとした理解をもたらすために、次の考察でそのようなこれまでの発展について概要を述べる。この文脈で、以下の考察が提供され、参考文献の教示が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は必ずしもそのような応用に限定されるものではないが、この文脈を用いて、様々な例の考察を通して本発明の様々な態様が理解され得る。不安感は、目下の脅威が無い状況で、高まった心配が持続する状態であり、病的な状態では、非常に心身を衰弱させるものとなる。本開示の実施形態は、不安感関連の行動の基礎をなす神経回路に関連した治療法を研究開発するために、二光子顕微鏡法、電気生理学および不安感測定法を有する細胞種特異的光遺伝学的ツールのうちの1つ以上を使用することを対象とする。本開示の態様は、精神病に関連のある神経回路機能の研究における、細胞種よりはむしろ脳の特定の投射を標的とする光遺伝学に関連する。本開示の特定の実施形態と一致するが、可逆的な抗不安効果をもたらすために、扁桃体中心核CeA中の基底外側扁桃体BLA末端に時間的に正確な光遺伝学的刺激を用いる。その光遺伝学的刺激は、ChR2などの光反応性オプシンでのBLAのウイルス性形質導入とそれに続く、下流に位置するCeAの限定的な照明によって実施され得る。本開示の他の実施形態と一致するが、不安感関連の行動を増加させるために、扁桃体中心核CeA中の基底外側扁桃体BLA末端の光遺伝学的抑制を用いる。その光遺伝学的刺激は、eNpHR3.0などの光反応性オプシンでのBLAのウイルス性形質導入とそれに続く、下流に位置するCeAの限定的な照明によって実施され得る。BLA細胞体の直接的な光遺伝学的制御を用いて不安感に基づく効果が観察されなかったので、本開示の実施形態は神経細胞集団の特異的なターゲティングを対象とする。例えば、回路の要素としての特異的なBLA-CeA投射のターゲティングが哺乳類の脳での内在性の不安感制御に充分であることが実験的に示されている。本開示の実施形態と一致するが、回路の要素としての特異的なBLA-CeA投射のターゲティングは以後より詳細に考察される数多くの因子に基づいている。扁桃体は、複雑な相互接続性を有する機能的および形態的に異質の亜核から構成される。扁桃体の主要な細区画は基底外側扁桃体複合体BLAであり、それは外側LA扁桃体核、基底外側BL扁桃体核および基底内側BM扁桃体核BLAニューロンの約90がグルタミン酸作動性であるを包含する。対照的に、扁桃体中心核CeAは、外側中心CeL核および正中中心CeM核から構成されるが、主として約95GABA作動性中型有刺ニューロンからなる。BLAは、CeAの局所性インターニューロンおよび中型有刺ニューロンの両方と機能的に異なるGABA作動性介在細胞ITCの密集した束の中に覆われている。扁桃体の主要な出力核はCeMであり、化学的または電気的に興奮させられると、それは、恐怖や不安感に関係した自律的で行動に関する反応を脳幹への投射により仲介すると考えられている。CeMは、環境情報と認知情報が集中する主要な扁桃体の部位LAによって直接制御されてはいないが、LAとBLAのニューロンがGABA作動性CeLニューロンを興奮させ、それがCeM出力ニューロンへのフィードフォワード抑制をもたらし、そして、扁桃体の出力を低減させることが可能である。BLA-CeL-CeMは、恐怖の鎮静化ではなく条件付け抑制に関与すると示唆されている、あまり特徴が明らかではない経路である。おそらくは緊張とショックの明確な対不形成のため、恐怖の発現の抑制が、BLA-CeLシナプスの増強に関連すると示唆される。BLA細胞は、分界条床核BNST、側坐核、海馬および皮質への投射を含む、脳全体に渡って乱雑な投射を有する。本開示の態様は、他のBLA投射の情動/制御がほとんどまたは全く無い、CeL中のBLA末端の選択的制御法に関連する。オプシン遺伝子の発現をBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定することにより、そして、光の送達をCeAに限定することにより、BLA-CeLシナプスの優先的なターゲティングが促進され得る。例えば、CaMKIIαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスAAV5ベクターを用いることでBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成され得る。BLA内では、CaMKIIαはグルタミン酸作動性錐体ニューロンだけで発現し、局所性インターニューロンまたは介在細胞では発現しない。図1は、本開示の実施形態に一致する、脳の特定の投射の光遺伝学的ターゲティングを提供するシステムを示す。例えば、光の方向を定めるために、例えば、BLAへの光の送達を防ぎ、そして、CeAの選択的照明を可能にするために、斜めに切ったガイドカニューレを使用することができる。この光のCeA投射への優先的な送達は、CeLへの埋め込みと共に定位ガイダンスを用いて達成され得る。その結果の光の分布についての幾何的および機能的特質は、BLA細胞体ではなくBLA末端の選択的制御についての光パワーパラメータを判定するために、インビトロとインビボの両方で、例えば、インビボ電気生理学的レコーディングを用いて定量され得る。そのような選択的な興奮または抑制が顕著で即時の、そして、可逆的な不安感に基づく効果をもたらすことが実施例に記載されるものなどの実験結果によって確認される。本開示の実施形態は、本明細書において特定された解剖学的標的、機能的標的、構造的標的および回路標的の様々なものに適用される、上記の現実化を対象とする。例えば、不安感についての精神疾患の治療法を開発するために回路標的を研究することができる。これらの治療法は、非限定的な例として、薬理学的治療法、電気的治療法、磁気的治療法、外科的治療法および光遺伝学的治療法、または他の治療法を含むことができる。図2は、本開示の実施形態に一致する、不安感に基づく回路モデルの使用についてのフローチャートを示す。ウイルス性送達装置などの光遺伝学的送達装置が作製される202。標的細胞に光反応性オプシンを導入するようにこの送達装置を設計することができ、そして、この送達装置は特定の細胞種用に標的化プロモーターを含むことができる。その後、その送達装置がBLAに定位的にまたは他の状態で注入され得る204。その後、光送達装置が外科的に移植され得る206。この光送達装置は、標的への照明をもたらすように設計され得る例えば、指向性光学素子を使用して。その後、標的領域が照明される208。標的領域は、例えば、BLA-CeAであり得る。その後、その効果がモニターおよび/または評価され得る210。これは、治療または薬品スクリーニングに関連して使用されることも可能である。本開示の様々な実施形態は不安感の新しい治療法をスクリーニングするための特定されたモデルの使用に関連する。例えば、本明細書において考察される方法を用いて不安感を人工的に誘発または抑制することができ、その後、薬理学的治療法、電気的治療法、磁気的治療法、外科的治療法または光遺伝学的治療法を適用し、評価する。本開示の他の実施形態において、特定された回路のインビトロ近似法またはシミュレーションを開発するために、モデルを使用することができ、その後、それらは装置、試薬、ツール、技術、方法およびアプローチのスクリーニングに、および不安感と関連の障害の研究と厳密な調査に使用されることができる。この研究は、必ずしも限定されるものではないが、表現型、エンドフェノタイプおよび治療標的の特定を対象とすることができる。本開示の実施形態は、不安感の無条件付け発現を二方向に調節するための内在性神経基質としてBLA-CeL経路をモデル化することを対象とする。ある実施形態は、不安感の発現または不安感関連行動におけるそれらの役割のため、BNSTへのCeA投射などの他の下流回路を対象とする。例えば、BNSTのコルチコトロピン放出ホルモンCRHネットワークは、CeLがBNSTへのCRHの主要な放出源であるため、不安感関連行動の調節に決定的に関与し得ると考えられている。セロトニン、ドーパミン、アセチルコリン、グリシン、GABAおよびCRHを含む、他の神経伝達物質および神経調節物質が、分散型神経回路への効果を調節またはゲート開閉することができる。さらに他の実施形態は、BLA-CeLシナプスの並列回路または下流回路が不安感表現型の調節または発現に寄与すると考えられているので、この経路に合流し、そして、この経路から分出する神経回路網を対象とする。さらに、扁桃体の上流では、BLAおよびCeLへの強固な神経支配をもたらす前辺縁皮質、下辺縁皮質および島皮質を含む、恐怖と不安感を処理するのに重要な領域からのトップダウン皮質制御によってリクルートされるのに、この微小回路は良い位置につけている。CeLおよびCeMニューロンに投射するBLAニューロンの集団は大部分が重複していないことがBLA解剖学的構造に基づく実験結果から示唆される。自然状態では、CeL投射BLAニューロンは微小回路ホメオスタシス機構においてCeM投射BLAニューロンを興奮させることができ、それで、回路のバランスを歪めて無抑制のCeM活性化を可能にするシナプスの変化が存在するとき、潜在的な不安障害を研究するためにその回路を使用することができる。本明細書において考察される実施形態と特定の応用実施例を含むは、上記の態様、実施形態および実施との、ならびに図面に示され、以下に説明されるものとの関連で実施され得る。下記の実施例を参照することができ、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。方法論、装置および物質を含む、光反応性分子および/またはオプシンに関するより詳細について、以下の背景的刊行物を参照することもできる:ZhangらのSystemforOpticalStimulationofTargetCellsという表題の米国特許出願公開第2010/0190229号;ZhangらのやはりSystemforOpticalStimulationofTargetCellsという表題の米国特許出願公開第2010/0145418号;BoydenらのSystemforOpticalStimulationofTargetCellsという表題の米国特許出願公開第2007/0261127号;およびLightSensitiveIonPassingMoleculesという表題の国際出願公開第WO2011/116238号。これらの出願は特許書類の一部を形作り、参照により完全に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物と一致するが、標的細胞の光学的刺激と制御をもたらすために、多数のオプシンを哺乳類細胞においてインビボおよびインビトロで使用することができる。例えば、ニューロンなどの電気的に興奮させることができる細胞にChR2が導入されると、ChR2チャネルロドプシンの光活性化によりその細胞の興奮および/または発火がもたらされ得る。ニューロンなどの電気的に興奮させることができる細胞にNpHRが導入される場合では、NpHRオプシンの光活性化によりその細胞の発火の抑制がもたらされ得る。先に参照した特許出願の開示のこれらの態様および他の態様は本開示の様々な態様の実施に有用であり得る。本開示は様々な修飾および変更形態を受け入れることができるが、その詳細は図面における例により示されており、そして、さらに詳細が説明される。説明される特定の実施形態および/または応用に本開示を限定することを意図するものではないことが理解されるものとする。逆に、本開示の精神と範囲の内にある全ての修飾、同等物および代替物を包含することが意図される。序論不安感は、目下の脅威が無い状況で、高まった心配が持続する状態であり、病的な状態では、非常に心身を衰弱させるものとなる1。不安障害は、精神病のうちで最も一般的なものを代表し28の生涯有病率を有する2、そして、大うつ病と物質乱用の原因論と関係づけられている3~5。感情の処理に重要な脳の領域である扁桃体9~17が不安感に役割を担うと長らく仮定されてきたが18~23、不安感を制御、仲介する神経メカニズムは未だ特定されていない。本明細書で、我々は、不安感関連行動の根底にある神経回路を特定するために、細胞種特異的光遺伝学的ツールを二光子顕微鏡法、電気生理学および自由に動くマウスでの不安感測定法と組み合わせる。細胞種だけではなく細胞間の特定の結合を制御するために光遺伝学のユニークな能力24~26を利用して、我々は、ChR2によるBLAのウイルス性形質導入とそれに続く下流CeAでの限定的な照明により分析されて、扁桃体中心核CeA中の基底外側扁桃体BLA末端の時間的に正確な光遺伝学的刺激が甚大で即時の、そして、可逆的な抗不安効果を及ぼすことを観察した。逆に、eNpHR3.025を用いる同じ限定された投射の選択的光遺伝学的抑制が不安感関連行動を強力に、迅速に、そして、可逆的に増加させた。重要なことに、これらの効果はBLA細胞体そのものの直接的光遺伝学的制御では観察されなかった。まとめると、これらの結果は、回路の要素としての特定のBLA-CeA投射が哺乳類の脳における内在性の不安感制御に必要であると共に充分であることを意味し、そして、細胞種よりもむしろ特定の投射を光遺伝学的に標的とすることの精神疾患に関連の神経回路機能の研究における重要性を示す。不安障害は高い有病率を持ち、そして、深刻1であるにも関わらず、対応する神経回路基質の理解は不十分であり、安全で効果的な治療の開発を妨げている。利用可能な治療法は効果が一貫しない傾向にあり、または、ベンゾジアゼピン類の場合、常習性になり、認知障害と死を引き起こすこともありうる鎮静状態と呼吸抑制を含む、顕著な副作用に直結する傾向がある27、28。哺乳類の脳における不安感の制御機構のより深い理解29、30が、副作用がより少ない、より効果的な治療法を開発するために必要である。特に関心があり、そして、新しいのは、不安緩解の生来の経路をリクルートする可能性である。扁桃体は神経刺激と正のアウトカムまたは負のアウトカムの間の関係を処理することに決定的に関与し、無条件付け情緒状態の処理に関係があるとされてもいる。扁桃体微小回路は恐怖条件付けとの関連で機能的に分析されているが、扁桃体の関与が無条件付け不安感を含む多数の他の機能および情緒状態と関係があるとされている。扁桃体は、複雑な相互接続性を有する機能的および形態的に異質の亜核から構成される。扁桃体の主要な細区画は基底外側扁桃体複合体BLAであり、それは外側LA、基底外側BLおよび基底内側BM扁桃体核BLAニューロンの約90がグルタミン酸作動性であるを包含する33、34。対照的に、扁桃体中心核CeAは、外側中心CeL核および正中中心CeM核から構成されるが、主として約95GABA作動性中型有刺ニューロンからなる35。BLAは、CeAの局所性インターニューロンおよび中型有刺ニューロンの両方と機能的に異なるGABA作動性介在細胞ITCの密集した束の中に覆われている36、37。扁桃体の主要な出力核はCeMであり32、35、38~40、化学的または電気的に興奮させられると、それは、恐怖や不安感に関係した自律的で行動に関する反応を脳幹への投射により仲介すると考えられている6、12、32、35。CeMは、環境情報と認知情報が集中する主要な扁桃体の部位LAによって直接制御されてはいないが12、38、41、LAとBLAのニューロンがGABA作動性CeLニューロンを興奮させ42、それがCeM出力ニューロンへのフィードフォワード抑制40、46をもたらし、そして、扁桃体の出力を低減させることが可能である。BLA-CeL-CeMは、恐怖の鎮静化ではなく条件付け抑制、すなわち、緊張とショックの明確な対不形成が原因の、BLA-CeLシナプスの増強が原因の恐怖の発現の抑制に関与すると示唆されている、あまり特徴が明らかではない経路である47。恐怖は外的手がかりにより引き起こされる一過性の状態であると特徴づけられおり、一方、不安感は外的なきっかけが無い状態で起こり得る持続的状態であるが、我々は、恐怖の条件付け抑制を調節する回路がまた不安感の条件付け抑制の調節にも関与するだろうかと思った。材料と方法対象:実験法開始エポックで4~6週齢のオスC57BL/6マウスを反転型12時間明暗サイクル、自由飲食条件で飼育した。図3、4および5に示される動物ChR2末端グループ、EYFP末端グループおよびChR2細胞体グループのマウスは、不安感のベースラインレベルを上昇させるために典型的な高トラフィックマウス飼育施設に全て1匹ずつ飼育された。マウスはそれぞれ1つの処理グループに属した。図6に示される動物両側性EYFPグループおよびeNpHR3.0グループは、不安感のベースラインレベルを低下させるために特別な低トラフィックマウス飼育施設に集団で飼育された。我々の動物の動物管理と実験操作の全ての態様は米国国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、そして、スタンフォード機関内動物実験委員会のメンバーにより認可されたものである。光強度の測定:手早く殺処理したマウスに由来する脳組織のブロックを用いて光透過測定を行った。その後、その組織をパワーメーターThorLabs、ニュートン、ニュージャージー州の光検出器の上に置き、その組織を通過したレーザーの光強度を測定した。直径300μmの光ファイバーの先端が473nmブルーレーザーOEMLaserSystems、イーストランシング、ミシガン州に連結された。斜面の反対側への光透過の特徴を調べるために、斜めに切ったカニューレとパワーメーターの光検出器を並置した。光円錐を視覚化するために、我々は、キュベット中に入れた約5mg/mlのフルオレセインイソチオシアネート-デキストランFD150s;Sigma、セントルイス、ミズーリ州を用い、斜めに切ったカニューレのシールド付きの光ファイバーか斜めに切ったカニューレが無い光ファイバーをフルオレセイン溶液に対して垂直に向けた。光ファイバーから光を円錐状に出力することによる強度のわずかな減少と組織での光散乱による光の減少の両方を考慮して、特定の深度でのパワー密度を計算した。出力光の角発散を決めるマルチモード光ファイバーの発散半角θdivは、であり、ntisは灰白質の屈折率であり、NAfib0.37は光ファイバーの開口数である。ファイバーの末端からの距離zでの光を円錐状に出力することによる強度のわずかな減少は、rが光ファイバーの半径100μmである三角法を用いて計算された。光散乱が原因の減少後の光のわずかな伝達が、経験的な測定値とクベルカムンクのモデルを用いて双曲線関数としてモデル化された1、2。そして、ファイバーの先端でのパワー密度と円錐状の光の出力および光の散乱が原因のわずかな変化を組み合わせたものにより、ファイバーの下の特定の深度でのパワー密度の数値がもたらされる。ウイルスの構築とパッケージング:AAV5コートタンパク質を用いて組換えAAVベクターの血清型を調べ、そして、ノースカロライナ大学のウイルスベクターコアにより組換えAAVベクターがパッケージされた。ウイルスのタイターはAAV-CaMKIIα-hChR2H134R-EYFP、AAV-CaMKIIα-EYFPおよびAAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPについてそれぞれ2x1012粒子/mL、3x1012粒子/mL、4x1012粒子/mLであった。MluIおよびEcoRI制限部位を用いてAAV骨格にCaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPをクローニングすることによりpAAV-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPプラスミドを構築した。同様に、MluIおよびEcoRI制限部位を用いてAAV骨格にCaMKIIα-EYFPをクローニングすることによりpAAV-CaMKIIα-EYFPプラスミドを構築した。マップはオンラインによりwwwoptogeneticsorgで入手可能であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。定位的注射および光ファイバーの設置:全ての外科手術は定位ガイダンス下、麻酔条件下で行われた。1.5~3.0イソフルランを用いてマウスを麻酔した。座標は全てmm3単位でブレグマに相対的である。全ての実験、インビボとインビトロの両方で、ウイルスはBLAにのみ送達され、そして、CeAでのどのようなウイルスの発現も全ての実験からの排除ということになった。CeAに照明を限定するためにガイドカニューレが45~55°の角度になるように斜めに切られた。斜めに切ったガイドカニューレの短い側が前内側に配置され、斜めに切ったカニューレの長い側が光円錐の後外側部分を隠し、ウイルスの注射針と向きが逆であった。BLA-CeLシナプスを優先的に標的とするために、我々はオプシン遺伝子の発現をBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定し、そして、光送達をCeAに限定した。CaMKIIαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスAAV5ベクターを用いてBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成された。BLA内で、CaMKIIαは局所性インターニューロンではなくグルタミン酸作動性錐体ニューロンで発現するのみである4。ChR2末端グループおよびEYFP末端グループのマウスは光ファイバー用の斜めに切ったカニューレの片側の埋め込みを受けたが半球についてカウンターバランスがとられた、eNpHR3.0グループまたはそれぞれのEYFPグループのマウスはCeAへの斜めに切ったカニューレの両側の埋め込みを受けた前後方向APに-1.06mm;内外方向MLに±2.25mm;および背腹方向DVに-4.4mm;PlasticsOne、ロアノーク、バージニア州3。ChR2細胞体グループのマウスはBLAの-1.6mmAP;±3.1mmML;-4.5mmDVの位置に長期にわたって埋め込み可能なDoricパッチコードファイバーNA=0.22;Doriclenses、ケベック、カナダの片側埋め込みを受けた3。全てのマウスについて、ウイルスの注入をBLAに限定するために後外側に面した斜めに切った33ゲージまたは35ゲージの金属製ニードルを用いて、0.5μlの精製したAAV5をBLAの片側または両側性に注射した±3.1mmAP、1.6mmML、-4.9mmDV3。マイクロシリンジポンプUMP3;WPI、サラソタ、フロリダ州とその制御器Micro4;WPI、サラソタ、フロリダ州を用いて濃縮されたAAV溶液を送達するために、10μl用Hamiltonマイクロシリンジnanofil;WPI、サラソタ、フロリダ州を用いた。そして、1分あたり0.1μlの流速で各部位に0.5μlのウイルス溶液を注入した。注入が完了した後にニードルを0.1mm持ち上げ、そして、さらに10分間とどめ、その後、ゆっくりと引き抜いた。ファイバーガイドシステムを頭蓋骨に固定するために一層の粘着セメントCBメタボンド;Parkell、エッジウッド、ニューヨーク州と次に頭蓋可塑性セメントデンタルセメント;Stoelting、ウッドデール、イリノイ州を用いた。20分後に組織接着剤Vetbond;Fisher、ピッツバーグ、ペンシルバニア州を用いて切り口を閉じた。麻酔から回復するまで動物を保温パッド上に保った。ダミーのキャップラット:C312G、マウス:C313Gを挿入してガイドカニューレの開存性を保った。ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間後に行動試験および電気生理学的実験を行った。インビボレコーディング:以前に記述されたように、以前に4~6週間前にAAV-CaMKIIa-ChR2-eYFPウイルスコンストラクトでBLAに形質導入された成獣のオスマウスについての中央扁桃体CeAの光刺激と基底外側扁桃体BLAの電気的レコーディングが同時に行われた。動物は開頭のまえにイソフルランで深く麻酔され、足指をつまんでも反応しなかった。マウスを定位的に配置し扁桃体に対して背側の頭蓋骨をおよそ3mm2外科的に除去した後に。マウスが4~6週齢のとき外科手術を受け、マウスが8~10週齢のとき実験が行われるので、頭蓋骨と脳の成長を考慮して座標が調節され-1.5mmAP、±2.75mmMLに中心をとった3、1MΩで0.005インチの細胞外タングステン電極A-Msystemsを開頭した脳のBLAの上の領域に定位的に挿入した-1.65mmAP、±3.35mmML、-4.9mmDV3。これとは別に、0.2N.A.でコア部の直径が200μmのファイバー光ケーブルThorLabsがCeAの背側の脳に定位的に挿入された-1.1mmAP、±2.25mmML、-4.2mmDV3。光誘起反応の取得の後に、2秒の長さの刺激エポック20Hz、5ミリ秒のパルス幅の間に光の強度を変えるため、電圧ランプを用いた。光誘起シグナルの取得の後に、ファイバーの正確な位置が記録され、脳からファイバーが取り除かれ、ファイバーが自作の斜めに切ったカニューレに挿入され、同じ位置に再挿入され、そして、同じプロトコルが繰り返された。ほとんどの試験で、その後、ファイバー/カニューレが脳から抜き取られ、カニューレが外され、そして、そのままのファイバーが再挿入されて誘起されたシグナルを発信するニューロンの集団のフィデリティを確保した。記録されたシグナルが300Hzと20kHzの間のバンドパスフィルターにかけられ、1000倍か10000倍のどちらかのAC増幅にかけられA-MSystems1800、そして、デジタル化されMolecularDevicesDigidata1322A、その後にClampexソフトウェアMolecularDevicesを用いて記録された。Clampexソフトウェアはフィールドシグナルの記録とオプトロードに連結した473nmのOEMLaserSystemsソリッドステートレーザーダイオード源の制御の両方に使用された。ファイバーの先端からの光パワーを1mW未満約14mW/mm2と28mW約396mW/mm2の間で量を決め、そして、標準的光パワーメーターThorLabsを使用して光パワーを測定した。イソフルラン麻酔を1の定常レベルにまで下げた後にBLAに対しておよそ1mm背側で電気生理学的レコーディングを開始した。約0.1mmずつ腹側にオプトロードを下げて光誘起シグナルの位置を特定した。行動試験法:行動試験について使用された全ての動物はBLAニューロンのウイルス性形質導入と片側性ChR2グループと対照についてまたは両側性eNpHR3.0グループと対照についての光送達を可能にする埋め込みを受けた。行動試験について、光をCeAに限定するために、斜めに切ったカニューレの長片よりも短いが斜めに切ったカニューレの短辺よりも長い最適な長さにマルチモード光ファイバーsBFL37-300、開口数:0.37、コア部の直径:300μm;ThorLabs、ニュートン、ニュージャージー州を正確に切断した。光刺激のために、FC/PCアダプターを介してファイバーを473nmまたは594nmのレーザーダイオードOEMLaserSystems、イーストランシング、ミシガン州に連結した。473nmの光実験について20Hz、5ミリ秒のパルス幅の光トレイン、そして、594nmの光実験について連続光を送達するために、Master-8パルス刺激機A.M.P.I.、エルサレム、イスラエルを用いてレーザー出力を制御した。実験に含まれるすべての動物はBLAに位置するウイルス注射中心を有したが、時には隣接する領域または穿刺経路に沿って漏れがあった。CeA中でウイルスのどんな発現でも検出できたどんな場合でも、その動物は排除された。統計的に有意な光の効果すべてが考察され、考察されなかった比較は検出可能な差異を示さなかったものである。高架式十字迷路法はプラスチック製であり、そして、プラス型に中央部のプラットフォーム5×5×5cmから90度の角度で伸びる2本の明灰色のアーム30×5cmと2本の黒色の壁があるアーム30×5×30cmから構成された。迷路は床から30cm上に設置された。個体ごとにマウスが中央部に置かれた。セッションの開始前、操作からの回復に1~5分が見込まれた。マウスの位置、速度および頭、身体および尾の動きの観察記録をとるために、ビデオトラッキングソフトウェアBiObserve、フォートリー、ニュージャージー州を使用した。表示される測定値は全てマウスの身体に相対的であった。グループごとに光刺激プロトコルが明記される。ChR2:BLA-CeAマウスと対応する対照グループEYFP:BLA-CeAおよびChR2:BLA細胞体は不安感測定の前、少なくとも1週間、高ストレス環境に1匹ずつ飼育された:473nmの光パルストレイン20Hzで5ミリ秒のパルスの7~8mWファイバーの先端で約106mW/mm2、CeLで約6.3mW/mm2およびCeMで約2.4mW/mm2でのCeA中のBLA末端の片側照明。ChR2細胞体グループについて、7~8mWの照明は発作活性を誘発するので、BLAニューロンはより低い光パワーで直接照明され、BLAニューロンが473nmの光パルストレイン20Hzで5ミリ秒のパルスの3~5mW約57mW/mm2での片側性照明を受けた。eNpHR3.0と対応するEYFPグループについて、全てのマウスが集団で飼育され、そして、両側性ウイルス注射、および5分のライトオンエポックを通じて594nmの連続光の照明の4~6mWファイバーの先端で約71mW/mm2、CeLで約4.7mW/mm2およびCeMで約1.9mW/mm2でのCeA中のBLA末端の両側性照明を受けた。15分のセッションが3回の5分のエポックに分けられ、第1エポックでは光刺激が無くオフ、第2エポックでは先に明記されたように光が送達されオン、そして、第3エポックでは光刺激が無かったオフ。オープンフィールドチャンバー50×50cmとオープンフィールドが中央フィールド中央部、23×23cmおよび外側のフィールド辺縁部に分けられた。個々のマウスがフィールドの辺縁部に置かれ、そして、ビデオカメラによりその動物のパスが記録された。同じビデオトラッキングソフトウェアであるViewer2BiObserve、フォートリー、ニュージャージー州を用いることにより総歩行距離が分析された。高架式十字迷路試験の直後にオープンフィールド評価試験が行われた。オープンフィールドテストは3分のエポックが6回ある18分のセッションからなる。エポックはライトオフエポックで始まり、無光時間と光刺激時間の間で交互に反復した。オフ条件およびオン条件とのみ示される全ての分析およびチャートについて、3回のオフエポックがまとめられ、そして、3回のオンエポックがまとめられた。グルタミン酸受容体アンタゴニスト操作について、22.0mMのNBQXと38.0mMのD-APVTocris、エリスビル、ミズーリ州からなるグルタミン酸アンタゴニスト溶液は生理食塩水0.9NaClに溶けたものである。不安感測定の5~15分前に、10μlのHamilton注射筒nanofil;WPI、サラソタ、フロリダ州に連結された、光ファイバーを介した光送達に用いられるのと同じガイドカニューレに挿入された内部点滴用ニードルにより0.3μlのグルタミン酸アンタゴニスト溶液がCeAに点滴された。シリンジポンプHarvardApparatus、マサチューセッツ州により流速0.1μl/分が制御された。ウイルス注射、ガイドカニューレおよび長期にわたり埋め込まれたファイバーの配置は図7および10に示されるように組織学的に確認された。二光子光遺伝学的回路マッピングおよび生体外電気生理的レコーディング:マウスは4週齢の時にAAV5-CaMKIIα-ChR2-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。BLAとCeAの間の機能的接続性を調べるためにBLAおよびCeAを含む冠状薄片が調製された。mM単位で126NaCl、26NaHCO3、2.5KCl、1.25NaH2PO4、1MgCl2、2CaCl2および10グルコースを含む人工脳脊髄液aCSFの連続灌流下で二光子画像が撮られ、そして、電気生理的レコーディングがなされた。レコーディングは全て32°Cでなされた。パッチ電極4~6MΩがmM単位で:10HEPES、4Mg-ATP、0.5MgCl2、0.4Na3-GTP、10NaCl、140グルコン酸カリウムおよび80Alexa-Fluor594ヒドラジドMolecularProbes、ユージーン、オレゴン州で満たされた。二光子イメージング、全細胞レコーディングと光遺伝学的刺激が同時に行われ得るが、BLA、CeLおよびCeMニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われ、およそ30分間、細胞が満つるに任された後に改変型二光子顕微鏡PrairieMicroscopes、マジソン、ウィスコンシン州で画像が取得された。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。別途、言及されない限り、約7mW/mm2で473nmのLEDThorlabs、ニュートン、ニュージャージー州を使用して青色光のパルスが引き出された。コヒーレントチタンサファイアレーザーを用いてChR2-YFP940nmとAlexa-Fluor594800nmの両方を画像化した。両分子の放射光を分けるためにフィルター630/69とフィルター542/27Semrock、ロチェスター、ニューヨーク州と共にFF560ダイクロイックもまた使用した。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州を使用して全ての画像を撮影した。CeLへ投射する線維をBLAから単離し、そして、CeM内での反応を調べるために、先に説明したように、BLAが証明を受けない様にして薄片を調製した。対物レンズからCeLにねらいを定めて照明してCeM中で全細胞レコーディングを行った。BLAからCeLへの末端の活性化が選択的であることをさらに確実にするために、CeLの中心の周り、直径約125μmに照明が限定された。ここで、シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を470/3フィルターと共に6.5mW/mm2で用いて青色光のパルスを誘発した。機能マッピングについて、我々はまずChR2を発現するBLAニューロンから記録をとり、同時に電気生理的レコーディングをとり、そして、二光子イメージングを可能にするために細胞をAlexa-Fluor594ヒドラジドダイで満たした。ダイを満たしたBLAニューロンの軸索に沿った複数の位置で二光子Zスタックを収集した。次に、我々はCeL核に投射するBLAニューロンの軸索に注目し、そして、BLA末端フィールド中のCeLニューロンからの記録をとった。次に、我々は同時にCeLニューロンからの記録をとり、ダイで細胞を満たし、そして、二光子ライブイメージングを行った後にCeMへのCeLニューロン性軸索に関心を移した。そして、我々はCeMニューロンでこの手順を繰り返したが、CeL中の末端フィールドへと光を戻し、インビボで行われたのと同じ刺激パラメータでのBLA-CeLシナプスの優先的な照明を模倣した。EPSCを分離するために-70mV、IPSCを分離するために0mVの両方で電位固定レコーディングを行った。それぞれ、EPSCはグルタミン酸受容体アンタゴニストであるNBQX22μMとAP538μMのバス適用n=5を介してEPSCであると確認され、IPSCはIPSCを消失させるビククリンのバス適用10μM;n=2を介してIPSCであると確認された。細胞が約-70mVで静止しているとき、我々はまた電流固定レコーディングを行った。BLA軸索末端での光遺伝学駆動性の逆方向性刺激の特性解析について、4週齢で動物がAAV5-CaMKIIα-ChR2-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。我々はaCSFに0.1mMピクロトキシン、10μMCNQXおよび25μMAP5Sigma、セントルイス、ミズーリ州を添加した。全細胞パッチクランプレコーディングがBLAニューロンで行われ、そして、およそ30分間、いっぱいになるにまかされた後に二光子イメージングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州を使用して全ての画像を撮影した。シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を470/30フィルターと共に6.5mW/mm2で用いて青色光のパルスを誘発した。ダイを満たしたBLAニューロンの軸索に沿った複数の位置で二光子Zスタックを収集した。CeL核を向いた約300μmを超える直径にわたってその軸索が可視化可能であったニューロンのみが実験に含まれ、そして、あらゆる方向に向かう突起を持つニューロンはまた排除された。約125μmの直径の青色光点に対して薄片を移動させることにより軸索上/外での刺激がなされた。正確な発現に薄片を較正するために、CeL細胞上で全細胞パッチクランプが行われ、そして、BLA末端からCeLニューロンへのシナプス性放出が信頼できるものであることを確実にするために、約125μmの直径の点青色パルスが用いられた。CeMへの直接投射および間接投射の分解のため、4週齢で動物がAAV5-CaMKIIα-ChR2-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州により光が送達された。CeM核での全細胞パッチクランプの前にCeL核の位置が、そこを再訪するために、記録され、光点がこの領域に限定された。CeMニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を470/30フィルターと共に6.5mW/mm2で用いて青色光のパルスを誘発した。CeMレコーディング中にCeA中のBLA末端の、そして、20Hzで2秒間の5ミリ秒の光トレインでの広範囲の照明約425-450μmの直径が適用された。EPSCとIPSCを分離するために、それぞれ、70mVと0mVで電位固定レコーディングが行われた。電流固定レコーディングもまた行われた。次に、直径が約125μmである限定された光点を用いて照明をCeLへと移動させた。我々はもう一度、-70mVと0mVで電位固定レコーディングを行い、そして、20Hzで2秒間の5ミリ秒の光トレインを用いた。電流固定で行うCeMニューロンスパイキング抑制実験について、我々は、スパイキングの誘発に必要な最小電流ステップ約60pAを適用し、そして同時にCeL中のChR2発現BLA末端の20Hzで2秒間の5ミリ秒の光トレイン細胞あたり平均6スイープ超での優先的照明を適用した。CeMの中央に位置するBLA末端フィールドの広範囲の照明をBLA-CeL末端の選択的照明と比較する実験について、同じCeM細胞n=7でこれらの条件が繰返し交互に行われた。末端抑制が細胞体のスパイキングを変化させないことを確認するために、4週齢で動物がAAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。全細胞パッチクランプレコーディングがBLAニューロンで行われ、そして、およそ30分間、いっぱいになるにまかされた。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州により光が送達された。BLAニューロンについて全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を589/24フィルターと共に6.5mW/mm2で用いて黄色光のパルスを誘発した。パッチング後、非限定的な光点約425~450μmの直径をBLA細胞体上に配置し、そして、1秒のパルスを適用した。記録された電流が600pAの過分極電流よりも低く、軸索がCeL核に向かって約300μmを超えて伸びていなかったとき、細胞が排除された。その後、約125μmの直径に光点が限定された。軸索上および軸索外電位固定レコーディングを1秒の光パルスを用いて取った。電流固定レコーディングについて、パッチピペットを介して細胞体に250pAの電流を適用することにより活動電位を発生させた。eNpHR3.0発現BLA末端の選択的照明が自発的シナプス小胞放出の確率を低減させることを示すために、4週齢で動物がAAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。外側中心ニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州により光が送達された。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を589/24フィルターと共に6.5mW/mm2で用いて黄色光のパルスを誘発した。約125μmの直径に光点が限定された。カルバコールを20μMの濃度でバスに添加した。CeLニューロンでsEPSC活性が上昇した後に5秒から30秒の時間範囲で光パルスが適用された。eNpHR3.0発現BLA末端の選択的照明が電気的刺激によるシナプス小胞放出の確率を低減させ得ることを示すために、4週齢で動物がAAV5-CaMKIIα-eNpHR3.0-EYFPで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、4~6週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。二極性同心刺激プローブFHC、ボードイン、メイン州をBLAに設置した。CeLニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。40X/.8NALUMPlanFL/IR対物レンズOlympus、センターバレー、ペンシルバニア州により光が送達された。ピペットの直列抵抗は通常10~20MΩであった。シャッターUniblitz、ロチェスター、ニューヨーク州に連結されたXCiteハロゲン光源EXPO、ミシサガ、オンタリオ州を589/24フィルターと共に6.5mW/mm2で用いてコハク色光のパルスを誘発した。約125μmの直径に光点が限定された。40秒間、電気パルスが送達され、そして、光の送達は10秒で開始され、そして、中ごろの30秒で終了した。解剖学的追跡実験について、追跡した軸索が切断されていると観察されたとき、そのニューロンが排除される。そして、解剖的測定に含まれる全てのBLAニューロン図5a~iが電流ステップでBLA錐体ニューロンに典型的なスパイキング18を示した。薄片の免疫組織化学:インビボ光刺激の終了後100~110分後に氷冷したPBSpH7.4中の4パラフォルムアルデヒドPFAを用い、麻酔したマウスを経心的に灌流した。脳を4PFA中に一晩固定し、その後、PBS中の30ショ糖で平衡化した。凍結ミクロトームで40μm厚の冠状切片を切り出し、そして、凍結保護剤中に4°Cで免疫組織化学に進むまで保存した。PBSで自由浮遊切片を洗浄し、その後、0.3Tx100および3正常ロバ血清NDS中で30分間保温した。一次抗体とのインキュベーションを3NDS/PBSウサギ抗c‐fos抗体1:500、Calbiochem、ラホーヤ、カリフォルニア州;マウス抗CaMKII抗体1:500、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州中で4°C一晩行った。その後、切片を洗浄し、そして、Cy3またはCy5と複合体化した二次抗体1:1000JacksonLaboratories、ウエストグローブ、ペンシルバニア州と室温で3時間インキュベートした。DAPI1:50,000との20分間のインキュベーションの後、切片を洗浄し、PVD-DABCOを用いて顕微鏡用スライドグラスに切片を貼りつけた。共焦点顕微鏡法および分析:20X/0.70NA対物レンズまたは40X/1.25NA油浸対物レンズを用いるLeicaTCSSP5走査レーザー顕微鏡で共焦点蛍光画像を取得した。同等の環境を用い、複数の切片を通して10μmの深度にわたる連続スタック画像が取得された。バックグランドレベルより上のc‐fos免疫反応性に閾値をとり、そして、核の輪郭を描くためにDAPI染色を用いることにより、Volocity画像解析ソフトウェアImprovision/PerkinElmer、ワルトハム、マサチューセッツ州が視野あたりのc‐fos陽性細胞の数を計算した。実験条件に盲目的に全てのイメージングと分析が行われた。統計学:行動試験と生体外電気生理学のデータについて、ノンパラメトリックブートストラップt検定対合または適切な場合非対合を用いて一対比較が検定されたが5、線形対比を用いて2つよりも多くのグループの平均値が係わる仮説が検定されたそれぞれ、R6のブートパッケージおよびlme4パッケージを用いる。後者は線形混合効果モデル二元反復測定ANOVAの係数間の対比として公式化され、固定効果は遺伝学的または薬理学的操作および光処理オンまたはオフであった。全ての仮説の検定は演繹的に定められた。対象はランダム効果としてモデル化された。c‐fosの定量比較について、我々は、一元配置ANOVAと続いてテューキーの多重比較検定を使用した。データのプロットは観察値の平均と観察値の分散の間の関係を明確に示すすなわち、それらは不均一分散性である、例えば図3eおよび図5jを参照のこと。標準平方根変換がこのこととよく相関していることを我々は見出した。さらに、eNpHR3.0の高架式十字迷路法EPMデータは、時間の経過に伴う探索行動の減少を説明するために、時間経過に対する線形適合によるトレンド除去を必要とした。二元線形混合効果モデル二元反復測定ANOVAとしても知られるに標準的なことではあるが、我々はij番目の細胞でのk番目の観察値yijkの平方根値をとモデル化し、式中、μは全ての細胞での総平均であり観察値の収集におけるij番目の細胞とはi番目の条件、j番目の処理に対応するciは複数の処理でのi番目の動物条件に起因する固定効果例えば、遺伝学的操作であり、tjは複数の条件でのj番目の処理に起因する固定効果例えば、ライトオンまたはライトオフであり、c:tijはij番目の細胞でのi番目の条件とj番目の処理の相互作用に起因する固定効果であり、bjは複数の処理で用いられる動物に対応するランダム効果であり、そして、eijkは、平均値が0で分散がσ2であり、全てのjについてbjに独立した、独立同分布i.i.d.ランダム正規外乱である。固定効果を二元配置分散分析ANOVA計画行列X∈Rnxpに集め、疎マトリックスZ∈Rnxq中のランダム効果をダミーコードし、そして、とし、行列形式をと表現することができ、y∈Rn、b∈Rqおよびe∈Rnはそれぞれ変数Y、Βおよびeの観察値であり、我々のモデルはと仮定し、式中、Nμ,Σは平均ベクトルがμであり分散共分散行列がΣであるときの多変量ガウス分布であり、そして、⊥は2つの変数が独立であることを示す。係数ベクトルβ∈Rp、b∈Rq、および分散パラメータσおよび低密度ブロック対角化相対的分散共分散行列Σ∈Rqxqを推定するために、我々は、DouglasBatesおよびMartinMaechlerにより書かれたRのlme4パッケージを用い、それはまず、ランダム効果を球面にする座標の線形変化を見つけ出し、次に、ペナルティ付き反復加重最小二乗法を用いてβ、σおよびΣの最尤推定値を見つけ出し、計算速度を増すためにランダム効果行列の稀薄性を利用する。さらなる詳細については、httpwwwrprojectorgのアドレスのlme4リポジトリ中のパッケージに付随する文書を参照のこと。最尤推定値を求めるために、等式2の中の計画行列Xは全列ランクでなくてはならない。これは等式1におけるように切片を有する全因子計画行列には当てはまらないことは周知であり、したがって、固定効果係数が推定可能であるためには、Xの列を定義するために線形結合比較を用いなくてはならない。我々の計画は釣り合いが取れているほぼ釣り合いが取れているので、我々は、主原文で報告されているように、ライトオフ条件と比較したライトオンに関連の係数、対照条件と比較した末端刺激などの間で直交またはほぼ直交ヘルマー対比を用いた。そのような対比により我々はまとめたデータを反復測度デザイン内で互いに対して比較することができ、改善されたパラメータ推定とテストパワーがもたらされ、一方、動物内の相関が説明される。結果BLA細胞は、分界条床核BNST、側坐核、海馬および皮質への投射を含む、脳全体に渡って乱雑な投射を有する38、43。BLA-CeLシナプスが必然的に不安感に関与し得るかどうか試験するために、したがって、他のBLA投射を直接影響することなくCeL中のBLA末端を選択的に制御する方法を開発することが必要であった。BLA-CeLシナプスを優先的に標的とするために、我々はオプシン遺伝子の発現をBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定し、そして、光送達をCeAに限定した。CaMKIIαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルスAAV5ベクターを用いてBLAグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成された。BLA内では、CaMKIIαはグルタミン酸作動性錐体ニューロンだけで発現し、局所性インターニューロンまたは介在細胞では発現しない48。CeA投射へ光を優先的に送達するために、BLAへの光送達を防ぎ、そして、CeAの選択的照明を可能にするためにCeL上に斜めに切ったガイドカニューレを埋め込むと共に、定位ガイダンスの下、BLAにウイルスを片側的に送達した図7および8。その結果の光の分布についての幾何的および機能的特質は、BLA細胞体ではなくBLA末端の選択的制御についての光パワーパラメータを判定するために、インビトロとインビボの両方で、インビボ電気生理学的レコーディングを用いて定量され得る図9。BLA-CeA経路は不安緩解のための内在性機構を実施することができるという仮説を検討するために、我々は、2つの異なる、そして、よく検証された不安感測定法である高架式十字迷路法およびオープンフィールドテストで投射特異的光遺伝学的制御下にある自由に動くマウスを厳密に調査した図3a~f。壁が無いまたは丸見えの空間にさらされるとマウスは不安感関連行動を示し、したがって、高架式十字迷路法の壁が無いアームまたはオープンフィールドチャンバーの中央で過ごした時間の増加が不安感の減少を示す49、50。関連の行動の誘導と反転の両方を試験するため、我々はまず3回の5分のエポックの間、マウスに高架式十字迷路法を受けさせ、第2エポックのみに光が送達された。我々が観察した抗不安効果はCeA中のBLA末端の活性化に特異的であり、一般のBLA細胞に特異的ではないことを判定するために、我々は、投射特異的制御を受けたChR2:BLA-CeAグループの;図3aマウスを対照ウイルスでの形質導入を受け、同じパターンの照明を受けた陰性対照グループEYFP:BLA-CeAおよびBLAにAAV-CaMKIIα-ChR2-EYFPウイルスを形質導入され、BLA上に直接ファイバーを埋め込まれた陽性対照グループChR2:BLA細胞体と比較した。このグループChR2:BLA細胞体について、ChR2:BLA-CeAグループ図3bおよびcで観察された不安緩解を光刺激が誘発することはなかった。実際、ChR2:BLA-CeAグループは、対照EYFP:BLA-CeAグループおよびChR2:BLA細胞体グループと比較して、CeA中のBLA末端の光誘導性活性化中に、壁がないアームで有意により長い時間を過ごしたt42=8.312;p<0.00001;図3b、c。ChR2:BLA-CeAマウスはまた、迷路の中央の選択点から、壁があるアームよりはむしろ壁がないアームへ入っていく確率の上昇を示した図3c差込図。これは、通常不安を惹起する環境を選択する確率の上昇を意味する。我々は、オープンフィールドアレーナ上で6回の3分のエポックの間、マウスを厳密に調べ、無光条件オフと光刺激条件オンの間を交互に繰り返すことにより可逆性を再度試験した。オープンフィールドチャンバーの中央にいる時間で評価したように、試験ChR2:BLA-CeAマウスは中程度で強固であり、可逆的な光誘導性抗不安反応を示したが図3dおよびe、EYFP:BLA-CeAグループおよびChR2:BLA細胞体グループのマウスは示さなかった図3e。光刺激が自発運動活性図3fを著しく変えることはなかった。オフ条件ではグループ間に検出可能な差異はなかったが、オン条件の間、EYFP:BLA-CeAグループまたはChR2:BLA細胞体グループと比較してChR2:BLA-CeAグループのマウスがオープンフィールドの中央で過ごす時間の有意な増加があったt105=4.96178;各対照についてp<0.0001。BLA細胞体ではなくCeAへのBLA投射の選択的刺激が急性で急速に反転しうる抗不安効果をもたらし、BLA-CeL-CeM経路が不安感制御の天然の微小回路であり得るという仮説を裏付けると我々は結論した。我々は次にこの光誘導性抗不安効果の生理的基礎を研究した。BLA中のグルタミン酸作動性ニューロンは強固な興奮性投射をCeLニューロンならびにCeMニューロンに送り込む38。しかしながら、光源から離れたCeMシナプス図8ばかりかこれらのCeMニューロンの任意の残存性直接刺激も、抗不安効果というよりもむしろ不安惹起効果を引き起こすと期待される12。しかし、CeLニューロンはこれらの脳幹投射CeM出力ニューロンに対して強い抑制をもたらし32、35、40、それ故、我々は、CeA中のBLA末端の照明がBLA-CeLニューロンを活性化することができ、それによって、CeMニューロンへのフィードフォワード抑制を誘発し、観察された抗不安減少を実施することができると仮説を立てた。この光遺伝学的に限定された投射の活動を確認するために、我々は、行動試験で送達されたものに光送達プロトコルを合わせたインビボ実験を行い、そして、ニューロンの活性化のパターンを確認するためのリードアウトとして活性依存性最初期遺伝子c‐fosの発現解析図3g~kを行った。我々は盲検条件下で、ChR2:BLA-CeAグループ、EYFP:BLA-CeAグループおよびChR2:BLA細胞体グループについて、EYFPを発現する、またはc‐fos免疫反応性を示すBLA、CeLおよびCeM中のニューロンの割合を定量した図3i~k。BLAでのCaMKIIαプロモーター制御下のウイルスの発現はグルタミン酸作動性ニューロンを標的とし47、我々は局所性インターニューロンと介在細胞の両方でEYFPの発現を観察しなかった図10。各領域内のEYFP陽性細胞の割合にグループ間で有意な差は認められなかったが図3g~k、ChR2:BLA-CeAグループまたはEYFP:BLA-CeAグループと比較してChR2:BLA細胞体グループでc‐fos陽性BLA細胞の有意に高い割合を我々は見出した図3i;それぞれp<0.01およびp<0.05。ChR2:BLA-CeAグループとEYFP:BLA-CeAグループの間にはc‐fosについて検出可能な差は無く、斜めに切ったカニューレの遮蔽がBLA細胞体への直接照明を効果的に防いでいることを示した。ChR2:BLA細胞体グループではなく、EYFP:BLA-CeAグループp<0.05と比較してChR2:BLA-CeAグループで有意に高い割合のCeLニューロンがc‐fosを発現した図3j。したがって、CeA中のChR2を発現するBLA末端の選択的照明によりBLA細胞体を活性化することなくCeLニューロンを活性化することになった。CeMについて、我々はChR2:BLA-CeAグループよりもChR2:BLA細胞体グループで2倍多い総ニューロンに対するc‐fos陽性のニューロンを見出したが図3k、LAニューロンはCeLニューロンを選択的に神経支配し、扁桃体のBL核およびBM核のニューロンはCeLとCeMの両方に単シナプス性投射を有するので38、43、51、この発見は解剖学的投射とあう。まとめると、これらのデータは、急性抗不安行動表現型を引き起こすインビボ照明がBLA細胞体を活性化することがないBLA-CeLシナプスの選択的照明を満たすことを示している。CeL中のBLA末端の選択的照明がCeM出力ニューロンのフィードフォワード抑制を誘導するという仮説を検定するために、我々は全細胞パッチクランプレコーディングをライブ二光子イメージングと組み合わせて、微小回路を可視化すると同時に投射特異的光遺伝学的制御中のこれらの細胞間での機能的相互関係を厳密に調査した図4a~f。インビボで用いられる光刺激パラメータは光ファイバーを介して送達され、我々の生体外実験で用いられるパラメータは急速薄片に送達されるが、我々は我々の標的位置での光パワー密度を約6mW/mm2に合わせた。BLA-CeL-CeM回路の二光子画像は図4aに示されるが、3細胞全てが同じ薄片から画像化された図4a。ChR2-EYFPを発現するBLAニューロンは473nmの光の20Hz、5ミリ秒のパルスでの直接照明に対して強固で高フィデリティのスパイキングを示した図4b。ChR2-EYFPを発現するBLAニューロンの末端フィールドの照明中に記録されたCeLニューロンからの代表的なトレースはCeLで見られる典型的な興奮性反応を示し図4c、集団要約は、スパイキングフィデリティが40パルス光トレインを通じて安定していたこと、および、反応している細胞には弱く興奮したCeL細胞および強く興奮したCeL細胞が含まれることn=16;図4cを明らかにしている。BLA-CeLシナプスの照明がCeLニューロンからの強固なフィードフォワード抑制によりCeM細胞でスパイキングを妨げる程機能的に充分であるかどうか検討するために、我々はBLA-CeLシナプスを選択的に照明している間にCeMニューロンからの記録をとった図4d。実際に、我々はCeL中のBLA末端の光刺激によるCeMでの強力なスパイキング抑制F2、11=15.35、p=0.0044を観察した図4d;1秒当たりのスパイク:照明前49±9.0、照明中1.5±0.87および照明後33±8.4;平均値±SEM。次に、図4eはChR2-EYFPを発現するCeMでのBLAニューロンの末端フィールドの照明中に記録されたCeMの反応、および興奮性入力と抑制性入力を組み合わせたものを示す。予想されたように、EPSCの潜時は2シナプス性IPSCの潜時よりも短く、そして、平均IPSC振幅は平均EPSC振幅よりも大きいそれぞれ、0mVおよび-70mVで記録された;図4eことが電位固定レコーディングの集団要約により示された。重要なことに、まさに同じCeMニューロンn=7が、部位間で交互に反復可能な様式で、CeMへのBLA入力の広範囲の照明により正味の興奮を引き起こしたが図4e、CeLへのBLA入力の選択的照明により正味の抑制を示した図4f。このことは、BLAからCeMへの直接入力および間接入力のバランスがCeM出力を調節することができることを示している。まとめると、それによりCeA中のBLA末端の選択的照明がBLA-CeLシナプスを活性化し、そうしてCeLニューロンから脳幹投射CeMニューロンへのフィードフォワード抑制を上昇させる、構造的および機能的に特定された生理的微小回路をこれらのデータは明らかにしている。この抗不安効果の基礎をなす扁桃体性微小回路をさらに説明するために、我々はこの現象を支配する解剖学的および機能的特質を注意深く分析した。ラットでCeA中のBLA側枝の投射をマップする努力がいくつかなされてきたが、我々は、重複する集団または別個の集団のBLAニューロンがCeLおよびCeMに投射するのか先験的な方法で検討した図5a、b。注目に値する警告を述べると、我々は約350μm厚の冠状切片中のこれらのニューロンを可視化しており、軸索が切断されたニューロンを排除するようにいろいろと試みたが、我々はこれが起きている可能性を排除できないし、これがCeAにより近いBLAニューロンへの標本抽出バイアスをいくらか誘導したことを否定することができない。図5aは、標本抽出されたBLAニューロンn=18の解剖学的投射を要約し、そして、ニューロンの44がCeLだけに投射し、17がCeMだけに投射していたことを示す。しかしながら、少数のBLA細胞n=1;6はCeLとCeMの両方に投射し、CeLおよびCeMに別々の側枝を送るものもあり、および、分枝をCeLおよびCeMに送る側枝を送るものもあった。図5bは標本抽出された細胞試料の2光子画像を示し、それらの全てが電流ステップでBLA錐体ニューロンに典型的なスパイキングパターンを示した。次に、我々のc‐fos測定が、CeL中のBLA末端の照明はBLAニューロンそのものではなくCeLニューロンを興奮させるのに充分であることを示唆したので、我々はこの仮説を全細胞レコーディングにより確認しようとした。電気的刺激によって、軸索末端の脱分極が細胞体での逆方向性スパイキングを引き起こす。しかしながら、光遺伝学的に誘導された脱分極は異なる機構を介して機能する証拠が存在している。この扁桃体性微小回路での光遺伝学的に誘導された末端刺激の特性を評価するために、我々はChR2を発現するBLA錐体ニューロンから記録をとり、そして、光点を約120μmの直径細胞体から視認された軸索側枝への方向と軸索が無い方向の両方向に100μmずつ移動させた図5c。細胞体からそれぞれの距離で20Hzの光トレインを受けたBLAニューロンのスパイクフィデリティが図5dに要約され、脱分極性電流が図5eに要約される。全ての調製物について、我々は、BLA細胞体での高フィデリティスパイキング図5fおよびシナプス後CeLニューロンのレコーディングにより示されるようなBLA末端での確実なシナプス小胞放出図5g;図15を誘発するのに、使用された光刺激パラメータは充分であることを確認した。対照的に、細胞体から300μm離れた光点を用いて同じBLAニューロンをレコーディングしたとき、我々が軸索図5hに注目しているか、していないか図5iに関わらず、我々は確実な活動電位の誘導を観察しなかった。この逆方向性スパイキングの欠如はGABA受容体アンタゴニストおよびAMPA受容体アンタゴニストのバス適用n=7を受けても観察されたが、したがって、局所的な抑制性制約の寄与の可能性を排除する。BLA錐体ニューロンで逆方向性刺激が無いときに光遺伝学的に誘導されたシナプス小胞放出が起こり得ることを我々は示しているが、我々がここで使用した光パワー密度約6mW/mm2よりも大きい光パワー密度で逆方向性刺激が達成され得る可能性がある。これまで、我々は、CeLとCeMに投射するBLAニューロンの集団は大部分が別個のものであり、そして、BLA-CeLシナプスの照明がBLA細胞体それ自体を強く活性化することなくシナプス小胞放出とCeLの興奮を引き起こすことを示してきた。最後に、我々は、投射特異的光遺伝学的制御の環境でインビボ薬理学的分析を用いて機構をさらに探究した。我々が観察した抗不安効果はBLA-CeLシナプスのみの選択的活性化によるものであり得、CeAを通過するBLA線維によるものでも、その後、あらゆるBLA投射標的領域を神経支配するBLA細胞体への活動電位の逆行性伝播にもるものでもないことを判定するために、我々は、局所的なグルタミン酸受容体拮抗作用が光誘導性抗不安効果を減退させるかどうか検討した。不安感を変化させるCeAでの傷害が、CeAを通過するBNSTへのBLA投射6の切除の可能性によって混乱させられるので、この問題は十分に興味深い。我々は、前述のようにCeA中のBLA末端の選択的照明を実施するために、AAV-CaMKIIα-ChR2-EYFPでBLAニューロンを片側的に形質導入し、そして、斜めに切ったカニューレを埋め込みn=8;図8、そして、高架式十字迷路法およびオープンフィールドテストでマウスを試験した。しかしながら、この場合では、我々は同じ動物の異なる試験で光ファイバーガイドカニューレを用いてグルタミン酸アンタゴニストであるNBQXおよびAP5が生理食塩水対照のどちらかを注入し、試験は順番についてカウンターバランスをとった。通過する線維の制御よりもむしろ局所的シナプス性機構を確認すると、同じマウスと光刺激パラメータについて、CeAでの局所的グルタミン酸受容体拮抗作用が高架式十字迷路法図5kとオープンフィールドテスト図5jの両方での不安感の光誘導性減少を消失させた。重要なことに、対照実験では、薬品処理によって自発運動活性は損なわれず図11、そして、急速切片においてNBQXおよびAP5のバス適用を受けて時間的に同期した光誘起興奮性反応が消失した図12。まとめると、これらのデータは、我々が観察した光誘導性抗不安効果はBLA-CeLシナプスの活性化が引き起こしたものであり、CeAを通過する遠位標的へのBLA投射に起因するものではないことを示している。最終シリーズの実験において、選択的にこの経路を抑制することにより内在性の不安感軽減プロセスが妨害され得るか判定するために、我々は、これらの光遺伝学的に限定されたシナプスが可逆的に不安感を増大させ得るか検討した。我々は、両方ともBLAでCaMKIIαプロモーターの下にある、コハク色の光での照明を受けてニューロンの膜を過分極する光活性化塩素ポンプであるeNpHR3.025、またはEYFPのみのどちらかの両側的ウイルス性形質導入を行い、そして、CeA中のBLA末端の選択的照明を可能にするために斜めに切ったガイドカニューレを両側的に埋め込んだ図6a;図13。eNpHR3.0の発現はBLA中のグルタミン酸作動性CaMKIIα陽性ニューロンに限定された図6b。eNpHR3.0:BLA-CeAグループのみが、EYFP:BLA-CeAbilグループおよびeNpHR3.0:細胞体グループと比較して、CeMでのc‐fos発現レベルの著しい上昇p<0.05;図6c~eを示したが、これは、CeA中のBLA末端の選択的抑制がCeLニューロンからCeMニューロンへのフィードフォワード抑制を抑制し、そうしてCeM興奮性を増大させ、そして、下流のプロセスが不安感表現型を増大させることになることと一致する。重要なことに、BLA細胞体の抑制が不安惹起反応を誘導しなかったが、直接的BLA-CeM興奮性入力の同時的減少が原因のようである。我々はまた、eNpHR3.0:BLA-CeAグループは、EYFPグループおよび細胞体グループと比較して、高架式十字迷路法でライトオフエポックではなくライトオンエポック中に壁がないアームで過ごす時間および壁がないアームに入っていく確率の著しい減少を示したが図6f、g、自発運動活性は変化しなかった図16。eNpHR3.0:BLA-CeAグループはまた、EYFPグループおよび細胞体グループと比較して、594nmの光での照明を受けて中央にいる時間の著しい減少を示した統計、p=0.002;図6h、i。最後に、我々はまた、eNpHR3.0発現軸索末端の選択的照明が、細胞体でのスパイキングを妨げることなく図14、自発生起的シナプス小胞放出図6j~lおよび誘起的シナプス小胞放出図6m~pの確率を減少させ得ることを示す。CeA中のBLA末端の選択的抑制が不安感様行動の急性の増加を誘導することをこれらのデータは示す。結論:これらの実験において、我々は不安感の無条件付け発現を両方向に調節するための内在性の神経基質としてBLA-CeL経路を特定した。我々はCeLを通過するBLA線維よりもむしろBLA-CeL経路を重要な基質として特定しているが、BNSTへのCeA投射などの他の下流回路が不安感の発現または不安感関連行動に重要な役割を果たす可能性が有る4、6、13。実際、我々の発見は、CeLがBNSTへのCRHの主要な放出源であるので53、BNST中のコルチコトロフィン放出ホルモンCRHネットワークが不安感関連行動の調節に決定的に関与し得る6、52という考えを裏付け得る。セロトニン54、55、ドーパミン56、アセチルコリン57、グリシン58、GABA13およびCRH59を含む、他の神経伝達物質および神経調節物質が分散型神経回路への効果を調節またはゲート開閉することができる。BLA-CeLシナプスの並列回路または下流回路が不安感表現型の発現を調節するために役に立つようなので6、56、この経路に合流し、そして、この経路から分出する神経回路網が多くの機会を調節的制御に提供する。さらに、扁桃体の上流では、BLAおよびCeLへの強固な神経支配をもたらす前辺縁皮質、下辺縁皮質および島皮質を含む、恐怖と不安感を処理するのに重要な領域からのトップダウン皮質制御によってリクルートされるのに、この微小回路は良い位置につけている4、13、23、60。我々のBLA解剖学の検討により、CeLニューロンおよびCeMニューロンに投射するBLAニューロンの集団は大部分が重複していないことが示唆される。自然状態では、CeL投射BLAニューロンは微小回路ホメオスタシス機構においてCeM投射BLAニューロンを興奮させることができる。これはまた、回路のバランスを歪めて無抑制のCeM活性化を可能にするシナプスの変化が存在するとき、不安障害の基礎をなす潜在的な機構を表す可能性もある。まとめると、本明細書で提示されたデータは、哺乳類の脳での内在性の不安緩解の発現に必須であると共に充分である重要な回路要素としてのBLA-CeLシナプスの特定を裏付け、不安感への見識の新しい源ならびに新しい種類の治療標的を提供し、そして、精神疾患に関連する神経回路機能の研究において特定の投射の解明の重要性を示す。明確な理解を目的として、前述の発明が例証と例示をもって幾分詳細に説明されてきたが、説明と例示は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書において開示される全ての参考文献、刊行物および特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。参考文献1LiebRAnxietydisordersclinicalpresentationandepidemiologyHandbExpPharmacol4054322KesslerRCetalLifetimeprevalenceandageofonsetdistributionsofDSMIVdisordersintheNationalComorbiditySurveyReplicationArchGenPsychiatry625936023KoobGFBrainstresssystemsintheamygdalaandaddictionBrainRes129361754ResslerKJMaybergHSTargetingabnormalneuralcircuitsinmoodandanxietydisordersfromthelaboratorytotheclinicNatNeurosci10111611245VanderschurenLJEverittBJBehavioralandneuralmechanismsofcompulsivedrugseekingEurJPharmacol52677886DavisMWalkerDLMilesLGrillonCPhasicvssustainedfearinratsandhumansroleoftheextendedamygdalainfearvsanxietyNeuropsychopharmacology351051357EhrlichIetalAmygdalainhibitorycircuitsandthecontroloffearmemoryNeuron627577718HanJHetalSelectiveerasureofafearmemoryScience323149214969HerryCetalSwitchingonandofffearbydistinctneuronalcircuitsNature45460060610LeDouxJTheemotionalbrainfearandtheamygdalaCellMolNeurobiol2372773811MarenSQuirkGJNeuronalsignalingoffearmemoryNatRevNeurosci584485212PareDQuirkGJLedouxJENewvistasonamygdalanetworksinconditionedfearJNeurophysiol921913ShinLMLiberzonITheneurocircuitryoffearstressandanxietydisordersNeuropsychopharmacology3516919114DavisMTheroleoftheamygdalainconditionedandunconditionedfearandanxietyinTheAmygdalap21328815KillcrossSRobbinsTWEverittBJDifferenttypesoffearconditionedbehaviourmediatedbyseparatenucleiwithinamygdalaNature38837738016TyeKMJanakPHAmygdalaneuronsdifferentiallyencodemotivationandreinforcementJNeurosci273937394517TyeKMStuberGDdeRidderBBonciAJanakPHRapidstrengtheningofthalamoamygdalasynapsesmediatescuerewardlearningNature4531253125718BahiAMineurYSPicciottoMRBlockadeofproteinphosphatase2BactivityintheamygdalaincreasesanxietyanddepressionlikebehaviorsinmiceBiolPsychiatry661139114619DavisMAredifferentpartsoftheextendedamygdalainvolvedinfearversusanxietyBiolPsychiatry441239124720EtkinAetalIndividualdifferencesintraitanxietypredicttheresponseofthebasolateralamygdalatounconsciouslyprocessedfearfulfacesNeuron441043105521KalinNHSheltonSEDavidsonRJTheroleofthecentralnucleusoftheamygdalainmediatingfearandanxietyintheprimateJNeurosci245506551522RoozendaalBMcEwenBSChattarjiSStressmemoryandtheamygdalaNatRevNeurosci23SteinMBSimmonsANFeinsteinJSPaulusMPIncreasedamygdalaandinsulaactivationduringemotionprocessinginanxietypronesubjectsAmJPsychiatry16431832724BoydenESZhangFBambergENagelGDeisserothKMillisecondtimescalegeneticallytargetedopticalcontrolofneuralactivityNatNeurosci81263126825GradinaruVataLMolecularandcellularapproachesfordiversifyingandextendingoptogeneticsCe14115416526NagelGatalChannelrhodopsin2adirectlylightgatedcationselectivemembranechannelProcNatAcadSciUSA100139401394527FraserADUseandabuseofthebenzodiazepinesTherDrugMonit2048148928WoodsJHKatzJLWingerGBenzodiazepinesuseabuseandconsequencesPharmacolRev4415134729HovattaIBarlowCMoleculargeneticsofanxietyinmiceandmenAntiMed409210930HovattaIetalGlyoxalase1andglutathionereductase1regulateanxietyinmiceNature43866266631BlanchardRJYudkoEBRodgersRJBlanchardDCDefensesystempsychopharmacologyanethologicalapproachtothepharmacologyoffearandanxietyBehavBrainRes5815516532LeDouxJEIwataJCicchettiPReisDJDifferentprojectionsofthecentralamygdaloidnucleusmediateautonomicandbehavioralcorrelatesofconditionedfearJNeurosci82517252933CarlsonJlrnmunocytochemicallocalizationofglutamatedecarboxylaseintheratbasolateralamygdaloidnucleuswithspecialreferencetoGABAergicinnervationofamygdalostriatalprojectionneuronsJCompNeurol27351352634SmithYPareDIntraamygdaloidprojectionsofthelateralnucleusinthecatPHALanterogradelabelingcombinedwithpostembeddingGABAandglutamateimmunocytochemistryJCompNeurol34223224835McDonaldAJCytoarchitectureofthecentralamygdaloidnucleusoftheratJCompNeurol20840141836BissiereSHumeauYLuthiADopaminegatesLTPinductioninlateralamygdalabysuppressingfeedforwardinhibitionNatNeurosci658759237MarowskyAYanagawaYObataKVogtKEAspecializedsubclassofinterneuronsmediatesdopaminergicfacilitationofamygdalafunctionNeuron481025103738PitkanenAConnectivityoftheratamygdaloidcomplexinTheAmygdalap319939KrettekJEPriceJLAmygdaloidprojectionstosubcorticalstructureswithinthebasalforebrainandbrainstemintheratandcatJCompNeurol17822525440PetrovichGDSwansonLWProjectionsfromthelateralpartofthecentralamygdalarnucleustothepostulatedfearconditioningcircuitBrainRes76324725441LeDouxJECicchettiPXagorarisARomanskiLMThelateralamygdaloidnucleussensoryinterfaceoftheamygdalainfearconditioningJNeurosci101062106942KrettekJEPriceJLAdescriptionoftheamygdaloidcomplexintheratandcatwithobservationsonintraamygdaloidaxonalconnectionsJCompNeurol17825528043PetrovichGDRisoldPYSwansonLWOrganizationofprojectionsfromthebasomedialnucleusoftheamygdalaaPHALstudyintheratJCompNeural37438742044PareDSmithYTheintercalatedcellmassesprojecttothecentralandmedialnucleioftheamygdalaincatsNeuroscience571077109045LikhtikEPopaDApergisSchouteJFidacaroGAPareDAmygdalaintercalatedneuronsarerequiredforexpressionoffearextinctionNature45464264546JolkkonenEPitkanenAIntrinsicconnectionsoftheratamygdaloidcomplexprojectionsoriginatinginthecentralnucleusJCompNeurol395537247AmanoTUnalCTPareDSynapticcorrelatesoffearextinctionintheamygdalaNatNeurosci1348949448McDonaldAJMullerJFMascagniFGABAergicinnervationofalphatypeIIcalciumcalmodulindependentproteinkinaseimmunoreactivepyramidalneuronsintheratbasolateralamygdalaJCompNeurol44619921849CholerisEThomasAWKavaliersMPratoFSAdetailedethologicalanalysisofthemouseopenfieldtesteffectsofdiazepamchlordiazepoxideandanextremelylowfrequencypulsedmagneticfieldNeurosciBiobehavRev2523526050PellowSChopinPFileSEBrileyMValidationofopenclosedarmentriesinanelevatedplusmazeasameasureofanxietyintheratJNeurosciMethods1414916751SahPLopezDeArmentiaMExcitatorysynaptictransmissioninthelateralandcentralamygdalaAnnNYAcadSci985677752DavisMShiCTheextendedamygdalaarethecentralnucleusoftheamygdalaandthebednucleusofthestriaterminalisdifferentiallyinvolvedinfearversusanxietyAnnNYAcadSci87728129153SakanakaMShibasakiTLederisKDistributionandefferentprojectionsofcorticotropinreleasingfactorlikeimmunoreactivityintheratamygdaloidcomplexBrainRes38221323854HolmesAYangRJLeschKPCrawleyJNMurphyDLMicelackingtheserotonintransporterexhibit5HTreceptormediatedabnormalitiesintestsforanxietylikebehaviorNeuropsychopharmacology282077208855LeschKPetalAssociationofanxietyrelatedtraitswithapolymorphismintheserotonintransportergeneregulatoryregionScience2741527153156GraybielAMRauchSLTowardaneurobiologyofobsessivecompulsivedisorderNeuron2834334757PicciottoMRBrunzellDHCaldaroneBJEffectofnicotineandnicotinicreceptorsonanxietyanddepressi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