"1つ以上の標的核酸についてサンプルをアッセイする方法であって、以下のステップ:a1つ以上の標的核酸を含むサンプルを、以下を含む増幅反応混合物と接触させること:i正方向/逆方向オリゴヌクレオチドプライマーの1つ以上の対であって、サンプル中に存在する場合、前記プライマー対は、1つ以上の標的核酸を増幅することができる、プライマー対、ii2つ以上のプローブの組であって、前記組中の少なくとも1つのプローブは二本鎖部分を含む、プローブ組、この場合、少なくとも1つのプローブは2つのオリゴヌクレオチドを含み:第1のオリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイジンングオリゴヌクレオチドTHOとも呼ばれ、第2のオリゴヌクレオチドは、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドPCOとも呼ばれ、THOおよびPCOは、互いにハイブリダイズすることができ、部分的に二本鎖のプローブを形成する、この場合、前記組中の各プローブは、各プローブに特徴的な可変性のシグナルを生じることができる検出可能な標識または検出可能な標識の組み合わせを含む、およびこの場合、前記2つ以上のプローブは、同じ検出可能な標識、または、識別不可能な発光スペクトルを有する異なる検出可能な標識を含み、かかるプローブのそれぞれの融解特性は異なり、二本鎖部分を有する各プローブは特徴となる融解温度を有するのに対し、二本鎖部分を有さない一本鎖プローブは特徴となる融解温度を有さない;b増幅条件下で、サンプル/反応混合物において増幅反応を行なうこと、この場合、標的核酸が存在する場合、その標的核酸の一部に実質的に相補的であるTHOは前記標的核酸とハイブリダイズし、その結果、消費され、この場合、プローブの消費は、標識の検出可能なシグナルの変化を生じ、また、元のプローブが二本鎖部分を有する場合、消費されたプローブはもはや二本鎖部分を形成することはできない;およびc温度の関数としてプローブ中の標識からシグナルを検出することにより、前記反応混合物中の消費されないプローブの融解プロファイルを少なくとも一度測定すること、この場合、前記融解プロファイル分析における任意のプローブの融解特性の有無は、そのプローブの非消費または消費を示し、それにより、前記サンプル中に少なくとも1つの標的核酸が存在するか否かも示される、を含み、この場合、THOは標的配列に相補的であり、フルオロホアおよびクエンチャーで標識され、この場合、PCOは、THOに部分的に相補的であり、また、例えば、標識またはリン酸基を付けることにより修飾された3’末端を含み、その伸長を防ぎ、この場合、PCOの3’末端にクエンチャー例えばリン酸基でない標識が付けられている場合、蛍光放射はTHOおよびPCOのハイブリダイゼーションによって増加され、この種のプローブはプラスプローブTHO:PCOと呼ばれ、この場合、PCOの3’末端にクエンチャーが付けられている場合、蛍光放射はTHOおよびPCOのハイブリダイゼーションによって減少され、この種のプローブはマイナスプローブ-THO:PCOと呼ばれる、前記アッセイ方法。前記2つ以上のプローブの組がプラスプローブだけを含む、請求項1に記載の方法。前記2つ以上のプローブの組がマイナスプローブだけを含む、請求項1に記載の方法。前記2つ以上のプローブの組がプラスプローブとマイナスプライマーの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。前記2つ以上のプローブの組が一本鎖プローブと、プラスプローブまたはマイナスプローブの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。前記融解プロファイルが、反応/増幅が行われる前に測定され増幅前融解プロファイル、および/または、反応/増幅の完了後に測定され増幅後融解プロファイル、および/または、各サイクルもしくは選択されたサイクルにおける反応/増幅中に測定され増幅中融解プロファイル、以下のステップdicで得られた少なくとも2つの融解プロファイルを比較すること、および/またはiiステップcで得られた融解プロファイルを、同じプローブの以前に得られた融解プロファイルと、もしくは対照反応中の同じ時間に同時に得られた同じプローブの融解プロファイルと、もしくは同じプローブの理論的融解プロファイルと比較すること、をさらに含み、この場合、融解プロファイルの変化は、前記サンプル/反応混合物中に少なくとも1つの標的核酸が存在するか否かを示し、前記増幅前融解プロファイルは、反応/増幅開始前に同じ反応容器中で測定されるか、または、反応/増幅に必要な1つ以上の成分を欠くその反応混合物により増幅が行われない個別の反応容器中で測定され、ステップdにおいて、増幅後または増幅中融解プロファイルは、特定のプローブが消費されるか否かを調べるために、二本鎖のプローブの増幅前融解プロファイルと比較され、これにより、サンプル中の対応する標的の存在が示される、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記プローブの消費が、前記THOの前記標的配列へのハイブリダイゼーション、それに続く、前記THOの前記増幅生成物への組み入れによって達成されるか、または、前記THOが前記増幅生成物中に組み入れられ得る時、前記THOは伸長可能なプライマーであるか、もしくは、正方向/逆方向オリゴヌクレオチドプライマー対の一つである、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記プローブの消費が、前記THOと前記標的配列とのハイブリダイゼーション、それに続く、THOの分解により達成され、この場合、THOが反応中に分解される場合、前記反応混合物はヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記2つ以上のプローブの組が、二本鎖部分を有する少なくとも2つのプローブを含み、この場合、第1のプローブは、その二本鎖部分に関して融解温度Tm1を有し、この場合、第2のプローブは、その二本鎖部分に関して融解温度Tm2を有し、この場合、Tm1>Tm2であり、この場合、同じ標識が、第1および第2のプローブに独立して付けられ、この場合、Tm1および/またはTm2の任意の融解ピークの減少が、第1および/または第2のプローブの消費を示す、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記増幅反応混合物は、一塩基多型SNPをアッセイするための2つの関連するTHOプローブを含み、第1のTHOは第1の対立遺伝子用であり、第2のTHOは第2の対立遺伝子用である、請求項10に記載の方法。一塩基多型SNPをアッセイするための前記2つの関連するTHOは、同じPCOとハイブリダイズして、部分的に二本鎖であるプローブを形成することができる、請求項10に記載の方法。前記2つの関連するTHOは、同じ標識が付けられている、請求項10に記載の方法。前記プローブの第2のオリゴヌクレオチドは、前記プローブの第1のオリゴヌクレオチド、プライマー、反応バッファー、酵素および増幅中の反応に必要な他の成分を含む主要反応混合物から物理的に分離されるが、融解プロファイルを測定するために、増幅プロセスの完了後に前記主要反応混合物と混合され、この場合、前記第2のオリゴヌクレオチドは、前記反応完了後に前記主要反応容器中に添加される、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。請求項1~13のいずれか1項に記載の2つ以上のプローブの組を含む、1つ以上の核酸標的をアッセイするためのキットであって、以下:二本鎖部分を含む前記組中の少なくとも1つのプローブ、この場合、前記少なくとも1つのプローブは、2つのオリゴヌクレオチド:標的ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドTHOおよび部分的に相補的なオリゴヌクレオチドPCOを含み、THOおよびPCOは、互いにハイブリダイズすることができ、部分的に二本鎖のプローブを形成する、この場合、前記組中の各プローブは、各プローブに特徴的な可変性のシグナルを生じることができる検出可能な標識または検出可能な標識の組み合わせを含む、およびこの場合、前記2つ以上のプローブは、同じ検出可能な標識、または、識別不可能な発光スペクトルを有する異なる検出可能な標識を含み、かかるプローブのそれぞれの融解特性は異なり、二本鎖部分を有する各プローブは特徴となる融解温度を有するのに対し、二本鎖部分を有さない一本鎖プローブは特徴となる融解温度を有さない;この場合、THOは標的配列に相補的であり、フルオロホアおよびクエンチャーで標識され、この場合、PCOは、THOに部分的に相補的であり、また、例えば、標識またはリン酸基を付けることにより修飾された3’末端を含み、その伸長を防ぎ、この場合、PCOの3’末端にクエンチャー例えばリン酸基でない標識が付けられている場合、蛍光放射はTHOおよびPCOのハイブリダイゼーションによって増加され、この種のプローブはプラスプローブTHO:PCOと呼ばれ、この場合、PCOの3’末端にクエンチャーが付けられている場合、蛍光放射はTHOおよびPCOのハイブリダイゼーションによって減少され、この種のプローブはマイナスプローブ-THO:PCOと呼ばれ、この場合、前記2つ以上のプローブの組は、プラスプローブのみを含むか、または、前記2つ以上のプローブの組は、マイナスプローブのみを含むか、または、前記2つ以上のプローブの組は、プラスプローブとマイナスプライマーの組み合わせを含むか、または、前記2つ以上のプローブの組は、一本鎖プローブと、プラスプローブまたはマイナスプローブの組み合わせを含む、を含む、アッセイするためのキット。前記2以上のプローブの組が、一塩基多型SNPをアッセイするための2つの関連するTHOプローブを含み、第1のTHOは第1の対立遺伝子用であり、第2のTHOは第2の対立遺伝子用であり、前記2つの関連するTHOは、同じPCOとハイブリダイズして、部分的に二本鎖であるプローブを形成することができ、前記2つの関連するTHOは、同じ標識が付けられている、請求項14に記載のキット。本発明を以下の実施例においてさらに規定し、実施例中、特に記載しない限り、部分およびパーセンテージは重量により、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すけれども、例示のみのために示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、その精神および範囲から外れることなく、様々な使用および条件に適応させるために本発明の変更および修飾を行うことができる。したがって、本明細書中に示され記載されたものに加えての本発明の様々な修飾は、上述の記載から当業者には明らかであろう。そのような修飾もまた、添付された特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。本明細書中に示される各参考文献の開示は、参照によりその全体を本明細書中に組み入れられる。実施例1次の実験において使用される全てのプライマーは、EUROGENTECによって合成された。増幅プライマーおよびプローブは以下のとおりである:K10R266FamGttcaATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA;配列番号1K10R266DabGCGCGGTGAAACCCAATTGAAC;配列番号2SV40RlF3FAMATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC;配列番号3SV40RlF3DabCAAATGTGGTATGGCTGAT;配列番号4K10F155CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG;配列番号5SV40RealRCCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAAC配列番号6プライマー/プローブK10R266Fam第1のオリゴヌクレオチドは、5’末端においてFAMで標識されている。K10R266Dab第2のオリゴヌクレオチドは3’末端にDABCYLを含む。K10R266FamおよびK10R266Dabは、以下のような二本鎖部分を形成し得る:Fam-5’GTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA3’配列番号1DABCYL-3’CAAGTTAACCCAAAGTGGCGCG5’配列番号2上記のハイブリッドはプローブK10R266と呼ばれる。プライマー/プローブSV40RlF3FAM第1のオリゴヌクレオチドは5’末端においてFAMで標識されている。SV40RlF3Dab第2のオリゴヌクレオチドは、3’末端にDABCYLを含む。SV40RlF3FAMおよびSV40RlF3Dabは、は、以下のような二本鎖部分を形成し得る:Fam-5’ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC3’配列番号3DABCYL-3’TAGTCGGTATGGTGTAAAC5’配列番号4このハイブリッドはプローブSV40RlF3と呼ばれる。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドは、様々な比率、典型的には1:3で組み合わせられ、部分的に二本鎖の線状DNAプローブを形成した。標的が存在しない状態で、第1および第2のオリゴヌクレオチドのハイブリッドの形成は、クエンチャーおよびフルオロホアを近接近させ、蛍光シグナルを効率的にクエンチする。標的が存在する状態で、第1のオリゴヌクレオチドは、標的配列に優先的にハイブリダイズし、アンプリコンへ組み入れられる。その結果、クエンチャーはフルオロホアから分離し、蛍光放射の増加をもたらす。プライマー対K10R266FamおよびK10F155は、K10標的配列が存在する状態で110bpの生成物を増幅する。SV40RlF3FAMおよびSV40RealRは、SV40標的配列が存在する状態で125bpの生成物を増幅する。実施例2融解プロファイル実験は以下のとおり行なわれた:プローブの熱安定性は、蛍光放射が40~90°Cの範囲の温度で測定された、融解プロファイル実験において特性決定された。融解温度Tmは、第1および第2のオリゴヌクレオチド二本鎖が解離する特徴的温度として定義される。各融解プロファイルは、PCRバッファー1xThermoPol反応バッファー,NewEnglandBioLabsを含む20μlの反応においてチューブ中で測定された。温度サイクリングは、以下のサイクリング条件:90°C、3分間の変性を1サイクル;1サイクルごと1°Cずつ増加させて40~90°Cの温度範囲で30秒間保持することを50サイクル、により、Mx3005p定量PCRシステムStratageneで行なわれた。蛍光測定は、50サイクルの30秒間の保持ごとに記録された。融解プロファイルは、90~40°Cの範囲の温度で蛍光をモニターすることにより、プローブK10R266プローブ1およびプローブSV40RlF3プローブ2について測定した。K10R266は、72°CのTmを有し、SV40RlF3は、62°CのTmを有する。図9A。融解プロファイルは、プローブK10R266およびプローブSV40RlF3の一連の混合物について測定した:サンプル1は、0.5μMのK10R266および0.5μMのSV40RlF3を含む。サンプル2は、0.5μMのK10R266および0.25μMのSV40RlF3を含む。サンプル3は、0.5μMのK10R266および0.125μMのSV40RlF3を含む。サンプル4は、0.5μMKの10R266および0.0625μMのSV40RlF3を含む。サンプル5は、0.5μMのK10R266および0.003125μMのSV40RlF3を含む。そのプロファイルは図9Bに示される。プローブK10R266およびSV40RlF3の組み合わせは、テンプレートとしてK10およびSV40配列を含むプラスミドDNAを使用して、リアルタイムPCRアッセイにおいて試験した。マスター反応混合物は、0.5μMのK10R266および0.5μMのSV40RlF31:3の混合比の第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のヌクレオチドの組み合わせならびに標準PCR成分NEBを含むように作製された。増幅反応は、以下のサイクリング条件にて、StratageneMx3005リアルタイムPCRシステムで行なわれた:1.増幅前、融解プロファイル:1サイクルごと1°Cずつ減少させて90~40°Cの温度範囲で30秒間保持することを50サイクル。蛍光測定は、50サイクルの30秒間の保持ごとに記録された。2.増幅中:94°Cで20秒間;63°Cで30秒間;51°Cで30秒間;72°Cで30秒間;を30サイクル。蛍光測定は、読み取りステップ63°C、51°Cおよび72°C中に記録された。3.増幅後、融解プロファイル:1サイクルごと1°Cずつ増加させて40~90°Cの温度範囲で30秒間保持することを50サイクル。蛍光測定は、50サイクルの30秒間の保持ごとに記録された。4つの反応が設定された:反応1はK10テンプレートを含む;反応2はSV40テンプレートを含む;反応3はK10およびSV40テンプレートの両方を含む;反応4はテンプレートを含まない。4つの反応についての増幅前融解プロファイルが、図10に示される。増幅中、63°Cにて集められた蛍光放射は、図11Aに示される。増幅中、51°Cにて集められた蛍光放射は、図11Bに示される。増幅中、72°Cにて集められた蛍光放射は、図11Cに示される。4つの反応についての増幅後融解プロファイルは、図12に示される。増幅前および増幅後融解プロファイルの比較を以下に示した:反応1では、K10R266プローブが消費され、プロファイルはSV40RlF3プローブに特徴的である。反応2では、SV40RlF3プローブが消費される。反応3では、K10R266およびSV40RlF3プローブの両方が消費される。反応4では、プローブは消費されず、増幅前および増幅後プロファイルは類似している。サイクルごとの蛍光放射FEは、3つの測定温度にて得られた:MT72°C、63°Cおよび51°C。最初の蛍光放射FE1は、測定温度63°Cにて得られ、その温度で、第2のプローブSV40RlF3の10以下が二本鎖形態プローブの内部二本鎖形態であり;第2の蛍光放射FE2は、測定温度51°Cにて得られ、その温度で、2つのプローブの95以上が二本鎖形態であり、任意に、蛍光放射FE0が、測定温度72°Cにて得られ、その温度で、第1のプローブK10R266の10以下が二本鎖形態である。増幅反応において、2つの標的配列K10およびSV40のための2つのプローブが存在する。温度72°Cでは、K10R266プローブの10が二本鎖形態であり、SV40RlF3プローブの0が二本鎖形態である。63°Cでは、K10R266プローブの90が二本鎖形態であり、SV40RlF3プローブの5が二本鎖形態である。51°Cでは、すべてのプローブの98以上が二本鎖形態である。第1の蛍光放射は63°Cで集められ、それがFE1であり;第2の蛍光放射は51°Cで集められ、それがFE2である。FE1=90ACA15ACA2FE2=98ACA198ACA25ACA2は無視することができると想定すると、ACA1=FE1/90;ACA2=FE2/98-FE1/90である。ACA1はプローブ1の実際の消費された量であり;ACA2はプローブ2の実際の消費された量である。第1のプローブK10の実際の消費された量の増幅プロットは、ACA1として示される。第2のプローブSV40R1F3の実際の消費された量の増幅プロットは、ACA2として示される図13。実際の消費された量の計算は手作業で行うことができる。この計算は、コンピュータープログラムまたはソフトウェアによって行なうこともできる。定量を効率よく行うために、多重リアルタイムPCRからの放射データを管理し、かつ適切な計算を行なうためのソフトウェアが設計された。ソフトウェアは、Ctの手作業による選択およびブランクの減算等の他の機能を有した。ソフトウェアは、マイクロソフトエクセル用のAddinとしてビジュアルベーシックフォーアプリケーションVBAにおいて実行された。ソースコードは2つの主なモジュールに体系化された。1つのモジュールは、数学的機能、エクセルシート中に存在する放射データから配列を作成する機能、結果データおよび標識を印刷する機能、エラーおよびテンプレートを扱う機能、ならびに特定のタイプのチャートを作成する機能等のユーティリティー機能をすべて含んでいた。第2のモジュールは、プログラムの流れをコントロールする機能を含んでいた。このモジュールは、メニュー選択、バースライシングbarslicing、標準曲線中のデータの算入/除外等のユーザーとの相互作用を可能にする機能をすべて含んでいた。実施例3増幅プライマーおよびプローブは以下のとおりである:標的1K10用K10R266FamGttcaATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA;配列番号1K10R266DabGCGCGGTGAAACCCAATTGAAC;配列番号2K10F155CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG;配列番号5標的2SV40用SV40RlF3FAMATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC;配列番号3SV40RlF3DabCAAATGTGGTATGGCTGAT;配列番号4SV40RealRCCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAAC;配列番号6標的3Jak2用JKR3FamAACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA;配列番号11JKR3FDabFCTCAGAGCATCTGTT;配列番号12JKF2GCATCTTTATTATGGCAGAGAGAA。配列番号13オリゴヌクレオチドK10R266Famは、増幅プライマーであり、同時に、オリゴヌクレオチドK10R266Famは、プローブ1の第1のオリゴヌクレオチドである。K10R266Fam第1のオリゴヌクレオチドは、5’末端においてFAMで標識されている。K10R266Dab第2のオリゴヌクレオチドは、3’末端にDABCYLを含む。K10R266FamおよびK10R266Dabは、二本鎖部分を形成することができる。K10R266FamおよびK10R266Dabのハイブリッドはプローブ1と呼ばれる。オリゴヌクレオチドSV40RlF3FAMは、増幅プライマーであり、同時に、オリゴヌクレオチドSV40RlF3FAMは、プローブ2の第1のオリゴヌクレオチドである。SV40RlF3FAM第1のオリゴヌクレオチドは、5’末端においてFAMで標識されている。SV40RlF3Dab第2のオリゴヌクレオチドは、3’末端にDABCYLを含む。SV40RlF3FAMおよびSV40RlF3Dabは、二本鎖部分を形成することができる。SV40RlF3FAMおよびSV40RlF3Dabのハイブリッドはプローブ2と呼ばれる。オリゴヌクレオチドJKR3Famは、増幅プライマーであり、同時に、オリゴヌクレオチドJKR3Famは、プローブ3の第1のオリゴヌクレオチドである。JKR3Fam第1のオリゴヌクレオチドは、5’末端においてFAMで標識されている。JKR3FDabF第2のオリゴヌクレオチドは、3’末端にDABCYLを含む。JKR3FamおよびJKR3FDabFは、二本鎖部分を形成することができる。JKR3FamおよびJKR3FDabFのハイブリッドはプローブ3と呼ばれる。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドは、様々な比率で、典型的には、1:2~1:4で組み合わせられ、部分的に二本鎖の線状DNAプローブを形成した。標的が存在しない状態で、第1および第2のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、クエンチャーおよびフルオロホアを近接近させ、蛍光シグナルを効率的にクエンチする。標的が存在する状態で、第1のオリゴヌクレオチドは、標的配列に優先的にハイブリダイズし、アンプリコンへ組み入れられる。その結果、クエンチャーはフルオロホアから分離し、蛍光放射の増加をもたらす。プライマー対K10R266FamおよびK10F155は、K10標的配列が存在する状態で110bpの生成物を増幅する。SV40RlF3FAMおよびSV40RealRは、SV40標的配列が存在する状態で125bpの生成物を増幅する。プライマーJKR3FamおよびJKF2は、Jak2標的配列が存在する状態で222bpの生成物を増幅する。プローブ1、プローブ2、プローブ3ならびにプローブ1、2および3の混合物の融解プロファイル分析は、StratageneMx3005リアルタイムPCR装置図16を使用して行なわれた。熱プロファイルは、解離曲線分析ソフトウェアのパラメーターに基づいた:30秒間70°Cで加熱、40°Cまで冷却して30秒間保持、その後ゆっくりと、温度を94°Cまで増加させ、蛍光放射データは、温度上昇中、連続的に集められる。温度に対する放射測定値の第1の負の導関数は、曲線を形成するように温度に対してプロットされ、曲線の各ピークはプローブの実際のTmに相当する。一重、二重および三重の増幅は、1つの標的、または2つの標的、または3つの標的すべてが存在する状態において、同じ反応マスター混合物を使用して行なわれた。マスター反応混合物は、3つのプローブそれぞれについて0.1μMの第1のオリゴヌクレオチド、3つのプローブそれぞれについて0.4μMの第2のオリゴヌクレオチド、各標的について0.2μMのプライマープローブの第1のオリゴヌクレオチドではない、ならびに標準PCR成分NEBを含むように作製された。増幅反応は、以下のサイクリング条件にて、StratageneMx3005リアルタイムPCRシステムで行なわれた:1.増幅中:94°Cで15秒間;63°Cで20秒間;50°Cで20秒間;55°Cで20秒間;63°Cで20秒間;68°Cで20秒間;72°Cで20秒間;を40サイクル。蛍光測定は、読み取りステップ55°C、63°C、68°Cおよび72°C中に記録された。3.増幅後融解プロファイル:最終サイクル後に、72°Cにて20秒間、40°Cまで冷却して30秒間保持、その後ゆっくりと、温度を78°Cまで増加させ、蛍光放射データは、温度上昇中、連続的に集められる。8つの反応が設定された:反応Aはテンプレートを含まない;反応Bは標的2テンプレートを含む;反応Cは標的3テンプレートを含む;反応Dは標的2および3を含む;反応Eは標的1を含む;反応Fは標的1および2を含む;反応Gは標的1および3を含む;反応Hは標的1、2および3を含む。8つの反応のための増幅後融解プロファイルは、図16に示される。標的が存在する状態および標的が存在しない状態の増幅後融解プロファイルの比較を、以下に示した図16:反応Aでは、プローブは消費されず、融解プロファイルは3つのプローブすべての混合物に特徴的である。反応Bでは、プローブ2が消費される。反応Cでは、プローブ3が消費される。反応Dでは、プローブ2および3が消費される。反応Eでは、プローブ1が消費される。反応Fでは、プローブ1および2が消費される。反応Gでは、プローブ1および3が消費される。反応Hでは、プローブ1、2および3が消費される。サイクルごとの蛍光放射FEは、3つの測定温度にて得られた:MT50°C、55°C、63°C、68°Cおよび72°C。各プローブの実際の消費された量は、式FEa=ACA1ds1aACA2ds2aACA3ds3aACAndsnaによって計算され得る。実施例4標的1K10用増幅プライマー:K10F155CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG;配列番号5K10R14CCTGAGGGTTAAATCTTCCCCATTGA配列番号21標的1用プローブプローブ1と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドK10R266FamphGTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA配列番号75’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドK10R266DabGCGCGGTGAAACCCAATTGAAC配列番号23’末端にDABCYLが付けられている標的2SV40用増幅プライマー:dsredendF2GTAAGATCCACCGGATCTAGATAAC配列番号8;sv40testRGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAG配列番号9標的2用プローブプローブ2と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドSV40RlF3FAPhATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC配列番号105’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドSV40RlF3DabCAAATGTGGTATGGCTGAT配列番号43’末端にDABCYLが付けられている。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドは、様々な比率で、典型的には、1:2~1:4で組み合わせられ、部分的に二本鎖の線状DNAプローブを形成した。標的が存在しない状態で、第1および第2のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、クエンチャーおよびフルオロホアを近接近させ、蛍光シグナルを効率的にクエンチする。標的が存在する状態で、第1のオリゴヌクレオチドは、優先的に標的配列にハイブリダイズし、アンプリコンへ組み入れられる。その結果、クエンチャーはフルオロホアから分離し、蛍光放射の増加をもたらす。プローブ1および2における第1のオリゴヌクレオチドは、ブロックされた3’末端を含むように修飾され、その結果、伸長することができない。しかしながら、第1のオリゴヌクレオチドが標的配列と結合する場合、それはポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性によって分解され得る。プローブ消費されたプローブの第1のオリゴヌクレオチドの分解は、プローブの第2のオリゴヌクレオチドと結合することが可能な第1のオリゴヌクレオチドの数の減少をもたらし、それにより、適切な温度で測定された場合の蛍光シグナルが増加される。プローブ1、プローブ2、ならびにプローブ1および2の混合物の融解プロファイル分析は、StratageneMx3005リアルタイムPCR装置図17を使用して行なわれた。熱プロファイルは、解離曲線分析ソフトウェアのパラメーターに基づいた図17A:30秒間72°Cで加熱、40°Cまで冷却して30秒間保持、その後ゆっくりと、温度を94°Cまで増加させ、蛍光放射データは、温度上昇中、連続的に集められる。温度に対する放射測定値の第1の負の導関数は、曲線を形成するように温度に対してプロットされ、曲線の各ピークはプローブの実際のTmに相当する。プローブ1は、Tmとして67°Cにピークを有し;プローブ2は、Tmとして59°Cにピークを有する図17B。各プローブの二本鎖形態および一本鎖形態のパーセンテージは、以下の表中に概算した。実際の計算は、コンピューターソフトウェアによって行うこともできる。概算計算は、解離曲線の多成分図に基づいて行うことができる温度に対する蛍光R、図17C。ベースラインは、100二本鎖として仮定され、それは9000としてRを有する。ある温度100一本鎖のRは24500である。温度62°Cでは、Rは13000である。62°Cとベースラインとの間の蛍光の値の違いdR=13000-9000=4000である。62°Cの二本鎖プローブのパーセンテージは、4000/24500-9000として概算され、25.8である。多重リアルタイムPCRおよび標準曲線分析プライマー-プローブマスター混合物は以下のように設定された:プライマーおよびプローブは、最終濃度0.4μMのプローブおよび0.6μMのプライマーとなるように混合され、それにより、2Xプライマー-プローブマスター混合物が作製される。反応混合物は、2Xプライマー-プローブマスター混合物および2XTaqMan登録商標GeneExpressionMsterMixAppliedBiosystem,カタログ番号4369514を等量混合することにより作製された。標的1、標的2、ならびに標的1および2の組み合わせを含むテンプレートDNAを、以下の通り連続希釈した:1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001。一重PCRは、標的1k10または標的2SV40を含むDNAサンプルを使用して行なわれた。二重PCRは、標的1k10および標的2SV40の混合物を含むDNAサンプルを使用して行なわれた。熱プロファイルは以下の通りであった:95°Cで8分30秒間;40サイクルの94°Cで10秒間;66°Cで20秒間;63°Cで20秒;54°Cで30秒間;52°Cで20秒間;61°Cで20秒間;62°Cで20秒間;68°Cで20秒間;蛍光測定は、読み取りステップ66°C、63°C、54°C;52°C;61°C;62°C;68°C中に記録された。62°Cにおける蛍光放射dRはFE1として選択され;52°Cにおける蛍光放射dRはFE2として選択された。上記の表ならびに明細書および特許請求の範囲中の実際の消費された量ACAの計算式に基づき、我々は以下の関係を得た:62°Cにて、FE1=0.75ACA10.05ACA2152°Cにて、FE2=100ACA1100ACA221および2にしたがい、ACA1=FE1-0.05FE2/0.7ACA2=0.75FE2-FE1/0.7両方の標的が存在する二重反応のために、FE1およびFE2を取得した。標的1のために計算されたACAは、ACA1=FE1-0.05FE2/0.7を使用して得られた。ACA1のための増幅プロットの図的表示は図18Aに示される。標準曲線は図18Bに示される。標的2のために計算されたACAは、ACA2=0.75FE2-FE1/0.7を使用して得られた。ACA2のための増幅プロットの図的表示は図18Cに示される。標準曲線は図18Dに示される。標的1のみが反応中に存在する場合、ACA1のための増幅プロットの図的表示は図18Eに示され、ACA2のための増幅プロットは図18Gに示される。標的1のみが反応中に存在することから、ACA1は、通常の増幅曲線および通常の標準曲線図18Fを明示するのに対して、ACA2は、標識2に対するシグナルが存在しないことを示す背景曲線を明示する。標的2のみが反応中に存在する場合、ACA1のための増幅プロットの図的表示は図18Hに示され、ACA2のための増幅プロットは図18Iに示される。標的2のみが反応中に存在することから、ACA2は、通常の増幅曲線および通常の標準曲線図18Jを明示するのに対して、ACA1は、標識1に対するシグナルが存在しないことを示す背景曲線を明示する。実施例5標的1K10用増幅プライマー:K10F155CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG配列番号5K10R14CCTGAGGGTTAAATCTTCCCCATTGA配列番号21。標的1用プローブプローブ1と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドK10R266FamphGTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA配列番号75’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドK10R266DabGCGCGGTGAAACCCAATTGAAC配列番号23’末端にDABCYLが付けられている。標的2SV40用増幅プライマー:dsredendF2GTAAGATCCACCGGATCTAGATAAC配列番号8;sv40testRGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAG配列番号9。標的2用プローブプローブ2と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドSV40RlF3FAPhATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC配列番号105’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドSV40RlF3DabCAAATGTGGTATGGCTGAT配列番号43’末端にDABCYLが付けられている。標的3Jak2用増幅プライマー:JknewF8GTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACA配列番号14JKnewR8CTCCTGTTAAATTATAGTTTACACTGACA配列番号15標的3用プローブプローブ3と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドJKR3FamPhAACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA配列番号165’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドJKR3FDabFCTCAGAGCATCTGTT配列番号123’末端にDABCYLが付けられている。標的4Kras用増幅プライマー:KR12GVF1BGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGC配列番号17KR12GVR12AsGATCATATTCGTCCACAAAATGATTC配列番号18。標的4用プローブプローブ4と呼ばれるは以下を含む:第1のオリゴヌクレオチドKR12GVFamPhGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT配列番号195’末端にFamが付けられ;3末端に3’-OHの代わりにリン酸基が付けられている;および、第2のオリゴヌクレオチドKR12GVFamDabCACAAGTTTATATTC配列番号203’末端にDABCYLが付けられている。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドは、様々な比率で、典型的には、1:2~1:4で組み合わせられ、部分的に二本鎖の線状DNAプローブを形成した。標的が存在しない状態で、第1および第2のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、クエンチャーおよびフルオロホアを近接近させ、蛍光シグナルを効率的にクエンチする。標的が存在する状態で、第1のオリゴヌクレオチドは、優先的に標的配列にハイブリダイズする。その結果、クエンチャーはフルオロホアから分離し、蛍光放射の増加をもたらす。すべてのプローブの第1のオリゴヌクレオチドは、ブロックされた3’末端を含むように修飾され、その結果、伸長することができない。しかしながら、第1のオリゴヌクレオチドが標的配列と結合する場合、それはポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性によって分解され得る。プローブ消費されたプローブの第1のオリゴヌクレオチドの分解は、プローブの第2のオリゴヌクレオチドと結合することが可能な第1のオリゴヌクレオチドの数の減少をもたらし、それにより、適切な温度で測定された場合の蛍光シグナルが増加される。多重リアルタイムPCRおよび標準曲線分析プライマー-プローブマスター混合物は以下のように設定された:プライマーおよびプローブは、最終濃度0.4μMのプローブおよび0.6μMのプライマーとなるように混合され、それにより、2Xプライマー-プローブマスター混合物が作製される。反応混合物は、2Xプライマー-プローブマスター混合物および2XTaqMan登録商標GeneExpressionMsterMixAppliedBiosystem,カタログ番号4369514を等量混合することにより作製された。熱プロファイルは以下の通りであった:95°Cで8分30秒間;40サイクルの94°Cで10秒間;66°Cで20秒間;63°Cで20秒;54°Cで30秒間;49°Cで20秒間;55°Cで20秒間;61°Cで20秒間;68°Cで20秒間;蛍光測定は、読み取りステップ66°C、63°C、54°C;49°C;55°C;61°C;68°C中に記録された。反応中に存在する標的の様々な組み合わせが使用された。実施例6この新規方法の原理は以下の通りである:第1に、各標的に対して、我々は、2つのオリゴヌクレオチド:標的ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドTHOおよび部分的に相補的なオリゴヌクレオチドPCOから成るプローブを設計する。THOおよびPCOは、互いにハイブリダイズして、部分的に二本鎖のプローブを形成することができる図19。二本鎖領域のため、各プローブは固有の融解特性を有し、それはその融解温度Tmによって主として特徴づけられる。THO標的配列と相補的であるは、5’末端でフルオロホア例えば、FAMおよび3’末端でクエンチャー例えば、BHQ1に標識されている。PCOからの伸長これは望ましくないは、3’末端の修飾により、例えば、標識またはリン酸基を付けることにより、ブロックされる。リン酸基が使用される場合図19Aおよび図20A、蛍光放射はTHOとPCOのハイブリダイゼーションによって増加する。融解プロットの導関数が正の値を示す場合図19A、このタイプのプローブはプラスプローブTHO:PCOと呼ばれる。PCOが3’末端でクエンチャーによって標識される場合図19B、蛍光放射はTHOとPCOのハイブリダイゼーションにより減少する。これは、THO:PCOハイブリッドの形成が、クエンチャーおよびフルオロホアを近接近させ、蛍光シグナルを効率的にクエンチする。融解プロットの導関数が負の値を示す場合図19B、このタイプのプローブはマイナスプローブ-THO:PCOと呼ばれる。このシステムを使用する多重PCRにおいては、2つの異なる標的のための少なくとも2つのプローブが存在し、それらは同じフルオロホアで標識されている。同じ標識を有する異なるプローブを識別するために、融解曲線分析において認識することができる固有のTmを有するように各プローブは設計される。原理証明試験において、我々は2つのプローブ:HPV16配列のためのものおよびHPV18配列のためのものを設計した。それらは両方ともプラスプローブであり、TmHPV16=46°CおよびTmHPV18=37°Cを有する図20Aおよび20B。多重反応において、プローブは、プラスプローブおよびマイナスプローブの組み合わせであり得る。プローブのうちの1つが典型的なTmを有さない一本鎖プローブであり得ることも可能である。第2に、標的配列とハイブリダイズすることができる標的ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドTHOは、増幅中に消費され得る。標的が存在しない状態で、THOは消費されず、その結果、反応全体にわたり同じ濃度で残る。THO:PCOハイブリッドの融解プロファイルは変化しない。標的が存在する状態で、THOは標的配列とハイブリダイズし、結果として、消費されるので、濃度は減少する。THO:PCOハイブリッドの融解ピークは、融解曲線分析において、減少するか、または消失する。THOの消費の主要な特徴は、いくつかの方法のいずれであっても、達成することができる。例えば、THOはPCR生成物中に組み入れてもよく、この場合、THOはプライマーとして機能する。本研究において、我々は、TaqManプローブとして機能するTHOを選択し、それは増幅中に分解されるHollandら,1991。THOの分解は、TaqManに基づくリアルタイムPCRのように、蛍光シグナルの増加をもたらし、それはPCR中にモニターすることができる。その一方で、融解曲線分析中、THOの分解は、その特徴となる融解ピークの減少または消失をもたらし、このことは、対応するプローブが消費されていることを示し、代わって、標的が増幅されていることを指摘する。このシステムを試験するために、我々は、2つの最も伝染力が強く、危険性の高いHPV株:HPV16およびHPV18をリアルタイムPCR装置中の一つの検出チャンネルで検出するためのプローブおよびプライマーを設計した。HPVゲノム配列のE6/E7領域を標的とする2つのプラスプローブを設計した図20A。正方向および逆方向プライマーを、プローブ結合領域の上流および下流となるように設計した。部分的に二本鎖のDNAプローブを形成させるために、THOおよびPCOは1:2の比率で組み合わせられた。標的が存在する状態で、THOは、優先的に標的配列とハイブリダイズし、増幅中にTaqポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それにより、蛍光放射の増加がもたらされる。増幅後、融解曲線分析が行なわれ、それにより、蛍光、したがって、THO:PCOハイブリッドのレベルがある温度範囲にわたり測定される。HPV16およびHPV18のプローブ/プライマーのデザインを試験するためにリアルタイムPCRが行なわれた。プローブハイブリッドTHO:PCOは、蛍光レベルを測定するために、融解曲線分析において予め試験され、その結果、それらをともに混合した場合、それらは同様の高さの融解ピークを有していた図20B。HPV16THOおよびHPV18THOの最終濃度は、約200μMであった。標的HPV配列を含むテンプレートプラスミドの5つの10倍連続希釈物、ならびに、DNAを含まない1つの陰性対照が、StratageneMX3005PリアルタイムPCR装置においてPCR増幅され、蛍光放射はFAMチャンネルにて集められた。各テンプレートの連続希釈物に対する典型的なリアルタイムPCR増幅プロットは、図20に示されるパネルC-HPV16、パネルE-HPV18、パネルG-HPV16HPV18。融解プロファイルは増幅後に取得された。陰性対照と比較して、標的HPV16が存在する場合、融解曲線中の46°Cにおける融解ピークは消失した図20D。標的HPV18が存在する場合、37°Cにおける融解ピークは消失した図20F。標的HPV16およびHPV18の両方が存在する場合、2つの融解ピークは両方とも消失した図20H。この結果は、たとえ同じ検出チャンネルであっても、HPV16またはHPV18またはHPV16HPV18の両方を個々に検出することができ、識別することができることを明白に示す。次に、我々は、一つの検出チャンネルでより多くの標的を検出することができるかどうかを調べた。FAM色素で標識された4つのマイナスプローブが、HPV16、HPV31、HPV52およびHPV59配列のために設計された。プローブのTHOは、HPVゲノム配列の保存的L1領域に相補的である。増幅後に、融解プロファイルは取得された。陰性対照と比較して、個々のHPV標的配列は正確に識別することができる。同様に、HEX色素で標識された4つの他のマイナスプローブがHPVゲノム配列の保存的L1領域を標的として設計され、これらは、HPV18、HPV39、HPV58およびHPV68配列を検出することができた。結果は、これらの4つのHPV配列を正確に遺伝子型決定することができることを示す。プラスおよびマイナスプローブの組み合わせも、HPV配列を検出するために試験された。HPV33およびHPV45配列のL1領域を標的とする、テキサスレッド色素で標識された2つのマイナスプローブ、および、HPV35配列のL1領域を標的とする、同じテキサスレッド色素で標識された1つのプラスプローブが、PCR反応に含まれた。PCR増幅後に、融解曲線分析は行なわれた。DNAを含まない対照と比較して、各標的の存在する状態において、その対応する融解ピークは減少するかまたは消失した。次に、我々は、マイナスプローブおよび一本鎖プローブの組み合わせも使用することができるかどうかを試験した。HPV56およびHPV66配列のL1領域を標的とする、Cy5色素で標識された2つのマイナスプローブ、および、HPV51配列のL1領域を標的とする、同じCy5色素で標識された1つの一本鎖プローブが、PCR反応に含また。PCR増幅後に、融解曲線分析は行なわれた。DNAを含まない対照と比較して、HPV56またはHPV66の存在する状態において、その対応する融解ピークは減少するかまたは消失した。しかしながら、標的HPV51テンプレートが存在した時、HPV56およびHPV66の融解ピークは変化しなかった。しかし、全体の蛍光シグナルは増加した。全体の蛍光シグナルの増加は、陰性対照と比較した場合の、その融解曲線の比例的持ち上げが反映される。増幅プロットは、正常な増幅曲線も示し、それはHPV51配列の存在による。このことにより、多数のマイナスプローブおよび1つの一本鎖プローブの組み合わせを使用することによって、個々のHPV配列を識別することができることが示された。これらの14個のプローブL1領域を標的とするをともに混合し、単一のPCR増幅において使用した。14個のハイリスクHPV配列すべてのうち、個々の配列が検出され、ワンステップの閉管反応において識別可能であった。我々の結果によって、現在の1チャンネル-1標的の制約を克服することが可能かもしれないということが示される。多重PCRにおけるこの方法、リアルタイムモニタリングまたはエンドポイント検出のいずれかにしたがい、より多くの標的配列が、異なる標的配列にハイブリダイズし、異なる融解温度を有するプローブ組を設計することにより、単一の閉管の中で分析することができる。標的配列が存在する場合、その対応するプローブは消費される。次に、その標的は、反応の前および後の、プローブの融解プロファイルの比較に基づいて調べることができる。有利には、組中の異なるプローブに、同じ標識を付けることができ、それにより、単一の放射波長でモニターすることが可能となる。我々の方法は、現在の閉管多重PCR技術を越える著しい改善を提供し、現在の装置で分析される標的量の2~4倍の増加が可能となる。現在の研究において、本方法は、標的または多数の標的の有無を検出するため有用である。それは、通常のPCR装置で行ない、次に、融解曲線分析によって標的について遺伝子型を決定することができる。これは閉管エンドポイント検出方法である。この方法を使用することにより、高価なリアルタイムPCRの必要はなくなり、代わりに、リアルタイムPCRライセンスに高いロイヤルティを払う必要がないので、コスト削減である。さらに、この方法は、ゲル分析のためのチューブを開放する必要を回避する。定量的データが必要とされる場合、この方法は、リアルタイムで蛍光シグナルをモニターすることによるリアルタイムPCR装置中で行なうことができる。単一の検出チャンネルここで多数の標的が検出されるにおいて、存在するこれらの標的のうちの1つの量を正確に測定することができる。しかしながら、これらの標的が2つ以上存在する場合、定量的データは、1つの検出チャンネルからの多数の標的の組み合わせについて合計して得られるか、あるいは、本発明に記載された方法によって個々の定量的データを得ることができる。方法標的ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドTHOを、5’末端にフルオレセインFAMおよび3’末端にBHQ1で標識して合成した。HPV16THOのためのヌクレオチド配列は以下の通りである:5’TTCAGGACCCACAGGAGCGACCC3’。HPV18THOのためのヌクレオチド配列は以下の通りである:5’AGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACC3’。部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドPCOは、THOと同じ長さで合成され、3’末端にリン酸基が付けられた。HPV16PCOのためのヌクレオチド配列は以下の通りである:5’GGGTTGCTTCTGTGAGTCTTGAA3’。HPV18PCOのためのヌクレオチド配列は以下の通りである:5’GGTTAACTGGAGTTTTATTATGAGGCT3’。THOおよびPCOを1:2の比率で組み合わせて、部分的に二本鎖の核酸プローブを形成させた。標的は、HPV16およびHPV18配列のPCR増幅によって調製され、pJetベクターClonejetPCRクローニングキット,Fermentas中でクローニングされた。プラスミドはGenejetプラスミドミニ調製キットFermentasで精製された。正方向および逆方向プライマーは、プローブ結合領域の上流および下流となるように設計された。HPV16の正方向および逆方向プライマーの配列はそれぞれ、5’AGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACT3’および5’TCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTG3’である。HPV18の正方向および逆方向プライマーの配列はそれぞれ、5’GTATGCATGGACCTAAGGCAACA3’および5’TCGCTTAATTGCTCGTGACATAGA3’である。オリゴヌクレオチドは、Eurogentecによって合成された。25μlの最終容量のPCR反応物は、2つの等量の混合物から成る:12.5μlの2xFastStartUniversalプローブマスターRoxRocheDiagnosticsGmbh,MannheimGermanyおよび12.5μlのプライマー/プローブ混合物。プライマー/プローブ混合物は、以下のように作製された:プライマーおよびプローブは、0.6μMのプライマーおよび0.4μMのプローブの最終濃度となるように混合され、様々な量の標的テンプレートが添加された。増幅反応および融解プロファイルは、StratageneリアルタイムPCRMX3005Pシステムで行なわれた。熱のプロファイルは以下の通りであった:95°Cで9分30秒間;40サイクルの95°Cで20秒間および60°Cで60秒間。蛍光測定は60°Cの読み取りステップ中に記録された。増幅後融解プロファイルは、以下の条件を有した:PCRの最後のサイクルの後に、95°Cで10秒間加熱、30°Cまで冷却して30秒間保持、その後、ゆっくりと温度を80°Cまで上昇させる。蛍光放射データは、温度上昇時に連続的に集められる。温度に対する放射測定値の第1の負の導関数は、融解曲線を形成するために温度に対してプロットし、曲線のピークはプローブのTmに相当する。配列表フリーテキスト配列番号:1、2、5、7および21<223>K10由来PCRプライマー配列番号:3、4、6および8-10<223>SV40由来PCRプライマー配列番号:11-16<223>Jak2由来PCRプライマー配列番号:17-20<223>Kras由来PCRプライマー"