PDK4の発現または機能を抑制する物質を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤。PDK4の発現または機能を抑制する物質が1Pdk4遺伝子のRNAi誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはそれらの発現ベクター、または2PDK4に対する抗体、ドミナントネガティブ変異体、アプタマーもしくはそれらの発現ベクターである、請求項1に記載の予防または治療剤。骨粗鬆症が廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少からなる群より選ばれる請求項1または2に記載の予防または治療剤。下記工程:a骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞と被験物質とを接触させる工程、b前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞における発現量と比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、PDK4の発現を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。下記工程:a骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞と被験物質とを接触させる工程、b前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞における発現量と比較する工程、c下記工程c1またはc2のいずれかにより破骨細胞への分化を誘導する工程:c1前記比較工程bの結果に基づいて、骨芽細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、またはc2前記比較工程bの結果に基づいて、単球マクロファージ系列細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、単球マクロファージ系列細胞を、MCSFおよびRANKL存在下で培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で単球マクロファージ系列細胞をMCSFおよびRANKL存在下で培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、d前記工程cにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびe前記比較工程dの結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。下記工程:a’被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞を共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、b’前記工程a’における破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc’前記比較工程b’の結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。下記工程:a被験物質、MCSFおよびRANKL存在下で、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を誘導する工程、b前記工程aにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc前記比較工程bの結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。Pdk4遺伝子を欠損してなる、非ヒト非荷重抵抗性骨モデル動物。非荷重状態での骨量の減少の病態の解明に用いられる、請求項8に記載の骨モデル動物。病態が廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少からなる群より選ばれる、請求項9に記載の骨モデル動物。前記動物がマウスである請求項8~10のいずれか1項に記載の骨モデル動物。請求項8~11のいずれか1項に記載の骨モデル動物の子孫動物。請求項8~12のいずれか1項に記載の非ヒト動物から得られる組織または細胞。請求項8~12のいずれか1項に記載の骨モデル動物を用いることを特徴とする、骨粗鬆症の予防または治療剤のスクリーニング方法。下記工程:a請求項8~12のいずれか1項に記載の骨モデル動物の野生型対照に被験物質を投与し、当該骨モデル動物と野生型対照とを非荷重状態に供する工程、b前記被験物質の投与前後の野生型対照における骨の形態、骨体積または骨密度を解析し、請求項8~12のいずれか1項に記載の骨モデル動物における骨の形態、骨体積または骨密度と比較する工程、および、c前記bの比較結果に基づいて、非荷重状態における骨量の減少を抑制する被験物質を選択する工程を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤のスクリーニング方法。下記工程:a非荷重状態後に得られた請求項13に記載の組織または細胞、および非荷重状態後に野生型対照から得られた組織または細胞をインビトロで生理学的条件下で維持する工程、b前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度と、請求項13由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度とを比較する工程、または前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質と請求項13由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質を比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、リン酸化の程度が有意に変動しているタンパク質を選択する工程、または前記比較結果に基づいて、前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のみから得られ、請求項13由来の組織または細胞におけるタンパク質からは得られないPDK4結合タンパク質を選択する工程を含む、荷重刺激を感知し、骨粗鬆症の発症に関連するPDK4の標的タンパク質のスクリーニング方法。本発明の目的は、高齢者の骨粗鬆症、特に麻痺等に伴う廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症または宇宙滞在時の骨量減少の予防または治療薬の開発に有用な手段を提供し、非荷重状態で進行する骨粗鬆症等の病態の解明に役立つ手段等を提供することにある。本発明者は、骨芽細胞におけるBCL2の過剰発現が骨細胞のアポトーシスを誘導し、骨細胞ネットワークが完全に破壊されているBCL2トランスジェニックマウスは非荷重後の骨損失に耐性であることを見出した。野生型マウスおよびBCL2トランスジェニックマウスを比較することにより、非荷重後の骨損失に応答する遺伝子を探索した。野生型マウスでは非荷重後にPDK4発現がアップレギュレートし、再荷重後にダウンレギュレートするが、これらのレギュレーションはBCL2トランスジェニックマウスでは決して観察されないことを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。1PDK4の発現または機能を抑制する物質を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤。2PDK4の発現または機能を抑制する物質が1Pdk4遺伝子のRNAi誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはそれらの発現ベクター、または2PDK4に対する抗体、ドミナントネガティブ変異体、アプタマーもしくはそれらの発現ベクターである、前記1に記載の予防または治療剤。3骨粗鬆症が廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少からなる群より選ばれる前記1または2に記載の予防または治療剤。4下記工程:a骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞と被験物質とを接触させる工程、b前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞における発現量と比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、PDK4の発現を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。5下記工程:a骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞と被験物質とを接触させる工程、b前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞における発現量と比較する工程、c下記工程c1またはc2のいずれかにより破骨細胞への分化を誘導する工程:c1前記比較工程bの結果に基づいて、骨芽細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、またはc2前記比較工程bの結果に基づいて、単球マクロファージ系列細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、単球マクロファージ系列細胞を、MCSFおよびRANKL存在下で培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で、単球マクロファージ系列細胞をMCSFおよびRANKL存在下で培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、d前記工程cにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびe前記比較工程dの結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。6下記工程:a’被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞を共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、b’前記工程a’における破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc’前記比較工程b’の結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。7下記工程:a被験物質、MCSFおよびRANKL存在下で、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を誘導する工程、b前記工程aにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc前記比較工程bの結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法。8Pdk4遺伝子を欠損してなる、非ヒト非荷重抵抗性骨モデル動物。9非荷重状態での骨量の減少の病態の解明に用いられる、前記8に記載の骨モデル動物。10病態が廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少からなる群より選ばれる、前記9に記載の骨モデル動物。11前記動物がマウスである前記8~10のいずれかに記載の骨モデル動物。12前記8~11のいずれかに記載の骨モデル動物の子孫動物。13前記8~12のいずれかに記載の非ヒト動物から得られる組織または細胞。14前記8~12のいずれかに記載の骨モデル動物を用いることを特徴とする、骨粗鬆症の予防または治療剤のスクリーニング方法。15下記工程:a前記8~12のいずれかに記載の骨モデル動物の野生型対照に被験物質を投与し、当該骨モデル動物と野生型対照とを非荷重状態に供する工程、b前記被験物質の投与前後の野生型対照における骨の形態、骨体積または骨密度を解析し、前記8~12のいずれかに記載の骨モデル動物における骨の形態、骨体積または骨密度と比較する工程、および、c前記bの比較結果に基づいて、非荷重状態における骨量の減少を抑制する被験物質を選択する工程を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤のスクリーニング方法。16下記工程:a非荷重状態後に得られた前記13に記載の組織または細胞、および非荷重状態後に野生型対照から得られた組織または細胞をインビトロで生理学的条件下で維持する工程、b前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度と、前記13由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度とを比較する工程、または前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質と前記13由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質を比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、リン酸化の程度が有意に変動しているタンパク質を選択する工程、または前記比較結果に基づいて、前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のみから得られ、前記13由来の組織または細胞におけるタンパク質からは得られないPDK4結合タンパク質を選択する工程を含む、荷重刺激を感知し、骨粗鬆症の発症に関連するPDK4の標的タンパク質のスクリーニング方法。本発明は、非荷重後の骨芽細胞および骨髄細胞におけるPDK4発現のアップレギュレーションは、少なくとも一部はPDC不活性化とは別の経路を介して、非荷重後の破骨細胞形成および骨再吸収に導くという知見に基づくものである。本発明の骨粗鬆症の予防または治療剤によると、PDK4の発現または機能を抑制する物質を主成分とするものであることから、特に骨芽細胞または骨髄細胞に作用させた場合に、非荷重状態が主原因の骨粗鬆症を有効に予防または治療することができる。本発明のモデル動物によると、PDK4が欠損していることにより非荷重無重力に抵抗性の骨モデル動物として、無重力による骨量の減少など、無重力状態での骨組織での様々な生理学的状態を解明するモデルとして役立つ。本発明の組織または細胞によると、前記動物から得られるものであることから、invivoのみならずinvitroで骨量減少のメカニズムの研究に利用することが可能である。本発明のスクリーニング方法によると、骨粗鬆症の予防または治療剤の開発のみならず、非荷重状態でのPDK4の基質の解明等に貢献することができる。定義本発明において遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各1本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。本発明において遺伝子とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA正鎖並びに該正鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA相補鎖、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該遺伝子には、特定の塩基配列配列番号1で示される遺伝子だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質例えば同族体ホモログやスプライスバリアントなど、変異体および誘導体をコードする遺伝子が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする遺伝子としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号1で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、BergerandKimmelに教示されるように、核酸の融解温度に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常1×SSC、01SDS、37°C程度の条件をあげることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として05×SSC、01SDS、42°C程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として01×SSC、01SDS、65°C程度の洗浄条件をあげることができる。例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子ホモログは、HomoloGenehttpwwwncbinlmnihgovHomoloGeneにより同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をBLASTProcNatlAcadSciUSA90587358771993、httpwwwncbinlmnihgovBLASTにかけて一致するScoreが最も高く、Evalueが0でかつIdentityが100を示す配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGenehttpwwwncbinlmnihgovUniGeneに入力して得られたUniGeneClusterIDHsで示す番号をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子ホモログとしてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。本発明においてPdk4遺伝子またはPdk4のDNAとは、特定塩基配列配列番号1で示されるヒトPdk4遺伝子DNAならびに、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子DNAを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号1に記載のヒトPdk4遺伝子ならびに、そのマウスホモログおよびラットホモログなどが包含される。なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。本発明においてタンパク質またはペプチドには、特定のアミノ酸配列配列番号2で示されるタンパク質またはペプチドだけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体ホモログやスプライスバリアント、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGenehttpwwwncbinlmnihgovHomoloGeneにより同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。前記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、変異のないタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも70、好ましくは80、より好ましくは95、さらにより好ましくは97相同なものをあげることができる。前記誘導体には、タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端または側鎖を置換したものが包含される。前記アミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体があげられる。本発明においてPDK4という用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配列配列番号2で示されるヒトPDK4やその同族体、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。本明細書中、PDK4は通常、温血動物哺乳動物又は鳥類由来のものを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等をあげることができるが、これらに限定されるものではない。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。PDK4は、好ましくは哺乳動物由来のものであり、より好ましくは霊長類ヒト等又はげっ歯類マウス等由来のものである。PDK4が哺乳動物由来であるとは、PDK4の配列ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が哺乳動物のものであることを意味する。本発明においてPDK4をコードする遺伝子以下、Pdk4遺伝子またはPdk4と省略する場合もあるは、例えば、ヒトPdk4遺伝子は、Rowlesらの文献RowlesJetal1996JBiolChem271pp2237622382で公表されており、自体公知の方法により単離することができる。また、ヒトおよびマウスのPDK4の代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が、NCBIに以下の通りに登録されている。ヒトPDK4ヌクレオチド配列cDNA配列:アクセッション番号NM002612バージョンNM0026123配列番号1アミノ酸配列:アクセッション番号NP002603NP0026031配列番号2マウスPDK4ヌクレオチド配列cDNA配列:アクセッション番号NM013743バージョンNM0137432配列番号3アミノ酸配列:アクセッション番号NP038771バージョンNP0387711配列番号4なお、本明細書においてヌクレオチド配列は、特にことわりのない限りDNAの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがRNAである場合は、チミンTをウラシルUに適宜読み替えるものとする。荷重感知遺伝子本明細書における荷重感知遺伝子とは、生体動物に対する荷重刺激を感知し、荷重重力刺激がない場合、破骨細胞の活動を活性化させる遺伝子をいう。具体的には、荷重刺激のない非荷重場合に骨細胞および骨細胞からのシグナルによって骨芽細胞でアップレギュレートし、再荷重後にダウンレギュレートする遺伝子であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼのアイソザイムPDK4としても知られる遺伝子である。本発明は、Pdk4遺伝子を有効成分として含有する荷重感知遺伝子を提供する。また、本発明は、PDK4を有効成分として含有する荷重感知剤を提供する。骨粗鬆症の予防または治療剤本発明は、PDK4の発現または活性を抑制する物質を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤を提供する。本発明の予防または治療剤本発明の医薬と称する場合もあるが対象とする疾患は、骨粗鬆症である。本発明において骨粗鬆症とは、世界保健機構の定義で、骨密度測定により若年成人の25標準偏差未満で診断されるものをいう。骨量の低下は種々の原因により生じるが、長期的な寝たきり状態、固定化状態、運動障害、麻痺、無重力状態での生活などによる非荷重状態が主原因である骨粗鬆症、すなわち、廃用性骨粗鬆症が具体的にあげられる。また、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少もあげられる。PDK4の機能としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼとしてこれまでに知られているキナーゼとしての機能および今後解明されるであろう様々な機能があげられるが、エンドポイントとして、荷重刺激を感知して荷重重力刺激がない場合、破骨細胞の活動を活性化する機能を指標とすることができる。PDK4の発現又は機能を抑制する物質としては、PDK4のアンタゴニストがあげられる。例えば、PDK4のPDCリン酸化に対するアンタゴニストとして知られているジクロロ酢酸およびピルビン酸デヒドロゲナーゼデホスファターゼは、破骨細胞形成、Rankl発現およびRanklプロモーター活性に影響がほとんどないことから、PDK4のアンタゴニストであって、PDCリン酸化に対するアンタゴニスト作用を有さないものが好ましく、より好ましくは低分子化合物である。このようなアンタゴニストは、本発明のスクリーニング方法により容易に選別することができる。PDK4の発現又は機能を抑制する物質としては、例えば、PDK4の発現を特異的に抑制し得るsiRNA、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物があげられる。好ましくは、PDK4の発現を特異的に抑制し得るsiRNA、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターが用いられる。本明細書中、特異的な遺伝子発現の抑制とは、標的とする遺伝子の発現を、それ以外の遺伝子の発現よりも強く抑制することを意味する。PDK4の発現を特異的に抑制し得るsiRNAとしては、例えばAPDK4をコードするmRNA成熟mRNA又は初期転写産物のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む2本鎖のRNA、及びBPDK4をコードするmRNA成熟mRNA又は初期転写産物と治療対象動物好ましくはヒトの細胞内で特異的にハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりPDK4の転写を抑制する2本鎖のRNAを挙げることができる。本明細書中、特異的なハイブリダイゼーションとは、核酸が、標的とするヌクレオチドに対して、それ以外のヌクレオチドよりも強くハイブリダイズすることを意味する。PDK4をコードするmRNAのヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号1で表されるヌクレオチド配列ヒトPDK4、配列番号3で表されるヌクレオチド配列マウスPDK4をあげることができる。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉RNAiと呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから[Nature411494498]、リボザイムの代替技術として注目されている。siRNAは、代表的には、標的遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列又はその部分配列以下、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を有するRNAとその相補鎖からなる2本鎖オリゴRNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列第1の配列と、その相補配列第2の配列とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第1の配列が第2の配列と2本鎖構造を形成するRNAsmallhairpinRNAshRNAもsiRNAの好ましい態様の1つである。siRNAに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。siRNAが23塩基よりも長い場合には、該siRNAは細胞内で分解されて、約20塩基前後のsiRNAを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のmRNA成熟mRNAもしくは初期転写産物のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約18~約50塩基、好ましくは約19~約25塩基、より好ましくは約21~約23塩基である。また、siRNAを構成する各RNA鎖の長さも、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各RNA鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、siRNAの長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、各RNA鎖の長さは、例えば通常、約18~約50塩基、好ましくは約19~約25塩基、より好ましくは約21~約23塩基である。なお、shRNAの長さは、2本鎖構造をとった場合の2本鎖部分の長さとして示すものとする。標的ヌクレオチド配列と、siRNAに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、siRNAの中央から外れた位置についての塩基の変異少なくとも90以上、好ましくは95以上の同一性の範囲内であり得るについては、完全にRNA干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNA干渉によるmRNAの切断活性が極度に低下し得る。siRNAは、5’及び/又は3’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、siRNAが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常5塩基以下、例えば2~4塩基である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNAの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug3’、uu3’、tg3’、tt3’、ggg3’、guuu3’、gttt3’、ttttt3’、uuuuu3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。shRNAのヘアピンループのループ部分の長さは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、5~25塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、shRNAが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。アンチセンス核酸とは、標的mRNA成熟mRNA又は初期転写産物を発現する細胞の生理的条件下で該標的mRNAと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的mRNAにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。PDK4の発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えばAPDK4をコードするmRNA成熟mRNA又は初期転写産物のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及びBPDK4をコードするmRNA成熟mRNA又は初期転写産物と治療対象動物好ましくはヒトの細胞内で特異的にハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でPDK4ポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸等をあげることができる。アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、PDK4の発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約12塩基以上であり、長いものでmRNA成熟mRNA又は初期転写産物の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。即ち、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約12~約200塩基、好ましくは約15~約50塩基、より好ましくは約18~約30塩基である。アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、PDK4の発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、PDK4のmRNA成熟mRNA又は初期転写産物の全長配列であっても部分配列例えば約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、好ましくは、標的配列はPDK4のmRNAの5’末端からコード領域のC末端までに位置することが望ましい。アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でPDK4のmRNAとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約90以上好ましくは95以上、最も好ましくは100の同一性を有するものである。アンチセンス核酸の大きさは、通常約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。さらに、アンチセンス核酸は、PDK4のmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるPDLIM2遺伝子と結合して三重鎖トリプレックスを形成し、mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明において使用されるsiRNAやアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型リン酸結合のPOをPSに置換や2’Oメチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。siRNAやアンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。PDK4の発現を特異的に抑制し得るsiRNA及びアンチセンス核酸は、PDK4のmRNA配列例えば配列番号1又は3で表されるヌクレオチド配列や染色体DNA配列に基づいて標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機アプライドバイオシステムズ社、ベックマン社等を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を合成することにより調製できる。siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90~約95°Cで約1分程度変性させた後、約30~約70°Cで約1~約8時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い2本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。本発明の医薬は、PDK4の発現を特異的に抑制するsiRNA又はアンチセンス核酸を発現し得るコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターにおいては、上述のsiRNA又はアンチセンス核酸或いはそれをコードする核酸好ましくはDNAが、投与対象である哺乳動物好ましくはヒトの細胞例えば、骨細胞、骨芽細胞、骨髄細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。本発明の医薬は、好ましくは骨芽細胞に導入されることによりその作用をより効果的に発揮するものである。したがって、有効成分としての前記発現ベクターは、発現する遺伝子が骨芽細胞特異的プロモーターの下流に作動可能に連結されているものが好ましい。前記骨芽細胞特異的プロモーターとは、骨芽細胞特異的に下流の遺伝子の転写開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節する塩基配列を有するDNAをいう。前記プロモーターは、骨芽細胞が由来する動物に応じて適宜選択することができる。前記骨芽細胞特異的プロモーターとしては、I型コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター等があげられるが、I型コラーゲンプロモーターが好ましい。I型コラーゲンプロモーターとしては、例えばヒト由来のプロモーターの場合、JimenezSAVargaJOlsenALiLDiazAHerhalJandKochJFunctionalanalysisofhumanalpha1procollagengenepromoterDifferentialactivityincollagenproducingandnonproducingcellsandresponsetotransforminggrowthfactorbeta1JBiolChem2691268412691、マウス由来のプロモーターの場合、RavazzoloRKarsentyGanddeCrombruggheBAfibroblastspecificfactorbindstoanupstreamnegativecontrolelementinthepromoterofthemousealpha1collagengeneJBiolChem26673827387、RossertJEberspaecherHanddeCrombruggheBSeparatecisactingDNAelementsofthemouseproa1collagenpromoterdirectexpressionofreportergenestodifferenttypeIcollagenproducingcellsintransgenicmiceJCellBiol12914211432などに記載されている。上記発現ベクターは、好ましくは上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等をさらに含有することもできる。発現ベクターとしては、公知または市販のものを使用することができ、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが例示される。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルスなどのウイルスベクターがあげられる。前記プロモーターおよび遺伝子を発現ベクターに連結する方法は、自体公知の方法により行うことができる。PDK4の発現または機能を抑制する物質の別の態様は、PDK4に対する抗体、ドミナントネガティブ変異体、アプタマー、もしくはそれらの発現ベクターである。本発明の医薬に有効成分として含有する抗体は、ヒトへの適用を考慮した場合、キメラ抗体chimericantibody、ヒト化抗体humanizedantibody、ヒト型抗体humanantibodyが好ましく、ヒト化抗体およびヒト型抗体がより好ましい。キメラ抗体は、例えば実験医学臨時増刊号Vol6No101988、特公平373280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4506458号公報、特開昭62296890号公報等を、ヒト抗体は、例えばNatureGeneticsVol15p1461561997、NatureGeneticsVol7p13211994、特表平4504365号公報、国際公開第9425585号公報、日経サイエンス、6月号、第40~第50頁、1995年、NatureVol368p8568591994、特表平6500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。ドミナントネガティブ変異体は、PDK4に対する変異の導入によりその活性が低減したものである。ドミナントネガティブ変異体は、天然の翻訳産物と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異例、1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加があげられる。PDK4に対するアプタマーは、PDK4に特異的に結合してその機能的発現を阻害するオリゴヌクレオチドまたはペプチドである。PDK4に対するオリゴヌクレオチドアプタマーは、invitroselection法またはSELEX法により得ることができ、例えば、以下の手順があげられる。即ち、まず、DNA/RNA自動合成機を用いてランダムにオリゴヌクレオチド例えば、約60塩基を合成し、オリゴヌクレオチドのプールを作製する。次に、目的の蛋白質、即ちPDK4と結合するオリゴヌクレオチドをアフィニティーカラムで分離する。分離したオリゴヌクレオチドをPCRで増幅し、前述の選抜プロセスで再度選抜する。この過程を約5回以上繰り返すことによって、PDK4に親和性の強いアプタマーを選抜することができる。PDK4に対するペプチドアプタマーは、酵母のtwohybrid法により得ることができる。本発明の医薬が発現ベクターを有効成分とする場合、当該発現ベクターは、上記タンパク質抗体、ドミナントネガティブ変異体またはアプタマーをコードするポリヌクレオチドが、投与対象である生体の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。ここで、発現ベクターが含み得るプロモーターは、前記RNAi誘導性核酸またはアンチセンス核酸の発現ベクターで用いられるものを限定なく利用することができる。また、発現ベクター自体も、前記RNAi誘導性核酸またはアンチセンス核酸の発現ベクターと同様のものを限定なく利用することができる。本発明の医薬は、PDK4の発現又は機能を抑制する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム-グリコール-スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチンアンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。PDK4の発現又は機能を抑制する物質として、PDK4の発現を特異的に抑制し得るsiRNA、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを用いる場合、核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬はさらに核酸導入用試薬を含むことができる。核酸導入試薬としては、リポフェクチン、リポフェクタミンlipofectamine、リポフェクタミンRNAiMAXLipofectamineRNAiMAX、インビボフェクタミンInvivofectamine、DOGSトランスフェクタム、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリエチレンイミンPEI等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。本発明の骨粗鬆症の予防または治療剤の投与単位形態としては、経口剤または非経口剤があげられ、非経口剤が好ましい。非経口に適した形態としては、注射剤液剤、懸濁剤など、坐剤、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾール剤などが例示される。医薬組成物中のPDK4の発現又は機能を抑制する物質の含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、医薬組成物全体の約0.001ないし100重量である。本発明の医薬を所望の細胞好ましくは骨芽細胞または骨髄細胞に導入する方法は、例えば、invivo法またはexvivo法があげられる。invivo法は、本発明の医薬を、例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、関節内、筋肉内などに投与することができる。exvivo法の場合、本発明の医薬を、対象の生体内から取り出した細胞をinvitroで培養中に公知の方法によりトランスフェクション、インフェクションまたはインジェクションし、一定期間培養してPdk4遺伝子の発現抑制を確認した後、同一対象の体内に戻す方法を採用することができる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人1人当たり約00001100mg、好ましくは約000110mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。レトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1×103pfuないし1×1015pfuとなる量の範囲から選ぶことができる。exvivo法で本発明の医薬を導入した細胞の場合は、1×104細胞bodyないし1×1015細胞body程度を投与すればよい。本発明の医薬に含まれる有効成分により、生体内に投与された場合にPDK4の発現又は機能が抑制されるが、血糖値やグルココルチコイドの濃度に影響はない。これは、別のアイソザイムであるPDK1、PDK2およびPDK3が代償的に働くためであると考えられる。本発明の医薬医薬組成物は、哺乳動物例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒトに対して安全に投与されうる。非荷重抵抗性骨モデル動物本発明は、Pdk4遺伝子を欠損してなる、非ヒト非荷重抵抗性骨モデル動物を提供する。本発明の骨モデル動物は、Pdk4遺伝子を欠損していることから、好適には、非荷重状態での骨量の減少の病態の解明に用いられる。病態としては、骨粗鬆症があげられ、好ましくは、廃用性骨粗鬆症、ステロイド性骨粗鬆症および無重力時の骨量減少からなる群より選ばれる。非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではないが、ヒトに類似した骨細胞ネットワークを有する動物が好ましい。好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル等の実験動物ならびにウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の家畜があげられるが、遺伝子工学的に利用が容易であるところから、マウスがより好ましい。本発明において、Pdk4遺伝子を欠損するとは、内因性のPdk4遺伝子の塩基配列の1以上の塩基に置換、欠失、挿入もしくは付加の変異を導入することをいい、ノックアウトとも称する。また、このような改変をした動物をノックアウト動物と称する。ノックアウトの場合、少なくともPdk4遺伝子の一部を欠損させる変異を導入させ、当該遺伝子の機能的欠損を有するように操作することが好ましく、具体的には、マウスPdk4遺伝子の場合、エキソンのいずれか1つを欠損させるように構築されたターゲティングベクターを用いる方法が一例としてあげられる。より具体的には、実施例3および図2に記載のターゲティングベクターを用いた方法があげられる。本発明の骨モデル動物には、前記遺伝子の変異が対立遺伝子の両方に導入されたホモ接合動物、前記遺伝子の変異が対立遺伝子の片方に導入されたヘテロ接合動物およびそれらの出生前の胎仔も含まれる。前記ホモ変異動物は、前記ヘテロ変異動物を交配することにより得られるものである。ノックアウト動物は、例えば下記の工程a~cを含む方法により製造できる。aPdk4遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程;b前記胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;c前記キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程;d前記キメラ動物を交配させ、Pdk4遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。ノックアウト動物、胚性幹細胞、ターゲティングベクターの作製の詳細については、例えば、下記文献を参照することができる。1.別冊実験医学ザプロトコールシリーズジーンターデティングの最新技術2000年、羊土社コンディショナルターゲティング法p1151202.バイオマニュアルシリーズ8ジーンターゲティング-ES細胞を用いた変異マウスの作製1995年、羊土社p71773.SambrookらMolecularCloningALABORATORYMANUAL第3版COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS2001年4824854.RobertsonEJinTeratocarcinomasandembryonicstemcellsapracticalapproachedRobertsonEJ1987pp1081125.DyneckiSMらGeneTargetingapracticalapproach2ndeditionedJoynerAL2000pp68736.DyneckiSMらGeneTargetingapracticalapproach2ndeditionedJoynerAL2000pp7581このようにして得られた本発明の骨モデル動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。前記組織としては、すべての組織があげられ、長管骨、頭蓋骨、椎骨などが好ましい。また、前記細胞としては、前記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株があげられ、具体的には骨芽細胞、骨細胞または骨髄細胞などが好ましい。本発明の非ヒト骨モデル動物、子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞は、下記本発明のスクリーニング方法において好適に利用することができる。スクリーニング方法1スクリーニング方法1は、細胞または組織を用いたインビトロの系で実施する。具体的には、下記工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法11を提供する:a骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞と被験物質とを接触させる工程、b前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量を調べ、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞における発現量と比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、PDK4の発現を抑制する被験物質を選択する工程。前記工程aにおいて、被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。また、これらの化合物の2種以上の混合物を試料として供することもできる。前記工程aにおいて使用する骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞は、PDK4を発現しうる限り、いかなる動物由来の細胞であってもよい。本発明の非ヒト骨モデル動物由来の骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞をさらに陰性対照として用いる場合、非ヒト骨モデル動物と同種由来の細胞が望ましい。マウスの骨芽細胞および骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞の調製方法は、実施例7および8に記載されており、他の動物由来の細胞も実施例7および8に記載の方法に準じて調製することができる。工程aにおいて、骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞をPDK4の発現が維持される条件下に置いたものを用いることができる。かかる条件下としては、骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞を適当な培地中に入れ、約25~40°Cのインキュベーター中で生存または培養させることが好ましい。次に、前記培地中に被験物質を添加し、インキュベートを続けることで接触がなされうる。前記被験物質の添加量は、有効成分の種類、培地に対する溶解性、細胞の感受性等によって適宜設定することができる。工程bにおいて、前記被験物質を接触させた骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞におけるPDK4の発現量は、自体公知の方法により調べることができる。内在性のPDK4の発現量は、例えば、細胞からタンパク質を抽出してPDK4を認識する抗体を用いるウェスタンブロッテング等により測定する方法;細胞からRNAを抽出してRT-PCRまたはノーザンブロッテング等により転写されたPdk4mRNAを測定する方法;PDK4を認識する抗体を用いて、免疫組織化学によりinsituでPDK4を調べる方法等があげられる。内在性のPDK4の発現量は、Pdk4のプロモーター領域とレポーター遺伝子とを連結した発現ベクターを細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を測定するレポーターアッセイ等によっても推定できる。レポーターアッセイが好ましく用いられる。レポーター遺伝子は、公知の遺伝子を限定なく使用することができ、例えば、ルシフェラーゼ、GFP緑色蛍光タンパク質、CATクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどがあげられるが、これに限定されない。レポーター遺伝子の発現は、用いるレポーター遺伝子に応じて、自体公知の方法により測定することができる。前記工程bにおいて、被験物質を接触させない骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞も同時にまたは別途調べ、接触した場合の結果と接触しない場合の結果とを比較する。また、陰性対照として、本発明の骨モデル動物由来の骨芽細胞または骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞も準備することが好ましい。前記工程cにおいて、工程bで得られた比較結果に基づき、PDK4の発現を抑制する被験物質を選択する。選択する基準は、PDK4のタンパク質またはmRNAが低減していることを指標にすればよい。このようにして選択された被験物質は、骨芽細胞におけるPDK4のアンタゴニスト作用を有する剤として有用であるとともに、例えば、スクリーニング方法2のようなさらなるスクリーニングや薬理試験を実施することにより、副作用の少ない骨粗鬆症の予防または治療剤の候補薬ともなりうる。また、スクリーニング方法1の別の態様として、上記工程aおよびbに加え、下記工程を含む、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤のスクリーニング方法12を提供する:C下記工程c1またはc2のいずれかにより破骨細胞への分化を誘導する工程:c1前記比較工程bの結果に基づいて、骨芽細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、またはc2前記比較工程bの結果に基づいて、単球マクロファージ系列細胞でPDK4の発現を抑制する被験物質存在下で、単球マクロファージ系列細胞を、MCSFおよびRANKL存在下で培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、さらに対照として、被験物質非存在下で単球マクロファージ系列細胞をMCSFおよびRANKL存在下で培養し、同様に破骨細胞への分化を誘導する工程、d前記工程Cにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびe前記比較工程dの結果に基づいて、骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程。工程Cの工程c1において、PDK4の発現を抑制する被験物質存在下での骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞との共培養は、実施例8に記載の方法に従って行うことができる。破骨細胞への分化誘導は、骨芽細胞から産生されるMCSFおよびRANKLの存在下で培養することにより行うことができる。工程Cの工程c1において、さらに対照として、被験物質非存在下で骨芽細胞と骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞とを共培養し、上記と同様の条件下で破骨細胞への分化誘導を行うことが好ましい。工程Cの工程c2において、PDK4の発現を抑制する被験物質存在下での骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞の培養は、実施例8に記載の方法に従って行うことができる。破骨細胞への分化誘導は、MCSFおよびRANKLの存在下で培養することにより行うことができる。工程Cの工程c2において、さらに対照として、被験物質非存在下で骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞を培養し、上記と同様の条件下で破骨細胞への分化誘導を行うことが好ましい。工程dにおいて、破骨細胞への分化の有無およびその程度は、実施例8に記載の方法に従って、TRAP染色し、走査型電子顕微鏡による観察によって測定することができる。工程eにおいて、TRAP染色陽性細胞であって小核破骨細胞36の核を有するまたは大核破骨細胞6を超える核を有するの数が対照と比較して有意に減少している被験物質を選択する。このようにして選択された被験物質は、PDK4の発現を抑制し、かつ破骨細胞への分化を抑制しうる物質として、骨粗鬆症、特に非荷重状態における骨粗鬆症の予防または治療剤の候補薬ともなりうる。また、スクリーニング方法1のさらに別の態様として、下記工程を含むスクリーニング方法13を実施することにより、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤の候補薬をより簡便にスクリーニングすることができる。a’被験物質存在下で、骨芽細胞と骨髄由来の単球/マクロファージ系列細胞を共培養し、破骨細胞への分化を誘導する工程、b’前記工程a’における破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc’前記比較工程b’の結果に基づいて、骨髄由来の単球/マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程。前記工程a’、b’およびc’はそれぞれ、スクリーニング方法12の工程c1、dおよびeと同様に実施することができる。また、スクリーニング方法1のさらに別の態様として、下記工程を含むスクリーニング方法14を実施することにより、PDK4の発現または機能抑制を介した骨粗鬆症の予防および/または治療剤の候補薬をより簡便にスクリーニングすることができる。a被験物質、MCSFおよびRANKL存在下で、骨髄由来の単球/マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を誘導する工程、b前記工程aにおける破骨細胞への分化の程度を比較する工程、およびc前記比較工程bの結果に基づいて、骨髄由来の単球/マクロファージ系列細胞から破骨細胞への分化を抑制する被験物質を選択する工程。前記工程a、bおよびcはそれぞれ、スクリーニング方法12の工程c2、dおよびeと同様に実施することができる。スクリーニング方法2スクリーニング方法2は、本発明の骨モデル動物を用いてインビボの系で実施する。具体的には、下記工程を含む、骨粗鬆症の予防または治療剤のスクリーニング方法を提供する:a本発明の骨モデル動物の野生型対照に被験物質を投与し、当該骨モデル動物と野生型対照とを非荷重状態に供する工程、b前記被験物質の投与前後の野生型対照における骨の形態を解析し、本発明の骨モデル動物における骨の形態と比較する工程、および、c前記bの比較結果に基づいて、非荷重状態における骨量の減少を抑制する被験物質を選択する工程。前記工程aにおいて、被験物質は、スクリーニング方法1と同様のものがあげられる。被験物質を動物に投与する方法は特に限定されるものではないが、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内等の全身投与、あるいは関節内、標的細胞付近への局所投与等があげられる。前記被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定することができる。前記工程aにおいて、動物を非荷重状態に供する方法は、生体が重力を感知しない状態または重力の影響を受けにくい状態に維持可能であれば特に限定されるものではない。げっ歯類マウス、ラット等を例にとると、尾懸垂実験が好適にあげられ、実施例1に記載の方法に従って、行うことができる。尾懸垂は、通常、3~14日間、好ましくは7日間継続して行うことが望ましい。前記工程bにおいて、骨の形態、骨体積または骨密度を調べる方法としては、例えば、X線解析、マイクロCTμCT、pQCTおよび骨組織切片を用いた骨組織形態計測などがあげられ、定量的な解析方法として、μCTおよび骨組織形態計測が好ましい。μCT解析は、実施例4に記載されている。解析可能な骨梁パラメータとしては、骨梁体積、骨梁数、骨梁幅、骨梁間距離、骨梁密度、ストラクチャーモデルインデックス、骨梁連結性、異方性度があり、皮質骨パラメータとしては、皮質骨断面積、骨内膜周囲長、骨膜周囲長、皮質骨密度があげられる。骨組織形態計測の海面骨パラメータとしては、単位骨量、類骨面、類骨幅、骨芽細胞面、骨芽細胞数、多核破骨細胞数、破骨細胞面、吸収面、骨石灰化速度、石灰化面および骨形成速度があり、皮質骨パラメータとしては、骨断面積、皮質骨面積、骨髄腔面積、骨膜性骨形成率、皮質内骨形成率、皮質内骨吸収面があげられる。前記工程bにおいて、被験物質を投与しない動物における骨の形態、骨体積または骨密度も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。また、陽性対照として、本発明の骨モデル動物を同様に解析する。前記工程cにおいて、工程bで得られた比較結果に基づき、野生型動物の非荷重状態における骨量の減少を抑制する被験物質を選択する。選択する基準は、本発明の骨モデル動物を指標にすればよい。このようにして選択された被験物質は、非荷重状態における骨量の減少を抑制させ、骨粗鬆症、特に廃用性骨粗鬆症の候補薬となりうる。スクリーニング方法3スクリーニング方法3は、本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞を用いてインビトロの系で実施する。具体的には、下記工程を含む、荷重刺激を感知し骨粗鬆症の発症に関連するPDK4の標的タンパク質のスクリーニング方法を提供する:a非荷重状態後に本発明の骨モデル動物から得られた組織または細胞、および非荷重状態後に野生型対照から得られた組織または細胞をインビトロで生理学的条件下で維持する工程、b前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度と、本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度とを比較する工程、または前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質と本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞におけるタンパク質でPDK4に結合するタンパク質を比較する工程、およびc前記比較結果に基づいて、リン酸化の程度が有意に変動しているタンパク質を選択する工程、または前記比較結果に基づいて、前記野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のみから得られ、本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞におけるタンパク質からは得られないPDK4結合タンパク質を選択する工程。前記工程aにおいて動物を非荷重状態にするには、スクリーニング方法2と同様の条件で行えばよい。用いる組織または細胞は、動物に由来するものであれば特に限定されないが、荷重感知遺伝子PDK4の未知の基質を選択するという観点から、骨芽細胞、骨芽細胞を豊富に含む組織または骨芽細胞に分化可能な細胞もしくは組織、および破骨細胞、破骨細胞を豊富に含む組織または破骨細胞に分化可能な細胞もしくは組織が望ましい。前記工程aにおいて、組織または細胞をインビトロで生理学的条件下で維持する方法は、野生型対照由来の組織または細胞の場合、PDK4の発現が維持される条件下に置いたものを用いることができる。かかる条件下としては、組織または細胞を適当な培地中に入れ、約25~40°Cのインキュベーター中で生存または培養させることが好ましい。本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞も、野生型対照由来の組織または細胞と同じ条件下で維持する。前記工程bにおいて、野生型対照由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度と、本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞におけるタンパク質のリン酸化の程度とを比較する。タンパク質のリン酸化の程度は、自体公知の方法により調べることができる。例えば、細胞抽出液の一次元あるいは二次元電気泳動により変動タンパク質を同定する方法、リン酸化抗体アフィニティカラムを用いて細胞抽出液からリン酸化蛋白を濃縮し電気泳動により比較同定する方法、細胞抽出液を酵素消化して得られたペプチドから金属キレートカラムを用いてリン酸化ペプチドを精製し2DLCMSMSによりリン酸化ペプチドを同定比較する方法、さらにこれに安定同位体標識法による定量法を組み合わせたリン酸化ペプチドのLCMSMSによる定量的変動解析等があげられる。さらに、PDK4と結合するタンパク質の同定も、公知の方法により調べることができる。例えば、PDK4の全部あるいは一部をベイトとした酵母を用いたツーハイブリッド法、PDK4抗体アフィニティカラムを用いて細胞抽出液からPDK4およびその結合タンパク質を濃縮し電気泳動で比較同定する方法等が挙げられる。前記工程cにおいて、工程bで得られた比較結果に基づき、リン酸化の程度が有意に変動しているタンパク質を選択する。PDK4のキナーゼ活性を考慮すると、リン酸化が有意に上昇しているタンパク質を指標にすることが望ましい。また、野生型対照のみから得られ、本発明の骨モデル動物由来の組織または細胞からは得られないPDK4結合タンパク質を選択する。このようにして選択されたタンパク質は、荷重感知遺伝子であるPDK4の新規基質として、非荷重状態における骨低下のメカニズムの解明または特に廃用性骨粗鬆症の予防または治療剤の分子標的ともなりうる。以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。実施例1尾懸垂実験およびマイクロアレイ尾懸垂実験は、既報に準じて実施したSakaiANakamuraTChangesintrabecularboneturnoverandbonemarrowcelldevelopmentintailsuspendedmiceJMusculoskeletNeuronalInteract2001138739222。野生型マウスおよびBCL2トランスジェニック雄性マウス10週齢を、尾懸垂用の特殊なケージTSケージに置き、当該ケージに適応させるために1週間飼育した。尾懸垂は、尾懸垂群において8日間実施した。再負荷群のマウスは1週間の尾懸垂後に24時間尾懸垂から開放した。対照群は、尾懸垂を除いて同じ条件下においた。脛骨および大腿骨からRNAを抽出し、Agilentマイクロアレイを用いて、HokkaidoSystemScience社によりマイクロアレイ解析を実施した。実施例2リアルタイムRTPCR全骨から骨芽細胞、骨細胞および骨髄細胞を分離するために、大腿骨および脛骨から筋肉、結合組織および骨膜を取り除き、骨幹端で骨を切断した。大腿骨および脛骨の骨幹中の骨髄細胞をリン酸緩衝食塩水PBSで押し出した。次いで、マイクロ歯間ブラシKobayashiPharmaceuticalCoLtdOsakaJapanを用いて、骨芽細胞が豊富な細胞を回収した。残った骨を骨細胞が豊富な細胞として用いた。ISOGENを用いて全RNAを抽出し、LightCycler480SYBRGreenIシステムを用いてリアルタイムRTPCRを実施した。Gapdhの値を元にデータを正規化した。実施例3Pdk4マウスの作出マウスPdk4遺伝子のターゲティングベクターは、BAC改変技術により作製した。BAC改変キットをGeneBridgesHeidelbergGermanyから購入し、マウスPdk4遺伝子のすべてのエキソンを含むBACクローン、RP2325N12をBACPACResourceCenterOaklandCAから購入した。IRESLacZおよびPGKgb2neoを含むカセットをPCRで増幅し、BACクローンを含むバクテリアに導入し、Pdk4遺伝子の第3エキソンと第10エキソン間でゲノムDNAを置換した。IRESLacZおよびPGKgb2neoを含み、Pdk4遺伝子に相同なDNAが隣接するカセットを、PGKtkカセットを含むプラスミドにクローニングした。最終のターゲティングコンストラクトを線状化し、ES細胞のE14ラインにエレクトロポレーションにより導入した。ターゲティングされたES細胞をC57BL6胚盤胞にインジェクションし、キメラを作出した。既報に従って、サザンブロットによりミュータントアレルを確認したKomoriTetalTargeteddisruptionofCbfa1resultsinacompletelackofboneformationowingtomaturationalarrestofosteoblastsCell199789755764。Pdk4マウスおよびPdk4マウスの全身でLacZの発現を検出することができなかったので、ゲノムDNAの欠失はmRNAの安定性またはPDK4発現それ自体に影響するよう思われた。ヘテロ接合性雄性マウスをC57BL6J雌性マウスと6回戻し交配した。血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ5bTRAP5bレベルをELISAにより測定した。研究に先立ち、全ての実験は、長崎大学大学院医歯薬学総合研究科の動物保護と利用に関する委員会による審査と承認を受けた。実施例4マイクロ-CT解析定量マイクロ-CT解析は、マイクロ-CTシステムμCT20ScancoMedicalBruttisellenSwitzerlandを用いて行った。スキャンしたスライスからのデータを三次元解析に用いて、大腿骨の形態学的パラメータを計算した。骨梁のパラメータを大腿骨の遠位骨幹端で測定した。約24mmを頭尾方向にスキャンして、12μm増分の200枚のスライスを得た。実施例5組織学的解析長骨の組織学的解析のためマウスを剖検し、長骨を4パラホルムアルデヒド001Mリン酸緩衝化生理食塩水中で固定し、10EDTA中で脱灰し、パラフィンに包埋した。TRAP活性について、切片5μm厚を染色した。骨の組織形態学的解析は、既報に従って行ったLiuWToyosawaSFuruichiTKanataniNYoshidaCLiuYHimenoMNaraiSYamaguchiAKomoriTOverexpressionofCbfa1inosteoblastsinhibitsosteoblastmaturationandcausesosteopeniawithmultiplefracturesJCellBiol2001155157166。動的組織形態学的指標を評価するため、マウスを剖検する6日前と2日前に、体重10g当たり016mgの用量でカルセインを注射した。実施例6ウエスタンブロット解析およびCol1a1の定量以下の抗体を用いて、ウエスタンブロット解析を行った:ウサギ抗オステオポンチン抗体SantaCruzBiotechnologySantaCruzCA、ウサギ抗オステオカルシン抗体IBLTakasakiJapan、ウサギ抗PDK4抗体AbgenSanDiegoCA、マウス抗PDCE1a抗体MitoSciencesEugeneOregon、ウサギ抗PDCE1apSer293抗体CalbiochemDarmstadtGermanyおよびヤギ抗アクチン抗体SantaCruzBiotechnology。既報に従って、コラーゲンを抽出し、解析したDomenicucciCGoldbergHAHofmannTIsenmanDWasiSSodekJCharacterizationofporcineosteonectinextractedfromfoetalcalvariaeBiochemJ1988253139151。実施例7Invitroでの骨芽細胞形成初代骨芽細胞は、既報に従って、新生マウスの頭蓋冠の小片を三次元コラーゲンゲル中で12日間培養することにより調製したKomoriTetalCell19978975576423。骨芽細胞の分化に関しては、50μgmlアスコルビン酸および10mMβグリセロールリン酸を10FBSを補足したαMEMに添加し、アルカリホスファターゼ活性および石灰化に関して染色を行った。実施例8Invitroでの破骨細胞形成骨髄由来の単球マクロファージ系列細胞BMMを、FicollPaqueTMを用いた密度勾配遠心分離によって12週齢のマウスの骨髄から単離し、10FBS、20ngmlマクロファージコロニー刺激因子および100ngmlのGST可溶性ReceptoractivatorofNFκBligandを含むαMEM中で15x105wellの密度で96ウエルプレートに播種し、6日間培養した。TRAP染色は、既報に従って行ったMaruyamaZetalRunx2determinesbonematurityandturnoverrateinpostnatalbonedevelopmentandisinvolvedinbonelossinestrogendeficiencyDevDyn200723618761890。BMMを、10FBS含有αMEM中で106MプロスタグランジンE2および108M1α252D3の存在下、96wellプレートにてPOBとともに培養した。骨再吸収の評価のために、BMMおよび初代骨芽細胞を、象牙質ディスク上で6日間共培養し、再吸収された領域を走査型電子顕微鏡で測定した。ジクロロ酢酸は、SigmaAldrichから購入した。レスキュー実験に関して、Pdk4発現アデノウイルスベクターおよびEGFP発現アデノウイルスベクターを既報EnomotoHetalInductionofosteoclastdifferentiationbyRunx2throughreceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligandandosteoprotegerinregulationandpartialrescueofosteoclastogenesisinRunx2micebyRANKLtransgeneJBiolChem20032782397123977に従って作製し、25×107plaqueformingunitsmlで使用した。実施例9レポーターアッセイRanklプロモーター領域のゲノムDNAを既報に従ってクローニングしKitazawaRKitazawaSMaedaSPromoterstructureofmouseRANKLTRANCEOPGLODFgeneBiochimBiophysActa19991445134141、38kbおよび15kbの断片をpGL3ベクターに挿入した。ネスティッド欠損コンストラクトを、クローニングしたDNA断片のPCR増幅により作製し、シークエンスにより確認した。Pdp1cDNAをPCRで増幅し、pSG5にライゲートし、シークエンスにより確認した。初代骨芽細胞を、Fugene6を用いて、それぞれRanklプロモーターコンストラクトおよびpRLCMVを含むDNA混合物で一過性にトランスフェクトした。72時間後、DualLuciferaseReporterAssaySystemを用いて、細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を測定し、Renillaルシフェラーゼ活性に対して正規化した。結果非荷重後の骨細胞におけるPdk4発現の誘導本発明者は、BCL2トランスジェニックマウス骨細胞のアポトーシスにより骨細胞ネットワークが破壊されているおよび野生型マウスを用いた尾懸垂により、非荷重後にその発現がアップレギュレートされ再荷重後にダウンレギュレートする荷重感知遺伝子を探索した。脛骨および大腿骨由来のRNAを用いたマイクロアレイ解析において、野生型マウスにおいては、PDK4は非荷重後にアップレギュレートされるが再荷重によりダウンレギュレートされることを見出したが、BCL2トランスジェニックマウスでは非荷重後にPdk4はアップレギュレートされなかった。このことは、リアルタイムRTPCR解析により確認され、PDK4は野生型マウスでは破骨細胞豊富な画分および骨芽細胞豊富な画分の両方でアップレギュレートしているが、BCL2トランスジェニックマウスではアップレギュレートしなかった。PDK4は、骨格筋および心筋で高発現し、腎臓、肝臓、肺、脾臓および骨で中等度に発現している。PDK4は、骨中では、破骨細胞豊富な画分、骨芽細胞豊富な画分および骨髄細胞において中等度に発現していた。骨におけるPDKアイソフォームの発現レベルを比較するため、骨格筋に対して骨における発現レベルを比較した。比率はPDK4が最高値であった。PDK4は、非荷重後に骨格筋、大腿骨全体、骨細胞豊富な画分、骨芽細胞豊富な画分および骨髄細胞でアップレギュレートしたが、PDK1、PDK2およびPDK3は、非荷重後に骨全体ならびに骨芽細胞、骨細胞および骨髄細胞の各画分においてアップレギュレートしなかった。一方、PDK2は、非荷重後の骨格筋でアップレギュレートした。Pdk4マウスにおける正常な骨の発達および維持非荷重状態での骨におけるPDK4の役割を調べるため、本発明者は、Pdk4マウスを作出した。Pdk4マウスの体重は、野生型マウスと同様であった。μCT解析により、骨体積は野生型およびPdk4マウス間で3、6および12月齢で同様であった。組織学的解析において、Pdk4マウスの骨は正常に発達し、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞の形態は野生型マウスの形態と類似していた。骨芽細胞の分化マーカーRunx2、Osterix、ALP、Col1a1、オステオポンチン、骨シアロタンパク質およびオステオカルシンを含むの発現は、野生型マウスおよびPdk4マウス間で類似しており、Col1a1、Col1a2、オステオポンチンおよびオステオカルシンを含む骨マトリックスタンパク質の産生は、野生型マウスおよびPdk4マウス間で類似していた。野生型マウスにおいて非荷重後の骨量が減少するが、Pdk4マウスでは減少しない尾懸垂を1週間実施し、μCTにより非荷重後の骨量を比較した。生理学的条件下においては、野生型マウスとPdk4マウスではすべてのパラメータが類似していた。しかしながら、非荷重後、野生型マウスでは骨体積、脛骨の厚さおよび脛骨密度が減少したが、Pdk4マウスでは減少しなかった。組織形態学的解析において、すべてのパラメータ骨体積ならびに骨形成および吸収のパラメータを含むは、生理学的条件下では野生型マウスとPdk4マウスとでは類似していた。非荷重後、野生型マウスでは骨体積が低下し、骨吸収パラメータ破骨細胞数、破骨細胞面および吸収面を含むが増加したが、Pdk4マウスでは増加しなかった。血中グルコースおよびコルチゾールのレベルは、野生型マウスとPdk4マウスとでは類似しており、両マウスにおいて非荷重状態で影響がなかった。野生型マウスでは非荷重後に骨吸収およびRanklの発現が増加するが、Pdk4マウスでは増加しない野生型マウスおよびPdk4マウスにおいて、コントロール群と非荷重群とでは骨形成速度は有意に相違しなかったが、野生型マウスおよびPdk4マウスで、非荷重後にコントロール群と比較してCol1a1およびオステオカルシンの発現は同様に低下した。RanklおよびCtskの発現は、野生型マウスで非荷重後に顕著に増加したが、Pdk4マウスでは増加しなかった。一方、Opg、Rank、Nfatc1、DCSTAMPの発現は、野生型マウスおよびPdk4マウスの両マウスにおいて非荷重後に有意に変化しなかった。TRAP陽性細胞およびTRAP5bの血清レベルは、野生型マウスで非荷重後に増加したが、Pdk4マウスでは増加しなかった。骨芽細胞および破骨細胞前駆体の異常から生じるPdk4マウスにおける破骨細胞形成の低下PDK4の発現は骨芽細胞の分化中に上昇するが、Pdk4初代骨芽細胞は、野生型初代骨芽細胞と同様のレベルのALP活性および石灰化を示した。さらに、骨芽細胞マーカー遺伝子Runx2、Osterix、ALP、Col1a1、オステオネクチン、オステオポンチン、BSPおよびオステオカルシンがあげられるの発現レベルは、野生型とPdk4の初代骨芽細胞間で類似していた。ただし、RanklはPdk4初代骨芽細胞では低下していた。また、骨髄細胞におけるPdk4の発現は、MCSFおよびRANKLの存在下で破骨細胞への分化中に増加し、Pdk4BMMから小核破骨細胞および大核破骨細胞の形成は、野生型BMMの培養物と比較して大核破骨細胞においてより深刻な減少であった。Ctskの発現は低下し、他方、Rank、Nfatc1、DCSTAMP、Sirpa、CD47およびCD9の発現には影響がなかった。また、初代骨芽細胞とBMMとを共培養することにより、破骨細胞の分化も調べた。野性型骨芽細胞とPdk4BMMとの共培養において、36の核を有する小核破骨細胞の数は、野性型骨芽細胞とBMMとの共培養で得られたものと同様であったが、6を超える核を含む大核破骨細胞の数は、野性型骨芽細胞とBMMとの共培養で得られたものの約半分であった。Pdk4骨芽細胞と野生型BMMとの共培養も同様の結果を示した。Pdk4骨芽細胞とBMMとの共培養もまた、野性型骨芽細胞とBMMとの共培養と比較して、36の核を有する小核破骨細胞の数は同様であったが、710の核を有する大核破骨細胞の数は4分の1であり、10を超える核を含む巨核破骨細胞の数は、野性型骨芽細胞とBMMとの共培養で得られたものの10分の1未満であった。さらに、Pdk4骨芽細胞とBMMとの共培養における吸収領域は、野性型骨芽細胞とBMMとの共培養で得られたものの10分の1未満であった。Pdk4による破骨細胞形成とRanklプロモーターの正の調節次に、アデノウイルストランスファーを用いて、インビトロでPDK4が破骨細胞形成を誘導するか否かを調べた。Pdk4骨芽細胞とBMMとの共培養物にPdk4発現アデノウイルスを感染させると、GFP発現アデノウイルスを感染させたときと比べて、TRAP陽性細胞および吸収領域が増加した。Pdk4初代骨芽細胞にアデノウイルスによりPdk4を導入すると、Rankl発現を強く誘導し、Opg発現を中等度に誘導した。これにより、アデノウイルスによりGFPを導入したときと比べて、RanklOpg比が増加した。Rankl発現におけるPDK4の関与を調べるため、Ranklプロモーター領域のDNA断片を用いて、レポーターアッセイを行った。38kbの断片を含むレポーターベクターの活性は、野生型骨芽細胞と比較してPdk4骨芽細胞で低下した。Pdk4骨芽細胞でのレポーター活性の低下は、段階的に欠失させたコンストラクトを用いたアッセイでも観察された。さらに、PDK4のPdk4骨芽細胞への導入は、GFPの導入と比較して、欠失コンストラクトのレポーター活性を亢進させた。PDCリン酸化に対するPdk4アンタゴニストは破骨細胞形成およびRankl誘導を阻害しないジクロロ酢酸DCAは、PDKsによるPDCのE1aサブユニットのリン酸化を阻害するKatoMLiJChuangJLChuangDTDistinctStructuralMechanismsforInhibitionofPyruvateDehydrogenaseKinaseIsoformsbyAZD7545DichloroacetateandRadicicolStructure2007159921004。初代骨芽細胞をDCAで処理すると、PDCのリン酸化を阻害した。MCSFおよびRANKLの存在下で野生型BMMを培養した場合、DCAでの処理は破骨細胞の分化に影響がなかった。DCAでの処理は、野生型初代骨芽細胞とBMMとの共培養において破骨細胞形成にも影響がなかった。また、RanklおよびOpgの発現ならびにRanklプロモーター活性におけるDCAの効果も調べたが、DCAは影響しなかった。さらに、Pdp1の初代骨芽細胞への導入はPDCを脱リン酸化したが、Ranklプロモーター活性には影響がなかった。これらの知見は、PDCのリン酸化とは別の様式で、PDK4が破骨細胞形成を調節することを示唆する。PDK4は、グルコースの酸化的利用を制限するため、PDCの特異的キナーゼであると考えられてきた。DCAはピルビン酸の類似体である。DCAおよびピルビン酸は、PDKのN末端の調節ドメインの中心において共通の結合部位を共有し、DCAは、PDKの阻害およびその後のPDCの活性化につながる活性部位の変化を誘導する。DCAはPDCのリン酸化を阻害するが、破骨細胞形成、Rankl発現およびRanklプロモーター活性に影響しなかった。さらに、Pdp1によるPDCの脱リン酸化は、Ranklプロモーター活性に対して影響しなかった。これらの知見は、PDCのリン酸化とは別の様式でPDK4が破骨細胞形成を調節することを示しており、このことは、破骨細胞形成に関する骨芽細胞およびBMMにおいて、PDK4は新規な未知の基質を有していることを示唆する。破骨細胞形成に関するPDK4およびPDK4の基質は、廃用性骨粗鬆症の適切な治療標的となると考えられる。