FVIII活性を有し、invitroにおける安定性を増大させた、組換えFVIIIバリアントであって、半減期延長部分とコンジュゲートされ、invitroにおける安定性を結果として増大させるアミノ酸変化が導入されている、組換えFVIIIバリアント。ジスルフィド架橋を含む、請求項1に記載の組換えFVIIIバリアント。前記ジスルフィド架橋が、FVIIIバリアントの2つのドメインを共有結合により連結している、請求項2に記載の組換えFVIIIバリアント。ジスルフィド架橋が、重鎖と軽鎖とを連結している、請求項2に記載の組換えFVIIIバリアント。疎水性のアミノ酸残基によるアミノ酸置換を含み、導入された疎水性のアミノ酸残基が、FVIIIバリアントの疎水性相互作用およびinvitroにおける安定性を増大させる、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。正に帯電したアミノ酸残基および負に帯電したアミノ酸残基の形態でアミノ酸置換を含むバリアントであって、導入された帯電残基が、FVIIIバリアントの静電相互作用およびinvitroにおける安定性を増大させる、請求項1から5のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。Bドメイン切断バリアントである、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。側鎖基が、切断Bドメインに位置するOグリカンに連結され、前記FVIIIバリアントが活性化すると、前記側鎖基が除去される、請求項7に記載の組換えFVIIIバリアント。Bドメインの配列が、配列番号2に示される、請求項7または8に記載の組換えFVIIIバリアント。半減期延長部分が、親水性ポリマー、抗体またはその抗原結合断片、Fcドメイン、ポリペプチド、および脂肪酸または脂肪酸誘導体からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。配列番号3によるアミノ酸配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。以下の置換S149CおよびE1969Cを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。以下の置換D666CおよびS1788Cを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えFVIIIバリアント。請求項1から13のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントを含む医薬組成物。血友病を治療するための、請求項1から13のいずれか一項に記載のFVIIIバリアントまたは請求項14に記載の組成物の使用。したがって、当技術分野では、第VIII因子活性を伴い、invivoにおける循環半減期が著明に延長された、FVIIIバリアントが必要とされている。本発明は、FVIII活性を有する組換えFVIIIバリアントであって、FVIIIバリアントを半減期延長部分とコンジュゲートし、invitroにおけるバリアントの安定性を増大させるために、FVIIIバリアントにアミノ酸変化を導入した組換えFVIIIバリアントに関する。本発明はさらに、療法におけるこのような分子の使用にも関する。本発明による分子は、invivoにおける循環半減期が、野生型第VIII因子と比較して著明に延長されている。定義フォンウィレブランド因子vWFは、血漿中に存在する大型の単量体多量体糖タンパク質であり、内皮、巨核細胞、および内皮下結合組織において構成的に生成する。その主要な機能は、他のタンパク質、特に、第VIII因子への結合であり、創傷部位への血小板の接着において重要である。第VIII因子は、vWFに結合するが、循環中では不活性である。第VIII因子は、vWFに結合しないと、急速に分解されるか、または除去される。したがって、FVIIIにおけるvWF結合能の低減または除去は、これまでのところ、循環半減期が延長された因子FVIIIのバリアントを得るのにまったく望ましくない手法であると考えられてきた。しかし、分子が半減期延長部分にコンジュゲートされているならば、部位特異的突然変異誘発によってvWFを低減または除去することが可能でありうる。EP0319315において開示されている通り、vWFへの結合の原因となる第VIII因子内の領域は、残基1670~1684にわたる領域である。この領域に関わる、第VIII因子の点突然バリアントおよびまたは欠失突然バリアントは、vwFに対する結合能を変化させると想定されている。本発明により特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異Y1680F、Y1680R、Y1680N、およびE1682T、およびY1680Cのうちの1または複数を含むバリアントが含まれる。第VIII因子分子FVIII第VIII因子とは、肝細胞が主に生成させる、大型の複合体糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含めた2351アミノ酸からなり、相同性により規定される複数の異なるドメインを含有する。3つのAドメイン、単独のBドメイン、および2つのCドメインが存在する。ドメインの順序は、NH2A1A2BA3C1C2COOHと列挙することができる。FVIIIは、BA3間境界で分離される2本の鎖として、血漿中を循環する。該鎖は、二価金属イオン結合により連結される。A1A2B鎖を重鎖と称するのに対し、A3C1C2を軽鎖と称する。本明細書で用いられる第VIII因子またはFVIIIとは、内因性凝固経路のメンバーであり、血液凝固に不可欠である、ヒト血漿糖タンパク質を指す。天然FVIIIは、配列番号1に示される、全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1のアミノ酸741~1648にわたる。配列番号1ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本発明による第VIII因子分子バリアントは、残っているドメインが、配列番号1のアミノ酸番号1~740および1649~2332に示される配列に緊密に対応する、Bドメイン切断因子FVIII分子でありうる。本発明によるFVIIIバリアントは、配列番号1に示される配列と若干異なる場合があり、これは、invitroにおける安定性を増大させる目的で、アミノ酸置換が導入されるという事実のために、3つのAドメインおよび2つのCドメインが、配列番号1に示されるアミノ酸配列とは若干、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20アミノ酸異なりうることを意味する。例えば、vWV結合能を低減する目的で、他の突然変異を導入することもできる。さらに、例えば、LRP、各種の受容体、他の凝固因子、細胞表面など、他の各種の構成要素、グリコシル化部位の導入およびまたは除去などにより、第VIII因子の結合能を修飾するために、分子内の他の位置にアミノ酸修飾を導入することが妥当と思われる。本発明による第VIII因子バリアントは、第VIII因子活性を有するが、これは、凝固カスケード内で、FVIIIと機能的に類似するかまたは同等の形で機能し、活性化血小板においてFIXaと相互作用することによりFXaの形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力を意味する。活性化は、invitroにおいて、例えば、血栓解析、内因性トロンビンポテンシャル解析など、当技術分野でよく知られる技法により評価することができる。本発明による第VIII因子分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、および100であるか、または100をさらに超えるFVIII活性を有する。FVIIIの固有の安定性invitroにおける安定性例えば、FVIIIなどのポリペプチドの固有の安定性またはinvitroにおける安定性とは、場合によって、安定性、物理的安定性、固有の安定性、構造的安定性、化学的安定性、固有の安定性、熱力学的安定性、熱的安定性、フォールディングの安定性などを指す。このような用語の一般的な主題は、それらが、ポリペプチドのinvitroにおける安定性を指し、このinvitroにおける安定性が、その三次元構造を安定化させるように作用するポリペプチドの固有の特性の総体として見られうることである。FVIIIは、invivoにおいて多数のクリアランス機構の下にあるため、FVIIIのinvivoにおける安定性とFVIIIのinvitroにおける安定性との間には著明な差違が存在する。これまで、FVIIIのinvivoにおける循環半減期の延長を、この分子のinvitroにおける安定性を改善することにより得ることは考慮されてこなかった。当技術分野では、多様な側鎖を伴うFVIIIのコンジュゲーションが、FVIIIのinvivoにおける循環半減期の延長を得るための手段として知られている。例えば、FVIII分子のコンジュゲーションにより、循環半減期を約2倍に、すなわち、約24時間まで延長しうることが既に裏付けられている。37°CのTAPヒルジン抗凝固血漿中の半減期により決定される野生型FVIIIのinvitroにおける安定性は、約30時間である。理論により拘束されることなしに述べると、本発明の背後にある根拠は、FVIII分子を1または複数の側鎖とコンジュゲートすると、FVIIIのinvitroにおける安定性が、そのinvivoにおける循環半減期を何らかの形でさらに延長するための制限パラメータとなるということである。こうして、本発明者らは、1または複数の共有結合により連結された側鎖を、FVIII分子のinvitroにおける安定性を結果として増大させる、FVIIIの点突然変異アミノ酸変化と組み合わせると、効果が驚くほど増強されることを示した。本発明による分子により得られるであろうさらに驚くべき効果は、結果として得られるFVIIIバリアントが、活性化FVIII分子からのA2ドメインの解離速度の減少をもたらす特定の突然変異アミノ酸変化の結果としてより強力な分子をもたらす、比活性の著明な増大も保有しうる。FVIIIバリアントが、例えば、野生型FVIIIまたはinvitroにおける安定化のためのアミノ酸変化を伴わないBドメイン切断FVIIIバリアントと比較して、invitroにおける安定性を増大させているかどうかを決定するには、例えば、実施例6において開示される塩化グアジニウムアッセイを用いることができる。本明細書で用いられるアミノ酸変化とは、アミノ酸の置換、欠失、および付加を指す。本発明によるアミノ酸変化は、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、C1ドメイン、およびC2ドメインのうちの1または複数における1カ所、2カ所、3カ所、または数カ所のアミノ酸置換の形態であることが好ましい。例えば、1つ、2つ、または3つのジスルフィド架橋の導入、およびまたは疎水性アミノ酸残基の導入、およびまたは静電相互作用の導入、およびまたはFVIIIに結合させた金属イオン、例えば、CuイオンもしくはZnイオンの結合を安定化させるアミノ酸置換の導入、およびまたは酸化に対する抵抗の増大を結果としてをもたらすアミノ酸置換など、invitroにおける安定性を増大させたFVIIIバリアントを得る多くの方法を想定することができる。Bドメイン切断欠失第VIII因子分子第VIII因子におけるBドメインは、配列番号1のアミノ酸741~1648にわたる。Bドメインは、複数の異なる部位で切断されることから、循環血漿中のFVIII分子には大きな異質性が生じる。グリコシル化が高度なBドメインの正確な機能は、知られていない。知られていることは、このドメインが凝固カスケードにおけるFVIII活性にとって可欠であるということである。したがって、組換えFVIIIは、Bドメイン欠失切断バリアントの形態で生成することが多い。内因性の全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌される前に、前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失FVIIIは、2つの異なる戦略により生成させることができる。Bドメインのない重鎖および軽鎖を2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成するか、またはBドメイン欠失FVIIIを、単鎖前駆体ポリペプチド鎖として合成し、これを、全長FVIII前駆体と同じ形で重鎖および軽鎖へと切断する。Bドメイン欠失切断FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖部分と軽鎖部分とが通常、リンカーにより隔てられている。Bドメイン欠失FVIII内に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカー配列は、FVIIIのBドメインに由来することが好ましい。少なくとも、リンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644~1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIが活性化するとリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖内に配置される。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビンの活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に影響を与える可能性は低い。Bドメインの欠失切断は、FVIIIを生成させるのに有利である。にもかかわらず、生成能を低下させることなく、Bドメインの一部をリンカー内に組み入れることもできる。生成能に対するBドメインの負の影響が、Bドメインのいかなる特定のサイズまたは配列に帰せられたことはない。好ましい実施形態によれば、切断欠失Bドメインが含む潜在的なOグリコシル化部位は1つだけであり、1または複数の側鎖基半減期延長部分が、好ましくはリンカーを介して、共有結合によりこのOグリコシル化部位にコンジュゲートされる。本発明によるBドメイン切断分子におけるO結合オリゴ糖は、組換え手段により、かつまたはBドメインの切断を介して新規のOグリコシル化部位を生じさせることにより人工的に創出されたOグリコシル化部位に結合させることができる。いずれの場合にも、Bドメイン切断第VIII因子のアミノ酸配列をデザインし、その後、このアミノ酸配列を、コンピュータによる解析にかけ、切断Bドメイン内にOグリコシル化部位がある確率を予測することにより、このような分子を生成させることができる。このようなグリコシル化部位を有する確率が比較的高い分子を、適切な宿主細胞内で合成した後、グリコシル化パターンを解析し、その後、切断Bドメイン内にO結合グリコシル化を有する分子を選択することができる。第VIII因子分子はまた、多数のN結合オリゴ糖も含有し、これらのうちの各々は、半減期延長部分を結合させるためのアンカーとしても用いることができる。野生型のFVIII分子におけるBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明によるFVIIIバリアントにおける切断Bドメインの長さは、例えば、約12~500アミノ酸、約12~400アミノ酸、12~300アミノ酸、12~200アミノ酸、15~100アミノ酸、15~75アミノ酸、15~50アミノ酸、15~45アミノ酸、20~45アミノ酸、20~40アミノ酸、または20~30アミノ酸など、例えば、約10アミノ酸~約700アミノ酸など、約10~約800アミノ酸で変化しうる。切断Bドメインは、重鎖およびもしくは軽鎖の断片、ならびにまたは野生型FVIII分子内には見出されない、人工的に導入された配列の断片を含みうる。本明細書では、Bドメイン切断およびBドメイン欠失という用語を互換的に用いることができる。半減期延長部分側鎖側鎖基本発明によるFVIIIバリアントは、翻訳後修飾を介して、または融合タンパク質の形態で、半減期延長部分側鎖基と共有結合によりコンジュゲートされる。したがって、FVIIIの以下の修飾アルキル化、アシル化、エステル形成、ジスルフィド形成またはアミド形成などのうちの1または複数を実施することができる。これには、PEG化FVIII、システインPEG化FVIII、およびこれらのバリアントが含まれる。本発明によるFVIIIバリアントはまた、他の生物適合性脂肪酸およびこれらの誘導体、親水性ポリマー、ポリペプチド、XTENポリマー、PAS化またはHAP化、アルブミン結合ペプチドなどにもコンジュゲートすることができる。本発明によるFVIIIは、1または複数の疎水性の半減期延長部分側鎖基を介してアシル化することができる。12部分を有する化合物は、本発明の文脈において可能なアルブミン結合剤である。疎水性の半減期延長部分は、このような部分が、アルブミンと非共有結合を形成し、これにより、血流中のアシル化されたFVIIIバリアントの循環を促進することが可能であるという事実のために、アシル化されたFVIIIバリアントとアルブミンとの複合体は、崩壊してFVIIIバリアントを放出することが緩徐であるにとどまるために、アルブミン結合剤と称する場合もある。FVIIIは、化学的方法、ならびに本質的にWO03031464において開示されている工程に従う酵素的糖アシル化法を用いてアシル化することができる。酵素的方法は、任意の有機溶媒の使用を回避する利点を有する。PEG化されたFVIIIという用語は、PEG分子とコンジュゲートされたFVIIIを意味する。PEG分子は、任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含めた、FVIIIの任意の部分に結合しうることを理解されたい。システインPEG化されたFVIIIという用語は、FVIIIに導入されたシステインのスルフヒドリル基にPEG分子をコンジュゲートしたFVIIIを意味する。PEGは、デキストランなどの多糖と比較して、架橋形成することが可能な反応基をごく少数しか有さないので、適切なポリマー分子である。特に、単一官能性PEG、例えば、メトキシポリエチレングリコールは、その結合化学反応が比較的単純であるので、対象のPEGである。結果として、架橋形成の危険性が消失し、結果として得られるポリペプチドコンジュゲートの均一性が増大し、ポリマー分子のポリペプチドとの反応を制御することが容易となる。ポリマー分子をポリペプチドに共有結合させるためには、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を、活性化形態で、すなわち、反応性官能基を伴う形態でもたらす。PEG化は、ポリペプチド上における全てのコンジュゲーション可能な結合基を指向する場合もあり、1または複数の特異的な結合基、例えば、N末端アミノ基、N結合グリカンおよびまたはO結合グリカンなどを指向する場合もある。さらに、コンジュゲーションは1工程で達成される場合もあり、段階的に達成される場合もある。半減期延長部分をO結合グリカンおよびまたはN結合グリカンに連結する酵素的手法は、WO03031464において開示されている。融合タンパク質融合タンパク質キメラタンパク質とは、元は個別のタンパク質をコードする、2つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う単一のポリペプチドが結果としてもたらされる。したがって、本発明によるFVIIIバリアントの側鎖は、FVIIIに融合させたポリペプチドの形態でありうる。したがって、本発明によるFVIIIは、例えば、抗体およびFc融合誘導体またはFc融合タンパク質など、FVIIIに半減期の延長を付与しうるペプチドに融合させることができる。本明細書では、Fc融合タンパク質が、IgG抗体の循環半減期が比較的長いために、IgGのFcドメインが好ましいことが多いが、任意の抗体アイソタイプに由来しうるFcドメインに融合させたFVIIIを包含することを意図する。さらに、例えば、補体の結合およびまたは特定のFc受容体への結合など、特定のエフェクター機能を調節するために、Fcドメインを修飾することも可能である。FVIIIを、FcRn受容体に結合する能力を有するFcドメインと融合させると、一般に、野生型FVIIIタンパク質の半減期と比較して、融合タンパク質の循環半減期の延長が結果としてもたらされる。IgGのFcドメインの234、235、および237位における突然変異は一般に、FcγRI受容体に対する結合の低減を結果としてもたらし、おそらくはまた、FcγRIIaおよびFcγRIII受容体に対する結合の低減も結果としてをもたらす。これらの突然変異は、FcRn受容体に対する結合を変化させず、このため、細胞内再循環経路を介して循環半減期の延長が促進される。本発明による融合タンパク質の修飾されたIgGのFcドメインは、特定のFc受容体に対するアフィニティーの減少を結果としてをもたらす以下の突然変異、およびC1qを介する補体結合の低減を結果としてもたらす以下の突然変異のそれぞれのうちの1または複数を含む。FVIIIはまた、例えば、血小板の表面において発現するタンパク質に特異的な抗体など、例えば、血小板に特異的に結合する能力を伴うタンパク質など、FVIIIに循環半減期の延長を付与する能力を有する他の任意のポリペプチドに融合させることもできる。FVIIIはまた、例えば、HAP化による延長部分n273~84頁、XTENrPEGによる延長部分1186~90頁、PAS化による延長部分、ELPによる延長部分60~77頁、およびアルブミン結合ペプチドによる延長部分35035~43頁など、ポリペプチドによる延長部分に融合させることもできる。糖タンパク質糖タンパク質という用語は、骨格アミノ酸配列のうちの1または複数のアミノ酸残基に結合した、1または複数のオリゴ糖を含有する、ペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを包含することを意図する。グリカンは、N結合グリカンの場合もあり、O結合グリカンの場合もある。したがって、末端シアル酸または互換的な末端ノイラミン酸とは、グリカンまたはオリゴ糖鎖内の末端糖残基として連結されたシアル酸残基を包含することを意図する、すなわち、各分岐の末端の糖は、α2→3連結またはα2→6連結を介してガラクトースへと連結されたNアセチルノイラミン酸である。ガラクトースまたはその誘導体という用語は、天然のDガラクトースなどのガラクトース残基、またはNアセチルガラクトサミン残基など、その誘導体を意味する。末端ガラクトースまたはその誘導体という用語は、グリカンまたはオリゴ糖鎖内の末端糖残基として連結された、ガラクトースまたはその誘導体を意味し、例えば、各分岐の末端糖が、ガラクトースまたはNアセチルガラクトサミンである。アシアロ糖タンパク質という用語は、1または複数の末端シアル酸残基が、例えば、シアリダーゼによる処理を介して、または基底をなすガラクトースもしくはNアセチルガラクトサミンの層から、少なくとも1つのガラクトース残基またはNアセチルガラクトサミン残基を露出させる化学的処理を介して除去された糖タンパク質を包含することを意図する。一般に、NXSTモチーフを得るように、アミノ酸の突然変異を導入することにより、野生型FVIIIの一部ではないN結合グリカンを本発明のFVIII分子に導入することができる。本発明のFVIII分子は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN結合グリカンを含有する。N結合グリカンの構造は、高マンノース形態または複合体形態である。高マンノースグリカンは、グリカンの非還元性端部に、末端マンノース残基を含有する。複合体のNグリカンは、非還元性端部に、シアル酸、ガラクトース、またはNアセチルグルコサミンを含有する。シアリルトランスフェラーゼシアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、新たに生成するオリゴ糖へと転移させる酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖ヌクレオチドのドナー基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、糖脂質、または糖タンパク質のN結合グリカンもしくはO結合グリカンにおける末端のガラクトースに付加する。シアリルトランスフェラーゼは、半減期延長部分を、FVIII分子に存在するグリカンに酵素的にコンジュゲートするときに用いるのに適する。本発明によるFVIIIバリアントを生成させるのに適する宿主細胞は、FVIIIバリアント分子が、フォールディングおよび翻訳後修飾、例えば、グリコシル化および硫酸化において、適切にプロセシングされることを確保するために、哺乳動物に由来することが好ましい。本発明を実施する場合、細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくは、CHO細胞系、COS1細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、およびHEK293細胞系が含まれるがこれらに限定されない、確立された哺乳動物細胞系である。好ましいBHK細胞系は、通常BHK570細胞と称するtkts13BHK細胞系である。他の適切な細胞系には、ラットHepI細胞、ラットHepII細胞、TCMK細胞、NCTC1469細胞、DUKX細胞、およびDG44が含まれるがこれらに限定されない。また、3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫細胞、および骨髄腫細胞の他の細胞との融合細胞も有用である。現在のところ、好ましい細胞は、HEK293細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、および骨髄腫細胞であり、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。本発明によるFVIIIバリアントはまた、トランスジェニック動物により生成させることもでき、トランスジェニック植物により生成させることもできる。医薬組成物本明細書では、医薬組成物が、例えば、RTU滅菌水性組成物、または、例えば、水中もしくは水性緩衝液中で再構成しうる乾燥滅菌組成物など、非経口投与に適する、本発明による第VIII因子分子を含む組成物を包含することを意味することが好ましい。本発明による組成物は、各種の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤などを含みうる。このような組成物中のさらなる成分には、保湿剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調整剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質、および双性イオンが含まれうる。このようなさらなる成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を与えるべきでないことは当然である。非経口投与は、シリンジ、場合によって、ペン型シリンジによる皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して実施することができる。代替的に、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。循環半減期本発明との関連で用いられる循環半減期という用語は、invivoにおいて測定した循環半減期を指す。本発明によるFVIIIバリアントは、野生型FVIIIと比較して、循環半減期が著明に延長されている。好ましくは本発明によるFVIIIバリアントの循環半減期は、野生型FVIIIと比較して、少なくとも約2倍、好ましくは少なくとも約3倍、より好ましくは少なくとも約4倍、なおより好ましくは少なくとも約5倍、および最も好ましくは少なくとも約6倍延長される。循環半減期を測定するには、以下のアッセイを用いることができる全凝固時間アッセイ、TEGアッセイ、ROTEMアッセイ、FVIIIC血栓アッセイ、トロンビン生成時間アッセイ、比色活性アッセイ、ELISAなど。本明細書で用いられる治療という用語は、それを必要とする任意のヒト対象または他の動物対象に対する医学的治療を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを示す一時的または決定的な診断を施した治療者による身体検診を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態に従い、個体により異なりうる。したがって、前記治療は、予防的治療の場合もあり、緩和的治療の場合もあり、対症的治療の場合もあり、かつまたは治癒的治療の場合もある。第1の態様では、本発明が、FVIII活性を有し、invitroにおける安定性を増大させた、組換えFVIIIバリアントであって、半減期延長部分とコンジュゲートされ、ininvitroにおける安定性を結果として増大させるアミノ酸変化が導入されている組換えFVIIIバリアントに関する。したがって、FVIIIバリアントは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10カ所の、ininvitroにおける安定性を結果として増大させるアミノ酸変化を含み得る。本発明の一実施形態では、前記FVIIIバリアントが、ジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記バリアントが、2つのジスルフィド架橋を含む。第3の実施形態では、前記バリアントが、3つのジスルフィド架橋を含む。本発明の別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、FVIIIバリアントの2つのドメインを共有結合により連結する少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメインをA2ドメインに共有結合により連結する少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A2ドメインをA3ドメインに共有結合により連結する少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A3ドメインをC1ドメインに共有結合により連結する少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメインをA2ドメインおよびA3ドメイン、またはA2ドメインおよびC2ドメイン、またはA3ドメインおよびC2ドメインに共有結合により連結する2つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、重鎖を軽鎖に共有結合により連結する少なくとも1つのジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、DombkowskiBioinformatics191852~3頁により記載されるジスルフィド結合の合理的なデザイン手順に従う、改変された計算手順により選択される位置に配置される少なくとも1対のシステイン残基を含む。この手順は、低解像度のx線結晶構造の不確実性を説明するように改変されているが、高解像度の構造モデルの場合なら、固有のタンパク質の可塑性および可撓性も説明しうるであろう。よって、この新規の手順は、ジスルフィド架橋の形状を記載する結合角ならびにねじれ角についてより大きな許容度を容認する。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、Gly102Ala1974、Tyr105Gly1960、Ser149Glu1969、Pro264Gln645、Ser268Phe673、Asn280S524、His281Asp525、Arg282Thr522、Ser285Phe673、Glu287Phe673、His311Phe673、Ile312Pro672、Ser313Ala644、Ser313Gln645、Ser314Ala644、Ser314Gln645、Ser314Thr646、Asp647Asn1950、Phe648Tyr1979、Leu649Gly1981、Ser650Gly1981、Gly655Ala1800、Tyr656Ser1791、Thr657Ser1788、Met662Lys1827、Met662Asp1828、Val663Glu1829、Tyr664Thr1826、Y664Lys1967、Asp666Ser1788、Thr667Gly1981、Thr667Ser1788、Leu668Ser1788、Gly686Ser1791、Thr669Tyr1979、Thr669Val1982、Phe671Tyr1979、Gly686Arg1803、His693Gly1981、Asn694Pro1980、Asn694Asn1950、Ser695Glu1844およびAsp696Asn1950からなる群から選択される位置に配置される少なくとも1対のシステイン残基を含む。本発明の別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、A1ドメイン、A2ドメイン、またはA3ドメイン内に、FVIIIバリアントのinvitroにおける安定性に寄与する少なくとも1つのドメイン内ジスルフィド架橋を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、Ser13Lys47、Lys48Gly171、Val80Gly145、Gly102Tyr156、Leu277Gln297、Lys380Asp459、Ser650His693、Ser654Trp688、Thr1695Asn1770、Lys1845Lys1887、Ala1877Tyr1943、およびSer1946Leu1978からなる群から選択される位置に配置される少なくとも1対のシステイン残基を含む。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、疎水性アミノ酸残基を伴うアミノ酸置換を含み、導入された疎水性アミノ酸残基により、FVIIIバリアントの疎水性相互作用およびinvitroにおける安定性が増大する。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、以下の突然変異Met147Leu、Leu152Pro、Ser313Pro、Leu377Phe、Met539Pro、Thr646Pro、Met662Leu、Cys692Ser、Met1973Leu、およびGlu1793Proのうちの1または複数を含む。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、電荷の変化を伴うアミノ酸置換を含み、導入され帯電残基により、FVIIIバリアントの静電相互作用およびinvitroにおける安定性が増大する。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、以下の突然変異Gln316Lys、Gln316LysMet539Pro、Gln316His、Glu287AlaGlu676Ala、Asp666Asn、Asp666Val、Arg279AlaLys1967Ala、Arg279GlnLys1967Gln、Glu287Val、Glu676Val、Glu287ValGlu676Val、Asp519AlaGlu665Ala、Asp519AlaGlu665Val、Asp519AlaGlu1984Ala、Asp519AlaGlu1984ValAsp519ValGlu665Val、Asp519ValGlu1984Ala、Asp519ValGlu1984ValGlu665AlaGlu1984Ala、Glu665AlaGlu1984Val、Glu665ValGlu1984Ala、Glu665ValGlu1984Val、Asp519AlaGlu665ValGlu1984Ala、Asp519ValGlu665ValGlu1984Ala、Asp519ValGlu665ValGlu1984Val、Asp519Ala、Asp519Val、Asp525GluAsp605Glu、Arg489GlyAsp525GluAsp605Glu、Glu665Ala、Glu665Val、Glu1984AlaおよびGlu1984Valのうちの1つ、2つ以上を含む。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、直接、または酸化に感受性であるメチオニン残基の除去を介して、FVIIIに結合させた金属イオン、例えば、CuイオンもしくはZnイオンの結合を安定化させるアミノ酸置換であって、これらの変化が、FVIIIバリアントのinvitroにおける安定性を増大させることに寄与するアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、以下の突然変異Met320Gln、Met320GlnMet2010Gln、Met2010Gln、Leu649His、Phe697His、Leu649HisPhe697His、Gly2003Ser、およびSer313Glyのうちの1または複数を含む。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、Bドメイン切断バリアントである。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、切断Bドメインに位置するOグリカンに連結された半減期延長部分であって、前記FVIIIバリアントが活性化すると除去される半減期延長部分を含む。このバリアントが、他のいかなる半減期延長部分も含まない場合は、したがって、活性化FVIIIバリアントが、野生型の活性化FVIIIタンパク質と高度に類似する構造を有する。好ましい実施形態では、Bドメインの配列が、配列番号2に示される。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、選択的に導入された遊離システインに連結された半減期延長部分を含む。別の実施形態では、前記FVIIIバリアントが、選択的に導入された遊離システインに連結された半減期延長部分であって、前記FVIIIバリアントが活性化すると除去される半減期延長部分を含む。このバリアントが、他のいかなる側鎖基を含まない場合は、したがって、活性化FVIIIバリアントが、野生型の活性化FVIIIタンパク質と高度に類似する構造を有する。別の実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、親水性ポリマー、PEG基、抗体、Fcドメイン、アルブミン、ポリペプチド、および脂肪酸または脂肪酸誘導体アルブミン結合剤からなる群から選択される少なくとも1つの半減期延長部分を含む。別の実施形態では、半減期延長部分が、例えば、FVIIIFcドメイン融合タンパク質、抗体FVIII融合タンパク質、アルブミンFVIII融合タンパク質、またはトランスフェリンFVIII融合タンパク質など、前記FVIIIバリアントに融合させた融合パートナーの形態である。別の実施形態では、抗体が、例えば、GPIIbllla特異的抗体などの血小板特異的抗体である。本発明の一実施形態では、融合パートナーが、FVIII分子のA3ドメインを置換している。別の実施形態では、融合パートナーが、第VIII因子のBドメインに挿入されており、Bドメインは、場合によって、切断Bドメインである。別の実施形態では、融合パートナーが、第VIII因子のC2ドメインのN末端に挿入されている。一実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントのvWF結合能が低減されている。一実施形態では、本発明による前記FVIIIバリアントが、配列番号3によるアミノ酸配列を含む。配列番号3によるアミノ酸配列を含むFVIIIバリアントは、切断Bドメインに位置するOグリカンに結合させたPEG分子またはアルブミン結合剤と酵素的にコンジュゲートすることが好ましい。PEG分子のサイズは、約40kDaであることが好ましい。Bドメインに位置するOグリカンに結合させた半減期延長部分とコンジュゲートした、本発明によるFVIIIバリアントは一般に、前記FVIIIバリアントが活性化すると、Bドメインにおける側鎖基が除去されるので、野生型活性化FVIII分子の構造を模倣する能力を有する。一実施形態では、本発明によるFVIIIバリアントが、以下の置換S149CおよびE1969Cを含む。一実施形態では、本発明によるFVIIIバリアントが、以下の置換D666CおよびS1788Cを含む。別の実施形態では、本発明によるFVIIIバリアントが、N1950位のアミノ酸置換を含み、前記置換が、N1950Q、N1950F、およびN1950Iからなる群から選択される。この置換は、N1950QまたはN1950Iであることが好ましい。別の実施形態では、本発明によるFVIIIバリアントが、以下の置換D519VおよびE1984Aを含む。別の態様は、本発明によるFVIIIバリアントのうちのいずれか1つをコードするDNA分子に関する。別の態様は、本発明によるDNA分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。したがって、別の態様は、本発明によるFVIIIバリアントを生成させる方法に関する。このような方法は、本発明によるFVIIIバリアントをコードするDNA分子を含む宿主細胞を、適切な条件下においてインキュベートするステップと、前記FVIIIバリアントを単離するステップと、場合によって、FVIIIバリアントを側鎖基とコンジュゲートするステップとを含む。別の態様は、場合によって、1または複数の薬学的に許容される賦形剤を伴う、本発明によるFVIIIバリアントを含む医薬組成物に関する。この処方物は、静脈内投与を意図する非経口処方物であることが好ましい。処方物は、凍結乾燥形態にある、本発明によるFVIIIバリアントを含む1つの容器の形態であることが可能であり、場合によって、水性溶媒を含有する1つの容器であることが可能であるが、この場合は、凍結乾燥画分を水性画分中で溶解させてから投与する。別の態様は、血友病を治療するための、本発明によるFVIIIバリアントの使用に関する。別の態様は、血友病の治療法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、本発明によるFVIIIバリアントを投与するステップを含む治療法に関する。最後の態様は、場合によって、血友病の治療において用いられる1または複数の他の薬物と組み合わせた、血友病の治療のための、本発明によるFVIIIバリアントの使用に関する。本明細書で用いられるN8およびF8500とは、既にWO09108806の例において開示されている、Bドメインが切断されたFVIIIバリアントのアミノ酸配列を指す。N8F8500バリアントは、配列番号2に示される配列を伴うBドメインを有し、この分子の活性化変化形は、内因性活性化FVIIIと本質的に同一である。この分子の特異的突然バリアントを、配列番号1の番号付けによる特異的アミノ酸置換を後続させたF8500と称する。この分子の一部のバリアントは、好ましくは、切断Bドメイン内のOグリカンに位置する半減期延長部分にさらにコンジュゲートすることもできる。例えば、40kDaのPEG部分を、Oグリカンに結合させる場合は、この分子を、例えば、40KPEGOと名付ける。組換えBドメイン切断Oグリコシル化第VIII因子およびそのバリアント、例えば、第VIII因子または第VIII因子の生成細胞系および培養工程第VIII因子のcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。前記プラスミドは、Y1680F突然変異を含むBドメイン欠失第VIII因子、全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1~740を含む第VIII因子重鎖、および全長ヒト第VIII因子のアミノ酸1649~2332を含む第VIII因子軽鎖をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト第VIII因子のアミノ酸741~750および1638~1648による配列を含む21アミノ酸のリンカーにより連結した。このプラスミドによりコードされる第VIII因子アミノ酸配列は、配列番号3に示される通りである配列番号3ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKCVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKCEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYチャイニーズハムスター卵巣細胞に、前記プラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。工程の第1のステップは、作業用の細胞バンクバイアルに由来する細胞バイアルを、化学的に規定された、動物成分非含有増殖培地へと播くことである。まず融解後、細胞を、T型フラスコ内でインキュベートする。融解の1または2日後、細胞をシェーカーフラスコへと移し、細胞密度を02~30×106個mlに維持するために、培養物容量を系列希釈により拡張する。次のステップは、シェーカーフラスコ中の培地を、種培養用バイオリアクターへと移すことである。ここで培養物容量をさらに拡張してから、最終的に生成用バイオリアクターへと移す。化学的に規定された、同じ、動物成分非含有培地を、全ての接種物拡張ステップに用いる。生成用バイオリアクターへと移した後で、培地に、生成物濃度を増大させる成分を補充する。生成用バイオリアクターでは、サイクル時間を3日間とする反復バッチ工程で細胞を培養する。回収時には、培養物容量の80~90を、回収タンクへと移す。次いで、初期細胞密度を得るために、残りの培養液を、新鮮な培地で希釈し、次いで、新規の増殖期を開始する。遠心分離および濾過により回収バッチを洗浄し、保持タンクへと移してから、精製工程を開始する。保持タンク内の細胞を含まない回収物に緩衝液を添加し、pHを安定化させる。生成試行が終了するまでに、細胞バンクの生成を終了させるために、細胞を回収して凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、滅菌性、およびウイルス汚染について検査する。精製細胞培養培地から、Bドメイン欠失第VIII因子を単離するために、CaptoMMCカラムにおける濃縮ステップ、免疫吸着クロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、および最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を用いた11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、002のTween80、pH75中で平衡化したCaptoMMCによるカラムへと、流速15ml分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、15MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH75により、流速1ml分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、第VIII因子活性についてアッセイした。第VIII因子を含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。第VIII因子に対するモノクローナル抗体を開発した。エピトープマッピングにより、この抗体F25は、アミノ酸残基725~740の重鎖最C末端配列を認識することが判明した。本質的に、製造元により説明される通りに、ゲル1ml当たり24mgの密度で、F25抗体を、NHS活性化セファロース4FFに連結した。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、pH73で10倍に希釈し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73で平衡化したF25Sepharoseカラム16×95cmへと、流速05ml分で適用した。UVシグナルが一定となるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、UVシグナルが一定となるまで、再度、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、065MのNaCl、pH73で洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、50のエチレングリコール、pH73により、流速1ml分で、第VIII因子を溶出させた。1mlの画分を回収し、第VIII因子活性についてアッセイした。第VIII因子を含有する画分をプールし、通常約25mlのプール容量を得た。イオン交換ステップのために、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73および緩衝液B20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、1MのNaCl、pH73を調製した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分で、MacroPrep25QSupportによるカラムを平衡化した。前出の工程によるプールを、緩衝液Aで10倍に希釈し、流速2ml分でカラムへと送入した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分でカラムを洗浄し、流速2ml分で120mlの15緩衝液B~70緩衝液Bにわたる直線勾配により、第VIII因子を溶出させた。2mlの画分を回収し、第VIII因子活性についてアッセイした。第VIII因子を含有する画分をプールし、通常約36mlのプール容量を得た。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、150mMのNaCl、pH73で平衡化した調製グレードのSuperdex200カラムへと1ml分で適用し、溶出させた。3mlの画分を回収し、第VIII因子Cについてアッセイした。第VIII因子を含有する画分をプールし、通常約57mlのプール容量を得た。第VIII因子を含有するプールを、80°Cで保存した。FVIIICおよびELISAの測定により判定される通り、上記の4ステップの精製手順を用いることにより、約15の全収量が得られた。組換えOグリコシル化第VIII因子をPEG化する手順実施例1で得られた組換え第VIII因子分子は、以下の手順を用いてポリエチレングリコールとコンジュゲートする。グリコPEG化反応を効率的とするには、FVIII濃度を5mgmlとすることが必要とされる。FVIIIは通常可溶性ではないので、選択された緩衝液組成物のスクリーニングをこれらの濃度で実施したを参照されたい。これらの考慮に基づき、50mMのMES、50mMのCaCl2、150mMのNaCl、20のグリセロール、pH60を含有する緩衝液が、適切な反応緩衝液であることが判明した。上記で記載した通りに精製した組換えFVIIIは、段階的溶出を用いるPoros50HQカラムによるイオン交換、SartoriusVivaspinフィルター、10kDaのカットオフ、またはAmicon10kDaMWCOPESフィルターを介して、反応緩衝液中で6~10mgmLの濃度まで濃縮した。FVIIIのグリコPEG化は、反応緩衝液中で、第VIII因子を、シアリダーゼ、CMPSAグリセロールPEG40kDa、およびMBPST3Gal1と混合することにより開始した。反応混合物は、転換収率が総量の約20~30となるまで、32°Cでインキュベートした。インキュベーションの後、試料を、緩衝液Aで希釈し、Source15Qカラムに適用した。結合した材料を、緩衝液Aで洗浄し、緩衝液Bによる段階的勾配を用いて溶出させた。緩衝液Bを約25とするカラムから、グリコPEG化第VIII因子SAグリセロールPEG40kDaを溶出させた。シアリダーゼ処理中にNグリカン上で露出されている遊離ガラクトース部分を遮断するために、反応緩衝液中で、第VIII因子SAグリセロールPEG40kDaのプール画分を、CMPSAおよびMBPSBDST3Gal3と混合し、32°Cで11時間にわたりインキュベートした。結果として得られる、キャッピングされたグリコPEG化第VIII因子SAグリセロールPEG40kDaを、50mMのMES、50mMのCaCl2、150mMのNaCl、10のグリセロール、pH60で平衡化したSuperdex200カラム上で流速を025mL分とするゲル濾過を介して、cmpSAおよびST3GalIIIから分離した。生成物である第VIII因子SAグリセロールPEG40kDaは、38分後に溶出する。ピーク画分を回収し、アリコート分割し、後続の解析にかけた。Oグリカンにおける40kDaグリコPEGBDDFVIII水中にイミダゾール、塩化カルシウム、Tween80、塩化ナトリウム、およびグリセロールからなる緩衝液中で、BDDFVIIIを融解させた。アルトロバクターウレアファシエンスに由来するシアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびシチジン一リン酸N5PEGグリセロールノイラミン酸、CMPSAグリセロールPEG40kDaを添加した。最終容量を、15mlとした。結果として得られる混合物を、摂氏23度で24時間にわたり静置した。混合物を、緩衝液A中にイミダゾール、塩化カルシウム、Tween80、およびグリセロールで20mlへと希釈した。結果として得られる混合物を、MonoQ550GLカラムへと投入した。固定化された材料を、緩衝液Aで洗浄し、その後、0~100の緩衝液B中にイミダゾール、塩化カルシウム、Tween80、塩化ナトリウム、およびグリセロールによる勾配を用いて、それをカラムから溶出させた。回収された材料を、シチジン一リン酸N5アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼと混合した。最終容量および濃度は、それぞれ、256mlおよび046mgml、0132mgml、ならびに54マイクロモルであった。混合物は、摂氏32度で1時間にわたり静置し、このとき、混合物を、緩衝液Aで20mlまで希釈した。結果として得られる混合物を、MonoQ550GLカラムへと投入した。固定化された材料を緩衝液Aで洗浄し、その後、0~100の勾配を用いて、それをカラムから溶出させた。単離された画分中のタンパク質含量は、SDSPAGEゲルを用いて評価した。選択された画分をプールし、AmiconUltraCentrifugeTubeを用いて濃縮した。濃縮後の容量は、05mlとなった。結果として得られた溶液を、水中のヒスチジン、塩化カルシウム、Tween80、塩化ナトリウム、およびスクロースからなる緩衝液中であらかじめ平衡化したSuperose610300GLカラムへと投入した。言及された緩衝液および06ml分の流速を用いて、混合物の成分を、15カラム容量にわたり、サイズを1mlとする画分へと分離した。選択された画分をプールした。比色アッセイにおいて測定されたFVIIIC以下の通りに、CoatestSP試薬を用いるFVIII比色アッセイにおいて、rFVIII化合物5~8のFVIII活性を評価したCoatestアッセイ緩衝液中で、FVIII試料およびFVIII基準物質を希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレートに二連で添加した。CoatestSPキットによる第IXa因子第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を、513で混合し、このうちの75μlを、ウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後、50μlの第Xa因子基質S2765トロンビン阻害剤I2581ミックスを添加し、反応物を室温で10分間にわたりインキュベートしてから、pH3の1Mクエン酸25μlを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー上で、415nmにおける吸光度を測定した。陰性対照による値を、全ての試料から減じ、FVIII濃度と対比してプロットした吸光度値の線形回帰により、検量線を作成した。試料の活性を、HPLCにより決定されるタンパク質濃度で除することにより、比活性を計算した。軽鎖に対応するクロマトグラムのピーク下面積を積分し、野生型非修飾rFVIIIに対する並行的な解析における同じピーク面積と比較することにより、かつ、アミノ酸解析を介して飼料の濃度を決定した。Table1におけるデータは、FVIIICの比活性が、OグリコPEG化されたrFVIII化合物について維持されたことを裏付ける。一段階血栓アッセイにおいて測定されたFVIIIC以下の通り、一段階FVIII血栓アッセイにより、rFVIII化合物のFVIIICをさらに評価した。HBSBSA緩衝液中で、rFVIII試料およびFVIII基準物質を、約10Umlまで希釈した後、VWFを含有するFVIII欠損血漿中で10倍に希釈した。その後、試料を、HBSBSA緩衝液中で希釈した。単一の因子プログラムを用いて、ACL300R測定器またはACL5000測定器上で、APTT血栓形成時間を測定した。VWFを伴うFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、SynthASilInstrumentationLaboratoryをaPTT試薬として用いた。血栓測定器では、希釈した試料または基準物質を、37°Cで、FVIII欠損血漿およびaPTT試薬と混合する。塩化カルシウムを添加し、血栓形成までの時間を、濁度により決定する。FVIII基準物質の希釈液による血栓形成時間の検量線に基づき、試料中のFVIIICを計算する。Table1におけるデータは、血栓形成と比色活性との比を裏付ける。FVIIIバリアントをスクリーニングするためのFVIIIのinvitroにおける安定性についての塩化グアニジニウム加速化アッセイ異なるFVIIIバリアントにおいて1Mの塩化グアニジニウムを伴う伴わない場合のFVIII活性を、CoatestSP試薬を用いる比色FVIIIアッセイにより評価した。FVIII突然バリアントの生成および発現は、以下の通りに実施した。cMycタグをコードする断片を、28アミノ酸のBドメインリンカーを伴うFVIIIをコードする発現構築物中の重鎖のC末端に挿入した。このFVIIIcMyc2の発現レベルおよび活性は、タグ付けされていないFVIIIと同様であった。さらなる制限部位を、FVIIIcMyc2発現構築物に付加しバリアント間におけるドメインのスワッピングを容易にした。製造元の推奨に従いHKB11細胞および293フェクチンを用いる無血清トランスフェクションを実施した。懸濁液であるHKB11細胞を、50UmL1のペニシリンおよび50ugmL1のストレプトマイシンで補充した市販のFreestyle293発現培地中で増殖させた。細胞を、シェーカー内で細胞懸濁液として増殖させ、5のC02および95の相対湿度下、37°Cでインキュベートした。細胞を、細胞3×105個mL1の密度で播種し、3~4日間ごとに継代培養した。自動式細胞カウンティングのために画像解析ソフトウェアを用いるCedex解析により、生細胞濃度および全細胞濃度を評価した。生細胞は、それらが色素であるトリパンブルーを排除する能力により検出された。トランスフェクションの96時間後に細胞を採取し、静かに遠心分離することにより細胞ペレットを単離した。その後、細胞ペレットを、05MのNaClを含有するFreestyle293発現培地中に再懸濁させた。静かに遠心分離した後、FVIIIを含有する上清を採取し、さらなる解析まで80°Cで保存した。rFVIII試料およびFVIII基準物質を、Coatestアッセイ緩衝液中で希釈した。5μLの試料を、2Mの塩化グアニジニウム5μLと、別の試料を5μLのCoatestアッセイ緩衝液と混合し、室温で1時間にわたりインキュベートし、FVIIIバリアントの変性を可能とした。490μLのCoatestアッセイ緩衝液を添加し、試料を4倍に希釈した。あらかじめ希釈した試料50μl、基準物質、および緩衝液である陰性対照を、96ウェルSpectramaxマイクロ滴定プレートに添加した。CoatestSPキットによる第IXa因子第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を513に混合し、この混合物75μLをウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後に、50μLの第Xa因子基質S2765トロンビン阻害剤I2581ミックスを添加し、反応物を、室温で5分間にわたりインキュベートしてから、1Mのクエン酸、pH3、25μLを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるEnvisionプレートリーダーにより、405nmにおける吸光度を測定した。全ての試料から陰性対照の値を減じ、FVIIIの安定性と対比してプロットした基準物質の吸光度値の線形回帰により検量線を作成した。安定性は、1Mの塩化グアニジニウムと共にインキュベートした試料の活性を、0Mの塩化グアニジニウムと共にインキュベートした試料の活性で除することによる比として計算した。表中のデータは、対照およびバリアントのうちの少数、とりわけ、1950位に突然変異を伴うバリアントだけがアッセイにおいて安定であることを裏付ける。クエン酸で安定化させた血漿における減衰FVIIIまたはFVIIIバリアントを、クエン酸で安定化させてA型血友病血漿90μlに、1IUmlの濃度となるまで添加し、37°Cで0、3、6、20、24、44、および48時間にわたりインキュベートした。その後、比色アッセイにおいて、FVIII活性について試料を解析したFVIII試料およびFVIII基準物質の希釈液を、Coatestアッセイ緩衝液中で希釈した。50μlの試料、基準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレートに2連で添加した。CoatestSPキットによる第IXa因子第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を513に混合し、この混合物75μLをウェルに添加した。室温で15分間にわたるインキュベーション後に、50μLの第Xa因子基質S2765トロンビン阻害剤I2581ミックスを加し、反応物を、室温で10分間にわたりインキュベートしてから、1Mのクエン酸、pH3、25μLを添加した。620nmにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダーにより、415nmにおける吸光度を測定した。全ての試料から陰性対照の値を減じ、残りの試料のFVIII活性を、較正された野生型FVIII希釈液から作成された検量線に基づき計算した。FVIII活性を、インキュベーション時間と対比してプロットし、GraphPadPrismソフトウェアによる単相減衰についての式を用いて血漿半減期を計算した。以下の表は、文献において既に記載されているFVIIIM662CD1828CおよびFVIIID519VE1984Aの血漿t12と共に、野生型FVIIIおよびS149CE1969C置換を伴うFVIIIの血漿t12を示す。FVIIIS149CE1969Cの血漿中の安定性は、野生型FVIIIと比較して増大した。ヒルジンTAPで安定化させた血漿における減衰クエン酸で安定化させたA型血友病血漿に、ヒルジンおよびダニ抗凝固タンパク質を添加し、塩化カルシウムを20mMまで添加することにより、血漿を再石灰化させた。FVIIIまたはFVIIIバリアントを、ヒルジンTAPで安定化させた血漿90μlに、1IUmlの濃度となるまで添加し、37°Cで最長7日間の期間にわたり、例えば、0、3、6、24、48、72、96、168、192および216時間にわたりインキュベートした。その後、実施例7において記載した比色アッセイにおいて、FVIII活性について試料を解析した。以下の表は、野生型FVIIIの血漿t12、ならびに文献において既に記載されているFVIIIM662CD1828CおよびFVIIID519VE1984Aを含めたバリアントの血漿t12を示す。データは、重鎖と軽鎖との間にジスルフィド架橋を挿入したFVIIIバリアントであるD666CS1788Cの、ヒルジンTAPで安定化させた血漿中の安定性が、野生型FVIIIと比較して増強されていることを示す。トロンビン生成洗浄した血小板を、記載される通りに調製し、最終密度が1μl当たりの血小板150000個となるまで、A型血友病血漿に添加した。血小板を含有する血漿80μlを、マイクロ滴定ウェル内の脂質を再付加した組織因子5μlと混合し、FlouroskanAscentプレートリーダーにより37°Cで10分間にわたりあらかじめ加熱した。野生型FVIIIまたはバリアントを、15μl中に添加した。CaCl2と混合した蛍光原基質を、1時間にわたり持続的に20μl中に添加してから、蛍光を測定する。蛍光シグナルを、a2マクログロブリンを結合させたトロンビンの活性について補正し、記載される通りに、トロンビン濃度較正基準物質およびThrombinoscopeソフトウェアを用いることにより、トロンビン濃度へと変換した。安定化させたFVIII突然バリアントは、野生型FVIIIより多くのトロンビンを生成させた。これは、解析された最も低いFVIII濃度において最も顕著であった。これは、Thrombinoscopeソフトウェアから得られるトロンビン活性の最大レベルが示されるときに見られる。0011nMの野生型FVIIIおよびバリアントにより得られるトロンビン活性の最大レベルを、以下トロンビンの最大生成率トロンビン活性の最大レベルの通りにThrombinoscopeソフトウェアから得られるパラメータから計算したトロンビンの最大生成率と共にTable5に示す。FVIII欠損マウスおよびVWF欠損マウスにおけるrFVIIIの薬物動態rFVIIIバリアントの薬物動態を、FVIII欠損マウスマウスまたはvWF欠損マウスにおいて評価した。vWFKOマウスが、13の正常FVIIICを有する一方、FVIIIKOマウスは、検出可能なFVIIICを有さなかった。体重を約25グラムとし、週齢の範囲を16~28週齢とする、雄および雌の混合群を用いた。マウスの尾静脈に、rFVIIIの単回の静脈内注射を施した。血液は、投与の64時間後までの時点において、コーティング処理されていないガラス製の毛細管を用いて、眼窩神経叢から採取した。各マウスから3例ずつの試料を採取し、各時点において2~4例の試料を回収した。血液は、クエン酸ナトリウムで即座に安定化させ、4倍容量のFVIIICoatestSP緩衝液中で希釈してから、4000×gで5分間にわたり遠心分離した。希釈した血液から得られた血漿をドライアイス上で凍結させ、80°Cで保存した。実施例4において記載される比色アッセイにより、FVIIICを決定した。WinnonlinProversion41ソフトウェアを用いるノンコンパートメント法により、薬物動態解析を実施した。Table6は、薬物動態パラメータ半減期、クリアランス、および平均貯留時間の推定値を示す。データは、PEG化すると、クリアランスが減少し、半減期および平均貯留時間が延長されたことを示す。数学的モデルは、安定性が、TAPヒルジンで安定化させた血友病血漿における血漿半減期に基づく半減期に対して影響を及ぼすことを予測しうる。A型血友病マウスによるFeCl3誘導傷害モデルにおいてPEG化とFVIIIの安定化とを組み合わせることによる止血効果の延長40KPEGOFVIIIと対比した40KPEGON8の作用時間を、A型血友病マウスによるFeCl3誘導傷害モデルにおいて探索した。材料および方法マウスに麻酔をかけ、これを温熱パッド上に置いて体温を維持した。頸動脈を露出させ、超音波により血流を測定する流速プローブを、頸動脈の周囲に設置した。10のFeCl3溶液に短時間浸漬した濾紙を、露出された頸動脈の周囲に適用することにより、傷害を誘導した。3分後に濾紙を除去した。次いで、頸動脈を、09のNaClで3回にわたり洗浄し、最後に流速プローブ内の空気を抜き、血流測定の最適化を確保するためにSurgilubeを適用した。FeCl3で飽和させた濾紙を除去した後で、血流を、25分間にわたり記録し、FeCl3で飽和させた濾紙を除去してから血流が0ml分となるまでの時間を測定することにより、閉塞までの時間を決定した。25分後に閉塞が起こらなかった場合は、観察時間内に閉塞が起こらなくとも、閉塞時間を25分間として報告した。F8KOマウスを、Advate、40KPEGON8、または媒体で処置した。FeCl3誘導傷害は、投与の5分後、または24、48、60、および72時間後に生じさせた。血流は、FeCl3を除去した25分後に報告し、その後閉塞までの時間を決定した。結果FeCl3誘導傷害は、280IUkgの40KPEGON8、280IUkgの40KPEGOF8、または媒体を投与した5分後、72、および96時間後に生じさせた。血流は、FeCl3を除去した25分後に報告し、その後閉塞までの時間を決定したを参照されたい。1群当たり5~8匹ずつのマウスの平均およびSEMを示す。媒体で処置されたF8KOマウスでは閉塞が起こらなかったのに対し、40KPEGON8および40KPEGOF8で処置された全てのマウスでは投与の5分後に閉塞が起こり、平均の閉塞時間は、それぞれ、31±05分間および32±04であった。このモデルによる先行研究は、Advateで処置されたF8KOマウスの閉塞時間が、24および48時間後においてそれぞれ130±34分間および159±29分間であるが、Advateを投与した60および72時間後には閉塞が観察されなかったことを明らかにしている。これに対し、40KPEGON8で処置したF8KOマウスでは、72および96時間後のいずれにおいても、平均閉塞時間は長くなるが、閉塞が観察された。興味深いことに、安定化させたグリコPEG化FVIIIバリアントは、グリコPEG化野生型FVIIIと比較して、FeCl3誘導血栓形成モデルにおける効果の持続時間のなお一層の延長を示している。したがって、ダンの事後検定を包含するクルスカルワリス検定を用いて、異なる群間における閉塞までの時間を比較したところ、96時間後において統計学的有意差が明らかであったことから、分子を安定化させる付加効果が確認された。