"以下の工程を含む、サンプル間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法:i第1のサンプルを、前記酵素の非蛋白質性基質のxの異なる濃度に暴露する工程、ここでxは2であるかまたは2より大きい;ii該非蛋白質性基質のxの異なる濃度のそれぞれにおいて前記サンプルのポリペプチドの修飾を定量化する工程;iii前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を決定する工程;iv2番目のまたは次のサンプルについて工程iから工程iiiを繰り返す工程;およびv前記サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記酵素の親和性を比較する工程;ここで、サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記酵素の親和性における相違は、サンプルの間の前記酵素の活性の差を示している。前記サンプルが細胞溶解物である、請求項1記載の方法。工程iiの前に前記サンプルから消化でペプチド類の混合物を得る、請求項1または2記載の方法。以下を含む、二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法:i第1の基質のxの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を露出する工程、ここでxは2または2より大きく、第2の基質の濃度を一定とし、第1および第2の基質の1つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方がポリペプチドの混合物である;ii前記第1の基質のxのそれぞれの濃度でポリペプチドの前記混合物中のポリペプチドの修飾を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程;ここで、前記第1の基質に対する前記酵素の高親和性が、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。前記第1の基質が前記酵素の非蛋白質性基質である、請求項4記載の方法。前記第1の基質がポリペプチドの混合物である、請求項4記載の方法。ポリペプチドの前記混合物が未消化タンパク質の混合物である、請求項4から6のいずれか1項記載の方法。該未消化タンパクの前記混合物が、前記サンプル内の細胞を溶解して細胞溶解物を製造することによりサンプルから得られる、請求項7記載の方法。工程iを行う前に、低分子を前記細胞溶解物から除去する、請求項8記載の方法。サイズ排除ろ過で前記細胞溶解物から低分子を除去する、請求項9記載の方法。工程iを行う前に、前記細胞溶解物が脱リン酸化される、請求項8から10のいずれか1項記載の方法。工程iiの前に未消化タンパクの前記混合物から消化によりペプチド類の混合物を得る、請求項7から11のいずれか1項記載の方法。ポリペプチドの前記混合物が、蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物である、請求項4から6のいずれか1項記載の方法。消化が、プロテアーゼを使用することで行われる、請求項3,12または13記載の方法。プロテアーゼがトリプシン、キモトリプシン、ArgC、ペプシン、V8、Lys-C、Asp-C、およびAspNかから成る群から選択される、請求項14記載の方法。該ペプチドの長さが5から30アミノ酸である、請求項3、12から15のいずれか1項記載の方法。前記ポリペプチドが工程iiの前に精製される、請求項1から16のいずれか1項記載の方法。前記ポリペプチドが、クロマトグラフィーを使用することで精製される、請求項17記載の方法。クロマトグラフィーが固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、二酸化チタン粉末TiO2クロマトグラフィー、および酸化ジルコニウムZrO2クロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項18記載の方法。a前記二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼであり、前記非蛋白質性基質はATPであるか、またはb前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質アセチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質は、アセチル基を持っている化合物であるか、またはc二基質蛋白質修飾酵素が蛋白質グリコシルトランスフェラーゼであり、該非蛋白質性基質が活性化ヌクレオチド糖であるか、またはd前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質メチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質はメチル基を有する化合物であるであるか、またはe前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質は脂質パルミトイルを含む化合物である、請求項1から19のいずれか1項記載の方法。前記プロテインキナーゼが組換体プロテインキナーゼである、請求項20記載の方法。xが少なくとも3である、請求項1から21のいずれか1項記載の方法。xが5である、請求項22記載の方法。工程iiが、以下の工程を含む方法を使用して行われる、請求項1から23のいずれか1項記載の方法:aポリペプチド類に参照修飾ポリペプチドを追加し、ポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物を生成する工程;b前記ポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物について質量分析MSを行い、サンプル内のポリペプチド類に関するデータを得る工程;およびcサンプル内のポリペプチド類に関するデータと、修飾ポリペプチドに関するデータベース中のデータとを、コンピュータプログラムを使用して比較する工程;ここで、修飾ポリペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる;iサンプルからポリペプチド類を得ること;ii工程iで得られたポリペプチド類からの修飾ポリペプチドを富化すること;iii工程iiで得られた富化された修飾ポリペプチドについて、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析LC-MS/MSを行うこと;iv修飾ポリペプチドを同定するために、工程iiiで検出された修飾ポリペプチドを、公知のリファレンスデータベースと比較すること:およびv工程ivで同定された修飾ポリペプチドに関連するデータを、データベースにコンパイルすること。工程aがポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物から修飾ポリペプチドを富化し、富化された修飾ポリペプチドの混合物を製造することをさらに含み、工程bは、富化された修飾ポリペプチドの混合物に質量分析法MSを行い、サンプル中のポリペプチド類に関連したデータを得ることを含む、請求項24記載の方法。変性ポリペプチドを富化する工程が、クロマトグラフィーを使用することで行われる、請求項25記載の方法。クロマトグラフィーが固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、二酸化チタン粉末TiO2クロマトグラフィー、および酸化ジルコニウムZrO2クロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項26記載の方法。ホスホリル化ポリペプチドの富化工程が、抗体ベースの方法を使用することで行われる、請求項25記載の方法。サンプルのポリペプチドに関連するデータが、質量/電荷m/z比、電荷z、およびポリペプチドの相対保持時間を含む、請求項24から28のいずれか1項記載の方法。工程bにおける前記質量分析法MSは液体クロマトグラフィー-質量分析法LC-MSである、請求項24から29のいずれか1項記載の方法。工程iiが、多次元クロマトグラフィーを使用することで行われる、請求項24から30のいずれか1項記載の方法。多次元クロマトグラフィーが、固定された強いカチオン交換高速液加SCX-HPLC、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、および二酸化チタン粉末TiO2クロマトグラフィーを使用することで行われる、請求項31記載の方法。多次元クロマトグラフィーが陰イオン交換高性能液体クロマトグラフ法SAX-HPLC、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、および二酸化チタン粉末TiO2クロマトグラフィーである、請求項31記載の方法。工程iiが、抗体ベースの方法を使用することで行われる、請求項24から30のいずれか1項記載の方法。工程ivが、MASCOTサーチエンジンを使用することで行われる、請求項24から34のいずれか1項記載の方法。修飾ポリペプチドに関連するデータが、修飾ポリペプチドのアイデンティティ、質量/電荷m/z比、電荷z、およびポリペプチドの相対保持時間から成る群から選択される、請求項24から35のいずれか1項記載の方法。蛋白質リン酸化はキナーゼ活性の反映である。現在の質量分析法MSに基づいているホスホプロテオミック分析phosphoproteomicanalysisはただ一つのアッセイで、多発性シグナルリング系路の活性を評価する先例のない機会を提供する。しかしながら、そのような包括的アプローチはまだ可能でない。なぜなら多くの場合にはホスホプロテオミックのテクニックを使用して測定できる部位に作用するキナーゼの同一性を知らないからである。さらに、ヒトゲノムには500以上のキナーゼ遺伝子があり、激しい研究にもかかわらず、キナーゼ活性の全体的およびバイアスのない分析方法はまだ報告されていない。発明の要約本発明者は、全体的な方法で、調査中の細胞または組織で活性であるかもしれないとの酵素への先入観なしで、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素の活性を定量化するための方法について工夫した。従って、第1の態様では、本発明は以下の工程を含む、サンプル間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法を提供する:i第1のサンプルを、前記酵素の非蛋白質性基質のxの異なる濃度に暴露する工程、ここでxは2であるかまたは2より大きい;ii非蛋白質性基質のxの異なる濃度のそれぞれにおいて前記サンプル内のポリペプチドの修飾を定量化する工程;iii前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を決定する工程;iv2番目のまたは次のサンプルについて工程iから工程iiiを繰り返す工程;およびv前記サンプル間の前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を比較する工程;ここで、サンプル間の前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性における相違は、サンプル間の前記酵素の活性の差を示している。発明の詳細な説明本発明の第1の態様の方法は、サンプルの間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法である。本発明の方法は、二基質蛋白質修飾酵素の非蛋白質性基質の異なった濃度での第1のサンプルのポリペプチドの修飾を定量化することを含む。非蛋白質性基質の濃度を変えると、それぞれの修飾のための酵素の親和性の計算ができる。サンプルの間の親和性定数の差は、サンプルの間の酵素の活性、または活性化の差を示す。本発明の第1の態様の方法はinvitro法である。二基質蛋白質修飾酵素は2つの基質を有し、その1つが蛋白質である酵素をいう。本明細書においては他の基質を非蛋白質性基質と呼び、これは酵素によって触媒された反応で非蛋白質性基質から蛋白質性基質に転移される基を有する分子である。また、そのような酵素は蛋白質トランスフェラーゼproteintransferaseとも呼ばれる。トランスフェラーゼは、1つの分子しばしば供与体と呼ばれるから、他のものしばしば受容体と呼ばれるへの官能基の転移を触媒する酵素である。したがって、蛋白質トランスフェラーゼは、供与体から蛋白質である受容体への官能基の転移を触媒する酵素である。したがって、二基質蛋白質修飾酵素では、非蛋白質性基質が供与体であり、蛋白質または、ポリペプチドまたはペプチドなどの蛋白質の一部は受容体である。二基質蛋白質修飾酵素の例としてはプロテインキナーゼがあげられる。この非蛋白質性基質はATPであり、リン酸化として知られているプロセスによりタンパク性基質にATPからりん酸基を転移する。他の例としては蛋白質アセチルトランスフェラーゼがあげられる。この非蛋白質性基質はアセチル基を有する化合物、たとえばアセチルコエンザイムAアセチルCoAであり;蛋白質グリコシルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質は活性化ヌクレオチド糖グリコシル供与体としても知られるであり;蛋白質メチルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質はメチル基を有する化合物であり;および蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼ、この非蛋白質性基質はパルミトイルCoAのような脂質パルミトイルを含む化合物である。1つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。この実施態様では、本発明の第1の態様の方法は、以下の工程を含む、サンプルの間のプロテインキナーゼの活性の差を同定するための方法である:iATPのxの異なる濃度で第1のサンプルをインキュベートする工程、ここでxは2または2よりも大きい;iiATPのxの異なる濃度のそれぞれで、前記サンプル内のポリペプチドのリン酸化を定量化する工程;iiiATPについての前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程;iv第2または次のサンプルについて工程iからiiiを繰り返す工程;およびv前記サンプル間でATPについての前記プロテインキナーゼの親和性を比較する工程;ここで、サンプル間でATPについての前記プロテインキナーゼの親和性の相違がサンプルの間のプロテインキナーゼの活性の差を示している。本発明の第1の態様の方法の工程iは、第1のサンプルを前記酵素の非蛋白質性基質のxの異なる濃度に暴露することを含む、ここでxは2または2よりも大きい。この工程はそれに続いて2番目の、または引き続くサンプルについて繰り返される。本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプル第1、第2、および/または引き続くサンプルは、ペプチド類を含む任意のサンプルであることができる。サンプルは、典型的には生物学的サンプルであり、生物源から入手された任意のタイプのサンプルであることができ、例えば人間、動物、植物またはバクテリアから入手されたサンプルである。したがって、本発明は人間および非人間のソースから入手されたサンプルの使用を包含する。本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプルは、対象となるどんな種からも得ることができる。典型的に、サンプルは人間または動物から得られる。動物は、典型的には哺乳動物、例えば、マウス、ネズミまたはモルモットなどの齧歯動物、または牛、羊またはヤギなどの有てい類である。あるいはまた、動物は鳥、たとえば鶏であり、魚、たとえばゼブラフィッシュであり、ネマトーダ、たとえば虫線虫Caenorhabditiselegans、または昆虫、たとえばミバエキイロショウジョウバエDrosophilamelanogasterなどである。また、本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプルは、バクテリアや酵母などの他の生物形から得られる。本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプルは、典型的にはエシュリキア属大腸菌Escherichiacoli、サルモネラエンテリカSalmonellaenterica、肺炎球菌Streptococcuspneumoniaeまたは黄色ブドウ球菌Staphylococcusaureusなどのバクテリア、またはパン酵母サッカロマイシスセレビジエSaccharomycescerevisiae、または分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベSchizosaccharomycespombeなどの酵母の実験的に重要な種からのサンプルである。あるいはまた、本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプルは、植物、かび類またはウイルスから得られる。典型的に、生物試料は人間から得られ、例えば、尿、血液などの体液、または別の組織のサンプルであることができる。典型的には、生物試料は、細胞ラインまたは組織、典型的には第1次組織である。たとえば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物が、健康体であるか、または病体であることができる。別法として、サンプルは、健康であるか病気である人間または動物細胞から得られた細胞ラインであることができる。サンプルは典型的には本発明の第1の態様の方法の工程iの前に、サンプル中の細胞を溶解して細胞溶解物を製造することにより調製される。したがって、本発明の第1の態様の方法で使用されるサンプル第1、第2、および/または引き続くサンプルは、細胞溶解物であることができる。本明細書に使用される細胞を溶解するlysingcellsという用語は、当技術分野で普通の意味、すなわち、細胞を破砕するsplittingopencellsことをいう。細胞は、当技術分野で知られている任意の適当な手段、たとえば機械的な溶菌例えば、ワーリングブレンダを使用する方法、液体均質化、超音波処理または手動の溶菌例えば、乳棒と乳鉢を使用する方法などの物理的方法またはCHAPSまたはトリトン-Xなどの洗浄液ベースの方法を使用して溶解することができる。典型的には、細胞は、プロテアーゼインヒビタ、および/または、ホスファターゼ阻害剤が必要に応じて補われた、トリス-HCl、トリトン、およびEDTAの組み合わせを使用して溶解される。本発明の第1の態様の方法は典型的には細胞溶解物などのサンプル内に存在している二基質蛋白質修飾酵素、例えば、細胞溶解物中に存在している内因性プロテインキナーゼの活性の差を同定するために使用される。細胞溶解物などのサンプルが酵素の非蛋白質性基質に暴露された時に、内因性蛋白質基質を修飾するようにそのような二基質蛋白質修飾酵素は作用する。本発明の第1の態様の方法の工程iでは、第1のサンプルは前記酵素の非蛋白質性基質のxの異なる濃度に暴露される。この工程は2番目の、または、次のサンプルについて繰り返される。この工程は、細胞溶解物であることができるサンプルへ、特定の濃度の非蛋白質性基質と任意に適当なバッファーを加えることによって行われる。典型的には、第1、第2又は引き続くサンプルが、酵素が非蛋白質性基質に作用するに適当な条件下で、xの異なる非蛋白質性基質の濃度でインキュベートされる。第1、第2の、または引き続くサンプルは十分な時間と適温において、必要であれば撹拌しつつ、インキュベートされる。1つの具体的な実施態様では、サンプルは、5分間30°Cで撹はんしつつインキュベートされる。例えば、反応は尿素の添加により停止できる。本発明の第1の態様の方法の工程iでは、第1のサンプルは前記酵素の非蛋白質性基質のxの異なる濃度に暴露され、ここで、xは2またはそれ以上である。概して、xは少なくとも3、典型的には4、5、6、7、8、9または10である。しかしながら、xには制限はなく、非蛋白質性基質の濃度がグラフに記入でき、非蛋白質性基質についての酵素の親和性を計算するために使用される限り、非蛋白質性基質の異なった濃度の数を使用できる。非蛋白質性基質のすべての適当な濃度も、本発明の第1の態様の方法で使用できる。二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合、本発明の第1の態様の方法における使用のためのATPの濃度は典型的には0~500マイクロモルの範囲内であり、より典型的には0~100マイクロモルである。例えば、0、10、および100マイクロモル、0、100、200、300および500マイクロモル、または0、10、50、100および500マイクロモルのATPが使用できる。本発明の第1の態様の方法の工程iiは、非蛋白質性基質のxの異なる濃度での、サンプル内のポリペプチドの修飾を定量化することを含む。典型的に、サンプルは細胞溶解物である。1つの実施態様では、修飾はリン酸化である。他の実施態様では、修飾は、アセチル化、ニトロ化、グリコシル化、メチル化、および/または脂質化である。本発明の第1の態様の方法の工程iiを行う前に、典型的にはサンプルから消化によりペプチド類の混合物を得る。蛋白質から、より長い蛋白質をより短いペプチド類に分解することによって、ペプチド類を典型的に得る。タンパク分解は一般的に消化とも呼ばれる。したがって、1つの実施態様では、サンプル内の蛋白質類の消化により、サンプルからペプチド類を得る。蛋白質消化は、本発明では当技術分野で知られている任意の適当な薬剤を使用して行われる。蛋白質消化は、プロテアーゼを使用することで典型的に行われる。本発明では任意の適当なプロテアーゼが使用できる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Arg-C、ペプシン、V8、Lys-C、Asp-C、および/またはAspNである。あるいはまた、化学的に蛋白質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、BNPS-スカトール、2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸NTCBまたは他の適当な薬剤が使用できる。本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した蛋白質切断により典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約5から30のアミノ酸長さであり、例えば7から25のアミノ酸類、10から20のアミノ酸類、12から18のアミノ酸または14から16のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約2から約50、約3から約40、または約4から約45のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大300のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。1つの実施態様では、工程iiで定量化されるポリペプチドは、工程iiの前に精製される。精製は、本発明の第2の態様に関連して詳細に本明細書に記載された任意のテクニックを使用して行うことができる。そのようなテクニックは本発明の第1の態様に、その全体が適用可能である。リン酸化などの修飾の定量化は、任意の適切な方法を使用して行われることができる。典型的には、定量化は質量分析法MS、たとえば液体クロマトグラフィー-質量分析法LC-MSをはじめとする任意の方法により行うことができる。LC-MSまたはLC-MS/MSは典型的には無標識のMSである。本発明の第1の態様の方法では、リン酸化の定量化は、典型的にはWO2010/119261国際特許出願No.PCT/GB2010/000770に記載されているTIQUAS標的のシグナルリングの徹底的な定量化:targetedandindepthquantificationofsignallingのテクニックを使用することで行われる。この特許出願は本明細書に参考としてその全体が援用される。このテクニックは、シグナルリング系路活性signallingpathwayactivityの感受性の、迅速かつ包括的な定量化を許容する。この方法は、1つの分析で、同時に、蛋白質上の何千ものリン酸化部位の量を測定できる。WO2010/119261に示されるように、TIQUASのテクニックは、りん酸化ペプチド以外の修飾ペプチドを定量化するために使用できる。実際、TIQUASのテクニックは、質量分析法で検出されるすべての修飾を含むペプチド類を定量化するのに使用できる。本発明の第1の態様の方法では、工程iiが、以下の工程を含む方法を使用して行われる:a工程iで得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを追加し、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を生成する工程;b前記ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物について質量分析MSを行い、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る工程;およびcサンプル内のペプチド類に関するデータと、修飾ペプチドに関するデータベース中のデータとを、コンピュータプログラムを使用して比較する工程;ここで、修飾ペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる;iサンプルからペプチド類を得ること;ii工程iで得られたペプチド類からの修飾ペプチドを富化すること;iii工程iiで得られた富化された修飾ペプチドについて、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析LC-MS/MSを行うこと;iv修飾ペプチドを同定するために、工程iiiで検出された修飾ペプチドを、公知のリファレンスデータベースと比較すること:およびv工程ivで同定された修飾ペプチドに関連するデータを、データベースにコンパイルすること。TIQUASのテクニックは、本発明の第2の態様に関連して詳細に本明細書に記載され、本発明の第1の態様に全体として適用可能である。本発明の第1の態様の方法において、TIQUASのテクニックの代替手段として、リン酸化などの修飾の定量化を、定量化に代謝標識などの同位体標識を使用するMSのテクニックを使用して行うことができる。例えば、培地内の安定な同位体で標識されたアミノ酸、SILAC;OlsenJVetalCell127635648、および化学誘導体化、例えば、RossPLetalMolCellProteomics20043115469ICATTMT292131テクニックにより行うことができる。本発明の方法では、リン酸化などの修飾は非断片化しているイオン類の強度を測定するLC-MSのテクニック、またはフラグメントイオンの強度を測定するLC-MS/MSのテクニックたとえば、多重反応モニタリングMRMとも呼ばれる選択反応モニタリングSRMで定量化することができる。本発明の第1の態様の方法の工程iiiは、非蛋白質性基質に対する酵素プロテインキナーゼなどのの親和性を決定することを含む。非蛋白質性基質例えば、ATPに対する酵素例えば、プロテインキナーゼの親和性は、ミカエリス-メンテン速度論の原理を使用して決定することができる。例えば、親和性定数Ac,Kmに関連するは、図2Aに示されるように、それぞれのペプチドについて計算されることができる。図2Bは2つの代表的な反応を示している:aATPに対する高い親和性を有するプロテインキナーゼ活性低いAc、およびbATPに対する低い親和性を有するプロテインキナーゼ活性高いAc。1つの実施態様では、本発明の第1の態様の方法の工程iiiは以下を含む:a非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドの修飾が増加しているかどうか決定すること;および非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドの修飾が増加している場合には、b非蛋白質性基質に対する酵素の親和性定数Acを計算する。この実施態様では、酵素がプロテインキナーゼである場合には工程iiiは以下を含む:a非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドのリン酸化が増加しているかどうか決定すること;および非蛋白質性基質の濃度が増加されたとき、ペプチドのリン酸化が増加している場合には、b非蛋白質性基質に対する、プロテインキナーゼの親和性定数Acを計算する。本発明の第1の態様の方法の工程ivは、第2または引き続くサンプルについて工程iから工程iiiを繰り返すことを含む。そして、本発明の第1の態様の方法の工程vは、サンプルの間の非蛋白質性基質に対する酵素の親和性を比較することを含む。Acの測定は酵素プロテインキナーゼなどのの非蛋白質性基質との反応の親和性により、サンプルの間の非蛋白質性基質に対する酵素の親和性の比較を許容する。サンプルの間の親和性定数の相違は、サンプルの間での酵素の活性化または活性の差を示す。1つの実施態様では、本発明の第1の態様の方法は、サンプルの内因性蛋白質をリン酸化する際の内因のキナーゼ類の活性の定量化を行うことを含む。定量化は、本明細書に記載された方法の任意の方法を使用することで行われるが、本明細書に記載されたTIQUAS方法を使用することで典型的に行われる。ATPの濃度を変えると、それぞれのリン酸化のためのプロテインキナーゼの親和性の計算をすることができる。サンプルの間の親和性定数における相違は、サンプルの間の内因のキナーゼの活性化または活性の差を示す。この方法は、例えば、病的または通常の細胞または組織、または酵素阻害剤またはアクチベータなどの薬物類で処理されたサンプル中の内因のキナーゼの活性の相違を検出するために使用することができる。本発明者は、調査中の細胞または組織内で活性であるかもしれない酵素についての先入観無く、全体的な方法として、プロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の活性を定量化するためのテクニックについて工夫した。グローバルキナーゼアクティビティプロファイリングと名付けられたこのテクニックでは、定義された条件下で、細胞溶解物りん酸化内部基質に存在しているプロテインキナーゼは、溶解物の中にも存在している。次いで、反応生成物は、LC-MS/MSに基づく標準のホスホプロテオミクスのテクニックを使用することで定量化される。このアプローチで数100のキナーゼ反応を定量化できた。それの300より多くは生理的刺激EGFでの処理の関数として増加し、他のものはキナーゼ阻害剤LY292004またはU0126の処理で減少した。また、GKAPは、キナーゼ阻害剤での処理に対して異なった鋭敏度を示す白血病細胞系におけるキナーゼ活性のパターンが、著しく相違することを検出した。これらの結果は、GKAPは成長因子と薬理学的阻害剤によって調節されたキナーゼ活性を検出し、これらの活性が細胞表現型および薬物反応と互いに関連することを明らかにしている。その結果、本発明者は、初めて、キナーゼ活性の全体的およびバイアスのない分析のためのアプローチを示した。また、本発明者はプロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の基質を同定するための方法を開発した。この方法は、プロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するのに使用される。二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質は、生体内の基質であるそのような酵素の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド基質をいう。従って、第2の態様では、本発明は以下を含む、二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法を提供する:i第1の基質のxの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を露出する工程、ここでxは2または2以上であり、第2の基質の濃度を一定とし、第1および第2の基質の1つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方がポリペプチドの混合物である;ii前記第1の基質のxのそれぞれの濃度でポリペプチドの前記混合物中のポリペプチドの修飾を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程;ここで、前記第1の基質に対する前記酵素の高親和性が、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。本発明の第2の態様の方法は、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法である。したがって、本発明はまたプロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素のインビトロ基質が、生体内基質にも存在することの同定も許容する。本発明の第2の態様の方法はインビトロの方法である。1つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。この実施態様では、本発明の第2の態様の方法は、以下を含むプロテインキナーゼの生体内基質を同定するための方法である:i第1の基質のxの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでxは、2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とし、第1と第2の基質のひとつはATPであり、他方はポリペプチドの混合物である;ii前記第1の基質のxの異なる濃度のそれぞれにおいて、該ポリペプチドの混合物中のポリペプチドのリン酸化を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程;ここで、前記第1の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、前記ペプチドが前記プロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆する。本発明の第2の態様の方法の工程iは、第1の基質のxの異なる濃度へプロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素を暴露することを含む。ここでxは、2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とし、第1と第2の基質のひとつは該酵素の非蛋白質基質たとえばプロテインキナーゼに対してはATPであるであり、他方はポリペプチドの混合物である。二基質蛋白質修飾酵素は、2つの基質を有し、その1つが蛋白質であるものをいう。例えば、プロテインキナーゼは2つの基質を有し、ホスホリル化された蛋白質およびATPである。本発明の方法はプロテインキナーゼ類などの二基質蛋白質修飾酵素のこの特徴を利用する。本発明の第2の態様の方法の工程iは、第1の基質のxの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露することを含む。ここでxは、2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とされる。典型的には、第1の基質のxの異なる濃度で、二基質蛋白質修飾酵素は酵素が第1の基質に作用するに十分な時間、インキュベートされる。1つの実施態様では、第1の基質は酵素の非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物である。この実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、第1の基質はATPであり、第2の基質はポリペプチドの混合物である。別の実施態様では、第1の基質はポリペプチドの混合物であり、第2の基質は酵素の非蛋白質性基質である。この実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、第1の基質はポリペプチドの混合物であり、第2の基質はATPである。本発明の第2の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、未消化タンパクの混合物、または蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物のどちらかであることができる。本明細書において使用されるポリペプチドの用語は、文脈に応じて蛋白質とペプチドの両方を含むものとして使用される。本発明の第2の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、典型的にはサンプルから得る。本発明の第2の態様の方法で使用されるサンプルは、ペプチド類を含む任意のサンプルであることができる。サンプルは、典型的には生物学的サンプルであり、生物源から入手される任意のタイプのサンプルであることができ、例えば人間、動物、植物またはバクテリアから入手されたサンプルである。その結果、本発明は人間および非人間のソースから入手されたサンプルの使用を包含する。本発明の方法で使用されるサンプルは、本発明の第1の態様と関連して定義されるように、対象となるどんな種からも得ることができる。典型的に、生物試料は人間から得られ、例えば、尿、血液などの体液、または別の組織のサンプルであることができる。典型的に、生物試料は、細胞ラインまたは組織、典型的には1次組織である。例えば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物は、健康であるか、または病的であることができる。別法として、サンプルは、健康であるか病的な人間または動物細胞から得られた細胞ラインであることができる。本発明の第2の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物が未消化タンパクの混合物であるときに、未消化タンパクの混合物は典型的にはサンプル中の細胞を溶解し細胞溶解物を製造することにより得られる。本明細書に使用される場合、細胞を溶解するという用語は、当技術分野での普通の意味、すなわち、細胞を破砕することを意味する。細胞は、当技術分野で知られている任意の適当な手段を使用することで溶解されることができる。例えば機械的な溶菌例えば、ワーリングブレンダを使用する、液体均質化、超音波処理または手動の溶菌例えば、乳棒と乳鉢を使用するなどの物理的方法またはCHAPSまたはトリトンTriton-Xなどの洗浄薬ベースの方法を使用することができる。典型的に、細胞はトリス-HClTrisHCl、トリトンおよびEDTAの組み合わせを使用して溶解される。典型的には工程iを行う前に細胞溶解物から低分子物質を除去する。言い換えれば、蛋白質は溶解細胞の他の構成要素から分離される。任意の適当な手段、例えば、サイズ排除ろ過によりこれが達成される。1つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、工程iを行う前に、典型的には、蛋白質例えば、細胞溶解物の中の蛋白質は脱リン酸化される。これは細胞溶解物から低分子物質を除去するとともに、またはこれに代えて行われる。任意の適当な手段で脱リン酸化を行うことができる。1つの実施態様では、細胞溶解物からの蛋白質は、内因のホスファターゼが蛋白質に作用するのを許容するに適当な期間の間、細胞溶解物をインキュベートすることによって、脱リン酸化される。あるいはまた、外因のホスファターゼを脱リン酸化に作用するように蛋白質に加えることができる。この実施態様における使用に適したホスファターゼとしては、PTP1Bなどのチロシン特異性ホスファターゼ、PP2cPPP2CAなどのセリン/トレオニンの特異的ホスファターゼ、PHPなどのヒスチジンホスファターゼ、VHRおよびDUSP1ないしDUSP28などの二重特異性ホスファターゼ、およびアルカリホスファターゼなどがあげられる。典型的には、本発明の第2の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物が未消化タンパクの混合物であるときには、工程iiの前に未消化タンパクの前記混合物からペプチド類の混合物を得る。この実施態様では、本発明の第2の態様の方法は以下の工程を含む:i第1の基質のxの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露する工程、ここでxは2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とされる、第1および第2の基質の1つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物であり、該ポリペプチドの混合物は未消化タンパクの混合物である;前記未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る工程;ii前記第1の基質のxの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドの修飾を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程、ここで、前記第1の基質に対する前記酵素の高親和性は、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。この実施態様において、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合には、本発明の第2の態様の方法は以下の工程を含む:i第1の基質のxの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでxは2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とされる、第1および第2の基質の1つはATPであり、他方はポリペプチドの混合物であり、該ポリペプチドの混合物は未消化タンパクの混合物である;前記未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る工程;ii前記第1の基質のxの異なる濃度で、前記ペプチド類の混合物中のペプチドのリン酸化を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対するプロテインキナーゼの親和性を決定する工程;ここで、前記第1の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、該ペプチドが前記プロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆している。代替の実施態様では、本発明の第2の態様の方法で使用されるポリペプチドの混合物は、蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物である。この実施態様では、本発明の第2の態様の方法は以下の工程を含む:i蛋白質の消化でペプチド類の混合物を得る工程;第1の基質のxの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を暴露する工程、ここでxは2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とされる、第1および第2の基質の1つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方はペプチドの混合物である;ii前記第1の基質のxの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドの修飾を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程、ここで、前記第1の基質に対する前記酵素の高親和性は、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示唆する。1つの実施態様において、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼである場合には、本発明の第2の態様の方法は以下の工程を含む:i蛋白質の消化でペプチド類の混合物を得る工程;第1の基質のxの異なる濃度にプロテインキナーゼを暴露する工程、ここでxは2または2より大きく、第2の基質の濃度は一定とされる、第1および第2の基質の1つはATPであり、他方はペプチドの混合物である;ii前記第1の基質のxの異なる濃度のそれぞれで、前記ペプチド類の混合物中のペプチドのリン酸化を定量化する工程;およびiii前記第1の基質に対する前記プロテインキナーゼの親和性を決定する工程、ここで、前記第1の基質に対する前記プロテインキナーゼの高親和性は、前記ペプチドがプロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆する。したがって、これらの両方の実施態様では、本発明の第2の態様の方法の工程iは、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素に暴露されたペプチド類の混合物をもたらす。これらの両方の実施態様では、未消化タンパクの混合物からペプチド類の混合物を得る。典型的には、より長い蛋白質をより短いペプチド類に分解することによって、蛋白質からペプチド類を得る。また、タンパク分解は一般的に消化と呼ばれる。したがって、1つの実施態様では、サンプル内の蛋白質類の消化により、サンプルからペプチド類を得る。本発明において蛋白質の消化は、当技術分野で知られている任意の適当な薬剤を使用して行われることができる。蛋白質消化は、プロテアーゼを使用して典型的に行われる。任意の適当なプロテアーゼが本発明に使用されることができる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Arg-C、ペプシン、V8、Lys-C、Asp-C、および/または、AspNである。あるいはまた、化学的に蛋白質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、BNPS-スカトール、2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸NTCBまたは他の適当な薬剤が使用できる。本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した蛋白質切断で典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約5から30のアミノ酸長さであり、例えば7から25のアミノ酸類、10から20のアミノ酸類、12から18のアミノ酸または14から16のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約2から約50、約3から約40、または約4から約45のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大300のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。本明細書においてリン酸化蛋白質phosphoproteinという用語は、りん酸化された蛋白質について言及するために使用され、りん酸化ペプチドという用語は、りん酸化されたペプチドについて言及するために使用される。本明細書においてリン酸化部位という用語は、リン酸化の場所、たとえばりん酸化蛋白質またはペプチドのリン酸化部位を意味するために使用される。本明細書においてホスホプロテオミクスという用語は、りん酸化蛋白質の研究、特にはそのような蛋白質の同定、キャラクタリゼーションおよび識目録化cataloguingの研究を意味するために使用される。1つの実施態様では、工程iiで定量化されるペプチドまたはポリペプチドは、工程iiの前に精製される。ペプチドまたはポリペプチドは、典型的にはクロマトグラフィーを使用して精製される。典型的には、クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACであり、例えば、Alcolea、MP他、JProteomeRes8、3808で説明された、改変されたIMAC富化実験計画である。クロマトグラフィーの他のタイプも使用されることができ、たとえば二酸化チタン粉末TiO2クロマトグラフィー、および/または酸化ジルコニウムZrO2クロマトグラフィーが使用できる。別法として、ペプチドまたはポリペプチドは、抗体ベースの方法を使用して精製されることができる。本発明の1つの実施態様では、定量化されるペプチド類またはポリペプチド類がりん酸化ペプチドまたはポリペプチド類である場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される固定される。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低pH溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。本発明の第2の態様の方法の工程iは、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素をxが2またはそれ以上であるxの異なる濃度の第1の基質に暴露し、ここで第2の基質の濃度は一定とされ、第1および第2の基質の1つは前記酵素たとえばプロテインキナーゼについてはATPの非蛋白質性基質であり、他方はポリペプチドの混合物である。二基質蛋白質修飾酵素の例としては、プロテインキナーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はATPであり、リン酸化として知られているプロセスにより蛋白質基質にATPからりん酸基を転移する。他の例としては、蛋白質アセチルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はアセチル基を有する化合物であり、たとえばアセチルコエンチームAアセチルCoAであり、蛋白質グリコシルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質は活性化ヌクレオチド糖グリコシルドナーとしても知られているであり、蛋白質メチルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質はメチル基有する化合物であり、蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼがあげられ、その非蛋白質性基質は脂質パルミトイルを含む化合物、たとえばパルミトイルCoAである。1つの実施態様では、二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼである。プロテインキナーゼは典型的に組換体プロテインキナーゼである。本発明の第2の態様の方法は、任意のプロテインキナーゼについて生体内の基質を同定するのに使用することができる。本発明の第2の態様の方法は、したがって、任意の特定のプロテインキナーゼの使用には制限されず、任意のプロテインキナーゼ、たとえば細胞溶解物の中に存在しているすべてのプロテインキナーゼを使用して行うことができる。ヒトプロテインキナーゼは以下を含む多くのグループに分けることかできる:AGCキナーゼ、たとえばプロテインキナーゼAPKA、プロテインキナーゼBPKBAktとしても知られている、プロテインキナーゼCPKCおよびプロテインキナーゼGPKG;チロシンキナーゼ;チロシンキナーゼ様キナーゼ;カルシウム/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ;カゼインキナーゼ1グループ;CMGCグループ、たとえばCDK、MAPK、GSK3、およびCLKキナーゼ;STE、酵母Sterile7、Sterile11、およびSterile20キナーゼの相同体。例えば、本発明の方法で使用されるプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼBPKBとしても知られているAkt1であることができる。ATPの存在下でのプロテインキナーゼとのポリペプチドの混合物の反応は、例えば、尿素の添加で止めることができる。本発明の第2の態様の方法では、プロテインキナーゼなどの二基質蛋白質修飾酵素をxが2またはそれ以上であるxの異なる濃度の第1の基質に暴露し、ここで第2の基質の濃度は一定とされ、第1および第2の基質の1つは前記酵素の非蛋白質性基質たとえばプロテインキナーゼについてはATPであり、他方はポリペプチドの混合物である。したがって、酵素例えば、プロテインキナーゼは前記酵素の非蛋白質性基質たとえばプロテインキナーゼについてはATPまたはポリペプチドの混合物のxの異なる濃度に露出される、ここでxは2またはそれ以上である。一般的にはxは、少なくとも3、典型的には4または5、または6、7、8、9または10でさえある。しかしながら、xには限定はなく、第1の基質の濃度がグラフに記入できる限り、使用することのできる第1の基質の多くの異なる濃度に暴露することができ、第1の基質に対するプロテインキナーゼの親和性について計算するのに使用される。第1および第2の基質の任意の適当な濃度が、本発明の第2の態様の方法で使用されることができる。典型的には、二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであるときに、本発明における使用のためのATPの濃度は0~500マイクロモルまでの範囲内である。たとえば、0、10、50、100および500マイクロモルのATPの濃度が使用されることができる。本発明の第2の態様の方法の工程iiは、第1の基質の異なるxのそれぞれの濃度のときにペプチドまたはポリペプチドの修飾を定量化することを含む。1つの実施態様では、修飾はリン酸化である。他の実施態様では、修飾は、アセチル化、ニトロ化、グリコシル化、メチル化、および/または、脂質化である。リン酸化などの修飾の定量化は、任意の適切な方法を使用することで行われる。典型的に、定量化は、液体クロマトグラフィー-質量分析法LC-MSなどの質量分析法MSを始めとする任意の方法により行うことができる。LC-MSまたはLC-MS/MSは典型的には無標識のMSである。本発明の方法では、リン酸化の定量化は、典型的にはTIQUASシグナルリングのターゲット化された徹底的な定量化のテクニックを使用することで行われる。これはWO2010/119261国際特許出願No.PCT/GB2010/000770に記載されており、この出願は本明細書に参考として全体が援用される。このテクニックはシグナルリング系路活性に感受性の、急速で包括的な定量化を許容する。この方法は、1つの簡単な分析により、蛋白質上の何千ものリン酸化部位の量を同時に測定することができる。WO2010/119261に示されるように、TIQUASのテクニックは、りん酸化ペプチド以外の修飾ペプチドを定量化するためにも使用できる。実際に、TIQUASのテクニックは、質量分析法で検出されるすべての修飾を含むペプチド類を定量化するために使用される。本発明の第2の態様の方法の実施態様では、工程iiは以下の工程を含む方法を使用して行われる:a工程iで得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを加え、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を製造する工程;b前記のペプチドと参照修飾ペプチドの混合物について質量分析MSを行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る工程;およびcコンピュータプログラムを使用して、修飾ペプチドに関するデータベース中のデータとサンプル中のペプチド類に関するデータを比較する工程;ここで、修飾ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる;iサンプルからペプチド類を得る工程;ii工程iで得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する工程;iii工程iiで得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法LC-MS/MSを行う工程;iv工程iiiで検出された修飾ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較し、修飾ペプチドを同定する工程;およびv工程ivで同定された同定された修飾ペプチドに関するデータをデータベースにコンパイルする工程。二基質蛋白質修飾酵素がプロテインキナーゼであり、修飾がリン酸化である本発明の方法の1つの実施態様では、工程iiは以下の工程を含む方法を使用して行われる:a工程iで得られたペプチド類に参照りん酸化ペプチドを加え、ペプチド類と参照りん酸化ペプチドの混合物を製造する工程;b前記ペプチド類と参照りん酸化ペプチドの混合物について質量分析MSを行い、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る工程;およびcコンピュータプログラムを使用して、リン酸化ペプチドに関するデータベース中のデータとサンプル中のペプチド類に関するデータを比較する工程;ここで、リン酸化ペプチドのデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる;iサンプルからペプチド類を得る工程;ii工程iで得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する工程;iii工程iiで得られた富化されたりん酸化ペプチドについて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法LC-MS/MSを行う工程;ivりん酸化ペプチドを同定するために、工程iiiで検出されたりん酸化ペプチドを、既知のファレンスデータベースと比較する工程;およびv工程ivで同定されたりん酸化ペプチドに関するデータをデータベースにコンパイルする工程。本発明のこの実施態様に関して、用語ペプチドは用語ポリペプチドと互換性を持って使用される。この実施態様の工程aでは、参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドは工程iで得られたペプチド類に追加され、ペプチド類と参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドの混合物を製造する。その結果、工程aは1サンプルあたり1つのペプチド類変性されたもの、典型的にはリン酸化されたものを含んでいるの混合物をもたらす。また、参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドは本明細書においては内部標準ISsとも呼ばれる。典型的には、5から10、例えば、6から9,または7から8の参照修飾ペプチド典型的に参照りん酸化ペプチドが加えられる。本発明では、参照修飾ペプチドは典型的には、参照りん酸化ペプチドである。そのような参照りん酸化ペプチドは、しばしば内部標準IS蛋白質と呼ばれる、定義された特性と濃度の参照蛋白質から典型的に得る。ISsは市販の蛋白質、例えば、カゼインである場合がある。あるいはまた、ISsは特に本発明における使用のために合成される。本発明のこの実施態様では、参照りん酸化ペプチドはそれが定量化するのが望ましいりん酸化ペプチドのいくつかと同じ配列で典型的に合成されるが、炭素と窒素の安定した重同位元素が富化される。ペプチド類は、1回に1つのアミノ酸が加えられ、アミノ酸鎖またはポリペプチドを形成する固相化学を使用することで典型的に合成される。典型的には、そのようなペプチド類は一般的な12Cと14Nを置換する、13Cと15Nで富化される。この富化作用は、同じ配列を有する内因のりん酸化ペプチドより約6から10ダルトン重い参照りん酸化ペプチドをもたらし、質量分析計を使用することでそれらを区別できるようにする。本発明の別の実施態様では、本発明方法がアセチル化ペプチドを定量化するのに使用されるとき、参照修飾ペプチドは、参照アセチル化ペプチド類である。そのような参照アセチル化ペプチドは、典型的にはアセチル化アミノ酸類を含む合成ペプチドである。参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドは、比較されるサンプルのそれぞれに既知量で追加される。内因の修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの信号は、川下の分析で参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドに関する信号に対して規格化される。1つの実施態様では、この実施態様の工程aは、工程aで得たペプチド類と参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドの混合物から修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物を製造する。その結果、この付加段階は1サンプルあたり1つの富化された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物をもたらす。本発明のこの実施態様では、工程bは、富化された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物に質量分析法MSを行い、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得ることを含む。本発明のこの実施態様では、工程aは典型的には富化されたりん酸化ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物をもたらす。修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの富化工程は、クロマトグラフィーを使用することで典型的に行われる。1つの実施態様では、クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、二酸化チタンTiO2クロマトグラフィー、および/または二酸化ジルコニウムZrO2クロマトグラフィーである。典型的には、クロマトグラフィーは、IMACおよびTiO2クロマトグラフィーである。あるいはまた、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドを富化する工程は、抗体に基づく方法を使用することで行われる。本発明の1つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される固定される。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低pH溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。本発明の方法の工程bでは、質量分析法MSが工程aで得たペプチド類と参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドの混合物について行われ、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る。典型的に、このデータはサンプルのためのMSデータファイルの形である。本発明のひとつの実施態様では、本発明方法の工程aが、工程aで得たペプチド類と参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドの混合物から修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物を精製することをさらに含む場合に、工程bは富化された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの混合物に質量分析法MSを行い、典型的にはサンプルのMSデータファイルである、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る。典型的に、質量分析法は液体クロマトグラフィー-質量分析法LC-MSである。その結果、工程bは典型的に、LC-MSデータファイルそれぞれのサンプルから1つをもたらす。典型的には、サンプル内のペプチド類に関するデータは、ペプチド類の質量/電荷m/z比、電荷z、および/または相対保持時間を含む。本発明方法の工程cでは、サンプル中のペプチド類に関連するデータ典型的にはMSデータファイル形式であり、より典型的にはLC-MSデータファイルの形式であるは、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドに関するデータベースのデータと、コンピュータプログラムを使用して比較される。たとえば、サンプル中のペプチド類の質量/電荷:m/z比、電荷z、および相対保持時間が、データベースの修飾ペプチドの質量/電荷:m/z比、電荷z、および相対保持時間と比較される。これは、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドに関するデータベースを使用することで、サンプルのそれぞれの修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの同定と定量化を可能にする。典型的には、コンピュータプログラムは、PESCAL、156073、Cutillas、PR2007と呼ばれるプログラムである。PESCALは、比較されるべきすべてのサンプルから、データベースに存在するそれぞれの修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドのために抽出されたイオンクロマトグラムXIC、すなわち溶出プロファイルを構成する。修飾典型的にはりん酸化されるべき、先に同定されたペプチドの質量/電荷と保持時間すなわち、手順の第1で構成されたデータベース中に存在するものにXICをセンタリングすることによって行われる。また、PESCALは、ペプチドの電荷が同一性の正しい指摘の助けになると考えている。また、プログラムはそれぞれのXICのピーク高さとカーブの下の面積について計算する。データは、分析されたそれぞれの修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの強度読みピーク面積または高さを、参照修飾ペプチド典型的には参照りん酸化ペプチドの強度読みで割ることによって規格化される。この実施態様では、修飾ペプチドに関するデータベースは、以下の工程を含む方法によってコンパイルされる:iサンプルからペプチド類を得る;ii工程iで得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する;iii工程iiで得られた富化された修飾ペプチドに液体クロマトグラフィータンデム質量分析法LC-MS/MSを行う;iv修飾ペプチドを同定するために、工程iiiで得られた修飾ペプチドと既知のリファレンスデータベースを比較する;およびv工程ivで同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。データベースがりん酸化ペプチドに関するデータベースであれば、それは、以下の工程を含む方法によってコンパイルされる:iサンプルからペプチド類を得る;ii工程iで得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する;iii工程iiで得られた富化されたりん酸化ペプチドに液体クロマトグラフィータンデム質量分析法LC-MS/MSを行う;ivりん酸化ペプチドを同定するために、工程iiiで得られたりん酸化ペプチドと既知のリファレンスデータベースを比較する;およびv工程ivで同定されたりん酸化ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。この実施態様の工程iは、サンプルからペプチド類を得ることを含む。当技術分野で知られている任意の適切な方法および本明細書に記載される方法を使用して、サンプルからペプチド類を得ることができる。サンプルは典型的に生物試料であり、上記のように生物源から入手されたすべてのタイプのサンプルであることができる。典型的に、サンプルは、細胞ラインまたは組織である。本発明のいくつかの実施態様では、工程iに使用されるサンプルは細胞ラインであり、サンプルは工程iを行う前に阻害剤で処理される。阻害剤は任意の適当なタイプの阻害剤であることができる。典型的には、本発明の方法がりん酸化ペプチドを定量化するのに使用されるときには、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。ホスファターゼ阻害剤による処理はリン酸化の化学量論量を増加させ、データベースに含むことができるより大きい数のりん酸化ペプチドに帰結する。さらに、目的がアセチル化されたペプチド類およびメチル化されたペプチド類である場合には、それぞれメチル基転移酵素またはアセチル加水分解酵素の阻害剤を使用できる。1つの実施態様では、本発明の方法のこの実施態様の工程iは以下を含む:1サンプルの細胞を溶解する;2工程1で得られた溶解細胞から蛋白質を抽出する;および3前記蛋白質をペプチド類まで切断する。本発明のこれらの態様は上で説明したとおりのものである。しかしながら、工程3が、ペプチド類の混合物が蛋白質の混合物から消化で得られる上で説明した発明の第2の態様の実施態様と同じ方法を使用することで典型的に行われる。この実施態様の工程iiでは、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドは工程iで得られたペプチド類から富化される。その結果、工程iiは修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの中で富化されたいくつかの画分をもたらす。工程iiにおける、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの富化は、多次元クロマトグラフィーを使用することで典型的に行われる。1つの実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、強カチオン交換高速液クロマトグラフSCX-HPLC、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMAC、および二酸化チタンTiO2クロマトグラフィーで行われる。他の実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液クロマトグラフSAX-HPLC、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACおよび二酸化チタンTiO2クロマトグラフィーを使用して行われる。本発明のこれらの実施態様では、クロマトグラフィー技術は逐次的に行われる。別法として、工程iiの修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドの富化工程は、抗体に基づく方法で行われる。本発明の1つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低pH溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが抗体被覆基質の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。この実施態様の工程iiiでは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法LC-MS/MSが工程iiで得られた富化された修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドについて行われる。本発明の工程ivでは、修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドを同定するために、工程iiiで検出された修飾ペプチド典型的にはりん酸化ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較する。この工程は、典型的には市販のサーチエンジン、たとえばMASCOT、ProteinProspectorPhenyx、またはSequestサーチエンジンただしこれらに限定されるものではないを使用することで行われる。この実施態様の工程vでは、工程ivで同定された修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドに関連するデータが、データベースにコンパイルされる。このデータベースは次の生物学的実験における、りん酸化ペプチドの定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載する。典型的に、修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドに関連するデータは、修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドのアイデンティティ、質量/電荷m/z比、電荷zおよび/または相対保持時間を含む。これは、サンプル中のペプチドに関連するデータ、典型的にはサンプル中のペプチド類典型的にりん酸化ペプチドの質量/電荷数比、電荷z、および相対保持時間がデータベース内の修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの値と比較されることを許容して、その結果、サンプルの修飾ペプチドの識別と定量化を許す。この実施態様では、データベースのコンパイルは本発明の第1および第2の態様の方法と当時に行われる必要はない。データベースのコンパイルは、非蛋白質性基質本発明の第1の態様または第1の基質本発明の第2の態様の異なる濃度のそれぞれにおいて、ペプチドの修飾典型的にリン酸化を定量化するために、本発明の方法で使用されるTIQUASテクニックの前に別途行うことができる。TIQUAS技術の基礎はLC-MSで検出して定量化できる、修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドに関するデータベースの構築である。このデータベースは、次の生物学的実験における修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載し、これは修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドのアイデンティティ、質量/電荷比m/z、電荷および相対保持時間を含む。データベースは、多次元クロマトグラフィーたとえば強カチオン交換、IMACまたはTiO2を使用して修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドを富化することによって、構成される。そして、富化された修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの断片は修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの同定のためにLC-MS/MSによって分析される。生物学的実験から取られた修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドについてのLC-MSにおいて、データベースに記載されたそれぞれの修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドの定量化を自動化するPESCALというコンピュータプログラムを作成した。これらの生物学的実験において、細胞溶解物の蛋白質は、トリプシンまたは他の適当なプロテアーゼを使用することで消化される。参照修飾ペプチド典型的に参照りん酸化ペプチドであるペプチドたとえばりん酸化ペプチド内部標準は、比較されるすべてのサンプルに既知量でスパイクされる。得られたペプチド混合物の中の修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドは、実行が簡単なsimpletoperformIMACまたはTiO2抽出段階を使用して富化される。富化された修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドは約120分総サイクルの1回のLC-MS測定典型的にはそうであるが限定はされないで分析される。PESCALは次いで、比較されるすべてのサンプルにわたり、データベースに存在するそれぞれの修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチドのために、抽出されたイオンクロマトグラムXIC、溶出プロファイルを作成する。プログラムはそれぞれのXICのピーク高さと曲線下の面積を計算する。データは、それぞれの修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチド分析物質の強度読み値ピーク面積または高さを、修飾ペプチド典型的にりん酸化ペプチド内部標準のもので割ることによって、規格化される。本発明の第2の態様での方法でTIQUASのテクニックを使用することに代わる手段は、リン酸化などの修飾の定量化が、代謝標識などのように、定量化に同位体標識を使用するMSのテクニックを使用することで行われる例えば、stableisotopelabeledaminoacidsincultureOlsenJVetalCell127635648。また化学誘導体化テクニックたとえばiTRAQ115469ICATTMT292131も使用できる。本発明の方法では、非断片化しているイオン類の強度を測定するLC-MSのテクニックまたはフラグメントイオンの強度を測定するLC-MS/MSのテクニックたとえばセレクティド反応モニタリングSRM、マルチプル反応モニタリングMRMとも呼ばれるでリン酸化などの修飾が定量化できる。本発明の第2の態様の方法の工程iiiは、第1の基質に対する酵素たとえばプロテインキナーゼの親和性を決定することを含む。第1の基質に対する酵素たとえばプロテインキナーゼの高親和性はポリペプチドが酵素たとえばプロテインキナーゼの生体内の基質であることを示唆している。本発明の第2の態様の方法は、同時に第1の基質、すなわち酵素またはポリペプチドの混合物の非蛋白質性基質に対する、多数のペプチド類と関連した酵素の親和性を決定するのに使用される。それぞれのペプチド類についての第1の基質に対する酵素の親和性は格付けされ、そして、酵素の生体内の基質がペプチド類のどれであるかを決定する。第1の基質のために高親和性を示す修飾事象は、生体内でより起こりそうであって、真実の生理的基質である修飾部位の同定を許容する。したがって、本発明の第2の態様の方法は、同時に第1の基質、すなわちATPまたはポリペプチドの混合物に対するプロテインキナーゼの親和性を、多数のペプチド類に関して、言い換えれば、多数のホスホサイトに関して決定するのに使用される。次に、それぞれのペプチド類ホスホサイトについての第1の基質に対するプロテインキナーゼの親和性は格付けされ、プロテインキナーゼの生体内の基質がペプチド類のどれであるかを決定する。第1の基質に対する高親和性を示すりん酸化事象は、生体内でより起こりそうであって、真実の生理的基質であるリン酸化部位の識別を許容する。第1の基質例えば、ATPのための酵素例えば、プロテインキナーゼの親和性は、ミカエリス-メンテン速度論の原理を使用することで決定することができる。例えば、親和性定数Kmに関連する、Acは図2に示されているように、それぞれのペプチドについて計算される。図2Bは2つの代表的な反応を示している;aATPに対して高親和性を有するプロテインキナーゼ活性低いAc、およびbATPに対して低い親和性を有するプロテインキナーゼ活性高いAc1つの実施態様では、本発明の第2の態様の方法の工程iiiは以下を含む:a第1の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドの修飾が増加されているかどうか決定する;および第1の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドの修飾が増加されている場合には;b第1の基質について、酵素の親和性定数Acを計算する。この実施態様では、酵素がプロテインキナーゼである時、工程iiiは以下を含む:a第1の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドのリン酸化が増加されているかどうか決定する;および第1の基質の濃度が増加されているとき、ペプチドのリン酸化が増加されている場合には;b第1の基質について、プロテインキナーゼの親和性定数Acを計算する。Acの測定は酵素プロテインキナーゼなどの反応の基質との反応について、親和性により同定された基質のランキング付けを許容する。低いAcの基質は調査中の酵素たとえばプロテインキナーゼの生体内の基質であるより強い傾向がある。上記のMSベースのホスホプロテオミック分析には、シグナルリング系路活性の迅速で正確な定量化を許容する方法として素晴らしい潜在能力がある。シグナルリング系路の破壊から生じるさまざまな疾病に関する治療の調査と発達に、そのようなデータは非常に貴重であるだろう。しかしながら、通常、調査されたりん酸化事象の原因となるキナーゼが通常知られていないので、MSベースのホスホプロテオミクスは現在、制限される。最大限の潜在力をこの分野で発揮するために、それぞれのりん酸化事象を制御するキナーゼのアイデンイティティで正確にホスホプロテオームphosphoproteomeを注釈することが必要である。本発明者は、試験管内のキナーゼ分析と、プロテインキナーゼのりん酸化事象ダウンストリームのショットガン同定shotgunidentificationを可能にする定量的なホスホプロテオミクスを結合する戦略を開発した。パラダイムとしてAkt1を用い、このアプローチは以前に、それらの多くについて説明されていなかったこのキナーゼの、100以上の潜在的基質ダウンストリームpotentialsubstratesdownstreamの同定を可能にした。この戦略の精度を改良するために、発明者はそれぞれのリン酸化部位についてATPに対するAkt1の親和性の尺度を定義した。Acと呼ばれるこの定数は、ミカエリス-メンテン酵素反応速度論に基づいている。Acは、りんペプチドをATPに対して高親和性を有するもの低いAcと、ATPに対して低親和性を有する高いAcものに分類するのに使用された。低いAcを有するホスホサイトがたぶんAkt1の本当の生体内の基質であると提案された。これらの2つのグループのモチーフ分析motifanalysisが、低いAcを有するりんペプチドはモチーフのために富化され、これはAkt1のコンセンサスなリン酸化モチーフに対応し、その結果、おそらく真正な基質であった。この戦略は、すべてのキナーゼについて基質を同定するために適用されることができ、その結果、シグナルリング系路活性への調査の分野に大きな進歩を提供する。本発明の方法は当技術分野で知られている方法に比較して利益を有する。なぜなら、キナーゼ活性の調査のための伝統的方法は、しばしば放射能で標識されたATPの使用を必要として、その結果、彼らの使用が実用的な問題によって制限されるからである。さらに、これらの方法の多くが、基質識別を可能にするために長い精製工程を必要として、そのため非常に高価であって、手間がかかる。本発明の第2の態様の方法はそのような制限を克服する。追加的要因は通常、他のテクニックが1または2,3のキナーゼ基質の識別をもたらすのに対し、発明者の方法は、一度に100以上の基質を同定する潜在性を有する。既存のテクニックに対する本発明の方法の更なる利点は、キナーゼ基質反応の親和性を測定することによって基質の識別に一定レベルの信頼性を提供できるということである。本発明の第2の態様の方法には、多くの用途がある。ホスホプロトテオムの注釈に加えて、本発明の方法は、特異的キナーゼのダウンストリーム標的downstreamtargetを同定するのに使用される。これらの読み取りは、キナーゼのキナーゼ活性のバイオマーカーとして有用であり、また薬物動態学マーカー、および疾病および予後のマーカーとしても用途がある。さらに、同定された新規な基質は、特異疾患についての潜在的な新規な薬物標的を明らかにすることができる。本発明の第1の態様のための好ましい特徴は第2の態様に準用される。本発明の第2の態様のための好ましい特徴は第1の態様に準用される。以下の実施例を参照しつつ本発明を詳細に説明する。実施例は例示の目的のためにのみ示される。実施例では、以下の多くの図を参照する:"