"明細書に記載の発明。発明の要旨本発明は、哺乳動物における免疫応答を増強する方法を提供する。この方法は、免疫原と植物レクチンとを含む混合物を哺乳動物に投与することによる。それにより、哺乳動物は、植物レクチンの非存在下で生じる免疫応答に比較して増加した免疫応答を生じる。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1哺乳動物において免疫原に対する免疫応答を産生するための医薬の製造における、該免疫原および植物レクチンを含む混合物の使用であって、該免疫応答は、該植物レクチンの存在しない場合に該免疫原に対して惹起される免疫応答よりも大きい、使用。項目2前記混合物が粘膜に投与される、項目1に記載の使用。項目3前記混合物が鼻腔内投与される、項目2に記載の使用。項目4前記植物レクチンが、ML-1、ML-II、ML-III、WGA、およびUEA-1からなる群より選択される、項目1に記載の使用。項目5前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトからなる群より選択される、項目1に記載の使用。項目6前記免疫応答がT細胞応答である、項目1に記載の使用。項目7前記T細胞応答がTh2応答である、項目6に記載の使用。項目8前記T細胞応答がT細胞の増殖である、項目6に記載の使用。項目9前記免疫応答が抗体応答である、項目1に記載の使用。項目10前記哺乳動物が、IgG抗体およびIgA抗体からなる群より選択される抗体を産生する、項目9に記載の使用。項目11前記IgG抗体が、IgG1、IgG2a、およびIgG2bからなる群より選択される、項目10に記載の使用。項目12前記抗体が血清中に検出可能である、項目10に記載の使用。項目13前記抗体が粘膜分泌物中に検出可能である、項目10に記載の使用。項目14前記粘膜分泌物が、腸粘膜、膣粘膜、口腔粘膜、および鼻粘膜からなる群より選択される粘膜より得られる、項目13に記載の使用。項目15前記混合物が2以上のレクチンを含む、項目1に記載の使用。項目16前記混合物が2以上の免疫原を含む、項目1に記載の使用。項目17前記免疫原がタンパク質の感染因子である、項目1に記載の使用。項目18前記感染因子がウイルスである、項目20に記載の使用。項目19前記免疫原が、2型単純ヘルペスウイルス由来の糖タンパク質D2タンパク質である、項目21に記載の使用。項目20前記混合物が粘膜スプレーを使用して投与される、項目3に記載の使用。項目21前記混合物を含む液体が数滴投与される、項目3に記載の使用。項目22少なくとも2用量の前記混合物が投与される、項目1に記載の使用。項目23前記混合物が、免疫原および植物レクチンを少なくとも約1:1の比で含む、項目1に記載の使用。項目24前記比が少なくとも約10:1である、項目26に記載の使用。項目25抗体力価がELISAを使用して測定される、項目9に記載の使用。項目26項目1に記載の使用であって、ここで、前記混合物は、経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、膣内投与、皮下注射、筋肉内注射、経皮注射transdermal、および経皮注射transcutaneousからなる群より選択される方法によって投与される、使用。項目27前記植物レクチンが、2型リボソーム不活性化タンパク質である、項目1に記載の使用。項目28項目30に記載の使用であって、ここで、前記2型リボソーム不活性化タンパク質が、ニグリンb、塩基性ニグリンb、エブリン1、エブリンr1、エブリンr、エブリンf、ニグリンf、SNA1、SNA1、SNAV、SNAVI、SambucusnigraSNLRP1、SambucusnigraSNLRP2、リシン、トウゴマ属レクチン、PolygonatumRIP、Sieboldin-6、アブリン、アブリン11、モデシン、ボルケンシン、SSA、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Evanthishyemalis、RIP、虹彩アグルチニン、ML-I、ML-II、およびML-IIIからなる群より選択される、使用。項目29前記混合物が微粒子キャリアを使用して投与される、請求項1に記載の使用。項目30前記混合物が生物接着性ポリマーと組合わせて投与される、項目1に記載の使用。項目31前記混合物が腸処方物にある、項目1に記載の使用。従って、本発明は、哺乳動物における免疫応答を、単純かつ有効に増強する方法を提供する。詳細な説明本発明の一つの局面は、特定の植物レクチンが、粘膜アジュバントとして働いて、種々の免疫原に対する免疫応答を増強すること増加された抗体力価ヲ含むにより、単純で、非毒性で、かつ安価なワクチンまたは免疫原性組成物が調製されることを可能にすることである。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、植物レクチンおよび免疫源を含む混合物である。そのような混合物は、哺乳動物ヒトを含むに対する粘膜送達に特に適切であり、そして従って獣医学およびヒトの医学目的のために有用である。本発明の混合物は、植物レクチンおよび免疫原を含む。免疫原およびレクチンは、化学的に結合していなしが、適切な液体媒体例えば、リン酸緩衝化生理食塩水または他の等張性生理食塩水溶液中で単に一緒に混合されているだけである。必要に応じて、混合物は、安定化剤抗微生物剤、保存剤などを含むを含み得る。この混合物における免疫原およびレクチンの比率は変動し得、例えば、少なくとも約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、または10:1であり、これは、選択した免疫原とレクチンの特定の組合せに依存する。所望の場合、少なくとも2、3、4またはそれを越える異なる免疫原および/またはレクチンが、種々の比率で混合物中に含有され得る。本発明において有用なレクチンとしては、植物レクチン例えば、ヤドリギレクチンIML-1、ヤドリギレクチンIIML-II、ヤドリギレクチンIIIML-III、コムギ胚芽凝集素WGA、およびUlexeuropaeusUEA-1が挙げられる。有用であり得る他のレクチンとしては、レンズマメレクチン、ナタマメレクチンコンカナバリンA、およびアスパラガスマメ、ソラマメ、キャメルズフットトリーcamel’sfoottree、トウゴマ、ソラマメfavabean、ヘアリーベッチ、ホースグラム、フジ、トウアズキJequirity、スコッチラバナムScotchlaburnum、リママメlimabeam、月桂樹、リョクトウmungbean、オセージオレンジ、パゴダ状樹木Pagodatree、エンドウマメ、ポテト、アカイインゲンマメredkidneybean、シベリアマメの木Siberianpeatree、ニシキギ、スイトピー、トマト、およびウイングドピーwingedpeaのレクチンが挙げられる。2型のリボソーム不活化タンパク質RIP例えば、ニグリンb、塩基性ニグリンb、エブリン1,エブリンr、エブリンf、ニグリンf、SNA1、SNAI、SNAV、SNAVI、Sambucusnigra、SNLRP1、SNLRP2、リチン、Ricinuslectin,、PolygonatumRIP、シエボルディン-6、アブリン、アブリンII、モデシン、ボルケンシン、SSA、シナモニン、ポレクチン、ゲロリン、Evanthishyemalis、RIP、アヤメ凝集素、ML-I、ML-11、およびML-IIIがアジュバントとして特に有用である。そのようなレクチンとしては、リボソーム不活化活性を担うN-グリコシダーゼAサブユニット、およびガラクトース特異的糖結合Bサブユニットが含まれる29。ML-I、ML-II、およびML-IIIは、強力な粘膜アジュバントであり、これは、血清および粘膜分泌物において高い抗体力価を刺激し得る。2型RIPであって、インビボ毒性を示さないもの例えば、エブリン-132、ニグリンb33および塩基性ニグリンb34が特に好ましい。あるいは、レクチンは、部位特異的変異誘発による1つ以上のアミノ酸の改変を行ってレクチンがそのアジュバント特性を保持するが、哺乳動物レシピエントに非毒性になるようにすることによって遺伝子的に非毒性化され得る以下を参照のこと:35-39;EP0880361;EP620850;EP95/903889.4。レクチンは、好ましくは非結合の水溶性形態で存在する。本発明の混合物中において使用するための適切なレクチンは、商用供給源例えば、Sigmaから購入され得る。あるいは、レクチンは、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化、エレクトロフォーカシング、および調製ゲル電気泳動を含む、当該分野において周知のタンパク質精製プロトコルを用いて精製され得る。細胞性および/または体液性の応答が植物レクチンアジュバントを用いて増強され得る免疫原としては、感染性因子のタンパク質例えば、ウイルス、細菌、マイコプラズマ、プリオンおよび酵母ならびにホルモン、アレルゲン例えば、草、雑草、樹木および植物の花粉、動物例えば、ネコ、イヌ、ラットおよびブタの上皮、ハウスダストおよびコムギの籾殻が挙げられる。そのような免疫原ヲ取得する手段は、当該分野において周知である。免疫源は、植物レクチンの非存在下で細胞性および/または体液性の応答を惹起し得る必要はない。本発明の混合物は、レシピエント哺乳動物に種々の処方物として投与され得る。例えば、混合物はポリラクチド-コ-グリコリドPLGのような微粒子中に捕捉され得るかまたはその表面に吸着され得る35,米国特許第5,804,212号、同第6,876,761号および同第5,603,960号;PCT/US99/17308。混合物はまた、生体接着性ポリマー例えば、PCT/US99/12105,PCT/US99/11906,ならびに米国特許第5,955,097号、同第5,800,832号、同第5,744,155号、および同第5,814,329号に記載されるポリマーとともに投与され得る。あるいは、混合物の腸処方物は、経口投与の使用され得る米国特許第5,968,554ヲ参照のこと。本発明の混合物は、注射すなわち、皮下、筋肉内または他の非経口の注射例えば、経皮transdermalもしくは経皮transcutaneousの注射、経口または経鼻によって哺乳動物に投与され得る。混合物は、免疫応答を増強することが所望される任意の哺乳動物に投与され得る。そのような動物としては以下が挙げられるがそれらに限定されない:ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ウシ、マウス、モルモット、チンパンジー、ヒヒ、およびヒト。粘膜投与特に、一方または両方のいずれかの鼻孔への鼻内投与が好ましい。用量は、1以上の小滴またはスプレー例えば、エアゾールもしくは非エアゾールスプレーを用いて送達され得る。所望の場合、混合物の複数回の投与を用いて特定の免疫原に対する抗体力価を上昇させ得る。複数回投与の間の間隔は、混合物中の特定の免疫原および/またはレクチンに依存して、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日もしくは7日、またはそれを超える日数か、あるいは少なくとも2週間、3週間もしくは4週間またはそれを超える週数であり得る。投与されるべき混合物の容量は、投与形態および哺乳動物の大きさに従って変動する。鼻内投与のための代表的な容量は、1鼻内用量あたり、少なくとも5、10、15、25、50、75、100、200または250μlから、少なくとも500またはそれを超えるμlで変動する。混合物中の免疫原の濃度もまた、特定の免疫原および選択される投与の経路に従って変動する。鼻内投与について、例えば、混合物中の免疫原の濃度は、少なくとも0.033μg/μl、0.067μg/μl、0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.33μg/μl、0.5μg/μl、0.67μg/μl、0.75μg/μl、1μg/μl、2μg/μl、2.5μg/μl、5μg/μl、7.1μg/μl、10μg/μl、12.5μg/μl、15μg/μl、17.5μg/μl、20μg/μlまたは25μg/μlの間を変動する。本発明の混合物は、好ましくは、抗体産生およびT細胞応答を増強する。これには、サイトカイン産生、標的細胞殺傷、マクロファージ活性化、B細胞活性化、およびリンホカイン産生が含まれる。本発明の混合物は好ましくは、職部連れクチンの非存在下で単独で免疫原に対そのような応答に比較して、T細胞応答または抗体力価を少なくとも10、15、20、25、30、40、50、75または100またはそれを超える程度増加させる。T細胞応答を測定する方法は、当該分野において周知である。例えば、以下を参照のこと:Janewayetal.,eds.,1997,IMMUNOBIOLOGY:THEIMMUNESYSTEMINHEALTHANDDISEASE,3ded.,pp.2:31-2-33;Abbasetal.,1997,CELLULARANDMOLECULARIMMUNOLOGY,3ded.,pp.250-277、pp.290-293。本発明に従って、混合物中の免疫原に対して指向される抗体が産生され得る。免疫現に特異的に結合する抗体は、代表的に、免疫化学アッセイ例えば、ウェスタンブロット、ELISA,放射免疫アッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降または当該分野において公知の他の免疫化学アッセイにおいて使用される他のタンパク質で提供される検出シグナルよりも、少なくとも5倍、10倍または20倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、特定の免疫現に特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおける他のタンパク質を検出せず、溶液から免疫原を沈降させ得る。抗体力価は、好ましくは、以下の実施例1に記載されるようにELISAによって測定される。免疫原に対して指向される、IgGIgGサブタイプIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3ならびにIgA抗体は、血清、唾液、および粘膜分泌物膣内洗浄液、鼻洗浄液、および腸洗浄液を含むにおいて測定され得る実施例1を参照のこと。この開示において引用されるすべての特許および特許出願のすべての内容は、明示的に本明細書において援用される。以下の実施例は、例示の目的でのみ提供され、そして本発明の範囲を制限する意図はない。これは、上記に広い意味で記載してきた。実施例1:材料および方法免疫原およびレクチン。コレラ毒素CT、オボアルブミンOVA、V型、鶏卵およびWGAを、SigmaPoole,UKから入手した。インゲンマメは、以前に記載のように15調製した。UEA-IおよびLEAを、VectorLaboratoriesから入手した。ML-Iを、以前に記載のように分離した16。動物。8週齢の雌性Balb/cマウスHarlanOlac,Bicester,UKに自由に市販の食餌および水に対するアクセスを与えたLabsure,Manea,UK。粘膜免疫スケジュール。マウスのグループn=10から、最初の免疫前1週間に採血した。1日目、14日目、28日目および42日目に、マウスを、以下のもので鼻内免疫した:PBS、OVA10μg単独またはCT1CT1μg、ML-11μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μgもしくはUEA-I10μgとOVA10μgとの混合物。別の例において、マウスを、5μgの単純ヘルペスウイルス2型の糖タンパク質D2gD2で、1日目、14日目、28日目および49日目に、単独または1μgのCT、ML-I、ML-IIまたはML-IIIとともに鼻内免疫した。マウスに30μlの各々の調製物1鼻孔あたり15μlを、ピペットに付着したファインチップを通じて与えた。血液および粘膜の分泌物の収集物。血液サンプルを各々の免疫の1日前に、37°Cでの10分間のインキュベーション後に尾静脈から採血することによって収集した。最終免疫後2週間で、動物を最終麻酔してヒプノリンおよびジアゼパム唾液および膣の分泌物の収集を可能とした。ついで、マウスを、麻酔の過剰投与によって殺傷し、ついで放血した。血液をすぐに収集し、そして遠心分離し、そして血液を-20°Cで格納した。吸着性セルロースウイックWhatmanInternational,UKを、以前に記載されるように17唾液および膣液の収集のために用いた。洗浄流体氷冷、0.01MPBS、50mMEDTA、5mMPMSF、5μg/mlアプロチニンをウイックからの抗体の溶出に、ならびに鼻および腸洗浄のために用いた。唾液を、ウイックチップを2分間口に挿入することによって収集した17。抗体を、ウイックから400μlの粘膜洗浄流体から抽出した。膣液を、50μlの洗浄液の反復フラッシングおよび吸引ならびにウイックの2分間の挿入によって収集した。抗体を、ウイックから400μlの洗浄液へと抽出した。鼻気管洗浄液を、0.5mlの粘膜洗浄液を気管からバックフラッシュすることによって断頭した動物から収集した。腸洗浄液を、10mlの氷冷洗浄液で小腸をフラッシュすることによって得た。すべての分泌物を、分析に必要となるまで-20°Cで格納した。ELISAによる特定の抗体の検出。ELISAを設定して、OVA、CTおよび植物レクチンに対する特定のIgG、IgAおよびIgGサブクラスを測定可能にした。血清1;100からおよび粘膜分泌物1:2からを、適切な希釈緩衝液中で力価測定した。マイクロタイタープレートImmunolon4,Dynatechを、炭酸重炭酸緩衝液pH9.6中の1ウェルあたり75μlの免疫原でコーティングしCT/レクチンについて1μg/ml、50μg/mlOVAに対する応答を測定するときおよび2μg/mlgD2に対する応答を測定するとき、そして4°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、プレートを2ゼラチン/希釈緩衝液でブロッキングし、そして37°Cで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてサンプルを添加し、連続希釈し、そして37°Cで1時間インキュベートした。希釈緩衝液中のビオチン化抗血清を添加し、そして37°Cで1時間インキュベートした。さらなる洗浄後、ExtrAvidinperoxidaseSigma希釈緩衝液中1:750希釈を添加し、そして37°Cで30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして50μl/ウェルの現像液TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質1-C,KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg,MDを加えた。プレートを、暗がりで37°Cで30分間振盪しながらインキュベートした。この反応を、1MH2SO4の添加により停止し、そして吸光度を450nmで読んだ。ELISA希釈緩衝液は以下のとおりであった:CTPBS0.1TweenPBST、OVAPBST、WGA100mMN-アセチルグルコサミン/PBST、PHA0.1フェチュイン/PBST、UEA-I30mML-フコース/PBST、LEAキチン加水分解物1:200Vector/PBST、ML-1100mMD-ガラクトース/PBST。抗IgG1:8000およびIgA1:2600のビオチン化捕捉血清Sigmaの作業希釈液を、予備免疫し、そしてプールした陽性血清での予備的アッセイの後に決定した。IgGのサブクラス抗血清の作業希釈液Serotectを、製造業者が推奨するとおりであったIgG11:4000、IgG2a1:4000、IgG2b1:2000、IgG31:2000。末端点の力価を、血清または粘膜のサンプルの希釈として決定し、これは、同じ希釈でのコントロールサンプルの平均よりも0.1単位大きなODを与えた。総IgAを、以下の改変を用いて特異的IgAとして定量した:プレートを、ヤギ抗マウスIgA1:8000;a鎖特異的、Sigmaでコーティングした。PBSTを希釈液として用い、そしてPBST中の2ゼラチンをブロッキング溶液として用いた。総IgAレベルを、IgAIgAκ、Sigma標準曲線の直線領域から算出した。総IgAの末端点力価は、サンプルの希釈として決定し、これは、緩衝液単独よりも0.1単位大きなODを与えた。統計:データを、平均±標準偏差として表す。ついになっていない両側t検定を用いてグループの間の有意性を試験した。標準偏差がグループ間で有意に異なった場合、非母数検定Dunnの多数比較事後検定posttestでのKruskal-Wallis検定を行った。Dunnの多数比較事後検定でのKruskal-Wallis日母数検定はまた、総IgAデータの有意性を評価するためにも用いた。実施例2:血清および分泌物における総IgAレベルに対する免疫の効果マウスを、1日目、14日目、28日目および42日目に、PBS、OVA10μg単独またはOVA10μgとCT1μg、ML-I1μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μgもしくはUEA-110μgとをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを、最後の免疫の2週間後に収集した。結果を図1に示す。データは、平均±SDをあらわす。CTOVAでの4回の鼻内免疫後、総鼻気管洗浄IgAp<0.01の濃度は、すべての他のグループと比較して有意に増加していた。CTとOVAとの同時投与は、血清においても他のサンプリングした粘膜分泌物においても総IgA濃度において有意な増加を生じなかった。分泌物または血清のいずれかにおける総IgAレベルにおける植物レクチンのいずれかでの免疫の有意な効果はなかった。実施例3:植物レクチンの、OVA特異的血清抗体応答に対するアジュバント効果マウスを、鼻内で1日目、14日目、28日目、および42日目に、OVA10μg単独、またはOVA10μg単独またはOVA10μgとCT1μg、ML-I1μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μgもしくはUEA-110μgとをともにもちいて鼻内経路により免疫した。血清を、各々の免疫の1日前および研究の停止の前に収集した。図2A-Dは、この実験の結果を示す。点は、個々のデータを示し、そしてシンボル-は平均力価を示す。単回免疫後2週間で、OVA特異的血清IgGは、CTOVAで免疫されたマウス中で5/10で、およびML-IOVAで免疫されたマウスの1/10中で検出されたが、OVA特異的IgGは、他のグループでは検出されなかった。第二の投与の後、CTOVAで免疫したすべてのマウスにおいて平均力価40321、およびML-IOVAで免疫したマウスの9/10平均力価11090において、より高い応答が検出可能な抗体を用いて測定された。他のグループのなかでは、特異的IgGは、UEA-IOVAで免疫したマウスにおいてのみ検出された平均力価91。4回の投与の後、最高の平均IgG力価は、CTOVAで免疫したマウスにおいて存在した。これは、OVA単独を受けたマウスよりもおよそ286倍高かった。ML-IOVAで免疫したグループにおける平均力価は、約OVA単独を受けたマウスにおけるよりも118倍高かった。PHAOVAで免疫下マウスにおける力価は、OVA単独で投与したマウスにおける力価に類似していた。LEAOVAの投与は、OVA単独に比較して平均力価の少量の増加を生じた5倍。OVAとWGAおよびUEA-Iとの送達は、OVA単独に比較して、平均血清IgG抗OVA力価におけるそれぞれ41倍および51倍の増加を生じた。CTOVAおよびML-IOVAを受けたグループとは対照的に、WGAまたはUEA-IOVAで免疫したグループにおける応答は、かなり変動性であった。結果として、最終投与後には、CTOVAおよびML-IOVAグループのみ相違はグループ間で有意ではなかったは、OVA単独グループよりも有意に高いp<0.001平均OVA特異的IgG力価を有した。これらのグループにおける力価はまた、PHAOVAグループp<0.001よりも有意に高かった。高レベルの特異的IgGとは対照的に、非常に低い力価のOVA特異的血清IgAが検出された。事実、最終投与後、有意なレベルのOVA特異的血清IgAは、CTOVA平均力価、220およびML-IOVA平均力価、80で免疫したマウスにおいてのみ検出された。実施例4:OVA特異的IgGサブクラスパターンマウスを、1日目、14日目、28日目および42日目に、OVA10μg単独またはOVA10μgとCT1μg、ML-I1μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μgもしくはUEA-110μgとをともにもちいて鼻内経路により免疫した。サンプルを、最終免疫後2週間で収集した。図3は、この実験の結果を示す。ここのデータに当たる点およびシンボル-は、平均力価を表す。OVA特異的IgG抗体のサブクラスプロファイルの分析は、非常に偏重のかかった応答を示した。IgG1力価は、ほとんどのグループにおけるOVA特異的IgGの力価に類似した。CTOVAおよびML-IOVAでそれぞれ免疫したマウスにおいて、その平均力価は、OVA単独で面益したマウスよりもそれぞれ約450倍および255倍高かった。CTOVAグループにおける力価は、ML-IOVAp<0.05を除いてすべての郡において有意に高かった。ML-IOVAグループにおける力価は、OVA単独を受けたグループよりも、PHAOVAを受けたグループよりも有意に高かったp<0.001。OVA特異的IgG2aは、それぞれ8/10および2/10のCTOVA平均力価561およびML-IOVA平均力価331で免疫したマウスにおいて検出された。特定のIgG2aは、他のグループにおいて検出されなかった。特異的なIgG2bは、CTOVAで免疫したマウスの2/10においてのみ検出され、他のグループではなんら検出されなかった。特異的なIgG3は、検出されなかった。これらのデータは、これらのマウスにおけるCT特異的IgGアイソタイプ応答に対して驚くほど異なり、ここで、比較的高力価の特異的IgG2aおよび有意なレベルのIgG2bおよびIgG3が検出された表1。実施例5:OVA特異的粘膜IgA応答に対する植物レクチンのアジュバント効果マウスをOVA10μg単独、またはCT1μgML-I1μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μg、またはUEA-I10μgと共にOVA10μgで、1日目、14日目、28日目、および42日目に鼻内免疫した。力価を最終免疫の2週間後に測定した。結果を図4A~Dに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号-は、平均力価を表す。特異的IgAは、CTOVAおよびML-IOVAで免疫したマウスにおいてサンプリングした全ての粘膜部位で検出された。2つの群の間には、有意な差異はなかった。OVA特異的唾液IgAは、OVA単独、LEAOVAまたはPHAOVAで免疫したマウスにおいては検出されず、WGAOVAおよびUEA-IOVAでそれぞれ免疫したマウスでは、10匹のうちそれぞれ2匹および4匹において検出された。逆に、特異的唾液IgAは、CTOVAおよびML-IOVAでそれぞれ免疫したマウスでは、10匹のうちそれぞれ9匹および10匹において測定され、これはCTOVA群における平均力価の2倍以上である。膣洗浄では、OVA特異的IgAは、CTOVAおよびML-IOVAのそれぞれで免疫したマウスにおいて、10匹のうち9匹および7匹で検出された。平均力価は、CTOVA群において4倍高かったが、これは、大きくは、1つの高い応答者の結果であった。OVA特異的膣洗浄液IgAは、PHAOVAで免疫したマウスにおいて検出されず、OVA単独、LEAOVA、またはWGAOVAのいずれかで免疫したマウスにおいて10匹のうち1匹において検出され、そしてUEA-IOVAで免疫したマウスにおいては10匹のうち3匹において検出された。OVA特異的IgAの高い力価は、CTOVAまたはML-IOVAで免疫した全てのマウスからの経鼻気管洗浄液で検出された。これは、CTOVA群においておよそ5倍高い力価であった。OVA特異的経鼻気管洗浄液IgA力価は、ML-IOVAを除く全ての群においてよりも、CTOVAで免疫したマウスにおいて有意に高かったp<0.05。顕著なことに、これらの群におけるOVA特異的経鼻気管洗浄液IgA力価は、血清IgA力価に匹敵した。CTOVAおよびML-IOVAでそれぞれ免疫したマウス由来の血清中の総IgA力価は、それぞれ経鼻気管洗浄液において33倍および73倍高かった。特異的IgAは、OVA単独で免疫したマウスにおいて10匹のうち1匹の経鼻気管洗浄液で検出されたが、PHAOVAで免疫したマウスでは検出されなかった。OVA特異的経鼻気管洗浄液IgAは、WGAOVAで免疫したマウスにおいては10匹のうち7匹で測定され、そしてUEA-IOVAまたはLEAOVAのそれぞれで免疫したマウスにおいては10匹のうち5匹で測定された。OVA特異的IgAは、CTOVAまたはML-IOVAで免疫した全てのマウスからの腸洗浄液において検出され、CTOVA群においておよそ4倍高い力価であった。これらの群における力価は、互いには有意に異ならないが、他の全ての群におけるよりも有意に高かったp<0.05。他の群の間では、OVA特異的腸洗浄液IgAは、1:2の最大力価で散発的にのみ検出された。実施例6:CT/植物レクチン特異的応答マウスを、CT1μg、ML-I1μg、LEA10μg、PHA10μg、WGA10μg、またはUEA-I10μgと共にOVA10μgで1日目、14日目、28日目、および42日目に鼻内免疫した。結果を図5A~Fに示す。データは平均±SDで示す。データは、免疫原の最終投与の2週間後に測定された特異的血清IgGの力価である。CT特異的血清IgGは、CTOVAの一回の投与後に全ての動物において検出され、そして力価は、この後の各投与で増大した。全ての4つのIgGサブクラスの特異的抗体は、4回の投与後の血清中で検出された表1。最も高い力価は、IgG1であった。一方、CT特異的IgG2a、IgG2bおよびIgG3もまた検出された。最終投与後、CT特異的血清IgAは、全てのマウスにおいて検出され、平均力価は4481であった。特異的IgAはまた、唾液、膣洗浄液、経鼻気管洗浄液、および腸洗浄液においては全ての動物において検出された。唾液IgA力価は、動物間で比較的一致していた血清中よりもおよそ10倍低い平均力価。これらのマウス由来の唾液中の全IgA力価は、血清中よりも1340倍低かった。膣IgA力価は、非常に可変性であり、単一の高い応答者が平均力価を増大した。CT特異的IgAの高い力価は、全ての動物からの経鼻気管洗浄液において測定され、平均力価は、血清IgA力価に匹敵した。特異的IgAはまた、全てのマウスの腸洗浄液においても検出されたが、サンプリングされた他の粘膜部位でよりも低い平均力価であった。単回用量のML-1OVAの鼻内送達は、10匹のマウスのうち3匹においてML-I特異的IgGの産生を刺激した。二回目の投与およびその後の投与後に、高い力価の特異的IgGが全てのマウスにおいて検出された図5。ML-I特異的血清IgGサブクラスの分析は、高い力価のML-I特異的IgG1を見出した表1。ML-I特異的IgG2aおよびIgG2bもまた検出されたが、特異的IgG3は検出されなかった。ML-I特異的IgAは、血清中、および4回投与後にサンプリングした全ての粘膜部位で、全てのマウスにおいて検出された。唾液中の力価は、全ての動物について一致したが、単一の非常に高い応答者が、膣洗浄液の平均力価を増大した。高ML-I特異的IgA力価が、全ての動物の経鼻気管洗浄液において測定された。CTを用いるのと同様に、経鼻気管洗浄液における平均ML-I特異的力価は、血清IgA力価と匹敵しおよそ2倍低い、これは、経鼻気管洗浄液における全IgA力価がこれらのマウスに由来の血清中におけるよりも73倍低いので顕著なことであった。特異的IgAはまた、全ての動物からの腸洗浄液においても検出された。LEAOVAで免疫したマウスにおいては、LEA特異的血清IgGは、1回の投与後に10匹のマウスのうち9匹で検出された。力価は、その後の各投与後に、最終免疫後の比較的高いレベルにまで増大した図5。IgGサブクラスの分析は、高い力価のLEA特異的IgG1および低い平均IgG2a力価を見出した表1。特異的血清IgAは、4回の投与後に10匹のマウスのうち7匹において、低いレベルであるが検出された。特異的IgAはまた、試験した4つの全ての粘膜分泌物において検出されたが、CTOVAおよびML-IOVA群におけるデータに比較して、力価は非常に可変性であった。PHA特異的血清IgGは、PHAOVAの一回の投与後に10匹のマウスのうち1匹で検出された。その後の投与後に、力価は増加し、そして特異的IgGは、最終の投与後に10匹の動物のうち8匹において存在した図5。IgGサブクラスのうち、特異的IgG1のみが検出された表1。全ての動物において、低い力価の特異的血清IgAが検出された。PHA特異的IgAは、唾液においても膣洗浄液において検出されなかったが、経鼻気管洗浄液においては、10匹のマウスのうち5匹において、腸洗浄液においては10匹のマウスのうち1匹において検出された。最も低い力価の特異的抗体は、WGAOVAの4回の投与後であってもWGAに対して惹起された図5。特異的IgG1は、10匹のマウスのうち2匹において検出され、そして他のIgGサブクラスは、検出されなかった表1。特異的IgAは、4回の投与後に、最大力価の1:100であるが、多数のマウスにおいて検出された。低い力価の特異的IgAが、唾液、膣洗浄液、および経鼻気管洗浄液において、少数のマウスにおいて測定された。これらのデータは、この群ここでは、比較的高いレベルのOVA特異的血清IgGが多数のマウスで検出されたからのOVA特異的データと対照的である。UEA-I特異的血清IgGは、UEA-IOVAの1回の投与後に検出されなかったが、その後の投与後では検出され、そして最終投与後には10匹のマウスのうち8匹において検出された図5。特異的IgG1は、最終の投与後に10匹のマウスのうち9匹のマウスにおいて検出された表1が、特異的IgG2aは、10匹のマウスのうち1匹で、そしてIgG2bおよびIgG3は検出されなかった。特異的血清IgAは、最終投与後に10匹のマウスのうち3匹において検出された。比較的低いレベルのIgAが、唾液、膣洗浄液、および経鼻気管洗浄液において検出された。本データは、アジュバントに対しておよび免疫原に対して惹起される応答のタイプが異なり得ることを示す。高い力価の特異的IgG1が、OVAおよびCTの両方に対して検出されたが、比較的高い力価のCT特異的IgG2aが測定される一方、OVA特異的IgG2aはほとんどまたは全くなかった。ML-IOVAの送達は、同様の結果に至ったが、一方ML-I特異的IgG2a力価は比較的低かった。以前の研究は、OVACTの送達後にIgG2a力価よりも高いOVA特異的IgG1を見出したが、同じマウスにおいてIgG1よりも高い力価のCT特異的IgG2aが見いだされた24。CTキーホールリンペットヘモシアニンKLHをマウスに供給することは、CTに対して高い応答者であるマウスにおいて強いKLH特異的分泌IgA応答を刺激し、乏しい応答者においてはずっと小さい効果であった29。従って、CTの経口アジュバント効果は、CTそれ自体に対する強い免疫応答に依存した。しかし、WGAおよびUEA-Iは、OVAに対する血清IgG応答を増大し有意ではないが、高度に免疫原性ではなかった。近年の研究は、いくつかの食物レクチンPHAを含むが、ヒト好塩基球を誘発してIL-4およびIL-13を放出し得たことを見出した。例えば、ConAおよびPHA-Eは、IL-4レベルを抗IgE抗体での刺激により得られるレベルと同程度に高くに誘導した。高レベルのIL-4を刺激したレクチンはまた、おそらくIL-4これは、Th2タイプ応答に転換するのに必要である30を誘導することにより、IL-13およびヒスタミンの放出を誘導した。CTまたはML-IOVAで免疫したマウスにおけるOVAに対する抗血清IgG力価の誘導にも関わらず、血清IgAは、わずかに検出可能であった。以前の研究は、免疫原特異的血清IgAは、V.choleraezotタンパク質またはLTOVAでの2回の鼻内免疫後、マウスにおいて検出されなかったことを見出した19。同様に、LTTTの経口送達は、TTに対する高レベルの血清IgG抗体を刺激したが、一方、抗TT血清IgAは検出されなかったことが見いだされた23。CTおよびML-Iは、全ての粘膜分泌物において抗OVAIgAを有効に刺激したが、レベルは、経鼻気管洗浄液および唾液において最も高かった。CTOVAおよびML-IOVAで免疫したマウスにおける全血清IgA力価はそれぞれ、経鼻気管洗浄液において33倍および73倍高く、そして唾液において1340倍および1176倍高かったので、これらの部位でのOVA特異的IgA力価は、局所応答の誘導を示す。膣洗浄液における抗体力価は、非常に可変性であったが、これは、ホルモン影響を反映し得る31。実施例7:欧州ヤドリギViscumalbum由来の3つの異なるレクチンML-I、ML-II、およびML-IIIは、鼻内投与後のgD2特異的血清IgG抗体の力価を増大させるこれらの3つのレクチンの各々の1μgを、5μgの単純ヘルペスウイルス2型由来糖タンパク質D2gD2と混合し、そして上記のように1日目、14日目、28日目および49日目にマウスに鼻内送達した。他のマウスを、5μggD2単独または1μgCTと混合した5μggD2で鼻内免疫した。血清を、各免疫の1日前、および研究の終了時に採集した。gD2特異的血清IgG抗体の力価を上記のように測定した。結果を図6A~Dに示す。点は、個々のデータを参照し、そして記号-は、平均力価を表す。この3つのヤドリギレクチンの各々は、CTによって示されるのに匹敵するアジュバント活性を示した。実施例8:鼻内投与後のgD2特異的血清IgGサブクラス抗体の力価の増加マウスを、1日目、14日目、35日目、および49日目に、gD2単独5μgまたはCT1μg、ML-I1μg、ML-II1μg、もしくはML-III1μgと共にgD25μgのいずれかで鼻内免疫した。サンプルを最終免疫の2週間後に採集した。データは、最終免疫の2週間後に測定した力価である。図7A、IgG1;図7B、IgG2a;図7C、IgG2b;図7D、IgG3。点は、個々のデータを参照し、そして記号-は、平均力価を表す。括弧内のp値は、gD2のみ群と比較したデータの有意性を参照する。血清特異的IgG1、IgG2a、およびIgG2b抗体の力価は、3つのヤドリギレクチンの各々で処置したマウスにおいて増大した。実施例9:ML-I、ML-II、およびML-IIIは、鼻内免疫後にマウスにおいてgD2特異的IgA抗体力価を増大するgD2特異的IgA抗体力価は、1日目、14日目、35日目、および49日目に、gD25μg単独またはCT1μg、ML-I1μg、ML-II1μgもしくはML-III1μgと共にgD25μgのいずれかで鼻内免疫したマウスの分泌において測定された。データは、図8において、最終免疫の2週間後に測定した力価である。図8A、唾液;図8B、膣洗浄液;図8C、鼻内気管洗浄液;図8D、腸洗浄液。点は、個々のデータを参照し、そして記号-は、平均力価を表す。括弧内のp値は、gD2のみ群と比較したデータの有意性をいう。ヤドリギレクチンの各々は、試験した分泌物の各々におけるgD2特異的IgA抗体の力価を増大した。表2は、gD25μgを単独またはCT/植物レクチン1μgと共に用いて鼻内免疫したマウスにおけるレクチン特異的抗体応答を示す。マウスn=10を0日目、14日目、28日目、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56日目および57日目に採集した。実施例10非毒性II型RIPおよび関連する分子の粘膜免疫原性およびアジュバント活性非毒性型II型RIPニグリンB、塩基性ニグリンB、エブリンrIおよびそれらのB型サブユニットに関連する分子SNAII、SELfdの粘膜鼻腔内免疫原性およびアジュバント活性を、ML-1およびCTのそれと比較した。マウスを、gD25μg単独および植物レクチンまたはコレラトキシンCT1μgとともに鼻内免疫した。マウスを、0、21、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56および57日目に収集した。レクチン特異的応答およびバイスタンダー抗原であるgD2に対する応答を、ELISAによって測定した。図9は、1日目、21日目、および42日目に、gD25μg単独、またはgD25μgを1μgのCT、ML-1、ニグリンB、塩基性ニグリンB、エブリンrI、SNAII、またはSELfdを用いて、鼻腔内に免疫したマウスからのgD2特異的な総血清IgGおよびIgGサブクラス力価を示す。血清を研究の終わりに収集した。個々のデータおよびシンボル-に言及する点は、平均力価を表す。カッコ内のp値は、gD2のみのグループと比較したデータの有意性をいう。図10は、1日目、21日目、および42日目に、gD25μg単独、またはgD25μgを1μgのCT、ML-1、ニグリンB、塩基性ニグリンB、エブリンrI、SNAIIまたはSELfdを用いて、鼻腔内免疫したマウスの分泌液において測定したgD2特異的IgA抗体力価を示す。データは、a唾液、b膣内洗浄、c経鼻洗浄、d腸洗浄における最終免疫の2週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル-は、平均の力価を表す。カッコ内のp値は、gD2のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。表3は、II型RIPおよび関連する分子の免疫原性を示す。抗体応答は、gD25μg単独、またはCT/レクチン1μgとともに用いて鼻腔内免疫したマウスにおいて測定した。マウスのグループn=10を、0、14、28、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56および57日目に収集した。図11は、1日目、21日目、および42日目に、gD25μg単独、またはgD25μgと1μgのCT、ML-1、またはUEA-1とを用いて経鼻免疫したマウスにおいて測定されたgD2特異的血清IgAおよびIgG抗体力価を示す。データは、最終免疫の2週間後に測定された力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル-は、平均力価を表す。カッコ内のp値は、gD2のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。図12は、1日目、21日目、および42日目に、gD25μg単独、またはgD25μgと1μgのCT、ML-1、またはUEA-1とを用いて経鼻免疫したマウスにおいて測定したgD2特異的サブクラス抗体力価を示す。データは、最終免疫の2週間後に血清において測定された力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル-は、平均力価を表す。カッコ内のp値は、gD2のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。図13は、1日目、21日目、および42日目に、gD25μg単独、またはgD25μgを1μgのCT、ML-1またはUEA-1を用いて、鼻腔内免疫したマウスの分泌液において測定したgD2特異的IgA抗体力価を示す。データは、a唾液、b膣内洗浄、c経鼻洗浄、d腸洗浄における最終免疫の2週間後に測定した力価である。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル-は、平均の力価を表す。カッコ内のp値は、gD2のみのグループと比較したデータの有意性に言及する。図14は、IL-5、IL-4、およびIFN生産の平均濃度、および、gD2、ML-1、またはUEA-1を用いて、またはgD2をML-1、UEA-1、またはLTK63とともに用いての、3回の免疫0日目、21日目、42日目の8週間後の、a脾臓細胞およびb子宮頚管リンパ節におけるT細胞増殖アッセイについての1分あたりの計数を示す。脾臓細胞および子宮頚管リンパ節細胞を単離し、そしてインビトロでgD20μg/ml、1μg/ml、または5μg/mlまたは1:1000もしくは1:5000に希釈してラテックスビーズに結合させたgD2、またはPMA/cd3で刺激した。図15は、1日目、14日目、28日目、および49日目に、OVA5mg単独、またはOVA5mgとCT10μg、ML-I10μg、ML-II10μg、またはML-III10μgとを一緒に用いて、強制飼養によって免疫したマウスからのOVA特異的血清IgG抗体力価を示す。血清を、各免疫の1日前および研究の終わりに収集した。図15A、1用量後の血清IgG力価13日目;図15B、2用量後の血清IgG力価27日目;図15C、3用量後の血清IgG力価48日目;図15D、最終用量後の血清IgG力価62日目。点は、個々のデータに言及し、そしてシンボル-は、平均力価を表す。図16は、1日目、14日目、35日目、および49日目に、OVA5mg単独、またはOVA5mgとCT10μg、ML-I10μg、ML-II10μg、またはML-III10μgとを一緒に用いて、強制飼養によって免疫したマウスにおいて測定したOVA特異的血清IgGサブクラスおよびIgA抗体力価を示す。サンプルを最終免疫の2週間後に収集した。データは、最終免疫の2週間後に測定した力価である。図16A、IgG1;図16B、IgG2a;図16C、IgG2b;図16D、IgG3。点は、個々のデータを表し、そしてシンボル-は、平均力価を表す。図17は、強制飼養によって免疫したマウスの分泌物中において、1日目、14日目、35日目、および49日目に、OVA5mg単独、またはOVA5mgとCT10μg、ML-I10μg、ML-II10μg、またはML-III10μgとを一緒に用いて、測定したOVA特異的IgA抗体力価を示す。データは、最終免疫の2週間後に測定した力価である。図17A、唾液;図17B、膣洗浄;図17C、経鼻洗浄;図17D、腸洗浄。点は、個々のデータを表し、そしてシンボル-は、平均力価を表す。表4は、OVA5mg単独、または0.5mlの重炭酸ナトリウム中において投与されるレクチン10μgとともに用いて、強制飼養によって免疫したマウスにおけるOVA特異的抗体応答を示す。マウスのグループn=10を、0、14、28、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56日目および57日目に収集した。表5は、OVA5mg単独、またはレクチン10μgとともに免疫したマウスにおけるOVA特異的抗体応答を示す。マウスに、0.1mlPBS中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んで免疫した抗原±ML1を投与した。マウスのグループn=5を、0日目、14日目、28日目、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56日目および57日目に収集した。表6は、OVA5mg単独、またはレクチン10μgとともに経口免疫したマウスにおけるML1特異的抗体応答を示す。マウスに、0.1mlPBS中において強制飼養によって、または食餌ペレット中に組み込んだ抗原±ML1を投与した。マウスに、0日目、14日目、28日目、および42日目に免疫し、そしてサンプルを56日目および57日目に収集した。実施例11経皮経路で抗原とともに送達された場合の、II型RIPML1,エブリンRIのアジュバントとしての効力粘膜アジュバントとしてのヤドリギレクチンの効力を実証した研究からの続きで、これらの研究を、経皮投与された場合のアジュバントとしての、II型RIPのアジュバントとしての能力を評価するために行った。最近の研究は、CTがこの経路でアジュバントとして使用された場合の、免疫応答の効果的な誘導を実証しているGlennら、1998、1999。ML1に加えて、CTを陽性コントロールとしておよびエブリンrIを使用した。なぜなら、それは、鼻腔内投与された場合に、非毒性II型RIPの最も免疫原性のものであったからである。プロトコル雌Balb/cマウスn=5のグループを、0日目および21日目に免疫し、そして血清サンプルを、0日目、20日目、および35日目にELISAによる分析のために採取した。3つの異なるバイスタンダー抗原、BSA、DT、およびgD2を調査した。抗原50μgを、単独で、またはレクチン/トキシン50μgと混合して、マウスに投与した。特異的な抗体応答を、ELISAによって決定した。さらに、CTおよびレクチンに対する応答を測定して、それらの免疫原性を、経皮経路で評価した。マウスの背をno.40のクリッパーで剃り、そして動物を48時間休ませた。マウスに、免疫化手順の間、hypnormジアゼパムで麻酔した。その皮膚を、溶液を適用する1分前にエタノールで拭いた。免疫化溶液100μlを、剃った皮膚に2cm2の範囲にわたって適用した。30分後、さらに100μlの蒸留水を適用し、そしてマウスを90分間放置した。マウスを生温かい水道水で十分に洗浄し、たたいて乾燥し、そして再び洗浄した。研究グループI.BSA1.BSA50μg2.BSA50μgCT50μg3.BSA50μgMLI50μg4.BSA50μgエブリンrI50μgII.ジフテリア毒素DT1.DT50μg2.DT50μgCT50μg3.DT50μgMLI50μg4.DT50μgエブリンrI50μgIII.単純ヘルペスウイルス2糖タンパク質DgD21.gD250μg2.gD250μgCT50μg3.gD250μgMLI50μg4.gD250μgレクチンII50μg表7は、1および2経皮用量のBSA50μg単独、またはCT/植物レクチン50μgと一緒に投与した後に測定した、BSA特異的血清抗体力価を示す。表8は、DT50μg単独でまたはCT/植物レクチン50μgを伴ったDTの、1回および2回の経皮用量の後に測定したDT特異的血清抗体力価を示す。表9は、gD250μg単独でまたはCT/植物レクチン50μgを伴ったgD2の、1回および2回の経皮用量の後に測定したgD2特異的血清抗体力価を示す。乏しい応答に起因して、血清IgGaおよびIgG1レベルを決定しなかった。表10は、CT/ML1/Ebulinr150μgを伴った1回および2回の経皮的用量の後に測定したCTおよびレクチン特異的血清抗体力価を示す。実施例12マウスにおいて経口送達したレクチンの結合、取り込みおよび転移translocationレクチンの投与および組織の回収雌性Balb/cマウスを、実験前には自由給水にして通常の仕入れ飼料で維持した。マウスを、一晩絶食させ、そして24匹のマウスの群に、弯曲した経口投薬針20g×25mmを用いて胃管栄養法によりレクチンを送達した100μlの生理食塩水中1mgレクチン/マウス。水は、自由給水とした。8匹の動物の群を、ハロタン麻酔により屠殺し、続いて1時間後、6時間後および24時間後に瀉血した。血液を心臓穿刺により採取した。マウスを解剖し、そして腸全体を取り出し、そして胃、2つの部分の小腸、および大腸に分けた。腸の内容物を10mlの氷冷PBSで洗い出して、存在している非結合レクチンの量の指標を与えた。腸組織をポリエチレンバッグに入れ、そして液体窒素中で急速冷凍した。腸の切片を、各場合において採取し、そして組織学によるレクチン結合の試験のために4ホルマリンで固定した。全ての腸組織および洗浄物を、分析が必要になるまで-20°Cで保存した。さらに、肝臓、秘蔵および腎臓を動物から採取した。組織からのレクチンの抽出レクチンまたはコントロールの生理食塩水を投与した動物由来の組織を、ジアミノプロパンの20mM溶液中でホモジナイズすることにより抽出した。組織片を、抽出溶液995μl20mMジアミノプロパン5μlの5mg/mlアプロチニンSigmaに入れ、そして氷上で2分間24000rpmでホモジナイズしたJankeandKunkelIKA登録商標-Labortechnik,Ultra-Turrax登録商標。ホモジナイザーのヘッドを、蒸留水で洗浄し、抽出溶液1ml中で、そしてサンプルの間に再び蒸留水で洗浄した。サンプルを、20分間2°Cで18600gで遠心分離したJouan,MRI22。上清を回収し、そして分析が必要になるまで-20°Cで保存した。腸洗浄物の処理腸に存在するフリー非結合レクチンの量の指標を提供するために、腸の洗浄物に存在するレクチンの量を分析した。洗浄物500μlを、希釈緩衝液495μlプロテアーゼインヒビターであるアプロチニン5mg/mlを5μlに添加し、そして10分間8000rpmで遠心分離したMicrospin12S,Sorvall登録商標Instruments,DuPont。血液サンプルの処理採取の後、血液サンプルを室温で1時間放置し、そして6分間7000rpmで遠心分離したMicrospin12S,Sorvall登録商標Instruments,DuPont。血漿を回収し、そして分析が必要になるまで-20°Cで保存した。腸への植物レクチンの結合のELISA分析ELISAアッセイを設定して、抽出した組織サンプルおよび洗浄物中のWGAの定量を可能とした。マイクロタイタープレートImmunolon4,Dynatechを、ウェルあたり炭酸-炭酸水素緩衝液pH9.6で1:64000希釈した75μlのウサギ抗WGAでコーティングし、そして4°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、プレートをPBST/2ゼラチン/200mMN-アセチルグルコサミンでブロッキングし、そして37°Cで1時間インキュベートした。プレートを洗浄し;標準物質およびサンプルを添加し、希釈緩衝液PBST/200mMN-アセチルグルコサミンで段階希釈し、そして37°Cで1時間インキュベートした。10ng/ml~78pg/mlのWGA溶液を力価測定することにより、WGAの標準曲線を構築した。希釈緩衝液で1:16000希釈したビオチン化抗WGAを添加し、そして37°Cで1時間インキュベートした。さらに洗浄した後、希釈緩衝液で1:1000希釈したExtrAvidin登録商標ペルオキシダーゼSigmaを添加し、そして37°Cで30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、50μl/ウェルの発色溶液TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質1-CKirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg,USAを添加し、そして遮光して、37°Cで30分間振盪しながらインキュベートした。1MH2SO450μl/ウェルを添加することにより反応を停止させ、そして吸光度を450nmで読み取った。標準曲線の線形領域からWGAレベルを計算した。SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングSDS-PAGEゲルを泳動し、そしてタンパク質を、セミドライ転写装置を用いてPVDF膜に転写した。転写後、膜を2.5カゼイン溶液中で30分間室温でブロッキングした。膜を洗浄し、そして一次抗体ビオチン標識抗レクチンを1.2カゼイン溶液で1:2500希釈して添加した。室温で一晩攪拌しながらインキュベートした後、膜をPBSで徹底的に洗浄し、そしてExtrAvidin登録商標ペルオキシダーゼを1.2カゼインで1:5000希釈して添加した。室温で1時間インキュベートした後、膜をPBSおよび蒸留水で徹底的に洗浄した。過剰な液体を膜から除去し、そして発色溶液を添加しSupersignal登録商標Westpico検出キットPierce,Rockford,USA、そして遮光して5分間放置した。過剰な液体を膜から乾燥させ、そして膜をフィルムに露出しKodakX-OMATLSSigma、そして処理した。結果経口胃管栄養法後のマウス腸における植物レクチンの安定性および結合レクチンPHA、WGAおよびUEA-1は、胃管栄養法後、6時間までの間、マウス消化管において安定であった表11および12;図18および19。小腸において、レクチンは、ポジティブコントロールのサブユニットMWで検出されたに過ぎなかった。胃においては、PHAおよびUEA-1の場合、6時間および24時間後にレクチン凝集の指標があった。しかし、胃で検出されたレクチンの大部分は、やはりインタクトであった。腸に結合するレクチンの分析により、送達して1時間および6時間後に、結合したレクチンの位置に差異が見出された。PHAおよびWGA示さずは、小腸の近位に結合したが、UEA-1はこの領域において検出されなかったが、小腸の遠位に結合した表11。結合のパターンは、レクチン投与して1時間および6時間後のパターンと類似であった。送達の24時間後に、レクチンはホモジナイズした腸組織において検出されなかった。このことは、レクチンが腸から解離し、そして再結合するのではなく、解離した後に分泌されるようであることを示した。表11は、胃管栄養法によりPHAアイソタイプE2L2を1mg送達して1時間、6時間および24時間後の、マウス消化管におけるPHAの検出を示す。記号は、レクチンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、そして陽性シグナルを有するマウスの数各場合で8匹のうちを括弧に入れて示す。ポジティブコントロールのPHAサブユニット分子量は、29.5kDaであった。表12は、胃管栄養法によりUEA1を1mg送達して1時間、6時間および24時間後の、マウス消化管におけるUEA1の検出を示す。記号は、レクチンがウェスタンブロッティングで検出されたことを示し、そして陽性シグナルを有するマウスの数各場合で8匹のうちを括弧に入れて示す。ポジティブコントロールのUEA1のみかけのサブユニット分子量は、34.7kDaであった。内部器官および血液におけるレクチンの検出鋭敏な化学発光ウェスタンブロットアッセイを用いて、レクチン取り込みを決定した。3つ全てのレクチンについて、肝臓および腎臓への取り込みを測定した表13、図20および21。図20は、腎臓組織において検出されたUEA1がポジティブコントロールよりより高い分子量で存在することを示す。コントロール腎臓組織とは交差反応性が存在する。しかし、レクチンを投与した動物由来のマウス組織においてさらなるバンドが見える。これらのバンドは、コントロールより高い分子量で存在する。レクチンを、投与して1~24時間後に肝臓組織において検出した。しかし、反応性バンドのMWは、予測したサブユニットMWよりかなり高かった。実際に、3つのレクチンのうちいずれも、予測したサブユニットMWで内部器官において検出されなかった。レクチン取り込みの程度の指標を得るために、サンドイッチELISAを設定して、WGAを定量した。このことは、腸および内部器官におけるレクチンの測定を可能にした表13。レクチンは、送達して6時間までの間、投与したレクチンのおよそのレベルで腸ホモジネートにおいて検出された。24時間では、ホモジネート中にレクチンは検出されなかった。内部器官のうち、最高レベルのレクチンは、肝臓組織において検出された。この部位でのレクチンのレベルは、1~24時間まで増加した。しかし、検出されたレクチンの最高量289.3ngは、送達した用量のわずかな割合を示した。非常に低レベルのWGAは、血球もしくは血清、または脾臓において検出された。肝臓および腎臓における最高レベルのレクチンの検出は、ウェスタンブロットの結果と一致する。ここで、このレクチンは、肝臓および腎臓組織において検出可能であったが、血液または他の器官においては検出可能でなかった。ネイティブかつ吸収されたレクチンのトリプシンによるタンパク質分解に対する安定性ネイティブなレクチンの特性を保持して、吸収されたレクチンが肝臓および腎臓において検出されたか否かを決定するために、ネイティブなおよび組織抽出したPHA、WGAおよびUEA-1を、トリプシンの溶液とともに1時間インキュベートした。3つのレクチン全てが、それらのネイティブな形態でこの酵素に対して非常に安定であった。しかし、肝臓および腎臓組織において検出した改変されたレクチンは、酵素により分解された図22。このことは、肝臓および腎臓における細胞が、タンパク質分解に対して感受性の形態に植物レクチンを改変しうることを示す。これは、消化管において残存し、かつ吸収される、消化された植物レクチンの分解についての機構であり得る。表13は、0.1mlのPBS中の1mgのレクチン1回の用量を用いたマウス群n=8の経口胃管栄養法後の、組織におけるWGAの検出を示す。このレクチンを、定量的サンドイッチELISAにより測定し、そしてデータを器官あたりまたは血液1mlあたりのμgレクチンとしてあらわす。"