治療を必要とする脊椎動物に対し、治療有効量の、ダイズ属genusGlycineに属するダイズ植物体soyabeanplantから得られるイソフラボン、および薬剤として許容される前記イソフラボンの塩からなる群より選ばれる少なくとも1種の化合物を投与することを含む、NFーκB遺伝子発現を阻害する方法。選ばれる前記イソフラボンは、ダイズから抽出されたダイゼインおよびダイジンである、請求項1に記載の方法。使用される細胞株は、PC-3前立腺がん細胞株およびMCF-7乳がん細胞株からなる群より選ばれた、請求項1に記載の方法。前記NF-κBの阻害は、乳がん、前立腺がん、および糖尿病からなる群より選ばれる疾病の治療に用いられる、請求項1または2に記載の方法。前記使用されるダイゼインの有効量はおよそ3~5μg/mlである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。治療を必要とする対象者に対し、3~5μg/mlの範囲でダイゼインおよびダイジンからなる群より選ばれるイソフラボンを経口投与することを含む、ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病を治療する方法。NF-κB遺伝子発現の阻害剤としてのダイゼインおよびダイジンの使用。ヒトの前立腺がん、乳がん、および糖尿病の治療へのダイゼインおよびダイジンの使用。ダイゼインは、構造1を有する無毒の栄養補助食品イソフラボンであり、NF-κB遺伝子発現を阻害することによりNF-κBの合成を阻止する新規なNF-κB阻害剤である。構造1のダイゼインは、NF-κBの遺伝子転写を阻害するが、毒作用はない。構造2を有するグルコピラノシルダイゼインであるダイジンも、NF-κB遺伝子発現を阻害することによりNF-κBの合成を阻止するNF-κB阻害剤であり、毒作用はない。構造1のダイゼインも構造2のダイジンも、骨格筋細胞におけるパルミテート誘発によるNF-κBの過剰発現を改善する。構造1のダイゼインおよび構造2のダイジンは、パルミテートによって下方制御される、インスリン刺激によるGlut-4の原形質膜への移動を助けるため、インスリン刺激によるグルコースの取り込みを増加させる。構造1のダイゼインも構造2のダイジンも、PC―3およびMCF-7の阻害剤であり、新規なNF-κB転写阻害剤である。構造2のダイジンは、ダイゼインをしのぐ非常に優れた生体利用性を有する。ダイゼインは栄養補助食品の中に存在し、ダイズ、マメ科植物、およびエンドウマメに含まれているが、生体利用性の問題がある。構造1のダイゼインは、マウスに経口投与しても吸収されない。これは、構造1のダイゼインが、消化管細胞から放出されたUGT1酵素の存在によるグルクロン酸抱合プロセスによって消化管から排出されるからである。構造2のダイジンは、グルコシル化されたダイゼインであり、UGT1介在による分解から保護され、加水分解されてダイゼインになり、吸収されて4時間以上血液中に留まるため、様々な組織や臓器に分配されることが期待される。構造1のダイゼインと構造2のダイジンは、パルミテート刺激により増加するNF-κB合成を大幅に低減する。ダイゼインは、パルミテート刺激によるNF-κBDNA複合体の形成を阻害する。よって、構造1のダイゼインおよび構造2のダイジンは、PCー3および乳がんにおけるNF-κB遺伝子発現を阻害することによって、前立腺がんおよび乳がんに対して予防効果を発揮する。これら2つの化合物は、NF-κB転写を阻害することによって治療上活性となるため、糖尿病、関節炎およびアルツハイマー病といった重篤な疾患の治療に有益である。構造1のダイゼインおよび構造2のダイジンは、クロマトグラフィーによりダイズの葉から得た。ダイゼインおよびダイジンは、天然のものでも市販/合成されたものでも生物活性は同じである。例として以下の実施例を示すが、本発明の範囲を制限するものではない。実施例1ダイズの葉からダイジンを抽出および精製した。イソフラボンの一種であるダイジンを、溶媒分画、すなわち、ダイヤイオンHP-20およびM-ボンダパックC-18を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって、ダイズGlycinemaxの葉から単離および精製した。その構造を、1HNMR、13CNMRおよびQ-TOF-MSによって確認した。新鮮葉100gからなる植物材料をグラインダー付きミキサーで粉砕し、200mlのエタノール/水混合液70/30体積比に一晩浸漬した。濾過により抽出物を得、その植物性材料を再び未使用のエタノール性溶液である200mlのエタノール/水混合液70/30体積比に一晩浸漬した。このプロセスを3回繰り返す。混合抽出物を、減圧下、50°C未満で濃縮した。そして、濃縮された抽出物を、ヘキサン抽出100ml×3により脱脂した。次に、脱脂された水層を、クロロホルム、続いて酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下、50°C未満で蒸留した。次に、得られたゴム状の物質を、酢酸エチル、メタノール50/酢酸エチル、メタノール、および水45/メタノールを用いて、シリカゲルカラムによるクロマトグラフにかけた。水45/メタノールによる溶出で得られた画分が、それぞれダイゼインとダイジンであることがわかった。これら2つの画分を、水45/メタノールで溶出するC18RPカラムによるフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製して、純粋なダイゼインおよびダイジンを得た。単離された化合物を、Luna-C182カラムを用いて、HPLCウォーターズ社製HPLC装置によりさらに確認した。メタノール45/水体積比を溶媒系として使用し、流速1ml/分で35分間行った。10マイクロリットルの試料を注入して、232nmの紫外線でIクロマトグラムを記録した。その際、ダイゼインはクロマトグラム上の保持時間5.6分に現れ、ダイジンはクロマトグラム上の保持時間8.76分に現れた。そして、それぞれの構造を、IR、1H-NMR、13CNMRおよび質量スペクトルで確認した。実施例2生体利用性ダイゼインおよびダイジンの溶液をマウスに経口投与して、15分、30分、60分、120分および240分後に血液を採取し、血清分離することにより、ダイゼインおよびダイジンの生体利用性をテストした。最初に、標準および認証ダイゼインとダイジンを用いて、血液中のダイゼインおよびダイジンのHPLC評価用に検量線を較正した。その後、認証ダイゼインを標準として用いて、ダイズの種からダイゼインを精製した。ゾーバックス社製C1845カラムを用いて、ウォーターズ社製HPLC装置でダイゼインの分析を行った。H2PO40.1/水AおよびH2PO40.1/アセトニトリルBを溶媒系として使用しBを20~80勾配で25分間、Bを80から20勾配で5分間、流速1ml/分とした。クロマトグラムはすべて、232nmの紫外線で記録した。ダイゼイン、ダイジンおよび代表的な血清試料のHPLCクロマトグラムを、図1、図2および図3にそれぞれ示した。ダイゼインのピークは、クロマトグラム上の保持時間5.6分に現れる。ダイジンのピークは、クロマトグラム上の保持時間8.76分に現れる。血清試料は、保持時間8分あたりにピークを示さない。しかし、投与15分後に採取した血清は、保持時間5.227分にピークを示した。これは、血液中にダイジンはなく、イソフラボングリコシドであるダイジンの加水分解生成物であるダイゼインが血清中に存在することを明確に示唆している。4時間後に採取した血清試料において、ダイジンの加水分解生成物が観察された。これは、血清中において相当な保持時間である4時間以上もの間、体のそれぞれの組織や臓器が、循環系の供給源からダイゼインを利用可能であることを示している。ダイゼインの生体利用性フラボン化合物は、UGTグループ酵素のグルクロン酸抱合により腸管から速やかに排出されるため、その生体利用性には問題があるアールキングKingR、1998年、アメリカンジャーナルオブクリニカルニュートリションAmJClinNutr、第68巻、1496S~1499Sページ。そのため、ダイゼインについて、その生体利用性を調べた。ダイゼインには、天然の入手可能な形態として、グルコシル化されたものダイジンとアグリコンダイゼインの2つがあり、両者を比較した場合により活性度の高いダイゼインを実験で使用した。しかし、腸管からのダイゼインの吸収率はダイジンより低かった。我々は、グルコシル化されたものを経口投与すると、血清および肝臓においてダイゼインDnとして検出することができることを見出した。これは、腸管内で糖鎖が切断されることによって、腸管内でのグルクロン酸抱合から保護されるからだと考えられる。このことは、以前のレポートにおいても実証されていたアールキングKingRおよびディービーバーシルBursillDB、1998年、アメリカンジャーナルオブクリニカルニュートリションAmJClinNutr、第67巻、862~872ページ。したがって、生体研究においても将来の治療用としても、Dnの生体利用性が問題になることはないだろう。実施例3インスリン抵抗性におけるNF-κBの役割について数多くのレポートがあるが、その詳細なメカニズムはよくわかっていない。最近の証明によると、脂質誘発によるNF-κB活性の亢進が、インスリン抵抗性や2型糖尿病において重要な役割を果たしていることが示されている。κBキナーゼ阻害剤IKKの活性化により、NF-κBの阻害剤であるIκBがリン酸化される。IκBは、リン酸化されるとプロテアソーム分解され、その結果NF-κBが放出されて、NF-κBが核内へと移行する。NF-κB活性化の阻害はインスリン抵抗性を改善するものの、IκBおよびNF-κBの過剰な活性がインスリン抵抗性とリンクしていることは以前から示されていたディーカイCaiD、エムユアンYuanM、ディーエフフランツFrantzDF、ピーエーメレンデスMelendezPA、エルハンセンHansenL、ジェイリーLeeJ、およびエスイーシュールソンShoelsonSE、2005年、ローカルアンドシステマティックインスリンレジスタンスリザルティングフロムヘパティクアクティベーションオブアイケーケーベータアンドエヌエフカッパビーLocalandsystemicinsulinresistanceresultingfromhepaticactivationofIKKβandNFκB、ネイチャーメディスンNatMed、第11巻、183~190ページ。以前、我々は、パルミテートによるNF-κBの過剰発現がインスリン抵抗性と関係していることを報告したバルマ他Barmaetal、2009年。NF-κBは、糖尿病を制御するだけでなく、がん、関節炎およびアルツハイマー病といった炎症性の疾患の大半とも関連している転写因子である。したがって、強力なNF-κB阻害剤を見つけ出す必要がある。我々は、ダイズの葉から、ダイジンとして知られるイソフラボングリコシドを単離した。腸管細胞において、ダイジンは加水分解されてダイゼインを形成する。我々は、ダイジンおよびダイゼインのいずれもがNF-κBの遺伝子転写およびタンパク質合成を効果的に阻害することができることを見出した。ダイズイソフラボンであるダイゼインとゲニステインについては、現在臨床研究において調査が進められている。ゲニステインは、免疫機能、脳機能およびDNA修復に対して悪影響を及ぼす可能性があるとの懸念があることが報告されているディージェイキムKimDJ、エスエッチソクSeokSH、エムダブルボクBaekMW、エッチワイリーLeeHY、ワイアールナNaYR、エスエッチパクParkSH、エッチケーリーLeeHK、エヌケードゥッタDuttaNK、ケーカワカミKawakamiKおよびジェイエッチパクParkJH、2009年、デベロプメンタルトクシティアンドブレインアロマテーズインダクションバイハイジェニステインコンセントレーションズインゼブラフィッシュエンブリオズDevelopmentaltoxicityandbrainaromataseinductionbyhighgenisteinconcentrationsinzebrafishembryos、トクシコロジーメカニズムズアンドメソッズToxicologyMechanismsandMethods、第19巻、251~256ページ。ダイゼインはこうした副作用とは無縁であり、より効果的である。ダイゼインは、栄養補助食品に含まれており、ダイズ、マメ科植物およびエンドウマメにも含まれているが、生体利用性の問題がある。ダイジンを使うことにより、この問題を回避することができるであろう。実施例4NF-κB発現の阻害をモニターするため、L6骨格筋細胞株を使ってアッセイを行ったところ、インスリン活性がNF-κBによって阻害された。NF-κBがインスリン活性を阻害することはよく知られている。L6筋管または骨格筋細胞をパルミテートと共に、パルミテートなしに、またはパルミテートダイゼインと共にインキュベートした。細胞のインキュベーションが終了する前に、これらインキュベーション物に100nMのインスリンと[3H2-DOG]を加えた。パルミテートによってインスリン刺激によるグルコース取り込みが大幅に減少した一方で、ダイゼインとの共インキュベーションによりパルミテートの逆作用が著しく減少した図4A。L6筋管にGFP-Glut4プラスミドをトランスフェクトした後、パルミテートと共に、またはパルミテートダイゼインと共にインキュベートした。インキュベーション終了30分前にインスリンを加えた図4B。パルミテートによって、NF-κBp65およびNF-κBp50のいずれのタンパク質レベルも大幅に上昇した図4C。パルミテート誘発によるNF-κBの遺伝子およびタンパク質発現の増加は、濃度および時間依存的であった図4D、E。実施例5ウェスタンブロット法により細胞内のNF-κB含有量を測定したところ、パルミテート刺激されたNF-κBが、ダイゼインにより大幅に減少したことがわかった図5A。半定量RT-PCRおよび定量リアルタイムPCR分析によると、パルミテートでインキュベートしたL6筋管ではNF-κB遺伝子発現が大幅に増加したが、その増加がダイゼインによって防止されたことがわかった図5B。これらの結果は、ダイゼインがNF-κB遺伝子発現を阻害することを示唆している。すなわち、ダイゼインは、NF-κBの遺伝子転写を阻害することによって、パルミテートに起因するNF-κBタンパク質の過剰発現の阻害を成し遂げる。ダイゼインのフラボングリコシドであるダイジンも、パルミテート誘発によるNF-κBの遺伝子発現およびタンパク質合成を低減した図2C。実施例6L6筋管を、パルミテートと共に、またはパルミテートなしでインキュベートし、超音波処理により溶解した後、遠心分離した。上澄み液を採取して、セファデックスG75カラムに添加した。これら細胞からの溶出プロファイルから、パルミテート処理したものA2は、対照A1と比較してNF-κBp65タンパク質が増加したことがわかった。これらインキュベーション物からの溶出画分を、抗NF-κBp65抗体による免疫親和性クロマトグラフィーにかけて、さらに精製した。免疫親和性クロマトグラフィーからの溶出画分P2は、ウェスタンブロット分析において、抗NF-κB抗体との交差反応性を示している図6。我々は、パルミテート誘発によるNF-κB合成の増加が、ダイゼインによって防止されることを見出した。実施例7精製したNF-κBp65タンパク質をL6骨格筋細胞にトランスダクトした後、その細胞をインスリンおよび[3H]-2DOGと共にインキュベートして、細胞への過剰なNF-κBp65タンパク質の侵入がインスリン活性に影響を及ぼすかどうか観察した。NF-κBp65タンパク質がトランスダクトされた細胞において、グルコースの取り込み量が減少したが、ダイゼインにより減少が防止された図7A。ウェスタンブロット分析により、NF-κBp65タンパク質のトランスダクションによる細胞内のNF-Bp65の増加レベルを確認した図7B。NF-κBp65タンパク質を、GFP-Glut4によりトランスフェクトされた骨格筋細胞1バッチ分にトランスダクトした後、インスリンとインキュベートした。インキュベーションが終わると、カバーガラス上の細胞をパラホルムアルデヒド3.5に定着させた。レーザー走査共焦点顕微鏡でカバーガラスを観察して、GFP-Glut4の移行を調べた。インスリンとの反応によるGFP-Glut4の原形質膜への移行は、NF-κBp65をトランスダクトした細胞内では抑止されていたが、その抑止はダイゼインによって防止された図7C。実施例8パルミテートの活性化は、NF-κBの核局在化の増加につながる。FITC結合抗NF-κBp65抗体を使った免疫蛍光研究により、骨格筋細胞内のNF-κBの推移を観察した。細胞質においても核領域においても、パルミテートにより亢進されたNF-κBレベルがダイゼインによって阻害された図8。実施例9パルミテート誘発によるNF-κBの核内への移行の増加は、NF-κBとDNAとの結合の増大と符合する。EMSAを行って、このことを調べた。NF-κBとDNAとの複合体の形成はパルミテートにより刺激されたが、ダイゼインとSN-50はこのタンパク質とDNAとの複合体の形成を低減させた図9A。パルミテートは、NF-κBとそのκBエンハンサー因子との結合を誘発し、NF-κB自身の遺伝子発現を制御するバルマ他Barmaetal、2009年一方、ダイゼインはこの結合を阻害するため、NF-κBの遺伝子発現を不活性化する。このことは、NF-κBが自動制御ループを有しており、それによりNF-κB自身の遺伝子発現をコントロールすることを示唆している。パルミテート誘発によるIKKおよびIκBκのリン酸化はダイゼインによる影響を受けない。すなわちこれは、ダイゼインがNF-κB活性化経路に影響を及ぼさないことを示唆している図9B。実施例10ダイゼインは、パルミテート誘発によるNF-κBプロモーターの活性を阻害する。パルミテートなしで対照、パルミテートと、およびパルミテートダイゼインと共に細胞をインキュベートした。パルミテートとのインキュベーションによりNF-κBプロモーターの活性は著しく増大したが、ダイゼインはパルミテートの刺激効果を軽減した図10A。また、FACS分析をおこなって、対照細胞およびパルミテート処理した細胞におけるNF-κBタンパク質レベルを観察した。フローサイトメトリー分析により、パルミテートとの反応によるNF-κBの増加レベルがダイゼインにより著しく阻害されたことがわかった図10B。実施例11NF-κBは、多くの炎症遺伝子の転写を制御する。NF-κBは、インスリン受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるフェチュインAの転写を制御する。初代肝細胞をパルミテートなしで、またはパルミテートと、もしくはパルミテートダイゼインと共にインキュベートした。パルミテートは、フェチュインA遺伝子の発現を著しく誘発した。NF-κBsiRNAまたはダイゼインの添加は、NF-κBの発現を阻害することによってフェチュインAの合成を阻害する図11。ダイゼインは、NF-κB遺伝子発現を防止することにより、NF-κBの下流シグナル伝達を調節する。実施例12ダイゼインは、前立腺がんおよび乳がんに対しても予防効果がある。濃度5μg/mlのダイゼインは、PC-3アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞株図12AおよびMCF-7乳がん細胞株図12BにおけるNF-κB遺伝子発現を低減する。方法本願請求項の理解のため、NF-κB遺伝子転写の阻害におけるダイゼインDnの役割に関連した結果を得るために利用した手法の詳細について説明する。NF-κBのリン酸化体である活性NF-κBの、当該イソフラボンによる阻害に関するレポートはいくつかあるが、NF-κBの遺伝子およびタンパク質合成の阻害についてのレポートはこれまで全くない。本願の新規性はそこにある。1.試薬組織培養材料はすべて、ギブコBRLライフテクノロジーズ社米国、ゲイサーズバーグから入手した。[3H]-ロイシン比活性度1000Ci/mmolは、GEヘルスケア香港、九龍から入手した。[γ32p]-ATP比活性度6000Ci/mmolは、BRIT社インドから調達した。NF-κBp65、pNF-κBp65、pΙΚΚα/β、pΙκBαおよびβ-アクチン用の一次抗体は、サンタクルスバイオテクノロジー社米国カリフォルニア州から購入した。対照およびNF-κBp65hsiRNAも、サンタクルスバイオテクノロジー社米国カリフォルニア州から購入した。フルオレセインイソチオシアネートFITC結合ヒツジ抗ウサギ抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体は、シグマケミカル社米国、ミズーリ州セントルイスから購入した。その他化学薬品および試薬は、シグマケミカル社米国、ミズーリ州セントルイスから購入した。2.細胞株および細胞培養乳がん細胞株MCF-7、前立腺がん細胞株PC-3、およびLー6骨格筋細胞株は、米国ジョージタウン大学のパルタピーバネルジー博士DrParthaPBanerjeeから贈呈されたATCC寄託番号MCF-7、HTB-22、PC-3、CRL-1435、L6-CRL-1458。これらの細胞を、37°Cの加湿した95O2/5CO2雰囲気において、アール塩および非必須アミノ酸を含み、10ウシ胎児血清、ペニシリン100U/mlおよびストレプトマイシン100μg/mlを加えたDMEM培地で培養した。3.細胞培養処理融合性細胞をトリプシン処理により継代培養し、続いて必須添加物を加えたDMEM培地を含む6穴培養皿に幡種した。融合性MCF-7細胞を3μg/mlのダイゼインDnとインキュベートし、PC3細胞を5μg/mlダイゼインとインキュベートした。ダイゼインをDMSOに溶かした。対照細胞は、培地において同量のDMSOで処理した。インキュベーション終了時に、細胞を溶解し、10000gで10分間遠心分離し、上澄み液を採取した。上澄み液のタンパク質濃度を、以下のローリー他Lowryetalの方法で求めたオーエッチローリーOHLowry、エヌジェイローズブローNJRosebrough、エーイーファーAEFarr、アールジェイランドールRJRandall、プロテインメジャーメントウィズフォリンフェノールリエージェントProteinmeasurementwithFolinphenolreagent、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリーJBiolChem、第193巻1951年、265~275ページ。リポフェクタミン2000インビトロジェン社米国、カリフォルニア州カールズバッドを使って、同社の指示に従い、スクランブルsiRNAおよびNF-κBp65siRNAをトランスフェクトした。4.ウェスタンブロット我々の以前の記述に従って、ウェスタンブロットを行ったエスダスグプタSDasgupta、エスバッタチャルヤSBhattacharya、エービスワスABiswas、エスエスマジュムダールSSMajumdar、エスムコパディヤイSMukhopadhyay、エスレイSRay、およびエスバッタチャルヤSBhattacharya、2010年、エヌエフカッパビーメディエイツリピッドインデュースドフェチュインエーエクスプレッションインヘパトサイツザットインペアズアディポサイトファンクションエフェクティングインスリンレジスタンスNFκΒmediateslipidinducedfetuinAexpressioninhepatocytesthatimpairsadipocytefunctioneffectinginsulinresistance、バイオケミカルジャーナルBiochemJ、第429巻、451~462ページ。要約すると、対照または処理済み細胞溶解物からのタンパク質40~50μgを10または12.5SDS-PAGEで分離し、セミドライ式トランスブロット装置トランスブロット登録商標SDセル、バイオラッド社、米国を用いて、PVDF膜ミリポア社、米国、ベッドフォードに転写した。SNAP識別装置ミリポア社、米国、ベッドフォードを使って、まず希釈率1:1000で様々な一次抗体と共に、続いて同じ希釈率でアルカリホスファターゼ結合二次抗体それぞれと共に膜をインキュベートした。5-ブロモー4-クロロー3-インドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウムBCIP/NBTを使って現像することにより、タンパク質のバンドを検出した。5.RT-PCRおよびリアルタイムPCRTRI試薬を使って、その製造会社のプロトコルに従って、様々なインキュベーション物から全RNAを抽出した。第1cDNA鎖合成キット、リバートエイド登録商標ファーメンタスライフサイエンス社、米国メリーランド州ハノーバーを使ってRT-PCRを行った。リアルタイムPCRアプライドバイオシステムズ社、米国カリフォルニア州により、相対遺伝子発現をさらに確認した。以下の反応条件で、遺伝子特異プライマーを使ってPCRを行った。すなわち、初回活性化工程:95°Cで15分、変性:95°Cで30秒、アニーリング:50°C~55°Cで30秒、最終伸長:72°C、30秒を40サイクルとした。別反応でgapdhを同時に増幅した。CT値は、対応するgapdh対照を使って補正した。使用したプライマーシーケンスは以下のとおりである。すなわち、NFーκBp65順方向5ccatcagggcagatctcaaacc3、逆方向5gctgctgaaactctgagttgtc3、遺伝子バンク受入番号:NM0219753、Bcl-2順方向5TGGGATGCCTTTGTGGAACT3、逆方向5GAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC3、遺伝子バンク受入番号:NM0006571、サイクリンD1順方向5GGATGCTGGAGGTCTGCGAGGAAC3、逆方向5GAGAGGAAGCGTGTGAGGCGGTAG3、遺伝子バンク受入番号:NM0530562。gapdh順方向5gccatcaacgaccccttc3、逆方向5agccccagccttctcca3、遺伝子バンク受入番号:J040381。6.NF-κB精製のためのゲル濾過および免疫親和性クロマトグラフィーNF-κBを多量に含んだ画分を調製するため、Tris-Cl緩衝液10mMのTris-Cl、pH7.4で平衡化したセファデックスG-75アマシャムファルマシアバイオテク社、スウェーデン、ウプサラカラム2×50cmを使って、我々の研究室において以前作成した以下の記述に従い、ゲル濾過クロマトグラフィーを行ったディーバスDBasu、エスバッタチャルヤSBhattacharya、ピュリフィケーションオブトゥータイプスオブゴナドトロピンレセプターズフロムカープオバリアンフォリクルズ:オーバーラッピングレコグニションバイトゥーディファレントリガンズPurificationoftwotypesofgonadotropinreceptorsfromcarpovarianfolliclesoverlappingrecognitionbytwodifferentligands、ジェネラルアンドコンパラティブエンドクリノロジーGenCompEndo、第129巻2002年、152~162ページ。流速1ml/分を維持し、骨格筋細胞溶解物を添加した直後に1.0mlの画分を採取した。標準ゲル濾過分子量マーカーシグマケミカル社、米国、セントルイスを作動させて溶出したタンパク質の分子量の概算を求めた。およそ66kDaの画分をプールし、凍結乾燥して体積を減らし、10SDS-PAGEにかけた。そこでNF-κBp65を同定するために、ゲルをウェスタンブロット分析用のPVDF膜に転写した。免疫親和性クロマトグラフィーによりCNBr活性セファロース4Bビーズを抗NF-κBp65抗体と結合させ、さらに精製を行った。我々の研究室において以前作成した以下の手順により、抗体の結合を行った。要約すると、セファロース4Bビーズに結合したNF-κBp65抗体を5mlカラムに添加した。カップリング緩衝液pH8.5、続いて酢酸緩衝液0.1M、pH4.0で洗浄することにより、非結合の抗体を除去した。ビーズ上に残った活性基をグリシン緩衝液0.2M、pH8.0でブロックした。サンプルをカラムに添加し、4°Cで一晩おいた。非結合のタンパク質は10mMのトリス塩酸緩衝液pH7.4で溶出し、リガンドに結合したNF-κBp65は、カオトロピック剤として2.0MのKIを含む溶出緩衝液10mMトリス塩酸、pH7.4で溶出した。各溶出画分は1.0mlであった。280nmでの吸光度がベースラインに達するまで画分を採取し、プールし、透析によって緩衝液10mMトリス塩酸、pH7.4を排除し、凍結乾燥した。NF-κBp65の純度を10SDS-PAGEで調べたところ、抗NF-κBp65抗体と交差反応したタンパク質のバンドが一本現れた。7.電気泳動移動度シフト解析EMSANF-κB結合部位に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、がん細胞の様々なインキュベーション物質から作製した核抽出物を使って、EMSAを行った。プローブは、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ32p]-ATPで末端標識した後、10μgの対照細胞、およびDn処理したMCF-7およびPC3細胞の核抽出物と共に、20μlの結合反応液中で45分間インキュベートした。反応混合物を5ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ホスフォイメージャーGEヘルスケア社、米国で視覚化した。8.[3H]-ロイシン取り込みについての検討0.2ウシ血清アルブミンを加えたクレブスリンガーリン酸KRP緩衝液において、MCF-7およびPC3細胞をインキュベートした。NF-κBp65タンパク質合成に対するDnの効果を判定するために、Dn存在下、Dn不在下で、10μCi/mlの[3H]-ロイシンと共に細胞をインキュベートした。また、NF-κBp65siRNAまたはスクランブルsiRNAにより細胞をトランスフェクトした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解し、抗NF-κBp65抗体でNF-κBp65をプルダウンした。放射線計測によるNF-κBp65への取り込み量を液体シンチレーションカウンターパーキンエルマー社製Tri-Carb2800TRで測定した。9.[γ32p]-ATP取り込みについての検討MCF-7およびPC3細胞を、ダイゼインDnなしで、もしくはダイゼインと共にインキュベート、または80μMの[γ32p]-ATP存在下で、NF-κBp65siRNAまたはスクランブルsiRNAによりトランスフェクトした。インキュベーション終了時に、細胞溶解物を、抗pNF-κBp65抗体による免疫沈降にかけた。放射線計測によるpNF-κBp65への取り込み量を液体シンチレーションカウンターパーキンエルマー社製Tri-Carb2800TRで測定した。実施例13MCF-7およびPC3細胞をDn処理なしConもしくはDnそれぞれ3μg/mlと5μg/mlで処理、またはNF-κBp65siRNAp65KOもしくはスクランブルsiRNAモックによりトランスフェクトした。対照細胞は、溶媒としてDMSOを含んでいた。これら細胞から抽出した全RNAに対して、NF-κBp65遺伝子特異プライマーを用いて定量PCRを行った。内部標準としてgapdhを用いた。MCF-7およびPC3細胞をDnなしで、もしくはDnと共にインキュベート、またはNF-κBp65siRNAp65KOもしくはスクランブルsiRNAモックでトランスフェクトした後、[3H]-ロイシンまたは[γ32p]-ATPとのインキュベーションを行った。細胞溶解物からNF-κBp65またはpNF-κBp65をプルダウンし、放射標識されたロイシンまたはリン酸塩のNF-κBp65またはpNF-κBp65への取り込み量を、液体シンチレーションカウンターによる放射線計測により求めた。5回別個に行った実験のうち代表例のひとつを図に示す。示されたデータは平均値±標準誤差であり、p001vsCon、p0001vsCon。以上の結果は、p65siRNAおよびフラボノ化合物であるダイゼインDnによるNF-κBp65遺伝子発現の抑制により、がん細胞において不活性型およびリン酸化型いずれのNF-κBも減少したことを示している。NF-κB抑制のためにp65siRNAおよびDnを両方選択する理由は、NF-κBp65siRNAはそのmRNAを特異的に阻害し、Dnは、NF-κBが結合してその遺伝子を発現させるプロモーターκBセグメントを占有するからである。そこで、NF-κB依存型のがん細胞における不活性NF-κBと活性NF-κBとの平衡の重要性について検討するため、2つの方式でNF-κB遺伝子抑制を行った。MCF-7およびPC3細胞におけるNF-κB遺伝子発現が阻害されることにより、結果的にそのタンパク質の発現を低減することになり、このことはリン酸型NF-κBの大幅な減少とも符合した。このような発現の低減が、NF-κBタンパク質合成の阻害と、その結果としてのリン酸化の抑制によるものなのかを調べるため、MCF-7およびPC3細胞を[3H]-ロイシンもしくは[γ32p]-ATPと共にインキュベートした後、活性NF-κBと不活性NF-κBとをそれぞれの抗体と共に免疫沈降した。NF-κBp65siRNAまたはDnによりNF-κB遺伝子発現が抑制されたため、NF-κBタンパク質合成が顕著に低減された。このことは、リン酸化NF-κBの大幅な減少と一致しており、これら細胞における活性NF-κBのプールが、そのデノボ合成に依存的であることを示している。本発明の効果1.これまでNF-κB合成の阻害剤は報告されていない。ダイゼインは、NF-κBp65の転写を阻止するので、NF-κB遺伝子発現の効果的な阻害剤であるということが判明したので、これが達成されたことに我々の研究調査の新規性がある。2.ダイゼインは、NF-κB遺伝子発現を低減することによりその合成を阻害する。3.ここ数年、肺がん、乳がん、膵臓がん、大腸がん、脳腫瘍といったがんにおいて、NF-κBが過剰発現した状態にあるとのレポートがいくつかある。こういったがんにおいてNF-κBが強い発現を示すのは、これらのがんがNF-κBに依存的だからであると報告されている。このようなNF-κBの過剰発現には、これらがん細胞の生存性が必要であるサイトウ他Saitohetal、2010年、カンサーCancer、第70巻、263~270ページ、ユー他Yuetal、2003年、オンコロジーOncology、第65巻、37~45ページ、ユー他Yuetal、2004年、インターナショナルジャーナルオブコロレクタルディジーズIntJColorectalDis、第19巻、18~22ページ。したがって、このようなNF-κB依存型がん細胞においては、NF-κB発現の阻害剤が、がん細胞の成長および生存性にとって適切な処置となるであろう。ダイゼインは、我々のこれまでの研究を通じて知られた唯一のNF-κB発現阻害剤であるため、上記の目的にかなうであろう。これこそまさにダイゼインの大きな利点である。