シトクロムc6タンパク質に50~80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加されてなる融合タンパク質又はその変異型タンパク質であって、以下の、、若しくはのタンパク質であることを特徴とする、前記融合タンパク質又はその変異型タンパク質。配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質請求項1に記載の融合タンパク質又はその変異型タンパク質をコードする遺伝子であって、以下の若しくはのDNAを含むことを特徴とする、前記遺伝子。配列番号5に示される塩基配列を含むDNA配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA請求項2に記載の遺伝子を含む組換えベクター。請求項3に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。宿主がアグロバクテリウム属に属する微生物である、請求項4に記載の形質転換体。請求項2に記載の遺伝子が植物ゲノム中に導入されている、形質転換高等植物。植物細胞中の葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を有するものである、請求項6に記載の形質転換高等植物。以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願200527012号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。1.本発明の概要本発明は、シトクロムc6とシグナルペプチドとの融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物内に導入し、高等植物細胞内の葉緑体中のチラコイド内腔において、光合成明反応の電子伝達体としての役割を果たすシトクロムc6を発現させ且つ機能させることにより、高等植物の生長を促進させる方法に係るものである図2。本発明により、高等植物細胞内でのATP、NADPH、デンプン及びタンパク質の合成が促進され、またこれに伴い、二酸化炭素を炭水化物に変換する光合成暗反応炭素固定反応も促進され得る。本発明は、このような、高等植物におけるATP等の合成や炭素固定を促進する方法を含み、また、生長促進、ATP等の合成促進、及び炭素固定の促進がされ得る高等植物の作出方法をも含むものである。一般に、光合成明反応光合成電子伝達反応においては、クロロフィルの電子が太陽光のエネルギーを獲得し、チラコイド内腔チラコイド膜中の電子伝達鎖を次々と移動するが、その際、クロロフィルは水から電子を獲得し、酸素O2を遊離する一方、上記電子伝達反応に伴いチラコイド膜を介してHのくみ出しが起こり、それで生じたプロトンの駆動力によって葉緑体のストロマ内でATPが合成される。そして、一連の反応の最後では、高エネルギー電子をHとともにNADPが受け取り、NADPHが合成される。これに対し、光合成暗反応炭素固定反応では、光合成明反応で合成されたATPとNADPHがそれぞれエネルギー源と還元力として働くことで、葉緑体のストロマ内及び細胞質において、CO2が炭水化物に変換される。この炭素固定反応により、植物の葉等ではショ糖が合成される。ショ糖は、他の組織にも輸送され、様々な有機分子の合成材料として、ひいては植物自身の生長のためのエネルギー源として用いられる。通常、高等植物における光合成明反応の電子伝達体電子伝達タンパク質は、プラストシアニンであるが、電子伝達能酸化還元電位の高さに関しては、藻類における電子伝達体であるシトクロムc6の方が明らかに優れていることが分かっている図3。そのため、従来から、このシトクロムc6を高等植物内でも発現及び機能させ、光合成明反応及び暗反応を促進させようとする試みが種々なされてきた。しかしながら、このような試みは、実際のところ極めて困難であり、これまで成功例は無かった。高等植物において、その細胞内のゲノム情報をもとに発現されたタンパク質が光合成明反応の電子伝達体としての機能を発揮するためには、チラコイド内腔に存在することが必須条件となる。そのためには、通常、葉緑体包膜及びチラコイド膜の2種の膜を通過する必要がある。この点が高等植物におけるシトクロムc6の機能発現を極めて困難にしている主要因であると考えられていた。そこで本発明者は、遺伝子組換え技術により、シトクロムc6遺伝子を高等植物のゲノム中に導入するにあたり、シトクロムc6タンパク質が、特定のシグナルペプチド特定の長さ又は特定のアミノ酸配列のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質の状態で発現されるように、予めシグナル配列を付加した遺伝子を構築した上でその導入を行った。その結果、当該遺伝子導入により作出した植物体においては、チラコイド内腔にシトクロムc6タンパク質シグナルペプチド無しの存在が認められ、結果として、発現した融合タンパク質はそのシグナルペプチドの働きにより前述した2種の膜を通過し得るものであることが示され、本発明を完成した。PYC6遺伝子導入系の検討これまでに、PYC6の酸化還元電位は高電位であることが知られており、また、そのPYC6遺伝子配列も明らかにされている。本発明においては、はじめにPYC6遺伝子をバイナリーベクターに連結し、形質転換用アグロバクテリウムを調製した。シロイヌナズナは、播種後低温処理を行ったのち長日条件で生育させ、抽台した段階で減圧浸潤により形質転換を行った。つづいて、得られた形質転換体において遺伝子の導入と発現を解析するため、植物体から抽出したゲノムDNAとRNAを鋳型とし、それぞれPCR、RTPCRを行った。その結果、PYC6遺伝子の増幅が見られ、DNAシーケンサーによりその塩基配列はPYC6遺伝子と同様であることを確認した。次に、形質転換体中に確認されたPYC6遺伝子がタンパク質として発現しているかを解析するため、植物体から葉緑体タンパク質画分を抽出し、電気泳動後ウエスタンブロッティングを行った。その結果、PYC6タンパク質の発現を確認した。また、得られた形質転換体中のPYC6タンパク質のN末端アミノ酸配列を解析したところ、導入したPYC6のアミノ酸配列PIRaccessionNoJC5849と一致した。この結果から、高等植物であるAthaliana内で藻類由来cytc6PYC6を発現させることに成功した。PYC6導入による植物体の影響後述の実施例に示すように、PYC6導入植物の生育を観察したところ、葉の大きさは野生型WTに比べおよそ12~13倍、背丈は約15倍増大していた。PYC6導入植物は生育初期段階においてWTと比較して成長速度が上昇していた。また、PYC6導入植物中のクロロフィル量を測定した結果、WTのおよそ11~12倍であった。このPYC6導入により植物体にみられた現象は、明反応最終産物であるエネルギー物質を利用して光合成反応全体が活性化されたためではないかと考えられる。そこで、ルシフェリンルシフェラーゼ法によりPYC6導入植物のATP量を測定した結果、WTと比較して約17倍増大していた。これはAthalianaにおいて機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たな電子伝達体として紅藻cytc6が機能したことにより、明反応の電子伝達が活性化され、その最終生成物であるATP量が増大し、さらには植物全体の生育が活性化されたためと考えられた。なお、当該融合タンパク質が前述した2種の膜を通過するに際しては、第1の膜葉緑体包膜の通過時にはシグナルペプチドの一部が、第2の膜チラコイド膜の通過時にはその残りの部分が使用され、それぞれ使用後は脱離した後、最終的にシグナルペプチドの無い状態でPYC6がチラコイド内腔に輸送される。そして輸送されたPYC6タンパク質は、このチラコイド内腔でヘムヘムcと結合し且つフォールディングすることにより電子伝達体として機能し得るシトクロムc6になると考えられる。2.新規高等植物の作出方法本発明の作出方法は、前述の通り、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を有する新規な高等植物の作出方法であり、シトクロムc6タンパク質に50~80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入することを特徴とする方法である。作出対象となる高等植物本発明の作出方法に用い得る高等植物、すなわち葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を有するよう形質転換され得る高等植物としては、限定はされず、例えば以下の高等植物を挙げることができる。本発明において対象となる植物は、植物体全体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞カルスなどの組織培養を含むのいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、C3、C4、CAM植物、及びこれらの中間植物等のすべてを含み、例えばアブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科、アカザ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、ヒユ科、パイナップル科、サボテン科、及びアロエ科等に属する植物果実、野菜、花卉等を含むが挙げられるが下記参照、これらの植物に限定されるものではない。C3植物アブラナ科:シロイヌナズナ、ダイコンなどナス科:タバコ、ジャガイモSolanumなどイネ科:イネ、トウモロコシ、コムギTriticunなどマメ科:ダイズ、エンドウなどアカザ科:ホウレンソウなどバラ科:ヤマザクラ、バラなどキク科:ハルジオン、タンポポなどウリ科:カボチャ、キュウリなどヒルガオ科:サツマイモIpomeaなどラン科:ウチョウランPoneorchisなどC4植物イネ科:トウモロコシ、サトウキビSaccharumofficinarum、アワなどヒユ科:アマランサスなどCAM植物パイナップル科:パイナップルなどサボテン科:デフューサ、オプンティアなどアロエ科:キダチアロエ、アロエベラなどC3C4中間植物ツルナ科:クルマバザクロソウなどイネ科:キビなどなかでも、本発明の作出方法の効果として、生長促進効果の高い植物が得られる点を考慮すると、例えば、より市場性の高い植物のほうが本発明の利用価値が高く、具体的には、葉物ホウレンソウ、キャベツなど、花物バラ、コチョウランなど、茎物ジャガイモ、レンコンなど、根物ゴボウ、ダイコンなど、穀物イネ、コムギなど、果実物パイナップル、ブドウなど、観賞用植物マツ、カエデなど、木材スギ、ヒノキなどなどが好ましく挙げられる。融合タンパク質本発明の作出方法においては、高等植物のゲノム中に特定の融合タンパク質をコードする遺伝子を導入するが、当該融合タンパク質は、シトクロムc6タンパク質に特定の長さのシグナルペプチドが付加された融合タンパク質であることが重要である。上記融合タンパク質は、シグナルペプチドの長さが50~80アミノ酸残基であることが重要である。このようにシグナルペプチドが十分に長いことにより、シトクロムc6タンパク質を葉緑体包膜及びチラコイド膜のいずれにも通過させることができる。シグナルペプチドの配列は、高等植物から遺伝子クローニングすることにより決定することができる。なお上記融合タンパク質におけるシグナルペプチドは、一般に、シトクロムc6タンパク質のN末端に付加されていることが好ましい。本発明においては、上記融合タンパク質は、例えば、以下の、、又はのタンパク質であることが好ましい。配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ電子伝達能を有するタンパク質配列番号6に示されるアミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列及び前記シトクロムc6タンパク質に相当するアミノ酸配列においてそれぞれ1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質上記のタンパク質は、配列番号6に示すように、シトクロムc6タンパク質を構成する85個のアミノ酸配列番号2を含む配列のN末端側に、シグナルペプチドを構成する72個のアミノ酸配列番号4からなる配列が付加連結されてなる、合計157個のアミノ酸を含むものであるが、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質であってもよい。但し、シグナルペプチドは、上記72個に限定されるものではない。ここで、シトクロムc6タンパク質の由来は特に限定されるものではなく、紅藻Porphyrayezoensis、ラン藻、褐藻、珪藻、および緑藻などを用いることができ、紅藻Pyezoensis由来のタンパク質であることが好ましい。Pyezoensis由来のシトクロムc6タンパク質のアミノ酸配列は公知でありPIRaccessionNoJC5849、データベース検索することにより入手することができる。上記のタンパク質は、上記のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの前記シグナルペプチドに相当する72個のアミノ酸配列配列番号4において、1個又は数個例えば1個~10個程度、好ましくは1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。なお、上記のタンパク質は、上記のタンパク質と同様に高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であることが重要であるため、例えば、第53番目~第72番目のアミノ酸など、上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。上記のタンパク質は、上記のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの前記シトクロムc6タンパク質に相当する85個のアミノ酸配列配列番号2において、1個又は数個例えば1個~10個程度、好ましくは1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ光合成明反応における電子伝達能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、上記の電子伝達能を有するタンパク質とは、本発明においては、上記のタンパク質を構成する全アミノ酸配列から前記シグナルペプチドに相当するアミノ酸配列が除かれたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ヘムヘムcと結合した後において、電子伝達能を有するタンパク質を意味する。なお、上記のタンパク質は、シトクロムc6タンパク質と同様に電子伝達能を有するタンパク質であることが重要であるため、例えば、第14番目~第18番目のアミノ酸、及び第47番目~第60番目のアミノ酸など、高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。上記のタンパク質は、上記のタンパク質を構成する全アミノ酸配列のうちの、前記シグナルペプチドに相当する72個のアミノ酸配列配列番号4において1個又は数個例えば1個~10個程度、好ましくは1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、さらに前記シトクロムc6タンパク質に相当する85個のアミノ酸配列配列番号2においても1個又は数個例えば1個~10個程度、好ましくは1個~5個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに光合成明反応における電子伝達能を有するタンパク質であればよく、限定はされない。ここで、上記の電子伝達能を有するタンパク質とは、上記のタンパク質の場合と同様の意味である。なお、上記のタンパク質は、上記のタンパク質と同様に高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するタンパク質であることに加え、シトクロムc6タンパク質と同様に電子伝達能を有するタンパク質であることも重要であるため、例えば、第53番目~第72番目のアミノ酸などの上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列や、第14番目~第18番目のアミノ酸、及び第47番目~第60番目のアミノ酸などの高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列は、上記のタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されていないものが好ましい。上記及びのタンパク質の、電子伝達能の有無及び電子伝達能を有する場合、立体構造解析および酸化還元電位の測定を行うことにより確認測定することができる。なお、シトクロムc6の酸化還元電位は、およそ350~370mV程度である。このような配列番号6で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、MolecularCloningALaboratoryManual2nded、CurrentProtocolsinMolecularBiology、KunkelProcNatlAcadSciUSA8248892、KunkelMethodEnzymol8527636等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換又は付加等の変異型をコードする遺伝子の作製には、例えば、Kunkel法やGappedduplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTMSiteDirectedMutagenesisKitストラタジーン社製、GeneTailorTMSiteDirectedMutagenesisSystemインビトロジェン社製、TaKaRaSiteDirectedMutagenesisSystemMutanK、MutanSuperExpressKm等:タカラバイオ社製等を用いて行うことができる。遺伝子本発明の作出方法においては、高等植物のゲノム中に導入する遺伝子は、前述した融合タンパク質をコードする遺伝子であることが重要である。本発明においては、上記遺伝子は、例えば、以下の又はのDNAを含む遺伝子であることが好ましい。なお、以下の及びのDNAは、いずれも前述した融合タンパク質の構造遺伝子すなわち、シグナルペプチドをコードする遺伝子と、シトクロムc6又はこれと同様の電子伝達能を有するタンパク質の構造遺伝子とが連結した遺伝子であるが、これらDNAを含む遺伝子としては、これらDNAのみからなるものであってもよいし、これらDNAを一部に含み、その他に当該融合タンパク質の構造遺伝子の発現に必要な公知の塩基配列転写プロモーター、SD配列、Kozak配列、ターミネーター等をも含むものであってもよく、限定はされない。なお、シトクロムc6をコードする塩基配列は、例えば日本DNAデータバンクDDBJに公表されており公知であるaccessionnumber:AB40818。配列番号5に示される塩基配列を含むDNA配列番号5に示される塩基配列を含むDNAと相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつ高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNA上記のDNAは、上記のDNA若しくはそれと相補的な塩基配列を含むDNA、又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、およびサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。また、シグナルペプチド部分をコードする塩基配列配列番号3、シトクロムc6をコードする塩基配列配列番号1の両方又はいずれか一方の一部に変異が生じていてもよい。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、MolecularCloningALaboratoryManual2nded等を適宜参照することができる。ハイブリダイゼーション法を実施におけるストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩濃度が15~750mM、温度が25~65°C、好ましくは塩濃度が15~150mM、温度が45~55°Cの条件を意味する。具体的には、例えば、50mMで50°C等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件も考慮し、上記のDNAを得るための条件を適宜設定することができる。また、上記のDNAは、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーから得ることができる。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC~2×SSC、01~05SDS及び30°C~80°Cの条件が挙げられ、より詳細には、60~68°Cで30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68°Cに保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、01SDS中、室温で5~15分の洗浄を1~2回行う条件が挙げられる。ハイブリダイズするDNAとしては、上記のDNAの塩基配列に対して少なくとも70以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは80以上、さらに好ましくは90以上、さらに好ましくは95以上である。なお、上記のDNAは、高等植物の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能、並びに電子伝達能を有するタンパク質をコードするDNAであることが重要であるため、翻訳後のアミノ酸配列を考慮したときに、例えば、第53番目~第72番目のアミノ酸などの上記葉緑体包膜やチラコイド膜の通過に重要と考えられる部分のアミノ酸配列や、第14番目~第18番目のアミノ酸、及び第47番目~第60番目のアミノ酸などの高等植物の光合成明反応における電子伝達体として機能するために重要と考えられる部分のアミノ酸配列が、前述したのタンパク質のアミノ酸配列から変異置換されないような、塩基配列を有するものが好ましい。上記のDNAとしては、例えば、上記のDNAと完全に同一のものではないが、そのうちの第103番目の塩基をTからAに置換し翻訳されるアミノ酸がSerからThrになるよう変異させたもの、第216番目の塩基をCからTに置換するが翻訳されるアミノ酸には変化がないよう変異させたもの、及びこれらの塩基置換を組み合わせて変異させたもの、などが好ましく挙げられる。本発明において、上記遺伝子は、高等植物において発現させるものであるため、アミノ酸に対応するコドンが、転写後、植物一般において通常用いられているコドン好ましくは使用頻度の高いコドンを示すDNAを含むものであることが必要である。遺伝子の導入方法高等植物の他の形質を変えずに、そのゲノム中に前述した融合タンパク質をコードする遺伝子目的遺伝子を導入して、新規な高等植物形質転換高等植物を作出する方法としては、限定はされないが、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法等の公知の遺伝子組換え技術を任意に採用することができる。例えば、限定はされないが、目的遺伝子を含むバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム属細菌根頭がん種病菌を用いる減圧浸潤法等が好適である。以下に、詳細に説明する。組換えベクター前述した融合タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターとしては、限定はされないが、上記バイナリーベクターとして用い得るものが好ましい。具体的には、Vir領域遺伝子の働きで切り出されるTDNA領域を有するベクターの、当該TDNA領域中に、植物ゲノムに組込みたい目的遺伝子をGUS遺伝子の代わりに挿入して構築される組換えベクターが好ましい。上記TDNA領域を有するベクターとしては、例えば、pBI121ベクターClontech社製;カナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとし、35Sプロモーターの下流にGUS遺伝子を含む、pBI101ベクターClontech社製;カナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとし、GUS遺伝子を含む等が好ましく挙げられる。また、減圧浸潤法に用い得るものではないが、宿主細胞に適した公知の発現ベクターに、目的遺伝子を挿入して構築される組換えベクターも、本発明の組換えベクターに含まれる。必要に応じ、当該遺伝子の上流に転写プロモーターやSD配列宿主が原核細胞の場合やKozak配列宿主が真核細胞の場合を、下流にターミネーターを、PCR等により付加しておく。上記転写プロモーター等、融合タンパク質の発現に必要な各要素は、目的遺伝子に含まれていてもよいし、もともと発現ベクターに含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。このような組換えベクターは、例えば、前述した融合タンパク質の大量生産等に用いることができる。なお、これら各種組換えベクターの作製においては、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法等、公知の遺伝子組換え技術及び条件等を適宜採用して行うことができる。組換えベクターを導入してなる形質転換体組換えベクターを導入する宿主としては、限定はされないが、最終的に減圧浸潤法を行う場合は、バイナリーベクターを導入する宿主としては、アグロバクテリウム属細菌Agrobacteriumtumefaciens等を使用する。なお、アグロバクテリウム属細菌を用いる場合は、一般には、当該細菌が本来有しているTiプラスミド上のTDNA領域中のがん遺伝子が、潰されているか又は取り除かれている等して、予め形質転換されている菌体アグロバクテリウム属細菌の形質転換体を用いる。その他、組換えベクターとして発現ベクターを導入する場合は、公知の宿主、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、ヒトやマウス等の各種動物細胞等を用いることができる。宿主の形質転換の方法は、限定はされず、宿主と組換えベクターとの組み合わせを考慮して、公知の方法から適宜選択し実施することができる。例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショック法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法等が好ましく実施できる。得られる形質転換体においては、実際に用いた宿主と、組み換えベクターに含まれるEBNA1変異体遺伝子のコドン型の宿主とが、一致していてもよいし、異なっていてもよく、限定はされない。高等植物の形質転換、及び形質転換高等植物高等植物のゲノム中に目的遺伝子を導入し、形質転換高等植物を作製する方法は、限定はされないが、前述した減圧浸潤法が好ましい。また、形質転換を行う植物体の状態は、成体またはカルスを用いることが好ましい。減圧浸潤法による高等植物の形質転換方法では、具体的には、前述した融合タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換えベクターバイナリーベクターを含む形質転換細菌アグロバクテリウム属細菌の形質転換体を高等植物の葉片に感染させ、カナマイシン等の抗生物質を含む選択培地で培養し、不定芽カルスを形成させ栽培して、形質転換高等植物を得るようにする。なお、減圧浸潤法を行うにあたり、各処理工程における手段および処理条件等は、すべて公知の範囲から適宜選択して行うようにすればよく、限定はされない。上述のようにして得られた形質転換高等植物は、そのゲノム中に、前述した融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されている。当該遺伝子を基にして発現された融合タンパク質は、前述したシグナルペプチドを有し植物細胞中の葉緑体包膜及びチラコイド膜の通過能を有するものである。よって、得られた形質転換高等植物は、チラコイド内腔にシトクロムc6好ましくは光合成明反応の電子伝達体としてのシトクロムc6を有するものである。得られた形質転換高等植物においては、光合成明反応の電子伝達体として、プラストシアニンのみならずシトクロムc6も機能すると考えられ、効果的に生長促進が達成される。形質転換高等植物の成体の大きさ背丈、根長、葉の大きさ等は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは15倍以上例えば約19倍となる。また、形質転換高等植物においては、生長促進効果と同様に、各細胞中の各種分子数も増加する効果も得られる。例えば、クロロフィル分子の量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは15倍以上例えば約16倍となり、より一層光合成能が向上したものとなる。さらに、得られた形質転換高等植物は、光合成効率が向上するため、その生産物であるATP合成量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは15倍以上例えば約17倍となる。同様に、NADPHの合成量は、限定はされないが、野生型のものに比べ、例えば、11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは15倍以上例えば約17倍となる。さらに、得られた形質転換高等植物においては、ATP及びNADPHの合成量が増加することによって、これらがエネルギー源又は還元力となって働く、光合成暗反応の効率も向上したものとなる。例えば、形質転換高等植物は、二酸化炭素を炭水化物に変換する炭素固定能が、野生型のものに比べ、例えば、11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは14倍以上となる。さらに、得られた形質転換高等植物においては、光合成明反応暗反応の効率が促進されたことによりタンパク質合成の効率も向上したものとなる。例えば、形質転換高等植物は、タンパク質の含量が、例えば11倍以上、好ましくは12倍以上、さらに好ましくは15倍以上となる。また、硫酸および硝酸代謝や各種のアミノ酸合成、脂質合成量、色素ならびに花の増加なども期待できる。なお、得られた形質転換高等植物においては、上述した各種作用効果を少なくとも1種有していることが好ましいが、より好ましくは2種以上、さらに好ましくは全て有していることである。3.高等植物の生長促進方法、ATP、NADPH、デンプン及びタンパク質の合成促進方法、並びに炭素固定促進方法前述したように、得られた形質転換高等植物においては、生長促進、ATP、NADPH、デンプン及びタンパク質の合成促進、並びに炭素固定促進といった効果が認められる。よって、本発明は、高等植物の生長促進方法、高等植物のATP、NADPH、デンプン及びタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも1つの合成促進方法、並びに高等植物の炭素固定促進方法をも含むものである。これら方法は、具体的には、シトクロムc6タンパク質に50~80アミノ酸残基のシグナルペプチドが付加された融合タンパク質をコードする遺伝子を高等植物のゲノム中に導入して発現させ、葉緑体のチラコイド内腔にシトクロムc6を存在させることを特徴とするものである。これら方法において、融合タンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子の高等植物ゲノム中への導入方法、及び、得られる形質転換高等植物における種々の作用効果等については、前述した本発明の高等植物の作出方法における説明及び例示等が同様に適用できる。以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。導入用シトクロムc6遺伝子と植物発現用ベクターの構築Porphyrayezoensis由来シトクロムc6成熟タンパク領域遺伝子の調製本実施例では、Pyezoensis由来シトクロムc6遺伝子をクローニングすることにより入手し、ベクターへと連結しプラスミドを作製した。このプラスミドを鋳型として、今回の目的DNAであるPyezoensis由来シトクロムc6成熟タンパク領域遺伝子を増幅させた。その後電気泳動を行い、ゲル抽出により目的遺伝子を抽出した後に制限酵素SacIPstIで消化することで、遺伝子を調製した。反応液は、以下の組成となるように05mlアシストPCR用チューブに調製した。Primer:PYC6CtermSacI10pmolμl30merGCCont4335’GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG3’配列番号7Primer:CytSD10pmolμl29merGCCont4825’CCGCGGAGACGTTAAATTGAAGAAGAAGC3’配列番号8上記反応液にミネラルオイルを15μl重層した。その後、PTC100TMProgrammableThermalControllerを用いて反応を行った。反応は、94°Cで48秒、62°Cで48秒、72で1分24秒の反応を1サイクルとして、これを31サイクル行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物20μlにゲルローディング緩衝液4μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。2wvアガロースゲルから目的DNAと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをAmiconUltrafree登録商標DAに入れ、7300rpm4°C10min遠心分離を行った。遠心後UltrafreeMC上側のカラム部分を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、50μlのTEに溶解した。次に、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C120minインキュベートすることで制限酵素SacIによる消化を行った。インキュベート後のサンプル溶液に、等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C120minインキュベートすることで制限酵素PstIによる消化を行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物20μlにゲルローディング緩衝液4μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。その後、2wvアガロースゲルから目的DNAと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをAmiconUltrafree登録商標DAに入れ、7300rpm4°C10min遠心分離を行った。遠心後UltrafreeMC上側のカラム部分を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。結果を以下に示す。Pyezoensis由来シトクロムc6遺伝子全長が挿入されているプラスミドを鋳型とし、シトクロムc6成熟タンパク領域PYC6遺伝子をPCRにより増幅させた図4。その後PCR産物を2wvアガロースゲルTBE電気泳動を行ったところ、357bp付近に単一なバンドを確認することができた図5。このバンドがPYC6遺伝子であると考えられた。そこでこのPYC6遺伝子を2つの制限酵素SacIPstIで消化し、2wvアガロースゲルTBE電気泳動し、PYC6遺伝子SacIPstIサイト保有と思われる265bp付近のバンドをゲルから抽出し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行うことで、SacIPstIサイトを保有したPYC6遺伝子を得た。シトクロムc6への葉緑体包膜及びチラコイド膜通過ペプチド遺伝子の付加本項では、BamHIとPstIによる制限酵素処理と脱リン酸化BAP処理を行った葉緑体包膜およびチラコイド膜通過ペプチド遺伝子と、SacIとPstIによる制限酵素処理を行ったPyezoensis由来シトクロムc6成熟タンパク領域遺伝子をライゲーションさせた。その後クローニングベクターpBluescript登録商標IISKにライゲーションさせ、サブクローニングした後、植物導入用シトクロムc6spPYC6遺伝子の塩基配列を確認した。なお、下記のユニバーサルプライマーをDNAシーケンスの際に使用した。ユニバーサルFITC化ForwardprimerM13Fwprimer2pmolμl5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’配列番号9ユニバーサルFITC化ReverseprimerM13Rvprimer2pmolμl5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’配列番号10植物導入用シトクロムc6遺伝子の調製以下の組成になるように反応液を調製した。調製した反応液を低温恒温槽16°Cで一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。次に、この溶液にアルカリフォスファターゼを加え、脱リン酸化を行った。以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C3hrsインキュベートすることでBacterialAlkalinePhosphataseによる脱リン酸化を行った。インキュベート後のサンプル溶液に、等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。クローニングベクターpBluescript登録商標IISKの調製以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C5hrsインキュベートすることで制限酵素SacIによる消化を行った。インキュベート後のサンプル溶液に、等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C5hrsインキュベートすることで制限酵素BamHIによる消化を行った。反応終了後、15wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物20μlにゲルローディング緩衝液4μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TAEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。その後、15wvアガロースゲルから目的DNAと思われるバンドを切り出し、ゲル100μgを100μlに換算し、それに対しNaIsolutionを3vol加えよく撹拌し、55°Cで5分インキュベートしゲルを溶解させた。これにGLASSMILKを10μl加え、室温で15分間激しく撹拌し、14000rpm4°C5sec遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にNEWWASH300μlを加え、よく撹拌後、14000rpm4°C5sec遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を3度繰り返して得られた沈殿を乾燥させ、20μlの滅菌水に溶解させた。その後、溶液を05mlアシストPCR用チューブへと移し、14000rpm4°C30sec遠心分離を行った。得られた上清を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。植物導入用シトクロムc6遺伝子のサブクローニングシトクロムc6遺伝子のサブクローニングは、公知方法に従って行ったHanahanDJMolBiol166557580中山広樹等バイオイラストレイテッドII遺伝子解析の基礎秀潤社8388。植物導入用遺伝子と、クローニングベクターを以下の組成になるように調製した。調製した反応液を低温恒温槽16°Cで一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、150μlのコンピテントセルDH5aを氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液4μlを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で30分間放置した。放置終了後、42°Cで20秒間ヒートショックを行った。その後氷上で3分間静置し、LBAmpicillinXGalIPTGプレートにVectorInsert11、13それぞれ、菌体液100μl、50μlをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、37°Cで一晩培養した。アルカリSDS法によるプラスミド調製アルカリSDS法は、公知手法に従って行ったWeissBetalJBiolChem24345434555BirnboimHCMethodsEnzymol100243。すなわち、3mlLBAmpicillin液体培地で200rpm37°C16hrs震盪培養した菌体液を15mlずつ15mlmicrocentrifugedtubeに分注し、6000rpm4°C10min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿菌体に100μlのSolutionI50mMグルコース25mMTrisHClpH8010mMEDTAを加え、ボルテックスでよく撹拌し、200μlのSolutionIIを加え、静かに転倒させ撹拌した。5分間室温で放置後、さらに150μlのSolutionIII02NNaOH1SDSを加え、氷上で30分間放置後、100μlのクロロホルムを加え、14000rpm4°C10min遠心分離した。上清を新しいチューブに回収し、それに2倍量の995エタノールを加え、静かに転倒させ撹拌し、15分間室温で放置した。その後、500μlの70エタノールを加え14000rpm4°C10min遠心分離し、得られた沈殿を3~5分間TOMYMICROVacで乾燥させ、20μlのTEに溶かした。得られたプラスミドに目的DNAが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C120minインキュベートすることで制限酵素SacIBamHIによる消化を行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。この結果、目的DNAが組み込まれているサンプルに関してのみ、3mlLBAmpicillin液体培地での培養の残りの菌体液15mlから、100μlを5mlLBAmpicillin液体培地に植菌し、200rpm37°C16hrs震盪培養した。QIAGENSpinMiniprepKitによるプラスミドの調製5mlLBAmpicillin液体培地で培養した菌体液を6000rpm4°C10min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿菌体にキットに含まれているBufferP1を250μl加え、十分に懸濁させた。なお、QIAGENSpinMiniprepKit250QIAGENにはCollectiontube、QIAprepSpinColumn、BufferP1、BufferP2、BufferN3、BufferPB、BufferPE、BufferEBが含まれている。上記懸濁液に、BufferP2を250μl加え、静かに転倒させ溶液が均一になるまで撹拌した。さらにBufferN3を350μl加え静かに転倒させ撹拌し、13000rpm4°C10min遠心分離した。ここで得られた上清をあらかじめCollectiontubeにセットしておいたQIAprepspincolumnに移し、13000rpm4°C1min遠心分離した。Collectiontubeにたまった濾液を捨て、QIAprepspincolumnに、500μlのBufferPBを加え、13000rpm4°C1min遠心分離し、再び濾液を捨てた。さらにQIAprepspincolumnにBufferPEを750μl加え、13000rpm4°C1min遠心分離し濾液を捨て、再び13000rpm4°C1min遠心分離し、QIAprepspincolumnのみを新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移した。QIAprepspincolumnの中央に50μlのBufferEBを加え、室温で1分間放置し、13000rpm4°C1min遠心分離し、この濾液をプラスミドサンプルとした。得られたプラスミドに目的DNAが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C、120minインキュベートすることで制限酵素SacIBamHIによる消化を行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。ここで目的DNAが組み込まれており、単一性が確認されたものをシークエンスサンプルとした。ダイデオキシ法による塩基配列の決定塩基配列の決定は、オートシークエンサーを用いて公知方法SangerFSangerFDeterminationofnucleotidesequenceinDNAScience21412051210により決定した。塩基配列決定後は、解析ソフトであるGENETYXMACを用いてデータの分析を行った。結果2つの制限酵素BamHIPstI消化と脱リン酸化BAP処理を行ったsp遺伝子を、2つの制限酵素SacIPstI消化を行ったPYC6遺伝子とライゲーションさせ、さらに再度BAP処理を行い、フェノール抽出、エタノール沈殿により植物導入用シトクロムc6spPYC6遺伝子を作製することができた。このspPYC6遺伝子の塩基配列を確認するため、クローニングベクターpBluescriptIISK図6を2つの制限酵素BamHISacIで消化したものにライゲーションし、サブクローニング後、ダイデオキシ法によるシークエンスを行い、spPYC6遺伝子の全塩基配列474bpを決定した図7。そのシークエンス結果をGENETYXMACを用いて既知のsp遺伝子とPYC6遺伝子と比較したところ、シグナルペプチド配列中の103番目のTチミン塩基がAアデニン塩基に変異している以外は完全に一致した。またPrimer配列中に付加した制限酵素サイトも確認した図7。今回確認された塩基の変異は、コードするアミノ酸をSerからThrに変えるものであったが、ともに性質と分子量も類似しており、それによる二次構造aヘリックスなどの変化はなく、膜通過というシグナルペプチドとしての機能には影響がないと考えられたため、このサンプルspPYC6を以後の実験に用いた植物導入用シトクロムc6発現ベクターの作製本実施例では、塩基配列を確認した植物導入用シトクロムc6spPYC6遺伝子を発現ベクターpBI121に挿入し、植物へ導入用シトクロムc6発現ベクターpBIcytc6を構築した。植物発現用ベクターpBI121の調製以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C5hrsインキュベートすることで制限酵素SacIによる消化を行った。インキュベート後のサンプル溶液に、等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。続いて、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C5hrsインキュベートすることで制限酵素BamHIによる消化を行った。反応終了後、15wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物20μlにゲルローディング緩衝液4μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TAEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。その後、15wvアガロースゲルから目的DNAと思われるバンドを切り出し、ゲル100μgを100μlに換算し、それに対しNaIsolutionを3vol加えよく撹拌し、55°Cで5分インキュベートしゲルを溶解させた。これにGLASSMILKを10μl加え、室温で15分間激しく撹拌し、14000rpm4°C5sec遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にNEWWASH300μlを加え、よく撹拌後、14000rpm4°C5sec遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を3度繰り返して得られた沈殿を乾燥させ、20μlの滅菌水に溶解させた。その後、溶液を05mlアシストPCR用チューブへと移し、14000rpm4°C30sec遠心分離を行った。得られた上清を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。植物発現用シトクロムc6発現ベクターpBIcytc6の調製前記の通り作製した導入用シトクロムc6spPYC6遺伝子は、以下の組成になるように反応液を調製した。調製した反応液を低温恒温槽16°Cで一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。結果を以下に示す。塩基配列を確認したspPYC6遺伝子BamHISacI消化、BAP処理済みを、植物発現用ベクターpBI121を2つの制限酵素BamHISacIで消化したものにライゲーションし、植物導入用シトクロムc6発現ベクターpBIcytc6を調製することができた。形質転換植物シトクロムc6導入Arabidopsisthalianaの作製植物感染用Agrobacteriumtumefaciensの調製シトクロムc6発現ベクターpBIcytc6導入大腸菌の調製本実施例では、植物導入用シトクロムc6遺伝子を挿入した植物発現用ベクターpBIcytc6を宿主大腸菌HB101に形質転換した。その後、数個のコロニーを選び3mlのLBKanamycin液体培地で培養し、アルカリSDS法によるプラスミド調製を行うことでベクターの構築と宿主大腸菌HB101への形質転換の有無を確認した。大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、150μlのコンピテントセルHB101を氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液4μlを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で30分間放置した。放置終了後、42°Cで20秒間ヒートショックを行った。その後氷上で3分間静置し、LBKanamycinにそれぞれ菌体液100μl、50μlをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、37°Cで一晩培養した。培養後、形質転換体コロニーをランダムに20クローンピックアップし、そのコロニーを3mlLBKanamycin培地に植菌し、200rpm37°C16hrs震盪培養した。培養した菌体液を15mlずつ15mlmicrocentrifugedtubeに分注し、6000rpm4°C10min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。沈殿菌体に100μlのSolutionI前出を加え、ボルテックスでよく撹拌し、200μlのSolutionII02NNaOH1SDSを加え、静かに転倒させ撹拌した。5分間室温で放置後、さらに150μlのSolutionIII前出を加え、氷上で30分間放置後、100μlのクロロホルムを加え、14000rpm4°C10min遠心分離した。上清を新しい回収し、それに2倍量の995エタノールを加え、静かに転倒させ撹拌し、15分間室温で放置した。その後、500μlの70エタノールを加え14000rpm4°C10min遠心分離し、得られた沈殿を3~5分間TOMYMICROVacで乾燥させ、20μlのTEに溶かした。得られたプラスミドに目的DNAが組み込まれていることを確認するために、以下に示す組成となるようにサンプルを15mlmicrocentrifugedtubeに調製し、37°C120minインキュベートすることで制限酵素BamHIとSacIによる消化を行った。反応終了後、15wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TAEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。結果を以下に示す。植物導入用シトクロムc6発現ベクターpBIcytc6を、宿主大腸菌HB101へと形質転換させた図8。その後、形質転換体コロニーをランダムに20クローンピックアップした。その結果、20サンプル中3クローンにspPYC6遺伝子と思われるサイズ474bp付近に単一なバンドを確認することができた。よってこのプラスミド内にはspPYC6遺伝子が挿入されていることが示された。このプラスミドを保有する大腸菌HB101を以後の実験に用いた。形質転換Agrobacteriumtumefaciensの調製と選抜本項では、高等植物Athalianaへと目的遺伝子を導入するために必要な宿主アグロバクテリウムAgrobacteriumtumefaciensを調製するため、三者混合培養トリペアレンタルメイティングを行い、得られた形質転換体のうち、数個のコロニーを選び3mlのLBKanamycin液体培地で培養し、アルカリSDS法によるプラスミド調製を行うことで宿主アグロバクテリウムへの形質転換の有無を確認した。各種菌体の培養AgrobacteriumtumefaciensLBA4404pAL4404保有菌体のグリセロールストック溶液をYEPStreptomycin寒天培地プレート30μgmlStreptomycinに白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、30°Cでおよそ40hrs培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを5mlYEPStreptomycin30μgmlStreptomycin培地で200rpm30°C30hrs震盪培養した。EscherichiacoliHB101pRK2013保有菌体のグリセロールストック溶液をLBKanamycin寒天培地プレート40μgmlKanamycinに白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、37°Cで16hrs培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを5mlLBKanamycin40μgmlKanamycin培地で200rpm37°C16hrs震盪培養した。EscherichiacoliHB101pBIcytc6保有菌体のグリセロールストック溶液をLBKanamycin寒天培地プレート40μgmlKanamycinに白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、37°Cで16hrs培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを5mlLBKanamycin40μgmlKanamycin培地で200rpm37°C16hrs震盪培養した。トリペアレンタルメイティングトリペアレンタルメイティングは、公知方法により行った駒嶺穆野村港二生物化学実験法41植物細胞工学入門学会出版センター298302。すなわち、5mlのYEPSm液体培地あるいはLBKm液体培地で震盪培養した三種の菌体液AtumefaciensLBA4404pAL4404保有、EcoliHB101pBIcytc6保有、EcoliHB101pRK2013保有を5000rpm4°C5min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。洗浄のため培養時に使用した液体培地YEP培地あるいはLB培地を沈殿菌体に加えよく撹拌し、もう一度5000rpm4°C5min遠心分離した。遠心分離後、菌体を培養時に使用した液体培地YEP培地あるいはLB培地3mlに溶解させた。次にそれぞれの菌体液を30μlずつMinAKanamycin寒天培地プレートに重ねるように滴下し、そのまま静置した状態で30°C3days培養した。培養後、最少培地であるMinAKanamycin寒天培地プレートに生えてきた菌体を白金耳を用いてすべてかき取り、その菌体を10mMMgSO4200μlに溶解させた。その後、その菌体溶液を再びMinAKanamycin寒天培地プレートに白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、30°Cでおよそ3days培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを5mlYEPKanamycin40μgmlKanamycin培地で200rpm30°C40hrs震盪培養した。アルカリSDS法によるTiプラスミド調製5mlYEPKanamycin40μgmlKanamycin液体培地で200rpm30°C40hrs震盪培養した菌体液を15mlずつ15mlmicrocentrifugedtubeに分注し、5000rpm4°C10min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。1mlのSbufferを沈殿菌体に加え、ボルテックスでよく撹拌し、8000rpm4°C10min遠心分離し、アスピレーターで上清を吸引して取り除いた。なお、Sbufferは、C6H12O6グルコースMW18016を13512g秤取り、1MTrisHClpH80125ml、05MEDTApH8010ml加え、超純水で500mlに定容し、オートクレーブ処理121°C、10分を行うことにより調製した。沈殿に再び100μlのSbufferと10mgmlリゾチームを5μl加え、10分間室温で放置した。そこに200μlSolutionII、TEsaturatedPhenolを30μl加え、静かに転倒させ撹拌した。5分間室温で放置後、さらに150μlのSolutionIIIを加え、20°Cで15分放置した後、12000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解した。得られたプラスミドに1mlのRNaseAを加え、37°C90minインキュベートすることでRNase処理を行った。反応終了後、15wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TAEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。結果を以下に示す。AtumefaciensLBA4404はYEPSm培地で培養し、EcoliHB101はLBKm培地で培養した。その後、トリペアレンタルメイティング三者混合培養によりAtumefaciensLBA4404へpBIcytc6を導入し、形質転換させた。次にトリペアレンタルメイティングによりTiプラスミドpBIcytc6が導入された形質転換体Atumefaciensをランダムに10クローンピックアップした。そのコロニーを3mlYEPKm培地にて培養し、その後、アルカリSDS法によってプラスミドを調製し、これを1wvアガロースゲルTAE電気泳動した。その結果、1クローンにおいて、pBIcytc6と思われるサイズ135kbpにバンドを確認することができた。よって形質転換体AtumefaciensにはTiプラスミドpBIcytc6が導入されていることが示された。形質転換植物シトクロムc6導入Arabidopsisthalianaの作製Arabidopsisthalianaの栽培よく水洗いした75×75丸型ポットにバーミキュライトを九分目位まで入れた。次に、HYPONeX原液を2000倍希釈した溶液を500ml用意し、カッターで厚さ1cmほどにスライスしておいたロックウールを入れた。十分に水分を含んで湿ったロックウールをピンセットでつまみ、75×75丸ポットの上に3つずつのせた。台所用三角コーナーのメッシュをポットの口を覆える位の大きさに切り、よく水洗いし、ポットの口にかぶせて輪ゴムでとめた。このポットに、種子を1粒ずつ播種した。種子を播種した後、4°C3days低温処理を行った。低温処理終了後、植物育成用光照射インキュベーター内に移し、22°C長日条件下で栽培した。発芽後は2日に1度程度水を与え、週に1度程1000倍希釈したHYPONeXを液体肥料として与えた。適当に間引きを行い、およそ3週間後植物体が抽台し始めたときに摘心し、竹串支柱を利用して成長した植物体を支え、種子が完全に熟したら採種し、乾燥状態で保存しておいた。形質転換Agrobacteriumtumefaciensの植物体への感染次に、高等植物Athalianacol0に植物導入用シトクロムc6spPYC6遺伝子を導入するためアグロバクテリウム法の一つである減圧浸潤法により、形質転換植物を作製したBechtoldNPelletierGMethodsinMolecularBiology82。具体的には以下の通りである。Agrobacteriumtumefaciensの培養菌体のグリセロールストック溶液をMinAKm寒天培地プレート400μgmlKanamycinに白金耳を用いて、プレート全体に線画状に塗り、30°Cでおよそ40hrs培養した。培養後、コロニーをピックアップし、そのコロニーを10mlYEPKm40μgmlKanamycin培地で200rpm30°C30hrs震盪培養前培養し、その培養液を新たに100mlYEPKm40μgmlKanamycin培地に全量加え、さらに200rpm30°C30hrs震盪培養本培養した。植物体Arabidopsisthalianacol0の栽培形質転換させる植物として用いるAthalianacol0の播種から種子の採種までの栽培条件は以下のとおりである。低温処理:4°C暗所で3日間静置植物育成温度:22°C照射光:長日条件100μEm2s1液体肥料:HYPONeX11000倍希釈植物個体によって多少差はあるが、Wildtype株の場合、播種後7日低温処理3日間を含めるで発芽し、発芽後20日前後で植物が抽台した。その後、摘心処理し5~6日で側枝が伸長し始め、同時に最初の花の開花結実が始まった。採種は緑色のさやが薄茶色になり縦裂し始めたものから回収した。一つのさやからおよそ50粒の種子が得られた。回収した種子は、播種まで乾燥させた状態で保存しておいた。植物体への感染感染用植物体Arabidopsisthalianacol0を上記に記載の方法に従って栽培し、抽台を始めたころまで生育させた。その後、茎から茎葉が誘導され始めたときに摘心し、すでに開花結実している花を切除した。なお、実験は、この植物体と上記の菌体培養液の準備が同時に整うよう調整した。まず、浸潤操作を行う実験台にキムタオル敷いておいた。次に、Atumefaciens培養液を浸潤用懸濁培地でおよそ23倍希釈し、1L容ビーカーに入れた。そのビーカーを吸引鐘内にセットし、そこへ培養懸濁液を吸引しすぎないよう直前に十分に吸水させた植物体Athalianaを植えたポットごとビーカーの上に逆さにして固定し、植物体を培養懸濁液に浸けた。減圧浸潤法で用いたAtumefaciens培養液は、OD600=12~15のものをOD600=08となるように浸潤用懸濁培地で約23倍希釈したものを使用した。また減圧浸潤時間は30秒、1分、5分、10分と検討した結果、5分が最も適していた。それは、減圧浸潤時間が長くなるほどその後の植物体の生育は悪くなったが、5分間の処理の場合、それほど生育の悪化は見られず、花数及び結実したさや種子数も1分間処理したものと大差がなかったためである。次に、培養懸濁液に浸した植物体を吸引鐘に入れ、アスピレーターで減圧した。減圧終了後、吸引鐘から植物体を取り出し、キムタオルで余分な培養懸濁液を落とした。その植物体をプラスチックトレイに横倒しにして、端に水を滴下し、ふたをして20°Cで2~3日放置したその間は水を与えなかった。その後、ポットをおこし、植物育成用光照射インキュベーター内で22°C、長日条件で通常どおり栽培を行った。2日に1度程度水やりを行い、週に1度程1000倍希釈したHYPONeXを液体肥料として与えた。適当に間引きを行い、およそ3週間後植物体が抽台し始めたら摘心し、竹串支柱を利用して成長した植物体を支え、種子が完全に熟したときは採種し、乾燥状態で保存しておいた。形質転換植物におけるシトクロムc6遺伝子導入と発現の解析PCR法を用いたゲノムDNA中の導入遺伝子の解析本実施例では、形質転換体ArabidopsisthalianaよりゲノムDNAを抽出し、そのゲノムDNAを鋳型としてPCRにより導入遺伝子の増幅の有無をもって植物体内への導入を確認した。形質転換体からゲノムDNAの抽出葉2~3枚程度の形質転換体Arabidopsisthalianaをあらかじめ冷却した乳鉢の中に入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料を15mlmicrocentrifugedtubeに入れ秤量した。Washbufferに終濃度05ととなるように2Mercaptoethanolを加えた溶液を、上記秤量後の試料に1ml加えよく混ぜた。12500rpm4°C10min遠心分離後、上清を捨てた。そこへSolutionIに終濃度1となるように2Mercaptoethanolを加えた溶液を300μl加えボルテックスでよく混ぜた。次に、1NaBH4を30μl、SolutionIIを150μl加え、数秒ボルテックスにかけた。50°Cで10分インキュベートし、その溶液にISOPLANTIIに含まれる100μlのSolutionIIIAと120μlのSolutionIIIBを入れ、氷上で10分間放置した。12500rpm4°C10min遠心分離し、水相を回収した。そこへ2倍量の995エタノールを加え、直ちに8000rpm室温1min遠心分離し、上清を捨てた。さらに70エタノールを1ml加え8000rpm室温1min遠心分離し、上清を捨てた。沈殿物をある程度まで風乾させ、50μlのTEに溶解させた。この溶液に1mgmlRNaseAを1μl加え、37°Cで30分間インキュベートした。その後、ゲノムDNAの抽出を確認するために、得られたゲノムDNA5μlにゲルローディング緩衝液1μlを加え、マーカーにλHindIIIを用いて15wvアガロースゲルにて電気泳動を行った。泳動は泳動緩衝液1×TAEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。電気泳動によるゲノムDNA存在の確認後、その濃度測定を行うためゲノムDNA溶液を100倍希釈し、分光光度計でUV測定した。算出された濃度をもとに10ngμlとなるようにゲノムDNA溶液を調製し、今後の実験に用いた。PCRPCRは、公知方法に従って行ったSambrookJDWRussellMolecularCloningaLaboratoryManual3rdednCorldSpringHarborLaboratoryPressCorldSpringHarborNewYork。以下の組成となるように反応液を05mlアシストPCR用チューブに調製した。この反応液にミネラルオイルを15μl重層した。その後、PTC100TMProgrammableThermalControllerを用いて反応を行った。プライマーとして以下のものを用いた。PrimerATPNA1Bam10pmolμl31merGCCont5485’GGATCCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG3’配列番号11PrimerPYC6CtermSacI10pmolμl30merGCCont4335’GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG3’配列番号7ユニバーサルFITC化ForwardprimerM13Fwprimer2pmolμl5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’配列番号9ユニバーサルFITC化ReverseprimerM13Rvprimer2pmolμl5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’配列番号10反応は、94°Cで48秒、64°Cで48秒、72°Cで1分24秒×31サイクルの条件で行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。PCR産物のゲル抽出2wvアガロースゲルから、目的DNAと思われるバンドを切り出し、できるだけ細かく刻んだ。そして、そのゲルをAmiconUltrafreeDAに入れた。7300rpm4°C10min遠心分離を行った。遠心後UltrafreeMC上側のカラム部分を取りはずし、溶出してきた溶液に等量のTEsaturatedPhenolを加えボルテックスを用いてよく撹拌した。そして、14000rpm4°C10min遠心分離を行った。水層を新しい15mlmicrocentrifugedtubeに移し、3MNaOAcpH52を120vol、995エタノールを2vol加えた。よく撹拌した後、20°Cで30分放置した。その後14000rpm4°C10min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿に75エタノールを500μl加え沈殿をよく洗浄した。さらに14000rpm4°C5min遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿をある程度風乾させた後、20μlのTEに溶解させた。この溶液に目的のDNAが単一に抽出精製されているかを確認するため、2wvアガロースゲル電気泳動を行った。得られたサンプル10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動には泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。PCR産物のサブクローニングPCR産物のサブクローニングは、公知手法に従って行ったHanahanDJMolBiol166557580中山広樹等バイオイラストレイテッドII遺伝子解析の基礎秀潤社8388。PCR生成物に以下の組成になるように調製した。調製した反応液を低温恒温槽16°Cで一晩インキュベートし、ライゲーション反応させた。大腸菌への形質転換は、以下の通りに行った。まず、150μlのコンピテントセルDH5aを氷上である程度溶かし、そこにライゲーションさせた反応液4μlを穏やかに加え、チップの先で軽くかき混ぜ、氷上で30分間放置した。放置終了後、42°Cで20秒間ヒートショックを行った。その後氷上で3分間静置し、LBAmpicillinXGalIPTGプレートにVectorInsert11、13それぞれ、菌体液100μl、50μlをコンラージ棒を用いて、プレート全体に塗り広げ、37°Cで一晩培養した。アルカリSDS法によるプラスミド調製本項におけるプラスミド調製は、実施例1に記載した内容と同様にして行った。QIAGENSpinMiniprepKitによるプラスミドの調製本項におけるプラスミド調製は、実施例1に記載した内容と同様にして行った。ダイデオキシ法による塩基配列の決定本項における塩基配列の決定は、実施例1に記載の方法と同様にして行った。結果を以下に示す。形質転換体Athalianaの葉2~3枚ほどから、ISOPLANTIIを用いて純度の高いゲノムDNAを抽出した。そのゲノムDNA溶液を鋳型とし、植物導入用シトクロムc6遺伝子の導入の有無を確認するためPCRにより目的遺伝子を増幅させた。その後PCR産物を2wvアガロースゲルTBE電気泳動を行ったところ、474bp付近に単一なバンドを確認した図9。この増幅した遺伝子の塩基配列を確認するため、ゲル抽出後、サブクローニングを行い、ダイデオキシ法によるシークエンスにより増幅した遺伝子の全塩基配列474bpを決定した。そのシークエンス結果をGENETYXMACを用いて既知のsp遺伝子配列とPYC6遺伝子配列と比較したところ、導入遺伝子同様シグナルペプチド遺伝子配列中の103番目のTチミン塩基がAアデニン塩基に変異している以外は完全に一致した。以上の結果より植物体Athaliana内にspPYC6遺伝子が導入されたことが示された。RTPCR法を用いた全RNA中の発現遺伝子の解析本項では、形質転換体Arabidopsisthalianaより全RNAを抽出し、その全RNAを鋳型としてRTPCRにより導入遺伝子の増幅の有無をもって植物体内での遺伝子の発現を確認した。PrimerATPNA1Bam10pmolμl31merGCCont5485’GGATCCATGGCCGCAATTACATCAGCTACCG3’配列番号11PrimerPYC6CtermSacI10pmolμl30merGCCont4335’GGAGCTCTTACCAACCTTTTTCAGATTGAG3’配列番号7ユニバーサルFITC化ForwardprimerM13Fwprimer2pmolμl5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’配列番号9ユニバーサルFITC化ReverseprimerM13Rvprimer2pmolμl5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’配列番号10形質転換体から全RNAの抽出形質転換体から全RNAの抽出は、市販のキットRNeasyPlantMiniKitQIAGENを用い、説明書に従って行った。PCRPCRは、公知手法に従って行ったSambrookJDWRussellMolecularCloningaLaboratoryManual3rdednCorldSpringHarborLaboratoryPressCorldSpringHarborNewYork。以下の組成となるように反応液を05mlアシストPCR用チューブに調製した。この反応液にミネラルオイルを15μl重層した。その後、PTC100TMProgrammableThermalControllerを用いて反応を行った。反応終了後、2wvアガロースゲル電気泳動にて確認を行った。得られたPCR生成物10μlにゲルローディング緩衝液2μlを加え、泳動用サンプルとした。泳動は泳動緩衝液1×TBEを用い、100Vで30分間行った。泳動終了後、01mgmlエチジウムブロマイドで7分間染色を行い、10分間超純水で脱色を行った。脱色を行ったゲルをUVトランスイルミネーター上にのせ、手動式フード付きポラロイド登録商標カメラで写真に記録した。PCR産物のゲル抽出本項におけるPCR産物のゲル抽出は、実施例3と同様にして行った。PCR産物のサブクローニング本項におけるPCR産物のサブクローニングは、実施例3に記載の方法と同様にして行った。アルカリSDS法によるプラスミド調製本項におけるアルカリSDS法は、公知手法に従って、実施例1に記載の方法と同様に行ったWeissBetalJBiolChem24345434555BirnboimHCMethodsEnzymol100243。QIAGENSpinMiniprepKitによるプラスミドの調製本項におけるQIAGENSpinMiniprepKitによるプラスミドの調製は、実施例1に記載の方法と同様に行った。ダイデオキシ法による塩基配列の決定本項における塩基配列の決定は、実施例1に記載の方法と同様にして行ったSangerFSangerFDeterminationofnucleotidesequenceinDNAScience21412051210。結果遺伝子の導入が確認された形質転換植物PYC6導入植物の葉2~3枚ほどから、RNeasyPlantMiniKitを用いて発現している全RNAを抽出した。その全RNA溶液を鋳型とし、spPYC6遺伝子の発現の有無を確認するためRTPCRにより目的遺伝子を増幅させた。その後PCR産物を2wvアガロースゲルTBE電気泳動を行ったところ474bp付近に単一なバンドを確認した図9。この増幅した遺伝子の塩基配列を確認するため、ゲル抽出後、サブクローニングを行い、ダイデオキシ法によるシークエンスにより増幅した遺伝子の全塩基配列474bpを決定した。そのシークエンス結果をGENETYXMACを用いて既知のsp遺伝子配列とPYC6遺伝子配列と比較したところ、導入遺伝子同様シグナルペプチド遺伝子配列中の103番目のTチミン塩基がAアデニン塩基に変異している以外は完全に一致した。以上の結果より植物体Athaliana内にspPYC6遺伝子が発現していると考えられた。ウエスタンブロッティング法を用いた発現タンパク質の解析本項では、形質転換体Arabidopsisthalianaより葉緑体を抽出し、そこから得られた葉緑体タンパク質画分に導入したシトクロムc6が発現していることを確認した。葉緑体画分の調製葉緑体画分は公知手法に従って調製した中村研三等監修植物のタンパク質実験プロトコール細胞工学シリーズ第9巻秀潤社114117。5~6g程度の形質転換体Arabidopsisthalianaをあらかじめ冷却した乳鉢の中に入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に氷冷しておいた破砕Bufferを20ml加えよく撹拌し、4重にしたミラクロスで濾過した。得られた濾液を15ml容コーニングチューブに移し、7000rpm4°C15sec遠心分離し上清を丁寧に取り除いた。沈殿にその5volの破砕Bufferを加え均一になるまで混ぜ、あらかじめ10mlの30パーコールをいれておいたガラス遠沈管に静かに重層し、2000rpm4°C3min遠心分離した。終了後上清のパーコールを取り除き、沈殿を5mlの破砕Bufferで均一になるまで混ぜ、再び2000rpm4°C3min遠心分離したこの作業を2度繰り返す。最後に沈殿を1mlの破砕Bufferに溶解させ、その溶液を葉緑体画分とした。ウエスタンブロッティング上記で得られた葉緑体画分溶液にCelLyticPPlantCellLysisExtractionreagentを1ml加え、10000rpm4°C10min遠心分離し、得られた上清を葉緑体タンパク抽出溶液とした。15mlmicrocentrifugedtubeに1μgμl分子量標準マーカー5μlと超純水を5μl、葉緑体タンパク抽出溶液を加え、それぞれのチューブに等量の試料用緩衝液を加え、よく撹拌した。調製したチューブを40°C、30min湯浴中でインキュベートし、泳動用試料とした。泳動槽に陽極および陰極電極液、SDSPAGEゲルをセットし、ウェルに泳動用試料20μlを慎重にアプライし、30Vの定電圧で泳動用試料を分離ゲルの上端まで泳動し、100Vの定電圧でマーカーがゲルの下端から約5mm程度まで泳動した。泳動中にあらかじめ、濾紙をブロッティング緩衝液A、B、Cに各2枚ずつ浸し、PVDF膜は少量のメタノールに5sec浸して、ブロッティングC液に浸した。泳動が終了したら、ゲルをガラス板から外し、ブロッティングC液に5minほど浸した。セミドライブロッティング装置に下からAの濾紙2枚、Bの濾紙2枚、PVDF膜、ゲル、Cの濾紙2枚の順で重ね、セット後に60mAの定電流で90min転写した。ブロッティング終了後、直ちに以下に示す順に操作し、抗原抗体反応の操作を行った。PVDF膜をTBSに浸し5分間震盪する2回。5BSAinTBSに浸し1時間から一晩震盪する。TBSに浸し5分間震盪する。stantibodyに浸し2時間震盪する。TTBSに浸し5分間震盪する2回。2ndantibodyに浸し1時間30分震盪する。TTBSに浸し5分間震盪する2回。TBSに浸し5分間震盪する2回。2ndantibodydevelopmentreagentに浸し20分震盪する遮光。超純水で洗浄する。結果PYC6導入植物よりパーコールの密度勾配遠心により葉緑体画分を分離し、得られた葉緑体タンパク質をSDSPAGEにより電気泳動的に分子量でふるい分けた。次に、分離した全てのタンパク質をPVDF膜へと転写した後、Pyezoensis由来シトクロムc6を認識する一次抗体ウサギ抗体と抗ウサギ抗体二次抗体を用いて抗原抗体反応を行ったところ、PYC6導入植物のみに抗原抗体反応を検出することができた図10。以上の結果から、PYC6導入植物において導入したPYC6は葉緑体中で発現していることが明らかとなった。発現したシトクロムc6タンパク質のN末端アミノ酸配列解析本項では、上記で抗原抗体反応を示したPYC6タンパクのN末端アミノ酸配列を解析し、シグナルペプチド切断の有無を確認した。上記で得られた葉緑体画分溶液にCelLyticPPlantCellLysisExtractionreagentを1ml加え、10000rpm4°C10min遠心分離し、得られた上清を葉緑体タンパク抽出溶液とした。15mlmicrocentrifugedtubeに1μgμl分子量標準マーカー5μlと超純水を5μl、葉緑体タンパク抽出溶液を加え、それぞれのチューブに等量の試料用緩衝液を加え、よく撹拌した。調製したチューブを40°C、30min湯浴中でインキュベートし、泳動用試料とした。泳動槽に陽極および陰極電極液、SDSPAGEゲルをセットし、ウェルに泳動用試料20μlを慎重にアプライし、30Vの定電圧で泳動用試料を分離ゲルの上端まで泳動し、100Vの定電圧でマーカーがゲルの下端から約5mm程度まで泳動した。泳動中にあらかじめ、濾紙をブロッティング緩衝液A、B、Cに各2枚ずつ浸し、PVDF膜は少量のメタノールに5sec浸して、ブロッティングC液に浸した。泳動が終了したら、ゲルをガラス板から外し、ブロッティングC液に5minほど浸した。セミドライブロッティング装置に下からAの濾紙2枚、Bの濾紙2枚、PVDF膜、ゲル、Cの濾紙2枚の順で重ね、セット後に60mAの定電流で90min転写した。ブロッティング終了後、CBB染色、脱色操作を行い、目的タンパク質部分を1mmx5mmの大きさに切り15mlmicrocentrifugedtubeに移した。これをシーケンスサンプルとしてAppliedBiosystemsProteinSequencer492型でアミノ酸配列の解析を行った。形質転換植物より得られたPYC6抗体と抗原抗体反応を示す分子量およそ91kDaのタンパク質のN末端アミノ酸配列をエドマン法により解析した結果、その配列はN末端1残基目から順にADLDNGEKVF配列番号12であった下記表を参照。これはPYC6の成熟タンパク領域のN末端アミノ酸配列と完全に一致しており、植物体内でシグナルペプチドの切断が行われ、正確に葉緑体チラコイド膜を通過しルーメン側で発現していることが明らかになった。すなわち、得られた形質転換体中のPYC6タンパク質のN末端アミノ酸配列の解析結果より、葉緑体輸送シグナルが切断された成熟領域アミノ酸配列と一致したことから、spPYC6遺伝子は転写翻訳後葉緑体へと輸送されていることが確認できた。形質転換植物の生育測定と表現型の観察生育観察背丈、根長、葉の大きさ本項では、形質転換体Arabidopsisthalianaの播種後の生育を観察した。形質転換体を播種した後、植物体の背丈、根長及び葉の大きさを10日おきに観察測定した。植物試料は野生株と形質転換体共に20個体行い、その平均を算出し、統計処理により有意差を求めた。PYC6導入植物の生育表現型の観察を行った結果、PYC6導入植物の背丈は、最大で19倍播種後40日野生型WTに比べて大きくなり、約60日目で13倍増大していた図11。根長は、最大で135倍播種後40日WTに比べ大きくなり、約60日目で117倍増大していた図12。葉の大きさは、最大で19倍播種後40日の差が見られ、約60日目で13倍増大していた図13。これらPYC6導入植物にみられた現象は、植物体内でのPYC6の発現により何らかの形で植物の生育に非常に重要な光合成反応が活性化されたためと考えられ、その影響により植物体の生育速度が上昇したと思われた。総クロロフィル量の測定本項では、形質転換体Arabidopsisthalianaより全クロロフィルをアセトンにより抽出し、定量した。形質転換体Arabidopsisthalianaの葉をリーフパンチで採取し、秤量した。あらかじめ冷却した乳鉢の中に試料を入れ、素早く液体窒素を加え、植物体がパウダー状になるまでホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に80アセトンを加え4mlに定容した。その溶液の663nmと645nmの吸光度を分光光度計UVVISIBLESPECTROPHOTOMETERで測定した。得られた663nmと645nmの吸光値を以下に示した式に代入し、クロロフィル量を算出した。総クロロフィル量μgml802×ABS2021×ABSPYC6導入植物中のクロロフィル量を測定した結果、播種後40日から70日の間においてはWTよりも11~12倍増大していた図14。これは、PYC6の導入により明反応が活性化され、それにより増大した明反応最終産物であるエネルギー物質ATPがクロロフィルの合成に利用された影響ではないかと考えられた。形質転換植物の光合成活性測定方法及び結果光合成活性の指標として、アデニンヌクレオチドATP含量、NADPH量、二酸化炭素同化能力、デンプン量、及びタンパク質量を、それぞれ、以下に示す方法で測定した。総ATP含量の測定本実施例では、形質転換体Arabidopsisthalianaより全ATPを抽出し、ルシフェリンルシフェラーゼ法を用いて定量した。形質転換体Arabidopsisthalianaの葉を予め秤量した。秤量後、冷却した乳鉢の中に試料を入れ、素早く液体窒素を加えて、植物体がパウダー状になるまで乳棒でホモジナイズした。その後、パウダー状になった試料に025M過塩素酸を2ml加え、その溶液を15ml容コーニングチューブに回収した。10000rpm4°C10min遠心分離し、得られた上清を別の15ml容コーニングチューブに移し、1NKOHでpH70に調整した。調製後、02Mリン酸緩衝液pH72で5mlに定容し、これをATP抽出液とした。ATP抽出液100μlを15mlmicrocentrifugedtubeに準備し、ENLITENLuciferaseLuciferinReagentを20μl添加してから90sec後ルミノメーターGENELIGHT55で10sec反応液の発光強度を積算し、得られたRLU値から溶液のATP濃度を算出し、そこから植物重量当たりのATP量を換算した。その結果、PYC6導入植物の総ATP量は、最大で193倍播種後60日増大していた図15。これは、PYC6導入植物において機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たな電子伝達体として紅藻cytc6PYC6が機能したことにより、明反応の電子伝達が活性化され、その最終生成物であるATP量が増大したものと考えられた。総NADPH含量の測定本実施例では、形質転換体Arabidopsisthalianaより全NADPHを抽出し、定量した。形質転換体Arabidopsisthalianaを予め秤量した。その後、70°C程度のホットバスで温めた01NNaOHを入れ、ポリトロンホモジェナイザーを用いて破砕した。その後、アイスバスに移し、約2mlの01NHClを加え、pH試験紙でpH75に調整した。次に01mlのグリシルグリシン緩衝液pH75を加え、よく撹拌し、メスシリンダーに移し、液量を測定する。測定後、15ml容コーニングチューブに移し、10000rpm、20min、4°Cで遠心分離した。遠心分離後、上清を15ml容コーニングチューブに回収し、80°Cで一晩冷却し、溶解後、10000rpm、20min、4°Cで遠心分離し、定量に用いた。NADPH抽出液1000μl、01Mグリシルグリシン緩衝液pH743460μl、02Mニコチンアミド2000μl、32mgmlフェナジンメトサルフェートPMS820μl、5mgmlチアゾールブルー670μl、グルコース6リン酸2ナトリウム水和物200μlを混ぜ、分光光度計U3310にセットした。を用いて570nm、25°Cで測定する。U3310に温度制御ユニットを取り付け、25°Cにセットする。その後、570nmにおける吸光度の変化を30秒おきに2分間測定し、得られた吸光値の差からNADPH量を算出し、そこから植物重量あたりのNADPH量を算出した。その結果、PYC6導入植物の総NADPH量は播種後40~70日で12~14倍増大していた図16。これは、PYC6導入の高等植物への導入によって、野生型よりも多く電子が伝達され、その最終生成物であるNADPH量が増大したものと考えられた。二酸化炭素同化能力の測定本実施例では、形質転換体Arabidopsisthalianaの葉を用いて二酸化炭素の同化能力を測定した。二酸化炭素の同化能力は、CO2ガス分析機CIRAS1小糸工業製を用いて行った。また、二酸化炭素の供給量は350ppmに設定し、飽和光下で測定した。その結果、PYC6導入植物の二酸化炭素の同化能力は最大で22倍増大していた播種後50日図17。これは、PYC6導入の高等植物への導入によって、ATPやNADPH量が増大したことにより、そのエネルギーを利用する暗反応カルビンベンソンサイクルが活性化され、二酸化炭素の同化能力が増大したものと考えられた。デンプン量の測定本実施例では、形質転換体Arabidopsisthalianaよりデンプンを抽出し、定量した。植物葉を採取後、乾燥させる70度、2日。約5mgを量り取り乳鉢に入れ、3mlの32過塩素酸を加えて、乳棒でよく破砕する。その後、全て試験管に移し、20°Cで20分静置した。次に、60cmのWhatmanGFAgrassfibrediskで濾過し、濾液に5mlのヨウ素溶液を加え、よく混ぜ、約4°Cで30分間静置する。その後、15cmのWhatmanGFAgrassfibrediscで濾過し、フィルターを乾燥させる。乾燥したフィルターを試験管に入れ、4mlの075M硫酸を加え、沸騰湯浴中で30分間インキュベートする。その後、上清を回収し、フェノール硫酸法により発色させ、分光光度計を用いて485nmの吸収を測定した。その結果、PYC6導入植物のデンプン量は播種後40~70日で115~125倍増大していた図18。これは、PYC6導入の高等植物への導入によって、CO2の同化能が増大し、それに伴いデンプンの合成も促進されたと考えられた。タンパク質量の測定本実施例では、形質転換体Arabidopsisthalianaよりタンパク質を抽出し、Lowry法を用いて定量した。植物体の重量を測定し、記録する。乳鉢に適量の植物体を入れ、液体窒素下、乳棒で充分に破砕する。常温まで戻した後、植物体1gあたり2mlのCelLyticPSigma製を入れ、乳棒でよく磨砕し、試験管に移す。15分室温で転倒混和後、遠心分離する。この上清を抽出タンパク質とする。次に、LowryA液01Nの水酸化ナトリウム溶液に2になるように炭酸ナトリウムを加えたもの、LowryB液05硫酸銅五水和物と1クエン酸ナトリウムになるように調製したもの、LowryC液1Nフェノール溶液、LowryD液LowryA液LowryB液を作製した。その後、抽出したタンパク質溶液、01mlにLowryD液10mlを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した後、30°C、15minインキュベートした。次にLowryC液01mlを加えて、速やかにボルテックスミキサーで撹拌した後、30°C、30minインキュベートし、770nmの吸光値を測定した。その結果、その結果、PYC6導入植物のタンパク質量は、最大13倍播種後50日増大していた図19。これは、PYC6導入の高等植物への導入によって、増産されたATPやNADPHがタンパク質の合成を活性化したのではないかと考えられた。考察本発明で得られた知見として、PYC6導入植物はWTと比較して成長速度が上昇していた。これはPYC6導入植物中のATP及びNADPHが増大していたことから、Athalianaにおいて機能しているプラストシアニンに加え、さらに新たに導入した電子伝達体である紅藻cytc6が機能したことにより、明反応の電子伝達が2回路となったためにその最終生成物であるATP及びNADPH量が増大し、さらに植物全体の生育が活性化される結果となったと推測された。これまで陸上植物への暗反応カルビンベンソンサイクルの関連酵素の補強による成分量の増進についての研究は行われているが、本発明のように明反応を活性化させた例はない。また、これまでcytc6を機能させることを目的として植物へと導入した例はなく、本発明の内容は今後他種の植物にも十分応用可能であり、有用な植物の生長促進法や植物の生産技術果実物、葉物、生花などなどの基盤となる汎用性の高い発明であるといえる。さらに、植物体内で増産されたATP及びNADPHを利用することで他の物質代謝も活性化され、汚染物質CO2などの除去法の分野にも極めて有効と考えられた。