"L612として同定され、アメリカンタイプカルチャーコレクションAmericanTypeCultureCollectionにATCC受入番号CRL10724として寄託されているヒトBリンパ芽腫細胞系から分泌される、GM3、GM4またはSPGガングリオシド抗原に特異的に結合する抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。配列ID番号2に記載のアミノ酸配列を含んで成るH鎖可変部および配列ID番号4に記載のアミノ酸配列を含んで成るL鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。ヌクレオチド/アミノ酸配列:ここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。に記載のH鎖可変部、およびここに、下線アミノ酸は、相補性決定領域を表す。に記載のL鎖可変部を含む抗ガングリオシド抗体を有効成分として含んで成る腫瘍の診断に有用な医薬組成物。癌の治療や診断に応用可能な抗体を含む医薬組成物を提供する。この発明により、各種の腫瘍に反応し黒色腫の治療に効果的であることが実証された抗ガングリオシド抗体を分泌するヒトのBリンパ芽腫細胞系Bリンパ芽球様細胞系Blymphoblastoidcelllineが開発された。抗体は、癌の治療や診断に応用可能である。この発明の細胞系は、L612と名付けられており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学科DivisionofSurgicalOncologyattheUniversityofCaliforniaatLosAngelesSchoolofMedicineにおいて保存維持されている。L612細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクションメリーランド州ロックビルAmericanTypeCultureCollectionRockvilleMarylandにATCC受託番号CRL10724として寄託されている。この発明の特徴として、L612細胞系は、腫瘍抗原に反応するIgMκ抗体を産生するのに使われる。L612抗体は、局所注射により投与したときに、黒色腫瘍の治療に効果があることが示されている。この発明の他の特徴として、L612抗体は、抗原代用物質として利用できまたは診断手法において使用できるマウスの抗イディオタイプモノクローナル抗体を作るのに使われる。以下の詳細な説明を参照してこの発明がよりよく理解されるにつれて、この発明の上記特徴および他の多くの特徴並びに付随する利点が明らかになるであろう。癌の治療や診断に応用可能である。この発明の細胞系は、エプスタインバーウイルス形質転換法で形質転換されたBリンパ芽腫細胞系である。この細胞系は、L612と命名され、カリフォルニア大学ロサンゼルス校医学部外科腫瘍学部に保存されている。このL612細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクションAmericanTypeCultureCollectionRockvilleMarylandにATCC受託番号CRL10724で寄託される。L612細胞系は、2種の他のヒトモノクローナル抗ガングリオシド抗体類、L55抗-GM2およびL72抗GD2を産生するために使用したのと同じエプスタインバーウイルス形質転換法参照資料26~27および29によってリンパ球から培養によって樹立した。参照資料29に詳細に述べられているのと同じ形質転換法に従って、L612細胞系を樹立した。従来のL55とL72の細胞系およびこの発明のL612の細胞系を樹立するのに用いられるエプスタインバーウイルス形質転換法は、公知でかつこの技術分野の研究者が使用する通常の方法である。L612細胞系を樹立するのに使用した具体的方法は、次のとおりである。乳房切除中の乳癌患者から所属リンパ節を入手した。まず、このリンパ節を小片に切断し、次いで、その小片をハンクスの平衡塩類溶液HBSS中に懸濁させることによって、リンパ球をこれらリンパ節から単離した。次に、この懸濁液をステンレス金網を通過させて大きな組織の塊を分離し、次にFico11の密度勾配溶液を用いて遠心分離してリンパ球を凝集分離した。Eロゼット形成法を用いてTリンパ球を除去し、次いでBリンパ球画分をHBSSで3回洗浄し、次に10ウシ胎仔血清を含有するRPMI1640中でエプスタインバーウイルスEBVとともに20時間インキュベートした。細胞を限界希釈法によってクローン化し、先に記載したIA検定法参照資料29によって抗体の産生について監視した。ヒト乳癌細胞系のMDA-MB436参照資料31とヒト黒色腫細胞系のUCLA-SO-M12参照資料32を標的として使用した。436乳癌細胞系に対して陽性の抗体を分泌するクローンは、樹立後すぐに抗体の産生を停止したが、M12黒色腫細胞系に反応するクローンは、抗体の産生を続け、そして安定であった。抗体を分泌するクローンを、低濃度のウシ胎仔血清を含有するRPMI1640に徐々に添加した。次に、そのクローンを、成長因子を含有する血清なしの培地FDAはIrvineScientificCo社米国、カリフォルニア州、アービン所在から入手できるHBシリーズの血清なしの培地を承認した内で7回再クローン化した。L612細胞系の倍加時間は、1日間より短い。この細胞系は、20μg/mlを越える量のIgMκモノクローナル抗体を分泌した。使用済培地中のL612抗体を先に述べたようにして精製した参照資料25。さらに、L612細胞系によって産生された抗体は、細胞培養物から抗体を取り出して精製するのに用いるいずれかの通常の方法によって単離する。精製されたL612抗体は、各種のヒト腫瘍組織との反応性について試験した。L612抗体は、補体の存在下で、抗原陽性ヒト腫瘍細胞に対して強い細胞障害活性を有する。その反応性は、免疫粘着IA検定法と免疫粘着吸収IAA検定法の両者を用いて試験した。試験結果を[表1]に要約した。合計21個の生検黒色腫、32名の別個のドナー由来の末梢血リンパ球PBLおよび別の44名のドナー由来の赤血球を試験した。21個の黒色腫組織のうちの13個62が抗原陽性であったが、これに対してPBL0/32と赤血球0/44は全く陰性であった。培養したヒト悪性細胞系も抗原の存在について試験した表I。直接IA検定法で試験した16個の黒色腫細胞系のうち12個75が陽性であった。残りの癌細胞系の陽性反応性は、次のとおりであった。肺癌:4/4、乳癌:5/7、消化器癌:2/7、他のタイプの癌:1/4。しかし、試験した黒色腫細胞系に対して自己由来の、エプスタインバーウイルスで形質転換されたB細胞系11個は、敏感なIA吸収検定法でも陰性であった。黒色腫の陽性試料の百分率は肺癌の試料より低いが、単位試料当たりの全反応性は、他の組織学的タイプの癌より黒色腫の方がはるかに高かった。試験した黒色腫細胞系のうち、M15とM12が最高の反応性を示した。これらの細胞系をノイラミニダーゼ受容体破壊酵素で処理すると、これら細胞系の抗原性は完全に破壊されたが、トリプシンで処理したものは、破壊されなかった。各種の基準糖脂質に対するL612抗体の反応性も測定した。これらの糖脂質と、それぞれのL612抗体に対する抗原力価を、[表2]に示す。基準糖脂質5nmolをIA阻害試験法でL612の抗原活性について試験した。3種のガングリオシド:GM4、GM3およびSPGは陽性の反応性を示したが、これらの中の2種のGM4とGM3はSPG1:16より強い結合性1:64を示した。II3NeuGc-Lac-Cer、IV3NeuGc-nLcOse4-Cer、GM2、GM1a、GD3、GD2、GD1a、GD1bおよびGT1bを含む他のガングリオシド類ならびにGbOse3-Cer、GbOse4-CerおよびGgOse4-Cerを含む中性糖脂質は、抗原活性を全く示さなかった。上記結果をさらに確認するため、基準の糖脂質について、TLCプレート上でELISA法と酵素免疫染色法を行った。ELISA法と酵素免疫染色法で得た結果は、IA阻害検定法の結果と類似していた。ELISA法は、微量滴定ウェルmicrotiterwellsに結合させた15個の基準糖脂質を用いて行った。やはり3種のガングリオシドGM3、GM4およびSPGが固相ELISA法で明確な結合活性を示した。残りのガングリオシド類は反応性を全く示さなかった。GM4、GM3、SPG、GD3、GD2、GM2、N-グリコリルGM3、CDH、グロボシドおよびアシアロGM11μgによるTLCプレートの酵素免疫染色試験も実施した。GM3とGM4で強い陽性を示した。SPGについては、より緩やかな反応性が観測された。GM2については、ごく僅かな反応性が観察された。その外の糖脂質は、染色できなかった。これら異なる3種の免疫検定法の結果は、HuMAbのL612がNeuAcα2-3ガラクトース残基を有するGM3とGM4のようなガングリオシド類の末端の糖を検出することを実証している。凍結切片をHuMabL612で免疫染色すると、黒色腫、結腸腺癌および肺腺癌を含む新生物組織に対する強い特異性を示した。HuMabは、ある種の新生物組織を同定するためま優れたマーカを提供する。HuMabのL612は、腎細胞線癌に結合することが報告されている参照資料35。L612抗体のL鎖とH鎖の両者の可変部のDNA配列を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRで決定した。チオシアン酸グアニジウム/塩化セシウム法を用いて、L612B-リンパ芽球系から全RNAを調製した参照資料34。10μgのRNAを60pmolのμH鎖またはκL鎖の3′プライマと混合し、70°Cで10分間加熱した。得られた混合物を、10μlの5X逆転写酵素緩衝液BRL、4μlの10mMのdNTP混合物dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの最終濃度:200μMおよび3μlの600単位逆転写酵素SuperscriptBRLを含有する、50μlの逆転写酵素反応溶液に添加した。得られた混合物を37°Cで1時間インキュベートした。次に、97μlのPCR混合物を3μlのRNA-cDNA混合物に添加して、標準のPCR反応を実施した。そのPCR混合物は、10XのPCR緩衝液米国、カリフォルニア州所在のPerkinElmer社、各dNTPの最終濃度が60μMである10mMのdNTP混合物、5単位のTaqポリメラーゼPerkinElmer社および60μMの適正な5′と3′のH鎖とL鎖のプライマを含有していた。得られた混合物を、PerkinElmerCetus熱サイクラの中で、91°Cで1分間、52°Cで2分間および72°Cで1.5分間の増幅を35サイクル行い、次いで最終のインキュベーションを72°Cで10分間行った。そのPCR産物の一部は、2アガロースゲル上に正しい大きさのバンドを生成した。μH鎖とκL鎖のプライマは、それぞれ495個と603個の塩基対のcDNA産物を生成した。ゲルが正しい大きさの単一産物を示した場合、残りのPCR-cDNA産物をPCRに付してさらに産物を得た。ゲルによる産物を単離し、集め、フェノール/クロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。次に、そのDNAを、適正な制限酵素で消化し、抽出し、沈澱させ、次にGeneClean米国、カリフォルニア州、Bio101で精製した。そのDNAを、Bluescriptベクター米国、カリフォルニア州、Stratagene社の適正な切断制限部位に結合させた。可変部のμ鎖の10個の独立クローンおよび可変部のκ鎖の4個の独立クローンを単離して、配列を決定した。JHH鎖のプローブを用いて、H鎖クローンを選別して確認した。配列決定は、T7DNAポリメラーゼSequenase米国、オハイオ州、クリーブランド所在のUSB社を用い、メーカのプロトコルにしたがって、ジデオキシヌクレオチド法によって行った。使用したプライマは次のとおりであった。Hμ鎖のリーダプライマ3個のプライマー参照資料29:GGGAATTCATGGACTGGACCTGGAGGAGTCCTTCTGTCと、GGGAATTCATGGAGCTTTGGGCTGACGCTGGCGTTTCTTと、そしてGGGAATTCATGAGAACACATACTGTTGGTATCGCATCTCGCTCTCTGである。これらのプライマには、クローン化を容易にするEcoRI制限部位下線を付けた部分が含まれている。Hμ鎖のJ領域のプライマは、CCAAGCTTAGACGAGGGGGAAAAGGGTTであった。このプライマは、HindIII部位下線部分を含んでいる。Lκ鎖のリーダプライマは、次のとおりであった2個のプライマ引例文献30。すなわち、GACATCGAGCTCACCCAGTCTCCAと、GAAATTGAGCTCACGAGTCTCCAである。これらのプライマには、SacI部位が含まれている下線部分。Lκ鎖のJ領域のプライマは、GCGCCGTCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAGであった。このプライマには、Xba部位が含まれている下線部分。H鎖の可変部についてクローン化されたcDNAヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ID番号1に示す。上記のH鎖可変部のアミノ酸配列を配列ID番号2に示す。L鎖の可変部についてクローン化されたcDNAヌクレオチド配列とそのコード化アミノ酸配列を配列ID番号3に示す。上記のL鎖可変部のアミノ酸配列を配列ID番号4に示す。また、H鎖可変部についてヌクレオチド/アミノ酸配列を図1に示す。その相補性決定領域complementarydeterminingregionsCDR1、2および3には、下線を付けてある。また、L鎖可変部についてヌクレオチド/アミノ酸配列を図2に示す。また、そのCDR1,2および3にも下線を付けてある。この発明によるL612抗体は、GM3ガングリオシドまたはNeuAc2-3ガラクトースエピトープを含有する腫瘍を治療するため患者に投与される。GM3ガングリオシドは、Neuα2-3ガラクトース残基を有する末端糖を有している。上記のような組織を治療するため、患者に抗体を投与するのに用いられる通常の手法のいずれも用いることができる。これらの手法としては、静脈注射もしくは腹腔注射および病変部内注射がある。病変部内注射は、再発性の皮膚腫瘍に対する好ましい投与法である。L612抗体およびこの抗体の産生細胞系は、公知の方法で変形もしくは変化させて、他の免疫グログリンのイソタイプおよび腫瘍細胞を効率よく結合して殺すことができる抗体を産生する細胞を形成させることができる参照資料33。利用される特定の投与量は、腫瘍の抗原性によって変わり、そしてL55およびL72のような抗体を投与する公知の方法にしたがって決定することができる。L612モノクローナル抗体は、ヒト黒色腫瘍の生検試料と強く反応する。また、L612抗体は、肺癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌および腎臓癌由来のヒト腫瘍生検試料とも反応するが、反応程度は低い。UCLASO-M12黒色腫細胞系は、L612モノクローナル抗体で試験した細胞系のなかで最高の反応性細胞系であると確認された。UCLASO-M12細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部外科腫瘍学科に保存されている。L612HuMabを、悪性皮膚黒色腫を治療する治療剤として使用した。HuMabL612は、ヒトに使用する場合、先に述べたようにして生成した参照資料25。ヒト抗GD2HuMabL72の病変部内注射によって皮膚黒色腫を退行させることができるということは、以前の研究で実証された参照資料23。この実施例において、HuMabL62とHuMabL72の効能を比較する。84歳の女性が、彼女の左頬の急速に増殖する皮膚黒色腫病変部1.9×1.6cmの外科切除を受けた。組織切片の病理試験を行ったところ、クラークレベルIVの黒色腫であることが分かった。病変部生検試料のガングリオシド発現は、GM3に対しては中程度に陽性でありGD2に対して陰性であることが分かった。外科手術を行ってから2週間後、その切開部位に再発が起こった。上部病変部位は1週間毎に1mlのHuMabL612で治療し、下部病変部を1mlのHuMab72HuMabで治療した。1カ月間治療した後3回治療後、HuMabL612で治療された病変部の壊死と軟化が観察された。これに対して、HuMabL72HuMabで治療された病変部は全く反応を示さず、実際にはさらに進行した。この患者は、肝臓と脳に広く転移したため結局死亡した。また、L612抗体は、抗原代用物質または診断用試薬として用いられる抗イディオタイプを産生するのに利用できるハイブリドーマを産生するのに有用である。ハイブリドーマの産生とそれに続く抗イディオタイプの生成は、以下の実施手法において説明する。完全フロイントアジュバント中の精製L612モノクローナル抗体200μgを皮下注射することによって、BALB/cマウスを免疫化した。2週間後に、不完全フロイントアジュバント中のL612を別個に皮下注射してマウスの追加免疫を行った。この追加免疫を行ってから11日後、マウスに食塩水中のL612の200μgを腹腔内に注射した。3日後に脾臓を取り出し、標準手法を用いて脾細胞を黒色腫細胞系SP2/0と融合させてハイブリドーマを製造した。HAT培地選択を行った後、ハイブリドーマの培養ウェルを、ELISA法を用いて抗体について試験した。抗イディオタイプAB2を分泌するハイブリドーマを、HuMAbL612に対する強力な結合反応性があることと、3種の他の対照のヒトIgM:L55、L72およびヒト血清IgMに対する反応性がないことで同定した。抗原として用いる関連のないタンパク質としては、ウシ胎仔血清とヒト血清アルブミンがある。50μlのIgMまたはタンパク質50μg/mlで96ウェルのELISAプレートをコートして抗原として用い、AB2を検出した。ペルオキシダ-ゼ複合ヤギ抗マウスIgGIgMをAB2検出プローブとして使用し、続いて基質を加え次いで先に記載したように490nmにおける吸光度を読み取った参照資料19。上記のようにして調製した約2500個のハイブリドーマ培養ウェルのHAT選択を行って、L612HuMAbに対して明確な反応性を有しているが、3種の他の対照のヒトIgMおよび2種の関連のない血清タンパク質抗原には全く反応性を示さない抗体を分泌する40個のハイブリドーマを得た。これらの抗612抗体がL612の抗原結合部位に対するAB2βタイプの抗体であるか、またはL612の抗原結合部位の外側のペプチド領域に結合されたAB2α抗体であるかを決定するために、GM3陽性標的細胞系にもしくは精製抗原のガングリオシドGM3に結合するL612に対するこれらの抗612抗体の阻害活性を3種の検定システム:IA阻害法、細胞ELISA阻害法およびGM3-ELISA阻害法を使って試験した。検定において、試験した40個の抗体のうち、7個が抗原陽性標的黒色腫細胞系UCLASO-M12に結合するL612を阻害し、50以上がGM3に結合するL612を阻害したが、残りの12個は阻害活性が弱いかまたは阻害活性を全く示さなかった。7個の阻害活性抗イディオタイプのうち、4C10として識別されたものを、腫瘍を治療するのに用いる好ましいβ型抗イディオタイプとして、クローン化するために選択した。非阻害性群から18C6として識別された抗イディオタイプを、免疫診断検定法に使用する好ましいα型抗イディオタイプとして、クローン化するため選択した。抗イディオタイプの4C10と18C6の両者を、イソタイプの抗グロブリンで試験した結果、IgG1クラスのものでありかつκL鎖を含有することが見出された。4C10と18C6でクローン化されたハイブリドーマ細胞系を、FCS含有RPMI1640培地で増殖させ、5~10μg/mlの抗体を培養物上澄液中に分泌させた。これら培養物の上澄み液中の、L612に対する抗イディオタイプのELISA法による力価は、1:200~1:1000/106ハイブリドーマの範囲内であった。抗イディオタイプの18C6は、IA検定法において標的細胞に対しおよびELISA法においてガングリオシドGM3に対しHuMAbL612の低い結合阻害活性を実証し、一方4C10は、同じ抗体濃度で、ELISA検定法とIA検定法の両方において強い阻害性を示した。対照標準の検定として、4C10と18C6は、関連のない抗原システムのHuMAbL72の、M14標的細胞またはGD2抗原に対する結合を阻害できなかった。18C6の結合阻害性が欠如していることは、GM3抗原結合部位の外側に、L612抗体の結合部位があることを示し、そして4C10の特異的結合阻害は、その結合部位が抗原結合部位の中かその近傍にあることを示す。4C10と18C6のモノクローナル抗イディオタイプを分泌するハイブリドーマ細胞系は、カリフォルニア大学ロスアンゼルス校医学部の外科腫瘍学科に保存されている。L612に対して産生される4C10抗イディオタイプおよび他のβ型抗イディオタイプは、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用して腫瘍を治療することができる。それらは、黒色腫の治療に用いられるのに好まれる。これらのβ型イディオタイプは、抗癌免疫を高め、臓器移植の拒絶反応を抑制し、そして自己免疫病を抑制するための免疫モジュレータとして使用することもできる。β-抗イディオタイプは、抗体を患者に導入するのに使用する通常の手法のいずれによっても投与することができる。これらの手法としては、皮下注射、静脈注射または腫瘍内注射がある。β型の抗イディオタイプは、KLHと結合させ次いでフロイントの完全アジュバントのような適切な担体中に乳化することが好ましい。β型抗イディオタイプに用いる特定の投与量は、治療される腫瘍および多数の他の要因によって変わる。投与レベルは、一般的に知られていて、抗原免疫化剤またはモノクローナル抗体で患者を治療する場合に利用される公知の方法と原理によって規定される。L612抗体に対するβ型抗イディオタイプの免疫原的有用性が以下のように実証された。5頭の共通遺伝子系のBa1b/cマウスを精製4C10-KLHで免疫化した。対照標準として4頭のマウスをIgG1-KLHで免疫化し一頭のマウスをKLH単独で免疫化した。その免疫化された血清を、精製GM3を抗原の起源として用いてELISA法によって監視し、そして抗原陽性M12黒色腫細胞系を用いてIA検定法で監視した。ELISA法の場合、ペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスIgMIgGBoeringerMannheim社を二次抗体として用いた。測定可能な抗体AB3が、100μgの4C10-KLHによる5頭の免疫化のうちの3頭に産生された。免疫化血清は、GM3に結合したが、CDHアシアロGM3には結合したかった。IgG-KLHによりまたはKLHだけにより免疫化された5頭のマウス由来の血清は、いずれの糖脂質にも全く反応を示さなかった。AB3のIgクラスを決定する別の分析法ELISA法とTLC免疫染色法では、反応性の大部分は、IgMであると同定された。IA検定法において、M12細胞と反応するかも知れない種特異性の天然抗体を除くために、免疫化されたマウス血清を、ヒト赤血球で、4°Cで一夜、予め吸収させた。4のIAスコアを、吸収血清の1:10希釈によって得た。対照標準の血清は、1:2の希釈でも反応性を全く示さなかった。陽性反応性が細胞表面上でGM3抗原に対して起こったことを確認するため、IA阻害試験を行った。この試験には、GM310μg、CDH10μg、4C1010μgおよびBalb/cハイブリドーマ腹水から精製した関連のないIgG110μgを用いた。GM3や精製4C10では反応性が完全に阻害されたが、CDHや関連のないIgG1では全く阻害されなかった。上記の実施例によって、β型抗イディオタイプが黒色腫に免疫反応性であるAB3抗体を産生することが実証された。したがって、L612抗体に応答して生成するこれらβ型抗イディオタイプは、黒色腫を治療する際の免疫化剤として有効である。L612抗体に応答して産生されるα型抗イディオタイプは、3ステップ細胞ELISA法および腫瘍組織切片の3ステップ免疫ペルオキシターゼ染色法のような免疫診断法に使用することができる。実施例は次のとおりである。[3ステップ細胞ELISA法]生育可能なM12細胞1×105を、1BSA-PBSでプリブロッキングpreblockingを行った後、U字型底の960ウェル微量滴定プレートImmulon1Dynatec上にプレートした。50μlのL612100μg/mlを添加し、次いで室温で1時間インキュベートした。混合物を洗浄して未結合のHuMAbL612を除いた後、細胞を、マウスモノクロナル抗イディオタイプの18C6100μg/mlとともに室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、50μlのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体1/10,000希釈JacksonImmunoResearchを添加し、プレートを30分間インキュベートした。PBS溶液で洗浄した後、ペルオキシダーゼに対する基質を添加し、次いで結合活性を、Vmax動的マイクロプレートリーダを用いて、490nmにおける吸光度の関数として求めた。L612の抗原結合部位が、腫瘍細胞に発現されるGM3で占有されている場合、細胞に捕捉されたHuMAbL612は、抗イディオタイプβに対するその結合活性は減少している筈であるが、抗イディオタイプαに対しては充分な結合活性を依然として保持している。高密度の対応する抗原を発現する培養M12黒色腫細胞を用いて、上述の手法により、このプロセスが確認された。上記の細胞結合検定法は、ELISA技法の変形である。陽性反応の特異性を確証するために、いくつかの対照標準検定を行った。対照標準の抗ガングリオシドHuMAbとしてはL55IgM抗GM2およびL72IgM抗GD2があるが、これら両者は、GM2およびGD2が豊富なM14黒色腫細胞系に対して強い結合活性を示す参照資料26、27。抗イディオタイプの186C6は、HuMaBL612とともに予めインキュベートした後のM12細胞に強く反応したが、L55またはL72のHuMAbとともに予めインキュベートしたM14細胞には反応しなかった。ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgも、マウス抗イディオタイプ単独、L612、またはL612プラス抗イディオタイプβを含む他の対照標準の場合、M12細胞と反応しなかった。次いで、細胞ELISA検定法を、他のいくつかのヒト腫瘍細胞系に適用した。2ステップ細胞結合検定法HuMAbペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgMを、3ステップ細胞結合検定法と比較して、3ステップ検定法の有効性を評価した。3ステップ検定法は、2ステップ検定法と並行した反応性を有し、そしてほとんどすべての細胞系で感度がわずかに高かった。このデータは、3ステップ検定法のELISA吸光度値が、細胞表面のGM3抗原の密度の違いを正確に反映し、かつ生体外の検定法の2ステップ法と密接に関連していることを示している。[組織切片の3ステップ免疫ペルオキシダーゼ染色法]4μm厚の組織切片を、OTC化合物中に新たに凍結させた組織から切り取り、直ちに冷ホルムアルデヒド緩衝液12gのトリス緩衝液、9gの塩化ナトリウム、40mlの37ホルムアルデヒド、pH7.4で固定し、次いで風乾した。スライドをトリス緩衝液中に5分間浸漬し、次に3過酸化水素で10分間処理して、内因性のペルオキシダーゼ活性をクエンチした。流動水中で5分間洗浄した後、切片を5の正常ヒト血清で20分間覆った。次いで、HuMAbL612200μl中10μgのIgMを添加し、45分間インキュベートした。スライドをトリス緩衝液中で5分間洗浄し、精製抗イディオタイプ18C6200μl中10μgのIgG1を添加し、30分間インキュベートした。スライドを再び洗浄した後、三次抗体として1/100に希釈したビオチニル化ヤギ抗マウスIgG米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム所在のVectorLaboratories社を添加し、25分間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ストレプタビジン1/1000希釈度米国、サンフランシスコ所在のZymedLaboratories社を添加し、20分間インキュベートした。洗浄後、スライドを、6mlのアミノエチルカルバゾール、50mlの0.02M酢酸ナトリウム緩衝液pH5.1および0.4mlの新たに調製した3過酸化水素水を含有する基質溶液中に5分間浸漬した。スライドを水道水でもう一度洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色を行い、次いでグリセリン-ゼラチンを用いてカバースリップで染色切片をカバーした。免疫ペルオキシダーゼの3ステップ検定法を用いて、スナップ凍結されていた外科採取腫瘍組織に対するL612抗体の結合を検出するのに成功した。この発明の代表的な実施態様を説明してきたが、ここに開示されているのは例示に過ぎず、その外の各種の代替、適合および変更がこの発明の範囲内でなされ得ることを、当該技術分野の当業者は理解すべきである。例えば、L612抗体を用いて、各種の治療にまたは診断用試薬として有用なキメラ抗体を製造することができる。したがって、この発明は、ここに例示されている特定の実施態様に限定されず、後記の請求の範囲によってのみ限定される。[配列リスト]1一般情報i出願人イリエレイコエフii発明の名称抗ガングリオシド抗体を産生するヒトのBリンパ芽腫細胞系iii配列の数4iv連絡住所A宛先Poms,Smith,LandeRoseB街アベニューオブザスターズ21211400号室C市ロサンゼルスD州カリフォルニアE国アメリカ合衆国F郵便番号90067vコンピュータ読み取り書式AメディアタイプフロッピディスクBコンピュータIBM-PCコンパチCOSPC-DOS/MS-DOSDソフトウエアPatentInRelease1.0,Version1.25vi本出願データA出願番号USB出願日C分類vii先出願データA出願番号US07/609803B出願日1990年11月05日viii代理人情報A氏名Oldenkamp,DavidJB登録番号29421C整理番号94268ix通信情報A電話3107885046BFAX31027712972配列情報配列ID番号1i配列特性A配列の長さ432塩基対B配列の型核酸C鎖の数一本鎖Dトポロジ直鎖状ii配列の種類cDNAiiiハイポセティカルNoivアンチセンスNovi起源A生物名ホモサピエンスG細胞の種類EBウイルスによる形質転換B細胞HセルラインL612ix配列の特徴A名称/キーCDSB存在位置1..432D他の情報/機能=H鎖/生産物=免疫グロブリン可変部/標準名称=HuMabL612H鎖可変部配列ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置148..162D他の情報/機能=相補性決定領域1CDR1ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置271..300D他の情報/機能=相補性決定領域2CDR2ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置397..429D他の情報/機能=相補性決定領域3CDR3xi配列配列ID番号12配列情報配列ID番号2i配列特性A配列の長さ144アミノ酸B配列の型アミノ酸Dトポロジリニアii配列の種類蛋白質xi配列配列ID番号22配列情報配列ID番号3i配列特性A配列の長さ360塩基対B配列の型核酸C鎖の数一本鎖Dトポロジ直鎖状ii配列の種類cDNAiiiハイポセティカルNoivアンティセンスNovi起源A生物体ホモサピエンスC個体単離EBウイルスによる形質転換B細胞G細胞の種類B細胞HセルラインL612ix配列の特徴A名称/キーCDSB存在位置1..360D他の情報/機能=免疫グロブリンL鎖/生産物=HuMabL612L鎖可変部ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置58..108D他の情報/機能=相補性決定領域1CDR1ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置154..174D他の情報/機能=相補性決定領域2CDR2ix配列の特徴A名称/キーmisc_featureB存在位置271..297D他の情報/機能=相補性決定領域3CDR3xi配列配列ID番号32配列情報配列ID番号4i配列特性A配列の長さ120アミノ酸B配列の型アミノ酸Dトポロジリニアii配列の種類蛋白質xi配列配列ID番号4"