"トランスジェニック植物または植物組織を作出するための方法であって、植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を実質的に欠く核酸配列の少なくとも2つの領域と、少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位とを含む核酸分子を提供する工程であって、前記植物細胞のゲノムDNAとの実質的配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域が、前記少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する、工程、前記植物細胞または前記植物細胞を含む植物組織を前記核酸分子で形質転換する工程であって、前記核酸分子が植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる工程、および前記核酸分子で形質転換した前記植物細胞から植物組織を作製するか、または植物を再生する工程を含む方法。前記核酸分子が非同一制限部位をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記非同一制限部位が、複数のELPのコンカテマー化を可能にする適合一本鎖末端を含む、請求項2に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域がオープンリーディングフレームを含まない、請求項1に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも1つの領域がオープンリーディングフレームを含まない、請求項1に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域が約50bp~約3kbである、請求項1に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域が配列番号1~10からなる群の1つまたは複数から選択される、請求項1に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼが配列番号15および16を含む、請求項1に記載の方法。前記植物細胞のゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の少なくとも2つの領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼが、単子葉植物、キャノーラを含めた双子葉植物の形質転換に使用される植物形質転換用ベクター、pDAB104137、pDAB104139、pDAB104141、またはpDAB104143に取り込まれた配列番号15および16を含む、請求項1に記載の方法。前記ターゲティングエンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。前記核酸分子が、前記植物細胞のゲノム中にランダムに安定的に組み込まれる、請求項1に記載の方法。前記核酸分子が、前記植物細胞のゲノム中の1つまたは複数の既知の標的部位に安定的に組み込まれる、請求項1に記載の方法。前記核酸分子が、染色体または微小染色体の増幅領域に安定的に組み込まれる、請求項1に記載の方法。請求項1に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物組織または植物。請求項14に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。トランスジェニック植物を作出するための方法であって、請求項8に記載のトランスジェニック植物組織または植物から単離した細胞または組織を提供する工程、少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼ、または少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む第一の核酸分子を提供する工程であって、前記少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼが前記トランスジェニック植物のゲノム中に導入された少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する、工程、対象の核酸配列、および対象の核酸配列に隣接する2つの他の核酸配列を含む第二の核酸分子を提供する工程であって、前記2つの他の核酸配列のそれぞれが、ゲノムDNAとの配列相同性を欠く核酸配列の2つの領域のうちの1つと相同性がある、工程、i前記少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼまたは前記第一の核酸分子およびii前記第二の核酸分子を前記植物細胞または組織に導入する工程であって、前記対象の核酸配列が前記植物細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる工程、および前記第一および第二の核酸分子で形質転換した前記植物細胞または組織から植物を再生する工程を含む方法。請求項16に記載の方法によって作出されるトランスジェニック植物。請求項17に記載のトランスジェニック植物によって作出される種子。前記核酸分子の各末端上に、1つまたは複数の他のターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位が隣接する、請求項1に記載の方法。前記1つまたは複数の他のターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位を認識する1つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼを植物組織または植物に導入する工程であって、前記核酸分子が前記植物組織または植物のゲノムから切除される工程をさらに含む、請求項19に記載の方法。前記ターゲティングエンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項16に記載の方法。本明細書では、低い割合の相同的組換えを示す宿主生物、例えば植物または動物種のゲノムに核酸分子を導入する方法を開示する。特定の例において、操作されたランディングパッドELPを使用し、ELPは、DNA結合ドメイン例えば、ジンクフィンガータンパク質ZFP、メガヌクレアーゼ、またはロイシンジッパーの結合部位に隣接した、宿主生物のゲノムとの相同性を実質的に欠くヌクレオチド配列例えば、ランダムに生じる配列を含むヌクレオチド配列領域を含むことができる。ELPの結合部位を標的とするDNA結合ドメインは、DNA切断機能ドメインを本来含むことができ、または機能ドメイン、例えばエンドヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断半ドメイン例えば、ZFN、リコンビナーゼ、トランスポアーゼ、または修飾DNA結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼを含むホーミングエンドヌクレアーゼをさらに含む融合タンパク質の一部であってもよい。このクラスのDNA結合性切断タンパク質は、本明細書では一括してターゲティングエンドヌクレアーゼと呼ぶ。特定の例において、宿主生物以外の生物源由来の非ランダムのヌクレオチド配列も使用することができ、標的生物のゲノムとの非相同性が適切である。したがって、いくつかの例において、任意の配列決定した標的植物ゲノムの領域と相同性が実質的にないことを確実にするように、ヌクレオチド配列を設計しうる。いくつかの例において、ELPは、相同性指向型homologydirected遺伝子ターゲティングのためのターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNに対して高活性の相同性領域および結合部位を提供しうる。したがってELPは、外部または内部、核酸挿入体で他のヌクレオチド配列を使用する必要性を低減または排除しうる。いかなる擬似オープンリーディングフレームも欠如し、好ましくはベクターの構築または対象の核酸分子で形質転換した植物の分析のため、制限酵素部位を含有または欠如するように、ELPを設計しうる。いくつかの例において、ELPは制限酵素の消化の際に適合末端を生成する非同一制限部位に隣接する可能性はあるが、ハイブリッド結合部位は制限酵素の一方によって切断されない。これらおよび他の例において、これは、独自の相同性領域およびターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位例えば、ZFN結合部位をそれぞれが有する大規模アレイへの、ELPのコンカテマー化を可能にする。いくつかの例において、ELPを標的ゲノムにランダムに取り込ませることが可能であり、または生じるトランスジェニック植物に対して許容範囲の有害な影響ありで、もしくは有害な影響なしで、トランスジェニック挿入体を収容することが示されているゲノム部位にターゲティングしうる。ゲノム標的部位中の相同性領域は、標的ドナー核酸分子中の相同性領域と同一である可能性があり、それによってターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNによる二本鎖切断後の相同性指向型組換えが容易になる可能性がある。したがって、ELPを設計および作製する方法、およびELPを使用して対象の核酸分子で植物を形質転換する方法を開示する。本発明中で有用な核酸分子、および本発明による方法によって作出される遺伝子組換え植物も開示する。前述および他の特徴は、添付の図面の参照に続くいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からさらに明らかとなる。I.いくつかの実施形態の概要いくつかの実施形態において、宿主生物中へのさらなる対象の核酸分子の組み込みが容易になるように、宿主生物中に操作されたランディングパッドELPを含む核酸分子を導入する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ELPは、ターゲティングエンドヌクレアーゼ認識部位例えば、ZFN認識部位に隣接した、宿主生物の天然配列例えば、本質的にランダムに生じる核酸配列、本明細書に開示する特定の望ましい基準に基づき挿入用に次いで選択され得ると相同性がない核酸配列の領域を含み得る。ELPを組み込むための部位はランダムであってよく、例えばELPの部位に対象の核酸分子を導入するのに望ましい発現レベルを有する宿主ゲノム内の構造遺伝子を同定することにより決定することができ、またはELPをその部位に導入したとき形質転換宿主生物に代謝的、機能的、農学的植物の場合または他の制約を与えない宿主ゲノム内の位置を同定することにより決定しうる。例えば本発明の方法に従って作出される生物中にコンカテマーとしてELPが存在するように、ゲノム中にELPをタンデムで導入しうる。いくつかの実施形態において、対象の核酸分子の組み込みはELP部位に実施する。いくつかの実施形態において、ELP部位に導入される対象の核酸分子は、1つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼと結合し、ポリペプチドとして与えられまたは導入RNAもしくはDNAから発現される。さらに、導入核酸分子は、宿主ゲノム中に既に取り込まれたELPと異なるELPを含み得る。当業者は、野生型生物において宿主ゲノム中の天然核酸配列が発現される部位に導入される核酸配列は、天然核酸配列と類似した形式で発現されると予想されることを理解している。例えば、野生型生物において制御エレメントの調節下で例えば、核酸配列が例えば組織特異的または発生特異的な形式で発現されるように天然核酸配列が発現される場合、導入核酸配列は同一または類似の制御調節を受けると予想される。したがってELPは、ELP部位に導入された対象の核酸分子の所望の時間的および/または空間的発現を容易にしうる。II.略語ELISA酵素結合免疫吸着アッセイELP操作されたランディングパッドZFNジンクフィンガーヌクレアーゼIII.用語遺伝子発現:それによって核酸転写ユニット例えばゲノムDNAを含むのコード情報が、細胞の作動的、非作動的、または構造的な部分に変換されるプロセスタンパク質の合成を含むことが多いである。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、遺伝子発現を増大または低下させる物質への細胞、組織、または生物の曝露によって影響を受ける可能性がある。遺伝子の発現は、DNAからRNAそしてタンパク質への経路中の任意の場所で制御することもできる。遺伝子発現の制御は、例えば、転写、翻訳、RNA輸送およびプロセシング、mRNAなどの中間分子の分解に作用する調節によって、またはそれらが生成した後の特定タンパク質分子の活性化、不活性化、区画化、もしくは分解によって、またはこれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、ノーザンブロット、RT-PCR、ウエスタンブロット、またはinvitro、insitu、またはinvivoタンパク質活性アッセイ1つまたは複数を非制限的に含む当技術分野で知られている任意の方法により、RNAレベルまたはタンパク質レベルで測定しうる。ハイブリダイゼーション:オリゴヌクレオチドとそれらのアナログは、相補的塩基間のワトソン-クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によってハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジンシトシンC、ウラシルU、およびチミンTまたはプリンアデニンAおよびグアニンGのいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基はピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合は塩基対形成と呼ばれる。より具体的には、AはTまたはUと水素結合し、GはCと結合する。相補的なは、2つの異なる核酸配列または同じ核酸配列の2つの異なる領域間で起こる塩基対形成を指す。特異的にハイブリダイズ可能なおよび特異的に相補的なは、安定的および特異的結合がオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的の間で起こるような十分な程度の相補性を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列と100相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドと標的DNAまたはRNA分子の結合が標的DNAまたはRNAの正常機能に干渉し、特異的結合が望ましい条件下、例えばinvivoアッセイまたは系の場合生理的条件下でのオリゴヌクレオチドと非標的配列の非特異的結合を回避するほど十分な程度の相補性が存在するとき、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合は特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度特にNaおよび/またはMg2濃度はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに貢献するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を与える。特定の程度のストリンジェンシーを得るのに必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndedvol13ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork1989chs9and11中で論じられている。本開示の目的で、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間に25未満のミスマッチが存在する場合、その下でハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。ストリンジェントな条件は、特定のレベルのストリンジェンシーにさらに定義しうる。したがって、本明細書で使用する適度なストリンジェンシー条件は、その下で25を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件である。中間ストリンジェンシーの条件は、その下で15を超えるミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、高ストリンジェンシーの条件は、その下で10を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。非常に高いストリンジェンシーの条件は、その下で6を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、65°Cでのハイブリダイゼーション、次に40分間の0.1×SSC/0.1SDSを用いた65°Cでの連続洗浄を含み得る。単離された:単離された生物学的構成成分核酸またはタンパク質などは、その構成成分が本来存在する生物の細胞内の他の生物学的構成成分、すなわち他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、およびタンパク質から実質的に分離、生成、または精製されている。単離された状態である核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、および化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。核酸分子:RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得るポリマー型のヌクレオチド、ならびに前述の合成型および混合ポリマー。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、または一方の型のヌクレオチドの修飾型を指す。本明細書で使用する核酸分子は、核酸およびポリヌクレオチドと同義である。この用語は、一本鎖および二本鎖型のDNAを含む。核酸分子は、天然に存在するおよび/または非天然ヌクレオチド結合により1つに結合した、天然に存在するヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの一方または両方を含み得る。当業者によって容易に理解されるように、核酸分子は化学的または生化学的に修飾することができ、または非天然または誘導体ヌクレオチド塩基を含有しうる。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、および1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドとアナログの置換がある。他の修飾には、非荷電結合例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど、荷電結合例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどなどのヌクレオチド間修飾、ペンダント成分例えば、ペプチド、インターカレーター例えば、アクリジン、ソラレンなど、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合例えば、αアノマー核酸などがある。用語核酸分子は、一本鎖、二本鎖、部分的デュプレックス、トリプレックス、ヘアピン、環状、およびパドロック形状を含めた任意の位相幾何学的形状も含む。作動可能に連結した:第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係があるとき、第一の核酸配列は第二の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるとき、プロモーターはコード配列と作動可能に連結している。組換えにより生成するとき、および同一リーディングフレームで2つのタンパク質コード領域を接合することが必要である場合、作動可能に連結した核酸配列は一般に隣接している。しかしながら、エレメントは、作動可能に連結するように互いに隣接している必要はない。プロモーター:転写に必要とされる遺伝子の5’領域に向かって一般に上流に位置するDNAの領域。プロモーターは、それらが制御する遺伝子の正確な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含有する。これらの因子はプロモーターDNA配列と結合し、RNAポリメラーゼ遺伝子のコード領域からRNAを合成する酵素の動員をもたらす。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターを使用する。組織特異的プロモーターは、生物の他の組織と比較してプロモーターが特異的である組織中の、関連遺伝子の高レベルの転写を誘導するDNA配列である。組織特異的プロモーターの例には、タペート組織特異的プロモーター、葯特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター例えば、米国特許第7,141,424号、および国際PCT公開No.WO99/042587参照、胚珠特異的プロモーター例えば、米国特許出願No.2001/047525A1参照、果実特異的プロモーター例えば、米国特許第4,943,674号、および同第5,753,475号参照、および種子特異的プロモーター例えば、米国特許第5,420,034号、および同第5,608,152号参照がある。いくつかの実施形態において、発生段階特異的プロモーター、例えば発生中の後期段階で活性があるプロモーターも使用する。形質転換:ウイルスまたはベクターは、それが細胞に核酸分子を移すとき、細胞を形質転換または形質導入する。細胞ゲノム中への核酸分子の取り込み、またはエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞により安定的に複製された状態になるとき、細胞に形質導入された核酸分子によって細胞は形質転換される。本明細書で使用する用語形質転換は、それによって核酸分子をこのような細胞中に導入しうる、全ての技法を包含する。例には、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、エレクトロポレーションFrommetalNature3197913、リポフェクションFelgneretalProcNatlAcadSciUSA8474137、マイクロインジェクションMuelleretalCell1557985、アグロバクテリウムAgrobacterium媒介導入FraleyetalProcNatlAcadSciUSA8048037、直接的なDNAの取り込み、およびマイクロプロジェクタイルボンバードメントKleinetalNature32770があるが、これらに限定されない。導入遺伝子:外来核酸配列。一例では、導入遺伝子は、遺伝子配列例えば、除草剤耐性遺伝子、産業上もしくは薬学上有用な化合物をコードする遺伝子、または望ましい農業的形質をコードする遺伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子はアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現は標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入遺伝子と作動可能に連結した制御配列例えば、プロモーターを含有しうる。いくつかの実施形態において、ELP標的組換えにより導入される対象の核酸分子は導入遺伝子である。しかしながら、他の実施形態において、対象の核酸分子は、その内因性核酸配列の追加的ゲノムコピーが望ましい内因性核酸配列、または宿主生物中の標的核酸分子に対してアンチセンス方向に存在する核酸分子である。ベクター:細胞中に導入し、それによって形質転換細胞を生成する核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞中でのその複製を可能にする核酸配列を含むことができる。例には、細胞中に外来DNAを運ぶ、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスがあるが、これらに限定されない。ベクターは、当技術分野で知られている、1つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および/または選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含むことができる。ベクターは細胞に形質導入、形質転換、または感染し、それによってベクターによってコードされる核酸分子および/またはタンパク質を細胞に発現させうる。ベクターは、細胞中への核酸分子の進入の実施を容易にする物質例えば、リポソーム、コードタンパク質などを場合によっては含むことができる。IV.植物における遺伝子ターゲティング用の操作されたランディングパッドA.概要いくつかの実施形態において、ELPを植物に導入して、例えば1つまたは複数の対象のさらなる核酸分子の導入を容易にする。対象のさらなる核酸分子は、例えば、宿主生物中で発現されるタンパク質をコードする任意の核酸配列を含むことができる。他の実施形態において、ELPを使用して未知の機能の核酸分子の導入を容易にし、異所遺伝子発現に基づいてそれらの機能を識別する。1つまたは複数のELPに隣接する領域は、1つまたは複数のELPが部位特異的に宿主植物ゲノム中に組み込まれるように、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的であってもよい。ELPを使用して様々な長さの核酸分子を取り込むことができる。いくつかの実施形態において、トランスジェニックELP標的にターゲティングされる核酸分子は、標的部位における連続遺伝子付加を可能にするために第二のELPを含有しうる。1つまたは複数のターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNをこのプロセス中連続的または同時に使用しうる。望む場合、2つ以上のターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位例えば、ZFN結合部位を、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な1つまたは複数のELP領域内に追加的に取り込ませうる。いくつかの実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位は、それらがELPに隣接するように加えることができる。この後者およびさらなる実施形態において、植物中の加えた結合部位で切断するターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNの発現はELPの切除をもたらす。いくつかの実施形態において、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な領域を、他の隣接DNAと組み合わせて使用して、ELP標的に導入される対象の核酸分子、例えば、遺伝子発現エレメントまたは対象の遺伝子などに隣接した核酸分子を挿入させることもできる。DNA切断を使用して、この部位における相同的組換えを高めることができる。いくつかの実施形態において、ゲノム核酸配列と相同的なELP中の相同性領域は、ZFN、メガヌクレアーゼまたは他のターゲティングエンドヌクレアーゼなどのDNAを切断する酵素によって容易になる、核酸分子の標的挿入に使用することもできる。いくつかの実施形態において、DNA増幅プロセスによりまたは微小染色体において生成しうる修飾染色体領域中に、ELPを取り込ませうる。いくつかの実施形態において、相同性領域および適切に配置されたターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNを使用して、宿主植物のゲノム核酸配列と相同的な隣接領域内の配列の修飾を容易にする。B.ELPの設計いくつかの実施形態において、植物染色体の位置における相同的組換えを容易にするように、ELPを設計しうる。ELPは周辺遺伝子またはDNA配列に対して中立的影響を有し得る。ELPは植物ゲノム内の独自の、標的可能配列を示し得る。特定の実施形態において、所望の染色体位置に対する各5’および3’相同性領域の大きさ例えば、1kbを、相同性指向型組換えを容易にするのに望ましいと考えられる最小の大きさに見合うよう選択する。具体的な実施形態において、各5’および3’相同性領域の大きさは、約50bp、100bp、200bp、400bp、600bp、700bp、750bp、800bp、1kb、1.2kb、1.4kb、1.6kb、1.8kb、2kb、または3kbである。特定の実施形態において、5’および3’相同性領域は同じ大きさである必要はない。例えば乱数発生用のコンピュータープログラムを使用して、ELP配列を生成しうる。例えば乱数発生により生成したELP配列は次いで、望ましい特徴標的生物の天然ゲノム配列に対する相同性を実質的または完全に欠く配列を含むがこれらに限定されないに基づいてELPとして使用するために選択しうる。選択したELPは、以下でさらに詳述するように修飾することもできる。いくつかの実施形態において、ELPの設計および/または選択したELPの修飾に関する基準は、以下の1つまたは複数を含み得る:クローニングに通常使用する制限部位の除去、潜在的メチル化部位例えば、CGおよびCNGの数の減少、および300bpを超える任意のオープンリーディングフレームの不在。さらに、ELPの設計中、例えば、エクソン:イントロン接合部5’または3’;ポリA付加シグナル;RNAポリメラーゼ終了シグナル;および非常に安定した鎖内二次構造を含む、核酸配列中の他の部位を除去しうる。配列を分析し、修飾してTAまたはCGダブレットの頻度を低下させることも可能である。[GC]または[AT]の約6を超える連続残基を有する配列ブロックを、ELPの設計中に配列から除去することもできる。いくつかの実施形態において、ELPは例えば、X1-Y-X2であって、前式でYが少なくとも1つのターゲティングエンドヌクレアーゼ結合部位例えば、ZFN結合部位であり、X1が宿主生物のゲノムとの相同性を欠く選択したヌクレオチド配列でありYの5’に位置し、X2が、X1とは異なる宿主生物のゲノムとの相同性を欠く選択したヌクレオチド配列であるヌクレオチド配列を含み得る。例示的なX1およびX2ヌクレオチド配列は、以下の配列、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9および配列番号10から独立に選択しうる。いくつかの実施形態において、これらの配列に対するさらなる修飾、欠失、または付加例えば、制限部位の除去または付加を施して、付加または異なる機能を与えることができる。例えば、特定の実施形態において、配列番号1を修飾して配列番号11を生成することができ、配列番号3を修飾して配列番号12を生成することができ、配列番号2を修飾して配列番号13を生成することができ、配列番号4を修飾して配列番号14を生成することができ、配列番号5を修飾して配列番号17を生成することができ、配列番号6を修飾して配列番号18を生成しうる。特定の実施形態において、例示的なELPには、以下の配列、配列番号15、配列番号16、および配列番号19があるが、これらに限定されない。制限酵素部位例えば、FseI制限酵素部位をELPの隣に導入して、適切なベクターへのELPのクローニングを可能にしうる。制限酵素の消化によって適合末端を生成する制限酵素部位例えば、BglIIおよびBamHI部位をELPの隣に導入して、宿主植物ゲノムにおいて、例えばコンカテマーとしてのELPの同時の鎖形成を可能にすることもできる。制限酵素部位を導入して、組換えによりELPに後にターゲティングされる対象の核酸配列の宿主植物における分析を可能にすることもできる。2つ以上の制限酵素部位を1つのELPの隣に導入しうる。例えば、BglIIおよびBamHI部位をFseI部位の内部に含めることができる。制限酵素部位を導入して、組換えによる挿入用にELPにターゲティングされる対象の核酸配列の宿主植物における分析を可能にすることもできる。例えば、PmeI部位を挿入部位の隣に導入しうる。C.ELPを含有する植物細胞への核酸分子の送達標的組み込みによる植物ゲノムへの、対象の核酸分子例えば、事前に組み込まれたELPにターゲティングされる1つまたは複数のELPおよび/または外来核酸分子のターゲティングエンドヌクレアーゼ媒介の組み込みを可能にするため、ターゲティングエンドヌクレアーゼまたはターゲティングエンドヌクレアーゼコード核酸分子の送達、次に植物細胞中での機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現が必要とされる。ターゲティングエンドヌクレアーゼがその中で送達または発現されるのと同時に、対象の核酸分子も植物細胞中に存在するはずであり、したがって機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質は1つまたは複数の標的部位で二本鎖破壊を誘導する可能性があり、それらは次いで標的遺伝子座への対象の核酸分子の相同性指向型組み込みにより修復される。当業者は、機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現は、ターゲティングエンドヌクレアーゼコード構築物のトランスジェネシス、またはターゲティングエンドヌクレアーゼコード構築物の一過性発現に限定されないが、これらを含むいくつかの方法により実施しうることを想定しうる。この両方の場合において、植物細胞中での機能性ターゲティングエンドヌクレアーゼタンパク質の発現およびドナーDNAの送達を同時に実施して、標的組み込みを誘導しうる。したがって、特定の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ例えば、ZFNを形質転換植物中で核酸分子から発現させて、形質転換植物のゲノム中、例えば植物に事前に導入した1つまたは複数のELP中に二本鎖破壊を導入する。ELP中に存在するように設計された1つまたは複数の認識配列を標的とする、ターゲティングエンドヌクレアーゼを使用しうる。したがって、本発明のELPを構築するための設計および選択手法は、ELPに対象の核酸分子を導入するために後に使用されるターゲティングエンドヌクレアーゼ1つまたは複数によって認識される、1つまたは複数の特異的核酸配列を決定することにより始めることができる。ZFN系の柔軟性および特異性は、知られているリコンビナーゼ媒介遺伝子切除戦略により以前は実施不能であった一定レベルの制御をもたらす。一例として、ZFNを容易に操作して、例えば特異的核酸配列例えば、ELPを認識しうる。WuetalCellMolLifeSci64293344。ジンクフィンガー認識残基に関するコドンのランダム化は、任意で選択したDNA配列に対して高い親和性を有する新たなフィンガーの選択を可能にする。さらに、ジンクフィンガーは天然DNA結合分子であり、改変ジンクフィンガーは生きた細胞中でそれらの設計標的に作用することが示されている。したがって、ジンクフィンガーベースのヌクレアーゼは、特異的であるが任意の認識部位にターゲティングしうる。キメラジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインの二量体化に関する要件は、高レベルの配列特異性をもたらす。3フィンガーの各組は9連続塩基対と結合するので、それぞれのジンクフィンガードメインが完全な特異性を有する場合、2キメラヌクレアーゼは18bpの標的を効果的に必要とする。この長さの任意の所与の配列は1ゲノム内に特有であると予想される約109bpと仮定。BibikovaetalMolCellBiol2128997、Wuetal、上記。さらに、他のフィンガーは高い特異性をもたらし、BeerlietalProcNatlAcadSciUSA951462833、KimandPaboProcNatlAcadSciUSA9528127、LiuetalProcNatlAcadSciUSA94552530、したがって各DNA結合ドメイン中のジンクフィンガーの数が増大して一層高い特異性をもたらす可能性がある。例えば、24bpの配列を認識する一対の4フィンガーZFNを使用することによって、特異性はさらに増大し得る。UrnovetalNature43564651。したがって、宿主植物ゲノム中に導入されるELP中の認識配列がゲノム内に特有であるように、ZFNを使用しうる。ELPにおける標的組換えによって導入される対象の核酸分子は、望ましい形質または表現型を与えるのに十分な量の遺伝子の発現を誘導する、1つまたは複数の植物プロモーター1つまたは複数と作動可能に連結しうる。この使用および他の使用に適したプロモーターは当技術分野でよく知られている。このようなプロモーターを記載する非制限的な例には、米国特許第6,437,217号メイズRS81プロモーター、同第5,641,876号イネアクチンプロモーター、同第6,426,446号メイズRS324プロモーター、同第6,429,362号メイズPR-1プロモーター、同第6,232,526号メイズA3プロモーター、同第6,177,611号構成的メイズプロモーター、同第5,322,938号、同第5,352,605号、同第5,359,142号、および同第5,530,196号35Sプロモーター、同第6,433,252号メイズL3オレオシンプロモーター、同第6,429,357号イネアクチン2プロモーター、およびイネアクチン2イントロン、同第5,837,848号根特異的プロモーター、同第6,294,714号光誘導性プロモーター、同第6,140,078号塩誘導性プロモーター、同第6,252,138号病原体誘導性プロモーター、同第6,175,060号リン欠乏誘導性プロモーター、同第6,388,170号双方向性プロモーター、同第6,635,806号γ-コイキシンプロモーター、および米国特許出願第09/757,089号メイズ葉緑体アルドラーゼプロモーターがある。他のプロモーターには、ノパリンシンターゼNOSプロモーターEbertetalProcNatlAcadSciUSA8457459、オクトパインシンターゼOCSプロモーターこれはアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensの腫瘍誘発プラスミドで実施される、カリフラワーモザイクウイルスCaMV19SプロモーターなどのカリモウイルスプロモーターLawtonetalPlantMolBiol931524、CaMV35SプロモーターOdelletalNature3138102、ゴマノハグサモザイクウイルス35S-プロモーターWalkeretalProcNatlAcadSciUSA8466248、スクロースシンターゼプロモーターYangandRussellProcNatlAcadSciUSA8741448、R遺伝子複合体プロモーターChandleretalPlantCell1117583、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、CaMV35S米国特許第5,322,938号、同第5,352,605号、同第5,359,142号、および同第5,530,196号、FMV35S米国特許第6,051,753号、および同第5,378,619号、PC1SVプロモーター米国特許第5,850,019号、SCP1プロモーター米国特許第6,677,503号およびAGRtu.nosプロモーターGenBank受託番号V00087、DepickeretalJMolApplGenet156173、BevanetalNature3041847などがある。対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントには、輸送ペプチドをコードする配列がある。例えば、A.タリアナAthalianaのEPSPSCTPKleeetalMolGenGenet21043742、およびペチュニアハイブリダPetuniahybridaのEPSPSCTPdellaCioppaetalProcNatlAcadSciUSA8368737などの適切な葉緑体輸送ペプチドの取り込みは、異種のEPSPSタンパク質配列をトランスジェニック植物中の葉緑体にターゲティングすることが示されている。国際PCT公開No.WO2008/105890中に記載されたように、ジカンバモノオキシゲナーゼDMOも葉緑体にターゲティングしうる。対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントは、翻訳リーダー配列として機能するプロモーター配列とコード配列の間に位置する5’UTRも含む。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全にプロセシングされたmRNA中に存在する。翻訳リーダー配列は、mRNAへの一次転写産物のプロセシング、mRNAの安定性、および/または翻訳効率に影響を与えることができる。翻訳リーダー配列の例には、メイズおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー米国特許第5,362,865号、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、およびその他がある。例えば、TurnerandFosterMolecularBiotech322536を参照。5’UTRの非制限的な例には、GmHsp米国特許第5,659,122号、PhDnaK米国特許第5,362,865号、AtAnt1;TEVCarringtonandFreedJVirol6415907、およびAGRtunosGenBank受託番号V00087、およびBevanetalNature3041847がある。対象の核酸分子と場合によっては作動可能に連結しうる他の遺伝子エレメントは、3’非翻訳配列、3’転写終結領域、またはポリアデニル化領域も含む。これらはポリヌクレオチド分子の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナル、および/または転写、mRNAプロセシング、または遺伝子発現に影響を与えることができる他の制御シグナルを与えるポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは植物中で機能して、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニレートヌクレオチドの付加を引き起こす。ポリアデニル化配列は、天然遺伝子、様々な植物遺伝子、またはT-DNA遺伝子に由来してよい。3’転写終結領域の非制限的な一例は、ノパリンシンターゼ3’領域であるnos3’、FraleyetalProcNatlAcadSciUSA8048037。異なる3’非翻訳領域の使用の一例はIngelbrechtetalPlantCell167180中に与えられる。ポリアデニル化シグナルの非制限的な例には、ピスムサティブムPisumsativumRbcS2遺伝子からのポリアデニル化シグナルPsRbcS2E9、CoruzzietalEMBOJ316719、およびAGRtu.nosGenBank受託番号E01312がある。D.核酸分子を用いた宿主細胞の形質転換植物に核酸分子を導入するための当技術分野で知られている任意の技法を使用して、本発明による形質転換植物を作出する、例えば、宿主植物ゲノムに1つまたは複数のELPを導入する、および/または対象の核酸分子をさらに導入しうる。植物の形質転換に適した方法には、米国特許第5,384,253号中に例示されたエレクトロポレーションによる方法、米国特許第5,015,580号、同第5,550,318号、同第5,538,880号、同第6,160,208号、同第6,399,861号、および同第6,403,865号中に例示されたマイクロプロジェクタイルボンバードメントによる方法、米国特許第5,635,055号、同第5,824,877号、同第5,591,616号、同第5,981,840号、および同第6,384,301号中に例示されたアグロバクテリウムAgrobacterium媒介形質転換による方法、および米国特許第5,508,184号中に述べられたプロトプラスト形質転換による方法などの、それによってDNAを細胞中に導入しうる任意の方法がある。これらの技法などの技法の施用によって、ほぼ任意の植物種の細胞を安定的に形質転換することができ、当業者に知られている技法によって、これらの細胞をトランスジェニック植物に成長させうる。例えば、綿花形質転換の状況で特に有用でありうる技法は米国特許第5,846,797号、同第5,159,135号、同第5,004,863号、および同第6,624,344号中に開示され、特にアブラナ属Brassica植物を形質転換するための技法は例えば米国特許第5,750,871号中に開示され、ダイズを形質転換するための技法は例えば米国特許第6,384,301号中に開示され、コーンを形質転換するための技法は例えば米国特許第7,060,876号、米国特許第5,591,616号、および国際PCT公開WO95/06722中に開示される。レシピエント細胞への外来DNAの送達の実施後、さらなる培養および植物再生用の形質転換細胞が一般に確認される。形質転換体を同定する能力を向上させるために、形質転換体を作製するために使用する、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子および形質転換用ベクターを利用することが望ましい可能性がある。この場合、おそらく形質転換された細胞集団は、1つまたは複数の選択剤に細胞を曝すことによりアッセイすることができ、または望ましいマーカー遺伝子形質に関して細胞をスクリーニングしうる。選択剤への曝露に対して生存する細胞、またはスクリーニングアッセイ中で陽性と記録された細胞は、植物の再生を促進する培地中で培養しうる。いくつかの実施形態において、任意の適切な植物組織培養培地例えば、MSおよびN6培地は、成長調節物質などのさらなる物質を含めることによって改変しうる。植物再生作業を始めるのに十分な組織が得られるまで、または、反復した数ラウンドの手作業による選択後、組織の形態が再生に適した状態になり例えば、少なくとも2週間、次いで苗条形成を促進する培地に移すまで、成長調節物質を含む基本培地上に組織を維持しうる。十分な苗条形成が起こるまで、培養物は定期的に移動させる。苗条が形成された後、それらは苗条形成を促進する培地に移す。十分な根が形成された後、さらなる増殖および成熟のため植物を土壌に移すことができる。再生植物中の対象の核酸分子の存在を確認するために、様々なアッセイを実施しうる。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティングおよびPCRなどの分子生物学的アッセイ、例えば免疫学的手段ELISAおよび/またはウエスタンブロットまたは酵素機能による、タンパク質産物の存在の検出などの生化学的アッセイ、葉または根のアッセイなどの植物部分アッセイ、および再生植物全体の表現型の分析がある。標的組み込みイベントは、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを例えば使用して、例えばPCR増幅によってスクリーニングしうる。PCRによる遺伝子型決定は、ゲノム中に組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予想される単離宿主植物カルス組織由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅、次にPCR増幅産物の標準的なクローニングおよび配列分析に限定されないが、これらを含むと理解される。PCRによる遺伝子型決定の方法は十分記載されており例えば、RiosGetalPlantJ3224353、細胞培養物を含めた任意の植物種または組織型由来のゲノムDNAに適用しうる。標的配列と導入配列の両方と結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組合せは、PCR増幅反応において連続的に使用または多重化しうる。標的部位、導入核酸配列、および/またはこの2つの組合せとアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーが考えられる。したがって、PCRによる遺伝子型決定戦略は、植物ゲノム中の特異的配列の増幅、植物ゲノム中の多重特異的配列の増幅、植物ゲノム中の非特異的配列の増幅、またはこれらの組合せに限定されないがこれらを含むことができる。当業者は、ゲノムを調べるためのプライマーと増幅反応混合物の他の組合せを考案しうる。例えば、一組のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを、導入核酸配列境界外の標的に特異的な1つまたは複数の核酸配列とアニーリングするように設計しうる。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、対象の核酸分子内のコード領域、または対象の核酸分子の他の部分に相当する配列で、対象の導入核酸分子と特異的にアニーリングするように設計しうる。これらのプライマーは、前に記載したプライマーと共に使用しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは所望の配列に従って合成することができ、例えば、IntegratedDNATechnologies、Inc.、Coralville、IAから市販されている。増幅にクローニングおよび配列決定、または増幅産物の直接的配列分析を続けることができる。当業者は、PCRによる遺伝子型決定中に生成した増幅産物を分析するための他の方法を想定しうる。一実施形態において、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをPCR増幅中に利用する。E.トランスジェニック植物の栽培および使用本発明に従いELP部位に標的組み込みにより挿入した1つまたは複数のELPおよび/または対象の核酸分子を含むトランスジェニック植物は、1つまたは複数の望ましい形質を有する可能性がある。このような形質は、例えば、昆虫、他の病虫害、および病原因子に対する抵抗性、除草剤に対する耐性、高い安定性、収率、または貯蔵寿命、環境耐性、医薬品生産、工業製品生産、および栄養価向上を含むことができる。望ましい形質は、望ましい形質を示す植物中で発現されるELP部位に標的組み込みにより挿入される1つまたは複数の核酸分子によって与えられる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、望ましい形質は、植物のゲノムELP部位に導入される植物中の1つまたは複数の導入遺伝子の存在に原因がある可能性がある。他の実施形態において、望ましい形質は従来の品種改良によって得ることができ、その形質はELP部位に標的組み込みにより挿入される1つまたは複数の核酸分子によって与えられる可能性がある。本発明によるトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子で形質転換しうる任意の植物であってよい。したがって、植物は双子葉植物または単子葉植物であってよい。本発明の方法中で有用な双子葉植物の非制限的な例には、アルファルファ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、綿花、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、パンプキン、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ、テンサイ、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびスイカがある。本発明の方法中で有用な単子葉植物の非制限的な例には、コーン、タマネギ、イネ、モロコシ、コムギ、ライムギ、キビ、サトウキビ、オートムギ、ライコムギ、スイッチグラス、およびターフグラスがある。本発明によるトランスジェニック植物は任意の形式で使用または栽培することができ、1つまたは複数のELPおよび/または対象の核酸分子の存在が望ましい。したがって、本発明による核酸分子で形質転換することによって、特に1つまたは複数の望ましい形質を有するように操作することができ、当業者に知られている任意の方法によって収穫および栽培しうる。以下の実施例は、本発明の実施形態を例証するために含まれる。実施例中に開示する技法は、本発明の実施において十分機能することが本発明者らにより発見された技法を表すことは、当業者によって理解される。しかしながら当業者は、本開示に照らして、開示する具体的な実施形態において多くの変形を作製することができ、本発明の範囲から逸脱せずに同様または類似の結果をさらに得ることができることを理解する。より具体的には、同様または類似の結果を得ながら、化学的かつ生理的に関係がある特定の作用物質を、本明細書に記載する作用物質に置換しうることは明らかである。当業者には明らかである全てのこのような類似の代替および変更形態は、添付の特許請求の範囲によって定義する本発明の範囲内にあると考えられる。ベクター構築1kbpの5’相同性領域pDAB100610/pDAB100640中の操作されたランディングパッド領域1配列番号11およびpDAB100611/pDAB100641中の改変合成相同性領域3配列番号12、および1kbpの3’相同性領域pDAB100610中の操作されたランディングパッド領域2配列番号13およびpDAB100611/pDAB100641中の改変合成相同性領域4配列番号14からなる、2つの異なるELPを合成した。これらの相同性領域は2つの異なるEXZACTジンクフィンガーヌクレアーゼeZFN結合部位によって分けた。それぞれELP1配列番号15およびELP2配列番号16で表すpDAB100610およびpDAB100611に使用した2つのELPを、GATEWAY登録商標LRクロナーゼ反応Invitrogen、Carlsbad、CAを使用してpDAB100704、pSB11由来のデスティネーションスーパーバイナリーベクターに移したWO94/00977およびWO95/06722。pDAB100704は、ZmUbi1プロモータープロモーター、トウモロコシZeamaysユビキチン1プロモーターChristensenetalPlantMolecularBiology1867589由来の5’非翻訳領域UTRおよびイントロン、アリルオキシフェノオキシプロピオネート除草剤に対する耐性を与えるαケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードするAAD-1選択マーカー遺伝子スフィンゴビウムヘルビシドボランスSphingobiumherbicidovorans由来の、合成、植物最適型のアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ遺伝子ATCC登録商標700291WO2005/107437、WO2008/141154A2、およびUS2009/0093366、その各々は参照により本明細書に組み込まれる、およびZmLip3’UTRトウモロコシZeamaysLIP遺伝子の転写終結およびポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域UTR、GenBank受託番号L35913を含有する。それぞれELP1配列番号15およびELP2配列番号16で表すpDAB100640およびpDAB100641に使用した2つのELPを、GATEWAY登録商標LRクロナーゼ反応Invitrogen、Carlsbad、CAを使用してpDAB101849、バイナリーベクターに移した。pDAB101849は、OsAct1プロモータープロモーター、およびイネアクチンプロモーター由来のイントロン米国特許第5641876号、pat選択マーカー遺伝子ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、WohllebenetalGene702537、およびZmLip3’UTRトウモロコシZeamaysLIP遺伝子の転写終結およびポリアデニル化部位を含む3’非翻訳領域UTR、GenBank受託番号L35913を含有する。生成したクローン、pDAB100610図1、pDAB100611図2、pDAB100640図3、およびpDAB100641図4の配列を確認した。pDAB100610およびpDAB100611ベクターは、pSB1バイナリープラスミドを有するアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株LBA4404に移し、T鎖領域は相同的組換えによってpSB1に組み込んだ。pDAB100640およびpDAB100641ベクターは、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens株LBA4404に移した。それぞれのプラスミドの構造は制限酵素の消化によって確認した。対象の核酸分子ドナーDNAを含有するベクターを、ELP1およびELP2の型2v2として示す切断型の5’および3’相同性領域の間にYFP発現カセットおよびPATもしくはAAD-1発現カセットを挿入することによって構築した。PAT発現カセットは、ZmLip3’非翻訳領域に隣接したpat遺伝子ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、WohllebenetalGene702537を発現させるために使用したOsAct1プロモーターイネアクチン1プロモーター、McElroyetalPlantCell2163171を含有する。AAD-1発現カセットは、aad-1遺伝子およびZmPer53’UTRを誘導するためのZmUbi1プロモーターを含有する米国特許第6384207号。YFP発現カセットは、PhiYFP遺伝子黄色蛍光タンパク質米国特許出願US2007/0298412の発現を誘導するために使用しZmPer53’UTRに隣接するZmUbi1プロモーターからなる米国特許第6384207号。PATおよびYFP発現カセットは、ELP1中の切断型の操作されたランディングパッド領域1と操作されたランディングパッド領域2の間にクローニングしたpDAB105955、図5。あるいは、PATおよびYFP発現カセットを、ELP2中の切断型の改変相同性領域3と改変相同性領域4の間にクローニングしたpDAB105956、図6。同様に、AAD-1およびYFP発現カセットを、ELP1中の切断型の操作されたランディングパッド領域1と切断型の操作されたランディングパッド領域2の間にクローニングしたpDAB105979、図7。あるいは、AAD-1およびYFP発現カセットを、ELP2中の切断型の改変相同性領域3と切断型の改変相同性領域4の間にクローニングしたpDAB105980、図8。ドナーDNA構築物をバイオリスティック、ウィスカーまたはアグロバクテリウムAgrobacterium媒介形質転換用にバイナリーベクターにクローニングした。さらに、DNA構築物は、直接DNA送達形質転換に使用するプラスミドDNAの作製用に高コピー数プラスミド例えば、ColE1複製起点を有するpBR322誘導体にクローニングしうる。ウィスカー媒介のDNA送達メイズの胚Hi-II細胞培養物を米国特許第7,179,902号中に記載されたように生成し、その標的組み込みを例示した生存する植物細胞の供給源として使用した。AAD-1植物選択マーカーカセット、およびそれぞれpDAB100610ならびにpDAB100611由来のELP1ならびにELP2を含有する断片、およびPAT植物選択マーカーカセット、およびそれぞれpDAB100640ならびにpDAB100641由来のELP1ならびにELP2を含有する断片を使用してトランスジェニックイベントを作製した。トランスジェニックイベントは単離し特徴付けした。次いで相同性指向型相同的組換えを使用してこれらのイベントをターゲティングし、対象の核酸分子は操作されたランディングパッド内に組み込むことができる。12mLのヘマトクリット値PCVの予め凍結保存した細胞系および28mLの条件培地を、500mLエルレンマイヤーフラスコ中の80mLのGN6液体培地N6培地ChuetalSciSin18659668、2.0mg/Lの2,4-D、30g/Lのスクロース、pH5.8に二次培養し、28°Cにおいて125rpmでシェーカー上に置いた。合計36mLのPCVが3フラスコ中に分配されるように、このステップは同じ細胞系を使用して2回繰り返した。24時間後、GN6液体培地を除去し、72mLのGN6S/M浸透圧培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、30g/Lのスクロース、45.5g/Lのソルビトール、45.5g/Lのマンニトール、100mg/Lのミオ-イノシトール、pH6.0と交換した。適度な攪拌で125rpm28°Cにおいて30~35分間、暗所中でフラスコをインキュベートした。インキュベーション時間中、炭化ケイ素ウィスカーの50mg/mL縣濁液AdvancedCompositeMaterials、LLC、Greer、SCを、8.1mLのGN6S/M液体培地に405mgの滅菌、炭化ケイ素ウィスカーを加えることにより調製した。GN6S/M浸透圧培地中でのインキュベーション後、各フラスコの内容物は250mL遠心分離容器にプールした。フラスコ中の全細胞が底部に沈殿した後、過剰な約14mLのGN6S/M液体中の内容物体積を抜き取り、後の使用のため滅菌1リットルフラスコ中に回収した。予め湿潤させたウィスカーの縣濁液を60秒間ボルテックスにおいて最大速度で混合し、次いで遠心分離容器に加えた。pDAB100610またはpDAB100611プラスミドDNAのいずれかに由来する170μgの精製断片をそれぞれの容器に加えた。DNAを加えた後、容器はすぐに市販の改良型RedDevil5400ペイントミキサーRedDevilEquipmentCo.、Plymouth、MN中に置き、10秒間攪拌した。攪拌後、細胞、培地、ウィスカーおよびDNAのカクテルを、1リットルフラスコの内容物および125mLの新たなGN6液体培地に加えて浸透圧調節物質を減らした。細胞は放置して、2時間125rpmに設定したシェーカーに回収した。6ミリリットルの分散懸濁液を、容器当たり60フィルターを得るように、ハウスバキュームラインと結び付けたガラスセルコレクターユニットを使用してWhatman4濾過紙5.5cmに濾過した。フィルターはGN6固体培地2.5g/LのGelriteゲル化剤を含むこと以外GN6液体培地と同じの60×20mmプレート上に置き、1週間暗所条件下において28°Cで培養した。推定トランスジェニックイベントの同定および単離DNA送達後1週間で、濾過紙を適切な選択剤を含有するGN61H選択培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、30g/Lのスクロース、100mg/Lのミオ-イノシトール、2.5g/LのGelrite、pH5.8の60×20mmプレートに移した。これらの選択プレートは、暗所中で1週間28°Cにおいてインキュベートした。暗所中で1週間の選択後、37~38°Cに保った3.0mLのGN6アガロース培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、30g/Lのスクロース、100mg/Lのミオ-イノシトール、7g/LのSEAPLAQUE登録商標アガロース、pH5.8、121°Cで10分間オートクレーブ処理を含有する試験管に各プレート由来の細胞の半分をかき取ることによって、新たな培地に組織を包埋した。アガロース/組織混合物をスパチュラで破壊し、その後3mLのアガロース/組織混合物を、GN61H培地を含有する100×15mmペトリ皿の表面上に均一に注いだ。このプロセスは各プレートの両半分に繰り返した。全ての組織を包埋した後、プレートは個別にNESCOFILM登録商標またはPARAFILM登録商標Mで密閉し、最大10週間暗所条件下において28°Cで培養した。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、60×20mmプレート中の新たな選択培地に移した。約2週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤選択剤に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析用に後に採取した。イベントの分子的特性ゲノムDNA抽出。ゲノムDNAgDNAを単離したメイズ細胞から抽出し、PCRによる遺伝子型決定実験の鋳型として利用した。DNEASY登録商標96PlantキットQIAGENInc.、Valencia、CAに詳述された製造者のプロトコールに従い、単離した約100~300μlのヘマトクリット値PCVのHi-IIカルスからgDNAを抽出した。ゲノムDNAは100μlのキット供給溶出バッファー中に溶出し、20~200ng/μLの最終濃度を得て、PCRベースの遺伝子型決定法によって後に分析した。コピー数の分子学的分析TAQMAN登録商標アッセイと類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子コピー数の決定を、LIGHTCYCLER480登録商標システムRocheAppliedScience、Indianapolis、INを使用してリアルタイムPCRにより実施した。アッセイは、LIGHTCYCLER登録商標プローブ設計ソフトウエア2.0を使用して、AAD-1およびPAT遺伝子ならびに内部標準遺伝子用に設計した。増幅用に、LIGHTCYCLER登録商標480プローブマスター混合物RocheAppliedScience、Indianapolis、INを、0.4μMの各プライマーおよび0.2μMの各プローブを含有する10μL体積の多重反応混合物中に1×最終濃度に調製した。2ステップの増幅反応を38秒間58°Cにおいて延長部分で実施し蛍光を得た。全てのサンプルは三連で施用し、平均サイクル閾値Ctを各サンプルの分析用に使用した。リアルタイムPCRデータの分析は、相対定量モジュールを使用してLIGHTCYCLER登録商標ソフトウエアリリース1.5を使用して実施し、ΔΔCt法に基づいた。このため、シングルコピーカリブレーターからのゲノムDNAのサンプルおよび知られている2コピーチェックをそれぞれの施用に含めた前述のINVADER登録商標アッセイに使用したものと同一。このデータから、それぞれのサンプルに関して見た目のAAD-1またはPATコピー数を次いで推定した。PCRによる遺伝子型決定用のプライマー設計オリゴヌクレオチドプライマーは標準的脱塩条件下で例えば、IntegratedDNATechnologies,Inc.Coralville、IAにより合成され、100μMの濃度まで水で希釈した。オリゴヌクレオチドプライマーは、DNA挿入体の末端領域とアニーリングするように設計した。非トランスジェニック生物から単離したDNAの存在下でプラスミドDNAの希釈物を使用して、プライマーを試験した。pDAB100610、pDAB100611pDAB100640およびpDAB100641の挿入体は、プライマーを使用して推定イベントのゲノムDNAからPCR増幅した。生成した断片はプラスミドベクターにクローニングし、配列決定し、操作されたランディングパッドが形質転換中に植物ゲノムに完全に組み込まれたことを確認した。サザンブロット解析。サザンブロット解析を実施して導入遺伝子のコピー数を確認した。この解析用に、ゲノムDNAを適切な制限酵素で消化しプローブ処理した。遺伝子座特異的PCRにより推定ELPを含有すると確認したメイズ組織をサザンブロット解析に進めた。サザンブロット解析用に、組織サンプルを2mlのエッペンドルフチューブに回収し、2日間凍結乾燥させた。組織解離を、Kleco組織粉砕機およびタングステンビーズKleco、Visalia、CAを用いて実施した。組織解離後、製造者の示したプロトコールに従いDNeasyPlantミニキットQiagen、Germantown、MDを使用して、ゲノムDNAを単離した。ゲノムDNAはQuant-ITPicoGreenDNAアッセイキットMolecularProbes、Invitrogen、Carlsbad、CAにより定量化した。定量化したDNAはサザンブロット解析用に4μgに調節し、一晩37°Cにおいて適切な制限酵素を使用して消化した。消化したDNAは、製造者の示したプロトコールに従いQuick-PrecipEdgeBioSystem、Gaithersburg、MDを使用して精製した。沈殿したDNAは10×色素中に再縣濁し、40ボルトで0.8SeaKemLEアガロースゲルLonza、Rockland、ME上において17時間電気泳動に施した。DNAは一晩ナイロンチャージメンブレンMillipore、Bedford、MAに移し、UVStrataリンカー1800Stratagene、LaJolla、CAを使用してメンブレンに架橋させた。ブロットは20mLのPerfectHybPlusSigma、St.Louis、MOとプレハイブリダイズさせ、適切な放射標識プローブで一晩プローブ処理した。ブロットは洗浄し、ホスファーイメージスクリーン上に24時間置き、次いでSTORM商標860スキャナーMolecularDynamicsを使用して分析した。挿入DNAを用いたトランスジェニックイベントの選択AAD-1またはPAT遺伝子カセットおよび完全ELPを含有する完全植物転写単位PTUに関して、前に記載したように加水分解プローブアッセイおよびPCRによってイベントをスクリーニングした。コピー数は、AAD-1およびPAT遺伝子およびELPプローブを用いた標準的な方法を使用して、サザンブロット解析によってさらに確認した。pDAB100610およびpDAB100611からのシングルコピー、完全挿入体を有する選択したトランスジェニックイベント由来のカルスを、AAD-1遺伝子の発現に関する後の試験用に維持した。AAD-1qRT-PCR法およびELISA以下を使用したスクリーニングによって、AAD-1を発現するイベントを同定した。AAD-1を発現するイベントのqRT-PCR分析定量リアルタイムPCRqRT-PCRを使用して、AAD-1遺伝子発現のmRNA発現を定量化した。内部参照遺伝子からのmRNA発現に対してこれらのレベルを標準化することによって、トランスジェニックHi-IIカルスのサンプルからの相対的AAD-1mRNA発現を定量化するために、このアッセイを開発した。内部参照遺伝子からのmRNAに対するAAD-1mRNAの標準化は異なるサンプル間のAAD-1発現の比較を可能にし、これを使用して高度に発現する可能性があるイベントを同定しうる。全RNAは、QiagenRNeasy登録商標96キットQiagen、Valencia、CAを使用して新たなカルス組織から調製した。RNAはキットの説明書に従いRNaseを含まないDNaseで処理して、任意のゲノムDNA汚染物質を除去した。第一鎖合成はSuperscript登録商標III逆転写酵素Invitrogen、Carlsbad、CAの製造者の説明書に従い設定し、ランダムヘキサマーを使用してプライマー処理した。合成したcDNA鎖は1:10および1:50の比で水に希釈したこれが複数の標的をPCR増幅するのに十分な鋳型を与える。それぞれのアリコートは無期限に-20°Cで保存した。qRT-PCR反応混合物は以下のようにAAD-1cDNAの増幅用に設定した。7.5μLの2×LC480プローブマスターバッファーRocheDiagnostic、Indianapolis、IN、10μMストックからの0.3μLの遺伝子特異的フォワードプライマー、10μMストックからの0.3μLの遺伝子特異的リバースプライマー、LightCycler登録商標480プローブマスターからの0.15μLのUPLプローブ、RocheDiagnostic、Indianapolis、IN、1.5μLの10w/vポリビニルピロリドン-40PVP-40、および3.9μLの水。UPLプローブRocheDiagnostics、Indianapolis、USAはロックド核酸であり、したがって他で計算するより高いTmを有する。全ての構成成分は、標準および未知の構成成分を処理する前にフリーザー中に戻した。384ウエルマイクロプレートを境界画定および標識し、ウエル当たり13.5μLのマスター混合物を加えた。シーリングホイルをマイクロプレートに軽く取り付けた。Qiagenマイクロプレート遠心分離において3,000rpmで1分間、プレートを遠心分離した。1.5μLの解凍、希釈合成cDNA鎖を加えた。さらに、1.5μLのプラスミドDNAコピー数標準を最小~最高濃度の希釈系で別々のウエルに加え、これらの標準は全mRNAから合成したAAD-1cDNAと比較してコピー数を定量化した。AAD-1DNAコピー数標準系は、pCR2.1プラスミドInvitrogen、Carlsbad、CAに標的アンプリコンをクローニングすること、およびコピー数を定量化するための希釈系を作製することによって作製した。ホイルシールをプレートに確実に取り付け、前に記載したのと同様に遠心分離した。PCRプログラムを実行し、DNAはリアルタイムPCR装置LC480Roche、Indianapolis、INまたは相当物で増幅した。ELISAによるメイズ組織中のAAD-1タンパク質の測定酵素結合免疫吸着アッセイELISA技法を使用して、メイズカルス中のAAD-1タンパク質を定量的に測定するための方法を開発した。本明細書に記載する方法を使用してAAD-1タンパク質を検出することができ、トランスジェニックメイズカルス由来の植物組織サンプルを分析しうる。0.05Tween20PBSTを含有し、ウシ血清アルブミン、プロテアーゼ阻害剤またはアスコルビン酸をおそらく含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液ベースのカルス特異的バッファーを用いて、AAD-1タンパク質をメイズサンプルから抽出した。抽出物を遠心分離し、水様性上清を回収し、希釈し特異的AAD-1ELISAを使用してアッセイした。このアッセイでは同時サンドイッチELISA形式を施用した。希釈サンプルのアリコートおよびビオチニル化抗AAD-1モノクローナル抗体MAb473F185を、固定抗AAD-1モノクローナル抗体MAb473H274でコーティングしたマイクロタイタープレートのウエルでインキュベートした。これらの抗体はウエル中でメイズ発現AAD-1タンパク質と結合して、可溶性抗体と固定抗体の間で結合したAAD-1タンパク質とサンドイッチを形成した。次いで非結合サンプルおよびコンジュゲートを、PBSTで洗浄することによりプレートから除去した。過剰量のストレプトアビジン-酵素アルカリホスファターゼコンジュゲートを、インキュベーション用にウエルに加えた。AAD-1の存在は、酵素コンジュゲートおよび酵素基質をインキュベートし、着色生成物を生成することによって検出した。AAD-1は抗体サンドイッチにおいて結合したので、発色のレベルはサンプル中のAAD-1の濃度と関係があるすなわち、低いタンパク質濃度は低い発色をもたらす。405nmにおける吸光度はプレートリーダーを使用して測定した。高発現AAD-1イベントは選択したトランスジェニックイベントから同定し、ドナーDNAを用いた後のターゲティング用に保存した。ELPを含有する植物細胞へのバイオリスティック媒介のDNA送達標的DNAを用いたトランスジェニックイベントの再生低コピー数であり完全PTUを含有することを確認したpDAB100160およびpDAB100611由来のイベントを再生して、ターゲティング用の未分化胚ドナー材料を作出した。健常に成長した組織は最初に28100ハロキシホップMS培地MurashigeandSkoogPhysiolPlant15473497、0.025mg/Lの2,-4D、5mg/LのBAP、0.0362mg/Lのハロキシホップ、30g/Lのスクロース、2.5g/Lのゲルライト、pH5.7に移し、弱光14μE/m2sec16時間光周期で7日間、次に強光89μE/m2sec16時間光周期でさらに7日間インキュベートした。緑化構造は36100ハロキシホップBAPおよび2,4-Dを含まない28100ハロキシホップと同じに移し、苗条構造が温室に移植するのに十分な根に発達するまで、強光40μE/m2sec16時間光周期でインキュベートした。95Metro-Mix360登録商標および5粘土/ローム土壌の混合物を使用して、植物は温室内で成熟状態まで成長させ、植物の健康状態に応じて授粉した。活発に成長した植物は自家受粉または授粉させ同じイベント由来の植物、低活性植物はHi-II、A188またはB104と交差させドナー材料の胚形成能力を維持した。ELPを含有する植物細胞へのバイオリスティック媒介のDNA送達pDAB100610およびpDAB100611から生じたイベントのターゲティング。ドナー配列のターゲティングは、2つの異なる形質転換プロトコールを使用して実施した。選択マーカーとしてAAD-1を含有したトランスジェニック完全ELPイベントpDAB100610およびpDAB100611イベントに関して、カルス前状態の未熟胚へのバイオリスティック媒介のDNA送達によってターゲティングを実施した。1.2~2.0mmの大きさの胚を授粉後10~13日で採取し、N6E培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、2.8g/LのL-プロリン、100mg/Lのカゼイン加水分解物、100mg/Lのミオ-イノシトール、4.25mg/Lの硝酸銀、30g/Lのスクロース、pH5.8に平板培養し、暗所で2~3日間28°Cにおいてインキュベートした。膨張した胚はN6OSM36.4g/lのソルビトール、36.4g/Lのマンニトールを加えL-プロリンを0.7g/Lに低下させたN6Eと同じに移し、Whatman4濾過紙上に2.5cm径の円形が広がった。1,000μmスクリーンを使用してブラスティング用の胚を含有し、胚はブラスティング前に4時間28°Cにおいて暗所でインキュベートした。DNAでバイオリスティック粒子をコーティングするため、0.60ミクロン径の金粒子3mgを100エタノールで一回、滅菌蒸留水で2回洗浄し、シリコーンマイクロフュージチューブ内の50μlの水中に再縣濁した。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびドナーDNA断片、pDAB105955またはpDAB105956をコードする合計5μgのプラスミドDNAセパレートベクター、20μlのスペルミジン0.1Mおよび50μlの塩化カルシウム2.5Mを金縣濁液に別々に加え、ボルテックスで混合した。混合物は室温で10分間インキュベートし、10秒間ベンチトップマイクロ遠心分離機で10,000rpmにおいてペレット状にし、60μlの氷冷100エタノール中に再縣濁し、8~9μlをそれぞれのマクロキャリアに分配した。BiolisticPDS-1000/HE商標システムBio-RadLaboratories、Hercules、CAを使用して衝突を行った。胚を含有するプレートは650psiおよび27インチのHg真空管の条件下で中段に置き、操作説明書に従い一回衝突させた。衝突後24時間で、胚は回収のため前と同じN6Eに濾過紙なしで直接移し、13日間28°Cにおいて暗所でインキュベートした。胚は選択培地N6SN6培地、2.0mg/Lの2,4-D、100mg/Lのミオ-イノシトール、0.85mg/Lの硝酸銀、2mg/Lのビアラホス、30g/Lのスクロース、2.5g/LのゲルライトおよびpH5.8に移し、2週間毎に選択培地に3回移し、最大10週間暗所条件において28°Cでインキュベートした。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、60×20mmプレート中の新たな選択培地に移した。約2週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤選択剤に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析以下に記載する分析用に後に採取した。pDAB100640およびpDAB100641から生じたイベントのターゲティング。選択マーカーとしてPATを含有したトランスジェニック完全ELPイベントpDAB100640およびpDAB100641に関して、胚状メイズカルスへのバイオリスティック媒介のDNA送達によってターゲティングを実施した。二次培養後6~8日で、胚状メイズ組織約0.4mLPCVの細胞は、2.5g/Lのゲルライトで凝固させたGN6S/M培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、30g/Lのスクロース、45.5g/Lのソルビトール、45.5g/Lのマンニトール、100mg/Lのミオ-イノシトール、pH5.8を含有する100×15mmペトリ皿上に置いたWhatman4濾過紙の上に2.5cm径の円形に薄く広がった。細胞は暗所条件下において4時間インキュベートした。DNAは前に記載したようにブラスティング用に調製し、pDAB105979およびpDAB105980はターゲティング用に使用した。BiolisticPDS-1000/HE商標システムBio-RadLaboratories、Hercules、CAを使用して衝突を行った。細胞を含有するプレートは1,100psiおよび27インチのHg真空管の条件下で中段に置き、操作説明書に従い一回衝突させた。衝突後24時間で、植物細胞を含有する濾過紙は2.5g/Lのゲルライトで凝固させたGN6固形培地N6培地、2.0mg/Lの2,4-D、100mg/Lのミオ-イノシトール、30g/Lのスクロース、pH5.8に移し、暗所条件下において28°Cで24時間インキュベートした。24時間の回収期後、植物細胞を含有する濾過紙はGN6100ハロキシホップN6培地、2.0mg/Lの2,4-D、100mg/Lのミオ-イノシトール、30g/Lのスクロース、0.0362mg/Lのハロキシホップ、2.5g/Lのゲルライト、pH5.8に移し、細胞は濾過紙上で薄層に広がった。2週間毎に選択培地に3回移動を続けた。ドナーDNAの組み込みから生じた可能性があるトランスジェニック分離株が現れ始めるまで、組織は最大12週間インキュベートした。これらの選択条件下で増殖したおそらく形質転換された分離株は包埋プレートから除去し、60×20mmプレート中の新たな選択培地に移した。約2週間後に持続的増殖が明らかであった場合、イベントは施用した除草剤選択剤に耐性があると考え、細胞のアリコートは遺伝子型決定の分析以下に記載する分析用に後に採取した。PCR遺伝子型決定による標的組み込みイベントのスクリーニングトランスジェニックメイズにおけるELPへのドナー分子pDAB105979、pDAB105980、pDAB105955、pDAB105956のターゲティングを、1遺伝子座特異的PCR、2ドナー特異的TaqMan、および3遺伝子座特異的サザンブロットの組合せの使用により分析して、挿入精度、完全性およびコピー数を評価する。陽性再ターゲティングイベントは、a陽性アウト-アウトPCRまたは重複イン-アウトPCR結果および2ドナーの存在のサザンブロット診断画像を有すると予想される。DNA抽出再ターゲティングトランスジェニックメイズ由来の組織カルス組織または植物の葉を、96ウエル回収プレートQiagen、Germantown、MD中で少なくとも2日間凍結乾燥させる。DNAは製造者の説明に従いBioSprint96ワークステーションQiagen、Germantown、MDを使用して凍結乾燥組織から抽出し、200μlの水中に再縣濁する。モデル2-96AKleco組織粉砕機GarciaManufacturing、VisaliaCAを組織破壊用に使用する。DNA定量化:生成したゲノムDNAは、QUANT-IT登録商標PicoGreenDNAアッセイキットMolecularProbes、Invitrogen.Carlsbad、CAを使用して定量化する。段階希釈した20ng/μL~1.25ng/μLの範囲の5つの予め定量化したDNA標準は、標準曲線作成に使用した。未知のサンプルは、アッセイの直線範囲内で1:10または1:20希釈に最初に希釈する。5μLの希釈サンプルおよび標準を100μLの希釈PicoGreen基質1:200と混合し、暗所で10分間インキュベートする。次いでSynergy2プレートリーダーBiotekを使用して蛍光を記録する。ゲノムDNA濃度は、バックグラウンド蛍光補正後に計算した標準曲線から推定する。Biorobot-3000自動液体ハンドラーQiagen、Germantown、MDを使用して、DNAは後に2ng/μLの濃度に標準化する。標準化したDNAはPCR、およびコピー数分析に使用する。PCR分析3つの型の遺伝子座特異的PCRアウト-アウト、5’アウト-イン、3’アウト-インを実施して、ドナープラスミドがELPにターゲティングされるかどうかを評価する。PCR反応を実施してドナーDNAの完全コピーの存在を調べるアウト-アウトPCR。他のPCR反応は、標的とドナーの間の5’境界およびドナーと標的の間の3’境界に焦点を当てるイン-アウトPCR。分析に使用したプライマーの位置に関する概略は図9中に例示する。それぞれのドナーおよびELP標的に関する予想PCR産物は表1中に概略する。分析に使用したプライマーの配列は表2中に示す。PCR増幅:ポリメラーゼ連鎖反応PCRを実施してELPの再ターゲティングを評価および確認する。PCR反応混合物は、PhusionDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabs、Ipswich、MAまたはAccuPrimeInvitrogen、Carlsbad、CAを用いて25μl体積で調製する。PhusionのPCRに関して、それぞれの反応混合物は、1×PhusionGCバッファー、0.2mMのdNTPs、0.2μMのフォワードおよびリバースオリゴ、2.5単位のPhusionDNAポリメラーゼおよび20ngのゲノムDNAを含有する。再ターゲティングイベントを模倣するために構築した10~20ngのプラスミドDNAは陽性対照として施用する。非鋳型対照鋳型としての水も施用する。PCR条件は以下の通りである。98°C、1分間、98°C10秒間、65°C、20秒間、72°Cで2.5分間、次に72°Cで10分間の35サイクル。AccuPrimeInvitrogen、Carlsbad、CAで実施した25マイクロリットルのPCR反応混合物は、1×バッファーII、0.2uMのフォワードおよびリバースオリゴ、2.5単位のAccuPrimeTaqポリメラーゼ、および20ngのゲノムDNAを含有した。陽性および陰性対照はPhusionに関して前に記載したように施用する。AccuPrimeに関する条件は以下の通りである。98°C、1分間、98°C10秒間、65°C、20秒間、68°Cで2.5分間、次に68°Cで10分間の35サイクル。増幅断片はゲル切除し、製造者の指示に従い精製する。精製した断片はプラスミドベクターに後にクローニングし、大腸菌Ecoliコンピテントセルに形質転換する。個々のコロニーを選択し、増幅PCR断片を含有することを確認する。プラスミドクローンの二本鎖配列決定反応を実施して、PCR増幅ゲノム配列が組み込んだドナーを含有することを確認する。ドナー断片を含有することを確認したイベントは、特定遺伝子標的におけるZFN媒介二本鎖破壊の相同性駆動型修復およびドナーDNAの標的組み込みが起こる標的となる。加水分解プローブ/TaqManアッセイTaqMan分析を実施して、推定再ターゲティングイベントにおけるドナーのコピー数を画定する。TAQMAN登録商標アッセイと類似した加水分解プローブアッセイによるコピー数の決定は、LIGHTCYCLER登録商標480システムRocheAppliedScience、Indianapolis、INを使用してリアルタイムPCRにより実施する。アッセイは、LIGHTCYCLER登録商標プローブ設計ソフトウエア2.0を使用して、PATおよびAAD1ならびに内部標準遺伝子GLP1およびInvertase用に設計する。増幅用に、LIGHTCYCLER登録商標480プローブマスター混合物RocheAppliedScience、Indianapolis、INを、0.498°C、1分間、98°C10秒間、65°C、20秒間、72°Cで2.5分間、次に72°Cで10分間の35サイクルMの各プライマー、および0.298°C、1分間、98°C10秒間、65°C、20秒間、72°Cで2.5分間、次に72°Cで10分間の35サイクルMの各プローブを含有する10μL体積の多重反応混合物中に1×最終濃度に調製する表3。2ステップの増幅反応を、PAT/GLP1に関して38秒間58°Cで、およびAAD-1およびInvertaseに関して40秒間60°Cで、延長部分で実施し蛍光を得る。全てのサンプルは三連で施用し、平均サイクル閾値Ctを各サンプルの分析用に使用する。リアルタイムPCRデータの分析は、相対定量モジュールを使用してLIGHTCYCLER登録商標ソフトウエアリリース1.5を使用して実施し、ΔΔCt法に基づく。このため、シングルコピーカリブレーターからのゲノムDNAのサンプルおよび知られている2コピーチェックをそれぞれの施用に含めた。サザンブロット解析サザンブロット解析を実施して、ELP遺伝子座におけるドナーDNAのターゲティングを確認する。この解析用に、ゲノムDNAを適切な制限酵素で消化し、ドナー中に存在しない遺伝子座特異的放射標識断片でプローブ処理する。メイズカルスpDAB100640およびpDAB100641標的実験またはT0メイズ植物pDAB100610およびpDAB100611標的実験を使用する。組織サンプルを2mlの微量遠心分離チューブに回収し、2日間凍結乾燥する。組織解離は、Kleco組織粉砕機およびタングステンビーズを用いて前述のように実施する。組織解離後、製造者の示したプロトコールに従いDNeasyPlantミニキットQiagen、Germantown、MDを使用して、ゲノムDNAを単離する。ゲノムDNAはQuant-ITPicoGreenDNAアッセイキットMolecularProbes、Invitrogen、Carlsbad、CAにより定量化する。それぞれのサンプルに関する4マイクログラムのDNAを、一晩37°Cにおいて適切な制限酵素を使用して消化する。消化したDNAは、製造者の示したプロトコールに従いQuick-PrecipEdgeBioSystem、Gaithersburg、MDを使用して精製する。0.8のSeaKemLEアガロースゲルLonza、Rockland、ME上での電気泳動後、DNAは一晩ナイロンチャージメンブレンMillipore、Bedford、MAに移し、UVStrataリンカー1800Stratagene、LaJolla、CAを使用してメンブレンに架橋させる。ブロットは20mlのPerfectHybPlusSigma、St.Louis、MOとプレハイブリダイズさせ、適切な放射標識プローブで一晩プローブ処理する。ブロットは洗浄し、ホスファーイメージスクリーン上に24時間置き、次いでStorm860スキャナーMolecularDynamicsを使用して分析する。ELP、選択マーカーを許容し植物中での独立した構築物エレメントの切除を可能にする中間植物形質転換用ベクターの構築改変ジンクフィンガーヌクレアーゼeZFN結合部位およびELPエレメントは、生成する形質転換植物細胞、組織または植物が以下の性質1元のトランスジェニック挿入部位においてELP内で、正確な標的形式で他の導入遺伝子により再形質転換され得る能力、および2予想可能および有効な形式で、導入遺伝子、特に植物選択マーカー遺伝子を除去することにより、トランスジェニック遺伝子座を修飾する能力を有するように、植物形質転換用ベクターに個別または一緒に取り込ませうる。一連のベクターは一定範囲の植物種を形質転換するために構築した。これは、以下に記載する中間植物形質転換用ベクター、一次形質転換用ベクターとして知られるベースベクターへの全ての選択マーカーおよびELPに隣接するeZFNの取り込みに影響を与えるためのベクターを使用することによって実施した。右のT-DNA境界と左のT-DNA境界の間に位置する特有のマルチクローニングサイトMCSを有するアグロバクテリウムAgrobacteriumバイナリー形質転換用ベクターの骨格を含む、中間植物形質転換用ベクターを構築した。この中間ベクターはpDAB104132である図10。pDAB104132において使用したMCSは、AgeI、NotI、FseI、SwaI、XbaI、AseI、PacI、XhoI、SalI、およびNsiIに特有の制限酵素部位を含有する。この実施例では、これらの部位を使用して、最終一次形質転換用ベクターに重要な機能エレメントを取り込む。特有のNotI部位を使用してGATEWAY商標デスティネーションベクターカセットを有するNotI断片を導入することができ、次いでこれらを後に使用して、形質転換用ベクターに複数の導入遺伝子をInvitrogenのGATEWAY商標システムを使用して積み重ねることができる。特有のFseI部位を使用して、それらの末端にFseI部位を有するELPを導入しうる。これらの実施例において前に記載したように、トランスジェニック植物中に存在するとき、ELPを標的部位として使用して、eZFNを使用して他の遺伝子を挿入しうる。MCS中の他の部位を使用して、選択マーカー遺伝子を含めた対象の他の遺伝子を挿入しうる。前に記載した特有の制限部位を使用して、pDAB104132などの中間植物形質転換用ベクターを使用して、GATEWAY商標デスティネーションベクターカセット、ELP、選択マーカー-ZFNモジュール、およびeZFN切除を可能にし得るまたはし得ない任意の他の導入遺伝子を含めた機能エレメントの任意および全ての組合せを、1つの植物形質転換用ベクターに一緒に運ぶことができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼモジュールを使用した切除可能植物選択マーカーカセットの構築。この実施例では、eZFN結合部位を使用して、形質転換植物からの、植物中の選択マーカー遺伝子を含めた任意の導入遺伝子の欠失を可能にする。参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願No._61/297,628を参照。この能力は、導入遺伝子を1つまたは複数のeZFN結合部位に隣接させ、トランスジェニック植物細胞を作出するために次いで使用する植物形質転換用ベクターに、これらの切除可能遺伝子モジュールを次いで取り込ませることによって得られる。このようなモジュールおよびベクターの構築は、標準的な分子生物学の技法を使用して当業者により実施しうる。ZFN結合部位モジュールを有する中間体プラスミドは、切除可能遺伝子カセットの構築に向かう有用な第一ステップである。eZFN結合部位モジュールは、導入遺伝子をクローニングしうる1つまたは複数の制限酵素部位に隣接する少なくとも2つのeZFN結合部位を含有するDNAのセグメントである。一例は、配列番号20および図11によって表されるZFNモジュール2:4-MCS-2:4である。このモジュールは、eZFN2およびeZFN4に関する結合部位の対に隣接する制限部位AseI、HindIII、PacI、SbfI、SphIおよびSalIからなるマルチクローニングサイトMCSを含有する。このZFNモジュール内には、eZFN結合部位に隣接する100bpのランダムな配列からなる配列の2つの同一コピーもある。さらに、制限酵素部位SpeIとXhoIの対は機能モジュール全体に隣接し、植物形質転換用ベクターへのそのクローニングを可能にする。pDAB104126、ZFNモジュール2:4-MCS-2:4を有するプラスミドは図12中に示す。4つの異なる植物選択マーカー遺伝子を、標準的な分子クローニング技法を使用してpDAB104126中のZFNモジュール2:4-MCS-2:4に個別に挿入した。1つの選択マーカー遺伝子は、双子葉植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計した機能PAT遺伝子であった。このPAT遺伝子は、CsVMVプロモーターキャッサバ葉脈モザイクウイルスCassavaVeinMosaicvirus由来のプロモーターおよび5’非翻訳領域、VerdagueretalPlantMolecularBiology3111291139およびAtuORF1の3’UTRと作動可能に連結したPATコード配列で構成されていた。PAT遺伝子カセットは、ZFNモジュールのHindIII-SphI部位中にHindIII-SphI断片として挿入し、プラスミドpDAB104136を生成した図13。第二の選択マーカー遺伝子は、単子葉植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計したPAT遺伝子であった。このPAT遺伝子は、OsAct1プロモーターおよびZmLipの3’UTRと作動可能に連結したPATコード配列を含んでいた。この単子葉植物のPAT遺伝子は、ZFNモジュールのPacI-SphI部位中にPacI-SphI断片として挿入し、プラスミドpDAB104138を生成した図14。第三の選択マーカー遺伝子は、単子葉植物においてハロキシホップまたは2,4-D耐性を与えるように設計したAAD-1遺伝子を含んでいた。このAAD-1遺伝子は、ZmUbi1プロモーターおよびZmLipの3’UTRと作動可能に連結したAAD-1コード配列を含んでいた。この単子葉植物のAAD-1遺伝子は、ZFNモジュールのHindIII-SbfI部位中にHindIII-SbfI断片として挿入し、プラスミドpDAB104140を生成した図15。第四の選択マーカー遺伝子は、キャノーラ植物においてグルホシネート耐性を与えるように設計したPAT遺伝子を含んでいた。このPAT遺伝子は、CsVMVプロモーターおよびAtuORF1の3’UTRと作動可能に連結し破壊されたイソペンテニルトランスフェラーゼipt遺伝子内に位置するPATコード配列を含んでいた。PAT遺伝子は、ZFNモジュールのAse-XhoI部位中にAseI-SalI断片として挿入し、プラスミドpDAB104142を生成した図16。したがって、pDAB104136、pDAB104138、pDAB104140およびpDAB104142は、植物形質転換用ベクター中に取り込むことが可能である異なるZFN切除可能選択マーカー遺伝子を有する中間体プラスミドである。形質転換により植物ゲノム中に最終的に取り込むとき、選択マーカーZFNモジュールは選択マーカー遺伝子の後の除去を可能にする。植物細胞中でeZFN2またはeZFN4タンパク質を、それらをコードする遺伝子の一過的発現または安定的発現のいずれかにより生成することによって、これを実施しうる。例えばeZFN2、または代替的にeZFN4を、eZFN2またはeZFN4遺伝子の一方からのeZFNの一過的発現によって、事前に形質転換した植物細胞において発現させうる。eZFN酵素は特異的eZFN結合部位を認識しそれらと結合し、これらの位置におけるゲノム中の二本鎖破壊を引き起こす。モジュール内の選択マーカー遺伝子の両側における二本鎖破壊は、ゲノムDNAからの選択マーカー遺伝子の切除をもたらす。後に二本鎖破壊は、ZFNモジュール中に含まれた反復100bp配列間の非相同的末端接合または相同的一本鎖修復のいずれかによって修復される。このプロセスは、その元のゲノム位置に関する選択マーカー遺伝子の永続的欠失をもたらす。植物一次形質転換用ベクターの構築。当業者は、段階的に組合せで前に記載したエレメントを構築して、異なる作物において使用するための一次形質転換用ベクターを生成しうる。ELP1をpDAB104132のFseI部位中に挿入してpDAB104133を生成した図17。次に、GATEWAY商標デスティネーションベクターカセットをpDAB104133のNotI部位中に挿入して、ELP配列に対するGatewayカセットのそれらの方向のみが異なるpDAB104134図18およびpDAB104135図19を生成した。次いで、前に記載した4個の選択マーカーZFNモジュールをpDAB104135にクローニングして、4個の新規な植物形質転換用ベクターPTVを生成した。この構築は、以下に記載する標準的なDNAクローニング法を使用して、当業者により実施しうる。双子葉植物のPATZFNモジュールはSpeIを使用してpDAB104136から切除し、pDAB104135のXbaI部位にクローニングしてPTVpDAB104137を生成した図20。pDAB104137はELP1およびZFN切除可能双子葉植物PAT選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、他の導入遺伝子のGATEWAY商標クローニングを可能にするGATEWAY商標デスティネーションベクターでもある。単子葉植物のPATZFNモジュールはSpeIを使用してpDAB104138から切除し、pDAB104135のXbaI部位にクローニングしてPTVpDAB104139を生成した図21。pDAB104139はELP1およびZFN切除可能単子葉植物PAT選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、GATEWAY商標デスティネーションベクターでもある。単子葉植物のAAD1ZFNモジュールはSpeIを使用してpDAB104140から切除し、pDAB104135のXbaI部位にクローニングしてPTVpDAB104141を生成した図22。pDAB104141はELP1およびZFN切除可能単子葉植物AAD1選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、Gateway商標デスティネーションベクターでもある。キャノーラのPATZFNモジュールはXhoIを使用してpDAB104142から切除し、pDAB104135のXhoI部位にクローニングしてPTVpDAB104143を生成した図23。pDAB104143はELP1およびZFN切除可能キャノーラPAT選択マーカーを有する植物形質転換用バイナリーベクターであり、GATEWAY商標デスティネーションベクターでもある。植物形質転換法を使用して、これらの構築物を使用して作物を形質転換しうる。生じたトランスジェニックイベントは、他の新たな導入遺伝子で後にターゲティングしうる。この場合、新たな導入遺伝子はELPとの相同的組換えによってターゲティングされる。さらに、選択マーカー発現カセットは除去または切除しうる。選択マーカーカセットの切除から生成した生成ELPは、前に記載した技法を使用して相同的組換えにより、新たな導入遺伝子で後に再ターゲティングしうる。"