"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明は、HIVのEnvポリペプチド、tatポリペプチド、polポリペプチド、protポリペプチド、逆転写酵素、またはGag含有ポリペプチドの改善された発現、およびウイルス様粒子の産生に関する。例えば、本発明は、以下を提供する。項目1HIVGagポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ここで、該Gagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号20として示される配列に対して少なくとも90の同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目2HIVGagポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、項目1に記載の発現カセットであって、ここで該Gagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号9として示される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目3項目1に記載の発現カセットであって、ここで、HIVGagポリペプチドを含むポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号4として示される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目4前記ポリヌクレオチド配列が、HIVプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載の発現カセット。項目5項目4に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号5、配列番号78および配列番号79からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目6前記ポリヌクレオチド配列が、HIV逆転写酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載の発現カセット。項目7項目6に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83および配列番号84からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目8前記ポリヌクレオチド配列が、HIVtatポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載の発現カセット。項目9項目8に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号86、配列番号87、配列番号88および配列番号89からなる群より選択される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目10項目1に記載の発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列が、HIVポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号6として示される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目11項目1に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリヌクレオチド配列が、HIVポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、i該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号4として示される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含み、そしてii該配列が逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変されている、発現カセット。項目12前記ポリヌクレオチド配列が、Tヘルパー細胞およびCTLエピトープを保つ、項目11に記載の発現カセット。項目13項目1に記載の発現カセットであって、ここで前記ポリヌクレオチド配列が、HCVコアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号7として示される配列に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目14HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ここで該Envポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号71図58または配列番号72図59に対して少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む、発現カセット。項目15前記Envポリペプチドが、V1領域に隣接する配列を含むが、該V1領域自体に欠失を有する、項目14に記載の発現カセット。項目16前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号65図52gp160.modUS4.delV1として示される配列を含む、項目15に記載の発現カセット。項目17前記Envポリペプチドが、V2領域に隣接する配列を含むが、該V2領域自体に欠失を有する、項目14に記載の発現カセット。項目18前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号60図47および配列番号66図53からなる群より選択される、項目17に記載の発現カセット。項目19項目17に記載の発現カセットであって、ここで前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号34図20;配列番号37図24;配列番号40図27;配列番号43図30;配列番号46図33;配列番号49図36および配列番号76図64からなる群より選択される、発現カセット。項目20前記Envポリペプチドが、V1/V2領域に隣接する配列を含むが、該V1/V2領域自体において欠失を有する、項目14のいずれかに記載の発現カセット。項目21項目20に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号59図46;配列番号61図48;配列番号67図54および配列番号75図63からなる群より選択される、発現カセット。項目22項目20に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号35図21;配列番号38図250;配列番号41図28;配列番号44図31;配列番号47図34および配列番号50図37からなる群より選択される、発現カセット。項目23前記Envポリペプチドが、gp140ポリペプチドのgp120ポリペプチドおよびgp41ポリペプチドへの切断を妨げる、変異した切断部位を有する、項目14に記載の発現カセット。項目24項目23に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号57図44;配列番号61図48および配列番号63図50;からなる群より選択される、発現カセット。項目25項目23に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号39図26;配列番号40図27;配列番号41図28;配列番号42図29;配列番号43図30;配列番号44図31;配列番号45図32;配列番号46図33;配列番号47図34からなる群より選択される、発現カセット。項目26前記Envポリペプチドが、gp160Envポリペプチドまたはgp160Envポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目14に記載の発現カセット。項目27項目26に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号64図51;配列番号65図52;配列番号66図53;配列番号67図54;配列番号68図55;配列番号75図63および配列番号73図61からなる群より選択される、発現カセット。項目28項目26に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号48図35;配列番号49図36;配列番号50図37;配列番号76図64および配列番号74図62からなる群より選択される、発現カセット。項目29前記Envポリペプチドが、gp140Envポリペプチドまたはgp140Envポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目14に記載の発現カセット。項目30項目29に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号56図43;配列番号57図44;配列番号58図45;配列番号59図46;配列番号60図47;配列番号61図48;配列番号62図49および配列番号63図50からなる群より選択される、発現カセット。項目31項目29に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号36図23;配列番号37図24;配列番号38図25;配列番号39図26;配列番号40図27;配列番号41図28;配列番号42図29;配列番号43図30;配列番号44図31;配列番号45図32;配列番号46図33および配列番号47図34からなる群より選択される、発現カセット。項目32前記Envポリペプチドが、gp120Envポリペプチドまたはgp120Envポリペプチドから誘導されたポリペプチドを含む、項目14に記載の発現カセット。項目33項目32に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号54図41および配列番号55図42からなる群より選択される、発現カセット。項目34項目32に記載の発現カセットであって、ここで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号33図19;配列番号34図20および配列番号35図21からなる群より選択される、発現カセット。項目35項目14に記載の発現カセットであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、配列番号55図42;配列番号62図49;配列番号63図50および配列番号68図55からなる群より選択される、発現カセット。項目36選択された宿主細胞中で使用するための組換え発現系であって、項目1~35のいずれかに記載の発現カセットを含み、そしてここで、前記ポリヌクレオチド配列が、該選択された宿主細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、組換え発現系。項目37項目36に記載の組換え発現系であって、前記制御エレメントが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からなる群より選択される、組換え発現系。項目38前記転写プロモーターが、CMV、CMVイントロンA、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr、およびメタロチオネインからなる群より選択される、項目36に記載の組換え発現系。項目39項目1~35のいずれかに記載の発現カセットを含む細胞であって、前記ポリヌクレオチド配列が、前記選択された細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞。項目40前記細胞が哺乳動物細胞である、項目39に記載の細胞。項目41前記細胞が、BHK細胞、VERO細胞、HT1080細胞、293細胞、RD細胞、COS-7細胞、およびCHO細胞からなる群より選択される、項目40に記載の細胞。項目42前記細胞がCHO細胞である、項目41に記載の細胞。項目43前記細胞が、昆虫細胞である、項目39に記載の細胞。項目44前記細胞が、TrichoplusianiTn5またはSf9昆虫細胞のいずれかである、項目43に記載の細胞。項目45前記細胞が、細菌細胞である、項目39に記載の細胞。項目46前記細胞が、酵母細胞である、項目39に記載の細胞。項目47前記細胞が、植物細胞である、項目39に記載の細胞。項目48前記細胞が、抗原提示細胞である、項目39に記載の細胞。項目49前記リンパ様細胞が、マクロファージ、単球、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞、およびこれらの前駆細胞からなる群より選択される、項目48に記載の細胞。項目50前記細胞が、初代細胞である、項目39に記載の細胞。項目51前記細胞が、不死化細胞である、項目39に記載の細胞。項目52前記細胞が、腫瘍由来細胞である、項目39に記載の細胞。項目53HIVGagポリペプチド配列を含むポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、該ポリペプチドを生成するための条件下で項目39に記載の細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。項目54ウイルス様粒子VLPを生成するための方法であって、該方法は、該VLPを生成するための条件下で項目39に記載の細胞をインキュベートする工程を包含する、方法。項目55ウイルス様粒子VLPの組成物を生成するための方法であって、該方法は、a該VLPを生成するための条件下で項目39に記載の細胞をインキュベートする工程;およびb該VLPを実質的に精製して、VLPの組成物を生成する工程、を包含する、方法。項目56項目1~35のいずれかに記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトした適切な宿主細胞を含む、レンチウイルスベクターをパッケージングするために有用な細胞株であって、そしてここで、前記ポリヌクレオチド配列が、該宿主細胞における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、細胞株。項目57適切な宿主細胞が、項目1~13のいずれかに記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目56に記載の細胞株。項目58適切な宿主細胞が、項目1~3に記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目56に記載の細胞株。項目59適切な宿主細胞が、項目14~35に記載の発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトされている、項目56に記載の細胞株。項目60哺乳動物被験体において使用するための遺伝子送達ベクターであって、ここで該ベクターが、項目1~35のいずれかに記載の発現カセットを含み、そしてここで前記ポリヌクレオチド配列が、該被験体における発現と適合性の制御エレメントに作動可能に連結されている、遺伝子送達ベクター。項目61被験体のDNA免疫の方法であって、該方法は、項目60に記載の遺伝子送達ベクターを、該被験体における前記発現カセットの発現と適合性の条件下で、該被験体に導入する工程を包含する、方法。項目62前記遺伝子送達ベクターが非ウイルスベクターである、項目61に記載の方法。項目63前記ベクターが粒子状キャリアを用いて送達される、項目61に記載の方法。項目64前記ベクターが金粒子またはタングステン粒子上にコートされ、そして、該コートされた粒子が、遺伝子銃を用いて前記被験体に送達される、項目63に記載の方法。項目65前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化される、項目63に記載の方法。項目66前記ベクターがウイルスベクターである、項目61に記載の方法。項目67前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目66に記載の方法。項目68前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目67に記載の方法。項目69前記被験体が哺乳動物である、項目61に記載の方法。項目70前記哺乳動物がヒトである、項目69に記載の方法。項目71被験体において免疫応答を生成させる方法であって、該方法は、該被験体の細胞を、項目60に記載の遺伝子送達ベクターで、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリペプチドの生成を可能にする条件下で、トランスフェクトし、それによって、該ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する工程、を包含する、方法。項目72前記ベクターが非ウイルスベクターである、項目71に記載の方法。項目73前記ベクターが粒子状キャリアを用いて送達される、項目72に記載の方法。項目74前記ベクターが金粒子またはタングステン粒子上にコートされ、そして、該コートされた粒子が、遺伝子銃を用いて前記脊椎動物の細胞に送達される、項目73に記載の方法。項目75前記ベクターがリポソーム調製物中にカプセル化される、項目73に記載の方法。項目76前記ベクターがウイルスベクターである、項目71に記載の方法。項目77前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、項目76に記載の方法。項目78前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目77に記載の方法。項目79前記被験体が哺乳動物である、項目71に記載の方法。項目80前記哺乳動物がヒトである、項目79に記載の方法。項目81前記トランスフェクションがエキソビボで行われ、前記トランスフェクトされた細胞が前記被験体に再導入される、項目71に記載の方法。項目82前記トランスフェクションが前記被験体においてインビボで行われる、項目71に記載の方法。項目83前記免疫応答が体液性免疫応答である、項目71に記載の方法。項目84前記免疫応答が細胞性免疫応答である、項目71に記載の方法。項目85アルファウイルスベクター構築物を含む遺伝子送達ベクターであって、ここで、該アルファウイルス構築物は、項目1~35のいずれかに記載の発現カセットを含む、遺伝子送達ベクター。項目86前記アルファウイルスベクター構築物がcDNAベクター構築物である、項目85に記載の遺伝子送達ベクター。項目87前記アルファウイルスが組換えアルファウイルス粒子調製物を含む、項目85に記載の遺伝子送達ベクター。項目88前記ベクターが、真核生物層状ベクター開始系を含む、項目85に記載のアルファウイルスベクター。項目89被験体において免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、該被験体において免疫応答を刺激するのに有効な量の、項目85~88のいずれかに記載の遺伝子送達ベクターを投与する工程を包含する、方法。項目90前記遺伝子送達ベクターが、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮、膣内、直腸内、経口または静脈内に投与される、項目89に記載の方法。1つの実施形態において、本発明は、発現カセットを包含する。この発現カセットは、配列番号20として示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を含むHIVGagポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、このGagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号9または配列番号4に示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む。この発現カセットは、HIVプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列例えば、以下;配列番号5、配列番号78、および配列番号79からなる群より選択される配列に少なくとも90の配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含み得る。この発現カセットは、HIVの逆転写酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド例えば、以下;配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、および配列番号84からなる群より選択される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を、さらに含み得る。この発現カセットは、HIVのtatポリペプチドをコードするポリヌクレオチド例えば、以下;配列番号87、配列番号88、および配列番号89からなる群より選択される配列を、さらに含み得る。この発現カセットは、HIVのポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列例えば、配列番号6として示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を、さらに含み得る。この発現カセットは、HIVのポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。ここで、iこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号4として示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を、含み、そしてiiここでこの配列は、逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変される。上記の発現カセットは、Tヘルパー細胞およびCTLエピトープを保存し得る。この発現カセットは、HCVのコアポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列例えば、配列番号7として示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を、さらに含み得る。別の局面において、本発明は、HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。ここでこのEnvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号71図58または配列番号72図59に対して、少なくとも90の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態において、このEnv発現カセットは、V1領域に隣接するが、V1領域自体には欠失を有する配列例えば、配列番号65図52、gp160.modUS4.delV1として示される配列を含む。特定の実施形態において、Env発現カセットは、V2領域に隣接するが、V2領域自体には欠失を有する配列例えば、配列番号60図47;配列番号66図53;配列番号34図20;配列番号37図24;配列番号40図27;配列番号43図30;配列番号46図33;配列番号76図64および配列番号49図36において示される配列を含む。特定の実施形態において、Env発現カセットは、V1/V2領域に隣接するがV1/V2領域自体には欠失を有する配列例えば、配列番号59図46;配列番号61図48;配列番号67図54;配列番号75図63;配列番号35図21;配列番号38図25;配列番号41図28;配列番号44図31;配列番号47図34および配列番号50図37を含む。Envコード発現カセットはまた、gp120ポリペプチドおよびgp41ポリペプチドへのgp140ポリペプチドの切断を妨げる変異した切断部位例えば、配列番号57図44;配列番号61図48;配列番号63図50;配列番号39図26;配列番号40図27;配列番号41図28;配列番号42図29;配列番号43図30;配列番号44図31;配列番号45図32;配列番号46図33;および配列番号47図34を含み得る。Env発現カセットは、gp160Envポリペプチドまたはgp160Envポリペプチドに由来するポリペプチド例えば、配列番号64図51;配列番号65図52;配列番号66図53;配列番号67図54;配列番号68図55;配列番号75図63;配列番号73図61;配列番号48図35;配列番号49図36;配列番号50図37;配列番号76図64;および配列番号74図62を含み得る。Env発現カセットは、gp140Envポリペプチドまたはgp140Envポリペプチドに由来するポリペプチド例えば、配列番号56図43;配列番号57図44;配列番号58図45;配列番号59図46;配列番号60図47;配列番号61図48;配列番号62図49;配列番号63図50;配列番号36図23;配列番号37図24;配列番号38図25;配列番号39図26;配列番号40図27;配列番号41図28;配列番号42図29;配列番号43図30;配列番号44図31;配列番号45図32;配列番号46図33;および配列番号47図34を含み得る。Env発現カセットはまた、gp120Envポリペプチドまたはgp120Envポリペプチドに由来するポリペプチド例えば、配列番号54図41;配列番号55図42;配列番号33図19;配列番号34図20;および配列番号35図21を含み得る。Env発現カセットは、系統SF162またはUS4に対して、残基128~約194に対応するアミノ酸を欠くEnvポリペプチド例えば、配列番号55図42;配列番号62図49;配列番号63図50;および配列番号68図55を含み得る。別の局面では、本発明は、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含する。この系は、選択された宿主細胞における発現に適合した制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書中に記載の1つ以上の発現カセットを含む。この発現カセットは、1つまたは複数のベクター上に含まれ得、そして同じまたは異なるプロモーターを用い得る。例示的な制御エレメントは、転写プロモーター例えば、CMV、CMVイントロンA、SV40、RSV、HIV-Ltr、MMLV-ltr、およびメタロチオネイン、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終止配列を含む。別の局面においては、本発明は、選択された宿主細胞における使用のための組換え発現系を包含する。この系は、選択された宿主細胞における発現に適合した制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書中に記載の任意の1つの発現カセットを含む。例示的なコントロールエレメントとしては、転写プロモーター例えば、CMV、CMVイントロンA、SV40、RSV、HIV-LTR、MMLV-LTR、およびメタロチオネイン、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、および翻訳終止配列が挙げられるがこれらに限定されない。なお別の局面では、本発明は、細胞における発現に適合した制御エレメントに作動可能に連結した、本明細書中に記載の1つ以上の発現カセットを含む細胞を包含する。この細胞は、例えば、哺乳動物細胞例えば、BHK、VERO、HT1080、293、RD、COS-7、またはCHO細胞、インセクト細胞例えば、TrichoplusianiTn5またはSf9、細菌細胞、植物細胞、酵母細胞、抗原提示細胞例えば、初代の不死化されたかまたは腫瘍由来のリンパ細胞例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞およびそれらの前駆細胞であり得る。別の局面において、本発明は、HIVの、prot、pol、逆転写酵素、Env、またはTatを含有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法を包含する。この方法は、このポリペプチドを産生するための条件下で、本明細書に記載の1つ以上の発現カセットを含む細胞をインキュベートする工程を包含する。なお別の局面では、本発明は、免疫学的応答を生成するための組成物を含む。この組成物は、本明細書に記載の1つ以上の発現カセットを含む。特定の実施形態において、この組成物はまた、アジュバントを含む。なおさらなる局面において、本発明は、被験体において免疫応答を生成する方法を包含する。この方法は、本明細書に記載の1つ以上の発現カセットを含む組成物を、被験体におけるこの発現カセットの発現に適した条件下で、この被験体に導入する工程を包含する。特定の実施形態では、この発現カセットは、遺伝子送達ベクターを用いて導入される。1つより多い発現カセットが、1つ以上の遺伝子送達ベクターを用いて導入され得る。なお別の局面において、本発明は、HIVEnvポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む精製されたポリヌクレオチドを含む。ここで、このEnvポリペプチドをコードするこのポリヌクレオチド配列は、配列番号71図58または配列番号72図59に少なくとも90配列同一性を有する配列を含む。さらなる例示的な精製されたポリヌクレオチド配列が上記に提示された。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術、またはそれらの組み合わせにより生成され得る。別の実施形態において、本発明は、HIVGagポリペプチド配列を含むポリペプチドを産生するための方法を包含する。ここでこの方法は、ポリペプチドの産生のための条件下で、目的の発現カセットを含む任意の上記の細胞をインキュベートする工程を包含する。本発明はさらにVLPを産生するための条件下で、目的の発現カセットを含有する任意の上記の細胞をインキュベートする工程を包含する。別の局面において、本発明は、ウイルス様粒子VLPの組成物を産生するための方法を包含する。ここでは、目的の発現カセットを含有する任意の上記の細胞を、VLPの産生のための条件下でインキュベートし、そしてVLPは、実質的に精製され、VLPの組成物を生成する。本発明のさらなる実施形態において、本発明の発現カセットを用いて、パッケージング細胞株を生成する。例えば、レンチウイルスベクターをパッケージングするために有用な細胞株は、本発明の発現カセットを含有する発現ベクターを有する適切な宿主細胞を包含する。ここでこのポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における発現に適した制御エレメントに作動可能に連結される。好ましい実施形態において、このような宿主細胞は、HIVポリメラーゼポリペプチドまたはそれに由来するポリペプチド例えば、ここでこのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号6として示される配列に少なくとも90の配列同一性を有する配列を含むを有する1つ以上の発現カセットでトランスフェクトされ得る。さらに、HIVポリメラーゼポリペプチドは、逆転写酵素およびインテグラーゼに対応するコード領域の欠失により改変され得る。このようなポリヌクレオチド配列は、例えば、ワクチン適用において用いられる場合、Tヘルパー細胞およびCTLエピトープを保存し得る。さらに、このポリヌクレオチド配列はまた、他のポリペプチドを含み得る。さらに、さらなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列その発現がパッケージング細胞株機能のために有用であるがまた、利用され得る。別の局面において、本発明は、被験体に用いるための遺伝子送達ベクターまたはワクチンベクターを含む。ここで、このベクターは、被験体において用いるのに適切な遺伝子送達ベクターであり、そして本発明の1つ以上の発現カセットのいずれかを含む。ここで、目的のポリヌクレオチド配列は、被験体における発現に適合性の制御エレメントに作動可能に連結される。このような遺伝子送達ベクターは、被験体のDNA免疫の方法において、例えば、被験体における発現カセットの発現に適合性である条件下で、遺伝子送達ベクターを被験体に導入することによって用いられ得る。本発明の実施において有用な遺伝子送達ベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:非ウイルスベクター、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、特定のキャリアここで、このベクターは、ポリ乳酸コ-グリコリドco-glycolide粒子、金粒子またはタングステン粒子でコートされ、例えば、コートされた粒子は、遺伝子銃を用いて被験体細胞に送達され得る、リポソーム調製物、およびウイルスベクター例えば、アルファウイルス属、ポックスウイルス属、およびワクシニアウイルス属由来のベクター、ならびにレトロウイルスベクターレンチウイルスベクターを含むが、これに限定されない。アルファウイルス由来のベクターとしては、例えば、アルファウイルスcDNA構築物、組換えアルファウイルス粒子調製物、および真核生物層状layeredベクター開始系initiationsystemが挙げられる。1つの実施形態において、被験体は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物であり、そしてさらなる実施形態において、被験体はヒトである。本発明はさらに、被験体において免疫応答を発生させる方法を含む。ここで、被験体の細胞は、上記の遺伝子送達ベクター例えば、アルファウイルス構築物;アルファウイルスcDNA構築物;真核生物細胞層状ベクター開始系例えば、適切な真核生物細胞層状ベクター開始系の記載に関する、米国特許第5,814,482号を参照のこと、アルファウイルス粒子調製物;などのいずれかを用いて、選択されたポリヌクレオチドの発現および目的のポリペプチドすなわち、本発明の任意の発現カセットによりコードされるの産生を可能にする条件下でトランスフェクトされ、それにより、ポリペプチドに対する免疫学的応答を誘発する。細胞のトランスフェクションは、エキソビボで行われ得、そしてトランスフェクトされた細胞は、被験体に再導入される。あるいは、またはさらに、この細胞は、被験体にインビトロでトランスフェクトされ得る。免疫応答は、体液性および/または細胞媒介性細胞性であり得る。本発明のさらなる実施形態は、精製したポリヌクレオチドを含む。1つの実施形態において、精製したポリヌクレオチドは、配列番号20として示される配列に少なくとも90の同一性を有するポリヌクレオチド配列、およびその相補鎖を含む。別の実施形態において、精製したポリヌクレオチドは、HIVGagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここで、このポリヌクレオチド配列は、配列番号20として示される配列に少なくとも90の同一性を有する配列、およびその相補鎖を含む。なお別の実施形態は、精製したポリヌクレオチドは、HIVGagポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ここで、このポリヌクレオチド配列は、配列番号9として示される配列に少なくとも90の同一性を有する配列、およびその相補鎖を含む。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、以下の配列の1つに少なくとも90の同一性を有する配列を含む:配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、およびその相補鎖。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術、合成技術、またはその組換えにより産生され得る。本発明のこれらの実施形態または他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば当業者に容易に見出される。発明の詳細な説明本発明の実施は、他に言及しなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を、当該分野の範囲内で、使用する。そのような技術は、文献において充分説明されている。例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences、18thEditionEaston、Pennsylvania:MackPublishingCompany、1990;MethodsInEnzymologyS.ColowickおよびN.Kaplan編、AcademicPress、Inc.;ならびにHandbookofExperimentalImmunology、Vols.I-IVD.M.WeirandC.C.Blackwell、eds.、1986、BlackwellScientificPublications;Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版、1989;ShortProtocolsinMolecularBiology、第4版Ausubelら編、1999、JohnWileySons;MolecularBiologyTechniques:AnIntensiveLaboratoryCourse、Reamら編.、1998、AcademicPress;PCRIntroductiontoBiotechniquesSeries、第2版NewtonGrahameds.、1997、SpringerVerlagを参照のこと。本明細書および添付の特許請求の版において使用される場合、単数形a、anおよびtheは、その内容が、そうでないことを明確に示さない限り、その複数形を包含する。従って、例えば、anadjuvantとの参照は、2以上のそのような因子の混合物を包含する。1.定義本発明を記載するにおいて、以下の用語を使用し、そして、以下に示すように定義されることを意図する。合成配列とは、本明細書において使用される場合、Envコードポリヌクレオチド、tatコードポリヌクレオチドまたはGagコードポリヌクレオチドをいう。それらの発現は、本明細書において記載されるように、例えば、コドン置換、欠失、置換および/または阻害配列の不活化によって、最適化される。野生型またはネイティブの配列とは、本明細書において使用される場合、それらが天然において見出されるのと本質的に同様なポリペプチドコード配列をいう。例えば、HIV-1SF2単離体において見出されるようなGagコード配列またはHIV-1SF162もしくはHIV1US4において見出されるEnvコード配列。本明細書において使用される用語ウイルス様粒子またはVLPとは、非複製性のウイルスシェル以下にさらに考察するようないくつかのウイルスのうちのいくつかに由来するをいう。VLPは、概して、1つ以上のウイルスタンパク質例えば、以下であるがそれらに限定されない:キャプシドタンパク質、コートタンパク質、シェルタンパク質、表面タンパク質および/またはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質またはそれらに由来する粒子形成ポリペプチドから構成される。VLPは、適切な発現系においてそのタンパク質の組換え発現の際に自然に形成し得る。具体的なVLPを生成するための方法が当該分野において知られており、そして以下により詳細に記載される。ウイルスタンパク質の組換え発現に続くVLPの存在は、当該分野において公知の従来技術例えば、電子顕微鏡、生物物理学的特徴付けなどを用いて検出され得る。例えば、Bakerら、Biophys.J.199160:1445-1456;Hagenseeら、J.Virol.199468:4503-4505を参照のこと。例えば、VLPは、密度勾配遠心分離により単離され得るか、そして/または特徴的な密度バンド形成により同定され得る例えば、実施例7。あるいは、低温電子顕微鏡cryoelectronmicroscopyが問題のVLP調製物のガラス状水性サンプルにおいて行われ得、そして画像が、適切な曝露条件下で記録され得る。粒子ウイルスタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドは、全長のウイルスタンパク質、およびそのフラグメントもしくは内部欠失を有するウイルスタンパク質であって、VLP形成に有利な条件下でVLPを形成する能力を有するものを意味する。従って、このポリペプチドは、全長配列、フラグメント、短縮型および部分の配列、ならびにその参照分子のアナログおよび前駆体を含み得る。従って、この用語は、そのポリペプチドがVLPを形成する能力を保持さえすれば、その配列に対する欠失、付加および置換を意図する。従って、この用語は、特定のポリペプチドの天然の改変体を含む。なぜなら、コートタンパク質における改変がウイルス単離体の間にしばしば生じるからである。この用語はまた、そのタンパク質がVLPを形成する能力を保持する限り、その参照タンパク質において天然iは生じない欠失、付加および置換を包含する。好ましい置換は、天然において保存的である置換である。すなわち、その側鎖において関連があるアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。具体的には、アミノ酸は、一般に4つのファミリーに分割される:1酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸;2塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;3非極性-アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および4非荷電極性-グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、ときに、芳香族アミノ酸と分類される。抗原とは、1つ以上のエピトープ直鎖状、立体配座的、またはその両方を含む分子であって、宿主の免疫系を刺激して、体液性抗原特異的応答および/または細胞性抗原特異的応答をおこすものをいう。この用語は、用語免疫原と互換的に使用される。通常、B細胞エピトープは、少なくとも約5つのアミノ酸を含むが、3~4アミノ酸ほどの小ささであり得る。T細胞エピトープ例えばCTLエピトープは、少なくとも約7~9アミノ酸を含み、そしてヘルパーT細胞エピトープは、少なくとも約12~20アミノ酸を含む。通常、エピトープは、約7と約15との間のアミノ酸例えば、9、10、12または15のアミノ酸を含む。用語抗原とは、サブユニット抗原すなわち、その抗原が天然に随伴する生物全体から分離され、そして別個にある抗原、および殺傷され、減弱化され、または不活化された細菌、ウイルス、真菌、寄生動物または他の微生物の両方を意味する。抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメントのような抗体、および抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープもまた、本明細書において使用されるように抗原の定義のもとに入る。同様に、遺伝子治療およびDNA免疫適用におけるような、インビボの抗原または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドヌクレオチドもまた、本明細書における抗原の定義に包含される。本発明の目的のために、抗原は、以下により詳細に記載されるように、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生動物および真菌のいずれかに由来し得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために、抗原は、そのタンパク質が本明細書で記載されるように、免疫応答を惹起する能力を維持する限りにおいて、そのネイティブ配列に対して欠失、付加および置換のような改変一般的に、天然で保存的であるを包含するタンパク質をいう。これらの改変は、部位指向的変異誘発によるように意図的であり得るが、または抗原を産生する宿主の変異によるように、事故的であり得る。抗原または組成物に対する免疫学的応答は、目的の組成物において存在する抗原に対する、体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答の、被験体における発達である。本発明の目的のために、体液性免疫応答とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいう。他方、細胞性免疫応答とは、Tリンパ球および/または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の1つの重要な局面は、細胞傷害性T細胞CTLによる抗原特異的な応答を包含する。CTLは、腫瘍組織適合性複合体MHCによってコードされるタンパク質と会合して提示され、そして細胞の表面に発現されるペプチド抗原に対して特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の破壊、または細胞の溶解を誘導および進行させることを助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーT細胞は、それらの表面におけるMHC分子と会合してペプチド抗原を表示する細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激すること、およびその活性に焦点を充てることを助けるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化T細胞および/または他の白血球CD4T細胞およびCD8T細胞由来の白血球によって産生される、サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子の産生をいう。細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、細胞表面にMHC分子と会合しての抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するよう作用し得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面において抗原を提示する細胞においてかまたはその付近に指向される。さらに、抗原特異的なTリンパ球が、免疫された宿主の将来の保護を可能にするように生成され得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ球増殖リンパ球活性化アッセイ、CTL細胞障害性細胞アッセイ、または感作された被験体におけるその抗原についてのTリンパ球をアッセイすることによるような、多数のアッセイによって決定され得る、そのようなアッセイは当該分野において周知である。例えば、Ericksonら、J.Immunol.1993151:4189-4199;Doeら、Eur.J.Immunol.199424:2369-2376を参照のこと。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法としては、T細胞集団、またはエピトープ特異的なTsaibouの測定による、細胞内サイトカインまたはサイトカイン分泌の測定を包含する例えば、テトラマー技術によるMcMichael、A.J.、andO’Callaghan,C.A.、J.Exp.Med.18791367-1371,1998;McheyzerWilliams、M.G.、etal、Immunol.Rev.150:5-21,1996;Lalvani、A.、etal、J.Exp.Med.186:859-865,1997により概説される。従って、本明細書において使用されるような免疫学的応答は、CTLの生成および/またはヘルパーT細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果の1つ以上を包含し得る:B細胞による抗体の産生;ならびに/または目的の組成物もしくはワクチンにおいて存在する抗原単数または複数に対して指向されたサプレッサーT細胞および/もしくはγδT細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、および/または抗体依存性細胞傷害性ADCCを媒介して免疫された宿主に対する保護を提供するように作用し得る。そのような応答は、当該分野で周知の、標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。免疫学的組成物は、抗原性分子を含む組成物である。ここで、この組成物の被験体への投与は、目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答の、被験体における発達をもたらす。サブユニットワクチンとは、ウイルス、細菌または真菌のような目的の病原体からの抗原に由来するか、または相同である、1つ以上の選択された抗原を含むが、すべての抗原は含まないワクチン組成物を意味する。そのような組成物は、インタクトな病原細胞もしくは病原性粒子、またはそのような細胞または粒子の溶解物を実質的に含まない。従って、サブユニットワクチンは、その病原体またはそのアナログから少なくとも部分的に精製された好ましくは、実質的に精製された免疫原性ポリペプチドから調製され得る。従って、そのサブユニットワクチンに含まれる抗原を入手する方法は、標準的な精製技術、組換え産生、または合成生成を含み得る。実質的に精製されたとは、一般に、物質が存在するサンプルの大部分の割合をその物質が含むような、物質化合物、ポリヌクレオチド、蛋白質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物の単離をいう。代表的には、サンプルにおいて、実質的に精製された成分は、そのサンプルの、50、好ましくは80-85、より好ましくは90~95を含む。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術としては、当該分野において周知であり、そして例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降が挙げられる。コード配列、すなわち選択されたポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列または制御エレメントの制御下に配置されるとき、インビボで転写DNAの場合、そしてポリペプチドへと翻訳mRNAの場合される核酸分子である。コード配列の境界は、5’アミノ末端における開始コドンおよび3’カルボキシ末端での終始コドンによって決定される。コード配列としては、以下が挙げられ得るがそれらに限定されない:ウイルス、原核生物、または真核生物のmRNAからのcDNA、ウイルスまたは原核生物のDNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列でさえも。転写終結配列がコード配列の3’側に配置され得る。代表的な制御エレメントには、以下が挙げられるがそれらに限定されない:転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列転写終結コドンの3’に配置される、翻訳の開始の最適化のための配列コード配列の5’側に配置される、および翻訳終結配列。例えば、McCaughanら1995PNASUSA92:5431-5435;Kochetovら1998FEBSLetts.440:351-355を参照のこと。核酸分子としては以下が挙げられるが、それらに限定されない:原核生物配列、真核生物のmRNA、真核生物のmRNAからのcDNA、真核生物例えば、哺乳動物DNAからのゲノムDNA配列、および合成DNA配列でさえも。この用語はまた、DNAおよびRNAの、任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。作動可能に連結されるとは、エレメントの配置をいう。ここで、そのように記載された成分は、その通常の機能を実施するように配置される。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するときに、そのコード配列の配列を実行し得る。このプロモーターは、それがその発現を指向するように機能する限りにおいて、そのコード配列と連続的である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが、なおも転写される配列が、プロモーターとコード配列との間に存在し得、そしてそのコード配列およびそのプロモーター配列は、なおも、そのコード配列に作動可能に連結されている、とみなされ得る。組換え体とは、本明細書において使用されるとき、ゲノム起源、cDNA起源、半合成起源または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは、その起源もしくは操作のために、以下の通りである:1天然に随伴するポリヌクレオチドの全部または一部が随伴しないか;そして/または2天然に連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドが連結されている。用語組換えは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用されると、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養物、および単細胞生物性の存在として原核生物の微生物もしくは真核生物細胞株を示す、他のそのような用語は、互換的に使用され、そして組換えベクターもしくは他のトランスファーDNAについてのレシピエントとして使用され得るかもしくは使用された細胞をいい、そしてトランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。単一の親の細胞の子孫は、偶然もしくは意図的な変異に起因して、必ずしも、形態学的またはゲノムもしくは全DNAにおいてもとの親のものと完全に同一であるとは限らないかもしれない。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列のような関連する特性によって特徴づけられるほどに親と十分に類似している、その親の細胞の子孫は、この定義が意図する子孫において包含されており、そして上記の用語によって網羅される。アミノ酸配列の類似性を決定するための技術は、当該分野において周知である。一般に、類似性とは、適切な位置での2つ以上のポリペプチドの、正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。ここで、アミノ酸は、同一であるか、または荷電もしくは疎水性のような、類似する化学的特性および/または物理的特性を有する。次いで、いわゆる類似性が、比較されるポリペプチド配列の間で決定され得る。核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術もまた、当該分野において周知であり、そしてその遺伝子に関するmRNAのヌクレオチド配列を決定すること通常、cDNA中間体を介するおよびそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれを、第二のアミノ酸配列を比較することを包含する。一般に、同一性とは、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、それぞれ、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の、正確な対応性をいう。2つ以上のポリヌクレオチド配列は、その同一性を決定することによって比較され得る。2つ以上のアミノ酸配列は、同様に、その同一性を決定することによって比較され得る。2つの配列の同一性は、核酸もしくはペプチドの配列に拘わらず、一般に、2つの整列された配列の間の正確な適合度を、その短い方の配列の長さで除し、そして100を乗じた数として記載される。核酸配列についての適切な整列は、SmithおよびWaterman、AdvancesinAppliedMathematics2:482-4891981の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムを、Dayhoff、AtlasofProteinSequencesandStructure、M.O.Dayhoff編、5補遺3:353-358、NationalBiomedicalResearchFoundation、Washington、D.C.、USAによって開発されたスコアリング行列を用いて拡張して、そしてGribskov、Nucl.AcidsRes.146:6745-67631986によって正規化して、ペプチド配列とともに使用し得る。核酸およびペプチドの配列についてのこのアルゴリズムの実行は、GeneticsComputerGroupMadison、WIによって、そのBestFitユーティリティーアプリケーションにおいて、提供される。この方法についてのデフォルトパラメータは、WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual、Version81995GeneticsComputerGroup、Madison、WIから入手可能において記載されている。配列の間の同一性または類似性を算出するための、他の等価に適切なプログラムは、一般に、当該分野において公知である。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性は、デフォルトスコアリング表および6つのヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いて、SmithandWatermanの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。本発明の状況に置いて同一性を確立する別の方法は、UniversityofEdinburghが著作権を有するプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。このプログラムは、JohnF.CollinsおよびShaneS.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics、Inc.MountainView、CAによって配布されている。このパッケージスイートから、Smith-Watermanアルゴリズムが使用され得る。ここで、デフォルトパラメータがこのスコアリング表について使用される例えば、ギャップオープンペナルティgapopenpenaltyは12,ギャップエクステンションペナルティgapextensionpenaltyは1、そしてギャップgapは6。生成されたデータから、マッチMatch値は、配列同一性を反映する。配列の間の同一性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは当該分野において一般に公知であり例えば、整列プログラム、これはまた、デフォルトパラメータを用いて使用され得る。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用され得る:geneticcode=standard;filter=none;strand=both;cutoff=60;expect=10;Matrix=BLOSUM62;Descriptions=50sequences;sortby=HIGHSCORE;Databases=non-redundant、GenBankEMBLDDBJPDBGenBankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見いだされ得るhttp://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するための適切な検索パラメータを用意に決定し得る。例えば、検索パラメータは、問題の配列の大きさに基づいて変動し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Xの連続したヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを包含する。ここで、iXの連続したヌクレオチドは、本明細書において記載された配列のいずれかに由来する、Yの連続したヌクレオチドと少なくとも約50の同一性を有し、iiXはYと等価であり、そしてiiiXは、6ヌクレオチド以上、かつ、5000までのヌクレオチドであり、好ましくは、8ヌクレオチド以上、かつ、5000までのヌクレオチドであり、より好ましくは、10~12ヌクレオチド以上、かつ、5000までのヌクレオチドであり、そしてさらにより好ましくは、15~20ヌクレオチド以上、かつ、本明細書に記載される前兆配列に存在するヌクレオチドの数までである例えば、配列表および特許請求の範囲を参照のこと。これは、上記の範囲に入る全ての整数値を包含する。本発明の合成発現カセットおよび精製されたポリヌクレオチドは、本発明の配列をクエリ配列として用いる場合に、本明細書において開示される合成発現カセット配列に対して例えば、表1Aおよび1Bにおいて提示される配列に対して、約80~約100、80~85を超え、好ましくは90~92を超え、より好ましくは95を超え、そして最も好ましくは98の配列これらの記載される範囲内に入るすべての整数値を包含する同一性を有する、関連するポリヌクレオチド配列を包含する。2つの核酸フラグメントは、本明細書において記載されるように、選択的にハイブリダイズするとみなされる。2つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が、標的分子に対してハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価され得る例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第二版、1989ColdSpringHarbor、N.Y.を参照のこと。そのようなアッセイは、選択制の程度を変更させることによって実施され得る例えば、低度から高度のストリンジェンシーへと変更する条件を用いる。低ストリジェンシーの条件が使用される場合、非特異的な結合の非存在は、非特異的な結合事象の非存在下で、その二次プローブはその標的にはハイブリダイズしないように部分的な程度の配列同一性さえも欠如する二次プローブ例えば、その標的分子と約30未満の配列同一性を有するプローブを用いて評価され得る。。ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、核酸は標的核酸配列に対して相補的である核酸プローブが選択され、次いで、適切案条件の選択により、そのプローブおよびその標的配列は、選択的にハイブリダイズするか、または互いに結合して、ハイブリッド分子を形成する。中程度のストリンジェントのもとで標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、約10~14ヌクレオチド長で、その選択された核酸プローブに対して少なくとも約70配列同一性を有するヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、約10~14ヌクレオチド長で、その選択された核酸プローブの配列に対して約90~95の配列同一性を有する標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ/標的のハイブリダイゼーションに対して有用なハイブリダイゼーション条件ここで、そのプローブおよび標的は、特定の程度の配列同一性を有するは、当該分野において公知のように、決定され得る例えば、NucleicAcidHybridization:APracticalApproach、編者B.D.HamesおよびS.J.Higgins、1985Oxford;Washington、DC;IRLPressを参照のこと。ストリンジェンシー条件に関して、多数の等価な条件を使用して、部分的なストリンジェンシーを確立し得ることは周知であり、これは例えば、以下の因子を変動させることによる:プローブおよび標的の配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液の成分の濃度、そのハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤例えば、ホルムアルデヒド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコールの存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間のパラメータ、ならびに洗浄条件の変更。特定のセットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当該分野における標準的な方法に従って選択される例えば、Sambrook、ら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第二版、1989ColdSpringHarbor、N.Y.を参照のこと。。第一のポリヌクレオチドは、それが、第二のポリヌクレオチドの領域と同じかまたは実質的に同じ塩基対配列を有するとき、またはそれが上記の配列同一性を示すときに、その第二のポリヌクレオチドに由来するderivedfrom。第一のポリペプチドは、それが、i第二のポリヌクレオチドに由来する第一のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはii上記の第二のポリペプチドに対して配列同一性を示すときに、その第二のポリペプチドに由来する。一般に、ウイルスポリペプチドは、それが、iそのウイルスのポリヌクレオチドウイルスポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームによってコードされるか、またはii上記のように、そのウイルスの特定のポリペプチドに対して配列同一性を示すときに、そのウイルスの特定のポリペプチドウイルスポリペプチドに由来する。によってコードされるencodedbyとは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。ここで、そのポリペプチド配列またはその一部は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドからの、少なくとも3~5アミノ酸、より好ましくは少なくとも8~10アミノ酸、そしてさらにより好ましくは、15~20アミノ酸のアミノ酸配列を含む。また、その配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に識別可能であるポリペプチド配列も含まれる。精製されたポリヌクレオチドとは、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントであって、そのポリヌクレオチドに天然に随伴するタンパク質を実質的に含まない、例えば少なくとも約50未満、好ましくは約70未満、より好ましくは約90未満、を含むものをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当該分野において周知であり、そして例えば、以下を包含する:そのポリヌクレオチドを含む細胞の、カオトロピック剤での破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および密度による沈降での、そのポリヌクレオチドおよびタンパク質の分離。核酸免疫とは、1つの抗原、複数の抗原、1つのエピトープまたは複数のエピトープのインビボ発現のための、1つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。その核酸分子は、例えば、注射、吸入、経口、経鼻および粘膜での投与によってレシピエント被検体へ直接導入され得るか、またはその宿主から取り出された細胞へエキソビボ出導入され得る。後者の場合、形質転換された細胞は、その被検体に再導入され、そこで、その核酸分子によってコードされる抗原に対する免疫応答がマウントされ得る。遺伝子移入または遺伝子送達とは、目的のDNAまたはRNAを、宿主細胞へと信頼性よく挿入するための方法または系に対していう。そのような方法は、組み込まれずに移入されたDNAの一過的な発現、移入されたレプリコン例えば、エピソームの染色体外複製および発現、または宿主細胞のゲノムDNAへの移入された遺伝的物質の組み込みを生じ得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、アルファウイルス、天然痘ウイルスおよびワクシニアウイルスに由来するベクター。免疫に使用されるときには、そのような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと称され得る。Tリンパ球またはT細胞は、免疫系の細胞が媒介する分野の部分を構成する、抗体非産生リンパ球である。T細胞は、骨髄から、胸腺ホルモンの指向のもとで成熟プロセスを受ける胸腺へと移動する未熟なリンパ球から生じる。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分割して増加して、非常に大多数になる。成熟中のT細胞は、それらが特定の抗原を認識し、そして結合する能力に基づいて免疫適格になる。免疫適格T細胞の活性化は、リンパ球の表面レセプターに抗原が結合するときに惹起される。用語トランスフェクションは、細胞による外来DNAの取り込みをいうために使用される。細胞は、外来DNAが細胞膜の内側に導入されたときに、トランスフェクトされている。多数のトランスフェクション技術が当該分野において一般的に公知である。例えば、Grahamら1973Virology、52:456、Sambrookら1989MolecularCloning、alaboratorymanual、ColdSpringHarborLaboratories、NewYork、Davisら1986BasicMethodsinMolecularBiology、Elsevier、andChuら1981Gene13:197を参照のこと。そのような技術を用いて、1つ以上の外来Dな部分を適切な宿主細胞へと導入し得る。この用語は、その遺伝的物質の安定なおよび一過的の両方の取り込みをいい、そしてペプチド連結されたDNAおよび抗体連結されたDNAを包含する。ベクターは、遺伝子配列を標的細胞に移入させ得る例えば、細菌プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリアおよびりっぽそーむ。代表的なベクター構築物、発現ベクターおよび遺伝子移入ベクターは、目的の遺伝子の発現を指向し得、そして遺伝子配列を標的細胞へと移入し得る任意の核酸構築物を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。自殺遺伝子例えば、薬物感受性遺伝子の標的細胞への移入によって、その細胞は、通常の細胞には比較的非毒性である化合物または組成物に対して感受性になる。Moolten、F.L.1994CancerGeneTher.1:279-287。自殺遺伝子の例としては、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼHSVtk、シトクロムP450Manomeら1996GeneTherapy3:513-520、ヒトデオキシシジチンキナーゼManomeら1996NatureMedicine25:567-573および細菌酵素シトシンデアミナーゼDongら1996HumanGeneTherapy7:713-720が挙げられる。これらの遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロ薬物であるガンシクロビルHSV-tk、シクロホスファミドシトクロムP4502B1、シトシンアラビノシドヒトデオキシシチジンキナーゼまたは5-フルオロシトシン細菌シトシンデアミナーゼに対して感受性になっている。Culverら1992Science256:1550-1552、Huberら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8302-8306。選択マーカーまたはレポーターマーカーとは、遺伝子移入ベクターに包含されるヌクレオチド配列であって、治療的活性を有しないが、遺伝子移入ベクターの、より単純な調製、製造、特徴付けまたは試験を可能にするために含まれるものをいう。特異的結合剤因子とは、分子の特異的結合対メンバーをいう。ここで、その分子の一方は、第二の分子に対して、化学的手段および/または物理的手段を通じて特異的に結合する。特異的結合剤の1つの例は、選択された抗原に対して指向される抗体である。被検験体とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味し、これは、以下を包含するがそれらに限定されない:ヒトおよびその他の霊長類非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサルの種を含む;家畜例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウシ;家庭用哺乳動物例えば、イヌおよびネコ;実験動物齧歯類例えば、マウス、ラットおよびモルモット;鳥類家庭用、野生および遊技のための鳥類例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類鳥類、アヒル、ガチョウなど。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体および新生の個体の両方が網羅されることが意図される。上記の系は、上記の任意の脊椎動物種において使用することが意図される。なぜなら、これらの脊椎動物のすべての免疫系が同様に機能するからである。薬学的に受容可能なまたは薬理学的に受容可能なとは、生物学的または他の様式で所望されなくはない物質を意味する。すなわち、この物質は、所望されない生物学的効果を何ら起こすことも、それが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式において相互作用することもなく、処方物または組成物中で個体に投与され得る。生理的pHまたは生理的範囲のpHとは、ほぼ7.2~8.0両端含むの範囲、より代表的には約7.2~8.0両端含むの範囲のpHを意味する。本明細書で用いられる処置とは、以下のいずれかをいうI伝統的なワクチンにおけるように、感染または再感染の予防、ii症状の低減または除去、およびiii問題の病原体の実質的または完全な除去。処置は、予防的感染の前または治療的感染後に行われ得る。レンチウイルスベクターおよび組換えレンチウイルスベクターは、レンチウイルスとして知られるレトロウイルスのサブセットに由来する。レンチウイルスベクターとは、目的の核酸分子を有し、そして特定の実施形態においてはその発現を指向し得る核酸構築物をいう。レンチウイルスベクターは、少なくとも1つの転写プロモーター/エンハンサーまたは位置規定エレメント、あるいは他の手段による遺伝子発現を制御する他のエレメント例えば、代替スプライシング、核RNA輸送、メッセンジャーの転写後改変、またはタンパク質の翻訳後改変を制御するものを包含する。そのようなベクター構築物はまた、使用されるレンチウイルスベクターに対して適切な、パッケージングシグナル、長末端反復LTRまたはその部分、ならびにおよび-鎖プライマー結合部位を包含するこれらが、レトロウイルスベクターにはそれまでには存在していない場合。必要に応じて、組換えレンチウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー例えば、Neo、TK、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、またはDHFRならびに翻訳終結配列を包含し得る。例えば、そのようなベクターは、代表的に、5’LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖DNA合成の起点、および3’LTRまたはその部分を包含する。レンチウイルスベクター粒子とは、本発明において利用されるときに、目的の少なくとも1つの遺伝子を有するレンチウイルスをいう。このレトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。組換えレンチウイルスは、感染すると、その遺伝的物質RNAをDNAへと逆転写し得、そしてこの遺伝的物質を、宿主細胞のDNAへと組み込み得る。レンチウイルスベクター粒子は、レンチウイルスのエンベロープ、非レンチウイルスエンベロープ例えば、アンホamphoまたはVSV-Gエンベロープ、またはキメラエンベロープを有し得る。核酸発現ベクターまたは発現カセットとは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に対して作動可能に連結されるプロモーターを含む。他の制御エレメントもまた存在し得る。本明細書において記載される発現ベクターは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、そのプラスミド構築物はまた、細菌の複製起点、1つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖として存在することを可能にするシグナル例えば、M13複製起点、複数のクローニング部位、および哺乳動物の複製起点SV40またはアデノウイルス複製起点を含み得る。パッケージング細胞とは、組換えレトロウイルスベクターを欠如する感染性組換えレトロウイルス例えば、レンチウイルスの産生に必要なそれらのエレメントを含む細胞をいう。代表的に、そのようなパッケージング細胞は、Gag、polおよびenvのタンパク質をコードするタンパク質を発現し得る、1つ以上の発現カセットを含む。プロデューサー細胞またはベクタープロデューサー細胞とは、組換えレトロウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントを含む細胞をいう。2.発明の実施の形態本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物またはプロセスのパラメータには限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、当然ながら、そのようなものは、変動し得るからである。本明細書において使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためのみに存在し、そして限定を意図しないこともまた理解されるべきである。本明細書において記載される方法および物質に類似するかまたは等価である、多数の方法および物質が本発明の実施において使用され得るが、好ましい物質およぶ方法が本明細書において使用される。2.1合成発現カセット2.1.1HIV-1GAG核酸コード配列の改変本発明の1つの局面は、HIV-1Gagタンパク質コード配列、および対応する野生型配列よりも改善された発現を有する、関連配列の生成である。本発明の例示的な実施形態は、HIV-1SF2株から入手されるGagタンパク質野生型配列を改変するために例示される配列番号1;Sanchez-Pescador,R.、ら、Science2274686:484-492,1985;Luciw,P.A.、ら米国特許第5,156,949号、1992年10月20日発行;Luciw、P.A.、ら、米国特許第5,688,688号、1997年11月18日。他のHIV改変体から得られたGag配列は、本明細書の教示に従って同様の様式で操作される。そのような他の改変体としては以下が挙げられるがそれらに限定されない:単離体HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV,HIVLAI,HIVMN,HIV-1CM235、、HIV-1US4、多様な亜型由来の他のHIV-1株例えば、サブタイプA~G、およびO、HIV-2株および多様な亜型例えば、HIV-2UC1およびHIV-2UC2、およびサル免疫不全ウイルスSIV.これらおよび他の関連するウイルスの説明について、例えば、Virology、第三版W.K.Joklik編、1988から得られるGagタンパク質コード配列;FundamentalVirology、第二版B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編、1991;Virology、第三版Fields、BN、DMKnipe、PMHowley編、1996、Lippincott-Raven、Philadelphia、PAを参照のこと。まず、HIV-1コドン使用パターンを改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子に見いだされるコドン使用と同じにさせた実施例1。HIVコドン使用は、コドントリプレットのヌクレオチドAまたはTの高含量を反映する。HIV-1コドン使用の効果は、DNA配列において高度のAT含量であり、これは、mRNAの減少した翻訳能力および不安定性をもたらす。比較すると、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドGまたはCを好む。Gagコード配列は、高度に発現されるヒト遺伝子において見出されるコドン使用と同じに改変された。図11において実施例1、公知の不安定のmRNAおよび公知の安定のmRNAについてのmRNAに対応するcDNA配列のA-T含量が、本発明のネイティブHIV-1SF2GagcDNAおよび合成のGagcDNA配列のA-T含量と比較される。本発明の支持において実施される実験は、合成Gag配列が、ネイティブGag配列よりも、高いレベルのタンパク質生成実施例を参照のことし得たことを示した。図11において示されるデータは、この増加された生成の1つの理由ががネイティブGagコード配列に対応するmRNAに対して合成Gagコード配列に対応するmRNAの安定性の増加であることを示唆する。第二に、Gagコード配列のコード配列内に配置された阻害または不安定性エレメントINSが存在する実施例1。RREは、HIVがコードするRevタンパク質と相互作用して、INSの発現を下方調節する効果を克服する第二のRNA構造である。PREおよびRevの翻訳後活性化機構を克服するために、不安定性エレメントは、コードされるタンパク質の読み枠を変更しなかった複数の点変異を導入することによって不活化された。図1は、もとのSF2Gag配列、INS配列の位置、およびINS配列に施されてその効果を減少させる改変を示す。得られる改変されたコード配列は、合成Gag発現カセットとして提示される配列番号4。Gagポリペプチドコード配列の改変は、多数の哺乳動物細胞株において野生型コード配列および他の型の細胞株昆虫細胞を含むがそれらに限定されないよりも改善された発現を生じた。さらに、その配列の発現は、これらの細胞株以下を参照のことによるウイルス様粒子VLPの産生を生じた。同様なGagポリペプチドコード配列は、以下を含むがそれらに限定されないような他の改変体を含む種々の単離体科、亜型、株などから得られ得る:以下の単離体から得られたGagポリペプチドコード配列:HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-lUS4、多様な亜型由来の他のHIV-1株例えば、亜型A~GおよびO、HIV-2株および多様な亜型例えば、HIV-2UClおよびHIV-2UC2、ならびにサル免疫不全ウイルスSIV。例えば、Virology、第三版W.K.Joklik編、1988;FundamentalVirology、第二版B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編.1991;Virology、第三版Fields、BN、DMKnipe、PMHowley編、1996,Lippincott-Raven、Philadelphia、PAを参照のこと。これらの改変体に由来するGagポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって、哺乳動物における改善された発現のための最適化および試験され得る実施例、特に実施例1を参照のこと。2.1.2HIV-1Gag核酸コード配列を含む配列のさらなる改変本発明の支持において実施される実験は、ExperimentsperformedinsupportofthepresentinventionhaveshownthatsimilarmodificationsofHIV-1Gag-プロテアーゼ、Gag-逆転写酵素およびGagポリメラーゼの配列の類似の改変もまた、そのポリタンパク質の発現の改善、およびそのように改変されたコード配列から産生されるポリペプチドによって形成されるVLPの産生を生じる。Gag-プロテアーゼ配列野生型、配列番号2;改変型、配列番号5、78、79について、コドン使用における変化は、-1フレームシフトの上流の領域に限定されていた図2。さらに、Gagプロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に配置される阻害または不安定性エレメントINSもまた変更された図2に示す。改変されたGagプロテアーゼ配列をコードする例示的な構築物これは、-1フレームシフトを含むは、配列番号78および79に示されるものを包含する図69および70。これらは、以下である:GP1配列番号78ここでは、プロテアーゼ領域をまた、コドン最適化され、そしてINS不活化した、ならびにGP2配列番号79ここでは、そのプロテアーゼ領域をINS不活化にのみ供した。他のGag含有配列例えば、Gagポリメラーゼ配列野生型、配列番号3;改変型、配列番号6またはGag逆転写酵素野生型、配列番号77;改変型、配列番号80~84について、コドン使用における変化は、Gagプロテアーゼ配列についての変化に類似する。Gag-Polコード配列におけるフレームシフトを含むそれらの発現カセットは、FS配列番号80および81、図71および72と称するが、他方で、名称FS-配列番号82、83および84、図73、74および75は、このコード配列において利用されるフレームシフトが存在しないことを示す。HIV関連配列を含むポリタンパク質に加えて、本発明の種々のGag-、Gag-prot、Gag-pol、Gag逆転写酵素をコードする配列は、免疫原性が所望される他のポリペプチドに融合され得るこれは、キメラポリペプチドを作製する。そのようなキメラタンパク質の例は、改善された発現Gagコード配列の、C型肝炎ウイルスHCVコアタンパク質への連結である。この場合において、HCVコアをコードする配列は、HIV-Gagコード配列とインフレームに配列され、配列番号7として提示されるGag/HCVコアコード配列を生じる野生型配列は、配列番号8として提示される。本発明の実施において有用なさらなる配列としては以下が挙げられるが、それらに限定されない:ウイルスエピトープ/抗原をコードする配列以下を包含するがそれらに限定されない:HCV抗原例えば、E1、E2;Houghton,M..、ら、米国特許第5,714,596号、1998年2月3日発行;Houghton、M..、ら、米国特許第5,712,088号、1998年1月27日;Houghton、M..、ら、米国特許第5,683,864号、1997年11月4日発行;Weiner、A.J.、ら、米国特許第5,728,520号、1998年3月17日発行;Weiner、A.J.、ら、米国特許第5,766,845号、1998年6月16日発行;Weiner、A.J.、ら,米国特許第5,670,152号、1997年9月23日発行、HIV抗原例えば、nef、tat、rev、vpu、vif、vprおよび/またはenvに由来する;ならびに腫瘍の抗原/エピトープをコードする配列。さらなる配列は、以下に記載される。また、Gagおよび他のコード配列の、互いに対する方向における改変もまた、以下に記載される。Gag、Gag-プロテアーゼ、Gag-逆転写酵素および/またはGag-ポリメラーゼのポリペプチドをコードする配列は、以下を含むがそれらに限定されない任意のHIV単離体異なる科、亜型および株から得られ得る:HIVIIIb、HIVSF2、HIVSFl62、HIVus4、HIVcm235、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN例えば、MyersらLosAlamosDatabase、LosAlamosNationalLaboratory、LosAlamos、NewMexico1992;Myersら、HumanRetrovirusesandAids、1997,LosAlamos、NewMexico:LosAlamosNationalLaboratoryを参照のこと。合成発現カセットは、そのようなコード配列を出発材料として、本明細書の教示に従って例えば、実施例1を参照のこと用いて生成され得る。さらに、本発明の合成発現カセットは、本明細書において開示される合成発現カセット例えば、配列番号4;配列番号5;配列番号6;および配列番号20、Gag主要相同性領域GagMajorHomologyRegionに対して、75を超え、好ましくは80~85を超え、より好ましくは90~95を超え、そして最も好ましくは98を超える配列同一性またはこれらの範囲内の任意の整数値を有する、関連するGagポリペプチドをコードする配列を包含する。2.1.3HIV-1GAGおよび関連ポリペプチドをコードする合成配列の発現本発明のいくつかの合成Gagコード配列発現カセットを、多数のこと成る発現ベクター中にクローニングして実施例1、VLPの発現および産生のレベルを評価した。2つの改変された合成コード配列を、合成Gag発現カセット配列番号4および合成Gag-プロテアーゼ発現カセット配列番号78および79を提示する。他の合成Gagコードタンパク質が提示される例えば、配列番号80~84として。Gagコードポリペプチドについての合成DNAフラグメント例えば、Gag、Gag-プロテアーゼ、Gag-ポリメラーゼ、Gag-逆転写酵素を、実施例1に記載される発現ベクター一過性発現ベクター、CMVプロモーターベースの哺乳動物ベクター、およびバキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターを含む中にクローニングした。対応する野生型配列を、同じベクター中にクローニングした。次いで、これらのベクターを、いくつかの異なる細胞型種々の哺乳動物細胞293、RD、COS-7、およびCHO細胞株、例えば、ATCCから入手可能を含む中にトランスフェクトした。細胞株を、適切な条件下で培養し、そして上清中でのp24Gag発現のレベルを評価した実施例2。これらのアッセイの結果は、合成Gagコード配列の発現が、対応する野生型配列よりも顕著に高かったことを実証した実施例2;表2。さらに、ウエスタンブロット分析によって、合成Gag発現カセットを含む細胞が、予測される55kDp55タンパク質を、ネイティブ発現カセットを含む細胞よりも、1細胞あたりより高い濃度で産生したことを示した。Gagp55タンパク質は、細胞溶解物および上清の両方において見られた。産生レベルは、本発明の合成Gag発現カセットでトランスフェクトされた細胞についての細胞上清において顕著により高かった。本発明の支持において実施される実験は、合成Gagタンパク質発現カセットを含む細胞が、野生型発現カセットを含む細胞よりも、1細胞あたりの比較的高い濃度で予測されるGagタンパク質を賛成したことを示唆する。合成Gag発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清の分画は、それが、p55タンパク質およびVLPの両方が、野生型Gag配列によりも優勢な産生を提供することを示した実施例6および7。これらのGag含有ポリペプチドの哺乳動物細胞株における効率よい発現は、以下の利益を提供する:Gagポリペプチドは、バキュロウイルス夾雑物を含まない;FDAによって承認された確立された方法によって産生;純度の増加;収率の増加ネイティブコード配列に比較して;ならびに本発明の構築物を用いて得られる発現の増加の非存在において実施可能ではないCHOまたは他の哺乳動物細胞において、Gag含有ポリペプチドを産生する新規の方法。例示的な哺乳動物細胞株としては以下が挙げられるがそれらに限定されない:BHK、VERO、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/clone8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、ミエローマ細胞例えば、SB20細胞およびCEMX174。このような細胞株は、例えば、ATCCから入手可能である。本発明の合成Gag発現カセットはまた、昆虫細胞へとトランスフェクトされるときに、発現およびVLPの産生の高レベルを実証した実施例7。さらに、より高レベルの総タンパク質収率に加えて、合成p55発現されたGagからの最終産物は、一過的に、ネイティブp55発現されたGagからの最終精製産物よりも少ない夾雑するバキュロウイルスタンパク質を含んだ。さらに、本発明の合成Gag発現カセットはまた、酵母細胞Saccharomycescerevisea;Rosenberg、S.およびTekamp-Olson、P.、米国特許第RE35,749、1998年3月17日発行に記載されるようなベクターを用いるへと形質転換され、そして一過的に発現される公募ベクターへと導入された。実施例に記載される哺乳動物および昆虫のベクターに加えて、本発明の合成発現カセットは、選択された発現制御エレメントを用いて種々の発現ベクターへと組み込まれ得る。任意の所定の細胞型について適切なベクターおよび制御エレメントは、当業者によって、本明細書の教示および当該分野における発現ベクターについての情報に鑑みて、選択され得る。例えば、合成Gag発現カセットは、所望のコード配列に作動可能に連結される制御エレメントを含むベクター中に挿入され得る。これは、選択される細胞型中の遺伝子の発現を可能にする。例えば、とりわけ、哺乳動物細胞発現のための代表的なプロモーターとしては、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター例えば、CMV前初期プロモーターCMVプロモーターは、イントロンAを含み得る、RSV、HIV-LTR、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRMMLV-LTR、FIV-LTR、アデノウイルス主要後期プロモーターAdMLP、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーターもまた、哺乳動物発現についての使用を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳終結コドンの3’側に位置する。好ましくは、コード配列の5’側に位置する、翻訳の開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター/ポリアデニル化のシグナルの例としては、以下が挙げられる:Sambrookら、前出に記載されるようなSV40からの配列、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列。スプライスドナーおよびアクセプターの部位を含むイントロンもまた、本発明の使用のための構築物中に設計され得るChapmanら、Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986。エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増加するための本明細書において使用され得る。例としては、以下が挙げられる:SV40初期遺伝子エンハンサーDijkemaら、EMBOJ.19854:761において記載される、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復LTR由来のエンハンサー/プロモーターGormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1982b79:6777に記載されるおよびヒトCMVに由来するエレメントBoshartら、Cell198541:521に記載される例えば、CMVイントロンA配列において含まれるエレメントChapmanら、Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986。所望される合成Gagポリペプチドコード配列は、任意の数の市販のベクターにクローン化され、適切な宿主系においてポリペプチドの発現を発生し得る。これらの系として、以下が挙げられるがこれらに限定されない:バキュロウイルス発現{Reilly、P.R.ら、BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual1992;Beamesら、Biotechniques11:3781991;Pharmingen;Clontech,PaloAlto,CA}、ワクシニア発現{Earl,P.L.ら、ExpressionofproteinsinmammaliancellsusingvacciniaInCurrentProtocolsinMolecularBiologyF.M.Ausubelら、編、GreenePublishingAssociatesWileyInterscience,NewYork1991;Moss,B.ら、米国特許第5,135,855号、1992年8月4日発行}、バクテリア中の発現{Ausbel,F.M.ら、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileyandSons、Inc.,MediaPA;Clontech}、酵母中の発現{Rosenberg,S.およびTekamp-Olson,P.米国特許第RE35,749号,1998年3月17日発行;Shuster,J.R.,米国特許第5,629,203号、1997年5月13日発行;Gellissen,G.ら、AntonieVanLeeuwenhoek,621-2:79-931992;Romanos、M.A.ら、Yeast86:423-4881992;Goeddel,D.V.、MethodsinEnzymology1851990;Guthrie,C.およびG.R.Fink、MethodsinEnzymology1941991}、哺乳動物細胞中の発現{Clontech;Gibco-BRL、GroundIsland、NY;例えば、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株Haynes,J.ら、Nuc.Acid.Res.11:687-7061983;1983、Lau、Y.F.ら、Mol.Cell.Biol.4:1469-14751984;Kaufman,R.J.、SlectionandcoamplificationofheterologousgenesinmammaliancellsMethodsinEnzymology、185巻、537-566頁、AcademicPress,Inc.SanDiegoCA1991、および植物細胞中の発現{植物クローンベクター、ClontechLaboratories、Inc.,PaloAlto,CA、およびPharmaciaLKBBiotechnology,Inc.,Pistcataway、NJ;Hood、E.ら、J.Bacteriol.168:1291-13011986;Nagel、R.ら、FEMSMicrobiol.Lett.67:3251990;Anら、BinaryVectors、およびothersPlantMolecularBiologyManualA3:1-191988;Miki,B.L.A.ら、249-265頁、およびothersPlantDNAInfectionsAgentsHohn,T.ら、編Springer-Verlaq、Wien、Austria1987;PlantMolecularBiology:EssentialTechniques、P.G.JonesandJ.M.Sutton、NewYork、J.Wiley、1997;Miglani、GurbachanDictionaryofPlantGeneticsandMolecularBiology、NewYork、FoodProductsPress、1998;Henry、R.J.、PracticalApplicationsofPlantMolecularBiology、NewYork、ChapmanHall、1997}。本発明において、例えば実施例1に記載されたCMVプロモーター含有ベクター適切な宿主のコード領域の発現を可能にするコード配列および発現調節エレメントを含むのような発現ベクターも含まれる。この調節エレメントとして、一般に、プロモーター、翻訳開始コドン、ならびに翻訳および転写終止配列、ならびにベクター中への挿入を導入するための開始部位が挙げられる。翻訳調節エレメントはM.Kozakによって検討されてきた例えば、Kozak,M.、Mamm.Genome78:563-574、1996;Kozak,M.,Biochimie769:815-821、1994;Kozak,M.、J.CellBiol1082:229-241、1989;Kozak,MおよびShatkin,A.J.,MethodsEnzymol60:360-375,1979。酵母系における発現は、商業的産生の利点を有する。ワクシニアおよびCHO細胞株による組換えタンパク質産生は、哺乳動物発現系であるという利点を有する。さらに、ワクシニアウイルス発現は、以下に挙げる幾つかの利点を有する:iその広範な宿主範囲;ii正確な転写改変後の組換えタンパク質の、プロセシング、折りたたみ、輸送、分泌、および構築;iii比較的可溶な組換えタンパク質の高いレベルの発現;およびiv外来性DNAを収容するための大容量。合成Gagコード発現カセット由来の組換え発現ポリペプチドは、典型的に溶解された細胞または培養培地から単離される。精製は、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ分別、およびアフィニティークロマトグラフィーを含む当該分野で公知の方法によって実施され得る。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、例えばGag抗原に基づいて発生される抗体を使用して採用され得る。哺乳動物細胞を使用する本発明のGag含有タンパク質を発現する利点として以下が挙げられるが、これらに限定されない:スケールアップ産生のための高度に確立されたプロトコール;VLPを産生するための能力;細胞株が優れた製造プロセスGMP標準を満たすように適切であること;哺乳動物のための培養条件が当該分野において公知であること。2.1.4HIV-1ENV核酸コード配列の改変本発明の1局面は、HIV-1Envタンパク質コード配列、および対応する野生型配列に対して改良された発現を有する関連配列の発生である。本発明の例示的な実施形態として、本明細書中において、HIV-1サブタイプB株HIV-1US4およびHIV-1SF162から得られるEnvタンパク質野生型配列を改変することが例示されるMyersら、LosAlamosDatabase、LosAlamosNationalLaboratory、LosAlamos、NewMexico1992;Myersら、HumanRetrovirusesandAids、1997、LosAlamos、NewMexico:LosAlamosNationalLaboratory。他のHIV変異体から得られるEnv配列は、本明細書の教示に従う同様の様式で操作され得る。このような他の変異体として、章2.2.1において前述されたもの、およびワールドワイドウェブインターネット例えば、http://hiv-web.lanl.gov/cgi-bin/hivDB3/public/wdb/ssampublicおよびhttp://hiv-web.lanl.govで公開されたものが挙げられる。第1に、HIV-1コドン使用パターンは、得られる核酸コード配列が高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用に匹敵するように改変された実施例1。このHIVコドン使用は、コドン-トリプレットの高含量のヌクレオチドAまたはTを反映する。このHIV-1コドン使用の効果は、mRNAの減少した翻訳能力および不安定性を生じるDNA配列における高いAT含量である。対照的に、高度に発現されたヒトコドンはヌクレオチドGまたはCを好む。Envコード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されたコドン使用に匹敵するように改変された。本発明の支持下で実施された実験は、合成Env配列が天然Env配列に対してより高いレベルのタンパク質産生実施例を参照のことを可能にすることを示した。この増加した産生の1つの理由は、天然Envコード配列に対応するmRNAに対する、合成Envコード配列に対応するmRNAの安定性の増加であリ得る。Envポリペプチドコード配列の改変は、多くの哺乳動物細胞株の野生型コード配列に対する改良された発現を生じた。同様のEnvポリペプチドコード配列は、種々の単離体ファミリー、サブタイプなどから得られ得る。これらの変異体由来のEnvポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって哺乳動物における改良された発現に対して最適化され得、そして試験され得る実施例、特に実施例2を参照のこと。2.1.5HIV-1Env核酸コード配列のさらなる改変タンパク質含有HIV関連配列に加えて、本発明のEnvコード配列は、他のポリペプチドに融合され得るキメラポリペプチドを作製する。さらに、Envおよび他のコード配列の配向におけるバリエーションが互いに対して考慮される。さらに、本発明のHIVタンパク質コードカセットは、1つのベクターまたは複数のベクターを使用して共発現され得る。さらに、ポリタンパク質polyproteinが同じまたは異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。Envポリペプチドコード配列は、任意のHIV単離体異なるファミリー、サブタイプ、および株から得られ得、このHIV単離体として、HIVIIIb、HIVSF2、HIVUS4、HIVCM235、HIVSF162、HIVLAV、HIVLAI、HIVMNが挙げられるが、これらに限定されない例えば、Myersら、LosAlamosDatabase、LosAlamosNationalLaboratory、LosAlamos、NewMexico1992;Myersら、HumanRetrovirusesandAids、1997、LosAlamos、NewMexico:LosAlamosNationalLaboratoryを参照のこと。合成発現カセットは、本発明の教示例えば、実施例1を参照のことに従うことによって、出発物質としてこのようなコード配列を使用して発生され得る。さらに、本発明の合成発現カセットおよび精製されたポリヌクレオチドは、本発明の配列が照会配列querysequenceとして使用される場合、本明細書中に開示された合成発現カセット配列例えば、配列番号:71-72;および/または表1Aおよび1Bに表される配列に対して、90より大きい、好ましくは92より大きい、より好ましくは95より大きい、そして最も好ましくは98より大きい配列同一性を有する関連Envポリペプチドコード配列を含む。2.1.6合成配列コードHIV-1Envおよび関連ポリペプチドの発現本発明の幾つかの合成Envコード配列発現カセットは、多くの異なる発現ベクターにクローンされ実施例1、Envポリペプチドの発現および産生のレベルを評価する。改変された合成コード配列は、合成Env発現カセットとして表される実施例1、例えば表1Aおよび1B。Envのための合成DNAフラグメントは、実施例1および上記の章2.1.3に記載される真核生物発現ベクター一過性発現ベクターおよびCMVプロモーターをベースとする哺乳動物ベクターを含むにクローンされた。対応する野生型配列が同じベクターにクローンされた。次いで、これらのベクターは幾つかの異なる細胞型にトランスフェクトされ、これらの細胞型は、種々の哺乳動物細胞株293、RD、COS-7、およびCHO、例えばA.T.C.Cから入手可能な細胞株を含む。この細胞株は、適切な条件下で培養され、上清中のgp120、gp140およびgp160Env発現のレベルが評価された実施例2。Envポリペプチドとして、例えば、天然gp160、オリゴマーgp140、モノマーgp120ならびにこれらのポリペプチドの改変された配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイの結果は、合成Envコード配列の発現が対応する野生型配列より有意に高いことを実証した実施例2;表3および4。さらに、ウエスタンブロット分析は、合成Env発現カセットを含む細胞が天然発現カセットを含む細胞より1細胞あたりの高い濃度で、予想されたタンパク質gp120、gp140またはgp160を産生したことを示した。このEnvタンパク質は、細胞溶解液および上清の両方に見られた。産生のレベルは、野生型と比べて、本発明の合成Env発現カセットでトランスフェクトされた細胞の細胞上清においてより有意に高かった。合成Env発現カセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞からの上清の画分は、それが、野生型Env配列に対してEnvタンパク質のより優れた産生を提供することを示した実施例2および3。哺乳動物細胞株におけるこれらのEnv含有ポリペプチドの効率的な発現は、以下の利点を提供する:このEnvポリペプチドがバキュロウイルスまたの他のウイルス夾雑物を含まないこと;FDAによって承認された確立された方法による産生;増加した純度;より高い収率天然コード配列に対して;および本発明の構築物を使用して得られた増加した発現の非存在下において実行可能性の低いCHO細胞におけるEnv含有ポリペプチドを産生する新規な方法。例示的な細胞株例えば、哺乳動物、酵母、昆虫などは、Gag含有構築物について章2.1.3で前述したものを含む。さらに、任意の所与の細胞型のための適切なベクターおよび調節エレメント例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などは、本発明の教示および発現ベクターに関する当該分野において公知の情報の観点で、当業者によって、章2.1.3に前述されるように、選択され得る。さらに、合成Envコード発現カセット由来の組換え発現ポリペプチドは、Gagコード発現カセットについて前述されたように、典型的に単離され、そして溶解された細胞または培養培地から精製される。例示的な精製は、実施例4に記載され、そして図60に示される。2.1.7HIV-1TAT核酸コード配列の改変本発明の別の局面は、HIV-1tatタンパク質コード配列、および対応する野生型配列に対して改良された発現を有する関連配列の発生である。本発明の例示的な実施形態として、本明細書中において、上記のようなSF162から得られたtat野生型ヌクレオチド配列配列番号:85、図76を改変することが挙げられる。例示的な合成tat構築物は、配列番号:87これは、系統SF162由来の完全長tatポリペプチドをコードする構築物を示す;配列番号:88これは、システイン残基を22位で変化させるtatポリペプチドをコードするtat構築物を示す;および配列番号:89これは、系統SF162由来のtatポリペプチドのアミノ末端部分をコードするtat構築物を示すに示される。tatタンパク質のアミノ部分は、免疫応答を誘導する多くのエピトープを含む。さらに、さらなる改変は、例えばバリン残基、アラニン残基またはグリシン残基配列番号:88および89、図79および81による22位におけるシステイン残基の置換または欠失を含む。例えば、Caputoら、1996GeneTher.3:235を参照のこと。図81これは、tatポリペプチドのアミノ末端部分をコードするtat構築物を示すにおいて、システイン残基をコードするヌクレオチドヌクレオチド64-66に下線が引かれる。適切な構築物の設計および構築は、本明細書の教示を使用して容易に行われ得る。Gag、pol、protおよびEnvのように、ポリペプチドコード配列は種々の単離体から得られるファミリー、サブタイプなど。tatポリペプチドコード配列の改変は、多くの細胞株例えば、哺乳動物、酵母、細菌細胞および昆虫細胞における野生型コード配列に対する改良された発現を生じる。これらの変異体由来のtatポリペプチドコード配列は、本明細書の教示に従うことによって哺乳動物での改良された発現のために最適化され得、そして試験され得る実施例、特に実施例2を参照のこと。本明細書中に記載される本発明の異なる実施形態の種々の形態が組み合わせられ得る。例えば、ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチド配列から誘導され得、このポリヌクレオチド配列として、Gagポリペプチド、Envポリペプチド、ポリメラーゼポリペプチド、プロテアーゼポリペプチド、tatポリペプチド、および逆転写酵素ポリペプチドのためのコード配列が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のポリヌクレオチドコード配列は、典型的に各ポリペプチドに対する各コード配列がIRES配列によって先行される多重シストロン発現カセットに組み合わせられ得る。2.2ウイルス様粒子の産生およびパッケージング細胞株を形成するための本発明の構築物の使用ヒト免疫欠損ウイルス型-1HIV-1の群特異的な抗原Gagは、出芽によって種々の真核細胞から放出される非感染ウイルス様粒子VLPに自己集合するFreed、E.O.,Virology251:1-15、1998によって検討される。本発明の合成発現カセットは、種々の異なる細胞株哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されないを使用して、HIV-Gagウイルス様粒子VLPの産生のための効率的な手段を提供する。ウイルス粒子は、宿主の免疫系に対して、捕捉されたまたは会合した抗原の適切な提示のためのマトリックスとして使用され得る。例えば、米国特許第4,722,840号は、異種ポリペプチドに融合されたウイルス例えば、B型肝炎ウイルスHBV表面抗原HBsAgの粒子形成フラグメント由来の構造タンパク質の粒子形成フラグメントからなるハイブリッド粒子について記載する。Tindleら、Virology1994200:547-557は、ヒトパピローマウイルスHPV型16E7形質転換タンパク質のエピトープを含有するキメラHBVコア抗原粒子の産生および使用について記載する。Adamら、Nature1987329:68-70は、酵母におけるハイブリッドHIVgp120:TyVLPの組換え産生Brownら、Virology1994198:477-488、ヒトパルボウイルスB19のVP2タンパク質およびヒト単純ヘルペスウイルス1型およびマウス肝炎ウイルスA59由来のエピトープからなるキメラタンパク質の産生について記載する。WagnerらVirology1994200:162-175、Brandら、J.Virol.Meth.199551:153-168;Virology1996220:128-140およびWolfら1991年10月2日に公開されたEP0449116A1;1996年10月3日に公開されたWO96/30523は、キメラHIV-1p55Gag粒子の構築について記載する。米国特許第5,503,833号は、治療薬剤を被包し送達するためのロタウイルスVP6球体の使用について記載する。2.2.1本発明の合成発現カセットを用いるVLP産生本発明を支持して実施した実験は、本発明の合成発現カセットが、ネイティブコード配列に対して、タンパク質およびVLPの両方の優れた産生を提供することを示した実施例7および15。さらに、VLP産生の電子顕微鏡評価実施例6および15、図3A~Bおよび65A~Fは、予期されたサイズの遊離のおよび発芽する未熟ウイルス粒子が、合成発現カセットを含む細胞によって産生されたことを示した。ウイルス様粒子の産生のために、ネイティブコード配列よりむしろ、本発明の合成発現カセットを用いることが、いくつかの利点を提供する。第一に、VLPは、増大された量で産生され得、これによりVLPの単離および精製をより容易にする。第二に、VLPは、合成発現カセットを用いて種々の細胞タイプにおいて産生され得る。特に、哺乳動物細胞株例えば、CHO細胞が、VLP産生のために使用され得る。CHO細胞を用いる産生は、以下を提供する:iVLP形成;ii正確なミリスチル化および発芽budding;iii非哺乳動物細胞混入物例えば、昆虫ウイルスおよび/または細胞がないこと;およびiv精製の容易さ。本発明の合成発現カセットは、また、哺乳動物細胞株以外の細胞タイプにおいて増強された発現のために有用である。例えば、合成発現カセットをコードするバキュロウイルスベクターによる昆虫細胞の感染は、野生型コード配列に比較してより高いレベルの全タンパク質収量、およびより高いレベルのVLP産生を生じた。さらに、バキュロウイルス-Gag合成発現カセットに感染した昆虫細胞からの最終産物は、一貫して、野生型コード配列が用いられたときの最終産物より低い量の混入昆虫タンパク質を含んだ実施例。VLPは、目的の粒子形成ポリペプチドが、適切な宿主細胞において組換え発現される場合に自発的に形成し得る。従って、好都合には、本発明の合成発現カセットを用いて産生されたVLPは、組換え技術を用いて調製される。以下で議論するように、本発明の合成発現カセットをコードするGagポリペプチドは、目的の他のポリペプチドコード配列を含み得る例えば、Env、tat、rev、HIVプロテアーゼ、HIVポリメラーゼ、HCVコア;実施例1を参照のこと。このような合成発現カセットの発現は、目的のポリペプチドと同様に、合成発現カセットの産物を含むVLPを生じる。一旦所望の粒子形成ポリペプチドのコード配列が単離されるか、または合成されると、それらは、任意の適切なベクターまたは発現用レプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターは、当業者に周知であり、そして、適切なクローニングベクターの選択は、選択事項である。一般には、Ausubelら、前出またはSambrookら、前出を参照のこと。次いで、ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な組換え発現系は、細菌、哺乳動物、バキュロウイルス/昆虫、ワクシニア、セムリキ森林ウイルスSFV、アルファウイルス例えば、シンドビス、ベネズエラウマ脳炎VEE、哺乳動物、酵母、およびXenopus発現系これらは、当業者に周知であるを包含するが、これらに限定されない。特に好ましい発現系は、哺乳動物細胞株、ワクシニア、シンドビス、昆虫および酵母系である。例えば、多数の哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そしてAmericanTypeCultureCollectionA.T.C.C.から入手可能な不死化細胞株例えば、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、293細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓BHK細胞、マウスミエローマSB20、サル腎臓細胞COS、ならびに他の細胞であるが、これらに限定されないを包含する。同様に、細菌宿主例えば、E.coli、Bacillussubtilis、およびStreptococcusspp.は、現在の発現構築物との使用を見出す。本発明において有用な酵母宿主は、とりわけ、Saccharomycescerevisiae、Candidaalbicans、Candidamaltosa、Hansenulapolymorpha、Kluyveromycesfragilis、Kluyveromyceslactis、Pichiaguillerimondii、Pichiapastoris、SchizosaccharomycespombeおよびYarrowialipolyticaを包含する。バキュロウイルス発現系と使用するための昆虫細胞は、とりわけ、Aedesaegypti、Autographacalifornica、Bombyxmori、Drosophilamelanogaster、Spodopterafrugiperda、およびTrichoplusianiを包含する。例えば、SummersおよびSmith、TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.15551987を参照のこと。真菌宿主は、例えば、Aspergillusを包含する。真核細胞における粒子の産生のために、ウイルスベクターが使用され得る例えば、ポックス科のウイルスワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含むに由来のベクター。さらに、ワクシニアベースの感染/トランスフェクション系Tomeiら、J.Virol.199367:4017-4026およびSelbyら、J.Gen.Virol.199374:1103-1113に記載もまた、本発明との使用を見出す。この系において、まず細胞に、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体をインビトロで感染させる。このポリメラーゼは、それが、T7プロモーターを保有する鋳型のみを転写するので、見事な特異性を示す。感染後、細胞を、T7プロモーターによって駆動される目的のDNAでトランスフェクトする。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されたポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いで、このRNAは、宿主翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。あるいは、T7は、前駆体Progenitor系におけるように精製タンパク質または酵素として付加され得るStudierおよびMoffatt、J.Mol.Biol.1986189:113-130。この方法は、大量のRNAおよびその翻訳産物の高レベルの一過性の細胞質産生を提供する。選択された発現系および宿主に依存して、VLPSは、粒子形成ポリペプチドが発現され、そしてVLPが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより産生される。適切な増殖条件の選択は、当業者の範囲内である。VLPが細胞内で形成される場合、この細胞は、化学的手段、物理的手段、または機械的手段を用いて破壊される。これらの手段は、細胞を溶解するが、なおVLPを実質的に無傷のままとする。このような方法は、当業者に公知であり、そして、例えば、ProteinPurificationApplications:APracticalApproach、E.L.V.HarrisおよびS.Angal,編、1990に記載されている。次いで、粒子は、それらの完全性を保持する方法例えば、密度勾配遠心分離例えば、スクロース勾配、PEG沈降、ペレット化など例えば、Kirnbaugerら、J.Virol.199367:6929-2936を参照のこと、ならびに標準的な精製方法例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含むを用いて単離されるかまたは実質的に精製される。本発明の合成発現カセットを含む細胞により産生されたVLPは、被験体に投与された場合に免疫応答を惹起するために使用され得る。本発明の1つの利点は、VLPが、以前には可能でなかったレベルで、合成発現カセットを有する哺乳動物細胞によって産生され得ることである。上述したように、VLPは、Gagポリペプチドに加えて、種々の抗原を含み得る例えば、Env、tat、Gag-プロテアーゼ、Gag-ポリメラーゼ、Gag-HCVコア。本発明の合成発現カセットを用いて産生された精製VLPは、通常ワクチン組成物の形態で、脊椎動物被験体に投与され得る。混合ワクチンもまた使用され得る。ここで、このようなワクチンは、例えば、HIVもしくは他の生物由来の他のサブユニットタンパク質例えば、envまたはこのような抗原をコードする遺伝子送達ワクチンを含有する。投与は、単独または他の抗原と共に処方されたVLPを用いて行い得る。さらに、VLPは、DNA免疫以下を参照のことの合成発現カセットの送達および/または他のワクチンの送達の前、これと同時、またはこれに続いて投与され得る。また、VLP投与部位は、投与される他のワクチン組成物と同じであっても、異なってもよい。遺伝子送達は、多数の方法によって達成され得る。このような方法には、DNA、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターでの免疫化を包含するが、これらに限定されない。VLP免疫刺激またはワクチン組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調整剤などを含み得る。免疫刺激組成物は、免疫学的応答を惹起するのに十分な量のVLP/抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって決定され得る。このような量は、慣用の試験によって決定され得る比較的広い範囲にあり、そして、一般に、抗原当たりのVLPが約0.1μg~約1000μg、より好ましくは、約1μg~約300μgの桁の量である。必要に応じて、組成物を受容する固体に有害な抗体の産生をそれ自体が誘発しない分子であるキャリアが、存在する。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物例えば、油小滴またはリポソーム、および不活性ウイルス粒子である。粒子状キャリアの例は、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来のキャリア、ならびにポリラクチドおよびポリラクチド-コ-グリコリドPLGとして公知である由来の微粒子を包含する。例えば、Jefferyら、Pharm.Res.199310:362-368;McGeeJPら、JMicroencapsul.142:197-210,1997;O’HaganDTら、Vaccine112:149-54,1993を参照のこと。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤アジュバントとして機能し得る。さらに、この抗原は、細菌トキソイド例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなど由来のトキソイド、ならびにE.coli由来の毒素と結合体化され得る。このようなアジュバントは、以下を包含するが、これらに限定されない:1アルミニウム塩明礬例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど;2水中油型乳濁液濁処方物他の特定の免疫刺激薬剤例えば、ムラミルペプチド以下を参照のことまたは細菌細胞壁成分を伴うか伴わない、例えば、以下:a5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85必要に応じて、種々の量のMTP-PE以下を参照のことを含有するが、必要ではないを含み、モデル110Y微小流体化器Microfluidics、Newton、MAのような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方されたMF59国際公開番号WO90/14837;bμ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、10スクアレン、0.4Tween80、5プルロニックブロックポリマーL121、およびthr-MDP以下を参照のことを含有するSAF、ならびにc2スクアレン、0.2Tween80、およびモノホスホリピドAMPL、トレハロースジミコレートTDM、および細胞壁骨格CWSからなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分好ましくはMPLおよびCWSDetoxTMを含むRibiTMアジュバント系RAS、RibiImmunochem、Hamilton、MT;3サポニンアジュバント例えば、StimulonTMCambridgeBioscience、Worcester、MAを使用し得るか、またはそれから粒子例えば、ISCOM免疫刺激性複合体を生成し得る;4完全フロイントアジュバントCFAおよび不完全フロイントアジュバントIFA;5サイトカイン例えば、インターロイキン例えば、IL-1、IL-2など、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、腫瘍壊死因子TNF、βケモカインMIP、1-α、1-βRantesなど;6コレラ毒素CT、百日咳毒素PT、またはE.coli熱不安定性毒素LTのような細菌ADP-リボース化毒素の無毒化変異体詳細には、LT-K6363位で野生型アミノ酸がリジンに置換されている、LT-R7272位で野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている、CT-S109109位で野生型アミノ酸がセリンに置換されている、PT-K9/G1299位で野生型アミノ酸がリジンに、そして129位で野生型アミノ酸がグリシンに置換されている例えば、WO93/13302およびWO92/19265を参照のこと;および7その組成物の効力を強化するための免疫刺激薬剤として作用する他の物質。ムラミルペプチドは、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンnor-MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンMTP-PEなどを包含するがそれらに限定されない。VLP組成物での投薬量処置は、単一投薬スケジュールまたは複数回投薬スケジュールであり得る。複数回投薬スケジュールは、ワクチン接種の主要な経過が1~10の別個の投薬であり得、続いて、他の投与が、免疫応答を維持および/または増強するために選択された次の時間間隔例えば、第二の投薬のために1~4ヶ月与えられ、そして必要であれば、数ヵ月後に続く投薬を行うスケジュールである。投薬レジメはまた、少なくとも部分的には、様式modalityの効力、用いられるワクチン送達、被験体の必要性によって決定され、そして担当医の判断に依存する。疾患の防止が望まれる場合例えば、症状、再発、疾患進行の減少、一般に、抗原保有VLPが、目的の病原体による最初の感染前に投与される。処置が望まれる場合例えば、症状または再発の減少、一般に、VLP組成物が、最初の感染に続いて投与される。2.2.2パッケージング細胞株を作出するための本発明の合成発現カセットの使用多数のウイルスベース系が、哺乳動物宿主細胞のための遺伝子導入ベクターとして使用するために開発されてきた。例えば、レトロウイルス特に、レンチウイルスベクターは、遺伝子送達系のための好都合なプラットホームを提供する。目的のコード配列例えば、遺伝子治療適用に有用な配列は、遺伝子送達ベクターに挿入され得、そして当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子においてパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてインビボまたはエキソビボで被験体の細胞に送達され得る。例えば、以下を含む多数のレトロウイルス系が記載されている:米国特許第5,219,740号;Millerら1989Biotechniques7:980;Miller,A.D.1990HumanGeneTherapy1:5;Scarpaら1991Virology180:849;Burnsら1993Proc.Natl.Acad.Sci.SA90:8033;Boris-Lawrieら1993Cur.Opin.Genet.Develop.3:102;GB2200651;EP0415731;EP0345242;WO89/02468;WO89/05349;WO89/09271;WO90/02806;WO90/07936;WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;WO93/11230;WO93/10218;WO91/02805;U.S.5,219,740;U.S.4,405,712;U.S.4,861,719;U.S.4,980,289およびU.S.4,777,127;米国特許出願第07/800,921号;ならびにVile1993CancerRes53:3860-3864;Vile1993CancerRes53:962-967;Ram1993CancerRes53:83-88;Takamiya1992JNeurosciRes33:493-503;Baba1993JNeurosurg79:729-735;Mann1983Cell33:153;Cane1984ProcNatlAcadSciUSA81;6349;ならびにMiller1990HumanGeneTherapy1。遺伝子治療適用に有用な配列は、以下を包含するが、これらに限定されない。第VIII因子cDNAそれらの誘導体および欠失を含む国際公開番号WO96/21035、WO97/03193、WO97/03194、WO97/03195、およびWO97/03191。第IX因子cDNAKurachiら1982Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6461-6464。第V因子cDNAは、pMT2-Vから得られ得るJenny1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4846,A.T.C.C受託番号DepositNo.40515。全長第V因子cDNA、またはそれらのBドメイン欠失もしくはBドメイン置換が使用され得る。第V因子のBドメイン欠失は、Marquette1995Blood86:3026およびKane1990Biochemistry29:6762によって報告されたものを包含する。抗トロンビンIIIcDNAProchownik1983J.Biol.Chem.258:8389,A.T.C.C.受託番号57224/57225。プロテインCコード化cDNAFoster1984Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4766;Beckmann1985NucleicAcidsRes.13:5233。プロトロンビンcDNAは、公開されたベクターDegen1983Biochemistry22:2087の制限酵素消化によって得られ得る。内皮細胞表面タンパク質、トロンボモジュリンは、トロンビンによるプロテインCの正常な活性化に必要な補因子である。可溶性組換え体形態は、記載されているParkinson1990J.Biol.Chem.265:12602;Jackman1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:6425;Shirai1988J.Biochem.103:281;Wen1987Biochemistry26:4350;Suzuki1987EMBOJ.6:1891,A.T.C.C.受託番号61348,61349。欠陥遺伝子の遺伝により引き起こされる多くの遺伝子疾患は、正常な遺伝子産物の産生不全を生じる。例えば、サラセミア、フェニルケトン尿症、レッシュ-ナイハン症候群、重症複合免疫不全SCID、血友病Aおよび血友病B、嚢胞性線維症、ダッチェンヌ筋ジストロフィーDuchenne’sMuscularDystrophy、遺伝性気腫inheritedemphysemaおよび家族性高コレステロール血Mulliganら1993Science260:926;Andersonら1992Science256:808;Friedmanら1989Science244:1275。遺伝子疾患は、遺伝子産物の不在を生じ得るが、内分泌障害例えば、糖尿病および下垂体低下は、遺伝子が、適切なホルモンインスリンおよびヒト成長ホルモンのそれぞれを十分なレベルで生成できないことにより引き起こされる。1つの局面では、本発明の構築物および方法を使用する遺伝子治療は、T細胞内への通常の組換え遺伝子の導入を包含し、その結果、新たなタンパク質または喪失しているタンパク質が、患者へのその導入または再導入の後に、そのT細胞によって産生される。多くの遺伝的疾患が、遺伝子治療を用いる処置に選択されており、これには、アデニンデアミナーゼ欠損、嚢胞性線維症、α1-アンチトリプシン欠損、ゴシェ症候群が挙げられる。非遺伝的疾患も同様である。詳細には、ゴシェ症候群は、酵素グルコセレブロシダーゼの欠損によって特徴付けられる遺伝的障害である。この酵素の欠損は、身体内のすべての細胞のリソソームにおけるグルコセレブロシドの蓄積を導く。概説として、Science256:7941992およびScriverら、TheMetabolicBasisofInheritedDisease、第6版、第2巻、1677頁を参照のこと。従って、グルコセレブロシダーゼを発現する遺伝子移入ベクターが、この障害の処置における使用のために構築され得る。同様に、ラクターゼをコードする遺伝子移入ベクターが、遺伝性乳糖不耐症の処置において使用され得、ADを発現する遺伝子移入ベクターが、ADA欠損の処置のために使用され得、そしてα1-アンチトリプシンをコードする遺伝子移入ベクターが、α1-アンチトリプシン欠損の処置のために使用され得る。遺伝的疾患の遺伝子治療処置の概要については、Ledley,F.D.1987J.Pediatrics110:157-174、Verma,I.1987年11月ScientificAmerican、第68-84頁、およびGeneTherapyTreatmentforaVarietyofDiseasesandDisordersと表題付けられた国際公開番号WO95/27512号を参照のこと。本発明のなおさらなる実施形態において、遺伝子移入ベクター内に組込まれ得るヌクレオチド配列としては、酵素欠損障害と関連したタンパク質例えば、嚢胞性線維症膜貫通調節因子例えば、米国特許第5,240,846号およびLarrickら1991GeneTherapyApplicationsofMolecularBiology、Elsevier、NewYorkを参照のことおよびアデノシンデアミナーゼADA米国特許第5,399,346号を参照のこと;増殖因子、または増殖因子のアゴニストもしくはアンタゴニストBandaraら1992DNAandCellBiology、11:227;p53、Rb、またはC-CAMIのような1つ以上の癌抑制遺伝子Kleinermanら1995CancerResearch55:2831;生物体の免疫系を調節する分子例えば、HLA分子Nabelら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11307;リボザイムLarssonら1996Virology219:161;ペプチド核酸Hirshmanら1996J.Invest.Med.44:347;アンチセンス分子Bordierら1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9383これは、異常なタンパク質または外来のタンパク質例えば、HIVタンパク質または広範な種々のオンコジーン例えば、p53の発現または合成をダウンレギュレートするために使用され得るHesketh、TheOncogeneFactsBook、AcademicPress、NewYork1995;HIV感染を処置するために使用される生物薬剤またはアンチセンス分子例えば、p24のインヒビターNakashimaら1994NucleicAcidsRes.22:5004;あるいは、逆転写酵素Bordier前出を参照のことが挙げられるが、これらに限定されない。治療目的の他のタンパク質が、本発明の方法を使用して、遺伝子移入ベクターによってインビボで発現され得る。例えば、組織因子抑制タンパク質TFPIの持続性インビボ発現は、敗血症およびDICを含む状態の処置のため、ならびに再灌流障害の予防の際に有用である国際公開番号WO93/24143、WO93/25230、およびWO96/06637を参照のこと。TFPIの種々の形態をコードする核酸配列が、例えば、米国特許第4,966,852号;同第5,106,833号;および同第5,466,783号に記載される様に獲得され得、そして本明細書中に記載の遺伝子移入ベクターに組込まれ得る。エリトロポイエチンEPOおよびレプチンleptinもまた、本発明の方法に従って遺伝的に改変されたT細胞からインビボで発現され得る。例えば、EPOは、種々の障害貧血を含むの遺伝子治療処置において有用であるGeneTherapyforTreatmentofAnemiaと表題付けられた国際公開番号WO95/13376を参照のこと。本発明の方法によるレプチンの持続性送達は、肥満症の処置において有用である。レプチン遺伝子および肥満症の処置におけるその使用の概要については、国際公開番号WO96/05309を参照のこと。種々の他の障害もまた、本発明の方法によって処置され得る。例えば、遺伝的に改変されたT細胞からのアポリポタンパク質Eまたはアポリポタンパク質Aの持続性インビボ全身性産生が、高脂血症の処置のために使用され得るBreslowら1994Biotechnology12:365を参照のこと。アンギオテンシンレセプターインヒビターGoodfriendら1996N.Engl.J.Med.334:1469の持続性産生が、本明細書中に記載の方法によって提供され得る。なおさらなる例として、アンギオスタチンangiostatinの長期のインビボ全身性産生は、種々の腫瘍の処置において有用であるO’Reillyら1996NatureMed.2:689を参照のこと。他の実施形態では、遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは他の免疫調節分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブなIL-2またはγ-インターフェロンをコードする核酸配列が、それぞれ、米国特許第4,738,927号および同第5,326,859号に記載のように獲得され得、一方で、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第4,853,332号に記載のように獲得され得る。mCSFの短形態および長形態をコードする核酸配列は、それぞれ、米国特許第4,847,201号および同第4,879,227号に記載のように獲得され得る。本発明の特定の局面では、サイトカインまたは免疫調節遺伝子を発現するレトロウイルスベクターが、本明細書中例えば、本発明のパッケージング細胞株を使用するおよびCompositionsandMethodsforCancerImmunotherapyと表題付けられた国際出願番号PCTUS94/02951に記載のように生成され得る。本明細書における使用のために適切な免疫調節分子の例としては、以下が挙げられる:IL-1およびIL-2Karupiahら1990J.Immunology144:290-298、Weberら1987J.Exp.Med.166:1716-1733、Gansbacherら1990J.Exp.Med.172:1217-1224、および米国特許第4,738,927号;IL-3およびIL-4Tepperら1989Cell57:503-512、Golumbekら1991Science254:713-716および米国特許第5,017,691号;IL-5およびIL-6Brakenhofら1987J.Immunol.139:4116-4121および国際公開番号WO90/06370;IL-7米国特許第4,965,195号;IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、およびIL-13CytokineBulletin、Summer1994;IL-14およびIL-15;αインターフェロンFinterら1991、Drugs42:749-765、米国特許第4,892,743号および同第4,966,843号、国際公開番号WO85/02862、Nagataら1980Nature284:316-320、Famillettiら1981MethodsinEnz.78:387-394、Twuら1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2046-2050、およびFaktorら1990Oncogene5:867-872;β-インターフェロンSeifら1991J.Virol.65:664-671;γ-インターフェロンRedfordら1991TheAmericanSocietyofHepatology20082015、Watanabeら1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9456-9460、Gansbacherら1990CancerResearch50:7820-7825、Maioら1989Can.Immunol.Immunother.30:34-42、ならびに米国特許第4,762,791号および同第4,727,138号;G-CSF米国特許第4,999,291号および同第4,810,643号;GM-CSF国際公開番号WO85/04188;腫瘍壊死因子TNFJayaramanら1990J.Immunology144:942-951;CD3Krissanenら1987Immunogenetics26:258-266;ICAM-1Altmanら1989Nature338:512-514、Simmonsら1988Nature331:624-627;ICAM-2、LFA-1、LFA-3Wallnerら1987J.Exp.Med.166:923-932;MHCクラスI分子、MHCクラスII分子、B7.1-.3、β2-マクログロブリンParnesら1981Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2253-2257;カルネキシンのようなシャペロン;ならびにMHC連結輸送体タンパク質またはそのアナログPowisら1991Nature354:528-531。免疫調節因子はまた、これらの分子に対するアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドであり得る。例えば、レセプターの可溶性形態は、しばしば、これらの型の因子に対するアンタゴニストとして挙動し得、因子自体の変異形態も同様であり得る。上記の物質をコードする核酸分子、ならびに本発明における使用のために有益な他の核酸分子は、種々の供給源例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのような寄託機関を含むまたは商業的供給源例えば、BritishBio-TechnologyLimitedCowley、OxfordEnglandから、容易に入手され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる:BBG12127アミノ酸の成熟タンパク質をコードするGM-CSF遺伝子を含む、BBG6これは、γインターフェロンをコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号39656これは、TNFコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号20663これは、α-インターフェロンをコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号31902、同31902、および同39517これは、β-インターフェロンをコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号67024これは、インターロイキン-1bをコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号39405、同39452、同39516、同39626、および同39673これは、インターロイキン-2をコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号59339、同59398、および同67326これは、インターロイキン-3をコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号57592これは、インターロイキン-4をコードする配列を含む、A.T.C.C.受託番号59394および同59395これは、インターロイキン-5をコードする配列を含む、ならびにA.T.C.C.受託番号67153これは、インターロイキン-6をコードする配列を含む。サイトカイン遺伝子または免疫調節遺伝子を含むプラスミド国際公開番号WO94/02951およびWO96/21015は、適切な制限酵素を用いて消化され得、そして標準的な分子生物学的技術例えば、Sambrookら前出またはAusubelら編CurrentProtocolsinMolecularBiology、GreenePublishingandWiley-Interscienceを参照のことを使用して、特定の目的の遺伝子を含むDNAフラグメントを遺伝子移入ベクター内に挿入し得る。長期発現に有用である例示的なホルモン、増殖因子および他のタンパク質は、例えば、欧州公開番号0437478B1Cyclodextrin-PeptideComplexesと表題に記載されている。種々のホルモンをコードする核酸配列が使用され得、これには、ヒト成長ホルモン、インスリン、カルシトニン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンFSH、黄体化ホルモンLH、ヒト絨毛性ゴナドトロピンHCG、および甲状腺刺激ホルモンTSHをコードする核酸配列が挙げられる。種々の異なる形態のIGF-1およびIGF-2増殖因子ポリペプチドもまた、当該分野において周知であり、そしてインビボでの長期発現のための遺伝子移入ベクター内に組込まれ得る。例えば、欧州特許第0123228B11993年9月19日交付のために公開され、HybridDNASynthesisofMatureInsulin-likeGrowthFactorsと表題を参照のこと。さらなる例として、異なる形態の線維芽細胞増殖因子の長期インビボ発現もまた、本発明の組成物および方法を使用してもたらされ得る。例えば、異なる線維芽細胞増殖因子の概要については、米国特許第5,464,774号、同第5,155,214号および同第4,994,559号を参照のこと。上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法例えば、その遺伝子を発現する細胞由来のcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってか、またはその遺伝子を含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することによるを使用して、入手され得る。例えば、変更された細胞性産物をコードする配列を含むプラスミドは、A.T.C.C.のような寄託機関または商業的供給業者から入手され得る。目的のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、適切な制限酵素を用いて消化され得、そして標準的な分子生物学的技術を使用して、そのヌクレオチド配列を含むDNAフラグメントが、遺伝子移入ベクター内に挿入され得る。あるいは、本発明での使用のためのcDNA配列は、標準的技術例えば、フェノール抽出、およびcDNAまたはゲノムDNAのPCRを使用して、その配列を発現するかまたは含有する細胞から獲得され得る。例えば、DNAを獲得および単離するために使用される技術の概要については、Sambrookら前出を参照のこと。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞由来のmRNAが、オリゴ-dTまたはランダムプライマーを使用して、逆転写酵素で逆転写され得る。次いで、一本鎖cDNAが、所望の配列のいずれかの側にある配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRによって増幅され得る米国特許第4,683,202号、同4,683,195号および同第4,800,159号を参照のこと。PCRTechnology;PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification、Erlich編、StocktonPress、1989もまた参照のこと。目的のヌクレオチド配列はまた、クローン化されるのではなく、DNA合成装置例えば、AppliedBiosystemsModel392DNASynthesizerABI、FosterCity、Californiaから入手可能を使用して、合成的に生成され得る。ヌクレオチド配列は、所望される産物の発現のために適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列が、標準的な方法によって調製されたオリゴヌクレオチドを重複させることから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Edge1981Nature292:756;Nambairら1984Science223:1299;Jayら1984J.Biol.Chem.259:6311を参照のこと。本発明の合成的発現カセットは、レトロウイルスベクターでの使用のためのパッケージング細胞株の構築において使用され得る。レトロウイルスの1つの型であるマウス白血病ウイルスすなわち、MLVは、遺伝子治療適用のために広範に利用されている一般的に、MannらCell33:153、1993、CaneおよびMulliganProc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:6349、1984、ならびにMillerら、HumanGene21erapy1:5-14、1990を参照のこと。レンチウイルスベクターは、代表的に、5’レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、目的の1つ以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、第2鎖DNA合成の起点、および3’レンチウイルスLTRを含み、ここでレンチウイルスベクターは、核移行エレメントを含む。核移行エレメントは、目的のコード配列の上流5’または下流3’のいずれかに位置付けられ得る。特定の実施形態では、核移行エレメントは、RREではない。1つの実施形態では、パッケージングシグナルは、伸長したextendedパッケージングシグナルである。他の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであるか、あるいは、CMVのようなプロモーターである。他の実施形態では、レンチウイルスベクターはさらに、IRESinternalribosomeentrysiteを含む。広範な種々のレンチウイルスが、本発明の状況において利用され得、これには、例えば、HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、およびSIVからなる群から選択されるレンチウイルスが挙げられる。本発明の1つの実施形態では、合成Envおよび/またはGagポリメラーゼ発現カセットが提供される。これは、プロモーターならびに合成Gagポリメラーゼをコードする配列配列番号6およびvpr、vpu、nef、またはvifのうちの少なくとも1つをコードする配列を含み、ここでこのプロモーターは、Gagポリメラーゼおよびvpr、vpu、nef、またはvifに作動可能に連結されている。本発明のなお別の局面では、本明細書中に記載される任意の発現カセットを含む宿主細胞例えば、パッケージング細胞株が提供される。例えば、1つの局面では、合成Envおよび/またはGagポリメラーゼをコードする配列、ならびに核移行エレメントを含む発現カセットを含むパッケージング細胞株が提供され、ここでプロモーターは、Envおよび/またはGagポリメラーゼをコードする配列に作動可能に連結されている。パッケージング細胞株はさらに、プロモーター、およびtat、rev、またはエンベロープをコードする配列を含み得、ここでこのプロモーターは、tat、rev、またはエンベロープをコードする配列に作動可能に連結されている。パッケージング細胞株はさらに、1つ以上の任意のnef、vif、vpu、またはvprをコードする配列を含み得る。1つの実施形態では、発現カセット例えば、合成Env、合成tatおよび/または合成Gagポリメラーゼを保有するは、安定に組み込まれる。パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入に際して、代表的に、ウイルス粒子を産生する。合成発現カセットの発現を調節するプロモーターは、誘導性であり得る。代表的に、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターの導入に際して、複製能を有するウイルスを実質的に含まないウイルス粒子を産生する。合成Envまたは、Gagポリメラーゼ遺伝子の発現を指向する発現カセット、発現のために最適化されたGagまたはEnv遺伝子の発現を指向する発現カセット例えば、Andre,S.ら、JournalofVirology722:1497-1503、1998;Haas,J.ら、CurrentBiology63:315-324、1996を含むパッケージング細胞株が提供される。レンチウイルスベクターは、パッケージング細胞株中に導入されて、ベクター粒子を産生する細胞株を生成する。上述のように、レンチウイルスベクターは、選択された遺伝子または目的の配列を保有または発現するように設計され得る。レンチウイルスベクターは、広範な種々のレンチウイルスから容易に構築され得るRNATumorViruses、第2版、ColdSpringHarborLaboratory、1985を参照のこと。レンチウイルスの代表的な例としては、HIV、HIV-1、HIV-2、FIV、およびSIVが挙げられる。このようなレンチウイルスは、患者の分離菌から、もしくは、より好ましくは、アメリカンタイプカルチャーコレクションのような寄託機関またはコレクションから入手され得るか、または、利用可能な技術を使用して、公知の供給源から単離され得るかのいずれかであり得る。レンチウイルス遺伝子送達ベクターまたは、ビヒクルの部分は、異なるウイルスに由来し得る。例えば、所定の組換えレンチウイルスベクターにおいて、LTRはHIV由来であり得、パッケージングシグナルはSIV由来であり得、そして第2鎖合成の起点は、HrV-2由来であり得る。レンチウイルスベクター構築物は、5’レンチウイルスLTR,tRNA結合部位、パッケージングシグナル、1つ以上の異種配列、第2鎖DNA合成の起点および3’LTRを含み得、ここでこのレンチウイルスベクターは、RREではない核移行エレメントを含む。簡単には、長い末端反復LTRは、U5、RおよびU3と命名された3つのエレメントに細分される。これらのエレメントは、種々のシグナルを含み、これらのシグナルは、例えば、U3内に配置される、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを含むレトロウイルスの生物学的活性に原因がある。LTRは、いずれかのゲノムの末端での正確な重複に起因して、DNA形態で組み込まれるプロウイルスで容易に同定され得る。本明細書中で利用されるように、5’LTRは、5’プロモーターエレメントおよび十分なLTR配列を含み、ベクターのDNA形態の逆転写および形成を可能にすると理解されるべきである。3’LTRは、ポリアデニル化シグナル、および十分なLTR配列を含み、、ベクターのDNA形態の逆転写および形成を可能にすると理解されるべきである。tRNA結合部位および第2鎖DNA合成の起点もまた、レトロウイルスが生物学的活性であるのに重要であり、そして当該者によって容易に同定され得る。例えば、レトロウイルスtRNAは、Watson-Crick塩基対によってtRNA結合に結合し、ウイルス部分にレトロウイルスゲノムで運搬される。次いで、tRNAは、逆転写によるDNA合成のためのプライマーとして利用される。tRNA結合部位は、5’LTR由来のまさに下流位置に基づいて容易に同定され得る。同様に、第2鎖DNA合成の起点は、その名が意味するように、レトロウイルスの第2鎖DNA合成のために重要である。ポリプリントラクトpoly-purinetractと呼ばれる領域はまた、3’LTRのまさに下流に位置している。5’LTRおよび3’LTR、tRNA結合部位、ならびに第2鎖DNA合成の起点に加えて、組換えレトロウイルスベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、および目的の1以上の遺伝子またはコード配列を含み得る。さらに、レンチウイルスのベクターは、好ましい実施形態においてRREではない核輸送エレメントを有する。適切な核輸送エレメントの代表的なエレメントは、以下が挙げられる:ラウス肉腫ウイルスのエレメントOgertら、JViroL70,3834-3843,1996、ラウス肉腫ウイルスのエレメントLiuMertz,GenesDev.,9,1766-1789,1995およびシミアンレトロウイルスタイプIのゲノム中のエレメントZolotukhinら、JVirol.68,7944-7952,1994。他の潜在的エレメントとしては、ヒストン遺伝子Kedes,Annu.Rev.Biochem.48,837-870,1970、α-インターフェロン遺伝子Nagataら、Nature287,401-408,1980、β-アドレナリン作用性レセプター遺伝子Koilkaら、Nature329,75-79,1987、およびc-Jun遺伝子Hattorieら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,9148-9152,1988のエレメントが挙げられる。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、Gag-ポリメラーゼおよびenvコード配列の両方を欠く。組換えレンチウイルスベクターは、代表的に、Gag-ポリメラーゼまたはenv遺伝子に見出される20未満,好ましくは15未満、より好ましくは10未満、そして最も好ましくは8未満の連続的ヌクレオチドを含む。本発明の1つの利点は、合成Gag-ポリメラーゼ発現カセットこの発現カセットは、組換えレトロウイルスベクター構築物のためにパッケージング細胞株を構築するために使用され得るは、野生型のGag-ポリメラーゼ配列に対してほとんど相同性を有さず、従って、合成配列と野生型配列との間の相同性組換えの可能性をかなり減少するか、または排除する。レンチウイルスベクターはまた、目的の1以上の遺伝子または配列の発現を駆動する組織特異的プロモーターを含み得る。例えば、本発明のレンチウイルスベクター粒子は、肝臓特異的プロモーターを含み得、ベクターに含まれる外因性DNA配列の肝臓特異的発現の能力を最大にし得る。好ましい肝臓特異的プロモーターとしては、B型肝炎X遺伝子プロモーターおよびB型肝炎コアタンパク質プロモーターが挙げられる。これらの肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、これらのプロモーターの個々のエンハンサーとして使用される。このエンハンサーエレメントは、目的の配列をコードする核酸の5’末端および3’末端のいずれかで連結され得る。B型肝炎X遺伝子プロモーターおよびそのエンハンサーは、332塩基対EcoRV-NcoIDNAフラグメントとしてウイルスゲノムから得られ得、これには、Twuら、JVirol.61:3448-3453,1987に記載される方法を利用する。B型肝炎コアタンパク質プロモーターは、584塩基対BamHI-BglIIDNAフラグメントとしてウイルスゲノムからえられ得、これには、Gerlachら、Virol189:59-66,1992に記載される方法を利用する。BamHI-BglIIフラグメント中の陰性の調節塩基対を除去することが、このフラグメントを挿入する前に必要であり得る。他の肝臓特異的プロモーターとしては、EP特許公開0415731に開示されるようなAFPα-胎児タンパク質遺伝子プロモーターおよびアルブミン遺伝子プロモーター、Rettengerら、Proc.Natl.Acad.Sci.91:1460-1464、1994に記載されるような-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、フィブリノーゲン遺伝子プロモーター、APO-AlApolipoproteinAl遺伝子プロモーター、ならびに例えば、SGOT、SGPTおよびグルタミルトランスフェラーゼのような肝臓転移酵素の対するプロモーター遺伝子が挙げられる。また、レンチウイルスベクター粒子中の肝臓特異的プロモーターの使用の記載について、PCT特許公開番号WO90/07936およびWO91/02805を参照のこと。レンチウイルスベクター構築物は、目的の1以上の遺伝子を発現させることで産生され得る。これは、ジシストロンカセットまたはオリゴシストロンカセット例えば、コード配列が80ヌクレオチド以下に分割される場合一般に、Levinら、Gene108:167-174、1991を参照のことの使用によってか、あるいはInternalRibosomeEntrySitesIRESの使用によって達成され得る。上記の組換えレトロウイルスベクターの構築に使用するのに適切なパッケージ細胞株は、本明細書中で提供される開示により容易に調製され得る。簡単には、パッケージング細胞株が誘導される親の細胞株は、種々の哺乳動物の細胞株から選択され得、これには、例えば、293、RD、COS-7、CHO、BHK、VERO、HT1080、および骨髄腫細胞が挙げられる。パッケージ細胞株の産生のために適切な宿主細胞の選択後、1以上の発現カッセットが、細胞株に導入され、欠失されたベクターのトランス成分を補完するかまたは、補充する。適切な発現カッセットの代表例は、本明細書中に記載され、そしてこれには、合成Env、tat、Gag、合成Gagプロテアーゼ、合成Gag逆転写酵素および合成Gagポリメラーゼ発現カセットが挙げられる。このカセットは、例えば、Env、tat、またはGagポリメラーゼおよび少なくとも1つのvpr、vpu、nefまたはvifをコードするプロモーターおよび配列を含む。ここで、このプロモーターは、Env、tat、またはGagポリメラーゼおよびvpr、vpu、nefまたはvifに作動可能に連結される。上記のように、配列をコードする最適化されたEnv、Gagおよび/またはtatはまた、パッケージング細胞株の産生での種々の組み合わせに利用され得る。上記の発現カセットを利用すると、広範に種々のパッケージ細胞株が、産生され得る。例えば、1局面において、パッケージ細胞株が提供される。この細胞株は、合成HIV例えば、Gag、Env、tat、Gagポリメラーゼ、Gag逆転写酵素またはGagプロテアーゼポリペプチド、および核輸送エレメントをコードする配列を含む発現カセットを含む。ここで、このプロモーターは、HIVポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結される。他の局面において、パッケージ細胞株が提供される。この細胞株は、Gag、tat、rev、またはエンベロープ例えば、HIVenvをコードするプロモーターおよび配列を含む。ここで、このプロモーターは、Gag、tat、rev、またはエンベロープをコードする配列に作動可能に連結される。さらなる実施形態において、パッケージング細胞株は、任意の1以上のnef、vif、vpuまたはvprをコードする配列を含み得る。例えば、パッケージング細胞株は、nef、vif、vpuまたはvpr単独のみ、nefおよびvif、nefおよびvpu、nefおよびvpr、vifおよびvpu、vifおよびvpr、vpuおよびvpr、nefvifおよびvpu、nefvifおよびvpr、nefvpuおよびvpr、vvirvpuおよびvpr、あるいは、nefvifvpuおよびvprの4つ全てを含み得る。1実施形態において、発現カセットは、安定的に組み込まれる。別の実施形態において、レンチウイルスベクターの導入の際に、パッケージング細胞株は、粒子を産生する。さらなる実施形態において、プロモーターが、誘導される。本発明の特定の好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターの導入の際に、パッケージング細胞株は、複製適格ウイルスのない粒子を産生する。最適なコード配列を含む合成カセットは、選択された細胞株にトランスフェクトされる。i代表的に、組み込まれ、安定なGag、Pol、およびEnvコード配列のコピーを運搬し、かつiiこれらのポリペプチドの受容可能なレベルを発現するトランスフェクトされた細胞が、選択される発現は、先行技術において公知の方法によって、評価され得る実施例1~4を参照のこと。VLPを産生するための細胞株の能力はまた、変化され得る実施例6、7および15。目的の配列は、上記のような適切なウイルスベクターに構築される。次いで、欠損ウイルスは、パッケージ細胞株にトランスフェクトされる。パッケージ細胞株は、ウイルス様粒子を産生するために必要なウイルス機能を提供し、目的の配列を含む欠損ウイルスゲノムをパッケージする。次いで、これらのVLPを単離し、そして例えば、遺伝子送達または遺伝子治療に使用し得る。さらに、このようなパッケージング細胞株はまた、VLPのみを産生するために使用され得、このVLPは、例えば、他の抗原またはワクチン組成物と共に投与するためのアジュバントとして使用され得る。また、パッケージング細胞株におけるポリペプチド例えば、抗原をコードする目的の選択配列の同時発現はまた、VLP中の/VLPを有する選択ポリペプチドの捕捉および/または会合を引き起こし得る。2.3DNA免疫法および遺伝子送達種々のポリペプチド抗原が、本発明の実施において使用され得る。ポリペプチド抗原は、DNA免疫構築物に関与し得、この構築物は、例えば、このポリペプチド抗原のコード配列にインフレームで融合した、本明細書中に記載される任意の合成発現カセットを含むDNA免疫化構築物に関与し得、ここでこの構築物の発現は、目的の抗原を発現するVLPを生じる。抗原は、種々のウイルス、細菌、真菌、植物、原生動物および他の寄生生物由来であり得る。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の種々のタンパク質単純ヘルペスウイルスHSV1型および2型例えば、HSV-1およびHSV-2gB、gD、gH、VP16およびVP22のタンパク質;水痘‐帯状疱疹ウイルスVZV、エプスタイン-バーウイルスEBV、ならびにCMVgBおよびgHを含むサイトメガロウイルスCMV由来の抗原、ならびに他のヒトヘルペスウイルス例えば、HHV6およびHHV7由来の抗原をふくむに対する免疫応答を刺激するための用途を見出す例えば、サイトメガロウイルスの内容物をコードするタンパク質の総説について、Cheeら、CytomegalovirusesJ.K.McDougall編、Springer-Verlag、1990125~169頁;ウイルスHSV-1コード化タンパク質の議論について、McGeochら、J.Gen.Virol.198869:1531~1574;HSV-1およびHSV-2gBおよびgDタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の議論について、米国特許第5,171,568号;EBVゲノムにおける配列をコードするタンパク質の同定について、Bearら、Nature1984310:207~211;VZVの総説について、DavisonおよびScott、J.Gen.Virol.198667:1759~1816を参照のこと。さらに、肝炎ファミリーのウイルスA型肝炎ウイルスHAV、B型肝炎ウイルスHBV、C型肝炎ウイルスHCV、D型肝炎ウイルスHDV、E型肝炎ウイルスHEVおよびG型肝炎ウイルスを含む由来の抗原に対する免疫応答がまた、本発明の構築物を使用して刺激され得る。例として、HCVゲノムは、いくつかのウイルス性タンパク質E1Eとしても公知であるおよびE2E2/NSIとしても公知であるをコードし、このHCVゲノムは、本発明を用いる用途を見出すE1およびE2を含むHCVタンパク質の議論について、Houghtonら、Hepatology199114:381~388を参照のこと。HDV由来のδ抗原もまた使用され得る例えば、δ-抗原の議論について、米国特許第5,389,528号を参照のこと。同様に、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザA型のエンベロープ糖タンパクHAおよびNAは、免疫応答を生成するために特に関心がもたれる。インフルエンザA型の多数のHAサブタイプが同定されいるKawaokaら、Virology1991179:759~767;Websterら、AntigenicvariationamongtypeAinfluenzaviruses、127~168頁、P.PaleseおよびD.W.Kingsbury編、Geneticsofinfluenzaviruses、Springer-Verlag、NewYork。本発明の実施に使用するために特に興味が持たれる他の抗原には、ヒト乳頭腫ウイルスHPV由来の抗原およびその抗原由来のポリペプチド、例えば、E6およびE7を含む1つ以上の様々な初期タンパク質;ダニ媒介脳炎ウイルス;およびHIV-1HTLV-III、LAV、ARVなどとしても公知であるを含み、これには、抗原例えば、gp120、gp41、gp160、Gagおよび種々の単離体これには、HIVIIIb、HIVSF2、HIV-1SF162、HIV-1SF170、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1US4、が挙げられるが、これらに限定されない由来のpol、多様なサブタイプ例えば、サブタイプA~GおよびO由来の他のHIV-1鎖、HIV-2鎖、ならびに多様なサブタイプ例えば、HIV-2UC1およびHIV-2UC2が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Myersら、LosAlamosDatabase,LosAlamosNationalLaboratory,LosAlamos,NewMexico;Myersら、HumanRetrovirusesandAids,1990,LosAlamos,NewMexico:LosAlamosNationalLaboratoryを参照のこと。他のウイルス由来のタンパク質はまた、特許請求される方法における用途を見出し、この他のウイルス由来のタンパク質には、以下のファミリーのメンバー由来のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない:ピコナウイルス科例えば、ピコルナウイルスなど;カリチウイルス科;トガウイルス科例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど;フラビウイルス科;コロナウイルス科;レオウイルス科;ビルナウイルス科;ラブドウイルス科例えば、狂犬病ウイルスなど;フィロウイルス科;パラミクソウイルス科例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど;オルトミクソウイルス科インフルエンザウイルスA型、B型およびC型など;ブンヤウイルス科;アレナウイルス科;レトロウイルス科、例えば、とりわけ、HTLV-I;HTLV-II;HIV-1;HIV-2;サル免疫欠損ウイルスSIV。これらおよび他のウイルスの議論については、例えば、Virology、第3版W.K.Joklik編、1988;FundamentalVirology、第2版B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編、1994;Virology、第3版、Fields、BN、DMKnipe、PMHowley編、1996、Lippincott-Ravan、Philadelphia、PAを参照のこと。特に好ましい細菌性抗原は、ジフテリア、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原状態を生じる生物由来であり、このような抗原には、以下に由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない:ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、髄膜炎菌髄膜炎菌A、B、C、YおよびWI35MenA、B,C、YおよびWI35を含む、ヘモフィルスインフルエンザB型Hib、およびヘリコバクターピロリ。寄生生物抗原の例には、マラリア、結核およびライム病を引き起こす生物由来のものが挙げられる。さらに、本明細書中に記載される方法は、様々な悪性癌を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のシステムは、問題としている癌例えば、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカーに対して特異的な特定のタンパク質に対する体液免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を高めるために使用され得る。このような腫瘍抗原には、とりわけ、任意の種々のMAGEメラノーマ関連抗原EMAGE1、2、3、4などを含むBoon,T.ScientificAmerican1993年3月:82~89;任意の種々のチロシナーゼ;MART1T細胞によって認識されるメラノーマ抗原、改変体ras;改変体p53;p97メラノーマ抗原;CEA癌胎児抗原が挙げられる。本発明の合成発現カセットを使用するDNA免疫法は、有効であることが示されている実施例8および10~12。動物を、合成発現カセットおよび野生型発現カセットの両方で免疫化した。プラスミド-DNAを用いる免疫化の結果は、この合成発現カセットは、ネイティブの発現カセットに比べて明らかに改善された免疫原性を提供することを示した。また、第2のブースト免疫化は、例えば2~8週後に2次免疫応答を誘導した。さらに、CTLアッセイの結果は、DNA免疫化による細胞傷害性T-リンパ球CTL応答の誘導に関して、合成発現カセットの増加した効力を示した。本発明は、種々の抗原に対する免疫応答を高め、それ故、多くの疾患を処置または予防するために使用され得ることは容易に明らかである。2.3.1本発明の合成発現カセットの送達上記の分子についてコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して例えば、cDNAおよび遺伝子を発現する細胞由来のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクター由来の遺伝子を誘導することによって得られ得る。これらの配列は、従来の配列決定技術によって分析され得る。さらに、所望の遺伝子が、標準的技術例えば、フェノール抽出、およびcDNAまたはゲノムDNAのPCRを使用して、これらの遺伝子を含む細胞および組織から直接単離され得る。例えば、DNAを得、単離しそして配列決定するために使用される技術の記載については、Sambrookら、前出を参照のこと。一旦、配列が分かると、目的の遺伝子がまた、クローン化されるよりむしろ合成的に産生される。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、この配列が発現する意図される宿主に適切なコドンを選択する。完全配列は、標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全コード配列を構築する。例えば、Edge,Nature1981292:756;Nambairら、Science1984223:1299;Jayら、J.Biol.Chem.1984259:6311;Stemmer,W.P.C.、1995Gene164:49~53を参照のこと。次に、所望の抗原をコードする遺伝子配列が、本発明の合成発現カセットを含むベクターに挿入され得る例えば、種々の例示的な合成発現カセットの構築について実施例1を参照のこと。抗原は、合成コード配列に挿入され、その結果この組み合わされた配列が発現する場合、それがポリペプチドおよび/または目的の抗原を含むVLPの産生を生じる。挿入は、Gagコード配列内またはコード配列のいずれかの末端5’発現されるポリペプチドのアミノ末端;または3’発現されるポリペプチドのカルボキシ末端--例えば、実施例1を参照のことでなされ得るWagner,R.ら、ArchVirol.127:117~137、1992;Wagner,R.ら、Virology200:162~175、1994;Wu,X.ら、J.Virol.696:3389~3398、1995;Wang,C-T.ら、Virology200:524~534、1994;Chazal,N.ら、Virology681:111~122、1994;Griffiths,J.C.ら、J.Virol.676:3191~3198、1993;Reicin、A.S.ら、J.Virol.692:642~650、1995。p55Gagのコード領域の50までが、ウイルス様の粒子への会合および発現効率に影響を与えることなく、欠失され得るBorsetti,A.ら、J.Virol.7211:9313~9317、1998;Gamier,L.ら、JVirol.726:4667~4677、1998;Zhang,Y.ら、JVirol.723:1782~1789,1998;Wang,C.ら、JVirol.7210:7950~7959、1998。本発明の1つの実施形態において、ハイレベルで発現する合成のp55GagMod発現カセットおよびp55GagProtMod発現カセットの免疫原性は、異なる構造のHIV抗原または非構造的HIV抗原、マルチエピトープカセット、あるいはサイトカイン配列の、p55GagMod配列の欠失領域、変異領域、または短縮型領域への挿入によって増加され得る。本発明の別の実施形態において、ハイレベルで発現する合成Env発現カセットの免疫原性は、異なる構造のHIV抗原または非構造的HIV抗原、マルチエピトープカセット、あるいはサイトカイン配列の、gp120Mod配列、gp140Mod配列またはgp160Mod配列の欠失領域への挿入によって増加され得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された、全長の改変されたEnv配列を使用することに対する、このアプローチの1つの考えられる利点は、より高い発現効率/分泌効率および/または発現産物のより高い免疫原性であり得る。このような欠失は、本発明の教示および当業者に利用可能な情報に従って作製され得る。異種ポリペプチドに融合された、全長のEnv配列、Gag配列、またはTat配列を使用することに対する、このアプローチの1つの考えられる利点は、より高い発現効率/分泌効率および/または発現産物のより高い免疫原性であり得る。配列がGagのアミノ末端に付加される場合例えば、本発明の合成p55GagMod発現カセットを使用する場合、このポリヌクレオチドは、ミリスチン部分をそのGag含有ポリペプチドに付加するためのシグナルをコードするコード配列例えば、Met-Glyをコードする配列を、5’末端に含み得る。Gag含有ポリペプチド構築物のVLPを形成する能力は、本明細書の教示に従って経験的に決定され得る。HIVポリペプチド/抗原の合成発現カセットは、対象の種においてインビボでの遺伝子の発現を可能にする、コード配列に作動可能に結合された制御エレメントを含む。例えば、哺乳動物細胞の発現のための代表的なプロモーターとしては、とりわけ、SV40初期プロモーター、CMV最初期プロモーターのようなCMVプロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターAdMLP、および単純ヘルペスウイルスプロモーターが挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような、他の非ウイルス性プロモーターもまた、哺乳動物発現のための使用を見出す。代表的に、転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた存在し、転写終止コドンに対して3’側に位置される。好ましくは、コード配列に対して5’側に位置される、転写の開始の最適化のための配列もまた存在する。転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルの例としては、Sambrookら、前出、に記載されるようなSV40由来の転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナル、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列由来の転写が挙げられる。エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを高めるために、本明細書中において使用され得る。例としては、Dijkemaら、EMBOJ.19854:761に記載されるようなSV40初期遺伝子エンハンサー、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1982b79:6777に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの長末端反復LTR由来のエンハンサー/プロモーター、ならびにBoshartら、Cell198541:521に記載されるようなヒトCMV由来のエレメント例えば、CMVイントロンA配列に含まれるエレメントが挙げられる。さらに、例えば目的の複数の抗原/エピトープ例えば、1つのウイルス単離体または1つより多いウイルス単離体由来をコードするキメラ抗原をコードする遺伝子配列を含むプラスミドが構築され得る。代表的には、抗原をコードする配列は、合成コード配列の前または後に存在し、そしてキメラ転写単位は、目的の抗原および合成Gagコード配列の両方をコードする、単一のオープンリーディングフレームを有する。あるいは、マルチシストロン性カセット例えば、二シストロン性カセットが構築され得、これは、EMCVIRESなどを用いて1つのmRNAからの複数の抗原の発現を可能にする。最後に、抗原は、1つのプラスミドまたは他のベクター上の独立したプロモーターから離れた転写物上にコードされ得る。一旦完成すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して核酸免疫などのために使用される。遺伝子送達の方法は当該分野において公知である。例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物の被験体に直接的に送達され得るか、または、代替的に、被験体由来の細胞にエキソビボで送達され、そしてこの細胞は被験体中に再移植され得る。多数のウイルスベースの系が、哺乳動物の細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のために都合の良いプラットホームを提供する。選択された配列は、当該分野において公知である技術を用いてベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスは単離され得、そしてインビボかまたはエキソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されてきた米国特許第5,219,740号;MillerおよびRosman、BioTechniques19897:980~990;Miller,A.D.、HumanGeneTherapy19901:5~14;Scarpaら、Virology1991180:849~852;Burnsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA199390:8033~8037;ならびにBoris-LawrieおよびTemin、Cur.Opin.Genet.Develop.19933:102~109。多数のアデノウイルスベクターもまた記載されてきた。宿主ゲノムに組み込むレトロウイスルと異なり、アデノウイルスは、染色体外で存続し、従って挿入変異誘発に伴う危険を最小化するHaj-AhmadおよびGraham、J.Virol.198657:267~274;Bettら、J.Virol.199367:5911~5921;Mitterederら、HumanGeneTherapy19945:717~729;Sethら、J.Virol.199468:933~940;Barrら、GeneTherapy19941:51~58;Berkner、K.L.BioTechniques19886:616~629;ならびにRichら、HumanGeneTherapy19934:461~476。さらに、種々のアデノ随伴ウイルスAAVベクター系が、遺伝子送達のために開発されてきた。AAVベクターは、当該分野において周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第5,173,414号および同第5,139,941号;国際公開番号WO92/010701992年1月23日公開およびWO93/037691993年3月4日公開;Lebkowskiら、Molec.Cell.Biol.19888:3988~3996;Vincentら、Vaccines901990ColdSpringHarborLaboratoryPress;Carter、B.J.CurrentOpinioninBiotechnology19923:533~539;Muzyczka,N.CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.1992158:97~129;Kotin,R.M.HumanGeneTherapy19945:793~801;ShellingおよびSmith、GeneTherapy19941:165~169;ならびにZhouら、J.Exp.Med.1994179:1867~1875。本発明のポリヌクレオチドを送達するために有用な別のベクター系は、Small,Jr.,P.A.ら米国特許第5,676,950号、1997年10月14日公布によって記載される、腸内にenterically投与される組換えポックスウイルスワクチンである。目的の抗原をコードする核酸分子を送達するための使用を見出す、さらなるウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルスおよび鳥類ウイルスを含む、ポックスファミリーのウイルスに由来するベクターが挙げられる。例示のために、遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体は、以下のように構築され得る。特定の合成Gag/抗原コード配列をコードするDNAが、まず適切なベクターに挿入され、その結果、このDNAは、ワクシニアプロモーターおよび隣接するワクシニアDNA配列例えば、チミジンキナーゼTKをコードする配列に隣接する。次いで、このベクターを使用して細胞をトランスフェクトし、この細胞には、同時にワクシニアに感染される。相同組換えが生じ、ワクシニアプロモーターおよび目的のコード配列をコードする遺伝子を、そのウイルスゲノムに挿入する。得られたTK組換え体は、5-ブロモデオキシウリジンの存在下で細胞を培養し、そして5-ブロモデオキシウリジンに耐性なウイルスプラークを選ぶことによって選択され得る。あるいは、禽痘ウイルス例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスはまた、遺伝子を送達するために使用され得る。哺乳動物病原体から免疫原を発現する組換え禽痘ウイルスは、非鳥類種に投与される場合に、防御免疫を付与することが公知である。禽痘ベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、禽痘属のメンバーは、感受性の鳥類種において防御的に複製されるのみであり得、従って、哺乳動物細胞において感染性でないからである。組換え禽痘ウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記のように、遺伝的組換えを使用する。例えば、WO91/12882;WO89/03429;およびWO92/03545を参照のこと。分子結合体ベクター例えば、Michaelら、J.Biol.Chem.1993268:6866-6869およびWagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA199289:6099-6103に記載されるアデノウイルスキメラベクターもまた、遺伝子送達のために使用され得る。アルファウイルス属のメンバー例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス由来のベクターであるが、これらに限定されないはまた、本発明のポリヌクレオチドを送達するためのウイルスベクターとしての使用を見出す例えば、以下の実施例14に記載されるような、合成Gag-ポリペプチドまたは合成Env-ポリペプチドをコードする発現カセット。本方法の実施のために有用な、シンドビスウイルス由来のベクターの説明については、Dubenskyら、J.Virol.199670:508-519;および国際公開番号WO95/07995およびWO96/17072;ならびにDubensky,Jr.,T.W.ら、米国特許第5,843,723号1998年12月1日発行、およびDubensky,Jr.,T.W.、米国特許第5,789,245号1998年8月4日発行を参照のこと。ワクシニアに基づく感染/トランスフェクション系は、宿主細胞において目的のコード配列例えば、合成Gag/HCV-コア発現カセットの誘導可能な一過性の発現を提供するために簡便に使用され得る。この系において、細胞は、まず、バクテリオファージT7RNAポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体を用いてインビトロで感染される。このポリメラーゼは、精巧な特異性を提示し、ここで、このポリメラーゼは、単にT7プロモーターを保有する鋳型を転写する。感染後、細胞は、T7プロモーターによって駆動される、目的のポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされる。ワクシニアウイルス組換え体由来の細胞質において発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたDNAをRNAに転写し、次いで、これは、宿主翻訳機械によってタンパク質へと翻訳される。この方法は、大量のRNAおよびその翻訳産物の、高レベルな一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Elroy-SteinおよびMoss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199087:6743-6747;Fuerstら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA198683:8122-8126を参照のこと。ワクシニアまたは禽痘ウイルス組換え体を用いる感染に対するか、または他のウイルスベクターを使用する遺伝子の送達に対する代替のアプローチとして、宿主細胞への導入後の高レベルな発現を導く増幅系が、使用され得る。詳細には、T7RNAポリメラーゼのコード領域に先行するT7RNAポリメラーゼプロモーターが、操作され得る。この鋳型由来のRNAの翻訳は、より多くの鋳型を順番に転写するT7RNAポリメラーゼを生成する。同時に、発現がT7プロモーターの制御下にあるcDNAが存在する。従って、増幅鋳型RNAの翻訳から生成されるいくつかのT7RNAポリメラーゼは、所望の遺伝子の転写を導く。いくつかのT7RNAポリメラーゼが増幅を開始するために必要であるので、T7RNAポリメラーゼは、鋳型とともに細胞へ導入されて転写反応をプライムし得る。ポリメラーゼは、タンパク質としてかまたはRNAポリメラーゼをコードするプラスミド上に導入され得る。T7合成および細胞を形質転換するためのそれらの使用のさらなる議論については、例えば、国際公開番号WO94/26911;StudierおよびMoffatt,J.Mol.Biol.1986189:113-130;DengおよびWolff,Gene1994143:245-249;Gaoら、Biochem.Biophys.Res.Commun.1994200:1201-1206;GaoおよびHuang,Nuc.AcidsRes.199321:2867-2872;Chenら、Nuc.AcidsRes.199422:2114-2120;ならびに米国特許第5,135,855号を参照のこと。目的の合成発現カセットはまた、ウイルスベクターなしで送達され得る。例えば、合成発現カセットは、被験体またはそれに由来する細胞に送達する前に、リポソームにおいてDNAまたはRNAとしてパッケージングされ得る。脂質被包は、一般に、核酸を安定に結合するかまたは捕獲entrapし、そして保持し得る、リポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する濃縮DNAの比は、変化し得るが、一般におよそ1:1mgDNA:マイクロモル脂質であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、HugおよびSleight,Biochim.Biophys.Acta.19911097:1-17;Straubingerら、MethodsofEnzymology1983、第101巻、512-527頁を参照のこと。本発明における使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性正に荷電した調製物、アニオン性負に荷電した調製物および中性の調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドDNAFelgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA198784:7413-7416;mRNAMaloneら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA198986:6077-6081;および精製された転写因子Debsら、J.Biol.Chem.1990265:10189-10192の細胞内送達を媒介することが示されている。カチオン性リポソームは、容易に利用可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイルオキシプロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウムDOTMAリポソームは、GIBCOBRL,GrandIsland,NYから商標Lipofectinの下で利用可能であるまた、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA198784:7413-7416を参照のこと。他の市販の脂質としては、DDAB/DOPEおよびDOTAP/DOPEBoerhingerが挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して容易に利用可能な材料から調製され得る。例えば、Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:4194-4198;DOTAP1,2-ビスオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンリポソームの合成の説明について、PCT公開番号WO90/11092を参照のこと。同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、AvantiPolarLipidsBirmingham,ALから容易に利用可能であるか、または、容易に利用可能な材料を使用して容易に調製され得る。このような材料としては、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEなどが挙げられる。これらの材料はまた、適切な比でDOTMAおよびDOTAP開始剤量とともに混合され得る。これらの材料を使用するリポソームを作製するための方法は、当該分野で周知である。リポソームは、多重膜小胞MLV、小さな単膜小胞SUV、または大きな単膜小胞LUVを含み得る。種々のリポソーム-核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODSOFIMMUNOLOGY1983,第101巻,512-527頁;Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:4194-4198;Papahadjopoulosら、Biochim.Biophys.Acta1975394:483;Wilsonら、Cell197917:77;DeamerおよびBangham,Biochim.Biophys.Acta1976443:629;Ostroら、Biochem.Biophys.Res.Commun.197776:836;Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA197976:3348;EnochおよびStrittmatter,Proc.Natl.Acad.Sci.USA197976:145;Fraleyら、J.Biol.Chem.1980255:10431;SzokaおよびPapahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA197875:145;ならびにSchaefer-Ridderら、Science1982215:166を参照のこと。DNAおよび/またはタンパク質抗原はまた、Papahadjopoulosら、Biochem.Biophys.Acta.1975394:483-491によって記載される調製物と類似の蝸牛殻状脂質調製物において送達され得る。米国特許第4,663,161号および同第4,871,488号もまた参照のこと。目的の合成発現カセット例えば、実施例1において記載される任意の合成発現カセットはまた、粒状のキャリアに被包され得るか、粒状のキャリアに吸着され得るか、または粒状のキャリアと会合され得る。このようなキャリアは、免疫系に対する複数コピーの選択された抗原を提示し、そして局所的なリンパ節における抗原の移動、捕獲および保持を促進する。粒子は、専門のprofession抗原提示細胞例えば、マクロファージおよび樹状細胞によって取り込まれ得るか、ならびに/または他の機構例えば、サイトカイン放出の刺激を通じて抗原提示を増強し得る。粒状のキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のキャリア、ならびにポリラクチドおよびポリラクチド-co-グリコリドPLGとして公知由来の微粒子が挙げられる。例えば、Jefferyら、Pharm.Res.199310:362-368;McGeeJPら、JMicroencapsul.142:197-210,1997;O’HaganDTら、Vaccine112:149-54,1993を参照のこと。さらに、他の粒子系およびポリマーは、目的の遺伝子のインビボまたはエキソビボ送達のために使用され得る。例えば、ポリマー例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれらの分子の結合体は、目的の核酸を移入するために有用である。同様に、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿または他の不溶性無機塩例えば、リン酸ストロンチウム、珪酸アルミニウムベントナイトおよびカオリンを含む、酸化クロム、珪酸マグネシウム、タルクなどを使用する沈殿は、本発明の方法との使用を見出す。例えば、遺伝子移入に有用な送達系の総説については、Felgner,P.L.,AdvancedDrugDeliveryReviews19905:163-187を参照のこと。ペプチドZuckerman,R.N.ら、米国特許第5,831,005号、1998年11月3日発行もまた、本発明の構築物の送達のために使用され得る。さらに、粒状のキャリア例えば、金およびタングステンを使用する微粒子銃biolistic送達系は、本発明の合成発現カセットを送達するために特に有用である。この粒子は、送達されるべき合成発現カセットを用いてコーティングされ、そして一般に減圧下で、遺伝子銃genegunからの火薬発射を使用して高速に加速され得る。このような技術の説明、およびそのために有用な装置については、例えば、米国特許第4,945,050号;同第5,036,006号;同第5,100,792号;同第5,179,022号;同第5,371,015号;および同第5,478,744号を参照のこと。また、針なし注射系が、使用され得るDavis,H.L.ら、Vaccine12:1503-1509,1994;Bioject,Inc.,Portland,OR。本発明の合成発現カセットを保有する組換えベクターは、脊椎動物被験体への送達のために組成物中に処方される。これらの組成物は、予防的感染を予防するためまたは治療的感染後の疾患を処置するためのいずれかであり得る。組成物は、治療的有効量の目的の遺伝子を含み、その結果、一定量の抗原がインビボで産生され得、その結果、免疫応答が、それが投与される個体において生成される。必要な正確な量は、処置されている被験体;処置されるべき被験体の年齢および一般的状態;被験体の免疫系が抗体を合成する能力;所望される防御の程度;処置されている状態の重症度;選択される特定の抗原および投与のその様式などの因子に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、治療的有効量は、慣用的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲に及ぶ。組成物は、一般に、1つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどを含む。さらに、補助物質例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝化物質、界面活性剤などが、このようなビヒクル中に存在し得る。免疫原性の、または核酸取り込みおよび/もしくは発現の、特定の促進剤facilitator例えば、ブピバカイン、カルジオトキシンcardiotoxinおよびスクロースであるが、これらに限定されないはまた、組成物中に含まれ得るか、あるいは同時投与され得る。一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接的に投与され得る例えば、上記のようにか、または、あるいは、上記の方法のような方法を使用して、被験体由来の細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、リポフェクトアミンおよびLT-1媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチド対応する抗原を有するか、または有さないの被包、および核へのDNAの直接的なマイクロインジェクションが挙げられ得る。インビボにおける合成発現カセット組成物の直接的な送達は、一般に、上記のように、従来のシリンジ、針なしデバイス例えば、Bioject登録商標または遺伝子銃例えば、Accell登録商標遺伝子送達システムPowderJectTechnologies,Inc.,Oxford,Englandのいずれかを使用する注射によって、ウイルスベクターを用いてかまたは用いずに達成される。構築物は、皮下に、表皮に、皮内に、筋内に、静脈内に、粘膜内に例えば、鼻に、直腸に、および膣に、腹腔内に、または経口的にのいずれかで送達され例えば、注射され得る。表皮の細胞へのDNAの送達は、この様式の投与が皮膚関連リンパ細胞への接近を提供し、そしてレシピエントにおけるDNAの一過的な存在を提供する場合に、特に好ましい。他の様式の投与としては、経口摂取および肺投与、坐剤、針なし注射、経皮的transcutaneous塗布および経皮的transdermal塗布が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数回用量スケジュールであってもよい。2.3.2本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達1つの実施形態において、T細胞、ならびに関連する細胞型抗原提示細胞例えば、マクロファージ、単球、リンパ細胞、樹状細胞、B細胞、T細胞、幹細胞、およびそれらの前駆細胞が挙げられるがこれらに限定されないは、本発明の合成発現カセットのエキソビボ送達のために使用され得る。T細胞は、当業者に公知の種々の手順によって末梢血リンパ球PBLから単離され得る。例えば、T細胞集団は、付属のaccexsory細胞およびB細胞の除去によってPBLの集団から濃縮され得る。特に、T細胞濃縮は、抗MHCクラスIIモノクローナル抗体を使用する非T細胞の除去によって達成され得る。同様に、他の抗体は、非T細胞の特定の集団を枯渇するために使用され得る。例えば、抗Ig抗体分子は、B細胞を枯渇するために使用され得、そして抗MacI抗体分子は、マクロファージを枯渇するために使用され得る。T細胞は、さらに、当業者に公知の技術によって、多くの異なる部分集団へと分割され得る。2つの主要な部分集団は、細胞表面マーカーCD4およびCD8のこれらの示差的な発現に基づいて単離され得る。例えば、上記のようなT細胞の濃縮後、CD4細胞は、CD4に特異的な抗体を使用して濃縮され得るColiganら、前出を参照のこと。抗体は、固体支持体例えば、磁気ビーズに結合され得る。逆に、CD8細胞は、CD4細胞を除去するためにCD4に特異的な抗体の使用によって濃縮され得るか、または固体支持体に結合されたCD8抗体の使用によって単離され得る。HIV-1に感染した患者由来のCD4リンパ球は、Wilsonら1995J.Infect.Dis.172:88によって記載されるように、形質導入の前または後に、エキソビボで拡大expandされ得る。T細胞の精製の後、当業者に公知の遺伝的改変の種々の方法が、本明細書中に記載されるように構築された非ウイルスに基づく遺伝子移入ベクターまたはウイルスに基づく遺伝子移入ベクターを使用して実施され得る。例えば、1つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞由来の培養物のベクター含有上清を用いる、精製されたT細胞集団の形質導入を含む。第2のアプローチは、精製されたT細胞とのベクター産生細胞の照射単層の同時培養を含む。第3のアプローチは、類似の同時培養アプローチを含む;しかし、精製されたT細胞は、種々のサイトカインとともに予め刺激され、そして照射されたベクター産生細胞との同時培養の前に48時間培養される。このような形質導入の前の予めの刺激は、有効な遺伝子移入を増大するNoltaら1992Exp.Hematol.20:1065。増殖するためのこれらの培養物の刺激はまた、患者への再注射のために、増加した細胞集団を提供する。同時培養後、T細胞は、ベクター産生細胞単層から収集され、拡大され、そして液体窒素で凍結される。本発明の1つ以上の合成発現カセットを含む、遺伝子移入ベクター単離されたT細胞に対する送達のために適切な制御エレメントと結合されるは、公知の方法を使用してアセンブルされ得る。選択マーカーはまた、遺伝子転移ベクターの構築において使用され得る。例えば、この遺伝子転移ベクターで形質導入した哺乳動物細胞に細胞傷害性薬剤に対する耐性を与えるマーカーが使用され得る。この細胞傷害性薬剤は、限定しないが、ネオマイシン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、アクチノマイシン、ネトロプシンnetropsin、ジスタマイシンdistamycinA、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得る。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIは、ネオマイシンアナログであるジェネティシンgeneticinnG418に対する耐性を与える。T細胞はまた、選択される前に、少なくとも1つの型の増殖因子を含む培地で維持され得る。種々の増殖因子が当該分野で公知であり、これらは、特定の細胞型の増殖を持続させる。このような増殖因子の例は、サイトカインマイトジェン例えば、rIL-2、IL-10、IL-12およびIL-15であり、これは、リンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の型の細胞は、ホルモンのような他の増殖因子によって刺激され、これらのホルモンとしては、ヒト絨毛性ゴナドトロピンhCGおよびヒト成長ホルモンが挙げられる。特定の細胞集団に適切な増殖因子の選択は、当業者によって容易に達成される。例えば、分化した前駆体および幹細胞のような白血球は、種々の増殖因子によって刺激される。より詳細には、活性化THによって産生されそしてマクロファージにより活性化されたIL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、GM-CSF、M-CSFおよびG-CSFは、骨髄性幹細胞を刺激し、次いで、多能性幹細胞、顆粒球-単球前駆体、好酸球前駆体、好塩基球前駆体、巨核球、および赤血球前駆体に分化する。分化は、GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-11およびEPOのような増殖因子によって調節される。次いで、多能性幹細胞は、リンパ系幹細胞、骨髄間質細胞、T細胞前駆体、B細胞前駆体、胸腺細胞、TH細胞、TC細胞およびB細胞に分化する。この分化は、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、IL-2およびIL-5のような増殖因子によって調節される。顆粒球-単球前駆体は、単球、マクロファージおよび好中球に分化する。このような分化は、増殖因子GM-CSF、M-CSFおよびIL-8によって調節される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。このプロセスは、GM-CSFおよびIL-5によって調節される。肥満細胞および好塩基球への好塩基球前駆体の分化は、GM-CSF、IL-4およびIL-9によって調節される。巨核球は、GM-CSF、EPOおよびIL-6に応答して血小板を産生する。赤血球前駆体細胞は、EPOに応答して赤血球に分化する。従って、CD3結合剤による活性化の間に、T細胞はまた、マイトジェン例えば、IL-2のようなサイトカインと接触され得る。特に好ましい実施形態において、IL-2は、約50~100μg/mlの濃度で、T細胞の集団に添加される。CD-3結合剤での活性化は、2~4日間行われ得る。一旦適切に活性化されると、T細胞は、ベクターのT細胞へのトランスフェクションを可能にする条件下でT細胞を適切な遺伝子転移ベクターと接触させることによって、遺伝的に改変される。遺伝的改変は、T細胞集団の細胞密度が、約0.1×106と5×106との間、好ましくは約0.5×106と2×106との間である場合に行われる。多数の適切なウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子転移ベクターが、本明細書中での使用のために記載されている。形質導入後、形質導入した細胞は、公知の技術を使用して、形質導入されていない細胞から選択される。例えば、形質導入に使用される遺伝子転移ベクターが、細胞傷害性薬剤に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、細胞は、適切な細胞傷害性薬剤と接触され得、それにより、形質導入されていない細胞が、形質導入された細胞から陰性に選択され得る。選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、細胞は、特定の細胞表面マーカーに特異的な結合剤と接触され得、それにより形質導入された細胞は、集団から陽性に選択され得る。この選択工程はまた、蛍光細胞分析分離装置FACS技術を伴い得、例えば、ここでFACSは、特定の表面マーカーを含む集団から細胞を選択するために使用される。またはこの選択工程は、標的細胞の捕捉および/またはバックグラウンドの除去についての回収可能な支持として磁性的に応答する粒子の使用を伴い得る。より詳細には、形質導入された細胞の陽性選択は、FACSセルソーター例えば、FACSVantageTMCELLSorter,BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose,CAを使用して行われ、選択細胞表面マーカーを発現する、形質導入された細胞を選別および収集し得る。形質導入の後に、細胞は、特定の細胞表面マーカーに対して指向される蛍光標識化抗体分子で染色される。各細胞に結合した抗体の量は、細胞を含む液滴をセルソーターに通過させることによって測定され得る。染色された細胞を含む液滴に電磁的電荷を与えることによって、形質導入された細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、陽性に選択された細胞は、滅菌収集容器に収集される。これらの細胞選別手順は、例えば、FACSVantageTMTrainingManualに、第3-11~3-28節および第10-1~10-7節に対する特定の参照とともに、詳細に記載される。形質導入された細胞の陽性選択はまた、発現または特定の細胞表面マーカーに基づく細胞の磁性分離を使用することによって行われ得る。このような分離技術において、陽性に選択される細胞は、まず、特異的結合剤例えば、細胞表面マーカーと特異的に相互作用する抗体または試薬と接触される。次いで、この細胞は、回収可能な粒子例えば、磁性的に応答する粒子と接触され、特異的結合剤陽性細胞に結合したを結合する試薬とカップリングされる。次いで、細胞結合剤-粒子複合体は、例えば、磁場を使用して、標識されていない細胞から物理的に分離され得る。磁性的に応答する粒子を使用した場合、標識された細胞は、磁場を使用して容器内に保持され得、一方、陰性細胞は取り除かれる。これらおよび類似の分離手順は、当業者に公知である。選択された形質導入された細胞におけるベクターの発現は、当業者に公知の多数のアッセイによって評価され得る。例えば、ウエスタンブロットまたはノーザン分析は、目的の挿入されたヌクレオチド配列の性質に依存して使用され得る。一旦、発現が、選択された合成発現カセットの存在について試験されると、それらは、末梢血流を介して患者に注入するために準備される。本発明は、原発性哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝的改変のためのキットを含む。キットは、代表的には、1つ以上の容器に含まれる少なくとも1つの選択マーカーをコードする遺伝子転移ベクターおよび少なくとも1つの合成発現カセット、補助的な試薬またはハードウェア、ならびにキットの使用のための説明書を含む。実施例以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は、例示の目的のためにのみ提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限することは意図されない。使用される数例えば、量、温度などに対する正確さを確実にするための試みがなされているが、いくつかの実験誤差および偏差は、もちろん可能であるべきである。実施例1:合成GagおよびEnv発現カセットの生成A.HIV-1Gag、Gag-プロテアーゼ、Gag-逆転写酵素およびGag-ポリメラーゼ核酸コード配列の改変Gag配列番号1、Gag-プロテアーゼ配列番号2、Gag-ポリメラーゼ配列番号3、およびGag-逆転写酵素配列番号77コード配列を、HIV-1SF2株Sanchez-Pescador,R.ら、Science2274686;484-492,1985;Luciw,P.A.ら、米国特許第5,156,949号1992年10月20日発行;Luciw,P.A.ら、米国特許第5,688,688号1997年11月18日から選択した。これらの配列を操作して、それらの遺伝子産物の発現を最大にした。第1に、HIV-1コドン使用頻度パターンを、得られた核酸コード配列が高度に発現されるヒト遺伝子に見出されるコドン使用頻度に適合するように、改変した。このHIVコドン使用頻度は、コドントリプレットのヌクレオチドAまたはTの高い含有量を反映する。HIV-1コドン使用頻度の効果は、RNAにおける高いAU含量をもたらすDNA配列における高いAT含量およびmRNAの減少した翻訳能力および翻訳不能力である。比較において、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドGまたはCを好む。Gagコード配列を、高度に発現されたヒト遺伝子において見出されるコドン使用頻度に適合可能であるように改変した。図11は、不安定なRNAに対する安定なcDNAについてのA-T含量のパーセントの比較を示す比較ウインドウサイズ=50。ヒトIFNγmRNAは、以下のことが知られている:i不安定であること、ii短い半減期を有すること、およびiii高いA-U含量を有すること。ヒトGAPDHグリセルアルデヒド-3リン酸デヒドロゲナーゼmRNAは、i安定なRNAであること、およびii低いA-U含量を有すること、が知られている。図11において、これらの2つの配列のA-T含量のパーセントを、ネイティブのHIV-1SF2GagcDNAのA-T含量のパーセントおよび本発明の合成GagcDNA配列に対して比較する。図の上部の2つのパネルは、IFNγおよびネイティブのGagについての配列の長さにわたって、A-T含量のパーセントを示す。図の下部の2つのパネルは、GAPDHおよび合成Gagについての配列の長さにわたってA-T含量のパーセントを示す。本発明の支持において行われる実験は、合成Gag配列が、ネイティブのGag配列よりも高いレベルのタンパク質を産生し得た実施例を参照のことことを示した。図11におけるデータは、この増加した産生の1つの理由が、ネイティブのGagコード配列に対応するmRNAに対して合成Gagコード配列に対応するmRNAの増加した安定性であり得ることを示唆する。第2に、Gagのコード配列およびGag-プロテアーゼコード配列内に位置する阻害性または不安定性エレメントINSが存在するSchneiderR.ら、J.Virol.717:4892-4903,1997。RREは、二次RNA構造であり、これは、HIVにコードされるRevタンパク質と相互作用して、INSの発現ダウンレギュレーション効果を克服する。RREおよびRevの転写後活性化機構についての要件を克服するために、そしてGagポリペプチドの非依存性発現を増強するために、INSを、コードされるタンパク質のリーディングフレームを変更しない複数の点変異を導入することによって不活化した。図1は、本来のSF2配列、INS配列の位置、およびINS配列がそれらの効果を減少するような改変を示す。Gag-プロテアーゼ配列野生型、配列番号2;合成、配列番号5、78および79について、コドン使用頻度における変化は、-1のフレームシフトまでの領域に制限され、そしてGagリーディングフレームの末端で再び開始した図2;図2の小文字で示される領域は、未改変領域である。さらに、Gag-プロテアーゼポリペプチドコード配列のコード配列内に位置する阻害性または不安定性エレメントINSも同様に変化させた図2に示した。合成コード配列を、MidlandCertifiedReagentCompanyMidland,Texasによって構築した。Gag-ポリメラーゼ配列野生型、配列番号3;合成、配列番号6およびGag-逆転写酵素配列配列番号80~84の改変は、フレームシフト領域を保存するためにGag-プロテアーゼについて記載されたのと類似の改変を含む。不活化部位の位置およびこの不活化部位を変更するための配列に対する変化を、ネイティブのHIV-1SF2Gagポリメラーゼ配列について図12に示す。本発明の1実施形態において、Gag-ポリメラーゼ配列の全長ポリメラーゼコード領域は、合成の最適化されたGag発現カセットによって発現されるウイルス様粒子についてのエピトープの数を増加させるために、合成Gag配列内に含まれる。合成HIV-1Gag-ポリメラーゼは、潜在的に有害な機能的酵素である逆転写酵素RTおよびインテグラーゼINTを構造タンパク質およびプロテアーゼに加えて発現するので、RTおよびINTの機能を不活化するのに重要である。RTおよびINTのリーディングフレームにおけるいくらかのインフレームでの欠失が、それらのRTおよびINTの活性に関して触媒非機能性酵素を達成するために生成され得る。さらに、選択されたB細胞エピトープおよび/またはT細胞エピトープが、RTコード配列およびINTコード配列の欠失内のGag-ポリメラーゼ構築物に付加されて、RTおよびINTの機能的改変によって欠失された任意のエピトープを置換しそして増強し得る。あるいは、RTおよびINTから選択されたB細胞エピトープおよびT細胞エピトープCTLエピトープを含むは、合成Gagまたは合成GagProtカセット上記の発現によって形成される最小VLPに含まれ得る。公知のHIVB細胞エピトープおよびHIVT細胞エピトープの説明については、HIVMolecularImmunologyDatabaseCTLSearchInterface;LosAlamosSequenceCompendia,1987-1997;インターネットアドレス:http://hiv-web.lanl.gov/immunology/index.html.を参照のこと。得られた改変コード配列を、合成Gag発現カセット配列番号4、合成Gag-プロテアーゼ発現カセット配列番号5、78および79、および合成Gag-ポリメラーゼ発現カセット配列番号6として示す。逆転写酵素領域におけるコドンの改変を含む合成発現カセットを、配列番号80~84に示す。選択された配列の整列を、図7に示す。共通領域Gag-共通;配列番号9は、1位から1262位に及ぶ。GagおよびGag-プロテアーゼについての合成DNAフラグメントを、以下の発現ベクターにクローニングした:一過性発現アッセイおよびDNA免疫研究についてはpCMVKm2pCMVKm2ベクターは、pCMV6aChapmanら、Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986に由来し、そしてカナマイシン選択マーカー、ColE1複製起点、CMVプロモーターエンハンサーおよびイントロンA、続いてウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化シグナルに続いて以下に記載される合成配列についての挿入部位を含む--pCMVKm2ベクターは、ポリリンカー部位が、pCMV結合図14、1646~1697位のポリリンカーを生成するためにpCMVKm2に挿入された点でpCMV-結合ベクターとは異なる;チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞における発現については、pESN2dhfr図13AおよびpCMVPLEdhfr図13Bに示されるように、pCMVIIIとしてもまた公知;ならびにバキュロウイルス発現系における使用のためのシャトルベクターであるpAcC13pAcC13は、MunemitsuS.ら、MolCellBiol.1011:5977-5982、1990によって記載されるpAcC12に由来した。ベクターpCMV結合についての制限地図を、図14に示す。この図において、CMVプロモーターCMVIEENH/PRO、ウシ成長ホルモンターミネーターBGHpA、カナマイシン選択マーカーkan、およびColE1複製起点ColE1oriを示す。ポリクローニング部位もまた、この図において、CMVプロモーター配列の下に示す。ベクターpESN2dhfrについての制限地図を、図13Aに示す。この図において、CMVプロモーターpCMVhCMVIE、ウシ成長ホルモンターミネーターBGHpA、SV40複製起点SV40ori、ネオマイシン選択マーカーNeo、SV40ポリASV40pA、アデノウイルス2後期プロモーターAd2VLP、およびマウスdhfr遺伝子mughfrを示す。ポリクローニング部位もまた、この図において、CMVプロモーター配列の下に示す。簡単には、pCMVPLEdhfrpCMVIIIの構築は、以下のようであった。DHFRカセットを構築するために、EMCVIRESリボソーム内部の進入部位リーダーを、pCite-4aNovagen,Inc.,Milwaukee,WIよりPCR増幅し、そしてpET-23dNovagen,Inc.,Milwaukee,WIにXba-Ncoフラグメントとして挿入して、pET-EMCVを得た。dhfr遺伝子を、pESN2dhfrからPCR増幅して、翻訳停止コドンの代わりにGly-Gly-Gly-Serスペーサーを有する産物を得、そしてNco-BamHIフラグメントとして挿入して、pET-E-DHFRを得た。次に、弱毒化したneo遺伝子をpSV2NeoClontech,PaloAlto,CA誘導体からPCR増幅し、そしてpET-E-DHFRの唯一のBamHI部位に挿入して、pET-E-DHFR/Neoを得た。次いで、pCDNA3Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CAからのウシ成長ホルモンターミネーターを、neo遺伝子の下流に挿入して、pET-E-DHFR/NeoBGHtを得た。EMCV-dhfr/neo選択マーカーカセットフラグメントをpET-E-DHFR/NeoBGHtの開裂によって調製した。CMVエンハンサー/プロモーターおよびイントロンAをHindIII-SalIフラグメントとしてpCMV6aChapmanら、Nuc.AcidsRes.199119:3979-3986からpUC19NewEnglandBiolabs,Inc.,Beverly,MAに移した。pUC19のベクター骨格をNdeIからSapI部位まで欠失させた。上記のDHFRカセットを構築物に付加し、その結果、EMCVIRESをCMVプロモーターに続けて配置して、最終構築物を産生した。ベクターはまた、ampr遺伝子およびSV40の複製起点を含んだ。合成発現カセットを含む選択されたpCMVKm2ベクターを以下のように設計した:pCMVKm2.GagMod.SF2、pCMVKm2.GagprotMod.SF2およびpCMVKm2.GagpolMod.SF2、pCMVKm2.GagprotMod.SF2.GP1配列番号78およびpCMVKm2.GagprotMod.SF2.GP2配列番号79。他の例示的なGagコード発現カセットを、図において、および配列表として示す。B.合成発現カセットのHIV-1Gag/C型肝炎コアキメラタンパク質核酸コード配列の産生の改変GagおよびHCVコアコード配列の連結を促進するために、PCR増幅を使用した。合成p55Gag発現カセットを以下のプライマーとともにPCRの鋳型として使用した:GAG5配列番号11およびP55-SAL3配列番号12。PCR増幅をStratageneのPfuポリメラーゼを用いて、55°Cで25サイクル行った。得られたPCR産物を、PromegaPCRクリーンナップキットを使用して、ヌクレオチドおよびプライマーを含まないようにし、次いでEcoRIおよびSalIの消化に供した。HCVコアコード配列に対して、上に概要を示した条件を用いて、以下のプライマーをHCV鋳型とともに使用したHoughton,M.ら、米国特許第5,714,596号、1998年2月3日発行;Houghton,M.ら、米国特許第5,712,088号、1998年1月27日発行;Houghton,M.ら、米国特許第5,683,864号、1997年11月4日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,728,520号、1998年3月17日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,766,845号、1998年6月16日発行;Weiner,A.J.ら、米国特許第5,670,152号、1997年9月23日発行:CORESAL5配列番号13および173CORE配列番号14。精製産物を、SalI制限酵素およびBamHI制限酵素を用いて消化した。消化されたGagおよびHCVコアPCR産物を、EcoRIおよびBamHIを用いて消化したpCMVKm2ベクターに連結した。SalI部位でのPCR産物の連結は、p55Gagの最終アミノ酸の、HCVコアの第2のアミノ酸、セリンへの直接の融合を生じた。コアのアミノ酸173はセリンであり、そしてTAG終末コドンが直ぐに続く。融合クローンの配列を確認した。合成発現カセットを含むpCMVKm2ベクターを、pCMVKm2.GagModHCVコアとして消化した。p55Gag-コア173のEcoRI-BamHIフラグメントをまた、バキュロウイルスの発現のためにEcoRI-BamHIで消化したpAcC13中にクローン化した。ウエスタンブロットにより発現を確認し、そしてショ糖勾配沈降、加えて電子顕微鏡検査を用いて粒子の形成を確認した。野生型の代わりに合成Gag配列を含むことを除いて上記のクローンを産生するために、以下の工程を行った:pCMVKm2改変p55Gagを、MS65配列番号15プライマーおよびMS66配列番号16プライマーとともにPCR増幅のための鋳型として使用した。増幅された領域は、合成Gag配列のC末端のBspHIおよびSalI部位に対応する。増幅産物を、BspHIおよびSalIを用いて消化し、そしてSalI/BamHIで消化されたpCMV連結、加えてpCMV-Km-p55modGagからのSal/BspHIフラグメント改変Gagのアミノ末端終点を表すおよびpCMV-p55Gag-コア173からのSalI/BamHIフラグメントに連結した。その後、T4平滑末端化SalI部分/BamHIフラグメントを、pAcC4-SmaI/BamHIに連結し、pAcC4-P55GagMod-コア173を産生した配列番号7に示される合成配列を含む。C.HIV-1p55Gagの主要な相同性領域MHRの定義HIV-1p55Gagの主要な相同性領域MHRは、Gagのp24-CA配列中に位置する。それは、20アミノ酸の保存されたストレッチ配列番号19である。野生型HIV-1SF2Gagタンパク質における位置は、アミノ酸286~305であり、そしてネイティブなHIV-1SF2GagDNA配列におけるヌクレオチド856~915の領域にかかる。合成Gagタンパク質における位置は、アミノ酸288~307であり、そして合成GagDNA配列についてはヌクレオチド862~921の領域にかかる。合成GagMod.SF2におけるMHRについてのヌクレオチド配列を、配列番号20として示す。MHRのアミノ酸配列における変異または欠損は、粒子産生を激しく障害し得るBorsetti,A.ら、J.Virol.7211:9313-9317、1998;Mammano,F.ら、J.Virol.6884927-4936、1994。MHRヌクレオチド配列に対する同一性のパーセントは、例えばMacDNAsisプログラムHitachiSoftwareEngineeringAmericaLimited、SouthSanFrancisco、CA、以下の例示的なパラメータを用いるHigginsアルゴリズムを使用して決定され得る:gappenalty=5,no.oftopdiagonals=5,fixedgappenalty=5,k-tuple=2,windowsize=5,およびfloatinggappenalty=10。D.合成Env発現カセットの産生本発明のEnvコード配列としては、以下のHIVコードポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定はされない:gp160、gp140およびgp120例えば、HIV-1SF2SF2のEnvポリペプチドを記載する米国特許第5,792,459号を参照のこと。これらのポリペプチド間の関係を図15に概要的に示す:図面において、ポリペプチドを直線として示し、アミノ末端およびカルボキシ末端をgp160の線上に示す;白抜きの丸は、オリゴマー形成ドメインを表す;白抜きの四角は、膜貫通架橋ドメインTMを表す;そしてCは、開裂部位の位置を表し、gp140.mutにおいてXは、開裂部位が変異し、もはや開裂部位として機能しないことを示す。ポリペプチドgp160は、gp120およびgp41についてのコード配列を含む。ポリペプチドgp41は、オリゴマー形成ドメインODおよび膜貫通架橋ドメインTMを含むいくつかのドメインから構成される。ネイティブなEnvにおいて、オリゴマー形成ドメインは、3つのgp41ポリペプチドが三量体構造を形成するための非共有結合性の会合のために必要とされる:gp41三量体およびそれ自体との非供給結合性の相互作用を介して、gp120ポリペプチドはまた、三量体構造に組織化される。開裂部位単数または複数は、およそgp120についてのポリペプチド配列とgp41に対応するポリペプチド配列との間に存在する。この開裂部位は、この部位での開裂を妨げるために変異され得る。得られるgp140ポリペプチドは、gp41の膜貫通架橋ドメインが欠損しているgp160の短縮された形態に対応する。このgp140ポリペプチドは、gp41部分中のオリゴマー形成ドメインの存在のおかげで単量体およびオリゴマーすなわち、三量体の形態の両方で存在し得る。開裂部位が開裂を妨げるために変異され、そしてgp41の膜貫通部分が欠失した状況において、得られるポリペプチド産物は、変異されたgp140例えば、gp140.mutを示す。当業者に明らかなように、改変部位は、種々の方法で変異され得る。SF162開裂部位におけるネイティブなアミノ酸配列は:APTKAKRRVVQREKR配列番号21であり、ここでKAKRR配列番号22は、第2部位と名づけられ、そしてREKR配列番号23は、第1部位である。例示的な変異としては、以下の構築物が挙げられる:開裂部位領域においてアミノ酸配列APTKAISSVVQSEKS配列番号24をコードするgp140.mut7.modSF162;開裂部位領域においてアミノ酸配列APTIAISSVVQSEKS配列番号25をコードするgp140.mut8.modSF162およびアミノ酸配列APTKAKRRVVQREKS配列番号26をコードするgp140mut.modSF162。変異は、下線で印される。US4開裂部位におけるネイティブなアミノ酸配列は:APTQAKRRVVQREKR配列番号27であり、ここでQAKRR配列番号28は、第2部位と名づけられ、そしてREKR配列番号23第1部位である。例示的な変異としては、以下の構築物が挙げられる:開裂部位領域においてアミノ酸配列APTQAKRRVVQREKS配列番号29をコードするgp140.mut7.US4。変異は、下線で印される。E.HIV-1Envエンベロープ核酸コード配列の改変本発明の1つの実施形態において、野生型Envコード配列を、HIV-1SF162SF162株より選択したCheng-Mayer1989PNASUSA86:8575-8579。これらのSF162配列は、以下のようであった:gp120、配列番号30図16;gp140、配列番号31図17;およびgp160、配列番号32図18。本発明の別の実施形態において、野生型Envコード配列を、HIV-US4株より選択したMascolaら、1994J.Infect.Dis.169:48-54。これらのUS4配列は、以下のようであった:gp120、配列番号51図38;gp140、配列番号52図39;およびgp160、配列番号53図40。これらのEnvコード配列を、これらの遺伝子産物の発現を最大化するために操作した。第1に、野生型コード配列領域は、1つ以上の以下の方法で改変した。1つの実施形態において、Envの超可変領域特にV1および/またはV2をコードする配列を欠失させる。他の実施形態において、変異をオリゴマーgp140のgp120モノマーへの酵素学的開裂をなくすためにEnv中の開裂部位をコードする配列に導入した。例えば、Earlら、1990PNASUSA87:648-652;Earlら、1991J.Virol.65:31-41を参照のこと。さらにまた別の実施形態において、超可変領域を欠失して、N-グリコシル化部位を除去し、そして/あるいは改変部位を変異した。第2に、HIV-1のコドンの使用パターンを改変し、その結果、得られた核酸コード配列は、高度に発現されたヒト遺伝子に見い出されるコドンの使用に適合した。HIVコドンの使用は、コドントリプレット中の高含量のヌクレオチドAまたはTを反映する。HIV-1のコドンの使用の効果は、減少した翻訳能力およびmRNAの不安定性を生じるDNA配列中の高AT含量である。比較すると、高度に発現されたヒトコドンは、ヌクレオチドGまたはCを好む。Envコード配列を、高度に発現されたヒト遺伝子において見い出されるコドンの使用に適合するように改変した。図22A~22Hは、安定なRNA対不安定なRNAのcDNAについてのA-T含量のパーセントの比較を示すcomparisonwindowsize=50。ヒトIFNγmRNAは、i不安定であり、ii短い半減期を有し、そしてiii高A-U含量を有することが知られている。ヒトGAPDHグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼmRNAは、i安定なRNAであり、そしてi低A-U含量を有することが知られている。図22A~Hにおいて、これら2つの配列のA-T含量のパーセントは、1ネイティブなHIV-1US4Envgp160cDNA、本発明の合成US4Envgp160cDNA配列すなわち、改変されたコドンを有する;および2ネイティブなHIV-1SF162Envgp160cDNA、本発明の合成SF162Envgp160cDNA配列すなわち、改変されたコドンを有するのA-T含量のパーセントと比較される。図22A~Hは、IFNγ図22Cおよび22G;ネイティブなgp160EnvUS4およびSF162それぞれ、図22Aおよび図22E;GAPDH図22Dおよび22H;およびUS4およびSF162に対する合成gp160Env図22Bおよび22Fに対する配列の長さにわたるA-T含量のパーセントを示す。本発明を支持して行われた実験は、合成Env配列が、ネイティブなEnv配列よりも高レベルのタンパク質の産生が可能であることを示した実施例を参照のこと。図22A~Hにおけるデータは、この上昇した産生に対する1つの理由が、mRNA合成Envコード配列に対応する対mRNAネイティブなEnvコード配列に対応するの安定性の増加であることを示唆する。本発明の合成コード配列を作製するために、遺伝子カセットを、目的の全体のコード配列を含むように設計した。合成遺伝子カセットを、遺伝子フラグメントを産生するためにオリゴヌクレオチド合成およびPCR増幅によって構築した。プライマーを、サブクローニングのための便利な制限部位を提供するために選択した。次いで得られたフラグメントを、全体の所望の配列を作製するために連結し、次にそれを適切なベクターにクローン化した。最終の合成配列をi制限エンドヌクレアーゼ消化および分析によってスクリーニングし、ii所望の配列が得られたことを確認するためにDNA配列決定に供し、そしてiii発現タンパク質の同一性および完全性を、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって確認した実施例を参考のこと。合成コード配列をChironCorp.においてか、またはMidlandCertifiedReagentCompanyMidland,Texasによって構築した。例示的な改変されたコード配列が、表1Aおよび1Bに、合成Env発現カセットとして表される。以下の発現カセットは、i固有の末端EcoRIおよびXbaIクローニング部位を有し;ii最適な翻訳を促進するためにKozak配列を含み;iiitPAシグナル配列細胞膜に対してENVポリペプチドに方向付けするため、例えば、Chapmanら、infraを参照のこと;iv哺乳類の細胞における発現のために最適なオープンリーディングフレーム;および翻訳停止シグナルコドンを含む。上の表に示された配列のアラインメントは、図66Aおよび図66Bに示される。共通領域Evn-共通は、野生型US4配列に対して、ヌクレオチド位置1186~ヌクレオチド位置1329配列番号69、図56、および野生型SF162配列に対して、ヌクレオチド位置1117~位置1260配列番号79、図57に伸長する。これらの領域に対応する本発明の合成配列は、合成EvnUS4共通領域に対して配列番号71図58として、および合成EnvSF162共通領域に対して配列番号72図59として表される。この配列に対するパーセント同一性が、例えば、Smith-Waterman検索アルゴリズムTimeLogic,InclineVillage,NVを使用して決定され得、このアルゴリズムは、以下の例示的なパラメータを有する;重量マトリックスweightmatrix=nuc4x4hb;ギャップオープニングペナルティgapopeningpenalty=20、ギャップ伸長ペナルティgapextensionpenalty=5、レポーティング閾値reportingthreshold=1;アラインメント閾値alignmentthreshold=20。本発明の異なる実施形態の種々の形態例えば、構築物が、組合せられ得る。F.本発明の合成Env発現カセットのクローニングEnvポリペプチドをコードする合成DNAフラグメントが、典型的に、Gag例えば、pCMVKm2/pCMVlink図4、pCMV6a、pESN2dhfr図13A、pCMVIII図13B;あるいは、pCMV-PL-E-dhfr/neoベクターとして表されるについて、上記の真核生物の発現ベクターにクローニングされた。本発明の合成発現カセットを含むpCMVlinkベクターについての例示的な命名は、以下の通りである:G.合成tat発現カセットの産生Tatコード配列はまた、本明細書の教示に従って改変された。変異体SF162由来のtatをコードする野生型ヌクレオチド配列は、図76配列番号85に示される。対応する野生型アミノ酸配列は、図77配列番号86に示される。図81配列番号89は、tatタンパク質のアミノ末端をコードするヌクレオチド配列を示し、そしてシステイン-22をコードするコドンに下線が引かれている。合成tatポリペプチドをコードする他の例示的な構築物が、図78および79に示される配列番号87および88。1つの実施形態配列番号88において、位置22のシステイン残基は、グリシンによって置き換えられている。Caputoら、1996GeneTherapy3:235は、この変異が、Tatのトランス活性化ドメインに影響することを示した。本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態が、組合わせられ得る。H.ベクターの寄託以下に示され、本明細書中に記載される選択された例示的な構築物は、ChironCorporationEmeryville,CA,94662-8097で寄託され、そしてAmericanTypeCultureCollection、10801UniversityBoulevard,Manassas、VA20110-2209に1999年12月27日に送られた。実施例2合成Gag、EnvおよびTatコード配列についての発現アッセイA.GagおよびGagプロテアーゼコード配列HIV-1SF2野生型Gag配列配列番号1およびGagプロテアーゼ配列配列番号2を、合成Gag配列配列番号4およびGagプロテアーゼ配列配列番号5、78または79をクローン化したベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローン化した。HIV-1SF2野生型Gag配列および合成Gag配列を保持する種々のベクターについての発現効率を以下のように評価した。いくつかの哺乳動物細胞株由来の細胞293、RD、COS-7、およびCHO;すべて、AmericanTypeCultureCollection、10801UniversityBoulevard、Manassas、VA20110-2209から得たを、トランスフェクション試薬LT1PanVeraCorporation、545ScienceDr.、Madison、WI中の2μgのDNAを用いてトランスフェクトした。この細胞を、還元型reduced血清培地Opti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD中で5時間インキュベートした。次いで、この培地を以下のような正常normal培地で置き換えた:293細胞、IMDM、10ウシ胎仔血清、2グルタミンBioWhittaker、Walkersville、MD;RDおよびCOS-7細胞、D-MEM、10ウシ胎仔血清、2グルタミンOpti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD;およびCHO細胞、Ham’sF-12、10ウシ胎仔血清、2グルタミンOpti-MEM、Gibco-BRL、Gaithersburg、MD。細胞を48時間または60時間のいずれかでインキュベートした。上清を収穫し、0.45μmのシリンジフィルターを通して濾過し、必要に応じて-20°Cで保存した。上清を、HIVコア抗原に対して指向されたマウスモノクローナル抗体でコーティングされた96ウェルプレートを使用して、Coulterp24アッセイCoulterCorporation、Hialeah、Fl、USを用いて評価した。HIV-1p24抗原は、コーティングされたウェルに結合する。HIVに対するビオチニル化抗体は、結合p24抗原を認識する。結合ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼは、ビオチンと反応する。ペルオキシダーゼとTMB基質との反応から色が現れる。この反応は、4NH2SO4の添加によって終結する。色の強度は、サンプル中のHIVp24抗原の量に正比例する。これらの発現アッセイの結果は、表2Aおよび2Bに提示される。表2Aおよび2Bは、配列番号5の合成Gagプロテアーゼ発現カセットを使用して得られたデータを示す。同様な結果を、配列番号78および79のGagプロテアーゼ発現カセットを使用して得た。これらのデータは、合成GagおよびGagプロテアーゼ発現カセットが、種々の細胞株で発現された場合、ネイティブなHIV-1SF2野生型配列に対して、それらのタンパク質産物の産生において劇的な増加を提供したことを示した。B.Envコード配列HIV-SF162SF162野生型Env配列配列番号1~3およびHIV-US4US4野生型Env配列配列番号22~24を、合成Env配列がクローン化されるベクターと同じ特徴を有する発現ベクターにクローン化した。SF162およびUS4野生型配列および合成Env配列を保持する種々のベクターについての発現効率を、細胞溶解物が40μL溶解緩衝液1.0NP40、0.1MTrispH7.5中で調製し、-20°Cで凍結させ、そして捕獲ELISAを以下のように実施した。捕獲ELISAについて、硫酸アンモニウムIgG切断の、gp120SF2/env2-3に対するヤギポリクローナル抗体の250ngを使用して、96ウェルプレートCorning、Cornig、NYの各ウェルをコーティングした。gp120/SF2タンパク質MID167の連続希釈物を使用して、トランスフェクション上清および溶解物由来のUS4またはSF162gp120タンパク質の発現を計算する定量曲線を設定した。サンプルを未希釈で、および必要に応じて連続的に2倍希釈でスクリーニングした。HIV-1gp120/SF2に対するヒトポリクローナル抗体を使用して、結合gp120エンベロープタンパク質を検出し、続いて西洋わさびペルオキシダーゼHRP標識ヤギ抗ヒトIgG結合体を検出した。基質としてTMBPierce、Rockford、ILを使用し、そして反応を4NH2SO4の添加によって終結させた。この反応を、450nmでの光学濃度ODを測定することによって定量した。色の強度は、サンプル中のHIVgp120抗原の量に正比例した。精製されたSF2gp120タンパク質を希釈し、そして標準として使用した。一過性発現アッセイの結果を、表3および4に提示する。表3は、目的のEnvカセットを保持するpCMVKm2ベクターを用いてトランスフェクトされた293細胞中での一過性発現を示す。表4は、目的のEnvカセットを保持するpCMVKm2ベクターを用いてトランスフェクトされたRD細胞中で一過性発現を示す。これらのデータは、合成Envおよび発現カセットが、種々の細胞株で発現された場合、ネイティブなHIV-1SF2野生型またはUS4野生型配列に対して、それらのタンパク質産物の産生において有意な増加を提供したことを示した。C.CHO細胞株Env発現データチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞を、製造業者の指示に従って、MirusTransIT-LT1ポリアミントランスフェクション試薬PanVeraを使用して、合成HIV-1gp120またはgp140のタンパク質をコードするプラスミドDNA例えば、pESN2dhfrまたはpCMVIIIベクター骨格を用いてトランスフェクトし、96時間インキュベートした。96時間後、培地を選択培地250μg/mlG418を用いた特別なF12に代え、そして細胞を1:5に分割し、さらに48時間インキュベートした。培地を、コロニーが形成を始めるまで5~7日間毎に代え、コロニーが形成を始めた時にコロニーを摘み取り、96ウェルプレートにプレートし、そしてgp120捕獲ELISAによってスクリーニングした。陽性クローンを24ウェルプレートに拡張し、上記のように、捕獲ELISAによるEnvタンパク質産生のために数時間スクリーニングした。24ウェルプレート中でコンフルーエンシーを達した後に、陽性クローンをT25フラスクCorning、Corning、NYに拡張した。これらを、コンフルーエンシーおよび陽性クローンがT75フラスクに拡張された後に、数回スクリーニングした。陽性T75クローンを、LN2中で凍結させ、最高の発現クローンを0~5μMメトトレキサートMTXでいくつかの濃度で増幅させ、そして100mm培養皿にプレートした。プレートをコロニー形成についてスクリーニングし、そしてすべての陽性クローンclosedを再び上記のように拡張した。クローンをgp120捕獲ELISAによって各工程において拡張し、増幅しそしてスクリーニングした。陽性クローンを各メトトキサレートレベルにおいて凍結させた。最高産生クローンを、より大きなバイオリアクターにスケールアップするために、低血清懸濁培養条件に拡張および適合させるために、灌流バイオリアクター3L、100L中で増殖した。表5および6は、合成HIV-US4およびSF162Envポリペプチドをコードするカセット例えば、変異切断部位、改変コドン利用および/または欠失された超可変領域を保持するpCMVIIIベクターでトランスフェクトされたCHO細胞からの捕獲ELISAデータを示す。従って、Envポリペプチド例えば、gp120、gp140モノマー性、およびgp140-オリゴマー性を発現する安定にトランスフェクトされたCHO細胞株が、産生された。上記に示された結果は、CHO細胞内のEnvポリペプチドの発現を提供する本発明の構築物の能力を実証する。CHO細胞を使用するポリペプチドの産生は、以下を提供する:i正しいグリコシル化パターンおよびタンパク質コンホメーションMABのパネルに結合することによって決定されるように;iiCD4レセプター分子との正しい結合;iii非哺乳動物細胞夾雑物の非存在例えば、昆虫ウイルスおよび/または細胞;ならびにiv精製の容易性。D.Tatコード配列HIV-SF162SF162野生型Tat配列番号85配列を、合成Tat配列をクローン化した配列番号87、88および89ベクターと同様の特徴を有する発現ベクターにクローン化した。SF162野生型および合成Tat配列を有する種々のベクターについての発現効率を、適切な抗tat抗体を伴う捕捉ELISAおよび/またはCHO細胞アッセイを使用して、GagおよびEnvについて上記のように本質的に評価した。合成カセットよりコードされるポリペプチドの発現は、野生型に関して改善される。実施例3発現のウエスタンブロット分析A.GagおよびGagプロテアーゼコード配列ヒト293細胞を、ネイティブまたは合成Gag発現カセットを含むpCMV6aベースのベクターを用いて、実施例2に記載されるようにトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、60時間、培養した。上清を記載されるように調製した。細胞溶解物を以下のように調製した。細胞を一旦、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄し、洗剤0.1MTris-HCl中1NP40SigmachemicalCo.、St.Louis、MO、pH7.5を用いて溶解し、そしてその溶解物を新しいチューブに移した。SDSポリアクリルアミドゲルプレキャストpre-cast8-16;Novex,SanDiego,CAを、20μlの上清または12.5μlの細胞溶解物とともにロードした。タンパク質標準もまた、ロードした5μl、広範なサイズ範囲標準;BioRadLaboratories、Hercules、CA。電気泳動を実施し、そしてタンパク質を、BioRadTransferChamberBioRadLaboratories、Hercules、CAを使用して、ImmobilonP膜MilliporeCorp.、Bedford、MAに移した製造業者Milliporeにより推奨される転移緩衝液を使用。ここで、この転移を、100ボルトで90分間、実施した。この膜を、HIV-1-陽性ヒト患者血清に曝露し、そしてO-フェニレンジアミン二塩化水素化物OPD;Sigmaを使用して免疫染色した。免疫ブロット分析の結果は、合成Gag発現カセットを含む細胞が、期待されたp55タンパク質を、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で産生したことを示した。Gagp55タンパク質を、細胞溶解物および上清の両方で観察した。産生レベルは、本発明の合成Gag発現カセットでトランスフェクトした細胞についての細胞上清において、有意に高かった。本発明の支持において実施された実験は、合成Gag-プロット発現カセットを含む細胞が、予期されたGag-プロットタンパク質を、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、比較的より高い濃度で産生したことを示唆する。さらに、トランスフェクトされた293細胞に由来する上清を、ショ糖勾配に対して分別した。上清のアリコートを、20wt/wtショ糖溶液が下に敷かれたPolyclearTM超遠心分離管BeckmanInstruments、Columbia、MDに移し、そしてBeckmanSW28ローターにおいて28,000rpmで2時間、遠心分離に供した。生じたペレットをPBS中に懸濁し、そして20~60wt/wtのショ糖勾配上に積み重ね、そしてBeckmanSW41tiローターにおいて40,000rpmで2時間、遠心分離に供した。次いでこの勾配を、およそ10×1mlのアリコートに分別したこの勾配の頂部で開始し、20で終了。サンプルをフラクション1~9から選び、8~16のSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。フラクション番号4ピークフラクションは、Gagタンパク質VLPの予期された密度と一致する。293/合成Gag細胞に由来する上清は、293/ネイティブGag細胞に由来する上清よりもかなり強いp55バンドを与え、そして予期されたように、いずれかの上清において最も高い濃度のp55を、フラクション4において見出した。これらの結果は、合成Gag発現カセットは、ネイティブなGagコード配列に関して、p55タンパク質およびVLPの両方のすぐれた産生を提供することを実証する。B.Envコード配列ヒト293細胞を、実施例2に記載されるように、ネイティブまたは合成Env発現カセットを含む、pCMVKm2ベースのベクター;pCMVlinkベースのベクター;pCMVIIベースのベクターまたはpESN2ベースのベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を48時間または60時間培養した。細胞溶解物および上清を記載実施例2されるように調製した。手短には、細胞を一旦、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄して、洗剤0.1MTris-HCl中1NP40SigmachemicalCo.、St.Louis、MO、pH7.5を用いて溶解し、そしてその溶解物を新しいチューブに移した。SDSポリアクリルアミドゲルプレキャスト8-16;Novex,SanDiego,CAを、20μlの上清または12.5μlの細胞溶解物とともにロードした。タンパク質分子量標準およびHIVSF2gp120陽性コントロールタンパク質5μl、広範なサイズ範囲標準;BioRadLaboratories、Hercules、CAもまた、ロードした。電気泳動を実施し、そしてタンパク質を、BioRadTransferChamberBioRadLaboratories、Hercules、CAを使用して、ImmobilonP膜MilliporeCorp.、Bedford、MAに移した製造業者Milliporeにより推奨される転移緩衝液を使用。ここでこの転移を、100ボルトで90分間実施した。次いで、この膜を、ポリクローナルヤギ抗gp120SF2/env2-3抗血清に対して反応させ、次いでブタ抗ヤギIgGペルオキシダーゼPODSigma、St.Louis、MOとともにインキュベートした。結合を示すバンドを、膜上の褐色沈殿物を沈着させる過酸化水素を有するDABを添加することにより可視化した。免疫ブロット分析の結果は、合成Env発現カセットを含む細胞は、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で、SDSポリアクリルアミドゲルにおける移動度によって決定される推定分子量の予期されるEnvgpタンパク質を産生したことを示した。Envタンパク質を、細胞溶解物および上清の両方で観察した。産生レベルは、本発明の合成Env発現カセットでトランスフェクトされた細胞についての細胞上清において有意に高かった。C.Tatコード配列ヒト293細胞を、ネイティブまたは合成Tat発現カセットを含む種々のベクターを用いて実施例2に記載されるようにトランスフェクトした。細胞を培養し、そして単離されたタンパク質を上記のように分析した。免疫ブロット分析は、合成Tat発現カセットを含む細胞は、ネイティブな発現カセットを含む細胞よりも、細胞ごとに、より高い濃度で、SDSポリアクリルアミドゲルにおける移動度によって決定される推定分子量の予期されるTatタンパク質を産生したことを示す。実施例4Envポリペプチドの精製A.オリゴマーgp140の精製オリゴマーgp140o-gp140US4の精製を、図60において示されるように本質的に実施した。本明細書中に記載される実験について、o-gp140とは、ネイティブ形態または改変化形態例えば、発現配列を最適化された、欠失形態、変異形態、短縮形態などのいずれかにおけるオリゴマーgp140をいう。手短には、CHO細胞培養から得られた濃縮された30~50×上清を、DNAおよび他の血清タンパク質を除去するアニオン交換DEAEカラム上にロードした。溶出した物質を、血清タンパク質には結合するが、HIVEnvタンパク質とは結合しない、セラミックヒドロキシアパタイトカラムCHAP上にロードした。DEAEおよびCHAPからのフロースルーflow-throughを、残留する任意の血清免疫グロブリンを除去するための予防工程として、プロテインAカラム上にロードした。フロースルー中のEnvタンパク質を、次いで、レクチングルバンザスナバリスlectingluvanthusnavalisGNA、VectorLabs、Burliname、CAを使用して、捕捉した。GNAは、例えば、Envのようなマンノースリッチな炭水化物に対して高い親和性を有する。Envタンパク質を、次いで、GNA基質とともに溶出させた。他の高度にグリコシル化されたタンパク質を除去するために、カチオン交換カラムSPを使用して、gp140/gp120を精製した。最終工程o-gp140からgp120を分離するにおいて、ゲルろ過カラムを使用して、モノマーからオリゴマーを分離した。最終産物のサイジングsizingおよびクロマトグラフィー分析は、このストラテジーが、オリゴマーgp140の良好な単離へと導くことを示した。B.gp120の精製gp120の精製を、他のEnvタンパク質について以前に記載されるように、本質的に実施した。手短には、CHO細胞培養から得られた濃縮された上清を、DNAおよび他の血清タンパク質を除去する、アニオン交換DEAEカラム上にロードした。溶出した物質を、血清タンパク質に結合するが、HIVEnvタンパク質とは結合しない、セラミックヒドロキシアパタイトカラムCHAP上にロードした。CHAPカラムに由来するフロースルーを、カチオン交換カラムSP上にロードし、ここでフロースルーを捨て、結合フラクションを、塩を用いて溶出させた。溶出したフラクションを、Suprose12/Superdex200TandemカラムPharmacia-Upjohn、Uppsala、Sweden上にロードし、これより精製されたgp120を得た。最終産物のサイジングおよびクロマトグラフィー分析は、このストラテジーが、gp120タンパク質を良好に精製したことを示した。実施例5精製されたEnvポリペプチドの分析A.o-gp140の分析HIVEnvタンパク質は、その正しいコンホメーションにおいてCD4だけに結合する。従って、上記のように産生され、そして精製されたo-gp140US4ポリペプチドのCD4細胞に結合する能力を試験した。o-gp140US4を、15分間、FITC標識CD4と共に室温にてインキュベートして、WatersのHPLCを使用するBiosil250BioRadサイズ排除カラム上にロードする。CD4-FITCは、最も長い溶出時間2.67分を有し、次いで、CD4-FITC-gp1202.167分である。最も短い溶出時間1.9分を、CD4-FITC-o-gp140US4について観察し、このことは、予期されるように、o-gp140US4は、CD4と結合し、カラムに対する溶出時間を減少させる大きな複合体を形成することを示唆する。従って、上記のように産生され、そして精製されたo-gp140US4は、正確なサイズおよびコンホメーションを有する。さらに、US4o-gp140上記のように精製されたをまた、CD4結合部位、CD4誘導部位、V3ループおよびオリゴマー特異的gp41エピトープに対する公知のエピトープ特異性を有する種々のモノクローナル抗体と結合するその能力について試験した。o-gp140は、これらの抗体と強く結合し、このことは、精製されたタンパク質が、その構造完全性を保持することを示唆する。B.gp120の分析上記のように、CD4-FITCは、HPLCカラムに対する減少した溶出時間によって実証されるように、gp120に結合する。従って、上記の方法により精製されたUS4gp120は、そのコンホメーション完全性を保持する。さらに、精製されたgp120の特性を、ウエスタンブロットについてその完全性および同一性を調べることによって、ならびにタンパク質濃度、pH、伝導性、エンドトキシンレベル、バイオバーデンbioburdenなどを調べることにより試験し得る。上記のように精製されたUS4gp120をまた、CD4結合部位、CD4誘導部位、V3ループおよびオリゴマー特異的gp41エピトープに対する公知のエピトープ特異性を有する、種々のモノクローナル抗体と結合する能力について試験した。gp120に対するmAb結合のパターンは、精製されたタンパク質がその構造の完全性を保持すること、例えば、精製されたgp120は、オリゴマー特異的gp41エピトープを有するmAbと結合しないことを示唆した予期されるように。実施例6VLP産生の電子顕微鏡的評価トランスフェクションする前の日に、電子顕微鏡法のための細胞を、50~70コンフルエンスの密度でプレートした。細胞を、トランスフェクション試薬LT1Panveraを使用して、10μgのDNAを用いてトランスフェクトし、そして血清還元培地において5時間インキュベートした実施例2を参照のこと。次いで、培地を、通常の培地で置換し実施例2を参照のこと、そして細胞を14時間COS-7または40時間CHOインキュベートした。インキュベーション後、細胞を2回、PBSで洗浄して、2グルタルアルデヒドで固定した。電子顕微鏡法を、Prof.T.S.BenedictYen、VeteransAffairs、MedicalCenter、SanFrancisco、CAによって実施した。電子顕微鏡法を、透過電子顕微鏡Zeiss10cを使用して実行した。細胞を、オスミウムで前染色し、そして酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色した。倍率は、100,000×であった。図3Aおよび3Bは、合成Gag発現カセット配列番号5またはGagプロット発現カセット配列番号79を有するpCMVKM2でトランスフェクトしたCHO細胞の顕微鏡写真を示す。この図において、予期されるサイズ100nmの遊離かつ出芽している未成熟ウイルス様粒子VLPが、Gag発現カセットについて観察され図3A、そして未成熟VLPおよび成熟VLPの両方が、Gagプロット発現カセットについて観察される図3B。同じベクターでトランスフェクトしたCOS-7細胞は、同じ発現パターンを有する。VLPはまた、CHO細胞およびCOS-7細胞の細胞内に見出され得る。ネイティブGag発現カセットおよび合成Gag発現カセットを、ヒト293細胞をトランスフェクトするために使用する場合、VLP産生のそれらの連想されるレベルについて比較した。その比較を、細胞上清の密度勾配超遠心分離法および勾配フラクションのウエスタンブロット分析によって実施した。合成Gag構築物を使用した場合に、VLPの産生において明らかな改善が存在した。実施例7バキュロウイルス系におけるウイルス様粒子の発現A.ネイティブHIVp55Gagの発現ネイティブHIVp55Gagバキュロウイルスのシャトルベクターを構築するために、プロトタイプSF2HIVp55プラスミドpTM1-GagSelbyM.J.ら、J.Virol.7110:7827-7831,1997を、制限エンドヌクレアーゼNcolおよびBamHIを用いて消化し、1.5Kbのフラグメントを抽出し、これを続いてpAcC4Bio/Technology6:47-55.1988pAc436の誘導体にサブクローニングした。2μgのHIVp55GagpAcC4シャトルベクターを、0.5μgの線状化AutographacalifornicaバキュロウイルスAcNPV野生型ウイルスDNAと共に、SpodopterafrugiperdaSf9細胞に同時トランスフェクトすることにより、組換えバキュロウイルスの作製を達成したKitts,P.A.,AyresM.D.,およびPosseeR.D.,NucleicAcidsRes.18:5667-5672,1990。HIVp55Gagを発現している組換えウイルスの単離を、標準的な技術O’Reilly,D.R.,L.K.Miller,およびV.A.Luckow,BaculovirusExpressionVector:ALaboratoryManual,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1992に従って行なった。HIVp55Gagの発現を、HIVp55Gag組換えバキュロウイルスを用いて、感染多重度MOI10で感染させた、無血清培地で増殖されたSf9細胞の500ml懸濁培養物Miaorella,B.,D.Inlow,A.Shauger,およびD.Harano,Bio/Technology6:1506-1510,1988を使用して達成した。感染の48時間後、上清を遠心分離により分離し、0.2μmのフィルターを通して濾過した。次いで、この上清のアリコートを、PolyclearTMBeckmanInstruments,PaloAlto,CA超遠心分離管に移し、20重量/重量のスクロースを下地にして、そしてBeckmanSW28ローターを使用して24,000rpmで2時間遠心分離にかけた。生じたペレットを、Tris緩衝液20mMTrisHCl、pH7.5、250mMNaCl、および2.5mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]に懸濁し、20~60重量/重量スクロース勾配上に重ね、そしてBeckmanSW41tiローターを使用して40,000rpmで2時間遠心分離にかけた。次いで、この勾配を勾配の上部20スクロースで始めて、約12の0.75mlのアリコートに分けた。各フラクションのサンプルを8~16SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして生じたバンドをcommasie染色の後、視覚化した図4。さらなるアリコートを屈折率分析にかけた。図4に示される結果は、p55Gagウイルス様粒子が、約1.17g/mlにピークを有するスクロース密度1.15~1.19g/mlの範囲に、バンド形成するということを示した。このピークのフラクションをプールし、そして第2の20スクロースペレット化により濃縮した。生じたペレットを、1mlのTris緩衝液上記に懸濁した。BicimchrominicAcidBCAPierceChemical,Rockford,ILにより見積もられた全タンパク質の収量は、1.6mgであった。B.合成HIVp55Gagの発現合成p55Gag配列を含むバキュロウイルスシャトルベクターを、以下のように構築した。合成HIVp55発現カセット実施例1を、制限酵素SalIを用いで消化し、続いてT4-DNAポリメラーゼを用いてインキュベーションした。生じたフラグメントを、単離しPCRClean-upTM,Promega,Madison,WI、次いでBamHIエンドヌクレアーゼを用いて消化した。シャトルベクターpAcC13MunemitsuS.ら、MolCellBiol.1011:5977-5982、1990を、EcoIを用いる消化により線状化し、続いてT4-DNAポリメラーゼを用いてインキュベーションし、次いで単離したPCRClean-upTM。線状化したベクターをBamHIを用いて消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてアガロースゲルでのサイズフラグメンテーションにより単離した。単離された1.5kbのフラグメントを、調製されたpAcC13ベクターと連結させた。生じたクローンを、pAcC13-Modif.p55Gagと呼んだ。合成HIVp55VLPのための発現条件は、ネイティブp55Gagの発現条件と、以下のように異なった:500mlの代りに1リットルの培養体積を使用した;TrichoplusianiTn5Wickham,T.J.,およびNermerow,G.R.,BioTechnologyProgress,9:25-30,1993昆虫細胞を、Sf9昆虫細胞の代りに使用した;そして、10のMOIの代りに3のMOIであった。本発明を支持して行なわれた実験は、ネイティブp55クローンを有するSf9昆虫細胞とTn5昆虫細胞との間の発現レベルにおいて、明確な差がないということを示した。MOIについては、ネイティブp55クローンでの経験が、10のMOIが、より低いMOIよりもVLPのより高い発現約2倍を生じるということを示唆した。合成p55VLPに使用されたスクロースペレット化およびバンド形成方法は、以下の例外を除いて、ネイティブp55VLPに使用された方法上記に類似であった:ペレット化したVLPを、1.0mlのTris緩衝液の代わりに、4mlのリン酸緩衝化生理食塩水PBSに懸濁し;そして単一勾配の代わりに、4つの20~60のスクロース勾配を使用した。また、高濃度のバンドVLPに起因して、ペレット化によるさらなる濃縮は、必要なかった。4つの勾配全てからのピークフラクションを、PBSに対して簡単に透析した。バンドVLPのおよその密度は、1.23~1.28g/mlの範囲であった。BCAにより見積もられた全タンパク質の収量は、46mgであった。合成p55のスクロース勾配バンド形成の結果を、図5に示す。2つのバキュロウイルス発現カセットから得られたいくつかの調製物から精製されたHIVp55Gagの全量の比較を、図6に要約した。ネイティブp55からの平均収量は、培養物1リットルにつき3.16mgn=5、標準偏差sd±1.07、範囲=1.8~4.8mg/Lであり、合成p55からの平均収量は、10倍より多く、培養物1リットルにつき44.5mgn=2、sd=±6.4であった。より高い全タンパク質収量に加えて、合成p55発現Gag由来の最終産物は、ネイティブp55発現Gag由来の最終産物よりも、一貫して少ない量の混入バキュロウイルスタンパク質を含んだ。この差異は、図4および図5の2つのクーマシーcommassie染色ゲルに示され得る。C.ネイティブGagコアおよび合成Gagコアの発現HIVp55Gag/HCVコア173配列番号8の発現を、無血清培地中で増殖されたSf9細胞の2.5リットルの懸濁培養物を使用して、達成したMiaorella,B.,D.Inlow,A.Shauger,およびD.Harano.1988Bio/Technology6:1506-1510。この細胞をHIVp55Gag/HCVコア173組換えバキュロウイルスを用いて感染させた。感染の48時間後、上清を遠心分離により細胞から分離し、そして0.2μmのフィルターを通して濾過した。次いで、上清のアリコートを、30重量/重量スクロースを含むPolyclearTMBeckmanInstruments,PaloAlto,CA超遠心分離管に移し、そしてBeckmanSW28ローターおよび超遠心機で24,000rpmで2時間遠心分離にかけた。生じたペレットをTris緩衝液50mMTris-HCl、pH7.5、500mMNaCl中に懸濁し、そして30~60重量/重量スクロース勾配上に重ね、そしてBeckmanSW41tiローターおよび超遠心機で、40,000rpmで2時間遠心分離にかけた。次いで、この勾配を勾配の上部30から始めて約11×1.0mlのアリコートに分画した。各フラクションを、8~16のSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そして生じたバンドを、クーマシー染色の後に視覚化した。アリコートのサブセットをまた、HIVp24HIVp55のサブユニットに特異的なモノクローナル抗体76C.5EGSteimer,K.S.ら、Virology150:283-290,1986を使用してウエスタンブロット分析にかけた。スクロース勾配からのピークフラクションを、プールし、そして第2の20スクロースペレット化により濃縮した。生じたペレットを、1mlの緩衝液Tris緩衝液に懸濁して、そしてBCAPierceChemical,Rockford,ILにより見積もられた全タンパク質収量は、約1.0mgであった。SDSPAGEからの結果を、図8に示し、そして抗p24ウエスタンブロット分析の結果を、図9に示す。あわせて考えると、これらの結果は、HIVp55Gag/HCVコア173キメラVLPが、HIVp55GagVLPのスクロース密度と類似するスクロース密度でバンド形成するということ、および約72,000kdの分子量に移動した可視タンパク質バンドが、HIVp24特異的モノクローナル抗体と反応性であるということを示す。約55,000kdのさらなる免疫反応性バンドはまた、抗p24抗体と反応性であることが明らかになり、そしてこれは分解産物でありえる。上記の調製由来のアリコートを、HCVコア特異的抗体抗CD22ウサギ血清との反応性について試験しなかったが、類似の調製物からの結果を図10に示す。そしてこの結果は、主要なHCVコア特異的反応性は、キメラタンパク質の推定分子量に一致する約72,000kdの分子量に移動するということを示す。合成HIVp55Gag/HCVCore173配列番号8VLPの発現条件は、ネイティブp55Gagの発現条件とは異なり、以下のとおりである:2.5リットルの代わりに1リットルの培養容量を使用し、TrichoplusianiTn5Wickham,T.J.およびNemerow,G.R.1993BioTechnologyProgress,9:25-30昆虫細胞を、Sf9昆虫細胞の代わりに使用し、そしてMOIを、10に代えて3にした。合成HIVp55Gag/HCVCore173VLPについて用いた、スクロースペレット化およびバンド形成方法は、ネイティブHIVp55Gag/HCVCore173VLPについて使用した方法と同様であった。しかし、以下の差異を含んだ:ペレット化したVLPを、1.0mlのTris緩衝液の代わりに1mlのリン酸緩衝化生理食塩水PBS中に懸濁し、単一の20~60のスクロース勾配を使用した。2つのバキュロウイルス発現カセットから得られた複数の調製物由来の精製HIVp55Gag/HCVCore173の全量の比較によって、合成HIVp55Gag/HCVCore173カセットを使用する発現の増加が存在することが示された。D.HIVp55GagVLPの富化のための代替的方法培地からの精製に加えて、バキュロウイルスにおいて発現された例えば、本発明の合成発現カセットを使用してp55Gagタンパク質もまた、感染された昆虫細胞からウイルス様粒子として精製し得る。例えば、感染の48時間後、培地および細胞ペレットを遠心分離によって分離し、そして細胞ペレットを、以後の使用まで-70°Cで保存する。処理時に、細胞ペレットを、5容量の低張性の溶解緩衝液20mMTris-HCl,pH8.2、1mMEGTA;1mMMgCl、およびCompleteProteaseInhibitor登録商標BoehringerMannheimCorp.,Indianapolis,IN中に懸濁する。必要な場合、次いで、細胞溶解を完全にするために、細胞を8~10回ダンスdounceする。次いで、この溶解物を、約100~1500×gで20分間遠心分離する。この上清を、UltraClearTM管内にデカントし、20w/wスクロースで重層し、そしてSW28バケット中で、24,000rpmで2時間遠心分離する。得られたペレットを、Tris緩衝液0.1IGEPAL界面活性剤SigmaChemcal,St.Louis,MOおよび250ユニット/mlのベンゾナーゼbenzonaseAmericanInternationalChemical,Inc.,Natick,MAを含む、20mMTrisHCl,pH7.5、250mMNaCl、および2.5mMエチレンジアミン四酢酸EDTA中に懸濁し、そして少なくとも30分間、4°Cでインキュベートする。続いて、この懸濁液を、20~60スクロース勾配に重層し、SW41tiローターを使用して、40,000rpmで20~24時間スピンする。超遠心分離後、このスクロース勾配を分画し、そしてアリコートを、SDSPAGE上で泳動して、ピーク画分を同定する。このピーク画分を、PBSに対して透析し、そしてタンパク質含量を測定する。逆染色した電子顕微鏡写真は、代表的に、出芽VLPよりも幾分小さい直径80~120nmの非エンベロープVLPを示す。この様式で調製されたHIVGagVLPはまた、マウスにおいてGag特異的CTL応答を生成し得る。実施例8合成Gag発現カセットのインビボ免疫原性A.免疫合成Gag発現カセットの可能な改善された免疫原性を評価するために、マウス研究を実施した。合成Gag発現カセットを保有するプラスミドDNA、pCMVKM2を、100μlの全量中で以下の最終濃度に希釈した:20μg、2μg、0.2μgおよび0.02μg。この希釈されたDNAの潜在的な負の希釈効果を克服するために、各サンプル中の全DNA濃度を、ベクターpCMVKM2単独を使用して20μgに増加させた。コントロールとして、ネイティブGag発現カセットのプラスミドDNAを、同じ様式で操作した。4つのBalb/cマウスCharlesRiver,Boston,MAの12の群を、表7のスケジュールに従って、筋肉内で免疫した50μl/脚での、前脛骨への筋肉内注射。群1~4を、0週目免疫前、4週目、6週目、8週目および12週目で採血した。群5~12を、0週目免疫前および4週目に採血した。B.体液性免疫応答体液性免疫応答を、免疫後0週間および4週間群5~12、および、さらにそれぞれ、免疫後6週間および8週間、第2の免疫後2週間および4週間群1~4で、マウス血清の抗HIVGag抗体ELISA酵素結合イムノソルベント検定法によってチェックした。この血清の抗体力価を、抗Gag抗体ELISAによって決定した。手短に言うと、免疫したマウス由来の血清を、HIVp55Gagタンパク質に対する抗体についてスクリーニングした。ELISAマイクロタイタープレートを、1ウェルあたり0.2μgのHIV-1SF2p24-Gagタンパク質で一晩コートし、そして4回洗浄し;続いて、PBS-0.2TweenSigmaを用いて2時間ブロッキングした。ブロッキング溶液の除去後、100μlの希釈マウス血清を添加した。血清を、1/25希釈で、およびその後の連続的な3倍希釈によって試験した。マイクロタイタープレートを4回洗浄し、そして二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体Pierce,Rockford,ILと共にインキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、そして100μlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;Pierceを、1ウェルあたりに添加した。各ウェルの吸光度を、15分後に測定した。報告された力価は、最大の1/2half-maximumの吸光度O.D.を与える血清の希釈度の逆数である。ELISAの結果を、表8に示す。プラスミドDNAでのマウス免疫の結果は、これらの合成発現カセットが、ネイティブの発現カセットと比較して、免疫原性の明らかな改善を提供することを示す。また、第2の追加免疫は、2週間後の二次的な免疫応答を誘導した群1~3。C.細胞性免疫応答特定の細胞傷害性Tリンパ球CTLの頻度を、ペプチドをパルスpulseしたBalb/cマウスCD4細胞の標準的なクロム放出アッセイによって評価した。Gag発現ワクシニアウイルスを感染させたCD8細胞を、陽性コントロールとして使用したvvGag。手短に言うと、脾臓細胞エフェクター細胞、Eを上記のように免疫したBALB/cマウス表8から得て、これを、培養し、再刺激し、そして記載Doe,B.およびWalker,C.M.,AIDS107:793-794,1996のように、Gagペプチドをパルスした標的細胞に対するCTL活性についてアッセイした。使用したHIV-1SF2Gagペプチドは、p7g配列番号10であった。細胞傷害性活性を、標準的な51Cr放出アッセイにおいて測定した。標的T細胞を、エフェクターE細胞と共に、種々のE:T比で4時間培養し、二連のウェルから得られた平均cpmを使用して、特異的な51Cr放出の割合を計算した。結果を表9に示す。細胞傷害性T細胞CTL活性を、HIVGagDNAで免疫したマウスから回収した脾細胞において測定したエフェクターカラム表9を免疫スケジュール表8に対して比較する。GagDNAで免疫した動物由来のエフェクター細胞は、Gagp7gペプチドをパルスしたSV-BALBMHC適合標的細胞の特異的溶解を示し、これは、CTL応答を示す。ペプチドをパルスし、そしてMHC非適合マウス株MC57から誘導された標的細胞は、溶解されなかった表9;MC/p7g。このCTLアッセイの結果は、DNA免疫による細胞傷害性Tリンパ球CTL応答の誘導についての、合成Gag発現カセットの能力の増加を示す。実施例9Envポリペプチドでのインビボ免疫A.Ras-3cアジュバント系におけるUS4o-gp140の免疫原性研究上記のように精製したUS4o-gp140で免疫したウサギを使用して、研究を行った。また、US4gp120、SF162o-gp140およびSF162gp120の免疫原性を決定するために、動物において研究が行われている。2匹のウサギ1および2を、2スクアレン、0.2Tween80、およびモノホスホリルリピドAMPL,RibiImmunochem,Hamilton,TMからなる群由来の1以上の細菌細胞壁成分を含む、RibiTMアジュバント系RAS-3cRibiImmunochem,Hamilton,MT中の、50μgのUS4o-gp140で、0週目、4週目、12週目および24週目に、筋肉内で免疫した。本明細書中に記載される各実験において、o-gp140は、ネイティブ、変異型および/または改変型であり得る。US4o-gp140タンパク質に対する抗体応答は、ELISAによって測定される。結果を、表10に示す。US4o-gp140タンパク質に対する抗体のアビディティを、漸増濃度のアンモニウムイソチオシアネートでの連続的洗浄を使用する、類似のELISA形式で測定した。結果を、表11に示す。これらの結果は、US4o-gp140が高度に免疫原性であり、そして1回または2回のみの免疫後に実質的に抗体応答を誘導し得ることを示す。B.MF-59ベースのアジュバントにおけるUS4o-gp140の免疫原性4匹のウサギの群を、3つの異なるMF59ベースのアジュバントMF59は、国際公開番号WO90/14837に記載され、そして代表的に、5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85を含む中の、種々の用量のUS4o-gp140タンパク質で、0週目、4週目、12週目および24週目に、筋肉内で免疫した。QHCは、クイルquillベースのアジュバントIscotek,Uppsala,Swedenである。結果を、表12に示す。従って、アジュバント化されたadjuvantedo-gp140は、抗原特異的抗体を生成した。さらに、これらの抗体は、経時的にアビディティが増加されることが示された。C.中和抗体3回目の免疫後の中和抗体を、T細胞株適応ウイルスTCLAアッセイでHIV-1SF2に対して、および標的細胞としてCCR5CEMx174LTR-GFPレポーター細胞株、5.25N.Landau、SalkInstitute、SanDiego、CAにより提供されるを使用して、PBMC-増殖HIV-1改変体SF2、SF162および119に対して測定した。結果を、表13において示す。表13o-gp140.modUS4タンパク質を用いて免疫されたウサギにおける中和抗体応答TCLA中和抗体の力価50阻害。決定されない。採血前の任意の検出可能な非特異的阻害を差し引いた、1:10希釈の血清における阻害。ウサギにおける上記の研究は、US4o-gp140タンパク質は、非常に免疫原性であることを示す。アジュバントと共に投与する場合、このタンパク質は、1回だけまたは2回の免疫後に実質的な抗体応答を誘導し得た。さらに、補強されたadjuvantedo-gp140タンパク質は、連続する免疫後のアビディティを増加する抗原特異的抗体を生成し得、そしてT細胞株適応HIV-1に対する活性を実質的に中和にし得た。中和活性はまた、PBMC-増殖初期HIV株に対して観察され、CCR5コレセプターR5-利用単離物SF162および119を中和する困難を含む。実施例10合成Env発現カセットのインビボでの免疫原性A.一般的な免疫方法合成Env発現カセットの免疫原性を評価するため、モルモット、ウサギ、マウス、アカゲザルおよびヒヒを使用した研究を実施した。この研究を、以下のように構築した:DNA免疫単独1回または複数回;DNA免疫に続き、タンパク質免疫ブースト;DNA免疫に続き、シンドビス粒子免疫;シンドビス粒子単独による免疫。B.体液性免疫応答体液性免疫応答を、免疫後の種々の時間に、抗HIVEnv抗体ELISA酵素結合イムノソルベントアッセイにより、免役された動物由来の血清標本において調査した。血清の抗体力価を、上記のように抗Env抗体ELISAにより決定した。簡潔には、免疫された動物由来の血清を、HIVgp120またはgp140Envタンパク質に対する抗体についてスクリーニングした。ELISAマイクロタイタープレートのウェルを、選択されたEnvタンパク質で一晩コートし、そして4回洗浄し;後に、ブロッキングを、PBS-0.2TweenSigmaを用いて、2時間行った。ブロッキング溶液の除去後、100μlの希釈されたマウス血清を添加した。血清を、1/25希釈液で、およびその後連続的な3倍希釈により試験した。マイクロタイタープレートを、4回洗浄し、そして二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体Pierce、Rockford、ILと共にインキュベートした。ELISAプレートを洗浄し、そして100μlの3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMB;Pierceを、1つのウェルあたり添加した。各々のウェルの吸光度を、15分後に測定した。最大値の半分である吸光度O.D.を与える血清の希釈度の逆数として、力価を代表的に報告する。実施例11合成Gag発現カセットを使用したヒヒのDNA免疫A.ヒヒ4頭のヒヒを、1mgのpCMVKM2.GagMod.SF2プラスミドDNA実施例1を用いて、四頭の両側に筋内で3回免疫した0週、4週および8週。この動物を、各々の免疫後2週間飼育し、そしてp24抗体ELISAを、単離された血漿を用いて実施した。ELISAを、2次抗体結合体が、1:500の希釈度で使用される抗ヒトIgG、g鎖特異的、ペルオキシダーゼ結合体SigmaChemicalCo.、St.Louis、MD63178であることを除き、実施例5に記載されるように本質的に実施した。50μg/mlの酵母抽出物を、ヒヒ中の既存の酵母抗体による非特異的バックグラウンドを減少させるため、血漿サンプルおよび抗体結合体の希釈液に添加した。この抗体の力価の結果を、表14に示す。表14awpi=免疫後の週b相乗平均抗体の力価表14において、採血前のpre-bleedデータを、免疫番号0として与え;最初の免疫後2週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号1として与え;2回目の免疫後2週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号2として与え;そして3回目の免疫後2週間で採取された血液についてのデータを、免疫番号3として与える。さらに、p24抗原に対するリンパ増殖応答もまた、4回目の免疫後2週間14週で、ヒヒ221およびヒヒ222において観察し、そしてVLPでのブースト後44週および76週に実質的に増強した。このような増殖の結果は、Tヘルパー細胞の機能の誘導を示している。B.アカゲザルマウスおよびヒヒの研究において観察されるコドン改変gag発現プラスミドの改善された能力を、アカゲザルにおいて確認した。4頭のアカゲザルのうち4頭は、2回または3回の1mgの用量の改変gagプラスミドの投与後、検出可能なGag-特異的CTLを有した。対照的に、以前の研究で、野生型HIV-1SF2Gagをコードする1mg用量のプラスミドDNAを与えられた4頭のヒヒのうちの1頭のみしか、強いCTL活性を示さず、この活性は、7回の免疫後まで明らかではなかった。改変されたgagプラスミドの能力のさらなる証拠は、4頭のアカゲザルのうち2頭由来のCTLが、3つの重複しないGagペプチドプールと反応する観察であり、これは、3つもの異なるGagペプチドが認識されることを示唆し、そしてCTL応答がポリクローナルであることを示す。さらなる定量化および特異性研究は、プラスミド免疫アカゲザルにおけるGagに対するT細胞応答をさらに特徴化するために進行中である。改変されたgagプラスミドを用いたアカゲザルのDNA免疫は、有意な免疫抗体応答を生じず、4頭の動物のうち2頭だけが低い力価でセロコンバートした。対照的に、同じ研究で、p55Gagタンパク質を用いて免疫された群のアカゲザルの大多数は、セロコンバートし、そして強いGag特異的抗体力価を有した。これらのデータは、プライムprimeブーストストラテジーDNA-プライムおよびタンパク質-ブーストが、強いCTL応答および抗体応答の誘導について非常に期待できるものであり得ることを示唆する。つまり、これらの結果は、合成GagプラスミドDNAが、非ヒト霊長類において免疫原性であることを実証する。野生型GagプラスミドDNAを用いて同様の実験を行った場合には、このような抗p24抗体の誘導を、4回の免疫化後では観測しなかった。実施例12Env発現カセットおよびポリペプチドを使用した、動物のDNA免疫化およびタンパク質免疫化A.モルモット各々6匹のモルモットを含む群を、gp120.modUS4、gp140.modUS4、gp140.modUS4.delV1、gp140.modUS4.delV2、gp140.modUS4.delV1/V2またはUS4由来Envの配列をコードするgp160.modUS4をコードするプラスミドDNAで、0、4および12週間に筋肉内に免疫化した。続いてこの動物を、MF59アジュバント中の一回の筋肉内用量のUS4o-gp140.mut.modUS4タンパク質で18週間でブーストした。抗gp120SF2抗体力価幾何平均力価を3回目のDNA免疫化の2週間後、およびタンパク質でのブーストの2週間後に測定した。結果を表15に示す。これらの結果は、免疫応答を生じるための合成構築物の有用性、ならびにDNA免疫化後の免疫応答を増強するためのタンパク質でのブーストを提供することの利点を実証する。B.ウサギウサギを、Biojectニードレスシリンジを使用して、以下の合成SF162EnvポリペプチドをコードするプラスミドDNAで、筋肉内および内皮に免疫化した。:gp120.modSF162、gp120.modSF162.delV2、gp140.modSF162、gp140.modSF162.delV2、gp140.mut.modSF162、gp140.mut.modSF162.delV2、gp160.modSF162、およびgp160.modSF162.delV2。合成Env発現カセットを保有する約1mgのプラスミドDNApCMV連結を、ウサギを免疫化するために使用した。ウサギを、0、4および12週間に、プラスミドDNAで免疫化した。3回目の免疫化の2週間後、全ての構築物は試験動物において有意な抗体力価を有することが示された。さらに、V2領域の欠失を含む構築物で免疫化されたウサギは、一般的に、V2領域を依然として含む伴構築物で免疫化されたウサギと比較して同様の抗体力価を生じた。核酸免疫化後、初めの免疫化の24週間に、o-gp140.modSF162.delV20.1mgの精製タンパク質でタンパク質のブーストを行う。結果を表16に示す。全ての構築物は、非常に免疫原性であり、そしてウサギにおける2回の免疫化後のみ、実質的な抗原結合抗体応答を生じる。C.ヒヒ4匹のヒヒの群を0、4、8、12、28および44週間で、異なる形態の合成US4gp140以下の表を参照のことをコードする1mg用量のDNAで筋肉内に免疫化した。この動物をまた、44および76週間で、アジュバントとしてMF59を使用して、US4o-gp140タンパク質gp140.mut.modUS94で2回ブーストした。結果を表17に示す。表17における結果は、霊長類例えばヒヒにおける免疫応答を生じる合成構築物の有用性を実証する。さらに、全ての動物は、抗原Env抗原特異的リンパ球増殖性応答の証拠を示した。D.マカクアカゲザル二匹のマカクアカゲザルH445およびJ408と呼ばれるを、0、4、8および28週間に、筋肉内IMおよび皮内ID経路で、欠失したV2領域SF162.gp140.delV2を有するSF162gp140をコードする1mgのDNAで免疫化した。約100μgの、SF162.gp140mut.delV2構築物によりコードされるタンパク質をまた、28週間に、IM送達によりMF59中で投与した。ELISA力価を図61に示す。中和抗体活性を表18および表19に示す。中和抗体活性を、初期のリンパ球またはPBMCに基づくアッセイ中の、種々の初期のHIV-1単離物に対して決定した以下の表を参照のこと。さらに、各々の初期の単離物ためのこの表現型補レセプターの用法を記載する。表において見られ得るように、HIV-1初期単離物すなわち、SF128A、92US660、92HT593、92US657、92US714、91US056、および91US054を含む試験された単離物ごとに、中和抗体を検出した。リンパ球増殖活性LPAをまた、これらの動物における抗原性刺激、次いで3H-チミジン取り込みにより決定した。これを表20に示す。実験1を、3回目のDNA免疫の14週間後に行い、実験2を、4回目のDNA免疫の2週間後に、DNAおよびタンパク質を用いて行った。gp120ThaiE、gp120SF2およびUS4o-gp140については、刺激指数S.I.;抗原性刺激CPM/バックグラウンドCPMを計算するために、適切なバックグラウンド値を使用した。表20に示される結果により理解され得るように、o-gp140.US4抗原に対するリンパ球増殖応答はまた、両方の実験の時点で、4つの動物すべてにあった。このような増殖結果は、ヘルパーT細胞機能の誘導を示す。上記で示される結果は、合成gp140.modSF162.delV2DNAおよびタンパク質が、非ヒト霊長類において免疫原性であることを示す。実施例13合成GagまたはEnv発現カセットを含む組換えシンドビスRNAおよびDNAのインビトロ発現A.合成Gag発現カセットアルファウイルスベクターにおける合成Gag発現カセットの発現効率を評価するために、合成Gag発現カセットを、プラスミドDNAに基づくシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子に基づくシンドビスウイルスベクターの両方にサブクローン化した。特に、シンドビスウイルスRNAベクターレプリコンのインビトロ転写のためのcDNAベクター構築物pRSIN-luc;Dubenskyら、JVirol.70:508-519,1996を、プラスミド直線化のためのPmeI部位、および異種遺伝子の挿入のためのポリリンカーを含むように改変した。ポリリンカーを、部位XhoI、PmlI、ApaI、NarI、XbaI、およびNotI部位を含む2つのオリゴヌクレオチドXPANXNF、配列番号17、およびXPANXNR、配列番号18を用いて作製した。プラスミドpRSIN-lucDubenskyら、前出を、XhoIおよびNotIで消化してルシフェラーゼ遺伝子挿入物を除去し、クレノウおよびdNTPを用いて平滑末端化し、そしてGeneCleanIIBio101,Vista,CAを用いてアガロースゲルから精製した。オリゴヌクレオチドを互いにアニールし、そしてプラスミドに結合した。得られた構築物を、NotIおよびSaclで消化して最小シンドビス3’末端配列およびA40トラクトを除去し、そしてPKSSIN1-BVWO97/38087由来の約0.4kbpのフラグメントと結合した。この0.4kbpのフラグメントを、NotIおよびSacIを用いるpKSSIN1-BVの消化、ならびにサイズ分画後のアガロースゲルからの精製により得た。このフラグメントは、完全なシンドビスウイルス3’末端、A40トラクトおよび直線化のためのPmeI部位を含んだ。この新規なベクター構築物を、SINBVEと命名した。合成HIVGagコード配列を、EcoRIを用いる消化、クレノウおよびdNTPを用いる平滑末端化、GeneCleanIIを用いる精製、SalIを用いる消化、アガロースゲルでのサイズ分画、およびアガロースゲルからのGeneCleanIIを用いる精製によって、親プラスミドから得た。この合成Gagコードフラグメントを、XhoIおよびPmlIで消化したSINBVEベクターに結合した。得られたベクターを、GeneCleanIIを用いて精製し、そしてSINBVGagと命名した。ベクターRNAレプリコンは、インビトロでSINBVGagから転写され得Dubenskyら、前出、そして細胞のトランスフェクトのために直接使用される。あるいは、レプリコンは、欠損ヘルパーRNAとの共トランスフェクトか、または例えば、米国特許第5,843,723号および5,789,245号に記載されるようなアルファウイルスパッケージング細胞株を用いることにより、組換えベクター粒子にパッケージングされ得、次いで記載されるようにインビボで投与され得る。DNAに基づくシンドビスウイルスベクターpDCMVSIN-β-galDubenskyら、JVirol.70:508-519,1996を、SalIおよびXbaIで消化してβガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除去し、そしてアガロースゲルサイズ分画後にGeneCleanIIを用いて精製した。HIVGag遺伝子を、SalIおよびXhoIを用いるSINBVGagの消化、アガロースゲルサイズ分画後のGag含有フラグメントのGeneCleanIIを用いる精製、ならびに結合により、pDCMVSIN-β-galに挿入した。得られた構築物をpDSIN-Gagと命名し、これはインビボでの投与のために直接使用され得るか、または本明細書中に記載される任意の方法を用いて処方され得る。BHK細胞および293細胞を、組換えシンドビスベクターRNAおよび組換えシンドビスベクターDNAでそれぞれトランスフェクトした。上清および細胞溶解物を、Coulterp24捕獲ELISAを用いて試験した実施例2。BHK細胞を、エレクトロポレーションにより組換えシンドビスRNAでトランスフェクトした。p24の発現ng/mlを表21に示す。表中、SINGag1および2は、2連の測定値を示し、そしてSINβgalは、陰性コントロールを示す。上清および溶解物を、トランスフェクトの24時間後に収集した。293細胞を、LT-1実施例2を用いて組換えシンドビスDNAでトランスフェクトした。合成pCMVKM2GagMod.SF2を、陽性コントロールとして使用した。上清および溶解物を、トランスフェクトの48時間後に収集した。p24の発現ng/mlを表22に示す。表21および22に示される結果は、Gagタンパク質が、合成Gag発現カセットp55Gag.modを用いて、DNAに基づくシンドビスベクター系およびRNAに基づくシンドビスベクター系の両方から、効率的に発現され得ることを示す。B.合成Env発現カセットアルファウイルスベクターにおける合成Env発現カセットの発現効率を評価するために、合成Env発現カセットを、Gagについて上に記載されるように、プラスミドDNAに基づくシンドビスウイルスベクターおよび組換えベクター粒子に基づくシンドビスウイルスベクターの両方にサブクローン化した。合成HIVEnvコード配列を、SalIおよびXbaIを用いる消化、アガロースゲルでのサイズ分画、ならびにアガロースゲルからのGeneCleanIIを用いる精製により、親プラスミドから得た。合成Envコードフラグメントを、XhoIおよびXbaIで消化したSINBVEベクターに結合した。得られたベクターを、GeneCleanIIを用いて精製し、そしてSINBVEnvと命名した。ベクターRNAレプリコンは、インビトロでSINBVEnvから転写され得Dubenskyら、前出、そして細胞のトランスフェクトのために直接使用され得る。あるいは、レプリコンは、欠損ヘルパーRNAとの共トランスフェクトによるか、またはアルファウイルスパッケージング細胞株を用いることにより、組換えベクター粒子にパッケージングされ得、そしてGagについて上記に記載されるように投与され得る。DNAに基づくシンドビスウイルスベクターpDCMVSIN-β-galDubenskyら、JVirol.70:508-519,1996を、SalIおよびXbaIで消化してβガラクトシダーゼ遺伝子挿入物を除去し、そしてアガロースゲルサイズ分画後にGeneCleanIIを用いて精製した。HIVEnv遺伝子を、XbaIおよびXhoIを用いるSINBVEnvの消化、アガロースゲルサイズ分画後のEnv含有フラグメントのGeneCleanIIを用いる精製、ならびに結合により、pDCMVSIN-β-galに挿入した。得られた構築物をpDSIN-Envと命名し、これはインビボでの投与のために直接使用され得るか、または本明細書中に記載される任意の方法を用いて処方され得る。BHK細胞および293細胞を、シンドビスベクターRNAおよびシンドビスベクターDNAのそれぞれを用いてトランスフェクトした。この上清および細胞溶解物を、捕獲ELISAにより試験した。BHK細胞を、組換えシンドビスRNAを用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。Envの発現ng/mlでのを表23に示す。表において、合成Env発現カセットを含むシンドビスRNAを示し、そしてβgalは、陰性コントロールを示す。上清および溶解物をトランスフェクションから24時間後に、収集した。293細胞を、LT-1媒介トランスフェクションPanVeraを使用して、本発明の合成発現カセットおよび陰性コントロールとしてのβgal配列を含む組換えシンドビスDNAを用いてトランスフェクトした。上清および溶解物を、トランスフェクションから48時間後に、収集した。Envの発現ng/mlでのを表24に示す。表23および表24に示された結果は、Envタンパク質が、本発明の合成Env発現カセットを用いるDNAおよびRNAに基づくシンドビスベクター系の両方から効果的に発現され得ることを実証した。実施例14A.Gag含有DNAおよび/またはシンドビス粒子を用いるインビボでの免疫化CB6F1マウスを、表25に示したようなGagMod.SF2配列を含むプラスミドDNAおよび/またはシンドビスベクターRNA含有粒子の各々を用いて、0週間目および4週間目に筋肉注射して免疫化した。動物を、第2の免疫化後の3週間目第7週間目にSF2Gagを発現する組換えワクチンでチャレンジした。脾臓を、CTL活性に対する標準的51C放出アッセイについて、免疫化し、かつ5日後にチャレンジした動物から取り出した。表25において示される値は、各群由来の3匹のマウスの脾臓からの結果を示す。表25において囲まれた値は、pCMVKm2.GagMod.SF2DNAおよび/またはシンドビスGagMod.SF2ウイルス粒子を単独かまたは組み合わせてのいずれかで用いて、免疫化を受けたマウスの全ての群が、抗原特異的CTL活性を示すことを示した。a20μgb107粒子第2の免疫化後の3週間目第7週におけるHIV-1SF2Gagを発現する組換えワクシニアウイルスを用いるチャレンジ。脾臓を5週間後に取り出す。エキソビボCTLアッセイを、標準的な51Cr放出アッセイにより実施した。示された値は、群あたりの3つのプールされたマウスの脾臓から得られる。B.Env含有DNAおよび/またはシンドビド粒子を用いるインビボでの免疫化Balb/Cマウスを、プラスミドDNAおよび/またはシンドビスイルスRNA含有粒子それぞれgp120.modUS4配列を含むを用いて以下の表に示されるように0週間目および4週間目に筋肉注射により免疫化した。処置レジメンおよび抗体力価を表26に示す。抗体力価を、プレートを被覆するgp120SF2タンパク質を用いるELISAにより決定した。上記に示されたデータから見られ得るように、全てのマウスは、概して、採血番号2により実質的な免疫学的応答を実証した。Envに関して、最良の結果は、i第1の免疫のための50μgのgp120.modUS4DNAに続く、50μgのgp120.modUS4DNAを用いての第2の免疫か、またはii第1の免疫のための25μgのgp120.modUS4DNAに続く、107pfuのシンドビスを用いての第2の免疫のいずれかを用いて得られた。上記に示された結果は、本発明のEnvタンパク質およびGagタンパク質が、シンドビスベクター系これは、合成Env例えば、gp120.modUS4発現カセットまたはGag発現カセットを含むを用いて免疫応答を誘導するのに有効であることを実証する。実施例15モノシストロニック構築物およびビシストロニックbicistronic構築物としてのEnvおよびGagの同時トランスフェクションi野生型US4EnvポリペプチドおよびSF162Envポリペプチド、ii合成US4EnvポリペプチドおよびSF162Envポリペプチドgp160.modUS4、gp160.modUS4.delV1/V2、gp160.modSF162、およびgp120.modSF162.delV2、ならびにiiiSF2gagポリペプチドすなわち、SF2改変体から得られるGagコード配列またはgagSF2に対応する最適化配列--gag.modSF2をコードするDNA構築物を調製した。これらのモノシストロニック構築物を、以下の組み合わせを用いる過性トランスフェクションプロトコルにおいて、293T細胞に同時トランスフェクトした:gp160.modUS4;gp160.modUS4およびgag.modSF2;gp160.modUS4.delV1/V2;gp160.modUS4.delV1/V2およびgag.modSF2;gp160.modSF162およびgag.modSF2;gp120.modSF162.delV2およびgag.modSF2;ならびにgag.modSF2単独。さらなるいくつかのビシストロニック構築物を、作製した。ここで、EnvおよびGagのコード配列は、単一のCMVプロモーターの制御下であり、そして二つのコード配列の間に、IRESinternalribosomeentrysiteEMCVIRES;Kozak,M.,CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology2745:385-402,1992;Witherell,G.W.ら、Virology214:660-663,1995配列を、Envコード配列の後およびGagコード配列の前に導入した。これらの構築物は、下記の通りであった:gp160.modUS4.gag.modSF2配列番号73図61;gp160.modUSF162.gag.modSF2配列番号74図62;gp160.modUS4.delV1/V2.gag.modSF2配列番号75図63;ならびにgp160.modSF162.delV2.gag.modSF2配列番号76図64。細胞培養物由来の上清を、0.45μmフィルターを通して濾過して、次いで20スクロースクッションを通して、SW28ローターにおいて24,000rpm140,000×gで2時間、超遠心した。ペレット化した物質を、懸濁して、そして20~60スクロース勾配に層化して、そしてSW41Tiローターで40,000rpm285,000×gで2時間スピンした。勾配を、1.0mlサンプルに分画した。合計9~10の画分を代表的に、各DNAトランスフェクション群から収集した。この画分を、Envタンパク質およびGagタンパク質の存在について、試験した全ての画分にわたって。これらの結果は、適切なタンパク質が、トランスフェクトした細胞において発現されることを実証したすなわち、Envコード配列が存在する場合、対応するEnvタンパク質が検出され;Gagコード配列が存在する場合、対応するGagタンパク質が検出された。ウイルス様粒子VLPは、選択されたスクロース密度の範囲にわたって、存在することが既知であった。キメラウイルス様粒子VLPが、EnvおよびGagの両方を含む構築物の全ての試験された組み合わせを用いて形成された。gp160.modUS4.delV1/V2およびgag.modSF2を用いてトランスフェクトされた細胞から収集された上清において、他の全ての上清においてよりも有意に多いタンパク質が見出された。ウエスタンブロット分析もまた、各トランスフェクション由来のスクロース勾配画分で実施された。この結果は、ビシストロニックプラスミドが、モノシストロニックプラスミドでの同時トランスフェクションを用いて得られた量よりも少量のVLPを与えたことを示す。これらの細胞株によるキメラVLPの産生を実証するために、以下の電子顕微鏡分析を実施した。293T細胞を、トランスフェクションの前日に、100mm皿に60~70コンフルエンスの密度でプレートした。この細胞を、トランスフェクション試薬LT1PanveraCorporation,545ScienceDr.,Madison,WI中の10μgのDNAを用いて、トランスフェクトした。この細胞を、還元血清培地opti-MEM,Gibco-BRL,Gaithersburg,MD中で一晩インキュベートした。この培地を、翌日の朝にIMDM中10胎仔ウシ血清、2グルタミンで置換して、そして細胞を65時間インキュベートした。上清および溶解物を、上記のような分析のために収集した実施例2を参照のこと。固定されたトランスフェクト293T細胞および精製されたENV-GAGVLPを、電子顕微鏡により分析した。この細胞を、以下のように固定した。細胞単層をPBSで2回洗浄して、そして2グルタルアルデヒドで固定した。精製されたVLPに関して、勾配ピーク画分を収集して、そして2時間、超遠心24,000rpmにより濃縮した。電子顕微鏡分析は、T.S.BenedictYen教授VeteransAffairs,MedicalCenter,SanFrancisco,CAにより実施された。電子顕微鏡検を、透過性電子顕微鏡Zeiss10cを用いて、実施した。この細胞を、オスミウムで前染色して、そして酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色した。免疫染色を行い、VLPのエンベロープを可視化した。倍率は、100,000倍であった。図65A~65Fは、以下の構築物でトランスフェクトされた293T細胞の顕微鏡写真を示す:図65A、gag.modSF2;図65B、gp160.modUS4;図65C、gp160.modUS4.delV1/V2.gag.modSF2ビシストロニックEnvおよびビシストロニックGag;図65Dおよび65E、gp160.modUS4.delV1/V2およびgag.modSF2;ならびに図65F、gp120.modSF162.delV2およびgag.modSF2。図において、Envタンパク質を付加decorateされた推定サイズ約100nmの遊離かつ出芽した未熟ウイルス様粒子VLPが観察される。要するに、構築物を細胞内に同時トランスフェクトする場合、gp160ポリペプチドが、GagVLPに取り込まれる。高合成発現由来のV欠失Envポリペプチドをコードする構築物を用いる場合、取り込みの効率は、2~3倍高い。本発明の好ましい実施形態が、幾分詳細に記載されているが、明らかな変化が、添付の特許の請求の範囲により規定されるような、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされなけれ得ることが理解される。[配列表]"