"DNA依存性DNAポリメラーゼと、少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドとを含むことを特徴とするキット。DNA依存性DNAポリメラーゼと、鋳型DNA分子、DNAプライマー分子、および前記DNA依存性ポリメラーゼによって合成されるdsDNAから置換されるかあるいは前記dsDNAに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムとを含むことを特徴とするキット。請求項1または2に記載のキットにおいて、少なくとも、ホスホトランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とするキット。請求項1~3のいずれか一項に記載のキットにおいて、少なくとも1つの天然または修飾デオキシヌクレオシドをさらに含むことを特徴とするキット。請求項1~4のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび/またはデオキシシチジンまたはこれらの混合物から選択されることを特徴とするキット。請求項1~5のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記少なくとも1つの修飾デオキシヌクレオシドが、BrdUおよび/またはIdU、またはこれらの混合物などの修飾チミジンおよび修飾シチジンから選択されることを特徴とするキット。請求項1~6のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とするキット。請求項7に記載のキットにおいて、前記蛍光部分および消光部分が、一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とするキット。請求項2~6のいずれか一項に記載のキットにおいて、前記蛍光部分が、PicoGreen、EvadyeまたはSYBRGreenIなどの二本鎖DNA表面結合または挿入分子であることを特徴とするキット。請求項7または8に記載のキットにおいて、前記一本鎖DNAプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とするキット。請求項9に記載のキットにおいて、前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼまたはTthポリメラーゼなどの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするキット。請求項7または8に記載のキットにおいて、前記一本鎖DNAプローブに結合された前記蛍光部分が、その無傷の形態でその標的鋳型とハイブリッド形成した場合に最大蛍光を達成することを特徴とするキット。サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性を測定するための方法において、a.容器中のサンプルを、DNA依存性DNAポリメラーゼと、少なくとも1つのデオキシヌクレオシドと、鋳型DNA分子、DNAプライマー分子、および前記DNA依存性ポリメラーゼによって合成されるdsDNAに取り込まれるか前記dsDNAから置換されるかあるいは前記dsDNAに結合されることが可能である蛍光部分を含む検出システムとを含む反応混合物と接触させるステップと、b.前記容器をインキュベートするステップと、c.前記蛍光部分からのシグナルを測定するステップと、d.前記蛍光部分からのシグナルを、前記サンプル中のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性と関連付けるステップとを特徴とする方法。請求項13に記載の方法において、前記少なくとも1つのデオキシヌクレオシドが、天然もしくは修飾デオキシヌクレオシドまたはこれらの混合物であることを特徴とする方法。請求項13または14に記載の方法において、前記少なくとも1つの天然デオキシヌクレオシドが、デオキシチミジンおよび/またはデオキシシチジンまたはこれらの混合物から選択されることを特徴とする方法。請求項13または14に記載の方法において、前記少なくとも1つの修飾デオキシヌクレオシドが、BrdUおよび/またはIdU、またはこれらの混合物などの修飾チミジンおよび修飾シチジンから選択されることを特徴とする方法。請求項13~16のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とする方法。請求項13~17のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分および消光部分が、一本鎖DNAプローブに結合されることを特徴とする方法。請求項13~16のいずれか一項に記載の方法において、前記蛍光部分が、PicoGreen、EvadyeまたはSYBRGreenIなどの二本鎖DNA表面結合または挿入分子であることを特徴とする方法。請求項13~18のいずれか一項に記載の方法において、前記一本鎖DNAプローブがその無傷の形態である場合に、前記プローブに結合された前記蛍光部分が消光されることを特徴とする方法。請求項20に記載の方法において、前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、TaqDNAポリメラーゼまたはTthポリメラーゼなどの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする方法。請求項17または18に記載の方法において、前記一本鎖DNAプローブに結合された前記蛍光部分が、その無傷の形態でその標的鋳型とハイブリッド形成した場合に最大蛍光を達成することを特徴とする方法。定義:本明細書中の全ての用語および単語は、関連技術分野におけるその通常の意味および使用に従って解釈されるべきである。明白にするためにいくつかの用語は以下により具体的に議論される。チミジンおよびデオキシチミジンは、他に記載されない限り、本発明全体にわたって交換可能に使用される。均一アッセイは、プライマー-鋳型システムが伸長されている間にシグナルを発生する非固相アッセイであり、最小限のプライマー伸長後の処理を必要とする。これらのアッセイは分離工程を必要としない。反応は、低親和性相互作用を妨害するためにビーズまたは固相を取り付けることなく完全に溶液中で生じる。均一アッセイ方法は、創薬において必要とされるスループットのためおよびアッセイの小型化のために必須である。あらゆる均一アッセイにおいて、アッセイの成分は全て測定中ずっと存在している。分離工程の排除はこれらのアッセイの大きな利点であるが、これは、アッセイ成分の非特異的測定のために困難を呈するソース:http://www.genomicglossaries.com/content/Assays.asp、2010年4月28日に検索。デオキシヌクレオシドは、五炭糖デオキシリボースに取り付けられた窒素含有塩基から構成される分子である。デオキシヌクレオシドは、デオキシリボース糖に結合された単純な塩基と呼ばれることが多い。天然デオキシヌクレオシドは、非修飾デオキシヌクレオシドと定義される。これらの例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。天然デオキシヌクレオシドは、ヒトなどの野生型生物において存在する形態のデオキシヌクレオシドである。ヌクレオシド類似体とも呼ばれる修飾デオキシヌクレオシドは、グリコシルアミンまたは核酸塩基において任意のタイプの修飾を有するデオキシヌクレオシドである。医学において、いくつかのヌクレオシド類似体は、抗ウィルス薬または抗癌薬として使用される。修飾デオキシヌクレオシドの例は、アジドチミジンAZT、ブロモ-デオキシウリジンBr-dU、ヨード-デオキシウリジン、ビニル-デオキシチミジンおよびフルオロ-デオキシウリジンである。DNA依存性DNAポリメラーゼは、鋳型としての役割を果たす一本鎖DNAによる、デオキシリボヌクレオシド三リン酸のデオキシリボ核酸への構築を触媒する酵素である。いくつかの文献では、DNA依存性DNAポリメラーゼは、DNA指向性DNAポリメラーゼとも呼ばれ得る。DNA依存性DNAポリメラーゼは、3つの別個の酵素活性:aデオキシヌクレオシド5’-三リン酸から生成されるモノヌクレオチド単位の、プライマー鎖の3’-ヒドロキシル末端への付加を鋳型DNAの指示下で触媒する5’→3’ポリメラーゼ活性と、b二重鎖DNAにおいてのみ活性な5’→3’エキソヌクレアーゼと、c不適正な末端ヌクレオチドを選択的に除去することができる、主として一本鎖DNAにおいて活性な3’→5’エキソヌクレアーゼとを有することができる。DNAポリメラーゼIに加えて、TaqDNAポリメラーゼおよびTthポリメラーゼサーマスサーモフィラスThermusthermofilusに由来だけがこれまでに確認された5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNA依存性ポリメラーゼであることに留意されたい。鋳型DNA分子は、DNA依存性DNAポリメラーゼのための鋳型としての役割を果たすssDNA分子である。DNAプライマー分子は、一続きの鋳型DNA分子に相補的な短いDNA分子であり、DNA依存性DNAポリメラーゼによるDNA重合のためのプライマーとしての役割を果たす。無傷の形態intactform:本発明で使用されるDNAプローブは、本発明に従うあらゆるポリメラーゼ反応が実施される前の形態である場合に、その無傷の形態であるといわれる。サルベージ合成経路は図1に示されており、TTPおよびdCTPの合成のための経路の1つである。TTPおよびdCTPは、チミジンおよびデオキシシチジンの対応するデオキシヌクレオシドの三リン酸塩である。これらはまず、デオキシリボヌクレオシドキナーゼの助けを借りて、例えばATPからのリン酸基を移動して、対応する一リン酸塩のTMPまたはdCMPを生じることによって生成される。dTMPキナーゼおよびシチジル酸cytidylateキナーゼは、対応する二リン酸ヌクレオシドのTDPおよびdCDPの形成を触媒する。ヌクレオシド二リン酸キナーゼは、二リン酸塩を最終の三リン酸ヌクレオチドに変換する。RNA依存性DNAポリメラーゼは、第1の鎖の合成中に鋳型としての役割を果たす一本鎖RNAによる、デオキシリボヌクレオシド三リン酸のデオキシリボ核酸への構築を触媒する酵素である。使用される略語ATPアデノシン5’-三リン酸AZTMPアジド-チミジン一リン酸BrdUブロモデオキシウリジンdCDPデオキシシチジン二リン酸dCKデオキシシチジンキナーゼEC2.7.1.21;ATP:シチジン-5’-ホスホトランスフェラーゼdCMPデオキシシチジン一リン酸dCMPKシチジル酸キナーゼ:EC2.7.4.14;ATP:dCMPホスホトランスフェラーゼdsDNA二本鎖DNAhrdCKヒト組換えデオキシヌクレオシドキナーゼhrTK1ヒト組換えチミジンキナーゼ1MMXMasterMix[サンプルなしの試薬混合物]NdPKヌクレオシド二リン酸キナーゼ:EC2.7.4.6;ATP:ヌクレオシド二リン酸ホスホトランスフェラーゼhrTK1ヒト組換えチミジンキナーゼ1ssDNA一本鎖DNATDPデオキシチミジン二リン酸TKチミジンキナーゼ:EC2.7.1.21;ATP:チミジン-5’-ホスホトランスフェラーゼTMPKdTMPキナーゼ:EC2.7.4.9;ATP:TMPホスホトランスフェラーゼTMPデオキシチミジン一リン酸以下は、本明細書のこのセクションに記載される全ての検出システムに適用される。-反応チューブおよびPCR機器は、実施例1に続く全ての実施例について同一である。-緩衝混合物は、実施例1に続く全ての実施例について同一である。-MMXは、試験すべきデオキシリボヌクレオシドキナーゼ含有サンプルデオキシリボヌクレオシドキナーゼサンプルが緩衝液で置き換えられた負の対照を含むを除く全ての成分を含むと定義される。-サンプルは、組換えもしくは精製デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、またはこれらを含む血清もしくは血漿のいずれかであり得る。-デオキシリボヌクレオシドキナーゼの希釈は、全ての実施例に対して、表2に記載される緩衝液中で行われる。-反応容積は検出システムに関係なく25μlである。-全てのサンプルは、使用される検出システムに関係なく3通り実行される。実施例1:検出システム1に従うhrTK1標準曲線200pg、20pgおよび2pgのhrTK1から、hrTK1触媒活性値を示す標準曲線を作成した。hrTK1の負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、0pgの標準点を含有させた。hrTK1の比活性は、2.1μmol分-1mg-1であった。各標準点を3通り実行した。hrTK1は、TK希釈緩衝液表2中に希釈した。簡単に言うと、酵素混合物は、500×に希釈1回の反応につき0.01単位の最終触媒濃度を与えるした酵母からのNdPKと、50×に希釈1回の反応につき36ngに等しいしたTMPKと共に、hrTK1の各標準点を含有するように調製した。酵母NdPKおよび組換えTMPKの比活性は、それぞれ5.4および3μmol/分/mgであると推定される。緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチド混合物を表4に従って調製した。各標準点に対する3.225μlのMMXは、緩衝混合物、基質混合物、およびオリゴヌクレオチド混合物表3を0.8UのKlenowexo-DNAポリメラーゼと一緒に混合することによって、1.5mlのポリプロピレン微小遠心管中室温で調製した0pgのhrTK1の負の対照を含む。鋳型を含まない対照MMXNo-Template-ControlMMX中に200pgの酵素混合物を含有させた。100μlのPCRチューブQiagenGmbHに25μlを3通り分配した。チューブを閉め、Rotor-GeneQ3000QiagenGmbHリアルタイムPCR機器に入れた。実行プロファイルは、142°Cで2分間保持、235°Cで1分間保持、337°Cで15分間保持、4サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、SYBRGreenI登録商標/FAMチャネル470nmで励起、510nmで検出に対してシグナルを獲得した。各サイクルを90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。結果蛍光の規格化はサイクル1から行った。90サイクル分の後に交差する0pgのhrTK1に対する閾値を選択した。この実施例では、0.000標準蛍光単位における閾値を得た。X軸には、それぞれの標準点からの活性デオキシリボヌクレオシドキナーゼのpgで与えられるが与えられる。各標準点は、pgx;Cty値を保有する。0.965のR2値が得られ、標準曲線が、サンプル中のTKU/lの量を決定するための手段としての役割を果たすことができることが示される。実施例2.検出システム1に従うhrdCKからのdCK標準曲線20000pg、2000pg、200pg、20pgおよび2pgの酵素から、hrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。hrdCKの負の対照として、そして規格化された蛍光の閾値レベルの決定のために、0pgの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、hrTK1の各標準点と、実施例1と同様のNdPKと、50×に希釈1回の反応につき48ngの酵素に等しいしたdCMPKとを含有するように調製した表4。組換えdCMPKの比活性は、35μmol/分/mgであると推定される。3.225μlのMMXは、緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチドを0.8UのKlenowexo-断片DNAポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、1.5mlのポリプロピレン微小遠心機中室温で調製した0pgのhrdCKの負の対照を含む。MMX調製物は、dCTPがMMX中TTPで置き換えられることを除いて、実施例1の場合と同一であった。オリゴヌクレオチド混合物は表4に従う。最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物を添加した。2000pgのhrdCKの酵素混合物をNTCMMX中に含有させた。次に、3つの別個のPCRチューブに25μlを分配した。チューブを閉め、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで2分間保持、235°Cで1分間保持、337°Cで15分間保持、4サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、SYBRGreenI登録商標/FAMチャネル470nmで励起、510nmで検出に対してシグナルを獲得した。各サイクルを90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。結果蛍光の規格化はサイクル1からである。90分後の0pgに対する閾値を選択した。閾値を0.017標準蛍光単位に設定した。X軸には、それぞれの標準点からの活性デオキシリボヌクレオシドキナーゼのpgで与えられるが与えられる。各標準点は、pgx;Cty値を保有する図4。実施例3検出システム2に従うhrTK1標準曲線200pg、20pgおよび2pgのhrTK1から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。0pgの標準点を負の対照として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、hrTK1標準点と、実施例1の場合と同様のNdPKおよびTMPKとを含有するように調製した。MMXは、0.4UのTaqDNAポリメラーゼがKlenowDNAポリメラーゼの代わりに用いられ、オリゴヌクレオチドが表5に従ったことを除いて、実施例1の場合と同様に調製した。最後に、それぞれの標準点の酵素混合物を各専用MMXに添加した。200pgの酵素混合物をNTC中に含有させた。各標準点混合物から25μlを3つのPCRチューブに分配した。チューブにフタをし、PCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで1分間保持、235°Cで1分間保持、3サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、SYBRGreenI登録商標/FAMチャネル470nmで励起、510nmで検出に対してシグナルを獲得した。各1分間サイクルを60回繰り返した。全アッセイ時間は65分間である。結果図12は、この実験から得られる生の蛍光を示す。生の蛍光を標準規格化した。すなわち、最初の5回のサイクルにわたって単に計算し、サイクル1から開始して直線化した図5。それぞれの標準点に対するCtの数X軸を決定するために、閾値レベルを約60分後の2pgに対して選択した。閾値は、標準蛍光単位の0.12Y軸であることが分かった。内臓ソフトウェアRotor-genev.6.01を用いて、選択された閾値に対してCt値を決定した。各標準点Ctの平均Y軸およびhrTK1のpg値X軸の対数回帰プロットによって、得られた標準曲線を使用して本当のサンプルの単位活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られた。アッセイの精度性能CV結果は、以下の表6に要約される。Ct値が反応中のhrTKのピコグラムからの活性に対応することに注意されたい。この特定の構築物の比活性が2.1μmol/分/酵素1mgであることが分かれば、実際の触媒濃度を推定することが可能である。しかしながら、国際単位定義すなわち、1U=1μmol/分/lに従うためのTK活性の標準化がまだ存在しないので、単純な理由だけで、この実施例では対応するピコグラム活性が与えられる。検出システム2に従うHrdCKからのdCK標準曲線20000pg、2000pg、200pg、20pgおよび2pgの酵素から、HrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。負の対照として0pgの標準点を含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、標準点と、実施例1および2で与えられるようなNdPKおよびdCMPKとを含有するように調製した。3.225μlのMMXは、緩衝混合物、基質混合物、オリゴヌクレオチド混合物表7を0.4UのTaqDNAポリメラーゼと一緒に混合することによって、各標準点に対して、1.5mlのポリプロピレン微小遠心管中室温で調製した0pgのdCKの負の対照を含む。オリゴヌクレオチドを以下の表7で与えられるもので置き換えたことに注意されたい。最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物をMMXに添加した。20000pgの酵素混合物をNTCMMX中に含有させた。25μlのMMXおよび標準点混合物を3つのPCRチューブに分配した。チューブにフタをし、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで1分間保持、235°Cで1分間保持、3サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、JOEチャネル530nmで励起、555nmで検出に対してシグナルを獲得した。各サイクルを60回繰り返した。全アッセイ時間は65分間である。結果dCKのpg値の各標準点に対するCt値は、実施例3に記載されるように得た。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのdCK活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られた。精度性能結果は、表8に要約される。対数スケールの線形回帰は図7に示される。実施例5.検出システム3に従うhrTK1標準曲線200pg、20pgおよび2pgの酵素から、hrTK1触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、実施例3に記載されるようなNdPKおよびTMPKと一緒にヌクレオシド標準点を含有するように調製した。3.225μlmpMMXは、以下の点:DNA依存性DNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドを以下の表9に与えられるもので置き換えた点を除いて、実施例3に従って調製した。最後に、それぞれの標準点からの酵素混合物をそれぞれのMMXに添加した。200pgの酵素混合物をNTC中に含有させた。チューブを閉め、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで1分間保持、235°Cで1分間保持、337°Cで15分間保持、4サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、FAMチャネルに対してシグナルを獲得し、90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。閾値は90分における0pgに対して選択した。結果図xは、置換されたFAM/Dabcyl分子ビーコンプローブからの生の蛍光の減少をリアルタイムで示す。閾値は0.012標準蛍光単位に設定される。図14は、3つの標準点から得られたCt値の平均の対数回帰を示す。R2値は0.96である。直線的な蛍光の対数回帰によって、この標準曲線を使用して本当の臨床サンプルからのdCK活性値を決定することの妥当性を示す0.98のR2値が得られる。実施例6.検出システム3に従うhrdCK標準曲線2000pg、200pg、および20pgおよび2pgの酵素から、hrdCK触媒活性値を示す標準曲線を作成した。0pgの標準点を負の対照として、そして規格化された蛍光値の閾値を設定するために含有させた。簡単に言うと、それぞれのヌクレオシドキナーゼのための酵素混合物は、ヌクレオシド標準点と、実施例2および4に従うNdPKおよびdCMPKとを含有するように調製した。3.225μlのMMXは、オリゴヌクレオチドが以下の表10に従うことを除いて、実施例5に従って調製した。最後に、それぞれのヌクレオシドおよびそれぞれの標準点からの酵素混合物をそれぞれのMMXに添加した。200pgの酵素混合物をNTCMMX中に含有させた。各標準点から3つの100μlのPCRチューブに25μlを分配し、フタをし、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで1分間保持、235°Cで1分間保持、3サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、JOEチャネルに対してシグナルを獲得した。各サイクルを90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。結果蛍光シグナルの規格化はサイクル1からである。閾値は、90分後の0pgに対して選択した。平均Ct値の対数回帰は4つの標準点からである。R2値は0.96である。実施例7.異なる量の各デオキシリボヌクレオシドキナーゼを有する混合物を用いる検出システム2に従うhrTK1およびhrdCKの多重決定以下の表11で与えられる異なるhrTK1およびhrdCKの触媒活性値を有する混合物から標準曲線を作成した。簡単に言うと、酵素混合物は、実施例1および2に従うNdPK、TMPKおよびdCMPKと一緒に、各標準点hrTK1/hrdCK点を含むように調製した。MMXは、以下の点:実施例4からのオリゴヌクレオチドを含有させ、NdPKが0.02U/反応である点を除いて、実施例3に従って調製した。最後に、それぞれの酵素混合物を各MMXに添加した。チューブにフタをし、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで2分間保持、235°Cで1分間保持、337°Cで15分間保持、4サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、FAM/SYBRチャネルに対して、そして、JOEチャネルからシグナルをそれぞれ獲得した。各サイクルを90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。サイクル1からの規格化を開始した。閾値は90分後の0pgのTKに対して選択した。結果図8は、多重化実験からの対数スケールの線形回帰結果を示す。Y軸は、検出に必要とされるCtの数である。X軸は、それぞれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼからの任意のpg活性である。結果は明らかに、いずれのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの量も他方のプライマー伸長効率に影響を与えないことを示す。関連する2つのデオキシリボヌクレオシドキナーゼの異なる傾斜は、恐らく、これらの酵素が示し得る異なる比活性によるものである。実施例8検出システム2に従うイヌ血清サンプル中の野生型TKの触媒濃度の決定およびTK-REA法との相関事前に悪性疾患を有することが診断されたイヌ血清サンプルを、検出システム2に従ってhrTK1触媒濃度について試験した。各血清は、TK-REA法によって予め測定されている。標準曲線には、200pg、20pgおよび2pgのhrTK1からの触媒活性を含有させた。実験は、以下の点:1血清サンプルTK希釈緩衝液がhrTK1の代わりに使用され、血清を5の最終濃度まで添加したこと、すなわち、各反応中に1.25μlの血清を含有させたMMX/酵素混合物当たり4μlの血清ことと、2サイクリングプロファイルが実施例1に従ったこととを除いて、実施例2に従って実行した。規格化はサイクル1からであった。閾値は、90分後の0pgのTKに対して選択した。結果Rotor-Genev.6.1ソフトウェアQiagenGmbHを用いて、各標準点および血清サンプルに対するCtを得た。サンプルおよび標準曲線において対数スケールの線形回帰を実行した図9。2つの血清が最初に得られたTK-REAU/l値に適合できないことがすぐに分かるであろう。>80値を有する第3の血清は直線に適合し得るはずがないので、これも適合されることはできない。従って、これらの3つの血清は異常値であると考えられ、これらの3つの血清を除いた回帰直線を作成した。標準点に対する式と、3つの異常値>80、33.2および9.8のTK-REAU/lを除いた血清サンプルに対する式とは、曲線の傾斜に関して2.4Ctだけ異なる。2つの曲線は同じ傾斜を共有することは明らかである。本発明に従う方法を用いてこの実施例の血清から得られるU/lを評価する際、これは、血清点に対する回帰直線式、すなわち、式y=-10.79Lnx93.784だけを用いて行われる。血清サンプル回帰直線に対するhrTK1のpgの相関は、標準点回帰曲線に対して与えられるTKのpg活性量に関して、式U/l=e^11.79lnpgx21.085/10.67を用いるだけで解決される。図9において、各標準点は[pgTKX;CtY]で表され、各血清は、[TK-REAU/lTKX;CtY]で表される。R2値は、各曲線に対して与えられる。図9中のOLは、異常値の血清を示す。図9からの結果は精度データと共に、表12および13において一覧にされる。興味深いことに、>80U/lサンプルは、延長された血清回帰直線への外挿による希釈を必要とせずに、本発明に従う方法を用いて評価されて、450U/lTK-REAの対応する単位を有し得る。実施例9SYBRGreenI技術の原理、すなわち検出システム1を用いる血清添加hrTK1サンプルの決定Diasorins.r.l.SaluggiaItalyからのTK-REA製品を用いてTK1活性が予め測定されているイヌからの血清を、SYBRgreen技術の原理を用いて試験した。血液提供者からの10ヒト正常血清が添加された、40pg、20pg、4pg、2pgおよび0pgのhrTK1からの触媒活性を示す標準曲線サンプルを、血清サンプル最終10と一緒に測定した。0pgの添加標準点サンプルを負の対照および規格化された蛍光の閾値決定因子として含有させた。簡単に言うと、酵素混合物は、0.002UのNdPKと、1回の反応につき18ngのdTMPキナーゼと、各hrTK1標準点サンプルまたは各血清サンプルとを含有するように調製した。緩衝混合物、基質混合物およびオリゴヌクレオチド混合物は表3に従って調製した。各サンプルに対するMMXは、1.5mlのポリプロピレン微量遠心管中室温で、水と、混合物と、0.5UのKlenowexo-DNAポリメラーゼFermentasAGとを混合することによって調製した。MMX200pgのhrTK1の酵素混合物標準点サンプルは、No-Template-ControlNTCとして使用した。サンプルを分配し、チューブを閉め、リアルタイムPCR機器に入れた。実行プロファイルは、140°Cで1分間保持、230°Cで1分間保持、335°Cで10分間保持4サイクリング:35°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、SYBRGreenI登録商標チャネル470nmで励起、510nmで検出に対してシグナルを獲得した。各サイクルを60回繰り返した。結果蛍光の規格化を獲得し、標準規格化を用いてサイクル1から直線にした図10すなわち、最初の5回のサイクルからの平均蛍光を使用して、ソフトウェア供給者に従って、その後のサイクルから得られる蛍光から推定されるバックグラウンド蛍光を決定した。NTC閾値カットオフは、蛍光の最高の増大を有するサンプルの4である。内臓ソフトウェアRotor-genev.6.01CorbettResearch,Australiaを用いて、選択された閾値対してCt値を決定した。約56サイクルCtの後に交差する0pgのhrTK1に対して閾値を選択した。この実施例では、0.03295標準蛍光単位における閾値を得た。図11は、得られたCt値の対数スケールの線形回帰を示す。X軸には、hrTK1のpgとして、あるいはTK-REAU/lとして、それぞれのサンプルからの活性が与えられる。各サンプル点は、pg/TK-REAU/lX;Cty値を有する。血清添加hrTK1標準点サンプル対して線形回帰および0.9688のR2スコアが得られ、サンプル中のTKU/lの量を決定するために相関が十分良好であることが示された。傾斜間の関係をさらに決定するために、2つの別々の回帰曲線に対してスチューデントのt検定を適用した。データセットが小さいため、t検定は手作業で計算した。分散は等しいがサンプルサイズが等しくない検定を実施した。データセットにおける0.07のスコアは、傾斜が等しいと考えられる可能性が高いことを示した。実施例10.鎖置換技術の原理を用いて、すなわち検出システム3に従って得られたhrTK1標準曲線80pg、40pg、20pg、8pg、4pg、2pgおよび0pgのhrTK1から、触媒活性値を示す標準曲線を作成した。簡単に言うと、MMXは、各標準点に対して、実施例2および表7に記載されるように調製した。80pgのhrTK1含有酵素混合物をNTC中に含有させた。MMXを分配し、チューブを閉じ、リアルタイムPCR機器に入れた。サイクリングプロファイルは、142°Cで1分間保持、235°Cで1分間保持、337°Cで15分間保持、4サイクリング:37°Cで30秒間→37°Cで30秒間であり、FAMチャネルに対してシグナルを獲得し、90回繰り返した。全アッセイ時間は108分間である。閾値は90分における0pgに対して選択した。結果図12は、置換されたFAM分子ビーコンヘアピンプローブからの規格化された蛍光からの減少をリアルタイムで示す。使用した規格化方法は、ソフトウェア提供者の説明書Corbett-Researchに従うダイナミックチューブ規格化であった。閾値は、-マイナス0.02118標準蛍光単位に設定した。図13は、6つの標準点から得られる平均Ct値の対数スケールの線形回帰を示す。R2値は0.9422であり、血清または血漿からの臨床サンプル中のTK活性の決定のために標準曲線が適用され得ることが示される。参考文献ErikssonS,Munch-PetersenB,JohanssonK,EklundH.Structureandfunctionofcellulardeoxyribonucleosidekinases.CellMolLifeSci.2002598:1327-46.TopolcanOandHolubecL.Jr.Theroleofthymidinekinaseincancerdiseases.Expert.Opin.Med.Diagn.200822:129-141特許:米国特許出願公開第2008/0248472号明細書、欧州特許第1385005号明細書、国際公開第2009/063254号パンフレット"