"アミノ末端からカルボキシル末端に、P1-L1-D-L2-P2を含む可溶性ポリペプチド融合物であって:P1は配列番号:2のアミノ酸残基25-141と少なくとも95同一性を有する第1のポリペプチドであり;L1は第1のポリペプチドリンカーであり;Dは二量体化ドメインであり;L2は第2のポリペプチドリンカーであり;P2は配列番号:2のアミノ酸残基25-141と少なくとも95同一性を有する第2のポリペプチドであり;該ポリペプチド融合物は、CD155の細胞外ドメイン配列番号:22のアミノ酸残基28-343に特異的に結合することができる、融合物。アミノ末端からカルボキシル末端に、P2-L2-P1-L1-Dを含む可溶性ポリペプチド融合物であって:P1は配列番号:2のアミノ酸残基25-141と少なくとも95同一性を有する第1のポリペプチドであり;L1は第1のポリペプチドリンカーであり;Dは二量体化ドメインであり;L2は第2のポリペプチドリンカーであり;P2は配列番号:2のアミノ酸残基25-141と少なくとも95同一性を有する第2のポリペプチドであり;該ポリペプチド融合物は、CD155の細胞外ドメイン配列番号:22のアミノ酸残基28-343に特異的に結合することができる、融合物。P1およびP2の少なくとも1つが、配列番号:2のアミノ酸残基25-141と100同一性を有する、請求項1または2に記載のポリペプチド融合物。P1およびP2の少なくとも1つが、配列番号:18の残基23-139に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載のポリペプチド融合物。Dが免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド融合物。L1が15から32個のアミノ酸残基からなり、該残基の1から8個がシステイン残基である、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド融合物。L2が、複数のグリシン残基を含み、少なくとも1個のセリン残基を含んでいてもよい、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド融合物。L2が、配列番号:21に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のポリペプチド融合物。配列番号:18の残基23-493に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド融合物。配列番号:20の残基23-508または23-507に示されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のポリペプチド融合物。請求項1から10のいずれかに記載のポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチド。以下の作動可能に連結した成分:転写プロモーター;請求項1から10のいずれかに記載のポリペプチド融合物をコードするDNAセグメント;および転写ターミネーターを含む発現ベクター。請求項12に記載の発現ベクターを導入されている培養細胞であって、DNAセグメントを発現する、培養細胞。ポリペプチド融合物を製造する方法であって:請求項12に記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養すること、ここに、該細胞はDNAセグメントを発現し、コードされたポリペプチド融合物が生産される;および該ポリペプチド融合物を回収することを含む、方法。請求項1から10のいずれかに記載の二量体タンパク質;および薬学的に許容される担体を含む組成物。T細胞介在免疫障害を処置する方法であって、有効量の請求項1から10のいずれかに記載のポリペプチド融合物を、該T細胞介在免疫障害を有する対象に投与することを含む方法。該自己免疫疾患が、リウマチ性関節炎および多発性硬化症から選択される、請求項16に記載の方法。発明の詳細な説明I.概観本発明は、可溶性二量体融合タンパク質に関する組成物および方法を提供する。一般的に、本発明の二量体融合タンパク質は、二量体化ドメインを介して連結された第1および第2のポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖は、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応する第1および第2のポリペプチドセグメントを含む本明細書において単量体または単量体ドメインとしても称される。したがって、二量体融合タンパク質は、一般的に単量体ドメインに対して四価である。それぞれのポリペプチド鎖の第1および第2の単量体ドメインは、同じか、または異なっていてよい。1つの態様において、二量体融合タンパク質の単量体ドメインは同じであり、特定の単量体ドメインに対して四価である分子を提供する。第1および第2の単量体ドメインは、それぞれ、二量体化ドメインに対してアミノ末端およびカルボキシル末端に位置し得る本明細書においてバーベル型としても称される。あるいは、第1および第2の単量体ドメインは、両方とも、二量体化ドメインに対してカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにタンデムに位置し得る本明細書においてタンデム型としても称される。特定の局面において、本発明は、可溶性二量体VSTM3B7R1融合タンパク質に関する組成物および方法ならびにT細胞介在免疫障害、特にT細胞介在自己免疫疾患の処置のためのそれらの使用を提供する。本発明において、二量体VSTM3融合物は、二量体化ドメインを介して連結された第1および第2のポリペプチド鎖を含み、それぞれのポリペプチド鎖はVSTM3の細胞外ドメインに対応する第1および第2の単量体ドメインを含む。したがって、二量体VSTM3融合物は、一般的に、VSTM3対抗受容体CD155に対する結合部位に対して四価である。VSTM3細胞外ドメインに対応する第1および第2の単量体ドメインは、上記に要約されたバーベルまたはタンデム型のいずれかに位置し得る。本明細書においてさらに記載されているとおり、本発明の二量体VSTM3融合タンパク質は、インビボでのT細胞介在応答の抑制ために特に有効である。II.ポリペプチド融合物および二量体タンパク質したがって、1つの局面において、本発明は、アミノ末端からカルボキシル末端に、P1-L1-D-L2-P2およびP2-L2-P1-L1-Dから選択される式を含む可溶性ポリペプチド融合物であって、P1はi第1の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであるか、またはii第1のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであり;L1は第1のポリペプチドリンカーであり;Dは二量体化ドメインであり;L2は第2のポリペプチドリンカーであり;P2はi第2の細胞表面受容体の細胞外ドメインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントであるか、またはii第2のサイトカインまたはその機能性変異体もしくはフラグメントである融合物を提供する。本発明の特定の態様内で、P1およびP2は同じでありまたは同じ細胞表面受容体またはサイトカイン由来である、ポリペプチド融合物がホモ二量体化されると、P1/P2単量体に対して四量体であるタンパク質を提供する。いくつかの代替態様において、P1およびP2は、異なる細胞表面受容体および/またはサイトカイン由来であり、ポリペプチド融合物がホモ二量体化されると、2つの異なる単量体ドメインP1およびP2に対して二量体であるタンパク質を提供する。例えば、いくつかのバリエーションにおいて、P1は第1の細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、P2は第1と異なっている第2の細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、融合物のホモ二量体化が2つの異なる細胞表面受容体またはその変異体もしくはフラグメントに対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。同様に、他のバリエーションにおいて、P1は第1のサイトカインに対応し、P2は第1と異なっている第2のサイトカインに対応し、融合物のホモ二量体化が2つの異なるサイトカインまたはその変異体もしくはフラグメントに対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。さらに他のバリエーションにおいて、P1は細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応し、P2はサイトカインに対応し逆も同様、融合物のホモ二量体化が細胞表面受容体およびサイトカインまたはそれらの変異体もしくはフラグメントの両方に対してホモ二量体であるタンパク質をもたらす。さらに他の態様において、P1およびP2は、ヘテロ二量体細胞表面受容体の2つの異なるサブユニット由来の細胞外ドメイン、または、ヘテロ二量体サイトカインの2つの異なるサブユニットに対応する。このような態様において、ポリペプチドリンカーL1およびL2は、これらの単量体ドメインが互いに非共有結合し、単一の機能性ヘテロ二量体ユニットを形成することが可能であるように、単一のポリペプチド融合物内で単量体ドメインP1およびP2間の十分な空間および柔軟性を提供するように設計され、その結果、融合物のホモ二量体化が2つのこのような機能性ヘテロ二量体ユニットを有するタンパク質をもたらす。P1および/またはP2が由来し得る細胞表面受容体の例は、例えば、4-1BB;ACTH受容体;アクチビン受容体;BLTRロイコトリエンB4受容体;BMP受容体;C3a受容体;C5a受容体;CCR1;CCR2;CCR3;CCR4;CCR5;CCR6;CCR7;CCR8;CCR9;CD19;CD22;CD27;CD28;CD30;CD40;CD70;CD80;CD86;CTLA-4;CD226;VSTM3B7R1;CD112;CD155;B7H6;NKp30;ICAM;VLA-4;VCAM;CT-1受容体;CX3CR1;CXCR1;CXCR2;CXCR3;CXCR4;CXCR5;D6;DARC;DcR3;DR4;DR5;DcR1;DcR2;ECRF3;Fas;fMLP受容体;G-CSF受容体;GIT受容体;GM-CSF受容体;成長ホルモン受容体;HVEM;BTLA;インターフェロン-α受容体;インターフェロン-β受容体;インターフェロン-γ受容体;IL-1受容体タイプI;IL-1受容体タイプII;IL-10受容体;IL-11受容体;IL-12受容体;IL-13受容体;IL-15受容体;IL-16受容体CD4;IL-17受容体AIL-17RA;IL-17受容体BIL-17RB;IL-17受容体CIL-17RC;IL-17受容体DIL-17RD;IL-17受容体EIL-17RE;IL-18受容体;IL-2受容体;IL-3受容体;IL-4受容体;IL-5受容体;IL-6受容体;IL-7受容体;IL-9受容体;IL-20受容体AIL-20RA;IL-20受容体BIL-20RB;IL-21受容体;IL-22受容体AIL-22RA;IL-22受容体BIL-22RB;IL-28受容体AIL-28RA;IL-27受容体AIL-27RA;IL-31-受容体AIL-28RA;BCMA;TACI;BAFF受容体;免疫調節セマフォリン受容体CD72;カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスGPCR;リポキシンA4受容体;リンホトキシンβ受容体;リゾリン脂質成長因子受容体;ニューロキニン1;エンドルフィンに対するオピオイドμ、δおよびκ受容体;オンコスタチンM受容体;オステオポンチン受容体;オステオプロテゲリン;Ox40;PACAPおよびVIP受容体;PAF受容体;ポックスウイルス;IFNα/β受容体ホモログ;ポックスウイルスIFNγ受容体ホモログ;ポックスウイルスIL-1β受容体ホモログ;ポックスウイルス膜結合Gタンパク質結合受容体ホモログ;ポックスウイルス分泌ケモカイン結合タンパク質;ポックスウイルスTNF受容体ホモログ;プロラクチン受容体;RANK;RON受容体;SCF受容体;ソマトスタチン受容体;T1/ST2;TGF-ベータ受容体;TNF受容体例えば、p60およびp80;TNFRSF19;TPO受容体;US28;XCR1;エリスロポエチン受容体;成長ホルモン受容体;白血病阻害因子受容体;およびC-kit受容体を含む。P1および/またはP2が由来し得るサイトカインの例は、例えば、α-MSH;9E3/cCAF;ACTH;アクチビン;AK155;アンギオスタチン;Apo2L/TRAIL;APRIL;BAFFBLys;BLR1リガンド/BCA-1/BLC/CXCL13;BMPファミリー;BRAK;カルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRP;伝染性軟属腫ウイルスのCCケモカイン;CCL27;CCL28;CD100/Sema4D;CD27リガンド;CD30リガンド;CD40リガンド;CKβ8-1/MPIF-1/CCL23;CLF/CLC;CSF-1;CT-1;CTAP-III、βTGおよびNAP-2//CXCL7;CXCL16;デフェンシン;ELC/MIP-3β/エクソダス-3/CCL19;ENA-78/CXCL5;エンドルフィン;エンドスタチン;エオタキシン2/MPIF-2/CCL24;エオタキシン/CCL11;エリスロポエチン;エクソダス-1/LARC/MIP-3αSCYA20;Fasリガンド;Flt-3リガンド;fMLP;フラクタルカイン/CX3CL1;G-CSF;GCP-2/CXCL6;GM-CSF;成長ホルモン;HCC-1/CCL14;HCC-4/CCL16;高移動度グループボックス1HMGB1;ヒトカテリシジン抗菌性ペプチドLL-37;I-309/CCL1;IFNα、IFNβおよびIFNωリガンド;IL-1α;IL-1β;IL-10;IL-11;IL-12;IL-13;IL-15;IL-16;IL-17A;IL-17B;IL-17C;IL-17D;IL-17E;IL-17F;IL-18;IL-1Ra;IL-2;IL-27;IL-3;IL-4;IL-5;IL-6;IL-7;IL-8/CXCL8;IL-9;IP-10/CXCL10;IL-19;IL-20;IL-21;IL-22;IL-23;IL-24;IL-26;IL-31;ケラチン生成細胞成長因子;KSHV関連IL-6リガンド;レプチン;ロイコタクチン1/HCC-2/MIP-1δ/CCL15;ロイコトリエンB4;LIGHT;リポキシン;リンホタクチン/XCL1;リンホトキシンαおよびβ;リゾリン脂質成長因子;マクロファージ由来ケモカイン;マクロファージ刺激タンパク質MSP;MCP-1/CCL2、MCP-2/CCL8、MCP-3/CCL7、MCP-4/CCL13、およびMCP-5/CCL12;メトキシエストラジオール;MGSA/GRO/CXCL1、CXCL2、CXCL3;MIF;MIG/CXCL9;MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4;MIP-1γ/MRP-2/CCF18/CCL9/10;MuC10/CCL6;オンコスタチンM;オステオポンチン;パラポックスウイルスオルフウイルスIL-10ホモログ;PARC/DC-CCK1/AMAC-1/CCL18;PDGF-A;PDGF-B;PDGF-C;PDGF-D;血小板-活性化因子;血小板因子4/CXCL4;上皮細胞増殖因子関連ポックスウイルス増殖因子;ポックスウイルス分泌補体制御タンパク質;オルフウイルスのポックスウイルス血管内皮細胞増殖因子VEGFホモログ;プロラクチン;RANKリガンド;RANTES/CCL5;S100A12;SDF-1/CXCL12;SERP-1、分泌ポックスウイルスセルプン;SLC6Ckine/エクソダス-2/TCA-4/CCL21;ソマトスタチン;幹細胞因子;サブスタンスP;TARC/CCL17;TCA3/マウスCCL1;TECK/CCL25;TGFβ;トロンボポエチン;TNFα;TSG-6;TWEAK;ワクシニアウイルスセマフォリン;vCXC-1およびvCXC-2;VEGF;VIPおよびPACAP;ならびにウイルスIL-10変異体を含む。特定の細胞表面受容体の細胞外ドメインの機能性変異体またはフラグメントは、該変異体またはフラグメントが該細胞表面受容体の同種リガンドまたは対抗受容体に特異的に結合する能力を評価するための日常的な生物学的または生化学的アッセイを使用して、容易に同定することができる。同様に、特定のサイトカインの機能性変異体またはフラグメントは、該変異体またはフラグメントが該サイトカインの同種受容体に特異的に結合する能力を評価するための日常的な生物学的または生化学的アッセイを使用して、容易に同定することができる。特定の参照ポリペプチド例えば、野生型サイトカインまたは野生型細胞表面受容体の細胞外ドメイン、例えば、VSTM3B7R1の細胞外ドメインの機能性変異体は、一般的に、参照ポリペプチドと比較して1つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変異は、好ましくは重要でない特性の変異であり、すなわち、保存的アミノ酸置換例えば、いくつかの典型的な保存的アミノ酸置換を挙げている上記表1、参照およびタンパク質またはポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意に影響しない他の置換;小さい欠失、一般的に1から約30個のアミノ酸の欠失;ならびに、小さいアミノ-もしくはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約20-25残基の小さいリンカーペプチド、または精製を容易にする小さい伸長アフィニティータグ、例えば、ポリヒスチジントラクト、タンパク質ANilssonらEMBOJ410751985NilssonらMethodsEnzymol19831991、グルタチオンSトランスフェラーゼSmithandJohnsonGene67311988または他の抗原エピトープもしくは結合ドメイン一般的に、FordらProteinExpressionandPurification2951071991参照による伸長である。アフィニティータグをコードするDNAは、商業的供給者例えば、PharmaciaBiotechPiscatawayNJから入手できる。表1:保存的アミノ酸置換受容体またはサイトカインポリペプチド中の必須のアミノ酸は、当分野で知られている手順、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発にしたがって同定することができるCunninghamandWellsScience244108110851989BassらProcNatlAcadSciUSA88449845021991。後者の技術において、単一のアラニン変異を分子中のあらゆる残基で導入し、得られた変異体分子を生物学的活性例えば、リガンド結合およびシグナル変換について試験し、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。リガンド受容体相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識化のような技術により決定される結晶構造の分析により決定される例えば、deVosらScience2553063121992SmithらJMolBiol2248999041992WlodaverらFEBSLett30959641992参照。必須のアミノ酸の同定はまた、関連受容体またはサイトカインとの相同性の分析から推論することができる。複数のアミノ酸置換は、変異誘発およびスクリーニングの既知の方法、例えば、ReidhaarOlsonandSauerScience24153571988またはBowieandSauerProcNatlAcadSciUSA86215221561989により記載されているものを使用して作製および試験することができる。簡潔には、これらの著者らは、ポリペプチド中の2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能性ポリペプチドを選択し、次に、変異誘発ポリペプチドをシーケンシングし、それぞれの位置における許容可能な置換の範囲を決定する方法を記載している。使用することができる他の方法は、ファージディスプレイ、例えば、LowmanらBiochem3010832108371991;Ladnerら米国特許第5,223,409v;Huse、WIPO公開WO92/06204および領域特異的変異誘発DerbyshireらGene461451986NerらDNA71271988を含む。変異体ヌクレオチドおよびポリペプチド配列はまた、DNAシャッフリングを介して作製することができる例えば、StemmerNature3703891994StemmerProcNat’lAcadSciUSA91107471994;国際公開WO97/20078参照。簡潔には、変異体DNA分子は、親DNAのランダムフラグメント化、次にPCRを使用する再集合により、ランダムに導入された点変異を生じることによるインビトロ相同組換えにより作製される。該技術は、親DNA分子のファミリー、例えば、異なる種由来の対立遺伝子変異体またはDNA分子を使用して、該プロセスにさらなる可変性を導入することにより修飾することができる。所望の活性についての選択またはスクリーニング、次に変異誘発およびアッセイのさらなる繰り返しは、望ましい変異について選択することにより配列の迅速な進化、そのうえ有害な変異に対して同時に選択することを提供する。上記変異誘発方法は、ハイスループットスクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞におけるクローニングされた変異誘発受容体の活性を検出することができる。この点において好ましいアッセイは、以下に記載されている細胞増殖アッセイおよびバイオセンサーベースのリガンド結合アッセイを含む。活性受容体またはサイトカイン変異体をコードする変異誘発DNA分子は、宿主細胞から回収し、近代的装置を使用して迅速にシーケンシングすることができる。これらの方法は、興味あるポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にし、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。以前に議論されているとおり、本発明のポリペプチド融合物は、特定のサイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインの機能性フラグメントに対応するポリペプチドセグメントを含むことができる。核酸分子の日常的な欠失分析を行って、所定のサイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインをコードする核酸分子の機能性フラグメントを得ることができる。一例として、配列番号:1の残基73-423のヌクレオチド配列を有するVSTM3をコードするDNA分子をBal31ヌクレアーゼで消化して、一連の入れ子の欠失を得ることができる。次に、該フラグメントを適当なリーディングフレームにおいて発現ベクターに挿入し、発現されるポリペプチドを単離し、CD155またはCD112に結合する能力について試験する。エキソヌクレアーゼ消化の1つの代替方法は、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、所望のフラグメントの生産を特定するために欠失または終始コドンを導入することである。あるいは、サイトカインまたは受容体をコードする遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して合成することができる。この一般的なアプローチは、インターフェロンの末端のいずれか、または両方での切断における試験により例示されるHorisbergerandDiMarcoPharmacTher665071995参照。さらに、タンパク質の機能性分析のための標準技術は、例えば、TreuterらMolecGenGenet2401131993ContentらExpressionandpreliminarydeletionanalysisofthe42kDa25AsynthetaseinducedbyhumaninterferoninBiologicalInterferonSystemsProceedingsofISIRTNOMeetingonInterferonSystems6572HerschmanTheEGFReceptorinControlofAnimalCellProliferationVol1169199CoumailleauらJBiolChem270292701995FukunagaらJBiolChem270252911995YamaguchiらBiochemPharmacol5012951995およびMeiselらPlantMolecBiol3011996により記載されている。上記方法を使用して、当業者は、i可溶性サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応する参照ポリペプチドと実質的に同一である、およびii参照ポリペプチドの機能性結合特性を保持する、種々のポリペプチドを調製することができる。サイトカインまたは受容体ポリペプチドの受容体-もしくはリガンド-結合特性を決定するためのアッセイ系は一般的に当分野で知られており、P1および/またはP2がサイトカインまたは細胞表面受容体変異体に対応する式P1-L1-D-L2-P2およびP2-L2-P1-L1-Dの可溶性ポリペプチド融合物の機能性結合特性の決定における使用のために、容易に適合させることができる。典型的なアッセイは、本明細書にさらに記載されている。例えば、好ましいアッセイ系は、受容体ポリペプチドが受容体チップの表面上に固定される市販されているバイオセンサー装置BIAcoreTMPharmaciaBiosensorPiscatawayNJを使用する。該装置の使用は、KarlssonおよびCunninghamandWellsにより記載されている。本発明の使用のために、本発明の可溶性ポリペプチド融合物例えば、可溶性VSTM3ポリペプチド融合物は、アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、フローセル内で金膜に結合しているデキストラン繊維に共有結合する。試験サンプルを、セルに通過させる。リガンド例えば、可溶性VSTM3ポリペプチド融合物の場合、可溶性CD155またはCD112がサンプル中に存在するとき、それは固定化ポリペプチド融合物に結合し、金膜の表面プラズモン共鳴における変化として検出することができる媒体の屈折率の変化を引き起こす。この系は、結合親和性を計算することができるオン速度およびオフ速度の決定、ならびに結合の化学量論の評価を可能にする。可溶性ポリペプチド融合物はまた、当分野で知られている他のアッセイ系内で使用することができる。このような系は、結合親和性の決定のためのScatchard分析ScatchardAnnNYAcadSci516606721949参照および熱量アッセイCunninghamらScience2535455481991CunninghamらScience2548218251991参照を含む。1つの態様において、P1およびP2は、細胞表面受容体VSTM3B7R1の細胞外ドメイン由来である。したがって、いくつかの態様において、本発明の可溶性ポリペプチド融合物は、アミノ末端からカルボキシル末端に、P1-L1-D-L2-P2およびP2-L2-P1-L1-Dから選択される式を含み、P1はVSTM3ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも80配列同一性、またはVSTM3細胞外ドメインの機能性フラグメントと少なくとも80配列同一性を有する第1のポリペプチドであり;L1は第1のポリペプチドリンカーであり;Dは二量体化ドメインであり;L2は第2のポリペプチドリンカーであり;P2はVSTM3ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも80配列同一性、またはVSTM3細胞外ドメインの機能性フラグメントと少なくとも80配列同一性を有する第2のポリペプチドであり;該ポリペプチド融合物は、CD155ポリペプチドの細胞外ドメイン例えば、配列番号:22のアミノ酸残基28-343または配列番号:24のアミノ酸残基29-345に特異的に結合することができる。1つの態様において、P1および/またはP2は、VSTM3ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその機能性フラグメントと少なくとも90または少なくとも95配列同一性を有する。例えば、いくつかの変異において、P1および/またはP2は、VSTM3ポリペプチドの細胞外ドメインまたはその機能性フラグメントと100配列同一性を有する。P1および/またはP2は、例えば、ヒトまたはマウスVSTM3ポリペプチドの細胞外ドメイン例えば、配列番号:2の残基22-141または配列番号:4の残基26-138由来、またはそれらの機能性フラグメント由来であり得る。例えば、1つの態様において、P1および/またはP2は、配列番号:2のアミノ酸残基25-141と少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95同一性を有するか;または、P1および/またはP2は、配列番号:4のアミノ酸残基26-138と少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95同一性を有する。いくつかのこのような変異において、P1およびP2の一方または両方は、配列番号:2のアミノ酸残基25-141と100同一性を有するか、または、P1およびP2の一方または両方は、配列番号:4のアミノ酸残基26-138と100同一性を有する。他の変異において、P1およびP2の一方または両方は、配列番号:2の残基69に対応するアミノ酸位置に非システイン残基例えば、チロシンを含む。特に適当なP1および/またはP2ポリペプチドは、配列番号:18の残基23-139配列番号:20の残基23-139に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様において、P1および/またはP2は、配列番号:18のアミノ酸残基23-139配列番号:20の残基23-139と少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95同一性を有する。いくつかのこのような変異において、P1および/またはP2は、配列番号:18の残基67に対応するアミノ酸位置に非システイン残基を有する。例えば、特定の変異において、配列番号:18のアミノ酸残基23-139と少なくとも80、少なくとも90または少なくとも95同一性を有するP1および/またはP2ポリペプチドは、配列番号:18のチロシン67に対応するチロシン残基を保持する。配列同一性パーセントは、慣用の方法により決定される。例えば、AltschulらBullMathBio486031986およびHenikoffandHenikoffProcNatlAcadSciUSA89109151992参照。例えば、2つのアミノ酸配列は、10のギャップ開始ペナルティ、1のギャップ伸長ペナルティおよび表2アミノ酸は標準1文字コードにより示されるに示される上記HenikoffandHenikoffのBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用してアラインメントスコアを最適化するようにアラインすることができる。次に、同一性パーセントを、[同一の対応の全ての数]/[より長い配列の長さおよび2つの配列をアラインするために、より長い配列に導入されたギャップの数]100として計算する。表2:BLOSUM62スコアリングマトリックス当業者は、2つのアミノ酸配列をアラインするために利用できる多数の確立されたアルゴリズムが存在することを認識している。PearsonandLipmanのFASTA類似性検索アルゴリズムは、本明細書に記載されているアミノ酸配列およびそれらの推定変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを検討するために適当なタンパク質アラインメント方法である。FASTAアルゴリズムは、PearsonandLipmanProcNat’lAcadSciUSA8524441988およびPearsonMethEnzymol183631990によって記載されている。簡潔には、FASTAは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、クエリー配列例えば、配列番号:2の残基25-141または配列番号:18の残基23-139および同一性の最も高い密度ktup変数が1であるときまたは同一性の対ktup=2のときのいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することにより配列類似性を特性化する。次に、同一性の最も高い密度を有する10個の領域を、アミノ酸置換マトリックスを使用して全ての対合アミノ酸の類似性を比較することにより再スコア化し、領域の末端を最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように切り取る。配列の長さおよびktup値に基づいて予め決定された式により計算されたカットオフ値より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在するとき、切り取られた最初の領域は、該領域がギャップを有する近接のアラインメントを形成するように連結することができるか否かを決定するために試験される。最後に、2つのアミノ酸配列の最も高いスコアリング領域は、アミノ酸挿入および欠失を考慮するNeedleman-Wunsch-SellersアルゴリズムNeedlemanandWunschJMolBiol484441970SellersSIAMJApplMath267871974の修飾を使用してアラインされる。FASTA分析に対する例示的パラメーターは、ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1および置換マトリックス=blosum62である。これらのパラメーターは、Appendix2ofPearsonMethEnzymol183631990に説明されているように、スコアリングマトリックスファイルSMATRIXを修飾することによりFASTAプログラムに導入することができる。FASTAはまた、上記比率を使用して核酸分子の配列同一性を決定するために使用することができる。ヌクレオチド配列の比較のために、ktup値は1から6、好ましくは3から6、より好ましくは3であってよく、他のパラメーターは上記のとおりである。本発明は、配列番号:2の残基25-141または配列番号:18の残基23-139配列番号:20の残基23-139のアミノ酸配列と比較して保存アミノ酸変化を有する可溶性VSTM3ポリペプチド融合を含む。例えば、アルキルアミノ酸がVSTM3アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に置換されている、芳香族性アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列における芳香族性アミノ酸に置換されている、硫黄含有アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に置換されている、ヒドロキシ含有アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に置換されている、酸性アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列における酸性アミノ酸に置換されている、塩基性アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に置換されている、または二塩基モノカルボン酸性アミノ酸がVSTM3アミノ酸配列における二塩基モノカルボン酸性アミノ酸に置換されている、配列番号:2の残基25-141または配列番号:18の残基23-139の1つ以上のアミノ酸置換を含むVSTM3変異体を得ることができる。一般的なアミノ酸の中で、保存的アミノ酸置換は、例えば、以下の群のそれぞれにおけるアミノ酸間の置換により説明される:1グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、2フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、3セリンおよびスレオニン、4アスパラギン酸およびグルタミン酸、5グルタミンおよびアスパラギン、ならびに6リジン、アルギニンおよびヒスチジン。保存的アミノ酸変化の典型的な群は、上記表1においてさらに示されている。BLOSUM62表表2参照は、500を越える関連タンパク質の群の高度に保存されている領域を示す、タンパク質配列セグメントの約2,000の位置の多数のアラインメントに由来するアミノ酸置換マトリックスであるHenikoffandHenikoffProcNat’lAcadSciUSA89109151992。したがって、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入され得る保存的アミノ酸置換を定義するために使用することができる。上記のような化学特性に単に基づくアミノ酸置換を設計することが可能であるが、保存的アミノ酸置換なる用語は、好ましくは-1を越えるBLOSUM62値により示される置換を示す。例えば、置換が0、1、2または3のBLOSUM62値により特徴付けられるとき、アミノ酸置換は保存されている。この系において、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも1例えば、1、2または3のBLOSUM62値により特徴付けられるが、さらに好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも2例えば、2または3のBLOSUM62値により特徴付けられる。サイトカインまたは受容体ポリペプチド例えば、VSTM3の特定の変異体は、アミノ酸配列における変異が1つ以上の保存的アミノ酸置換によって、対応するアミノ酸配列例えば、配列番号:2の残基25-141または配列番号:18の残基23-139に対して少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98または少なくとも99配列同一性を有することにより特徴付けられる。種々の二量体化ドメインは、本明細書に記載されている二量体融合タンパク質における使用のために適当である。1つの態様において、二量体化ドメインは、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、Fc領域である。Fc領域は、天然配列Fc領域または変異体Fc領域であり得る。いくつかの態様において、Fc領域は1つまたはそれ以上のエフェクター機能例えば、ADCCおよびCDCエフェクター機能の1つまたは両方を欠いている。1つまたはそれ以上のエフェクター機能を欠いている典型的なFc領域は、例えば、Fc-488、Fc4、Fc5、Fc6およびFc7を含む図2A-2C;それぞれアミノ酸残基16からの配列番号:29-33参照。本発明における使用のためのポリペプチドリンカーは、天然、合成または両方の組合せであり得る。該リンカーは、2つの別々のポリペプチド領域例えば、二量体化ドメインおよびVSTM3B7R1の細胞外ドメインに対応するポリペプチドに結合し、より長いポリペプチドの別々および別個のドメインとして連結されたポリペプチド領域を維持する。リンカーは、別々の、別個のドメインが共に別々の特性を維持することが可能である例えば、VSTM3の細胞外ドメインに対応するポリペプチドに連結したFc領域二量体化ドメインの場合、Fc受容体例えば、FcRn結合はFc領域に対して維持され、VSTM3細胞外ドメインのCD155結合特性は維持され得る。新規連結融合ポリペプチドにポリペプチドを結合するための天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、当分野でよく知られている例えば、HallewellらJBiolChem264526052681989AlfthanらProteinEng87257311995RobinsonandSauerBiochemistry351091161996KhandekarらJBiolChem27232190321971997FaresらEndocrinology139245924641998SmallshawらProteinEng126236301999;米国特許第5,856,456号参照。一般的に、リンカーポリペプチド内の残基は、全体的に親水性特性を提供し、非免疫原性およびフレキシブルであるように選択される。本明細書において使用されるフレキシブルなリンカーは、溶液中で実質的に安定な高次構造を欠いているものであるが、局所的安定性の領域は許される。一般的に、小さい極性親水性残基が好ましく、巨大かつ疎水性残基は望ましくない。局所的電荷地域は回避するべきである;リンカーポリペプチドが荷電残基を含むとき、それらは、通常、ポリペプチドの小さい領域内で正味の中性電荷を提供するように位置される。したがって、反対の電荷の残基に隣接して荷電残基を置くことが好ましい。一般的に、リンカーポリペプチド内での包含のために好ましい残基はGly、Ser、Ala、Thr、AsnおよびGlnを含み;さらに好ましい残基はGly、Ser、AlaおよびThrを含み;最も好ましい残基はGlyおよびSerである。一般的に、Pro残基は疎水性および柔軟性の欠如によって、ならびにLysおよびArg残基は潜在的免疫原性によって、Phe、Tyr、Trp、Pro、Leu、Ile、LysおよびArg残基は回避されるリンカーの免疫グロブリンヒンジ領域内に存在しない限り。Cys残基は、本明細書に記載されているように、ジスルフィド結合を提供するように含まれ得る。リンカーの配列はまた、望ましくないタンパク質分解を回避するように設計することができる。いくつかの態様において、ポリペプチドリンカーL1は、15から32個のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなり、該残基の1から8個はシステイン残基である。本発明の好ましい態様において、それぞれのリンカーは正確に2つのシステイン残基を含む。リンカーは、ドメインがポリペプチド内の意図される機能を行うことが可能であるように、二量体化ドメインおよびP1ポリペプチド例えば、VSTM3細胞外ドメインに対応するP1ポリペプチド間の十分な空間および柔軟性を提供するように設計される。リンカー長および組成物は、所望の空間および柔軟性の程度を提供するように選択されるが、また、所望の構造を安定化させるように1つ以上の鎖間ジスルフィド結合も提供される。特定のバリエーションにおいて、L1は免疫グロブリンヒンジ領域、または免疫グロブリンヒンジ領域のフラグメントもしくは変異体である。本発明の1つの態様において、集合された天然抗体が免疫グロブリン軽鎖とジスルフィド結合を形成する最もN-末端のシステイン残基Eu残基220;配列番号:27の残基103は、別のアミノ酸残基例えば、Serと置換または欠失もしくは切断のいずれかにより、ヒンジから省かれる。ヒンジ配列における他の変化もまた、作製することができる。例えば、Lys残基Eu218;配列番号:27の残基101は、Argに変化することができる。したがって、ポリペプチドリンカーは、他の鎖上のポリペプチドリンカーとジスルフィド結合を形成する少なくとも2つのシステイン残基を含む、免疫グロブリンヒンジ領域またはそのフラグメントもしくは変異体を含むことができる。免疫グロブリンヒンジ領域は、任意の免疫グロブリン重鎖から得ることができる。ガンマIgGヒンジ領域、例えば、γ1ヒンジは、よく特徴付けられており、本発明内で好都合に使用される。典型的なL2ポリペプチドリンカーは複数のグリシン残基を含む。例えば、いくつかの態様において、L2ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン残基および所望により少なくとも1個のセリン残基を含む。式P1-L1-D-L2-P2を含むポリペプチドの特定の変異において、L2は式Gly-Gly-Gly-Ser-Gly配列番号:21を含む。P2-L2-P1-L1-Dを含むポリペプチドの特定の変異において、L2ポリペプチドリンカーは式[Gly-Gly-Gly-Ser]n配列番号:22を含み、nは3から5の整数である。式[Gly-Gly-Gly-Ser]nを含むL2リンカーの特定のバリエーションにおいて、nは4である。本発明内で使用のためのポリペプチドセグメント例えば、VSTM3細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメント、免疫グロブリンヒンジ領域を含むリンカー、および二量体化ドメイン、例えば、Fcフラグメントは、様々な種から得ることができる。二量体タンパク質をヒトにおける治療に使用するとき、ヒトポリペプチド配列を使用することが好ましい。しかしながら、非ヒト配列は、変異体配列として使用することができる。他の使用、例えば、インビトロ診断使用および獣医使用において、ヒトまたは非ヒト動物由来のポリペプチド配列を使用することができるが、患者と同じ種由来の配列が、分子間反応の種特異性が存在するとき、インビボ獣医使用またはインビトロ使用に対して好ましいかもしれない。したがって、本発明内で使用のためのポリペプチドセグメントは、限定はしないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよび鳥類ポリペプチド、ならびにそれらの変異体であり得る。P1およびP2のそれぞれがVSTM3B7R1の細胞外ドメインに由来する式P1-L1-D-L2-P2を含むポリペプチド融合物の特定の態様において、ポリペプチド融合物は、配列番号:18の残基23-493または1-493;配列番号:6の残基22-498または1-498;配列番号:10の残基26-489または1-489、配列番号:14の残基36-506または1-506、配列番号:16の残基36-506または1-506、または配列番号:18の残基23-493または1-493に示されるアミノ酸配列を含む。P1およびP2のそれぞれがVSTM3の細胞外ドメインに由来する式P2-L2-P1-L1-Dを含むポリペプチド融合物の特定の態様において、、ポリペプチド融合物は、配列番号:20の残基23-508、23-507、1-508または1-507;配列番号:8の残基22-513、22-512、1-513または1-512;配列番号:12の残基26-504、26-503、1-504または1-503;または、配列番号:20の残基23-508、23-507、1-508または1-507に示されるアミノ酸配列を含む。本発明はまた、上記第1および第2のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質を提供する。したがって、別の局面において、本発明は、第1のポリペプチド融合物および第2のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質であって、第1および第2のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、本明細書に記載されているP1-L1-D1-L2-P2またはP2-L2-P1-L1-Dを含む二量体タンパク質を提供する。例えば、特定の態様において、本発明の二量体VSTM3B7R1タンパク質は、第1のポリペプチド融合物および第2のポリペプチド融合物を含み、第1および第2のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、P1-L1-D1-L2-P2を含み、P1およびP2のそれぞれは、VSTM3の細胞外ドメイン由来であり、二量体タンパク質はCD155の細胞外ドメイン例えば、配列番号:22のアミノ酸残基28-343に特異的に結合することができる。他の態様において、本発明の二量体VSTM3タンパク質は、第1のポリペプチド融合物および第2のポリペプチド融合物を含み、第1および第2のポリペプチド融合のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、P2-L2-P1-L1-Dを含み、P1およびP2のそれぞれは、VSTM3の細胞外ドメイン由来であり、二量体タンパク質は、CD155の細胞外ドメインに特異的に結合することができる。III.ポリペプチド融合物および二量体タンパク質を作製するための材料および方法本発明はまた、上記融合ポリペプチドをコードするDNAおよびRNA分子を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖分子の両方を含む。ポリペプチド融合物の種々のセグメント例えば、二量体化ドメイン、例えば、Fcフラグメント;P1およびP2ポリペプチドセグメントをコードするポリヌクレオチドは、核酸の組換え操作のための既知の方法を使用して、作製され、互いに連結され、本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチドを形成することができる。サイトカインおよび細胞表面受容体例えば、VSTM3B7R1をコードするDNA配列、例えば、このような受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントは、当分野で知られている。種々の二量体化ドメイン例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、FcフラグメントをコードするDNA配列もまた、知られている。サイトカイン、細胞表面受容体および二量体化ドメインポリペプチドをコードするさらなるDNA配列は、遺伝子コードに基づいて当業者により容易に作製することができる。対応RNA配列は、TのUでの置換により作製することができる。当業者は、遺伝子コードの縮重を考慮して、多数の配列変異が与えられたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子中で可能であることを容易に認識している。このようなポリペプチドの機能性変異体およびフラグメントをコードするDNAおよびRNAはまた、ポリヌクレオチド配列に変異を導入するための既知の組換え方法、次に、適当なスクリーニングアッセイを使用するコードされたポリペプチドの発現および機能活性例えば、同種受容体またはリガンドへの結合の決定を使用して、得ることができる。DNAおよびRNAを調製するための方法は、当分野でよく知られている。例えば、相補的DNAcDNAクローンは、興味あるポリペプチドをコードする多量のRNAを生産する組織または細胞から単離されるRNAから調製することができる。全RNAは、グアニジンHCl抽出を使用して調製し、次に、CsCl勾配中の遠心分離により単離することができるChirgwinらBiochemistry1852941979。ポリARNAは、AvivandLederの方法を使用して全RNAから調製される。相補的DNAは、既知の方法を使用してポリARNAから調製される。別法において、ゲノムDNAを単離することができる。いくつかの適用例えば、トランスジェニック動物における発現において、ゲノムクローンを使用すること、または、少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようにcDNAクローンを修飾することが利点であり得る。cDNAおよびゲノムクローンを同定および単離するための方法はよく知られており、当業者のレベルの範囲内であり、ライブラリーのプロービングまたはプライミングのための本明細書に記載されている配列またはその部分の使用を含む。興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応により同定および単離されるPCR、Mullis、米国特許4,683,202。発現ライブラリーは、興味あるポリペプチドに対する抗体、受容体フラグメントまたは他の特異的結合パートナーで探索することができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、自動合成により合成することができる。短い二本鎖セグメント60から80bpの生産は、技術的に簡単であり、相補鎖を合成し、次にそれらをアニーリングすることによっって成し遂げることができる。より長いセグメント一般的に>300bpは、20から100ヌクレオチド長である一本鎖フラグメントからモジュール形態において集合される。ポリヌクレオチドの自動合成は当業者のレベルの範囲内であり、適当な装置および試薬は商業的供給者から利用できる。一般的に、GlickandPasternakMolecularBiotechnologyPrinciplesApplicationsofRecombinantDNAASMPressWashingtonDC1994ItakuraらAnnRevBiochem533233561984およびClimieらProcNatlAcadSciUSA876336371990参照。別の局面において、材料および方法は、本発明のポリペプチド融合物、例えば、ポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質を生産するために提供される。ポリペプチド融合物は、慣用の技術にしたがって遺伝的に操作された宿主細胞において生産することができる。適当な宿主細胞は、外因性DNAで形質転換もしくはトランスフェクトされ、培地で増殖することができる細胞型であり、細菌、真菌細胞および培養高等真核細胞多細胞生物体の培養細胞を含む、特に培養哺乳動物細胞を含む。クローン化DNA分子を操作する、および外因性DNAを種々の宿主細胞に導入するための技術は、SambrookらMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989、およびAusubelらedsCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenandWileyandSonsNY1993により記載されている。一般的に、ポリペプチド融合物をコードするDNA配列は、発現ベクター内で、一般的に転写プロモーターおよびターミネーターを含む発現のために必要とされる他の遺伝子成分に作動可能に連結される。ベクターはまた、1つまたはそれ以上の選択可能なマーカーおよび1つまたはそれ以上の複製起点を一般的に含むが、当業者は、特定の系内で、選択可能なマーカーが別々のベクターに提供され得、外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識している。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の成分の選択は、当業者のレベルの日常的な設計の事柄である。多数のこのような成分は文献に記載されており、商業的供給者を介して利用できる。ポリペプチド融合物を宿主細胞の分泌経路に指向するために、分泌シグナル配列は発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列は、天然非免疫グロブリンポリペプチドのものであってよく、または別の分泌タンパク質由来のものであってよく例えば、t-PA;米国特許第5,641,655号参照、またはデノボで合成され得る。操作された切断部位が、ポリペプチド融合物の分泌ペプチドおよび残りの結合点に含まれ、宿主細胞中のタンパク質分解プロセッシングを最適化し得る。分泌シグナル配列は、ポリペプチド融合物をコードするDNA配列に作動可能に連結する、すなわち、2つの配列は、正しいリーディングフレームに結合させ、新たに合成されたポリペプチド融合物を宿主細胞の分泌経路に指向するように配置される。分泌シグナル配列は、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列に対する5’に一般的に位置するが、特定のシグナル配列は、興味あるDNA配列において他に位置し得る例えば、Welchら米国特許第5,037,743号Hollandら米国特許第5,143,830号参照。本発明の使用のために適当な分泌シグナル配列は、例えば、配列番号:14のアミノ酸残基1-35または配列番号:18のアミノ酸残基1-22をコードするポリヌクレオチドを含む。宿主細胞分泌経路を介するポリペプチド融合物の発現は、二量体タンパク質の生産をもたらすことが予期される。したがって、別の局面において、本発明は、上記第1および第2のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質例えば、第1のポリペプチド融合物および第2のポリペプチド融合物を含む二量体タンパク質であって、第1および第2のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、P1-L1-D1-L2-P2を含むか、または、第1および第2のポリペプチド融合物のそれぞれは、アミノ末端からカルボキシル末端に、P2-L2-P1-L1-Dを含み、該二量体タンパク質はCD155の細胞外ドメイン例えば、配列番号:22のアミノ酸残基28-343に特異的に結合することができる二量体タンパク質を提供する。二量体はまた、適当な条件下で成分ポリペプチドのインキュベーション時にインビトロで集合され得る。一般的に、インビトロでの集合は、変性および還元条件下でタンパク質混合物をインキュベートすること、次にポリペプチドをリフォールディングおよび再酸化し、二量体を形成することを含む。細菌細胞において発現されるタンパク質の回収および集合は、以下に記載されている。培養哺乳動物細胞は、本発明における使用のための適当な宿主である。外因性DNAを哺乳動物宿主細胞に導入するための方法は、リン酸カルシウム介在トランスフェクションWiglerらCell147251978CorsaroandPearsonSomaticCellGenetics76031981GrahamandVanderEbVirology524561973、エレクトロポレーションNeumannらEMBOJ18418451982、DEAE-デキストラン介在トランスフェクションAusubelらsupraおよびリポソーム介在トランスフェクションHawleyNelsonらFocus15731993CiccaroneらFocus15801993を含む。培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの生産は、例えば、Levinsonら米国特許第4,713,339号;Hagenら米国特許第4,784,950号;Palmiterら米国特許第4,579,821号;およびRingold米国特許第4,656,134号により記載されている。適当な培養哺乳動物細胞は、COS-1ATCCNoCRL1650、COS-7ATCCNoCRL1651、BHKATCCNoCRL1632、BHK570ATCCNoCRL10314、293ATCCNoCRL1573GrahamらJGenVirol3659721977およびチャイニーズハムスター卵巣例えば、CHOK1ATCCNoCCL61CHODG44UrlaubらProcNatlAcadSciUSA77421642201980細胞系を含む。さらなる適当な細胞系は当分野で知られており、公の受託機関、例えば、AmericanTypeCultureCollectionManassasVirginiaから利用できる。強い転写プロモーターは、例えば、SV-40、サイトメガロウイルスまたは骨髄増殖性肉腫ウイルス由来のプロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第4,956,288号および米国特許出願公開第20030103986号参照。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子由来のもの米国特許第4,579,821および4,601,978号およびアデノウイルス主要後期プロモーターを含む。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、それぞれ受入番号98669、98668およびPTA-5266の下にAmericanTypeCultureCollection10801UniversityBlvdManassasVAUSAで寄託されているpZP-1、pZP-9およびpZMP21、ならびにこれらのベクターの誘導体を含む。薬剤選択は、一般的に、外来DNAが挿入されている培養哺乳動物細胞に対して選択するために使用される。このような細胞は、一般的に、形質転換体と称される。選択的薬剤の存在下で培養され、興味ある遺伝子をその子孫に伝えることができる細胞は、安定な形質転換体と称される。典型的な選択可能なマーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬剤、例えば、G-418などの存在下で行われる。選択系はまた、増幅と称されるプロセスである興味ある遺伝子の発現レベルを増加させるために使用することができる。増幅は、低レベルの選択的薬剤の存在下で形質転換体を培養し、次に高レベルの導入された遺伝子の産物を生産する細胞を選択するために選択的薬剤の量を増加することにより、行われる。典型的な増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキサートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼもまた使用することができる。細胞表面マーカーおよび他の表現型選択マーカーは、例えば、蛍光活性化細胞分類による形質転換細胞の同定を容易にするために使用することができ、例えば、CD8、CD4、神経成長因子受容体、緑色蛍光タンパク質などを含む。昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞もまた、宿主として使用することができる。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウムリゾゲネスの使用は、SinkarらJBiosci1147581987により概説されている。昆虫細胞の形質転換およびそれにおける外来ポリペプチドの生産は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO94/06463により記載されている。昆虫細胞は、一般的にキンウワバ科核多角体病ウイルスAcNPV由来の組換えバキュロウイルスに感染させることができる。KingandPosseeTheBaculovirusExpressionSystemALaboratoryGuideChapmanHallLondonOReillyらBaculovirusExpressionVectorsALaboratoryManualOxfordUniversityPressNewYork1994およびRichardsonEdBaculovirusExpressionProtocolsMethodsinMolecularBiologyHumanaPressTotowaNJ1995参照。組換えバキュロウイルスはまた、LuckowらJVirol67456645791993により記載されているトランスポゾンに基づく系の使用を介して生産することができる。転移ベクターを利用するこの系は、キット形態で市販されているBAC-TO-BACキット;LifeTechnologiesGaithersburgMD。転移ベクター例えば、PFASTBAC1;LifeTechnologiesは、バクミドと称される大型プラスミドとして、大腸菌に維持されているバキュロウイルスゲノム中に、興味あるタンパク質をコードするDNAを移動させるTn7トランスポゾンを含む。HillPerkinsandPosseeJGenVirol719719761990BonningらJGenVirol75155115561994およびChazenbalkandRapoportJBiolChem270154315491995参照。当分野で知られている技術を使用して、ポリペプチド融合物をコードする転移ベクターを大腸菌宿主細胞に形質転換し、該細胞は、組換えバキュロウイルスを示す分断lacZ遺伝子を含むバクミドに対してスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAを、一般的な技術を使用して単離し、ヨトウガ細胞、例えば、Sf9細胞に導入するために使用する。次に、ポリペプチド融合物を発現する組換えウイルスが生産される。組換えウイルス貯蔵物は、当分野で一般的に使用される方法により作製される。タンパク質生産のために、組換えウイルスを、宿主細胞、一般的にツマジロクサヨトウ、ヨトウガ例えば、Sf9またはSf21細胞またはキンウワバ例えば、HIGHFIVEcellsInvitrogenCarlsbadCA由来の細胞系に感染させるために使用する。一般的にGlickandPasternaksupra参照。米国特許第5,300,435号も参照。無血清培地を使用して細胞を増殖させ、維持する。適当な培地処方は、当分野で知られており、商業的供給者から得ることができる。該細胞を約2-5×105細胞の接種密度から1-2×106細胞の密度まで増殖させ、そのときに、組換えウイルスストックを0.1から10、さらに一般的には約3の感染の多重度MOIで加える。使用される手順は、入手可能な実験マニュアル例えば、KingandPosseesupraOReillyらsupraRichardsonsupraに一般的に記載されている。酵母細胞を含む真菌細胞もまた、本発明において使用することができる。この点において特定の興味ある酵母菌種は、出芽酵母、メタノール資化酵母およびメチロトローフ酵母を含む。サッカロミセスセレビシエ細胞を外因性DNAで形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産するための方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号;Kawasakiら米国特許第4,931,373号;Brake、米国特許第4,870,008号;Welchら米国特許第5,037,743号;およびMurrayら米国特許第4,845,075号により記載されている。形質転換細胞は、選択可能なマーカー、一般的に薬剤耐性または特定の栄養素例えば、ロイシンの非存在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。出芽酵母における使用のための典型的なベクター系は、形質転換細胞をグルコース含有培地中の増殖により選択することができるKawasakiら米国特許第4,931,373号により記載されているPOT1ベクター系である。酵母における使用のための適当なプロモーターおよびターミネーターは、糖分解酵素遺伝子例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号;Kingsmanら米国特許第4,615,974号;およびBitter、米国特許第4,977,092号参照およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものを含む。米国特許第4,990,446;5,063,154;5,139,936;および4,661,454号も参照。ハンゼヌラポリモルファ、分裂酵母、キラー酵母、クリュイベロミセスフラギリス、トウモロコシ黒穂病菌、メタノール資化酵母、メチロトローフ酵母、ピチアグイレルモンジおよびカンジダマルトーサを含む他の酵素のための形質転換系は、当分野で知られている。例えば、Gleesonら、JGenMicrobiol132345934651986;Cregg、米国特許第4,882,279号;およびRaymondら、Yeast1411231998参照。アスペルギルス細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法にしたがって利用され得る。アクレモニウムクリソゲナムを形質転換する方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号により記載されている。アカパンカビを形質転換するための方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号により記載されている。メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の生産は、米国特許第5,716,808;5,736,383;5,854,039;および5,888,768号に記載されている。細菌大腸菌、バチルス属および他の属の株を含む原核生物宿主細胞はまた、本発明における有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、それらにおいてクローニングされた外来DNA配列を発現するための技術は、当分野でよく知られている例えば、上記Sambrookら、参照。細菌、例えば、大腸菌においてポリペプチド融合物を発現させるとき、該ポリペプチドは、一般的に不溶性顆粒として、細胞質内に保持され得るか、または細菌分泌配列によりペリプラズム空間に向けられ得る。前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えば、塩酸グアニジンまたはウレアを使用して、変性させる。次に、変性ポリペプチドは、変性剤を希釈することにより、例えば、ウレアの溶液ならびに還元および酸化グルタチオンの組合せに対する透析、次に緩衝生理食塩水に対する透析により、リフォールディングさせ、二量体化させることができる。代替として、タンパク質は、可溶性形態において細胞質から回収され、変性剤を使用しないで単離され得る。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中で、水性抽出物として細胞から回収される。興味あるタンパク質を捕獲するために、抽出物をクロマトグラフィー媒体、例えば、固定化された抗体またはヘパリン-セファロースカラムに直接加える。分泌されたポリペプチドは、細胞を破壊し例えば、超音波処理または浸透圧衝撃により、タンパク質を回収することにより、可溶性かつ機能性形態においてペリプラズム空間から回収することができ、それにより変性およびリフォールディングの必要性を回避することができる。例えば、LuらJImmunolMeth2672132262002参照。形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で慣用の手順にしたがって培養される。規定の培地および複合培地を含む種々の適当な培地は当分野で知られており、一般的に炭素供給源、窒素供給源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地はまた、必要に応じて、増殖因子または血清のような成分を含み得る。増殖培地は、一般的に、例えば、発現ベクター上で運ばれるか、または宿主細胞に共トランスフェクトされる選択可能なマーカーにより補足される必須の栄養素における薬剤選択または欠乏により、外因的に加えられたDNAを含む細胞を選択する。本発明のタンパク質は、慣用のタンパク質精製方法、一般的に、クロマトグラフィー技術の組合せにより精製される。一般的に、AffinityChromatographyPrinciplesMethodsPharmaciaLKBBiotechnologyUppsalaSweden1988andScopesProteinPurificationPrinciplesandPracticeSpringerVerlagNewYork1994参照。免疫グロブリン重鎖ポリペプチドを含むタンパク質は、固定化タンパク質A上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。さらなる精製工程、例えば、ゲル濾過は、所望の純度レベルを得るために、または脱塩、バッファー交換などを提供するために使用することができる。例えば、分別および/または慣用の精製方法は、組換え宿主細胞から精製された本発明のポリペプチド融合物および二量体タンパク質を得るために使用することができる。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿および酸またはカオトロープ抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLCおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを含み得る。適当なクロマトグラフィー媒体は、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、専用のシリカなどを含む。PEI、DEAE、QAEおよびQ誘導体が適当である。典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチルまたはオクチル基で誘導体化されたもの、例えば、Phenyl-SepharoseFFPharmacia、Toyopearlbutyl650TosoHaasMontgomeryvillePA、Octyl-SepharosePharmaciaなど;またはポリアクリル酸樹脂、例えば、AmberchromCG71TosoHaasなどを含む。適当な固体支持体は、使用される条件下で不溶性であるガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂などを含む。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および/または炭水化物部分によりタンパク質の結合を可能にする反応基で修飾され得る。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化ならびにカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を含む。これらの、および他の固体媒体は当分野でよく知られており、広く使用されており、商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離および精製のための特定の方法の選択は、日常的な設計の事柄であり、一つには選択される支持体の特性により決定される。例えば、AffinityChromatographyPrinciplesMethodsおよびDoonanProteinPurificationProtocols参照。タンパク質単離および精製におけるさらなる変形は、当業者により考案することができる。例えば、本明細書に記載されているポリペプチド融合物または二量体タンパク質に特異的に結合する抗体例えば、サイトカインまたは細胞表面受容体の細胞外ドメインに対応するポリペプチドセグメントに特異的に結合する抗体は、免疫アフィニティー精製により多量のタンパク質を単離するために使用することができる。本発明のタンパク質はまた、特定の特性の利用により単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着IMACクロマトグラフィーは、ポリヒスチジンタグを含むものを含むヒスチジン-リッチタンパク質を精製するために使用することができる。簡潔には、ゲルを最初に二価金属イオンで充填し、キレートを形成するSulkowskiTrendsinBiochem311985。ヒスチジン-リッチタンパク質は、使用される金属イオンに依存して、異なるアフィニティーで該マトリックスに吸着させ、競合溶離、pHの低下または強力なキレート化剤の使用により溶離する。精製の他の方法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を含む例えば、MDeutscherMethEnzymol1825291990参照。本発明のさらなる態様において、興味あるポリペプチドおよびアフィニティータグ例えば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメインの融合物が、精製を容易にするために構築され得る。さらに、二量体タンパク質の受容体-またはリガンド-結合特性は、精製のために利用することができる。例えば、二量体VSTM3タンパク質は、CD155をカラムに結合させ、二量体VSTM3タンパク質を結合させるアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより単離し、次に標準クロマトグラフィー方法を使用して溶離され得る。本発明のポリペプチドは、一般的に、夾雑高分子、特に他のタンパク質および核酸に対して少なくとも約80純度、さらに一般的に少なくとも約90純度および好ましくは少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98または少なくとも約99純度に精製されており、感染性および発熱性因子を含まない。本発明のポリペプチドはまた、99.9以上で純粋である薬学的に純粋な状態に精製され得る。特定の調製において、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。IV.使用の方法および医薬組成物本発明の二量体タンパク質は、P1およびP2ポリペプチドと関連する1つ以上の活性を提供するため、診断、治療または研究のために使用することができる。このような活性は、限定はしないが、受容体結合、受容体活性化およびリガンド結合を含む。当業者は、タンパク質に関する使用の範囲を容易に想像する。治療的使用は、例えば、癌または免疫学的障害の処置のための、サイトカインアンタゴニスト、および、例えば、組織増殖または治癒を促進する、または血管系または他の組織の発達を促進するために、増殖因子アゴニストとしての使用を含む。診断的使用は、例えば、放射性同位体または他の標識に対する標的化剤として、細胞表面上または生物学的液体もしくは抽出物中の分子の存在を検出するための、またはインビトロアッセイにおけるコントロールとしての使用を含む。研究において、本発明のタンパク質は、例えば、細胞を標識化するため、細胞表面受容体または可溶性分子の存在に関するアッセイするため、サイトカインもしくは受容体ポリペプチドまたはそれらの結合パートナーの生物学を試験するために使用することができる。特定の局面において、本発明は、T細胞介在免疫障害を処置する方法を提供する。該方法は、一般的に、本明細書に記載されている有効量の二量体VSTM3B7R1タンパク質をT細胞介在免疫障害を有する対象に投与することを含む。本発明による処置に適しているT細胞介在免疫障害は、例えば、自己免疫疾患、移植片対宿主病GVHDおよび移植拒絶反応を含む。T細胞介在自己免疫疾患の例は、いくつか例を挙げると、リウマチ性関節炎、多発性硬化症MS例えば、脊髄-眼MS、一次進行型MSPPMSおよび再発寛解型MSRRMS、インスリン依存性糖尿病IDDM、全身性エリテマトーデスSLE、セリアック病、神経炎、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、白斑症、シェーグレン症候群、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリリウム症および特発性肺線維症を含む。治療的使用のために、本明細書に記載されている二量体タンパク質は、処置が要求される疾患または障害の管理と関連する慣用の方法論と一致する方法において送達される。本明細書の記載にしたがって、有効量の二量体タンパク質は、疾患または障害を予防または処置するために十分な時間および条件下で、このような処置を必要とする対象に投与される。本明細書に記載されている二量体タンパク質の投与の対象は、特定の疾患または障害を発症する高い危険性を有する患者ならびに既存の疾患または障害を示す患者を含む。1つの態様において、対象は、処置が要求される疾患または障害を有すると診断されている。さらに、対象は、疾患または障害における何らかの変化のために例えば、疾患または障害の臨床症状における増加または減少のために処置過程中、モニタリングすることができる。また、いくつかの変異において、対象は、二量体タンパク質のP1またはP2ポリペプチドセグメントに対応するサイトカインまたは受容体ポリペプチドの投与を含む処置を必要とする別の疾患または障害に罹患していない。予防適用において、医薬組成物または薬物は、疾患のリスクを除去または減少するために、または発生を遅延するために十分な量において、特定の疾患に罹患しやすい、または危険性を有する患者に投与される。治療適用において、組成物または薬物は、疾患およびその合併症の症状を治癒する、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量において、このような疾患の疑いのある、またはすでに罹患している患者に投与される。これを達成するために十分な量は、治療または薬学的有効用量または量と称される。予防および治療レジメンの両方において、薬剤は、十分な応答例えば、不適当なT細胞応答の阻害がなし遂げられるまで、通常数回投与される。一般的に、応答はモニタリングされ、所望の応答消失し始めるとき、反復投与を与える。本発明の方法による処置のための対象患者を特定するために、認められるスクリーニング方法は、特定の疾患と関連する危険因子を決定するために、または対象において特定された既存の疾患の状態を決定するために、使用され得る。このような方法は、例えば、個体が特定の疾患と診断された親族を有するか否かを決定することを含むことができる。スクリーニング方法はまた、例えば、遺伝的要素を有することが知られている特定の疾患に対する家族性状態を決定するための慣用の精密検査を含むことができる。この目的に向けて、ヌクレオチドプローブは、日常的に、興味ある特定の疾患と関連する遺伝子マーカーを有する個体を同定するために使用することができる。加えて、特定の疾患に対するマーカーを同定するために有用である多種多様の免疫学的方法は、当分野で知られている。スクリーニングは、既知の患者症状、年齢因子、関連危険因子などより示されるように実行され得る。これらの方法は、臨床医が日常的に処置のための本明細書に記載されている方法を必要とする患者を選択することを可能にする。これらの方法にしたがって、本発明の二量体タンパク質を使用する処置例えば、不適当なT-細胞応答を阻害するための二量体VSTM3タンパク質を使用する処置は、独立した処置プログラムとして、または他の処置の経過観察、補助的もしくは同等の処置レジメンとして実行され得る。投与のために、本発明の二量体タンパク質は、医薬組成物として製剤化される。二量体タンパク質を含む医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための既知の方法にしたがって製剤化することができ、それによって、治療分子は、薬学的に許容される担体と混合物として混合される。組成物の投与がレシピエント患者により耐用性であるとき、該組成物は薬学的に許容される担体であると称される。滅菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適当な担体は、当業者によく知られている例えば、GennaroRemingtonsPharmaceuticalSciences参照。製剤は、1つ以上の賦形剤、防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質の喪失を防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。本発明の二量体タンパク質を含む医薬組成物は、有効量で対象に投与される。二量体タンパク質は、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、非経口、鼻腔内、肺内、経皮、胸膜内、髄腔内および経口投与経路を含む種々の投与様式により対象に投与され得る。予防および処置目的のために、二量体タンパク質は、単一ボーラス送達において、長期間にわたる連続的な送達例えば、連続的な経皮送達を介して、または反復投与プロトコール例えば、毎時、毎日または毎週において対象に投与され得る。この文脈において有効用量の決定は、一般的にヒト臨床試験によりフォローアップされる動物モデル試験に基づき、モデル対象における対象疾患または障害の発生または重症度を有意に減少させる有効用量および投与プロトコールを決定することにより導かれる。本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、処置が予防的または治療的であるか、ならびに個体における所望の応答を誘導する組成物自体の比活性およびその能力を含む多数の異なる因子に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患において、患者は非ヒト哺乳動物であり得る。一般的に、投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように、すなわち、安全性および有効性を最適化するように調節される。したがって、治療または予防的有効量はまた、望ましくない副作用よりも有益な効果が勝るものである例えば、二量体VSTM3タンパク質の場合、望ましくない副作用よりも二量体VSTM3タンパク質でのT-細胞性免疫応答を阻害する有益な効果が勝るとき。本発明の二量体タンパク質、例えば、二量体VSTM3タンパク質の投与のために、用量は、一般的に、約0.1gから100mg/kgまたは1g/kgから約50mg/kgおよびさらに通常、10gから5mg/kg対象体重の範囲である。さらに特定の態様において、薬剤の有効量は、約1g/kgから約20mg/kg、約10g/kgから約10mg/kgまたは約0.1mg/kgから約5mg/kgである。この範囲内の用量は、例えば、1日あたり複数回投与または毎日、毎週、隔週もしくは毎月の投与を含む単回または複数回投与によりなし遂げることができる。例えば、特定の変形において、レジメンは、最初の投与、次に、毎週または隔週の間隔での複数回の後の投与からなる。別のレジメンは、最初の投与、次に、毎月または隔月の間隔での複数回の後の投与からなる。あるいは、投与は、疾患または障害の臨床的症状のモニタリングおよび/または疾患バイオマーカーまたは他の疾患相関関係例えば、T細胞介在免疫障害の場合、T細胞活性のモニタリングにより示されるとおり、不規則な基準に基づくことができる。医薬組成物の用量は、標的部位における所望の濃度を維持するために、担当医により変更され得る。例えば、静脈内送達様式が選択されるとき、標的組織における血流中の薬剤の局所濃度は、対象の状態および計画される応答に依存して、1リットルあたり約1-50ナノモルの組成物、ときどき1リットルあたり約1.0ナノモルおよび1リットルあたり10、15または25ナノモルであり得る。より高いまたはより低い濃度が、送達様式、例えば、経皮送達対粘膜表面に対する送達に基づいて選択され得る。用量はまた、投与製剤、例えば、鼻腔用スプレー対粉末、持続放出経口または注射粒子、経皮製剤などの放出速度に基づいて調節すべきである。同じ血清濃度レベルをなし遂げるために、例えば、5ナノモルの放出速度標準条件下を有する徐放粒子は、10ナノモルの放出速度を有する粒子の約2倍の用量で投与される。本明細書に記載されている二量体タンパク質例えば、二量体VSTM3タンパク質を含む医薬組成物は、液体形態、エアロゾルまたは固体形態において提供することができる。液体形態は、注射可能な溶液、エアロゾル、液滴、位相溶液および経口懸濁液により例示される。典型的な固体形態は、カプセル、錠剤および放出制御形態を含む。後者の形態は、微小浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される例えば、BremerらPharmBiotechnol102391997RanadeImplantsinDrugDeliveryinDrugDeliverySystems95123BremerらProteinDeliverywithInfusionPumpsinProteinDeliveryPhysicalSystems239254YeweyらDeliveryofProteinsfromaControlledReleaseInjectableImplantinProteinDeliveryPhysicalSystems93117参照。他の固体形態は、クリーム、ペースト、他の位相適用などを含む。リポソームは、治療ポリペプチドを対象に、例えば、静脈内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、皮下または経口投与、吸入または鼻腔内投与を介して送達するための1つの手段を提供する。リポソームは、水性区画を取り囲む1つ以上の脂質二重層からなる微細小胞である一般的に、BakkerWoudenbergらEurJClinMicrobiolInfectDis12S611993KimDrugs466181993RanadeSiteSpecificDrugDeliveryUsingLiposomesasCarriersinDrugDeliverySystems324参照。リポソームは、細胞膜と組成が類似であり、結果として、リポソームを安全に投与することができ、生分解性である。調製の方法に依存して、リポソームは単層または多重層であり得、リポソームは0.02μmから10μm以上の版である直径を有するサイズで変化し得る。種々の薬剤はリポソームに封入することができ:疎水性薬剤は二重層に分配され、親水性薬剤は内部の水性腔内に分配される例えば、MachyらLiposomesInCellBiologyAndPharmacologyOstroらAmericanJHospPharm4615761989参照。さらに、リポソームのサイズ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの電荷および表面特性を変化させることにより封入された薬剤の治療的有用性をコントロールすることが可能である。リポソームは、実質的にはあらゆる型の細胞に吸着し、次に、ゆっくり封入された薬剤を放出することができる。あるいは、吸着されたリポソームは、食細胞性である細胞によりエンドサイトーシス的に取り込まれ得る。エンドサイトーシスは、リポソーム脂質のリソソーム内分解および封入された薬剤の放出が続くScherphofらAnnNYAcadSci4463681985参照。静脈内投与後、小リポソーム0.1から1.0μmは、一般的に、細網内皮系の細胞に取り込まれ、主に肝臓および脾臓に位置するが、3.0μm以上のリポソームは肺に沈着する。細網内皮系の細胞によるより小さいリポソームのこの選択的な取込みは、化学療法剤をマクロファージおよび肝臓の腫瘍に送達するために使用されている。細網内皮系は、リポソーム粒子の大量投与での飽和または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法により回避することができるClaassenらBiochimBiophysActa8024281984参照。加えて、糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質のリポソーム膜への取り込みは、細網内皮系により有意に減少した摂取をもたらすことが示されているAllenらBiochimBiophysActa10681331991AllenらBiochimBiophysActa115091993参照。リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、または受容体または対抗受容体をリポソームに挿入することにより、特定の細胞または臓器を標的とするように調製することができる。例えば、高含量の非イオン性界面活性剤で調製されたリポソームは、肝臓を標的とするために使用されている例えば、JapanesePatent04244018toHayakawaらKatoらBiolPharmBull169601993参照。これらの製剤は、メタノール中ダイズホスファチジルコリン、α-トコフェロールおよびエトキシル化水素化ヒマシ油HCO-60を混合し、減圧化で混合物を濃縮し、次に混合物を水で再構成することにより調製した。ダイズ由来ステリルグルコシド混合物SGおよびコレステロールChとジパルミトイルホスファチジルコリンDPPCのリポソーム製剤もまた、肝臓を標的とすることが示されているShimizuらBiolPharmBull208811997参照。あるいは、種々の標的対抗受容体、例えば、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミンおよび輸送タンパク質は、リポソームの表面に結合させることができる。例えば、肝臓への標的化のために、リポソームは、肝細胞の表面上で専ら発現されるアシアロ糖タンパク質ガラクトース受容体を標的とするように、分枝型ガラクトシル脂質誘導体で修飾することができるKatoandSugiyamaCritRevTherDrugCarrierSyst142871997MurahashiらBiolPharmBull202591997参照。組織標的化についてのさらなる一般的なアプローチにおいて、標的細胞を、標的細胞により発現される対抗受容体に特異的なビオチン化抗体で前標識するHarasymらAdvDrugDelivRev32991998参照。遊離抗体の血漿除去後、ストレプトアビジンコンジュゲートリポソームを投与する。別のアプローチにおいて、標的抗体をリポソームに直接結合させるHarasymらsupra参照。ポリペプチドは、タンパク質マイクロカプセル化の標準技術を使用してリポソーム内に封入させることができる例えば、AndersonらInfectImmun3110991981AndersonらCancerRes5018531990CohenらBiochimBiophysActa1063951991AlvingらPreparationandUseofLiposomesinImmunologicalStudiesinLiposomeTechnology317WassefらMethEnzymol1491241987参照。上記のとおり、治療的に有用なリポソームは、種々の成分を含み得る。例えば、リポソームは、ポリエチレングリコールの脂質誘導体を含み得るAllenらBiochimBiophysActa115091993参照。分解性ポリマーミクロスフェアは、治療タンパク質の高い全身レベルを維持するように設計されている。ミクロスフェアは、分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド-コ-グリコリドPLG、ポリ無水物、ポリオルトエステル、非生分解性酢酸エチルビニルポリマーから調製され、タンパク質がポリマー内に封入されている例えば、GombotzandPettitBioconjugateChem63321995RanadeRoleofPolymersinDrugDeliveryinDrugDeliverySystems5193RoskosandMaskiewiczDegradableControlledReleaseSystemsUsefulforProteinDeliveryinProteinDeliveryPhysicalSystems4592BartusらScience28111611998PutneyandBurkeNatureBiotechnology161531998PutneyCurrOpinChemBiol25481998参照。ポリエチレングリコールPEG被覆ナノ粒子はまた、治療タンパク質の静脈内投与のための担体を提供することができる例えば、GrefらPharmBiotechnol101671997参照。他の投与形態は、例えば、AnselandPopovichPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsGennaroRemingtonsPharmaceuticalSciencesおよびRanadeandHollingerDrugDeliverySystemssにより示されているように、当業者により考案することができる。例えば、二量体VSTM3B7R1タンパク質を含む本明細書に記載されている二量体タンパク質は、遺伝子治療の文脈において、使用することができる。遺伝子治療は、一時的または永久的に細胞表現型を変化させるための細胞への遺伝物質の移動として広義的に定義することができる。多数の方法が、腫瘍患者内の特定の位置に対する遺伝子治療を介する、サイトカイン、腫瘍抗原およびさらなる共刺激分子の送達のために開発されている一般的に、RosenbergPrinciplesandpracticeofthebiologictherapyofcancer参照。これらの方法論は、本発明のポリペプチド融合物をコードするDNAまたはRNAを使用するために適合させることができる。したがって、いくつかの態様において、対象における疾患または障害は、本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードする核酸の投与により処置される。例えば、1つの態様において、対象におけるT細胞介在応答は、本明細書に記載されているVSTM3B7R1ポリペプチド融合物をコードする核酸の投与により阻害される;このようなVSTM3をコードする核酸を使用して、T細胞介在免疫障害は、一般的に上記のとおりに処置することができる。核酸治療の場合、本明細書に記載されているポリペプチド融合物は、上記対象に直接投与される本発明の二量体タンパク質と同様の様式において治療効果を発揮する二量体タンパク質を形成するように、細胞から発現され、分泌される例えば、VSTM3をコードする核酸の場合、VSTM3本明細書に記載されているポリペプチド融合物は、対象に直接投与される二量体VSTM3タンパク質と同様の様式においてT細胞介在効果を阻害する二量体VSTM3タンパク質を形成するように、発現され、分泌される。あるいは、本発明のポリペプチド融合物は、例えば、機能性膜貫通ドメインまたはGPI結合でタンパク質が発現される細胞の表面との結合を維持する形態において発現され得る;このような態様は、局所的治療効果例えば、二量体VSTM3タンパク質の発現を介するT細胞介在応答の局所的阻害を維持するように、特定の細胞または組織に対する標識化を容易にするために特に有用である。治療方法における使用のためのポリペプチドをコードする核酸は、DNAまたはRNAであり得る。本明細書に記載されているポリペプチド融合物をコードする核酸セグメントは、一般的に、患者の意図される標的細胞におけるDNAセグメント発現を可能にする調節要素、例えば、プロモーターおよびエンハンサーに連結される。例えば、血液細胞における発現のために、VSTM3ポリペプチドの発現を介するT細胞介在応答の阻害のために望ましいとき、軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー因子またはCMV主要中間体早期プロモーターおよびエンハンサーが、発現を指向するために適当である。連結された調節要素およびコード配列は、しばしば、ベクターにクローニングされる。レトロウイルス系例えば、LawrieandTuminCurOpinGenetDevelop31021091993参照;アデノウイルスベクター例えば、BettらJVirol6759111993参照;アデノ随伴ウイルスベクター例えば、ZhouらJExpMed17918671994参照、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含むpoxファミリー由来のウイルスベクター、アルファウイルス属由来のウイルスベクター、例えば、シンドビスおよびセムリキ森林熱ウイルス由来のもの例えば、DubenskyらJVirol705085191996参照およびパピローマウイルスOheらHumanGeneTherapy63253331995;WO94/12629Wooら;XiaoBrandsmaNucleicAcidsRes24263026221996を含む多くのウイルスベクター系が利用できる。本発明のポリペプチド融合物をコードするDNAまたはそれを含むベクターは、リポソーム中にパッケージングすることができる。適当な脂質および関連アナログは、US5,208,036、5,264,618、5,279,833および5,283,185により記載されている。ポリペプチド融合物をコードするベクターおよびDNAはまた、粒子担体に吸着または結合し得、これらの例は、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリラクチド-コ-グリコリドを含む例えば、McGeeらJMicroEncap1996参照。遺伝子治療ベクターまたは裸のDNAは、個々の患者への投与、一般的に全身投与例えば、静脈内、腹腔内、経鼻、胃内、皮内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入または局所適用例えば、US5,399,346参照により、インビボで送達することができる。DNAはまた、遺伝子銃を使用して投与することができるXiaoBrandsmasupra参照。ポリペプチドをコードするDNAは、微細金属ビーズの表面上に沈殿する。微粒子銃は、衝撃波または膨張ヘリウムガスで加速させ、いくつかの細胞層の深さまで組織を貫通する。例えば、AgacetusIncMiddletonWIにより製造されたAccelTMGeneDeliveryDeviceが適当である。あるいは、裸のDNAは、DNAを皮膚上に化学的または機械的刺激で付けることにより、皮膚を介して血流に簡単に通過させることができる例えば、WO95/05853参照。本明細書に記載されている医薬組成物はまた、併用療法の文脈において使用され得る。併用療法なる用語は、本明細書に記載されている少なくとも1つの治療有効用量の二量体タンパク質および別の治療剤を対象に投与することを示すために、本明細書において使用される。医薬組成物は、本明細書に記載されているポリペプチド融合物、二量体タンパク質またはポリヌクレオチドを含む容器を含むキットとして提供され得る。治療分子は、例えば、単回または複数回投与用の注射可能な溶液の形態において、または、注射前に再構成される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生機または治療タンパク質もしくはポリヌクレオチドの投与用の噴霧器を含むことができる。このようなキットは、医薬組成物の指示および用法の書面情報をさらに含み得る。例えば、VSTM3B7R1組成物を含むキットの特定の態様において、このような情報は、VSTM3組成物がVSTM3に対する既知の過敏症を有する患者には禁忌であることの記載を含み得る。本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。実施例1マウスB7R1バーベルmB7R1-バーベルの構築および発現mB7R1-mFc2-mB7R1天然mB7R1リーダー配列を有するmB7R1-バーベル;配列番号:9に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:10に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、2つの工程プロセスを使用する相同組換えを介して構築された。工程1最初に、融合タンパク質mB7R1-mFc2マウスFcフラグメントmFc2に融合したマウスB7R1細胞外ドメインECDに対する配列を含むDNAフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するPCR増幅により作製した。mB7R1-mFc2フラグメントはpZMP42に配列重複を有し、プライマーzc60639配列番号:36、zc60643配列番号:37およびzc60645配列番号:38を使用して作製した。このフラグメントを、以下のPCR条件で作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許出願公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、10μlの挿入DNAおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAPREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。構築の第2の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。工程2構築の第2の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するmB7R1ECDフラグメントの作製を含む。mB7R1ECDフラグメントはフラグメントの5’末端に加えられたBspEI制限切断部位およびフラグメントの3’末端に加えられたBsu36I部位を有し、プライマーzc60642配列番号:39およびzc60641配列番号:40を使用して作製した。該フラグメントを、以下のPCR条件を使用して作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。第1の工程からの構築物および第2の工程のmB7R1ECDフラグメントの両方を、BspEIおよびBsu36Iを使用して消化した。第1の工程の構築物および第2の工程のmB7R1ECDフラグメントに対する消化されたDNAを1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、DNAのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、2つの精製されたDNA調製物を互いに連結した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、1μlのライゲーション調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。このクローンは、1863と称した。天然シグナル配列を有するmB7R1-バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:9および10に示される。mB7R1-バーベルの成熟形態は、配列番号:10のアミノ酸26-489配列番号:9のヌクレオチド76-1467によってコードされるに対応する。mB7R1-バーベルの発現3セットの200μgの構築物1863をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例2ヒトB7R1バーベルB7R1-バーベルの構築および発現B7R1-Fc5-B7R1天然B7R1リーダー配列を有するB7R1-バーベル;配列番号:5に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:6に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、2つの工程プロセスを使用する相同組換えを介して構築された。工程1最初に、融合タンパク質B7R1-Fc5エフェクター機能を有さないFcフラグメントFc5に融合したヒトB7R1細胞外ドメインECDに対する配列を含むDNAフラグメントを、PCR増幅および組換えにより作製した。B7R1ECDフラグメントおよびFc5フラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。B7R1ECDフラグメントはFc5に配列重複を有し、プライマーzc53051配列番号:41およびzc60385配列番号:42を使用して作製した。Fc5をコードするフラグメントは、B7R1ECDへの5’重複、GGGSGリンカー、BspEI部位および下流BglII部位を含む複数のクローニング領域、ならびにpZMP42ベクター配列との配列重複を有し、プライマーzc60386配列番号:43、zc59433配列番号:44およびzc59434配列番号:45を使用して作製した。これらの2つのフラグメントを、以下のPCR条件で作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許出願公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、10μlの挿入DNAおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAPREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該構築物を1795と称し、構築の第2の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。工程2構築物1795を、pZMP42においてヒトB7R1バーベルベクターを構築する第1の工程として構築した。1795は、リンカー配列からなる3’付加ならびに制限酵素認識部位BspEIおよびBglIIを含む多数のクローニング領域を含むベクターpZMP42中にB7R1-Fc5フラグメントを含む。構築の第2の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するB7R1ECDフラグメントの作製を含む。B7R1ECDフラグメントはフラグメントの5’末端に加えられたBspEI制限切断部位およびフラグメントの3’末端に加えられたBglII部位を有し、プライマーzc59435配列番号:77、zc60392配列番号:78およびzc59434配列番号:45を使用して作製した。フラグメントを、以下のPCR条件を使用して作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。構築物1795および第2の工程のB7R1ECDフラグメントの両方を、BspEIおよびBglIIを使用して消化した。構築物1795および第2の工程のB7R1ECDフラグメントに対する消化されたDNAを1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、DNAのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、2つの精製されたDNA調製物を互いに連結した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、1μlのライゲーション調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。このクローンを1812と称した。天然シグナル配列を有するB7R1-バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:5および6に示される。B7R1-バーベルの成熟形態は、配列番号:6のアミノ酸22-498配列番号:5のヌクレオチド64-1494によってコードされるに対応する。B7R1-バーベルの発現3セットの200μgの構築物1812をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例3マウスB7R1タンデムmB7R1-タンデムの構築および発現mB7R1m-mB7R1-mFc2天然mB7R1リーダー配列を有するmB7R1-タンデム;配列番号:11に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:12に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、mFc2挿入物実施例1の工程1に記載されている構築物を含む発現ベクターpZMP42の以前に修飾されたバージョンにライゲーションを介して構築された。mB7R1細胞外ドメインECDを含むDNAフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。フラグメントは、5’末端に操作されたEcoRI部位、mB7R1ECD、およびGly-Serリンカーを有し、プライマーzc60639配列番号:36、zc60640配列番号:46およびzc60644配列番号:47を使用して作製した。第2のDNAフラグメントは、3’末端上に第1のフラグメントのGly-Serリンカー、mB7R1ECD、およびフラグメントの3’末端上にBglII部位に重複で作製し、プライマーzc60642配列番号:48およびzc28844配列番号:49を使用して作製した。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。これらの2つのDNAフラグメントを、重複PCRを使用して単一のフラグメントに融合した。2つのゲル精製フラグメントをPCRチューブに加え、プライマーzc60639配列番号:36およびzc28844配列番号:49を使用して増幅した。得られたフラグメントは、コア配列mB7R1-mB7R1の側面に5’EcoRI部位および3’BglII部位を含んだ。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。精製されたフラグメントおよび修飾されたベクターpZMP42の両方を、EcorIおよびBglIIを使用して消化し、興味あるバンドを単離し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して精製した。次に、精製されたフラグメントを、mB7R1-mB7R1フラグメントが修飾されたpZMP42ベクターに含まれるmFc2とインフレームであるように、当分野で知られている方法を使用して連結した。得られた構築物は、mB7R1-mB7R1-mFc2からなるタンパク質を発現する。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した特許公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されているエレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、1μlのライゲーションDNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。最終クローンを構築物1864と称した。天然シグナル配列を有するmB7R1-タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:11および12に示される。mB7R1-タンデムの成熟形態は、配列番号:12のアミノ酸26-504または26-503それぞれ、配列番号:11のヌクレオチド76-1512または76-1509によってコードされるに対応する。mB7R1-タンデムの発現3セットの200μgの構築物1864をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例4ヒトB7R1タンデムB7R1-タンデムの構築および発現B7R1-B7R1-Fc5天然B7R1リーダー配列を有するB7R1-タンデム;配列番号:7に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:8に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、発現ベクターpZMP42にB7R1-Fc5挿入物を含む構築物1795実施例2の工程1に記載されている構築物を称される以前に作製された構築物にライゲーションを介して構築された。構築は2つの工程プロセスで行った。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した特許公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。工程1B7R1細胞外ドメインECDを含むDNAフラグメントを、鋳型として以前に作製されたクローンを使用して作製した。フラグメントは、5’末端に操作されたEcoRI部位、B7R1ECD、BspEI部位を含むGly-Serリンカーを有し、プライマーzc53051配列番号:41、zc62529配列番号:50およびzc62530配列番号:51を使用して作製した。このフラグメントを、以下のPCR条件で作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。構築物1795および精製されたPCRフラグメントの両方を、EcoRIおよびBspEIを使用して消化した。構築物1795およびPCRフラグメントに対する消化されたDNAを1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、DNAのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、2つの精製されたDNA調製物を互いに連結した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、1μlのライゲーションDNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。構築の第2の工程のためのベースとして、該構築物を使用した。工程2構築の第2の工程は、鋳型として以前に作製されたクローンを使用するB7R1-Fc5フラグメントエフェクター機能を有さないFcフラグメントFc5に融合したヒトB7R1細胞外ドメインECDの作製を含む。B7R1-Fc5フラグメントはフラグメントの5’末端に加えられたBspEI制限切断部位およびフラグメントの3’末端に加えられたBglII部位を有し、プライマーzc62531配列番号:52およびzc62532配列番号:53を使用して作製した。フラグメントを、以下のPCR条件を使用して作った:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。第1の工程からの構築物および第2の工程のB7R1-Fc5フラグメントの両方を、BspEIおよびBglIIを使用して消化した。第1の工程の構築物および第2の工程のB7R1-Fc5フラグメントに対する消化されたDNAを1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、DNAのサイズに対応するバンドをゲル抽出した。次に、当分野で知られている方法を使用して、2つの精製されたDNA調製物を互いに連結した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、1μlのライゲーション調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該クローンを1914と称した。天然シグナル配列を有するB7R1-タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:7および8に示される。B7R1-タンデムの成熟形態は、配列番号:8のアミノ酸22-513または22-512それぞれ、配列番号:7のヌクレオチド64-1539または64-1536によってコードされるに対応する。B7R1-タンデムの発現3セットの200μgの構築物1914をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例5otPAリーダー配列を使用してG25成熟開始を有するヒトB7R1バーベルB7R1[G25-P141]-バーベルの構築および発現B7R1[G25-P141]-Fc5-B7R1[G25-P141]B7R1[G25-P141]-バーベル;配列番号:13の残基106-1518に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:14の残基36-506に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、結合されると、B7R1[G25-P141]-バーベルに対する配列を含む3つのDNAフラグメント、および発現ベクターpZMP42を使用する相同組換えを介して構築した。B7R1[G25-P141]-バーベルフラグメントを、鋳型としてB7R1-バーベルの以前に作製されたクローンを使用して3つのフラグメントのPCR増幅により作製した。第1のフラグメントは、ベクターに対する5’フランキング配列、最大残基C69までの第1のB7R1細胞外ドメインECDモジュールの部分、およびC69の後ろの残基の重複を含むオリゴzc64230配列番号:54およびzc64219配列番号:55を使用して作製した。第2のフラグメントは、フランキング配列から第1のフラグメントに、第1のB7R1モジュールの残基C69を介して、Fc5の末端までにわたるオリゴzc64215配列番号:56およびzc64216配列番号:57を使用して作製した。最終フラグメントは、オリゴzc64228配列番号:58、zc64220配列番号:59、zc64224配列番号:60、zc64231配列番号:61、zc64225配列番号:62、zc64221配列番号:63、zc64226配列番号:64、zc64222配列番号:65、zc64223配列番号:66、zc64258配列番号:67およびzc59434配列番号:45を使用する重複PCRを介して合成的に作製した。酵母組換えにより集合させたとき、3つのフラグメントの融合物は、pZMP42ベクターの5’重複、otPAリーダー配列、第2のB7R1[G25-P141]モジュールに融合したFc5に融合した第1のB7R1[G25-P141]モジュール、およびpZMP42ベクター配列の3’重複を含む。それぞれのフラグメントを作製するために使用されたPCR条件は、以下のとおりであった:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許出願公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、3μlのそれぞれの挿入DNAフラグメントおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAPREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該クローンを構築物2024と称した。otPAシグナル配列を有するB7R1[G25-P141]-バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:13および14に示される。B7R1[G25-P141]-バーベルの成熟形態は、配列番号:14のアミノ酸36-506配列番号:13のヌクレオチド106-1518によってコードされるに対応する。B7R1[G25-P141]-バーベルの発現3セットの200μgの構築物をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例6otPAリーダー配列を使用してG25成熟開始およびC69Y変異を有するヒトB7R1バーベルB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの構築および発現B7R1[G25-P141][C69Y]-Fc5-B7R1[G25-P141][C69Y]B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベル;配列番号:13の残基106-1518に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:16の残基36-506に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、結合されると、B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルに対する配列を含む3つのDNAフラグメント、および発現ベクターpZMP42を使用する相同組換えを介して構築した。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルフラグメントを、鋳型としてB7R1-バーベルの以前に作製されたクローンを使用して3つのフラグメントのPCR増幅により作製した。第1のフラグメントは、ベクターに対する5’フランキング配列、最大残基C69までの第1のB7R1細胞外ドメインECDモジュールの部分、およびC69の後ろの残基の重複を含むオリゴzc64230配列番号:54およびzc64218配列番号:68を使用して作製した。第2のフラグメントは、フランキング配列から第1のフラグメントに、第1のB7R1モジュールの残基C69を介して、Fc5の末端までにわたるオリゴzc64215配列番号:56およびzc64216配列番号:57を使用して作製した。最終フラグメントは、オリゴzc64228配列番号:58、zc64220配列番号:59、zc64224配列番号:60、zc64227配列番号:69、zc64225配列番号:62、zc64221配列番号:63、zc64226配列番号:64、zc64222配列番号:65、zc64223配列番号:66、zc64258配列番号:67およびzc59434配列番号:45を使用する重複PCRを介して合成的に作製した。酵母組換えにより集合させたとき、3つのフラグメントの融合物は、pZMP42ベクターの5’重複、otPAリーダー配列、第2のB7R1[G25-P141][C69Y]モジュールに融合したFc5に融合した第1のB7R1[G25-P141][C69Y]モジュール、およびpZMP42ベクター配列の3’重複を含む。それぞれのフラグメントを作製するために使用されたPCR条件は、以下のとおりであった:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。該挿入物は、B7R1ECDモジュールの修飾を含む。残基C69は、チロシンYに変異されていた。成熟タンパク質のN-末端開始はまた、ヒト予測開始アミノ酸残基22からアミノ酸残基25G25を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、3μlのそれぞれの挿入DNAフラグメントおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAPREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該クローンを構築物2026と称した。otPAシグナル配列を有するB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:15および16に示される。B7R1[G25-P141]-バーベルの成熟形態は、配列番号:16のアミノ酸36-506配列番号:15のヌクレオチド106-1518によってコードされるに対応する。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの発現3セットの200μgの構築物をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例7EMILリーダー配列を使用してG25成熟開始およびC69Y変異を有するヒトB7R1バーベルB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの構築および発現B7R1[G25-P141][C69Y]-Fc5-B7R1[G25-P141][C69Y]B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベル;配列番号:17の残基67-1497に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:18の残基23-493に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルに対する配列を含むDNAフラグメント、および発現ベクターpZMP42を使用する相同組換えを介して構築した。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルフラグメントはプライマーzc65030配列番号:70、zc65029配列番号:71、およびzc59434配列番号:45を使用するPCR増幅により作製した。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルフラグメントを、鋳型として構築物2026と称されるB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの以前に作製されたクローンを使用して3つのフラグメントのPCR増幅により作製した。該フラグメントはpZMP42ベクター配列との5’重複、EMILと称されるリーダー配列配列番号:17の残基1-66;配列番号:18の残基1-22に示されるコードされたアミノ酸配列、B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルセグメント配列番号:17の残基67-1497;配列番号:18の残基23-493に示されるコードされたアミノ酸配列、ならびにpZMP42ベクター配列との3’重複を含む。使用されたPCR条件は、以下のとおりであった:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。該挿入物は、B7R1細胞外ドメインECDモジュールの修飾を含む。残基C69は、チロシンYに変異されていた。成熟タンパク質のN-末端開始はまた、ヒト予測開始アミノ酸残基22からアミノ酸残基25G25を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許出願公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、10μlの挿入DNAおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該クローンを構築物2065と称した。EMILシグナル配列を有するB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:17および18に示される。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの成熟形態は、配列番号:18のアミノ酸23-493配列番号:17のヌクレオチド67-1497によってコードされるに対応する。B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルの発現3セットの200μgの構築物をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例8EMILリーダー配列を使用してG25成熟開始およびC69Y変異を有するヒトB7R1タンデムB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムの構築および発現B7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]-Fc5B7R1[G25-P141][C69Y]-タンデム;配列番号:19の残基67-1524に示されるポリヌクレオチド配列;配列番号:20の残基23-508に示されるコードされたポリペプチド配列を含む発現プラスミドは、B7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]配列番号:20の残基23-139に対する配列を含むDNAフラグメント、Fc5をコードするDNAフラグメント、および発現ベクターpZMP42を使用する相同組換えを介して構築した。B7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]フラグメントはオリゴzc65030配列番号:70、zc65029配列番号:71、zc65050配列番号:72、zc65051配列番号:73、およびzc65052配列番号:74を使用する一連のPCR増幅により作製した。Fc5フラグメントはオリゴzc65053配列番号:75およびzc65054配列番号:76を使用して作製した。B7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]フラグメントを、鋳型として構築物2026と称されるB7R1[G25-P141][C69Y]-Fc5-B7R1[G25-P141][C69Y]B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベル実施例6参照の以前に作製されたクローンを使用して3つのフラグメントのPCR増幅により作製した。第1の反応は、オリゴzc65030配列番号:70、zc65029配列番号:71およびzc65050配列番号:72を使用して5’EMILリーダー配列を有する1つのB7R1[G25-P141][C69Y]ユニットを増幅した。第2の反応は、オリゴzc65051配列番号:73およびzc65052配列番号:74で第2のB7R1[G25-P141][C69Y]ユニットを増幅した。最終反応は、オリゴzc65030およびzc65052で第1の2つの増幅された産物に対する重複PCRを使用して、単一の融合B7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]フラグメントを作製した。該フラグメントはpZMP42ベクター配列との5’重複、EMILと称されるリーダー配列配列番号:19の残基1-66;配列番号:20の残基1-22に示されるコードされたアミノ酸配列、Gly-Serリンカーを介して連結されたB7R1[G25-P141][C69Y]の2つの連続コピー配列番号:19の残基67-828;配列番号:20の残基23-276に示されるコードされたアミノ酸配列、およびFc5の5’末端の3’重複を含む。使用された全ての反応に対するPCR条件は、以下のとおりであった:1サイクル、94°C、5分;35サイクル、94°C、1分、次に、58°C、2分、次に、72°C、3分;1サイクル、72°C、10分。Fc5をコードする第2のフラグメント配列番号:19の残基829-1524;配列番号:20の残基277-508に示されるコードされたアミノ酸配列は、プライマーzc65053配列番号:75およびzc65054配列番号:76を使用して作製した。このフラグメントはFc5フラグメントおよびベクターpZMP42の3’重複を含む。PCR反応混合物を1アガロースゲルに流し、QIAQUICKTMGelExtractionKitを使用して、挿入物のサイズに対応するバンドをゲル抽出した。該挿入物は、B7R1細胞外ドメインECDモジュールの修飾を含む。残基C69は、チロシンYに変異されていた。成熟タンパク質のN-末端開始はまた、ヒト予測開始アミノ酸残基22からアミノ酸残基25G25を離れて調節された。これらの変化は、ヒトタンパク質の生産で観察されるいくつかの問題を解決するために実施された。プラスミドpZMP42は、MPSVプロモーター、コード配列の挿入のための多数の制限酵素認識部位、およびotPAシグナルペプチド配列;C型肝炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、および膜貫通ドメインのC-末端で切断されたCD8の細胞外ドメイン;ポリオウイルス由来の内部リボソーム侵入部位IRESエレメント、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター;大腸菌複製起点;ならびにサッカロミセスセレビシエにおいて選択および複製のために必要なURA3およびCEN-ARS配列を有する発現カセットを含む哺乳動物発現ベクターである。それは、pZMP21から構築した米国特許出願公開第US2003/0232414号A1ATCCPTA-5266として称され、AmericanTypeCultureCollection10801UniversityBoulevardManassasVA201102209に寄託されている。PCRフラグメントでの酵母における組換えの前に、プラスミドpZMP42をBglIIで切断した。100マイクロリットルのコンピテント酵母サッカロミセスセレビシエ細胞を、5μlのB7R1[G25-P141][C69Y]-B7R1[G25-P141][C69Y]フラグメントDNA、5μlのFc5フラグメントDNAおよび100ngのカットされたpZMP42ベクターと独立して組み合わせて、混合物を0.2cmエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物を、0.75kV5kV/cm、∞オーム、および25μFの電源セットを使用して電気パルスを行った。600μlの1.2Mのソルビトールをキュベットに加え、酵母を2つのURA-Dプレート上の100μlおよび300μlアリコート中に置き、30°Cでインキュベートした。約72時間後、単一のプレートからのUra酵母形質転換体を1mlのH2Oに再懸濁し、簡潔に回転させ、酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを0.1mlの溶解バッファー2のTritonX-100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA中でボルテックスにより再懸濁し、10ユニットのザイモリエイスを有する0.1mLのP1QIAPREPSpinMiniprepKitQiagencat27106を加えたZymoResearchcatE1002。酵母懸濁液を水浴中で37°Cで10分間インキュベートした。試薬P2を加える工程で開始する標準QIAPREPSpinMiniprepKitprotocolを使用して、酵母由来のDNAを単離した。エレクトロコンピテント大腸菌宿主細胞DH12Sの形質転換を、5μlの酵母DNA調製物および50μlの細胞を使用して行った。細胞を2.0kV、25μF、および400オームで電気パルスを行った。エレクトロポレーション後、1mlのSOC2のBACTOTMTryptone、0.5の酵母抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコースを加え、次に、細胞を2つのLBAMPプレート上の50μlおよび200μlのアリコートLB培養液、1.8のBACTOTMAgar、100mg/Lのアンピシリン中に置いた。構築物に対するいくつかのクローンの挿入物を配列分析に付し、正しい配列を含む1つのクローンを選択した。製造業者の指示にしたがって市販されているキットQIAGENPlasmidMegaKitQiagenValenciaCAを使用して、大規模プラスミドDNAを単離した。該クローンを構築物2066と称した。EMILシグナル配列を有するB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムに対する全長ヌクレオチドコード配列および対応するアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号:19および20に示される。B7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムの成熟形態は、配列番号:20のアミノ酸23-508または23-507それぞれ配列番号:19のヌクレオチド67-1524または67-1521によってコードされるに対応する。B7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムの発現3セットの200μgの構築物をそれぞれ、37°Cで3時間200ユニットのPvuIで消化し、次に、IPAで沈殿させ、1.5mLの微量遠心チューブ中で遠沈した。上清をペレットに注ぎ、ペレットを1mLの70エタノールで洗浄し、室温で5分間インキュベートした。チューブを14,000RPMで10分間微量遠心管中で回転させ、上清をペレットに注いだ。次に、ペレットを無菌環境下で750μlのZF1培地に再懸濁し、60°Cで10分間インキュベートし、室温に冷やした。5×106CHODXB115xSA細胞をそれぞれの3つのチューブ中で遠沈し、DNA-培地溶液を使用して再懸濁した。DNA/細胞混合物を0.4cmギャップキュベット中に置き、以下のパラメーターを使用して電気穿孔した:950μF、大容量、および300V。次に、キュベットの内容物を取り出し、プールし、ZF1培地で25mLに希釈し、125mLの振とうフラスコに置いた。フラスコを、37°Cで、6CO2および120RPMでの振とうの振とう器上のインキュベーター中に置いた。該細胞系を栄養素選択、次に、200nMのメトトレキサートMTXへの増幅工程に付した。発現をウェスタンブロットにより確認し、細胞系をスケールアップし、タンパク質を精製した。実施例9ヒトおよびマウスB7R1タンデムおよびバーベルタンパク質の精製ヒトおよびマウス可溶性B7R1細胞外ドメインを、一時的および安定な発現のために2つの立体配置タンデムおよびバーベルにおけるヒトFc上記実施例参照と融合した。ヒトB7R1Fc融合タンパク質はトランスフェクト293またはCHO細胞から生産し、マウスタンパク質はトランスフェクトCHO細胞から生産した。トランスフェクションは、当分野で知られている方法を使用して行った。ヒト形態がより高い収量をなし遂げるように操作されるヒト形態を、天然B7R1細胞外ドメインのグリシン25G25での成熟開始を有するように、ならびに位置69C69Yにてシステインをチロシン変異へ組換えるように操作した;上記例えば、実施例7および8参照まで、マウスタンパク質はヒト形態より高いレベルで一貫して生産された。全ての形態を、アフィニティー捕獲、次に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用するバッファー交換のための濃縮からなる同じプロセスを使用して精製した。ヒトおよびマウスB7R1Fc融合タンパク質の両方において、精製は1.5から10Lのラボベンチ規模で行った。表3:ヒトおよびマウスB7R1タンデムおよびバーベルの精製細胞培養上清を回収し、0.2μmフィルターを使用して無菌濾過した。タンパク質を、タンパク質AセファロースまたはMabSelectSUREおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィー全て、GEHealthcarePiscatawayNJからの組合せにより濾過された媒体から精製した。規模に依存して、5から157mlのタンパク質Aカラムを、3カラム容量CVの25mMのクエン酸ナトリウム-リン酸ナトリウム、250mMの硫酸アンモニウムpH3バッファーで再溶離し、20CVの25mMのクエン酸ナトリウム-リン酸ナトリウム、250mMの硫酸アンモニウムpH7.2で平衡にした。CHO培養上清を4°Cで一晩24-42cm/hrでタンパク質Aカラムに直接負荷し、上清中のB7R1Fc融合タンパク質を捕獲した。負荷完了後、カラムを少なくとも10CVの平衡バッファーで洗浄した。次に、カラムを少なくとも10CVの25mMのクエン酸ナトリウム-リン酸ナトリウム、250mMの硫酸アンモニウムpH7.2バッファーで洗浄し、次に、結合タンパク質をクエン酸-リン酸-硫酸アンモニウムバッファーを使用して形成されたpH7.2からpH3の20CV勾配で92-149cm/hrで溶離した。溶離されたタンパク質を即座に中和するために、画分を含む対象を2.0MのTris、pH8.0を含むチューブに回収した。画分を、溶離プロフィールにおけるA280屈折に基づいてプールした。次に、アフィニティープールを、AmiconUltra-1530KNWML遠心装置Milliporeまたは30kDMWカットオフ膜での撹拌セルのいずれかを使用して、限外ろ過によるサイズ排除カラムで<3の容量に濃縮下。次に、濃縮物を、28cm/hrで35mMのリン酸ナトリウム、120mMのNaClpH7.3において再平衡した適当なサイズのSuperdex200カラム上に注入した。精製されたB7R1Fc融合タンパク質を含む画分をA280に基づいてプールし、0.2μmフィルターを介して濾過し、内容物およびエンドトキシンについてアッセイし、-80°Cでアリコートとして冷凍した。最終精製されたタンパク質の内容物を、理論的消滅係数を使用してA280での吸光度により決定した。全プロセス回収は、マウスタンパク質に対して10-14mg/Lおよびヒト構築物に対して6-66mg/Lで変化した。精製されたB7R1タンデムおよびバーベルタンパク質の分析組換えB7R1Fc融合タンパク質は、タンパク質に対して0.1CoomassieR250染色でのSDS-PAGE412BisTrisInvitrogenCarlsbadCAおよび抗-IgG-HRPでの免疫ブロット法により特徴付けられた。精製されたタンパク質を、InvitrogenNovex’sXcellIIminicellを使用して電気泳動し、25mMのTris塩基、200mMのグリシン、および20メタノールを含むバッファー中で600mAで環境温度で45分間でニトロセルロース02mmInvitrogenCarlsbadCAに移した。次に、フィルターを室温で15分間50mMのTris、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.05のIgepalTBSの10の脱脂粉乳でブロックした。ニトロセルロースを迅速に濯ぎ、IgG-HRP抗体1:10,000を加えた。ブロットを穏やかな振とうにて4°Cで一晩インキュベートした。インキュベーション後、ブロットをTBS中でそれぞれ10分間で3回洗浄し、次に、迅速にH2O中で濯いだ。ブロットを市販されている化学発光基質試薬RocheLumiLightを使用して現し、シグナルをImageQuantTL装置およびソフトウェアGEHealthcareを使用して捕獲した。精製されたB7R1マウスおよびヒトタンデムおよびバーベルFc融合タンパク質は、ウェスタンブロットおよびCoomassie染色ゲルの両方において、非還元条件下で約160kDaおよび還元条件下で約64kDaの2つのバンドとして現れ、予想通りグリコシル化二量体形態を示唆した。該タンパク質は、正しいNH2末端、正しいアミノ酸組成物を有し、SECMALSを使用してグリコシル化の質量およびパーセントについてよく特徴付けられた。実施例10B7R1融合タンパク質の動的光散乱DLS分析動的光散乱DLSを使用して、プレートリーダーフォーマットにおけるDynaProPlus装置WyattTechnologySantaBarbaraCAで21°C、5°Cおよび37°CでのヒトおよびマウスB7R1融合構築物の短期安定性および凝集モニタリングした。マウスとヒト型を比較するこれらの最初の試験の結果として、元のヒト対応物に対する変異ヒトバーベルおよびタンデム構築物の安定性を比較するために、さらなる実験を行った。1.分析技術における背景DLSは、マイクロ秒の時間規模にわたって散乱光強度の時間依存性変動を測定する。強度におけるこれらの変動は、ブラウン運動によって溶液中に拡散している粒子の結果であり、拡散速度はサイズと関連する。DLS生データは、拡散係数Dtが得られる自己相関関係プロットとして獲得される。多重種類、例えば、大型オリゴマーまたは凝集体での単量体が存在するとき、拡散係数の分布はDynamicsソフトウェアv60WyattTechnologyによる解析後に見られる。次に、流体力学的半径または、StokesradiusRhを、溶液中の粒子の拡散速度およびサイズ間の理論的関連を示すStokes-Einstein関連を使用するソフトウェアにより得る。DLSは非常に少量の大型種類に極度に感受性であり、全サンプルの0.01に至るまでのタンパク質凝集体を容易に定量するために使用することができる。2.分析パラメーターの記載サンプル調製サンプルを-80°C保存から回復させ、1mg/mLでの分析のために室温で30分間、または次に25mg/mL分析のために10KMWCOAmiconユニットにおける回転濃縮工程で解凍した。次に、200μlのアリコートを1.5mLの微量遠心チューブに移し、環境温度で5分間Eppendorf卓上遠心機において14Krpmで遠心した。遠心分離後、20μlのサンプルを、それぞれのサンプルに対するトリプリケートにおいてスキャンするために、Corning384ウェルガラス底プレートに移した。一滴のシリコーン油カバーを、分析中、それぞれのウェルに加えた。両方のサンプル濃度を、元の製剤バッファーのみの中で試験した。分析パラメーターデータを、それぞれ15秒の単位において60秒間それぞれのウェルにおいて収集した。サンプルを、21°C示度のために室温で2時間、5°Cで一晩、次に37°Cで2時間インキュベーション後にスキャンした。新たに調製されたサンプルでの37°Cでの別々の経時的実験もまた、より高い温度で時間とともに凝集をモニタリングするために行った。3.結果の要約DLSサイズ分布分類の鍵単一モードおよび多モードなる用語は、検出されるビンまたはピークの数を示す。単分散および多分散なる用語は、それぞれのビン内の種類のサイズの変動性を示す。例えば、サンプルを、2つ以上の密接に関連した種類、例えば、単量体/二量体/トリマーを含む検出された単一モード/多分散=1つのビンとして分類した。マウスおよびヒト型間の観察される違い精製されたマウスB7R1の最初の型の分析は、全4つの立体配置、すなわち、Fc配列番号:34、VASP配列番号:35、バーベル配列番号:10残基26-489;構築物1863およびタンデム配列番号:12残基26-504または26-503;構築物1864型が全3つの温度で安定であったことを示した。37°Cで不安定性は観察されなかった。逆に、バーベル配列番号:6残基22-498;構築物1812およびタンデム配列番号:8残基22-513または22-512;構築物1914分子のヒト形態は、ヒトFcB7R1-Fc5;配列番号:79およびVASPB7R1-VASP;配列番号:81構築物と同様に、37°Cで著しい不規則な凝集および不安定性を示した。該凝集は2時間以内に観察され、可逆性ではなく、会合/凝集がアンフォールディング経路を介して生じることを示した。37°CでのヒトB7R1の不安定性は、低および高濃度の両方で観察され、ロット間分析と一貫していた。ヒトバーベルおよびタンデム型の変異の効果ヒトB7R1バーベルおよびタンデム分子の変異型-B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベル配列番号:18残基23-493;実施例7参照およびB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデム配列番号:20残基23-508または23-507;実施例8参照もまた、DLSを使用して分析した。データを、37°Cでさらなる経時的試験で全3つの温度で収集した。1mg/mLで、両方の変異型は、平均半径のわずかな増加により示されるとおり、観察されたごくわずかな多重合で21°Cおよび5°Cで短期安定性を示す。59nm半径の大型種類は37°CでT=4hrで観察されたが、サンプルの微量成分0.1重量であり、環境温度に冷却時に可逆的に解離された。25mg/mLのより高い濃度で、両方の型は、小さい、密接に関連した種類、例えば、二量体/トリマーの量においてわずかな増加を示す、わずかにより大きい平均半径および増加した多分散性を有したが、該サンプルは単一モードおよび単分散すなわち、1つのビンが検出されるを維持し、HMW凝集体を含まなかった。これらの2つの型のバーベルは、わずかにより安定であると考慮されたが、しかしながら、どちらのサンプルもT=18時の最終測定までの短期間にわたって37°Cで有意な不安定性を示さなかった。結論B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルおよびB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムは、元のヒト構築物で観察される凝集問題の完全な改善で、低および高濃度の両方で37°Cで安定性における所望の増加を示した。実施例11ヒトB7R1構築物に対する結合アッセイB7R1受容体含有タンパク質に対する細胞ベースの結合アッセイを、既知のPVRポリオウイルス受容体;CD155-B7R1受容体-リガンド対を使用して確立した。P815細胞マウス肥満細胞腫細胞系、ATCCを、標準技術を使用して、ネオマイシンG418選択マーカーを含むヒトPVR発現ベクターをトランスフェクトした。G418選択下での増殖後、hPVRの発現をフローサイトメトリーにより確認した。空のベクターを有するP815細胞の平行トランスフェクションコントロールをG418選択下で増殖し、フローサイトメトリーによりhPVRの発現を有さないことを確認した。4つのヒトB7R1受容体含有タンパク質:A1648.1、アミン結合を介してAlexaFluor647で直接標識されているhB7R1-VASP分子配列番号:81;A2648F、hB7R1-Fc2二量体配列番号:79;A2751F、hB7R1-バーベル-Fcタンパク質配列番号:18残基23-493;A2752F、hB7r1-タンデムFcタンパク質配列番号:20残基23-508または23-507を、hPVRを発現するP815細胞に結合する能力について試験した。後者3つを、Zenon-PEマウスIgG標識化キットInvitrogenで直接標識した。ウェルあたり100,000個のhPVRを発現する細胞またはネガティブコントロール細胞を、96-ウェルU底プレートに置いた。プレートをRTで300×gで5分間遠心し、上清を除去した。細胞を、5μg/mLで開始する上記タンパク質の滴定で、100μlのStainingMediaPBS、1v/vのFBS、0.05w/vのアジ化ナトリウムに再懸濁し、0コントロールを含む6点曲線のために0.06μgに至るまでの3倍連続希釈で滴定した。タンパク質/細胞を氷上で1時間インキュベートし、次に細胞を全3回の洗浄のために150μlのStainingMediaで洗浄した。最終洗浄後、細胞をStainingMedia:CytofixBectonDickensonの150μlの1:1混合物に再懸濁した。細胞を、LSRII装置BectonDickensonにおけるフローサイトメトリーにより分析した。全データ点をトリプリケートで行った。全hB7R1含有タンパク質は、hPVRを発現するP815細胞への用量依存性結合を示した。ネガティブコントロール細胞への結合はなかった。実施例12ヒトB7R1構築物に対する競合アッセイヒトB7R1含有構築物の競合的結合を測定するために細胞ベースのアッセイを確立した。ウェルあたり100,000個の上記hPVRを発現するP815細胞を96-ウェルU底プレートに置いた。プレートをRTで300×gで5分間遠心し、上清を除去した。細胞を、1:100希釈の市販されているFc-blockBectonDickensonを含む50μlのStainingMediaPBS、1v/vのFBS、0.05w/vのアジ化ナトリウムに再懸濁し、バックグラウンド結合を最小限にした。氷上で10分インキュベーション後、ヒトB7r1含有タンパク質の滴定を含む50μlのStainingMediaを、30μg/mLから0.042μg/mに至るまでの滴定の3×濃度で加えた。この添加の直後、3μg/mLのA1476-AlexaFluor647アミン結合を介してAlexaFluor647で直接標識されているhB7r1-Fc2を含む50μlのStainingMediaを、穏やかなピペッティングにより混合されたそれぞれのウェルに加えた。染色を氷上で1時間続行した。インキュベーション後、細胞を全3回の洗浄のために150μlのStainingMediaで洗浄した。最終洗浄後、細胞をStainingMedia:CytofixBectonDickensonの150μlの1:1混合物に再懸濁した。細胞を、LSRII装置BectonDickensonにおけるフローサイトメトリーにより分析した。全データ点をトリプリケートで行い、EC50は、GraphPadPrismソフトウェアでの4-パラメーター非曲線回帰曲線フィットを使用して計算した。全hB7R1含有タンパク質-B7R1-VASP配列番号:81;B7R1-Fc2二量体配列番号:79;B7R1[G25-P141][C69Y]-バーベル配列番号:18残基23-493;およびB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデム配列番号:20残基23-508または23-507は、標識化hB7R1-Fc2結合に対して用量依存的競合を示した。hPVR発現に対してネガティブであるWTP815細胞への結合はなかった。2つの異なる実験からのIC50は、以下の表4に示されている。表4:PVRP815細胞へのB7R1-Fc2結合に対する競合実施例13ヒトB7R1タンデムおよびバーベルタンパク質の生物学的活性T細胞は、通常、抗原提示細胞APCにより提示されるMHC分子および外来ペプチドによるT細胞抗原受容体TCR関与により活性化される。プロフェショナルAPCはまた、T細胞上の他の受容体に関与し、活性化に寄与する多くの共刺激分子を発現する。該プロセスは、TCR/CD3複合体に対する抗体を提示するFc受容体を発現する細胞により模倣することができる。次に、共刺激分子の提示は、Fc受容体を発現する細胞のトランスフェクションにより選択される分子を提供することにより、若干制御することができる。我々は、Fc受容体を発現し、抗-CD3抗体と有効に架橋するマウス肥満細胞腫細胞系P815を使用する。野生型P815細胞および抗-CD3抗体はヒトT細胞を刺激することができるが、PVRが共刺激性シグナルを送達するT細胞上のCD226DNAM-1と関与するため、P815細胞が、PVRCD155も発現する場合は、刺激のレベルが増強される。可溶性B7R1は、この相互作用を阻害し、CD226介在共刺激シグナルをブロックする。ヒトT-細胞をネガティブ選択PanTcellIsolationKitMiltenyiBiotecAuburnCAにより末梢血から単離し、CFSEInvitrogenCarlsbadCAで標識した。T-細胞を、増殖培地RPMI1640培地、L-グルタミン、10のFBS、NEAA、HEPES、Pen-Strep;InvitrogenCarlsbadCA中、ウェルあたり100,000個の細胞で96ウェルプレートのそれぞれのウェル中に置いた。ウェルを、以下のさらなる試薬を用いて、または用いないでトリプリケートにおいて構成した:ウェルあたり50,000個の細胞でのP815細胞またはウェルあたり50,000個の細胞の全長ヒトPVRP815/PVRでトランスフェクトされ、安定に発現するP815細胞、50ng/mlでの抗-CD3BDBioscienceSanDiegoCA、0.6-5μg/mlでのB7R1融合タンパク質。この系において、P815細胞上のFc-受容体は、T細胞に対するアゴニスト抗-CD3Mabと架橋し、T細胞受容体TCRを介して準最適な一次刺激を提供し、PVRはCD226の関与を介して共刺激する。可溶性B7R1の付加は、PVRへ結合し、CD226活性化をブロックすることにより共刺激を阻害するはずである。サンプルを37°Cで4日間インキュベートし、回収し、典型的な染色プロトコールにしたがって、フルオロクロム結合型抗-CD4および抗-CD8BDBioscienceSanDiegoCAで染色した。T細胞をフローサイトメトリーLSRIIBDBioscienceSanDiegoCAにより分析し、細胞増殖をCFSE希釈物により測定した。CD4およびCD8T細胞に対する効果を、これらの特定の集団のゲーティングすることにより独立してモニタリングした。本実施例において、タンパク質の2つの四量体型を試験し、以下のタンパク質ロットを含むFc-二量体タンパク質と比較した:B7r1G25-P141C69YFc5バーベル配列番号:18残基23-493;本明細書においてB7R1[G25-P141][C69Y]-バーベルとも称される;実施例7参照;B7r1G25-P141C69YFc5タンデム配列番号:20残基23-508または23-507;本明細書においてB7R1[G25-P141][C69Y]-タンデムとも称される;実施例8参照;およびB7r1G25-P141C69YFc5二価二量体配列番号:80。図3A-3Fは、減少した増殖活性により測定される、可溶性B7R1タンパク質により誘導されるT細胞阻害のレベルを示す。B7R1-Fc5タンパク質による比較的小さい阻害があった。対照的に、タンデムおよびバーベルタンパク質の両方は、全3つの血液ドナーならびにCD4およびCD8T細胞型の両方に対して全用量範囲にわたって有意な阻害を誘導し、タンデムがバーベルよりもわずかに大きい活性を示した。これは、これらのタンパク質がインビトロでT細胞増殖の有効な阻害剤であり、二量体型よりも優れていることを示し、それらがまた、臨床状況において二価二量体よりも優れているはずであるということをさらに示唆する。実施例14可溶性B7R1受容体バーベル構築物は、多発性硬化症のマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎EAEモデルにおける疾患発症および進行を減少させるAマウスアレルギー性脳脊髄炎EAEモデルメカニズムを試験し、多発性硬化症に対する可能性のある治療の効果を評価するために、実験的自己免疫性脳脊髄炎EAEの動物モデルを一般的に使用する。慢性進行性EAEモデルにおいて、8から10週齢メスC57BL/6マウスCharlesRiverLaboratoriesを、0日目に完全フロイントアジュバント中で乳化されたミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質MOG35-55ペプチドで皮下に、次に、0日目に百日咳毒素の腹腔内送達および2日目に静脈内百日咳毒素で免疫化した。約8から23日以内に、動物は、このモデルの特徴である体重減少およびまひの症状を示し始める。疾患の程度は、以下に詳細にあるとおり、マウスの体重を計り、それぞれのマウスに対して臨床スコア0-8を割り当てることにより、マウスにおいて毎日評価する。免疫化した以外は未処置マウスにおける疾患症状の典型的なパターンは、体重減少およびまひのうちの1つである。可溶性B7R1受容体バーベル構築物mB7R1-バーベル;配列番号:10の残基26-489、二量体マウスFc2構築物配列番号:34、VASP構築物配列番号:35またはビヒクルPBSを、-1日目に始まってマウスに投与した。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、それぞれのB7R1分子は1回の投与につきマウス1匹あたり150μgで投与された。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。B疾患のモニタリング動物は、MOG35-55免疫化後、約8から23日間、まひおよび体重減少の症状を示し始め得る。多数の動物は免疫化の11-17日以内に症状を発症するが、中にはこれより遅く、または早く症状を示し得る。全ての動物を、毎日、観察し、体重を計り、臨床スコアを割り当て、疾患の状態を評価した。C臨床スコア0=正常;健常1=わずかに尾脆弱尾の先端がねじ曲がっていない2=尾まひ尾を直立させ続けることができない3=尾まひおよび中程度のよたよた歩き4=尾まひおよび重度のよたよた歩き5=尾まひおよび1つの肢のまひ6=尾まひおよびいずれか2つの肢のまひ7=四肢不全まひ全4つの肢のまひ8=瀕死または死サイトカインの血清レベルおよび疾患の他のメディエーターのレベルをモニタリングするために、血液を実験中および最後に回収した。安楽死のとき、血液を血清のために回収した。D結果mB7R1-バーベルを与えたマウスのグループn=それぞれ10-12は、反復測定、二元分散分析ANOVAにより分析されるとき、ビヒクルPBSで処置されたマウスと比較して、臨床スコアにおいて有意な減少p<0.05により証明されるとおり、時間とともに疾患重症度において有意な減少p<0.05により特徴付けられた図4参照。二量体マウスFc2またはVASP構築物で処置されたマウスのグループは、疾患進行における遅延により示されるように、疾患から若干保護される傾向にあった。しかしながら、これらの2つのグループおよびビヒクル-処置グループ間の違いは、二元ANOVAにより有意差がなかった。経時的に疾患スコアの合計として分析されるとき曲線下面積計算または疾患暴露と同様に、B7R1-バーベル構築物で処置されたマウスは、PBSで処置されたマウスよりも有意により低い平均疾患暴露指数を有した~2.3倍より低い累積スコア;p<0.05。二量体マウスFc2またはVASP構築物のそれぞれで処置されたマウスのグループは、PBS処置グループよりも~25より低い累積スコアを有したが、該差異は統計的差異ではなかった。B7R1-バーベル構築物および二量体マウスFc2構築物のそれぞれで処置されたマウスは疾患発症のより低い発生率を有し、マウスのB7R1-バーベル-および二量体マウスFc2-処置グループの両方の~25が疾患から保護され、~17のVASP-処置マウスが疾患から保護され、~8のみのPBS-処置マウスが保護された。さらに、B7R1-バーベルを投与されたマウスに対する疾患発症の平均日数は19日であり、二量体マウスFc2-処置マウスに対して17.6日であり、VASP-処置マウスに対して16.5日であったが、PBS-処置マウスに対する疾患発症の平均日数はより短く13.7日、疾患発症が可溶性B7R1分子、とりわけB7R1-バーベル処置で遅延されたことを示した。総合すれば、これらの結果は、B7R1-バーベルのインビボ投与がヒト多発性硬化症のモデルであるEAEにおける疾患発症および重症度の減少において有効であったことを示す。他の可溶性B7R1分子で有効性が観察される傾向にあったが、バーベル構築物が、この実験において統計的に有意差を示す唯一の可溶性受容体であった。これらの結果は、可溶性B7R1バーベル構築物がヒト多発性硬化症を処置することにおいて有効であることを示す。実施例15B7R1タンデム構築物は、多発性硬化症のモデルとしての再発寛解型RRマウス実験的アレルギー性脳脊髄炎EAEにおける疾患発症および進行を減少させるAマウスアレルギー性脳脊髄炎EAEモデルメカニズムを試験し、多発性硬化症に対する可能性のある治療の効果を評価するために、実験的自己免疫性脳脊髄炎EAEの動物モデルを一般的に使用する。再発寛解型EAEモデルにおいて、9から10週齢メスSJLマウスJacksonorCharlesRiverLabsを、静脈内百日咳毒素なしで完全フロイントアジュバント中で乳化されたプロテオリピドペプチドPLPで皮下に免疫化した。約14から18日以内に、動物は、このモデルの特徴である体重減少およびまひの症状を示し始めた。疾患の程度は、以下に詳細にあるとおり、マウスの体重を計り、それぞれのマウスに対して臨床スコア0-8を割り当てることにより、マウスにおいて毎日評価した。免疫化した以外は未処置マウスにおける疾患症状の典型的なパターンは、体重減少およびまひのうちの1つ、次に、疾患症状寛解の期間、ならびにその後の疾患症状の再発である。疾患症状の再発および寛解のパターンが続いて起こり、再発寛解型疾患として知られるこの種の多発性硬化症を有するヒトにおいても見られる。可溶性B7R1受容体タンデム構築物mB7R1-タンデム;配列番号:12の残基26-504または26-503、可溶性B7R1受容体バーベル構築物mB7R1-バーベル;配列番号:10の残基26-489、ビヒクルPBSまたは臨床的に関連したポジティブコントロールマウス特異的CTLA4-Igを、疾患の最初のピークを越えた2日後に処置を開始するような治療投与レジメンにおいて投与した。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、mB7R1-タンデム、mB7R1-バーベルおよびmCTLA4-Ig分子は投与あたりマウスあたり150μgで投与された。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。B疾患のモニタリング動物は、PLP免疫化後、約8から23日間、まひおよび体重減少の症状を示し始め得る。この実験における多数の動物は免疫化の14-18日以内に症状を発症した。全ての動物を、毎日、観察し、体重を計り、臨床スコアを割り当て、疾患の状態を評価した。C臨床スコア0=正常;健常1=わずかに尾脆弱尾の先端がねじ曲がっていない2=尾まひ尾を直立させ続けることができない3=尾まひおよび中程度のよたよた歩き4=尾まひおよび重度のよたよた歩き5=尾まひおよび1つの肢のまひ6=尾まひおよびいずれかの2つの肢のまひ7=四肢不全まひ全4つの肢のまひ8=瀕死または死D結果B7R1-タンデムで処置されたマウスのグループn=それぞれ12-13は、ビヒクルPBSで処置されたマウスと比較して、臨床スコアおよび体重減少において有意な減少p<0.05により証明されるとおり、寛解相への疾患重症度において有意な減少p<0.05により特徴付けられた。さらに、B7R1-タンデムで処置されたマウスは、ビヒクルPBS処置マウスと比較して、疾患再発の有意に低いp<0.05発生率を有した。これは、疾患再発がこの疾患モデルおよびヒトにおける再発寛解型MSの特徴であるため、非常に重要な結果である。B7R1-バーベル分子で処置されたマウスのグループは、ポジティブコントロールmCTLA4-Igで処置されたマウスのグループと同様の疾患スコアおよび再発率を有した。マウスのB7R1-バーベルもmCTLA4-Ig処置グループも、マウスのPBS-処置グループと比較して、有意に異なる疾患スコアまたは再発率を有さなかった。総合すれば、これらの結果は、B7R1-タンデムのインビボ投与がヒト再発寛解型多発性硬化症のモデルであるPLPEAEにおける疾患発症および重症度の減少において有効であり得ることを示す。これらの結果は、可溶性B7R1-タンデム構築物がヒト多発性硬化症を処置することにおいて有効であることを示す。実施例16B7R1-タンデムは、T細胞養子移植大腸炎および乾癬のマウスモデルにおける疾患発症および進行を減少させるT細胞養子移植大腸炎モデル小さい組織適合不一致または先天性免疫不全マウスへのナイーブT細胞の養子移植は、大腸炎Leachら1996Powrieら1997ならびに乾癬に似た皮膚損傷Schonら1997Davenportら2002の発症を引き起こす。免疫不全C.B-17SCIDマウスへのBALB/CまたはB10.D2マウス由来の20万個という低量のCD4CD25-T細胞の移植は、体重減少、潜血存在便および皮膚損傷の発症をもたらす。これらのマウスにおける症状は、コロニー毎で変化する。大腸炎/乾癬のこのモデルは、ヒトクローン病および乾癬といくつかの類似性を有し、ヒトにおけるこれらの疾患のための治療の有効性を試験するために広範囲に使用されている。この実験において、マウス5B10.D2メスマウスドナー;20C.B-17SCIDメスレシピエントを、それぞれ、JacksonLaboratoriesまたはCharlesRiverLaboratoriesから得る。5B10.D2マウスから脾臓を回収する。CD4CD25-T細胞を、当分野で知られている標準方法論を使用してプールされた脾臓から単離する。T-細胞の純度を、フローサイトメトリーにより評価する。C.B-17SCIDマウスは、静脈内注射を介して脾臓由来の5×105-10×105のCD4CD25-T-細胞を受ける。全てのマウスを、1週間に少なくとも5回体重を計り、体重減少について注意深く観察する。臨床大腸炎スコア便の硬さおよび便の血液を1週間に少なくとも1日とる。マウスをまた、1週間に少なくとも5日モニタリングし、乾癬の症状および程度脱毛、引っかき傷および脱毛症に対するスコアを割り当てる。可溶性B7R1受容体タンデム構築物B7R1-タンデムまたはビヒクルPBSを、0日目に細胞移入の日開始してマウスに投与する。処置は、一日おきに腹腔内注射として送達され、B7R1-タンデムは1回の投与につきマウス1匹あたり150μgで投与する。それらはまた、同様の投与レジメンまたは他の投与経路を使用して送達することができる。試験の最後に、組織サンプル例えば大腸および皮膚を大腸炎および乾癬それぞれの組織学的証拠のために提出し、血清をサイトカインおよびケモカインレベルの分析のために回収した。結果B7R1-タンデムを受けるマウスのグループn=それぞれ10は、ビヒクルPBSで処置されたマウスと比較して、大腸炎および乾癬の臨床スコアおよび体重減少において有意な減少p<0.05により証明されるとおり、疾患重症度において有意な減少p<0.05により特徴付けられる。さらに、B7R1-タンデムで処置されたマウスは、ビヒクルPBS処置マウスと比較して、大腸炎および乾癬の病理学的/組織学的証拠をあまり有さない。総合すれば、これらの結果は、B7R1-タンデムのインビボ投与がマウスT細胞移入モデルにおける大腸炎および乾癬の減少において有効であり得ることを示し、該可溶性受容体がヒト炎症性腸疾患および/または乾癬を処置することにおいて有効であり得ることを示唆する。実施例17B7R1可溶性受容体バーベルおよびタンデム構築物は、マウスコラーゲン誘導関節炎CIAモデルにおける疾患発症および進行を減少させるAマウスコラーゲン誘導関節炎CIAモデル2週齢メスDBA/1JマウスJacksonLabsを、15匹のマウス/グループの3つのグループに分類し、予防用量のPBS、B7R1バーベルタンパク質またはB7R1タンデムタンパク質に指定した。21日目に、全ての動物に、完全フロイントアジュバントChondrexRedmondWAにより調製された中で製剤化された50-100μlの1mg/mLのトリ由来のタイプIIコラーゲンの皮内尾注射を与え、3週間後、0日目に、それらに、不完全フロイントアジュバントにおいて調製されたことを除いて同じ注射を与えた。B7R1-バーベルmB7R1-バーベル;配列番号:10の残基26-489、B7R1-タンデムmB7R1-タンデム;配列番号:12の残基26-504または26-503、B7R1-VASPmB7R1-VASP;配列番号:35またはビヒクルPBSを、-1日目に開始して3週間一日おきに腹腔内注射として投与した。グループに投与あたり動物あたり150μgのB7R1-バーベルまたはB7R1-タンデムタンパク質を与え、コントロールグループにビヒクルコントロールPBSLifeTechnologiesRockvilleMDを与えた。動物は第2のコラーゲン注射後に関節炎の症状を示し始め、多数の動物は1-2週間以内に炎症を発症した。疾患の程度は、キャリパーを使用して足の厚さを測定することにより、それぞれの足に対して臨床スコア0-3を割り当てることにより、それぞれの足において評価した以下参照。B疾患のモニタリング動物は、第2のコラーゲン注射後すぐに足の炎症の症状を示し始め得、いくつかの動物は、第2のコラーゲン注射前に足指の炎症の症状を有し始め得る。多数の動物はブースト注射の1-2週間以内に関節炎を発症するが、中にはより長い期間を必要とし得る。このモデルにおける疾患の発生率は一般的に90-100であり、0-5匹の非応答動物観察の6週間後に決定されたが一般的に60匹の動物を使用する試験において見られる。全動物を毎日観察し、それぞれの足に対する定性臨床スコアを割り当てることにより行われるそれらの足における疾患の状態を評価した。毎日、それぞれの動物は、臨床的疾患の状態にしたがって4つの足をスコア化された。臨床スコアを決定するために、足は、足指、足自体前肢末梢環節または足状部および足首または足関節の3つの領域を有すると考えることができる。これらの領域に関する炎症の程度および重症度は、腫れに関するそれぞれの足指の観察;裂けた爪または足指の発赤;任意の足における浮腫または発赤の何らかの証拠の表記;腱および骨の洗練された解剖的境界の喪失の表記;何らかの浮腫または発赤に関する足首または足関節の評価;および炎症が脚の上付近にまで伸長しているときの表記を含んで書き留められる。1、2または3の足スコアは、第1に、重症度の全体の印象、第2に、どれほど多くの領域が含まれるかに基づいた。臨床スコアのために使用されるスケールは以下に示される。C臨床スコア0=正常0.5=1つ以上の足指が関与しているが、足指のみが炎症している1=足指を含み得る足1つの領域に関与している軽度の炎症2=複数の足指および/または足首/足関節2つの領域を含み得る足における中程度の炎症3=足、足首/足関節、および複数または全ての足指3つの領域における重度の炎症抗-コラーゲン抗体の血清レベル、ならびに血清ケモカインおよびサイトカインレベルをモニタリングするために、血液を実験の最後に回収した。B7R1-バーベルおよびB7R1-タンデム分子を受けたマウスのグループは、PBSを受けるマウスと比較して、実験過程にわたって有意に少ない関節炎および足の炎症により特徴付けられたp<0.05図5参照。さらに、B7R1-タンデムを受けたマウスは、B7R1-VASPタンパク質を受けたマウスと比較して、実験過程にわたってさらに少ない関節炎および足の炎症を有する傾向にあったp=0.09。IL-6およびケモカインMCP-1、IP-1およびKCの血清レベルは、PBS処置マウスと比較して、B7R1-バーベルおよびB7R1-タンデム分子で処置されたマウスにおいてより低かった。グループ間の抗-コラーゲン抗体の血清レベルにおける有意差はなかった。これらの結果は、B7R1-バーベルおよびB7R1-タンデムが炎症、ならびにこの関節炎のモデルと関連する疾患進行を減少させることができることを示し、B7R1バーベルまたはB7R1可溶性受容体のタンデム構築物がヒト関節炎の処置において有効であり得ることを示唆する。前記から、本発明の特定の態様は、説明の目的のために本明細書に記載されているが、種々の修飾が本発明の精神および範囲から逸脱することなく作ることができることが理解される。したがって、本発明は、特許請求の範囲を除いて限定されない。本明細書において引用されている全ての出願、特許および特許出願は、全ての目的のためにそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる。"