"サポニン配糖体、ステロール及び抗原を含んでなるワクチンであって、前記サポニン配糖体及び前記ステロールが互いに会合してらせん状ミセルの形状の複合体を形成し、かつ前記抗原が前記らせん状ミセルと混合されているが、しかしその内部には組み込まれていない、上記ワクチン。獣医学的に許容可能なキャリアーをさらに含んでなる、請求項1に記載のワクチン組成物。前記の獣医学的に許容可能なキャリアーが水中油型乳剤である、請求項2に記載のワクチン組成物。前記サポニン配糖体がトリテルペノイドである、請求項1に記載のワクチン組成物。前記トリテルペノイドがQuilAである、請求項4に記載のワクチン組成物。前記ステロールがコレステロールである、請求項1に記載のワクチン組成物。前記抗原がウイルス抗原、細菌抗原またはその組み合わせを含んでなる、請求項1に記載のワクチン組成物。前記抗原がウシウイルス性下痢ウイルスBVDV1型またはBVDV2型抗原を含んでなる、請求項7に記載のワクチン組成物。請求項1に記載のワクチンの製造方法であって、a緩衝液中に抗原組成物を調製し;bサポニンをステップaの組成物に加え;そしてcアルコール中のステロールをステップbの組成物に加える、ステップを含む製造方法。実施例1AMPHIGEN商標登録処方物の調製AMPHIGEN商標登録処方物を、二工程の過程にて調製した。第一工程では、80リットルのDrakeolレシチン油溶液、116リットルの破傷風トキソイド生理食塩液、1.2リットルのSPAN80、及び2.8リットルのTween80を混ぜ合わせ、そしてRoss乳化装置を用いて乳化した。Drakeolレシチン油溶液は、大豆レシチン25及び鉱油75を含有した。乳化した生成物を、Ross乳化装置により最低5容量または最低10分間再循環させた。乳化した生成物を、さらなる処理のために、2~7°Cにて最大24時間保管した。Ross乳化装置のタンクから得られた乳剤を、Gaulinホモジナイザーに移し、そして4500psiの圧力下で20分間ホモジナイズした。次いで、得られた40Drakeolレシチン油溶液以下、AMPHIGEN商標登録処方物またはAMPHIGEN商標登録溶液を、無菌のポリプロピレンカルボキシ容器に分注した。分注は、クラス10,000の制御環境にあるクラス100の分注フードの中で行った。容器を、2~7°Cにて保管した。このAMPHIGEN商標登録処方物を、特に示さない限り、以下に記載の実験において用いた。実施例2BVDワクチンの急速混和ホモジナイゼーションによる第一の混和このホモジナイゼーション過程に用いられる装置を、図1に示す。無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、BVDI型抗原不活化したBVDI型ウイルス調製物を含有するボトルを、混和容器上の底部ポートに連結した。必要とされる容量のBVDI型抗原の移行が完了した後に、BVDI型のボトルを、不活化BVDII型ウイルス調製物不活化BVDII型ウイルス調製物を含有するボトルと取り替えた。必要量のBVDII型抗原の移行が完了した後に、Rossホモジナイザーをポータブル容器に取り付け、そして再循環を最大のRPM3300rpmにて開始した。容器の撹拌を、中等度の速度にて維持した。無菌技術または蒸気用三方弁を用いて、Quil-Aを50mg/mlの濃度で含有するボトルを、混和容器上のホモジナイザーインラインポートに取り付けた。必要量のQuil-A溶液を、ライン吸引により容器へと通した。Quil-A溶液の移行が完了した後に、ボトルを取り外した。同じ方法で、必要量のコレステロールエタノール溶液18mg/mlを、混和容器に移した。続いて、必要量のAMPHIGEN商標登録処方物、10Thimerosol溶液、及び基本改変イーグル培地BME増量剤溶液を、混和容器に加えた。すべての添加が完了した後に、混合をさらに15分間続けた。得られた処方物を、2ml用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物に基づくBVDワクチンを表した。ワクチンの各用量は、Quil-A500μg、コレステロール500μg、AMPHIGEN商標登録処方物2.5、及びThimerosol0.009を含有した。二つの異なるBVD株の抗原濃度を、gp53に対するELISA力価に関して測定した。実施例3マイクロ流動化による第二の混和図2は、マイクロ流動化を介した第二の混和に用いられる過程を示す。マイクロ流動化装置を、蒸気滅菌した。まず、補助の処理モジュールチャンバーをユニット内に設置し、そして空のチャンバーを二番目のチャンバー位置に設置した。実施例2に記載のように調製された、十分にアジュバント添加されているBVDワクチンを含有する容器を、供給容器のドレイン弁からマイクロ流動化装置の入口への移行ラインを取り付けることにより、マイクロ流動化装置に接続した。窒素ガスを、供給容器の空気フィルターの入口に接続し、そして容器の圧設定を20±5PSIに調整した。収集容器のドレイン弁を、マイクロ流動化装置の出口からの移行ラインに接続した。すべての必要な接続を行った後に、弁を開き、そしてマイクロ流動化を動作圧10,000±500PSIにて開始した。ワクチンの全量をマイクロ流動化装置に一度通し、そしてマイクロ流動化後チャンバー中に収集した。この調製物を、2mL用量に分割し、そしてこれはマイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくBVDワクチンを表した。実施例4ベンチ混和によるワクチン組成物の調製実施例1に記載のように調製されたAMPHIGEN商標登録処方物を、BVD抗原及び増量剤を加えて2.5に希釈した。得られた溶液を、ホモジナイザーを用いる代わりに撹拌子を用いて、ベンチにて混和した。最終調製物は、以下の組成物を含有した:BVD1型及び2型抗原、2.5AMPHIGEN商標登録処方物実施例1に記載のように、油、レシチン、SPAN商標登録及びTWEEN商標登録を含有する、ならびに生理食塩液。TWEEN80及びSPAN80は、最終ワクチン調製物中にそれぞれ0.18及び0.08容量にて存在する。実施例5マイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物とマイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物との液滴サイズ分布の比較実施例2に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン、実施例3に記載のように調製されたマイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン、及び実施例4に記載のようにベンチで混和により作られた調製物を用いて、ワクチン調製物の液滴サイズを比較した。2ミリリットルの各調製物の試料を、Malvern2000レーザー回折計測器に添加し、そして液滴サイズ分布を測定した。図3に示すように、結果は、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子体積がおよそ0.1ミクロンであり、一方、マイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物の最大粒子分布体積がおよそ1ミクロンであったことを、示している。実施例6ワクチンの相分離の低減三つの異なるワクチン調製物:実施例2に記載のように調製されたマイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン、実施例3に記載のように調製されたマイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン、及び実施例4に記載のようにベンチ混和により調製されたワクチン調製物を、並列に比較して、長期保管時のそれらの相分離の特性を判定した。すべてのこれらの調製物を4°Cにて約1ヶ月間静置させ、そして相分離を、ワクチン調製物最上部のクリーム状の層の出現に関してモニターした。図4に示すように、他の二つの調製物と比較した場合、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づく調製物では相分離はなかった。実施例7マイクロ流動化された、及びマイクロ流動化されていないウシウイルス下痢ウイルスに対するウシ用ワクチンの調製ウシウイルス下痢ウイルス抗原を、マイクロ流動化を介してAMPHIGEN商標登録処方物中に内在的に取り込んだ。内在的に取り込んだの語は、マイクロ流動化の前に抗原をAMPHIGEN商標登録処方物に添加することによる過程を指す。抗原をアジュバント処方物の成分とともに、マイクロ流動化過程の物理的な力にかけた。マイクロ流動化されていない対照群では、抗原調製物を、混和によりAMPHIGEN商標登録処方物中に分散させた。対照及びマイクロ流動化された調製物の双方の最終組成物は、以下のとおりであった:gp53に対する不活化後のELISA力価2535RU/用量のBVDI型、1.25mg/用量の濃度のQuil-A、1.25mg/用量の濃度のコレステロール、2.5の最終濃度のAMPHIGEN商標登録処方物、及び0.009の最終濃度のThimerosol。ワクチン用量は、5mlであった。実施例8マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物における、内在的に取り込まれたBVDウイルス抗原の長期安定性この実験は、内在的に取り込まれた抗原の長期保管中における安定性を判定するために行った。死滅BVDII型ウイルス抗原を、マイクロ流動化の過程中にAMPHIGEN商標登録処方物中に内在的に取り込んで、マイクロ流動化されたワクチン調製物A907505を得た。同抗原をマイクロ流動化されていないAMPHIGEN商標登録処方物A904369、A904370及びA904371中に含有する三つの他のワクチン調製物を、対照とした。マイクロ流動化されていない調製物では、抗原をAMPHIGEN商標登録処方物と混合し、そしてRossホモジナイザーを用いた混和により混合した。すべての四つのワクチン調製物を、4°Cにて2年間保管した。保管中の異なる時点0、6、12または24ヶ月で、すべての四つの処方物を用いて、3ヶ月齢のウシにワクチン接種した。第0日及び第21日に、3ヶ月齢のウシを、皮下経路を介して、2mlのワクチン処方物でワクチン接種した。ワクチン接種された動物の血清を第35日に採取し、そしてワクチンに対する血清学的応答を、BVDV-E2ELISAにより、抗体価に関して測定した。図5に示すように、マイクロ流動化されたワクチン調製物は、試験したすべての時点0、6、12及び24ヶ月で抗体価の上昇を示し、抗原調製物の安定性がマイクロ流動化の過程中における抗原の内在的な取り込みの間に失われないことが、示唆された。その上、マイクロ流動化されたワクチン調製物が、すべての時点で免疫応答の増強を誘導することもまた、驚くべきことに見いだされた。実施例9マイクロ流動化後の、ワクチンにより誘導される直腸温増加の低減実施例7に記載のように作られたマイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第0日にウシにワクチン接種し、そして直腸温を、ワクチン接種1日前からワクチン接種後4日までの期間モニターした。ワクチン用量は、2mlであった。当該群を、1倍用量または2倍用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。直腸温を、第-1日から第4日まで毎日測定及び記録した。第0日における直腸温は、被験物質の投与前に測定した。図6に示すように、結果は、1倍用量または2倍用量いずれかのマイクロ流動化されていないワクチン処方物でワクチン接種されたこれらの動物において、ワクチン接種後約24時間に直腸温の急激な上昇があったことを、示している。しかしながら、マイクロ流動化された形状のワクチンでワクチン接種された動物においては、ワクチン接種後の直腸温の上昇は、ほんのわずかで、かつマイクロ流動化されていない処方物でワクチン接種された動物よりも有意に低かった図6。実施例10マイクロ流動化されたワクチン処方物でワクチン接種した場合、注射部位反応体積はより速く回復した実施例7に記載のように作られた、マイクロ流動化されたワクチン調製物及びマイクロ流動化されていないワクチン調製物を用いて、第0日にウシにワクチン接種した。この試験に含まれる動物は、交雑食用牛であった。プラセボ治療群T01及びT02のそれぞれには、3例の動物がいた。T03~T06群のそれぞれには、6例の動物がいた。ワクチン用量は2mlであり、そして当該群を、第0日に1または2用量のいずれかのワクチンでワクチン接種した。第0日に、被験物質を、右首に投与した。2倍用量4mlの被験物質を投与される動物T02、T04及びT06には、片側に1回の注射として、全2倍用量を投与した。注射部位における反応サイズの評価を始めとする注射部位の観察を、第0日から第4日までの全日、及び第6、9及び14日に、首の右側で行った。第0日に、注射部位を、被験物質の投与前に観察した。1または2用量のプラセボでワクチン接種した群は、注射部位反応体積のいかなる有意な増加も示さず、そしてそれゆえにこれらのデータを図7に示していない。マイクロ流動化されていないワクチン処方物の場合、1用量と2用量のワクチン接種との間に注射部位反応体積の比例的な増加があった。他方で、マイクロ流動化されたワクチン処方物の場合、1倍用量がより大きな注射部位反応体積を誘導したが、二番目の用量での注射はいかなるさらなる増加も引き起こさなかった。その上、マイクロ流動化されたワクチン処方物で注射した動物の場合、注射部位反応部位体積は、マイクロ流動化されていないワクチン処方物で注射した動物と比較した場合に、より速い速度で回復した。これらの結果を、図7に示す。実施例11内在的に取り込まれたBVDウイルス及びレプトスピラ抗原、ならびにQuilA及びDDAなどの免疫刺激分子を用いた、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物の調製ホルマリンで不活化したLeptospirahardjobovisCLS株を、直接計数約1.4×109生物体/5ml用量にて、適切なアジュバント中に処方物化した。ホルマリンで不活化したLeptospirapomonaT262株を、約2400比濁単位/5ml用量にて処方物化した。比濁単位は、処理前の発酵液の比濁測定に基づき算出した。BVDウイルス1型を、約3000相対単位/5ml用量のE2Elisa力価にて処方物化した。BVDウイルス2型を、約3500相対単位/5ml用量のE2Elisa力価にて処方物化した。相対単位は、合わせる前の不活化後のバルク液のE2ELISA力価に基づき算出した。Quil-Aとコレステロールの双方を、0.5mg/用量の濃度にて用いた。Thimerosol及びAMPHIGEN商標登録処方物を、それぞれ0.009及び2.5の最終濃度にて用いた。水酸化アルミニウムRehydragelLVを、2.0の最終濃度にて用いた。DDAを免疫調節物質として用いた場合、DDAはAMPHIGEN商標登録処方物内に含まれた。AMPHIGEN商標登録処方物すなわち、40Drakeol-レシチンストック溶液は1.6mg/mlのDDAを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は2.5AMPHIGEN商標登録処方物及び0.1mg/mlのDDAを含有した。異なるワクチン処方物の調製において、BVD画分、レプト、Quil-A、コレステロール、Thimerosol、AMPHIGEN商標登録処方物、及び増量剤としての生理食塩液を、Silversonホモジナイザーに添加し、そして10,000±500RPMにて15分間混合した。次いで、成分を、200ミクロンのスクリーンを介して、10,000psiにてマイクロ流動化した。ワクチン処方物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて4°Cにて一晩混合した。実施例12曝露試験用BVDウイルスワクチンの調製この実験に用いられるワクチン調製物は、BVDウイルス1型及びBVDウイルス2型の双方由来の抗原を含有した。BVD1-5960抗原を、gp53に対する不活化後のELISA力価2535RU/用量にて用いた。BVD2-890抗原を、gp53に対する不活化後のELISA力価3290RU/用量にて用いた。QuilA及びコレステロールを、0.5mg/mlの濃度にて用いた。Thimersol及びAMPHIGEN商標登録処方物を、それぞれ0.009及び2.5の最終濃度にて用いた。DDAを免疫調節物質として用いた場合、DDAはAMPHIGEN商標登録処方物内に含まれた。AMPHIGEN商標登録ストック溶液40Drakeol-レシチン溶液は様々な量のDDAを含有し、そして適切に希釈された場合、最終的なワクチン調製物は2.5AMPHIGEN商標登録処方物及び0.5mg/用量~2.0mg/用量のDDA濃度を含有した。アルミニウムゲルRehydragelLVを、2の最終濃度にて用いた。GPI-0100を、2、3及び5mg/用量の範囲で用いた。すべての成分をSilversonホモジナイザーに添加し、そして10,500rpmにて15分間混和し、次いで10,000psiにて200ミクロンのチャンバーに通すことによりマイクロ流動化した。ワクチン調製物が水酸化アルミニウムを含有した場合、マイクロ流動化を水酸化アルミニウムなしで行った。マイクロ流動化が完了した後に、水酸化アルミニウムを添加し、そして撹拌子を用いて4°Cにて一晩混合した。実施例13レプトスピラ抗原を伴うマイクロ流動化されたAmphigenワクチン処方物でワクチン接種後の、レプトスピラ曝露に対する防御表1は、本試験において試験されたワクチン調製物におけるアジュバント処方物の組成を示す。ワクチン調製物を、実施例11に記載のように調製した。各群には、6例の動物がいた。約7ヶ月齢の交雑種未経産牛を、本試験において用いた。ワクチン接種を、第0日及び第21日に、皮下経路を介して5mlのワクチン容量にて行った。曝露を、国立動物疾病センターNADC、NationalagriculturalDiseaseCenterから得たLhardjobovis203株を用いて行った。曝露は、第57~59日に、1mlの接種により行った。曝露を、眼及び腟に同時投与した。曝露材料は、5.0X106レプトスピラ/mlを含有した。尿を、レプト培養、FA及びPCRのために一週間毎に採取した。腎臓の採取を、第112日及び第113日の間に行った。表2は、レプトスピラ曝露試験から得られたデータを示す。曝露された動物におけるレプトスピラ感染率を決定する際に、以下の基準を用いた。腎臓培養が一試料のみで陽性であったならば、動物はレプトスピラに陽性であると考えられる。動物がFAまたはPCRのいずれかに関して一試料のみで陽性であるならば、動物は陰性であると考えられる。試料がFA及びPCRの双方に関して一試料のみで陽性であるならば、レプトスピラに陽性であると考えられた。表2に示す結果は、すべての三つのアッセイに基づくすべてのワクチン群において、尿への排出期間が有意に短かったことを示している。尿及び腎臓のコロニー形成に関する限り、QAC及びDDAを含有するAlOHを含まない処方物の有効性は、同程度であった。AlOHは、本曝露試験においては、QACまたはDDAを含有するワクチンの有効性を改善せず、そしてむしろ低減した。ワクチン処方物中の双方のレプトスピラ抗原に対する血清学的応答を、ワクチン接種された動物において検出し、そしてピーク応答は第35日にみられた。血清学的応答と曝露に対する防御との間に、相関はなかった。血清学的応答がワクチン中のアルミニウムゲルの存在により増強されたにもかかわらず、ワクチン処方物中のアルミニウムゲルの存在は、防御レベルを低減させた。実施例14AMPHIGEN商標登録処方物及びDDAを含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、BVDウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びBVD2型ウイルス曝露に対する防御4~7ヶ月齢の血清陰性の子ウシを、本実験において用いた。異なる6群があり、そして各群は10例の動物を有した表4。第0日及び第21日に、各動物は、2mlのワクチンまたはプラセボの皮下用量を、肩甲骨と頭蓋骨との中ほどにある側頸に1回受けた。5ml用量の曝露用ウイルス調製物1鼻孔につき、およそ2.5mlを、試験第44日に鼻腔内投与した。細胞変性していないBVD2型ウイルスである単離番号24515Ellis株、ロット番号46325-70を、本試験において曝露用株として用いた。保持しておいた曝露用材料の試料を、曝露開始時及びその完了直後に力価測定した1力価測定につき二つ組で。5ml用量あたりの平均生存ウイルスは、曝露前は5.3log10FAID50/5ml、そして曝露後は5.4log10FAID50/5mlであったFAIDは、TCID50に相当する。動物を、第-3日から第58日まで、毎日モニターした。BVD2感染に起因する臨床徴候に基づいた0、1、2または3の臨床疾患スコアを、第42日から第58日まで、各動物について行った。第44日におけるスコアは、曝露の前に記録した。BVD1型及びBVD2型ウイルス中和抗体の血清力価を測定するために、血液試料二つの13ml血清分離用チューブ、SSTを、第0、21、35、44及び58日に各動物から採取した。血液試料を、第42日から第58日までの全日、各動物から採取し、そしてバフィーコート細胞におけるBVDウイルスの存在を判定した。第44日に、試料を曝露の前に得た。白血球細胞数を測定するために、血液試料4mlEDTAチューブ1本を、第42日から第58日までの全日、各動物から採取した。第44日に、試料を曝露の前に得た。白血球減少症を、40またはそれを超えるベースライン曝露2日前及び曝露当日の、曝露前の平均のWBC数からのWBC数の減少として、定義した。臨床疾患スコアを、以下のように疾患状態を定義するために用いた:スコアが≦1ならば、疾患=なし;スコアが>2ならば、疾患=あり。表5及び表6に示すように、AMPHIGEN商標登録処方物、QuilAまたはDDAとともにBVDウイルス抗原を含有し、かつマイクロ流動化されたワクチンでワクチン接種された群は、BVD1型とBVD2型ウイルスの双方に対する有意な血清ウイルス中和力価によって血清転換した。これらの群では、曝露後にウイルス血症を示す動物の率の有意な低減もあったが、対照群では、100の動物がウイルス血症であった表7。加えて、これらのワクチン接種された群において、疾患の頻度もまた有意に低減した表8。同様に、白血球減少症を示す動物の率もワクチン群において低減し、そして白血球減少症の低減は、QuilAを含有する群よりもDDAを含有する群においてより有意であった表9。対照群では、ワクチン接種群と比較した場合に、体重増加の有意な降下があった表10。血清学第0日におけるワクチン接種の前に、試験におけるすべての動物は、BVDウイルス1型及び2型に対する抗体に血清陰性SVN<1:2であったデータは示さず。二回目のワクチン接種第35日後14日に、プラセボを投与されたすべての動物T01は、BVDウイルス1型及び2型に対する抗体に血清陰性のままであり;そして、ITA研究用被験抗原でワクチン接種されたすべての動物T02、T03、T04、T05及びT06は、BVDウイルス1型及び2型に対する抗体に血清陽性SVN≧1:8であった。AMPHIGEN商標登録処方物をアジュバントとして添加したDDA2mg/用量のワクチンを投与された1例の動物は、第35日に、BVDウイルス2型に対する抗体に対してSVN力価3であった表11及び表12。第44日における曝露の前に、1例を除くすべての対照T01は、BVDウイルス1型及び2型に対する抗体に血清陰性SVN<1:2であったデータは示さず。1例の対照2497は、BVDウイルス1型に対する抗体に血清陽性SVN=10、そしてBVDウイルス2型に対する抗体に血清陰性であった。曝露後14日に、試験におけるすべての動物は、BVDウイルス1型及び2型に対する抗体に血清陽性であった。ウイルスの単離表13に示すデータのように、曝露期間第44日~第58日中に、対照T01におけるすべての10例の動物は、ウイルス血症であったBVDウイルスが、1日以上で単離された。ITA投与群では、ウイルス血症の動物の頻度は、10例の各群それぞれ、T02、T03、T04、T05及びT06において1、0、3、2及び2例であった。対照とITA投与群との間の差は、統計学的に有意であったP≦0.05。ウイルス血症の最小二乗平均日数もまた、ITA投与群0.0~0.5日と比較して、対照で有意に大きかった10.4日。臨床疾患臨床徴候スコア2または3の動物は、BVD疾患の徴候を示していると考えられた。表14に示すように、BVDウイルス疾患の臨床徴候を伴う動物の頻度は、対照T01において10例中9例、そしてITA投与各群それぞれ、T02、T03、T04、T05及びT06において、10例中1、2、0、0及び0例であった。対照とITA投与群との間の差は、統計学的に有意であったP≦0.05。白血球減少症表15に示すように、曝露期間第44日~第58日中に、対照T01におけるすべての10例の動物は、白血球減少症であった第42~44日の曝露前ベースラインから、白血球数が40低減。白血球減少症を伴う動物の頻度は、ITA投与各群それぞれ、T02、T03、T04、T05及びT06において、10例中6、2、4、3及び2例であった。対照と、0.5mg/用量のAMPHIGEN商標登録処方物及び水酸化アルミニウムをアジュバントとして添加したワクチン投与群T03との間の差は、統計学的に有意であったP≦0.05。白血球減少症の最小二乗平均日数は、ITA投与群0.2~1.2日と比較して、対照で有意に大きかった7.8日。実施例15GPI-0100を含有するマイクロ流動化されたワクチン調製物で免疫後の、BVDウイルス抗原に対する免疫応答の誘発、及びBVD2型ウイルス曝露に対する防御実施例14に記載の一連の実験条件にしたがい、そしてQuilAとGPI-0100との直接比較を行った。表11及び表12に示すように、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づいた、QuilAまたはGPI-0100のいずれかを含有する調製物に含まれるBVD抗原でワクチン接種された動物は、BVD1型とBVD2型ウイルスの双方に対する有意な抗体価を有した。BVD1型ウイルスに対する抗体価は、BVD2型ウイルスに対するものよりもかなり高かった。しかしながら、それに続くBVD2型ウイルスによる曝露は、強力な防御を示し、そして疾患発生率は、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくGPI-0100含有ワクチン調製物でワクチン接種された子ウシにおいて、低減した。結論として、各ワクチンの安全性は、ワクチン接種された動物において副作用または死亡がないことにより示された。各ワクチンの効力は、100のワクチン接種された動物における血清転換BVD-1及びBVD-2に対するSVN抗体価>1:8によって、示された。曝露に対する十分な耐性は、GPI-01002mgのみをアジュバントとして添加したワクチンにより示された。実施例16マイクロ流動化された水中油型乳剤中にマイクロカプセル化された抗原を含有するワクチン調製物3gのトレハロースFluka社を水に加えて、333mg/mlのトレハロース溶液を得た。0.8SDS溶液中に可溶化した組換えPauA抗原SDS/rPauAをトレハロース溶液に加えて、494μgrPauA/mlの最終濃度を得た。次の工程で、10gのポリ乳酸グリコール酸PLGResomerRE503H、ベーリンガーインゲルハイム社を、200mlの塩化メチレンMeCl2に溶解した。得られたPLG/MeCl2溶液を、最初の工程で調製されたSDS-rPauA/トレハロース溶液と組み合わせた。組み合わせた溶液を、MicrofluidicsモデルM110EHのマイクロ流動化装置を用いてマイクロ流動化にかけ、そしてマイクロ流動化された調製物を、テプコ噴霧乾燥機モデルSD-05を用いて噴霧乾燥した。噴霧乾燥した材料を、500ミクロンのスクリーンを用いて収集した。この噴霧乾燥した材料中のrPauA濃度を、ウエスタンブロット解析を用いて定量した。1.04mgの噴霧乾燥した材料を、50μlのアセトン中に溶解し、そして室温にて10分間、13,200rpmで遠心分離した。上清を、除去した。上清画分及びペレット画分を、生物学的安全フード内で2.5時間乾燥させた。ペレットを、47.43μLの試料溶液25μlの試料緩衝液10μlの還元剤65μlの水中に再懸濁した。乾燥させた上清画分を、20μlの試料溶液で再懸濁した。ウエスタン解析において、精製PauAを、噴霧乾燥した材料のrPauA含量を定量するための標準品として用いた。20マンニトールストック溶液を、100mgのマンニトールシグマ社を500mlの注射用水WFIに溶解することにより、調製した。溶液をホットプレート/撹拌機で40°Cに加熱し、そして30°Cに冷ました。溶液を、0.22ミクロンの無菌フィルターミリポア社を介して無菌ろ過した。2.5カルボキシメチルセルロース溶液を、12.5gのカルボキシメチルセルロースシグマ社を500mlのWFIに溶解することによって調製し、そして4°Cにて一晩混合した。溶液を、121°Cにて高圧滅菌した。噴霧乾燥により得られた粉末を、5マンニトール、0.3カルボキシメチルセルロース及び1:5000のThimerosolを含有する溶液中で再構成した。最終溶液を3mlバイアルに分割し、そして凍結乾燥機USIFROIDを用いて凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は、マイクロカプセル化されたrPauAを表した。マイクロカプセル化されたサブユニットタンパク質抗原を、2mlのAMPHIGEN商標登録処方物を含有するマイクロ流動化された水中油型乳剤実施例20に記載されるマイクロ流動化された乳剤など中に再懸濁する。実施例17水中油型乳剤中に細菌全細胞抗原と組換えタンパク質抗原の双方を含有するマイクロ流動化されたワクチン処方物の調製実施例2及び3に記載のように水中油型乳剤に内在的に添加された、組換えStreptococcusuberisPauAタンパク質と大腸菌細菌細胞の双方を含有する二つのワクチン調製物を、作った。組換えPauA抗原は100μg/用量の濃度であり、そして大腸菌細胞は4X109/用量の最終数であった。二つのワクチン処方物の乳剤アジュバント組成物を、表16に示す。実施例18水中油型乳剤中にrPauA及び全細胞細菌因子を含有するマイクロ流動化されたワクチンに対する免疫応答成熟乳牛を、本実験において用いた。動物は、登録時に初回または二回目の授乳が終了したところであった。2mlの各ワクチン処方物を、乾乳時D-0に一度、28日後D=28、及び分娩後4~10日C4~C10に再び、3回皮下投与した。最初及び三回目の用量を首の左側に投与し、そして二回目の用量を首の右側に投与した。血液を、各ワクチン接種の前、ならびに三回目のワクチン接種後およそ14日及び32日に採取した。大腸菌及びrPauAに対する抗体価を、ELISAにより測定した。図8に示すように、結果は、rPauAに対する抗体価が、GPI-0100を免疫刺激剤として含有するワクチン処方物でワクチン接種された群においてより高く、そして最初のワクチン接種後第70日にピークとなったことを示している。大腸菌抗原に対する抗体価を、図9に示す。免疫刺激剤としてのGPI-0100の存在が、免疫刺激剤としてDDAを伴う処方物と比較した場合に相対的により高い抗体価を誘導したにもかかわらず、大腸菌抗原に対する抗体価は、双方のワクチン処方物で同程度であった。実施例19マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物の殺ウイルス活性の分析マイクロ流動化がウイルスを不活化するかどうかを判定するために、三つのマイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物に基づくウイルス調製物の殺ウイルス活性を測定した。この三つの調製物は、三つの異なるウシ感染性ウイルス、すなわちウシヘルペスウイルスBHV、パラインフルエンザウイルス3PI3及びウシ呼吸器合胞体ウイルスBRSVを含有した。三つのワクチン調製物における殺ウイルス活性の検出を、USDA9CFR11335要件にしたがって行った。表16に示した結果は、AMPHIGEN商標登録処方物に基づくワクチン調製物のマイクロ流動化がワクチン調製物のいかなる有意な不活化も引き起こさないことを、示している。実施例20マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物の調製AMPHIGEN商標登録処方物を、DRAKEOLレシチン油溶液25レシチンを伴う軽質鉱油とTWEEN800.18の最終濃度でとSpan800.08の最終濃度でとを組み合わせて、36±1°Cにて8~22時間混合することにより、調製した。次いで、RossHauppauge、ニューヨーク州、11788乳化装置をおよそ3400rpmで用いて、油混合物を生理食塩液に加えた。続いて、該混合物を、200μmの相互作用チャンバーを伴うマイクロ流動化装置に、4500±500psiにて一度通した。図10A及び図10Bは、マイクロ流動化されたAMPHIGEN商標登録処方物の安定性を示す。レーザー回折により測定された、最初の開始時点における粒子サイズ分布図10Aは、22ヶ月間の4°C保管後の粒子サイズ分布図10Bとほとんど同一であった。実施例21QuilA-コレステロール免疫原性複合体の電子顕微鏡による分析QuilA及びコレステロールにより形成された免疫原性複合体の性質を判定するため、これらの二成分の混合物を、抗原の存在下及び非存在下のいずれかで作った。50mlのKR-Hals緩衝液を含有するビーカーに、溶液を磁気撹拌子で攪拌しながら、BVDI型抗原を加えた。その後、QuilAの濃縮ストック溶液50mg/mlを、溶液を攪拌しながら1滴ずつ加えて、50μg/mlの最終濃度に到達させた。QuilAの添加後に、コレステロールエタノール溶液18mg/mlを50μg/mlの最終濃度となるように加えた。二番目のビーカーには、QuilA及びコレステロールを、BVDI型抗原を全く含まない50mlの緩衝液に同じ方法で加えた。透過型電子顕微鏡用に、10μlの各試料を、formvar/炭素担体プラットホームを伴う400メッシュ銅グリッドElectronMicroscopySciencesInc、フォートワシントン、ペンシルバニア州上に吸着させた。該試料を、ろ過したpH5.2の2リンタングステン酸10μlを造影剤として用いて、ネガティブ染色した。該試料を、80kVの加速電圧にてJEOL1230透過型電子顕微鏡JEOLInc、東京、日本を用いて、検討した。デジタルイメージングを、GatanBioScan792カメラで行った。顕微鏡撮影を、4489EMフィルムで行い、そしてコダブロムIIRCF3紙EastmanKodakCompany、ロチェスター、ニューヨーク州に印刷した。BVDI型抗原を全く含まない、コレステロール及びQuilAのみを含有する溶液では、らせん状ミセルが、QuilAミセル及びコレステロール結晶とともに検出された図11。らせん状ミセルは、絡み合い、そしてメッシュのようにみえた。BVDI型抗原を含有する試料では、らせん状ミセルは、ランダムに特定の高密度領域を取り囲むことがみられた図12。該高密度領域はBVD1型抗原を表し、そしてQuilAとコレステロールの会合により生じるらせん状免疫原性複合体は、BVDI型抗原の表面に吸着することが見いだされている。"