"関節リウマチを治療する方法であって、関節リウマチに罹患している個人または関節リウマチを発症しやすい個人を特定する工程と、前記個人に下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する方法。慢性全身性炎症を治療する方法であって、慢性全身性炎症に罹患した患者を同定する工程と、前記患者に下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する方法。被験者の慢性全身性炎症の少なくとも1つの症状を軽減する方法であって、下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩をJAK2キナーゼを阻害する効果がある量で投与する工程を有する方法。前述の請求項のいずれかに記載の方法において、前記JAK2キナーゼ阻害薬は1日に最高で4回投与されるものである方法。前述の請求項のいずれかに記載の方法において、前記JAK2キナーゼ阻害薬は1日に約0.01mg/kg~約1500mg/kgの量で投与されるものである方法。前述の請求項のいずれかに記載の方法において、この方法は、第2の治療薬を投与する工程を有するものである方法。請求項6記載の方法において、前記JAK2キナーゼ阻害薬および前記第2の治療薬は別に投与されるものである方法。請求項6記載の方法において、前記JAK2キナーゼ阻害薬および前記第2の治療薬は単回投与として投与されるものである方法。慢性炎症を治療する組成物であって、哺乳類の被験者における慢性炎症の少なくとも1つの症状を軽減するために有効な量の下記式:を有する化合物またはその塩と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤とを有する組成物。請求項9記載の組成物において、前記組成物は単位投薬形態である組成物。請求項9~10のいずれかに記載の組成物において、前記組成物は錠剤またはカプセルである組成物。請求項9~11のいずれかに記載の組成物において、前記化合物またはその塩は0.01mg/kg~約1500mg/kgの量で存在するものである組成物。関節リウマチの治療のための、下記式:を有するJAK2キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。慢性全身性炎症の治療のための、下記式:を有するJAK2キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。哺乳類の被験者における慢性炎症の少なくとも1つの症状を軽減するための、下記式:を有するJAK2キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。炎症性疾患または疾病の治療のための、下記式:を有するJAK2キナーゼ阻害化合物またはその塩の使用。本出願書類は、下記構造を有する1,2,4-トリアゾロ[1,5a]ピリジン誘導体化合物A:またはその塩、およびヤーヌスキナーゼ2JanusKinase2:JAK2が介在する疾患または疾病の治療におけるその使用に関する。特に、化合物AはJAK2の強力な経口活性小分子阻害薬であり、慢性関節リウマチrheumatoidarthritis:RAなどの慢性全身性疾患によって特徴付けられる疾病または疾患の治療に有用である。以下には、JAK2の活性を阻害または調節することで、関節リウマチRAなどの慢性全身炎症性疾患および疾病を治療する方法のさらに制限されない詳細を提供する。以下には、前記JAK2活性を阻害または調節する、化合物Aなどの特定化合物、および関節リウマチなどの慢性全身性炎症により特徴付けられる疾患または疾病を治療するため、これらの化合物を用いる方法も提供する。本明細書で使用したセクションのタイトルは索引作業および検索の目的のみであり、いかなる方法でも制限するものとして解釈すべきではない。1つの態様では、本出願書類が関節リウマチを治療する方法について説明およびこれを提供し、前記方法は、関節リウマチに罹患した個人または関節リウマチを発症しやすい個人を特定する工程と、前記個人に下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する。別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する方法について説明およびこれを提供し、前記方法は、慢性全身性炎症に罹患した患者を特定する工程、および前記患者に下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩の治療有効量を投与する工程とを有する。別の態様では、本出願書類が被験者の慢性炎症の少なくとも1つの症状を軽減する方法を説明およびこれを提供し、前記方法は、下記式:を有するJAK2阻害薬またはその塩をJAK2キナーゼを阻害する効果がある量で投与する工程とを有する。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記JAK2キナーゼ阻害薬は1日4回まで投与される。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記JAK2キナーゼ阻害薬は1日につき約0.01mg/kg~約1500mg/kgの量で投与される。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記JAK2阻害薬は少なくとも1つの追加治療薬と併用投与される。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記JAK2阻害薬と少なくとも1つの追加治療薬は別に投与される。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う方法を説明およびこれを提供し、前記JAK2阻害薬と少なくとも1つの追加治療薬は単一の固定用量として併用投与される。別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する組成物について説明およびこれを提供し、下記式:またその塩を、哺乳類の被験者の慢性炎症の症状を軽減するために有効な量で有し、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を有する化合物を有する。別の態様では、本出願書類が慢性全身性炎症を治療する組成物について説明およびこれを提供し、治療有効量の下記式:またその塩を、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤、および選択的に、少なくとも1つの追加治療薬との混合剤で有する。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は単位投薬形態であり、前記化合物は約0.01mg/kg~約1500mg/kgの量で存在する。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は単位投薬形態であり、錠剤またはカプセルの形態である。別の態様では、本出願書類が上述の態様のいずれかに従う組成物を説明およびこれを提供し、前記組成物は経口投与される。定義本明細書で説明する化合物は、国際純正応用化学連合InternationalUnionforPureandAppliedChemistry:IUPACまたは化学情報検索サービス機関ChemicalAbstractsService:CASの命名法に従い命名することができる。それとは反対に明示されていない限り、下記式を有する化合物、化合物A、および化合物は、化合物Aと指定された化合物および化合物Aのすべての塩を指し、これを含む。本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、治療する方法および治療方法は特定の疾患の治療に使用するためのという表現と置き換えて使用することができる。後者の表現は最近、化合物の医学的/治療的使用を主張するが、同時にスイス式の形態を廃止する適切な形態としてEPOに認められた。本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、薬学的に許容されるは、例えば、薬学的に許容される賦形剤などの指定構成要素は、製剤または組成物中の他の成分と化学的および/または物理的に混合可能であり、および/またはその患者と生理学的に適合することを示している。本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、被験者および患者はヒトを含む哺乳類を指す。ヒトの用語はヒトの小児、思春期青年、または成人を指し、これを含む。本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、治療する、治療している、治療された、および治療は、予防、改善、緩和、および治療のための使用および結果、またはその組み合わせを指し、これを含む。予防または予防のための使用または結果は、絶対的または完全な予防つまり、100の予防または保護のための使用または結果を指さず、またはこれを必要としないことは理解されるものとする。本明細書で使用するとおり、予防または予防のための使用または結果は、化合物または組成物の投与が本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の重症度を軽減または低下させ、本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患が生じる可能性を軽減または低下させ、または本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の発症または再燃再発を遅らせ、または前述のすべての組み合わせとなる使用および結果を指す。本明細書で用いるとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、治療上のおよび治療有効量は、a本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患を治療し、b本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の1若しくはそれ以上の症状を減弱、改善、または消失させ、c本明細書で説明する特定の病状、症状、疾病、または疾患の発症または再燃再発を遅らせる化合物または組成物の量を指す。治療上のおよび治療有効量という用語は、前述の効果a~cのいずれか1つを単独または他の効果a~cのいずれかと組み合わせて含むことは理解されることとする。本明細書で使用するとおり、単独であろうと別の用語と併用していようと、治療薬は疾患、病状、または障害または共存症つまり、別の疾患、病状、または障害と同時に存在する疾患、病状、または障害の治療に有用な組成物に含まれる何らかの物質を指し、化合物Aではない。製剤本明細書で説明する化合物の薬学的に許容される塩には、薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を含む。酸付加塩の例には、例えば、塩化物HCl、硫酸、およびリン酸塩などの無機酸付加塩、および、酢酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、および乳酸塩などの有機酸付加塩を含む。金属塩の例には、例えば、リチウム、ナトリウム、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、および例えば、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、および亜鉛塩などのアルカリ土類金属塩を含む。アンモニウム塩の例には、例えば、アンモニウムおよびテトラメチルアンモニウム塩などの塩を含む。有機アミン付加塩の例には、例えば、モルホリンおよびピペリジン塩を含む。アミノ酸付加塩の例には、例えば、グリシン、フェニルアラニン、グルタミン酸およびリジン塩などの塩を含む。化合物Aは、1若しくはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤と混合することで薬学的組成物または単に組成物または製剤に製剤化することができる。本明細書で用いるとおり、賦形剤の用語は、本明細書で定義するとおり、組成物中に存在する可能性がある、化合物Aおよび他の治療薬以外のすべての成分を指し、これを含む。したがって、薬学的に許容される賦形剤は、例えば、界面活性剤、湿潤剤、香味料/味覚マスキング剤、溶媒、担体、希釈剤、防腐剤、充填剤、可溶化剤などを指し、これを含む。賦形剤の選択は、主に、例えば特定の投与様式、および望みの溶解性および安定性プロフィール、および前記投薬形態の性質などの因子に依存する。化合物Aを有する組成物は、例えば、特に溶液または懸濁液の形態の非経口、特に錠剤、カプセル、またはシロップ/液剤の形態の経口、粉末、点鼻薬、またはエアロゾルの形態の経鼻、または特にゲル、クリーム、ローション、または経皮貼布の形態の経皮など、いかなる投与様式の種類にも調整することができる。化合物Aを有する組成物は、単位投与量で都合良く投与することができ、例えばRemington’sPharmaceuticalSciencesMackPub.Co.,Easton,PA,1980に説明されているように、薬学分野でよく知られているいずれかの方法によって調整することができる。錠剤は、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびメチルセルロースなどの賦形剤、でんぷん、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、および結晶セルロースなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの潤滑剤、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、およびメチルセルロースなどの結合剤、ショ糖脂肪酸エステルおよびソルビトール脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを用い、従来の方法で調整することができる。各錠剤には化合物Aを約0.01mg~約1000mg含むことが好ましい。顆粒は、ラクトースおよびスクロースなどの賦形剤、でんぷんなどの崩壊剤、ゼラチンなどの結合剤などを用い、従来の方法で調整することができる。粉末は、ラクトースおよびマンニトールなどの賦形剤などを用い、従来の方法で調整することができる。カプセルは、ゼラチン、水、スクロース、アラビアゴム、ソルビトール、グリセリン、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどを用い、従来の方法で調整することができる。前記カプセルには、ビーズなどの固体粒子を含むか、または代わりに、液体またはゲルが充填されていてもよい。各カプセルには化合物Aを約0.01mg~約1000mg含むことが好ましい。化合物Aを有するシロップ製剤は、スクロース、水、エタノールなどの糖を用い、従来の方法で調整することができる。化合物Aを有する軟膏は、ワセリン、流動パラフィン、ラノリンおよびマクロゴールなどの軟膏基剤、ラウリル乳酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびアラビアゴムなどの乳化剤などを用い、従来の方法で調整することができる。化合物Aを有する注射用製剤は、水、生理食塩水、植物油例えば、オリーブ油およびピーナッツ油、オレイン酸エチル、およびプロピレングリコールなどの溶媒、安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、およびウレタンなどの可溶化剤、塩化ナトリウムおよびグルコースなどの等張化剤、フェノール、クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、およびクロロブタノールなどの防腐剤、アスコルビン酸およびピロ亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤などを用い、従来の方法で調整することができる。非経口投与製剤には、ポリエチレングリコール、水素化ナフタレンなどのポリアルキレングリコールを含むことができる。特に、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体は、活性な化合物Aの放出を制御するために有用な賦形剤となる可能性がある。他に、化合物Aにとって有用となる可能性のある非経口送達システムには、エチレン酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、およびリポソームを含む。他の非経口投与製剤には、口腔投与用グリココール酸、直腸投与用サリチル酸塩、または膣内投与用クエン酸も含む可能性がある。吸入投与製剤には、例えば、ラクトースなどの賦形剤を含むか、例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩、およびデオキシコール酸塩を含む水溶液、または点鼻薬の形態、または鼻腔内に適用されるゲルとして投与する油性溶液とすることができる。経皮貼布用製剤は、好ましくは親油性乳剤である。化合物Aまたはその薬学的に許容される塩は、単独投与、または医薬品中の、本明細書で定義した1若しくはそれ以上の追加治療薬と併用投与することができる。一般に慢性全身性炎症、または特に関節リウマチに伴う1若しくはそれ以上の中核症状および/または共存症を治療するため、追加の治療薬を使用することができる。1つの態様では、化合物Aが固定用量として少なくとも1つの治療薬とともに製剤化および投与される。別の態様では、化合物Aが前記治療薬とは別に製剤化および投与される。化合物Aと併用して使用することのできる治療薬の例には、これに限定されるものではないが、例えば、非ステロイド性抗炎症薬/鎮痛薬nonsteroidalanti-inflammatoryagents/analgesics:NSAIDs、オーラノフィンRidaura登録商標、アザチオプリンImuran登録商標、金チオリンゴ酸ナトリウムAurolate登録商標、メトトレキセート、またはレフルノミドなどの抗リウマチ薬disease-modifyinganti-rheumaticdrugs:DMARDs、ベタメタゾンまたはプレドニゾンなどのグルココルチコイド、スルファサラジン、アバタセプトOrencia登録商標、アダリムマブHumira登録商標、アナキンラKineret登録商標、エタネルセプトEnbrel登録商標、インフリキシマブRemicade登録商標、ゴリムマブSimponi登録商標、リツキシマブMabThera/Rituxan登録商標、セルトリズマブCimzia登録商標、またはトシリズマブRoActemra/Actemra登録商標などの様々な生物反応修飾物質、トラマドールまたはアセトアミノフェンなどの様々な鎮痛薬、CP-690,550tasocitinib、VX-509、VX-702、BMS-582949、INCB-18424、INCB-28050、R-788ホスタマチニブジナトリウム、AC430、SB1578、AG490、TG101209、CYT387、AZ960、XL019、SGI-1252、AT9283、CEP-701レスタウルチニブなどの他の小分子阻害薬、ボルテゾミブVelcadeおよびPR-957/ONYX0914などのプロテアソーム阻害薬、およびカーフィルゾミブを含む。化合物Aおよびその薬学的に許容される塩は、経口投与または、例えば軟膏または注射などの非経口投与とすることができる。特定医薬品中の化合物Aの濃度は、本明細書に説明するとおり、または当業者の1人によって決定されるとおり、変化する可能性がある。特に、特定の投薬形態での化合物Aの濃度は、総投与量、化合物Aの化学的特徴例えば、疎水性、投与経路、患者の年齢、体重、および症状などに依存する。化合物Aの好ましい投与量の範囲は、治療される疾患の種類および進行の程度、前記特定患者の全体的な健康状態、そこに含まれる特定の製剤投薬形態および賦形剤、また投与経路に依存する可能性がある。化合物Aの典型的な用量範囲は、約1μg/kg~約3g/kg体重/日である。1つの態様では、化合物Aの好ましい用量範囲が約0.01mg/kg~約1500mg/kg体重/日である。別の態様では、化合物Aの好ましい用量範囲が約0.1mg/kg~約300mg/kg体重/日であり、これは1日1~4回投与される。まだ別の態様では、化合物Aの好ましい用量範囲が約30mg/kg~約100mg/kg体重/日であり、これは1日1回または2回投与され、経口投与がより好ましい。さらに別の態様では、約30mg/kg~約100mg/kgの化合物Aを、例えば持続注入などにより、連続的に投与することが好ましい。当業者は、本明細書に提供される説明および例に基づき、化合物Aの投与範囲および投与法は治療分野で周知の方法に従って調節可能であることを理解するだろう。つまり、当業者の1人は、検出可能な治療上の利益を提供するために必要な、化合物Aの特定用量および投与の時間的要件を容易に決定することができる。したがって、本出願書類では特定の用量および投与法について説明および/または例示しているが、これらの例は、決して、本明細書で説明される方法を実行する上で使用することのできる用量または投与法を制限するものではないことは理解されるものとする。材料と方法化合物A化合物A、[8-4-メタンスルホニル-フェニル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-2-イル]-[3-4-メチル-ピペラジン-1-イル-フェニル]-アミンは下記構造を有する。本明細書で説明する実験について、化合物Aは国際出願第PCT/US10/37363号の実施例35で報告されている方法と類似の方法で調整した。本明細書で説明される実験および実施例は、化合物AがRAに特徴的な、特定の生物学的状況および症状を改善することができる、強力な経口活性JAK2阻害薬であることを示している。より具体的には、本明細書で説明される実験および実施例は、化合物Aを投与した結果、JAK2阻害がIL-6、IL-12、IL-1β、およびIFNγを含む数種類の炎症性サイトカインを全身および疾患部位局所的に抑制し、また、十分忍容性のある方法で、慢性の病的関節破壊の特定症状を治療したことを示している。化合物Aは、単離したヒト酵素を用いたアッセイで強力なJAK2キナーゼの阻害薬として同定されたIC50=1.8±0.6nM、図1A。化合物AはJAKファミリーの他のメンバーと対比して評価し、TYK2に対する選択性は40倍を超える様々な程度であるのに対し、JAK1は800倍を超えることが証明された図1A。一連の402キナーゼに対する結合アッセイを用い、化合物Aがカイノームkinomeの他のメンバーを阻害する力も評価した[25]。1μMの試験濃度で、化合物Aは高い選択性を示した。Karamanらが定義した選択性スコアを用い、402キナーゼの9が90超阻害され、1のみが99超阻害されたS90402=0.09およびS99402=0.01[26]。図1A。invitro細胞系において、STAT5のリン酸化を測定することにより、化合物AはHEL92細胞のJAK2を阻害することが示された図1B。invivoでの化合物AのJAK2阻害力は、HEL92細胞を用いた薬力学的pharmacodynamic:PKアッセイにより証明した図1C。GeneBLAzer登録商標レポーターアッセイを利用した他の実験では、化合物Aはirf-blaTF-1細胞のJAK2も阻害することが示された。別の実験では、化合物Aが抗pSTAT3活性も示した。研究からは、STAT3がEGFR受容体およびSrcキナーゼシグナル伝達経路を介して活性化される可能性があることが示された[27,28]。しかし、上述のプロファイリングパネルでは、化合物Aにはこれらのキナーゼいずれかに対する活性はなく、化合物AのpSTAT3に対する作用はJAK2の阻害を介していることが示唆される。総じて、上述のinvitroおよびinvivoデータは、化合物AがJAK2の強力で選択的な阻害薬であることと一致している。JAKキナーゼを阻害することで治療上利益が得られる可能性があることは、当初は臓器移植の免疫抑制を意図した強力なJAK3阻害薬であったCP-690,550を使用し、RAで証明されたが、その後、抗JAK1およびJAK2活性も有することが示された[26]。より最近では、選択的JAK1/JAK2阻害薬であるINCB028050が様々な齧歯類RAモデルで効果があることが示され、さらに、この疾患ではJAKキナーゼが中心的役割を果たしていることも示された[14]。RAに対してトシリズマブActemra登録商標の使用が成功したことで、さらに、疾患の発症機序の中心にあるサイトカイン経路を標的とすることの機構的根拠が証明され、TNFα遮断生物製剤のいくつかには免疫抑制の副作用はない[15]。JAK2を阻害することで、コラーゲン抗体関節炎が抑制され、局所サイトカイン反応が阻害される。抗コラーゲンII型抗体をマウスにi.v.にて送達し、最小スコアの要件を満たし、投与群に登録された時点で、化合物Aの経口投与を開始した。化合物Aは合計2週間、1日2回で10、30、または55mg/kgをp.o.投与した。溶媒群に1DMSOに溶解したPEG400を投与し、標準的なグルココルチコイド参照治療薬としてデキサメタゾンdexamethasone:Dexを用いた。Dexは生理食塩水に溶解し、全身の体重1kgあたり1.5mgで週3回48時間ごとに単独i.p.投与した。この高用量のDexを選択したのは完全に治療された疾患の指標を定義するためであり、炎症モデルを用いていくつかの群で利用された範囲内である0.3~1.5mg/kg[29,30,31]。1本1本の足は標準的な電気キャリパーを用いてスコア化および測定し、測定値を平均化して結果をグラフ化した。用量依存的反応は、投与により、経時的に足の厚さまたはサイズが減少したことから明らかであった溶媒と比較し、55mg/kgの投与では13日目に1.3倍減少図2A-1。これらの結果は、使用した最高用量、つまり55mg/kgで総臨床スコアのピークが低下したこととよく関連していた溶媒と比較し、55mg/kgの投与では13日目に2.4倍低下図2A-2。CAIA誘導後13~20日目に、化合物Aの55mg/kg投与で観察された効果はDexで認められた結果と同等であった図2A-2。20日目、投与後2および6時間での血漿、足、および脾臓中の化合物A濃度を分析し、これらの組織では化合物A濃度が用量依存的に増加することが証明された図2B。標的組織、つまり、足の化合物A濃度は比較的低かったが、化合物Aの濃度は55mg/kg投与群では2つの時点で比較的一定であった。この結果は、化合物Aが経時的に疾患つまり、炎症組織に保持されているため、投与後、これらの部位で慢性炎症および/またはRAの症状を治療する上で効果的であることを示している。図2Bに示したデータ平均±SEM、N=3を以下の表にまとめる。投与したマウスの足における化合物Aのリン酸化STATsおよびサイトカイン濃度に対する効果を検討するため、マルチプレックスビーズアレイmultiplexbeadarrayを用いた分析用に、滑液および細胞関節抽出物を罹患動物の足および足関節から得る方法が開発された[32]。化合物Aを用いたinvitroおよびinvivo実験の結果に基づきつまり、図1A-B、投与したマウスの足ではリン酸化STAT5pSTAT5、STAT3pSTAT3、および可能性としてはSTAT1pSTAT1が減少すると想定された。マルチプレックスビーズキットを用い、リン酸化STATsの測定は、ウエスタンブロット法のみを用いる方法と同様で、これよりも定量的であると判断された。したがって、本明細書に説明するすべての実験でリン酸化STATsを測定する主な方法として、多重分析を利用した。罹患動物の局所的な足pSTAT5濃度は溶媒のみと同様であったが、罹患していない動物と比べ、最も高くアップレギュレートされたSTAT分子としてpSTAT3が多数派を占めており、JAK2を抑制すると総濃度が有意に低下し図3A、検討したすべてのサンプルでpSTAT1はわずかに検出されただけであった。化合物A55mg/kg投与後2時間で足のホスホ-STAT3レベルはほぼ消失し図3A、左図、投与後6時間でゆっくりと回復し始めただけであった図3A、右図。足のpSTAT3の総発現量は、疾患経過中、溶媒を投与した対照マウスと比較し、化合物Aを投与した場合に減少した。抗体移入後3日でLPS25μgを用いてマウスを初回刺激する必要があったため、pSTAT3濃度はCAIAマウスで上昇したが、これらの動物では足の炎症が持続し、経時的にpSTAT3活性があったことから、疾患が持続していたことは明らかであった図3B。化合物Aのb.i.d.投与後24時間以内に、pSTAT3の低下は溶媒のみと比較し、Dexで有意に大きくなった図3B、6~7日目、溶媒と比較し、30mg/kgでp0.01、55mg/kgでp0.001。このpSTAT3の低下は、投与開始後48時間でDex投与により達成された図3B、6~8日目。残りの実験期間中、化合物Aはアッセイの下限までpSTAT3発現を低下させた図3B。図2A-1に示すとおり足腫脹と、図3Aおよび3Bに示すとおりpSTAT3発現の抑制は、これらの化合物A濃度つまり、30~55mg/kgでは、STAT3によるいくつかのサイトカイン発現の抑制が後で観察されることを強く示している図3C-1~3C-6参照。この仮説を確認するため、化合物Aの用量30mg/kg、55mg/kg、および100mg/kgを用いてCAIAモデル実験を繰り返し、足抽出物の炎症性サイトカイン数種類の発現レベルを分析した。化合物Aの用量55mg/kgおよび100mg/kgは、いずれも、RAの発症機序に関係があるとされるサイトカイン数種類の濃度を有意に低下させた[33]。足抽出物で検討したすべてのサイトカイン、特にGM-CSF、IL-12、IL-2、およびIL-4で用量依存的減少が観察された図3C-1~3C-655mgのみおよび図8A~8Cを参照。検討したサイトカイン数種類について、サイトカイン発現はDex投与群で観察された濃度未満に有意に低下し図3C、溶媒と比較してp0.05、55mg/kgの用量の化合物Aは残りの試験期間、サイトカイン抑制を低下および持続させた図3C、IL-1β、IL-6、TNFα、IL-12、溶媒と比較してp0.01。このデータは、これらの実験では1.5mg/kgと比較的高用量のDexを利用していたにもかかわらず、化合物Aを投与することで重要な臨床パラメーターの数が効率的にDexで達成できる濃度未満に低下したことから、化合物Aがこの標準的治療薬よりも強力で効果的であることが示唆される。脱灰された前後肢の組織学的解析は、化合物Aの投与により、進行性関節リウマチに伴う臨床的特徴のいくつかも軽減することを示していた。独立した病理学者によるスコア化と画像収集から、化合物Aの投与は、溶媒を用いた対照と比較し、基質の浸食、軟骨骨溶解、骨増殖、滑膜増殖、パンヌス形成、および炎症の程度などいくつかのパラメーターを有意に抑制する可能性があると判断された図6、表Iを参照。JAK2阻害薬の投与、つまり化合物Aの投与に対する用量依存的反応により、組織病理学画像から明らかなとおり、骨分解、組織破壊、および骨関節炎が抑制された図3D。化合物Aすべての用量を投与したすべてのCAIA誘導動物について、全身の体重は溶媒投与動物と有意な差はなかった図3E。これまでの実験では、罹患していない動物が溶媒投与動物と比較して体重増加が同等であることが示されている。JAK2を阻害すると慢性コラーゲン誘導関節炎の進行が遅くなり、疾患を進行させるTh1細胞の生成が抑制される化合物AをRAのより生理的な進行性疾患モデルで検討したつまり、コラーゲン誘導関節炎collagen-inducedarthritis:CIAモデル。この実験では、自己II型コラーゲンに対して事前に感作させ、自然RAの表現型を示していた関節炎マウスに化合物Aを投与した。実験室での研究からは、すでに文献で報告されているとおり、このCIAモデルが関節炎様の炎症を示すことが証明された[18]。初期のモデル最適化研究では、対照を投与した罹患していない動物にはない、確実なコラーゲン誘導関節炎の表現型を一貫して発生させた。CIA関節炎動物を治療群に分け、30、55、および100mg/kgの用量で化合物Aをb.i.d、p.o.投与し、溶媒または標準的な参照治療薬のDex1.5mg/kgは上述のとおり投与した。化合物Aを投与したマウスでは、平均的な足のサイズが明らかに減少するとともに足の値は1匹ずつ回収した、臨床スコアが用量依存的に減少していた図4A-1および4A-2。最も印象的な所見は、Dexを投与したマウスと、化合物A100mg/kgを投与したマウスでは、足腫脹抑制がほぼ同じであることであった図4A-1。さらに、前記100mg/kg投与群では前記Dex投与群と比較し、腫脹がより急速に抑制されることが観察された図4A-1、43日目。100mg/kg投与群ではより早く腫脹の減少が起こることは、化合物Aの作用機序の差によって説明できる。図4Bに示すとおり、pSTAT3は55mg/kg図4B、p0.01および100mg/kg図4B、p0.001で化合物Aを投与したマウスで有意に減少した。化合物Aの用量3種類すべてについて、データは、局所的な足pSTAT3発現量の減少が、関節炎の疾患進行に関与するいくつかの血清および足サイトカイン図4C-1~4C-4参照、IL-12、IL-2、IL-10、TNFα、p0.05。図8Aも参照、IL-4、p0.001および脾臓IL-12図8B、p0.05の減少と直接対応していたことを示している。上述のCAIA実験では、化合物Aによる足IL-6の減少図8C、p0.05も観察された。しかし、溶媒群では見かけ上IL-6で誘導された炎症が急増を引き起こしていたため、このサイトカインIL-6はモニターが困難であった。体重はいずれの投与群でも有意な変化はなかったが、化合物Aを投与したマウスは、対照群よりも健康であるように見え、より大きな体重を保持していた図9A。化合物Aの用量反応は、病原性Th1およびTh17細胞の主な前駆体であり促進因子であるIL-12[34,35]を測定した場合に最も明らかに観察された図4C-1。この実験で投与したDexの用量1.5mg/kgは関節炎マウスの血清における内因性IL-12の発現を抑制する上で効果的であったが、化合物Aの3種類の用量はすべてDexで観察された濃度と比較し、IL-12濃度を有意に低下させることができた図4C-1。IL-12はT-bet発現を介してTh1細胞を分化させるサイトカインであり、抗コラーゲンII型Th1細胞はCIAモデルの足炎症の主な促進因子の1つであるため、化合物Aが循環血液中のIL-12を抑制することができれば、II型コラーゲン特異的T細胞の総度数は投与によって減少するはずであると仮定された。足に局所的に認められるTh1細胞は動物体内を循環して二次的なリンパ器官に入るため、IFNγT細胞Elispotアッセイにおいて、投与したCIAマウスの脾細胞全体を、exvivoで精製II型コラーゲンフラグメントCB11を含む免疫優勢エピトープを用いて再刺激した。図4Dに示すとおり、Dexまたは化合物Aを55mg/kgまたは100mg/kgで4週間b.i.d、p.o.投与した場合、CB11特異的IFNγ分泌T細胞の度数が有意に減少した図4D、p0.001。代表的なElispotブロット画像は、化合物Aの用量が高いほど、Th1様細胞反応の度数が大きく減少することを示している図4D。しかし、化合物A投与マウスで抗CIIIgG血清力価の減少は観察されず図9B、問題の根元、つまり自己反応性B細胞についてはまだ取り組む必要があることを示唆している[36]。抗CII抗体は関節炎ではないマウスには存在せず、抗CI抗体を検討したが、この実験または前記CIAモデルには認められなかった。化合物Aを用いて疾患を治療すると、組織学的分析図4Eおよび独立し、盲検化した病理学者のスコア図7、表IIから証明されるとおり、足の炎症および骨の劣化が少なくなる可能性がある。CIAモデルでは、足根骨は手根骨よりも炎症が大きくなる傾向があるが、前記CAIAモデルでは反対の効果が認められる。化合物Aの用量100mg/kgおよび55mg/kgはいずれも足根骨を保護したが、化合物Aの用量100mg/kgではいずれの領域も最適な保護を提供した図4E。CIAモデルの炎症度のみが、化合物Aの用量100mg/kgおよび55mg/kgのいずれにおいても有意となることが観察された図7、溶媒による対照と比較し、100mg/kgではp0.01、および55mg/kgではp0.05。空気嚢炎症モデルを用い、JAK2阻害により細胞性免疫を阻害する細胞レベルでの化合物AによるJAK2阻害の影響を検討するため、マウス空気嚢モデルairpouchmodel:APMを利用した。空気で膨らんだ皮下の空気嚢を滅菌条件で管理し、10、30、および55mg/kgの化合物Aと同時に、1カラギナンを注入した。食塩水のみ溶媒またはデキサメタゾン1.5mgkgを対象として用いた。化合物AのJAK2阻害は、空気嚢の細胞内蓄積を有意に減少させた図5A、溶媒と比較しp0.05。化合物Aの投与に対してJAK2阻害も、Dexよりも低くIL-6の発現を阻害することが示された図5B、溶媒と比較しp0.05。さらに、間接的な血管新生アッセイであるDrabkinアッセイを用い、空気嚢の内容物の総ヘモグロビン含有量を測定したとおり、血管新生が影響を受けた図5C、溶媒と比較しp0.05。空気嚢モデルAPMで化合物Aを投与すると、1~0.1mg/kgで投与した場合、結果が同様となった。これらのデータは、化合物AによるJAK2阻害が直接細胞免疫機能に影響するため、RAモデルの作用機序が白血球の流れおよびサイトカイン放出/反応のレベルで介在している必要があることを示している。動物、抗体、細胞培養試薬、化合物、細胞株CIAおよびCAIA研究に使用したマウスはHarlan雌DBA/1マウスであり、JacksonLaboratoriesの雌Balb/cmiceをすべての空気嚢モデルairpouchmodel:APM研究に用いた。実験開始から6~8週間でマウスの年齢をマッチさせた。すべての動物を24時間の明暗サイクルで管理し、食餌と水は自由に摂取させた。すべての動物実験手順は、Cephalon,Inc.の研究機関の動物管理使用委員会InstitutionalAnimalCareandUseCommittee:IACUCの承認を受け、その規制に従った。すべての脾臓サンプルをAccuriC6フローサイトメーターAccuriCytometers、米国ミシガン州AnnArborを用いて分析した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、抗リン酸化STAT5CellSignalingTechnology、米国マサチューセッツ州Danversおよび抗総STAT5CellSignalingTechnology、米国マサチューセッツ州Danversであった。すべてのElispot実験について、脾細胞のexvivo培養が関与するすべての実験に完全培地R10を用いた。完全培地は、RPMI1640Cellgro、米国バージニア州Manassas1Pen-StrepCellgro、米国バージニア州Manassas、1L-GlnCellgro、米国バージニア州Manassas、1非必須アミノ酸Cellgro、米国バージニア州Manassas、β-メルカプトエタノールSigma、米国ミズーリ州StLouis、および10FBSCellgro、米国バージニア州Manassasから成った。小分子JAK2阻害薬である化合物Aは、別の文献で詳細が示されている手順に従い合成した[16]。細胞株HEL92ATCC、米国バージニア州Manassasを、化合物Aを用いたpSRAT5阻害の初期薬力学的pharmacpdynamic:PD検査に用いた。ウエスタンブロット法サンプルを10分間70°Cで加熱し、NuPAGE10Bis-Trisゲル、1.5mm、15ウェルInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbadに載せた。使用した分子量のマーカーはBioRadKaleidoscope染色済み基準品BioRad、米国カリフォルニア州Herculesであった。実行条件は、150ボルト、室温roomtemperature:RTで1時間とした。半乾燥させた移動装置BioRad、米国カリフォルニア州Herculesを用い、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。一次抗体は、リン酸化STAT3pY705CellSignalingTechnology、米国マサチューセッツ州Danversでは5牛乳で1:1000に希釈し、総STAT3CellSignalingTechnology、米国マサチューセッツ州Danversでは5BSAで1:1000に希釈し、TBS中5牛乳0.05Tween-20を用いて4°Cで一晩インキュベートした。抗ウサギIgG、HRP結合二次抗体を1:2000で使用したCellSignalingTechnology、米国マサチューセッツ州Danvers。SuperSignalWestPico化学発光基質Pierce米国イリノイ州Rockfordを用いて検出を行った。濃度測定はGelProアナライザー3.1ソフトウェアを用いて行った。酵素アッセイ他の文献で説明されている時間分解蛍光time-resolvedfluorescence:TRF検出システムを利用し[17]、バキュロウイルス発現ヒトJAKキナーゼJAK1、JAK2、JAK3、またはTYK2のキナーゼ活性を測定した[17]。各96ウェルのCostar高結合プレートCorning、米国ニューヨーク州Corningを100μl/ウェルの10μg/mlニュートラアビジンPierceBiotechnology、米国イリノイ州Rockfordにより、TBS中、37°Cで2時間コーティングした後、100μl/ウェルの1μg/ml15merペプチド基質ビオチニル-アミノ-ヘキサノイル-EQEDEPEGDYFEWLE-アミド、InfinityBiotechResearchandResource、米国ペンシルベニア州Astonにより、37°Cで1時間コーティングした。20mMHEPESpH7.2、ATP各キナーゼのKmレベル、1mMMnCl2、0.1BSA、および被験化合物DMSOに希釈、アッセイ中最終濃度2.5DMSOから成るキナーゼアッセイ混合物総量=100μl/ウェルを前記アッセイプレートに加えた。使用したATP濃度は、JAK1、JAK2、およびTYK2で0.2μMATP、JAK3で0.1μMATPであった。酵素を加え、前記反応を20分間RTで進めた。リン酸化生成物の検出は、TBS-T中0.25BSAで1:5000または1:10000に希釈した100μl/ウェルのEu-N1標識PY100抗体PerkinElmerLifeSciences、米国マサチューセッツ州Bostonを加えて行った。サンプルはRTで1時間インキュベートした後、100μlの強化溶液PerkinElmerLifeSciences、米国マサチューセッツ州Bostonを加えた。プレートを10分間攪拌し、得られた溶液の蛍光性はPerkinElmerEnVision登録商標2102または2104マルチラベルプレートリーダーを用いて測定した。IC50値は、XLFit登録商標4IDBS,Ltd.、英国Guildfordの4パラメーターロジスティックモデルにより決定した。コラーゲン抗体関節炎collagen-antibody-induced-arthritis:CAIAモデル試験開始前に順化したマウスを無作為に割り付け、事前に採血し、ベースラインの炎症を測定した。0日の時点で、DBA/1雌マウスに、食塩水に懸濁したII型コラーゲンChondrex、米国ワシントン州Redmondの様々なエピトープに対する関節炎発症モノクローナル抗体の10mg/mlカクテル1.5mgを含む食塩水100μlをi.v.注射した。3日目、マウスに50μgのE.coli0111:B4LPS0.5mg/ml原液Chondrex、米国ワシントン州Redmond100μlをi.p.注射し、回復中はゲル状食を与えた。関節炎の足はLPS投与後2日間のモニタリングを開始し、関節炎のピークは通常LPS投与後2~3日に発生した。各四肢について臨床スコア1以上を示したマウスは関節炎とみなし、研究に用いた。関節炎の臨床スコアを表にしたものは、別の文献にみられる[18]。簡潔に言えば、スコア0は紅斑および腫脹の根拠がないことを示し、スコア1は足根骨に限局した紅斑および軽度の腫脹を示し、スコア2は足関節から足中央部に広がる紅斑および軽度の腫脹を示し、スコア3は足関節から中足関節に広がる紅斑および中等度の腫脹を示し、スコア4は足関節、足、および指を含む紅斑および重度の腫脹を示す。溶媒は1日2回b.i.d経口投与されるPEG4001DMSOから成った。デキサメタゾンDexHanna’sPharmaceuticalSupply、米国デラウェア州Wilmingtonを食塩水中1.5mg/kgで週3回i.p.投与し、炎症のピーク時から実験終了まで継続した。実験中、サイトカインおよび抗体の血清サンプルを採取するため、マウスの頬を出血させた。すべてのサンプルはアッセイの準備ができるまで-80°Cに維持した。STATおよびサイトカインの定量と組織学的解析を行うため、約4週間の時点でマウスの脾臓、血清、および関節炎の足を摘出した。早期に妥当性を確認するため、誘導後3~4週間前後で試験を終了し、様々な時点で足を摘除し、経時的にサイトカイン濃度を測定した。コラーゲン誘導関節炎Collagen-InducedArthritis:CIAモデル試験開始前に順化したマウスを無作為に割り付け、事前に採血し、ベースラインの炎症を測定した。0日目、CFA、5mg/mlChondrex、米国ワシントン州Redmond乳剤に懸濁した0.05M酢酸Chrondrex、米国ワシントン州Redmond中、等容積のウシII型コラーゲンCII、2mg/ml原液によりDBA/1雌マウスに一次免疫を行い、尾のつけ根に100μgのCIIを100μlで経皮intradermally:i.d.注射した。一次免疫後21日目の時点で、フロイント不完全アジュバントIncompleteFreund’sAdjuvant:IFAThermoScientific、米国イリノイ州Rockfordに乳化したCIIをマウスの横腹にs.c.再負荷した。28日目、各マウスにE.coli0111:B4LPS0.5mg/ml原液Chondrex、米国ワシントン州Redmondを食塩水100μl中10μgでi.p.注射した25~50μgのLPSは1匹あたり10μgに減量し、エンドトキシンショックによる死亡率を低下させた。35日目前後にマウスは足に炎症および疾患の徴候を示し始めた。投与開始前にマウスを無作為に割り付け、グループに分け、スコア化し、耳にタグを付け、事前に採血してベースライン疾患を決定した。各四肢について臨床スコア1以上を示したマウスは関節炎とみなし、研究に登録した。関節炎の臨床スコアはCAIAモデルをスコア化するために使用したものと同じであったCAIAの方法を参照。溶媒は1日2回b.i.d経口投与されるPEG4001DMSOから成った。デキサメタゾンHanna’sPharmaceuticalSupply、米国デラウェア州Wilmingtonを食塩水中1.5mg/kgで週3回i.p.投与し、炎症のピーク時から実験終了まで継続した。実験中、サイトカインおよび抗体の血清サンプルを採取するため、マウスの頬を出血させた。すべてのサンプルはアッセイの準備ができるまで-80°Cに維持した。STATおよびサイトカインの定量と組織学的解析を行うため、約60日目の時点でマウスの脾臓、血清、および関節炎の足を摘出した。カラギナン誘導炎症の空気嚢マウスモデルこの迅速な炎症スクリーニングモデルの確立およびデザインに関する詳細は、他の文献に見ることができる[19,20]。簡潔に言えば、5日前の時点でBalb/cマウスに滅菌した空気4mlをs.c.注射し、ベースラインの測定値を記録し、マウスを群に無作為に割り付けた。3日前までに空気嚢を維持する試験にマウスを登録したが、この時点で空気嚢を維持するため2mlの滅菌した空気を注入する。0日目、直接マウスの空気嚢に食塩水に懸濁した1カラギナンSigma、米国ミズーリー州St.Louisを注射した。これにより、主に好中球およびマクロファージの急速な炎症性流入が誘導される。この被験化合物を食塩水中、総量100μlでmg/kgの濃度とし、前記カラギナン注射と同時に直接空気嚢に導入した食塩水中カラギナン1。炎症反応が誘導され、続いてIL-6、TNFα、IL-1β空気嚢サイトカインが急増し、これは8日目までに解消した。カラギナンおよびそれぞれの被験化合物投与後24時間で100μlの空気嚢液を細胞性滲出物とともに摘出した。細胞性滲出物を遠心分離にかけ、上清はLuminexサイトカイン分析用に処理し、細胞ペレットの総肝細胞および死滅細胞を計数した。総細胞数の計数はBDTruCountビーズBDBiosciences、米国カリフォルニア州SanJoseを用いて実施し、細胞分析は生存判別色素として7-AADSigma、米国ミズーリー州St.Louisを用いて行い、死滅細胞を除外した。DrabkinのアッセイSigma、米国ミズーリー州St.Louisアッセイを利用し、ヘモグロビン含有量を決定した。組織学-CAIAおよびCIA関節炎モデル各実験終了時に、組織学的解析のため、前足および後足手根骨および足根骨を含むを動物身体から摘除した。指先端の皮膚を剥離し、外科用ハサミを用いて中足部の皮膚を穿孔し、完全に脱灰させた。サンプルは、別の文献で説明されたとおり、ギ酸を用いた脱灰手順に従った[21,22]。7~10日脱灰した後、サンプルを蒸留水で2時間洗い、処理の準備ができるまで4°Cで70エタノールに保存した。サンプルをパラフィン包埋し、切片とし、ヘマトキシリンおよびエオシンHematoxylinandEosin:HE染色し、基質分解を検討するためサフラニン-Oでも染色した画像は図示せず、病理学者がスコア化に使用した。すべての組織学的研究はWistarInstitute米国ペンシルバニア州Philadelphiaで行った。画像はOlympusDP70カメラおよびOlympusLabSensソフトウェアを備えたOlympusBX50顕微鏡2009により収集した。組織病理像により各群合計5匹のマウスを分析し、検討した各群について10倍の代表的画像を示している。血清抗I型およびII型コラーゲン自己抗体の測定血清は1~2週間ごとに収集し、使用まで-80°Cで保存した。解凍したサンプルを社内で作成したII型およびI型コラーゲンELISA法により分析した。簡潔に言えば、BBS0.025MNa2B4O7-10H2O、0.01MH3BO3、0.075MNaCl、pH8.4バッファー中、4°Cで一晩、96ウェルプレートの各ウェルを5μg/mlのI型コラーゲンChondrex、米国ワシントン州RedmondまたはII型コラーゲンChondrex、米国ワシントン州Redmond50μlでコーティングした。手順の前にプレートをBBS0.1Tween-20で3回洗った。精製したマウス抗コラーゲンI型またはII型抗体を用いて標準曲線を作成し、1ウェルあたり50μlで血清を加え、室温roomtemperature:RTで1時間インキュベートした後、BBSTween-20で洗った。洗浄後、1μg/mlのウサギ抗マウスHRP-Fabフラグメント50μlを検出抗体として加えRockland、米国ペンシルバニア州Gilbertsville、RTで45分間インキュベートした。プレートはBBSTween-20で4回洗い、次に100μlのテトラメチルベンジジンtetramethylbenzidine:TMB基質を加え、100μlの1MH2SO4を用いて反応を停止した。プレートを450nmで読み取り、参照波長は570nmとした。ElispotsTおよびB細胞Elispot法については別の文献にみられ[23,24]、各方法について以下に簡潔に説明する。T細胞ElispotsCIA実験については、MilliporeニトロセルロースIPフィルタープレートMillipore、米国マサチューセッツ州Billericaを、滅菌PBS中、1ウェルあたり60μlでそれぞれ7μg/mlまたは2μg/mlの抗マウスIFNγAN18、MabTech、米国オハイオ州Mariemontまたは抗マウスIL-411B11、eBioscience、米国カリフォルニア州SanDiegoでコーティングし、RTで3時間または4°Cで一晩インキュベートした。コーティングしたウェルをPBS0.1Tween-20で洗い、軽く叩いて半乾燥させてから、完全培地を用いて使用前に少なくとも1時間ブロッキングした。精製したマウスII型コラーゲンChrondrex、米国ワシントン州Redmond、I型コラーゲンChrondrex、米国ワシントン州Redmond、または第三者の対照トリオボアルブミンovalbumin:OVASigma米国ミズーリー州St.Louisを用い、総抗原濃度10μg/mlで1ウェルあたり100万個の処理脾細胞を負荷した。バックグラウンドの対照として培地のみを用い、第三者の対照としてOVA、IFNγおよびIL-4の陽性対照としてPMAイオノマイシンが、それぞれTh1およびTh2細胞によって放出される。B細胞ElispotsB細胞Elispotの成分はMabTechから入手し、ニトロセルロースIPフィルタープレートはMilliporeから入手した。簡潔に言えば、CIA実験では、B細胞Elispotのウェルをエタノールで活性化した後、滅菌PBS中、10μg/mlの精製したウシII型またはI型コラーゲンChrondrex、米国ワシントン州Redmondで洗い、コーティングし、第三者の対照としてOVAを用い、バックグラウンドは培地のみとした。処理した脾細胞を各ウェルに加え、LPS刺激は行わず、抗体分泌細胞タイプantibodysecretingcell:ASCsの真のexvivo度数を回避した。IgG産生ASC全体について抗マウス総IgGを陽性対照として用い、結果を正規化するために使用した。各抗原を検出するための細胞度数は、検討する各モデルの最適化および検証過程ですでに同定されていたデータ図示せず。CIA実験では、CIおよびCIIでコーティングしたウェルについて、合計500,000個の細胞を各ウェルに加えた。B細胞Elispotsを一晩37°C、5CO2でインキュベートした。各アッセイを展開するため、二次抗体MabTech、米国オハイオ州Mariemontを各ウェルに加え、インキュベート、洗浄して、アルカリホスファターゼストレプトアビジンを抱合体JacksonImmunoresearch、米国ペンシルバニア州WestGroveとして用い、BCIP-NBTRocklandBiologicals、米国ペンシルバニア州Gilbertsvilleを基質として用い、スポットが見えるようになるまで展開した。すべてのElispot分析はImmunospotC.T.L.スキャナおよびBiospotソフトウェア2009を用いて行った。マルチプレックスLuminex登録商標ビーズアッセイによる血清サイトカインの測定-80°Cで凍結した血漿を氷上解凍し、ボルテックスをかけた後、10分間遠心分離して壊死組織片および凝集体を取り除いた。製造業者の指示に従い、Luminex登録商標アッセイには合計25~50μlの血清を用いた。マウスサイトカイン10-plexビーズキットInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbadを用い、10種類のマウスサイトカインを測定した。簡潔に言えば、フィルタープレートMillipore、米国マサチューセッツ州Billericaを200μlの洗浄液キットの構成要素で事前に湿らせ、1ウェルあたり25μlのビーズを加えた。血清サンプルを希釈し、1ウェルあたり合計50μlの量を加えたつまり、サンプル血清25μlアッセイ希釈液25μl。ビーズが入ったプレートを、暗所でオービタルシェーカーに載せ、2時間RTでインキュベートした。インキュベーション終了時にプレートをバッファーで2回洗い、前記キットに提供されているビオチン希釈液中、希釈倍率1:10、100μlで二次ビオチン化抗体を加えた。プレートを暗所、RTで1時間インキュベートし、バッファーで2回洗った。アッセイ希釈液に溶解したストレプトアビジンを1ウェルあたり100μlで加えた後、暗所、RTで30分間インキュベートした。プレートは100μlの洗浄液で3回洗い、暗所、RTで2~3分間攪拌した。データ取得および解析ソフトウェアを搭載したLuminexxMAP200ユニットInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbadで直ちにプレートを測定した。ビーズの洗浄はすべて、真空マニホールドユニットPall、米国ニューヨーク州PortWashingtonを用いて行った。マルチプレックスLuminex登録商標ビーズアッセイによる足サイトカインおよびホスホ-STATsの測定この方法のより詳細な説明は別の文献に見ることができるLuら、2010、発表用に提出済み。簡潔に言えば、前手根骨を含むおよび後足根骨を含む右足を採取し、ドライアイスで冷却したイソペンタン中に凍結し、使用するまで-80°Cで保存した。足は2mm×2mmの切片に切断し、ポリプロピレン製の丸底試験管に入れ、ドライアイスで保存した。プロテアーゼ阻害薬カクテルCalbiochem、米国カリフォルニア州SanDiegoおよびHaltプロテアーゼ阻害薬カクテルThermoScientific、米国イリノイ州RockfordまたはRocheプロテアーゼ阻害薬カクテルRoche、米国インディアナ州Indianapolisを組織抽出試薬IInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlesbad中に含む組織抽出バッファー700μlを各サンプルに加えた。サンプルはPT10-35Polytronホモジナイザーを用いて凍結後均質化した。均質化後、4°C、2000×gで10分間サンプルを遠心分離し、4°C、最大スピード14,000×gで15分間、上清を再度遠心分離した。上清を慎重に取り除き、最上層の脂質/脂肪組織片を取らないようにした。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイPierce、米国イリノイ州Rockfordを用いて測定し、3mg/mlに調節した。上述のプロトコールでは、マウスサイトカイン10-plexビーズキットInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbadまたはリン酸化STAT1,3,5a/b,3-plexキットInvitrogen、米国カリフォルニア州Carlsbadを用い、この抽出物を最低25μl使用した。化合物の定量化PK、薬物動態足および脾臓サンプルの血漿およびタンパク質抽出物を定量分析に提出し、それぞれの化合物の濃度を決定した。血液サンプルをヘパリン添加した試験管に回収し、遠心分離16,000×g、5分まで氷上に置き、結晶を分離した。上清を回収し、分析を待つ間、-20°Cで保存した。分析時に、2種類の用量の内部標準アルプレノロールを含む冷アセトニトリルを各サンプルに追加し、これをボルテックスにかけ、遠心分離した。上清を除き、オートサンプラーのバイアルに入れ、サンプルに存在する化合物の量を液体クロマトグラフ/質量分析LC-MS-MSにより分析した。サンプル中の化合物の濃度は、5~20,000ng/mlの濃度範囲で連続的に希釈して作成したマウス血漿の標準曲線と比較して定量した。前記標準曲線の最小部を10以上超える濃度を含むサンプルは、アセトニトリルで1:10に希釈した。血漿、足、および脾臓の検出限界は10ng/mlであった。統計解析すべてのELISAまたはLuminex登録商標アッセイは線形回帰曲線を用いて分析し、データ取得後に分析物の濃度を決定した。Mann-Whitneyノンパラメトリック一元または二元分散分析を統計学的検定として用い、実験および検討した仮説によって図の説明文に示した。p値が0.05未満の場合に有意と考えた。使用した統計ソフトウェアはGraphPadPrismバージョン5.01、2007であり、計算はMicrosoftOfficeExcelProfessional、2003により行った。本明細書に報告したのは、選択性が高く、経口投与可能なJAK2小分子阻害薬である化合物Aの有効性プロフィールであり、2つのRAマウスモデルで評価した。JAK2の薬力学的阻害により、足浮腫および臨床スコアの平均値が関節炎のCIAおよびCAIAモデルの両方で低下した。足および血清サイトカインの減少は、exvivoIFNγElispotで測定したとおり、脾臓のCII特異的Th1細胞度数の減少と関連していた。いずれのモデルでも、投与により疾患寛解の組織学的証拠が示され、足pSTAT3濃度が低下した。この研究では、強力で選択性の高い経口投与可能なJAK2阻害薬をRAの治療に用いることの有用性を示している。CIAモデルはT細胞およびB細胞反応の両方に依存しており、ヒトRAと同様、IL-6の作用に依存していることから、化合物Aはヒトの疾患に関与する重要な免疫サイトカインを調節できることが示される[15,37,38]。CIAモデルとは異なり、CAIAモデルではこのサイトカインが欠乏しているマウスもまだ関節炎を誘導することができるため、完全にIL-6に依存しているわけではないことが示された[39]。しかし、驚くべきことに、化合物Aの強力な活性がCAIAモデルで観察され、この活性は標準的な治療薬であるDexを超えることもある。トシリズマブを使用することで、明白な免疫抑制を行わずにサイトカインを標的とすることが、疾患の進行にいかに直接影響しているかが示されている[8]。INCB028050などの他の小分子も同様の表現型を示す、つまり、免疫抑制を行わずにIL-6および疾患を抑制することも報告された[14]。急性炎症性マウスモデルつまり、INCB028050では遅延型過敏症、化合物AではAPMモデルでは化合物AとINCB028050がいずれも免疫細胞の流入およびサイトカインの放出を阻害する可能性があるため、化合物AはINCB028050と同様に作用する可能性がある。JAK2は、gp130受容体ファミリー、IL-6RおよびIL-12Rβ、およびIFNγR2など、自己免疫および炎症に重要な役割を果たすことと強く関連する受容体を含む、数種類の受容体によるシグナル伝達に介在している[40]。さらに、JAK2はGM-CSF受容体スーパーファミリーのいくつかの構成要素例えば、IL-3R、IL-5R、GM-CSF-Rによるシグナル伝達に介在する。JAK2は、エリスロポエチン受容体Epo-R、トロンボポエチン受容体Tpo-R、成長ホルモン受容体GH-R、プロラクチン受容体PRL-Rおよびレプチン受容体LRなどの単鎖受容体もコントロールする。レプチンはIL-2およびIL-15と構造が類似しており、免疫に関与していると考えられてきた[41]。JAK2はLRからのシグナル伝達に介在するため、JAK2の阻害は、動脈硬化およびアテローム性動脈硬化など、明らかに心血管系が関連している炎症性疾患の標的として作用する可能性がある[42]。様々な免疫関連シグナル伝達分子とJAK2との相互作用は、このキナーゼの阻害がいかに他の免疫細胞タイプ、またそのため他の自己免疫疾患の治療に影響することができるかを決定する。下流のJAK2はSTAT5a/b、STAT3、STAT4、およびSTAT1と相互作用することができる[43]。しかし、STAT5a/bのみが直接JAK2による活性化を受け、STAT4はTYK2により、STAT1はJAK1により活性化される可能性があり、STAT3はEGFR経路、JAK1、およびSrcキナーゼにより活性化される可能性がある[27,28]。さらに、Tec、Vav1、Fyn、Yes1、およびPTK2を含むいくつかのキナーゼも直接JAK2と相互作用する[44-48]。これらのキナーゼは、すべてある程度、免疫サブセット、特にTおよびBリンパ球の制御および活性化に関与している。JAK2の阻害は、ただサイトカインシグナル伝達を直接阻害するよりもさらに意味があると考えられる。JAK2阻害によりTおよびB細胞の活性化は下流で阻害され、別の適応症でこのキナーゼの強力な阻害薬を使用できる可能性が広がる。例えば、リンパ球の活性化をコントロールするキナーゼにはチロシンキナーゼのTecファミリーを含み、T細胞のアダプター分子の島SLP76のVav1およびB細胞のBLNKなどの分子と相互作用するItkおよびBtkキナーゼを含む[49]。主に、Tecキナーゼは適切なT細胞受容体のシグナル伝達および活性化に関与する。TecキナーゼItkが欠損したマウスはTh2エフェクター細胞に効率的に分化することができず、侵入してくる細胞外寄生虫、および一部のウイルス感染に対しても防御促進力が欠けている[50]。Itk欠損マウスも、喘息マウスモデルでT細胞の肺浸潤の低下を示す[51]。下流分子のVav1は、T細胞活性化に関与するPKCおよびERKを介して、TCRおよびCD28シグナルをCREに伝達する[52]。JAK2の下流標的として考えられるFynおよびYes1は、TおよびB細胞の活性化に重要な役割を果たし、いずれかを阻害するとリンパ球の活性化に必要な下流の閾値に影響する可能性がある[53]。したがって、JAK2活性の阻害により上述のキナーゼのいずれかを完全または部分的に阻害すると、数種類の自己免疫疾患の発症および進行に大きく影響する可能性がある。他の免疫疾患でこの強力な阻害薬を使用するためには、さらなる研究が必要である。JAK-STATシグナル伝達のサプレッサーである、SOCSも、直接JAK2と相互作用する例えば、SOCS3[43,54]。SOCSタンパク質はJAK-STAT経路のネガティブフィードバックループとして働く[55]。興味深いことに、SOCSの発現はRA患者では変化しており、SOCS1およびSOCS3の濃度はRA患者のPBMCでは上昇していることが示された[56]。SOCS1は、RA患者の末梢血単球のSOCS3発現に関与する末梢血T細胞でアップレギュレートされていた[56]。SOCS1は、骨関節炎患者と比較し、RA患者の滑膜でアップレギュレートされることも示された。これは、SOCSの作用を介したJAK2シグナル伝達の脱制御がRAの発症に寄与している可能性があり、患者の疾患の発症しやすさを予測することを示唆している。化合物Aにより疾患を促進させるサイトカイン経路の阻害は、標準的な治療を用いて測定した結果に匹敵し、クローン病および潰瘍性大腸炎など、他のIL-6依存性疾患にこの阻害薬を使用することを強く提案している。化合物Aは、SLE、IBD、乾癬、および結腸、前立腺、および膵癌を含む様々な癌など、これらの同経路に依存する他の疾患にも有用と考えられる。これらの結果から、化合物Aなどの選択的JAK2阻害薬のさらなる前臨床評価が必要である。当業者は、本明細書に詳細を示した具体的実験が、本発明の様々な態様を説明するためだけのものであることは容易に理解するだろう。本出願書類の精神および範囲から離れずに、様々な変更を行うことができることは理解されるものとする。参考文献本出願書類が関係する技術の状態をより十分説明するため、以下の科学論文は上記で言及されている。これらの参考文献の引用はすべて、以下に提供される。1NathanCDingANonresolvinginflammationCell20101408718822KunduJKSurhYJInflammationgearingthejourneytocancerMutatRes200865915303ChanACCarterPJTherapeuticantibodiesforautoimmunityandinflammationNatRevImmunol2010103013164OparAKinaseinhibitorsattractattentionasoralrheumatoidarthritisdrugsNatRevDrugDiscov201092572585CohenSFleischmannRKinaseinhibitorsanewapproachtorheumatoidarthritistreatmentCurrOpinRheumatol2010223303356BajpaiMFostamatinibaSykinhibitorprodrugforthetreatmentofinflammatorydiseasesIDrugs2009121741857BinghamCO3rdEmergingtherapeuticsforrheumatoidarthritisBullNYUHospJtDis2008662102158OldfieldVDhillonSPloskerGLTocilizumabareviewofitsuseinthemanagementofrheumatoidarthritisDrugs2009696096329KerbleskiJFGottliebABDermatologicalcomplicationsandsafetyofantiTNFtreatmentsGut2009581033103910WilliamsELGadolaSEdwardsCJAntiTNFinducedlupusRheumatology20094871672011RamosCasalsMBritoZeronPSotoMJCuadradoMJKhamashtaMAAutoimmunediseasesinducedbyTNFtargetedtherapiesBestPractResClinRheumatol20082284786112WalkerJGSmithMDTheJakSTATpathwayinrheumatoidarthritisJRheumatol2005321650165313WestKCP690550aJAK3inhibitorasanimmunosuppressantforthetreatmentofrheumatoidarthritistransplantrejectionpsoriasisandotherimmunemediateddisordersCurrOpinInvestigDrugs20091049150414FridmanJSScherlePACollinsRBurnTCLiYLiJCovingtonMBThomasBCollierPFavataMFetalSelectiveinhibitionofJAK1andJAK2isefficaciousinrodentmodelsofarthritispreclinicalcharacterizationofINCB028050JImmunol20101845298530715UchiyamaYYorozuKHashizumeMMoriyaYMiharaMTocilizumabahumanizedantiinterleukin6receptorantibodyamelioratesjointswellinginestablishedmonkeycollageninducedarthritisBiolPharmBull2008311159116316CurryMDorseyBDuganBGingrichDMesarosEMikiewiczKPreparationandUsesof124Triazolo15aPyridineDerivativesCephalonIncFiledJune4201017HexnerEOSerdikoffCJanMSwiderCRRobinsonCYangSAngelesTEmersonSGCarrollMRuggeriBetalLestaurtinibisaJAK2inhibitorthatsuppressesJAK2STAT5signalingandtheproliferationofprimaryerythroidcellsfrompatientswithmyeloproliferativedisordersBlood20081115663567118BrandDDKangAHRosloniecEFThemousemodelofcollageninducedarthritisMethodsMolMed200410229531219RomanoMFaggioniRSironiMSaccoSEchtenacherBDiSantoESalmonaMGhezziPCarrageenaninducedacuteinflammationinthemouseairpouchsynovialmodelRoleoftumournecrosisfactorMediatorsInflamm19976323820EllisLGilstonVSooCCMorrisCJKiddBLWinyardPGActivationofthetranscriptionfactorNFkappaBintheratairpouchmodelofinflammationAnnRheumDis20005930330721VerdeniusHHAlmaLAquantitativestudyofdecalcificationmethodsinhistologyJClinPathol19581122923622EggertFMGermainJPRapiddemineralizationinacidicbuffersHistochemistry19795921522423SeaveyMMMaciagPCAlRawiNSewellDPatersonYAnantivascularendothelialgrowthfactorreceptor2fetalliverkinase1ListeriamonocytogenesantiangiogenesiscancervaccineforthetreatmentofprimaryandmetastaticHer2neubreasttumorsinamousemodelJImmunol20091825537554624VingsboCLarssonPAnderssonMHolmdahlRAssociationofpepsinwithtypeIIcollagenbreakscontrolofCIIautoimmunityandtriggersdevelopmentofarthritisinratsScandJImmunol19933733734225FabianMABiggsWH3rdTreiberDKAtteridgeCEAzimioaraMDBenedettiMGCarterTACiceriPEdeenPTFloydMetalAsmallmoleculekinaseinteractionmapforclinicalkinaseinhibitorsNatBiotechnol20052332933626KaramanMWHerrgardSTreiberDKGallantPAtteridgeCECampbellBTChanKWCiceriPDavisMIEdeenPTetalAquantitativeanalysisofkinaseinhibitorselectivityNatBiotechnol20082612713227TurksonJBowmanTGarciaRCaldenhovenEDeGrootRPJoveRStat3activationbySrcinducesspecificgeneregulationandisrequiredforcelltransformationMolCellBiol1998182545255228LoHWHsuSCAliSeyedMGunduzMXiaWWeiYBartholomeuszGShihJYHungMCNuclearinteractionofEGFRandSTAT3intheactivationoftheiNOSNOpathwayCancerCell2005757558929KangILeeWWLeeYModulationofcollageninducedarthritisbyIL4anddexamethasonethesynergisticeffectofIL4anddexamethasoneontheresolutionofCIAImmunopharmacology20004931732430MontesinosMCDesaiACronsteinBNSuppressionofinflammationbylowdosemethotrexateismediatedbyadenosineA2AreceptorbutnotA3receptoractivationinthioglycollateinducedperitonitisArthritisResTher20068R5331DouniESfikakisPPHaralambousSFernandesPKolliasGAttenuationofinflammatorypolyarthritisinTNFtransgenicmicebydiacereincomparativeanalysiswithdexamethasonemethotrexateandantiTNFprotocolsArthritisResTher20046R65R7232LuLDStumpKLSeaveyMMNovelMethodofMonitoringTraceCytokinesandActivatedSTATMoleculesinthePawsofArthriticMiceusingMultiplexBeadTechnologyJournalofImmunologicalMethods2010inreview33McInnesIBSchettGCytokinesinthepathogenesisofrheumatoidarthritisNatRevImmunol2007742944234CornelissenFvanHamburgJPLubbertsETheIL12IL23axisanditsroleinTh17celldevelopmentpathologyandplasticityinarthritisCurrOpinInvestigDrugs20091045246235SinghRAggarwalAMisraRTh1Th17cytokineprofilesinpatientswithreactivearthritisundifferentiatedspondyloarthropathyJRheumatol2007342285229036CaleroINietoJASanzIBCellTherapiesforRheumatoidArthritisBeyondBcellDepletionRheumDisClinNorthAm20103632534337AlonziTFattoriELazzaroDCostaPProbertLKolliasGDeBenedettiFPoliVCilibertoGInterleukin6isrequiredforthedevelopmentofcollageninducedarthritisJExpMed199818746146838SasaiMSaekiYOhshimaSNishiokaKMimaTTanakaTKatadaYYoshizakiKSuemuraMKishimotoTDelayedonsetandreducedseverityofcollageninducedarthritisininterleukin6deficientmiceArthritisRheum1999421635164339KagariTDoiHShimozatoTTheimportanceofIL1betaandTNFalphaandthenoninvolvementofIL6inthedevelopmentofmonoclonalantibodyinducedarthritisJImmunol20021691459146640FonsecaJESantosMJCanhaoHChoyEInterleukin6asakeyplayerinsystemicinflammationandjointdestructionAutoimmunRev2009853854241ProcacciniCLourencoEVMatareseGLaCavaALeptinsignalingAkeypathwayinimmuneresponsesCurrSignalTransductTher20094223042LaCavaAMatareseGTheweightofleptininimmunityNatRevImmunol2004437137943OSheaJJMurrayPJCytokinesignalingmodulesininflammatoryresponsesImmunity20082847748744TakahashiTezukaMHibiMFujitaniYFukadaTYamaguchiTHiranoTTectyrosinekinaselinksthecytokinereceptorstoPI3kinaseprobablythroughJAKOncogene1997142273228245ShigematsuHIwasakiHOtsukaTOhnoYArimaFNihoYRoleofthevavprotooncogeneproductinerythropoietinmediatedcellproliferationandphosphatidylinositol3kinaseactivityJBiolChem1997272143341434046SayeskiPPAliMSSafaviALylesMKimSOFrankSJBernsteinKEAcatalyticallyactiveJak2isrequiredfortheangiotensinIIdependentactivationofFynJBiolChem1999274331313314247FuhrerDKYangYCComplexformationofJAK2withPP2AP13KandYesinresponsetothehematopoieticcytokineinterleukin11BiochemBiophysResCommun199622428929648RyuHLeeJHKimKSJeongSMKimPHChungHTRegulationofneutrophiladhesionbypituitarygrowthhormoneaccompaniestyrosinephosphorylationofJak2p125FAKandpaxillinJImmunol20001652116212349BradshawJMTheSrcSykandTecfamilykinasesdistincttypesofmolecularswitchesCellSignal2010221175118450FowellDJShinkaiKLiaoXCBeebeAMCoffmanRLLittmanDRLocksleyRMImpairedNFATctranslocationandfailureofTh2developmentinItkdeficientCD4TcellsImmunity19991139940951MuellerCAugustAAttenuationofimmunologicalsymptomsofallergicasthmainmicelackingthetyrosinekinaseITKJImmunol20031705056506352HaubertDWeckbeckerGVav1couplestheTcellreceptortocAMPresponseelementactivationviaaPKCdependentpathwayCellSignal20102294495453SeftonBMTaddieJARoleoftyrosinekinasesinlymphocyteactivationCurrOpinImmunol1994637237954HaanSWullerSKaczorJRolveringCNockerTBehrmannIHaanCSOCSmediateddownregulationofmutantJak2counteractscytokineindependentsignalingOncogene2009283069308055YingMLiDYangLWangMWangNChenYHeMWangYLossofSOCS3expressionisassociatedwithanincreasedriskofrecurrentdiseaseinbreastcarcinomaJCancerResClinOncol201056IsomakiPAlanaraTIsohanniPLagerstedtAKorpelaMMoilanenTVisakorpiTSilvennoinenOTheexpressionofSOCSisalteredinrheumatoidarthritisRheumatology20074615381546"