"富化腎臓細胞集団による分泌産物とネイティブ腎臓をインビボで接触させることを含むネイティブ腎臓に再生効果を与える方法。産物がパラクリン因子を含む請求項1に記載の方法。産物が内分泌因子を含む請求項1に記載の方法。産物がジャクスタクライン因子を含む請求項1に記載の方法。産物が小胞を含む請求項1に記載の方法。小胞が微小胞を含む請求項5に記載の方法。小胞がエキソソームを含む請求項5に記載の方法。小胞が、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびRNA、からなる群より選択される分泌産物を含む請求項5~7のいずれか1項に記載の方法。産物が足場の上または中に直接播種された富化腎臓細胞集団を含む腎臓細胞構築物から分泌される請求項1に記載の方法。足場が生体適合性材料を含む請求項9に記載の方法。生体適合性材料がヒドロゲルを含む請求項10に記載の方法。産物の分泌が酸素レベルに対する生物学的応答である請求項1または9に記載の方法。分泌が大気中酸素レベル未満の酸素により誘導される請求項12に記載の方法。より低い酸素レベルが約5酸素未満である請求項13に記載の方法。再生効果が上皮間葉転換EMTの減少である請求項1または9に記載の方法。上皮間葉転換EMTの減少がTGF-βシグナル伝達の減弱化を介する請求項15に記載の方法。再生効果が腎臓線維形成の減少および/または腎臓炎症の減少である請求項1または9に記載の方法。再生効果がネイティブ腎臓中の幹細胞マーカーの発現差異を特徴とする請求項1または9に記載の方法。集団が尿細管細胞の富化集団を含む第1細胞集団、B2を含む請求項1または9に記載の方法。集団が第1細胞集団、B2を含むヒト腎臓細胞、および第2細胞集団の混合物を含み、B2が尿細管細胞の富化集団を含み、第2細胞集団が1つまたは複数のエリスロポエチンEPO産生細胞、糸球体細胞および血管細胞を含む、請求項1または9に記載の方法。B2細胞集団が約1.045g/mL~約1.052g/mLの密度を有する請求項19または20に記載の方法。第2細胞集団が約1.063g/mL~約1.091g/mLの密度を有するB4細胞集団である請求項20に記載の方法。第2細胞集団が約1.052g/ml~約1.063g/mlの密度を有するB3細胞集団である請求項20に記載の方法。混合物が第3細胞集団をさらに含み、第3細胞集団が1つまたは複数のエリスロポエチンEPO産生細胞、糸球体細胞および血管細胞を含む請求項21~23のいずれか1項に記載の方法。第3細胞集団が約1.063g/mL~約1.091g/mLの密度を有するB4細胞集団である請求項24に記載の方法。第3細胞集団が約1.052g/ml~約1.063g/mlの密度を有するB3細胞集団である請求項24に記載の方法。富化腎臓細胞集団がネイティブ腎臓に対し非自己である請求項1または9に記載の方法。富化腎臓細胞集団がネイティブ腎臓に対し自己である請求項1または9に記載の方法。腎疾患KD患者が治療薬による処置に応答するか否かを評価する方法であって、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、治療薬で処置したKD患者から採取した試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量を検出することを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、試験検体中のより多いかまたはより少ない小胞またはその内腔含有物の量が該治療薬による処置に対する該患者の応答を示す前記方法。小胞が腎臓由来小胞である請求項29に記載の方法。小胞がバイオマーカーを含む請求項29または30に記載の方法。バイオマーカーがmiRNAである請求項31に記載の方法。治療薬が腎臓細胞の富化集団を含む請求項29に記載の方法。試験検体が尿を含む請求項29に記載の方法。発明の詳細な説明本発明は、生理活性腎臓細胞BRCの異種起源混合物、およびこれらを単離し培養する方法、ならびに本明細書記載のBRCおよび/またはBRCを播種した足場から形成したBRC含有構築物を必要としている対象を治療する方法に関する。生理活性腎臓細胞は、尿細管およびエリスロポエチンEPO産生腎臓細胞含有単離腎臓細胞であってもよい。BRC細胞集団は、富化尿細管およびEPO産生細胞集団を含んでもよい。BRCは、健康な個体由来腎臓細胞画分由来か、または画分それ自体であってもよい。さらに、本発明は、対応する健康な個体の腎臓細胞画分と比較して、特定の細胞成分が欠如している可能性があるが、それでも、治療特性を保持している不健康な個体から採取した腎臓細胞画分を提供する。本発明は、また、健康な個体に比較して細胞成分が欠けている治療的に活性な細胞集団を提供し、一実施形態では、この細胞集団は、種々の疾患状態の自己ソースから単離、増殖できる。本発明は、また、ネイティブ腎臓を腎臓細胞による分泌産物とインビボで接触させることによりネイティブ腎臓に再生効果を与える方法、ならびに分泌産物を調製する方法に関する。本発明は、マーカーを使用して本明細書記載の方法による治療後の腎臓再生の存在の測定にさらに関する。定義特に断らなければ、本明細書で使われる技術的および科学的用語は、本発明の属する当業者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。PrinciplesofTissueEngineering、3rdEd.EditedbyRLanza、RLanger、JVacanti、2007、は本出願で使われる多くの用語に対する一般的ガイドを当業者に提供する。当業者なら、本明細書記載のものと類似の、または等価な、本発明の実施に使用可能な多くの方法と材料に気付くであろう。実際、本発明は、記載されている方法と材料に限定されるものではない。本明細書で使用される用語の細胞集団は、適切な組織ソース、通常は哺乳動物、から直接単離することにより得られいくつかの細胞を指す。単離細胞集団は、その後、インビトロで培養してもよい。当業者なら、本発明で使用可能な細胞集団を単離し培養する種々の方法および本発明で使用される細胞集団中の様々な数の細胞について解るであろう。細胞集団は、腎臓由来の未分画の、異種起源の細胞集団であってもよい。例えば、異種起源の細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から単離されてもよい。あるいは、異種起源の細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から構築された哺乳動物細胞のインビトロ培養物由来であってもよい。未分画異種起源の細胞集団は、また、非富化細胞集団と呼ぶこともできる。用語のネイティブ腎臓は、生体の腎臓を意味する。対象は、健康でも不健康でもよい。不健康対象は、腎疾患に罹患していてもよい。用語の再生効果は、ネイティブ腎臓に対する利益を提供する効果を意味する。効果は、これらに制限されないが、ネイティブ腎臓に対する障害度の減少、またはネイティブ腎臓機能の改善、修復もしくは安定化を含んでもよい。腎損傷は、線維形成、炎症、糸球体肥大、等の形態であってもよく、対象の腎疾患に関連してもよい。本明細書で使用される用語の混合物は、2つ以上の未分画、異種起源の細胞集団由来の単離された、富化細胞集団の組み合わせを指す。特定の実施形態では、本発明の細胞集団は、腎臓細胞集団である。富化細胞集団または調製物は、出発集団中のその細胞型の割合よりも高い割合の特定細胞型を含む、出発腎臓細胞集団例えば、未分画、異種起源の細胞集団由来の細胞集団を指す。例えば、出発腎臓細胞集団は、第1、第2、第3、第4、第5、等の対象細胞集団用として富化してもよい。本明細書で使用される用語の細胞集団、細胞調製物および細胞プロトタイプは、同義に使用される。一態様では、本明細書で使用される用語の富化細胞集団は、出発集団中のEPO産生可能な細胞の割合よりも高い割合のEPO産生可能な細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団例えば、腎生検または培養哺乳類腎臓細胞由来の細胞懸濁液を指す。例えば、用語のB4は、出発集団に比べて、より大きな割合のEPO産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。本発明の細胞集団は、1つまたは複数の細胞型を富化させ、1つまたは複数の他の細胞型を枯渇させてもよい。例えば、富化EPO産生細胞集団は、間質性線維芽細胞を富化させ、尿細管細胞を枯渇させて、非富化細胞集団、すなわち、富化細胞集団が得られる出発細胞集団中の間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比べて、管上皮細胞を集合させることができる。EPO富化またはB4集団に言及している全ての実施形態において、富化細胞集団は、内在性ネイティブEPO遺伝子からの酸素で調節可能なEPO発現により示されるように、酸素調節手法でEPOを産生出来る細胞を含む異種起源の細胞集団である。別の態様では、出発集団の細胞型の割合より大きな割合の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む富化細胞集団は、また、健康な個体または対象由来の出発腎臓細胞集団に比べて、1つまたは複数の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠けているか、または不足していてもよい。例えば、一態様では、用語のB4’、すなわちB4プライムは、健康な個体に比較して、出発標本の疾患状態に応じて、1つまたは複数の細胞型、例えば、血管、糸球体または内分泌型が欠けているか、または不足している出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。一実施形態では、B4’細胞集団は、慢性腎疾患の対象由来である。一実施形態では、B4’細胞集団は、巣状分節性糸球体硬化症FSGSの対象由来である。別の実施形態では、B4’細胞集団は、自己免疫性糸球体腎炎の対象由来である。別の態様では、B4’は、1つまたは複数の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、枯渇するか、または不足する、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。さらに別の態様では、B4’は、1つまたは複数の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、富化される、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。例えば、一実施形態では、B4’細胞集団は、血管細胞が富化され、糸球体および/または内分泌細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体細胞が富化され、血管および/または内分泌細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、B4’細胞集団は、内分泌細胞が富化され、血管および/または糸球体細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、B4’細胞集団は、血管および内分泌細胞が富化され、糸球体細胞が枯渇してもよい。好ましい実施形態では、B4’細胞集団が、単独または別の富化細胞集団、例えば、B2および/またはB3と混合されて、治療特性を保持する。B4’細胞集団は、例えば、本明細書の実施例、例えば、実施例7~9に記載されている。別の態様では、富化細胞集団は、また、上で考察のように、出発集団中の1つまたは複数の尿細管細胞マーカー発現細胞の割合よりも大きな割合の1つまたは複数の尿細管細胞マーカー発現細胞を含む、出発腎臓細胞集団由来の細胞集団を指してもよい。例えば、用語B2は、出発集団に比較して、より大きな割合の尿細管細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団を指す。さらに、1つまたは複数の尿細管細胞マーカーまたはB2を発現する細胞を富化した細胞集団は、集合管系由来の一部の上皮細胞を含んでもよい。1つまたは複数の尿細管細胞マーカーまたはB2を発現する細胞を富化した細胞集団は、相対的に、EPO産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が枯渇しているが、富化集団は、出発集団に比べてより小さな割合のこれらの細胞EPO産生、糸球体、および血管細胞を含んでもよい。一般的に、異種起源の細胞集団は、1つまたは複数の細胞型が枯渇し、その結果、枯渇細胞集団は、枯渇前の異種起源の細胞集団に含まれる細胞型の割合に比較して、より小さい割合の細胞型を含む。枯渇する可能性のある細胞型は、腎臓細胞のいずれの型でもよい。例えば、特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、大きな粒度の集合管および尿細管系を有する細胞が含まれ、これは、密度が約1.045g/ml未満で、B1と呼ばれる。他の特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞が含まれ、密度は約1.095g/ml超で、B5と呼ばれる。一部の実施形態では、尿細管細胞を富化した細胞集団は、相対的に次の全てが枯渇している:B1、B5、酸素で調節可能なEPO発現細胞、糸球体細胞、および血管細胞。本明細書で使用される用語の低酸素性の培養条件は、細胞が大気酸素レベル約21で培養される標準的培養条件に比較して、細胞が培養系で利用可能な酸素レベルの低下にさらされる培養条件を指す。非低酸素性条件は、本明細書では、正常、または正常酸素圧培養条件と呼ばれる。本明細書で使用される用語の酸素で調節可能なは、細胞に利用可能な酸素量に基づいて、遺伝子発現を調節上昇または低下する細胞の能力を指す。低酸素誘導可能は、酸素圧力の減少に応答した遺伝子発現上昇を指す前誘導または出発酸素圧力にかかわらず。本明細書で使われる用語の生体材料は、生きている組織中への導入に適した天然または合成生体適合性材料を指す。天然生体材料は、生体系により作られる材料である。合成生体材料は、生体系では作られない材料である。本明細書で開示の生体材料は、天然および合成生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書で使用される生体材料には、例えば、高分子マトリックスおよび足場が含まれる。当業者には、生体材料は、例えば、液体ヒドロゲル懸濁液、多孔性発泡体のような種々の形態に作られてもよく、1つまたは複数の天然または合成生体適合性材料を含んでもよいことは理解されるであろう。本明細書で使用される用語の貧血は、対象のEPO産生細胞による機能性EPOタンパク質の不適切は産生、および/または全身循環へのEPOタンパク質の不適切放出、および/または骨髄中の赤芽球がEPOタンパク質に反応できないこと、による赤血球数および/またはヘモグロビンレベルの不足を指す。貧血の対象は、赤血球恒常性を維持できない。一般的に、腎臓機能の低下または喪失例えば、慢性腎不全による貧血、相対的EPO欠乏に関連した貧血、うっ血性心不全に関連した貧血、化学療法または抗ウイルス療法例えば、AZT等の骨髄抑制療法に関連した貧血、非骨髄性癌に関連した貧血、HIV等のウイルス性感染症に関連した貧血、および自己免疫疾患例えば、関節リウマチ等の慢性疾患、肝臓疾患、および多相器系不全の貧血が発生しうる。用語のEPO欠乏は、貧血を含む、エリスロポエチン受容体アゴニスト例えば、組換え型EPOまたはEPO類似体で治療可能な任意の状態または障害を指す。本明細書で使用される用語の腎疾患は、腎臓の血液濾過および血液からの過剰体液、電解質、および廃棄物の除去機能の実行能力の低減を生ずる急性または慢性腎不全の任意の段階または程度に関連した障害を指す。腎疾患は、また内分泌機能異常、例えば、貧血エリスロポエチン欠乏、およびミネラル不均衡ビタミンD欠乏を含む。腎疾患は、腎臓が起源であるか、または心不全、高血圧症、糖尿病、自己免疫疾患、または肝臓疾患これらに限定されないを含む種々の状態に続発することもありうる。腎疾患は、腎臓に対する急性傷害後に発生する慢性腎不全の状態でありうる。例えば、虚血および/または毒物への暴露による腎臓に対する障害が、急性腎不全を引き起こす可能性がある;急性腎傷害後の不完全回復が慢性腎不全の発生をもたらす可能性がある。用語の処置は、腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に対する治療の処置および予防または防止手段の両方を指す。この場合、目的は、標的の障害を逆戻りさせるか、防ぐか、または減速させる小さくすることである。処置を必要としている人には、既に、腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に罹患している人、ならびに腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下になりそうな人、または腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下を予防すべき人が含まれる。本明細書で使用される用語の処置は、腎臓機能の安定化および/または改善を含む。本明細書で使用される用語のインビボ接触は、腎臓細胞富化集団により分泌された産物または腎臓細胞/腎臓細胞画分を含む混合物または構築物およびネイティブ腎臓間の直接インビボ接触を指す。直接インビボ接触は、本質的に、パラクリン、内分泌、またはジャクスタクラインであってもよい。分泌された産物は、本明細書記載の異なる産物の異種起源の集団であってもよい。本明細書で使用される用語のリボ核酸またはRNAは、ヌクレオチドユニットの鎖を指し、各ユニットは、窒素性塩基、リボース糖、およびリン酸塩で構築されている。RNAは、単鎖型でも二重鎖型でもよい。RNAは、小胞の一部であっても、小胞内に存在しても、または小胞に関連するものでもよい。小胞は、エキソソームであってもよい。RNAには、mRNA、rRNA、小型RNA、snRNA、snoRNA、マイクロRNAmiRNA、低分子干渉RNAsiRNA、および非翻訳領域RNAが含まれるがこれらに限定されない。RNAは、ヒトRNAが好ましい。用語の構築物は、1つまたは複数の合成または天然生体適合性材料から作られた足場またはマトリックスの表面上またはその中に析出させた1つまたは複数の細胞集団を指す。1つまたは複数の細胞集団は、1つまたは複数の合成または天然生体適合性高分子、タンパク質、またはペプチドから作られた生体材料でコートするか、その上に析出させるか、その中に包埋するか、それに付着させるか、またはその中に封入してもよい。1つまたは複数の細胞集団は、生体材料または足場もしくはマトリックスとインビトロまたはインビボで組み合わせてもよい。一般的に、足場/生体材料を形成するために使用される1つまたは複数の生体適合性材料は、少なくとも1つの析出した細胞集団の多細胞3次元組織化を指示するか、促進するか、または許容するように選択される。構築物を生成するのに使用される1つまたは複数の生体材料は、内在性宿主組織を有する構築物または構築物の細胞成分の分散および/または一体化を指示するか、促進するか、または許容するか、または構築物もしくは構築物の細胞成分の生存、生着、耐性、または機能的性能を指示するか、促進するか、または許容するように選択できる。用語のマーカーまたはバイオマーカーは、通常、DNA、RNA、タンパク質、炭水化物、または糖脂質ベース分子マーカーを指し、培養した細胞集団中でのそれらの発現または存在は、標準的な方法または本明細書で開示の方法により検出可能で、特定の細胞型である培養した細胞集団中の1つまたは複数の細胞と一致する。マーカーは、細胞により発現されたポリペプチドまたは特定可能な染色体上の物理的位置、例えば、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはネイティブ細胞により発現されるポリペプチドをコードする核酸例えば、mRNAであってもよい。マーカーは、遺伝子発現マーカーと呼ばれる遺伝子の発現領域、または既知のコード機能のない一部のDNAセグメントであってもよい。バイオマーカーは、細胞由来の産物、例えば、分泌産物であってもよい。用語の発現差異遺伝子、遺伝子発現差異およびそれらの同義語は、同義に使用され、第1細胞または細胞集団の発現が、第2細胞または細胞集団のその発現に比べて、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を指す。この用語は、また、第1または第2細胞の継代培養時間の間の異なる段階で、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を含む。また、発現差異遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害されてもよく、または選択的スプライシングに供され、異なるポリペプチド産物を生じてもよいことは理解されよう。このような差異は、例えば、mRNAレベルの変化、表面発現、分泌またはポリペプチドのその他の区分け手法により立証できる。遺伝子発現差異には、2つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の比較、または2つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、またはさらに第1細胞と第2細胞の間で異なる別々に処理された2つの同じ遺伝子の産物の比較、を含んでもよい。発現差異には、例えば、第1細胞および第2細胞中の遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞発現パターンにおける定量的、ならびに定性的差異の両方が含まれる。本発明の目的としては、第1細胞と第2細胞の間の所与の遺伝子の発現の差異がある場合に、遺伝子発現差異が存在すると考えられる。マーカーの発現差異は、投与後の患者由来の細胞第2細胞中の発現に比べて、細胞集団、混合物、または構築物第1細胞の投与前の患者由来の細胞中に存在してもよい。用語の阻害する、下方制御する、過小発現するunder-expressおよび減らすは同義に使われ、遺伝子の発現、またはRNA分子もしくは1つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価RNA分子のレベル、または1つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、1つまたは複数の対照、例えば、1つまたは複数の陽性および/または陰性対照に比べて低減することを意味する。過小発現は、投与後の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与前の患者由来の細胞中に存在してもよい。用語の上方制御するまたは過剰発現は、遺伝子の発現、またはRNA分子もしくは1つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価RNA分子のレベル、または1つまたは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、1つまたは複数の対照、例えば、1つまたは複数の陽性および/または陰性対照に比べて高められていることの意味に使用される。過剰発現は、投与前の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与後の患者由来の細胞中に存在してもよい。用語の対象は、腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の1つまたは複数の徴候、症状、または他の指標を経験しているか、または経験したことがある、治療適格患者を含む、任意の個々のヒトの対象を意味する。このような対象には、限定されないが、腎疾患、貧血、またはEPO欠乏を新規に診断された、または以前に診断されたか、および現在これらの再発または再燃を経験しているか、またはこれらに罹患のリスクがある対象が、理由がなんであれ、含まれる。対象は、腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の治療を以前行っていても、また、そうでなくてもよい。用語の患者は、任意の個々の動物、より好ましくは、治療が必要な哺乳動物例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類、等の非ヒト動物を含むを指す。本明細書の患者は、ヒトが最も好ましい。用語の検体または患者検体または生物試料は、通常、対象または患者、体液、体組織、細胞株、組織培養物、または他のソースから採取した任意の生物試料を意味する。この用語は、組織生検、例えば、腎生検を含む。この用語は、培養細胞、例えば、培養哺乳類腎臓細胞を含む。哺乳動物から組織生検および培養細胞を得る方法は、当技術分野でよく知られている。用語の検体が単独で使用される場合、検体は、依然として生物試料または患者検体を意味し、すなわち、これらの用語は、同義に使用される。用語の試験検体は、本発明の方法で処置された対象由来の検体を指す。この試験検体は、限定されないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織、等を含む哺乳類対象の種々のソース由来であってもよい。用語の対照または対照検体は、陰性または陽性の結果により、試験検体の結果の相関付けを支援することが期待される陰性または陽性対照を指す。本発明に適する対照には、限定されないが、正常な赤血球恒常性の指標特性を示すことが解っている検体、貧血の指標特性を示すことが解っている検体、貧血でないことが解っている対象から採取した検体、および貧血であると解っている対象から採取した検体が含まれる。本発明の方法に使用可能なさらなる対照には、限定されないが、赤血球生成を調節すると解っている薬剤例えば、組換え型EPOまたはEPO類似体で処置されたことがある対象由来の検体が含まれる。さらに、対照は、本発明の方法により処置される前に対象から採取した検体であってもよい。追加の適する対照は、いずれかの型または段階の腎疾患であると解っている対象から採取した試験検体、およびいずれの型または段階の腎疾患であるか解っていない対象から採取した検体であってもよい。対照は、正常で健康な調和の取れた対照であってもよい。当業者なら、本発明での使用に適した他の対照が解るであろう。再生予後Regenerationprognosis、再生予後regenerativeprognosis、または再生予後prognosticforregenerationは、通常、本明細書記載の細胞集団、混合物または構築物の投与または移植の可能な再生経過または転帰の予見または予測を指す。予後に対して、予見または予測は、1つまたは複数の次記により知ることができる:移植または投与後の腎臓機能の改善、移植または投与後の機能的腎臓の発生、移植または投与後の改善腎臓機能または能力の発生、および移植または投与後のネイティブ腎臓による特定のマーカーの発現。再生腎臓は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後のネイティブ腎臓を指す。再生腎臓は、限定されないが、ネイティブ腎臓中の機能または能力の発生、ネイティブ腎臓中の機能または能力の改善、およびネイティブ腎臓中の特定のマーカーの発現、を含む種々の指標を特徴とする。当業者なら、他の指標が、再生腎臓を特徴付けるのに適切である可能性があることを解るであろう。細胞集団腎疾患の処置に使用するための、すなわち、腎臓機能の安定化および/または改善および/または再生を提供する、特異的生理活性成分または細胞型を富化した、および/または特異的不活性または望ましくない成分または細胞型を枯渇させた異種起源の単離腎臓細胞集団、およびそれらの混合物は、以前に、2009年11月12日出願の米国特許出願第12/617、721号に記載された。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、健康な個体に比べて、細胞成分を欠くが、依然として、治療特性を保持している、すなわち、腎臓機能の安定化および/または改善および/または再生を行える単離腎臓細胞画分を提供する。本明細書記載の細胞集団、細胞画分、および/または細胞の混合物は、健康な個体、腎疾患の個体、または本明細書記載の対象由来であってもよい。生理活性細胞集団一態様では、本発明は、生理活性成分を富化させ、不活性または望ましくない成分を枯渇させた異種起源の腎臓細胞集団の特定の亜画分が、出発集団より優れた治療および再生結果を提供するという驚異的知見に基づいている。例えば、本発明の生理活性成分、例えば、不活性または望ましくない成分、例えば、B1およびB5が枯渇しているB2、B4、およびB3は、単独または混合して、予想外の腎臓機能の安定化および/または改善および/または再生を提供する。別の態様では、本発明は、1つまたは複数の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞型が枯渇または不足している特異的亜画分であるB4、すなわち、B4’は、単独で、または他の生理活性亜画分、例えば、B2および/またはB3と混合した場合、治療特性、例えば、腎臓機能の安定化および/または改善および/または再生特性を保持しているという驚異的知見に基づいている。好ましい実施形態では、生理活性細胞集団はB2ある。特定の実施形態では、B2細胞集団は、B4またはB4’と混合される。他の実施形態では、B2細胞集団は、B3と混合される。他の実施形態では、B2細胞集団は、B3とB4の両方、またはB3および/またはB4の特定細胞成分と混合される。B2細胞集団は、1つまたは複数の下記からなる群より選択される尿細管細胞マーカーの発現を特徴とする:メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ2HAS2、ビタミンD325-ヒドロキシラーゼCYP2D25、N-カドヘリンNcad、E-カドヘリンEcad、アクアポリン-1Aqp1、アクアポリン-2Aqp2、RAB17、memberRAS癌遺伝子ファミリーRab17、GATA結合タンパク質3Gata3、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4Fxyd4、溶質キャリアファミリー9ナトリウム/水素交換体、member4Slc9a4、アルデヒド脱水素酵素3ファミリー、memberB1Aldh3b1、アルデヒド脱水素酵素1ファミリー、memberA3Aldh1a3、およびカルパイン-8Capn8、ならびに集合管マーカーアクアポリン-4Aqp4。B2は、B3および/またはB4より大きく、より粒状化しており、従って、約1.045g/ml~約1.063g/mlげっ歯類、約1.045g/ml~1.052g/mlヒト、および約1.045g/ml~約1.058g/mlイヌのの浮遊密度を有する。B3細胞集団は、一部のEPO産生細胞を伴ったB2とB4に比べて中間的サイズと粒度の血管、糸球体および近位の尿細管マーカーの発現を特徴とする。従って、約1.063g/ml~約1.073g/mlげっ歯類、約1.052g/ml~約1.063g/mlヒト、および約1.058g/ml~約1.063g/mlイヌのの浮遊密度を有する。B3は、1つまたは複数の下記からなる群より選択されるマーカーの発現を特徴とする:アクアポリン7Aqp7、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子2Fxyd2、溶質キャリアファミリー17リン酸ナトリウム、member3Slc17a3、溶質キャリアファミリー3、member1Slc3a1、クローディン2Cldn2、napsinAアスパラギン酸ペプチダーゼNapsa、溶質キャリアファミリー2促進性ブドウ糖輸送体、member2Slc2a2、アラニル膜アミノペプチダーゼAnpep、膜貫通タンパク質27Tmem27、アシルCoAシンテターゼ中等度鎖ファミリーメンバー2Acsm2、グルタチオンペルオキシダーゼ3Gpx3、果糖-1、6-ビホスファターゼ1Fbp1、およびアラニン-グリオキシル酸アミノ基転移酵素2Agxt2。B3は、また、血管発現マーカー血小板内皮細胞接着分子Pecamおよび糸球体発現マーカーポドシンPodnを特徴とする。B4細胞集団は、PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146の内の1つまたは複数を含む血管マーカーセットの発現;ポドシンPodn、およびネフリンNephの内の1つまたは複数を含む糸球体マーカーセットの発現;ならびに未分画UNFX、B2およびB3に比較して、酸素で調節可能なEPO富化集団、を特徴とする。B4は、また、1つまたは複数の下記マーカーの発現を特徴とする:ケモカインC-X-Cモチーフ受容体4Cxcr4、エンドセリン受容体B型Ednrb、コラーゲン、V型、アルファ2Col5a2、カドヘリン5Cdh5、プラスミノーゲン活性化因子、組織Plat、アンジオポエチン2Angpt2、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体Kdr、分泌タンパク質、酸性の、システインリッチオステオネクチンSparc、セルグリシンSrgn、TIMPメタロペプチダーゼ阻害剤3Timp3、Wilms腫瘍1Wt1、ウィングレス型MMTV統合部位ファミリー、member4Wnt4、G-タンパク質シグナル伝達制御因子4Rgs4、血小板内皮細胞接着分子Pecam、およびエリスロポエチンEpo。B4は、また、B2またはB3に比較して、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とする。また、約1.073g/ml~約1.091g/mlげっ歯類、約1.063g/ml~約1.091g/mLヒトおよびイヌの浮遊密度を有する。B4’細胞集団は、1.063g/mL~1.091g/mLの浮遊密度を有し、1つまたは複数の下記のマーカーを発現するとして定義される:PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、ポドシン、ネフリン、EPO、CK7、CK8/18/19。一実施形態では、B4’細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146の内の1つまたは複数を含む血管マーカーセットを発現することを特徴とする。別の実施形態では、B4’細胞集団は、内分泌マーカーEPOの発現を特徴とする。一実施形態では、B4’細胞集団は、ポドシンPodn、およびネフリンNephの内の1つまたは複数を含む糸球体マーカーセットの発現を特徴とする。特定の実施形態では、B4’細胞集団は、PECAM、vEGF、KDR、HIF1aの内の1つまたは複数を含む血管マーカーセットの発現、および内分泌マーカーEPOの発現を特徴とする。別の実施形態では、B4’は、また、B2またはB3に比べて、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とし、約1.073g/ml~約1.091g/mlげっ歯類、約1.063g/ml~約1.091g/mLヒトおよびイヌのの浮遊密度を有する。一態様では、本発明は、1.063g/mL~1.091g/mLの密度の少なくとも1つのエリスロポエチンEPO産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞を含む単離された、ヒト腎臓細胞富化B4’集団を提供する。一実施形態では、B4’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。一部の実施形態では、B4’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現が可能である。一実施形態では、B4’細胞集団は、尿細管細胞を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度のB2細胞集団を含まない。別の実施形態では、B4’細胞集団は、集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、B4’細胞集団は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。一実施形態では、B4’細胞集団は、尿細管細胞を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度のB2細胞集団;集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団;および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。一部の実施形態では、B4’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度の第1細胞集団、B2、およびエリスロポエチンEPO産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇した約1.063g/mL~1.091g/mLの密度の第2細胞集団、B4’を含むヒト腎臓細胞混合物を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の1.045g/ml未満の密度の大きな粒状化細胞を含むB1細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。特定の実施形態では、B4’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、B2は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、細胞の混合物は、受容体媒介アルブミン取込が可能である。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸HAの高分子量種の産生可能な、および/または産生を刺激可能なHAS-2発現細胞を含む。全ての実施形態で、第1および第2細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。一実施形態では、混合物は、インビボ送達時に再生刺激を与えることができる。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および/または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化し、または改善することができる。一実施形態では、B4’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。一態様では、本発明は、少なくとも1つのエリスロポエチンEPO産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞を含む1.063g/mL~1.091g/mLの密度の単離された、ヒト腎臓細胞富化B4’集団を提供する。一実施形態では、B4’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。発現しない糸球体マーカーは、ポドシンであってもよい実施例7参照。一部の実施形態では、B4’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現が可能である。一実施形態では、B4’細胞集団は、1.045g/mL~1.052g/mLの密度の尿細管細胞含有B2細胞集団を含まない。別の実施形態では、B4’細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、B4’細胞集団は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。一実施形態では、B4’細胞集団は、尿細管細胞を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度のB2細胞集団;集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団;および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。一部の実施形態では、B4’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度の第1細胞集団、B2、およびエリスロポエチンEPO産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している約1.063g/mL~1.091g/mLの密度の第2細胞集団、B4’を含むヒト腎臓細胞の混合物を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。特定の実施形態では、B4’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体のマーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、B2は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、細胞の混合物は、受容体媒介アルブミン取込が可能である。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸HAの高分子量種の産生および/または産生の刺激が可能なHAS-2発現細胞を含む。全ての実施形態で、第1および第2細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。一実施形態では、混合物は、インビボ送達時に再生刺激与えることができる。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および/または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化または改善できる。一実施形態では、B4’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。好ましい実施形態では、混合物は、B2を、B3および/またはB4と組み合わせて含む。別の好ましい実施形態では、混合物は、B2を、B3および/またはB4’と組み合わせて含む。他の好ましい実施形態では、混合物は、iB2をB3および/またはB4と組み合わせて;またはiiB2をB3および/またはB4’と組み合わせて構成されるか、または基本的に構成される。B4’細胞集団を含む混合物は、また、不健康対象から採取したB2および/またはB3細胞集団を含んでもよい。不健康な対象は、B4’画分が得られたのと同じ対象であってもよい。B4’細胞集団とは対照的に、不健康対象から採取したB2およびB3細胞集団は、健康な個体由来の出発腎臓細胞集団に比べて、通常、1つまたは複数の特定細胞型が欠如していない。B2およびB4によるヒアルロン酸産生ヒアルロナンヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩とも呼ばれるは、グリコサミノグリカンGAGであり、非硫酸化二糖ユニットの規則的反復配列、特にN-アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸から構成される。その分子量は、400ダルトン二糖から百万ダルトン超までの範囲に及ぶ。それは、皮膚、軟骨、および目等、の全組織中、ならびに、成人動物の、全てではないにしても、ほとんどの体液中に可変量として認められる。それは特に初期の胚中に豊富である。ヒアルロナンにより形成された空間、および実際にGAGは、通常、細胞遊走、細胞付着中に、創傷修復、器官形成、免疫細胞接着、細胞内シグナル伝達の活性化、ならびに腫瘍転移の間に、それが何らかの役割を果たすことを可能とする。これらの役割は、ヒアルロナンへの特異的タンパク質およびプロテオグリカンの結合により媒介される。細胞の運動性および免疫細胞接着は、細胞表面受容体RHAMMヒアルロナン媒介運動性のための受容体;Hardwicketal.、1992およびCD44Jalkenanetal.、1987;Miyakeetal.、1990により媒介される。ヒアルロナンは、細胞表面の内側膜で直接合成され、合成されるにつれ、成長するポリマーが膜を通して細胞の外側へ押し出される。合成は、遺伝子ファミリーが少なくとも3つのメンバーから構成される単一タンパク質酵素、ヒアルロナン合成酵素HASにより媒介される。最近、ヒアルロン酸がCD44と相互作用することが示されたが、このような相互作用は、多くの作用の中でも特に、非居住細胞例えば、間葉系幹細胞MSCを傷害腎臓組織に補充することができ、腎臓再生を強化するKidneyInternational200772、430-441。意外にも、B2細胞集団中でより特異的に富化されているマーカーであるヒアルロン酸シンターゼ-2HAS-2の作用により、インビトロおよびインビボの両方で、B2およびB4細胞調製物が、より大きい分子量種のヒアルロン酸HAを発現可能であることが明らかとなった。5/6NxモデルにおけるB2を使った処置が、強力なHAS-2インビボ発現および予期された処置組織内の高分子量HAの産生と同時に、線維形成を減らすことが示された。特に、未処置で残された5/6Nxモデルは、わずかのHAS-2の検出および極わずかな高分子量HAの産生と共に、線維形成が生じた。理論に拘泥する意図はないが、B2により主として産生されたある程度はB4によるこのHAの抗炎症性高分子量種は、腎線維症の減少および腎臓再生の支援において、細胞調製物と相乗的に作用すると仮定される。従って、本発明は、ヒアルロン酸含有生体材料中の本発明の細胞プロトタイプの送達を含む。移植細胞を使った直接産生または産生の刺激による再生刺激生体材料成分の提供もまた本発明で意図されている。一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血および/またはEPO欠乏の処置に使われる、単離された、異種起源のEPO産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、細胞集団は、腎生検由来である。別の実施形態では、細胞集団は、全腎臓組織由来である。もう一つの実施形態では、細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から構築された哺乳類腎臓細胞のインビトロ培養物由来である。全ての実施形態で、これらの集団は、未分画細胞集団であり、また、本明細書では非富化細胞集団と呼ばれる。別の態様では、本発明は、エリスロポエチンEPO産生腎臓細胞がさらに富化され、それにより、出発または初期細胞集団中のEPO産生細胞の割合に比較して、富化亜集団中のEPO産生細胞の割合が大きくなった単離EPO産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、富化EPO産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比較して、より大きな割合の間質性線維芽細胞およびより小さな割合の尿細管細胞を含む。特定の実施形態では、富化EPO産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる糸球体細胞、血管細胞および集合管細胞に比較して、より大きな割合の糸球体細胞および血管細胞およびより小さな割合の集合管細胞を含む。このような実施形態では、これらの集団は、本明細書では、B4細胞集団と呼ばれる。別の態様では、本発明は、1つまたは複数の追加の腎臓細胞集団と混合されたEPO産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、EPO産生細胞集団は、EPO産生細胞を富化した第1細胞集団、例えば、B4である。別の実施形態では、EPO産生細胞集団は、EPO産生細胞を富化していない第1細胞集団、例えば、B2である。別の実施形態では、第1細胞集団は、第2腎臓細胞集団と混合される。一部の実施形態では、第2細胞集団は、尿細管細胞が富化され、これは尿細管細胞表現型の存在により立証できる。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、1つの尿細管細胞マーカーの存在により示すことができる。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、1つまたは複数の尿細管細胞マーカーの存在により示すことができる。尿細管細胞マーカーには、限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ2HAS2、ビタミンD325-ヒドロキシラーゼCYP2D25、N-カドヘリンNcad、E-カドヘリンEcad、アクアポリン-1Aqp1、アクアポリン-2Aqp2、RAB17、memberRAS癌遺伝子ファミリーRab17、GATA結合タンパク質3Gata3、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4Fxyd4、溶質キャリアファミリー9ナトリウム/水素交換体、member4Slc9a4、アルデヒド脱水素酵素3ファミリー、memberB1Aldh3b1、アルデヒド脱水素酵素1ファミリー、memberA3Aldh1a3、およびカルパイン-8Capn8、が含まれる。別の実施形態では、第1細胞集団は、限定されないが、下記を含むいくつかの型の内の少なくとも1つの腎臓細胞と混合される:間質由来細胞、尿細管細胞、集合管由来細胞、糸球体由来細胞、および/または血液または脈管構造由来細胞。EPO産生腎臓細胞集団は、B2および/またはB3との混合物の形態の、または富化細胞集団、例えば、B2B3B4/B4’の形態のB4またはB4’を含んでもよい。一態様では、本発明のEPO産生腎臓細胞集団は、EPO発現および酸素に対する生物学的応答を特徴とし、培養系の酸素圧力の減少によりEPO発現が誘導される。一実施形態では、EPO産生細胞集団は、EPO産生細胞が富化される。一実施形態では、EPO発現は、通常の雰囲気約21の利用可能酸素に比べて、利用可能な培養系の酸素レベルが減少している条件下で細胞集団を培養する場合に誘導される。一実施形態では、通常の酸素条件下で培養したEPO産生細胞に比べて、低酸素条件下で培養したEPO産生細胞は、より高いレベルのEPOを発現する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素での細胞培養低酸素性培養条件とも呼ばれるは、低い酸素のレベルが、通常の雰囲気レベルの利用可能酸素正常または正常酸素圧培養条件と呼ばれるでの細胞の培養に比べて、低下していることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件には、1酸素未満、約2酸素未満、約3酸素未満、約4酸素未満、または約5酸素未満で細胞を培養することが含まれる。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件には、約10酸素、約12酸素、約13酸素、約14酸素、約15酸素、約16酸素、約17酸素、約18酸素、約19酸素、約20酸素、または約21酸素で細胞を培養することを含む。もう一つの実施形態では、約5未満の利用可能酸素で細胞を培養し、EPO発現レベルを大気圧約21酸素下で培養した細胞と比較することにより、EPOの発現誘導または発現増加が得られ、また、観察できる。別の実施形態では、一定期間細胞の培養が大気中酸素約21下で行われる第1培養相および利用可能酸素レベルが低減され、約5未満の利用可能酸素下で同じ細胞が培養される第2培養相を含む方法により、EPOの誘導は、EPOを発現できる細胞の培養中に得られる。別の実施形態では、低酸素性条件に応答するEPO発現は、HIF1αにより調節されている。当業者なら、当技術分野で既知の他の酸素操作培養条件も本明細書記載の細胞の目的に使用可能であることを理解するであろう。一態様では、EPO産生哺乳動物細胞富化集団は、灌流条件に対する生物学的応答例えば、EPO発現を特徴とする。一実施形態では、灌流条件は、一過性、間欠性、または連続の液体流動灌流を含む。一実施形態では、流動を介して動力を細胞に移す方式で、細胞培養用培地を間欠的にまたは連続的に循環させるか、または攪拌する場合に、EPO発現が機械的に誘導される。一実施形態では、一過性、間欠性、または連続的液体流動に曝された細胞は、それらがフレームワークおよび/またはこのような3次元構造を形成する空間を提供する材料中または材料上の3次元構造体として存在する方式で培養される。一実施形態では、細胞は、多孔性ビーズ上で培養され、揺動プラットホーム、軌道周回プラットホーム、またはスピナーフラスコを用いて間欠性または連続的液体流動に曝される。別の実施形態では、細胞は、3次元足場上で培養され、装置中に置かれる。これにより、足場は固定され、液体は、足場を通る、または横切る方向へ流動する。当業者なら、当技術分野で既知の他の灌流培養条件を、本明細書記載の細胞用として使用可能であることを理解するであろう。不活性細胞集団本明細書で記載のように、本発明は、1つには、生理活性成分富化および不活性または望ましくない成分が枯渇している腎臓細胞の異種起源の集団の特定亜画分が、出発集団よりも優れた処置および再生の結果を提供するという驚くべき知見に基づいている。好ましい実施形態では、本発明の細胞集団は、B1および/またはB5細胞集団が枯渇している。例えば、下記は、B1および/またはB5を枯渇していてもよい:2つ以上のB2、B3、およびB4’の混合物;B2、B3、およびB4’富化細胞集団。B1細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな、粒状細胞を含み、その集団の細胞は、約1.045g/m未満の浮遊密度を有する。B5細胞集団は、低粒度および低生存率の約1.091g/ml超の浮遊密度を有する壊死組織片および小細胞から構成される。細胞集団を単離培養する方法一態様では、本発明は、治療上の使用のために、腎臓細胞成分、例えば、富化細胞集団を分離し、単離する方法を提供し、この方法は、腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、および糸球体濾過機能低下の処置を含む。一実施形態では、細胞集団は新たに消化された、すなわち、機械的に、もしくは酵素的に消化された腎臓組織から、または哺乳類腎臓細胞のインビトロ異種起源培養物から単離される。意外にも、密度勾配による分離の前に低酸素性培養条件下で腎臓細胞の異種起源混合物を培養することにより、B4’を含むB4およびB2および/またはB3画分の両方が増強された分布と細胞組成が得られることが明らかになった。病気、および非疾患腎臓の両方から単離された腎臓細胞で、B2からB4への酸素依存性細胞の富化が認められた。理論に拘泥する意図はないが、これは、1つまたは複数の下記の事象に起因する可能性がある:1低酸素性培養期間の間の特定細胞成分の選択的生存、死亡、または増殖;2低酸素性培養に応答した細胞粒度および/またはサイズの変化と、それによる浮遊密度およびその後の密度勾配分離の間の局在化の変化への影響;および3低酸素性培養期間に応答した細胞遺伝子/タンパク質発現の変化と、それによる所与のいずれかの勾配画分内の細胞の特性差異が生ずる。従って、一実施形態では、尿細管細胞富化細胞集団、例えば、B2は、低酸素耐性である。本発明の細胞集団の分離と単離のための代表的技術には、対象集団に含まれる異なる細胞型の比重の差異に基づいた密度勾配による分離が含まれる。任意の所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度、細胞内の水の容量、および他の因子に影響される可能性がある。一態様では、本発明は、限定されないが、ヒト、イヌ、およびげっ歯類を含む複数の種にわたる本発明細胞調製物、例えば、B2とB4’含有B4の単離のための最適勾配条件を提供する。好ましい実施形態では、密度勾配は、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規尿細管細胞画分富化集団、すなわち、B2細胞集団を得るために使用される。一実施形態では、密度勾配は、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規EPO産生細胞画分富化集団、すなわち、B4細胞集団を得るために使用される。他の実施形態では、密度勾配は、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、および内皮細胞富化亜集団を得るために使用される。一実施形態では、EPO産生および尿細管細胞の両方が、赤血球および細胞壊死組織片から分離される。一実施形態では、EPO産生、糸球体、および血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、同時に他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離される。もう一つの実施形態では、内分泌、糸球体、および/または血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から同時に分離される。本発明の一部では、60非イオン性ヨウ素標識化合物イオジキサノール水溶液を含むOPTIPREP登録商標Axis-Shield密度勾配培地を使って、下記の重要な特定の特性に基づいて、新規細胞集団を産生した。しかし、当業者なら、本発明の細胞集団を分離するための必要な特性を含む、任意の密度勾配または他の手段、例えば、当技術分野で既知の細胞表面マーカーを使った免疫学分離、が本発明に従って使用可能であることが解るであろう。また、当業者なら、密度勾配サイズと粒度による細胞亜集団の分離に寄与する同じ細胞特性が開発され、フローサイトメトリー前方散乱=フローサイトメトリーによるサイズを反映、側方散乱=粒度を反映により細胞亜集団を分離できることも認識すべきである。重要なことは、密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないことである。密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないが、一方で、本発明では、対象の細胞の選択プロセスで、ある種の役割を果たす勾配培地の使用も意図している。理論に拘泥する意図はないが、投入と回収ステップの間でかなりの細胞減少があったので、イオジキサノール含有勾配により回収された本発明の細胞集団は、イオジキサノール抵抗性であるように思われ、勾配の条件下でのイオジキサノールへの暴露により、特定の細胞の排除に至ったことが示唆される。イオジキサノール勾配後の特異的バンドに出現する細胞は、イオジキサノールおよび/または密度勾配露出のいかなる不都合な作用にも抵抗性がある。従って、本発明は、また、本発明の細胞集団の単離および/または選択において、追加の軽度から中等度の腎毒素である造影剤の使用も意図されている。さらに、密度勾配培地は、また、ヒト血漿中のタンパク質と結合しても、また、対象細胞の重要な機能に悪影響を与えてもいけない。別の態様では、本発明は、蛍光活性化セルソーターFACSを使った腎臓細胞型の富化方法および/または枯渇方法を提供する。一実施形態では、腎臓細胞型は、BDFACSAria登録商標または等価物を使って、富化および/または枯渇されてもよい。別の態様では、本発明は、磁気細胞選別を使った腎臓細胞型の富化および/または枯渇方法を提供する。一実施形態では、腎臓細胞型は、MiltenyiautoMACS登録商標システムまたは等価物を使って富化および/または枯渇されてもよい。別の態様では、本発明は、腎臓細胞集団の3次元培養方法を提供する。一態様では、本発明は、連続灌流による細胞集団培養方法を提供する。一実施形態では、3次元培養および連続灌流により培養された細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高い細胞充実性およびインターコネクティビティを示す。別の実施形態では、3次元培養および連続および連続灌流により培養した細胞集団は、このような細胞集団の静的培養に比べて、より多いEPO発現、ならびに尿細管関連遺伝子、例えば、e-カドヘリンの発現増加を示す。さらに別の実施形態では、連続灌流により培養した細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高いレベルのブドウ糖およびグルタミンの消費を示す。本明細書記載実施例3を含むのように、本発明の細胞集団を調製する方法で、低または低酸素性の酸素条件を使うことができる。しかし、本発明の方法は、低酸素条件付けのステップなしで使用可能である。一実施形態では、正常酸素圧条件を使ってもよい。当業者なら、本明細書記載の細胞に対し、当技術分野で既知の他の単離と培養方法を使用できることを理解するであろう。生体材料ポリマーマトリックスまたは足場Bertrametal.の特許公開第20070276507号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるに記載のように、ポリマーマトリックスまたは足場は、任意の数の所望形状に成形して、任意の数の全体系、幾何学的配置または空間の制約を満たすことができる。一実施形態では、本発明のマトリックスまたは足場は、3次元であってもよく、また、成形されて、器官または組織構造の寸法と形状に適合されてもよい。例えば、腎疾患、貧血、EPO欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下の処置のためのポリマー足場の使用で、3次元3-Dマトリックスを使用できる。種々の別々に成形された3-D足場を使用可能である。当然、ポリマーマトリックスは、異なるサイズと形状に成形して別々のサイズの患者に適合させることができる。ポリマーマトリックスは、また、別の方法で成型して、特殊ニーズの患者に適合させることができる。別の実施形態では、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性、多孔性ポリマー足場であってもよい。足場は、限定されないが、次記を含む種々の合性または天然材料から形成してもよい:連続気泡ポリ乳酸OPLA登録商標、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ化ポリエチレン、フェノール、ポリ-4-メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミデイミド、ポリアクリラート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカルボナート、ポリシアノアリールエテル、ポリエステル、ポリエステルカルボナート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリフッ化ビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素-ホルムアルデヒド、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギナート、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらの共重合体もしくは物理的混合物。足場形状は、ソフト多孔性足場としての液体ヒドロゲル懸濁液から剛直、形状保持多孔性足場までの範囲が可能である。ヒドロゲルは、種々のポリマー材料から形成でき、種々の生物医学的用途に有用である。ヒドロゲルは、親水性高分子の3次元ネットワークとして物理的に記述できる。ヒドロゲルのタイプに応じて、それらは、可変割合の水を含むが、水には全く溶解しない。高い水含量にも関わらず、ヒドロゲルは、親水性の残基の存在により、大容量の液体とさらなる結合が可能である。ヒドロゲルは、ゼラチン状の構造を変えることなく、大幅に膨潤する。ヒドロゲルの基本的物理特性は、使用されたポリマーおよび製品の特殊付加部分の特性に従って、特異的に改変できる。好ましくは、ヒドロゲルは、ポリマー、生物由来材料、合成物由良材料またはそれらの組み合わせ、すなわち、生物学的に不活性で、生理学的に哺乳類組織と適合する材料で作られる。ヒドロゲル材料は、炎症反応を誘発しないのが好ましい。ヒドロゲルの形成に使われる他の材料の例には、a修飾アルギン酸塩、b一価カチオンに暴露するとゲル化する多糖類例えば、ジェランガムおよびカラゲナン、c非常に粘稠な液体で、チクソトロピックであり、構造の緩慢進化により時間をかけてゲルを形成する多糖類例えば、ヒアルロン酸、およびdポリマーヒドロゲル前駆物質例えば、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロック共重合体およびタンパク質、が含まれる。米国特許第6,224,893B1号は、本発明に従ったヒドロゲルの作成に適した種々のポリマー、およびこのようなポリマーの化学特性の詳細説明を提供している。足場または生体材料特性は、細胞を付着させ、足場または生体材料と相互作用させることができ、および/またはその中に細胞が捕捉されうる多孔性空隙を提供できる。一実施形態では、本発明の多孔性足場または生体材料は、多孔性足場として構成されている生体材料の上に例えば、細胞の付着により、および/または足場の気孔の中に例えば、細胞の捕捉により、1つまたは複数の細胞集団または混合物の付加または析出を可能とする。別の実施形態では、足場または生体材料は、足場内での細胞:細胞および/または細胞:生体材料の相互作用を可能とするか、または促進して、本明細書記載の構築物を形成する。一実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ヒドロゲル型のヒアルロン酸HAからなり、5.1kDAから2x106kDa超までの大きさの範囲のHA分子を含む。別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、多孔質発泡体型のヒアルロン酸からなり、また、5.1kDAから2x106kDa超の大きさの範囲のHA分子を含む。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ポリ乳酸PLAベース発泡体からなり、約50ミクロン~約300ミクロンの孔径の連続気泡構造を有する。さらに別の実施形態では、好ましくはB2であるがB4でもよい特異的細胞集団は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸シンターゼ-2HAS-2により高分子量ヒアルロン酸を直接的に合成する、および/または合成を刺激する。当業者なら、当技術分野で既知の他の型の合成または天然材料が、本明細書記載の足場を形成するために使用可能であることを理解するであろう。一態様では、本発明は、上で言及の足場または生体材料から作られる本明細書に記載の構築物を提供する。構築物一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の処置のための1つまたは複数の本明細書記載の細胞集団を有する移植可能な構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、1つまたは複数の合性または天然生体適合性材料からなる生体適合性材料または生体材料、足場またはマトリックス、および付着および/または捕捉により足場の表面上に析出したまたは内部に包埋された1つまたは複数の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られている。特定の実施形態では、構築物は、生体材料、および生体材料成分でコートされた、その上に析出させた、その中に析出させた、それに付着させた、その中に捕捉された、その中に包埋された、またはそれと組み合わされた、1つまたは複数の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られている。富化細胞集団またはそれらの混合物を含むいずれかの本明細書記載の細胞集団は、マトリックスと組み合わせて使用して、構築物を形成することができる。別の実施形態では、析出細胞集団または構築物の細胞成分は、酸素で調節可能なEPO産生細胞を富化した第1腎臓細胞集団である。別の実施形態では、第1腎臓細胞集団は、酸素で調節可能なEPO産生細胞に加えて、糸球体および血管細胞を含む。一実施形態では、第1腎臓細胞集団は、B4’細胞集団である。もう一つの実施形態では、析出細胞集団または構築物の細胞成分は、第1富化腎臓細胞集団および第2腎臓細胞集団の両方を含む。一部の実施形態では、第2細胞集団は、酸素で調節可能なEPO産生細胞が富化されていない。別の実施形態では、第2細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化されている。別の実施形態では、第2細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化され、集合管上皮細胞を含む。他の実施形態では、腎臓尿細管細胞は、1つまたは複数の尿細管細胞マーカーの発現を特徴とし、限定されないが、マーカーには下記を含んでもよい:メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ2HAS2、ビタミンD325-ヒドロキシラーゼCYP2D25、N-カドヘリンNcad、E-カドヘリンEcad、アクアポリン-1Aqp1、アクアポリン-2Aqp2、RAB17、memberRAS癌遺伝子ファミリーRab17、GATA結合タンパク質3Gata3、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4Fxyd4、溶質キャリアファミリー9ナトリウム/水素交換体、member4Slc9a4、アルデヒド脱水素酵素3ファミリー、memberB1Aldh3b1、アルデヒド脱水素酵素1ファミリー、memberA3Aldh1a3、およびカルパイン-8Capn8。一実施形態では、本発明の構築物を形成するために生体材料または足場上に析出した、またはそれと組み合わされた細胞集団は、種々のソース、例えば、自己ソース由来である。また、非自己ソースも、限定されないが、同種異系、または同種同系自家遺伝子系または同遺伝子系ソース、等が使用に適する。当業者なら、細胞集団を析出させて、あるいは生体材料と組み合わせて構築物を形成するいくつかの適切な方法があることを理解するであろう。一態様では、本発明の構築物は、本明細書記載の使用方法で使用するために適切である。一実施形態では、構築物は、全ての原因による腎疾患、貧血、または全ての原因によるEPO欠乏の治療を必要としている対象に対する投与に適している。他の実施形態では、構築物は、赤血球恒常性の改善または回復を必要としている対象への投与に適している。別の実施形態では、構築物は、腎臓機能の改善を必要としている対象への投与に適している。さらに別の態様では、本発明は、腎臓機能改善を必要としている対象への移植のための構築物を提供し、この構築物は、a1つまたは複数の生体適合性合成高分子または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料;およびb腎疾患を有する対象由来の哺乳類腎臓細胞の混合物で、1.045g/mL~1.052g/mLの密度の単離された、尿細管細胞富化集団を含む第1細胞集団、B2、および、エリスロポエチンEPO産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している1.063g/mL~1.091g/mLの密度の第2細胞集団、B4’を含み、これら細胞集団は、生体材料成分でコートされ、その上もしくはその中に析出し、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および/または別の方法でそれと組み合わされている。特定の実施形態では、混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。一実施形態では、構築物は、血管マーカーの発現を特徴とするB4’細胞集団を含む。一部の実施形態では、B4’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現を可能とする。全ての実施形態で、混合物は、哺乳類腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。一実施形態では、構築物は、混合物の捕捉および/または付着に適切な3次元3-D多孔性生体材料として構成されている生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、哺乳動物細胞の包埋、付着、懸濁、またはコーティングに適した液体または半液体ゲルとして構成されている生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、主にヒドロゲル型のヒアルロン酸HA高分子量種からなるように構成されている生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、主に多孔性発泡体型のヒアルロン酸高分子量種からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、約50ミクロン~約300ミクロンの気孔を有するポリ乳酸ベース発泡体からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、改善された腎臓機能を必要としている対象に対し自己である腎臓検体由来であってもよい1つまたは複数の細胞集団を含む。特定の実施形態では、検体は、腎生検である。一部の実施形態では、対象は、腎疾患を有する。さらに他の実施形態では、細胞集団は、非自己腎臓検体由来である。一実施形態では、構築物は、赤血球恒常性を提供する。分泌産物もう一つの態様では、本発明は、本明細書記載の富化腎臓細胞集団または富化腎臓細胞集団の混合物からの分泌産物に関する。一実施形態では、産物は、1つまたは複数の下記を含む:パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、および小胞。小胞は、1つまたは複数の次の物を含んでもよい:パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、微小胞、エキソソーム、およびRNA。分泌産物は、また、微小胞内にない産物を含んでもよく、限定されないが、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびRNAが含まれる。例えば、細胞外のmiRNAは、小胞外から検出されているWangetal.、NucAcidsRes2010、1-12doi:10.1093/nar/gkq601、July7、2010。分泌産物は、また、細胞由来産物、例えば、細胞由来小胞、と呼ばれる。もう一つの実施形態では、分泌産物は腎臓細胞由来の小胞の一部であってもよい。小胞は、因子を他の目的地へ送達できる。一実施形態では、小胞は、分泌小胞である。いくつかの型の分泌小胞が意図され、これらには、限定されないが、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エキソソーム様小胞、およびアポトーシス性小胞が含まれるTheryetal.2010.Nat.Rev.Immunol.9:581-593。一実施形態では、分泌小胞は、エキソソームである。もう一つの実施形態では、分泌小胞は、微小胞である。もう一つの実施形態では、分泌小胞は、1つまたは複数の細胞成分を含むか、またはそられからなる。成分は、1つまたは複数の以下の物であってもよい:膜脂質、RNA、タンパク質、代謝産物、細胞質成分、およびこれらの任意の組み合わせ。好ましい実施形態では、分泌小胞は、マイクロRNAを含むか、それから構成されるか、または基本的にそれから構成される。好ましくは、miRNAは、ヒトmiRNAである。一実施形態では、1つまたは複数のmiRNAが、miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124、およびmiR-151からなる群より選択される。もう一つの実施形態では、1つまたは複数のmiRNAが、下記からなる群より選択できる:let-7a-1;let-7a-2;let-7a-3;let-7b;let-7c;let-7d;let-7e;let-7f-1;let-7f-2;let-7g;let-7i;mir-1-1;mir-1-2;mir-7-1;mir-7-2;mir-7-3;mir-9-1;mir-9-2;mir-9-3;mir-10a;mir-10b;mir-15a;mir-15b;mir-16-1;mir-16-2;mir-17;mir-18a;mir-18b;mir-19a;mir-19b-1;mir-19b-2;mir-20a;mir-20b;mir-21;mir-22;mir-23a;mir-23b;mir-23c;mir-24-1;mir-24-2;mir-25;mir-26a-1;mir-26a-2;mir-26b;mir-27a;mir-27b;mir-28;mir-29a;mir-29b-1;mir-29b-2;mir-29c;mir-30a;mir-30b;mir-30c-1;mir-30c-2;mir-30d;mir-30e;mir-31;mir-32;mir-33a;mir-33b;mir-34a;mir-34b;mir-34c;mir-92a-1;mir-92a-2;mir-92b;mir-93;mir-95;mir-96;mir-98;mir-99amir-99b;mir-100;mir-101-1;mir-101-2;mir-103-1;mir-103-1-as;mir-103-2;mir-103-2-as;mir-105-1;mir-105-2;mir-106a;mir-106b;mir-107;mir-122;mir-124-1;mir-124-2;mir-124-3;mir-125a;mir-125b-1;mir-125b-2;mir-126;mir-127;mir-128-1;mir-128-2;mir-129-1;mir-129-2;mir-130a;mir-130b;mir-132;mir-132;mir-133a-1;mir-133a-2;mir-133b;mir-134;mir-135a-1;mir-135a-2;mir-135b;mir-136MI101351120;mir-137;mir-138-1;mir-138-2;mir-139;mir-140;mir-141;mir-142;mir-143;mir-144;mir-145;mir-146a;mir-146b;mir-147;mir-147b;mir-148a;mir-148b;mir-149;mir-150;mir-151;mir-152;mir-153-1;mir-153-2;mir-154;mir-155;mir-181a-1;mir-181a-2;mir-181b-1;mir-181b-2;mir-181c;mir-181d;mir-182;mir-183;mir-184;mir-185;mir-186;mir-187;mir-188;mir-190;mir-190b;mir-191;mir-192;mir-193a;mir-193b;mir-194-1;mir-194-2;mir-195;mir-196a-1;mir-196a-2;mir-196b;mir-197;mir-198;mir-199a-1;mir-199a-2;mir-199b;mir-200a;mir-200b;mir-200c;mir-202;mir-203;mir-204;mir-205;mir-206;mir-208a;mir-208b;mir-210;mir-211;mir-212;mir-214;mir-215;mir-216a;mir-216b;mir-217;mir-218-1;mir-218-2;mir-219-1;mir-219-2;mir-221;mir-222;mir-223;mir-224;mir-296;mir-297;mir-298;mir-299;mir-300;mir-301a;mir-301b;mir-302a;mir-302b;mir-302c;mir-302d;mir-302e;mir-302f;mir-320a;mir-320b-1;mir-320b-2;mir-320c-1;mir-320c-2;mir-320d-1;mir-320d-2;mir-320e;mir-323;mir-323b;mir-324;mir-325;mir-326;mir-328;mir-329-1;mir-329-2;mir-330;mir-331;mir-335;mir-337;mir-338;mir-339;mir-340;mir-342;mir-345;mir-346;mir-361;mir-362;mir-363;mir-365-1;mir-365-2;mir-367;mir-369;mir-370;mir-37;mir-372;mir-373;mir-374a;mir-374b;mir-374c;mir-375;mir-376a-1;mir-376a-2;mir-376b;mir-376c;mir-377;mir-378;mir-378b;mir-378c;mir-379;mir-380;mir-381;mir-382;mir-383;mir-384;mir-409;mir-410;mir-411;mir-412;mir-421;mir-422a;mir-423;mir-424;mir-425;mir-429;mir-431;mir-432;mir-433;mir-448;mir-449a;mir-449b;mir-449c;mir-450a-1;mir-450a-2;mir-450b;mir-451;mir-452;mir-454;mir-455;mir-466;mir-483;mir-484;mir-485;mir-486;mir-487a;mir-487b;mir-488;mir-489;mir-490;mir-491;mir-492;mir-493;mir-494;mir-495;mir-496;mir-497;mir-498;mir-499;mir-500a;mir-500b;mir-501;mir-502;mir-503;mir-504;mir-505;mir-506;mir-507;mir-508;mir-509-1;mir-509-2;mir-509-3;mir-510;mir-511-1;mir-511-2;mir-512-1;mir-512-2;mir-513a-1;mir-513a-2;mir-513b;mir-513c;mir-514-1;mir-514-2;mir-514-3;mir-514b;mir-515-1;mir-515-2;mir-516a-1;mir-516a-2;mir-516b-1;mir-516b-2;mir-517a;mir-517b;mir-517c;mir-518a-1;mir-518a-2;mir-518b;mir-518c;mir-518d;mir-518e;mir-518f;mir-519a-1;mir-519a-2;mir-519b;mir-519c;mir-519d;mir-519e;mir-520a;mir-520b;mir-520c;mir-520d;mir-520e;mir-520f;mir-520g;mir-520h;mir-521-1;mir-521-2;mir-522;mir-523;mir-524;mir-525;mir-526a-1;mir-526a-2;mir-526b;mir-527;mir-532;mir-539;mir-541;mir-542;mir-543;mir-544;mir-544b;mir-545;mir-548a-1;mir-548a-2;mir-548a-3;mir-548aa-1;mir-548aa-2;mir-548b;mir-548c;mir-548d-1;mir-548d-2;mir-548e;mir-548f-1;mir-548f-2;mir-548f-3;mir-548f-4;mir-548f-5;mir-548g;mir-548h-1;mir-548h-2;mir-548h-3;mir-548h-4;mir-548i-1;mir-548i-2;mir-548i-3;mir-548i-4;mir-548j;mir-548k;mir-548l;mir-548m;mir-548n;mir-548o;mir-548p;mir-548s;mir-548t;mir-548u;mir-548v;mir-548w;mir-548x;mir-548y;mir-548z;mir-549;mir-550a-1;mir-550a-2;mir-550b-1;mir-550b-2;mir-551a;mir-551b;mir-552;mir-553;mir-554;mir-555;mir-556;mir-557;mir-558;mir-559;mir-561;mir-562;mir-563;mir-564;mir-566;mir-567;mir-568;mir-569;mir-570;mir-571;mir-572;mir-573;mir-574;mir-575;mir-576;mir-577;mir-578;mir-579;mir-580;mir-581;mir-582;mir-583;mir-584;mir-585;mir-586;mir-587;mir-588;mir-589;mir-590;mir-591;mir-592;mir-593;mir-595;mir-596;mir-597;mir-598;mir-599;mir-600;mir-601;mir-602;mir-603;mir-604;mir-605;mir-606;mir-607;mir-608;mir-609;mir-610;mir-611;mir-612;mir-613;mir-614;mir-615;mir-616;mir-617;mir-618;mir-619;mir-620;mir-621;mir-622;mir-623;mir-624;mir-625;mir-626;mir-627;mir-628;mir-629;mir-630;mir-631;mir-632;mir-633;mir-634;mir-635;mir-636;mir-637;mir-638;mir-639;mir-640;mir-641;mir-642a;mir-642b;mir-643;mir-644;mir-645;mir-646;mir-647;mir-648;mir-649;mir-650;mir-651;mir-652;mir-653;mir-654;mir-655;mir-656;mir-657;mir-658;mir-659;mir-660;mir-661;mir-662;mir-663;mir-663b;mir-664;mir-665;mir-668;mir-670;mir-671;mir-675;mir-676;mir-708;mir-711;mir-718;mir-720;mir-744;mir-758;mir-759;mir-760;mir-761;mir-762;mir-764;mir-765;mir-766;mir-767;mir-769;mir-770;mir-802;mir-873;mir-874;mir-875;mir-876;mir-877;mir-885;mir-887;mir-888;mir-889;mir-890;mir-891a;mir-891b;mir-892a;mir-892b;mir-920;mir-921;mir-922;mir-924;mir-933;mir-934;mir-935;mir-936;mir-937;mir-938;mir-939;mir-940;mir-941-1;mir-941-2;mir-941-3;mir-941-4;mir-942;mir-942;mir-943;mir-944;mir-1178;mir-1179;mir-1180;mir-1181;mir-1182;mir-1183;mir-1184-1;mir-1184-2;mir-1184-3;mir-1185-1;mir-1185-2;mir-1193;mir-1197;mir-1200;mir-1202;mir-1203;mir-1204;mir-1205;mir-1206;mir-1207;mir-1208;mir-1224;mir-1225;mir-1226;mir-1227;mir-1228;mir-1229;mir-1231;mir-1233-1;mir-1233-2;mir-1234;mir-1236;mir-1237;mir-1238;mir-1243;mir-1244-1;mir-1244-2;mir-1244-3;mir-1245;mir-1246;mir-1247;mir-1248;mir-1249;mir-1250;mir-1251;mir-1252;mir-1253;mir-1254;mir-1255a;mir-1255b-1;mir-1255b-2;mir-1256;mir-1257;mir-1258;mir-1260;mir-1260b;mir-1261;mir-1262;mir-1263;mir-1264;mir-1265;mir-1266;mir-1267;mir-1268;mir-1269;mir-1270-1;mir-1270-2;mir-1271;mir-1272;mir-1273;mir-1273c;mir-1273d;mir-1273e;mir-1274a;mir-1274b;mir-1275;mir-1276;mir-1277;mir-1278;mir-1279;mir-1280;mir-1281;mir-1282;mir-1283-1;mir-1283-2;mir-1284;mir-1285-1;mir-1285-2;mir-1286;mir-1287;mir-1288;mir-1289-1;mir-1289-2;mir-1290;mir-1291;mir-1292;mir-1293;mir-1294;mir-1295;mir-1296;mir-1297;mir-1298;mir-1299;mir-1301;mir-1302-1;mir-1302-10;mir-1302-11;mir-1302-2;mir-1302-3;mir-1302-4;mir-1302-5;mir-1302-6;mir-1302-7;mir-1302-8;mir-1302-9;mir-1303;mir-1304;mir-1305;mir-1306;mir-1307;mir-1321;mir-1322;mir-1323;mir-1324;mir-1468;mir-1469;mir-1470;mir-1471;mir-1537;mir-1538;mir-1539;mir-1825;mir-1827;mir-1908;mir-1909;mir-1910;mir-1911;mir-1912;mir-1913;mir-1914;mir-1915;mir-1972-1;mir-1972-2;mir-1973;mir-1976;mir-2052;mir-2053;mir-2054;mir-2110;mir-2113;mir-2114;mir-2115;mir-2116;mir-2117;mir-2276;mir-2277;mir-2278;mir-2355;mir-2861;mir-2909;mir-3065;mir-3074;mir-3115;mir-3116-1;mir-3116-2;mir-3117;mir-3118-1;mir-3118-2;mir-3118-3;mir-3118-4;mir-3118-5;mir-3118-6;mir-3119-1;mir-3119-2;mir-3120;mir-3121;mir-3122;mir-3123;mir-3124;mir-3125;mir-3126;mir-3127;mir-3128;mir-3129;mir-3130-1;mir-3130-2;mir-3131;mir-3132;mir-3133;mir-3134;mir-3135;mir-3136;mir-3137;mir-3138;mir-3139;mir-3140;mir-3141;mir-3142;mir-3143;mir-3144;mir-3145;mir-3146;mir-3147;mir-3148;mir-3149;mir-3150;mir-3151;mir-3152;mir-3153;mir-3154;mir-3155;mir-3156-1;mir-3156-2;mir-3156-3;mir-3157;mir-3158-1;mir-3158-2;mir-3159;mir-3160-1;mir-3160-2;mir-3161;mir-3162;mir-3163;mir-3164;mir-3165;mir-3166;mir-3167;mir-3168;mir-3169;mir-3170;mir-3171;mir-3173;mir-3174;mir-3175;mir-3176;mir-3177;mir-3178;mir-3179-1;mir-3179-2;mir-3179-3;mir-3180-1;mir-3180-2;mir-3180-3;mir-3180-4;mir-3180-5;mir-3181;mir-3182;mir-3183;mir-3184;mir-3185;mir-3186;mir-3187;mir-3188;mir-3189;mir-3190;mir-3191;mir-3192;mir-3193;mir-3194;mir-3195;mir-3196;mir-3197;mir-3198;mir-3199-1;mir-3199-2;mir-3200;mir-3201;mir-3202-1;mir-3202-2;mir-3605;mir-3606;mir-3607;mir-3609;mir-3610;mir-3611;mir-3612;mir-3613;mir-3614;mir-3615;mir-3616;mir-3617;mir-3618;mir-3619;mir-3620;mir-3621;mir-3622a;mir-3622b;mir-3646;mir-3647;mir-3648;mir-3649;mir-3650;mir-3651;mir-3652;mir-3653;mir-3654;mir-3655;mir-3656mir-3657;mir-3658;mir-3659;mir-3660;mir-3661;mir-3662;mir-3663;mir-3664;mir-3665;mir-3666;mir-3667;mir-3668;mir-3669;mir-3670;mir-3670;mir-3671;mir-3671;mir-3673;mir-3673;mir-3675;mir-3675;mir-3676;mir-3663;mir-3677;mir-3678;mir-3679;mir-3680;mir-3681;mir-3682;mir-3683;mir-3684;mir-3685;mir-3686;mir-3687;mir-3688;mir-3689a;mir-3689b;mir-3690;mir-3691;mir-3692;mir-3713;mir-3714;mir-3907;mir-3908;mir-3909;mir-3910-1;mir-3910-2;mir-3911;mir-3912;mir-3913-1;mir-3913-2;mir-3914-1;mir-3914-2;mir-3915;mir-3916;mir-3917;mir-3918;mir-3919;mir-3920;mir-3921;mir-3922;mir-3923;mir-3924;mir-3925;mir-3926-1;mir-3926-2;mir-3927;mir-3928;mir-3929;mir-3934;mir-3935;mir-3936;mir-3937;mir-3938;mir-3939;mir-3940;mir-3941;mir-3942;mir-3943;mir-3944;mir-3945;mir-4251;mir-4252;mir-4253;mir-4254;mir-4255;mir-4256;mir-4257;mir-4258;mir-4259;mir-4260;mir-4261;mir-4262;mir-4263;mir-4264;mir-4265;mir-4266;mir-4267;mir-4268;mir-4269;mir-4270;mir-4271;mir-4272;mir-4273;mir-4274;mir-4275;mir-4276;mir-4277;mir-4278;mir-4279;mir-4280;mir-4281;mir-4282;mir-4283-1;mir-4283-2;mir-4284;mir-4285;mir-4286;mir-4287;mir-4288;mir-4289;mir-4290;mir-4291;mir-4292;mir-4293;mir-4294;mir-4295;mir-4296;mir-4297;mir-4298;mir-4299;mir-4300;mir-4301;mir-4302;mir-4303;mir-4304;mir-4305;mir-4306;mir-4307;mir-4308;mir-4309;mir-4310;mir-4311;mir-4312;mir-4313;mir-4314;mir-4315-1;mir-4315-2;mir-4316;mir-4317;mir-4318;mir-4319;mir-4320;mir-4321;mir-4322;mir-4323;mir-4324;mir-4325;mir-4326;mir-4327;mir-4328;mir-4329;mir-4329;およびmir-4330。本発明は、本明細書記載の細胞集団または構築物から得られる細胞由来または分泌miRNAに関する。一実施形態では、1つまたは複数の個別miRNAを使って、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与えることができる。個別miRNAの組み合わせは、このような効果を与えるのに適切である可能性がある。代表的組み合わせには、2つ以上の次記のものが含まれる:miR-21;miR-23a;miR-30c;miR-1224;miR-23b;miR-92a;miR-100;miR-125b-5p;miR-195;miR-10a-5p;およびこれらの任意の組み合わせ。別の代表的組み合わせには、2つ以上の次記のものが含まれる:miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124、miR-151、および来られの任意の組み合わせ。一実施形態では、miRNAの組み合わせには、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ超の個別miRNAを含んでもよい。当業者なら、他のmiRNAおよびmirRNAの組み合わせが、本発明での使用に適する可能性があることを理解するであろう。追加のmiRNAのソースには、http://mirbase.orgのmiRBaseが含まれ、これは、英国マンチェスター大学生命工学部FacultyofLifeSciencesで運営、維持されている。一実施形態では、分泌産物は、パラクリン因子を含む。一般的に、パラクリン因子は、短い距離を拡散し、隣接細胞の変化、すなわち、パラクリン相互作用、を誘導するか、または起こさせることができる細胞により合成された分子である。拡散可能分子は、パラクリン因子と呼ばれる。さらに別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数の単離された本明細書記載の腎臓細胞由来分泌小胞組成物に関する。当業者なら、分泌小胞を含む種々の型の組成物が適することを理解できるであろう。別の態様では、本発明は、腎臓細胞分泌産物、例えば、小胞を調製する方法を提供する。一実施形態では、方法は、1つまたは複数の富化腎臓細胞集団の混合物を含む腎臓細胞集団を用意するステップを含む。別の実施形態では、方法は、適切な条件下でその集団を培養するステップをさらに含む。その条件は、低酸素条件であってもよい。別の実施形態では、方法は、腎臓細胞集団から分泌産物を分離するステップをさらに含む。分泌小胞は、細胞集団の細胞培地から採取してもよい。もう一つの実施形態では、腎臓細胞は、酸素レベルに対する生物学的応答である小胞産生および/または分泌を特徴とし、その結果、培養系の酸素圧力の低下が小胞産生および/または分泌の誘導に繋がる。一実施形態では、通常の大気~21レベルの利用可能酸素で培養した細胞集団に比べて、培養系の利用可能酸素レベルの低下した環境に曝される条件下で細胞集団が培養される場合に、小胞産生および/または分泌が誘導される。一実施形態では、より低酸素条件下で培養した細胞集団は、通常の酸素条件下で培養した細胞集団に比べて、より高いレベルの小胞を産生および/または分泌する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素下低酸素性培養条件とも呼ばれるでの細胞の培養は、低い酸素レベルが、通常の大気レベルの利用可能酸素正常または正常酸素圧培養条件とも呼ばれる下での細胞培養に比べて、減らされていることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件には、約1酸素未満、約2酸素未満、約3酸素未満、約4酸素未満、または約5酸素未満での細胞の培養が含まれる。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件には、約10酸素、約12酸素、約13酸素、約14酸素、約15酸素、約16酸素、約17酸素、約18酸素、約19酸素、約20酸素、または約21酸素での細胞の培養が含まれる。好ましい実施形態では、方法は、腎臓細胞からエキソソームおよび/または微小胞の単離を提供する。一実施形態では、産物は、腎臓細胞から分泌される。産物は、足場上にない、例えば、細胞が本明細書記載の構築物の一部ではない、腎臓細胞から分泌されてもよい。別の実施形態では、産物は、足場上、例えば、構築物上に播種されている腎臓細胞により分泌される。構築物には、足場上またはその中に直接播種されている1つまたは複数の富化腎臓細胞集団またはそれらの混合物が含まれる。別の態様では、本発明は、1つまたは複数の富化腎臓細胞集団、および該集団を含む混合物または構築物のバイオセラピューティック効力を選別/最適化/モニタリングするためのインビトロの方法を提供する。一実施形態では、方法には、1つまたは複数の試験集団、試験混合物または試験構築物被検物質を用意するステップが含まれる。別の実施形態では方法には、本明細書記載の適切な条件下で被検物質を培養するステップが含まれる。もう一つの実施形態では、方法には、培養した被検物質から細胞培地を集めるステップが含まれる。この培地は、馴化培地と呼ぶことができ、被検物質の腎臓細胞により分泌された産物を含むことが予期される。もう一つの態様では、馴化培地を使って、1つまたは複数のインビトロアッセイを行いい、被検物質のバイオセラピューティック効力を試験することもできる。一実施形態では、馴化培地は、上皮間葉転換EMTアッセイに供される。アッセイは、TGFβ1により誘導されたEMTを試験できる。実施例15は、このアッセイ用の代表的プロトコルを提供する。別の実施形態では、馴化培地は、例えば、PCRベースアッセイによるRNAの検出、および/または例えば、FACSによる小胞またはエキソソームの検出に供される。もう一つの実施形態では、馴化培地は、シグナル伝達経路アッセイ、例えば、免疫応答例えば、NFκB、線維化反応PAI-1、および血管新生アッセイに供される。実施例12~14は、これらのアッセイ用の代表的プロトコルを提供する。使用方法一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはEPO欠乏を本明細書記載の腎臓細胞集団および腎臓細胞の混合物により処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、EPO産生細胞富化第1腎臓細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、第1細胞集団は、EPO産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が富化されている。一実施形態では、第1腎臓細胞集団は、B4’細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、1つまたは複数の追加の腎臓細胞集団をさらに含んでもよい。一実施形態では、追加の細胞集団は、EPO産生細胞が富化されていない第2細胞集団である。別の実施形態では、追加の細胞集団は、EPO産生細胞、糸球体細胞、または血管細胞が富化されていない第2細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、また、本明細書記載の疾患または障害の処置のために、生体材料中に析出して、その上に析出して、その中に包埋されて、それによりコートされて、またはその中に捕捉されて本明細書記載の移植可能な構築物を形成する腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む。一実施形態では、細胞集団は、単独または他の細胞または生体材料、例えば、ヒドロゲル、多孔性足場、またはネイティブもしくは合成ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて使用し、急性または慢性疾患状態の再生を刺激する。別の態様では、本発明の方法による対象の腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の効果的処置は、赤血球生成および/または腎臓機能の種々の指標により観察可能である。一実施形態では、赤血球恒常性の指標には、限定されないが、ヘマトクリットHCT、ヘモグロビンHB、平均赤血球血色素量MCH、赤血球数RBC、網状赤血球数、網状赤血球、平均赤血球容積MCV、および赤血球分布幅RDWが含まれる。もう一つの実施形態では、腎臓機能の指標には、限定されないが、血清アルブミン、グロブリン対アルブミン比率A/G比率、血清亜リン酸、血清ナトリウム、腎臓の大きさ超音波で測定、血清カルシウム、亜リン酸:カルシウム比率、血清カリウム、蛋白尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血中窒素尿素BUN、コレステロールレベル、トリグリセリドレベルおよび糸球体濾過率GFRが含まれる。さらに、総体的な健康および幸福のいくつかの指標には、限定されないが、体重増または減少、生存時間、血圧平均体血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧、および持久力、が含まれる。別の実施形態では、有効な処置は、1つまたは複数の腎臓機能指標の安定化により立証される。腎臓機能の安定化は、本発明の方法により処置されていない対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証される。あるいは、腎臓機能の安定化は、処置前の同じ対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証できる。第1指標の変化は、値の増加でも減少でもよい。一実施形態では、本発明により提供される処置は、対象の血中尿素窒素BUNレベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察BUNレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。もう一つの実施形態では、処置は、血清クレアチニンレベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察血清クレアチニンレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。別の実施形態では、処置は、対象のヘマトクリットHCTレベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察HCTレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。別の実施形態では、処置は、対象の赤血球RBCレベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察RBCレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。当業者には、1つまたは複数の本明細書記載のまたは当技術分野で既知の追加の指標で測定して対象の腎疾患の効果的な処置を判定できることは理解されよう。別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の赤血球恒常性を提供する方法に関する。一実施形態では、方法は、a対象に腎臓細胞集団、例えば、本明細書記載のB2もしくはB4’、または腎臓細胞混合物、例えば、B2/B4’および/またはB2/B3、を投与するステップ;およびb対象由来の生物試料において、対照の指標レベルに比べて、赤血球生成指標のレベルが異なり、指標レベルの差異がi対象がaの投与ステップに反応していることを示すか、またはii対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、a対象に本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む組成物を投与するステップ;およびb対象由来の生物試料において、対照の指標レベルに比べ赤血球生成指標が異なり、指標レベルの差異が、i対象がaの投与ステップに反応していることを示すか、またはii対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、a生体材料または生体適合性高分子足場を用意するステップ;b生体材料または足場の上または中に本発明の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を本明細書記載の方法で析出させ、移植可能な構築物を形成するステップ;c構築物を対象に移植するステップ;およびd対象由来の生物試料で、赤血球生成指標のレベルが対照の指標レベルに比較して異なり、指標レベルの差異がi対象がaの投与ステップに反応していることを示すか、またはii対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の態様では、本発明は、腎臓機能の安定化および赤血球恒常性の回復の両方を必要としている対象に提供する方法であって、前記対象が腎臓機能不足および貧血および/またはEPO欠乏の両方を有している場合の方法に関する。一実施形態では、方法は、少なくとも1つの下記の細胞型を含む本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を投与するステップを含む:尿細管由来細胞、糸球体由来細胞、間質由来細胞、集合管由来細胞、間質組織由来細胞、または脈管構造由来細胞。別の実施形態では、集団または混合物は、EPO産生細胞および尿細管上皮細胞の両方を含み、尿細管細胞は、少なくとも1つの下記のマーカーにより特定される:メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ2HAS2、ビタミンD325-ヒドロキシラーゼCYP2D25、N-カドヘリンNcad、E-カドヘリンEcad、アクアポリン-1Aqp1、アクアポリン-2Aqp2、RAB17、memberRAS癌遺伝子ファミリーRab17、GATA結合タンパク質3Gata3、FXYDドメイン含有イオン輸送制御因子4Fxyd4、溶質キャリアファミリー9ナトリウム/水素交換体、member4Slc9a4、アルデヒド脱水素酵素3ファミリー、memberB1Aldh3b1、アルデヒド脱水素酵素1ファミリー、memberA3Aldh1a3、およびカルパイン-8Capn8。この実施形態では、対象の処置は、未処置対象または対象の処置前指標と比較して、少なくとも1つの赤血球生成指標の改善と同時に、少なくとも1つの腎臓機能の指標の改善により立証されるであろう。一態様では、本発明は、本明細書記載のEPO産生細胞富化腎臓細胞集団またはEPO産生細胞富化細胞集団を含む腎臓細胞の混合物を投与することによりi腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の処置;ii腎臓機能の安定化、iii赤血球恒常性の回復、またはivこれらのいずれかの組み合わせの方法を提供し、投与の薬効は、EPO産生細胞が富化されていない細胞集団の投与の効果よりも大きい。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清血中尿素窒素BUNレベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清中のタンパク質の保持を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清コレステロールおよび/またはトリグリセリドのレベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、ビタミンDのレベルを改善する。一実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、リン:カルシウム比率を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、血清クレアチニンのレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘマトクリットのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球数RBCのレベルを改善する。一実施形態では、改善レベルのヘマトクリットは、95正常な健康レベルに回復している。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球数を改善する。他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球割合を改善する。さらに他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球容量分布幅RDWレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、骨髄での赤血球造血反応を提供し、それにより、骨髄細胞充実性は正常に近くなり、骨髄:赤血球比率はほぼ正常になる。別の態様では、本発明は、富化細胞集団を投与することにより、i腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の処置;ii腎臓機能の安定化、iii赤血球恒常性の回復、またはivこれらの任意の組み合わせの方法を提供し、本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の投与の薬効は、組換え型EPOrEPOの投与による薬効に比較して、赤血球恒常性の改善を特徴とする。一実施形態では、必要としている対象に投与する場合、集団または混合物は、組換え型EPOタンパク質の投与に比較して、赤血球恒常性を改善するヘマトクリット、ヘモグロビン、またはRBCで判定して。一実施形態では、集団または混合物は、投与された場合、組換え型EPOに比較して、ヘマトクリット、RBC、またはヘモグロビンレベルを改善し、対照のヘマトクリットより約10低いか、または高い程度である。さらなる実施形態では、投与する場合、集団または混合物の1回量または送達により、組換え型EPOタンパク質の1回量または送達により赤血球恒常性が改善される期間を大きく超える期間にわたり、処理対象の赤血球恒常性が改善されるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはRBCの増加で判定して。別の実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、同等の健康な対照の正常なレベルの約110を越えるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはRBCを生じない。さらなる実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、本明細書記載の用量で送達した組換え型EPOタンパク質に比べて、優れた赤血球恒常性を与えるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはRBCで判定して。別の実施形態では、組換え型EPOが、約100IU/kg、約200IU/kg、約300IU/kg、約400IU/kg、または約500IU/kgの用量で送達される。当業者なら、当技術分野で既知の組換え型EPOの他の投与量も適する可能性があることを理解するであろう。別の本発明の実施形態は、少なくとも1つの細胞集団の使用に関する。細胞集団は、必要としている対象の腎疾患、貧血、またはEPO欠乏の処置に有用な薬物の調製、必要としている対象の赤血球恒常性の提供、必要としている対象の腎臓機能の改善、またはネイティブ腎臓に対する再生効果の提供のために、本明細書記載の富化細胞集団およびそれらの混合物、または本明細書記載の移植可能な構築物、または本明細書記載の分泌産物を含む。別の本発明の実施形態は、具体的に立証された治療特性に基づく特定細胞亜集団の選択を基準にした特定の病因の腎疾患の処置のための、特定の富化細胞集団本明細書記載のの使用に関する。さらに別の態様では、本発明は、必要としている対象の腎疾患の処置方法を提供し、この方法は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む1.045g/mL~1.052g/mLの密度の第1細胞集団、B2、およびエリスロポエチンEPO産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している1.063g/mL~1.091g/mLの密度の第2細胞集団、B4’を含む哺乳類腎臓細胞の混合物を含む組成物を対象に投与することを含み、混合物は、大きな集合管および尿細管系粒状細胞を含む1.045g/ml未満の密度のB1細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む1.091g/ml超の密度のB5細胞集団を含まない。特定の実施形態では、方法は、腎臓機能指標レベルが、対照の指標レベルに比べて、異なり、指標レベルの差異が、対象の1つまたは複数の腎臓機能の低下の減少、安定化、または改善を示す対象由来の試験検体の測定を含む。一実施形態では、その方法で使用されるB4’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、その方法で使われるB4’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。一実施形態では、その方法で使われる細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチンEPO発現が可能である。特定の実施形態では、本発明の方法により処置される腎疾患は、エリスロポエチンEPO欠乏が付随する。特定の実施形態では、EPO欠乏は、貧血である。一部の実施形態では、EPO欠乏または貧血は、対象の腎不全に引き続いて発生する。一部の実施形態では、EPO欠乏または貧血は、慢性腎不全、原発性EPO欠乏、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄性癌、HIV感染症、肝臓疾患、心臓不全、関節リウマチ、または多臓器不全からなる群より選択される傷害に引き続いて起こる。特定の実施形態では、その方法で使用される組成物は、1つまたは複数の生体適合性合成高分子および/または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料をさらに含み、混合物は、生体材料でコートされ、その上にまたは中に析出し、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および/または他の方法でそれと組み合わされる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される混合物は、哺乳類腎臓組織または培養哺乳類腎臓細胞由来である。他の実施形態では、混合物は、必要としている対象に対し自己である腎臓検体由来である。一実施形態では、検体は、腎生検である。他の実施形態では、本発明の方法で使われる混合物は、非自己腎臓検体由来である。さらに別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血またはEPO欠乏の処置に有用である薬物の調製のための、本発明の細胞調製物およびそれらの混合物または移植可能な構築物の、使用を提供する。別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象のネイティブ腎臓の再生のための方法を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を対象に投与または移植するステップを含む。再生ネイティブ腎臓は、ネイティブ腎臓の機能または能力の発生、ネイティブ腎臓の機能または能力の改善、および特定のネイティブ腎臓マーカーの発現これらに限定されないを含むいくつかの指標を特徴とすることができる。一実施形態では、機能または能力の発生または改善は、上述の赤血球恒常性および腎臓機能の種々の指標に基づいて観察してもよい。別の実施形態では、再生腎臓は、1つまたは複数の幹細胞マーカーの発現差異を特徴とする。幹細胞マーカーは、1つまたは複数の下記のものであってもよい:SRY性決定領域Y-box2Sox2;未分化胚細胞転写因子UTF1;マウス由来NodalHomologNODAL;プロミニン1PROM1またはCD133CD133;CD24;およびこれらの任意の組み合わせ。別の実施形態では、幹細胞マーカーの発現は、対照に比べ、発現上昇している。富化細胞集団およびそれらの混合物ならびに前記を含む構築物を含む本明細書記載の細胞集団を使用して、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与えることができる。効果は、細胞それ自体によって、および/または細胞からの分泌産物によって提供されてもよい。再生効果は、1つまたは複数の下記を特徴としてもよい:上皮間葉転換の減少TGF-βシグナル伝達の減弱を介してもよい;腎臓線維形成の減少;腎臓炎症の減少;ネイティブ腎臓の幹細胞マーカーの発現差異;移植細胞および/またはネイティブ細胞の腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位への遊走、腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位での移植細胞の生着;1つまたは複数の腎臓機能指標の安定化本明細書記載の;赤血球恒常性の回復本明細書記載の;およびこれらの任意の組み合わせ。再生モニタリング方法別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の対象への投与または移植後のネイティブ腎臓の再生をモニタリングするための予後徴候予測方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象由来試験検体および対照検体中のマーカー発現レベルを検出するステップを含み、対照検体に比べてより高いレベルの試験検体中のマーカーの発現は、対象のネイティブ腎臓の再生の予後徴候となる。別の実施形態では、方法は、検体中の1つまたは複数の幹細胞マーカーの発現の検出を含む。幹細胞マーカーは、Sox2;UTF1;NODAL;CD133;CD24;およびこれらの任意の組み合わせから選択できる。検出ステップは、幹細胞マーカーの発現が発現上昇しているか、または対照検体に比べ試験検体中で高いことを測定することを含んでもよく、より高いレベルの発現は、対象のネイティブ腎臓再生の予後徴候となる。もう一つの実施形態では、幹細胞マーカーのmRNA発現が検出される。他の実施形態では、mRNA発現の検出は、PCRベース方法、例えば、qRT-PCRによってもよい。インサイツハイブリダイゼーションもまた、mRNA発現の検出に使用できる。もう一つの実施形態では、幹細胞マーカーのポリペプチド発現が検出される。別の実施形態では、ポリペプチド発現は、抗幹細胞マーカー試薬を使って検出される。もう一つの実施形態では、試薬は、マーカーに対する抗体である。別の実施形態では、幹細胞マーカーポリペプチド発現は、免疫組織化学またはウェスタンブロットを使って検出される。当業者なら、マーカーのmRNAおよび/またはポリペプチド発現を検出する他の方法が解るであろう。一実施形態では、検出ステップは、対象由来試験検体を採取するステップにより先行される。別の実施形態では、試験検体は、腎臓組織である。もう一つの態様では、本発明は、ネイティブ腎臓の再生のための代用マーカーとして、マーカー、例えば、幹細胞マーカーの使用を提供する。このようなマーカーは、機能または能力が発生しているか、または改善されているかどうか例えば、赤血球恒常性および腎臓機能の指標に基づいて、再生の評価と独立に、または連携して使用可能である。再生の経時変化に対する代用のマーカーのモニタリングは、また、再生の予後指標として役立つ可能性がある。別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の患者の予後評価の方法を提供する。一実施形態では、方法は、a前記対象から採取した試験検体のマーカー発現のレベルの検出ステップ;b対照検体に対するマーカー発現のレベルまたは制御基準値に比べて試験検体中の発現レベルを測定するステップ;およびcマーカー発現レベルの測定に基づいて患者の再生予後徴候を予測するステップを含み、対照検体または制御基準値に比べて、試験検体のマーカーのより高いレベルの発現は、対象の再生に対する予後徴候である。別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の患者の予後評価方法を提供する。一実施形態では、方法は、a患者生物試料を採取するステップ;およびb生物試料中の幹細胞マーカー発現を検出するステップを含み、幹細胞マーカー発現は、患者のネイティブ腎臓再生の予後徴候となる。一部の実施形態では、対照検体または制御基準値に比べて、患者の生物試料中の増加した幹細胞マーカー発現は、対象における再生に対する予後徴候となる。一部の実施形態では、対照検体または制御基準値に比べて、患者検体中の減少した幹細胞マーカー発現は、対象における再生に対する予後徴候となる。患者検体は、生検を含む試験検体であってもよい。患者検体は、体液、例えば、血液または尿であってもよい。もう一つの態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の対象への投与または移植後のネイティブ腎臓の再生のモニタリングを使った非侵襲的方法による予後予測方法を提供する。組織生検の代替として、処置を受けている対象の再生結果は、体液、例えば、尿の検査から評価できる。対象由来尿ソースから採取した微小胞は、限定されないが、特異的タンパク質および本発明の細胞集団による処置により影響を受けた腎臓細胞集団から最終的に誘導されるmiRNA等の特定の成分を含むことが明らかになった。これらの成分は、幹細胞複製および分化、アポトーシス、炎症ならびに免疫調節に関与する因子を含んでもよい。微小胞関連miRNA/タンパク質発現パターンの経時的分析は、本発明の細胞集団、混合物、または構築物を受けている対象の腎臓内の再生結果の連続モニタリングを可能とする。実施例17は、対象の尿の分析用の代表的プロトコルについて記載する。これらの対象の腎臓由来小胞および/または腎臓由来小胞の尿中流入内腔含有物は、再生結果を示すバイオマーカーにより分析してもよい。一実施形態では、本発明は、腎疾患KD患者が治療薬による処置に反応するかどうかを評価する方法を提供する。方法は、対照検体中の小胞の量と比較またはそれに対して、治療薬で処置したKD患者由来の試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量の測定または検出するステップ、を含むことができ、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、より高いまたはより低い試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量は、処置患者の治療薬による処置に対する反応性を示す。また、本発明は、KD患者の治療薬による処置の効力のモニタリング方法を提供する。一実施形態では、方法は、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、またはそれに対して、治療薬で処置したKD患者由来の試験検体中の小胞の量を測定または検出するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比較して、より高いまたはより低い試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量は、KD患者における治療薬による処置の効力の指標となる。本発明は、また、患者亜集団中の腎疾患KDの処置に対し治療効果のある試薬を特定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、試薬の効力と、対照検体由来の検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較した、患者亜集団由来の検体中の小胞の量の存在の間の相関を判定するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、患者亜集団由来検体中のより高いまたはより低い小胞またはその内腔含有物の量は、試薬が患者亜集団中のKDを処置するのに有効であるという指標となる。本発明は、試薬が腎疾患KDの処置に有効である患者亜集団を特定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、試薬の効力と、対照検体由来の検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較した、患者亜集団由来の検体中の小胞の量の存在の間の相関を判定するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、患者亜集団由来検体中のより高いまたはより低い小胞またはその内腔含有物の量は、試薬が患者亜集団中のKDを処置するのに有効であるという指標となる。測定または検出ステップは、試験検体中に存在する可能性のあるmiRNAまたは他の分泌産物の量を分析することを含んでもよい実施例17参照。非侵襲的予後推定方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の投与または移植前および/または後の対象由来尿検体を採取するステップを含んでもよい。小胞および他の分泌産物は、望ましくない壊死組織片を除去する遠心分離これに限定されないを含む標準的な方法を使って尿検体から単離できるZhouetal.2008.KidneyInt.745:613-621;Skogetal.米国特許公開第20110053157号:これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、処置後の対象の再生結果を検出する非侵襲的方法に関する。方法は、処置対象由来の尿中の小胞またはその内腔含有物の検出を含む。内腔含有物は、1つまたは複数のmiRNAであってもよい。個別の組み合わせまたはパネルmiRNAの検出は、このような予後推測方法に対し適切である可能性がある。代表的組み合わせには、次記の内の2つ以上の組み合わせが含まれる:miR-24;miR-195;miR-871;miR-30b-5p;miR-19b;miR-99a;miR-429;let-7f;miR-200a;miR-324-5p;miR-10a-5p;およびこれらの任意の組み合わせ。一実施形態では、miRNAの組み合わせには、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、またはそれ超の個別miRNAを含んでもよい。当業者なら、他のmiRNAおよびmiRNAの組み合わせでも、このような予後推測方法の使用に適する可能性があることを解るであろう。さらなるmiRNAのソースには、http://mirbase.orgのmiRBaseが含まれ、これは、英国マンチェスター大学生命工学部FacultyofLifeSciencesで運営、維持されている。当業者なら、この再生を検出する予後予測方法は、本明細書記載の細胞集団および構築物とは別に、当技術分野で既知の他の治療薬で処置された対象に適する可能性があることを解るであろう。一部の実施形態では、測定ステップは、i試験検体および対照中のマーカー発現または小胞/小胞含有物の差異レベルの測定;および/またはii試験検体および対照中のマーカー発現の差異レベルの測定から得たデータの解析の目的のために、適切なプロセッサにより実行されるソフトウェアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェアおよびプロセッサは、当技術分野でよく知られており、市販品として利用可能である。プログラムは、有形的表現媒体、例えば、CD-ROM、フロッピーディスク、ハードディスク、DVD、またはプロセッサに付属のメモリーに保存されたソフトウェア中に組み込まれてもよいが、当業者なら、全体プログラムまたはその一部は、プロセッサ以外の装置、および/またはファームウェア中に組み込まれた装置および/または専用ハードウェアを使って、よく知られた方法で、代替法として実行できることが容易に解るであろう。測定ステップ後、測定結果、所見、診断、予測および/または処置提案が、通常記録され、例えば、技師、医師および/または患者に連絡される。特定の実施形態では、コンピュータを使って、このよう情報を関係者、例えば、患者および/または主治医に連絡する。一部の実施形態では、診断結果が連絡される国または管轄区域とは異なる国または管轄区域で、アッセイが行われるか、またはアッセイ結果が解析される。好ましい実施形態では、マーカー発現レベルの差異を有する試験対象で測定されたマーカー発現のレベルに基づく予後、予測、および/または処置提案は、アッセイの完了および予後および/または予測生成後すぐに対象に連絡される。結果および/または関連情報は、対象の処置医師により対象に連絡してもよい。あるいは、結果は、文書、電子形式通信、例えば、電子メール、または電話、等の任意の連絡手段で試験対象に直接連絡してもよい。連絡は、例えば、電子メールコミュニケーションの場合のように、コンピュータを使って円滑化してもよい。特定の実施形態では、電気通信の専門家にはよく知られているコンピュータハードとソフトの組み合わせを使って、予後徴候試験結果および/または試験から得た結論および/または処置提案を含む連絡が自動的に生成され、対象に送付される。健康管理指向コミュニケーション系の一例が、米国特許第6,283,761号に記載されている。しかし、本発明は、この特定のコミュニケーション系を使う方法に限定されない。本発明の方法の特定の実施形態では、検体のアッセイ、再生の予後および/または予測、ならびにアッセイ結果または予後の連絡を含む全てまたは一部の方法のステップは、多様な例えば、外国の管轄区域で行うことができる。別の態様では、本明細書記載の予後予測方法は、移植または投与による再生の成功に関する情報を関係者に提供する。全ての実施形態では、本明細書記載の処置を必要としている対象に再生腎臓を提供する方法には、上述の移植後の再生予後評価のステップを含んでもよい。投与方法と経路本発明の細胞調製物および/または構築物は、単独または他の生理活性成分と組み合わせて投与できる。本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の治療有効量は、対象により安全に受け入れられる最大細胞数から、腎疾患の、例えば、安定化、減少率低下、または1つまたは複数の腎臓機能の改善に必要な最小細胞数の範囲にわたりうる。特定の実施形態では、本発明の方法では、本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団を次の量で投与する:約10,000細胞/kg、約20,000細胞/kg、約30,000細胞/kg、約40,000細胞/kg、約50,000細胞/kg、約100,000細胞/kg、約200,000細胞/kg、約300,000細胞/kg、約400,000細胞/kg、約500,000細胞/kg、約600,000細胞/kg、約700,000細胞/kg、約800,000細胞/kg、約900,000細胞/kg、約1.1x106細胞/kg、約1.2x106細胞/kg、約1.3x106細胞/kg、約1.4x106細胞/kg、約1.5x106細胞/kg、約1.6x106細胞/kg、約1.7x106細胞/kg、約1.8x106細胞/kg、約1.9x106細胞/kg、約2.1x106細胞/kg、約2.1x106細胞/kg、約1.2x106細胞/kg、約2.3x106細胞/kg、約2.4x106細胞/kg、約2.5x106細胞/kg、約2.6x106細胞/kg、約2.7x106細胞/kg、約2.8x106細胞/kg、約2.9x106細胞/kg、約3x106細胞/kg、約3.1x106細胞/kg、約3.2x106細胞/kg、約3.3x106細胞/kg、約3.4x106細胞/kg、約3.5x106細胞/kg、約3.6x106細胞/kg、約3.7x106細胞/kg、約3.8x106細胞/kg、約3.9x106細胞/kg、約4x106細胞/kg、約4.1x106細胞/kg、約4.2x106細胞/kg、約4.3x106細胞/kg、約4.4x106細胞/kg、約4.5x106細胞/kg、約4.6x106細胞/kg、約4.7x106細胞/kg、約4.8x106細胞/kg、約4.9x106細胞/kg、または約5x106細胞/kg。別の実施形態では、対象に対する細胞の投与量は、単回投与量でも、単回投与量プラス追加の投与量であってもよい。他の実施形態では、投与量は、本明細書記載の構築物として提供されてもよい。他の実施形態では、対象に対する細胞の投与量は、推定腎臓量または機能的腎臓量に基づいて計算してもよい。本明細書記載の腎臓細胞集団またはその混合物の治療有効量は、薬学的に許容可能なキャリアーまたは賦形剤中に懸濁できる。このようなキャリアーには、限定されないが、基本培地プラス1血清アルブミン、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、コラーゲン、アルギナート、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの組み合わせ、が含まれる。製剤は、投与方法に適合させなければならない。従って、本発明は、対象の腎疾患の処置用薬物の製造のための、単独のまたはB3および/またはB4またはB4’細胞集団と混合した腎臓細胞集団またはその混合物、例えば、B2細胞集団の使用を提供する。一部の実施形態では、薬物は、組換え型ポリペプチド、例えば、増殖因子、ケモカインまたはサイトカインをさらに含む。さらなる実施形態では、薬物は、ヒト腎臓由来細胞集団を含む。薬物製造に使われる細胞は、本明細書記載の方法として提供されたいずれかの変形方法を使って単離、誘導、富化できる。腎臓細胞調製物もしくはその混合物、または組成物は、ヒトに適合された医薬組成物として、常法により処方される。通常、静脈内投与、動脈内投与または腎被膜内投与用組成物は、例えば、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。また、必要に応じ、組成物は、注射部位での起こりうる疼痛を改善するために局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、成分は、別々に、または混合して一緒に、単位剤形、例えば、気密シール容器、例えば、活性試薬の量を表示したアンプル、に入れた凍結保存濃縮製剤として供給される。組成物が注入により投与される場合は、無菌の医薬品グレード水または食塩水を含む注入ボトルに分注できる。組成物が注射により投与される場合は、注射用無菌水または食塩水のアンプルが用意され、投与の前に成分を混合できる。薬学的に許容可能なキャリアーは、一部は、特定の投与組成物、ならびに組成物の投与に使われる特定の方法により規定される。従って、多種多様の適切な医薬組成物製剤が存在する例えば、AlfonsoRGennaroed、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy、以前のレミントンの薬学Remington’sPharmaceuticalSciences20thed.、Lippincott、WilliamsWilkins、2003、を参照のこと。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張性として処方され、米国食品医薬品局の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則GoodManufacturingPracticeGMPに完全に準拠している。本発明の一態様は、本発明の腎臓細胞調製物、例えば、単独の、またはB3および/またはB4またはB4’細胞調製物と組み合わせたB2細胞調製物、および薬学的に許容可能なキャリアーを含む医薬製剤をさらに提供する。一部の実施形態では、製剤は、104~109の哺乳類腎臓由来細胞を含む。一態様では、本発明は、本明細書記載の1つまたは複数の、混合物を含む細胞集団を、必要としている対象に与える方法を提供する。一実施形態では、細胞集団のソースは、自己または同種異系、同種同系自家遺伝子系または同系遺伝子系、およびそれらの任意の組み合わせでよい。ソースが自己でない場合、方法には、免疫抑制剤の投与を含んでもよい。適切な免疫抑制剤には、限定されないが、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス水和物、クロランブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オーラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、ビオシンソルブ、ムロモナブ、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、レフロノミド、バシリキシマブ、ドルナーゼα、ビンダリド、クラドリビン、ピメクロリムス、イロデカキン、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス、ガビリモマブ、ファラリモマブ、クロファラビン、ラパマイシン、シプリズマブ、サイレイト、LDP-03、CD4、SR-43551、SKF-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG、およびAGI-1096米国特許第7,563,822号参照が含まれる。当業者なら、他の適切な免疫抑制剤を解るであろう。この発明の処置方法は、単離腎臓細胞集団、またはその混合物を個体に送達することを含む。一実施形態では、恩恵を意図する部位への細胞の直接投与が好ましい。一実施形態では、本発明の細胞調製物、またはその混合物は、送達媒体を用いて個体に送達される。治療を必要としている対象は、また、ネイティブ腎臓を、1つまたは複数の富化腎臓細胞集団および/または前記を含む混合物または構築物から分泌された産物とインビボで接触させることにより、処置可能である。ネイティブ腎臓を、インビボで分泌産物と接触させるステップは、細胞培地、例えば、馴化培地由来の分泌産物の集団の使用/投与、または富化細胞集団、および混合物、または産物をインビボで分泌できる構築物の移植により実現可能である。インビボ接触ステップは、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与える。本明細書を考慮すると、細胞および/または分泌産物を対象に投与する種々の手段は、当業者には明らかであろう。このような方法には、対象標的部位への細胞の注射が含まれる。細胞および/または分泌産物は、送達装置または媒体中に装填でき、対象への注射または移植による導入が促進される。特定の実施形態では、送達媒体には、天然の物質を含んでもよい。他の特定の実施形態では、送達媒体には、合成物質を含んでもよい。一実施形態では、送達媒体は、器官の構造を模倣する、またはそれにうまく適合する構造を与える。他の実施形態では、送達媒体は、体液様の性質である。このような送達装置には、細胞と液体をレシピエント対象の身体の中に注入するためのチューブ、例えば、カテーテル、を含んでもよい。好ましい実施形態では、チューブは、針、例えば、シリンジをさらに有し、本発明の細胞がそれを通って対象の目的部位に導入されうる。一部の実施形態では、哺乳類腎臓由来細胞集団は、カテーテル経由で血管に投与されるように処方される用語のカテーテルは、物質を血管に送達するための様々なチューブ様系のいずれかを含むことを意味する。あるいは、細胞を、生体材料または足場中または上に挿入でき、生体材料または足場には、限定されないが、織物、例えば、敷布、ニット、ブレード、メッシュ、および不織布、有孔フィルム、スポンジおよび発泡体、ならびにビーズ、例えば、中実または多孔性ビーズ、微粒子、ナノ粒子、等例えば、Cultispher-Sゼラチンビーズ-Sigmaが含まれる。細胞は、種々の異なる形で送達用に調製できる。例えば、細胞は、溶液またはゲル中に懸濁できる。細胞は、本発明の細胞が生存可能な、薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤と混合できる。薬学的に許容可能なキャリアーおよび希釈剤には、食塩水、水性緩衝液、溶剤および/または分散媒が含まれる。このようなキャリアーおよび希釈剤の使用は、当技術分野でよく知られている。溶液は、無菌の液体が好ましく、また、等張性であることが多い。溶液は、製造と貯蔵条件下で安定であり、また、微生物、例えば、細菌や真菌の汚染作用に対し、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等の使用により、保護されていることが好ましい。当業者なら、本発明の細胞集団およびその混合物の送達に使われる送達媒体は、上述の特性の組み合わせを含んでもよいことを解るであろう。単離された腎臓細胞集団、例えば、単独またはB4’および/またはB3と混合したB2細胞集団の投与方式には、限定されないが、全身性、腎臓内例えば、実質、静脈内または動脈内注射および目的作用部位の組織への直接注射、が含まれる。さらなる投与方式には、直接開腹手術経由の、直接腹腔鏡検査経由の、経腹腔的、または経皮的単回または複数回の注射が含まれる。また本発明で使われるさらなる投与方式には、例えば、逆行注入および腎盂尿管注入が含まれる。外科的投与手段には、一段手術、例えば、限定されないが、腎部分摘出術および構築物移植、腎部分摘出術、腎盂部分切除術、網±腹膜による血管新生、注射筒に取り付ける円錐形状または角錐形状の多源性生検注射痕、および、腎臓柱状置換、ならびに、例えば、再移植のためのオルガノイド内部バイオリアクター等の2段手術、が含まれる。一実施形態では、細胞の混合物は、同じ経路で、同じ時間に送達される。別の実施形態では、制御された混合物を含むそれぞれの細胞組成物は、別々に特異的部位に送達されるか、または特異的方法を経由して、同時にまたは時間経過制御方式で、1つまたは複数の本明細書記載の方法により、送達される。ヒトの適切な細胞移植投与量は、細胞の活性、例えば、EPO産生、に関連する既存情報、または前臨床の試験で行った投薬試験から推定した情報から決定できる。インビトロ培養およびインビボ動物実験から、細胞の量が定量化でき、適切な移植材料投与量の計算に使用できる。従って、患者をモニターし、追加の移植ができるか、または移植材料をそれに応じて減らすことができるかどうかを決定できる。1つまたは複数の選択細胞外のマトリックス成分、例えば、1つまたは複数の当技術分野で既知の型のコラーゲンまたはヒアルロン酸、および/または増殖因子、多血小板血漿および薬剤等の他の成分を本発明の細胞集団およびその混合物に添加できる。当業者なら、本明細書記載の分泌産物に適した種々の処方および投与方法が解るであろう。キット本発明は、本発明のポリマーマトリックスおよび足場および関連材料、および/または細胞培地および使用説明書を含むキットをさらに含む。使用説明書は、例えば、細胞の培養または細胞および/または細胞産物の投与に関するインストラクションを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、本明細書記載の足場およびインストラクションを含むキットを提供する。さらに別の実施形態では、キットは、マーカー発現検出用試薬、薬剤を使用するための試薬、および使用説明書を含む。このキットは、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の対象のネイティブ腎臓の再生予後の測定のために使うことができる。キットは、また、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物のバイオセラピューティック効力の測定に使用可能である。報告書本発明の方法では、商業目的で実施する場合、一般的に、再生予後の報告書または要約を作成する。本発明の方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物のいずれかの投与または移植の前と後の可能なコースまたは再生結果の予測を含む報告を作成することになる。この報告は、予後に関連するいずれかの指標の情報を含んでもよい。本発明の方法および報告は、データベースに報告を保存することもさらに含んでもよい。あるいは、方法は、対象に対するデータベースに記録をさらに作成することができ、記録にデータを呼び込むことができる。一実施形態では、報告は、文書による報告書であり、別の実施形態では、報告は、聴覚による報告であり、別の実施形態では、報告は電子記録である。報告は、医師および/または患者に提供されることが意図されている。報告の受領は、データおよび報告を含むサーバーコンピュータにネットワーク連結を確立すること、およびサーバーコンピュータからデータおよび報告を要求することをさらに含む。本発明により提供される方法は、また、全体または一部が自動化されてもよい。本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、および文献の参照は、参照によってその全体が組み込まれる。以下の実施例は、説明の目的のみのために提供されており、本発明の範囲を限定する意図は全くない。実施例1-生物学的応答性腎臓細胞の単離およびキャラクタリゼーション成体雄ブタイノシシの貧血を伴う特発性進行性慢性腎疾患CKDの症例から、同年齢の正常なブタ腎臓組織と直接比較して細胞組成物の評価とキャラクタリゼーションを行うための、新鮮な腎臓患部組織が提供された。採取時間での腎臓組織の組織学的検査により、重篤なびまん性慢性間質性線維症および多巣性線維形成を伴う半月体形成性糸球体腎炎を特徴とする腎疾患であると確認された。臨床化学により、高窒素血症血中尿素窒素および血清クレアチニンの上昇、および軽度の貧血ヘマトクリットの軽度の減少および低下したヘモグロビンレベルである事が確認された。病気および正常の両方の腎臓組織由来の細胞が単離され、増殖されて、特性が明らかにされた。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図1に示されるように、ゴモリのトリクローム染色により正常な腎臓組織に比較して腎臓患部組織中の線維形成が強調される矢印で示す青色染色。キュビリン:メガリンを発現し、受容体媒介アルブミン輸送ができる機能性尿細管細胞が、正常および病気両方の腎臓組織から増殖する。エリスロポエチンEPO発現細胞は、また、培養物中に存在し、複数の継代中保持され、冷凍/解凍サイクルを受ける。さらに、分子分析により、正常および患部組織の両方由来のEPO発現細胞は、インビトロの低酸素性の条件に応答し、EPOおよびvEGF等の他の低酸素調節遺伝子標的のHIF1α駆動型誘導が起こる。細胞は、コラゲナーゼディスパーゼの酵素消化によりブタ腎臓組織から単離され、また、単純な機械的消化および外植片培養を行うことにより、別の実験でも単離された。継代2で、EPO発現細胞含有外植片由来細胞培養を大気21および可変の低酸素性<5培養の両方の条件に供し、低酸素への暴露が、EPO遺伝子発現の上昇発現の結果をもたらすのかどうかを判定する。げっ歯類培養で述べるように実施例3を参照、正常なブタは、酸素依存性発現およびEPO遺伝子調節を示した。驚くべきことに、CKDブタの尿毒性/貧血状態ヘマトクリット<34、クレアチニン>9.0にもかかわらず、EPO発現細胞は、容易に単離され、組織から増殖し、EPO遺伝子の発現は、低酸素に調節されたままであったPresnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図2に示すように。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図3に示すように、増殖培養物中の細胞は、尿細管様構造へと自己組織化する能力を示した。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図4に示すように、培養細胞によるFITC複合化アルブミンの受容体媒介取込を観察することにより、培養物継代3の中の機能的尿細管細胞の存在が確認された。緑色ドット細い白色の矢で示すは、取り込まれたフルオレセイン複合化アルブミンを表し、これは、尿細管細胞特異的受容体、メガリンとキュビリンにより媒介され、機能的尿細管細胞によるタンパク質の再吸収を示す。青色染色細い白色の矢で示すは、Hoescht染色した核である。まとめると、これらのデータは、機能的尿細管および内分泌細胞は、CKDに激しく侵されている腎臓組織であっても、ブタ腎臓組織から単離、増殖できることを示唆している。さらに、これらの知見は、CKDの処置に対する自己細胞ベースの治療薬の進展を支援する。さらに、EPO産生細胞は、正常なヒト成人腎臓から酵素を使って単離された上述の実施例1のように。単離手続きにより、初期組織の場合よりも、単離後、比較的多くのEPO発現がもたらされた。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図6に示すように、培養中にヒトEPO産生細胞を維持し、EPO遺伝子発現を保持することが可能である。ヒト細胞を組織培養物処置プレーンプラスチックまたは一部の細胞外のマトリックス、例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲンコートプラスチック上で培養/増殖し、全てのものが経時EPO発現を裏付けることが明らかになった。実施例2-特定生理活性腎臓細胞の単離および富化腎臓細胞単離:簡単に述べると、10、2週齢雄Lewisラット腎臓のバッチを市販品納入業者HilltopLabAnimalsInc.から入手し、約4°CのViaspan保存培地中に入れ一晩輸送した。本明細書記載の全ステップは、生物学的安全キャビネットBSC中で行い、無菌を保った。腎臓を、ハンクス平衡塩類溶液HBSSで3回洗浄してViaspan保存培地を洗い流した。3回目の洗浄後、残っている腎臓カプセル剤、ならびに残っている全ての間質組織が除去された。また、主要腎杯を顕微解剖技術を使って取り出した。次に、腎臓を無菌のメスを使って細かく分割してスラリーにした。その後、スラリーを50mlの遠心分離機のコニカルチューブに移し、秤量した。小検体をRNA分析用に集め、無菌の無RNアーゼ1.5ml微量遠心分離機チューブ中に入れ、液体窒素中で急速凍結した。凍結するとすぐに、-80°Cフリーザーに移し、分析まで保存した。10個の若齢腎臓の組織重量は、約1グラムに相当する。バッチの重量に基づいて、消化培地を、1グラムの組織当たり20mlの消化培地になるように調節した。この手続き用消化緩衝液には、4ユニットのHBSS中ディスパーゼ1StemCellTech、5mMCaCl2シグマ含有300Units/mlのコラゲナーゼタイプIVWorthingtonを含めた。適切な容量の予熱した消化緩衝液をチューブに添加し、シールして、37°Cのインキュベーター中のロッカーに20分間入れた。この第1消化ステップは、多くの赤血球を除き、残っている組織の消化を高める。20分後、チューブを取り出し、BSC中に入れた。組織をチューブの底に静置し、次に、上清を取り出した。残っている組織に、出発容量と等量の新しい消化緩衝液を補充した。追加の30分間、37°Cインキュベーター中のロッカーにチューブを再度入れた。30分後、消化混合物を70μmセルストレーナーBDFalconを使って等容量の中和緩衝液中に分注しDMEMw/10FBS、消化反応を停止させた。その後、細胞懸濁液を300xgの遠心分離により5分間洗浄した。遠心分離後、ペレットをKSFM培地に再懸濁し、トリパンブルー色素排除を使った細胞計数および生存率評価用に検体を採取した。細胞数を計算するとすぐに、百万個の細胞をRNA分析用に集め、PBSで洗浄し、急速液体窒素中で凍結した。残った細胞懸濁液をKSFM培地で50mlにして、再度300xgの遠心分離により5分間洗浄した。洗浄後、KSFM1ml当たり1千5百万細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁した。次に、5mlの腎臓細胞懸濁液を15ml遠心分離機コニカルチューブBDFalcon中の5mlの30w/vOptiprep登録商標に添加し、6回反転により混合した。これにより、15w/vのOptiprep登録商標の最終混合物が形成された。反転後、チューブを1mLPBSで注意深く層状化した。チューブをブレーキなしで、800xgで15分間遠心分離した。遠心分離後、チューブを取り出し、混合勾配の先端に細胞バンドを形成した。また、赤血球、死細胞、および少しの小さな顆粒状の少ない細胞、少しのEPO産生細胞、少しの尿細管細胞、および少しの内皮細胞、等の小集団の生細胞を含むペレットも存在した。バンドを、ピペットで注意深く取り出し、別の15mlコニカルチューブに移した。吸引により勾配培地を取り出し、ペレットを1mlのKSFM中へ再懸濁した。次に、バンド細胞およびペレット細胞を再度組み合わせて、KSFMを使って少なくともの集めたバンド容量の3倍の希釈度にして再懸濁し、300xgの遠心分離で5分間洗浄した。洗浄後、細胞を20mlのKSFMに再懸濁し、細胞計数用検体を集めた。トリパンブルー色素排除を使った細胞数の計数が終わるとすぐ、RNA検体として百万個の細胞を集め、PBSで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。密度勾配分離を使って特定の生理活性腎臓細胞の生存率と培養能力を高めるための前培養精製Clean-up:不純物のない、生存可能な培養用細胞集団を得るために、腎臓細胞単離で上述のように、最初に細胞懸濁液を生成した。随意選択ステップとして、および初期調製物を精製する手段として、無菌の等張性緩衝液中に懸濁させた1億個もの全体細胞を、ストックの60w/vイオジキサノール従って、最終的に15w/vOptiprep溶液が得られるから室温で調製した等容量の30Optiprep登録商標で完全に1:1とし、6回の反転により完全に混ぜ合わせる。混合後、1mlのPBS緩衝液を混合細胞懸濁液の上端に注意深く層状に加えた。その後、勾配チューブを注意深く遠心分離機に装填し、適性バランスを確保した。勾配チューブを800xg、25°Cで15分間、ブレーキなしで遠心分離した。精製細胞集団生存可能で、かつ機能的集合管、尿細管、内分泌、糸球体、および血管細胞を含むは、1.025~1.045g/mLの間の密度に対応する6と8w/vOptiprep登録商標の間に分配された。他の細胞および壊死組織片は、チューブの底部にペレット化された。腎臓細胞培養:1つにまとめた細胞バンドとペレットを、次に、DMEM高ブドウ糖/{5v/vFBS、2.5μgEGF、25mgBPE、抗生物質/抗真菌剤を含む1XITSインスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウム培地補助剤を含むKSFM}の50:50混合物150ml中に30、000細胞/cm2の細胞濃度で、組織培養物処理トリプルフラスコNuncT500または等価物中に播種した。細胞を、加湿5CO2インキュベーター中で2~3日培養し、21大気酸素レベルを細胞に与えた。2日後、培地を交換し、培養物をCO2/窒素ガスマルチガス加湿インキュベーターSanyoから提供された2酸素レベル環境中に24時間置いた。24時間のインキュベーション後、細胞を60mlの1XPBSで洗浄し、40mlの0.25w/vトリプシン/EDTAGibcoで取り出した。取り出しに際し、細胞懸濁液を等容量の10FBS含有KSFMで中和した。その後、細胞を300xgの遠心分離で10分間洗浄した。洗浄後、細胞を20mlのKSFM中に再懸濁し、50mlコニカルチューブに移して、細胞計数用検体を集めた。生存可能な細胞数がトリパンブルー色素排除を使って決定されるとすぐに、RNA検体として百万個の細胞を集め、PBSで洗浄後、液体窒素中で急速凍結した。細胞をPBSで再度洗浄し、300xgの遠心分離で5分間、集めた。洗浄した細胞ペレットをKSFM中に3千7百50万細胞/mlの濃度で再懸濁した。密度ステップ勾配分離を使った特定の生理活性腎臓細胞の富化:、主に腎臓尿細管細胞からなるが、他の細胞型集合管、糸球体、血管、および内分泌細胞小亜集団を含む培養腎臓細胞を、複数の濃度w/vのイオジキサノールOptiprepから作られた密度ステップ勾配を使って、それらの成分亜集団に分離した。採取前に、培養物を低酸素性環境中に24時間まで置き、勾配にかけた。無菌の15mLコニカルチューブ中で4つの異なる密度の培地を相互の上端の上に層状に導入することによりステップ勾配を形成し、最高密度の溶液を底部に配置し、最低密度溶液を上端に層状に導入した。細胞をステップ勾配の上端に加え、遠心分離し、これにより、集団をサイズと粒状性に基づき複数のバンドに分離させる結果を得た。簡単に述べると、KFSM培地を希釈剤として使用して、7、11、13、および16Optiprep登録商標60w/vイオジキサノールの密度を作った。例えば、50mlの7w/vOptiprep登録商標に対し、5.83mlのストック60w/vイオジキサノールを44.17mlのKSFM培地に添加し、反転により良く混合した。無菌の毛細血管に連結した無菌のL/S16タイゴンチューブを備えたぜん動ポンプMasterFlexL/Sを、2ml/分の流量に設定し、2mLの各4つの溶液を、最初に16溶液、続いて13溶液、11溶液、そして7溶液の順に、無菌のコニカル15mLチューブに加えた。最後に、7千5百万個の培養げっ歯類腎臓細胞含有2mL細胞懸濁液をステップ勾配の頂上に加えた上述の腎臓細胞培養にあるようにして懸濁液が生成された。重要なのは、ポンプが勾配溶液をチューブに送り始めると、液体が45°の角度でチューブの側面をゆっくり流れ落ちるようにして、適正な界面が各勾配の層の間に確実に形成されるように注意することである。細胞を負荷されたステップ勾配は、次に、800xgで20分間、ブレーキなしで遠心分離にかけられる。遠心分離後、チューブを各界面を乱さないように注意深く取り出した。5つの異なる細胞画分が得られた4バンドおよびペレットB1~B4、ペレット図1A、左コニカルチューブ参照。各画分を無菌のディスポーザブルバルブピペットまたは5mlピペットを使って集め、表現型および機能性の観点から特徴付けしたPresnelletal.国際公開第2010/056328号の実施例10を参照。げっ歯類腎臓細胞懸濁液をステップ勾配分画にかけると、尿細管細胞富化画分および集合管由来の細胞を少し含むは、1.062~1.088g/mLの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培養後に密度勾配分離を行った場合、尿細管細胞富化画分および集合管由来の細胞を少し含むは、1.051~1.062g/mLの密度区分に分配された。同様に、単離直後に、げっ歯類腎臓細胞懸濁液がステップ勾配分画にかけられた場合、EPO産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞B4富化画分は、1.025~1.035g/mLの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培養後に、密度勾配分離を行った場合は、EPO産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞B4富化画分は、1.073~1.091g/mLの密度の区分に分配された。重要なのは、培養物の低酸素性培養環境への暴露約1時間~約24時間の間により、培養後に細胞のB2およびB4画分への分配が高められたことである低酸素は、採取およびステップ勾配手続きの前で、21大気未満の酸素レベルとして定義されるバンド分布に対する低酸素効果についてのさらなる詳細は、実施例3で提供される。各バンドを3x容量のKSFMで希釈し、よく混合し、300xgで5分間遠心分離することにより洗浄した。ペレットを2mlのKSFM中に再懸濁し、生存可能な細胞をトリパンブルー色素排除および血球計を使って計測した。百万個の細胞をRNA検体として集め、PBSで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。尿毒性および貧血雌ラットに対する移植調査のために、B2およびB4由来の細胞を使用した。これらのラットは、CharlesRiverLaboratoriesで2段ステップ5/6腎摘出術法により生成された。エリスロポエチンとvEGFの酸素調節発現、糸球体マーカーの発現ネフリン、ポドシン、および血管マーカーの発現PECAMを含むB4の特性は、定量リアルタイムPCRにより確認された。B2画分の表現型は、E-カドヘリン、N-カドヘリン、およびアクアポリン-2.の発現により確認された。Presnelletal.国際公開第2010/056328号の図49aと49bを参照。従って、ステップ勾配戦略の使用は、EPO産生細胞B4の希少な集団の富化のみでなく、機能的尿細管細胞B2が相対的に富化された画分を生成する手段も可能とするPresnelletal.国際公開第2010/056328号の図50と51を参照。ステップ勾配戦略は、また、EPO産生および尿細管細胞の、赤血球、細胞壊死組織片、および他の潜在的に望ましくない細胞型、例えば、大きな細胞凝集物および特定の型の免疫細胞からの分離を可能とする。ステップ勾配手続きは、採用された特定の密度については、細胞成分の良好な分離を得るためにチューニングが必要な場合がある。好ましい勾配チューニング手法には、1勾配の底の高密度例えば、16~21Optiprepから、勾配の上端の相対的に低密度例えば、5~10までの連続的密度勾配を機能させることが含まれる。連続的勾配は、任意の標準的密度勾配溶液フィコール、パーコール、ショ糖、イオジキサノールを使って、標準的な方法AxisShieldに従って調製できる。対象の細胞を連続勾配に加え、800xGで20分、ブレーキなしで遠心分離する。類似のサイズと粒度の細胞は、一緒に勾配中に分離する傾向があり、その結果、勾配の相対的位置が測定でき、さらに、その位置の溶液の比重も、測定できる。従って、その後で、特定条件下で密度勾配を全体にわたるその能力に基づいて、特定の細胞集団の単離に焦点を合わせた確定したステップ勾配を得ることができる。不健康-対-健康組織由来細胞を単離する場合、または、異なる種由来の特定細胞を単離する場合に、このような最適化が、採用される必要がありうる。例えば、最適化がイヌのおよびヒト両方の腎臓細胞培養物に対して行われ、ラットで同定された特異的B2およびB4亜集団を他の種から単離可能であることを確実にした。げっ歯類B2およびB4亜集団の単離用最適勾配は、7、11、13、および16w/vOptiprepから構成される。イヌのB2およびB4亜集団の単離用最適勾配は、7、10、11、および16w/vから構成される。ヒトB2およびB4亜集団単離用最適勾配は、7、9、11、16w/vから構成される。この結果、培養げっ歯類、イヌ、およびヒト腎臓細胞のB2およびB4に対する局在化密度範囲は、表2.1に示される。実施例3-勾配前の低酸素培養が、バンド分布、組成、および遺伝子発現に影響するプロトタイプB2およびB4の分布および組成に与える酸素条件の効果を測定するために、勾配ステップの前に、異なる種由来の新規腎臓neokidney細胞調製物を種々の酸素条件に暴露した。ラット細胞単離および培養開始のための標準的手順を使って、上述のように、げっ歯類新規腎臓増強NKA細胞調製物RK069を形成した。21大気酸素条件下で2~3日間、全てのフラスコを培養した。培地を交換し、半分のフラスコを2酸素に設定された酸素制御インキュベーターに再配置し、一方、残りのフラスコを追加の24時間の間、21酸素条件に保持した。次に、上述の標準的な酵素による採取法を使って、各セットの条件から細胞を採取した。標準的手続きに従ってステップ勾配を調製し、正常酸素圧21酸素および低酸素性の2酸素培養物を別々に採取し、並行してステップ勾配に適用した図2。両条件で4バンドおよびペレットが生成されたが、勾配全体の細胞の分布は、21と2酸素培養バッチで異なっていた表1。特に、B2の収率は、低酸素で増加し、同時にB3が減少した。さらに、低酸素性培養細胞から生成された勾配中でB4特異的遺伝子例えば、エリスロポエチンの発現が増加したPresnelletal.国際公開第2010/056328号の図73を参照。上述のように、イヌ細胞単離および培養に関する標準的手順げっ歯類単離および培養手順に類似のを使って、イヌのNKA細胞調製物DK008を形成した。全てのフラスコを21大気酸素条件下で4日間培養した後、フラスコのサブセットを低酸素2環境に24時間移したが、一方、サブセットのフラスコを、21で維持した。続けて、各セットのフラスコから回収し、同じステップ勾配供した図3。ラットの結果実施例1と同様に、低酸素性培養イヌ細胞は、大気圧酸素培養イヌ細胞とは異なり、勾配全体に分配された表3.1。再度、B2の収率は、勾配の前の低酸素性暴露により増加し、同時にB3への分配は減少した。上のデータは、勾配前の低酸素への暴露が、B2の成分ならびに特定の分化細胞エリスロポエチン産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞のB4への分配を高めることを示す。従って、上述の低酸素性培養、それに続く密度勾配分離は、種全体にわたるB2とB4細胞集団の生成の有効な方法である。実施例4-ヒト腎臓からの尿細管/糸球体細胞の単離全体にわたり記載されている酵素を使った単離方法により、正常なヒト腎臓組織から尿細管および糸球体細胞を単離し、増殖した。上述の勾配方法により、尿細管細胞画分を培養後、エクスビボで富化した。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図68に示すように、表現型特性は単離および増殖中、維持された。標識アルブミンの取込により評価された尿細管細胞機能は、また、繰り返された継代後も維持され、冷凍保存された。Presnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図69は、尿細管富化および尿細管枯渇集団が3Dダイナミック培養により培養される場合、尿細管マーカー、カドヘリン発現の有意な増加が尿細管富化集団で認められた。このことにより、細胞が3Dダイナミック環境で培養される場合、尿細管細胞の富化が、初期の富化を越えて維持できることが確認される。実施例5-フローサイトメトリーによるEPO産生細胞のさらなる分離上述の実施例2で記載の腎臓細胞の同じ培養集団をフローサイトメトリー分析に供し、前方散乱および側方散乱を調査した。小さくて、顆粒がより少ないEPO産生細胞集団は識別可能であり8.15、また、フローサイトメーターの選別能力を使って、小さくて、顆粒がより少ない集団のポジティブセレクションにより分離されるPresnelletal.国際公開第2010/056328号参照によりその全体が本明細書に組み込まれるの図70を参照。実施例6-自己免疫糸球体腎炎患者検体から単離された腎臓細胞の未分画混合物のキャラクタリゼーション腎臓細胞の未分画混合物を上述のように自己免疫性糸球体腎炎患者検体から単離した。腎臓組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムPCRqrtpcr分析Brunskilletal.、前出、2008を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。表6.1に示すように、HK20は、自己免疫性糸球体腎炎患者検体である。表6.2は、qRTPCR測定の結果の基づき、HK20から生成された細胞は、糸球体細胞が欠乏していることを示す。実施例7-巣状分節性糸球体硬化症の症例から単離された治療に適する腎臓生理活性細胞集団の遺伝的プロファイリング腎臓組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムPCRqrtpcr分析Brunskilletal.、前出、2008を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。糸球体の大部分が破壊されている巣状分節性糸球体硬化症FSGSの症例由来の、ヒト調製物HK023をB4画分の糸球体細胞の存在に関し、採取時に評価した。簡単に述べると、未分画UNFX培養物を生成しAboushwarebetal.、前出、2008、標準的生検方法を使って腎臓から採取した4コア生検をそれぞれ相互に独立に維持した。UNFXエクスビボでの2継代後、細胞を採取し、密度勾配法実施例8のようにに供し、げっ歯類、イヌ、および他のヒト検体で行った研究に基づいて、内分泌、血管、および糸球体細胞が富化されていると解っている亜画分B4を含む亜画分を生成した。1.063~1.091g/mLの浮遊密度を有する細胞の異なるバンドと思われるHK023の各独立UNFX検体からB4画分を別々に集めた。RNAを各検体から単離し、ポドシン糸球体細胞マーカーおよびPECAM内皮細胞マーカーの発現を定量リアルタイムPCRにより調べた。重篤FSGSの生検由来検体から予期されるように、画分中のポドシン糸球体細胞の存在に関し一貫性がなく、検体の2/4でポドシン検出不可であった。対照的に、PECAM血管細胞は、生検で惹起された培養物の4/4のB4画分で一貫して存在した。従って、B4画分は、重篤な疾患状態のヒト腎臓からの場合であっても、1.063~1.091g/mL密度範囲で単離できる。さらに、表7.2に示すように、ヒト検体HK018は、密度勾配遠心分離後のqRTPCRでは、ポドシン糸球体のマーカーが検出されなかった。実施例8-蛍光活性化セルソーターFACSを使った生存可能な腎臓細胞型の富化/枯渇蛍光活性化セルソーターFACSを使って、1つまたは複数の単離腎臓細胞を富化でき、および/または単離した1次腎臓組織から1つまたは複数の特定の腎臓細胞型を枯渇できる。試薬:70エタノール;洗浄緩衝液PBS;50:50腎臓細胞培地50DMEM高グルコース:50ケラチノサイト-SFM;トリパンブルー0.4;標的腎臓細胞集団、例えば、腎臓内皮細胞のためのCD31および腎臓糸球体細胞のためのネフリン、に対する一次抗体。対応するアイソタイプ特異的蛍光二次抗体;染色緩衝液PBS中0.05BSA。方法:生物学的安全キャビネットBSCを標準的手順で洗浄後、1次単離または培養細胞由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液をT500T/C処理フラスコに取り出し、腎臓細胞培地に再懸濁させて、氷上に置く。次に、トリパンブルー色素排除法を使って細胞数と生存率を測定する。例えば、異種起源の集団からの糸球体細胞または内皮細胞の腎臓細胞富化/枯渇に対しては、10~50e6個の少なくとも70の生存率の生細胞を得る。腎臓細胞の異種起源の集団を、次に、出発濃度1μg/0.1mlの染色緩衝液/1x106細胞必要に応じ力価の、標的細胞型特異的一次抗体で染色した。標的抗体は、例えば、CD31PE腎臓内皮細胞特異的と複合化できるが、例えば、ネフリン腎臓糸球体細胞特異的と複合化できない。その後、30分間、光から保護された4°Cの氷上で細胞を染色した。30分のインキュベーション後、細胞を300xgで5分間遠心分離して、洗浄した。次に、複合化アイソタイプ特異的二次抗体の必要性に応じ、PBSまたは染色緩衝液中にペレットを再懸濁した。細胞を蛍光色素複合化一次抗体で標識する場合は、10e7細胞当たり2mlのPBS中に細胞を再懸濁し、FACSariaまたは等価な細胞選別機で処理する。細胞を蛍光色素複合化抗体で標識しない場合は、1μg/0.1ml/1e6細胞の出発濃度のアイソタイプ特異的蛍光色素複合化二次抗体で細胞を標識する。次に、30分間、光から保護された4°Cの氷上で細胞を染色する。30分のインキュベーション後、細胞を300xgで5分間遠心分離して、洗浄した。遠心分離後、ペレットを5e6/mlPBSの濃度でPBSに再懸濁し、12x75mm当たり4mlを無菌のチューブに移す。FACsAriaをメーカーのインストラクションBDFACsAriaユーザーマニュアルに従って、生細胞無菌選別用に準備する。検体チューブをFACsAriaに装填し、データ取込開始後、PMT電圧を調整する。ゲートを特定の波長を使った蛍光の強度により腎臓の特異的細胞型を選択するように設定する。別のゲートを、陰性集団を選択するように設定する。所望のゲートを陽性標的集団および陰性集団を包含するように設定するとすぐに、メーカーのインストラクションに従って、細胞が選別される。陽性の標的集団を、1つの15mlコニカルチューブの集め、陰性集団を1mlの腎臓細胞培地を入れた別の15mlコニカルチューブに集める。収集後、各チューブからの検体を、フローサイトメトリーにより分析し、純度を測定する。集めた細胞を300xgで5分間の遠心分離により洗浄し、ペレットを腎臓細胞培地に再懸濁し、さらなる分析と実験に備える。実施例9-磁気細胞選別を使った腎臓細胞型の富化/枯渇1つまたは複数の単離された腎臓細胞を富化でき、および/または1つまたは複数の特定の腎臓細胞型を単離1次腎臓組織から枯渇できる。試薬:70エタノール、洗浄緩衝液PBS、50:50腎臓細胞培地50DMEM高グルコース:50ケラチノサイト-SFM、トリパンブルー0.4、操作緩衝液PBS、2mMEDTA、0.5BSA、リンス緩衝液PBS、2mMEDTA、洗浄溶液70v/vエタノール、MiltenyiFCRブロッキング試薬、いずれかのIgGアイソタイプに特異的なMiltenyiマイクロビーズ、標的抗体、例えば、CD31PECAMもしくはネフリン、または二次抗体。方法:生物学的安全キャビネットBSCを標準的手順で洗浄後、1次単離または培養由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎臓細胞培地に再懸濁する。細胞数および生存率をトリパンブルー色素排除法により測定する。異種起源の集団から、例えば、糸球体細胞または内皮細胞腎臓細胞の富化/枯渇のためには、少なくとも70の生存率の少なくとも10e6~4e9個の生細胞が得られる。最良の分離を行える富化/枯渇手法は、対象標的細胞に基づいて決定される。10未満の標的出現頻度の細胞の富化、例えば、ネフリン抗体を使った糸球体細胞、に対しては、MiltenyiautoMACSのPOSSELDS高感度モードのダブルポジティブ選択doublepositiveselection、または同等の計器プログラムが使われる。10超の標的出現頻度の細胞の枯渇に対しては、MiltenyiautoMACSのDEPLETES高感度モードの枯渇depletion、または同等の計器プログラムが使われる。15mlのコニカル遠心分離チューブに0.05BSAを含む1μg/10e6細胞/0.1mlPBSを加えることにより、生細胞を標的特異的一次抗体、例えば、糸球体細胞のためのネフリン腎生検ポリクローナル抗体、で標識し、続けて、4°Cで15分のインキュベーションを行う。標識後、細胞を洗浄して、10e7細胞当たり1~2mlの緩衝液を加え、続けて、300xgで5分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。洗浄後、アイソタイプ特異的二次抗体、例えば、0.05BSA含有1μg/10e6/0.1mlPBSのニワトリ抗ウサギPEを添加し、続いて、4°Cで15分のインキュベーションを行う。インキュベーション後、細胞を洗浄し、10e7細胞当たり1~2mlの緩衝液を加え、続けて、300xgで5分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。上清を取り出し、細胞ペレットを再懸濁した10e7全体細胞当たり60μlの緩衝液中に再検索後、10e7全体細胞当たり20μlのFCRブロッキング試薬を添加し、これをよく混合する。20μlのダイレクトMACSマイクロビーズ例えば、抗PEマイクロビーズを添加、混合し、4°Cで15分のインキュベーションを行う。インキュベーション後、標識容量の10~20xの緩衝液を添加し、300xgで5分間、懸濁液を遠心分離することにより細胞を洗浄し、細胞ペレットを10e8細胞当たり500μl~2mlの緩衝液に添加して再懸濁する。メーカーのインストラクションに従い、autoMACSシステムを洗浄し、autoMACSを使った磁気細胞分離のための準備をする。新規無菌収集チューブを出口の下に置く。autoMACS細胞分離プログラムを選択する。選別では、POSSELDSプログラムを選ぶ。枯渇に対しては、DEPLETESプログラムを選ぶ。標識細胞を取込ポートに挿入後、プログラムを開始する。細胞選別または枯渇の後に、検体を集め、使用まで氷上に置く。枯渇または選別された検体の純度をフローサイトメトリーで検証する。実施例10-正常および慢性疾患腎臓組織から治療可能性のある細胞を単離、増殖できる本調査の目的は、ハイコンテントアナリシスHCAによりヒトNKA細胞の機能的特性解析を行うことにあった。ハイコンテントイメージングHCIは、多くの検体全体に対し、2つ以上の蛍光プローブ多重処理を使って、複数の細胞下イベントの同時画像処理を提供する。ハイコンテントアナリシスHCAは、ハイコンテントイメージングで捕捉された複数の細胞パラメーターの同時定量測定を提供する。簡単に述べると、未分画UNFX培養物を生成しAboushwarebetal.、前出、2008、標準的生検手順を使って、進行性慢性腎疾患CKDおよび3つの非CKDヒト腎臓を含む5つのヒト腎臓から採取したコア生検とは独立に維持する。UNFXのエクスビボによる2継代後、細胞を採取し、密度勾配法実施例2のようにに供し、亜画分B2、B3、および/またはB4を含む亜画分を生成する。表10.1にまとめたように、ヒト腎臓組織を非CKDおよびCKDヒトドナーから入手した。図4は、HK17とHK19検体の病理組織学的特徴を示す。エクスビボ培養物を全ての非CKD3/3およびCKD5/5腎臓から生成した。対象領域ROIを規定するヒトNKA細胞のアルブミン輸送のハイコンテントアナリシスHCAを図5ヒトNKA細胞中のアルブミン輸送のHCAに示す。非CKDおよびCKD腎臓由来NKA細胞のアルブミン輸送の定量比較を図6に示す。図6で認められるように、アルブミン輸送は、CKD由来NKA培養物に易感染性ではない。尿細管富化B2および尿細管細胞枯渇B4亜画分の間のマーカー発現の比較分析を図7CK8/18/19に示す。尿細管富化B2および尿細管細胞枯渇B4亜画分の間の比較に基づくアルブミン輸送の機能分析を図8に示す。亜画分B2が近位の尿細管細胞中で富化され、その結果、アルブミン輸送機能の増加を示す。アルブミン取込:24ウエル、コラーゲンIVプレートBDBiocoat登録商標中で培養密度に成長させた細胞の培地を18~24時間の間、フェノールレッド不含で、無血清の1X抗真菌性/抗生物質および2mMグルタミン含有低グルコースDMEMpr-/s-/lgDMEMで置換した。アッセイ直前に、細胞を洗浄し、pr-/s-/lgDMEM10mMHEPES、2mMグルタミン、1.8mMCaCl2、および1mMMgCl2を使って30分間インキュベートした。細胞を25μg/mLローダミンコンジュゲート化ウシアルブミンInvitrogenに30分間暴露し、氷冷PBSで洗浄してエンドサイトーシスを停止させ、25μg/mLHoechst核染料含有2パラホルムアルデヒドで直ちに固定した。阻害実験に対しては、1μM受容体関連タンパク質RAPRayBiotech、Inc.、NorcrossGAをアルブミン添加の10分前に添加した。BDPathway登録商標855ハイコンテントバイオイメージャーBectonDickinsonを用いて顕微鏡画像処理および分析を行ったKelleyetal.AmJPhysiolRenalPhysiol.2010Nov;2995:F1026-39.EpubSep8、2010、を参照。結論として、HCAは、細胞レベルデータを与え、他のアッセイでは検出できない集団動力学、すなわち遺伝子またはタンパク質発現を示すことができる。アルブミン輸送HCA-AT機能の測定のための定量化可能なエクスビボHCAアッセイを利用して、ヒト腎臓尿細管細胞をヒトNKAプロトタイプの成分として特徴付けることができる。HCA-ATは、比較に基づく細胞機能の評価を可能とし、アルブミン輸送コンピテント細胞がヒトCKD腎臓由来NKA培養物中に保持されることを示した。また、NKA培養物、B2およびB4の特定の亜画分は、高められたアルブミン輸送活性を有する尿細管細胞富化画分であるB2とは、表現型と機能が異なることも示された。ヒトCKD由来B2細胞亜集団は、インビボでの効力を立証した上述げっ歯類B2細胞と表現型的に、また機能的に類似である。実施例11-腎臓再生の予測因子としてのマーカー発現この調査は、治療的生理活性1次腎臓細胞亜集団で処理した5/6腎摘出ラットにおける腎臓再生の予測因子としての幹細胞および前駆細胞マーカー発現に関する。根底にあるNKA処置が腎機能を改善するメカニズムは、特徴付けられつつある。NKA処置の作用機序に関する我々の調査は、細胞-細胞シグナル伝達、生着、および線維化経路に関する。本調査は、NKA処置が、-おそらく、動員腎臓幹細胞の動員による-器官固有の再生能力をどのようしてに高めることができるかについてに焦点を絞った。我々は、NKA処置5/6NXラットで観察された生存の延長および腎機能の改善は、特定の幹細胞マーカー分子の発現に関連していると仮定する。この調査では、CKDラット5/6腎摘出術モデルを使い、分子アッセイを採用して特定された、治療的生理活性1次腎臓細胞集団での直接注射に対し応答した、ラット5/6腎摘出腎臓内の常在性幹細胞および前駆細胞の動員を評価する。この細胞ベース治療は、主要幹細胞マーカーCD24、CD133、UTF1、SOX2、LEFTY1、およびNODALの転写物およびタンパク質の両方のレベルの上方制御に特異的に関連していることが観察された。上方制御は、注射の1週間後までに検出され、注射後12週までにピークに達した。幹細胞および前駆細胞マーカーの活性化は、未処理腎摘出対照に比べて、生存の増加と血清バイオマーカーの有意な改善に関連していた。材料および方法ラット由来1次腎臓細胞集団の単離:前述のように、ラットから1次腎臓細胞集団の単離を行ったAboushwarebetal.、前出、2008;Presnelletal.、2009FASEBJ23:LB143。インビボ調査の設計と分析:1次腎臓細胞集団の単離Presnelletal.TissueEngPartCMethods.2010Oct27.[印刷板に先行のEpub版]および5/6腎摘出CKDげっ歯類モデルの1次腎臓細胞亜集団の生理活性を評価したインビボ調査Kelleyetal.前出、2010の詳細記載。慢性腎疾患げっ歯類モデルにおいて、1次腎臓細胞の尿細管細胞富化亜集団が、生存を改善し、腎臓機能を強化することは、別のところで報告した。この調査では、ラット由来死体解剖時の組織を単離し、B2NKA1またはB2B4混合物NKA2で処置し、腎摘出Nxおよび疑似手術された非腎摘出ラット対照と比較した。図9および11ならびに表11.1では、NKA1とNKA2処置ラット由来のデータをプールした。毎週および死体解剖前に調査ラットから採取した血液検体の分析により全身性データを得た。表11.1は、疑似手術処置動物対照、n=3を示す;nx対照Nx、n3;B2細胞NKA1で処置した動物、n=7;B2B4細胞NKA2;n=7、に対する生存データを示す。調査の終了時点23~24週で、Nx動物のどれも残っていなかった。NKA処置動物は、未処置Nx対照に比較して、優れた生存割合であった。RNA単離、cDNA合成およびqRT-PCR:RNAを、最適切削温度OCT凍結培地中に埋め込んだ組織から以下のようにして単離した:組織ブロックを室温下に置き、OCT超過分を除き、次に、組織をPBS中に入れ、解凍させて、残されているOCTを取り除き、組織をPBSで3回洗浄した後、大まかに切断して、微量遠心チューブに分注した。次に、分注組織を乳棒を使って微粉砕し、RNAをRNeasyPlusMiniキットQiagen、ValenciaCAを使って、抽出した。RNAの健全性を分光光度計を使って測定し、SuperScript登録商標VILO登録商標cDNA合成キットInvitrogen、CarlsbadCAを使って、1.4μgに匹敵する多量のRNAからcDNAを生成した。cDNA合成後、200μlのdiH2O脱イオン水を添加し、最終容量を240μlにすることにより、各検体を1:6に希釈した。ABIのカタログにあるプライマーとプローブおよびABI-Prism7300リアルタイムPCRシステムAppliedBiosystems、FosterCityCAを使って、定量リアルタイムPCRqRT-PCRにより標的転写物の発現レベルを調査した。TaqMan登録商標GeneExpressionMasterMixABI、Cat4369016を使って増幅を行い、ペプチジルプロリル異性化酵素BPPIBを内在性対照として利用した。qRT-PCR反応:10μlMasterMix2X、1μlプライマーおよびプローブ20X、9μlcDNA、反応当たりの全容量:20μl。TaqMan登録商標プライマーおよびプローブを使って、各反応を以下のように設定した。ウェスタンブロット:OCT凍結培地に包埋した凍結全腎臓組織をタンパク質試料捕集に利用した。上述のようにOCTを除き、50mMトリスpH8.0、120mMNaCl、0.5NP40、およびプロテアーゼ阻害剤混合物RocheAppliedScience、IndianapolisINを含む緩衝液に揺動を加えながら室温で全組織の溶解を15分間行い、続けて、13,000RPMで10分間の遠心分離を行った。全上清液を集め、タンパク質濃度をBradfordアッセイにより測定した。検体当たり30μgのタンパク質を、NuPAGE登録商標Novex10Bis-TrisGelInvitrogenの各ウエルに添加して、SDSPAGEGelを行った。ゲルを200Vで40分間、MES泳動バッファーInvitrogen中で電気泳動を行った。その後、タンパク質をI-BlotsystemInvitrogenを使ってニトロセルロース膜に移し、0.1Tween-20TBS-Tシグマ、St.Louis、MO含有トリス緩衝食塩水中に溶解した15mLの4w/v低脂肪乳を使い、室温で2時間ブロッキングした。下記の抗体それぞれ、2w/v低脂肪乳を含む5mLTBS-Tで希釈で、膜を°室温下、一晩検出した:抗ヒトLefty-ALongおよびShortisoformRDsystemsMAB7461;抗ヒト、マウスおよびラットCD133AbcamAB19898;抗ヒトおよびマウスUTF1MilliporeMAB4337;抗ヒトNODALAbcamAB55676;抗ヒトおよびラットCDH11OBカドヘリンThermoScientificMA1-06306;抗ラットCD24BectonDickinson。膜を3回/各10分TBS-Tで洗浄し、次に、2w/v低脂肪乳1:60、000を含むTBS-Tで希釈した適切なHRPコンジュゲート二次抗体VectorLabsPI-2000;PI-1000を使って、室温で1.5時間検出した。膜をTBS-Tで3回/各10分洗浄し、続けて、diH2Oで10分の洗浄を2回行った。ブロットをECLAdvance化学発光試薬GEHealthcareLifeSciences、PiscatawayNJを使って発色させ、ChemiDoc登録商標XRS分子イメージャーおよびQuantityOne登録商標ソフトウェアBioRad、HerculesCAを使って可視化した。結果:5/6NXラットの常在性幹細胞および前駆細胞の動員を評価するための分子アッセイを開発、使用して、NKA処置に対するこれらのマーカーの経時応答を調査した。主要幹細胞マーカーCD24、CD133、UTF-1、SOX-2、LEFTY、およびNODALのmRNA転写物およびタンパク質両方のレベルの上方制御に特異的に関連することが認められた。上方制御は、注射後1週までに検出され、注射後12週までにピークに達した。幹細胞および前駆細胞マーカーの活性化は、未処置5/6NX対照動物に比べて、生存の増加と血清バイオマーカーの有意な改善すなわち、腎臓濾過の改善に関連していた。図9は、5/6NXラットのNKAによる処置後の宿主組織中のSOX2のmRNAの発現を示す。SOX2mRNA発現の経時分析により、移植後12週までに、NKA処置群でNx対照よりも1.8倍のSOX2mRNAの増加が認められた。移植後24週までに、Nx対照に比べNKA処置群でSOX2mRNA発現の2.7倍の増加が観察された。1週:対照疑似、Nx対照、および処置NKAに対し各n=312週:対照疑似およびNx対照に対しn=1;処置NKAに対しn=424週:対照疑似およびNx対照に対しn=1;処置NKAに対しn=4。は、p値=0.023または0.05未満を示す。図10は、疑似対照対照、Nx対照Nx、およびラット処置NKA1およびNKA2の処置後1、12および24週でのCD24、CD133、UTF1、SOX2、NODALおよびLEFTYの発現の経時変化を示すウェスタンブロットである。OCT凍結培地に包埋した凍結全腎臓組織各検体に対しN=1をタンパク質試料捕集のために利用した。負荷された全質量のタンパク質によりレーンを正規化した。NKA処置組織中のCD133、UTF1、NODAL、LEFTYおよびSOX2タンパク質レベルを全ての時点で、対照またはNxラットに比較して、評価した。図11は、再生応答指数RRIの経時変化を示す。個別タンパク質発現の濃度測定分析図10を使って、再生マーカータンパク質発現の定量的指数、または再生応答指数RRIを生成した。バンド強度を各ウェスタンブロットから、ImageJv1.4ソフトウェアNIHを使って計算し、値を各タンパク質の単位面積当たりに正規化した。各時点に対するウェスタンブロット分析に使用した5つのマーカーを集計して、疑似、Nx、およびNKA処置群に対し、平均強度を決定した。プロットは、1、12、および24週の時点から生成される平滑化ラインフィットと共にXY散布図を示す。各群の平均強度を時間に対してプロットし、幹細胞マーカータンパク質発現の宿主組織応答における傾向を強調した。各検体に対し同じ分散を仮定して、標準的な両側スチューデントt-検定を使って統計的分析を行った。95の信頼区間p値<0.05を使って、統計的有意性を求めた処置NKA群n=2;対照疑似群n=1;Nx対照群n=1。疑似対照動物では、RRIは、90.47から処理後24週の81.89まで、わずかな減少のみ示す。対照的に、5/6Nx対照由来の腎臓は、基本的に逆の応答を示し、処置後1週の82.26から動物の死亡時点である処置後18週の140.56までRRIが増加する。NKA処置動物では、RRIは、処置後1週の62.89から処置後12週の135.61に急速に増加し、処置後24週までに112.61まで低下する。NKA処置は、幹細胞マーカーCD24、CD133、UTF-1、SOX-2およびNODALの宿主組織中の転写物およびタンパク質の両方のレベルの上方制御に関連していることが観察された。上方制御は、処置後1週までに検出され、処置後12週までにピークに達した。宿主組織中の幹細胞および前駆細胞マーカーの全体活性化は、未処置腎摘出対照に比べて、生存の増加1および臨床関連血清バイオマーカーの改善と関連していた。NKA処置に応答した常在性幹細胞および前駆細胞集団の動員は、損傷腎臓組織および器官構造の再生による5/6NX動物の腎臓機能の回復に寄与する可能性がある。従って、この調査で使用した分子アッセイは、CKDに対する生体組織工学および再生医学療法を評価するための直接的で、迅速かつ予測的な再生結果アッセイを提供する可能性がある。実施例12-マイクロRNA含有1次腎臓細胞由来エキソソーム我々は、再生結果を得る機序を解明するためのインビボ調査の設計に繋げるために、特定のエキソソーム由来miRNAと、標的細胞における機能的に関連した結果とをインビトロで関連付けるよう努めてきた。方法:馴化培地の再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に与える効果について、商業的に利用可能は細胞:HK-2ヒト近位尿細管細胞株、1次ヒト腎臓糸球体間質細胞HRMC、およびヒト臍帯内皮細胞HUVECを使って調査を行った。ヒトおよびラット1次腎臓細胞培養物UNFX由来馴化培地中のエキソソーム由来RNA含有物を、既知miRNAを検出するように設計したPCRベースアレイにより選別した。低酸素は、エキソソーム排出sheddingに影響すると報告されている;そのため、培養群を、培地採集の前の24時間の間、低酸素2O2に暴露した。エキソソームをFACSにより細胞性壊死組織片と分離した。図12は、UNFX馴化培地の調製と分析に対する模式図を示す。結果:UNFX馴化培地は、再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に影響することが明らかになった;これらの応答は、非馴化培地を使った対照では観察されなかった。特に、NFκB免疫応答および上皮間葉転換線維化応答がHK-2細胞で低下し、PAI-1線維化応答がHRMC細胞で低下し、さらに、血管新生がHUVECで促進された。UNFX馴化培地由来エキソソーム含有物のPCRアレイ選別による予備的データは、UNFXがUNFX馴化培地に対する観察された応答と一致するmiRNA配列を含むエキソソームを産生することを示している。図13A~Cは、UNFX培養物由来馴化培地が、再生結果に関連する可能性のある複数の細胞プロセスにインビトロで影響することを示す。NFkBシグナル伝達は、腎疾患のプロセスの主要炎症性メディエーターとして提案されておりRanganetal.、2009.FrontBiosci12:3496-3522;Sanzetal.、2010.JAmSocNephrol21:1254-1262、また、腫瘍壊死因子TNFにより活性化されうる。HK-2細胞は、非馴化培地左またはUNFX馴化培地右で、37°C、1時間プレインキュベートされ、その後、10ng/mlのTNFαのある場合とない場合で活性化が行われた。図13Aは、UNFX馴化培地がNF-kBのTNF-α媒介活性化を弱めることを示す。NFkB活性化は、RelA/p65免疫蛍光染色緑により測定した。Hoechst対比染色核青およびファロイジン染色繊維状アクチン赤がRelA/p65核局在化白色矢印の評価を容易にする。図13Bは、UNFX馴化培地が、HUVEC細胞培養物の血管新生促進作用を増やすことを示す。HUVEC細胞ウエル当たり100,000個を、0.5BSA添加培地200中に入れた重合マトリゲルの上に重ねて入れた。非馴化培地左またはUNFX馴化培地右を添加し、細胞組織化応答を、画像キャプチャを使って3~6時間の間、目視によりモニターした。細胞遊走白色矢頭、整列化黒色矢頭、尿細管形成赤色矢頭、および閉じ多角形の形成アスタリスクの細胞組織化に対し印を付けた。UNFX馴化培地は、非馴化培地に比べて、より多くの尿細管および閉じ多角形を誘導し、培地中に血管新生促進因子が存在することを示唆している。図13Cは、UNFX馴化培地が、上皮細胞中の線維形成経路を弱めることを示す。HK-2細胞は、インビトロで形質転換増殖因子TGFに暴露した場合、上皮の特性を失い、間葉表現型を獲得し、腎臓の線維形成の進行に関連する上皮間葉転換EMTを再現するZeisbergetal.2003NatMed9:964-968。HK-2細胞を、非馴化培地CTRL、10ng/mlTGFβ1TGFβ1含有非馴化培地、または10ng/mlTGFβ1TGFβ1CM含有UNFX馴化培地中で72時間培養した。細胞のCDH1上皮のマーカー、CNN1間葉マーカーおよびMYH11間葉マーカーを定量RT-PCRによりアッセイした。馴化培地は、CDH1、CNN1、およびMYH11遺伝子発現により測定して、TGFβ1誘導EMTの程度を低減させる。エラーバーは、3回の反復実験の平均標準誤差SEMを表す。図13Dは、そのまま放置すれば、細胞外マトリックスタンパク質の進行性蓄積につながる可能性がある、TGFβ1およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1により形成される陽性のフィードバックループを示すSeoetal.、2009.AmJNephrol30:481-490。図14A~Bは、糸球体間質細胞における線維形成経路の減弱を示す。対照CTRLまたは5ng/mlTGFβ1の添加の有る場合と無い場合-のUNFX馴化培地UNFXCM中で、HRMCを24時間培養した。PAI-1のウェスタンブロット分析は、UNFXCMが、TGFβ1誘導PAI-1タンパク質レベルの増加を弱めることを示す。β-アクチンは、ローディングコントロールとして示される。ヒト腎臓糸球体間質細胞HRMCは、5ng/mlTGFb1の存在下、増加したレベルのPAI-1を発現する。ヒト生理活性腎臓細胞由来馴化培地CMとの共培養は、TGFb1誘導されたPAI-1タンパク質発現を低下させる。mRNAレベルでのPAI-1発現のCMによる変化は生じないデータは示さず。図14Bは、ラット生理活性腎臓細胞由来CMには、培養HRMC誘導および非誘導-に与える、TGFb1と類似の効果があったことを示す。遠心分離後採集したCM上清枯渇ラットCMは、PAI-1発現の低下に関し有効性が低く、PAI-1タンパク質の観察された減弱化の原因のCM成分は、ラット生理活性腎臓細胞による小胞分泌に関連している可能性があることを示唆している。図15は、UNFX由来馴化培地が、分泌小胞を含むことを示す。図15Aは、分泌小胞エキソソームを含むを示し、これは、細胞質由来内部成分緑を包含する二相脂質構造赤である。ホスファチジルセリン青三角形は、小胞生合成中に細胞外の空隙中に暴露される膜の成分であるTheryetal.、2010.NatRevImmunol9:581-593。PKH26およびCFSEは、それぞれ、分泌小胞の脂質膜および細胞質を標識しAliottaetal.、2010.ExpHematol38:233-245、一方、アネキシンVはホスファチジルセリンに結合する。図15B~Cは、FACS選別を示す。UNFX馴化培地をPKH26、CFSE、およびAPCコンジュゲートアネキシンVで標識し、蛍光支援細胞選別FACSにより選別した。分泌小胞を表すトリプルポジティブ粒子を集め、トリゾール試薬を使って全体RNAを抽出した。市販の利用可能なRT-PCRベースアレイを使って、既知の配列に対しマイクロRNA含量物を選別した。表12.1は、治療結果が予想されるマイクロRNAを含む分泌小胞を示す。UNFX細胞は、既知のmiRNA配列を含むエキソソームを放出する。UNFX馴化培地は、機能的に関連するヒト細胞株の再生応答に影響を与える。検出miRNAと観察された再生応答の間の原因と効果の関係は、鋭意調査中であるが、現在までに得られた結果から、UNFX細胞が、miRNAの標的細胞と組織へのエキソソーム媒介輸送による治療に関連するパラクリン効果をもたらす可能性があることが示唆される。このデータは、生理活性腎臓細胞培養由来分泌小胞が、TGFb1/PAI-1フィードバックループにより誘導されるPAI-1を弱める成分を含むという結論を支持する。マイクロアレイおよびRT-PCR分析:Lewisラット由来未分画UNFX生理活性腎臓細胞を、基本培地DMEMおよびKSFMの50:50混合物;血清または補充薬品なし中で、低酸素条件2O2下、24時間培養した。馴化培地を集め、100,000xg、4°C、2時間の条件で超遠心分離を行い、分泌小胞例えば、微小胞、エキソソームをペレット化した。得られたペレットから全体RNAを抽出し、既知マイクロRNA種に対し、リアルタイムRT-PCRによりアッセイしたラットマイクロRNAゲノムV2.0PCRアレイ;QiagenMAR-100A。下記のmiRNAを検出可能である。実施例13-生理活性腎臓細胞由来パラクリン因子この調査では、我々は、インビトロ細胞ベースアッセイを採用し、生理活性腎臓細胞がプラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1PAI-1等のメディエーターにより線維形成を調節できると思われるパラクリン機序を調査した。材料と方法:馴化培地を、生理活性腎臓細胞Aboushwarebetal.、WorldJUrol26、295、2008;Presnelletal.2010、前出のラットおよびヒトの血清と補充物質不含条件の培養物から集め、インビトロアッセイに利用した。インビトロアッセイでは、市販品として利用可能なラットおよびヒト由来糸球体間質細胞を宿主応答組織の代用試薬として使った。理由は、糸球体間質細胞は、傷害または病気の腎臓中のPAI-1産生のソースであるためであるRerolleetal.、KidneyInt58、1841、2000.。PAI-1遺伝子およびタンパク質発現を、それぞれ、定量RT-PCRおよびウェスタンブロットでアッセイした。細胞により培地中に排出された小胞粒子例えば、エキソソームを高速遠心分離により集めWangetal.、NucAcidsRes2010、1-12doi:10.1093/nar/gkq601、July7、2010、トリゾール試薬Invitrogenを使って全RNAをペレットから抽出した。小胞のRNA含有物を、既知のマイクロRNA配列のPCRベースアレイQiagenを使って選別した。結果:生理活性腎臓細胞培養由来の馴化培地は、TGFβ1誘導による糸球体間質細胞中のPAI-1定常状態タンパク質レベルの増加を弱めたが、定常状態mRNAレベルに影響を与えなかった。これは、マイクロRNAが標的遺伝子を調節するという機序と一致する観察であった。マイクロRNAが細胞外の小胞輸送により細胞間を移動できるという仮説Wangetal.、前出、2010に基づき、我々は、馴化培地のマイクロRNA含有物を分析し、PAI-1阻害剤と推定されるマイクロRNA30b-5pmiR-30b-5pの存在を確認した。ここに提示のデータは、生理活性腎臓細胞が、エキソソーム経由miR-30b-5pの標的糸球体間質細胞への細胞間移動により線維形成を直接調整できることを示唆している。糸球体間質細胞によるmiR-30b-5p取込の結果として、定常状態PAI-1タンパク質レベルでのTGFβ1誘導増加を弱め、腎臓組織において、最終的に糸球体の空隙内の細胞外マトリックスの析出を減らす応答を弱める。現在、PAI-1が実際にmiR-30b-5pを直接に標的にすることを確認するための調査が進行中である。図14A~Bは、対照CTRLまたはTGFβ1の培地への添加のある場合と無い場合-の生理活性腎臓細胞馴化培地CMで24時間培養したヒト糸球体間質細胞中のPAI-1とα-アクチン対照タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。CTRL培養では、TGFβ1がPAI-1タンパク質発現を増加させた。CM培養では、TGFβ1-誘導応答が減弱した。分泌小胞について、PAI-1の推定抑制因子であるマイクロRNAを分析した。ヒトおよびラット生理活性腎臓細胞CM由来分泌小胞を高速遠心分離により集め、既知の配列のPCRベースアレイを使って、マイクロRNA含有物をアッセイした。miR-449a、PAI-16の推定制御因子、を特定した。HRMCは、一時的にmiR-449aを形質移入したか、または形質移入しなかったCTRL。形質移入24時間後に、細胞を、さらに24時間、5ng/mlTGFb1に暴露するか、または暴露しなかった-。図16Aは、総タンパク質を調製し、PAI-1とβ-アクチンをアッセイしたウェスタンブロットを示す。miR-449aは、定常状態PAI-1タンパク質レベルを減らしレーン1~レーン3を比較、PAI-1タンパク質の誘導レベルもまた、miR-449a形質移入培養物で低下したレーン2~レーン4を比較。このデータは、分泌小胞がmiR-449aを含み、miR-449aの糸球体間質細胞中への取込は、PAI-1発現を低下させるという結論を支持する。図16Bは、マイクロRNAであるmiR-30b-5pを示し、これも、PCRベースアレイで特定され、予測アルゴリズムhttp://mirbase.org-miRBaseは、英国マンチェスター大学生命工学部FacultyofLifeSciencesで運営、維持されているに基づいたPAI-1の推定制御因子である。糸球体中のPAI-1タンパク質レベルを、5/6腎摘出術により生理活性腎臓細胞で誘導されたCKDの処置後、インビボで調査した。図17A~Cは、片側腎摘出術A、5/6腎摘出術B、または5/6腎摘出術と生理活性腎臓細胞の腎臓内送達Cを受けたLewisラット腎臓のPAI-1の代表的免疫組織化学像A~Cを示す。処置Cの結果、5/6腎摘出術式Bの結果としての糸球体矢頭中のPAI-1の蓄積が減少した。別の調査では、死体解剖時に採取した腎臓組織に対しqRT-PCRを行い、相対的遺伝子発現値を調査日数に対しプロットした。図17Dは、5/6腎摘出ラット赤正方形が、生理活性腎臓細胞青菱形および偽手術された対照緑三角形で処置されたものに比べ、より強力なPAI-1の発現を立証したことを示す。図17Eは、処置後3ヶ月および6ヶ月で採取された腎臓検体の代表的ウェスタンブロット分析を示す。5/6腎摘出ラットNxの処置組織NxTxは、PAI-1とフィブロネクチンFNタンパク質の蓄積が減少したKelleyetal.2010、前出。このデータは、5/6腎摘出術により誘導されたCKDの生理活性腎臓細胞による処置後、インビボで糸球体中のPAI-1タンパク質レベルが減少するという結論を支持する。まとめると、実施例12~13は、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する1つの機序は、常在性腎臓細胞の線維化経路を調節する成分の細胞間移動を経由する可能性があるという仮説を支持する。実施例14-生理活性腎臓細胞由来分泌因子がNFκBシグナル伝達経路を弱めるこの調査では、我々は、5/6腎摘出術モデルの疾患進行のNKA媒介減弱化におけるNFκB経路の役割を調査し、また、NFκB活性化の直接調節による再生結果に対し寄与できる生理活性腎臓細胞の特性を特定することを検討した。図17Gは、TNFαによるNFkB経路の標準的活性化を示す。材料と方法:残遺物腎臓を、PBS中のB2B4NKAプロトタイプでの処置の6週前に2段5/6腎摘出術式を行ったLewisラットから採取した。NKA処置TXまたは未処置UNTX組織に対し、免疫組織化学、RT-PCR、ウェスタンブロット分析、および電気泳動移動度シフトアッセイEMSAによりNFκB活性化をアッセイした。血清および補助剤不含培地中で成長させたエクスビボNKA細胞培養物から集めた馴化培地CMをインビトロ機能性アッセイ用に使った。ヒトの近位尿細管細胞株HK-2を、分子および免疫蛍光法ベースアッセイ読み取りのための標的細胞型として使用した。細胞により培地中に排出された小胞粒子エキソソームを高速遠心分離により集めた。エキソソームから単離された全RNAを既知マイクロRNA配列のPCRベースアレイQiagenを使って選別した。結果:5/6腎摘出ラット由来残遺物腎臓中にNFκBサブユニット、RelA/p65の核局在化が観察され、UNTX組織中の炎症経路の活性化を示唆する。RT-PCRによるTX組織との予備的比較により、RelA遺伝子発現の現象が示され、NKA処置がRelA/p65発現の抑制を介してNFκB経路活性化に影響する可能性があることが示唆された。この仮説は、CM腫瘍壊死因子αTNFαに対する応答に比べ、暴露HK-2細胞中のRelA/p65の核局在化の低減図17Fからも明らかなように、CMがTNFα誘導NFκB活性化をインビトロで弱める観察により支持される。進行中のNKAエキソソームマイクロRNAのRT-PCR分析では、NFκB経路に影響することが既知の配列が存在するか否かを調査している。図17Fは、免疫蛍光アッセイで、NKACMに対する2時間暴露が、TNFαで前処置された対照培養物中に比べ、HK-2中のNFκBp65緑の核局在化を減らすことを示す。InHK-2では、NFkBp65緑は、TNFα対照培地への暴露30分後、核に局在化する。しかし、HK-2細胞のNKA馴化培地によるTNFα添加の前の2時間の前処置が、NFkBp65核局在化応答を弱めた。核をDAPI青で染色し、繊維状アクチンをAlexa594-ファロイジン赤で染色して、NFκB核局在化の強さの定性的評価を支援する組み合わせパネル中最下段のTNFα処置対照細胞の少し薄くなったファロイジン境界に注意されたい。対比染色は、組み合わせ画像中のNFkB局在化に対する基準を与える。Lewisラットの腎臓組織中のNFkBp65サブユニットの免疫組織化学は、5/6腎摘出術パネルBにより惹起された進行性CKDの動物では、対照動物パネルAの片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べて、より強力なNFkBp65サブユニットの核局在化が、特に尿細管上皮細胞黒の矢頭中で起こることを示す。腎摘出術後6週で採取した組織。倍率200X。パネルC:5/6腎摘出術を受けたLewisラット腎臓組織の細胞質Cおよび核Nタンパク質抽出物中のNFkBp65のウェスタンブロット分析。チューブリンレベルローディングコントロールが相対的に一定である1週と13週の比較では、核のNFkBp65は、時間経過と共に増加し、免疫組織化学結果と一致する。パネルD:核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイEMSAにより、5/6腎摘出術後に核に局在化するNFkBは、DNA結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で2つの動物から調製された核抽出物を表す。NFkB経路は、慢性腎疾患の5/6腎摘出術モデルにおいて徐々に活性化される。Lewisラットの腎臓組織中のNFkBp65サブユニットの免疫組織化学分析を行った。図18A~Dは、5/6腎摘出術パネルBにより惹起された進行性CKDの動物では、対照動物パネルAの片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べ、NFkBp65サブユニットのより強い核局在化が、特に尿細管上皮細胞黒色矢頭中で、発生することを示す。腎摘出術後6週に採取した組織。倍率200X。図18Cは、5/6腎摘出術を受けたLewisラット腎臓組織の細胞質Cおよび核Nタンパク質抽出物中のNFkBp65のウェスタンブロット分析を示す。チューブリンレベルローディングコントロールが相対的に一定である1週と13週を比較すると、核のNFkBp65は、時間経過につれ増加し、免疫組織化学結果と一致する。図18Dは、核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイEMSAを示し、5/6腎摘出術後に核に局在化するNFkBは、DNA結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で2つの動物から調製された核抽出物を表す。1mgの核タンパク質を5ngのNFkBDNA結合部位と共にインキュベートし、6DNA遅延ゲルで電気泳動を行い、続けて臭化エチジウムで染色した。NKA細胞の腎臓内送達がNFkB核局在化を減らす:複数の確定腎臓細胞亜集団を単離し、CKDの5/6腎摘出術モデルの腎機能の改善におけるインビボで生理活性をアッセイしたPresnelletal.2010、前出。NKA細胞は、生理活性を示したが、一方、他の亜集団は生理活性を示さなかったKelleyetal.2010前出。図18Eは、NKAAまたは非生理活性腎臓細胞Bの腎臓内注射を受けた確定CKDのLewisラットを示す。確定CKDのLewisラットは、NKAAまたは非生理活性腎臓細胞Bの腎臓内注射を受けた。処置後6ヶ月で、組織を採取し、免疫組織化学によりNFkBp65サブユニットをアッセイした。NKA処置動物由来組織は、非生理活性腎臓細胞で処理した動物由来組織に比べ、より少ないNFkBp65の核局在化を、特に近位尿細管中で示し、NKA処置がインビボでNFkB経路活性の低減に寄与したことを示唆する。ヒトおよびラットNKA馴化培地から高速遠心分離で単離された分泌小胞の既知配列のPCRベースアレイを使ったマイクロRNA含有物の分析により、NFkBを介して免疫応答に影響を与えることができるいくつかのマイクロRNA種を、文献の報告MarquezRTetal.2010AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol298:G535;TaganovKDetal.2006ProcNatlAcadSciUSA103:12481、または予測アルゴリズムhttp://mirbase.org-miRBaseは、英国マンチェスター大学生命工学部FacultyofLifeSciencesで運営、維持されているに基づいて特定した。インビボおよびインビトロ知見は、どのようにして、生理活性腎臓細胞NKAが、免疫応答経路、例えば、NFkB活性化により影響を受けた経路を調節することにより慢性疾患腎臓の腎機能を改善できるかに関する洞察を与える。活性化NFkBp65核局在化、特に近位尿細管細胞中では、5/6腎摘出術げっ歯類モデルの慢性腎疾患の形成に関連し、NKA処置により弱められる。近位尿細管細胞HK-2のNKA馴化培地に対するインビトロ応答は、NKA処置に応答したNFkB核局在化のインビボ減弱化を模倣する。NFkB活性化に対する細胞間抑制の推定メディエーターマイクロRNAがNKA馴化培地中で特定された。まとめると、これらのデータは、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する1つの機序は、常在性腎臓細胞の免疫応答を調節する成分、例えば、RNAの細胞間移動を経由している可能性があるという仮説を支持する。実施例15-NKA構築物の機能評価ゼラチンまたはHAベースヒドロゲル上に播種した腎臓細胞集団は生存可能であり、トランスクリプトーム、プロテオミクス、セクレトームおよび共焦点免疫蛍光法アッセイにより測定して、3日間のインビトロ成熟の間、尿細管上皮機能性表現型を維持した。NKA構築物が疾患状態に影響する可能性のある機序を調べるため、CKD進行に付随する尿細管間質性線維形成に関係するTGF-βシグナル伝達経路に対する馴化培地の効果を評価した。馴化培地は、ヒト近位尿細管細胞株HK2中でのインビトロTGF-β-誘導上皮間葉転換EMTを弱めることが観察された。材料と方法生体材料:生体材料を、ビーズ同種構成の球形状として、または粒子ギザギザの縁のある異種起源集団として、調製した。PercellBiolyticaÅstorp、スエーデンにより製造されたゼラチンビーズCultispherSおよびCultispherGLをそれぞれ、Sigma-AldrichSt.Louis、MOおよびFisherScientificPittsburgh、PAから購入した。架橋HAおよびHA/ゼラチンGlycosanBioSystems、SaltLakeCity、UTからのHyStem登録商標およびExtracel登録商標粒子を、メーカーのインストラクションに従って作成した凍結乾燥スポンジから形成した。ゼラチンSigma粒子を架橋、凍結乾燥スポンジから形成した。PCLをSigma-AldrichSt.Louis、MOから購入した。PLGA50:50をDurectCorp.Pelham、ALから購入した。PCLおよびPLGAビーズを修飾二重エマルジョンW/O/W溶媒抽出法を使って調製した。PLGA粒子を、溶媒キャスト孔物質溶出solventcastingporogenleaching技術を使って調製した。全ビーズおよび粒子は、ドライ状態で測定した場合、65~355μmの間であった。細胞の単離、調製および培養:研究目的のためのヒト組織の使用を管理する全てのNIHガイドラインを順守して、死体ヒト腎臓をNationalDiseaseResearchInstituteNDRIから入手した。イヌの腎臓を契約研究機関Integraから入手した。ラット腎臓21日齢LewisをCharlesRiverLabsMIから入手した。1次腎臓細胞集団UNFXおよび全ラット、イヌおよびヒト腎臓由来の確定亜集団B2の調製については、以前記載したAboushwarebetal.WorldJUrol264:295-300;2008;Kelleyetal.前出、2010;Presnelletal.WO/2010/056328。簡単に述べると、腎臓組織を4.0ユニット/mLディスパーゼStemCellTechnologies、Inc.、VancouverBC、Canadaおよび300ユニット/mlコラゲナーゼIVWorthingtonBiochemical、LakewoodNJを含む緩衝液中で酵素により解離させ、次に、赤血球および壊死組織片を15イオジキサノールOptiprep登録商標、AxisShield、Norton、MAを使って遠心分離により取り除き、UNFXを得た。UNFX細胞を組織培養物処理ポリスチレンプレートNUNC、RochesterNY上に播種し、50:50培地、高グルコースDMEM:5FBS、2.5μgEGF、25mgBPE、1XITSインスリン/トランスフェリン/亜セレン酸ナトリウム培地補充剤、および抗生物質/抗真菌剤全てInvitrogen、CarlsbadCAから入手含有ケラチノサイト無血清培地KSFMの1:1混合物中で培養した。B2細胞を、UNFX培養物から遠心分離により、げっ歯類16、13、11、および7、イヌ16、11、10、および7、またはヒト16、11、9、および7用に特別に層別化した4段イオジキサノールOptiPrep;非補充KSFM中60w/v密度勾配を使って単離したPresnelletal.国際公開第2010/056328号;Kelleyetal.、前出、2010。勾配を800xgで20分間、室温で遠心分離したブレーキ無し。対象のバンドをピペットで取り出し、無菌の燐酸塩緩衝食塩水PBSで2回洗浄した。細胞/生体材料複合体NKA構築物:生体材料上での細胞機能のインビトロ分析のために、均一層の生体材料上述のように調製されたを、6ウエル低接着性プレートの1つのウエル上に重ねたCostar3471、Corning。ヒトUNFXまたはB2細胞ウエル当たり2.5x105を生体材料上に直接播種した。イヌの細胞の生体材料への付着性を調べるために、2.5x106のUNFX細胞を、非接着性24ウエルプレートCostar3473、Corning中の50μlの圧縮容積packedvolumeの生体材料に播種した。ロッキングプラットフォーム上で4時間経過後、イヌのNKA構築物を37°Cの5CO2インキュベーター中で一晩成熟させた。翌日、生死染色アッセイキットInvitrogenを使い、メーカーのインストラクションに従って生死染色を行った。ラットNKA構築物を60ccシリンジ中で、ローラーボトル回転装置を使って1RPMの回転速度で調製した。下記のトランスクリプトーム、セクレトーム、およびプロテオミクス分析のために、NKA構築物を3日間成熟させた。その後、細胞をトランスクリプトームまたはプロテオミクス分析用に採取し、馴化培地をセクレトームプロファイリング用に集めた。尿細管細胞関連酵素活性の機能分析:24ウエルプレートに入れたイヌのNKA構築物10μlの緩い圧縮容積を前に報告の方法Tateetal.MethodsEnzymol113:400-419;1985から改良したロイシンアミノペプチダーゼLAP活性用のアッセイを使って評価した。簡単に述べると、0.5mlのPBS中の0.3mML-ロイシンp-ニトロアニリドSigmaを室温で1時間かけてNKA構築物に添加する。ウエルを二通りに検体採取し、405nmの吸光度をLAP活性の測定値として記録した。LLC-PK1細胞ライセートアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関ATCCを陽性対照とした。トランスクリプトームプロファイリング:RNeasyPlusMiniキットQiagen、CAを使ってポリアデニル化RNAを抽出した。濃度と健全性をUV分光光度法により測定した。SuperScriptVILOcDNA合成キットInvitrogenを使って、1.4μgの単離RNAからcDNAを生成した。市販品で利用可能なプライマーおよびプローブ表15.1、ならびに、ABI-Prism7300RealTimePCRSystemAppliedBiosystems、CAを使って、標的転写物の発現レベルを定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応qRT-PCRにより調査した。TaqManGeneExpressionMasterMixABI、Cat4369016および内在性対照としての役目をするTATAボックス結合タンパク質遺伝子TBPを使って、増幅を行った。各反応は、10μlMasterMix2X、1μlプライマーおよびプローブ20Xならびに、9μlcDNAから構成される。試料を3回反応させた。セクレトームプロファイリング:ヒトNKA構築物由来馴化培地を集め、-80°Cで凍結した。検体のバイオマーカー濃度定量化による評価を行った。馴化培地中の所与のバイオマーカー濃度の結果を対照培養物生体材料の無い場合の2D培養物由来の馴化培地中の同じバイオマーカーの濃度に対して正規化し、単位のない比率として表した。プロテオミクスプロファイリング:3つの独立した複写物を細胞/生体材料複合体からタンパク質を抽出し、2Dゲル電気泳動法による分析用としてプールした。全試薬は、Invitrogenから入手した。200μlのZOOM2Dタンパク質溶解剤1CatZS10001に再懸濁した30μgのタンパク質、ZOOM両性電解質担体pH4~7CatZM0022、および2MDTTCat15508-013をpH4~7ZOOMIEFストリップCatZM0012に加えて等電点電気泳動IEFを行った。500Vで18時間の電気泳動後、SDS-PAGE分離のために、IEFストリップをNuPAGENovex4~12Bis-TrisZOOMIPGウエルゲルCatNP0330BOXにロードし、200Vで45分間、MES緩衝液CatNP0002中で電気泳動を行った。タンパク質を、SYPRORubyタンパク質ゲル染色CatS-12000を使い、メーカーのインストラクションに従って可視化した。共焦点顕微鏡観察:ヒトもしくはラットUNFXまたはB2細胞から調製したNKA構築物を3日間成熟させ、その後、2パラホルムアルデヒドで30分間固定した。固定されたNKA構築物をブロッキングし、D-PBSInvitrogen0.2トリトンX-100Sigma中の10ヤギ血清Invitrogenを用いて室温RTで1時間のインキュベーションにより透過処理した。免疫蛍光法に対しては、NKA構築物を、室温下、5μg/mlの最終濃度で一晩、一次抗体表15.2で標識した。標識NKA構築物を2ヤギ血清/D-PBS0/2トリトンX-100で2回洗浄し、5μg/mlの濃度のヤギまたはウサギTRITCコンジュゲート抗マウスIgG2AInvitrogen二次抗体と共にインキュベートした。DBAドリコス豆凝集素によるに二重標識に対しては、NKA構築物候補を、2ヤギ血清/D-PBS0.2トリトンX-100中で2mg/mlの濃度に室温で2時間希釈したFITCコンジュゲートDBAVectorLabsと共にさらにインキュベートした。検体をD-PBSで2回洗浄し、LSMImageソフトウェアZeissまたはPathway855共焦点顕微鏡BDBiosciencesを利用したZeissLSM510レーザー走査共焦点システムCellularImagingCore、WakeForestBaptistMedicalCenter、を使って、光学的に薄片を作った。HK2細胞中のTGF-β媒介EMTの分析:フィブロネクチンまたはコラーゲンIVコート培養皿BDBiosciencesに入れた50:50培地中でHK2細胞ATCCを培養した。EMTアッセイに対しては、50:50培地または2次元2DヒトUNFX培養物から、もしくは培地採取の前2日間熟成したヒトUNFXで作ったNKA構築物から集めた馴化培地と共に、HK2細胞を24ウエルコラーゲンIVコートプレートに70~80の培養密度で播種した。EMTアッセイ用細胞からのRNAの単離の前に、10ng/mlを3日間培地に加えることによりTGF-β誘導を惹起した。3日間のインキュベーション期間の終わりに、E-カドヘリンの相対的発現上皮マーカーおよびカルポニン間葉マーカーをqRT-PCRで分析することにより、EMTをモニターした。採取したHK2細胞から、TaqManqRT-PCR分析用RNAを上述のように調製した。各検体の等分散を仮定して、標準的両側スチューデントt検定を使って、統計的分析を行った。95p値<0.05および99p値<0.01の信頼区間を使用して統計的有意性を求めた。無細胞生体材料およびNKA構築物のインビボ移植:Lewisラット6~8週齢をCharlesRiverKalamazoo、MIから購入した。全実験工程をCarolinasMedicalCenterのPHSとIACUCガイドラインに従って、実施した。イソフルラン麻酔下で、雌Lewisラット約2~3月齢に正中切開を行い、左腎臓を露出させた。35μlの圧縮生体材料無細胞の生体材料またはNKA構築物を微量注入により腎実質中に導入した。2つの注射経路を使用した:i各極から皮質の方向へ皮質注射と呼ぶ、またはii腎臓正中から骨盤の方向へ髄質注射と呼ぶ。注射後1、4、または8週でラットを屠殺した。早期死は発生しなかった。無細胞移植調査の調査計画を表15.3に示すND=実施せずnotdone。腎臓組織:代表的腎臓検体を集め、10緩衝液ホルマリン中に24時間置いた。徐増濃度のエタノール中で切片を脱水し、パラフィン中に包埋した。切片5μmを切りだし、帯電スライド上に置き、標準的染色プロトコルProphetetal.、ArmedForcesInstituteofPathology:組織工学における実験室的手法Laboratorymethodsinhistotechnology.Washington、DC:AmericanRegistryofPathology;1992に従って、ヘマトキシリンとエオシンHE染色、Massonのトリクローム染色および過ヨウ素酸シッフPAS染色処理を行った。DigitalSightDS-U1カメラを備えたNikonEclipse50i顕微鏡を使ってx40、x100およびx400の全倍率のディジタルマイクロ写真をキャプチャした。腎臓形態学変化を通常使われるShackelfordetal.ToxicolPathol301:93-96;2002重症度グレード体系グレード1、2、3、4により評価し、これに対し、記述用の用語最小、軽度、中等度、重度/重篤を適用して、観察された糸球体硬化症、尿細管萎縮症および拡張症、尿細管円柱、および間質性線維症、ならびに炎症の程度を記載した。結果生体材料の腎実質中への注射に対する哺乳類腎臓組織の応答:健康なラット腎臓への直接注射により、生体材料の腎臓細胞/生体材料複合体としての使用の可能性を分析した表15.3。組織応答を、注射後1および4週目の病理組織学パラメーター炎症、線維形成、壊死、石灰化/鉱質化および生体適合性パラメーター生体材料分解、新血管新生、および新組織形成の程度を測定することにより評価した。図19A~Bは、移植後1週目の生体材料のインビボ評価を示す。トリクロームX10:生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームX40:生体材料凝集体の拡大像。HEX400:細胞/組織浸潤の程度を評価するための生体材料凝集体高倍率像。材料と方法のところで記載するように、各腎臓の2つの部位で注射した。移植後1週目では、各試験生体材料により誘導された宿主組織応答は、通常、類似であったが、ゼラチンヒドロゲルは、より少ない程度の病理組織学的応答、およびより多い生体適合性応答を誘発するように思われた。図19Cは、移植後4週目の生体材料のインビボ評価を示す。移植後4週目で、HAまたはゼラチン粒子を注射した組織の病理組織学パラメーターの重症度は、移植後1週目に比べて、定性的に減少した。ゼラチン粒子は、ほぼ完全に再吸収され、HA粒子を受けた組織の場合より少ない巨細胞反応が観察された。大抵のケースで、生体材料が髄質注射経路で注射された場合例えば、髄質/骨盤中へより深く、水腎症の原因となる閉塞、より高い重症度の炎症反応、および梗塞の原因となる腎臓細動脈と毛細管微小塞栓、等の望ましくない結果が観察されたデータは示さず。治療に関連のある生体材料を含む腎臓細胞集団の機能表現型の評価:腎実質への直接注射後の慢性腎疾患のげっ歯類モデルで、生存を延長し、腎機能を高める治療に関連のある腎臓細胞集団UNFXを特徴づけPresnelletal.国際公開第2010/056328号;Kelleyetal.前出、2010、それらの単離、キャラクタリゼーション、および増殖の方法を開発し、複数の種間へ適用したPresnelletal.2010、前出。NKA構築物に組み込まれた場合、優先的に尿細管、上皮表現型に付着するのか、生存可能なそれらのまま残るのか、およびそれらを保持するのかどうかを判断するために、UNFX細胞および種々の生体材料から産生したNKA構築物に対し、トランスクリプトーム、セクレトーム、プロテオミクス、および共焦点免疫蛍光法顕微鏡分析を行った。付着性および生存率:イヌの由来UNFX細胞をゼラチンビーズ、PCLビーズ、PLGAビーズ、HA粒子、およびHA/ゼラチン粒子と共に記載したように生体材料当たり3NKA構築物播種した。播種の1日後、細胞分布および生存率を生死染色により評価した。図20A~Dは、イヌのUNFX細胞を播種したNKA構築物の生死染色を示すA=ゼラチンビーズ;B=PCLビーズ;C=HA/ゼラチン粒子;D=HA粒子。緑は生細胞を示す;赤は死細胞を示す。Aゼラチンビーズ;BPCLビーズ;CHA/ゼラチン粒子;およびDHA粒子。生存可能な細胞は、全ヒドロゲルベースNKA構築物で観察されうる。UNFX細胞は、天然由来ヒドロゲルベース生体材料、例えば、ゼラチンビーズおよびHA/ゼラチン粒子A、Dの黒色矢印に強く付着したが、合成PCLBまたはPLGAビーズには最小の付着性を示したデータは示さず。細胞は、HA粒子Cに付着しなかったが、生物学的応答の証拠すなわち、スフェロイド形成が認められた。ヒドロゲルベースNKA構築物上での播種UNFX細胞の機能生存率をロイシンアミノペプチダーゼ、近位尿細管関連加水分解酵素をアッセイすることにより確認したデータは示さず。トランスクリプトームプロファイリング:ヒドロゲルベースNKA構築物生体材料当たり3NKA構築物およびUNFX細胞のパラレル2D培養物中でのヒトUNFX細胞の遺伝子発現プロファイルを定量トランスクリプトーム分析により比較した。図20E~Gは、NKA構築物のトランスクリプトームプロファイリングを示す。TC:2D培養した1次ヒトUNFX細胞。ゼラチン:ヒトUNFX細胞とゼラチンヒドロゲルから構成されるNKA構築物。HAゲル:ヒトUNFX細胞とHA/ゼラチン粒子から構成されるNKA構築物。qRT-PCRデータをグラフと表フォーマットで示した。調査した転写物は、4つの主要カテゴリーに分けられる:i尿細管:アクアポリン2AQ2、E-カドヘリンECAD、エリスロポエチンEPO、N-カドヘリンNCAD、チトクロムP450、ファミリー24、サブファミリーA、ポリペプチド1-別名;ビタミンD24-ヒドロキシラーゼCYP、キュビリン、ネフリン;ii間葉:カルポニンCNN1、平滑筋ミオシン重鎖SMMHC;iii内皮:血管内皮細胞増殖因子VEGF、血小板内皮細胞付着分子PECAM;およびiv糸球体:ポドシン。全体として、尿細管マーカー発現は、ヒドロゲルベースNKA構築物と2DUNFX培養物の間で同程度であった。同様に、内皮マーカーVEGFとPECAM波動程度であった。対照的に、糸球体マーカーポドシンは、NKA構築物の間で有意な差異を示した。HA/ゼラチンベースNKA構築物中のポドシンレベルは、2DUNFX培養物で観察されたレベルに極めて類似していた。興味深いことには、間葉マーカーCNN1とSMMHC発現は、2DUNFX培養物に比べて、ヒドロゲルベースNKA構築物中で、有意に下方制御されp<0.05、腎臓培地配合物中のヒドロゲルベースNKA構築物の場合と同様に、UNFXの線維芽細胞亜集団は増殖できないことが示唆される。セクレトームプロファイリング:ヒトUNFXおよびB2細胞ならびにゼラチンまたはHA/ゼラチンヒドロゲルを使ってNKA構築物を産生した細胞型当たり、生体材料当たり、1NKA構築物=全体で4NKA構築物。図21A~Bは、NKA構築物のセクレトームプロファイリングを示す。データは、3D:2D比率として提示している。材料と方法に記載のように、ヒトUNFXまたはB2細胞およびゼラチンヒドロゲル1またはHA/ゼラチンヒドロゲル2ヒドロゲルからNKA構築物を産生した。セクレトームプロファイリングを、3日間熟成したNKA構築物由来馴化培地に対し行い、NKA構築物3次元、すなわち3D、培養の分析物発現の2D培養物に対する比率3D:2D比率を計算することにより、ヒトUNFXまたはB2細胞のパラレル2D培養物と比較した。UNFX細胞で播種した3つのNKA構築物のそれぞれで、3D:2D比率は、1であるか、または1に近く、これらの生体材料上の播種工程および3日間の成熟は、UNFX細胞のセクレトームプロファイルに、ほとんど影響しなかったことを示唆している。B2細胞を播種したNKA構築物に対しては、3D:2D比率が1または1に近いという類似の結果が観察され、これらの生体材料上の播種工程および3日間の成熟は、治療に関連する腎臓細胞のセクレトームプロファイルには、ほとんど影響を与えなかったという追加の証明を提供する。プロテオミクスプロファイリング:所与の細胞または組織のプロテオミクスプロファイルが2Dゲル電気泳動法を使って全体細胞タンパク質を分離することにより作成され、腎疾患に関連する特異的バイオマーカーを特定するために使用されてきたVidaletal.ClinSciLond1095:421-430;2005。図22A~Bは、NKA構築物のプロテオミクスプロファイリングを示す。NKA構築物を、示したように、ヒトUNFX細胞および生体材料を使って産生した。総タンパク質量抽出物中のタンパク質を、材料と方法に記載されるように、2Dゲル電気泳動法により分離した。この実験では、プロテオミクスプロファイリングを使って、NKA構築物ゼラチンまたはHA/ゼラチンヒドロゲルベース、生体材料当たり3NKA構築物および2D組織培養物中のヒトUNFX細胞におけるタンパク質発現を比較した。NKA構築物またはUNFX細胞の2D培養物から単離された総タンパク質量のプロテオームプロファイルは、基本的に、同じであり、これらの生体材料上の播種工程および3日間の成熟は、UNFX細胞により発現されたプロテオームには、ほとんど影響を与えなかったという追加の証明を提供する。共焦点顕微鏡観察:NKA構築物中のラットおよびヒトB2細胞Presnelletal.2010、前出の尿細管上皮表現型の保持を、確立したバイオマーカーの共焦点画像処理により評価した:図23A~Cは、NKA構築物共焦点顕微鏡像を示す。ヒトAまたはラットB、CB2細胞およびゼラチンヒドロゲルを使って産生されたNKA構築物の共焦点顕微鏡像。AE-カドヘリン赤-中実白色矢印、DBA緑-点線緑矢印およびゼラチンヒドロゲルビーズは、DIC光学を使って可視化される。BDAPI染色により可視化されたDNA青-中実白色矢印および次のそれぞれ緑色のマーカー点線白色矢印:IgG対照、N-カドヘリン、E-カドヘリン、サイトケラチン8/18/18、DBA。Cマーカーの二重標識像および色表示。ヒトNKA構築物中のE-カドヘリンおよびDBA、ならびに、ラットNKA構築物中のE-カドヘリン、DBA、N-カドヘリン、サイトケラチン8/18/19、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼGGT-1、およびメガリン。共焦点像の光学的切片作成により、また、播種および3日間の成熟後の生体材料中への細胞浸潤の程度の評価が可能となる。ヒトおよびラットNKA構築物中のB2細胞は、複数の尿細管上皮マーカーの発現を示した。光学的切片は、ヒドロゲル構築物の最小の細胞浸潤を示し、細胞は、通常生体材料の表面に限定されていた。NKA構築物プロトタイプの移植に対するインビボ応答:腎実質への生体材料の注射に対するインビボ応答、ならびに、上述のNKA構築物中のUNFXおよびB2細胞のインビトロ表現型および機能キャラクタリゼーションに基づいて、ゼラチンヒドロゲルを選択して、健康なLewisラットにおける腎実質へのNKA構築物の注射に対するインビボ応答を評価した。NKA構築物を同系B2細胞から産生し、2匹の動物へ移植した。これらの動物は、移植後1、4、および8週で屠殺した。全動物が腎臓組織切片の採取予定の死体解剖時まで生存し、切片作成を行って、トリクローム、ヘマトキシリンおよびエオシンHE、ならびに過ヨウ素酸シッフPASで染色した。図24A~Bは、移植後1および4週目のNKA構築物のインビボ評価を示す。トリクロームX10:生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームX40:生体材料凝集体の拡大像。HE/PASX400:細胞/組織浸潤の程度を評価するための生体材料凝集体の高倍率像。各腎臓は、材料と方法で記載のように、2つの部位に注射された。図24Aは、移植後1週目のNKA構築物のインビボ評価を示す。注射後1週目で、ゼラチンビーズは、好塩基性染色した球状で多孔性の材料の局所的凝集体として存在し左パネル、丸で囲んだ領域、多くの血管結合組織および食細胞の多核マクロファージや巨細胞に取り囲まれていた。血管結合組織を、ビーズ内に組み込み、新腎臓組織形成を示す尿細管上皮成分を提示した。さらに、尿細管および血管糸球体vasculoglomerular構造を形態学により特定したPASパネル。図24Bは、移植後4週目のNKA構築物のインビボ評価を示す。注射後4週までに、ヒドロゲルは完全に再吸収され、空隙は進行性腎臓再生および最小の線維形成を伴う修復により置換された4週トリクロームパネル中の円で囲んだ領域内の多数の機能性尿細管に注意されたい。図25A~Dは、移植後8週目のNKA構築物のインビボ評価を示す。トリクロームX10:生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームX40:生体材料凝集体の拡大像。HE/PASX400:細胞/組織浸潤の程度の評価のための生体材料凝集体高倍率像。A中等度の慢性炎症マクロファージ、血漿細胞およびリンパ球、顕著な血管結合組織応答Massonのトリクロームによる青色染色-黒色矢印を伴う中程度の数のヘモジデリン沈着マクロファージ注射による慢性出血;B新腎臓組織形成と一致する再生応答誘導を示すAのボックスで囲んだ領域のさらに高い倍率トリクローム染色、x400C近接正常な腎実質の代表例で、典型的皮質糸球体形態HEを示す、x400;DHE染色切片、x400処置領域で観察された新糸球体形態vs.図154Cの比較。図25A~Dは、移植後8週目のNKA構築物のインビボ評価を示す。移植後8週目で、腎形成における初期のイベントの誘導と同じ新腎臓様組織形成の証拠が観察された。再生誘導B、Dの領域と近接皮質実質Cの比較により、複数のS-形状体および新規形成糸球体の存在が示された。NKA構築物由来馴化培地のHK2細胞中のTGF-β誘導EMTに与える効果:CKDの進行の間の尿細管間質性線維形成の発生は、尿細管上皮細胞のTGF-β媒介EMTと関連があるZeisbergetal.AmJPathol1606:2001-2008;2002。また、進行性CKDのげっ歯類モデルにおいて、TGF-β経路の減弱化がインビボで観察され、UNFXおよびB2細胞を使った処置により生存が延長され、腎機能が改善されたPresnelletal.国際公開第2010/056328号。ヒト近位尿細管細胞株HK2は、TGF-β誘導EMTに対する小分子またはタンパク質の刺激または阻害効果を試験するためのインビトロモデルシステムとして充分確立されているDudasetal.NephrolDialTransplant245:1406-1416;2009;Hillsetal.AmJPhysiolRenalPhysiol2963:F614-621;2009。移植後腎臓組織応答に対するNKA構築物の影響に関する可能な機序を検討するために、UNFX細胞とヒドロゲルから産生したNKA構築物から集めた馴化培地をHK2EMTアッセイシステムで評価した。図26は、NKA構築物由来の馴化培地がHK2細胞中のTGF-β誘導EMTをインビトロで弱めることを示す。ECAD上皮およびCNN1間葉マーカーの相対発現を定量化することによりEMTをモニターした。表示のように、50:50培地対照およびTGFB対照検体またはヒトUNFX細胞TCもしくはヒトUNFX細胞の2D培養物およびゼラチンもしくはHA/ゼラチンから産生されたNKA構築物由来の馴化培地CM中でHK2細胞を培養した。EMTを誘導するために、10ng/mlTGF-βをアッセイ前の3日間、各検体対照を除くに添加した。HK2細胞を50:50培地対照中で培養した場合、CNN1間葉マーカーより高レベルでECAD上皮マーカーが発現した。TGF-βを3日間、培地に添加する場合TGFB対照、ECAD発現は、CNN1の上方制御と同時に、有意に下方制御され、EMTイベントの誘導と一致する。2DUNFX細胞培養由来馴化培地は、HK2細胞のTGF-βTCCMに対するEMT応答を有意に弱めたECADおよびCNN1の両方に対しp<0.05。NKA構築物ゼラチンCMおよびHA/ゼラチンCM由来の馴化培地も、また、TGF-βに対するEMTの応答を弱めた;しかし、全体的効果は、2DUNFX細胞培養由来馴化培地で観察された効果より小さかった両方のNKA構築物でのECADに対しては有意p<0.05で、対照の方に近づく傾向があるが、CNN1に対しては統計的に有意でない。追加の間葉マーカーを選別し、類似の結果を得たデータは示さず。これらのデータは、NKA構築物が、細胞ベース処置Presnelletal.国際公開第2010/056328号で観察されたものと類似の形式で、尿細管間質性線維形成に関連するTGF-β経路にインビボで影響を与える可能性があることを示唆している。これらのデータは、また、インビボ応答がインビトロEMT応答と統計的に有意な関連性があり、それにより、時間のかかる、高価なインビボアッセイの必要性を低減可能性があることを立証できるなら、インビトロEMTアッセイは、NKA構築物のバイオセラピューティック効力の選別/最適化/モニタリング対する適用の可能性があることを示唆している。この調査は、合成および天然生体材料、無細胞および生理活性腎臓細胞/生体材料複合体すなわち、NKA構築物の両方の移植に対する哺乳類腎実質の応答を検討した。インビトロ機能アッセイおよびインビボ再生結果の組み合わせを解析し、NKA構築物プロトタイプ中への組み込みを可能にするために、候補生体材料を機能的に選別した。無細胞のヒドロゲルベース生体材料の腎実質への移植図19は、通常、最少の線維形成または慢性炎症、および移植後4週まで壊死の形跡のないことに繋がっている。最少の残遺物生体材料と共に中等度の細胞/組織の内成長および新血管新生が観察された。これらのインビボデータに基づいて、ヒドロゲルベース生体材料を選択し、NKA構築物を産生して、これを使ってインビトロ生体機能性およびインビボ再生可能性を評価した。材料生体適合性のインビトロでの確認をNKA構築物の生死分析により行った図20。ゼラチン含有ヒドロゲルは、1次腎臓細胞集団の強い付着性に関連していた。生理活性1次腎臓細胞集団UNFXまたはB2およびヒドロゲル生体材料から産生したNKA構築物の表現型および機能分析は、尿細管上皮細胞表現型の維持の継続と一致する。NKA構築物のトランスクリプトーム、セクレトーム、プロテオミクス、および共焦点顕微鏡分析により、2D培養で播種した1次腎臓細胞に対する有意差が無いことが確認された。最終的に、ヒドロゲルベースNKA構築物の健康な生体げっ歯類の腎実質への移植は、最少の炎症性および線維化応答、ならびに移植後8週までの新腎臓様組織の再生に結びついていた。まとめると、これらのデータは、再生応答がNKA構築物によりインビボで誘導されたことを示唆する証拠を与える。これらの調査は、治療的に効果のある1次腎臓細胞/生体材料複合体の移植に対する哺乳類腎臓の生物学的応答の最初のインビボ腎臓内調査を意味する。観察結果は、NKA構築物が、新腎臓組織の再生の促進、および非再生例えば、修復治癒応答の減弱化の両方に対する潜在能力を有することを示唆している。ポリマー材料の移植に対する哺乳類腎臓の生物学的応答:別の調査では、げっ歯類腎臓に関し、天然および合成生体材料の腎臓内注射に対する宿主組織応答を調査し、生理活性腎臓細胞集団との細胞/生体材料複合体の形成のための候補生体材料を評価したPresnelletal.前出、2010。方法:天然生体材料には、ゼラチンおよびヒアルロン酸HAを含めた。合成生体材料には、ポリカプロラクトンPCLおよび乳酸グリコール酸共重合体PLGAを含めた。候補生体材料を2種の別々の物理形態:同種の球状ビーズまたは異種起源で非均一粒子、で評価した。PCLおよびPLGAビーズを修飾二重エマルジョン乳剤水/オイル/水溶媒抽出法を使って調製した。ゼラチンビーズは、購入したCultispher-S登録商標、Sigma-Aldrich、St.Louis、MO。PLGA粒子を溶媒キャスト孔物質溶出技術を使って調製した;ゼラチンおよびHA粒子を架橋および凍結乾燥した発泡体から調製した。35μlの緩く圧縮充填した生体材料を2回の注射で3月齢Lewisラットの左腎実質に送達した。炎症、組織/細胞内成長、新血管新生、材料分解、および繊維と細胞の応答に関する0無しから4重度までの重症度の半定量分類スコアを使って、注射後1週および4週の腎臓組織のホルマリン固定切片の病理組織学的評価を行った。総合スコアは、陰性応答に対する陽性応答の比率として計算した総合スコアが高いほど、優れた結果となる。結果:生体材料候補に対する病理組織学的評価-移植1週後採取し、切片をMassonのトリクロームで染色した代表的な腎臓の40X像データは示さず。天然起原、例えば、ゼラチンおよびHAのポリマーから構成される材料は、合成生体材料、例えば、PLGAおよびPCL器質性線維状被包形成に比べて、より穏やかな繊維と細胞の応答および慢性炎症、ならびにより大きい細胞内成長、新血管新生、生体材料分解、ならびに組織治癒および組織集積に要求される必然的な炎症と関連していた。病理組織学的評価スコアリングの要約:スコアは、材料組成で平均化した平均±SD。合成材料PLGAおよびPCLは最低スコアになり、ゼラチン材料は、通常、HA材料より高いスコアになった。この傾向は、4週の時点で最も際立っている。材料の注射に関係の無い要因のために、必ずしも全ての1週目の試験検体が4週目の分析に利用可能ではなかった。ゼラチン、HA、および合成群に含まれる標本数は、それぞれ、1週目で、3、4、3であり、4週目で2、3、1である。注射により組織応答を誘発した健康な腎実質に送達された天然起原の生体材料例えば、ゼラチンまたはHAは、半定量病理組織学的評価により測定して、注射後4週目で、合成起原に比べ、病的な状態はより少なかった。実施例16-培養ヒト腎臓細胞の低酸素暴露が細胞遊走および付着のメディエータを誘導し、尿細管細胞単層の修復をインビトロで促進する慢性腎疾患CKDモデルの立証された治療機能を有する腎臓上皮細胞選択集団B2の単離および機能における酸素圧力の役割を調査した。この調査では、処理中の低酸素暴露が選択されたヒトの選択腎臓細胞SRCまたは生理活性腎臓細胞BRCの組成および機能を変えるのか否かを調べた。2酸素への暴露に際し、以下が観察された:密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化Presnelletal.国際公開第10/056328号を参照;この特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、全体の勾配後収率の改善、酸素により調節される遺伝子発現Kelleyetal.前出、2010、で以前に報告の調節、エリスロポエチン、VEGF、HIF1アルファ、およびKDRVEGFR2の発現増加。処理中の低酸素への暴露は、選択生理活性腎臓細胞の傷害性尿細管を修復/再生する能力を高める。図27は、細胞を処理中に低酸素へ暴露する手順を示す。図28は、2酸素に暴露に際し、下記が観察されたことを示す:密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化、全体の勾配後収率の改善。低酸素暴露<3は、大気酸素圧力21に比べて、培養ヒトCKD由来腎臓細胞のイオジキサノールベース密度勾配からの回収率を増加させ96vs.74、また、選択細胞B2の高密度>9イオジキサノール画分への相対的配分を増加させた21.6vs.11.2。競合的インビトロアッセイは、B2細胞の低酸素性条件への24時間の事前暴露は、21酸素圧力で培養したB2細胞よりも、傷害性腎臓の近位尿細管単層培養物の修復に対しより高い能力を有し、傷害の2時間以内に修復の発生が58.6±3であったことを示した。図29Aは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。1.細胞を蛍光染料で標識する2酸素、21酸素、およびHK2尿細管細胞。2.尿細管細胞単層を作成し、創傷を与えた。3.酸素暴露標識細胞を添加2および21暴露細胞。それらを、20,000/cm2で均等に播種する。培養は、無血清培地中、5O2で24時間行う。4.創傷を修復する細胞を定量する。図29B-定量画像解析BDPathway855BioImager-赤色円=2O2で培養細胞、青色円=21O2培養。図29C-2酸素誘導細胞がより急速に付着し2時間、24時間わずかな優位性を持続することが観察された。2酸素で誘導された細胞は、尿細管上皮単層の修復に対し、より大きな能力を有する。図30Aは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。1.細胞を蛍光染料で標識する。2.8μm孔径のトランスウエルインサートの底部に尿細管細胞単層を形成し、創傷を与えた。3.インサートを反転し、酸素暴露標識細胞を添加する2および21酸素暴露細胞。それらに、50,000/cm2で均等に播種する。培養は、無血清培地中、5O2で24時間行う。4.創傷を修復する細胞を定量する。図30Bは、2酸素暴露細胞による誘導により、非誘導21酸素に比べ、遊走および創傷修復が強化されたことを示す。図30Cは、遊走時間に対し遊走細胞のをプロットしたものである。細胞の平均数および細胞の平均パーセンテージは、表16.1に示されている。低酸素は、また、CXCR4、MMP9、ICAM1、およびジストログリカンのmRNA発現も誘導した;これらは、細胞遊走および付着を媒介する遺伝子である。MMP9の局所的蓄積および細胞の細胞膜へのコネキシン43凝集体の増加が免疫細胞化学手法により確認された。図31Aは、オステオポンチンが尿細管細胞により分泌され、傷害に対する応答で発現上昇することを示すオステオポンチン免疫細胞化学:Hoechst核染色青、オステオポンチン赤、10x。オステオポンチンは、分泌リン酸化糖タンパク質であるKellyetal.JAmSocNephrol、1999。オステオポンチンは、免疫蛍光図31AおよびELISA図31Bにより示されるように、尿細管中で発現し、付着および遊走に関与する。オステオポンチンは、尿細管細胞単層中に形成された傷害により発現上昇する。図32Aは、細胞の遊走応答が、一部は、オステオポンチンにより媒介されることを示す緑=遊走細胞5x。図32Bは、オステオポンチンに対する中和抗体NAbが腎臓細胞遊走応答を50減らすことを示す。図33は、細胞低酸素誘導が組織リモデリング遺伝子の発現を調節することを示す。カベオリン1は、インテグリンシグナル伝達の調節に関与する足場タンパク質である。MMP9は、細胞外のマトリックス分解を介して遊走を促進するメタロプロテアーゼである。ICAM1は、上皮細胞運動性に関連する細胞間接着分子である。CXCR4は、細胞遊走を媒介するケモカイン表面受容体である。図34は、腎臓再生に繋がる低酸素による細胞の生理活性増強に対する推定機序を示す。まとめると、これらの結果は、低酸素下暴露が尿細管傷害のインビトロ修復に対する立証された生理活性を有する特異的腎臓細胞亜集団の単離を促進し、その結果、これらの細胞のインビボ送達の後に患部組織へ遊走し生着する能力を潜在的に高めることができることを示唆する。SRCは、進行性CKDのげっ歯類モデルの腎機能を安定化させ、生存を延長する能力を立証した。低酸素レベル2O2は、下記を提供した:選択再生細胞の培養後回収率の増加;尿細管傷害に応答した細胞付着および単層修復の強化;ならびに尿細管傷害に応答した細胞遊走の刺激。さらに、細胞遊走および付着は、一部は、オステオポンチンによりインビトロで媒介された。低酸素は、組織リモデリング、遊走、および細胞間情報伝達を媒介するインテグリン、分泌タンパク質、および細胞接着分子を発現上昇させた。実施例17-尿由来微小胞尿中に排出された腎臓由来微小胞の内腔含有物内に含まれるmiRNAおよびタンパク質の分析を行い、再生結果を評価するためのバイオマーカーとして使用可能かどうかを判定した。過剰微小胞が細胞外の空隙に排出されるに従い、一部は隣接細胞と融合し、他のものは、尿中に分泌されるZhouetal.2008.KidneyInt.745:613-621。これらの尿中の微小胞は、今度は、処置結果のより良い理解に向けたアッセイ開発のための優れたバイオマーカーになる。ZSF1慢性進行性腎不全の代謝疾患のげっ歯類モデルを使用した。B2B4細胞をZSF1動物の腎実質に注射した。健康な動物およびPBS溶媒を対照として使用した。尿由来小胞を、以下にまとめたように、種々の時点で分析した。1:ZSF1動物-PBS溶媒注射;注射後197日に尿採取2:ZSF1動物-PBS溶媒注射;注射後253日に尿採取3:ZSF1動物-B2B4画分注射;注射後197日に尿採取4:ZSF1動物-B2B4画分注射;注射後253日に尿採取5.ZSF1動物-注射なし;調査の197日目に尿採取6.ZSF1動物-注射なし;調査の253日目に尿採取7.健康動物-注射なし;調査の197日目に尿採取8.健康動物-注射なし;調査の253日目に尿採取処置後197日目および約253日目に試験動物から尿を採取した。当技術分野で既知の標準的な方法により尿から微小胞を回収した例えば、Zhouetal.KidneyInt.2008September;745:613-621、を参照。図35の標準的ウェスタンブロッティングで示されるように、処置動物の尿から回収された微小胞レーン3~4は、溶媒処置レーン1~2または未処置対照レーン5~8に比較して、前駆細胞関連タンパク質CD133およびWNT7Aの増加を示した。実際、微小胞は、微小胞特異的タンパク質CD63の発現図35により示されるように、病気の動物の尿レーン1~6のみから回収され、健康な対照レーン7~8からは回収されなかった。CD133含有微小胞は、腎臓細胞から排出されたプロミノソームprominosomeであるように見える。CD133およびWNT7Aの両方は、再生および幹細胞分裂に関連するとされてきたRomagnaniPandKalluriR.2009.FibrogenesisTissueRepair.21:3;Lieetal.2005.Nature.4377063:1370-5;Willertetal.2003.Nature.4236938:448-52;Lietal.2009.AmJPhysiolRenalPhysiol.2976:F1526-33。まとめると、このことは、再生をモニターするように設計されたアッセイ開発のために、微小胞中でバイオマーカーとして発現したタンパク質を標的とすることを支持する。miRNAマイクロアレイおよびRT-PCR:尿由来の小胞由来miRNAのマイクロアレイおよびRT-PCR分析を当技術分野で既知の標準的な方法により行った例えば、Wangetal.前出、2010、参照。タンパク質に加えて、miRNAは、単離された微小胞の含有物中にも見つかった。表17.1は、処置により増加することが解ったmiRNAの例を示す。B2B4で処置したZSF1動物のmiRNAの変化を経時的に分析した197日目および253日目。何倍というレベルの変化が以下のmiRNAで観察された:B2B4で処置したZSF1動物253日目のmiRNAレベルを分析し、PBS溶媒で処置したZSF1動物253日目のmiRNAレベルと比較した。何倍というレベルの変化が以下のmiRNAで観察された:B2B4で処置したZSF1動物197日目のmiRNAレベルを分析し、PBS溶媒で処置したZSF1動物197日目のmiRNAレベルと比較した。何倍というレベルの変化が以下のmiRNAで観察された:表17.1に挙げたmiRNAは、組織再生に関連するプロセスに結びつけられているmiRNAの例を提供する。miR-15bは、BCL-2およびカスパーゼ調節を介してアポトーシスの調節Guoetal.2009.JHepatol.504:766-78、ならびにサイクリンの調節を介して細胞周期進行Xiaetal.2009.BiochemBiophysResCommun.3802:205-10に結びつけられている。miR-21は、生存経路MAPK/ERKを調節することによりアポトーシスを阻害することが示された。miRNAのmiR-30ファミリーは、有足細胞構造および機能にとって重要で、増加が糸球体形成に必要である可能性があることを示唆している。miR-141、200a、200cおよび429は、全て、線維形成を減らす可能性のあるTGF-βシグナル伝達に対し応答した上皮から間葉への転換EMTの調節に関与するSaaletal.2009.Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.18:317-323。miR-146aおよび151は、NFκB調節に関係づけられ、従って、インビボで炎症反応を減らす可能性があるTaganovetal.2006.ProcNatlAcadSciUSA.10333:12481-6;Griffiths-Jonesetal.2006.NAR.34DatabaseIssue:D140-D144。まとめると、これらのmiRNAは、成功している再生結果に関連するプロセスを調節する;従って、それらをアッセイ開発のための候補バイオマーカーとする。全体的に見て、このデータは、尿中の微小胞および/またはそれらの内腔含有物が再生アッセイ用の実行可能な標的であるという構想を支持する。理由は、それらが、処置のモニタリングの非侵襲的手段を開業医に提供することに加えて、TGFβ-1、NFκB、アポトーシス、細胞分裂、および多分化能、等の複数の経路を調節することができるタンパク質およびmiRNAを含むからである。"