"aサルモネラinvA遺伝子標的DNAの存在を確認するために、試料を提供する段階と、b配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット並びに配列番号5及び6のプライマーセットからなる群から選択されるサルモネラinvA遺伝子標的DNAにアニーリングすることができる増幅プライマーセットを提供する段階と、c前記サルモネラ標的DNAに実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列、並びに検出可能な標識を含むプローブを提供する段階と、d増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液;RNaseH活性、及びプローブが存在し、かつ前記プローブ内のRNA配列が、前記サルモネラ標的DNAのPCR切片内の相補的なDNA配列とRNA:DNAヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、第1増幅プライマーと第2増幅プライマーとの間のPCR切片を増幅させる段階と、e前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的DNAの存在を示すことである段階と、を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法。前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブと、前記PCR切片の鎖のうち一つとの間に形成されるヘテロデュプレックスが、RNaseHによって切断されることから由来することを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブは、FRET対で標識されたことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記増幅緩衝液は、Tris酢酸塩緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記PCR切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseH活性であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記RNaseH活性は、ホットスタートRNaseH活性であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記試料は、食品試料を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記試料は、表面採取試料を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。前記試料内の核酸は、ウラシル-N-グリコシラーゼ前処理されることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記ウラシル-N-グリコリラーゼは、PCR増幅前に不活性化されることを特徴とする請求項13に記載の方法。前記プローブは、配列番号7,13または14の配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。aサルモネラinvA標的RNAの存在を確認するために、試料を提供する段階と、b配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセットならびに配列番号5及び6のプライマーセットからなる群から選択される、サルモネラinvA標的核酸配列にアニーリングすることができるフォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーのセットを提供する段階と、c検出可能な標識、及び前記サルモネラ標的RNAのcDNAに実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階と、d逆転写酵素活性及び前記リバース増幅プライマーの存在の下で、サルモネラinvA標的RNAを逆転写し、標的cDNA配列を生成する段階と、e前記プローブ内のRNA配列が、PCR切片内の相補的な配列とRNA:DNAヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、前記標的cDNA配列、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液;RNaseH活性、及びプローブが存在下で、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーと間のPCR切片を増幅させる段階と、f前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的RNAの存在を示すことである段階と、を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法。前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブのRNA配列と、前記サルモネラ標的RNAのcDNA配列との間に形成されるヘテロデュプレックスが、RNaseHによって切断されることから由来することを特徴とする請求項16に記載の方法。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記プローブは、FRET対で標識されたことを特徴とする請求項16に記載の方法。前記増幅緩衝液は、Tris酢酸塩緩衝液を含むことを特徴とすることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記PCR切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性であることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記RNaseH活性は、ホットスタートRNaseH活性であることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記試料は、食品試料を含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。前記試料は、表面採取試料を含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。前記試料内の核酸は、ウラシル-N-グリコシラーゼ前処理されることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記ウラシル-N-グリコリラーゼは、PCR増幅前に不活性化されることを特徴とする請求項28に記載の方法。前記プローブは、配列番号7,13または14の配列を含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。a配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット並びに配列番号5及び6のプライマーセットからなる群から選択されるサルモネラinvA標的DNA配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセットと、b検出可能な標識、並びに前記サルモネラinvA標的DNA配列に実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブと、c増幅ポリメラーゼ活性と、dRNaseH活性と、を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキット。前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群をさらに含むことを特徴とする請求項31に記載のキット。前記キットは、ウラシル-N-グリコリラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項31に記載のキット。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記プローブは、FRET対で標識されることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記プローブまたはPCR切片は、固体支持体に連結されたことを特徴とする請求項31に記載のキット。前記キットは、増幅緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項31に記載のキット。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性であることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記RNaseH活性は、ホットスタートRNaseH活性であることを特徴とする請求項31に記載のキット。前記プローブは、配列番号7,13または14の配列を含むことを特徴とする請求項31に記載のキット。a標的サルモネラinvARNA配列を逆転写し、標的cDNA配列を生成するための逆転写酵素活性と、b配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット並びに配列番号5及び6のプライマーセットからなる群から選択される前記標的cDNA配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセットであるところの増幅プライマーセットと、c増幅プライマーセット間の前記標的cDNA配列をPCR増幅し、サルモネラinvAPCR切片を生成するための増幅活性と、d検出可能な標識、並びに前記PCR切片内のDNA配列に実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブと、eRNaseH活性と、を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキット。前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群をさらに含むことを特徴とする請求項43に記載のキット。前記キットは、ウラシル-N-グリコリラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項43に記載のキット。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記プローブは、FRET対で標識されることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記プローブまたはPCR切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記キットは、増幅緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項43に記載のキット。前記キットは、増幅ポリメラーゼ活性をさらに含むことを特徴とする請求項43に記載のキット。前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性であることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記RNaseH活性は、ホットスタートRNaseH活性であることを特徴とする請求項43に記載のキット。前記プローブは、配列番号7,13または14の配列を含むことを特徴とする請求項43に記載のキット。一具体例によれば、サルモネラ属細菌に特異的な浸湿遺伝子invasiongeneを標的として、食品と表面とでサルモネラ属細菌のリアルタイム検出のためのキットを考案するにおいて、PCR及びCataCleave技術が組み合わされた。他の様相によれば、サルモネラ属細菌と関連性のない核酸配列を内部対照群internalcontrolとして使用し、品質管理qualitycontrol問題を確認することによって、リアルタイム検出反応をモニタリングする方法を開示する。一具体例で、サルモネラ標的DNAの存在を確認するために、試料を提供する段階、サルモネラ標的DNAにアニーリングすることができる増幅プライマーセットを提供する段階と、前記サルモネラ標的DNAに実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列に対して検出可能な標識を含むプローブを提供する段階と、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液が存在し;RNaseH活性がなされ、かつプローブが存在し、かつ前記プローブ内のRNA配列が、前記サルモネラ標的DNAのPCR切片内の相補的なDNA配列とRNA:DNAヘテロデュプレックスheteroduplexを形成できる条件下で、第1増幅プライマーと第2増幅プライマーとのPCR切片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的DNAの存在を示すことである段階と、を含む試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法を開示する。一様相で、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブと、前記PCR切片の鎖のうち一つとから形成されるヘテロデュプレックスが、RNaseHによって切断されることから由来する。前記サルモネラ標的DNA配列は、InvA遺伝子を含むことができる。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、互いに共有結合されうる。前記プローブ上の検出可能な標識は、FRET対のような蛍光標識でありうる。前記増幅緩衝液は、HEPES緩衝液でありうる。前記プローブまたはPCR切片は、固体支持体に連結されうる。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であって、前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性でありうる。前記RNaseHは、部位site非特異的または部位特異的でありうる。一具体例で、前記RNaseHは、RNaseHIIでありうる。他の具体例で、前記RNaseHIIは、Pyrococcusfuriosus、Thermusthermophilus、PyrococcushorikoshiiまたはThermococcuslitoralisから由来したものでありうる。前記試料は、食品試料または表面採取した試料を含むことができる。前記試料と共にテンプレート核酸は、PCR増幅前に不活性化されたウラシル-N-グリコシラーゼUNGを処理して、その後の汚染を防止できる。一様相で、前記プローブは、配列番号7,13または14の配列を有することができる。他の様相で、前記増幅プライマーセットは、配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット、及び配列番号5及び6のプライマーセットでありうる。他の具体例で、サルモネラ標的RNAの存在を確認するために、試料を提供する段階、サルモネラinvA遺伝子標的核酸配列にアニーリングすることができるフォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーのセットを提供する段階と、逆転写酵素活性及び前記リバース増幅プライマーの存在の下で、サルモネラinvA標的RNAを逆転写し、標的cDNA配列を生成する段階と、前記標的cDNA配列、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液が存在し;RNaseH活性され、かつプローブが存在し、かつ前記プローブ内のRNA配列が、前記サルモネラ標的DNAのPCR切片内の相補的なDNA配列とRNA:DNAヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーとのPCR切片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的RNAの存在を示すことである段階と、を含む試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法を開示する。一様相で、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブのRNA配列と、前記サルモネラ標的RNAのcDNA配列とに形成されるヘテロデュプレックスが、RNaseHによって切断されることから由来する。一様相で、前記増幅プライマーセットは、配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット、及び配列番号5及び6のプライマーセットでありうる。他の具体例は、サルモネラ標的DNA配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセット、サルモネラ標的DNA配列に実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブ及び増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びRNaseHを含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキットを開示する。他の具体例は、標的サルモネラinvARNA配列を逆転写し、標的cDNA配列を生成するための逆転写酵素活性、配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット、及び配列番号5及び6のプライマーセットからなる群から選択されるものであるサルモネラinvA標的DNA配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセット、増幅プライマーセット間の前記標的cDNA配列をPCR増幅し、サルモネラinvAPCR切片を生成するための増幅活性、検出可能な標識及び前記PCR切片内のDNA配列に実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブ;anRNaseH活性を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキットを開示する。前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群及びウラシル-N-グリコシラーゼをさらに含むことができる。前記サルモネラ標的DNAは、InvA遺伝子を含むことができる。前記キットの一様相で、前記プローブは、DNA配列-RNA配列-DNA配列の構造を有し、前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合で連結され、前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識でありうる。他の具体例で、前記プローブは、FRET対で標識されうる。前記プローブまたはPCR切片は、固体支持体に連結されうる。前記増幅緩衝液は、HEPESでありうる。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であって、前記RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性でありうる。前記キットの他の様相で、前記プローブは、配列番号7,13または14の塩基配列を有するプローブを含むことができ、前記増幅プライマーセットは、配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット、及び配列番号5及び6のプライマーセットでありうる。前記開示した具体例は、試料でリアルタイムでサルモネラ属細菌の核酸配列を検出するにおいて、多数の利点を有する。前記検出方法は、迅速であって正確であり、多量の試料を処理するのに適している。また、食品試料及び表面でのサルモネラ属細菌の検出のための、便利であって、ユーザ親和的であり、信頼性の高い診断キットが開示される。明細書に開示された具体例の実験は、取り立てて表示されていなければ、当業界で知られている一般的な分子生物学的技法を使用した。かような技法は、当業者に周知されており、文献に十分に説明されている。例えば、Ausubel,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,Inc.,NY,N.Y.、及びSambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.を参照した。本明細書で、取り立てて定義されていないものであるならば、本明細書で使われたあらゆる技術的、科学的用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。また本明細書は、詳細な説明及び請求項の解釈の一助とするサポートのために、用語の定義を提供する。結果として、定義が他の定義と一致しなければ、前記定義は、本明細書に説明されているものであると規定されるのである。本明細書で使われた用語核酸nucleicacidは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、変形されたり、または変形された塩基を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、2ないし60のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。ポリヌクレオチドは、2以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは、第2鎖が第1オリゴヌクレオチドの逆相補的reversecomplement配列のオリゴヌクレオチドとアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖DNA、ジオキシミジンを含む単一鎖核酸重合体、単一鎖RNA、二重鎖RNAまたはRNA/DNAヘテロデュプレックスを含む単一鎖核酸重合体でありうる。核酸は、ゲノムDNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、切片化された核酸、ミトコンドリアまたは葉緑体のような細胞小器官から得た核酸、及び微生物から得た核酸または生物学的試料内または試料上に存在しうるDNAウイルスまたはRNAウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。核酸は、例えば、RNA及びDNAの場合のように、ある種の部分moietyから構成されているか、または、例えば、RNA/DNAキメラchimeraの場合のように、互いに異なる部分の混合でありうる。標的DNAtargetDNAまたは標的RNAtargetRNAまたは標的核酸targetnucleicacid、または標的核酸配列targetnucleicacidsequenceは、DNA増幅によって、標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、PCRpolymerasechainreaction反応または逆転写酵素PCRreversetranscriptase-PCR反応で増幅されるためのテンプレートとして提供される。標的核酸配列は、自然発生的な分子及び合成分子をいずれも含むことができる。例えば、標的核酸配列は、ゲノムDNAまたはゲノムRNAを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書で使われた用語標識lableまたは検出可能な標識detectablelabelは、ヌクレオチド、ヌクレオチド重合体、または核酸結合因子に結合されたいかなる化学的部分をも意味することができ、前記結合は、共有結合または非共有結合でありうる。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、本発明の実験者に検出されうる前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド重合体でありうる。検出可能な標識は、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光クエンチング剤quenchingagent、色調分子、放射性同位元素またはシンチラントscintillantを含む。検出可能な標識はまた、任意の有用なリンカ分子例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、HRP、proteinA、proteinG、抗体またはその断片、Grb2、ポリヒスチジン、Ni2、FLAGタグ、mycタグ、重金属、酵素例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びルシフェラーゼ、電子供与体donor/受容体acceptor、アクリジウムエステル、染料dye及び熱量測定基質calorimetricsubstrateを含む。また、表面プラズモン共鳴surfacePlasmonresonance検出の場合のように、質量の変化changeinmassを示すのに検出可能な標識が考慮されうる。当業者は、前記で言及されていない有用な検出可能な標識についても容易に認識しうるものであり、それらもまた、本発明の実施に使われうる。サルモネラ標的配列の選択DNA増幅のための標的になるサルモネラ属細菌の核酸配列は、まず、当業界に知られているサルモネラ属細菌の核酸配列から選択した。本明細書で使われた用語サルモネラ標的配列Salmonellatargetsequenceまたはサルモネラ属細菌の標的配列は、サルモネラ属に属するバクテリアの核酸配列を含むDNA配列またはRNA配列を意味する。これは、亜種:entericaI、salamaeII、arizonaeIIIa、diarizonaeIIIb、houtenaeIV及びindicaVIを含むが、これらに限定されるものではないサルモネラエンテリカ種及びサルモネラボンゴリ種を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、亜種サルモネラエンテリカの血清群及び血清型serovarは、米国特許第7,659,381号明細書で確認することができ、これは、本明細書に参照として挿入される。本発明による増幅のために標的になる例示的なサルモネラ核酸配列は、下記文献に開示されており、これらは、本明細書に参照として挿入される:LiuWQetal.,SalmonellaparatyphiC:geneticdivergencefromSalmonellacholeraesuisandpathogenicconvergencewithSalmonellatyphi,PLoSOne,2009;4:e4510;ThomsonNRetal.,ComparativegenomeanalysisofSalmonellaenteritidisPT4andSalmonellagallinarum28791providesinsightsintoevolutionaryandhostadaptationpathways,GenomeRes,2008Oct;18:162437;EnchevaVetal.,ProteomeanalysisofserovarstyphimuriumandPullorumofSalmonellaentericasubspeciesI,BMCMicrobiol,2005Jul18;5:42;McClellandMetal.,ComparisonofgenomedegradationinParatyphiAandTyphi,humanrestrictedserovarsofSalmonellaentericathatcausetyphoid,NatGenet,2004Dec;36:126874;ChiuCHetal.,SalmonellaentericaserotypeCholeraesuis:epidemiology,pathogenesis,clinicaldisease,andtreatment,ClinMicrobiolRev,2004Apr;17:31122;DengWetal.,ComparativegenomicsofSalmonellaentericaserovarTyphistrainsTy2andCT18,JBacteriol,2003Apr;185:23307;ParkhillJetal.,CompletegenomesequenceofamultipledrugresistantSalmonellaentericaserovarTyphiCT18,Nature,2001Oct25;413:84852;McClellandMetal.,CompletegenomesequenceofSalmonellaentericaserovartyphimuriumLT2,Nature,2001Oct25;413:8526.Salmonellaentericasubsp.entericaserovartyphimuriumstr.LT2の完全なゲノム4857432bpの例示的なヌクレオチド配列は、GenBankAccessionNo.NC_003197で確認することができる。一具体例で、標的サルモネラInvA核酸配列にアニーリングされる前記増幅プローブは、配列番号7,13または14の配列を有するものでありうる。他の具体例で、前記標的核酸配列は、下記DNA配列を有するサルモネラ-特異的なInvA遺伝子核酸配列である。配列番号12、サルモネラエンテリカInvA遺伝子GenBankAccessionNo.:U43272.1:AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCGTGACTCGCGTAAATGGCGATAGCGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTTAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTGGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGCGTTTATTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAATTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTAGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGATGTCCGTCGATTTATTAAGAAA本明細書で使われた用語オリゴヌクレオチドoligonucleotideは、時にはプライマーまたはポリヌクレオチドpolynucleotideと混用されうる。用語プライマーは、PCR反応で、DNA合成を始めるための開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、一般的に15ないし35個のヌクレオチドであり、前記標的配列に相補的な領域と混成化される。一具体例で、増幅プライマーのセットすなわち、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号1及び2のプライマーセット、配列番号3及び4のプライマーセット、または配列番号5及び6のプライマーセットでありうる。プライマー二量体primerdimerは、PCRで潜在的に発生しうる副産物byproductであり、プライマー内の一連の相補的な塩基によって、互いに部分的に混成化されるプライマー分子によって構成される。その結果、DNAポリメラーゼは、プライマー二量体を増幅することになり、PCR反応液との競争を誘発するので、従って、潜在的にPCR増幅のために標的になるDNA配列の増幅を阻害する。リアルタイムPCRで、プライマー二量体は、敏感度を低下させて正確な定量quantificationを妨害する。図7は、サルモネラSalmonella検出のためのプライマー配列が、プライマー二量体の形成formationofprimerdimerに対してスクリーニングされる方法について示している。PCR反応は、SybrGreenIの存在下で、フォワードプライマー及びリバースプライマーのセットを使用して行われた。この染料の蛍光放出強度は、デュプレックスduplexDNA内に染料が挿入されるときに増大するので、核酸増幅反応で、非特異的なプローブとして提供されうる。前記反応は、40nMのフォワードプライマー及びリバースプライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ及びSybrGreenIを含む実施例3に開示された適した反応緩衝液で行われる。温度サイクルリングcycling条件は、95°Cで5分、その後95°Cで15秒、55°Cで15秒、及び72°Cで30秒を40回反復する。リアルタイムデータは、72°C段階で収集する。増大したSybrGreenI蛍光放出の結果は、AppliedBiosystems7500FastRealTimePCRSystemまたはBioradCFX96realtimePCRthermocyclerのような適切な装置を使用して、リアルタイムで検出できる。プライマー二量体形成は、プライマー特異的なテンプレートDNAの存在下で見られるところと類似した、特徴的なs字形の放出プロファイルを引き起こす。前記図面は、有意のプライマー二量体が生成された34個のうち32個のプライマーセットが、その後の分析から除外されたということを示している。図5及び図6で開示されているように、最小限のプライマー二量体が形成されたプライマーセット33及び34がアッセイに使われた。オリゴヌクレオチドは、適切な方法例えば、化学的合成によって合成されて製造され、これは、当業界に周知されている。また、オリゴヌクレオチドは、商業的な出所を介して便利に入手できる。本明細書で、用語アニーリングannealing及び混成化hybridizationは混用され、1つの核酸と他の核酸とが塩基対形成相互作用によって、デュプレックス、トリプレックスtriplex、または他の高次元構造の形成を引き起こすことを意味する。一具体例で、一次相互作用は、例えば、A/T及びG/Cのように、Watson/Crick及びHoogsteen型の水素結合による塩基特異的なものである。一具体例でまた、塩基スタッキングbasestacking及び疎水性相互作用がデュプレックス安定性に寄与できる。本明細書で使われた用語実質的に相補的なsubstantiallycomplementaryは、配列内で十分に相補的な2個の核酸鎖がアニーリングされ、安定したデュプレックスを形成することを意味する。前記相補性は、完全である必要性はない;例えば、2個の核酸間に塩基対のミスマッチmismatchがいくつかほどありえる。しかし、ミスマッチの数が多すぎて、最小限の厳格な混成化条件ですら混成化が起こらない場合には、前記配列は、実質的に相補的な配列ではない。本明細書で、2個の配列が実質的に相補的であると解釈されれば、前記配列は、選択された反応条件下で、互いにが混成化されうるように十分に相補的であることを意味する。特異性を達成できる十分な核酸の相補性と混成化の厳格性との関係は、当業界に周知されている。2個の実質的に相補的な鎖は、例えば、完全に相補的であるか、または、例えば、対をなす配列と対をなさない配列との差異点を十分に許す限り、1ないし多数のミスマッチを含むことができる。従って、実質的に相補的である配列は、二重鎖区域で、100,95,90,80,75,70,60,50以下、または前記数字間のいかなるの塩基対相補性をも有する配列を意味することができる。当業者は、所望のサルモネラゲノム配列を増幅できるPCRプライマーを考案する方法を知っているであろう。合成されたオリゴヌクレオチドは、一般的に、約55°CのTmを有する、20ないし26個の塩基対である。テスト試料でのバクテリア核酸配列のための富化enrichment標的サルモネラ配列を検出する1つの例示的な方法は、食品試料または表面採取物を提供する段階と、試料または採取物と成長培地とを混合し、培養してサルモネラの数または群集を増加させる段階富化enrichmentと、サルモネラ細胞を破砕する段階溶解lysisと、前記得た溶解物lysateを標的サルモネラ配列の増幅及び検出に適用する段階と、を含む。食品試料は、サケのような魚類、牛乳やタマゴのような酪農製品、家禽類、果物ジュース、粉砕豚肉,豚肉,粉砕牛肉または牛肉のような肉類、ホウレンソウまたはアルファルファスプラウトalfalfasproutのような野菜類、またはピーナッツバターのような加工された堅果類を含むことができるが、これらに限定されるものではない。食品汚染に対する検出限界LOD:Limitofdetectionは、25gの固体または25mlの液体食品、または限定された空間の表面で検出されうるコロニー形成ユニットCFU:colonyformingunitの数について説明される。定義によれば、コロニー形成ユニットは、生きているバクテリア数の測定である。死んていたり、あるいは生きているあらゆる細胞を数える間接的な顕微鏡計数法とは異なり、CFUは、生きている細胞を測定する。1CFU1つのバクテリア細胞は、成長して許容される条件下で、アガールプレート上に1つのコロニーを形成する。UnitedStatesFoodTestingInspectionServiceでは、最小LODを、固体食品25gまたは液体食品25mLの固体食品当たり1CFU、または表面区域当たり1CFUと定義している。実際、1CFUで食品試料または表面を反復的に接種し、富化過程でバクテリアが生き残るようにすることは不可能である。かような問題は、一つまたはさまざまな標的レベルで試料を接種し、最適確数法MPN:Pmostprobablenumberと呼ばれている統計的評価を使用して、結果を分析することによって克服されうる。例えば、サルモネラ培養は、分光測定計で吸光度を測定することによって、具体的な細胞密度で育ちうる。前記標的の10倍連続的希釈を介してアガール培地に塗抹し、生きているバクテリアを計数する。かようなデータは、塗抹された細胞密度に対するCFU/体積に係わる標準曲線を生成するのに使われる。MPNが有意であるために、さまざまな接種レベルでの試験試料が分析される。富化及び抽出後、少量の試料がリアルタイム分析のために除去される。最終目標は、25ないし75の間すなわち、CataCleaveプローブを使用し、逆転写酵素PCRを利用したアッセイで、陽性試料テストの25ないし75の間であり、これは、下記で説明されるの有効化率fractionalrecoveryを達成するものである。かような有効化率パーセントを選択する理由は、固体食品の試料25g、液体食品の試料25mL、または表面の限定された空間について、0.3CFUないし1.375CFU間のMPN値に変換されるためである。それらMPN値は、要求される1CFU/試料のLODにまとめることができる。実際、それらの有効化率をを達成するために、希釈された接種源の体積を測定標準曲線に基づくすることが可能である。サルモネラ標的核酸配列のPCR増幅プライマーが選択され、テスト試料内の核酸が準備されれば実施例参照、核酸増幅は、重合酵素連鎖反応PCR、核酸配列基盤増幅NASBA、リガーゼ連鎖反応LCR、及びローリングサークル増幅RCAを含んだ多様な方法によって行われうる。前記重合酵素連鎖反応は、特異的な標的DNA配列を増幅するのに最も一般的に使われる方法である。重合酵素連鎖反応polymerasechainreactionあるいはPCRは、一般的に、所望するヌクレオチド配列をインビトロinvitroで増幅する方法を意味する。前記過程は、米国特許第4,683,202号明細書、同第4,683,195号明細書、同第4,800,159号及び同第4,965,188号に詳細に説明されており、前記内容は、全体として本明細書に挿入される。一般的に、前記PCR過程は、2倍モル濃度以上過量の、前記二重鎖標的配列の反対鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、所望する標的配列を含む反応混合物に入れる段階からなる。前記反応混合物は、DNAポリメラーゼの存在下で、温度サイクルリングプログラムに適用し、前記DNAプライマーセット間の所望する標的配列を増幅する。一具体例で使われうるプライマーは、配列番号1ないし6のDNA配列を有することができる。本発明の一具体例で使われうるプローブ時にはCataCleaveプローブを意味するは、下記配列を有することができる:5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ配列番号7前記小文字rは、RNA塩基を意味するすなわち、rGは、リボグアノシンである、または5’-/FAM/AGGTAACCrGrArArAACAAGCC/3IABlk_FQ配列番号8本明細書で使われた用語PCR切片PCRfragmentまたは逆転写酵素PCR切片reversetranscriptasePCRfragmentまたはアンプリコンampliconは、特定の標的核酸の増幅によって生成されるポリヌクレオチド分子または、集合的に分子の多数を意味する。PCR切片は、一般的に、DNAPCR切片を意味するが、これに限定されるものではない。PCR切片は、単一鎖または二重鎖、または任意の濃度比によるその混合物でありうる。PCR切片または逆転写酵素PCR切片は、100ないし500個のヌクレオチド、またはそれ以上でありうる。増幅緩衝液bufferは、増幅反応に添加され、前記増幅反応を調節することによって、前記増幅反応の一つ以上の要素の安定性、活性、及び/または寿命を変形させる化合物である。本発明の前記緩衝液は、PCR増幅及びRNaseH切断活性と両立できる。緩衝液の例は、4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPES、3-N-モルホリノ-プロパンスルホン酸MOPS及び酢酸塩またはリン酸塩を含む緩衝液などを含むが、これらに限定されるものではない。また、PCR緩衝液は、一般的に、約70mM以下のKCl、約1.5mMまたはそれ以上のMgCl2、約50ないし200μMのそれぞれのdATP,dCTP,dGTP及びdTTPを含むことができる。本発明の緩衝液は、効率的な逆転写酵素PCRまたはPCR反応を最適化させるために添加物を含むことができる。添加物は、前記組成物の一つ以上の要素の安定性、活性、及び/または寿命を変形させる組成物に添加される化合物である。一具体例で、前記組成物は、増幅反応組成物である。一具体例で、添加物は汚染された酵素の不活性化、蛋白質フォールディングfoldingの安定化、及び/または凝集の低減に影響を及ぼす。増幅反応に含まれうる添加物の例は、ベタイン、ホルムアミド、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、NaCO32、LiCl、MnOAc、NMP、トレハロース、ジメチルスルホキシドDMSO、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトールDTT、ピロホスファターゼThermoplasmaacidophilum無機ピロホスファターゼTAP:inorganicpyrophosphataseを含むが、これに限定されるものではない、ウシ血清アルブミンBSA、プロピレングリコール、グリシンアミド、CHES、パーコールpercoll、アウリントリカルボン酸、Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween85、Brij30、NP-40、TritonX-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAON-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、Zwittergent3-10、Xwittergent3-14、XwittergentSB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、EColiSSB、RecA、ニッキングエンドヌクレアーゼnickingendonuclease、7-デアザG、dUTP、陰イオンデタージェントanionicdetergent、陽イオンデタージェントcationicdetergent、非イオンデタージェントnonionicdetergent、zwittergent、ステロール、浸透調節物質osmolyte、陽イオン、及び増幅の効率を変化させることができるその他化合物、蛋白質、または補助因子を含むが、これらに限定されるものではない。一具体例で、2以上の添加物が増幅反応に含まれる。前記添加物が、RNaseHの活性を妨害するものでなければ、添加物は、プライマーアニーリングの選択性を向上させるために選択的に添加されうる。本明細書で使われた用語である、酵素に適用される熱安定性thermostableは、上昇した温度例えば、55°C以上で生物学的活性を維持したり、または加熱及び冷却の反復されたサイクルによって、生物学的活性を維持する酵素を意味する。熱安定性ポリヌクレオチドポリメラーゼは、特別にPCR増幅反応で使われうる。本明細書で使われた用語熱安定性ポリメラーゼthermostablepolymeraseは、熱に相対的に安定しており、それぞれのPCRサイクル前に、酵素を添加する必要性を除去した酵素である。熱安定性ポリメラーゼの非制限的な例は、好熱性バクテリアであるThermusaquaticusTaqポリメラーゼ、ThermusthermophilusTthポリメラーゼ、ThermococcuslitoralisTliポリメラーゼまたはVENTポリメラーゼ、PyrococcusfuriosusPfuポリメラーゼまたはDEEPVENTポリメラーゼ、PyrococcuswoosiiPwoポリメラーゼ及び他のPyrococcus種、BacillusstearothermophilusBstポリメラーゼ、SulfolobusacidocaldariusSacポリメラーゼ、ThermoplasmaacidophilumTacポリメラーゼ、ThermusruberTruポリメラーゼ、ThermusbrockianusDYNAZYMEポリメラーゼ、ThermotoganeapolitanaTneポリメラーゼ、ThermotogamaritimaTma及びThermotoga属の他種Tspポリメラーゼ、及びMethanobacteriumthermoautotrophicumMthポリメラーゼから分離したポリメラーゼを含むことができる。前記PCR反応は、さらに効率的な標的配列の増幅を引き起こす相補的な性質を有する一つ以上の熱安定性ポリメラーゼ酵素を含むことができる。例えば、高い進行性processivity広いヌクレオチド区画をコピーできる能力を有するヌクレオチドポリメラーゼは、校正能proofreadingcapability標的核酸配列の伸張の間、誤りを正しく修正できる能力を有する他のヌクレオチドポリメラーゼと相互補完されうるので、高いフィデリティfidelityを有する長い標的配列を複製できるPCR反応を生成させることができる。前記熱安定性ポリメラーゼは、野生型として使われうる。代案として、前記ポリメラーゼは、前記酵素の切片を含んだり、または前記PCR反応を増進させることができる有利な特徴を提供する突然変異を含むように変形されうる。一具体例で、前記熱安定性ポリメラーゼは、Taqポリメラーゼでありうる。AmpliTaq、AmpliTaqStoffelfragment、SuperTaq、SuperTaqplus、LATaq、LAproTaq及びEXTaqを含む、向上された特徴を有したTaqポリメラーゼの多様な変形体が知られている。サルモネラRNA標的核酸配列の逆転写酵素PCR増幅遺伝子発現を研究するために、最も広範囲に使われる技法のうち一つが、PCRによる増幅のために、mRNA配列をテンプレートとして、第1鎖cDNAを活用することである。たびたびPCRまたは逆転写酵素PCRとして解釈される前記方法は、PCR過程の高い敏感性及び特異性を利用し、RNAの検出及び定量に広範囲に使われる。終点endpointまたはリアルタイムアッセイとして行われる前記逆転写酵素PCR過程は、2段階の分離された分子的合成を含む:iRNAテンプレートからcDNAの合成、及びiiPCR増幅を介して新しく合成されたcDNAの複製。逆転写酵素PCRとたびたび関連した技術的な問題を処理するための試みとして、前記過程の3種の基本的な段階を考慮し、多数のプロトコルが開発された:aRNAの変性denaturation及びリバースプライマーの混成化、bcDNAの合成、及びcPCR増幅。いわゆる、連結されていないuncoupled逆転写酵素PCR過程例えば、二段階twostep逆転写酵素PCRで逆転写は、逆転写酵素活性のための最適の緩衝液条件を使用し、独立的な段階として行われる。cDNA合成に続き、前記反応は、TaqDNAポリメラーゼ活性に最適の条件で、MgCl2及びジオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTPの濃度が低下するように希釈した後、PCRを標準条件米国特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書を参照によって行う。これに反し、連結されたcoupled逆転写酵素PCR法は、逆転写酵素及びTaqDNAポリメラーゼの活性のために、共通の緩衝液を使用する。第1バージョンで、リバースプライマーのアニーリングは、酵素の添加前に分離された段階であり、その後、単一反応容器に添加する。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性TthDNAポリメラーゼの構成要素である。アニーリング及びcDNA合成は、Mn2の存在下で行われ、その後、PCRは、キレート試薬によってMn2が除去された後、Mg2の存在下で行われる。最後に、前記連続的なcontinuous方法例えば、ワンステップonestep逆転写酵素PCRは、前記逆転写酵素PCRの3段階を、成分または酵素添加のための反応チューブの開放を防止する1つの連続的な反応に統合する。連続的な逆転写酵素PCRは、熱安定性TaqDNAポリメラーゼ及びTthポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する単一酵素システム、及び開始温度が65°CであるAMV逆転写酵素及びTaqDNAポリメラーゼを使用する2酵素システムとして説明される。RNA変性段階は省略する。リアルタイムで最初の段階である逆転写PCRは、テンプレート特異的なDNAプライマーの一つを使用し、相補的なDNA鎖を生成する。伝統的なPCR反応で、該生成物は変成され、第2テンプレート特異的なプライマーが前記cDNAに結合され、デュプレックスDNAを形成するように拡張される。この生成物は、温度サイクルリングの次の段階で増幅される。最も高い敏感性を維持するために、cDNAの合成前に前記RNAは、分解されないことが重要である。RNA:DNAハイブリッドは、RNaseHの基質になりうるために、反応緩衝液でのRNaseHの存在は、前記過程の最初の段階で形成されるRNA:DNAハイブリッドの願わない分解を引き起こすであろう。かような問題を克服する2種の主要方法が存在する。一つは、DNA変性段階開始の高い温度の間に溶けうるワックスのような膜を使用することによって、逆転写反応の残りから、RNaseHを物理的に分離するのである。2番目の方法は、一般的に45ないし55°Cの逆転写温度で不活性化されるように、RNaseHを変形させるのである。RNaseHを抗体と反応させたり、または可逆的な化学変形を含んださまざまな方法が当業界に知られている。例えば、本発明で使われたホットスタートhotstartRNaseH活性は、RNaseHをアルカリ条件下で、シスアコニット酸無水物と反応させた後で生成された可逆的な化学変形を有するRNaseHでありうる。変形された酵素が、Tris基盤の緩衝液と共に反応で使われるとき、温度を95°Cに上げ、溶液のpHを低くすれば、RNaseH活性は回復される。この方法は、逆転写の開始前、反応混合物内にRNaseHを含めるようにする。本発明で使われうるRNaseH酵素及びホットスタートRNaseH酵素のさらなる例は、Walderetal.の米国特許出願第2009/0325169号に開示されている。ワンステップ逆転写酵素PCRは、連結されていない逆転写酵素PCRに比べて、数種の利点を提供する。ワンステップ逆転写酵素PCRは、連結されていない逆転写酵素PCR例えば、2段階の反応間で、成分または酵素の添加のために反応チューブを開くことに比べ、反応混合物試薬及び核酸産物の操作handlingが少なく要求され、従って、労働強度が低く、要求される時間が短縮される。ワンステップ逆転写酵素PCRはまた、試料を少なく要求し、汚染の危険を低減させることができる。ワンステップ逆転写酵素PCRの敏感性及び特異性は、与えられた試料または病原性RNAの検出において、一つないしいくつかの遺伝子の発現レベルを研究するのに適すると証明されている。一般的に、かような過程は、cDNA合成を始めるために、遺伝子特異的なプライマーの使用を制限する。それら逆転写酵素PCR技法と組み合わされたリアルタイム検出によるPCR反応の動力学を測定する能力は、高い敏感度を有するRNAコピー数を正確であって精密に決定する。これは、下記で説明される5’蛍光発生ヌクレアーゼアッセイTaq-ManまたはエンドヌクレアーゼアッセイCataCleaveのような、蛍光二重標識された混成化プローブ技法による増幅過程の間のPCR産物の蛍光モニタリング及び測定を介して、逆転写酵素PCR産物を検出することによって可能である。CataCleaveプローブを利用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイムPCR増幅後のアンプリコン検出は、多くの労働力が必要なだけではなく、時間もまた多くかかる。PCR過程の間、増幅をモニタするために、リアルタイム方法が開発された。かような方法は、一般的に蛍光標識プローブを、新しく合成されたDNAまたは二重鎖DNA間に挿入されて蛍光放出が増大する染料に結合させる。前記プローブは、一般的に標的がない場合、2つの発色団間での蛍光共鳴エネルギー移動FRET:fluorescenceresonanceenergytransferによって供与体放出が消滅されるように設計される。供与体発色団donorchromophoreは、励起状態excitedstateで、発色団対が近距離に位置するときに、受容体発色団acceptorchromophoreにエネルギーを伝達する。かような伝達は、常に非放射線で、対極子対極子結合dipoledipolecouplingを介して起こる。発色団間の距離を十分に延長させるあらゆる工程は、FRET効率を低下させ、供与体発色団放出を放射能的に検出させる。一般的な受容体発色団は、FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5及びTexasRedなどを含む。受容体発色団は、供与体の放出スペクトルと励起スペクトルとが重なることができるように選択される。例えば、かような結合対は、FAM-TAMRAがある。また、広範囲な供与体をクエンチquenchする非蛍光受容体がありうる。それ以外にも、適した供与体受容体FRET対の他の例は、当業者に周知されている。PCRのリアルタイム検出のために使われうるFRETプローブの共通的な例は、分子ビーコンmolecularbeacon、Taq-Manプローブ例えば、米国特許第5,210,015号明細書及び同第5,487,972号明細書、及びCataCleaveプローブ例えば、米国特許第5,763,181号明細書を含む。分子ビーコンは、単一鎖のオリゴヌクレオチドであり、非結合状態では、前記プローブは、供与体と受容体との発色団と近接しており、供与体放出を低減させることができる二次構造を形成するように考案されている。適切な反応温度で、ビーコンは、構造が解除され、特にアンプリコンに結合される。いったん解除されれば、供与体と受容体との発色団間の距離が延長され、FRETが変わることになり、特別な機器を利用して供与体放出をモニタできることになる。Taq-Man技法及びCataCleave技法は、利用されるFRETプローブが切断され、供与体と受容体との発色団がFRETを変えるのに十分なほどに離れることになるという点で、分子ビーコンとは異なる。Taq-Man技法は、5’末端に供与体発色団で標識され、3’末端に受容体発色団で標識された単一鎖オリゴヌクレオチドプローブを利用する。増幅のために利用される前記DNAポリメラーゼは、5’エキソヌクレアーゼ活性exonucleaseactivity→3’エキソヌクレアーゼ活性を有さねばならない。Taq-Manプローブは、プライマーが結合されるとき、共にアンプリコンの1つの鎖に結合される。DNAポリメラーゼがプライマーを伸張させる間、ポリメラーゼは、結局結合されたTaq-Manプローブと対向することになる。このとき、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が5’末端で始まり、順次にTaq-Manプローブを分解することになる。前記プローブが分解されるによって、プローブを含むモノヌクレオチドは、反応緩衝液にリリースされる。供与体が受容体から拡散されることによって、FRETは変わることになる。供与体からの放出は、プローブ切断を確認するためにモニタリングされる。Taq-Manの作用のために、特別なアンプリコンは、PCRのサイクルごとにただ1回ずつ検出されうる。Taq-Man標的部位を介したプライマーの伸張は、二重鎖産物を生成し、アンプリコンが次のPCRサイクルで変性されるまで、Taq-Manプローブの追加結合を防止する。本明細書に参照として結合された米国特許第5,763,181号明細書の内容は、他のリアルタイム検出方法CataCleaveと命名を開示している。CataCleave技法は、プローブの切断がポリメラーゼ活性のない二次酵素によって行われるという点で、Taq-Manと異なる。CataCleaveプローブは、例えば、制限酵素またはRNaseのようなエンドヌクレアーゼの標的分子内に配列を有している。一具体例で、CataCleaveプローブは、プローブの5’末端及び3’末端はDNAにより、切断部位はRNAによって構成されているキメラ構造を有している。前記プローブのDNA配列部分は、両末端や内部で、FRET対で標識される。PCR反応は、RNA-DNA二重鎖のRNA配列部分を特異的に切断することができるRNaseH酵素を含む。切断後、プローブの半分は、いずれも反応温度で標的アンプリコンで解離され、反応溶液に分散される。供与体及び受容体が分離されるほど、FRETは、Taq-Manプローブのような方法のように変わることになり、供与体放出は、モニタリングされうる。切断及び解離は、さらなるCataCleave結合のための部位を再生産する。かような方法で、プライマーがCataCleaveプローブ結合部位を介して伸張されるまで、単一アンプリコンを標的とし、またはプローブ切断を何回か反復できるようにする。サルモネラ-特異的なCataCleaveプローブの標識用語プローブprobeは、例えば、標的核酸配列のような特異的な核酸配列の相補的な領域を有する配列特異的な方法で混成化されるように考案された特異的な部分を含むポリヌクレオチドを含む。一具体例で、前記オリゴヌクレオチドプローブは、15ないし60個のヌクレオチド範囲である。さらに望ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、18ないし30個のヌクレオチド範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列及び長さは、前記プローブが結合される標的ポリヌクレオチドの性質によって部分的に異なる。結合位置及び長さは、特定の具体例で、適切なアニーリング及び変成される特性をなすために多様でありうる。かような考案選択のための指針は、Taq-manアッセイまたはCataCleaveを開示する文献である米国特許第5,763,181号明細書、同第6,787,304号明細書及び同第7,112,422号に見出され、前記内容は、全体として本明細書に参照として挿入される。本明細書で使われる用語標識labelまたは検出可能な標識detectablelabelは、共有結合または非共有結合によってプローブに結合された蛍光色素化合物を含むCataCleaveプローブの任意の標識を意味することができる。本明細書で使われる用語蛍光色素fluorochromeは、放出される光よりさらに短い波長の光によって励起される光を放出する蛍光化合物を意味する。用語蛍光供与体fluorescentdonorまたはfluorescencedonorは、本発明に開示されたアッセイで測定される光を放出する蛍光色素を意味する。さらに具体的に、蛍光供与体は、蛍光受容体によって吸収される光を提供する。用語蛍光受容体fluorescentacceptorまたはfluorescenceacceptorは、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収する第2蛍光色素またはクエンチング分子を意味する。第2蛍光色素は、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収し、蛍光供与体によって放出される光よりさらに長い波長の光を放出する。クエンチング分子は、蛍光供与体によって放出されたエネルギーを吸収する。いかなる発光分子、望ましくは、蛍光色素及び/または蛍光クエンチャーquencherも、本発明の実施に使われうる。前記発光分子は、例えば、AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、フルオレセイン、OregonGreen488、OregonGreen514、テトラメチルローダミン、ローダミンX、テキサスレッド染料、QSY7、QSY33、Dabcyl、BODIPYFL、BODIPY630/650、BODIPY6501665、BODIPYTMR-X、BODIPYTR-X、ジアルキルアミノクマリン、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPAEu3-AMCA及びTTHAEu3AMCAを含むが、これらに限定されるものではない。一具体例で、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端ヌクレオチドは、遮断されているか、または核酸ポリメラーゼによって拡張されないようになっている。かような遮断は、前記プローブの末端3’地域に、リポーターreporter分子またはクエンチャー分子を付着させることによって便利に行われる。一具体例で、リポーター分子は、連結部分を介して、前記プローブの3’末端または5’末端の終端への付着のために由来した蛍光有機染料である。望ましくは、クエンチャー分子は、本発明の具体例によって、蛍光でもあり、蛍光ではなくもある、有機染料である。例えば、本発明の望ましい具体例で、前記クエンチャー分子は、非蛍光である。一般的に、クエンチャー分子が蛍光であるか、または非放射性の分解によってリポーターから伝えられるエネルギーを単純に放出するものであるならば、前記クエンチャーの吸収バンドは、前記リポーター分子の蛍光放出の吸収バンドと実質的に重なることになる。本明細書で、励起されたリポーター分子から吸収されるが、放射性のエネルギーを放出させない非蛍光クエンチャー分子を、発色性分子chromogenicmoleculeと解釈する。リポータークエンチャー対は、例えば、フルオレセイン及びローダミン染料を含むキサンテン染料xanthenedyeから選択されうる。オリゴヌクレオチドの結合のための結合部位として、または結合機能性functionalityとして使われうるフェニル部分上に置換基を有するそれら化合物の多様な適切な形態を広く商業的に入手できる。蛍光化合物の他の基は、アルファ位置またはベータ位置に、アミノ基を有するナフチルアミンである。前記ナフチルアミノ化合物は、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホネート、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート及び2-p-トルイジニル-6-ナフタレンスルホネートのような化合物を含む。他の染料は、3-フェニル-7-イソシアナートクマリン、9-イソチオシアナートアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン;N-p-2-ベンゾオキサゾリルフェニルマレイミド;ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。一具体例で、リポーター分子及びクエンチャー分子は、フルオレセイン及び非蛍光クエンチャー染料から選択される。オリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端に、リポーター分子またはクエンチャー分子を付着させる多様なリンキング部分linkingmoiety及び方法論は、下記参考文献に例示されいる:Eckstein,editor,OligonucleotideandAnalogues:APracticalApproach;Zuckermanetal.,NucleicAcidResearch,15:53055321;Sharmaetal.,NucleicAcidResearch,19:3019;Giustietal.,PCRMethodandApplications,2:223227,Fungetal.,米国特許第4,757,141号明細書Stabinsky,米国特許第4,739,044号;Agrawaletal.,TetrahedronLetters,31:15431546;Sproatetal.,NucleicAcidResearch,15:4837;Nelsonetal.,NucleicAcidResearch,17:71877194など。ローダミン及び非蛍光クエンチャー染料はまた、固相合成の開始段階で、オリゴヌクレオチドの3’末端に便利に付着されうる例えば、Wooetal.,米国特許第5,231,191号明細書;及びHobbs,Jr.,米国特許第4,997,928号明細書参照。固体支持体へのサルモネラ特異的CataCleaveプローブの付着本発明の一具体例で、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に付着されうる。異なるプローブは、固体支持体に付着し、試料内の異なる標的配列を同時に検出するのに使われうる。異なる蛍光波長を有するリポーター分子は、異なるプローブに使われ、従って、異なるプローブに対する混成化が別個に検出されることを可能にする。オリゴヌクレオチドプローブの固定のための固体支持体の望ましい形態の例は、ポリスチレン、アビジンコーティングされたポリスチレンビードセルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル及活性化されたデキストラン、統制された孔隙ガラスCPG:controlledporeglass、ガラスプレート及び高交差結合highlycrosslinkedポリスチレンを含む。かような固体支持体は、それらの化学的安定性、機能化functionalizationの容易性及び良好に規定された表面面積のために、混成化及び診断研究において望ましい。統制された孔隙ガラス500Å、1,000Å及び非膨脹高交差結合ポリスチレン1,000Åのような固体支持体が、オリゴヌクレオチド合成とのそれらの親和性compatibilityのために特に望ましい。オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に多様な方式で付着されうる。例えば、前記プローブは、前記プローブの3’末端または5’末端のヌクレオチドを、前記固体支持体に付着させることによって、前記固体支持体に付着されうる。しかし、前記プローブは、前記プローブを前記固体支持体から距離をおかせるリンカによって、前記固体支持体に付着されうる。前記リンカは、最も望ましくは、30原子長以上、さらに望ましくは、50原子長以上である。固体支持体に固定されたプローブの混成化は、一般的に前記プローブが30原子以上、さらに望ましくは、50原子以上ほど、前記固体支持体から分離されることを必要とする。かような分離をなすために、リンカは、一般的に、前記リンカと3’ヌクレオシドとの間に位置したスペーサspacerを含む。オリゴヌクレオチド合成のために、前記リンカアームarmは、普通塩基性試薬によって切断され、オリゴヌクレオチドを前記固体支持体から自由にすることができるエステル結合によって、3’ヌクレオシドの3’-OHに付着する。オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に付着させるのに使用できる多種のリンカが当業界に知られている。リンカは、標的配列が固体支持体に付着されたプローブに混成化されることを顕著に妨害しない任意の化合物によって形成されうる。リンカは、自動化された合成によって、リンカに容易に添加されうる同種重合体オリゴヌクレオチドから形成されうる。代案として、機能化されたポリエチレングリコールのようなポリマーが、前記リンカとして使われうる。かようなポリマーは、それらがプローブの標的オリゴヌクレオチドへの混成化を顕著に妨害しないために、同種重合体オリゴヌクレオチドに比べて望ましい。ポリエチレングリコールは、それが商業的に購入可能であり、有機培地及び水性培地いずれにも溶解可能であり、機能化するのに便利であり、オリゴヌクレオチド合成及び合成後の状態下で、完全に安定するために特に望ましい。固体支持体、リンカ及びプローブ間の結合は、高温での塩基条件下で、塩基保護基の除去の間、望ましくは、切断されない。望ましい結合の例は、カルバメート結合及びアミド結合を含む。プローブの固定immobilizationは、当業界に周知されており、業界の通常の技術者は、固定条件を決定できる。本方法の一具体例によれば、混成化プローブは、固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドプローブは、混成化に有利な条件下で、核酸の試料と接触される。非混成化状態では、蛍光標識は、クエンチャーによって抑制される。標的と混成化されれば、蛍光標識は、クエンチャーから分離されて蛍光を発する。また、固体支持体への混成化プローブの固定は、プローブに混成化された標的配列を試料から容易に分離させる。その後の段階で、分離された標的配列を固体支持体から分離し、研究者の特別の必要によって、当業界に周知されている方法で、加工例えば、精製、増幅されうる。CataCleaveプローブを使用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出前記標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、試料内で、サルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使われうる。CataCleaveオリゴヌクレオチドプローブは、まず、選択されたサルモネラ標的配列を含むPCRアンプリコン内で発見される配列と相補的なDNA配列及びRNA配列に合成される。一具体例で、前記プローブは、FRET対、例えば、プローブの一末端は、フルオレセイン分子であり、他末端は、非蛍光クエンチャー分子で標識される。従って、前記プローブが、PCRアンプリコンと混成化されたとき、RNaseH活性によって切断されうるRNA:DNAヘテロデュプレックス形態が形成される。RNaseHは、RNADNA混成体で、RNAを加水分解する。この酵素は、初めウシの胸腺から確認されたが、その後、多様な生物で発見された。RNaseH活性は、真核生物及びバクテリアに偏在してubiquitous現れる。たとえRNaseHが多様な分子量及び核溶解活性の蛋白質ファミリーによって構成されるとしても、基質必要物は、多様な同型isotype間で類似して現れる。例えば、これまで研究されたほとんどのRNaseHは、エンドヌクレアーゼとして機能を行い、5’ホスフェート末端及び3’ヒドロキシル末端を有する切断生産物を生産するために、二価陽イオン例えば、Mg2、Mn2を必要とする。EColi由来のRNaseHIは、RNaseHファミリーのうち最も周知されている。RNaseHI以外にも、2番目のEColiRNaseH、EColiRNaseHIIがクローニングされて特性が確認されたItaya,M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,85878591。RNaseHIは、155個のアミノ酸からなっているのに対して、これは、213個のアミノ酸からなっている。EColiRNaseHIIは、EColiRNaseHIと、ただ17の相同性homologyを示すのみである。S.typhimuriumからクローニングされたRNaseHは、EColiRNaseHIと、ただ11個の位置で異なるのみであり、155個のアミノ酸からなっているItaya,M.andKondoK.,NucleicAcidsRes.,1991,19,44434449。RNaseH活性を示す蛋白質がクローニングされ、いくつかのウイルス、他のバクテリア及び酵母から精製されたWintersberger,U.Pharmac.Ther.,1990,48,259280。多くの場合において、RNaseH活性を有する蛋白質が、RNaseHが異なる酵素、普通DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合蛋白質に現れる。RNaseHドメインは、大腸菌RNaseHIと高い相同性があると持続的に明らかにされたが、他のドメインが実質的に多様であり、融合蛋白質の分子量及び他の特性が非常に多様である。高等真核生物で、RNaseHの2個クラスは、分子量、二価陽イオンの効果、スルフヒドリルsulfhydryl試薬に対する感受性及び免疫学的交差反応性の差に基づいて、定義されてきたBusenetal.,Eur.J.Biochem.,1977,74,203208。RNaseHI酵素は、68ないし90kDa範囲の分子量を有し、Mn2またはMg2によって、活性化され、スルフヒドリル試薬に無感受性であると報告されている。反対に、RNaseHII酵素は、31ないし45kDa範囲の分子量を有し、Mg2を必要とし、スルフヒドリル試薬に高感受性を示し、Mn2によって抑制されると報告されているBusen,W.,andHausen,P.,Eur.J.Biochem.,1975,52,179190;Kane,C.M.,Biochemistry,1988,27,31873196;Busen,W.,J.Biol.Chem.,1982,257,71067108。RNaseHII特性を有する酵素が、ヒト胎盤からほぼ均質に精製されたFranketal.,NucleicAcidsRes.,1994,22,52475254。この蛋白質は、約33kDaの分子量を有し、6.5ないし10のpH範囲で活性化され、最適pHが8.5ないし9であると報告されている。前記酵素は、Mg2を必要とし、Mn2及びn-エチルマレイミドによって抑制されると報告されている。切断反応の生成物は、3’ヒドロキシル末端及び5’ホスフェート末端を有する。一具体例によれば、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、RNaseH活性、サルモネラ標的ポリヌクレオチドに混成化されうるPCR増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチドプローブの存在下で、標的ポリヌクレオチドで行われる。リアルタイムPCR反応の間、RNaseHによるプローブの切断は、蛍光クエンチャーから蛍光供与体を分離させ、試料内のサルモネラ標的DNA配列のリアルタイム検出によって、プローブの蛍光をリアルタイムで増加させる。図7から分かるように、一具体例で、リアルタイム核酸増幅は、約40回以下のPCR増幅サイクルで、単一標的DNA分子のリアルタイム検出を可能にする。キット本発明はまた、試料内のサルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の反応試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。また前記キットは、一つ以上の下記の品目を含むことができる:緩衝液、使用説明書、及び陽性対照群または陰性対照群。キットは、本明細書に記述された方法を行うために、適切な割合で共に混合された反応試薬の容器を含むことができる。反応試薬容器は、望ましくは、前記方法を行うときに測定する段階を省略できるように、単位数量の反応試薬を含む。キットはまた、これらに限定されるものではないが、熱安定ポリメラーゼ、熱安定RNaseH、サルモネラ核酸標的配列を増幅させるために選択されたプライマー、及びリアルタイムPCR産物にアニーリングされる標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチドプローブを含むリアルタイムPCRのための反応試薬を含み、本明細書に記述された方法論によって、サルモネラ標的核酸配列の検出を可能にする。キットは、2個以上のサルモネラ標的核酸配列の検出のための反応試薬を含むことができる。キット反応試薬はまた、適用できるRT-PCR分析のための反応試薬を含むことができる。他の具体例で、前記キット試薬は、生物学的試料からゲノムDNAまたはゲノムRNAを抽出するための試薬をさらに含む。また、キット試薬は、逆転写酵素PCR分析に適用するための試薬を含むことができる。一具体例で、前記増幅プライマーセットは、配列番号1及び2、または3及び4、または5及び6の配列を有する。他の具体例で、前記CataCleaveオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号7または8または13または14の配列を有する。試料でのサルモネラInvA遺伝子配列のリアルタイム検出例実施例1によれば、食品試料固体または液体内または表面のサルモネラ種富化の実施例を示す。試料がテストされうるように、食品試料をプラスチックバッグに入れ、正常な保管温度に近い温度で、24ないし48時間ほど培養する。かようなことは、試料が商業的な処理や国内の厨房で、一般的に扱われるところを倣ったものであり、自然に死んだり、またはバクテリア汚染物質が増殖されるようにするのである。具現するための目的として、汚染された試料を摸倣するために、実施例1で、サケにサルモネラパラチフスBを人為的に接種した。正常には、前記試料は、生産施設から収得されたものとして処理されたものである。表面のために、試料を4インチx4インチ、または1インチx1インチとした。4x4インチ試料は、Dey-Engley培地10mLが含まれた成分が明確に究明された溶液を、スポンジを利用して表面試料を清め、1X1インチ試料の場合は、Dey-Engley培地で湿した綿棒を利用してふき取った。スポンジと綿棒は、それぞれプラスチックバッグに入れておいた。表面試料は、24ないし48時間の初期保管期間を経ない。初期保管期間後、さらに食品試料は、試料のマトリックスsamplematrixによって、25gまたは25mLでいくつかに分ける。前記部分は、富化enrichmentするまで、個人プラスチックバッグにおく。表面及び部分の食品試料は、トリプチカーゼ豆培地trypticasesoybroth225mLで富化させる。それぞれのプラスチックバッグに培地を追加した後、培地を密封し、内容物が試料を介して富化培地を分散させるために、ストマッカー機器stomacherdeviceを利用して前記内容物を処理した。前記試料は、35°Cないし42°Cで、18ないし24時間の間培養する。培養期間の間、サルモネラは、汚染された内容物が入っている試料バッグで増殖する。富化は、汚染された試料で、サルモネラスレショルド値が、分析のための核酸の濃度を十分に超えるようにする。実施例2で、一具体例として、核酸を見つけ出すために、富化された試料の溶解lysisを記載している。増殖された試料の小さい一部は、アジ化ナトリウムsodiumazide、プロテイナーゼKproteinaseK、及びデタージェントTritonX-100で溶解される。前記プロテイナーゼK及びTritonX-100は、バクテリア細胞壁を破り、核酸が外に出させる。アジ化ナトリウムの機能は、ほとんど知られていなかったが、溶解試薬の効率性を高めるための還元剤としての役割を行う。溶解後、前記試料は、プロテイナーゼKを不活性化させるために、95°Cに加熱した。図2では、食品及び表面で、サルモネラ属に係わる、組み合わされたPCR/CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。PCRプライマーは、配列番号1及び2を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのPCRプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうるCataCleaveと結合される。実施例3に開示された、熱安定性RNaseH、熱安定性DNAポリメラーゼ、及びウラシル-N-グリコリラーゼUNGを含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、試料は、37°Cで最初に培養され、ウラシル-N-グリコシラーゼによって、以前検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸を切断する。かような物質は、サルモネラの疑陽性falsepositive検出を起こしうる汚染源である。UNGは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジンthymidine位置にウラシルuracilを含まないためである。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変性され、UNGは、不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的なアンプリコンに混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、RNaseHによって、RNA/DNAデュプレックスのRNA部分が切断される。切断されることになれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液で分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷していないintact状態で、供与体からの蛍光は、大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、AppliedBiosystems7500FastRealTimePCRSystemまたはBioradCFX96realtimePCRthermocyclerのような適切な機器を利用してリアルタイムで検出されうる。プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。1つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用することができるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅することができる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されれば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅/検出サイクルで、テンプレートとして作用する。図3では、サケに係わるリアルタイムPCRCataCleaveの結果の一具体例であり、サルモネラパラチフスBを人為的に接種した。前記図面は、汚染されたサケサンプルから得た核酸が、前記検出のテンプレートとして使われうることを示している。十分な量のDNAテンプレートが含まれた検出で、フルオレセイン放出強度記録emissionintensitytraceは、標的増幅と関連して、指数関数の特徴的な形態を有する。強度値intensityvalueは、結局試薬の一部のように渋滞状態となる。サルモネラで汚染されていないサンプルは、贋物増殖mockenrichmentを利用して行った陰性対照群検出と比較して、蛍光放出でいかなる増大も示していない。図4A及び図4Bは、リアルタイムPCRCataCleave反応の組成物を検証するために、内部対照群の使用に係わる具体例である。試薬が、キット製造時に、品質管理細部事項qualitycontrolspecificationを充足するにしても、リアルタイム検出に使われた一つ以上の試薬が分解されうる可能性がある。かような条件下で、効果的な検出は失敗し、偽陰性結果が出てくることがある。かような場合は、リアルタイム反応で、サルモネラ種特異的なテンプレートの存在いかんによって、陽性結果を示すものであると知られている内部対照群internalcontrolを含めて確認することができる。かような内部対照群の一実施例としては、サルモネラアンプリコンDNA配列と類似した長さであるが、サルモネラ増幅のためのプライマー及びプローブとは異なる結合部位を有する、短いランダムDNA配列を含むプラスミドでありうる。このように含まれた配列及びCataCleaveプローブは、サルモネラ種、または非常に関連性のいかなる生物体とも何らの相同性もあってはならない。実施例4は、かような内部対照群の形態を含む。内部対照群のコピー数は、サルモネラティフィムリウムの効果的な増幅を干渉しないように制限される。図5では、サルモネラゲノムDNAの1ないし106のコピーを検出するための、組み合わされたPCR/CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。PCRプライマーは、配列番号3及び4を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのPCRプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうる配列番号13のCataCleaveプローブと結合される。プライマー及びプローブセット33かようなセットは、1409ないし1564を増幅し、前記プローブは、1473ないし1489に結合される、Inv遺伝子配列U43273参照。プライマー:5’-ACGCGCTTGATGAGCTTTAC配列番号35’-GTTGTACCGTGGCATGTCTG配列番号4プローブ:5’-/FAM/CGGTATTrCrArGrGAAACAA/IaBlkFQ/配列番号13小文字rは、プローブでのRNAを示す。供与体はFAMであり、クエンチャーは、アイオワブラックFGIowaBlackFQである。実施例3に開示された、熱安定性RNaseH、熱安定性DNAポリメラーゼ、及びウラシル-N-グリコシラーゼを含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、サンプルは、37°Cで最初に培養され、ウラシル-N-グリコシラーゼによって、以前検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸は切断されうる。かような物質は、サルモネラの疑陽性検出を起こしう汚染源である。UNGは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジン位置にウラシルを含まないためである。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変成され、UNGは不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的なアンプリコンと混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、RNaseHによって、RNA/DNAデュプレックスのRNA部分が切断される。切断されれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液に分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷されていない状態で、供与体からの蛍光は大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、AppliedBiosystems7500FastRealTimePCRSystemまたはBioradCFX96realtimePCRthermocyclerのような適切な機器を利用してリアルタイムで検出されうる。プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。1つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用できるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅できる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されるならば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅/検出サイクルでテンプレートとして作用する。図5は、配列番号13のCataCleaveプローブと組み合わされた配列番号3及び4のプライマー対が、40またはそれ以下の増幅サイクルで、サルモネラゲノムDNAの1つのコピーを検出することができるということを示している。図6では、サルモネラゲノムDNAの1ないし106のコピーを検出するための、組み合わされたPCR/CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。PCRプライマーは、配列番号5及び6を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのPCRプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうる配列番号14のCataCleaveプローブと結合される。プライマー及びプローブセット34かようなセットは、1492ないし1609を増幅し、前記プローブは、1530ないし1551に結合されるInv遺伝子配列U43273参照。プライマー:5’-CATATGCTGGACCAACTGGA配列番号55’-CGGAAACACGTTCGCTTAAT配列番号6プローブ:5’-/FAM/ATGTCTGAGrCrArCrUTCTTTAAGT/IaBlkFQ/配列番号14小文字rは、プローブでのRNAを示す。供与体はFAMであり、クエンチャーは、アイオワブラックFGIowaBlackFQである。実施例3に開示された、熱安定性RNaseH、熱安定性DNAポリメラーゼ、及びウラシル-N-グリコシラーゼを含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、サンプルは、37°Cで最初に培養され、ウラシル-N-グリコシラーゼによって、以前の検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸は切断されうる。かような物質は、サルモネラの疑陽性検出を起こしうる汚染源である。UNGは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジン位置にウラシルを含まないためにある。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変性され、UNGは不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的な核酸に混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、RNaseHによって、RNA/DNAデュプレックスのRNA部分が切断される。切断されれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液に分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷されていない状態で、供与体からの蛍光は大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、AppliedBiosystems7500FastRealTimePCRSystemまたはBioradCFX96realtimePCRthermocyclerのような適切な機器を利用して、リアルタイムで検出されうる。プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。1つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用できるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅できる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、DNAポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されるならば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅/検出サイクルでテンプレートとして作用する。図6は、配列番号14のCataCleaveプローブと組み合わされた配列番号5及び6のプライマーセットが、40回未満の増幅サイクル内で、サルモネラゲノムDNAの信号コピーを検出できるということを示している。本発明は、下記実施例によって詳細に説明され、それらは、いかなる方法によっても限定されるものではないと解釈されねばならない。実施例1:サケでのサルモネラ属パラチフスB菌の富化enrichment300g当たり4CFUのタイタtiterで、サルモネラ属パラチフスB菌をサケに接種した。サルモネラコロニーを5μlのトリプチケースソイブロスtrypticasesoybrothに接種し、35°Cで一晩振盪培養した。前記培養液を1xPBSphosphatebufferedsalineに希釈し、サルモネラのタイタは、トリプチケースソイ寒天培地trypticasesoyagar上でプレートカウントアッセイplatecountassayによって決定された。サケ切り身filletの重さを量り、1xPBSに希釈されたサルモネラ属パラチフスB菌を、ピペットを利用して接種し、サケ切り身の表面上に押しなべて細菌を分布させた。前記処理されたサケを、プラスチックバッグに入れて手でもみ込み、前記接種された細菌が押しなべて分布されるようにした。その後、前記バッグを密封し、4°Cで48時間培養させた。前記試料を、滅菌されたナイフをを利用して25gずつの部分に分け、それぞれの部分をプラスチックバッグに入れた。それぞれの部分を、225μlのトリプチケースソイブロスに再懸濁し、ストマッカー機器Stomacher400circulatorを利用し、250rpmで2分間破砕させた。その後、試料を35°Cで18ないし24時間培養した。実施例2:集積後のサルモネラ属パラチフスB菌の溶菌前記サルモネラ集積5μl部分を、1mg/μlのプロテイナーゼK、0.3125mg/μlのアジ化ナトリウム、0.125のTritonX-100、及び12.5mMTris-HCl、pH8.0を含む45μlの溶菌溶液に希釈させた。前記試料を、55°Cで15分間培養させた後、95°Cで10分間プロテイナーゼKを不活性化させた後、4°Cに冷却させた。実施例3:サケでのサルモネラ属パラチフスB菌のリアルタイム検出リアルタイム反応は、2μlの溶解物と、23μlのPCR反応ミックスとを混合した。前記PCR反応ミックスは、32mM4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPES-KOHpH7.8、100mM酢酸ナトリウム、4mM酢酸マグネシウム、0.11ウシ血清アルブミン、1ジメチルスルホキシド、800μMSalmonellaフォワードプライマー、800μMSalmonellaリバースプライマー、200μMSalmonellaCataCleaveプローブ、dUTP/NTPミックス80μMdGTP,dCTP,dATP及び160μMdUTP、2.5ユニットのThermusaquaticusDNA重合酵素、1ユニットのPyrococcusfuriosisRNaseHII、及び0.1ユニットのウラシル-N-グリコシラーゼを含んでいる。前記サルモネラのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、サルモネラ浸湿遺伝子内に含まれた180bpの切片を増幅させた。前記プライマー及びプローブの配列は、次の通りである:Salmonellaフォワードプライマー:5’-TCGTCATTCCATTACCTACC配列番号1Salmonellaリバースプライマー:5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA配列番号2SalmonellaCataCleaveプローブ:5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ配列番号7前記小文字rは、RNA塩基を意味するすなわち、rGはリボグアノシンである。略語:FAM:6-カルボキシフルオレセイン、BHQ:IntegratedDNATechnologiesCoralville、IA社の短波長放出用BlackHoleQuenche反応は、常温で行われ、下記循環プロトコルを使用して、RocheLightcycler480で、リアルタイムPCR反応を進めた:37°Cで10分;95°Cで10分;その後、50回の間増幅反応;95°Cで15秒、60°Cで20秒。FAM放出は、前記60°C段階の間にモニタリングされた。前記リアルタイムFAM信号の結果を、図3に示した。前記結果は、テストされた11個の試料のうち9つで、サルモネラ属パラチフスB菌汚染に係わる陽性結果を示している。陰性対照群反応は、前記溶菌液の代わりに、2μlの水が使われたことを除いては、前記反応成分がいずれも含まれた。前記データのMPN分析は、前記検出感度が0.75CFU/gであることを示している。実施例4:リアルタイムPCR増幅反応の品質管理qualitycontrol確認サルモネラティフィムリウムをトリプチケースソイブロスに接種させ、35°Cで一晩振盪培養して最大細胞密度まで成長させた。前記集積5μl部分を、1mg/μlのプロテイナーゼK、0.3125mg/μlのアジ化ナトリウム、0.125のTritonX-100、及び12.5mMTris-HCl、pH8.0を含む45μlの溶菌溶液に希釈させた。前記試料を55°Cで15分間培養させた後、95°Cで10分間プロテイナーゼKを不活性化させ、4°Cに冷却させた。リアルタイム反応は、2μlの溶解物と、23μlのPCR反応ミックスとを混合した。前記PCR反応ミックスは、32mMHEPES-KOHpH7.8、100mM酢酸ナトリウム、4mM酢酸マグネシウム、0.11ウシ血清アルブミン、1ジメチルスルホキシド、800μMSalmonellaフォワードプライマー、800μMSalmonellaリバースプライマー、200μMSalmonellaCataCleaveプローブ、200μM内部増幅対照群CataCleaveプローブ、15コピーの内部増幅対照群プラスミド、dUTP/NTPミックス80μMdGTP,dCTP,dATP及び160μMdUTP、2.5ユニットのThermusaquaticusDNA重合酵素、1ユニットのPyrococcusfuriosisRNaseHII、及び0.1ユニットのウラシル-N-グリコシラーゼを含んでいる。前記プライマー及びプローブの配列は、次の通りである:Salmonellaフォワードプライマー:5’-TCGTCATTCCATTACCTACC配列番号1Salmonellaリバースプライマー:5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA配列番号2SalmonellaCataCleaveプローブ:5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ/配列番号7Salmonella内部増幅対照群フォワードプライマー:5’-CTCGCGCGTAGATTGCCATGCGTAGAGC配列番号9Salmonella内部増幅対照群リバースプライマー:5’-GTGAACCCACTTGCCTTTGCGTCTTAAT配列番号10サルモネラ内部増幅対照群プローブ:5’-/TYE665/AGGTAACCrGrArArAACAAGCC-/IABFQ/配列番号11小文字rは、RNA塩基を意味するすなわち、rGはリボグアノシンである。略語:FAM:6-カルボキシフルオレセイン;TYE665:IntegratedDNATechnologiesCoralvile、IA社のCy5の変形体;IABFQ:IntergratedDNATechnologiesCoralville、IA社の短波長放出のためのBlackHoleQuencher;IABRQ:IntergratedDNATechnologiesCoralville、IA社の長波長放出のためのBlackHoleQuencher。反応は、常温で行われ、下記循環プロトコルを使用して、RocheLightcycler480でリアルタイムPCR反応を進めた:37°Cで10分、95°Cで10分、その後、50回間増幅反応、95°Cで15秒、最後に60°Cで20秒。FAM及びTYE665Cy5チャネルでは、前記60°C段階の間にモニタリングされた。前記リアルタイムFAMサルモネラティフィムリウム及びTYE665内部増幅対照群信号の結果を、図4A及び図4Bに示した。前記結果は、サルモネラ及び内部増幅対照群は、チャネル間に混線closstalkなしに同時に検出されうるということを示している。サルモネラの存在に対する陽性である試料は、FAMチャネルで、特徴的なs字形のリアルタイム増幅信号を示している。同時に、CY5チャネルで、内部対照群がモニタされ、この信号はまた、内部増幅対照群プラスミドの存在に対して陽性になる。かような情報は、反応混合物のあらゆる要素が、品質管理細部事項内にあるということを確認するのに使われ、前記獲得したデータは、FAMチャネルで有効である。実施例5:プライマー及びプローブ1の包括性inclusivity実施例3と類似した過程によって、総116個の標準サルモネラ血清型serovarを対象でそれらの標的核酸の検出をテストした。本実施例で、MarylandDepartmentofHealthandMentalHygieneから提供された60個のサルモネラ血清型を対象に、実施例3で使用したのと同じプライマー/プローブセットを使用して検出テストした。本実施例では、5mlのテスト細胞懸濁液を、95°Cで10分間、45mlの溶解緩衝液2Triton-X、5mg/mlアジ化ナトリウム、0.2MTrispH=8;A.Abolmaaty,C.Vu,J.OliverandR.E.LevinMicrobios101,181189,2000内で抽出し、2mlの溶解結果物をテンプレートとして使用する方法で、実施例3の過程を変形した。あらゆる血清型が効率的に検出された。その結果を下記表1に示した。表1で、それぞれの細胞の最初の行は、サルモネラ種血清型の名称であり、2行目は、種またはaccessionで、3行目は低減したCpである。実施例6:プライマー及びプローブの包括性実施例5と類似した過程によって、Manassas、VAUSAのAmericanTypeCultureCollectionATCCから購入した54個のサルモネラ血清型を対象に、実施例3で使用したのと同じプライマー/プローブセットを使用して検出テストした。あらゆる血清型が効率的に検出された。その結果を下記表2に示した。表2で、それぞれの細胞の最初の行は、サルモネラ種血清型serovarの名称であり、2行目は、種またはaccessionであり、3行目は、低減したCpである。実施例7:食品試料のテスト実施例5と類似した過程によって、多様な食品試料に、表3に開示されたサルモネラ血清型をそれぞれ接種した後、サルモネラ血清型検出テストを行った。結果を下記表3に示した。表3で、接種レベルから獲得された陽性比率をAOACInternationalGaithersburg、MD、USAによって、有効であると考慮される。実施例8:InvA遺伝子プライマーセットの比較InvA遺伝子プライマーは、下記論文から選択された:HoorfarJ.etal.,J.Clin.Micro.38,pp.342934351SalmonellaF1:5’-TCGTCATTCCATTACCTACC配列番号12SalmonellaR:5’-AAACGTTGAAAAACTGAGGA配列番号18TrafnyEAetal.,Lett.Appl.Micro.43,pp.6736793Sal-invF:5’-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT配列番号154Sal-invR:5’-AGACGGCTGGTACTGATCGATAAT配列番号19FeyA.etal.,App.Env.Micro.70,pp.361836235Sal-InvA2-F1:5’GATTCTGGTACTAATGGTGATGATC配列番号166Sal-InvA2-R1:5’GCCAGGCTATCGCCAATAAC配列番号207Sal-InvA2-F2:5’-GATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCT配列番号178Sal-InvA2-R2:5’-GCCAGGCTATCGCCAATAACG配列番号27それらプライマーのうち一部は変形し、下記のような新しいプライマーに製造された:9InvA-S1:5’-TGATTCTGGTACTAATGGTGATG配列番号2110InvA-S2:5’-CTATGTTCGTCATTCCATTACCTAC配列番号2211InvA-S3:5’-CCGTGGTCCAGTTTATCG配列番号2312InvA-A1:5’-AACTGAGGATTCTGTCAATGTAG配列番号2413InvA-A2:5’-AAAAACTGAGGATTCTGTCAATGTAG配列番号2514InvA-A3:5’-GGCATCCGCATCAATAATAC配列番号2615Sal-InvR2:5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA配列番号2InvA遺伝子候補群プライマー:これら15個のプライマーは、サルモネラ検出敏感性を決定し、プライマー二量体互いにテンプレートとして作用するプライマーから由来したアンプリコンの生成のために、マトリックス内でスクリーニングされた。分析後、8個のセットが感知するほどのプライマー二量体を形成せず、標的の10ないし1,000のコピー間で検出されうるということを発見した。それらのセットは、それぞれプライマー番号1-5,1-7,3-14,4-5,4-7,8-5,9-5及び4-15である。それらプライマーセットの一部に係わる代表的なデータを、図10に示した。前記結果は、他のプライマーセットと比較するとき、プライマーセット4-15配列番号1及び2;太い黒色線に該当するがそれぞれの濃度で、Cp値が多いサイクルであるとき、他のプライマーセットを使用した同じ濃度に係わる相応する値より低いさらに良好な性能を示している。実施例9:サルモネラInvA遺伝子CataCleaveプローブの比較3個の互いに異なるプローブを合成して、効率性をテストした。Inv-CC-probe1:5’-CTGGTTGArTrTrTrCCTGATCG配列番号28Inv-CC-probe2:5’-CGATCAGrGrArArATCAACCAG配列番号30Inv-CC-probe3:5’-CAGTTTTTCrArArCrGTTTCCTGC配列番号29図11Inv-CC-probe1及び2及び図12Inv-CC-probe3に、結果を示した。プローブ1,2及び3の比較から、低減されたCp値、及び動的範囲dynamicrangeいずれについても、プローブ1より明白にさらに良好な性能を示している。図12から分かるように、プローブ3は、本実験で切断されなかった。かような結果は、本発明の一具体例によるInv-CC-probe2が、比較プローブcomparativeprobeに比べて、はるかに良好な効率性を示すということを示している。本明細書で開示されたいかなる特許、特許出願、公開または他の開示資料は、その全体として本明細書に参照として挿入される。ここで、参照として挿入されるとするいかなる資料またはその一部も、本明細書の定義、陳述またはその他開示資料と矛盾する場合、挿入された資料と現在開示資料との間に、矛盾しないほどにのみ挿入されると解釈するのである。"