"アゾスピリラム属菌の16SrDNAに由来するDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、配列番号1で示される塩基配列kはグアニン又はチミンを表すのうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号2で示される塩基配列のうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなることを特徴とするプライマーセット。上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号2で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる、ことを特徴とする請求項1に記載のプライマーセット。上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする請求項2に記載のプライマーセット。上記第一のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加していることを特徴とする請求項2に記載のプライマーセット。請求項1~4の何れか一項に記載のプライマーセットを備えることを特徴とするアゾスピリラム属菌の検出キット。以下の工程:a対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程、b上記試料に対して、請求項1~4の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、c上記工程bで得られる増幅断片の有無を検出する工程、を含むことを特徴とする、アゾスピリラム属菌の検出方法。上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルであることを特徴とする請求項6に記載の検出方法。分子遺伝学的な識別法において、例えば、アゾスピリラム属菌については、ランダムに増幅される多型DNAの分析、及び増幅されたリボソームDNA断片の制限酵素分析をすることによって、アゾスピリラム属菌を他菌属と識別することが試みられた非特許文献10、非特許文献11参照。しかしながら、この方法は特定のアゾスピリラム属菌種、菌株のみを識別可能にすぎない。また、アゾスピリラム株の16SrDNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブも開発され、アゾスピリラム属に属する菌の所在をつきとめ、その動的特徴を知るために使用された非特許文献13、非特許文献14、非特許文献16参照。しかしながら、プローブを使用するこの方法は煩雑な実験操作を必要とし、精密な操作及び熟練性を必要とする。制限酵素及びプローブを用いた方法に比べ、プライマーセットを用いた方法は煩雑な実験操作を必要とせず、迅速かつシンプルな方法である。非特許文献3では、16S-23SrDNA遺伝子間スペーサ領域ISR:internalspacerregionに基づき設計されたPCRプライマーセットfAZO/rAZOについて開示している。しかしこのプライマーセットは、菌株によってはアゾスピリラム属菌を認識できなかったり偽陰性、非アゾスピリラム属菌を誤認識したりする偽陽性ことがしばしばあり、検出精度に問題点がある。上記事情を鑑みて、本発明は、アゾスピリラム属菌をより精度よく、迅速かつシンプルに検出識別することのできるプライマーセット、検出キット及び検出方法を提供することを目的とする。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。1アゾスピリラム属菌の16SrDNAに由来するDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なプライマーセットであって、配列番号1で示される塩基配列のうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号2で示される塩基配列のうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。2上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号2で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記1に記載のプライマーセット。3上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記2に記載のプライマーセット。4上記第一のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記2に記載のプライマーセット。5上記1~4の何れか一項に記載のプライマーセットを備えるアゾスピリラム属菌の検出キット。6以下の工程:a対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程、b上記試料に対して、上記1~4の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、c上記工程bで得られる増幅断片の有無を検出する工程、を含むアゾスピリラム属菌の検出方法。7上記対象サンプルが、土壌サンプル又は植物由来サンプルである6に記載の検出方法。本発明は、PCR法でアゾスピリラム属菌を検出することができるという効果を奏する。以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。プライマーセット本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属に属する細菌アゾスピリラム属菌の16SrDNAに由来するDNA断片を、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって増幅可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、アゾスピリラム属菌の16SrDNA及び16SrDNAの断片にハイブリダイズして、PCRにより所定サイズの上記DNA断片を増幅させる。上記プライマーセットは、アゾスピリラム属菌の16SrDNAに由来するDNA断片を、PCRによって選択的に増幅可能という特性を有する。ここで、選択的に増幅可能とは、当該プライマーセットを用いたPCRを行った場合に、アゾスピリラム属菌由来のDNA断片が専ら増幅産物として得られるが、他の多くの生物由来のDNA断片は増幅産物として実質的に得られないことを指す。実施例にも示すように、本発明に係るプライマーセットを用いた増幅では、アゾスピリラム属に属する複数種の細菌において共通のPCR増幅産物が得られる反面、アゾスピリラム属に近縁な細菌を含む多くの細菌ではPCR増幅産物が得られない。また、土壌サンプル及び植物含有サンプル植物の根部等に対するPCR増幅の結果から、本発明に係るプライマーは、植物、及びアゾスピリラム属菌ではない多くの土壌微生物由来のPCR増幅産物が実質的に得られないことが示されている実施例参照。従って、本発明に係るプライマーは、アゾスピリラム属菌の検出に極めて有用である。本発明に係るプライマーセットは、具体的には以下の1~4の何れかに示すヌクレオチドより具体的にはDNAである。1配列番号1で示される塩基配列のうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第一のプライマーと、配列番号2で示される塩基配列のうち連続する少なくとも15塩基部分を有するヌクレオチドからなる第二のプライマーとからなるプライマーセット。なお、配列番号1で表される塩基配列中のkはグアニン又はチミンを示す。なお、PCR増幅の選択性をより向上させる観点では、第一のプライマーは、配列番号1で示される塩基配列のうち連続する少なくとも18塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましい。また、同様に、第二のプライマーは、配列番号2で示される塩基配列のうち連続する少なくとも18塩基部分を有するヌクレオチドからなることがより好ましく、少なくとも20塩基部分を有するヌクレオチドからなることがさらに好ましい。また、後述するように第一のプライマー、及び第二のプライマーともに、上記条件を満たす複数種のプライマーの混合物であってもよく、単独1種類のプライマーであってもよい。2上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンであるヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンであるヌクレオチドの少なくとも一方からなり、上記第二のプライマーが配列番号2で示される塩基配列を有するヌクレオチドからなる上記1に記載のプライマーセット。3上記第一のプライマーが、配列番号1で示される塩基配列においてkがグアニンである上記ヌクレオチド、及び配列番号1で示される塩基配列においてkがチミンである上記ヌクレオチドの混合物からなる上記2に記載のプライマーセット。第一のプライマーとして当該混合物を用いれば、アゾスピリラム属菌に対する特異性がより高まり、より多種類にわたるアゾスピリラム属菌を増幅可能となる。上記第一のプライマーとして上記混合物を用いる場合、kがグアニンである上記ヌクレオチドとkがチミンである上記ヌクレオチドとの混合比率は特に限定されず、例えば、1:9~9:1の範囲内、より好ましくは4:6~6:4の範囲内とすることができる。4上記第一のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加されており、かつ上記第二のプライマーにおいて1~2個の塩基が欠失、置換、又は付加している上記2又は3に記載のプライマーセット。なお、基本となるプライマーに対して1~2個の塩基に変異がある場合でも、所望のPCR増幅断片は得られる。また、上記3に記載のプライマーセットを構成する第一のプライマー混合物において、1~2個の塩基が欠失又は置換する場合は、配列番号1で示される塩基配列におけるk以外の塩基が欠失又は置換しているものとする。また、特に限定されないが各プライマーのGC含量は、例えば、50~70の範囲とするのが好ましく、50~65の範囲とすることがより好ましい。プライマーのTm値も特に限定されないが、例えば、50°C~65°Cとすることが好ましく、50°C~60°Cとすることがより好ましい。本発明に係るプライマーセットは常法に従って合成することができる。また、本発明に係るプライマーセットを用いたPCRの反応条件は特に限定されない。アゾスピリラム属菌の検出キット本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマーセットを備える。この検出キットは、アゾスピリラム属菌の有無の判別を含む検出に用いる。さらに、必要に応じて、1PCRに用いる各種試薬及び器具ポリメラーゼ、PCRバッファー、各dNTP、ピペット等、2PCRに供するDNAを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具試験管、バッファー等、3PCR増幅断片を解析するための各種試薬及び器具電気泳動ゲル材料、ピペット等、4さらなる詳細解析のため、アゾスピリラム属に属する特定種のみを増幅可能なPCRプライマーセット、5検出キットの使用説明書、等の少なくとも1つを備えていてもよい。アゾスピリラム属菌の検出方法本発明に係るアゾスピリラム属菌の検出方法は、以下の工程:a対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程、b上記試料に対して、本発明に係るプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、c上記工程bで得られる増幅断片の有無を検出する工程、を含む。以下、各工程を説明する。1工程a工程aは、対象サンプルからDNAを含有する試料を調製する工程である。ここで、対象サンプルとは、アゾスピリラム属菌の有無を判別しようとするサンプルを意味する。対象サンプルは、アゾスピリラム属菌を含む可能性のあるものであればよく、限り特に限定されない。例えば、土壌サンプル、植物の根部等の植物由来サンプル、培地上の微生物コロニー、微生物を含む培養液等が挙げられる。DNAを含有する試料は、例えば、土壌サンプル等の対象サンプルから常法に従って調製することができる。例えば、ボイル法、CTAB法等が挙げられる。これらの中では、操作の簡便さの観点では、ボイル法が好ましい。なお、ボイル法とは、対象サンプルを液体中例えば、滅菌蒸留水又はバッファーに懸濁して短時間例えば5分程度以下加熱して、DNAを取り出す方法である。なお、調製されたDNAを含有する試料には、DNAの他に、各種RNA、タンパク質、細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製してもよい。但し、実施例にも示す通り、本発明の方法では、当該試料に対して一切の精製を行わなくとも、一度のPCRにより非常に高感度な検出を行うことができる。2工程b工程bは、上記試料に対して、上記した本発明に係るプライマーセットを用いたPCRを行う工程である。工程bにおけるPCRは、常法に従って行うことができる。工程bにより、試料中にアゾスピリラム属菌が含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するアゾスピリラム16SrDNA由来のPCR増幅断片が得られる。3工程c工程cは、工程bで得られるPCR増幅断片の有無を検出する工程である。PCR増幅断片アンプリコンの有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりPCR増幅断片の有無及びサイズを確認することができる。PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が存在する場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在すると判別することができる。また、PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が存在しない場合には、対象サンプルにアゾスピリラム属菌が存在していないと判別することができる。従来法による農業サンプルからのアゾスピリラム属菌の分離プロセスでは、選択培地の使用と菌の生理形態学的評価を繰り返し行うため、一定の特徴を持った菌株のみを分離する選択バイアスが生じる。例えば、非特許文献24では、窒素源を含まない培地を使用した従来の分離プロセスにおいて、高い窒素固定能を有するアゾスピリラム属菌が分離され、低い窒素固定能の菌株は分離できなかったことを開示している。後述する実施例にも示す通り、本発明の一形態としてのAz16S-Aプライマーセットを使用したアゾスピリラム属菌のPCR検出により、選択培地と生理形態学的評価の使用を減らすことができるため、結果的に選択バイアスを低減させた分離プロセスを実現できる。また、本発明の一形態であるこのPCR検出法は、農業サンプルから多様なアゾスピリラム属菌を分離し、新規の植物成長促進細菌株を探索する上で有用な手法、またはアゾスピリラム属菌集団の多様性と生態とを分析するための有用な手法として利用できる。多数のアゾスピリラム属菌及び分離株を対象にしてAz16S-AプライマーセットによるPCR増幅産物アンプリコンのDNA配列を決定したところ、少なくとも15の一塩基多型SNPが見出され、そのうち12の一塩基多型は購入可能な制限酵素の認識サイトである。さらに、この12のSNPのうちの一つは、アゾスピリラム属菌とR.centenariaとの識別に有用であると見込まれる。一塩基多型について更なる分析と確認が必要であるが、おそらく、Az16S-Aプライマーセットの利用により、一回のPCRと制限酵素処理例えば、PCR-RFLP分析法によって、アゾスピリラム属分離株またはアゾスピリラム属菌集団の精密な同定及び多様性分析の両方が可能である。さらに、発明者らの実験では、根圏土壌と植物体部位に対してAz16S-Aプライマーセットを使用し、アゾスピリラム属菌の局在性を予測している。このような微生物動態の分析では、非特許文献16で開示された、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブも使用できるが、しかし我々の方法は、アゾスピリラム属菌の動態分析後の分離プロセスにおいても利用できる点で優位性がある。PCR法は最確数MPN法と併用することによって、アゾスピリラム属菌集団の定量にも利用できる非特許文献25、26参照。本発明のPCR法を組み込んだ迅速、容易且つ選択バイアスが最小となったアゾスピリラム分離技術、及びAz16S-Aプライマー配列に基づくリアルタイムPCR定量技術に対するさらなる応用が考えられる。実施例1<プライマーセットの設計及び作製>アメリカ国立バイオテクノロジーインフォメーションセンターNCBI,USA,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBankFtp.htmlジーンバンクヌクレオチドデータベースから合計30個のアゾスピリラム16SrDNA配列14の種からを入手し、バチルス属菌、Pseudomonas属菌、Roseomonas属菌を含む関連する類縁細菌群の16SrDNA配列と比較しながら、16SrDNAの開始コドンの下流300bp~1200bpにおける、推測上の属特異的且つ保存的領域について同定した。推測上のアゾスピリラム属特異的領域に基づき、属特異的なプライマーセットを設計するために、GeneiousPro4.8.5ソフトウエアBiomattersLtd社,Auckland,NewZealandを使用して、アゾスピリラム及びその類縁細菌群に属する菌に対して、DNA配列アライメント解析を実施した。同様に、ジーンバンクから6つのipdC遺伝子配列3つのアゾスピリラム属菌種から、3つのnifA遺伝子配列2つのアゾスピリラム属菌種から、12のnifH遺伝子配列3つのアゾスピリラム属菌種からを入手し、プライマーセットを設計した。ipdC、nifA及びnifH遺伝子は何れも細菌による植物成長促進において重要な遺伝子である。具体的には、ipdC遺伝子は、インドール-3-酢酸生合成酵素をコード化するものであり、nifA遺伝子及びnifH遺伝子はそれぞれ、窒素固定のためのニトロゲナーゼ酵素の制御遺伝子及び構造遺伝子をコード化するものである。各プライマーセットの設計に際して、次の条件1~3を適用した。1原則として20個前後、好ましくは20個を超えるヌクレオチド塩基を有するプライマーセットを設計し、2上記プライマーセットは200-800bpのDNA断片アンプリコンを生成させると予測されるものを選択し、3上記プライマーセットのヌクレオチドコードはアゾスピリラム属菌の間で同じかまたは最大で2塩基程度異なるものを許容するように設計した。表1は、Baudoinらによって報告されたfAZO/rAZOプライマー非特許文献3参照と共に、今回設計されたプライマーを表示したものである。設計されたが、簡易PCRを伴う予備分析preliminaryassaysによって排除されたものは、表1には示されていない。<結果>表1は、今回設計した9つのプライマーセットと共に、Baudoinらによって報告されたプライマーセットfAZO/rAZO非特許文献3参照を表示したものである。プライマー名に16Sが含まれるもの、ipdが含まれるもの、nifが含まれるものは、順に、16SrDNAの塩基配列、ipdの塩基配列、nifの塩基配列に基づき設計されたものである。設計されたが予備分析preliminaryassaysによって排除されたものは、表1には示されていない。表において、KはG及びTの二種の塩基の混合すなわち、Kがグアニンであるプライマーと、Kがチミンであるプライマーとの混合物。両者の混合比率は約1:1。であることを意味している。アンプリコンサイズはアゾスピリラムブラシレンセJCM1224TSのDNA配列により推測されたものである。実施例2<プライマーセットの属特異性評価>12のアゾスピリラム標準株referencestrains及び15の非アゾスピリラム標準株について、実施例1で作製したプライマーセットの属特異性について調べた。使用した12のアゾスピリラム標準株及び15の非アゾスピリラム標準株、合計27の標準株を以下に示した。TSは基準株であることを示している。アゾスピリラム属の12の標準株1A.brasilenseJCM1224TS2A.brasilenseJCM12253A.brasilenseJCM12264A.lipoferumJCM12275A.lipoferumJCM12286A.lipoferumJCM1247TS7A.lipoferumJCM12708A.amazonenseDSM2787TS9A.halopraeferensDSM3675TS10A.irakenseDSM11586TS11A.picisDSM19922TS12A.rugosumDSM19657TS非アゾスピリラム属の15の標準株アゾスピリラム属の類縁細菌群に属するもの:1RhodocistacentenariaDSM9894TS2MagnetospirillummagnetotacticumDSM3856TS3PaeospirillumfulvumDSM113TS4RhodospirillumrubrumDSM467TS5R.salinarumDSM9154TS6ThalassospiralucentensisDSM14000TSそのほかのプロテオバクテリア:7AgrobacteriumtumefaciensMAFF3012248AgrobacteriumtumefaciensMAFF3015409RhizobiumleguminosarumMAFF21003910Alcaligenaceaesp.RERT02012611StenotrophomonasmaltophiliaMAFF30169012StenotrophomonasmaltophiliaRERT020018Firmicutesに属するもの:13BacilluspumilusMAFF11825614BacilluspumilusRERT02011115MicrobacteriumesteraromaticumRERT02002012のアゾスピリラム及び15の非アゾスピリラム、合計27の標準株表2を参照は、ドイツ微生物培養細胞収集有限会社DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen、DSMZから11のDSM菌株、日本独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室JapanCollectionofMicroorganisms、JCMから7つのJCM菌株、日本独立行政法人農業生物資源研究所NationalInstituteofAgrobiologicalSciences、NIASから5つのMAFF菌株、および発明者の細菌コレクションから上記10、12、14、15のRERT菌株4つ入手したものである。12のアゾスピリラム属菌株は、PCR実験の時点で、上記機関において入手できるアゾスピリラム属7種すべてを含む。InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology及びNCBIで報告された14のアゾスピリラム属菌種のうち非特許文献18、非特許文献19参照、その種の菌株の取得または培養の困難さのために7つの種は本実施例での考慮対象外とした例えばA.doebereineraeDSMZ13131TS。これまでの系統分類学的解析では、種間の関係が分析間で多少異なる点はあるが、考慮対象外とした上記7つの種は何れも本研究で使用された7つのアゾスピリラム属菌種の間に位置するという結果を示す。考慮対象外とした上記7つの種は、1A.doebereinerae非特許文献9、非特許文献19、2A.largimobile非特許文献9、非特許文献20、3A.canadense非特許文献21、非特許文献23、非特許文献19、4A.melinis非特許文献21、非特許文献23、5A.zeae非特許文献22、非特許文献23、6A.oryzae非特許文献20、非特許文献24、7A.palatum非特許文献19参照である。15の非アゾスピリラム菌株は、類縁細菌群非特許文献17参照とBaudoinら非特許文献3参照が研究において使用した土壌バクテリアの菌株から選択された。プライマーセットの属特異性の分析実験は、次のように行われた。27の標準株の定常期培養物stationary-phaseculturesの一定分量を、遠心し、滅菌蒸留水に再懸濁させた溶液を95°Cにおいて5分間放置した後、遠心を行いPCRの鋳型となる細胞溶解物上清を得た。PCR反応混合物は、10xPCRバッファー2.5μl、1.5mMMgCl2、各dNTPを0.25mMずつ、各プライマーを0.02μMずつ、TaqDNAポリメラーゼBIOTAQ,BioLine,London,UKを2.5ユニット、粗製のバクテリア溶解物10μlを含み、総量は25μlである。PCRはVeritiサーマルサイクラーAppliedBiosystems,CA,USによって、下記条件に基づいて実施された。まず94°Cにおいて3分間放置し、初期変性させる。次に、下記操作を35サイクル繰り返す。各サイクルは、94°Cで30秒間変性させた後、各プライマーセットの最適温度で30秒アニーリングさせ、72°Cで1分間伸長させる。上記最適温度として、Az16SA配列番号1及び2として示すAz16SB、Az16S‐Cは58°Cである。AzipdC、AznifA-A、AznifA-Bは52°Cである。AznifH‐A,AznifH‐B,AznifH‐Cは55°Cである塩基配列に関しては表1を参照。上記35サイクルが終了した後、72°Cで5分間放置し最終的な伸長をさせた。Baudoinらによって報告されたfAZO/rAZOプライマーを使用したPCRは、彼らの報告した手順に従って実施した。PCR産物は、100-bpDNAラダーHyperLadderIV,BioLineと共に2アガロースゲル中に展開され、臭化エチジウム溶液によって染色され、AE‐6905HImageSaverHRATTO,Tokyo,Japanによって撮影された。このPCR実験によって選ばれたAz16S‐Aプライマーセットの属特異性は、さらに、35のアゾスピリラム様分離株及び70の未知の分離株に対しても、同様のPCR及び電気泳動の手順によって分析された後述の実施例3を参照。<結果>上記属特異性分析実験の結果を、表2に示した。表2において及び-はそれぞれ、予測アンプリコンの有無を示している。すなわち、は予測アンプリコンが得られたことを指し、-は予測アンプリコンが得られなかったことを指す。実験が行われた10のプライマーセット表1を参照において、16SrDNA配列に基づき設計されたプライマーセットAz16SAは、12のアゾスピリラム標準株7の種すべて及び1の非アゾスピリラム属菌株RhodocistacentenariaDSM9894表2参照に対して、単一のアンプリコンを生成させることに成功した。アンプリコンは単一のDNAバンドとして観察され、上記DNAバンドの長さはおおよそ640bpであって図1を参照、この長さはA.brasilense16SrDNA配列から予測された長さ表1を参照に一致するものである。なお、非アゾスピリラム属菌株Rhodocistacentenariaは、自然界では温泉などの特殊環境に棲息することが報告されており、アゾスピリラム属菌とは棲息環境が異なる。プライマーセットAz16SBを用いたPCRは、12のアゾスピリラム標準株すべてから予測アンプリコンを生成させただけでなく、α-プロテオバクテリア及びβ-プロテオバクテリアにわたる10の非アゾスピリラム属菌株からも、予測アンプリコンを生成させた。プライマーセットAz16SC、AznifHA、及びAznifHBは、Baudoinらによって報告されたプライマーセットfAZO/rAZOと同じように、12のアゾスピリラム属菌株のうち、1-3の株に対してはアンプリコンを生成させることができず、17の非アゾスピリラム属菌株のうち、25の株に対しては複数のアンプリコンを生成させた。これらの4のプライマーセットにおいて、プライマーセットAznifHA及びAznifHBは、他の2のプライマーセットに比べ比較的良い属特異性を示した。残りの4つのプライマーセットからは良くない結果が得られた。従って、プライマーセットAz16SAはアゾスピリラム属菌に対して最も優れた特異性を示した。ここで、図1について説明すると、図1は、プライマーセットAz16S-Aを用いた、未知分離株に対するPCR実験の結果を示している。PCR産物は2アガロースに溶解され、臭化エチジウム溶液によって染色された。識別された分離株は、16SrDNA配列決定解析によって、下記のように確認された。レーン1はAchromobacter及びRahnellaによって汚染された、アゾスピリラム属菌培養物であり、レーン2はAchromobacter、レーン3はAchromobacter、レーン4はアゾスピリラム、レーン5はアゾスピリラム、レーン6はAchromobacter、レーン7はアゾスピリラム、レーン8はStenotrophomonas、レーン9はアゾスピリラム、レーン10はAchromobacter、レーン11は参照物としてのA.brasilenseJCM1224TS、レーンMは100-bpDNAラダーである。実施例3<作製されたプライマーセットの利用可能性>さらに、35のアゾスピリラム様分離株と、農業サンプルから得られた70の未知の分離株を用いて、選択されたプライマー候補の特異性、検出限界及び利用可能性について調べた。アゾスピリラム属菌の分離において検出限界は重要な面であって、根圏土壌及び植物体から分離するプロセスにおいては、アゾスピリラム属の菌落及び培養物はしばしば非アゾスピリラム微生物によって汚染されているからである。使用された35のアゾスピリラム様分離株と70の未知の分離株アゾスピリラム様分離株は、根圏土壌並びに作物及び草の根部から収集されたものである。上記収集は、独立行政法人農業生物資源研究所NIASと十勝農業協同組合連合会農産化学研究所ARITFACによって、選択培地及び形態生理学評価の両方を用いて行われた。選択培地は例えば、窒素不含有ブロモチモールブルーNFb培地、RojoCongoコンゴレッド培地である。形態生理学評価は、例えば、アセチレン減少分析ARA非特許文献5、非特許文献9である。これらの分離株のrDNA配列データは入手できないものであった。全部で35のアゾスピリラム様分離株を、上記収集されたコレクションからランダムに選出した。さらに、根圏土壌、穀物及び飼草の根部から、ARAとrDNA配列決定を用いずに、選択培地のみによって収集した我々のストックから、70の未知の分離株をランダムに選出した。これらの分離株の属及び種は未知であった。使用された35のアゾスピリラム様分離株は多数の、70の未知の分離株は少数の、アゾスピリラム属菌を含むものと考えられる。作製したプライマーセットによる検出実験すべての菌株及び分離株に対して、16SrDNA配列決定解析を行った。ボイル法によって抽出された粗製DNAは、アゾスピリラム16SrDNA配列に基づき設計されたAz16SD配列決定プライマーによって、PCR増幅された。Az16SD配列決定プライマーセットのフォワードプライマーは5’CCGCGGTAATACGAAGGGGGCであり、リバースプライマーは5’GCCTTCCTCCGGCTTGTCACCGGCである。当該プライマーセットによるアンプリコンサイズは、おおよそ650bpと推測され、それは属レベルで系統発生的分類をするのには充分である。PCRはアニーリング温度60°Cで、前記のPCR実験で記載されているのと同じ手順によって実施された。PCR産物はMin-ElutePCR精製キットQIAGEN,Hilden,Germanyによって精製され、Az16SDフォワードプライマー、BigDyeTerminatorv3.1サイクル配列決定キット,3730xlDNAアナライザーAppliedbiosystemsによって配列決定された。配列データは、SEQMATCHprogramver.3.0非特許文献7参照を使用し、リボソームデータベースプロジェクトリリース10、ミシガン州立大学微生物生態学センター[http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp]で得られたデータと比較し、カットオフ類似性Sab値を>0.7に設定しマッチする微生物種を探索し上位20マッチに基づき菌株及び分離株の属を決定した。<結果>上記作製したプライマーセットによる検出実験の結果を、表3に示した。表3は、35のアゾスピリラム様分離株及び70の未知分離株に対するPCR実験及びrDNA配列決定解析の結果を比較したものである。表3において、NIASは独立行政法人農業生物資源研究所であり、ARITFACは十勝農業協同組合連合会農産化学研究所である。と-はそれぞれ、予測されたアンプリコンの有無を示している。表3によれば、プライマーセットAz16SAを用いたPCRは、NIASから入手した20のアゾスピリラム様分離株のうち17の菌株から、予測された単一のアンプリコンを得た。PCR検出においてアンプリコンが得られた17の分離株は、16SrDNA配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類され、残りの3つの株は、Williamsia、Bacillus、Rhizobiumに分類された。PCR実験及びrDNA配列決定解析の結果における完全な一致は、ARITFACから入手した15のアゾスピリラム様分離株及び我々のストックから入手した70の未知分離株においても見られた表3及び図1を参照。アンプリコンが得られた5つの未知分離株のうちの一つ図1レーン1参照のrDNA配列決定解析は、この培養物はアゾスピリラムのほかにも二つの種、Achromobacter及びRahnellaを含んでいることを示した。従って、プライマーセットAz16SAを用いたPCRは、混合培養物におけるアゾスピリラムを成功裏に検出することができた。Baudoinらによって報告されたプライマーセットfAZO/rAZOを用いたPCRでは、アゾスピリラム疑似分離株に対して、PCR実験及びrDNA配列決定解析の結果における完全な一致が見られた。しかし、70の未知分離株のうち詳細は示していない、2つの非アゾスピリラム分離物BacillusとPantoeaからも、5つのアゾスピリラムと同様に、アンプリコンを生成させた。NIASから入手した分離株のうち、3つの非アゾスピリラム分離株は、Williamsia,Bacillus,Rhizobium種である。同じように、我々のストックからの67の非アゾスピリラム分離株のうち、34はBacillusとして同定され、8はMicrobacteriumとして、6はPaenibacillusとして、6はStenotrophomonasとして、6はAcromobacterとして、2はAlcaligenesとして、2はLysinibacillusとして、1はHerbaspirilluとして、1はPantoraとして、1はYersiniaとして同定された。実施例4<アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション>上記実施例3において、70の未知分離株のうち、Az16SAプライマーを用いたPCRによって得られたアンプリコンの存在が確認されたのは5つの分離株である。この5つの分離株は、16SrDNA配列決定解析によって、アゾスピリラム属に分類された。これらの属種及び生理学的特性をさらに調べるため、この5つの分離株における炭素源利用、IAA生成、窒素固定化について、A.brasilenseJCM1224TS及びA.brasilenseJCM1226と比較しながら評価した。炭素源利用の評価についてはAPI20NEシステムbioMERIEUX,Lyon,Franceを用いて、製造元のプロトコルに従って実施した。IAA生成については、修飾されたSalkowski試薬非特許文献12を参照を用いて比色法によって計測された。分離株は1mMトリプトファンを補充したLuria-BertaniLBブロスにおいて、30°C条件下において2日間、定常期になるまで培養され、それからIAAの計測に供された非特許文献8を参照。窒素固定能は、水素炎イオン検出器を備えたガスクロマトグラフ装置GC4000GLScience,Tokyo,Japanを使用して、ARA法非特許文献9、非特許文献15を参照によって見積もられた。ARAを行うため、バクテリア培養物は、2mlの濃度1v/vの半固体NFb培地に添加され、9-ml密封バイアル瓶中において、30°C条件下で24時間培養された。上記培養後に10体積気体体積のアセチレンをバイアル瓶中に導入し、さらに24時間培養し、それからガスクロマトグラフィーを実施した。それぞれの分離株のIAA生成及びアセチレン減少については、それぞれ3~4のバイアル瓶で重複して実験された。<結果>上記アンプリコンの存在を示した分離株のキャラクタリゼーション実験の結果を、表4に示した。表4は、いわゆる農業サンプルからPCR実験によって分離されたアゾスピリラム属菌の炭素源利用、インドール-3-酢酸IAA生成及びアセチレン減少について示した表である。炭素源利用タイプはAPI20NEシステムによって評価されたものであり、ABタイプはA.brasilenseに特有の利用型であって、N-アセチルグルコサミン-、L-アラビノース、D-グルコース-、D-マンニトール-、D-マンノース-を利用するものである。我々のストックから入手の分離株のうち、アンプリコンが得られた5つの分離株は、A.brasilense表4を参照に特有的な炭素源利用型と同様の炭素源利用型を示した。IAA生成能及びアセチレン減少窒素固定能力は、5つの分離株すべてにおいて見られた。分離株におけるこれら二つの能力は、A.brasilenseJCM1224TSより優れていた。アセチレン減少に見られる分離株同士の大きな差異は、IAA生成に見られる分離株同士より顕著であった。分離株のIAA生成とアセチレン減少との間には、顕著な相関性は観察されなかった。これらの結果から、プライマーセットAz16S‐Aは、アゾスピリラム独特の生理学特性を示す分離株を正確に識別する能力を有することがさらに確認された。実施例5<プライマーセットの検出限界>Az16SAプライマーを用いたPCRを、異なる濃度10‐106CFUml-1のA.brasilenseJCM1224TSに対して、上記と同じ手順にて実施した。さらに、BacilluspumilusMAFF118256が混入されたA.brasilenseJCM1224TS培養物に対しても、PCRを実施した。バチルス属菌がモデル汚染菌として選ばれた理由は、我々の実験系において、アゾスピリラム選択培地に観察される非アゾスピリラム属菌の大部分においてバチルス属菌が存在するからである。混合培養物を得るために、アゾスピリラム及びバチルス培養物はそれぞれ、LB培養液において37°C条件下において48時間及び24時間培養された。それから、最終菌濃度が107CFUml-1となるように、A.brasilense:B.pumilusを1:1~1:104の異なる比率で混合した。プライマーの検出限界とは、検出可能なPCRアンプリコンをもたらすことのできる、最小のアゾスピリラム濃度または比率である。<結果>プライマーセットAz16SAを用いるPCRは、103CFUml-1の濃度を有するA.brasilense純粋培養物から、予測サイズに該当する検出可能な量のアンプリコンを生成させることが出来た図2中のaを参照。同様に、A.brasilense:B.pumilusを1:104またはそれ以上の比率で混合して得られた混合培養物からも、PCRでは同じように予想アンプリコンを生成することが出来た図2中のbを参照。A.brasilense:B.pumilusを1:104の比率で混合した混合培養物は、おおよそ103CFUml-1のA.brasilenseを含んでいる。したがって、プライマーセットの検出限界は、純粋培養物及び混合培養物において同じである。さらに、PCRの汚染菌存在時におけるアゾスピリラム菌の検出能力は、農業サンプルから得られた70の未知分離株においても確認された図1レーン1参照。なお、図2は純粋培養物及び混合培養物におけるプライマーセットAz16S-Aを用いたアゾスピリラム属菌のPCR検出を示した図である。図中aのPCR産物はA.brasilenseJCM1224TS純粋培養物から得られ、図中bのPCR産物はBacilluspumilusMAFF118256が混合されたA.brasilense培養物から得られた。PCR産物は2アガロースに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。図中aにおける、レーン上部の数字は、A.brasilense濃度CFUml-1である。レーンMは100-bpDNAラダーである。図中bにおいて、レーン1はA.brasilenseのみ、レーン2は、A.brasilense:B.pumilusを1:1で混合したもの、レーン3は、1:10で混合したもの、レーン4は、1:102で混合したもの、レーン5は、1:103で混合したもの、レーン6は1:104で混合したもの、レーン7は、B.pumilusのみのもの、を夫々示す。PCR産物は2アガロースゲルに展開され、臭化エチジウム溶液によって染色された。"