"a.組換えポリペプチドをコードする核酸と;b.原栄養能を栄養要求性宿主細胞へ回復させる少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸と;を含む核酸構築物を含む細菌発現系で使用するための、栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞。したがって本発明の目的は、効率的で調節可能であり、規制上および環境上の懸念を最小限に抑える培地中で実施される、標的タンパク質の産生のための改良発現系を提供することである。本発明の別の目的は、標的タンパク質の産生のための改良発現系における宿主細胞として使用するための生物を提供することである。本発明のなお別の目的は、標的タンパク質の改良された産生のためのプロセスである。本発明のさらに別の目的は、標的タンパク質の産生のための改良発現系で使用される新規な構築物および核酸を提供することである。したがって、本発明は以下を提供する。1a.組換えポリペプチドをコードする核酸と;b.原栄養能を栄養要求性宿主細胞へ回復させる少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸と;を含む核酸構築物を含む細菌発現系で使用するための、栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞。2シュードモナスが蛍光菌である、上記1に記載の細胞。3上記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、上記1に記載の細胞。4上記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、上記1に記載の細胞。5上記栄養要求性細胞が1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、上記1に記載の細胞。6上記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、上記1に記載の細胞。7上記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、上記1に記載の細胞。8上記酵素がオロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼである、上記7に記載の細胞。9上記酵素が配列番号1および3からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記8に記載の細胞。10上記酵素が配列番号2のアミノ酸配列を含む、上記7に記載の細胞。11上記酵素がΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼである、上記7に記載の細胞。12上記酵素が配列番号6および8からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記11に記載の細胞。13上記酵素が配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記11に記載の細胞。14上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子を無効にすることによって産生される、上記1に記載の細胞。15上記無効にされたpyrF遺伝子が、配列番号1および配列番号3からなる群から選択される核酸を含む、上記14に記載の細胞。16上記栄養要求性細胞がproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記1に記載の細胞。17上記無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号8からなる群から選択される核酸を含む、上記16に記載の細胞。18上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子およびproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記1に記載の細胞。19上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号9からなる群から選択される核酸を含む、上記18に記載の細胞。20上記細胞がPlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の染色体lacIインサートも含有する、上記1に記載の細胞。21上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記20に記載の細胞。22上記核酸構築物が少なくとも1つのlacOid配列をさらに含む、上記1に記載の細胞。23上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記22に記載の細胞。24上記核酸構築物が1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む、上記1に記載の細胞。25少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの5’側に位置し、少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの3’側に位置する、上記24に記載の細胞。26少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記25に記載の細胞。27lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記26に記載の細胞。28改変がlacI遺伝子の少なくとも1つの染色体挿入を含み、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、細菌発現系で使用するための遺伝子改変シュードモナスPseudomonad細胞。29上記シュードモナスが蛍光菌である、上記28に記載の細胞。30上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記28に記載の細胞。31上記lacI遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、上記28に記載の細胞。32上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記28に記載の細胞。33上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記32に記載の細胞。34上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記32に記載の細胞。35少なくとも1つのlacOid配列を含む核酸をさらに含む、上記28に記載の細胞。36上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記35に記載の細胞。371つを超えるlacオペレーター配列を含む核酸をさらに含む、上記28に記載の細胞。38少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記37に記載の細胞。39上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記38に記載の細胞。40少なくとも1つのlacOidオペレーター配列を含む核酸構築物を含む、細菌発現系で使用するためのシュードモナスPseudomonad細胞。41上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記40に記載の細胞。42上記lacOid配列がプロモーターの3’側に位置する、上記40に記載の細胞。43上記lacOid配列がプロモーターの5’側に位置する、上記40に記載の細胞。44上記lacOid配列がプロモーターの3’側および5’側に位置する、上記40に記載の細胞。45上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記40に記載の細胞。46上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記45に記載の細胞。47上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記45に記載の細胞。48上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記40に記載の細胞。49上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記40に記載の細胞。501つを超えるlacオペレーター配列を含む核酸構築物を含む、細菌発現系で使用するためのシュードモナスPseudomonad細胞。51少なくとも1つのlacオペレーターがlacOid配列である、上記50に記載の細胞。52上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記51に記載の細胞。53上記lacOid配列がプロモーターの5’または3’側である、上記51に記載の細胞。54上記lacOid配列がプロモーターの5’および3’側である、上記51に記載の細胞。55上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記50に記載の細胞。56上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記55に記載の細胞。57上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記55に記載の細胞。58上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記50に記載の細胞。59上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記50に記載の細胞。60組換えポリペプチドを産生するプロセスであって:a.少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するために、遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonad細胞において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程と;b.原栄養能を栄養要求性細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程と;c.栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を培養する工程と;を含むプロセス。61上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記60に記載のプロセス。62上記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、上記60に記載のプロセス。63上記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、上記60に記載のプロセス。64上記栄養要求性細胞が1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、上記60に記載のプロセス。65上記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、上記64に記載の細胞。66上記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、上記60に記載のプロセス。67上記酵素がオロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼである、上記66に記載のプロセス。68上記酵素が配列番号1および3からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記67に記載のプロセス。69上記酵素が配列番号2のアミノ酸配列を含む、上記68に記載のプロセス。70上記酵素がΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼである、上記66に記載のプロセス。71上記酵素が配列番号6および8からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記70に記載のプロセス。72上記酵素が配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記70に記載のプロセス。73上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子を無効にすることによって産生される、上記60に記載のプロセス。74上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸を含む、上記73に記載のプロセス。75上記栄養要求性細胞がproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記60に記載のプロセス。76上記無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号8からなる群から選択される核酸を含む、上記75に記載のプロセス。77上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子およびproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記60に記載のプロセス。78上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたproC遺伝子が核酸からなる群から選択される配列番号6および配列番号9を含む、上記77に記載のプロセス。79上記細胞がPlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の染色体lacIインサートも含有する、上記60に記載のプロセス。80上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記79に記載のプロセス。81上記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも1つのlacOid配列をさらに含む、上記60に記載のプロセス。82上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記81に記載のプロセス。83上記組換えポリペプチドをコードする核酸が1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む、上記60に記載のプロセス。84少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの5’側に位置し、少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの3’側に位置する、上記83に記載のプロセス。85少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記84に記載のプロセス。86上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記85に記載のプロセス。87lacI遺伝子の少なくとも1つの染色体挿入を含むシュードモナスPseudomonadにおいて組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、プロセス。88上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記87に記載のプロセス。89上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記87に記載のプロセス。90上記lacI遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、上記87に記載のプロセス。91上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記87に記載のプロセス。92上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記91に記載のプロセス。93上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記87に記載のプロセス。94上記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも1つのlacOid配列を含む、上記87に記載のプロセス。95上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記94に記載のプロセス。96上記組換えポリペプチドをコードする核酸が1つを超えるlacオペレーター配列を含む、上記87に記載のプロセス。97少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記96に記載のプロセス。98上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記97に記載のプロセス。99シュードモナスPseudomonad細胞において組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、核酸が少なくとも1つのlacオペレーター配列をさらに含み、lacオペレーター配列がlacOid配列である、プロセス。100上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記99に記載のプロセス。101上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記99に記載のプロセス。102少なくとも1つのlacOid配列がプロモーターの3’側に位置する、上記99に記載のプロセス。103少なくとも1つのlacOid配列がプロモーターの5’側に位置する、上記99に記載のプロセス。104少なくとも1つのlacOid配列がプロモーターの3’および5’側に位置する、上記99に記載のプロセス。105上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記99に記載のプロセス。106上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記105に記載のプロセス。107上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記105に記載のプロセス。108上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記99に記載のプロセス。109シュードモナスPseudomonadにおいて組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する工程を含む、組換えポリペプチドを産生するためのプロセスであって、核酸が1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む、プロセス。110少なくとも1つのlacオペレーターがlacOid配列である、上記109に記載のプロセス。111上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記110に記載のプロセス。112上記lacOid配列がプロモーターの5’または3’側である、上記110に記載のプロセス。113上記lacOid配列がプロモーターの5’および3’側である、上記110に記載のプロセス。114上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記109に記載のプロセス。115上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記114に記載のプロセス。116上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記114に記載のプロセス。117上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記109に記載のプロセス。118上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記109に記載のプロセス。119宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって:a.シュードモナスPseudomonad細胞を選択する工程であって、細胞が細胞にlacI遺伝子を染色体的に挿入することによって遺伝子改変され、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、工程と;b.細胞に組換えポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されたLacIタンパク質プロモーターを含む核酸構築物を導入する工程と;を含むプロセス。120上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記119に記載のプロセス。121上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記119に記載のプロセス。122上記lacI遺伝子がレバンスクラーゼ位置に挿入される、上記119に記載のプロセス。123上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記119に記載のプロセス。124上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記123に記載のプロセス。125上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記123に記載のプロセス。126上記組換えポリペプチドをコードする核酸が少なくとも1つのlacOid配列を含む、上記119に記載のプロセス。127上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記126に記載のプロセス。128少なくとも1つのlacOid配列がプロモーターの3’側に位置する、上記126に記載のプロセス。129少なくとも1つのlacOid配列がプロモーターの5’側に位置する、上記126に記載のプロセス。130上記lacOid配列がプロモーターの3’および5’側に位置する、上記126に記載のプロセス。131上記組換えポリペプチドをコードする核酸が1つを超えるlacオペレーター配列を含む、上記119に記載のプロセス。132少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記131に記載のプロセス。133上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記132に記載のプロセス。134宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって:a.シュードモナスPseudomonad細胞を選択する工程と;b.核酸構築物であって:i.組換えポリペプチドをコードする核酸と;ii.少なくとも1つのlacOidオペレーター配列と;を含む核酸構築物を導入する工程と;を含むプロセス。135上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記134に記載のプロセス。136上記lacOid配列がプロモーターの3’側に位置する、上記134に記載のプロセス。137上記lacOid配列がプロモーターの5’側に位置する、上記134に記載のプロセス。138上記lacOid配列がプロモーターの3’および5’側に位置する、上記134に記載のプロセス。139上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記134に記載のプロセス。140上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記139に記載のプロセス。141上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記139に記載のプロセス。142上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記134に記載のプロセス。143上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記134に記載のプロセス。144宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を調節するプロセスであって:a.シュードモナスPseudomonad細胞を選択する工程と;b.核酸構築物であって:i.組換えポリペプチドをコードする核酸と;ii.1つを超えるlacオペレーター配列と;を含むプロセス。145少なくとも1つのlacオペレーターがlacOid配列である、上記144に記載のプロセス。146上記lacOid配列が配列番号14および配列番号59からなる群から選択される、上記145に記載のプロセス。147上記lacOid配列がプロモーターの3’および5’側である、上記145に記載のプロセス。148上記lacOid配列がプロモーターの3’および5’側である、上記145に記載のプロセス。149上記細胞が細胞内で少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を産生するようにさらに改変されている、上記144に記載のプロセス。150上記栄養要求株がpyrFおよびproCからなる群から選択される遺伝子への改変によって産生される、上記149に記載のプロセス。151上記栄養要求株がpyrFおよびproC遺伝子の両方への改変によって産生される、上記149に記載のプロセス。152上記細胞がlacI遺伝子の染色体挿入を含有し、lacI遺伝子が完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である、上記144に記載のプロセス。153上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記144に記載のプロセス。154抗生物質の非存在下での組換えポリペプチドの産生のプロセスであって:a.シュードモナスPseudomonad細胞を選択する工程であって、細胞が少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、それにより栄養要求性細胞を産生する、工程であって;b.細胞に:i.組換えポリペプチドをコードする核酸と;ii.原栄養能を栄養要求性宿主細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸と;を含む核酸構築物を導入する工程と;c.組換えポリペプチドおよび原栄養能回復ポリペプチドを細胞内で発現させる工程と;d.栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を増殖させる工程と;を含むプロセス。155上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記154に記載のプロセス。156上記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、上記154に記載のプロセス。157上記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、上記154に記載のプロセス。158上記栄養要求性細胞が1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、上記154に記載のプロセス。159上記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、上記158に記載のプロセス。160上記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、上記154に記載のプロセス。161上記酵素がオロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼである、上記160に記載のプロセス。162上記酵素が配列番号1および3からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記161に記載のプロセス。163酵素が配列番号2のアミノ酸配列を含む、上記160に記載のプロセス。164上記酵素がΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼである、上記160に記載のプロセス。165上記酵素が配列番号6および8からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記164に記載のプロセス。166上記酵素が配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記164に記載のプロセス。167上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子を無効にすることによって産生される、上記154に記載のプロセス。168上記無効にされたpyrF遺伝子が、配列番号1および配列番号3からなる群から選択される核酸を含む、上記167に記載のプロセス。169上記栄養要求性細胞がproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記154に記載のプロセス。170上記無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号8からなる群から選択される核酸を含む、上記169に記載のプロセス。171上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子およびproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記154に記載のプロセス。172上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号9からなる群から選択される核酸を含む、上記171に記載のプロセス。173上記細胞がPlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の染色体lacIインサートも含有する、上記154に記載のプロセス。174上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記173に記載のプロセス。175上記核酸構築物が少なくとも1つのlacOid配列をさらに含む、上記154に記載のプロセス。176上記核酸構築物が1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む、上記154に記載のプロセス。177少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの5’側であり、少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの3’側である、上記176に記載のプロセス。178少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記177に記載のプロセス。179選択の間に栄養共生阻害が最小限に抑えられる抗生物質の非存在下での組換えポリペプチドの産生のプロセスであって:a.シュードモナスPseudomonad細胞を選択する工程であって、細胞が少なくとも1つの代謝産物に対する栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、それにより栄養要求性細胞を産生する、工程であって;b.細胞に:i.組換えポリペプチドをコードする核酸と;ii.原栄養能を栄養要求性宿主細胞に回復させるポリペプチドをコードする核酸と;を含む核酸構築物を導入する工程と;c.組換えポリペプチドおよび原栄養能回復ポリペプチドを細胞内で発現させる工程と;d.栄養要求性代謝産物の欠乏した培地上で細胞を増殖させる工程と;を含むプロセス。180上記シュードモナスPseudomonadが蛍光菌Pseudomonasfluorescensである、上記179に記載のプロセス。181上記細胞がウラシルに対して栄養要求性である、上記179に記載のプロセス。182上記細胞がプロリンに対して栄養要求性である、上記179に記載のプロセス。183上記栄養要求性細胞が1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である、上記179に記載のプロセス。184上記細胞がウラシルおよびプロリンに対して栄養要求性である、上記183に記載のプロセス。185上記原栄養能回復ポリペプチドが細胞生存に必要な代謝産物の生合成で活性な酵素である、上記179に記載のプロセス。186上記酵素がオロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼである、上記185に記載のプロセス。187上記酵素が配列番号1および3からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記186に記載のプロセス。188上記酵素が配列番号2のアミノ酸配列を含む、上記185に記載のプロセス。189上記酵素がΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼである、上記185に記載のプロセス。190上記酵素が配列番号6および8からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、上記189に記載のプロセス。191上記酵素が配列番号7のアミノ酸配列を含む、上記189に記載のプロセス。192上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子を無効にすることによって産生される、上記179に記載のプロセス。193上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸含む、上記192に記載のプロセス。194上記栄養要求性細胞がproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記179に記載のプロセス。195上記無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号8からなる群から選択される核酸を含む、上記194に記載のプロセス。196上記栄養要求性細胞がpyrF遺伝子およびproC遺伝子を無効にすることによって産生される、上記179に記載のプロセス。197上記無効にされたpyrF遺伝子が配列番号1および3からなる群から選択される核酸を含み、無効にされたproC遺伝子が配列番号6および配列番号9からなる群から選択される核酸を含む、上記196に記載のプロセス。198上記細胞がPlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の染色体lacIインサートも含有する、上記179に記載のプロセス。199上記lacI遺伝子がlacI、lacIQ、およびlacIQ1からなる群から選択される、上記198に記載のプロセス。200上記核酸構築物が少なくとも1つのlacOid配列をさらに含む、上記199に記載のプロセス。201上記核酸構築物が1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む、上記179に記載のプロセス。202少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの5’側に位置し、少なくとも1つのlacオペレーター配列がプロモーターの3’側に位置する、上記201に記載のプロセス。203少なくとも1つのlacオペレーター配列がlacOid配列である、上記202に記載のプロセス。204配列番号1または3からなる群から選択される核酸配列を含む、蛍光菌PseudomonasfluorescenspyrF遺伝子、またはpyrF遺伝子を用いてハイブリダイズする核酸。205上記核酸が配列番号1の配列を含む、上記204に記載の遺伝子。206上記核酸が配列番号3の配列を含む、上記204に記載の遺伝子。207配列番号6または8からなる群から選択される核酸配列を含む、蛍光菌PseudomonasfluorescensproC遺伝子、またはproC遺伝子を用いてハイブリダイズする核酸。208上記核酸が配列番号6の配列を含む、上記207に記載の遺伝子。209上記核酸が配列番号8の配列を含む、上記207に記載の遺伝子。210a.組換えポリペプチドをコードする核酸と;b.蛍光菌Pseudomonasfluorescensから単離されたpyrF遺伝子をコードする核酸と;を含む核酸構築物。211上記pyrF遺伝子が配列番号1の核酸配列を含む、上記210に記載の構築物。212上記pyrF遺伝子が配列番号3の核酸配列を含む、上記210に記載の構築物。213a.組換えポリペプチドをコードする核酸と;b.蛍光菌Pseudomonasfluorescensから単離されたproC遺伝子をコードする核酸と;を含む核酸構築物。214上記proC遺伝子が配列番号6の配列を含む、上記213に記載の構築物。215上記proC遺伝子が配列番号8の配列を含む、上記213に記載の構築物。発明の要旨非抗生物質耐性の栄養要求性選択が可能である、および/またはlacI遺伝子の染色体インサートまたは誘導体を含有するシュードモナスPseudomonad生物を宿主細胞として選択することによって、細菌タンパク質産生を改良し得ることが発見されている。特にシュードモナスPseudomonad生物の蛍光菌Pseudomonasfluorescensがこの目的に特に適していることが発見されている。このために、蛍光菌Pseudomonasfluorescensが、組換えポリペプチドの高細胞密度発酵中の栄養要求性選択の下で有害な栄養共生阻害を示さないことが驚くべきことに発見されている。そのような発見は、組換えポリペプチドの高レベルでの効率的な産生における栄養要求性蛍光菌Pseudomoasfluorescensの宿主細胞としての使用を可能にして、抗生物質耐性選択マーカーの使用に固有の欠点および他の細菌発現系に存在する栄養要求性栄養共生の問題を克服する。シュードモナスPseudomonad内の完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外のLacIをコードする遺伝子の使用が、驚くべきことにプレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケールでの発酵におけるより高い細胞密度、および以前に教示されたlacI-lacZYAシュードモナスPseudomonad染色体挿入米国特許第5169760と比較して所望の産物のより高い収率をもたらすことも、驚くべきことに発見されている。このlacI挿入は、Plac-Ptacファミリープロモーター制御導入遺伝子の抑制において、蛍光菌PseudomonasfluorescensにおいてLacIリプレッサータンパク質をコードするマルチコピープラスミドと同じくらい有効であり、それによりLacIリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを細胞内に保持する必要がなくなり、そのような保持によって引き起こされる生産の非効率性が低減される。デュアルlacオペレーター配列の使用が、蛍光菌Pseudomonasfluorescensの続いての誘導収率の同時低下なしに、誘導前に組換えタンパク質発現の優れた抑制を提供することも発見されている。したがって本発明の1つの態様において、タンパク質の改良産生での宿主細胞として使用するために、シュードモナスPseudomonad生物が提供される。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、栄養要求株を誘導するために遺伝的に改変されている。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、栄養要求株は、少なくとも1つの窒素含有塩基化合物生合成遺伝子、または少なくとも1つのアミノ酸生合成遺伝子への遺伝子改変の結果である。さらなる実施形態において、遺伝子改変は、ウラシル生合成経路、チミジン生合成経路、またはプロリン生合成経路にて活性である酵素をコードする遺伝子に対してである。なおさらなる実施形態において、遺伝子改変は、オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするpyrF遺伝子、チミジラートシンターゼをコードするthyA遺伝子、またはΔ1-プロリン-5-カルボキシラートレダクターゼをコードするproC遺伝子に対してである。別の実施形態において、本発明は、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、ゲノムに挿入されたLacIをコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを提供するために、遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonad生物を提供する。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、LacIリプレッサータンパク質をコードする天然の大腸菌EColilacI遺伝子をコードする。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad細胞は、lacIQ遺伝子を含有する。なお別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad細胞は、lacIQ1遺伝子を含有する。別の実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する、少なくとも1つのlacO配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナスPseudomonad生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、核酸構築物は1つを超えるlacO配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は、少なくとも1つの、そして好ましくは1つを超えるlacOid配列を含む。1つの実施形態において、核酸構築物はPlacファミリープロモーターの3’に位置するlacO配列、またはその誘導体、そしてPlacファミリープロモーターの5’に位置するlacO配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、lacO誘導体はlacOid配列である。さらなる実施形態において、本発明は、栄養要求性を誘導するように遺伝子改変され、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子、lacIQ遺伝子、またはlacIQ1遺伝子の染色体挿入を含有するようにさらに改変されたシュードモナスPseudomonad生物を提供する。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも1つのlacO配列を含む核酸構築物を含有するようにさらに改変される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の別の態様において、タンパク質の改良産生で使用するための核酸配列が提供される。1つの実施形態において、栄養要求性シュードモナスPseudomonad宿主細胞で使用するための原栄養性回復酵素をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから窒素含有塩基化合物生合成酵素をコードする核酸配列が提供される。1つの実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens中のpyrF遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号1および3。別の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens中のthyA遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号4が提供される。なお別の実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから精製されたアミノ酸生合成化合物をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens中のproC遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号6および8。別の態様において、本発明は、新規な核酸発現の産物である、新規なアミノ酸配列を産生する。本発明のなお別の態様において、ペプチドの改良された産生で使用するための核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、a組換えポリペプチドをコードする核酸配列、およびb原栄養可能酵素prototrophyenablingenzymeをコードする核酸配列を含むシュードモナスPseudomonad宿主細胞の形質転換に使用するための核酸構築物が提供される。別の実施形態において、核酸構築物は、cPlac-Ptacファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物は、dlacまたはtacファミリープロモーターの3’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体をさらに含む。まだ別の実施形態において、核酸構築物は、elacまたはtacファミリープロモーターの5’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体をさらに含む。1つの実施形態において、lacO配列の誘導体は、lacOid配列でもよい。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の1つの実施形態において、a組換えポリペプチドをコードする核酸配列、bPlac-Ptacファミリープロモーター、clacまたはtacファミリープロモーターの3’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体、dlacまたはtacファミリープロモーターの5’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体を含む、シュードモナスPseudomonad生物中の発現ベクターとして使用するための核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、誘導体lacO配列は、lacOid配列でもよい。1つの実施形態において、核酸構築物は、e栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞で使用するための原栄養可能prototrophyenabling選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の別の態様において、タンパク質の改良された産生で使用するための改変細胞が提供される。1つの実施形態において、i組換えポリペプチド、ii原栄養可能prototrophyenabling核酸を含む核酸構築物を有する、栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞が提供される。別の実施形態において、核酸構築物は、iiiPlac-Ptacファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物は、iv1つを超えるlacO配列をさらに含む。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、栄養要求性蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞である。さらなる実施形態において、本発明は、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の天然の大腸菌EcolilacI遺伝子、lacIQ遺伝子、またはlacIQ1遺伝子の染色体挿入を含むようにさらに遺伝子改変された、蛍光菌Pseudomonasfluorescensを含めた栄養要求性シュードモナスPseudomonad生物をさらに含む。別の実施形態において、染色体に挿入された、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外のlacI導入遺伝子、またはその誘導体と、bi組換えポリペプチドと、iiPlac-Ptacファミリープロモーターとを含む核酸構築物とを含む、シュードモナスPseudomonad細胞が提供される。なお別の実施形態において、核酸構築物は、iii少なくとも1つのlacO配列と、好ましくは1つを超えるlacO配列とをさらに含む。つの実施形態において、lacO配列はlacOid配列である。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、栄養要求性を誘導するようにさらに改変されている。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonad細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の1つの態様において、改良されたタンパク質産生で使用するための組換えポリペプチドを発現させるプロセスが提供される。1つの実施形態において、プロセスは、a組換えポリペプチドと、b少なくとも1つの代謝産物に対して栄養要求性である、シュードモナスPseudomonad内の原栄養回復酵素とをコードする核酸を含む核酸構築物の発現を提供する。代替的な実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞である。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、窒素含有塩基化合物およびアミノ酸からなる群から選択される代謝産物、または代謝産物の組合せに対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad内で発現される。さらに特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ウラシル、プロリン、およびチミジンからなる群から選択される代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad内で発現される。別の実施形態において、栄養要求性は、宿主pyrF、proC、またはthyA遺伝子それぞれのノックアウトによって産生し得る。代替的な実施形態である組換えポリペプチドは、PlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の天然の大腸菌EcolilacI遺伝子、lacIQ遺伝子、またはlacIQ1遺伝子の宿主細胞染色体への挿入を通じて、遺伝子改変された栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞内で発現される。1つの特定の実施形態において、栄養要求株内で発現される組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも1つのlacOidオペレーター配列を含む。1つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞内で発現される組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも2つのlacオペレーター配列、またはその誘導体を含む。なおさらなる実施形態において、組換えポリペプチドはPlacファミリープロモーターによって駆動される。別の実施形態において、プロセスは、シュードモナスPseudomonad宿主細胞のゲノムへ挿入されたLacIをコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを提供するように遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonad宿主細胞を含み、ここでlacIをコードする遺伝子は、PlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である。1つの実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子のそれと同じである。別の実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、lacIQ遺伝子である。なお別の実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、laclQ1遺伝子である。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、栄養要求性細胞を産生するようにさらに遺伝子改変される。別の実施形態において、プロセスは、少なくとも約3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/Lまたは少なくとも約10g/Lの組換えポリペプチドレベルを産生する。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、3g/L~100g/Lのレベルで発現される。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、栄養要求性を誘導するために遺伝子改変されている。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、栄養要求株は、少なくとも1つの窒素含有塩基化合物生合成遺伝子、または少なくとも1つのアミノ酸生合成遺伝子に対する遺伝子改変の結果である。さらなる実施形態において、遺伝子改変は、ウラシル生合成経路、チミジン生合成経路、またはプロリン生合成経路において活性である酵素をコードする遺伝子に対してである。なおさらなる実施形態において、遺伝子改変は、オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするpyrF遺伝子、チミジラートシンターゼをコードするthyA遺伝子、またはΔ1-プロリン-5-カルボキシラートレダクターゼをコードするproC遺伝子に対してである。別の実施形態において、本発明は、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、ゲノムに挿入されたLacIをコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを提供するために、遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonad生物を提供する。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、LacIリプレッサータンパク質をコードする天然の大腸菌EColilacI遺伝子をコードする。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad細胞は、lacIQ遺伝子を含有する。なお別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad細胞は、lacIQ1遺伝子を含有する。別の実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する、少なくとも1つのlacO配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナスPseudomonad生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。1つの実施形態において、核酸構築物は1つを超えるlacO配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は、少なくとも1つの、そして好ましくは1つを超えるlacOid配列を含む。1つの実施形態において、核酸構築物はPlacファミリープロモーターの3’に位置するlacO配列、またはその誘導体、そしてPlacファミリープロモーターの5’に位置するlacO配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、lacO誘導体はlacOid配列である。さらなる実施形態において、本発明は、栄養要求株を誘導するように遺伝子改変され、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子、lacIQ遺伝子、またはlacIQ1遺伝子の染色体挿入を含有するようにさらに改変されたシュードモナスPseudomonad生物を提供する。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも1つのlacO配列を含む核酸構築物を含有するようにさらに改変される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は、蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。組換えポリペプチドを産生する発現系で使用するために本発明で提供される宿主細胞は、シュードモナスPseudomonadおよび密接に関連する細菌から、または以下で定義するようなそのサブグループから選択され得る。1つの実施形態において、宿主細胞はシュードモナスPseudomonas属から選択される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonasの特定の種は、蛍光菌Pfluorescensである。特定の実施形態において、宿主細胞は、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプAまたはビオバルIである。定義単離されたという用語は、例えば、細胞成分でありうる他の物質成分から実質的にまたは本質的に遊離した核酸、タンパク質、またはペプチドを指す。断片という用語は、ヌクレオチド、タンパク質、またはペプチド配列の一部または部分配列を意味する。本明細書で使用する場合細胞タンパク質総パーセントという用語は、凝集した細胞タンパク質のパーセンテージとしての宿主細胞中のタンパク質またはペプチドの量を意味する。作動可能に結合されたという用語は本明細書で使用する場合、転写および任意の翻訳調節要素が、宿主細胞の作用において、または作用によって調節要素がコード配列の発現を指示し得るようなコード配列に対する配置で、コード配列に共有結合される、いずれの構造も指す。栄養要求株という用語は本明細書で使用する場合、増殖および代謝に必要な特定の物質を生成するその能力を除去または低減するように改変された細胞を指す。本明細書で使用する場合、細胞タンパク質総パーセントという用語は、細胞によって発現された所与のタンパク質の相対量を表す総細胞タンパク質の分率の尺度である。原栄養能という用語は本明細書で使用する場合、細胞が増殖および代謝に必要な特定の物質を生成し得ることを指す。本明細書で使用する場合、相同のという用語は、i所与の元のタンパク質またはペプチドの配列と実質的に類似しているすなわち少なくとも70、75、80、85、90、95、または98アミノ酸配列を有し、そして元のタンパク質またはペプチドの所望の機能を保持するタンパク質またはペプチド、あるいはii所与の核酸の配列と実質的に類似しているすなわち少なくとも70、75、80、85、90、95、または98配列を有し、そして元の核酸配列の所望の機能を保持する核酸のいずれかを意味する。本発明および開示の実施形態のすべてにおいて、開示されたタンパク質、ペプチドまたは核酸はいずれも、所望の機能を保持する相同タンパク質または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸によって置換し得る。本発明および開示の実施形態のすべてにおいて、いずれかの核酸が開示されるとき、本発明が開示された核酸にハイブリダイズするすべての核酸も含むことを前提とすべきである。1つの非制限的な実施形態において、相同なポリペプチドの同一でないアミノ酸配列は、表1に示す15の保存的または半保存的グループのいずれか1つの構成要素であるアミノ酸でありうる。I.シュードモナスPseudomonadおよび関連細菌の宿主細胞としての選択本発明は、タンパク質の改良された産生における、シュードモナスPseudomonadおよび関連細菌の宿主細胞としての使用を提供する。栄養要求性選択効率シュードモナスPseudomonadが、他の系に通例関連する欠点、例えば、プラスミド不安定性および栄養共生を伴わずに、プラスミドを発現するタンパク質の保持に栄養要求性選択マーカーを利用する能力を有することが発見されている。他の宿主細胞系の栄養要求性マーカーは、特にプラスミドの消失が無プラスミド細胞に選択的利点を与えて、大量の非増殖細胞の蓄積を引き起こし、産物形成を減少させる発酵の間には、各細胞内にプラスミドを保持するには必ずしも十分であるとは限らない。そのような復帰変異菌株は、栄養要求性代謝産物に原栄養可能細菌prototrophicenabledbacteriaから栄養共生する能力を有する場合、特に厄介である。例えば、大腸菌Ecoliトリプトファン栄養要求株内のプラスミドでのtrpオペロンの使用は、ほとんどの無プラスミド細胞がvalSts宿主内のvalS遺伝子バリルt-RNAシンターゼをコードすると結合するまで蓄積するのを防止するには十分でないSkogmanSGNilssonJTemperaturedependentretentionofatryptophanoperonbearingplasmidinEscherichiacoliGene19843111722。おそらくプラスミド上にtrpオペロンを含有する細胞は、無プラスミド細胞の増殖を可能にするのに十分なトリプトファンまたは関連分子を分泌した。同様に、leu2ミュータント酵母内のキシリトールレダクターゼ産生プラスミド上のLEU2遺伝子の使用は、プラスミドの消失を引き起こした;ロイシンはプラスミド含有細胞によってブロス中に分泌されるため、供給バッチ培養物の80までが産生プラスミドなしの細胞より構成されていたMeinanderNQHahnHaegerdalBFedbatchxylitolproductionwithtworecombinantSaccharomycescerevisiaestrainsexpressingXYL1atdifferentlevelsusingglucoseasacosubstrateacomparisonofproductionparametersandstrainstabilityBiotechnologyandBioengineering199754391399。蛍光菌PseudomonasfluorescensPfが他の宿主細胞系、例えば、大腸菌Ecoliおよび酵母で観察された栄養共生に関連する固有の問題を示さないことが発見されている。特定の理論に縛られたくはないが、蛍光菌Pseudomonasfluorescensが宿主細胞として使用するのに特に適切な生物であることが考えられる。なぜなら、栄養要求性代謝産物を含有する添加培地上で原栄養可能prototrophicenablingプラスミドを含有する栄養要求性細胞にPf栄養要求性細胞が勝てないことが観察され、Pf栄養要求株が必要な代謝産物を導入することが本来難しいことが示されるからである。このため、選択マーカープラスミドを喪失するPf栄養要求性細胞は、補助代謝産物の存在下でも、選択マーカーを含有するPf栄養要求性細胞に勝る選択的利点を得られず、栄養共生の潜在的影響を大きく低下させる。この栄養共生の影響の低下のため、発酵操作での組換えポリペプチドの産生収率は、非組換えポリペプチド産生細胞の存在により低下しない。LacIインサートシュードモナスPseudomonadが完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の単一コピーのlacI導入遺伝子、染色体インサートを使用でき、誘導までタンパク質発現を効果的に抑制することが発見されている。RNAポリメラーゼによる調節プロモーターからの転写開始は、調節タンパク質の結合または解放によって活性化または脱活性化される。したがって、調節プロモーターは、目的の標的ポリペプチドをコードする遺伝子が、プロモーターが調節タンパク質すなわちリプレッサータンパク質を含まないときのみ発現される負の制御に関与するものすなわち抑制性プロモーター、およびプロモーターが調節タンパク質すなわちアクチベータータンパク質によって結合されたときのみ遺伝子が発現される正の制御に関与するものを含む。細菌発現系で使用される抑制性プロモーターの最も一般的なクラスの1つは、Placベースプロモータの科である。Placベースプロモータの科は、天然の大腸菌Ecoliラクトースオペロンから発して、lacオペロンと呼ばれ、lacZYAとして記号表示もされ、その発現は、lacI遺伝子の発現産物によって調節される。オペロンの天然の大腸菌Ecoli構造は、PlacI-lacI-PlacZ-lacZYAであり、ここで天然の大腸菌EcoliPlacプロモーターはPlacZによって表されるPlacZYAとも呼ばれる。PlacIは、lacI遺伝子の天然のプロモーターを表し、lacIは、lacリプレッサーをコードする遺伝子、すなわちLacIタンパク質を表す。lacZYAは、ラクトース利用経路をコードするオペロンを表す。LacI調節プロモーターは特に、天然の大腸菌EcoliラクトースオペロンプロモータPlacを含む。加えて改良ミュータントも、Placのプロモーター内ハイブリッド、例えば、Ptacプロモーター、Ptrcプロモーター、およびPtacIIプロモーターと同様に発見された。大腸菌Ecoli中のPtacプロモーターは例えば、完全に抑制解除されたときにPlacプロモーターよりも3倍強力である。したがってそれは、大腸菌Ecoliでの高レベルの調節遺伝子発現を促進するために頻繁に使用される。しかしながらPlacプロモーターはLacIによって1000倍抑制されるが、Ptacプロモーターは同様の条件下では50倍のみ抑制されるLanzerMHBujard1988ProcNatlAcadSciUSA858973。大腸菌EcoliPtacプロモーターまたは他のlac関連プロモーターの抑制は、リプレッサー、LacIの濃度に依存するDeBoeretal1983ProcNatlAcadSciUSA782125。上記したように抑制からの解放は、その特異性DNA結合部位に対するリプレッサー、この場合、lacオペレーターlacOの親和性を低下させるインデューサの添加によって発生しうる。あるいは、プラスミドの特異性DNA結合部位のモル濃度に対するリプレッサーの濃度の低下も、プロモーターを抑制解除し得る。lacI遺伝子が高コピー数クローニングプラスミドに位置する場合、そのような系で産生される大量のリプレッサーのために、発現を開始するためには大量のインデューサが必要である。市販の産生系において、lacリプレッサーは、典型的には、発現が構成性、すなわち非調節性である遺伝子によってコードされ、したがって、所望の宿主細胞バイオマスまたは細胞密度が達成されるまで所望の標的タンパク質をコードする所望の導入遺伝子が抑制される細胞内環境を提供する。そのとき、その存在が導入遺伝子からリプレッサーを解離させるのに有効なインデューサとして公知の低分子が細胞培養物に少量添加されて、宿主細胞によって吸収され、それにより導入遺伝子の転写が可能になる。lacリプレッサータンパク質の場合、インデューサはラクトース、または非代謝性無償性インデューサ、例えば、イソプロピル-ベータ-D-チオ-ガラクトシドIPTGでありうる。インデューサが添加される選択された時点は、誘導期と呼ばれる。種々のlacリプレッサー遺伝子が、組換えポリペプチド発現ベクターに存在するPlacファミリープロモーターの抑制に有用であるとして認識されている。これらは、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子および/または同じLacIタンパク質をコードするが、より高い発現レベルにおいてである、lacIQおよびlacIQ1遺伝子を含むその変異体を含む。例えば、lacIQ変異は、プロモーター領域lacIの-35における1回のCGからTAへの変化CalosM1978Nature274762であり、これは大腸菌EcoliにおけるLacI発現の10倍の上昇を引き起こすMuellerHillBetal1968ProcNatlAcadSciUSA591259。野生型大腸菌Ecoli細胞は、10-8Mまたは細胞当たり分子約10個のLacI濃度を有し、タンパク質の99はテトラマーとして存在するFickertRBMuellerHill1992JMolBiol22659。lacIQ変異を含有する細胞は、細胞当たり約分子100個または10-7MLacIを含有する。結果として多数の細菌発現系が開発され、そこではプラスミド内に常在するPlacファミリープロモーター制御導入遺伝子がLacIタンパク質を発現する宿主細胞内に種々のレベルで保持され、それによって細胞増殖の選択された誘導期まで所望の導入遺伝子が抑制される。しかしながら、多くの場合では、細胞増殖中の標的タンパク質発現の抑制は不完全なことがあり、特定の誘導期前に著しい量の発現が引き起こされる。この漏出性の抑制は、宿主細胞ストレス、正常な細胞増殖から導入遺伝子へ転用される代謝エネルギーによる炭素源の非効率的な利用、および細胞密度誘導点への到達遅延を引き起こし、より長く高価な発酵作業、そしてしばしば標的タンパク質の収率低下を引き起こす。Placファミリープロモーター駆動導入遺伝子の抑制を改善するための1つの一般的な方法は、Placファミリープロモーター駆動標的遺伝子を持つプラスミド上にlacIまたはlacIQ遺伝子を配置することであった例えば、MJRStarkinGene5125567andEAmannetalinGene30115を参照。しかしながらこれはLacリプレッサータンパク質の過剰産生を引き起こすことが多く、次に導入遺伝子の誘導レベルを回復して組換えタンパク質産生の低下を克服するために、なお一層高いインデューサ濃度の使用を必要とする。その上、Placファミリープロモーター駆動標的遺伝子を含有するプラスミドとは独立したlacI遺伝子を含有する第2のプラスミドの使用は、発現宿主細胞内に両方のプラスミドを保持するために、2つの異なる選択マーカー遺伝子2つの異なるプラスミドの各々に対して1つの選択マーカー遺伝子の使用を必要とする。第2の選択マーカー遺伝子、すなわち第2のプラスミドの選択マーカー遺伝子の存在は次に、1抗生物質耐性選択マーカー遺伝子の場合には独立した抗生物質、これは費用がかかり、健康/安全性規制の観点から不都合である、;または2栄養要求性選択マーカー遺伝子の場合には宿主細胞ゲノムにおける独立した代謝不全、これは宿主細胞を変異させるというさらなる労力を必要とする、のいずれかの使用を必要とする。驚くべきことに、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外のlacI挿入が、蛍光菌Pseudomonasfluorescens内でLacIリプレッサータンパク質をコードする多コピープラスミドとしてのPlac-Ptacファミリープロモーター制御導入遺伝子を抑制するのに有効であることが発見された。この驚くべき発見は、細胞内でLacIリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを維持する必要をなくすか、またはさらなる栄養要求性選択マーカーを定義する必要をなくし、lacI含有プラスミドのそのような維持によって引き起こされる潜在的な産生非効率性をさらに減少させる。シュードモナスPseudomonasにおける導入遺伝子発現を調節する以前の試みでは、lacZプロモーター領域が欠失しているが、構成性PlacIプロモーターを保持する大腸菌EcoliPlacI-lacI-lacZYAオペロンを染色体に挿入した米国特許第5,169,760号を参照。欠失は、lacオペロンの遺伝産物の構成発現を可能にする。しかしながら、挿入されたオペロンは、ラクトーストランスポータタンパク質ラクトースパーミアーゼをコードする大腸菌EcolilacY遺伝子を含有する。ラクトースパーミアーゼは、ラクトース、または同様の誘導体を培地から宿主細胞内に輸送することが可能である。ラクトースパーミアーゼの存在は、培地からのラクトース様汚染物質の移入増加を引き起こし、最終的に誘導前にPlacファミリープロモーターの抑制を生じさせる。さらにlacオペロンlacZ、lacY、およびlacA遺伝子産物の発現は、これらの産物への炭素利用源の不十分な利用をもたらして、細胞に対する代謝ストレスの増大を引き起こし、誘導のための高い細胞密度の定着を遅延させる。加えて、より大きなlacI-lacZYA融合オペロンが、宿主細胞内での単独のlacIインサートと比較して、メッセージ不安定性の上昇を生じる。シュードモナスPseudomonad内での完全または切断PlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外のLacIをコードする遺伝子の使用が、以前に教示されたZacl-lacZYAシュードモナスPseudomonad染色体挿入米国特許第5169760号と比較して、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケール発酵でのより高い細胞密度、および所望の産物のより高い収率を引き起こしたことが、驚くべきことに発見された。プロモーター改変のためにlacよりも高レベルで発現される誘導体lacI遺伝子、例えば、lacIQおよびlacIQ1を利用するさらなる試みもまた記載されている。CGGlascockMJWeickertは、プラスミド保持Ptac駆動標的遺伝子の制御のレベルを評価する試みにおいて、独立したLacIタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞の染色体内に存在する大腸菌Ecoli菌株について記載する。CGGlascockMJWeickertUsingchromosomallacIQItocontrolexpressionofgeneonhighcopynumberプラスミドinEscherichiacoliGene22322131を参照;WO97/04110も参照。LacIタンパク質をコードする遺伝子のうち、lacI、lacIQ、およびlacIQ1で試験を行った。lacI遺伝子およびlacIQ遺伝子について得られた結果は、高コピー数プラスミド上に存在するときにPtac駆動標的遺伝子の抑制レベルの劣化を示し、プレ誘導標的遺伝子発現の実質的なレベルを生じさせた。高発現lacIQ1遺伝子のみが、その系において実質的な抑制を与えた。しかしながらそのような方法は、誘導時にプロモーターを十分に抑制解除するために必要なインデューサの量を増加させることによって、そしてインデューサが構成発現されたリプレッサータンパク質すべてを十分に結合することができないために収率が低下することによって、費用を増大させる可能性を有する。比較上、驚くべきことに、単一コピーのlacI染色体インサートがPlac-Ptacファミリープロモーター駆動導入遺伝子発現を抑制するのに十分であることが発見された。そのような発見は、使用されるインデューサの量に関して潜在的な費用節約措置を可能にして、タンパク質の改良された産生における宿主細胞としての蛍光菌Pseudomonasfluorescensの開発にさらに柔軟性を与える。シュードモナスPseudomonad生物シュードモナスPseudomonadおよび密接に関連する細菌は、本明細書で使用する場合、本明細書でグラム-プロテオバクテリアサブグループ1として定義するグループと同じ範囲である。グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、さらに詳細には、REBuchananandNEGibbonsBergeysManualofDeterminativeBacteriologypp217289によってグラム陰性好気性桿菌および球菌と呼ばれるその分類学上のパートに含まれるとして記載されている、科および/または属に属するプロテオバクテリアの群として定義される。表4は、この分類学的パートに挙げられた生物の科および属を表す。グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、その分類学的パートを形成するのに使用された基準に従って分類されるすべてのプロテオバクテリアと同様に、その下で分類されるすべてのプロテオバクテリアを含有する。結果として、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、例えば、:すべてのグラム陽性細菌;このBergey1974の分類法の19パートのその他に分類される、グラム陰性細菌、例えば、エンテロバクテリアセアEnterobacteriaceae;アーキアArchaeaの非細菌科として以前から認識されてきた科である、このBergey1974のパートの全体の科V.ハロバクテリアセアHalobacteriaceae;および細菌の非プロテオバクテリア属として以前から認識されてきた属である、このBergey1974のパートで挙げられた属サーマスThermusを除外する。グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、このBergey1974のパートで定義された属または科に属する以前はその種と呼ばれたプロテオバクテリアをさらに含み、他のプロテオバクテリア分類学的名を以前から与えられている。一部の場合では、このような再命名は、完全に新しいプロテオバクテリア属の作製を引き起こした。例えば、アシドボラックスAcidovorax、ブレバンジモナスBrevundimonas、ブルクホリデリアBurkholderia、ヒドロゲノファーガHydrogenophaga、オーシャンイモナスOceanimonas、ラルストニアRalstonia、およびステノトロホモナスStenotrophomonasは、属シュードモナスPseudomonasの属に属する以前はその種と呼ばれた生物を、Bergey1974で定義されたように再グループ化することによって作製された。同様に例えば、スフィンゴモナスSphingomonas属およびそれから由来するブラストモナスBlastomonas属は、キサントモナスXanthomonas属に属する以前はその種と呼ばれた生物をBergey1974で定義されたように再グループ化することによって作製された。同様に例えば、アシドモナスAcidomonas属は、アセトバクターAcetobacter属に属するそして以前はその種と呼ばれた生物をBergey1974で定義されたように再グループ化することによって作製された。そのように続いて再割当された種も、本明細書で定義するグラム-プロテオバクテリアサブグループ1に含まれる。他の場合では、このBergey1974のパートで定義された属および科に含まれるプロテオバクテリア種は、プロバクテリアの他の既存の属の下で単に再分類された。例えば、シュードモナスPseudomonas属の場合、シュードモナスエナリアPseudomonasenaliaATCC14393、シュードモナスニグリファシエンスPseudomonasnigrifaciensATCC19375、およびシュードモナスプトレファシエンスPseudomonasputrefaciensATCC8071は、アルテロモナスハロプランクテイスAlteromonashaloplanktis、アルテロモナスニグリファシエンスAlteromonasnigrifaciens、およびアルテロモナスプトレファシエンスAlteromonasputrefaciensとしてそれぞれ以前から再分類されている。同様に例えば、シュードモナスアシドボランスPseudomonasacidovoransATCC15668およびシュードモナステストステロニPseudomonastestosteroniATCC11996は、コマモナスアシドボランスComamonasacidovoransおよびコマモナステストステロニComamonastestosteroniとしてそれぞれ以前から再分類されている;シュードモナスニグリファシエンスPseudomonasnigrifaciensATCC19375およびシュードモナスピスキキダPseudomonaspiscicidaATCC15057は、シュードアルテロモナスニグリファシエンスPseudoalteromonasnigrifaciensおよびシュードアルテロモナスピスキキダPseudoalteromonaspiscicidaとしてそれぞれ以前から再分類されている。そのように続いて再割当された種も、本明細書で定義するグラム-プロテオバクテリアサブグループ1に含まれる。グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、以前から発見された、または以前からこのBergey1974のパートのプロテオバクテリア科および/または属の中に属するとして再分類されているプロテオバクテリア種も含む。プロテオバクテリア科に関しては、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1は、科:シュードモナダセアPseudomonadaceae、アセトバクテラセアAzotobacteraceae今は同義語のシュードモナダセアPseudomonadaceaeのアゾトバクター群と呼ばれることが多い、リゾビアセアRhizobiaceae、およびメチロモナダセアMethylomonadaceae今は同義語のメチロモナダセアMethylomonadaceaeと呼ばれることが多いのいずれかに属するとして分類されたプロテオバクテリアも含む。結果として、本明細書で記載された以外の属に加えて、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1に含まれる、さらなるプロテオバクテリア属は:1アゾリゾフィラスAzorhizophilus属のアゾトバクター群細菌;2セルビブリオCellvibrio、オリゲラOligella、およびテレジニバクターTeredinibacter属のシュードモナダセアPseudomonadaceae科細菌;3キレートバクターChelatobacter、エンサイファEnsifer、リベリバクターLiberibacterカンジダタスリベリバクターCandidatusLiberibacterとも呼ばれる、およびシノリゾビウムSinorhizobium属のリゾビアセアRhizobiaceae科細菌;および4メチロバクターMethylobacter、メチロカルダムMethylocaldum、メチロミクロビウムMethylomicrobium、メチロサルシナMethylosarcina、およびメチロスフェラMethylosphaera属のメチロコッカセアMethylococcaceae科細菌を含む。1つの実施形態において、宿主細胞は、上で定義したようにグラム-プロテオバクテリアサブグループ1から選択される。別の実施形態において、宿主細胞はグラム-プロテオバクテリアサブグループ2から選択される。グラム-プロテオバクテリアサブグループ2は、以下の属カタログに記載され、公に入手可能な、その寄託株の総数をカッコ内に示し、別途示す場合を除いて、すべてATCCに寄託されている:アシドモナスAcidomonas2;アセトバクターAcetobacter93;グルコノバクターGluconobacter37;ブレバンジモナスBrevundimonas23ベイジェリンキアBeijerinckia13デルキシアDerxia2;ブルセラBrucella4;アグロバクテリウムAgrobacterium79;キレートバクターChelatobacter2;エンサイファEnsifer3;リゾビウムRhizobium144;シノリゾビウムSinorhizobium24;ブラストモナスBlastomonas1;スフィンゴモナスSphingomonas27;アルガリゲネスAlcaligenes88;ボルデテラBordetella43;ブルクホリデリアBurkholderia73;ラルストニアRalstonia33;アシドボラックスAcidovorax20;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga9;ゾーグレアZoogloea9;メチロバクターMethylobacter2;メチロカルダムMethylocaldumNCIMBにて1;メチロコッカスMethylococcus2;メチロミクロビウムMethylomicrobium2;メチロモナスMethylomonas9;メチロサルシナMethylosarcina1;メチロスフェラMetlaylosphaera;アゾモナスAzomonas9;アゾリゾフィラスAzorhizophilus5;アゾトバクターAzotobacter64;セルビブリオCellvibrio3;オリゲラOligella5;シュードモナスPsdudomonas1139;フランシセラFrancisella4;キサントモナスXanthomonas229;ステノトロホモナスStenotrophomonas50;およびオーシャンイモナスOceanimonas4のプロテオバクテリアの群として定義される。グラム-プロテオバクテリアサブグループ2の宿主細胞種の例は、これに限定されるわけではないが、以下の細菌その菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す:アシドモナスメタノリカAcidomonasmethanolicaATCC43581;アセトバクターアセチAcetobacteracetiATCC15973;グルコノバクターオキシダンスGluconobacteroxydansATCC19357;ブレバンジモナスディミヌタBrevundimonasdiminutaATCC11568BeijerinckiaindicaATCC9039およびATCC19361;デルキシアgummosaDerxiagummosaATCC15994ブルセラメリテンシスBrucellamelitensisATCC23456、ブルセラアボルツスBrucellaabortusATCC23448;アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensATCC23308、アグロバクテリウムラジオバクターAgrobacteriumradiobacterATCC19358、アグロバクテリウムリゾゲネスAgrobacteriumrhizogenesATCC11325;キレートバクターheintziiChelatobacterheintziiATCC29600;エンサイファアドへレンスEnsiferadhaerensATCC33212;リゾビウムレグミノサルムRhizobiumleguminosarumATCC10004シノリゾビウムfrediiSinorhizobiumfrediiATCC35423;ブラストモナスnatatoriaBlastomonasnatatoriaATCC35951;スフィンゴモナスパウシモビリスSphingomonaspaucimobilisATCC29837アルカリゲネスフェカリスAlcaligenesfaecalisATCC8750;ボルデテラペルタシスBordetellapertussisATCC9797;バークホルデリアセパシアBurkholderiacepaciaATCC25416;ラルストニアピックティRalstoniapickettiiATCC27511;アシドボラックスファシリスAcidovoraxfacilisATCC11228;ヒドロゲノファーガフラバHydrogenophagaflavaATCC33667;ゾーグレアラミゲラZoogloearamigeraATCC19544;メチロバクタールテウスMethylobacterluteusATCC49878;メチロカルダムグラシルMethylocaldumgracileNCIMB11912;メチロコッカスカプスラタスMethylococcuscapsulatusATCC19069;メチロミクロビウムagileMethylomicrobiumagileATCC35068;メチロモナスメタニカMethylomonasmethanicaATCC35067;メチロサルシナfibrataMethylosarcinafibrataATCC700909;メチロスフェラハンソニーMetlaylosphaerahansoniiACAM549;アゾモナスagilisAzomonasagilisATCC7494;アゾリゾフィラスpaspaliAzorhizophiluspaspaliATCC23833;アゾトバクタークロロコッカムAzotobacterChroococcumATCC9043;セルビブリオミクスタスCellvibriomixtusUQM2601;オリゲラurethralisOligellaurethralisATCC17960;シュードモナスエアルギノサPseudomonasaeruginosaATCC10145;蛍光菌PseudomonasfluorescensATCC35858;フランシセラツラレンシスFranscisellatularensisATCC6223;ステノトロホモナスマルトフィリアStenotrophomonasmaltophiliaATCC13637;キサントモナスカンペストリスXanthomonascampestrisATCC33913;およびオーシャンイモナスドウドロッフィOceanimonasdoudoroffiiATCC27123を含む。別の実施形態において、宿主細胞はグラム-プロテオバクテリアサブグループ3から選択される。グラム-プロテオバクテリアサブグループ3は、以下の属:ブレバンジモナスBrevundimonas;アグロバクテリウムAgrobacterium;リゾビウムRhizobium;シノリゾビウムSinorhizobium;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;アルガリゲネスAlcaligenes;ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラックスAcidovorax;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga;メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMetlaylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィラスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPsdudomonas;テレジニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonasおよびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。別の実施形態において、宿主細胞はグラム-プロテオバクテリアサブグループ4から選択される。グラム-プロテオバクテリアサブグループ4は、以下の属:ブレバンジモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラックスAcidovorax;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga;メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMetlaylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィラスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPsdudomonas;テレジニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonasおよびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。1つの実施形態において、宿主細胞はグラム-プロテオバクテリアサブグループ5から選択される。グラム-プロテオバクテリアサブグループ5は、以下の属:メチロバクターMethylobacter;メチロカルダムMethylocaldum;メチロコッカスMethylococcus;メチロミクロビウムMethylomicrobium;メチロモナスMethylomonas;メチロサルシナMethylosarcina;メチロスフェラMetlaylosphaera;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィラスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPsdudomonas;テレジニバクターTeredinibacter;フランシセラFrancisella;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonasおよびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ6から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ6は、以下の属:ブレバンジモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラックスAcidovorax;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga;アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィラスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPsdudomonas;テレジニバクターTeredinibacter;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonasおよびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ7から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ7は、以下の属:アゾモナスAzomonas;アゾリゾフィラスAzorhizophilus;アゾトバクターAzotobacter;セルビブリオCellvibrio;オリゲラOligella;シュードモナスPsdudomonas;テレジニバクターTeredinibacter;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonas;およびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ8から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ8は、以下の属:ブレバンジモナスBrevundimonas;ブラストモナスBlastomonas;スフィンゴモナスSphingomonas;ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラックスAcidovorax;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga;シュードモナスPsdudomonas;ステノトロホモナスStenotrophomonas;キサントモナスXanthomonasおよびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ9から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ9は、以下の属:ブレバンジモナスBrevundimonas;ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;アシドボラックスAcidovorax;ヒドロゲノファーガHydrogenophaga;シュードモナスPsdudomonas;ステノトロホモナスStenotrophomonas;およびオーシャンイモナスOceanimonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ10から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ10は、以下の属:ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPsdudomonas;ステノトロホモナスStenotrophomonas;およびXanthomonasキサントモナスのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ11から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ11は、以下の属:シュードモナスPsdudomonas;ステノトロホモナスStenotrophomonas;およびXanthomonasキサントモナスのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ12から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ12は、以下の属:ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPsdudomonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ13から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ13は、以下の属:ブルクホリデリアBurkholderia;ラルストニアRalstonia;シュードモナスPsdudomonasおよびキサントモナスXanthomonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ14から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ14は、以下の属:シュードモナスPsdudomonasおよびキサントモナスXanthomonasのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ15から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ15は、シュードモナスPseudomonas属のプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ16から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ16は、以下のシュードモナス種その菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す:シュードモナスabietaniphilaPseudomonasabietaniphilaATCC700689;シュードモナスエアルギノサPseudomonasaeruginosaATCC10145;シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenesATCC14909;シュードモナスanguillisepticaPseudomonasanguillisepticaATCC33660;シュードモナスcitronellolisPseudomonascitronellolisATCC13674;シュードモナスフラベセンスPseudomonasflavescensATCC51555;シュードモナスメンドシナPseudomonasmendocinaATCC25411;シュードモナスニトロレデュセンスPseudomonasnitroreducensATCC33634;シュードモナスオレオボランスPseudomonasoleovoransATCC8062;シュードモナスシュードアルカリゲネスPseudomonaspseudoalcaligenesATCC17440;シュードモナスレシノボランスPseudomonasresinovoransATCC14235;シュードモナスストラミネアPseudomonasstramineaATCC33636;シュードモナスagariciPseudomonasagariciATCC25941;シュードモナスアルカリフィアPseudomonasalcaliphilaシュードモナスalginovoraPseudomonasalginovoraシュードモナスアンダーソニーPseudomonasandersonii;シュードモナスaspleniiPseudomonasaspleniiATCC23835;シュードモナスアゼライカPseudomonasazelaicaATCC27162;シュードモナスbeijerinckiiPseudomonasbeijerinckiiATCC19372;シュードモナスボレアリスPseudomonasborealis;シュードモナスボレオポリスPseudomonasboreopolisATCC33662;シュードモナスbrassicacearumPseudomonasbrassicacearumシュードモナスbutanovoraPseudomonasbutanovoraATCC43655;シュードモナスセルローサPseudomonascellulosaATCC55703;シュードモナスオウランチアカPseudomonasaurantiacaATCC33663;シュードモナスクロロラフィスPseudomonaschlororaphisATCC9446ATCC13985ATCC17418ATCC17461;シュードモナスフラギPseudomonasfragiATCC4973;シュードモナスlundensisPseudomonaslundensisATCC49968;シュードモナスタエトロレンスPseudomonastaetrolensATCC4683;シュードモナスcissicolaPseudomonascissicolaATCC33616;シュードモナスコロナファシエンスPseudomonascoronafaciens;シュードモナスditerpeniphilaPseudomonasditerpeniphila;シュードモナスエロンガタPseudomonaselongataATCC10144;シュードモナスflectensPseudomonasflectensATCC12775;シュードモナスアゾトフォルマンスPseudomonasazotoformans;シュードモナスbrenneriPseudomonasbrenneriシュードモナスcedrellaPseudomonascedrella;シュードモナスcorrugataPseudomonascorrugataATCC29736;シュードモナスextremorientalisPseudomonasextremorientalis;蛍光菌PseudomonasfluorescensATCC35858;シュードモナスgessardiiPseudomonasgessardiiシュードモナスlibanensisPseudomonaslibanensis;シュードモナスmandeliiPseudomonasmandeliiATCC700871;シュードモナスマルギナリスPseudomonasmarginalisATCC10844;シュードモナスmigulaePseudomonasmigulae;シュードモナスmucidolensPseudomonasmucidolensATCC4685;シュードモナスオリエンタリスPseudomonasorientalis;シュードモナスrhodesiaePseudomonasrhodesiae;シュードモナスsynxanthaPseudomonassynxanthaATCC9890;シュードモナストラシイPseudomonastolaasiiATCC33618;シュードモナスveroniiPseudomonasveroniiATCC700474;シュードモナスfrederiksbergensisPseudomonasfrederiksbergensis;シュードモナスgeniculataPseudomonasgeniculataATCC19374;シュードモナスgingersPseudomonasgingers;シュードモナスグラミニスPseudomonasgraminis;シュードモナスgrimontiiPseudomonasgrimontii;シュードモナスハロデニトリフィカンスPseudomonashalodenitrificans;シュードモナスハロフィラPseudomonashalophila;シュードモナスhibiscicolaPseudomonashibiscicolaATCC19867;シュードモナスhuttiensisPseudomonashuttiensisATCC14670;シュードモナスhydrogenovoraPseudomonashydrogenovora;シュードモナスジェッセニイPseudomonasjesseniiATCC700870;シュードモナスkilonensisPseudomonaskilonensis;シュードモナスランセオラータPseudomonaslanceolataATCC14669;シュードモナスリニPseudomonaslini;シュードモナスマルギナータPseudomonasmarginataATCC25417;シュードモナスmephiticaPseudomonasmephiticaATCC33665;シュードモナスデニトリフィカンスPseudomonasdenitrificansATCC19244;シュードモナスpertucinogenaPseudomonaspertucinogenaATCC190;シュードモナスpictorumPseudomonaspictorumATCC23328;シュードモナスサイクロフィラムPseudomonaspsychrophila;シュードモナスフルバPseudomonasfulvaATCC31418;シュードモナスmonteiliiPseudomonasmonteiliiATCC700476;シュードモナスmosseliiPseudomonasmosselii;シュードモナスオリジハビタンスPseudomonasoryzihabitansATCC43272;シュードモナスplecoglossicidaPseudomonasplecoglossicidaATCC700383;シュードモナスプチダPseudomonasputidaATCC12633;シュードモナスリアクタンツPseudomonasreactantsシュードモナススピノサPseudomonasspinosaATCC14606;シュードモナスバレアリカPseudomonasbalearica;シュードモナスルテオラPseudomonasluteolaATCC43273;シュードモナススツッエリPseudomonasstutzeriATCC17588;シュードモナスamygdaliPseudomonasamygdaliATCC33614;シュードモナスavellanaePseudomonasavellanaeATCC700331;シュードモナスcaricapapayaePseudomonascaricapapayaeATCC33615;シュードモナスチコリアイPseudomonascichoriiATCC10857;シュードモナスficuserectaePseudomonasficuserectaeATCC35104;シュードモナスfuscovaginaePseudomonasfuscovaginae;シュードモナスmeliaePseudomonasmeliaeATCC33050;シュードモナスシリンゲPseudomonassyringeATCC19310;シュードモナスビリジフラバPseudomonasviridiflavaATCC13223;シュードモナスサーモカルボキシドボランスPseudomonasthermocarboxydovoransATCC35961;シュードモナスサーモトレランスPseudomonasthermotolerans;シュードモナスthivervalensisPseudomonasthivervalensis;シュードモナスvancouverensisPseudomonasvancouverensisATCC700688;シュードモナスwisconsinensisPseudomonaswisconsinensis;およびシュードモナスxiamenensisPseudomonasxiamenensisのプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞グラム-プロテオバクテリアサブグループ17から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ17は、例えば、以下のシュードモナスPseudomonas種:シュードモナスアゾトフォルマンスPseudomonasazotoformans;シュードモナスbrenneriPseudomonasbrenneri;シュードモナスcedrellaPseudomonascedrella;シュードモナスcorrugataPseudomonascorrugata;シュードモナスextremorientalisPseudomonasextremorientalis;蛍光菌Pseudomonasfluorescens;シュードモナスgessardiiPseudomonasgessardii;シュードモナスlibanensisPseudomonaslibanensis;シュードモナスmandeliiPseudomonasmandelii;シュードモナスマルギナリスPseudomonasmarginalis;シュードモナスmigulaePseudomonasmigulae;シュードモナスmucidolensPseudomonasmucidolens;シュードモナスオリエンタリスPseudomonasorientalis;シュードモナスrhodesiaePseudomonasrhodesiae;シュードモナスsynxanthaPseudomonassynxantha;シュードモナストラシイPseudomonastolaasii;およびシュードモナスveroniiPseudomonasveroniiに属するものを含む、フロオレッセントシュードモナズfluorescentPseudomonadsとして当該分野で公知のプロテオバクテリアの群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ18から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ18は、例えば、以下菌株例のATCCまたは他の寄託番号をカッコ内に示す:ビオバル1またはビオバルIとも呼ばれる、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプAATCC13525;ビオバル2またはビオバルIIとも呼ばれる、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプBATCC17816;ビオバル3またはビオバルIIIとも呼ばれる、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプCATCC17400;ビオバル4またはビオバルIVとも呼ばれる、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプFATCC12983;ビオバル5またはビオバルVとも呼ばれる、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプGATCC17518;蛍光菌PseudomonasfluorescensビオバルVI;蛍光菌PseudomonasfluorescensPfO-1;蛍光菌PseudomonasfluorescensPf-5ATCCBAA477;蛍光菌PseudomonasfluorescensSBW25;および蛍光菌PseudomonasfluorescenssubspcellulosaNCIMB10462に属するものを含む、蛍光菌Pseudomonasfluorescens種の亜種、変異体、菌株、および他のサブスペシャル単位すべての群として定義される。宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ19から選択され得る。グラム-プロテオバクテリアサブグループ19は、蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプAのすべての菌株の群として定義し得る。このバイオタイプの特に特別な菌株は、蛍光菌Pfluorescens菌株MB101Wilcoxへの米国特許第5169760を参照、およびその誘導体である。1つの実施形態において、宿主細胞は、シュードモナス目Pseudomonadaleのプロテオバクテリアのいずれかである。特定の実施形態において、宿主細胞は、シュードモナダセア科Pseudomonadaceaeのプロテオバクテリアのいずれかである。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ1から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ2から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ3から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ5から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ7から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ12から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ15から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ17から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ18から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム-プロテオバクテリアサブグループ19から選択される。本発明で使用され得るさらなる蛍光菌Pfluorescens菌株は、以下のATCC呼称:NCIB8286;NRRLB1244;NCIB8865菌株CO1;NCIB8866菌株C02;1291ATCC17458;IFO15837;NCIB8917;LA;NRRLB1864;ピロリジン;PW2ICMP3966;NCPPB967;NRRLB899;13475;NCTC10038;NRRLB16036;IFO15840;521C;CCEB488ABU140;CCEB553IEM1547;IAM1008AHH27;IAM1055AHH23;1IFO15842;12ATCC25323;NIH11;denDoorendeJong216;18IFO15833;WRRLP7;93TR10;1085222;IFO15832;143IFO15836;PL;14924040;IFO15838;182IFO3081;PJ73;184IFO15830;185W2L1;186IFO15829;PJ79;187NCPPB263;188NCPPB316;189PJ227;1208;191IFO15834;PJ236;221;194KlingeR60;PJ253;196PJ288;97PJ290;198PJ302;201PJ368;202PJ372;203PJ376;204IFO15835;PJ682;205PJ686;206PJ692;207PJ693;208PJ722;212PJ832;215PJ849;216PJ885;267B9;271B1612;401C71A;IFO15831;PJ187;NRRLB31784;IFO15841;KY8521;3081;3021;IFO3081;N;PYR;PW;D946B83BU2183;FERMP3328;P2563FERMP2894;IFO13658;IAM112643F;M1;A506A506;A505A5051;A526A526;B69;72;NRRLB4290;PMW6NCIB11615;SC12936;AlIFO15839;F1847CDCEB;F1848CDC93;NCIB10586;P17;F12;AmMS257;PRA25;6133D02;6519E01;N1;SC15208;BNLWVC;NCTC2583NCIB8194;H13;1013ATCC11251;CCEB295;IFO3903;1062;またはPf5を有する、蛍光菌MigulaPseudomonasfluorescensMigulaおよび蛍光菌LoitokitokPseudomonasfluorescensLoitokitokを含む。II.栄養要求性選択マーカー本発明は、少なくとも1つの代謝産物に対して栄養要求性を誘導するように遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonadsおよび関連する細胞を提供する。遺伝子改変は、代謝経路、例えば、同化生合成経路または異化利用経路において作用する酵素をコードする1つまたは複数の遺伝子に対して可能である。好ましくは、宿主細胞は、生体触媒活性を確実に除去するために、除去または不活性化された所与の生体触媒活性をコードするすべての作用する遺伝子を有する。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞である。1つまたはそれ以上の代謝活性が、ノックアウトまたは交換のために選択される。複数の天然の栄養要求株の場合、追加の代謝ノックアウトまたは交換を提供し得る。複数の活性を選択する場合、栄養要求株回復選択マーカーは、生合成型同化または利用型異化であり、あるいは、両方の型から選択され得る。選択した化合物の所与の生合成経路での例えば、1つまたはそれ以上の活性をノックアウトし得る;あるいは、それぞれ異なる生合成経路からの1つを超える活性をノックアウトし得る。次に、対応する1つまたは複数の活性は、細胞への形質転換時に細胞に対する原栄養性を回復する少なくとも1つの組換えベクターによって供給される。栄養要求性宿主細胞を産生するためにその生合成または利用が標的にし得る化合物および分子は:例えば、脂肪酸を含む脂質;例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、グルコース-6-ホスフェート、およびグルコン酸、ならびにEntner-Doudoroffおよびペントースホスフェート経路中間体および生成物も含む、モノおよびジサッカライドならびにその置換誘導体;ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド例えば、ATP、dCTP、FMN、FAD、NAD、NADPを含む、窒素含有塩基例えば、ピリジン、プリン、ピリミジン、プテリン、およびヒドロ-、デヒドロ-、および/または置換窒素含有塩基誘導体、例えば、コファクター、例えば、ビオチン、コバマミド、リボフラビン、チアミンを含む;有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物例えば、ヒドロキシ酸およびアミノ酸を含む;貯蔵炭水化物および貯蔵ポリヒドロキシアルカノアートポリマー例えば、セルロース、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ポリヒドロキシブチラート、およびポリラクテートを含むを含む。1つの実施形態において、栄養要求性宿主細胞を産生するためにノックアウトされた生体触媒活性は:脂質;ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体;有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物からなる群から選択される。好ましくは、ノックアウトされた生体触媒活性は:ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体;有機酸ならびに解糖およびクエン酸回路中間体および生成物からなる群から選択される。より好ましくは、ノックアウトされた生体触媒活性は:ピリミジンヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体;アミノ酸からなる群から選択される。所与のトランスジェニック宿主細胞は、1つまたはそれ以上の選択マーカーまたは選択マーカー系を使用する。例えば、本発明による1つまたはそれ以上の生合成選択マーカーまたは選択マーカー系は、互いに共に使用し得るか、および/または本発明による利用型選択マーカーまたは選択マーカー系と組み合せて使用し得る。これらの原栄養可能prototrophyenabling実施形態のいずれの1つにおいても、宿主細胞は、1つまたはそれ以上の非栄養要求性選択マーカーまたは選択マーカー系も含むことがある。非栄養要求性選択マーカーおよび系の例は、例えば、:毒素耐性マーカー遺伝子、例えば、抗生物質を分解する酵素活性をコードする抗生物質耐性遺伝子;毒素耐性マーカー遺伝子、例えば、酵素をそのような変異を含有しない酵素の変異体によって示された毒素阻害に対して非感受性にする変異が発現される、アセトラクテートシンターゼALS;EC2216のイミダゾリノン耐性ミュータントを含む。化合物は、この効果を直接発揮する;または化合物は、例えば、化合物を毒素形態に変換する細胞の代謝作用の結果として、または化合物と少なくとも1つのさらなる化合物との組合せの結果として、この効果を間接的に発揮する。そのようなマーカー酵素をコードする細菌性宿主作用遺伝子は、ノックアウト細胞の作製用に選択された細菌宿主細胞株から、他の細菌から、または他の生物から入手可能であり、天然の形態または改変例えば、変異または配列組換え形態で使用される。例えば、ノックアウト生体触媒活性を示す酵素のDNAをコードする配列は、1つまたはそれ以上の生物から入手され、次に宿主細胞内で作用するDNA調節要素に作動可能に結合される。特に、選択された酵素活性をコードする選択された宿主の細胞内遺伝子のすべてがノックアウトされる;次に細菌ノックアウト宿主を、細菌ノックアウトによって活性喪失を示す酵素をコードする、天然のまたは非天然の遺伝子の少なくとも1つの作用コピーを含有するベクターによって形質転換する。そのような酵素をコードする細菌および他の遺伝子は、当業者が利用し得る種々の供給源を通じて選択および入手され得る。これらは、酵素をコードする配列および種-作用DNA調節要素のヌクレオチド配列を含む。有用なオンラインインターネットリソースは、例えば:1例えば、httpusexpasyorgで入手され得る、SwissInstituteofBioinformaticsBatimentEcoledePharmacieRoom3041UniversitedeLausanne1015ローザンヌ-ドリニー;スイスのExPASyproteomicsfacilityENZYMEandBIOCHEMICAL経路SMAPSfeaturesを参照;および2NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBINationalLibraryofMedicineNationalInstitutesofHealthUSDeptofHealthHumanServicesBuilding38Aベセズダ、メリーランド州米国によって提供され、httpwwwncbinlmnihgoventrezqueryfcgiにて入手され得る、GenBankfacilityおよび他のEntrezリソースPUBMEDPROTEINNUCLEOTIDESTRUCTUREGENOMEetalfeaturesを参照を含む。選択したコード配列は、その遺伝子コードを細菌宿主細胞によって利用される遺伝子コードに一致するように変更することによって改変され、そのコドン配列は、宿主によって利用されるコドン配列にさらに近づくように強化され得る。遺伝子コードの選択およびコドン頻度強化は、当業者に公知の種々の方法のいずれか、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に従って実施され得る。このプロセスを補助するための有用なオンラインインターネットリソースは、例えば:1かずさDNA研究所千葉県木更津市かずさ鎌足2-6-7、292-0818、日本の、httpwwwkazusaorjpcodonで利用され得る、CodonUsageDatabase;および2httpwwwncbinlmnihgovTaxonomyUtilswprintgccgimodecのNCBITaxonomydatabaseからGeneticCodestables利用され得るを含む。例えば、シュードモナスPseudomonas種は、NCBITaxonomyサイトのGeneticCode翻訳Table11の利用して、かずさのサイトではhttpwwwkazusaorjpcodoncgibinに示された表のコドン使用頻度を示して報告されている。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、宿主細胞として使用され得る。1つの実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、少なくとも1つの栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供する。代替的な実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、すべての栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供する。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、宿主細胞であるのと同時に、少なくとも1つの、好ましくはすべての栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供し得る。生合成ヌクレオシドおよび窒素含有塩基選択マーカー1つの実施形態において、同化代謝に関与する生合成酵素は、栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。特に生合成酵素は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ジヌクレオチド、窒素含有塩基、および窒素含有塩基誘導体の生合成に関与するものから選択され得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのプリン型生合成酵素が栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。そのようなプリン生合成酵素は、例えば、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アデニロスクシナートリアーゼ、アデニロスクシナートシンターゼ、GMPシンターゼ、IMPシクロヒドロラーゼ、IMPデヒドロゲナーゼ、ホスホリボシルアミン-グリシンリガーゼ、ホスホリボシル-アミノイミダゾールカルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ、ホスホリボシル-ホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ、ホスホリボシル-ホルミルグリシンアミジンシンターゼ、ホスホリボシル-グリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、リボース-ホスフェートジホスホキナーゼ、およびリボース-5-ホスフェート-アンモニアリガーゼを含む。別の特定の実施形態において、ピリミジン型生合成酵素を栄養要求性選択マーカーとして選択し得る。そのようなピリミジン型生合成は、UMPの生合成に関与する酵素、例えば、カルバメートキナーゼEC2722、カルバモイル-ホスフェートシンターゼEC6355、アスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼEC2132、ジヒドロオロターゼEC3523、ジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼEC1331、オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼOPRT;EC24210、およびオロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼODCase;EC41123を含む。ピリミジン型生合成酵素をコードする遺伝子の例は周知である。UMPの細菌合成の場合、有用な遺伝子の例は:カルバメートキナーゼをコードするarcC遺伝子;カルバモイル-ホスフェートシンターゼを集合的にcollectivelyコードするcarAおよびcarB遺伝子;アスパルテートカルバモイトランスフェラーゼをコードするpyrB遺伝子;ジヒドロオロターゼをコードするpyrC遺伝子;ジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼを単独でまたは集合的にコードするpyrD遺伝子;オロタートホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするpyrE遺伝子;およびオロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするpyrF遺伝子を含む。特定の実施形態において、本発明による発現系は、pyrF栄養要求性選択マーカー遺伝子を利用する。pyrF遺伝子は、細菌ピリミジンヌクレオチド生合成経路に必要な酵素であるODCaseをコードして、それにより細胞は、ピリミジンヌクレオチドUTP、CTPならびにピリミジンデオキシヌクレオチドdTTP、dCTPのデノボ合成を適正に行う。経路の最初の反応物質は、ATP、アミノ基源すなわちアンモニウムイオンまたはL-グルタミン、およびカルボキシル基源すなわち二酸化炭素または重炭酸イオンである;経路の最後の生成物はdTTPであり、dCTP、UTP、およびCTPもプロセスで生成される。特に細菌デノボピリミジンヌクレオチド生合成経路は、カルバモイルホスフェートの生成で開始する。カルバモイルホスフェートは:aarcC遺伝子によってコードされるカルバメートキナーゼEC2722の作用;またはさらに一般的には、bその小および大サブユニットがcarAおよびcarB遺伝子によってそれぞれコードされる、グルタミン加水分解されたカルバモイル-ホスフェートシンターゼEC6355の作用のいずれかによって合成される。次にカルバモイルホスフェートは、以下の6ステップ経路によってUDPに変換される:1pyrBによってコードされるアスパルテートカルバモイルトランスフェラーゼEC2132による、カルバモイルホスフェートからN-カルバモイル-L-アスパルテートへの変換;次に2pyrCによってコードされるジヒドロオロターゼEC3523による、そのS-ジヒドロオロタートへの変換;次に3pyrD遺伝子によってコードされるジヒドロオロタートデヒドロゲナーゼEC1331による、そのオロタートへの変換;次に4pyrEによってコードされるオロタートホスホリボシルトランスフェラーゼOPRT;EC24210による、そのオロチジン-5’-モノホスフェートOMPへの変換;そして次に5pyrFによってコードされるオロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼODCase;EC41123による、そのウリジン-5’-モノホスフェートUMPへの変換。次にピリミジンヌクレオチドUTP、CTP、dTTP、dCTP、核酸、核タンパク質、および他の細胞代謝産物の合成のための種々の経路によって、UMPを利用する。carA、carB、またはpyrB-pyrF遺伝子の1つまたはそれ以上が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、細胞が機能するウラシル回収経路を含有するという条件で、ウラシルが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。ほとんどの細菌は、シュードモナスPseudomonadsおよび関連種を含めて、天然のウラシル回収経路を含有する。ウラシル回収経路では、細胞は外来性ウラシルをUMPに導入および変換して、必要なピリミジンヌクレオチドを合成する。ここでは、ウラシルは5-ホスホリボシル-1-ピロホスフェートと反応して、upp遺伝子によってコードされるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼEC2429、またはpyrRによってコードされる2官能性ピリミジンオペロン調節タンパク質pyrR2官能性タンパク質のいずれかの作用によって、UMPを生成する。得られたUMPは上記したように、次にUDPに、そして続いてピリミジンヌクレオチドに変換される。結果として、pyrF-シュードモナスPseudomonadまたは関連細胞は、ウラシル含有培地上で維持され得る。pyrF遺伝子含有DNA構築物をpyrF-細胞にトランスフェクトおよび発現させて、機能するODCase酵素を形成した後、得られた複合pyrFプラスミド-宿主細胞系は、ウラシルが欠乏した培地で維持され得る。シュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞で使用するためのpyrF遺伝子のコード配列は、機能するODCaseを生成するために選択されたシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素ODCaseをコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。pyrFをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の1つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および/または配列生成技術の利用から得られた操作配列である。pyrF選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を選択したシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞の遺伝子コードおよび/または、まずコドン使用頻度に従って改良または最適化され得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。上記のpyrF遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。1つの実施形態において、pyrFをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞から単離される。pyrF遺伝子全体コード配列および周囲の調節領域を含むは、そこから単離され得る。特定の実施形態において、pyrF遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目Pseudomonadalesの構成要素member、シュードモナス亜目Pseudomonadineaeの構成要素、シュードモナダセア科Pseudomonadaceaeの構成要素、シュードモナス族Pseudomonadeaeの構成要素、シュードモナス属Pseudomonasの構成要素、および蛍光菌Pseudomonasfluorescens種群の構成要素すなわちフルオレッセントシュードモナズからなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌Pseudomonasfluorescensに属する。特定の実施形態において、pyrF遺伝子は、配列番号1の核酸配列表2、またはその変異体を含有する。あるいは、pyrF遺伝子によってコードされるODCaseは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号2のアミノ酸配列表3、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。あるいは、pyrF遺伝子は、配列番号1に対して少なくとも70、75、80、85、88、90、および95相同である核酸配列からなる群から選択される、ODCase酵素をコードする核酸配列を含有する。同様にpyrF遺伝子は、配列番号2に対して少なくとも70、75、80、85、88、90、および95相同であるアミノ酸配列からなる群から選択されるODCaseをコードする。別の実施形態において、pyrF遺伝子は、配列番号1のヌクレオチド974-1669のヌクレオチド配列に対して少なくとも90、93、95、96、97、98または99相同であるヌクレオチド配列を有するコード配列を含有し得る。特定の実施形態において、pyrF遺伝子は、ハイブリダイゼーションが高ストリンジェントな条件下で実施されたときに、配列番号3のアンチコドン配列表4にハイブリダイズするコドン配列を有するコード配列を含有し得るか、またはそれと重複するコドン配列を有し得る。特に特定の実施形態において、pyrF遺伝子は配列番号3のヌクレオチド配列を含有する。代替的な実施形態において、本発明による発現系は、thyA栄養要求性選択マーカー遺伝子を利用する。thyA遺伝子は、細菌ピリミジンヌクレオチド生合成経路に必要な酵素の、チミジラートシンターゼEC21145をコードする。DNAはウラシルの代わりにチミン5-メチルウラシルを主要な塩基として含有するため、チミジンモノホスフェートdTMPまたはチミジラートの合成は、dATP、dGTP、およびdCTPと共に、DNA複製に必要なdTTPチミジントリホスフェートを供給するために不可欠である。5,10-メチレンテトラヒドロフォラートをメチル基源として利用する、チミジラートシンターゼによるdUMPのメチル化は、チミジラートを生成する。チミジラートシンターゼの除去、阻害、または破壊によって、チミジラート合成を中断、そして続いてのDNAの合成を停止させ得る。thyA遺伝子が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、外来性チミジンが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。蛍光菌Pseudomonasfluorescensにおいて、外来性チミジンでの生存のためには、チミジンキナーゼをコードする大腸菌Ecolitdk遺伝子の添加が必要である。したがって選択の前に、tdk遺伝子を含むプラスミドを使用してthyA-蛍光菌Pfluorescens宿主細胞を形質導入して、thyA-/ptdk細胞を産生させて、チミジン含有培地での生存を可能にし得る。あるいは、蛍光菌Pseudomonasfluorescensにおいて外来性チミジンを利用し得る機能性チミジラートシンターゼ酵素を生成するtdk遺伝子をゲノムに挿入して、thyA-/tdk宿主細胞を産生し得る。thyA遺伝子含有DNA構築物をthyA-/ptdk細胞にトランスフェクションして、発現させて機能チミジラートシンターゼ酵素を生成した後に、得られた組み合わせthyAプラスミド-宿主細胞系は、チミジン欠乏培地中で維持され得る。シュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞で使用するためのthyA遺伝子のコード配列は、機能性TSを生成するために選択されたシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、チミジラートシンターゼ酵素TSをコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。thyAをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の1つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および/または配列生成技術の利用から生じた操作配列である。thyA選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を、まず、選択したシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞の遺伝子コードおよび/またはコドン使用頻度に従って改良または最適化し得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。上記のthyA遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。1つの実施形態において、thyAをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞から単離される。thyA遺伝子全体コード配列および周囲の調節領域を含むは、そこから単離され得る。特定の実施形態において、thyA遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目Pseudomonadalesの構成要素、シュードモナス亜目Pseudomonadineaeの構成要素、シュードモナダセア科Pseudomonadaceaeの構成要素、シュードモナス族Pseudomonadeaeの構成要素、シュードモナス属Pseudomonasの構成要素、および蛍光菌Pseudomonasfluorescens種群の構成要素すなわちフルオレッセントシュードモナズからなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌Pseudomonasfluorescensに属する。特定の実施形態において、thyA遺伝子は、配列番号4の核酸配列表5を含有する。あるいは、thyA遺伝子によってコードされるTSは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号5のアミノ酸配列表6、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。生合成アミノ酸選択マーカー代替的な実施形態において、栄養要求性選択マーカーとして選択された、同化代謝に関与する生合成酵素は、アミノ酸の生合成ものから選択され得る。特定の実施形態において、生合成アミノ酸酵は:グルタメートファミリーGlu;Gln、Pro、およびArg;アスパルテートファミリーAsp;Asn、Met、Thr、Lys、およびIle;セリンファミリーSer;GlyおよびCys;ピルベートファミリーAla、Val、およびLeu;芳香族ファミリーTrp、Phe、およびTyr;およびヒスチジンファミリーHisの生合成にて活性な酵素からなる群から選択される。これらの生合成経路に関与する遺伝子および酵素の例は:例えば、argA-argH、gdhA、glnA、proA、proCを含む、グルタメートファミリー構成要素arg、gdh、gln、およびpro遺伝子;例えば、asnA、asnB、aspC、dapA、dapB、dapD-dapF、lysA、lysC、metA-metC、metE、metH、metL、thrA-thrCを含む、アスパルテートファミリー構成要素asd、asn、asp、dap、lys、met、およびthr遺伝子;例えば、cysE、cysK、glyA、serA-serCを含む、セリンファミリー構成要素cys、gly、およびser遺伝子;例えば、aroA-aroH、aroK、aroL、trpAtrpE、tyrA、およびtyrBを含む、芳香族ファミリー構成要素aro、phe、trp、およびtyr遺伝子;ならびにhisA-hisD、hisF-hisHを含む、ヒスチジンファミリー構成要素his遺伝子を含む。さらに特定の実施形態において、栄養要求性選択マーカーは、グルタメートファミリーの構成要素の生合成に関与する酵素から選択され得る。有用なグルタメートファミリー栄養要求性選択マーカーの例は、そのコード遺伝子の代表的な例と共に挙げた以下:N-アセチルグルタメートシンターゼ、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼをコードする、argA;アセチルグルタメートキナーゼをコードする、argB;N-アセチル-ガンマグルタミルホスフェートレダクターゼをコードする、argC;アセチルオルニチンデルタ-アミノトランスフェラーゼをコードする、argD;アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする、argE;オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする、argFおよびargI;アルギニンスクシナートシンセターゼをコードする、argG;アルギニノスクシナートリアーゼをコードする、argH;グルタメートデヒドロゲナーゼをコードする、gdhA;グルタミンシンセターゼをコードする、glnA;ガンマグルタミルホスフェートレダクターゼをコードする、proA;ガンマグルタメートキナーゼをコードする、proB;およびピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼをコードするproCを含む。1つの実施形態において、アミノ酸生合成選択マーカー遺伝子は、プロリン生合成ファミリーの少なくとも1つの構成要素、例えば、proA、proB、またはproCでありうる。特定の実施形態において、プロリン生合成選択マーカー遺伝子は、proC遺伝子を含みうる。proC遺伝子は、プロリン生合成経路の最終ステップを触媒する酵素をコードする。細菌では、プロリンすなわちL-プロリン生合成経路は、L-グルタミン酸で始まる3つの酵素プロセスを含む。このプロセスのステップは:1proBによってコードされるグルタメート-5-キナーゼGK;EC27211による、L-グルタミン酸のL-グルタミル-5-ホスフェートへの変換;次に2aproAによってコードされるグルタミル-5-ホスフェートレダクターゼGPRとしても公知の、グルタメート-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼEC12141による、そのL-グルタメート-5-セミアルデヒドへの変換、続いて2bΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートを生成するための、その自発的環化;および次に3proCによってコードされるΔ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼP5CR;EC1512による、そのL-プロリンへの変換を含む。ほとんどの細菌では、proCはP5CRサブユニットをコードし、活性P5CR酵素は、そのホモマルチマーである。proA、proB、またはproC遺伝子の1つまたはそれ以上が不活性化または消失する、あるいは非機能性酵素をコードするように変異される細菌において、プロリンが培地に添加されるならば、細胞はなお増殖し得る。結果として、proC-シュードモナスPseudomonadまたは関連細胞は、プロリン含有培地上で維持され得る。proC遺伝子含有DNA構築物をproC-細胞にトランスフェクションし、発現させて機能性P5CR酵素を生成した後に、得られた組み合わせたproCプラスミド-宿主細胞系は、プロリン欠乏培地中で維持され得る。シュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞で使用するためのproC遺伝子のコード配列は、機能性P5CRを生成するために選択されたシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞によってコード配列が転写、翻訳、そしてそうでなければ処理されるという条件で、Δ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼ酵素P5CRをコードするいずれの遺伝子によっても供給され得る。proCをコードする配列は天然の配列であるか、または、例えば、当該分野で公知の1つまたはそれ以上の配列変更、配列結合、および/または配列生成技術の利用から生じた操作配列である。proC選択マーカー遺伝子の一部として使用する前に、選択したコード配列を選択したシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞の遺伝子コードおよび/またはコドン使用頻度に従って最初に改良または最適化され得る。発現可能なコード配列は、選択した宿主細胞内で機能し得る転写プロモーター、ならびに他の必要な転写および翻訳調節要素すべてに作動可能に結合される。proC遺伝子の天然のコード配列は、それが上記の要件を満足するという条件で、細菌から、または他の任意の生物から入手され得る。1つの実施形態において、proCをコードする配列は、選択マーカーとして使用されることが意図されているシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞から単離される。proC遺伝子全体コード配列および周囲の調節領域を含むは、そこから単離され得る。特定の実施形態において、proC遺伝子またはコード配列を提供する細菌は、シュードモナス目Pseudomonadalesの構成要素、シュードモナス亜目Pseudomonadineaeの構成要素、シュードモナダセア科Pseudomonadaceaeの構成要素、シュードモナス族Pseudomonadeaeの構成要素、シュードモナス属Pseudomonasの構成要素、および蛍光菌Pseudomonasfluorescens種群の構成要素すなわちフルオレッセントシュードモナズからなる群から選択される。特定の実施形態において、細菌は、種蛍光菌Pseudomonasfluorescensに属する。特定の実施形態において、proC遺伝子は、配列番号6の核酸配列表7、またはその変異体を含有する。あるいは、proC遺伝子によってコードされるP5CRは、本発明による所与の宿主細胞によって使用される遺伝子コードに従って、配列番号7のアミノ酸配列表8、その変異体、またはそれと重複するコドン配列を有する変異体を含有する。あるいは、proC遺伝子は、配列番号6に対して少なくとも70、75、80、85、88、90、および95相同であるP5CR酵素をコードする核酸配列を含有する。同様にproC遺伝子は、配列番号7に対して少なくとも70、75、80、85、88、90、および95相同であるODCaseをコードする。別の実施形態において、proC遺伝子は、配列番号8のヌクレオチド配列表9に対して少なくとも90、93、95、96、97、98または99相同であるコード配列を含有し得る。特定の実施形態において、proC遺伝子は、ハイブリダイゼーションがストリンジェントな条件下で実施されたときに、配列番号8のアンチコドン配列にハイブリダイズするコドン配列を有するコード配列を含有し得るか、またはそれと重複するコドン配列を有し得る。特に特定の実施形態において、proC遺伝子は配列番号8のヌクレオチド配列を含有する。選択マーカーの利用1つの実施形態において、代謝産物の異化利用に関与する酵素は、栄養要求性選択マーカーとして選択され得る。特に酵素は、炭素源の利用に関与するものから選択され得る。そのような酵素の例は、例えば、スクラーゼ、ラクターゼ、マルターゼ、デンプン異化酵素、グリコーゲン異化酵素、セルラーゼ、およびポリヒドロキシアルカノアートデポリメラーゼを含む。細菌宿主細胞が選択した型の天然の異化活性を示す場合、原栄養回復prototrophyrestoringベクターによる形質転換前にノックアウトされ得る。これらの化合物に対して天然の栄養要求性を示す細菌も、その形質転換のための天然の状態で使用され得る。細胞内へ移入または拡散できない化合物が選択され、培地に添加されるこれらの実施形態において、原栄養回復prototrophyrestoringまたは原栄養可能prototrophyenabling酵素が使用されるために分泌され得る。そのような場合、分泌された酵素は、選択した宿主細胞内で作用する分泌シグナルペプチドのためのコード配列を含むように酵素のコード配列を選択または設計することによって、化合物を細胞外で分解して、細胞内に拡散または移入可能であるより小さい化合物、例えば、グルコースを生成し得る。このような実施形態では、原栄養回復prototrophyrestorative遺伝子は、細胞膜を介した酵素の運搬を達成するために、選択した宿主細胞内で作用する分泌シグナルペプチドのためのコード配列を含むように選択または操作され得る。これらの実施形態、または選択した化合物が細胞内に移入または拡散可能である実施形態のいずれかで、細胞は、選択した化合物は別として、他の炭素源を供給しない培地中で増殖する。炭素源利用ベースマーカー系において、各原栄養回復prototrophyrestorativeまたは原栄養可能prototrophyenabling炭素源利用酵素は、ただ1つの炭素源の利用に関与し得る。例えば、同じ異化経路からの2つの遺伝子を、1つのベクター上で共に発現させたり、または別のベクター上で別個に同時発現させたりして、原栄養性を提供する。そのような多遺伝子炭素源利用ベースマーカー系の特定の例は、例えば、グリコーゲンホスホリラーゼおよびアルファ-1,4グルカントランスフェラーゼの両方のトランスジェニック発現による、唯一の炭素源としてのグリコーゲンの使用;ならびにアルファ-アミラーゼ、およびアルファ1→6グルコシダーゼの両方のトランスジェニック発現による、唯一の炭素源としてのデンプンの使用を含む。しかしながら、選択した単遺伝子または多遺伝子炭素源マーカー系は、細胞に供給された唯一の炭素源が炭素源異化選択マーカー系で使用するために選択された化合物であるという条件で、同じ宿主細胞内で他の種類のマーカー系と同時に使用され得る。生化学利用型活性に有用な酵素の他の例は、当該分野で周知であり、細胞に供給された有用でないD-炭素源を栄養性のL-炭素源に供給し得るラセマーゼおよびエピマラーゼを含み得る。これらの系の例は、例えば、:対応するラセマーゼのトランスジェニック発現によって使用されたD-酸またはD-アシル化合物;およびトランスジェニック発現されたラクテートラセマーゼによって使用されたラクテートを含む。同様に、マーカー系で使用するためにアミノ酸生合成活性が選択されている場合、栄養要求性は、細胞に、R-アミノ酸を、細胞が栄養要求性である対応するL-アミノ酸に変換する利用不可R-アミノ酸およびR-アミノ酸ラセマーゼまたはエピマラーゼEC511の両方を供給することによっても克服し得る。形質スタッキング本発明による、標的遺伝子発現のための栄養要求性選択マーカー遺伝子の挿入の前後に、複数の表現型変化を宿主細胞に対して行い得る。例えば、細胞は、種々の増強された表現型形質を示すために、同時に、または連続的に遺伝子改変され得る。このプロセスは、形質スタッキングと呼ばれる。pryF欠失は、1つのそのような表現型形質として存在し得る。そのような菌株において、本発明によるpyrF遺伝子は、他の所望の形質のクロスインacrossin/クロスアウトcrossout対立遺伝子交換を行うために、自殺ベクター上で選択マーカーおよび対抗選択マーカーの両方として5’-フルオロオロチン酸の存在下で使用され得る。したがって本発明によるpyrF遺伝子は、宿主細胞を形質スタッキングするプロセスで使用され得る。そのようなプロセスでは、そのようなpyrF遺伝子を含有する自殺ベクターを複数の別個の形質転換において宿主細胞菌株に形質転換し得る;そのような各手順では、pyrF表現型の再確立を使用して、次の遺伝的に強化されたgeneticallyenhancing表現型変化を無限に作製し得る。したがって、pyrF遺伝子自体は形質を提供され得るだけでなく、形質スタッキングのプロセスでさらなる表現型形質を得るために使用され得る。1つの実施形態において、本発明は、追加の栄養要求株を誘導するためにさらに遺伝子改変された栄養要求性シュードモナスPseudomonadsおよび関連細菌を提供する。例えば、pyrF-栄養要求株は、例えば、proC遺伝子またはthyA遺伝子の不活性化を通じて、同化または異化経路に存在する別の生合成酵素を不活性化するためにさらに改変され得る。このようにして、宿主細胞中に複数の栄養要求株を産生し得る。別の実施形態において、宿主細胞での組換えポリペプチドの発現を改良するために、宿主細胞に遺伝子改変を行い得る。さらなる改変は、特定の炭素源のさらに効率的な利用を可能にし、それにより発酵全体の全効率を最適化する遺伝子改変を含み得る。1つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞は、lacI含有導入遺伝子の宿主染色体への挿入によってさらに改変される。好ましくはlacI導入遺伝子、またはその誘導体は、完全または切断PlacI-lacI-lacZYA構築物の一部以外である。栄養要求株を誘導するための改変本発明による発現系で使用するために選択されたシュードモナスPseudomonadまたは関連宿主細胞は、選択した栄養要求性活性を示す、任意の機能性生体触媒を発現するその能力を欠損していてもよい。例えば、オロチジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ活性を選択した場合、宿主細胞はa任意のpyrF遺伝子産物すなわち任意の機能性ODCase酵素、およびbしたがって、任意の有効な置換すなわちODCase活性を有する他の生体触媒を発現するその能力が欠損していてもよい。1つの実施形態において、宿主細胞は、標的栄養要求株に関与する機能性酵素すなわちODCaseを発現できないようにするために、そのゲノム遺伝子を改変することによって、選択した活性が生体触媒によって不足するようにされる。言い換えれば、原栄養細胞活性細胞は、標的原栄養経路に関与する機能性酵素をコードする遺伝子のノックアウトによって栄養要求株となるすなわち活性-細胞。この改変は、選択した活性をコードする遺伝子の細胞ゲノムコード配列を改変することによって行える。1つの実施形態において、コード配列改変は:コード配列読み枠を変化させる挿入または欠失変異;十分な数のコドンを改変する置換または反転変異;および/またはそこから非機能性酵素を産生し得る近接コドンの十分に大きな群を欠失させる欠失変異を導入することによって実施され得る。宿主細胞菌株がその中の選択マーカーとして使用するために栄養要求性遺伝子を提供した1つの実施形態において、好ましくは選択された遺伝子の転写プロモーターおよび/または転写ターミネーター要素はそれぞれ、欠失変異を含む変異の導入によって非活性化され得る。例えば、転写要素不活性化は場合により、上記のコード配列改変に加えて実施され得る。宿主細胞菌株がまた栄養要求性選択マーカー遺伝子を提供した1つの実施形態において、選択した遺伝子のDNAすべてを宿主細胞ゲノムから欠失させ得る。そのようなノックアウト菌株は、当該分野で有効であるとして公知の種々の方法のいずれかに従って調製され得る。例えば、所望の核酸欠失配列の相同標的遺伝子配列5’および3’を含有する相同組換えベクターを宿主細胞へ形質転換し得る。理想的には、相同組換え時に、所望の標的酵素遺伝子ノックアウトを産生し得る。遺伝子ノックアウト方法の特定の例は、例えば、:以前に記載されたポリヌクレオチドの挿入による遺伝子活性化を含む。例えば、DLRoederACollerMarkerexchangemutagenesisofapectatelyaseisozymegeneinErwiniachrysanthemiJBacteriol1645156を含む。あるいは、所望の表現型のためのトランスポゾン突然変異誘発および選択例えば、ベンゾアートまたはアントラニラートを代謝できないことを使用して、標的遺伝子が挿入によって不活性化された細菌株を単離し得る。例えば、KNidaPPClearyInsertionalinactivationofstreptolysinSexpressioninStreptococcuspyogenesJBacteriol155115661を参照。特定の遺伝子における特定の変異または欠失は、例えば、JAWellsetalCassettemutagenesisanefficientmethaodforgenerationofmultiplemutationsatdefinedsitesGene3431523に記載されているように、カセット突然変異誘導を使用して作製し得る;それにより直接またはランダム変異は、遺伝子の選択した部分に行われ、次に相同組換えによる遺伝子の染色体コピー内へ包含させる。1つの実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる生物および選択マーカー遺伝子が利用される宿主細胞の両方は、原核生物から選択され得る。特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる生物および選択マーカー遺伝子が利用される宿主細胞の両方が細菌から選択され得る。別の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる細菌および選択マーカー遺伝子が利用される細菌宿主細胞の両方がプロテオバクテリアから選択される。なお別の実施形態において、選択マーカー遺伝子が得られる細菌および選択マーカー遺伝子が利用される細菌宿主細胞の両方が以下で定義されるように、シュードモナスPseudomonadsおよび密接に関連する細菌から、またはそのサブグループから選択され得る。特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方を同じ種から選択し得る。好ましくは、種は、原核生物;より好ましくは細菌、なおより好ましくはプロテオバクテリウムである。別の特定の実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方が、以下で定義するようにシュードモナスPseudomonadsおよび密接に関連付けられる細菌から、またはそのサブグループから選択される属の同じ種から選択され得る。1つの実施形態において、選択マーカー遺伝子源生物および宿主細胞の両方が、シュードモナスPseudomonas俗の種、特に蛍光菌Pseudomonasfluorescens種、そして好ましくは蛍光菌PseudomonasfluorescensバイオタイプA種から選択され得る。III.LACI挿入本発明は、完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、染色体挿入lacI導入遺伝子または誘導体を含有するように遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonadsおよび関連細胞を提供する。1つの実施形態において、lacIインサートは、ベクター上のlacO配列または誘導体を結合して、ベクター上のPlac-Ptacファミリープロモーターを阻害する、LacIリプレッサータンパク質の発現によって厳密な発現ベクター制御を提供する。結果は、誘導前の組換えポリペプチド発現の低下した基底レベルである。1つの実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子の、またはlacI遺伝子誘導体、例えば、lacIQまたはlacIQ1の染色体挿入を含有するシュードモナスPseudomonad宿主細胞が提供され、lacIインサートは、完全または切断構造遺伝子含有PlacI-lacI-lacZYA構築物以外である。本発明で有用な他の誘導体lacI導入遺伝子は;天然のlacI遺伝子とは異なる改変コドン配列を有するlacI誘導体例えば、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子はgtg開始コドンを含有し、これは選択した発現宿主細胞での翻訳開始に有効な代わりの開始コドン、例えば、atgによって置換される;標的遺伝子誘導を達成するために温度の変化、例えば、42°Cまで変化に反応する、温度感受性lacIミュータント、例えば、lacItsまたはlacITsによってコードされるものを含む、変異アミノ酸配列を有するLacIタンパク質をコードするlacI誘導体例えば、BukrinskyetalGene7041517NHasanWSzybalskiGene1633540HAdarietalDNAcellBiol1494550を参照;誘導を達成するためにラクトース以外の代わりの糖、例えば、アラビノース、リボース、またはガラクトースの存在に反応するLacIミュータント例えば、WO9927108forLacRepressorProteinswithAlteredResponsivityを参照;および少なくともlacオペレーターに対する野生型結合を示すが、インデューサ例えば、IPTGに対しては向上した感受性を示す、またはlacオペレーターに対しては向上した結合を示すが、少なくとも野生型脱抑制性を示す、LacIミュータント例えば、LSwintKruseetalBiochemistry421400416を参照を含む。特定の実施形態において、染色体に挿入されたLacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子のそれと同一であり、配列番号9の核酸配列表10を有する。別の実施形態において、宿主染色体に挿入された遺伝子は、配列番号10のアミノ酸配列表11を有するLacリプレッサータンパク質をコードする。代替的な実施形態において、挿入されたlacI導入遺伝子は、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子の誘導体である。1つの特定の実施形態において、lacI誘導体遺伝子は、配列番号11の核酸配列表12を有するlacIQ遺伝子である。lacIQ変異体は、大腸菌Ecoli中のlacIリプレッサーのレベルを10倍上昇させるプロモーターの-35領域に単点変異を有することを除いて、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子と同じである。例えば、MPCalosNature27476265を参照。なお別の実施形態において、lacI誘導体遺伝子は、配列番号12の核酸配列表13を有するlacIQ1遺伝子である。lacIQ1変異体は、そのヌクレオチド配列が大腸菌Ecoli-35領域コンセンサス配列と正確に一致する-35領域を置換する再構成であり、大腸菌Ecoliでの天然のプロモーターより100倍高い発現を引き起こす。例えば、MPColasJHMillerMolGenGenet18355960。本発明において、宿主細胞染色体は、LacIタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも1つのコピーを含有する少なくとも1つの核酸配列の挿入によって改変可能であり、該遺伝子は、好ましくは、コードされるLacIタンパク質、ならびにPlacI-lacI-lacZYA核酸配列以外である遺伝子を含有するポリヌクレオチドすなわちPlacI-lacI-lacZYAオペロンのPlac-バージョンまたはPlacI-lacI-lacZポリヌクレオチドすなわちそのようなPlac-オペロンの構造lac利用オペロン遺伝子含有部分、例えば、PlacI-lacI-lacZYA核酸配列の少なくとも部分的に切断されたバージョンを構成的に発現するために、細胞による使用が可能である。選択したLacIタンパク質をコードする遺伝子は、好ましくは、構成的に発現される。これは選択した発現宿主細胞で構成的に発現される任意のプロモーターの使用によって達成され得る。例えば、天然の大腸菌EcoliPlacIは、選択したLacIコード配列に作動可能に結合されるか、または別の構成的に発現されたプロモーターはそれに作動可能に結合される。ある場合では、調節されたプロモーターが発酵の間LacIタンパク質がそれから連続される発現される状態で維持されるという条件で、調節されたプロモーターが使用され得る。特定の実施形態において、Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp-PlacUV5、lpp-lac、nppM-lac、T7lac、T5lac、T3lac、およびPmacを含む、lacまたはtacファミリープロモーターは、本発明で利用される。ゲノム挿入部位染色体挿入は、当該分野で公知の任意の技術に従って実施され得る。例えば、DSToderGenereplacementinPseudomonasaeruginosaMethodsinEnzymology23546674andJQuandtMFHynesVersatilesuicidevectorwhichallowdirectselectionforgenereplacementinGramnegativebacteriaGene1271521を参照。当該分野で公知であるようなトランスポン型挿入技術、およびその後の選択も使用され得る:例えば、IYGoryshinWSReznikoffTn5invitrotranspositionJournalofBiologicalChemistry273736774を参照。あるいは、非溶解ファージ形質導入によるトランスフェクションも、染色体挿入に使用され得る:例えば、JHMillerExperimentsinMolecularGeneticsを参照。lacI遺伝子、またはその誘導体を挿入するのに有用な場所である細菌発現宿主細胞染色体内の部位は、使用した発酵条件下での細胞機能には必要とされない部位、例えば、存在、転写、または発現が、使用した発酵条件下での細胞の健全な機能にとって重要である任意の遺伝子内の任意の位置を含む。そのような挿入部位の実例は、これに限定されるわけではないが:スクロースインポートおよび代謝遺伝子例えば、sacB、フルクトースインポートおよび異化遺伝子例えば、フルクトキナーゼ遺伝子、1-ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、芳香族炭素源インポートおよび利用遺伝子例えば、アントラニラートオペロン遺伝子、例えば、antABC遺伝子、ベンゾアートオペロン遺伝子、benABCD遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子例えば、ampC、blll、blc遺伝子、blo遺伝子、blp遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子例えば、phoA、ヌクレオベースまたはヌクレオチド生合成遺伝子例えば、pyrBCDEF遺伝子、アミノ酸生合成遺伝子例えば、proABC遺伝子、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子例えば、asd、3-イソプロピルマラートデヒドロゲナーゼ遺伝子例えば、leuB、およびアントラニラートシンターゼ遺伝子例えば、trpEを含む。ゲノム挿入が栄養要求株をもたらしたか、または同時に生じる任意の実施形態において、致死効果を克服および回避するために宿主細胞が有効な置換代謝産物を細胞に供給する培地中で培養されるか、または置換遺伝子が対応する原栄養能を回復させるのに有効である生体触媒を発現する宿主細胞内に、例えば、選択マーカー遺伝子として供給される。代謝栄養要求株の作製時に欠失または不活性化すなわちノックアウトのために選択された1つまたは複数の遺伝子は、代謝経路で作用する酵素をコードするいずれの遺伝子でもよい。酵素は、細胞生存に必要である分子の同化生合成に関与する酵素である。あるいは、酵素は、細胞生存に必要である分子の異化利用に関与する酵素でありうる。好ましくは、所与の生体触媒活性をコードするすべての作用遺伝子は、栄養要求性宿主細胞の作製時に宿主細胞から標的酵素活性を確実に除去するために、欠失または不活性化される。あるいは、宿主細胞は、先在する栄養要求株例えば、天然の栄養要求株を示すことが可能であり、そこでは欠失または不活性化ノックアウトを介したさらなる遺伝子改変を実施する必要がない。例えば、アミノ酸生合成遺伝子例えば、proA、proBまたはproC遺伝子または、ヌクレオベースまたはヌクレオチド生合成遺伝子例えば、pyrB、pyrC、pyrD、pyrE、またはpyrFは挿入部位として使用され、その場合に必要な生合成活性は通常、妨害されて、したがって栄養要求株を産生する。そのような場合:1生合成経路への代謝依存を回避するために、プロリンまたはウラシル補給物と同様に、培地に添加されるか、;または2栄養要求性宿主細胞が発現され、したがって生合成経路から消失する生体触媒を置換するさらなる遺伝子によって形質転換され、それによって代謝選択マーカー遺伝子、例えば、proC、pyrF、またはthyAと同様に、細胞への原栄養性を回復するかのいずれかである。特定の実施形態において、pyrF、thyA、およびproCからなる群から選択される遺伝子のノックアウト、または遺伝子の組合せによって同時にまたは続いて栄養要求的に誘導されるlacI導入遺伝子、またはその変異体が細胞に挿入される。特定の実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子は、pyrFのノックアウトによって同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内へ挿入される。別の特定の実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子は、proCのノックアウトによって同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内に挿入される。なおさらなる実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子は、pyrFおよびproCのノックアウトによって、同時にまたは続いて栄養要求性にされる細胞内に挿入される。別の実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子、またはその誘導体を、宿主細胞のレバンスクラーゼ位置に挿入し得る。例えば、1つの特定の実施形態において、天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子、またはその誘導体を蛍光菌Pseudomonasfluorescensのレバンスクラーゼ遺伝子位置に挿入し得る。特に天然の大腸菌EcolilacI、lacIQ、またはlacIQ1導入遺伝子、またはその誘導体を、配列番号13の核酸配列表14を有する蛍光菌Pseudomonasfluorescensのレバンスクラーゼ遺伝子位置に挿入し得る。IV.LACO配列プロモーターの漏出性を抑制する試みは、標的組換えポリペプチド発現の潜在的に同時に起こる低下によって平衡を保たせる必要がある。プロモーターをさらに抑制して、プロモーターの漏出性を低下させる1つの手法は、オペレーター配列として公知の調節要素を改変して、誘導時の標的組換えポリペプチドの潜在的発現を低下させることなく、関連するリプレッサータンパク質がオペレーター配列に結合する能力を向上させることである。蛍光菌Pseudomoasfluorescensにおけるデュアルlacオペレーターの使用が、誘導されたタンパク質の収率を同時に低下させることなく、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の優れた抑制を提供することが発見されている。1つの実施形態において、導入遺伝子発現の抑制に関与する少なくとも1つのlacO配列を含む核酸を含有する核酸構築物を含むシュードモナスPseudomonad生物が提供される。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomoasfluorescensである。1つの実施形態において、核酸構築物は1つを超えるlacO配列を含む。別の実施形態において、核酸構築物は少なくとも1つの、好ましくは1つを超えるlacOid配列を含む。1つの実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの3’側に位置するlacO配列、またはその誘導体、およびプロモーターの5’側に位置するlacO配列、またはその誘導体を含む。特定の実施形態において、lacO誘導体はlacOid配列である。本発明の別の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞に使用される1つを超えるlacオペレーター配列、またはその誘導体を含む核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、少なくとも1つのlacオペレーター配列はlacOid配列である。天然の大腸菌Ecolilacオペレーターは、インデューサの非存在下でlacオペロンの発現をダウンレギュレートするように作用する。このためlacオペレーターは、LacIリプレッサータンパク質によって結合され、オペロンの転写を抑制する。LacIタンパク質がDNA分子上の2つのlacオペレーターを同時に結合され得ることが決定されている。例えば、MulleretalRepressionoflacpromotorasafunctionofdistancephaseandqualityofanauxiliarylacoperatorJMolBiol2572129を参照。抑制は、ismediatedbytheプロモーターに隣接するオペレーターO1、ならびにlacZ遺伝子のコード領域内のO1の下流の401塩基対、およびO1上流の92bpにそれぞれ位置する、2つの補助オペレーターO2およびO3によって仲介される図4を参照。天然の大腸菌Ecolilacオペレーター配列の理想的なlacオペレーターOidによる置換は、大腸菌Ecoliにおける天然のlacオペロンの抑制上昇を引き起こす。MulleretalRepressionoflacpromotorasafunctionofdistancephaseandqualityofanauxiliarylacoperatorJMolBiol2572129を参照。lacO配列または誘導体を、プロモーターに対して大腸菌Ecoli天然のO1位置に配置し得る。あるいは、lacO配列または誘導体をプロモーターに対して大腸菌Ecoli03位置に配置し得る。別の実施形態において、lacO配列または誘導体をプロモーターに関して大腸菌Ecoli天然の01位置、天然の03位置、または両方に配置し得る。1つの実施形態において、核酸構築物は、プロモーター配列に対して5’側またはプロモーター配列に対して3’側に、少なくとも1つのlacOid配列を含有する。特定の実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの3’側にlacOid配列、プロモーターの5’側に少なくとも1つのlacO配列、または誘導体を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの5’側にlacOid配列、およびプロモーターの3’側に少なくとも1つのlacO配列、または誘導体を含有する。なお別の実施形態において、核酸構築物は、プロモーターの5’および3’側の両方のlacOid配列を含有する。特定の実施形態において、lacO配列は、配列番号14によって表されるlacOid、または実質的に相同な配列である。別の実施形態において、配列番号59のlacOid配列、または配列番号59に実質的に相同な配列が利用される。V.単離核酸およびアミノ酸本発明の別の態様において、タンパク質の改良された生成法で使用される核酸配列が提供される。1つの実施形態において、栄養要求性シュードモナスPseudomonad宿主細胞で使用するための原栄養回復酵素をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから生成された窒素含有塩基化合物生合成酵素をコードする核酸配列が提供される。1つの実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens中のpyrF遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号1および3。別の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens内でthyA遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号4。なお別の実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから精製されたアミノ酸生合成化合物をコードする核酸配列が提供される。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens内でproC遺伝子をコードする核酸配列が提供される配列番号6および8。別の態様において、本発明は、タンパク質の改良された生成法に使用される新規なアミノ酸配列を提供する。1つの実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから精製された窒素含有塩基化合物生合成酵素のアミノ酸配列が提供される。1つの実施形態において、配列番号2を含有するアミノ酸配列が提供される。別の実施形態において、配列番号5を含有するアミノ酸配列が提供される。なお別の実施形態において、生物蛍光菌Pseudomonasfluorescensから精製されたアミノ酸生合成化合物のアミノ酸配列が提供される。特定の実施形態において、配列番号7を含有するアミノ酸配列が提供される。本発明の1つの実施形態は、蛍光菌PseudomonasfluorescenspyrF遺伝子の新規な単離核酸配列表2、配列番号1;表4、配列番号3である。本発明の別の態様は、蛍光菌PseudomonasfluorescenspyrF遺伝子の単離ペプチド配列表3、配列番号2を提供する。配列番号1、2、または3に対して少なくとも90、95、98または99相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号1、2または3の、少なくとも10、15、17、20または25、30、40、50、75、100、150、250、350、500、または1000個の連続する核酸またはアミノ酸を含有するヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。配列番号1、2または3の断片、誘導体および類似体もさらに提供される。配列番号1、2または3の断片は、少なくとも約10bp、15bp、17bp、20bp、50bp、100bp、500bp、1kbp、5kbpまたは10kpbの任意の連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態は、蛍光菌PseudomonasfluorescensthyA遺伝子の新規な単離核酸配列表5、配列番号4である。本発明の別の態様は、蛍光菌PseudomonasfluorescensthyA遺伝子の単離ペプチド配列表6、配列番号5を提供する。配列番号4または5に対して少なくとも90、95、98または99相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号4または5の少なくとも10、15、17、20、または25、30、40、50、75、100、150,250、350、500、または1000個の連続する核酸またはアミノ酸のヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。さらに、配列番号4および5の断片、誘導体および類似体も提供される。配列番号4または5の断片は、少なくとも約10bp、15bp、17bp、20bp、50bp、100bp、500bp、1kbp、5kbpまたは10kpbを含む連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態は、蛍光菌PseudomonasfluorescensproC遺伝子の新規な単離核酸配列表7、配列番号6;表9、配列番号8である。本発明の別の態様は、蛍光菌PseudomonasfluorescensproC遺伝子の新規な単離ペプチド配列表8、配列番号7を提供する。配列番号6、7、または8に対して少なくとも90、95、98または99相同な核酸およびアミノ酸配列が提供される。さらに、配列番号6、7、または8の、少なくとも10、15、17、20または25、30、40、50、75、100、150、250、350、500、または1000個の連続する核酸またはアミノ酸を含有するヌクレオチドおよびペプチド配列も提供される。配列番号6、7、または8の断片、誘導体および類似体も提供される。配列番号6、7、または8の断片は、少なくとも約10bp、15bp、17bp、20bp、50bp、100bp、500bp、1kbp、5kbpまたは10kpbを含む連続する核酸またはペプチド配列を含み得る。配列相同性配列相同性は、当該分野で周知の種々の方法のいずれかに従って決定される。有用な配列アラインメントおよび相同性決定方法の例は、以下で記載するものを含む。相同配列のアラインメントおよび検索は、USNationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIプログラムのMegaBLAST現在、httpwwwncbinlmnihgovBLASTで入手され得るを使用して実施され得る。アミノ酸配列について70に設定された、または90に設定されたパーセント同一性のオプションを用いたこのプログラムの使用は、クエリー配列に対して70、また90、またはそれ以上の相同性を持つ配列を同定する。当該分野で公知の他のソフトウェアも、相同配列、例えば、本発明によるプロモーター塩基配列またはアクチベータ-タンパク質コード塩基配列を含有する情報ストリングに対して少なくとも70または90相同である配列を配列比較および/または検索するために利用され得る。例えば、クエリー配列に対して少なくとも70または90相同である配列を同定するための比較に関する配列アラインメントは、そこで規定されたデフォルトパラメータと、70または90に設定した相同性の程度のパラメータと共に、GCGSequenceAnalysisSoftwarePackageGeneticsComputerGroupUniversityofWisconsinBiotechnologyCenter1710UniversityAvenueマジソン、ウィスコンシン州53705から入手され得るで利用され得るGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAプログラムを使用することによって実施され得る。または、例えば、CLUSTALプログラムカリフォルニア州マウンテンビューのIntelligeneticsのPCGenesoftwarepackageで利用され得るが使用され得る。これらおよび他の配列アラインメント方法は当該分野で周知であり、手動アラインメントによって、目視検査によって、あるいは配列アラインメントアルゴリズム、例えば、上記のプログラムによって具現されるアルゴリズムの任意の手動または自動利用によって実施され得る。種々の有用なアルゴリズム、例えば、:WRPearsonDJLipmanによって、ProcNatlAcadSciUSA85244448で記載されている類似性検索方法;TFSmithMSWatermanによって、AdvApplMath248289およびJMolecBiol14719597で記載されている局所相同性方法;SBNeedlemanCDWunschによって、JMolecBiol4844353で記載されている相同性アライメント方法;例えば、WRPearsonによって、Genoinics1163550で;WRPearsonによって、MethodsMolecBiol2430731and2536589によって;およびDGHigginsPMSharpによって、CompApplnsinBiosci515153およびGene7323744で記載されている種々の方法を含む。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される核酸ハイブリダイゼーションも、本明細書で記載した十分に相同な配列を得るための有用な技術である。VI.核酸構築物本発明のなお別の態様において、ペプチドの改良された生成法で使用するための核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、a組換えポリペプチドをコードする核酸配列と、b原栄養可能prototrophyenabling酵素をコードする核酸配列とを含む、シュードモナスPseudomonad宿主細胞を形質転換するために使用する核酸構築物が提供される。別の実施形態において、核酸構築物はcPlac-Ptacファミリープロモーターをさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物はdlacまたはtacファミリープロモーターの3’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体をさらに含む。なお別の実施形態において、核酸構築物はelacまたはtacファミリープロモーターの5’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体をさらに含む。1つの実施形態において、誘導体lacO配列は、lacOid配列でありうる。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の1つの実施形態において、a組換えポリペプチドをコードする核酸配列と、bPlac-Ptacファミリープロモーターと、clacまたはtacファミリープロモーターの3’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体と、dlacまたはtacファミリープロモーターの5’側の少なくとも1つのlacO配列、または誘導体を含む、シュードモナスPseudomonad生物内で発現ベクターとして使用するための核酸構築物が提供される。1つの実施形態において、誘導体lacO配列は、lacOid配列でありうる。1つの実施形態において、核酸構築物は、e栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞内で使用するための原栄養可能prototrophyenabling選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad生物は蛍光菌Pseudomonasfluorescensである。本発明の1つの実施形態において、栄養要求性宿主細胞を原栄養能に形質転換し得る少なくとも1つの生合成酵素をコードする核酸を含む核酸構築物が提供される。生合成酵素は、生合成酵素の発現なしに宿主細胞が栄養要求性代謝不全のために生存できない選択培地上で、栄養要求性宿主細胞が生存し得るようにするいずれの酵素でもよい。そのようなものとして、生合成酵素は、非栄養要求性代謝産物添加培地上で増殖するために原栄養能力を回復することによって、栄養要求性宿主の代謝不全を補完する酵素でありうる。1つの特定の実施形態において、本発明は、pyrF-栄養要求性宿主を補完する機能性オロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素をコードする核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号1または3の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。別の特定の実施形態において、本発明は、thyA-栄養要求性宿主を補完する機能性チミジラートシンターゼ酵素をコードする核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は配列番号4の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。さらなる特定の実施形態において、本発明は、proC-栄養要求性宿主を補完する機能性Δ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼ酵素をコードする、核酸構築物を提供する。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号6または8の核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号7のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。代替的な実施形態において、本発明は、栄養要求性宿主細胞を原栄養能および追加の非栄養要求性選択マーカーに形質転換し得る少なくとも1つの生合成酵素をコードする、核酸構築物を提供する。非栄養要求性選択マーカーの例は当該分野で周知であり、比色/発色または蛍光反応を生じさせるマーカー例えば、lacZ遺伝子、GUS遺伝子、CAT遺伝子、luxAB遺伝子、抗生物質耐性選択マーカー例えば、アンホテリシンB、バシトラシン、カルバペネム、セファロスポリン、エタンブトール、フルオロキノロン、イソニジド、セファロスポリン、メチシリン、オキサシリン、バノマイシン、ストレプトマイシン、キノリン、リファンピン、リファンピシン、スルホンアミド、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、セファロチン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子、または他の一般に使用される非栄養要求性選択マーカーを含み得る。別の実施形態において、発現ベクターは、栄養要求性宿主細胞を原栄養能に形質転換し得る、1つを超える生合成酵素を含み得る。生合成酵素は、生合成酵素の発現なしに宿主細胞が栄養要求性代謝不全のために生存できない選択培地上で、栄養要求性宿主細胞が生存し得るようにするいずれの酵素でもよい。生合成酵素は、非栄養要求性代謝産物添加培地上で増殖するために原栄養能力を回復することによって、栄養要求性宿主の代謝不全を補完する酵素でありうる。例えば、発現ベクターは、第1および第2の原栄養可能prototrophyenabling選択マーカー遺伝子を含み、構築物を含有する宿主細胞が宿主細胞の生存が選択マーカー遺伝子の存在を必要とする条件のいずれか、または両方で維持されるようにする。マーカー-遺伝子依存性生存条件の一方のみが存在する場合、対応するマーカー遺伝子は発現される必要があり、次に他方のマーカー遺伝子は細胞が栄養要求性である必要なすべての栄養分は培地によってなお供給されるが、活性または不活性のいずれかである。このことは、宿主細胞が異なる条件間で移動されるときに、所望のトランスジェニック産物および/またはトランスジェニック活性をコードする同じ標的遺伝子、または共有結合された標的遺伝子の同じセットが宿主細胞内に連続して維持されるようにする。選択した選択マーカー遺伝子それぞれのコード配列は独立して、構成性または調節プロモーターのいずれかに作動可能に結合され得る。特定の実施形態において、核酸ベクターは、pyrF-栄養要求性宿主細胞、proC-栄養要求性宿主細胞、またはpyrF-/proC-デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性オロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素および機能性Δ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号1または3、および配列番号6または8の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は配列番号2および7のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。代替的な特定の実施形態において、核酸ベクターは、pyrF-栄養要求性宿主細胞、thyA-栄養要求性宿主細胞、またはpyrF-/thyA-デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性オロトジン-5’-ホスフェートデカルボキシラーゼ酵素および機能性チミジラートシンターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号1または3、および配列番号4の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号2および5のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。特定の実施形態において、核酸ベクターは、proC-栄養要求性宿主細胞、thyA-栄養要求性宿主細胞、またはproC-/thyA-デュアル栄養要求性宿主細胞を補完し得る機能性Δ1-ピロリン-5-カルボキシラートレダクターゼ酵素およびチミジラートシンターゼ酵素をコードする、核酸構築物を含む。特定の実施形態において、核酸構築物は、配列番号4、および配列番号6または8の核酸配列を含む。代替的な実施形態において、核酸構築物は、配列番号5および7のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含有する。プロモーター発酵プロセスにおいて、標的組換えポリペプチドの発現が誘導されると、発現系の効率を最大限にするために、高レベルの産生を有することが理想的である。プロモーターは、転写を開始させ、一般にリボソーム結合部位の10~100ヌクレオチド上流に位置する。プロモーターは理想的に、宿主細胞の細胞タンパク質全体の約50の組換えポリペプチド蓄積を可能にするのに十分強力となり、厳密な調節を受け、容易に安価に誘導される。本発明によって使用したプロモーターは、構成性プロモーターまたは調節プロモーターである。一般に使用される誘導性プロモーターおよびその続いてのインデューサは、lacIPTG、lacUV5IPTG、tacIPTG、trcIPTG、PsynIPTG、trpトリプトファン飢餓、araBAD1-アラビノース、lppaIPTG、lpp-lacIPTG、phoAホスフェート飢餓、recAナリジクス酸、proU容量オスモル濃度、cst-1グルコース飢餓、tetAテトラサイクリン、cadApH、nar嫌気性条件、PL42°Cへの熱移動、cspA20°Cへの熱移動、T7熱誘導、T7-lacオペレーター、T3-lacオペレーターIPTG、T5-lacオペレーターIPTG、T4遺伝子32T4感染、nprM-lacオペレーターIPTG、Pmアルキル-またはハロ-ベンゾアート、Puアルキル-またはハロ-トルエン、Psalサリチラート、およびVHb酸素を含む。例えば、MakridesSCMicrobiolRev60512538HannigGMakridesSCTIBTECH165460StevensRCStructures8R177R185を参照。例えば、:JSanchezRomeroVDeLorenzoGeneticEngineeringofNonpathogenicPseudomonasstrainsasBiocatalystsforIndustrialandEnvironmentalproCessesinManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnologypp46074HSchweizerVectorstoexpressforeigngeneandtechniquestomonitorgeneexpressionforPseudomonadsCurrentOpinioninBiotechnology12439445andRSlaterRWilliamsTheExpressionofForeignDNAinBacteriainMolecularBiologyandBiotechnologypp12554を参照。選択した細菌宿主細胞に対して天然のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーター例えば、シュードモナスPseudomonasアントラニラートまたはベンゾアートオペロンプロモータPant、Pbenはまた、標的ポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するために使用され得る。1つを超えるプロモーターが相互に別のプロモーターに共有結合されているタンデムプロモータ、例えば、Pant-Pbenタンデムプロモータプロモーター間ハイブリッドまたはPlac-Placタンデムプロモータも、配列が同じでも異なっていても使用し得る。調節プロモーターは、プロモーターが部分である遺伝子の転写を制御するために、プロモーター調節タンパク質を利用する。本明細書で調節プロモーターを使用する場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明による発現系の部分となる。プロモーター調節タンパク質の例は:アクチベータタンパク質、例えば、大腸菌Ecoli異化産物アクチベータタンパク質、MaITタンパク質;AraCファミリー転写アクチベーター;リプレッサータンパク質、例えば、大腸菌EcoliLacIタンパク質;およびデュアルファクションdualfaction調節タンパク質、例えば、大腸菌EcoliNagCタンパク質を含む。多くの調節プロモーター/プロモーター調節タンパク質の対は当該分野で公知である。プロモーター調節タンパク質は、プロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも1つのDNA転写調節領域を放出させるか、または該領域に結合させて、それにより遺伝子の転写を開始するときトランスクリプターゼ酵素の作用を許容または遮断するために、エフェクタ化合物、すなわち調節タンパク質と可逆的または非可逆的に結合する化合物と相互作用する。エフェクタ化合物は、インデューサまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクタ化合物および無償性インデューサ化合物を含む。多くの調節プロモーター/プロモーター調節タンパク質/エフェクタ化合物トリオは、当該分野で公知である。エフェクタ化合物は、細胞培養または発酵の間に使用され得るが、調節プロモーターを使用する特定の実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量または密度の増殖後、所望の標的遺伝子の発現を直接または間接的に引き起こすために、適切なエフェクタ化合物が培養物に添加される。一例として、lacファミリープロモーターを利用する場合、lacI遺伝子、またはその誘導体、例えば、lacIQまたはlacIQ1遺伝子も系に存在し得る。通常は構成的に発現された遺伝子であるlacI遺伝子は、これらのプロモーターのlacオペレーターに結合するLacリプレッサータンパク質LacIタンパク質をコードする。したがってlacファミリープロモーターを利用する場合、lacI遺伝子も発現系に包含させて発現させ得る。lacプロモータファミリ構成要素、例えば、tacプロモーターの場合、エフェクタ化合物はインデューサ、好ましくは無償性インデューサ、例えば、IPTGイソプロピル-P-D-1-チオガラクトピラノシド、イソプロピルチオガラクトシドとも呼ばれるである。特定の実施形態において、本発明では、Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PlacUV5、lpp-PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T71ac、T51ac、T31ac、およびPmacを含むlacまたはtacファミリープロモーターが利用される。他の要素上記したようにlacO配列および誘導体を含む他の調節要素を、発現構築物に含め得る。そのような要素は、これに限定されるわけではないが、例えば、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始および停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン性レギュレーター、ポリシストロン性レギュレーター、ヌクレオチド配列tagsおよびtagペプチドコード配列発現されたポリペプチドの同定、分離、精製、または単離を促進するtag配列、例えば、His-tag、Flag-tag、T7-tag、S-tag、HSV-tag、B-tag、Strep-tagを含む、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸Ala-Trp-Trp-Pron、チオレドキシン、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、CTP:CMP-3-デオキシ-D-マンノ-オクツロソナートシチジルトランスフェラーゼ、trpEまたはtrpLE、アビジン、ストレプトアビジン、T7遺伝子10、T4gp55、スタヒロコッカスタンパク質A、ストレプトコッカスタンパク質G、GST、DHFR、CBP、MBP、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、GFP、KSI、c-myc、ompT、ompA、pelB、NusA、ユビキチン、およびヘモシリンAを含む。最低でも、本発明のタンパク質コード遺伝子は、タンパク質コード配列に加えて、それに作動可能に結合した以下の調節要素:プロモーター、リボソーム結合部位RBS転写ターミネーター、翻訳開始および停止シグナルを含み得る。有用なRBSは、本発明による発現系内の宿主細胞として有用な種のいずれかから、好ましくは選択した宿主細胞から得られる。多くの特異的な種々のコンセンサスRBS、例えば、DFrishmanetalStartsofbacterialgenesestimatingthereliabilityofcomputerpredictionsGene23425765およびBESuzeketalAprobabilisticmethodforidentifyingstartcodonsinbacterialgenomesBioinformatics17112330によって説明および引用されたものが公知である。さらに、天然のまたは合成RBSのいずれか、例えば、:EP0207459合成RBSOIkehataetalPrimarystructureofnitrilehydratasededucedfromthenucleotidesequenceofaRhodococcusspeciesanditsexpessioninEscherichiacoliEurJBiochem18156370AAGGAAGの天然のRBS配列に記載されているものが使用される。本発明で有用な方法、ベクター、ならびに翻訳および転写要素、ならびに他の要素のさらなる例が、例えば、:Gilroyへの米国特許第5055294およびGilroyetalへの米国特許第5,128,130号;Rammleretalへの米国特許第5,281,532号;BarnesetalへのUSPatentNos4695455および4861595;Grayetalへの米国特許第4,755,465号;およびWilcoxへの米国特許第5,169,760号に記載されている。ベクターシュードモナスPseudomonad宿主による本発明の酵素をコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミドに挿入することによってさらに向上させ得る。代表的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を向上させる通常10~300bpのサイズの、DNAのcis作用要素である。一般に、組換え発現ベクターは、シュードモナスPseudomonad宿主細胞、例えば、本発明の栄養要求株回復遺伝子の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、ならびに下流構造配列の転写を指示する、高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、上記されている。非相同配列構造配列は適切な期に翻訳開始および終止配列によって構築され、ある実施形態において、リーダー配列が翻訳ポリペプチドの分泌を指示し得る。場合により本発明に従って、非相同配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与する、N末端同定ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし得る。酵素の発現で蛍光菌Pfluorescensによって使用するための有用な発現ベクターは、所望の標的ポリペプチドをコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、作動可能な読み取りフェーズreadingphaseに機能性プロモーターとともに挿入することによって作製される。ベクターは、ベクターを確実に維持して、所望ならば宿主内での増幅を提供するために、1つまたはそれ以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。本開示による形質転換に適切な宿主は、シュードモナスPseudomonas属内の多様な種を含み、特に蛍光菌Pseudomonasfluorescensの宿主細胞株である。ベクターは当該分野では、宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるのに有用であるとして公知であり、これらのいずれも改変され、本発明による遺伝子を発現するために使用され得る。そのようなベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、およびファージ発現ベクターを含む。本発明で使用するために改変され得る有用なプラスミドベクターの例は、これに限定されるわけではないが、発現プラスミドpBBR1MCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600、およびRSF1010を含む。さらなる例は、pALTER-Ex1、pALTER-Ex2、pBAD/His、pBAD/Myc-His、pBAD/gIII、pCal-n、pCal-n-EK、pCal-c、pCal-Kc、pcDNA2.1、pDUAL、pET-3a-c、pET9a-d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET-14b、pET15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b、pET-21a-d、pET-22b、pET-23a-d、pET24a-d、pET-25b、pET-26b、pET-27b、pET28a-c、pET-29a-c、pET-30a-c、pET31b、pET-32a-c、pET-33b、pET-34b、pET35b、pET-36b、pET-37b、pET-38b、pET-39b、pET-40b、pET-41a-c、pET-42a-c、pET-43a-c、pETBlue-1、pETBlue-2、pETBlue-3、pGEMEX-1、pGEMEX-2、pGEXlλT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P、pHAT10/11/12、pHAT20、pHAT-GFPuv、pKK223-3、pLEX、pMAL-c2X、pMAL-c2E、pMAL-c2g、pMAL-p2X、pMAL-p2E、pMAL-p2G、pProEXHT、pPROLar.A、pPROTet.E、pQE-9、pQE-16、pQE-30/31/32、pQE-40、pQE-50、pQE-70、pQE-80/81/82L、pQE-100、pRSET、およびpSE280、pSE380、pSE420、pThioHis、pTrc99A、pTrcHis、pTrcHis2、pTriEx-1、pTriEx-2、pTrxFusを含み得る。そのように有用なベクターの他の例は、例えば、:NHayaseinApplEnvirMicrobiol60333642AALushnikovetalinBasicLifeSci3065762SGraupnerWWackernagelinBiomolecEng171116HPSchweizerinCurrOpinBiotech1243945MBagdasarianKNTimmisinCurrTopicsMicrobiolImmunol964767TIshiietalinFEMSMicrobiolLett11630713INOlekhnovichYKFomichevinGene1406365MTsudaTNakazawainGene1362576CNietoetalinGene8714549JDJonesNGuttersoninGene61299306MBagdasarianetalinGene1623747HPSchweizeretalinGenetEng236981PMukhopadhyayetalinJBact17247780DOWoodetalinJBact145144851andRHoltwicketalinMicrobiology14733744に記載されているものを含む。シュードモナスPseudomonas宿主細胞で使用され得る発現ベクターのさらなる例は、示されたレプリコンに由来するような、表16に示した発現ベクターを含む。発現プラスミドRSF1010は、例えば、FHeffronetalによってproCNatlAcadSciUSA72362327に、KNagahariKSakaguchiによって、JBact133152729に記載されている。プラスミドRSF1010およびその誘導体は、本発明の特に有用なベクターである。当該分野で公知のRSF1010の有用な誘導体の例は、例えば、pKT212、pKT214、pKT231および関連プラスミド、ならびにpMYC1050および関連プラスミド例えば、ThompsonetalへのUSPatentNos5527883および5840554、例えば、pMYC1803を含む。プラスミドpMYC1803は、調節テトラサイクリン耐性マーカーならびにRSF1010プラスミドからの複製および起動位置を保持する、RSF1010ベースのプラスミドpTJS260に由来するWilcoxへのUSPatentNo5169760を参照。他の有用なベクターの例は、PuhleretalへのUSPatentNo4680264に記載されているものを含む。1つの実施形態において、発現プラスミドは発現ベクターとして使用される。別の実施形態において、RSF1010またはその誘導体は、発現ベクターとして使用される。なお別の実施形態において、pMYC1050またはその誘導体、あるいはpMYC1803またはその誘導体は、発現ベクターとして使用される。VII.シュードモナスPseudomonad宿主細胞における組換えポリペプチドの発現本発明の1つの態様において、改良されたタンパク質生成に使用するための、組換えポリペプチドを発現させるプロセスが提供される。1つの実施形態において、プロセスは、少なくとも1つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonadにおいて、a組換えポリペプチドと、b原栄養性回復酵素とをコードする核酸を含む核酸構築物の発現を提供する。代替的な実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、1つを超える代謝産物に対して栄養要求性である。1つの実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞である。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、窒素含有塩基化合物およびアミノ酸からなる群から選択される代謝産物、または代謝産物の組合せに対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonadにおいて発現される。さらに特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、ウラシル、プロリン、およびチミジンからなる群から選択される代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonadにおいて発現される。別の実施形態において、栄養要求株は、宿主pyrF、proC、またはthyA遺伝子それぞれのノックアウトによって産生され得る。代替的な実施形態、組換えポリペプチドは、PlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外の、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子、lacIQ遺伝子、またはlacIQ1遺伝子の、宿主細胞の染色体への挿入によって遺伝子改変された栄養要求性シュードモナスPseudomonad細胞において発現される。1つの特定の実施形態において、栄養要求性宿主細胞で発現された組換えポリペプチドを含有するベクターは、少なくとも2つのlacオペレーター配列、またはその誘導体を含む。なおさらなる実施形態において、組換えポリペプチドはPlacファミリープロモーターによって駆動される。別の実施形態において、プロセスは、シュードモナスPseudomonad宿主細胞ゲノムに挿入されたLacIコード遺伝子の少なくとも1つのコピーを提供するように遺伝子改変されたシュードモナスPseudomonad宿主細胞の使用を含み、ここでlacIコード遺伝子は、PlacI-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外である。1つの実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、天然の大腸菌EcolilacI遺伝子のそれと同じである。別の実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、lacIQ遺伝子である。なお別の実施形態において、Lacリプレッサータンパク質をコードする遺伝子は、lacIQ1遺伝子である。特定の実施形態において、シュードモナスPseudomonad宿主細胞は、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞である。別の実施形態において、シュードモナスPseudomonadは、栄養要求性細胞を産生するためにさらに遺伝子改変される。別の実施形態において、プロセスは、少なくとも約3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/Lまたは少なくとも約10g/Lの組換えポリペプチドレベルを生じる。別の実施形態において、組換えポリペプチドは、3g/L~100g/Lのレベルで発現される。方法は一般に:a本発明で記載するようなシュードモナスPseudomonad宿主細胞、好ましくは蛍光菌Pseudomonasfluorescensを提供する工程;bi目的の標的組換えポリペプチド、および栄養要求性宿主を利用する場合には、ii発現されたときに宿主細胞の栄養要求性を克服する原栄養可能prototrophyenabling酵素をコードする遺伝子、を含む少なくとも1つの核酸発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクションする工程;c宿主細胞中に目的の組換えポリペプチドを含有する核酸発現ベクターを維持するために有効な選択圧を供給する増殖培地で宿主細胞を増殖させる工程;ならびにd目的の標的組換えポリペプチドを発現させる工程;を含む。方法は、宿主細胞に、iiiPlacファミリープロモーター、および場合によりiv1つを超えるlacオペレーター配列をさらに含む発現ベクターによって少なくとも1回トランスフェクションする工程をさらに含み得る。1つの実施形態において、少なくとも1つのlacオペレーター配列は、lacOid配列でありうる。好ましくは、発現系は、少なくとも1g/L~少なくとも80g/Lのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、または少なくとも80g/Lのレベルで発現される。特定の実施形態において、Plac、Ptac、Ptrc、PtacII、PIacUV5、lpp-PlacUV5、lpp-lac、nprM-lac、T71ac、T51ac、T31ac、およびPmacを含む、lacまたはtacファミリープロモーターが本発明で利用される。1つの実施形態において、少なくとも1つの組換えポリペプチドは、1つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad細胞にて発現させることが可能であり、ここで該栄養要求株は、目的のポリペプチおよび原栄養可能prototrophyenabling酵素をコードする核酸発現ベクターの維持のための選択マーカーとして作用する。あるいは、1つを超える組換えポリペプチドは、1つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad細胞にて発現させることが可能であり、ここで組換えポリペプチドをコードする該核酸は、同じベクターに、あるいは複数のベクターに含有されることが可能である。なお別の実施形態において、異なる標的ポリペプチドをコードする1つを超える発現ベクターを少なくとも1つの代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad宿主細胞内に維持することが可能であり、ここで1つの発現ベクターは、原栄養可能prototrophicenabling酵素および目的の第1の標的ポリペプチドをコードする核酸を含有し、第2の発現ベクターは、代わりの非栄養要求性選択マーカーおよび目的の第2のポリペプチドをコードする核酸を含有する。別の実施形態において、少なくとも1つの組換えポリペプチドは、1つを超える代謝産物に対して栄養要求性であるシュードモナスPseudomonad細胞において発現させることが可能であり、ここで複数の原栄養能は、核酸発現ベクターの維持のための選択マーカーとして作用する。例えば、第1および第2の原栄養可能prototrophyenabling選択マーカー遺伝子が存在する発現ベクターが利用され得る。両方のマーカー遺伝子が同じDNA構築物に存在する場合、構築物を含有する宿主細胞は、宿主細胞の生存が選択マーカー遺伝子の存在を必要とする条件のいずれかまたは両方の下で維持される。マーカー-遺伝子依存性生存条件の一方のみが存在する場合、対応するマーカー遺伝子は発現される必要があり、他方のマーカー遺伝子は、細胞が栄養要求性のままである必要なすべての栄養素はは培地によってなお供給されるが、活性または不活性のいずれかである。このことは、宿主細胞が異なる条件間で移動されるときに、所望のトランスジェニック産物および/または所望のトランスジェニック活性をコードする同じ標的遺伝子、または共有結合された標的遺伝子の同じセットが宿主細胞内に連続して維持されるようにする。2つの選択マーカー遺伝子それぞれが別のDNA構築物に位置する場合、宿主細胞内にDNA構築物の両方を維持するために、マーカー-遺伝子依存性生存条件の両方が存在し、対応するマーカー遺伝子の両方が発現される必要がある。このことは、1つを超える非共有結合標的遺伝子または標的遺伝子のセットが宿主細胞内で別個に維持されるようにする。選択した選択マーカー遺伝子それぞれのコード配列は独立して、構成性または調節プロモーターのいずれかに作動可能に結合され得る。そのような多標的遺伝子系の二重標的遺伝子の例は、これに限定されるわけではないが:1標的遺伝子の一方の発現産物が他方の標的遺伝子事態と相互作用する系;2標的遺伝子の一方の発現産物がもう一方の標的遺伝子の発現産物、例えば、タンパク質およびその結合タンパク質またはαn-βnタンパク質のα-およびβ-ポリペプチドと相互作用する系;32つの遺伝子両方の2つの発現産物が第3の成分、例えば、宿主細胞内に存在する第3の成分と相互作用する系;42つの遺伝子両方の発現産物が一般的な生体触媒経路に関与する系;および52つの遺伝子の2つの発現産物が相互に独立して機能する系、例えば、バイクローナル抗体発現系を含む。上に挙げたタイプ1の二重標的遺伝子系の1つの例において、第1の標的遺伝子は、所望の標的タンパク質をコードし、ここで第1の標的遺伝子は調節プロモーターの制御下にあり;次に第2の標的遺伝子は第1の標的遺伝子のプロモーターの調節に関与するタンパク質をコードし、例えば、第2の標的遺伝子は、第1の標的遺伝子のプロモータアクチベータまたはリプレッサータンパク質をコードする。第2の遺伝子が第1の遺伝子のプロモーター調節タンパク質をコードする例において、第2の遺伝子のコード配列は、構成性プロモーターの制御下にありうる。1つの実施形態において、第2の遺伝子は、細胞内に高コピー数構築物として維持される独立したDNA構築物の一部となり、少なくとも10、20、30、40、50のコピー数、または50コピー超が宿主細胞内に維持される。別の実施形態において、本発明は、シュードモナスPseudomonads、特に蛍光菌Pseudomonasfluorescens中での組換えポリペプチドの産生における発現ベクター上の1つを超えるlacO配列の使用を提供する。別の態様において、本発明は、lacI導入遺伝子、またはその誘導体、例えば、lacIQまたはlacIQ1をコードするLacリプレッサータンパク質の少なくとも1つの染色体挿入されたコピーを有する、シュードモナスPseudomonadsおよび密接に関連した細菌の構成要素である細菌宿主細胞を形質転換する工程を含む、組換えポリペプチドを産生する方法を提供し、該導入遺伝子は、PlacI-lacI-lacZYA構築物を少なくとも1つの標的組換えポリペプチドをコードする核酸構築物と共に含有する完全または切断構造遺伝子の一部以外である。少なくとも1つの標的組換えポリペプチドをコードする核酸は、Placファミリープロモーターに作動可能に結合することが可能であり、宿主細胞内に存在するPlacファミリープロモーターはすべて、染色体に挿入されたlacI導入遺伝子から唯一発現されるLacリプレッサータンパク質によって調節される。場合により、発現系は、少なくとも3g/L~少なくとも10g/Lのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。好ましくは発現系は、少なくとも3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、または少なくとも10g/Lのポリペプチド総生産性にて標的ポリペプチドを発現し得る。1つの実施形態において、本発明は、PlacI-laellacZYAオペロンの一部として以外の、細胞のゲノム内に挿入されたLacIコード遺伝子の少なくとも1つのコピーを提供するようにさらに遺伝子改変された栄養要求性シュードモナスPseudomonadまたは関連細菌を利用する発現系において組換えポリペプチドを発現させる方法を提供する。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、lacI導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主細胞にて発現される。別の特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、lacIQ導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主細胞にて発現される。なお別の特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、lacIQ1導入遺伝子インサートを含有する栄養要求性蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主細胞にて発現される。蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主は、生存のために細胞によって要求される生化学物質に対して栄養要求性でありうる。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞は、窒素含有塩基に対して栄養要求性である。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、チミンおよびウラシルからなる群から選択される窒素含有塩基に対して栄養要求性である。特に特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主細胞の栄養要求性は、関連するコード産物を非機能性にするpyrFまたはthyA遺伝子への遺伝子改変によって誘導される。代替的な実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens細胞は、アミノ酸に対して栄養要求性である。特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescensは、アミノ酸プロリンに対して栄養要求性である。特に特定の実施形態において、蛍光菌Pseudomonasfluorescens宿主細胞の栄養要求性は、関連するコード産物を非機能性にするproC遺伝子への遺伝子改変によって誘導される。形質転換シュードモナスPseudomonad宿主細胞のベクターによる形質転換は、当該分野で公知の任意の形質転換方法を使用して実施され、細菌宿主細胞は、無傷の細胞として、またはプロトプラストすなわちサイトプラストを含むとして形質転換され得る。形質転換方法の例は、穿孔方法例えば、電気穿孔、プロトプラスト融合、細菌結合、および2価カチオン処理例えば、カルシウムクロライド処理またはCaCl/Mg2処理、あるいは当該分野で周知の他の方法を含む。例えば、MorrisonJBact132349351ClarkCurtissCurtissMethodsinEnzymology101347362SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualKrieglerGeneTransferand発現ALaboratoryManualandCurrentProtocolsinMolecularBiologyを参照。選択好ましくは、うまく形質転換されない細胞は、形質転換の後に、および発酵中に連続的に選択される。選択マーカーは、栄養要求性選択マーカーまたは従来の抗生物質選択マーカーでありうる。細胞が多数の栄養化合物に対して栄養要求性である場合、栄養要求性細胞は、原栄養回復ベクターによって形質転換されるまで、これらの栄養化合物すべてが添加された培地上で培養され得る。宿主細胞は、多数の生合成活性を欠いているか、または欠くようにされている場合、原栄養回復マーカー系は、1つまたはそれ以上のまたはすべての生合成活性を回復させるために選択可能であり、残りは、培地中になお欠乏している栄養の供給を継続することによって補償される。1つを超える生合成活性、および/または1つを超える原栄養能が回復される選択マーカー系において、複数の選択マーカー遺伝子が1つのベクター上で共に発現されるか、または異なるベクター上で別個に同時発現される。単一の代謝産物が選択マーカー系の標的である場合、多数の生合成活性を選択マーカー系に包含させ得る。例えば、同じ同化経路から活性をコードする2つまたはそれ以上の遺伝子は、経路の生成物である化合物の生合成に関して原栄養能を回復させるために、1つのベクター上で共に発現されるか、または異なるベクター上で別個に同時発現される。選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、当該分野で周知であるように、非形質転換および復帰変異体細胞を淘汰するために関連抗生物質を培地に添加し得る。発酵本明細書で使用する場合、発酵という用語は、文字通りの発酵が利用される実施形態および他の非発酵培養方式が利用される実施形態の両方を含む。発酵は、任意のスケールで実施され得る。1つの実施形態において、発酵培地は富栄養培地、最少培地、無機塩培地から選択される;富栄養培地が使用され得るが、好ましくは回避される。別の実施形態では、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。なお別の実施形態において、最少培地が選択される。また別の実施形態において、無機塩培地が選択される。無機塩培地が特に特別である。原栄養可能prototrophicenabling酵素をコードする核酸構築物による宿主細胞の形質転換の前に、宿主細胞を、栄養要求株を補完する補助代謝産物、またはその類似体を含む培地中に維持し得る。形質転換の後に、宿主細胞を宿主細胞が栄養要求性である補助代謝産物の欠乏した培地で培養し得る。このようにして、原栄養性を可能にする選択マーカーを含有しない宿主細胞は淘汰される。同様に抗生物質耐性選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターから組換えタンパク質を発現する細胞を、形質転換の前に選択のために、関連抗生物質が欠乏した培地上に維持し得る。形質転換後および発酵の間に、非形質転換および復帰変異体細胞を淘汰するために、抗生物質を当該分野で公知の濃度で培地に添加し得る。無機塩培地は、無機塩および炭素源、例えば、グルコース、スクロース、またはグリセロールから成る。無機塩培地の例は、例えば、M9培地、シュードモナスPseudomonas培地ATCC179、DavisandMingioli培地BDDavisESMingioliinJBact601728を参照を含む。無機塩培地を作製するのに使用する無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウム、および微量無機物、例えば、塩化カルシウム、ホウ酸塩、および鉄、銅、マンガン、および亜鉛の硫酸塩から選択されるものを含む。有機窒素源、例えば、ペントン、トリプトン、アミノ酸、または酵母抽出物は、無機塩培地には含まれていない。代わりに無機窒素源が使用され、例えば、アンモニウム塩、水性アンモニア、およびガス状アンモニアから選択され得る。特定の無機塩培地は、グルコースを炭素源として含有する。無機塩培地と比較すると、最少培地は無機塩および炭素源も含有し得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分を、これらは最小限のレベルで添加されるが添加し得る。1つの実施形態において、培地は以下の表16に挙げた成分を使用して調製され得る。成分は以下の順序で添加され得る:最初にNH4HPO4、KH2PO4およびクエン酸を蒸留水約30リットルに溶解させ得る;次に微量元素の溶液を添加して、消泡剤、例えば、UcolubN115の添加を続ける。次に加熱滅菌例えば、約121°Cにての後、グルコースMgSO4およびチアミン-HCLの滅菌溶液を添加され得る。約6.8でのpHの制御は、水性アンモニアを使用して実施され得る。次に滅菌蒸留水を添加して、371マイナスグリコールストック123mLの初期体積まで調整する。化学薬品は、種々の供給者、たとえMerckから入手され得る。この培地は、シュードモナスPseudomonas種および関連細菌の増殖のための高細胞密度培養HCDCを可能にし得る。HCDCは、バッチプロセスとして開始可能であり、2相バッチ供給培養が続く。バッチ部の制限されない増殖の後、増殖は、低下した比増殖速度にて、バイオマス濃度が数倍上昇可能である3倍増時間の期間に渡って制御され得る。そのような培養プロセスのさらなる詳細は、RiesenbergDSchulzVKnorreWAPohlHDKorzDSandersEARossADeckwerWDHighcelldensitycultivationofEscherichiacoliatcontrolledspecificgrowthrateJBiotechnol201727によって記載されている。本発明による発現系は、いずれの発酵形式でも培養され得る。例えば、本明細書では、バッチ、供給バッチ、半連続、および連続発酵方式が利用され得る。本発明による発現系は、いずれの発酵スケール例えば、体積でも導入遺伝子発現に有用である。したがって、例えば、マイクロリットルスケール、センチリットルスケール、およびデシリットルスケール発酵体積が使用され得る;そして1リットルスケールおよびそれ以上の発酵体積が使用され得る。1つの実施形態において、発酵体積は、1リットルまたはそれ以上となる。別の実施形態において、発酵体積は約5リットル、10リットル、15リットル、20リットル、25リットル、50リットル、75リットル、100リットル、200リットル、500リットル、1,000リットル、2000リットル、5,000リットル、10,000リットルあるいは50,000リットルまたはそれ以上となる。本発明において、形質転換宿主細胞の増殖、培養、および/または発酵は、宿主細胞の生存を可能にする温度範囲、好ましくは約4°C~約55°Cその温度を含むの範囲内の温度で実施される。細胞密度組換えタンパク質の発現で蛍光菌Pseudomonasfluorescensを使用するさらなる利点には、大腸菌Ecoliまたは他の細胞発現系と比較して、高い細胞密度で増殖する蛍光菌Pseudomonasfluorescensの能力が含まれる。このために、本発明による蛍光菌Pseudomonasfluorescens発現系は、約20g/Lまたはそれ以上の細胞密度を供給し得る。本発明による蛍光菌Pseudomonasfluorescens発現系は同様に、容量当たりのバイオマスによって示すように、少なくとも約70g/Lの細胞密度を提供することが可能であり、バイオマスは、乾燥細胞重量として測定される。1つの実施形態において、細胞密度は、少なくとも20g/Lである。別の実施形態において、細胞密度は少なくとも25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、または少なくとも150g/Lである。別の実施形態において、誘導時の細胞密度は、20g/L~150g/L;20g/L~120g/L;20g/L~80g/L;25g/L~80g/L;30g/L~80g/L;35g/L~80g/L;40g/L~80g/L;45g/L~80g/L;50g/L~80g/L;50g/L~75g/L;50g/L~70g/L;40g/L~80g/Lである。組換えタンパク質の発現レベル本発明による発現系は、トランスジェニックポリペプチドを全細胞タンパク質tcp5~80のレベルで発現し得る。1つの実施形態において、発現レベルは、5、8、10、12、15、20、25、30,35、40、45、50、55、60、65、70、75、または80tcpまたはそれ以上である。単離および精製本発明によって生成された組換えタンパク質は、これに限定されるわけではないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取用電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーなどの物質を用いた選択的沈殿、免疫精製法、およびその他を含む、当該分野で周知の標準技術によって単離され、実質的に純粋になるまで精製される。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、ガンドを可逆的に融合し得る。適切なリガンドを用いると、タンパク質は精製カラムに選択的に吸着され、次に比較的純粋な形でカラムから遊離され得る。次に融合タンパク質は、酵素活性によって除去される。さらに、タンパク質は、免疫アフィニティカラムまたはNiNTAカラムを使用して精製され得る。一般技術はさらに、例えば、RScopesProteinPurificationPrinciplesandPracticeSpringerVerlagNYDeutscherGuidetoProteinPurificationAcademicPressUSPatNo4511503SRoeProteinPurificationTechniquesAPracticalApproachOxfordPressDBollagetalProteinMethodsWileyLisaIncAKPatraetalProteinExprPurif18p18292およびRMukhijaetalGene165p3036に記載されている。例えば、AusubeletalDeutscherGuidetoProteinPurificationMethodsinEnzymologyvol182およびこのシリーズの他の巻ColiganetalCurrentProtocolsinProteinScienceWileyGreeneNYおよびタンパク質精製製品の使用に関するメーカーの文献、例えば、PharmaciaPiscatawayNJまたはBio-RadRichmondCalifも参照。組換え技術との組合せは、適切なセグメントへの、例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去型配列を介して融合され得る同等物への融合を可能にする。例えば、HochuliChemischeIndustrie126970HochuliPurificationofRecombinantProteinswithMetalChelateAbsorbentinSetlowGeneticEngineeringPrincipleandMethods128798PlenumPressNYandCroweetalQIAexpressTheHighLevelExpressionProteinPurificationSystemQUIAGENIncChatsworthCalifも参照。発現タンパク質の検出は、当該分野で公知の方法によって実施され、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降を含む。組換え生成および発現酵素は、組換え細胞培養物から種々の方法によって回収および精製可能であり、例えば、高速液体クロマトグラフィーHPLCは、必要に応じて最終精製ステップで利用され得る。本発明で発現されるあるタンパク質は、不溶性凝集体封入体を形成する。複数のプロトコルが封入体からのタンパク質の精製に適している。例えば、封入体の精製は、典型的には、宿主細胞の破壊によって、例えば、50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、1mMDTT、0.1mMATP、および1mMPMSFの緩衝液中でのインキュベーションによって、封入体の抽出、分離および/または精製を包含する。細胞懸濁物は、典型的には、フレンチプレスによって2~3継代を使用して溶解させる。細胞懸濁物は、PolytronBrinknanInstrumentsを使用してホモジナイズするか、または氷上で超音波処理され得る。細菌を溶解する代わりの方法は、当業者には明らかである例えば、SambrooketalsupraAusubeletalsupraを参照。必要ならば封入体は溶解させることが可能であり、典型的には、溶解された細胞懸濁物を遠心分離にかけて望ましくない不溶性物質を除去する。封入体を形成するタンパク質は、適合性緩衝液を用いた希釈または透析によって復元され得る。適切な溶媒は、これに限定されるわけではないが、尿素約4M~約8M、ホルムアミド少なくとも約80、体積/体積ベース、およびグアニジンヒドロクロライド約4M~約8Mを含む。グアニジンヒドロクロライドおよび同様の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的であり、変性は変性剤の除去例えば、透析によるまたは希釈時に起こり、免疫および/または生物活性タンパク質の再生成を可能にする。他の適切な緩衝液は当業者に公知である。あるいは、宿主周辺質からの組換えタンパク質またはペプチドを精製することが可能である。宿主細胞の溶解後、組換えタンパク質が宿主細胞の周辺質に搬出されるときに、細菌の周辺質画分を、当業者に公知の他の方法に加え、低温浸透圧衝撃によって単離し得る。例えば、周辺質から組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを作製し得る。ペレットは、20スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁させ得る。細胞を溶解させるために、細菌を遠心分離することが可能であり、ペレットを氷冷5mMMgSO4に再懸濁させて、氷浴で約10分間保持し得る。細胞懸濁物を遠心分離して、上澄みをデカンテーションして、保存し得る。上澄み中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。初期塩画分は、望ましくない宿主細胞タンパク質または細胞培養培地に由来するタンパク質の多くを目的の組換えタンパク質から分離し得る。1つのそのような例は、硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次にタンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性になればなるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度でより沈殿しやすくなる。代表的なプロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が20~30となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することを含む。この濃度は、最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次に沈殿物を廃棄して目的のタンパク質が疎水性でない限り、硫酸アンモニウムを、目的のタンパク質を沈殿させることが公知である喉まで上澄みに添加する。次に沈殿物を緩衝液に可溶化させて、過剰な塩を必要に応じて透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって除去する。タンパク質の溶解度に依存する他の方法、例えば、冷エタノール沈殿は、当業者に周知であり、複合タンパク質混合物を分画するために使用され得る。組換えタンパク質の分子量は、種々の孔径の膜例えば、AmiconまたはMillipore膜を通じた限外濾過を通じて、それをより大きいまたはより小さいサイズのタンパク質から単離するために使用され得る。第1のステップとして、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔径を備えた膜を通じて濾過し得る。次に限外濾過の保持液を目的のタンパク質の分子量よりも大きい分子カットオフを備えた膜に対して限外濾過し得る。組換えタンパク質は、膜を通じて濾液中へ通過する。次に濾液を以下で記載するようにクロマトグラフにかけ得る。組換えタンパク質は、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドへの親和性に基づいて、他のタンパク質から分離し得る。さらに、タンパク質に対して産生された抗体は、カラムマトリクスおよび免疫精製されたタンパク質に結合し得る。これらの方法すべては、当該分野で周知である。クロマトグラフ技術がいずれのスケールでも、多くの種々メーカー例えば、PharmaciaBiotechからの機器を使用して実施し得ることは、当業者に明らかとなる。復元および再折畳み不溶性タンパク質は、2級または3級タンパク質構造配座を生成するために復元または再折畳みし得る。組換え産物の形態を完成させるために、タンパク質再折畳みステップを必要に応じて使用し得る。再折畳みおよび復元は、タンパク質の解離/会合を促進するために、当該分野で公知の薬剤を使用して実施され得る。例えば、タンパク質は、チオスレイトールを用いてインキュベートすることが可能であり、酸化グルタチオンジナトリウム塩によるインキュベーションが続き、再折畳み剤、例えば、尿素を含有する緩衝液によるインキュベーションが続く。組換えタンパク質も、例えば、それをホスフェート緩衝食塩水PBSまたは50mMNa-アセテート、pH6緩衝液プラス200mMNaClに対して透析することによって復元され得る。あるいは、タンパク質を再折畳みして、同時にプロテアーゼインヒビタを含有する500mMNaCl、20グリセロール、20mMTris/HClpH7.4中の直鎖6M~1M尿素勾配を使用して、カラム、例えば、NiNTAカラムに固定化し得る。復元は、1.5時間またはそれ以上の期間に渡って実施され得る。復元後、タンパク質は、250mMイミダゾールの添加によって溶離され得る。イミダゾールは、PBSまたは50mMナトリウムアセテート、pH6緩衝液プラス200mMNaClに対する最終透析ステップによって除去され得る。精製タンパク質は、4°Cにて保管または-80°Cにて凍結され得る。他の方法は、MHLeeetalProteinExprPurif25p16673WKChoetalJBiotechnology77p16978AusubeletalDeutscherGuidetoProteinPurificationMethodsinEnzymologyvol182andothervolumesinthisseriesColiganetalCurrentProtocolsinProteinScienceWileyGreeneNYSRoeProteinPurificationTechniquesAPracticalApproachOxfordPressDBollagetalProteinMethodsWileyLisaIncに記載されているものを含む。VI.組換えポリペプチド本発明は、細菌発現系における改良されたタンパク質生成法を提供する。本発明で使用され得る組換えポリペプチドの例は、原核および真核生物に由来するポリペプチドを含む。そのような生物は、原生生物、菌類、植物、および動物界からの生物を含む、古細菌、細菌、真核生物ドメインからの生物が挙げられる。本発明で利用され得るタンパク質の種類は、非制限的な例であるが、例えば、生細胞の数千の化学反応の触媒に関与する酵素;構造または支持タンパク質の重要な型であるケラチン、エラスチン、およびコラーゲン;ヘモグロビンおよび他の気体運搬タンパク質;オボアルブミン、カゼイン、および他の栄養分子;免疫系の分子である抗体;代謝を調節するタンパク質ホルモン;および機械的作業を遂行するタンパク質例えば、収縮筋タンパク質であるアクチンおよびミオシンが挙げられる。他の特定の非制限的なポリペプチドは、分子、例えば、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモンである、レニン;ウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ1-抗トリプシン;インスリンA鎖;インスリンB鎖;プロインスリン;トロンボポイエチン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;凝固因子例えば、因子VIIIC、因子IX、組織因子、およびvonWillebrands因子;抗凝固因子例えば、プロテインC;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;プラスミノゲンアクチベータ例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノゲンアクチベータt-PA;ボンベシン;トロンビン;造血増殖因子;腫瘍壊死因子-アルファおよび-ベータ;エンケファリナーゼ;血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン;ミュラー阻害物質;レラキシンA鎖;レラキシンB鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;細菌性タンパク質、例えば、ベータラクタマーゼ;Dnase;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子VEGF;ホルモンまたは増殖因子のレセプタ;インテグリン;プロテインAまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子例えば、脳由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3、-4、-5、または-6NT-3、NT-4、NT-5、またはNT-6、あるいは神経増殖因子例えば、NGF-ベータ;カルジオトロピン心臓肥大因子例えば、カルジオトロピン-1CT1;血小板由来増殖因子PDGF;線維芽細胞増殖因子例えば、aFGFおよびbFGF;上皮増殖因子EGF;形質転換増殖因子TGF例えば、TGF-アルファおよびTGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、またはTGF-ベータ5を含む、TGF-ベータ;インスリン様増殖因子-Iおよび-IIIGF-IおよびIF-II;des1-3-IGF-I脳IGF-I、インスリン様増殖因子結合タンパク質;CDタンパク質例えば、CD-3、CD-4、CD-8、およびCD-19;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質BMP;インターフェロン、例えば、インターフェロン-アルファ、-ベータ、および-ガンマ;コロニー刺激因子CSF例えば、M-CSF、GM-CSF、およびG-CSF;インターロイキンILs例えば、IL-1~IL-10;抗HER-2抗体;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプタ;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウィルス抗体、例えば、AIDSエンベロープの部分;輸送タンパク質;ホーミングレセプタ;アドレシン;調節タンパク質;抗体;および上に挙げたポリペプチドのいずれかの断片を含む。本発明に従って発現される組換えペプチドは、標的ポリペプチドコード配列が転写および翻訳調節要素に作動可能に結合され、宿主細胞がタンパク質またはペプチドを発現し得る機能性遺伝子を形成するポリヌクレオチドから発現されることが可能である。コード配列は、利用可能な場合には標的ポリペプチドの天然のコード配列でありうるが、より好ましくは、選択した発現宿主細胞で使用するために選択、改良または最適化されたコード配列となる:例えば、シュードモナスPseudomonas種、例えば、蛍光菌Pseudomonasfluorescensのコドン使用バイアスcodonusebiasを反映するために遺伝子を合成することによる。生じる遺伝子は、1つまたはそれ以上のベクター内で作製されるか、1つまたはそれ以上のベクター内に挿入され、次に発現宿主細胞に形質転換される。発現可能な形態で供給されると記載された核酸またはポリヌクレオチドは、選択した細菌発現宿主細胞によって発現させ得る少なくとも1つの遺伝子を含有する核酸またはポリヌクレオチドを意味する。分子遺伝学および遺伝子工学技術に必要な広範囲に渡る配列情報は、幅広く公に入手され得る。ヒトと同様に哺乳類のヌクレオチド配列、遺伝子、cDNA配列、アミノ酸配列およびゲノムの入手は、GenBankからURLアドレスhttpwwwncbinlmmihgovEntrezにて達成され得る。追加情報も、WeizmannInstituteofScienceGenomeandBioinformaticshttpbioinformaticsweizmannacilcardsによる、遺伝子およびその産物に関する情報ならびに生物医学用途を統合する電子百科事典であるGeneCardsから得られ、ヌクレオチド配列情報も、EMBLヌクレオチド配列データベースhttpwwwebiacukemblまたはDNADatabankofJapanの手順に従って作製したエレクトロコンピテント蛍光菌Pfluorescens細胞を、精製プラスミド0.5μgを用いて形質転換した。形質転換体は、カナマイシン50μg/mLを含むLB培地で平板培養することによって選択した。このプラスミドは、蛍光菌Pfluorescens内で複製できず、したがってカナマイシン耐性コロニーは、染色体に組み込まれるプラスミドから生じる。プラスミドの組み込み部位は、HOTSTARTAQポリメラーゼおよびプライマーpryana1FおよびM13F~40を使用して、57°Cでのアニーリングおよび伸長時間4分間でPCRによって解析した。10個の単離体のうち1個MB101::pDOW1215-7が下流領域へのpDOW1215-7の挿入を含有し2.8kb解析産物、残りの9個は上流領域であった2.1kb解析産物。第2に、相同領域間の組換えによって組み込みプラスミドを失った菌株を同定するために、以下の解析PCR手順を使用した:単一のコロニーからのMB101::pDOW1215-72を250mMウラシルを添加したLBに接種して、一晩増殖させて、次にLBウラシルおよび500μg/mL5-フルオロオロチン酸5-FOA-ZymoResearch、オレンジ、カリフォルニア州上で平板培養した。8個のコロニーを、57°Cでのアニーリングおよび伸長4分で、HOTSTARTAQならびにプライマーpyrana1Fおよびpyrana1Rを用いてPCRによって解析した。親MB101からの増幅産物の予想サイズは3.2kBであり、pyrF遺伝子が欠失している場合には、2.5kbであった。各コロニーは、pyrFの欠失から予想された2.5kBバンドを発生させた。第1の3つの単離体を精製して、PFG116、PFG117、およびPFG118DC36としても公知と命名した。3つの単離体は、pyrF欠失から予想される表現型を示し、すなわちそれらはカナマイシンに感受性であり、ウラシルは増殖に必要であり、それらは5-FOAに対して耐性である。PFG118のDNA配列は、pDOW1215-7内の増幅領域の配列と同じであった;すなわち、pyrFからすぐ下流のステムループ構造内の3つの変異が、pyrF欠失に沿ってPFG118ゲノム内に包含される。蛍光菌Pfluorescens発現系における選択マーカーとしてのpyrF遺伝子の使用pyrF遺伝子が選択マーカーとして作用する能力は、tacプロモーターの制御下で既存のテトラサイクリン耐性マーカーおよび標的酵素コード配列の両方を含有するpMYC発現プラスミド内へクローニングすることによって試験した。このために、プラスミドpMYC5088を、ウシ血清アルブミンBSANewEnglandBiolabsより、ビバリー、マサチューセッツ州のNEB緩衝液4および0.1mg/mLを使用して、反応物50uL中でSnaBIを用いて37°Cにて2時間消化した。次に反応混合物を70°Cにて20分間処理して酵素を不活性化し、次に上記のようにゲル精製した。SnaBI消化pMYC508860ngは、FASTLINKDNAライゲーションキットEpicentreTechnologies、マジソン、ウィスコンシン州を使用して、MB214pyrF1-MB214pyrR1PCR産物50ngに連結させた。25°Cでの1時間後、混合物を70°Cにて20分間処理することによって、反応を停止させた。次に結果は、メーカーが推奨する条件を使用して、ケミカルコンピテントJM109大腸菌Ecoli細胞PromegaCorp、マジソン、ウィスコンシン州に形質転換した。形質転換体は、テトラサイクリンを15μg/mLでを含有するLB培地上で選択した。プラスミドDNAをQiaPrepSpinMiniprepKitQiagen、バレンシア、カリフォルニア州を使用して12個の単離体から調製し、NotIおよびEcoRIを用いてスクリーニングして、このことは1個の単離体が所望のクローンpDOW1249-2を含むことを示した図2。プラスミドpDOW1249-2を、lacIリプレッサー発現カセットおよびカナマイシン耐性マーカー遺伝子を含有するpCNプラスミドを含有するpyrF-蛍光菌Pfluorescens内へ形質転換した。単離体を振とうフラスコおよび20L発酵槽内で試験した。DOW1249-2プラスミドへの選択圧のみがプラスミドのpyrF遺伝子が染色体内のpyrF欠失を補完する能力によって供給されるように、単離体をテトラサイクリンを含まない、最小塩培地およびカナマイシン中で培養した。SDS-PAGE解析によって決定されるように、振盪フラスコ試験で新しい菌株によって産生された標的タンパク質の量は、pDOW1249-2内のpyrF遺伝子の非存在を除いて、対照菌株である、同じ2つのプラスミドを含有するゲノムpyrF蛍光菌Pfluorescens対照系の量と同様であり、同じであるが、プラスミドを維持するためにテトラサイクリンをさらに添加した培地上で増殖したデータは示さず。20Lスケールでのさらなる解析のために、2つの菌株をSDS-PAGEゲルで見られた標的タンパク質の量および振とうフラスコ内でのOD575値に基づいて選択した。両方の菌株が、対照菌株で見られる正常範囲内の標的タンパク質の蓄積レベルを示した図1。蛍光菌Pfluorescens宿主細胞発現系におけるpyrFproCデュアル栄養要求性選択マーカー系の作製本明細書で使用したオリゴヌクレオチドproC15’-ATATGAGCTCCGACCTTGAGTCGGCCATTG-3’配列番号22proC25’-ATATGAGCTCGGATCCAGTACGATCAGCAGGTACAG-3’配列番号23proC35’-AGCAACACGCGTATTGCCTT-3’配列番号24proC55’-GCCCTTGAGTTGGCACTTCATCG-3’配列番号255’-GATAAACGCGAAGATCGGCGAGATA-3’配列番号26proC75’-CCGAGCATGTTTGATTAGACAGGTCCTTATTTCGA-3’配列番号27proC85’-TGCAACGTGACGCAAGCAGCATCCA-3’配列番号28proC95’-GGAACGATCAGCACAAGCCATGCTA-3’配列番号29genF25’-ATATGAGCTCTGCCGTGATCGAAATCCAGA-3’配列番号30genR25’-ATATGGATCCCGGCGTTGTGACAATTTACC-3’配列番号31XbaNotDraU2リンカー5’-TCTAGAGCGGCCGCGTT-3’配列番号32XbaNotDraLリンカー5’-GCGGCCGCTCTAGAAAC-3’配列番号33蛍光菌PfluorescensからのproCのクローニングおよびproCを含有するpCN発現プラスミドの作製proCを含むpCN51lacIへの抗生物質耐性遺伝子の配置proCORFおよび隣接する上流および下流配列の約100bpをMB101ゲノムDNAから、proC1およびproC2を使用して、アニーリング温度56°Cおよび伸長1分間で増幅させた。1kB産物のゲル精製およびSacIを用いた消化の後、断片をSacI消化dpDOW1243ポリリンカーの添加およびkanRのゲンタマイシン耐性遺伝子との置換による、pCN51lacIに由来するプラスミド内へクローニングして、pDOW1264-2を作製した。このプラスミドをproC-ミュータント株PFG932内で、pDOW1249-2からのアミラーゼ合成を調節するその能力について試験した。20Lスケールでの発現標的酵素産生レベルは、デュアル抗生物質耐性マーカー対照菌株DC88のレベルと同様であったデータは示さず。次にgenR抗生物質マーカー遺伝子はpDOW1264-2図3から除去して、proCおよびlacIを持つ、抗生物質マーカーを含まないプラスミドを作製した。genR遺伝子の除去は、pDOW1264-2のBamHIによる制限消化、6.1kB断片の精製、それ自体への連結、およびproC-蛍光菌Pfluorescens宿主PFG1016内への電気泳動によって実施される。単離体は、EcoRIを使用した制限消化によって確認した。得られたプラスミドをpDOW1306-6と命名した。EcoRIを用いた分析制限消化およびBamHI接合部に渡る配列決定は、プラスミドの同一性およびその中の遺伝子の適正な定位を裏付けた。配列決定は、ザダウケミカルカンパニーTheDowChemicalCompanyが実施した。proC配列は、配列番号4内に示される。抗生物質耐性マーカーの代わりにpyrFマーカーを含有する標的酵素発現プラスミドの作製tacプロモーター制御下の標的酵素コード遺伝子を含有する抗生物質マーカーを含まない生成プラスミド、pDOW1269-2を、tetR/tetA遺伝子を除去するためにPvuIを用いたpDOW1249-2の制限消化によって作製した。MB214からのpyrF遺伝子の挿入によりpMYC5088に由来するpDOW1249-2は、実施例1で記載するように作製した。10.6kBPvuI断片をゲル精製して、それ自体に連結させて、電気穿孔によってPFG118/pCN51lacIへ形質転換させて、pCN51lacIを維持するためにカナマイシンを含有するM9グルコース培地上に広げた。プラスミドDNAを単離して、NcoIを用いて解析制限消化を実施した;2つの単離体は、予想されたバンドと一致する制限消化を示した。どちらの単離体もPvul接合部に渡って配列決定し、そのことはプラスミドの同一性およびその中の遺伝子の適正な定位を裏付けた。pyrFおよびproCのゲノム欠失による蛍光菌Pseudomonasfluorescens菌株の作製pyrFが欠失した蛍光菌PfluorescensMB101菌株であるPFG118は、実施例1で記載した。遺伝子交換および欠失のためのベクター、pDOW1261-2の作製ベクターpDOW1261-2は、以下の特性を組み合せることによって、クロスイン/クロスアウト法Toder1994Davison2002によるマーカー交換を使用して、ゲノムDNAの清浄な欠失を作製するように設計された:大腸菌Ecoliのみで機能し、蛍光菌Pfluorescensでは機能しないColEI複製起点;プラスミドの染色体内への組み込みのための選択マーカーtetR/tetA;挿入プラスミドの消失の選択を可能にする対抗選択マーカーpyrF宿主菌株がpyrFである限り;pyrF遺伝子を失った細胞は、5-FOAに対して耐性である;一般的でない8bp認識部位を有する平滑末端クローニング部位SrfI-所望のインサートが該部位を欠く場合、インサートなしで連結するベクターを再開裂させるためにSrfIStratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州を連結反応に添加することによって挿入の効率を上昇させ得る。このベクターを作製するために、tetR、tetA、およびpyrF遺伝子を含有する5kBPstI-EcoRI断片を、PstIおよびEcoRIによって消化されたpCRScriptCAMStratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州内にクローニングして、pDOW12612を作製した。proCを染色体から欠失させるベクターの作製proCの欠失を作製するために、proC遺伝子の上流および下流のフランキング領域のコピーをPCRによって連結して、次にpDOW1261-2遺伝子置換ベクター内にクローニングした。ATG開始コドンからTAG停止コドンまでのコード配列全体を欠失させるために、proCORFを架橋するproC7プライマーが設計された。停止コドンの下流のさらなる16bpも欠失に含めた。proCから上流および下流の領域のPCR融合物を作製するために、PCR増幅のメガプライマー法を使用したBarik1997。メガプライマーを作製するために、proC読み取り枠のすぐ上流の0.5kB領域を、プライマーproC5およびproC7を使用して、MB214ゲノムDNAからPCRによって増幅した。プライマーproC7は、proCORFの上流および下流の領域と重複する。ポリメラーゼ連鎖反応は、ベンダーが推奨する緩衝液中でプライマー1uM、4つのdNTP各200uM、およびHerculaseハイフィディリティポリメラーゼStratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州を用いて実施した。Herculaseは、平滑末端を残す、ほとんどPfuポリメラーゼより成るハイフィディリティ酵素である。増幅プログラムは、95°Cにて2分、kB当たり95°Cにて30秒、50°Cにて50°C、および72°Cにて1分の30サイクル、続いて72°Cにて10分であった。増幅産物は、TBE中での1アガロースゲル電気泳動によって分離して、チジウムブロミドを使用して描出した。DNAを含有するゲルスライスをゲルから切り出して、上記のように精製した。proC遺伝子から下流の1.3kB領域は、プライマーproC3およびproC6を使用して増幅され、続いての反応のテンプレートとして作用した。60°Cのアニーリング温度を除いて、同じ増幅プロトコルを使用した。反応物はアガロースゲル上で確認し、StrataPrepPCR精製キットStratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州を使用して精製した。欠失融合物を作製する第2のステップにおいて、proC6と共に、そしてテンプレートとしてのproC3-proC6PCR反応物と共に、メガプライマーをPCR反応におけるプライマーの1つとして使用した。61°Cのアニーリング温度および2分間の伸長時間を使用した。1kBPCR産物を精製し、SrfIによって消化された自殺ベクターpDOW1261-2に平滑末端連結させた。ベクターの再ライゲーションによって引き起こされたバックグラウンドを低下させるために、メーカーからの説明書pCRScriptCamクローニングキット-Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア州に従って、SrfIをライゲーションに含めた。ライゲーションを電気穿孔DH102mMギャップキュベット、25μF、2.25kV、200オームによって、DH10βGibcoBRLLifeTechnologies、現在はInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州に形質転換させてArtiguenaveetal1997、DraIII制限酵素を使用して単離体をスクリーニングした。それぞれの単離体のPCR増幅領域はザダウケミカルカンパニーTheDowChemicalCompanyが配列決定した;単離体pDOW1305-6は、正しいゲノムDNA配列を含有しているとして検証された。蛍光菌PfluorescenspyrF-proC二重欠失の作製二重欠失菌株を作製するために、PFG118をpDOW1305-6を用いて上記のように電気穿孔によって形質転換した。HotStarTaqQiagen、バレンシア、カリフォルニア州、アニーリング温度59°Cおよび伸長時間4分間を用いた、プライマーproC8およびM13/pUC逆配列決定プライマーReverseSequencingPrimer-48プラスミドのみにハイブリダイズするNewEnglandBiolabs、ビバリー、マサチューセッツ州を含むコロニーに対する解析PCRは、22個の単離体のうち9個がproCの上流の領域に組み込まれたプラスミドを有し、22個のうち7個が下流に組み込まれたプラスミドを有することを示したデータは示さず。各定位のうち3つを1個のコロニーまで精製した。3つの単離体PFG118::1305-6.1、-6.8、-6.10は、上流の領域に挿入を有し、3つの単離体PFG118::1305-6.2、-6.3、-6.9は、下流の領域に挿入を有する。プラスミドと染色体遺伝子との間で相同組換えを実施して、それにより欠失を残す細胞を選択するために、PFG118::1305-6.1および-6.2をウラシルおよびプロリン添加を含むLB50mL中で静止期まで増殖させ、次にウラシルおよびプロリン添加を含むLB-5-FOA上で平板培養した。組み込まれたプラスミドを組換えによって失う細胞は、pyrF遺伝子も失い、したがってそうでなければ毒性化合物に変換される5FOAに対して耐性であることが予想される。プラスミドを失って、元の配列を再生させた細胞と、欠失を残した細胞とを区別するために、proC8およびproC9を用いたPCR解析を実施した。予想された1.3kBを有する2つの単離体を2つの選択物からそれぞれ選択して、PFG1013、PFG1014、PFG1015およびPFG1016DC164としても公知と命名した。4つの単離体はすべて、プロリンおよびウラシルが添加されない限りM9グルコース上で増殖することができず、テトラサイクリン感受性であった。PFG118野生型proCおよびPFG1016proC欠失のゲノム領域をPCRプライマーproC8およびproC9、HotStarTaqポリメラーゼ、アニーリング63°Cおよび伸長3分によって増幅して、配列した。菌株PFG101のproC5とproC6との間の領域は、予想された835bp欠失を除いて、親と同一であった。デュアル栄養要求性選択マーカー発現系PFG1016/pDOW1306-6pDOW1269-2の作製プラスミドを菌株PFG118pCN51lacIpDOW1269-2からHISPEEDPlasmidMidiキットQiagen、バレンシア、カリフォルニア州によって単離した。pDOW1269-2をpCN51lacIからアガロース電気泳動によって部分的に精製して、次にPFG1016pDOW1306-6内へ電気穿孔した。形質転換体を添加物なしのM9/グルコース上で選択した。pDOW1269-2調製物を汚染するpCN51lacIの一部が細胞内へ同時形質転換される可能性もあるため、各形質転換からの3つの単離体を、pCN51lacIに保持されている抗生物質マーカーであるカナマイシンへの感受性について試験した;6つすべてが感受性であることが見出された。標的酵素活性の試験では、6つの菌株すべてが標的酵素を発現することが見出された。PCR解析は、6つすべてが染色体proC欠失を含有することを示した。形質転換体から単離したプラスミドの制限消化は、予想したパターンと一致した。振とうフラスコでのデュアル栄養要求性マーカー発現系の性能試験次に、6つの菌株を実施例1で記載したように振とうフラスコ内で試験した。標的酵素発現の誘導は、IPTGの添加により26時間にて開始した。6つすべての菌株のOD575は、デュアル抗生物質耐性マーカー発現系対照DC88のOD575と匹敵していた。6つすべての標的酵素産生レベルも、SDS-PAGEによって評価されるように、対照の産生レベルに匹敵していた。さらなるキャラクタリゼーションのために、最高のOD575を達成した2つの菌株である、菌株1046および1048を選択した。デュアル栄養要求性マーカー発現系の20Lバイオリアクターでの性能試験続いて、菌株1046および1048を20Lバイオリアクターで試験した。標的酵素発現の誘導は、IPTGの添加により26時間にて開始した。両方の菌株が、OD575および標的酵素活性の両方について、DC88対照菌株の正常範囲内のレベルを達成した。これらの2つの菌株の性能平均を図1に示す。播種段階および26時間の誘導開始の直前にに採取したサンプルから調製したプラスミドの制限消化は、予想と一致したパターンを示した。同じサンプルに実施したゲノムDNAの解析PCRは、proC欠失およびpyrF欠失の保持を示した。25時間サンプルの分割量をテトラサイクリン-、ゲンタマイシン、またはカナマイシン-添加培地上で平板培養した;細胞増殖は観察されず、したがって抗生物質耐性遺伝子活性の非存在が確認された。20Lバイオリアクターでの菌株1046DC167としても公知の解析は、同様の結果で2回反復した。播種段階および発酵の25時間後誘導の直前におけるプラスミド安定性は、希釈して完全培地で平板培養したサンプルからのレプリカ平板法によって試験した。どちらのプラスミドも検査したコロニーの97超に存在し、プラスミドなしで生存し得る栄養共生復帰変異体の欠如および蛍光菌Pseudomonasfluorescens内での発現ベクターの安定的維持が示された。結果pyrF発現系のどちらも、抗生物質耐性マーカーのみが使用される対照系図1と同様に作用した。対照菌株では、溶解細胞からの外来性代謝産物の移入が培地中の抗生物質から供給された選択圧を低減または除去しないため、栄養共生の負の影響はなかった。2つのpyrF発現系に対する栄養共生の結果として予想された、性能の予想される低下は驚くべきことに観察されなかった。蛍光菌PfluorescensでのlacI、lacIQおよびlacIQ1の染色体組み込み染色体に組み込まれた3つの異なるdifferentエシェリキアコリlacI対立遺伝子、lacI配列番号9、lacIQ配列番号11、およびlacIQ1配列番号12のうちの1つをそれぞれ用いて、3つの蛍光菌Pfluorescens菌株を作製した。3つの菌株は、LacIリプレッサー蓄積の異なる量を示した。各菌株は、そのlacI遺伝子の1個のコピーを、上記のようにそのpyrF遺伝子を欠失させることによって形成されたMB101誘導体TDLandryetalSafetyevaluationofanαamylaseenzymepreparationderivedfromthearchaealorderThermococcalesasexpressedinPseudonaonasfluorescensbiovarIRegulatorToxicologyandPharraacology37149168を参照である、蛍光菌PfluorescensDC36のレバンスクラーゼ位置配列番号13に保持している。ベクターまたは他のDNA配列は、菌株内に残っていない。菌株は抗生物質耐性遺伝子を含まず、pyrF欠失も含み、ウラシル未添加培地での増殖中の、pyrF遺伝子を持つ発現プラスミドの維持を可能にする。タンパク質産生は、抗生物質耐性遺伝子および抗生物質を完全に含まない。MB214は、USPat5169760で記載されたlacI-lacZYA染色体インサートを含有する。MB214は、LacIリプレッサーの分子量に約10kDaを添加する、LacIタンパク質のC末端に重複も含有する。レバンスクラーゼ位置への遺伝子挿入のためのベクターpDOW1266-1の作製プラスミドpDOW1266-1を、レバンスクラーゼに関する蛍光菌Pfluorescens遺伝子の上流および中の領域配列番号13のPCR増幅によって作製し、メガプライマー方法を使用して開始コドンをXbaI部位で置換した、ABarikMutagenesisandGeneFusionbyMegaprimerPCRinBAWhitePCRCloningProtocols173182を参照。PCRは、HERCULASEポリメラーゼStratagene、マジソン、ウィスコンシン州、米国を使用して、プライマーLEV1配列番号34およびLEV2配列番号35、ならびに蛍光菌PfluorescensMB214ゲノムDNAをテンプレートとして使用して実施したオリゴヌクレオチド配列については以下を参照。プライマーLEV2配列番号35は、XbaI部位を挿入する配列を含有する。反応は、95°Cで2分間、[95°Cで30秒間、58°Cで30秒間、72°Cで1分間]の35サイクル、続いて72°Cで10分間で実施した。1kB産物をゲル精製して、次の反応でテンプレートとしてのMB214ゲノムDNAおよび伸長時間が2分間であることを除く同じ条件を使用して、LEV3配列番号36と共にプライマーの1つとして使用した。品質を向上させるために、2kB産物をゲル精製して、LEV2配列番号35およびLEV3配列番号36を用いて再増幅した。使用したオリゴヌクレオチドLEV1配列番号345’-TTCGAAGGGGTGCTTTTTCTAGAAGTAAGTCTCGTCCATGALEV2配列番号355’-CGCAAGGTCAGGTACAACACLEV3配列番号365’-TACCAGACCAGAGCCGTTCALEV7配列番号375’-CTACCCAGAACGAAGATCAGLEV8配列番号385’-GACTCAACTCAATGGTGCAGGBglXbaLacF配列番号395’-AGATCTCTAGAGAAGGCGAAGCGGCATGCATTTACGlacIR4配列番号405’-ATATTCTAGAGACAACTCGCGCTAACTTACATTAATTGCLacpro9配列番号415’-ATATTCTAGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGALacIQF配列番号425’-GCTCTAGAAGCGGCATGCATTTACGTTGACACCLacINXR配列番号435’-AGCTAGCTCTAGAAAGTTGGGTAACGCCAGGGTlacIQ1配列番号445’-AGTAAGCGGCCGCAGCGGCATGCATTTACGTTGACACCACCTTTCGCGGTATGGCATG以下のオリゴヌクレオチドは、解析配列決定のみに使用した。lacIF1配列番号455’-ACAATCTTCTCGCGCAACGClacIF2配列番号465’-ATGTTATATCCCGCCGTTAAlacIR1配列番号475’-CCGCTATCGGCTGAATTTGAlacIR2配列番号485’-TGTAATTCAGCTCCGCCATCSeqLev5AS配列番号495’-TATCGAGATGCTGCAGCCTCSeqLev3S配列番号505’-ACACCTTCACCTACGCCGACLEV10配列番号515’-TCTACTTCGCCTTGCTCGTTLEV2-LEV3増幅産物は、クロスアウトの選択を促進するために、蛍光菌PfluorescenspyrF遺伝子を選択マーカーとして含有する自殺ベクターであるpDOW1261-2のSrfI部位内にクローニングした。新しいプラスミドをpDOW1266-1と命名した。増幅領域を配列した。lacI遺伝子の挿入ベクターpDOW1266-1へのクローニング大腸菌EcolilacI遺伝子を、プライマーBglXbaLacF配列番号39およびlacIR4配列番号40を有するpCN51lacIから、HERCULASEポリメラーゼ62°Cでのアニーリングおよび2分間の伸長時間を使用して増幅した。ゲル精製およびXbaIを用いた消化の後、lacI遺伝子をpDOW1266-1のXbaI部位へクローニングして、pDOW1310を作製した。lacIQ遺伝子は、テンプレートとしてのpCN511acIを15のプライマーlacpro9配列番号41およびlacIR4配列番号40と共に使用して、HERCULASEポリメラーゼ62°Cでのアニーリングおよび2分間の伸長時間を使用して、PCR増幅によって作製した。ゲル精製およびXbaIを用いた消化の後、lacI遺伝子をpDOW1266-1のXbaI部位へクローニングして、pDOW1311を作製した。lacIQ1遺伝子は、プライマーlacIQ1配列番号44およびCVXR配列番号43を用いて大腸菌EcoliK12ATCC47076からのlacI遺伝子を増幅することによって作製し、pCR2.1TopoInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国内へクローニングして、pCR2-lacIQ1を作製した。lacIQ1遺伝子は、プライマーlacIQF配列番号42およびlacINXR配列番号43をHerculaseポリメラーゼ61°Cでのアニーリング、3分間の伸長時間、35サイクルと共に使用して、pCR2-lacIQ1から再増幅した。ゲル精製およびXbaIを用いた消化の後、PCR産物をpDOW1266-1のXbaI部位へクローニングして、pDOW1309を作製した。pCR2-lacIQ1内のPCR増幅インサートpDOW1310、pDOW1311、およびpDOW1309を配列決定してプライマーlacIF1配列番号45、lacIF2配列番号46、lacIR1配列番号47、lacIR2配列番号48、SeqLev5AS配列番号49、SeqLev3S配列番号50、およびLEV10配列番号51を使用して、PCR反応によって変異が導入されていないことを確認した。それぞれの場合で、lacIがレバンスクラーゼ遺伝子と同じ方向で転写される定位を選択した。レバンスクラーゼプロモータはlacIの転写を潜在的に制御され得るが、プロモーターは、使用した発酵条件では非存在であるスクロースの存在下のみで活性である。レバンスクラーゼ位置に組み込みlacI遺伝子を有する蛍光菌菌株の作製ベクターpDOW1309、pDOW1310、およびpDOW1311を電気穿孔によってDC36内に導入して、最初にベクターのテトラサイクリン耐性を持つゲノムへの組み込みに関して選択した。コロニーをスクリーニングして、ベクターがプライマーLEV7配列番号37およびM13RNewEnglandBiolabsより、グロスター、マサチューセッツ州、米国を用いたPCRによってレバンスクラーゼ位置に組み込まれたことを決定した。lacI遺伝子をゲノム内に残す第2のクロスオーバーに関して選択するために、単離体を5’-フルオロオロチン酸の存在下で、そしてテトラサイクリンの非存在下で増殖させた。ゲノム内の複製領域間の組換えは、親遺伝子型を復元するか、またはlacI遺伝子を残すかのいずれかである。生じた単離体は、ウラシルの非存在下で培養して、プライマーLEV7配列番号37およびLEV8配列番号38を用いたPCRによってテトラサイクリンに対する感受性についてスクリーニングした。新しい菌株の名称を表17に示す。ゲノム領域の配列情報を得るために、PCR産物を直接配列決定した、EWerleDirectsequencingofpolymerasechainreactionproductsLaboratoryMethodsfortheDetectionofMutationsandPolymorphismsinDNA163174を参照。各菌株では、配列決定がプロモーターの同一性、フランキング領域に対するlacI変異体の定位、および親配列に対する点変異の存在または非存在を確認した。DC202およびDC206の配列は予想通りであった。DC204の配列は、lacIQ下流の、レバンスクラーゼ読み取り枠内に点変異を示し、これはコード配列を変更せず、したがって重要度が低い。pCN51IacIと比較した、lacI組込み体におけるLacIの相対濃度の解析UnBlotは、ウェスタン解析と類似した方法であり、フィルタへ移動する必要なしにタンパク質がゲル中で検出される。該技術は、メーカーであるPierceBiotechnologyロックフォード、イリノイ州、米国の指示に従って実施した。UnBlotを使用した解析は、新しい組込み体菌株それぞれのLacIの量はMB214より多いことを示した。MB214は、USPat5169760で記載されたlacI-lacZYAインサートを含有する。lacIQおよびlacIQ1組込み体中のLacIの相対濃度は、lacIを含有する多コピープラスミドである、pCN51lacIを保持する菌株とほぼ同じであった。図5を参照。MB214、DC202lacI組込みおよびDC206lacI組込み中のLacI濃度の相対差をより正確に評価するために、希釈シリーズを実施した。MB101pCN51lacI、DC204およびDC206は、MB214の約100倍のLacIを有するのに対して、DC202は約5倍を有する。ニトリラーゼ発現および転写菌株DC140は、蛍光菌PfluorescensMB214内に、ニトリラーゼ遺伝子GDeSanthisetalJAmerChemSoc1251147677がPtacプロモータの制御下で挿入されたテトラサイクリン耐性広域宿主域プラスミドである、pMYC1803WO2003068926を導入することによって作製された。DC202およびDC206内の標的遺伝子のMB214による未誘導発現の調節を比較するために、同じニトリラーゼ遺伝子を、テトラサイクリン耐性遺伝子がpyrF選択マーカーによって置換されたpMYC1803誘導体へクローニングした。次に新しいプラスミドpDOW2415をDC202およびDC204内へそれぞれ電気穿孔した。DC140、DC239およびDC240を20L発酵槽内で、グルコースまたはグリセロールを添加した無機塩培地での増殖によって、最終的に約20g/L~70g/L超の乾燥細胞重量の範囲内のバイオマスを与える細胞密度まで培養したWO2003068926を参照。発現を誘導するために、Ptacプロモーターの無償性インデューサ、IPTGを添加した。DC140対DC239対DC240のプレインキュベーションニトリラーゼ活性の比は、6:2:1であった。同じサンプルのノザンブロットによるRNA解析は、抑制解除の同じランキングを明らかにした。濃度測定に基づいて、DC140:DC239:DC240の非誘導転写レベルの比は、2.4:1.4:1.0であった。0.3mMIPTGによる誘導30分間の直後、すべての菌株の転写レベルは同じであった。誘導後のニトリラーゼ生産性も同程度であった。このことは、使用したインデューサの濃度が、その異なるLacIタンパク質レベルにもかかわらず、これら3つの菌株においてPtacプロモーターを完全に誘導するのに十分であったことを示す。しかしながら最も抑制解除された菌株DC140の発酵は、誘導の約24時間後のニトリラーゼ活性の損失に伴う著しい細胞溶解を被った。改良された、より厳密に調節された菌株DC239およびDC240の誘導は、高いニトリラーゼ生産性を維持しながら誘導後48時間超まで延長可能であり、最終的な結果としてニトリラーゼ収率が2倍となった。図6を参照。結果実施例は、シュードモナスPseudomonadsにおける完全または切断Plac-lacI-lacZYAオペロンの一部として以外のLacIコード遺伝子の使用が、以前に教示したlacI-lacZYAシュードモナスPseudomonad染色体挿入米国特許第5,169,760号と比較して、プレインキュベーション組換えタンパク質発現の実質的に改良された抑制、商業スケール発酵でのより高い細胞密度、および所望の産物のより高い収率をもたらしたことを示している。結果は、lacI挿入が蛍光菌Pseudomonasfluorescens中でのLacIリプレッサータンパク質の産生にも有効であり、それによって細胞内にLacIリプレッサータンパク質をコードする独立したプラスミドを維持する必要がなくなり、そのような維持によって引き起こされる潜在的な産生非効率性が低減されることも示した。抗生物質を含まないことに加えて、DC239およびDC240での増殖段階中の抑制解除は、MB214菌株の10分の1未満までであった。DC239およびDC240のプレインキュベーションニトリラーゼ活性レベルは、13を超える独立した発酵で平均して0.4U/mlに達し、DC239およびDC240における細胞密度およびニトリラーゼ発現は、DC140のように延長された誘導期の間に低下しなかった。より高い抑制解除を与えると、DC239およびDC240発酵作業は、増殖期の時間を30超短縮して、発酵コストを低減させた。1個の最適なlacオペレーターを有する、および2個のlacオペレーターを有する、tacプロモーターの作製天然のtacプロモーターは、1個の天然のlacオペレーターAATTGTGAGCGGATAACAATTのみをO1位置図4に有する。第1の構築物pDOW1418において、天然のオペレーターをさらに対称なlacOidオペレーター配列5’-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3’配列番号14と置換したJRSadlerHSasmorandJLBetzPNAS1983Nov8067859。tacプロモーターおよび天然のlacO配列を含有する289bpHindIII/SpeI断片をpMYC1803誘導体のpDOW2118から除去して、対称lacOid配列を含有するSOEPCR増幅産物から単離したHindIII/SpeI断片によって置換した。SOEPCRプライマーRC-3およびRC-9は、最適化/対称lacO配列を産生した4つのヌクレオチド変化3個の塩基対置換および1個の塩基対欠失を包含していた。得られたプラスミドpDOW2201のHindIII/SpeIプロモーター断片をpMYC1803をベースとするニトリラーゼ発現プラスミド内へクローニングして、天然のtacプロモーターを置換してpDOW1414を生じさせた。次にこの発現カセットをpyrFプラスミドpDOW1269上へ移動して、DraI/XhoI断片を交換することによってpDOW1418を生じさせた。次にプラスミドpDOW1418を宿主菌株DC206に形質転換させて、菌株DC281を生じさせた図4を参照。使用したオリゴヌクレオチドRC-3配列番号525’-GTGAGCGCTCACAATTCCACACAGGAAAACAGRC-4配列番号535’-TTCGGGTGGAAGTCCAGGTAGTTGGCGGTGTARC-9配列番号545’-GAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCRC-10配列番号555’-ATTCAGCGCATGTTCAACGG第2の構築物pDOW1416において、lacOidオペレーター5’-AATTGTGAGCGCTCACAATT-3’配列番号14を既存の天然のlacO1の52ヌクレオチド上流5’にPCRによって挿入した。メガプライマー法を使用するプロモーター領域のPCR増幅は、pMYC1803誘導体のpMYC5088、ならびに以下のプライマーAKB-1およびAKB-2を第1段階として使用した。得られたPCR産物を同じテンプレートを使用する2回目のPCR増幅において、プライマーAKB-3と組み合せた。精製ならびにHindIIIおよびSpeIによる消化の後、デュアルオペレーターを含有するプロモーター断片をプラスミドpMYC5088HindIIIおよびSpeI部位内へクローニングして、pDOW1411を生じた。第2のオペレーターの導入は、独自のMfeI部位を最適オペレーターのすぐ上流に導入した。次にpDOW1411のプロモーター領域を持つXhoI/SpeIベクター断片をニトリラーゼ遺伝子を保持するpMYC1803誘導体の適合性断片に連結して、DOW1413を形成する。pDOW1413のMfeI/XhoI発現カセット断片の、pDOW1269の適合性ベクター断片への続いてのライゲーションは、pDOW1416を生じた;これをDC206へ形質転換すると、菌株DC262が形成された。使用したオリゴヌクレオチドAKB-1配列番号565’-ACGGTTCTGGCAAACAATTGTGAGCGCTCACAATTTATTCTGAAATGAGCAKB-2配列番号575’-GCGTGGGCGGTGTTTATCATGTTCAKB-3配列番号585’-TACTGCACGCACAAGCCTGAACAニトリラーゼ抑制解除ノザンブロット解析を誘導前および誘導後にMB214、DC202、およびDC206に対して実施した。MB214、DC202、およびDC206は上記したように、野生型lacO配列をtacプロモーターの3’側のO1位置に含有するニトリラーゼ発現ベクターを用いて形質転換して、MB214wtO1、DC202wtO1DC239、およびDC206wtO1DC240を作製した。DC206は、上記のようなtacプロモーターの3’側のO1位置における野生型lacO配列の代わりにlacOid配列を含有するニトリラーゼ発現ベクターによって形質転換して、DC2060idDC281を作製した。DC206もtacプロモーターの3’側のO1位置に野生型lacO配列を、tacプロモーターの5’側のO3位置にlacOid配列を含有するニトリラーゼ発現ベクターを用いて形質転換して、DC206wtO1O3idDC263を含有するデュアルlacOを作製した。ノザンブロット解析は、誘導前にデュアルlacO配列DC206wtO1O3idDC263カセットを含有する菌株による、より大きな抑制を示した。プレインキュベーション発現のより大きな抑制は、プレインキュベーション毒性タンパク質の基底レベルが細胞の増殖期への移行遅延、そして潜在的に産物のより低い全体的な収率を生じさせるため、毒性タンパク質を産生するときに特に有用である。"