a蛍光色素に共有結合で連結させたCOMT基質を用意する工程、b工程aの分子を、カテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMT、SアデノシルメチオニンSAM、および候補化合物と接触させる工程、ならびにc工程bの混合物の蛍光読み取り値を測定する工程であって、候補化合物の存在下における蛍光読み取り値の、ブランクと比較しての変化が、カテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMTの調節因子の指標となる、工程を含む、カテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMTの活性の調節因子を同定するための方法。前記方法がCOMT阻害剤を同定するための方法であって、工程cにおける蛍光読み取り値の、ブランクと比較しての低下が、COMT阻害剤の指標となる、請求項1記載の方法。COMT基質が4ニトロカテコールである、請求項1または2記載の方法。蛍光色素がAlexaFluor登録商標488である、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。工程cにおける蛍光読み取り値が速度論的読み取り値である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。COMTがヒトCOMTである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。ハイスループットスクリーニング法である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。マイクロタイタープレートで行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。COMTの最終濃度が約25nMである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。COMT基質の最終濃度が約200nMである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。SAMの最終濃度が約500nMである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。a蛍光色素に共有結合で連結させたCOMT基質およびSアデノシルメチオニンSAMを含む混合物を用意する工程、b工程aの混合物を異なる濃度の候補化合物と接触させる工程、c工程bの混合物をカテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMTと接触させる工程、ならびにd工程cの混合物の速度論的蛍光読み取り値を測定する工程であって、候補化合物の濃度上昇の関数としての蛍光読み取り値のプラトーの低下が、カテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMTの基質の指標となる、工程を含む、カテコールOメチルトランスフェラーゼ酵素COMTの基質を同定するための方法。COMT基質が4ニトロカテコールである、請求項12記載の方法。蛍光色素がAlexaFluor登録商標488である、請求項12または13記載の方法。発明の詳細な説明本発明のアッセイは、COMT基質に共有結合でカップリングさせた蛍光色素、例えばニトロカテコールに共有結合で連結させたAlexaFluor登録商標488が分子内消光により蛍光の減少を示すこと、ならびにCOMTによるCOMT基質-蛍光色素複合体中のCOMT基質のメチル化によって蛍光の消滅がなくなる、すなわちCOMT基質-蛍光色素複合体中のCOMT基質のメチル化によって非メチル化複合体と比較して蛍光の増加がもたらされるという発見に基づく。COMTという用語は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳類種由来の天然配列COMTおよびCOMTバリアント以下にさらに定義されるを表すために用いられる。COMTポリペプチドは、ヒト組織型を含む様々な供給源から単離されてよく、または組み換え法および/もしくは合成法によって調製されてもよい。天然または組み換えで生成されたCOMTを本アッセイで用いることができる。組み換えタンパク質とは、異種細胞における発現に基づいて単離、精製、または同定されたタンパク質であって、該細胞は宿主細胞における該タンパク質の発現を推進するように操作された組み換え発現ベクターを一過性または安定的に形質導入またはトランスフェクションされている。組み換えCOMTは、原核細胞、例えば大腸菌Ecoli、酵母、例えば分裂酵母Spombe、または真核細胞、例えばHEK293細胞、Sf9昆虫細胞において生成され得る。好ましくは、組み換えCOMTの高発現のためにSf9昆虫細胞を用いる。アッセイに用いるCOMTは、精製されていてよい。本明細書において用いる精製されたという用語は、その天然環境からまたは組み換え生成の供給源から取り出され、単離または分離されたポリペプチドであって、天然に付随する他の成分、例えば膜およびミクロソームを、少なくとも60、より好ましくは少なくとも80含まない、ポリペプチドを表す。天然配列COMTとは、その調製様式にかかわらず、天然に存在するCOMTポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す。天然配列COMTは、天然から単離されてもよく、または組み換え法および/もしくは合成法によって調製されてもよい。天然配列COMTという用語は、具体的には、天然に存在する切断型または分泌型、天然に存在するバリアント型例えば、選択的スプライシング型、および天然に存在するCOMTの対立遺伝子バリアントを包含する。NCBIデータベースにおけるヒトCOMTポリペプチドの識別名は、AAA68927SeqIdNo1である。COMTバリアントという用語は、天然配列における1つまたは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入を含む、天然配列COMTのアミノ酸配列バリアントを表す。アミノ酸配列バリアントは、一般に、天然配列COMTのアミノ酸配列と少なくとも約75、好ましくは少なくとも約80、より好ましくは少なくとも約85、さらにより好ましくは少なくとも約90、最も好ましくは少なくとも約95の配列同一性を有する。化合物という用語は、本明細書において、本発明のアッセイに関連して記載される試験化合物または薬物候補化合物の文脈において用いられる。そのため、これらの化合物は、合成したまたは天然供給源に由来する有機または無機化合物を含む。化合物には、比較的低分子量を特徴とするポリヌクレオチド、脂質、またはホルモン類似物質等の無機または有機化合物が含まれる。他の生体高分子有機試験化合物には、約2~約40個のアミノ酸を含むペプチド、および抗体または抗体結合体等の約40~約500個のアミノ酸を含むより大きなポリペプチドが含まれる。速度論的読み取り値という用語は、酵素反応の線形部におけるある2つの時点で測定された蛍光シグナルの差を表す。酵素反応の初めに第一の測定を行い開始点、インキュベーション時間の後に第二の読み取りを実施する終点。次いで、最終シグナルをrfu-rfu/インキュベーション時間としてrfu分で算出する。rfu:相対的蛍光単位本発明の方法を利用して、カテコールOメチルトランスフェラーゼCOMT酵素を阻害する化合物を同定することができる。したがって、本発明の方法によって同定されたCOMT阻害剤を、例えばうつ病の予防または制御においてCOMTによる神経外カテコールアミンの失活が役割を果たす病気の治療、予防、または制御のための方法に用いることができる。この場合、本発明の化合物を、個々の化合物としてまたは病気の経過に良い影響を与える他の治療上活性のある物質と組み合わせて用いることができる。本発明の化合物を、治療上活性のある他の物質との併用薬comedicationとしても用いることができる。本発明の方法を用いて、試験化合物で処理した動物の組織サンプルにおけるCOMT活性を決定することができる。例えば、本アッセイは、試験化合物COMT調節因子で処置した動物、例えばマウスおよびラットに由来する脳および肝臓の組織サンプルにおけるCOMT活性を決定するのに適している。実験部分4ニトロカテコールAlexaFluor登録商標488の合成1トリエチルアミンを含有するDMSO中のアミノエチルニトロブレンツカテキン1の10mM溶液を、1トリエチルアミンを有するDMSO中のAlexaFluor登録商標488カルボン酸スクシンイミジルエステル2InvitrogenCorporation5791VanAllenWayCarlsbadCalifornia92008の10mM溶液と、1:1の化学量論比で混合した。反応混合物を室温で一晩穏やかに混合し、AktaExplorer100逆相HPLCで精製した。生成物を凍結乾燥し、DMSOに再懸濁した。蛍光アッセイプロトコール以下のアッセイプロトコール、試薬、および材料を本発明の実施例において用いた。実施例の結果を図1~7に記載する。マイクロタイタープレート:Corning社のポリスチレン製の透明な平底、非結合性表面を有する黒色の384ウェルマイクロタイタープレート参照:3655。試薬およびバッファーストック溶液:バッファーストック溶液:-Mリン酸バッファーpH76Na2HP04Fluka71644、NaH2P04Merck63460500、4°Cで保存-580mMMgCl2Merck108330250、室温で保存-1MCaCl2、4°Cで保存-65mMDTTSigmaD0632、20°Cで保存組み換えヒトCOMT:自家調製、80°Cで保存4ニトロカテコールAlexaFluor488:自家調製、DMSO中に13mM、暗所にて室温で保存Sアデノシルメチオニン:H2O中に10mMSigmaAldirchA2804、20°Cで保存試薬およびバッファー溶液:アッセイバッファー終濃度:-40mMリン酸バッファーpH76-288mMMgCl2-09mMDTT-025mMCaCl2化合物希釈液:100DMSOSigma41640中の希釈液、DMSO最終アッセイ濃度625組み換えヒトCOMT:アッセイバッファー中に80nM、最終アッセイ濃度25nM4ニトロカテコールAlexaFluor登録商標488:アッセイバッファー中に320nM、最終アッセイ濃度200nMSアデノシルメチオニン:アッセイバッファー中に800nM、最終アッセイ濃度500nMアッセイ法:10μlhCOMTヒトCOMT2μl試験化合物シェーカーで1分間20μl基質SAM混合物シェーカーで5分間読み取り:プレートでの速度論的測定::ビジョンTMリーダー励起475nm、発光535nm、強度75、露光時間1秒間