"ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号71を含む重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号97を含む軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号71に示す重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号97に示す軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を含む抗体。配列番号71と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。配列番号71に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項4に記載の抗体。配列番号97と少なくとも90同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。配列番号97に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項6に記載の抗体。配列番号111と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。配列番号111に記載する重鎖アミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体。配列番号113と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。配列番号113に記載する軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項10に記載の抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号71と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号97と少なくとも90同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号71に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号97に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号111と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列、および配列番号113と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号111に記載する重鎖アミノ酸配列、および配列番号113に記載する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体。ノッチ1に結合し、ノッチ1に対する結合について請求項1、2または3に記載の抗体と競合する抗体。ノッチ1に結合する抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体が、Asn1461、Lys1462、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Tyr1621、Gly1622、Met1670、Asp1671、Val1672、Arg1673、Leu1707、Ala1708、Leu1710、Leu1711、Leu1712、Leu1713、Leu1716およびLeu1718から選択される少なくとも7個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合部分。IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM分子であるか、またはそれに由来する、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体。IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群から選択されるサブクラスを有するIgGであるか、またはそれに由来する、請求項18に記載の抗体。前記サブクラスが、IgG1に由来する、請求項19に記載の抗体。請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。配列番号112に記載する配列を含む核酸。配列番号114に記載する配列を含む核酸。請求項21から23のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。請求項24に記載のベクターを含む宿主細胞。抗体を生産するための方法であって、請求項25に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養培地から抗体を回収するステップとを含む方法。請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体を組換えにより産生する宿主細胞。請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体または請求項28に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。前記障害が、ノッチ1の異常な活性化と関連している、請求項29に記載の方法。前記障害が、それを必要とする対象におけるT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLCおよび乳がんからなる群から選択される、請求項29または30に記載の方法。療法において使用するための、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体。医薬の製造ための、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体の使用。それを必要とする対象におけるT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLCおよび乳がんの治療のためである、請求項32または33に記載の使用。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号115に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号129に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体。ノッチ1に結合する抗体であって、配列番号149に記載する重鎖アミノ酸配列、および配列番号151に記載する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体。ヒトノッチ1に結合する抗体であって、Asp1458、Asn1461、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Met1581、Pro1582、Tyr1621、Gly1622、Arg1623、Asp1671、Val1672、Arg1673、Gly1674、Leu1710、Gly1711、Ser1712、Leu1713、Asn1714、Ile1715、Pro1716およびLys1718から選択される少なくとも8個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する抗体。ネイティブなノッチ1受容体のノッチ1活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ1受容体のノッチ1活性化のより高い阻害を示す抗体。請求項35から38のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、請求項35から38のいずれか一項に記載の抗体または請求項39に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。前記障害が、ノッチ1の異常な活性化と関連している、請求項40に記載の方法。前記障害が、それを必要とする対象におけるT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLCおよび乳がんからなる群から選択される、請求項40または41に記載の方法。療法において使用するための、請求項35から38のいずれか一項に記載の抗体。医薬の製造ための、請求項35から38のいずれか一項に記載の抗体の使用。それを必要とする対象におけるT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLCおよび乳がんの治療のためである、請求項43または44に記載の使用。いくつかの戦略が、がんにおける治療の目的でノッチシグナル伝達を阻害するために開発されつつある。1つのアプローチは、膜からの細胞内ノッチのタンパク質分解性の放出を、ガンマ-セクレターゼGSIの阻害剤を用いる治療により遮断することである。GSIは、診察室で使われるまでになったが、個々のノッチ受容体を区別することができず、ノッチ1およびノッチ2の両方の阻害によるものである腸毒性を引き起こす。当技術分野では、がんを治療し、かつ副作用、特に、腸毒性を低下させるための新規の抗ノッチ1療法が依然として求められている。一実施形態では、本発明は、配列番号71を含む重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号97を含む軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。また、本発明は、1配列番号71を含む重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域、ならびに2配列番号97を含む軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号71と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号71に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号97と少なくとも90同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号97に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号111と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号111に記載する重鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号113と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらに、配列番号113に記載する軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号71と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号97と少なくとも90同一である軽鎖可変アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号71に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号97に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号111と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列および配列番号113と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号111に記載する重鎖アミノ酸配列および配列番号113に記載する軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヒトノッチ1に結合する抗体であって、抗体が、Asn1461、Lys1462、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Tyr1621、Gly1622、Met1670、Asp1671、Val1672、Arg1673、Leu1707、Ala1708、Leu1710、Leu1711、Leu1712、Leu1713、Leu1716およびLeu1718から選択される少なくとも8個のアミノ酸残基を有するエピトープに結合する、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号115を含む重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号129を含む軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。また、本発明は、1配列番号115を含む重鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する重鎖可変領域、ならびに2配列番号129を含む軽鎖可変領域に由来するCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を有する軽鎖可変領域を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号115と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号115に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号129と少なくとも90同一である軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号129に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号149と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらに、配列番号149に記載する重鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。また、配列番号151と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらに、配列番号151に記載する軽鎖アミノ酸配列を有する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号115と少なくとも90同一である重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号129と少なくとも90同一である軽鎖可変アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号115に記載する重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号129に記載する軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号149と少なくとも90同一である重鎖アミノ酸配列および配列番号151と少なくとも90同一である軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体を提供する。さらに、配列番号149に記載する重鎖アミノ酸配列および配列番号151に記載する軽鎖アミノ酸配列を有するノッチ1に結合する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヒトノッチ1に結合する抗体であって、Asp1458、Asn1461、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Met1581、Pro1582、Tyr1621、Gly1622、Arg1623、Asp1671、Val1672、Arg1673、Gly1674、Leu1710、Gly1711、Ser1712、Leu1713、Asn1714、Ile1715、Pro1716およびLys1718から選択される少なくとも8個のアミノ酸残基を有するエピトープに結合する、抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、ネイティブなノッチ1受容体のノッチ1活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ1受容体のノッチ1活性化のより高い阻害を示す抗体を提供する。さらに、突然変異ノッチ1受容体が、負の調節領域NRR中に突然変異を有する場合を想定している。さらなる実施形態では、NRR中の突然変異は、クラス1、クラス2およびクラス3の突然変異からなる群から選択される。さらなる実施形態では、NRR中の突然変異は、ノッチ1の異常な活性化を示す細胞と関連している。さらに、細胞は、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL細胞である場合を想定している。また、T-ALL細胞は、HPB-ALL細胞、ALL-SIL細胞、CCRF-CEM細胞、MOLT-4細胞およびDND-41細胞からなる群から選択される場合を想定している。また、ノッチ1に結合し、ノッチ1に対する結合について本明細書に記載する抗体のうちのいずれかと競合する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ノッチ1に結合する抗体であって、アイソタイプIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMである抗体を提供する。さらに、ノッチ1に結合する抗体であって、アイソタイプはIgGであり、サブクラスは、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4であるかまたはそれらに由来する抗体も提供する。また、ノッチ1に結合する抗体であって、サブクラスはIgG1に由来する抗体も提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかをコードする核酸または本明細書に記載する抗体の重鎖および/もしくは軽鎖のうちのいずれかをコードする核酸を提供する。例えば、一実施形態では、本発明は、配列番号112に記載する配列を有する核酸を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号114に記載する配列を有する核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号150に記載する配列を有する核酸を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号152に記載する配列を有する核酸を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する核酸のうちのいずれかを含むベクターを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載するベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかを生産するための方法であって、本明細書に記載する任意の宿主細胞を培養するステップと、培養培地から抗体を回収するステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかを組換えにより産生する宿主細胞を提供する。一実施形態では、本明細書に記載する宿主細胞のうちのいずれかを単離する。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に記載する抗体のうちのいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象においてノッチ1の異常な活性化と関連している障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において、障害、例として、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLC、乳がんおよび結腸がんを治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを対象に投与するステップを含む方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象において障害を治療する方法であって、本明細書に記載する抗体または医薬組成物のうちのいずれかを、1つまたは複数の治療剤と組み合わせて対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、療法において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、療法のための医薬の製造のための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを使用する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象におけるノッチ1の異常な活性化と関連している障害の治療において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における障害、例として、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLC、乳がんおよび結腸がんの治療において使用するための、本明細書に開示する抗体のうちのいずれかを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ヒト、マウスおよびカニクイザル以下、cynoのノッチ1に結合するが、ヒトノッチ2には結合しない抗体を提供する。別の実施形態では、本発明は、ヒト、マウスおよびcynoのノッチ1に結合するが、ヒトおよびマウスのノッチ3には結合しない抗体を提供する。本発明は、ノッチ1に結合する単離抗体、特に、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体およびラットモノクローナル抗体に関する。さらに、本開示は、ネイティブなノッチ1受容体のノッチ1活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ1受容体のノッチ1活性化のより高い阻害を示す単離抗体も提供する。本開示は、単離抗体、およびそのような抗体を作製する方法、および抗体を含有する医薬組成物を提供する。さらに、本開示は、そのような抗体を含有するイムノコンジュゲートおよび二重特異性分子にも関する。また、本開示は、抗体を使用して、ノッチ1活性化を阻害し、異常な細胞の増殖に関する種々の疾患、例として、がん例えば、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLC、結腸がん、乳がんおよび卵巣がんを治療する方法にも関する。一般的な技法別段の記載がない限り、本発明の方法および技法は一般に、当技術分野でよく知られている従来法に従って実施し、別段の記載がない限り、本明細書全体を通して引用し、論じる種々の一般的な参考文献およびより特定の参考文献の記載に従って実施する。例えば、SambrookらMolecularCloning:ALaboratoryManual、2ded.、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.1989、およびAusubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology、GreenePublishingAssociates1992、ならびにHarlowおよびLaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、N.Y.1990を参照されたい。これらは、参照により本明細書に組み込まれている。定義ノッチ1またはノッチ-1は、ネイティブなヒトノッチ1タンパク質、ヒトノッチ1タンパク質の変異体、ヒトノッチ1タンパク質のアイソフォーム、およびヒトノッチ1タンパク質の種相同体を指す。ネイティブなヒトノッチ1タンパク質は、例えば、リーダーペプチド、大型の上皮増殖因子EGF様の反復領域、3つのLin12リピート、N末端ヘテロ二量体化ドメインHD-1、C末端ヘテロ二量体化ドメインHD-2、膜貫通TM配列および細胞内ドメインノッチ1ICDから構成される。完全長ヒトノッチ1のNCBI/GenBank受託番号は、NM_017617.2である。ノッチ1の負の調節領域またはノッチ1NRRは、本明細書で使用する場合、別段の記載がない限り、ノッチ1の3つのLin12ドメイン、および3つのLin12ドメインの間に位置する1つまたは複数のアミノ酸配列、さらに、HD1ドメインおよびHD2ドメインからなる、ノッチ1の任意の本来または合成のポリペプチド領域を指す。一実施形態では、ノッチ1NRRは、3つのLin12ドメイン、ならびに2つのヘテロ二量体化ドメインHD-1およびHD-2を含み、ノッチ1のHD-1ドメインとHD-2ドメインとが、共有結合しており、フューリン様プロテアーゼによりまだ切断されていないS1切断前。別の実施形態では、ノッチ1NRRは、3つのLin12ドメイン、ならびに2つのヘテロ二量体化ドメインHD-1およびHD-2を含み、HD-1ドメインとHD-2ドメインとが非共有結合しているS1切断後。この実施形態の一態様では、HD-2ドメイン内部のS2部位が、ADAM型金属プロテアーゼにより切断されていない。この実施形態の別の特定の態様では、HD-2ドメイン内部のS2部位は、ADAM型金属プロテアーゼにより切断されつつあるかまたはすでに切断されている。Gordon,W.R.ら、NatureStructuralMolecularBiology、2007、volume14、295~300。抗体は、免疫グロブリン分子であり、標的、例として、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を通して特異的に結合することが可能である。本明細書で使用する場合、この用語は、未変化のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、また、それらの断片例えば、抗原結合性部分例として、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、単鎖ScFv、ならびにドメイン抗体、例として、サメおよびラクダ科の抗体も、抗体の部分例として、ドメイン抗体を含む融合タンパク質も、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された配置も網羅する。抗体は、任意のクラス、例として、IgG、IgAまたはIgMまたはそれらのサブクラスの抗体を含み、抗体は、いずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの5つの主要なクラスアイソタイプ、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。単離抗体は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を示す他の抗体を実質的に含有しない抗体を指すことを意図する例えば、ノッチ1に特異的に結合する単離抗体は、ノッチ1以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含有しない。しかし、ノッチ1に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例として、他の種に由来するノッチ-1分子に対して交差反応性を示し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および/または化学物質も実質的に含有しない場合がある。本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得る抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在する場合がある、天然に存在する可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対して作られる。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最低限の配列を含有するキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’2もしくは抗体の他の抗原結合性サブ配列である非ヒト例えば、マウス抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域CDRに由来する残基が、所望される特異性、親和性および能力を有する、非ヒト種、例として、マウス、ラットまたはウサギのCDRドナー抗体に由来する残基で置き換わっているヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvのフレームワーク領域FWの残基が、対応する非ヒト残基で置き換わっている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入したCDR配列およびフレームワーク配列中にも見出されないが、抗体の性能をさらに精緻化および最適化するために含まれる残基を含む場合もある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含み、この場合、CDR領域の全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、FW領域の全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のFW領域である。また、ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメインFc、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体の他の形態は、元々の抗体に関して変化している、1つまたは複数のCDRL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2またはH-CDR3を有し、これらのCDRはまた、元々の抗体に由来する1つまたは複数のCDRから誘導した1つまたは複数のCDRとも呼ばれる。ヒト抗体または完全ヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基例えば、invitroにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってかまたはinvivoにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異を含むことができる。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも1つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、当技術分野で知られている種々の技法を使用して生産することができる。用語キメラ抗体は、可変領域配列が1つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例として、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図する。用語組換え抗体は、本明細書で使用する場合、組換えの手段により調製、発現、創出または単離が行われる全ての抗体を含む。そのような組換え抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域が生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換え抗体に対して、invitroにおける変異誘発または、Ig配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合には、invivoにおける体細胞変異誘発を行うことができ、したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、それらの配列に関連するが、invivoにおける抗体の生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列となる。本明細書においては、句抗原を認識する抗体および抗原に特異的な抗体を、用語抗原に特異的に結合する抗体と互換的に使用する。当技術分野で知られているように、用語Fc領域を使用して、免疫グロブリン重鎖のC末端領域CH2CH3を定義する。Fc領域は、ネイティブな配列のFc領域であってもまたは変異体のFc領域であってもよい。ネイティブな配列のFc領域は、自然界において見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。変異体のFc領域は、ネイティブな配列のFc領域のアミノ酸配列とは少なくとも1つのアミノ酸の改変によって異なるが、にもかかわらず、ネイティブな配列のFc領域の少なくとも1つの機能を保持するアミノ酸配列を含む。用語Fc受容体またはFcRを使用して、抗体のFc領域に結合する受容体を記載する。例えば、FcRは、ネイティブな配列のヒトFcRであり得る。さらに、FcRは、IgG抗体に結合する受容体であり得ガンマ受容体、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIおよびFcγRIVのサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされる形態も含まれる。FcγRII受容体は、FcγRIIA活性化受容体およびFcγRIIB阻害性受容体を含み、これらは、主としてそれらの細胞質ドメインにおいて異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフITAMを含有する。当業者であれば理解するであろうが、阻害性受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメイン中に、免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフITIMを含有する。FcRは、広範に検討されており、当業者にはよく知られている。本明細書においては、用語FcRは、将来同定されるものを含めて、他のFcRを包含する。また、この用語は、新生児型受容体FcRnも含み、この受容体は、母体のIgGの胎児への移動およびIgGの半減期の延長に関与する。用語結合するは、2つの分子、例えば、抗原と抗体との間の親和性を指す。ノッチ1に特異的に結合する抗体は、複数の異なる抗原を含む試料中の、抗体のノッチ1抗原に対する優先的な結合を指し、KDの差は、少なくとも100倍、または好ましくは、1,000倍である。用語高い親和性は、1×10-6M以下のKDを有する、より好ましくは、1×10-8M以下のKDを有する抗体を指す。親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して測定することができる。エピトープは、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することが可能である、任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープ決定因子は、通常、分子の化学的に活性な表面集団、例として、アミノ酸または糖側鎖からなり、通常、特異的な三次元の構造的な特徴および特異的な電荷の特徴を有する。用語konは、本明細書で使用する場合、特定の抗体抗原相互作用のオン速度on-rateまたは結合速度を指すことを意図し、一方、用語koffは、本明細書で使用する場合、特定の抗体抗原相互作用のオフ速度off-rateまたは解離速度を指すことを意図する。用語KDは、本明細書で使用する場合、平衡解離定数を指すことを意図し、平衡解離定数は、koff対konの比すなわち、koff/konから得られ、モル濃度Mとして表される。抗体についてのKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のKDを決定するための1つの方法は、バイオセンサーシステム、例として、Biacore登録商標システムを典型的に使用する表面プラズモン共鳴を使用することによる方法である。本明細書においては、用語ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチドおよびタンパク質を互換的に使用して、任意の長さ、好ましくは、比較的短い例えば、10~100個のアミノ酸アミノ酸の鎖を指す。鎖は、直鎖であってももしくは分枝であってもよく、アミノ酸の改変を含んでもよく、かつ/または非アミノ酸を介在させてもよい。ポリペプチドは、単鎖として存在してもまたは結合状態の複数の鎖として存在してもよいことを理解されたい。当技術分野で知られているように、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本明細書においては互換的に使用して、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体であってもよく、さらに、DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼにより鎖中に組み込まれ得る任意の基質であってもよい。抗体の可変領域は、単独でまたは組み合わせてのいずれかの抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としてもまた知られている、3つの相補性決定領域CDRにより接続されている4つのフレームワーク領域FWからなる。それぞれの鎖中のCDRは、FWにより、密接に近接して一緒に保たれ、他の鎖に由来するCDRと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。可変ドメインのCDRは、Kabatの定義、Chothiaの定義、KabatおよびChothiaの両方の集積、AbM、接触および/もしくは立体構造の定義、または当技術分野でよく知られている、CDRの決定の任意の方法に従って同定される可変領域内部のアミノ酸残基である。抗体のCDRは、Kabatらにより当初定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Kabatら、1992、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、5thed.、PublicHealthService、NIH、WashingtonD.C.を参照されたい。また、CDRの位置は、Chothiaらにより当初記載された構造的なループとして同定することもできる。例えば、Chothiaら、1989、Nature342:877~883を参照されたい。CDRの同定に対する他のアプローチは、KabatとChothiaとの間の折衷案であり、OxfordMolecular’sAbMantibodymodelingソフトウエア現在、Accelrys登録商標を使用して誘導されるAbMの定義、またはMacCallumら、1996、J.Mol.Biol.、262:732~745に記載されている、観察された抗原の接触に基づくCDRの接触による定義を含む。本明細書においてはCDRの立体構造の定義と呼ぶ、別のアプローチでは、CDRの位置は、抗原結合にエンタルピーの寄与をもたらす残基として同定することができる。例えば、Makabeら、2008、JournalofBiologicalChemistry、283:1156~1166を参照されたい。さらなる他のCDRの境界の定義は、上記のアプローチのうちの1つに厳格には従わない場合があるが、それにもかかわらず、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはCDR全体が抗原結合に顕著には影響しないという予測または実験的知見に照らしてそれらが短縮または伸張されていることがあるものの、KabatのCDRの少なくとも一部と重複する。本明細書で使用する場合、CDRは、アプローチの組合せを含めて、当技術分野で知られている任意のアプローチにより定義されるCDRを指すことができる。本明細書において使用する方法は、これらのアプローチのうちのいずれかに従って定義されるCDRを活用することができる。2つ以上のCDRを含有する、任意の所与の実施形態については、CDRを、Kabatの定義、Chothiaの定義、延長された定義、AbMの定義、接触の定義および/または立体構造の定義のうちのいずれかに従って定義することができる。抗体の定常領域は、単独でまたは組み合わせてのいずれかの抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。宿主細胞は、ポリヌクレオチド挿入部の組込みのためのベクター複数可についてのレシピエントになり得るかまたはそうしたレシピエントになっている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、形態学的状態としてまたはゲノムDNAの相補体として元々の親細胞と必ずしも完全には同一でない場合がある。宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチド複数可をinvivoにおいてトランスフェクトした細胞を含む。本明細書で使用する場合、ベクターは、構築物を意味し、この構築物は、宿主細胞において、1つまたは複数の、目的の遺伝子または配列を送達する、好ましくは、発現することが可能である。ベクターの例として、これらに限定されないが、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNAの発現ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクターまたはファージベクター、カチオン性縮合剤を伴うDNAまたはRNAの発現ベクター、リポソーム中に被包されているDNAまたはRNAの発現ベクター、および特定の真核細胞、例として、プロデューサー細胞が挙げられる。本明細書で使用する場合、発現制御配列は、核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例として、構成性もしくは誘導性のプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写されるべき核酸配列に作動可能に連結している。本明細書で使用する場合、薬学的に許容できる担体または薬学的に許容できる賦形剤は、活性成分と組み合わせた場合、この成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系とは反応しない、任意の材料を含む。例として、これらに限定されないが、標準的な薬学的担体、例として、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例として、油/水エマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤のうちのいずれかが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水PBSまたは通常の0.9生理食塩水である。そのような担体を含む組成物を、よく知られている従来法により製剤化する。個体または対象は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。また、哺乳動物として、これらに限定されないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも挙げられる。単離タンパク質、単離ポリペプチドまたは単離抗体は、その起源または入手源によって、1タンパク質、ポリペプチドまたは抗体にそのネイティブな状態において伴う、天然に付随する構成成分が付随しない、2同じ種に由来する他のタンパク質を含有しない、3異なる種に由来する細胞が発現する、または4自然界においては存在しないタンパク質、ポリペプチドまたは抗体である。したがって、化学的に合成されるかまたはポリペプチドの天然の起源である細胞とは異なる細胞系中で合成されるポリペプチドは、その天然に付随する構成成分から単離されている。また、タンパク質を、当技術分野でよく知られているタンパク質精製の技法を使用する単離により、天然に付随する構成成分を実質的に含有しない状態になすこともできる。ノッチ1受容体ヒトノッチ1のcDNAは、リーダーペプチド、36個のEGF様リピート、負の調節領域NRR、膜貫通TM配列および細胞内ドメインノッチ1ICDからなる2556個のアミノ酸残基のタンパク質をコードする。NRRに結合する抗ノッチ1抗体現在の開示では、ノッチ1ドメインに高い親和性で結合する抗体は、ノッチ1のシグナル伝達を低下させることができ、したがって、invitroおよびinvivoにおいて生物学的活性を示して、がん細胞の増殖、特に、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL、非小細胞肺がんNSCLC、乳がん、結腸がんおよび卵巣がんを阻害することができることも企図する。そのような抗体は、当業者に知られている一般的な方法に従って生産することができる。一実施形態では、そのような抗体を、免疫原を用いるラットの免疫化、続いて、抗体のハイブリドーマによるクローニングを通して生産し、こうして生成した、クローニングした抗体を、多様なアッセイによりアッセイすることができる。使用して、ノッチ1と特異的に反応する抗体を同定することができる多くのアッセイの中には、例えば、固相ELISAイムノアッセイ、免疫沈降、BIAcore、FACSおよびウエスタンブロット分析がある。ELISAアッセイに従って選択した抗体のノッチ1結合親和性を、表面プラズモン共鳴Biacore登録商標計測器上で測定することができる。現在の開示の抗ノッチ1抗体は、上記の段落に記載した方法以外の、任意の他の当技術分野で知られている方法により生産することもできる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書においてさらに記載する、抗体の賦活および生産のための確立された従来の技法に沿うものである。ヒトおよびマウスの抗体の生産のための一般的な技法は、当技術分野で知られており、かつ/または本明細書に記載されている。ハイブリドーマ技術により生成する抗ノッチ1抗体。現在の開示では、ヒトを含めた、任意の哺乳動物の対象、またはそれらに由来する抗体産生細胞を操作して、ヒトを含めた、哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の生産のための基礎として用いることができることも企図する。典型的には、宿主動物に、ある量の、本明細書に記載する免疫原を含めた、免疫原を、腹腔内に、筋肉内に、経口により、皮下に、足底内に、かつ/または皮内に接種する。ハイブリドーマは、リンパ球と不死化骨髄腫細胞とから、Kohler,B.およびMilstein,C.1975Nature256:495~497の一般的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法を使用して、またはBuck,D.W.ら、InVitro、18:377~3811982により改変された技法に従って調製することができる。抗体の供給源として使用することができるハイブリドーマは、ノッチ1に特異的なモノクローナル抗体またはそれらの一部を産生する親ハイブリドーマの全ての派生物、子孫細胞を包含する。そのような抗体を産生するハイブリドーマを、知られている手順を使用して、invitroまたはinvivoにおいて増殖することができる。モノクローナル抗体を、培地または体液から、従来の免疫グロブリン精製の手順により単離することができる。宿主動物における免疫化により生成した抗ノッチ1抗体のヒト化。現在の開示では、宿主動物における免疫化により生成する、本開示の抗ノッチ1抗体は、多くの方法で操作して、それらの生物学的活性および医薬特性を改善することができることも企図する。そのような操作の1つの方法がヒト化である。抗体をヒト化する方法は、当業者によく知られている。一般に、モノクローナル抗体をヒト化するためには、4つの基本的なステップがある。これらには、1抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを開始するヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸の配列を決定するステップ、2ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化のプロセスの間に、どの抗体のフレームワーク領域を使用すべきかを決めるステップ、3実際のヒト化の方法/技法のステップ、ならびに4ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現のステップがある。非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合性部位を含む、いくつかのヒト化抗体分子が文献に記載されており、これには、ヒト定常ドメインに融合しているげっ歯類または改変されたげっ歯類のV領域およびそれらに付随するCDRを有するキメラ抗体;ヒト支持フレームワーク領域FR中にグラフトしてから、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させたげっ歯類CDR;ならびに組換えにより遺伝子工学的に作製したげっ歯類フレームワーク領域により支持されているげっ歯類CDRがある。そのようなヒト化分子を設計して、ヒトレシピエントにおいて、げっ歯類抗ヒト抗体分子の治療的適用の持続時間および有効性を制限する、それらの部分に対する望まれない免疫学的応答を最小限に留める。ヒト抗ノッチ1抗体現在の開示では、完全ヒト抗ノッチ1抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子工学的に作製されている、市販されているマウスを使用することによって得ることができることも企図する。また、より望ましい例えば、完全ヒト抗体またはよりロバストな免疫応答をもたらすように設計されるトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成のために使用することもできる。そのような技術の例が、Abgenix,Inc.Fremont、CA製のXenomouse商標、ならびにMedarex,Inc.Princeton、NJ製のHuMAb-Mouse登録商標およびTCMouse商標である。また、当業者に容易に明らかになるであろうが、現在の開示では、完全ヒト抗ノッチ1抗体は、ファージディスプレイ技術の一般的な方法に従って、組換えにより得ることができることも企図する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、未免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変Vドメインの遺伝子レパートリーから、invitroにおいてヒトの抗体および抗体断片を生産することもできる。また、遺伝子シャッフリングを使用して、げっ歯類抗体からヒト抗体を得ることもでき、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体に類似する親和性および特異性を有する。上記の論述は、ヒト化抗体およびヒト抗体に関するが、論じた一般的な原理は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおいて使用するための抗体を特別に作るために適用できる。本明細書に記載する、抗体をヒト化する1つまたは複数の態様を、例えば、CDRグラフト化、フレームワーク突然変異およびCDR突然変異と組み合わせることができる。組換えにより作製した、遺伝子工学的に作製および改変されている抗ノッチ1抗体一般に、所望される抗体のDNA配列を発現ベクター中に置き、続いて、宿主細胞においてトランスフェクションおよび発現を行うによって、抗体を組換えにより作製することができ、宿主細胞として、これらに限定されないが、別の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌E.coli細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞または骨髄腫細胞が挙げられる。また、他の宿主細胞、例として、トランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック乳細胞を使用してもよい。また、抗体を組換えにより改変することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常領域のDNAを、マウス抗体DNAの相同なマウス配列の代わりに使用することができ、または非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部もしくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合性につなぐことができる。類似の様式で、本明細書の抗ノッチ1モノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラまたはハイブリッドの抗体を調製することもできる。また、抗体の可変領域を、CDRグラフト化により改変することもできる。CDR配列が、ほとんどの抗体抗原相互作用に主に関与するので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトした、特定の天然に存在する抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。したがって、本開示の別の態様は、本明細書に記載するCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびに本明細書に記載するCDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体に関する。したがって、そのような抗体は、本明細書に記載するモノクローナル抗体のVHのCDR配列およびVLのCDR配列を含有するが、にもかかわらず、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有し得る。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースまたは公開されている参考文献から得ることができる。別のタイプの可変領域の改変は、VHおよび/またはVLのCDR1領域、CDR2領域および/またはCDR3領域内部のアミノ酸残基を突然変異させて、それにより、目的の抗体の1つまたは複数の結合特性例えば、親和性を改善することである。部位特異的変異誘発またはPCR媒介型変異誘発を実施して、突然変異複数可を導入することができ、抗体結合に対する作用または目的とする他の機能特性を、本明細書に記載するinvitroまたはinvivoにおけるアッセイを使用して評価することができる。典型的には、下記に論じるような保存的改変を導入する。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、CDR領域内部の1、2、3、4または5つ以下の残基を改変する。エピトープマッピングモノクローナル抗体に結合する抗原上のエピトープを、抗原抗体相互作用のタイプに応じて、いくつかの方法によりマッピングすることができる。抗体が、抗原中の連続的なアミノ酸残基からなる単一のエピトープに結合する場合、エピトープの結合は通常、抗原の立体構造変化の影響を受けず、結合性エピトープは、直鎖状エピトープと呼ばれる。直鎖状エピトープのアミノ酸配列の決定を、当技術分野でよく知られている技法を活用することによって達成することができる。抗原がそのネイティブな構造に折り畳まれることによって一緒になる、いくつかの順次に不連続なセグメントまたは隣接しない残基により構成される非直鎖状エピトープは、立体構造エピトープとして知られている。立体構造エピトープのマッピングは、抗原のネイティブな立体構造における、抗体の抗原に対する相互作用に依存する。いくつかの当技術分野でよく知られている技法が、立体構造エピトープを決定するのに有用である。例えば、抗原抗体の複合体の共結晶化、X線回析および構造解析は、抗原抗体相互作用の方向を可視化する。こうした技術は、アミノ酸の変異誘発と組み合わせた場合、抗体結合性エピトープについての強力な証拠および鮮明な絵を提供することができる。エピトープ、または抗ノッチ1抗体のそれぞれが結合するエピトープのセットを、上記のマッピング方法または当技術分野で一般に知られている他の方法に従って決定することができる。保存的置換また、抗体のアミノ酸残基のうちの1つもしくは複数の保存的置換によってかまたは抗体のアミノ酸に対する、アミノ酸の1つもしくは複数の欠失もしくは付加によって、抗体を組換えにより改変することもできる。アミノ酸配列の挿入は、1つの残基から100個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲に及ぶアミノ末端および/またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端への挿入の例として、N末端のメチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合している抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、血液循環中の抗体の半減期を増加させる、酵素またはポリペプチドの、抗体のN末端またはC末端への融合がある。置換変異体では、抗体分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、その場所に、異なる残基が挿入される。置換変異誘発について最も大きな関心がある部位は、超可変領域を含むが、また、FRの変化も企図する。親和性成熟抗ノッチ1抗体本開示は、親和性成熟の実施形態を含む。例えば、親和性成熟抗体を、当技術分野で知られている手順により生産することができる例として、Marksら1992Bio/Technology、10:779~783;Barbasら1994ProcNat.Acad.Sci、USA91:3809~3813;Schierら1995Gene、169:147~155;Yeltonら1995J.Immunol.、155:1994~2004;Jacksonら1995J.Immunol.、1547:3310~9;Hawkinsら1992J.Mol.Biol.、226:889~896;および国際公開第2004/058184号。そのような方法を、抗体の親和性を調節するためおよびCDRを特徴付けるために使用することができる。抗ノッチ1抗体の翻訳後の改変また、翻訳後の改変により、抗体を改変することもでき、それらの改変として、これらに限定されないが、当技術分野でよく知られている技法による異なる糖を用いるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化が挙げられる。翻訳後の改変の他の方法には、当技術分野で知られているカップリングの技法の使用があり、それらの技法として、これらに限定されないが、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられる。改変は、例えば、イムノアッセイのための標識をつなぐために使用することができる。定常領域の改変を有する抗ノッチ1抗体本開示のいくつかの実施形態では、抗体は、定常領域の改変、例として、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解を引き起こさない、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性ADCCを賦活しない、もしくはミクログリアを活性化させない定常領域;または以下、すなわち、補体媒介性溶解を引き起こすこと、抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性ADCCを賦活すること、もしくはミクログリアを活性化することのうちの任意の1つもしくは複数において、未改変の抗体と比較して活性の低下を示す定常領域を含む。定常領域の異なる改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび/または組合せを達成することができる。例えば、Morganら、Immunology86:319~3241995;Lundら、J.Immunology157:4963~9157:4963~49691996;Idusogieら、J.Immunology164:4178~41842000;Taoら、J.Immunology143:2595~26011989;およびJefferisら、ImmunologicalReviews163:59~761998を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の突然変異、すなわち、より低いヒンジ領域中のL234A/L235A/G237Aを含むヒト重鎖IgG1定常領域を含み、結果として、ADCC活性およびCDC活性の実質的な低下が生じる。例えば、US20090155256を参照されたい。典型的には、Fc領域内部の改変を使用して、抗体の1つまたは複数の機能特性、例として、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合性および/または抗原依存性細胞傷害性を変化させることができる。さらに、本開示の抗体は、化学的に改変して例えば、1つもしくは複数の化学的部分を抗体につなぐことができるか、または改変し、そのグリコシル化パターンを変化させて、ここでも、抗体の1つまたは複数の機能特性を変化させることもできる。本開示が企図する本明細書の抗体の別の改変はペグ化である。抗体をペグ化して、例えば、抗体の生物学的例えば、血清半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するためには、典型的には、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコールPEG、例として、PEGの反応性のエステルまたはアルデヒドの誘導体と、1つまたは複数のPEG基を抗体または抗体断片につなげる条件下で反応させる。典型的には、反応性PEG分子または類似の反応性水溶性ポリマーとのアシル化反応またはアルキル化反応を介して、ペグ化を実施する。本明細書で使用する場合、用語ポリエチレングリコールは、モノC1~C10アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミド等の他のタンパク質を誘導体化するために使用されているPEGの形態であれば、いずれも包含することを意図する。特定の場合には、ペグ化しようとする抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野で知られており、本開示の抗体に適用することができる。融合タンパク質また、本開示は、本開示の抗体またはポリペプチドに由来する1つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も網羅する。一実施形態では、現在の開示の抗体の可変軽鎖領域の少なくとも10個の近接するアミノ酸および/または可変重鎖領域の少なくとも10個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個もしくは少なくとも約30個の近接するアミノ酸、および/または可変重鎖領域の少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約20個、少なくとも約25個もしくは少なくとも約30個の近接するアミノ酸を含む融合ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、現在の開示の抗体の軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、現在の開示の抗体の1つまたは複数のCDRを含む。本開示の目的では、融合タンパク質は、1つまたは複数の抗体、およびそうした抗体がネイティブな分子中ではつながっていない別のアミノ酸配列、例えば、異種の配列または別の領域に由来する同属の配列を含有する。例示的な異種の配列として、これに限定されないが、タグ、例として、FLAGタグまたは6Hisタグが挙げられる。融合ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法によって、例えば、合成または組換えにより生み出すことができる。二重特異性分子本開示の抗体またはその抗原結合性部分を、誘導体化してか、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質例えば、別の抗体もしくは受容体のためのリガンドに連結させて、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本開示の抗体は実際に、誘導体化してか、または2つ以上の他の機能性分子に連結させて、3つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することができる。用語二重特異性分子は、本明細書で使用する場合、そのような多重特異性分子もまた包含することを意図する。本開示の二重特異性分子を生み出すためには、本開示の抗体を、1つまたは複数の他の結合性分子、例として、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合性模倣物質に、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性に結び付けることまたは別の方法により機能的に連結することができ、結果として、二重特異性分子が生じる。単鎖抗体本開示の抗体は、単鎖抗体ScFvであり得、この場合、重鎖および軽鎖の可変領域Fv領域が柔軟なリンカーにより接続されて、単一のポリペプチド鎖を形成しており、このポリペプチド鎖が、抗原結合性領域を形成する。そのような単鎖抗体は、2つの可変ドメインのポリペプチドVLおよびVHをコードするDNAの間にペプチドリンカーをコードするDNAを融合させることによって調製することができる。結果として生じるポリペプチドは、2つの可変ドメインの間の柔軟なリンカーの長さに応じて、自らの上に再び折り畳まれて、抗原結合性の単量体を形成する場合、または多量体例えば、二量体、三量体もしくは四量体を形成する場合があるKorttら1997Prot.Eng.10:423;Korttら2001Biomol.Eng.18:95~108。異なるVLとVHとを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体性のScFvを形成することができるKriangkumら2001Biomol.Eng.18:31~40。単鎖抗体は、当技術分野で知られている種々の技法を使用して生産することができる。イムノコンジュゲート本開示の抗体は、イムノコンジュゲートまたは抗体-薬物のコンジュゲートADCであり得る。イムノコンジュゲートにより、モノクローナル抗体の結合特異性と化学療法剤の効力とが組み合わさる。抗ノッチ1抗体をコードするポリヌクレオチドまた、本開示は、本開示の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドおよびペプチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。一態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む組成物、例として、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本開示の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本開示の抗体またはポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。別の態様では、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチドのうちのいずれかを作製する方法を提供する。また、本開示は、任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖コード鎖もしくはアンチセンス鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、DNAゲノムDNA、cDNAもしくは合成DNA分子であってもまたはRNA分子であってもよい。RNA分子は、イントロンを含有し、DNA分子に一対一の様式で対応するHnRNA分子、およびイントロンを含有しないmRNA分子を含む。追加のコード配列または非コード配列が、必要でない場合もあるが、本開示のポリヌクレオチド内部に存在し得、ポリヌクレオチドが、必要でない場合もあるが、他の分子および/または支持材料に連結され得る。ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列すなわち、抗体もしくはその一部をコードする内在性の配列を含んでもよく、またはそのような配列の変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチドの変異体は、コードするポリペプチドの免疫反応性を、ネイティブな免疫反応性分子と比べて減少させないように、1つまたは複数の置換、付加、欠失および/または挿入を含有する。コードするポリペプチドの免疫反応性に対する作用は一般に、本明細書の記載に従って評価することができる。変異体は、ネイティブな抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは、少なくとも約70の同一性、より好ましくは、少なくとも約80の同一性、その上より好ましくは、少なくとも約90の同一性、最も好ましくは、少なくとも約95の同一性を示す。2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、一致が最大となるように整列させる場合、2つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであるならば、同一であるといわれる。当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載するポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最低限の相同性を示す。にもかかわらず、コドンの使用の差に起因して変化するポリヌクレオチドは、本開示により具体的に企図される。さらに、本明細書において提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も、本開示の範囲に属する。対立遺伝子は、1つまたは複数の突然変異、例として、ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換の結果として変化している内在性の遺伝子である。結果として生じたmRNAおよびタンパク質は、必要でない場合もあるが、構造または機能の変化を示し得る。対立遺伝子は、標準的な技法例として、ハイブリダイゼーション、増幅および/またはデータベース配列との比較を使用して同定することができる。本開示のポリヌクレオチドは、化学的合成、組換えの方法またはPCRを使用して得ることができる。組換えの方法を使用してポリヌクレオチドを調製するためには、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクター内に挿入することができ、続いて、ベクターを適切な宿主細胞内に導入して、複製および増幅を行うことができる。適切なクローニングベクターは、標準的な技法に従って構築してもよく、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択するクローニングベクターは、使用することを意図する宿主細胞に従って変化し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有し得、かつ/またはベクターを含有するクローンを選択する際に使用することができるマーカーのための遺伝子を担持し得る。発現ベクターは一般に、本開示に従うポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソーム、または染色体DNAに内在する部分のいずれかとして、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが示唆される。ベクターの構成成分として一般に、これに限定されないが、以下、すなわち、シグナル配列;複製開始点;1つもしくは複数のマーカー遺伝子;適切な転写制御エレメント例として、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結コドンのうちの1つまたは複数を挙げることができる。目的のポリヌクレオチドを含有するベクターを、いくつかの適切な手段のうちのいずれかにより、宿主細胞内に導入することができ、それらの手段には、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および感染例えば、ベクターが、感染性病原体、例として、ワクシニアウイルスである場合がある。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択はしばしば、宿主細胞の特徴に依存する。また、本開示は、本明細書に記載するポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種のDNAを過剰発現することが可能である任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的で使用することができる。適切な非哺乳動物宿主細胞は、原核生物例として、大腸菌E.coliまたは枯草菌B.subtillisおよび酵母例として、出芽酵母S.cerevisae、分裂酵母S.pombe;またはクリベロミセスラクチスK.lactisを含む。好ましくは、宿主細胞は、宿主細胞中に対応する内在性の目的の抗体またはタンパク質のcDNAが存在する場合には、それよりも、約5倍高い、より好ましくは、10倍高い、さらにより好ましくは、20倍高いレベルでcDNAを発現する。医薬組成物別の態様では、本開示は、組成物、例えば、本開示のモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性部分複数可の1つまたは組合せを、薬学的に許容できる担体と一緒に製剤化して含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本開示の抗体の1つもしくは組合せ例えば、2つ以上の異なる抗体またはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性分子を含むことができる。例えば、本開示の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは相補的な活性を示す抗体の組合せまたはイムノコンジュゲートもしくは二重特異性を含むことができる。また、本開示の医薬組成物は、組合せ療法において、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、組合せ療法は、本開示の抗ノッチ1抗体を、少なくとも1つの他の抗炎症剤、抗がん剤または免疫抑制剤と組み合わせて含むことができる。組合せ療法において使用することができる治療剤の例が、下記の本開示の抗体の使用に関するセクションに、より詳細に記載されている。本明細書で使用する場合、薬学的に許容できる担体は、生理学的に適合性であるあらゆる溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。典型的には、担体は、例えば、注射または注入による静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、その抗原結合性部分、イムノコンジュゲートまたは二重特異性分子を、化合物を不活性化させる可能性がある酸の作用および他の天然の条件から化合物を保護するための材料中に被覆することができる。特定の実施形態では、本開示の抗体は、双性イオンの形態を含めた中性の形態をとってかまたは正もしくは負に荷電している種として存在し得る。場合によっては、抗体は、対イオンと複合体を形成して、薬学的に許容できる塩を形成することもできる。したがって、本開示の医薬化合物は、1つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含むことができる。薬学的に許容できる塩は、親化合物例えば、抗体の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的作用をもたらさない塩を指す例えば、Berge,S.M.ら1977J.Pharm.Sci.66:1~19を参照されたい。例えば、用語薬学的に許容できる塩は、1つまたは複数の抗体と1つまたは複数の対イオンとを含む複合体を含み、対イオンは、薬学的に許容できる無機および有機の酸および塩基から得られる。そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、無毒性の無機酸、例として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等、および無毒性の有機酸、例として、脂肪族のモノ-およびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸等から得られるものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等、および無毒性の有機アミン、例として、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等から得られるものを含む。さらに、薬学的に許容できる無機塩基は、金属イオンも含む。金属イオンとして、これに限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および他の生理学的に許容できる金属イオンが挙げられる。無機塩基から得られる塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレニウム、スズ、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩、第一マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウムおよび亜鉛、ならびにそれらの通常の原子価をとるものを含む。本開示の抗体の薬学的に許容できる酸付加塩は、以下の酸から調製することができ、それらの酸として、非限定的に、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、樟脳酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、芬くぬぎ酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リジン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、p-ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボニン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β-ヒドロキシ酪酸、グリシン、グルシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサール5-リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、N-アセチル-L-アスパラギン酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が挙げられる。薬学的に許容できる有機塩基は、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミンN-メチルグルカミン、プロカイン、環状アミン、四級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、2-エチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジウム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸、6-アミノ-2-メチル-2-ヘプタノール、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール、脂肪族のモノ-およびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、2-N-モルホリノエタンスルホン酸、ビス2-ヒドロキシエチルアミノ-トリスヒドロキシメチルメタン、N-2-アセトアミド-2-アミノエタンスルホン酸、1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸、3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、1,3-ビス[トリスヒドロキシメチルメチルアミノ]プロパン、4-モルホリンプロパンスルホン酸、4-2-ヒドロキシエチルピペラジン-1-エタンスルホン酸、2-[2-ヒドロキシ-1,1-ビスヒドロキシメチルエチルアミノ]エタンスルホン酸、N,N-ビス2-ヒドロキシエチル-2-アミノエタンスルホン酸、4-N-モルホリノブタンスルホン酸、3-N,N-ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、2-ヒドロキシ-3-[トリスヒドロキシメチルメチルアミノ]-1-プロパンスルホン酸、4-2-ヒドロキシエチルピペラジン-1-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、ピペラジン-1,4-ビス2-ヒドロキシプロパンスルホン酸二水和物、4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンプロパンスルホン酸、N,N-ビス2-ヒドロキシエチルグリシン、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-4-ブタンスルホン酸、N-[トリスヒドロキシメチルメチル]-3-アミノプロパンスルホン酸、N-トリスヒドロキシメチルメチル-4-アミノブタンスルホン酸、N-1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸、2-シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸、3-シクロヘキシルアミノ-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸、3-シクロヘキシルアミノ-1-プロパンスルホン酸、N-2-アセトアミドイミノ二酢酸、4-シクロヘキシルアミノ-1-ブタンスルホン酸、N-[トリスヒドロキシメチルメチル]グリシン、2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール、ならびにトロメタモールを含む。また、本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として、1水溶性の抗酸化剤、例として、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等;2油溶性の抗酸化剤、例として、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソールBHA、ブチル化ヒドロキシトルエンBHT、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール等;および3金属キレート化剤、例として、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸EDTA、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。本開示の医薬組成物中で利用することができる適切な水性および非水性の担体の例として、水、エタノール、ポリオール例として、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等およびそれらの適切な混合物、植物油、例として、オリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例として、オレイン酸エチルが挙げられる。例えば、被覆材料、例として、レシチンの使用により、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。また、これらの組成物は、アジュバント、例として、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤を含有することもできる。上記の滅菌手順、ならびに種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含ませることの両方によって、微生物の存在の阻止を保証することができる。また、等張化剤、例として、糖、塩化ナトリウム等を組成物中に含めるのが望ましい場合もある。さらに、吸収を遅延させる薬剤、例として、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、注射用医薬剤型の吸収の延長をもたらすこともできる。薬学的に許容できる担体は、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射用の液剤または分散剤を用時調製するための無菌の粉末を含む。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。従来の媒体または薬剤はいずれも、活性化合物と不和合性である場合を除き、本開示の医薬組成物中でのそれらの使用を企図する。また、補助的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。治療用組成物は典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物を、高い薬物濃度に適した液剤、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の秩序ある構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えば、被覆、例として、レシチンの使用により、分散剤の場合には、必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例として、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレートの塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、注射用組成物の吸収の延長をもたらすことができる。適切な溶媒中に、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つまたは組合せと共に組み込み、続いて、滅菌精密ろ過を行うことによって、無菌注射用液剤を調製することができる。一般に、基剤としての分散媒体、および上記に列挙したものに属する必要な他の成分を含有する無菌のビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって、分散剤を調製する。無菌注射用液剤を調製するための無菌の散剤の場合には、調製の方法として、これらに限定されないが、任意の追加の所望の成分を足した活性成分のあらかじめ無菌ろ過した溶液から得られた、それらの成分の粉末を得る真空乾燥および凍結して乾燥すること凍結乾燥が挙げられる。担体材料と組み合わせて、単一の剤形を生成することができる活性成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて変化する。担体材料と組み合わせて、単一の剤形を生成することができる活性成分の量は一般に、治療効果をもたらす組成量である。一般に、薬学的に許容できる担体と組み合わせた場合、百分率として、この量は、約0.01パーセント~約99パーセントの活性成分、好ましくは、約0.1パーセント~約70パーセント、最も好ましくは、約1パーセント~約30パーセントの活性成分の範囲に及ぶ。投与計画を調節して、最適な所望の応答例えば、治療応答をもたらす。例えば、単回のボーラスを投与すること、いくつかの分割用量を、長期にわたり投与すること、または用量を、治療状況の要件が示すところに従って比例的に低下もしくは増加させることができる。投与の簡便性および投与量の一様性のために、非経口組成物を投与量単位剤型として製剤化するのがとりわけ好都合である。投与量単位剤型は、本明細書で使用する場合、治療しようとする対象のための投与量の単位として適した物理的に個別の単位を指す。それぞれの単位が、必要な薬学的担体と一緒に合わさって所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の分量を含有する。本開示の投与単位剤型についての特定化は、a活性化合物の特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびにbそのような活性化合物を調剤する当技術分野に内在する、個体における感受性を取り扱うことについての制限により定まり、それらに直接依存する。抗体を投与する場合、投与量は、約0.0001~100mg/kg宿主体重、より一般的に、0.01~5mg/kg宿主体重の範囲に及ぶ。例えば、投与量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重もしくは10mg/kg体重、または1~10mg/kgの範囲内であり得る。例示的な治療計画では、投与を、週1回、2週に1回、3週に1回、4週に1回、月1回、3カ月に1回または3~6カ月に1回行う。本開示の抗ノッチ1抗体のための投与計画として、例えば、静脈内投与を介する1mg/kg体重または3mg/kg体重が挙げられ、抗体を、以下の投与スケジュール、すなわち、i4週に1回、6回投与し、次いで、3カ月毎;ii3週毎;iii3mg/kg体重を1回、続いて、1mg/kg体重を3週毎のうちの1つを使用して投与する。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2つ以上のモノクローナル抗体を、同時に投与し、この場合には、投与されるそれぞれの抗体の投与量が、指定される範囲内に収まる。抗体は通常、複数の機会を設けて投与する。各投与の間の間隔は、例えば、1週、1カ月、3カ月または1年であり得る。また、間隔は、患者中の標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定による指標に従って変則的であってもよい。投与量を調節して、いくつかの方法では、約1~1000μg/mlの血漿抗体濃度を達成し、いくつかの方法では、約25~300μg/mlを達成する。あるいは、抗体を、持続放出性製剤として投与することもでき、この場合には、必要な投与頻度が低下する。投与量および頻度は、患者中の抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が、最も長い半減期を示し、それに、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、治療が、予防のためまたは治療のためのいずれであるかに応じて変化し得る。予防的適用では、比較的低い投与量を、比較的長い間隔で、長い期間にわたり投与する。患者の中には、残りの生涯にわたり治療を受け続ける者もいる。治療的適用では、時には、比較的高い投与量が、比較的短い間隔で、疾患の進行が低下するかまたは止まるまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで必要になる。その後、患者には、予防的な形態を投与し得る。患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者に望まれる治療応答を達成するのに有効な活性成分の量、組成物および投与様式を得るように、本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルを変化させることができる。選択される投与量レベルは、多様な薬物動態学的要因に依存し、それらの要因には、利用する本開示の特定の組成またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、利用する特定の化合物の排泄速度、治療の持続期間、利用する特定の組成と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および/または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康および以前の病歴、ならびに医学技術においてよく知られている同類の要因が含まれる。本開示の抗ノッチ抗体の治療有効投与量の結果、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状を示さない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患に罹患していることに起因する機能的障害もしくは身体障害の阻止が得られる。例えば、ノッチ1陽性腫瘍の治療のためには、治療有効投与量により、細胞の増殖または腫瘍の増殖が、未治療対象と比べて、好ましくは、少なくとも約20、より好ましくは、少なくとも約40、さらにより好ましくは、少なくとも約60、さらにより好ましくは、少なくとも約80だけ阻害される。化合物の、腫瘍の増殖を阻害する能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の阻害する能力を検査することによって評価することもでき、アッセイによるinvitroにおけるそのような阻害は、当業者に知られている。治療用化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させるか、または別の点で対象における症状を寛解させることができる。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択した特定の組成または投与経路等の要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。本開示の組成物を、当技術分野で知られている多様な方法のうちの1つまたは複数を使用して、1つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者であれば理解するであろうが、投与の経路および/または様式は、所望の結果に応じて変化する。本開示の抗体のための投与経路は、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路を含む。句非経口投与は、本明細書で使用する場合、経腸投与および外用投与以外の通常、注射による投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含む。あるいは、本開示の抗体またはその抗原結合部分を、外用、上皮または粘膜の投与経路等の非経口以外のnon-parenteral経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または外用の投与経路を介して投与することもできる。インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出性製剤等、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて、活性化合物を調製することができる。生分解性、生体適合性ポリマー、例として、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許権を有するかまたは当業者に一般に知られている。例えば、SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems、J.R.Robinson編、MarcelDekker,Inc.、NewYork、1978を参照されたい。本開示の使用および方法本開示の抗体、特に、ヒト抗体、抗体組成物および方法には、ノッチ1媒介性障害の診断および治療に関与する、invitroおよびinvivoにおける診断および治療の多数の有用性がある。例えば、これらの分子を、invitroもしくはexvivoにおいて培養物中の細胞に投与してか、またはヒト対象には、例えば、invivoにおいて投与して、多様な障害を治療、予防および診断することができる。本明細書で使用する場合、用語対象は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例として、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ノッチ1活性が媒介する障害を有するヒト患者を含む。方法は、異常なノッチ1の発現または活性化と関連している障害を有するヒト患者を治療するのに特に適している。ノッチ1に対する抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合、これら2つは、いずれかの順番でかまたは同時に投与することができる。本開示の抗体がノッチ1に特異的に結合することを考慮すると、本開示の抗体は、細胞表面上のノッチ1の発現を特異的に検出するために使用することができ、さらに、ノッチ1を、免疫親和性による精製を介して精製するために使用することもできる。さらに、本開示の抗体、抗体組成物および方法は、異常なノッチ1の発現、例えば、がんを有する対象を治療するためにも使用することができる。1つの特定の実施形態では、がんは、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALLである。別の特定の実施形態では、がんは、非小細胞肺がんNSCLC、乳がん、結腸がんまたは卵巣がんである。本開示の抗体により治療することができる異常なノッチ1の発現の他のタイプとして、例えば、中皮腫、肝胆道肝臓および胆道の導管、原発性もしくは続発性のCNS腫瘍、原発性もしく続発性の脳腫瘍、肺がんNSCLCおよびSCLC、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部もしく頚部のがん、皮膚もしく眼内のメラノーマ、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、消化器胃、結腸直腸および十二指腸、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、精巣がん、慢性もしく急性の白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系CNSの新生物、原発性CNSリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または前述のがんのうちの1つもしく複数の組合せが挙げられる。本開示の抗体組成物例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性の分子、ならびにイムノコンジュゲートをinvivoおよびinvitroにおいて投与する適切な経路は、当技術分野でよく知られており、当業者が選択することができる。例えば、抗体組成物を、例えば、静脈内または皮下の注射により投与することができる。使用する分子の適切な投与量は、対象の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および/または処方に依存する。本開示のヒト抗ノッチ1抗体は、1つまたは他の複数の治療剤、例えば、細胞傷害剤、放射毒性の薬剤または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体を、免疫複合体として薬剤に連結すること、または薬剤とは別個に投与することができる。後者別個の投与の場合、抗体は、薬剤の前、後にかもしくは薬剤と同時に投与してもよく、または他の知られている療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線と同時投与してもよい。抗体および薬剤を、同時の、連続的なまたは別個の投与のために調製することができる。そのような治療剤として、とりわけ、抗悪性腫瘍剤、例として、ドセタキセル、ドキソルビシンアドリアマイシン、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素が挙げられ、それらの抗悪性腫瘍剤自体は、患者にとって毒性または準毒性であるレベルにおいてのみ有効である。シスプラチンを、100mg/用量として4週に1回静脈内投与することができ、アドリアマイシンを、60~75mg/mlの用量として21日に1回静脈内投与する。本開示のヒト抗ノッチ1抗体と化学療法剤との同時投与により、ヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害作用をもたらす異なる機構を介して作動する2つの抗がん剤が提供される。キットまた、本開示の抗体組成物例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性の分子、またはイムノコンジュゲート、および使用のための指示を含むキットも本開示の範囲に属する。キットは、1つまたは複数の追加の試薬、例として、免疫抑制試薬、細胞傷害剤もしくは放射毒性の薬剤、または1つもしくは複数の追加の本開示の抗体例えば、第1のヒト抗体とは明確に異なるノッチ1抗原中のエピトープに結合する相補的な活性を有するヒト抗体をさらに含有することができる。したがって、本開示の抗体組成物を用いて治療する患者には、本開示のヒト抗体の投与の前に、それと同時にまたはその後に、ヒト抗体の治療効果を増強するかまたは増大させる別の治療剤、例として、細胞傷害性または放射毒性の薬剤もさらに投与することができる。本開示を、以下の実施例によりさらに例証するが、これらの実施例は、本開示をさらに限定すると解釈してはならない。全ての図ならびに本出願全体を通して引用する全ての参考文献、特許および公開されている特許出願の内容が、参照により本明細書に明確に組み込まれている。実施例1組換えのヒトおよびマウスのノッチ1タンパク質免疫原の生成A.ヒトおよびマウスのノッチ1NRRタンパク質の発現および精製N末端にシグナルペプチドを、C末端にAviおよびHis6からなるタグを有する、表1に示すノッチ1NRR領域、すなわち、ヒトノッチ1についての配列番号2のアミノ酸、およびマウスノッチ1についての配列番号6のアミノ酸をコードするcDNA構築物を、発現ベクターpSMED2中にクローニングした。これらの構築物を、COS細胞またはチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞中に一過性にトランスフェクトし、馴化培地中の分泌タンパク質を、SDS-PAGE上で分析した。S1切断部位におけるプロセシングの後に、ノッチ1NRRドメインのN末端側の約26キロダルトンLNR-A、B、CおよびHD1の半分とC末端側の約12キロダルトンHD2およびAvi_Hisタグの半分とが、非共有結合性相互作用を通して結び付いた状態を維持して、図1に示すヘテロ二量体複合体を形成する。ノッチ1NRRのS1プロセシングは、CHO細胞から調製した試料中では約50以下であることを決定した。S1切断部位におけるプロセシングを増強するために、ノッチ1NRR発現構築物を、CHO-PACE細胞中にトランスフェクトしHarrisonら、SeminHematol.1998Apr;352Suppl2:4~10、ノッチ1NRRの最も高い発現および完全なプロセシングを示す安定な細胞株を選択した。これらの細胞株の培養を拡大して、馴化培地CMの収集を行い、そこから、ノッチ1NRRタンパク質を精製した。濃縮したCHO-PACEのCMを、PBSを用いて平衡化した27mlのQiagenNi-NTASuperflowカラム上に、1ml/分の流速、4°Cで充填した。充填の後、10カラム体積CVのPBS、続いて、10CVの緩衝液A300mMNaCl、50mMNa2HPO4、pH8.0、続いて、10CVの4緩衝液B500mMイミダゾール、300mMNaCl、50mMNa2HPO4、pH8.0を用いて、カラムを洗浄した。ヒトノッチ1Avi_Hisを、10CV上の100緩衝液Bに対する直線勾配を使用して溶出した。ヒトノッチ1Avi_Hisを含有する画分をプールし、ろ過し、カルシウム、マグネシウムを含有しないCMFPBSに対して透析した。TBS1mMCaCl2、0.1mMZnCl2を用いて平衡化した、縦に並べたSuperdex-200カラムおよびSuperdex-75カラム総CV=600ml上における2回の分子ふるいクロマトグラフィーを用いて、タンパク質をさらに精製した。精製したヒトおよびマウスのノッチ1NRR_Avi_Hisタグタンパク質のSDS-PAGE分析は、精製タンパク質の>90が予測されるノッチ1NRRのN末端およびC末端のペプチドのサイズに正しく切断されたことを示している。精製したヒトおよびマウスのノッチ1NRRタンパク質の光散乱SEC-MAL解析は、ネイティブな条件下で、分子ふるいカラム上に40キロダルトンの予想される分子量におけるピークを示し、このことは、未変化のノッチ1NRRヘテロ二量体の適切な形成を示している。B.cyno-ノッチ1NRR-Fcの融合タンパク質の発現および精製N末端にシグナルペプチド、C末端にヒトIgG1のFc断片を有する、表1に示すcynoノッチ1NRR領域、すなわち、cynoノッチ1についての配列番号10のアミノ酸をコードするcDNA構築物を、発現ベクターpSMED2中にクローニングした。この構築物を、293Invitrogen細胞中に、可溶性PACE過剰発現構築物と共に一過性にコトランスフェクトしてHarrisonら、SeminHematol.1998Apr;352Suppl2:4~10、cyno-ノッチ1NRR領域の完全なプロセシングを確保した。馴化培地を、トランスフェクトした細胞から収集し、cyno-ノッチ1NRR-Fcの融合タンパク質を、プロテインA親和性による精製を介して精製した。次いで、精製タンパク質を、1mMCaCl2を含有するTBS中に透析した。SDS-PAGE分析は、2つのポリペプチド断片を、12キロダルトンHD1および37キロダルトンHD2Fcの予想されるサイズにおいて示し、タンパク質は、>95の純度で調製された。ネイティブな条件下におけるSECによる解析は、上記に記載した2つの断片のヘテロ二量体を示す、およそ50キロダルトンの単一ピークを示し、調製物中の凝集体は最低限の量<1であった。下記の表1は、ヒト、マウスおよびcynoのノッチ1NRR領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。実施例2ラット抗ノッチ1阻害性抗体の生成、クローニングおよびヒト化A.免疫化およびハイブリドーマ生成実施例1に記載したヒトおよびマウスの免疫原をSprague-Dawleyラット中に同時注射して、ハイブリドーマの生成を行った。フロイントの完全アジュバント中に、ヒトおよびマウスのノッチ1NRR_Avi_His組換えタンパク質をそれぞれ20μg含有する混合物の皮下注射により、Sprague-Dawleyラットを免疫化した。免疫化を、2週間隔で12週間繰り返した。第1の注射後の第0、35、49および63日に収集した血清試料を、下記の記載に従って、循環している抗ノッチ1抗体の力価の活性について、酵素結合免疫吸着測定法ELISAにより試験した。最適力価に達したら、タンパク質混合物の最終用量を、最適抗体価を有するラット中に静脈尾静脈内注射し、4日後に、ラットを屠殺して、脾細胞の収集を行った。ラットから得られた全ての脾細胞2×10E08個を、PEG4000を使用して、マウス骨髄腫細胞株P3X63.Ag8.6532.5×10E07個と融合させた。融合させた細胞を、96ウエルプレート中に蒔き0.2ml/ウエル、HAT選択を行った5×10E-04Mヒポキサンチン、1.6×10E-05Mチミジン、4×10E-04Mアミノプテリンおよび20熱不活性化FCSを含有するRPMI1640。融合後の第14日に、ハイブリドーマ上清を収集し、下記の記載に従って、ELISAにより、ヒトおよび/またはマウスのノッチ1NRR組換えタンパク質、ならびにU-2OS細胞表面上に発現させた完全長ノッチ1に対する結合活性を示すラットIgGの存在について試験した。ノッチ1標的に対して結合活性を示した上清を、下記の記載に従って、レポーター遺伝子アッセイにおいて、ノッチ1媒介性シグナル伝達活性を遮断するそれらの能力についてさらに試験した。次いで、選択したノッチ1シグナル伝達を遮断するクローンをサブクローニングして、さらに分析した。B.ノッチ1特異的抗体のスクリーニングおよび選択1.組換えタンパク質結合ELISAハイブリドーマ培養物から得られた上清を、組換えのヒトおよびマウスの免疫原に対する結合について、ELISAにより最初にスクリーニングした。精製したヒトまたはマウスのノッチ1NRR_Avi_Hisタグタンパク質を、1μg/mlの濃度のMg/Caを有する100μlのPBS中で、CoStar高結合性96ウエルELISA用プレート上に一晩コートした。プレートを、PBS-Mg/Caを用いて洗浄し、PBS-Mg/Ca中で1BSAを用いて1時間ブロックした。ブロック用溶液をプレートからデカンテーションし、ハイブリドーマ培養物上清をプレートに適用した。室温で1時間インキュベーションを行った後、プレートを、PBS-Mg/Caを用いて再び洗浄してから、ブロック用緩衝液中で1:20,000に希釈したHRPコンジュゲート二次抗体を適用した。試験する一次抗体がラットIgGである場合には、二次抗体はヤギ抗ラットIgGFcBethylBiotechであり、一次抗体がマウスIgGである場合には、二次抗体はヤギ抗マウスIgGFcThermalScientificであった。二次抗体との1時間のインキュベーションの後、プレートを上記の記載に従って再び洗浄し、TMB基質溶液を添加した。反応を10分間発生させてから、停止用溶液0.18MH2SO4を添加した。O.D.450nMにおける吸光度を測定し、MicrosoftExcelおよびGraphpad-Prizmソフトウエアを用いて、データをプロットし、解析した。ヒトおよび/またはマウスのノッチ1NRRに対して結合活性を示す抗体を選択して、下記の記載に従って、細胞ベースELISAをさらに行った。2.細胞ベースELISA次いで、上記に記載した組換えノッチ1NRRに基づいたELISAにおいて免疫原に対する陽性の結合を提示したクローンから得られた上清を、細胞ベースELISAにおいて、細胞表面のノッチ1に対する結合についてスクリーニングした。細胞表面上にヒトまたはマウスの完全長ノッチ1タンパク質を安定に過剰発現するU-2OS細胞を、ELISAアッセイの前日に、96ウエルプレート白色不透明、BD/VWR中に50,000細胞/ウエルで蒔いた。ELISAの当日に、培地をウエルから除去し、ブロック用緩衝液中で1:3に段階希釈した抗体溶液またはハイブリドーマ培養物上清をプレートに適用した。プレートを、室温で2時間インキュベートしてから、PBS-Mg/Caを用いて洗浄した。次いで、HRPコンジュゲート二次抗体を適用し、上記の記載に従って細胞と共に1時間インキュベートして、組換えタンパク質のELISAを行った。プレートを、PBS-Mg/Caを用いて洗浄してから、Pico-Chemiluminescent発光キットThermalScientificを用いて発光させ、化学発光の測定を、製造元の指示に従って実施した。MicrosoftExcelおよびGraphpad-Prizmソフトウエアを用いて、データのプロットおよび解析を実施した。下記の実施例の記載に従って、ハイブリドーマクローンのスクリーニング、ならびに親ラット抗体およびヒト化抗体の特徴付けにおいて、このデータを使用した。3.レポーター遺伝子アッセイ次いで、免疫原に対する陽性の結合を提示したクローンから得られた上清を、ヒトおよびマウスのノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイRGAにおいて、中和活性についてスクリーニングした。スクリーニングの結果を使用して、初代クローンを選択した。ヒトノッチ1のレポーター細胞を、トリプシン処理し、培養プレートからマッコイ5A完全培地10FBSおよびペニシリン、ストレプトマイシンを有するマッコイ5A、Invitrogen中に収集し、計数した。同じ培地を用いて、細胞の適切な希釈度を得て、96ウエル培養プレート白色不透明、BD/VWR上で、80μlの総体積/ウエル中に、マッコイ5A完全培地中で1:3に段階希釈した抗体溶液またはハイブリドーマ培養物上清の存在下において、3,000細胞/ウエルを整えた。細胞と抗体の希釈物との混合物を、細胞培養用インキュベーター37°C、5CO2中、プレート上で1時間インキュベートしてから、15,000個/ウエルのヒトDLL4-HEK293細胞を、各ウエルに添加した。hHDLL4-HEK293細胞の添加後、プレートを、インキュベーター中でさらに20時間インキュベートし、Dual-GloルシフェラーゼアッセイシステムPromegaを使用して、製造元の指示に従って、ホタルルシフェラーゼ活性および内部対照ウミシイタケRenillaルシフェラーゼ活性を測定した。MicrosoftExcelおよびGraphpad-Prismソフトウエアを使用して、データをプロットし、解析した。マウスノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイを、ヒトノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイについての記載に従って実施したが、ただし、20,000細胞/ウエルのマウスノッチ1のレポーター細胞を、40,000細胞/ウエルのマウスDLL4-HEK293細胞と同時培養した。C.クローニングおよび配列決定細胞表面結合性または中和活性が確認された初代クローンをサブクローニングし、例として、下記にさらに記載するクローン438および351を得た。下記の記載に従って、サブクローンに由来するRNAを抽出し、発現した抗体に由来する可変領域DNA配列を、RT-PCRクローニングを介して得た。1~5×106個のサブクローニングしたハイブリドーマ細胞をホモジナイズし、QIAGENRNAeasyMiniキットを用いて、全RNAを単離した。次いで、SuperScriptIIIRTキットInvitrogenを使用して、第1の鎖のcDNAを生産した。続いて、抗ノッチ1IgGの可変領域についての二本鎖cDNAを生成し、下記の記載に従って、PCRにより、ラットのIgG重鎖IgG1、2a、2bおよび軽鎖カッパまたはラムダの定常領域に由来するプライマーを使用して増幅した。PCRサイクリングの条件:95°C、1分間を1サイクル;95°C、1分間、63°C、1分間および72°C、1分間を25サイクル。結果として生じたRT-PCR産物を、TOPO-BluntクローニングベクターInvitrogenにクローニングし、従来法により配列決定する。親ラット438および親ラット351以下それぞれ、ラット438およびラット351に由来する可変V領域cDNAを、哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングし、ラット可変重鎖VHを、マウスIgG1mIgG1を有するフレーム中に融合させ、ラット可変軽鎖VLを、マウスカッパと融合させた。同様に、ラットV領域とヒトIgG定常領域とを有するキメラ抗体を生成するために、ラットVHを、ヒトIgG1hIgG1を有するフレーム中に、VLをヒトカッパと、それぞれ融合させた。対応するキメラ抗体を、COS細胞中で、これらの構築物から一過性のトランスフェクションにより生成し、それらの結合性および中和活性を、アッセイにおいて確認した。下記の実施例の記載に従って、精製したラット可変-マウス定常のキメラ抗体以下、ラット438-mIgG1およびラット351-mIG1を、組換え抗原と細胞表面標的との結合のアッセイ、RGAにおけるノッチ1活性阻害アッセイおよび血管形成アッセイ、ならびにマウスモデルにおける腫瘍増殖阻害を含めた、一連のinvitroおよびinvivoにおけるアッセイにおいてさらに特徴付けた。リード抗体であるラット438およびラット351は、これらの研究に基づいて選択された。表2は、ラット438およびラット351の可変領域、ならびに追加のクローン90、132、132A12/G11および137の種々の領域のアミノ酸および核酸の配列を列挙する。D.ラット438およびラット351のヒト化ラット438およびラット351をヒト化し、さらに開発を進めて、ヒト化モノクローナル抗体438および351以下それぞれ、ヒト化438およびヒト化351を得た。より低いヒンジ領域中にhIgG1のエフェクター機能を不活性化させる3つの突然変異L234A/L235A/G237Aを有するヒトIgG1重鎖定常領域、およびヒトカッパ軽鎖定常領域を、ヒト化438抗体およびヒト化351抗体のための定常領域として使用した。ラット438およびラット351の可変領域のヒト化を、CDRグラフト戦略を使用して実施した。表3は、ヒト化438変異体およびヒト化351変異体の種々の領域のアミノ酸および核酸の配列を示す。試験後に、リードヒト化438変異体は、VH1.1/VL1.8であることが決定された。ヒト化438VH1.1/VL1.8は、配列番号71に記載する可変重鎖および配列番号97に記載する可変軽鎖を有する。ヒト化438変異体の場合、変異体VH1.0および1.1についてのCDR領域が同じであり、変異体VL1.0、1.1、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.10および1.11についてのCDR領域が同じである。試験後に、リードヒト化351変異体は、VH1.0/VL1.1であることが決定された。ヒト化351VH1.0/VL1.1は、配列番号115に記載する可変重鎖および配列番号129に記載する可変軽鎖を有する。ヒト化351変異体の場合、変異体VL1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6および1.7についてのCDR領域が同じである。関連のCDRドナー配列を有する、ヒトアクセプターフレームワークである重鎖についてのDP54および軽鎖についてのDPK9を含有するcDNAが、GeneArt,AGにより合成された。合成されたcDNA産物を、サブクローニングし、哺乳動物発現ベクターのpSMED2およびpSMN2中でそれぞれ、重鎖についてはヒトIgG1-3m定常領域と、または軽鎖についてはヒトカッパと、インフレームで融合させた。ヒトアクセプターフレームワーク、ラット438およびヒト化438変異体、ならびにラット351およびヒト化351変異体のVHならびにVLのアラインメントを、下記の表4に示す。KabatスキームのCDRに、下線を付す。351VHおよび351VLについては、フレームワーク領域中の小文字のテキストにより、ラット351とヒト化351変異体との間の残基の差を示す。ヒトアクセプターフレームワークとラット438可変領域フレームワークとの間には顕著な、すなわち、VHについては78およびVLについては61の相同性がある。また、ヒトアクセプターフレームワークとラット351可変領域との間にも顕著な、すなわち、VHについては76およびVLについては61の相同性がある。ヒト化の間に、CDRグラフト化抗体から、元々の抗体の活性の喪失が生じる可能性がある。フレームワーク領域の差が、結果として生じたヒト化438抗体およびヒト化351抗体の立体構造の変化の原因となり得、元々の抗体のフレームワークに対して、ヒトアクセプターフレームワーク中の復帰突然変異を選択して、導入して、活性および結合性エピトープを回復させた。表5は、活性および結合性エピトープを最適化するために選択した、ラット438およびラット351の残基に対する、対応する位置におけるヒトアクセプターフレームワーク中の復帰突然変異を示す。実施例3抗ノッチ1阻害性抗体の特徴付けA.発現、およびノッチ1に対する結合ヒト化438変異体およびヒト化351変異体の相対的な発現収率を、COS細胞中の一過性の発現アッセイにおいて試験した。表6に示すように、ヒト化438VH1.1/VL1.8を含めた、いくつかのヒト化438変異体、およびヒト化351VH1.0/VL1.1を含めた、いくつかのヒト化351変異体が、30μg/ml超の顕著な収率を示した。馴化培地中のIgGの総合的な発現レベルを、実施例2の記載に従って、定量的なIgGのELISAにより測定した。表7は、ヒト化438変異体およびラット438、ならびにヒト化351変異体およびラット351について、細胞表面のノッチ1に対する結合ELISAから計算したEC50nM値を示す。データから、ヒト化438VH1.1/VL1.8を含めた、ヒト化438の複数の変異体が、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合において、ラット438に類似することが実証されている。さらに、表7は、ヒト化438のVH1.1/VL1.8およびVH1.1/VL1.3の両方が、U-2OS細胞の細胞表面上に発現するマウスノッチ1に対するラット438の交差反応性を完全に保持したことも示す。データから、ヒト化351のVH1.0/VL1.1およびVH1.1/VL1.4が、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合において、ラット351に類似することがさらに実証されている。さらに、表7は、ヒト化351のVH1.0/VL1.1およびVH1.1/VL1.4が、U-2OS細胞の細胞表面上に発現するマウスノッチ1に対するラット351の交差反応性を完全に保持したことも示す。B.競合ELISA組換えのヒトノッチ1または細胞表面に発現する完全長ヒトノッチ1に対する、ヒト化438変異体とビオチン化ラット438との間、およびヒト化351変異体とビオチン化ラット351との間の競合ELISAを実施した。組換えタンパク質または細胞ベースELISAについての記載に従って、類似する様式で、96ウエル細胞培養プレートに、ノッチ1NRR-Avi_Hisタンパク質をコートする高結合性co-Starプレートかまたは完全長ノッチ1を発現するU-2OS細胞を播種する細胞培養プレート、Co-starのそれぞれのいずれかを行った。ブロック用緩衝液中で1:3に段階希釈した抗体溶液または細胞培養の馴化培地を、0.8nMのビオチン化ラット438抗体またはビオチン化ラット351抗体の存在下において、プレートに適用した。2時間のインキュベーションの後、プレートを、上記の記載に従って洗浄し、ブロック用緩衝液中で1:5000に希釈したHRPコンジュゲートストレプトアビジンSouthernBiotechを適用した。ストレプトアビジンを伴うインキュベーションを30分間行ってから、プレートを再び洗浄し、TMB溶液を加えて10分間発色させた。発色反応を、0.18MH2SO4を添加することによって停止し、450nMにおける吸光度を測定した。MicrosoftExcelおよびGraphpad-Prizmソフトウエアを用いて、データのプロットおよび解析を実施した。表8は、組換えヒトノッチ1NRR免疫原に対する結合についての、ヒト化438変異体とビオチン化ラット438抗体との競合ELISAのEC50nM値を示す。データから、ヒト化438VH1.1/VL1.8を含めた、ヒト化438の複数の変異体は、競合ELISAにおいて、未標識のラット438に類似するEC50値を示したことが示されている。このことは、ヒト化438変異体が、未標識のラット438と同じ程度に良好に、ノッチ1NRR免疫原に対する結合について、ビオチン化ラット438と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化438変異体は、ラット438抗体と同じであるかまたはラット438抗体に類似する、免疫原上のエピトープに結合することが示されている。表8は、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合についての、ヒト化438変異体とビオチン化ラット438抗体との競合ELISAのEC50nM値をさらに示す。データから、ヒト化438VH1.1/VL1.8を含めた、ヒト化438の複数の変異体は、競合ELISAにおいて、未標識のラット438に類似するEC50値を示したことが示されている。このことは、ヒト化438変異体が、未標識のラット438と同じ程度に良好に、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合について、ビオチン化ラット438と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化438変異体は、ラット438抗体と同じであるかまたはラット438抗体に類似する、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1上のエピトープに結合することが示されている。表9は、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合についての、ヒト化351変異体とビオチン化ラット351抗体との競合ELISAのEC50nM値を示す。データから、ヒト化351VH1.0/VL1.1を含めた、ヒト化351の複数の変異体は、競合ELISAにおいて、未標識のラット351に類似するEC50値を示したことが示されている。このことは、ヒト化351変異体が、未標識のラット351と同じ程度に良好に、細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1に対する結合について、ビオチン化ラット351と競合することを実証している。これらの結果から、ヒト化351変異体は、ラット351抗体と同じであるかまたはラット351抗体に類似する、U-2OS細胞の細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ1上のエピトープに結合することが示されている。C.他のヒトノッチ相同体に対する結合の特異性ノッチ受容体ファミリーの他のメンバーが、生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。例えば、マウスモデルにおいて、ノッチ2が欠損すると、胎性致死が生じる。対照的に、マウスモデルにおいては、ノッチ3が欠損しても、遠位動脈における軽度の表現型が生じるに過ぎず、ノッチ4が欠損しても、検出可能な表現型は生じない。ノッチ1NRR領域の最も近い相同体は、ノッチ2およびノッチ3であり約50の相同性、ノッチ4は、関係のより薄い相同体である34の相同性。抗ノッチ1抗体の、ノッチファミリーの他のメンバー、とりわけ、ノッチ2に対する交差反応性が、患者において望まれない作用をもたらす可能性がある。したがって、ラット438抗体およびヒト化438抗体、ならびにラット351抗体およびヒト化351抗体の、他のノッチファミリーメンバーに対する潜在的な交差反応性を評価した。ヒトIgG1のFc断片と融合させたヒトノッチ2およびノッチ3のNRR領域をコードする発現構築物を、CHO-PACE細胞中に安定に導入した。NRR-Fcの融合体を発現するこれらの細胞から得られた馴化培地を収集した。ヒトノッチ2NRR-Fcならびにヒトおよびマウスのノッチ3NRR-Fcを、プロテインA親和性により精製し、続いて、分子ふるいクロマトグラフィーSECを行った。精製した調製物を、1mMCaCl2を有するTBS中に透析し、SECにより解析して分析すると、>99の純度を得た。表10に示すように、ラット438は、ヒトノッチ2NRR-Fcの融合タンパク質に対する検出可能な結合を欠いた。さらに表10に示すように、ヒト化438変異体は、U-2OS細胞表面上に発現する完全長ヒトノッチ3に対する検出可能な結合を欠き、このことは、438は、ノッチ3と交差反応しなかったことを示している。表11に示すように、ヒト化351VH1.0/VL1.1は、ヒトノッチ2NRR-Fcの融合タンパク質ならびにヒトおよびマウスの両方のノッチ3NRR-Fcの融合タンパク質に対する検出可能な結合を欠いた。しかし、ヒト化351VH1.0/VL1.1は、ヒト、マウスおよびcyno-のノッチ1NRRと交差反応した。D.ヒトノッチ1NRRに対する結合親和性抗ノッチ1NRRの相互作用の反応速度定数を、表面プラズモン共鳴Biacore登録商標T100、BiacoreInc.、Piscataway、NJにより決定した。CM5チップのフローセルに、10mMグリシン、pH5.0中で、およそ10,000レゾナンスユニットRUの抗ヒトIgG-FcBiacore登録商標を10μl/分で600秒間固定化した。1mMCaCl2を有するTBS中で希釈した抗ノッチ1ヒト化438変異体および抗ノッチ1ヒト化351変異体10μg/mlを、10μl/分で捕捉した。100μl/分において、ヒトノッチ1NRR_Avi_His組換えタンパク質の4つの濃度3.7~100nMおよびゼロ濃度試験用緩衝液の結合を、1mMCaCl2を有するTBS中で3分間記録した。複合体の解離を、10分間測定した。チップの表面を、3mMEGTAを有する3MMgCl2を10μl/分で60間注入することによって再生した。参照シグナルおよび緩衝液のシグナルを減じた後に得られた曲線を、Biacore登録商標T100評価ソフトウエアBiacore登録商標を用いて、1:1のラングミュア結合モデルに適合させた。選択したヒト化438変異体およびヒト化351変異体、ならびにA2抗体Wu,Y.ら、Nature464:1052~1057、2010の、ヒトノッチ1NRRタンパク質に対する結合親和性を決定し、表12に示した。Biacoreによる動態解析は、選択したヒト化438変異体について、VH1.1/VL1.8およびVH1.1/VL1.3を含めて、A2抗体と比較して、類似するkaオン速度およびkdオフ速度を示した。さらに、Biacoreによる動態解析は、ラット351および選択したヒト化351変異体について、VH1.0/VL1.1およびVH1.1/VL1.4を含めて、A2抗体と比較して、より高いkaオン速度およびkdオフ速度を示した。ラット351および選択したヒト化351変異体について得られたKD値は類似するが、kaオン速度およびkdオフ速度に示されるこれらの差は、下記の実施例に記載する、ノッチ1依存性のシグナル伝達に対する明確に異なる中和活性において役割を果たしている可能性がある。D.熱安定性タンパク質またはタンパク質ドメインの熱安定性は、タンパク質またはタンパク質ドメインの安定性と正に相関する。タンパク質またはタンパク質ドメインのより高い融点はしばしば、製造性の改善およびより長い有効期間をもたらす。示差走査熱量測定DSCを使用して、ヒト化438変異体およびラット438-mIgG1の熱安定性を評価した。タンパク質試料をPBS中に希釈して、250μlの体積中の0.3mg/mlとした。対応する調合用緩衝液のブランクを使用して、参照試料を得た。8°Cに設定したMicroCalThermoVacSampleDegassingandThermostatMicrocal,Inc.、Northampton、MAを使用して、両方の試料を徹底的に脱気した。MicroCalVP-DSCCapillaryCellMicroCalorimterMicrocal,Inc.、Northampton、MAの適切なセル中に試料を分注した。試料を、15°Cで4分間平衡化し、次いで、100°C/時間の速度で100°Cまでスキャンした。20秒のフィルタリング期間を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を正規化した。OriginSoftwareOriginLabCorporation、Northampton、MAを使用して、データを、適切な数の転移を有するMN2-StateModelに適合させた。下記の表13に示すように、全てのヒト化438変異体が、それらのFab領域において、ラット438-mIgG1と比較して、より高い熱安定性を示し、このことは、より高い融点により示されている全てが、77°Cを上回った。実施例4ノッチ1NRR上の、抗ノッチ1阻害性抗体に結合するエピトープの同定A.ドメインスワップキメラ構築物実施例3に記載したように、ヒト化438変異体およびヒト化351変異体は、ノッチ3タンパク質との交差反応性を欠いた。ノッチ1NRRとノッチ3NRRとのドメインスワップキメラ構築物を調製して、抗ノッチ1ラット438-mIgG1抗体、抗ノッチ1ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体のエピトープマッピングを行った。C末端Fc融合ヒトIgG1のFc断片を有する、ヒトノッチ3-ノッチ1本明細書においては、ノッチ3-1と呼ぶNRR領域のドメインスワップキメラをコードする発現構築物を個々に、CHO-PACE中にトランスフェクトし、各キメラを発現する安定なプールを確立した。それぞれの安定なプールから得られた馴化培地を、プロテインA親和性クロマトグラフィーに、続いて、分子ふるいクロマトグラフィーSECに適用して、キメラ融合タンパク質の精製を行った。次いで、精製した調製物を、1mMCaCl2を有するTBS中に透析し、SECにより解析して分析した。図2は、ラット351-mIgG1、ラット438-mIgG1およびA2についてエピトープマッピングを行うための、組換えヒトノッチ1NRRドメインと組換えヒトノッチ3NRRドメインとのスワップキメラ構築物を示す。図2に示すように、組換えNRRキメラタンパク質は、ヒトFc未表示に融合させた、種々のノッチ3灰色で示すおよびノッチ1黒色で示すのドメインからなる。ノッチ3-1NRRドメインスワップキメラに対する、ラット438-mIgG1およびラット351-mIgG1の相対的な結合能力を、Biacore登録商標SPR技術を用いて試験し、抗体の相対的なレゾナンスユニットRUによる結合能力を試験した。ノッチ3-1NRRキメラに対する、ラット438-mIgG1およびラット351-mIgG1のSPRによる結合性を、表面プラズモン共鳴Biacore登録商標3000、BIAcoreInc.、Piscataway、NJにより決定した。CM5チップのフローセルに、10mMグリシン、pH5.0中で、抗マウスIgGヤギおよび対照としてのヤギIgGのそれぞれのおよそ10,000RUを10μl/分で600秒間固定化した。0.1mMCaCl2を有するHBS-P中で1μg/mlに希釈したラット438-mIgG1抗体およびラット351-mIgG1抗体を、10μl/分で300秒間捕捉した。およその捕捉は、それぞれの抗体について、150RUであった応答1。次に、10μg/mlのノッチ3-1NRRキメラを、同じ緩衝液中で、捕捉されたラット438-mIgG1抗体およびラット351-mIgG1抗体上に10μl/mlで300秒間注入し、捕捉されたノッチ3-1NRRを測定した応答2。各サイクルの後の複合体の解離を、10mMAcpH1.5を30μl/分で20秒間使用して達成した。図2に示すように、ノッチ1NRRのドメインに対する、ラット438-mIgG1およびラット351-mIgG1のエピトープ結合プロファイルは、ノッチ1NRRのドメインに対するA2の結合プロファイルとは明確に異なる。より具体的には、NRRに対するA2の結合性は、LNR-Bドメインに、ラット438-mIgG1よりも依存する。さらに、ノッチ1NRRに対するラット351-mIgG1の結合性の、LNR-AドメインおよびLNR-Bドメインに依存する程度は、A2と比較して低い。ドメインの結合プロファイルの差を、下記に記載する共結晶構造から明らかになったノッチ1NRR中の接触残基の差に関する、ならびにラット438-mIgG1およびA2との結合におけるノッチ1NRRの明確に異なる配向性に関するより詳細な情報と組み合わせると、ラット438-mIgG1は、ノッチ1NRRと、A2とは異なる様式で相互作用することが示される。B.X線結晶解析ラット438およびラット351を、上記の実施例2の記載に従って、発現させ、精製した。Fab抗原結合性断片を、ラット438およびラット351から、PierceFab調製キット固定化パパイン、製品番号44685を使用して生成した。ラット438およびラット351を、固定化パパインと共に37°Cで24時間インキュベートした。Fabを、50mMTrispH8.0を用いて平衡化したZebaカラムPierceを用いて脱塩することによって精製した。Fabを、50mMTrispH8.0を用いて平衡化したQFFカラムから得られたフロースルー中に収集した。得られたFab断片とヒトノッチ1NRRタンパク質とを、1:1.2のモル比で、0.9mMCaCl2を添加して混合し、氷上で30分間インキュベートしてから、25mMTrispH8.0、150mMNaClおよび0.9mMCaCl2を用いて平衡化したS200分子ふるいカラム上で精製した。Fab:NRRの複合体を含有する顕著なピークから得られた画分を、プールし、10キロダルトンのカットオフのVivaspinHY濃縮器Sartoriusを使用して11mg/mlまで濃縮した。Fab:NRRの複合体を、懸滴蒸気拡散法を使用して結晶化した。ラット438については、結晶を得るためには、キモトリプシンを使用する複合体の限定的なタンパク質分解が必要であった。最初に、複合体をキモトリプシンと混合して、2μg/mlの最終濃度を得、次いで、100mMカコジル酸ナトリウムpH5.5、14~20PEG8000、100~200mM酢酸カルシウムからなる等しい体積のウエル溶液と組み合わせた。結晶が、1週間以内に出現し、3週間成長し続けた。ラット351については、複合体を、20PEG3350、200mM硫酸ナトリウムからなる等しい体積のウエル溶液と組み合わせた。結晶が、1週間後に出現し、3週間成長し続けた。結晶を、25グリセロールを添加したウエル溶液に通すことによって低温から保護した。X線データを、SER-CATのAdvancedPhotonSourceにおける、ラット438についてはビームライン22BM、およびラット351についてはビームライン22IDにおいて収集し、HKL-2000HKLSoftwareソフトウエアパッケージを使用して、2.6オングストロームの分解能まで処理した。構造を、Phaserソフトウエアを使用して、分子置換により解いた。検索モデルを、ノッチ1NRRについてはpdbid3L95、ラット438の場合、重鎖については2HRP、および軽鎖については1xgp、ならびにラット351の場合、重鎖については1BM3、および軽鎖については3L95から得た。得られたモデルを、cootおよびBUSTERGlobalPhasing,Ltd.を、softNCSrestraintを含めて使用して再構築および精緻化した。構造の妥当性を、molprobityを使用して確認した。pymolおよびPISAを使用して、相互作用に関与する残基を決定した。ヒトノッチ1NRR上のラット438エピトープの構造的見解を図3に示し、ヒトノッチ1NRR上のラット351エピトープの構造的見解を図4に示す。類似のX線結晶解析を、A2抗体について公開されているデータを使用して完了し、図5は、ヒトノッチ1NRR上のA2エピトープの構造的見解を示す。図3~5については、抗体から3.8オングストローム以内のアミノ酸残基を、黒色で示す。下記の表14は、ラット438、ラット351およびA2についてのノッチ1NRRと抗体との相互作用に関与する残基を示す。データは、ラット438およびA2が、ノッチ1NRR内の重複するが明確に異なる表面に結合することを示している。両方のエピトープが、HDドメインの中心を含む。ラット438およびA2が、LNR-Aと相互作用するが、ラット438は、より大きな表面と相互作用する。ラット438のみが、S1ループ領域と相互作用し、A2のみが、LNR-Bと相互作用する。より具体的には、データは、ラット438が、ヒトノッチ1NRRの残基のAsn1461、Lys1462、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Tyr1621、Gly1622、Met1670、Asp1671、Val1672、Arg1673、Leu1707、Ala1708、Leu1710、Leu1711、Leu1712、Leu1713、Leu1716およびLeu1718に結合することを示している。また、データは、ラット351およびA2が、ノッチ1NRR内の重複するが明確に異なる表面に結合することも示している。特に、ラット351のみが、S1ループ領域と相互作用し、A2のみが、LNR-Bと相互作用する。ラット351およびA2の両方が、LNR-Aと相互作用するが、ラット351は、LNR-Aのアミノ酸の明確に異なるサブセットと相互作用する。より具体的には、データは、ラット351が、ヒトノッチ1NRRの残基のAsp1458、Asn1461、Val1463、Cys1464、Leu1466、Leu1580、Met1581、Pro1582、Tyr1621、Gly1622、Arg1623、Asp1671、Val1672、Arg1673、Gly1674、Leu1710、Gly1711、Ser1712、Leu1713、Asn1714、Ile1715、Pro1716、Lys1718に結合することを示している。ノッチ1NRRに結合するラット438およびラット351の残基のX線結晶構造を、プログラムPISAを使用してさらに解析した。データは、ラット438が、残基のLys1718およびArg1673と強い静電的相互作用塩架橋を形成したことを示している。ラット438抗体と水素結合を形成するノッチ1NRRの残基は、Asn1461、Asp1671、Arg1673、Leu1713、Lys1718、Cys1464、Ala1708およびSer1712であった。ラット438抗体との複合体の形成時に40オングストローム2超の埋没表面積に寄与するノッチ1NRRの残基は、重鎖との相互作用からは、Arg1673、Val1463、Lys1462、Gly1622、Asp1671であり、軽鎖との相互作用からは、Leu1466、Lys1718、Gly1711、Cys1464、Pro1716およびVal1463であった。同定された残基のうち、ラット438は、ヒトノッチ1NRRに、少なくとも残基Asn1461、Val1463、Lys1462、Asp1671、Arg1673、Leu1713およびLys1718において結合する。データは、ラット351が、残基のAsp1458およびArg1673と強い静電的相互作用塩架橋を形成することを示している。ラット351抗体と水素結合を形成するノッチ1NRRの残基は、Asp1458、Val1463、Cys1464、Ser1465、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Gly1711、Ser1712、Leu1713およびAsn1714であった。ラット351との複合体の形成時に40オングストローム2超の埋没表面積に寄与するノッチ1NRRの残基は、軽鎖との相互作用からは、Val1463、Cys1464、Leu1466、Gly1711、Asn1714、Pro1716およびLys1718であり、重鎖との相互作用からは、Asn1461、Leu1580、Asp1671およびArg1673であった。同定された残基のうち、ラット351は、ヒトノッチ1NRRに、少なくとも残基Asp1458、Val1463、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Ser1712およびLeu1713において結合する。さらに、A2は、残基Asp1458、Val1463、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Ser1712およびLeu1713とは相互作用しない。図6は、ラット438抗体およびA2抗体に結合しているヒトノッチ1NRRの構造の重ね合わせを示す。ヒトノッチ1NRRが、下部にある。ラット438およびA2の重鎖を黒色で示し、灰色で示す軽鎖は、2つの重鎖の間にある。図6に示すように、NRRに対するラット438抗体の配向性とA2抗体の配向性とは、ほとんど180度回転しており、したがって、ラット438の軽鎖N末端は、LNR-Aに向かい、一方、A2の軽鎖は、ノッチ1NRRの背部領域中のLNR-Cに向かう。このことから、NRRから眺めると、それらの重鎖は、2つの軽鎖の向かい合う側面上に置かれる。したがって、A2の重鎖は、S1ループからの軽鎖の反対側にある。図7は、ラット351抗体およびA2抗体分子表面として示すに結合しているヒトノッチ1NRRリボンとして示すの構造の重ね合わせを示す。ラット351およびA2の重鎖を黒色で示す。ラット351の軽鎖を、暗い灰色で示し、A2の軽鎖を、明るい灰色で示す。図7は、ラット351抗体とA2抗体とは、反対の方向に結合することを示しており、このことから、それらが特有のエピトープと結合することが確認される。実施例5細胞ベースアッセイにおける、抗ノッチ1阻害性抗体の機能の特徴付け。A.ノッチ1のレポーター遺伝子アッセイにおけるEDTA処理リガンドの不在下では、ヘテロ二量体性のS1切断されたノッチ1受容体は、細胞膜に不活性な状態で留まる。ノッチ1NRRドメインは、切断部位2S2を埋め、したがって、金属プロテアーゼへの接近を阻止することによって、自己阻害性の立体構造をとる。ノッチ1NRRドメインには、二価のカチオン、例として、カルシウムにより安定化する非共有結合性相互作用が関わる。しかし、ノッチ1NRRドメインの阻害性相互作用を、キレート化剤EDTAにより混乱させることができる。EDTAによるカルシウムのキレート化の結果、細胞膜からの細胞外ドメインの急速な排出が生じ、このキレート化は、ノッチ1シグナル伝達を活性化させるのに十分であるRandら、Mol.Cell.Biol.205:1825~35、2000。抗ノッチ1阻害性抗体が、不活性な立体構造をとるノッチ1NRRを、二価のカチオンをキレート化した際に、安定化させるかどうかを決定するために、ノッチ1-レポーター細胞下記のセクションBを参照されたいを、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体またはA2抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と共にあらかじめインキュベートし、次いで、5mMEDTAを用いて処理した。ヒトノッチ1のレポーター細胞を、壁が白色の96ウエルプレート中に40,000細胞/ウエルで蒔き、マッコイ5A培地、10FBS、Pen/Strep/グルタミン中で一晩培養した。培地を、吸引により除去し、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体またはA2抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体を、0、0.01、0.1、1、10および30μg/mlで含有する培地と室温で1時間かけて交換した。1時間の抗体の前処理の後に、EDTAを、細胞に5mMの最終濃度で添加し、5CO2中、37°Cで6時間インキュベートした。Dual-GloルシフェラーゼアッセイシステムPromegaを使用して、8×CSLホタル-ルシフェラーゼノッチ1誘導性レポーターおよびウミシイタケRenilla-ルシフェラーゼ構成性レポーターの活性を測定した。ホタル-ルシフェラーゼからの発光の読取りを、ウミシイタケRenilla-ルシフェラーゼの読取りで割って、ノッチ1シグナル伝達のレベルを計算した。それぞれの処理から得られた3回の反復の平均および標準偏差を計算し、プロットした。表15は、キレート化剤EDTAが存在し、リガンドが存在しない場合に、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体、ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の濃度を増加させて用いて実施したノッチ1のレポーター遺伝子アッセイを示す。データは、ノッチ1-レポーター細胞株に、EDTA単独を添加する場合には、ホタル-ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が刺激される0μg/ml条件を参照されたいことを示している。予想通り、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体は、ノッチ1シグナル伝達を阻害しなかった。対照的に、EDTAの存在下において、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体それぞれを、濃度を増加させて用いて細胞を前処理する場合には、ホタル-ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化が用量依存的に阻害された。1μg/ml、10μg/mlおよび30μg/mlの濃度において、ラット351-mIgG1、ラット438-mIgG1およびA2により処理したホタル-ルシフェラーゼ対ウミシイタケRenilla-ルシフェラーゼの比は、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaよりも顕著に低く、このことは、ノッチ1シグナル伝達の阻害を示している。B.ノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイのための細胞株の構築抗ノッチ1ヒト化438抗体および抗ノッチ1ヒト化351抗体の阻害活性を、実施例2に記載したノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイにおいて試験した。ヒト化438抗体およびヒト化351抗体を、ノッチ1のレポーター細胞と共にあらかじめインキュベートし、次いで、ノッチ1シグナル伝達を活性化させるためのDLL4-HEK293細胞または対照としての親のHEK293細胞と同時培養した。ノッチ1のレポーター細胞株を生成するために、連続3回の安定なトランスフェクションを、U-2OSヒト骨肉腫細胞株ATCC、Manassas、VA中で実施した。第1のトランスフェクションでは、pCMV6-Entry-Myc-Flag骨格Origeneに基づく完全長のヒトノッチ1またはマウスノッチ1の発現のためのベクターを使用し、両方において、ノッチ1挿入部の正しいDNA配列を確認した。TransIT-LT1トランスフェクション試薬Mirus、Madison、WIを用いたトランスフェクションに続き、U-2OS細胞をG418中で選択し、クローン株を単離した。第2に、安定にノッチ1を発現するU-2OSのクローンに、CSLエンハンサー配列CGTGGGAAAATの8つの縦に並べたコピーを含有するpGL4.27[luc2P/minP/Hygro]ベクターPromega、Madison、WIを再トランスフェクトし、ハイグロマイシンBおよびG418中で選択を行い、クローン株を単離した。8×CSLホタル-ルシフェラーゼレポーター構築物は、活性化されたノッチ1シグナル伝達に対して応答性である例えば、Jeffriesら、Mol.Cell.Biol.2211:3927~3941、2002を参照されたい。第3に、ノッチ1-pGL4.27U-2OS細胞に、LinearPuromycinMarkerClontech、MountainView、CAを加えたpGL4.74[hRluc/TK]ベクターPromegaを再トランスフェクトし、ピューロマイシン、ハイグロマイシンBおよびG418中で選択を行い、クローン株を単離した。pGL4.74ベクターにより、ウミシイタケRenilla-ルシフェラーゼ遺伝子がコードされ、この遺伝子は、HSV-TKプロモーターから構成的に発現し、内部対照として働いた。三重に、安定にトランスフェクトしたU-2OS株本明細書においては、ノッチ1のレポーター細胞と呼ぶを、10FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミンGibco、0.25mg/mlG418硫酸塩、0.3mg/mlハイグロマイシンBおよび0.001mg/mlピューロマイシンを含有するマッコイ5A培地Gibco、GrandIsland、NY中に維持した。リガンド発現細胞を生成するために、HEK293細胞ATCCに、ヒトDLL4またはマウスDLL4の発現のためのベクターをトランスフェクトした。両方のベクターが、pCMV6-AC-HA-His骨格Origene、Rockville、MDに基づき、DLL4挿入部の正しいDNA配列を確認した。トランスフェクションに続き、HEK293細胞を、0.5mg/mlG418中で選択し、クローン株を単離し、拡大増殖し、DLL4の発現について分析した。高いDLL4の発現を示すクローンおよびU-2OS細胞中でノッチ1のレポーター活性の高い誘導を示すクローンを使用して、抗ノッチ1抗体の阻害作用を評価した。ホタル-ルシフェラーゼからの発光の読取りを、内部対照のウミシイタケRenilla-ルシフェラーゼの読取りで割って、シグナルを正規化した本明細書においては、F/R比と呼ぶ。ノッチ1シグナル伝達の誘導の倍率を計算するために、DLL4-HEK293の同時培養レポーターアッセイから得られたF/R比を、親のHEK293の同時培養から得られたF/R比で割り、これを、相対ルシフェラーゼ単位RLUまたは相対ルシフェラーゼ活性と呼んだ。ヒトノッチ1およびマウスノッチ1のレポーター同時培養アッセイにおける、ヒト化438VH1.1/VL1.8およびA2の滴定は、用量依存的な、強力なノッチ1シグナル伝達の阻害を示した。図8および9はそれぞれ、ヒトノッチ1およびマウスノッチ1のレポーター細胞中の、ノッチ1依存性のシグナル伝達に対するヒト化438VH1.1/VL1.8抗体およびラット438抗体の中和活性を示す。ヒト化438VH1.1/VL1.8は、ヒトおよびマウスの両方のノッチ1依存性シグナル伝達レポーターアッセイにおいて、ラット438の中和活性と同等の中和活性を示した。したがって、ヒト化438VH1.1/VL1.8は、ラット438の中和活性を完全に保持した。下記の表16に示すように、ラット438-mIgG1およびヒト化438変異体のIC50nM値を、ノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイから得られたノッチ1依存性のシグナル伝達の阻害から計算した。ヒト化438VH1.1/VL1.8が、ヒトおよびマウスの両方のノッチ1シグナル伝達に対する阻害の最も顕著なレベルを示し、このことは、全てのヒト化438変異体のうちの最も低いIC50値により示されている。同時培養レポーターアッセイ上のラット351抗ノッチ1抗体およびA2抗ノッチ1抗体の阻害作用を、抗体の濃度を約0.01nM~200nMの範囲にわたり増加させて添加することによって調べた。抗ノッチ1抗体処理同時培養のパーセント阻害を計算するために、抗体の濃度を増加させた処理から得られたRLUを、式1-処理/未処理×100を使用して、未処理の対照で割った。ヒトノッチ1およびマウスノッチ1のレポーター同時培養アッセイにおけるラット351抗体およびA2抗体の滴定は、ノッチ1シグナル伝達に対するラット351の特有の中和活性を実証した。図10、11および表17に示すように、ラット351およびA2の両方が、ノッチ1シグナル伝達を用量依存的に阻害し、ノッチ1のレポーター同時培養アッセイから計算された類似のIC50値を示した。図10および表17は、A2が、ヒトノッチ1のレポーター同時培養アッセイにおいて、抗体濃度がIC50値の20倍超である場合に、約100のノッチ1シグナル伝達の最大阻害プラトー阻害を達成したことを示す。対照的に、ラット351は、約85に過ぎない最大阻害しか達成せず、これは、A2について観察された最大阻害よりも低かった。ラット351は、抗体濃度がIC50値の250倍であった場合でさえ、100の最大阻害を達成することができなかった。図11および表17は、マウスノッチ1のレポーター同時培養アッセイについても、類似の結果が観察されたことを示す。A2は、マウスノッチ1のレポーター同時培養アッセイにおいて、約86のノッチ1シグナル伝達の最大阻害を達成した。対照的に、ラット351は、約55に過ぎない最大阻害しか達成せず、これは、86のA2について観察された最大阻害よりも低い。図12および13は、ヒトおよびマウスの両方のノッチ1依存性シグナル伝達レポーターアッセイそれぞれにおける、ヒト化351変異体およびラット351-mIgG1の中和活性を示す。表18は、ノッチ1のレポーター遺伝子同時培養アッセイから得られたノッチ1依存性のシグナル伝達の阻害から計算した、ヒト化351変異体、ラット351-mIgG1およびA2のIC50nM値を示す。データは、ヒト化351VH1.0/VL1.1が、ラット351-mIgG1およびラット351に類似する中和活性プロファイルを示したことを示す。ヒト化351VH1.0/VL1.1は、約87.4のノッチ1シグナル伝達の最大阻害を達成し、これは、A2について観察された最大阻害よりも低い。実施例6クローン351の中和活性についての構造上および機能上の根拠ノッチ1NRRのLNR-A、BおよびCのドメインのそれぞれ中のCa2の結合が、ノッチ1NRRの構造の完全性を維持するのに必要である。Ca2を、例えば、ノッチ1を発現している細胞の培地へのEDTAの添加により除去すると、ノッチ1NRRの構造の不安定化が生じる。この結果、ノッチ1NRR中のS2のメタロプロテイナーゼ切断部位の暴露およびノッチ1シグナル伝達の活性化が生じるRandら、Mol.Cell.Biol.205:1825~35、2000。ラット351のFabとヒトノッチ1NRRとの共結晶構造は、単一の結晶中に4つの独立した複合体を有する。しかし、4つの複合体のうちの1つのみが、LNR-Aに対する、予想されるCa2の結合を含有した。図14Aは、複合体1のLNR-A領域におけるラット351とヒトノッチ1NRRとの相互作用を示す。この構造では、ノッチ1NRR中の負に荷電した残基Asp1458が、構造中に存在するカルシウムとのイオン性相互作用を示した。図14Bは、複合体2のLNR-A領域におけるラット351とヒトノッチ1NRRとの相互作用を示す。複合体2は、複合体2~4の代表的な画像である。複合体2~4では、カルシウムとのイオン性相互作用を示す代わりに、ヒトノッチ1NRRのAsp1458は、ラット351のVHのCDR2中の正に荷電した残基Arg58と塩架橋を形成した。このことは、ラット351の正に荷電したArg58が、正に荷電したCa2と、ヒトノッチ1NRRの負に荷電したAsp1458に対する結合について競合していることを示している。ラット351の機能特性における正に荷電した残基Arg58の意義を実証するために、突然変異させたラット351-mIgG1抗体を生成し、この場合、VH中のArg58を、中性残基のTyrにおよびVal60-AlaまたはArgと組み合わせたArg58-Tyrに突然変異させた。突然変異させたラット351-mIgG1抗体を、ノッチ1シグナル伝達阻害レポーターアッセイにおいて試験し、結果を、図15および表19に示す。示すように、ラット351は、約87に過ぎない最大阻害しか達成せず、一方、突然変異させたラット351-mIgG1およびA2はそれぞれ、約95および約98のより高い最大阻害を達成した。実施例7抗ノッチ1阻害性抗体の、内皮細胞の出芽、血管形成および血管化に対する作用A.抗ノッチ1阻害性抗体のinvitroにおける評価ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECフィブリンゲルビーズアッセイFGBA本明細書においては、HUVEC-FGBAともまた呼ぶを使用する、内皮細胞の出芽のinvitroにおけるモデルにおいて、抗ノッチ1阻害性抗体の血管形成に対する作用を調べた。HUVEC-FGBAの改変バージョンを、NakatsuらMicrovasc.Res.662:102~112、2003による記載に本質的に従って実施したが、ただし、初代ヒト肺腫瘍関連線維芽細胞LTAFを、Detroit551皮膚線維芽細胞の代わりに用いた。HUVECの出芽を、線維芽細胞の添加後の第10~15日に調べた。ヒト肺腫瘍組織試料87852A1;Asterand、Detroit、MIを、機械的かつ酵素的に脱凝集させた。細胞を、40μmの細胞用ストレーナーを通してふるいにかけて、単一細胞の懸濁液を得た。生存細胞を、赤血球溶解用緩衝液Roche、Indianapolis、INを用いて処理し、死んだ細胞からの磁気分離MiltenyiBiotec、Auburn、CAを行った後に単離した。初代肺腫瘍関連線維芽細胞を確立し、20FBSを含有するRPMI培地中に維持した。LTAF含有HUVEC-FGBAを、ラット438抗体、ラット351抗体またはA2抗体を用いて処理した。また、培地単独未処理および抗VEGF阻害剤のアバスチンGenentech、So.SanFrancisco、CA対照処理も含めた。図16は、ラット438、ラット351およびA2により処理したHUVECの出芽の第10日時のCD31-Cy3の免疫染色の代表的な落射蛍光画像を示す。培地単独未処理対照と比較して、ラット438およびラット351による処理における、HUVECの出芽および血管の長さの増加が実証された。対照的に、抗VEGF阻害剤のアバスチンを用いる処理は、HUVECの出芽を完全に阻止した。したがって、ラット438およびラット351を用いるノッチ1シグナル伝達の阻害は、血管形成を、抗VEGF阻害剤、例として、アバスチンとは明確に異なる様式で調節解除した。さらに、表20は、ラット438およびラット351は、HUVEC-FGBAにおいて、処理の第6日および第12日に、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と比較して、1個のビーズ当たりの出芽分枝点の平均数も増加させたことを示す。しかし、ラット351の、1個のビーズ当たりの分枝点の平均数に対する作用は、ラット438およびA2と比較して、第6日にはより低かった。第12日までに、ラット438およびラット351の両方、ならびにA2が、1個のビーズ当たりの分枝点の類似の数を誘導している。血管形成の間、活性なノッチ1シグナル伝達は、内皮の先端の細胞の数を負に制御し、したがって、分枝および出芽のレベルを調節するHellstrom,M.ら、Nature4457129:776~780、2007。B.抗ノッチ1阻害性抗体のinvivoにおける評価抗ノッチ1阻害性抗体の作用を、血管形成および血管化のinvivoにおけるマウスアッセイにおいてさらに調べた。新生児の網膜は、血管形成の十分に特徴付けられたモデルであり、このプロセスにおけるノッチ経路の役割を研究するために使用されている。出生時から始まるマウス網膜における広範な血管形成がある。ヒト網膜においてと同様、血管構造は、視神経を起源とし、広がって、血管のネットワークを形成し、次いで、このネットワークは、下方に出芽して、二次的なネットワークを確立する。ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作により、適切なノッチシグナル伝達が、新生児の網膜における血管形成に必要であることが実証されているHellstrom,M.ら、Nature4457129:776~780、2007。妊娠中のCD-1マウスを個々に飼育し、同腹仔の出生について定期的にモニターした。ラット438-mIgG1については、出生後の第1および3日に、10mg/kgの対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体、10mg/kgのラット438-mIgG1または10mg/kgのA2のいずれかを仔に投与した。ラット351-mIgG1については、出生後の第1および3日に、30mg/kgの対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体、30mg/kgのラット351-mIgG1または30mg/kgのA2のいずれかを仔に投与した。出生後の第5日に、仔を安楽死させ、眼を収集し、2ホルムアルデヒド中で一晩固定した。翌日、眼をPBSに移動させ、網膜を単離した。網膜を染色するために、イソレクチンB4Sigma、St.Louis、MOを、AlexaFluor488に、標識化キットInvitrogen、Carlsbad、CAを用いてコンジュゲートし、10ヤギ血清、1TritonX-100、0.1アジ化ナトリウムならびにそれぞれ0.1mMのCaCl2、MgCl2およびMnCl2を有するPBS中、15mg/mlで使用した。網膜を、1TritonX-100、0.1アジ化ナトリウムならびにそれぞれ0.1mMのCaCl2、MgCl2およびMnCl2を有するPBS中で5回洗浄し、最後に、0.1アジ化ナトリウムならびにそれぞれ0.1mMのCaCl2、MgCl2およびMnCl2を有するPBS中で洗浄した。網膜を切断し、Fluormount-GEMS、Hatfield、PAを用いてマウントし、ZeissLSM510共焦点顕微鏡CarlZeissMicroImaging,LLC、Thornwood、NY上で画像を撮影した。図17は、血管形成のマウス網膜モデルにおける、ラット438-mIG1、ラット351-mIgG1およびA2を用いた処理後のイソレクチンB4-Alexa488の染色の代表的な共焦点画像を示す。また、抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体および未処理の対照も含めた。図17に示すように、ラット438-mIgG1処理群中のマウス仔から得られた網膜は、抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体処理および未処理の対照群中のマウス仔から得られた網膜と比較して、異なる血管構造を有した。このことは、ラット438-mIgG1抗体が、invivoにおける血管形成を混乱させたことを示す。特に、ラット438-mIgG1処理群から得られた網膜は、より広範な血管構造を示し、この構造は、これまでに報告された、ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作の後の血管構造に類似したHellstrom,M.ら、Nature4457129:776~780、2007。このことは、ラット438-mIgG1を用いるノッチ1シグナル伝達の阻害が、マウス新生児の網膜における血管形成に直接影響を及ぼしたことを示す。さらに、図17には、ラット351-mIgG1処理群中のマウス仔から得られた網膜が、抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体処理および未処理の対照群中のマウス仔から得られた網膜と比較して、類似の血管構造を有したことも示されている。対照的に、A2群から得られた網膜は、より広範な血管構造を示し、この構造は、これまでに報告された、ノッチシグナル伝達の遺伝子操作および薬理学的操作の後の血管構造に類似したHellstrom,M.ら、Nature4457129:776~780、2007。このことは、A2とは対照的に、ラット351-mIgG1抗体が、invivoにおけるマウスの血管形成を顕著には混乱させなかったこと、またはラット351-mIgG1のマウス血管構造に対する潜在的な作用が、選ばれた時点では観察されなかったか、もしくは試験した投与計画を用いては観察されなかったことを示している。実施例8抗ノッチ1阻害性抗体の、ネイティブなノッチ1受容体および突然変異ノッチ1受容体を有する細胞株に対する作用A.ネイティブなノッチ1受容体を有するヒト線維芽細胞の細胞株CCD1076SKにおける、抗ノッチ1阻害性抗体のノッチ1活性化に対する作用ノッチ1シグナル伝達は、細胞外ノッチ1NRRドメイン内の立体構造変化を誘発し、それにより、金属プロテアーゼおよびガンマ-セクレターゼによる切断部位を暴露させるリガンドの結合により活性化される。タンパク質分解の結果、細胞膜から、転写活性化因子であるノッチ1細胞内ドメインノッチ1ICDが放出される。ラット438抗体、ラット351抗体またはA2抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の濃度を増加させて用いて処理した組換えヒトDLL4リガンド上に24時間蒔いたヒト線維芽細胞の細胞株CCD1076SKから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ノッチ1活性化およびノッチ1ICDの放出を調べた。バリン残基から始まるノッチ1ICD分子の放出を、D3B8抗体抗ノッチ1ICDCellSignalingTechnology、Danvers、MAを用いて検出した。ノッチ1シグナル伝達を活性化させるために、CCD1076SK皮膚線維芽細胞を、DLL4リガンドの存在下で培養した。6ウエルプレートを、CaCl2およびMgCl2を含有する1×DPBS中の2μg/mlの組換えヒトDLL4RDSystems、Minneapolis、MNを用いてコートした。10FBSを含有するDMEM培地中の2×10E6個のCCD1076SK皮膚線維芽細胞を、0、0.001、0.01、0.1、1ならびに10μg/mlのラット438抗体、ラット351抗体およびA2抗体ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の存在下で、組換えヒトDLL4でコートしたウエルに添加した。細胞を、抗体と共に、5CO2中、37°Cで24時間インキュベートした。細胞を、CompleteMiniProtease阻害剤カクテルRocheおよび0.4mMPMSFを含有する1NP40、0.5デオキシコール酸ナトリウム、5mMEDTA、0.25MNaCl、0.025MTris-HCl、pH7.5中に溶解させた。抽出物を、7.5ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース紙に、iBlotゲル移動システムInvitrogenを使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ1ICD分子を、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、抗ノッチ1ICDおよび充填対照としての抗ベータ-アクチンを用いて検出した。濃度測定解析を、フィルム上で実施し、これらのフィルムを、BioRadGS-800CalibratedDensitometerを用いてスキャンし、QuantityOne、4.6.9版ソフトウエアBioRadを用いて解析した。ノッチ1ICDのレベルを、各試料中のベータ-アクチンの対照に対して正規化し、次いで、未処理の対照と比較した。図18に示すように、ラット438の滴定は、ノッチ1活性化を用量依存的に強力に阻害し、このことは、検出されたノッチ1ICDの放出のレベルによって示されている。さらに、図18および表21に示すように、10μg/mLまでのラット351の滴定は、A2と比較して、ネイティブなノッチ1受容体のノッチ1活性化のより低い阻害も示し、このことは、検出されたノッチ1ICDの放出のレベルによって示されている。全ての濃度、特に、0.1μg/mL以上では、ラット351は、A2と比較して、ノッチ1ICDの放出のより高いレベルを示した。B.突然変異ノッチ1受容体を有するT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL細胞株における、抗ノッチ1阻害性抗体のノッチ1活性化に対する作用構成的なノッチ1活性化およびノッチ1細胞内ドメインノッチ1ICDの放出が、T細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL患者のサブセット、およびノッチ1受容体のNRRドメイン内に突然変異を有するT-ALL細胞株において報告されているWengら、Science306:269~271、2004。これらの突然変異は、3つの主要なクラスのカテゴリーに分けられる。クラス1の突然変異は、HD1中の単一アミノ酸置換および小型のインフレームの欠失または挿入である。クラス2の突然変異は、HD2の遠位領域中のより長い挿入であり、これらの挿入により、S2-金属プロテアーゼの切断部位が、自己阻害性NRRドメインを超えて移転する。クラス3の突然変異は、膜近傍伸長突然変異JMEともまた呼ばれ、NRRを細胞膜から離れたところに動かす。試験したノッチ1受容体のクラス1の突然変異を有するT-ALL細胞株は、アミノ酸1575におけるロイシンからプロリンへの突然変異L1575Pを有するHPB-ALL細胞、アミノ酸1594におけるロイシンからプロリンへの突然変異L1594Pを有するALL-SIL細胞、アミノ酸1601におけるロイシンからプロリンへの突然変異L1601Pを有するMOLT-4細胞、ならびにアミノ酸位置1594におけるロイシンからプロリンへおよびアミノ酸位置1610におけるアスパラギン酸からバリンへの複合のクラス1の突然変異L1594P/D1610Vを有するDND-41細胞を含む。CCRF-CEM細胞株は、クラス2の突然変異を有し、1595位における12個のアミノ酸の挿入を保有する。ジャーカット細胞株は、1740位に17個のアミノ酸を挿入する、クラス3のJEM突然変異を有する。ラット438-mIgG1抗体、ヒト化438VH1.1/VH1.8抗体、ラット351-mIgG1抗体またはA2抗体、および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の濃度を増加させて用いて処理したT-ALL細胞株から生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析により、ノッチ1活性化およびノッチ1ICDの放出を調べた。放出された、バリン残基から始まるノッチ1ICD分子を、D3B8抗体抗ノッチ1ICDを用いて特異的に検出する。T-ALL細胞株であるHPB-ALL細胞、ALL-SIL細胞、CCRF-CEM細胞、MOLT-4細胞、DND-41細胞およびジャーカット細胞を、上記のCCD1076SK線維芽細胞の代わりに使用した。T-ALL細胞は、構成的に放出されるノッチ1ICDを保有するので、外来のDLL4リガンドを必要としなかった。2×10E6個のT-ALL細胞の浮遊培養物を、10FBS、Pen/Strep/グルタミンを含有するRPMI1640培地中で、0、0.001、0.01、0.1、1および10μg/mlのラット438-mIgG1抗体、ヒト化438VH1.1/VH1.8抗体、ラット351-mIgG1抗体またはA2抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と混合した。細胞を、抗体と共に、5CO2中、37°Cで24時間インキュベートした。細胞を、遠心分離により収集し、培地を、吸引により除去した。CompleteMiniProtease阻害剤カクテルRocheを含有する、1NP40、0.5デオキシコール酸ナトリウム、5mMEDTA、0.25MNaCl、0.025MTris-HCl、pH7.5中に、細胞ペレットを溶解した。抽出物を、7.5ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース紙に、iBlotゲル移動システムInvitrogenを使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ1ICD分子を、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、抗ノッチ1ICDおよび充填対照としての抗ベータ-アクチンを用いて検出した。濃度測定解析を、フィルム上で実施し、これらのフィルムを、BioRadGS-800CalibratedDensitometerを用いてスキャンし、QuantityOne、4.6.9版ソフトウエアBioRadを用いて解析した。ノッチ1ICDのレベルを、各試料中のベータ-アクチンに対して正規化し、次いで、未処理の対照と比較した。図19に示すように、ラット438-mIgG1およびヒト化438VH1.1/VL1.8の濃度を増加させて用いてHBP-ALL細胞を処理すると、構成的なノッチ1活性化が顕著に阻害され、このことは、検出されたノッチ1ICDの放出のレベルによって示されている。したがって、1575位におけるロイシンからプロリンへの突然変異は、ラット438-mIgG1抗体およびヒト化438VH1.1/VL1.8抗体の、ノッチ1活性化を阻害する能力に影響を及ぼさなかった。このことは、ラット438抗体が、野生型NRR-抗体の共結晶構造において、1575位のアミノ酸と相互作用しなかったことを示す表14と一致している。図20および表22に示すように、ラット438-mIgG1、ラット351-mIgG1およびA2の濃度を増加させて用いて、T-ALL細胞株のHPB-ALL細胞、ALL-SIL細胞、CCRF-CEM細胞、MOLT-4細胞およびDND-41細胞を処理すると、ノッチ1活性化が用量依存的に阻害され、このことは、ウエスタンブロットおよび濃度測定解析による、ノッチ1ICDの放出の検出の減少によって示されている。対照的に、ラット351-mIgG1およびA2の濃度を増加させて用いてジャーカット細胞を処理しても、ノッチ1活性化は阻害され得ず、このことは、ウエスタンブロット分析によるノッチ1ICDの放出の検出によって示されている。予想通り、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体は、T-ALL細胞株のうちのいずれにおいても、ノッチ1ICDの放出のレベルに対する作用を示さなかった。ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体は同様に、クラス1L1575Pを有するHPB-ALL細胞、L1594Pを有するALL-SIL細胞、L1601Pを有するMOLT-4細胞および複合のクラス1の突然変異L1594P/D1610Vを有するDND-41細胞ならびにクラス21595位における12個のアミノ酸の挿入を有するCCRF-CEM細胞株のNRRの突然変異を有する特定のT-ALL細胞株において、ノッチ1活性化およびノッチ1ICDの放出を阻害し、ラット351-mIgG1およびA2は、クラス3のJEM突然変異を有するジャーカット細胞においては、ノッチ1受容体の切断およびノッチ1ICDの放出を阻害し得なかった。さらに、ラット351-mIgGは、図20および表22に示すように、図18および表21に示す、ラット351による、ネイティブなノッチ1受容体のノッチ1活性化の阻害と比較して、突然変異ノッチ1受容体のノッチ1活性化のより高い阻害も示した。C.抗ノッチ1阻害性抗体の、突然変異ノッチ1受容体を有するT細胞急性リンパ芽球性白血病T-ALL細胞株の生存率に対する作用抗ノッチ1抗体のHBP-ALL細胞に対する作用を、MTS細胞生存率指標Promega、Madison、WIを使用し、処理後のパーセント生存細胞を決定してさらに評価した。MTS試薬は、490ナノメートルの光学密度O.D.490nmで測定することができる産物に、死んだ細胞ではなく、代謝活性を示す、生きている細胞より変換された。10FBS、Pen/Strep/グルタミンを含有するRPMI1640培地中のHBP-ALL細胞1×10E4細胞/ウエルを、0、0.47、1.88、7.5ならびに30μg/mlのヒト化438VH1.1/VL1.8抗体、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と共に7日間インキュベートし、次いで、MTS試薬を用いて、製造元の指示に従ってアッセイした。表23は、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体、ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の濃度を増加させて用いる、HPB-ALL細胞の抗ノッチ1阻害性抗体による処理のMTS生存率アッセイを示す。結果として、ラット438-mIgG1、ラット351-mIgG1およびA2の濃度を30μg/mlまで増加させて用いて処理したHBP-ALL細胞は、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaによる処理よりも低い、変換されたMTS試薬のO.D.490nmにおけるレベルを示した。このことは、ラット438-mIgG1、ラット351-mIgG1およびA2により処理した細胞の場合、より少ない細胞が存在したことを示し、これは、細胞死の増加および/または増殖の減少の結果である。表24に示すように、類似の結果が、ヒト化438VH1.1/VL1.8についても観察され、この表は、ヒト化438VH1.1/VL1.8、ラット438-mIgG1および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaの濃度を増加させて用いる、HPB-ALL細胞の抗ノッチ1阻害性抗体による処理のMTSアッセイを示す。したがって、ノッチ1活性化の阻害に加えて、また、ヒト化438VH1.1/VL1.8抗体は、T-ALL患者における共通の特色であるノッチ1のNRRドメイン中の突然変異を有するがん細胞の増殖も阻害した。突然変異させたラット351抗体のinvitroにおける活性を実証するために、ラット351-mIgG1抗体、ラット351R58Y-mIgG1抗体、ラット351R58Y/V60A-mIgG1抗体、438ヒト化VH1.1/VL1.8抗体、A2抗体または対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体のいずれかの濃度を増加させて用いて、HPB-ALL細胞を処理した。表25は、抗ノッチ1阻害性抗体による処理のMTSアッセイ、およびそれらの結果として得られたIC50値を示す。ラット351R58Y-mIgG1抗体およびラット351R58Y/V60A-mIgG1抗体の両方が、HPB-ALLの増殖を阻害するが、それらのIC50値により決定する場合、野生型ラット351-mIgG1抗体よりも、ヒト化438VH1.1/VL1.8により類似する様式で阻害した。したがって、ラット351-mIgG1中のArg58残基は、突然変異NRRを有するノッチ1受容体に対する、その強力な阻害活性に寄与した。実施例9抗ノッチ1阻害性抗体の、ヒト腫瘍異種移植片のinvivoにおける増殖に対する作用A.ノッチ1とジャギド1との同時免疫組織化学的検査抗ノッチ1阻害性抗体の作用を、それらの潜在的な有効性を最大化するために、異種移植した腫瘍および宿主の間質細胞の両方の中でノッチ1を発現する前臨床モデルにおいて試験した。ノッチ1およびそのリガンドのうちの1つであるジャギド1を発現する前臨床モデルを同定するために、抗ノッチ1抗体および抗ジャギド1抗体を使用する免疫組織化学的検査を、37622A1非小細胞肺がんNSCLC患者由来の異種移植片PDXに対して実施し、この移植片を以下、37622A1NSCLCPDXと呼ぶ。37622A1NSCLCPDXから得られた組織断片に、標準的な組織学的手順を使用して、ホルマリン固定およびパラフィン包埋FFPEを行った。5ミクロンのFFPE切片を、切断し、脱ろうし、蒸留水に対して水和させた。抗原を、圧力釜中で、pH6.0のクエン酸緩衝液中に回収した。内在性のペルオキシダーゼを、0.3H2O2を用いて15分かけてブロックした。切片を、DAKOタンパク質ブロックと共に20分間インキュベートした。内在性のビオチンを、アビジン/ビオチンのブロックキットVectorによりブロックした。1:50の希釈度のウサギ抗ノッチ1ab52627;Abcamを、切片に室温で1時間適用した。抗ウサギIgG-ビオチンJacksonImmunoを、切片に室温で30分間適用した。ストレプトアビジン-HRPを、切片に室温で30分間添加した。DABを使用して、5分間発色させた。切片を、pH6.0のクエン酸緩衝液中、98°Cで10分間加熱して、最初の反応に由来する、結合している抗ノッチ1一次抗体および抗ウサギIgG二次抗体を破壊した。切片を、DAKOタンパク質ブロック中で20分間ブロックし、1:100の希釈度のウサギ抗ジャギド1抗体SantaCruzと共に室温で2時間インキュベートした。抗ウサギIgG-HRPのポリマーDAKOを、室温で30分間適用した。ImmPACTVIP基質を使用して、7分間発色させた。切片を、Mayerのヘマトキシリン中で短時間対比染色し、脱水し、清澄化し、カバーガラスで覆った。図21に示すように、37622A1NSCLCPDXは、実線で境界を定めた腫瘍細胞のクラスター内で、ヒトノッチ1受容体破線の左およびヒトジャギド1リガンド破線の右の異種性の発現を示した。また、核性のノッチ1ICD矢印も、ヒトノッチ1腫瘍細胞とヒトジャギド1腫瘍細胞との界面において検出し、これは、活性なノッチ1シグナル伝達を示している。また、マウス間質内では、マウスノッチ1も、PDX関連の血管構造において検出され、このことは、ノッチ1シグナル伝達がマウス新生児の網膜における血管形成を制御するというこれまでの知見と一致している。37622A1NSCLCPDXにおけるノッチ1およびジャギド1の発現パターンから、このモデルが、抗ノッチ1抗体のinvivoにおける作用を調べるための適切なモデルであることが示された。NSCLCにおいては、K-rasが、腫瘍の増殖を促す、頻繁に突然変異するがん遺伝子である。したがって、37622A1NSCLCPDXから得られたK-ras遺伝子を配列決定して、この遺伝子が野生型K-rasまたは突然変異したK-rasのいずれを含有するかを決定した。ゲノムDNAを、37622A1NSCLCPDXの断片から、PrepGEMキットを使用して、製造元ZyGEM、SolanaBeach、CAの指示に従って単離した。K-rasのDNA配列を、KODポリメラーゼEMDChemicals、Gibbstown、NJを用いて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して増幅した。PCRサイクリングの条件:75°C、15分間を1サイクル、95°C、5分間を1サイクル、96°C、1分間を1サイクル、ならびに96°C、15秒間、60°C、15秒間および72°C、40秒間を35サイクル、ならびに72°C、1分20秒間を1サイクル。496塩基対の増幅したPCR産物を、QIAquickPCRPurificationキットQiagen、Valencia、CAを用いて精製し、DNAを、BigDyeTerminatorv1.1Cycle配列決定キットABI、FosterCity、CAを用いて、製造元の指示に従って配列決定した。図22に示すように、DNA配列解析により、37622A1NSCLCPDXは、ヒトK-ras遺伝子中のアミノ酸13におけるグリシンからバリンDNA配列GTTがコードするへの突然変異G13Vを保有することが示された。B.NSCLC異種移植片のinvivoにおける増殖阻害研究適切な同意手順に従って得られた、用時切除したNSCLC腫瘍Asterandの断片から確立された、ヒト腫瘍異種移植片のinvivoにおける増殖に対する、抗ノッチ1阻害性抗体の作用を、免疫不全マウスにおいて調べた。87393A1NSCLC患者由来の異種移植片および37622ANSCLC患者由来の異種移植片以下それぞれ、87393A1NSCLCPDXおよび37622A1NSCLCPDXと呼ぶをそれぞれ、動物間移植断片として、NOD-SCIDかつヌードNu/Nuの雌マウス中のinvivoにおいて継代した。腫瘍が、200~400mm3の体積に達したら、それらを段階分けして、種々の処理群間の腫瘍サイズの一様性を確保してから、抗ノッチ1抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体の投与を行った。37622A1NSCLCPDXモデルには、10mg/kgのラット438-mIgG1およびA2ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体を週1回3週間i.p.投与した。87393A1NSCLCPDXモデルには、20mg/kgのラット351-mIgG1および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体を週2回4週間i.p.投与した。腫瘍を、少なくとも週1回測定し、それらの体積を、式:腫瘍体積mm3=0.5×腫瘍の幅2腫瘍の長さを用いて計算した。8~11匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍体積±SEMを計算し、対照処理と比較した。表26は、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と比較した、K-ras中のG13V突然変異を有する、37622A1NSCLC患者に由来する異種移植片におけるラット438-mIgG1抗体およびA2抗体の有効性を示す。37622A1PDXのラット438-mIgG1による増殖阻害から、活性化されたノッチ1および/またはK-rasがん遺伝子中の突然変異を有するNSCLCは、ノッチ1経路の阻害剤に対して感受性を示し得るであろうことが示されている。表27は、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と比較した、87393A1NSCLCPDXにおけるラット351-mIgG1の有効性を示す。ラット351-mIgG1を用いた処理の結果、第28日に、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した腫瘍と比較して、29の腫瘍増殖阻害が生じた。ノッチ1活性化が阻害されたことを確認するために、研究の終わりに、D3B8抗体抗ノッチ1ICDを使用するウエスタンブロット分析を、異種移植片から生成したタンパク質抽出物に対して実施した。研究の終わりに、ラット438-mIgG1、A2および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した37622A1NSCLCPDXモデルからの異種移植片、ならびにラット351-mIgG1および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した87393A1NSCLCPDXモデルからの異種移植片を収集した。CompleteMiniProtease阻害剤カクテルRocheを含有する、1NP40、0.5デオキシコール酸ナトリウム、5mMEDTA、0.25MNaCl、0.025MTris-HCl、pH7.5中に、腫瘍組織を溶解した。抽出物を、7.5ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース紙に、iBlotゲル移動システムInvitrogenを使用して移動させた。放出された、バリン残基から始まるノッチ1ICD分子を、D3B8抗体抗ノッチ1ICDを用いて検出し、ノッチ1のC末端ドメインの総合的なレベルを、標準的なウエスタンブロットの手順を使用して、D1E11抗ノッチ1CellSignalingTechnologiesを用いて検出した。β-アクチンを、充填対照として示す。図23は、ラット438-mIgG1およびA2を用いて処理した37622A1NSCLCPDXから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す。ノッチ1ICDの放出の検出を、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した腫瘍において観察したが、ラット438-mIgG1により処理した腫瘍においては観察せず、後者は、ノッチ1活性化の阻害を示している。図24は、ラット351-mIgG1抗体および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体を用いて処理した87393A1NSCLCPDXから生成したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析を示す。ノッチ1ICDの放出の検出を、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した腫瘍において観察したが、ラット351-mIgG1により処理した腫瘍においては観察せず、後者は、ノッチ1活性化の阻害を示している。元々の87393A1NSCLCPDX標本に属するドナーの臨床情報によれば、患者の腫瘍は、肺の侵襲性の分化が乏しい扁平上皮癌であることが示された。インボルクリンは、肺腫瘍における扁平上皮細胞の分化についてのマーカーであるSaid,J.W.ら、LaboratoryInvestigation、1983、volume49、563~568。ノッチ1活性化の阻害が、87393A1NSCLCPDX腫瘍細胞の分化に対して作用を示すかどうかを決定するために、インボルクリンの発現を、免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析により解析した。図25および26はそれぞれ、ラット351-mIgG1および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した腫瘍の、インボルクリンの免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析を示す。87393A1NSCLCPDXにおけるノッチ1活性化の阻害の結果、免疫組織化学的検査およびウエスタンブロット分析が示すように、インボルクリンの発現レベルの増加が生じた。したがって、腫瘍サイズの低下に加えて、また、抗ノッチ1による処理により、腫瘍細胞の分化も増加した。ノッチ1活性化の阻害が単独で体重に影響を及ぼすかどうかを決定するために、マウスを、invivoにおける有効性の研究間に体重測定した。表28は、87393A1NSCLCPDXにおいて、研究の間のラット351-mIgGにより処理した群および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体により処理した群のマウス体重-腫瘍重量の平均が顕著には異ならなかったことを示す。C.HPB-ALL異種移植片についての、invivoにおける増殖阻害研究上記に記載した37622A1NSCLCPDXおよび87393A1NSCLCPDXを用いて実施した実験に類似するinvivoにおける実験を、突然変異ノッチ1HPB-ALL細胞株を用いて実施した。異種移植片を生成するために、ヌード雌マウスNu/Nuに、50マトリゲルBDBiosciences中の8×10E6個のHPB-ALL細胞を皮下に埋め込んだ。腫瘍が、200~400mm3の体積に達したら、腫瘍を段階分けして、種々の処理群間の腫瘍質量の一様性を確保してから、抗ノッチ1抗体および対照のD16A抗体の投与を行った。HPB-ALLモデルに、20mg/kgのラット438-mIgG1、351-mIgG1、A2またはD16A抗体を、週2回2週間s.c.投与した。腫瘍を、少なくとも週1回測定し、それらの体積を、式:腫瘍体積mm3=0.5×腫瘍の幅2腫瘍の長さを用いて計算した。8~11匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍質量±SEMを計算し、対照処理と比較した。表29は、ノッチ1NRR中のL1575P突然変異を有するHPB-ALL異種移植片における、ラット438-mIgG1抗体、ラット351-mIgG1抗体およびA2抗体の有効性を示す。データは、ラット438-mIgG1を用いた処理およびラット351-mIgG1処理の両方が、対照のD16A抗体と比較して、HPB-ALL細胞のinvivoにおける増殖を阻害し、したがって、腫瘍の増殖を緩慢化したことを実証している。D.Calu-6NSCLC異種移植片についての、invivoにおける増殖阻害研究invivoにおける研究について上記したHPB-ALL細胞を用いて実施した実験に類似する実験を、Calu-6NSCLC細胞株を用いて実施した。Calu-6異種移植片を、最初に、ヌード雌マウスNu/Nuにおいて、2×10E6個のinvitroにおいて50マトリゲルBDBiosciences中で培養した細胞から確立し、次いで、腫瘍の動物間移植断片として、invivoにおいて連続継代した。腫瘍が、200~400mm3の体積に達したら、腫瘍を段階分けして、種々の処理群間の腫瘍サイズの一様性を確保してから、抗ノッチ1抗体および対照抗体の投与を行った。Calu-6モデルに、3、10および30mg/kgのラット438-mIgG1もしくはA2、または10mg/kgの対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaを、週2回2週間i.p.投与し、腫瘍を、少なくとも週1回測定し、それらの体積を、式:体積mm3=0.5×腫瘍の幅2腫瘍の長さを用いて計算した。8~11匹の動物から、それぞれの処理群についての平均腫瘍体積±SEMを計算し、対照処理と比較した。Calu-6モデルが、ノッチ経路阻害剤、例として、抗DLL4抗体Ridgewayら、Nature444:1083~1087、2006およびA2抗体に応答することが以前に実証されていることから選ばれた。表30は、Calu-6肺がんモデルにおける、ラット438-mIgG1およびA2の有効性を示す。3mg/kg、10mg/kgおよび30mg/kgのラット438-mIgG1を用いた処理の結果、腫瘍の増殖の用量依存的な減少が生じた。しかし、Calu-6異種移植片の効率的な>50の増殖の低下は、30mg/kgの用量においてのみ生じ、この用量は、37622A1PDXの増殖を類似のレベルまで阻害するのに必要な用量よりも3倍高かった。ノッチ1シグナル伝達の阻害が単独で体重に影響を及ぼすかどうかを決定するために、マウスを、invivoにおける有効性の研究間に体重測定した。表31は、研究の間の、ラット438-mIgG1により処理した群およびA2により処理した群ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した群のマウス体重-腫瘍重量の平均が、顕著には異ならなかったことを示す。E.乳がん異種移植片についての、invivoにおける増殖阻害研究ヒト化438VH1.1/VL1.8の作用を、トリプルネガティブ乳がん異種移植モデルであるSum149およびMDA-MB-231において、invivoにおける増殖に対して調べた。胸腺欠損雌マウスNu/Nu、6~8週齢を、CharlesRiverLaboratoriesから入手し、国際実験動物管理公認協会の指針に従って、病原体を含有しない特定条件下で飼育した。動物に、無菌のげっ歯類用固形飼料および水を自由に与えた。胸腺欠損マウス中に埋め込むための細胞を収集し、450×gで5~10分間遠心分離することによってペレット化した。細胞ペレットを1回洗浄し、無菌の無血清培地中に再懸濁させた。腫瘍細胞に、50マトリゲルBDBiosciencesを補充して、異種移植片として選択した腫瘍細胞が腫瘍として取り込まれ、増殖するのを促進した。細胞100μL中の2~3×106個を、マウスの後側腹部領域中の皮下に埋め込み、指定のサイズまで増殖させてから、それぞれの実験のために、化合物の投与を行った。腫瘍に対する有効性について、150~300mm3のサイズの腫瘍を担持する動物を、対照抗体26H6またはヒト化438VH1.1/VL1.8のいずれかを投与する群に無作為に分け、週1回のs.c.注射により投与を行った。ドセタキセルを、週1回のi.p.注射により投与した。腫瘍を、2~3日毎に測定した。腫瘍体積mm3を、副尺ノギスを用いて測定し、式:長さmm×幅mm×幅mm×0.52を使用して計算し、表32および33に示した。パーセント阻害値を、研究の最終日に、ビヒクル処理マウスと比較して、薬物処理マウスについて測定し、100-{1-[処理最終日-処理第1日/対照最終日-対照第1日]}として計算した。全ての腫瘍増殖阻害実験について、8~10匹のマウス/用量群を使用した。スチューデントのt検定を使用して、P値を決定した。表34は、トリプルネガティブ乳がん異種移植モデルにおけるヒト化438VH1.1/VL1.8の有効性を示す。実施例10抗ノッチ1阻害性抗体の、腸細胞の分化および増殖に対する作用ノッチシグナル伝達が薬理学的および遺伝子的に阻害されると、腸腺窩内の増殖性の前駆細胞が分泌性の杯細胞に変換されるvanEsら、Nature435:959~963、2005。抗ノッチ1阻害性抗体の、マウス腸中の細胞の増殖および分化に対する作用を、実施例9のCalu-6および87393A1NSCLCPDXにおける有効性研究から収集した組織に関して調べた。ムチンすなわち、分泌性の杯細胞についてのアルシアンブルー染色および増殖についての抗Ki67を使用する免疫組織化学的検査を、腸試料に対して実施した。マウス小腸を、Calu-6および87393A1NSCLCPDXにおける有効性研究から収集し、長軸方向に切り取り、ホルマリン固定し、70ETOH中に保った。次いで、組織をパラフィン中に包埋した。アルシアンブルー染色を、粘液物質について、製造元の指示に従って実施した。抗Ki67抗体SP6、Abcam、Cambridge、MAを使用する免疫組織化学的検査を、DAKOAutoStainerDAKO、Carpinteria、CA上で、製造元の指示に従って実施して、細胞増殖を示した。1.画像の獲得染色した組織切片を、NanozoomerSlideScannerHamamatsu、Bridgewater、NJ上で、20×objの設定を使用してスキャンした。画像をスキャンし、ndpファイルフォーマットとして保存した。仮想画像を、AperioImageScopeSoftwareAperioTechnologies、Vista、CA中で開いた。腸管腔の向かい合う側面から得られた2つの画像を、10×の仮想倍率で捕捉し、Tiff画像として保存した。図27は、Calu-6有効性研究から得られたマウス腸の回腸切片に対するアルシアンブルー染色を使用した、分泌性の杯細胞の組織化学的同定を示し、この有効性研究では、10mg/kgのラット438-mIgG1、A2または対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体のいずれかを用いて処理が行われていた。腸の絨毛および腺窩の代表的な画像を示す。杯細胞を、矢印で画定し、簡単にするために、各画像中の1個の細胞のみを、例として強調している。抗ノッチ1抗体は、研究の間に、体重減少を引き起こさなかったが、ラット438-mIgG1またはA2のいずれかを用いた処理により、分泌性の杯細胞の分化が誘導され、このことは、絨毛および腺窩中のアルシアンブルー染色の増加により証明されている。したがって、ノッチ1シグナル伝達の阻害は、単独で杯細胞の分化を増加させたが、体重に顕著な影響を及ぼすレベルではなかった。2.画像解析仮想画像を、ImagePro-PlusSoftwareMediaCybernetics、Bethesda、MD中で開いた。手動で描いたAreaofInterestAOIを作り出し、ここには、腸組織腺窩および絨毛を含めたが、平滑筋、人工物、ひだおよびデブリは除外した。アルシアンブルー染色領域および組織領域を同定するための閾値を求めた。閾値を、AOIに適用し、レンジ別統計を、Excel表計算ソフトにエクスポートした。Excelにおいて、平均アルシアンブルー染色比を、各動物について、2つの収集した染色比から計算して、動物毎に単一の計算したアルシアンブルー染色比を得た。平均アルシアンブルー染色比および標準偏差を、各群について求めた。統計操作を、JMP統計ソフトウエアJMP、Cary、NCを使用して実施した。表35は、Calu-6有効性研究においてラット438-mIgG1およびA2ならびに対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体により処理したマウス腸のアルシアンブルー染色比の画像定量化を示す。10mg/kgの抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella対照と比較して、10mg/kgおよび30mg/kgで投与したラット438-mIgG1において、アルシアンブルー染色比が顕著に増加した。アルシアンブルー染色の定量的画像解析により、図27に示す領域と比較して、回腸のより大きな領域にわたる杯細胞の分化の増加が確認されている。各処理群から得られた平均averageormeanアルシアンブルー染色比間の一対比較の統計学的解析を、表36に示す。それぞれの対についての比を、スチューデントのt検定を使用して決定した。正の値は、顕著に異なる、対の平均を示す。A2とは異なり、3mg/kgで投与したラット438-mIgG1は、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体と比較して、アルシアンブルー染色比の顕著な増加は誘導しなかった。さらに、10mg/kgで投与したA2は、10mg/kgで投与したラット438-mIgG1と比較して、アルシアンブルー染色比の顕著な増加を誘導し、このことは、ラット438-mIgG1が腸細胞において引き起こした細胞の分化はA2よりも低いことを示唆している。図28は、10mg/kgのラット438-mIgG1、A2または対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体のいずれかを用いる処理を行ったCalu-6有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する、抗Ki67の免疫組織化学的検査を示す。Ki67で染色した腸腺窩の代表的な画像を示す。Ki67染色が、腺窩の基部で、ラット438-mIgG1により処理した動物において低下したが、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した動物においては低下しなかった。Ki67で染色した増殖性の腺窩細胞の喪失は、アルシアンブルー染色により観察された、有糸分裂後の杯細胞への変換と一致した。表37は、87393A1NSCLCPDX有効性研究において、ラット351-mIgG1により処理したマウス腸および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体により処理したマウス腸のアルシアンブルー染色比の画像定量化を示す。抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella対照と比較して、ラット351-mIgG1処理マウスにおいては、アルシアンブルー染色比の有意な差はなかったp=0.22。アルシアンブルー染色の定量的画像解析により、ラット351-mIgG1は、他のノッチ経路阻害剤のようには、杯細胞の過形成を誘導しないことが示された。したがって、ラット351-mIgG1を用いるノッチ1シグナル伝達の阻害は、杯細胞の分化を増加させなかった。図29および表38は、ラット351-mIgG1抗体または対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体のいずれかを用いて処理を行った87393A1NSCLCPDX有効性研究から得られたマウス腸腺窩に対する、抗Ki67の免疫組織化学的検査およびKi67染色比の定量化を示す。図29は、Ki67で染色した腸腺窩の代表的な画像を示し、これらの画像から、Ki67染色が、腺窩の基部で、ラット351-mIgG1により処理した動物において低下したが、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenellaにより処理した動物においては低下しなかったことが示されている。表38は、この観察結果と一致する、ラット351-mIgG1により処理したマウス腸および対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体により処理したマウス腸のKi67染色比の画像定量化を示す。データは、ラット351-mIgG1による処理において、対照の抗鶏盲腸コクシジウムE.tenella抗体による処理と比較して、Ki67染色比の小さいが、静的に有意なp=0.023減少があることを示している。Ki67染色比の定量分析は、腺窩の基部における細胞の増殖の減少を示し、このことは、図29の上部パネルに示す領域と比較して、回腸のより大きな領域にわたるKi67染色の相対レベルの低下により示されている。したがって、ラット351-mIgG1を用いるノッチ1シグナル伝達の阻害により、増殖が減少した。実施例11抗ノッチ1阻害性抗体の薬物動態および薬力学1.ヨウ素化の手順ヨウ素化を、IODO-BEADS法を使用して、製造元Pierce、Rockford、ILの指示に従って実施した。手短に述べると、約200μgの試験物品を、2mCiの125-ヨウ素Perkin-Elmer当たり使用し、2つのIODO-BEADSおよび約200μLのPBSと共に、室温で15~25分間インキュベートした。反応混合物を、IODO-BEADSから、ろ過Centricon-10、Millipore、Billerica、MA製により分離した。2.投与用溶液の調製および特徴付けラット438-mIgG1については、10mL/kgの投与体積のマウスにおける投与を可能にするために、未標識試験物品のラット438-mIgG1、微量の125I標識試験物品および調合用緩衝液PBSを混合することによって、投与用溶液を調製して、2mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。ラット351-mIgG1については、群I5mg/kgi.v.、群II5mg/kgi.p.および群III30mg/kgi.p.のためにそれぞれ、2.5、10および12.5mL/kgの投与体積のマウスにおける投与を可能にするために、未標識試験物品のラット351-mIgG1、微量の125I標識試験物品および調合用緩衝液PBSを混合することによって、3つの投与用溶液を調製して、2、0.5および2.4mg/mLの最終タンパク質濃度を得た。遊離のヨウ素が占める投与用溶液中の放射活性の割合遊離ヨウ素を、トリクロロ酢酸TCAによる沈殿を使用して決定した。投与用溶液の一定分量5μLを、マウス血清45μLと混合し、総放射活性について三つ組で計数したModel1480WIZARD登録商標、WallacInc.、Gaithersburg、MD、またはModel2470、PerkinElmer、WalthamMA。TCA50μLの20原液を、試料に添加した。試料を、およそ3000gで10分間遠心分離した。得られた上清の50μLの一定分量を、1分当たりの可溶性カウントcpmについて計数した。投与用溶液中の遊離ヨウ素の割合を、式:[2×平均可溶性溶出cpm/平均総溶出cpm×100]を使用して計算した。投与用溶液の比活性μCi/mgを、式:[平均総cpm-2×平均可溶性cpm]/[投与用溶液濃度mg/mL×投与用溶液体積mL×2,200,000cpm/μCi]により計算した。また、投与用溶液の純度も、SDS-PAGEを使用して定性的に分析し、非還元性条件下では主に単一バンドとして、および還元性条件下では二重バンドとして確認した。3.血清および組織中の放射性当量濃度の決定血清試料50μL、二つ組中の総放射活性を、ガンマカウントにより決定した。それぞれの血清の一定分量中に、同等体積の20TCAを添加し、試料を、約12000rpmで10分間スピンした。50μLの上清の一定分量中のTCA可溶性放射活性を、ガンマ-カウントにより決定した。所与の試料中のTCA沈殿性放射活性cpm総cpm-2×TCA可溶性cpm、投与用溶液の比活性TCA沈殿性cpm/mgタンパク質、ならびに試料tSおよび投与用溶液tDの測定の日を使用して、所与の試料中の試験物品濃度を、式:[平均TCA沈殿性cpm/EXP-0.693/60.2×tS-td]/[比活性cpm/mgで示す×試料体積mLで示す]を使用して計算した。125I標識試験物品の放射性当量組織濃度μgeq./gの定量化は、125Iの半減期について補正を行った後の組織中の総放射活性および投与用溶液の比活性に基づき、式:[試料cpm/EXP-0.693/60.2×tS-tD]/[比活性cpm/mgで示す×試料重量mgで示す]を使用した。組織試料についてのTCAによる沈殿は実施しなかった。所与の時点における組織試料についての組織濃度対血清濃度の比T/Sを、組織中の放射性当量濃度μgeq./g対血清中の放射性当量濃度μgeq./mLの比を使用して計算した。4.薬物動態学的計算薬物動態学的計算は、マウス中の平均の血清濃度または組織濃度に基づいた。薬物動態学ソフトウエアパッケージWinNonlin、5.1版Pharsightの非コンパートメント解析モジュールIV投与およびIP投与後の血清データの解析のためにそれぞれ、Model201およびModel200を使用した。血清濃度対時間曲線下面積AUCを、線形台形法を使用して計算した。見かけの終末相の勾配を、対数-線形回帰により、少なくとも3つのデータ点を使用して推定し、終末速度定数λを、勾配から求めた。AUC0-∞を、AUC0-tこの場合、tは、最後に濃度が測定可能であった時間であるとCt/λとの和として推定した。見かけの終末半減期t1/2を、0.693/λとして計算した。表39は、125ヨウ素標識ラット438-mIgG1抗体の単回の5mg/kgi.p.注射の後に指定した時点で測定した、ラット438-mIgG1抗体に対する、非腫瘍担持ヌードマウスの血清および組織の暴露を示す。最も高い放射性当量RE濃度および暴露AUC0-INFが、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、皮膚、腎臓、大腸、小腸、肺および眼中に見出された。表39に示すように、組織中の放射活性は、時間と共に減退した。マウスの消化管において、ノッチ1が発現し、ノッチ1シグナル伝達が不可欠な役割を果たすことが知られているにもかかわらず、ラット438-mIgG1が、試験した他の組織と比較して、大腸および小腸中に優先的には蓄積しなかった。組織濃度対血清濃度の比を計算し、ヌードマウスへのラット438-mIgG1の単回の5mg/kgi.p.投与の後の平均の組織濃度/血清濃度の比を、表40に示す。組織濃度対血清濃度の比は、調べた時点を通して、比較的一定した状態を維持し、このことは、血清と組織との間の平衡を示している。ラット438-mIgG1の血清濃度は、組織濃度よりも高く、したがって、T/Sの比は低く一般に、<1、mIgG1について観察される典型的な範囲に属した。125I標識ラット438-mIgG1の投与後、Cmaxを計算して、16.4μgeq./mLを得、Tmaxには、3時間で達した。表41に示すように、排出t1/2は58時間であり、暴露AUC0-∞は、788μgeq.×時間/mLであった。単回の5mg/kgi.p.投与の後のラット438-mIgG1の半減期は、比較的短い約2.4日。ラット351-mIgG1の血清暴露を、非腫瘍担持ヌードマウス中で、125I標識ラット351-mIgG1抗体の単回の5mg/kgi.v注射、5mg/kgi.p.注射または30mg/kgi.p.注射の後に測定した。観察された血清濃度の値を使用して、複数の薬物動態パラメータを計算し、これらを、表42および表43に示す。表42は、雌ヌードマウスへの5mg/kgの125I標識ラット351-mIgG1のi.v.投与の後の薬物動態パラメータを示す。ラット351-mIgG1の排出t1/2および全身クリアランスはそれぞれ、約3日70.2時間および1.74mL/時間/kgであった。定常状態における分布体積Vdssは、177mL/kgであった。暴露AUC0-INFは、2871μgeq.時間/mLであった。表43は、雌ヌードマウスへの5および30mg/kgの125I標識ラット351-mIgG1のi.p.投与の後の薬物動態パラメータを示す。Cmaxはそれぞれ、30および151μgeq./mLであり、両方の投与群が、Tmaxに6時間で達した。5および30mg/kgのi.p.投与に続きそれぞれ、排出t1/2は、93および163時間約4~7日であり、暴露AUC0-INFは、2754および24080μgeq.×時間/mLであった。i.p.投与とi.v.投与との間の投与正規化AUC比Fは、約1.4であり、このことは、マウスにおける30mg/kgのi.p.投与の後の吸収が完全であったことを示唆している。ラット351-mIgG1に対する非腫瘍担持ヌードマウスの血清および組織の暴露を、125I標識ラット351-mIgG1の単回の5および30mg/kgのi.p.注射の後に測定した。5mg/kgi.p.投与については、表44に示すように、最も高い放射性当量RE濃度および暴露AUC0-INFが、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、脾臓、皮膚、腎臓、小腸、大腸、肺および眼中に見出された。30mg/kgi.p.投与については、表45に示すように、最も高い放射性当量RE濃度および暴露AUC0-INFが、調べた全ての時点で、血清中に、続いて、肝臓、皮膚、脾臓、小腸、肺、腎臓、眼および大腸中に見出された。データは、ラット351-mIgG1が、5mg/kgおよび30mg/kgの両方のi.p.投与について、試験した他の組織と比較して、大腸および小腸中に優先的には蓄積しなかったことを示している。"