"aヘルペスウイルス由来の第1のタンパク質もしくはその断片をコードする第1のヌクレオチド配列またはその断片およびb前記ヘルペスウイルス由来の第2のタンパク質もしくはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列またはその断片を含むポリヌクレオチドを含む自己複製RNA分子であって、前記自己複製RNA分子が適した細胞の中に導入された場合に、前記第1のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片および前記第2のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片が、前記第1のタンパク質または断片および前記第2のタンパク質または断片を含有する前記細胞における複合体の形成に十分な量で産生されるように、前記第1のヌクレオチド配列および前記第2のヌクレオチド配列が1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている、自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質および前記第2のタンパク質が、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、前記第1のタンパク質が、前記第2のタンパク質の断片ではなく、前記第2のタンパク質が、前記第1のタンパク質の断片ではないという条件を有する、請求項1に記載の自己複製RNA分子。前記第1のヌクレオチド配列が、第1の制御エレメントに作動可能に連結され、前記第2のヌクレオチド配列が、第2の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項1または2に記載の自己複製RNA分子。前記ヘルペスウイルス由来の第3のタンパク質またはその断片をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第3のヌクレオチド配列は、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子。前記第3のヌクレオチド配列が、第3の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項4に記載の自己複製RNA分子。前記ヘルペスウイルス由来の第4のタンパク質またはその断片をコードする第4のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第4のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項4または5に記載の自己複製RNA分子。前記第4のヌクレオチド配列が、第4の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項6に記載の自己複製RNA分子。前記ヘルペスウイルス由来の第5のタンパク質またはその断片をコードする第5のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第5のヌクレオチド配列が、制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項6または7に記載の自己複製RNA分子。前記第5のヌクレオチド配列が、第5の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項8に記載の自己複製RNA分子。前記制御エレメントが、サブゲノムプロモーター、IRES、およびウイルス2A部位から成る群から独立して選択される、請求項1~9のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子。前記ヘルペスウイルスが、サイトメガロウイルスCMVである、請求項1~10のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片、前記第2のタンパク質または断片、前記第3のタンパク質または断片、前記第4のタンパク質または断片、および前記第5のタンパク質または断片が、gB、gH、gL;gO;gM、gN;UL128、UL130、UL131、および前述のもののいずれか1つの断片から成る群から独立して選択される、請求項11に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片が、gHまたはその断片であり、前記第2のタンパク質または断片が、gLまたはその断片である、請求項11に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片が、gHまたはその断片であり、前記第2のタンパク質または断片が、gLまたはその断片であり、前記第3のタンパク質または断片が、gOまたはその断片である、請求項11に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片が、gHまたはその断片であり、前記第2のタンパク質または断片が、gLまたはその断片であり、前記第3のタンパク質または断片が、UL128またはその断片であり、前記第4のタンパク質または断片が、UL130またはその断片であり、前記第5のタンパク質または断片が、UL131またはその断片である、請求項11に記載の自己複製RNA分子。前記ヘルペスウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルスVZVである、請求項10に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片、前記第2のタンパク質または断片、前記第3のタンパク質または断片、前記第4のタンパク質または断片、および前記第5のタンパク質または断片が、gB、gE、gH、gI、gL、および前述のもののいずれか1つの断片から成る群から独立して選択される、請求項16に記載の自己複製RNA分子。前記第1のタンパク質または断片が、gHまたはその断片であり、前記第2のタンパク質または断片が、gLまたはその断片である、請求項16に記載の自己複製RNA分子。アルファウイルスレプリコンである、請求項1~18のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子。請求項19に記載のアルファウイルスレプリコンを含むアルファウイルスレプリコン粒子VRP。請求項20に記載のVRPおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。第2のVRPをさらに含み、前記第2のVRPは、前記ヘルペスウイルス由来のタンパク質またはその断片をコードする自己複製RNA分子を含有する、請求項21に記載の組成物。アジュバントをさらに含む、請求項21または22に記載の組成物。請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNAおよび薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物。前記ヘルペスウイルス由来のタンパク質またはその断片をコードする第2の自己複製RNA分子をさらに含む、請求項24に記載の組成物。RNA送達系をさらに含む、請求項24または25に記載の組成物。前記RNA送達系が、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせである、請求項26に記載の組成物。前記送達系が、水中油型カチオン性ナノエマルジョンである、請求項26に記載の組成物。タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に請求項20に記載のVRPを送達する工程およびアルファウイルスレプリコンの発現に適した条件下で前記細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。前記細胞が、invivoにおけるものである、請求項29に記載の方法。タンパク質複合体を形成する方法であって、細胞に請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNAを送達する工程および前記自己複製RNAの発現に適した条件下で前記細胞を維持する工程を含み、ここでタンパク質複合体が形成される、方法。前記細胞が、invivoにおけるものである、請求項21に記載の方法。細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、前記細胞を請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNAと接触させる工程を含む、方法。細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害する方法であって、前記細胞を請求項20に記載のVRPと接触させる工程を含む、方法。前記細胞が、上皮細胞、内皮細胞、および線維芽細胞から成る群から選択される、請求項33または請求項34に記載の方法。前記細胞が、上皮細胞である、請求項35に記載の方法。前記細胞が、invivoにおけるものである、請求項33~36のいずれか一項に記載の方法。個体において免疫応答を誘発する方法であって、請求項20に記載のVRPまたは請求項21~23のいずれか一項に記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。個体において免疫応答を誘発する方法であって、請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子または請求項24~28のいずれか一項に記載の組成物を前記個体に投与する工程を含む、方法。前記免疫応答が、中和抗体の産生を含む、請求項38または39に記載の方法。前記中和抗体が、補体非依存性である、請求項40に記載の方法。請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNA分子をコードする組換えDNA分子。前記組換えDNA分子が、プラスミドである、請求項42に記載の組換えDNA分子。細胞においてタンパク質複合体を形成するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNAまたは請求項20に記載のVRPの使用。細胞へのヘルペスウイルス侵入を阻害するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNAまたは請求項20に記載のVRPの使用。個体において免疫応答を誘発するための、請求項1~19のいずれか一項に記載の自己複製RNA、請求項20に記載のVRP、または請求項21~28のいずれか一項に記載の組成物の使用。2つ以上のヘルペスウイルスタンパク質をコードする核酸、同じ細胞において2つ以上のヘルペスウイルスタンパク質を発現する方法、およびより良好な免疫応答をもたらす免疫化方法に対する必要性が存在する。本発明は、サイトメガロウイルスCMVタンパク質などの2つ以上のヘルペスウイルスタンパク質、特に、invivoにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達co-deliveryするためのプラットフォームに関する。一態様では、本発明は、第1のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードする第1の配列および第2のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードする第2の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子である。たとえば、本発明は、aヘルペスウイルス由来の第1のタンパク質またはその断片をコードする第1のヌクレオチド配列およびbヘルペスウイルス由来の第2のタンパク質またはその断片をコードする第2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む自己複製RNA分子を提供する。自己複製RNA分子が適した細胞の中に導入された場合に、第1および第2のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片が、第1および第2のタンパク質または断片を含有する細胞において複合体を形成するのに十分な量で産生されるように、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列が1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。好ましくは、第1のタンパク質および第2のタンパク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第1のタンパク質は、第2のタンパク質の断片ではなく、第2のタンパク質は、第1のタンパク質の断片ではない。第1のヌクレオチド配列は、第1の制御エレメントに作動可能に連結することができ、第2のヌクレオチド配列は、第2の制御エレメントに作動可能に連結することができる。自己複製RNA分子は、当該ヘルペスウイルス由来の第3のタンパク質またはその断片をコードする第3のヌクレオチド配列、任意選択で、当該ヘルペスウイルス由来の第4のタンパク質またはその断片をコードする第4のヌクレオチド配列、および任意選択で、当該ヘルペスウイルス由来の第5のタンパク質またはその断片をコードする第5のヌクレオチド配列をさらに含むことができる。ヘルペスウイルス由来の追加のタンパク質または断片をコードする配列つまり第3のヌクレオチド配列、第4のヌクレオチド配列、および第5のヌクレオチド配列が存在する場合、これらの配列は、1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。ペンタシストロニックpentacistronic構築物の一例では、第1のヌクレオチド配列は、第1の制御エレメントに作動可能に連結され、第2のヌクレオチド配列は、第2の制御エレメントに作動可能に連結され、第3のヌクレオチド配列は、第3の制御エレメントに作動可能に連結され、第4のヌクレオチド配列は、第4の制御エレメントに作動可能に連結され、第5のヌクレオチド配列は、第5の制御エレメントに作動可能に連結されている。構築物中に存在する制御エレメントたとえば第1、第2、第3、第4、および第5の制御エレメントは、サブゲノムsubgenomicプロモーター、IRES、およびウイルスたとえばFMDV2A部位から成る群から独立して選択することができる。ヘルペスウイルスは、HSV-1、1、HSV-2、VZV、EBV1型、EBV2型、CMV、HHV-6A型、HHV-6B型、HHV-7、およびHHV-8であり得る。いくつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子たとえば自己複製RNAは、これらのヘルペスウイルスのいずれか1つのgHまたはその断片およびgLまたはその断片をコードする。より特定の実施形態では、ヘルペスウイルスは、CMVまたはVZVである。組換えポリシストロニック核酸分子たとえば自己複製RNAが、2つ以上のVZVタンパク質をコードする場合、タンパク質は、gB、gE、gH、gI、gL、およびその断片たとえば少なくとも10アミノ酸のから成る群から選択することができる。いくつかの実施形態では、組換えポリシストロニック核酸分子たとえば自己複製RNAは、VZVgHまたはその断片およびVZVgLまたはその断片をコードする。具体例では、本発明は、a第1のサイトメガロウイルスCMVタンパク質またはその断片をコードする第1の配列およびb第2のCMVタンパク質またはその断片をコードする第2の配列を含むポリヌクレオチドを含む自己複製RNA分子を提供する。自己複製RNA分子が適した細胞の中に導入された場合に、第1および第2のCMVタンパク質が、第1および第2のCMVタンパク質または断片を含有する細胞において複合体を形成するのに十分な量で産生されるように、第1の配列および第2の配列が1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている。第1のCMVタンパク質および第2のCMVタンパク質は、gB、gH、gL;gO;gM、gN;UL128、UL130、UL131、および前述のもののいずれか1つの断片から成る群から独立して選択される。好ましくは、第1のCMVタンパク質および第2のCMVタンパク質は、同じタンパク質でも同じタンパク質の断片でもなく、第1のCMVタンパク質は、第2のCMVタンパク質の断片ではなく、第2のCMVタンパク質は、第1のCMVタンパク質の断片ではない。所望の場合、自己複製RNA分子は、第3のCMVタンパク質をコードする第3の配列をさらに含むことができ、第3の配列は、制御エレメントに作動可能に連結されている。同様に、追加のCMVタンパク質をコードする追加の配列たとえば第4のCMVタンパク質をコードする第4の配列、第5のCMVタンパク質をコードする第5の配列を含むことができる。制御エレメントは、サブゲノムプロモーターおよびIRESおよびウイルス2A部位から成る群から独立して選択することができる。いくつかの実施形態では、自己複製核酸分子は、CMVタンパク質gHおよびgLをコードする。他の実施形態では、自己複製RNA分子は、CMVタンパク質gH、gL、およびgOをコードする。他の実施形態では、自己複製RNA分子は、CMVタンパク質gH、gL、UL128、UL130、およびUL131をコードする。自己複製RNA分子は、アルファウイルスレプリコンであり得る。そのような場合には、アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコン粒子VRPの形態で送達することができる。自己複製RNA分子はまた、裸のRNA分子の形態とすることもできる。本発明はまた、本明細書において記載される自己複製RNA分子をコードする組換えDNA分子にも関する。いくつかの実施形態では、組換えDNA分子は、プラスミドである。いくつかの実施形態では、組換えDNA分子は、コードされる自己複製RNA分子の転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含む。本発明はまた、本明細書において記載される自己複製RNA分子および薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物にも関する。自己複製RNA分子は、裸のものであり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、CMVタンパク質gHおよびgLをコードする自己複製RNA分子を含む。他の実施形態では、組成物は、CMVタンパク質gBをコードする自己複製RNA分子をさらに含む。組成物はまた、リポソーム、ポリマーナノ粒子、水中油型カチオン性ナノエマルジョン、またはその組み合わせなどのRNA送達系を含有することができる。たとえば、自己複製RNA分子は、リポソーム中に被包され得る。ある実施形態では、組成物は、2つ以上のCMVタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンを含有するVRPを含む。いくつかの実施形態では、VRPは、CMVgHおよびgLをコードするレプリコンを含む。所望の場合、組成物は、CMVgBをコードするレプリコンを含有する第2のVRPをさらに含むことができる。組成物はまた、アジュバントをも含むことができる。本発明はまた、CMVタンパク質複合体を形成するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNAは、細胞に送達され、細胞は、CMVタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここで、CMVタンパク質複合体が形成される。他の実施形態では、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNAを含有するVRPは、細胞に送達され、細胞は、CMVタンパク質の発現に適した条件下で維持され、ここでCMVタンパク質複合体が形成される。方法は、invivoにおいて、細胞においてCMVタンパク質複合体を形成するために使用することができる。本発明はまた、個体において免疫応答を誘発するための方法にも関する。いくつかの実施形態では、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNAは、個体に投与される。自己複製RNA分子は、リポソームなどのRNA送達系を含有する組成物として投与することができる。他の実施形態では、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNAを含有するVRPは、個体に投与される。好ましい実施形態では、自己複製RNA分子は、CMVタンパク質gHおよびgLをコードする。好ましくは、誘発された免疫応答は、中和抗CMV抗体の産生を含む。より好ましくは、中和抗体は、補体非依存性である。本発明はまた、細胞の中へのCMV侵入を阻害するための方法であって、細胞をgHおよびgLなどの2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNA分子と接触させることを含む方法にも関する。細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、およびその組み合わせから成る群から選択することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNAを含有するVRPと接触させられる。本発明はまた、免疫応答を誘発するまたは細胞の中へのCMV侵入を阻害するために、細胞においてCMVタンパク質複合体を形成する、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNA分子たとえばVRP、自己複製RNA分子を含む組成物、およびリポソームの使用にも関する。本発明は、サイトメガロウイルスCMVタンパク質などのヘルペスウイルスタンパク質、特に、invivoにおいて複合体を形成するタンパク質を細胞に同時送達するためのプラットフォームを提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質およびそれらが形成する複合体は、強力な中和抗体を誘発する。ヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質、特に、invivoにおいて複合体を形成するものたとえばgH/gLの同時送達によってもたらされる免疫応答は、他のアプローチを使用してもたらされる免疫応答より優れたものとなり得る。たとえば、CMVのgHおよびgLの両方をコードするRNA分子たとえばレプリコンは、gBをコードするRNA分子、gHをコードするRNA分子、gLをコードするRNA分子、またはさらにgHまたはgLを個々にコードするRNA分子の混合物と比較して、より良好な中和性の力価および/または防御免疫を誘発することができる。さらに、gH/gL/UL128/UL130/UL131をコードするレプリコンは、gH/gLのみをコードするものより優れた応答を提供することができる。一般的な態様では、本発明は、2つ以上のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質を細胞に送達するためのプラットフォームに関する。プラットフォームは、第1のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードする第1の配列および第2のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードする第2の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子を含む。所望の場合、追加のタンパク質をコードする1つまたは複数の追加の配列、たとえば、第3のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片、第4のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片、第5のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片などは、組換えポリシストロニック核酸分子において存在することができる。ヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードする配列は、ヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質または断片が組換えポリシストロニック核酸を含有する細胞によって産生されるように、1つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結されている。本明細書において記載されるポリシストロニック核酸において、コードされる第1および第2のヘルペスウイルスタンパク質または断片ならびにコードされる第3、第4、および第5のヘルペスウイルスタンパク質または断片は、存在する場合、一般的に、また好ましくは、同じヘルペスウイルス由来のものである。ある例において、ポリシストロニックベクターによってコードされるヘルペスウイルスタンパク質または断片はすべて、CMVタンパク質またはVZVタンパク質である。本明細書において記載される組換えポリシストロニック核酸分子は、細胞に、2つ以上のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質をコードする配列を送達し、かつinvivoにおいて2つ以上のヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質を含有するタンパク質複合体の形成をもたらすのに十分なレベルでヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質の発現を駆動する利点を提供する。このアプローチを使用して、2つ以上のコードされるヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質は、ヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質複合体たとえばgH/gLの形成に十分な細胞内レベルで発現させることができる。たとえば、コードされるヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片は、適切な発現制御配列たとえばプロモーター、IRES、2A部位などを選択することによって、実質的に同じレベルでまたは所望の場合、異なるレベルで発現させることができる。これは、非効率的で、非常に変わりやすいものとなり得る、異なるヘルペスウイルスたとえばCMVをコードする2つ以上の個々のDNA分子を同じ細胞に同時送達することよりも、invivoにおいてタンパク質複合体を産生するための著しくより効率的な方法である。たとえば、国際公開第2004/076645号を参照されたい。組換えポリシストロニック核酸分子は、DNAたとえばプラスミドもしくはウイルスDNAまたはRNAなどの任意の所望の核酸に基づくものであり得る。任意の適したDNAまたはRNAは、ヘルペスウイルスたとえばCMVタンパク質またはその断片をコードするオープンリーディングフレームを持つ核酸ベクターとして使用することができる。適した核酸ベクターは、1つを超えるタンパク質遺伝子を持ち、その発現を駆動するための能力を有する。そのような核酸ベクターは、当技術分野において公知であり、たとえばプラスミド、ワクシニアウイルスベクターたとえばNYVAC、米国特許第5,494,807号を参照されたいおよびポックスウイルスベクターたとえばALVACカナリアポックスベクター、SanofiPasteurなどのDNAウイルスから得られるDNA、ならびにアルファウイルスなどの適したRNAウイルスから得られるRNAを含む。所望の場合、組換えポリシストロニック核酸分子は、修飾することができる、たとえば、本明細書においてさらに記載される修飾核酸塩基および/または連結を含有することができる。好ましくは、ポリシストロニック核酸分子は、RNA分子である。いくつかの態様では、組換えポリシストロニック核酸分子は、プラスミドDNAなどのDNA分子である。そのようなDNA分子は、たとえば、ポリシストロニックレプリコンをコードし、レプリコンの転写を駆動する哺乳動物プロモーターを含有することができる。組換えポリシストロニック核酸分子またはこのタイプは、哺乳動物に投与され得、その後、ヘルペスウイルスタンパク質を発現するポリシストロニックレプリコンを産生するようにinsituにおいて転写され得る。いくつかの態様では、本発明は、ヘルペスウイルスgHまたはその断片およびヘルペスウイルスgLまたはその断片をコードする配列を含有するポリシストロニック核酸分子である。gHおよびgLタンパク質またはその断片は、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV1型、EBV2型、CMV、HHV-6A型、HHV-6B型、HHV-7、KSHV、およびその他同種のものなどの任意の所望のヘルペスウイルス由来のものであり得る。好ましくは、ヘルペスウイルスは、VZV、HSV-2、HSV-1、EBV1型もしくは2型、またはCMVである。より好ましくは、ヘルペスウイルスは、VZV、HSV-2、またはCMVである。さらにより好ましくは、ヘルペスウイルスは、CMVである。gHおよびgLタンパク質ならびにこれらのウイルス由来のタンパク質をコードする核酸の配列は、当技術分野において周知である。例示的な配列は、表1で特定される。ポリシストロニック核酸分子は、表1に開示されるgHタンパク質をコードする第1の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99同一である配列を含有することができる。ポリシストロニック核酸分子はまた、表1に開示されるgLタンパク質をコードする第2の配列もしくはその断片またはそれと少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99同一である配列をも含有することができる。本発明の本記載において、特定の配列成分は、核酸の明確な記載を容易にするために第1の配列、第2の配列などと呼ばれる。第1および第2の配列は、任意の所望の順序または方向で現れ得、特定の順序または方向は、第1の、第2のなどの語によって意図されないことが理解される。同様に、タンパク質複合体は、複合体において存在するタンパク質、たとえばgH/gLを列挙することによって言及される。これは、複合体において存在するタンパク質によって複合体を記載するように意図され、タンパク質の相対量または組換え核酸上でタンパク質をコードする配列の順序もしくは方向を示すものではない。CMVタンパク質をコードする配列を含有するアルファウイルスVRPおよび自己複製RNAなどのある種の好ましい実施形態は、本明細書においてさらに記載される。そのような好ましい実施形態におけるCMVタンパク質をコードする配列は、他のヘルペスウイルス由来のgHおよびgLなどのタンパク質をコードする配列と交換することができることが意図される。アルファウイルスVRPプラットフォームいくつかの実施形態では、CMVタンパク質は、下記に記載されるポリシストロニックレプリコンまたはベクターを用いるアルファウイルスレプリコン粒子VRPを使用して、細胞に送達される。本明細書において使用されるように、ポリシストロニックは、バイシストロニックベクターおよび3つ以上のシストロンを含むベクターを含む。ポリシストロニックベクターにおけるシストロンは、同じCMV株または異なるCMV株由来のCMVタンパク質をコードすることができる。シストロンは、任意の5’-3’の順序で方向づけることができる。CMVタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列は、タンパク質を産生するために使用することができる。2つ以上のCMVタンパク質またはその断片をコードするポリシストロニック核酸を調製するのに有用な例示的な配列は、本明細書において記載される。本明細書において使用されるように、用語アルファウイルスは、当技術分野におけるその通常の意味を有し、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEE;たとえばTrinidaddonkey、TC83CRなど、セムリキ森林ウイルスSFV、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、S.A.AR86ウイルス、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイルス、バーマ森林ウイルス、ミッデルブルグウイルス、ピクスナウイルス、オニオニオンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ユナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルスBanbankivirus、キジラガチウイルスKyzylagachvirus、ハイランドJウイルス、フォートモーガンウイルスFortMorganvirus、ヌドゥムウイルス、およびバギークリークウイルスBuggyCreekvirusなどの様々な種を含む。アルファウイルスという用語はまた、1つを超えるアルファウイルス由来のゲノム配列を含有するキメラアルファウイルスたとえばPerriら、2003年J.Virol.77巻19号:10394~403頁によって記載されるものをも含んでいてもよい。アルファウイルスレプリコン粒子VRPまたはレプリコン粒子は、アルファウイルス構造タンパク質によりパッケージされたアルファウイルスレプリコンである。アルファウイルスレプリコンまたはレプリコンは、標的細胞においてinvivoにおいてそれ自体の増幅を指示することができるRNA分子である。レプリコンは、RNA増幅を触媒するポリメラーゼ複数可nsP1、nsP2、nsP3、nsP4をコードし、コードされるポリメラーゼ複数可によって認識され、利用される、複製に必要とされるシスRNA配列を含有する。アルファウイルスレプリコンは、典型的に、次の順序付けられたエレメントを含有する:複製のためにシスで必要とされる5’ウイルス配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質nsP1、nsP2、nsP3、nsP4をコードする配列、複製のためにシスで必要とされる3’ウイルス配列、およびポリアデニレートトラクトpolyadenylatetract。アルファウイルスレプリコンはまた、異種ヌクレオチド配列の発現を指示する1つまたは複数のウイルスサブゲノムジャンクション領域プロモーターを含有してもよく、これは、ある実施形態において、発現されることとなるサブゲノム断片および異種配列複数可のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾されてもよい。下記に記載される他の制御エレメントを使用することができる。CMVタンパク質をコードするアルファウイルスレプリコンは、VRPを産生するために使用される。そのようなアルファウイルスレプリコンは、少なくとも2つのCMVタンパク質またはその断片をコードする配列を含む。これらの配列は、同じまたは異なるものであり得る、サブゲノムプロモーター、IRESたとえばEMCV、EV71、およびウイルス2A部位などの1つまたは複数の適した制御エレメントに作動可能に連結されている。本明細書において開示されるポリシストロニックベクターを使用するこれらの複合体の成分の送達は、所望の相対量で2つ以上のCMVタンパク質をコードする核酸配列を提供するための効率的な方法であるのに対して、複数のアルファウイルス構築物が、複合体形成のための個々のCMVタンパク質を送達するために使用される場合、VRPの効率的な同時送達が、必要とされるであろう。適した制御エレメントの任意の組み合わせもまた、任意の順序で使用することができる。一例では、単一のサブゲノムプロモーターは、2つの異なるCMVタンパク質をコードする2つの配列に作動可能に連結されており、IRESは、2つのコード配列の間に位置づけられる。他の例では、2つの異なるCMVタンパク質をコードする2つの配列は、別々のプロモーターに作動可能に連結されている。他の例では、2つの異なるCMVタンパク質をコードする2つの配列は、単一のプロモーターに作動可能に連結されている。2つの異なるCMVタンパク質をコードする2つの配列は、ウイルス2A部位をコードするヌクレオチド配列を通して互いに連結されており、したがって、両方のCMVタンパク質のアミノ酸配列を含有する単一のアミノ酸鎖をコードする。この文脈におけるウイルス2A部位は、コードされるポリプロテインから2つのCMVタンパク質を生成するために使用される。サブゲノムプロモータージャンクション領域プロモーターとしても公知であるサブゲノムプロモーターは、タンパク質発現を調節するために使用することができる。アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、アルファウイルスの構造タンパク質の発現を調節する。StraussおよびStrauss、Thealphaviruses:geneexpression,replication,andevolutionMicrobiolRev.1994年9月;58巻3号:491~562頁を参照されたい。ポリシストロニックポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来のサブゲノムプロモーターを含むことができる。2つ以上のサブゲノムプロモーターがポリシストロニックポリヌクレオチドにおいて存在する場合、そのプロモーターは、同じかまたは異なるものであり得る。たとえば、サブゲノムプロモーターは、配列CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA配列番号___を有することができる。ある実施形態では、サブゲノムプロモーターは、タンパク質のウイルス転写を増大させるまたは低下させるために修飾することができる。米国特許第6,592,874号を参照されたい。内部リボソーム導入部位internalribosomalentrysiteIRESいくつかの実施形態では、1つまたは複数の制御エレメントは、内部リボソーム導入部位IRESである。IRESは、複数のタンパク質が単一のmRNA転写物から作製されるのを可能にする。なぜなら、リボソームがそれぞれのIRESに結合し、真核細胞においてタンパク質の翻訳を開始するために通常必要とされる5’キャップの非存在下において翻訳を開始するからである。たとえば、IRESは、EV71またはEMCVであり得る。ウイルス2A部位FMDV2Aタンパク質は、非構造タンパク質FMDV2BからFMDVの構造タンパク質を隔てるための役目をする短いペプチドである。このペプチドに対する初期の研究は、それが自己触媒プロテアーゼとして作用することを示唆したが、他の研究たとえばDonnellyら、2001年、J.Gen.Virol.82巻、1013~1025頁は、この短い配列およびこれに続くFMDV2Bの単一のアミノ酸Glyが、翻訳の停止-開始点stop-startとして作用することを示唆する。厳密な作用様式にかかわらず、配列を、2つのポリペプチドの間に挿入し、単一のオープンリーディングフレームからの複数の個々のポリペプチドの産生を達成することができる。本発明との関連において、FMDV2A配列を、少なくとも2つのCMVタンパク質をコードする配列の間に挿入することができ、単一のオープンリーディングフレームの一部としてそれらの合成を可能にする。たとえば、オープンリーディングフレームは、ウイルス2A部位をコードする配列によって隔てられたgHタンパク質およびgLタンパク質をコードしてもよい。単一のmRNAは、その後、翻訳ステップの間に転写され、gHおよびgLペプチドは、ウイルス2A部位の活性により別々に産生される。任意の適したウイルス2A配列が使用されてもよい。多くの場合、ウイルス2A部位は、コンセンサス配列Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Proを含み、ここでXは、任意のアミノ酸である配列番号___。たとえば、口蹄疫ウイルス2Aペプチド配列は、DVESNPGP配列番号___である。Trichasら、Useoftheviral2ApeptideforbicistronicexpressionintransgenicmiceBMCBiol.2008年9月15日;6巻:40頁およびHalpinら、Self-processing2A-polyproteins--asystemforco-ordinateexpressionofmultipleproteinsintransgenicplantsPlantJ.1999年2月;17巻4号:453~9頁を参照されたい。いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、VEE-シンドビスキメラレプリコンVCRまたはVEE株TC83レプリコンTC83RまたはTC83-シンドビスキメラレプリコンTC83CRなどのキメラレプリコンである。いくつかの実施形態では、VCRは、VEEレプリコンのnsP3における配列の代わりに、また3’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび3’UTRを含有する;Perriら、J.Virol.77巻、10394~403頁、2003年を参照されたい。いくつかの実施形態では、TC83CRは、VEE株TC83レプリコンのnsP3における配列の代わりに、また3’末端に、シンドビスレプリコン由来のパッケージングシグナルおよび3’UTRを含有する。VRPの産生VRPを調製するための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、パッケージング細胞を使用してVRPに構築される。アルファウイルスパッケージング細胞またはパッケージング細胞は、1つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含有し、アルファウイルスレプリコン、真核生物層状ベクター開始系eukaryoticlayeredvectorinitiationsystemたとえば米国特許第5,814,482号、または組換えアルファウイルス粒子の導入後に組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞である。1つまたは複数の異なるアルファウイルス構造タンパク質カセットは、アルファウイルス構造タンパク質を提供することによってヘルパーとしての役目をする。アルファウイルス構造タンパク質カセットは、1つまたは複数のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、アルファウイルスレプリカーゼ認識配列の少なくとも1つ、5つまでのコピーつまり1、2、3、4、または5を含む発現カセットである。構造タンパク質発現カセットは、典型的に、5’から3’に、アルファウイルスRNAの転写を開始する5’配列、任意選択のアルファウイルスサブゲノム領域プロモーター、アルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、3’非翻訳領域これはまた、RNA転写をも指示する、およびポリAトラクトpolyAtractを含む。たとえば、国際公開第2010/019437号を参照されたい。好ましい実施形態では、2つの異なるアルファウイルス構造タンパク質カセット分割された不完全ヘルパーは、複製能力のあるウイルスを産生し得る組換え事象を最小限にするために、パッケージング細胞において使用される。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質Cをコードするが、どちらの糖タンパク質E2およびE1もコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、カプシドタンパク質およびE1またはE2糖タンパク質のいずれか両方ではないをコードする。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、E2およびE1糖タンパク質をコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質カセットは、E1またはE2糖タンパク質両方ではないをコードするが、カプシドタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、VRPは、様々な供給源の細胞の中へのレプリコンおよびヘルパーRNAの同時の導入によって産生される。これらの条件下で、たとえば、BHKV細胞1×107は、10μgレプリコンRNA:6μg不完全ヘルパーCapRNA:10μg不完全ヘルパーGlyRNAを、たとえば220ボルト、1000μF、2つの手動のパルスでエレクトロポレーションされ、アルファウイルス含有上清は、約24時間後に収集される。レプリコンおよび/またはヘルパーはまた、トランスフェクトされた細胞内に適したRNAを送り出すDNA形態で導入することもできる。パッケージング細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞たとえばSF9またはトリの細胞たとえば初代ニワトリもしくはアヒル線維芽細胞もしくは線維芽細胞細胞株などの非哺乳動物細胞であってもよい。米国特許第7,445,924号を参照されたい。細胞のトリの供給源は、EB66登録商標VIVALISなどのトリの胚性幹細胞;EBx登録商標細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞、およびニワトリ胚性生殖細胞などのニワトリ胚性幹細胞を含むニワトリ細胞;たとえばVaccine27巻:4975~4982頁2009年および国際公開第2005/042728号において記載されるAGE1.CRおよびAGE1.CR.pIX細胞株ProBioGenなどのアヒル細胞;ならびにガチョウ細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、AGE.CRPROBIOGENなどの初代アヒル線維芽細胞またはアヒル網膜細胞株である。同時の核酸導入および/またはパッケージング細胞のための細胞の哺乳動物の供給源は、たとえば国際公開第01/38362号および国際公開第02/40665号において記載され、ECACC寄託番号96022940下で寄託されるPerC6PER.C6細胞CRUCELLN.V.;MRC-5ATCCCCL-171;WI-38ATCCCCL-75;胎児アカゲザル肺細胞ATCCCL-160;ヒト胎児腎臓細胞たとえば剪断されたアデノウイルス5型DNAによって典型的に形質転換された293細胞;サル腎臓由来のVERO細胞を含むヒトまたは非ヒト霊長類細胞;ウマ、ウシたとえばMDBK細胞、ヒツジ、イヌたとえば、国際公開第97/37001号において記載されるようなイヌ腎臓由来のMDCK細胞、ATCCCCL34MDCKNBL2、またはMDCK33016、寄託番号DSMACC2219の細胞;ネコ、ならびにげっ歯類たとえば、BHK21-F、HKCC細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞などのハムスター細胞を含むが、これらに限定されず、たとえば成体、新生児、胎児、および胚を含む種々様々の発生段階から取得され得る。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は、1つまたは複数の構造タンパク質発現カセット複数可により安定して形質転換される。構造タンパク質発現カセットは、トランスフェリン-ポリカチオン媒介性のDNA移行DNAtransfer、裸の核酸または被包された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介性の細胞融合、DNAでコーティングされたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃法、およびDEAEまたはリン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションを含む、標準的な組換えDNA技術を使用して、細胞の中に導入することができる。構造タンパク質発現カセットは、DNA分子として宿主細胞の中に典型的に導入されるが、invitroで転写されたRNAとして導入することもできる。発現カセットはそれぞれ、別々にまたは実質的に同時に導入することができる。いくつかの実施形態では、安定したアルファウイルスパッケージング細胞株は、組換えアルファウイルス粒子を産生するために使用される。これらは、それらのゲノムの中に安定して組み込まれる不完全ヘルパーRNAを発現するDNAカセットを含むアルファウイルス許容細胞である。Poloら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA96巻、4598~603頁、1999年を参照されたい。ヘルパーRNAは、構成的に発現されるが、アルファウイルス構造タンパク質は、遺伝子がアルファウイルスサブゲノムプロモーターの制御下にあるので、そうではないPoloら、1999年。トランスフェクションまたはVRP感染によるパッケージング細胞のゲノムの中へのアルファウイルスレプリコンの導入に際して、レプリカーゼ酵素は、産生され、ヘルパーRNA上でカプシドおよび糖タンパク質遺伝子の発現を引き起こし、結果としてVRPが産生される。レプリコンの導入は、アルファウイルスレプリコン粒子のシードストックによるトランスフェクションおよび感染の両方を含む様々な方法によって達成することができる。その後、パッケージング細胞は、培養上清中にパッケージされたアルファウイルスレプリコン粒子を産生するのに十分な条件下でかつ十分な時間、インキュベートされる。したがって、パッケージング細胞は、VRPが自己増殖ウイルスとして作用するのを可能にする。この技術は、VRPが、弱毒化生ワクチンまたはアデノウイルスE1AおよびE1B遺伝子を発現する細胞において成長させた複製能力がないアデノウイルスベクターなどの入手可能なプロデューサー細胞株を有する他のウイルスベクターに使用されるものとほとんど同じ様式で、また同じ設備を使用して産生されるのを可能にする。いくつかの実施形態では、2ステップのプロセスが、使用され、第1のステップは、レプリコンRNAまたはプラスミドDNAベースのレプリコンによりパッケージング細胞をトランスフェクトすることによってアルファウイルスレプリコン粒子のシードストックを産生することを含む。その後、レプリコン粒子のはるかに多くのストックは、シードストックによりパッケージング細胞の新鮮な培養物を感染させることによって、第2のステップにおいて産生される。この感染は、MOI=0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、3、5、10、または20を含む、様々な感染多重度MOIを使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、感染は、低いMOIたとえば1未満で実行される。ある期間にわたって、レプリコン粒子は、シードストックにより感染させたパッケージング細胞から収集することができる。いくつかの実施形態では、その後、レプリコン粒子は、繰り返しの低多重度の感染によって、ナイーブパッケージング細胞のさらにより多くの培養物において継代され得、同一の高い力価を有する商業規模の調製物をもたらすことができる。自己複製RNAプラットフォーム2つ以上のCMVタンパク質は、被験体の細胞における、タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって産生することができる。好ましくは、組換え核酸分子は、2つ以上のCMVタンパク質をコードし、たとえばこれらはポリシストロニックである。上記に定義されるように、ポリシストロニックは、バイシストロニックを含む。CMVタンパク質の産生を引き起こすために被験体に投与することができる好ましい核酸は、自己複製RNA分子である。本発明の自己複製RNA分子は、RNAウイルスのゲノムRNAに基づくが、1つまたは複数の構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。自己複製RNA分子は、自己複製RNAによってコードされるRNAウイルスの非構造タンパク質およびCMVタンパク質を産生するために翻訳することができる。自己複製RNAは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質から成る群から選択される少なくとも1つまたは複数の遺伝子を含有し、また、5’および3’末端シス活性複製配列ならびに2つ以上の所望のCMVタンパク質をコードする異種配列を含む。異種配列複数可の発現を指示するサブゲノムプロモーターは、自己複製RNA中に含むことができる。所望の場合、異種配列は、自己複製RNAにおける他のコード領域に対してインフレームで融合されてもよいおよび/または内部リボソーム導入部位IRESの制御下にあってもよい。本発明の自己複製RNA分子は、自己複製RNA分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘発することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製RNAにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする1つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製RNA分子が、シンドビスウイルスSIN、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEなどのアルファウイルスに基づくものである場合、カプシドおよび/またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする1つまたは複数の遺伝子は、取り除くことができる。所望の場合、本発明の自己複製RNA分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘発するようにまたは1回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。自己複製RNA分子は、あらゆるタンパク質がなくても、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からのまたはそれ自体のアンチセンスコピーからの転写によって複数の娘RNAの産生を導くことができる。自己複製RNAは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたRNAから転写物をその後産生するRNA依存性RNAポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたRNAは、複数の娘RNAの産生を導く。これらの転写物は、送達されたRNAに関してアンチセンスであり、コードされるCMVタンパク質のinsitu発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよいまたはコードされるCMVタンパク質複数可のinsitu発現を提供するために翻訳される、送達されたRNAと同じセンスを有する転写物をさらに提供するために転写されてもよい。自己複製を達成するのに適したある系は、本明細書において記載されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスベースのRNAレプリコンを使用することである。これらの鎖レプリコンは、レプリカーゼまたはレプリカーゼ-トランスクリプターゼを産生するために細胞に送達した後に翻訳される。レプリカーゼは、鎖送達RNAのゲノム-鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの-鎖転写物は、鎖の親RNAのコピーをさらに提供するために、また、2つ以上のCMVタンパク質をコードする1つまたは複数のサブゲノム転写物をも生じさせるために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞によるCMVタンパク質複数可のinsitu発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。好ましい自己複製RNA分子は、したがって、i自己複製RNA分子からRNAを転写することができるRNA依存性RNAポリメラーゼおよびii2つ以上のCMVタンパク質またはその断片をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質nsP4を含むアルファウイルスレプリカーゼであり得る。タンパク質nsP4は、レプリカーゼの重要な触媒成分である。天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製RNA分子は、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をコードするわけではないことが好ましい。したがって、自己複製RNAは、RNA含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムRNAコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製RNA分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製RNAに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物CMVタンパク質またはその断片をコードする遺伝子複数可によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。したがって、本発明による有用な自己複製RNA分子は、異なるCMVタンパク質またはその断片をコードする2つの配列を有する。CMVタンパク質または断片をコードする配列は、任意の所望の方向とすることができ、同じまたは別々のプロモーターに作動可能に連結することができる。所望の場合、CMVタンパク質または断片をコードする配列は、単一のオープンリーディングフレームの一部であり得る。いくつかの実施形態では、RNAは、たとえば他の追加のCMVタンパク質またはその断片をコードする、1つまたは複数の追加の下流配列またはオープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製RNA分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の5’配列を有することができる。一態様では、自己複製RNA分子は、本明細書において定義されるようなアルファウイルスレプリコンなどのアルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。他の態様では、自己複製RNA分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖RNAウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、AmericanTypeCultureCollection、Rockville、Md.などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラATCCVR-368、ベバルウイルスATCCVR-600、ATCCVR-1240、カバスCabassouATCCVR-922、チクングニヤウイルスATCCVR-64、ATCCVR-1241、東部ウマ脳脊髄炎ウイルスATCCVR-65、ATCCVR-1242、フォートモーガンATCCVR-924、ゲタウイルスATCCVR-369、ATCCVR-1243、キジラガチATCCVR-927、マヤロウイルスATCCVR-66;ATCCVR-1277、ミッデルブルグATCCVR-370、ムカンボウイルスATCCVR-580、ATCCVR-1244、ヌドゥムATCCVR-371、ピクスナウイルスATCCVR-372、ATCCVR-1245、ロスリバーウイルスATCCVR-373、ATCCVR-1246、セムリキ森林ATCCVR-67、ATCCVR-1247、シンドビスウイルスATCCVR-68、ATCCVR-1248、トナテTonateATCCVR-925、トリニティATCCVR-469、ユナATCCVR-374、ベネズエラウマ脳脊髄炎ATCCVR-69、ATCCVR-923、ATCCVR-1250ATCCVR-1249、ATCCVR-532、西部ウマ脳脊髄炎ATCCVR-70、ATCCVR-1251、ATCCVR-622、ATCCVR-1252、ワタロアATCCVR-926、およびY-62-33ATCCVR-375を含む。本発明の自己複製RNA分子は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有し、そのため、invivoにおいて改善された安定性を有し、分解およびクリアランスに対して抵抗性であり、また他の利点を有することができる。あらゆる特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNA分子は、自己複製RNAが細胞に送達される場合、エンドソームおよび細胞質内免疫受容体の刺激を回避するまたは低下させると考えられる。これは、自己複製、増幅、およびタンパク質の発現が起こるのを可能にする。修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNAが、自然免疫系の活性化および続く望まれない結果たとえば注射部位の炎症、注射部位の刺激、痛み、およびその他同種のものを低下させるので、これはまた、修飾ヌクレオチドを含有しない自己複製RNAに関する安全性の問題をも低下させる。自己複製の結果として産生されるRNA分子が、細胞質内免疫受容体によって外来核酸として認識されることもまた、考えられる。したがって、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNA分子は、宿主細胞におけるRNAの効率的な増幅およびCMVタンパク質の発現ならびにアジュバント効果を提供する。RNA配列は、たとえば、RNAの翻訳の有効性および半減期を増大させるために、そのコドン使用頻度に関して修飾されてもよい。ポリAテイルたとえば約30アデノシン残基以上のは、その半減期を延長させるためにRNAの3’末端に付加されてもよい。RNAの5’末端は、構造m7G5’ppp5’Nキャップ0構造を有する修飾リボヌクレオチドまたはその誘導体によりキャップされてもよく、これは、RNA合成の間に組み込むことができるまたはRNA転写後に酵素により操作することができるたとえば、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒する、mRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン-7-メチルトランスフェラーゼguanine-7-methytransferaseから成るワクシニアウイルスキャッピング酵素VCEを使用することによって。キャップ0構造は、RNA分子に対して、安定性および翻訳の有効性を提供することができる。RNA分子の5’キャップは、翻訳の有効性をさらに増大させ得るキャップ1構造m7Gppp[m2’-O]Nの生成をもたらす2’-O-メチルトランスフェラーゼによってさらに修飾されてもよい。キャップ1構造はまた、invivoにおける効力をも増大させてもよい。本明細書において使用されるように、修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシドたとえばシトシンC、チミンTもしくはウラシルU、アデニンA、またはグアニンGの窒素を含む塩基においてまたはその塩基上に1つまたは複数の化学修飾たとえば置換を含有するヌクレオチドを指す。所望の場合、自己複製RNA分子は、ヌクレオシドの糖部分たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、6員環糖アナログ、もしくは鎖状糖アナログまたはホスフェート中にまたはその上に化学修飾を含有することができる。自己複製RNA分子は、好ましくは5’キャップの一部ではない、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含有することができるたとえば、5キャップの一部である修飾に加えて。したがって、自己複製RNA分子は、単一の位置に修飾ヌクレオチドを含有することができるか、2つ以上の位置に特定の修飾ヌクレオチドたとえばプソイドウリジン、N6-メチルアデノシン、5-メチルシチジン、5-メチルウリジンを含有することができるか、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含有することができるたとえば、それぞれ1つもしくは複数の位置に。好ましくは、自己複製RNA分子は、窒素を含む塩基上にまたはその中に修飾を含有するが、修飾糖部分または修飾ホスフェート部分を含有しない修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、自己複製RNA分子におけるヌクレオチドの0.001~99または100は、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製RNA分子におけるヌクレオチドの0.001~25、0.01~25、0.1~25、または1~25は、修飾ヌクレオチドである。他の例では、自己複製RNA分子における特定の未修飾ヌクレオチドの0.001~99または100は、修飾ヌクレオチドと交換される。たとえば、ウリジンを含有する自己複製RNA分子におけるヌクレオチドの約1は、ウリジンのプソイドウリジンとの交換によってなどのように、修飾することができる。他の例では、自己複製RNA分子における所望の量パーセンテージの2、3、または4つの特定のヌクレオチドウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。たとえば、自己複製RNA分子における特定のヌクレオチドの0.001~25、0.01~25、0.1~25、または1~25は、修飾ヌクレオチドである。他の例では、自己複製RNA分子における特定のヌクレオチドの0.001~20、0.001~15、0.001~10、0.01~20、0.01~15、0.1~25、0.01~10、1~20、1~15、1~10、または約5、約10、約15、約20は、修飾ヌクレオチドである。自己複製RNA分子におけるヌクレオチドの100未満が、修飾ヌクレオチドであることが好ましい。自己複製RNA分子における特定のヌクレオチドの100未満が、修飾ヌクレオチドであることもまた好ましい。したがって、好ましい自己複製RNA分子は、少なくともいくつかの未修飾ヌクレオチドを含む。哺乳動物RNA上に見つけられる96を超える天然に存在するヌクレオシド修飾がある。たとえばLimbachら、NucleicAcidsResearch,22巻12号:2183~2196頁1994年を参照されたい。ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびにヌクレオシドの調製物は、当技術分野において、たとえば、すべてそれらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第4373071号、第4458066号、第4500707号、第4668777号、第4973679号、第5047524号、第5132418号、第5153319号、第5262530号、第5700642号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが、市販で入手可能である。修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドの中に組み込むことができ、RNA分子において存在することができる修飾核酸塩基は、m5C5-メチルシチジン、m5U5-メチルウリジン、m6AN6-メチルアデノシン、s2U2-チオウリジン、Um2’-O-メチルウリジン、m1A1-メチルアデノシン;m2A2-メチルアデノシン;Am2-1-O-メチルアデノシン;ms2m6A2-メチルチオ-N6-メチルアデノシン;i6AN6-イソペンテニルアデノシン;ms2i6A2-メチルチオ-N6イソペンテニルアデノシン;io6AN6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;ms2io6A2-メチルチオ-N6-cis-ヒドロキシイソペンテニルアデノシン;g6AN6-グリシニルカルバモイルアデノシン;t6AN6-トレオニルカルバモイルアデノシン;ms2t6A2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;m6t6AN6-メチル-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン;hn6AN6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;ms2hn6A2-メチルチオ-N6-ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン;Arp2’-O-リボシルアデノシンホスフェート;Iイノシン;m1I1-メチルイノシン;m’Im1,2’-O-ジメチルイノシン;m3C3-メチルシチジン;Cm2T-O-メチルシチジン;s2C2-チオシチジン;ac4CN4-アセチルシチジン;f5C5-ホルミルシチジンfonnylcytidine;m5Cm5,2-O-ジメチルシチジン;ac4CmN4アセチル2TOメチルシチジン;k2Cリシジン;m1G1-メチルグアノシン;m2GN2-メチルグアノシン;m7G7-メチルグアノシン;Gm2’-O-メチルグアノシン;m22GN2,N2-ジメチルグアノシン;m2GmN2,2’-O-ジメチルグアノシン;m22GmN2,N2,2’-O-トリメチルグアノシン;Grp2’-O-リボシルグアノシンホスフェート;yWワイブトシン;o2yWペルオキシワイブトシン;OHyWヒドロキシワイブトシン;OHyW非修飾undermodifiedヒドロキシワイブトシン;imGワイオシン;mimGメチルグアノシン;Qクエオシン;oQエポキシクエオシン;galQガルタクトシル-クエオシン;manQマンノシル-クエオシン;preQo7-シアノ-7-デアザグアノシン;preQi7-アミノメチル-7-デアザグアノシン;Gアーケオシン;Dジヒドロウリジン;m5Um5,2’-O-ジメチルウリジン;s4U4-チオウリジン;m5s2U5-メチル-2-チオウリジン;s2Um2-チオ-2’-O-メチルウリジン;acp3U3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウリジン;ho5U5-ヒドロキシウリジン;mo5U5-メトキシウリジン;cmo5Uウリジン5-オキシ酢酸;mcmo5Uウリジン5-オキシ酢酸メチルエステル;chm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジン;mchm5U5-カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル;mcm5U5-メトキシカルボニルメチルウリジン;mcm5UmS-メトキシカルボニルメチル-2-O-メチルウリジン;mcm5s2U5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン;nm5s2U5-アミノメチル-2-チオウリジン;mnm5U5-メチルアミノメチルウリジン;mnm5s2U5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン;mnm5se2U5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン;ncm5U5-カルバモイルメチルウリジン;ncm5Um5-カルバモイルメチル-2’-O-メチルウリジン;cmnm5U5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン;cnmm5Um5-カルボキシメチルアミノメチル-2-L-Oメチルウリジン;cmnm5s2U5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン;m62AN6,N6-ジメチルアデノシン;Tm2’-O-メチルイノシン;m4CN4-メチルシチジン;m4CmN4,2-O-ジメチルシチジン;hm5C5-ヒドロキシメチルシチジン;m3U3-メチルウリジン;cm5U5-カルボキシメチルウリジン;m6AmN6,T-O-ジメチルアデノシン;rn62AmN6,N6,O-2-トリメチルアデノシン;m2’7GN2,7-ジメチルグアノシン;m2’2’7GN2,N2,7-トリメチルグアノシン;m3Um3,2T-O-ジメチルウリジン;m5D5-メチルジヒドロウリジン;f5Cm5-ホルミル-2’-O-メチルシチジン;m1Gm1,2’-O-ジメチルグアノシン;m’Am1,2-O-ジメチルアデノシンイリノメチルウリジン;tm5s2US-タウリノメチル-2-チオウリジン;imG-144-デメチルグアノシン;imG2イソグアノシン;ac6AN6-アセチルアデノシン、ヒポキサンチン、イノシン、8-オキソ-アデニン、その7-置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-アミノウラシル、5-C1~C6-アルキルウラシル、5-メチルウラシル、5-C2~C6-アルケニルウラシル、5-C2~C6-アルキニルウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、5-クロロウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシシトシン、5-C1~C6-アルキルシトシン、5-メチルシトシン、5-C2~C6-アルケニルシトシン、5-C2~C6-アルキニルシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、N2-ジメチルグアニン、7-デアザグアニン、8-アザグアニン、7-デアザ-7-置換グアニン、7-デアザ-7-C2~C6アルキニルグアニン、7-デアザ-8-置換グアニン、8-ヒドロキシグアニン、6-チオグアニン、8-オキソグアニン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,4-ジアミノプリン、2,6-ジアミノプリン、8-アザプリン、置換7-デアザプリン、7-デアザ-7-置換プリン、7-デアザ-8-置換プリン、水素無塩基残基、m5C、m5U、m6A、s2U、W、または2’-O-メチル-Uを含む。これらの修飾核酸塩基のいずれか1つまたは任意の組み合わせは、本発明の自己複製RNA中に含まれてもよい。これらの修飾核酸塩基およびそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、民間の供給者から入手可能である。所望の場合、自己複製RNA分子は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、および/またはメチルホスホネート連結を含有することができる。少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む自己複製RNA分子は、任意の適した方法を使用して調製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するRNA分子を産生するためのいくつかの適した方法は、当技術分野において公知である。たとえば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNA分子は、T7ファージRNAポリメラーゼ、SP6ファージRNAポリメラーゼ、T3ファージRNAポリメラーゼ、およびその他同種のものまたはRNA分子への修飾ヌクレオチドの効率的な組み込みを可能にするポリメラーゼの突然変異体などの適したDNA依存性RNAポリメラーゼを使用して、自己複製RNA分子をコードするDNAを転写することたとえばinvitro転写によって、調製することができる。転写反応は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに適した緩衝剤および適した塩などの、選択されるポリメラーゼの活性を支持する他の成分を含有するであろう。自己複製RNAへのヌクレオチドアナログの組み込みは、たとえば、そのようなRNA分子の安定性を改変するために、RNアーゼに対する抵抗性を増大させるために、適切な宿主細胞に導入した後に複製を確立するためにRNAの感染性、ならびに/または自然および適応免疫応答を誘発するもしくは低下させるために操作されてもよい。適した合成方法は、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する自己複製RNA分子を産生するために、単独でまたは1つもしくは複数の他の方法たとえば組換えDNAもしくはRNA技術と組み合わせて使用することができる。デノボ合成に適した方法は、当技術分野において周知であり、特定の用途に適合させてもよい。例示的な方法は、たとえば、CEMなどの適した保護基を使用する化学合成Masudaら、2007年NucleicAcidsSymposiumSeries51巻:3~4頁、β-シアノエチルホスホラミダイト法BeaucageSLら1981年TetrahedronLett22巻:1859頁;ヌクレオシドH-ホスホネート法GareggPら1986年TetrahedronLett27巻:4051~4頁;FroehlerBCら1986年NuclAcidRes14巻:5399~407頁;GareggPら1986年TetrahedronLett27巻:4055~8頁;GaffneyBLら1988年TetrahedronLett29巻:2619~22頁を含む。これらの化学反応は、実行することができるまたは市販で入手可能な自動核酸合成装置との使用に適合させることができる。追加の適した合成方法は、Uhlmannら1990年ChemRev90巻:544~84頁およびGoodchildJ1990年BioconjugateChem1巻:165頁において開示される。核酸合成はまた、ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物のクローニング、プロセシング、ならびに/または発現を含む、当技術分野において周知であり通常の適した組換え法を使用して実行することができる。無作為の断片化ならびに遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのPCR再構築によるDNAシャフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計し、操作するために使用することができる公知の技術の例である。部位特異的突然変異誘発は、核酸およびコードされるタンパク質を改変するために、たとえば、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドン優先度codonpreferenceを変化させる、スプライスバリアントを産生する、突然変異を導入する、およびその他同種のもののために、使用することができる。核酸配列の転写、翻訳、および発現に適した方法は、当技術分野において公知であり、通常のものである。一般的に、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第2巻、Ausubelら編、GreenePublish.Assoc.WileyInterscience、第13章、1988年;Glover、DNACloning、第II巻、IRLPress、Wash.,D.C.、第3章、1986年;Bitterら、inMethodsinEnzymology153巻:516~544頁1987年;TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces、Strathernら編、ColdSpringHarborPress、第I巻およびII巻、1982年;およびSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborPress、1989年を参照されたい。自己複製RNA分子における1つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および/または量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば、自己複製RNAは、モノホスフェートに消化され得たとえば、ヌクレアーゼP1を使用して、脱リン酸化することができたとえば、CIAPなどの適したホスファターゼを使用して、結果として生じるヌクレオシドは、逆相HPLCたとえばYMCPackODS-AQカラム5ミクロン、4.6×250mmを使用して、勾配、30B0~5分~100B5~13分を使用し、100B13~40分、流量0.7ml/分、UV検出波長:260nm、カラム温度30°Cで溶離することによって分析することができる。緩衝液A20mM酢酸-酢酸アンモニウムpH3.5、緩衝液B20mM酢酸-酢酸アンモニウムpH3.5/メタノール[90/10]。自己複製RNAは、送達系と結合させてもよい。自己複製RNAは、アジュバントと共にまたはなしで、投与されてもよい。RNA送達系本明細書において記載される自己複製RNAは、裸のRNA送達または細胞への侵入を容易にする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせたものなどの様々なモダリティーの送達に適している。自己複製RNA分子は、任意の適した技術を使用して、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃biolystics、およびその他同種のものによって、標的細胞または被験体の中に導入することができる。自己複製RNA分子はまた、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第6,090,619号;WuおよびWu、J.Biol.Chem.、263巻:14621頁1988年;およびCurielら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88巻:8850頁1991年を参照されたい。たとえば、米国特許第6,083,741号は、それ自体インテグリン受容体結合部分たとえば配列Arg-Gly-Asp配列番号____を有する環状ペプチドにカップリングされているポリカチオン部分たとえば3~100リシン残基を有するポリL-リシンに核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。自己複製RNA分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第6,071,890号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。自己複製RNAは、裸のRNAとしてたとえば単にRNAの水溶液として送達することができるが、細胞への侵入およびまた続く細胞間の効果をも増強するために、自己複製RNAは、好ましくは、微粒子またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与される。多くの送達系は、当業者らに周知である。そのような送達系は、たとえばリポソームベースの送達DebsおよびZhu1993年国際公開第93/24640号;ManninoおよびGould-Fogerite1988年BioTechniques6巻7号:682~691頁;Rose米国特許第5,279,833号;Brigham1991年WO91/06309;ならびにFelgnerら1987年Proc.Natl.Acad.Sci.USA84巻:7413~7414頁ならびにウイルスベクターの使用たとえばアデノウイルスたとえばBernsら1995年Ann.NYAcad.Sci.772巻:95~104頁;Aliら1994年GeneTher.1巻:367~384頁;およびHaddadaら1995年Curr.Top.Microbiol.Immunol.199巻Pt3:297~306頁を検討のために参照されたい、パピローマウイルス、レトロウイルスたとえばBuchscherら1992年J.Virol.66巻5号2731~2739頁;Johannら1992年J.Virol.66巻5号:1635~1640頁1992年;Sommerfeltら、1990年Virol.176巻:58~59頁;Wilsonら1989年J.Virol.63巻:2374~2378頁;Millerら、J.Virol.65巻:2220~2224頁1991年;Wong-Staalら、PCT/US94/05700、ならびにRosenburgおよびFauci1993年inFundamentalImmunology、第3版Paul編RavenPress,Ltd.、NewYorkおよびその中の参考文献、ならびにYuら、GeneTherapy1994年前掲を参照されたい、ならびにアデノ随伴ウイルスベクターWestら1987年Virology160巻:38~47頁;Carterら1989年米国特許第4,797,368号;CarterらWO93/246411993年;Kotin1994年HumanGeneTherapy5巻:793~801頁;Muzyczka1994年J.Clin.Invst.94巻:1351頁、およびSamulski前掲をAAVベクターの概要について参照されたい;Lebkowski、米国特許第5,173,414号;Tratschinら1985年Mol.Cell.Biol.5巻11号:3251~3260頁;Tratschinら1984年Mol.Cell.Biol.,4巻:2072~2081頁;HermonatおよびMuzyczka1984年Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻:6466~6470頁;McLaughlinら1988年、およびSamulskiら1989年J.Virol.、63巻:03822~3828頁もまた、参照されたい、ならびにその他同種のものを含む。3つの特に有用な送達系は、iリポソーム、ii無毒性で生分解性のポリマー微粒子、およびiiiカチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。リポソーム様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてRNA含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基headgroupを有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、1960年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、1990年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表2に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンDOTAP、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDSDMA、1,2-ジオレイルオキシ-N,Nジメチル-3-アミノプロパンDODMA、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLinDMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLenDMAを含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、DPPC、DOPC、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、iアニオン性脂質の混合物iiカチオン性脂質の混合物iii両性イオン性脂質の混合物ivアニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物vアニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物vi両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、またはviiアニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、DSPC両性イオン性、飽和、DlinDMAカチオン性、不飽和、および/またはDMPGアニオン性、飽和を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、1つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。脂質の親水性部分は、ペグ化することができるすなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Heyesら2005年JControlledRelease107巻:276~87頁において開示されるものなどの技術を使用してPEGにコンジュゲートすることができる。DSPC、DlinDMA、PEG-DMPG、およびコレステロールの混合物は、リポソームを形成するために使用することができる。本発明の別の態様は、DSPC、DlinDMA、PEG-DMG、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製RNAなどのRNAを被包する。リポソームは、3つの群に通常分けられる:多重膜小胞MLV;小型単層小胞SUV;また大型単層小胞LUV。MLVは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。SUVおよびLUVは、水性コアを被包する単一の二重層を有する;SUVは、典型的に、直径≦50nmを有し、LUVは、直径>50nmを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、50~220nmの範囲の直径を有するLUVである。異なる直径を有するLUVの集団を含む組成物については:i数の上で少なくとも80が、20~220nmの範囲の直径を有するべきであり、ii集団の平均直径Zav、強度によるは、理想的には、40~200nmの範囲にあり、および/またはiii直径は、多分散指数polydispersityindex<0.2を有するべきである。適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばLiposomes:MethodsandProtocols、第1巻:PharmaceuticalNanocarriers:MethodsandProtocols.Weissig編.HumanaPress、2009年.ISBN160327359X;LiposomeTechnology、第I巻、II巻、およびIII巻.Gregoriadis編.InformaHealthcare、2006年;ならびにFunctionalPolymerColloidsandMicroparticles第4巻Microspheres、microcapsulesliposomes.ArshadyGuyot編.CitusBooks、2002年を参照されたい。1つの有用な方法は、i脂質のエタノール性の溶液、ii核酸の水溶液、およびiii緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含むHeyesら2005年JControlledRelease107巻:276~87頁.。RNAは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性RNA含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、RNアーゼ消化からRNAを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部RNAを含むことができるたとえばリポソームの表面上にが、好ましくは、少なくともRNAの半分理想的には、実質的にそのすべては、被包される。ポリマー微粒子様々なポリマーは、RNAを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの処方物を調製するのを支援するために滅菌することもできる。適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトンポリカプロラクトンを含む、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリラクチドPLAなどのポリα-ヒドロキシ酸、ポリD,L-ラクチド-co-グリコリドPLGなどのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにD,L-ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なPLGポリマーは、たとえば20:80~80:20、たとえば25:75、40:60、45:55、55:45、60:40、75:25の範囲のラクチド/グリコリドモル比を有するものを含む。有用なPLGポリマーは、たとえば5,000~200,000Da、たとえば10,000~100,000、20,000~70,000、40,000~50,000Daの分子量を有するものを含む。微粒子は、理想的には、0.02μm~8μmの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも80が、0.03~7μmの範囲の直径を有するべきである。適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばFunctionalPolymerColloidsandMicroparticles第4巻Microspheres,microcapsulesliposomes.ArshadyGuyot編.CitusBooks、2002年;PolymersinDrugDelivery.UchegbuSchatzlein編.CRCPress、2006年.特に第7章、およびMicroparticulateSystemsfortheDeliveryofProteinsandVaccines.CohenBernstein編.CRCPress、1996年を参照されたい。RNAの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばO’Haganら2001年JVirology75巻:9037~9043頁;およびSinghら2003年PharmaceuticalResearch20巻:247~251頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および/または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第2009/132206号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。本発明の微粒子は、40~100mVのゼータ電位を有することができる。RNAは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料たとえばカチオン性脂質を含めることによって容易になる。水中油型カチオン性エマルジョン水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント添加adjuvanting、たとえばFLUAD商標製品におけるMF59商標アジュバント、およびPREPANDRIX商標製品におけるAS03アジュバントについて公知である。エマルジョンが1つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、RNA送達は、水中油型エマルジョンの使用により達成することができる。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したRNAが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。エマルジョンは、1つまたは複数の油を含む。適した油複数可は、たとえば、動物魚類など供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性代謝可能かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒cerealgrainの油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび1,2-プロパンジオールの6~10炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、5-炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアランスクアレンに対する飽和アナログもまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α-トコフェロールが好ましい。D-α-トコフェロールおよびDL-α-トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα-トコフェロールは、DL-α-トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロールたとえばDL-α-トコフェロールを含む油の組み合わせを使用することができる。好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含むC30H50;[CH32C[=CHCH2CH2CCH3]2=CHCH2-]2;2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン;CASRN7683-64-9。エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも1つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。エマルジョンの水性成分は、淡水plainwaterたとえばw.f.i.であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤;Tris緩衝剤;ホウ酸緩衝剤;コハク酸緩衝剤;ヒスチジン緩衝剤;またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、5~20mMの範囲で含まれるであろう。エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンDOTAP、3’-[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDCコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムDDA、たとえばブロミド、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパンDMTAP、ジパルミトイルC16:0トリメチルアンモニウムプロパンDPTAP、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパンDSTAPを含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウムBAK、塩化ベンゼトニウム、セトラミドcetramideテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウムdedecyltrimethylammoniumブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する、セチルピリジニウムクロリドCPC、セチルトリメチルアンモニウムクロリドCTAC、N,N’,N’-ポリオキシエチレン10-N-獣脂tallow-1,3-ジアミノプロパン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドDDAB、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、N,N-ジメチル-N-[22-メチル-4-1,1,3,3テトラメチルブチル-フェノキシ]-エトキシエチル]-ベンゼンメタンアミニウムクロリドDEBDA、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、[1-2,3-ジオレイルオキシ-プロピル]-N,N,N,トリメチルアンモニウムクロリド、1,2-ジアシル-3-トリメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、1,2-ジアシル-3ジメチルアンモニオプロパンアシル基=ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル、1,2-ジオレオイル-3-4’-トリメチルアンモニオブタノイル-sn-グリセロール、1,2-ジオレオイル3-スクシニル-sn-グリセロールコリンエステル、コレステリル4’-トリメチルアンモニオブタノエート、N-アルキルピリジニウム塩たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド、N-アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルムbolaform電解質C12Me6;C12BU6、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、L-αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミンジオクタデシルアミドグリシルスペルミンDOGS、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミンDPPES、リポポリLまたはD-リシンLPLL、LPDL、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリLまたはD-リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステルC^GluPhCnN、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステルCl4GIuCnNを含むが、これらに限定されない、コレステロールのカチオン性誘導体コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル-3β-オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル-3β-カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、およびコレステリル-3β-カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されないである。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるUS2008/0085870およびUS2008/0057080において記載される。カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性代謝可能かつ生体適合性である。油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および/または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤一般的にTweenと呼ばれる、とりわけポリソルベート20およびポリソルベート80;線状EO/POブロックコポリマーなどの、DOWFAX商標商標下で販売されている、エチレンオキシドEO、プロピレンオキシドPO、および/またはブチレンオキシドBOのコポリマー;繰り返しのエトキシオキシ-1,2-エタンジイル基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール-9TritonX-100またはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが特に興味深い;オクチルフェノキシポリエトキシエタノールIGEPALCA-630/NP-40;ホスファチジルコリンレシチンなどのリン脂質;トリエチレングリコールモノラウリルエーテルBrij30などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテルBrij界面活性剤として公知;ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル;ならびにソルビタントリオレエートSpan85およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステルSpanとして一般的に公知を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80Tween80;ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Span85ソルビタントリオレエート、レシチン、およびTritonX-100である。これらの界面活性剤の混合物、たとえばTween80/Span85混合物またはTween80/Triton-X100混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールTritonX-100などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス9ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、10~20の範囲のHLB値を有する界面活性剤たとえば、15.0のHLBを有するポリソルベート80および1~10の範囲のHLB値を有する界面活性剤たとえば、1.8のHLBを有するソルビタントリオレエートを含むことができる。最終エマルジョン中の油の好ましい量容積によるは、2~20、たとえば5~15、6~14、7~13、8~12である。約4~6または約9~11のスクアレン含有量は、特に有用である。最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量重量によるは、0.001~8である。たとえば、0.2~4、特に0.4~0.6、0.45~0.55、約0.5、または1.5~2、1.8~2.2、1.9~2.1、約2、または0.85~0.95、または約1のポリオキシエチレンソルビタンエステルポリソルベート80など;0.02~2、特に約0.5または約1のソルビタンエステルソルビタントリオレエートなど;0.001~0.1、特に0.005~0.02のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノールTritonX-100など;0.1~8、好ましくは0.1~10、特に0.1~1、または約0.5のポリオキシエチレンエーテルラウレス9など。油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての4:1~5:1の重量比は、典型的である過剰な油。エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ直径である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロンsubmicron範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲50~750nmにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、250nm未満、たとえば200nm未満、150nm未満である。平均液滴サイズは、有用には、80~180nmの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも80数では、直径250nm未満であり、好ましくは少なくとも90がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および/または単一粒子光学検知法single-particleopticalsensingの技術、たとえば、ParticleSizingSystemsSantaBarbara、USAから入手可能な機器のAccusizer商標およびNicomp商標シリーズ、またはMalvernInstrumentsUKからのZetasizer商標機器、またはHoribaKyoto、JapanからのParticleSizeDistributionAnalyzer機器を使用する。理想的には、液滴サイズの分布数によるは、1つの最大値だけを有する、すなわち、2つの最大値を有するのではなく、平均値モードのあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、<0.4、たとえば0.3、0.2、またはそれ以下の多分散性を有する。サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、マイクロフルイダイゼーションの使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。マイクロフルイダイゼーションの繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。マイクロフルイダイゼーションの代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、220nmのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、DOTAPである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/mlのDOTAPを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.5mg/ml~約25mg/ml、約0.6mg/ml~約25mg/ml、約0.7mg/ml~約25mg/ml、約0.8mg/ml~約25mg/ml、約0.9mg/ml~約25mg/ml、約1.0mg/ml~約25mg/ml、約1.1mg/ml~約25mg/ml、約1.2mg/ml~約25mg/ml、約1.3mg/ml~約25mg/ml、約1.4mg/ml~約25mg/ml、約1.5mg/ml~約25mg/ml、約1.6mg/ml~約25mg/ml、約1.7mg/ml~約25mg/ml、約0.5mg/ml~約24mg/ml、約0.5mg/ml~約22mg/ml、約0.5mg/ml~約20mg/ml、約0.5mg/ml~約18mg/ml、約0.5mg/ml~約15mg/ml、約0.5mg/ml~約12mg/ml、約0.5mg/ml~約10mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約2mg/ml、約0.5mg/ml~約1.9mg/ml、約0.5mg/ml~約1.8mg/ml、約0.5mg/ml~約1.7mg/ml、約0.5mg/ml~約1.6mg/ml、約0.6mg/ml~約1.6mg/ml、約0.7mg/ml~約1.6mg/ml、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml、約1.0mg/ml、約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約12mg/ml、約18mg/ml、約20mg/ml、約21.8mg/ml、約24mg/mlなどのDOTAPを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.8mg/ml~約1.6mg/ml、たとえば0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、または1.6mg/mlのDOTAPを含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、DCコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlDCコレステロールのDCコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.62mg/ml~約5mg/ml、約1mg/ml~約5mg/ml、約1.5mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.46mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.92mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.46mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1mg/ml、約0.1mg/ml~約0.62mg/ml、約0.15mg/ml、約0.3mg/ml、約0.6mg/ml、約0.62mg/ml、約0.9mg/ml、約1.2mg/ml、約2.46mg/ml、約4.92mg/mlなどのDCコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.62mg/ml~約4.92mg/ml、たとえば2.46mg/mlのDCコレステロールを含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、DDAである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/mlのDDAを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.1mg/ml~約5mg/ml、約0.1mg/ml~約4.5mg/ml、約0.1mg/ml~約4mg/ml、約0.1mg/ml~約3.5mg/ml、約0.1mg/ml~約3mg/ml、約0.1mg/ml~約2.5mg/ml、約0.1mg/ml~約2mg/ml、約0.1mg/ml~約1.5mg/ml、約0.1mg/ml~約1.45mg/ml、約0.2mg/ml~約5mg/ml、約0.3mg/ml~約5mg/ml、約0.4mg/ml~約5mg/ml、約0.5mg/ml~約5mg/ml、約0.6mg/ml~約5mg/ml、約0.73mg/ml~約5mg/ml、約0.8mg/ml~約5mg/ml、約0.9mg/ml~約5mg/ml、約1.0mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml~約5mg/ml、約1.45mg/ml~約5mg/ml、約2mg/ml~約5mg/ml、約2.5mg/ml~約5mg/ml、約3mg/ml~約5mg/ml、約3.5mg/ml~約5mg/ml、約4mg/ml~約5mg/ml、約4.5mg/ml~約5mg/ml、約1.2mg/ml、約1.45mg/mlなどのDDAを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約20mg/ml、約21mg/ml、約21.5mg/ml、約21.6mg/ml、約25mg/mlのDDAを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約0.73mg/ml~約1.45mg/ml、たとえば1.45mg/mlのDDAを含む。カテーテルまたは同様のデバイスは、標的器官または組織の中に、裸のRNAとしてまたは送達系と組み合わせて、本発明の自己複製RNA分子を送達するために使用されてもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第4,186,745号;第5,397,307号;第5,547,472号;第5,674,192号;および第6,129,705号において開示される。本発明は、単独でまたは他の高分子と組み合わせて、たとえば、免疫応答を引き起こすために、2つ以上のCMVタンパク質をコードする自己複製RNA分子を送達するために、被包されたまたは吸着された自己複製RNAを有するリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンエマルジョン微粒子などの適した送達系の使用を含む。本発明は、吸着されたおよび/または被包された自己複製RNA分子を有するリポソーム、微粒子、およびサブミクロンエマルジョンならびにその組み合わせを含む。リポソームおよびサブミクロンエマルジョン微粒子と結合した自己複製RNA分子は、宿主細胞に有効に送達することができ、自己複製RNAによってコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘発することができる。CMVタンパク質をコードするポリシストロニック自己複製RNA分子およびポリシストロニックアルファウイルスレプリコンを使用して産生されるVRPは、細胞においてCMVタンパク質複合体を形成するために使用することができる。複合体は、gB/gH/gL;gH/gL;gH/gL/gO;gM/gN;gH/gL/UL128/UL130/UL131;およびUL128/UL130/UL131を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、VRPの組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、1.gH/gLVRPおよび別のVRP;2.gH/gLVRPおよびgBVRP;3.gH/gL/gOVRPおよびgBVRP;4.gBVRPおよびgH/gL/UL128/UL130/UL131VRP;5.gBVRPおよびUL128/UL130/UL131VRP;6.gBVRPおよびgM/gNVRP;7.gBVRP、gH/gLVRP、およびUL128/UL130/UL131VRP;8.gBVRP、gH/gLgOVRP、およびUL128/UL130/UL131VRP;9.gBVRP、gM/gNVRP、gH/gLVRP、およびUL128/UL130/UL131VRP;10.gBVRP、gM/gNVRP、gH/gL/OVRP、およびUL128/UL130/UL131VRP;11.gH/gLVRPおよびUL128/UL130/UL131VRPを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、自己複製RNA分子の組み合わせは、細胞に送達される。組み合わせは、1.gH/gLをコードする自己複製RNA分子および他のタンパク質をコードする自己複製RNA分子;2.gHおよびgLをコードする自己複製RNA分子ならびにgBをコードする自己複製RNA分子;3.gH、gL、およびgOをコードする自己複製RNA分子ならびにgBをコードする自己複製RNA分子;4.gBをコードする自己複製RNA分子ならびにgH、gL、UL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;5.gBをコードする自己複製RNA分子ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;6.gBをコードする自己複製RNA分子ならびにgMおよびgNをコードする自己複製RNA分子;7.gBをコードする自己複製RNA分子、gHおよびgLをコードする自己複製RNA分子、ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;8.gBをコードする自己複製RNA分子、gH、gL、およびgOをコードする自己複製RNA分子、ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;9.gBをコードする自己複製RNA分子、gMおよびgNをコードする自己複製RNA分子、gHおよびgLをコードする自己複製RNA分子、ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;10.gBをコードする自己複製RNA分子、gMおよびgNをコードする自己複製RNA分子、gH、gL、およびgOをコードする自己複製RNA分子、ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子;11.gHおよびgLをコードする自己複製RNA分子ならびにUL128、UL130、およびUL131をコードする自己複製RNA分子を含むが、これらに限定されない。CMVタンパク質適したCMVタンパク質は、gB、gH、gL、gOを含み、任意のCMV株由来のものであり得る。他の適したCMVタンパク質は、UL128、UL130、およびUL131を含み、任意のCMV株由来のものであり得る。たとえば、CMVタンパク質は、CMVのMerlin、AD169、VR1814、Towne、Toledo、TR、PH、TB40、またはFix株由来のものであり得る。例示的なCMVタンパク質および断片は、本明細書において記載される。これらのタンパク質および断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化されたcodonoptimizedかまたはコドン脱最適化されたcodondeoptimized配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードされ得る。CMVタンパク質およびそれらのタンパク質をコードする核酸の例示的な配列は、表2において提供される。CMVgBタンパク質gBタンパク質は、完全長であり得るかまたはタンパク質の1つもしくは複数の領域を取り除くことができる。その代わりに、gBタンパク質の断片を使用することができる。gBアミノ酸は、907アミノ酸長である配列番号___において示される完全長gBアミノ酸配列CMVgBFLに従ってナンバリングされる。完全長タンパク質から除くことができるまたは断片として含むことができるgBタンパク質の適した領域は、シグナル配列アミノ酸1~24、gB-DLDディスインテグリン様ドメインアミノ酸57~146、フューリン切断部位アミノ酸459~460、7アミノ酸繰り返し領域679~693、膜通過ドメインアミノ酸751~771、およびアミノ酸771~906由来の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、gBタンパク質は、アミノ酸67~86中和エピトープAD2および/またはアミノ酸532~635免疫優性エピトープAD1を含む。gB断片の具体例は、gBの最初の692アミノ酸を含むgBsol692およびgBの最初の750アミノ酸を含むgBsol750を含む。シグナル配列、アミノ酸1~24は、所望されるように、gBsol692およびgBsol750に存在してもよいまたは存在しなくてもよい。任意選択で、gBタンパク質は、10アミノ酸長以上のgB断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、または875アミノ酸を含むことができる。gB断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。任意選択で、gB断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gB断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVgHタンパク質いくつかの実施形態では、gHタンパク質は、完全長gHタンパク質たとえば、743アミノ酸タンパク質であるCMVgHFL、配列番号___である。gHは、716位から出発して743位までの膜通過ドメインおよび細胞質ドメインを有する。717~743のアミノ酸の除去により、可溶性gHたとえばCMVgHsol、配列番号___が提供される。いくつかの実施形態では、gHタンパク質は、10アミノ酸長以上のgH断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、または725アミノ酸を含むことができる。任意選択で、gHタンパク質は、10アミノ酸長以上のgH断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、または725アミノ酸を含むことができる。gH断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。gH残基は、配列番号___において示される完全長gHアミノ酸配列CMVgHFLに従ってナンバリングされる。任意選択で、gH断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gH断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVgLタンパク質いくつかの実施形態では、gLタンパク質は、完全長gLタンパク質たとえば、278アミノ酸タンパク質であるCMVgLFL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、gL断片を使用することができる。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、または250アミノ酸を含むことができる。gL断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。gL残基は、配列番号___において示される完全長gLアミノ酸配列CMVgLFLに従ってナンバリングされる。任意選択で、gL断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gL断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVgOタンパク質いくつかの実施形態では、gOタンパク質は、完全長gOタンパク質たとえば、472アミノ酸タンパク質であるCMVgOFL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、gOタンパク質は、10アミノ酸長以上のgO断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、または450アミノ酸を含むことができる。gO断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。gO残基は、配列番号___において示される完全長gOアミノ酸配列CMVgOFLに従ってナンバリングされる。任意選択で、gO断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gO断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVgMタンパク質いくつかの実施形態では、gMタンパク質は、完全長gMタンパク質たとえば、371アミノ酸タンパク質であるCMVgMFL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、gMタンパク質は、10アミノ酸長以上のgM断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、または350アミノ酸を含むことができる。gM断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。gM残基は、配列番号___において示される完全長gMアミノ酸配列CMVgMFLに従ってナンバリングされる。任意選択で、gM断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gM断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVgNタンパク質いくつかの実施形態では、gNタンパク質は、完全長gNタンパク質たとえば、135アミノ酸タンパク質であるCMVgNFL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、gNタンパク質は、10アミノ酸長以上のgN断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または125アミノ酸を含むことができる。gN断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。gN残基は、配列番号___において示される完全長gNアミノ酸配列CMVgNFLに従ってナンバリングされる。任意選択で、gN断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、gN断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVUL128タンパク質いくつかの実施形態では、UL128タンパク質は、完全長UL128タンパク質たとえば、171アミノ酸タンパク質であるCMVUL128FL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、UL128タンパク質は、10アミノ酸長以上のUL128断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、または150アミノ酸を含むことができる。UL128断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。UL128残基は、配列番号___において示される完全長UL128アミノ酸配列CMVUL128FLに従ってナンバリングされる。任意選択で、UL128断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、UL128断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVUL130タンパク質いくつかの実施形態では、UL130タンパク質は、完全長UL130タンパク質たとえば、214アミノ酸タンパク質であるCMVUL130FL、配列番号___である。いくつかの実施形態では、UL130タンパク質は、10アミノ酸長以上のUL130断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、または200アミノ酸を含むことができる。UL130断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。UL130残基は、配列番号___において示される完全長UL130アミノ酸配列CMVUL130FLに従ってナンバリングされる。任意選択で、UL130断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、UL130断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。CMVUL131タンパク質いくつかの実施形態では、UL131タンパク質は、完全長UL131タンパク質たとえば、129アミノ酸タンパク質であるCMVUL131、配列番号___である。いくつかの実施形態では、UL131タンパク質は、10アミノ酸長以上のUL131断片であり得る。たとえば、断片におけるアミノ酸の数は、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、または200アミノ酸を含むことができる。UL131断片は、残基番号:のいずれからでも始まり得る。UL131残基は、配列番号___において示される完全長UL131アミノ酸配列CMVUL131FLに従ってナンバリングされる。任意選択で、UL131断片は、断片の出発残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、N末端にさらに伸長することができる。任意選択で、UL131断片は、断片の最後の残基から、5アミノ酸、10アミノ酸、20アミノ酸、または30アミノ酸だけ、C末端にさらに伸長することができる。上記に述べられるように、本発明は、第1のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片をコードする第1の配列および第2のヘルペスウイルスタンパク質またはその断片をコードする第2の配列を含有する組換えポリシストロニック核酸分子に関する。したがって、アルファウイルスVRPおよび2つ以上のCMVタンパク質またはその断片をコードする配列を含有する自己複製RNAなどのある好ましい実施形態の前述の記載は、本発明の例証となるが、本発明の範囲を限定するものではない。そのような好ましい実施形態におけるCMVタンパク質をコードする配列は、HHV-1、HHV-2、HHV-3、HHV-4、HHV-6、HHV-7、およびHHV-8などの他のヘルペスウイルス由来のgHおよびgLまたは10アミノ酸長以上のその断片などのタンパク質をコードする配列と交換することができることが十分に理解されるであろう。たとえば、適したVZVHHV-3タンパク質は、gB、gE、gH、gI、およびgLならびに10アミノ酸長以上のその断片を含み、任意のVZV株由来のものであり得る。たとえば、VZVタンパク質またはその断片は、VZVのpOka、Dumas、HJO、CA123、またはDR株由来のものであり得る。これらの例示的なVZVタンパク質およびその断片は、ヒト細胞などの所望の宿主における発現のためにコドン最適化されたかまたはコドン脱最適化された配列を含む任意の適したヌクレオチド配列によってコードすることができる。VZVタンパク質の例示的な配列は、本明細書において提供される。たとえば、一実施形態では、ポリシストロニック核酸分子は、VZVgHタンパク質またはその断片をコードする第1の配列およびVZVgLタンパク質またはその断片をコードする第2の配列を含有する。いくつかの実施形態では、ポリシストロニック核酸分子中に存在するヘルペスウイルスタンパク質または断片をコードする配列のそれぞれは、それ自体の制御エレメントに作動可能に連結されている。たとえば、ヘルペスウイルスタンパク質または断片をコードするそれぞれの配列は、それ自体のサブゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。したがって、アルファウイルスレプリコンなどのポリシストロニック核酸分子は、2、3、4、または5つのサブゲノムプロモーターを含有することができ、これらのそれぞれは、ヘルペスウイルスタンパク質または断片の発現を制御する。このタイプのポリシストロニック核酸分子がアルファウイルスレプリコンなどの自己複製RNAである場合、それは、VRPとしてパッケージすることができるまたはRNA送達系と結合することができるもしくはそれと共に処方することができる。方法および使用いくつかの実施形態では、自己複製RNA分子またはVRPは、免疫応答を刺激するために個体に投与される。そのような実施形態では、自己複製RNA分子またはVRPは、典型的に、薬学的に許容される担体および任意選択でアジュバントを含んでいてもよい組成物中に存在する。たとえば米国特許第6,299,884号;米国特許第7,641,911号;米国特許第7,306,805号;およびUS2007/0207090を参照されたい。免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、それぞれの送達されるCMVタンパク質に対して誘発される。細胞媒介性免疫応答は、ヘルパーT細胞Th応答、CD8細胞傷害性T細胞CTL応答、またはその両方を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、体液性免疫応答を含み、抗体は、中和抗体である。中和抗体は、細胞のウイルス感染を遮断する。CMVは、上皮細胞におよびまた線維芽細胞の細胞にも感染する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、両方の細胞型の感染を低下させるまたは予防する。中和抗体応答は、補体依存性または補体非依存性であってもよい。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、補体非依存性である。いくつかの実施形態では、中和抗体応答は、交差中和性である;すなわち、投与された組成物に対して生成される抗体は、組成物において使用される株以外の株のCMVウイルスを中和する。当技術分野における抗体効力の有用な尺度は、50中和力価である。50の中和性の力価を決定するために、免疫化された動物由来の血清を希釈し、どれくらい希釈した血清が、依然として細胞への50のウイルスの侵入を遮断する能力を保持するかを評価する。たとえば、700の力価は、血清が、700倍に希釈された後にウイルスの50を中和する能力を保持したことを意味する。したがって、より高い力価は、より強力な中和抗体応答を示す。いくつかの実施形態では、この力価は、約200、約400、約600、約800、約1000、約1500、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500、約5000、約5500、約6000、約6500、または約7000の下限を有する範囲にある。50の中和力価範囲は、約400、約600、約800、約1000、約1500、約200、約2500、約3000、約3500、約4000、約4500、約5000、約5500、約6000、約6500、約7000、約8000、約9000、約10000、約11000、約12000、約13000、約14000、約15000、約16000、約17000、約18000、約19000、約20000、約21000、約22000、約23000、約24000、約25000、約26000、約27000、約28000、約29000、または約30000の上限を有することができる。たとえば、50の中和力価は、約3000~約6500であり得る。約は、記載される値のプラスまたはマイナス10を意味する。中和力価は、下記の具体例において記載されるように測定することができる。免疫応答は、個体、典型的に、ヒトを含む哺乳動物にVRPまたは自己複製RNAを投与することによって刺激することができる。いくつかの実施形態では、誘発される免疫応答は、防御免疫応答である、つまり、応答は、CMV感染の危険性または重症度を低下させる。防御免疫応答の刺激は、特にCMV感染および疾患の危険性のあるいくつかの集団において特に望ましい。たとえば、危険な状態にある集団は、実質臓器移植SOT患者、骨髄移植患者、および造血幹細胞移植HSCT患者を含む。VRPは、移植前の移植ドナーまたは移植前および/もしくは後の移植レシピエントに投与することができる。母親から子供への垂直伝播が乳児を感染させるよくある原因であるので、妊娠し得る女性へのVRPまたは自己複製RNAの投与は、特に有用である。投与の任意の適したルートを使用することができる。たとえば、組成物は、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または経皮的に投与することができる。いくつかの実施形態は、口腔内にintra-orally、鼻腔内に、腟内に、および直腸内になどのように、粘膜内ルートを通して投与されるであろう。組成物は、任意の適したスケジュールに従って投与することができる。受託番号によって言及されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む本開示において引用される特許、特許出願、および参考文献はすべて、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。上記の開示は、全般的な説明である。より完全な理解は、例示のみの目的のために提供される次の特定の実施例に対する参照によって得ることができる。実施例1VRPプラットフォームを使用する個々のCMV抗原の送達それぞれのCMV糖タンパク質gBおよびgHは、中和応答を誘発し、gBは、線維芽細胞の感染を中和するヒト血清中の抗体の間で有力な抗原であるBrittら1990年J.Virol.64巻3号:1079~85頁。次の実験は、マウスにおいてVRPプラットフォームを使用して送達されたこれらの抗原に対する中和応答を実証する。CMV抗原はそれぞれ、pcDNA-6HisベクターInvitrogenの中にクローニングし、図2において示される構築物をもたらす、PerriらJ.Virol77巻19号10394~10403頁2003年によって記載されるプラスミドに由来するアルファウイルスレプリコンベクター、pVCR2.1SalI/XbaIの中にクローニングする前にタンパク質発現について試験した。pVCR2.1SalI/XbaIは、不完全ヘルパーのカプシドおよび糖タンパク質RNAと共にエレクトロポレーションされた場合、感染性アルファウイルス粒子を形成する自己複製RNAベクターである。pVCRベクターは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEに由来する不完全ヘルパーのカプシドおよび糖タンパク質RNAの存在下において、ベビーハムスター腎臓BHKV細胞の中にエレクトロポレーションされるRNAを作製するために使用した。エレクトロポレーション後に、分泌されたアルファウイルスベクター粒子VRPを含有する上清は、収集し、精製し、力価測定しtiter、マウス免疫化研究に使用した。マウスは、3週間、間隔をあけた一連の2回の免疫化において1×106感染単位/マウスIUで免疫化した。最終的な採血は、2回目の免疫化の3週間後であった。モノシストロニックgB、gH、およびgLVRP可溶性gBの異なる2つのバージョンを構築した:gBsol750は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠き、gBsol692もまた、疎水性領域を欠き図2A、Reapらの構築物に類似する。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く可溶性gHgHsol716もまた、構築した図2C。免疫化マウス由来の血清は、いくつかのアッセイにおいてスクリーニングした。免疫ブロット法データ示さずおよび免疫蛍光アッセイは、抗原に対する特異的な抗体応答を確認するために使用した。中和アッセイは、引き起こされた抗体応答が、CMV感染を中和することができたことを実証するために使用した。免疫化マウス由来の血清は、gB-6Hisを発現する構築物によりトランスフェクトした293T細胞においてgBの認識について免疫蛍光法によって検査した。細胞は、抗His抗体抗6His、モノクローナルgB抗体抗gB27~156、または収集したプールマウス血清のいずれかによりプローブした。免疫前血清は、すべての場合において陰性であった。gBFL-6Hisを発現する構築物によりトランスフェクトし、固定し、透過処理した細胞において、抗6His染色は、エンドサイトーシス/エキソサイトーシス輸送経路に対応する可能性が最も高い点状の細胞質パターンと共に表面発現の発現パターンを明らかにした。抗gB27~156およびプールマウス血清の両方は、同様の発現パターンを示した。それぞれのgBFLVRP、gBsol750VRP、およびgBsol692VRPにより免疫化したマウス由来の血清は、同じ発現パターンを示した。gHFLVRPおよびgHsol716VRPにより免疫化したマウスは、gHに特異的な抗体を産生した。gHFL-6Hisを発現する構築物によりトランスフェクトした293T細胞の免疫蛍光分析は、抗6His、抗gH、およびプールマウス血清によるgHの強力な認識を検出した。gLVRPにより免疫化したマウスから収集された血清は、免疫ブロット法分析および免疫蛍光法によって決定されるように、特異的な抗体応答をもたらした。gLVRPは、中和応答を引き起こさなかった。gBVRPまたはgHVRPにより免疫化したマウス由来の血清は、CMV中和アッセイを使用して、中和抗体の存在について分析した。様々に希釈した血清を、CMVウイルスTB40UL32EGFPTB40-GFP、GFPを発現するように操作した臨床分離株と共にあらかじめインキュベートし、その後、ARPE-19上皮細胞を追加し、5日間インキュベートした。感染の5日後に、GFP陽性細胞を数えた。このアッセイにおいて、中和抗体を含有する血清と共にインキュベートした細胞は、ウイルスのみと共にまたは免疫前血清と共にインキュベートしたウイルスと共にインキュベートした細胞と比較して、GFP陽性細胞がより少ない。gBVRP、gBFLVRP、gBsol750VRP、またはgBsol692VRPにより免疫化したマウス由来の血清は、モルモット補体の存在下において強力な中和活性を有した1:1280~1:2560の血清希釈で50の中和力価;図3。gHFLVRPまたはgHsolVRPにより免疫化したマウス由来の血清は、モルモット補体に非依存性のある程度の中和活性を有した図3。実施例2ポリシストロニックアルファウイルスベクターの構築CMVは、感染の間にいくつかの多タンパク質複合体を産生する。所望の複合体の成分をすべて発現する単一のレプリコンを、被験体においてCMV複合体を産生するために使用することができるかまたは複合体の成分を、複数のレプリコンベクターから同時送達することができるかどうかを決定するために、発明者らは、複数のCMVタンパク質の発現の制御を可能にするプラットフォームを設計した。アルファウイルスベクターpVCR2.1SalI/XbaIは、複数のサブゲノムプロモーターSGPおよび目的の遺伝子GOIの構築を可能にするために修飾した。11026~31bpのpVCR2.1SalI/XbaIApaI部位は、に変更した。ClaIおよびPmlI制限部位は、第1のサブゲノムプロモーターおよびSalI-XbaI挿入部位の直ぐ下流の領域に追加した。7727~7754bpの配列は、に変更した。シャトルベクター系は、SalI-XbaI部位を使用してSGPの直ぐ下流にGOIの挿入を可能にするように設計した。pcDNA3.1-Cは、以下のように修飾した。3つのSalI部位を欠失させた:1046~1051bp、3332~3337bp、および5519~21、1~3bp位をpcDNA3.1-Cは、位置916~921bpのXbaI部位を突然変異させるために修飾した。pcDNA3.1-Cは、に、位置942~947ClaIおよび950~955SacIIbpにClaI部位およびSacII部位を追加するために修飾した。一度、制限部位を追加し、結果として生じる配列を検証したら、bp7611~7689からの領域を次のプライマーを使用して、修飾pVCR2.1アルファウイルスベクターから増幅した。増幅した領域は、適切な部位NotI-ClaIまたはClaI-SacIIの間に、シャトルベクターpcDNASVを作製するために、修飾pcDNA3.1-Cベクターの中に追加した。NotI-SGPSal-Xba-ClaIの挿入により、pcDNASVカセット2を形成し、ClaI-SGPSal-Xba-SacIIの挿入によりpcDNASVカセット3を形成する。これらのSVカセットは、配列決定した。pcDNASVカセット2は、ClaI部位がpcDNASVカセット2ベクターにおいてカットされなかったので、XbaI部位およびClaI部位の間に追加の12bpCCACTGTGATCG配列番号____を含有する。そのため、PmlI部位を追加した。pcDNASVカセット2については、PmlI部位は、bp1012CACGTG配列番号__に挿入した。カセット3については、PmlI部位は、bp935~940に追加した。それぞれのポリシストロニックベクターについては、第1の遺伝子は、SalI-XbaI部位を使用して、pVCR2.1修飾ベクターの中に直接挿入した。第2の遺伝子は、SalI-XbaIを使用して、pcDNASVカセット2の中にライゲーションし、NotI-PmlI、NotI-SacIIを使用して切り取ったまたはNotI-ClaIについてプライマーを使用してPCRし、NotIおよびClaIを使用して消化した。結果として生じる挿入物SGP-SalI-GOI-Xbaは、NotI-PmlI、NotI-SacII、またはNotI-ClaI部位を使用して修飾pVCR2.1ベクターの中にライゲーションした。構築物中の所望の遺伝子がPmlI部位を含有した場合に限り、NotI-ClaI挿入物を使用した。いくつかの場合には、第3の遺伝子は、SalI-XbaIを使用して、pcDNASVカセット3の中にライゲーションし、PmlI-SacIIを使用して切り取ったまたはClaI-SacIIについてプライマーを使用してPCRし、ClaIおよびSacIIを使用して消化した。結果として生じる挿入物SGP-SalI-GOI-XbaIは、PmlI-SacIIまたはClaI-SacIIを使用して、修飾pVCR2.1の中にライゲーションした。SalI-XbaI消化は、ポリシストロニックベクターDNAの構築を検証するために使用した。SalI-XbaIによる消化後に、アガロースゲル電気泳動は、GOIの存在を確認するために実行した。その後、ポリシストロニックベクターDNAは、PmeIにより一晩直線化し、QiagenのPCR精製キットを使用して精製し、AmbionmMessagemMachineキットを使用して、RNAを作製するために鋳型として使用した。RNA品質は、RNAアガロースゲル上に試料のアリコートを泳動することによってチェックした。ポリシストロニックベクターからの発現蛍光タンパク質GFP緑色蛍光タンパク質およびmCherry赤色蛍光タンパク質は、ポリシストロニックベクターが2つのタンパク質を発現する能力を評価するために、GOIとして使用した。発明者らは、GFPが第1のサブゲノムプロモーターを使用して、発現され、mCherryが第2のサブゲノムプロモーターから発現されるバイシストロニックベクターを調製した図4A。これらのタンパク質についてのコード配列を含有するポリヌクレオチドは、SalI-XbaI部位を使用して挿入した。第1のポリヌクレオチドGFPは、修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中に直接挿入した。第2のポリヌクレオチドmCherryは、コード配列の直ぐ上流にサブゲノムプロモーターを含有するシャトルベクターの中に最初に挿入した。第2のサブゲノムプロモーターおよび第2のポリヌクレオチドの両方を含有する断片を単離し、第1のポリヌクレオチドを含有する修飾アルファウイルスレプリコンベクターの中にライゲーションし、複数のサブゲノムプロモーターを有するアルファウイルスレプリコンがもたらされた。VRPは、CapおよびGlyについての不完全ヘルパーRNAとともにレプリコンRNAをエレクトロポレーションすることによって、BHKV細胞において産生した。VRPは、エレクトロポレーションの24時間後に収集し、細胞当たり20感染単位IUの感染多重度MOIでBHKV細胞を感染させるために使用した。実験により、4セットのVRPを試験した:GFPのみを発現する1つのVRP;mCherryを発現する1つのVRP;両方とも20IU/細胞のMOIで、GFPのみを発現する1つのVRPおよびmCherryのみを発現する1つのVRP;ならびにバイシストロニックベクターGFP1-SGPmCherry2を含有する1つのVRP。VRP感染BHKV細胞は、共存のパーセントを決定するために感染の24時間後に検査した。一つずつ感染させた場合、細胞は、ほぼすべて、GFPまたはmCherryについて陽性であった。2つの別々のVRPを感染させた細胞は、緑色または赤色のいずれかに見えた。黄色の細胞はほとんどなく、少数の細胞が等しいレベルでGFPおよびmCherryを発現し、同時感染のレベルが低かったことを示した。これらのデータは、FACS分析を使用して確認した図4B。対照的に、バイシストロニックベクターGFP1-SGPmCherry2を含有するアルファウイルスを感染させた細胞は、すべて黄色であり、これは、GFPおよびmCherryのほぼ等しい発現を示す。本研究は、単一のポリシストロニックアルファウイルスレプリコンベクターから複数のタンパク質を成功裏に発現させることができることを実証する。実施例3CMV複合体の産生本実施例は、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンベクターから、複合体成分の送達後に細胞においてCMVタンパク質複合体を形成することができることを実証する。gH/gLおよびgH/gL/gO複合体ポリシストロニックgH/gLおよびgH/gL/gOアルファウイルスレプリコンは、上記に記載される図5Aにおいて概略的に示されるように構築した。gH、gL、gO、gH/gL、およびgH/gL/gOをコードするレプリコンを含有するVRPは、上記に記載されるようにBHKV細胞において産生し、invitroにおける複合体形成を実証するためにBHKV細胞を感染させるために使用した。VRP感染ARPE-19細胞は、gH/gLのジスルフィド結合複合体を産生した。gOは、gH/gL結合を検出可能な程度に改変しなかった図5B。免疫蛍光研究は、単独で送達されたgHおよびgLの局在化を評価し、ポリシストロニックアルファウイルスを使用して送達した場合に、同時発現された場合のタンパク質の再局在化を調べるために行なった。gH局在化は、gLまたはgL/gOの存在下または非存在下において変化するように見えなかった。gHおよびgH/gOの存在下における場合、gL局在化は変化した。最後に、gH/gLの結合を、免疫沈降によって検査した。市販のgH抗体Genwayは、gHおよびgLの結合を調査するために使用した。すべての場合において、gH抗体は、gHを効率的に免疫沈降させた図5C。gHが存在しなかった場合、gLは、免疫沈降しなかった。gLがgHまたはgH/gOの存在下において発現した場合、gHとgLが結合した図5C。gHの存在下におけるgLの再局在化およびgH/gLの結合gOありまたはなしは、ポリシストロニックアルファウイルスレプリコンの成分がすべて、発現され、複合体を形成するように結合することを示す。実施例4invitroにおいてgH/gL複合体形成を達成するVRPは、gBVRPに対して引き起こされる免疫応答より質的かつ量的に優れた、CMVに対する強力な免疫応答を誘発する本実施例は、単一成分を送達するVRPもしくは組み合わせて投与される単一成分VRPを使用して得られる免疫応答またはgBVRPによって引き起こされる応答と比較した、ポリシストロニックgH/gLVRPまたはgH/gL/gOVRPを送達することによって形成される複合体に対する頑健な免疫応答の誘発を実証する。マウスは、3週間間隔で投与したVRPにより3回感染させたマウス1匹あたり106IU;5匹のBalbCマウス/群。単一のおよびポリシストロニックVRPによる免疫化から収集した血清は、上記に記載されるように、CMV中和アッセイを使用して中和抗体についてスクリーニングした。中和力価は、以下のように測定した。血清の様々な希釈物は、モルモット補体の存在下または非存在下においてTB40-UL32-EGFPと共にあらかじめインキュベートし、その後、ARPE-19上皮細胞またはMRC-5線維芽細胞の細胞に追加し、5日間インキュベートした。ウイルスによる5日の感染後に、GFP陽性細胞を数えた。ARPE-19細胞についての結果は、図6A、図6B、および図6Cに示す。MRC-5細胞についての結果は、図7Aおよび図7Bに示す。gHFLVRPにより免疫化したマウス由来の血清は、低度の補体非依存性中和活性を有した図6Aおよび図6B。中和活性は、モルモット補体の存在下または非存在下において、gLまたはgOのみにより免疫化したマウス由来の血清を使用した場合観察されなかった図6C。いくつかのCMVgBタンパク質gBFL、gBsol750、およびgBsol692による免疫化由来のプール血清は、モルモット補体の存在下において強力な中和活性を実証し、1:1280血清希釈で50の中和力価であった。しかしながら、プールgB血清についてARPE-19細胞においてモルモット補体の非存在下における中和活性はなかった。単一のCMVタンパク質を発現するVRP106IU/マウス/VRPで、gH-もしくはgL-VRPまたはgH-、gL-、およびgO-VRPの同時投与は、gHのみのものを超えて中和活性を増強しなかった。対照的に、バイシストロニックgH/gLまたはトリシストロニックgH/gL/gOVRP1×106IU/マウスにより免疫化したマウス由来の血清は、頑健な中和応答を実証した。さらに、応答は、モルモット補体の存在下および非存在下において類似しており、ポリシストロニックVRPが補体非依存性免疫応答を成功裏に誘発したことを示した図6C。50の中和力価は、TB40-GFPCMVウイルスを有するARPE-19細胞において1:3500~6400血清希釈であった。この力価は、gBプール血清についての50の補体依存性中和力価のほぼ3~4倍の力価である。MRC-5線維芽細胞の細胞における結果は、ARPE-19細胞における結果に類似した図7Aおよび7B。バイシストロニックgH/gLまたはトリシストロニックgH/gL/gOVRPにより免疫化したマウス由来の血清は、gHのみ、gLのみ、またはgOのみをコードするVRPにより免疫化したマウス由来の血清ならびにgHVRPおよびgLVRPの同時投与またはgHVRP、gLVRP、およびgOVRPの同時投与によって免疫化したマウス由来の血清と比較して、強力な中和活性を実証した。これらの結果は、ポリシストロニックVRPの投与が、線維芽細胞の細胞のCMV感染の好適な補体非依存性中和を提供する免疫応答を誘発したことを実証する。CMVの異なる株に対するgH/gL免疫血清の広さbreadthおよび効力を評価するために、発明者らは、血清が、CMVの6つの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断する能力を比較した。図8は、gH/gL血清が、広範囲の株による両方の細胞型の感染を強力に中和することを示す。これらのデータはまた、1つのタンパク質のみを発現するVRPの混合プールによってではなく、ポリシストロニックVRPにより免疫化したマウス由来の血清についての強力な中和活性を実証する。これは、単一のレプリコン上にタンパク質複合体の成分をコードするポリシストロニックレプリコンがinsituにおいて複合体の効率的な産生をもたらすことを示す。さらに、Merlin株CMVタンパク質をこれらの応答を刺激するために使用したので、TB40株CMVウイルスを使用して得られたinvitroにおけるデータは、ポリシストロニックVRPの送達によって誘発される中和抗体が交差中和抗体であることを実証する。実施例5RNA合成アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドDNA図14~16を参照されたいは、invitroにおけるRNAの合成のための鋳型としての役目をした。アルファウイルスレプリコンは、RNA複製に必要とされる遺伝子エレメントを含有するが、粒子構築に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを欠き、アルファウイルスゲノムの構造遺伝子は、異種タンパク質をコードする配列と交換する。真核細胞へのレプリコンの送達に際して、プラス鎖RNAは、4つの非構造タンパク質を産生するように翻訳され、これらは、ともに、ゲノムRNAを複製し、異種遺伝子産物または目的の遺伝子GOIをコードする大量のサブゲノムmRNAを転写する。アルファウイルス構造タンパク質の発現が欠如していることにより、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘発することができない。アルファウイルスcDNAの上流のバクテリオファージプロモーターT7またはSP6は、invitroにおけるレプリコンRNAの合成を容易にし、ポリAテイルの直ぐ下流のデルタ型肝炎ウイルスHDVリボザイムは、その自己切断活性を通して正確な3’末端を生成する。抗原性タンパク質複合体の形成を可能にするために、同じ細胞における当該複合体の個々の成分の発現は、最も重要である。理論上、これは、個々の成分をコードする遺伝子により細胞を同時トランスフェクトすることによって達成することができる。しかしながら、非ウイルスまたはVRP送達アルファウイルスレプリコンRNAの場合には、この戦略は、複数のRNAの同じ細胞への非効率的な同時送達によってか、あるいは個々の細胞における複数の自己複製RNAの非効率的な開始launchによって妨げられる。タンパク質複合体の成分の同時発現を容易にするための潜在的により効率的な方法は、同じ自己複製RNA分子の一部としてそれぞれの遺伝子を送達することである。この目的のために、発明者らは、目的の複数の遺伝子をコードするアルファウイルスレプリコン構築物を創出した。すべてのGOIの前に、アルファウイルス転写機構によって認識されるそれ自体のサブゲノムプロモーターを置く。それによって、複数のサブゲノムメッセンジャーRNA種は、個々の細胞において合成され、多成分タンパク質複合体の構築を可能にする。適した制限エンドヌクレアーゼによるHDVリボザイムの下流のプラスミドDNAの直線化の後に、ランオフrun-off転写物を、T7バクテリオファージ由来のDNA依存性RNAポリメラーゼを使用して、invitroにおいて合成した。転写は、製造者Ambion、Austin、TXによって提供される説明書に従って、7.5mMのそれぞれのヌクレオシド三リン酸ATP、CTP、GTP、およびUTPの存在下において37°Cで2時間実行した。転写の後に、鋳型DNAは、TURBODNアーゼAmbion、Austin、TXにより消化した。レプリコンRNAは、LiClにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。キャップがないRNAは、ユーザーマニュアルにおいて概説されるように、ScriptCapm7GキャッピングシステムEpicentreBiotechnologies、Madison、WIを使用して、ワクシニアキャッピング酵素VCEにより転写後にキャップした。転写後にキャップしたRNAは、LiClにより沈殿させ、ヌクレアーゼを含まない水で再構成した。RNA試料の濃度は、260nmでの光学濃度を測定することによって決定した。invitroにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。脂質ナノ粒子LNP処方物1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチル-3-アミノプロパンDLinDMAは、以前に公開された手順を使用して合成した[Heyes,J.、Palmer,L.、Bremner,K.、MacLachlan,I.Cationiclipidsaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids.JournalofControlledRelease,107巻:276~287頁2005年]。1,2-ジステアロイルDiastearoyl-sn-グリセロ-3-ホスホコリンDSPCは、Genzymeから購入した。コレステロールは、Sigma-AldrichSt.Lois、MOから得た。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール-2000]アンモニウム塩PEGDMG2000は、AvantiPolarLipidsから得た。LNPRV0114は、次の方法を使用して処方した。150μgバッチ、PES中空繊維、ムスタングmustangなし:エタノール中の新たな脂質ストック溶液を調製した。37mgのDlinDMA、11.8mgのDSPC、27.8mgのコレステロール、および8.07mgのPEGDMG2000を秤量し、7.55mLのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液は、均質の混合物を形成するために約15分間、37°Cで穏やかに揺り動かした。その後、2mLの使用脂質ストック溶液を作製するために、453μLのストックを、1.547mLエタノールに追加した。脂質のこの量は、8:1N:P窒素対ホスフェート比の150μgRNAを有するLNPを形成するために使用した。DlinDMAカチオン性脂質上のプロトン化可能なprotonatable窒素およびRNA上のホスフェートは、この計算に使用される。自己複製RNA分子1μgは、3nmoleのアニオン性ホスフェートを含有することが想定され、DlinDMA1μgは、1.6nmoleのカチオン性窒素を含有することが想定された。RNAの2mL使用溶液もまた、100mMクエン酸緩衝液pH6Teknovaにおいて約1μg/μLのストック溶液から調製した。3つの20mLガラスバイアル撹拌棒を含むは、RNaseAway溶液MolecularBioProductsによりすすぎ、RNアーゼからバイアルを除染するために使用の前に多量のMilliQ水により洗浄した。バイアルの1つは、RNA使用溶液に使用し、他のものは脂質およびRNAミックスを収集するために使用した後に記載する。使用脂質およびRNA溶液は、3ccluer-lokシリンジBDMedicalの中に装填する前に10分間、37°Cで加熱した。2mLのクエン酸緩衝液pH6を他の3ccのシリンジ中に装填した。RNAおよび脂質を含有するシリンジは、FEPチューブ[フッ化エチレンプロピレン]2mmID×3mmOD、IdexHealthScience、OakHarbor、WAを使用してTミキサーPEEK商標500μmIDジャンクションに接続した。Tミキサーからの出口もまた、FEPチューブ2mmID×3mmとした。クエン酸緩衝液を含有する第3のシリンジは、チューブの別々の部分2mmID×3mmODに接続した。その後、シリンジはすべて、シリンジポンプkdScientific製、モデル番号KDS-220を使用して、7mL/分の流量で駆動した。チューブの出口は、20mLガラスバイアル中に混合物を収集するように位置づけた撹拌しながら。撹拌棒を取り出し、1時間、室温でエタノール/水溶液を平衡化させた。その後、混合物は、FEPチューブ2mmID×3mmODの部分に取り付けた5ccシリンジBDMedical中に装填し、等しい長さのFEPチューブを有する他の5ccシリンジ中に、等しい容積の100mMクエン酸緩衝液pH6を装填した。2つのシリンジは、シリンジポンプを使用して7mL/分の流量で駆動し、最終混合物は、20mLガラスバイアル中に収集した撹拌しながら。次に、LNPは、2mLまで濃縮し、最終生産物を回収する前に、タンジェンシャルフローフィルトレーションTFFシステムを使用して10~15容積の1×PBSTeknova製に対して透析した。TFFシステムおよび中空繊維濾過膜は、SpectrumLabsから購入し、製造者のガイドラインに従って使用した。100kD孔径カットオフおよび20cm2表面積を有するポリエーテルスルホンPES中空繊維濾過膜部品番号P-C1-100E-100-01Nを使用した。invitroおよびinvivoにおける実験のために、処方物は、1×PBSTeknova製により、必要とされるRNA濃度まで希釈した。粒度粒度は、製造者の説明書に従って、ZetasizerNanoZSMalvernInstruments、Worcestershire、UKを使用して測定した。粒度は、多分散指数pdiによるZ平均値として報告する。リポソームは、測定の前に1×PBSにおいて希釈した。被包効率およびRNA濃度被包されたRNAのパーセンテージおよびRNA濃度は、Quant-iTRiboGreenRNA試薬キットInvitrogenによって決定した。アッセイにおいて製造者の説明書に従った。キット中に提供されるリボソームRNA標準物質は、標準曲線を生成するために使用した。方法1または方法2~5から得たLNPは、色素の追加前に、1×TE緩衝液キットからのにおいてそれぞれ10倍または100倍に希釈した。別々に、LNPは、色素の追加の前に、0.5TritonXSigma-Aldrichを含有する1×TE緩衝液中に10または100倍に希釈した。その後、等量の色素をそれぞれの溶液に追加し、その後、色素追加後の約180μLのそれぞれの溶液を、96ウェル組織培養プレートVWRから得た、カタログ番号353072の中に二連で入れた。蛍光Ex485nmおよびEm528nmは、マイクロプレートリーダーBioTekInstruments,Inc.製上で読み取った。TritonXは、LNPを破壊するために使用し、全RNA量に対応する蛍光の読み取り値を提供し、TritonXを用いない試料は、被包されていないRNAに対応する蛍光を提供した。RNA被包は、以下のように決定した:LNPRNA被包=[Ft-Fi/Ft]×100、Ftは、tritonXの追加ありのLNPの蛍光強度であり、Fiは、洗浄剤の追加なしのLNP溶液の蛍光強度である。これらの値FtおよびFiは、ブランク1×TE緩衝液蛍光強度からの減算後に得た。被包されたRNAの濃度は、生成された標準曲線とFt-Fiを比較することによって得た。LNP処方物はすべて、被包用量に基づいてinvivoにおいて投薬した。ウイルスレプリコン粒子VRPレポーター遺伝子または抗原のinvivoにおける発現を達成するための従来のRNAベクターRNA-vectoredアプローチとRNAワクチンを比較するために、発明者らは、対応するRNA構築物と同じ抗原の発現をコードする、PerriらJ.Virol77巻19号:10394~10403頁2003年によって記載される方法によってBHK細胞において産生されるウイルスレプリコン粒子VRPを利用した。この系において、抗原は、シンドビスウイルスの3’末端配列3’UTRおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナルPSを含有するように操作された、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEVのゲノムに由来するアルファウイルスキメラレプリコンVCRから成ったPerriらの図2を参照されたい。レプリコンは、シンドビスウイルスのカプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする不完全ヘルパーRNAと共に、ベビーハムスター腎臓BHK細胞の中にそれらを同時にエレクトロポレーションすることによってVRPにパッケージしたPerriらの図2を参照されたい。その後、VRPは、収集し、スクロースクッション上で超遠心分離法によって部分的に精製し、Amicon濃縮機で濃縮した。結果として生じるVRPストックは、標準的な方法によって力価を測定し、培養液または他の等張性の緩衝液で動物に接種した。ベネズエラウマ脳炎およびシンドビスウイルスに由来するアルファウイルスレプリコン粒子キメラは、強力な遺伝子ベースのワクチン送達ベクターである。J.Virol.77巻、10394~10403頁。マウス免疫原性研究8~10週齢で体重が約20gである10匹の雌のBALB/cマウスの群を、0日目、21日目、および42日目に、1×106IUVRPまたは1.0μgRNAにより免疫化し、2回目のワクチン接種の3週間後および3回目のワクチン接種の3週後に採血した。動物はすべて、それぞれ2本の後肢の四頭筋に注射し、等価な容積部位当たり50μlを受けた。マイクロ中和アッセイ血清試料は、感染低下中和試験によって中和抗体の存在について試験した。HI血清10HIFBSを有するDMEM中の2倍段階希釈物を、およそ200IU/50μlを示すようにあらかじめ力価測定した等しい容積のCMV株TB40または臨床分離株8819に追加した。VR1814、Towne、AD169株、および臨床分離株8822もまた、使用した。血清/ウイルス混合物は、ウイルス中和が起こるように、37°Cおよび5CO2で2時間インキュベートし、その後、50μlのこの混合物およそ200IUを含有するを、96ハーフウェルプレート中のARPE-19細胞の二連のウェル上に接種した。プレートは、40~44時間インキュベートした。その他に示されない限り、陽性感染した増殖巣focusの数は、AlexaFluor488コンジュゲートIE1CMVモノクローナル抗体により免疫染色し、その後自動計数を続けることによって決定した。中和力価は、対照血清なしと比べた、ウェル当たりの陽性ウイルス増殖巣の数における50の低下をもたらす血清希釈の逆数として定義される。gH/gLVRPおよびLNP処方RNAの免疫原性CMVの表面糖タンパク質BgBを発現するA323レプリコン、完全長糖タンパク質HおよびLgH/gLの膜複合体を発現するA160レプリコン、ならびに糖タンパク質HおよびLの可溶性の形態の膜複合体gHsol/gLを発現するA322レプリコンを本実験に使用した。BALB/cマウス、群当たり10匹の動物に、gBを発現するVRP1×106IU、gH/gLを発現するVRP1×106IU、gHsol/gLを発現するVRP1×106IU、および対照としてのPBSにより、0日目、21日目、および42日目に、両側の筋肉内ワクチン接種肢当たり50μLを与えた。3つの試験群は、LNPRV0114中に処方した自己複製RNAA160、A322、またはA323を受けた。血清は、39日目3wp2および63日目3wp3に免疫学的分析のために収集した。結果実験のために作製したRV0114処方物における被包RNAのsiveおよびパーセンテージを表3に示す。最終的な血清63日目、最終ワクチン接種の3週後についての50の中和性の力価を表4に示す。HCMVgH/gL複合体の完全長形態または推定される可溶性の形態を発現するRNAは、2つの異なるHCMV株を使用して上皮細胞上でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を引き起こす。gH/gLRNAによって引き起こされる平均力価は、対応するgH/gLVRPについての平均力価と少なくとも同じくらい高い図17を参照されたい。実施例6CMVタンパク質をコードするバイシストロニックおよびペンタシストロニック核酸ヒトサイトメガロウイルスHCMV由来の糖タンパク質複合体を発現する追加のバイシストロニックおよびペンタシストロニックアルファウイルスレプリコンを、調製した、また、図18および20に概略的に示す。アルファウイルスレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスVEEに基づいた。レプリコンは、ウイルスレプリコン粒子VRPの中にパッケージした、脂質ナノ粒子LNP中に被包した、またはカチオン性ナノエマルジョンCNEと共に処方した。レプリコンのそれぞれからのコードされたHCMVタンパク質およびタンパク質複合体の発現は、免疫ブロット法、免疫共沈降、およびフローサイトメトリーによって確認した。フローサイトメトリーは、五量体複合体上に存在するコンフォメーション性エピトープに特異的なヒトモノクローナル抗体を使用して、複合体のタンパク成分をコードする五量体のレプリコンからの五量体のgH/gL/UL128/UL130/UL131複合体の発現を検証するために使用したMacagnoら2010年、J.Virol.84巻2号:1005~13頁。図19は、これらの抗体が、HCMVgH/gL/UL128/UL130/UL131五量体複合体A527を発現するレプリコンRNAによりトランスフェクトされたBHKV細胞に結合することを示す。細胞を同じレプリコン構築物から作製したVRPにより感染させた場合、同様の結果が得られた。これは、五量体複合体を発現するように設計したレプリコンが、潜在的な副産物gH/gLではなく所望の抗原を実際に発現することを示す。VRP、LNP中に被包したRNA、およびCNEと共に処方したRNAは、後方の四頭筋への筋肉内注射によってBalb/cマウスを免疫化するために使用した。マウスは、3回、3週間間隔で免疫化し、血清試料は、それぞれの免疫化に先立ってならびに3回目および最終の免疫化の3週間後に収集した。血清は、ワクチン接種によって引き起こされる中和抗体応答の効力を測定するためにマイクロ中和アッセイにおいて評価した。力価は、50の中和性の力価として表現する。VRPにおける可溶性のHCMVgH/gL複合体についてのバイシストロニック発現カセットの多くの異なる構成の免疫原性を評価した。図20は、膜に係留された完全長gH/gL複合体を発現するVRPが、類似するバイシストロニック発現カセットから発現された可溶性複合体gHsol/gLよりもわずかに高度な力価で、強力な中和抗体を引き起こしたことを示す。gHsolおよびgLをコードする遺伝子の順序の変更またはサブゲノムプロモーターのうちの1つのIRESもしくはFMDV2A部位との交換は、実質的に免疫原性を改善しなかった。gH/gLを発現するVEE/SINVRPにより免疫化したマウス由来の血清におけるHCMV中和活性の広さおよび効力は、HCMVの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表5は、gH/gL免疫血清が、補体の非存在下における両方の細胞型に対するHCMVの6つの異なる株に対して広くかつ強力に中和性であったことを示す。補体の追加は、血清の中和性の効力に対してわずかな陰性な影響を有した。LNP被包RNAA160およびgH/gLを発現するVRPpVCR修飾gH-SGPgLと比較した、五量体複合体をコードするLNP被包RNAA526およびA527の免疫原性を評価した。表6は、五量体複合体を発現するレプリコンがgH/gLを発現するレプリコンよりも強力に中和抗体を引き起こしたことを示す。中和抗体の最高の力価を引き起こしたペンタシストロニックVEEベースのRNAレプリコンA527は、VRPとしてパッケージし、VRPの免疫原性は、gH/gL発現VRPおよびgH/gLおよび五量体複合体を発現するLNP被包レプリコンと比較した。表7は、五量体複合体を発現するVRPがgH/gLを発現するVRPよりも高度な力価の中和抗体を引き起こしたことを示す。さらに、VRPの106感染単位は、VRPおよびRNAが同じタンパク質複合体をコードした場合、LNP被包RNAの1μgと少なくとも同じくらい強力である。五量体複合体をコードするVEEベースのRNAA527により免疫化したマウス由来の血清におけるHCMV中和活性の広さおよび効力は、HCMVの異なる株による線維芽細胞および上皮細胞の感染を遮断するために血清を使用することによって評価した。表8は、抗gH/gL/UL128/UL130/UL131免疫血清が広く強力に上皮細胞の感染を中和したことを示す。この効果は、補体非依存性であった。対照的に、血清は、線維芽細胞の感染に対して低下したまたは検出可能でない効果を有した。五量体複合体が線維芽細胞の感染に必要とされず、その結果として、UL128、UL130、およびUL131に対する抗体が線維芽細胞の感染を遮断しないので、これらの結果は、gH/gL/UL128/UL130/UL131五量体複合体に対して特異的な抗体をほとんど含有する免疫血清について期待されるものであるAdlerら2006年、J.Gen.Virol.87巻Pt.9:2451~60頁;WangおよびShenk2005年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA102巻50号:18153~8頁。したがって、これらのデータは、gH/gL/UL128/UL130/UL131五量体複合体をコードする五量体レプリコンがinvivoにおいて複合体に対する抗体を特異的に引き起こすことを実証する。gH/gLおよび五量体複合体を発現するバイシストロニックおよびペンタシストロニックレプリコンが異なる処方物において中和抗体を引き起こすかどうか確かめるために、コットンラットは、カチオン性ナノエマルジョンCNEと混合したバイシストロニックまたはペンタシストロニックレプリコンにより免疫化した。表9は、CNEにおけるレプリコンが、LNP中に被包された同じレプリコンと同等の中和抗体力価を引き起こしたことを示す。実施例7VZVタンパク質をコードするレプリコンVZVタンパク質をコードする核酸は、gB、gH、gL、gE、およびgIをコードするモノシストロニックレプリコンを産生するためにおよびgH/gLまたはgE/gIをコードするバイシストロニックレプリコンを産生するために、VEEレプリコンベクターの中にクローニングした。バイシストロニックレプリコンにおいて、それぞれのVZVオープンリーディングフレームの発現は、別々のサブゲノムプロモーターによって駆動された。レプリコンRNAを調製するために、レプリコンをコードするプラスミドは、PmeIによる消化によって直線化し、直線化されたプラスミドは、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールisoamylalchoholにより抽出し、酢酸ナトリウム/エタノール中に沈殿させ、20μlのRNアーゼを含まない水において再懸濁した。RNAは、MEGAscriptT7キットAMBIONAM1333を使用して、直線化されたDNAの1μgのinvitroにおける転写によって調製した。20μl反応は、キャップアナログを用いないで製造者の説明書に従って設定し、32°Cで2時間インキュベートした。TURBODNアーゼ1μlを追加し、混合物を32°Cで30分間インキュベートした。RNアーゼを含まない水30μlおよび酢酸アンモニウム溶液30μlを追加した。溶液は混合し、-20°Cで少なくとも30分間冷やした。その後、溶液は、4°Cで25分間、最高速度で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットは70エタノールによりすすぎ、4°Cで10分間、最高速度で再び遠心分離した。ペレットは風乾し、50μlのRNアーゼを含まない水中に再懸濁した。RNAの濃度を測定し、品質は、変性ゲル上でチェックした。RNAは、ScriptCapm7GCappingSystemEpicentreSCCE0625を使用してキャップした。反応は、RNAおよびRNアーゼを含まない水を組み合わせることによって調整した。その後、RNAは、65°Cで5~10分間変性させた。変性したRNAは、氷に素速く移し、次の試薬を次の順序で追加した:ScriptCapCappingBuffer、10mMGTP、新たに調製した2mMSAM、ScriptGuardRNアーゼ阻害剤、およびScriptCapCappingEnzyme。混合物は、37°Cで60分間インキュベートした。反応は、RNアーゼを含まない水および7.5MLiClを追加し、よく混合し、-20°Cで少なくとも30分間、混合物を保存することによって停止させた。その後、混合物は、4°Cで25分間、最高速度で遠心分離し、ペレットは、70エタノールによりすすぎ、4°Cで10分間、最高速度で再び遠心分離した。ペレットは風乾させた。ペレットは、RNアーゼを含まない水中に再懸濁した。RNAの濃度を測定し、品質は、変性ゲル上でチェックした。RNAトランスフェクション細胞BHK-V細胞は、6ウェルプレート上にまき、トランスフェクションの時に90~95コンフルエンスに至った。それぞれのトランスフェクションのために、3μgのRNAを第1のチューブにおいて50mLOPTIMEM培地において希釈した。Lipofectamine2000を、50mLOPTIMEM培地を含有する第2のチューブに追加した。第1および第2のチューブを組み合わせ、室温で20分間維持した。6ウェルプレート中の培養培地を、新たな培地と交換し、RNA-Lipofectamine複合体を細胞上に配置し、プレートを穏やかに揺り動かすことによって混合した。プレートは、CO2インキュベーターにおいて37°Cで24時間インキュベートした。トランスフェクトした細胞におけるVZVタンパク質の発現は、ウエスタンブロットおよび免疫蛍光法によって評価した。ウエスタンブロットのために、トランスフェクト細胞の溶解産物は、電気泳動5μg総タンパク質/レーンによって分離し、ブロットした。OKA/Merckワクチン株に由来する、透明なウイルス懸濁液7μg総タンパク質/レーンを、陽性対照として使用した。ブロットは、VZVタンパク質に結合する市販で入手可能な抗体1:1000希釈を使用してプローブした。免疫蛍光法のために、トランスフェクトした細胞を、収集し、96ウェルプレート中にまき、細胞内染色は、市販で入手可能なマウスmAb希釈範囲1:1001:400を使用して実行した。細胞ペレットを固定し、Citofix-Citoperm溶液により透過処理した。二次試薬、Alexa488標識ヤギ抗マウスFab’21:400最終希釈を使用した。VZVタンパク質gEおよびgIの発現は、モノシストロニック構築物gEまたはgIによりトランスフェクトした細胞において検出され、gEおよびgIの両方の発現は、市販で入手可能なマウス抗体、gEについては13B1およびgIについては8C4を使用して、ウエスタンブロットにおいてバイシストロニックgE/gI構築物によりトランスフェクトした細胞において検出された。VZVタンパク質gBの発現は、市販で入手可能な抗体10G6を使用して、免疫蛍光法によって、gBをコードするモノシストロニック構築物によりトランスフェクトした細胞において検出された。VZVタンパク質複合体gH/gLの発現は、モノシストロニックgHおよびモノシストロニックgLによりまたはバイシストロニックgH/gL構築物によりトランスフェクトされた細胞において免疫蛍光法によって検出された。gH/gL複合体は、市販で入手可能な抗体SG3を使用して検出された。マウス免疫原性研究6~8週齢で体重が約20gである8匹の雌のBALB/cマウスの群を、0日目、21日目、および42日目に、CNEまたはLNPRV01と共に処方した7.0または1.0μgのレプリコンRNAにより筋肉内で免疫化した。血液試料は、2回目の免疫化の3週間後および3回目の免疫化の3週間後に、免疫化した動物から取った。群を表10に示す。VZV抗原に対する免疫応答血清試料は、VZVレプリコンでトランスフェクトしたMRC-5細胞の細胞内染色によってgBに対する抗体の存在について試験した。MRC-5細胞は、10ウシ胎仔血清を有するDulbeccoModifiedEagle’sMediumにおいて維持した。VZVOka株接種材料ATCCから得たは、MRC-5細胞培養物を感染させるために使用し、感染した細胞全体は、ウイルスの二次継代subpassageのために使用した。感染した細胞および感染しなかった細胞の間の比は、1:10であった。感染後30時間の細胞は、免疫化後に得られたマウス血清希釈範囲1:200~1:800のプールによる細胞内染色を実行するために、96ウェルプレート中にまくためにトリプシンにより分散させた。市販のmAbは、感染レベルを定量化するために対照として使用した。細胞ペレットを固定し、Citofix-Citoperm溶液により透過処理した。二次試薬、Alexa488標識ヤギ抗マウスFab’2を使用した1:400最終希釈。gB10G6、gHSG3、ならびにgE13B1SBAおよび8612Milliporeに対する市販の抗体は、陽性対照として使用し、それぞれ、感染したMRC-5細胞を細胞内染色した。CNEまたはLNPと共に処方した1または7μgのRNAによる3回目の免疫化の3週間後に得られた免疫血清は、1/200、1/400、および1/800に希釈し、感染したMRC-5細胞を細胞内染色するために使用した。結果は、図21研究1、群1、5、7、9、11、13、および15、CNE処方物ならびに図22研究2、群1~7、LNP処方物に示す。中和アッセイ免疫化マウス血清はそれぞれ、標準的な培地において1:20から出発して、2倍の増分ずつ連続的に希釈し、モルモット補体の存在下において等しい容積のVZV懸濁液に追加した。37°Cでの1時間のインキュベーション後に、ヒト上皮細胞株A549を追加した。感染細胞は、顕微鏡下で培養物中に形成されたプラークを数えることによって培養の1週間後に測定することができる。プラーク数から、それぞれの血清希釈での阻害を計算した。それぞれの血清試料のチャートは、希釈係数である対数目盛に対する阻害の値をプロットすることによって作製した。続いて、希釈係数および阻害の間の関係についての近似の線approximatelineを引いた。その後、50の中和力価を、線が50の阻害の値で交差する希釈係数として決定した。表11は、モノシストロニックgE、バイシストロニックgE/gI、およびバイシストロニックgH/gLにより免疫化したマウスから得られた血清が頑健な中和抗体力価を含有したことを示す。"