"少なくとも1種の上皮増殖因子受容体EGFR発現細胞の増殖を抑制するための細胞増殖抑制剤であって、1以下のA及びBにそれぞれ特徴を記載した抗体:AEGFRに対して特異的に結合する人為的に製造された抗EGFR抗体であって、エピトープがEGFRの細胞外ドメインを構成する4つのサブドメインのうちのN末端側から数えて4番目のシステイン-リッチサブドメイン2C2にあり、重鎖可変領域VH領域は、配列番号1に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、軽鎖可変領域VL領域は、配列番号2に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗EGFR抗体;BEGFRに対して特異的に結合する人為的に製造された抗EGFR抗体であって、エピトープがEGFRの細胞外ドメインを構成する4つのサブドメインのうちのN末端側から数えて1番目のリガンド結合ドメイン1L1にあり、重鎖可変領域VH領域は、配列番号3に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、軽鎖可変領域VL領域は、配列番号4に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有している、抗EGFR抗体;のうちのいずれか一方若しくは両方の抗体と、2少なくとも1種の薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤。前記抗体は、前記VH領域及び前記VL領域に加えてさらにヒト型IgGの重鎖定常領域CH領域と軽鎖定常領域CL領域とを含むヒト型IgGに形成されていることを特徴とする、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤。前記EGFR発現細胞がKRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該KRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項1又は2に記載の細胞増殖抑制剤。上皮増殖因子受容体EGFRに対して特異的に結合する人為的に製造された抗EGFR抗体であって、エピトープがEGFRの細胞外ドメインを構成する4つのサブドメインのうちのN末端側から数えて4番目のシステイン-リッチサブドメイン2C2にあり、重鎖可変領域VH領域は、配列番号1に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、軽鎖可変領域VL領域は、配列番号2に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗EGFR抗体。上皮増殖因子受容体EGFRに対して特異的に結合する人為的に製造された抗EGFR抗体であって、エピトープがEGFRの細胞外ドメインを構成する4つのサブドメインのうちのN末端側から数えて1番目のリガンド結合ドメイン1L1にあり、重鎖可変領域VH領域は、配列番号3に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有しており、且つ、軽鎖可変領域VL領域は、配列番号4に示すアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列に1~数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び/又は付加されて成る前記特異的結合能を維持した改変アミノ酸配列を有していることを特徴とする、抗EGFR抗体。前記VH領域及び前記VL領域に加えてさらにヒト型IgGの重鎖定常領域CH領域と軽鎖定常領域CL領域とを含む、ヒト型IgGに形成されていることを特徴とする、請求項4又は5に記載の抗EGFR抗体。少なくとも1種の上皮増殖因子受容体EGFR発現細胞の増殖を抑制する方法であって、請求項4~6のいずれかに記載の抗EGFR抗体を対象とするEGFR発現細胞に付与することを特徴とする、細胞増殖抑制方法。前記EGFR発現細胞がKRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞である、当該KRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞の増殖を抑制するための請求項7に記載の方法。配列番号1~4のうちの少なくとも一つの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列にコードされたアミノ酸配列を備えるペプチドを発現するために人為的に設計されたポリヌクレオチド。以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄例えば遺伝子組み換え技術やタンパク質抗体の精製、或いはバイオアッセイに関する一般的事項は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。本明細書において人為的に製造された抗体とは、ヒト又は動物の体内における自然な免疫反応により産生された抗体とは異なり、典型的には遺伝子工学的手法により人為的に製造された抗体をいう。ここで抗体とは、典型的には重鎖と軽鎖とから構成される免疫グロブリンを示す用語であるが、ネイティブな構造の免疫グロブリン分子典型的にはIgG、例えばヒト型のIgGの他、種々のフラグメント抗体、例えばFabフラグメントやFab’2フラグメントを包含する。また、本明細書においての抗体は、遺伝子工学的手法によって形成され得る抗体分子を包含する。例えば、単一のペプチド鎖上にVL領域を構成するアミノ酸配列とVH領域を構成するアミノ酸配列とを備える人為的に製造されたいわゆる単鎖抗体scFvもここでいう抗体に包含される。また、本明細書においてアミノ酸残基とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。また、本明細書において上記VH領域若しくはVL領域を構成する所定のアミノ酸配列について改変アミノ酸配列とは、当該所定のアミノ酸配列が有する抗原結合能を損なうことなく、1~数個例えば1個又は2個又は3個のアミノ酸残基が置換、欠失及び/又は付加挿入されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、1個又は数個典型的には2個又は3個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換conservativeaminoacidreplacementによって生じた配列例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列や酸性アミノ酸残基が別の酸性アミノ酸残基に置換した配列、或いは、所定のアミノ酸配列について1個又は数個典型的には2個又は3個のアミノ酸残基が付加挿入した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。また、本明細書においてポリヌクレオチドとは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー核酸を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのDNAフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、人為的に設計されたポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチド鎖全長がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成即ち遺伝子工学に基づく生産によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。例えば、ここで開示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドDNA、組換えファージDNA等は、本明細書における人為的に設計されたポリヌクレオチドに包含される典型例である。本発明によって提供される細胞増殖抑制剤は、本発明者によって創出された少なくとも1種の抗体即ちC2ドメイン結合性抗EGFR抗体及び/又はL1ドメイン結合性抗EGFR抗体を含み、少なくとも1種のEGFR発現細胞の増殖を抑えることにより特徴付けられる組成物であり、その他の含有成分や薬剤としての調製法、保存法、使用法、等は従来の抗体医薬抗体を含む薬学上の組成物と同様でよく、特に限定されない。例えば、薬学的に許容される担体として、生理食塩水、PBSその他のバッファー類、リンゲル溶液等が挙げられる。また、添加剤として、各種の抗生物質、pH調整剤、酸化防止剤、キレート剤、色素、保存料、各種のビタミンや酵素等が挙げられる。本発明者は、本発明者らが構築保有するファージ提示型の単鎖抗体ライブラリーこの種のライブラリーの製造例は上記特許文献2が参考になる。から既知の抗ヒトEGFRモノクローナル抗体をいわゆるガイド分子として使用したスクリーニングを行うことによって、従来の抗EGFR抗体とはエピトープの異なる新たな単鎖抗体scFvを複数種類選抜し、それらscFvの可変領域に対応するアミノ酸配列ならびに該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を同定することによって本発明を完成するに至った。即ち、ここで開示される一つの好適な抗EGFR抗体C2ドメイン結合性抗EGFR抗体は、VH領域に配列番号1に示すアミノ酸配列或いはその改変アミノ酸配列を有すること、及び/又は、VL領域に配列番号2に示すアミノ酸配列或いはその改変アミノ酸配列を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをC2ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。また、ここで開示される他の一つの好適な抗EGFR抗体L1ドメイン結合性抗EGFR抗体は、VH領域に配列番号3に示すアミノ酸配列或いはその改変アミノ酸配列を有すること、及び/又は、VL領域に配列番号4に示すアミノ酸配列或いはその改変アミノ酸配列を有すること、によって特徴付けられる抗体であり、エピトープをL1ドメインに有する新規な人為的に作製された抗体である。ここで開示される抗体は、エピトープに結合する可変領域のアミノ酸配列が明らかであるため、遺伝子工学的手法によって容易に製造することができる。例えば、上記ライブラリーから得られた単鎖抗体scFvの状態でも抗体医薬として十分使用することができるが、生体内での結合親和性の向上や物理的安定性を付与するために完全型の抗体例えばヒト型IgGに形成されることが好ましい。後述する実施例に示すように、scFvをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターからVH領域をコードするヌクレオチド配列VH遺伝子とVL領域をコードするヌクレオチド配列をVL遺伝子を一般的なPCR技法を用いて増幅し、これを定常領域CH領域及びCL領域を有する抗体発現ベクタープラスミド等に導入し、所定の宿主細胞典型的にはCHO細胞ChineseHamsterOvaryCell等の動物細胞で発現させることにより、容易に製造することができる。従って、本発明は、ここで開示されるVH領域及び/又はVL領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド情報即ちヌクレオチド配列を利用することを特徴とする、抗EGFR抗体の製造方法を提供するものである。ここで開示される細胞増殖抑制剤は、本発明者が創出した少なくとも一種のC2ドメイン結合性抗EGFR抗体及び/又はL1ドメイン結合性抗EGFR抗体を抗体成分として使用する結果、後述する実施例からも明らかなように、従来のこの種の抗体が無効であったKRAS遺伝子変異型の高EGFR発現細胞例えば転移性大腸癌の細胞に対してもKRAS遺伝子無変異型の高EGFR発現細胞と同様に、その細胞増殖を効果的に抑制することができる。従って、本発明によると、ここで開示される少なくとも一種のC2ドメイン結合性抗EGFR抗体及び/又はL1ドメイン結合性抗EGFR抗体即ち該抗体を含む薬剤組成物を患者に投与することを特徴とする、転移性大腸癌のようなKRAS遺伝子変異型の高EGFR発現細胞からなる悪性腫瘍を制御する方法を提供することができる。なお、ここで開示される細胞増殖抑制剤の患者への投与量や投与頻度或いは投与の態様経口投与、皮下注射、静脈内注射、灌腸、等は、対象とする患者症状の状態や、投与先悪性腫瘍の形態ならびに使用する細胞増殖抑制剤薬剤組成物の形状、抗体の形態例えばscFvか或いは完全ヒト型IgGかなど、含まれる抗体の濃度、抗体以外の副成分の有無やその濃度、等によって適宜異なり得る設計事項である。当業者は事情に応じて周知技術である抗体エンジニアリングの知見に加えて薬学上、臨床医学上、生理学上或いは衛生学上の知見に基づいて、適切な形態の細胞増殖抑制剤を調製し得、さらに所定の患者の体内或いは患者から取り出した組織や細胞の培養物に適切な形態の細胞増殖抑制剤抗体医薬を適切な量で投与添加することができる。このこと自体は、本発明を特徴付けるものではないため、これ以上の詳細な説明は省略する。以下の実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明を以下の実施例に記載のものに限定することを意図したものではない。<試験例1:抗EGFR抗体の製造>予め用意してあったファージ提示型単鎖抗体scFvライブラリーに対し、発明者らが創出したマウス由来の抗ヒトEGFRモノクローナル抗体であって現在では市販もされているB4G7モノクローナル抗体をガイド分子とするスクリーニングを実施し、ガイド分子の近傍に結合するscFv提示ファージを選択的に回収し、最終的には計4つの新規な抗EGFR単鎖抗体scFvと該抗体をコードする遺伝子が得られた。得られたscFv遺伝子を所定のプライマーを用いてPCR法により増幅し、VH領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列、ならびにVL領域のヌクレオチド配列と該配列にコードされるアミノ酸配列を同定した。得られた4つの抗体試料サンプルNo.45、No.38、No.40、No.42とする。についてのアミノ酸配列ならびにヌクレオチド配列情報は以下のとおり。次に、上記得られた各サンプルscFvの配列情報を利用して、ヒト型IgGを遺伝子組換え技法により作製した。図1Aのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクターpHIgHzeoならびに図1Bのプラスミドマップに示す発現プラスミドベクターpHIgKneoを使用した。pHIgHzeoの全ヌクレオチド配列を配列番号17に示し、pHIgKneoの全ヌクレオチド配列を配列番号18に示す。図1Aのプラスミドマップに示すように、pHIgHzeoは、ヒト型IgG1の重鎖定常領域CH領域をコードする遺伝子CH1~CH3を有している。他方、図1Bのプラスミドマップに示すように、pHIgKneoは、ヒト型IgG1の軽鎖κ鎖定常領域CL領域をコードする遺伝子CK1を有している。これらプラスミドベクターは、図示されるように、2箇所の制限酵素Esp3Iの切断サイトEsp3Iの認識部位は、配列番号17の第619位~第625位のagagacgと第2336位~第2341位のgtctcg、配列番号18の第622位~第627位のgagacgと第2319位~第2324位のgtctcgに認められる。を有しており、当該Esp3Iで処理することにより開裂した部位切断サイトに、目的とするVH領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列以下VHコード遺伝子という。あるいは、VL領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列以下VLコード遺伝子という。を挿入することができる。具体的には、Esp3Iで酵素処理した各プラスミドベクター50ngに対して、いずれかのサンプルNo.のVHコード遺伝子およびVLコード遺伝子をそれぞれ10ng添加し、市販Clontech社製品のInFusionAdvantagePCRCloningKitを製品マニュアルに準じて使用することにより、目的のVHコード遺伝子即ち、配列番号9、11、13、15に示すいずれかのヌクレオチド配列がEsp3I切断サイトに組み込まれた組換えpHIgHzeoを得た。同様に、目的のVLコード遺伝子即ち、配列番号10、12、14、16に示すいずれかのヌクレオチド配列がEsp3I切断サイトに組み込まれた組換えpHIgKneoを得た。次いで、得られた各組換え発現ベクターを一般的なコンピテントセルである大腸菌TOP10コンピテントセルに導入し、50μg/mL濃度となるようにゼオシンZeocin若しくはカナマイシンKanamycinを添加した10シュクロース含有SOB培地プレート上で形質転換体をセレクトした。次いで、目的の遺伝子インサートが正しくインフュージョンされたポジティブクローン、即ちVH組換えpHIgHzeoとVL組換えpHIgKneoとを得るべく、2セットのプライマー、即ちVH側については配列番号19で示すpFUSEseq-fと配列番号20で示すCHseq-rとのセット、VL側については配列番号21で示すIgKss-fと配列番号22で示すCkseq-rとのセットを用いてコロニーPCRを行い、インサートチェックを行った。次いで、正しくインサートがインフュージョンされたポジティブクローン大腸菌TOP10を単離し、10シュクロース含有SOB培地にて増殖させた。こうして得られた組換え発現ベクターのうち、対象とする各サンプルNo.45、38、40、42に正しく対応するVH組換えpHIgHzeoとVL組換えpHIgKneoとを等量混合したものを市販invitrogen社製品のFreeStyle商標CHO-S細胞に導入し、常法に基づいて当該細胞を培養し、二価抗体である完全ヒト型IgGhIgGを製造した。以下、上記4種のscFvサンプルにそれぞれ対応して得られたIgGを、上記サンプル番号を引用してhIgG45、hIgG38、hIgG40、hIgG42とする。<試験例2:エピトープ存在領域の確認>上記得られた4種の人為的に製造された抗EGFR抗体ヒト型IgGのEGFRの結合部分について調べた。即ち、適当なプライマーを用いたPCR技法により、EGFRの細胞外ドメインのうちの上記4つのサブドメインL1、C1、L2、C2の何れかを欠失させたEGFR細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドをコードする遺伝子を計4種類作製した。また、欠失なしのEGFR細胞外ドメインペプチドをコードする遺伝子も作製した。かかる遺伝子を組み込んだ発現ウイルスベクターを構築し、BJ細胞をトランスフェクトすることにより、上記EGFR細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのEGFR細胞外ドメインペプチドを発現するBJ細胞を得た。図2の左側は、各EGFR細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドの欠失部分を示す図である。この図のΔで示す部位数字はN末端から数えたときの欠失アミノ酸残基の位置と範囲を示すが欠失部分である。なお、図示されるように、本試験例で構築したEGFR細胞外ドメインペプチドは何れもN末端側にシグナル配列SSを有し且つC末端側にEGFRの膜貫通ドメインTMを有すると共にさらにそのC末端側にV5-tagが付与されるように構築されている。而して、BJ細胞で発現された上記EGFR細胞外ドメイン欠失変異体ペプチドあるいは欠失なしのEGFR細胞外ドメインペプチドを使用し、試験例1で得られたhIgG45、hIgG38、hIgG40、hIgG42、更に比較対象として市販の抗EGFRモノクローナル抗体であるB4G7及びセツキシマブを用いて一般的なウェスタンブロット解析を行った。本ウェスタンブロットにおける供試抗体の各供試ペプチドに対する結合能の対比解析、即ち細胞外ドメインを構成する4つのサブドメインのうちのどのサブドメインが欠失した場合に結合力を失うかの解析によって、図2の右側に示すように、各供試抗体の結合する部分が明らかとなった。図2の右側における各供試抗体の欄ので示す位置に対応する図2左側の欠失サブドメインが当該抗体の結合部分である。即ち、図2に示す結果から明らかなように、試験例1で得られたhIgG45の結合部分エピトープはC2ドメインにあり、hIgG38の結合部分エピトープはL1ドメインにあり、hIgG40の結合部分エピトープはC1ドメインにあり、そしてhIgG42の結合部分エピトープはC2ドメインにあることが確認された。<試験例3:各抗EGFR抗体の細胞増殖抑制阻害性能の評価1>次に、得られた各抗体を種々の培養細胞に供給し、その細胞増殖抑制阻害性能をインビトロの細胞培養試験において評価した。使用したセルライン細胞株は、いずれも公知のA431、A549、NA、MDA-MB-231の4種である。即ち、A431はヒト扁平上皮がん細胞株、A549はヒト扁平上皮肺がん細胞株、NAはヒト口腔扁平上皮がん細胞株、MDA-MB-231はヒト乳がん細胞株である。具体的には、細胞増殖測定用色素であるAlamarBlue登録商標:invitrogen社製品を使用して、上記細胞株に対して所定濃度の抗体を添加し、所定培養時間24時間、48時間、72時間経過した後の細胞増殖の程度を上記色素のOD値で測定した。即ち、1×104セル/ウェルの細胞濃度となるように10FCSを含有するDMEM培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種し、対数増殖中期になるまで37°C、5CO2条件下で2日間培養した。次いでFCSフリーDMEM培地培地の色による影響をなくすためにフェノールレッドを含まないものに交換し、さらに一晩培養を継続した。次いで、0.1FCSを含むDMEM培地に交換するとともに、所定濃度ここでは0.1μg/mL若しくは10μg/mLで供試抗体のいずれかを添加し、培養を継続した。比較対照として抗体無添加のものと、上記B4G7抗体を同濃度で添加したものを設けた。また、色素AlamarBlue登録商標は、ウェルあたり最終濃度10となるように添加しておいた。抗体添加後、24時間、48時間そして72時間経過後に、それぞれ、一般的な分光光度計を用いて570nmと600nmの吸光度を測定した。結果を、図3A431細胞株、図4A549細胞株、図5NA細胞株、図6MDA-MB-231細胞株に示す。これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、IgG45とIgG38については、EGFRを比較的高率に発現するA431細胞株、A549細胞株、NA細胞株に対して顕著な細胞増殖抑制阻害効果が認められた。特にKRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍細胞由来のA549細胞株に対しても高い細胞増殖抑制阻害効果が認められた。図2に示すように、IgG42とIgG45は、見かけ上では同じ部位即ちC2ドメインに結合するものであるのに、上述のように細胞株に対する反応が異なったのは、IgG42とIgG45それぞれの実際のエピトープがC2ドメインにおける2つの異なるより狭い部位にあることによると解される。このことは、従来の抗EGFR抗体例えば本試験例の比較対照であるB4G7では効果が認められなかったA549のようなKRAS遺伝子変異型の悪性腫瘍に対してIgG45及び/又はIgG38が有効な抗体医薬として作用し得ることを示すものである。<試験例4:各抗EGFR抗体の細胞増殖抑制阻害性能の評価2>次に供試抗体の細胞増殖抑制能に関する濃度用量依存性DoseDependencyを調べるため、上記と同様のAlamarBlue登録商標アッセイを行い、各抗体の添加濃度0.1,1,10,100μg/mLにおける細胞生存率を調べた。使用したセルラインは上述のA549、NAに加えて新たにSK-OV3ヒト卵巣腫瘍細胞株、HCT-116ヒト大腸がん細胞株、Caki-2ヒト腎がん細胞株の各細胞株を使用した。なお、吸光度測定は、上記試験例3で説明した培養条件で所定量の抗体を添加後、72時間経過した時点で行った。細胞生存率は、以下の式:生存率=[抗体無添加処理の標準OD値-IgG添加処理の標準OD値/抗体無添加処理の標準OD値]×100結果を図7A549細胞株、図8NA細胞株、図9SK-OV3細胞株、図10HCT-116細胞株、図11Caki-2細胞株に示す。これらのグラフから明らかなように、供試抗体のうち、IgG45とIgG38については、EGFRを比較的高率に発現し、KRAS遺伝子が変異した悪性腫瘍細胞に対して顕著な細胞増殖抑制阻害効果を低濃度典型的には1μg/mL以上の濃度、特に10μg/mL以上の濃度から安定して発揮させ得ることが認められた。以上の試験例により、本発明によって提供される有用な抗EGFR抗体即ちIgG45ならびにIgG38の好適なものを説明したが、この形態に限られない。例えば、上記完全ヒト型IgG45や完全ヒト型IgG38から一般的な酵素処理で得られるFabフラグメントやFab’2フラグメントもここで開示される本発明の抗体に包含される典型例である。"