"水溶性ポリマーに共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲート。前記水溶性ポリマーに共有結合した前記IL-2部分が、放出可能な連結を介して共有結合している、請求項1に記載のコンジュゲート。前記水溶性ポリマーに共有結合した前記IL-2部分が、安定な連結を介して共有結合している、請求項1に記載のコンジュゲート。前記水溶性ポリマーが分枝鎖状水溶性ポリマーである、請求項1~3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、及びポリアクリロイルモルホリンからなる群から選択されるポリマーである、請求項1~4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。前記水溶性ポリマーがポリアルキレンオキシドである、請求項5に記載のコンジュゲート。前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項6に記載のコンジュゲート。前記ポリエチレングリコールが、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャップ部分で末端がキャップされている、請求項7に記載のコンジュゲート。前記水溶性ポリマーが、約500ダルトン~約100,000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。前記コンジュゲートが、前記IL-2部分の残基のアミン基に共有結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。1個、2個、3個又は4個の水溶性ポリマーが前記IL-2部分の残基に結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。1個、2個又は3個の水溶性ポリマーが前記IL-2部分の残基に結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。1個又は水溶性ポリマーが前記IL-2部分の残基に結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。1個の水溶性ポリマーが前記IL-2部分の残基に結合している、請求項1~10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。水溶性ポリマーに共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートであって、前記水溶性ポリマーが、共有結合する前には、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を有するポリマー試薬である、コンジュゲート。請求項1~15のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。請求項16に記載の医薬組成物を個人に投与するステップを含む方法。コンジュゲート形成条件下で、IL-2部分をポリマー試薬と接触させるステップを含むコンジュゲートの作製方法。IL-2部分をコードする単離核酸分子であって、配列番号5に示される配列と少なくとも95の配列同一性を有する配列を含む核酸分子。DNAである、請求項19に記載の核酸分子。請求項19に記載の核酸分子を含む発現ベクター。プラスミドである、請求項21に記載の発現ベクター。請求項22に記載のベクターを含むインビトロ宿主細胞。タンパク質を、前記タンパク質のサイズより小さい孔径を有する透析バッグ内に入れてタンパク質が入った透析バッグを形成するステップと、前記タンパク質が入った透析バッグをタンパク質変性剤不含溶液に供するステップとを含む方法。IL-2部分と、5~15mM酢酸ナトリウムと、2~7トレハロースとを含む組成物。しかしながら、そうしたアプローチにもかかわらず、依然としてIL-2のコンジュゲートが必要とされている。そのため、特に、本発明の1つ又は複数の実施形態は、本明細書に記載されるとおりのコンジュゲート並びにコンジュゲートを含む組成物及び関連する方法に関し、それらは新規で、且つ当該技術分野において提案されたことが全くないものと思われる。従って、本発明の1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。本発明の1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このIL-2部分の残基は、放出可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合する。本発明の1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このIL-2部分は前駆IL-2部分である。本発明の1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、このIL-2部分は非前駆IL-2部分である。本発明の1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートの送達方法であって、IL-2の残基と水溶性ポリマーとのコンジュゲートを含む組成物を患者に皮下投与するステップを含む方法が提供される。本発明の1つ又は複数の実施形態では、単離核酸分子であって、IL-2部分をコードする単離核酸分子が提供され、前記核酸分子は、配列番号5に示される配列と実質的な例えば少なくとも80の配列同一性sequenceidentifyを有する配列を含む。本発明の1つ又は複数の実施形態では、発現ベクターであって、本明細書に提供される核酸分子を含む発現ベクター例えば、インビトロ発現ベクターが提供される。本発明の1つ又は複数の実施形態では、宿主細胞であって、本明細書に提供されるとおりの発現ベクターを含む宿主細胞例えば、インビトロ宿主細胞が提供される。本発明の1つ又は複数の実施形態を詳細に説明する前に、この発明は、特定のポリマー、合成方法、IL-2部分などに限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形a、an、及びtheが、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことは注記されるべきである。従って、例えば、ポリマーapolymerと言うとき、それは単一のポリマー並びに2つ以上の同じ、又は異なるポリマーを含み、任意選択の賦形剤anoptionalexcipientと言うとき、それは単一の任意選択の賦形剤並びに2つ以上の同じ、又は異なる任意選択の賦形剤を指すなどする。本発明の1つ又は複数の実施形態の説明及び特許請求においては、以下の専門用語を下記の定義に従い用いるものとする。PEG、ポリエチレングリコール、及びポリエチレングリコールは、本明細書で使用されるとき同義であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリエチレンオキシドを包含する。典型的には、本発明に従い使用されるPEGは、以下の構造-OCH2CH2n-式中、nは2~4000であるを含む。本明細書で使用されるとき、PEGはまた、末端酸素が例えば合成変換中に置換されたかどうかに応じて、-CH2CH2-OCH2CH2On-CH2CH2-、及び-OCH2CH2nO-も含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、用語PEGには、様々な末端基又はエンドキャップ基などを有する構造が含まれることに留意しなければならない。用語PEGはまた、過半数の、すなわち50を超える-OCH2CH2-の反復サブユニットを含むポリマーも意味する。具体的な形態に関して、PEGは、様々な分子量、並びに分枝鎖状、直鎖状、フォーク型、多官能性などの構造又は幾何形状のうちのいずれをとってもよく、これについては以下にさらに詳細に記載される。用語エンドキャップされた及び末端がキャップされたは、本明細書では同義的に用いられ、ポリマーの末端又は終点がエンドキャップ部分を有することを指す。典型的には、必須ではないが、エンドキャップ部分はヒドロキシ基又はC1~20アルコキシ基、より好ましくはC1~10アルコキシ基、さらにより好ましくはC1~5アルコキシ基を含む。従って、エンドキャップ部分の例としては、アルコキシ例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ、並びに、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。エンドキャップ部分には、ポリマー中の末端単量体の1個又は複数の原子が含まれ得ることに留意しなければならない[例えば、CH3OCH2CH2On-及びCH3OCH2CH2n-におけるエンドキャップ部分メトキシ]。加えて、前述の各々の飽和型、不飽和型、置換型、及び非置換型が想定される。さらに、エンドキャップ基はシランであってもよい。エンドキャップ基はまた、有利には検出可能標識も含み得る。ポリマーが検出可能標識を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び/又はそのポリマーが結合している部分例えば、活性薬剤の量又は位置を、好適な検出器を用いて決定することができる。かかる標識としては、限定なしに、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識に用いられる部分、比色例えば、色素、金属イオン、放射性部分などが挙げられる。好適な検出器としては、光度計、フィルム、分光計などが挙げられる。エンドキャップ基はまた、有利にはリン脂質も含み得る。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び得られるコンジュゲートに固有の特性が付与される。例示的なリン脂質としては、限定なしに、ホスファチジルコリンと称されるクラスのリン脂質から選択されるものが挙げられる。具体的なリン脂質としては、限定なしに、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンからなる群から選択されるものが挙げられる。エンドキャップ基はまた、ポリマー並びにそれに結合するあらゆるもの、例えばIL-2部分が目的の範囲に選択的に局在することができるように、標的部分も含み得る。本明細書に記載されるとおりのポリマーに関して天然に存在しないとは、そのままの状態としては自然界に見ることのできないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマーは、全体としてのポリマー構造が自然界に見られない限りにおいて、1つ又は複数の天然に存在する単量体又は単量体セグメントを含み得る。水溶性ポリマーにあるような用語水溶性のポリマーは、室温で水に対して可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、ろ過後の同じ溶液により伝達される光の少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約95を伝達する。水溶性ポリマーは、重量基準で、好ましくは水に対して少なくとも約35重量溶解することができ、より好ましくは水に対して少なくとも約50重量溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約70重量溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約85重量溶解することができる。しかしながら、最も好ましくは、水溶性ポリマーは水に対して約95重量溶解することができ、又は水に対して完全に溶解することができる。水溶性ポリマー、例えばPEGに関連した分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書で分子量と言うときは全て、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均のいずれの分子量の測定も、ゲル浸透クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる。また、分子量の値を計測するための他の方法を用いて、例えば、末端基分析を用いるか、若しくは束一的性質例えば、凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧を計測することにより数平均分子量を決定してもよく、又は、光散乱法、超遠心法若しくは粘度測定法を用いることにより重量平均分子量を決定してもよい。本発明のポリマーは、典型的には多分散系でありすなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない、好ましくは約1.2未満、より好ましくは約1.15未満、さらにより好ましくは約1.10未満、なおさらにより好ましくは約1.05未満、及び最も好ましくは約1.03未満の低い多分散性値を有する。用語活性の、反応性の、又は活性化されたは、特定の官能基と併せて使用されるとき、別の分子上の求電子剤又は求核剤と容易に反応する反応性官能基を指す。これは、反応させるために強力な触媒又は極めて非現実的な反応条件が必要な基すなわち、非反応性の、又は不活性の基と対比される。本明細書で使用されるとき、用語官能基又はその任意の同義語は、その保護型並びに無保護型を包含することが意図される。用語スペーサー部分、連結、及びリンカーは、本明細書では、例えばポリマーセグメントの末端とIL-2部分又はIL-2部分の求電子剤若しくは求核剤との相互接続部分を場合により連結するために用いられる結合又は原子若しくは原子集合を指して用いられる。スペーサー部分は、加水分解に対して安定であってもよく、又は生理的に加水分解可能か、若しくは酵素分解可能な連結を含んでもよい。文脈上特に明確に指示されない限り、スペーサー部分は化合物の任意の2つの要素間に場合により存在する例えば、IL-2部分の残基と水溶性ポリマーとを含む提供のコンジュゲートは、直接的にも、又はスペーサー部分を介して間接的にも結合することができる。アルキルは炭化水素鎖を指し、典型的には約1~15個の範囲の原子長さである。かかる炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分枝鎖状であっても、又は直鎖状であってもよく、但し典型的には直鎖状が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、1-メチルブチル、1-エチルプロピル、3-メチルペンチルなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、アルキルには、シクロアルキル並びにシクロアルキレン含有アルキルが含まれる。低級アルキルは、1~6個の炭素原子を含むアルキル基を指し、直鎖状であっても、又は分枝鎖状であってもよく、メチル、エチル、n-ブチル、i-ブチル、及びt-ブチルにより例示されるとおりである。シクロアルキルは、飽和又は不飽和の環状炭化水素鎖を指し、架橋、縮合、又はスピロ環化された化合物を含み、好ましくは3~約12個の炭素原子、より好ましくは3~約8個の炭素原子で構成される。シクロアルキレンは、環式環系における任意の2個の炭素で鎖を結合させることによりアルキル鎖に挿入されたシクロアルキル基を指す。アルコキシは、-OR基であって、式中、Rがアルキルか、又は置換アルキル、好ましくはC1~6アルキル例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシなどである-OR基を指す。例えば置換アルキルにあるような用語置換されたは、限定はされないが、アルキル、C3~8シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど;ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード;シアノ;アルコキシ、低級フェニル;置換フェニル;などの1つ又は複数の干渉しない置換基で置換された部分例えば、アルキル基を指す。置換アリールは、1つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するアリールである。フェニル環に対する置換について、置換基はいかなる配向すなわち、オルト、メタ、又はパラであってもよい。干渉しない置換基は、分子中に存在するとき、典型的にはその分子中に含まれる他の官能基との反応性を有しない基である。アリールとは、1つ又は複数の芳香環であって、各々が5個又は6個の中心炭素原子であるものを意味する。アリールは、ナフチルにおけるように縮合していることも、又はビフェニルにおけるように縮合していないこともある複数のアリール環を含む。アリール環はまた、1つ又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合していても、又は縮合していなくともよい。本明細書で使用されるとき、アリールにはヘテロアリールが含まれる。ヘテロアリールは、1~4個のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、1つ又は複数の環状炭化水素、複素環式環、アリール環、又はヘテロアリール環と縮合していてもよい。複素環又は複素環式とは、5~12個の原子、好ましくは5~7個の原子の1つ又は複数の環であって、不飽和特性又は芳香族特性を伴うことも、又は伴わないこともあり、且つ炭素以外の少なくとも1個の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。置換ヘテロアリールは、1つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するヘテロアリールである。置換複素環は、干渉しない置換基から形成された1つ又は複数の側鎖を有する複素環である。有機ラジカルは、本明細書で使用されるとき、アキルakyl、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含む。求電子剤及び求電子基は、求電子中心、すなわち電子を求引する中心を有し、求核剤と反応することが可能なイオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。求核剤及び求核基は、求核中心、すなわち求電子中心を求引する中心を有するか、又は求電子剤を伴う、イオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。生理学的に切断可能な又は加水分解可能な又は分解可能な結合とは、生理学的条件下で水と反応するすなわち、加水分解される結合である。結合が水中で加水分解し易いかどうかは、2個の中心原子をつなぐ連結の一般的なタイプのみならず、そうした中心原子と結合する置換基にも依存し得る。加水分解に対して不安定な、又は加水分解を受け易い適切な連結としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。酵素分解可能な連結とは、1つ又は複数の酵素により分解を受ける連結を意味する。加水分解に対して安定な連結又は結合とは、水中で実質的に安定な、すなわち生理学的条件下で長期間にわたってもいかなる認め得る程度の加水分解も受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に対して安定な連結の例としては、限定はされないが、以下のもの:炭素-炭素結合例えば、脂肪族鎖中、エーテル、アミド、ウレタンなどが挙げられる。概して、加水分解に対して安定な連結とは、生理学的条件下で1日約1~2未満の加水分解率を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解率については、多くの標準的な化学テキストを参照することができる。薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とは、場合により本発明の組成物中に含めることができ、患者に対して何ら有意な毒性の有害作用を引き起こすことのない賦形剤を指す。薬理学的な有効量、生理学的な有効量、及び治療上の有効量は、本明細書では同義的に用いられ、血流中又は標的組織中に所望のレベルのコンジュゲート又はそれに対応する非コンジュゲート化IL-2部分をもたらすのに必要なポリマー-IL-2部分コンジュゲートの量を意味する。正確な量は、例えば、特定のIL-2部分、治療組成物の成分及び物理的特性、目的とする患者集団、個々の患者の考慮事項など数多くの要因に依存し、当業者は、本明細書に提供される情報に基づきそれを容易に決定することができる。多官能性のとは、3個以上の官能基を中に含むポリマーを意味し、ここで官能基は、同じであっても、又は異なってもよい。本発明の多官能性ポリマー試薬は、典型的にはポリマー骨格内に約3~100個の官能基、若しくは3~50個の官能基、若しくは3~25個の官能基、若しくは3~15個の官能基、若しくは3~10個の官能基を含み、又は3、4、5、6、7、8、9若しくは10個の官能基を含む。用語IL-2部分は、本明細書で使用されるとき、ヒトIL-2活性を有する部分を指す。IL-2部分はまた、ポリマー試薬との反応に好適な少なくとも1つの求電子基又は求核基も有し得る。加えて、用語IL-2部分は、コンジュゲート形成前のIL-2部分並びにコンジュゲート形成後のIL-2部分残基の双方を包含する。以下にさらに詳細に説明するとおり、当業者は、任意の所与の部分がIL-2活性を有するかどうかを決定することができる。配列番号1~4のいずれか1つに対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにそれと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドが、IL-2部分である。本明細書で使用されるとき、用語IL-2部分には、例えば部位特異的突然変異誘発によって意図的に修飾されたか、又は突然変異によって偶発的に修飾されたかかるタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、1~6個のさらなるグリコシル化部位を有する類似体、タンパク質のカルボキシ末端側の終端部に、少なくとも1個のさらなるアミノ酸であって、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む1個又は複数のさらなるアミノ酸を有する類似体、及び少なくとも1つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え産生された部分の双方が含まれる。用語実質的に相同なとは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が、1つ又は複数の置換、欠失、又は付加だけ基準配列と異なるが、その正味の効果としては、基準配列と対象配列との間に機能上の有害な相違は生じないことを意味する。本発明の目的上、80パーセントより高いより好ましくは85パーセントより高く、さらにより好ましくは90パーセントより高く、95パーセントより高いことが最も好ましいの相同性、等価な生物活性必須ではないが等価な生物活性強度、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同であると見なされる。相同性を決定する目的では、成熟配列のトランケーションは無視するものとする。本明細書で用いられる例示的なIL-2部分には、実質的に相同な配列番号2である配列が含まれる。用語断片とは、IL-2部分の一部又は断片のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質又はポリペプチドであって、IL-2の生物活性を有するものを意味する。断片には、IL-2部分のタンパク質分解によって産生されたタンパク質又はポリペプチド、並びに当該技術分野においてルーチンの方法による化学合成によって産生されたタンパク質又はポリペプチドが含まれる。用語患者とは、活性薬剤例えば、コンジュゲートを投与することにより予防又は治療することのできる病態を患っている、又はそうした病態に罹りやすい生物体を指し、ヒト及び動物の双方を含む。任意選択の、又は場合によりとは、続いて記載される状況が起こることも、又は起こらないこともあり、従ってその記載は、その状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。実質的にとは、ほぼ全面的又は完全に、という意味であり、例えば、以下のうちの1つ又は複数を満足する:条件の50超、51以上、75以上、80以上、90以上、及び95以上。本明細書で使用されるとき、配列同一性は、基準DNA配列の配列を、別のDNA配列の当該部分と比較することにより決定され、これらの配列は、配列ギャップを最小限にしながら2つの配列間の重複が最大となるように並べられ、ここで2つの配列間の任意の突出する配列は無視される。本明細書に記載される任意の配列同一性に関して、好ましくは少なくとも80、より好ましくは85、さらにより好ましくは90、なおさらにより好ましくは95の配列同一性であり、96、97、98、及び99の配列同一性が最も好ましい。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のとおり略記される:フェニルアラニンはPhe又はFであり;ロイシンはLeu又はLであり;イソロイシンはIle又はIであり;メチオニンはMet又はMであり;バリンはVal又はVであり;セリンはSer又はSであり;プロリンはPro又はPであり;スレオニンはThr又はTであり;アラニンはAla又はAであり;チロシンはTyr又はYであり;ヒスチジンはHis又はHであり;グルタミンはGln又はQであり;アスパラギンはAsn又はNであり;リジンはLys又はKであり;アスパラギン酸はAsp又はDであり;グルタミン酸はGlu又はEであり;システインはCys又はCであり;トリプトファンはTrp又はWであり;アルギニンはArg又はRであり;及びグリシンはGly又はGである。本発明の1つ又は複数の実施形態について見ると、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと直接、又はスペーサー部分を介して共有結合したIL-2部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。本発明のコンジュゲートは、以下の特徴のうちの1つ又は複数を有する。IL-2部分先述のとおり、一般的にこのコンジュゲートは、水溶性ポリマーと直接、又はスペーサー部分を介して共有結合したIL-2部分の残基を含む。本明細書で使用されるとき、用語IL-2部分は、コンジュゲート形成前のIL-2部分、並びに非ペプチド性水溶性ポリマーと結合した後のIL-2部分を指すものとする。しかしながら、本来のIL-2部分が非ペプチド性水溶性ポリマーと結合すると、ポリマーとの連結に伴い1つ又は複数の共有結合が存在するため、IL-2部分は僅かに変化することが理解されるであろう。多くの場合に、この別の分子と結合して僅かに変化した形態のIL-2部分は、IL-2部分の残基と称される。IL-2部分は、非組換え方法からも、及び組換え方法からも得ることができ、本発明はこの点について限定されない。加えて、IL-2部分は、ヒト供給源にも、動物供給源にも、及び植物供給源にも由来し得る。IL-2部分は、非組換え的に誘導することができる。例えば、生物系からIL-2を単離し、及び他の方法で、培養した培地からIL-2を得ることが可能である。例えば、米国特許第4,401,756号明細書及びPaulyetal.1984J.ImmunolMethods751:73-84に記載される手順を参照のこと。IL-2部分は、組換え方法から誘導することができる。例えば、米国特許第5,614,185号明細書、本明細書に提供される開示及び実施例を参照のこと。非組換え手法及び組換え手法で得られた任意のIL-2部分を、本明細書に記載されるコンジュゲートの調製においてIL-2部分として使用することができる。IL-2部分は、細菌[例えば、大腸菌E.coli、例えば、Fischeretal.1995Biotechnol.Appl.BioIL-2m.213:295-311を参照]、哺乳動物[例えば、Kronmanetal.1992Gene121:295-304を参照]、酵母[例えば、ピキアパストリスPichiapastoris、例えば、Moreletal.1997Biochem.J.3281:121-129を参照]、及び植物[例えば、Moretal.2001Biotechnol.Bioeng.753:259-266を参照]の発現系で発現させることができる。発現は、外因性発現によっても宿主細胞が天然で所望の遺伝コードを含む場合又は内因性発現によっても起こり得る。組換えに基づくタンパク質の調製方法には違いがあり得るが、典型的には、組換え方法には、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸の構築、核酸の発現ベクターへのクローニング、宿主細胞例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物細胞の形質転換、及び核酸の発現による所望のポリペプチド又は断片の産生が関わる。組換えポリペプチドをインビトロで原核生物及び真核生物の宿主細胞において産生し、発現させる方法は、当業者に公知である。組換えポリペプチドの同定及び精製を促進するため、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加し、それにより所望のポリペプチドと、結合に適したポリペプチドとを含む融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質の同定及び精製は、初めに融合タンパク質を含む混合物を、融合タンパク質中のエピトープタグ又は他の結合配列に対する結合部分例えば、抗体を有するアフィニティーカラムに通過させ、それによって融合タンパク質をカラム内に結合させることにより行うことができる。その後、カラムを適切な溶液例えば、酸で洗浄して結合した融合タンパク質を遊離させることにより、融合タンパク質を回収することができる。組換えポリペプチドはまた、宿主細胞の溶解、ポリペプチドの、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離、親和性結合手法、疎水性相互作用手法により精製し、その後、MALDI又はウエスタンブロットにより同定し、及びポリペプチドを回収することもできる。組換えポリペプチドを同定及び精製するためのこれらの及び他の方法は、当業者に公知である。しかしながら、本発明の1つ又は複数の実施形態では、IL-2部分は融合タンパク質の形態ではない。IL-2活性を有するタンパク質の発現に用いられる系に応じて、IL-2部分はグリコシル化されていなくても、又はグリコシル化されていてもよく、いずれも使用することができる。すなわち、IL-2部分はグリコシル化されていなくてもよく、又はIL-2部分はグリコシル化されていてもよい。本発明の1つ又は複数の実施形態では、IL-2部分はグリコシル化されていない。IL-2部分は、有利には、1つ又は複数のアミノ酸残基、例えば、リジン、システイン及び/又はアルギニンを含む及び/又は置換するように修飾することができ、それによりポリマーがそのアミノ酸の側鎖内の原子と結合し易くなる。IL-2部分の置換の例は、米国特許第5,206,344号明細書に記載される。加えて、IL-2部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加する方法は、当業者に公知である。J.March,AdvancedOrganicIL-2mistry:ReactionsMechanismsandStructure,4thEd.NewYork:Wiley-Interscience,1992を参照されたい。加えて、IL-2部分は、有利には、官能基の結合官能基を含むアミノ酸残基の付加によるものは除くを含むように修飾することができる。例えば、IL-2部分は、チオール基を含むように修飾することができる。加えて、IL-2部分は、N末端のα炭素を含むように修飾することができる。加えて、IL-2部分は、1つ又は複数の炭水化物部分を含むように修飾することができる。加えて、IL-2部分は、アルデヒド基を含むように修飾することができる。加えて、IL-2部分は、ケトン基を含むように修飾することができる。本発明の一部の実施形態では、IL-2部分は、チオール基、N末端のα炭素、炭水化物、アルデヒド基adehydegroup及びケトン基のうちの1つ又は複数を含むようには修飾されないことが好ましい。例示的なIL-2部分は、文献中、並びに例えば米国特許第5,116,943号明細書、同第5,153,310号明細書、同第5,635,597号明細書、同第7,101,965号明細書及び同第7,567,215号明細書及び米国特許出願公開第2010/0036097号明細書及び同第2004/0175337号明細書に記載されている。好ましいIL-2部分としては、配列番号1~4からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列を有するもの、及びそれと実質的に相同な配列が挙げられる。好ましいIL-2部分は、配列番号3に対応するアミノ酸配列を有する。ある場合には、IL-2部分は、対応するペプチドの単一の発現が個別の単位として体系付けられる単量体の形態である。別の場合には、IL-2部分は、2つの単量体形態のタンパク質が互いに例えばジスルフィド結合により結合されている二量体の形態例えば、組換えIL-2の二量体である。例えば、組換えヒトIL-2の二量体との関連では、二量体は、各単量体のCys125残基から形成されるジスルフィド結合によって互いに結合した2つの単量体の形態であり得る。加えて、IL-2部分として、前駆体形態のIL-2を用いることができる。例示的な前駆体形態のIL-2は、配列番号1の配列を有する。前述の配列のいずれかのトランケート型、ハイブリッド変異体、及びペプチド模倣物もまた、IL-2部分として機能することができる。少なくともある程度のIL-2活性を維持している前述のいずれかの生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体もまた、IL-2部分として機能することができる。任意の所与のペプチド又はタンパク質部分について、当該の部分がIL-2活性を有するかどうかを決定することが可能である。当該技術分野では、インビトロのIL-2活性の様々な決定方法が記載されている。例示的な手法は、以下の実施例に記載するCTTL-2細胞増殖アッセイである。例示的な手法は、Moreauetal.1995Mol.Immunol.32:1047-1056に記載される。簡潔に言えば、非特異的結合アッセイでは、提案されるIL-2部分が、IL-2の受容体を有する細胞系統の存在下で4°Cで1時間予備インキュベートされる。その後、125I標識IL-2がその系において4°Cで3時間インキュベートされる。データは、野生型IL-2に対する提案されるIL-2部分活性の阻害能として表される。電気測定法、分光測定法、クロマトグラフィー、及び放射測定法を含め、当該技術分野において公知の他の方法論もまた、IL-2機能の評価に用いることができる。水溶性ポリマー先に考察したとおり、各コンジュゲートは水溶性ポリマーと結合したIL-2部分を含む。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは非ペプチド性で、非毒性であり、天然には存在せず、且つ生体適合性である。生体適合性に関して、物質は、生体組織に関連して物質を単独で、又は別の物質例えば、IL-2部分などの活性薬剤と共に使用すること例えば、患者への投与に伴う有益な作用が、臨床医、例えば医師が評価するとき、いかなる有害な作用にも勝る場合に、生体適合性であると見なされる。非免疫原性に関して、物質は、生体内での物質の意図される使用によって望ましくない免疫反応例えば、抗体の形成が生じることがない場合か、又は、免疫反応が生じる場合にも、かかる反応が、臨床医の評価で臨床的に有意、又は重要とは見なされない場合に、非免疫原性であると見なされる。非ペプチド性水溶性ポリマーは、生体適合性且つ非免疫原性であることが特に好ましい。さらに、このポリマーは、典型的には2~約300個の末端を有するものとして特徴付けられる。かかるポリマーの例としては、限定はされないが、ポリエチレングリコールPEG、ポリプロピレングリコールPPG、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などのポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミド、ポリメタクリル酸ヒドロキシアルキル、ポリサッカライド、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリンPOZこれについては、国際公開第2008/106186号パンフレットに記載されている、ポリN-アクリロイルモルホリン、及び前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。水溶性ポリマーは特定の構造に限定されず、直鎖状例えば、エンドキャップされた、例えばアルコキシPEG又は二官能性PEG、分枝鎖状又は多腕状例えば、フォーク型PEG又はポリオール核と結合したPEG、樹木状又は星型の構造であってもよく、各々は、1つ又は複数の分解可能な連結を有することも、又は有しないこともある。さらに、水溶性ポリマーの内部構造は、種々の反復パターンのいずれとして体系付けられてもよく、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリコポリマー、ランダムトリコポリマー、及びブロックトリコポリマーからなる群から選択することができる。典型的には、活性化PEG及び他の活性化水溶性ポリマーすなわち、ポリマー試薬は、IL-2部分上の所望の部位とのカップリングに適した好適な活性化基により活性化される。従って、ポリマー試薬は、IL-2部分と反応するための反応基を有する。代表的なポリマー試薬及びこうしたポリマーを活性部分とコンジュゲート化するための方法は、当該技術分野において公知であり、Zalipsky,S.ら、UseofFunctionalizedPolyEthyleneGlycolsforModificationofPolypeptides、PolyethyleneGlycolChemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications所収、J.M.Harris、PlenusPress、NewYork1992年、及びZalipsky1995年AdvancedDrugReviews16:157-182頁にさらに記載されている。IL-2部分のカップリングに好適な例示的活性化基としては、特に、ヒドロキシル、マレイミド、エステル、アセタール、ケタール、アミン、カルボキシル、アルデヒド、アルデヒド水和物、ケトン、ビニルケトン、チオン、チオール、ビニルスルホン、ヒドラジンが挙げられる。好ましくは、本明細書に記載されるコンジュゲートの調製に使用されるポリマー試薬は、ホスゲンを使用することなく調製される。このような手法は、例えば、米国特許第4,902,502号明細書に記載される開示とは対照的な位置にあり、この開示は、具体的には、クロロホルメートを形成し、続いてそれを使用してPEG活性エステルを形成し、次にそれをIL-2と反応させることを記載している。ホスゲンを使用すると塩化水素が生じ、それによりポリマーの鎖開裂が起こることで不純物が増加する可能性があり、この不純物は、従来技術を用いては除去できないこともある。従って、理論による拘束を望むものではないが、ホスゲンを使用することなく形成されたポリマー試薬から調製されるIL-2部分コンジュゲートは、実質的に高分子鎖分解生成物が存在しない、より高品質の組成物を提供する。また、1つ又は複数の実施形態において、水溶性ポリマーとIL-2部分との間のスペーサー部分は、カルバメートを含むスペーサー部分ではない。典型的には、コンジュゲート中の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約100ダルトン~約150,000ダルトンである。しかしながら、例示的範囲としては、5,000ダルトン超~約100,000ダルトンの範囲、約6,000ダルトン~約90,000ダルトンの範囲、約10,000ダルトン~約85,000ダルトンの範囲、10,000ダルトン超~約85,000ダルトンの範囲、約20,000ダルトン~約85,000ダルトンの範囲、約53,000ダルトン~約85,000ダルトンの範囲、約25,000ダルトン~約120,000ダルトンの範囲、約29,000ダルトン~約120,000ダルトンの範囲、約35,000ダルトン~約120,000ダルトンの範囲、及び約40,000ダルトン~約120,000ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。任意の所与の水溶性ポリマーについて、これらの範囲のうちの1つ又は複数の分子量を有するPEGが好ましい。水溶性ポリマーについての例示的な重量平均分子量としては、約100ダルトン、約200ダルトン、約300ダルトン、約400ダルトン、約500ダルトン、約600ダルトン、約700ダルトン、約750ダルトン、約800ダルトン、約900ダルトン、約1,000ダルトン、約1,500ダルトン、約2,000ダルトン、約2,200ダルトン、約2,500ダルトン、約3,000ダルトン、約4,000ダルトン、約4,400ダルトン、約4,500ダルトン、約5,000ダルトン、約5,500ダルトン、約6,000ダルトン、約7,000ダルトン、約7,500ダルトン、約8,000ダルトン、約9,000ダルトン、約10,000ダルトン、約11,000ダルトン、約12,000ダルトン、約13,000ダルトン、約14,000ダルトン、約15,000ダルトン、約20,000ダルトン、約22,500ダルトン、約25,000ダルトン、約30,000ダルトン、約35,000ダルトン、約40,000ダルトン、約45,000ダルトン、約50,000ダルトン、約55,000ダルトン、約60,000ダルトン、約65,000ダルトン、約70,000ダルトン、及び約75,000ダルトンが挙げられる。前述のいずれかの総分子量を有する分枝鎖型の水溶性ポリマー例えば、2つの20,000ダルトンのポリマーを含む40,000ダルトンの分枝鎖状水溶性ポリマーもまた、使用することができる。1つ又は複数の実施形態において、コンジュゲートは、直接的にも、又は間接的にも、約6,000ダルトン未満の重量平均分子量を有するPEGと結合したPEG部分は有しない。ポリマーとして用いられるとき、PEGは、典型的には複数のOCH2CH2単量体[又はCH2CH2O単量体、PEGがどのように定義されるかによる]を含む。この説明全体を通じた使用について、反復単位の数は、OCH2CH2nの添え字nによって特定される。従って、nの値は、典型的には以下の範囲の1つ又は複数のなかに含まれる:2~約3400、約100~約2300、約100~約2270、約136~約2050、約225~約1930、約450~約1930、約1200~約1930、約568~約2727、約660~約2730、約795~約2730、約795~約2730、約909~約2730、及び約1,200~約1,900。分子量が既知の任意の所与のポリマーについては、ポリマーの総重量平均分子量を反復単量体の分子量で除算することにより、反復単位の数すなわち、nを決定することが可能である。本発明での使用に特に好ましいポリマーの一つは、エンドキャップされたポリマー、すなわち、少なくとも1つの末端が下級C1~6アルコキシ基などの比較的不活性な基で但し、ヒドロキシル基も用いることができるキャッピングされたポリマーである。例えば、ポリマーがPEGであるとき、メトキシPEG一般にmPEGと称されるを使用することが好ましく、このメトキシPEGは、ポリマーの一方の末端がメトキシ-OCH3基で、それに対し他の末端が、場合により化学修飾されていてもよいヒドロキシル又は他の官能基である直鎖型のPEGである。本発明の1つ又は複数の実施形態で有用な一形態において、遊離PEG又は非結合PEGは、各末端がヒドロキシル基で終端している直鎖状ポリマー:HO-CH2CH2O-CH2CH2On-CH2CH2-OHであり、式中、nは典型的には0~約4,000の範囲である。上記のポリマー、α-、ω-ジヒドロキシルポリエチレングリコールは、簡略な形ではHO-PEG-OHと表すことができ、ここでは-PEG-記号が、以下の構造単位を表し得ることが理解される:-CH2CH2O-CH2CH2On-CH2CH2-式中、nは上記に定義されるとおりである。本発明の1つ又は複数の実施形態で有用な別のタイプのPEGは、メトキシPEG-OH、又は簡略にはmPEGであり、これは一方の末端が比較的不活性なメトキシ基で、それに対し他方の末端がヒドロキシル基である。mPEGの構造は、以下に示すとおりである。CH3O-CH2CH2O-CH2CH2On-CH2CH2-OH式中、nは上記のとおりである。米国特許第5,932,462号明細書に記載されるような多腕状又は分枝鎖状PEG分子もまた、PEGポリマーとして使用することができる。例えば、PEGは以下の構造を有し得る:式中:polya及びpolybは、メトキシポリエチレングリコールなどのPEG骨格でありいずれも同じか、又は異なる;Rは、H、メチル又はPEG骨格などの非反応性部分であり;及びP及びQは、非反応性の連結である。好ましい実施形態において、分枝鎖状PEGポリマーはメトキシポリエチレングリコール二置換リジンである。使用される具体的なIL-2部分によっては、二置換リジンの反応性エステル官能基がさらに修飾され、IL-2部分内の標的基との反応に好適な官能基を形成してもよい。加えて、PEGはフォーク型PEGを含むことができる。フォーク型PEGの例は、以下の構造によって表される:式中:Xは、1個又は複数の原子のスペーサー部分であり、各Zは、一定長の原子鎖によってCHと連結された活性化末端基である。国際公開第99/45964号パンフレットは、本発明の1つ又は複数の実施形態に用いることが可能な様々なフォーク型PEG構造を開示している。Z官能基を分枝鎖状炭素原子と連結する原子鎖はテザー基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含み得る。PEGポリマーは、カルボキシルなどの反応基が、PEG鎖の末端ではなく、PEGの長さに沿って共有結合するペンダント型PEG分子を含み得る。ペンダント型の反応基はPEGと直接、又はアルキレン基などのスペーサー部分を介して結合することができる。上述した形態のPEGに加え、ポリマーはまた、上述のポリマーのいずれかを含め、ポリマー中に1つ又は複数の弱い、又は分解可能な連結を含むように調製することもできる。例えば、PEGは、加水分解を受けやすいエステル連結をポリマー中に含むように調製することができる。以下に示されるとおり、この加水分解の結果として、ポリマーがより低い分子量の断片に切断される:-PEG-CO2-PEG-H2O→-PEG-CO2HHO-PEG-ポリマー骨格内の分解可能な連結として、及び/又はIL-2部分との分解可能な連結として有用な、加水分解により分解可能な他の連結としては、カーボネート連結;例えばアミンとアルデヒドとの反応から得られるイミン連結例えば、Ouchiら1997年PolymerPreprints381:582-3頁を参照;例えばアルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル連結;典型的にはヒドラジドとアルデヒドとの反応によって形成されるヒドラゾン連結;典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応によって形成されるアセタール連結;例えばギ酸塩とアルコールとの間の反応によって形成されるオルトエステル連結;例えばPEGなどのポリマーの末端にあるアミン基と別のPEG鎖のカルボキシル基とによって形成されるアミド連結;例えば末端イソシアネート基を有するPEGとPEGアルコールとの反応から形成されるウレタン連結;PEGなどのポリマーの末端にあるアミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド連結;及び、例えば、例えばポリマーの末端にあるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。コンジュゲートのかかる任意選択の特徴、すなわち、1つ又は複数の分解可能な連結を高分子鎖の中に、又はIL-2部分に対して導入することは、コンジュゲートを投与したときの、その最終的な所望の薬理学的特性に対してさらなる制御をもたらし得る。例えば、大型で比較的不活性なコンジュゲートすなわち、1つ又は複数の高分子量のPEG鎖、例えば約10,000より大きい分子量を有する1つ又は複数のPEG鎖がそこに結合しているもの、この場合、コンジュゲートは本質的に生物活性を有しないが投与されてもよく、これは放出されて、元のPEG鎖の一部を有する生物活性コンジュゲートを生じる。このようにして、時間の経過に伴うコンジュゲートの生物活性が平衡するように、コンジュゲートの特性をより効果的に調整することができる。コンジュゲートに関連する水溶性ポリマーはまた、放出可能であってもよい。すなわち、水溶性ポリマーは放出され加水分解、酵素過程、触媒過程又は他の方法のいずれかにより、それによりコンジュゲート化されていないIL-2部分がもたらされる。ある場合には、放出可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーのいかなる断片も残さずIL-2部分から離れる。別の場合には、放出可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーからの比較的小さい断片例えば、コハク酸タグを残してIL-2部分から離れる。例示的な開裂可能ポリマーには、カーボネート連結を介してIL-2部分に結合するものが含まれる。当業者は、前述の非ペプチド性水溶性ポリマーに関する考察が、何ら網羅的なものではなく、単に例示に過ぎず、上記の質を有するあらゆるポリマー材料が企図されることを認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語ポリマー試薬は、概して、水溶性ポリマーセグメントと官能基とを含み得る分子全体を指す。上記のとおり、本発明のコンジュゲートは、IL-2部分と共有結合した水溶性ポリマーを含む。典型的には、任意の所与のコンジュゲートについて、1~3個の水溶性ポリマーが、IL-2活性を有する1つ又は複数の部分と共有結合している。しかしながら、ある場合には、コンジュゲートは、IL-2部分と個々に結合した1、2、3、4、5、6、7、8個又はそれ以上の水溶性ポリマーを有し得る。任意の所与の水溶性ポリマーは、IL-2部分のアミノ酸か、又はIL-2部分が例えば糖タンパク質である場合には、IL-2部分の炭水化物と共有結合し得る。炭水化物との結合は、例えば、シアル酸-アジド化学反応を用いる代謝的官能化metabolicfunctionalization[Luchanskyら2004年Biochemistry4338:12358-12366頁]、又はグリシドールの使用によりアルデヒド基の導入を促進する[Heldtら2007年EuropeanJournalofOrganicChemistry32:5429-5433頁]などの他の好適な手法を利用して行ってもよい。IL-2活性を有する部分とポリマーとの内部の特定の連結は、様々な要因に依存する。かかる要因としては、例えば、用いられる特定の連結の化学的特性、特定のIL-2部分、IL-2部分内の利用可能な官能基ポリマーと結合するためのものか、又は好適な結合部位に変換されるためのもの、IL-2部分内における別の反応性官能基の存在などが挙げられる。本発明のコンジュゲートは、必須ではないが、プロドラッグであってもよく、すなわちこれは、ポリマーとIL-2部分との間の連結が放出可能で、それにより親部分を放出できることを意味する。例示的な放出可能な連結としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかる連結は、IL-2部分例えば、タンパク質のカルボキシル基C末端、又はタンパク質中に含まれるセリン又はスレオニンなどのアミノ酸の側鎖ヒドロキシル基、又は炭水化物中の同様の官能基及び/又はポリマー試薬のいずれかを、当該技術分野で一般的に用いられるカップリング方法を用いて適切に修飾することにより、容易に調製することができる。しかしながら、最も好ましくは、好適に活性化されたポリマーを、IL-2活性を有する部分中に含まれる修飾されていない官能基と反応させることにより容易に形成される放出可能な連結である。或いは、加水分解に対して安定な連結、例えば、アミド、ウレタンカルバメートとしても知られる、アミン、チオエーテルスルフィドとしても知られる、又は尿素カルバミドとしても知られる連結もまた、IL-2部分のカップリング用連結として用いることができる。さらに、加水分解に対して安定な連結としては、アミドが好ましい。一手法では、活性化エステルを有する水溶性ポリマーを、IL-2部分のアミン基と反応させて、それによりアミド連結を生じさせることができる。コンジュゲートはコンジュゲートされていないIL-2部分と対比されるものとして、測定可能な程度のIL-2活性を有することも、又は有しないこともある。すなわち、本発明に係るポリマー-IL-2部分コンジュゲートは、修飾されていない親IL-2部分の約0.1~約100の範囲の生物活性を有し得る。ある場合には、ポリマー-IL-2部分コンジュゲートは、修飾されていない親IL-2部分の100より大きい生物活性を有し得る。好ましくは、IL-2活性をほとんど又は全く有しないコンジュゲートは、ポリマーを部分とつなぐ加水分解可能な連結を含み、そのためコンジュゲート中に活性が欠如している又は比較的欠如していることとは関係なしに、加水分解可能な連結が水により誘発されて切断されると、活性な親分子又はその誘導体が放出される。かかる活性は、用いられるIL-2活性を有する特定の部分についての既知の活性に応じて、好適なインビボ又はインビトロモデルを用いて測定し得る。加水分解に対して安定な連結を有し、それがIL-2活性を有する部分をポリマーとカップリングするコンジュゲートについて、このコンジュゲートは、典型的には測定可能な程度の生物活性を有する。例えば、かかるコンジュゲートは、典型的には、コンジュゲートされないIL-2部分の生物活性と比べた以下の割合のうちの1つ又は複数を満足する生物活性を有するものとして特徴付けられる:少なくとも約2、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約97、少なくとも約100、及び105超当該技術分野において周知のものなど、好適なモデルでの測定時。好ましくは、加水分解に対して安定な連結例えば、アミド連結を有するコンジュゲートは、修飾されていない親のIL-2活性を有する部分の生物活性の少なくともある程度を有する。ここで、本発明に係る例示的なコンジュゲートを説明する。典型的には、かかるIL-2部分は、配列番号1~4の少なくとも1つに提供される配列と同様のアミノ酸配列を少なくとも一部において共有するものと予想される。従って、配列番号1~4内の特定の位置又は原子が参照されるものの、そうした参照は便宜上に過ぎず、当業者は、IL-2活性を有する他の部分における対応する位置又は原子を容易に決定し得る。特に、天然ヒトIL-2に関して本明細書に提供される説明は、多くの場合に、前述のいずれかの断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体に適用することができる。IL-2部分のアミノ基は、IL-2部分と水溶性ポリマーとの間の結合点を提供する。配列番号1~2に提供されるアミノ酸配列を使用すると、コンジュゲートに利用し得るε-アミノ酸を有する数個のリジン残基が各々にあることは明らかである。さらに、いずれのタンパク質のN末端アミンもまた、結合点として機能することができる。IL-2部分の利用可能なアミンとの共有結合性の連結を形成するのに有用な好適なポリマー試薬の例は、数多くある。具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表1に提供する。表中、変数nは反復単量体単位の数を表し、-NH-IL-2は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のIL-2部分の残基を表す。表1に示される各ポリマー部分[例えば、OCH2CH2n又はCH2CH2On]は末端がCH3基であるが、これは他の基H及びベンジルなどに置換されてもよい。IL-2部分のアミノ基とのポリマー試薬のコンジュゲート形成は、様々な方法で達成することができる。一手法では、IL-2部分が、スクシンイミジル誘導体又は他の活性化エステル基、この場合、そうした代替的な活性化エステル基を含有するポリマー試薬について記載されるものと同様の手法を用いることができるにより官能化されたポリマー試薬とコンジュゲート化され得る。この手法では、スクシンイミジル誘導体を有するポリマーは、pH7~9.0の水性媒体中でIL-2部分と結合し得るが、異なる反応条件を用いると例えば、6~7などのより低いpH、又は異なる温度及び/又は15°C未満、結果としてポリマーは、IL-2部分の異なる位置に結合し得る。加えて、アミン末端を有する非ペプチド性水溶性ポリマーを、活性なカルボン酸基を有するIL-2部分と反応させることにより、アミド連結を形成することができる。例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される式中:nは、2~4000の値を有する整数であり;Xは、スペーサー部分であり;R1は、有機ラジカルであり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される:式中、nは2~4000の値を有する整数であり、及びIL-2は、IL-2部分の残基である。IL-2部分のポリマー試薬とのコンジュゲート化に有用な別の手法としては、還元的アミノ化を用いることによるIL-2部分の第一級アミンの、ケトン、アルデヒド又はその水和物形態例えば、ケトン水和物、アルデヒド水和物で官能化されたポリマー試薬とのコンジュゲート化が典型的である。この手法では、IL-2部分の第一級アミンがアルデヒド又はケトンのカルボニル基又はそれに対応する水和アルデヒド又はケトンのヒドロキシル含有基と反応し、それによりシッフ塩基が形成される。ひいては、次にシッフ塩基が、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用することにより安定なコンジュゲートに還元的に変換され得る。特に、ケトン又はα-メチル分枝鎖アルデヒドで官能化されたポリマーを用いると、及び/又は特定の反応条件下例えば、低いpHでは、選択的な反応例えば、N末端におけるが可能である。水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートには、水溶性ポリマーが以下の構造に包含されるものが含まれる:式中、各nは、独立して2~4000の値を有する整数である。本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される:式中:各nは、独立して2~4000の値を有する整数であり;Xはスペーサー部分であり;bは、2~6の値を有する整数であり;cは、2~6の値を有する整数であり;R2は、存在するごとに、独立してH又は低級アルキルであり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される:式中:各nは、独立して2~4000の値を有する整数であり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。本発明の他の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される:式中:各nは、独立して2~4000の値を有する整数であり;aは、0又は1のいずれかであり;Xは、存在するとき、1つ又は複数の原子を含むスペーサー部分であり;b’は、0又は1~10の値を有する整数であり;cは、1~10の値を有する整数であり;R2は、存在するごとに、独立してH又は有機ラジカルであり;R3は、存在するごとに、独立してH又は有機ラジカルであり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。本発明のさらに別の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される:式中:各nは、独立して2~4000の値を有する整数であり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。放出可能な連結を含む例示的コンジュゲートには、IL-2部分が、以下の式に包含されるポリマー試薬とコンジュゲート化されるものが含まれる:式中:POLY1は、第1の水溶性ポリマーであり;POLY2は、第2の水溶性ポリマーであり;X1は、第1のスペーサー部分であり;X2は、第2のスペーサー部分であり;Hαは、イオン化水素原子であり;R1は、H又は有機ラジカルであり;R2は、H又は有機ラジカルであり;aは、0又は1のいずれかであり;bは、0又は1のいずれかであり;Re1は、存在するとき、第1の電子改変基であり;Re2は、存在するとき、第2の電子改変基であり;及びFGは、活性薬剤のアミノ基と反応してカルバメート連結などの放出可能な連結を形成することが可能な官能基である。この式中、さらに確定的な構造を有するポリマー試薬が企図される:式中、POLY1、POLY2、X1、X2、R1、R2、Hα及びFGの各々は、先に定義したとおりであり、及びRe1は第1の電子改変基であり;及びRe2は第2の電子改変基である。さらに別の例示的ポリマー試薬は、以下の式に含まれる:式中、各構造について、かつ各例において、nは、独立して4~1500の整数である。これらの放出可能な連結を提供するポリマー試薬は、米国特許出願公開第2006/0293499号明細書に記載される手順に従い調製することができる。放出可能な連結を提供するポリマー試薬を使用して形成される例示的コンジュゲートには、以下の式のものが含まれる:式中:POLY1は、第1の水溶性ポリマーであり;POLY2は、第2の水溶性ポリマーであり;X1は、第1のスペーサー部分であり;X2は、第2のスペーサー部分であり;Hαは、イオン化水素原子であり;R1は、H又は有機ラジカルであり;R2は、H又は有機ラジカルであり;aは、0又は1のいずれかであり;bは、0又は1のいずれかであり;Re1は、存在するとき、第1の電子改変基であり;Re2は、存在するとき、第2の電子改変基であり;Y1は、O又はSであり;Y2は、O又はSであり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。例示的コンジュゲートは、以下の構造を有する:式中、各構造について、かつ各例において、nは、独立して4~1500の整数であり、及びIL-2は、IL-2部分の残基である。カルボキシル基は、IL-2部分における結合点として機能し得る別の官能基を表す。構造上、コンジュゲートは以下を含み得る:式中、IL-2及び隣接するカルボニル基は、カルボキシル含有IL-2部分に対応し、Xは連結鎖、好ましくはO、NH、及びSから選択されるヘテロ原子であり、POLYは、場合により末端にエンドキャップ部分を有する、PEGなどの水溶性ポリマーである。CO-X連結は、末端官能基を有するポリマー誘導体とカルボキシル含有IL-2部分との間の反応から得られる。上記に考察されるとおり、具体的な連結は、利用される官能基のタイプに依存し得る。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化又は活性化される場合、結果として得られる連結はカルボン酸エステルとなり、XはOとなる。ポリマー骨格がチオール基で官能化される場合、結果として得られる連結はチオエステルとなり、XはSとなる。特定の多腕状、分枝鎖状又はフォーク型ポリマーが用いられると、COX部分、特にX部分は比較的複雑となり得るとともに、より長い連結構造を含み得る。ヒドラジド部分を含む水溶性誘導体もまた、カルボニル及びカルボン酸におけるコンジュゲート形成に有用である。IL-2部分がカルボニル部分又はカルボン酸を含まない限りでは、当業者に公知の手法を用いて付加することができる。例えば、カルボニル部分は、カルボン酸例えば、C末端カルボン酸を還元することにより、及び/又はグリコシル化若しくは糖化されたこの場合、付加される糖がカルボニル部分を有する形のIL-2部分を提供することにより、導入することができる。カルボン酸を含有するIL-2部分に関して、PEG-ヒドラジン試薬は、カップリング剤例えば、DCCの存在下に、IL-2部分と共有結合させることができる[例えば、mPEG-OCH2CONHNH2HOCO-IL-2の結果、mPEG-OCH2CONHNHCO-IL-2が得られる]。ヒドラジド部分を含有する水溶性誘導体の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表2に提供する。加えて、活性化エステルを含有する水溶性ポリマー誘導体をヒドラジンNH2-NH2又はtert-カルバジン酸ブチル[NH2NHCO2CCH33]と反応させることにより、活性化エステル例えば、スクシンイミジル基を含有する任意の水溶性誘導体を、ヒドラジド部分を含むように変換することができる。表中、変数nは反復単量体単位の数を表し、-CO-IL-2は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のIL-2部分の残基を表す。場合により、ヒドラゾン連結は、好適な還元剤を用いて還元してもよい。表2に示される各ポリマー部分[例えば、OCH2CH2n又はCH2CH2On]は末端がCH3基であるが、これは他の基H及びベンジルなどに置換されてもよい。IL-2部分中に含まれるチオール基は、水溶性ポリマーが結合する有効な部位として機能することができる。特に、システイン残基は、IL-2部分がタンパク質であるとき、チオール基を提供する。次に、かかるシステイン残基のチオール基が、チオール基との反応に特異的な活性化PEG、例えば、N-マレイミジルポリマー又は米国特許第5,739,208号明細書及び国際公開第01/62827号パンフレットに記載されるとおりの他の誘導体と反応し得る。加えて、保護基を有するチオールを活性化糖タンパク質のオリゴ糖側鎖に導入し、続いてチオール反応性水溶性ポリマーで脱保護してもよい。試薬の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表3に提供する。表中、変数nは反復単量体単位の数を表し、-S-IL-2は、水溶性ポリマーとのコンジュゲート形成後のIL-2部分残基を表す。表3に示される各ポリマー部分[例えば、OCH2CH2n又はCH2CH2On]は末端がCH3基であるが、これは他の基H及びベンジルなどに置換されてもよい。例示的IL-2部分に対応する配列番号1及び2に関して、125位にシステイン残基があることが分かる。従って、例示的チオール結合部位は、125位に位置するシステインである。所与のIL-2部分に関連するいかなるジスルフィド結合も分断しないことが好ましいが、これらのシステイン残基の1つ又は複数の側鎖中のポリマーを結合して、ある程度の活性を維持することが可能であり得る。加えて、従来の合成技法を用いてシステイン残基をIL-2部分に付加することが可能である。例えば、システイン残基の付加については、国際公開第90/12874号パンフレットに記載される手順を参照されたく、かかる手順をIL-2部分に適合させ得る。加えて、従来の遺伝子工学方法を用いてシステイン残基をIL-2部分に導入することもできる。しかしながら一部の実施形態では、追加のシステイン残基及び/又はチオール基を導入しないことが好ましい。1つ又は複数のマレイミド官能基を有する水溶性ポリマーから形成されたコンジュゲートに関してマレイミドがIL-2部分のアミン基と反応するか、又はチオール基と反応するかにかかわらず、対応する1つ又は複数のマレアミド酸型の水溶性ポリマーもまたIL-2部分と反応することができる。一定の条件下例えば、pH約7~9且つ水の存在下では、マレイミド環が開環することにより対応するマレアミド酸が形成される。ひいては、マレアミド酸が、IL-2部分のアミン基又はチオール基と反応し得る。例示的なマレアミド酸ベースの反応が、以下に概略的に示される。POLYは水溶性ポリマーを表し、IL-2はIL-2部分を表す。本発明に係る代表的なコンジュゲートは、以下の構造を有し得る:POLY-L0,1-COZ-Y-S-S-IL-2式中、POLYは水溶性ポリマーであり、Lは任意選択のリンカーであり、Zは、O、NH、及びSからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Yは、C2~10アルキル、C2~10置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、IL-2はIL-2部分である。IL-2部分と反応することができ、結果としてこのタイプのコンジュゲートをもたらすポリマー試薬は、米国特許出願公開第2005/0014903号明細書に記載されている。先に指摘したとおり、水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造を含む分枝鎖型の水溶性ポリマーを有し得る:式中、各nは、独立して2~4000の値を有する整数である。分枝鎖型の水溶性ポリマーを有する例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて調製することができ:これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される:式中:各構造について各nは、独立して2~4000の値を有する整数であり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。さらなる例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて形成することができ:これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される:式中:各構造についてnは、独立して2~4000の値を有する整数であり;及びIL-2は、IL-2部分の残基である。コンジュゲートは、チオール選択的ポリマー試薬を使用して様々な方法で形成することができ、本発明はこの点について限定されない。例えば、IL-2部分-場合により好適な緩衝液必要であれば、アミンを含有する緩衝液を含む中にあるもの-がpH約7~8の水性媒体に入れられ、チオール選択的ポリマー試薬がモル過剰で添加される。そのまま反応を約0.5~2時間にわたり進め、但し、ペグ化の収率が比較的低いと判断される場合、2時間より長い例えば、5時間、10時間、12時間、及び24時間の反応時間が有用であり得る。この手法で使用することのできる例示的なポリマー試薬は、マレイミド、スルホン例えば、ビニルスルホン、及びチオール例えば、オルトピリジニル又はOPSSなどの官能性チオールからなる群から選択される反応基を有するポリマー試薬である。ポリマー試薬に関して、本明細書及びその他に記載されるものは、商業的な供給業者から購入するか、又は市販の出発物質から調製することができる。加えて、ポリマー試薬の調製方法は、文献中に記載がある。IL-2部分と非ペプチド性水溶性ポリマーとの結合は直接であってもよく、この場合、IL-2部分とポリマーとの間に介在する原子は存在せず、又は結合は間接的であってもよく、この場合、IL-2部分とポリマーとの間に1個又は複数の原子が位置する。間接的な結合に関して、スペーサー部分が、IL-2部分の残基と水溶性ポリマーとの間のリンカーとして機能する。スペーサー部分を構成する1個又は複数の原子としては、炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、及びそれらの組み合わせのうちの1つ又は複数を挙げることができる。スペーサー部分は、アミド、第二級アミン、カルバメート、チオエーテル、及び/又はジスルフィド基を含むことができる。具体的なスペーサー部分の非限定的な例としては、-O-、-S-、-S-S-、-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-NH-、-O-CO-NH-、-CS-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-CO-NH-CH2-、-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CO-NH-、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-、-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-、-CO-O-CH2-、-CH2-CO-O-CH2-、-CH2-CH2-CO-O-CH2-、-CO-O-CH2-CH2-、-NH-CO-CH2-、-CH2-NH-CO-CH2-、-CH2-CH2-NH-CO-CH2-、-NH-CO-CH2-CH2-、-CH2-NH-CO-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-、-CO-NH-CH2-、-CO-NH-CH2-CH2-、-O-CO-NH-CH2-、-O-CO-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-CO-CH2-、-CO-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CH2-CO-CH2-、-CH2-CH2-CO-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CO-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-、-O-CO-NH-[CH2]h-OCH2CH2j-、二価シクロアルキル基、-O-、-S-、アミノ酸、-NR6-、及び前述のいずれかの2つ以上の組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられ、式中、R6は、Hか、又は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される有機ラジカルであり、hは0~6であり、jは0~20である。他の具体的なスペーサー部分は以下の構造を有する:-CO-NH-CH21~6-NH-CO-、-NH-CO-NH-CH21~6-NH-CO-、及び-O-CO-NH-CH21~6-NH-CO-、式中、各メチレンの後ろの添え字の値は構造中に含まれるメチレンの数を示し、例えば、CH21~6は、その構造が、1、2、3、4、5又は6個のメチレンを含み得ることを意味する。加えて、上記のスペーサー部分のいずれも、1~20個のエチレンオキシド単量体単位[すなわち、-CH2CH2O1~20]を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖をさらに含み得る。すなわち、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサー部分の前にも、又は後ろにも、及び場合によっては2個以上の原子を含むスペーサー部分の任意の2個の原子間に、存在することができる。また、オリゴマー鎖は、オリゴマーがポリマーセグメントに隣接し、単にポリマーセグメントの延長部に相当するに過ぎないならば、スペーサー部分の一部とは見なされない。組成物コンジュゲートは、典型的には組成物の一部である。概して、組成物は複数のコンジュゲートを含み、必須ではないが、好ましくは各コンジュゲートは同じIL-2部分を含むすなわち、組成物全体のなかに、ただ1つのタイプのIL-2部分が存在する。加えて、組成物は、任意の所与のコンジュゲートが2つ以上の異なるIL-2部分からなる群から選択されるある部分を含む複数のコンジュゲートを含み得るすなわち、組成物全体のなかに、2つ以上の異なるIL-2部分が存在する。しかしながら、最適には、組成物中の実質的に全てのコンジュゲート例えば、組成物中の複数のコンジュゲートのうちの85以上が、各々、同じIL-2部分を含む。組成物は、単一のコンジュゲート種例えば、単一のポリマーが、組成物中の実質的に全てのコンジュゲートについて同じ位置で結合するモノペグ化コンジュゲートか、又はコンジュゲート種の混合物例えば、ポリマーの結合が異なる部位で起こるモノペグ化コンジュゲートの混合物、及び/又は、モノペグ化、ジペグ化及びトリペグ化コンジュゲートの混合物を含み得る。組成物はまた、4、5、6、7、8個又はそれ以上のポリマーが、IL-2活性を有する任意の所与の部分と結合している他のコンジュゲートも含み得る。加えて、本発明は、組成物が複数のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、1個のIL-2部分と共有結合した1個の水溶性ポリマーを含む場合、並びに1個のIL-2部分と共有結合した2、3、4、5、6、7、8個、又はそれ以上の水溶性ポリマーを含む組成物も含む。組成物中のコンジュゲートに関して、組成物は、以下の特性のうちの1つ又は複数を満足し、すなわち、組成物中のコンジュゲートの少なくとも約85が、IL-2部分と結合した1~4個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約85が、IL-2部分と結合した1~3個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約85が、IL-2部分と結合した1~2個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約85が、IL-2部分と結合した1個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約95が、IL-2部分と結合した1~5個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約95が、IL-2部分と結合した1~4個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約95が、IL-2部分と結合した1~3個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約95が、IL-2部分と結合した1~2個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約95が、IL-2部分と結合した1個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約99が、IL-2部分と結合した1~5個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約99が、IL-2部分と結合した1~4個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約99が、IL-2部分と結合した1~3個のポリマーを有する;組成物中のコンジュゲートの少なくとも約99が、IL-2部分と結合した1~2個のポリマーを有する;及び組成物中のコンジュゲートの少なくとも約99が、IL-2部分と結合した1個のポリマーを有する。例えばx~y個のポリマーとしてポリマーの範囲を参照するときは、ポリマーの数が、端点を含めてx~yであることを意図しているすなわち、例えば1~3個のポリマーは、1個のポリマー、2個のポリマー及び3個のポリマーを意図し、1~2個のポリマーは1個のポリマー及び2個のポリマーを意図する等ことが理解される。1つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートを含む組成物は、アルブミンを含まないか、又は実質的に含まないことが好ましい。また、組成物は、IL-2活性を有しないタンパク質を含まないか、又は実質的に含まないことも好ましい。従って、組成物は、85、より好ましくは95、最も好ましくは99がアルブミンを含まないことが好ましい。加えて、組成物は、85、より好ましくは95、最も好ましくは99が、IL-2活性を有しないいかなるタンパク質も含まないことが好ましい。組成物中にアルブミンが存在する限りにおいて、本発明の例示的組成物は、IL-2部分の残基をアルブミンと連結するポリエチレングリコールポリマーを含むコンジュゲートを実質的に含まない。アルデスロイキンのPROLEUKIN登録商標ブランドPrometheusLaboratoriesInc.,SanDiegoCAから入手可能では、IL-2は、ドデシル硫酸ナトリウムSDSと組み合わせて提供される。対照的に、本発明の組成物は、有利にはSDSが不要であってよく、SDS並びに一般的に界面活性剤例えばTween20及びTween80を含まない又は実質的に含まない。結果的に、本発明の組成物及びコンジュゲートは、SDS、Tween20、及びTween80を添加するステップを実施することなく調製することができる。加えて、本発明の組成物及びコンジュゲートは、界面活性剤又は他の賦形剤を添加するステップを実施することなく調製することができる。さらに、本発明の組成物は、SDS、Tween20、及びTween80などの界面活性剤を含まない又は実質的に含まない例えば、約20未満、より好ましくは約15未満、さらにより好ましくは約10未満、さらになおより好ましくは約9未満、さらになおより好ましくは約8未満、さらになおより好ましくは約7未満、さらになおより好ましくは約6未満、さらになおより好ましくは約5未満、さらになおより好ましくは約4未満、さらになおより好ましくは約3未満、さらになおより好ましくは約2未満、さらになおより好ましくは約1未満、さらになおより好ましくは約0.5未満であり、0.001未満が最も好ましい。加えて、本発明の組成物及びコンジュゲートは、SDS、Tween20、及びTween80などの界面活性剤を例えば限外ろ過により除去するステップを実施することなく調製することができる。さらに、本発明の組成物及びコンジュゲートは、界面活性剤を例えば限外ろ過により除去するステップを実施することなく調製することができる。任意の所与の部分に対するポリマーの所望の数の制御は、適切なポリマー試薬、ポリマー試薬のIL-2部分に対する比、温度、pH条件、及びコンジュゲート形成反応の他の側面を選択することにより実現することができる。加えて、精製手段により、望ましくないコンジュゲート例えば、4個以上のポリマーが結合したコンジュゲートの低減又は除去を実現することができる。例えば、ポリマー-IL-2部分コンジュゲートを精製して、異なるコンジュゲート化種を得る/単離することができる。具体的には、生成混合物を精製して、各IL-2部分につき平均1、2、3、4、5個又はそれ以上の範囲のPEG、典型的には、各IL-2部分につき1、2又は3個のPEGを得ることができる。最終的なコンジュゲート反応混合物の精製方針は、例えば、用いられるポリマー試薬の分子量、特定のIL-2部分、所望の投薬レジメン、1つ又は複数のコンジュゲートの個々の残基活性及びインビボ特性を含め、様々な要因に依存し得る。必要であれば、ゲルろ過クロマトグラフィー及び/又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて分子量が異なるコンジュゲートを単離することができる。すなわち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、その分子量の違いに基づきこの違いは、本質的に水溶性ポリマー分の平均分子量に対応する、ポリマー-対-IL-2部分の比の大きさが異なるもの例えば、1mer、2mer、3merなど、ここで1merは、1ポリマー対IL-2部分を示し、2merは、2ポリマー対IL-2部分を示す等が分画される。例えば、35,000ダルトンのタンパク質が、約20,000ダルトンの分子量のポリマー試薬に対してランダムにコンジュゲート化される例示的反応では、結果として得られる反応混合物は、非修飾タンパク質分子量約35,000ダルトン、モノペグ化タンパク質分子量約55,000ダルトン、ジペグ化タンパク質分子量約75,000ダルトンなどを含み得る。この手法を用いることで、異なる分子量を有するPEGと他のポリマー-IL-2部分コンジュゲートとを分離することはできるが、概してこの手法は、IL-2部分中のポリマー結合部位が異なる位置アイソフォームの分離には役立たない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、PEG1mer、2mer、3merなどの混合物を互いに分離することはできるが、回収したコンジュゲート組成物の各々は、IL-2部分中の異なる反応基例えば、リジン残基に結合した1つ又は複数のPEGを含み得る。このタイプの分離を行うのに好適なゲルろ過カラムとしては、AmershamBiosciencesPiscataway,NJから入手可能なSuperdex商標カラム及びSephadex商標カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、望ましい所望の分画範囲に依存し得る。溶出は、概して、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して行われる。収集された画分は、例えば、iタンパク質含量についての280nmの吸光度、iiウシ血清アルブミンBSAを標準として使用する色素ベースのタンパク質分析、iiiPEG含量についてのヨウ素試験Simsら1980年Anal.BioIL-2m、107:60-63頁、ivドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSPAGEと、続くヨウ化バリウムによる染色、及びv高速液体クロマトグラフィーHPLCなど、様々な異なる方法により分析され得る。位置アイソフォームの分離は、好適なカラム例えば、AmershamBiosciences又はVydacなどの企業から市販されているC18カラム又はC3カラムを使用した逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCを用いる逆相クロマトグラフィーによるか、又はイオン交換カラム、例えば、AmershamBiosciencesから入手可能なSepharose商標イオン交換カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。いずれの手法を用いても、同じ分子量を有するポリマー-活性薬剤の異性体すなわち、位置アイソフォームを分離することができる。組成物は、好ましくはIL-2活性を有しないタンパク質を実質的に含まない。加えて、組成物は、好ましくは他のいかなる非共有結合性の水溶性ポリマーも実質的に含まない。しかしながら、ある状況下では、組成物は、ポリマー-IL-2部分コンジュゲートと非コンジュゲート化IL-2部分との混合物を含み得る。場合により、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。必要であれば、薬学的に許容可能な賦形剤はコンジュゲートに添加され、組成物を形成することができる。例示的な賦形剤としては、限定なしに、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、及び/又は糖ポリマーなどの炭水化物が、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば:フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなどの単糖類;ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類;ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類;及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトールグルシトール、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリンなどのアルジトールが挙げられる。賦形剤としてはまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせなどの無機塩又は緩衝剤も挙げることができる。組成物はまた、微生物の繁殖を防止又は抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明の1つ又は複数の実施形態に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソールthimersol、及びそれらの組み合わせが挙げられる。抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤を使用すると酸化が防止され、それによりコンジュゲート又は調製物の他の構成成分の劣化が防止される。本発明の1つ又は複数の実施形態での使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、Tween20及びTween80などのポリソルベート、並びにF68及びF88双方とも、BASF、MountOlive,NewJerseyから入手可能などのプルロニック;ソルビタンエステル;レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン但し、リポソーム形態ではないことが好ましい、脂肪酸、並びに脂肪酸エステルなどの脂質;コレステロールなどのステロイド;並びにEDTA、亜鉛及び他のかかる好適な陽イオンなどのIL-2レーティングIL-2lating剤が挙げられる。酸又は塩基が組成物中に賦形剤として存在してもよい。使用することのできる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定なしに、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。1つ又は複数のアミノ酸は、本明細書に記載される組成物中に賦形剤として存在することができる。この関連における例示的なアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びグリシンが挙げられる。組成物中のコンジュゲートすなわち、活性薬剤とポリマー試薬との間で形成されるコンジュゲートの量は、様々な要因によって異なり得るが、最適には、組成物が単位用量容器例えば、バイアルに保存されるとき、治療上有効な用量であり得る。加えて、医薬調製物はシリンジに収容されてもよい。治療上有効な用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを生じるかを判断するために、コンジュゲートの量を漸増させながら反復投与することにより実験的に決定することができる。組成物中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性によって異なり得る。典型的には、任意の個別の賦形剤についての最適量の決定は、ルーチンの実験を通じて、すなわち、様々な量の賦形剤低量から高量までの範囲にわたるを含む組成物を調製して安定性及び他のパラメータを調べ、次にどの時点で有意な副作用なしに最適な効果が得られるかを決定することにより行われる。しかしながら、概して賦形剤は組成物中に約1~約99重量、好ましくは約5~約98重量、より好ましくは約15~約95重量の賦形剤の量で存在し、濃度は30重量未満が最も好ましい。これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、Remington:TheSciencePracticeofPharmacy、第19版、WilliamsWilliams、1995年、Physician’sDeskReference、第52版、MedicalEconomics、Montvale,NJ1998年、及びKibbe,A.H.、HandbookofPharmaceuticalExcipients、第3版、AmericanPharmaceuticalAssociation、Washington,D.C.、2000年に記載されている。組成物は、あらゆるタイプの製剤、特に注射に適したもの、例えば、再構成することのできる粉末又は親液体並びに液体を包含する。固形組成物の注射前の再構成に好適な希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中のデキストロース5、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。液状の医薬組成物に関しては、溶液及び懸濁液が想定される。本発明の1つ又は複数の実施形態の組成物は、必須ではないが、典型的には注射により投与され、従って投与直前には概して液状の溶液又は懸濁液である。医薬調製物はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形態をとることもできる。他の投与方法には、肺内、直腸、経皮、経粘膜、経口、髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、皮下、動脈内なども含まれる。本発明はまた、本明細書に提供されるとおりのコンジュゲートを、コンジュゲートによる治療に反応性を有する病態を患う患者に対して投与する方法も提供する。この方法は、患者に対し、概して注射により、治療上有効量のコンジュゲート好ましくは医薬組成物の一部として提供されるものを投与することを含む。先述のとおり、コンジュゲートは、注射例えば、筋肉内、皮下及び非経口することができる。非経口投与に好適な製剤タイプとしては、特に、即時注射用溶液、使用前に溶媒と混和する乾燥粉末、即時注射用懸濁液、使用前に媒剤と混和する不溶性の乾燥組成物、並びに投与前に希釈する乳剤及び液状濃縮物が挙げられる。コンジュゲートを投与する方法は好ましくは医薬組成物の一部として提供する、場合により、コンジュゲートを特定の範囲に局在させるように実施することができる。例えば、コンジュゲートを含む液体、ゲル及び固形製剤を、罹患範囲腫瘍内、腫瘍の近傍、炎症範囲内、及び炎症範囲の近傍などに外科的に植え込んでもよい。好都合には、臓器及び組織はまた、所望の位置がコンジュゲートに対してより良好に曝露されることを確実にするため、画像化され得る。このような投与方法を用いて、コンジュゲートの投与により治癒又は予防することのできる任意の病態が治療され得る。当業者は、具体的なコンジュゲートがどの病態を有効に治療することができるのかを理解する。例えば、コンジュゲートを単独で、又は他の薬物療法との組み合わせで用いて、腎細胞癌、転移性黒色腫、C型肝炎ウイルスHCV、ヒト免疫不全ウイルスHIV、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、若年性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乳癌及び膀胱癌からなる群から選択される疾患に罹患している患者を治療することができる。有利には、コンジュゲートは、別の活性薬剤の投与より前に、その投与と同時に、又はその投与後に患者に投与することができる。実際の投与用量は、被験体の年齢、体重、及び全般的な状態、並びに治療対象となる病態の重症度、医療従事者の判断、及び投与されるコンジュゲートによって異なり得る。治療上の有効量は当業者には公知であり、及び/又は関連する参照テキスト及び文献に記載されている。概して、治療上の有効量は約0.001mg~100mgの範囲、好ましくは0.01mg/日~75mg/日の用量、より好ましくは0.10mg/日~50mg/日の用量であり得る。所与の用量は、例えば、有機リン剤中毒の症状が軽減され、及び/又は完全になくなるまで定期的に投与され得る。単位投薬量の任意の所与のコンジュゲートここでも、好ましくは医薬調製物の一部として提供されるものは、臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュールで投与することができる。具体的な投薬スケジュールは、当業者には周知であるか、又はルーチンの方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投薬スケジュールとしては、限定なしに、1日1回、週3回、週2回、週1回、月2回、月1回、及びそれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。臨床的なエンドポイントが達成されると、組成物の投薬は中止される。本発明は、その好ましい具体的な実施形態に関連して説明されているが、前述の説明並びに以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点及び変更は、本発明の係る当該技術分野の当業者には明らかであろう。本明細書で参照される論文、著作、特許及び他の刊行物は全て、全体として参照により本明細書に援用される。本発明の実施には、特に指示されない限り、有機合成、生化学、タンパク質精製などの従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の範囲内である。かかる方法は文献中に詳しく説明されている。例えば、J.March、AdvancedOrganicChemistry:ReactionsMechanismsandStructure、第4版NewYork:Wiley-Interscience、1992年、上記を参照のこと。以下の実施例では、使用される数例えば、量、温度等に関する正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮しなければならない。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海上気圧又はその近傍におけるものである。以下の例の各々は、当業者が本明細書に記載される実施形態の1つ又は複数を実行するための教示と見なされる。本実施例で使用するため、成熟タンパク質配列である配列番号3のアミノ酸配列に対応する組換えIL-2rIL-2を含む水溶液ストック溶液を、MyodermNorristownPAから入手し、又は実施例1に従い調製した。ストック溶液の濃度は、1~100mg/mLの間で異なった。SDS-PAGE分析試料は、InvitrogenNuPAGEシステム及びNovex4~10ビス-トリスプレキャストゲルInvitrogen,Carlsbad,CAを使用して、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析した。製造者が記載するとおり試料を調製し、ゲルに負荷し、電気泳動法を実施した。陽イオン交換クロマトグラフィーベッドボリュームが約100mlのSP-HPSepharoseGEHealthcare陽イオン交換カラムcanionexchangecolumnを、標準方法を用いて調製した。カラムをGEHealthcareChalfontSt.Giles,UKAKTAExplorer100に接続し、調製したPEG-rIL-2コンジュゲートを精製した。精製過程の詳細は以下に記載する。RP-HPLC分析AgilentSantaClara,CA1100HPLCシステムで逆相クロマトグラフィーRP-HPLC分析を実施した。試料は、Silverton日本IntradaWP-RPカラム3um粒度、2.1×150mmを使用して分析した。カラムの流量は0.5ml/分であった。移動相は水中0.09TFA溶媒A及びアセトニトリル中0.04TFA溶媒Bであった。実施例1IL-2遺伝子のクローニング及びrIL-2の発現ヒトIL-2cDNA配列は、生物ごとにコドン使用頻度が大きく異なるため、大腸菌E.coliなどの原核生物では最適に発現しないこともある。既存のヒト由来cDNA配列に対して点突然変異を多数行って大腸菌E.coliコドン使用頻度を最大化する代わりに、PCR技法を用いて遺伝子を完全に合成した。オーバーラッププライマーから遺伝子を合成する方法は、本質的に2つの方法の組み合わせに少し改良を加えたものであった。各個別の方法の基本的な考察は、Youngetal.2004NucleicAcidsResearch327:e59及びDevlinetal.1988Gene65:13-22に提供される。簡潔に言えば、DNA配列を、いくつかを除いては35bp未満のフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドに分割し、オリゴヌクレオチド間にギャップはなかった。各オリゴヌクレオチドは、隣接する2つが、3’末端で少なくとも10ヌクレオチド及び5’末端で少なくとも15ヌクレオチドだけ、対向するストランドに重なり合った。二重非対称PCRを用いて遺伝子の部分断片を構築し、それらをオーバーラップ伸長PCRを用いて組み合わせ、遺伝子全体を構築した。次に、Youngらによって記載されるとおり、T7エンドヌクレアーゼI選択ステップを用いてミスマッチ二重鎖を取り除いた。Youngetal.2004NucleicAcidsResearch327:e59を参照のこと。遺伝子末端に制限酵素部位を含め、最終的な遺伝子断片を市販の大腸菌E.coli用発現ベクターにクローニングした。DNA配列解析を用いて、図1及び配列番号5に示されるとおり得られた配列を確認した。この手法を用いると、このアミノ酸配列では、天然の成熟ヒト配列と比較したときアミノ酸位置1位アラニンが除外され、及び示されるとおりの配列についてアミノ酸位置125位にC→Sアミノ酸突然変異が含まれる。この配列の1番目のアミノ酸は、直接的な細菌発現のメチオニンであるコードされるシグナルペプチドがない。しかしながら発現時、最初のメチオニンは宿主のメチオニンアミノペプチダーゼによって取り除かれる。遺伝子をpETT7発現ベクターの一つにクローニングした。大腸菌E.coli株BL21DE3でタンパク質を発現させ、株の一つを典型的にはT7発現系に使用した。この発現系は市販されており、発現させる方法は、EMDBiosciences,MerckKGaA,Darmstadt,Germanyから利用可能である。この系の使用は、BrookhavenNationalLaboratoryのリサーチライセンスに基づき行った。ベクターにより、タンパク質が大腸菌E.coliの封入体として発現した。発現に用いられる典型的な配合は、文献中、及びProteinProductionbyAuto-InductioninHigh-DensityShakingCultures,F.WilliamStudier著,BiologyDepartment,BrookhavenNationalLaboratory,Upton,NY119732007年12月20日に見出すことができる。発酵後、遠心することにより細胞を回収した。さらにホモジナイズするため、細胞マスペレットを-80°Cで保存した。凍結した細胞マスペレットを、細胞洗浄緩衝液50mMトリス、5mMEDTA、pH8.0に10W/Vの濃度となるよう再懸濁し、13860×gで30分間遠心した。上清を廃棄した。洗浄したペレットをホモジナイゼーション緩衝液50mMトリス、5mMEDTA、1mMPMSF、pH8.0に再懸濁し、1回のパスについて4~15°CでMicrofluidizerMicrofluidics,Newton,Massachusetts,USAからのM-110Pによりホモジナイズした。ホモジネートを細胞洗浄緩衝液50mMトリス、5mMEDTA、pH8.0で2倍希釈し、13860×gで60分間遠心した。上清を廃棄した。封入体ペレットを、逐次的に、50mMトリス、5mMEDTA、2TritonX-100、pH8.0;50mMトリス、5mMEDTA、1デオキシコール酸ナトリウム、pH8.0;及び50mMトリス、5mMEDTA、1MNaCl、pH8.0の緩衝液を使用して、3段階で洗浄した。洗浄後、粗IL-2封入体が得られた。粗IL-2封入体を、6Mグアニジン、100mMトリス、pH8の緩衝液に溶解した。EDTAを添加して最終濃度を2mMにした。次にジチオスレイトールDTTを添加して最終濃度を50mMにした。混合物を50°Cで30分間インキュベートした。還元後、混合物に水を添加してグアニジン濃度を4.8に低下させた。13860×gで1時間遠心した後、得られたゲル様ペレットを廃棄した。水を添加することにより、上清のグアニジン濃度をさらに3.5Mまで低下させた。100酢酸の滴定でpHを5に調整した。混合物を室温で60分間インキュベートし、13860×gで1時間遠心した。得られたペレットを、3.5Mグアニジン、20mM酢酸塩、5mMDTT、pH5の緩衝液に懸濁し、13860×gで1時間遠心した。この洗浄ステップをもう1回繰り返した。清浄な還元したIL-2封入体を、6Mグアニジン、100mMトリス、pH8の緩衝液に溶解した。100mMCuCl2ストックを添加して最終的なCu2濃度を0.1mMとした。混合物を4°Cで一晩インキュベートした。本発明の別の実施形態は、タンパク質に三次構造をとらせる改良方法に関する。これに関連して、これまでの方法は多くの場合に段階希釈に頼るが、これはタンパク質にとって過酷であることが多い。従って、より穏やかな条件下でタンパク質のフォールディングを可能にする改良手法では、ある方法が提供され、この方法は、発現したタンパク質例えば、本実施例に従い調製されたIL-2などのIL-2部分を、発現したタンパク質のサイズより小さい孔径の透析バッグの中に入れるステップと、タンパク質変性剤不含溶液例えば水を好ましくは数時間かけて、例えば6時間かけて、より好ましくは10時間かけて、及びさらにより好ましくは15時間かけて添加するステップとを含む。例示的なタンパク質変性剤不含溶液を当業者は認識し、例えば、グアニジン、尿素、過塩素酸リチウム、2-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール及び界面活性剤を欠いている又は実質的に欠いている溶液例えば、緩衝液及び水が挙げられる。従って、この方法において、発現したIL-2溶液は透析バッグ分子量孔径が3.5キロダルトンに入れた。透析バッグは、4.8Mグアニジン、0.1Mトリス、pH8の緩衝液が入ったリザーバに入れた。3時間平衡化させた後、リザーバのグアニジン濃度を、15時間の時間をかけて水をリザーバに圧送することにより、2Mまで徐々に低下させた。リフォールディング過程の全体を、4°Cで完了させた。リフォールディングされたIL-2をSEC-HPLCで確認した。リフォールディングされたIL-2を13860×gで60分間遠心し、沈殿物を除去した。上清を、PelliconXLTFF膜システムMilliporeCorporation,USAで濃縮した。リフォールディングして濃縮したIL-2を、SephacrylS-100HR樹脂が詰められたBPGカラムGEHealthcareBio-SciencesAB,UppsalaSwedenに負荷した。流動緩衝液は、2Mグアニジン、20mMトリス、pH8であり、及び流量は25mL/分であった。IL-2単量体ピーク下の画分をプールした。イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーHICクロマトグラフィーなどの、他の好適な精製方法もまた用い得ることに留意しなければならない。PelliconXLTFF膜システムMilliporeCorporation,USAを使用して、4°C及び30~40psiの動作圧でIL-2単量体画分プールを約1~2mg/mLに濃縮した。濃縮したIL-2単量体溶液を最終配合緩衝液10mM酢酸Na、5トレハロース、pH4.5に透析し、配合緩衝液を数回交換することにより通常は4~5回、グアニジン濃度を0.1mM未満に降下させた。配合されたIL-2溶液を0.22umフィルタに通すことにより無菌にし、以降の使用のため-80°Cで保存した。実施例2mPEG2-C2-fmoc-20K-NHSによるrIL-2のペグ化mPEG2-C2-fomc-20K-N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体、20kDamPEG2-C2-fmoc-20K-NHSアルゴン下に-80°Cで保存したmPEG2-C2-fmoc-20K-NHSを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。mPEG2-C2-fmoc-20K-NHSのストック溶液200mG/mLを2mMのHCl中に調製し、mPEG2-C2-fmoc-20K-NHSを、mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS対rIL-2のモル比が100:1に達するのに十分な量でrIL-2に添加した。混合物中のrIL-2の最終濃度は0.5mG/mL0.035mMであった。重炭酸ナトリウム緩衝液1M、pH9.0を混合物に添加して最終濃度を20mMとし、コンジュゲート形成を30分間進行させると、[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートが提供された。30分後、反応混合物に1MグリシンpH6.0を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を100mMとした。次にクエンチした反応混合物を、0.5mS/cm25°C未満の伝導度となるようにH2Oで希釈した。氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図2.1に提供する。[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]及び未反応のPEGが示され、線は、様々な波長例えば、280nm及び225nmにおける吸光度に対応する。逆相HPLC分析による[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]の純度分析から、280nmで100の精製コンジュゲートの純度が検出された。図2.2を参照のこと。純度は、20μgの精製mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]でのクマシーブルー染色を伴う4~12NuPageビス-トリスSDS-PAGEゲルゲルは示さずにより決定するとき、95以上であった。見かけ上大きい、200kDa超の分子量のコンジュゲートは、PEG水和度が高く、その結果水力学的半が比較的大きくなることに起因して、ゲルを通じるコンジュゲートの移動度が低い結果であると考えられた。これらの試験から、3つのコンジュゲートの生成が確認された:4mer、3mer、2mer及び1mer、すなわち、4merについては4つの[mPEG2-C2-fmoc-20K]が単一の[rIL-2]に結合し、3merについては3つの[mPEG2-C2-fmoc-20K]が単一の[rIL-2]に結合し、2merについては2つの[mPEG2-C2-fmoc-20K]が単一の[rIL-2]に結合し、及び1merについては1つの[mPEG2-C2-fmoc-20K]が単一の[rIL-2]に結合する[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]。逆相HPLCによって種の変化を検出することにより、rIL-2を遊離する[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]の放出可能な性質が示された。簡潔に言えば、精製[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]を、100mMのNaHCO3溶液中、pH9.0、37°Cで数時間インキュベートした。一定期間ごとにこの系のアリコートを採取し、[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートの消失及び遊離したrIL-2の存在を検出する試験を行った。rIL-2の出現は、インキュベーションから約10時間後にプラトーに達し、おそらくは沈殿により、徐々に減少した。データを図2.3に提供する。実施例3mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSによるrIL-2のペグ化mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-ヒドロキシスクシンイミド誘導体、20kDamPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSアルゴン下に-80°Cで保存したmPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSのストック溶液200mG/mLを2mMのHCl中に調製し、mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSを、mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS対rIL-2のモル比が100:1に達するのに十分な量でrIL-2に添加した。混合物中のrIL-2の最終濃度は0.5mG/mL0.035mMであった。重炭酸ナトリウム緩衝液1M、pH9.0を混合物に添加して最終濃度を20mMとし、コンジュゲート形成を30分間進行させると、[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートが提供された。30分後、反応混合物に1MグリシンpH6.0を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を100mMとした。次にクエンチした反応混合物を、0.5mS/cm25°C未満の伝導度となるようにH2Oで希釈した。氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図3.1に提供する。[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]が示され、線は、様々な波長における吸光度に対応する。逆相HPLC分析による[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]の純度分析から、280nmで98.5の精製コンジュゲートの純度が検出された。19.6分におけるピークは、未反応のmPEG2-CAC-fmoc-20K-NHSこれが<0.1を構成するに相当する。図3.2を参照のこと。純度は、20μgの精製[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]でのクマシーブルー染色を伴う4~12NuPageビス-トリスSDS-PAGEゲルゲルは示さずにより決定するとき、95以上であった。見かけ上大きい、200kDa超の分子量のコンジュゲートは、PEG水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であると考えられた。精製[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートの分子量もまた、MALDI-TOF分光測定法により決定した。図3.3で分かるとおり、79.6kDaの主ピークは、3mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートの分子量の予測範囲内にある。100.8kDaのピークは、4mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]の分子量の予測範囲内にある。MW40kDa及び58.7kDaのピークは、二価3merIL-2コンジュゲート及び4merIL-2コンジュゲートに相当し得る。実施例4分枝鎖状mPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、20kDaによるrIL-2のペグ化mPEG2-ru-20K-N-ヒドロキシスクシンイミジルHydroxylsuccinimidyl誘導体、20kDamPEG2-ru-20K-NHSアルゴン下に-80°Cで保存したmPEG2-ru-20K-NHSを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。mPEG2-ru-20K-NHSのストック溶液200mG/mLを2mMのHCl中に調製し、mPEG2-ru-20K-NHSを、mPEG2-ru-20K-NHS対rIL-2のモル比が100:1に達するのに十分な量でrIL-2に添加した。混合物中のrIL-2の最終濃度は0.5mG/mL0.035mMであった。重炭酸ナトリウム緩衝液1M、pH9.0を混合物に添加して最終濃度を20mMとし、コンジュゲート形成を30進行させると、[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]コンジュゲートが提供された。30分後、反応混合物に1MグリシンpH6.0を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を100mMとした。次にクエンチした反応混合物を、0.5mS/cm25°C未満の伝導度となるようにH2Oで希釈した。氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図4.1に提供する。[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]及び未反応のmPEG2-ru-20K-NHSが示され、線は、様々な波長例えば、280nm及び225nmにおける吸光度に対応する。逆相HPLC分析による[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]の純度分析から、280nmで100の精製コンジュゲートの純度が検出された。図4.2を参照のこと。純度は、20μgの精製[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]でのクマシーブルー染色を伴う4~12NuPageビス-トリスSDS-PAGEゲルゲルは示さずにより決定するとき、95以上であった。見かけ上大きい、200kDa超の分子量のコンジュゲートは、PEG水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であった。実施例5分枝鎖状mPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、40kDaによるrIL-2のペグ化mPEG2-ru-40K-N-ヒドロキシスクシンイミジルHydroxylsuccinimidyl誘導体、40kDamPEG2-ru-40K-NHSアルゴン下に-80°Cで保存したmPEG2-ru-40K-NHSを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。mPEG2-ru-40K-NHSのストック溶液200mG/mLを2mMのHCl中に調製し、mPEG2-ru-40K-NHSを、mPEG2-ru-40K-NHS対rIL-2のモル比が100:1に達するのに十分な量でrIL-2に添加した。混合物中のrIL-2の最終濃度は0.5mG/mL0.035mMであった。重炭酸ナトリウム緩衝液1M、pH9.0を混合物に添加して最終濃度を20mMとし、コンジュゲート形成を30分間進行させると、[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]コンジュゲートが提供された。30分後、反応混合物に1MグリシンpH4.0を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を100mMとした。次にクエンチした反応混合物を、0.5mS/cm25°C未満の伝導度となるようにH2Oで希釈した。氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図5に提供する。[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]及び未反応のPEGが示され、線は、280nmにおける吸光度に対応する。逆相HPLC分析による[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]の純度分析から、280nmで100の精製コンジュゲートの純度が検出された。純度は、20μgの精製[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]でのクマシーブルー染色を伴う4~12NuPageビス-トリスSDS-PAGEゲルゲルは示さずにより決定するとき、95以上であった。見かけ上大きい、200kDa超の分子量のコンジュゲートおそらく3mer型の[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]は、PEG水和度が高いことに起因してゲルを通じたコンジュゲートの移動度が低い結果であった。カラムを通して最初は未反応のmPEG2-ru-40K-NHSが溶離され、続いて[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]コンジュゲートが溶離された。実施例6分枝鎖状mPEG-N-ヒドロキシスクシンイミジル誘導体、4kDaによるrIL-2のペグ化mPEG2-ru-20K-N-ヒドロキシスクシンイミジルHydroxylsuccinimidyl誘導体、4kDamPEG2-ru-4K-NHSアルゴン下に-80°Cで保存したmPEG2-ru-4K-NHSを、窒素パージ下で周囲温度に加温した。mPEG2-ru-4K-NHSのストック溶液200mG/mLを2mMのHCl中に調製し、mPEG2-ru-4K-NHSを、mPEG2-ru-4K-NHS対rIL-2のモル比が100:1に達するのに十分な量でrIL-2に添加した。混合物中のrIL-2の最終濃度は、0.015SDSにより可溶化されて0.5mG/mL0.035mMであった。重炭酸ナトリウム緩衝液1M、pH9.0を混合物に添加して最終濃度を100mMとし、コンジュゲート形成を30分間進行させると、[mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]コンジュゲートが提供された。30分後、反応混合物に1MグリシンpH4.0を添加することによりクエンチングを達成し、最終濃度を100mMとした。次にクエンチした反応混合物を、0.5mS/cm25°C未満の伝導度となるようにH2Oで希釈した。氷酢酸を使用してpHを4.0に調整した後、カラムクロマトグラフィー精製した。[mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]の典型的な陽イオン交換クロマトグラフィー精製プロファイルを、図6に提供する。溶離された[mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]コンジュゲートは、溶離画分中の3mer、2mer及び1mer[mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]コンジュゲートの混合物を示した。図6に示すとおり、3mer/2mer[mPEG2-ru-4K]-[rIL2]の混合物を含む画分、並びに2mer/1mer[mPEG2-ru-4K]-[rIL2]の混合物を含む画分を、個別にプールした。実施例7直鎖状mPEG-ブチルアルデヒド誘導体、30kDaによるrIL-2のペグ化直鎖状mPEG-ブチルアルデヒド誘導体、30kDamPEG-ButyrALD全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なrIL-2濃度が2.5mg/mlになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に-20°Cで保存したmPEG-ButyrALD、30kDaを、周囲温度に加温する。ペグ化されるrIL-2の10~50mol当量に等しいPEG試薬の分量を秤量し、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5及び1mMEDTAに溶解して、12試薬溶液を形成する。12PEG試薬溶液をストックrIL-2溶液のアリコートに添加し、15~30分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウムNaCNBH3を、PEG試薬に対して10~100モル過剰で添加し、反応液を室温で5~18時間撹拌することによって第二級アミン連結を介したカップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。mPEG-ButyrALDのアルデヒド基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、rIL-2に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。1つ又は複数のアミンがポリマーと結合するようになる選択性は、コンジュゲート形成条件のpHを調整することにより調節できる。比較的低いpH条件例えば、pH約5.5は、N末端に対するコンジュゲート形成を誘導し得る。比較的中性のpH条件例えば、約7.5及びそれを少し上回るでは、共有結合は他の位置においてすなわち、タンパク質中に含まれるリジン残基のアミン側鎖でより頻繁に起こるようになる。コンジュゲート形成条件のpHを調整すると、どの位置でコンジュゲートを生じさせるかに関してある程度制御することが可能となり、従って所望の位置異性体を実現する能力が高まり得る。この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するmPEG-BuryrALDを使用して、他のコンジュゲートが調製される。実施例8分枝鎖状mPEG-ブチルアルデヒド誘導体、40kDaによるrIL-2のペグ化分枝鎖状mPEG-ブチルアルデヒド誘導体、40kDamPEG2-ButyrALD全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なrIL-2濃度が2.5mg/mlになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に-20°Cで保存したmPEG2-ButyrALD、40kDaを、周囲温度に加温する。ペグ化されるrIL-2の10~50mol当量に等しいPEG試薬の分量を秤量し、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5及び1mMEDTAに溶解して、12試薬溶液を形成する。12PEG試薬溶液をストックrIL-2溶液のアリコートに添加し、15~30分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウムNaCNBH3を、PEG試薬に対して10~100モル過剰で添加し、反応液を室温で5~18時間撹拌することによって第二級アミン連結を介したカップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。mPEG2-ButyrALDのアルデヒド基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、rIL-2に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するmPEG2-BuryrALDを使用して、他のコンジュゲートが調製される。実施例9直鎖状mPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノエート誘導体、30kDaによるrIL-2のペグ化直鎖状mPEG-スクシンイミジルα-メチルブタノエート誘導体、30kDamPEG-SMB全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なrIL-2濃度が2.5mg/mlになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に-20°Cで保存したmPEG-SMB、30kDaを、周囲温度に加温する。ペグ化されるrIL-2の10~50mol当量に等しいPEG試薬の分量を秤量し、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5及び1mMEDTAに溶解して、12試薬溶液を形成する。12PEG試薬溶液をストックrIL-2溶液のアリコートに添加し、室温で5~18時間撹拌することによりコンジュゲート溶液を得る。コンジュゲート溶液は、最終的なリジンモル濃度がPEG試薬モル濃度の10~100倍となるように、リジン溶液pH7.5でクエンチされる。mPEG-SMB誘導体は立体障害性の活性NHSエステルを提供することが分かっており、このエステルはリジン及び末端アミンと選択的に反応する。この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するmPEG-SMBを使用して、他のコンジュゲートが調製される。実施例10mPEG-PIP、20kDaによるrIL-2のペグ化ポリマー試薬の基本構造を以下に提供する:全ての反応成分及び緩衝液を添加した後、最終的なrIL-2濃度が2.5mg/mlになるように、ペグ化反応を設計する。アルゴン下に-20°Cで保存したmPEG-PIP、20kDaを、周囲温度に加温する。ペグ化されるrIL-2の10~50mol当量に等しいPEG試薬の分量を秤量し、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5及び1mMEDTAに溶解して、12試薬溶液を形成する。12PEG試薬溶液をストックrIL-2溶液のアリコートに添加し、15~30分間撹拌する。次に、還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウムNaCNBH3を、PEG試薬に対して10~100モル過剰で添加し、反応液を室温で5~18時間撹拌することによって第二級アミン連結を介した第二級炭素とのカップリングを確実にし、それによりコンジュゲート溶液を形成する。コンジュゲート溶液は、最終的なリジンモル濃度がPEG試薬モル濃度の10~100倍となるように、リジン溶液pH7.5でクエンチされる。mPEG-PIPのケトン基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬により還元したとき、rIL-2に関連する第一級アミンと反応し、第二級アミンを介してそれと共有結合することが分かっている。この同じ手法を用いて、他の重量平均分子量を有するmPEG-PIPを使用して、他のコンジュゲートが調製される。実施例11例示的rIL-2-PEGコンジュゲートの活性アルデスロイキン対照、実施例2の[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]、実施例3の[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]、及び実施例4の[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]の活性を、CTLL-2細胞を使用した細胞増殖アッセイで評価した。CTLL-2細胞マウス細胞傷害性Tリンパ球細胞系を、2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、10ウシ胎仔血清、及び10IL-2培養添加物T-STIM商標、ConAコンカナバリンA含有を補足した完全RPMI1640培地に、5CO2雰囲気下37°Cで維持した。細胞を、2~3×105細胞/mLの細胞密度に達するまで懸濁液中で培養した後、分割した。活性アッセイのため、最後の分割から3~4日後、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。次に細胞を、T-STIM商標を含まない補足培地に約2×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁し、壁が白色で底面が透明な96ウェルマイクロプレートに90μl/ウェルで播いた。実験はまた、インキュベートする間のコンジュゲートの放出を最小限に抑えるため、pH6.7~7に調整した補足培地T-STIM商標不含を使用して実施した。次に、T-STIM商標不含の補足培地に希釈した10μlの10倍濃度の試験化合物を添加した。細胞を5CO2雰囲気下37°Cで24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、各ウェルに100μLのPromega製CellTiter-Glo登録商標試薬を添加した。プレートをオービタルシェーカーで2分間混合し、次に室温で10分間インキュベートした。次に、1秒/ウェルの積分時間でPerkinElmer製TopCount登録商標機器を使用して、ルミネセンスを記録した。実施例2の[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]放出可能コンジュゲート及び実施例3の[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]放出可能コンジュゲートについて、放出されたIL-2及び未放出のコンジュゲートの双方の活性を試験した。試験化合物は酸性条件下10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4に保存して、コンジュゲート形成を安定化させた。コンジュゲートの活性を試験するため、アッセイの約1時間前に、貯蔵緩衝液から試料を補足培地に希釈した。放出されたIL-2の活性を試験するため、放出可能コンジュゲート{すなわち、実施例2の[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲート及び実施例3の[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲート}を、100mM最終濃度重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9に10倍希釈し、アッセイ開始前に37°Cで8時間予備インキュベートした。GraphPadのPrism5.01ソフトウェアを使用して、用量反応曲線の非線形回帰分析により細胞増殖のEC50値最大反応の50を示すのに必要な試験化合物の濃度を得た。細胞増殖アッセイを用いてアルデスロイキン及びコンジュゲートの活性を計測した。結果の概要は表4に示す。全ての被験物質が、CTLL-2細胞の成長を用量依存的に誘導した。放出可能コンジュゲートはタンパク質の放出を強いる条件下で予備インキュベートしたため、アルデスロイキンもまた対照として予備インキュベートすることにより、強制的な放出処理条件下におけるタンパク質それ自体の安定性について試験した。表4に示すとおり、アルデスロイキンは、放出条件下37°Cで8時間、pH9で予備インキュベートした後も安定したままであり、推奨条件下で保存されたアルデスロイキンに対する相対的な効力が示された。IL-2の放出を生じさせる条件下で実施例2の[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]及び実施例3の[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]を予備インキュベートした後、図8に示されるとおり、活性は回復した;これらのコンジュゲートから放出されたIL-2が対照アルデスロイキンに対する相対的な効力を示した一方、未放出のコンジュゲートの一部は、アルデスロイキンと比べて効力が低かった。安定な3mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]コンジュゲートが最小の効力を示し図7、アルデスロイキンの0.04であったが、1mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]は、既知のアッセイ標準偏差を考慮すると、アルデスロイキンと同等の効力を示した。実施例12例示的rIL-2-PEGコンジュゲートの薬物動態アルデスロイキン対照、実施例2の[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]、実施例3の[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]、及び実施例4の[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]の薬物動態プロファイルを、マウスにおける単回注射後、ELISAで評価した。アルデスロイキン濃度を、不均一系のサンドイッチELISAにより計測した。簡潔に言えば、96ウェルマイクロタイタープレートをIL-2に対するマウスモノクローナル抗体でコーティングし、ブロックした。試料及び標準を原血漿に調製し、続いてIL-2に対するビオチン化ウサギポリクローナル抗体を含む緩衝液で10血漿に希釈した後、アッセイプレートでインキュベートした。ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ、続いて比色基質の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMBを使用して、IL-2を検出した。停止液を添加し、吸光度を450nmで読み取り、650nmでバックグラウンド減算した。重み付き4パラメータアルゴリズムにより標準曲線を作成し、標準曲線に補間することにより試料濃度を決定した。定量下限は0.05ng/mLであった。プールした1mer/2mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]濃度を、均一系HTRF登録商標アッセイCisbioUS,BedfordMAにより計測した。反応混合物15uL、IL-2に対するユウロピウムクロメートコンジュゲートマウスモノクローナル抗体、ストレプトアビジン-d2、及びPEGに対するビオチン化ウサギモノクローナル抗体を、白色の低容量384ウェルマイクロタイタープレートに添加した。原血漿に希釈した試料及び標準5uLを添加し、プレートをインキュベートした。プレートを蛍光リーダーで615及び665nmで読み取り、及びデルタFを計算した。重み付き5パラメータアルゴリズムにより標準曲線を作成し、標準曲線に補間することにより試料濃度を決定した。定量下限は0.5ng/mLであった。全IL-2アッセイで3mer[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]及び3mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]を計測した。[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]及び[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]コンジュゲートは放出可能コンジュゲートであるため、試料中には異なる分子種が存在し得ることから、個別の定量化は困難である;従って、全IL-2レベルを計測した。試料及び標準ストックを、原血漿中に調製して、放出緩衝液100mMHEPES/100mMトリス-HCL、pH9と1:1希釈し、37°Cで30~36時間インキュベートすることにより、コンジュゲートのポリマー含有成分を強制的にコンジュゲートから放出させた。インキュベーション後、25容量の0.1M酢酸を添加して、高pHを中和した。上記に記載されるELISAにより、放出されたIL-2を計測した。図9は、単回の筋肉内注射1mg/kg後のC57BL/6マウスにおける被験物質の濃度-時間プロットを示す。10分の時点、及び1時間、6時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、168時間及び336時間の時点で、ヘパリンナトリウム添加sodiumheparanized血漿試料を回収した。各時間点につき3匹のマウスから幾何平均濃度を計算した。図9に示されるとおり、アルデスロイキンは半減期が短く、6時間後に検出できなかったが<0.05ng/mL、コンジュゲートは半減期が長く、336時間の時点でもなお検出された。実施例13肺転移性黒色腫有効性試験IL-2活性を有するものと意図される化合物の有効性の評価には、転移性黒色腫肺モデルが広く用いられており、C57BL/6マウスで展開される。このモデルでは、初めにマウスにB16F10メラノーマ細胞が静脈内投与され、それにより種々の数及びサイズの肺小結節を発生させる。肺小結節の数並びにそれらの病変部の全表面積は、移植された細胞濃度に応じて異なる。次にマウスの治療群に目的の試験化合物が投与され、及び別のマウス群が、未治療のままにしておくことで対照として供される。試験化合物の有効性は、治療群と未治療群との間の各肺についての肺小結節の数及びサイズ並びに全病変面積の減少率として決定することができる。この試験では、100,000個のB16F10細胞継代はP8以下を尾静脈注射により移植した。細胞を移植した日から3日目に、IP腹腔内経路又はIV静脈内経路のいずれかによる投与に従い目的の試験化合物又はビヒクルを表5に示すとおり投与した。細胞を移植した日から14日目、マウスを犠牲にし、同時に肺を摘出してホルムアルデヒド含有ボーエンBowen液に1~2日間固定した。肺ボーエンBowen液に固定したものを実体顕微鏡で調べ、各肺についての病変部の数及びサイズを決定した。図10に示されるとおり、細胞を移植した日から14日目、マウスを犠牲にし、その摘出肺をボーエンBowen液に固定した。アルデスロイキンPrometheusLaboratoriesInc.,SanDiegoCA、実施例1のIL-2部分、プールした3mer/4mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]、プールした3mer/4mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]、及びプールした1mer/2mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]の各々について、腫瘍小結節及びそのサイズをカウントした。実施例14皮下B16F10黒色腫有効性試験IL-2活性を有するものと意図される化合物の有効性の評価には、同系マウス、すなわちC57BL/6マウスにおける極めてロバストな皮下黒色腫モデルが用いられている。簡潔に言えば、100万個のB16F10細胞を5~6週齢の各C57BL/6マウスの背中領域に皮下移植した。腫瘍を触知可能なサイズ、すなわち70~120平方mmまで成長させた後、無作為化して、表6に示されるとおりの群に割り当てた。マウスに試験化合物、すなわち、アルデスロイキンPrometheusLaboratoriesInc.,SanDiegoCA、rIL-2-ポリマーコンジュゲート又はビヒクルを、種々の用量濃度及び用量レジームで投与した。1日おきに体重及び腫瘍容積を計測した。この試験のエンドポイントは、所与の群の腫瘍容積中央値が1500平方mmに達した時点又は45日の、いずれか早い方である。アルデスロイキンPrometheusLaboratoriesInc.及びrIL-2-ポリマーコンジュゲートを種々の投与スキームで投与した後の腫瘍成長阻害の用量反応曲線を、図11A及び図11Bに提供する。これらの結果は、試験したrIL-2-ポリマーコンジュゲートの単回用量での有効性が、3mg/kgを1日2回5日間投与されたアルデスロイキンPrometheusLaboratoriesInc.より優れているエビデンスが得られたことを示している。図11Aは、rIL-2-ポリマーコンジュゲートの単回用量投与後、腫瘍容積中央値が1500mm3に達するまでの腫瘍増殖抑制期間を示す。腫瘍進行曲線からの腫瘍増殖遅延TGDは、2mg/kg及び4mg/kg用量濃度のプールした3mer/4mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]について、それぞれ4.6日及び6.2日であることが分かった。プールした3mer/4mer[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]については、2mg/kg及び4mg/kg用量濃度でTGDはそれぞれ6.4日及び7.6日であることが分かった。図11Bは、rIL-2-ポリマーコンジュゲートの単回用量投与後、腫瘍容積中央値が1500mm3に達するまでの腫瘍増殖抑制期間を示す。腫瘍進行曲線からのTGDは、6mg/kg及び8mg/kg用量濃度のプールした1mer/2mer[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]について、それぞれ3.6日及び4.6日であることが分かった。プールした1mer/2mer[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]については、TGDは2mg/kgで3.8であることが分かった一方、4mg/kg用量濃度は本質的に毒性であることが分かった。腫瘍進行曲線からのTGDは、2mg/kg及び4mg/kg用量濃度のプールした1mer/2mer[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]について、それぞれ2.2日及び3.6日であることが分かった。簡潔に言えば、肺病変転移モデル実施例13及び皮下マウス黒色腫モデル実施例14の双方において、rIL-2ポリマーコンジュゲートにより、アルデスロイキンPrometheusLaboratoriesInc.と比較したとき実質的により少ない頻度の投与且つより少ない総タンパク質量で有効性が実現した。"