"以下の工程を含む、標識化プローブ-水溶性担体複合体の作製方法。工程1.チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類を結合させてプローブ結合体とし、工程2.次にチオール基を有する前記プローブ結合体と、マレイミド基を有する高分子の水溶性担体を結合させてプローブ結合体-水溶性担体複合体とし、工程3.さらに前記プローブ結合体-水溶性担体複合体とビオチン化標識物を混合して、プローブ結合体-水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。アビジン類がアビジンまたはストレプトアビジンである請求項1に記載の方法。水溶性担体の分子量が50万以上である請求項1または2に記載の方法。水溶性担体が、デキストラン、アミノデキストラン、デキストリン、クラスターデキストリン、フィコールまたはプルランから選ばれる請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。被験物質に対して結合可能なプローブが抗体または抗体断片である請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。二種類以上の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。抗体または抗体断片がFab’、Fab’2、FabまたはIgGから選ばれる請求項5または6に記載の方法。被験物質に対して結合可能なプローブがプロテインG、プロテインA、プロテインL、レクチンまたは受容体から選ばれる請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。ビオチン化標識物がビオチン化ルシフェラーゼ、ビオチン化アルカリホスフォターゼ、ビオチン化POD、ビオチン化GOD、ビオチン化FITC、ビオチン化アクリジニウム、ビオチン化アクリジニウム誘導体またはビオチン化トリス2,2‘ビピリジルルテニウムIIから選ばれる請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。ビオチン化ルシフェラーゼが遺伝子組換えにより作製されたものである、請求項9に記載の方法。請求項1~10のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体。請求項1~10のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いる測定法。請求項1~7または9~10のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いる免疫測定法。請求項1~10のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いる高感度測定法。被験物質と特異的に結合するプローブと標識物の結合物を用いて、プローブを介した被験物質と標識物の結合量を指標として、高感度に被験物質を検出測定するためには、1分子のプローブと標識物の結合物に多量の標識物が含まれなければならない。そのために、大分子のプローブと標識物の結合物を作製する必要がある。しかしながら、大分子の結合物を形成すべく担体を使用した場合、反応性は増加するものの、ブランク値での反応も増加し、結果として高感度かつ安定な複合体を得ることは困難である。また、担体とプローブまたは標識物の結合を複合体形成の最初の段階として行うと、担体の多官能性に起因して、所望の複合体を再現性良く作製することは困難である。そこで、上記課題を解決する結合物および当該結合物を安定的に作製する方法が期待される。発明者等は、標識化プローブ-担体複合体の作製におけるプローブと標識物の結合において、アビジン類とビオチンとの特異的な結合を利用することに思い至り、また、アビジン類とプローブとの結合を、担体との結合に先立って行うことで、極めて高感度かつ安定な複合体を再現性良く作製し得ることを見出した。加えて、化学結合のためにプローブの化学修飾を行うときに、プローブにチオール基を導入することが、プローブの結合能に影響を与えないことを見出し、さらに、担体として水溶性担体を用いることで、高感度で安定な検出測定に有用な標識化プローブ-水溶性担体複合体を構築した。すなわち、本発明は、以下の工程を含む、標識化プローブ-水溶性担体複合体の作製方法に関するものである。工程1.チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類を結合させてプローブ結合体とし、工程2.次にチオール基を有する前記プローブ結合体と、マレイミド基を有する高分子の水溶性担体を結合させてプローブ結合体-水溶性担体複合体とし、工程3.さらに前記プローブ結合体-水溶性担体複合体とビオチン化標識物を混合して、プローブ結合体-水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。また、本発明は、当該工程により作製する標識化プローブ-水溶性担体複合体に関するものである。さらに、本発明は、上記工程により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いる測定法、免疫測定法または高感度測定法に関するものである。本発明において、プローブとは、被験物質と相互作用する結合パートナーを意味し、非限定的な例として、抗体もしくは抗体断片、プロテインG、プロテインA、プロテインL、レクチンまたは受容体等を挙げることが出来る。また、抗体または抗体断片の非限定な例として、Fab’、Fab’2、FabまたはIgG等を挙げることが出来る。また、当該抗体または抗体断片として、二種類以上の抗体または抗体断片を用いることが出来る。本発明において、アビジン類とは、低分子の塩基性糖タンパク質のアビジン、それに類似するタンパク質またはその断片等、ビオチン化合物と安定した複合体を形成するものを意味し、当該アビジン類の非限定な例として、アビジンまたはストレプトアビジン等を挙げることが出来る。本発明において、水溶性担体は、分子量が50万以上であることが好ましい。本発明の水溶性担体の非限定な例として、デキストラン、アミノデキストラン、デキストリン、クラスターデキストリン、フィコールまたはプルラン等を挙げることが出来る。本発明ではビオチン化標識物を使用する。ここでビオチンは、ビタミンB複合体の一つであり、アビジンと非常に強く結合することが知られているものである。本発明におけるビオチン化標識物の非限定な例として、ビオチン化ルシフェラーゼ、ビオチン化アルカリホスフォターゼ、ビオチン化PODperoxidase、ビオチン化GODglucoseoxidase、ビオチン化FITCfluoresceinisothiocyanate、ビオチン化アクリジニウム、ビオチン化アクリジニウム誘導体またはビオチン化トリス2,2‘ビピリジルルテニウムII等を挙げることが出来る。当該ビオチン化標識物におけるビオチンと標識物の結合には、化学修飾等を含む既知の何れの手段を利用することが出来るが、特に遺伝子組換えを利用することが好ましい。なぜなら、化学結合のための化学修飾をしないことから、その標識物の活性を低下させないからである。本発明に係る工程1においては、まず被験物質に対して結合可能なプローブが十分なチオール基を有していない場合、当該プローブにチオール基を導入する。チオール基の導入には既知の何れの方法を用いることが出来るが、プローブが抗体または抗体断片である場合、2-メルカプトエタノール等の還元剤を使用し、内在するジスルフィド結合を還元することによりチオール基を導入することは、プローブの結合能に対する影響を最小限化出来るので、特に有利である。次に、アビジン類へマレイミド基を導入する。マレイミド基の導入には、既知の何れの方法を用いることが出来、例えば、Sulfo-KMUS同仁化学社製といった既知のマレイミド試薬を使用することが出来る。チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類との結合には、既知の何れの方法を用いることが出来る。例えば、プローブおよびアビジン類をそれぞれ適切な濃度において緩衝液に溶解し、当該溶解液を反応させることで結合反応を行うことが出来る。また、以降の工程における非特異反応を回避すべく、上記結合反応完了後、2-メルカプトエタノール等のチオール試薬を用いて未反応のマレイミド基をブロックすることが出来る。ブロック後のプローブ-アビジン類結合体は、ゲル濾過等既知の方法によって精製することが出来る。本発明に係る工程2においては、まず工程1において作製したプローブ-アビジン類結合体にチオール基を導入する。チオール基の導入には、例えば、2-イミノチオランを使用するといった、既知の何れの方法を用いることが出来る。水溶性担体へのマレイミド基の導入は、既知の何れの方法を用いることが出来る。例えば、水溶性担体を酸と反応させることにより、カルボキシル基を導入し、当該酸を透析等により除去した後、エチレンジアミン等の既知のアミノ基導入試薬を用いて、カルボキシル基をアミノ基に置換する。置換後、透析等により未反応のアミノ基導入試薬を除去し、既知のマレイミド試薬を加え反応させることにより、マレイミド基を有する水溶性担体を得ることが出来る。チオール基を有するプローブ-アビジン類結合体と、マレイミド基を有する水溶性担体との結合には、既知の何れの方法を用いることが出来る。また、以降の工程における非特異反応を回避すべく、結合反応完了後、2-メルカプトエタノール等のチオール試薬を用いて水溶性担体に導入した未反応のマレイミド基をブロックすることが好ましい。ブロック後のプローブ結合体-水溶性担体複合体は、ゲル濾過等既知の方法によって精製することが出来る。本発明に係る工程3においては、上記プローブ結合体-水溶性担体複合体をビオチン化標識物と混合することにより、プローブ結合体-水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。上記の通り、アビジン類とビオチンとの親和性は非常に強いため、例えば、プローブ結合体-水溶性担体複合体およびビオチン化標識物をそれぞれ適切な濃度に調製し、当該調製液を混合することによって、当該アビジン類とビオチンとの結合反応を行うことが出来る。本発明に係る工程により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体は、当該プローブが標的とする被験物質と高感度、かつ安定的に反応するため、既知の何れの測定法において利用することが出来る。また、当該プローブが抗体または抗体断片である場合、本発明に係る標識化プローブ-水溶性担体複合体は、既知の何れの免疫測定法において利用すること出来る。さらに、本発明に係る工程により作製した標識化プローブ-水溶性担体複合体は長期間保存後においても極めて安定である。37°Cで1週間の加速安定性試験下においても、その経時的な安定性を保持していた。本発明を、一例としてビオチン化標識物にビオチン化ルシフェラーゼを、プローブとしてFab’を、アビジン類としてストレプトアビジンを、水溶性担体としてデキストランT2000を各々用いて説明するが、本例に限定されることはない。IgG抗体をペプシン消化して得たFab’2に2-メルカプトエタノールを加えて還元処理した後にゲルろ過により精製し、チオール基を有するFab’を得る。一方、ストレプトアビジンにマレイミド基を導入する試薬を加えて処理した後にゲルろ過により精製し、マレイミド基を導入したストレプトアビジンを得る。上記した方法で得られたチオール基を導入したFab’およびマレイミド基を導入したストレプトアビジンを混合して反応させた後に2-メルカプトエタノールを添加して未反応のマレイミド基をブロックし、ゲルろ過により精製してFab’-ストレプトアビジン結合体を得る。得られたFab’-ストレプトアビジン結合体に2-イミノチオランを加えて反応させた後にゲルろ過により精製し、チオール基を導入したFab’-ストレプトアビジン結合体を得る。デキストランT2000にアミノ基を導入したアミノデキストランを作製し、さらにマレイミド試薬を加えて反応させた後にゲルろ過により精製し、マレイミド基を導入したデキストランT2000を得る。上記した方法で得られたチオール基を導入したFab’-ストレプトアビジン結合体およびマレイミド基を導入したデキストランT2000を混合して反応させた後に2-メルカプトエタノールを添加して未反応のマレイミド基をブロックし、ゲルろ過により精製してFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体を得る。得られたFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体とビオチン化ルシフェラーゼを混合して反応させて、ルシフェラーゼ標識Fab’-デキストランT2000複合体を得る。得られたルシフェラーゼ標識Fab’-デキストランT2000複合体を標識抗体として用い、別に用意した抗体を固定化した固相と組み合わせてサンドイッチイムノアッセイを行うと、高感度の検出測定法が完成する。理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明によって、従来と比較して、極めて高感度かつ安定な標識化プローブ-水溶性担体複合体が再現性良く得られることは、プローブと標識物の結合を、アビジン類とビオチンとの高い親和性を介して行ったこと、かつ、当該プローブとアビジン類との結合を、担体との結合に先立って行ったことに主に起因するものであると考えられる。プローブとアビジン類との結合、およびアビジン類とビオチンとの結合は、その結合に関する分子数比等を制御し易く、従って、同等の構造を有する標識化プローブ-水溶性担体複合体を再現性良く安定的に作製できるのであろう。また、このように安定的に作製された標識化プローブ-水溶性担体複合体は、ノイズを構成する非特異的反応を相対的に抑制しつつ、シグナルを構成する特異的反応のみを増加させるのに極めて適した構造を有するものと考えられる。本発明を実施することにより、被験物質と特異的に結合する高感度かつ安定な標識化プローブ-水溶性担体複合体が再現性良く得られ、この標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いることにより、高感度かつ安定な検出測定が可能となる。被験物質と特異的に結合するプローブを固定化した不溶性担体と検体を反応させた後に検体を除去洗浄し、その後に標識化プローブ-水溶性担体複合体を加えて反応させ、再度除去洗浄した後に不溶性担体上の標識物の活性を測定することにより、検体中の被験物質の検出測定を行う。還元処理によるチオール基を有するIgGの調製抗HCVコア抗原マウスモノクローナルIgG抗体c11-9およびc11-14を0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解して、各々5mg/mLの溶液を調製した。これらのIgG溶液300μLに0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製30μLを添加し、37°Cで1.5時間反応させた。反応後、PD-10GEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、抗体に内在するジスルフィド結合を還元して得られるチオール基を有するIgGを得た。各々のチオール基の数を定量した結果、IgG1分子あたり8.0個のチオール基の存在が確認された。還元処理によるチオール基を有するFab’の調製抗HCVコア抗原マウスモノクローナルIgG抗体c11-9およびc11-14を0.1M酢酸ソーダ緩衝液pH4.5にて10mg/mLとなるように調製した。次に、これらのIgG溶液1mLに対してペプシン0.2mgを添加し、37°Cで6時間攪拌することによりIgGをペプシン消化した。ペプシン消化後、2NNaOHにて中和し、さらにSuperdex200カラムGEヘルスケア社製で精製することによりFab’2を得た。各々3.0mg/mLのFab’21300μLに0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製130μLを添加し、37°Cで1.5時間反応させた。反応後、PD-10GEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、抗体に内在するジスルフィド結合を還元して得られるチオール基を有するFab’を得た。各々のチオール基の数を定量した結果、c11-9ではFab’1分子あたり3.3個、c11-14ではFab’1分子あたり3.4個のチオール基の存在が確認された。ストレプトアビジンへのマレイミド基の導入20mgのストレプトアビジンMPBio社製を0.1Mリン酸緩衝液pH7.22mLに溶解し、ジメチルホルムアミドに6mg/mLとなるように溶解したマレイミド試薬Sulfo-KMUS同仁化学社製133μLを加えた。30°Cで1時間反応させた後、PD-10GEヘルスケア社製にてゲルろ過精製し、マレイミド基を導入したストレプトアビジンを得た。マレイミド基の数を定量した結果、ストレプトアビジン1分子あたり3.7個のマレイミド基の存在が確認された。IgG-ストレプトアビジン結合体の作製実施例1で作製したc11-9およびc11-14のチオール基を導入したIgGを0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解し、各々2.5mg/mLのチオール基を導入したIgG溶液を調製した。一方、実施例3で作製したマレイミド基を導入したストレプトアビジンを0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解し、13.0mg/mLのマレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液を調製した。次に、各々のチオール基を導入したIgG溶液500μLに対して、マレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液38μLを添加し、30°Cで1時間反応させた。反応後、0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製54μLを添加し、4°Cで一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Superdex200カラムGEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、IgG-ストレプトアビジン結合体を得た。ルシフェラーゼ標識IgGの作製実施例4で作製した10μMのc11-9およびc11-14のIgG-ストレプトアビジン結合体50μLに対して、61μMのビオチン化ルシフェラーゼキッコーマン社製8.2μL加えて、25°Cで1時間反応させることによりルシフェラーゼ標識IgGを作製した。Fab’-ストレプトアビジン結合体の作製実施例2で作製したc11-9およびc11-14のチオール基を導入したFab’を0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解し、各々2.6mg/mLのチオール基を導入したFab’溶液を調製した。一方、実施例3で作製したマレイミド基を導入したストレプトアビジンを0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解し、13.0mg/mLのマレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液を調製した。次に、各々のチオール基を導入したFab’溶液1400μLに対して、マレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液365μLを添加し、30°Cで1時間反応させた。反応後、0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製177μLを添加し、4°Cで一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Superdex200カラムGEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、Fab’-ストレプトアビジン結合体を得た。ルシフェラーゼ標識Fab’の作製実施例6で作製した26.4μMのc11-9およびc11-14のFab’-ストレプトアビジン結合体10μLに対して、61μMのビオチン化ルシフェラーゼキッコーマン社製4.3μL加えて、25°Cで1時間反応させることにより、ルシフェラーゼ標識Fab’を作製した。アミノ基を導入したデキストランへのマレイミド基の導入デキストランT2000およびデキストランT500各々2gとモノクロロ酢酸4.7gを50mLの3NNaOH溶液に溶解し、室温で70分間攪拌することによってデキストランT2000およびデキストランT500にカルボキシル基を導入した。次に、リン酸2水素ナトリウム0.2gを添加し、6NHClで混合液を中和することにより反応を停止させ、透析により未反応のモノクロロ酢酸を除去した。透析後、16.4gのエチレンジアミンと1.2gの1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドを添加し、室温で4時間攪拌することによりデキストランT2000およびデキストランT500に導入したカルボキシル基をアミノ基に変換した。次に、透析により未反応のエチレンジアミンとカルボジイミドを除去し、凍結乾燥することによってアミノデキストランT2000およびアミノデキストランT500を回収した。アミノデキストランT2000およびアミノデキストランT500各々1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液pH7.23mLに溶解し、ジメチルホルムアミド中に12mg/mLに溶解したマレイミド試薬Sulfo-KMUS同仁化学社製を30μL加え、37°Cで30分間反応させた。反応後、PD-10GEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、マレイミド基を導入したアミノデキストランT2000およびアミノデキストランT500を得た。マレイミド基の数を定量した結果、デキストランT20001分子あたり294個、デキストランT5001分子あたり65個のマレイミド基の存在が確認された。IgG-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体の作製実施例4で作製したc11-9およびc11-14のIgG-ストレプトアビジン結合体の各々を0.1Mリン酸緩衝液pH7.2で溶解して2.5mg/mLの溶液とし、等量混合してIgG-ストレプトアビジン結合体溶液を調製した。このIgG-ストレプトアビジン結合体溶液264μLに対して、ジメチルホルムアミドに1mg/mLとなるように溶解した2-イミノチオランPIERCE社製を2μL添加し、30°Cで30分間反応させた。反応後、PD-10GEヘルスケア社製にてゲルろ過精製し、チオール基を導入したIgG-ストレプトアビジン結合体を得た。チオール基の数を定量した結果、IgG-ストレプトアビジン結合体1分子あたり4.8個のチオール基の存在が確認された。次に、実施例8で作製した0.625μMのマレイミド基を導入したアミノデキストランT2000溶液40μLに8.6μMのチオール基を導入したIgG-ストレプトアビジン結合体290μLを混合し、30°Cで1時間静置した。その後、0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製33μLを添加し、4°Cで一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Superdex200カラムGEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、図1に示すボイドピーク画分よりIgG-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体を得た。IgG-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体へのビオチン化ルシフェラーゼの導入実施例9で作製したIgG-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体を、IgG-ストレプトアビジン結合体濃度として570nMになるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2を用いて調製した。このIgG-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体溶液300μLに対して、61μMのビオチン化ルシフェラーゼキッコーマン社製溶液3.0μLを加え、25°Cで1時間反応させることにより、ルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体を得た。Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体の作製実施例6で作製した4.0mg/mLのc11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体420μLおよび2.6mg/mLのc11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体646μLに対して、ジメチルホルムアミドに1mg/mLになるように溶解した2-イミノチオランPIERCE社製を2μL添加し、30°Cで30分間反応させた。反応後、PD-10GEヘルスケア社製にてゲルろ過精製し、チオール基を導入した各々のFab’-ストレプトアビジン結合体を得た。チオール基の数を定量した結果、c11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体1分子あたり4.6個、c11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体1分子あたり3.0個のチオール基の存在が確認された。次に、実施例8で作製したマレイミド基を導入したアミノデキストランT2000およびT500とチオール基を導入したFab’-ストレプトアビジン結合体を混合し、30°Cで1時間静置した。なお、マレイミド基を導入した各々のアミノデキストランとチオール基を導入した各々のFab’-ストレプトアビジン結合体は以下に示すとおりの濃度、液量で組み合わせ、合計4種類の重合体を作製した。1c11-9およびc11-14を混合したFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体21μMのチオール基を導入したc11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体200μL、18μMのチオール基を導入したc11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体240μL、および0.625μMのマレイミド基を導入したアミノデキストランT2000142μLを混合した。2c11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体21μMのチオール基を導入したc11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体200μLおよび0.625μMのマレイミド基を導入したアミノデキストランT200071μLを混合した。3c11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体18μMのチオール基を導入したc11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体240μLおよび0.625μMのマレイミド基を導入したアミノデキストランT200071μLを混合した。4c11-9およびc11-14を混合したFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT500複合体21μMのチオール基を導入したc11-9Fab’-ストレプトアビジン結合体200μL、18μMのチオール基を導入したc11-14Fab’-ストレプトアビジン結合体240μL、および2.5μMのマレイミド基を導入したアミノデキストランT500116μLを混合した。反応後、0.2Mの2-メルカプトエタノール和光純薬社製を各々の複合体溶液の1/10量添加し、4°Cで一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。翌日、Superdex200カラムGEヘルスケア社製でゲル濾過精製し、図2~5に示す各サンプルのボイドピーク画分よりFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体を得た。Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体へのビオチン化ルシフェラーゼの導入実施例11で作製した4種類のFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体を、Fab’-ストレプトアビジン結合体濃度として1.8μMになるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2にて調製した。これらのFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストラン複合体溶液100μLに対して、61μMのビオチン化ルシフェラーゼキッコーマン社製3.0μLを加え、25°Cで1時間反応させることにより、以下に示す4種類のルシフェラーゼ標識Fab’-デキストラン複合体を作製した。1ルシフェラーゼ標識c11-9c11-14Fab’-デキストランT2000複合体2ルシフェラーゼ標識c11-9Fab’-デキストランT2000複合体3ルシフェラーゼ標識c11-14Fab’-デキストランT2000複合体4ルシフェラーゼ標識c11-9c11-14Fab’-デキストランT500複合体ルシフェラーゼ標識抗体を用いた酵素免疫測定WSCを用いたカルボジイミド法により、抗HCVコア抗原マウスモノクローナル抗体c11-3、c11-7、およびAOT3を磁性粒子に固定化し、0.2抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、正常ヒト血清およびPCRで確認された2種類のHCV陽性血清100μLと検体処理液6M塩酸グアニジン、0.5NHCl、12.5TritonX100、0.75Tween20100μLを混合し、37°Cで15分間置くことによって検体の前処理を行った後、反応液0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MNaCl、1BSA、0.5カゼイン、0.05Tween20、pH7.3140μLと1Mトリス緩衝液20μLを混合し、この混合液160μLに前処理検体80μLを加えることにより、前処理検体を中和した。次に、中和した前処理検体240μLに0.2抗体固相化磁性粒子を20μL加え、37°Cで15分間置くことによって1次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、実施例5で作製したルシフェラーゼ標識IgGおよび実施例10で作製したルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体を添加した。標識抗体の量は、ルシフェラーゼ濃度として18nMに希釈したものを120μL加え、攪拌後さらに37°Cで15分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、50mMトリス緩衝液pH8.5100μLに再懸濁させた。磁性粒子を再懸濁したチューブに基質溶液ルシフェリン100μLを加え、ルーマットLB9507ベルトールド社製を使ってルシフェラーゼの発光を測定した。発光測定は、ルシフェリン添加0.5秒後から5秒間の発光を積算した。その結果、表1に示すとおり、ルシフェラーゼ標識IgGよりもルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体のほうが高い発光値を示した。パネル検体MのS/N比から見積もると、およそ50~100倍程度、反応性が向上していると推察された。ルシフェラーゼ標識抗体断片を用いた酵素免疫測定標識抗体として実施例7および実施例12で作製したものを使用した以外は、実施例13と同じ方法で実施した。その結果、表2に示すとおり、ルシフェラーゼFab’標識よりも、ルシフェラーゼ標識Fab’-デキストランT2000複合体またはルシフェラーゼ標識Fab’-デキストランT500複合体のほうが高い発光値を示し、IgGの場合と同様に重合化することにより50~100倍程度反応性が向上していることが確認された。また、c11-9またはc11-14抗体断片を個別に重合化した場合も反応性の向上は見られるが、両者を組み合わせることによりさらに反応性が向上することが確認された。既存のプローブ複合体作製方法を応用して作製した重合化標識抗体との性能比較既存のプローブ複合体作製方法を応用した重合化標識抗体の作製国際公開2006/011543に記載の方法を応用してプローブ複合体を作製した。まず、デキストランT200044mgを秤量し、0.1Mリン酸緩衝液pH7.00.8mLに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を0.4mL添加混合した。室温で2時間反応させた後、ゲルろ過PD-10;GEヘルスケア社製により余剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ストレプトアビジンSA溶液とCAPS溶液10を添加して室温で5時間反応させることにより、デキストランにストレプトアビジンを導入した。さらに、反応産物の安定化のため、DimethylamineBorateDMBA;生化学工業社製1mgと1Mトリス溶液0.4mLを添加混合して室温で一晩反応させた。その後、ゲルろ過SephacrylS-300HR1.6x30;GEヘルスケア社製により反応産物を精製し、デキストラン-SA結合物を得た。次に、0.1Mリン酸緩衝液pH7.0を用いてデキストラン-SA結合物を2mg/mLになるように調製し、このデキストラン-SA結合物溶液0.5mLに対して、ジメチルホルムアミドにて10mg/mLになるように溶解したマレイミド試薬EMCS同仁化学社製5μLを加え、室温で1.5時間反応させた。この反応産物をPD-10GEヘルスケア社製にてゲルろ過精製し、未反応のEMCSを除去することによりマレイミド基を導入したデキストラン-SA結合物を得た。一方、実施例2に記載した方法によりc11-9とc11-14のFab’を作製し、各Fab’を等量混合することにより0.5mg/mLのFab’溶液を調製した。次に、2mg/mLのマレイミド基を導入したデキストラン-SA結合物0.5mLに対して、0.5mg/mLFab’溶液を1mL添加して4°Cで一晩反応させた。その後、終濃度が15mMになるように2-メルカプトエチルアミンを添加し、室温で1時間反応させることにより未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、SephacrylS-300HRカラムGEヘルスケア社製にてゲルろ過精製し、デキストラン-SA-Fab’複合体を得た。精製したデキストラン-SA-Fab’複合体に含まれるSAは、濃度既知のSA溶液を標準として、HABA試薬による発色を指標として定量した。作製したデキストランT2000-SA-Fab’重合体を、SA濃度として570nMになるように0.1Mリン酸緩衝液にて調製した。このデキストランT2000-SA-Fab’重合体溶液300μLに対して、ビオチン化ルシフェラーゼキッコーマン社製61μMを3.0μL添加し、25°Cで1時間反応させることにより、既存の方法を応用した重合化標識抗体を作製した。ルシフェラーゼ標識抗体を用いた酵素免疫測定WSCを用いたカルボジイミド法により、抗HCVコア抗原マウスモノクローナル抗体c11-3、c11-7、およびAOT3を磁性粒子に固定化し、0.2抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、正常ヒト血清および2種類のHCVコア抗原陽性血清100μLと検体処理液6M塩酸グアニジン、0.5NHCl、12.5TritonX100、0.75Tween20100μLを混合し、37°Cで15分間置くことによって検体の前処理を行った後、反応液0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MNaCl、1BSA、0.5カゼイン、0.05Tween20、pH7.3140μLと1Mトリス緩衝液20μLを混合し、この混合液160μLに前処理検体80μLを加えることにより、前処理検体を中和した。次に、中和した前処理検体240μLに0.2抗体固相化磁性粒子を20μL加え、37°Cで15分間置くことによって1次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、実施例5で作製したルシフェラーゼ標識IgG、実施例10で作製したルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体を添加した。標識抗体の量は、ルシフェラーゼ濃度として18nMに希釈したものを120μL加え、攪拌後さらに37°Cで15分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、50mMトリス緩衝液pH8.5100μLに再懸濁させた。磁性粒子を再懸濁したチューブに基質溶液ルシフェリン100μLを加え、ルーマットLB9507ベルトールド社製を使ってルシフェラーゼの発光を測定した。発光測定は、ルシフェリン添加0.5秒後から5秒間の発光を積算した。その結果、表3に示すとおりルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体は既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体よりも高い反応性を示した。パネル検体LおよびMのS/N比から見積もると、ルシフェラーゼ標識IgG-デキストランT2000複合体は、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体よりも、およそ3~5倍程度、反応性が向上していた。なお、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体の場合、使用する抗体量を多くしても、そのS/N比に大きな改善は見られなかった。ビオチン化PODへの応用POD標識Fab’の作製実施例6で作製した15.4μMのc11-9およびc11-14のFab’-ストレプトアビジン結合体30μLに対して、56.8μMのビオチン化PODインビトロジェン社製8.1μLを加えて、4°Cで一晩置くことによりPOD標識Fab’を作製した。Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体へのビオチン化PODの導入実施例11で作製したc11-9およびc11-14を混合したFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体を、Fab’-ストレプトアビジン結合体濃度として1.4μMになるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2にて調製した。この複合体溶液50μLに対して、56.8μMのビオチン化PODインビトロジェン社製1.2μLを加えて、4°Cで一晩置くことによりPOD標識Fab’-デキストランT2000複合体を作製した。POD標識抗体を用いた酵素免疫測定WSCを用いたカルボジイミド法により、抗HCVコア抗原マウスモノクローナル抗体c11-3、c11-7、およびAOT3を磁性粒子に固定化し、0.2抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、組み換え体HCVコア抗原c11を0nM、0.12nM、1.2nMになるように正常ヒト血清で希釈し、これらのサンプル100μLと検体処理液6M塩酸グアニジン、0.5NHCl、12.5TritonX100、0.75Tween20100μLを混合し、37°Cで15分間置くことによってサンプルの前処理を行った。さらに、反応液0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MNaCl、1BSA、0.5カゼイン、0.05Tween20、pH7.3140μLと1Mトリス緩衝液20μLを混合し、この混合液160μLに前処理検体80μLを加えることにより、前処理検体を中和した。次に、中和した前処理検体240μLに0.2抗体固相化磁性粒子を20μL加え、37°Cで15分間置くことによって1次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、上記方法により作製したPOD標識Fab’およびPOD標識Fab’-デキストランT2000複合体を添加した。標識抗体の量は、POD濃度として18nMに希釈したものを120μL加え、攪拌後さらに37°Cで15分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄した。次に、磁性粒子のチューブに基質溶液ルミノール200μLを加え、ルーマットLB9507ベルトールド社製を使ってPODの発光を測定した。発光測定は、ルミノール添加12秒後から3秒間の発光を積算した。その結果、表4に示すとおりPOD標識Fab’よりもPOD標識Fab’-デキストランT2000複合体のほうが高い発光値を示し、ルシフェラーゼの場合と同様に本発明によるシグナルの増幅が確認された。以上の結果から本発明はルシフェラーゼ以外の酵素を用いて実施可能であることが示された。ビオチン化FITCへの応用FITC標識Fab’の作製実施例6で作製した15.4μMのc11-9およびc11-14のFab’-ストレプトアビジン結合体30μLに対して、160μMのビオチン化FITCインビトロジェン社製2.9μLを加えて、4°Cで一晩置くことによりFITC標識Fab’を作製した。Fab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体へのビオチン化FITCの導入実施例11で作製したc11-9およびc11-14を混合したFab’-ストレプトアビジン結合体-デキストランT2000複合体を、Fab’-ストレプトアビジン結合体濃度として6.3μMになるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2にて調製した。この複合体溶液20μLに対して、160μMのビオチン化FITCインビトロジェン社製1.0μLを加えて、4°Cで一晩置くことによりFITC標識Fab’-デキストランT2000複合体を作製した。FITC標識抗体を用いた蛍光免疫測定WSCを用いたカルボジイミド法により、抗HCVコア抗原マウスモノクローナル抗体c11-3、c11-7、およびAOT3を磁性粒子に固定化し、0.2抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、組み換え体HCVコア抗原c11を0nM、0.12nM、1.2nMになるように正常ヒト血清で希釈し、これらのサンプル100μLと検体処理液6M塩酸グアニジン、0.5NHCl、12.5TritonX100、0.75Tween20100μLを混合し、37°Cで15分間置くことによってサンプルの前処理を行った。さらに、反応液0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MNaCl、1BSA、0.5カゼイン、0.05Tween20、pH7.3140μLと1Mトリス緩衝液20μLを混合し、この混合液160μLに前処理検体80μLを加えることにより、前処理検体を中和した。次に、中和した前処理検体240μLに0.2抗体固相化磁性粒子を20μL加え、37°Cで15分間置くことによって1次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄し、上記方法により作製したFITC標識Fab’およびFITC標識Fab’-デキストランT2000複合体を添加した。標識抗体の量は、FITC濃度として65nMに希釈したものを200μL加え、攪拌後さらに4°Cで一晩反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて3回洗浄した。次に、磁性粒子のチューブに10mMPBSpH7.4を200μL加え、磁性粒子を懸濁し、懸濁液を96穴白色プレートサーモフィッシャー社製に分注した。その後、蛍光プレートリーダーinfinite200テカン社製を使ってFITCの蛍光を測定した。蛍光測定の条件は、485nmの波長で励起し、535nmの蛍光を測定した。その結果、表5及び図6に示すとおりFITC標識Fab’よりもFITC標識Fab’-デキストランT2000複合体のほうが高い蛍光活性を示し、ルシフェラーゼやPODの場合と同様に本発明によるシグナルの増幅が確認された。以上の結果から本発明は酵素以外の低分子標識物を用いても実施可能であることが示された。標識化プローブ-水溶性担体複合体の加速安定性本発明に係る標識化プローブ-水溶性担体複合体の加速安定性を試験した。詳細には、実施例12で作製したルシフェラーゼ標識c11-9c11-14Fab’-デキストランT2000複合体について、4°C保存条件下における活性と、37°C、1週間での加速条件後の残存活性を測定し、比較検討した。活性の測定は実施例13と同じ方法で行った。結果は表6に示すとおりであった。上記結果より、本発明に係る標識化プローブ-水溶性担体複合体が優れた加速安定性を示すことが実証された。即ち、本発明に係る標識化プローブ-水溶性担体複合体は、37°Cで1週間保存しても、約90程度乃至それ以上の残存活性を保持したことが観察された。また、当該加速条件に伴うバックグラウンドの上昇は観察されなかった。これらの結果から、本発明により、被験物質と特異的に結合する高感度かつ安定な標識化プローブ-水溶性担体複合体が得られ、この標識化プローブ-水溶性担体複合体を用いることにより、従来と比較して、より高感度かつ安定的な検出測定が可能となることが実証された。また、本願発明が酵素以外の低分子標識物に対しても有効であることが実証された。"