"少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを用いて、種々の分化ステージにある清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPS及びその誘導体を作製する方法。前記少なくとも1つのエンドヌクレアーゼがNANOG遺伝子中で二本鎖破断を誘導する、請求項1に記載の清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPSの作製方法。2つのエンドヌクレアーゼを用い、1つのエンドヌクレアーゼがNANOG遺伝子中で二本鎖破断を誘導し、1つのエンドヌクレアーゼが別の遺伝子中で二本鎖破断を誘導する、請求項1に記載の清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPSの作製方法。前記エンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項1に記載の清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPSの作製方法。NANOG遺伝子及びバリアント中で二本鎖破断を誘導するメガヌクレアーゼ。NANOG4配列を認識する請求項5に記載のメガヌクレアーゼ。NANOG4配列を認識し、配列番号33~40のバリアントICreIアミノ酸配列を含んでなる、請求項5に記載のメガヌクレアーゼ。NANOG4配列を認識し、配列番号33~40のバリアントICreIアミノ酸配列を含んでなる、請求項5に記載のメガヌクレアーゼ。配列番号33~40からなる群より選択されるNANOG4関連標的配列を認識する、請求項5に記載のメガヌクレアーゼ。ホモ二量体である請求項5に記載のメガヌクレアーゼバリアント。へテロ二量体である請求項5に記載のメガヌクレアーゼバリアント。偏性へテロ二量体である請求項5に記載のメガヌクレアーゼバリアント。単鎖である請求項5に記載のメガヌクレアーゼバリアント。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを含んでなる医薬組成物。請求項5に記載のメガヌクレアーゼ又はそのメガヌクレアーゼ活性を有するフラグメントをコードするポリヌクレオチド。請求項15に記載のポリヌクレオチドを含んでなる医薬組成物。請求項15に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。請求項17に記載のベクターを含有する宿主細胞。請求項18に記載の宿主細胞を培養することを含んでなるメガヌクレアーゼの作製方法。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いてNANOG遺伝子中で少なくとも1つの二本鎖破断を誘導することによりNANOG遺伝子の発現をノックアウトする方法。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いてNANOG遺伝子中で少なくとも1つの二本鎖破断を誘導することにより、NANOG遺伝子中に、興味対象の遺伝子若しくはポリヌクレオチド又はその一部を挿入する方法。興味対象の遺伝子又はポリヌクレオチドがレポーター遺伝子又はレポーター配列である、請求項21に記載の方法。興味対象の遺伝子又はポリヌクレオチドが治療用導入遺伝子又はモジュレーター遺伝子である、請求項21に記載の方法。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いて、NANOG遺伝子中にレポーター遺伝子を、NANOG遺伝子又はその一部と共発現するように挿入し、そしてレポーター遺伝子発現のレベルを測定することを含んでなる、細胞中でNANOG発現レベルを決定する方法。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いて、ガン細胞のNANOG遺伝子中にレポーター遺伝子を、NANOG遺伝子又はその一部と共発現するように挿入し、そしてレポーター遺伝子発現のレベルを測定することを含んでなる、ガン細胞中でNANOG発現レベルを決定する方法。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いてレポーター遺伝子がNANOG遺伝子と共発現するように作動可能に挿入されている、ガン又は腫瘍の細胞。請求項5に記載のメガヌクレアーゼを用いてレポーター遺伝子がNANOG遺伝子と共発現するように作動可能に挿入されている細胞と薬剤を接触させることを含んでなる、NANOG活性又は細胞表現型をモジュレートする能力について薬剤をスクリーニングする方法。NANOG遺伝子又はその一部及び興味対象のヌクレオチド遺伝子を含有する組換え細胞。NANOGがエンドヌクレアーゼによりノックアウトされている細胞を含む細胞バンク。NANOGがメガヌクレアーゼによりノックアウトされている細胞を含む細胞バンク。請求項5に記載のエンドヌクレアーゼを用いて興味対象のヌクレオチド配列をNANOG遺伝子中に導入することを含み、更に真核細胞を選択することを含んでなる、真核細胞中でNANOGの発現を調節する方法。CNCMアクセッション番号CNCMI4337を有するメガヌクレアーゼバリアントを含む生物学的材料の寄託物。請求項32に記載の生物学的材料の一部である配列番号35のDNA挿入物。iPS細胞が清浄及び又は安全及び又は安定している精製iPS細胞培養物。iPS細胞のNANOG遺伝子が機能的でない請求項34に記載の精製iPS細胞培養物。請求項34又は35に記載の精製iPS細胞培養物から選択される精製分化細胞培養物。本発明者らは、新規エンドヌクレアーゼ、例えば、非限定的例としてNANOG標的部位であるNANOG2及びNANOG4のようなNANOG遺伝子配列を標的するメガヌクレアーゼを同定し開発した。この新規なエンドヌクレアーゼ、特に本発明のメガヌクレアーゼは、NANOG遺伝子内で二本鎖破断を導入し、NANOG遺伝子発現を改変し、モジュレートし及び制御し、NANOG遺伝子発現を検出し、又はNANOG遺伝子座中に導入遺伝子を導入するための新たな機会を提供する。発明の簡単な要旨本発明は、エンドヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、特に本発明のメガヌクレアーゼを使用することにより、清浄であり、及び又は安全であり、及び又は安定していると特徴付けられる新たなクラスの人工多能性幹細胞及びその誘導体を作製する方法に関する。4つの転写因子Oct34、Sox2、KLF4及びcmycの導入によりiPSを作製する現在のプロトコルの鍵となる点は:-導入が制御されず、導入遺伝子が同じ遺伝子座に挿入されておらず及び又は同じコピー数でないiPS細胞の異質集団を導き、-iPS細胞がこれら4つの導入遺伝子を永続的に発現し、更なる分化工程について問題をもたらすということである。本発明のエンドヌクレアーゼは、これら古典的な問題を克服し、-iPS同質集団の高量での制御された作製を可能にする、安定、堅牢で及び単一コピーでの、規定された遺伝子座への4つの導入遺伝子の標的された挿入-更なる再分化工程及び治療用途において清浄なiPSを取得するために、iPSが作製されるとゲノム上に痕跡を残すことなく4つの導入遺伝子を除去できる可能性を可能にする選択ツールである。本発明エンドヌクレアーゼにより扱われる別の問題は、安定にされたiPSを作製する可能性、及び十分に規定されているが依然として経験に頼る現在のプロトコルを標準化する可能性である。非限定例としてのNANOG遺伝子のターゲティング及び破壊を誘導するメガヌクレアーゼを、分化プロセスの規定された工程で用いることにより、これら細胞の無限に自己複製可能な性質が喪失するので、分化状態に向かうiPSの進行が不可逆的で安全になされる。また、エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノムの安全な遺伝子座に、興味対象の遺伝子及び分化細胞へのiPSの進行に必須として規定される特定の誘導性遺伝子を挿入することにより、iPSの分化工程を標準化することが可能になる。このiPS作製及び分化のエンドヌクレアーゼアプローチは、-iPS分化プロセスを安全にし、標準化するため、-遺伝子欠損を有するか又は有しない初代細胞で化合物について化学ライブラリをスクリーニングする、-薬理ゲノム学的アプローチにおいて薬物応答を単一患者スケールで評価するため、-予測的毒物学的尺度における予測的な方法及びアルゴリズムに由来するストラテジ又は化学物質を確証するか又は無効にする分子及び又は遺伝子のインビトロスクリーニングに新たな道を開く。また、エンドヌクレアーゼは、iPS再プログラム化プロセスを確証するために、規定された再プログラム化工程に特異的なプロモーターに融合されたレポーター遺伝子を安全な遺伝子座で組み込むレポーター細胞株を創出する理想的なツールであり得る。同じアプローチは、再分化プロセス間に、このプロセスを正確に制御すること、及び依然として制限された回数分割可能であり、身体中を動き回り、それらが必要とされる組織に向けて移動することが知られる始原細胞バンクを創出することを可能にすると考えられる;それらは、既知の移植適合性の問題を提示することのない身体修復系として作用するので、成体生物の治療に特に有用である。治療用途に関して、エンドヌクレアーゼは、上記のような患者生物に再注入する前に、清浄で安全なiPS細胞中で病因遺伝子欠損を標的及び修正する理想的ツールである。iPS細胞の再プログラム化に関与するいずれの遺伝子も本発明の一部であり、本発明によるエンドヌクレアーゼの有用な標的である。本発明はまた、新たなタイプのiPSに関する;新たな物としての清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPS細胞は、該iPS細胞において清浄化及び安定化プロセスが生じた後は、もはや、iPS細胞の清浄化及び安定化プロセスのために標的された興味対象の遺伝子の産物を発現しない。具体的には、本発明は、NANOG遺伝子配列を標的切断するメガヌクレアーゼバリアント、これらバリアントをコードするベクター、これらメガヌクレアーゼバリアントをコードするベクターで形質転換された細胞、及びメガヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを発現させることによるメガヌクレアーゼバリアントの作製方法、NANOG2及びNANOG4DNA配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを含むNANOG遺伝子を認識するメガヌクレアーゼバリアントを設計する方法を包含する。これらバリアントのメガヌクレアーゼは、NANOG遺伝子の機能を研究するため、ノックアウト変異をNANOG遺伝子中に導入すること又は興味対象のレポーター遺伝子若しくは他の遺伝子をNANOG遺伝子座に導入することによってその発現を未分化細胞又は多能性細胞及び分化細胞中で追跡するため使用する。本発明のメガヌクレアーゼバリアントはまた、この遺伝子配列とメガヌクレアーゼとの相互作用により細胞におけるNANOG発現をモジュレートするために、例えば、その表現型を制御するために、腫瘍細胞のような細胞におけるNANOG発現をノックダウン若しくは制御するために、又は種々のその他の治療応用若しくは診断応用において使用してもよい本発明の特定の観点は、再プログラム化プロセスに関与する任意の遺伝子、特にNANOG遺伝子中で二本鎖破断を誘導することができるメガヌクレアーゼである。本発明の別の観点は、NANOG発現をノックアウト又はモジュレートするために、NANOG配列を認識するメガヌクレアーゼを使用することを包含する。図1は、このストラテジを説明する。NANOGのノックアウトのために種々のストラテジを行うことができる。本発明の別の観点は、興味対象の遺伝子をNANOG遺伝子又は遺伝子座中に導入するための、NANOGを認識するメガヌクレアーゼの使用である。興味対象の遺伝子は、NANOG発現の決定又は経時的な追跡を可能にするレポーター遺伝子であって、標的された細胞に新たな能力又は性質を付加するためにゲノム中に導入されるヌクレオチド配列に結合しているか又はしていないレポーター遺伝子であり得る。NANOG発現又は活性に対する非NANOG遺伝子又は薬剤化合物の効果を決定する方法は、レポーター遺伝子を用いるアッセイを使用して評価し得る。この方法は、レポーターに結合したNANOG遺伝子を組み込むように改変された腫瘍又はガン細胞に適用される場合に特に役立つ。或いは、興味対象の遺伝子は、NANOG遺伝子座を待避場として使用するNANOG以外の治療用導入遺伝子であり得る。この治療用遺伝子は、NANOGと共発現すると、特定の細胞表現型を提供するか、又は細胞分化の特定のフェーズ若しくはステージを維持若しくは促進するものであり得る。よって、本発明の第3の関連する観点は、興味対象の遺伝子を挿入するか又はその発現をモジュレートする着地場所としての、NANOG遺伝子の遺伝子座の使用に関する。発明の詳細な説明本発明は、エンドヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、特に本発明のメガヌクレアーゼを使用することにより、清浄であり、及び又は安全であり、及び又は安定していると特徴付けられる新たなクラスの人工多能性幹細胞及びその誘導体を作製する方法に関する。4つの転写因子Oct34、Sox2、KLF4及びcmycの導入によりiPSを作製する現在のプロトコルの鍵となる点は以下である:-導入が制御されず、導入遺伝子が同じ遺伝子座に挿入されておらず及び又は同じコピー数でないiPS細胞の異質集団を導き、-iPS細胞がこれら4つの導入遺伝子を永続的に発現し、更なる分化工程について問題をもたらし、本発明のエンドヌクレアーゼは、これら古典的な問題を克服し、-iPS同質集団の高量での制御された作製を可能にする、安定、堅牢で及び単一コピーでの、規定された遺伝子座への4つの導入遺伝子の標的された挿入-更なる再分化工程及び治療用途において清浄なiPSを取得するために、iPSが作製されるとゲノム上に痕跡を残すことなく4つの導入遺伝子を除去できる可能性を可能にする選択ツールである。本発明エンドヌクレアーゼにより扱われる別の問題は、安定にされたiPSを作製する可能性、及び十分に規定されているが依然として経験に頼る現在のプロトコルを標準化する可能性である。非限定例としてのNANOG遺伝子のターゲティング及び破壊を誘導するメガヌクレアーゼを、分化プロセスの規定された工程で用いることにより、これら細胞の無限に自己複製可能な性質が喪失するので、分化状態に向かうiPSの進行が不可逆的で安全になされる。また、エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノムの安全な遺伝子座に、分化細胞へのiPSの進行に必須として規定される誘導性遺伝子を挿入することにより、iPSの分化工程を標準化することが可能になる。このiPS作製及び分化のエンドヌクレアーゼアプローチは、-iPS分化プロセスを安全にし、標準化するため、-遺伝子欠損を有するか又は有しない初代細胞で化合物について化学ライブラリをスクリーニングする、-薬理ゲノム学的アプローチにおいて薬物応答を単一患者スケールで評価するため、-予測的毒物学的尺度における予測的な方法及びアルゴリズムに由来するストラテジ又は化学物質を確証するか又は無効にする分子及び又は遺伝子のインビトロスクリーニングに新たな道を開く。また、エンドヌクレアーゼは、iPS再プログラム化プロセスを確証するために、規定された再プログラム化工程に特異的なプロモーターに融合されたレポーター遺伝子を安全な遺伝子座で組み込むレポーター細胞株を創出する理想的なツールであり得る。同じアプローチは、再分化プロセス間に、このプロセスを正確に制御すること、及び依然として制限された回数分割可能であり、身体中を動き回り、それらが必要とされる組織に向けて移動することが知られる始原細胞バンクを創出することを可能にすると考えられる;それらは、既知の移植適合性の問題を提示することのない身体修復系として作用するので、成体生物の治療に特に有用である。NANOG機能に関して、この遺伝子のターゲティングは、ES及びiPS細胞におけるノックイン及びノックアウト実験により多能性幹細胞の多能的性質をよりよく理解するために有用となる。この目的のために、NANOGを認識するメガヌクレアーゼは選択ツールである。なぜならば、それは、この遺伝子を特異的に標的するように設計することができるからである。よって、該遺伝子を特異的にノックアウトすることが可能になるが、NANOG調節エレメント下で発現するレポーター遺伝子をノックインすることも可能になる。よって、NANOG発現は、未分化ステージ及び分化ステージの両方で追跡し得る。このアプローチはまた、分化細胞の脱分化プロセスのモニターも可能にする。NANOG設計メガヌクレアーゼの別の応用は、再プログラミングプロセスの研究用及びこのプロセスにおいて或る役割を演じることができる新たなファクターの同定用である。事実、科学界によって膨大な研究がなされているが、再プログラミングプロセスは依然としてほとんど非効率的で、十分に制御されないままである。更に、導入遺伝子組込みに基づくストラテジは、現在のところ、最も効率的であるが、それは重大な欠点を有する。遺伝子導入用の組込み部位は、予測不可能で再現不可能のままであり、このことは、内因性細胞遺伝子機能に影響するか又は腫瘍形成性を促進することがある。加えて、組み込まれた再プログラミング因子は、デノボDNAメチル化により、経時的に転写的にサイレントになるが、それらは、細胞培養及び分化の間に自発的に再活性化され得る。したがって、再プログラミングプロセスを改善させる新たなストラテジの開発が必要とされる。NANOGメガヌクレアーゼを利用して、体性細胞中に内因性NANOG調節配列及び制御エレメントの制御下でレポーター遺伝子をノックインして、多能性遺伝子NANOGの活性化を模倣するレポーター遺伝子の発現により再プログラミング効率をモニターすることが可能になる。最後に、NANOGメガヌクレアーゼはまた、この遺伝子をノックダウンすることにより、多能性幹細胞の腫瘍形成能を減少させるために有用であり得る。事実、ES細胞についての最近の研究は、ES細胞に由来する分化始原細胞の動物への移植後における異常な過成長の存在を浮き彫りにしている。この目的のための候補としてのNANOGの選択はまた、NANOGが最近になってヒト腫瘍発生における潜在的役割について記載されたという事実に基づく。この関連で、hNANOGのノックアウトは、増殖及びクローン原性成長を減少させることによって腫瘍形成を阻害する。多能性幹細胞は、例えばニューロンのような身体の全ての細胞タイプの入手を許容するので、細胞治療及び薬剤スクリーニングに有用である。それらはまたヒト起源を有する;それらは無制限の量で取得することができる。事実、細胞治療又は薬剤スクリーニング研究は、制限された量で得られ、増殖能がほとんどない初代細胞を用いて行われる。別の供給源は成体の幹細胞であるが、多能性幹細胞と比較すれば、それらは、その入手及び培養条件に起因して依然として限定的である。更に、移植に関して、適合性の問題は依然として存在する;この問題は、移植する患者に直接由来することができるiPS細胞を用いて克服され得る。薬剤スクリーニング研究のために、iPS細胞は、所与の疾患について何人かの患者及び彼らの未罹患の親について作製され得、よってヒト多様性を利用できるので有用である。更に、誘導されていない病状の原因変異は、本来のもののままである。その後、変異の効果は、罹患した組織に対する可能性のある薬剤の効果を同定して副次効果がないことを確認するために他の組織に対する効果も同定するために、種々の組織において研究することができる。したがって、NANOGに対して指向するメガヌクレアーゼは、多能性幹細胞のより十分な理解を可能にし、よって細胞治療及び薬剤スクリーニング研究用のこれら細胞により導かれる実際の問題を克服し得る幾つかの応用のための選択ツールである。上記のように、本発明の或る観点は、本発明のNANOG認識メガヌクレアーゼで実行し得る、NANOG遺伝子発現をモジュレートし、改変し又は制御するための種々のストラテジを反映する。より詳細には、これらには以下の事項が含まれる。NANOG標的配列を認識するメガヌクレアーゼ下記表1は、本発明のメガヌクレアーゼにより認識されるNANOG遺伝子座内の標的ヌクレオチド配列を示す。NANOGコーディング配列の内部の標的部位及び外部の標的部位は、種々の手順に有用である。例えば、NANOG2中への挿入は、NANOGの変異のノックアウトを生じさせることに有用であり、NANOG4中への挿入は、調節配列又はレポーター配列の導入に使用することができる。NANOG標的配列を認識するエンドヌクレアーゼ下記表1の2は、本発明のエンドヌクレアーゼにより認識されるNANOG遺伝子座内の標的ヌクレオチド配列を示す。NANOG遺伝子発現のノックアウト方法NANOGをノックアウトするために種々のストラテジを実行することができる。コーディング配列は、オープンリーディングフレーム中の配列を標的するメガヌクレアーゼを用いる非相同末端連結により変異させることができる。NANOG2配列を標的するメガヌクレアーゼは、酵素である。この場合、マトリクスは必要ない。幾つかのエキソンは、ノックアウトDNAマトリクスにより供給される1つのメガヌクレアーゼの作用により欠失させることができる。NANOG2又はNANOG4配列を認識するメガヌクレアーゼが有用である。第2のサブタイプのノックアウトストラテジは、その本質が、2つのメガヌクレアーゼの作用によるNANOG遺伝子内の大きな領域の置き換えに存し、KOマトリクスは、大きな配列の欠失に使用することができる。このKOマトリクスは、標的されたエキソン並びに幾つかの変異エキソンが欠失した配列を用いて構築することができる。NANOG遺伝子座での興味対象の遺伝子のノックインNANOG遺伝子座はレポーター及び興味対象の遺伝子の発現に使用することができるので、エキソン中の配列又はイントロン中の配列を標的する幾つかのメガヌクレアーゼが、相同組換えによるノックインマトリクスの組込みに有用である。このKIマトリクスは、調節エレメント有り又は無しで、興味対象の遺伝子が付加された標的遺伝子座に相同な配列を用いて構築することができる。本発明のICreIバリアントは、図2bに説明され、国際PCT出願WO2006097784及びWO2006097853、並びにArnouldら及びSmithらに記載されたコンビナトリアルアプローチを用いて創出された。本発明によるバリアントの切断活性は、任意の周知のインビトロ又はインビボ切断アッセイ、例えば国際PCT出願WO2004067736Epinatら,NucleicAcidsRes20033129522962;Chamesら,NucleicAcidsRes200533e178;Arnouldら,JMolBiol2006355443458及びArnouldら,JMolBiol20073714965に記載されたアッセイにより行い得る。例えば、本発明のバリアントの切断活性は、直列反復組換えアッセイにより、酵母又は哺乳動物細胞において、レポーターベクターを用いて測定してもよい。レポーターベクターは、酵母又は哺乳動物発現ベクターにクローニングされた、レポーター遺伝子の2つの短縮型で非機能的なコピーと介在配列内のゲノムDNA標的配列とを含んでなる。通常、ゲノムDNA標的配列は、親ホモ二量体ICreIメガヌクレアーゼ標的配列の各々の異なる1つの半分を含む。ヘテロ二量体バリアントの発現は、ゲノムDNA標的配列を切断することができる機能的なエンドヌクレアーゼを生じる。この切断は、直列反復間の相同組換えを誘導し、機能的なレポーター遺伝子を生じ、その発現は適切なアッセイによりモニターすることができる。バリアントのゲノムDNA標的に対する切断活性は、天然の標的に対する野生型ICreI又はISceI活性に匹敵し得る。おそらくは又はそうでなくとも、Arnouldら,JMolBiol20073714965に説明される方法に従って、少なくとも2回の選択スクリーニングを行う。1回目に、ヘテロ二量体の一方の単量体に変異を誘発し、他方の単量体と共発現させてヘテロ二量体を形成し、改良した単量体Yを、興味対象の遺伝子からの標的に対して選択する。2回目に、他方の単量体に変異を誘発し、改良した単量体Yと共発現させてヘテロ二量体を形成し、興味対象の遺伝子からの標的に対して選択して、改良された活性を有するメガヌクレアーゼを得る。変異誘発は、上記で示されるように、単量体又は単量体のプールに対するランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発であり得る。有利には、両タイプの変異誘発を組み合わせる。1つ又は両方の単量体に対して追加の回の選択スクリーニングを行って、バリアントの切断活性を改良してもよい。前記バリアントの好ましい実施形態において、ICreIの44位~77位に位置するサブドメイン中の前記置換は、44位、68位、70位、75位及び又は77位にある。前記バリアントの別の好ましい実施形態において、ICreIの28位~40位に位置するサブドメイン中の前記置換は、28位、30位、32位、33位、38位及び又は40位にある。前記バリアントの別の好ましい実施形態において、バリアントは、ICreI単量体中、DNA標的配列と接触するか又はDNA主鎖若しくはヌクレオチド塩基と直接若しくは水分子を介して相互作用する他のアミノ酸残基の位置に1又はそれより多い変異を含んでなる;これら残基は当該分野において周知である。具体的には、追加の置換を、例えば最終C末端ループ中の、リン酸主鎖と接触する位置に導入してもよい。好ましくは、前記残基は、前記DNA切断部位の結合及び切断に関与する。より好ましくは、前記残基は、ICreIの138位、139位、142位又は143位にある。各変異が138位及び139位の残基対と142位及び143位の残基対とから選択される異なる残基対にあることを条件として、1つのバリアントにおいて2つの残基を変異させてもよい。導入される変異は、最終C末端ループの前記アミノ酸とICreI部位のリン酸主鎖との相互作用を改変する。好ましくは、138位又は139位の残基は、疎水性アミノ酸により置換して、DNA切断部位のリン酸主鎖との水素結合の形成を回避する。例えば、138位の残基はアラニンにより置換されるか、又は139位の残基がメチオニンにより置換される。142位又は143位の残基は、有利には、小さなアミノ酸、例えばグリシンにより置換して、これらアミノ酸残基の側鎖のサイズを減少させる。より好ましくは、最終C末端ループ中の前記置換は、ICreI部位の±1~2位、±6~7位及び又は±11~12位のヌクレオチドに対するバリアントの特異性を改変する。前記バリアントの別の好ましい実施形態において、バリアントは、NANOG遺伝子からのDNA標的配列に対するバリアントの結合及び又は切断特性を改良する1又はそれより多い追加の変異を含んでなる。変異される追加の残基は、ICreI配列全体に、特にICreIのC末端側半分にあり得る。有利には、両方のICreI単量体を変異させる;各単量体中の変異は同一であっても異なってもよい。例えば、バリアントは、以下の位置に1又はそれより多い追加の置換を含んでなる:2、7、8、19、43、54、61、80、81、96、105及び132。有利には、前記置換は、N2S、K7E、E8K、G19S、F43L、F54L、E61R、E80K、I81T、K96E、V105A及びI132Vからなる群より選択される。より好ましくは、バリアントは、N2S、K7E、E8K、G19S、F43L、F54L、E61R、E80K、I81T、K96E、V105A及びI132Vからなる群より選択される少なくとも1つの置換を含んでなる。バリアントはまた、C末端に追加の残基を含んでなり得る。例えば、グリシン及び又はプロリン残基がICreIの164位及び165位にそれぞれ挿入され得る。好ましい実施形態によると、前記バリアント中の前記追加の変異は、機能的ホモ二量体の形成を更に損なう。より好ましくは、前記変異はG19S変異である。有利には、G19S変異をヘテロ二量体ICreIバリアントの2つの単量体の一方に導入して、増強された切断活性及び増強された切断特異性を有するメガヌクレアーゼを得る。加えて、切断特異性を更に増強するために、他方の単量体は、機能的ホモ二量体の形成を損なうか又はヘテロ二量体の形成に好ましい別個の変異を有し得る。前記バリアントの別の好ましい実施形態において、前記置換は、当初のアミノ酸の、A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y、C、V、L、M、F、I及びWからなる群より選択されるアミノ酸での置換である。具体的には、バリアントは配列番号25~32及び33~40からなる群より選択される。本発明のバリアントは、野生型ICreI、又は配列番号1と少なくとも85同一性、好ましくは少なくとも90同一性、より好ましくは少なくとも95同一性を有するICreI足場タンパク質、例えばICreI配列の2位でのアラニンの挿入及びC末端でのAADの挿入を有するICreIN75と呼ばれる足場に由来し得る。本特許出願では、記載する全てのICreIバリアントは、追加のアラニンを野生型ICreI配列の最初のメチオニンの後に含んでなる。これらバリアントはまた、2つの追加のアラニン残基及びアスパラギン酸残基を野生型ICreI配列の最後のプロリンの後に含んでなる。これら付加残基は、当該酵素の性質に影響しない。混乱を回避するために、残基への言及は、専ら、バリアント中に存在している野生型ICreI酵素の残基を参照するので、付加残基は、本特許出願で言及するICreI又はバリアント中の残基の番号付け法には影響しない。例えば、ICreIの残基2は、実際には、最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなるバリアントの残基3である。加えて、本発明のバリアントは、配列のNH2末端及び又はCOOH末端に挿入された1又はそれより多い残基を含み得る。例えば、タグを、NH2末端及び又はCOOH末端に導入する;前記タグは、前記バリアントの検出及び又は精製に有用である。バリアントはまた、核局在化シグナルを含み得る;前記NLSは、前記バリアントの細胞核中への移入に有用である。NLSは、バリアントの最初のメチオニンの直後又はN末端タグの直後に挿入し得る。本発明によるバリアントは、パリンドローム又は偽パリンドロームDNA標的配列を切断することができるホモ二量体であり得る。或いは、前記バリアントは、ICreIの28位~40位及び44位~77位に種々の置換を有する第1及び第2の単量体の結合から生じ、NANOG遺伝子からの非パリンドロームDNA標的配列を切断することができるヘテロ二量体である。具体的には、前記へテロ二量体バリアントは、配列番号25~配列番号32及び配列番号33~配列番号40からなる群からの単鎖分子のN末端単量体及びC末端単量体を構成するバリアント同士間の可能な会合の1つによって構成される。DNA標的配列は、NANOGオープンリーディングフレーム中に位置し、これら配列はNANOGORFを全てカバーする。具体的には、本発明のバリアント及び誘導体についての前記DNA標的配列は、図3及び5並びに表Iに示されるように、配列番号4~配列番号23からなる群より選択される。各ICreIバリアントの配列は、示される位置での変異後の残基によって規定される。位置は、ICreI配列を参照して示される;ICreIは、30、32、33、38、40、44、68、70、75、77及び80位に、それぞれN、S、Y、Q、S、Q、R、R、D、I及びEを有する。本発明によるへテロ二量体バリアントの各単量体はまた、上記に示されるように変異されている、28位、30位、32位、33位、38位、40位、44位、68位及び70位、75位及び77位の11残基並びに追加の残基に因んで一文字コードを用いて命名され得る。例えば、本発明のNANOG2標的を標的する単鎖分子を構成するN末端単量体中の変異7E28R33R38Y40Q44K54I64A68A70G75N96E147A。本発明において、所定のDNA標的について、2誘導体標的配列は、当初のゲノム標的と2位、1位、1位、2位で異なり、ICreI切断部位は前記当初のゲノム標的のこれら位置での対応する配列に置換している。3誘導体標的配列は、前記2誘導体標的配列の左側部分に由来するパリンドローム配列である。4誘導体標的配列は、前記2誘導体標的配列の右側部分に由来するパリンドローム配列である。5誘導体標的配列は、当初のゲノム標的の左側部分に由来するパリンドローム配列である。6誘導体は、当初のゲノム標的の左側部分に由来するパリンドローム配列である。本発明において、単鎖分子の単量体の一方を構成するN末端単量体とは、3又は5パリンドローム配列を切断することができるバリアントをいう。本発明において、単鎖分子の単量体の一方を構成するC末端単量体とは、4又は6パリンドローム配列を切断することができるバリアントをいう。上記で規定されるようなへテロ二量体バリアントは、上記で示すようなアミノ酸置換のみを有していてもよい。この場合、示されていない位置は変異しておらず、よって野生型ICreIに対応する。本発明は、上記の配列と少なくとも85同一性、好ましくは少なくとも90同一性、より好ましくは少なくとも95同一性を有し、NANOG遺伝子からのDNA標的を切断することができるICreIバリアントを包含する。ヘテロ二量体バリアントは、有利には、2つのICreI単量体間で分子間相互作用をする第1及び第2の単量体の残基に対応する少なくとも一対の変異を有する偏性ヘテロ二量体バリアントであり、ここで、前記対の第1の変異は第1の単量体中にあり、前記対の第2の変異は第2の単量体中にあり、前記変異対は各単量体からの機能的ホモ二量体の形成を妨げ、NANOG遺伝子のゲノムDNA標的を切断することができる機能的ヘテロ二量体の形成を可能にする。偏性ヘテロ二量体を形成するために、単量体は、有利には、第1の単量体及び第2の単量体についてそれぞれ以下の変異対の少なくとも1つを有する:a8位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換、及び7位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換;第1の単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも一方のアルギニンによる置換を更に含み得る、b61位のグルタミン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換、及び96位のリジンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換;第1の単量体は、7位及び96位のリジン残基の少なくとも一方のアルギニンによる置換を更に含み得る、c97位のロイシンの芳香族アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンでの置換、及び54位のフェニルアラニンの小さなアミノ酸、好ましくはグリシンでの置換;第1の単量体は、54位のフェニルアラニンのトリプトファンによる置換をさらに含み得、第2の単量体は、58位のロイシン又は57位のリジンのメチオニンによる置換を更に含み得る、及びd137位のアスパラギン酸の塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンでの置換、及び51位のアルギニンの酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸での置換。例えば、第1の単量体は変異D137Rを、第2の単量体は変異R51Dを有し得る。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、上記a、b、c又はdで規定される少なくとも二対の変異を含んでなる;一方の変異対は、有利には、c又はdで規定されるとおりである。好ましくは、一方の単量体は、7位及び96位のリジン残基の酸性アミノ酸又はグルタミン酸、好ましくはグルタミン酸による置換を含んでなり、他方の単量体は、8位及び61位のグルタミン酸残基の塩基性アミノ酸又はリジン;例えばE8K及びE61Rによる置換を含んでなる。より好ましくは、偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、上記a、b及びcで規定される三対の変異を含んでなる。偏性ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは、有利には、変異E8R、E8K若しくはE8H、E61R、E61K若しくはE61H、及びL97F、L97W若しくはL97Y;変異K7R、E8R、E61R、K96R及びL97F、又は変異K7R、E8R、F54W、E61R、K96R及びL97Fを少なくとも有する第1の単量体と、変異K7E若しくはK7D、F54G若しくはF54A、及びK96D若しくはK96E;変異K7E、F54G、L58M及びK96E、又は変異K7E、F54G、K57M及びK96Eを少なくとも有する第2の単量体とからなる。例えば、第1の単量体は、変異K7RとE8R若しくはE8KとE61RとK96RとL97F、又は変異K7RとE8R若しくはE8KとF54WとE61RとK96RとL97Fを有し得、第2の単量体は、変異K7EとF54GとL58MとK96E、又は変異K7EとF54GとK57MとK96Eを有し得る。偏性ヘテロ二量体は、上記で規定される少なくとも1つのNLS及び又は1つのタグを含んでなり得る;前記NLS及び又はタグは、第1及び又は第2の単量体にあり得る。本発明の主題はまた、上記で規定されるICreIバリアントに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼである。単鎖メガヌクレアーゼは、2つのICreI単量体、2つのICreIコアドメイン、又はこの両方の組合せを含み得る。好ましくは、2つの単量体コアドメイン又はこの両方の組合せは、ペプチドリンカーにより連結される。より好ましくは、単鎖キメラメガヌクレアーゼは、NANOG2及びNANOG4遺伝子座の所定のDNA標的について、それぞれ表II及びIIIに示されるN末端単量体及びC末端単量体からなる群からのバリアント同士間の可能な会合の1つによって構成され、単量体バリアントはリンカーにより接続される。より好ましくは、本発明による単鎖キメラメガヌクレアーゼは、配列番号25~配列番号32及び配列番号33~配列番号40からなる群からのものである。NANOG2遺伝子座のNANOG21標的に関して、本発明による単鎖キメラメガヌクレアーゼは、配列番号25~配列番号32からなる群からのものである。NANOG41標的に関して、本発明による単鎖キメラメガヌクレアーゼは、配列番号33~配列番号40からなる群からのものである。本発明の範囲はまた、NANOG遺伝子中の標的配列の1つを切断することができるICreIバリアント自体を包含するものと理解される。本発明の範囲はまた、ヒト以外の真核生物又はウサギ、ウシ、ブタ、ウマ若しくはヤギのNANOG遺伝子中の等価な配列を標的する上記のICreIバリアントを包含するものと理解される。本発明の主題はまた、上記で規定されるバリアント又は単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドフラグメントである;前記ポリヌクレオチドは、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体バリアントの1つの単量体、又は単鎖キメラメガヌクレアーゼの2つのドメイン単量体をコードし得る。本発明の主題はまた、本発明によるバリアント又は単鎖メガヌクレアーゼの発現用組換えベクターである。組換えベクターは、上記で規定されるバリアント又は単鎖メガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドフラグメントを含んでなる。好ましい実施形態において、前記ベクターは、各々がヘテロ二量体バリアントの一方の単量体をコードする2つの異なるポリヌクレオチドフラグメントを含んでなる。本発明において使用することができるベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体の、非染色体の、半合成若しくは合成の核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子が挙げられる。好ましいベクターは、自律複製可能なもの及び又は連結された核酸を発現可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスを含む二本鎖DNAウイルスが挙げられる。その他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳類C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLVBLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる。ベクターは、選択マーカー、例えば真核細胞培養については、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ及びヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ;エスセレビシエについてはTRP1、URA3及びLEU2;大腸菌においてはテトラサイクリン、リファンピシン又はアンピシリン耐性を含んでなり得る。好ましくは、前記ベクターは、本発明のバリアント単鎖メガヌクレアーゼをコードする配列が、適切な転写及び翻訳制御エレメントの制御下に配置されて、該バリアントの産生又は合成を可能にする発現ベクターである。したがって、前記ポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。より具体的には、該ベクターは、複製起点、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結部位を含んでなる。これはまた、エンハンサーを含んでなり得る。プロモーターの選択は、ポリペプチドを発現する細胞に依存する。好ましくは、バリアントがヘテロ二量体である場合、各単量体をコードする2つのポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドの発現を同時に駆動することができる1つのベクターに含まれる。適切なプロモーターとしては、組織特異的及び又は誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例は、重金属レベルの増加によって誘導される真核メタロチオニンプロモーター、イソプロピルβDチオガラクトピラノシドに応答して誘導される原核lacZプロモーター、及び温度上昇によって誘導される真核熱ショックプロモーターである。組織特異的プロモーターの例は、骨格筋クレアチンキナーゼ、前立腺特異的抗原、αアンチトリプシンプロテアーゼ、ヒトサーファクタントA及びBタンパク質、βカゼイン及び酸性ホエータンパク質遺伝子である。前記ベクターの別の有利な実施形態によると、該ベクターは、上記で規定されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列を含んでなるターゲティング構築物を含む。例えば、バリアントのゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する前記配列は、NANOG遺伝子のフラグメントである。或いは、ICreIバリアント単鎖メガヌクレアーゼをコードするベクター及びターゲティング構築物を含んでなるベクターは、異なるベクターである。より好ましくは、ターゲティングDNA構築物は:a上記で規定されるゲノムDNA切断部位を取り囲む領域と相同性を有する配列と、baに記載の配列で挟まれたか又はaに記載の配列に含まれる、導入される配列とを含んでなる。好ましくは、少なくとも50bp、好ましくは100bpを超える、より好ましくは200bpを超える相同配列が用いられる。したがって、ターゲティングDNA構築物は、好ましくは200bp~6000bp、より好ましくは1000bp~2000bpである。実際に、共有される相同DNAは、破断部位の上流及び下流で接する領域に位置し、導入されるDNA配列は2つのアームの間に位置すべきである。導入される配列は、幾つかの特異的様式で染色体DNAを変更させるために用いる任意の配列であり得、NANOG遺伝子中の変異を修復し、変異したものに代えて機能的なNANOG遺伝子を回復し、NANOG遺伝子中の特定配列を改変するため、NANOG遺伝子を減弱若しくは活性化するため、NANOG遺伝子若しくはその一部を不活化若しくは欠失させるため、興味対象の部位に変異を導入するため、又は外因性遺伝子若しくはその一部を導入するために用いられる配列を含む。このような染色体DNAの変更は、ゲノム工学又はゲノム療法に用いられる。ターゲティング構築物は、有利には、2つの相同性アームの間にポジティブ選択マーカーと、第1の相同性アームの上流又は第2の相同性アームの下流にネガティブ選択マーカーとを含んでなる。マーカーは、標的部位での相同組換えにより興味対象の配列が挿入された細胞の選択を可能にする。導入される配列は、ゲノム治療の目的のためには、NANOG遺伝子中の変異を修復する配列である。NANOG遺伝子を修正するために、遺伝子の切断は、変異の近傍、好ましくは変異の500bp内で起こる。ターゲティング構築物は、切断を修復するための、標的部位に接する少なくとも200bpの相同配列を有するNANOG遺伝子フラグメントを含んでなり、変異を修復するために変異領域に対応する野生型NANOG遺伝子の一部をコードする配列を含む。結果として、遺伝子修正用のターゲティング構築物は、最小修復マトリクスを含んでなるか、又は最小修復マトリクスからなる;該最小修復マトリクスは、好ましくは200bp~6000bp、より好ましくは1000bp~2000bpである。好ましくは、バリアントの切断部位が変異と重複する際には、修復マトリクスは、NANOG遺伝子中で切断を誘導するために用いるバリアントによって切断されない改変切断部位とNANOG遺伝子のオープンリーディングフレームを変化させない野生型NANOGとをコードする配列を含む。或いは、ノックイン細胞動物を作製するために、ターゲティングDNA構築物は、切断を修復するためのICreIバリアントの標的部位に接する少なくとも200bpの相同配列を有するNANOG遺伝子フラグメントに対応する隣接領域と、発現カセット内の興味対象の外因性遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーとを含んでなる。配列の挿入のために、相同DNAは、一般に、破断部位の直ぐ上流及び下流の領域に位置する。しかし、挿入が、切断部位に接するORF配列の欠失を伴う場合、共有される相同DNAは、欠失領域の上流及び下流の領域に位置する。或いは、機能的遺伝子を回復するために、遺伝子の切断は、変異の近傍又は上流で生じる。好ましくは、当該変異は、該遺伝子の配列中の既知の最初の変異であり、そのことにより、下流の全ての変異を同時に修正することができる。ターゲティング構築物は、切断部位の下流に、インフレームで融合され、3に転写を停止させるためのポリアデニル化部位を有するエキソンを含んでなる。導入される配列は、機能的タンパク質をコードすることができるmRNAへの工学的に操作された遺伝子の転写を可能にするように、切断部位を取り囲むイントロン又はエキソン配列で挟まれている。例えば、エキソンノックイン構築物は、上記で規定される最小修復マトリクスからの、切断部位の上流及び下流の配列により挟まれる。本発明の主題はまた、上記で規定されるターゲティングDNA構築物である。本発明の主題はまた、上記で規定される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ及び又は上記で規定される前記メガヌクレアーゼをコードする少なくとも1つの発現ベクターを含んでなることを特徴とする組成物である。前記組成物の好ましい実施形態において、該組成物は、上記で規定されるターゲティングDNA構築物を含んでなる。好ましくは、前記ターゲティングDNA構築物は、組換えベクター中に含まれるか、又は本発明によるメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター中に含まれる。本発明の主題は更に、NANOG遺伝子の変異修復のための、上記で規定されるメガヌクレアーゼ、1又は2のポリヌクレオチドの使用である。本発明の主題は更にまた、治療を必要とする対象者に有効量の本発明に包含される少なくとも1つのバリアントを投与することを含んでなる、NANOG遺伝子中の変異によって引き起こされる遺伝子疾患の治療方法である。前記使用の有利な実施形態によると、該使用は、ゲノムDNA標的配列を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位中に二本鎖破断を誘導し、これによりDNA組換え事象、DNA欠失又は細胞死を誘導するためである。本発明によると、前記二本鎖破断は、NANOG遺伝子中の特定配列を修復するため、NANOG遺伝子中の特定配列を改変するため、変異した遺伝子の代わりに機能的NANOG遺伝子を回復させるため、NANOG遺伝子を減弱若しくは活性化するため、NANOG遺伝子の興味対象部位中に変異を導入するため、外因性遺伝子若しくはその一部を導入するため、NANOG遺伝子若しくはその一部を不活化若しくは欠失させるため、染色体アームを転座させるため、又はDNAを修復されないままにして分解させるためである。NANOG遺伝子がiPS細胞又はガン細胞中でのみ発現されるという事実を考えれば、NANOGを通常発現しない細胞中では、インサートがこの遺伝子座から発現することができるという条件で、NANOGを通常発現する細胞中では、挿入がNANOGの発現に影響しないという条件又は該細胞中に機能的な対立遺伝子が残っているという条件で、NANOG遺伝子座を待避場として考えることができる。例えば、イントロン中の挿入は、発現パターンの改変無し又は僅かな改変で行い得る。しかし、このアプローチにおいて、NANOG遺伝子自体は破壊され得る。したがって、本発明の別の観点において、本発明者らは、NANOG遺伝子を標的するエンドヌクレアーゼバリアントが、NANOG遺伝子座を待避場遺伝子座として使用して、該遺伝子座にてNANOG以外の治療用導入遺伝子を挿入するために使用できることを見出した。換言すれば、本発明は、導入遺伝子の安全な挿入に使用するための、NANOG遺伝子座中の標的配列を切断することができる変異体エンドヌクレアーゼであって、前記遺伝子座の破壊又は欠失が当該遺伝子座の外側に位置する遺伝子の発現を改変しない変異体エンドヌクレアーゼに関する。本発明の主題は更にまた、治療を必要とする対象者に有効量の本発明に包含される少なくとも1つのバリアントを投与することを含んでなる、NANOG遺伝子以外の遺伝子中の変異によって引き起こされる遺伝子疾患の治療方法である。当業者は、遺伝子座の破壊又は欠失が当該遺伝子座の外側に位置する近隣遺伝子の発現を改変するかどうかを、プロテオミクスツールを用いて容易に検証することができる。そのような分析に適切な多くのタンパク質発現プロファイリングアレイが市販されている。近隣遺伝子は、NANOG遺伝子座の各端部に位置する1、2、5、10、20又は30遺伝子を意味する。本発明の導き出される主要な観点において、本発明者らは、NANOG遺伝子座を、治療剤以外の興味対象の遺伝子を挿入し発現させるための着地場所として使用し得ることを見出した。この観点において、本発明者らは、本発明の前述の観点によるNANOG遺伝子座を標的する特異的なメガヌクレアーゼバリアントによるメガヌクレアーゼ誘導組換えにより、GOIを含有する遺伝子構築物が、NANOG遺伝子座にてゲノム中に組み込まれ得ることを見出した。本発明の主題は更にまた、導入遺伝子を、細胞、組織又は非ヒト動物のゲノムNANOG遺伝子座中に挿入する方法であって、本発明の少なくとも1つのバリアントが前記細胞、組織又は非ヒト動物中に導入される方法である。好ましい実施形態において、NANOG遺伝子座は更に導入遺伝子の安定発現を可能にする。別の好ましい実施形態において、NANOG遺伝子座の内部の標的配列は、前記細胞、組織又は個体のゲノム内に1つだけ存在する。別の好ましい実施形態において、本発明によるメガヌクレアーゼバリアントは、少なくとも1つの細胞中にGOIをコードする配列を導入するキットの一部であり得る。より好ましい実施形態において、少なくとも1つの細胞は、CHOK1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2OS細胞;NIH3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHOS細胞;DG44細胞;K562細胞、U937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;Jurkat細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT1080細胞;HCT116細胞;Huh7細胞;Huvec細胞;Molt4細胞を含んでなる群より選択される。本発明の主題はまた、少なくとも以下の工程を含んでなる、NANOG遺伝子ノックアウト又はノックイン組換え細胞を作製する方法である:細胞中に、上記で規定されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識切断部位を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘導する工程、同時に又は連続的に、工程の細胞中に、切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に、前記興味対象部位を修復するDNAとを含んでなるターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより該興味対象部位が修復された組換え細胞を作製する工程、任意の適切な手段により、工程の組換え細胞を単離する工程。本発明の主題はまた、少なくとも以下の工程を含んでなる、NANOG遺伝子ノックアウト又はノックイン動物を作製する方法である:動物の多能性前駆細胞又は胚に、上記で規定されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識切断部位を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘導する工程、同時に又は連続的に、工程の動物の前駆細胞又は胚に、切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に、該興味対象部位を修復するDNAとを含んでなるターゲティングDNAを導入して、相同組換えにより該興味対象部位が修復された遺伝子改変動物の前駆細胞又は胚を作製する工程、工程の遺伝子改変動物の前駆細胞又は胚をキメラ動物に成長させる工程、工程のキメラ動物からトランスジェニック動物を得る工程。好ましくは、工程は、工程で作製された遺伝子改変前駆細胞を胚盤胞に導入し、キメラ動物を作製することを含んでなる。ターゲティングDNAは、細胞中に、興味対象部位へのターゲティングDNAの導入に適切な条件下で導入される。ノックアウト細胞動物を作製するために、興味対象部位を修復するDNAは、NANOG遺伝子を不活化する配列を含んでなる。ノックイン細胞動物を作製するために、興味対象部位を修復するDNAは、興味対象の外因性遺伝子の配列及びネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを含んでなる。好ましい実施形態において、前記ターゲティングDNA構築物はベクターに挿入される。本発明の主題はまた、少なくとも以下の工程を含んでなる、NANOG欠損細胞を作製する方法である:細胞中に、上記で規定されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識切断部位を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘導し、そのことによって非相同性末端連結により二重鎖破断が修復されている遺伝子改変NANOG遺伝子欠損細胞を作製する工程、任意の適切な手段により、工程の遺伝子改変NANOG遺伝子欠損細胞を単離する工程。本発明の主題はまた、少なくとも以下の工程を含んでなる、NANOG遺伝子ノックアウト動物を作製する方法である:動物の多能性前駆細胞又は胚に、上記で規定されるメガヌクレアーゼを導入して、該メガヌクレアーゼのDNA認識切断部位を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位に二本鎖切断を誘発し、それにより非相同性末端連結により二重鎖破断が修復されている遺伝子改変前駆細胞又は胚を作製する工程、工程の遺伝子改変動物の前駆細胞又は胚をキメラ動物に生育させる工程、工程のキメラ動物からトランスジェニック動物を得る工程。好ましくは、工程は、工程で得られた遺伝子改変前駆細胞を胚盤胞に導入して、キメラ動物を作製することを含んでなる。改変される細胞は、特異的な標的部位を含有する限りにおいて任意の興味対象の細胞であり得る。ノックイントランスジェニックマウスを作製するために、細胞は、当該分野において周知である胚由来幹細胞のような多能性前駆細胞である。組換えヒト細胞株を作製するために、細胞は、有利には、PerC6又はHEK293細胞である。動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは研究用げっ歯動物又はウサギ、ウシ、ブタ、ウマ若しくはヤギである。前記メガヌクレアーゼは、直接細胞に、又は前記メガヌクレアーゼをコードし、用いられる細胞中での発現に適切なポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを介して細胞に提供することができる。興味対象の異種タンパク質を発現する組換え細胞株を作製するために、ターゲティングDNAは、相同組換えによってNANOG遺伝子中に興味対象の外因性配列が組み込まれた遺伝子改変細胞を作製するように、興味対象の産物をコードする配列と上記で規定される切断部位の上流及び下流の配列に接するマーカー遺伝子と含んでなる。興味対象の配列は、或る興味対象のタンパク質ペプチドをコードする任意の遺伝子であり得、限定されないが、レポーター遺伝子、レセプター、シグナル伝達分子、転写因子、医薬的に活性なタンパク質及びペプチド、疾患原因の遺伝子産物及び毒素を含む。配列はまた、例えばShRNA、miRNA又はsiRNAのような当該分野において周知の干渉RNAを含む興味対象のRNA分子をコードしてもよい。外因性配列の発現は、内因性NANOG遺伝子プロモーター又は異種プロモーター、好ましくは上記で規定される構成性又は誘導性の遍在性又は組織特異的プロモーターにより駆動され得る。加えて、興味対象の配列の発現は、条件的であり得る;発現は、部位特異的リコンビナーゼにより誘導され得るNucleicAcidsRes25176673;ZhuXDSadowskiPDJBiolChem270。よって、興味対象の配列は、前記興味対象の遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターと、限定されないがマーカー遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスアクセプター配列、イントロン、タンパク質検出用タグ及びエンハンサーを含む1又はそれより多い機能的配列とを含んでなり得る適切なカセット中に挿入される。本発明の主題はまた、上記で規定される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ及び又は1つの発現ベクターを含んでなるNANOG遺伝子ノックアウト又はノックイン細胞動物を作製するキットである。好ましくは、該キットは、前記メガヌクレアーゼのDNA切断部位を取り囲むNANOG遺伝子領域と相同性を有する配列に挟まれた、NANOG遺伝子を不活化する配列を含んでなるターゲティングDNAを更に含む。加えて、ノックイン細胞動物を作製するために、該キットはまた、前記細胞動物のゲノム中に導入される興味対象の配列と、上記で規定される選択マーカー遺伝子とを含んでなるベクターを含む。本発明の主題はまた、その必要がある個体における、上記で規定されるNANOG遺伝子中の変異により引き起こされる病的状態を予防、改善又は治癒する医薬の製造のための、上記で規定される少なくとも1つのメガヌクレアーゼ及び又は1つの発現ベクターの使用である。メガヌクレアーゼの使用は、少なくともドナー個体の体性組織において、二本鎖切断を、前記メガヌクレアーゼの少なくとも1つの認識切断部位を含んでなるNANOG遺伝子の興味対象部位に、前記切断部位を前記メガヌクレアーゼと接触させることにより誘導する工程、及び前記体性組織にターゲティングDNAを導入する工程切断部位を取り囲む領域と相同性を有するDNAと、ターゲティングDNAと染色体DNAとの間の組換えの際に、NANOG遺伝子を修復するDNAとを含むを含んでなり得る。ターゲティングDNAは、体性組織に、興味対象部位へのターゲティングDNAの導入に適切な条件下で導入される。本発明によれば、前記二本鎖切断は、エクスビボで、疾患個体からの体性細胞へ前記メガヌクレアーゼを導入し、その後改変細胞を疾患個体に移植し戻すことにより誘導され得る。本発明の主題はまた、その必要がある個体において、NANOG遺伝子の変異により引き起こされる病的状態を予防、改善又は治癒する方法であり、該方法は、前記個体に上記で規定される組成物を任意の手段により投与する工程を少なくとも含んでなる。メガヌクレアーゼは、ポリペプチドとして、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物として用いることができる。メガヌクレアーゼは、マウス細胞中に、当業者に周知の、特定細胞タイプに適切な任意の好都合な手段により、単独で又は少なくとも1つの適切なビヒクル若しくはキャリア及び又はターゲティングDNAと組合せて導入される。本発明による使用の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼは、以下のものと組み合わされる:-リポソーム、ポリエチレンイミン;この場合、組合せが投与され、したがって標的体性細胞に導入される。-膜移送ペプチド;この場合、バリアント単鎖メガヌクレアーゼの配列は、膜移送ペプチドの配列と融合される。本発明による使用の別の有利な実施形態によると、メガヌクレアーゼ及び又はターゲティングDNAは、ベクターに挿入される。ターゲティングDNA及び又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、種々の方法により細胞に導入することができる。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞中で安定的又は一過性に発現させることができる。真核細胞における発現技法は、当業者に周知である。所望により、組換えタンパク質中に、核局在化シグナルを組み込んで、核内でそれが発現されることを確実にすることが好ましくあり得る。一旦細胞中に入ると、メガヌクレアーゼ及び存在するならばターゲティングDNA及び又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、細胞質から核中の作用部位まで、細胞によって移入又は移送される。メガヌクレアーゼは特異的DNA配列を認識するので、ヒト遺伝子治療に関して開発される任意のメガヌクレアーゼは、当該部位が存在する限りにおいて、ヒトにおけるNANOGの遺伝子治療とは無関係の他の状況で使用し得る。治療目的には、メガヌクレアーゼ及び医薬的に許容される賦形剤は、治療有効量で投与される。この組合せは、投与量が生理学的に有意である場合、治療有効量で投与されると言う。作用剤は、その存在が、レシピエントの生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に有意である。本発明に関して、作用剤は、その存在が、標的疾患の1又はそれより多い症状の重篤度を低減させ、損傷又は異常のゲノム修正をもたらす場合、生理学的に有意である。ターゲティングDNA及び又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含んでなるベクターは、細胞中に、種々の方法により導入することができる。メガヌクレアーゼは、発現ベクターを用いて、細胞中で安定的又は一過性に発現させることができる。真核細胞における発現技法は、当業者に周知である。本発明による使用の1つの実施形態において、メガヌクレアーゼは、実質的に非免疫原性であり、すなわち、有害な免疫学的応答をほとんど又は全く生じない。この種の有害な免疫学的反応を緩和又は排除するための種々の方法を、本発明に従って用いることができる。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼは、Nホルミルメチオニンを実質的に含まない。望まない免疫学的反応を回避する別の方法は、メガヌクレアーゼをポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールのものに接合することである。Davisらにより記載されるようなPEG又はPPGとの接合は、例えば、抗ウイルス活性を有する、非免疫原性で、生理学的に活性な水溶性エンドヌクレアーゼ接合体を提供することができる。ポリエチレンポリプロピレングリコール共重合体も用いる類似の方法が、Saiferらに記載される。本発明はまた、上記で規定されるポリヌクレオチド又はベクター、好ましくは発現ベクターにより改変された原核又は真核宿主細胞に関する。本発明はまた、細胞の全て又は一部が上記で規定されるポリヌクレオチド又はベクターにより改変されていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物に関する。本明細書で用いる場合、細胞とは、原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば動物、植物若しくは酵母細胞をいう。本発明の主題はまた、上記で規定される少なくとも1つのメガヌクレアーゼバリアントの、他のメガヌクレアーゼを作製するための足場としての使用である。例えば、新規なメガヌクレアーゼを作製する目的で、更なる回の変異誘発及び選択スクリーニングを前記バリアントに対して行うことができる。本発明によるメガヌクレアーゼの種々の使用及びメガヌクレアーゼを使用する方法は、上記で規定される、ICreIバリアント、該バリアントに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼ、該バリアント又は単鎖キメラメガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又は非ヒトトランスジェニック哺乳動物の使用を含む。興味対象の遺伝子からのDNA標的を切断することができる単鎖キメラメガヌクレアーゼは、当該技術において周知の方法により、本発明によるバリアントから導かれる。このような方法はいずれも、本発明で規定されるバリアントに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼを構築するために適用し得る。本発明で規定されるバリアントをコードするポリヌクレオチド配列は、当業者に公知の任意の方法により調製し得る。例えば、これらは、cDNA鋳型から、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。好ましくは、前記cDNAのコドンは、所望の発現系における前記タンパク質の発現に好ましいように選択される。前記ポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターは、周知の組換えDNA及び遺伝子工学技法により取得して、宿主細胞に導入し得る。本発明で規定されるICreIバリアント又は単鎖誘導体は、上記で規定されるポリペプチドを発現させることにより生成される;好ましくは、該ポリペプチドは、ポリペプチドの発現又は共発現に適切な条件下で、1つの発現ベクター又は2つの発現ベクターにより改変された宿主細胞又はトランスジェニック動物植物で、発現又は共発現され、バリアント又は単鎖誘導体は、宿主細胞培養物又はトランスジェニック動物植物から回収される。本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常の技法を用いる。このような技法は、文献に充分に説明されている。例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology;MolecularCloningALaboratoryManual,第3版;OligonucleotideSynthesis;Mullisら米国特許第4683195号;NucleicAcidHybridization;TranscriptionAndTranslation;CultureOfAnimalCells;ImmobilizedCellsAndEnzymes;BPerbalAPracticalGuideToMolecularCloning;theseriesMethodsInENZYMOLOGY、具体的にはVol154及び155並びにVol185GeneExpressionTechnology;GeneTransferVectorsForMammalianCells;ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology;HandbookOfExperimentalImmunology,第I~IV巻;及びManipulatingtheMouseEmbryoを参照。定義-ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において、一文字コードに従って表記し、例えばQはGln又はグルタミン残基を意味し、RはArg又はアルギニン残基を意味し、DはAsp又はアスパラギン酸残基を意味する。-アミノ酸置換は、或るアミノ酸残基の別のアミノ酸残基での置換を意味する。例えば、ペプチド配列中におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置換がアミノ酸置換である。-変更された増強された増大した切断活性とは、標的DNA配列に対する第1のメガヌクレアーゼの活性と比較した、第2のメガヌクレアーゼによる標的DNA配列に対するメガヌクレアーゼ切断活性の検出レベルの増加をいう。通常、第2のメガヌクレアーゼは、第1のメガヌクレアーゼのバリアントであり、第1のメガヌクレアーゼと比較して1又はそれより多い置換されたアミノ酸残基を含んでなる。-iPS又はiPSCとは人工多能性幹細胞をいう。-清浄なiPS細胞は、最初はiPSへの再プログラム化のためにゲノムに挿入されていた導入遺伝子が、その後、清浄なiPSを取得するためにゲノムに痕跡無しで除去されており、古典的アプローチでのこれら導入遺伝子の永続的な発現に起因する、更なる再分化工程及び治療的使用における問題を回避するiPS細胞を意図する。-安全なiPSは、自己複製可能な性質を、例えば少なくとも該自己複製可能な細胞性質を付与するか又はこれに関わる遺伝子をノックアウトすることによって喪失しているiPS細胞を意図する。-安定したiPS細胞は、分化プロセスの所定段階で、より分化した細胞タイプへのiPS細胞の進行が不可逆となったiPS細胞を意図する。-清浄な及び又は安全な及び又は安定したiPSは、上記の性質の1又はそれより多くを含むiPS細胞を意図する。-再プログラム化プロセスは、iPS細胞への体性細胞の脱分化プロセスを意図する。-ヌクレオチドは、次のように指称する:ヌクレオシドの塩基を指称するために一文字コードを用いる:aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドについては、rはg又はaを表し、kはg又はtを表し、sはg又はcを表し、wはa又はtを表し、mはa又はcを表し、yはt又はcを表し、dはg、a又はtを表し、vはg、a又はcを表し、bはg、t又はcを表し、hはa、t又はcを表し、nはg、a、t又はcを表す。-エンドヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子内、好ましくはDNA分子内の核酸同士間の結合の加水分解を触媒することができる任意の野生型の又はバリアントの酵素を意図する。エンドヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子をその配列とは無関係に切断せず、DNA又はRNA分子を、標的配列又は標的部位と呼ばれる特異的なポリヌクレオチド配列で認識切断し、所定の遺伝子座での特異的なメガヌクレアーゼ誘導DNA二本鎖破断によるHRを有意に増加させる。エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、遺伝子工学的に操作されたジンクフィンガードメインとFokIのような制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は化学エンドヌクレアーゼであり得る。キメラエンドヌクレアーゼにおいて、化学又はペプチド切断物質は、特異的標的配列を認識する別のDNA又は核酸ポリマーのいずれかに結合され、そのことによって切断活性を特異的配列に対して標的化する。化学エンドヌクレアーゼはまた、オルトフェナントロリンとDNA切断分子と三重鎖形成性オリゴヌクレオチドとの接合体のような合成ヌクレアーゼを包含する。このような化学エンドヌクレアーゼは、本発明による用語エンドヌクレアーゼに含まれる。本発明の範囲には、特異的DNA配列と結合することができる分子と、DNAを切断することができるか又はDSB修復に関係する細胞タンパク質に干渉することができる因子試薬化学物質との間の任意の融合体が意図される;非限定例として、このような融合体は、DSB切断後のトポイソメラーゼの再ライゲーション活性を阻害することが知られている化学インヒビターに連結された特異的DNA配列結合ドメインにより構成され得る。エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、12~45bpの二本鎖DNA標的配列を有するエンドヌクレアーゼを意図する。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは当該分野で周知である。ホーミングエンドヌクレアーゼはDNA標的配列を認識し、一本鎖又は二本鎖破断を生じさせる。12~45塩基対長の範囲、通常は14~40bp長の範囲のDNA標的部位を認識するホーミングエンドヌクレアーゼは高度に特異的である。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、又はGIYYIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。前記メガヌクレアーゼは、各ドメインが単量体上にある二量体酵素、又は単一ポリペプチド上に2つのドメインを含んでなる単量体酵素のいずれかである。本発明によるエンドヌクレアーゼはまた、TALENに由来し得、FokI触媒ドメイン及びXanthomonas属の植物病原因子による感染プロセスで使用されるタンパク質ファミリーである転写アクチベーター様エフェクターに由来するDNA結合ドメインを用いる新たなクラスのキメラヌクレアーゼであり得る。FokIベースのTALEヌクレアーゼの機能的なレイアウトは、本質的には、ジンクフィンガーDNA結合ドメインがTALEドメインにより置換されているZFNのものである。このように、TALENによるDNA切断には、非特異的中心領域に接する2つのDNA認識領域が必要である。本発明に包含されるエンドヌクレアーゼはまた、TALENに由来し得る。本発明によるエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼ、すなわち転写アクチベーター様エフェクターに由来するDNA結合ドメインと1又は2の触媒ドメインとの間の融合体に由来し得る。-メガヌクレアーゼドメインは、メガヌクレアーゼのDNA標的の一方の半分と相互作用し、同じメガヌクレアーゼのDNA標的の他方の半分と相互作用する他のドメインと会合して該DNA標的を切断可能な機能的メガヌクレアーゼを形成することができる領域を意図する。-メガヌクレアーゼバリアント又はバリアントは、親のメガヌクレアーゼのアミノ酸配列中の少なくとも1つの残基を別のアミノ酸で置換することにより得られるメガヌクレアーゼを意図する。-ペプチドリンカーは、第1の単量体のC末端アミノ酸残基を第2の単量体のN末端残基と連結し、2つのバリアント単量体を活性に関して正しいコンホメーションを取らしめ、標的に対するいずれの単量体の特異性も変更しない、少なくとも10アミノ酸、好ましくは少なくとも17アミノ酸のペプチド配列を意味するものとする。-サブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的の半部位の異なる部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。-ターゲティングDNA構築物最小修復マトリクス修復マトリクスは、インシチュnでDNA標的の5及び3側の領域に相同である第1及び第2の部分を含んでなるDNA構築物を意味するものとする。DNA構築物はまた、第1及び第2の部分の間に位置する、インサイチュの対応するDNA配列と幾らかの相同性を有するか、或いはインサイチュでDNA標的の5及び3側の領域に相同性を有さない第3の部分を含んでなる。DNA標的の切断後、NANOG遺伝子を含有するゲノムと修復マトリクスとの間で相同組換え事象が刺激され、DNA標的を含有するゲノム配列は、修復マトリクスの第3の部分並びに修復マトリクスの第1及び第2の部分の変動し得る一部分により置換される。-機能的バリアントは、DNA標的配列を切断することができるバリアントを意図するものとする。好ましくは、前記標的は、親のメガヌクレアーゼにより切断されない新たな標的である。例えば、このようなバリアントは、DNA標的配列に接触するか又は該DNA標的と直接若しくは間接に相互作用する位置にアミノ酸変動を有する。-選択は、観察された特定の表現型、例えば変更された切断活性に基づく1又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの単離を意味するものとする。この選択は、観察がなされたペプチド形態のバリアントの選択であり得るか、或いは選択されたメガヌクレアーゼバリアントをコードするヌクレオチドの選択であり得る。-スクリーニングは、特定の表現型、例えば変更された切断活性を示す1又はそれより多いメガヌクレアーゼバリアントの逐次又は同時の選択を意味するものとする。-由来とは、親のメガヌクレアーゼから創出され、それ故にそのペプチド配列が親のメガヌクレアーゼのペプチド配列に関連するが該配列から得られるメガヌクレアーゼバリアントを意味するものとする。-ICreIは、配列表中の配列番号1の配列に相当するpdbアクセッションコード1g9yの配列を有する野生型ICreIを意図するものとする。-新規な特異性を有するICreIバリアントは、親のメガヌクレアーゼのものとは異なる標的切断パターンを有するバリアントを意図するものとする。等価で、同様に用いられる用語新規な特異性、改変された特異性、新規な切断特異性、新規な基質特異性とは、DNA標的配列のヌクレオチドに対するバリアントの特異性をいう。本特許出願では、記載される全てのICreIバリアントは、野生型ICreI配列の最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなる。これらバリアントはまた、野生型ICreI配列の最後のプロリンの後に2つの追加のアラニン残基及び1つのアスパラギン酸残基を含んでなる。これら追加の残基は、当該酵素の性質に影響しない。混乱を回避するために、これら追加の残基は、本特許出願で言及するICreI又はバリアント中の残基の番号付けに影響しない。なぜならば、これらへの言及は、専ら、バリアント中に存在する野生型ICreI酵素の残基をいうからである。例えば、ICreIの残基2は、実際には、最初のメチオニンの後に追加のアラニンを含んでなるバリアントの残基3である。-ICreI部位は、ICreIにより切断される22~24bpの二本鎖DNA配列を意図する。ICreI部位は、野生型非パリンドロームICreIホーミング部位及びC1221とも呼ばれる配列5t12c11a10a9a8a7c6g5t4c3g2t1a1c2g3a4c5g6t7t8t9t10g11a12のような派生パリンドローム配列を含む。-ドメイン又はコアドメインは、約100アミノ酸残基の配列に相当する、LAGLIDADGファミリーのホーミングエンドヌクレアーゼに特徴的なα1β1β2α2β3β4α3折り畳みであるLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインを意図する。ドメインは、DNA標的の一方の半分と相互作用する、逆平行βシートに折り畳まれた4つのβ鎖を含んでなる。このドメインは、DNA標的の他方の半分と相互作用する別のLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインと会合して、該DNA標的を切断可能な機能的エンドヌクレアーゼを形成することができる。例えば、二量体ホーミングエンドヌクレアーゼICreIの場合、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインは、残基6~94に相当する。-サブドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼDNA標的の半部位の異なる部分と相互作用するLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの領域を意図する。-キメラDNA標的又はハイブリッドDNA標的は、2つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体を意図する。加えて、標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。-βヘアピンは、ループ又はターンにより接続されたLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインの逆平行βシートの連続する2つのβ鎖を意図する。-単鎖メガヌクレアーゼ、単鎖キメラメガヌクレアーゼ、単鎖メガヌクレアーゼ誘導体、単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体又は単鎖誘導体は、ペプチドスペーサーにより連結された2つのLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼドメイン又はコアドメインを含んでなるメガヌクレアーゼを意図する。単鎖メガヌクレアーゼは、各親メガヌクレアーゼ標的配列の1つの異なる半分を含んでなるキメラDNA標的配列を切断することができる。-DNA標的、DNA標的配列、標的配列、標的部位、標的、部位、興味対象部位、認識部位、認識配列、ホーミング認識部位、ホーミング部位、切断部位は、ICreIのようなLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ又はバリアント又はICreIに由来する単鎖キメラメガヌクレアーゼにより認識切断される20~24bpのパリンドローム、部分的パリンドローム又は非パリンドロームの二本鎖ポリヌクレオチド配列を意図する。これらの用語は、そこでメガヌクレアーゼにより二本鎖破断が誘導される独特のDNA位置、好ましくはゲノム位置をいう。DNA標的は、C1221について上記で示したように、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖の5→3配列により定義される。DNA標的の切断は、センス鎖及びアンチセンス鎖についてそれぞれ2位及び2位のヌクレオチドで生じる。そうでないと記載しない限り、ICreIメガヌクレアーゼバリアントによるDNA標的の切断が生じる位置は、DNA標的のセンス鎖上の切断部位に相当する。-DNA標的半部位、半切断部位又は半部位は、各LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼコアドメインが結合する、DNA標的の部分を意図する。-キメラDNA標的又はハイブリッドDNA標的は、2つの親メガヌクレアーゼ標的配列の異なる半分の融合体を意図する。加えて、標的の少なくとも一方の半分は、少なくとも2つの別個のサブドメインが結合するヌクレオチドの組合せを含んでなり得る。-遺伝子は、特定のタンパク質又はタンパク質セグメントをコードする、染色体に沿って線状様式で整列したDNAセグメントからなる、遺伝の基本単位を意図する。遺伝子は、代表的には、プロモーター、5非翻訳領域、1又はそれより多いコーディング配列、任意にイントロン、3非翻訳領域を含む。遺伝子は、更に、ターミネーター、エンハンサー及び又はサイレンサーを含んでなり得る。遺伝子はまた、上記のようなこの遺伝子の1又は幾つかの部分を意図する。-NANOG遺伝子は、好ましくは脊椎動物のNANOG遺伝子又はその一部、より好ましくはヒトのような哺乳動物のNANOG遺伝子又はその一部を意図する。NANOG遺伝子配列は、NCBIGenBankデータベースのような配列データベースにおいて入手可能である。この遺伝子は、NC000012エントリーとしてデータバンクに記載されている。-NANOG遺伝子からのDNA標的配列、ゲノムDNA標的配列、ゲノムDNA切断部位、ゲノムDNA標的又はゲノム標的は、メガヌクレアーゼバリアント又は単鎖キメラメガヌクレアーゼ誘導体により認識切断される、上記で規定されたNANOG遺伝子の20~24bpの配列を意図する。-親のメガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼ又は野生型メガヌクレアーゼの同一の性質を有するバリアント、或いは同じメガヌクレアーゼの野生型バージョンと比較して幾らか変更された特徴を有するメガヌクレアーゼを意味するものとする。本発明において、親のメガヌクレアーゼとは、一連のバリアントが由来する当初のメガヌクレアーゼをいうことができる。-ベクターは、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意図する。-相同は、配列間での相同組換えを導くに充分な別の配列との同一性を有する配列、より具体的には少なくとも95同一性、好ましくは97同一性、より好ましくは99又は995を有する配列を意図する。-同一性とは、2つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性をいう。同一性は、比較のために整列させ得る各配列中の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基により占められる場合、それら分子は、当該位置において同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一の又は適合するヌクレオチドの数の関数である。種々のアラインメントアルゴリズム及び又はプログラムの一部として利用可能であるFASTA又はBLASTを含むを使用して、2つの配列間の同一性を算出してもよく、例えばデフォルト設定で使用することができる。-変異は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列中の1、2、3、4、5、6、10又はそれより多いヌクレオチドアミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。変異は、遺伝子のコーディング配列又はその調節配列に影響することがある。これはまた、ゲノム配列の構造又はコードされるmRNAの構造安定性に影響し得る。-興味対象の遺伝子又はGOIとは、既知又は推定の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列をいう。-本明細書中で使用する場合、用語遺伝子座は、染色体上でのDNA配列の特定の物理的位置である。用語遺伝子座とは、通常、染色体上でのエンドヌクレアーゼの標的配列の特定の物理的位置をいう。本発明によるエンドヌクレアーゼによって認識切断される標的配列を含んでなる遺伝子座は、本発明による遺伝子座と呼ばれる。-細胞、組織又は個体のゲノムの待避場遺伝子座は、導入遺伝子が安全に挿入され得、該挿入の結果としての遺伝子座の破壊又は欠失が該遺伝子座の外側に位置する遺伝子の発現を改変しない遺伝子座を意図する。NANOG遺伝子は、正常細胞中でサイレントであり、iPS細胞又はガン細胞中でのみ発現するので、良好な待避場遺伝子座である。-本明細書中で使用する場合、用語導入遺伝子とは、ポリペプチドをコードする配列をいう。好ましくは、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、該導入遺伝子を挿入する細胞、組織又は個体中で発現していないか、又は発現しているが生物学的に活性でない。最も好ましくは、導入遺伝子は、個体の治療に有用である治療用ポリペプチドをコードする。本発明の上記説明は、当業者が本発明の対象を製造し使用することができるように、その様式及び方法を提供する。この実施可能性は、特に、添付の特許請求の範囲の主題について提供される。上記で使用するように、句からなる群より選択される、から選択されるなどは、特定されたものの混合物を含む。本明細書中で数値限定又は範囲に言及する場合には終点は含まれる。また、数値限定内の全ての値又は部分的範囲は、あたかも明示的に記載されているように明確に含まれる。上記の説明は、当業者が本発明の対象を作製し、使用することができるように提示されており、特定の適用及びその要件に関して提供されている。好ましい実施形態の種々の改変が、当業者に容易に明らかとなる。本明細書中で規定される包括的原理は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施形態及び応用に適用され得る。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図しておらず、本明細書中に記載される原理及び特徴と一致する最も広い範囲を意図される。本発明を概説してきたので、或る具体例を参照することにより更なる理解を得ることができる。以下の非限定的な例は、本発明の幾つかの観点を説明する。実施例実施例1:NANOG2部位を標的とするメガヌクレアーゼの作製タンパク質設計コンビナトリアルアプローチを用いてICreIタンパク質のDNA結合ドメインを全体的に再設計することにより、所望のNANOG遺伝子標的について完全に操作された特異性を有する新規なメガヌクレアーゼを遺伝子操作することによって、NANOG2部位を標的とするICreIバリアントを創出した。本発明の概念全体を妥当化する、本発明者らにより同定されたDNA標的の幾つかを上記表Iに示す。これらDNA標的の誘導体を図3及び5に示す。図2に説明され、国際PCT出願WO2006097784及びWO2006097853に記載され、Arnouldら及びSmithらにも記載されるようなコンビナトリアルアプローチを使用して、ICreIタンパク質のDNA結合ドメインを再設計することにより、完全に操作された特異性を有する新規なメガヌクレアーゼを作製した。aNANOG2部位を標的とするバリアントの構築NANOG2部位は、作製されたメガヌクレアーゼバリアントの標的の例である。NANOG2標的配列又はNANOG21は、NANOG遺伝子のエキソン2中でNC000012エントリーの3786位~3809位に位置する。NANOG21配列は、図3に示される10AACP、5CCTP、10TAGP及び5GAGP標的配列の部分的な組合せである。これら配列は、国際PCT出願WO2006097784及びWO2006097853、Arnouldら及びSmithらに記載されるように得られたメガヌクレアーゼによって切断される。2つのパリンドローム標的NANOG23及びNANOG24、並びに2つの偽パリンドローム標的NANOG25及びNANOG26は、NANOG21及びNANOG22から得られた。NANOG23及びNANOG24はパリンドロームであるので、これらはホモ二量体タンパク質により切断される。したがって、配列番号10のNANOG23パリンドローム標的配列又は配列番号11のNANOG24パリンドローム標的配列のいずれかを切断するホモ二量体ICreIバリアントを、Chamesら、Arnouldら、Smithら及びArnouldらに記載される方法に由来する方法を用いて構築した。へテロ二量体を形成するとNANOG2標的配列を切断することができるICreIバリアントについて単鎖偏性へテロ二量体構築物を作製した。これら単鎖構築物を、リンカーRM2:を用いて作製した。この設計工程の間、変異K7E、K96Eを、NANOG23を切断する変異体中に、変異E8K、G19S、E61Rを、NANOG24を切断する変異体中に導入して、SCOHNANOG2と呼ばれる単鎖分子:単量体1RM2単量体2を創出した。ICreI誘導体の活性を増強する4つの追加のアミノ酸置換が以前の研究で見出された:これら変異は、フェニルアラニン54のロイシンでの置換、グルタミン酸80のリジンでの置換、バリン105のアラニンでの置換及びイソロイシン132のバリンでの置換に相当する。幾つかの組合せを、N末端及びC末端タンパク質フラグメントのコーディング配列中に導入し、得られるタンパク質の幾つかをNANOG2標的の切断を誘導する能力についてアッセイした。b哺乳動物細胞染色体外アッセイにおける幾つかのSCOHNANOG2バリアントの検証NANOG2標的に対する単鎖分子の活性を、本発明者らの内部コントロールSCOHRAG及びISceIメガヌクレアーゼと共に、記載されるCHOアッセイを用いてモニターした。全ての比較を、002~25ngのトランスフェクトバリアントDNAで行った。全ての単鎖分子が、表IIに列挙したように、CHOアッセイにおいてNANOG2標的切断活性を示した。バリアントは、有する変異プロフィールに依存して、アッセイ用量に対して特異的な挙動を有した。例えば、pCLS4412及びpCLS4414を除き全てが、低用量で、本発明者らの標準コントロールSCOHRAGと類似するプロフィール及び活性範囲を有し、DNA用量が漸増するにつれて最大に達して減少する。pCLS4412は、本発明者らの標準に類似するプロフィールを有し、ISceIと類似する範囲の活性を示す。pCLS4414は、低用量で、ISceIと本発明者らのSCOHRAG標準との中間の活性を示すが、25ngのトランスフェクトDNAまで安定なプラトーに達する。記載した全てのバリアントが強力に活性であり、NANOG2遺伝子座中に遺伝子を標的するために使用することができる。実施例2:NANOG4部位を標的するメガヌクレアーゼの作製aNANOG4部位を標的するバリアントの構築NANOG4部位は、作製されたメガヌクレアーゼバリアントの標的の例である。NANOG4標的配列又はNANOG41は、NANOG遺伝子のイントロン1中でNC000012エントリーの1222位~1245位に位置する。NANOG4配列は、図5に示される10TGAP、5GCTP、10AAGP及び5ATTP標的配列の部分的な組合せである。これら配列は、国際PCT出願WO2006097784及びWO2006097853、Arnouldら及びSmithらに記載されるように得られたメガヌクレアーゼによって切断される。2つのパリンドローム標的NANOG43及びNANOG44、並びに2つの偽パリンドローム標的NANOG45及びNANOG46は、NANOG41及びNANOG42から得られた。NANOG43及びNANOG44はパリンドロームであるので、これらはホモ二量体タンパク質により切断される。したがって、配列番号のパリンドローム標的NANOG43配列又は配列番号のNANOG44パリンドローム標的配列のいずれかを切断するホモ二量体ICreIバリアントを、Chamesら、Arnouldら、Smithら及びArnouldらに記載される方法に由来する方法を用いて構築した。へテロ二量体を形成するとNANOG4標的配列を切断することができるICreIバリアントについて単鎖偏性へテロ二量体構築物を作製した。これら単鎖構築物を、リンカーRM2を用いて作製した。この設計工程の間、変異K7E、K96Eを、NANOG43を切断する変異体中に、変異E8K、G19S、E61Rを、NANOG44を切断する変異体中に導入して、SCOHNANOG4と呼ばれる単鎖分子:単量体1RM2単量体2を創出した。ICreI誘導体の活性を増強する4つの追加のアミノ酸置換が以前の研究で見出された:これら変異は、フェニルアラニン54のロイシンでの置換、グルタミン酸80のリジンでの置換、バリン105のアラニンでの置換及びイソロイシン132のバリンでの置換に相当する。幾つかの組合せを、N末端及びC末端タンパク質フラグメントのコーディング配列中に導入し、得られるタンパク質の幾つかをNANOG4標的の切断を誘導する能力についてアッセイした。a哺乳動物細胞染色体外アッセイにおける幾つかのSCOHNANOG4バリアントの検証NANOG4標的に対する単鎖分子の活性を、本発明者らの内部コントロールSCOHRAG及びISceIメガヌクレアーゼと共に、記載されるCHOアッセイを用いてモニターした。全ての比較を、002~25ngのトランスフェクトバリアントDNAで行った。全ての単鎖分子が、表IIIに列挙したように、CHOアッセイにおいてNANOG4標的切断活性を示した。バリアントは、有する変異プロフィールに依存して、アッセイ用量に対して特異的な挙動を有した。例えば、pCLS4421、pCLS4422、pCLS4698及びpCLS4699は、本発明者らの標準コントロールSCOHRAGより高い活性範囲を有する。これらは、低用量で活性プラトーに達し、DNA用量の漸増に伴い安定である。pCLS4697、pCLS4701及びpCLS4702は、本発明者らの標準に類似するプロフィールを有し、ISceIと類似する範囲の活性を示す。pCLS4420は、低用量で、ISceIと本発明者らのSCOHRAG標準との中間の活性を示すが、25ngのトランスフェクトDNAより高い用量で最大に達する。記載した全てのバリアントが強力に活性であり、NANOG4遺伝子座中に遺伝子を標的するために使用することができる。実施例3:哺乳動物細胞におけるクローニング及び染色体外アッセイaCHOスクリーニング用ベクターにおけるNANOG2及びNANOG4標的のクローニングゲートウェイクローニング配列に接する標的配列に相当するオリゴヌクレオチドを用いて、標的を下記のとおりクローニングした;下記のオリゴヌクレオチドをPROLIGOに注文した。これらオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する:NANOG2:5TGGCATACAAGTTTCCAACATCCTGAACCTCAGCTACACAATCGTCTGTCA3NANOG4:5TGGCATACAAGTTTACTGAACGCTGTAAAATAGCTTAACAATCGTCTGTCA3単鎖オリゴヌクレオチドのPCR増幅により作製された二本鎖標的DNAを、Gatewayプロトコルを用いてCHOレポーターベクター中にクローニングした。標的をクローニングして、配列決定により検証した。b単鎖分子のクローニング一連の合成遺伝子アセンブリをGeneCustに注文した。NANOG遺伝子を標的する種々の単鎖バリアントをコードする合成遺伝子を、AscI及びXhoI制限部位を用いてpCLS1853中にクローニングした。c哺乳動物細胞における染色体外アッセイCHOK1細胞を実施例12に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、培養培地を取り出し、150μlのβガラクトシダーゼ液体アッセイ用溶解暴露緩衝液を加えた。37°Cでのインキュベーション後、ODを420nmで測定した。プロセス全体を、自動化Velocity11BioCelプラットフォームで実行した。アッセイあたり、150ngの標的ベクターを002又は08~25ngの漸増量のバリアントDNAと共トランスフェクトした。空のベクターを用いて、175ngまでの全量のDNAのトランスフェクトを完了した。本発明について多くの改変及び変形が上記の教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、本明細書中に具体的に記載されているもの以外で実施され得ると理解されるべきである。実施例4:内因性部位で誘導された変異誘発の検出ゲノムDNA二本鎖破断は、相同組換え又は非相同末端連結により修復することができる。相同組換えがゲノムの一体性を回復することができる場合、NHEJは、DSBでの小さな挿入又は欠失を生じる、エラーを起こし易い機構であると考えられる。したがって、同族の内因性遺伝子座でメガヌクレアーゼにより誘導された変異誘発の検出は、この特定部位に対するこのメガヌクレアーゼの活性全体を反映する。よって、NANOG2及びNANOG4DNA標的を切断するように設計されたメガヌクレアーゼを、同族の内因性部位で変異誘発を誘導する能力について分析した。NANOG2及びNANOG4標的をそれぞれ標的する単鎖ICreIバリアントを、pCLS1853プラスミドにクローニングした。得られるプラスミド、それぞれpCLS4415、pCLS4416、pCLS4417、pCLS4418、pCLS4421及びpCLS4422を、この実験に用いた。事前実験の当日、ヒト胚性腎臓細胞株293Hからの細胞を、10cmディッシュに1×106細胞ディッシュの密度で播種した。翌日、リポフェクタミンを用いて、細胞を空のプラスミドとメガヌクレアーゼ発現プラスミドとの組合せに相当する10μgのトータルDNAでトランスフェクトした。使用したプラスミド比は、10μg0μg、9μg1μg、5μg5μg、0μg10μgであった。トランスフェクションの48時間後、細胞を採集し、新鮮な培養培地に希釈した。7日間の培養後、細胞を採集し、ゲノムDNAを抽出した。300ngのゲノムDNAを使用して、メガヌクレアーゼ切断部位を取り囲む内因性遺伝子座をPCR増幅により増幅させた。各NANOG標的を取り囲むDNAフラグメントを特異的に増幅させた。特異的PCRプライマー対は下記のとおりである:NANOG2及びNANOG4をそれぞれ取り囲むフラグメントを増幅するために使用したA、B、及びC、D。PCR増幅を実行して、454配列決定システムで配列決定サービスを提供する企業により提供された特定のアダプター配列に接するフラグメントを取得した。2つのアンプリコンのプールから平均18000配列を取得した。配列決定後、上記アダプターの最初のものに導入したバーコード配列に基づいて、種々のサンプルを同定した。次いで、配列を、各NANOG標的の切断部位中の挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果を表IVにまとめる。InDel事象は、それぞれNANOG2及びNANOG4を標的する単鎖ICreIバリアントメガヌクレアーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞中で検出することができた。最後に、NANOG2を標的する単鎖ICreIバリアントpCLS4418及びNANOG4を標的するpCLS4421は、条件5μg5μgで、PCRフラグメント集団内でそれぞれ0317及び0323のInDel事象を検出することができたので、内因性遺伝子座で最高の活性を示す。表IVの説明:6つのメガヌクレアーゼを、2つの異なるDNA配列である、NANOG遺伝子内のNANOG2及びNANOG4をそれぞれ切断するように作製した。pCLSはプラスミドの識別番号及び対応する配列番号を表す。InDelは、メガヌクレアーゼプラスミド量について、特異標的を取り囲むアンプリコンの詳細な配列決定分析により決定されたメガヌクレアーゼ誘導変異誘発を表す。括弧内の値は配列決定バックグランドレベルを表す。類似する実験をiPS細胞中のNANOG4について行った。pCLS4421の代わりに、使用したプラスミドは、iPS細胞中での発現用のEF1aプロモーター下にクローニングされた同じ単鎖メガヌクレアーゼを有するpEF1a4421である。トランスフェクションの当日に、iPS細胞を、10μMのROCKiで処理した後、CDK処理により剥離させた。次いで、細胞を計数し、1条件あたり1×106の細胞を、溶液2及びB16プログラムを用いる幹細胞ヌクレオフェクションキットに従って、Amaxaヌクレオフェクターを用いるヌクレオフェクションによりトランスフェクトした。使用したプラスミド比は、10μg5μg、15μg0μg、0μg15μgであった。トランスフェクション後の細胞を、6ウェルプレートの1つのウェル中、Geltrexをコーティングしたディッシュで、10ngmlのFGF2を補充した馴化培地において播種した。2、3及び7日間の培養後、細胞を採集し、ゲノムDNAを抽出した。293H細胞について前記したように、300ngのゲノムDNAを使用して、メガヌクレアーゼ切断部位を取り囲む内因性遺伝子座を、PCRプライマー対C及びDを用いるPCR増幅により増幅させた。PCR増幅を実行して、454配列決定システムで配列決定サービスを提供する企業により提供された特定のアダプター配列に接するフラグメントを取得した。2つのアンプリコンのプールから平均18000配列を取得した。配列決定後、上記アダプターの最初のものに導入したバーコード配列に基づいて、種々のサンプルを同定した。次いで、配列を、各NANOG標的の切断部位中の挿入又は欠失事象の存在について分析した。結果を表Vにまとめる。InDel事象は、NANOG4を標的する単鎖ICreIバリアントメガヌクレアーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトした細胞中で検出することができた。最後に、NANOG4を標的する単鎖ICreIpEF1a4421は、条件15μgで、PCRフラグメント集団内で0503のInDel事象を検出することができたので、内因性遺伝子座で最高の活性を示す。実施例5:種々の細胞タイプにおけるNANOGメガヌクレアーゼ発現メガヌクレアーゼの効率は、細胞中での発現レベルに依存する。事実、メガヌクレアーゼが何らかの理由で細胞中で発現しない場合、ノックイン又はNHEJ実験は実行できなかった。したがって、検証するために、NANOG遺伝子を標的するメガヌクレアーゼの種々のアイソフォームを、ヒト胚性腎臓細胞株293H中での発現レベルについて評価した。NANOG2及びNANOG4標的をそれぞれ標的する単鎖ICreIバリアントを、pCLS1853プラスミドにクローニングした。得られるプラスミド、それぞれpCLS4415、pCLS4416、pCLS4417、pCLS4418、pCLS4421及びpCLS4422を、この実験に用いた。事前実験の当日、ヒト胚性腎臓細胞株293Hからの細胞を、10cmディッシュに1×106細胞ディッシュの密度で播種した。翌日、リポフェクタミンを用いて、細胞を空のプラスミドとメガヌクレアーゼ発現プラスミドとの組合せに相当する10μgのトータルDNAでトランスフェクトした。使用したプラスミド比は、10μg0μg、9μg1μg、5μg5μg、0μg10μgであった。トランスフェクションの48時間後、細胞を、タンパク質抽出のために採集した。細胞を、プロテアーゼインヒビターを含むRIPA緩衝液中で溶解させ、タンパク質上清をBCA定量により定量した。次いで、条件あたり20μgのタンパク質を、タンパク質分離用のプレキャストポリアクリルアミドゲルにロードした。ICre1由来のカスタムメガヌクレアーゼを認識するウサギポリクローナル抗ICreIN75抗体を用いるブロッティングのために、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。ヤギ抗ウサギIgGHRP二次抗体を用い、続いて化学発光ルミノール試薬とのインキュベーションによりて発色を行った。次いで、膜をx線フィルムに曝した。結果を図7パネルAに示す。全てのNANOGメガヌクレアーゼが293H細胞において発現し、その発現レベルはメガヌクレアーゼ発現プラスミドの量と共に増加する。同じプロセスに従って、iPS細胞中のNANOG4メガヌクレアーゼ発現もまた、pEF1a4421を用いて評価した。トランスフェクションの当日に、iPS細胞を10μMのROCKiで処理した後、CDK処理により剥離させた。次いで、細胞を計数し、1条件あたり1×106の細胞を、溶液2及びB16プログラムを用いる幹細胞ヌクレオフェクションキットに従って、Amaxaヌクレオフェクターを用いるヌクレオフェクションによりトランスフェクトした。使用したプラスミド比は、10μg5μg、15μg0μg、0μg15μgであった。トランスフェクション後の細胞を、6ウェルプレートの1つのウェル中、Geltrexをコーティングしたディッシュで、10ngmlのFGF2を補充した馴化培地において播種した。48日間の培養後、細胞を、タンパク質抽出のために採集した。細胞を、プロテアーゼインヒビターを含むRIPA緩衝液中で溶解させ、タンパク質上清をBCA定量により定量した。次いで、条件あたり20μgのタンパク質を、タンパク質分離用のプレキャストポリアクリルアミドゲルにロードした。ICre1由来のカスタムメガヌクレアーゼを認識するマウスモノクローナル抗ICreIN75抗体を用いるブロッティングのために、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。ヤギ抗マウスIgGHRP二次抗体を用い、続いて化学発光ルミノール試薬とのインキュベーションにより発色を行った。次いで、膜をx線フィルムに曝した。結果を図7パネルBに示す。NANOG4メガヌクレアーゼはiPS細胞において発現し、その発現レベルはメガヌクレアーゼ発現プラスミドの量と共に増加する。実施例6:清浄なiPS細胞の生成清浄なiPS細胞を作製するプロセスは、体性細胞のiPS細胞への再プログラミングを可能にするために、第1に、エンドヌクレアーゼを用いて再プログラム化転写因子を導入し、第2に、生成したiPS細胞において、再びメガヌクレアーゼを用いて導入遺伝子を除去して清浄なiPS細胞を取得することからなる。実施例6A:293H細胞における抜け落ちストラテジ検証このストラテジは、単鎖RAG1メガヌクレアーゼを用いて、293H細胞中、内因性RAG1遺伝子座で最初に検証した。事前実験の当日、ヒト胚性腎臓細胞株293Hからの細胞を、10cmディッシュに1×106細胞ディッシュの密度で播種した。翌日、リポフェクタミンを用いて、細胞を3μgの3Fマトリクスプラスミドと2μgのメガヌクレアーゼ発現プラスミドとの組合せに相当する5μgのトータルDNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞を採集し、新鮮な培養培地に希釈した。10日間の培養後、ネオマイシン選択を培養培地に加えた。17日目に、ネオマイシン耐性細胞を採取し、96ウェルプレート中に播種した。22日目に、プレートを複製した。1つのプレートは、標的事象を同定するためのPCRスクリーニング用に停止させ、第2のプレートは、KIポジティブクローンの更なる分析用に凍結した。PCRスクリーニングに使用した特異的PCRプライマー対は以下のとおりである:E、F。プライマーEは導入遺伝子上に位置する一方、プライマーFはメガヌクレアーゼにより標的される内因性遺伝子座上に位置する。こうして、標的事象のみが増幅される。標的事象の例を図17に示す。PCRスクリーニングの結果は、ネオマイシン耐性クローンのうち116が標的組込みを示すことが示した。この結果を検証するため、及び標的組込みのみを有するクローンを同定するために、サザンブロット実験を行った。15のポジティブクローンを選択した後、増幅させてコンフルエントな10cmディッシュを得た。次いで、ゲノムDNAを抽出し、EcoRVにより消化した。その後、配列番号88のneoプローブを用いてサザンブロットを行った。図18に示されるように、15クローンのうち、11クローンが独特な標的組込みを提示する。次いで、ISce1メガヌクレアーゼを用いて導入遺伝子を除去する抜け落ち実験のために1つのクローンを選択した。事実、3Fマトリクスは、2つのISce1部位を有するように設計されている。更に、3相同領域の上流に、5相同領域の端部が付加されている。このことにより、メガヌクレアーゼISce1が発現されると、痕跡なしに導入遺伝子の除去が可能になる。事前実験の当日、選択したクローンからの細胞を、10cmディッシュに1×106細胞ディッシュの密度で播種した。翌日、リポフェクタミンを用いて、細胞を6μgのメガヌクレアーゼ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞を採集し、新鮮な培養培地に希釈した。13日目に、クローンを採取し、96ウェルプレート中に播種した。21日目に、プレートを複製した。1つのプレートは、抜け落ち事象を同定するためのPCRスクリーニング用に停止させ、第2のプレートは、配列決定による更なる分析用に凍結した。KI事象検出用と同じPCRを使用して、標的組込みの喪失を同定した;この場合、プライマーE及びFによる増幅は観察されない。標的事象の喪失の例を図19に示す。抜け落ち事象候補を検出した。次いで、ポジティブクローンを配列検定分析に送り、導入遺伝子の切除を確証した。この方法論により、明確な抜け落ち事象が確証された。実施例6B:清浄なiPS細胞の生成293H細胞で検証されたストラテジを、線維芽細胞からの清浄なiPS細胞の生成に適用した。トランスフェクションの当日に、線維芽細胞を剥離し、計数した後、Amaxaヌクレオフェクター又はCytopulse技術を用いて、条件あたり1×106細胞のエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。高率の標的事象を得るために、幾つかのプラスミド比を評価して最良条件を同定する。メガヌクレアーゼプラスミドは、DNA又はRNAとして送達される。次いで、全てのトランスフェクト細胞を、6ウェルプレート形式のウェルにおいて線維芽細胞培地中にプレートする。トランスフェクション後3日目に、細胞をトリプシン処理し、10cmのコーティング済みディッシュ、BDBiosciencesにプレートする。5日目に、線維芽細胞培地を、抗生物質及びバルプロ酸を有する又は有さない馴化iPS培地で交換する。次いで、細胞を馴化iPS培地中で、iPSクローンが出現するまで維持する。クローンが規定サイズに達したら、それらを採取し、新たなディッシュに1クローンディッシュで再プレートする。その後、iPS状態について特徴付けるため、及び標的遺伝子座での独特な標的組込み事象から生成したiPSを同定するために、iPSクローンを増幅させる。唯一の独特な標的組込みを含有する真のiPSクローンを、次いで、ISce1メガヌクレアーゼでトランスフェクトして、導入遺伝子の抜け落ちを達成する。トランスフェクションの当日に、iPS細胞を10μMのROCKiで処理した後、CDK処理により剥離させる。次いで、細胞を計数し、1条件あたり1×106の細胞を、溶液2及びB16プログラムを用いる幹細胞ヌクレオフェクションキットに従って、Amaxaヌクレオフェクターを用いるヌクレオフェクションによりトランスフェクトする。或る範囲のメガヌクレアーゼプラスミド量を使用して、高率の抜け落ち事象を達成するための最良条件を同定する。その後、細胞を、クローン密度で、Geltrexをコーティングした10cmディッシュにおいて、10ngmlのFGF2を補充した馴化培地中に播種する。次いで、規定サイズに達したら、クローンを採取した後、PCRスクリーニングを行って増幅させ、抜け落ち事象を同定し、配列決定による更なる分析用に凍結貯蔵する。PCR及び配列決定分析により、清浄なiPS細胞が確証される。実施例7:NANOG4メガヌクレアーゼを用いるKIによるNANOGのKO種々のNANOGエンドヌクレアーゼを用いて、種々のストラテジを適用して、安全な及び安定したiPS細胞を作成することができる。特に、NANOG遺伝子のイントロン1を標的するNANOG4メガヌクレアーゼは、ノックインマトリクスを用いてNANOGのエキソン1を欠失させるために使用することができる。本発明者らのアプローチは、NANOGのエキソン1を、標的事象の同定を容易にするレポーター遺伝子により置換するために、このメガヌクレアーゼを使用することである。なぜならば、それはNANOG4調節エレメント下で発現するからである。エキソン1をメガヌクレアーゼ媒介相同組換えによりレポーター遺伝子で置換するために、組換えマトリクス中で、左相同領域は、エキソン1の前の5配列に相同であり、右相同領域は、NANOG4認識部位直後の3部分に相同である。NANOGノックアウトを達成するマトリクスは、同じ足場をベースにし、下記のものによって構成される:-発現が内因性NANOG調節エレメントにより制御される蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子;-内因性NANOG調節エレメント下での耐性遺伝子の発現を可能にするIRES又はT2Aタンパク質分解部位;-標的事象を選択し、NANOG二重KOを実行する選択カセット:ハイグロマイシン又はピューロマイシン;-ISce1メガヌクレアーゼを用いて導入遺伝子を除去するための2つのIsce1部位。切除を媒介するため、種々のバージョンの右相同領域が設計された。メガヌクレアーゼ媒介相同組換えの結果を図20Cに示す。前記のとおり、NANOGノックアウトiPS細胞からの導入遺伝子の除去を可能にするために、2つのISce1部位を付加した。このため、NANOGの不可逆的、可逆的又は清浄な可逆的KOを生じるように3つの異なるタイプのマトリクスを設計した。第1のマトリクスは、ISce1切除後にNANOGエキソン1とイントロン1の一部との欠失を導く古典的な左及び右相同領域によって構成される;よって、得られるiPS細胞はNANOGについて不可逆的KOであり、十分に安定化され且つ安全である。他の2つのマトリクスはNANOGKOの復帰を可能にする。事実、図21Bに記載される第2のマトリクスにおいて、NANOGエキソン1がISce1による導入遺伝子切除後にKINanog対立遺伝子を機能的に維持するように、左相同領域の端部が右相同領域の前に付加される。最後に、第3のマトリクスは、第2のものと類似し、NANOG遺伝子に痕跡なしで導入遺伝子の切除を可能にする、NANOG4認識部位の前に存在するイントロン1の一部が付加されている。これらマトリクスは、その後、以下のプロセスに従って安全な及び安定なiPS細胞を生成するために使用される:トランスフェクションの当日に、iPS細胞を10μMのROCKiで処理した後、CDK処理により剥離させる。次いで、細胞を計数し、1条件あたり1×106の細胞を、溶液2及びB16プログラムを用いる幹細胞ヌクレオフェクションキットに従って、Amaxaヌクレオフェクターを用いるヌクレオフェクションによりトランスフェクトする。高率の標的事象を得るために、幾つかのプラスミド比を評価して最良条件を同定する。その後、細胞を、クローン密度で、Geltrexをコーティングした10cmディッシュにおいて、10ngmlのFGF2を補充した馴化培地中に播種する。適応する選択を適用した後、耐性クローンを単離し、96ウェルプレートにプレートする。細胞がコンフルエントに達したら、プレートを複製し、1つを、内因性遺伝子座及び導入遺伝子の両方の増幅を可能にするプライマーを用いるPCRスクリーニングにより標的組み込みについてのポジティブクローンを同定するために使用する。次いで、ポジティブクローンをサザンブロット実験により検証して、独特の標的組込みが確証される。クローンは、おそらくモノ対立形質性の組込みを示すので、ポジティブクローンについて、第1のクローンの生成に使用したものとは異なる選択を有するマトリクスを用いて同じ実験を繰り返す。よって、両方の選択について耐性である細胞は、標的された両方のNANOG対立形質を有する。データを、PCR及びサザンブロット実験により検証する。使用するマトリクスに依存して、NANOG遺伝子のKOは、前記のように、可逆的又は非可逆的である。使用したマトリクスを下記の表に列挙する:改変及び他の実施形態記載したメガヌクレアーゼ生成物の、組成物及び方法、並び本発明の概念の種々の改変及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかになる。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求の範囲に記載された本発明が、そのような具体的実施形態に限定されることを意図していないと理解すべきである。医学、生物学、化学若しくは薬学分野又は関連分野の当業者に自明である、本発明を実施するために記載した態様の種々の改変は、下記の特許請求の範囲内であると意図される。本発明はまた、CNCM寄託物CNCMI4336及びCNCMI4337並びに前記それぞれの受託番号で受託されたプラスミド中の、NANOG2及びNANOG4バリアントをそれぞれコードするインサートに関する。本明細書中下記で特に規定されない限り、本明細書中で使用する全ての技術的及び科学的用語は、遺伝子治療、生化学、遺伝学及び分子生物学の分野の当業者が通常理解するものと同義である。本明細書中に記載したものと類似する又は等価な全ての方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用することができ、適切な方法及び材料は本明細書中に記載されている。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書が支配する。更に、材料、方法及び実施例は例示目的のみであり、そうでないと記載されない限り、限定的であることを意図していない。明細書中で引用した参考文献の一覧1YuJVodyanikMASmugaOttoKAntosiewiczBourgetJFraneJLTianSNieJJonsdottirGARuottiVStewartRSlukvinIIThomsonJAScience2007318191719202TakahashiKTanabeKOhnukiMNaritaMIchisakaTTomodaKYamanakaSCell20071318618723TakahashiKYamanakaSCell20061266636764ChambersIColbyDRobertsonMNicholsJLeeSTweedieSSmithACell2003May30113643555SilvaJNicholsJTheunissenTWGuoGvanOostenALBarrandonOWrayJYamanakaSChambersISmithACell2009Aug21138722376SilvaJBarrandonONicholsJKawaguchiJTheunissenTWSmithAPLoSBiol2008Oct216e2537DarrHMaysharYBenvenistyNDevelopment2006Mar13311932018DarrHBenvenistyNHandbExpPharmacol2006119Review9LiJPanGCuiKLiuYXuSPeiDJBiolChem2007Jul62821948192Epub2007May1510CapecchiMRScience1989Jun16244128892Review11SmithiesetalNatMed200171083612ThierryandDujonNucleicAcidsRes1992205625563113PuchtaetalNucleicAcidsRes1993215034504014RouetetalMolCellBiol1994148096810615ChoulikaetalMolCellBiol1995151968197316PuchtaetalProcNatlAcadSciUSA1996935055506017SargentetalMolCellBiol19971726727718CohenTannoudjietalMolCellBiol1998181444144819DonohoetalMolCellBiol1998184070407820ElliottetalMolCellBiol1998189310121ChevalierandStoddardNucleicAcidsRes2001293757377422SmithetalNucleicAcidsRes19992767468123BibikovaetalMolCellBiol20012128929724BibikovaetalGenetics20021611169117525BibikovaetalScience200330076426PorteusandBaltimoreScience200330076327AlwinetalMolTher20051261061728UrnovetalNature200543564665129PorteusMHMolTher20061343844630PaboetalAnnuRevBiochem20017031334031JamiesonetalNatRevDrugDiscov2003236136832RebarandPaboScience199426367167333KimandPaboProcNatlAcadSciUSA1998952812281734KlugetalProcNatlAcadSciUSA199491111631116735IsalanandKlugNatBiotechnol20011965666036CattoetalNucleicAcidsRes2006341711172037HockemeyeretalNatBiotechnol2009Sep27851738ChevalieretalNatStructBiol2001831231639ChevalieretalJMolBiol200332925326940MoureetalJMolBiol200333468569341SilvaetalJMolBiol19992861123113642BolducetalGenesDev2003172875288843IchiyanagietalJMolBiol200030088990144MoureetalNatStructBiol2002976477045ChevalieretalMolCell20021089590546EpinatetalNucleicAcidsRes20033129526247SeligmanetalGenetics19971471653166448SussmanetalJMolBiol2004342314149ArnouldetalJMolBiol200635544345850RosenetalNucleicAcidsRes2006344791480051SmithetalNucleicAcidsRes200634e14952DoyonetalJAmChemSoc20061282477248453GimbleetalJMolBiol2003334993100854AshworthetalNature200644165665955ArgastetalJMolBiol199828034535356JuricaetalMolCell1998246947657ChevalieretalBiochemistry200443140151402658PaquesFandDuchateauPCurrentGeneTherapy20077496659AubryLBugiALefortNRousseauFPeschanskiMPerrierALPNAS2008Oct281051670712Epub2008Oct1560TabarVPanagiotakosGGreenbergEDChanBKSadelainMGutinPHStuderLNatBiotechnol2005May236016Epub2005Apr2461JeterCRBadeauxMChoyGChandraDPatrawalaLLiuCCalhounDavisTZaehresHDaleyGQTangDGStemCells2009May27993100562RoyNSClerenCSinghSKYangLBealMFGoldmanSANatMed2006Nov12125968Epub2006Oct22ErratuminNatMed2007Mar1338563YouJSKangJKSeoDWParkJHParkJWLeeJCJeonYJChoEJHanJWCancerRes2009Jul1569571625Epub2009Jun3064JiJWerbowetskiOgilvieTEZhongBHongSHBhatiaMPLoSOne2009Nov304e806565JiLLiuYXYangCYueWShiSSBaiCXXiJFNanXPeiXTJCellPhysiol2009Oct221546666BrignierACGewirtzAMJAllergyClinImmunol2010Feb125S33644Epub2010Jan12Review67PhillipsBWCrookJMBioDrugs2010Apr12499108doi1021651153227000000000000000Review68BochJHScholzeetalBreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTALtypeIIIeffectorsScience32615091269CapecchiMRAlteringthegenomebyhomologousrecombinationScience24412889270ChristianMTCermaketalTargetingDNAdoublestrandbreakswithTALeffectornucleasesGenetics1867576171LiTSHuangetalTALnucleaseshybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNAcleavagedomainNucleicAcidsRes393597272MoscouMJandAJBogdanoveAsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectorsScience326150173SmithiesOFortyyearswithhomologousrecombinationNatMed710836"