"異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、請求項1に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターによって発現している、請求項1または2に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌である、請求項1~3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。前記異種細菌がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusである、請求項1~3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターがオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFの上流域または下流域に組み込まれ、該LDH遺伝子が該G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusに由来する、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項6~8のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項6~9のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項6~10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項6~10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。NITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEAP-1154で寄託されている、請求項6~12のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。前記工程が相同組換えにより行われる、請求項14に記載の方法。前記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを組み込む、請求項14または15に記載の方法。前記異種細菌がサーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌である、請求項14~16のいずれかに記載の方法。前記異種細菌がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusである、請求項14~16のいずれかに記載の方法。オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAコンストラクトを構築する工程と、前記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程とを備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。前記LDH遺伝子がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusに由来する、請求項19に記載の方法。前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項19に記載の方法。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項19~21のいずれかに記載の方法。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項19~21のいずれかに記載の方法。前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項19~23のいずれかに記載の方法。前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項19~23のいずれかに記載の方法。モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程をさらに備える、請求項19~25のいずれかに記載の方法。前記pyrF破壊株がモーレラサーモアセティカMoorellathermoaceticaATCC39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、請求項19~25のいずれかに記載の方法。前記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEP-1057で寄託されている株である、請求項27に記載の方法。請求項19~28のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子がフィルミクテスFirmicutes門クロストリジウムClostridia綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクト。前記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、請求項30に記載のDNAコンストラクト。前記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、請求項30に記載のDNAコンストラクト。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、請求項30~32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。前記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、請求項30~32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。前記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項30~34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。前記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、請求項30~34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。請求項1~13のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌または請求項14~28のいずれかに記載の方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。そこで、本発明は、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を提供することを課題とする。本発明者らは、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をモーレラ属細菌に導入し、かつ該遺伝子が発現すると、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を得られること、より詳細には、モーレラサーモアセティカATCC39073株野生株のウラシル生合成経路のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊することにより得たウラシル要求性株dpyrF株に、pyrFを選択マーカーとして、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicus39E株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子T-ldhを、その上流に野生株由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターG3PDプロモーターを連結して導入すると、NADHを補酵素とした場合に、野生株およびdpyrF株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼLDH活性が大幅に上昇し、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌株C31株MTA-T-ldh株を得られることを知得し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に掲げる1~37を提供する。1異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。2上記LDH遺伝子が相同組換えによってゲノムに組み込まれた、上記1に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。3上記LDH遺伝子が同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターによって発現している、上記1または2に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。4上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌である、上記1~3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。5上記異種細菌がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusである、上記1~3のいずれかに記載のモーレラ属細菌。6乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターがオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFの上流域または下流域に組み込まれ、上記LDH遺伝子が上記G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。7上記LDH遺伝子がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusに由来する、上記6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。8上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記6に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。9上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記6~8のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。10上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記6~9のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。11上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記6~10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。12上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記6~10のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。13NITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEAP-1154で寄託されている、上記6~12のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。14異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。15上記工程が相同組換えにより行われる、上記14に記載の方法。16上記LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを組み込む、上記14または15に記載の方法。17上記異種細菌がサーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌である、上記14~16のいずれかに記載の方法。18上記異種細菌がサーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusである、上記14~16のいずれかに記載の方法。19オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、上記pyrFおよび上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、上記LDH遺伝子がフィルミクテスFirmicutes門クロストリジウムClostridia綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクトを構築する工程と、上記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程とを備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法。20上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記19に記載の方法。21上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記19に記載の方法。22上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記19~21のいずれかに記載の方法。23上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記19~21のいずれかに記載の方法。24上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記19~23のいずれかに記載の方法。25上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記19~23のいずれかに記載の方法。26モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊する工程をさらに備える、上記19~25のいずれかに記載の方法。27上記pyrF破壊株がモーレラサーモアセティカMoorellathermoaceticaATCC39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られる、上記19~25のいずれかに記載の方法。28上記pyrF破壊株がNITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEP-1057で寄託されている株である、上記27に記載の方法。29上記19~28のいずれかに記載の方法によって作製された、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌。30オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、上記pyrFおよび上記G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、上記LDH遺伝子がフィルミクテスFirmicutes門クロストリジウムClostridia綱に属する乳酸生産性を持つ細菌に由来するDNAコンストラクト。31上記LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードする、上記30に記載のDNAコンストラクト。32上記LDH遺伝子が配列番号2のDNA塩基配列からなる、上記30に記載のDNAコンストラクト。33上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列がホストのモーレラ属細菌株またはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一である、上記30~32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。34上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列が配列番号3のDNA塩基配列に含まれる、上記30~32のいずれかに記載のDNAコンストラクト。35上記pyrFが配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードする、上記30~34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。36上記pyrFのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなる、上記30~34のいずれかに記載のDNAコンストラクト。37上記1~13のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌または上記14~28のいずれかに記載の方法によって作製された遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養する工程を備える乳酸の製造方法。本発明によれば、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌およびその製造方法が提供される。また、本発明によれば、乳酸生産性を付与した遺伝子組換えモーレラ属細菌を有機栄養的に培養して乳酸を製造する方法が提供される。モーレラ属細菌を乳酸等の有用物質の生産に利用することの利点としては、1培養が高温、無酸素の状態で行われるため、コンタミネーションの危険が非常に少ない、2芽胞形成菌であるため有用菌株を保存維持しやすい、3好熱性のモーレラ属細菌の培養温度50~60°Cに加熱するコストの方が酵母等の培養温度に冷却するコストに比べて安い、4培養温度が高温であるため、自然条件に左右されにくく、安定したオペレーションが可能になる、等が挙げられる。I.乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌である。上記LDH遺伝子をモーレラ属細菌のホストに組み込む方法は、特に限定されないが、相同組換えを用いることが好ましい。上記ホストに組み込まれた上記LDH遺伝子を発現するプロモーターは、特に限定されないが、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターが好ましい。上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクターThermoanaerobacter属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusがさらに好ましい。より詳細には、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターがオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFの上流域または下流域に組み込まれ、該LDH遺伝子が該G3PDプロモーターによって発現している乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌であって、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、かつ、該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来する、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌である。以下、本発明の乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌について詳細に説明する。1.モーレラ属細菌遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌ホストのモーレラ属細菌ともいう。は、モーレラサーモアセティカMoorellathermoacetica、モーレラサーモオートトロフィカM.thermoautotrophica、モーレラグリセリニM.glyceriniもしくはモーレラムルデリM.mulderiに分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されないが、モーレラサーモアセティカが好ましく、なかでも、ATCC39073株またはその変異株がより好ましく、ATCC39073株のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊して作出したウラシル要求性変異株である、NITEP-1057株がさらに好ましい。ここで、細菌分類学的にモーレラMoorella属に分類される細菌とは、IJSEMInternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology誌にモーレラMoorella属として発表された細菌またはバージェイズマニュアルDeVosPaul、外7名編、BergeysManualofSystematicBacteriology、第2版、第3巻、米国、シュプリンガー、2009年に従って分類した場合にモーレラ属に分類することが適当であると認められる細菌をいう。本発明において、ホストのモーレラ属細菌に遺伝子組換えを行った結果作出されるモーレラ属細菌は、形態、資化性、醗酵性その他の表現形質が種の定義に合致しない場合であっても、ホストのモーレラ属細菌と同種とみなす。本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌としては、後記する本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌の製造方法に従って作出された形質転換株であって、NITE特許微生物寄託センターNPMDに寄託された、受託番号NITEAP-1154をもつ細菌株が特に好ましい。2.乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれる乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusに由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼLDHは、NAD依存型L-乳酸デヒドロゲナーゼEC1.1.1.27であり、下記式の反応を触媒する。なお、本発明において、遺伝コードは標準コードと一部異なり、翻訳開始コドンとして、ATGAUGの他、TTGUUG、CTGCUG、GTGGUG、ATTAUU、ATCAUC、ATAAUAも使用され得る。翻訳開始コドンとして使用されるときはメチオニンMet,Mをコードするが、翻訳開始コドン以外として使用されるときは、標準コードと同じく、TTGUUGおよびCTGCUGはロイシンLeu,Lを、ATTAUU、ATCAUCおよびATAAUAはイソロイシンIle,Iを、GTGGUGはバリンVal,Vを、それぞれコードする。また、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌においては、上記LDH遺伝子は、その上流に組み込まれたグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターにより発現される。3.グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼリン酸化GAPDH,EC1.1.1.12は、解糖系/糖新生に関与する酵素であり、D-グリセルアルデヒド-3-リン酸と1,3-ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し下記反応式、常時発現している。モーレラ属細菌のゲノムに組み込まれるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターは、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一であるもの、が好ましい。上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列は、配列番号3のDNA塩基配列に含まれるものが好ましい。上記G3PDプロモーターは、その周辺の領域とともにホストのモーレラ属細菌のゲノムに組み込まれてもよく、G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に直接連結されてホストのモーレラ属細菌のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFの上流域または下流域に組み込まれることが好ましい。上記G3PDプロモーターを含む領域は、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子を発現しうるものであれば、G3PDプロモーター部分以外のDNA塩基配列は特に限定されないが、上記G3PDプロモーターを含む領域のDNA塩基配列としては、そのG3PDプロモーターが由来する菌株のG3PDプロモーターおよびその周辺領域のDNA塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号3のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。4.オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼOMPデカルボキシラーゼ,EC4.1.1.23をコードする遺伝子である。OMPデカルボキシラーゼは、ピリミジンの生合成に関与する酵素であり、オロチジンモノリン酸OMPを脱炭酸してウリジンモノリン酸UMPに変換する反応を触媒する下記化学式。この酵素はウリジン三リン酸およびシチジン三リン酸のdenovoの生合成に不可欠である。したがって、pyrFが破壊された菌株は、ウラシル要求性変異株となる。上記オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFは、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のpyrFであってもよい。外来性のpyrFとしては、ホストのモーレラ属細菌種と同一種の細菌に由来するものが好ましく、ホストのモーレラ属菌株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。上記pyrFとしては、配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼをコードするものが好ましく、そのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌のゲノムにおいては、pyrFの上流域または下流域に、G3PDプロモーター領域およびLDH遺伝子が配置されるが、pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置は、G3PDおよびLDHがpyrFの上流域または下流域に挿入された配置であって、pyrFおよびLDHが正常に発現する配置であれば特に限定されない。5.乳酸生産性本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌において、乳酸生産性は、有機栄養的に培養した場合に乳酸を生産する能力があることをいう。有機栄養的に培養する場合の炭素源としては、本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌が資化できるものであれば特に限定はされないが、例えば、グルコース、フルクトース等のヘキソース類が挙げられる。II.乳酸生産性を持つモーレラ属細菌の製造方法本発明において、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子が発現している、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造する方法は、特に限定されないが、異種細菌に由来する乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子をモーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌を作製する方法によることが好ましい。上記工程において、LDH遺伝子を組み込む方法は特に限定されないが、相同組換えにより行うことが好ましい。LDH遺伝子を組み込む際に、LDH遺伝子とともに、同種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを組み込むことが好ましい。上記異種細菌は、特に限定されないが、サーモアナエロバクテアリアThermoanaerobacteriales目に帰属する細菌が好ましく、サーモアナエロバクターThermoanaerobacter属に帰属する細菌がより好ましく、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusがさらに好ましい。また、本発明において、G3PDプロモーターおよびLDH遺伝子を、pyrFの上流域または下流域に組み込んで乳酸生産性を持つモーレラ属細菌を製造する方法は特に限定されないが、オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、該G3PDプロモーターを含む領域が該LDH遺伝子の上流に該LDH遺伝子を発現するように連結され、該G3PDプロモーターおよび該LDH遺伝子が該pyrFの上流域または下流域に挿入されたDNAコンストラクトであって、該pyrFおよび該G3PDプロモーターがホストのモーレラ属細菌種に由来し、かつ、該LDH遺伝子が配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするDNAコンストラクトを構築する工程と、前記DNAコンストラクトをモーレラ属細菌のpyrF破壊株に形質転換する工程とを備える方法が好ましい。1.DNAコンストラクトターゲティングベクター本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌を製造するためのDNAコンストラクトターゲティングベクターは、骨格となるプラスミドベクターおよび相同組換え領域を含むものが好ましく、さらに薬剤耐性感受性遺伝子を含んでもよい。1-1.相同組換え領域上記相同組換え領域は、オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrF、その上流域および下流域、乳酸デヒドロゲナーゼLDH遺伝子ならびにグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記LDH遺伝子の上流に上記LDH遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記LDH遺伝子が上記pyrFの上流域または下流域に挿入されたものが好ましい。1-1-2.LDH遺伝子前記LDH遺伝子としては、配列番号1のアミノ酸配列からなる乳酸デヒドロゲナーゼをコードするものであれば特に限定されないが、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicusに由来するもの、または配列番号2のDNA塩基配列からなるものが好ましい。1-1-3.G3PDプロモーター前記G3PDプロモーターとしては、ホストのモーレラ属細菌種に由来するもの、すなわち、ホストのモーレラ属細菌と同種のモーレラ属細菌に由来するもの、であれば特に限定されないが、ホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株に由来するもの、またはホストのモーレラ属細菌株もしくはその野生株のG3PDプロモーターのDNA塩基配列と同一であるもの、が好ましい。上記G3PDプロモーターのDNA塩基配列は、配列番号3のDNA塩基配列に含まれるものが好ましい。上記G3PDプロモーターを含む領域は、上記G3PDプロモーターが上記LDH遺伝子を発現しうるものであれば、G3PDプロモーター部分以外のDNA塩基配列は特に限定されないが、上記G3PDプロモーターを含む領域のDNA塩基配列としては、そのG3PDプロモーターが由来する菌株のG3PDプロモーターおよびその周辺領域のDNA塩基配列と同一であることが好ましく、配列番号3のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。1-1-4.pyrF上記pyrFは、モーレラ属細菌のpyrF破壊株に導入したとき正常に機能するタンパク質を発現するものであれば、特に限定されず、ホストのモーレラ属細菌に由来するものであってもよいし、外来性のpyrFであってもよい。外来性のpyrFとしては、モーレラ属細菌のpyrF破壊株と同一種の細菌に由来するものが好ましく、モーレラ属細菌のpyrF破壊株と同一株またはその野生株に由来するものがより好ましい。上記pyrFとしては、配列番号4のアミノ酸配列からなるオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼEC4.1.1.23をコードするものが好ましく、そのDNA塩基配列が配列番号5のDNA塩基配列からなるものがより好ましい。上記pyrFの上流域は、そのpyrFが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるpyrF翻訳領域の上流域をいい、長さは特に限定されないが、約2kb以下が好ましく、約1kb程度がより好ましい。上記pyrFの下流域は、そのpyrFが由来するモーレラ属細菌株のゲノムにおけるpyrF翻訳領域の下流域をいい、長さは特に限定されないが、約2kb以下が好ましく、約1kb程度がより好ましい。1-1-6.pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置pyrF、G3PDおよびLDH遺伝子の配置は、G3PDおよびLDHがpyrFの上流域または下流域に挿入された配置であって、pyrFおよびLDHが正常に発現する配置であれば特に限定されない。1-2.DNAコンストラクトターゲティングベクターの構築方法DNAコンストラクトターゲティングベクターの構築方法としては、特に限定されず、適当なプラスミドベクターに上記相同組換え領域を組み込む方法が挙げられる。プラスミドベクターに相同組換え領域を組み込む方法としては、従来公知の方法を使用することができ、例えば、相同組換え領域の全部を含むDNAフラグメントを作製し、リニア化したプラスミドベクターにDNAリガーゼ等を用いて連結する方法、pyrF、その上流域および下流域を組み込んだ組換えベクターを作製しておき、pyrFの上流域または下流域を制限酵素等で切断してプラスミドベクターをリニア化し、G3PD領域に対応するDNA断片およびLDH遺伝子に対応するDNA断片をG3PD領域がLDH遺伝子の上流に連結されるように、DNAリガーゼ等を用いて連結する方法等が挙げられる。プラスミドベクターは、相同組換えに利用することができるものであれば特に限定されず、用いることができ、例えば、プラスミドpK18mobが挙げられる。DNAコンストラクトの構築は、例えば、Gatewayシステムインビトロジェン、Red/ETリコンビネーションシステムオープンバイオシステムズ、In-FusionPCRクロンテック等を用いて行うことができる。2.オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼpyrF破壊株pyrF破壊株の作出方法は特に限定されないが、モーレラ属細菌の野生株またはpyrF未破壊株のpyrFを相同組換えによって破壊したものが好ましい。前記pyrF破壊株としては、モーレラ属細菌株のpyrFを破壊したものであれば特に限定はされないが、モーレラサーモアセティカMoorellathermoaceticaATCC39079株のpyrFを相同組換えによって破壊して得られるものが好ましく、NITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEP-1057で寄託されているものがより好ましい。3.形質転換上記DNAコンストラクトターゲティングベクターを上記pyrF破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、DNAコンストラクトの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。大腸菌およびモーレラ属細菌の両方で複製するシャトルベクターでない場合には、pyrF破壊株への導入方法としては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。上記方法によって形質転換をして製造されたモーレラ属細菌としては、NITE特許微生物寄託センターNPMDに受託番号NITEAP-1154で寄託されているものが挙げられる。以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。本実施例では、モーレラサーモアセティカMoorellathermoaceticaATCC39073株野生株またはWTともいう。のpyrF破壊、ウラシル要求性変異株dpyrF株に、当該ATCC39073株由来のpyrF、サーモアナエロバクターシュードエタノリクスThermoanaerobacterpseudethanolicus39E株由来のL-乳酸デヒドロゲナーゼT-LDH遺伝子T-ldh、およびT-ldhを発現するための当該ATCC39073株由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターG3PDプロモーターを導入して、ウラシル要求性の除去および乳酸生産性の付与を行い、乳酸生産性を持つ遺伝子組換えモーレラ属細菌C31株MTA-T-ldh株を作製した。さらに、作製したC31株MTA-T-ldh株、dpyrF株および野生株WTについて、フルクトースを炭素源として培養した場合のldh転写量、LDH酵素活性、乳酸および酢酸の生産量を対比した。1.pyrF破壊株dpyrF株の作製モーレラサーモアセティカATCC39073株のpyrFを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。1遺伝子破壊ベクターpK18-dpyrFの構築以下の手順でモーレラサーモアセティカATCC39073株のオロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊するためのベクターを構築した。[遺伝子破壊ベクターpK18-dpyrFの構築]モーレラサーモアセティカATCC39073株を完全合成培地改変ATCC1754PETCMedium、表22Aを参照に植菌し、55°Cで嫌気的に培養した。培養後、NucleoSpinTissueMACHEREY-NAGEL社製を用いてトータルDNAを抽出した。まず、表1に示したプライマーpyrF-up-F1配列番号6:5tgacgttctagaccctacctctccaagattacc3とpyrF-up-R1配列番号7:5tgacgtactagtggcaagcaggccagaag3との組合せ、およびpyrF-dn-F1配列番号8:5tgacgtactagtaacttcggcctgctttcatgc3とpyrF-dn-R1配列番号9:5tgacctgatatctgtccaagcttatgcaccttcc3との組合せを用いて、表2に示す反応液の組成で、表3に示す条件でPCRを行い、pyrFの上流域および下流域のそれぞれ約1000bpを増幅した。表2において、プライマーFとプライマーRとの組合せは、上記組合せである。また、テンプレートDNAは、モーレラサーモアセティカATCC39073株のトータルDNAである。なお、KOD-Plus-NeoPCR酵素、10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo、2mMdNTPsおよび25mMMgSO4は、KOD-Plus-Neo東洋紡社製に含まれるものを用いた。図1に示すとおり、プライマーpyrF-up-F1配列番号6およびpyrF-up-R1配列番号7は、pyrFの上流の隣接領域を増幅し、pyrF-dn-F1配列番号8およびpyrF-dn-R1配列番号9は、pyrFの下流の隣接領域を増幅する。得られたPCR産物を、制限酵素SpeIで処理した後に、MagExtracterKit東洋紡を用いて精製を行い、pyrF上流域のPCR産物を5μL、下流域のPCR産物を5μL、LigationhighVer.2東洋紡を10μL混合し、16°Cで30分間インキュベートし、ライゲーション産物をテンプレートDNAとして、プライマーpyrF-up-F1配列番号6およびpyrF-up-R1配列番号7を用いて、表4に示す反応液組成で、表5に示す条件でPCRを行った。なお、KOD-Plus-NeoPCR酵素、10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo、2mMdNTPsおよび25mMMgSO4は、KOD-Plus-Neo東洋紡社製に含まれるものを用いた。得られたPCR産物をMagExtractorKit東洋紡製を用いてゲル抽出を行った後、2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigationhighVer.2東洋紡製と混合し、16°Cで1時間インキュベートし、EscherichiacoliHST08Premiumコンビテントセルタカラバイオ製にライゲーション溶液10μLを添加して軽く撹拌した後、氷中に10分静置し、42°Cで1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。SOC培地を1mL加え、37°Cで1時間インキュベート後、LB寒天培地カナマイシン、X-gal、IPTG含有に塗沫し、37°Cで一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。[遺伝子破壊ベクターの確認]上記遺伝子破壊ベクターpk18-dpyrFの構築で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したLB培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF-up-Fl配列番号6、pyrF-dn-R1配列番号9を用いた。コロニーダイレクトPCRの反応液組成を表6に、反応条件を表7に示す。コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、SapphireAmpFastPCRMasterMix2×Premixおよび滅菌蒸留水は、SapphireAmpRPCRMasterMixタカラバイオ社製に含まれるものを用いた。得られたPCR産物について、電気泳動によりバンドを確認した。バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。吸光度による濃度測定および電気泳動による確認後、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的の遺伝子破壊ベクターpk18-dpyrFが構築できていることを確認した。2pyrF破壊株dpyrF株の作製上記1で構築した遺伝子破壊ベクターpK18-dpyrFを、以下の手順で、モーレラサーモアセティカATCC39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってpyrFが破壊された株dpyrF株を選抜した。[ATCC39073株への遺伝子破壊ベクターの導入]272mMスクロース、16mMHEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH7に合わせたHS緩衝液を調製し、20分間N2ガスで溶存酸素を置換した。80の水素、20の二酸化炭素の混合ガスを基質とし、改変型ATCC1754PETC培地、またはグリシンを終濃度5g/Lになるように添加した改変型ATCC1754PETC培地で、モーレラサーモアセティカATCC39073株を培養した。菌体濃度がOD600で約0.3になるまで培養し、培養液約100mL分を集菌した後、HS緩衝液で菌体を2回洗浄した。洗浄した菌体を適当な量のHS緩衝液約3mLに懸濁し、懸濁液380μLとプラスミド20μLとを混合した。GenePulserXcellTMエレクトロポレーションシステムバイオラッドラボラトリーズおよび電極間距離ギャップ0.2cmのエレクトロポレーションキュベットバイオラッドラボラトリーズを用いて、1.5kV、500Ω、50μFでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の懸濁液を、ピルビン酸40mMの終濃度で添加した5mLの培地に植菌し、55°Cで2日間培養後に、ウラシル10μg/mL、5-フルオロオロチン酸5-FOA0.2の終濃度で添加した寒天培地に植菌し、ロールチューブを作製した。[ダイレクトPCRによるpyrF破壊株dpyrF株の確認]上記寒天培地に形成された20個のコロニーを、5mLのウラシル10μg/mL、5-FOA0.2の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養3日目に培地が濁っていることが確認できた6株を選択し、培養液1mLを集菌した。アクロモペプチダーゼ20mg/mLリゾチーム20mg/mLの入ったTE緩衝液20μLで懸濁し、37°Cで5分間インキュベートし、DMSOを20μL添加して懸濁し、PCRの鋳型とした。下記表に示すプライマーのうち、pyrF-up-F2配列番号10:5tgtcctcaacaccctcacc3とpyrF-dn-R2配列番号11:5tcttcccaggtcctgtagg3、pyrF-up-F3配列番号12:5tgtcctcaacaccctcacc3とpyrF-dn-R3配列番号13:5tcttcccaggtcctgtagg3、またはpyrF-F配列番号14:5acctgaagttccacgacatcc3とpyrF-R配列番号15:5ggtcacgatgacgaactc3との組合せを用い、各々の組合せについて、表9に示す反応液組成で、表10に示す反応条件でコロニーダイレクトPCRを行い、電気泳動によりバンドを確認した。表9において、プライマーFとプライマーRとの組合せは、上記組合せである。また、コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、KODFXPCR酵素、2×PCRBufferforKODFXおよび2mMdNTPsは、KODFX東洋紡社製に含まれるものを用いた。ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを20株選択し、液体培地10μg/mLウラシル、0.25-FOAにて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトPCRによる確認を行った。培養3日目に増殖が確認できた6株について、プライマーpyrF-up-F2配列番号10とpyrF-dn-R2配列番号11との組合せ、またはpyrF-up-F3配列番号12とpyr-dn-R3配列番号13との組合せを用いて、pyrFの外側からPCRを行ったところ、6株中1株において、野生株よりも短いバンドが確認できた。さらに、プライマーpyr-F配列番号14とpyrF-R配列番号15との組合せを用いて、pyrFの内側をPCRしたところ、前述の株においてはバンドが確認できなかった。これらの結果から、野生株よりも短いバンドを確認できた株がpyrF破壊株dpyrF株である可能性があると判断し、ゲノムDNA抽出を行った後に、もう一度PCRを行った。その結果、ダイレクトPCRの際と同様のバンドパターンが得られた。さらに、pyrFが破壊された部分には、制限酵素SpeIサイトが1カ所付与されることからプライマーpyrF-up-R1、pyrF-dn-F1参照、上記のPCR産物についてSpeIで消化したところ、SpeIサイトで切断が起こり、バンドが2本になることを確認した。次に、pyrF破壊候補株についてウラシル要求性試験を行った。酵母エキスを除いた改変型ATCC1754PETC培地に、pyrF破壊株を植菌し、10μg/mLの終濃度でウラシルを添加した場合と添加しなかった場合とで増殖の確認を行った。その結果、ウラシルを添加したサンプルでは、培養2日目には菌体の増殖が確認できたが、ウラシルを添加しなかったサンプルにおいては、増殖が確認できなかった。これらの結果から、pyrFの破壊が確認できた。このpyrF破壊株は、受託番号NITEP-1057として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターNPMDに寄託されている。2.T-ldh導入株の作製1pyrF相補ベクターpK18-epyrFの構築[pyrF相補ベクターpK18-epyrFの構築]以下に示すプライマーpyrF-up-F1配列番号6とpyrF-dn-R1配列番号9との組み合わせを用いて、以下の条件でPCRを行い、pyrF遺伝子翻訳領域とその5’側の約1000bp、3’側の約1000bpを含む約2.7kbの遺伝子断片を増幅した。なお、KODFXPCR酵素、2×PCRBufferforKODFXおよび2mMdNTPsは、KODFX東洋紡社製に含まれるものを用いた。得られたPCR産物についてMagExtractorKit東洋紡製を用いてゲル抽出を行った。2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigationhighVer.2東洋紡製と混合し、16°Cで1時間インキュベートした。EscherichiacoliHST08Premiumコンピテントセルタカラバイオ製にライゲーション溶液10μLを添加して軽く攪拌した。氷中に10分静置した。42°Cで1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。SOC培地を1ml加え、37°Cで1時間インキュベート後、LB寒天培地カナマイシン、X-gal、IPTG含有に塗沫した。37°Cで一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。[pyrF相補ベクターの確認]上記1で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加LB寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーはpyrF-up-F1配列番号6、pyrF-dn-R1配列番号9を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を以下に示す。なお、KODFXPCR酵素、2×PCRBufferforKODFXおよび2mMdNTPsは、KODFX東洋紡社製に含まれるものを用いた。電気泳動によりバンドを確認した。バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。吸光度による濃度測定、およびEcoRIまたはPstI処理サンプルの電気泳動を行った。さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のpyrF遺伝子相補ベクターpK18-epyrFが構築できていることを確認した。2T-ldh導入用相補ベクターpK18-ldhの構築T.pseudethanolicus39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子T-ldhを取得し、上記2で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpK18-epyrFのpyrF遺伝子領域へ挿入し、T-ldh遺伝子導入用相補ベクターpK18-ldhを構築することを目的とした。形質転換のためのホストは、モーレラサーモアセティカATCC39073株のpyrF遺伝子破壊株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託したNITEP-1057株を用いた。[In-FusionPCRによるT-ldh導入用相補ベクターpK18-ldhの構築]T.pseudethanolicus39E株のTotalDNA、およびプライマーpyrF-1765-F配列番号16:5tcggcctgctttcatgcttg3とpyrF-1764-R配列番号17:5agttattatttcaccatctctatttc3とを用いて、pyrF相補ベクターpK18-epyrFを鋳型として、pyrF領域を含むベクター領域をPCR増幅した。PCRの条件は以下の通りである。なお、KODFXPCR酵素、2×PCRBufferforKODFXおよび2mMdNTPsは、KODFX東洋紡社製に含まれるものを用いた。プライマーG3PD-F11配列番号18:5ggtgaaataataactggacggttgccaagtacc3とG3PD-SD-R12配列番号19:5tatgtactcctccttatatttattgtaacg3とを用いて、ATCC39073株由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のSD配列を含むプロモーター領域G3PDプロモーター領域を増幅した。PCRの条件は以下の通りである。なお、KOD-Plus-NeoPCR酵素、10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo、2mMdNTPsおよび25mMMgSO4は、KOD-Plus-Neo東洋紡社製に含まれるものを用いた。T.pseudethanolicus39E株のTotalDNA、およびプライマーldh-F-1配列番号20:5aaggaggagtacataatgaacaaaatatctataataggttc3とldh-R-1配列番号21:5atgaaagcaggccgattatatatcaagctcttgtattacac3との組合せを用いて、T.pseudethanolicus39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子T-ldhを増幅した。PCRの条件は以下の通りである。PCR反応終了後、各PCR産物をゲル抽出した。なお、KOD-Plus-NeoPCR酵素、10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo、2mMdNTPsおよび25mMMgSO4は、KOD-Plus-Neo東洋紡社製に含まれるものを用いた。下記表に記載の反応溶液でIn-FusionPCRを行った。反応条件は、37°C30分→50°C15分とした。なお、5×In-FusionReactionBufferおよびIn-FusionEnzymeは、In-FusionRAdvantagePCRCloningKitタカラバイオ社製に含まれるものを用いた。In-Fusionサンプルに滅菌水を50μl加えて希釈した。希釈したサンプル10μlを形質転換に用いた。ダイレクトPCRによりコロニーを選択した。In-FusionPCRおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。ldh-F-1およびldh-R-1をプライマーとしたコロニーダイレクトPCRの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から3株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素EcoRI、EcoRV、またはPstI処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてT-Idhの挿入が確認できた。3T-ldh導入用相補ベクターpK18-ldhによるdpyrF株の形質転換宿主としては、M.thermoaceticaATCC39073のpyrF破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託したdpyrF株登録名MTA-D-pF株受託番号NITEP-1057を用いた。ここでは、上記2で構築したT-ldh導入用相補ベクターpK18-ldhをdpyrF株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、dpyrF株の染色体にT-ldhを組み込むことを目的とした。[dpyrF株の培養]dpyrF株は完全合成培地終濃度0.01g/Lのウラシルに植菌し、H2CO2を炭素源として55°Cで培養した。OD600=0.1前後まで培養し、エレクトロポレーション用のサンプルとした。完全合成培地の組成を表22Aに示す。炭素源としてフルクトースを添加する場合には終濃度5g/Lで、ウラシルを添加する場合には終濃度0.01g/Lで、それぞれ添加した特に断りがある場合を除く。また、ロールチューブ法に用いる場合には、Agar高温用20g/Lを添加した。[エレクトロポレーションによるpK18-ldhの導入]培養液を272mMスクロースbufferで2回洗浄した。洗浄後のペレットにスクロースbufferを4ml加えて懸濁した。エレクトロポレーション用のキュベット2mmギャップに懸濁液を380μl、形質転換用プラスミドを20μl加えた。この際、プラスミド量が1μg~2μgとなるように調整した。1.5kV、500Ω、50μFでパルスを与えた。パルスを与えた懸濁液を、5mlの完全合成培地終濃度0.01g/Lのウラシル終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。55°Cで48時間培養した。ロールチューブ法により、コロニー形成を試みた。培養5~7日で得られたコロニーを、5mlの完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。増殖が確認できた3株を50mlの完全合成培地H2CO2の入ったバイアルへ移し、T-ldh遺伝子導入株候補とした。[T-ldh遺伝子導入株の確認]3株のT-ldh導入株候補からTotalDNAを抽出した。抽出キットにはNucleoSpinTissueMACHEREY-NAGELを使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。染色体上pyrF周辺領域への遺伝子の挿入は、プライマーpyrF-up-F2配列番号10とpyrF-dn-R2配列番号11との組合せを用いて、PCRにより確認した。PCRの条件を以下に示す。なお、KODFXNeoPCR酵素、2×PCRBufferforKODFXNeoおよび2mMdNTPsは、KODFXNeo東洋紡社製に含まれるものを用いた。pK18-ldhを用いてdpyrF株を形質転換した。ロールチューブ法により形質転換体のコロニー形成を試みた結果、コロニーが得られた。コロニーを分離して培養し、生育が見られた3つのT-ldh導入候補株からTotalDNAを抽出した。染色体上の遺伝子挿入周辺領域をPCRにより増幅した。その結果、全ての株においてpyrFおよびT-ldhの挿入が確認できた。それらの株の中からC31株MTA-T-ldh株を選択し、以降の実験に用いた。C31株MTA-T-ldh株のpyrFおよびT-ldhの挿入の確認結果を図2に示す。野生株のATCC39073株では、pyrF遺伝子が存在するので、1.6kbの位置にバンドが見られる。dpyrF株では、0.73kbのpyrF遺伝子が欠失しているので、0.87kbの位置にバンドが見られる。C31株MTA-T-ldh株では、0.73kbのpyrFに加えて、1.2kbのT-ldhが挿入されていることから2.8kbの位置にバンドが見られる。3C31株MTA-T-ldh株のT-ldh遺伝子の転写量測定上記2で構築したC31株MTA-T-ldh株に導入されたT-ldhが転写されているか、定量RT-PCRを用いて調べた。[TotalRNAの抽出と定量RT-PCR]C31株MTA-T-ldh株およびATCC39073株を完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトースで、dpyrF株を完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトース終濃度0.01g/Lのウラシルで、それぞれ培養した。TotalRNAの抽出にはNucleoSpinRNAIIMACHEREY-NAGELを使用し、抽出方法は添付のマニュアルに従った。定量RT-PCRのキットにはOneStepSYBRPrimeScriptPLUSRT-PCRKitタカラバイオを用いた。方法は添付のマニュアルに従った。反応条件を以下に記す。図3はフルクトースを炭素源として培養した際の、各株のT-ldh遺伝子の転写量を示した。ATCC39073株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子M-ldhの転写量はすべての株において、ほぼ同程度の転写量だった。T.pseudethanolicus39E株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子T-ldhの転写はC31株MTA-T-ldh株でのみ観察された。C31株MTA-T-ldh株において、フルクトースを炭素源として培養した場合は約19倍強く転写されていた。なお、gyrBの転写量を内部標準とした。4LDHの酵素活性測定上記3でT-ldhの転写が確認できた。そこで、T-ldhの転写産物から乳酸デヒドロゲナーゼが合成され、機能しているかを確認するために乳酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。ATCC39073株およびC31株MTA-T-ldh株を完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトースで、dpyrF株を完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトース終濃度0.01g/Lのウラシルで、それぞれ培養した。OD600=0.5前後で菌体を回収し、超音波破砕した。破砕した菌体溶液を20400×Gで30分間遠心分離し、上清を無細胞抽出液として酵素活性測定に用いた。乳酸生成のLDH活性は、50mMリン酸バッファーpH6.0中に1mMピルビン酸、0.2mMNADHorNADPH、0.2mMフルクトース-1,6-ビスリン酸FBPを含む反応液で、55°Cにおける吸光度A340を測定することで求めた。ピルビン酸生成のLDH活性は、50mMリン酸バッファーpH7.5中に50mML-乳酸、1mMNADorNADP、0.2mMFBPを含む反応液を用いて、55°Cで測定した。1分あたり1mMのNADHを酸化または1mMのNADを還元する酵素量を1Uとした。タンパク質濃度はBSAをスタンダードとして用いて、Bradford法により決定した。LDH比活性を下記表26に示した。全ての反応において、野生株とdpyrF株の比活性は同程度であった。NADHを補酵素とした際の乳酸生成反応は、C31株MTA-T-ldh株が高い活性を示した。C31株MTA-T-ldh株のLDH比活性は野生株やdpyrF株と比較して約10倍高かった。NADPHを補酵素とした場合の乳酸生成反応は、すべての株においてほぼ同じであった。5C31株MTA-T-ldh株による乳酸生産完全合成培地にリン酸bufferpH6.5を50mMとなるように添加した。炭素源としてフルクトースを60mMとなるように加えた。C31株MTA-T-ldh株、ATCC39073株を上述の培地に10植菌した。OD600、pH、フルクトース濃度HPLC分析、乳酸濃度HPLC分析、酢酸濃度HPLC分析を経時的に測定した。HPLCの条件を以下に示す。装置名:日本分光製LC-2000Plusシリーズポンプ:PU-2080Plus、オートサンプラー:AS-2057Plus、カラムオーブン:CO-2065Plus、検出器:RI-2031Plusカラム:BIO-RAD製発酵モニタリングカラムカタログNo125-0115カラム温度:65°C使用バッファー:1mMH2SO4流速:1ml/min検出器:RI野生株ATCC39073株とC31株MTA-T-ldh株を酢酸生成によるpH低下を防ぐために50mMリン酸bufferを含んだ完全合成培地終濃度5g/Lのフルクトースで培養した。図4Aには野生株とC31株MTA-T-ldh株をフルクトースとリン酸bufferを含んだ完全合成培地で培養した際のOD600とpH、図4Bにはフルクトース消費量、乳酸および酢酸の生成量の経時変化を示した。C31株MTA-T-ldh株と野生株は増殖に伴い、フルクトースが消費され、酢酸が生成され、pHが低下した。pHはリン酸bufferの影響で、pH5程度までしか下がらなかった。野生株は乳酸を蓄積しなかったが、C31株MTA-T-ldh株は酢酸の生成と同様に、増殖と連動して乳酸を蓄積し、定常期に入ると生成は止まった。C31株MTA-T-ldh株は最終的には0.7g/L6.8mMの乳酸を蓄積した。"