"式Iによるケージドリジン又はその塩。請求項1に記載のケージドリジンを含むポリペプチド。ケージドリジンが、ポリペプチドにおける、野生型ポリペプチドにおけるリジン残基に対応する位置に存在する、請求項2に記載のポリペプチド。ヌクレオチド三リン酸結合性タンパク質である、請求項2又は3に記載のポリペプチド。キナーゼである、請求項4に記載のポリペプチド。ケージドリジンがキナーゼの触媒部位に存在する、請求項5に記載のポリペプチド。リジンが脱ケージングされることにより、ポリペプチドのキナーゼ活性が可能になる、請求項6に記載のポリペプチド。ポリペプチドをコードするRNAの翻訳をアレンジすることを含む、請求項1に記載のケージドリジンを含む前記ポリペプチドを作製する方法であって、前記RNAが直交性コドンを含み、前記翻訳が、前記直交性コドンを認識し、請求項1に記載のケージドリジンを負荷されることができるtRNAの存在下、及び前記tRNAに請求項1に記載のケージドリジンを負荷することができるtRNA合成酵素の存在下、かつ請求項1に記載のケージドリジンの存在下で行われる、方法。tRNA合成酵素が、表Iに従って、野生型配列と比較して、1~5個の位置にミューテーションを有するピロリジルtRNA合成酵素を含み、前記ミューテーション複数可が、M241、A267、Y271、L274及びC313から選択される1~5個の残基に対応する位置に存在する、請求項8に記載の方法。tRNA合成酵素が、M241F、A267S、Y271C及びL274Mである4つのミューテーションを含む、請求項9に記載の方法。直交性コドンがアンバーコドンTAGである、請求項8~10のいずれかに記載の方法。直交性tRNAがPyltRNACUAである、請求項11に記載の方法。請求項1に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾して、請求項1に記載のケージドリジンを組み入れることが望まれる前記ポリペプチド内の位置複数可に対応する1又は2以上の位置にアンバーコドンをもたらすことを含む、方法。核酸を修飾することが、リジンのコドンをアンバーコドンTAGにミューテーションさせることを含む、請求項13に記載の方法。請求項8~14のいずれかに記載の方法によって作製される、請求項2に記載の同種組換えポリペプチド。表Iに従って、野生型配列と比較して、1~5個の位置にミューテーションを有し、前記ミューテーション複数可がM241、A267、Y271、L274及びC313から選択される1~5個の残基に対応する位置に存在する、ピロリジルtRNA合成酵素。M241F、A267S、Y271C及びL274Mである4つのミューテーションを含む、請求項16に記載の直交性ピロリジルtRNA合成酵素。直交性ピロリジルtRNA合成酵素が請求項16又は17に記載の直交性ピロリジルtRNA合成酵素であり、直交性tRNAがPyltRNACUAである、直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対。したがって、当技術分野では、リジンに対する効率的なケージング分子を提供することに関する問題がある。別の問題は、リジンに対する効率的なケージング分子がタンパク質に部位特異的に取り込まれることを可能にする方法及び/又はシステムを提供することである。別の問題は、ケージドタンパク質の細胞送達に関する目下の問題を緩和しながら、前記タンパク質を産生する方法を提供することである。本発明は、340nmを超えるUV光を照射することによって効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージドcagedリジン分子に関する。本発明は、さらに、表Iに従って、最大5つの位置にミューテーションmutationを有し、そのミューテーションが、M241残基、A267残基、Y271残基、L274残基及びC313残基に存在する直交性orthogonalピロリジルtRNA合成酵素、及びそれから生じる直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対に関する。本発明の別の態様は、本発明によるケージドリジンアミノ酸を真核細胞内のタンパク質にインビトロで組み入れる方法であって、i当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位にアンバーコドンを導入する、又は特定のコドンを置き換えるステップと、ii本明細書に記載の発現系を細胞に導入するステップとiii培地中において、培地中に存在する本明細書に記載のケージドリジンと共に細胞を培養させるステップとを含む、方法に関する。本発明のさらに別の態様は、340nmを超えるUV光を照射することによって、タンパク質の少なくとも1つの性質を決定すること又は変化させることにおける、本発明によるケージドリジンアミノ酸の使用に関する。本発明は、340nmを超えるUV光を照射することで効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージドリジン分子に関する。355nmを超えるUV光、好ましくは365nmのUV光を照射することでケージング基が効率的に脱ケージングされることが適切である。光分解の副生成物はリジンのε-アミノ基と縮合しないことが適切である。ケージドリジンは、式Iによる、又はその塩であることが適切である。別の態様では、本発明は、そのアミノ酸配列内に上記のケージドリジンが組み入れられたタンパク質に関する。組み入れは部位特異的であることが適切である。ケージドリジンの組み入れは、リジンアミノ酸の置き換えであることが適切である。前記置き換えられたリジンアミノ酸は天然に存在する配列内に存在していたことが適切である。タンパク質を標識用分子と連結させることが適切である。標識用分子は蛍光タンパク質であることが適切である。別の態様では、本発明は、表Iに従って、1~5個の位置にミューテーション複数可を有するピロリジルtRNA合成酵素直交性ピロリジルtRNA合成酵素であって、ミューテーション複数可がM241、A267、Y271、L274及びC313から選択される1~5個の残基に存在するピロリジルtRNA合成酵素直交性ピロリジルtRNA合成酵素に関する。直交性ピロリジルtRNA合成酵素は、M241F、A267S、Y271C及びL274Mである4つのミューテーションを含むことが適切である。別の態様では、本発明は、直交性ピロリジルtRNA合成酵素が上記の直交性ピロリジルtRNA合成酵素である、直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対に関する。直交性tRNAはPyltRNACUAであることが適切である。別の態様では、本発明は、PyltRNACUAの発現がCMVエンハンサーの下流のU6プロモーターの制御下にある、プラスミドなどの核酸と、CMVエンハンサーの制御下にある上記の直交性ピロリジルtRNA合成酵素を含む、プラスミドなどの核酸とを含む、上記の直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対を発現させるための、真核細胞における発現系に関する。上記のケージドリジンアミノ酸を細胞内のタンパク質にインビトロで組み入れる方法であって、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位において、アンバーコドンなどの直交性コドンを導入する、又は、特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えるステップと、上記の発現系を細胞に導入し、その細胞を、培地中において、培地中に存在する上記のケージドリジンと共に培養させるステップとを含む、方法。当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列における、リジンのコドンをアンバーコドンに置き換えることが適切である。別の態様では、本発明は、340nmを超えるUV光を照射することによって、タンパク質の少なくとも1つの性質を決定することにおいて使用するための上記のケージドリジンアミノ酸に関する。別の態様では、本発明は、340nmを超えるUV光を照射することによって、タンパク質の少なくとも1つの性質を変化させることにおいて使用するための上記のケージドリジンアミノ酸に関する。別の態様では、本発明は、少なくとも1つの性質を変化させることにより、そこから生じる生物学的効果の動態を測定することが可能になる、上記のケージドリジンアミノ酸に関する。別の態様では、本発明は、タンパク質の少なくとも1つの性質が真核細胞内のタンパク質の局在化である、上記のケージドリジンアミノ酸に関する。当該タンパク質は真核細胞内にあることが適切である。当該タンパク質はヒト体内にあることが適切である。当該タンパク質はインビトロであることが適切である。ここで、本発明を、番号を付したパラグラフによって説明する:パラグラフ1.式Iによるケージドリジン又はその塩。パラグラフ2.パラグラフ1に記載のケージドリジンを含むポリペプチド。パラグラフ3.ケージドリジンが、ポリペプチドにおける、野生型ポリペプチドにおけるリジン残基に対応する位置に存在する、パラグラフ2に記載のポリペプチド。パラグラフ4.ヌクレオチド三リン酸結合性タンパク質である、パラグラフ2又はパラグラフ3に記載のポリペプチド。パラグラフ5.キナーゼである、パラグラフ4に記載のポリペプチド。パラグラフ6.ケージドリジンがキナーゼの触媒部位に存在する、パラグラフ5に記載のポリペプチド。したがって、本発明は、光活性化可能なキナーゼを提供する。本発明は、キナーゼを光活性化する方法であって、前記キナーゼの触媒ドメイン内のケージドリジン残基を脱ケージングするステップを含む方法にも関する。ケージドリジンは、キナーゼの触媒部位の保存されたリジン残基、例えば、MEKのK97に対応する残基などに存在することが適切である。キナーゼは、MAPキナーゼカスケードのメンバーであることが適切である。キナーゼは、MEKMAPKKであることが適切である。パラグラフ7.リジンが脱ケージングされることにより、ポリペプチドのキナーゼ活性が可能になる、パラグラフ6に記載のポリペプチド。パラグラフ8.パラグラフ1に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードするRNAの翻訳をアレンジするarrangingことを含み、前記RNAが直交性コドンを含み、前記翻訳が、前記直交性コドンを認識し、パラグラフ1に記載のケージドリジンを負荷されることができるtRNAの存在下、及び前記tRNAにパラグラフ1に記載のケージドリジンを負荷することができるtRNA合成酵素の存在下、及びパラグラフ1に記載のケージドリジンの存在下で行われる、方法。パラグラフ9.tRNA合成酵素が、表Iに従って、野生型配列と比較して、1~5個の位置にミューテーションを有するピロリジルtRNA合成酵素を含み、そのミューテーション複数可が、M241、A267、Y271、L274及びC313から選択される1~5個の残基に対応する位置に存在する、パラグラフ8に記載の方法。パラグラフ10.tRNA合成酵素が、M241F、A267S、Y271C及びL274Mである4つのミューテーションを含む、パラグラフ9に記載の方法。パラグラフ11.直交性コドンがアンバーコドンTAGである、パラグラフ8~10のいずれかに記載の方法。パラグラフ12.直交性tRNAがPyltRNACUAである、パラグラフ11に記載の方法。パラグラフ13.パラグラフ1に記載のケージドリジンを含むポリペプチドを作製する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸を修飾して、パラグラフ1に記載のケージドリジンを組み入れることが望まれる前記ポリペプチド内の位置複数可に対応する1又は2以上の位置にアンバーコドンをもたらすことを含む、方法。パラグラフ14.核酸を修飾することが、リジンのコドンをアンバーコドンTAGにミューテーションさせることを含む、パラグラフ13に記載の方法。パラグラフ15.パラグラフ8~14のいずれかに記載の方法によって作製される、パラグラフ2に記載の同種組換えポリペプチド。パラグラフ16.表Iに従って、野生型配列と比較して、1~5個の位置にミューテーションを有し、そのミューテーション複数可が、M241、A267、Y271、L274及びC313から選択される1~5個の残基に対応する位置に存在する、ピロリジルtRNA合成酵素。パラグラフ17.M241F、A267S、Y271C及びL274Mである4つのミューテーションを含む、パラグラフ16に記載の直交性ピロリジルtRNA合成酵素。パラグラフ18.直交性ピロリジルtRNA合成酵素がパラグラフ16又は17に記載の直交性ピロリジルtRNA合成酵素であり、直交性tRNAがPyltRNACUAである、直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対。本発明は、340nmを超えるUV光を照射することで効率的に脱ケージングするために、電子供与性置換基によってケージング基を誘導する、ケージドリジン分子に関する。ケージング基への電子の供与の効果により、340nmを超える光を照射した場合にケージング基が効率的に脱ケージングされることが可能になる。UV照射は355nmを超えることが好ましく、360~370nmであることが好ましく、約365nmであることがさらに好ましい。他のケージング分子に関する利点は、これらの高いUV波長で照射した場合のケージド分子の光分解の効率であることは当業者には明らかである。図3及び実施例3に示されているように、365nmのUV照射により、5分後に、本質的にケージドタンパク質の集団全体が脱ケージされる。ケージング基は、光分解の際に光分解の副生成物がリジンのe-アミノ基との縮合反応において反応しないように構築することがさらに好ましい。好ましい実施形態は、本発明によるケージドリジンが式Iによるものである、又はその塩である場合である。本発明の別の態様は、タンパク質のアミノ酸配列に組み入れられた場合の上記のケージドリジンである。以下に考察するように、利点は、これにより、タンパク質の特定の性質の決定及び/又は変更が可能になることである。ケージドリジンがタンパク質の特定のポイントに存在することに起因してタンパク質の特定の性質の決定/変更が有利に可能になるので、組み入れは部位特異的であることが好ましい。部位特異的なケージドリジンアミノ酸の組み入れは、ポリペプチド配列内の任意のポイントにおけるものであってよい。これは、一般には、対象とするポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列の部位特異的ミューテーション、その後のその核酸の、ポリペプチドへの転写必要であれば及び翻訳によって実現される。組み入れは、現存するコドンを置き換えることによるものであってよい、又は、コドンを挿入することによるものであってよい。一般には、ケージドリジンを指定するために使用されるコドンは、アンバーコドンTAGCUAである。しかし、当然、組み入れのために使用されるtRNA合成酵素-tRNA対が、異なるコドン又は四つ組コドンを認識するtRNAを含む場合、アンバーコドンの代わりにそのtRNA合成酵素-tRNA対の対応する同族のコドンを使用する。アンバーコドンは、それによって遺伝的な組み入れを容易に実現することができる適切な直交性コドンの好ましい例であるが、そのような任意の他のコドン複数可の同族のtRNAに負荷する適切な系を使用することができるのであれば、これに限定するものでも、他のコドン複数可の使用を排除するものでもない。タンパク質のアミノ酸配列へのケージドリジンアミノ酸の部位特異的な組み入れは、タンパク質の野生型配列に存在するリジン残基の置き換えであることがさらに好ましい。前記タンパク質の利点は、一度照射及びその結果として生じる脱ケージングが起これば、そのリジン残基の内因性の性質、したがって、そのリジンによって媒介される又はその影響を受けるタンパク質の生物学的効果複数可を経験的に決定することが可能になることである。好ましい一実施形態では、上記の本発明によるタンパク質を、さらに標識用分子と連結させる。標識用分子は、タンパク質の一部の生物学的に関連性のある性質又は機能を決定するための実験的な状況の下で当業者が使用することができる任意の分子であってよい。そのような分子の一部の例は、放射性元素、蛍光マーカー又は発光マーカーである。タンパク質と標識用分子を連結する方法は、使用する標識用分子の種類に完全に左右され、その選択は、十分に当業者の専門知識の範囲内である。前記系の好ましい例では、標識用分子は、ケージドリジンが組み入れられたタンパク質のC末端と融合したGFPなどの蛍光タンパク質である。前記例は、タンパク質を連結する方法は、GFPタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ケージドアミノ酸を有するタンパク質をコードするプラスミドに組み入れることによって容易に実現されるので、好ましい。前記好ましい例では、細胞において発現させた、生じたタンパク質は、容易に可視化される。本発明の別の態様は、ケージドリジンアミノ酸を、真核細胞内にあることが適切である選択されたタンパク質に、遺伝的且つ部位特異的に組み入れる方法、例えばインビトロにおける方法などである。ケージドリジンアミノ酸を前記方法によって遺伝的に組み入れることの1つの利点は、この実施形態では、ケージドアミノ酸を含むタンパク質を直接標的細胞において合成することができるので、一度形成されたら、ケージドアミノ酸を含むタンパク質を細胞に送達する必要がなくなることである。この方法は、iタンパク質をコードするヌクレオチド配列における、所望の部位において、アンバーコドンなどの直交性コドンを導入する、又は特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えるステップと、ii直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対の発現系を細胞に導入するステップと、iii本発明によるケージドリジンと共に培地中で細胞を培養させるステップとを含む。ステップiは、タンパク質の遺伝子配列における、所望の部位において、特定のコドンをアンバーコドンなどの直交性コドンに置き換えることを伴う。これは、ケージドリジンが導入される/それに置き換えられることが望まれる部位を、アンバーコドンなどの直交性コドンを含むように変化させた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドなどの構築物を単に導入することによって実現することができる。これは、十分当業者の能力の範囲内であり、そのようなものの例が本明細書の以下に示されている。ステップiiは、ケージドリジンアミノ酸を所望の位置に特異的に組み入れるための直交性の発現系を必要とする例えば、アンバーコドン。したがって、一緒に前記tRNAにケージドリジンを負荷することができる、直交性ピロリジルtRNA合成酵素などの特異的な直交性tRNA合成酵素と特異的な対応する直交性tRNAの対が必要である。したがって、本発明の別の態様は、本発明によるケージドリジンのためのピロリジルtRNA合成酵素などの直交性tRNA合成酵素を提供することである。前記直交性ピロリジルtRNA合成酵素は、表Iにおいて定義されている、最大5つの位置、M241残基、A267残基、Y271残基、L274残基及びC313残基において存在するミューテーション複数可を有する野生型ピロリジルtRNA合成酵素であることが適切である。好ましい実施形態では、直交性ピロリジルtRNA合成酵素は、表Iのクローン7である、すなわち、ミューテーションは、M241F、A267S、Y271C及びL274Mであり、これは、表Iにおいて定義されている通り、最も効率的な合成酵素クローンであることが見いだされているという利点を有する。上記方法のステップiiを実行することを可能にするための発現系を構成するために、本発明による直交性ピロリジルtRNA合成酵素を直交性tRNAと結びつける必要がある。PyltRNACUAをコードする遺伝子であるPylTの使用は、真核生物のtRNAに見いだされるコンセンサス内部RNAポリメラーゼIIIプロモーター配列を欠いており、直交性ピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対において使用するための直交性tRNA系として当技術分野でよく知られているGalliGHofstetterHBirnstielMLNature1981294626631。PylTは、転写のために外部のプロモーターを必要とする。tRNA発現は、PylTの効率的な転写を可能にする、CMVエンハンサーの下流のU6プロモーターXiaXGZhouHXDingHLAffarEBShiYXuZSNuclAcidsRes200331e100の制御下にあることが好ましい。したがって、上記方法のステップiiにおいて使用するために好ましい発現系は、a.PyltRNACUA発現がCMVエンハンサーの下流のU6プロモーターの制御下にあるプラスミド、b.CMVエンハンサーの制御下にある本明細書に記載の直交性ピロリジルtRNA合成酵素を含むプラスミドを含む。本発明の別の態様では、本発明によるケージドリジンは、340nmを超えるUV光を照射することによって、タンパク質の少なくとも1つの性質を決定するため又は変化させるために使用することができる。照射は355nmを超えることが好ましく、360~370nmであることがより好ましく、約365nmであることがさらにより好ましい。そのような使用の利点は、ケージドリジンを有するタンパク質が脱ケージングされる時間及び百分率の両方の意味で、ケージドから脱ケージドに切り換える方式が効率的に実現されること、及びそのようなシステムが非侵襲的であり、細胞に対して毒性でないことである。有利に、そのようなシステムは、真核生物内、それどころかヒト体内にあるタンパク質の少なくとも1つの性質を決定又は変更するために使用することができる。当該タンパク質の前記少なくとも1つの性質は、野生型タンパク質に存在し、ケージドアミノ酸が存在する場合には存在しない、当該タンパク質の生化学的性質であってよい。これは、当該タンパク質の唯一の生物学的機能であってよい、又は当該タンパク質のいくつかの性質のうちの1又は2以上であってよい。その性質が当該タンパク質の唯一の生物学的機能ではない例は、腫瘍抑制因子p53に存在するNLS配列である。その性質及びタンパク質に対するその効果は、タンパク質のサイズ、形状、及び同様に重要なことにポリペプチド鎖にケージドリジンが組み入れられる位置に応じて変動し得る。したがって、光分解によって脱ケージングした際の決定に使用される場合、本発明は、脱ケージングされるとタンパク質の生物学的効果に影響を及ぼすケージドリジン残基によって、どのように性質が妨害されるかを試験するためのオペレーターを可能にする。タンパク質の性質を変化させることにおけるその使用では、変化によって生じる生物学的効果は既知であり、したがって、研究することができる、又は、未知であってよく、その場合、本発明は、そのような性質を決定又は推測することに有意に適用することができる。既知の性質への本発明の適用の例は、今度はアンケージド配列が適切な細胞の区画内のタンパク質に局在化することを可能にし、それによって、動態研究又は他の観察を行うことを可能にするために、局在化配列に位置するケージドリジンを放出させるという要望である。ケージドリジンを、野生型タンパク質に存在するリジンに置き換えることが好ましい。これは、脱ケージングするとタンパク質がその野生型構造に戻るので、脱ケージングによって細胞内のタンパク質の内因性の機能を決定することが可能になるので、好ましい。変更のために使用する場合、変更によって生じる生物学的効果は既知である及び/又は所望のものであることを想定する。ケージドリジンのオルタネーターalternatorスイッチ[switch]としてのこのような使用は、脱ケージングによって生じるタンパク質の動態を試験するために作動させることができる。1つの例は、ケージドリジンが存在することによってタンパク質の折りたたみが妨害される場合である。そのような場合では、ケージドアミノ酸を脱ケージングすることにより、タンパク質の折りたたみが再び起こることが可能になり、さらに、それにしたがって、脱ケージングに起因するタンパク質の折りたたみの動態を測定することが可能になる。別の例は、ケージドリジンアミノ酸を局在化配列に組み入れることである。これにより、脱ケージングされるまでタンパク質の適切な局在化が攪乱され、タンパク質の局在化の動態を測定することが可能になる。したがって、所望のタンパク質の性質が脱ケージングによって変化する本発明の実施形態は、時には、スイッチングswitching又はオルタネーションalternationすなわち、脱ケージングされた状態である、タンパク質の代替の形態に移ることと称される。さらに、340nmを超えるUV光を照射することによってタンパク質の少なくとも1つの性質を変化させることオルタネーティングさせることに関する本明細書の上記の使用は、治療目的で使用することができるものと企図する。脱ケージングによるオルタネーションにより、以前は局在化する/ある特定の機能を有する/完全に折りたたまれていることが望ましくなかったタンパク質を、今度は局在化する/ある特定の機能を有する/完全に折りたたまれている、したがって、特定の治療的機能を有するようにすることができる。起こり得るそのような状況のタンパク質の例は、膜タンパク質であり、特に公知の表面抗原分類タンパク質、又は、例えば、補体免疫系に属する抗体若しくはタンパク質の発現である。ケージドリジン種式Iのケージドリジン以外の代替のケージドリジンを本発明において使用することができる。有用なケージドリジン化合物の例を図13に示している。可能性のある化合物は、MayerGHeckelAAngewChemIntEd20064549004921に概説されている。図13に示されている化合物は、以下の引用に詳細に記載されている。これらの引用の、図13に示されている化合物を説明している節、具体的には、図13に示されている対応する化合物複数可の構造又は産生の詳細について特に参照により本明細書に組み込まれる:化合物4:MomotakeetalNatMeth3、3540化合物5:WalbertetalHelvChimActa84、1601-1611化合物6:SinghetalBioconjugChem13、12861291化合物7:FurutaetalProcNatAcadSci96、11931200SuzukietalOrgLett5、48674870HagenetalChemBioChem4、434442。化合物8:FedoryaketalOrgLett4、34193422。化合物9:ParketalJACS119、24532463ZhangetalJACS121、56255632ConradIIetalOrgLett2、15451547。化合物10:AtemnkengetalOrgLett5、44694471。化合物11:KlanetalPhotochemPhotobiolSci1、920923KlanetalOrgLett2、15691571ケージドリジンは、式Iに示されている通りであることが最も適切である。参照配列メタノサルシナバーケリMethanosarcinabarkeriPylT遺伝子は、MbtRNACUAtRNAをコードする。メタノサルシナバーケリのPylS遺伝子は、MbPylRStRNA合成酵素タンパク質をコードする。数値アドレスを用いて特定のアミノ酸残基を参照する場合、MbPyIRSメタノサルシナバーケリピロリジル-tRNA合成酵素アミノ酸配列を参照配列すなわち、公的に入手可能な野生型メタノサルシナバーケリPylS遺伝子、受託番号Q46E77にコードされるとして用いて番号付けする:MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNLこれは、所望の残基を位置づけるために当技術分野でよく理解されている通りに使用するべきである。これは常に厳密な計数行為というわけではない-前後関係に注意を払わなければならない。例えば、所望のタンパク質が、長さがわずかに異なる場合、その配列内の例えばY271に対応する正しい残基の位置づけには、単に所望の配列の271番目の残基を取るのではなく、配列をアラインメントし、等価物又は対応する残基を選ぶことが必要になる場合がある。これは、十分当業者skilledreaderの範囲内である。ミューテーションとは、当技術分野における通常の意味を有し、言及されている残基、モチーフ又はドメインの置換又は短縮又は欠失を指し得る。ミューテーションは、ポリペプチドレベルで、例えば、ミューテーションした配列を有するポリペプチドを合成することによって行うことができる、又は、ヌクレオチドレベルで、例えば、ミューテーションした配列をコードする核酸を作製することによって行うことができ、その核酸を、その後翻訳してミューテーションしたポリペプチドを産生することができる。所与のミューテーション部位に対する置き換えアミノ酸として特定されるアミノ酸がない場合、例えば、本明細書に記載の通り、本発明のtRNA合成酵素の進展及び適応に関連して、前記部位のランダム化を用いることが適切である。初期状態のミューテーションとして、アラニンAを用いることができる。特定の部位複数可において使用されるミューテーションは本明細書で示されている通りであることが適切である。断片は、長さが少なくとも10アミノ酸であることが適切である、少なくとも25アミノ酸であることが適切である、少なくとも50アミノ酸であることが適切である、少なくとも100アミノ酸であることが適切である、少なくとも200アミノ酸であることが適切である、少なくとも250アミノ酸であることが適切である、少なくとも300アミノ酸であることが適切である、少なくとも313アミノ酸であることが適切である、又は、所望のtRNA合成酵素ポリペプチドの大多数であることが適切である。本発明のポリヌクレオチドは、組換え型の複製可能なベクターに組み入れることができる。ベクターを使用して、適合性宿主細胞内の核酸を複製することができる。したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入すること、ベクターを適合性宿主細胞に導入すること、及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を培養させることによって本発明のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌が挙げられる。ベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結していることが好ましい、すなわち、ベクターは、発現ベクターである。作動可能に連結しているという用語は、記載されている構成成分が、それらが、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に作動可能に連結している調節配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が実現されるようにライゲーションする。本発明のベクターは、本発明のタンパク質の発現をもたらすために、記載の通り、適切な宿主細胞に形質転換すること又はそれにトランスフェクトすることができる。このプロセスは、上記の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を、ベクターによってタンパク質をコードするコード配列の発現がもたらされる条件下で培養することを含んでよく、場合によって発現されるタンパク質を回収することを含んでもよい。ベクターは、例えば、複製開始点、場合によって前記ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーター、及び場合によってプロモーターの調節因子を備えるプラスミド又はウイルスベクターであってよい。ベクターは、1又は2以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合ではアンピシリン耐性遺伝子を含有してよい。ベクターは、例えば、宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換するために用いることができる。本発明のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結した制御配列は、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、発現ベクターを使用するために設計する対象の宿主細胞と適合するように選択することができる。プロモーターという用語は当技術分野で周知であり、最小のプロモーターから上流エレメント及びエンハンサーを含むプロモーターまでのサイズ及び複雑さにわたる核酸領域を包含する。タンパク質の発現及び精製本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、本発明のタンパク質を発現させることができる。宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養することができる。本発明のタンパク質の発現は、それらが連続的に産生されるように構成的であってよい、又は、発現を開始するために刺激を必要とする誘導性であってよい。誘導性の発現の場合では、タンパク質の産生は、必要な時に、例えば、培地に、誘導性物質、例えば、デキサメタゾン又はIPTGを加えることによって開始することができる。本発明のタンパク質は、宿主細胞から、酵素的溶解、化学的溶解及び/又は浸透性の溶解及び物理的な破壊を含めた当技術分野で公知のさまざまな技法によって抽出することができる。以下の非限定的な例は、本発明の例示である:全ての実施例において、式Iによるケージドリジンは、それ自体で表示する、又は化合物1として表示する。我々は、タンパク質の局在化、翻訳後修飾及び酵素活性を制御するためのリジンの光ケージングについて教示している。タンパク質のリジン残基によって媒介されるこれらの重要な機能を光化学的に制御することは、生細胞においてこれまで実証されていない。本発明では、1を合成し、哺乳動物の細胞において、アンバーコドンに応じてこのアミノ酸の組み入れを遺伝的にコードするように、ピロリジル-tRNA合成酵素/tRNA対を進化させる。このアミノ酸の有用性を例証するために、ヒト細胞における核質の核局在化配列NLS,nuclearlocalizationsequence及び腫瘍抑制因子p53をケージし、したがって、これらのタンパク質を細胞質ゾルに誤って局在化させるmislocalizing。核内移入の動態を直接数量化することを可能にする光のパルスを用いてタンパク質の核内移入を誘発する。式Iによるケージドリジンの合成ニトロベンジルケージドリジン1を、塩基性THF/H2O溶液中、0°CでNα-Boc-リジンとクロロギ酸エステル3を反応させ、4を収率82でもたらし、その後CH2Cl2中TFAを用いて収率95で脱保護することによって調製したスキームS1。クロロギ酸エステル3を、アルコール3ref19に従って合成されたを、Na2CO3の存在下でTHF中トリホスゲンを用いたアシル化、その後の揮発性物質の蒸発、及びさらなる精製を伴わない直接的な反応によって生成した。Na2CO3を存在させることにより、2が脱水されて対応するスチレンになることを防いだ。合成プロトコール2S-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-6-{[1-6-ニトロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イルエトキシ]カルボニルアミノ}ヘキサン酸416-ニトロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イルエタノール2500mg、2.36mmolを、Na2CO3247mg、2.36mmolを含有するTHF5mLに溶解させ、0°Cまで冷却した。この溶液に、トリホスゲン701mg、2.36mmolを加え、反応物を室温で12時間撹拌し続けた。反応物を濾過し、その後、揮発性物質を加熱せずに蒸発させ、残渣を真空下で乾燥させて、NPOCクロロギ酸エステル3を定量的変換で得た644mg、2.36mmol。Nε-Boc-リジン500mg、2.02mmolのTHF/1MのNaOHaq.中溶液1:4混合物、総量8mLに、0°Cで、NPOC-α-メチルクロロギ酸エステル3496mg、182mmolを加えた。反応物を室温で12時間撹拌した後、水層をEt2O5mLで洗浄し、その後、氷冷の1MのHCI20mLを用いてpH1まで酸性化し、EtOAc30mLを用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を蒸発させ、4を黄色の泡として収率82でもたらした720mg、1.49mmol。1HNMR300MHz,CDCl3δ=1.18~1.81m,18H、3.08brs,2H、4.23brs,1H、5.11~5.38m,1H、6.07s,2H、6.20~6.36m,1H、6.99s,1H、7.40s,1H。13CNMR75MHz,CHCl3δ=22.3、22.6、28.5、29.4、32.3、40.8、53.3、69.1、80.4、103.3、105.4、105.8、136.7、141.5、147.2、152.6、155.7、156.1、176.4。HRMS:m/z計算値C21H29N3O10[MNa]:506.1745;実測値:506.1748。1HNMRスペクトルについては図1参照2S-2-アミノ-6-{[1-6-ニトロベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イルエトキシ]カルボニルアミノ}ヘキサン酸TFA塩1化合物4720mg、1.49mmolをDCM:TFA1:1混合物、総量14mLに溶解させ、反応物を40分間攪拌した。その後、揮発性物質を蒸発させ、残渣をMeOH5mLに再溶解させ、Et2O250mL中に沈殿させ、1を白色固体として収率95でもたらした679mg、142mmol。1HNMR300MHz,D2Oδ=1.08~1.40m,7H、1.63~1.88m,2H、2.80~2.88m,2H、3.83~3.97m,1H、5.91~6.00m,3H、6.92s,1H、7.28s,1H。13CNMR75MHz,D2Oδ=21.1、21.7、28.5、29.5、39.9、52.7、68.8、103.6、104.4、105.7、136.1、140.6、146.9、152.7、156.9、171.9。HRMS:m/z計算値C15H21N3O6[MH]:384.1402;実測値:384.1403。1HNMRスペクトルについては図2参照式Iによるケージドリジンのための直交性のピロリジルtRNA合成酵素/tRNA対の合成アンバーコドンに応じてケージドリジン1を組み入れるための直交性のMbPylRS/PyltRNACUA対NeumannHPeakChewSYChinJWNatChemBiol20084232234を進化させるために、ピロリジン環の結合ポケット内の5つの位置M241、A267、Y271、L274、C313を可能性のある全てのアミノ酸に対してランダム化した108種のMbPyIRSのミューテーション体のライブラリーを創出した。pBKAcKRS3ampNeumannHHancockSMBuningRRouthAChapmanLSomersJOwenHughesTvanNoortJRhodesDChinJWMolecularCell200936153163を、MbPyIRSミューテーション体のライブラリーの生成における鋳型として使用した。インバースPCRRackhamOChinJWNatChemBiol20051159166を3ラウンド実施して、このライブラリー内の20種の天然アミノ酸全てに対してM241、A267、Y271、L274及びC313のコドンをランダム化した。PCR反応の各ラウンドにおいて以下のプライマーを使用した:ラウンド1PylSM241f5’GCGCAGGTCTCAGAACGTNNKGGCATTAACAACGACACCGAACTGAGCAAAC3’及びPylSM241r5’GCGCAGAGTAGGTCTCAGTTCCACATATTCCGCCGGAATCAGAATC3’;ラウンド2PylSAYLf5’GCGCAGGTCTCAATGCTGNNKCCGACCCTGNNKAACTATNNKCGTAAACTGGATCGTATTCTGCCGGGC3’及びPylSAYLr5’GCGCAGAGTAGGTCTCAGCATCGGACGCAGGCACAGGTTTTTATC3’;ラウンド3PylSC313f5’GCGCAGGAAAGGTCTCAAACTTTNNKCAAATGGGCAGCGGCTGCACCCGTGAAAAC3’及びPylSC313r5’GCGCAGAGTAGGTCTCAAGTTAACCATGGTGAATTCTTCCAGGTGTTCTTTG3’。各ラウンドにおけるPCR産物を、まず、Dpnl及びBsalを用いて消化し、ライゲーションによって再環状化し、エレクトロコンピテントDH10Bを形質転換するために使用した。再単離したプラスミドは、ミューテーション誘発の次のラウンドの鋳型としての機能を果たした。ミューテーション誘発の第3ラウンドのライゲーション産物を用いてエレクトロコンピテントDH10Bを形質転換することにより、ライブラリーの理論的な多様性2×107を99超網羅する108種の形質転換体が産生された。1に特異的なミューテーション体の選択を、アセチル-リジンに特異的な合成酵素の進化について記載されている通り行ったNeumannHPeakChewSYChinJWNatChemBiol20084232234。以前に記載されている通りNeumannHPeakChewSYChinJWNatChemBiol20084232234、ChinJWMartinABKingDSWangLSchultzPGProcNatlAcadSci2002991102011024、大腸菌において、このライブラリーに対する陽性の選択及び陰性の選択を交互に3ラウンド実施した。選択で残存したクローンを、許容的な位置にアンバーコドンを有するクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするプラスミドを用いて形質転換した。最良のクローンでは、11mMの存在下で、300μg/mlに至るまでのクロラムフェニコールを含有する培地において細胞が残存することが可能になったが、1の非存在下では、50μg/mlで残存しなかった。これは、選択された合成酵素が1に対して高い特異性を有し、共通の20アミノ酸のいずれも組み入れないことを実証している。最も活性な合成酵素は、野生型MbPylRSに対してミューテーションM241F、A267S、Y271C、及びL274Mを含有した。この合成酵素を光ケージドLysyl-tRNA合成酵素PCKRSと名付け、さらに特徴付けた全ての単離されたMbPyIRS配列については表1を参照されたい。インビトロにおけるミオグロビンにおける365nmの光を照射した際のデケージングの実証1.ミオグロビンの発現及び精製非天然アミノ酸を組み入れたミオグロビンを発現させるために、我々は、大腸菌DH10B細胞を、pBKampPCKRS及びpMyo4TAGPylThis6を用いて形質転換した。細胞を、37°Cで1時間、1mlのLB培地中に回収した後、アンピシリン100μg/mL及びテトラサイクリン25μg/mLを含有するLB100mL中でインキュベートした37°C、250r.p.m.で16時間。この一晩培養物20mLを使用して、アンピシリン50μg/mL、テトラサイクリン12μg/mL及び2mMの1を補充したLB1Lに接種した。細胞を培養させ37°C、250r.p.m.、OD600~0.6において、アラビノースを最終濃度0.2まで加えることによってタンパク質の発現を誘導した。誘導の3時間後に細胞を回収した。タンパク質を4°Cで超音波処理によって抽出した。抽出物を遠心分離によって澄ませ20分、21,000g、4°C、Ni2-NTAビーズQiagen社製300μlを抽出物に加え、混合物を4°Cで1時間、撹拌しながらインキュベートした。遠心分離によって10分、1000gビーズを採取した。ビーズを2回、洗浄緩衝液50mLに再懸濁させ、1000gで遠心沈澱させた。その後、ビーズを洗浄緩衝液20mlに再懸濁させ、カラムに移した。タンパク質を、250mMのイミダゾールを補充した洗浄緩衝液1ml中に溶出させ、次いで、セファデックスSephadexG25カラムを用いて20mMの炭酸水素アンモニウムに対して再緩衝した。145位のアンバーコドンに応じて非天然アミノ酸BocK又は1を組み入れるsfGFP-his6psfGFP145TAGPylThis6を同じプロトコールに従って発現させ、精製した。2.タンパク質の質量分析LCT飛行時間型質量分光計においてエレクトロスプレーイオン化ESI,electrosprayionization、Micromass社を用いてタンパク質の総質量を決定した。タンパク質を20mMの炭酸水素アンモニウムに再緩衝し、ギ酸メタノール/H2O=1:1中1と1:1で混合した。試料を1分当たり10μlで注入し、ウマ心臓ミオグロビンを使用して陽イオンモードで較正を実施した。60のスキャンを平均し、MassLynxバージョン4.1Micromass社製を使用して、多重荷電したタンパク質の質量スペクトルについて、畳み込みを解くことによって分子質量を得た。野生型タンパク質の理論的質量を、Protparamhttpusexpasyorgtoolsprotparamhtmlを使用して算出し、タンパク質を含有する非天然アミノ酸についての理論的質量を手動で調整した。sfGFP145-1のMS/MS分析のために、ゲルバンドを洗浄し、アルキル化し、トリプシンを用いてゲル内消化した。消化物混合物1μlをCHCAマトリックス60のMeCN/0.1のTFA中3mg/ml1μlと予備混合し、1μlをステンレス鋼の標的に塗布した。UltraflexIIITOFTOF質量分光計BrukerDaltonics社、Bremen、Germanyを用いてスペクトルを取得した。さらにMS/MS断片化するために、1で修飾したペプチドと一致するm/z2145.972の断片を手動で選択した。一連の断片化イオンにより、ペプチドLEYN1NSHNVYITADKの同一性及び修飾部位が確認された。アンケージングプロセスを分析するために、高出力LED供給源モジュールBlackled365、Prizmatix社製を365nmで用いて、精製したミオグロビンを365nmで光分解した。次いで、タンパク質の総質量を上記の通り決定した。PCKRS/PyltRNACUAの存在下でのmyo4TAGhis6NeumannHPeakChewSYChinJWNatChemBiol20084232234、ChinJWMartinABKingDSWangLSchultzPGProcNatlAcadSci2002991102011024の発現は効率的であり、1の添加に依存した。エレクトロスプレーイオン化質量分析ESI-MS,Electrosprayionizationmassspectrometry及びMS-MS配列決定により、単一の遺伝的にコードされた部位に1が組み入れられることが確認される図3。インビトロで365nmの光を照射すると、1を含有するミオグロビンが効率的に脱ケージングされることが確認された図3E。直交性のPCKRS/PyltRNACUA対がヒト細胞において機能的であることの実証PCKRS/PyltRNACUA対がヒト胎児由来腎臓HEK293細胞において機能的であることを実証するために、我々は、1の存在下、及び非存在下で、mCherry-TAG-egfp-haこのレポーターは、N末端のmCherry遺伝子、アンバー終止コドンを含有するリンカー、C末端の高感度GFP遺伝子、及びHAタグコード配列を含有する、PCKRS及びPyltRNACUAを含有する細胞の赤色の蛍光及び緑色の蛍光を検査した。プロトコール1.培養、トランスフェクション及び免疫ブロット分析接着性のヒト胎児由来腎臓HEK,humanembryonickidney-293細胞を、37°C、5のCO2雰囲気下、10のFBS及び1×penstrep溶液を補充したDMEMGlutaMAX-1培地Gibco社製中で培養した。細胞を、GenejuiceNovagen社製を製造者のプロトコールに従って用いて一過性にトランスフェクトした。二重のトランスフェクションを、両方のプラスミドを等量用いて実施した。トランスフェクトする前に、培地を、必要な場合、非天然アミノ酸を補充した新鮮な抗生物質を含まない培地に交換した濃度については図の説明文を参照されたい。トランスフェクトした24時間後に細胞を分析した。ウエスタンブロット分析のために、細胞を低温のPBSで洗浄し、次いで普遍的な溶解緩衝液Roche社製を用いて4°Cで10分間溶解した。HAタグSigma社製、FlagタグCellsignaling社製、Ds-RedClontech社製又はp53Abcam社製に対する抗体を使用してウエスタンブロットを実施した。2.質量分析100mmのペトリ皿中のHEK293細胞を、mCherry-TAG-egfp-ha及びPCKRS/PyltRNACUAでトランスフェクトし、2mMの1の存在下で24時間培養させた。細胞を溶解し、ProFound商標MammalianHATagIPCoIPKitPierce社製を製造者のプロトコールに従って使用して、全長のmCherry-1-EGFP-HAをプルダウンした。タンパク質試料を、SDS-PAGEによって精製した。所望のタンパク質バンドをクーマシーブルー染色したゲルから切除し、洗浄し、アルキル化し、トリプシンを用いてゲル内消化した。ゲル内消化ペプチド混合物の一部を、ナノスケールの液体クロマトグラフィーDionex社製によって、逆相C18カラム150×0.075mmID、流速0.2μl/分で分離した。溶出液をLTQOrbitrapXL質量分光計に直接導入した。社内のMASCOTMS/MSイオン検索wwwmatrixsciencecomを使用して、タンパク質配列AQASPWH1QLAMVSKmCherry-1-EGFP-HAの残基243~257に対してスペクトルを検索した。一連の断片化を手動で検査することによって同一性及び修飾部位を確認した。顕微鏡mCherry-TAG-EGFP-HAを発現している細胞をイメージングするために、24ウェルプレートに細胞を播種し、トランスフェクトした。レーザー走査型共焦点顕微鏡検査を、PlanFluorELWD20×045対物レンズを備えたNikonEclipseTE300倒立顕微鏡に搭載したBioRadRadiance2100システムを使用して実施した。EGFPについては515~530nmの蛍光発光を測定し励起波長:488nm、mCherryについては560nm超の蛍光発光を測定した励起波長:543nm。生細胞をイメージングするために、μ-DishIbidi社製に細胞を播種し、トランスフェクトした。室温で、PlanApochromat63×14油浸対物レンズを備えたZeissLSM710レーザー走査顕微鏡を用いて生細胞をイメージングした。EXFOXCite120XLシステムを用いて、UVフィルターフィルターの設定-励起G365、ビームスプリッターFT395、発光BP445/50を備えた120ワットのハロゲン化金属ランプを使用して、細胞を1~5秒間照明し力:12mW/cm2、室温でイメージングした励起:488nm、放出:500~560nm。顕微鏡の設定:細胞画像については、スキャン解像度512×512、平均化8、スキャンズーム3×、スキャンスピード10;リアルタイムイメージングについては、スキャン解像度512×512、平均化1、スキャンズーム5×又は3×、スキャンスピード8。平均の核蛍光強度Fn及び細胞質の蛍光強度Fcを、ImageJソフトウェアを用いて数量化して、次式に従ってFn/c比を決定することを可能にした:Fn/c=Fn-Fb/Fc-Fb、Fbは平均バックラウンド蛍光強度である。プラスミド哺乳動物の細胞においてヒトTyr-tRNACUAを発現させるためのプラスミドpCR21htRNATyrCUAは、AshtonCroppUniversityofMarylandからの好意の寄贈品であった。哺乳動物の細胞において発現させるためにコドン最適化したMbPyIRS遺伝子及びMmPyIRS遺伝子は、GeneArt社から購入した。1.pMbPylRSmCherryTAGEGFPHA及びpPCKRSmCherryTAGEGFPHAの構築我々は、どちらもCMVプロモーターの制御下にあるMbPyIRS又はPCKRSN末端のFlagタグを有するを発現させることができる単一のプラスミドを、mCherry-TAG-EGFPC末端のHAタグを有するを用いて構築した。これを行うために、最初に、鋳型としてpEGFPN1Clonetch社製、及びプライマーmGFPHindamf/AG27を用いてPCRによってEGFP-HA配列を生成することによって、及び、次いで、HindIII制限部位及びBamHI制限部位を用いてPCR産物をpmCherryC1Clontech社製に導入することによって、プラスミドpmCherryTAGEGFPHAmCherry-TAG-GFP-HAの発現を可能にするを造った。次いで、プライマー3367bkf/3367bkr用いてベクターの骨格を増幅することによって、及び、次いでPCR産物をSacllで消化し、再ライゲーションし、プラスミドpMCSmCherryTAGEGFPHAをもたらすことによって、pmCherryTAGEGFPHAのCMVプロモーターの上流に多重クローニング部位MCS,multiplecloningsiteを導入した。次いで、上流のCMVプロモーター及びポリA部位を含有する下流の配列に隣接するFlag-MbPyIRSの配列を、プライマーKpnpvuKSf/AgesacKSrを用いて、及び鋳型として、Flag-MbPyIRS遺伝子哺乳動物の細胞での発現のためにコドン最適化したをpCDNA4TOInvitrogen社製のBamHI部位及びHindIII部位に導入することによって最初に造ったプラスミドを使用して、PCRによって増幅した。次いで、生じた断片を、pMCSmCherryTAGEGFPHA内のPvul部位とSacll部位の間でライゲーションし、プラスミドpMbPylRSmCherryTAGEGFPHAをもたらした。Flag-MbPyIRSの代わりにFlag-PCKRSを含有するプラスミドpPCKRSmCherryTAGEGFPHAを、Flag-PCKRS遺伝子哺乳動物の細胞での発現のためにコドン最適化したをpMbPylRSmCherryTAGEGFPHAのAfIII部位及びEcoRI部位にクローニングすることによって生成した。PCKRS内のミューテーションをPCRによって導入した:2つの断片を、プライマーAG40/AG43及びAG42/AG41、及び鋳型としてMbPylRS遺伝子を使用して生成し、次いで、オーバーラップPCRによって、プライマーAG40/AG41を使用して組み立てた。2.p4CMVEU6PylTの構築我々は、哺乳動物の細胞におけるPyltRNACUAの発現を可能にするプラスミドp4CMVEU6PylTを構築した。発現は、上流のCMVエンハンサーを有するU6プロモーターによって駆動される。最初に、pmCherryC1Clontech社製のCMVプロモーター由来のCMVエンハンサー配列CMVE,CMVenhancersequence1~484を、プライマーAG16/AG17を用いてPCRによって増幅し、PCR産物を、BamHI及びBgIIIを用いて消化し、消化産物を、BgIII部位を用いてpSIRENShuttleClontech社製にライゲーションしてpCMVEU6をもたらした。次いで、5’-リーダー、5AGATCTTCTAGACTCGAA3、及び3’-トレーラー、5GACAAGTGCGGTTTTT3に隣接するPyltRNACUAのDNA配列からできた配列、5GGAAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCG3を、プライマーAG30/AG20及び鋳型としてPyltRNACUA配列を含有するプラスミドを使用してPCRによって生成した。次いで、PCR産物をBamHI及びMfeIを用いて消化し、BamHI部位及びEcoRI部位を用いてpCMVEU6にライゲーションしてpCMVEU6PylTをもたらした。次いで、pCMVEU6PylT由来のCMV-U6-PylT配列をSpel及びEcoRIを用いて切断することによって、次いで、生じた断片をpCMVEU6PylTのNheI部位及びEcoRI部位にライゲーションすることによって2倍のCMVE-U6-PylTのクラスターを生成し、p2CMVEU6PylTをもたらした。4倍のCMVE-U6-PylTのクラスターを含有するプラスミドp4CMVU6CMVを、p2CMVEU6PylT内の2倍のCMVE-U6-PylTのクラスターをSpel及びEcoRIによって切断することによって、次いで、生じた断片をp2CMVEU6PylTのNheI部位及びEcoRI部位にライゲーションすることによって生成した。結果予測通り、mCherry蛍光は1ありで、又は1なしで検出されたが、EGFP蛍光は、11mMを加えた際にのみ観察された図4。これにより、哺乳動物の合成酵素は、ヒト細胞においてPyltRNACUAを目に見えるほどにアミノアシル化しないことMukaiTKobayashiTHinoNYanagisawaTSakamotoKYokoyamaSBiochemBiophysResCommun2008371818822が確認され、またこれは、1を用いたPCKRS/PyltRNACUA対によるアンバーコドンの抑制と一致する。PyltRNACUA又はPCKRSを欠く対照実験により、アミノ酸の組み入れにはその両方が必要であることが実証されている図5。ウエスタンブロット分析図4Cにより、PCKRS/PyltRNACUA対を用いた1の組み入れの効率は、内在性のヒトチロシル-tRNA合成酵素によって効率的にアミノアシル化されるヒトチロシル-tRNACUAhTyrtRNACUAを用いたチロシンの組み入れの効率に匹敵することが示されている。MbPyIRS/PyltRNACUA対及びPylRSMukaiTKobayashiTHinoNYanagisawaTSakamotoKYokoyamaSBiochemBiophysResCommun2008371818822、NguyenDPLusicHNeumannHKapadnisPBDeitersAChinJWJAmChemSoc200913187208721の公知の基質であるε-Boc-保護されたリジンを用いて同様の結果が得られた図6。哺乳動物の細胞において1がmCherry-EGFP-HAに部位特異的に組み入れられることを、さらに、MS/MS配列決定によって確認した図4D。核内移入プロセスの試験におけるケージドリジンによる光化学的な制御の有用性の実証哺乳動物の細胞における機能的研究に対する1の適用性を実証するために、我々は、まず、核内移入プロセスを光化学的に制御することに対するその有用性を調査した。詳細には、核質の古典的な二分核定位シグナルNLSRobbinsJDilworthSMLaskeyRADingwallCCell199164615623によって駆動される核内移入の動態を、インポーチン-αの結合に関与するリジン残基の1つをケージングすることによって調査した図7A。N末端の野生型NLSを有するGFP-HAnls-gfp-haの発現を可能にする構築物、標的のリジンをアラニンに置き換えたNLSミュータントを有するGFP-HAnls-A-gfp-haの発現を可能にする構築物、及び標的リジンをアンバーコドンに置き換えたNLSミュータントを有するGFP-HAnls--gfp-haの発現を可能にする構築物を生成した。プロトコールは、上記に従い、以下にも従った:pPCKRS-NLS-GFP-HA、pPCKRS-NLS-GCC-GFP-HA、pPCKRS-NLS-TAG-GFP-HAの構築プラスミドを、NLS-GFP-HA、NLS-GCC-GFP-HA又はNLS-TAG-GFP-HAについてのPCR断片を、pPCKRSp53EGFPHAのNheI部位及びBsshI部位にライゲーションすることによって得た実施例6を参照されたい。鋳型としては、MurrayStewartMRCLaboratoryofMolecularBiology社、CambridgeUKによって提供された、GFPと融合した核質NLSを含有するプラスミドを使用した。NLS-GFP-HAのPCR断片を、プライマーAG95/AG96を使用することによって得た。NLS-GCC-GFP-HAのPCR断片を、プライマーAG95/AG96を使用して、オーバーラップPCRによって2つの断片プライマーAG95/AG98及びAG99/AG96を用いて生成したを組み立てることによって得た。NLS-TAG-GFP-HAのPCR断片を、プライマーAG95/AG96を使用して、オーバーラップPCRによって2つの断片プライマーAG95/AG97及びAG99/AG96を用いて生成したを組み立てることによって得た。結果nls--gfp-ha由来の全長のNLS-GFP-HAタンパク質の発現は、PCKRS/PyltRNACUA対及び1の添加に依存し、これは、アンバーコドンに応じて1が組み入れられることを実証している図7B。我々は、次に、蛍光イメージングによって、光ケージドリジン1が、アラニンミューテーションと同じくらい効率的にNLS機能を遮断し、GFP融合物の、細胞質への部分的な再局在化を導くことを確認した図7C。GFPは、受動的な拡散が原因で依然として核内に存在する。NLS--1-GFP-HAを光分解1秒;365nm;12mW/cm2すると、脱ケージング及びその後のGFPの核内移入の結果として、細胞質のGFPの核内移入が観察された図7C、D。27個の代表的な細胞について数量化することにより、光分解した後に細胞質内のタンパク質に対する核内のタンパク質の比が3.75倍上昇したことが示されている図7D。光分解した後のリアルタイム蛍光顕微鏡検査により、細胞質ゾル内のGFPの移入について約20秒の半減時間を測定することが可能になった図7E。NLS-A-GFP-HAを発現している細胞に照射することにより、いかなるGFP再局在化も導かれなかった図7C。hTyrtRNACUAを有するnls--gfp-haにおけるアンバーコドンが抑制されている場合に同様の結果が得られた示されていない。これらの結果は、再局在化が急速であり、また、光分解した際に1が特異的に脱ケージングされることに起因することを実証している。多数の経路によって調節されるより複雑な核内移入プロセスの試験におけるケージドリジンによる光化学的な制御の有用性の実証次に、より複雑な系における光ケージング手法の有用性の調査を始めるため、及び多数の経路によって調節される系内の1つのリジンをケージングすることの効果を調査するために、我々は、光ケージドリジン1を使用して腫瘍抑制因子p53の核内移入を制御した。p53の核内移入は二分核定位シグナルNLSによって行われ、K305が核への局在化の重大な決定因子であるLiangSHClarkeMFJBiolChem19992743269932703OkeefeKLiHPZhangYPMolCellBiol20032363966405図8A。我々は、C末端のEGFP-HATAGを有するp53p53-egfp-haの発現を可能にする構築物、ミューテーションK305Aを有するp53ミュータントp53-K305A-egfp-haの発現を可能にする構築物、又はアンバーコドンを有するp53ミュータントp53-K305-egfp-haの発現を可能にする構築物を生成した。上記と同じプロトコールを使用し、以下も使用した:pPCKRSp53EGFPHA、pPCKRSp53305GCCEGFPHA、pPCKRSp53305TAGEGFPHA及びpMbPyIRSp53305TAGEGFPHAの構築p53EGFPHA、p53305GCCEGFPHA又はp53305TAGEGFPHAについてのPCR断片を、pPCKRSmCherryTAGEGFPHA又はpMbPylRSmCherryTAGEGFPHAのNheI部位及びMfeI部位にライゲーションすることによって、プラスミドを得た。p53-EGFP-HAのPCR断片を、プライマーAG52/AG55を使用してオーバーラップPCRによって2つの断片を組み合わせることによって得た:p53断片プライマーAG52/AG53、及び鋳型としてp53cDNAを使用して生成した及びGFP-HA断片プライマーAG54/AG55、及び鋳型としてpmCherryTAGEGFPHAを使用して生成した。p53-K305A-EGFP-HAのPCR断片を、プライマーAG52/AG55を使用して、オーバーラップPCRによって3つの断片:p53由来の2つの断片プライマーAG52/AG58及びAG56/AG53、及び鋳型としてp53cDNAを使用して生成した及び上記のGFP-HA断片を組み合わせることによって得た。p53-305TAG-GFP-HAのPCR断片は、AG58の代わりにプライマーAG57を用いて同じ戦略によって得た。結果p53-K305-egfp-ha由来の全長のp53-EGFP-HAタンパク質の産生は、PCKRS/PyltRNACUA対及び1の添加に依存し、これは、p53の305位のアンバーコドンTAGに応じて1が組み入れられることを確認している。ウエスタンブロット図8Bは、1を含有するp53のレベルが、内在性のp53レベルと同程度であったが、それよりもわずかに低かったことを実証している。蛍光イメージングによって、以前報告された通りLiangSHClarkeMFJBiolChem19992743269932703OkeefeKLiHPZhangYPMolCellBiol20032363966405、p53-EGFP-HAが核に局在していること、及びp53-K305A-EGFP-HAが主に細胞質ゾルに局在していることが確認された図8C。11mMの存在下でp53-K305-egfp-haがPCKRS/PyltRNACUA対と一緒に発現している場合、p53は主に細胞質ゾルに局在していることが観察された図8D及び図9。これは、p53NLSシグナルの機能が、単一のケージドリジンの導入によって有効に抑止されていることを実証している。光分解5秒;365nm;12mW/cm2すると、脱ケージング及びその後のp53の核内移入の結果として、細胞質内のp53の進行性の核内移入が観察される図8D、図9。この系が非常に複雑であることと一致して、核質の場合よりも核内移入における細胞間の変動性が大きいことが観察される。対照実験では、我々は、p53の305位のアンバーコドンに応じてε-Boc-保護されたリジン又はチロシンを組み入れた。これらのp53変異体は、光分解した後、細胞質に局在し、核には局在化せず図8D、図9、これは、再局在化が1の特異的な脱ケージングに起因することを確認している。結論として、我々は、新しい光ケージドリジン1の合成及びヒト細胞内のタンパク質への部位特異的な遺伝的な組み入れを実証した。このアミノ酸を使用して核局在化シグナルをケージングし、ヒト細胞におけるタンパク質の局在化を、非光損傷性のUV照射の急速なパルスを使用して光化学的に制御することによって核内移入の動態を測定した。生細胞におけるシグナル伝達ネットワークの時間的解析を可能にする、遺伝子工学で操作された光によって活性化されたキナーゼ生細胞の内部で、高い時間分解能でユーザー定義のキナーゼを活性化することにより、シグナルトランスダクションについての理解が加速する。我々は、光によって活性化されたキナーゼを創出するための一般的な戦略を報告する。光活性化可能なMEK1により、MAPキナーゼシグナル伝達内のサブネットワークを特異的、急速、且つ受容体非依存的に活性化することが可能になる。微速度顕微鏡により、MEK1を光活性化した後に、単一の哺乳動物の細胞におけるERK2の移行を高い時間分解能で観察することが可能になった。光活性化されたサブネットワークは、EGF刺激した経路よりもはるかに少ない細胞間の変動性を示す。ERK2の核内レベルはEGFに曝露させると上昇するが、刺激前のレベルに戻る前に、光活性化されたサブネットワークにより、核内のERK2のレベルが持続する。MEK1の上流のMAPキナーゼ経路は、ERK2の移行前に遅延を導入するが、移行の動態は一度開始されたら制限されない。MEK1を光活性化した後の核内へのERK2の蓄積は、S字状sigmoidalの時間経過を示し、これは、核内移入に対する律速であるMEK1による非発展的な離散的なERK2の二重リン酸化と一致した。緒言生物体は、複雑なシグナル伝達ネットワークを時間的且つ空間的に調節することによって生存し、発達し、環境の変化に応答する。正常な生理状態及び疾患においてシグナル伝達ネットワークが情報を伝達する動的なプロセスを理解することは、重要な目的である。プロテインキナーゼは、ほぼ間違いなく、最も重要なクラスのシグナル伝達タンパク質である。酵素のこの大きなクラス500を超えるメンバーを含有するManningGWhyteDBMartinezRHunterTandSudarsanamSTheproteinkinasecomplementofthehumangenomeScience29819121934は、ガンマリン酸をATPから標的タンパク質の特定のチロシン残基、トレオニン残基又はセリン残基に転移させる。代謝プロセス、細胞周期の進行、細胞骨格の再配置、細胞小器官輸送、膜輸送、筋肉収縮、成長、アポトーシス及び分化、免疫並びに学習及び記憶を含めたほとんど全ての生物学的プロセスは、リン酸化によって制御されるManningGWhyteDBMartinezRHunterTandSudarsanamSTheproteinkinasecomplementofthehumangenomeScience29819121934。キナーゼに媒介されるネットワークの接続性についての理解が広がるにつれBreitkreutzAChoiHSharomJRBoucherLNeduvaVLarsenBLinZYBreitkreutzBJStarkCLiuGetalAglobalproteinkinaseandphosphataseinteractionnetworkinyeastScience32810431046、シグナルトランスダクション経路が、クロストークする可能性があり、フィードバックする可能性があり、フィードフォワードする可能性があり、全く異なる速度で作動する基本のステップを含有する可能性がある、複雑で動的な多段階プロセスであることがますます明らかになりつつある。シグナル伝達ネットワークが複雑であることにより、経路の細胞外の入力とその出力との間の事象に分子的な原因及び効果を割り当てることが難しくなっている。我々は、細胞内の単一のキナーゼの活性化を急速に且つ特異的に標的にする能力により、細胞のシグナル伝達ネットワークを、より単純なサブネットワークに分けることが可能になるはずであることを理解した図14a。これらのより単純なサブネットワークは、試験をより受けやすい可能性があり、ネットワーク全体の状況では解明されない事象の動態を直接観察することが可能になり得る。プロテインキナーゼの活性を制御するためのいくつかの方法が報告されており、それらとしては、二量体化の誘導SpencerDMWandlessTJSchreiberSLandCrabtreeGRControllingsignaltransductionwithsyntheticligandsScience26210191024、制御分解BanaszynskiLAChenLCMaynardSmithLAOoiAGandWandlessTJArapidreversibleandtunablemethodtoregulateproteinfunctioninlivingcellsusingsyntheticsmallmoleculesCell1269951004、遺伝子工学で操作されたアロステリック活性化KarginovAVDingFKotaPDokholyanNVandHahnKMEngineeredallostericactivationofkinasesinlivingcellsNatBiotechnol28743747、不活性化ミューテーションの化学的なレスキューQiaoYMolinaHPandeyAZhangJandColePAChemicalrescueofamutantenzymeinlivingcellsScience31112931297及び感作されたキナーゼの選択的な阻害BishopACUbersaxJAPetschDTMatheosDPGrayNSBlethrowJShimizuETsienJZSchultzPGRoseMDetalAchemicalswitchforinhibitorsensitiveallelesofanyproteinkinaseNature407395401が挙げられる。これらの方法は、キナーゼ機能に関する我々の知見に実質的に寄与してきたがBurkardMERandallCLLarochelleSZhangCShokatKMFisherRPandJallepalliPVChemicalgeneticsrevealstherequirementforPololikekinase1activityinpositioningRhoAandtriggeringcytokinesisinhumancellsProcNatlAcadSci10443834388、ChoiDSWeiWDeitchmanJKKharaziaVNLesscherHMMcMahonTWangDQiZHSieghartWZhangCetalProteinkinaseCdeltaregulatesethanolintoxicationandenhancementofGABAstimulatedtoniccurrentJNeurosci281189011899、JustmanQASerberZFerrellJEJrElSamadHandShokatKMTuningtheactivationthresholdofakinasenetworkbynestedfeedbackloopsScience324509512、KimJSLilleyBNZhangCShokatKMSanesJRandZhenMAchemicalgeneticstrategyrevealsdistincttemporalrequirementsforSAD1kinaseinneuronalpolarizationandsynapseformationNeuralDev323、LarochelleSBatlinerJGambleMJBarbozaNMKraybillBCBlethrowJDShokatKMandFisherRPDichotomousbutstringentsubstrateselectionbythedualfunctionCdk7complexrevealedbychemicalgeneticsNatStructMolBiol135562、LiSMakovetsSMatsuguchiTBlethrowJDShokatKMandBlackburnEHCdk1dependentphosphorylationofCdc13coordinatestelomereelongationduringcellcycleprogressionCell1365061、VenturaJJHubnerAZhangCFlavellRAShokatKMandDavisRJChemicalgeneticanalysisofthetimecourseofsignaltransductionbyJNKMolCell21701710、これらは、a特異的なキナーゼに限られる場合があり、bキナーゼを活性化するのではなく、不活性化し、cキナーゼの触媒活性を、キナーゼが果たし得る他の役割-例えば、足場又はアンカーとして作用することなどと独立して調節することができない場合があり、dキナーゼの触媒活性を活性化した後の数秒間のうちに起こる急速なプロセスを試験することができない。生細胞の内部のタンパク質機能を急速に活性化させるための潜在的に魅力的な戦略は、タンパク質内の重要なアミノ酸をアミノ酸の光ケージドバージョンに置き換え、不活性なタンパク質をもたらすことを含む。タンパク質を照明すると、光ケージが除去され、タンパク質のネイティブな機能が回復するDeitersAPrinciplesandapplicationsofthephotochemicalcontrolofcellularprocessesChembiochem114753、DeitersALightactivationasamethodofregulatingandstudyinggeneexpressionCurrOpinChemBiol13678686、LawrenceDSThepreparationandinvivoapplicationsofcagedpeptidesandproteinsCurrOpinChemBiol9570575、LeeHMLarsonDRandLawrenceDSIlluminatingthechemistryoflifedesignsynthesisandapplicationsofcagedandrelatedphotoresponsivecompoundsACSChemBiol4409427。化学的な方法及び酵素的な方法としては、ネイティブな化学的なライゲーション及びインビトロにおける翻訳を使用して光ケージング基をタンパク質にインビトロで導入することが挙げられるEndoMNakayamaKKaidaYandMajimaTDesignandsynthesisofphotochemicallycontrollablecaspase3AngewChemIntEd4356435645、GhoshMSongXMouneimneGSidaniMLawrenceDSandCondeelisJSCofilinpromotesactinpolymerizationanddefinesthedirectionofcellmotilityScience304743746、PelloisJPHahnMEandMuirTWSimultaneoustriggeringofproteinactivityandfluorescenceJAmChemSoc12671707171。これらの手法は、ケージドタンパク質を、透過処理によってHahnMEandMuirTWPhotocontrolofSmad2amultiphosphorylatedcellsignalingproteinthroughcagingofactivatingphosphoserinesAngewChemIntEd4358005803、又はマイクロインジェクションによってPelloisJPandMuirTWALigationandphotoreleasestrategyforthetemporalandspatialcontrolofproteinfunctioninlivingcellsAngewChemIntEd4457135717真核細胞に導入するために拡張されているが、これらの方法は、難しいままである。ある場合では、出芽酵母Scerevisiaeにおけるセリンのリン酸化部位を、酵母においてアンバーコドンに応じて光ケージドセリンを組み入れる進化させたロイシル-tRNA合成酵素/tRNACUA対LemkeEASummererDGeierstangerBHBrittainSMandSchultzPGControlofproteinphosphorylationwithageneticallyencodedphotocagedaminoacidNatChemBiol3769772を用いてPho4に組み込んだ光ケージドセリンを使用して遮蔽したが、キナーゼの活性ではなく基質の利用可能性を調節するこの手法は、哺乳動物の細胞において実証されていない。さらに、この手法は、チロシンのリン酸化、又は、チロシンのリン酸化、トレオニンのリン酸化及びセリンのリン酸化の組み合わせを含めた多重リン酸化によって調節される大多数のプロセスを試験するために使用することができない。我々は、最近、哺乳動物の細胞においてアンバー終止コドンに応じて光ケージドアミノ酸1のタンパク質への組み入れを導く図14cGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088、M.バーケリのピロリジル-tRNA合成酵素/tRNACUAの進化させた変異体である光ケージドリジル-tRNA合成酵素/RNACUAPCKRS/tRNACUA対を報告した。我々は、このアミノ酸をタンパク質の核局在化配列内に組み入れ、それらの核内移入機能を遮断し、タンパク質を細胞質ゾルに誤って局在化させた。光のパルスを1秒用いて脱ケージングすると、タンパク質上1がリジンに変換された-その核局在化配列が回復した-そして、核への局在化の動態をリアルタイムで追跡することができたGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088。多くのプロテインキナーゼは、それらの調節ドメインを欠失させることによって、又は、それらのリン酸化活性化部位を負に荷電したアミノ酸にミューテーションさせることによってCowleySPatersonHKempPandMarshallCJActivationofMAPkinasekinaseisnecessaryandsufficientforPC12differentiationandfortransformationofNIH3T3cellsCell77841852、HuangSJiangYLiZNishidaEMathiasPLinSUlevitchRJNemerowGRandHanJApoptosissignalingpathwayinTcellsiscomposedofICECed3familyproteasesandMAPkinasekinase6bImmunity6739749、MansourSJMattenWTHermannASCandiaJMRongSFukasawaKVandeWoudeGFandAhnNGTransformationofmammaliancellsbyconstitutivelyactiveMAPkinasekinaseScience265966970、MindenALinAMcMahonMLangeCarterCDerijardBDavisRJJohnsonGLandKarinMDifferentialactivationofERKandJNKmitogenactivatedproteinkinasesbyRaf1andMEKKScience26617191723、RaingeaudJGuptaSRogersJSDickensMHanJUlevitchRJandDavisRJProinflammatorycytokinesandenvironmentalstresscausep38mitogenactivatedproteinkinaseactivationbydualphosphorylationontyrosineandthreonineJBiolChem27074207426構成的に活性化することができるので、キナーゼに活性化ミューテーションを、及び酵素の活性部位に光ケージングに重要な残基を同時に導入することにより、光活性化できる状態になっているキナーゼを創出する可能性があり得ると我々は理解した。プロテインキナーゼは、それらのATP結合ポケットにほぼ普遍的に保存された、ATPをつなぎ留め、方向づけるリジン残基を含有するManningGWhyteDBMartinezRHunterTandSudarsanamSTheproteinkinasecomplementofthehumangenomeScience29819121934。いくつかのキナーゼの活性部位における保存されたリジンの代わりに1をモデリングすることにより、かさのあるケージング基はATPの結合を妨げるが、キナーゼの構造をかき乱すことなく活性部位内に収容され得ることが明らかになった図14b。ここで、我々は、光を用いて活性化することができるキナーゼを創出するための一般的な戦略を報告し、細胞の増殖、生存、分化、アポトーシス、運動性及び代謝において重要な保存されたMAPキナーゼ経路に新しい洞察をもたらすために我々の手法を適用する。1~2秒の光のパルスを用いて光活性化可能なMEK1キナーゼのバージョンを創出し、それによってMEK1によりトレオニン残基及びチロシン残基の両方のERK1/2がリン酸化されるサブネットワークの特異的、急速且つ受容体非依存的な活性化が可能になり、それが、核内へのERK1/2の蓄積並びにPC12細胞における神経の分化に重要な転写因子のリン酸化及び活性化並びに細胞周期への再進入並びに線維芽細胞におけるDNA合成の開始につながるDikicISchlessingerJandLaxIPC12cellsoverexpressingtheinsulinreceptorundergoinsulindependentneuronaldifferentiationCurrBiol4702708、LenormandPSardetCPagesGLAllemainGBrunetAandPouyssegurJGrowthfactorsinducenucleartranslocationofMAPkinasesbutnotoftheiractivatorMAPkinasekinaseinfibroblastsJCellBiol12210791088、TraverseSSeedorfKPatersonHMarshallCJCohenPandUllrichAEGFtriggersneuronaldifferentiationofPC12cellsthatoverexpresstheEGFreceptorCurrBiol4694701。タイムラプスtimelapse顕微鏡により、単一の細胞において、MEK1を光活性化した後のERK2の核内への蓄積を高い時間分解能で追跡することが可能になった。これらの実験により、光活性化されたサブネットワークがEGF刺激した経路よりもはるかに少ない細胞間の変動性を示すことが明らかになった。EGF刺激により厳密な適応がもたらされCohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893ERK2の核内レベルがEGFに曝露させると上昇するが、その後刺激前のレベルに戻る現象、光活性化されたMEK1のプールは、長期間核内に高レベルのERK2を維持する定常の刺激として作用する。我々の結果は、MEK1の上流のMAPキナーゼ経路は、ERK2の移行前に遅延を導入するが、移行の動態は一度開始されたら制限されないことを示している。MEK1を光活性化した後の核内へのERK2の蓄積は、時間とともにS字状であり、これは非発展的な離散的なBurackWRandSturgillTWTheactivatingdualphosphorylationofMAPKbyMEKisnonprocessiveBiochemistry3659295933、SalazarCandHoferTMultisiteproteinphosphorylationfrommolecularmechanismstokineticmodelsFEBSJ27631773198、核内移入に対する律速であるMEK1によるERK2の二重リン酸化と一致した。結果MEK-1の光活性化によるMAPキナーゼサブネットワークの制御照明すると活性化することができるMEK1ミュータントを創出するために、我々は、まず、構成的に活性な、残基30~49が欠失しているMEK1ミュータントであるA-MEK1-ΔNAは活性であることを示すを構築したMansourSJMattenWTHermannASCandiaJMRongSFukasawaKVandeWoudeGFandAhnNGTransformationofmammaliancellsbyconstitutivelyactiveMAPkinasekinaseScience265966970。A-MEK1-ΔNにおける、ATPの結合及び触媒作用にとって重大なほぼ普遍的に保存されたリジンであるリジンK97を、K97のコドンをmek1-ΔN-97TAGを創出するアンバー終止コドンに置き換えること、及び進化させたPCKRS/tRNACUA対を用いて、このコドンに応じて1を指向的に組み入れることによって、光ケージドリジン1に置き換えたGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088。これにより、C-MEK1-ΔNが産生され、ここでCは、触媒の残基K97が、アミノ酸1を遺伝的に組み入れることによってケージングされることを示す。免疫ブロッティングにより、mek1-ΔN-97TAGでトランスフェクトされ、12mMの存在下で培養させるとPCKRS/tRNACUA対を発現するヒト胎児由来腎臓HEK293T細胞におけるC-MEK1-ΔNタンパク質のレベルが、1の代わりに、ヒトチロシンアンバーサプレッサーtRNATYRCUAを用いてチロシンを組み入れた場合に得られたC-MEK1-ΔNタンパク質のレベルに匹敵したことが示された図15a。同様に、C-MEK1-ΔNのレベルは、A-MEK1-ΔN及びキナーゼの触媒活性を無効にする公知のミューテーション、K97Mを含有するD-MEK1-ΔNミュータントDは機能しないことを示すのレベルに匹敵した図15a及び図21。総合すると、これらの知見は、光ケージドキナーゼを野生型キナーゼに匹敵するレベルで産生することができること、及びトランスフェクトされた細胞におけるこれらのタンパク質のレベルが、マイクロモル濃度で細胞に存在する内在性のMEK1のレベルに匹敵すること図21bを実証している。MEK1は、下流の細胞外シグナルに調節されるプロテインキナーゼであるERK1及びERK2に高度に特異的であり、他の公知の基質を有さないShaulYDandSegerRTheMEKERKcascadefromsignalingspecificitytodiversefunctionsBiochimBiophysActa177312131226。MEK1は、ERK1/2における2つの調節残基、どちらも保存されたThr-Glu-TyrTEYモチーフの一部であるトレオニン及びチロシンをリン酸化するPayneDMRossomandoAJMartinoPEricksonAKHerJHShabanowitzJHuntDFWeberMJandSturgillTWIdentificationoftheregulatoryphosphorylationsitesinpp42mitogenactivatedproteinkinaseEMBOJ10885892。光ケージドリジン1を導入することによってキナーゼ活性が妨げられることを検証するために、静止HEK293ET細胞において、C-MEK1-ΔNを高感度緑色蛍光タンパク質と融合したERK2EGFP-ERK2と同時発現させた。免疫ブロッティングにより、内在性のERK1/2及びEGFP-ERK2のどちらにおいてもTEYモチーフがリン酸化されないことが明らかになり図15a、これは、ケージドリジン1により、C-MEK1-ΔNの触媒活性がD-MEK1-ΔNにおけるK97Mミューテーションと同じくらい効率的に遮断されることを示している。C-MEK1-ΔNを活性化するために、我々は、培養プレートの下に置いた365nmの発光ダイオードLED,lightemittingdiodeランプを使用してタンパク質を産生している細胞を1分間照明した。この方法により、ウエスタンブロット分析するために十分な数の細胞を、試料を加熱することを回避する単色の光で照明することが可能になった。免疫ブロッティングにより、細胞を照明した1分後にEGFP-ERK2及び内在性のERK2がリン酸化され、照明の10分後あたりでリン酸化が最大になることが明らかになった図15b及び図22。リン酸化された内在性のERK1/2よりも多くのリン酸化されたEGFP-ERK2が観察された。これは、EGFP-ERK2及びC-MEK1-ΔNは、あるサブセットの細胞のみが、トランスフェクションによってそれを含有するが、内在性のERK1/2は本質的に全ての細胞が含有するという事実と一致する。これらの知見は、リン酸化が、全ての細胞に影響を及ぼし、ERKのリン酸化につながる内在性のMAPキナーゼ経路を活性化する照明誘導性の細胞のストレス応答ではなく、アンケージド同時発現C-MEK1-ΔNに直接起因することを示唆している。C-MEK1-ΔNを不活性なキナーゼであるD-MEK1-ΔNに置き換える対照実験図15b及び図22又はタンパク質なしの対照実験図22では、照明した後に、EGFP-ERK2又は内在性のERK1/2の検出可能なリン酸化は導かれなかった。これらの対照実験は、さらに、照明によって内在性のMAPキナーゼ経路は活性化されず、ERKのリン酸化が導かれることを実証している。トランスフェクトされた細胞におけるEGFP-ERK2のレベルは、内在性のERKのレベルよりも低い、又はそれと等しい。C-MEK1-ΔNとEGFP-ERK2を同時発現している細胞を、時間を増やしながら照明することにより、EGFP-ERK2のリン酸化が増え図15c、これは、単に照明する時間を調整することによって、活性なキナーゼの細胞における濃度を高い精度で制御することが可能であることを実証している。C-MEK1-ΔNを光活性化することによってERK1/2基質のリン酸化が導かれることを実証するために、我々は、ERK1/2の2つの下流の基質であるp90リボソームのS6キナーゼp90RSK及び転写因子Elk-1のリン酸化の状態を探索した。C-MEK1-ΔNとEGFP-ERK2を同時発現している静止細胞を照明することにより、C-MEK1-ΔNの代わりにD-MEK1-ΔNを使用した場合、又はMEK1阻害剤U0126を加えた場合には観察されなかった、内在性のリン酸化されたp90RSK及びElk-1が増加した図15d。これらのデータは、C-MEK1-ΔNを光活性化することにより、細胞において、ERK1/2がリン酸化され、その後、p90RSK及びElk-1がリン酸化されるMAPキナーゼ経路のサブネットワークを特異的に活性化することが可能になることを実証している。EGF刺激すると、長い遅滞期の後、高い細胞間の変動性を伴ってERKの移行が導かれる細胞全体内のサブネットワークを特異的に活性化することにより、経路全体を活性化した場合には観察することが難しいサブネットワークにおけるプロセスの動態を直接観察することが可能になり得る。活性化因子としてのその役割に加えて、MEK1は、ERK1/2に対する細胞質のアンカータンパク質としても作用するFukudaMGotohYandNishidaEInteractionofMAPkinasewithMAPkinasekinaseitspossibleroleinthecontrolofnucleocytoplasmictransportofMAPkinaseEMBOJ1619011908、RubinfeldHHanochTandSegerRIdentificationofacytoplasmicretentionsequenceinERK2JBiolChem2743034930352。二重にリン酸化されると、ERK1/2は、MEK1及びそれの他の細胞質のアンカーから脱離し、核内に移行しKhokhlatchevAVCanagarajahBWilsbacherJRobinsonMAtkinsonMGoldsmithEandCobbMHPhosphorylationoftheMAPkinaseERK2promotesitshomodimerizationandnucleartranslocationCell93605615、RubinfeldHHanochTandSegerRIdentificationofacytoplasmicretentionsequenceinERK2JBiolChem2743034930352、そこで、転写因子をリン酸化することによって遺伝子発現を調節するBrunetARouxDLenormandPDowdSKeyseSandPouyssegurJNucleartranslocationofp42p44mitogenactivatedproteinkinaseisrequiredforgrowthfactorinducedgeneexpressionandcellcycleentryEMBOJ18664674、ChenRHSarneckiCandBlenisJNuclearlocalizationandregulationoferkandrskencodedproteinkinasesMolCellBiol12915927、KimKNoseKandShibanumaMSignificanceofnuclearrelocalizationofERK12inreactivationofcfostranscriptionandDNAsynthesisinsenescentfibroblastsJBiolChem2752068520692、LenormandPSardetCPagesGLAllemainGBrunetAandPouyssegurJGrowthfactorsinducenucleartranslocationofMAPkinasesbutnotoftheiractivatorMAPkinasekinaseinfibroblastsJCellBiol12210791088。核内のERK1/2が脱リン酸化されると核に戻るAndoRMizunoHandMiyawakiARegulatedfastnucleocytoplasmicshuttlingobservedbyreversibleproteinhighlightingScience30613701373、CostaMMarchiMCardarelliFRoyABeltramFMaffeiLandRattoGMDynamicregulationofERK2nucleartranslocationandmobilityinlivingcellsJCellSci11949524963、VolmatVCampsMArkinstallSPouyssegurJandLenormandPThenucleusasiteforsignalterminationbysequestrationandinactivationofp42p44MAPkinasesJCellSci11434333443。インビトロで、MEK1に媒介されるERK1/2の2つのリン酸化部位のリン酸化は非発展的離散的であり、ERK1/2の離散的なリン酸化により、ジリン酸化されたdiphosphorylated形態を形成する超高感度の、切り換え様の、S字状の動態が導かれることが公知であるBurackWRandSturgillTWTheactivatingdualphosphorylationofMAPKbyMEKisnonprocessiveBiochemistry3659295933、FerrellJEJrandBhattRRMechanisticstudiesofthedualphosphorylationofmitogenactivatedproteinkinaseJBiolChem2721900819016、MarkevichNIHoekJBandKholodenkoBNSignalingswitchesandbistabilityarisingfrommultisitephosphorylationinproteinkinasecascadesJCellBiol164353359、SalazarCandHoferTMultisiteproteinphosphorylationfrommolecularmechanismstokineticmodelsFEBSJ27631773198。しかし、足場及び他のタンパク質がキナーゼを組織化し、調節し得るインビボではBashorCJHelmanNCYanSandLimWAUsingengineeredscaffoldinteractionstoreshapeMAPkinasepathwaysignalingdynamicsScience31915391543、MalleshaiahMKShahrezaeiVSwainPSandMichnickSWThescaffoldproteinSte5directlycontrolsaswitchlikematingdecisioninyeastNature465101105、この基本のステップについてのS字状の動態が保存されているかどうか、及びこれらのリン酸化、又はMEKの上流のステップが、ERK1/2の移行を制御するかどうかは未知であるLidkeDSHuangFPostJNRiegerBWilsbacherJThomasJLPouyssegurJJovinTMandLenormandPERKnucleartranslocationisdimerizationindependentbutcontrolledbytherateofphosphorylationJBiolChem28530923102。この経路が、ERK応答性の転写因子を制御する重要な調節ステップであるERK1/2の移行の動態をどのように制御するかの洞察をもたらす目的で、我々は、a経路全体を、受容体を媒介して刺激した後のERK1/2の移行の動態と、b光活性化したサブネットワークにおけるERKの移行の動態を比較することを試みた。野生型のMEK1及びEGFP-ERK2を発現している細胞を100ng/mlの上皮成長因子EGFで刺激した場合、全体のMAPキナーゼ経路が活性化され、EGFP-ERK2が核内に移行する。蛍光微速度顕微鏡画像による数量化により、EGFP-ERK2の核内への蓄積が、EGFP-ERK2が急速に核内に蓄積する前に3分の遅滞期を伴うS字状の動態を示すことが実証されている図16a、b。移入のt1/2及び細胞質のEGFP-ERK2に対する核内のEGFP-ERK2の最大の比に相当な細胞間の変動性が観察され、以前報告された通りCohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893、刺激後に観察された核内移入のタイミングの変動性は、核内のERK2の画分の変動性よりも少なかったCohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893図16c、d。EGFP-ERK2の核内への蓄積は、ピークになり、その後、刺激前のレベルにまで消失し、これは、厳密な適応として公知の細胞系における周知の効果であるCohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893。この効果は、EGFシグナル伝達についての分子の詳細では理解されていないが、EGF刺激を一部の-今のところは未定義の-経路におけるポイント複数可において補償する細胞のプロセスを伴うに違いない。トランスフェクトされた細胞を用いた我々の実験により、内在性のMEK1を有する安定な細胞系、及び、蛍光でタグを付けた、内在性のプロモーターから内在性のレベルで産生されたMEK2を用いてEGF刺激した後の細胞間の変動性に関する以前の観察が再現されるCohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893。これにより、内在性の状況を我々の実験が反映することがさらに確認される。C-MEK1を光活性化することにより、細胞間で高度に再現性のある急速なERKの移行が導かれるMEK1を光によって活性化した際のERK2の核内移行の動態を特徴付けるために、我々は、新しい光活性化可能なMEK1が必要であった。C-MEK1-ΔNは、MEK1の細胞質への局在化に関与する核外移出配列NES,nuclearexportsequence、残基33~44も含有する、MEK1を構成的に活性するN末端配列残基30~49が欠失しているので、ERK2を細胞質内に隔離するのに使用することができなかったFukudaMGotohIGotohYandNishidaECytoplasmiclocalizationofmitogenactivatedproteinkinasekinasedirectedbyitsNH2terminalleucinerichshortaminoacidsequencewhichactsasanuclearexportsignalJBiolChem2712002420028。リン酸化された状態を模倣する、通常Rafによってリン酸化されてMEK1を活性化するSer218及びSer222がAsp残基で置換されている構成的に活性なMEK1A-MEK1-DDの保存されたリジンK97を光ケージングすることによってN末端のNESを有する新しいケージドMEK1を創出したMansourSJMattenWTHermannASCandiaJMRongSFukasawaKVandeWoudeGFandAhnNGTransformationofmammaliancellsbyconstitutivelyactiveMAPkinasekinaseScience265966970。免疫ブロッティング実験によって、新しい光活性化可能なケージドMEK1C-MEK1-DDが、C-MEK1-ΔNと同じくらい効率的に機能することが確認された図23。共焦点蛍光イメージングにより、C-MEK1-DDがEGFP-ERK2を細胞質内に保持することが示され、これは、そのアンカー機能が、その触媒活性が排除されている間維持されることを実証している図17a。UVフィルターを備えた顕微鏡のハロゲン化金属ランプで照明すると2秒、365nm、1mW/cm2、細胞質内にC-MEK1-DD及びEGFP-ERK2を含有する休止状態にある細胞は、EGFP-ERK2を核内に急速に蓄積した図17a、b。10分以内に、細胞質のEGFP蛍光Fn/cに対する核のEGFP蛍光Fn/cの比に4倍の上昇が観察された図17b。照明する前に10μMのMEK1阻害剤U0126を加えることにより、核内への蓄積が有意に遮断された図17a、b。同様に、EGFP-ERK2を、野生型wt-MEK1と、又は触媒として機能しないミュータントD-MEK1-DDと同時発現している休止細胞を照明した場合、核内移行は観察されなかった図17a、b。これらの実験は、光によって活性化されたC-MEK1-DDがリン酸化されると、EGFP-ERK2が休止細胞に移行することを示している。さらに、C-MEK1-DDを、リン酸化部位TEYがAAAにミューテーションしたEGFP-ERK2ミュータントEGFP-ERK2-AAAと同時発現させた場合、照明した際にEGFP-ERK2-AAAの移行は観察されず図17a、b、これは、TEYモチーフの二重リン酸化によって駆動される核内移行と一致した。これらのデータは、MEK1に誘導されるTEYモチーフのリン酸化によるERK2の活性化が、ERK2の核内移行を誘発するために十分であることを示している。EGFP-ERK2の核内移行のリアルタイム測定により、C-MEK1-DDを光活性化した後のサブネットワークにおける移行プロセスが、経路全体のEGF刺激による活性化よりもはるかに速く開始されることが示されているt1/2=15分対4.5分、図18b。EGF刺激とは対照的に、C-MEK1-DDの光活性化により、EGFP-ERK2の核内への蓄積が長い期間にわたって持続される図18a、b、図16b。これは、光活性化されたC-MEK1-DDのプールが、定常の刺激として作用すること、及び、経路全体のEGF刺激とは異なり、サブネットワークの活性が厳密な適応を受けないことを示している。これらの知見は、分子標的がEGF応答において最適に調節されること、及び、これらの標的に対して作用する調節因子が、MAPKネットワークにおいてMEK1とERK2の間に位置することができないことを示唆している。移行の速度及び核内の蛍光の増加について、C-MEK1-DDを光活性化した場合、野生型MEK1をEGFで刺激した場合よりもはるかに少ない細胞間の変動性が観察され図18c~f、これは、光活性化されたサブネットワークの細胞間の変動性に対する感受性が、外部の刺激によって活性化されたネットワーク全体の細胞間の変動性に対する感受性よりも低いことを示している。そのようなサブネットワークの頑強性は定量的測定に役立つはずである。ERK1/2を核内移入させるための定常の刺激は、核内でのERK1/2の脱リン酸化及びその移出によって打ち消されるAndoRMizunoHandMiyawakiARegulatedfastnucleocytoplasmicshuttlingobservedbyreversibleproteinhighlightingScience30613701373、CostaMMarchiMCardarelliFRoyABeltramFMaffeiLandRattoGMDynamicregulationofERK2nucleartranslocationandmobilityinlivingcellsJCellSci11949524963、VolmatVCampsMArkinstallSPouyssegurJandLenormandPThenucleusasiteforsignalterminationbysequestrationandinactivationofp42p44MAPkinasesJCellSci11434333443。この相殺プロセスを明らかにし、ERK2の核外移出を可視化するために、C-MEK1-DDを光活性化することによってEGFP-ERK2の核内移行を誘導し、次いで、MEK1阻害剤U0126を加えることによって、MEK1に誘導されるERK2の核内移行を遮断した。これにより、EGFPの核内の蛍光の急速な喪失が引き起こされt1/2が3分未満図19a、b、補足の動画S1、これは、急速な脱リン酸化に誘導される、移入したERK2の核外移出と一致するAndoRMizunoHandMiyawakiARegulatedfastnucleocytoplasmicshuttlingobservedbyreversibleproteinhighlightingScience30613701373、CostaMMarchiMCardarelliFRoyABeltramFMaffeiLandRattoGMDynamicregulationofERK2nucleartranslocationandmobilityinlivingcellsJCellSci11949524963。これらのデータは、MEK1に対するU0126の作用が、MAPキナーゼ経路に対するその効果の要因になるのに十分であることを実証している。ERKの移行の動態は、MEK1に媒介されるリン酸化によって調節される高い時間分解能を有する蛍光微速度顕微鏡検査により、EGFP-ERK2の移行のS字状曲線が示される。EGF刺激による移行についてのS字状曲線図16b及び光活性化による移行についてのS字状曲線図18g、h及び補足の動画S2は、一度移行が開始されたら、匹敵する傾斜を有する50の正味の移行が生じている時の傾斜によって判断するが、EGF刺激した実験における最初の遅滞期は、光活性化された実験における最初の遅滞期よりもはるかに長い図18g、h及び図16bを比較されたい。これらの知見は、経路内のMEK1の上流のステップが、移行プロセスを活性化する前に遅延を導入するように機能するが、一度移行が始まれば、移行速度には有意な影響を及ぼさないことを示唆している。したがって、移行の速度は、経路内のMEK1とERK2の間で定められる。サブネットワークについてのS字状曲線図18hは、以前はインビトロでのみ観察され、細胞における移行の速度を決定するためにインビボで操作したMEK1による離散的なERK1/2の二重リン酸化と一致するFerrellJEJrandBhattRRMechanisticstudiesofthedualphosphorylationofmitogenactivatedproteinkinaseJBiolChem2721900819016、SalazarCandHoferTMultisiteproteinphosphorylationfrommolecularmechanismstokineticmodelsFEBSJ27631773198。LEDランプを用いて1分間にわたってサブネットワークを活性化した後、我々は、リン酸化されたERK1/2の蓄積をウエスタンブロットによって追跡した。リン酸化されたERK1/2は急速に蓄積したが、この方法の時間分解能では、二重にリン酸化された種の形成における遅滞期を直接観察することはできなかった図20d、e。EGFP-ERK2の移行の正味の動態及びそれらとEGFP-ERK2のリン酸化の速度との関係をさらに特徴付けるために、我々は、欠失Δ174~177を含有し、核内移入速度は変化するが移出速度は変化しないことが報告されているERK2-Δ4ミュータントの移行の速度を試験したLidkeDSHuangFPostJNRiegerBWilsbacherJThomasJLPouyssegurJJovinTMandLenormandPERKnucleartranslocationisdimerizationindependentbutcontrolledbytherateofphosphorylationJBiolChem28530923102。このミュータントをC-MEK1-DDと同時発現している細胞を光活性化した場合、核内移行が観察されたが、動態は遅くt1/2=6分図20a、b、核内への蓄積のレベルは低かった図20c。核内への蓄積が遅いことは、この時点で核内移入の速度が移出速度よりもほんのわずかだけ速いことを示唆している。光活性化後の遅延時間及び移入の正味の速度50の正味の移行が生じている時の傾斜によって判断するはどちらも、野生型の場合から変化した。遅延時間及び移入の正味の速度が連動して変化したことは、野生型の場合のその核内移入において律速ステップになっているERK1/2の離散的な二重リン酸化と一致する。我々のデータは、最近提唱された通り、このミュータントの移行が遅いことは、リン酸化が遅いことに起因し得ることを示唆しているLidkeDSHuangFPostJNRiegerBWilsbacherJThomasJLPouyssegurJJovinTMandLenormandPERKnucleartranslocationisdimerizationindependentbutcontrolledbytherateofphosphorylationJBiolChem28530923102。移入速度及び移出速度が、それぞれのリン酸化速度及び脱リン酸化速度によって駆動されると考えると、EGFP-ERK2-Δ4について観察される核内移入が遅いこと、及び核内への蓄積が減ることは、リン酸化されたEGFP-ERK2-Δ4の蓄積が遅いこと、及びそれが減ることを伴うはずである。EGFP-ERK2-Δ4及びC-MEK1-DDを同時発現している細胞について免疫ブロッティングし、LEDランプで1分間にわたって照明することにより、EGFP-ERK2-Δ4のリン酸化の見かけの速度がEGFP-ERK2より遅いこと、及びEGFP-ERK2-Δ4のリン酸化の程度がEGFP-ERK2よりも低いことが明らかになった図20d~e。この実験により、EGFP-ERK2-Δ4の核内への蓄積が遅いこと、及びそれが減ることとリン酸化が遅いことが直接互いに関係づけられ、それにより、ERK1/2の核内移行がMEK1による二重のリン酸化の速度によって制御されることのさらなる証拠がもたらされる。考察結論として、我々は、生きている哺乳動物の細胞において、1~2秒の光パルスによって活性化することができるキナーゼを創出するための戦略を実証した。我々は、光ケージドリジン1を遺伝的にコードすることによって、MEK1触媒活性を、そのアンカー機能を維持しながら不活性することができることを示した。我々は、活性化されたMEK1の量を、照明の持続時間によって制御することができること、及び我々の方法によってMAPキナーゼシグナル伝達内のサブネットワークを、細胞外の受容体を通じた経路の活性化とは独立してオンにすることができることを実証した。我々は、光活性化した際のサブネットワークの活性化の動態は、EGFに媒介される活性化の動態よりも少ない細胞間の変動性を示すことを実証した。この知見は、多様な細胞外の入力によって生じるシグナルを、追加的なノイズを導入することによってこれらのシグナルを歪めることなく再現性よく伝達することにおけるMEK1サブネットワークの進化的に保存された役割を反映し得る。そのようなモデルにより、ERK1/2が移入すると開始される転写性のプログラムが、細胞外の刺激のレベル及び強度に正確に応答することが可能になり得る。EGFによって活性化された経路とは異なり、サブネットワークは厳密な適応によって制御されない。これは、細胞間の変動がMEKの活性化の上流のプロセスに起因し得ること、及びMEKの下流の経路はEGF刺激によって引き出されるERK2の移行における適応応答を引き出すために十分でないことを示唆している。EGFによる活性化とサブネットワークによる活性化を比較することによって、MEK1に先立つステップにより、EGF刺激の後、ERK1/2の移行の開始に数分間の遅延が創出され、それによりMEK1の切り換え様の活性化が導かれるが、一度輸送が開始されれば、ERK1/2の輸送の動態が劇的に変化することはなく、これは、MEK1に先立つステップはERK1/2の移行に対する律速ではないことを示していると我々は結論づけた。最終的に、我々は、MEK1を光活性化した後のERK1/2の移行速度が遅滞期を示すこと、及び、ERK1/2のリン酸化に直接影響を及ぼすミューテーションが、MEK1が活性化された後のERK1/2の核内への蓄積の動態にも直接影響を及ぼすことを示した。これらの結果は、MEK1によるERK1/2の離散的な二重リン酸化が、このMAPキナーゼ経路におけるERKの輸送に対する律速であることを示唆している。本明細書において提示している方法体系を使用して、細胞における空間的なキナーゼの活性化及び時間的なキナーゼの活性化の効果に取り組むための非常に高い時間分解能及び空間分解能をもたらすことができるLevskayaAWeinerODLimWAandVoigtCASpatiotemporalcontrolofcellsignallingusingalightswitchableproteininteractionNature4619971001。標的のリジン残基の相当な保存に起因して、本明細書において報告される光による活性化の方法は、他のキナーゼの光活性化されたバージョンを創出するために一般に、且つ容易に適用可能であるべきである。さらに、リジンの光ケージングを経路内の各キナーゼに適用することにより、キナーゼネットワークの動態及び個々のキナーゼの基質への正確な定量的洞察が可能になる。特異的且つ急速に活性化された単一の細胞サブネットワークにおけるそのような定量的洞察により、細胞間の変動性及び頑強性及び適応につながる分子経路がさらに明らかになり、シグナルトランスダクションの定量的モデルにおける実験パラメータを速やかに制約することが可能になるはずであるAldridgeBBBurkeJMLauffenburgerDAandSorgerPKPhysicochemicalmodellingofcellsignallingpathwaysNatCellBiol811951203、AsthagiriARandLauffenburgerDAAcomputationalstudyoffeedbackeffectsonsignaldynamicsinamitogenactivatedproteinkinasepathwaymodelBiotechnolProg17227239、BarkaiNandLeiblerSRobustnessinsimplebiochemicalnetworksNature387913917、FujiokaATeraiKItohREAokiKNakamuraTKurodaSNishidaEandMatsudaMDynamicsoftheRasERKMAPKcascadeasmonitoredbyfluorescentprobesJBiolChem28189178926。我々の手法をNTPの結合を利用する広範囲の他のタンパク質に拡張することも可能であろう。これにより、広範囲の生物学的プロセスの時間的な依存及び空間的な依存を操作及び調査することが可能となる。材料及び方法試薬-光ケージドリジン1を以前に記載されている通り調製したGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088。TPA12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテートは、CellSignaling社から購入した。MEK阻害剤U0126は、Promega社から購入した。組換えヒト上皮成長因子EGF,epidermalgrowthfactorは、Gibco社から購入した。ウエスタンブロットは、HAタグSigma社製、FlagタグCellSignaling社製、p44/42MAPKERK1/2CellSignaling社製、phospho-p44/42MAPKERK1/2T202/Y204CellSignaling社製、phospho-ElklS383Cellsignaling社製、phospho-p90RSKS380CellSignaling社製に対する抗体を使用して実施した。DNA構築物-プラスミドp4CMVEU6PylT哺乳動物の細胞においてピロリジルtRNACUAの発現を可能にする及びpPCKRSmCherryTAGEGFPHAについては前述しているGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088。哺乳動物の細胞においてヒトチロシンアンバーサプレッサーtRNATYRCUAを発現させるためのプラスミドpCR21htRNATYRCUAは、TAshtonCroppUniversityofMarylandからの好意の寄贈品であった。HAタグと融合したMEK1ミュータントMEK1-HAをコードする遺伝子は、以前報告されたpPCKRSp53EGFPHAプラスミドのNheI部位及びBssHII部位にライゲーションしGautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088、MEK1-HAと光ケージドリジル-tRNA合成酵素PCKRSの同時発現を可能にした。異なるMEK1ミュータントを発現させるためのプラスミドは、PCRミューテーション誘発によって得られ、DNA配列決定によって配列を検証した。A-MEK1-ΔNは、欠失Δ30~49を含有し;C-MEK1-ΔNは、欠失Δ30~49及びミューテーションK97TAGを含有し;D-MEK1-ΔNは、欠失Δ30~49及びミューテーションK97Mを含有し;A-MEK1-DDは、ミューテーションS218D及びS222Dを含有し;C-MEK1-DDは、ミューテーションS218D、S222D及びK97TAGを含有し;D-MEK1-ΔNは、ミューテーションS218D、S222D及びK97Mを含有し;MEK1-K97M-HAは、ミューテーションK97Mを含有する。ERK2遺伝子は、pEGFPCClontech社製の高感度緑色蛍光タンパク質EGFP遺伝子の下流のPstI部位及びKpnI部位にライゲーションした。ERK2ミュータントを発現させるためのプラスミドは、PCRミューテーション誘発によって得られ、DNA配列決定によって配列を検証した。ERK2-AAAは、ミューテーションT185A、E186A及びY187Aを含有する。ERK2-Δ4は、欠失Δ174~177を含有する。細胞培養及びトランスフェクション-ヒト胎児由来腎臓293ET細胞を、トランスフェクトする前に、37°C、5のCO2雰囲気下、10ウシ胎児血清FBS及び1×penstrep溶液を補充したDMEMGlutaMAX1培地Gibco社製中で24時間培養させた。細胞に、GenejuiceNovagen社製を製造者のプロトコールに従って一過性にトランスフェクトした。分析前に、細胞の血清を欠乏させ0.1のFBSを伴うDMEM、2mMの光ケージドリジン1と一緒に24時間培養させた。光活性化実験の前に培養培地を新鮮な、0.1のFBSを補充した1を含まないDMEMと置き換えた。光活性化-24ウェルプレートにおいて培養させた細胞を、プレートの下に置いた高出力のLED供給源モジュールを用いて、365nmで照明し黒色led365、Prizmatix、次いで免疫ブロッティング分析のために回収した。免疫ブロッティング-細胞を、氷冷のリン酸緩衝食塩水PBS,phosphatebuffersalineで洗浄し、次いで、プロテアーゼ阻害剤反応混液Roche社製、1mMのバナジン酸ナトリウム、5mMのフッ化ナトリウム及び10mMのEDTAを補充した氷冷の普遍的な溶解緩衝液Roche社製を用いて溶解した。試料を、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した後、適切な抗体を用いて免疫ブロッティングによって分析した。生細胞のイメージング-μ-DishIbidi社製において培養させた生細胞を、室温でPlanApochromat63×/1.4油浸対物レンズを備えた倒立ZeissLSM710レーザー走査顕微鏡を用いてイメージングした。光活性化を、EXFOXCite120XLSystemを用いて、UVフィルターを伴う120Wのハロゲン化金属ランプを使用しておよそ2秒力:1mW/cm2実施したフィルターの設定-励起G365、ビームスプリッターFT395、発光BP445/50。EGFPを、488nmのアルゴンレーザーを用いて励起させ、500~560nmの発光を収集した。平均の核の蛍光強度Fn及び細胞質の蛍光強度Fcを、ImageJソフトウェアを使用して数量化して、Fn/c比を次式によって決定することを可能にした:Fn/c=Fn-Fb/Fc-Fb、Fbは平均バックラウンド蛍光強度である。[実施例7A]光によって活性化されたキナーゼにより、生細胞におけるシグナル伝達ネットワークの時間的解析が可能になる補足の動画の一覧動画S1.ERK2の核細胞質間往復輸送を明らかにすること。PCKRS、ピロリジンtRNACUA、EGFP-ERK2及びC-MEK1-DDをコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたHEK293細胞を、2mMの1及び0.1のFBSを補充した培地中で培養させた。細胞を、時間t=0分において365nmの光を用いて照明し2秒、1mW/cm2、8分後にU012610μMを加えた。右側に、代表的な細胞のEGFP蛍光が示されている。左側には、対照として、U0126で処置していない代表的な細胞のEGFP蛍光が示されている。グラフは、8分後にU0126を加えた黒色場合及びU0126を加えていない灰色場合の時間に対する正規化されたFn/cを示している10の代表的な実験の平均。動画S2.ケージドMEK1を光活性化した際の初期のEGFP-ERK2の核内移行の動態PCKRS、ピロリジンtRNACUA、EGFP-ERK2及びC-MEK1-DDをコードするプラスミドを同時トランスフェクトしたHEK293細胞を、2mMの1及び0.1のFBSを補充した培地中で培養させた。細胞を、時間t=0秒において365nmの光を用いて照明した2秒、1mW/cm2。代表的な細胞のEGFP蛍光を追跡した。スケールバーは10μmを表す。右側のグラフは、時間に対する正規化されたFn/cを示す10の代表的な実験の平均。図21、図22及び図23を参照する。実施例7の参考文献AldridgeBBBurkeJMLauffenburgerDAandSorgerPKPhysicochemicalmodellingofcellsignallingpathwaysNatCellBiol811951203AndoRMizunoHandMiyawakiARegulatedfastnucleocytoplasmicshuttlingobservedbyreversibleproteinhighlightingScience30613701373AsthagiriARandLauffenburgerDAAcomputationalstudyoffeedbackeffectsonsignaldynamicsinamitogenactivatedproteinkinasepathwaymodelBiotechnolProg17227239BanaszynskiLAChenLCMaynardSmithLAOoiAGandWandlessTJArapidreversibleandtunablemethodtoregulateproteinfunctioninlivingcellsusingsyntheticsmallmoleculesCell1269951004BarkaiNandLeiblerSRobustnessinsimplebiochemicalnetworksNature387913917BashorCJHelmanNCYanSandLimWAUsingengineeredscaffoldinteractionstoreshapeMAPkinasepathwaysignalingdynamicsScience31915391543BishopACUbersaxJAPetschDTMatheosDPGrayNSBlethrowJShimizuETsienJZSchultzPGRoseMDetalAchemicalswitchforinhibitorsensitiveallelesofanyproteinkinaseNature407395401BreitkreutzAChoiHSharomJRBoucherLNeduvaVLarsenBLinZYBreitkreutzBJStarkCLiuGetalAglobalproteinkinaseandphosphataseinteractionnetworkinyeastScience32810431046BrunetARouxDLenormandPDowdSKeyseSandPouyssegurJNucleartranslocationofp42p44mitogenactivatedproteinkinaseisrequiredforgrowthfactorinducedgeneexpressionandcellcycleentryEMBOJ18664674BurackWRandSturgillTWTheactivatingdualphosphorylationofMAPKbyMEKisnonprocessiveBiochemistry3659295933BurkardMERandallCLLarochelleSZhangCShokatKMFisherRPandJallepalliPVChemicalgeneticsrevealstherequirementforPololikekinase1activityinpositioningRhoAandtriggeringcytokinesisinhumancellsProcNatlAcadSci10443834388ChenRHSarneckiCandBlenisJNuclearlocalizationandregulationoferkandrskencodedproteinkinasesMolCellBiol12915927ChoiDSWeiWDeitchmanJKKharaziaVNLesscherHMMcMahonTWangDQiZHSieghartWZhangCetalProteinkinaseCdeltaregulatesethanolintoxicationandenhancementofGABAstimulatedtoniccurrentJNeurosci281189011899CohenSaidonCCohenAASigalALironYandAlonUDynamicsandvariabilityofERK2responsetoEGFinindividuallivingcellsMolCell36885893CostaMMarchiMCardarelliFRoyABeltramFMaffeiLandRattoGMDynamicregulationofERK2nucleartranslocationandmobilityinlivingcellsJCellSci11949524963CowleySPatersonHKempPandMarshallCJActivationofMAPkinasekinaseisnecessaryandsufficientforPC12differentiationandfortransformationofNIH3T3cellsCell77841852DeitersAPrinciplesandapplicationsofthephotochemicalcontrolofcellularprocessesChembiochem114753DeitersALightactivationasamethodofregulatingandstudyinggeneexpressionCurrOpinChemBiol13678686DikicISchlessingerJandLaxIPC12cellsoverexpressingtheinsulinreceptorundergoinsulindependentneuronaldifferentiationCurrBiol4702708EndoMNakayamaKKaidaYandMajimaTDesignandsynthesisofphotochemicallycontrollablecaspase3AngewChemIntEd4356435645FerrellJEJrandBhattRRMechanisticstudiesofthedualphosphorylationofmitogenactivatedproteinkinaseJBiolChem2721900819016FujiokaATeraiKItohREAokiKNakamuraTKurodaSNishidaEandMatsudaMDynamicsoftheRasERKMAPKcascadeasmonitoredbyfluorescentprobesJBiolChem28189178926FukudaMGotohIGotohYandNishidaECytoplasmiclocalizationofmitogenactivatedproteinkinasekinasedirectedbyitsNH2terminalleucinerichshortaminoacidsequencewhichactsasanuclearexportsignalJBiolChem2712002420028FukudaMGotohYandNishidaEInteractionofMAPkinasewithMAPkinasekinaseitspossibleroleinthecontrolofnucleocytoplasmictransportofMAPkinaseEMBOJ1619011908GautierANguyenDPLusicHAnWDeitersAandChinJWGeneticallyencodedphotocontrolofproteinlocalizationinmammaliancellsJAmChemSoc13240864088GhoshMSongXMouneimneGSidaniMLawrenceDSandCondeelisJSCofilinpromotesactinpolymerizationanddefinesthedirectionofcellmotilityScience304743746HahnMEandMuirTWPhotocontrolofSmad2amultiphosphorylatedcellsignalingproteinthroughcagingofactivatingphosphoserinesAngewChemIntEd4358005803HuangSJiangYLiZNishidaEMathiasPLinSUlevitchRJNemerowGRandHanJApoptosissignalingpathwayinTcellsiscomposedofICECed3familyproteasesandMAPkinasekinase6bImmunity6739749JustmanQASerberZFerrellJEJrElSamadHandShokatKMTuningtheactivationthresholdofakinasenetworkbynestedfeedbackloopsScience324509512KarginovAVDingFKotaPDokholyanNVandHahnKMEngineeredallostericactivationofkinasesinlivingcellsNatBiotechnol28743747KhokhlatchevAVCanagarajahBWilsbacherJRobinsonMAtkinsonMGoldsmithEandCobbMHPhosphorylationoftheMAPkinaseERK2promotesitshomodimerizationandnucleartranslocationCell93605615KimJSLilleyBNZhangCShokatKMSanesJRandZhenMAchemicalgeneticstrategyrevealsdistincttemporalrequirementsforSAD1kinaseinneuronalpolarizationandsynapseformationNeuralDev323KimKNoseKandShibanumaMSignificanceofnuclearrelocalizationofERK12inreactivationofcfostranscriptionandDNAsynthesisinsenescentfibroblastsJBiolChem2752068520692LarochelleSBatlinerJGambleMJBarbozaNMKraybillBCBlethrowJDShokatKMandFisherRPDichotomousbutstringentsubstrateselectionbythedualfunctionCdk7complexrevealedbychemicalgeneticsNatStructMolBiol135562LawrenceDSThepreparationandinvivoapplicationsofcagedpeptidesandproteinsCurrOpinChemBiol9570575LeeHMLarsonDRandLawrenceDSIlluminatingthechemistryoflifedesignsynthesisandapplicationsofcagedandrelatedphotoresponsivecompoundsACSChemBiol4409427LemkeEASummererDGeierstangerBHBrittainSMandSchultzPGControlofproteinphosphorylationwithageneticallyencodedphotocagedaminoacidNatChemBiol3769772LenormandPSardetCPagesGLAllemainGBrunetAandPouyssegurJGrowthfactorsinducenucleartranslocationofMAPkinasesbutnotoftheiractivatorMAPkinasekinaseinfibroblastsJCellBiol12210791088LevskayaAWeinerODLimWAandVoigtCASpatiotemporalcontrolofcellsignallingusingalightswitchableproteininteractionNature4619971001LiSMakovetsSMatsuguchiTBlethrowJDShokatKMandBlackburnEHCdk1dependentphosphorylationofCdc13coordinatestelomereelongationduringcellcycleprogressionCell1365061LidkeDSHuangFPostJNRiegerBWilsbacherJThomasJLPouyssegurJJovinTMandLenormandPERKnucleartranslocationisdimerizationindependentbutcontrolledbytherateofphosphorylationJBiolChem28530923102MalleshaiahMKShahrezaeiVSwainPSandMichnickSWThescaffoldproteinSte5directlycontrolsaswitchlikematingdecisioninyeastNature465101105ManningGWhyteDBMartinezRHunterTandSudarsanamSTheproteinkinasecomplementofthehumangenomeScience29819121934MansourSJMattenWTHermannASCandiaJMRongSFukasawaKVandeWoudeGFandAhnNGTransformationofmammaliancellsbyconstitutivelyactiveMAPkinasekinaseScience265966970MarkevichNIHoekJBandKholodenkoBNSignalingswitchesandbistabilityarisingfrommultisitephosphorylationinproteinkinasecascadesJCellBiol164353359MindenALinAMcMahonMLangeCarterCDerijardBDavisRJJohnsonGLandKarinMDifferentialactivationofERKandJNKmitogenactivatedproteinkinasesbyRaf1andMEKKScience26617191723PayneDMRossomandoAJMartinoPEricksonAKHerJHShabanowitzJHuntDFWeberMJandSturgillTWIdentificationoftheregulatoryphosphorylationsitesinpp42mitogenactivatedproteinkinaseEMBOJ10885892PelloisJPHahnMEandMuirTWSimultaneoustriggeringofproteinactivityandfluorescenceJAmChemSoc12671707171PelloisJPandMuirTWALigationandphotoreleasestrategyforthetemporalandspatialcontrolofproteinfunctioninlivingcellsAngewChemIntEd4457135717QiaoYMolinaHPandeyAZhangJandColePAChemicalrescueofamutantenzymeinlivingcellsScience31112931297RaingeaudJGuptaSRogersJSDickensMHanJUlevitchRJandDavisRJProinflammatorycytokinesandenvironmentalstresscausep38mitogenactivatedproteinkinaseactivationbydualphosphorylationontyrosineandthreonineJBiolChem27074207426RubinfeldHHanochTandSegerRIdentificationofacytoplasmicretentionsequenceinERK2JBiolChem2743034930352SalazarCandHoferTMultisiteproteinphosphorylationfrommolecularmechanismstokineticmodelsFEBSJ27631773198ShaulYDandSegerRTheMEKERKcascadefromsignalingspecificitytodiversefunctionsBiochimBiophysActa177312131226SpencerDMWandlessTJSchreiberSLandCrabtreeGRControllingsignaltransductionwithsyntheticligandsScience26210191024TraverseSSeedorfKPatersonHMarshallCJCohenPandUllrichAEGFtriggersneuronaldifferentiationofPC12cellsthatoverexpresstheEGFreceptorCurrBiol4694701VenturaJJHubnerAZhangCFlavellRAShokatKMandDavisRJChemicalgeneticanalysisofthetimecourseofsignaltransductionbyJNKMolCell21701710VolmatVCampsMArkinstallSPouyssegurJandLenormandPThenucleusasiteforsignalterminationbysequestrationandinactivationofp42p44MAPkinasesJCellSci11434333443プライマーリストmGFPHindamf5’GCTCAAGCTTCACCATGGCACTAGCAATTAGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG3’AG275’TCCGGTGGATCCTTATCATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATCTTGTACAGCTCGTCCATGC3’3367bkf5’GAAGGTACCCGATCGCCGCGGACCGGTTTAATTAAGCGGCCGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCC3’3367bkr5’ATAGCGGCCGCTTAATTAAACCGGTCCGCGGCGATCGGGTACCATGCATGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAAC3’KpnpvukSf5’GAAGGTACCCGATCGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAG3’AgesacKSr5’GAAACCGGTCCGCGGAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATG3’AG405’TAAACTTAAGCTTGCCACCATGGACTACAAGGACGAC3’AG435’GGCACAGGTTCTTGTCCACCCGGAAAATCTGCTTGGACAGCTCGGTGTCGTTGTTGATGCCGAACCGCTCCACGTACTC3’AG425’GGTGGACAAGAACCTGTGCCTGCGGCCTATGCTGAGCCCCACCCTGTGCAACTACATGCGGAAACTGGACAGAATC3’AG415’ATCTGCAGAATTCCACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATC3’AG165’ATGCTAGGATCCTTAATTAAACTAGTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG3’AG175’ATGCTAAGATCTGTCCCGTTGATTTTGGTGCC3’AG305’ATGCTAGGATCCAGATCTTCTAGACTCGAAGGAAACCTG3’AG205’ATGCTACAATTGCCGCGGGAATTCGCTAGCAAAAACCGCACTTGTCCGGAAACC3’AG525’CAGATCCGCTAGCACCGGTGCGATCGCACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAG3’AG535’GCTCGAGATCTGAGTCCGGATGGCGCGCCGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG3’AG545’GGCGCGCCATCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGC3’AG555’TAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTC3’AG585’GTTGTTGGGCAGTGCTCGGGCAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTGGTG3’AG565’CGAGCACTGCCCAACAACACCAG3’AG575’GTTGTTGGGCAGTGCTCGCTAAGTGCTCCCTGGG3’AG955’AGATCCGCTAGCACCGGTGCGATCGCACCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAG3’AG965’CGGATGGCGCGCCTTATCATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATCTCGAGGCAGCCGGATCCTTTG3’AG975’TTGATCCAGTTTCTTTTTCTACGCCTGGCCC3’AG985’TTGATCCAGTTTCTTTTTGGCCGCCTGGCCC3’AG995’AAAAAGAAACTGGATCAAG3’参考文献DeitersAChembiochem2010114753LeeHMLarsonDRLawrenceDSACSChemBiol20094409427DeitersACurrOpinChemBiol200913678686YoungDDDeitersAOrgBiomolChem200759991005MayerGHeckelAAngewChemIntEd20064549004921EndoMNakayamaKKaidaYMajimaTAngewChemIntEd20044356435645PelloisJPHahnMEMuirTWJAmChemSoc200412671707171HahnMEMuirTWAngewChemIntEd20044358005803PelloisJPMuirTWAngewChemIntEd20054457135717WuNDeitersACroppTAKingDSchultzPGJAmChemSoc20041261430614307DeitersAGroffDRyuYHXieJMSchultzPGAngewChemIntEd20064527282731LemkeEASummererDGeierstangerBHBrittainSMSchultzPGNatChemBiol20073769772ChenPRGroffDGuoJTOuWJCellittiSGeierstangerBHSchultzPGAngewChemIntEd20094840524055StewartMNatRevMolCellBiol20078195208YangXJOncogene20052416531662NeumannHPeakChewSYChinJWNatChemBiol20084232234ChinJWMartinABKingDSWangLSchultzPGProcNatlAcadSci2002991102011024MukaiTKobayashiTHinoNYanagisawaTSakamotoKYokoyamaSBiochemBiophysResCommun2008371818822GalliGHofstetterHBirnstielMLNature1981294626631XiaXGZhouHXDingHLAffarEBShiYXuZSNuclAcidsRes200331e100NguyenDPLusicHNeumannHKapadnisPBDeitersAChinJWJAmChemSoc200913187208721RobbinsJDilworthSMLaskeyRADingwallCCell199164615623LiangSHClarkeMFJBiolChem19992743269932703OkeefeKLiHPZhangYPMolCellBiol20032363966405LusicHDeitersASynthesis200621472150NeumannHHancockSMBuningRRouthAChapmanLSomersJOwenHughesTvanNoortJRhodesDChinJWMolecularCell200936153163RackhamOChinJWNatChemBiol20051159166"