"呼吸器合胞体ウイルスの低分子量疎水性タンパク質の外部ドメイン、および担体を含む免疫原性組成物。外部ドメインがオリゴマーとして提示される、請求項1に記載の免疫原性組成物。外部ドメインが配列番号1-3、またはそれらの変異体を含む、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。外部ドメインが担体と遺伝学的に結合した、請求項1から3のいずれかに記載の免疫原性組成物。外部ドメインが担体と化学的に結合した、請求項1から3のいずれかに記載の免疫原性組成物。担体がオリゴマーである、請求項1から5のいずれかに記載の免疫原性組成物。オリゴマーがペンタマーである、請求項6に記載の免疫原性組成物。担体が軟骨オリゴマー基質タンパク質comp、Lpp-56、およびウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項1から7のいずれかに記載の免疫原性組成物。ワクチンとして使用するための、請求項1から8のいずれかに記載の免疫原性組成物。呼吸器合胞体ウイルス感染の防御用または治療用ワクチンを製造するための、請求項1から9のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。免疫原性組成物に対する抗体を検出および/または精製するための、請求項1から9のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。呼吸器合胞体ウイルスの低分子量疎水性タンパク質の外部ドメインに対する抗体を含む血液、血清および/または血漿を生成するための方法であって、a請求項1から9のいずれかに記載の免疫原性組成物を動物に送達すること、およびb1つまたは複数の抗RSV抗体を含む動物由来の血清を得ることを含む方法。請求項12に記載の方法によって得られる血液、血清および/または血漿。RSV感染を予防または治療するための、請求項12に記載の方法によって得られる血液、血清および/または血漿の使用。RSV感染を予防または治療するための、RSV-SH-タンパク質の外部ドメインに対するヒト型抗体を含む血液、血清および/または血漿の使用。RSV-SH-タンパク質の外部ドメインに対するRSV阻害性モノクローナル抗体。RSV感染を予防または治療するための、請求項16に記載のモノクローナル抗体の使用。請求項12に記載の方法によって得られる血清を含む医薬組成物。請求項16に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。請求項1から9に記載の免疫原性組成物を、場合によってアジュバントと共に含むワクチン。ヒトに使用するための、請求項20に記載のワクチン。獣医学的使用のための、請求項20に記載のワクチン。市販されている承認されたワクチンはないので、安全で有効なRSVワクチンの開発および利用性に関する満たされていないニーズが依然として存在する。驚くことに、本発明者らは、SHeと呼ばれる低分子量疎水性タンパク質SHの細胞外部分外部ドメインは、特にそれが担体においてオリゴマーとして、好ましくはペンタマーとして現れるとき、RSV感染に対する予防接種に安全に使用することができることを発見した。さらに、SHeに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、それぞれRSV感染を予防または治療するために、予防的または治療的に使用することもできる。本発明の第一の態様は、呼吸器合胞体ウイルスRSVの低分子量疎水性SHタンパク質の外部ドメイン、および担体を含む免疫原性組成物である。好ましい一実施形態では、RSVはヒト亜群Aまたはヒト亜群B株のいずれかであり、別の好ましい実施形態では、RSVはウシRSVである。SHタンパク質は当業者に知られており、64RSV亜群A、65RSV亜群B個のアミノ酸残基、またはウシRSVに関して81、77もしくは72個のアミノ酸残基を含有する。好ましい一実施形態では、SHの外部ドメインSHeは、亜群Aに関して23のカルボキシ末端アミノ酸配列番号1、および亜群Bに関して24のカルボキシ末端アミノ酸配列番号2からなる。外部ドメインの配列は、配列番号1外部ドメイン亜群Aおよび配列番号2外部ドメイン亜群B、またはそれらの変異体からなる群から選択されることが好ましい。本明細書で使用する変異体は、配列が欠失、挿入または置換などの1つまたは複数の突然変異を有し得ることを意味する。前記突然変異は置換であることが好ましい。さらにより好ましくは、前記変異体は、BLASTpアラインメントAltschulら、1997で測定して、80の同一率、好ましくは85の同一率、さらにより好ましくは90の同一率、最も好ましくは95の同一率を有する。前記変異体は、配列NKLC/SEY/HK/NXF配列番号3を含むことが好ましい。好ましい変異体は配列番号4-配列番号16で列挙する。別の好ましい実施形態では、外部ドメインは、前に定義したように配列番号17ウシRSVSHの外部ドメインまたはその変異体からなる。前記変異体は、配列NKLCXXXXXHTNSL配列番号18を含むことが好ましい。好ましい変異体は配列番号19-30で列挙する。担体分子はSHタンパク質とは異種である分子であり、担体は抗原提示に適した当業者に知られている任意の担体であってよく、HBcoreWhitacreら、2009などのウイルス様粒子、および集合体ウイルスカプシドまたはコートタンパク質由来の他のVLPを含むが、これらだけには限られない。それが免疫系に対して抗原を有効に提示することができるという条件で、ペンタマー軟骨オリゴマー基質タンパク質comp;McFarlaneら、2009、トロンボスポンジン3および4Malashkevichら、1996、細菌AB5型毒素のBサブユニット例えば、コレラ毒素のサブユニットまたはE.コリE.coli熱不安定性毒素;Williamsら、2006、ペンタマートリプトファン-ジッパーLiuら、2004、ペンタマーフェニルアラニン-ジッパーLiuら、2006またはテトラマーGCN4由来ロイシンジッパーtGCN4、DeFiletteら、2008およびLpp-56Shuら、2000などの、任意の他の分子構築物を使用することもできる。担体はタンパク質性、および非タンパク質性であってよい。非タンパク質性担体の例は、非制限的な例として、リポソーム、CLIPS商標構築物Timmermanら、2007およびトリメチルキトサンSlutterら、2010である。前記担体は、1つの足場上に複数のSHe分子を提示することによって、多量体化した足場上に1つのSHeを提示することによって、または両方の組合せによって、SHeを好ましくはオリゴマーとして提示し、さらに一層好ましくはペンタマーとして提示する。SHeオリゴマーは線状反復構造として、またはオリゴマー複合体を形成する個々のSHe単位として、または両方の組合せとして提示され得る。前記担体は、オリゴマー担体ダイマー、デカマーまでであることが好ましい。さらに一層好ましくは、前記担体はペンタマー担体である。具体的な一実施形態では、細胞質ドメインを好ましくは含まないSHの膜貫通ドメインを、場合によってさらに担体と融合または結合させて、オリゴマードメインとして使用することができる。全ての担体分子がSHeによって負荷されるはずはなく、実際非制限的な例として、ヘキサマー担体のわずか5単位がSHeで負荷され、それによってヘキサマー担体複合体上にペンタマーSHe複合体が提示されることは想像可能である。外部ドメインを担体と遺伝学的に結合させ、融合タンパク質を形成することが可能であり、両ドメインは直接融合することが可能であり、またはそれらはヒンジ配列もしくはスペーサー配列によって結合させることが可能である。本明細書で使用するように、遺伝学的に融合した構築物では、ヒンジ配列は2つのドメインを1つに結合させるアミノ酸配列であり、前記配列は柔軟な形式で2つのドメインを結合させることが好ましい。前記ヒンジ配列は好ましくは150アミノ酸より短く、さらに一層好ましくは100アミノ酸より短く、さらに一層好ましくは50アミノ酸より短く、最も好ましくは20アミノ酸より短い。本明細書で使用するスペーサーは、15アミノ酸より短い、短いヒンジ配列を示す。好ましい実施形態では、ヒンジ配列は、nが1、2、3、...20に等しい配列Gly-Sernを含む。別の好ましい実施形態では、ヒトIgG1のヒンジ領域などの免疫グロブリン遺伝子のヒンジを、ヒンジ配列として使用する。遺伝的結合の場合、前記結合はSHeのアミノ末端、およびカルボキシ末端で起こり得る。あるいは、外部ドメインは担体と化学的に結合する。化学結合は当業者に知られており、担体表面上の反応部位とペプチドの共有結合により担体と結合したペプチドを含むがこれだけには限られない。生成する構造は結合体である。担体表面上の反応部位は、化学的に活性がある、または活性化することができ、ペプチドとの共有結合に立体的にアクセス可能である部位である。好ましい反応部位はアミノ酸リシンのε窒素である。共有的に結合は、生理的条件下において加水分解に対して安定である共有結合の存在を指す。共有結合は、付加体形成、酸化、および還元を含めた生理的条件下において起こり得る他の反応に対して安定であることが好ましい。担体と抗原ペプチドの結合は、二官能性試薬を使用して得ることが多いHermanson、1996。SHeにおける任意の適切な残基は化学的担体との結合に使用することができ、SHeはそのアミノ末端またはカルボキシ末端付近で担体と結合することが好ましい。さらに別の実施形態では、疎水性相互作用、協同的H-結合相互作用、またはファンデルワールス相互作用などであるがこれらだけには限られない非共有結合的相互作用によって、外部ドメインと担体を結合させる。本発明の別の態様は、本発明による免疫原性組成物のワクチンとしての使用である。本発明のさらに別の態様は、RSV感染に対する防御用ワクチンを調製するための、本発明による免疫原性組成物の使用である。前記RSVは、RSV亜群AおよびRSV亜群Bからなる群から選択されることが好ましい。鼻腔内、腹腔内、筋肉内および皮内投与を含むがこれらだけには限られない当業者に知られている任意の経路により、治療する対象にワクチンを投与することができる。予防接種後、RSV感染による疾患症状の増大がないことが好ましい。ワクチンは動物またはヒト使用のためであってよい。好ましい動物用途は、ウシRSVなどであるがこれだけには限られないヒトRSVと関係があるウシ呼吸器ウイルスに対する予防接種による、畜牛または他のウシ科動物の防御である。RSV感染に対する防御は、予防用途と治療用途の両方を含む。より具体的には、ワクチンの好ましい用途は予防目的である。本明細書で使用するワクチンの調製は、本発明による免疫原性組成物を適切な賦形剤の添加により最適化することができること、または非制限的な例として、貯蔵寿命の増大もしくはワクチンの医薬的特性の改善のために、本発明による免疫原性組成物を製剤化することができることを意味する。本発明の別の態様は、本発明による免疫原性組成物、または本発明による免疫原性組成物の組合せを含むワクチンである。実際、非制限的な例として、RSV亜群AのSHeおよびRSV亜群BのSHeを含む免疫原性組成物を混合して、より広い特異性を有するワクチンを得ることができる。前記ワクチンはヒトまたは獣医学的使用のためであってよい。免疫原性組成物以外に、ワクチンはアジュバントなどの1つまたは複数の他の化合物を含むことができる。ワクチンは、RSV感染に対してヒトを防御するためのワクチン、またはウシRSVなどであるがこれだけには限られないヒトRSVと関係がある動物呼吸器ウイルスに対して動物を防御するためのワクチンであることが好ましい。本発明の別の態様は、RSVの外部ドメインに対する抗体を検出および/または精製するための、本発明による免疫原性組成物の使用である。このような抗体は、本発明の免疫原性組成物を対象に予防接種した後に単離することができ、あるいは、同様の抗体および/または抗体産生細胞をRSV感染したヒトまたは動物対象から得ることもでき、当技術分野で知られている適切な開発後、前に記載した予防または治療目的に使用することができる、SHe特異的抗体、好ましくはヒト型抗体の産生に使用することができる。本発明のさらに別の態様は、動物から血液、血漿および/または血清を生成するための方法であり、前記血液、血漿および/または血清はRSVのSHeドメインに対する1つまたは複数の抗体または抗体産生細胞を含み、前記方法はa本発明による免疫原性組成物を前記動物に送達することおよびb前記動物から血液、血漿および/または血清を得ることを含み、前記血液、血漿および/または血清はRSVのSHeドメインに対する1つまたは複数の抗体または抗体産生細胞、または前記抗体を産生する細胞を含む。前記動物は非ヒト動物であることが好ましい。本明細書で使用するように、血漿は血液細胞除去後の血液の液体分画であり、血清はフィブリノゲンおよび他の血液凝固因子除去後の血漿である。前に示したように、本発明による免疫原性組成物を使用して特異的抗SHe抗体を単離することができる。本発明のさらなる態様は、RSV感染に対する防御および/またはRSV感染の治療のための、RSV抗体を含有する血液、血漿および/または血清ならびに本発明による方法で得られる血液、血漿および/または血清の使用である。前述のように、RSV感染に対する防御は予防用途と治療用途の両方を含む。実際、抗体を含む血清をヒトまたは動物に投与し、それによってRSV感染に対する受動免疫をもたらすことができる。前記血清は血清を含む医薬組成物の一部であってよく、この場合血清は適切な賦形剤と製剤化および/または混合する。したがって、本発明の別の態様は、本発明による方法によって得られる血清を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、RSVSH-タンパク質の外部ドメインに対するRSV阻害性モノクローナル抗体である。本明細書で使用するRSV阻害は、感染時に、適切な動物モデルで測定して、未治療動物と比較して、肺中ウイルス力価が治療動物においてより低いことを意味する。前記モノクローナル抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本発明のさらに別の態様は、本発明によるRSVSH-タンパク質の外部ドメインに対するモノクローナル抗体を含む医薬組成物である。実際、免疫処置済み非ヒト動物の臓器、好ましくは前記動物の脾臓、または免疫処置済み動物またはヒト対象由来の血液サンプルは、単鎖抗体、多価抗体、または抗ウイルス化合物と結合した抗体などであるがこれらだけには限られないモノクローナル抗体および誘導体を産生するための出発物質として使用することができる。前記モノクローナル抗体および誘導体は受動免疫処置、またはRSV感染の治療に使用される。実施例の材料および方法クローニングおよびプラスミド構築。pLT32Flag-COMPcc-SHe発現プラスミドの構築。Flag-COMPcc-SHeのコード配列図1.Bを含有するプラスミドはGenscript配列番号31でオーダーした。Flag-COMPcc-SHeコード配列は、NdeI/NotIで開いたpLT32H細菌発現ベクターにおいてNdeI/NotI断片として連結させたMertensら、1995。pCAGGS-Etag-SH発現ベクターの構築。RSVA2感染Hep-2細胞の全RNAは、製造者の説明書に従い高純度RNA組織キットRoche、Mannheimを使用して調製した。cDNA合成後、RSVA2SHコード配列を、以下のフォワードプライマーとリバースプライマー5’ATAAGAAAGCGGCCGCTATGGAAAATACATCCATAACAATAG3’;5’GAAGATCTCTATGTGTTGACTCGAGCTCTTGGTAACTCAAA3’を使用して増幅した。PCR産物はNotIおよびBgIIIで消化し、NotI/BgIIIで開いたpCAGGS-PTB-Etag発現ベクターにおいて連結させたCornelisら、2005。生成したベクターpLT32-Flag-COMPcc-SHeは、2010年11月8日に寄託番号LMBP6817の下、BCCMBCCM/LMBP:Technologiepark927、9052Zwijnaarde、ベルギーにおいてブダペスト条約下で寄託された。pCAGGS-Luc発現ベクターの構築は以前に記載されたSchepensら、2005;pCAGGS-HIF-RLucと呼ばれる。pLT32mHBc発現ベクターの構築。ab1プラスミドの一部としてJegerlhenerらにより以前に記載されたmHBcのコード配列はGeneart配列番号32でオーダーしたDeFiletteら、2005;Jegerlehnerら、2002。このコード配列は、NdeI/NotIで開いたpLT32H細菌発現ベクターにおいてNdeI/NotI断片としてクローニングした。pLT32SHe-tGCN4-Flag発現ベクターの構築。pLT32SHe-tGCN4を構築するため、SHeコード配列を融合pcrによりtGCN4-Flagコード配列と融合させた。融合pcr用のSHe断片は、プライマー:5’GGAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3’および5’GATTTGTTTTAAACCTCCTGTATTTACTCGTGCCCGAGGCAA3’、およびGeneart配列番号33でオーダーしRSVA2SH外部ドメインのコード配列NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT配列番号40を含有する鋳型プラスミドを使用して増幅した。融合PCR用のGCN4断片は、プライマー5’CCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGA3’および5’TATTAACCCTCACTAAAGGGAAGG3’、およびtGCN4コード配列を含有し、3連続Flag-tag配列配列番号34;DeFiletteら、2008のコード配列とC末端融合した鋳型プラスミドを使用して増幅した。この2つのPCR断片は、プライマー:5’GGAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3’および5’TATTAACCCTCACTAAAGGGAAGG3’を使用して融合させた。この融合PCR産物は、NdeI/HindIIIで開いたpLT32H細菌発現ベクターにおいてNdeI/HindIII断片としてクローニングした。生成したpLT32SHe-tGCN4-Flagは、2010年11月8日に寄託番号LMBP6818の下、BCCMBCCM/LMBP:Technologiepark927、9052Zwijnaarde、ベルギーにおいてブダペスト条約下で寄託された。PLT32M2e-tGCN4発現ベクターの構築は以前に記載されたDeFiletteら、2008。pLH36-HisDEVD-LPP5-SHe発現プラスミドの構築。GlyGlyリンカーのコード配列により隔てられたSH外部ドメインのコード配列と融合したLPP5トリプトファン-ジッパーのコード配列を含有するプラスミドは、Genscriptでオーダーした。このコード配列は、以下のフォワードプライマーとリバースプライマー5’GCGAAATGGGATCAGTGGAGCAGC-3’;5’AATATAGGATCCCTAGGTCGCCCAGTTATCCCAGCG-3’を使用して増幅し、リン酸化しBamHIで消化した。pLH36-HisDEVD-LPP-SHeは、記載したPCR断片、BamHI/PstI消化型pLT32プラスミド断片およびEcoRV/PstI消化型pLH36断片を使用しツリーポイントライゲーションによって構築した。構築したpLH36-HisDEVD-LPP5-SHeプラスミドの配列は配列番号49で示す。SHe-tGCN4、M2e-tGCN4、Flag-COMPcc-SHe、mHBcおよびLPP5-SHeの発現および精製。pLT32SHe-tGCN4形質転換E.コリの30ml前培養物をLuriaブロス内で28°Cにおいて増殖させ、これを使用して1リットルの新たな培地を接種した。0.6-0.8のA600において、細胞を1mmのイソプロピル1-チオ-β-d-ガラクトピラノシドで処理し、さらに4時間インキュベートし、次いで遠心分離6000×g、20分、4°Cによって回収した。細菌のペレットは20mlのトリス-HClバッファー50mMのトリス-Hcl、50mMのNaClおよび1mMのEDTA、pH8中に再縣濁し、超音波処理した。細菌の残骸は遠心分離20,000×g、1時間、4°Cによってペレット状にした。上清を、50mMのNaClを含有するトリス-HClバッファーバッファーAで予め平衡化したDEAEセファロースカラムにかけた。洗浄後、0-40バッファーB50mMのトリス-Hcl、1MのNaClから40-100バッファーBまでの2ステップ勾配により結合タンパク質を溶離した。SHe-tGCN4を含有する分画をプールし、25硫酸アンモニウム飽和状態に調節し、25硫酸アンモニウム、50mmのトリス-HCl、pH8で予め平衡化したフェニル-セファロースカラムにかけた。結合タンパク質は2ステップ勾配で溶離した。2ステップの溶離は、0-40および40-100の50mMトリス-HClバッファー、pH8バッファーAで実施した。SHe-tGCN4を含有する分画はSuperdex75カラムに充填した。ゲル濾過はリン酸緩衝生理食塩水PBSで実施し、SHe-tGCN4を含有する分画はプールし-70°Cで保存した。flag-COMPcc-SHeの発現および精製は、DEAEセファロースカラムの代わりにアニオン交換クロマトグラフィー用のQセファロースカラムを使用したこと以外、SHe-tGCN4と同一であった。M2e-tGCN4の発現および精製は以前に記載されたDeFiletteら、2008。mHBcの発現および精製は、Superdex75カラムの代わりにゲル濾過クロマトグラフィー用SephacrylS400カラムを使用したこと以外、SHe-tGCN4と同一であった。LPP5-SHeの発現および精製。pLH36-HisDEVD-LPP5-SHe形質転換E.コリの30ml前培養物を、アンピシリンを含むLuriaブロス内で28°Cにおいて増殖させ、これを使用して3リットルの新たな培地を接種した。0.6-0.8のA600において、細胞を1mMのイソプロピル1-チオ-β-d-ガラクトピラノシドで処理し、さらに4時間インキュベートし、次いで遠心分離6000×g、20分、4°Cによって回収した。細菌のペレットは、20mMのNaH2PO4/Na2HPO4、300mMのNaClおよび5mMのイミダゾールを含有する300mlバッファー、pH7.5中に再縣濁し、超音波処理した。細菌の残骸は遠心分離20,000×g、1時間、4°Cによってペレット状にした。5mMイミダゾールを含有するバッファーで予め平衡化したニッケル-セファロースカラムに、上清を充填した。洗浄後、段階的50mM、100mM、200mMおよび400mMイミダゾール勾配により結合タンパク質を溶離した。LPP5-SHeを含有する分画をプールし、脱塩し、Q-セファロースカラムでさらに精製した。サンプルを、50mMのNaClを含有するトリス-HClバッファーバッファーAで予め平衡化したDEAEセファロースカラムにかけた。洗浄後、0-40バッファーB50mMのトリス-Hcl、1MのNaClから40-100バッファーまでの2ステップ勾配により結合タンパク質を溶離した。LPP5-SHeを含有する分画はSuperdex75カラムに充填した。ゲル濾過は、リン酸緩衝生理食塩水PBS、およびLPP5-SHeを含有する分画で実施した。アジュバント熱不安定性E.コリエンテロトキシンの解毒変異体、LTR192Gを鼻腔内i.n.投与に使用した。この調製物は寛大なことにDr.J.ClementsDepartmentofMicrobiologyandImmunology、TulaneUniversityMedicalCenter、NewOrleans、LA、USAによって提供されたNortonら、2010。She-HBc粒子の化学結合および特徴付け。その中で天然由来のシステインがセリンに置換されN末端にシステインが付加された、SHecc4s、化学合成したHPLC精製SHeペプチドを、PepscanPepscan、Lelystadでオーダーした。SHecc4sペプチドは、そのN末端システイン残基を介して、製造者の説明書に従いヘテロ二官能性スルホ-MBSPierceを使用した化学結合により、HBcVLP表面上のmHBcの免疫優性ループ中のリシンと融合させた。わずか400μgのmHBcを溶かした200μlのPBSをスルホ-MBSと1時間、1mg/mlの最終濃度でインキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィーによる非結合スルホ-MBS分子の除去後、スルホ-MBS結合mHBcVLPは2mlのH2Oに希釈した。後に、100mlのPBSに溶かした100μlのSHecc4sペプチドを加え、室温で1時間インキュベートして、mHBcVLPとペプチドの架橋を可能にした。最後に、遊離SHecc4sペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。純度および架橋効率は、SDS-PAGE、次にクーマシー染色によって試験した。細胞Hep-2細胞ATCC、CCL-23、Vero細胞ATCC、CCL-81、HEK293T細胞DrM.Hallからの進物およびA549細胞ATCC、CCL-185を、10熱不活化ウシ胎児血清FCS、1ペニシリン、1ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、非必須アミノ酸Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア、および1mMのピルビン酸ナトリウムを補充したDMEM培地中で増殖させた。マウスおよびウイルス。特定病原体を含まない、メスのBALB/cマウスをCharlesRiverCharlesRiverWiga、Sulzfeld、ドイツから得た。動物は12時間光/暗サイクルで温度調節した環境中に収容し、食物および水は制限せず与えた。動物実験室内で1週間適応させた後、マウスは8週齢で免疫処置した。動物実験施設は、FlemishGovernmentLicenseNumberLA1400091下に管理される。全ての実験は、法律1993年11月14日のEuropeanDirectiveandBelgianRoyalDecreeによって指定され動物実験倫理審査委員会によって認可された条件下で行った。RSVA2、RSVのA亜型ATCC、Rockvilleを、1FCSを含有する増殖培地の存在下における0.1MOIでの単層Vero細胞の感染により増殖させた。感染後5から7日で、細胞および増殖培地を回収、プールし遠心分離450×gによって浄化した。ウイルスを濃縮するため、浄化した上清を、10ポリエチレングリコールPEG6000の存在下において4°Cで4時間インキュベートした。遠心分離3000×gで30分間後、20スクロースを含有するハンクス平衡塩類溶液HBSS中にペレットを再縣濁し、アリコートにし-80°Cで保存した。鼻腔内免疫処置および感染。鼻腔内免疫処置または感染用に、マウスにイソフルランによって軽く麻酔をかけた。ワクチンアジュバントまたはウイルスの投与に使用した最終容積は50μlであった鼻孔当たり25μl。ワクチンアジュバントはPBSで製剤化し、一方ウイルス接種原はHBSSで製剤化した。プラークアッセイによる肺中ウイルス力価の決定。攻撃後3日または4日でマウスを屠殺した。マウス肺は無菌状態で除去し、10スクロースを含有する1mlのHBSSにおいて30秒間HeidolphRZR2020ホモジェナイザーを用いて均質にした。肺ホモジネートは4°Cでの遠心分離により後に浄化し、Hep-2細胞におけるウイルス滴定に使用した。単層のHep-2細胞には、96ウエルプレート中、ペニシリンとストレプトマイシンを補充した無血清OPTIMEM培地Invitrogen中で、50μlの連続1:3希釈肺ホモジネートを感染させた。4時間後、2FCSを含有するDEMEM培地で2回細胞を洗浄し、50μlのオーバーレイ培地1FCS、0.5アガロースを含有する完全DEMEM培地において37°Cで5日間インキュベートした。アガロースオーバーレイの上部に50ulの4パラホルムアルデヒド溶液を加えることにより、細胞を固定した。4°Cでの一晩の固定後、オーバーレイ培地およびパラホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞はPBSで2回洗浄し、1BSAを含有するPBSPBS/BSAでブロッキングした。その後、ポリクローナルヤギ抗RSV血清AB1128、ChemiconInternationalを加えた1/4000。PBS/BSAで3回洗浄した後、細胞はhrp結合抗ヤギIgG抗体SC2020、SantaCruzと共に30分間インキュベートした。非結合抗体は、0.01トリトン-X100を含有するPBS/BSAでの4回の洗浄、およびPBSでの1回の洗浄によって除去した。最後に、TrueBlueペルオキシダーゼ基質KPL、Gaithersburgの使用によって、プラークを目に見える状態にした。異なる希釈のプラークを計数し、それぞれの希釈に関して、肺1ml当たりのPFU数は、希釈中に存在したプラークの数×希釈×20=合計1000μlの上清容積/希釈系列の第一ウエルの感染に使用した50μlの上清容積として計算した。次いでPFU/肺の数を、異なる希釈に関して計算したPFU/肺の平均数として計算した。ホモジナイズした肺の各上清は二連で試験したので、最終的なPFU/肺の数はこれら二連の平均として計算した。qRT-PCRによる肺中ウイルス力価の決定。qRT-PCRによって肺RSV負荷を決定するため、前に記載したのと同様に肺ホモジネートを調製し浄化した。これらの肺ホモジネート由来の全RNAは、製造者の説明書に従い高純度RNA組織キットRoche、Mannheimの使用によって調製した。ヘキサマープライマーおよびTranscriptorFirstStrandcDNA合成キットRoche、Mannheimの使用によってcDNAを調製した。ゲノムRSVMcDNAの相対レベルは、RSVA2M-遺伝子のゲノムRNAに特異的なプライマー5’TCACGAAGGCTCCACATACA3’および5’GCAGGGTCATCGTCTTTTTC3’、ならびに5’末端をフルオレセインFAMおよび3’末端付近を黒色消光色素で標識したヌクレオチドプローブ150UniversalProbeLibrary、Rocheの使用によって、qRT-PCRにより決定した。GADPHmRNAの相対量は、マウスGADPHに特異的なプライマー5’TGAAGCAGGCATCTGAGGG3’および5’CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG3’、ならびにLightCycler480SYBRGreenIMaseterMixRocheの使用により、qRT-PCRにより決定した。肺ホモジネート当たりのゲノムRSVRNAの相対量は、RSVM-遺伝子RNAの相対量とマウスGADPHmRNAの相対量の間の比として計算した。ペプチドELISA各免疫処置後2週間で、血液サンプルを外側尾静脈から回収した。アベルチンで麻酔した動物の心臓穿刺により最終出血を実施した。血液を37°Cで30分間凝固させ、その後の2回の遠心分離から上清を得ることにより血清を入手した。血清抗体力価を、グループからプールした血清を使用してELISAにより決定した。M2eまたはSHe特異的抗体力価を決定するため、マイクロタイタープレートタイプIIF96MaxiSorp、Nuncを、それぞれ50mM重炭酸ナトリウムバッファー、pH9.7中50μlの2μg/mlのM2e-ペプチド溶液または2μg/mlのSHe-ペプチド溶液でコーティングし、37°Cで一晩インキュベートした。洗浄後、PBS中1200μlのBSAで1時間、プレートをブロッキングした。1時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄した。1/100希釈で始めた異なる血清サンプルの1/3希釈系列を、ペプチドコーティングプレートに充填した。結合抗体は、マウスアイソタイプIgG1またはIgG2aに対するペルオキシダーゼ標識抗体SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.、Birmingham、AL、USAで検出し、PBS1BSA0.05Tween20中に1/6000に希釈した。洗浄後、マイクロタイタープレートをTMB基質テトラメチルベンジジン、Sigma-Aldrichと5分間インキュベートした。反応は等容積の1MH3PO4を加えることにより停止させ、450nmで吸光度を測定した。終点力価は、バックグラウンド免疫前血清の2倍のO.D.値をもたらす最高希釈として定義する。フローサイトメトリー解析。Hek293T細胞を示した発現ベクターでトランスフェクトした。24時間後、酵素を含まない解離バッファーInvitrogen、Carslbad、カリフォルニアを使用して細胞を剥離し、PBSで1回洗浄し、1BSAを含有するPBSPBS/BSA中で1時間インキュベートした。その後、示した濃度で示した血清または抗体と共に、細胞をインキュベートした。1時間後、細胞はPBS/BSAで3回洗浄し、抗マウスIgGalexa633二次抗体と共に30分間インキュベートした。PBS/BSAで4回およびPBSで1回細胞を洗浄した後、BectonDickinsonLSRIIフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。一種のGFP発現細胞を、側方散乱シグナルのピーク表面、前方散乱シグナルのピーク表面およびピーク高、および緑色蛍光シグナルのピーク表面に基づいて選択した。最後に、これらのGFP陽性単細胞の中で、alexa633蛍光シグナルを測定した。免疫染色。Vero細胞を擬似感染、または無血清培地の存在下において0.5MOIのRSVA2で感染させた。4時間後、遊離ウイルスは洗浄除去し、1FCSを含有する増殖培地中で細胞をインキュベートした。16時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、2パラホルムアルデヒドで20分間固定した。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、5分間0.2トリトン-X100洗剤で透過処理した。PBSで1回洗浄した後、細胞はPBS/BSAでブロッキングした。1時間後、She特異的3G8モノクローナル抗体またはアイソタイプ対照抗体を5μg/mlの最終濃度で加えた。PBS/BSAで2回細胞を洗浄した後、ポリクローナル抗RSVヤギ血清を加えた。1時間後、細胞をPBS/BSAで3回洗浄した。細胞と示した抗体の結合は、それぞれalexa488とalexa568蛍光色素で標識した抗マウスと抗ヤギIgG抗体の使用により分析した。染色細胞の共焦点画像はZeiss共焦点顕微鏡で記録した。SHeモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成。SHe特異的モノクローナル抗体mAbを産生する安定的ハイブリドーマ細胞を、ハイブリドーマ技術KohlerandMilstein1975によって作成した。簡単に言うと、SHe特異的ハイブリドーマを、オールハイドロゲルを補充した10μgのSHe-tGCN4ワクチンBrenntagBiosectorを用いて3週間間隔で3回腹腔内免疫処置した個々のマウスから誘導した。融合3日前に、マウスを同じ製剤でもう1回追加抗原刺激し、脾臓細胞を単離し、次いでPEG1500RocheDiagnosticsGmbH、ドイツの存在下でSP2/0-Ag14ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞は、10ウシ胎児血清、10BMコンディムドH1RocheDiagnosticsGmbH、ドイツ、2mMのL-グルタミン、および24μMのβ-メルカプトエタノールおよび1×HATサプリメントInvitrogen、Carlsbad、カリフォルニアを補充したRPMI1640培地中で増殖させた。SHe特異的抗体を分泌するハイブリッドはSHeペプチドElisaスクリーニングによって同定し、モノクローナル抗体産生ハイブリッドは、限界希釈手順による2ラウンドのサブクローニング後に得た。モノクローナル抗体は、プロテインA-セファロースカラムelectricalengineeringbiosciencesで精製した。生成したハイブリドーマは、それぞれ2010年11月8日に3G8に関して寄託番号LMBP7795CB、および2010年11月10日に3D11に関して寄託番号LMBP7796CBの下、BCCMBCCM/LMBP:Technologiepark927、9052Zwijnaarde、ベルギーにおいてブダペスト条約下で寄託された。[実施例1]Flag-COMPcc-Sheの設計、発現および精製SHタンパク質は、RSVビリオンの表面、およびRSV感染細胞の原形質膜で、ペンタマーとして発現される。SHのペンタマー構造は、5パラレルα-ヘリックスのコイルドコイルとしてオリゴマー化するSH膜貫通型ドメインによって構造化される。その本来の立体配座を模倣するペンタマーとしてRSVAのC末端SH外部ドメインSHeを提示するために、これも5パラレルα-ヘリックスで構成されるラット軟骨オリゴマー基質タンパク質の短いペンタマーコイルドコイルドメインCOMPccと、SHeを遺伝学的に融合させたMalashkevichら、1996;図1。Flag-タグをCOMPのN末端と融合させ、Flag-COMPcc-SHeにした。Flag-COMPcc-SHeはpLT-32Mertensら、1995発現ベクターにおいてクローニングし、E.コリ中で発現させ精製した。ゲル濾過分析によりFlag-COMPcc-SHeが55-60kDa複合体として溶離したことを明らかにし、11kDaのFlag-COMPcc-SHeタンパク質は実際ペンタマーとしてオリゴマー化することを示した図2。[実施例2]Flag-COMPcc-SHeの予防接種は、SHe特異的抗体およびRSV感染に対する防御を誘導するFlag-COMPcc-SHeを用いた予防接種が、RSV感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、本発明者らはBALB/cマウスRSV感染モデルを使用した。BALB/cマウスは、1μgのE.コリ熱不安定性エンテロトキシンLTR192Gアジュバントと組み合わせた25μgのFlag-COMPcc-SHeで3回鼻腔内免疫処置した。テトラマーGNC4足場と融合したPBSおよびインフルエンザAM2外部ドメインはM2e-tGNC4DeFiletteら、2008は陰性対照として使用した。免疫処置は2週間毎に実施した。1つのRSV感染5×105PFUは陽性対照として使用した。各免疫処置後の第一週と第二週の間に、血液を回収してSHe特異的IgG抗体の誘導を調べた。SHe特異的抗体の存在は、最初にSHeペプチドELISAによって試験した。M2eペプチドELISAは陰性対照として使用した。図3は、SHeペプチド特異的IgG抗体を誘導し、それぞれFlag-COMPcc-SHeによる第二および第三免疫処置後に追加抗原刺激することを実証する。3連続のFlag-COMPcc-SHe/LTR192G免疫処置は高レベルのIgG2aSHe特異的抗体、ただしごく低レベルのIgG1SHe特異的抗体をもたらし、Th1指向型/誘導型免疫応答を示した。PBSまたはM2e-tGCN4/LTR192G予防接種マウスにおいて、SHe特異的IgG抗体を検出することはできなかった図3A、BおよびC。予想通り、Flag-COMPcc-SHe/LTR192GまたはPBS予防接種マウスデータの血清において、M2e特異的抗体を検出することはできなかった。以前の結果DeFiletteら、2008に従い、M2e-tGCN4で免疫処置したマウスは高力価のM2e特異的IgG2a抗体を蓄積した。次に本発明者らは、フローサイトメトリーにより、Flag-COMPcc-SHe免疫血清中に存在したSHe特異的抗体が、それらの表面でRSV-SHタンパク質を発現する細胞と結合可能であるかどうか調べた。SH発現ベクターpCAGGS-Etag-SHまたは陰性対照としてルシフェラーゼ発現ベクターpCAGGS-Lucのいずれかと組み合わせたGFP発現ベクターで、HEK-293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間で、細胞を剥離し、異なる希釈のFlag-COMPcc-SHeまたはM2e-tGCN4免疫血清で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図4は、M2e-tGCN4免疫血清とは対照的に、Flag-COMPcc-SHe予防接種マウス由来の血清は、生きた細胞の表面で発現されるSHタンパク質と特異的に結合することを示す。Flag-COMPcc-SHe/LTR192G予防接種が、RSV感染に対する防御を誘導することができるかどうか試験するために、最後の免疫処置後9週間で、1×106のPFURSVA2でマウスを攻撃した。感染後4日でマウスを屠殺し、プラークアッセイにより肺中ウイルス力価を決定した。図5は、PBSおよびM2e-tGCN4予防接種マウスと比較して、Flag-COMPcc-SHeを用いた予防接種がRSV複製を低下させたことを示す。攻撃前に生きたRSVを感染させたマウスにおいて、ウイルスは検出されなかった。ホルマリン不活化ウイルスまたはRSVGタンパク質を用いた予防接種は感染時に疾患の増大を誘導し、不均衡なTh2免疫応答の誘導により相当な罹患率をもたらし得ることはよく知られているPrinceら、1986。Flag-COMPcc-SHe予防接種も疾患の増大を誘導し得るかどうか試験するために、本発明者らは、RSV攻撃前後に体重をモニタリングした図6。RSV攻撃後いかなるマウスのグループにおいても、体重の減少は観察されなかった。これは、Flag-COMPcc-SHe予防接種がRSV感染時に疾患の増大をもたらさないことを強く示唆する。[実施例3]mHBc-SHeの設計、構築および精製B型肝炎ウイルスコアタンパク質HBcウイルス様粒子VLPは、密なアレイとして抗原を提示することができる。このようにしてHBc-VLPは、提示抗原に対する強力な液性免疫応答を誘導することができるBoisgeraultら、2002。したがって、ペンタマーとしてのSHeの提示に対する代替として、mHBc-VLPの免疫優性領域ループにSH外部ドメインを提示した。HBc-SHe-VLPは、リシンがHBc免疫優性領域の上部に導入されたHBcの変異体であるmHBcとSHeペプチドの化学結合によって得られたDeFiletteら、2005。化学結合を可能にするため、システイン残基をSHeのN末端に加えた。加えて、SHeペプチドの位置4に存在するシステイン残基をセリン残基に置換した。このペプチドをSHe-CC4Sと呼んだ。サイズ排除クロマトグラフィーによるmHBc-SHe-VLPの精製後、架橋の程度をSDSPAGEによって調べた。図7は、約50のHBcタンパク質がSHe-CC4Sペプチドと化学結合したことを示す。ゆっくり移動したバンドは、2または3個のSHecc4sペプチドが結合したmHBcモノマーを表し得る。SHeCC4S結合mHBcタンパク質が依然予想される大きさ30-34nmのVLPに構築するかどうか試験するために、動的光散乱法による分析を、生成されたmHBc-SHe粒子および完全に機能的な参照物である1604M2e-HBcVLPに実施した。図8は、mHBc-SHe-CC4Sの大きさ分布は1604M2e-HBc対照のそれと重複し、30nmにおいて最大値であり、それはHBcVLPの報告された大きさClarkeら、1987に相当することを示す。[実施例4]SHe-tGCN4-Flagの設計、構築および精製mHBcVLPの表面上でのSHeペプチドの提示に次いで、融合ペプチドRefmarinaGCN4に対する強力な液性応答を誘導することが知られているtGCN4とも、SHeを融合させた。SHeとFlag-タグは、それぞれtGCN4コード配列の5’末端と3’末端で遺伝学的に結合させ、PLT32発現ベクターにクローニングした。E.コリにおける発現後、アニオン交換、疎水性相互作用およびゲル濾過クロマトグラフィーにより組換えSHe-tGCN4-Flagを精製した図9。[実施例5]mHBc-SHeCC4SおよびSHe-tGCN4の予防接種は、SHe特異的抗体およびRSV感染に対する防御を誘導するmHBc-SHeCC4SおよびSHe-tGCN4を用いた予防接種が、RSV感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、1ugのLTR192Gアジュバントと組み合わせた10μgのmHBc-SHeCC4SおよびSHe-tGCN4で、Balb/cマウスを3回鼻腔内予防接種した。PBSおよび空mHBcを、後者は1ugのLTR192Gと組み合わせて、陰性対照として使用した。免疫処置は3週間毎に実施した。1つのRSV感染5.105PFUは陽性対照として使用した。各免疫処置後の第二週と第三週の間に、血液を回収してSHe特異的IgG抗体の誘導を調べた。She特異的抗体の存在は、SHeペプチドELISAによって試験した。図10Aは、SHeペプチド特異的IgG抗体を誘導し、それぞれmHBc-SHeCC4SおよびSHe-tGCN4による第二および第三免疫処置後に追加抗原刺激することを実証する。3連続のFlag-COMPcc-SHe/LTR192G免疫処置は高レベルのIgG2aSHe特異的抗体、および幾分低いレベルのIgG1SHe特異的抗体をもたらし、Th1指向型/誘導型免疫応答を示した図10B。mHBc-SHeCC4SまたはSHe-tGCN4を用いた予防接種が、RSV感染を妨げることができるかどうか試験するために、最後の追加抗原刺激による免疫処置後3週間で、5.106PFUのRSV-A2でマウスを攻撃した。攻撃後3日でマウスを屠殺し、QPCRにより肺中RSV-A2レベルを決定した。図11は、mHBc-SHeCC4SまたはSHe-tGCN4で予防接種した全てのマウス、またはRSVを事前に感染させたマウスは、mHBcで予防接種したマウスより低い肺中レベルのゲノムRSVRNAを有することを示す。これらのデータによって、粘膜SHeベースの予防接種はRSV複製に対してマウスを部分的に保護することができるという、本発明者らの以前の観察結果を確認する。特に、LTR192Gアジュバントと組み合わせた空mHBcで予防接種した全てのマウスは、LTR192GアジュバントなしのPBSで免疫処置したマウスより低レベルのRSVを示した。マウスの先天性免疫系に対するLTR192Gの影響によって、これを説明することができる。E.コリ熱不安定性エンテロトキシンは、先天性インプリンティングにより、RSVを含めた肺中ウイルス感染に対して一般的な防御をもたらすことが示されているWilliamsandHussel2004参照。肺中ウイルス複製に対するLTR192Gによる先天性インプリンティングの影響は一過性であると思われる。RSV複製に対するTLR192Rの影響は、最終LTR192G投与後9週でウイルス感染が起こると、大幅に低減するからである。再度いずれのマウスも有意な体重減少を示さず、SHeの予防接種は、VLPまたはtGCN4により提示されるとき、攻撃による疾患の増大を誘導しないことが示された図12。[実施例6]SHe特異的モノクローナル抗体の産生および試験。感染細胞と相互作用することができるSHe特異的抗体が、RSV感染に対する防御をもたらし得るかどうか調べるために、本発明者らは、SHe-TGCN4免疫処置マウスに基づきRSVSHe特異的モノクローナル抗体を開発した。ELISA中でSHeペプチドと効率よく結合する抗体を産生した1つのIgG13D11と1つのIgG2a3G8亜型ハイブリドーマを選択し、サブクローニングし抗体産生に使用した。3D11および3G8はプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ELISAによりSHeとの結合効率に関して試験した。図13は、3D11および3G8はコーティングSHeペプチドと結合することができ、それぞれIgG1およびIgG2a亜型であることを示す。抗体はADCCまたはCDCによる感染細胞の認識および殺傷を介してウイルス感染を防御することができるので、本発明者らは、SHe特異的モノクローナル抗体3D11および3G8が、細胞の表面上のSHを認識することができるかどうか調べた。したがって、Hek293T細胞を、いずれもGFP発現ベクターと組み合わせて、RSVSH発現ベクターまたは対照ホタルルシフェラーゼベクターSchepensら、2005でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間で、異なる濃度のSHe特異的モノクローナル抗体3D11および3G8またはアイソタイプ適合インフルエンザM2e特異的抗体14C2IgG1およびIG2aM2e特異的モノクローナル抗体で、生きた細胞を染色した。Flag-COMPcc-SHe免疫処置マウス由来のポリクローナル血清は陽性対照として使用した。図14は、Flag-COMPcc-SHeポリクローナル血清だけでなく、3D11モノクローナル抗体と3G8モノクローナル抗体の両方も、対照細胞ではなくSH発現細胞と容易に結合することができることを実証する。対照的に、IgG1およびIgG2aインフルエンザM2e特異的抗体はいずれも、SH発現細胞と結合することができなかった。これらのデータは、3D11と3G8の両方が細胞表面で発現されるSHの外部ドメインを認識することができることを、明らかに実証する。感染中、RSVSHタンパク質は、ER、ゴルジおよび細胞膜で主に発現される。したがって、RSVSH特異的抗体が、これらの細胞表面で発現されるSHを介して感染細胞を認識することができるかどうかより直接的に調べるため、本発明者らは、RSV感染および擬似感染細胞の免疫染色を実施した。ヒトA594肺上皮細胞を、0.05MOIのRSVまたは擬似感染のいずれかで感染させた。感染後24時間で、細胞を固定し、ポリクローナル抗RSV免疫血清と組み合わせたSHe特異的モノクローナル抗体3D11または3G8で染色した。図15は、SHe特異的モノクローナル抗体3D11および3G8は、感染細胞の細胞膜および核付近おそらくERおよびゴルジに相当でSHを容易に認識することができることを示す。これは、SHeモノクローナル抗体が、RSV感染細胞を認識することによりRSV感染に対して防御することを示す。このように、本明細書に記載するSHeモノクローナル抗体3D11および3G8は予防または療法治療剤として使用することができる。[実施例7]SHe特異的モノクローナル抗体3G8を使用する受動免疫処置はRSV複製を低減する。SHe特異的抗体がインビボでRSV複製を低減することができるかどうか試験するために、SHe特異的モノクローナル抗体でマウスを受動免疫処置した。SHe特異的3G8モノクローナル抗体、アイソタイプ対照抗体またはPBSを、RSV攻撃の1日前と1日後にマウスに鼻腔内投与した。RSV攻撃後3日で、血液を回収し、治療マウスの血清中のモノクローナル抗体の存在に関して試験した。RSV攻撃後4日で、マウスを屠殺し肺中ウイルス力価を決定した。ペプチドELISAは、各抗体で治療したマウス血清中の低濃度のSHe特異的およびアイソタイプ対照抗体の存在を実証したデータ示さず。図16は、SHe特異的モノクローナル抗体を与えたマウスは、PBSまたはアイソタイプ対照モノクローナル抗体で治療したマウスと比較して、低い肺中RSV力価を有することを示す。これらのデータは、SHe特異的抗体の鼻腔内投与は、マウスにおけるRSV感染を低減することができることを示唆する。[実施例8]SHe-KLHの構築SHeベースのワクチンも、代替アジュバントおよび異なる担体と共に、代替経路によりこのワクチンを投与するとき、RSV感染に対して防御することができるかどうか試験するために、担体としてのキーホールリンペットヘモシアニンKLHと共に腹腔内でワクチンを試験した。マレイミド活性化KLHPierceを、RSVASH外部ドメインに対応するペプチドCGGGSNKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT配列番号50;RSVASH外部ドメインSheに対応する配列に下線を引くと化学結合させた。直接的化学結合を助長するため、CysGlyGlyGlySerリンカーをRSVASHeペプチドのN末端に加えた。さらに、本来のRSVASHe中に存在したシステイン残基をセリン残基に置換した。化学結合は製造者Pierceの説明書に従い実施した。架橋KLH-SHeタンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。[実施例9]KLH-SHeを用いた腹腔内予防接種はマウスにおけるRSV複製を低減する。SHeベースのワクチンを用いた腹腔内I.P.予防接種が、RSV感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、50μlのフロイント不完全アジュバントMiliporeとそれぞれ組み合わせた20μgのKLH-SHeまたはKLHで、Balb/cマウスグループ当たり6匹のマウスを3回腹腔内予防接種した。アジュバントなしのPBS予防接種を追加の陰性対照として使用した。予防接種後の第二週と第三週の間に、血液を回収してSHe特異的IgG抗体の誘導を決定した。SHe特異的抗体の存在を決定しSHeペプチドELISAにより定量化した。図17A-Bは、KLH-SHeを用いた3連続予防接種は、IgG1亜型とIgG2a亜型の両方の、高レベルのSHe特異的IgG抗体を誘導することを実証する。PBSまたはKLH予防接種マウス由来の血清において、SHe特異的IgG抗体を検出することはできなかった。さらにフローサイトメトリー分析は、KLH-SHeを腹腔内予防接種したマウス由来の血清は、それらの表面でRSVSHタンパク質を発現するHEK293T細胞と特異的に結合することができ、一方で免疫前血清はできなかったことを明らかにした。腹腔内KLH-SHe予防接種がRSV感染を低減し得るかどうか試験するために、最後の予防接種後4週で1.106PFUのRSV-A2を予防接種マウスに感染させた。攻撃後5日で、マウスを屠殺しプラークアッセイにより肺中RSV-A2力価を決定した。図17Dは、KLH予防接種マウスの肺中よりSHe-KLH予防接種マウスの肺中で、有意に少ないウイルスを検出することができたことを示すP>0.005、マンホイットニーのU検定。KLH-SHe予防接種マウス間で、血清SHe特異的IgG抗体の高い力価が感染後5日で低レベルの肺中RSVと強く相関関係があったという観察結果R2=0.95は、KLH-SHe予防接種によるRSV複製の低減がSHe特異的抗体によって仲介されることを示唆する図17E。全てのマウスの体重は、感染日および屠殺日にモニタリングした。図17Cは、KLH-SHeで予防接種したマウスは、KLHで予防接種したマウスより有意に体重が増大したことを示すP>0.005、マンホイットニーのU検定。これらのデータは、SHeベースのワクチンを用いた腹腔内予防接種は、罹患状態を誘導せずにRSV複製を低減することができることを実証する。さらにこれらのデータは、mHBcに次いで、tGCN4およびCOMPccさらにKLHをSHeペプチドベースワクチン用のタンパク質担体として使用することができることを示す。さらにこれらのデータは、Titermaxに次いで、フロイント不完全アジュバントも、SHe特異的免疫を誘導するのに適したアジュバントとして使用することができることを示す。[実施例10]KLH-SHeを用いた鼻腔内予防接種はマウスにおけるRSV複製を低減する。KLH-SHeを用いた鼻腔内予防接種が、RSV感染に対する防御を誘発し得るかどうか試験するために、1μgのLTR192Gアジュバントとそれぞれ組み合わせた20μgのKLH-SHeまたはKLHで、Balb/cマウスグループ当たり6匹のマウスを3回鼻腔内予防接種した。アジュバントなしのPBS予防接種を追加の陰性対照として使用した。予防接種後の第二週と第三週の間に、血液を回収してSHe特異的IgG抗体の誘導を調べた。SHe特異的抗体の存在はSHeペプチドELISAにより試験した。図18A-Bは、KLH-SHeを用いた3連続予防接種は、IgG1亜型とIgG2a亜型の両方のSHe特異的IgG抗体を誘導することを実証する。PBSまたはKLH予防接種マウス由来の血清において、SHe特異的IgG抗体を検出することはできなかった。さらにフローサイトメトリー分析は、免疫前血清ではなく、KLH-SHe血清を鼻腔内予防接種したマウス由来の血清が、それらの表面でRSVSHタンパク質を発現するHEK293T細胞と特異的に結合することができることを明らかにした。腹腔内KLH-SHe予防接種がRSV感染を低減し得るかどうか試験するために、最後の予防接種後9週で1.106PFUのRSV-A2を予防接種マウスに感染させた。攻撃後5日で、マウスを屠殺しBAL気管支肺胞洗浄液3mlを回収した。プラークアッセイにより回収したBAL液中のRSV-A2力価を決定した。図18Eは、KLH予防接種マウスの肺中よりKLH-SHe予防接種マウスの肺中で、有意に少ないウイルスを検出することができたことを示すP>0.05、マンホイットニーのU検定。回収したBAL液中のSHe特異的IgAおよびIgG抗体の存在は、SHeペプチドELISAによって分析した。この分析は、PBSおよびKLH予防接種マウスと対照的に、KLH-SHeを予防接種したマウスのBAL液は、IgGとIgASHe特異的抗体の両方を含有していたことを明らかにした図18C-D。KLH-SHe予防接種マウスのBAL液中に存在したIgGSHe特異的抗体のレベルは、各マウスの血清中のIgGSHe特異的抗体のレベルと相関関係があった。KLH-SHe予防接種マウス間で、BAL液中に存在したSHe特異的IgG抗体の高い力価が感染後5日で低レベルの肺中RSV力価と強く相関関係があったという観察結果R2=0.97は、KLH-SHe予防接種によるRSV複製の低減がSHe特異的抗体によって仲介されることを示唆する図18F。これらのデータは、SHeベースのワクチンを用いた鼻腔内予防接種は、罹患状態を誘導せずにRSV複製を低減することができることを実証する。さらに、これらのデータによって、mHBcに次いで、tGCN4およびCOMPccさらにKLHをSHeペプチドベースワクチン用のタンパク質担体として使用することができることを確認する。[実施例11]KLH-SHe免疫血清の受動輸送はマウスにおけるRSV感染を防御する。SHeベースワクチンで予防接種したマウスにおけるRSV複製の低減が、RSVSHe特異的抗体により仲介され得るかどうかさらに調べるために、受動輸送の実験を実施した。いずれも75μlのフロイント不完全アジュバントと組み合わせたKLH-SHeまたはKLHのいずれか20μgで、Balb/cマウスを腹腔内予防接種した。追加の陰性対照として、アジュバントなしのPBSでマウスを予防接種した。SHeペプチドELISAは、KLH-SHeで予防接種した全てのマウスの血清が、高レベルのSHe特異的IgG抗体を含有することを示した。最後の出血後、各グループのマウスの血清をプールし、56°Cで30分間熱失活させた。KLH-SHe血清はRSV感染を防御することができるかどうか試験するために、40μlのKLHまたはKLH-SHe血清を、RSV攻撃2.105PFU第0日1日前第-1日と1日後第1日にマウスに鼻腔内投与した。PBSで治療したマウスは追加の対照として含めた。全てのマウスの体重を毎日モニタリングした図19C。感染後5日で、マウスを屠殺し肺ホモジネートを調製した。プラークアッセイによる分析は、KLH-SHe血清で治療したマウスの肺ホモジネートは、KLH血清で治療したマウス由来の肺ホモジネートより、約40倍少ない複製ウイルスウイルス力価の平均の比を含有していたことを実証した図19B。KLH血清で治療したマウスの肺中RSV力価が、PBSで治療したマウスの肺中RSV力価と違わなかったという観察結果は、対照血清の投与はマウスにおける肺中RSV複製に影響を与えないことを示す。[実施例12]mHBc-SHeBの構築それらの亜型内で高度に保存されているにもかかわらず、RSVBウイルスのSHeアミノ酸配列は、RSVA亜型ウイルスのそれと異なる。したがって、RSVBウイルスに対して防御するため、SHeベースワクチンはRSVBのSHeアミノ酸配列を含むことが最も必要とされ得る。RSVBSHeワクチンを、mHBcウイルス様粒子とコンセンサスRSVBSHeペプチドSHeB:CGGGSNKLSEHKTFSNKTLEQGQMYQINT配列番号51の化学結合によって構築した。化学結合を助長するため、CysGlyGlyGlySerリンカーをRSVBSHeペプチドのN末端に加えた。さらに、本来のRSVBSHe中に存在したシステイン残基をセリン残基に置換した。mHBcとRSVBSHeペプチドの化学結合から生じた免疫原はmHBc-SHeBと名付けた。サイズ排除クロマトグラフィーによるmHBc-SHeBVLPの精製後、SDS-PAGEゲル電気泳動およびクーマシー染色により架橋の程度を分析した。図20は、半分より多くのHBcモノマーが少なくとも1つのSHeペプチドと架橋することを示す。[実施例13]mHBc-SHeBを用いたマウスの免疫処置は、RSVB感染細胞の表面と結合するSHeB特異的抗体を誘導する。mHBc-SHeBVLPが免疫原性であるかどうか試験するために、50μlのTitermaxSigmaと組み合わせた20μgのmHBc-SHeBで、1匹のBALB/cマウスを3回皮下免疫処置した。3回の免疫処置は2週間間隔で実施した。各免疫処置1日前および最終免疫処置後2週間で、出血を実施した。mHBc-SHeB免疫血清が、感染細胞の表面上で発現されるRSVBSHタンパク質を認識し得るかどうか試験するために、Vero細胞には、親切なことにDr.MarcvanRanst、UniversityofLeuven、Leuven、ベルギーにより提供されたRSVBウイルスの臨床分離株を擬似感染させたか、または感染させた。感染後72時間で、細胞を固定し、0.2トリトンX-100を使用して透過処理、または非透過処理した。フロイント不完全アジュバントと組み合わせたmHBc-SHeB免疫血清1/100希釈またはKLHKLH血清で予防接種したBALB/cマウス由来の対照免疫血清1/100希釈のいずれかで、細胞を次いで染色した。サンプルは免疫蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって分析した。図21AおよびBは、mHBc-SHeB免疫血清は、非感染細胞ではなく、透過処理と非透過処理RSVB感染細胞の両方と結合することができることを示す。対照的に、対照免疫血清はRSVB感染細胞と結合しなかった。これは、mHBc-SHeBによるマウスの予防接種は、おそらく大部分はRSVB感染細胞の表面上で発現されるRSVBSHタンパク質との結合によって、RSVB感染細胞を認識することができる血清抗体を誘導することを実証する。[実施例14]mHBc-SHeBを用いた免疫処置はマウスにおけるRSV複製を低減する。mHBc-SHeBを用いた予防接種は、RSVB感染からマウスを防御することができるかどうか試験するために、6匹のマウスの2グループを、50μlのフロイント不完全アジュバントを補充したmHBcまたはmHBc-SHeBVLPで免疫処置した。追加の対照として、6匹のマウスをPBSで予防接種した。3週間間隔で3回、腹腔内予防接種した。各免疫処置後2週間で出血を実施した。SHe特異的抗体の誘導は、コーティングペプチドとしてSHeAまたはSHeBを使用したペプチドELISAにより決定した。この分析は、全てのマウスにおいて、3連続のmHBc-SHeB免疫処置が、IgG1亜型とIgG2a亜型の両方の高力価のRSVBShe特異的IgG抗体を誘導することを実証した図22A-C。mHBc-SHeB免疫血清も、はるかに低い程度ではあるがSHeAペプチドと結合した図22A、BおよびD。本発明者らおよび他の研究室における以前の実験は、RSVB感染マウスから、全くまたはほとんど複製ウイルスを奪還することができないことを示している。それにもかかわらず本発明者らは、RSVB臨床分離株の感染がBALB/cマウスにおいて肺炎症および体重減少を誘導することを、観察することができたデータ示さず。したがって本発明者らは、mHBc-SHeBを用いた予防接種が、RSVB誘導型肺炎症からマウスを防御することができたかどうか試験した。2.106PFUのRSVB臨床分離株によるマウスの鼻腔内攻撃後6日で、気管支肺胞洗浄BALを実施した。擬似感染マウスは、BAL細胞浸潤の分析用の陰性対照として使用した。Bogaertら、2011中に記載されたように、フローサイトメトリーにより免疫細胞浸潤に関してBAL液を分析した。図22E-Fは、RSVB感染が免疫細胞、特にCD8Tリンパ球の肺浸潤をもたらすことを示し、これはマウスにおけるRSV誘導型罹患の原因であることが知られている。しかしながら、PBSまたはmHBc予防接種マウスと比較して、mHBc-SHeB予防接種マウスは有意に少ない肺細胞浸潤を示した。これらのデータは、mHBc-SHeB予防接種がRSV関連の免疫学的病状を低減することを実証する。[実施例15]LPP5-SHeタンパク質の設計、発現および精製。ペンタマーとしてSHeを提示するための代替のタンパク質足場として、本発明者らは、E.コリLPP-56リポタンパク質Liuら、2004由来のLiuらによって記載されたペンタマートリプトファン-ジッパーLPP5を使用した。Mertensら、1995によって記載されたように、LPP5トリプトファン-ジッパーのコード配列はSHeコード配列と遺伝学的に融合させ、ヘキサヒスチジンペプチドおよびカスパーゼ切断部位を含有するE.コリ発現ベクターpLH36にクローニングした。この発現プラスミドはpLH36-HisDEVD-LPP-SHe配列番号49と名付けた。このプラスミドからの発現によってキメラLPP5-SHeタンパク質配列番号52が生じるMHHHHHHPGGSDEVDAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWATGGNKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT、ヒスタグ配列には下線を引き、リンカーはイタリック体であり、DEVDカスパーゼ切断部位はイタリック体および下線であり、ペンタマーLPPトリプトファン-ジッパーは太字であり、RSVASH外部ドメインは太字およびイタリック体である。E.コリにおける発現の誘導後、二次的ニッケルアフィニティー、アニオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーによりLPP5-SHeタンパク質を精製した。図23は、粗製細胞抽出物中で23Aおよび精製タンパク質として24B、両方で、She特異的3G8モノクローナル抗体によりLPP5-SHeタンパク質を認識することができることを実証する。[実施例16]コットンラットの免疫処置独立した動物モデルにおけるワクチンの有効性を証明するため、コットンラットを使用する。コットンラットサイグモンドンヒスピダスSigmondonhispidusはRSV感染の影響を受けやすいPrinceら、1978。それぞれ6匹のコットンラットの5グループを使用する。100μgのKLH賦形剤対照または100μgのKLH-SHeすなわち、RSV-A由来のSHeペプチドと担体としてのKLHの化学結合体で、2グループの動物を腹腔内i.p.免疫処置した。KLHおよびKLH-SHeワクチン抗原はフロイント不完全アジュバントで製剤化し、これらを使用して第0日、21日、および42日にコットンラットを免疫処置する。第三グループの動物には、アラムアジュバントの存在下においてホルマリン不活化RSVFI-RSVで筋肉内免疫処置する。後者のグループは、RSVによる二次攻撃により明らかとなるワクチン増大型疾患の誘導に関する陽性対照として働く。第四グループの動物には、第0日にコットンラット当たり2.04×105プラーク形成単位のRSV-Tracyを感染させ、二次攻撃に対する防御に関する陽性対照として働く。第五グループのコットンラットは攻撃の日まで未治療状態に保ち、RSV攻撃に関する対照として働く。予防接種のスケジュールは図24中に示す。各免疫処置前および攻撃の日に血清を回収する。第63日に、2.04×105プラーク形成単位のRSV-Tracyでコットンラットを鼻腔内攻撃する。攻撃ウイルスは100マイクロリットルの容積で鼻腔内投与し、一方動物にはイソフルランで軽く麻酔をかける。第68日に、血清を回収し、全ての動物を屠殺して、ウイルス滴定および病理組織学的解析用に肺を回収する。それぞれの肺を2つに分けて、病理組織学的解析およびウイルス滴定を実施する。左肺の血行を止め病理組織学的解析に使用する。15グリセリンを含む3mlのイスコフ培地を使用して、右肺の葉を洗浄する。洗浄液は滴定まで氷上に保存する。さらに、同じ培地中に2ml各鼻孔用に1mlで鼻腔洗浄液を調製する。肺および鼻腔洗浄液中のウイルス負荷は、HEp2細胞におけるプラークアッセイによって決定する。連続希釈した洗浄液サンプルで90分間、細胞を感染させる。接種原の除去後、抗生物質を含むMEMにおいて2メチルセルロースを細胞に塗布する。CO2インキュベーターにおける37°Cでのインキュベーションの6日後、プラークは0.1クリスタルバイオレット/10ホルマリン溶液で対比染色し、24時間室温で放置する。病理組織学的解析用に、10中性緩衝ホルマリンで左肺を灌流させる。固定した肺組織はミクロトームで後に処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する切片を得て、病理組織学的病変の程度を記録する。ペプチドELISAおよびマイクロ中和アッセイにより、抗SHeおよび抗RSV中和抗体の存在に関して血清サンプルをアッセイする。ペプチドELISA用に、50μlの0、1M炭酸バッファー、pH9.6中の2μgのSHe-ペプチドで、37°Cにおいて一晩プレートをコーティングする。コーティング後、PBS中3w/v乳粉末でプレートをブロッキングし、次にコットンラット血清の3倍連続希釈液をかける。保持されたSHe特異的コットンラットIgGは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体およびテトラメチルベンジジン基質を使用して検出する。サンプル中の終点抗SHeペプチドIgG力価は、その吸光度が免疫前血清のそれより少なくとも2倍高い最高希釈として定義する。HEp2細胞を含む96ウエルマイクロタイタープレートにおいて、RSV-Aおよび-Bに関する中和抗体力価を決定する。血清サンプルの連続希釈液は一定量の接種原ウイルスと混合する。50を超える低減が細胞変性効果である血清希釈として定義する、中和抗体力価を観察する。この細胞変性効果は細胞の破壊を指し、細胞を10中性緩衝ホルマリンで固定しクリスタルバイオレットで染色した後に目視により決定する。これらの結果は、フロイントアジュバント中KLH-SHeを予防接種した動物が中和抗体を発色し、明らかに防御されることを示し、一方で賦形剤対照は全く防御を示さない。"