前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団。少なくとも約50の前部前腸内胚葉細胞を含む、請求項1に記載の細胞集団。前記前部前腸内胚葉細胞が咽頭内胚葉細胞である、請求項1または2に記載の細胞集団。前部前腸内胚葉細胞を誘導する方法であって、胚体内胚葉細胞をBMPの阻害剤またはTGFβシグナル伝達の阻害剤を用いて培養するステップを含む方法。前記胚体内胚葉細胞をBMPの前記阻害剤およびTGFβシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養するステップを含む、請求項4に記載の方法。胚体内胚葉が、アクチビンAの非存在下で培養される、請求項4または5に記載の方法。BMPの前記阻害剤が、ノギン、コーディン、またはフォリスタチンである、請求項4~6のいずれか一項にに記載の方法。BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項7に記載の方法。TGFβシグナル伝達の前記阻害剤が、SB431542である、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。BMPの前記阻害剤がノギンであり、TGFβシグナル伝達の前記阻害剤がSB431542である、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。前記胚体内胚葉細胞が胚様体細胞である、請求項4から10のいずれか一項に記載の方法。アクチビンA中で前記胚体内胚葉細胞を培養するステップをさらに含む、請求項4から11のいずれか一項に記載の方法。前記胚体内胚葉細胞が、アクチビンAの非存在下でBMPの前記阻害剤およびTGFβシグナル伝達の前記阻害剤を用いて培養される、請求項4から12のいずれか一項に記載の方法。前記前部前腸内胚葉細胞がヒト細胞である、請求項4から13のいずれか一項に記載の方法。前記前部前腸内胚葉細胞が多能性細胞に由来する、請求項4から14のいずれか一項に記載の方法。前記多能性細胞がES細胞である、請求項15に記載の方法。前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項15に記載の方法。前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。前記前部前腸内胚葉細胞がFoxa2を発現し、前記胚体内胚葉細胞においてSox2およびCdx2の発現と比べて、Sox2発現のレベルの上昇およびCdx2発現のレベルの低下を含む、請求項4から18のいずれか一項に記載の方法。多能性細胞から前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、前記多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成する条件下で前記多能性細胞を培養するステップと、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成する条件下で前記胚体内胚葉細胞を培養し、それによって、前部前腸内胚葉細胞の前記濃縮された集団を調製するステップとを含む方法。前記多能性細胞が、前記多能性細胞を誘導して前記胚体内胚葉細胞を形成するためにbFGF、BMP4およびアクチビンAの存在下で培養される、請求項20に記載の方法。前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの阻害剤またはTGFβシグナル伝達の阻害剤の存在下およびアクチビンAの非存在下で培養される、請求項20または21に記載の方法。前記胚体内胚葉細胞が、前記胚体内胚葉細胞を誘導して前記前部前腸内胚葉細胞を形成するためにBMPの前記阻害剤およびTGFβシグナル伝達の前記阻害剤の存在下ならびにアクチビンAの非存在下で培養される、請求項22に記載の方法。BMPの前記阻害剤が、ノギンまたはコーディンである、請求項22または23に記載の方法。BMPの前記阻害剤がノギンである、請求項24に記載の方法。TGFβシグナル伝達の前記阻害剤が、SB431542である、請求項22から25のいずれかに記載の方法。前記多能性細胞が1~4日間培養される、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。前記胚体内胚葉細胞が2~6日間培養される、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。前記前部前腸内胚葉細胞を単離するステップをさらに含む、請求項20から28のいずれか一項に記載の方法。前記多能性細胞がES細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。前記多能性細胞がiPS細胞である、請求項20から29のいずれか一項に記載の方法。前記多能性細胞がヒト細胞である、請求項30または31に記載の方法。請求項4から19のいずれか一項に記載の方法によって誘導された前部前腸内胚葉細胞。請求項20から32のいずれか一項に記載の方法によって調製された前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団。前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定する方法であって、試験される作用物質の存在下で請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いが、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している方法。細胞分化に関与する遺伝子を同定する方法であって、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現する遺伝子の同定が、細胞分化に関与する遺伝子を示している方法。胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、請求項1に記載の濃縮された細胞集団に対する抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法。前記抗体が、前記胚体内胚葉に有意に結合しない、請求項37に記載の方法。前記前部前腸内胚葉細胞が、腹側化した前部前腸内胚葉細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞集団。前部前腸内胚葉の腹側化を誘導する方法であって、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される1種または複数の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む方法。Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される2つ以上の因子で前記前部前腸内胚葉を培養するステップを含む、請求項40に記載の方法。前記因子が、FGF7、FGF10、EGF、BMP4およびWnt3aからなる群から選択される、請求項40または41に記載の方法。細胞中で肺の運命を誘導する方法であって、前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞を誘導して前記肺の運命を示すために、レチノイン酸の存在下で、請求項4から32のいずれか一項に記載の方法によって産生された前部前腸内胚葉細胞を、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される1種または複数の因子で培養するステップを含む方法。前記肺の運命の細胞を示す前記細胞が、1種または複数の肺マーカーを発現する、請求項43に記載の方法。前記1種または複数の肺マーカーが、Gata6またはサーファクタントタンパク質Cである、請求項44に記載の方法。前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される1種または複数の因子で培養することによって誘導された、請求項43に記載の方法。前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される2つ以上の因子を用いて培養することによって誘導された、請求項46に記載の方法。前記腹側化した前部前腸内胚葉細胞が、前部前腸内胚葉をWntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される2つ以上の因子で培養することによって誘導された、請求項47に記載の方法。細胞中で副甲状腺の運命を誘導する方法であって、腹側化した前部前腸内胚葉細胞をソニックヘッジホッグおよび線維芽細胞増殖因子で培養するステップを含む方法。前記副甲状腺の運命の細胞を示す前記細胞が、副甲状腺マーカーを発現する、請求項49に記載の方法。前記副甲状腺マーカーがGCMBである、請求項50に記載の方法。少なくとも一部で、本発明は、多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性および人工多能性幹細胞から前部前腸内胚葉を生成するための方法の発見に基づいている。特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。特定の実施形態において、本発明は、咽頭内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。これらの細胞集団は、本明細書に記載した方法によって得ることができる。本明細書で使用される場合、細胞集団という用語は、単離した細胞集団を意味し、正常な発生の結果として動物に存在する細胞の集団を意味しない。特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉を誘導するための方法であって、BMPの阻害剤またはTGFβシグナル伝達の阻害剤を用いておよびアクチビンAの非存在下で胚体内胚葉を培養するステップを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉は、BMPの阻害剤およびTGFβシグナル伝達の阻害剤の両方を用いて、アクチビンAの非存在下で培養される。好ましい実施形態において、BMPの阻害剤はノギンであり、TGFβの阻害剤は、SB431542である。特定の実施形態において、本発明は、ES細胞またはiPS細胞など、前記多能性細胞から前部前腸内胚葉を誘導する方法であって、多能性細胞を誘導して胚体中胚葉を形成するステップ、例えば、本明細書に記載される通り、マーカーであるEPCAM、CXCR4およびCKITを発現させるステップと、次いで、本明細書に記載される通り、胚体中胚葉から前部前腸内胚葉を誘導するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本明細書に記載した方法によって誘導された前部前腸内胚葉細胞は、FOXA2を発現し、胚体内胚葉細胞におけるSOX2およびCDX2の発現と比べて、SOX2発現レベルの上昇およびCDX2発現レベルの低下を含む。好ましい実施形態において、本発明は、多能性細胞、例えば、ESもしくはiPS細胞、最も好ましくは、ヒトESまたはiPS細胞から前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を調製する方法であって、多能性細胞を誘導して胚体内胚葉細胞を形成するために、塩基性FGF、骨形態形成タンパク質4およびアクチビンAの存在下で前記多能性細胞を培養するステップと、胚体内胚葉細胞を誘導して前部前腸内胚葉細胞を形成するために、BMPの阻害剤、例えば、ノギンまたはコーディンまたはフォリスタチン、およびまたはTGFβシグナル伝達の阻害剤、例えば、SB431542の存在下およびアクチビンAの非存在下で胚体内胚葉細胞を培養するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定する方法であって、試験される作用物質の存在下および非存在下で前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いが、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、細胞分化に関与する遺伝子を同定する方法であって、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現する遺伝子の同定が、細胞分化に関与する遺伝子を示している方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団に対する抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、前部咽頭内胚葉または咽頭嚢の運命において腹側細胞の運命を誘導する方法であって、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される1種または複数の因子を投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、腹側化した前部前腸内胚葉細胞をソニックヘッジホッグおよび線維芽細胞増殖因子を用いて培養することにより細胞中の副甲状腺の運命を誘導する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、FGFおよびWntシグナル伝達アクチベーターを含むレチノイン酸の存在下で腹側化した前部前腸内胚葉を培養することにより細胞中の肺の運命を誘導する方法を提供する。やはり提供されるのは、本明細書に記載した方法によって産生した細胞および細胞の集団である。別段定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明において用いるために本明細書に記載され当技術分野で公知の他の適当な方法および材料は用いることもできる。材料、方法、および例は、例示的なものにすぎず、限定するものではない。本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参照は、その全体を参照によって組み込む。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書に従うものとする。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図からならびに特許請求の範囲から明らかである。胚形成中、前部および咽頭内胚葉の形成は、ボディープランの確立、ならびに耳、口蓋扁桃、胸腺、副甲状腺、甲状腺、肺、食道および気管の部分などの多臓器系の発達において決定的に重要なステップである。その形成に続いて、胚体内胚葉は、内胚葉サブ系統に次第に分化する。より後部の内胚葉は、中腸および後腸を生じる。肺野から前方の咽頭内胚葉は、咽頭嚢と呼ばれる4つのアウトクロッピングを形成する。それぞれの嚢は、特定の臓器、例えば、耳管および鼓膜の内部リーフレット、口蓋扁桃、胸腺、副甲状腺、ならびに甲状腺の傍濾胞C細胞に発達する。本来の甲状腺は、咽頭の床から発達する。肺、食道および気管は、嚢の遠位にある前部前腸内胚葉に由来する。多能性細胞から前部前腸咽頭内胚葉細胞の集団を生成する能力は、細胞の成長および分化に影響を与える作用物質についてのアッセイ、ならびに組織の発生および分化に関する研究においてこれらの組織の細胞置換治療に有用であるはずである。しかし、現在、前部前腸内胚葉細胞の集団を多能性細胞から生成するための方法が無く、前部前腸内胚葉形成を制御する分子の機序は、定義が不十分である。これらの形成および組織の発生をより良く理解するために、前部前腸内胚葉細胞集団を得ることが有利であるはずである。前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を単離するまたは生成することが今まで可能でなかった。本発明は、多能性細胞を誘導して胚体内胚葉に分化し、その後、胚体内胚葉を前部の運命にパターン形成することにより前部前腸内胚葉の集団を得るための方法を提供する。続いて、前部前腸内胚葉は、それに由来する組織のいずれかに分化するよう誘導することができる。特定の実施形態において、腹側前部前腸内胚葉、副甲状腺および肺マーカーは、前部前腸咽頭内胚葉から誘導される。したがって、本発明は、多能性細胞から前部前腸内胚葉細胞の集団を生成するための方法を提供する。かかる細胞集団は、細胞の成長および分化に影響を与える作用物質を同定し、組織の発達に関与する遺伝子を同定し、細胞置換治療のために分化した細胞および組織を生成するのに有用である。本明細書で使用される場合、前部前腸内胚葉は、肝臓を生じる内胚葉よりも前部である内胚葉を意味する。したがって、当業者には、前部前腸内胚葉は、例えば、咽頭内胚葉および内胚葉細胞のより高度に分化した他の集団を含み、前部前腸内胚葉という用語によって包含される様々な細胞タイプが、分子のマーカーの異なる発現パターンを示し得ることが容易に理解される。当業者には、前部前腸内胚葉が、例えば、扁桃、鼓膜、甲状腺、副甲状腺、胸腺、気管、食道、胃、肺および喉頭咽頭など、様々な組織を生じることが理解される。例えば、ES細胞などの多能性細胞の胚体内胚葉への方向づけされた分化は、高濃度のアクチビンAを適用することによって得ることができる。この戦略についての科学的根拠は、モルフォゲンであるnodalによるシグナル伝達が、内胚葉形成に必要とされていることである。アクチビンAは、nodalと同じ受容体を活性化するが、可溶性サイトカインとして利用可能である。ES細胞の胚体内胚葉への分化を行うために利用可能な方法にもかかわらず、invitroで胚体内胚葉を前方化し、前部前腸内胚葉を誘導するまたは単離するのに利用可能な方法は、現在存在しない。胚組織は、分子のマーカーの特徴的なセットを発現する。内細胞塊細胞は、転写制御因子OCT34、NANOG、およびSOX2を発現する。胚体内胚葉細胞は、転写制御因子FOXA2、SOX17およびFOXA3を発現する。前部前腸内胚葉細胞は、転写制御因子FOXA2およびSOX2を発現する。咽頭内胚葉細胞は、転写制御因子TBX1およびSOX2を発現する。第3の咽頭嚢細胞は、転写制御因子PAX19、HOXA3およびSIXlを発現する。胸腺上皮細胞は、転写制御因子FOXN1を発現する。前部前腸内胚葉の肺野は、NKX21およびGATA6を発現する。組織中の前部前腸内胚葉マーカーの検出は、それ自体で、ES細胞に由来する前部前腸内胚葉の存在を実証するのに十分ではない。ES細胞は、特定の培養条件下で、未分化状態で維持される。これらの条件を取り除くと、胚様体を形成するが、これは、自発性の原腸形成を起こし、ランダム分化を起こすすべての胚葉の誘導体のランダム生成をもたらす細胞の球である。ランダム分化を起こすEBは、前部前腸内胚葉用のマーカーを含めた多くの胚組織用のマーカーを発現する。したがって、前部前腸内胚葉としてのES由来組織の妥当な分類は、前部前腸内胚葉用のマーカーの単なる発現以上に組織の追加の特徴付けを要し、前部前腸内胚葉と関連しない細胞運命が抑制されることまたは胚体内胚葉シグナルおよび後部内胚葉シグナルが欠乏することなどが必要とされる。咽頭および前部前腸内胚葉に由来する組織を生成するための方法は、多能性細胞からの胚体内胚葉の誘導、前部前腸内胚葉を形成するための胚体内胚葉の誘導、それに続いて、例えば、咽頭内胚葉へのさらなる分化および特異的な誘導体の特定化によって進行し得る。胚体内胚葉の生成胚体内胚葉のヒトESもしくはiPS細胞からの生成は、マウスES細胞から胚体内胚葉を発生させるために用いられるプロトコールを適合することにより達成され得る。Kuboら、Development131巻1651~1662頁Gadueら、ProcNatlAcadSciUSA10316806~16811頁GouonEvansら、NatBiotechnol、24巻1402~1411頁。ヒトES細胞を、低濃度のBMP4でパルス標識し、低濃度のBMP4およびbFGF中で培養し、次いで、組織処理されていないプラスチック上で高濃度のアクチビンA中で培養し、胚様体の形成をもたらす。EBは、実質的に均一に内胚葉からなる。内胚葉の発生は、CXCR4およびcKITの発現によって確認することができる。内胚葉の発生は、5日まで、ESマーカーであるSOX2を喪失し、MIXL1、SOX17およびFOXA2を経時的に獲得することによって達成される。いくつかの実施形態において、他の多能性幹細胞は、ES細胞の代わりに用いることができる。例えば、成人幹細胞胚性幹細胞、または胎盤もしくは臍帯から得られた幹細胞前駆細胞および人工多能性幹細胞は用いることができる。いくつかの実施形態において、iPS細胞を参照のことが用いられる。一般に、ヒト起源の細胞が好ましい。胚体内胚葉からの前部前腸内胚葉の形成アクチビンAが内胚葉を誘導するが、アクチビンAは、この組織を後方化することが発見されている。したがって、前部前腸内胚葉の調製は、アクチビンAを低減するまたは除去し、その後、胚体内胚葉を形成することが必要である。したがって、特定の態様において、本発明は、前部前腸内胚葉について濃縮された集団細胞の形成ならびに中間のおよび後部の内胚葉シグナルの欠乏のための方法を提供する。かかる集団は、前部前腸内胚葉に存在する分子マーカーを発現し、前部前腸内胚葉に存在しない分子マーカーが欠乏する。内胚葉細胞集団は、当技術分野で公知のマーカーによって特徴付けられ、識別される。胚体内胚葉内で、ESマーカーSOX2は、前部前腸内胚葉のマーカーとして再出現し、CDX2は、後部内胚葉のマーカーである。アクチビンAにより内胚葉を形成するために4~5日間誘導された細胞を長期培養すると、CDX2を増加させ、SOX2を喪失させ、これらの条件で後方化することが示唆される。胚体内胚葉の前方化は、アクチビンAを中止するまたは遮断することによりおよび前方化するモルフォゲンを加えることにより達成することができる。好ましい前方化するモルフォゲンは、BMPおよびTGFβシグナル伝達の阻害剤である。BMPおよびTGFβシグナル伝達の阻害剤は、単独でまたは組み合わせて用いることができる。好ましくは、BMPおよびTGFβシグナル伝達の阻害剤は、組み合わせて用いられる。BMP阻害剤の例は、ノギン、コーディンおよびフォリスタチンである。好ましいBMPの阻害剤は、ノギンである。TGFβシグナル伝達の阻害剤の例は、Ly364947、SM16、SB505124、SB431542、および抗TGFβ抗体である。好ましいTGFβシグナル伝達の阻害剤は、SB431542である。好ましい実施形態において、ノギンおよびSB431542の組み合わせは、胚体内胚葉の前方化を誘導するために用いられる。特定の実施形態において、ノギンおよびSB431542の組み合わせは、培養の4~5日目に加えられて胚体内胚葉の前方化が誘導される。ノギンおよびSBによる胚体内胚葉の前方化は、例えば、SOX2、TBX1、PAX9、FOXP2、DLX3、FOXA2、およびまたはSOX7の1つまたは複数の発現を、例えば、検出する場合によっては、PAX6およびまたはBRACHYURYの発現の欠如を検出することにより確認することができる。細胞集団したがって、特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。前部前腸内胚葉の濃縮された集団は、少なくとも25、例えば、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99または少なくとも999の前部前腸内胚葉細胞を含む。特定の実施形態において、本発明は、咽頭内胚葉細胞について濃縮された細胞集団を提供する。咽頭内胚葉の濃縮された集団は、少なくとも25、例えば、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99または少なくとも999の咽頭内胚葉細胞を含む。特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉を誘導する方法であって、BMPの阻害剤またはTGFβシグナル伝達の阻害剤を用いて、アクチビンAの非存在下で胚体内胚葉を培養するステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、胚体内胚葉は、BMPの阻害剤およびTGFβシグナル伝達の阻害剤の両方を用いて、アクチビンAの非存在下で培養される。いくつかの実施形態において、BMPの阻害剤はノギンである。本明細書に記載した方法のいくつかの実施形態において、ノギンは、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、ノギンは、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、ノギンは、約100ngmlの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、TGFβの阻害剤は、SB431542である。本明細書に記載した方法のいくつかの実施形態において、SB431542は、約01μM~1mM、1μM~100μM、1μM~500μM、1μM~250μM、または1μM~100μMの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、SB431542は、約5μM~250μM、5μM~100μM、5μM~50μM、または5μM~25μMの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、SB431542は、約10μMの濃度で培養物中に存在する。やはり好ましいのは、本発明の方法において用いられる培養物が、約75ngml~150ngmlの濃度のノギンおよび約5μM~25μMの濃度のSB431542を含む実施形態である。腹側前部前腸内胚葉の誘導胸腺、副甲状腺、気管および肺などの最も多くの前部前腸内胚葉に由来するほとんどの臓器は、前部前腸内胚葉の腹側または腹外側の面である。ノギンSB431542によって誘導される前部前腸内胚葉は、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の1種または複数のアゴニストで処理することにより腹側化した前部前腸内胚葉を形成するためにさらに誘導することができる。腹側前部前腸内胚葉の有効な誘導は、ノギンSB431542による処理に依存する。腹側前部前腸内胚葉を形成するために誘導される組織は、例えば、マーカーNKX21およびNKX25によって同定することができる。いくつかの実施形態において、前部前腸内胚葉は、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の2種以上のアゴニストの組み合わせにより腹側化される。さらに好ましいのは、前部前腸内胚葉が、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の2種以上のアゴニスト、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の3種以上のアゴニスト、Wntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の4種以上のアゴニスト、またはWntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、BMPシグナル伝達およびEGFシグナル伝達経路の5種以上のアゴニストの組み合わせにより腹側化される実施形態である。いくつかの実施形態において、Wntシグナル伝達のアゴニストは、正準のWntシグナル伝達を媒介するWnt3aであり正準のWntシグナル伝達のいずれかの誘導物質は、用いることができ、例えば、Wntβカテニン経路アゴニストであるグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β阻害剤、またはカゼインキナーゼ1阻害剤である。Wntアゴニストの限定しない例には、βカテニンをコードするDNA、βカテニンポリペプチド、1種または複数のWntβカテニン経路アゴニスト、、プルバラノールA、オロモウシン、アルステルパウロン、ケンパウロン、ベンジル2メチル124チアジアゾリジン35ジオン、2チオ5134オキサジアゾール、24ジベンジル5オキソチアジアゾリジン3チオン、6ブロモインジルビン3オキシム、α4ジブロモアセトフェノン阻害剤、2クロロ1エタノン、NN尿素、インジルビン5スルホンアミドインジルビン5スルホン酸アミドインジルビン3モノキシム5ヨードインジルビン3モノキシム5フルオロインジルビン55ジブロモインジルビン5ニトロインジルビン5クロロインジルビン5メチルインジルビン、5ブロモインジルビン、4ベンジル2メチル124チアジアゾリジン35ジオン、2チオ5134オキサジアゾール、24ジベンジル5オキソチアジアゾリジン3チオン、6ブロモインジルビン3オキシム、α4ジブロモアセトフェノン阻害剤、2クロロ1エタノン、NN尿素、HKEAPPAPPQSpPNH2およびMyrNGKEAPPAPPQSpPNH2からなる群から選択される1種または複数のグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β阻害剤、GSK3βmRNAに特異的に結合する1種もしくは複数のアンチセンスRNAまたはsiRNA、1種または複数のカゼインキナーゼ1阻害剤、1種または複数のプロテアーゼ阻害剤、1種または複数のプロテアソーム阻害剤が含まれる。WNT3aが本明細書に記載した方法において用いられるとき、Wnt3aは、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、Wnt3aは、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは用いられ、例えば、FGF7、FGF9、またはFGF10である。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF7またはFGF10は、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF7またはFGF10は、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、FGF7およびFGF10の両方が、約10ngmlの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、FGFシグナル伝達の他のアゴニストは、用いることができ、例えば、FGF1、2、3、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、または23である。好ましい実施形態において、EGFシグナル伝達のアゴニストは、EGFである。本明細書に記載した方法における使用の場合、EGFは、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、EGFは、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のEGFは、約20ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、BMPシグナル伝達のアゴニストは、いくつかの実施形態において、別のBMPを用いることができ、例えば、BMP1~BMP20のいずれか、例えば、BMP2~7のいずれかであるが、BMP4である。本明細書に記載した方法における使用の場合、BMP4は、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、BMP4は、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のBMP4は、約10ngmlの濃度で培養物中に存在する。非常に最も好ましい実施形態において、FGF7、FGF10、EGF、BMP4およびWnt3aは、それぞれ10、10、20、10および100ngmlの濃度で存在する。腹側化した内胚葉からの早期肺マーカーの誘導肺マーカーGATA6を発現する腹側化した前部前腸内胚葉は、Wntリガンド、Wntシグナル伝達アクチベーター、BMP、上皮増殖因子および線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される1種または複数の因子と併用したレチノイン酸で処理することにより誘導することができる。いくつかの実施形態において、肺マーカーの誘導は、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAの存在下で胚体内胚葉を培養することにより促進される。好ましい実施形態において、レチノイン酸は、オールトランスレチノイン酸である。本明細書に記載した方法における使用の場合、ATRAは、約1nM~10μM、1nM~100μM、5nM~10μM、5nM~1μM、50nM~1μMおよび100nM~5μMの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、ATRAは、約100nM~1μM、または1μM~5μMの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、ATRAは、約1μMの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、ATRAは、咽頭領域とは対照的に肺野に偏っている腹側前部前腸を誘導するために前述の因子と併用して用いられる。末端肺マーカーSPCの誘導19日目までWnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFおよびRAで処理を継続することによって、低レベルの末端II型肺胞細胞マーカーSPCをもたらした。これらの因子が、11日目にWnt3a、FGF7およびFGF10により置換されたとき、SPCの最適な発現は達成された。好ましい実施形態において、末端肺マーカーSPCは、RAの存在下ならびにWntシグナル伝達、FGFシグナル伝達、およびBMPの2種以上のアゴニストの組み合わせにおいて腹側化した前部前腸内胚葉から誘導される。いくつかの実施形態において、Wntシグナル伝達のアゴニストは、Wnt3aでありその他は、本明細書に記載した通り用いることもできる。本明細書に記載した方法における使用の場合、Wnt3aは、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、Wnt3aは、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ngmlの濃度で培養物中に存在する。いくつかの実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは、FGF7またはFGF10でありその他は、本明細書に記載した通り用いることもできる。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF7またはFGF10は、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF7またはFGF10は、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、FGF7およびFGF10の両方が、約10ngmlの濃度で培養物中に存在する。非常に最も好ましい実施形態において、FGF7、FGF10、およびWnt3aは、それぞれ10、10、および100ngmlの濃度で存在する。特異的な副甲状腺マーカーGCMBの誘導前部前腸内胚葉が、Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGFの存在下で腹側化され、それに続いて、11日目にこれらの因子を除去し、SHH、FGF8またはその両方を添加したとき、腹側化した前部前腸内胚葉からの特異的な副甲状腺マーカーの誘導は達成された。好ましい実施形態において、特異的な副甲状腺マーカーSPCは、SHHおよびFGF8シグナル伝達の1種または複数のアゴニストの組み合わせにより腹側化した前部前腸内胚葉から誘導される。好ましい実施形態において、SHHシグナル伝達のアゴニストは、SHHである。本明細書に記載した方法における使用の場合、SHHは、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、SHHは、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。さらに好ましい実施形態において、Wnt3aは、約100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGFシグナル伝達のアゴニストは、FGF8である。本明細書に記載した方法における使用の場合、FGF8は、約1ngml~10μgml、10ngml~1μgml、10ngml~500ngml、10ngml~250ngml、または10ngml~100ngmlの濃度で培養物中に存在する。好ましい実施形態において、FGF8は、約25ngml~150ngml、50ngml~150ngmlまたは75ngml~150ngmlの濃度で培養物中に存在する。最も好ましい実施形態において、両方のFGF8は、約10ngmlの濃度で培養物中に存在する。非常に最も好ましい実施形態において、FGF8およびSHHは、それぞれ10および100ngmlの濃度で存在する。スクリーニングの方法特定の実施形態において、本発明は、前部前腸内胚葉細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質を同定するための方法を提供する。これらの方法は、試験される作用物質の存在下で前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団を培養するステップと、前記作用物質の存在下および非存在下で前記細胞の増殖、分化または生存を比較するステップとを含み、前記作用物質の存在下での違いは、前記細胞の増殖、分化または生存に影響を与える作用物質の同定を示している。特定の実施形態において、本発明は、細胞分化に関与する遺伝子を同定するための方法を提供する。これらの方法は、胚体内胚葉細胞および前部前腸内胚葉細胞を単離するステップと、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の遺伝子発現プロフィールを比較するステップとを含み、前記胚体内胚葉細胞および前記前部前腸内胚葉細胞の間で差次的に発現される遺伝子の同定は、細胞分化に関与する遺伝子を示している。遺伝子プロフィールを決定する方法は、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、本発明は、胚体内胚葉から前部前腸内胚葉への進行の分子マーカーを認識する抗体を同定する方法であって、前部前腸内胚葉細胞の濃縮された集団に抗体を産生させるステップと、前記抗体が前記胚体内胚葉に結合するよりも有意に高く前記前部前腸内胚葉に結合する抗体についてスクリーニングするステップとを含む方法を提供する。抗体を産生させる方法およびスクリーニングする方法は、当技術分野で周知である。好ましい抗体は、モノクローナル抗体である。細胞置換治療本明細書に記載した方法により誘導され、多能性細胞に由来する前部前腸内胚葉細胞は、それに由来する組織への損傷から起こる状態またはそれに由来する組織の非存在から起こる状態を治療するための細胞置換治療用の細胞または組織の生成に有用であり、その状態とは、例えば、それだけには限らないが、甲状腺が、遺伝子突然変異、自己免疫攻撃または外科的除去のため機能的でない遺伝的原因による、または外科的アブレーション後に起こる副甲状腺機能低下症肺損傷例えば、同種造血幹細胞移植によって損傷したまたは先天性疾患のため存在しない胸腺上皮などであった。いくつかの実施形態において、細胞、例えば、本明細書に記載した方法によりESまたはiPS細胞に由来する胸腺上皮細胞は、ヒト化マウスモデルを改善し得る。免疫学における主な課題は、ヒト免疫系のマウスモデルを確立することである。現在、最良のモデルは、ヒト臍帯血造血幹細胞および前駆細胞で新生児期に移植した免疫不全Rag1ilr2gまたはNODSCIDilr2gマウスである。かかるマウスにおいて、すべての主な造血系統は、再構成され、さらには、第2のリンパ器官の構造は、ヒトとして現れる。しかし、アロ反応性および末梢T細胞ホメオスタシス異常を除いてヒトT細胞応答は弱いTraggiaiら、Science304巻104~107頁Legrandら、MethodsMolBiol415巻65~82頁Gimenoら、Blood104巻3886~3893頁。より頑健なT細胞活性を有するこのモデルを改善したのが、BLTマウスである。これは、腎臓被膜下でヒト胎児胸腺および肝臓を用いて移植し、続いて胎児の肝臓CD34前駆細胞を用いて移植したNODSCIDilr2gマウスである。生得のならびにMHCIおよびIIによって制限されたこれらのマウスにおいて、T細胞依存性免疫応答が観察された。興味深いことに、すべてのT細胞発生は、グラフトされたヒト胸腺において起こるが、内因性マウス胸腺においては起こらない。これらのデータにより、ヒト胸腺組織の存在が、ヒト化マウスを開発するのに重要な意味を持ち得ることが示唆される。したがって、TECが胸腺の本質的な機能成分であるため、ESもしくはiPS由来TECは、改善されたヒト化マウスを構成するために用いることもできるということになる。さらに、患者特異的iPS細胞を用いることによって、マウスモデルにおいて疾患感受性における遺伝的多様性およびヒト間の免疫応答の一部を攻略することが可能である。最後に、iPS技術によって、同系のヒト組織の同時移植が可能になる。このようなマウスにおいて、自己免疫または感染と関連する臓器もしくは組織特異的免疫応答を研究することができる、あるいはワクチンを試験することができる。一例として、自己免疫または免疫系が関与した疾患のマウスモデルは、共に自己免疫または免疫系が関与した疾患を有するヒトの対象由来の、本明細書に記載した通りに誘導した骨髄幹細胞およびTECを免疫不全マウス移植することによって創出することができる。いくつかの実施形態において、骨髄幹細胞およびTECは、同じ対象から得られたものであり、いくつかの実施形態において、これらは、異なる対象から得られたものとなり得る。骨髄血液幹細胞は、ヒト由来胸腺に行き、そこでT細胞になる。これは、マウスにおいて自己免疫疾患をモデルにするために用いることができる。いくつかの実施形態において、これらの方法は、iPS由来ヒト自己免疫標的組織を移植するステップがさらに含まれる。本発明を、以下の実施例においてさらに記載しており、これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限しない。ヒト胚性および人工多能性幹細胞からの前部前腸内胚葉の生成以下の材料および方法を、本実施例において用いた。細胞および培養条件。hESCを8000~12000細胞cm2で蒔いたマウス胚線維芽細胞上で培養した。DMEMF12培地、20ノックアウト血清置換、01mMβメルカプトエタノール、およびFGF220ngmlを毎日交換した。細胞を、トリプシンで継代培養し、洗浄し、15~110の希釈で再び蒔いた。hiPS細胞系であるHDF2およびHDF9をhES2として培養した。hESおよびhiPS培養物を、CO25大気環境において維持し、hES分化を、CO25O25N290環境で維持した。内胚葉誘導。マウス胚線維芽細胞を、Y27632を有するマトリゲル上で24h継代まで枯渇させ、胚様体を低粘着性の皿上で形成した。胚様体形成および分化中、HES2細胞を同じ濃度で再び播種し、HDF2およびHDF9は、効率的な内胚葉生成のためにより高い播種を必要とした。分化を、N2、B27、アスコルビン酸、Glutamax、モノチオグリセロールを補充したDMEMF12の培地で行った。因子の以下の濃度を、原始線条形成、内胚葉誘導、前部咽頭内胚葉誘導、その後の前部後部のおよび背腹側のパターン形成のために用いた。すなわち、ヒトBMP4、1ngmlおよび10ngmlヒトbFGF、25ngmlヒトアクチビンA、100ngmlヒトノギン、200ngmlY27632、1μMSB431542、10μMヒトFGF10、10ngmlヒトFGF7、10ngmlネズミEGF20ngmlおよびヒトWNT3a、100ngmlである。肝臓の条件は、前述した2通りであり、BMP4、50ngmlbFGF、10ngmlVEGF、10ngmlHGF、10ngmlTGFα、20ngmlデキサメタゾン、40ngmlを含む。すべての因子を、TocrisからのSB431542およびY27632、ならびにデキサメタゾンを除いてRDSystemsから購入した。これらの因子を、以下の順序で加えた。1日目、Y276321~5日目、BMP4、bFGFおよびアクチビンA5~9日目、ノギンおよびSB4315427~19日目WNT3a、FGF10、BMP4、FGF7およびEGF。肝臓の分化の場合、これらの因子を、以下の順序で加えた。1日目、Y276321~5日目、BMP4、bFGFおよびアクチビンA5~9日目、デキサメタゾン、bFGF、HGF、VEGF、EGF、TGFaおよびBMP4。いくつかの実験について、500μMオールトランスレチノイン酸を培養物に加えた。5日目に、胚様体を、トリプシン処理し、ゼラチンでコーティングされた、組織培養処理皿に10000~50000細胞cm2で蒔いた。モルフォゲンの11日目のスクリーニングには、対で、FGFS、SU5402、Wnt5a、WNT3a、sFRPl、BMP4、ノギン、SHH、シクロパミン、SB431542、TGFβ1、DAPT、レチノイン酸、DEAB、EGF、チロフォスチンAG1478およびWP1066の添加のオーダーがより高いものが含まれていた。定量的PCR。全RNAを、トリゾール、位相ロック管およびRNeasyキットを用いて抽出した。全RNA1~2μgを、DNaseIで処理し、ランダムヘキサマーおよびSuperscriptIIIを用いてそれを逆転写した。増幅された材料を、SybrGreenを用いて検出した。リアルタイム定量PCRを、95°Cで10分のステップで、それに続いて、95°Cを15秒間および60°Cを1分間の40周期でABI7900HTサーモサイクラーで行った。すべての実験を、SYBRGreenER定量的PCRSuperMixで3回行った。各遺伝子についての変性曲線を用いてDNA産物の均質性を確認した。絶対定量を、ゲノムDNA希釈シリーズの検量線に対して得た。対照となる遺伝子についての定量化した値を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびβアクチンによって決定した入力に対して正規化した。各培養ウェルについてのqPCRを3回行った。プライマー配列をTable1に挙げる。フローサイトメトリー。5日目の胚様体または13日目の単層培養物を、トリプシンEDTAで分離した。細胞を、10血清を補充したIMDM中で、直接結合したCXCR4、cKITおよびEPCAMで染色した。細胞をLSRIIで分析した。Flowjoソフトウェアをすべての分析に用いた。免疫蛍光法。7日目、9日目または13日目の培養物を、25°Cで30分間新しいパラホルムアルデヒドで固定し、次いで、PBS中で洗浄した。細胞を透過処理し、01サポニン、01BSA、10FCSおよび10胎児ロバ血清を含む溶液中で遮断した。三次元培養物について、細胞を、前述のように包埋およびオントップアッセイを用いてマトリゲル中で5日目に包埋した。培養物を9日目に最適切断温度で包埋し、抽出し、薄片を作り、上記の通り処理した。一次抗体を終夜加え、これには、PAX9、TBX1、SOX2、CDX2、NKX21およびAIREが含まれる。細胞を、洗浄し、ロバ抗マウス全IgGDylight488、ロバ抗ヤギ全IgGCy3、およびロバ抗ウサギ全IgGCy5で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、核をDAPIで染色した。染色を蛍光顕微鏡用いて可視化した。この器具を、蛍光獲得用のDFC340FxMonochrome冷却デジタルカメラに装着し、可変の対物レンズを用いた。フィルターモデルは、A4UV、11504135GFP、11532366YFP1153267RFP、11513894CY3、11600231である。曝露設定は変わるが、並行して、分化し染色した肝臓特定化培養物に基づいて設定した。画像をPBS中で、25°CでLeicaApplicationSuiteAdvancedFluorescenceSoftwarePackageAF6000を用いて得た。画像をレンダリングまたは逆重畳せずに示す。画像を、AdobePhotoshopCS4を用いてコントラストおよび明るさのみを変更することによりデジタル処理し、これらの操作を、肝臓特定化および実験条件で同時に行った。定量を20×倍率で最低10のランダム場でカウントすることにより行った。ほとんどのパネル上で、対物レンズによる倍率を示す。マウス。NODCgPrkdcscidIl2rgtmlWjlSzJマウスをJacksonLaboratoryから購入した。動物を、ある特定の病原体がない設備において管理した。実験および動物の世話を、MountSinaiInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeに従って行った。100万細胞を腎臓被膜下に注射した。増殖を、切除し、OCTに包埋し、上記と同様に特定の抗原のための形態または免疫蛍光法についてヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて分析した。統計分析。統計分析について、独立t検定を用い、2つ以上の群を比較する場合は、一元配置ANOVAを用いた。結果を平均±標準誤差として表した。結果胚本体の3つの胚葉のうちの1つである、胚体内胚葉は、原腸形成6中の高濃度のアクチビンA、模倣のnodalシグナル伝達によりES細胞から誘導される。定量的PCRによりhES細胞系HES2におけるこの過程の実験により、原始線条マーカーMIXL1、次いで、内胚葉転写因子SOX17およびFOXA2がアップレギュレートされる転写カスケードが明らかになったGouonEvansetら、NatBiotechnol24巻、1402~1411頁Gadueら、ProcNatlAcadSciUSA103巻、16806~16811頁ZornWells、AnnuRevCellDevBiol25巻、221~251頁Yasunagaら、NatBiotechnol23巻、1542~1550頁。4dのアクチビンAへの曝露後、細胞の95は、胚体内胚葉マーカーCXCR4、cKITおよびEPCAMを発現した。原腸形成後、胚体内胚葉は、前後軸のアイデンティティーが異なる管を形成する。胚体内胚葉内で、多能性マーカーSOX2は、前腸マーカーとして再出現し、CDX2は、後腸を同定する。培養の5日目のアクチビンA除去後、CDX2およびSOX2の両方の発現の増加を観察し、前部および後部の胚体内胚葉の混合物の生成が示唆された。したがって、胚体内胚葉の誘導後に付加されたどのシグナルが、前部内胚葉生成を促進し、後部の内胚葉生成を抑制するかを実験した。アクチビンAに曝露された胚様体におけるCXCR4EPCAM集団の生成に続いて、胚様体を分離し、単層として蒔いた。5日目にモルフォゲンおよび阻害剤の24の組み合わせを添加して試験し、FOXA2、SOX2、CDX2、TBX1の発現Sherwoodら、DevDyn238巻、29~42頁Petersら、GenesDev12巻、2735~2747頁およびPAX9Petersら、GenesDev12巻、2735~2747頁を、培養の9日目に細胞のアイデンティティーの読み出し情報として用いた。BMPシグナル伝達の生理的阻害剤であるノギンとアクチビンAnodalおよびTGFβシグナル伝達の薬理学的阻害剤であるSB431542の合わせた存在下においてのみ、SOX2発現が誘導され、CDX2発現が抑制され、FOXA2発現が維持された。さらに、この条件のみ、TBX1およびPAX9の強力な発現を誘導した。アクチビンA誘導段階中、細胞数は、45±19倍増加し、ノギンSB431542段階中、細胞は、他の14±04倍に拡大した。特に、ノギンSB431542処理は、SOX2、PAX9およびTBX1の誘導を有する2つのhiPS細胞系において等しく強力であった。発生においてこれらの機能と整合する複数のFGFファミリーメンバーおよびWNT3aGadueら、ProcNatlAcadSciUSA103巻、16806~16811頁Liら、GenesDev22巻、3050~3063頁は、CDX2発現の増加によって示される通り、胚体内胚葉を後方化した。しかし、可溶性Frizzled関連タンパク質3の添加によるWNT拮抗作用は、SOX2を誘導するのに十分でなかった。さらに、sFRP3は、ノギンSB431542と協同せず、さらに、PAX9およびSOX2の誘導に対して有害であると思われた。56日目に均一のCXCR4cKITまたはCXCR4EPCAM集団の生成直後に処理しただけで、9日目にSOX2FOXA2集団を誘導したため、ノギンSB431542の添加のタイミングは重要であった。早期投与すると、原腸形成を抑止し、後期投与すると、後部マーカーCDX2をダウンレギュレートしなかった。FOXA2を、脊索においてもまた発現し、FOXA2およびSOX2を後脳底板によって同時に発現するWeinsteinら、Cell78巻、575~588頁。さらに、アクチビンAによって事前に内胚葉を誘導せずにノギンSB431542をhES細胞に直接適用すると、神経外胚葉の運命をもたらす。したがって、これらの代替の運命の存在をアッセイした。予想通り、ノギンSB431542を1日目に添加した場合、神経外胚葉マーカーPAX6を培養物中で発現し、脊索および原腸形成細胞のマーカーであるBRACHYURYを早期内胚葉の誘導中に発現した。BRACHYURYもPAX6もノギンSB431542に曝露した胚体内胚葉において発現せず、アクチビンA誘導胚体内胚葉のノギンSB431542処理がAFEのみを特定化することを示した。ノギンSB431542誘導内胚葉細胞が、前述した内胚葉の系統と異なるか否かをさらに評価するために、9日目のノギンSB431542で処理した培養物を、肝臓の運命に好都合に働く条件下で成長した9日目の培養物と比較した。後者は、内胚葉のアクチビンA誘導後にBMP4およびbFGFを必要とすることを前もって示している。CDX2、後腸マーカーであるEVX1、肝臓マーカーであるCREB313およびCEBPA、ならびに胃ドメインマーカーであるODD1の発現は、ノギンSB431542条件においてよりも肝臓条件において高く、これの逆が、前部マーカーであるTBX1、PAX9、SOX2およびFGF8、咽頭嚢内胚葉に特異的な内胚葉内のマーカーで成り立った。したがって、ノギンSB431542処理は、肝臓の条件において特定化されるものと異なるAFE細胞を特定化する。ノギンSB431542をアクチビンA誘導胚体内胚葉に適用すると、空の細胞内腔様または嚢胞様の開口部の周囲の高密度に詰め込まれた細胞のコロニーを生成した。90を超える細胞は、高密度で蒔いた場合、かかるコロニーにおいて見出された。実質的にすべての細胞は、まれに細胞がFOXA2のみを発現したが、SOX2およびFOXA2を同時発現した。すべてのコロニーは、TBX1、PAX9および咽頭内胚葉マーカーFOXG1に対して陽性に染色された。因子を含まない培地中で細胞を培養したとき、ノギンSB431542処理培養物において観察された典型的なコロニーを示さなかった。これらの条件において、細胞の95は、FOXA2を発現したが、SOX2FOXA2細胞が観察されるのはごく稀であった。この形態を有するコロニーはまた、肝臓の条件において観察されなかった。ノギンSB431542または肝臓の条件で並行して培養したHES2由来内胚葉細胞の比較免疫蛍光法分析では、ノギンSB431542培養物だけが、強力なSOX2、PAX9およびTBX1発現を特徴とすることが明らかにされた。集合的に、これらの発現データは、ノギンSB431542がアクチビンA誘導胚体内胚葉においてAFE表現型を有する細胞の高度に濃縮された集団を特定化することを示す。これらの知見は、BMPアンタゴニストコーディンに対してヌルのマウスが、前部トランケーションを示すという事実と整合し、アクチビンA誘導内胚葉がCDX2後部内胚葉の大型の画分を含むという観測と整合している。ノギンSB431542条件において培養された細胞のinvivoにおける可能性を決定するために、106細胞を、NODSCIDIl2rgマウスの腎臓被膜下に移植した。未分化HES2細胞が3つのすべての胚葉に由来する細胞を含む奇形腫を生成し、ノギンSB431542処理細胞は、同定可能な外胚葉もしくは中胚葉要素を欠如する成長をもたらした。複数の管腔の構造を観察し、偽重層上皮または1~3層の核を含むより組織的でない上皮によって内側が覆われた構造を観察した。後者は、肺中のII型肺胞細胞に特異的なマーカーであるサーファクタントタンパク質Cに常に染まった。hES細胞由来奇形腫において、SFTPC染色を観察しなかった。細胞の残りは、FOXA2に対してほぼ均一に染色された。しかし、管腔の構造を除いて、おそらくFOXA2末端AFE誘導体への分化または異種移植における異常なFOXA2調節によりFOXA2は細胞質に限局した。PAX9を発現する細胞の島、ならびにAIREの分離した核の小斑点を示すまれな領域をも検出した。hES由来奇形腫において、PAX9を軟骨形成のゾーンにおいて観察したにすぎず、AIRE発現を観察しなかった。集合的に、これらのデータによって、ノギンSB431542誘導胚体内胚葉の発生の可能性が、これらの条件においてAFE誘導体に大いに制限されることが示唆される。次に、これらの細胞をさらに分化した。AFEは、背腹側のパターン形成を経て、腹部の中胚葉から肺芽、WNT、BMPおよびFGFシグナルの特定化をもたらしたMorriseyHogan、DevCell18巻、8~23頁。この段階で、S0X2発現は、依然として背面に高いままであり、NKX21MorriseyHogan、DevCell18巻、8~23頁、NKX25およびPAX1は、特異的な腹部マーカーである。13日目までノギンSB431542を用いて処理を拡大すると、SOX2の発現が継続し、背部の運命を示唆し、ノギンがAFEにおいて背部で発現し、BMP4が腹部により発現するという事実と整合する。対照的に、培養の7日目にノギンSB431542をWNT3a、KGF、FGF10、BMP4およびEGFと置換すると、SOX2の発現が低くなり、13日目に腹部のマーカーNKX21、PAX1およびNKX25を誘導した。早期甲状腺マーカー、PAX8の発現は観察しなかったが、NKX21誘導が甲状腺の運命よりも肺の運命への関連付けを示していることが示唆された。さらに、気道前駆細胞のマーカーであるP63を、強力に誘導し、大部分の細胞は、上皮マーカーEPCAMを発現した。個別の因子の添加は、この転写誘導に十分でなかった。さらに、ノギンSB431542への曝露前のみ、WKFBEによるPAX1、NKX21およびNKX25のその後のアップレギュレーションが可能であるにすぎず、肝臓カクテルまたは培地単独への曝露前は可能ではなく、アクチビンA誘導胚体内胚葉のノギンSB431542処理が腹側AFEの運命への分化のために必要とされていることが実証された。9日目でなく7日目に処理した培養物のみがNKX21、PAX1およびNKX25を発現する適格性があったため、WKFBE腹側化刺激のタイミングは重要であった。この時点で、細胞の92±2は、FOXA2SOXA2であった。免疫蛍光法では、WKFBEの誘導後、細胞の37±6が、NKX21を発現することが明らかになった。ノギンSB431542、それに続いてアクチビンA誘導内胚葉のWKFBE処理中、細胞は、さらに895±33倍拡大した。したがって、ノギンSB431542誘導AFEは、invitroで腹側化シグナルに応答する特有の形の適格性がある。ノギンSB431542誘導AFEのWKFBEへの曝露は、培養の13日目または19日目に胸腺、副甲状腺、甲状腺または肺用の最終の分化マーカーの発現をもたらさなかった。これらの細胞がinvivoでSFTPC細胞を生じる可能性を有したため、invitroで肺の特定化を達成させることが試みられた。早期肺発生におけるレチノイン酸の決定的に重要な役割と整合して、レチノイン酸をWKFBEカクテルに添加すると、咽頭嚢マーカーであるPAX1の発現が減少したが、肺の運命を示唆する一群のマーカーであるFOXP2、NKX21、GATA6およびFOXJ1が増加した。SFTPC誘導を増強するために、シグナル伝達アゴニストおよびアンタゴニストの組み合わせを、11日目にレチノイン酸の存在下で腹側化したAFEに加えた。試験された400の組み合わせの中で、WNT3aFGF10FGF7は、19日目に高レベルのSFTPCmRNAを誘導し、FGF10およびWntシグナル伝達が遠位の肺発生に決定的に重要であるという発生観測と整合する。ノギンSB431542誘導AFEが、咽頭嚢誘導体を生成するか否かを評価するために、レチノイン酸の非存在下で、WKFBEで腹側化した培養物をパターン形成することを試みた。副甲状腺発生のためのソニックヘッジホッグおよびFGF8の要件と整合し、FGF8またはSHHのAFE培養物への添加は、副甲状腺特異的マーカーであるGCM2を誘導した。SHHおよびFGF8の効果は、相加的でなく、ミラーリングinvivoエピスタシス研究では、Shhがマウス咽頭嚢発生においてFgf8の上流であることを示した。時間的およびシグナル伝達の並べ換えすべてを余すところなく試験しているわけではないが、これらのデータによれば、ノギンSB431542誘導細胞が、肺野および咽頭嚢を含めて下流系統に分化することができるということを示唆している。集合的に、データは、hEShiPS細胞由来胚体内胚葉におけるBMPおよびTGFβシグナル伝達を二重に阻害すると、高度に濃縮されたAFE集団を特定化することを示し、invivoにおけるAFEに由来する細胞タイプおよび組織へのヒト多能性細胞の定方向分化についてのinvitroの手法を提供する。他の実施形態本発明が、その詳細な説明と併せて記載されており、前述の説明は例証するものであり、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではないということが理解されるべきである。他の態様、利点、および修正形態は、以下の特許請求の範囲内である。