"プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ下記a~cからなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド:a添付の配列表の配列番号1又は14;b配列番号1又は14に相補的な核酸配列;ca及びbに定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖。プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号1又は14からなる請求項1に記載される単離されたポリヌクレオチド。プロトイルデン活性を有するポリペプチドをコードする請求項1又は2に記載される核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列が、前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される配列を制御するように機能的に連結されている、ベクター。発現ベクターであることを特徴とする、請求項2に記載されるベクター。前記ベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソーム、又はウイルスの形態で存在することを特徴とする、請求項2又は3に記載されるベクター。下記a~dからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド:a配列番号2に示されるアミノ酸配列、b配列番号2に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号1又は14に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列;c配列番号2に示されるアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列であって、前記オーソログが、配列番号1又は14に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列;及びd配列番号2に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む断片。請求項2~4のいずれか一項に記載されるベクターを含有する宿主細胞。前記宿主細胞が、酵母などの真菌、細菌、昆虫、動物及び植物細胞からなる群より選択されることを特徴とする、請求項7に記載される宿主細胞。前記宿主細胞が、大腸菌Escherichiacoli細胞であることを特徴とする、請求項7又は8に記載される宿主細胞。前記プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、それぞれの細胞のコドン使用頻度に合わせて改変されていることを特徴とする、請求項7~9のいずれか一項に記載される宿主細胞。前記宿主細胞が、同担子菌類homobasidiomycesteであることを特徴とする、請求項7、8又は9に記載される宿主細胞。前記宿主細胞が、ナラタケArmillaria属の同担子菌類、特にワタゲナラタケArmillariagallica、ナラタケArmillariamelleaであることを特徴とする、請求項11に記載される宿主細胞。下記工程a及びbを含む、メレオリドを生産する方法:a.前記メレオリドの生産を可能にする好適な栄養条件下で、請求項5~10のいずれか一項に記載される宿主細胞を増殖させる工程;及びb.前記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。前記メレオリドが、メレオリドI、アルミラリジン、メレオリドA、メレオリドF、メレオリドB、メレオリドK、アルミリルエベルニテート、アルミラリン、アルナミオール、メレオリドJ、アルミラリビン、10-α-ヒドロキシ-メレオリド、アルミリルオルセリネート、メレオリドE、1-O-トリフルオロアセチル-メレオリドE、メレオリドH、5’-O-メチル-メレドナール、メレドナール、アルナミアール、メレオリドC、メレオリドD、メレドナールA、メレドナールC、メレドノールから選択されることを特徴とする、請求項9に記載される方法。前記工程a及びbが、下記工程i~ivからなることを特徴とする、請求項9又は10に記載される方法:i.a添付の配列プロトコルからの配列番号1又は14、b配列番号1又は14に相補的な核酸配列、並びにca及びbに定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖から選択される核酸配列を含むように形質転換又は形質導入された宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させる工程;ii.前記核酸配列を過剰発現させる工程;並びにiii.このようにして、前記宿主細胞でのメレオリド生産を増大させる工程;iv.前記宿主細胞又はその増殖培地からメレオリドを単離する工程。請求項12~16のいずれか一項に記載される方法によって得られるメレオリド。メレオリドの生産を目的とする、請求項1又は2のいずれか一項に記載されるポリヌクレオチド、又は請求項3~5のいずれか一項に記載されるベクター、又は請求項6に記載されるポリペプチドの使用。前記メレオリドの生産が、プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの異種過剰発現又は相同過剰発現を用いて実施されることを特徴とする、請求項17に記載される使用。従って、本発明の目的は、相同的又は異種のいずれにかかわらず標的生産を達成するのに用いることができる新規の手段を提供することである。本発明によれば、上記及びその他の目的は、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし、且つ下記a~cからなる群より選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は合成若しくは組換えポリヌクレオチドを提供することによって達成される:a添付の配列表の配列番号1又は14;b配列番号1又は14に相補的な核酸配列;ca及びbに定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖。上記目的は、さらに、メレオリドの生産を目的とする、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの使用、及びメレオリドを生産するための各方法によって達成される。上記目的はこのようにして完全に達成される。前述したポリヌクレオチドは、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、ポリヌクレオチドは、本発明者らの知る限りでは、初めて同定、精製され、酵素により特性決定された。この新規に同定されたポリヌクレオチドは、プロトイルデンへのファルネシル二リン酸の環化を触媒するが、その段階は、メレオリド生産の合成において極めて重要な段階を表している。従って、プロトイルデンシンターゼをコードする遺伝子を同定したことによって、例えば、新規に同定された遺伝子を過剰発現させて、プロトイルデンシンターゼの複数のコピーを生成することにより、メレオリドの生産に影響を与える貴重かつ有効な手段がみいだされ、生み出された。これを用いて、メレオリド合成の環化速度が高められ、これにより、メレオリドの生産が増大する。このようして、高度に濃縮されたメレオリドを得ることができ、こうしたメレオリドは、強力な抗菌性かつ細胞傷害性物質であり、治療及び医療のあらゆる分野において治療手段として用いることができる。本発明によれば、ポリヌクレオチドという用語は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、非修飾RNA若しくはDNA又は修飾RNA若しくはDNAのいずれであってもよい。ポリヌクレオチドとしては、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖又は、より一般的には二本鎖、若しくは三本鎖領域、あるいは一本鎖及び二本鎖領域の混合物のいずれであってもよいDNA及びRNAを含むハイブリッド分子がある。さらに、本明細書で用いられるポリヌクレオチドとは、RNA若しくはDNA又はRNA及びDNAの両方を含む三本鎖領域を指す。こうした領域における鎖は、同じ分子由来のものであっても、異なる分子由来のものであってもよい。上記領域は、1つ以上の上記分子の全部を含んでいてもよいが、より一般には、上記分子のいくつかの1領域のみを含む。三重らせん領域の分子の1つは、多くの場合オリゴヌクレオチドである。本明細書で用いるポリヌクレオチドという用語は、1つ以上の修飾塩基を含む前述のDNA又はRNAも含む。従って、安定性若しくは別の理由のために修飾された骨格を有するDNA又はRNAは、その用語が本明細書で意図されるポリヌクレオチドである。さらには、2つだけ例を挙げれば、イノシンのような特殊塩基、又はトリチル化塩基のような修飾塩基を含むDNA又はRNAは、その用語が本明細書で用いられるポリヌクレオチドである。当業者には公知の多くの有用な目的に役立つDNA及びRNAに対して、非常に多様な修飾が実施されていることは理解されよう。本明細書で用いられるポリヌクレオチドという用語は、ポリヌクレオチドの化学的に、酵素により若しくは代謝により修飾された形態、並びにウイルス及び細胞例えば、単細胞及び複合細胞などに特有のDNA及びRNAの化学形態を包含する。また、ポリヌクレオチドは、一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。ポリペプチドとは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。ポリペプチドとは、一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる短い鎖と、一般にタンパク質と呼ばれる、より長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、20個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチドは、プロセシング及びその他の翻訳後修飾のような自然のプロセス、また化学的修飾技術のいずれによって修飾されたものも含む。こうした修飾については基礎的テキストに十分に説明されており、研究論文、並びに大部の研究文書にさらに詳しく記載されており、当業者には公知である。所与のポリペプチドにおいて複数の部位に同じタイプの修飾が同じ程度若しくは様々な程度で存在してもよいことは理解されよう。また、所与のポリペプチドが様々な種類の修飾を含んでいてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、並びにアミノ若しくはカルボキシル末端など、ポリペプチドのどこに存在してもよい。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールphosphotidylinositolの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化及びADP-リボシル化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質に対するtRNA媒介によるアミノ酸付加、例えば、アルギニル化及びユビキチン化などがある。ポリペプチドは、分枝していてもよいし、分枝を含む、若しくは含まない環状であってもよい。環状、分枝及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから得られたものでもよいし、完全に合成方法によって作製したものでもよい。単離されたとは、その天然の状態から人の手によって改変されている、すなわち、もしそれが天然に存在するものであれば、変化しているか、若しくはその本来の環境から取り出されている、又はその両方を意味する。例えば、生存する生物に天然に存在しているポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されていないが、その天然の状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、その用語が本明細書で用いられている意味で、単離されている。同様に、本明細書で用いられている合成配列という用語は、合成によって生成され、天然の供給源から直接単離されたものではない任意の配列を意味する。組換えとは、ある種に由来する遺伝子を別の種の宿主生物の細胞に移植又はスプライシングすることによって調製される遺伝子改変DNAを意味する。こうしたDNAは、宿主の遺伝子組成の一部となり、複製される。本明細書で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドという用語は、本発明のポリペプチド、特に、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を有するワタゲナラタケAmillariagallicaのプロトイルデンシンターゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、コード及び/又は非コード配列も含みうる別の領域と一緒に、ポリペプチドをコードする単一の連続的領域又は不連続的領域例えば、組込まれたファージ又は挿入配列若しくは修正によって分断されたものを含むポリヌクレオチドも包含する。本明細書で用いる変異体という用語は、それぞれ基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、これとは別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化によって、基準ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が改変することもあれば、しないこともある。後述するように、ヌクレオチドの変化によって、基準配列によりコードされたポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断が起こりうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、これとは別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、相違は限定的であるため、基準ポリペプチド及び変異体の配列は全体として非常に類似しており、多数の領域で同一である。変異体と基準ポリペプチドは、1つ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組合せによりアミノ酸配列が異なっている可能性がある。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされたものであってもよいし、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のような天然に存在するものであってもよいし、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術、直接合成、並びに当業者には公知のその他の組換え方法によって作製することができる。さらに、宿主細胞とは、形質転換若しくは形質導入された細胞、又は外来ポリヌクレオチド配列による形質転換若しくは形質導入が可能な細胞として現在定義されている。本発明の一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1又は14からなり、プロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。配列番号1はゲノム配列を表すのに対し、配列番号14はcDNAを表す。添付の配列表に開示する配列番号1及び14は、それぞれ、ワタゲナラタケAmillariagallicaから同定されて、特性決定されたプロトイルデンシンターゼのゲノム配列及びcDNAである。新規に同定されたプロトイルデンシンターゼによって、類似のプロトイルデンシンターゼ、すなわち配列番号1又は14とは若干異なるプロトイルデンシンターゼを、配列比較及びこれに続く酵素試験によって同定するのに用いることができる貴重な手段が提供されることから、上記配列の変異体少なくとも90の配列同一性を有し、別のナラタケAmillaria種でもみいだされうるもまた好適であり、本発明に含まれることが理解されるべきである。本発明はまた、本発明の1つのポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子改変される宿主細胞、並びに組換え技術による本発明のポリペプチドの生産にも関する。また、本発明のDNA構築物から誘導したRNAを用いてこうしたポリペプチドを生産するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。従って、上記に加え、本発明はまた、プロトイルデン活性を有するポリペプチドをコードする、上に定義した核酸配列を含むベクターにも関する。尚、この核酸配列は、上記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される配列を制御するように機能的に連結されている。本発明の一形態によれば、上記ベクターは、発現ベクターであり、別の形態によれば、上記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、リポソーム、若しくはウイルスの形態で存在させることができる。組換え生産のために、発現系若しくはその部分、又は本発明のポリヌクレオチドを組み込むように宿主細胞を遺伝子改変することができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、多数の標準的実験マニュアル、例えば、Davisetal.,BasicMethodsinMolecularBioloty,1986,及びSambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaobratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1989に記載されている方法によって実施することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞中に安定的に形質転換/形質導入しようとするベクターに含有させてもよい。ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子/ポリヌクレオチドの発現を特異的にターゲッティングすることができるように、誘導プロモーターの制御下にあり、所望であれば、このようにして遺伝子を過剰発現させることもできる。本発明のポリペプチドを生産するのに、非常に多様な発現系を用いることができる。こうしたベクターとして、中でも、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポソン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せ由来のベクター、例えば、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝子エレメント例えば、コスミド及びファージミド由来のものがある。発現系構築物は、発現を調節すると共に、発現を発生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的に、これに関しては、宿主においてポリヌクレオチドを維持し、増殖させる、若しくは発現させるのに適している、且つ/又はポリペプチドを発現させるのに適している任意の系若しくはベクターを発現に用いてよい。公知及び常用の技術、例えば、Sambrooketal.前掲参照に記載の技術のいずれかにより、適切なDNA配列を発現系に挿入することができる。以上のことから、本発明は、下記a~dからなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチドにも関する:a配列番号2に示されるアミノ酸配列;b配列番号2に示されるアミノ酸配列の対立遺伝子変異体のアミノ酸配列であって、前記対立遺伝子変異体が、配列番号1又は14に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列;c配列番号2に示されるアミノ酸配列のオーソログのアミノ酸配列であって、前記オーソログが、配列番号1又は14に示される核酸分子の逆鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされている、アミノ酸配列;d配列番号2に示されるアミノ酸配列の断片であって、少なくとも10個の連続したアミノ酸を含む断片。また、本発明は、上に定義したベクターを含む宿主細胞、特に、酵母などの真菌、細菌、昆虫、動物及び植物細胞からなる群より選択される宿主細胞に関する。本発明の別の形態によれば、それぞれの宿主細胞のコドン使用頻度に合わせて改変されたプロトイルデンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を用いる。本発明の別の実施形態によれば、宿主細胞は、同担子菌類、特にナラタケArmillaria属の同担子菌類homobasidiomyceste、特にワタゲナラタケArmillariagallica、ナラタケArmillariamellea、オニナラタケArmillariaostoyae、並びにナラタケArmillaria属のその他のメンバーである。本発明のさらに別の形態は、下記工程a及びbを含む、メレオリドを生産する方法に関する:a.メレオリドの生産を可能にする好適な栄養条件下で、上に定義した宿主細胞を増殖させる工程;及びb.上記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。本発明の一形態によれば、メレオリドは、メレオリドI、アルミラリジン、メレオリドA、メレオリドF、メレオリドB、メレオリドK、アルミリルエベルニテートarmillylevernitate、アルミラリン、アルナミオール、メレオリドJ、アルミラリビン、10-α-ヒドロキシ-メレオリド、アルミリルオルセリネートarmillylorsellinate、メレオリドE、1-O-トリフルオロアセチル-メレオリドE、メレオリドH、5’-O-メチル-メレドナール、メレドナール、アルナミアール、メレオリドC、メレオリドD、メレドナールA、メレドナールC、メレドノールから選択される。さらに別の形態によれば、前記工程を含む方法は、下記工程i~ivからなる:i.a添付の配列プロトコルからの配列番号1又は14、b配列番号1又は14に相補的な核酸配列、並びにca及びbに定義した核酸配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列又はそれらの相補鎖から選択される核酸配列を含むように形質転換若しくは形質導入された宿主細胞を好適な栄養条件下で増殖させる工程;ii.上記核酸配列を過剰発現させる工程;iii.このようにして、上記宿主細胞でのメレオリド生産を増大させる工程;並びにiv.上記宿主細胞又はその増殖培地から前記メレオリドを単離する工程。開示された方法とプロトイルデンシンターゼの標的過剰発現を用いれば、宿主細胞又は宿主細胞が含まれている培地にメレオリドを蓄積させることが可能である。宿主細胞又は宿主細胞培養物に、メレオリド生産の増大を達成又は補助するのに必要となりうる追加的及び/若しくは必須の前駆体又はその他の物質、栄養素若しくは代謝物を添加することは、当業者の技術及び知識の範囲内にあることが理解されるべきである。従って、本発明はまた、上に定義した方法によって得られるメレオリドにも関する。こうして得られたメレオリドは、例えば、あらゆる細菌を原因とする感染又は疾患を治療するための薬剤として効果的に用いることができる。以上のことから、本発明はまた、メレオリドの生産を目的とする、それぞれ上に定義したポリヌクレオチド、ベクター、又はポリペプチドの使用にも関連する。本発明のメレオリドの生産は、プロトイルデンシンターゼをコードするポリヌクレオチドの異種過剰発現又は相同過剰発現によって実施され得ることが理解されるべきである。系及び方法、並びにそれぞれの好適な宿主細胞については、当業者が本発明の教示を読めば明瞭に理解されよう。さらに別の利点が以下の実施形態及び添付の図面の説明から明らかになるであろう。以上述べてきた特徴、並びにこれから説明しようとする特徴が、それぞれ明示した組合せだけではなく、別の組合せでも、あるいは単独でも、本発明の範囲を逸脱することなく用いられうることは言うまでもない。本発明の複数の実施形態を図面に示し、以下の説明でさらに詳しく説明することにする。図1に、メレオリドI生合成の推定スキームを示すが、これは、6-プロトイルデンへのファルネシル二リン酸の環化、酸化反応及び側鎖結合を含む。実施例1:タンパク質抽出物の調製Traunseeオーストリア付近で採集した担子器果から、ワタゲナラタケArmillariagallica株FU02472を樹立し、200mLのYMG培地を含む500mLErlenmeyer振盪フラスコのバッチ式液内培養において、23°Cにて140rpmで撹拌しながら増殖させた。菌糸体を培養ブロスからろ過によって回収し、液体窒素で衝撃凍結した後、-80°Cで貯蔵した。大腸菌Escherichiacoli株TOP10Invitrogen,Karlsruhe,Germanyをクローニングに使用し、また異種タンパク質発現には、Gateway商標適合ベクターpDEST14Invitrogenと一緒に、株BL21DE3CodonPlusAgilent,Karlsruhe,Germanyを用いた。ナラタケArmillariaからタンパク質抽出物を調製するために、ワタゲナラタケA.gallica細胞培養物を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した。5容量の抽出バッファー50mMMES、20mMMgCl2、5mM2-メルカプトエタノール、10v/vグリセロール及び0.1g/g菌糸体PVPP、pH6.5を粉末に添加した。Ultraturraxを用いてさらに処理した12,000rpmで1分後、タンパク質抽出物を遠心分離4°Cにて5,000rpmで10分により清澄にした。タンパク質濃度をQuickStartBradfordProteinAssayBioradによって決定した。すべてのタンパク質定量アッセイは3回反復して実施した。前記抽出バッファー中の培養物から細胞ペレットを分離することにより、大腸菌Escherichiacoliタンパク質抽出物を調製して、細胞を2ラウンドのMicrofluidizer処理により、一定冷却下で溶解した。アッセイバッファー50mMMOPS、20mMMgCl2、5mM2-メルカプトエタノール、pH7.2中の[1-3H]-ファルネシル二リン酸FPP20Ci/mモルBiotendを用いて、プロトイルデンシンターゼ活性を決定した。500nMの[1-3H]-FPPを2分用いた後、酢酸エチルでクエンチングすることにより、標準的プロトイルデンシンターゼ活性測定を実施した。次に、有機抽出物の一部をシリカゲルTLCプレート上にスポットしてから、溶媒として9:1シクロヘキサン:酢酸エチルを用いて分離した後、ラジオTLCリーダーRaytest,Straubenhardtで分析した。KM値の決定のために、100mMEDTA最終濃度でクエンチングすることにより反応を停止した後、n-ペンタンで抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーよる精製、次いで液体シンチレーション計数による定量を実施した。すべての動態活性アッセイは3回反復して実施した。溶媒抽出物の質量分析法による分析を、Rxi商標-5ms内径0.25mm、長さ30mカラムRestekを備えたQP2010S四極質量分析計Shimadzuで、以下の温度プログラムを用いて実施した:80°Cで20分の後、カラムを速度15°C/分で300°Cまで加熱し、300°Cの最終一定温度を4分。1keVでの電気イオン化によってフラグメント化を達成した。実施例2:cDNAライブラリー構築及び配列決定塩化セシウム-密度勾配と、OligotexQiagen,Hildenによって精製したワタゲナラタケA.gallica株FU02472mRNAとを用いて、製造者のプロトコルに従い、ワタゲナラタケA.gallicaCloneMiner商標cDNAライブラリーInvitrogenを構築した。組換え大腸菌E.coliを50μg/mLカナマイシン含有2YT-寒天プレート上で選択して、2800個のランダムに採取したコロニーを、選択のための50μg/mLカナマイシンと一緒に、ウェル当たり200μLの2YT培地を含む96-ウェルマイクロプレートに移した。プレートを160rpmで連続振盪しながら、37°Cで約12時間インキュベートした。フォワードプライマー5’-CTCGCGTTAACGCTAGCATGGATG-3’配列番号3及びリバースプライマー5’-GTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTG-3’配列番号4を用いて、ワタゲナラタケA.gallicacDNAを培養物から直接増幅させた。PCR産物を清浄にしてから、プライマー5’-CGACGGCCAGTCTTAAGCTCGGGC-3’配列番号5を用いて、AppliedBiosystems3730DNAAnalyzerで配列決定したFraunhoferIMEAachen,FunctionalandAppliedGenomicsGroup。配列データを、CLCCombinedWorkbench3softwareCLCbio、LasergenePackageDNASTARNCBIBLASTx及びLocalBLASTを用いて分析した。実施例3:大腸菌E.coliにおけるワタゲナラタケA.gallicaプロトイルデンシンターゼの異種発現cDNA配列決定により、候補テルペンシンターゼクローンをみいだした場合には、対応するpENTRYベクターを、pDEST14destinationベクターを用いるLR組換え反応に使用した。得られた発現構築物を異種発現のために大腸菌E.coliBL21DE3CodonpluscellsStratageneに導入した。組換え細菌をFerenbach-baffledフラスコ中で培養して、OD600が0.5に達したら1mMIPTGで誘導した。誘導した細菌を160rpmで一定に振盪しながら28°Cで8時間維持した。次に、遠心分離により細胞を回収し、プロトイルデンアッセイバッファー中に再懸濁させた後、マイクロフルイダイザーを用いて溶解させた。実施例4:ゲノムDNA単離及びサザンブロットハイブリダイゼーションワタゲナラタケA.gallicaゲノムDNAをセチルトリメチルアンモニウムブロミドCTAB法を用いて単離した後、120μgを、必要に応じて50単位のBamHI、EcoRI若しくはHindIIINEBBiolabsで8時間消化した。消化したDNAを一定50Vでの0.7アガロースゲル電気泳動に一晩かけて分画し、陽荷電ナイロン膜Rocheに移した後、一本鎖サケ精子DNAを含有するRoti登録商標-Hybri-QuickRothとプレハイブリダイズさせた。2つの核酸プローブ約400bpを、プローブ1については、フォワードプライマー5’-CCTTCCTGATACTCTTGCCAACTG-3’配列番号6及びリバースプライマー5’-CCTCCTCCGTCGAGACGTCCGAGTAC-3’配列番号7を、またプローブ2については、フォワードプライマー5’-GTCATCAATCATCCGGTTATCAAAG-3’配列番号8及びリバースプライマー5’-CTTGGGCATCAGCGTTATCCACCTC-3’配列番号9を用いて、PCRにより合成した。これらの産物は、製造者の推奨に従い、DecaLabel商標DNALabelingKitFermetasを用いて、α-32P-dATPHartmannAnalyticで標識した。実施例5:ワタゲナラタケA.gallicaプロトイルデンシンターゼゲノムクローンの単離ワタゲナラタケA.gallicaプロトイルデンシンターゼ遺伝子を含むゲノムクローンを、フォワードプライマー5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGTCTCAACGCATCTTCCTTCCTG-3’配列番号10、リバースプライマー5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGAGATGAAATCCGTCAACAATTTGAGG-3’配列番号11及び50-l反応液中のHerculase登録商標IIFusionDNAポリメラーゼStratageneを用いて、100ngのワタゲナラタケA.gallicaゲノムDNAを増幅することにより単離した。前述したように、PCR産物を精製した後、配列決定した。実施例6:結果及び論考Traunseeオーストリア付近で採集したキノコ標本から細胞培養物FU02472を樹立することにより、推定ナラタケArmillariagallicaプロトイルデンシンターゼを単離して、特性決定した。この培養物を、メレオリド生産を可能にする液体YM6.3培地中で培養した。約500時間の発酵後、培養物を回収して、メレオリド産物プロフィールを、適切な対照物質を用いてLC-UV-MSにより決定した。FU02472によって生産された主要メレオリドは、メレオリドI及びアルミラリジンとして同定された図2を参照。様々な時点で培養物をサンプリングすることにより、メレオリド蓄積プロフィール及びプロトイルデンシンターゼ活性を長時間にわたって調査した。放射性標識ファルネシル二リン酸と一緒に、培養物からの可溶性酵素抽出物をインキュベートすることにより、酵素活性を試験した。次いで、これら反応物からの有機抽出物をラジオTLCによって分析した図3参照。試験したすべての粗タンパク質抽出物において様々なレベルのプロトイルデンシンターゼ活性が観察され、Rf値0.7の強度の非極性産物仮に6-プロトイルデンと同定すると、Rf値0.1の産物仮にファルネソールと同定するが得られた。2つの産物のアイデンティティーは後にGC-MSによって確認した以下参照。熱不活性化した対照画分は、ファルネシル二リン酸を非極性産物に変換することができなかった。最も高いプロトイルデンシンターゼ活性が185時間後の培養物において観察されたため、この時点を酵素精製のために選択した。次に、可溶性タンパク質画分における推定プロトイルデンシンターゼ活性が、実際に、真菌抽出物中に存在するプロトイルデンシンターゼ酵素活性によるものであるか否かを決定した。そのため、非放射性ファルネシル二リン酸にトリチウム標識材料を加えてから、FU02472由来の可溶性タンパク質抽出物と一緒に12時間インキュベートした。次いで、放射性材料画分をラジオTLC及びGC-MSによって分析することにより、産物のRf値及びアイデンティティーを確認した。抽出した産物の質量スペクトルによって、m/z20424の分子親イオンと共に、m/z175100、11991、10559、13335、9140、18917、16115及び14714のイオンが得られた。観察されたフラグメント化パターンは、セスキテルペノイド6-プロトイルデンについて以前報告されたものと一致した図2参照。驚くことに、GC-Ms分析によって7-プロトイルデンの存在は明らかにされなかったが、これは、最終的なメレオリド最終産物に観察されるように、67位から78位へのアリル転位が起こったことを示している。類似のアリル転位が、パクリタキセルの合成において、シトクロムP450依存性モノオキシゲナーゼによって触媒されるタキサ-45,1112-ジエンのタキサ-420,1112-ジエンへの、及びタキサ-45,1112-ジエン-5-オールへの転換について記載されているJenneweinetal.,2004。従って、出願人らは、メレオリド生合成中に、アリル転位とヒドロキシル化反応の両方を触媒する類似のシトクロムP450依存性モノオキシゲナーゼ段階が関与していると考える。前記酵素の更なる特性決定を、部分的に精製したワタゲナラタケA.gallicaプロトイルデンシンターゼ、チチウムtitium標識ファルネシル二リン酸及びラジオTLC分析を用いて実施した。これらの実験から、ファルネシル二リン酸のKmが0.53Mであることが明らかになった。予想通り、酵素活性は二価金属イオンに完全に依存していることがわかった。最も高いプロトイルデンシンターゼ活性は、5mMMgCl2の存在下で達成され、代わりにMnCl2を用いると75低下した。最適温度は22°Cであり、>35°Cでは活性がほぼ完全に消失した。複数の緩衝系を50mMで試験したところ、pH7.2MOPSバッファーで最適活性が得られた。活性はpH5.8MESバッファー及びpH8.5Trisバッファーで50低下した。酵素はまた、エタノールの存在に対して非常に感受性が高く、5という低い濃度であっても活性の著しい低減を引き起こした。真菌の菌糸体からワタゲナラタケA.gallicaのプロトイルデンシンターゼタンパク質を均一になるhomogeneityまで精製して、Edman配列決定によりN-末端アミノ酸配列を決定する試みはうまくいかなかったことが明らかになったが、この酵素は恐らく45kDaモノマーであることがわかった。cDNAライブラリーをFU02472菌糸体培養物から構築した後、2592個のランダムに選んだクローンからの配列の分析によって、真菌性テルペンシンターゼ例えば、ウシグソヒヒトヨタケCoprinopsiscinereaCoprinuscinereus由来のものとの相同性を有する6つの部分配列が同定された。これら配列のうち5つ2つの全長cDNA、1つの部分cDNA、並びにイントロンを含む2つのクローンは、単一の推定プロトイルデンシンターゼ遺伝子Pro1と称されるを呈示した。残る配列、すなわち長さが約600bpの部分cDNAは、Pro2と称される異なる遺伝子を呈示した。2つの推定酵素は、比較に利用可能な約200個の残基についてアミノ酸レベルで約55の同一性を示した。Pro1の更なる分析から、長さ1042bpのオープンリーディングフレームが明らかになり、これは、347個のアミノ酸残基及び推定分子質量40kDaを有するタンパク質をコードする。Pro1ポリペプチドは、他のテルペンシンターゼに特徴的であるのと同様に、適切な配向でDEXXD及びNDxxSxxxEモチーフを含有していた。Pro1アミノ酸配列を用いて、GenBankを検索したところ、担子菌類ウシグソヒヒトヨタケCoprinopsiscinerea由来のCop3及びCop5セスキテルペンシンターゼとの近縁関係それぞれ32.6及び33の同一性が明らかになった。Cop3は-ムウロレンシンターゼであるが、Cop5の正確な機能は未だ決定されていない。Pro1と、子嚢菌又は植物由来のテルペンシンターゼとの間に、有意な相同性はまったく観察されなかった。大腸菌EscherichiacoliにおけるPro1の異種発現によって、0.5Mトリチウム標識ファルネシル二リン酸基質の80を5分以内に6-プロトイルデンの特性Rf=0.7に適合する産物に変換するのに十分なセスキテルペンシンターゼ活性を有する粗可溶性タンパク質抽出物が得られた。同じ溶解物をゲルナイルゲラニルgernaylgeranyl二リン酸と一緒にインキュベートしても、有意な量のより低極性の産物は生産されず<1、空ベクター対照由来の大腸菌E.coli対照溶解物を用いた場合、ファルネシル二リン酸及びゲラルニルゲラニル二リン酸のいずれも、より低極性の産物に変換されなかった図3参照。ペンタンで抽出した非放射性ファルネシル二リン酸を用いた異種テルペンシンターゼの特性決定、並びにGC-MSによる有機抽出物の分析によって、天然のプロトイルデンシンターゼと同一の保持時間及び質量スペクトルを有する産物の形成が明らかにされた。1270全長Pro1cDNAクローンを用いて、対応するゲノムDNA配列の増幅を可能にするプライマーを設計した図4。1645bpの産物の分析により、8つのイントロンと9つのエキソンの存在が明らかになり、中には50bpという短いものもあった。植物テルペンシンターゼ遺伝子の以前の分析からはイントロンはほとんどみいだされなかった。Pro1クローンの5’及び3’末端をそれぞれ呈示する2つのオリゴヌクレオチドプローブを用いたサザンブロットによって、ワタゲナラタケA.gallicaゲノムにはPro1遺伝子のたった1つのコピーしかないことがわかった図5。"