以下の工程を含むことを特徴とする、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する方法:aポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、b該試料を各々、同一のプロテアーゼと共にインキュベートする工程、c逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMSMS分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、d工程cで一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程cで他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定されるアミノ酸配列の差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによって変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する、工程。参照質量スペクトルシグナルの強度に対する試料質量スペクトルシグナルの強度の比が3より大きいアミノ酸配列の差異の全てが、アミノ酸配列変異であることを特徴とする、請求項1記載の方法。パターン比較用のmzフレーム幅が、16またはそれを上回ることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。eMSMS分析によりアミノ酸配列中のアミノ酸変異の種類および位置を決定する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。既知のアミノ酸配列変異を有するポリペプチドでスパイクされたポリペプチドを含むさらなる試料が提供され、かつ提供された試料に加えて、該さらなる試料がインキュベート、分析、および比較されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。分析する工程が、pH80未満のpH値および40°C未満の温度で実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。試料が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液中に提供されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。試料とプロテアーゼをインキュベートする工程が、ポリペプチドをプロテアーゼにより3~60アミノ酸残基長のアミノ酸配列断片に切断することであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。工程dの比較する工程が、1つまたは複数またはすべてのMS電荷状態のデータを用いて実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリン結合体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。試料をプロテアーゼと共に16時間~18時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。試料をプロテアーゼと共に4時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、請求項1~10のいずれか一項記載の方法。比較する工程が、参照試料および他の分析対象試料各々の質量分析トータルイオンクロマトグラムMSTICをオーバーレイすることを含み、ここで、オーバーラップおよびアラインしたすべての質量の強度比が計算され、比が10より大きいピークがアミノ酸配列変異と評価されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。比較する工程が、理論的アミノ酸配列のDNA翻訳タンパク質分解断片ペプチドパターンと分析対象試料の質量分析トータルイオンクロマトグラムMSTICを比較する工程を追加で含み、かつ、該理論的アミノ酸配列の算出された理論的質量の各々にまたは該理論的質量から、アミノ酸を変化させる三塩基組コドンにおける核酸変異、欠失または挿入により生じる質量差をそれぞれ加えるまたは減ずることにより、アミノ酸配列変異が同定されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。以下の工程を含む、ポリペプチドを産生する方法:ポリペプチドを産生する細胞を選択する工程であって、該ポリペプチドが、全処理試料の中で、または、請求項1~14のいずれか一項記載の方法により決定された参照試料もしくは既定のアミノ酸配列に対して、最小数のアミノ酸配列変異を含む、工程。以下の工程を含む、免疫グロブリンを産生する方法:a免疫グロブリンをコードする核酸を含む細胞を少なくとも2つ提供する工程、b該細胞を個別播種および培養する工程、c請求項1~14のいずれか一項記載の方法を実施する工程、d参照試料に対して最小数のアミノ酸配列変異を含む免疫グロブリンを産生する細胞を選択する工程、e該細胞を培養する工程、f該細胞または培養培地からポリペプチドを回収することによって該ポリペプチドを産生する工程。発明の詳細な説明例えば組み換え法により産生される、治療用タンパク質は、アミノ酸配列がわずかに異なる分子の混合物であり得、その違いはアミノ酸配列のC末端またはN末端のみならず、アミノ酸配列内にも見られる例えば、アミノ酸変異、交換、酸化またはチオエーテル形成。アミノ酸配列変異バリエーションは、本明細書で報告する方法を用いてペプチドマッピング手法により検出することができる。これらのアミノ酸配列変異バリエーションは、例えば、i核酸複製の際の核酸ポリメラーゼのエラーにより、またはii核酸転写の際のRNAポリメラーゼもしくはスプライシング装置のエラーにより、またはiiiタンパク質翻訳の際の誤ったtRNAの取得によりもしくは誤ったアミノ酸を保持するtRNAにより、またはiv意図せぬ翻訳後修飾もしくはシグナルペプチドの不完全除去として、発生し得る。したがって、アミノ酸配列変異バリエーションは、各ポリペプチドをコードするDNAの組み込み/増幅プロセス、またはコード核酸の複製、または転写後修飾例えば、mRNAスプライシングの際もしくはRNA編成の際を含む転写に起因し得るか、あるいは翻訳の間に起こりうる。リボソームから分子が放出された後の個々のアミノ酸残基の修飾に起因するアミノ酸バリエーションは、必ずしも意図されていないとは言えない翻訳後修飾と定義され、本明細書が指す変異バリアントではない。真核生物および原核生物酵素が以下の程度の平均エラー率averageerrorrateを有することは文献により公知となっている:複製:通常のポリメラーゼで、複製核酸塩基108~1012個あたり1個、エラープローンポリメラーゼで、複製核酸塩基101~103個あたり1個;転写:転写核酸塩基対104~105個あたり1個;翻訳:導入アミノ酸残基103~104個あたり1個。このことは、一方で複製工程の際にエラープローンポリメラーゼにより誘導されるエラー率および他方で翻訳の際のエラー率が、特に、例えばトランスフェクション後の選択プロセスの際または選択剤の存在下での増殖の際に細胞にかかるストレスと組み合わせると、最も大きく影響することを示している。さらに、翻訳の際の変異は統計的事象であるのに対して、複製の際の変異は位置/遺伝子座が安定な単発事象となる。すなわち、複製の際のエラーは位置特異的かつ再現性のあるアミノ酸配列変異差異をもたらすのに対して、転写および翻訳の際のエラーは位置非特異的なアミノ酸変異バリエーションおよび分子全体に及ぶこれらの変化の統計的分布をもたらす。最後に、組み換え細胞を得るためのゲノムへの組み込みを含むトランスフェクションプロセスもまた、最大1が変化したDNAを生じ得る例えば、LebkowskiJSetalMolCellBiol419511960を参照のこと。これは、最大1100の頻度で、複製前に位置特異的な変異バリエーションをもたらし得る。本明細書において、ポリペプチドの正確な組成およびアミノ酸配列ならびに潜在的変異アミノ酸配列バリアント対非変異アミノ酸配列非バリアントの相対量を明らかにするための、最大限の配列カバー域を有するLCMSMSベースのペプチドマッピングを含む二次元データ分析を用いる試料調製、データ収集および評価法を報告する。本明細書で報告する方法は、インタクトなまたは完全体のタンパク質に代えて断片化されたタンパク質を分析に使用する点に注目されたい。これにより、この方法の超低レベルの変異に対する検出感度が増大する。また、これにより、干渉ならびに潜在的変異と等重の質量によるその識別および分解の必要性が回避される。アミノ酸配列変異バリエーションの判定において、二つの異なる出発位置を利用できる:ケースA:予め特徴決定された試料を利用できる場合、これを参照試料として選択することができ、判定対象の試料をこれと比較することができる:既知のペプチドパターンおよびピーク割当peakassignmentが参照として使用され、試料において検出された差異はいずれもアミノ酸配列変異バリエーションであり得る。そのような参照物質は、十分に特徴決定された細胞株由来、例えば明確な発酵プロセス由来の物質であり得る。ケースB:予め特徴決定された試料が利用できない場合、a一つの試料のピーク割当に関する完全な特徴決定を実施し、ケースAを適用/続行することができるケースB1;またはb一つの試料を参照試料として任意選択しケースB2、残りの試料をそれと比較する;これは、参照試料および非参照試料の両方における差異すなわち変異の判定を含む。参照試料は、異なる細胞株もしくは細胞株世代もしくは培養スケール由来、または変更された/異なる培養条件例えば、培地組成下で得られたものであり得る。一つの態様において、多数の試料を分析する必要がある場合、任意の試料を参照試料として選択し、他のすべての試料をアミノ酸配列変異バリエーションの判定にしたがってグループ化することができる。その後に、各グループにおいて詳細な特徴決定を行う。本明細書で報告するすべての局面の一つの態様において、ポリペプチドは、完全体の免疫グロブリン、または免疫グロブリン断片、または免疫グロブリン結合体である。方法論概要:分析対象のポリペプチドを含む試料をプロテアーゼ、例えばトリプシンで消化し、特有のアミノ酸配列断片ペプチドを得る。一つの態様において、アミノ酸配列断片のサイズは3または4アミノ酸残基長から始まり最大60アミノ酸残基長である。第二の工程では、アミノ酸配列断片のクロマトグラフィー分離逆相高速液体クロマトグラフィー、RPHPLCと、それに接続された、フーリエ変換イオンサイクロトロンFTICRFTorbitrap技術を用いる高分解能質量分析MSおよび質量分析装置内での衝突誘起解離CIDにより得られたアミノ酸配列断片の質量分析MSMSを行う。これは、二次元データ分析である。分析が二次元、すなわち時間対質量であるため、分解が向上し得る。また、二次元分析であるがゆえに、MS分析の前に低分解性の液体クロマトグラフィー分離を受け入れることができ、その際にオーバーラップしたピークはMS分析時に分解することができる。その後、得られたHPLCMSデータセットを比較する、すなわち、試料のアミノ酸配列断片の溶出パターンおよび質量電荷mzパターンの比較ならびに変異すなわち差異の同定を、MSMSフラグメントスペクトルの分析によって行う。参照試料ベースの分析を実施する場合、アミノ酸断片の同定、ピークの割当および/または配列カバー域の決定を、アミノ酸配列変異バリエーションを含むアミノ酸配列断片およびそれらの相対量の検出に加えて実施する必要がある。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンポリペプチドのいずれかである。本明細書で報告する方法によって、試料の組成およびアミノ酸配列変異バリエーションを含む分子のフラクションを決定することができる。また、実験的に決定された質量分析フラグメンテーションデータを、ポリペプチドおよびそのバリアントのインシリコタンパク質分解消化ならびにその後の衝突誘起フラグメンテーションのシミュレーションにより得られる理論的なアミノ酸配列断片質量と照合することにより、試料の一貫性の量的決定を行うことができる。最後に、人為的なデータ評価により、提示された変異バリエーションおよび変異バリエーション位置を有する配列を入手および確認することができる。アミノ酸配列変異バリエーションが同定されれば、1つ、複数またはすべてのMS電荷状態のデータを使用することにより、それを非修飾アミノ酸配列に対して相対的に定量化することができる。スパイク実験を用いることにより、本明細書で報告する方法は、少なくとも01~10の変異アミノ酸配列バリアントの全体検出限界を有することが見出された。さらに、一方で試料調製時に塩基性pH値および高温を避けることが、脱アミノ化、すなわち方法により誘導される修飾を避けるのに有益であることも見出された。したがって、本明細書で報告する方法の一つの態様において、この方法は、中性および弱塩基性pH範囲、すなわちpH80以下かつpH65以上のpH値、ならびに穏やかな温度、すなわち40°C以下の温度で実施される。さらに、一つの態様において、一般的に使用されている重炭酸アンモニア緩衝液に代えてトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液を質量分析に使用することにより、方法依存的な副産物が抑制されることも見出された。本方法は、決定にLCMSデータセットを使用し、それによって試料ポリペプチドのトリプシン消化物中の1つまたは複数のアミノ酸変異バリエーションの検出および同定を実現する。同定にはMSMSデータを使用することができ、エラートレラントサーチerrortolerantsearch法は、単一核酸交換、挿入または欠失に基づきアミノ酸配列変異バリエーションを同定する。同様に、断片およびいくつかの他の既知の修飾を同定することも可能である。この比較アプローチは、詳細に分析する必要があるのが差異のみであるため、分析に必要な時間を劇的に短縮することができる。また、選択された場合、参照試料は一度しか分析する必要がない。試料中に多くの変異差異が存在する場合、これらは修飾ごとにグループ化することができ、各グループの代表試料を分析することができる。方法の詳細:以下では、本明細書で報告するすべての方法の具体的態様について解説する。試料は、ジチオトレイトールDDTの添加により還元することができる。また、遊離スルフヒドリル残基は、ヨード酢酸によりカルボキシメチル化することができる。その後、試料の緩衝液を交換し、酵素消化用に調整することができる。試料は、一晩16~18時間酵素消化することができ、消化はトリフルオロ酢酸の添加により停止することができる。消化した試料は、RPHPLC分離および分離したアミノ酸配列断片の高分解能質量分析に供することができる例えば、FTICRFTorbitrap質量分析装置を用いる。本明細書で使用する場合、用語データセットは、試料中に含まれる消化されクロマトグラフィー溶出により時間分解されたアミノ酸配列断片をイオン化して荷電分子または荷電断片を発生させることにより質量分析装置において得られた質量電荷比を意味する。データセットは、少なくとも質量分析トータルイオンクロマトグラムMSTICおよび親分子の衝突誘起解離により得られるタンデム質量分析データMSMSデータを含む。ケースA:評価対象の試料を、利用可能な参照試料と共に分析する。各試料および参照試料に対して少なくとも2回、決定を行うべきである。陽性対照として、参照試料と類似する、すなわち1または2のアミノ酸配列変異バリエーションを含む試料を参照試料にスパイクし、人工変異アミノ酸配列バリアントとして使用する。人工変異アミノ酸配列バリアントは、一つの態様において、この方法の全体感度の確認のために、05wwで参照試料にスパイクする。分析方法のパラメータを設定するために、参照試料、すなわち、変異修飾を有さないまたは既知の変異修飾パターンを有する組み換え産生ポリペプチドを用いて得られた結果、および人工アミノ酸配列変異バリアントを含む変異アミノ酸配列でスパイクした参照試料を用いて得られた結果を比較することができる。これらのパラメータを用いて、以下の分析を実施することができる。決定のために、参照試料および分析対象試料のトータルイオンクロマトグラムTICをオーバーレイし、所定の保持時間での対応する質量シグナルのシグナル強度すなわち、保持時間および関連質量を比較することができる。したがって、一つの態様において、分析する工程および/または判定する工程は、クロマトグラフィー保持時間および質量mz値にしたがう分離を用いる二次元分析である。オーバーレイ/アラインしたすべての質量の強度比、すなわち、参照試料のシグナル強度に対する試料のシグナル強度の比を計算することができる。この比を、保持時間に対してプロットすることができ、ここで:a参照試料と試料で同じ質量、同じ強度のピークは約1の値を示し、分析対象試料においてより高頻度で存在する質量は1より大きい値を示し、b1より大きい値を有する、一つの態様では、3より大きい、または10より大きい、または100より大きい値を有する、一つの態様では、10~5109の値を有する、別の態様では、100~5109の値を有する、すべての質量を同定し、ここで、その同定のために、親の質量に対応するすべてのMSMSスペクトルを使用し、それらの異なる電荷状態も考慮し、c変異アミノ酸配列バリエーションの定量化は、質量スペクトルにおける1つまたは複数またはすべての電荷状態を使用することによって、互いに対して相対的に実施することができ、ここで、天然アミノ酸配列および変異アミノ酸配列バリアントで同じ電荷状態を選択し、抽出イオンクロマトグラムEICを生成し、EICにおける相互に対応するピークの曲線下面積を、次式にしたがい、互いに対して相対的に定量化する。一つの態様において、分析に使用するmzウィンドウは、各質量±16amumzである。データが適時に処理できるようにするため、一つの態様において、25または3の比を閾値として設定する、すなわち、その限界を下回る比を分析しない。ケースB:このケースでは、予め特徴決定された試料が利用可能でない。提供された分析対象試料の一つについてこのケースでは1つ以上の分析対象試料が利用可能である必要がある、TICにおけるすべての決定された質量と理論的に決定されたペプチドパターンのアラインメントを、消化に既定のプロテアーゼを用いて実施することができる、すなわち、ピーク割当を実施することができる。正確なアラインメントのために重要なのは、一方では厳密な質量であり、他方では提唱されたペプチドの配列確認のためのMSMSフラグメントカバー域であり得る。一つの特定の態様において、アミノ酸配列変異バリエーションは、算出された天然アミノ酸配列の理論的質量の各々に、または当該理論的質量から、核酸変異すなわちアミノ酸配列を変化させる三塩基組コドンにおける単一ヌクレオチド置換、欠失または挿入により生じる質量差を、それぞれ足すまたは引くことによるエラートレラントサーチにより同定することができる。その後、提唱されたアミノ酸配列変異バリエーションを、MSMSフラグメンテーションパターンにより確認する必要がある。それと共に、アミノ酸配列変異の種類差異だけでなくアミノ酸変異の位置変化も、MSMS分析におけるフラグメントの質量によりカバーされている必要がある。しかし、LCMSデータセットの完全なピーク割当は必須ではなく、差異のみを分析することができる。残りの全ての試料は、上記の通りに分析した試料と比較することができる。変異アミノ酸配列バリエーションの定量化は、質量スペクトルにおける1つ、複数またはすべての電荷状態を使用することによって互いに対して相対的に実施し、ここで、天然アミノ酸配列および変異アミノ酸配列バリエーションの各々で同じ電荷状態を選択し、抽出イオンクロマトグラムEICを生成し、EICにおける相互に対応するピークの曲線下面積を、次式にしたがい、互いに対して相対的に定量化する。本明細書で報告する方法を用いることで、低百分率の範囲にまでアミノ酸配列変異バリアントの同定方法を利用することができる。全体感度は、アミノ酸配列断片の性質に依存して少なくとも約05であると決定された。特定のケースにおいて、感度は、05を下回ることがある例えば、クロマトグラフィーおよび/またはイオン化特性の優れたアミノ酸配列断片の場合。ケーススタディでは、01~10のばらつきが検出され、いくつかのケースでは002まで低下した。これは、例えば、有意かつ信頼性のある結果を達成するのに必要とされる定められたソフトウェアツールの組み合わせにより達成することができる。アミノ酸配列変異バリエーションの検出のケースにおいて、偽陽性結果は:ペプチドマップからアミノ酸配列変異バリエーションを含むポリペプチドを単離し、エドマン配列決定を行う、アミノ酸変異バリエーションを有するペプチドを合成し、それをMSおよびMSMS分析においてポリペプチドにスパイクし、保持およびMSMSプロフィールを確認する、各試料を産生する細胞クローンのDNA配列決定によりその存在を確認する、異なるタンパク質分解酵素で消化し、それによって得られた断片を分析する、のいずれかによりその検出を確認することによって排除することができる。スパイク実験の例:変異バリエーションを有するポリペプチドの検出感度の評価は、モデルポリペプチドであるモノクローナル抗体mAbを、アミノ酸配列変異バリエーションを有する第2のmAbにより様々な割合すなわち様々な濃度でスパイクすることによって実施した。一つの例において、本明細書で報告する方法により2つの異なるペプチドが同定されることを予想して、アミノ酸配列変異バリエーションを有するmAbを1wwスパイクした。第二の例において、17個の異なる変異バリアントペプチドを予想して、変異バリアントmAbを様々な比率05~10でmAbにスパイクした。このように、本明細書は、以下の工程を含むことを特徴とする、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する方法を報告する:aポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、b該試料を各々、同一のプロテアーゼと共にインキュベートする工程、c逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMSMS分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、d工程cで一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程cで他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定されるアミノ酸配列の差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによって変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する、工程。一つの態様において、参照質量スペクトルシグナルの強度に対する試料質量スペクトルシグナルの強度の比が3より大きいアミノ酸配列の差異の全てが、アミノ酸配列変異である。さらなる態様において、分析する工程で使用するmzフレーム幅は、16またはそれを上回る。さらなる態様において、この方法はさらに、MSMS分析によりアミノ酸配列中のアミノ酸変異の種類および位置を決定する工程eを含む。また、一つの態様において、既知のアミノ酸配列変異バリエーションを有するポリペプチドでスパイクされたポリペプチドを含むさらなる試料が提供され、かつ提供された試料に加えて、該さらなる試料がインキュベート、分析、および比較される。一つの態様において、分析する工程は、pH80未満のpH値および40°C未満の温度で実施される。別の態様において、試料は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液中に提供される。また、一つの態様において、試料とプロテアーゼをインキュベートする工程は、ポリペプチドをプロテアーゼにより3~60アミノ酸残基長のアミノ酸配列断片に切断することである。さらに、一つの態様において、工程dの比較する工程は、1つまたは複数またはすべてのMS電荷状態のデータを用いて実施される。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片または免疫グロブリン結合体である。別の態様において、試料はプロテアーゼと共に16時間~18時間インキュベートされ、その後に蟻酸またはトリフルオロ酢酸が添加される。さらなる態様において、試料はプロテアーゼと共に4時間インキュベートされ、その後に蟻酸またはトリフルオロ酢酸が添加される。また、一つの態様において、比較する工程は、参照試料と他の分析対象試料各々の質量分析トータルイオンクロマトグラムMSTICをオーバーレイすることを含み、ここで、オーバーラップおよびアラインしたすべての質量の強度比が計算され、その比が3より大きい、特に10より大きいピークがアミノ酸配列変異と評価される。さらに別の態様において、比較する工程は、理論的アミノ酸配列のDNA翻訳タンパク質分解断片ペプチドパターンと分析対象試料の質量分析トータルイオンクロマトグラムMSTICを比較する工程を追加で含み、かつ、該理論的アミノ酸配列の算出された理論的質量の各々にまたは該理論的質量から、アミノ酸を変化させる三塩基組コドンにおける核酸変異、欠失または挿入により生じる質量差をそれぞれ加えるまたは減ずることにより、アミノ酸配列変異が同定される。本明細書で報告するさらなる局面は、以下の工程を含む、ポリペプチドを産生する方法である:ポリペプチドを産生する細胞を選択する工程であって、該ポリペプチドが、全処理試料の中で、または、本明細書で報告する方法により決定された参照試料もしくは既定のアミノ酸配列に対して、それぞれ最小数もしくは最小比のアミノ酸配列変異を含む、工程。また、本明細書で報告する一つの局面は、以下の工程を含む、免疫グロブリンを産生する方法である:a免疫グロブリンをコードする核酸を含む細胞を少なくとも2つ提供する工程、b該細胞を個別播種および培養する工程、c本明細書で報告する方法を実施する工程、d参照試料に対してそれぞれ最小数または最小比のアミノ酸配列変異を含む免疫グロブリンを産生する細胞を選択する工程、e該細胞を培養する工程、f該細胞または培養培地からポリペプチドを回収することによって該ポリペプチドを産生する工程。以下の実施例、配列表および添付の図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されるものである。本発明の精神から逸脱することなく示されている手順に変更を加えることができることを理解されたい。配列表の説明配列番号1抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン1配列番号2抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン1配列番号3抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン2配列番号4抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン2配列番号5抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン3配列番号6抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン3配列番号7ヒトIgG1定常領域配列番号8ヒトIgG4定常領域配列番号9ヒトκ軽鎖定常ドメイン配列番号10ヒトλ軽鎖定常ドメイン実施例1材料および方法参照および試料の試料調製法:a還元およびアルキル化:250μgの免疫グロブリン、最大100μl量を、変性緩衝液04MTrisHCl、80Mグアニジン塩酸塩、pH8で希釈し終量240μlとした。この溶液に20μlのジチオトレイトール変性緩衝液中240mMを添加し、混合物を37°C±2°Cで60分間インキュベートした。その後、20μlのヨード酢酸溶液純水中06Mを添加し、激しく混合し、室温、暗所で15分間インキュベートした。アルキル化反応は、30μlのジチオトレイトール溶液変性緩衝液中240mMの添加によって停止させた。b緩衝液の交換:変性、還元、カルボキシメチル化免疫グロブリンを含む溶液の300μlおよそ250μgまたは32nmolの緩衝液を、NAP商標5Sephadex商標G25脱塩カラムを用いて交換した。簡潔に説明すると、このカラムを、50mMTrisHClを含むpH75の緩衝液溶液10mlで平衡化し、試料をカラムに適用し、カラムを350μlの上記緩衝液溶液で洗浄し、そして試料をおよそ480μl分回収した。各工程カラムの平衡化、試料の適用、洗浄および溶出の間に、溶液を充填カラム床全体に行き渡らせた。c酵素消化:緩衝液交換した免疫グロブリン溶液に48μlのトリプシン溶液TrisHCl中02gl、pH75を添加し、37°Cで約16時間室温でインキュベートした。消化は、20μlの10vvトリフルオロ酢酸TFA溶液の添加により停止させた。LCMSMSデータの取得法:LCMSMS分析は、トリプシン消化工程で得られた加水分解ペプチドのクロマトグラフィー分離LCと、それに続く、HPLCと質量分析装置の間のインターフェースとしてAdvionBioSciences製のナノESIイオン源を用いるMSおよびMSMS検出のそれぞれにより実施した。クロマトグラフィーは、以下のパラメータで実施した:HPLC:DionexUltimate3000流速:40μl分UV検出波長:220nmおよび280nmカラムオーブンの温度:35°C試料ループ:10μlカラム:DionexpepMapC18、3μm、100Å、1x150mm注入量:10μl溶出液A=01蟻酸を含むHPLCグラジエントグレード水溶出液B=01蟻酸を含むHPLCグラジエントグレードアセトニトリル適用した勾配は、75分間で5vol溶出液Bから100vol溶出液Bであった。ナノESIMSまたはMSMSは、以下のパラメータで実施した:ナノESI源:TriversaNanoMateAdvion質量分析装置イオン源への流量:およそ200nl分、フロースプリッター制御ガス圧:01~05psi印加電圧:11~17kV陽イオン:選択質量スペクトルの検出は、以下のパラメータで実施した:機器:ESILTQFTICRThermoScientificキャピラリー温度:175°CMSMSのイオントラップ衝突エネルギー:40チューブレンズ電圧:100V動的除外Dynamicexclusion特性:入反復計数RepeatCount:1、除外時間ExclusionDuration:8秒、除外質量幅Exclusionmasswidth:3ppmMSMSスペクトルのデータ依存的取得におけるスキャンイベントサイクルの代表的時系列は、図1に示されている。MSスペクトルのデータ取得範囲は、350~2000mzとした。MSMSスペクトルのmz範囲は、機器の標準設定を使用した。高分解能FTスキャンごとのMSMSスペクトル数は、3~5の間である。SIDスキャンはこのタイプの分析に必須ではない。実施例2抗CD19抗体参照および試料の分析データの生成:参照および試料の抗CD19抗体を、材料および方法の節にしたがい処理した。MSデータを、材料および方法の節にしたがい取得した。データの分析:aLCMSデータセットを用いる参照試料間の差異の検出参照および試料について得た質量プロフィールトータルイオンクロマトグラム、図2参照の比較には、SIEVE商標ソフトウェアパッケージバージョン110、ThermoScientific製を使用した。簡潔に説明すると、参照および試料のTICデータセットを保持時間でアラインし図3、プリセットの保持時間ウィンドウ内のプリセットの閾値に達するまでの質量ピーク強度について比較した図4および5。評価用に予め定義したパラメータにしたがう参照および試料における質量シグナルの差異を表1に列挙する。参照および試料において同一強度で存在する質量シグナルは1の比で表される。参照よりも試料において高い強度を有する質量シグナル例えば、アミノ酸点変異は、1より大きい比で表される。これらの比は、試料の所定のmz対保持時間フレームにおける全体シグナル強度を参照における対応する強度で割ることによって計算した。参照の所定のmz対保持時間フレームにおける全体シグナル強度がゼロの場合例えば、データ取得時の能動的なノイズ除去によりバックグラウンドシグナルがなくなった場合、その比は、対応するフレームにおける試料の全体シグナル強度と同じとする例えば、表1における第2~10ヒット。表1比が50のすべての示差的ピークのデータSIEVEによる参照および試料のLCMSデータの比較に使用したパラメータは、以下の通りであった:フレームmz幅:16フレーム時間幅:03分強度閾値:10000Mz開始:350Mz最終:2000検索ピーク幅:30保持時間開始:5分保持時間終了:60分これらのパラメータは、アミノ酸配列の差異に関連するヒットと偽陽性、すなわちアミノ酸配列の差異に関連しないヒットを識別するよう最適化した。以下のもののみ、LCMSデータの実際のパラメータにしたがい調節する必要がある:iクロマトグラフィー分解能フレーム時間幅、およびii使用した機器の感度およびバックグラウンドノイズ強度閾値さらに、この方法の必要とされる感度、例えば微量の変異アミノ酸配列バリアントの検出に必要とされる感度は、設定すべき閾値強度を決定する。例えば、LTQFTICR機器を用いた場合、02までの絶対頻度の変異配列バリアントが同定された。bMSMSデータを用いる参照試料間の差異の同定前段落に記載される手順を用いて見出された差異の同定に関して、最初に、同位体ピーククラスターを、ペプチドに典型的なものであることについて検査した。次に、各mzシグナルがMSMSフラグメンテーションの生成のために選択されたかどうか、およびそれがMascotエラートレラントサーチMascotETSによって同定されるかどうかを検査した。MascotETSによって同定された各暫定配列バリアントを、得られたMSMSフラグメントイオンスペクトルを用いて手作業で検査および確認した図6および7参照。あるいは、MSMSデータが記録されておりかつMascotETSが配列を提示しなかった場合、手作業でまたはソフトウェアを用いてのいずれかによりデノボ配列決定を適用した。c同定された変異アミノ酸配列バリアントの定量化同定された変異アミノ酸配列バリアントを、変異バリエーションを含むトリプシン消化アミノ酸配列断片のレベルで、かつ同一試料中のオリジナルの非変異アミノ酸配列断片との関係で、定量化した図8および9参照。試料のLCMSデータから2つの抽出イオンクロマトグラムEIC、一方は試料用、一方は参照試料用、を生成した。抽出イオンクロマトグラムEICは、各ペプチドのすべての電荷状態およびすべての同位体ピークを含む。各EICにより生成されたピークを、機器ソフトウェアXCaliburを用いて積分し、それによって算出された面積を以下の式で使用する:ここで、すべての電荷状態およびすべての同位体ピークを網羅する抽出イオンクロマトグラムのピーク面積を使用する。実施例3抗CCR5抗体参照および試料の分析可変ドメインすなわち軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにおける単一アミノ酸変化変異の判定のために、抗CCR5抗体を用いた。第一のすなわち参照抗CCR5抗体は、配列番号1および2、配列番号3および4、ならびに配列番号5および6の対から選択される可変重鎖および可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を有する。第二のすなわち試料抗CCR5抗体は、以下のアミノ酸変異変化を有する:重鎖可変ドメインVHにおいて、109アミノ酸位のイソロイシン残基がスレオニンに変異変化しておりVHI109T、軽鎖可変ドメインVLにおいて、52アミノ酸位のバリン残基がイソロイシンに変異変化しているVLV52I。試料抗CCR5抗体を、参照抗CCR5抗体に1wtスパイクした。aLCMSデータセットを用いる参照試料アミノ酸配列間の差異の検出参照および試料について得た質量プロフィールトータルイオンクロマトグラムの比較には、SIEVE商標ソフトウェアパッケージバージョン110、ThermoScientific製を使用した。簡潔に説明すると、参照および試料のデータセットを保持時間でクロマトグラフィー的にアラインし図10、プリセットの保持時間ウィンドウ内のプリセットの閾値に達するまでの質量ピーク強度について比較した図11。評価用に予め定義したパラメータにしたがう参照および試料における質量シグナルの差異を表2に列挙する。参照および試料において同一強度で存在する質量シグナルは1の比で表される。参照よりも試料において高い強度を有する質量シグナル例えば、アミノ酸点変異は、1より大きい比で表される。これらの比は、試料の所定のmz対保持時間フレームにおける全体シグナル強度を参照における対応する強度で割ることによって計算した。参照の所定のmz対保持時間フレームにおける全体シグナル強度がゼロの場合例えば、データ取得時の能動的なノイズ除去によりバックグラウンドシグナルがなくなった場合、その比は、対応するフレームにおける試料の全体シグナル強度と同じとする。表2示差的ピークのデータbMSMSデータを用いる参照と試料の間の差異の同定前段落に記載される手順を用いて見出された差異の同定に関して、最初に、同位体ピーククラスターを、ペプチドに典型的なものであることについて検査した。次に、各mzシグナルがMSMSフラグメンテーションの生成のために選択されたかどうか、およびそれがMascotエラートレラントサーチMascotETSによって同定されるかどうかを検査した。MascotETSによって同定された各暫定配列変異バリアントを、得られたMSMSフラグメントイオンスペクトルを用いて手作業で検査および確認した。あるいは、MSMSデータが記録されておりかつMascotETSが配列を提示しなかった場合、手作業でまたはソフトウェアを用いてのいずれかによりデノボ配列決定を適用した。c同定された配列バリアントの定量化同定された変異アミノ酸配列バリアントを、変異バリエーションを含むトリプシン消化アミノ酸配列断片のレベルで、かつ同一試料中のオリジナルの非変異ペプチドとの関係で、定量化した図12および13参照。試料のLCMSデータから2つの抽出イオンクロマトグラムEIC、一方は変異ペプチドバリアント用、一方はネイティブペプチド用、を生成した。抽出イオンクロマトグラムEICは、各ペプチドのすべての電荷状態およびすべての同位体ピークを含む。各EICにより生成されたピークを、機器ソフトウェアXCaliburを用いて積分し、それによって算出された面積を実施例1に示される式にしたがい使用する。