"単離モノPEG化ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFシステインムテインであって、ポリエチレングリコールが、G-CSF成熟タンパク質のT11番目の位置のスレオニン:以下同様に、アルファベットはアミノ酸の一文字記号を指し、数字は成熟タンパク質内の置換されるアミノ酸の位置を指す、P2、L3、A6、S7、W58、A68、E93、A129、T133、A136、A139、A141およびQ173から選択されたアミノ酸と置換されたシステイン残基に取り付けられるか、またはポリエチレングリコールが、G-CSF成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されたシステインに取り付けられており、前記ムテインはヒトG-CSFに応答して増殖する細胞系統を用いたインビトロ増殖バイオアッセイで100pg/mL以下のEC50を有する、単離モノPEG化ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFシステインムテイン。単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFシステインムテインであって、システインが、G-CSF成熟タンパク質のP22番目の位置のプロリン:以下同様に、アルファベットはアミノ酸の一文字記号を指し、数字は成熟タンパク質内の置換されるアミノ酸の位置を指す、A6、S7、W58、A68、E93、A129、T133、A136、A139、A141およびQ173から選択されたアミノ酸と置換されているか、またはシステインが、G-CSF成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されており、前記ムテインはヒトG-CSFに応答して増殖する細胞系統を用いたインビトロ増殖バイオアッセイで100pg/mL以下のEC50を有する、単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子G-CSFシステインムテイン。したがって、多大な努力にもかかわらず、1個または複数の遊離システイン残基を含有する不溶性または凝集性タンパク質を、高収率で可溶性の生物学的に活性な形にリフォールディングさせる方法に対する要求が依然として存在する。本発明はこの要求を満たし、さらに関連する利点を提供する。同様に、PEG化によるなどのタンパク質分子量を増すことによる持続性組み換えタンパク質の均一調製物の製造方法に対する要求も存在する。発明の概要本発明は一般的に、1個または複数の遊離システイン残基を有し、不溶性または凝集性の形で宿主細胞により発現される、タンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を得るための方法に関する。このようなタンパク質には、GHなどの成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、IFN-α、G-CSFおよびGM-CSFタンパク質、ならびにエンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されるものではない。この方法は一般的に、a遊離システイン残基を含有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること;b細胞を溶解すること;c変性剤、還元剤およびシステインブロッキング剤の存在下で不溶性または凝集性タンパク質を可溶化すること;およびd変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることによりタンパク質をリフォールディングすることによって行われる。場合によっては、可溶性のリフォールディングされたタンパク質は、リフォールディングされた混合物中の他のタンパク質から単離される。適当な宿主細胞には、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞が含まれる。宿主細胞は、細菌細胞、特に大腸菌であることが好ましい。本発明の方法によって製造された可溶性のリフォールディングされたタンパク質は、組み換えタンパク質、特にタンパク質のシステイン変異体またはシステインムテインであることが好ましい。本明細書では、用語システイン変異体およびシステインムテインは、タンパク質のアミノ酸配列に以下の変化、成熟タンパク質のアミノ末端の前または成熟タンパク質のカルボキシ末端の後への非天然システイン残基の付加;タンパク質中の既存のアミノ酸の非天然システイン残基による置換;タンパク質中の2個の正常に隣接するアミノ酸間への非天然システイン残基の導入;またはタンパク質中で通常はジスルフィド結合を形成する天然に存在するシステイン残基の別のアミノ酸による置換のいずれかを含むことを意味する。この方法は、GH、G-CSF、GM-CSFおよびインターフェロン、特にα-インターフェロン、これらのタンパク質のシステイン変異体、それらの誘導体または拮抗薬を含むがこれらに限定されないタンパク質を製造するのに有用である。この方法が有用である他のタンパク質には、GHスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバー、トランスフォーミング成長因子TGF-β-スーパーファミリー、血小板由来成長因子-A、血小板由来成長因子-B、神経成長因子、脳由来の神経向性因子、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、血管内皮成長因子、ケモカイン、ホルモン、エンドスタチン、アンジオスタチン、これらのタンパク質のシステインムテイン、またはその誘導体もしくはその拮抗薬が含まれる。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のシステインムテインまたはその誘導体も想定されている。本明細書では、用語システインブロッキング剤は、タンパク質中で可逆的にブロックされた遊離システイン残基の形成をもたらすすべての試薬または試薬の組合せを意味する。有用なシステインブロッキング剤の例には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸などのジチオール、またはシステイン、システアミン、チオグリコール酸、および還元型グルタチオンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。チオールは、酸化剤の存在下に用いることが好ましい。有用な酸化剤には、酸素、ヨウ素、フェリシアン化物、過酸化水素、ジヒドロアスコルビン酸、テトラチオン酸塩tetrathionate、およびO-ヨードソ安息香酸が含まれる。場合によっては、銅CuまたはコバルトCoなどの金属イオンを加えて酸化反応を触媒することができる。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、発明者らは、システインブロッキング剤がタンパク質中の遊離システイン残基と混合ジスルフィドを形成し、それによって遊離システイン残基が関与して起こる可能性のあるジスルフィド転位を制限すると仮定している。混合ジスルフィドは遊離システイン残基を安定化し、適切に折り畳まれた生物学的に活性な可溶性タンパク質の収率を著しく向上させる。本明細書でDTTおよび2-メルカプトエタノールなどの還元剤をシステインブロッキング剤として見なさないのは、それらがタンパク質中の遊離システイン残基との可逆的にブロックされた混合ジスルフィドの形成をもたらさないからである。DTTは通常、酸化によって生成する熱力学的に好ましい分子内結合のために、タンパク質中のシステイン残基とは混合ジスルフィドを形成しない。遊離システイン残基を介して2個以上のリフォールディングされたタンパク質の共有結合によって形成される高次の二量体および多量体タンパク質も本発明の範囲内にある。本方法にはさらに、リフォールディングされたタンパク質にシステイン反応性部分を結合させ、遊離のシステイン残基を介してリフォールディングされたタンパク質にシステイン反応性部分が結合している修飾タンパク質を生成する様々な方法が含まれる。リフォールディングされたタンパク質と結合することができる有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性PEGであり、これを用いてPEG化タンパク質を生成することができる。このような方法には、aリフォールド混合物中の他のタンパク質から遊離システイン残基を有するリフォールディングされたタンパク質を単離すること、b単離したリフォールディングされたタンパク質をジスルフィド還元剤で少なくとも部分的に還元すること、およびcそのタンパク質をシステイン反応性PEGなどのシステイン反応性部分に暴露することが含まれる。場合によっては、修飾タンパク質を非修飾タンパク質から単離することができる。他の有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性デキストラン、システイン反応性炭水化物、システイン反応性ポリN-ビニルピロリドン、システイン反応性ペプチド、システイン反応性脂質、およびシステイン反応性多糖類である。本発明にはさらに、本明細書中に開示された方法により製造されるPEG化タンパク質を含む、可溶性のリフォールディングされたタンパク質およびそれらの誘導体が含まれる。このようなPEG化タンパク質には、GH、G-CSF、GM-CSFおよびα-インターフェロンタンパク質のモノPEG化、システイン変異体が含まれる。このようなPEG化タンパク質には、2個以上のPEG分子で修飾され、少なくとも1個のPEG分子が遊離システイン残基を介してタンパク質と結合しているGH、G-CSF、GM-CSFおよびα-インターフェロンタンパク質のシステイン変異体も含まれる。発明の詳細な説明本発明は、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるGH、IFN-α2、G-CSF、GM-CSFタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製する方法を提供する。本発明を用いて、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるGHスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバーのリフォールディングされた可溶性の形を調製することができる。本発明を用いて、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現される、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生タンパク質を含むがそれらに限定されない他のタイプのタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製することもできる。本発明はさらに、新規タンパク質、特にこれらの新規方法によって製造される組み換えタンパク質ならびにこのような組み換えタンパク質の誘導体を提供する。このようなタンパク質を調製するための新規な方法は一般的に、a遊離システインを有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること;b化学的、酵素的または物理的手段により、宿主細胞を溶解すること;c変性剤、還元剤およびシステインブロッキング剤に不溶性または凝集性タンパク質を暴露することによって、そのタンパク質を可溶化すること;およびd可溶化混合物中の変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることにより、タンパク質をリフォールディングすることによって行われる。任意選択で、リフォールディングされた可溶性のタンパク質は、リフォールド混合物中の他のタンパク質から単離することができる。本発明の方法および他の実施形態は、2000年5月16日出願の米国仮出願番号60/204,617で詳細に記載されていた。米国仮出願番号60/204,617の全体を引用により本明細書に組み込む。上述のように、上記方法の第一ステップは、遊離システイン残基を含有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させることである。適当な宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。組み換えタンパク質を発現させるのに用いることができる適当な宿主細胞の例には、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞が含まれる。細菌細胞は具体的に、大腸菌が特に有用である。宿主細胞にタンパク質を発現させる方法は当技術分野で良く知られており、諸例を本明細書中に示す。本明細書では、用語遊離システイン残基を有するタンパク質は、2N1個のシステイン残基を含有し、Nが0またはどのような整数でもよい天然または組み換えタンパク質またはペプチド、および2N個のシステインを含有し、2個以上のシステインが通常はジスルフィド結合に関与していない天然または組み換えタンパク質またはペプチドを意味する。したがって、本発明の方法は、遊離のシステインを有するタンパク質またはペプチド、具体的には1個または複数の遊離システインを有するシステイン付加変異体組み換えタンパク質本明細書ではシステインムテインまたはシステイン変異体と呼ぶの発現、回収および精製を促進するのに有用である。天然宿主細胞によって発現される遊離システインを有する天然タンパク質の発現、回収および精製も、本発明の方法によって促進できるが、本明細書中の説明は主に、例示の目的でのみ組み換えタンパク質に言及する。さらに、タンパク質は、ヒト、コンパニオンアニマルおよび家畜を含むいかなる動物種からも誘導することができる。タンパク質はまた、植物種または微生物からも誘導することができる。したがって、本発明は多種多様の組み換えタンパク質、およびこれらのタンパク質のシステイン変異体を包含する。これらのタンパク質には、GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、およびこれらのタンパク質のシステイン変異体が含まれる。以下のタンパク質まとめてGHスーパー遺伝子ファミリーと呼ぶがGHスーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされるBazan1990;1991;1992;MottおよびCampbell1995;SilvennoinenおよびIhle1996;Martin他1990;Hannum他1994;Blumberg他、2001:GH、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチンEPO、トロンボポエチンTPO、インターロイキン-2IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12p35サブユニット、IL-13、IL-15、IL-19、IL-20、IL-TIF、MDA-7、AK-155、オンコスタチンM、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、ω-インターフェロン、τ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、カルジオトロフィン-1CT-1、幹細胞刺激因子およびflt3/flk2リガンド。将来的には遺伝子クローニングおよびシークエンシングによりGHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーがさらに同定されることが予想される。GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般的にはアミノ酸またはDNA配列の同一性が限られているかかわらず類似した二次および三次構造を有している。GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの共有する構造的特徴はBazan1990;1991;1992、MottおよびCampbell1995およびSilvennoinenおよびIhle1996に記載されており、遺伝子ファミリーの新しいメンバーの同定を容易にしている。Shanafelt他2000によって記載された選択的IL-2拮抗薬などのこれらのタンパク質の変異体も本発明に包含される。本発明はまた、TGF-β-スーパーファミリーのメンバーを含む追加の組み換えタンパク質の発現、回収および精製を促進することができる。TGF-β-スーパーファミリーのメンバーには、グリア細胞由来の神経成長因子GDNF、トランスフォーミング成長因子-β1TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、インヒビンA、インヒビンB、骨形成タンパク質-2BMP-2、BMP-4、インヒビンα、ミューラー阻害物質MIS、およびOP-1骨形成タンパク質1が含まれるが、これらに限定されるものではない。TGF-β-スーパーファミリーの単量体サブユニットは、このファミリーの他のメンバーを容易に同定できるようにするある種の構造的特徴を共有しており、一般的に4個の分子内スルフィドを形成する8個の高度に保存されたシステイン残基を含有する。通常は、9番目の保存システインは、タンパク質の単量体では遊離しているが、単量体サブユニットのホモ二量体化またはヘテロ二量体化に形成される分子間ジスルフィド結合に関与する。TGF-β-スーパーファミリーの他のメンバーは、引用により本明細書に組み込むMassague1990、Daopin他1992、Kingsley1994、Kutty他1998、およびLawton他1997によって記載されている。免疫グロブリンIg重鎖および軽鎖単量体もまた、分子内ジスルフィドに関与するシステイン残基ならびに遊離システインを含有するRoitt他、1989およびPaul、1989。これらの遊離システインは通常、重鎖ホモ二量体化、重鎖-軽鎖ヘテロ二量体化、重鎖-軽鎖ヘテロ二量体のホモ二量体化などの多量体化、およびIgMの場合には重鎖-軽鎖ヘテロ二量体の五量体化などの他の高次の集合の結果としてジスルフィド結合に関与するに過ぎない。したがって、本発明の方法を用い、ヒト免疫グロブリン、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgDおよびIgE、ならびにこれらのタンパク質のシステイン変異体またはそのフラグメントなどの重鎖および/または軽鎖またはその様々な領域の発現、回収および精製を促進することができる。他の種に由来する免疫グロブリンも同様に、発現、回収および精製することができる。ChamowおよびAshkenazi1996に記載されているように、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン領域と遺伝的に融合したタンパク質も同様に、発現、回収および精製することができる。タンパク質のグループは、シスチンノットと呼ばれる共有構造的モチーフに基づいて構造上のスーパーファミリーとして分類されてきた。シスチンノットは、位相的に結ばれた3個の分子内ジスルフィド結合を形成する6個の保存システイン残基によって定義されるMcDonaldおよびHendrickson、1993。これらのタンパク質はまた、ホモまたはヘテロ二量体を形成し、すべてではないが一部の例では、二量体化が分子間ジスルフィド形成を含んでいる。このファミリーのメンバーには、TGF-β-スーパーファミリーのメンバー、および血小板由来成長因子-APDGF-A、PDGF-B、神経成長因子NGF、脳由来神経栄養因子BDNF、ニューロトロフィン-3NT-3、NT-4および血管内皮成長因子VEGFなどの他のタンパク質が含まれる。システインブロッキング剤もまた、この構造モチーフを有するタンパク質、およびこれらのタンパク質のシステイン付加変異体の発現、回収および精製を促進すると考えられる。本発明はまた、他の組み換えタンパク質および/またはそれらのタンパク質のシステイン付加変異体の発現、回収および精製を促進することができる。本発明が有用であると思われるタンパク質の種類には、プロテアーゼおよび他の酵素、プロテアーゼ阻害剤、サイトカイン、サイトカイン拮抗薬、サイトカイン選択的作動薬、アレルゲン、ケモカイン、ゴナドトロフィンgonadotrophins、ケモタクチン、脂質結合タンパク質、下垂体ホルモン、増殖因子、ソマトメジン、免疫グロブリン、インターロイキン、インターフェロン、可溶性受容体、細胞表面受容体の細胞外領域、ワクチン、単鎖抗体およびヘモグロビンが含まれる。タンパク質の具体的な例には、例えばレプチン、インスリン、インスリン様増殖因子IおよびIIIGF-IおよびIGF-II、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、アスパラギナーゼ、ウリカーゼ、線維芽細胞増殖因子、アルギナーゼ、アンジオスタチン、エンドスタチン、VIII因子、IX因子、インターロイキン1受容体拮抗薬、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン放出因子、カルシトニン、VEGF受容体の細胞外領域、プロテアーゼネキシンおよびアンチトロンビンIIIが含まれる。PEG化による恩恵を受け、したがってシステイン付加修飾に適当な候補と思われる他のタンパク質変異体には、溶解性が不十分か凝集する傾向のあるタンパク質もしくはペプチド、タンパク質分解を受けやすいタンパク質もしくはペプチド、機械的安定性を改善する必要があるタンパク質もしくはペプチド、身体から急速に消失するタンパク質もしくはペプチド、または望ましくない免疫原性もしくは抗原性antigenticproperttyを有するタンパク質もしくはペプチドが含まれる。所望の場合には、これらのタンパク質のシステインまたは他のアミノ酸ムテインを一般的に、以下の実施例およびそれぞれの全体を引用により本明細書に組み込むPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されているように、部位特異的PCRをベースとする変異誘発を用いて構築することができる。PCRをベースとするPCR手順を用いてムテインを構築する方法は、MethodsinMolecularBiology、Vol.15:PCRProtocols:CurrentMethodsandApplicationseditedbyWhite、B.A.1993HumanaPress、Inc.、Totowa、NJおよびPCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplicationseditedbyInnis、M.A.他1990AcademicPress、Inc.SanDiego、CAに一般論として記載されている。当技術分野で知られている方法を用い、例えば以下の実施例に記載する方法のように、細胞の起源に応じて細胞質中でタンパク質の発現を誘発し、またはタンパク質の分泌を誘導することができる。多種多様のシグナルペプチドを用いて、タンパク質を大腸菌の周辺質空間まで運ぶことに成功してきた。これらの例には、ompA、stII、PhoAシグナルDenefle他、1989、OmpTJohnson他、1996、LamBおよびOmgFHoffmanおよびWright、1985、ベータ-ラクタマーゼKadonaga他、1984、エンテロトキシンLT-A、LT-BMorioka-Fujimoto他、1991、および黄色ブドウ球菌由来のタンパク質AAbrahmsen他、1986などの原核生物のシグナル配列が含まれる。ある種のタンパク質の分泌を容易にする多くの非天然、合成シグナル配列も当業者には知られている。次に、宿主細胞を溶解する。細胞溶解は、以下に述べる可溶化手順の前、または同時に行うことができる。細胞溶解は、例えばフレンチ圧力セルなどの機械的せん断、酵素消化、音波処理、均質化、ガラスビーズボルテックス、界面活性剤処理、有機溶媒、凍結解凍、アルミナまたは砂による粉砕、以下に定義する変性剤による処理などによって行うことができるBollag他、1996。任意選択で、変性剤、ジスルフィド還元剤、またはシステインブロッキング剤の存在下で細胞を溶解することができる。任意選択で、不溶性または凝集性材料を、遠心分離、濾過限外濾過を含む、沈殿反応、凝集floculation、または沈降などの様々な方法によって可溶性タンパク質から分離することができる。次に、不溶性または凝集性材料または事前に溶解しない細胞全体を変性剤、およびシステインブロッキング剤でもあるジスルフィド還元剤に暴露することにより不溶性または凝集性材料または事前に溶解しない細胞全体を可溶性または単量体にする。有用な変性剤には、尿素、グアンジンguandine、アルギニン、チオシアン酸ナトリウム、極端なpH希酸または希塩基、界面活性剤SDS、サルコシル、塩塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、セチルメチルアンモニウム塩、トリクロロ酢酸塩、化学的誘導体化亜硫酸分解、シトラコン酸無水物との反応、溶媒2-アミノ-2-メチル-1-プロパノールまたは他のアルコール、DMSO、DMF、またはQ-セファロースなどの強陰イオン交換樹脂が含まれる。尿素の有用な濃度は1~8Mであり、5~8Mが好ましい濃度である。グアニジンの有用な濃度は1~8Mであり、4~8Mが好ましい濃度である。システインブロッキング剤でもある有用なジスルフィド還元剤には、システイン、チオグリコール酸、還元型グルタチオンおよびシステアミンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は0.5~200mMの範囲で用いることができ、1~50mMが好ましい濃度である。システイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸およびシステアミンが好ましい還元剤であるのは、それらがシステインブロッキング剤でもあるため、すなわちタンパク質中の遊離システイン残基と反応して可逆的にブロックされた遊離システイン残基を生成するためである。可溶化ステップ中にシステインブロッキング剤でもあるジスルフィド還元剤を使用すると、不溶性または凝集性タンパク質を可溶性の活性型にリフォールディングする全過程に必要な化合物数およびステップ数が減少する。さらに、システインブロッキング剤を使用すると、後述する様々なシステイン反応性部分および手順を用いる遊離システイン残基における誘導体化に適したリフォールディングされたタンパク質の形が得られる。変性/還元混合物のpHはpH6とpH10の間であることが好ましい。手順中の次のステップは、タンパク質をリフォールディングしてタンパク質の天然の立体配置および天然のジスルフィド結合を得ることである。リフォールディングは、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで変性剤および還元剤の濃度を低下させることにより行われる。これは、透析、希釈、ゲル濾過、タンパク質の沈殿を介して、または樹脂上への固定化と続く緩衝液洗浄によって行うことができる。このステップの条件は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の再生が行えるように選択する。これは、ジスルフィド交換反応を触媒するために、酸化剤、または酸化剤と還元剤の酸化還元混合物を添加することによって行うことができる。天然のジスルフィド結合形成および可逆的にブロックされた遊離システイン残基をもたらす試薬または試薬の組合せが選択される、すなわち試薬および試薬の組合せがシステインブロッキング剤としての役割を果たすことが好ましい。有用な酸化剤の例には、酸素、シスチン、酸化型グルタチオン、シスタミン、およびジチオグリコール酸が含まれる。有用な酸化還元混合物の例には、システイン/酸素、システイン/シスチン、システイン/シスタミン、システアミン/シスタミン、還元型グルタチオン/酸化型グルタチオンなどが含まれる。任意選択で、DTTまたは2-メルカプトエタノールなどの還元剤をリフォールド混合物に添加し、ジスルフィド交換を促進することができる。任意選択で、銅CuまたはコバルトCoなどの金属イオンをリフォールド混合物に添加し、タンパク質酸化を促進することができる。リフォールド混合物中の金属イオンの有用な濃度は1μMから1mMであり、40μMが好ましい濃度である。リフォールド混合物のpHはpH6とpH10の間であることが好ましい。あるいは、変性剤、およびシステインブロッキング剤であってもなくてもよいジスルフィド還元剤を用いることにより、不溶性または凝集性材料または前もって溶解しない細胞全体を可溶性または単量体にする。有用な変性剤には上述の変性剤が含まれるが、それらに限定されるものではない。有用なジスルフィド還元剤の例には、DTT、2-メルカプトエタノール、水素化ホウ素ナトリウム、三級ホスフィンならびにシステイン、還元型グルタチオン、チオグリコール酸およびシステアミンなどのチオールが含まれるが、これらに限定されるものではない。DTTおよび2-メルカプトエタノールは0.5~200mMの範囲で用いることができ、1~50mMが好ましい濃度である。次いで、変性および還元されたタンパク質を、還元された場合にシステインブロッキング剤としての役割を果たすモル過剰還元剤の濃度に対してのジチオール試薬と混ぜる。還元された場合にシステインブロッキング剤としての役割を果たす有用なジチオール試薬には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸、5,5′-ジチオビス2-ニトロ安息香酸Ellman′s試薬、ピリジンジスルフィドなどのジスルフィド結合を含む化合物、Rが有機化合物であるタイプR-S-S-CO-OCH3の化合物、ジホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシスチン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチン、ジチオジプロピオン酸、ジメチルシスチンなどのシスチンの他の誘導体、またはジスルフィド交換反応を受けることができるいずれのジチオールもしくは化学薬品も含まれる。タンパク質のリフォールディングは、変性剤の濃度を低下させ後述の方法を用い、システイン、ジチオスレイトール、2-メルカプトエタノール、還元型グルタチオン、チオグリコール酸または他のチオールなどの還元剤を添加することによってジスルフィド交換を促進することによって開始させる。天然のジスルフィド結合形成および可逆的にブロックされた遊離システイン残基をもたらす試薬および試薬の組合せが選択されることが好ましい。任意選択で、銅CuまたはコバルトCoなどの金属イオンをリフォールド混合物に添加し、タンパク質酸化を促進することができる。任意選択で、グリセロールをリフォールド混合物に添加し、リフォールディングされたタンパク質の収率を向上することができる。リフォールド混合物中のグリセロールの有用な濃度は1~50体積/体積であり、10~20が好ましい範囲である。リフォールド混合物のpHは6~10であることが好ましい。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、本発明の方法で用いるシステインブロッキング剤は、遊離システイン残基と共有結合し、混合ジスルフィドを形成することにより、遊離システイン残基を安定化し、タンパク質の多量体化および凝集を防ぐと考えられる。多くのチオール反応性化合物をシステインブロッキング剤として用い、遊離システインを含有するタンパク質を安定化することができる。システイン、システアミン、チオグリコール酸および還元型グルタチオンの他に、システインブロッキング剤には、シスチン、シスタミン、ジチオグリコール酸、酸化型グルタチオン、5,5′-ジチオビス2-ニトロ安息香酸Ellman′s試薬、ピリジンジスルフィドなどのジスルフィド結合を含む試薬、R-S-S-CO-OCH3型の化合物、ジホルミルシスチン、ジアセチルシスチン、ジグリシルシスチン、ジアラニルシスチン、ジグルタミニルシスチン、シスチニルジグリシン、シスチニルジグルタミン、ジアラニルシスチン二無水物、シスチンフェニルヒダントイン、ホモシスチン、ジチオプロピオン酸、ジメチルシスチンなどのシスチンの他の誘導体、またはジスルフィド交換反応を受けることができるいずれのジチオールもしくは化学物質も含まれる。ハロゲン化スルフェニルも混合ジスルフィドの調製に用いることができる。遊離システイン残基を含有するタンパク質を安定化するのに使用法が見いだされる他のチオールブロッキング剤には、遊離チオールと可逆的に反応できる化合物が含まれる。これらの試剤には、ある種の重金属塩または亜鉛、水銀および銀の有機誘導体が含まれる。他のメルカプチド生成剤または可逆的チオール反応性化合物はCecilおよびMcPhee1959ならびにTorchinskii1971によって述べられている。任意選択で、遊離システイン残基を含有するリフォールディングされた可溶性タンパク質は、リフォールド混合物の可溶性分画中の他のタンパク質から回収および単離される。このような回収および精製方法は、当業者に知られているか容易に決定され、例えば遠心分離、濾過、透析、ならびにサイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用およびアフィニティクロマトグラフィ処理を含むクロマトグラフィなどが含まれる。所望のタンパク質の回収および精製に適している方法は、タンパク質の性質および意図する使用法によってある程度異なる。本発明はまた、生物学的に活性なG-CSFタンパク質、特に野生型G-CSF、G-CSFC17S、ならびにシステイン変異体を含むG-CSFおよびG-CSFC17S変異体まとめてG-CSFタンパク質と呼ぶを製造する新規な方法であって、適切にプロセシングされ生物学的に活性な回収G-CSFタンパク質の割合に著しい増加をもたらす方法も提供する。これらの新規な方法には、stIIシグナル配列を用いて大腸菌周辺質中にG-CSFタンパク質を分泌させること、不溶性または凝集性G-CSFタンパク質を変性およびリフォールディングすること、および再生/リフォールド混合物の可溶性分画中の他のタンパク質から可溶性でリフォールディングされたG-CSFタンパク質を精製することが含まれる。回収G-CSFタンパク質は、G-CSFタンパク質が大腸菌の細胞内で発現された場合に存在する非天然N末端メチオニン残基を欠く。公表された報告Perez-Perez他、1995は、修飾ompAリーダー配列を用いる大腸菌周辺質へのG-CSFの分泌について記載している。しかしながら、発現したomp-A-G-CSF融合タンパク質が適切にプロセシングされて得られる成熟G-CSFは極めてわずかであった。適切にプロセシングされたG-CSFタンパク質の割合は、大腸菌dnaJおよびdnaKタンパク質の同時発現により発現された全G-CSFタンパク質の10~30まで増加すると考えられる。いずれの場合にも、分泌したG-CSFタンパク質は極めて不溶性で生物学的に不活性である。本発明の方法では、適切にプロセシングされたG-CSFタンパク質が少なくとも80~100得られ、dnaKおよびdnaJタンパク質の同時発現を必要としない。本発明はまた、不溶性の分泌G-CSFタンパク質を生物学的に活性な形に変性およびリフォールディングする方法を初めて提供する。これらの方法に従って得られる精製タンパク質は、所望の場合にはさらに処理することができる。例えば、単離されたタンパク質を、様々なシステイン反応性部分により遊離システイン残基で修飾することができる。例えば、タンパク質を様々なシステイン反応性PEG試薬により遊離システイン残基でPEG化し、続いてモノPEG化タンパク質として精製することができる。用語モノPEG化は、タンパク質への単一のPEG分子の共有結合により修飾されたタンパク質を意味すると定義される。当業者に知られているいずれの方法を用いても非修飾タンパク質および未反応PEG試薬からPEG化タンパク質を精製でき、その方法には、以下の実施例、ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の方法が含まれる。他の有用なシステイン反応性部分の例は、システイン反応性デキストラン、システイン反応性炭水化物およびシステイン反応性ポリN-ビニルピロリドンである。本発明はまた、GH、G-CSF、GM-CSF、α-インターフェロンおよび2N1個のシステイン残基を含有する他のタンパク質、ならびに2N個のシステイン残基を含有し、2個以上のシステイン残基が遊離している他のタンパク質のシステインムテイン、特に遊離システイン残基が混合ジスルフィドでブロックされているそれらのムテインおよびタンパク質をPEG化する方法を提供する。本発明はさらに、生物学的に活性であるばかりでなく、タンパク質依存性の哺乳動物細胞増殖アッセイで高い特異的活性を保持する、本明細書に記載された方法によって製造される精製モノPEG化タンパク質変異体に関する。このようなタンパク質変異体には、例えばG-CSF、GH、GM-CSFおよびIFN-α2の精製モノPEG化システインムテインが含まれる。例えば、本明細書に記載のある種のモノPEG化G-CSF変異体のインビトロにおける生物活性は、アミン反応性NHS-PEG試薬を用いてPEG化されたG-CSFの生物活性に比べて3~50倍大きい。25個以上の異なるIFN-α遺伝子があるPestka他、1987。IFN-αファミリーのメンバーは、様々なアミノ酸相同性を共有し、重複する生物活性を示す。様々なIFN-αタンパク質の領域を結合することにより作成された非天然組み換えIFN-αが様々な臨床開発段階にあるHorisbergerおよびDiMarco、1995。IFN-αの各位置に最も一般的なアミノ酸を組み入れた非天然コンセンサスインターフェロンBlatt他、1996も記載されている。本発明の方法はまた、他のα-インターフェロン分子種および遊離システイン残基を含有する非天然α-インターフェロンタンパク質をリフォールディングするのに有用である。IFN-α2のシステインムテインをPEG化するのに有用な部位および領域は、IFN-α遺伝子ファミリーの他のメンバーおよび非天然IFN-αに直接適用できる。Kinstler他1996は、アミンまたはアミド結合を介して、タンパク質がN末端非天然メチオニン残基で優先的にモノPEG化されるモノPEG化コンセンサスインターフェロンについて記載した。PEG化タンパク質の生物活性は、非修飾コンセンサスインターフェロンに比べて約5分の1に低下したKinstler他、1996。モノPEG化G-CSFの一実施形態では、G-CSFのへリックスAに近接する領域にポリエチレングリコールが結合され、得られるモノPEG化G-CSFは、約1000pg/ml約50pM未満、好ましくは約100pg/ml約5pM未満、より好ましくは約20pg/ml約1pM未満および最も好ましくは約15pg/ml約0.7pM未満のEC50を有する。あるいは、G-CSFのC-Dループにポリエチレングリコール部分を結合させることができ、得られるモノPEG化G-CSFは、約1000pg/ml約50pM未満、好ましくは約100pg/ml約5pM未満、より好ましくは約20pg/ml約1pM未満および最も好ましくは約15pg/ml約0.7pM未満のEC50を有する。あるいは、G-CSFのヘリックスDに対して遠位の領域にポリエチレングリコール部分を結合させることができ、得られるモノPEG化G-CSFは、約1000pg/ml約50pM未満、好ましくは約100pg/ml約5pM未満、より好ましくは約20pg/ml約1pM未満および最も好ましくは約15pg/ml約0.7pM未満のEC50を有する。Kinstler他1996は、アミンまたはアミド結合を介して、タンパク質がN末端非天然メチオニン残基で優先的にモノPEG化されるモノPEG化野生型G-CSFについて記載した。モノPEG化G-CSFの生物活性は、非修飾G-CSFに比べて約30低下したと報告されているが、EC50は示されなかったKinstler他、1996。Kinstler他1996は、G-CSF中のヘリックスAに近接する領域の他のアミノ酸を修飾することが、生物学的に活性なG-CSFタンパク質をもたらすか否かについては解決していない。本発明の一目的は、PEGを結合させることができるG-CSF中のヘリックスAに近接する領域、および他の領域にあり、生物学的に活性なモノPEG化G-CSFタンパク質をもたらす他のアミノ酸位置を開示することである。モノPEG化GM-CSFの一実施形態では、GM-CSFのヘリックスAに近接する領域にポリエチレングリコールが結合され、得られるモノPEG化GM-CSFは、約14000pg/ml約1000pM未満、好ましくは約1400pg/ml約100pM未満、より好ましくは約280pg/ml約20pM未満および最も好ましくは約140pg/ml約10pM未満のEC50を有する。あるいは、GM-CSFのB-Cループにポリエチレングリコール部分を結合させることができ、得られるモノPEG化G-CSFは、約14000pg/ml約1000pM未満、好ましくは約1400pg/ml約100pM未満、より好ましくは約280pg/ml約20pM未満および最も好ましくは約140pg/ml約10pM未満のEC50を有する。あるいは、GM-CSFのC-Dループにポリエチレングリコール部分を結合させることができ、得られるモノPEG化GM-CSFは、約14000pg/ml約1000pM未満、好ましくは約1400pg/ml約100pM未満、より好ましくは約280pg/ml約20pM未満および最も好ましくは約140pg/ml約10pM未満のEC50を有する。モノPEG化GHの一実施形態では、GHのヘリックスAに近接する領域にポリエチレングリコールが結合され、得られるモノPEG化GHは、約2000ng/ml約100nM未満、好ましくは約200ng/ml約10nM未満、より好ましくは約20ng/ml約1nM未満および最も好ましくは約2ng/ml約0.1nM未満のEC50を有する。本発明はさらに、二量体、三量体および四量体などの高次の多量体を製造するために互いと、または化学基と共有結合または抱合させることができるタンパク質変異体を提供する。このような高次の多量体は、当業者に知られている方法に従い、または実施例2および20に記載のように製造することができる。例えば、このような抱合は、対応する天然タンパク質よりも大きな分子量を有するGH、G-CSF、GM-CSFまたはα-IFN付加物を製造することができる。カップリングに適している化学基は、非毒性および非免疫原性であることが好ましい。これらの化学基には炭水化物、またはポリオールなどのポリマーが含まれるであろう。本発明のシステイン変異体に結合させてPEG化タンパク質を形成するのに有用なPEG部分には、適当なポリマー、例えば直鎖または分枝鎖ポリオールが含まれる。好ましいポリオールは、ポリエチレングリコールであり、これはエチレンオキシド単位からなる合成ポリマーである。エチレンオキシド単位は、約10,000から500,000kDa以上までのサイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量でPEG化タンパク質変異体を得ることができるように変えることができる。PEG部分のサイズは循環半減期に直接影響するYamaoka他、1994。したがって、一般にはPEG部分のサイズまたは構造を変えることにより特定の治療応用または好ましい投与計画のために異なる循環半減期を有するタンパク質変異体を設計することになる。すなわち、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDa以上、より好ましくは約70kDa以上の見かけの分子量を有し、EC50が約400ng/ml約18nM未満、好ましくは100ng/ml約5nM未満、より好ましくは約10ng/ml約0.5nM未満およびさらにより好ましくは約2.2ng/ml約0.1nMであるGHタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、EC50が約100ng/ml5nM未満、好ましくは1000pg/ml50pM未満、より好ましくは100pg/ml6pM未満およびさらにより好ましくは約15pg/ml0.7pMであるG-CSFタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、IC50が約1900pg/ml100pM未満、好ましくは400pg/ml21pM未満、より好ましくは100pg/ml5pM未満、およびさらにより好ましくは約38pg/ml2pMであるアルファIFNIFN-αタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、EC50が約14,000pg/ml約1000pM未満、好ましくは1400pg/ml約100pM未満、より好ましくは280pg/ml20pM未満、およびさらにより好ましくは約140pg/ml約1pMであるGM-CSFタンパク質変異体を包含する。システイン修飾用の反応性PEG末端基には、ビニルスルホン、マレイミドおよびヨードアセチル成分が含まれるが、これらに限定されるものではない。PEG末端基はチオールに特異的で、タンパク質を損なわない条件下で反応が起きなければならない。拮抗薬のhGH変異体も、PCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されているように、システイン付加変異体GHを用いて調製することができる。GH拮抗薬の投与から恩恵を受けると考えられる状態には、末端肥大症、血管性眼疾患、糖尿病性ネフロパシー、血管形成術後の再狭窄および成長ホルモン感受性悪性腫瘍が含まれる。本明細書では、用語誘導体は、本方法によって発現および回収されるタンパク質のいかなる変異体も意味する。このような変異体には、PEG化バージョン、二量体および他の高次変異体、アミノ酸変異体、切断変異体、融合タンパク質、炭水化物の変化、天然タンパク質上に見いだされるリン酸化または他の結合基、および本明細書に開示された他のいかなる変異体も含まれるが、これらに限定されない。本方法によって製造される化合物は、インビトロおよびインビボにおける様々な使用法に用いることができる。本発明のタンパク質およびそれらの誘導体は、それらの野生型、天然、または従来から知られている修飾対応物について知られている研究、診断または治療目的に用いることができる。インビトロにおける使用法には、例えば、他のタンパク質をスクリーニング、検出かつ/または精製するためのタンパク質の使用法が含まれる。治療に使用する場合には、当業者は適当な投与量、投与回数および投与経路を容易に決定することができる。このような決定を行うに際しての要素には、投与するタンパク質の性質、治療される状態、潜在的な患者のコンプライアンス、患者の年齢および体重などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の化合物はまた、結合した治療薬の循環半減期を高めるための送達手段として、または体内の特異的標的への直接的送達のために使用することができる。以下の実施例は、限定することは意図しておらず、本発明の特定の実施形態の例示に過ぎない。実施例実施例1成長ホルモンムテインT3Cのリフォールディング組み換えヒト成長ホルモンhGHおよびhGHシステインムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。hGHのシステインムテインを構築する方法もPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。大腸菌でhGHを発現するための好ましい方法の一つは、STIIリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌されたhGHは可溶性であり、PCT/US00/00931に記載されているようにカラムクロマトグラフィにより精製することができる。hGHのある種のシステインムテインは、STIIリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。不溶性の分泌hGHタンパク質をリフォールディングする方法はこれまで記載されたことは未だない。不溶性のhGHシステインムテインを生物学的に活性な形にリフォールディングするために以下のプロトコルを開発した。不溶性のGHT3Cムテイン3位のスレオニンをシステインに変えた;PCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載は、PCT/US00/00931に記載したように、stIIリーダー配列を用いて周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現させた。T3Cタンパク質は、以下の2手順を用いて可溶化およびリフォールディングしたが、どちらも還元剤および遊離システイン残基を安定化するためのシステインブロッキング剤としてシステインを用いる。T3Cムテインを発現する大腸菌株の培養液200mlを培養し、PCT/US00/00931に記載したようにT3Cの発現を誘導した。細胞を溶解し、実施例14に記載したように不溶性部分を遠心分離によって単離した。T3Cを含有する不溶性材料を8M尿素、20mMシステイン、20mMトリス、pH920mLに溶かし、振とうすることにより室温で1時間混ぜた。次に可溶化混合物を2つに分割し、半分は10グリセロール、20mMトリス、pH850mL中に希釈し、別の半分は0.5TWEEN20、20mMトリス、pH850mL中に希釈した。リフォールドを4°Cに24時間保ち、遠心分離によって透明にし、20mMトリス、0.5TWEEN20、pH7.6で予め平衡化したQ-セファロースHiTrapカラム5mLに載せた。リフォールディングされた可溶性T3Cは、0.5TWEEN20、20mMトリス、pH7.6に溶かした0~300mMNaClの20カラム体積グラジエント中にカラムから溶出された。回収されたカラム分画を非還元SDS-PAGEにより分析した。単量体T3Cは、およそ160mMNaClで溶出した。再生緩衝液中のグリセロールを含有するリフォールドから単量体T3C約790μgが回収された。再生緩衝液中にTween20が存在する場合には、リフォールドから単量体T3C約284μgが回収された。この結果は、どちらのリフォールド/再生手順を用いても可溶性単量体T3Cタンパク質を得ることができることを示している。単量体T3Cタンパク質がより高い回収率であったことから、続くリフォールド実験では安定剤としてグリセロールを用いた。実施例2成長ホルモンT3Cムテインをリフォールディングするために使用した還元剤の比較T3Cムテインを発現する大腸菌株の培養液200mlを培養し、PCT/US00/00931に記載したようにT3Cを発現させた。実施例5および14に記載のように、細胞の界面活性剤/リゾチーム処理で細胞を溶解することにより不溶性T3Cを単離した。この材料を8M尿素、20mMトリス、pH920mLに懸濁し、3管に等分した。第一管リフォールドAには還元剤を加えず、第二管リフォールドBには5mMDTTを加え、第三管リフォールドCには20mMシステインを加えた。室温で1時間混ぜた後、可溶化物を10グリセロール、20mMトリス、pH830mL中に希釈した。リフォールドを一夜4°Cに保った。翌日、遠心分離によってリフォールドを透明にし、PCT/US00/00931に記載したようにQ-セファロースHiTrapカラム5mLに載せた。回収されたカラム分画を非還元SDS-PAGEにより分析した。リフォールドA還元剤なしから回収されたT3Cタンパク質は、Q-セファロースカラムからいくつかの幅広いピークとして溶出した。SDS-PAGEによれば、回収タンパク質生成物には多少の単量体T3Cタンパク質が存在したが、大部分は凝集性T3C二量体210mMNaClで溶出するおよびT3C三量体300mMと1000mMNaClの間で溶出するからなっていた。単量体および二量体T3Cタンパク質の最終的な回収率を表1に示す。リフォールドB5mMDTTを含むから回収されたT3Cタンパク質は、Q-セファロースカラムから単一の幅広いピークとして溶出したが、非還元SDS-PAGE分析によると不均一であった。単量体T3Cバンドは、下垂体hGHバンドよりはるかに幅広く、T3Cの様々なジスルフィドアイソフォームに相当すると思われる多くの異なる分子量の単量体分子種を含んでいた。いくつかの分画では少量の二量体T3Cタンパク質も検出された。リフォールドC還元剤としてシステインを使用からは主に単量体T3Cタンパク質が得られ、160mMNaClでQ-セファロースカラムから溶出するピークの鋭さおよび非還元SDSPAGEにより分析した場合の正しい分子量標準の下垂体hGHに対してにおけるタンパク質バンドの鋭さによって立証されるように、単一で均一な分子種であるように見えた。単量体および二量体形態のT3Cの各リフォールドからの最終的な回収率を表1に示す。データは、システインの存在下でT3Cタンパク質を可溶化/リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはDTTの存在下でタンパク質を可溶化/リフォールディングするよりも可溶性単量体T3Cタンパク質が高収率で得られることを示している。この結果はまた、システインの存在下でT3Cタンパク質を可溶化/リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはDTTの存在下でタンパク質を可溶化/リフォールディングするよりも可溶性単量体T3Cタンパク質がより安定で均一な調製物として得られることを示している。可溶化混合物中にDTTを含有するリフォールドBから回収された単量体T3Cタンパク質は、タンパク質をジスルフィド結合形成が可能な条件下に置くことによって安定なジスルフィド結合のホモ二量体T3Cタンパク質に変換することができる。これらには、酸化剤をタンパク質に添加する条件、またはpHが中性もしくはアルカリ性に近い場合にジスルフィド転位を受けることができる第二のジスルフィド結合試薬の添加による条件が含まれる。使用することができた酸化剤の例には、テトラチオン酸ナトリウムまたは酸素が含まれる。任意選択で、銅またはコバルトなどの微量の二価金属イオンを添加して反応を触媒することができる。有用なジスルフィド結合試薬には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸、または他の低分子量ジチオールが含まれる。あるいは、単量体T3Cタンパク質を酸性pHで維持し、凝集および望ましくないジスルフィド転位を防ぐことができる。実施例1および2に記載の手順に従って調製された可溶性でリフォールディングされたGHシステインムテインは、当業者に知られている様々なクロマトグラフィ手順によって精製することができる。これらのクロマトグラフ手順には、イオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用HIC、金属キレート化アフィニティクロマトグラフィIMAC、サイズ排除クロマトグラフィSEC、逆相クロマトグラフィまたはこれらの技術の組合せが含まれる。一例としては、20mMトリス-HCl、pH8.0で平衡化したQ-セファロースファストフローfastflow樹脂Pharmaciaを用い、リフォールド混合物の可溶性分画からGHムテインを捕捉することができる。カラムを20mMトリス-HCl、pH8.0で洗浄し、20mMトリス-HCl、pH8.0に溶かした0から250mMNaCl10~20体積の線形漸増塩グラジエントにより結合タンパク質を溶出することができる。任意選択で、グリセロール10の最終濃度をカラム緩衝液に加えることができる。hGHムテインを含有する分画は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法により同定することができる。リフォールド/再生混合物の可溶性分画からhGHムテインを捕捉するのに用いることができる代わりの樹脂には、HIC、他のイオン交換樹脂または親和性樹脂が含まれる。システインムテインは、疎水性相互作用クロマトグラフィによりさらに精製することができる。GHムテインを含有するQ-セファロースカラム分画をプールし、2Mの最終濃度までNaClを加えることができる。このプールを、予め2MNaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH7.5で平衡化したブチル-セファロースファストフロー樹脂上に載せることができる。20mMリン酸塩、pH7.5に溶かした2Mから0MNaClの逆塩グラジエントを用い、樹脂からGHムテインを溶出することができる。GHムテインを含有する分画は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法により同定し、プールすることができる。あるいは、GHムテインを含有するQ-セファロース分画をプールし、フェニル-セファロースカラム上に載せる前に2Mの最終濃度まで硫酸アンモニウムを加えることができる。20mMリン酸ナトリウム、pH7.5に溶かした2Mから0M硫酸アンモニウムの逆塩グラジエントを用い、樹脂からGHムテインを溶出することができる。GHムテインを含有する分画をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット法により同定し、プールすることができる。さらに精製が求められる場合には、10mMリン酸ナトリウム、0.5MNaCl、pH7.5で平衡化したニッケルキレート樹脂Qiagen上に、GHムテインを含有するHICプールを直接載せることができる。洗浄ステップの後、10mMリン酸ナトリウム、0.5MNaCl、pH7.5に溶かした0~30mMイミジゾールimidizoleを用いてGHムテインを回収することができる。GHは、おそらくH18、H21およびE174により形成された二価金属結合部位を介してニッケルに対する高い親和性を有している。結果として、金属キレート化カラムを用い、GHを高純度で得ることができるMaisano他、1989。GHムテインはニッケルカラムに固く結合し、野生型GHと同様のイミダゾール濃度約15mMで溶出するはずである。あるいは、銅キレート樹脂をニッケルキレート樹脂の代わりに用いることができる。精製されたGHシステインムテインの生物活性は、PCT/US00/00931に記載の細胞増殖アッセイを用いて測定することができる。タンパク質濃度は、Bradford染料結合アッセイBio-RadLaboratoriesを用いて決定することができる。T3Cムテインを以下の通り精製した。大腸菌培養液600mLを培養し、上述のようにT3Cタンパク質の発現を誘導した。実施例5および14に記載するように界面活性剤/リゾチーム混合物B-Per商標、Pierceで細胞を処理することにより不溶性T3Cを単離した。不溶性材料を8M尿素、20mMトリス、20mMシステイン、pH940mLに懸濁した。室温で1時間混ぜた後、可溶化混合物を15グリセロール、20mMトリス、pH8、40μM硫酸銅200mL中に希釈した。リフォールドを一夜4°Cに保った。翌日、遠心分離によってリフォールドを透明にし、10グリセロール、20mMトリス、pH8で平衡化したQ-セファロースHiTrapカラム5mL上に載せた。20mMトリス、pH8、10グリセロールに溶かした0~250mMNaClの20カラム体積のグラジエントによる溶出でT3Cを回収した。回収された分画を非還元SDS-PAGEにより分析した。正しい見かけ分子量のT3Cタンパク質を主に含有する分画をプールした。プールした分画から精製されたT3Cタンパク質4.6mgが得られた。この材料を実施例3に記載のPEG化研究に用いた。精製されたT3Cタンパク質の生物活性は、実施例1および2ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載のGH-R4細胞増殖アッセイで測定した。T3Cタンパク質は、1.35ng/mlのEC50でGH-R4細胞の増殖を促進した。この手順によって調製した他のシステインムテインには、-1C、P2C、P5C、K38C、Q40C、K41C、S55C、S57C、T60C、Q69C、N72C、N99C、L101C、V102C、Y103C、D130C、S132C、P133C、R134C、T135C、Q137C、K140C、Q141C、T142C、Y143C、K145C、D147C、N149C、S150C、H151C、N152C、D153C、E186C、およびG187Cが含まれる。特定の精製GHシステインムテインの生物活性は、PCT/US00/00931に記載のGH-R4細胞増殖アッセイで測定した。ムテイン-1C、P2C、P5C、K38C、Q40C、S55C、N99C、L101C、V102C、Y103C、P133C、Q137C、K140C、Y143C、D147C、N149C、E186C、およびG187Cで実測されたEC50は、0.7ng/mlから2.2ng/mlまでの範囲であった。これらの値はすべて、これらのアッセイで0.3ng/mlから1.5ng/mlの範囲である野生型GH対照で実測されたEC50とほぼ等しかった。実施例3PEG化および遊離システイン残基を含有するPEG化形のタンパク質を精製するための一般法遊離システイン残基を含有するタンパク質は、市販されている様々なシステイン反応性PEG-マレイミドまたはPEG-ビニルスルホンを用いてPEG化することができる。組み換えタンパク質は一般的に、遊離システインの最適なPEG化を行うためにジチオスレイトールDTT、トリス2-カルボキシエチルホスフィン-HClTCEP、またはいくつかの他の還元剤で部分的に還元する。この部分的還元ステップを行わない場合には、遊離システインはシステイン反応性PEGに対して比較的非反応性である。各ムテインを部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、様々なpHおよび温度における還元剤濃度の範囲を用いて経験的に決定することができる。還元剤濃度は通常、0.5モル当量から10倍モル過剰量まで変化する。好ましい温度は4°Cから37°Cである。pHは6.5から9.0までの範囲でよいが、7.5から8.5であることが好ましい。最適条件は、還元剤および暴露時間によって異なる。適切な条件下では、熱力学的により安定な天然ジスルフィドではなくて最も安定性の低いジスルフィド通常は分子間ジスルフィドおよび混合ジスルフィドが最初に切断される。通常、室温で30分間のDTT5~10倍モル過剰が効果的である。部分的還元は、逆相カラムからのタンパク質の溶出プロフィールにおける僅かなシフトによって検出することができる。部分的還元はまた、タンパク質試料の非還元SDS-PAGE分析による見かけの分子量の僅かなシフトによっても検出することができる。タンパク質を過還元over-reduceしたり別のシステイン残基を暴露しないように注意しなければならない。過還元は、逆相HPLCにより過還元されたタンパク質は完全に還元され変性したタンパク質に類似した保持時間を有するはずである、およびPEG化反応後に2個のPEGを含有するタンパク質分子の出現によりSDS-PAGE上の見かけ分子量の変化により検出可能検出することができる。システインムテインの場合には、対応する野生型タンパク質が対照としての役割を果たすが、それは天然の分子内ジスルフィドを還元しない条件下でPEG化してはならないからである。過剰の還元剤は、PEG化の前にサイズ排除クロマトグラフィまたは透析によって除去することができる。TCEPは、遊離チオール基を含有しないことからPEG化試薬の添加前に除去する必要はない。部分的に還元されたタンパク質を様々な濃度のPEG-マレイミドまたはPEG-ビニルスルホン通常、PEG:タンパク質モル比は1:1、5:1、10:1および50:1と反応させ、2種類の試薬の最適な比を決定する。タンパク質のPEG化は、例えばSDS-PAGEを用いて分子量シフトによってモニターすることができる。ジPEG化生成物を与えることなく有意な量のモノPEG化生成物をもたらす最少量のPEGが通常望ましいと考えられる。一部の例では、ある種の添加物がPEG化収率を向上することがある。これらの添加物には、EDTA、ホウ酸塩、カオトロープ尿素、グアニジン、有機溶媒、界面活性剤、浸透圧分解osmolytic安定剤ポリオール、糖、ポリマー、アミノ酸およびその誘導体、および他のイオン性化合物クエン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、四級アミン、塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、他が含まれるが、これらに限定されるものではない。EDTAの有用な濃度は0.01~10mMであり、0.5~1mMが好ましい濃度である。一般的に、モノPEG化タンパク質は、サイズ排除、イオン交換、アフィニティ、逆相、または疎水性相互作用クロマトグラフィによって非PEG化タンパク質および未反応PEGから精製することができる。モノPEG化タンパク質単一PEG分子がシステインムテインに結合したに富んだ分画は、SDS-PAGEおよび/またはウエスタンブロット法により同定することができる。これらの分画をプールし、冷凍保存することができる。PEG部分の存在は一般的に、樹脂に対するタンパク質の親和性を変化させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。2相有機抽出または塩沈殿などの他の精製プロトコルを用いることもできる。精製されたPEG化タンパク質は、本明細書に記載の様々な実施例ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の細胞増殖/阻害アッセイで試験することができる。PEG化タンパク質のインビボにおける有効性は、本明細書に示す実施例ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載したように決定することができる。PEG分子が適切な部位でタンパク質と結合していることを確認するための実験を行うことができる。この実験は、タンパク質の化学的またはタンパク質分解的消化、サイズ排除、イオン交換または逆相クロマトグラフィによるPEG化ペプチド大きな分子量を有しているはずのの精製と、続くアミノ酸配列決定によって行う。PEGとカップリングしたアミノ酸は、アミノ酸配列決定実行中にブランクとして出現するはずである。以下の条件を用いてGHムテインT3CをPEG化し、PEG化T3Cタンパク質を精製した。最初のPEG化反応条件は、実施例2に記載したように調製した還元剤ならびにタンパク質を可溶化およびリフォールディングするためのシステインブロッキング剤としてシステインを用いリフォールディングされたT3Cタンパク質の一部、還元剤としてのTCEP[トリス2-カルボキシエチルホスフィン]-HCl、およびShearwaterPolymersHuntsville、Alabama製の5kDaシステイン反応性PEGを用いて決定した。精製されたT3Cの一部2μgを、様々な過剰量の5kDAマレイミド-PEGまたは5kDaビニルスルホン-PEGの存在下で100mMトリス、pH8.5中室温でTCEP濃度を増加させながらインキュベートした。120分後、反応物の一部を直ちに非還元SDS-PAGEによって分析した。pH8.5では、5倍モル過剰量のTCEPおよび15倍モル過剰量の5kDAマレイミドまたは5kDaビニルスルホンPEGにより2時間後に、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化T3Cタンパク質が得られた。PEG化のためにTCEPなどの還元剤で処理することによりT3Cムテインを部分的に還元する必要があった。野生型GHは同一の部分的還元条件下でPEG化されず、このことはPEG部分がムテインに導入されたシステイン残基に結合していることを示している。これらの条件を用い、精製および生物活性の評価のためにPEG化反応をスケールアップした。5倍過剰量のTCEPおよび15倍の10kDaマレイミドPEGを用い、より大きなPEG化反応300μgを室温で2時間行った。反応時間の終了時にPEG化混合物を氷冷20mMトリス、15グリセロール、pH8.0で2倍に希釈し、直ちにQ-セファロースカラム1mL、HiTrap上に載せた。20mMトリス、15グリセロール、pH8.0に溶かした0~0.2MNaCl20mLグラジエントを実行することによりカラムからPEG化T3Cを溶出した。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。モノPEG化T3C単一PEG分子がT3C単量体に結合したに富んだ分画をSDS-PAGEによって同定し、プールして冷凍した。モノPEG化T3Cタンパク質は80mMNaClで溶出し、SDS-PAGEによる見かけの分子量は約30kDaであった。上述の方法により10KPEG-T3C、20KPEG-T3C、および40KPEG-T3Cも調製した。精製されたPEG-T3Cタンパク質の生物活性は、実施例1および2ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の細胞増殖アッセイで測定し、その比活性を決定した。PEG-T3Cタンパク質は、野生型GHおよび非PEG化T3Cタンパク質と同様にGH-R4細胞の増殖を促進した。5KPEG-T3Cタンパク質のEC50は1.2ng/mlであり、10KPEG-T3CのEC50は1.2ng/mlであり、20KPEG-T3CのEC50は3~4ng/mlであった。40K-PEG-T3CのEC50は、実施例1および2ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の細胞増殖アッセイを用いて決定することができた。PEG-T3Cおよび他のPEG化GHシステインムテインのインビボにおける有効性は、PCT/US98/14497およびPCT/US00/00931および実施例4に記載したように決定することができる。上記で概要を説明した手順に従ってPEG化および精製されたGHの他のシステインムテインには、P2C、P5C、S132C、P133C、およびR134Cが含まれる。20kDa-PEG部分で修飾されたこれらのムテインの生物活性は、実施例1および2ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の細胞増殖アッセイを用いて測定した。これらのPEG化ムテインムテインで実測されたEC50は、1.7ng/mlから6.0ng/mlまでの範囲であった。これらの値はすべて、並行して行われた野生型GH対照アッセイで実測されたEC50と類似していたが、僅かに大きかった。これらの野生型GH対照のEC50は、0.6ng/mlから1.2ng/mlまでの範囲であった。実施例4PEG-T3C成長ホルモンは、成長ホルモン欠損ラットにおける体成長を促進するA.PEG-T3Cの体成長を促進する能力は、下垂体の除去により成長ホルモンの合成ができない下垂体摘出HYPOXラットで測定した。HYPOX雄Sprague-Dawleyラットは民間の供給メーカーから購入し、体重は約90gであった。ラットを13日間馴化させた。馴化の間に4g以上増加した動物は試験から除いた。体重測定は毎日同じ時間に行った9:30AM。ラットを体重別に様々な試験群に無作為割り付けした。1群当たり5匹のラットとしたが、ただし20kDa-PEG-T3Cを毎日投与する群は4匹のラットのみであった。ラットの体重を毎日測定し、プラセボラット血清アルブミンSigmaChemicalCompany200μg/mlを含有するリン酸緩衝食塩水PBS、市販の組み換えヒト成長ホルモン、ニュートロピン登録商標、または様々な投与量の実施例3に記載のように調製した20kDa-PEG-T3Cを毎日または1日おきに皮下注射で投与した。すべてのタンパク質溶液は、ラット血清アルブミン200μg/mlを含有するPBS中で調製した。動物は連続9日間処理した。10日目に動物を屠殺し頸骨を採取した。頸骨を10中性緩衝ホルマリン中で固定した。5ギ酸中で固定した頸骨から石灰質を除き、前面の近接端部で分割した。頸骨をパラフィン包埋のために加工して8ミクロンの薄片を作り、トルイジンブルーで染色した。頸骨の骨端幅を左の脛骨で測定した1頸骨当たり5回測定。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端測定を表2に示す。この結果は、20kDa-PEG-T3Cが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。B.試験化合物を毎日または2日おきに皮下注射により投与したことを除いては実施例4のAについて記載したように第二の実験を行った。さらに、40kDa-PEGで修飾したT3Cの一用量を試験した。HYPOX雄Sprague-Dawleyラットは民間の供給メーカーから購入し、体重は約100gであった。体重測定は毎日同じ時間に行った。ラットを体重別に様々な試験群に無作為割り付けした。40kDa-PEG-T3Cを投与した試験群を除いては、1群当たり5匹のラットとした。ラットの体重を毎日測定し、プラセボラット血清アルブミンSigmaChemicalCompany200μg/mlを含有するリン酸緩衝食塩水PBS、市販の組み換えヒト成長ホルモン、ニュートロピン登録商標、様々な投与量の20kDa-PEG-T3Cまたは40kDa-PEG-T3Cを毎日または2日おきに皮下注射で投与した。PEG-T3Cタンパク質は実施例3に記載したように調製した。すべてのタンパク質溶液は、ラット血清アルブミン200μg/mlを含有するPBS中で調製した。動物は連続9日間処理した。10日目に動物を屠殺し頸骨を採取し、実施例4のAに記載したように薄片を作るために調製した。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端幅を表3に示す。この結果は、20kDa-PEG-T3Cおよび40kDa-PEG-T3Cが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。実施例5IFN-α2システインムテインのリフォールディングおよび精製組み換えヒトα-インターフェロン2IFN-α2およびIFN-α2システインムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はPCT/US00/00931に記載されている。IFN-α2のシステインムテインを構築する方法および付加システイン残基の位置として好ましいIFN-α2タンパク質内の部位もPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。これらの方法を用い、大腸菌中で以下のムテインを構築した。C1S、Q5C、43C44、N45C、Q46C、F47C、Q48C、A50C、D77C、C98S、Q101C、T106C、E107C、T108C、S163C、E165C、166C、D2C、L3C、T6C、S8C、T52C、G102C、V103C、G104C、V105C、P109C、L110C、M111C、S160C、L161C、R162CおよびK164C。大腸菌でIFN-α2を発現するための好ましい方法の一つは、STIIリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌したIFN-α2の分画は可溶性であり、PCT/US00/00931に記載されているようにカラムクロマトグラフィにより精製することができる。IFN-α2のある種のシステインムテインは、STIIリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。ムテインの浸透圧衝撃上清のSDS-PAGE分析は、大部分が19kDarIFN-α2バンドのレベルを低下野生型に比べてさせたことを示した。浸透圧衝撃からの全細胞溶解物および不溶性材料のSDS-PAGE分析は、これらのムテインが比較的高レベルで分泌されたが、主に不溶性の形でおそらく周辺質中に蓄積したことを示した。これらのタンパク質は還元条件下で野生型rIFN-α2標準品と一緒に移動し、STIIリーダーが除去されたことを示した。ムテインの相対的発現レベルの定性的評価を表4に要約する。不溶性の分泌IFN-α2タンパク質をリフォールディングする手順がこれまで記載されたことは未だない。IFN-α2システインムテインを生物学的に活性な形で発現しリフォールディングするために以下のプロトコルここではプロトコルIと呼ぶを開発した。IFN-α2システインムテインおよびIFN-α2の発現には通常、2リットルの振とうフラスコ中の培養液325ml、または2リットルのバッフル付きbaffled振とうフラスコ中の培養液500mlを37°Cで、ジャイロトリーgyrotoryシェーカー用バス中約170~220rpmで培養した。培養液は、PCT/US00/00931に記載したように培養し、誘導し、採取し、浸透圧衝撃に供した。得られた上清およびペレットを直ちに処理、または-80°Cで保存した。浸透圧衝撃ペレット中の不溶性タンパク質として回収されたIFN-α2システインムテインを変性し、還元し、以下のリフォールド手順を用いてそれらの適切な立体配置にリフォールディングした。浸透圧衝撃溶解物からのペレットはまず、製造者Pierceにより記載されたようにB-PER商標細菌タンパク質抽出試薬で処理した。B-PERは、大腸菌細胞膜を破壊して細胞の細胞質内容物を放出させる緩和な界面活性剤混合物である。不溶性材料は遠心分離によって回収し、水に懸濁し、再度遠心分離した。得られたペレットは、20mMトリスベースに溶かした6Mグアニジン、50mMシステイン5mL中に可溶化した。混合物を30分間撹拌した後、40mMリン酸ナトリウム、150mMNaCl、pH8.0400mLに対して4°Cで一夜透析した。翌日、リフォールド混合物のpHを3.0に調整し、混合物を遠心分離した後、浸透圧衝撃上清からのrIFN-α2の精製についてPCT/US00/00931に記載したように、S-セファロースカラムと、続いてCuIMACカラム上に載せた。これらの手順を用い、6種類のIFN-α2システインムテインQ5C、C98S、Q101C、T106C、E107Cおよび166Cをリフォールディングして精製した。同様の手順を用いて不溶性の野生型IFN-α2をリフォールディングして精製することができる。精製されたQ5C、C98S、Q101C、T106C、E107C、および166Cシステインムテインの非還元SDS-PAGE分析は、ムテインが主に単量体として回収され、予想どおりの分子量19kDaまでで移動することを示した。C98Sは、天然のCys1-Cys-98ジスルフィド結合の欠如のために他のrINF-α2ムテインより僅かに大きな分子量で移動した。一部の精製ムテインは少量のジスルフィド結合のrINF-α2二量体を含んでいた。この二量体分子種の分子量は約37~38kDaであった。INF-α2の多くのシステインムテインをプロセシングするときに、ある種のシステインムテインが細胞溶解後の可溶性および不溶性分画の両方に存在するらしいことを発見した。可溶性と不溶性IFN-α2タンパク質の比は、突然変異体間で変化した。したがって、IFN-αシステインムテインの回収率を向上させるため、細胞全体の可溶化ステップを含む代替の可溶化/リフォールディング手順ここでは、プロトコルIIと呼ぶを開発した。培養方法の改良がSTIIリーダー配列のプロセシングの効率を改善することが分かり、以下に詳述するようにリフォールディングおよび精製のためにIFN-αシステインムテインを発現するのに用いた。改良方法では、100mMMES、pH5.0、および100μg/mlアンピシリンを含有するLB培地中で培養液325~400mlを、37°Cで激しく振とうしながら、例えばNewBrunswickC25KCの環境保護のシェーカー中220~250rpmで600nmで0.5~0.7ODの細胞密度まで培養した。次いで、IPTGイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを最終濃度0.5mMまで添加することにより培養液を誘導し、誘導したら温度を28°Cまで下げ、シェーカー速度を140rpmに落とした。誘導された培養液を一夜14~18時間インキュベートし、遠心分離によって採取した。細胞ペレットを直ちに処理し、プロセシングまで-20°Cまたは-80°Cで保存した。誘導培養液325~400mLからの細胞ペレットはまず、8Mグアニジン、20mMシステイン、20mMMes、2Tween20、pH3の10mLに懸濁し、均一な懸濁液が存在するまで混ぜる。次いで、pHをpH8~9に上げ、可溶化混合物を3時間撹拌する。次に、細胞溶解物を氷冷した再生緩衝液20mMトリス、pH0.3Mグアニジン、1M尿素、40μm硫酸銅、pH8で1:20に希釈した。濁った懸濁液を4°Cで1~2日放置した。リフォールドを遠心分離と、続く3へのpH調整および2回目の遠心分離により透明にする。上清を冷水で1:4に希釈し、S-SephHiTrap5mL上に載せる。イオン交換カラムを、緩衝液Aが20mMMes、pH5で緩衝液Bが10エチレングリコール、500mMNaCl、20mMMes、pH5である0~70緩衝液Bの100mLグラジエントで溶出する。あるいは、リフォールディングされたIFN-αシステインムテインは、フェニル-セファロースカラムなどのHICカラムを用いてリフォールド混合物から捕捉することができる。リフォールド混合物をまず遠心分離し、上清に硫酸アンモニウムを最終濃度10まで加え、混合物を遠心分離し、10硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH8で平衡化したフェニルセファロースカラム10mL上に載せる。10硫酸アンモニウム、20mMトリスpH8から30エチレングリコール、20mMトリス、pH8までの線形グラジエント100mLを用いてIFN-αシステインムテインをカラムから溶出する。フェニル-セファロースカラムからのインターフェロンプールは、銅キレートカラム、S-セファロースカラムまたは両方を用いてさらに精製することができる。インターフェロンシステインムテインはまた、システインブロッキング剤の役割を果たす他の還元剤を用いて可溶化およびリフォールディングすることができる。可溶化/リフォールド混合物中のシステインを還元型グルタチオン、チオグリコール酸またはシステアミンに置き換えると、実施例7に記載の手順に従って精製およびPEG化できるリフォールディングされた可溶性IFNシステイン変異体が得られた。還元剤がないか、可溶化/リフォールド混合物中のシステインを20mMDTTで置き換えた場合には、リフォールディングされた可溶性IFNシステインムテインの収率は、リフォールド混合物を逆相HPLCにより分析したときに検出できないレベルまで低下した。さらに、還元剤がないか、可溶化/リフォールド混合物中のシステインを20mMDTTで置き換えた場合には、リフォールド混合物のS-セファロースクロマトグラフィ後にリフォールディングされた可溶性IFNシステインムテインはまったく回収されなかった。プロトコルIIを用い、以下のムテインを大腸菌中で発現させ、リフォールディングして精製した:C1S、Q5C、43C44、N45C、F47C、Q48C、A50C、C98S、Q101C、T106C、E107C、S163C、E165C、166C、D2C、L3C、T6C、S8C、T52C、G102C、V103C、G104C、V105C、P109C、L110C、M111C、S160C、L161C、R162CおよびK164C。これらのリフォールドは、pH8または一部の例では7.5で行った。実施例6IFN-α2システインムテインの生物活性実施例5のプロトコルIを用いて精製した精製Q5C、C98S、Q101C、T106C、E107C、および166CIFN-α2システインムテインの生物活性をPCT/US00/00931に記載のDaudi増殖阻害アッセイで測定した。タンパク質濃度はBradfordまたはBCAタンパク質アッセイキットBio-RadLaboratoriesおよびPierceを用いて決定した。市販の野生型rIFN-α2およびPCT/US00/00931に記載されたように調製したrIFN-α2は、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。ムテインは、アッセイの誤差の範囲内で野生型rIFN-α2対照タンパク質と同程度にDaudi細胞の増殖を阻害した。ムテインのうち5種類Q5C、Q101C、T106C、E107Cおよび166Cの平均IC50は、野生型rIFN-α2タンパク質の平均IC50と類似しており、15~18pg/mlの範囲であった。C98Sタンパク質の平均IC50は28pg/mlであった。これらのデータを表4に要約する。実施例5のプロトコルIIを用いて精製した以下のムテインの生物活性を、PCT/US00/00931に記載のDaudi増殖阻害アッセイで測定した:C1S、D2C、L3C、S8C、N45C、F47C、C98S、V103C、V105C、E107C、M111C、R162C、S163C、K164C、E165Cおよび166C。実測されたIC50を、同一実験で用いた野生型rIFN-αタンパク質のIC50と共に表5に列挙する。実施例7IFN-α2システインムテインのPEG化実施例3ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の手順を用いて、精製IFN-α2システインムテインをPEG化することができる。遊離システイン残基で精製IFN-α2システインムテインをモノPEG化することができる条件を特定するために、2種類の精製IFN-α2システインムテインについて小スケールのPEG化実験を行った。タンパク質の過還元は、タンパク質のアンフォールディングによる予想より大きな見かけ分子量へのシフト、または天然ジスルフィドの還元により生じるいくつもがPEG化された分子種の出現を探索する非還元SDS-PAGEによりモニターした。精製野生型およびrIFN-α2ムテインT106CおよびE107Cの一部1μgを、10倍モル過剰のTCEPおよび20倍モル過剰の5kDAaマレイミドPEGと共に室温で1時間、pH8.5でインキュベートした。60分後反応を止めてすぐに非還元性SDS-PAGEにより分析した。反応混合物のSDS-PAGE分析によれば、両ムテインともこれらの条件下でモノPEG化タンパク質を与えた。非還元SDS-PAGEによれば、モノPEG化タンパク質の見かけの分子量は約28kDaであった。野生型rIFN-α2には、これらの条件下で検出可能なPEG化は見られなかった。対照実験は、T106CおよびE107CシステインムテインをPEG化するには、TCEPなどの還元剤で部分的に還元する必要があることを示した。これらのデータは、T106CおよびE107Cタンパク質に導入されたシステイン残基にPEG分子が結合することを示している。大量のIFN-α2システインムテインを様々なサイズのシステイン反応性PEGで修飾して精製すると生物活性測定に十分な材料を得ることができる。PEG化タンパク質の精製には、大量のPEG化反応を上述のように室温で1時間行い、20mMMES、pH5.0で10倍に希釈し、pH3.0に調整し、次いで、rIFN-α2ムテインの最初の精製について記載した条件と類似した条件を用いS-セファロースカラム上に素早く載せなければならない。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。S-セファロースカラムからのクロマトグラムは、2本の主要なタンパク質ピークを示すはずである。早く溶出する主要ピーク230mM未満のNaCl濃度で溶出するはモノPEG化IFN-αタンパク質のはずであり、これは非還元SDS-PAGE分析によって確認することができる。5kDaシステイン反応性PEGで修飾されたモノPEG化IFN-α2の見かけの分子量は、SDS-PAGEによれば約28kDaである。後に溶出する主要ピーク約230mMNaClで溶出するは未反応IFN-α2タンパク質のはずである。主にPEG-IFN-α2を含有する早く溶出するピークからの分画をプールし、生物活性測定に使用することができる。精製PEG-IFN-α2タンパク質の生物活性は、PCT/US00/00931に記載のDaudi細胞アッセイで測定することができる。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて決定することができる。PEG化IFN-α2システインムテインのインビボにおける生物活性は、PCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載のように決定することができる。Q5CムテインのPEG化の場合は、精製タンパク質を100mMトリス、pH8でタンパク質100μg/mlまで希釈した。15倍過剰の5kDa-マレイミドPEGと、続いて10~15倍モル過剰のTCEPを加える。EDTAも加えて0.5mMの最終濃度、タンパク質が部分的に還元されたときのジスルフィド形成を抑える。混合物を室温で2時間保つ。良好なPEG化効率も得られる代替法には、PEGおよびTCEP試薬の繰返し添加が関係した。発明者らは、10倍モル過剰のPEG試薬および10倍モル過剰のTCEPを2時間にわたり3回添加すると、80を超すPEG化効率が得られることを見いだした。PEGおよびTCEPを繰り返し添加するこの後者の手順を用い、10kDa-、20kDa-および40kDa-PEGで修飾したQ5Cを調製することに成功した。実施例5に記載のS-セファロースプロトコルを用いるイオン交換クロマトグラフィにより、PEG化タンパク質を未反応のQ5C出発材料およびPEG化試薬から分離した。他のイオン交換体Q、DEAE、CM、HIC樹脂フェニル、ブチル、アフィニティカラム、サイズ排除カラム、またはキレート樹脂などの代替法を用いてPEG化タンパク質を精製することができる。10kDa-、20kDa-および40kDa-PEG-Q5Cタンパク質の生物活性は、PCT/US00/00931に記載のDaudi細胞アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて決定した。10kDa-PEG-Q5C、20kDa-PEG-Q5C、および40kDa-PEG-Q5Cタンパク質の平均IC50は、それぞれ70pg/mlN=2アッセイ、100pg/mlN=8アッセイ、および108pg/mlN=8アッセイであると決定された。実施例8野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sのクローニング、発現および精製A.G-CSFをコードするDNA配列のクローニング。G-CSFをコードするcDNAを、ヒト膀胱癌細胞株5637AmericanTypeCultureCollectionから単離した全RNAからPCRにより増幅した。10FBS、50単位/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地中で細胞を培養した。Qiagen、Inc.SantaClarita、CAから購入したRNeasyMiniRNA単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、BoehiringerMannheimCorp製のRT-PCR用1stStrandcDNASynthesisKitAMVを用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のPCR反応は、順方向プライマーBB915>CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG>3;配列番号1および逆方向プライマーBB925>CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG>3;配列番号2で行った。プライマーBB91は、G-CSF分泌シグナル用のコード配列の5′末端とアニールし、逆方向プライマーBB92は、G-CSFコード配列の3′末端とアニールする。得られた約640bpのPCR産物をHindIIIおよびBamHIで消化し、ゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化されたpCDNA3.1ベクター中にクローニングし、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいDNA配列のクローンSouza他、1986;Nagata他、1986a、bは、pCDNA3.1::G-CSFfusまたはpBBT165と名付けた。PCRを用い、野生型G-CSF野生型および天然に存在する17位の遊離システインがセリンによって置き換えられた変異体C17Sの大腸菌における周辺質および細胞質発現のために、このG-CSFクローンを修飾した。野生型G-CSFタンパク質は5個のシステインを含有し、そのうち2個は重要なジスルフィド結合に関与し、部分的に覆い隠されている1個の遊離システインC17は活性に必要ではないIshikawa他、1992、Kuga他、1989、Lu他、1992、Wingfield他、1988。対になっていないシステインによる潜在的困難を避けるため、発明者らは、プラットフォーム分子として17位におけるCysからSerへの置換を含む変異体C17Sを構築した。この後のシステインムテインはすべて、C17S置換が存在するもとで調製した。G-CSFC17Sは、野生型G-CSFと同一の生物活性を有することが報告されているIshikawa他、1992、Lu他、1992。分泌G-CSFは付加的N末端メチオニンを含んでおらず、天然に存在するG-CSFと同一のアミノ配列を有するSouza他、1986。分泌型のG-CSFを発現させるために、PCRを用い、大腸菌の耐熱性エンテロトキシンSTII遺伝子Picken他、1983のリーダー配列を成熟G-CSFのコード配列に融合させ、カルボキシ末端残基、P174の後ろにTAA終止コドンを付加した。同時に、G-CSFコード配列のアミノ末端部分も修飾した。2、5、および10位のプロリンのコドンをすべてCCGに変え、次の変異誘発手順を容易にするためにTTAからCTCにL18コドンを変えることによってXhoI制限酵素認識部位を導入した。これらの構築は野生型およびC17S遺伝子について並行して行い、続く3種類のPCR反応に用いた。C17S構築物の場合には、第一の反応は、順方向プライマーBB1165>GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTGAAGAGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG>3;配列番号3および逆方向プライマーBB1145>CGCGAATTCTTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG>3;配列番号4を用い、テンプレートしてクローン化G-CSFcDNAを用いた。BB116は、成熟G-CSFのコード配列の5′末端とアニールし、コードされるアミノ酸を変化させないP2、P5、P10,およびL18における上述のコドン変化を導入する。BB116はまた、C17S変異TGC=>AGCを導入し、15位のロイシンコドンを好ましいCTGトリプレットに変化させる。BB114は、G-CSFコード配列の3′末端18bpとアニールし、カルボキシ末端残基P174の直ぐ後にTAAの翻訳終止コドンを導入する。BB114はまた、クローニング目的用のEcoRI部位を含む。野生型構築物の場合には、第一の反応は、順方向プライマーBB1175>GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTTAAGTGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG>3;配列番号5および逆方向プライマーBB114配列は上記のとおりと、テンプレートとしてクローン化G-CSFcDNAを用いた。BB117は、天然に存在するC17コドン、TGCが存在し、使用されるL15コドンがCTTであることを除けばBB116と同一である。このCTTは、AflII制限酵素認識部位を生み出し、C17S変異体から野生型C17クローンを区別するための迅速かつ便利な方法を提供する。このC17Sクローンは、15位にCTGコドンを有し、したがってAflII制限酵素認識部位を欠く。これらの反応の各々からの約530bpのPCR産物をゲル精製し、第二のPCR反応用テンプレートとして用いた。第二の反応用に、ゲル精製した約530bpの産物を、順方向プライマーBB1155>ATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCGTACGCAACCCCGCTGGGCCCGGCCAGCTCCCTG>3;配列番号6および逆方向プライマーBB114配列は上記のとおりで増幅した。BB115の3′部分27個のヌクレオチドを、野生型とC17SPCR産物の双方と一致する成熟G-CSFの修飾コード配列の5′末端とアニールする。BB115の5′セグメント36個のヌクレオチドはSTIIリーダーペプチドの部分をコードする。これらの二次反応の約550bpの各PCR産物をゲル精製し、PCRの第三および最終回用テンプレートとして用いた。第三の反応では、約550bpの各ゲル精製産物を、順方向プライマーBB115>CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG>3;配列番号7および逆方向プライマーBB114配列は上記のとおりで増幅した。BB11は、STIIリーダーペプチドの残部を付加し、STIIリーダーの開始ATGと重なるNdeI部位ならびにクローニング目的用のXbaI部位を含む。これらの反応の約620bpの産物をEcoRIおよびXbaIで消化し、同様に消化した配列決定用プラスミドベクターpBC-SKStratagene中にクローニングした。野生型構築物については、pBBT187と名付けた1種類のクローンが、STII-G-CSFコード配列を含有する620bpのNdeI-EcoRIセグメントに対する正しい配列を含んでいることが分かった。次いで、このフラグメントを、NdeIEcoRIカットcut発現ベクターpCYB1NewEnglandBioLabs中にサブクローニングした。得られたプラスミドをpBBT188と名付けた。C17S構築物の場合には、配列決定した3種類のクローンはいずれも正しい配列を含んでいないことが分かった。すべてが1個または複数の誤りを有していた。1種類のクローンは、STIIリーダーのA10位に単一のミスセンス変異を含んでおり、620bpのNdeI-EcoRIセグメントの配列の残部は正しかった。このクローンとプラスミドpBBT188の間のインビトロにおける組換えを用い、pCYB1において正しい配列のSTII-G-CSFC17S構築物を作成した。pBBT188とSTIIリーダーのA10位に単一のミスセンス変異を含むC17Sクローンを共に、BsiWIおよびEcoRIで消化した。どちらか一方のプラスミド中に存在するEcoRI部位のみがG-CSF翻訳終止コドンに続く部位である。BsiWIはまた、STIIリーダーペプチドのコード配列内の部位で、成熟G-CSFコード配列の先頭から7bpを一度だけ切断する。したがって、pBBT188の約535bpのBsiWI-EcoRIフラグメントを正しいC17S構築物配列を有する約535bpのBsiWI-EcoRIフラグメントと置き換えることにより、発明者らは、STII-G-CSFC17Sコード配列を発現するpCYB1誘導体を作成した。このプラスミドをpBBT223と名付けた。大腸菌中の細胞質発現の場合には、クローン化STII-G-CSF野生型およびSTII-G-CSFC17S遺伝子をPCRによって修飾してSTIIリーダー配列を削除し、成熟G-CSFのアミノ末端アミノ酸T1のコドンの直ぐ前にイニシエータのメチオニンコドンATGを付加した。配列が確認されたSTII-G-CSF野生型およびSTII-G-CSFC17Sクローンは、プライマーBB1665>CGCCATATGACCCCGCTGGGCCCGGCCAG>3;配列番号8およびBB144配列は上記のとおりで増幅した。BB166は成熟G-CSFのコード配列の5′末端にアニールし、成熟G-CSFの最初のアミノ酸の前のイニシエータメチオニンをコードする。ATGと重なり合うNdeI部位がクローニング目的用に含まれていた。これらのPCR反応の約540bpの産物をNdeI部位の下流で約400bpを切断するNdeIとAatIIで消化した。これらの約400bpのフラグメントをゲル精製し、NdeIとAatIIで切断された上述のpBBT187、pBC-SK::STII-G-CSF構築物中にクローニングし、アルカリホスファターゼで処理してゲル精製した。1種類のMet-G-CSF野生型および1種類のMet-G-CSFC17Sクローンを配列決定し、両者とも正しい配列を含んでいることが分かった。これらのMet-G-CSF野生型およびMet-G-CSFC17S遺伝子を、NdeI-EcoRIフラグメントとして、上述のNdeI-EcoRIカット発現ベクターpCYB1中にサブクローニングした。得られたプラスミドをpBBT225=pCYB1::Met-G-CSFおよびpBBT226=pCYB1::Met-G-CSFC17Sと名付けた。B.大腸菌における野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sの発現。Met-G-CSF野生型をコードするpBBT225、Met-G-CSFC17SをコードするpBBT226およびpCYB1親ベクターを大腸菌JM109中にトランスフォームした。これらの菌株による実験の結果、G-CSFタンパク質が発現した。分泌したG-CSFの野生型およびC17S形双方が優れているのは、それらが細胞質で発現したMet-G-CSFタンパク質のN末端における非天然メチオニン残基を欠いているからである。分泌G-CSFの発現には、pBBT188[pCYB1::STII-G-CSF]、pBBT223[pCYB1::STII-G-CSFC17S]および親ベクターpCYB1を大腸菌W3110中にトランスフォームした。得られた菌株をBOB130:W3110pCYB1、BOB213:W3110pBBT188、およびBOB268:W3110pBBT223と名付けた。予備的スクリーニング実験では、回転培養管中、37°Cで100μg/mlアンピシリンを含有するLuriaBrothLB培地中で一夜、菌株を培養した。飽和した前夜の培養液を100μg/mlアンピシリンを含有するLB中、A600で約0.025O.D.まで希釈し、振とうフラスコ中28、37、または42°Cでインキュベートした。通常どおり、培養液25mlを250ml振とうフラスコ中で培養した。培養液のO.D.が約0.3~0.5に達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えてG-CSFの発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後0、1、3、5および約16時間に培養液をサンプリングした。誘導および非誘導培養液の試料を既製の14トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。BOB213野生型とBOB268C17Sの誘導培養液は共に、約19kDaにバンドを示し、これは成熟G-CSFの分子量と一致する。このバンドは、BOB213およびBOB268の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB130の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。ウェスタンブロット分析は、BOB213およびBOB268溶解物中の約19kDaのバンドが抗ヒトG-CSF抗血清RDSystemsと強力に反応することを示した。この抗体は、BOB213およびBOB268の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB130の誘導および非誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタンブロットはまた、この約19kDaのバンドがRDSystemsから購入した市販のヒトG-CSF標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、STIIリーダーペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。実施例10に示すN末端配列決定試験は、STIIシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。28°Cおよび37°Cの培養液からの誘導後16時間の試料を、KoshlandおよびBotstein1980の手順に基づき浸透圧衝撃に供した。この手順は、大腸菌の外膜を破裂させ、周囲の培地中に周辺質の内容物を放出する。続く遠心分離により細胞質成分、不溶性周辺質成分、および細胞関連成分ペレット中に回収されるから可溶性の周辺質成分上清中に回収されるを分離する。両方の温度で、BOB213による野生型、およびBOB268によるC17Sのいずれの場合も、合成された一部のG-CSFタンパク質が上清中に回収されるが、G-CSFの大部分はペレットと結びついたままであった。このことは、タンパク質がプロセシングされ周辺質に分泌されたように見えるが、主に不溶性の形でそこに蓄積していることを示す。G-CSF野生型およびC17S変異体についての発現条件の予備的スクリーニングは、様々な条件下で両タンパク質が比較的満足に発現することを示した。大スケールの発現および精製の場合には、培養液を28°Cで培養し、約16時間誘導した。C.野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sの精製。野生型およびG-CSFC17Sを同一のプロトコルを用いてより大きなスケールで発現させて精製した。BOB213野生型およびBOB268C17Sの新鮮な飽和一夜培養液を、100μg/mlアンピシリンを含有するLB中にA600おいて約0.05ODで接種した。通常、2Lのバッフル付き振とうフラスコ中で培養液400mlを28°Cで、ジャイロトリーシェーカー用水浴中250rpmで培養した。培養液の密度が約0.5~0.7ODに達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えた。次いで、誘導培養液を約16時間一夜インキュベートした。遠心分離により細胞をペレットにし、-80°Cで冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者Pierceのプロトコルに従ってB-PER商標細菌タンパク質抽出試薬5mLで処理した。G-CSFタンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、B-PER中に懸濁した。この混合物をリゾチーム200μg/mlで10分間処理して細胞壁をさらに破壊し、MgCl2最終濃度10mMおよびプロテアーゼ非含有DNAse2μg/mlを加えた。不溶性のG-CSFを遠心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞の破片を除去した。不溶性のG-CSFを含有する得られたペレットを、20mMトリスベース中の8M尿素、25mMシステイン20mlに溶かした。この混合物を室温で30分間撹拌し、次いで40mMリン酸ナトリウム、40μM硫酸銅、15グリセロール、pH8.0100ml中に希釈した。このリフォールド混合物を4°Cに2日間保った。次いで、リフォールド混合物のpHを希HClで4.0に調整し、混合物を遠心分離した後、40mMリン酸ナトリウムpH4.0緩衝液Aで平衡化したS-セファロースカラムPharmaciaHiTrap5ml上に載せた。0~100緩衝液B500mMNaCl、40mMリン酸ナトリウム、pH4.0の線形塩グラジエントで結合したタンパク質を溶出した。野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは、塩濃度約300~325mMNaClで単一の主ピークとしてS-セファロースカラムから溶出した。非還元SDS-PAGEによりカラム分画を分析した。G-CSFを含有し目に見える不純物を含有しない分画をプールした。野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sの最終的な収量をBradford分析により測定すると、それぞれ培養液400mlから約1.1mgおよび3.3mgであった。精製野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは、SDS-PAGEの還元および非還元条件下で一緒に移動した。誘導および非誘導G-CSFおよびG-CSFC17Sの見かけの分子量は、それぞれ約19および17kDaであった。D.野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sのインビトロにおける生物活性。マウスNFS60細胞株を用いる細胞増殖アッセイを開発し、野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sの生物活性を測定した。NFS60細胞株は、UniversityofTennesseeMedicalSchool、MemphisTennesseeのJ.Ihle博士から入手した。この細胞株は、ヒトもしくはマウスのG-CSFまたはIL-3に反応して増殖するWeinstein他、1986。この細胞を、10FBS,50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよび17~170単位/mlマウスIL-3RDSystemsを添加したRPMI1640培地中に維持した。バイオアッセイは、IL-3を除いた細胞維持培地中で行った。一般的に、NFS60細胞をRPMI培地添加物なしで3回洗浄し、IL-3を除いた細胞維持培地中に0.5~1×105/mlの濃度で細胞を再懸濁することによってバイオアッセイを開始した。細胞懸濁液50μl2.5~5×103個の細胞を、平底の96ウエル組織培養プレートの試験ウエルに等分した。試験するタンパク質試料の段階希釈液をIL-3を除いた維持培地中で調製した。組み換えヒトG-CSF大腸菌による発現;RDSystemsの段階希釈液を並行して分析した。希釈したタンパク質試料50μlを試験ウエルに加え、加湿した5CO2組織培養インキュベータ中37°Cでプレートをインキュベートした。タンパク質試料は、三つ組みのウエル中でアッセイした。約48~72時間後、CellTiter96AQueousOneSolutionPromegaCorporation20μlを各ウエルに加え、組織培養インキュベータ中37°Cで1~4時間プレートをインキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて490nmでウエルの吸光度を読みとった。対照ウエルは培地を含み細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウエルの平均吸光度値を、試験ウエルについて得られた平均値から差し引いた。各試料について、EC50、最大刺激半減濃度を算出した。NFS60細胞株は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により明らかなように、G-CSFに対して強い増殖反応を示す。市販のG-CSFおよび発明者らにより調製されたG-CSFは、バイオアッセイにおいてそれぞれ19および10pg/mlの平均EC50を有していた表6。意外にも、G-CSFC17Sは7pg/mlの平均EC50を有しており、バイオアッセイにおいて再現性よく、発明者らの野生型G-CSF標準品よりも1.5から2倍強力であり、市販の野生型G-CSFより約3倍強力であった表3。野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは同一の活性を有すると報告されているためLu他、1992、G-CSFC17Sの活性が優れているのは意外であった。実施例9G-CSFC17Sシステインムテインの構築、発現、精製および生物活性A.G-CSFシステインムテインの構築PCT/US00/00931ならびにInnis他1990およびWhite1993に記載の手順と類似した、部位特異的PCRをベースとする変異誘発手順を用い、15種類の変異G-CSF遺伝子を構築した。発明者らは、ヘリックスAから近位のアミノ末端領域中の5種類のムテイン[-1C天然アミノ末端へのシステイン残基の付加、T1C、L3C、A6CおよびS7C];B-Cループ中の2種類のムテイン[E93CおよびS96C];C-Dループ中の6種類のムテイン[A129C、T133C、A136、A139C、A141CおよびS142C];およびヘリックスDから遠位のカルボキシ末端領域中の2種類のムテイン[Q173Cおよび175C天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加を構築した。G-CSFシステインムテインはすべて、野生型G-CSF中の17位に通常存在する無対のシステインによって引き起こされる可能性のある潜在的な困難および/またはあいまい性を避けるためにC17Sバックグラウンドで構築した。G-CSFC17Sは、既に報告されているように完全な生物活性を有しておりIshikawa他、1992;Lu他、1992、発明者らの大腸菌発現系においても、精製C17Sの収率が精製野生型G-CSFの収率よりも高いことを発見している。さらに、インビトロにおけるアッセイでも、発明者らの組み換えC17Sは、発明者らによって製造された野生型G-CSFおよび民間供給メーカーRDSystems、Inc.から入手した大腸菌発現による組み換え野生型G-CSFよりも活性である。変異誘発性PCR反応に用いるテンプレートは、pBBT223実施例8に記載由来のSTII-G-CSFC17S遺伝子をNdeI-EcoRIフラグメントとしてNdeI-EcoRIカットpUC18中にクローニングしたプラスミドpBBT227とした。PCR産物を適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、これらと同一の制限酵素により切断されたpBBT227ベクターDNAと連結し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドDNAを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたPCRフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびPCR反応または合成オリゴヌクレオチドプライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。システイン置換変異L3Cは、以下のように構築した。変異誘発性順方向オリゴヌクレオチドBB1725>ACCAACGCGTACGCAACCCCGTGTGGCCCGGCCAGC>3;配列番号9は、成熟G-CSFの3位にあるロイシン用のコドンCTGをシステインをコードするTGTに変え、すぐ近くのMluI部位に橋を架けるように設計した。このオリゴを、pBBT227中で成熟G-CSFのアミノ酸残基21~27をコードするDNA配列にアニールする逆方向の非変異誘発性プライマーBB1885>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;配列番号10と共にPCRで用いた。PCR反応100μlは、1.5mMMgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートプラスミドpBBT227上記3ng、TaqポリメラーゼPromega2.5単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.5単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中で行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、96°C3分、[95°C60秒、60°C30秒、72°C45秒]25サイクルおよび4°C保持とした。PCR反応物のアリコート10μlをアガロースゲル電気泳動で分析し、予想サイズ約100bpの単一フラグメントを生成することが分かった。反応物の残りを、QIAquickPCRPurificationKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってMluIおよびXhoINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、MluIおよびXhoIで切断されたpBBT277と消化生成物を連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。L3C変異および約70bpのMluI-XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。置換変異T1Cは、L3Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。T1のACCコドンをシステインのTGCコドンに変え、すぐ近くのMluI部位に橋を架ける変異誘発性オリゴヌクレオチドBB1715>ACCAACGCGTACGCATGCCCGCTGGGCCCGGCCAGC>3;配列番号11をBB172の代わりにPCR反応で用いた。置換変異Q173Cは、L3Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。Q173のCAGコドンをシステインのTGTコドンに変え、すぐ近くのEcoRI部位に橋を架ける変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチドBB1855>CGCGAATTCTTAGGGACAGGCAAGGTGGCG>3;配列番号12をBB172の代わりにPCR反応で用いた。pBBT227中で成熟G-CSFのアミノ酸残基78~84をコードするDNA配列にアニールする順方向の非変異誘発性プライマーBB1875>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;配列番号13を、BB188の代わりに用いた。PCR反応物のアリコート10μlをアガロースゲル電気泳動で分析し、予想サイズ約300bpの単一フラグメントを生成することが分かった。反応物の残りを、QIAquickPCRPurificationQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってStyIおよびEcoRINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、消化生成物を1.5アガロースゲル上に展開し、約220bpの当該StyI-EcoRIフラグメントをQIAquickGelExtractionKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってゲル精製した。ゲル精製したフラグメントを、StyIおよびEcoRIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。Q173C変異および約220bpのStyI-EcoRIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。G-CSFコード配列のカルボキシ末端アミノ酸の後ろにシステインを付加した変異も構築した。175Cと呼ぶこの変異体は、Q173C変異体の構築について上記に記載したプロトコルを用いて構築したが、以下の相違点を有している。P174のCCCコドンとTAA終止コドンの間にシステインのTGTコドンを挿入し、すぐ近くのEcoRIに橋を架ける変異誘発性オリゴヌクレオチドBB1865>CGCGAATTCTTAACAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG>3;配列番号14をBB185の代わりにPCR反応で用いた。置換変異A6Cは、Horton他1993およびPCT/US00/00931に記載のようにオーバーラップエクステンションoverlapextensionによる変異誘発の技術を用いて構築した。A6C構築の最初の、すなわち一次PCR反応は、1.5mMMgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートプラスミドpBBT2271ng、TaqポリメラーゼPromega1.5単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.25単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中、反応体積50μlで行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、96°C3分、[95°C60秒、60°C30秒、72°C45秒]25サイクルおよび4°C保持とした。用いたプライマー対は、[BB173×BB188]および[BB174×BB125]とした。BB1885>GCCATGGCCCTGGATCTTACG>3;配列番号10はpBBT227中で成熟G-CSFのアミノ酸残基21-27をコードするDNA配列にアニールする。BB1255>CTATGCGGCATCAGAGCAGATA>3;配列番号17は、クローン化G-CSF配列の約20bp上流のpUC18ベクター配列にアニールする。BB173およびBB174は、A6のGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。BB173の配列は5>CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG>3;配列番号15であり、BB174の配列は、5>CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG>3;配列番号16である。PCR産物を2アガロースゲル上で展開すると、[BB173×BB188]および[BB174×BB125]PCR反応で[BB173×BB188]については約80bpおよび[BB174×BB125]については約140bpである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、QIAquickGelExtractionKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロースゲル切片から一緒に溶出し、10mMトリス-HClpH8.530μl中に回収した。次いで、これら2種類の変異誘発されたフラグメントを、次の、すなわち二次PCR反応で一緒にスプライシングした。この反応では、ゲル精製した一次反応のPCR産物3μlをテンプレートとして用い、BB125およびBB188をプライマーとして用いた。反応体積は100μlとし、Taqポリメラーゼ2.5単位およびPfuポリメラーゼ0.5単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次PCRのアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析し、予想した約190bpのバンドを観察した。二次PCR反応の全体を、QIAquickPCRPurificationQiagenを用いてクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってNdeIおよびXhoINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、消化生成物を、NdeIおよびXhoIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、A6C変異を含み約130bpのNdeI-XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。置換変異S7Cは、A6Cについて上記に記載したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。S7のAGCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB1755>CTGGGCCCGGCCTGCTCCCTGCCGCAG>3;配列番号18およびBB1765>CTGCGGCAGGGAGCAGGCCGGGCCCAG>3;配列番号19を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。成熟G-CSFのアミノ末端残基T1のコドンの前にシステインコドンを付加した変異を構築し、配列確認した。-1Cと呼ぶこの変異は、A6Cの構築について上記に記載したプロトコルを用いて構築したが、以下の相違点を有している。STIIリーダー配列のカルボキシ末端残基のGCAコドンとpBBT227中の成熟G-CSFのアミノ末端残基のACCコドンとの間にシステインのTGCコドンを挿入する相補的変異誘発性プライマーBB2065>AACCCGTACGCATGTACCCCGCTGGGC>3;配列番号20およびBB2075>GCCCAGCGGGGTACATGCGTACGCGTT>3;配列番号21を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。一次PCR反応は、反応体積20μlで行った。各プライマーは0.5μM存在させた。反応物には、テンプレートプラスミドpBBT2270.5ng、Taqポリメラーゼ2単位、およびPfuポリメラーゼ0.25単位が含まれていた。反応プログラムは、95°C3分、[94°C60秒、60°C30秒、72°C45秒]25サイクルおよび4°C保持とした。一次反応の産物は、調製用2アガロースゲル上に直接ロードした。一次反応により、[BB206×BB188]については約100bpおよび[BB207×BB125]については約125bpである予想サイズの産物が得られた。二次PCRでは、反応体積を100μlとし、ゲル精製した一次反応のPCR産物5μlをテンプレートとして用い、BB187およびBB126をプライマーとして用い、Taqポリメラーゼ4単位およびPfuポリメラーゼ0.25単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。置換変異A129Cは、A6Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。一次PCR反応は、プライマー対[BB177×BB126]および[BB178×BB187]を用いた。逆方向の非変異誘発性プライマーBB1265>TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC>3;配列番号22は、クローン化G-CSF配列の約40bp下流のpUC18ベクター配列にアニールする。順方向の非変異誘発性プライマーBB1875>GCCATCGCCCTGGATCTTACG>3;配列番号13は、pBBT227中で成熟G-CSFのアミノ酸残基78~84をコードするDNA配列にアニールする。BB177およびBB178は、A129CのGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。BB177の配列は5>GGAATGGCCCCTTGCCTGCAGCCCACC>3;配列番号23であり、BB178の配列は5>GGTGGGCTGCAGGCAAGGGGCCATTCC>3;配列番号24である。一次反応の産物からは、[BB177×BB126]については約220bpおよび[BB178×BB187]については約170bpである予想サイズの産物が得られた。二次PCRは、BB187およびBB126をプライマーとして用い、予想サイズ約360bpの産物を生成した。この産物を供給メーカーのプロトコルに従いStyIおよびEcoRINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、消化生成物を、StyI-EcoRIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、A129C変異を含み約230bpのStyI-EcoRIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。置換変異T133Cは、A129Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。T133のACCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB1795>GCCCTGCAGCCCTGCCAGGGTGCCATG>3;配列番号25およびBB1805>CATGGCACCCTGGCAGGGCTGCAGGGC>3;配列番号26を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。一次反応の産物からは、[BB179×BB126]については約205bpおよび[BB180×BB187]については約180bpである予想サイズの産物が得られた。置換変異A139Cは、A129Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。A139のGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB1815>GGTGCCATGCCGTGCTTCGCCTCTGCT>3;配列番号27およびBB1825>AGCAGAGGCGAAGCACGGCATGGCACC>3;配列番号28を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。一次反応の産物からは、[BB181×BB126]については約185bpおよび[BB182×BB187]については約200bpである予想サイズの産物が得られた。置換変異S142Cは、A129Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。S142のTCTコドンをシステインのTGTコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB1835>CCGGCCTTCGCCTGTGCTTTCCAGCGC>3;配列番号29およびBB1845>GCGCTGGAAAGCACAGGCGAAGGCCGG>3;配列番号30を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。一次反応の産物からは、[BB183×BB126]については約180bpおよび[BB184×BB187]については約210bpである予想サイズの産物が得られた。置換変異A136Cは、A129Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。A136のGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB2245>CCCACCCAGGGTTGCATGCCGGCCTTC>3;配列番号31およびBB2255>GAAGGCCGGCATGCAACCCTGGGTGGG>3;配列番号32を、それぞれ一次PCR反応におけるBB173およびBB174と置き換えた。一次PCR反応は、反応体積20μlで行った。各プライマーは0.5μM存在した。反応物には、テンプレートプラスミドpBBT2270.5ng、Taqポリメラーゼ2単位、およびPfuポリメラーゼ0.25単位が含まれていた。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、95°C3分、[94°C60秒、60°C30秒、72°C45秒]25サイクルおよび4°C保持とした。一次反応の産物は、調製用2アガロースゲル上に直接ロードした。一次反応の産物からは、[BB224×BB126]については約195bpおよび[BB225×BB187]については約190bpである予想サイズの産物が得られた。二次反応では、反応体積を100μlとし、ゲル精製した一次反応のPCR産物5μlをテンプレートとして用い、BB187およびBB126をプライマーとして用い、Taqポリメラーゼ4単位およびPfuポリメラーゼ0.25単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。置換変異A141Cは、A136Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。A141のGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB2265>ATGCCGGCCTTCTGCTCTGCTTTCCAG>3;配列番号33およびBB2275>CTGGAAAGCAGAGCAGAAGGCCGGCAT>3;配列番号34を、それぞれ一次PCR反応におけるBB224およびBB225と置き換えた。一次反応の産物からは、[BB226×BB126]については約180bpおよび[BB227×BB187]については約205bpである予想サイズの産物が得られた。置換変異E93Cは、オーバーラップエクステンションによる変異誘発の技術を用いて構築した。E93C構築の一次PCR反応は、1.5mMMgCl2、各プライマー0.5μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートプラスミドpBBT2270.5ng、TaqポリメラーゼPromega2単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.25単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中、反応体積20μlで行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、95°C3分、[94°C60秒、60°C30秒、72°C45秒]25サイクルおよび4°C保持とした。用いたプライマー対は、[BB218×BB211]および[BB219×BB210]とした。逆方向の非変異誘発性プライマーBB2115>GGCCATTCCCAGTTCTTCCAT>3;配列番号35は、pBBT227中で成熟G-CSFのアミノ酸残基121-127をコードするDNA配列にアニールする。順方向の非変異誘発性プライマーBB2105>TTCGTTTTCTCTATCGCTACCAAC>3;配列番号36は、pBBT227中でSTIIリーダーペプチドのアミノ酸残基13~20をコードするDNA配列にアニールする。BB218およびBB219は、E93のGAAコドンをシステインのTGTコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。BB218の配列は5>CTGCAGGCCCTGTGTGGGATCTCCCCC>3;配列番号37であり、BB219の配列は、5>GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG>3;配列番号38である。一次反応の産物を、調製用2アガロースゲル上に直接ロードすると、PCR反応により[BB218×BB211]については約115bpおよび[BB219×BB210]については約325bpである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、QIAquickGelExtractionKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロースゲル切片から一緒に溶出し、10mMトリス-HClpH8.530μl中に回収した。二次PCR反応では、ゲル精製した一次反応のPCR生成物プール5μlをテンプレートとして用い、BB211およびBB210をプライマーとして用いた。反応体積は100μlとし、Taqポリメラーゼ4単位およびPfuポリメラーゼ0.25単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次PCRのアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析し、予想した約415bpのバンドを観察した。二次PCR反応の全体を、QIAquickPCRPurificationQiagenを用いてクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってStyIおよびXhoINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、消化生成物を、StyIおよびXhoIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、E93C変異を含み約260bpのStyI-XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。置換変異S96Cは、E93Cについて上記で詳述したプロトコルを用いて構築し、配列確認したが、以下の相違点を有している。S96のTCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性プライマーBB2205>CTGGAAGGGATCTGCCCCGAGTTGGGT>3;配列番号39およびBB2215>ACCCAACTCGGGGCAGATCCCTTCCAG>3;配列番号40を、それぞれ一次PCR反応におけるBB218およびBB219と置き換えた。一次反応の産物からは、[BB220×BB211]については約110bpおよび[BB221×BB210]については約330bpである予想サイズの産物が得られた。周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現するには、ムテインをコードするSTII-G-CSFC17S遺伝子を、約600bpのNdeI-EcoRIフラグメントとしてpUC18ベースのpBBT227誘導体から切り取り、pCYB1発現ベクター中にサブクローニングし、大腸菌W3110中に形質転換した。本明細書に記載した手順に類似した手順を用い、G-CSFおよびG-CSFC17Sの他のシステインムテインを一般的に構築することができる。システインムテインは、G-CSFコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換える置換変異、G-CSFコード配列中の天然に存在する2個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはG-CSFコード配列の一番目のアミノ酸T1の前にシステイン残基を付加する、もしくはG-CSFコード配列の末端アミノ酸残基P174の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはG-CSFコード配列中のどこか、2個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。G-CSFにシステイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスA、A-Bループ、B-Cループ、C-Dループに先行する領域、およびDヘリックスから遠位の領域中である。他の好ましい部位は、A、B、C、およびDヘリックスの最初または最後の3個のアミノ酸である。上述した変異の他に、システイン置換を作成するためにこれらの領域中で好ましい他の残基は、P2、G4、P5、S8、L9、P10、Q11、S12、T38、K40、S53、G55、I56、W58、A59、P60、L61、S62、S63、P65、S66、Q67、A68、Q70、A72、Q90、A91、L92、G94、I95、S96、E98、G100、G125、M126、A127、Q131,Q134、G135、S142、A143、Q145、およびP174である。本実施例に記載の変異体はすべて、天然タンパク質配列または天然に存在する遊離システイン残基システイン-17が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変えられた変異体タンパク質であるという状況で提供される。一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するG-CSF中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するG-CSFおよびG-CSFC17Sを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は今や遊離である。システイン残基は、他の19個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。これらの変異体は、天然タンパク質配列または天然に存在する遊離システイン残基システイン-17が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変えられた変異体タンパク質であるという状況で提供される。遊離システイン残基はまた、Sytkowski他1998によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってG-CSFに導入することもできる。実施例8、9、10、11および13に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にタンパク質を大腸菌中で発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をPEG化し、インビトロおよびインビボにおけるバイオアッセイでそれらの生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、PCT/US00/00931に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然G-CSFシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。B.G-CSFC17Sシステインムテインの発現および精製。13種類のG-CSFC17Sムテイン-1C、T1C、L3C、A6C、S7C、E93C、A129C、T133C、A136C、A139C、A141C、Q173C、および175Cを発現する大腸菌株を培養し、BOB213野生型およびBOB268D17Sの場合に用いた実施例8に記載のプロトコルを用いて誘導し、採取した。ムテインはすべて極めて不溶性であった。G-CSF野生型およびG-CSFC17Sについて実施例8に記載したプロトコルを用いてムテインをリフォールディングして精製した。非還元SDS-PAGE分析は、13種類の精製システインムテインが主に単量体として回収され、約17kDaで移動することを示した。精製ムテインは、野生型G-CSFよりわずかに遅く移動する-1Cムテインを除き、野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sと同時に移動した。1種類だけ除いてすべてのムテインは、野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sに類似した塩濃度でイオン交換カラムから溶出した。一つの例外E93Cは、グラジエント中の後半でNaCl濃度約400mM溶出したが、これは荷電アミノ酸であるグルタミン酸でシステインを置換したためと思われる。C.G-CSFC17Sシステインムテインの生物活性。13種類の精製G-CSFC17Sシステインムテインは、実施例8に記載のNFS60細胞増殖アッセイでアッセイした。タンパク質濃度は、Bradfordタンパク質アッセイキットBio-RadLaboratoriesを用いて測定した。市販の野生型G-CSFならびに発明者らによって調製された野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。13種類のムテインはすべて、アッセイの誤差の範囲内で野生型G-CSF対照タンパク質と同程度にNFS60細胞の増殖を刺激した。13種類のムテインの平均EC50は、5~9pg/mlの範囲であった。システインムテインの平均EC50は、G-CSFC17S対照タンパク質の平均EC50に類似しており、発明者らの野生型G-CSF対照タンパク質の平均EC50に比べて1.5から2分の1、すなわちより強力であり、市販の野生型G-CSFタンパク質の平均EC50に比べて約3分の1であった。これらのデータを表6に要約する。D.G-CSF二重システイン変異体の構築2個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、実施例9、14および15に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは2個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、PEG化された場合に各々が高活性を維持する2個以上のシステインムテインが組み合わされた変異体であろう。その例は、L3CプラスT133C、L3Cプラス175C、ならびにT133Cおよび175Cであろう。他の好ましい多重変異体は、表3および表4からのデータに基づいて推論でき、L3C、T133C、A141Cおよび175Cからなる群から選択される2個以上の変異を含有する組合せが含まれるであろう。発明者らは、以下のG-CSF二重システイムテイン:L3C/T133C、L3C/175C、およびT133C/175Cを構築した。L3C/T133Cを製造するためには、pBBT227のL3C誘導体pUC18中のG-CSFC17SをXhoIおよびEcoRIで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。DNAをQiagenPCRクリーンアップキットを用いて抽出し、G-CSFL3CX-R1-Cipベクターと呼ぶ。次に、pBBT227のT133C誘導体をXhoIおよびEcoRIで消化し、約480bpのフラグメントをゲル精製し、G-CSFL3CX-R1-Cipベクターと連結した。連結反応で大腸菌JM109を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。L3C/175Cを製造するためには、pBBT227の175C誘導体をXhoIおよびEcoRIで消化し、約480bpのフラグメントをゲル精製し、G-CSFL3CX-R1-Cipベクター上記参照と連結した。連結反応で大腸菌JM109を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。T133C/175Cを製造するためには、pBBT227のT133C誘導体は、逆方向変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーBB1865>CGCGAATTCTTAACAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG>3;配列番号14およびG-CSF挿入の上流のpUC18ベクター配列にアニールする順方向非変異誘発性オリゴヌクレオチドBB125を用いるPCR反応におけるテンプレートの役割を果たした。PCRは50μl反応で、1.5mMMgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートフラグメント0.5ng、TaqポリメラーゼPromega1単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.1単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中で行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、95°C5分、[94°C30秒、55°C30秒、72°C45秒]22サイクル、72°C保持7分および4°C保持とした。PCR20μlをアガロースゲル電気泳動によって分析し、約630bpのフラグメントをゲルから単離した。このフラグメントをXhoIおよびEcoRIで消化し、QiagenPCRクリーンアップキットを用いて抽出した。このDNAを、pBBT227のT133C誘導体をXhoIおよびEcoRIで消化することによって調製したベクターに連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、QiagenPCRクリーンアップキットを用いて抽出した。連結反応で大腸菌JM109を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。実施例10G-CSFシステインムテインのPEG化、精製および生物活性A.予備的PEG化試験。最初のPEG化反応条件は、試験タンパク質としてT1C、還元剤としてTCEP[トリス2-カルボキシエチルホスフィン]-HCl、およびShearwaterPolymers、Inc.製の5kDaシステイン反応性PEGを用いて決定した。タンパク質の過還元は、タンパク質のアンフォールディングによる予想より大きな見かけ分子量へのシフト、または天然ジスルフィドの還元により生じるいくつもがPEG化された分子種の出現を探索する非還元SDS-PAGEによりモニターした。精製T1Cのアリコート1μgを、様々な過剰量の5kDAマレイミド-PEGまたは5kDaビニルスルホン-PEGの存在下で100mMトリス、pH8.5中室温でTCEP濃度を増加させながらインキュベートした。60分後、反応物を直ちに非還元SDS-PAGEによって分析した。野生型G-CSFを修飾することなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質を与えたTCEPおよび特定のPEG試薬の量を、他の実験に使用した。滴定実験は、pH8.5では、10倍モル過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミドPEGにより、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質SDS-PAGEによる見かけの分子量28kDaが得られたことを示した。野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは同一のPEG化条件で修飾されなかった。これらの反応条件を用い、他のG-CSFムテインのPEG化をスケールアップした。対照実験は、T1Cタンパク質をPEG化するには、TCEPなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があることを示した。B.PEG化G-CSFシステインムテインの調製および精製13種類の精製G-CSFシステインムテインのアリコート200から300μgを5kDaマレイミドPEGでPEG化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大規模のPEG化反応はまた、上述の条件を用いて室温で1時間行った。これらの反応条件により、すべてのムテインについてモノPEG化タンパク質が得られた。モノPEG化ムテインのうち11種類は、以下に記載する手順を用いて精製した。反応時間の終了時に、PEG化混合物を40mMリン酸ナトリウム一塩基で10倍に希釈し、pHを4.0に調製した後、G-CSFムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件20mLグラジエント、40mMリン酸ナトリウムpH4に溶かした0~0.5MNaClを用い、S-セファロースカラム1mL、HiTrap上に素早く載せた。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。S-セファロースカラムからのクロマトグラムは、大部分のムテインについて約275mMNaClおよび300~325mMNaClで溶出する2本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピークは、SDS-PAGEによりモノPEG化G-CSFC17Sムテインであると決定した。後に溶出する主要ピークは、G-CSFC17Sムテインであると決定した。PEG-E93Cムテインは約325mMNaClで溶出し、これに対して未反応E93Cタンパク質の場合は約400mMNaClであった。モノPEG化G-CSFC17Sムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。5種類のシステインムテインL3C、T133C、A141C、Q173Cおよび175Cもまた、20kDaPEG-マレイミドならびに上述のPEG化および精製手順を用いてPEG化した。20kDa-PEG化タンパク質は、約250mMNaClでS-セファロースカラムから溶出した。SDS-PAGE分析は、精製PEG化タンパク質が10未満およびおそらく5未満の非PEG化タンパク質を含んでいることを示した。システインムテインをPEG化するには、TCEPなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があった。野生型G-CSFおよびG-CSFC17Sは同一の部分還元条件ではPEG化されず、ムテインに導入されたシステイン残基にPEG部分が結合していることを示している。C.L3CG-CSFシステインムテインの精製およびPEG化L3Cについて、リフォールドおよびPEG化反応の時間的経過を追った。この特定ムテインのリフォールドは、4時間までに完了することが分かった。リフォールド反応の進行は、逆相HPLCC4カラムによりモニターした。収量は、実施例8に記載のように培養した培養液400mL当たり約10mgであった。10kDa、20kDaおよび40kDaPEGでL3CムテインのPEG化について時間的経過を追った。0.5mMEDTAをPEG化緩衝液に含有させたことを除いて、PEG化反応条件は、実施例10で上述した通りとした。反応物0.5~1mgの場合には、室温で2~4時間の長い反応時間で多量のPEG化生成物が得られた。PEG化の効率は、時間延長で約80であった。大量の5mgまでPEG化反応を同等な効率で行った。実施例10で既に記載した精製方法を用い、S-セファロースカラム5mL上の非PEG化タンパク質からPEG化タンパク質を精製した。20kDaのPEG化タンパク質は、約200mMNaClで溶出し、40kDa-PEGタンパク質および10kDa-PEGタンパク質は、それぞれ約150mMおよび約220mMで溶出した。非PEG化G-CSFL3Cムテインは、約260mMで溶出した。EDTAの存在は、PEG化反応におけるタンパク質二量体の生成を有意に減少させた。D.20kDa-PEG-L3CのN末端配列決定。天然G-CSFのN末端アミノ酸はスレオニンであるSouza他、1986。自動Edman分解化学反応を用いる精製20kDa-PEG-L3Cタンパク質のN末端配列決定により配列TPXGPASが得られ、N末端が正しくプロセシングされPEG化された3番目の残基と一致していることを示している。PEG化アミノ酸は、Xによって示されるように、配列決定の実行ではブランクとして出現する。E.円二色性CD分析によるPEG化G-CSFシステインムテインの構造決定CD分析は、光路長1cmの300μlセル中、周囲温度でJasco720CD分光偏光計で行った。データは、感度50m ゚および32回の積算により260nm~200nmから集めた。最初の実験は、L3Cムテインおよび10KPEG-L3Cタンパク質について行った。どちらも野生型G-CSFについて文献に見られるスペクトルと極めて類似したCDスペクトルを有していた。同様の分析は、他のG-CSFシステインムテインおよびそれらのPEG化誘導体に対しても行うことができる。F.PEG化G-CSFC17Sシステインムテインの生物活性:11種類の精製5kDa-PEG-G-CSFC17Sシステインムテインおよび5種類の精製20kDa-PEG-G-CSFC17Sシステインムテインの生物活性は、実施例8に記載のNFS60細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて測定した。すべてのPEG化G-CSFC17Sシステインムテインは類似の用量反応曲線を示し、アッセイの誤差の範囲内でG-CSFC17Sと同じレベルの最大増殖刺激に達した。5kDa-PEG修飾システインムテインの平均EC50は、2~11pg/mlの範囲であった。これらのPEG化ムテインは、バイオアッセイにおいて、発明者らの野生型G-CSFよりも1.5から2倍強力であり、市販の野生型G-CSFよりも約3倍強力であった。20kDa-修飾システインムテインの平均EC50は、9~14pg/mlの範囲であった。PEG化G-CSFC17Sシステインムテインの生物活性は、野生型G-CSFの生物活性に等しいか、優れていた。5kDa-PEG-L3CのNFS60細胞刺激活性はすべて、G-CSFに対する中和モノクローナル抗体RDSystems、Inc.によって取り除かれると考えられ、成長促進活性がタンパク質調製物中の不純物ではなくPEG-L3CG-CSFタンパク質によるものであることを示している。生物活性データを表7に要約する。40kDa-PEGで修飾したL3CのEC50をNFS60細胞増殖アッセイを用いて測定すると、30~50pg/mlであった。本明細書に記載のPEG化G-CSFC17Sシステインムテインの生物活性は、そのすべてが野生型G-CSFに比べて低下した生物活性を有している既に記載したPEG化G-CSFタンパク質Tanaka他、1991;Kinstler他、1996a;Bowen他、1999の活性より優れている。Tanaka他1991は、アミン反応性10kDaNHS-PEGで修飾したG-CSFが、様々なリジン基またはN末端アミノ酸において修飾された複数の分子量の分子種および複数のアイソフォームからなっていると報告した。このNHS-PEG混合物の生物活性を測定すると、非修飾G-CSFに比べて約3分の1に低下していたTanaka他、1991;Satake-Ishikawa他、1992。Bowen他1999は、5kDa-、10kDa-および20kDa-アミン反応性PEGで修飾したG-CSF変異体は、非修飾G-CSFに比べて約6分の1、10分の1、20分の1に低下したと報告した。Bowen他1999は、20kDa-アミン反応性PEGで修飾したPEG化G-CSF変異体の単一分子量分子種を精製し、その生物活性が非修飾G-CSFに比べて約4分の1に低下していることを見いだした。Bowen他1999によって単離された単一分子量分子種は単一PEG分子で修飾されたG-CSF変異体に対応するが、複数の部位でタンパク質に結合したPEG分子のためにPEGタンパク質調製物は不均一であった。Kinstler他1996は、アミンまたはアミド結合を介して、大腸菌発現のMet-G-CSF細胞質中発現の非天然アミノ末端メチオニン残基において優先的に修飾されるPEG化Met-G-CSF分子種を精製した。このPEG化Met-G-CSFタンパク質は、野生型Met-G-CSFのインビトロにおける生物活性の68を有しているに過ぎなかったKinstler他、1996。実施例11システインブロッキング剤の使用は、適切に折り畳まれたG-CSFシステインムテインの回収率を改善する不溶性、大腸菌発現野生型G-CSFおよびG-CSFC17S/Q173Cは、触媒量の硫酸銅の存在下および非存在下に還元剤の量およびタイプを変化させる手順によってリフォールディングした。G-CSFについての最適化リフォールドプロトコルKuga他、1989でその使用法を記載する参考文献に基づき、5mMジチオスレイトールDTTを標準的還元剤として選択した。Lu他1992は、可溶化ステップ中は還元剤を存在させないが再生緩衝液中には40μM硫酸銅を含める、不溶性G-CSFをリフォールディング/再生するプロトコルについて記載している。実施例8に記載したように、大腸菌培養液400mLを培養し、各G-CSFタンパク質の発現を誘導した。細胞を溶解し、実施例8に記載したように不溶性部分を遠心分離によって単離した。大部分の不溶性G-CSFタンパク質を含有する不溶性材料を、8M尿素、20mMトリス、pH820mLに懸濁し、均一になるまで撹拌した。混合物を6本の管に等分し、実施例6に記載したように5mMDTTまたは25mMシステインをそれぞれの管に加えた。1時間後、可溶化混合物を、40μM硫酸銅を含む、および含まない40mMリン酸ナトリウム、15グリセロール、pH825mL中に希釈した。リフォールドを4°Cに2日間保った。この時点で各々のpHを4に調整した。リフォールドを遠心分離し、上清をS-セファロースカラム上に載せ、実施例8に記載したようにG-CSF野生型およびQ173Cタンパク質を精製した。実施例8に記載したように、カラム分画を非還元SDS-PAGEに基づいてプールした。クロマトグラフィ後に回収された各タンパク質の量を表5に示す。表8に示すように、G-CSF野生型およびG-CSFシステインムテインの最高収量は、可溶化ステップ中に還元剤としてシステインを用いた場合に達成された。硫酸銅40μMの存在は、還元剤と併せて用いた場合、わずかに収量を向上するように見えた。リフォールドプロトコルA~Fを用いて回収された野生型G-CSFタンパク質の非還元SDS-PAGE分析は、各々が、単量体G-CSFで予想されるサイズの単一分子量分子種非還元条件下で約17kDaを主に含んでいることを示した。対照的に、G-CSFC17S/Q173CリフォールドA~DからのS-セファロースカラムプールを非還元SDS-PAGEにより分析した場合には、最終生成物バンドは幅広く、単量体範囲で多数の様々に異なる見かけ分子量の分子種を含んでいた。おそらく、様々な分子量の単量体分子種は、G-CSFC17S/Q173Cタンパク質の様々なジスルフィドアイソフォームに相当している。リフォールドEおよびFから回収されたG-CSFC17S/Q173Cタンパク質は、野生型G-CSFと同時に移動する単一の鋭いバンドとして動き、単一で過半が折り畳まれた分子種が回収されたことを示した。このデータは、可溶化およびリフォールディングステップ中のシステインの添加が、適切に折り畳まれたG-CSFC17S/Q173Cタンパク質の収率を著しく向上させることを示している。いかなる特定の理論に束縛されることは望まないが、発明者らは、添加したシステインがムテイン中の遊離システイン残基と混合ジスルフィドを形成すると仮定している。この混合ジスルフィドは、遊離システイン残基が関係して起きる可能性のあるジスルフィド転位を制限する。システインがDTTより有効なのは、DTTが通常、酸化されて形成する熱力学的に好ましい分子内結合のために混合ジスルフィドを形成しないからである。実施例12システインの存在下および非存在下で調製されたG-CSFタンパク質安定性の比較リフォールド手順A還元剤なし、硫酸銅なしおよびリフォールド手順F25mMシステイン、40μM硫酸銅を用いて実施例11に記載のように調製された野生型G-CSFおよびG-CSFC17S/Q173Cタンパク質をpH4およびpH8で50°Cに置いた。0、5分、30分、1、2、3、4、5、および20時間目に、タンパク質試料を遠心分離して変性したタンパク質沈殿をすべて除去した。アリコートを上清から抜き取り冷凍した。実験の終了時に非還元SDS-PAGEによってすべてのアリコートを分析し、元のG-CSFタンパク質試料のうちどれほどの部分が溶液中にあり、かつ単量体であるかを測定した。ゲル上の目に見える相対的バンド強度に基づき、各タンパク質の可溶性半減期を測定した。結果は、野生型G-CSFがpH4ではpH8よりも長い可溶性半減期を有し、Arakawa他1993によって既に報告された結果と一致する。野生型G-CSFの可溶性半減期は、タンパク質がリフォールド手順AかあるいはFを用いてリフォールディングされたかで実質的な差はなかった。対照的に、G-CSFC17S/Q173Cは、タンパク質が手順A30分未満を用いた場合よりも手順F20時間超を用いてリフォールディングされた場合の方がはるかに長い可溶性半減期を有していた。したがって、可溶化/リフォールディング過程におけるシステインの使用は、適切に折り畳まれたG-CSFシステインムテインの回収率を向上させる他に、最終生成物の熱安定性を向上させる。追加の試験を行い、G-CSFシステインムテインと野生型G-CSFの安定性を比較することができる。例えば、タンパク質を様々なpH、温度および血清濃度に暴露することによりマトリックス状の実験を行うことができる。様々な時点で、実施例8に記載のNFS60インビトロ細胞増殖生物活性アッセイ、サイズ排除クロマトグラフィ、円二色性、ELISAアッセイおよびウエスタンブロット分析などであって、これに限定されないアッセイにより、タンパク質の完全性をモニターすることができる。実施例13PEG-G-CSFシステインムテインのインビボにおける有効性各々が約320gの体重である3匹の雄生SpragueDawleyラットからなる群に、1回の静注外側尾静脈で野生型組み換えG-CSFBolderBioTechnologyにより調製、ニューポジェン登録商標Amgen、Inc.より販売の組み換えG-CSFまたはPEG-L3Cを100μg/kgの用量で投与した。タンパク質濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて測定した。選択された時点に、血液試料0.3から0.4mlをラットからEDTA抗凝血管中に採取した。血液試料のアリコートを、全血球CBC計算のために民間会社に送った。血液試料の残りを遠心分離し、血漿を-80°Cで冷凍した。注射して0.25、1.5、4、8、12、16、24、48、72、96、120および144時間後に血液試料を採取した。0時間の基準値試料は、試験化合物の注射約24時間前に入手した。表10および11は、様々な試験群についての経時的な平均血中好中球および全白血球数を示す。3種類の試験化合物はすべて、ベースライン値を上回る末梢性白血球および好中球の増加を刺激した。野生型組み換えG-CSFおよびニューポジェン登録商標を投与された試験群の白血球および好中球数は注射後約24時間で最高になり、約48時間までに基準値に戻った。対照的に、PEG-L3Cを投与されたラットの白血球および好中球数は注射後約48~72時間で最高になり、注射後約120時間まで基準値に戻らなかった。PEG-L3Cを投与されたラットで観察された最高白血球および好中球レベルは、野生型組み換えG-CSFまたはニューポジェン登録商標を投与された群よりも有意に高値であったp<0.05。このデータは、PEG-L3Cには循環する好中球および白血球の増加を刺激する能力があり、その末梢白血球数および好中球における絶対的増加は、野生型G-CSFまたはニューポジェン登録商標で見られるよりも大きく持続性であることを示している。同様の実験を行い、他のPEG化G-CSFシステインムテインC17またはC17Sバージョンの有効性を証明することができる。同様の試験はまた、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。血漿中のG-CSFおよびPEG化G-CSFシステインムテインタンパク質は、市販のG-CSFELISAキットRDSystems、Inc.を用いて定量することができる。滴定実験を行い、野生型G-CSF、非修飾G-CSFシステインムテインおよびPEG化G-CSFシステインムテインを検出するためのELISAの相対的感度を測定することができる。同様の実験は、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。実施例13で上記のように概説した有効性実験からの血漿中タンパク質濃度は、RDSystems、Inc.から購入したヒトG-CSFELISAキットを用いて測定した。結果を表12に示す。この結果は、20kDa-PEG-L3Cが、ラットにタンパク質を静脈内投与した後に野生型G-CSFまたはニューポジェン登録商標よりも有意に長い循環半減期を有していることを示している。PEG化G-CSFシステインムテインC17またはC17Sバージョンのインビボにおける有効性は、正常または好中球減少症のマウスまたはラットなどの齧歯動物において、媒体処理動物に比べ、タンパク質が循環好中球レベルおよび顆粒球生成の増加を刺激することを証明することにより測定することができる。G-CSFは、100μg/kgの用量で正常または好中球減少症の齧歯動物における好中球レベルを刺激するKubota他、1990;Kang他、1995。正常マウスにおける有効性を証明する場合には、5匹のマウス各々の体重約20gからなる群に、規定の間隔で5日間までG-CSF、PEG-G-CSFシステインムテインまたはプラセボ媒体溶液を皮下注射で投与することができる。ICRマウスなどの正常マウスは、民間供給メーカーから購入した。6日目に動物を屠殺し、全血球計算CBC分析用に血液試料を集めることができる。造血組織肝臓および脾臓を集め、秤量し、組織病理学分析のためにホルマリン中に固定して顆粒球生成増加の証拠を探索することができる。骨髄を様々な長骨および胸骨からユニットパーティクルプレップunitparticleprepsおよび組織病理学分析のために摘出し、顆粒球生成増加の証拠を探索することができる。群間比較は、単一の比較のためにはStudentsT検定を、複数の比較のためには一元配置分散分析を用いて行うこととした。P<0.05を有意と見なすこととした。PEG化G-CSFシステインムテインは、媒体処置のマウスに比べ、マウスの循環好中球レベルおよび顆粒球形成の大きな増加を刺激するはずである。5kDa、10kDa、20kDaまたは40kDaPEGで修飾したPEG化G-CSFシステインムテインの有効性は、1回、1日1回、1日おき、または2日おきに投与してテストすることができる。最初の実験では、マウスの様々な群に、1回の注射でPEG化G-CSFシステインムテイン0.0032,0.016、0.08、0.4および2μgを皮下注射で投与することができる。対照マウスには、媒体溶液のみを投与することができる。追加の対照群には、PEG化G-CSFシステインムテインと同一の投与計画を用い、野生型G-CSF2μg/毎日EDを5日間および野生型G-CSF2μgを投与することができる。PEG化G-CSFシステインムテインの有効性はまた、好中球減少症のマウスで証明することもできる。好中球減少症は、一般的に使用される骨髄抑制化学療法剤でありヒトの臨床場面に関係のあるシクロホスファミドCPA;100mg/kgで処理することによって誘発することができる。G-CSFは、シクロホスファミド処置動物において正常な好中球レベルの回復を加速するKubota他、1990;Kang他、1995;Matsuzaki他、1996。0日目に、シクロホスファミドの腹腔内注射をマウス約20gに投与し、好中球減少症を誘発することができる。動物を様々な群に分割し、規定の間隔で5日間までG-CSF、PEG化G-CSFシステインムテインまたはプラセボを皮下注射で投与することとする。一つの対照群にはシクロホスファミドを投与せず、プラセボ注射を投与することとする。5kDa、10kDa、20kDaまたは40kDaPEGで修飾したPEG化G-CSFシステインムテインの有効性は、1回、1日おき、または2日おきに投与してテストすることができる。最初の実験では、マウスの様々な群に、1回の注射でPEG化G-CSFシステインムテイン0.0032,0.016、0.08、0.4および2μgを皮下注射で投与することができる。対照マウスには、媒体溶液のみを投与することができる。追加の対照群には、PEG化G-CSFシステインムテインと同一の投与計画を用い、野生型G-CSF2μg/毎日EDを5日間および野生型G-CSF2μgを投与することができる。0~10日目に、1群当たり5匹のマウスを屠殺し、血液および組織試料を上記の正常マウス実験について記載したように分析した。PEG化G-CSFシステインムテインは、媒体注射、CPA注射対照群に比べて、マウスにおける循環する好中球および白血球の増加を刺激して加速するはずである。あるいは、PEG化G-CSFシステインムテインの有効性は、ラットモデルを用いる好中球減少症試験で証明することができる。G-CSFは、骨髄抑制化学療法剤で処置したラットにおいて正常な好中球レベルの回復を加速する。この場合には、SpragueDawleyラット各々の体重は約300gに、CPA100mg/kgを0日目に腹腔内投与し、好中球減少症を誘発することができる。動物を3群に分割し、それらの群に、規定の間隔で10日間までG-CSF、PEG化G-CSFシステインムテインまたはプラセボを皮下注射で投与することができる。一つの対照群にはシクロホスファミドではなくプラセボ注射液を投与することができる。10kDa、20kDaまたは40kDaPEGで修飾したPEG化G-CSFシステインムテインの有効性は、約0.1μg~500μg/kg好ましい範囲は1~100μg/kgの皮下投与を行い、各分量を1回、毎日、1日おき、または2日おきに投与して測定するすることができる。追加の対照群には、毎日、5日間市販の野生型G-CSF100μg/kgを投与することができ、他の対照群には、PEG化G-SCFシステイン変異体と同一の投与量および投与計画で野生型G-CSFを投与することができる。対照ラットには、媒体溶液のみを投与することができる。0~6、8、10、12、および14日目に、CBC分析のために血液試料を集めることができる。時間的経過の終了時に、造血組織および骨髄の採取のためにラットを屠殺し、顆粒球生成増加の証拠を調べることができる。PEG化G-CSFシステイン変異体は、媒体注射、CPA注射対照群に比べて、ラットにおける循環する好中球レベルおよび顆粒球生成の増加を刺激して加速するはずである。実施例14野生型GM-CSFのクローニング、発現、精製および生物活性A.GM-CSFをコードするクローン化DNA配列発明者らは、ヒトGM-CSFをコードするcDNAを、ヒト膀胱癌細胞株5637AmericanTypeCultureCollectionから入手から単離した全RNAのRT-PCRによりクローニングして配列決定した。G-CSFをコードするcDNAは、ヒト膀胱癌細胞系5637AmericantypeCultureCollectionから単離した全RNAのPCRにより増幅した。10FBS、50単位/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地中で細胞を培養した。Qiagen、Inc.SantaClarita、CAから購入したRNeasyMiniRNA単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、BoehiringerMannheimCorp製のRT-PCR用1stStrandcDNASynthesisKitAMVを用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のPCR反応は、順方向プライマーBB2675>GACACTGCTGCTGAGATGAATG>3;配列番号75および逆方向プライマーBB2685>CTTGTAGTGGCTGGCCATCATG>3;配列番号76で行った。プライマーBB268は、GM-CSF分泌シグナル用のコード配列の5′末端にアニールし、逆方向プライマーBB268は、GM-CSFコード配列の3′末端にアニールする。得られた約450bpのPCR産物をHindIIIおよびBamHIで消化し、ゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化されたpCDNA3.1ベクター中にクローニングし、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいDNA配列のクローンは、pCDNA3.1::GM-CSFfusまたはpBBT267と名付けた。発明者らはPCRを用い、大腸菌における周辺質発現のためにこのGM-CSFクローンを修飾した。周辺質への分泌を介して大腸菌で発現させる場合に、GM-CSFは、付加的N末端メチオニンを含まず、天然に存在するGM-CSFと同一なアミノ酸配列を有するLee他、1985。分泌型のGM-CSFを発現させるためにPCRを用い、NdeI制限酵素認識部位の後ろの大腸菌の耐熱性エンテロトキシンSTII遺伝子Picken他、1983のリーダー配列を、成熟GM-CSFのアミノ末端コード配列に融合させた。さらに、カルボキシ末端残基E127の後に、EcoRI制限酵素認識部位に直ぐ続けてTAA終止コドンを付加した。同時に、2、6、8、12、117および124位のプロリンのコドンをすべてCCGに変え、114位のロイシンのコドンをCTGに変えた。PCR反応は、順方向プライマーBB3005>CGCAACGCGTACGCAGCACCGGCCCGCTCGCCGAGCCCGAGCACGCAGCCGTGGGAG>3;配列番号77および逆方向プライマーBB3015>CGCGAATTCTTACTCCTGGACCGGCTCCCAGCAGTCAAACGGGATGACCAGCAGAAA>3;配列番号78を用い、pBBT267をテンプレートとして行った。得られた約400bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、ゲル精製し、上記実施例9に記載のpBBT227中にクローニングした。pBBT227DNAをMluIおよびEcoRIで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、1アガロースゲル上に展開させた。約2.4kbのベクターフラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はGM-CSFに融合した完全stIIリーダーを有し、このstII-GM-CSF構築物を約450bpのNdeI-EcoRIフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローンは、pUC18::stII-GM-CSFと名付けた。発現試験の場合には、このプラスミドのNdeI-EcoRIフラグメントを発現ベクターpBBT257中にサブクローニングしたが、それを以下に記載する。得られたプラスミドpBBT257;stII-muGM-CSF、すなわちpBBT271を発現用の大腸菌W3110中に導入した。プラスミドpBBT257は、pCYB1のアンピシリン耐性遺伝子を削除し、それを古典的クローン化ベクターpBR322Bolivar他、1977に由来するテトラサイクリン耐性遺伝子と置き換えることにより発現ベクターpCYB1NewEnglandBioLabsから誘導した。pBBT257とpCYB1のいずれにおいても、クローン化遺伝子の発現はtacプロモーターの制御下とし、プラスミド性lacIq遺伝子の産物によって調節される。これらのベクターは、非融合タンパク質として、またはキチン結合領域との融合物として遺伝子を発現させることができる。発明者らの構築物は、タンパク質が非融合タンパク質として発現するように作成した。プラスミドpBBT257を以下の通りに構築した。プラスミドpBR322NewEnglandBioLabsから購入のテトラサイクリン耐性遺伝子TcR遺伝子は、プライマーBB2285>CGCGCTGCAGTTCTCATGTTTGACAGCTTATCATC>3;配列番号41およびBB2295>CGCGCTGCAGATTTAAATTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCAT>3;配列番号42を用いるPCRによって増幅した。順方向プライマーBB228は、TcR遺伝子の上流に位置し、TcR遺伝子プロモーターの-35部分を含む、pBR322配列のヌクレオチド1から25GenBAnkAccessionJ01749にアニールする。オリゴBB228は、クローニング目的用の付加PstI部位を含む。逆方向プライマーBB229は、TcR遺伝子のコード配列に続く翻訳終止コドンの直ぐ下流に位置するヌクレオチド1277から1300にアニールする。BB229は、クローニング目的用の付加DraI部位を含む。PCR反応40μlは、50mMKCl、10mMトリス-HClpH9.0、25°C、0.1トリトン登録商標X-100、1.5mMMgCl2中で行い、各200μMのdNTP、各プライマー20pmole、pBR322DNA0.5ng、TaqポリメラーゼPromega2.5単位、およびPFUポリメラーゼStratagene0.5単位を含んでいた。PCR反応は、95°C3分、[94°C30秒、60°C30秒、72°C90秒]25サイクルと、続く4°C保持で構成した。得られた約1300bpの産物をゲル精製し、PstIおよびDraIで消化し、以下に記載する連結反応に用いた。精製pCYB1DNAをPstIおよびSwaIで消化し、供給メーカーNewEnglandBioLabsのプロトコルに従って子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。PstIおよびSwaIは、それぞれベクターを1回切断し、アンピシリン耐性ApR遺伝子を隣接する。消化生成物を、QIAquickPCRCleanupKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってクリーンアップし、続いて1アガロースゲル上に展開した。ApR遺伝子を削除された約5.3kbのベクターフラグメントをゲル精製し、TcR遺伝子を含むPstI-DraIカットPCR産物と連結した。DraIとSwaIは共に、互いと連結することができる平滑末端消化生成物を生成する。連結反応を用い、大腸菌DH5αを形質転換し、テトラサイクリン耐性形質転換体を選択した。続いて、3種類の分離株を分析し、すべてがアンピシリンに感受性であることが分かった。これらの分離株から得られた制限エンドヌクレアーゼ消化生成物は、ApR遺伝子を含む約1500bpのPstIおよびSwaIフラグメントの欠失およびTcR遺伝子を運ぶ約1300bpのPstI-DraIフラグメントによるその置換とも一致した。pBBT257と名付けた一分離株を組み換えタンパク質の発現に使用するために選択した。B.大腸菌における野生型GM-CSFの発現。分泌GM-CSFの発現の場合には、pBBT271[pBBT257::STII-GM-CSF]およびpBBT257親ベクターを大腸菌W3110中に形質転換した。得られた菌株をBOB340:W3110pBBT257、およびBOB350:W3110pBBT271と名付けた。新鮮な飽和した前夜の培養液を、A600におけるO.D.約0.05で10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB中に接種した。これらの培養液100mlを、500mLのバッフル付き振とうフラスコ中28°Cで、約250rpmのジャイロトリーシェーカー用水浴中で培養した。培養液の密度が約0.6ODに達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えた。次いで、誘導培養液を約16時間一夜インキュベートした。誘導および非誘導培養液の試料を既製の16トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。BOB350野生型の誘導培養液は、約14kDaにバンドを示し、これは成熟GM-CSFの分子量と一致する。このバンドは、BOB350の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB340の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。ウェスタンブロット分析は、この約14kDaのバンドが抗ヒトGM-CSF抗血清RDSystemsと強力に反応することを示した。この抗血清は、BOB340およびBOB350の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB340の誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタンブロットはまた、この約14kDaのバンドがRDSystemsから購入した市販の大腸菌由来のヒトGM-CSF標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、STIIリーダーペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。以下に示すN末端配列決定試験は、STIIシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。これらの培養液からの誘導後16時間の試料を、KoshlandおよびBotstein1980の手順に基づき浸透圧衝撃に供した。この手順は、大腸菌の外膜を破裂させ、周囲の培地中に周辺質の内容物を放出する。続く遠心分離により、細胞質成分、不溶性周辺質成分、および細胞関連成分ペレット中に回収されるから可溶性の周辺質成分上清中に回収されるを分離する。合成されたGM-CSFタンパク質が上清中に回収されることはほとんどなかった。GM-CSFの大部分はペレットと結びついたままであった。このことは、タンパク質がプロセシングされ周辺質に分泌されたように見えるが、主に不溶性の形でそこに蓄積していることを示す。同様の結果は、大腸菌周辺質に分泌されたGM-CSFに関して他の研究者によって報告されているLibby他、1987;Greenberg他、1988。C.野生型GM-CSFの精製。野生型GM-CSFを、以下のプロトコルを用いてより大きなスケールで発現させて精製した。BOB350野生型の新鮮な飽和一夜培養液を、10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB中にA600おけるOD約0.05で接種した。2Lのバッフル付き振とうフラスコ中で培養液400mlを28°Cで、約250rpmのジャイロトリーシェーカー用水浴内で培養した。培養液の密度が約0.6ODに達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えた。次いで、誘導培養液を約16時間一夜インキュベートした。遠心分離により細胞をペレットにし、-80°Cで冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者Pierceのプロトコルに従ってB-PER商標細菌タンパク質抽出試薬5mLで処理した。GM-CSFタンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、B-PER中に懸濁した。この混合物をリゾチーム200μg/mlで10分間処理して細胞壁をさらに破壊し、MgCl2最終10mMおよびプロテアーゼ非含有DNAse2μg/mlを加えた。不溶性のGM-CSFを遠心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞破片の大部分を除去した。リフォールディングのため、不溶性のGM-CSFを含有する得られたペレットを、20mMトリスベース中の8M尿素、25mMシステイン10mlに溶かした。この混合物を室温で30分間撹拌し、次いで20mMトリス、40μM硫酸銅、15グリセロール、pH8.0100ml中に希釈した。このリフォールド混合物を4°Cに2日間保ち、次いで遠心分離し、20mMトリスpH8.0緩衝液Aで平衡化したQ-セファロースカラムPharmaciaHiTrap5ml上に載せた。0~35緩衝液B1MNaCl、20mMトリス、pH8の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。非還元SDS-PAGEによりカラム分画を分析した。GM-CSFは約230mMNaClで溶出した。主にGM-CSFを含有する分画をプールした。Q-セファロースプールを等体積の30硫酸アンモニウムで希釈し、室温まで温めた後、20mMリン酸ナトリウム、pH7.5に溶かした15硫酸アンモニウムで予め平衡化したフェニルHPカラムPharmaciaHiTrap1mL上に載せた。逆塩グラジエント20mMリン酸ナトリウム、pH7.5に溶かした15硫酸アンモニウムから0硫酸アンモニウムで溶出することにより、精製GM-CSFをカラムから回収した。GM-CSFに関するフェニルHPカラム溶出プロフィールは、約6.5硫酸アンモニウムで溶出する単一主ピークを示した。ピーク全体のカラム分画を非還元SDS-PAGEにより分析した。GM-CSFを含有し目に見える不純物を含有しない分画をプールした。野生型GM-CSFの最終的な収量をBradford分析により測定すると、培養液400mlから約2.6mgであった。自動Edman分解化学反応を用いる野生型GM-CSFのN末端配列決定により配列APARSPSが得られ、成熟ヒトGM-CSFの最初の7個のアミノ酸と同じく一致し、N末端が正しくプロセシングされていることを示しているLee他、1985。精製野生型GM-CSFおよび市販のGM-CSF大腸菌発現;RDSystemsは、ウエスタンブロット分析で示されるように還元および非還元条件下で一緒に移動した。両方のタンパク質は、分子内ジスルフィド結合の破壊により、還元条件下では予想されたより大きな見かけ分子量への移動性シフトを示した。D.野生型GM-CSFのインビトロにおける生物活性。ヒトTF-1赤白血病細胞株Kitamura他、1989を用いる細胞増殖アッセイを開発し、野生型GM-CSFの生物活性を測定した。ヒトTF-1細胞株は、AmericanTypeCultureCollectionから入手した。この細胞を、10FBS,50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンおよび2ng/ml組み換えヒトGM-CSF大腸菌発現;RDSystemsを添加したRPMI1640培地中に維持した。一般的に、TF-1細胞をRPMI1640培地添加物なしで3回洗浄し、10FBS,50単位/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地アッセイ培地中に1×105/mlの濃度で細胞を再懸濁することによってバイオアッセイを開始した。細胞懸濁液50μl5×103個の細胞を、平底の96ウエル組織培養プレートの試験ウエルに等分した。試験するタンパク質試料の段階希釈液をアッセイ培地中で調製した。市販の組み換えヒトGM-CSF大腸菌発現;RDSystemsの段階希釈液を並行して分析した。希釈したタンパク質試料50μlを試験ウエルに加え、加湿した5CO2組織培養インキュベータ中37°Cでプレートをインキュベートした。タンパク質試料は、三つ組みのウエル中でアッセイした。約3日後、MTS/PMS混合物CellTiter96AQueousOneSolution、Promega20μlを各ウエルに加え、組織培養インキュベータ中37°Cで1~4時間プレートをインキュベートした。マイクロプレートリーダーを用いて490nmでウエルの吸光度を読みとった。対照ウエルは培地を含み細胞を含まなかった。三つ組みの対照ウエルの平均吸光度値を、試験ウエルについて得られた平均値から差し引いた。各試料について、EC50、最大刺激半減濃度を算出し、タンパク質の生物活性を比較した。TF-1細胞株は、細胞数および吸光度値の用量依存的増加により明らかなように、GM-CSFに対して強い増殖反応を示す。市販のGM-CSFおよび発明者らにより調製されたGM-CSFは、バイオアッセイにおいてそれぞれ97および105pg/mlの平均EC50を有していた表13。実施例15GM-CSFシステインムテインの構築、発現、精製および生物活性A.GM-CSFシステインムテインの構築。Innis他1990およびHorton他1993ならびに実施例9で一般的に記載されている部位特異的PCRをベースとする変異誘発を用い、13種類の変異体GM-CSF遺伝子を構築した。発明者らは、ヘリックスAから近位のアミノ末端領域中の5種類のムテイン[-1C天然アミノ末端へのシステイン残基の付加、A1C、A3C、S5CおよびS7C];B-Cループ中の1種類のムテイン[S69C];C-Dループ中の3種類のムテイン[E93C、T94C、およびT102C];およびヘリックスDから遠位のカルボキシ末端領域中の3種類のムテイン[V125C、Q126Cおよび128C天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加を構築した。発明者らはまた、ヘリックスAの遠位末端に位置する推定上のN結合グリコシル化部位における1種類のムテイン[N27C]も構築した。変異誘発性PCR反応に用いたテンプレートは、STII-GM-CSF遺伝子がpUC18中のNdeI-EcoRIフラグメントとしてクローニングされているプラスミドpBBT268とした。PCR産物を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル精製し、これらと同一の制限酵素により切断されたpBBT268ベクターDNAと連結し、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドDNAを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたPCRフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびPCR反応または合成オリゴヌクレオチドプライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。周辺質空間に分泌されるタンパク質として大腸菌で発現するには、13種類のムテインをコードするSTII-GM-CSF遺伝子を、約450bpのNdeI-EcoRIフラグメントとしてpUC18ベースのpBBT268から切り取り、pBBT257発現ベクター中にサブクローニングし、大腸菌W3110中に形質転換した。本明細書に記載した手順に類似した手順を用い、GM-CSFの他のシステインムテインを一般的に構築することができる。システインムテインは、GM-CSFコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換える置換変異、GM-CSFコード配列中の天然に存在する2個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはGM-CSFコード配列の一番目のアミノ酸A1の前にシステイン残基を付加する、もしくはGM-CSFコード配列の末端アミノ酸残基E127の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはGM-CSFコード配列中のどこか、2個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。GM-CSFにシステイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスA、A-Bループ、B-Cループ、C-Dループに先行する領域、およびヘリックスDから遠位の領域中にある。他の好ましい部位は、A、B、C、およびDヘリックスの一番目または最後の3個のアミノ酸である。システイン変異に好ましいいくつかの位置を、表13に記載する。他の好ましい位置には、R67C、G68C、L70C、R30C、T32C、A33C、E35C、N37C、T39C、E45C、D48C、Q50C、E51C、Q99C、T98C、E113CおよびE127Cが含まれる。上述の変異の他に、システイン置換を作成するためにこれらの領域中で好ましい他の残基は、PCT/US98/14497に記載されている。一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するGM-CSF中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するGM-CSFを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、今や遊離している。システイン残基は、他の19個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。遊離システイン残基はまた、Sytkowski他1998によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってGM-CSFに導入することもできる。2個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、実施例8、9、14および15に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは2個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、PEG化された場合に各々が高活性を維持する2個以上のシステインムテインが組み合わされた変異体、例えばA3CプラスS69C、S69CプラスE93C、およびA3CプラスE93Cであろう。他の好ましい多重変異体は、表9および表10からのデータに基づいて推論でき、-1C、A1C、A3C、S5C、S7C、S69CおよびE93Cからなる群から選択される2個以上の変異を含有する組合せが含まれるであろう。実施例14~16に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にタンパク質を大腸菌中で発現させ、タンパク質を精製し、タンパク質をPEG化し、インビトロにおけるバイオアッセイでそれらの生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、PCT/US00/00931に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然GM-CSFシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。B.GM-CSFシステインムテインの発現および精製。13種類のGM-CSFシステインムテインを発現する大腸菌株を培養し、実施例14で野生型GM-CSFについて記載したプロトコルを用いて誘導し、採取した。野生型GM-CSFについて実施例14に記載したプロトコルを用いてムテインをリフォールディングして精製した。ムテインは、約200~230mMNaClでQ-セファロースカラムから、約6~8硫酸アンモニウムでフェニルHPカラムから溶出した。ムテインは主に単量体として回収され、非還元SDS-PAGEによる見かけの分子量は約14kDaであった。C.GM-CSFシステインムテインの生物活性。13種類の精製GM-CSFシステインムテインは、TF-1細胞増殖アッセイでアッセイした。タンパク質濃度は、Bradfordタンパク質アッセイキットBio-RadLaboratoriesを用いて測定した。市販の野生型GM-CSFおよび発明者らによって調製された野生型GM-CSFは、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。13種類のムテインはすべて、野生型GM-CSF対照タンパク質と同程度にTF-1細胞の増殖を刺激した。13種類のムテインの平均EC50は、80から134pg/mlの範囲であった表13。実施例16GM-CSFシステインムテインのPEG化、精製および生物活性A.予備的PEG化試験。最初のPEG化反応条件は、試験タンパク質としてA1C、S7CおよびS69C、還元剤としてTCEP[トリス2-カルボキシエチルホスフィン]-HCl、およびShearwaterPolymers製の5kDaシステイン反応性PEGを用いて決定した。精製システインムテインまたは野生型GM-CSFのアリコート3μgを、過剰の5kDAマレイミド-PEGまたは5kDaビニルスルホン-PEGポリマー末端の一方に反応性マレイミドまたはビニルスルホン基を有する平均分子量5kDaの直線型ポリエチレングリコールポリマーの存在下で100mMトリス、pH8.5中室温でTCEP濃度を増加させながらインキュベートした。マレイミドおよびビニルスルホン基は、Michael求核試薬と反応し、システイン側鎖上にあるようなメルカプタン基に高い選択性がある。90分後、反応物を直ちに非還元SDS-PAGEによって分析した。野生型G-CSFを修飾することなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質を与えたTCEPおよび特定のPEG試薬の量を、続く実験に使用するため選択した。滴定実験は、pH8.5では、15倍モル過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミドPEGにより、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化A1Cタンパク質が得られたことを示した。GM-CSFS69Cの場合には、5kDaビニルスルホン-PEGが5kDAマレイミド-PEGより好ましく、有意な量のモノPEG化S69Cタンパク質を与える。組み換え野生型GM-CSFは、50倍モル過剰のTCEPが存在してもPEGと反応しなかった。対照実験は、ムテインをPEG化するには、部分的に還元する必要があることを示した。B.PEG化GM-CSFシステインムテインの調製および精製10種類の精製GM-CSFシステインムテインのアリコート200から300μgをPEG化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大量のPEG化反応はまた、室温で1.5時間行った。各変異体の場合、15倍過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミド-PEGを用いた。唯一の例外は、5kDaビニルスルホン-PEGを用いたS69Cであった。これらの反応条件により、10種類のすべてのムテインについてモノPEG化タンパク質が得られた。反応時間の終了時に、PEG化混合物を氷冷20mMトリス、pH8.0で20倍に希釈した後、GM-CSFムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件25mLグラジエント、20mMトリスpH8に溶かした0~0.35MNaClを用い、Q-セファロースカラム1mL、HiTrap上に素早く載せた。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。PEG化反応の非還元SDS-PAGE分析は、唯一のPEG化分子種が、見かけの分子量約26kDaで移動するPEG-GM-CSFシステインムテイン単量体であることを示していた。Q-セファロースカラムからのクロマトグラムは、2本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピーク160~200mMNaClは、SDS-PAGEによりモノPEG化GM-CSFタンパク質であると決定した。二番目の主要ピーク200~230mMNaClは、未反応GM-CSFタンパク質であると決定した。モノPEG化GM-CSFシステインムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。すべてのGM-CSFムテインを同一のプロトコルによりPEG化し、精製した。PEG化タンパク質は、SDS-PAGEにより類似した見かけの分子量を示したが、PEG-E93CムテインおよびPEG-T94Cムテインは例外で、わずかに小さな見かけ分子量を示した。N末端領域における4種類のシステインムテイン-1C、A1C、A3C、およびS7Cも、10-および20kDaマレイミドPEGを用い、小スケールでPEG化した。これらの反応は、上述の条件を用いて各ムテイン3μgについて行い、SDS-PAGEにより分析した。これらの各ムテインは、10kDaおよび20kDaPEG試薬と容易に反応し、モノPEG化タンパク質が得られた。40kDa-PEG-A3Cも上述のプロトコルに従って調製した。このプロトコルをスケールアップすると多量の10kDa-、20kDa-および40kDa-PEG-A3Cタンパク質が得られた。C.PEG化GM-CSFシステインムテインの生物活性。発明者らは、正確なタンパク質濃度および特異的生物活性測定のために5kDaPEGで修飾した十分量の7種類のムテイン-1C,A1C、A3C、S5C、S7C、S69CおよびE93Cを精製した。7種類の精製5kDa-PEG-GM-CSFシステインムテインの生物活性は、TF-1細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて測定した。すべてのPEG化GM-CSFシステインムテインは類似した用量反応曲線を示し、野生型GM-CSFと同一レベルの最大増殖刺激に達した。PEG-GM-CSFシステインムテインの平均EC50は、80~123pg/mlの範囲であった表14。10kDa-、20kDa-および40kDa-PEG分子で修飾したA3Cムテインの生物活性は、TF-1細胞増殖アッセイで測定した。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて測定した。各PEG-A3Cタンパク質は、TF-1細胞の増殖を刺激した。10kDa-、20kDa-および40kDa-PEGA3Cシステインムテインの平均EC50は、それぞれ78/-3pg/ml、113/-5pg/ml、および300/-50pg/mlであったN=各タンパク質につき4回のアッセイ。D.5kDa-、10kDa-、20kDa-および40kDa-KPEGで修飾したA3Cの見かけ分子量。PEG化GM-CSFA3Cタンパク質の見かけの分子量は、BioradBio-SilSEC-400-5カラムを用いるサイズ排除HPLCSECによりBeckmanSystemGoldHPLCで測定した。リン酸緩衝食塩水からなる定組成グラジエントを溶出液として用いた。各タンパク質の保持時間を用い、ゲル濾過タンパク質標準品BioRadLaboraories、Richmond、CAで作成した標準曲線に基づいて分子量を算出した。PEG化タンパク質は、非PEG化GM-CSFに比べて見かけ分子量の劇的な増加を示した表15。大きなPEGは小さなPEGよりもタンパク質の見かけ分子量を増加させた。同様のデータは、GH、IFN-α2、およびG-CSFのPEG化システインムテインの場合にも記録された。実施例17野生型マウスGM-CSFおよびマウスGM-CSFのシステインムテインのクローニング、発現、精製および生物活性発明者らは、成熟マウスGM-CSFをコードするcDNAを、AmericanTypeCultureCollectionRockville、MDから入手したマウスEL4.IL-2細胞株カタログ番号TIB-181から単離した全RNAのRT-PCRによりクローニングして配列決定した。10FBS、50単位/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で細胞を培養した。RNA単離の前に、DMEM培地中の1μg/mlPHA-LSigma-AldrichChemicalCompany、カタログ番号L-4144および10ng/mlPMASigma-AldrichChemicalCompany、カタログ番号P-1585、10FBS、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンにより37°Cで6または24時間、細胞を誘導した。Qiagen、Inc.SantaClarita、CAから購入したRNeasyMiniRNA単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、BoehiringerMannheimCorp製のRT-PCR用1stStrandcDNASynthesisKitAMVを用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる続くPCR反応は、順方向プライマーBB4815>GCGACGCGTACGCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACT>3;配列番号43および逆方向プライマーBB482で行った。BB481は、成熟マウスGM-CSFの最初の8個のアミノ酸をコードする24個のヌクレオチドにアニールする。BB481はまた、上記の実施例7およびPicken他1983に記載の大腸菌stIIシグナル配列のカルボキシ末端の4個のアミノ酸をコードする配列と重なり合うヌクレオチドを、自身の配列の5′へ直に付加する。11個のこれらのヌクレオチドには、MluI制限酵素認識部位が含まれる。BB4825>GCGGAATTCTTATTTTTGGACTGGTTTTTTGCATTCAAAGGG>3;配列番号44は、マウスGM-CSFの10個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドにアニールし、コード配列の直後にTAA翻訳終止コドンおよびEcoRI制限酵素認識部位を付加する。6時間と24時間RNA試料は共に、GM-CSFRT-PCR産物を与えた。6時間RNA試料から得られた約400bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、ゲル精製し、上記実施例8に記載のpBBT227[pUC18::stII-GM-CSFC17S]中にクローニングした。pBBT227DNAをMluIおよびEcoRIで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、1アガロースゲル上に展開した。約2.4kbのベクターフラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はマウスGM-CSFに融合した完全stIIリーダーを有し、このstII-muGM-CSF構築物を約450bpのNdeI-EcoRIフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローンGough他、1984は、pUC18::stII-muGM-CSFまたはpBBT435と名付けた。発現試験の場合には、pBBT435のNdeI-EcoRIフラグメントを、上記の実施例14に記載する発現ベクターpBBT257中にサブクローニングした。得られたプラスミドpBBT257::stII-muGM-CSF、すなわちpBBT456を発現用の大腸菌W3110中に導入した。上記実施例14に記載のヒトGM-CSFの発現および精製用のプロトコルを用い、野生型マウスGM-CSFを発現させ精製した。Innis他1990およびHorton他1993ならびに上記の他の実施例で一般的に記載されている部位特異的PCRをベースとする変異誘発を用い、変異体マウスGM-CSF遺伝子を構築した。1種類のムテインT3Cは、ヘリックスAから近位のアミノ末端領域中に構築した。変異誘発性PCR反応は、テンプレートとしてのプラスミドpBBT435実施例17に記載ならびに順方向プライマーBB5045>GCGACGCGTACGCAGCACCCTGCCGCTCACCCATCACT>3;配列番号45および逆方向プライマーBB4825>GCGGAATTCTTATTTTTGGACTGGTTTTTTGCATTCAAAGGG>3;配列番号46を用いて行った。BB504は、成熟マウスGM-CSFの3位スレオニンのACCコドンをシステインのTGCコドンに変える。得られた約400bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、ゲル精製し、MluIおよびEcoRIで消化したpBBT435中にクローニングし、アルカリホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しい配列の一クローンは、pUC18::stII-muGM-CSFT3Cと名付けた。発現試験の場合には、このプラスミドのNdeI-EcoRIフラグメントを、上記の実施例14に記載する発現ベクターpBBT257中にサブクローニングした。得られたプラスミドpBBT257::stII-muGM-CSFT3C、すなわちpBBT469を発現用の大腸菌JM109中に導入した。上記実施例14に記載のヒトGM-CSFの発現および精製用のプロトコルを用い、マウスGM-CSFのT3Cムテインを発現させ精製した。本明細書、ならびに上記実施例9および15に記載した手順に類似した手順を用い、マウスGM-CSFの他のシステインムテインを一般的に構築することができる。システインムテインは、GM-CSFコード配列中の天然アミノ残基をシステインで置き換える置換変異、マウスGM-CSFコード配列中の天然に存在する2個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはマウスGM-CSFコード配列の一番目のアミノ酸の前にシステイン残基を付加する、もしくはマウスGM-CSFコード配列の末端アミノ酸残基の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはマウスGM-CSFコード配列中のどこか、2個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。システイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスA、A-Bループ、B-Cループ、C-Dループに先行する領域、およびヘリックスDから遠位の領域中にある。他の好ましい部位は、A、B、C、およびDヘリックスの最初または最後の3個のアミノ酸である。一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するGM-CSF中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するムテインを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は今や遊離である。システイン残基は、他の19個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。遊離システイン残基はまた、Sytkowski他1998によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってGM-CSFに導入することもできる。2個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、上記の実施例9および15に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは2個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、PEG化された場合に各々が高い、または完全な比活性を維持する2個以上のシステインムテインが組み合わされた変異体であろう。実施例12~14、15および16に記載の手順に類似した手順を用い、一般的にマウスGM-CSFムテインを発現させて精製し、PEG化し、インビトロにおけるバイオアッセイおよびインビボにおける有効性モデルでそれらのタンパク質の生物活性を測定することができる。タンパク質は、大腸菌で細胞質に、または周辺質空間に分泌されるタンパク質として発現することができる。ムテインはまた、PCT/US00/00931に記載の手順、または当業者によく知られている関連手順に類似した手順を用い、昆虫または哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現することができる。真核細胞からの分泌が望ましい場合には、天然GM-CSFシグナル配列、または別のシグナル配列を用いて真核細胞からタンパク質を分泌させることができる。精製マウスGM-CSF野生型タンパク質、システインムテイン、およびPEG化型のシステインムテインは、上記実施例8および9に記載したように、NFS60細胞株を用いる細胞増殖アッセイで生物活性をアッセイすることができる。マウス野生型GM-CSFおよびマウスT3CGM-CSFシステインムテインは、ヒトWT-GM-CSFについて記載した手順実施例14~16に従って大腸菌から単離したが、ただしヒトGM-CSFについて記載した15ではなく30硫酸アンモニウムを用いてマウスタンパク質をフェニル-セファロースカラムに結合させた。マウスT3C変異体は、ヒトGM-CSFA3Cシステインムテインについて上記で記載したプロトコルを用い、10kDa、20kDaおよび40kDaにより容易にPEG化された。これらのPEG化タンパク質の生物活性は、実施例8および9に記載のように、NFS60細胞増殖アッセイで測定した。実施例18野生型ヒトエリスロポエチンの大腸菌発現および精製A.大腸菌中への分泌によるエリスロポエチンの発現。野生型ヒトエリスロポエチンEpoをコードするDNAは、昆虫細胞中のEpoの発現に用いられてきたベクターpBlueBac4.5中のEpo用遺伝子インビトロgenを含むプラスミドpBBT358下記参照からPCRによって増幅した。pBBT358中のEpo用遺伝子は、変異誘発過程を容易にするためのXhoI制限酵素認識部位を作成する成熟Epoのアミノ酸84および85のコドンにおける3個のサイレント変異を除いては、天然cDNAと類似している。XhoI制限酵素認識部位を作成する3個の変異は、Horton他1993およびPCT/US00/00931に記載のようにオーバーラップエクステンションによる変異誘発の技術を用いて構築した。XhoI構築の最初の、すなわち一次PCR反応は、1.5mMMgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートプラスミドpBBT132pUC19中のBamHI-EcoRIフラグメントしてクローニングされた野生型Epo-Flag遺伝子PCT/US00/00931に記載1ng、TaqPlatinumBRL2単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.25単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中、反応体積50μlで行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、95°C5分、[94°C30秒、56°C30秒、72°C45秒]25サイクル、72°C保持7分および4°C保持とした。用いたプライマー対は、[BB361×BB125]および[BB362×BB126]とした。BB3615>GTTGGTCAACTCGAGCCAGCCGTGGGAG>3;配列番号79は、成熟Epoのアミノ酸残基81-89をコードするDNA配列にアニールする。BB1255>CTATGCGGCATCAGAGCAGATA>3;配列番号17は、クローン化Epo配列の約20bp上流のpUC19ベクター配列にアニールする。PCR産物を1.5アガロースゲル上に展開し、ゲルから切り取り、QIAquickGelExtractionKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従って単離した。次いで、これら2種類の変異誘発されたフラグメントを、次の、すなわち二次PCR反応で一緒にスプライシングした。この反応では、ゲル精製した一次反応の各PCR産物0.3μlをテンプレートとして用い、BB125およびBB126をプライマーとして用いた。反応体積は50μlとし、Taqポリメラーゼ2.5単位およびPfuポリメラーゼ0.5単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次PCRのアリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析し、予想した約190bpのバンドを観察した。二次PCR反応の全体を、QIAquickPCRPurificationQiagenを用いてクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってKpnIおよびStuINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップの後、消化生成物を、KpnIおよびStuIで切断されたpBBT138pBlueBac4.5中のBamHI-EcoRIフラグメントとしてクローニングされた野生型Epo-Flag遺伝子PCT/US00/00931と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、XhoI部位を含み433bpのKpnIおよびStuIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。成熟タンパク質の分泌を大腸菌周辺質に導くペプチド配列であるSTIIシグナルペプチドに融合したEpoの発現の場合、PCR反応に用いるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のN末端コード領域にアニールするBB5835>CCAACGCGTACGCAGCCCCACCACGCCTCATC>3;配列番号46、および遺伝子のC末端コード領域にアニールするBB5855>CCGGAATTCTTAACGGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号47あるいはBB5865>CCGGAATTCTTAGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号48とした。BB585には、cDNA配列によって予測されるC末端アミノ酸であるArg166のコドンが含まれるが、BB586はArg166コドンを削除し、C末端アミノ酸としてAsp165をコードする。得られた約600bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、同様に消化したpBBT227実施例9ベクター中にクローニングし、STIIリーダー配列と野生型Epoのアミノ末端コード配列との間の融合物を作成した。BB583およびBB585を用いるPCRによって形成される遺伝子をSTII-Epo-完全長STII-Epo-FLと呼び、BB583およびBB586を用いるPCRによって形成される遺伝子をSTII-Epo-desArgSTII-Epo-dRと呼ぶ。次いで、正しい配列のSTII-Epo-FLクローンおよびSTII-Epo-dRクローンをNdeI-EcoRIフラグメントとしてpBBT257実施例14に記載中にサブクローニングし、それぞれpBBT477およびpBBT478を作成した。pBBT477およびpBBT478をJM109中に形質転換し、菌株BOB578およびBOB579を作成した。これらの菌株は、BOB490pBBT257/JM109と併せ、回転培養管中、37°Cで10μg/mlテトラサイクリンを含有するLuriaBrothLB培地中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB媒地中、A600におけるO.D.約0.025まで希釈し、振とうフラスコ中37°Cでインキュベートした。通常、培養液25mlを250ml振とうフラスコ中で培養した。培養液のO.D.が約0.3~0.5に達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えてEpo野性型あるいはEpodesArg166の発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後4および約19時間に培養液をサンプリングした。試料を既製の14トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。BOB578とBOB579の誘導培養液は共に、約20kDaにバンドを示し、これは野性型Epoの分子量と一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるBOB490の誘導培養液では検出されなかった。B.大腸菌の細胞質でのMet-エリスロポエチンの発現。実施例18のA.に記載したように、野生型ヒトエリスロポエチンEpoをコードするDNAは、野性型Epoの遺伝子を含むプラスミドpBBT358からPCRによって増幅した。大腸菌の細胞質中におけるmet-Epoの発現の場合、PCR反応に用いるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のN末端コード領域にアニールするBB5845>TTCGCTAGCATGCATGACCTGCAGGAGGAAATTTAAATGGCCCCACCACGCCTCATC>3;配列番号49、および上述のBB5855>CCGGAATTCTTAACGGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号47あるいはBB5865>CCGGAATTCTTAGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号48とした。得られた約600bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、同様に消化したpBBT227実施例9ベクター中にクローニングし、メチオニル-Epoをコードする遺伝子を作成した。BB583およびBB585を用いるPCRによって形成される遺伝子をmet-Epo-完全長met-Epo-FLと呼び、BB583およびBB586を用いるPCRによって形成される遺伝子をmet-Epo-desArgmet-Epo-dRと呼ぶ。次いで、正しい配列のmet-Epo-FLおよびmet-Epo-dRを、NdeI-EcoRIフラグメントとしてpBBT257実施例14に記載中にサブクローニングし、それぞれpBBT479およびpBBT480を作成した。pBBT479およびpBBT480をJM109中に形質転換し、菌株BOB580およびBOB581を作成した。これらの菌株について、BOB490pBBT257/JM109と併せた発現実験は、STII-Epo構築物についての上述した実験と同一であった。BOB580とBOB581の誘導培養液は共に、約20kDaにバンドを示し、これは野性型Epoの分子量と一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるBOB490の誘導培養液では検出されなかった。実施例19エリスロポエチンシステインムテインの構築、大腸菌発現、精製および生物活性A.Epoシステインムテインの構築。部位特異的PCRをベースとする変異誘発手順を用いてEpoシステインムテインを構築する方法およびEPO中のシステインムテインの位置として好ましい部位は、PCT/US00/00931、PCT/US98/14497、ならびにInnis他1990およびWhite1993ならびに本明細書に示す様々な実施例に記載されている。さらに、L80は、システイン置換ムテインに好ましいもう一つの部位である。組み換えエリスロポエチンおよびエリスロポエチンのシステインムテインは、野性型EPOについて実施例18に記載の手順を用い、大腸菌で発現させることができる。B-perPierceを用い、製造者のプロトコルに従って細菌を溶解し、不溶性の部分を遠心分離により単離した。ペレットを、20mMシステイン、6Mグアニジン、20mMトリスを用いて可溶化する。混合物を室温で1~2時間撹拌した後、20mトリス、pH8、40μm硫酸銅、2ラウロイルサルコシンで1:20体積/体積に希釈する。再生物を4°Cで24~48時間放置する。リフォールディングされたEPOおよびEPOシステインムテインは、20mMMes、pH5、0.01Tweenおよび20グリセロール緩衝液Aで平衡化したS-セファロースカラムを用いて精製する。緩衝液Aに溶かした0~1MNaClの線形グラジエントを用い、S-セファロースカラムからEPOを溶出することができる。組み換えEPOをさらに精製するために二次カラムが必要な場合には、SEC、Blue-セファロース、ヒドロキシアパタイト、またはHIC樹脂フェニル、ブチルが含まれる。実施例20システインムテインのジスルフィド結合性三量体およびジスルフィド結合性高次多量体の構築2個以上の遊離システインを有するGH変異体を構築し、それらを用いてPCT/US00/00931に記載のようにhGHの高次ジスルフィド結合性多量体を作成できると考えられる。このような変異体は、実施例1および2ならびにPCT/US00/00931に記載のように、大腸菌中で発現させ、リフォールディングして精製することができるであろう。次いで、続くプロセシングステップを用い、実施例2およびPCT/US00/00931に記載のように、ジスルフィド結合形成を誘導することができるであろう。このような条件下では、T3Cなどの1個の遊離システインを有するいくつかのhGH変異体は、ほぼ定量的にジスルフィド結合性二量体に変換される。同一または類似の条件下では、2個の遊離システインを有するhGH変異体、例えばT3Cと別のシステインムテインを組み合わせた二重変異体による分子間ジスルフィド形成により、hGH分子の重合が起こり、このようなポリマーの鎖長は原則として無制限と考えられる。T3C変異体および/または他のシステインムテインなどのただ1個の遊離システインを有するhGH分子を重合反応に加えることにより、鎖長を制限したりある程度制御することができるであろう。成長するポリマーとただ1個の遊離システインを有する分子との間のジスルフィド結合形成が、未完成ポリマー中の2個の重合部位のうちの1個をキャップするか、それ以上の伸長を防いでくれるはずである。続いてのただ1個の遊離システインを有する第二のhGH分子と未完成ポリマーの他の重合部位との反応は、重合を終了させてポリマー分子の長さを確定する。平均ポリマー長は、反応剤の化学量論、すなわち2個の遊離システインを含むhGH分子と1個の遊離システインを含むhGH分子との比率によって制御できると考えられる。平均して短めのポリマーは小さな比率によることが好ましく、平均して長めのポリマーが大きな比率によるのが好ましい。より複雑な分枝ポリマーは、3個以上の遊離システインを含むhGH変異体とただ1個の遊離システインを有するhGH変異体が関与する反応から構築されると考えられる。続いて、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィなどのクロマトグラフ法により、個別のサイズのポリマーを精製できると考えられる。GHについて記載された手順と同様の手順を用い、G-CSF、α-インターフェロン、GM-CSFおよび他のタンパク質のジスルフィド結合性二量体および高次の多量体を作成できると考えられる。実施例21野性型ヒトエンドスタチンのクローニング、発現および精製A.エンドスタチンをコードするクローン化DNA配列。エンドスタチンをコードするcDNAは、ヒト胎児肝cDNAライブラリーClontechからPCRによって増幅した。PCR反応は、順方向プライマーBB3835>GCTAACGCGTACGCACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCG>3;配列番号50および逆方向プライマーBB3845>CGGAATTCCTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT>3;配列番号51で行った。プライマーBB383は、ヒトエンドスタチンのコード配列の5′末端にアニールし、逆方向プライマーBB92は、エンドスタチンコード配列の3′末端にアニールする。得られた約600bpのPCR産物をMulIおよびEcoRIで消化し、同様に消化したpBBT227実施例9ベクター中にクローニングし、STIIリーダー配列とヒトエンドスタチンのアミノ末端コード配列との間の融合物を作成した。その配列を確認した後、順方向プライマーBB4345>GTGCACCATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCTAGCATGCATGACCTGCAGGAGGAAATTTAAATGCACAGCCACCGCGACTTC>3;配列番号52およびBB384配列番号51によるPCR増幅により、細胞内発現のために遺伝子を修飾した。BB434は、メチオニンmetコドンをエンドスタチンのアミノ末端に融合する。得られた約630bpのフラグメントをNdeIおよびSacIIで消化し、同様に消化した上記のSTII-エンドスタチン-pUC18プラスミド中にクローニングした。次いで、正しい配列のmet-エンドスタチンクローンpBBT370をNdeI-EcoRIフラグメントとしてpBBT257実施例14に記載中にサブクローニングし、pBBT371を作成した。B.大腸菌pBBT371における野性型met-エンドスタチンの発現。Met-エンドスタチン野性型をコードするpBBT371、および親ベクターであるpBBT257を、大腸菌JM109中に形質転換して菌株BOB460およびBOB490を作成し、W3110中に形質転換して菌株BOB461およびBOB340を作成した。これらの菌株は、回転培養管中、37°Cで10μg/mlテトラサイクリンを含有するLuriaBrothLB培地中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB中、A600におけるO.D.で約0.025まで希釈し、振とうフラスコ中37°Cでインキュベートした。通常、培養液25mlを250ml振とうフラスコ中で培養した。培養液のO.D.が約0.3~0.5に達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えてヒトmet-エンドスタチンの発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後0、4および約19時間に培養液をサンプリングした。試料を既製の14トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。BOB460とBOB461の誘導培養液は共に、約20kDaにバンドを示し、これは成熟ヒトエンドスタチンと一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるBOB460とBOB461の非誘導培養液ならびにBOB490およびBOB340の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。約20kDAのバンドは、Calbiochemから購入した商品として調製されたヒトエンドスタチンと同時に移動した。実施例22ヒトエンドスタチンシステインムテインの構築、発現、精製および生物活性A.エンドスタチンシステインムテインの構築。PCT/US00/00931ならびにInnis他1990およびWhite他1993に記載の手順と類似した部位特異的PCRをベースとする変異誘発手順を用い、11種類の変異体ヒトエンドスタチン遺伝子を構築した。4種類のムテイン[-1C、H2C、R5C、およびF7C]はアミノ末端領域中で構築したアミノ酸残基は、Hohenester他1998において番号付けされた残基から130を引くことによって番号が付けられている。3種類のムテインは、遺伝子の中心の周囲にある配列によってコードされる残基で構築した[G90C、G98C、およびH112C]。3種類のムテインは、カルボキシ末端領域中で構築した[L154C、R157C、およびS162C]。さらに1種類のムテイン[R28C]は、エンドスタチンの活性部位内の残基で構築した。これは、バイオアッセイにおける対照タンパク質として役割を果たす。変異誘発性PCR反応に用いるテンプレートフラグメント源はpBBT370とした。PCR産物を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、QiagenPCRCleanupKitを用いて抽出し、これらと同一の制限酵素により切断されたpBBT370ベクターDNAと連結し、アルカリホスファターゼ処理し、QiagenPCRCleanupKitを用いて抽出した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドDNAを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたPCRフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびPCR反応または合成オリゴヌクレオチドプライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。システイン置換変異-1Cは、3回のPCR増幅を用いて以下のように構築した。変異誘発性順方向オリゴヌクレオチドBB5315>GAGGAAATTTAAATGTGCCACAGCCATCGCGACTTCC>3;配列番号53は、N末端ATGメチオニンコドンと1番目のCACヒスチジンコドンの間にTGCシステインコドンが挿入するように設計した。このオリゴを、エンドスタチンコード配列の下流60bp内のpUC18ベクター配列にアニールする逆方向の非変異誘発性プライマーBB1265>TGTGGAATTGTGAGCGGATA>3;配列番号54と共にPCR1で用いた。このPCR用テンプレートは、pBBT370に由来する精製1264bpNheI-ApaLIフラグメントとした。このフラグメントは、全エンドスタチンコード配列およびエンドスタチン遺伝子の下流にある670bpのpUC18配列を含み、BB126がアニールする配列が含まれる。PCR1は、1.5mMMgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレートフラグメント0.5ng、TaqポリメラーゼPromega1単位、およびPfuポリメラーゼStratagene0.1単位を含有する1XPromegaPCR緩衝液中、25μl反応で行った。反応は、Perkin-ElmerGeneAmp登録商標PCRSystem2400サーマルサイクラー中で行った。反応プログラムは、95°C5分、[94°C30秒、55°C30秒、72°C45秒]22サイクル、72°C保持7分および4°C保持とした。PCR2は、BB531の逆相補体である変異誘発性逆方向オリゴヌクレオチドBB5325>GGAAGTCGCGATGGCTGTGGCACATTTAAATTTCCTC>3;配列番号55、およびNdeI部位の40bp上流のpUC18配列にアニールする非変異誘発性プライマーBB1255>CTATGCGGCATCAGAGCAGAT>3;配列番号17を用いて行った。PCR2用テンプレートは、全エンドスタチンコード配列およびエンドスタチン遺伝子フラグメントの5′末端にあるNdeI部位の上流にある367bpのpUC18配列を含み、pBBT370に由来する精製990bpSspI-EcoRIフラグメントとし、BB125がアニールする配列が含まれる。PCR2の構成成分およびプログラムはPCR1と同一である。PCR1および2のアリコート10μlをアガロースゲル電気泳動により分析し、各々が予想したサイズの単一フラグメントを生成したことが分かった。PCR3は、非変異誘発性プライマーBB125およびBB126を用い、50μl反応で行った。このPCR用のテンプレートは、PCR11μlおよびPCR20.3μlとした。PCR3の構成成分は、反応1および2と同一である。反応プログラムは、95°C5分、[94°C30秒、56°C30秒、72°C1分]23サイクル、72°C保持7分および4°C保持とした。PCR3のアリコート10μlをアガロースゲル電気泳動により分析し、予想した通りに740bpのフラグメントを生成したことが分かった。反応の残りを、QIAquickPCRPurificationKitQiagenを用い、供給メーカーのプロトコルに従ってクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってNheIおよびBsrGINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップステップの後、消化生成物を、NheIおよびBsrGIで切断されたpBBT370と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理し、QIAquickPCRPurificationKitを用いてクリーンアップした。連結反応を用いて大腸菌JM109を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。-1C変異を有し、205bpNheI-BsrGIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。置換変異H2C、R5C、F7C、およびR28Cすなわち、2位のヒスチジンをシステインに変えたなどは、異なる変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いたことを除いては表16、-1Cについて上記に詳述したプロトコルを用いて構築し、配列決定した。順方向変異誘発性オリゴヌクレオチドは、常に逆方向の非変異誘発性プライマーBB126およびテンプレートとしての精製1264bpNheI-ApaLIフラグメントと共に用い、逆方向変異誘発性オリゴヌクレオチドは、常に順方向の非変異誘発性プライマーBB125およびテンプレートとしての精製990bpSsp-EcoRIフラグメントと共に用いた。ムテインG90CおよびG98Cは、変異誘発性オリゴヌクレオチドが異なり表16、PCR3用のテンプレートがPCR10.5μlおよびPCR20.5μlであることを除いては、-1Cについて記載した方法に類似した方法を用いて構築した。さらに、クリーンアップ後、PCR3をBsrGIおよびBsu36INewEnglandBioLabsで消化し、追加のクリーンアップステップに続いて、消化生成物を、BsrGIおよびBsu36Iで切断したpBBT370と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理し、QIAquickPCRPurificationKitを用いてクリーンアップした。ムテインL154C、R157C、およびS162Cは、変異誘発性オリゴヌクレオチドが異なり表16、PCR3用のテンプレートがPCR10.3μlおよびPCR21μlであることを除いては、-1Cについて記載した方法に類似した方法を用いて構築した。さらに、クリーンアップ後、PCR3をBsu36IおよびEcoRIで消化し、追加のクリーンアップステップに続いて、消化生成物を、Bsu36IおよびEcoRIで切断したpBBT370と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理し、QIAquickPCRPurificationKitを用いてクリーンアップした。ムテインH112Cは、-1Cについて記載した方法といくつかの点で異なる方法によって構築した。まず、PCR1で用いる順方向変異誘発性オリゴヌクレオチドの配列が異なり表16、反応の体積は25μlではなく50μlとした。PCR2およびPCR3は必要がないために行わなかった。代わりに、アリコート10μlをゲル電気泳動により分析し、この反応物をPCR3を通常処理するのとほぼ同様に処理した。すなわち、反応物の残りをQIAquickPCRPurificationKitを用いてクリーンアップし、供給メーカーのプロトコルに従ってBsu36IおよびEcoRINewEnglandBioLabsで消化した。QIAquickPCRPurificationKitを用いる追加のクリーンアップステップに続いて、消化生成物を、Bsu36IおよびEcoRIで切断したpBBT370と連結し、子ウシ腸アルカリホスファターゼNewEnglandBioLabsで処理し、QIAquickPCRPurificationKitを用いてクリーンアップした。連結反応を用いて大腸菌JM109を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。B.大腸菌におけるmet-エンドスタチンのシステインムテインの発現。正しい配列の各met-エンドスタチンシステインムテインをNdeI-EcoRIフラグメントとしてpBBT257実施例14に記載中にサブクローニングし、一組の発現プラスミドを作成し、これをJM109中に形質転換して発現試験で用いる菌株を作成した。これらの菌株は、回転培養管中、37°Cで10μg/mlテトラサイクリンを含有するLuriaBrothLB培地中で一夜培養した。飽和した前夜の培養液を10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB中、A600におけるO.D.で約0.025まで希釈し、振とうフラスコ中37°Cでインキュベートした。通常、培養液25mlを250ml振とうフラスコ中で培養した。培養液のO.D.が約0.3~0.5に達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加え、その菌株に特異的なエンドスタチンシステインムテインの発現を誘導した。誘導前、誘導後4時間および誘導後16時間に試料を集めた。試料を既製の14トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル上のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより分析し、クーマシーブルーで染色した。エンドスタチンシステインムテイン菌株の誘導培養液は、約20kDaにバンドを示し、これは成熟ヒトエンドスタチンと一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるBOB490誘導および非誘導培養液では検出されなかった。約20kDAのバンドは、Calbiochemから購入した商品として調製されたヒトエンドスタチンと同時に移動した。C.エンドスタチンおよびエンドスタチンシステインムテインの発現および精製。発現した野生型エンドスタチンまたはエンドスタチンシステインムテインR5Cを含む大腸菌を遠心分離によってペレット化し、-80°Cで冷凍した。細胞ペレットを解凍し、製造者Pierceのプロトコルに従ってB-PER商標細菌タンパク質抽出試薬5mLで処理した。エンドスタチンタンパク質の大部分を含む不溶性材料を遠心分離により回収し、B-PER中に懸濁した。この混合物をリゾチーム200μg/mlで10分間処理して細胞壁をさらに破壊し、MgCl2最終濃度10mMおよびプロテアーゼ非含有DNAse2μg/mlを加えた。不溶性のエンドスタチンを遠心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞の破片の大部分を除去した。リフォールディングのために、不溶性のエンドスタチンを含有する得られたペレットを、20mMトリスベース中の8M尿素、10mMシステイン20mlに溶かした。この混合物を室温で120分間撹拌した。シスチンを最終濃度10mMまで加えた後、氷冷した3M尿素、40μM硫酸銅、20mMトリス、pH7.5200ml中に希釈した。このリフォールド混合物を4°Cで3日間ゆっくりと撹拌した。リフォールド混合物のpHを希HClで5.0に調整し、混合物を遠心分離した後、40mMリン酸ナトリウムpH5.0緩衝液Aで平衡化したS-セファロースカラムPharmaciaHiTrap5ml上に載せた。0~100緩衝液B500mMNaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH5.0の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。主にエンドスタチンを含有するS-セファロース分画をプールし、pHを7.4に調整した後、20mMトリス、pH7.4中で予め平衡化したヘパリン-セファロースHitrapカラム上に載せた。このカラムを0~1MNaCl塩グラジエントで溶出した。純粋なエンドスタチンを含むヘパリンカラム分画を集めて冷凍した。エンドスタチンシステイン変異体G90C、G98C、H112C、およびR157Cも、ヘパリンカラムのステップを省略した上記のプロトコルを用いて部分的に精製した。R5Cエンドスタチンシステインムテインは、15倍過剰の5kDaPEGマレイミドおよび10~15倍過剰のTCEPを用いてPEG化した。反応によりモノPEG化R5Cタンパク質が得られた。D.エンドスタチンバイオアッセイ:リフォールディングされた野生型組み換えエンドスタチンおよびリフォールディングされたR5Cエンドスタチンシステインムテインは、Kim他2000によって記載されたMMP-2阻害アッセイを用いて生物学的に活性であることが判明した。タンパク質の生物活性はまた、内皮細胞増殖阻害アッセイで測定することができる。内皮細胞増殖のインビトロにおける阻害は、以下のように行うことができる。5000個のHMVEC-L細胞Cloneticsをゼラチンで覆った96ウエル培養プレート上にプレートし、bFGFを含有するHMVEC-L培地100μl中で24時間インキュベートする37°C、5CO2することができる。次いで、エンドスタチン、エンドスタチンシステインムテインまたはPEG化エンドスタチンシステインムテインの段階希釈液を含有する培地20μlで培地を置き換え、20分間インキュベートする。次いで、bFGFを含有する新鮮なHMVEC-L培地80μlをウエルに加える。72時間後、細胞数を測定することができる。様々なエンドスタチンは、アッセイの終了時における内皮細胞数の用量依存的減少によって明らかなように、内皮細胞の増殖を阻害するはずである。実施例23組み換えアンジオスタチンシステインムテインのリフォールディングアンジオスタチンは、グリコシル化されていない場合にも十分に活性であり、したがってその製造に真核生物の発現系を必要としない。ヒトプラスミノーゲンの最初の4個のクリングルkringleサブユニットからなるヒトアンジオスタチンのコード配列は、ヒトプラスミノーゲンcDNAテンプレートAmericanTypeCultureCollection、Rockville、MDから入手できるからPCR増殖させることができる。野生型アンジオスタチンおよびアンジオスタチンシステインムテインは、周辺質空間にタンパク質を運ぶためにSTIIまたはompAタンパク質由来の細菌シグナル配列を成熟アンジオスタチンのN末端上に融合することにより、大腸菌から分泌させることができる。この方法はまた、アンジオスタチンのフラグメントクリングルK1、K2、K3、およびK2-3、Cao他、1996についてもうまく用いられている。あるいは、アンジオスタチンおよびアンジオスタチンシステインムテインは、大腸菌または他の宿主細胞の細胞質に発現させることができる。アンジオスタチンは、13個のジスルフィドを形成する26個のシステインを有する。したがって、システインブロッキングを付加しない従来のリフォールドプロトコルは、アンジオスタチンのようにシステインに富んだタンパク質では成功しないであろう。アンジオスタチン中にシステイン残基を導入する好ましい部位には、K97C成熟アンジオスタチンのN末端上に付加されたシステイン残基、T365C、371C、S460C、A463C、および466C成熟アンジオスタチンタンパク質のC末端上に付加されたシステイン残基が含まれる。組み換えアンジオスタチンまたはアンジオスタチンシステインムテインを発現する細菌細胞は、製造者のプロトコルPierceによって記載されたように、B-perを用いて溶解することができる。不溶性部分は遠心分離によって単離することができる。ペレットは、20mMシステイン、6Mグアニジン、20mMTρισの混合物を用いて可溶化することができる。混合物を室温で2時間撹拌した後、20mMトリス中に10倍希釈することができる。このリフォールドを4°Cで1~2日間保持することができる。この時間の終了時に、リフォールドを遠心分離し、リジン-セファロースカラムを用いることによりアンジオスタチンタンパク質すなわちシステインムテインを精製することができる。リフォールド混合物は、20mMHepes、0.15MNaCl、pH7.4中で予め平衡化したカラム上に直接載せることができる。0~12mMε-アミノカプロン酸E-aminocaprioicacidのグラジエントを用い、樹脂からアンジオスタチンまたはアンジオスタチンシステインムテインを遊離させることができる。さらに精製が必要な場合には、様々なイオン交換またはHIC樹脂を用いて行うことができる。実施例24PEG化タンパク質のペプチドマッピング多くの場合、ペプチドマップを用いてPEG化の部位を確認することができる。通常、PEG化タンパク質は、システインムテインが他にシステイン残基を含まないペプチド中に存在するように特異的に消化される。ペプチドと共有結合したPEGの存在は、消化混合物を逆相HPLCによりアッセイする場合に保持時間を劇的に変えるはずである。文献Clark他、1996による条件を用いてトリプシンでGHを消化した場合、可能性のあるトリプシンによって生じた21種類のペプチドT1~T21、連続して番号付けされたを単離することができる。変異T3Cを含む残基1~8に相当するT1は、野生型64分すなわち下垂体成長ホルモンに対してシステイン変異体61分のわずかに早い保持時間にシフトする。5KPEGでPEG化された場合には、T1ペプチドはクロマトグラムの最後に移動し、保持時間は100分を超える。GHをエンドプロテアーゼLys-Cで消化する場合には、10種類のペプチドL1~10、連続して番号付けした残基1~38に相当するL1は、野生型GHの場合には約59分に、ムテインT3Cの場合には61分に溶出する。20KPEGでPEG化された場合には、L1はクロマトグラムから消える。これらのデータは、PEG部分が天然システインではなく、予想通りに3位のシステイン残基に結合していることを支持している。PEG化前後のIFNトリプシンおよびエンドプロテアーゼGlu-C、GM-CSFエンドプロテアーゼGlu-C、およびG-CSFエンドプロテアーゼLys-Cのシステインムテインの酵素的消化およびRPHPLC分析もまた、新たに導入されたシステイン残基における単一部位のPEG化に一致するデータを示した。実施例25PEG-G-CSFおよびPEG-GM-CSFシステインムテインによって開始される末梢血前駆細胞動員組み換えG-CSFおよび組み換えGM-CSFによる処理は、化学療法後の好中球および血小板のより急激な産生および移植を引き起こす末梢血前駆細胞PBPCを動員することが分かっている。PBPC動員および潜在的動員速度の亢進は、PEG化G-CSFおよびPEG化GM-CSFシステインムテインの存在下で評価することができる。明確な骨髄細胞プロフィールおよび増殖速度を有することが知られている脾臓摘出spleenctomizedマウスに、G-CSF野生型またはニューポジェン登録商標またはPEG化G-CSFシステインムテインを静脈内または皮下で1回または1日1回7日まで投与することができる。各実験はまた、等張性食塩水に懸濁したマウス血清アルブミンからなる担体のみで処理される一群のマウスを含むことができる。処理後、末梢血を心臓穿刺によって採取し、EDTA含有試験管中に集めることができる。CBC分析を行うことができる。大腿骨および骨髄の内容物を洗い流すことにより骨髄細胞を採取することができる。クリスタルバイオレットによる染色および血球計計数により白血球数を測定することができる。血液密度勾配分画を用いて低密度細胞を単離し、前駆細胞アッセイで用いることができる。前駆細胞アッセイのプロトコルは、Briddell他1993に概略が述べられている。基本的には、二重層寒天をベースとするシステムBradley他、1978を用い、原始的高増殖性コロニー形成細胞前駆細胞と成熟顆粒球マクロファージコロニー形成細胞前駆細胞を共に評価することができる。Iscove他1974によって開発されたメチルセルロースをベースとするアッセイ系を用い、赤芽球コロニー形成を評価することができる。PEG化G-CSFシステインムテインは前駆細胞および幹細胞の動員を促進するはずである。同様の試験は、PEG化GM-CSFシステインムテインおよび野生型GM-CSFについても行うことができる。最終的には、PEG化G-CSFおよびPEG化GM-CSFシステインムテインの存在下における致命的に照射を受けたマウスにおける移植の効率および移植過程を促進する能力を検討することができる。本発明の様々な実施形態を詳細に述べてきたが、これらの実施形態の修正形態および適応形態が当業者の頭に浮かぶことは明らかである。しかしながら、そのような修正形態および適応形態が本発明の範囲内にあることは明確に理解されるであろう。"