"造血系の疾患に罹患している対象の造血系を増強させることにおいて使用するための、治療有効量の接着性間質細胞を含む医薬組成物。対象の造血系を増強させることが、対象の造血細胞の数を増大させることを含む、請求項1に記載の医薬組成物。対象の造血系を増強させることが、CD45マーカーを発現する造血細胞の数を増大させることを含む、請求項2に記載の医薬組成物。対象が照射された対象である、請求項1に記載の医薬組成物。対象が化学療法による免疫不全である、請求項1に記載の医薬組成物。接着性間質細胞の起源が胎盤又は脂肪組織である、請求項1に記載の医薬組成物。接着性間質細胞が、細胞の拡大を支持する三次元培養条件下で培養されたものである、請求項1又は6に記載の医薬組成物。培養された接着性間質細胞が、培養培地中にFlt-3リガンド、IL-6及びSCFを分泌する、請求項7に記載の医薬組成物。接着性間質細胞の起源が胎盤又は脂肪組織であり、接着性間質細胞が、細胞の拡大を支持する三次元培養条件下で培養されたものである、請求項1に記載の医薬組成物。本発明は、細胞を拡大培養するための新規の方法、ならびにその方法によって作製される細胞および馴化培地の、幹細胞に関連する治療、幹細胞生着、およびHSC支持のための使用の発明である。本発明の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解されることができる。本発明の少なくとも1つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。発展し続ける医療界では、幹細胞、より具体的には、間質幹細胞間葉系幹細胞とも呼ばれるの需要が臨床目的および研究目的のためにますます高まっている。MSCは、HSC移植およびHSCの生着を支持するために使用され、また、ますます多くの状態例えば、心臓疾患、BM欠損、ニューロン関連疾患、および、臓器移植または組織移植を必要とする状態を治療するためにも使用される。幹細胞を使用する際の様々な障害は、これらの細胞の数がほとんどの組織において限られること、幹細胞を得るための手法に伴う不快さおよび危険性、ならびに、現在の回収手法による記憶B細胞および造血幹細胞の付随する喪失のために、幹細胞または始原体細胞の通常的に存在する集団を多量に単離することの技術的困難さにある。細胞をヒトの胚から得ることは、宗教的および倫理的な側面を既に存在する技術的困難さに加える。骨髄由来の幹細胞のための代替供給源には、脂肪組織および胎盤が含まれる。しかしながら、現在、幹細胞をそのような組織から効率的に拡大培養するための方法がない。本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞が3D培養条件で効率的に増殖し得ることを発見している。驚くべきことに、本発明者らは、そのような細胞が、MSCの特性と類似する機能的特性を含み、従って、これらの細胞、および、これらの細胞から作製される馴化培地が、治療目的のために、例えば、移植、組織再生およびインビボHSC支持などのために使用できることを発見した。本明細書中下記において、また、下記の実施例の節において例示されるように、本発明者らは、間質幹細胞の特性を3D環境において含む、脂肪および胎盤に由来する接着性細胞を拡大培養することができた。それに応じて拡大培養された細胞は、接着再増殖アッセイによって立証されるように、冷凍保存後に生存可能であることが見出された実施例1参照。胎盤由来の接着性細胞のフローサイトメトリー分析では、異なったマーカー発現パターンが発見された図3a~b参照。最も重要なことではあるが、2Dまたは3D環境で増殖した脂肪由来の接着性細胞および胎盤由来の接着性細胞はHSCの生着を支持することができた実施例2を参照のこと。このことは、間質幹細胞としての本発明の細胞の臨床での使用を実証する。従って、本発明の1つの態様によれば、細胞を拡大培養する方法が提供される。この方法は、胎盤組織または脂肪組織からの接着性細胞を、細胞の拡大培養を支持する三次元3D培養条件のもとで培養することを含む。本明細書中で使用される用語拡大培養するおよび用語拡大培養は、細胞および究極的には細胞成長を実質的な無分化で維持すること、すなわち、細胞集団の増大例えば、少なくとも2倍であって、そのような増大に付随する分化がないことを示す。本明細書中で使用される用語維持するおよび用語維持は、実質的な無分化での細胞再生、すなわち、実質的に定常的な細胞集団であって、そのような定常性に付随する分化がないことを示す。本明細書中で使用される表現接着性細胞は、足場依存的で、すなわち、インビトロで成長するために表面への付着を必要とする細胞の均一集団または不均一集団を示す。本明細書中で使用される表現脂肪組織は、脂肪細胞fatcell、adipocyteを含む結合組織を示す。本明細書中で使用される用語胎盤組織は、子宮壁の内側を覆い、妊娠期間中は胎児を包む、胎児が臍帯によって結び付けられる哺乳動物の雌性器官の任意の部分を示す。出産後、胎盤は排出されるこれは分娩後胎盤と呼ばれる。本明細書中で使用される表現三次元培養条件は、細胞を、細胞成長との適合性を有し、一方で、細胞が2層以上で成長することを可能にする条件に配置することを示す。生きている生物または組織における細胞のインサイチュー環境は三次元構成であることが十分に理解される。細胞は他の細胞によって取り囲まれる。細胞は、様々な局所的微小環境の確立を可能にする、細胞外マトリックスのナノスケール繊維の複雑な網状組織において保持される。それらの細胞外リガンドは、基底膜への結合だけでなく、様々な血管およびリンパ管へのアクセスを媒介する。酸素、ホルモンおよび栄養分が細胞に運ばれ、老廃物が運び去られる。本発明の三次元培養条件は、下記でさらに例示されるように、そのような微小環境を模倣するように構成される。従って、本発明のこの態様の接着性細胞は脂肪組織または胎盤組織から回収される。胎盤の細胞を満期または早産の胎盤から得ることができる。胎盤は、好ましくは、胎盤が完全に放血されると集められる。胎盤は、好ましくは、残存する細胞を除くために十分な期間にわたって灌流される。本明細書中で使用される用語灌流するまたは用語灌流は、流体を器官または組織に浴びせるか、または通すという行為を示す。胎盤組織は任意の哺乳動物に由来し得る。最も好ましくは、胎盤組織はヒト由来である。胎盤組織の好ましい供給源は分娩後の胎盤例えば、1~6時間に由来する。しかしながら、胎盤組織もしくは胎盤細胞の供給源、または、胎盤組織を単離する方法は本発明にとって重要でない。胎盤由来の接着性細胞を胎盤の胎児部分すなわち、羊膜または胎盤の内側部分、実施例1参照および母体部分すなわち、基底脱落膜および壁側脱落膜の両方から得ることができる。組織試料は生理学的緩衝液[例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水PBSまたはハンクス緩衝液]で洗浄される。単細胞懸濁物が、組織を消化酵素により処理すること下記参照、または/および、組織部分を細かく刻み、ナイロンフィルターに通すことによって、あるいは、洗浄媒体とともに穏やかなピペッティングすることFalcon、Becton,Dickinson、SanJose、CAによって作製される。脂肪組織由来の接着性細胞を、当業者に知られている様々な方法によって単離することができる。例えば、そのような方法が米国特許第6153432号に記載されている。脂肪組織は、大網/内臓部位、乳房部位、性腺部位または他の脂肪組織部位に由来し得る。脂肪組織の好ましい供給源は大網脂肪である。ヒトでは、脂肪は典型的には脂肪吸引によって単離される。脂肪組織からの単離された接着性細胞は、組織を消化酵素例えば、コラゲナーゼ、トリプシンおよび/またはジスパーゼなど、および/または、効果的な濃度のヒアルロニダーゼもしくはDNAse、および、エチレンジアミン四酢酸EDTAにより、25°C~50°Cの間での温度で10分~3時間にわたって処理することによって取り出すことができる。その後、細胞は20ミクロン~800ミクロンの間のナイロンまたはチーズクロスのメッシュフィルターに通すことができる。その後、細胞は直接に媒体での分画遠心法に供されるか、あるいは、FicollまたはPercollまたは他の微粒子の勾配による分画遠心法に供される。細胞は100~3000xgの間での速度において1分~1時間にわたって4~50°Cの間の温度で遠心分離される米国特許第7078230号参照。胎盤組織または脂肪組織に由来する接着性細胞に加えて、本発明ではまた、本明細書中下記においてさらに記載されるように間質幹細胞表現型によって特徴づけられる他の細胞供給源からの接着性細胞の使用が想定される。接着性細胞を回収することができる組織供給源には、臍帯血、毛嚢[例えば、米国特許出願第20060172304号に記載されるように]、精巣[例えば、GuanK.etal.、Nature、20064月27日、4407088:1199~203に記載されるように]、ヒト嗅粘膜[例えば、Marshall,CT.etal.、HistolHistopathol、2006Jun、216:633~43に記載されるように]、胚性卵黄嚢[例えば、GeijsenN、Nature、20041月8日、4276970:148~54に記載されるように]および羊水[Pieternellaetal.2004、StemCells、22:1338~1345]が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべて、間葉系幹細胞を含むことが知られている。これらの組織供給源からの接着性細胞は、細胞を接着性の表面で培養する。従って、接着性細胞を最初の集団における他の細胞から単離することによって単離することができる。起源例えば、胎盤組織または脂肪組織にかかわらず、細胞の回収は、好ましくは、無菌条件下で行われる。単離された細胞が得られると、単離された細胞は、接着性細胞をそれにより単離するために接着性材料例えば、表面として構成される接着性材料に接着させることができる。これは、3D培養条件での培養の前に行うことができ実施例1参照、または、3D培養条件での培養と同時に行うことができる。本明細書中で使用される接着性材料は、細胞を表面に保持することができる化学的構造例えば、荷電を帯びた表面露出基を有する細胞非毒性すなわち、生物学的に適合した材料の合成物、天然物、または、それらの組合せを示す。本発明のこの態様に従って使用することができる接着性材料の例には、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分例えば、フィブロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ポリL乳酸および不活性金属繊維が含まれるが、これらに限定されない。間質幹細胞についての精製または富化のさらなる工程を、この分野では広く知られている方法を使用して、例えば、本明細書中下記にさらに記載するように、間質幹細胞マーカーの発現を使用するFACSなどによって行うことができる。本発明に従って培養することにおいて有用な基礎培地の限定されない例には、培地199、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、MAB8713、DM145、ウイリアムズG、ノイマンタイテル、ヒグチ、MCDB301、MCDB202、MCDB501、MCDB401、MCDB411、MCDB153をはじめとして、数多くの中で、最少必須培地イーグル、ADC-1、LPMウシ血清アルブミン非含有、F10HAM、F12HAM、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培地フィトンジャクソン改変を含む培地および含まない培地、基礎培地イーグルBME、アール塩基礎の添加を伴う培地、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM-血清非含有、ヤマネ、IMEM-20、グラスゴー改変イーグル培地GMEM、ライボビッツL-15培地、マッコイ5A培地、培地M199M199E、アール塩基礎を伴う、培地M199M199H、ハンクス塩基礎を伴う、最少必須培地イーグルMEM-E、アール塩基礎を伴う、最少必須培地イーグルMEM-H、ハンクス塩基礎を伴う、および、最少必須培地イーグルMEM-NAA、非必須アミノ酸を伴うが含まれる。本発明において使用される好適な培地はDMEMである。これらの培地および他の有用な培地を、とりわけ、GIBCOGrandIsland、N.Y.、米国およびBiologicalIndustriesBetHaEmek、イスラエルから入手することができる。これらの培地のいくつかが、WilliamB.JakobyおよびIraH.Pastanによって編集され、AcademicPress,Inc.によって発行されるMethodsinEnzymology第LVIII巻、CellCulture、62頁~72頁に要約される。培地には、例えば、血清例えば、ウシまたは他の種の胎児血清など、ならびに、場合により、または、代替として、ピコグラム/ml~ミリグラム/mlの間の濃度での増殖因子、サイトカインおよびホルモン例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン3、インターロイキン6、インターロイキン7、マクロファージコロニー刺激因子、c-kitリガンド/幹細胞因子、オステオプロテゲリンリガンド、インスリン、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子および骨形態形成タンパク質などを補充することができる。さらなる成分が培養培地に加えられ得ることがさらに認識される。そのような成分は、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、アミノ酸、および、細胞の培養のためにこの分野で知られている他の成分であり得る。加えて、様々な成分を、必要とされるときには分化プロセスを強化するために加えることができるさらには下記参照。接着性細胞が得られると、接着性細胞は三次元環境に継代培養することができる下記の実施例の節の実施例1参照。だが、当然のことながら、細胞は上記で述べたように単離後直ちに3D形態のマトリックスに移すことができる。従って、本発明のこの態様の接着性材料は3D培養のために構成され、それにより、間質細胞の接着のための利用可能な付着表面を実質的に増大させ、その結果、組織例えば、胎盤の構造基盤を模倣する成長マトリックスを提供する。例えば、高さが0.5mmの成長マトリックスについては、増大が、成長マトリックスの基部への突出によって計算されたとき、少なくとも5~30倍である。約5~30倍のそのような増大は単位層についてであり、積み重ねられるか、または、スペーサーなどにより隔てられる場合であっても、多数のそのような層が使用されるならば、5~30倍の倍数がそれぞれのそのような構造体について適用される。マトリックスがシート形態好ましくは、不織繊維シート、または、開口した細孔の発泡ポリマーのシートで使用されるとき、シートの好ましい厚さは約50μm~1000μmまたはそれ以上であり、この場合、十分な多孔性が、細胞の進入、栄養分の進入のために、また、シートからの老廃物の除去のために提供される。好ましい実施形態によれば、細孔は10μm~100μmの有効直径を有する。そのようなシートは、様々な厚さの繊維から調製することができ、この場合、好ましい繊維厚さ範囲または繊維直径範囲は約0.5μm~20μmであり、一層より好ましい繊維は直径が10μm~15μmの範囲にある。本発明の構造体は、寸法安定性および物理的強度を提供する多孔性の支持シートまたは支持スクリーンによって支持され得るか、あるいは、一層良好には、そのようなシートまたはスクリーンに結合される。そのようなマトリックスシートはまた、同じ程度の厚さ約50μm~1000μmとともに、約0.2mm2~約10mm2の程度の突出領域を有する粒子を提供するために、切断、穴開けまたは断片化することができる。本発明を実施に移すために使用された成長マトリックスの製造、使用および/または利点に関するさらなる詳細が、米国特許第5168085号、および、特に、米国特許第5266476号に記載されているこれらはともに参考文献として本明細書中に組み込まれる。接着性表面は、正方形、リング、円盤および十字形からなる群から選択される形状を有することができる。大規模製造のために、培養は好ましくは、3Dバイオリアクターにおいて行われる。そのようなバイオリアクターの例には、プラグフローバイオリアクター、連続撹拌槽型バイオリアクターおよび定常床バイオリアクターが含まれるが、これらに限定されない。実施例の節の実施例1において示されるように、三次元3Dプラグフローバイオリアクター米国特許第6911201号に記載されるようなバイオリアクターは間質細胞の成長および長期間の維持を支持することができる。このバイオリアクターでは、間質細胞が、ポリエステルの不織布マトリックスから作製され、ガラスカラムに詰められ、それにより、大きな細胞数の増殖を比較的小さい体積で可能にするポロシブporrosive担体に播種される。プラグフローバイオリアクターにおいて使用されるマトリックスは、シート形態、不織繊維シート、または、開口した細孔の発泡ポリマーのシートのものが可能であり、シートの好ましい厚さは約50μm~1000μmまたはそれ以上であり、この場合、十分な多孔性が、細胞の進入、栄養分の進入のために、また、シートからの老廃物の除去のために提供される。本発明とともに使用され得る他の3Dバイオリアクターには、下記のバイオリアクターが含まれるが、これらに限定されない:時定数定常状態をリアクター内で維持するために、培養培地がバイオリアクターに連続的に供給され、生成物が連続的に抜き取られる連続撹拌槽型バイオリアクター。繊維状床バスケットを有する撹拌槽型バイオリアクターを、例えば、NewBrunswickScientificCo.Edison、NJから入手することができる。定常床バイオリアクター、エアーリフトバイオリアクターこのバイオリアクターでは、空気が、典型的には、中央通気管の底部に供給され、気泡を形成しながら上に流れ、排気ガスをカラムの上部から放出する、ポリアクティブ発泡体を有する細胞播種灌流バイオリアクター[Wendt,D.etal.、BiotechnolBioeng、84:205~2142003に記載されるようなバイオリアクター]、ラジアルフロー灌流バイオリアクターにおける管状のポリL-乳酸PLLAの多孔性足場[Kitagawaetal.、BiotechnologyandBioengineering、935:947~9542006に記載されるようなバイオリアクター]。本発明に従って使用することができる他のバイオリアクターが、米国特許第6277151号、同第6197575号、同第6139578号、同第6132463号、同第5902741号および同第5629186号に記載される。細胞の播種が、好ましくは、播種時において100000~1500000細胞/mmで行われる。細胞は好ましくは、制御されない分化および老化を好ましくは避けながら、少なくとも約40、60または80のコンフルエンスに到達すると集められる。培養は、少なくとも約2日間、3日間、5日間、10日間、20日間、1ヶ月間またはそれ以上行われる。当然のことながら、バイオリアクターにおける培養はこの期間を長くし得る。継代培養もまた、細胞数を増大させるために行うことができる。本発明の接着性細胞は、好ましくは、少なくとも1つの間質幹細胞表現型を含む。本明細書中で使用される間質幹細胞表現型は、骨髄由来の間質幹細胞すなわち、間葉系幹細胞に典型的な構造的表現型または機能的表現型を示す。本明細書中で使用される表現幹細胞は、最終分化していない細胞を示す。従って、例えば、細胞は紡錘体形状を有することができる。代替として、または、加えて、細胞は、間質幹細胞に典型的な1つのマーカーまたは一連のマーカー例えば、表面マーカーを発現することができる。間質幹細胞表面マーカー陽性および陰性の例には、CD105、CD29、CD44、CD73、CD90、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CD11B-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-およびFMC7-が含まれるが、これらに限定されない。他の間質幹細胞マーカーには、チロシンヒドロキシナーゼ、ネスチンおよびH-NFが含まれるが、これらに限定されない。間質幹細胞に典型的な機能的表現型の例には、T細胞抑制活性これはT細胞を刺激せず、逆に、T細胞を抑制する、造血幹細胞支持活性、ならびに、脂肪生成性分化、肝性分化、骨形成性分化および神経性分化が含まれるが、これらに限定されない。これらの構造的特徴または機能的特徴はどれも、本発明の細胞を適格とするために使用することができる下記の実施例の節の実施例1~2参照。本発明の教示に従って作製された細胞の集団は、実施例の節の実施例1において示されるような特異なタンパク質発現プロフィルを特徴とする。従って、例えば、発明の教示に従って作製された胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞は、高いレベルの選択された因子を発現および/または分泌することができる。例えば、そのような細胞は、SCF、Flt-3、H2AFまたはALDHXを、2D培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、または、好ましくは12倍大きく発現または分泌する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、IL-6、EEEF2、RCN2またはCNN1を、2D培養で成長させた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるレベルよりも少なくとも2倍、3倍または5倍大きいレベルで分泌または発現する。加えて、または、代替として、本発明の細胞の集団は、2D培養の細胞に対して比較されたとき、様々な他のタンパク質発現レベルがより低いことを特徴とする。従って、例えば、2D培養で成長させられた胎盤組織または脂肪組織の接着性細胞によって発現または分泌されるHnrph1、CD44抗原イソ型2前駆体、Papss2またはrpL7aの発現レベルの0.6、0.5、0.25または0.125未満を分泌または発現する。本発明を実施にさらに移しているとき、本発明者らは、接着性の間質細胞が、具体的には、3D-ASCが、免疫抑制活性を示したことに気付いている。下記の実施例の節の実施例3において示されるように、接着性の間質細胞、具体的には、3D-ASCは、ヒト臍帯血単核細胞の免疫反応をMLRアッセイにおいて抑制することが見出された。従って、本発明の細胞は、臨床において優先的に使用することができる生物学的活性例えば、T細胞抑制活性、造血幹細胞支持活性を含むことができる。本発明を実施にさらに移しているとき、本発明者らは、本発明の細胞の馴化培地が、臨床において優先的に使用することができる生物学的活性例えば、T細胞抑制活性、造血幹細胞支持活性を含み得ることに気付いている。従って、本発明ではさらに、馴化培地を集めること、および、そのままでのその使用、あるいは、この分野では広く知られている方法を使用する、濃縮、富化または分画化のさらなる工程の後でのその使用が想定される。好ましくは、本発明の馴化培地は、細胞の高い生存性の中期対数期培養から得られる。本明細書中上記で述べたように、本発明の細胞および馴化培地は間質幹細胞表現型を特徴とし、そのようなものとして、そのような細胞の使用が有益である任意の研究および臨床適用において使用することができる。移植されたHSCの生着および造血の開始は、内皮細胞バリアの両端におけるケモカインの勾配に従って、骨髄に向かい、適切な陥凹部に定着すること、一方で、移植された細胞、ECMおよび陥凹部の間葉系細胞の間での物理的接触を確立することを含む複雑なプロセスに依存する。これらすべてのプロセスにおいて、複雑な配列の分子、例えば、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、細胞外マトリックスタンパク質、増殖因子、細胞間相互作用タンパク質および接着タンパク質、ならびに、マトリックスタンパク質などが関わる。輸血されたHSCのほんの1~5が移植後2~3日でレシピエントのBMにおいて検出されるにすぎないことが知られている[Kerreetal.、JImmunol、167:3692~82001;Jetmoreetal.、Blood、99:1585~932002]。造血生着に対するMSC寄与は、部分的には、移植片対宿主病GvHDを引き起こすドナー由来T細胞が生じることを阻害することによってであり[CharbordP.およびMoore,K.、Ann.N.Y.Acad.Sci.、1044:159~1672005;MaitraB.etal.、BoneMarrowTransplant、336:597~6042004;米国特許第6010696号および同第6555374号]、また、部分的には、造血幹細胞HSCの支持を提供することすなわち、造血幹細胞の増殖、成熟化および/またはホーミングを持続し、助けることによってある。下記の実施例の節の実施例2において示されるように、胎盤組織および脂肪組織に由来する接着性細胞は、驚くべきことに、HSCの生着を化学療法の後でさえ支持し得ることが見出された。これらの結果を考慮すると、本発明の細胞または培地は、間質幹細胞移植が使用される任意の臨床的適用において使用され得ることが考えられ得る。従って、本発明の別の態様によれば、間質幹細胞移植が有益である医学的状態例えば、病理、疾患、症候群をその必要性のある対象において処置する方法を提供する。本明細書中で使用される用語処置するは、病理の発達を阻害もしくは停止すること、および/または、病理の軽減、寛解もしくは退行を引き起こすことを示す。当業者は、様々な方法論およびアッセイが、病理の発達を評価するために使用され得ること、また、同様に、様々な方法論およびアッセイが、病理の軽減、寛解もしくは退行を評価するために使用され得ることを理解する。好ましくは、用語処置するは、ガン性疾患に[関連する症状を緩和または軽減することを示す。好ましくは、処置することにより、医学的状態に関連する症状が治り、例えば、実質的に除かれる。本明細書中で使用される間質幹細胞移植が有益である医学的状態は、本発明の細胞/培地の投与によって緩和され得る任意の医学的状態を示す。移植、細胞置換または移植するの用語または表現は、本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を目標の組織に導入することを示す。本明細書中で使用される用語対象は任意の対象例えば、哺乳動物を示し、好ましくは、ヒト対象を示す。本発明のこの態様の方法は、本明細書中上記で記載される本発明の細胞または培地の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、間質幹細胞移植が有益である医学的状態を対象において処置することを含む。本発明のこの態様に従って投与することができる細胞には、二次元環境または三次元環境のいずれかで培養され得る上記の接着性細胞、ならびに、その接着性細胞の間葉系および非間葉系の部分的に分化した誘導体または最終分化した誘導体が含まれる。系列特異的な細胞を本発明の間質幹細胞から誘導する様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、米国特許第5486359号、同第5942225号、同第5736396号、同第5908784号および同第5902741号参照。細胞は未感作であるか、または、目的とする系列を誘導するように遺伝子操作され得る米国特許出願公開第20030219423号参照。細胞および培地は、新鮮な調製物または凍結例えば、冷凍保存された調製物の自己供給源または非自己供給源すなわち、同種または異種のものであり得る。医学的状態に依存して、対象には、さらなる化学的薬物例えば、免疫調節、化学療法などまたは細胞が投与され得る。従って、例えば、幹細胞の生着を改善すること例えば、レシピエントのBMにおける生存可能なHSCの数を増大させること、および、正常な白血球数を最適に改善することのために、本発明の細胞/培地を、HSC移植の前に、または、HSC移植と同時に、または、HSC移植の後で投与することができる。好ましくは、HSCおよび間質細胞は、共通するHLA抗原を互いに有する。好ましくは、HSCおよび間質細胞は1人の個体に由来する。代替として、HSCおよび間質細胞は異なる個体に由来する。移植、細胞置換または移植するの用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を目標の組織に導入することを示す。細胞はレシピエントに由来し得るか、あるいは、同種ドナーまたは異種ドナーに由来し得る。非自己細胞は、身体に投与されたとき、免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を、移植前に、免疫隔離する半透膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。カプセル化技術は一般には、小さい球状賦形剤を伴うマイクロカプセル化およびより大きいフラットシート膜および中空繊維膜を伴うマクロカプセル化に分類されるUludag,H.etal.、Technologyofmammaliancellencapsulation.、AdvDrugDelivRev、2000、42:29~64。マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの分野では知られており、これらには、例えば、LuMZetal.Cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpolyallylamine.、BiotechnolBioeng、2000、70:479~83、ChangTMおよびPrakashSProceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms.、MolBiotechnol、2001、17:249~60、および、LuMZetal.Anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepolyallylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate.、JMicroencapsul、2000、17:245~51によって開示される方法が含まれる。例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸2-ヒドロキシエチルHEMA、メタクリル酸MAAおよびメタクリル酸メチルMMAのターポリマー外皮により複合体化し、これにより、2~5μmのカプセル厚さを生じさせることによって調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、2~5μmのさらなるターポリマー外皮によりカプセル化することができるChia,S.M.etal.、Multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulation、Biomaterials、2002、23:849~56。他のマイクロカプセルはアルギン酸塩海洋多糖類Sambanis,A、Encapsulatedisletsindiabetestreatment.、DiabetesTechnol.Ther.、2003、5:665~8またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、塩化カルシウムの存在下における、ポリカチオンのポリメチレン-co-グアニジン塩酸塩との、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムの間での多電解質複合体化によって調製することができる。細胞のカプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解される。従って、カプセルサイズが1mm~400μmに減少したとき、カプセル化細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善されたCanapleL.etal.、Improvingcellencapsulationthroughsizecontrol.、JBiomaterSciPolymEd、2002、13:783~96。そのうえ、7nmもの小さい十分に制御された細孔サイズ、目的に合わせて調節された表面化学および精密な微小構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出されたWilliamsD、Smallisbeautiful:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices.、MedDeviceTechnol、1999、10:6~9;Desai,T.A.、Microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation.、ExpertOpinBiolTher、2002、2:633~46。免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンA、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジンスルファサラゾピリン、金塩、D-ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブREMICADE、エタネルセプト、TNF.アルファ.遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的製剤、および、非ステロイド抗炎症剤NSAIDが含まれるが、これらに限定されない。NSAIDの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Cox-2阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、細胞または培地はそれ自体で投与することができ、または、好ましくは、医薬的に許容され得る担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与することができる。本明細書中で使用される医薬組成物は、本明細書中に記載される化学的コンジュゲートの1つまたは複数と、他の化学的成分例えば、医薬的に好適な担体および賦形剤との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。以降、用語医薬的に許容され得る担体は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例には、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョンおよび有機溶媒と水の混合物がある。本明細書中において、用語賦形剤は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。本発明の好ましい実施形態によれば、医薬用担体は塩類の水溶液である。薬物の配合および投与のための様々な技術がRemington’sPharmaceuticalSciencesMackPublishingCo.、Easton、PA、最新版これは参考として本明細書中に組み込まれるに見出され得る。医薬組成物を本明細書中上記に詳述されるように全身的な方法で投与することができる。あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、局所的に医薬組成物を投与することができる。本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。本発明に従って使用するための医薬組成物は活性な化合物を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得る担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液などにおいて配合することができる。経粘膜投与の場合、浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量は、最初はインビトロでアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。好ましくは、用量は所望の濃度または滴定量を得るために動物モデルにおいて配合される。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における、インビトロで標準的な薬学的手法によって、決定されることができる。これらのインビトロでの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に対する投薬量範囲を決定するために使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができるFingl他、1975ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,Ch.1p.1参照。例えば、パーキンソン病の患者は、処置に対する肯定反応を示す改善された運動機能について症候的に監視されることができる。注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る、緩衝液例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩水緩衝液などにおいて配合することができる。投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に制御するために十分である有効成分のレベルまで個々に調節することができる。所望の効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特徴、および、投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿中濃度を決定するために使用することができる。処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与であることも複数回投与であることも可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。投薬量および投与のタイミングは、個々に変化する状態の慎重かつ継続的な監視に対応する。例えば、処置されているパーキンソン病の患者は、監視している徴候に基づいて、疾患の症状を緩和するのに十分な量の細胞を投与されるだろう。移植の後、本発明の細胞は好ましくは、治療効果が観察されるように、疾患領域においてある期間例えば、少なくとも6ヶ月にわたって生存する。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、適応される状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する1つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス例えば、FDA承認キットなどで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えDNAの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい:MolecularCloning:AlaboratoryManualSambrook他1989;Ausubel,R.M.編CurrentProtocolsinMolecularBiologyI~III巻1994、Ausubel他著;CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons,米国メリーランド州バルチモア1989;Perbal著APracticalGuidetoMolecularCloningJohnWileySons,米国ニューヨーク1988;Watson他、RecombinantDNAScientificAmericanBooks、米国ニューヨーク;Birren他編GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries1~4巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、米国ニューヨーク1998;米国特許の4666828号、4683202号、4801531号、5192659号および5272057号に記載される方法;Cellis,J.E.編CellBiology:ALaboratoryHandbookI~III巻1994;Coligan,J.E.編CurrentProtocolsinImmunologyI~III巻1994;Stites他編BasicandClinicalImmunology第8版、AppletonLange、米国コネティカット州ノーウォーク1994;MishellとShiigi編SelectedMethodsinCellularImmunology、W.H.FreemanandCo.、米国ニューヨーク1980;また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている:米国特許の3791932号、3839153号、3850752号、3850578号、3853987号、3867517号、3879262号、3901654号、3935074号、3984533号、3996345号、4034074号、4098876号、4879219号、5011771号および5281521号;Gait,M.J.編OligonucleotideSynthesis1984;Hames,B.D.およびHigginsS.J.編NucleicAcidHybridization1985;Hames,B.D.およびHigginsS.J.編TranscriptionandTranslation1984;Freshney,R.I.編AnimalCellCulture1986;ImmobilizedCellsandEnzymesIRLPress1986;APracticalGuidetoMolecularCloningPerbal,B.著1984およびMethodsinEnzymology1~317巻、AcademicPress;PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications、AcademicPress、米国カリフォルニア州サンディエゴ1990;Marshak他、StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual、CSHLPress、1996;なおこれらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。実施例1骨髄、胎盤組織および脂肪組織からの接着性間質細胞ASCの作製および培養接着性細胞を、3D担体を含有するバイオリアクターにおいて培養して、特異的な細胞マーカー発現プロフィルにより特徴づけられる3D-ASC細胞を作製した。成長効率を細胞計数によって調べた。これらの細胞の分化能を、分化培地で培養することによって調べた。材料および実験手順骨髄間質細胞-骨髄BM間質細胞を、開心術またはBM生検を受ける血液学的に健康なドナーの吸引された胸骨骨髄から得た。骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液HBSS;GIBCOBRL/Invitrogen、Gaithersburg、MDで3倍希釈し、Ficoll-HypaqueRobbinsScientificCorp.、Sunnyvale、CA密度勾配遠心分離に供した。その後、骨髄単核細胞1.077gm/cm3未満を集め、HBSSで3回洗浄し、成長培地[10のFCSGIBCOBRL、10-4MのメルカプトエタノールMerck、WhiteHouseStation、NJ、Pen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/ml;BeitHa’Emek、2mMのL-グルタミンBeitHa’Emekが補充されたDMEMBiologicalIndustries、BeitHa’emek、イスラエル]に再懸濁した。個々のドナーからの細胞を、培養培地を毎週交換しながら、37°C5CO2で組織培養フラスコCorning、Acton、MAにおいて別々にインキュベートした。細胞を、0.25トリプシン-EDTABeitHa’Emekを使用して3~4日毎に剥がした。2~40回の継代培養の後、60~80のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。胎盤由来の間質細胞。満期出産胎盤の内側部分BneiZionメディカルセンター、Haifa、イスラエルを無菌条件下で切断し、ハンクス緩衝液により3回洗浄し、0.1のコラゲナーゼ1mg/ml組織;Sigma-Aldrich、St.Lewis、MOとともに37°Cで3時間インキュベートした。その後、穏やかなピペッティングを使用して、懸濁された細胞を、10のFCS、Pen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/mlおよび2mMのL-グルタミンが補充されたDMEMにより洗浄し、75cm2フラスコに播種し、5CO2を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて37°Cでインキュベートした。その後、細胞をプラスチック表面に72時間接着させ、その後、培地を3~4日毎に交換した。60~80のコンフルエンスに達したとき通常、10~12日、細胞を、0.25トリプシン-EDTAを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。その後、培養細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。脂肪由来の間質細胞-間質細胞を脂肪吸引法のヒト脂肪組織から得たRambamHaifa、イスラエル。脂肪組織を等体積のPBSにより徹底的に洗浄し、コラゲナーゼ20mg/mlにより37°Cで30分間消化した。その後、細胞を、10のFCS、Pen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/mlおよびL-グルタミンを含有するDMEMにより洗浄し、1200rpmにおいてRTで10分間遠心分離し、溶解液1:10;BiologicalIndustries、BeitHa’emek、イスラエル、赤血球を除くためににより再懸濁し、遠心分離し、10のFCS、Pen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/mlおよびL-グルタミンを含有するDMEMにより再懸濁した。その後、洗浄された細胞を無菌の組織培養培地フラスコに3~10×107細胞/フラスコで播種した。翌日、細胞をPBSにより洗浄して、残留RBCおよび死細胞を除いた。細胞を、5CO2を伴う加湿条件のもとで組織培養インキュベーターにおいて37°Cで保った。培地を3~4日毎に交換した。60~80のコンフルエンスで、細胞を、0.25トリプシン-EDTAを使用して成長フラスコから剥離し、新しいフラスコに播種した。2~40回の継代培養の後、60~80のコンフルエンスに達したとき、細胞を、分析のために、または、バイオリアクターにおける培養のために集めた。PluriX商標プラグフローバイオリアクター-PluriX商標プラグフローバイオリアクターPluristem、Haifa、イスラエル;図1gに例示されるようなもの;米国特許第6911201号もまた参照のことに、ポリエステルの不織布マトリックスから作製された1~100mlの充填された3Dポロシブ担体直径、4mmを負荷した。これらの担体は大きい細胞数の増殖を比較的小さい体積において可能にする。ガラス器具はPluristemによって設計および製造された。バイオリアクターは37°Cのインキュベーターにおいて維持され、流量がバルブ図1gにおける6aおよび蠕動ポンプ図1gにおける9によって調節およびモニターされた。バイオリアクターは、細胞の連続した播種を可能にするサンプリングおよび注入点図1gにおける4を含有する。培養培地がリザーバー図1gにおける1からpH6.7~7.4で供給された。リザーバーには、空気/CO2/O2を異なる割合で含有するろ過されたガス混合物図1gにおける2、3が、バイオリアクターにおける細胞密度に依存して供給された。O2の割合は、モニター図1gにおける6によって求められるバイオリアクターの出口での溶存O2のレベルに合わせられた。ガス混合物がシリコーンチューブまたはディフューザーDeganiaBet,EmekHayarden、イスラエルを介してリザーバーに供給された。培養培地は、循環している非接着性細胞の捕集を可能にする分離用容器図1gにおける7に通された。培地の循環が蠕動ポンプ図1gにおける9によって得られた。バイオリアクターはさらに、さらなるサンプリング点図1gにおける10、および、連続した培地交換のための容器を備えた。3D接着性間質細胞3D-ASCの作製-上記のように成長させた非コンフルエントな初代ヒト接着性2D細胞培養物をトリプシン処理し、洗浄し、10のFCS、Pen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/mlおよび2mMのL-グルタミンが補充されたDMEMに再懸濁し、注入点を介して無菌のプラグフローバイオリアクター図1g参照における3D担体に播種した103~105細胞/ml。接種前に、バイオリアクターはPBS-Ca-MgBiologicalIndustries、BeitHa’emek、イスラエルで満たされ、オートクレーブ処理され120°C、30分、10の熱不活化ウシ胎児血清およびPen-Strep-ナイスタチン混合物100U/ml:100ug/ml:1.25un/mlを含有するダルベッコ成長培地により洗浄された。流れが0.1~5ml/分の速度で保たれた。播種プロセスでは、2~48時間にわたる循環の中断が伴い、それにより、細胞が担体に留まることを可能になった。バイオリアクターは、無菌の空気およびCO2が必要に応じて供給されるインキュベーターを使用して、制御された温度37°CおよびpHpH=6.7~7.4の条件のもとで保たれた。成長培地を週に2~3回取り替えた。循環培地を、4時間毎~7日毎に、新鮮なDMEM培地により取り替えた。1×106~1×107細胞/mlの密度で12~40日の成長の後、全培地体積をバイオリアクターから取り出し、バイオリアクターおよび担体をPBSにより3~5回洗浄した。その後、3D-ASC細胞をトリプシン-EDTABiologicalIndustries、BeitHa’emek、イスラエル;穏やかな撹拌とともに3~15分、1~5回により担体から剥離し、その後、DMEMに再懸濁し、凍結保存した。3D-ASCの性状の生物学的アッセイ-凍結保存された3D-ASC細胞を解凍し、計数した。細胞生存能の評価のために、2×105個の細胞を150cm2組織培養フラスコに播種し、その接着能および再増殖を播種後7日以内に評価した。その後、3D-ASCの膜マーカー表現型を、蛍光モノクローナル抗体フローサイトメーターBeckmanCoulter、Fullerton、CAを使用して分析した。フローサイトメトリーアッセイを使用する3D培養の接着性細胞および2D培養の接着性細胞の細胞膜マーカープロフィルの比較-2D培養および3Dフローシステム培養からの100000~200000個の接着性細胞を5mlのチューブにおいて0.1mlの培養培地に懸濁し、下記MAb、FITCコンジュゲート化抗ヒトCD90ChemiconInternationalInc.、Temecula、CA、PEコンジュゲート化抗ヒトCD73BactlabDiagnostic、Ceasarea、イスラエル、PEコンジュゲート化抗ヒトCD105eBioscience、SanDiego、CA、FITCコンジュゲート化抗ヒトCD29eBioscience、SanDiego、CA、Cy7-PEコンジュゲート化抗ヒトCD45eBioscience、PEコンジュゲート化抗ヒトCD19IQProducts、Groningen、オランダ、PEコンジュゲート化抗ヒトCD14MAbIQProducts、FITCコンジュゲート化抗ヒトCD11bIQProductsおよびPEコンジュゲート化抗ヒトCD34IQProductsのそれぞれの飽和濃度と、または、FITCコンジュゲート化抗ヒトHLA-DRMAbIQProductsとインキュベートした4°C、30分、暗所。インキュベート後、細胞を、1の熱不活化FCSを含有する氷冷PBSで2回洗浄し、500μlホルムアルデヒド0.5に再懸濁し、FC-500フローサイトメーターBeckmanCoulter、Fullerton、CAを使用して分析した。質量分析法による分析を使用する3D培養の接着性細胞および2D培養の接着性細胞のタンパク質プロフィルの比較-2D由来培養手法および3D由来培養手法のASCを上記のように胎盤から作製した。簡単に記載すると、2D培養物を、0.3~0.75×106個の細胞を、60~80のコンフルエンスに達するまで、加湿5CO2雰囲気のもと、37°Cで、175cm2フラスコにおいて4日間培養することによって作製した。2~10×106細胞/mlを、2000個の担体を含有するバイオリアクターに播種し、18日間培養することによって、3D培養物を作製した。回収後、細胞を3回洗浄して、全血清を除き、ペレット化し、凍結した。タンパク質を製造者のプロトコルに従ってペレットから単離した[Tri試薬キットSigma、SaintLouis、米国を使用し、トリプシンにより消化し、iTRAQ試薬AppliedBiosciences、FosterCity、CAにより標識した]。簡単に記載すると、iTRAQ試薬は、非ポリマーの、等重核のタグ化試薬である。それぞれのサンプルに含まれるペプチドが、それらのN末端および/またはリシン側鎖を介して4つの等重核の同位体コードタグのうちの1つにより標識される。4つの標識されたサンプルが混合され、ペプチドが質量分析法により分析される。ペプチドがフラグメント化されたとき、それぞれのタグが、異なった質量レポーターイオンを放出する。従って、4つのレポーターの比率により、サンプルにおける所与ペプチドの相対的な存在量が与えられるhttp://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdfにおける情報。胎盤由来ASCの2D培養対3D培養のプロテオミックス分析を、QTOF-PremierでのLC-MS/MSWaters、SanFrancisco、CAを使用してSmolerプロテオミックセンターBiology部門、Technion、Haifa、イスラエルにおいて行い、同定および分析をnrデータベースのヒト部分に対してPep-Minerソフトウエア[Beer,I.etal.、Proteomics、4、950~602004]によって行った。分析されたタンパク質は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質H1Hnrph1、GeneBankアクセション番号NP_005511、H2AヒストンファミリーH2AF、GenBankアクセション番号NP_034566.1、真核生物翻訳伸長因子2EEEF2、GeneBankアクセション番号NP_031933.1、レチクロカルビン3、EF-ハンドカルシウム結合ドメインRCN2、GeneBankアクセション番号NP_065701、CD44抗原イソ型2前駆体GeneBankアクセション番号NP_001001389、カルポニン1塩基性平滑筋CNN1、GeneBankアクセション番号NP_001290、3ホスホアデノシン5ホスホ硫酸シンターゼ2イソ型aPapss2、GeneBankアクセション番号NP_004661、リボソームタンパク質L7arpL7a、GeneBankアクセション番号NP_000963およびアルデヒドデヒドロゲナーゼXALDHX、GeneBankアクセション番号P47738であった。すべての実験が2回行われた。分析の性質のために、すべてのタンパク質は、サンプルにおいて現れたペプチドの数に従って分析されたそれぞれの分析において1つのタンパク質から2~20個のペプチドが出現した。ELISAを使用する3D培養の接着性細胞および2D培養の接着性細胞における分泌タンパク質の比較-胎盤から作製された2D由来培養手法および3D由来培養手法のASCを上記のように作製した3D培養物は24日の期間にわたった。その後、馴化培地を集め、Flt-3リガンド、IL-6、トロンボポエチンTPOおよび幹細胞因子SCFについて、3回の独立した実験で、ELISARDSystems、Minneapolis、MNを使用して分析した。結果を1×106細胞/mlについて正規化した。骨芽細胞分化培地-細胞を、10のFCS、100nMのデキサメタゾン、0.05mMのアスコルビン酸2-リン酸、10mMのB-グリセロリン酸が補充されたDMEMを含有する骨芽細胞分化培地で3週間の期間、培養することによって、骨形成性分化を評価した。石灰化したマトリックスがアリザリンレッドS染色によって示され、アルカリホスファターゼがアルカリホスファターゼアッセイキットによって検出されたすべての試薬がSigma-AldrichSt.Lewis、MOから得られた。結果PluriX商標バイオリアクターシステムは生理学的な類似する微小環境をもたらす。接着性細胞のための効率的な培養条件を与えるために、生理学的に類似する微小環境図1aに示すが、PluriX商標バイオリアクターPluristem、Haifa、イスラエル;担体が図1gに例示され、播種前が図1bに示されるを使用して人工的に作製された。図1c~fに示されるように、播種後の20日図1c~d、それぞれ150倍および250倍に拡大および40日図1e~f、それぞれ350倍および500倍に拡大において、骨髄から作製された3D-ASC細胞が首尾良く培養され、3Dマトリックス上で拡大培養された。PluriXバイオリアクターシステムで成長させた細胞は著しく拡大培養された。胎盤由来3D-ASCの種々の製造ロットをPluriXバイオリアクターシステムで成長させた。播種密度は13300細胞/担体であった合計で2×106細胞。播種後14日で、細胞密度は15倍になり、およそ200000細胞/担体に達し図2、すなわち、150個の担体のバイオリアクターにおいて30×106個に達した。異なる実験において、細胞が1.5×104細胞/mlの密度でバイオリアクターに播種され、播種後30日で、担体は、50倍を超える大きい細胞数、すなわち、およそ0.5×106細胞/担体または0.5×107細胞/mlを含有した。成長カラムの様々なレベルでの担体上の細胞密度は一致していた。このことは、細胞への酸素および栄養分の均一な移動を示している。従って、この3D培養システムは、生着および成功した移植を支持するという目的のために十分な量に効率的に成長させることができる、高密度の間葉系細胞培養の成長および長期にわたる維持のための支持条件を提供することが判明した。3D-ASCは特異な膜マーカー特徴を示す。骨環境を模倣する3D培養手法によって行われたとき、可溶性分子の分泌プロフィルおよびタンパク質産生における違いを明確にするために、FACS分析を行った。図3aに示すように、細胞マーカーのFACS分析は、3D-ASCが、2D条件で成長させた接着性細胞とは異なるマーカー発現パターンを呈示することを示す。2D培養の細胞は、3D培養の細胞と比較して、陽性の膜マーカーCD90、CD105、CD73およびCD29の膜マーカーのレベルが著しく上昇した。例えば、CD105は、2D培養の細胞における87に対して、3D培養の細胞では56の発現を示した。2Dおよび3Dの両方の胎盤培養のASCは造血系の膜マーカーを何ら発現しなかった図3b。3D-ASCは可溶性因子の特異なプロフィルを示す。造血陥凹部は、大量のサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を産生するサポーター細胞を含む。2D培養のASCと、3D培養のASCとの違いをさらに明確にするために、2Dおよび3DのASC培養物の馴化培地における4つの主要な造血系分泌タンパク質のプロフィルをELISAによって行った。図4a~cは、3D条件で成長させられた細胞が、より高いレベルのFlt-3リガンド図4a、IL-60図4bおよびSCF図4cを含む馴化培地をもたらし、一方、低いレベルのIL-6、ゼロに近いレベルのFlt-3リガンドおよびSCFが2D培養物の馴化培地において検出されたことを示す。トロンボポエチンTPOの産生は両方の培養物において非常に低く、等しかった。3D-ASCは特異なタンパク質プロフィルを質量分析法による分析において示す。2D培養のASCと、3D培養のASCとの違いをさらに明確にするために、これらの細胞のタンパク質プロフィルを質量分析法によって分析した。図4dは、2D培養のASCおよび3D培養のASCが顕著に異なるタンパク質発現プロフィルを示すことを示す。下記の表1に示されるように、3D培養の細胞では、H2AFおよびALDHXの発現レベルがはるかにより大きいことそれぞれ、9倍超および12倍超、また、EEEF2、RCN2およびCNN1のタンパク質のレベルがより大きいことそれぞれ、約3倍、2.5倍および2倍が示される。加えて、3D培養の細胞では、Hnrph1およびCD44抗原イソ型2前駆体のタンパク質の発現レベルが約1/2であり、Papss2およびrpL7aの発現レベルが約1/3であることが示される。3D-ASCは、骨芽細胞に分化する能力を有する。-3D-ASCをさらに特徴づけるために、細胞を骨芽細胞分化培地で3週間の期間、培養した。その後、カルシウム沈殿を行った。分化した細胞は、カルシウムこれは図5a~bにおいて赤色に示されるを産生することが示され、これに対して、コントロール細胞は線維芽細胞様の表現型を維持し、石灰化を示さなかった図5c~d。これらの結果は、胎盤由来の3D-ASCが、骨芽細胞にインビトロで分化する能力を有することを示す。実施例2HSCの生着を改善する胎盤由来の3D-ASCの能力の評価3D-ASCがHSC生着を支持することを、亜致死量の放射線が照射された免疫欠損NOD-SCIDマウス、または、化学療法により前処理された免疫欠損NOD-SCIDマウスにおいて検出されるヒト造血細胞hCD45のレベルによって評価した。材料および実験手順CD34細胞の単離-臍帯血サンプルを出産時に無菌条件下で採取しBneiZionMedicalCenter、Haifa、イスラエル、単核細胞を、LymphoprepAxis-ShieldPoCAs、Oslo、ノルウェー密度勾配遠心分離を使用して分画し、冷凍保存した。解凍した単核細胞を洗浄し、抗CD34抗体とインキュベートし、midiMACSMiltenylBiotech、BergishGladbach、ドイツを使用して単離した。2つ以上のサンプルからの細胞を、所望の数50000~100000個の細胞を達成するためにプールした。放射線照射マウスにおける移植細胞の検出-7週齢のオスおよびメスのNOD-SCIDマウスNOD-CB17-Prkdcscid/J;Harlan/WeizmannInst.、Rehovot、イスラエルを無菌の開放系ケージにおいて維持し、無菌の餌およびオートクレーブ処理の酸性水が与えられた。マウスには、亜致死量の放射線350cGyが照射され、その後放射線照射後48時間で、50000~100000個のhCD34細胞が、胎盤組織または脂肪組織に由来するさらなるASC0.5×106個~1×106個とともに、または、伴うことなくそれぞれの群において3~7匹のマウス、側尾静脈への静脈内注入によって移植された。移植後4~6週間で、マウスを脱臼によって屠殺し、BMを、大腿骨および脛骨の両方をFACS緩衝液50mlのPBS、5mlのFBS、0.5mlの5アジ化ナトリウムにより洗い流すことによって集めた。マウスBMにおけるヒト細胞をフローサイトメトリーによって検出し、処置されたNOD-SCIDマウスにおけるヒトおよびマウスのCD45造血細胞マーカー発現細胞の割合を、細胞を抗ヒトCD45-FITCIQProducts、Groningen、オランダとインキュベートすることによって求めた。明確なヒト生着についての最低の閾値が0.5で示された。化学療法により処置されたマウスにおける移植細胞の検出-6.5週齢のオスのNOD-SCIDマウスNOD.CB17/JhkiHsd-scid;Harlan、Rehovot、イスラエルを、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように維持し、ブスルファンを腹腔内注射した25mg/kg、2日間連続。2回目のブスルファン注射の2日後、マウスには、CD34細胞が単独で、または、胎盤から作製された0.5×106個のASCと一緒に注入された。移植後3.5週間で、マウスを屠殺し、ヒト造血細胞の存在を、放射線照射マウスについて本明細書中上記で記載されたように求めた。結果3D-ASCは放射線照射マウスにおいてHSCの生着を改善した-ヒトCD34造血細胞と、胎盤組織または脂肪組織に由来する3D-ASCとを、放射線照射されたNOD-SCIDマウスに同時移植した。生着効率を同時移植後4週間で評価し、HSCが単独で移植されたマウスと比較した。表2および図6に示すように、3D-ASCおよびUCBCD34細胞の同時移植は、UCBCD34細胞だけにより処置されたマウスと比較したとき、レシピエントマウスのBMにおける相当高い生着率およびより高いレベルのヒト細胞をもたらした。3D-ASCは、化学療法により処置されたマウスにおいてHSCの生着を改善した-ヒトCD34造血細胞を、化学療法により前処置されたNOD-SCIDマウスに、胎盤に由来する500000個の2D-ASCまたは3D-ASCとともに同時移植した。生着効率を同時移植後3.5週間で評価し、HSCだけが移植されたマウスと比較した。表3に示すように、ASC細胞およびUCBCD34細胞の同時移植は、UCBCD34細胞の単独と比較したとき、レシピエントマウスのBMにおいてより高い生着レベルをもたらした。そのうえ、表3に示すように、生着の平均レベルが、PluriXバイオリアクターシステムで成長させた胎盤由来の接着性細胞3D-ASCが同時移植されたマウスの方が、従来の静的な2D培養条件フラスコで成長させた、同じドナーからの細胞によるマウス同時移植の場合よりも大きかった。図7a~bに示すFACS分析結果により、ASCをhHSCと同時移植することの利点図7b、および、ASCはHSC移植後の造血系の回復を改善することができることが明らかになる。まとめると、これらの結果は、ASCが、HSC移植自家または同種の後の造血回復を改善するための支持細胞として役立ち得ることを示す。HSC移植後の造血幹細胞および/または前駆体細胞の生着を高める3D-ASCの能力は、移植された細胞のホーミング能、自己再生能および増殖能を改善し得るHSC支持サイトカインを分泌する3D-ASCの能力から生じ得るか、または、移植可能なHSCのホーミングおよび増殖のために必要とされる損傷した造血微小環境を再建するそのような細胞の能力から生じ得る。実施例32D培養のASCおよび3D培養のASCによるリンパ球応答の抑制接着性細胞、具体的には、3D-ASCは、ヒト臍帯血単核細胞の免疫反応をMLRアッセイにおいて抑制することが見出された。材料および実験手順混合リンパ球反応MLRアッセイ-胎盤から作製された、2D由来培養手法のASCおよび3D由来培養手法のASCの免疫抑制特性および免疫特権特性を、応答増殖性細胞および刺激非増殖性細胞の混合培養における不適合リンパ球の増殖率によって行われるような、HLA座における組織適合性を測定するMLRアッセイによって求めた。ヒト臍帯血CB単核細胞2×105個を応答細胞として使用し、等量105個の放射線照射3000Radされたヒト末梢血由来単球PBMCと、あるいは、胎盤から作製された2D培養もしくは3D培養の接着性細胞、または、接着性細胞およびPBMCの組合せと同時培養することによって刺激した。それぞれのアッセイを3回繰り返した。細胞を96ウエルプレートにおいてRPMI1640培地20のFBSを含有するで加湿5CO2雰囲気のもと、37°Cで4日間にわたって同時培養した。プレートを、培養の最後の18時間、1μCの3H-チミジンによりパルス処理した。その後、細胞をガラス繊維フィルター上に集め、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターにより定量した。結果図8は、PBMCにより刺激されたとき、これらの細胞の増殖の高まりによって表されるようなCB細胞の免疫応答を示す。これは、理論によって拘束されることはないが、おそらくは、HLA不適合性に対する応答におけるT細胞の増殖に関連する。しかしながら、相当低いレベルの免疫応答が、本発明の接着性細胞とインキュベートされたとき、これらの細胞によって示された。そのうえ、PBMCに対するCBの免疫応答が、これらの接着性細胞と同時インキュベートされたとき、実質的に減少した。従って、MSCに類似した様式で、ASCは、GvHDに典型的なドナー細胞のT細胞増殖を減少させる潜在的能力を有することが見出された。両方の培養物2Dおよび3Dはリンパ球の免疫応答を減少させたが、また、本明細書中上記で記載される3D-ASCの他の利点と一致して、3DASCはより免疫抑制的である。明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で言及した刊行物、特許および特許願ならびにGenBankアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許もしくは特許願またはGenBankアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。"