"二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスから2プロパノールを生産する組換え微生物であって、上記ガスからアセチルCoAを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチルCoAから2プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子が導入されていることを特徴とする2プロパノールを生産する組換え微生物。アセトバクテリウム属の細菌に、以下のa~dの遺伝子が導入されてなる形質転換体。aアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferaseをコードする外来性遺伝子bアセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferaseをコードする外来性遺伝子cアセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylaseをコードする外来性遺伝子d二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenaseをコードする外来性遺伝子請求項2において、アセトバクテリウム属の細菌はアセトバクテリウムウッディである形質転換体。これまでは2プロパノールの生産における基質としては、通常、糖質が想定されている。草本バイオマス中に多く含まれるセルロース、ヘミセルロースは、加水分解することによりグルコース、またはキシロース、アラビノースなどの単糖とすることができる。上述の組換え大腸菌による2プロパノール生産も基質はグルコースである。しかし、バイオマスには、タンパク質、脂質、リグニンなどの糖質以外の有機物も多く含まれており、これらは上記組換え大腸菌による2プロパノールの生産には利用することができない。さらに、セルロース系バイオマス以外にも家畜糞尿、下水汚泥など非糖質のバイオマス資源も多く存在している。従って、糖質のみを利用した従来の技術では、用いることができる資源が大きく限定される。そこで、本発明は、様々なバイオマスを利用することができるように、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスを基質とする2プロパノールの微生物生産プロセスを提案する。本発明者は、上記課題を解決すべく研究を重ね、WoodsLjungdahl経路アセチルCoA経路を利用すれば、二酸化炭素と水素とを含むガスのみならず、一酸化炭素と水素とを含むガス例えば、合成ガスを基質として、2プロパノールの微生物生産を行なうことが可能になることに着目し、本発明を完成させた。すなわち、ここに開示する2プロパノール生産能を有する組換え微生物は、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスからアセチルCoAを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチルCoAから2プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子が導入されていることを特徴とする。<WoodsLjungdahl経路>図1はWoodsLjungdahl経路を示す。この経路の特徴は、2分子のCO2から1分子のアセチルCoAが生成される点である。図1の左側の反応系ではCO2のメチル基への還元が触媒され、右側の反応系ではCO2の活性型COへの還元が触媒されている。最後にメチル基、活性型CO及びCoAが結合してアセチルCoAが生成される。アセチルCoAから最終的に酢酸を生産し、アセチルCoAのリン酸化によってATPを生産することができる。CO2の活性型COへの還元反応はCOデヒドロゲナーゼにより触媒され、メチル基とCoAを結合する反応はアセチルCoAシンターゼにより触媒される。左側反応系に示すように水性ガスシフト反応を利用することにより、H2CO2ガスに代えて合成ガスを用いることができる。また、アセチルCoA経路をもつ酢酸生産菌の中にはガス基質としてCOを利用できるものも知られている。<2プロパノール代謝経路>図2はH2CO2ガス基質から2プロパノールを生産する代謝経路を示す。すなわち、まず、図1のWoodsLjungdahl経路によりH2CO2ガス基質からアセチルCoAが合成される。4CO28H22HSCoA→2CH3COSCoA6H2Oついで、ABE発酵菌がもつ遺伝子群によって2プロパノールが生産される。2CH3COSCoAH2OH2→CH3CHCH3CO22HSCoA具体的にはアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの反応がアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferase別名;チオラーゼThiolaseによって触媒され、アセトアセチルCoAからアセトアセテートへの反応がアセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferaseによって触媒され、アセトアセテートからアセトンへの反応がアセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylaseによって触媒され、アセトンから2プロパノールへの反応が二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenase別名イソプロパノールデヒドロゲナーゼによって触媒される。全体の反応は次のとおりになる。3CO29H2→CH3CHCH35H2O比較としてグルコースからの2プロパノール合成反応を示すと次のようになる。C6H12O6H2O→CH3CHCH33CO23H2グルコースからの2プロパノール合成反応の場合、余剰の還元力として水素が放出される。水素の発生は微生物の代謝をかく乱するため、好気培養によって余剰の還元力を消去する必要があり、生産物収率が低下する原因となる。これに対して、本発明に係る2プロパノール生産では、異化された基質のすべてが2プロパノールに変換されるので、従来の糖を基質とした2プロパノール生産よりも効率が高くなりうる。<宿主微生物>図2の代謝経路を構築するためのプラットフォームとなるのは、WoodsLjungdahl経路を持つ微生物、例えば、中温菌であれば、クロストリジウム属のクロストリジウムオートエタノゲナムClostridiumautoethanogenum、クロストリジウムリュングダリイClostridiumljungdahlii、クロストリジウムカルボキシディボランスClostridiumcarboxidivorans、アセトバクテリウム属のアセトバクテリウムウッディAcetobacteriumwoodii、その他にオキソバクターフェニジイOxobacterpfennigii、ペプトストレプトコッカスプロダクツスPeptostreptococcusproductus、ユーバクテリウムリモーサムEubacteriumlimosum、ブチリバクテリウムメチロトロフィカムButyribacteriummethylotrophicum、クロストリジウムアセチクムClostridiumaceticumがあげられ、好熱性菌であれば、モーレラ属のモーレラサーモアセティカMoorellathermoacetica、モーレラサーモオートトロフィカMthermoautotrophicaや、デスルホトマクルムクズネツォビイDesulfotomaculumkuznetsoviiなどのホモ酢酸菌と呼ばれる微生物群があげられる。<外来性遺伝子>これらの微生物を宿主として、図2に列挙している、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferaseをコードする外来性遺伝子、アセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferaseをコードする外来性遺伝子、アセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylaseをコードする外来性遺伝子、並びに二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenaseをコードする外来性遺伝子の4遺伝子を導入して、たんぱく質発現をさせることにより、H2CO2ガス又は合成ガスから2プロパノールを生産する2プロパノール生産菌が得られる。上記4遺伝子が導入された微生物が2プロパノール生成能を有する限り、上記4遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は限定されない。上記4遺伝子は、例えば、ブタノールイソプロパノール発酵菌として知られるクロストリディウム属細菌、クロストリジウムベージェリンキーClostridiumbeijerinckii、クロストリジウムオウランティブチィリカムClostridiumaurantibutyricumなどが保有し、これらの菌から取得することができる。また、ブタノールアセトン発酵を行なうクロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicum、クロストリジウムサッカロペルブチルアセトニカムClostridiumsaccharoperbutylacetonicum、クロストリジウムサッカロアセトブチィリカムClostridiumsaccharoacetobutylicum、クロストリジウムパスツーリアウムClostridiumpasteurianum、クロストリジウムスポロゲンズClostridiumsporogenes、クロストリジウムカダベリスClostridiumcadaveris、クロストリジウムテタノモルフュウムClostridiumtetanomorphum等のクロストリジウム属細菌は、アセチルCoAからアセトンを生産するまでの3ステップの酵素をコードする遺伝子を有することが知られている。また、サーモアナエロバクターエサノリカスThermoanaerobacterethanolicus、サーモアナエロバクターテングコンゲネシスThermoanaerobactertengcongensis、サーモアナエロバクターブロッキーThermoanaerobacterbrockii、サーモシナスカルボキシディボランスThermosinuscarboxydivorans、メタノサシナバーケリMethanosarcinabarkeriなど細菌は、第4ステップアセトン→2プロパノールの酵素をコードする遺伝子を有することが知られている。従って、ブタノールイソプロパノール発酵菌由来の遺伝子に代えて、或いはこれらと共に、上記ブタノールアセトン発酵を行なうクロストリジウム属細菌由来の遺伝子や、サーモアナエロバクターエサノリカス等由来の遺伝子を組み合わせて用いることもできる。好ましいのは、クロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicumに由来する、アセチルCoAからアセトンを生産するまでの3ステップの酵素をコードする各遺伝子と、サーモアナエロバクターエサノリカスThermoanaerobacterethanolicusに由来する上記第4ステップの酵素をコードする遺伝子とを使用することである。これらの遺伝子は、中温菌であるClostridium属細菌ゲノムなどからクローニングすることができる。本発明では、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号1の塩基配列からなるDNAを用い、アセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号2の塩基配列からなるDNAを用い、アセトアセテートデカルボキシラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号3の塩基配列からなるDNAを用い、二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号4の塩基配列からなるDNAを用いるのが好ましい。配列番号1~3の塩基配列のDNAは、クロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicumに由来する遺伝子である。配列番号4の塩基配列のDNAは、サーモアナエロバクターエサノリカスThermoanaerobacterethanolicusに由来する遺伝子である。<遺伝子増幅>上述の種々の微生物由来の遺伝子の配列をPCRpolymerasechainreaction法により増幅する。PCR法は、公知のPCR装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。PCRのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を1サイクルとし、通常10~100サイクル、好ましくは、約20~50サイクルである。PCRの鋳型として、上述の2プロパノール代謝経路の酵素活性を示す微生物から単離したDNAを用い、各遺伝子のcDNAを増幅することができる。PCR法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、商業的に入手可能なPCRクローニングシステムなどを使用することができる。<シャトルベクターの構築>各遺伝子のPCR産物を大腸菌等に由来するベクターに組込む。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。PCR産物とベクターとを反応させた後、このPCR産物が組み込まれたベクターを用いて大腸菌を形質転換する。この形質転換にはコンピテントセルによる化学的遺伝子導入法を用いることができる。この形質転換された大腸菌を培養し、培養物からプラスミドDNAを抽出する。このようにして上記4遺伝子各々を単独でもつプラスミドを得た後、これらプラスミドから当該4遺伝子が融合した2プロパノール生合成遺伝子群オペロンを作成する。このオペロンを大腸菌と宿主微生物とのシャトルベクターに組み込む。<形質転換>上記4遺伝子を含むシャトルベクターの宿主微生物への導入は、例えば、塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの公知の方法で行うことができる。得られた形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用い嫌気条件下で培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等を用いることができる。<2プロパノールの生産>上記の如くして得られる培養物から回収分離された形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物は、嫌気条件下で2プロパノール生成反応に供せられる。すなわち、有機汚泥、糞尿、厨芥、木材、その他のバイオマスから発酵或いは熱化学的な方法により得た水素-二酸化炭素含有ガス、或いは水素-一酸化炭素含有ガスを原料として2プロパノールを生産することができる。本発明によれば、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスからアセチルCoAを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチルCoAから2プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子群を導入したから、タンパク質、脂質、リグニンなどの糖質以外の有機物も原料として利用することができ、様々なバイオマスを利用した2プロパノールの効率的な生産を行なうことができる。以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物或いはその用途を制限することを意図するものではない。本実施形態では、水素二酸化炭素資化性酢酸生成菌宿主株として中温性ホモ酢酸生成菌であるアセトバクテリウムウッディAcetobacteriumwoodiiATCC29683を用いた。1.アセトバクテリウムウッディ株の増殖特性基本培地の調製培養にはクロストリジウムリュングダリイに用いられるATCC1754PETC寒天培地を改変したものを基本培地として用いた。改変部分は、還元剤としてNa2S9H2Oを除き、代わりにCysteineHClH2Oを0.3g/Lとなるように添加した。培地作製においては、還元剤と基質を別に作製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Hungateの方法を改変したMillerらの方法を用いた。改変型ATCC1754PETC寒天培地の組成を表1に、トレースエレメント溶液の組成を表2に、Wolfesビタミン溶液の組成を表3に示す。改変型ATCC1754PETC寒天培地については、HClでpH6.9に調整後、滅菌水900mLを加えた。トレースエレメント溶液については、ニトリロ三酢酸を溶解し、KOHでpH6.0に調整後、残りの試薬を添加した。最終的に全量が1Lとなるように滅菌水を加え、遮光して4°Cで保存した。Wolfesビタミン溶液についても、各成分を混合し全量が1Lになるように滅菌水を加え、4°Cで遮光保存した。フルクトース溶液の調製滅菌水100mLを20分間ボイルして脱気した後、N2を注入しながら氷中で室温まで冷却後、フルクトース10gを添加し、N2雰囲気下、氷中でさらに20分間冷却した。ついで、冷却後の溶液を0.45μmフィルターで濾過滅菌しつつ、N2を注入した滅菌済みバイアル瓶に注入した。還元剤の調製滅菌水100mLを20分間ボイルして脱気した後、N2を注入しながら氷中で室温まで冷却後、LCysteineHClH2Oを3.0g添加した。その後、N2を注入しながら、さらに氷中で20分間冷却後、その冷却された溶液を0.45μmフィルターで濾過滅菌し、N2を注入した滅菌済みバイアル瓶に注入した。そして、遮光保存した。培地作製表1の基本培地を20分間湯浴しながら、培地が青から赤に変色するまで脱気した後、CO2を注入しながら氷中で20分間冷却した。その後、予めCO2を注入しておいた125mLのバイアル瓶に基本培地を18mLずつ分注した。ロールチューブ法では、ここでバイアル瓶一本につき0.35gの低温培養用寒天ナカライテスクを添加後、さらにCO2を3分間注入した。最後にブチルゴム栓とアルミシールで密閉後、オートクレーブ121°C×15分間した。菌体接種直前にバイアル瓶一本につきフルクトース溶液1mL及び還元剤0.2mLを添加し、培地が赤い場合にはTiクエン酸溶液を1、2滴添加した。実験結果フルクトース2g/Lを炭素源とした基本培地でOD660=0.6になるまで培養した菌体1mLを基本培地50mLに植菌し、菌体増殖をOD660にて測定したところ、図3に示すように、アセトバクテリウムウッディ株は増殖遅延なく対数増殖し、培養開始から28時間後にほぼ増殖停止した。このときのpHの経時変化を測定したところ、酢酸生成によりpHは低下し、培養開始から35時間後にpH5となった。フルクトースは完全に消費されており、さらにフルクトース濃度を上げることにより更なる菌体増殖が見込まれるが、pHの過剰な低下は菌体活性の低下、ひいては継代時の増殖遅延を引き起こす可能性があることから、フルクトース濃度としては2g/L程度で充分と考えられる。2.アセトバクテリウムウッディの薬剤耐性試験アセトバクテリウムウッディに外来性遺伝子を導入できたことを確認する手段として、アセトバクテリウムウッディが感受性を持つ抗生物質に対して耐性を有する遺伝子をマーカーとして、このマーカー遺伝子を目的遺伝子と同時に導入し、抗生物質存在下で増殖する抗生物質耐性株を取得する方法がある。そこで、まず、アセトバクテリウムウッディのいくつかの抗生物質に対する感受性を調べた。実験方法菌体を50mLのフルクトース含有基本培地に植菌し、OD660が0.5付近になったところで、その培養液を基本培地を用いて104倍に希釈した。ついで、表4の抗生物質を添加した15mLの基本培地と抗生物質を添加していない寒天培地に、上記の希釈菌体液を1mL植菌し、ロールチューブ法を実施し、寒天培地を30°Cのインキュベーターで静置培養した。実験結果培養開始から1週間後にコロニー形成を確認したところ、抗生物質を添加していない寒天培地ではコロニー形成が確認された。一方、抗生物質を添加したロールチューブでは全てコロニー形成を確認することができなかった。このことは、表4の抗生物質を当該濃度範囲で使用した場合、抗生物質耐性遺伝子による薬剤選択が可能であることを示している。3.アセトバクテリウムウッディへの外来遺伝子導入試験アセトバクテリウムウッディは多くの抗生物質に対して感受性を持つことから、それら抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして使用できる可能性があることがわかった。そこで、以下の実験方法にてカナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとしたアセトバクテリウムウッディの形質転換試験を行なった。同時にエレクトロポレーションによる形質転換効率に対する菌体集菌時の菌体濃度の影響を調べた。実験方法大腸菌の形質転換2プロパノール生合成遺伝子のクローニングのために、コンピテントセルであるエシェリヒアコリを、ベクターとしてpUC19プラスミド用いた化学的遺伝子導入法によって形質転換した。大腸菌の培養には、表5の基本培地を用いた。基本培地は5NNaOHでpH7.0に調整後、滅菌水で1000mLにメスアップした。プレート培地にすべくAgarを10g加え、オートクレーブ121°C×15分間した。ここで、選択物質である抗生物質は、100μg/mL最終濃度のアンピシリンか、40~100μg/mL最終濃度のカルベニシリンカルベニシリン2ナトリウム:ナカライテスクを使用した。また、青白判定法用に0.1M最終濃度のIPTG、5最終濃度のXGalXgal265mg,DMF5mLを培地に添加した。また、大腸菌からのプラスミドDNAの分離精製にはQuantumPrepPlasmidminiprepキットを用いた。アガロースゲル電気泳動DNA断片の長さを確認するために表6の緩衝液、表7のアガロースを用いて電気泳動を行なった。泳動後のゲルの染色には表8のエチジウムブロマイド溶液を用いた。また、PCR産物の精製にはMagExtractorPCRGelCleanUpを用いた。アセトバクテリウムウッディの形質転換アセトバクテリウムウッディの形質転換には、図4に示す大腸菌Ecoli由来のプラスミドであるpUC9と、クロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicum由来のプラスミドであるpIM13とを融合してなる、アセトバクテリウムウッディと大腸菌とのシャトルベクターであるpIKM1プラスミドを用いた。アセトバクテリウムウッディへの遺伝子導入はエレクトロポレーション法により以下の手順で行った。アセトバクテリウムウッディ菌体を50mLのフルクトース含有基本培地に植菌し、OD660=0.7付近になったところで菌体1mLを50mLのフルクトース含有基本培地に植え継いだ前培養。菌体濃度OD660が0.3、0.5、0.7の各々になるまで培養した。培養液を遠心加速度2200×g×10分間,4°Cの条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。その菌体を予め氷中で冷却しておいた表9のエレクトロポレーション緩衝液pH6.010mLで洗浄した。上記緩衝液を、20分間煮沸して脱気後、N2-CO2ガスを注入しながら氷中で20分間冷却した。この冷却後の緩衝液を、予めN2-CO2ガスを注入しておいた125mLのバイアル瓶に100mLずつ分注後、さらにN2-CO2ガスを3分間注入し嫌気性とした。懸濁液を遠心加速度2200×gで10分間,4°Cの条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。回収された菌体を予め氷中で冷却しておいたエレクトロポレーション緩衝液塩化マグネシウム無添加で懸濁した。この時、OD660が1.0となるように調製した。0.6mLの懸濁液をエレクトロポレーションキュベット4mmGapに添加した。上記エレクトロポレーションキュベットにDNA1μgを加え、よく混ぜ、1.8kV、600Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを実施した。50mLのフルクトース含有基本培地にエレクトロポレーション後の菌体溶液を加え、30°Cで24時間培養を行った。50μg/mLのカナマイシンを含む15mLのフルクトース含有基本培地2低温培養用寒天入りに培養液を1mL植菌し、ロールチューブ法により培養した。実験結果遺伝子導入実験の結果、選択マーカーとしてカナマイシンを添加したロールチューブ寒天培地上に形質転換株と考えられるコロニーが形成された。その効率は、表10に示すように集菌時菌体濃度によって大きく変化した。集菌時OD660が0.3であるときに、最も高いコロニー形成効率2.5×101cfu/μgDNAが得られた。しかし、集菌時の菌体濃度の上昇につれて効率は低下し、OD660が0.7のときには、形質転換株は得られなかった。このことから、形質転換に使用する菌体は対数増殖初期のOD6600.3以下が適当と考えられる。4.形質転換候補株への外来遺伝子導入の確認上記実験で得られたアセトバクテリウムウッディ形質転換候補株に実際にプラスミドが導入されていることを確認するため、ランダムに選択したアセトバクテリウムウッディ形質転換候補株からTotalDNAを抽出し、pIKM1のカナマイシン耐性遺伝子PCR試験、大腸菌への再形質転換試験を行なった。<形質転換候補株への外来遺伝子導入のPCR増幅による確認>実験方法アセトバクテリウムウッディゲノムDNAの抽出上記遺伝子導入試験で得られたコロニーを5mLの基本液体培地カナマイシン50μg/mLにて培養した。2mLの培養液を遠心加速度14000×gで1分間,4°Cの条件で集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。回収した菌体に、1mLのTEbufferに溶解された20mgのアクロモペプチダーゼと、1mLのTEbufferに溶解された20mgのリゾチームとをそれぞれ90μL入れて混合し、30°Cで10分間静置した。NucleoSpinTissueを用いて、菌体からTotalDNA抽出をした。TotalDNA中のカナマイシン耐性遺伝子の確認形質転換候補株DNAにおいて、形質転換前には存在しないカナマイシン耐性遺伝子を確認するために、表11乃至表13の条件でPCRを行った。実験結果形質転換候補株から得られたTotalDNAに対するカナマイシン耐性遺伝子のPCR増幅結果を図5に示す。同図によれば、カナマイシン耐性遺伝子と考えられる位置にDNAのバンドが検出されており、アセトバクテリウムウッディAwoodii形質転換候補株にカナマイシン耐性遺伝子が導入されていることが示唆されている。<大腸菌の再形質転換試験による形質転換候補株への外来遺伝子導入の確認>ここで、アセトバクテリウムウッディ形質転換候補株がpIKM1を持っていればそこから抽出したTotalDNAにより大腸菌は形質転換され、pIKM1がクローニングされるはずである。そこで、上記形質転換候補株から抽出したTotalDNAを用いて大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換した。具体的には、-80°Cのディープフリーザーからコンピテントセルを取り出して掌の温度で融かし、10分間氷冷し、コンピテントセル100μLに表11の反応液を10μL入れてピペッティングし、30分間氷冷し、その後42°C×90秒のヒートショック後、1分間氷冷し、氷冷後の溶液全量を800μLのSOC培地に加え、37°Cで45分間保持後、1のアガロース及び100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地のプレートに20μLの培養液を植菌し、37°Cで14時間の静置培養を行なった。実験結果再形質転換の結果、全てのtotalDNAにおいて、形質転換されたと考えられる大腸菌コロニーが見られた。そこで、コロニーを5mLの2×YT液体培地に植菌し、37°Cで一晩静置した後、QuantumPrepPlasmidminiprepkitを用いてプラスミドを抽出し、そのプラスミドをEcoRIで切断し、電気泳動で確認した。その結果、図6に示すように、確かにプラスミドと考えられるDNAバンドが見られ、候補株1,2ではpIKM1標品と同一の高さにバンドが見られた。これは、候補株がpIKM1を菌体内に実際に有していたことを示唆する。一方、候補株3ではpIKM1標品とは異なる位置にDNAバンドが見られた。これは、pIKM1に何らかの挿入変異が起きたことを示唆している。以上の結果から、今回行なった条件下でエレクトロポレーション法により、pIKM1が実際にアセトバクテリウムウッディに導入されていることが確認された。5.形質転換効率に及ぼすエレクトロポレーション緩衝液中のMgCl2濃度の影響エレクトロポレーション法によりpIKM1をアセトバクテリウムウッディに導入できることがわかったので、さらに形質転換効率を向上させるために、エレクトロポレーション用緩衝液中に含まれるMgCl2濃度の形質転換効率に及ぼす影響を検討した。集菌時OD660を0.3とし、洗浄も含めMgCl2濃度を変更した緩衝液を用い、それ以外は先と同様の方法で形質転換を行なった。結果を図7に示す。MgCl2濃度は形質転換効率に大きな影響を及ぼし、MgCl2濃度35mMのとき、4.0×101cfu/μgDNAの最大形質転換効率が得られた。MgCl2濃度を最適化すると、MgCl2濃度を最適化していない場合と比較して約2倍の形質転換効率が得られる。6.アセトバクテリウムウッディへの遺伝子導入試験のまとめアセトバクテリウムウッディAWoodiiATCC29683株を宿主とし、クロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicumATCC824株由来のプラスミドであるpIKM1をベクターとするエレクトロポレーション法による遺伝子組換え系を構築した。上記宿主ベクター系において集菌菌体濃度をOD660=0.3とし、エレクトロポレーション緩衝液中のMgCl2濃度を35mMとした時、4.0×101cfu/μgDNAの最大形質転換効率が得られた。2プロパノール生合成遺伝子を組込んだプラスミドの構築上述の通り、中温性水素二酸化炭素資化性菌への遺伝子導入が可能であることがわかったので、pIKM1に2プロパノール生合成遺伝子を組込んだプラスミドの構築を行なった。図2に示すように2プロパノール生合成に必要な酵素遺伝子は4つあり、クロストリジウムアセトブチィリカムClostridiumacetobutylicumATCC824から3つの遺伝子、すなわち、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferase、アセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferase及びアセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylaseを、サーモアナエロバクターエサノリカスThermoanaerobacterethanolicus39EATCC33223から二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenaseを単独でクローニング後、シャトルベクターpIKM1に連結して組込んだ。1.連結可能な2プロパノール生合成遺伝子のクローニング4つの2プロパノール生合成遺伝子を連結してpIKM1に導入するためには、連結すべき遺伝子同士が、連結方向に従って同じ制限酵素サイトを持っていればよい。そこで、4つの遺伝子を上記からの順番で連結することができるように、制限酵素サイトを付加した遺伝子増幅プライマーを以下のように設計し、表11に示す反応液を用い表14に示す条件でPCR増幅後、大腸菌にクローニングした。表15はアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferase遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーFAcetylCoAacetyltransferasegeneFはアニーリングサイトに制限酵素EcoRIサイトを付加してなり、プライマーRAcetylCoAacetyltransferasegeneRはアニーリングサイトに制限酵素EcoRIサイト及びXhoIサイトを付加してなる。配列番号1はアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼの遺伝子配列を示す。1塩基から27塩基まで、並びに1376塩基から1399塩基までがそれぞれプライマー結合位置である。遺伝子発現のために、74塩基から79塩基までのプロモータ配列ttgata、97塩基から102塩基までのプロモータ配列tataat、196塩基から201塩基までのSD配列aggaggを有する。表16はアセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferase遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーFAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferasegeneFはアニーリングサイトに制限酵素XhoIサイトを付加してなり、プライマーRAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferasegeneRはアニーリングサイトに制限酵素XhoIサイト及びBglIIサイトを付加してなる。配列番号2はアセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼの遺伝子配列を示す。1塩基から18塩基まで、並びに1230塩基から1245塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、1塩基から6塩基までにSD配列aggaggを有する。これは、14塩基から670塩基までがAcetoacetylCoAacetateButyrateCoAtransferaseのサブユニットAをコードし、672塩基から1337塩基までがサブユニットBをコードしているオペロンである。表17はアセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylase遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーFAcetoacetatedecarboxylasegeneFはアニーリングサイトに制限酵素BglIIサイトを付加してなり、プライマーRAcetoacetatedecarboxylasegeneRはアニーリングサイトに制限酵素BglIIサイト及びBamHIサイトを付加してなる。配列番号3はアセトアセテートデカルボキシラーゼの遺伝子配列を示す。1塩基から24塩基まで、並びに746塩基から773塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、14塩基から20塩基までにSD配列aggaaggを有する。表18は二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenase遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーFSecondaryalcoholdehydrogenasegeneFはアニーリングサイトに制限酵素BamHIサイトを付加してなり、プライマーRSecondaryalcoholdehydrogenasegeneRはアニーリングサイトに制限酵素BamHIサイト及びEcoRIサイトを付加してなる。配列番号4は二級アルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子配列を示す。1塩基から22塩基まで、並びに1050塩基から1074塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、1塩基から6塩基までにSD配列aggaggを有する。2.2プロパノール生合成遺伝子群を導入したシャトルベクターの構築クローニングした2プロパノール生合成遺伝子群を以下の手順で、シャトルベクターpIKM1に導入した。まず、4種類の各遺伝子のPCR産物をMagExtractorPCRGelCleanUpを用いて精製した。ついで、大腸菌用ベクターpUC19に対してSmaI処理30°C×1時間を行ない、MagExtractorPCRGelCleanUpを用いて精製した。さらに、SmaI処理後のpUC19をベクターとし、それぞれの遺伝子のPCR産物をインサートとし、1μLのベクター、9μLのインサート、10μLのLigationMixを混合して16°Cで1時間ライゲーション反応させたのち、反応後のプラスミドを用いてコンピテントセルDH-5αを形質転換し、図8~図11に示すそれぞれ単独遺伝子を持つ4種類のプラスミドを得た。次いで、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼAcetylCoAacetyltransferase遺伝子とアセトアセチルCoA:酢酸酪酸:CoAトランスフェラーゼAcetoacetylCoAacetatebutyrateCoAtransferase遺伝子とが連結した融合遺伝子を作製するために以下の操作を行なった。pUC19AcetylCoAacetyltransferasegeneをXhoIにより処理37°C×2時間した後に、MagExtractorPCRGelCleanUpを用いて精製した。さらに、pUC19AcetoacetylCoAacetatebutyrateCoAtransferasegeneを、M-13プライマーM13FGTTTTCCCAGTCACGAC、M13RCAGGAAACAGCTATGACによりPCR増幅した後、得られたPCR産物をMagExtractorPCRGelCleanUpを用いて精製した。ついで、XhoI処理後のpUC19AcetylCoAacetyltransferasegeneをベクター、PCR産物をインサートとし、1μLのベクター、9μLのインサート、10μLのLigationMixを混合し16°Cで1時間ライゲーション反応させたのち、反応後のプラスミドをコンピテントセルDH-5αに導入し、図12に示す目的プラスミドをクローニングした。アセトアセテートデカルボキシラーゼAcetoacetatedecarboxylase遺伝子と二級アルコールデヒドロゲナーゼSecondaryalcoholdehydrogenase遺伝子の融合プラスミド図13も同様にして作製した。同様の方法で図14に示す4つの遺伝子が融合した2プロパノール生合成遺伝子群オペロンをpUC19の中に組み込んだ。そして、このオペロンをpIKM1のEcoRIサイトに導入することにより、図15に示すアセトバクテリウムウッディAwoodiiへの2プロパノール生合成遺伝子群導入プラスミドを構築した。図16に2プロパノール生合成遺伝子群を組込んだpIKM1をEcoRI処理37°C×2時間したときの電気泳動写真を示す。制限酵素EcoRIで切断した場合、6.3kbの位置にpIKM1のバンドが見られ、そして、予想通り4.5kb付近に2プロパノール生合成遺伝子のバンドが見られる。3.アセトバクテリウムウッディの形質転換上述のpIKM1に2プロパノール生合成遺伝子群を組込んでなるプラスミドを用いてアセトバクテリウムウッディの形質転換を行なった。この形質転換はエレクトロポレーション法により以下の手順で行った。アセトバクテリウムウッディ菌体を50mLのフルクトース含有基本培地に植菌し、OD660が0.7付近になったところで1mLの培養液を50mLのフルクトース含有基本培地に植え継いだ。菌体濃度OD660が0.3になるまで培養した後、その培養液を遠心加速度2200×gで10分間,4°Cの条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。予め氷中で冷却しておいた表9のエレクトロポレーション緩衝液pH6.010mLで洗浄した。上記緩衝液は、20分間煮沸して脱気後、N2-CO2ガスを注入しながら氷中で20分間冷却、予めN2-CO2ガスを注入しておいた125mLのバイアル瓶に100mLずつ分注後、さらにN2-CO2ガスを3分間を注入し嫌気性とした。懸濁液を遠心加速度2200×gで10分間,4°Cの条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。回収された菌体を予め氷中で冷却しておいたエレクトロポレーション緩衝液塩化マグネシウム無添加で懸濁した。この時、OD660が1.0となるように調製した。0.6mLの懸濁液をエレクトロポレーションキュベット4mmGapに添加した。上記エレクトロポレーションキュベットにプラスミド1μgを加え、よく混ぜ、1.8kV、600Ω、50μFの条件でエレクトロポレーションを実施した。50mLのフルクトース含有基本培地にエレクトロポレーション後の菌体溶液を加え、30°Cで24時間培養を行った。カナマイシンを50μg/mL含む15mLのフルクトース含有基本培地2低温培養用寒天入りに培養液を1mL植菌し、ロールチューブ法により培養した。以上により、2プロパノール生合成遺伝子群を含むプラスミドDNAを保持したアセトバクテリウムウッディ菌株を得た。4.2プロパノールの生産上記の如くして得られたアセトバクテリウムウッディ菌株を接種したクロストリジウムリュングダリイ培地先に説明したATCC1754PETC寒天培地を改変したもの20mLを滅菌済みバイアル瓶125mLに入れ、H2CO2ガスH2:CO2=2:1を封入し、振とうしながら37°Cで36時間培養し、培養液を作製した。上記培養液を培地ブイヨンが入った発酵槽に移し、H2CO2ガスを再封入した。pHを7.0、温度を30°Cとし、H2CO2ガスを循環させ、且つ発酵槽内を攪拌しながら2プロパノール生成実験を行なった。その結果、2プロパノールの生成が認められた。"