"スルビビンから誘導されるMHCクラスI限定エピトープペプチドであって、以下の特性:iクラスIHLA分子を最大半分まで回復できるペプチドの量により測定される親和力C50値本明細書に記載するようなアセンブリー結合検定により測定すると最大50μMであるで限定されるクラスIHLA分子との結合能;ii癌患者のPBL集団においてELISPOTアッセイにより測定すると少なくとも1/104PBLの頻度でINF-γ産生細胞を惹起する能力;および/またはiiiエピトープペプチドと反応するCTLの腫瘍組織におけるインサイチュ検出能;のうちの少なくとも一つを有する、エピトープペプチド。最大30μMであるC50値を有する請求項1記載のペプチド。最大20μMであるC50値を有する請求項1~2のいずれか1項に記載のペプチド。MHCクラスIHLA-A分子により限定される請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチド。HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A24からなる群から選択されるMHCクラスIHLA種により限定される請求項4記載のペプチド。HLA-A2により限定される請求項4または5のいずれか1項に記載のペプチド。FLKLDRERA配列番号1、TLPPAWQPFL配列番号2、ELTLGEFLKL配列番号3、LLLGEFLKL配列番号4およびLMLGEFLKL配列番号5からなる群から選択される請求項4~6のいずれか1項に記載のペプチド。MHCクラスIクラスIHLA-B分子により限定される請求項1~3のいずれか1項に記載のペプチド。HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27およびHLA-B51からなる群から選択されるMHCクラスIHLA-B種により限定される請求項8記載のペプチド。HLA-B35またはHLA-B7により限定される請求項8または9のいずれか1項に記載のペプチド。CPTENEPDL配列番号6、EPDLAQCFF配列番号7、CPTENEPDY配列番号8、EPDLAQCFY配列番号9、LPPAWQPFL配列番号18およびQPFLKDHRI配列番号19からなる群から選択される請求項8~10のいずれか1項に記載のペプチド。最大20個のアミン酸残基を含む前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。最大10個のアミノ酸残基を含む請求項12記載のペプチド。ノナペプチドまたはデカペプチドである前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。哺乳動物種のスルビビンの天然の配列である前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。ヒトスルビビンから誘導される請求項15記載のペプチド。少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によりスルビビンの天然の配列から誘導される前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。リン酸化される前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。米国特許第6.245.523号において開示されている天然のスルビビンのThr34を含む請求項18記載のペプチド。各特異性HLA対立遺伝子に関して次の表に示すようなアミン酸残基のいずれかを含む前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド:癌患者のPBL集団においてINF-γ産生細胞を少なくとも10/104PBLの頻度で惹起する能力を有する前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。スルビビンが発現される癌疾患を有する患者のPBL集団においてINF-γ産生細胞を惹起する能力を有する前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項22記載のペプチド。癌疾患を有する患者のPBL集団において、乳癌細胞系MCF-7および黒色腫細胞系FM3からなる群から選択される細胞系を包含する癌細胞系のスルビビン発現細胞に対して細胞傷害効果を有するINF-γ産生細胞を惹起する能力を有する前記請求項のいずれか1項に記載のペプチド。請求項1~24のいずれか1項に記載のペプチドを含む医薬組成物。請求項4記載のペプチドを請求項8記載のペプチドとの組み合わせにおいて含む請求項25記載の組成物。請求項6記載のペプチドを請求項10記載のペプチドとの組み合わせにおいて含む請求項26記載の組成物。癌疾患に対して免疫応答を惹起する能力を有するワクチンである請求項25~27のいずれか1項に記載の組成物。スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む請求項25~28のいずれか1項に記載の組成物。スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはペプチドフラグメントが細胞アポトーシスの制御に関与するタンパク質またはそのペプチドフラグメントである請求項29記載の組成物。スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはそのペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントがBcl-2またはそのペプチドフラグメントである請求項29記載の組成物。マルチエピトープワクチンである請求項25~31のいずれか1項に記載の組成物。ワクチンがスルビビンが発現される癌疾患に対して免疫応答の惹起能を有する請求項32記載の組成物。癌疾患が慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項33記載の組成物。ワクチンがワクチン接種された対象において癌細胞に対して細胞傷害効果を有するエフェクターT細胞の産生を惹起する請求項33または34に記載の組成物。PBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性T細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための組成物であって、請求項1記載のペプチドを含む組成物。PBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性T細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための診断キットであって、請求項1~24のいずれか1項に記載のペプチドを含む診断キット。請求項1記載のペプチドおよびクラスIHLA分子またはかかかる分子のフラグメントの複合体。モノマーである請求項38記載の複合体。マルチマーである請求項38記載の複合体。スルビビン反応性T細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを請求項38記載の複合体と接触させ、該複合体と該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法。請求項1~24のいずれか1項に記載のペプチドに対して特異的結合能を有する分子。抗体またはそのフラグメントである請求項42記載の分子。請求項42または43記載の分子の結合の遮断能を有する分子。癌の治療用医薬を調製するための請求項1~24のいずれか1項において定義されるペプチドの使用。癌の治療用医薬を調製するための、請求項25記載の組成物、請求項42記載の分子または請求項44記載の分子の使用。治療される疾患がスルビビンが発現される癌疾患である請求項45または46のいずれか1項記載の使用。癌疾患が慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項46記載の使用。さらに別の治療と組み合わせられる請求項45~48のいずれか1項に記載の使用。さらに別の治療が放射線治療または化学療法である請求項49記載の使用。発明の開示従って、本発明はその第一の態様において、スルビビンから誘導されるMHCクラスI限定エピトープペプチドに関し、前記エピトープは以下の特徴の少なくとも1つを有する:iこれがクラスIHLA分子の最大の半分まで回復できるペプチドの量により測定される親和力C50値本明細書に記載するようなアセンブリー結合検定により測定すると最大50μMであるで限定されるクラスIHLA分子と結合できる、ii癌患者のPBL集団においてELISPOTアッセイで測定すると少なくとも1/104PBLの頻度でINF-γ産生細胞を惹起できる、および/またはiiiエピトープペプチドと反応するCTLの腫瘍組織においてインサイチュ検出が可能である。好ましくは、本発明のペプチドはこれらの3つの特性のうち少なくとも2つ、最も好ましくは全てを有する。本発明のさらに別の態様は、医薬組成物およびPBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性細胞の癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための組成物であって、前記定義のペプチドを含む組成物を提供する。さらに別の態様において、本発明は、PBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性T細胞の癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための診断キットであって、本発明のペプチド、およびかかるペプチドとクラスIHLA分子またはかかる分子のフラグメントの複合体を含むキットに関する。もう一つ別の態様において、癌患者においてスルビビン反応性T細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを前記定義の複合体と接触させ、該複合体の該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法も提供される。さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチド、例えば抗体またはそのフラグメント、およびかかる分子の結合をブロックできる分子と特異的に結合できる分子に関する。本発明の重要な態様は、癌の治療用医薬を調製するための本発明のペプチドの使用に関する。さらに別の態様は、前記の組成物または分子の、癌の治療用医薬の調製のための使用に関する。さらに別の態様は、独立して、哺乳動物、例えばヒトにおける癌を治療する方法であって、疾患にかかっている患者に有効量の本発明のペプチド、組成物または分子を投与することを含む方法に関する。発明の詳細な記載本発明の新規MHCクラスI限定ペプチドは、いくつかの特徴のうちの少なくとも1つを有することにより特徴づけられ、その一つは、本明細書において記載されるようなアセンブリーアッセイにおいてクラスIHLA分子の最大の半分を回復することができるペプチドの量C50値により測定される場合、最大で50μMの親和力に限定されるクラスIHLA分子と結合できる能力である。このアセンブリーアッセイは、既に記載されているようにして行われ12、13、ペプチドをペプチドトランスポーター欠損細胞系T2にロードした後のHLA分子の安定化に基づく。その後、正しく折り畳まれた安定なHLA重鎖を、構造依存性抗体を用いて免疫沈降させ、ペプチド結合を定量化する。このアッセイは、前記親和性で所定のHLA対立分子と結合するその能力について候補ペプチドをスクリーニングするための簡単な手段を提供する。好ましい具体例において、本発明のペプチドは、最高30μMのC50値を有するもの、例えば、最高10μM、最高5μM、最高2μMを包含する、最高20μMであるC50値を有するものである。前記のように、HLA系は、ヒト主要組織適合MHC系を表す。一般に、MHC系は一連の特徴:移植抗原、胸腺依存性免疫応答、ある種の相補因子およびある疾患の素因を制御する。さらに詳細には、MHCは、MHCのさらに一般的な特徴を決定する3種の異なる種類の分子、すなわち、クラスI、IIおよびIII分子をコード化する。これらの分子のうち、クラスI分子は、ほとんどの有核細胞および血小板の表面上に提示されるいわゆるHLA-A、HLA-BおよびHLA-C分子である。本発明のペプチドは、特定のMHCクラスHLAI分子と結合する限定されるその能力により特徴づけられる。従って、一具体例において、ペプチドは、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A9、HLA-A10、HLA-A11、HLA-Aw19、HLA-A239、HLA-A249、HLA-A2510、HLA-A2610、HLA-A28、HLA-A29w19、HLA-A30w19、HLA-A31w19、HLA-A32w19、HLA-Aw33w19、HLA-Aw3410、HLA-Aw36、HLA-Aw43、HLA-Aw6610、HLA-Aw6828、HLA-A6928をはじめとするMHCクラスIHLA-A分子に限定されるものである。文書全体にわたってさらに簡単な記号表示も用いられ、ここにおいて、主に数字の標記、例えばHLA-A19またはHLA-A24がそれぞれHLA-Aw19およびHLA-A249の代わりに使用される。特定の具体例において、本発明のペプチドは、HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-A24からなる群から選択されるMHCクラスIHLA種に限定される。本発明のペプチドは、スルビビンの既知の配列、例えば米国特許第6245523号に開示されている配列から誘導される。特定のHLA分子と結合する能力を潜在的に有するペプチドの選択は、特定のHLA分子と結合する既知の配列の整列により行うことができ、これによりいくつかの関連するアミノ酸のペプチドにおける特定の位置での優位性が明らかになる。このような優勢アミノ酸残基は、本明細書においてアンカー残基またはアンカー残基モチーフとも称する。アクセス可能なデータベースにおいて見いだすことができる既知の配列データに基づくこのような比較的簡単な手順にしたがって、ペプチドを特定のHLA分子と結合しそうなスルビビンタンパク質分子から誘導することができる。一連のHLA分子についてのこのような分析の代表例を以下の表に示す:このように、例として、HLA-A1と結合する能力を潜在的に有するノナペプチドは以下の配列のうちの一つを有する:Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y、Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y;Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-YまたはXaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-YXaaは任意のアミノ酸残基を示す。同様に、任意の他のHLA分子と結合する能力を潜在的に有する配列を設計することができる。当業者は、所定のHLA分子のさらに別のアンカー残基モチーフを同定することができるであろうと理解される。従って、有用な具体例において、本発明のペプチドは、その配列が表中に示す特定のHLA対立遺伝子のそれぞれについて、表中に示すようなアミノ酸残基の任意のものを含むペプチドを包含する。従って、本発明のペプチドを同定するための簡単な方法は:特定のHLA分子、例えば所定の集団中に高い割合で存在するものを選択し、スルビビンタンパク質においてアンカー残基モチーフを同定するために前記の様な配列分析を行い、1以上の同定されたアンカー残基を含む適当なサイズのペプチドを単離または構築し、得られるペプチドをi本明細書において既に記載したようなアセンブリーアッセイを用いて特定のHLA分子と結合する能力、ii本明細書において既に記載したようなELISPOTアッセイにより測定すると少なくとも1/104PBLの頻度で癌患者のPBL集団においてINF-γ産生細胞を惹起するペプチドの能力、および/またはiii試験されるエピトープペプチドと反応性である腫瘍組織CTLにおいてインサイチュで検出されるペプチドの能力について試験する工程を含む。特定の具体例において、本発明のペプチドは、次から選択される配列を有するHLA-A2限定スルビビン誘導ペプチドである:FLKLDRERAsurvivin101-109配列番号1、TLPPAWQPFLスルビビン5-14配列番号2、ELTLGEFLKLスルビビン95-104配列番号3、LLLGEFLKL配列番号4およびLMLGEFLKL配列番号5。かっこ内の表示は、米国特許第6245523号に開示されているようなスルビビンにおける残基の位置を示す。LLLGEFLKL配列番号4は、ペプチドの2位におけるTをLと置換することにより得られるスルビビン96-104から誘導される配列であり、LMLGEFLKL配列番号5は、2位のTをMで置換することによりスルビビン96-104から誘導される。さらに別の有用な具体例において、本発明のペプチドは、HLA-B5、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B12、HLA-B13、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B16、HLA-B17、HLA-B18、HLA-B21、HLA-Bw22、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B40、HLA-Bw41、HLA-Bw42、HLA-B44、HLA-B45、HLA-Bw46およびHLA-Bw47の任意のものを包含するMHCクラスIHLA-B分子により限定されるペプチドである。特定の具体例において、本発明のペプチドが結合できるMHCクラスIHLA-B種は、HLA-B7、HLA-B35、HLA-B44、HLA-B8、HLA-B15、HLA-B27およびHLA-B51から選択される。特定の具体例において、本発明のペプチドは:CPTENEPDLスルビビン46-54配列番号6、EPDLAQCFFスルビビン51-59配列番号7、CPTENEPDY配列番号8およびEPDLAQCFY配列番号9から選択される配列を有するHLA-B35限定スルビビン誘導ペプチドであるかっこ内の標記は米国特許第6245523号に開示されているスルビビンタンパク質における残基の位置を示す。CPTENEPDY配列番号8はペプチドのC末端におけるLをYで置換することによりスルビビン46-54から誘導され、EPDLAQCFY配列番号9はC末端2におけるF残基をYで置換することによりスルビビン51-59から誘導される。さらに別の具体例において、本発明のペプチドは、スルビビン38-46Sur38Y9P9でCがYに変化、MAEAGFIHY配列番号38、スルビビン47-56Sur47Y10P10でQがYに変化、PTENEPDLAY配列番号39、スルビビン92-101Sur92-101QFEELTLGEF配列番号27、およびスルビビン93-101Sur93T2P2でEがYに変化、FTELTLGEF配列番号36から選択される配列を有するHLA-A1限定ペプチドである。本発明のペプチドは、HLA-A3限定ペプチド、例えば、スルビビン18-24Sur18K10P10でFがKに変化、RISTFKNWPK配列番号57および/またはHLA-A11限定ペプチド、例えば、スルビビン53-62Sur53-62DLAQCFFCFK配列番号45および/またはHLA-A2限定ペプチド、例えば、スルビビン18-28Sur18-28RISTFKNWPFL配列番号66であってもよい。さらに別の有用な具体例において、本発明のペプチドは、HLA-Cw1、HLA-Cw2、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw5、HLA-Cw6、HLA-Cw7およびHLA-Cw16の任意のものを包含するMHCクラスIHLA-C分子に限定されるペプチドである。好ましくは、本発明のペプチドは、50未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは最高20のアミノ酸残基、例えば、最高10のアミノ酸残基を含む。特定の具体例において、ペプチドは、ヘプタペプチド、オクトペプチド、ノナペプチド、デカペプチドまたはウンデカペプチドである。本発明のペプチドは、前記のように、スルビビンタンパク質またはそのフラグメントから誘導される。そこからペプチドを誘導できるスルビビンタンパク質は、タンパク質が発現される任意の動物種からのスルビビンタンパク質である。好ましい具体例において、スルビビン出発タンパク質は、齧歯類、ウサギおよび霊長類、例えば人間をはじめとする哺乳動物種から得られる。選択されたスルビビンタンパク質の配列に基づいて、本発明のペプチドはスルビビン出発物質の任意の適当な化学処理または酵素処理により誘導され、その結果、前記のような適当なサイズのペプチドが得られるか、または当業者が精通している任意の慣用のペプチド合成法により合成することができる。本発明のペプチドは、誘導されるスルビビンタンパク質の天然の配列である配列を有し得る。しかしながら、所定のHLA分子に対してより高い親和性を有するペプチドは、例えば前記の手順に基づいた少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加により配列を修飾することにより、かかる天然の配列から誘導することができ、これにより所定のHLA分子に関する別のアンカー残基モチーフが同定される。従って、スルビビン誘導ペプチドの免疫原性を増大させるための、アミノ酸置換をアンカー位置に導入することができるが、TCR接触残基では導入できず、HLAクラスI分子とのペプチドの結合が増大する。この結果、より免疫原性のエピトープが得られる。例えば、これは癌反応性CTLを誘発する能力を向上させ、臨床的に意義のあるCTL応答の誘発にさらに適当であることが示されている。しかしながら、重要なことには、標的癌細胞は細胞表面上で天然のスルビビン誘導ペプチドを発現し、提示するのみである。この点において、修飾されたスルビビン誘導ペプチドについて特異的な治療誘発CTLが天然の類似体と交差反応することは、非常に重要である。本発明はさらに、本明細書において開示されているスルビビン誘導ペプチドの変異体および機能的等価物も包含する。本発明に関連して用いられる場合、機能的等価物とは、問題の配列のあらかじめ決められたフラグメントの対応する官能基を参照することにより立証される。機能的等価物は、例えば、HLAクラスI分子との類似の結合親和力、またはELISPOATアッセイにより示される同様の効力により立証される。本明細書に記載のスルビビン誘導ペプチドの機能的等価物および変異体は、挿入、欠失および同類置換を含む置換の数ならびに範囲が拡大した場合に、好ましい所定の配列と徐々に異なっているアミノ酸配列を示すものと理解されよう。この違いは好ましい所定の配列とスルビビン誘導変異体またはスルビビン誘導機能的等価物の間の相同性の減少として測定される。アミノ酸配列間の相同性は、当該分野において周知のアルゴリズムを用いて計算することができる。連続したスルビビン誘導アミノ酸残基を含むかまたは該アミノ酸残基からなるフラグメントと相同性を共有するフラグメントは、あらかじめ決められたスルビビン誘導ペプチドと、好ましくは少なくとも約90相同性、例えば少なくとも94相同性95、96、97、98または99相同性を包含するを有する場合に、本発明の範囲内に含まれると考えられる。さらに、本発明のペプチドの翻訳後修飾を行うことが有利である場合もある。乳ガンMCF-7または子宮頸癌Hela細胞を、アドリアマイシン、タキソール、またはUVBをはじめとする抗ガン剤に暴露すると、スルビビンの発現が4~5倍増大することが判明した。抗ガン剤治療後のスルビビンレベルにおける変化は、スルビビンmRNA発現の調節を含まず、新規遺伝子転写と独立していた。反対に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドールによるThr34上のスルビビンリン酸化の阻害の結果、スルビビン発現が失われ、非リン酸化可能なスルビビンThr34→Alaは野生型スルビビンと比べて加速されたクリアランスを示した。Thr34上のスルビビンリン酸化の逐次除去は、p53と独立して抗ガン剤により誘発される腫瘍細胞アポトーシスを向上させ、インビボでの乳ガン異種移植片モデルにおいて毒性なしに腫瘍増殖を抑制した。これらのデータは、Thr34リン酸化は腫瘍細胞におけるスルビビンレベルを高度に制御し、p34cdc2キナーゼ活性の逐次除去はスルビビン生存性チェックポイントを除去し、腫瘍細胞におけるアポトーシスを向上させることができることを示唆する。従って、本発明のスルビビン誘導ペプチドはリン酸化ペプチドを含むと考えられる。天然のスルビビンホスホペプチド抗原は、リン酸化部位Thr34のまわりのMHCペプチド結合モチーフの存在についてスキャンすることにより同定することができる。従って、可能なスルビビン誘導ホスホペプチド配列は、TPERMAEAGF、推定HLA-B35-および/またはHLA-B77-および/またはHLA-B51-限定ペプチド抗原を包含する。本発明に含まれるさらなる天然のホスホペプチドは:HLA-A2:CACTPERMAおよびCTPERMAEA;HLA-A3:FLEGCATP;HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51:WPFLEGCACTリン酸化Thr残基を太字でマークしたを包含する。本発明のペプチドの重要な特徴は、INF-γ産生レスポンダーT細胞、すなわち癌患者のPBL集団または腫瘍細胞標的細胞における特定のペプチドを特異的に認識する細胞毒性T細胞CTLを認識または惹起できることである。この活性は、患者から得られるPBLまたは腫瘍細胞を文献16および以下の実施例において記載されているELISPOTアッセイに付すことにより容易に決定される。アッセイ前に、分析されるPBL集団または腫瘍細胞を試験されるペプチドと接触させることにより刺激するのが有利である。好ましくは、ペプチドは本明細書において用いられるELISPOTアッセイにより決定すると少なくとも1/104PBLの頻度でINF-γ産生T細胞を惹起または認識できる。さらに好ましくは、頻度は少なくとも5/104PBLであり、最も好ましくは少なくとも10/104PBL、たとえば少なくとも50または100/104PBLである。ELISPOTアッセイは、スルビビンペプチド特異性T細胞応答をモニターするための強力な手段の代表である。しかしながら、ほとんどの場合におけるELISPOT反応性は、標的細胞を溶解させるためのCLLの能力と相関するが、この概念の決定的証拠は直接に得られるのみである。HLA/ペプチド複合体により単離されたスルビビン反応性細胞が標的細胞を溶解させる機能的能力を有することが示されるので、本発明においてこのような直接的証拠が得られる。さらに、本発明のペプチドを特異的に認識する単離されたCTLは、例えば黒色腫および乳ガンなどの異なる起源のHLA適合腫瘍細胞を溶解させることができる。この知見は、癌細胞が一般に同じ内因性スルビビンペプチドを処理し、提示することを強く示唆する。従って、本発明における知見の主な意味することは、本発明のペプチドは異なる組織学的起源の様々な細胞上で発現され、HLA分子と複合体形成することである。このことにより、これらの癌細胞はCTLによる破壊を受けやすくなり、異なる新生腫瘍の成長を制御するためのスルビビン免疫化の潜在的有用性が強調される。3種の関連しない癌、すなわち、乳ガン、黒色腫およびCLLにかかっている患者から得られるHLA限定スルビビン誘導ペプチドエピトープに対するPBLおよび腫瘍細胞における自発性CTL応答の存在は、さらにこの腫瘍抗原の普遍的免疫治療可能性を実証する。従って、別の好ましい具体例において、本発明のペプチドは、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌を包含する、スルビビンが発現される癌疾患を有する患者のPBL集団においてINF-γ産生細胞を惹起できる。特に、本発明のペプチドは、乳ガン細胞系MCF-7および黒色腫細胞系FM3から選択される細胞系を包含する癌細胞系のスルビビン発現細胞に対して細胞傷害効果を有するT細胞の形態において免疫応答を惹起できる。PBL集団およびガン細胞系において免疫応答を惹起するその能力に加えて、本発明のペプチドはインサイチュで、すなわち充実性腫瘍組織において細胞溶解性免疫応答を惹起できることが証明された。これは、例えばマルチマー化され、検出可能な標識を備えたHLA-ペプチド複合体を提供し、本発明のエピトープペプチドと反応性である腫瘍組織CTLにおいて検出するために免疫組織化学的染色のためにかかる複合体を使用することにより証明された。従って、本発明のペプチドのさらに別の重要な特徴は、これがエピトープペプチドと反応性であるCTLの腫瘍組織においてインサイチュ検出が可能であることである。本発明のペプチドは、HLA分子と結合し、その結果、細胞表面上のHLAおよびペプチドの複合体であって、次に細胞毒性T細胞のエピトープまたは標的としての働きをする複合体を提示するその能力に加えて、他の種類の免疫応答、例えばB細胞応答を惹起し、その結果、複合体に対する抗体の産生および/または遅延型過敏性DTH反応が生じると考えられる。後者のタイプの免疫応答は、本発明のペプチドの注射部位での赤みおよび触診可能な硬結として定義される。異なるHLA分子は、主なヒト集団において異なる有病率を有することはよく知られている。従って、本発明の方法にしたがって治療できる患者の集団を拡張するため、いくつかのHLAクラスI分子に限定されたペプチドエピトープを同定するために要件が存在する。異なるHLA制限エレメントを有する複数のスルビビンエピトープのキャラクタライゼーションにより、2つの重要な方法でこの標的抗原の臨床的可能性が拡大される。すなわち、iスルビビン誘導ペプチドに基づく免疫療法に適した患者の数を増大させる。HLA-A2抗原は、白人およびアジア人種の約50により発現され、HLA-A1およびHLA-A3抗原はどちらも白人の25およびアジア人の5により発現され、一方、HLA-A11抗原は白人の約15およびアジア人の30により発現される。これらの数は同時発現のために合計することができなくても、これらの多様性により限定されるペプチドの組み合わせはほとんどの癌患者を確実に包含する。ii各患者におけるいくつかの制限エレメントの全体的ターゲティングはHLA-対立遺伝子損失による免疫回避の危険性を減少させるであろう。一つのHLA-対立遺伝子の損失は癌細胞により表されるMHC変更の重要な成分であり、クラスI発現の全体的な損失は滅多に起こらない事象である。従って、異なるHLA対立遺伝子に限定されるスルビビンエピトープの同定で、対立遺伝子重複を有する患者において1以上のHLA分子を同時に標的とすることが可能である。従って、本発明の開示に基づいて、当業者は高度に免疫原性であるマルチエピトープワクチンを開発することができる。好ましくは、かかるワクチンは最もふさわしいスルビビン誘導ペプチドの、所望により以下に記載するような他の適当なペプチドおよび/またはアジュバントとの組み合わせにおける同時送達を促進するために設計するべきである。さらに、既に記載されているように、腫瘍は一般にクラスIIMHCを発現しないという事実にかかわらず、腫瘍特異性Tヘルパー細胞免疫性の惹起、すなわち、クラスII-MHC限定エピトープでのワクチン接種に対する関心が増大している。これは、多くの場合におけるワクチン誘発性抗腫瘍応答の誘発および有効性が腫瘍特異性CD4陽性Th細胞の連携を必要とするという最近の知見に基づく。従って、さらに複雑な組成を有するワクチンの開発を行う重要な因子は、例えば慎重に選択されたCTLおよびTh細胞エピトープの集合を含むかまたはコード化するワクチンを設計することにより複数の腫瘍抗原を標的にすることへの要望である。明らかに、多エピトープワクチンは、潜在的に有害なタンパク質、例えば癌タンパク質の導入遺伝子エンコーディングを必要とせずに、いくつかの異なる抗原から誘導されるエピトープに対する免疫性を惹起する有効な方法を構成する。このようなワクチンはまた、亜優占種潜在的T細胞エピトープに対する免疫性の選択的誘発を可能にし、これは正常組織において顕著に提示されるエピトープに対して寛容性が存在する、腫瘍関連自己抗原の場合において特に重要である。さらに、抗原提示細胞のイムノプロテアソームとほとんどの腫瘍細胞において存在する構成的プロテアソーム間の機能的相違のために、腫瘍細胞上で発現されるある種のエピトープを提示できない可能性がある。ペプチドベースのワクチンの場合、このようなエピトープは、宿主抗原提示細胞による抗原摂取およびプロセッシングと独立した外因性ローディングによる提示を可能にするMHC可能な形態において投与することができる。本発明の知見は、スルビビン誘導ペプチドの治療的ならびに診断的用途の基礎を提供することは明らかである。従って、本発明の重要な態様は組成物に関する。従って、さらに別の態様において、本発明は、本発明の1以上のペプチドを単独または他のタンパク質またはペプチドフラグメントとの組み合わせにおいて含む医薬組成物を提供する。具体例において、このような他のタンパク質またはペプチドフラグメントは、細胞アポトーシスの制御に関連するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを包含するが、これらに限定されるわけではない。このようなタンパク質の適当な例は、Bcl-2タンパク質ファミリー、例えばBcl-2タンパク質、Bcl-wタンパク質、Mcl-1タンパク質、Bcl-XLタンパク質、および該タンパク質の任意のものから誘導されるペプチドフラグメントから選択することができる。他の公知アポトーシス阻害剤としては、アポトーシスタンパク質の阻害剤IAPファミリーのメンバー、例えばX-IAP、C-IAP1およびC-IAPが挙げられる。これらのタンパク質はすべて比較的偏在的に発現されるが、アポトーシスポリペプチドの阻害剤ML-IAPはかなり選択的な発現を有し、黒色腫において主に検出される。従って、特異的T細胞応答、すなわち細胞毒性T細胞応答またはヘルパーT細胞応答を惹起できるML-IAPのフラグメントは、所望により本発明の組成物中に含めることができる。ML-IAPの有用なペプチドフラグメントは、ML-IAP245RLQEERTCKV配列番号75、ML-IAP280QLCPICRAPV配列番号76、ML-IAP90RLASFYDWPL配列番号77、ML-IAP154LLRSKGRDFV配列番号78、ML-IAP230VLEPPGARDV配列番号79、ML-IAP98PLTAEVPPEL配列番号80、ML-IAP34SLGSPVLGL配列番号81、ML-IAP54QILGQLRPL配列番号82、ML-IAP99LTAEVPPEL配列番号83、ML-IAP83GMGSEELRL配列番号84およびML-IAP200ELPTPRREV配列番号85を包含する。さらに、本発明の組成物は、本明細書において既に定義されたクラスI限定エピトープおよび/またはクラスII限定エピトープを含むマルチエピトープワクチンとして提供することができる。現在好ましいマルチエピトープワクチンの例としては、例えばHLA-A2、HLA-A3、およびHLA-B35表現型を有する患者などの所定の患者の組織タイプに依存するスルビビン誘導ペプチドエピトープのオーダーメード組み合わせを含み、sur1M2、sur9、sur18K10、sur46Y9、sur51Y9を含むワクチンと共にワクチン接種することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、少なくとも1種の、スルビビンタンパク質に属するか、またはこれから誘導されるタンパク質またはペプチドフラグメントから選択されるさらに別の免疫原性タンパク質またはそのペプチドフラグメントを含むのが有利である。特別な具体例において、免疫原性タンパク質またはそのペプチドフラグメントは、本明細書において既に記載したようなBcl-2タンパク質ファミリーから誘導される。さらに別の免疫原性Bcl-2誘導ペプチドは、Bcl172、Bcl180、Bcl208、およびBcl214から選択される配列を有するHLA-A2限定ペプチドである。本発明のペプチドは比較的小さな分子であるので、ワクチン、免疫原性組成物などを製造するために、このような組成物において様々な物質、例えばアジュバントとペプチドを組み合わせる必要がある場合もある。広義のアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。しばしば、一般に好まれるアジュバントは、フロインドの完全または不完全アジュバント、または死菌ビーペルツッシスB.pertussisであって、例えばalum沈降抗原との組み合わせにおいて用いられる。アジュバントの一般的議論は、Goding、モノクローナル抗体MonoclonalAntibodies:PrinciplesPractice第2版、1986、61-63ページに記載されている。しかしながら、Godingは、興味のある抗原が低分子量のものであるかまたは免疫原性が不十分である場合、免疫原性キャリアとのカップリングが推奨されると記載している。かかるキャリア分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミンおよびニワトリイムノグロブリンが挙げられる。様々なサポニン抽出物も免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であると示唆されている。最近、周知のサイトカインである顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFのアジュバントとしての使用が提案されているWO97/28816。従って、本発明は、任意の前記のものまたはその組み合わせをはじめとする任意のアジュバント物質をさらに含む治療組成物を包含する。抗原、すなわち本発明のペプチドおよびアジュバントは任意の適当な順序で別々の投与することができると考えられる。本発明の医薬組成物における抗原の選択は、当業者により決定できるパラメータに依存する。既に記載したように、本発明の異なるペプチドのそれぞれは、特定のHLA分子により細胞表上に提示される。従って、治療される患者がHLA表現型に関連して分類されるならば、特定のHLA分子に結合することが知られているペプチドが選択される。あるいは、興味のある抗原は所定の集団における様々なHLA表現型の優勢に基づいて選択される。一例として、HLA-A2は白色人種集団における最も優勢な表現型であるので、HLA-A2と結合するスルビビン誘導ペプチドを含有する組成物はこの集団の大部分において活性であろう。しかしながら、本発明の組成物は、2以上のスルビビン誘導ペプチドの組み合わせを含有し得、それぞれが異なるHLA分子と特異的に相互作用して、標的集団の大部分におよぶ。従って、例として、医薬組成物は、例えばHLA-A2およびHLA-B35などの標的集団におけるHLA表現型の優勢に対応するHLA-AおよびHLA-B分子を包含する、HLA-A分子に限定されるペプチドとHLA-B分子に限定されるペプチドの組み合わせを含有することができる。さらに、組成物はHLA-C分子に限定されるペプチドを含むことができる。本発明の有用な免疫原性組成物は、本明細書において定義されるスルビビン誘導ペプチドに加えて、免疫学的に有効な量の本明細書において定義されるスルビビンタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含んでもよいと考えられる。医薬組成物における本発明の免疫原性ペプチドの量は、特定の用途に応じて変わる。しかしながら、免疫原の単一量は好ましくは約10μg~約5000μg、さらに好ましくは約50μg~約2500μg、例えば約100μg~約1000μgである。投与様式としては、皮内、皮下および静脈内投与、徐放性処方の形態における埋め込みなどが挙げられる。当該分野において公知のありとあらゆる投与形態が本発明に含まれる。また、凍結乾燥形態および溶液、懸濁液またはエマルジョン形態所望により、慣用の医薬的に許容される担体、希釈剤、保存料、アジュバント、緩衝剤成分などを含んでもよいなどの注射可能な免疫原性ペプチド組成物の処方に適当であることが当該分野において知られている慣用の投与形態も含まれる。本発明の組成物の免疫保護効果は、いくつかの方法を用いて決定することができる。その例は、以下の実施例において記載される。免疫原性組成物により誘発されるCTL応答をどのようにして決定するかについてのさらに別の例は、前出のWO97/28816に記載されている。有効な免疫応答は、免疫化および/またはワクチン組成物のペプチドを特異的に認識する抗体の検出後のDTH反応の発生によっても決定することができる。好ましい具体例において、本発明の医薬組成物は、癌疾患に対する免疫応答を惹起できる免疫原性組成物またはワクチンである。本明細書において用いられる場合、免疫原性組成物またはワクチンなる表現は、癌細胞に対して少なくとも1種の免疫応答を惹起する組成物を意味する。従って、かかる免疫応答は前記のタイプの任意のものである:細胞溶解の原因である細胞表面上に提示されたHLA/ペプチド複合体を認識できるCTLが生成するCTL応答、すなわち、ワクチン接種された患者において癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターT細胞の産生を惹起するワクチン;抗癌抗体を産生させるB細胞応答;および/またはDTHタイプの免疫応答。有用な具体例において、MHCクラスI分子を患者からの抗原提示細胞APC上にロードするか、患者からPBLを単離し、細胞を患者に注入により戻す前に細胞をペプチドとともにインキュベートするか、または患者から前駆体APCを単離し、細胞を患者に注入により戻す前にサイトカインおよび抗原を使用して細胞をプロフェッショナルAPCに分化させるかのいずれかにより、本発明のペプチドを投与することにより、癌疾患に対する免疫原性応答が惹起される。従って、本発明の一具体例において、癌患者を治療する方法は、エクスビボでペプチドを患者の抗原提示細胞APCに提示し、続いてこのように処理されたAPCを患者に注入により戻すことによりペプチドが投与されるものである。これを行うのに少なくとも2つの代替法がある。一つの代替法は、癌患者からAPCを単離し、MHCクラスI分子をペプチドとともにインキュベートロードすることである。MHCクラスI分子のローディングとは、APCをペプチドと共にインキュベートして、ペプチドに対して特異的なMHCクラスI分子を有するAPCがペプチドと結合し、その後、これを細胞に提示できることを意味する。その後、APCを患者に再注入する。もう一つの代替法は、樹状細胞生物学の分野においてなされた最近の発見に依存する。この場合において、単球樹状細胞前駆体であるが患者から単離され、サイトカインおよび抗原の使用によりインビトロで分化されてプロフェッショナルAPCになる。これは、実施例3および5に記載され、ここにおいて、接着PBL主に単球であるはGM-CSF、IL-4およびTNF-αと共にインビトロで培養される。その後、インビトロで生成したDCはペプチドでパルスされ、患者に注入される。スルビビンがほとんどの癌形態において発現されるらしいという事実により、本発明のワクチンを、スルビビンが発現される任意のタイプの癌疾患を制御するために提供することができる。従って、例として、本発明のワクチン組成物は、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳ガン、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌に対して免疫学的に活性である。前記載事項から、当業者は本発明のペプチドが癌診断手段として有用であり、特にペプチドがあらゆる種類の癌において発現されるスルビビンから誘導される場合に有用である。従って、本発明のペプチドは癌疾患について広く適用できる診断および予後判定法を開発するための基礎を提供する。他の有用な具体例において、本発明の組成物は、例えばPBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性T細胞の検出に基づいた癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用組成物である。従って、さらに別の態様において、PBL中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性T細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用診断キットであって、1以上の本発明のペプチドを含む診断キット、および癌患者においてスルビビン反応性T細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを本発明のペプチドとクラスIHLA分子またはかかる分子のフラグメントの複合体と接触させ、該複合体の該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法が提供される。もう一つ別の有用な診断または予後判定法は、異種動物種における抗体、例えばその後、ペプチドを提示する癌細胞の存在について診断するために使用できる本発明のヒトスルビビン誘導ペプチドに対するネズミ抗体の生成に基づく。このような免疫化の目的のために、ペプチドの量は例えば前記のようなインビボ療法の間に用いられるものより少なくてもよい。一般に、好ましい用量は約1μg~約750μgのペプチドの範囲である。本発明のペプチドでの免疫化に基づいてモノクローナル抗体を生成することもできる。従って、本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合できる分子、特にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体そのフラグメントを包含する、および、例えば本発明のペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対して生成された抗体などの、かかる結合をブロックすることができる分子に関する。一態様において、本発明は、本発明のペプチドとクラスIHLA分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体を提供し、これは前記のように診断試薬として有用である。複合体は、次の実施例において記載されるようなものをはじめとする任意の慣用の手段により調製される。かかる複合体はモノマーであっても、マルチマーであってもよい。本発明は、癌疾患を緩和または治癒するための手段を提供する。従って、本発明のさらに別の態様は、癌の治療用医薬を調製するための前記定義のようなペプチドの使用である。本発明のさらに別の態様は、癌の治療用医薬を調製するための前記定義の分子または組成物の使用に関する。好ましくは、癌疾患は:慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳ガン、子宮頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌を例として包含するスルビビンの発現と関連する。使用は、疾患にかかっている患者に有効量の本発明の医薬組成物、本発明のペプチドに特異的に結合できる分子および/またはかかる分子の結合をブロックできる分子を投与することを含む。場合によっては、本発明の使用を放射線療法または化学療法などの慣用の癌治療法と組み合わせるのが適当である。本発明を以下の非制限的実施例および図においてさらに詳細に説明する。図中、図1は、患者CLL1におけるELISPOTにおいて測定される、ペプチドなし、Sur1LTLGEFLKL、配列番号10ペプチドおよびSur9ELTLGEFLKL、配列番号3ペプチドに対するT細胞応答を示す。PBLを重複試験において6×105細胞/ウェルでプレートする前に一度ペプチドで刺激した。CCDスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いてペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。図2は、ペプチドなし、ペプチド類似体Sur1L2LLLGEFLKL、配列番号4、およびペプチド類似体Sur1M2LMLGEFLKL、配列番号5に対する患者CLL1におけるELISPOTにおいて測定されるT細胞応答を示す。PBLを重複試験において104細胞/ウェルでプレートする前に一度ペプチドで刺激した。CCDスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いてペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。図3は、ペプチドなし黒、Sur1LTLGEFLKL、配列番号10ペプチド灰色、Sur9ELTLGEFLKL、配列番号3ペプチド白、類似ペプチドSur1L2LLLGEFLKL、配列番号4淡灰色、および類似ペプチドSur1M2LMLGEFLKL、配列番号5暗灰色に対する患者CLL2およびCLL3におけるELISPOTにおいて測定される応答を示す。各実験は重複試験において105細胞/ウェルで行い、ペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。図4は、インビトロで一度刺激し、ペプチドなし黒、ペプチドSur1LTLGEFLKL、配列番号10灰色およびSur9ELTLGEFLKL、配列番号3白に対する応答についてのELISPOTアッセイにおいて分析された患者Mel1、Mel2、およびMel3からの腫瘍浸潤リンパ節から単離されたT細胞を表す。各実験は重複試験においてウェルあたり105細胞で行った。各実験において、ペプチドを添加していない2つのウェルも含めた。ペプチドあたりの平均数を各患者について計算した。図5は、スルビビン特異性CTLの機能的活性を示す。スルビビンコートされた磁気ビーズを用いて黒色腫浸潤リンパ節からCTLを単離した。A黒色腫細胞系;HLA-A2陽性FM3三角およびHLA-A2陰性FM45四角の特異的溶解。B乳ガン細胞系;HLA-A2陽性MCF-7三角およびHLA-A2陰性BT-20四角の特異的溶解。図6は、乳ガン患者からのBPLにおけるスルビビン反応性CTLの頻度を示す。反応性をELISPOTにより3人の乳ガン患者それぞれ上、中、下において調べた。各患者について、アッセイをペプチドの不在下、sur1ペプチドの存在下、sur9の存在下、および修飾sur1M2ペプチドの存在下で行った。ウェルあたり1×104エフェクター細胞を使用した。グラフは、反応性細胞の定量化を表し;灰色の柱状グラフはIFN-γ産生細胞の平均数を表す。図7は、スルビビン誘導ペプチドのHLA-35結合およびスルビビン誘導ペプチドによるHLA-B35分子のペプチドによる回復の分析である。代謝的に標識されたT2-B35細胞の溶解産物を、50、5、0.5、0.05および0.005mMのペプチドの存在下、4°Cでインキュベートした。HLA-35の回復をアセンブリーアッセイにおいて分析し、ImageGaugeホスホルイメージャーソフトウェア富士写真フィルム株式会社、日本を用いてIEF-ゲル電気泳動後に定量化した。C50値はHLA-B35との最大結合の半分に必要なペプチドの濃度である。図8は、癌患者からのPBLにおいて観察される自発的T細胞応答を示す。A患者CLL5105細胞/ウェル、HEM12105細胞/ウェル、およびHEM85×104細胞/ウェルからのインビトロで刺激されたPBL中、ペプチド無し白、sur51-19黒またはsur46-54灰色を用いてELISPOTアッセイにおいて測定されたIFNγスポット形成細胞の数。Bペプチドパルス化成熟自己樹状細胞とともに10日間培養された、HEM12からの1.7×105PBL中のスポット形成細胞の数。柱状グラフは2回の測定値の平均を表す。図9は、黒色腫患者における天然および修飾スルビビンペプチドに対する自発的T細胞応答を表す。APBL4×103細胞/ウェルおよびTIL7×104細胞/ウェル中患者FM25からのsur51-59およびsur51Y9ならびにFM45104細胞/ウェルからのTILに対するELISPOTアッセイにおいて測定されるスポット形成細胞の数。柱状グラフは非特異性IFNγ放出を差し引いた2回の測定値の平均を表す。図10は、HLA-A1に対するスルビビン誘導ペプチドの結合親和力を示す。クラスIMHC重鎖はホスホルイメージャーで定量化した。安定化されたHLA-A1重鎖のマウントは、添加されたペプチドの結合親和力と直接関連する。40、4、0.4、0.04μMのSur93-101線、Sur93T2四角、Sur49-58円またはインフルエンザA、PB1591-599三角により誘発されるHLA-A1のペプチドによる回復任意単位。図11は、HLA-A1限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ELISPOTアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的T細胞応答。黒色腫患者からの5×104インビトロ刺激PBLまたはTIL中Sur92-101、Sur38Y9、Sur47Y10、およびSur93T2に応答して形成されるペプチド特異性IFNγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は黒色腫Mel患者からの6PBLサンプルおよび3TILサンプルの分析中観察された。非特異性IFNγスポットを差し引く。バー:重複試験の範囲。図12はHLA-A11限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ELISPOTアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的T細胞応答。癌患者からの5×104インビトロ刺激PBLまたはTIL中Sur53-62に応答して形成されるペプチド特異性IFNγスポットの平均数。ペプチド特異性応答は、5人の黒色腫Mel患者5PBL、1TILおよび2人のCLLCLL患者PBLの分析において観察された。非特異性IFNγスポットを差し引く。バー:重複試験の範囲。図13は、HLA-A3限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ELISPOTアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的T細胞応答。黒色腫患者からの5×104インビトロ刺激PBLまたはTIL中Sur18LK10に応答して形成されるペプチド特異性IFNγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は、黒色腫Mel患者からの23PBLサンプルおよび4TILサンプルの分析中観察された。非特異性IFNγスポットを差し引く。バー:重複試験の範囲。図14は、HLA-A2限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ELISPOTアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的T細胞応答。癌患者からの5×104インビトロ刺激PBL中11merペプチド、Sur18-28に応答して形成されるペプチド特異性IFNγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は、2人の黒色腫Mel患者、6人のCLLCLL患者、および2人の乳ガンMC患者からの10PBLサンプルの分析において観察された。非特異性IFNγスポットを差し引く。バー:重複試験の範囲。図15は、ELISPOTアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的T細胞応答を表す。5人の黒色腫患者mel25、mel26、mel3、mel6、mel39、2人のCLL患者CLL1、CLL54および2人の乳ガン患者breast11、breast15からの105インビトロ刺激PBL中sur6-14LPPAWQPFLに応答して形成されたペプチド特異的IFNγスポットの平均数。非特異的IFNγスポットを差し引く。図16は、4人の患者▲RW、●KN、-WWE、■GBのワクチン治療後のLDH、コリンエステラーゼ、クレアチニン、ヘモグロビン、白血球および血小板の安定な検出の実験値を示す。図17は、IFNγELISPOTアッセイにより評価されるスルビビンペプチドの免疫性の動態分析を示す。初回DCワクチン接種前およびその後3ヶ月にPBMCを得た。バックグラウンドを越えるIFNγスポット形成細胞の数を図示する。次の表において、本発明において用いられるペプチドのアミノ酸配列およびそのそれぞれの配列番号を記載する:実施例1癌患者におけるアポトーシス阻害タンパク質スルビビンに対する細胞毒性Tリンパ球応答の同定概要スルビビンから誘導されるCTLエピトープを使用して、ELISPOT分析により、慢性リンパ性白血病CLL患者からの末梢血および黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ節におけるかかる抗原に対する特異的T細胞反応性を検討した。スルビビン誘導ペプチドエピトープに対するCTL応答は、6人の黒色腫患者のうちの3人、および4人のCLL患者のうちの3人において検出された。6人の健常対照からのPBLにおいてT細胞反応性は検出されなかった。従って、スルビビン誘導ペプチドは、抗ガン免疫療法の重要かつ広範囲に適用可能な標的としての働きをする。はじめにスルビビンタンパク質を、HLA-A0201HLA-A2結合ペプチドモチーフの存在に関してスキャンし、首尾良く同定した後、ELISPOTアッセイにより白血病および黒色腫患者において特異的T細胞反応性について試験するためにペプチドを使用した。両患者において、2つのスルビビン誘導ペプチドエピトープに対するコホートCTL応答が検出され、一方、健常対照においてT細胞反応性は検出できなかった。これらのデータは、スルビビンが自己T細胞により認識される広範囲に発現された腫瘍抗原を代表することを示唆する。物質および方法患者および健常対照CLLと診断された4人の患者CLL1-4と表示からの末梢静脈血サンプルおよび6人の健常者からの血液サンプルをヘパリン化試験管中に集めた。Lymphoprep分離を用いてPBLを単離し、10ジメチルスルホキシドを含むウシ胎仔血清FCS中凍結させた。さらに、腫瘍浸潤リンパ節からのリンパ球を6人の黒色腫患者mel1-6と表示から得た。新たに切除されたリンパ節を細かく刻んで小片にし、粉砕して細胞を培養物中に放出させ、低温保存した。PBLは黒色腫患者のうち4人から得られた。包含される全ての個体は、HLA-A2特異的抗体BB7.2を用いたFACS分析により決定されるようにHLA-A2陽性であった。抗体をハイブリドーマ上清から精製した。州立大学病院Herlev、デンマークから患者サンプルを入手した。これらの測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。スルビビン誘導ペプチド全てのペプチドは、ResearchGeneticsハンツビル、AL、USAから入手し、HPLCおよびMC分析により実証されるように>90の純度で提供された。使用したペプチドを表1に記載する。a下付き文字で示した値の範囲は、米国特許第6245523号に開示されるようなスルビビン配列におけるペプチドの位置を示す。bC50値は、以下に記載するようにして決定されるHLA-A2との最大結合の半分に必要なペプチドの濃度である。クラスIMHC分子とのペプチド結合についてのアセンブリーアッセイ合成ペプチドの[35S]―メチオニンで代謝的に標識されたクラスIMHC分子に対する結合についてのアセンブリーアッセイを記載されているようにして行った12、13。アセンブリーアッセイは、ペプチドをペプチドトランスポーター欠損細胞系T2にロードした後のクラスI分子の安定化に基づく。その後、構造依存性抗体を用いて適切に折り畳まれた安定HMC重鎖を免疫沈降させた。IEF電気泳動後、ゲルをホスホルイメージャースクリーンに暴露し、ImagequantホスホルイメージャープログラムMolecularDynamics、サニーベール、CAを用いてペプチド結合を定量化した。PBLの抗原刺激ELISPOTアッセイの感度を拡大するために、分析前にPBLを一度インビトロで刺激した14、15。新しい、あらかじめ凍結させたPBLによりELISPOTアッセイにおいて同様の結果が得られた。0日に、PBLまたは粉砕されたリンパ節を解凍し、AIMV培地LifeTechnologiew、ロスキレ、デンマーク、5熱不活化ヒト血清および2mMのL-グルタミン中、10μMのペプチドの存在下で24穴プレートNunc、デンマーク中、2×106細胞の濃度で2ml/ウェルでプレートした。各実験において、ペプチドを含まないウェルを含めた。2日後、300IU/mlの組み換えインターロイキン-2IL-2Chiron、ラーティンゲン、ドイツを培養物に添加した。培養された細胞を12日にELISPOTアッセイにおいて反応性について試験した。ELISPOTアッセイペプチドエピトープ特異性インターフェロン-γ-放出エフェクター細胞を定量化するために用いられるELISPOTアッセイを16におけるのと同様に行った。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の96穴プレートMultiScreenMAIPN45、Millipore、Hedehusene、デンマークを抗INF-γ抗体1-D1K、Mabtech、Nacka、スウェーデンでコートした。ウェルをAIMV培地により洗浄し、ブロックし、細胞を異なる細胞濃度で重複試験において添加した。ペプチドを次いで各ウェルに添加し、プレートを一夜インキュベートした。翌日、培地を捨て、ビオチニル化二次抗体7-B6-1-Biotin、Mabtechの添加の前にウェルを洗浄した。プレートを2時間インキュベートし、洗浄し、アビジン-酵素接合体AP-Avidin、Calbiochem、LifeTechnologiesを各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、酵素基質NBT/BCIPGibco、LifeTechnologiesを各ウェルに添加し、室温で5~10分間インキュベートした。暗紫色スポットが出現したら水道水で洗浄することにより反応を停止させた。AlphaImagerSystemAlphaInnotech、サンリアンドロ、CA.USAを用いてスポットをカウントし、ペプチド特異性CTL頻度をスポット形成細胞の数から計算することができた。アッセイはすべて各ペプチド抗原について重複試験で行った。結果HLA-A2に対するスルビビン誘導ペプチドの結合主HLA-A2特異性アンカー残基17を用いて、スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を最もありそうなHLA-A2ノナマーおよびデカマーペプチドエピトープについてスクリーンした。10のスルビビン誘導ペプチドを合成し、HLA-A2に対する結合について調べた。HIV-1pol476-484ILKEPVHGV、配列番号11表1からのエピトープを正の対照として使用した。クラスIMHCの最大回復の半分に必要なペプチド濃度C50値は正の対照について0.7μMであった。対照的に、Sur9と表されるペプチドELTLGEFLKL、配列番号3はC50=10μMの親和力で結合した。Sur6FLKLDRERA、配列番号1およびSur8TLPPAWQPFL、配列番号2と表されるペプチドはそれぞれHLA-A2とC50=30μMで結合するが、Sur1LTLGEFLKL、配列番号10およびSur3KVRRAIEQL、配列番号13はさらに弱く結合したC50>100μM。試験した10のペプチドのうち5つSur2、Sur4、Sur5、Sur7、およびSur10はHLA-A2と結合しなかった。Sur1は弱いHLA-A2バインダーであるので、より良好なアンカー残基ロイシンまたはメチオニンが2位で天然のスレオニンと置換されているSur1L2およびSur1M2でそれぞれ表される2種のペプチド類似体を合成した。これらのペプチドはどちらも正の対照とほとんど同様の高さの親和力でHLA-A2と結合するC50=1μM。CLL患者におけるスルビビンに対するCTL応答5人のHLA-A2陽性CLL患者からのPBLをELISPOTアッセイにおける実験の前に一度インビトロで刺激した。この手続きは、ELISPOTの感度を拡大するために選択された。前記10種のスルビビン誘導ペプチドの全てを実験の第一ラインに含めた。Sur1およびSur9に対する応答が検出され、これらのペプチドのデータのみを図に示す。図1は、患者CLL1において決定されるSur1およびSur9に対するCTL反応性を示す。各スポットは、ペプチド反応性INF-γ産生細胞を表す。ペプチドあたりのスポットの平均数を、CDDスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いて計算した。6×105あたり52のSur9ペプチド特異性スポットペプチドが添加されていないスポットを差し引いた後がCLL1患者において検出された図1。弱HLA-A2結合ペプチドSur1に対して反応は検出されなかったが、患者は強HLA-A2結合ペプチド類似体Sur1M2に対して強力に反応した104細胞あたり35のペプチド特異性スポット図2。この患者において他の強HLA-A2結合ペプチド類似体Sur1L2に対して反応は検出されなかった。患者CLL2はSur9に対して強力に反応し105細胞あたり128のペプチド特異性スポット、Sur1に対しては弱く反応した105細胞あたり22のペプチド特異性スポット図3。Sur1L2類似体に対する応答は、天然のエピトープと比較して若干増大しただけであったが、患者はデカマーペプチドSur9に関してはSur1M2ペプチドに対して同様に強力に応答した。患者CLL3において、Sur9に対する弱い応答が観察された図3。Sur1または修飾Sur1ペプチドに対して該患者においてはスルビビン応答は観察されなかったデータは省略。スルビビンに対する応答が健康な個人において検出できるかどうかを調べるために、6人の健康なHLA-A2陽性対照からのPBLを分析した。どの対照においても任意のスルビビン誘導ペプチドに対する応答は観察されなかった。黒色腫患者におけるスルビビンに対するCTL応答HLA-A2陽性黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ節から単離されたTリンパ球を試験した。新たに切除されたリンパ節を細かく刻んで小フラグメントにし、粉砕して、細胞を培養物中に放出させた。細胞をELISPOTアッセイにおける試験前に一度インビトロでペプチドで刺激した。スルビビン特異性T細胞は分析した6人の患者のうち3人において検出された。患者Mel2およびMel3において強力なSur9応答が検出された。Sur1ペプチドに対するより弱い応答もこれらの患者において検出された図4。Mel1において、弱く結合したペプチドSur1に対する応答は、より強力なHLA-A2バインダーSur9に対する応答よりも強力であった図4。先の3人の黒色腫患者Mel4~6からの腫瘍浸潤リンパ節において応答は検出されなかった。スルビビン反応性患者の2人Mel1およびMel2から、および非反応患者の2人Mel4およびMel5からのPBLを試験した。これらの患者のいずれかからのPBLにおいてSur9またはSur1のいずれかに対する応答は検出できなかったデータは省略。実施例2癌患者におけるインビボおよびエクスビボのスルビビン誘導MHCクラスI限定T細胞エピトープに対する自発性細胞毒性T細胞応答概要スルビビン誘導MHCクラスI限定T細胞エピトープに対する自発性細胞毒性T細胞応答は、乳ガン、白血病、および黒色腫患者においてインサイチュならびにエクスビボで示された。さらに、MHC/ペプチド複合体でコートされた磁気ビーズにより単離されたスルビビン反応性T細胞は、異なる組織タイプのHLA適合腫瘍に対して細胞毒性であった。普遍的腫瘍抗原であるので、スルビビンは抗ガン免疫療法の広範囲に適用可能な標的としての働きをすることができる。材料および方法T細胞染色およびT細胞選別のためのHLAペプチド複合体の構築HLAA0201の細胞外ドメイン残基1~275の5’末端との融合物においてビオチンタンパク質リガーゼBirAを用いた酵素ビオチニル化の認識部位は、イーコリBL21DE3において発現された。組み換えタンパク質を、8M尿素中可溶化させた封入体から、サイズSephadexG25、Pharmaciaおよびイオン交換mono-Q、Pharmaciaクロマトグラフィーにより精製した。修飾スルビビンペプチドSur1M2LMLGEFLKL、配列番号5またはMAAペプチドgp100154-163の存在下で希釈によりHLAA0201をインビトロで折り畳み、その後、既に記載されているようにしてビオチニル化した35、36。PharmaciaSephadexG25カラム上でゲル濾過して未結合ビオチンを除去した後、タンパク質をストレプトアビジン-FITC接合デキストラン分子L.WintherDAKO、デンマークの好意により提供されたでマルチマー化して、免疫組織化学用多価HLA-デキストラン化合物を生成させた。HLAA0201構築物はMarkM.Davis博士スタンフォード大学微生物学および免疫学科パロアルト、CAの好意により贈呈された。細胞分離は、既に記載されているようにして行った37。簡単に説明すると、5×106ストレプトアビジン接合磁気ビーズDynal、オスロ、ノルウェーを2回200μlの冷PBS中で洗浄し、0.5μgのペプチド/A0201モノマーを添加し、混合物を15分間室温でインキュベートした。2回洗浄した後、これらのビーズをPBLと1:10の割合で混合し、その後、1時間インキュベートし、続いて磁場中ビーズ結合細胞を沈降させた。沈降工程を1回繰り返した。免疫組織化学的染色FITC接合マルチマーペプチド/MHC複合体で染色するために、組織片を一夜乾燥し、その後冷アセトン中5分間固定した。全てのインキュベーション工程は室温、暗所で:i一次抗体1:100希釈を45分、iiCys3-接合ヤギ抗マウス1:500希釈;コード115-165-100、JacksonImmunoResearch、Dianovaハンブルグ、ドイツから入手を45分間、およびiii最後にマルチマーを75分間で行った。各工程間にスライドを10分間PBS/BSA0.1中で2回洗浄した。スライドをベクタシールド中でマウントし、共焦点顕微鏡下で観察するまで冷蔵庫中で保存した。細胞毒性アッセイCTLによる細胞毒性の慣用の[51Cr]アッセイを13に記載されているようにして行った。標的細胞は自己EBV-形質転換B細胞系、HLA-A2陽性乳ガン細胞系MCF-7ATCCで入手可能、HLA-A2陽性黒色腫細胞系FM338、HLA-A2陰性乳ガン細胞系BT-20ATCCで入手可能およびHLA-A2陰性黒色腫細胞系FM4538であった。全てのガン細胞系はRT-PCRにより調べるとスルビビンを発現したデータは省略。ELISPOTアッセイペプチドエピトープ特異性IFN-γ放出エフェクター細胞を定量化するためにELISPOTアッセイを使用し、これはすでに記載されている39。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の96穴プレートMultiScreenMAIPN45、Milliporeを抗IFN-γ抗体1-D1K、Mabtech、スウェーデンでコートし、AIMVGibcoBRL、LifeTechnologiesInc.、ガイサーズバーグ、MD、USAを用いて非特異性結合をブロックした。リンパ球を異なる細胞濃度で、特異性ペプチドおよびT2細胞と共に添加し、一夜37°Cでインキュベートした。2回洗浄後、ビオチニル化検出抗体7-B6-1-ビオチン、Mabtechを添加した。アルカリホスファターゼ-アビジンをそれぞれの基質GibcoBRLと共に用いて特異性結合を可視化した。暗紫色スポットが出現したら反応を停止させ、AlphaImagerSystemAlphaInnotech、サンリアンドロ、CA、USAを用いてこれを定量化した。ELISPOTに使用したペプチドは、実施例1に記載されるようなSur1、Sur9およびSur1類似ペプチドSur1M2であった。結果HLA-A2/スルビビン反応性T細胞のインサイチュ染色実施例1において、白血病および黒色腫におけるT細胞により認識される2種のスルビビン誘導ペプチドエピトープ、すなわちSur1が同定された。HLA-A2に対するSur1の弱い結合親和力は、2位のスレオニンをさらに良好なアンカー残基メチオニン;Sur1M2で置換することにより実質的に向上された。この測定は、安定なHLA-A2/ペプチド複合体の構築を可能にする。これらの複合体は、デキストラン分子を用いてマルチマー化され、これをストレプトアビジンおよびFITCと接合させた。マルチマー化されたMHC-複合体を、アセトン固定された凍結物質を染色するために使用した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、Sur1M2/HLA-A0201反応性CTLは腫瘍微小環境においてインサイチュで容易に検出することができた。本発明者らは、一次腫瘍およびIII期の黒色腫患者の症徴リンパ節ならびに一次乳ガン病巣においてかかる細胞を表した。染色の特異性を確実にするために、一連の負の対照を行った。ペプチド/HLA-デキストランマルチマーと同じ腫瘍上の黒色腫分化抗原gp100から誘導されるペプチドの使用も、Sur1M2/HLA-デキストランマルチマーの使用も、HLA-A2陰性ドナーから得られる腫瘍サンプルの場合、陽性染色をもたらさなかった。単離されたスルビビン反応性CTLは異なる起源の腫瘍細胞系を溶解するスルビビン反応性CTLの機能的容量を特徴づけるために、HLA-A2/Sur1M2-複合体36でコートされた磁気ビーズによりこれらの細胞を単離した。新たに切除された黒色腫浸潤リンパ節を細かく刻んで小フラグメントにし、粉砕して、細胞を培養物中に放出させた。細胞を単離前にインビトロでペプチドで一度刺激した。単離後1日で、IL-2を添加し、5日でこれらの細胞が腫瘍細胞を殺す能力をELISPOTまたは標準的51Cr放出アッセイのいずれかにより試験した。まず、ELISPOT分析により、修飾Sur1M2/HLA-A2複合体を用いて単離されたCTLが天然のSur1ペプチドに対しても応答することを立証することができたデータは省略。第二に、HLA-A2陽性黒色腫細胞系FM3図5AおよびHLA-A2陽性乳ガン細胞系MCF-7図5Bに対するスルビビン反応性の細胞毒性を試験した。単離されたT細胞は、両HLA-A0201細胞系を有効に溶解させた。対照的に、HLA-A2陰性黒色腫細胞系FM45図5AまたはHLA-A2陰性乳ガン細胞系BT-20図5Bに対して細胞毒性は観察されなかった。ELISPOTによりPBLにおいて測定されるスルビビン反応性10人のHLA-A2陽性乳ガン患者からのスルビビン反応性T細胞の存在をELISPOTにより試験した。分析前に、PBLを一度インビトロで刺激して、アッセイの感度を拡大した。次のスルビビンペプチド:Sur1、Sur9およびSur1M2に対する反応性を試験した。スルビビン特異性T細胞は10人のHLA-A2陽性乳ガン患者のうちの6人において検出された。代表例を図6に示す。2人の患者からのPBLにおいて、Sur1および修飾された類似体Sur1M2に対してであるが、Sur9図6、上、中に対してはない応答が検出され、3人の患者において、Sur9に対する応答が検出されたが、Sur1またはSur1M2に対しては検出されず図6、下、1人の患者がSur1M2にのみ反応した。対照的に、20人の健康なHLA-A2陽性ドナーからのPBLにおいてはスルビビン応答は検出されなかった。同様に、14人のHLA-A2陽性黒色腫患者からのPBLを試験した。スルビビン応答はこれらの患者のうちの7人において存在した表2。2人の患者がSur9ペプチドに対して応答し、2人がSur1M2ペプチドに対して応答し、1人がSur1とSurM2の両方に対して応答し、1人が3つのペプチド全てに対して応答した。実施例1において、3人の慢性リンパ性白血病CLL患者におけるスルビビンに対するT細胞応答を試験した表2:CLL1、CLL2、CLL3。3人のさらに別のCLL患者からのPBLを使用してこれらの実験をさらに拡大した。明らかに、全ての患者は少なくとも1つのスルビビンエピトープに対してT細胞応答をもたらした表2;CLL5、CLL6、CLL7。加えて、慢性骨髄性白血病CMLにかかっている1人の患者からのPBLを試験した。この患者において、3つのペプチド全てに対する応答が同定されたデータは省略。データを表2にまとめる。a104あたりの反応性細胞の出現率;14人の患者を試験した。b104あたりの反応性細胞の出現率;10人の患者を試験した。c105あたりの反応性細胞の出現率;7人の患者を試験した。実施例3癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-B35限定免疫応答概要この実験において、HLA-B35に限定される2種のスルビビン誘導エピトープを同定し、特徴づけた。これらのエピトープの両方に対する特異性T細胞反応性は、異なる造血性悪性腫瘍および黒色腫を有する患者からの末梢血において存在した。C末端アンカー残基の置換は、黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ球による認識を向上させた。さらに、一次黒色腫病巣におけるインサイチュのスルビビンに対する自発性細胞毒性T細胞応答が示された。これらのエピトープは関連する患者の悪性腫瘍ならびにHLA特性に関連してスルビビンペプチドに基づく将来のワクチン法の適用可能性を拡大する。実施例1および2において、HLA-A2限定スルビビン誘導T細胞エピトープを試験した。HLA-A2は白色人種集団の約30においてのみ発現され63、治療できる患者の割合を拡大するために他のHLAクラスI分子に限定されるペプチドエピトープを同定する必要がある。この研究において、白色人種集団の9において発現される63HLA-B35に限定されるスルビビンからの2種の新規T細胞エピトープを同定し、これらのスルビビンペプチドに対する自発的免疫応答は、異なる造血性悪性腫瘍および黒色腫を有する患者において検出された。材料および方法患者癌患者からの末梢静脈血を集め、Lymphoprep分離を用いてPBLを単離し、HLA分類し大学病院臨床免疫学科、コペンハーゲン、10DMSOを含むFCS中で凍結させた。さらに分析するために10人のHLA-B35陽性患者を選択した。これらの患者はそれぞれ、黒色腫、CLL、濾胞性リンパ腫FL、肥満性大細胞型B細胞リンパ腫DLBCLおよび多発性骨髄腫MMにかかっていた。血液サンプルを集めた時点で、患者はそれ以前の4ヶ月以内に医学的治療を受けていなかった。さらに、リンパ節から単離された腫瘍浸潤リンパ球TILを3人の黒色腫患者から集め、10DMSOを含むFCS中で凍結させた。ペプチド7種の合成スルビビン誘導ペプチド:Sur6-14、Sur11-19、Sur34-43、Sur46-54、Sur51-59、Sur46Y9、Sur51Y9、およびEBV誘導ペプチドの一つであるEBNA3A457-46663をこの研究において使用した。全てのペプチドはResearchGeneticsハンツビル、ALから入手し、HPLCおよびMC分析により確認されるように>90の純度で提供された。ペプチドを次の表3に示す。MHCクラスI分子に対するペプチド結合のアセンブリーアッセイ合成ペプチドの[35S]メチオニンで代謝的に標識されたHLA-B35分子に対する結合親和力を測定するために実施例1および2に記載されるアセンブリーアッセイを使用した。簡単に説明すると、アッセイは、HLA-B35J.Haurum博士の好意により提供されたもの、SymphogenApS、Lyngby、デンマークで安定にトランスフェクトされたTAP欠損細胞系T2から細胞溶解により放出される空HLA分子のペプチドによる安定化に基づく。安定に折り畳まれたHLA分子を、構造依存性mAbW6/32を用いて免疫沈降させた。HLA分子をIEF電気泳動により分離し、ゲルをホスホルイメージャースクリーンImagingplate、富士写真フィルム株式会社、日本に暴露し、分析し、適切に折り畳まれたHLA分子の量を、ImageGaugeホスホルイメージャーソフトウェア富士写真フィルム株式会社、日本を用いて定量化した。PBLの抗原刺激ELISPOTアッセイの感度を拡張するために、リンパ球を分析前にペプチドでインビトロで一度刺激した14、15。PBLまたはTILを解凍し、96穴プレート中50μMの個々のペプチドエピトープで2時間26°Cで刺激しペプチドあたり5×105~106細胞、さらに10日間37°Cで5ヒト血清HSを含むx-vivo中24穴プレートNunc、ロスキレ、デンマーク中、2×106細胞/ウェルで培養するためにプールした。インキュベーションの第2日に、40μg/mlのIL-2ApodanA/S、デンマークを添加した。10日に、培養された細胞をELISPOTアッセイにおける反応性について試験した。ELISPOTアッセイ癌患者から集められたPBLまたはTILにおけるペプチド特異性IFN-γ放出エフェクター細胞を定量化するために使用されたELISPOTアッセイは、実施例1に記載されるようにして行った。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の96穴プレートMultiScreenMAIPN45;Millipore、Hedehusene、デンマークをヒトIFN-γに対するmAb、7.5μg/ml1-D1K;Mabtech、Nacka、スウェーデンでコートした。ウェルを洗浄し、x-vivox-vivo15TMBioWhittacker、MolecularApplicatiosAPS、デンマーク中でブロックし、細胞を重複試験において異なる濃度で添加した。抗原提示のために、104T2-B35細胞10μMペプチドを含むか含まないを各ウェルに添加した。プレートを一夜インキュベートし、細胞を捨て、ビオチニル化二次抗体7-B6-1-ビオチン;Mabtechを添加する前にウェルを洗浄した。プレートを2時間室温でインキュベートし、洗浄し、アビジン-アルカリホスファターゼ接合体を添加したAP-Avidin;Calbiochem、LifeTechnologies,Inc.。1時間室温でインキュベーションした後、酵素基質ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートコード番号K0598、DakoCytomationNordenA/Sを添加し、暗紫色スポットが3~7分で出現した。水道水で洗浄することにより反応を停止させた。AlphaImagerSystemAlphaInnotech、サンリアンドロ、CAを用いてスポットをカウントし、ペプチド特異性T細胞の出現率をスポット形成細胞の数から計算した。全てのアッセイは、各ペプチド抗原について重複試験において行い、同じウェルにおいて培養されたリンパ球を同じ細胞数で、ペプチドと共にまたはペプチド無しで試験して、培養物中のペプチド特異性細胞の数を測定した。樹状細胞DSの成熟化接着細胞を培養の2時間後にPBLから単離した。これらをさらに10日間、10FCSを含むRPMI1640GibcoTMInvitrogencorporation、UKにおいて培養した。800ng/mlのGM-CFSPreproTech、ロンドン、UKおよび40ng/mlのIL-4PreproTechを3日おきに添加した。10日に、50ng/mlのTNF-αPreproTechを添加することによりDCを24時間成熟化させた。成熟化後、DCを放出させ、3μg/mlのβ2-ミクログロブリンの存在下、20μMペプチドで2時間、26°Cでパルスした。ペプチド特異性T細胞の単離実施例2において記載されたsur51Y9/HLA-B35コートされた磁気ビーズを用いて抗体特異性細胞を単離した。2.5μgのモノマーを5×106ビーズと共に40μlのPBS中20分間室温でインキュベートすることにより、HLA-B35とsur51Y9のビオチニル化モノマーProImmune、オックスフォード、UKから入手をストレプトアビジンコートされた磁気ビーズDynabeadsM-280、DynalA/S、オスロ、ノルウェーとカップリングさせた。磁気装置DynalA/S、オスロ、ノルウェーを用いて磁気複合体を3回PBS中で洗浄し、その後、5BSAを含むPBS中1:10の割合でPBLと混合し、非常に穏やかに1時間回転させた。磁気複合体と結合する抗原特異性CD8細胞を2または3回穏やかに洗浄した。単離された細胞を、5ヒト血清で補足されたx-vivo中に数回再懸濁させ、2時間インキュベートした後、磁気ビーズを放出させ、細胞懸濁液から除去した。天然のペプチドと修飾されたペプチド間の交差反応性を分析するために、ELISPOTアッセイにおいて単離された抗原特異性CD8T細胞を使用した。変性勾配ゲル電気泳動DGGEによるTCRクローン型マッピングヒトTCRBV領域1~24のDGGEクローン型マッピングは、66に詳細に記載されている。簡単に説明すると、Purescript単離キットGentraSystemsInc.MNを用いてRNAを単離し、共通の定常領域プライマーとともにTCRベータ鎖の可変領域のプライマーを用いたPCRにより転写されたcDNAを増幅した。コンピュータープログラムMELT87を使用して、50bpのGCリッチな配列GC-clampが定常領域プライマーの5’末端に結合すると仮定すると、増幅されたDNA分子がDGGE分析に適することが確認された。DGGE分析を、20から80の尿素とホルムアミドの勾配を含有する6ポリアクリルアミドゲル中で行った。電気泳動を160Vで4.5時間、1×TAE緩衝液中、54°Cの一定温度で行った。免疫組織化学的染色実施例2に記載された手順を用いて、癌患者の腫瘍病巣において抗原特異性T細胞をインサイチュで同定するためにマルチマー化ペプチド/HLA複合体を使用した。ビオチニル化sur51Y9/HLA-B35モノマーはProimmunelimited、オックスフォード、UKから供給された。sur51Y9/HLA-B35のビオチニル化されたモノマーは、ストレプトアビジン-FITC接合デキストラン分子L.Winter博士DAKO、Glostrup、デンマークの好意により提供されたものでマルチマー化し、免疫組織化学のために多価HLA-デキストラン化合物を生成させた。組織片を一夜乾燥し、続いて冷アセトン中5分間固定した。全てのインキュベーション工程は、暗所、室温で行った:a45分の一次抗体1:100希釈bCy3-接合ヤギ抗マウス抗体1:500希釈;コード155-165-100;JacksonImmunoResearch、Dianova、ハンブルグ、ドイツから入手を45分間;最後にcマルチマーを75分間。各工程間で、スライドをPBS/BSA0.1中10分間2回洗浄した。スライドをベクタシールド中でマウントし、共焦点顕微鏡Leica下で観察するまで冷蔵庫中に入れた。結果HLA-B35結合スルビビン誘導ペプチドの同定スルビビンのアミノ酸配列を、アンカー残基を有するノナマーおよびデカマーペプチドについて、HLA-B35のペプチド結合モチーフにしたがってスクリーニングした67。2位にN末端アンカーとしてプロリンを、C末端アンカー残基としてフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはチロシンを含有する5種のペプチドを選択した表3アセンブリーアッセイにより、HLA-B35を有効に安定化させることができる2種のペプチド、sur51-59EPDLAQCFF、配列番号7およびsur46-54CPTENEPDL、配列番号6が明らかになった。さらに、2種のペプチド、sur34-43TPERMAEAGF、配列番号20およびsur6-14LPPAWQPFL、配列番号18は弱い安定化を示すが、残りのペプチドはHLA-B35を全く安定化しなかった。HLA-B35の最大回復の半分に必要なペプチド濃度C50は、sur51-59について13μM、sur46-54について20μMと推定される。比較として、EBNA3A458-466YPLHEQHQM、配列番号21からの陽性対照-エピトープC24は0.8μMの推定C50値を有していた。sur46-54およびsur51-59の結合親和力を向上させるために、C末端アミノ酸を、さらに良好なアンカー残基であるチロシンと置換した67。修飾ペプチドによるHLA-B35の回復をアセンブリーアッセイにおいて分析し、C50値はsur51Y9について1.5μM、sur46Y9について4μMと推定された図7。天然のペプチドエピトープに対する自発性免疫応答最初に、5人の患者を4種の天然のHLA-B35結合ペプチドsur51-59、sur46-54、sur34-43およびsur6-14に対する自発性免疫応答について分析した。これらの5人の患者は異なる造血性悪性腫瘍を有していた:HEM8およびHEM18はMMにかかり、HEM12はFL、HEM9はDLBCL、CLL5はCLLにかかっていた。ペプチド前駆体CTLを検出するために10日のインビトロ刺激後、PBLに関してINF-γELISPOTアッセイを行った。自発性免疫応答が天然のHLA-B35結合ペプチドのうちの2つ、sur51-59およびsur46-54に対して検出された。2人の患者、HEM12およびCLL5は、sur51-59およびsur46-54の両方に対して応答を示したが、HEM8はsur51-59に対してのみ応答を示した図8AおよびB。2人の残りの患者、HEM9およびHEM18において応答は検出できず、任意の患者において弱く結合したペプチドsur34-46およびsur6-14に対する応答は検出できなかった。インビトロ刺激に対する別の方法を患者HEM12において使用した。すなわち、PBLを、sur51-59でパルスされた成熟自己樹状細胞と同時培養して、インビトロのCTL応答を刺激した。この培養物から得られるPBLはELISPOTにおいてsur51-59に対して強い反応性を示した図8B。修飾ペプチドの増大した認識前記のように、HLA-B35親和力を増大するためのペプチド修飾の結果、天然のペプチドと比較してHLA-B35について5~10倍の高い親和力が得られた。5人の黒色腫患者のグループを、ELISPOTアッセイにより天然および修飾ペプチドの両方に対する自発性免疫応答について分析した。PBLサンプルはインビトロ刺激後に分析し、TILサンプルは直接分析した。自発性免疫応答は、5人の患者のうち3人からのPBLまたはTILのいずれかにおいて観察された。FM25はPBLおよびTILサンプルの両方においてsur51-59およびsur-51Y9に対して反応性を示した図9A。FM45は修飾ペプチドsur51Y9に対してのみ応答し、強力な応答がTILにおいて検出可能であった。PBLはこの患者からは得られなかった図9A。FM74はTILにおいてsur46Y9に対して強い応答を示したが、天然のペプチドに対する応答は検出できなかった図9B。sur46Y9に対する弱い応答がFM74からのPBLにおいても観察されたデータは省略。天然および修飾ペプチド間の交差反応性sur51Y9のHLA-B35に対する高い親和力は、sur51Y9を有するHLA-B35の安定なモノマーの産生を可能にする。異なる癌患者から得られる腫瘍浸潤リンパ節およびPBLにおけるスルビビン反応性Tリンパ球の存在を確認して、磁気ビーズをかかるHLA-B35/Sur51Y9複合体でコートし、スルビビンペプチド反応性Tリンパ球を患者CLL5から得られるPBLから単離するためにこれらを使用した。この患者は、sur51-59に対して強力な応答を示した。顕微鏡で可視化されるようにビーズは特定的細胞の細胞表面上にしっかりと結合しデータは省略、磁場による抗原特異性細胞の沈降を可能にする。単離されたsur51Y9特異性細胞はsur51-59に対して強力に応答することができ図9、残りのPBLにおいては応答は検出できなかったデータは省略。単離は、RT-PCR/DGGEに基づくTCRクローン型マッピングにより分析した。この技術により、ごく少数の細胞しか利用可能でない場合でも、複合細胞集団におけるT細胞クローン分析が可能になる。これらの分析は、8の異なるクローンが単離されたことを示したデータは省略。黒色腫病巣においてインサイチュで存在する抗原特異性T細胞ストレプトアビジンおよびFITCと接合したデキストラン分子を用いてsur51Y9/HLA-B35モノマーをマルチマー化した。マルチマー化されたMHC複合体を使用して、実施例2に記載された手順を用いてアセトン固定された凍結物質を染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて抗原特異性細胞を可視化した。3人の患者から得られる一次黒色腫の断片を分析し、Sur51Y9/HLA-35反応性CTLは患者の一人における腫瘍微小環境においてインサイチュで容易に検出できた。グランザイムBに対するmAbでの同時染色により、これらのスルビビン特異性CTLはグランザイムBを放出し、細胞毒性活性を発揮することが示され、HLA-B35陰性黒色腫患者を対照として使用したデータは省略。実施例4異なるHLA-A限定特性を有する新規スルビビン誘導CTLエピトープの同定概要新規HLA-A1-、HLA-A2-、HLA-A3-およびHLA-A11-限定スルビビンエピトープを癌患者におけるCTL応答に基づいて特徴づけた。これらのエピトープは明らかにスルビビン誘導ペプチドに基づく免疫療法に適した患者の数を増大させた。さらに、いくつかの限定エレメントの全体的ターゲティングはHLA-対立遺伝子損失による免疫回避の危険性を減少させる。材料および方法患者患者サンプルはWurzburg大学ドイツおよびHerlevデンマークの大学病院から受け取った。これらの測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。組織タイピングは大学病院の臨床免疫学科コペンハーゲン、デンマークで行った。Lymphoprep分離を用いて黒色腫、乳ガン、および慢性リンパ性白血病CLLの癌患者から得られる末梢血リンパ球PBLを単離し、10ジメチルスルホキシドを含むウシ胎仔血清FCS中で凍結させた。さらに、黒色腫患者からの一次病巣および組織浸潤リンパ節からのTリンパ球を得た。新たに切除された腫瘍組織を細か刻んで小フラグメントにし、粉砕して低温保存するために腫瘍浸潤リンパ球TILを放出させた。ペプチド全てのペプチドはInvitrogenカールズバッド、CA,USAから購入し、HPLCおよびMS分析により確かめられるように>80の純度で提供された。使用した全てのペプチドを以下の表4および実施例5に記載する。細胞系ヒトT細胞系はB-LCL.174およびLCLCEM細胞のTAP1およびTAP2欠損ハイブリッドであり、従って低レベルのHLAクラスI分子HLA-A0201およびHLA-B5101を細胞表面で発現するだけである。HLA-A0301でトランスフェクトされたT2細胞はAMcMicheael博士IMM、ジョンラドクリフ病院、オックスフォードの好意により提供された。HLA-A1101でトランスフェクトされたT2細胞はMMasucci博士MTC、カロリンスカ協会、ストックホルム、スウェーデンの好意により提供された。BM36.1細胞系もTAP機能が欠損し、表面でHLAクラスIHLA-A0101、HLA-B3501の低発現を有するT2と同様の表現型を有する。BM36.1細胞はAZiegler博士フンボルト大学、ベルリン、ドイツの好意により提供された。MHCクラスI分子に対するペプチド結合についてのアセンブリーアッセイ[35S]-メチオニンで代謝的に標識された合成ペプチドInvitrogen、カールズバッド、CA、USAのHLA-A1、-A2、-A3、または-A11に対する結合親和力を既に記載されているようにして12アセンブリーアッセイにおいて測定した。アッセイは、TAP欠損細胞系から細胞溶解により放出された空HLA分子のペプチドによる安定化に基づく。HLAクラスI特異性構造依存性mAbW6/32を用いて安定に折り畳まれたHLA分子を免疫沈降させ、等電点IEFゲル電気泳動法により分離した。ImageGaugeホスホルイメージャープログラムフジ写真フイルム株式会社、カロルトン、Tx、USAを用いてMHC重鎖バンドを定量化した。バンドの強度はアッセイ中に回収されるペプチド結合クラスIMHC複合体の量に比例する。次に、HLA分子の安定化の程度は添加されたペプチドの結合親和力と直接関連する。HLA分子の回収を分析するために使用されるペプチド濃度は、HLA-A1およびHLA-A11については40、4、0.4、0.04μM、HLA-A2およびHLA-A3については100、10、1、0.1、0.01μMであった。C50値を次に各ペプチドについて最大安定化の半分に必要なペプチド濃度として計算した。PBLの抗原刺激ELISPOTアッセイの感度を拡大するために、PBLを分析前に一度インビトロで刺激した。0日に、PBLまたは粉砕されたリンパ節を解凍し、x-vivo培地BioWhittaker、Walkersville、メリーランド、5熱不活化ヒト血清、および2mMのL-グルタミン中、10μMのペプチドの存在下で、24穴プレートNunc、ロスキレ、デンマーク中、2ml/ウェルで2×106細胞としてプレートした。2日後、20IU/mlの組み換えインターロイキン-2IL-2Chiron、ラーティンゲン、ドイツを培養物に添加した。培養された細胞を10日にELISPOTにおいて反応性について試験した。ELISPOTアッセイ既に記載されているようにして16、ペプチドエピトープ特異性インターフェロン-γ放出エフェクター細胞を定量化するためにELISPOTアッセイを使用した。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の96穴プレートMultiScreenMAIPN45、Millipore、Hedehusene、デンマークを抗IFN-γ抗体1-D1K、Mabtech、Nacka、スウェーデンでコートした。ウェルを洗浄し、x-vivo培地によりブロックし、細胞を重複試験において異なる細胞濃度で添加した。ペプチドをついで各ウェルに添加し、プレートを一夜インキュベートした。翌日、培地を捨て、ビオチニル化二次抗体7-B6-1―ビオチン、Mabtechの添加前にウェルを洗浄した。プレートを2時間インキュベートし、洗浄し、アビジン-アルカリホスファターゼ接合体Calbiochem、LifeTechnologies,Inc.サンディエゴ、CA、USAを各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートし、洗浄し、酵素基質NBT/BCIPDakoCytomation、NordenA/S、Glostrup、デンマークを各ウェルに添加し、室温で5~10分間インキュベートした。暗紫色スポットが出現したら、水道水で洗浄することにより反応を停止させた。ImmunoSpotシリーズ2.0アナライザーCTLAnalyzers、LLC、クリーブランド、USを用いてスポットをカウントし、スポット形成細胞の数からペプチド特異性CTL出現率を計算できた。全てのアッセイは各ペプチド抗原について重複試験において行った。結果HLA-A1限定スルビビンエピトープの同定HLA-A1に対するスルビビン誘導ペプチドの結合主HLA-A1特異性アンカー残基、3位のアスパラギン酸D、グルタミン酸EおよびC末端のチロシンY、フェニルアラニンFを用いて、スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を最もありそうなHLA-A1ノナマーおよびデカマーペプチドエピトープについてスクリーンした。その結果、6のスルビビン誘導ペプチドが合成され、HLA-A1に対する結合について調べた表4。さらに、2つのペプチドSur38-46MAEAGFIHC配列番号23およびSur47-56PTENEPDLAQ配列番号25は両方ともRammenseeらhttp://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/で入手可能による予想アルゴリズムにより可能な良好なバインダーとして同定されたので、主なアンカーの一つを含有するのみであるにもかかわらず、含まれていた。C50値は各ペプチドについて、HLA-A1の最大回復の半分に必要なペプチド濃度として推定された表4。しかしながら、これらのペプチドの一つSur92-101QFEELTLGEF配列番号27のみがインフルエンザAタンパク質からの公知の正の対照エピトープ、図10に例示されるような塩基性ポリメラーゼ1PB1VSDGGPNLYとほとんど同様の高い親和力で結合する。Sur93-101FEELTLGEF配列番号24はHLA-A1に対して低い結合親和力を有し、一方、分析された他のペプチドはどれもHLA-A1と結合しなかった表4。従って、本発明者らは、良好なアンカー残基が天然のペプチドと置換された多くの類似ペプチドを合成した。本発明者らは、C末端でそれぞれシステインCまたはグルタミンQの代わりにチロシンYを導入して2種のペプチド、Sur38-46MAEAGFIHC配列番号23およびSur47-56PTENEPDLAQ配列番号25を修飾した。修飾されたペプチドはいずれもHLA-A1と強力に結合した表4。さらに、本発明者らは、2つのペプチドSur92-101およびSur93-101において2位のアミノ酸を補助アンカースレオニンTまたはセリンSで置換した。これらの修飾はSur92-101のHLA-A1に対する結合の正の影響を有していなかった。対照的にSur93T2FTELTLGEF配列番号36はHLA-A1と高い親和力で結合した表4。図10は、天然の低親和力ペプチドSur93-101、高親和力修飾ペプチドSur93T2および非結合ペプチドSur49-58の、インフルエンザから得られる正の対照エピトープと比較しての結合を示す。最後に、本発明者らは、Sur14-22、Sur34-43、Sur49-58、Sur51-59、Sur92-101、およびSur93-101をC末端でチロシンYで修飾したが、これはこれらのペプチドのいずれについてもHLA-A1に対する結合親和力を向上させなかったデータは省略。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-A1限定CTL応答6人の黒色腫患者から得られるPBLおよび3人の黒色腫患者から得られるTILを、ELISPOTにより、4種の高親和力スルビビン推定ペプチドSur38Y9、Sur47Y10、Sur92-101、およびSur93T2のいずれかに対するCTL特異性の存在について分析した。スルビビン誘導ペプチドの少なくとも一つに対するT細胞反応性は、分析された9人の患者の全部からの3種のPBLサンプルおよび1種のTILサンプルにおいて観察された。図11において見られるように、1人の患者Mel.A1-3からのPBLは4種のペプチド、Sur38Y9、Sur47Y10、Sur92-101、およびSur93T2に対するT細胞応答を有していた。Mel.A1-2は、Sur47Y10、Sur92-101およびSur93T2に対して応答を示したが、Mel.A1-1/TILおよびMel.A1-4/PBL応答はそれぞれSur47Y10およびSur93T2に対して観察された図11。加えて、10人の黒色腫患者をELISPOTにより天然のペプチドSur93-101、Sur38-46およびSur47-56に対する免疫反応性について試験したが、これらの患者のいずれにおいてもペプチド特異性応答は検出されなかったデータは省略。HLA-A11限定スルビビンエピトープの同定スルビビン誘導ペプチドのHLA-A11に対する結合スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、HLA-A3およびHLA-A11を包含するHLA-A3超科のものに対応する結合モチーフを有するノナマーまたはデカマーペプチドについてスクリーンした。主要アンカー残基、2位にロイシンLおよびC末端にリシンKを有するペプチド配列を、Rammenseeらによる予想アルゴリズムにしたがってこれらの位置に関連するアミノ酸を有するペプチド配列と共に選択した表4。13種のペプチドをスルビビンのタンパク質配列から予想し、HLA-A11およびHLA-A3との結合にいて分析した。これらのペプチドのうちの3つ、Sur53-62DLAQCFFCFK配列番号47、Sur54-62LAQCFFCFK配列番号42およびSur112-120KIAKETNNK配列番号44は、EBV核抗原4からのウイルスエピトープAVFDRKSDAK配列番号63に匹敵する高い親和力でHLA-A11と結合した。加えて、1つのペプチド、Sur112-121KIAKETNNKK配列番号51はHLA-A11と弱く結合した表4。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-A11限定CTL応答5人の黒色腫患者および2人のCLL患者からのPBLを、4種のHLA-A11結合ペプチド、Sur53-62;Sur54-62、Sur112-120、およびSur112-121に対するT細胞反応性について試験した。本発明者らは、2人の黒色腫患者Mel.A11-1、Mel.A11-2からのPBLにおいてELISPOTによりスルビビン誘導ペプチドSur53-62に対する応答を検出することができた図12。さらに、本発明者らは、患者Mel.A11-2において腫瘍浸潤リンパ節からの腫瘍浸潤リンパ球TIL中Sur53-62特異性T細胞を検出した図12。患者Mel.A11-1において、スルビビンペプチドSur53-62に対する強力な免疫応答が2年の期間にわたって採取された5種の異なるサンプルにおいて観察されたデータは省略。HLA-A3限定スルビビンエピトープの同定HLA-A3に対するスルビビン誘導ペプチドの結合HLA-A3超科に対する結合について予想されるスルビビン誘導ペプチドをHLA-A3に対する結合についてさらに分析した。2つのペプチドSur112-120KIAKETNNK配列番号44およびSur112-121KIAKETNNKK配列番号57のみが、ウイルスエピトープ、インフルエンザA核タンパク質265-273ILRGSVAHK配列番号74と同様に、HLA-A3と高い親和力で結合した表4。さらに、2つのペプチドSur53-62DLAQCFFCFK配列番号47およびSur95-103ELTLGEFLK配列番号43はHLA-A3と弱く結合した。HLA-A3についての結合親和力を増大させるために検出可能な結合を有さないペプチドのいくつかを修飾した。かくして、本発明者らは、さらに良好なアンカー残基ロイシンLが2位の天然のアラニンAと置換されているSur54-62およびSur113-122の2つの類似ペプチドを合成した。Sur54L2LLQCFFCFK配列番号56はHLA-A3と高い親和力で結合するが、Sur113L2ILKETNNKKK配列番号59は弱くしか結合しなかった表4。加えて、本発明者らは、C末端の天然のフェニルアラニンFがさらに良好なアンカー残基リシンKで置換されたSur5-13、Sur13-22、Sur18-27、およびSur53-61の4つの類似ペプチドを合成した。Sur5K9TLPPAWQPK配列番号54およびSur18K10RISTFKNWPK配列番号58はHLA-A3と高い親和力で結合するが、置換は天然の類似体と比較して、Sur13K9FLKDHRISTK配列番号57およびSur53K9DLAQCFFCK配列番号55に対する結合に関して検出可能な影響を及ぼさなかった。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-A3限定CTL応答黒色腫患者からの9サンプル5PBlおよび4TILを、2つの天然の高親和力HLA-A3結合ペプチドSur112-120およびSur112-121、ならびに2つの天然の弱結合ペプチドSur53-62およびSur95-103に対する免疫反応性について分析した。しかしながら、これらのペプチドに対する免疫応答はどの患者においてもELISPOTにおいて検出できなかった。したがって、同じ患者を3つの高親和性修飾スルビビン誘導ペプチドSur5K9、Sur18K10、およびSur54L2に対する自発性免疫反応性について分析した。CTL反応性は、3人の患者、Mel.A3-1、Mel.A3-2、Mel.A3-3からのTILサンプルにおけるSur18Kに対して検出された図13。2つの他のペプチド、Sur5K9およびSur54L2に対する応答は検出されなかった。これらの応答をさらに確認するために、さらに18人の黒色腫患者からのPBLをSur18K10に対するCTL反応性について分析した。3人の応答する患者、Mel.A3-4、Mel.A3-5、およびMel.A3-6がこれらのなかから見いだされ、その結果、27人の分析された患者のうち合計6人の患者が応答した図13。新規HLA-A2限定スルビビンエピトープの同定HLA-A2に対する11-merスルビビン誘導ペプチドの結合スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、主要HLA-A2特異性アンカー残基を用いて最も可能性の高いHLA-A211-merペプチドエピトープについてスクリーンした。6種のスルビビン推定ペプチドを合成し、HLA-A2に対する結合について調べた。調べたペプチドはどれも、Eptein-BarrウイルスBMLF280-288ペプチドGLCTLVAML配列番号72からの公知の正対照エピトープと同様の高い親和力では結合しなかった表4。HLA-A2の最大回復の半分に必要なペプチド濃度C50値は正の対照について0.9μMであった。比較として、ペプチドSur18-28RISTFKNWPFL配列番号67およびSur86-96FLSVKKQFEEL配列番号69はHLA-A2と弱く結合したC50はそれぞれ69μMおよび72μM。しかしながら、公知のHLA-A2限定スルビビンエピトープはHLA-A2と同様に弱く結合し;Sur95-104ELTLGEFLKL配列番号43は中くらいの親和力で結合しC50=10μM、Sur96-104LTLGEFLKL配列番号10は弱くしか結合しなかったC50>100μM。試験した残りの4つの11-merペプチド、Sur4-14PTLPPAWQPFL配列番号66、Sur54-64LAQCFFCFKEL配列番号68、Sur88-98SVKKQFEELTL配列番号70、およびSur103-113KLDRERAKNKI配列番号74はHLA-A2と結合しなかった。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-A2限定CTL応答2種の弱結合11merペプチド、Sur18-28およびSur86-96がHLA-A2により提示され、癌患者の免疫系により認識されるかどうかを調べるために、10人の癌患者2人の黒色腫Mel、6人のCLLCLL、および2人の乳ガンMC患者をまず分析した。Sur18-28に対するCTL応答が、分析された10人の患者のうちの2人CLL-1、CLL-2、図14からのPBLにおいて見いだされ、一方、Sur86-96に対して応答は検出されなかったデータは省略。これらのSur18-28特異性応答を確認するために、さらに12人の患者7人の黒色腫、1人のCLL、および4人の乳ガン患者からのPBLをこのペプチドに対するCTL反応性に関して分析した。これらのうち、4人の患者CLL-3、MC-1、MC-2、Mel.A2-1がELISPOTにより検出可能なSur18-28特異性免疫活性を有していた図14。従って、分析された22人の患者のうち6人のPBLはSur18-28に対するCTL応答を有していた。HLA-B7限定スルビビンエピトープの同定HLA-B7に対するスルビビン誘導ペプチドの結合スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、HLA-B7のペプチド結合モチーフのアンカー残基を有する9~10のアミノ酸のペプチドについてスクリーンした。5つのペプチドを選択し、アセンブリーアッセイにおいてHLA-B7を安定化させるその能力について分析した。C50値を各ペプチドについてHLA-B7の最大安定化の半分に必要なペプチド濃度として推定した表4。2つのスルビビン誘導ペプチドsur6-14LPPAWQPFL配列番号18およびsur11-19QPFLKDHRI配列番号19はHLA-B7を若干安定化させ、C50値は100μM以上であり;sur46-54CPTENEPDL配列番号6、sur51-59EPDLAQCFF配列番号7、およびsur34-43TPERMAEAGF配列番号20はHLA-B7と結合しなかった表4。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA-B7限定CTL応答5人の黒色腫患者mel25、mel26、mel3、mel6、mel39、2人のCLL患者CLL1、CLL54および2人の乳ガン患者breast11、breast15から得られるHLA-B7陽性PBLを弱HLA-B7結合ペプチドsur6-14LPPAWQPFL配列番号18およびsur11-19QPFLKDHRI配列番号19に対するT細胞反応性について試験した。本発明者らは、CLL患者および乳ガン患者におけるスルビビン誘導ペプチドsur6-14に対して強力な自発的CTL応答を検出ることができた図15。さらに、本発明者らは、黒色腫患者mel3においてこのペプチドに対する弱い応答を検出することができた図15。癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するHLA対立遺伝子限定免疫応答の概要前記実施例において記載されたMHCクラスI分子に対するペプチド結合についてのアセンブリーアッセイを用いて、9~11のアミノ酸残基を含む一連のスルビビン誘導ペプチドを次のHLA対立遺伝子との結合について試験した:HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11およびHLA-B7。加えて、ペプチドのいくつかを、これも前記のELISPOTを用いてCTL免疫応答を惹起するその能力について試験した。前記実施例において得た結果を含む結果のまとめを以下の表4に示す。iELISPOTにより1人のリンパ腫患者HEM34においてペプチドSur112-120に対する応答が観察された。iiELISPOTにより3人のリンパ腫患者HEM9、11、34においてペプチドSur53-62に対して応答が検出された。ivELISPOTにより黒色腫患者FM-TIL95において弱い応答が観察された。vii黒色腫患者PM6においてSur112-121に対する応答が観察され、転移性リンパ節懸濁液において最も顕著であり、ELISPOTにより一次腫瘍からのTILおよびPBLにおいてはさらに弱かった。viiiCLL患者CLL9においてペプチドSur6-14に対する応答が観察され、elispotによりリンパ腫患者HEM21においてさらに弱い応答が観察されたデータは省略。実施例5免疫原としてスルビビン誘導体を用いた治療試験法概要5人のよく前治療されたIV期の黒色腫患者に、修飾されたHLA-A2限定スルビビンエピトープ、すなわち、例外的使用設定において自己樹状細胞により提示されたsur1M2ペプチドをワクチン接種した。患者のうち4人はこのエピトープに対してELISPOTアッセイにより測定すると強力なT細胞応答を示した。さらに、インサイチュペプチド/HLA-A2マルチマー染色により、スルビビン反応性細胞の内臓組織および軟組織転移中への浸潤が明らかになった。明らかに、毒性を伴うワクチン接種は観察されなかった。データから、後期黒色腫患者においてもスルビビンに対するT細胞応答を惹起でき、これらのワクチン接種は良好な耐用性を有することが示された。材料および方法患者の適格基準および治療計画全ての臨床手順は、ヘルシンキ宣言に従い、すべての患者は治療前にインフォームドコンセントを受けた。IV期の皮膚またはぶどう膜黒色腫患者は、少なくとも2種の異なる化学、免疫、または化学免疫療法にもかかわらず疾患が進行している場合に適格であった。加えて、患者は18歳以上であり、HLAA0201を発現し、頭蓋、胸郭および腹部コンピューター断層撮影法により確認される測定可能な疾患にかかっていなければならなかった。患者のクラノフスキー指数は60以上でなければならなかった。全身的化学および/または免疫療法を、ワクチン接種前4週間以内に行わなかった。重要な除外基準は、CNS転移、活性自己免疫または感染性疾患、妊娠および授乳、ならびに重大な精神異常の徴候であった。ペプチドパルス化樹状細胞は既に記載されているように生成された82。簡単に説明すると、白血球除去輸血から得られるPBMCをLymphoprepTMNycomedPharmaで単離し、アリコートに分けて凍結し、液体窒素中で貯蔵した。ワクチン接種の1週間前に、PBMCを解凍し、洗浄し、ゲンタマイシン、グルタミンおよび熱不活化自己血漿を含有する培地中で培養した。1日および5日に、IL-4およびGM-CSFを添加した。成熟DCを分化させるために、TNF-γおよびプロスタグランジンE2を6日に添加した。7日に、成熟DCの表現型および形態的特徴、すなわち不明瞭な外観および=75CD83発現を示す細胞を修飾スルビビン誘導HLA-A2限定スルビビン96-104エピトープ、LMLGEFLKL配列番号10Clinalfa、スイス14でパルス化した。1日および5日に培養物から採取されたサンプルの微生物試験が無菌であると証明される場合にのみ細胞をワクチン接種に使用した。最初の2回のワクチン接種については7日間隔、続いてさらなるワクチン接種について28日間隔で患者にワクチン接種した。合計10~20×106の成熟スルビビン96-104パルス化DCを、1ヒト血清アルブミンを含有するPBS中に再懸濁させ、局所リンパ節に近い大腿部の腹側正中領域において、注射部位ごとに1.5×106DCのアリコートで皮内注射した。排液リンパ節が除去および/または照射された肢節を排除した。患者の健康状態の重大な悪化またはCNS転移の発生の不在下で、5回のワクチン接種後に白血球除去輸血を繰り返した。臨床および免疫学的応答の測定ワクチン接種前、およびその後3ヶ月ごとまたは疾患の進行の重大な臨床的徴候が見られた場合に、CTスキャンを行った。3ヶ月ごとに得られるPBMCを用いて免疫学的応答をELISPOTアッセイによりモニターして、スルビビン96-104特異性IFN-γ放出を検出した。ELISPOTアッセイの感度を拡大するために、PBMCを、5熱不活化ヒト血清および2mMのL-グルタミンで補足されたx-vivo培地BioWhittaker、Walkersville、メリーランド中、10μMのペプチドの存在下で、24穴プレートNunc、デンマーク中1×106細胞/mlの濃度でインビトロで1回刺激した。2日後、40IU/mlの組み換えインターロイキン-2Il-2Chiron、ラーティンゲン、ドイツを添加した。10日後、細胞を反応性について試験した。この目的のために、ニトロセルロース底の96穴プレートMultiScreenMAIPN45、Millipore、Glostrup、デンマークを抗INF-γ抗体1-D1K、Mabtech、スウェーデンでコートした。リンパ球を、ウェルごとに200μlのx-vivo培地中104~105細胞で104T2細胞および当該ペプチドと共に最終濃度2μMで添加した。37°Cで一夜インキュベーションし、2回洗浄した後、ビオチニル化検出抗体7-B6-1-ビオチン、Mabtech、スウェーデンを添加し;アルカリホスファターゼ-アビジンをそれぞれの基質GibcoBRLと共に使用して、その特異的結合を可視化した。暗紫色AlphaImagerSystemAlphaInnotech、サンリアンドロ、CA、USAを用いて定量化したが出現したら反応を停止させた。スルビビン96-104/HLA-A0201反応性CD8Tリンパ球を、マルチマースルビビン96-104/HLA-A0201複合体により、ワクチン接種部位ならびに内臓、軟組織、または皮膚転移の両方でインサイチュで追跡した。ワクチン接種部位を全ての患者において皮内注射後24時間で切除し、一方、転移病巣は、容易にアクセス可能である選択された患者患者KNおよびGBにおいてのみ除去するか、または治癒目的で除去した患者WW。マルチマーペプチド/MHC複合体の染色法は既に記載されている68。HLA-A0201の細胞外領域残基1-275の5’末端で酵素ビオチニル化の認識部位を導入することにより、マルチマースルビビン96-104/HLA-A0201複合体を生成させた。組み換えタンパク質をサイズ排除SephadexG25、Pharmacia、エルランゲン、ドイツおよびイオン交換mono-Q、Pharmaciaクロマトグラフィーにより精製し、それぞれのペプチドおよびβ2-ミクログロブリンの存在下での希釈によりインビトロで折り畳んだ。SephadexG25カラム上でのゲル濾過後、タンパク質をデキストラン分子と接合させたストレプトアビジン-FITCL.Winter博士DAKO、コペンハーゲン、デンマークの好意により提供されたものでマルチマー化して、多価HLA-デキストラン複合体を生成させた。それぞれのサンプルの低温保存断片を一夜乾燥し、続いて冷アセトン中で5分間固定した。全てのインキュベーション工程を暗所、室温で次のように行った:i抗体-CD8抗体1:100、クローンHIT8a、Pharmingen、サンディエゴ、CAを45分間、iiCy3-接合ヤギ抗マウス1:500希釈;コード115-165-100、Dianova、ハンブルグ、ドイツを45分間、最後にiiiマルチマーを75分間。各工程間で、スライドをPBS/BSA0.1中10分間2回洗浄した。最後に、スライドをベクタシールド中でマウントし、Leica共焦点顕微鏡TCS4D、Leica、マンハイム、ドイツ下で観察した。結果患者の特徴、毒性および臨床経過5人のかなり進行したIV期黒色腫患者を登録させた。2人はぶどう膜黒色腫にかかっており、1人は軟組織黒色腫にかかっており、残りの1人は皮膚黒色腫にかかっていた。症候性脳転移の徴候のために、1人の患者は2回だけワクチン接種した後治療をやめた。他の4人の患者は15回までのワクチン接種を受けた。1人の患者は残存する転移を外科的に切除した後、腫瘍のない状態で心不全により死亡した。もう一人の患者は内臓転移RWの出現のために10回のワクチン接種後に治療をやめた。1人の患者は15回のワクチン接種後も実験を続けた。詳細な患者の特徴、薬歴、ワクチン接種回数および生存状況を表5にまとめる。重大な毒性は起こらなかった。従って、ヘモグロビン、白血球および血小板、ならびに乳酸脱水酵素、クレアチニンおよびコリンエステラーゼはワクチン接種療法により影響を受けなかった図16。全身性または局所毒性の徴候は注射部位で観察されなかった。さらに、傷の治癒の低下、出血性障害、心不全、脈管炎または炎症性腸管疾患は検出されなかった。1人の患者WWにおいて、既存の肝臓転移はワクチン接種療法下で安定化されたが、新しい副腎転移が起こった。残念なことに、この患者は治療的手術後に腫瘍がなかったが心不全のために死亡した。脳転移が患者PBにおいてワクチン接種開始後わずか4週間で検出された。従って、この患者は2回のみDC注射した後さらなるワクチン接種から排除しなければならなかった。他の3人の患者はその全般的な健康状態が実質的に損なわれることなく転移性疾患のゆっくりした進行を示した。際だって、患者KNに関して、ワクチン開始時での重度の転移および疾患の進行が速かったにもかかわらず、13ヶ月ワクチン開始から死亡までの全体的な生存が達成された。患者GBはスルビビン-ペプチドパルス化DCでのワクチン接種の開始後14ヶ月でプロトコルを続けていた。しかしながら、両患者RWおよびGBは腫瘍抑制のために、皮下腫瘍の照射RWまたは局所化学療法GBのいずれかの追加の局所治療を受けていたことに注目すべきである。スルビビン特異性CD8T細胞応答細胞毒性T細胞応答の反応速度をモニターするために、ワクチン接種前および3ヶ月後に得られたPBMCを、IFN-γについてのELISPOTにより修飾スルビビン96-104エピトープに対する反応性について試験した。分析前に、このアッセイの感度を拡大するためにPBMCを一度インビトロで刺激した。試験した4人の患者全てにおいて、スルビビン96-104反応性T細胞の誘発が顕著であった図17。他のHLA-A0201限定スルビビンペプチド、すなわち非修飾スルビビン96-104および隣接するSur9エピトープに対する反応性についての分析は、患者のうちの2人KNおよびRWにおいてこれらのペプチドに対してT細胞応答を示したデータは省略。末梢血における腫瘍特異性T細胞応答の測定の予後および臨床値は繰り返し問題として取り上げられてきた;従って、本発明者らはペプチド/MHCマルチマー染色によるインサイチュ腫瘍浸潤リンパ球中、スルビビン96-104/HLA-A0201反応性CD8Tリンパ球の存在についても試験した。この方法を有効にするために、本発明者らはまず24時間以内にワクチン接種部位で発生する遅延型過敏性反応からの組織サンプルを分析した。この分析により、ペプチドパルス化DCの皮内注射は強力なペプチド特異性炎症性T細胞浸潤を誘発するという先の観察が確認された。次に、ペプチド/MHCマルチマー染色法を軟組織および内臓転移に適用し、これによりCD8浸潤物中スルビビン96-104/HLA-A0201反応性細胞の存在が明らかになった。この観察により、ワクチン接種は所望の特異性を有するT細胞を誘発するだけでなく、これらに必要なホーミング能力を付与することが示唆される。参考文献1VandenEyndeBJandBoonTTumorantigensrecognizedbyTlymphocytesIntJClinLabRes27818619972RosenbergSADevelopmentofcancerimmunotherapiesbasedonidentificationofthegenesencodingcancerregressionantigensJNatlCancerInst20881635164419963MarchandMvanBarenNWeynantsPBrichardVDrenoBTessierMHRankinEParmianiGArientiFHumbletYBourlondAVanwijckRLienardDBeauduinMDietrichPYRussoVKergerJMasucciGJagerEDeGreveJAtzpodienJBrasseurFCouliePGvanderBruggenPandBoonTTumorregressionsobservedinpatientswithmetastaticmelanomatreatedwithanantigenicpeptideencodedbygeneMAGE3andpresentedbyHLAA1IntJCancer8021923019994BrossartPStuhlerGFladTStevanovicSRammenseeHGKanzLandBruggerWHer2neuderivedpeptidesaretumorassociatedantigensexpressedbyhumanrenalcellandcoloncarcinomalinesandarerecognizedbyinvitroinducedspecificcytotoxicTlymphocytesCancerRes5873273619985BrossartPHeinrichKSStuhlerGBehnkeLReichardtVLStevanovicSMuhmARammenseeHGKanzLandBruggerWIdentificationofHLAA2restrictedTcellepitopesderivedfromtheMUC1tumorantigenforbroadlyapplicablevaccinetherapiesBlood934309431719996VonderheideRHHahnWCSchultzeJLandNadlerLMThetelomerasecatalyticsubunitisawidelyexpressedtumorassociatedantigenrecognizedbycytotoxicTlymphocytesImmunity1067367919997LaCasseECBairdSKornelukRGandMacKenzieAETheinhibitorsofapoptosisandtheiremergingroleincancerOncogene173247325919988AltieriDCMarchisioPCandMarchisioCSurvivinapoptosisaninterloperbetweencelldeathandcellproliferationincancerLabInvest791327133319999AmbrosiniGAdidaCSirugoGandAltieriDCInductionofapoptosisandinhibitionofcellproliferationbysurvivingenetargetingJBiolChem2731117711182199810GrossmanDMcNiffJMLiFandAltieriDCExpressionandtargetingoftheapoptosisinhibitorsurvivininhumanmelanomaJInvestDermatol11310761081199911GrossmanDMcNiffJMLiFandAltieriDCExpressionoftheapoptosisinhibitorsurvivininnonmelanomaskincancerandgenetargetinginakeratinocytecelllineLabInvest7911211126199912AndersenMHSondergaardIZeuthenJElliottTandHaurumJSAnassayforpeptidebindingtoHLACw0102TissueAntigens54185190199913AndersenMHBonfillJENeisigAArsequellGndergaardINeefjesJZeuthenJElliottTandHaurumJSPhosphorylatedPeptidesCanBeTransportedbyTAPMoleculesPresentedbyClassIMHCMoleculesandRecognizedbyPhosphopeptideSpecificCTLJImmunol16338123818199914McCutcheonMWehnerNWenskyAKushnerMDoanSHsiaoLCalabresiPHaTTranTVTateKMWinkelhakeJandSpackEGAsensitiveELISPOTassaytodetectlowfrequencyhumanTlymphocytesJImmunolMethods210149166199715PassHASchwarzSLWunderlichJRandRosenbergSAImmunizationofpatientswithmelanomapeptidevaccinesimmunologicassessmentusingtheELISPOTassayCancerJSciAm4316323199816BerkeZAndersenMHPedersenMFuggerLZeuthenJandHaurumJSPeptidesspanningthejunctionalregionofboththeablbcrandthebcrablfusionproteinsbindcommonHLAclassImoleculesLeukemia14419426200017FalkKRotzschkeOStevanovicSJungGandRammenseeHGAllelespecificmotifsrevealedbysequencingofselfpeptideselutedfromMHCmoleculesNature351290296199118CornelisonTLHumanpapillomavirusgenotype16vaccinesforcervicalcancerprophylaxisandtreatmentCurrOpinOncol12466473200019LeeSPChanATCheungSTThomasWACroomCarterDDawsonCWTsaiCHLeungSFJohnsonPJandHuangDPCTLcontrolofEBVinnasopharyngealcarcinomaEBVspecificCTLresponsesinthebloodandtumorsofNPCpatientsandtheantigenprocessingfunctionofthetumorcellsJImmunol165573582200020SwanaHSGrossmanDAnthonyJNWeissRMandAltieriDCTumorcontentoftheantiapoptosismoleculesurvivinandrecurrenceofbladdercancerNEnglJMed341452453199921SalgallerMLAfsharAMarincolaFMRivoltiniLKawakamiYandRosenbergSARecognitionofmultipleepitopesinthehumanmelanomaantigengp100byperipheralbloodlymphocytesstimulatedinvitrowithsyntheticpeptidesCancerRes5549724979199522SalgallerMLMarincolaFMCormierJNandRosenbergSAImmunizationagainstepitopesinthehumanmelanomaantigengp100followingpatientimmunizationwithsyntheticpeptidesCancerRes5647494757199623ValmoriDFonteneauJFLizanaCMGervoisNLienardDRimoldiDJongeneelVJotereauFCerottiniJCandRomeroPEnhancedgenerationofspecifictumorreactiveCTLinvitrobyselectedMelanAMART1immunodominantpeptideanaloguesJImmunol16017501758199824PardollDMCancervaccinesNatMed4525531199825KuglerAStuhlerGWaldenPZollerGZobywalskiABrossartPTrefzerUUllrichSMullerCABeckerVGrossAJHemmerleinBKanzLMullerGAandRingertRHRegressionofhumanmetastaticrenalcellcarcinomaaftervaccinationwithtumorcelldendriticcellhybridsNatMed6332336200026BeckerJCGuldbergPZeuthenJBrockerEBandthorStratenPAccumulationofidenticalTcellsinmelanomaandvitiligolikeleukodermaJInvestDermatol11310331038199927RohayemJDiestelkoetterPWeigleBOehmichenASchmitzMMehlhornJConradKandRieberEPAntibodyresponsetothetumorassociatedinhibitorofapoptosisproteinsurvivinincancerpatientsCancerRes2000Apr16018157601815181728AdidaCHaiounCGaulardPLepageEMorelPBriereJDombretHReyesFDieboldJGisselbrechtCSallesGAltieriDCandMolinaTJPrognosticsignificanceofsurvivinexpressionindiffuselargeBcelllymphomasBlood9619211925200029IslamAKageyamaHTakadaNKawamotoTTakayasuHIsogaiEOhiraMHashizumeKKobayashiHKanekoYandNakagawaraAHighexpressionofSurvivinmappedto17q25issignificantlyassociatedwithpoorprognosticfactorsandpromotescellsurvivalinhumanneuroblastomaOncogene19617623200030KawasakiHAltieriDCLuCDToyodaMTenjoTandTanigawaNInhibitionofapoptosisbysurvivinpredictsshortersurvivalratesincolorectalcancerCancerRes5850715074199831SchmitzMDiestelkoetterPWeigleBSchmachtenbergFStevanovicSOckertDRammenseeHGandRieberEPGenerationofsurvivinspecificCD8TeffectorcellsbydendriticcellspulsedwithproteinorselectedpeptidesCancerRes6048454849200032AndersenMHPedersenLOBeckerJCandthorStratenPIdentificationofaCytotoxicTLymphocyteResponsetotheApoptoseInhibitorProteinSurvivininCancerPatientsCancerRes61869872200133LeeKHPanelliMCKimCJRikerAIBettinottiMPRodenMMFetschPAbatiARosenbergSAandMarincolaFMFunctionaldissociationbetweenlocalandsystemicimmuneresponseduringantimelanomapeptidevaccinationJImmunol16141834194199834RosenbergSAYangJCSchwartzentruberDJHwuPMarincolaFMTopalianSLRestifoNPDudleyMESchwarzSLSpiessPJWunderlichJRParkhurstMRKawakamiYSeippCAEinhornJHandWhiteDEImmunologicandtherapeuticevaluationofasyntheticpeptidevaccineforthetreatmentofpatientswithmetastaticmelanomaNatMed4321327199835AltmanJDMossPAGoulderPJRBarouchDHMcHeyzerWilliamsMGBellJIMcMichaelAJandDavisMMPhenotypicanalysisofantigenspecificTlymphocytesScience2749496199636SchramaDAndersenMHTerheydenPSchroderLPedersenLOthorStratenPandBeckerJCOligoclonalTCellReceptorUsageOfMelanocyteDifferentiationAntigenreactiveTCellsinStageIVMelanomaPatientsCancerRes61493496200137LuxembourgATBorrowPTeytonLBrunmarkABPetersonPAandJacksonMRBiomagneticisolationofantigenspecificCD8TcellsusableinimmunotherapyNatBiotechnol16281285199838KirkinAFReichertPetersenTOlsenACLiLthorStratenPandZeuthenJGenerationofhumanmelanomaspecificTlymphocyteclonesdefiningnovelcytolytictargetswithpanelsofnewlyestablishedmelanomacelllinesCancerImmunolImmunother417181199539ScheibenbogenCLeeKHMayerSStevanovicSMoebiusUHerrWRammenseeHGandKeilholzUAsensitiveELISPOTassayfordetectionofCD8TlymphocytesspecificforHLAclassIbindingpeptideepitopesderivedfrominfluenzaproteinsinthebloodofhealthydonorsandmelanomapatientsClinCancerRes3221226199740thorStratenPGuldbergPGronbaekKZeuthenJandBeckerJCInSituTCellResponsesagainstMelanomaCompriseHighNumbersofLocallyExpandedTCellClonotypesJImmunol163443447199941KesslerJHBeekmanNJBresVloemansSAVerdijkPvanVeelenPAKloostermanJoostenAMVissersDCtenBoschGJKesterMGSijtsAWouterDJOssendorpFOffringaRandMeliefCJEfficientidentificationofnovelHLAA0201presentedcytotoxicTlymphocyteepitopesinthewidelyexpressedtumorantigenPRAMEbyproteasomemediateddigestionanalysisJExpMed1937388200142deVriesTJFourkourAWobbesTVerkroostGRuiterDJandvanMuijenGNHeterogeneousexpressionofimmunotherapycandidateproteinsgp100MART1andtyrosinaseinhumanmelanomacelllinesandinhumanmelanocyticlesionsCancerRes5732233229199743JagerERinghofferMKarbachJArandMOeschFandKnuthAInverserelationshipofmelanocytedifferentiationantigenexpressioninmelanomatissuesandCD8cytotoxicTcellresponsesevidenceforimmunoselectionofantigenlossvariantsinvivoIntJCancer66470476199644CormierJNAbatiAFetschPHijaziYMRosenbergSAMarincolaFMandTopalianSLComparativeanalysisoftheinvivoexpressionoftyrosinaseMART1MelanAandgp100inmetastaticmelanomalesionsimplicationsforimmunotherapyJImmunother212731199845RikerACormierJPanelliMKammulaUWangEAbatiAFetschPLeeKHSteinbergSRosenbergSandMarincolaFImmuneselectionafterantigenspecificimmunotherapyofmelanomaSurgery126112120199946MaeurerMJGollinSMMartinDSwaneyWBryantJCastelliCRobbinsPParmianiGStorkusWJandLotzeMTTumorescapefromimmunerecognitionlethalrecurrentmelanomainapatientassociatedwithdownregulationofthepeptidetransporterproteinTAP1andlossofexpressionoftheimmunodominantMART1MelanAantigenJClinInvest9816331641199647GrossmanDKimPJSchechnerJSandAltieriDCInhibitionofmelanomatumorgrowthinvivobysurvivintargetingProcNatlAcadSciUSA98635640200148TammIWangYSausvilleEScudieroDAVignaNOltersdorfTandReedJCIAPfamilyproteinsurvivininhibitscaspaseactivityandapoptosisinducedbyFasBaxcaspasesandanticancerdrugsCancerRes5853155320199849MonzoMRosellRFelipEAstudilloJSanchezJJMaestreJMartinCFontABarnadasAandAbadAAnovelantiapoptosisgeneReexpressionofsurvivinmessengerRNAasaprognosismarkerinnonsmallcelllungcancersJClinOncol1721002104199950NakagawaraAMolecularbasisofspontaneousregressionofneuroblastomaroleofneurotrophicsignalsandgeneticabnormalitiesHumCell11115124199851RenkvistNCastelliCRobbinsPFandParmianiGAlistingofhumantumorantigensrecognizedbyTcellsCancerImmunolImmunother50315200152MeliefCJToesREMedemaJPvanderBurgSHOssendorpFandOffringaRStrategiesforimmunotherapyofcancerAdvImmunol7523582235282200053GilboaEThemakingsofatumorrejectionantigenImmunity11263270199954LiFAmbrosiniGChuEYPlesciaJTogninSMarchisioPCandAltieriDCControlofapoptosisandmitoticspindlecheckpointbysurvivinNature396580584199855ZaffaroniNandDaidoneMGSurvivinexpressionandresistancetoanticancertreatmentsperspectivesfornewtherapeuticinterventionsDrugResistUpdat56572200256ShinozawaIInokuchiKWakabayashiIandDanKDisturbedexpressionoftheantiapoptosisgenesurvivinandEPR1inhematologicalmalignanciesLeukRes24965970200057GranzieroLGhiaPCircostaPGottardiDStrolaGGeunaMMontagnaLPiccoliPChilosiMandCaligarisCappioFSurvivinisexpressedonCD40stimulationandinterfacesproliferationandapoptosisinBcellchroniclymphocyticleukemiaBlood9727772783200158AmbrosiniGAdidaCandAltieriDCAnovelantiapoptosisgenesurvivinexpressedincancerandlymphomaNatMed3917921199759AltieriDCValidatingsurvivinasacancertherapeutictargetNatRevCancer34654200360OlieRASimoesWustAPBaumannBLeechSHFabbroDStahelRAandZangemeisterWittkeUAnovelantisenseoligonucleotidetargetingsurvivinexpressioninducesapoptosisandsensitizeslungcancercellstochemotherapyCancerRes6028052809200061AndersenMHandthorStratenPSurvivinauniversaltumorantigenHistolHistopathol17669675200262AndersenMHPedersenLOCapellerBBrockerEBBeckerJCandthorSPSpontaneouscytotoxicTcellresponsesagainstsurvivinderivedMHCclassIrestrictedTcellepitopesinsituaswellasexvivoincancerpatientsCancerRes6159645968200163CurrierJRKutaEGTurkEEarhartLBLoomisPriceLJanetzkiSFerrariGBirxDLandCoxJHApanelofMHCclassIrestrictedviralpeptidesforuseasaqualitycontrolforvaccinetrialELISPOTassaysJImmunolMethods260157172200264ElvinJPotterCElliottTCerundoloVandTownsendAAmethodtoquantifybindingofunlabeledpeptidestoclassIMHCmoleculesanddetecttheirallelespecificityJImmunolMethods158161171199365RuppertJSidneyJCelisEKuboRTGreyHMandSetteAProminentroleofsecondaryanchorresiduesinpeptidebindingtoHLAA21moleculesCell74929937199366thorStratenPBarfoedASeremetTSaeterdalIZeuthenJandGuldbergPDetectionandcharacterizationofalphabetaTcellclonalitybydenaturinggradientgelelectrophoresisBiotechniques25244250199867RammenseeHBachmannJEmmerichNPBachorOAandStevanovicSSYFPEITHIdatabaseforMHCligandsandpeptidemotifsImmunogenetics50213219199968SchramaDPedersenLsLOKeikavoussiPAndersenMHStratenPPBrockerEBKampgenEandBeckerJCAggregationofantigenspecificTcellsattheinoculationsiteofmaturedendriticcellsJInvestDermatol11914431448200269MahotkaCWenzelMSpringerEGabbertHEandGerharzCDSurvivindeltaEx3andsurvivin2BtwonovelsplicevariantsoftheapoptosisinhibitorsurvivinwithdifferentantiapoptoticpropertiesCancerRes5960976102199970HicklinDJMarincolaFMandFerroneSHLAclassIantigendownregulationinhumancancersTcellimmunotherapyrevivesanoldstoryMolMedToday5178186199971SeligerBCabreraTGarridoFandFerroneSHLAclassIantigenabnormalitiesandimmuneescapebymalignantcellsSeminCancerBiol12313200272SetteAVitielloARehermanBFowlerPNayersinaRKastWMMeliefCJOseroffCYuanLRuppertJandTherelationshipbetweenclassIbindingaffinityandimmunogenicityofpotentialcytotoxicTcellepitopesJImmunol15355865592199473MoudgilKDandSercarzEECanantitumorimmuneresponsesdiscriminatebetweenselfandnonselfImmunolToday15353355199474ParkhurstMRSalgallerMLSouthwoodSRobbinsPFSetteARosenbergSAandKawakamiYImprovedinductionofmelanomareactiveCTLwithpeptidesfromthemelanomaantigengp100modifiedatHLAA0201bindingresiduesJImmunol15725392548199675GuichardGZerbibALeGalFAHoebekeJConnanFChoppinJBriandJPandGuilletJGMelanomapeptideMART1analogueswithenhancedbindingcapacitytothehumanclassIhistocompatibilitymoleculeHLAA2byintroductionofabetaaminoacidresidueimplicationsforrecognitionbytumorinfiltratinglymphocytesJMedChem4338033808200076ClayTMCusterMCMcKeeMDParkhurstMRobbinsPFKerstannKWunderlichJRosenbergSAandNishimuraMIChangesinthefinespecificityofgp100reactiveTcellsinpatientsfollowingvaccinationwithapeptidemodifiedatanHLAA21anchorresidueJImmunol16217491755199977MeliefCJvanderBurgSHToesREOssendorpFandOffringaREffectivetherapeuticanticancervaccinesbasedonprecisionguidingofcytolyticTlymphocytesImmunolRev188177182200278JagerERinghofferMAltmannsbergerMArandMKarbachJJagerDOeschFandKnuthAImmunoselectioninvivoindependentlossofMHCclassIandmelanocytedifferentiationantigenexpressioninmetastaticmelanomaIntJCancer71142147199779ThurnerBHaendleIRoderCDieckmannDKeikavoussiPJonuleitHBenderAMaczekCSchreinerDvondenDPBrockerEBSteinmanRMEnkAKampgenEandSchulerGVaccinationwithmage3A1peptidepulsedmaturemonocytederiveddendriticcellsexpandsspecificcytotoxicTcellsandinducesregressionofsomemetastasesinadvancedstageIVmelanomaJExpMed19016691678199980YeeCThompsonJARochePByrdDRLeePPPiepkornMKenyonKDavisMMRiddellSRandGreenbergPDMelanocytedestructionafterantigenspecificimmunotherapyofmelanomadirectevidenceoftcellmediatedvitiligoJExpMed19216371644200081SimonRMSteinbergSMHamiltonMHildesheimAKhleifSKwakLWMackallCLSchlomJTopalianSLandBerzofskyJAClinicaltrialdesignsfortheearlyclinicaldevelopmentoftherapeuticcancervaccinesJClinOncol19184818542001"