"宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖RNAを宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該dsRNAが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。宿主細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、二本鎖RNAを宿主細胞に、標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含み、該dsRNAが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする当該方法。標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNAを含む当該組成物。標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子の非翻訳配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNAを、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNAを含む当該組成物。標的遺伝子の発現を減衰させるための組成物であって、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のイントロン配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する二本鎖RNAを、発現時に生成する発現ベクターを含む当該組成物。dsRNAがハイブリダイズする標的遺伝子の非翻訳配列を、プロモーター配列及びエンハンサー配列よりなる群から選択する、請求項1に記載の方法又は請求項3若しくは4に記載の組成物。宿主細胞を培養に懸濁させる、請求項1及び2の何れかに記載の方法。宿主細胞が一動物個体内にある、請求項1及び2の何れかに記載の方法。標的遺伝子が、宿主細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。標的遺伝子が、異種遺伝子である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。標的遺伝子が、ウイルス遺伝子である、請求項11に記載の方法。宿主細胞が、霊長類細胞である、請求項1及び2の何れかに記載の方法。宿主細胞が、ヒトの細胞である、請求項13に記載の方法。dsRNAが、短い干渉性の二本鎖RNAであって、該RNAが宿主細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法又は請求項3若しくは5に記載の組成物。dsRNAが、15~45塩基対長である、請求項15に記載の方法又は組成物。dsRNAが、19~30塩基対長である、請求項15に記載の方法又は組成物。dsRNAが、少なくとも一の転写産物を生成するコード配列を有する発現ベクターによって細胞内で生成され、該転写産物が宿主細胞によりプロセッシングを受けてsiRNAになることを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法。dsRNAが、ヘアピンRNAであって、該RNAが宿主細胞によりプロセッシングを受けてsiRNA種になることを特徴とする、請求項1及び2の何れかに記載の方法又は請求項3若しくは5に記載の組成物。標的遺伝子の発現が、少なくとも10倍減衰される、請求項1及び2の何れかに記載の方法。下記:哺乳動物細胞内の短い干渉性二本鎖RNAであり又は該RNAを生じさせて標的遺伝子の発現を減衰させる二本鎖RNAの医薬製剤;及び該製剤を患者に投与するためのラベル又は使用説明書を含む医薬パッケージであって、このdsRNAは、哺乳動物細胞において、標的遺伝子の発現を減衰させるのに効果的な濃度で有意のPKR依存性応答を生じない当該医薬パッケージ。siRNAが、標的遺伝子の非転写配列又は非コード配列にハイブリダイズする、請求項21に記載の医薬パッケージ。請求項3~6の何れかに記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細胞内の標的遺伝子の発現を減衰させる方法。標的遺伝子の発現を減衰させることが、細胞の望ましくない増殖又は分化を減少させる、請求項23に記載の方法。短い干渉性二本鎖RNAを生成する方法であって、下記を含む当該方法:下記:相補的なセンス及びアンチセンス標的配列を含む二本鎖核酸RNAポリメラーゼを含むインビトロ転写系を用意し、該標的配列は、RNAポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写されてアニールしてsiRNAを形成することができ;そして該siRNAを該インビトロ転写系から単離する。RNAポリメラーゼが、バクテリオファージRNAポリメラーゼである、請求項25に記載の方法。RNAポリメラーゼを、T3ポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ及びSP6ポリメラーゼよりなる群から選択する、請求項26に記載の方法。インビトロ転写系が、siRNA種の多彩なライブラリーを生成する標的配列の多彩なライブラリーを含む、請求項25に記載の方法。短い干渉性二本鎖RNAの送達事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法:ユーザーにより指名された配列を有するsiRNA種の注文を受理し;下記:該ユーザーが指名したsiRNA種についての相補的なセンス及びアンチセンス配列の標的配列を有する二本鎖核酸、及びRNAポリメラーゼを含むインビトロ転写系を用意し、該標的配列は、RNAポリメラーゼのためのプロモーターと隣接し、センス及びアンチセンス標的配列は転写され、アニールしてsiRNAを形成することができ;該siRNAを該インビトロ転写系から単離し;そして該siRNAを梱包して該ユーザーに送付する。ドナー幹細胞又はその子孫のMHC表現型を変える方法であって、二本鎖RNAを幹細胞に、該RNAを導入しなければ該幹細胞又はその子孫によって発現されたMHC遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。dsRNAが、少なくとも一つのヒト白血球抗原の発現を減少させる、請求項30に記載の方法。少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNAのドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じる変化したMHC表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫の培養物。患者の移植の方法であって、下記を含む当該方法:少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNAのドナー幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したMHC表現型を有するドナー幹細胞又はその子孫のエキスビボ細胞又は組織培養を生成し該患者に、該細胞又は組織培養物を移植する。患者への移植のための細胞性医薬の製造における幹細胞の利用であって、該細胞性医薬が、幹細胞又はその子孫を含み、それらが、少なくとも一つのMHC遺伝子の発現の、二本鎖RNAの幹細胞への導入による安定な減衰から生じた変化したMHC表現型を有する当該利用。請求項3~6の何れかに記載の組成物の、少なくとも一つの遺伝子の発現をインビボで減衰させる医薬の製造における利用。宿主細胞の病原体の感染に対する罹病性を低下させる方法であって、二本鎖RNAを該宿主細胞に、該病原体の発現に必要な少なくとも一つの遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で導入することを含む当該方法。病原体がウイルスであり、dsRNAが、該ウイルスの宿主細胞への感染に必要な細胞表面タンパク質の発現を減衰させる、請求項36に記載の方法。二本鎖RNA転写産物をコードする導入遺伝子を含む生殖細胞系列及び/又は体細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該転写産物は、プロセッシングを受けて短い干渉性の二本鎖RNA種になり、該導入遺伝子の転写が、該動物の少なくとも一つの細胞型において、内因性標的遺伝子の発現を減衰させることを特徴とする当該トランスジェニック動物。前記の導入遺伝子についてキメラである、請求項38に記載のトランスジェニック動物。前記の導入遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項38に記載のトランスジェニック動物。導入遺伝子が、別個の相補的転写物を転写し、該転写物はアニールして前記のsiRNAを形成し、該siRNAが、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で、有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする、請求項38に記載のトランスジェニック動物。導入遺伝子が、ヘアピンRNAを転写し、該RNAがプロセッシングを受けて前記のsiRNAになる、請求項38に記載のトランスジェニック動物。ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び該第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンRNAであって、このヘアピンRNAは、該標的遺伝子の発現を減衰させて、標的遺伝子の発現を減衰させるのに有効な濃度で有意のPKR依存性応答を生じないことを特徴とする当該ヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、化学合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、インビトロで酵素により合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、インビトロでT7RNAポリメラーゼにより合成されたものである、請求項45に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、インビボで酵素により合成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、インビボでRNAポリメラーゼIIIにより合成されたものである、請求項47に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、ベクターにより生成されたものである、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、約20~50ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、約50~100ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンRNAが、約100~500ヌクレオチドのサイズを有する、請求項43に記載のヘアピンRNA。ヘアピンのループ内に制限酵素部位を含む、請求項43に記載のヘアピンRNA。二本鎖RNAdsRNAは、ショウジョウバエ、C.エレガンス、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類及び植物といった多くの生体内で遺伝子サイレンシングを誘発することができる。しかし、当業者がこの現象を高等真核生物、特に哺乳類細胞において再現するには至っていない。あるいは、培養された真核細胞においてこの現象を観察できるということが、先行技術で実証されたことはない。加えて、先行技術により確立された法則は、RNAiがエキソン配列を必要とするということを教示しており、それ故、イントロン又はプロモーター配列よりなる構築物は、RNAiの媒介において効果的な試薬であるとは考えられなかった。本発明は、これらの従来技術の欠陥の各々を扱うことを目的としており、RNAiが培養親核生物細胞において観察されうるということと非エキソン配列よりなるRNAi構築物が効果的に遺伝子発現を抑制しうるということの両方の証拠を提供する。発明の概要本発明の一つの特徴は、標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量の二本鎖RNAdsRNAを細胞に導入することを包含する、培養細胞において標的遺伝子の発現を減衰させる方法にして、前記dsRNAが、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含することを特徴とする方法を提供する。本発明の別の特徴は、哺乳類細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法にして、i細胞内でDicer活性又はArgonaut活性の片方又は両方を活性化し、そしてii標的遺伝子の発現を減衰させるのに充分な量のdsRNAを細胞に導入するここでdsRNAは、標的遺伝子のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含することを含む方法を提供する。ある態様においては、細胞は培養に懸濁される。他の態様においては、細胞は例えば非ヒト哺乳動物等の動物一個体内にある。ある好ましい態様においては、細胞はiDicer活性をコードする組換え遺伝子、iiArgonaut活性をコードする組換え遺伝子、又はiiiその両方で遺伝子工学処理される。例えば組換え遺伝子は、配列番号2又は4と、少なくとも50の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよい;あるいは2×SSC、22°Cの洗浄条件下で配列番号1又は3とハイブリダイズするコード配列、と定義されるものであってもよい。ある態様においては、組換え遺伝子は例えば、図24に示すArgonaut配列と、少なくとも50の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよい。ある具体例において、組換え体遺伝子は、配列番号2又は4に対する少なくとも60パーセント、70パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント又は95パーセントのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができる。ある具体例において、組換え体遺伝子は、0.2×から2.0×SSCより選択する洗浄ステップを含むストリンジェントな条件化で配列番号1又は3とハイブリダイズするコード配列により規定される。ある態様においては、複数の異種発現構築物を用いないで、例えば遺伝子活性化技術、活性化転写因子の発現、又は遺伝子の発現を誘導する他のシグナル変換タンパク質によって、あるいはタンパク質発現のレベルをアップレギュレートする又はタンパク質の分解を阻害する内因性因子で処理することによって、内因性Dicer遺伝子又はArgonaut遺伝子を活性化することができる。ある好ましい態様においては、標的遺伝子は細胞の内因性遺伝子である。他の態様においては、標的遺伝子は、病原体遺伝子例えばウイルス遺伝子等の、細胞ゲノムに対して異種の遺伝子である。ある態様においては、細胞は、プロテインキナーゼRNA活性化PKRアポトーシスを阻害する作用物質で処理される。例えばPKRの発現の阻害、PKRの破壊、及び/又はPKRのキナーゼ活性の阻害をする作用物質で処理される。ある好ましい態様においては、細胞は霊長類細胞、例えばヒト細胞である。ある好適具体例において、dsRNAの長さは、少なくとも20、21又は22ヌクレオチド長であり、サイズにおいて、例えば、Dicer依存性の開裂により生じるRNA産物に対応している。ある具体例において、このdsRNA構築物は、少なくとも25、50、100、200、300又は400塩基である。ある具体例において、このRNA構築物は、400~800塩基長である。ある好適具体例において、標的遺伝子の発現は、例えば、未処理の細胞又は標的遺伝子に対応しないdsRNA構築物で処理した細胞と比較して、少なくとも5倍、一層好ましくは少なくとも10、20又は50倍さえ減衰する。本発明の更に別の面は、培養細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、該方法は、該細胞中で転写時に標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で二本鎖RNAを生成するコード配列を有する発現ベクターを導入することを含み、dsRNAが、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む当該方法を提供する。ある具体例において、このベクターは、両方向の転写を引き起こしてコード配列の相補的転写物を形成する転写調節配列に操作可能に結合されたdsRNAの一本鎖コード配列を含む。他の具体例において、このベクターは、2つのコード配列を含み、それらは、それぞれ、アニールしたときにdsRNAを形成する2つの相補的配列を生じさせる。更に別の具体例において、このベクターは、ヘアピンを形成するコード配列を含む。ある具体例において、これらのベクターは、例えばエピソーム性であり、トランスフェクションは、一過性である。他の具体例においては、これらのベクターは、染色体に組み込まれて、例えば、安定にトランスフェクトされた細胞株を生じる。かかる安定な細胞株を形成するための好適なベクターは、米国特許第6,025,192号及びPCT公開WO/9812339に記載されている。本発明の他の面は、培養細胞における標的遺伝子の発現を減衰させる方法であって、転写時に該細胞において二本鎖RNAを標的遺伝子の発現を減衰させるのに十分な量で生成する非コード配列を有する発現ベクターを導入することを含む当該方法を提供する。この非コード配列は、関心ある標的遺伝子のイントロン又はプロモーター配列を含むことができ、このdsRNAは、ストリンジェントな条件下で標的遺伝子のプロモーター又はイントロンのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。ある具体例において、このベクターは、両方向の転写を引き起こして配列の相補的転写物を形成する転写調節配列に操作可能に結合されたdsRNAのための単一の配列を含む。他の具体例において、このベクターは、2つの配列を含み、それらは、それぞれ、アニールしたときにdsRNAを形成する2つの相補的配列を生じさせる。更に別の具体例において、このベクターは、ヘアピンを形成するコード配列を含む。ある具体例において、これらのベクターは、例えばエピソーム性であり、トランスフェクションは、一過性である。他の具体例において、これらのベクターは、染色体に組み込まれて、例えば安定にトランスフェクトされた細胞株を生成する。かかる安定な細胞株の形成に好適なベクターは、米国特許第6,025,192号及びPCT公開WO/9812339に記載されている。本発明の他の面は、哺乳動物の遺伝子の発現を阻止するための二本鎖RNAを提供する。このdsRNAは、0.2×SSC、65°Cでの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列及び該第一のヌクレオチド配列に相補的な第二のヌクレオチド配列を含む。一具体例において、前記の二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも20、21、22、25、50、100、200、300、400、500、800ヌクレオチド長である。他の具体例において、前記の二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子と同じである。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、一つの哺乳動物遺伝子と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で少なくとも一つのヒト遺伝子とハイブリダイズする。更に別の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒト遺伝子と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、一つのヒト遺伝子と同じである。この二本鎖RNAは、siRNA又はヘアピンであってよく、一時的に発現されても、安定に発現されてもよい。一具体例において、この二本鎖RNAは、ストリンジェントな条件下で少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第一のヌクレオチド配列、及び第一のヌクレオチド配列の相補的逆向き反復であって且つ該第一のヌクレオチド配列とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する第二のヌクレオチド配列を含むヘアピンである。該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列又は非コード配列の何れかとハイブリダイズすることができる。一具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子のコード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子のコード配列と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子のコード配列と同じである。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子の非コード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子の非コード配列とハイブリダイズする。他の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つの哺乳動物遺伝子の非コード配列と同じである。更に別の具体例において、該二本鎖RNAの第一のヌクレオチド配列は、少なくとも一つのヒトの遺伝子の非コード配列と同じである。前記の具体例の何れかにおいて、非コード配列は、非転写配列であってよい。本発明の更に別の面は、細胞において特定の表現型を与える原因である核酸配列を、コード配列であれ非コード配列であれ、同定するためのアッセイであって、該アッセイは、下記:二本鎖DNAを生成するためのプロモーターに対して一つの方向性を有する、細胞に由来する核酸配列の多彩なライブラリーを構築し;該多彩なdsRNAライブラリーを標的細胞の培養物に導入し;該細胞に特定の表現型を与えるライブラリーのメンバーを同定することを含み、該ライブラリーのメンバーに対応する、細胞由来の配列を同定することを特徴とする当該アッセイを提供する。本発明の更に別の面は、薬物送達事業を行なう方法であって、下記:RNAiにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を、主題のアッセイにより同定し;標的遺伝子の発現又は標的遺伝子の発現産物の活性を阻害する能力により薬剤を同定し;工程で同定された薬剤又はその類似体の、動物における効力及び毒性についての治療剤プロファイリングを行ない;そして工程で許容しうる治療剤プロフィルを有するとして同定された少なくとも一種の薬剤を含む医薬組成物を配合することを含む当該方法を提供する。この方法は、医薬製剤を販売のために分配するための分配システムを確立する更なる工程及び該医薬製剤のマーケティングのための販売グループを確立する工程を含むことができる。本発明の他の面は、標的を定めた送達の事業を行なう方法であって、下記を含む当該方法を提供する:RNAiにより阻害されたときに表現型として望ましい応答を与える標的遺伝子を主題のアッセイにより同定し;該標的遺伝子の治療剤プロファイリングを、動物における効力と毒性について行ない;そして該標的遺伝子の素外在の更なる開発の権利を第三者に許諾する。本発明の別の特徴は、RNAi酵素の発現又は活性を阻害することによって、RNAiを阻害する方法を提供する。従って、主題の方法は、Dicer及び/又は22量体RNAの活性を阻害することを含んでいてもよい。更に別の特徴は、RNAi酵素のRNA成分の配列を改変することによって、RNAiの特異性を変える方法に関する。他の面において、未分化幹細胞又は分化したその子孫における遺伝子発現は、本発明のdsRNAの導入により変化される。一具体例において、これらの幹細胞は、胚性幹細胞である。好ましくは、これらの胚性幹細胞は、哺乳動物に由来し、一層好ましくは、非ヒト霊長類に由来し、最も好ましくは、ヒトに由来する。これらの胚性幹細胞は、当業者に公知の方法によって、胚盤胞ステージの胎児の内部細胞塊から単離することができる。一具体例において、これらの胚性幹細胞は、以前に樹立された細胞株から得られる。第二の具体例において、これらの胚性幹細胞は、標準的方法によって、デノボで得られる。他の面において、これらの胚性幹細胞は、核トランスファーの結果である。ドナーの核は、任意の成体、胎児又は胎児組織から、当分野で周知の方法により得られる。一具体例において、ドナーの核は、予め改変されたレシピエントの卵母細胞にトランスファーされる。一具体例において、卵母細胞を、少なくとも一のdsRNAを利用して改変する。レシピエントの卵母細胞の典型的な改変には、改変卵母細胞に由来する胎児の子宮壁への上首尾の移植を阻害する、遺伝子又はタンパク質発現における任意の変化が含まれる。子宮壁への移植は、受精した哺乳動物胎児が胚盤胞ステージを超えて進行するのに必須であるので、かかる改変を受けた卵母細胞から生成した胎児は、生存力のある生物体を生じさせることができない。かかる改変の非制限的例には、胚盤胞と子宮壁との間での認識に必要な細胞表面レセプターの発現を減じ又は排除するもの、子宮内層のマトリクスを消化し、そうして、適当な移植を可能にするのに必要なプロテアーゼの発現を減じ又は排除する改変、並びに胚盤胞が透明帯から孵化するのに必要なプロテアーゼの発現を減じ又は排除する改変が含まれる。かかる孵化は、移植に必要である。他の具体例において、胚性幹細胞、又はそれらの分化した子孫は、少なくとも一のdsRNAを利用して改変し又は更に改変することができる。好適具体例において、この改変は、MHC発現を減じ又は排除する。この方法で改変された細胞は、レシピエントに許容され、そうして、移植片の拒絶により生じる合併症を回避することができる。かかる改変細胞は、血縁のある又はない患者に移植して細胞の損傷又は喪失により特徴付けられる状態を治療するのに適している。この発明の他の面において、未分化幹細胞は、成体の幹細胞である。典型的な成体幹細胞には、造血幹細胞、間充織幹細胞、心臓幹細胞、膵臓幹細胞、及び神経幹細胞が含まれるが、これらに限られない。典型的な成体幹細胞には、分化した外胚葉、中胚葉又は内胚葉性派生物を形成することのできる任意の幹細胞が含まれる。成体幹細胞から生じる分化した細胞型の非制限的例には、血液、骨格筋、心筋、心内膜、心膜、骨、軟骨、腱、靭帯、結合組織、脂肪組織、肝臓、膵臓、皮膚、神経組織、肺、小腸、大腸、胆嚢、直腸、肛門、膀胱、雌性及び雄性生殖管、性器及び体腔内層が含まれる。一具体例において、未分化成体幹細胞、又は分化したその子孫を、少なくとも一のdsRNAを用いて変化させて、MHC発現を減じ又は排除する。この方法で改変された細胞は、レシピエントに許容され、そうして、移植片拒絶により生じる合併症を回避することができる。かかる改変細胞は、血縁のある又はない患者に移植して、細胞の損傷又は喪失により特徴付けられる状態を治療するのに適している。この発明の他の面において、胚性幹細胞、未分化成体幹細胞、又は胚性幹細胞若しくは成体幹細胞の分化した子孫を、少なくとも一のdsRNAを用いて変化させて、HIV感染に必要な遺伝子の発現を減じ又は排除する。好適具体例において、この幹細胞は、造血幹細胞を生じさせることのできるものである。潜在的造血能力を有する改変細胞を、HIV又はAIDSの予防又は治療として患者に移植することができる。本発明の別の特徴は、RNAi酵素又はその成分の、精製又は半精製調製物に関する。ある態様においては調製物は、RNAi活性を阻害する又は強化する化合物特に、小型有機分子の同定に用いられる。例えば、二本鎖RNAを産生するウイルスで意図的にトランスフェクトした細胞において、低分子の阻害剤を用いて、dsRNA応答を阻害することができる。dsRNA構築物は、1種以上の重合リボヌクレオチド鎖を包含してもよい。リン酸-糖主鎖又はヌクレオシドのどちらかの改変を含んでいてもよい。二本鎖構造は、一本の自己相補的RNA鎖で構成されてもよいし、二本の相補的RNA鎖で構成されてもよい。RNA二本鎖の形成は、細胞内で開始してもよいし、細胞外で開始してもよい。dsRNA構築物は、細胞1個につき少なくとも1コピーの構築物となる量で導入することができる。二本鎖物質の投与量が多いほど、より効力のある阻害を得ることができる。RNAの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的となるという点において、阻害は配列特異的である。ある具体例において、標的遺伝子の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むdsRNA構築物が、阻害には好ましい。標的配列と比べて挿入、欠失及び点突然変異を有するRNA配列も、阻害に有効であることが判明している。従って、当分野で公知のアラインメントアルゴリズムを用い、ヌクレオチド配列間の差異パーセントを計算することによって、配列同一性を最適化することができる。或はRNAの二本鎖領域は、その機能から、標的遺伝子転写物の一部分にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列として定義することができる。他の具体例において、標的遺伝子の非コード部分と同一のヌクレオチド配列を含むdsRNA構築物は、阻害に好適である。典型的な非コード領域には、イントロン及びプロモーター領域が含まれる。標的の非コード配列に対して挿入、欠失及び点突然変異を有する配列も又、利用することができる。この発明の更に別の面は、dsRNA構築物をコードする導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、該dsRNAが、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列の何れかと同じか又は類似しており、好ましくは細胞のゲノムに安定に組み込まれる当該非ヒトトランスジェニック哺乳動物に関係する。これらの動物は、例えば、卵母細胞マイクロインジェクションにより得ることができ、その場合、その動物のすべての有核細胞は、導入遺伝子を含み、或は、導入遺伝子をトランスフェクトされた胚性幹細胞を利用して得ることができ、この場合、その動物はキメラであって、その有核細胞の一部のみが導入遺伝子を含む。ある場合には、配列依存性dsRNA応答も又、導入遺伝子を含む細胞において阻害される。更に別の具体例において、dsRNA自体を、遺伝子スプライシングを遂行するためにES細胞に導入することができ、その表現型は、少なくとも数回の分裂につき、その細胞の子孫に運ばれる。ある好適な具体例の詳細な説明1.概観本発明は、遺伝子を標的とする二本鎖RNAdsRNAを用いて、細胞における遺伝子発現を減衰させる方法を提供する。dsRNAは、阻害対象となる遺伝子標的遺伝子の少なくとも一部分のヌクレオチド配列に、細胞の生理的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列にハイブリダイズすることができる。本発明の特定の態様にとって重要な特徴は、培養哺乳動物細胞内及び生物体一個体内の両方で実際にRNAiを実施することができることを実証したことにある。これは、当分野で以前には報告されていない。本発明の他に顕著な特徴は、高等真核生物、特に哺乳類の非卵母細胞例えば哺乳動物成体由来の細胞においてRNAiの実施が可能なことにある。更に、従来技術の教示と対照的に、我々は、哺乳動物の系におけるRNAiが、標的遺伝子の非コード配列と同じか又は類似するdsRNAにより媒介されうるということを示す。以前は、非コード配列と同じか又は類似するdsRNAはRNAiを阻害しなかったが、かかるdsRNAが、RNAiを媒介するとは考えられないと考えられていた。以下に詳述するように、植物から哺乳動物にわたる真核生物中に進化上保存された必須RNA成分を含む、一連の酵素活性物質によって、RNAi現象が媒介される、という発見に本発明は基づいている。1個の酵素は必須RNA成分を含んでいる。複成分ヌクレアーゼ以下RISCヌクレアーゼと称するは部分的精製の後、基質mRNAに対する相同性によってヌクレアーゼに特異性を与えることのできる、別の22ヌクレオチドRNA種と共に分別される。短いRNA分子は、長い材料dsRNAから、処理反応によって得られる。dsRNA配列に相当する特定のmRNAを破壊するようにRISCヌクレアーゼを誘導するガイド配列として、上記22量体ガイドRNAが機能することが考えられるただしこの仮説に本発明が制限されるべきではない。説明したように、二本鎖形態の22量体のガイドRNAは、遺伝子発現の配列依存性のdsRNA阻害を誘導するのに十分な長さであってよい。説明のための例において、dsRNA構築物を、組換えルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する細胞に投与する。対照用細胞において、ルシフェラーゼレポーターの発現レベルは、値1に規格化される。説明したように、ルシフェラーゼ遺伝子に相補的な長い及び短いdsRNA構築物は、両方とも、遺伝子産物の発現を対照用細胞と比較して阻害することができた。他方、他のタンパク質であるグリーン蛍光タンパク質のコード配列と相補的な類似のサイズのdsRNAは、ルシフェラーゼの発現を有意に達成しなかった。同様に、ルシフェラーゼの一本鎖の22量体は、その遺伝子の発現を阻害しなかった。付属の実施例では、推定ガイドRNAを産生することのできる酵素、Dicerも同定している。Dicerは、dsRNAを特異的に開裂する、ヌクレアーゼのリボヌクレアーゼIIIファミリーの1種であり、蠕形動物、ハエ、植物、菌類からここに記載するように哺乳類にわたって進化上保存されている。この酵素は、ヘリカーゼドメイン及び2個のリボヌクレアーゼIIIモチーフを含む、特有の構造を有している。Dicerは更に、これまでに下等真核生物におけるRNAiに遺伝上関連があるとされているRDE1/QDE2/ARGONAUTEファミリーに対して相同な領域を含んでいる。実際に多くの場合、Dicerの活性化又は過剰発現が、そのほかの非受容性細胞[例えば培養された真核細胞或いは培養基内の又は生物体一個体内の哺乳類細胞非卵母細胞]において十分RNA干渉を起こしうる。ある態様においては、配列依存性アポトーシスを生じさせうるような、宿主細胞による一般的二本鎖RNA応答を阻害する複数の作用物質で細胞を処理することができる。例えば、これらの細胞を、PKRプロテインキナーゼRNAによって活性化されるとして知られるdsRNA依存性プロテインキナーゼを阻害する作用物質で処理することができる。哺乳類細胞における二本鎖RNAは一般に、プロテインキナーゼPKRを活性化して、アポトーシスへと導く。PKRの作用機構は、eIF2αをリン酸化し不活化することを含む[Fire1999TrendsGenet15:358]。PKRによるNF-κBの誘導がアポトーシス拘束に関与し、この過程はIKK複合体の活性化により媒介されるということも報告されている。dsRNAの存在はウイルス生活環の一般的な特徴であるので、この配列非依存性応答は、免疫応答の原始的な一形態を反映したものであろう。本明細書に記載するように、PKR応答を押さえて配列特異的RNAi応答が起こりうることを本発明者らは実証している。しかしある場合においては、PKR発現の阻害、破壊、及び/又はPKFのキナーゼ活性の阻害をする作用物質で細胞を処理するのが望ましいことがあり、本発明の方法においてはこれを使用することが特に企図されている。同様に、IF2αを異所的に活性化する過剰発現又は作用物質を用いることができる。PKR応答を抑制するために用いることのできる他の薬剤には、IκBのIKKリン酸化のインヒビター、IκBユビキチン化のインヒビター、IκB分解のインヒビター、NF-κB核トランスファーのインヒビター、及びNF-κBのκB応答エレメントとの相互作用のインヒビターが含まれる。他の細胞における配列依存性dsRNA応答のインヒビターには、ワクシニアウイルスE3Lの遺伝子産物が含まれる。このE3L遺伝子産物は、2つの別個のドメインを含んでいる。保存されたカルボキシ末端ドメインは、二本鎖RNAに結合して、細胞による抗ウイルス性dsRNA応答を阻害することが示されている。宿主細胞におけるE3L遺伝子の少なくともその部分の発現を利用して、一般的dsRNA応答を抑制することができる。カスパーゼインヒビターは、細胞を二本鎖RNAによって殺されるように感作する。従って、宿主細胞におけるカスパーゼの異所的発現又は活性化を利用して、一般的dsRNA応答を抑制することができる。他の具体例において、主題の方法を、二本鎖RNAに対する一般的応答を殆ど又は全く有しない細胞において実施する。図28~32で説明したように、CHO及びP19細胞は、PKR又は他の一般的dsRNA応答を阻害することなく利用することができる。従って本発明は、細胞特に哺乳類細胞における標的遺伝子の発現を阻害する方法及び組成物を提供する。ある態様においては本発明の方法は、部分又は全体が二本鎖であるRNAdsRNA構築物と称するを細胞内に又は細胞外部環境に導入することを包含する。標的遺伝子の部分からヌクレオチド配列を選択してdsRNA構築物を作製するという点で、阻害は特異的である。このdsRNAは、標的遺伝子のコード配列又は非コード配列と同じものであっても類似するものであってもよい。好ましい態様においては本発明の方法は、Dicer及び/又はArgonaute活性が組換えで発現される又はさもなくば異所で活性化される細胞を利用する。この方法は1遺伝子発現の減衰に有効性を有し、2標的となる遺伝子に特異性を有し、そして3様々な種類の標的遺伝子を阻害できるという点で汎用性を有することが可能である。II.定義簡便のために、本願明細書、実施例及び付属の請求項で用いた特定の用語をここにまとめる。本願明細書でいうベクターとは、それに結合した別の核酸を、運搬することのできる核酸分子のことを言う。ベクターの一つとして、宿主細胞の染色体DNAに統合することのできる、ゲノム統合ベクター又は統合ベクターがある。別種のベクターには、エピソームベクター、すなわち染色体外での複製が可能な核酸がある。操作可能に遺伝子に結合し、その遺伝子の発現を誘導することのできるベクターを、本願明細書では発現ベクターと称する。本願明細書においてプラスミド及びベクターは、文脈から明らかに使い分けているとわかる場合を除いては、特に区別をしていない。本願明細書でいう核酸とは、デオキシリボ核酸DNAや、適当な場合にはリボ核酸RNAなどの、ポリヌクレオチドを意味する。この言葉は更に、本明細書に記載された態様に用いられているように、一本鎖例えばセンス又はアンチセンス及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むものと解されるべきである。本願明細書でいう遺伝子又は組換え遺伝子とは、エキソン及び任意にイントロン配列の両方を含む、本発明のポリペプチドをコードする、開いた読み枠を含む核酸を意味する。この核酸は又、適宜、非コード配列例えばプロモーター又はエンハンサー配列を含むことができる。組換え遺伝子とは、染色体DNAに由来するイントロン配列を任意に含む、上記のような調節ポリペプチドをコードする核酸を意味する。イントロンの語は、所与の遺伝子内において、タンパク質に翻訳されない、一般にエキソンの間に存在するDNA配列を意味する。タンパク質コード配列又は特定のポリペプチド又はペプチドをコードする配列とは、適当な調節配列の制御下に置かれたとき、インビトロで又はインビボで、転写されるDNAの場合及びポリペプチドに翻訳されるmRNAの場合核酸配列のことである。コード配列の境界は、5’アミノ末端における開始コドンと、3’カルボキシ末端における翻訳停止コドンとで定義される。コード配列としては原核又は真核mRNAからのcDNA、原核又は真核DNAからのゲノムDNA配列、及び合成DNA配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。転写終結配列は通常、コード配列の3’側に位置する。同様にコードするとは、文脈から使い分けていると明らかに分かる場合を除いては、一般によく用いられているように、ポリペプチドをコードするDNA配列、並びに抑制性のアンチセンス分子に転写されるDNA配列を含むものとする。主題のRNAi方法によって阻害される遺伝子について用いられているように、機能喪失の語は、dsRNA構築物が存在しない場合のレベルと比較して、遺伝子の発現レベルが少なくとも一つのdsRNA構築物の存在下で減少することを意味する。遺伝子配列に関して用いる発現の語は、遺伝子の転写及び、適当な場合には、得られたmRNA転写物のタンパク質への翻訳のことをいう。従って文脈からも明らかとなるように、タンパク質コード配列の発現は、コード配列の転写及び翻訳が原因で起こる。本願明細書において細胞、宿主細胞又は組換え宿主細胞の語は区別せずに用いられる。これらの語は特定の主題の細胞を意味するだけでなく、その細胞の後代又は潜在的後代をも意味することは理解されよう。突然変異や環境の影響によって、後の世代に何らかの変異が起こる可能性があり、そのような後代は親細胞と実際には同一ではないと思われるが、本願明細書で用いる語の範囲に含まれる。用語培養細胞は、培養中に懸濁された細胞をいう。しかしながら、それは、培養にて供給しうる卵母細胞又は胎児全体を含まない。ある具体例において、これらの培養細胞は、成体細胞である。組換えウイルスの語は、例えば異種核酸構築物をウイルス粒子内に付加又は挿入することによって、遺伝子的に改変されたウイルスを意味する。本願明細書でいう形質導入及びトランスフェクションとは、公知の手法であり、核酸を媒介する遺伝子移入による、受容細胞内への核酸例えば発現ベクターの導入を意味する。本願明細書でいう形質転換とは、外因性DNA又はRNAを細胞内へ取り込んだ結果、細胞の遺伝子型が変化する工程のことをいい、例えば形質転換細胞がdsRNA構築物を発現することをいう。一過的トランスフェクションとは、外因性DNAがトランスフェクト細胞のゲノムと一体化しない場合、例えばエピソームDNAがmRNAに転写されてタンパク質に翻訳される場合をいう。細胞が核酸構築物で安定的にトランスフェクトされたとは、核酸構築物が娘細胞に受け継がれることができる場合をいう。本願明細書でいうレポーター遺伝子構築物とは、少なくとも1個の転写調節配列に操作可能に連結したレポーター遺伝子を含む核酸のことをいう。レポーター遺伝子の転写は、レポーター遺伝子が連結したこれらの配列に制御される。少なくとも1個以上のこれらの制御配列の活性は、標的受容体タンパク質によって、直接的又は間接的に調節することができる。転写制御配列の例としては、プロモーター配列が挙げられる。レポーター遺伝子は、細胞内で異種発現されるプロモーターレポーター遺伝子構築物を含むものとする。本願明細書でいう形質転換細胞とは、無制限の成長状態に自然に変換された細胞、すなわち、培養基内で無限回分裂して成長する能力を備えるようになった細胞のことをいう。形質転換細胞は、成長制御を失ったということについて、新生物形成性、未分化性及び/又は増殖性といった用語で特徴付けることができる。本発明の目的からは、悪性哺乳類細胞の形質転換された表現型及び形質転換された表現型の表現は、細胞培養における成長の持続、半固体培養基での成長、又は免疫不全の又は同質遺伝的な動物における腫瘍形成性成長として観察される、不死化、形態又は成長形質転換、及び腫瘍原性などの、哺乳類細胞の細胞形質転換に関する表現型特性全てを含むことを企図するが、これらに限定されるものではない。本願明細書でいう増殖する及び増殖は、有糸分裂中の細胞についての説明である。本願明細書でいう不死化細胞とは、化学的、遺伝子的及び/又は組換え的手段によって改変され、培養基中で無限回分裂して成長する能力を備えるようになった細胞のことをいう。細胞の成長状態とは、細胞の増殖率、及び細胞の分化状態を意味する。MHC抗原は、ここで用いる場合、少なくとも一つのMHC遺伝子のタンパク質産物をいい;この用語は、レシピエント生物体において免疫応答を引き起こすことのできるMHC遺伝子産物の断片及び類似体を包含する。MHC抗原の例には、ヒトのMHC遺伝子即ちHLA遺伝子の産物が含まれる。用語組織適合性は、異なる個体間の組織の類似性をいう。組織適合性のレベルは、患者とドナーが、どれ程よく一致しているかを記述する。主要組織適合性決定基は、ヒト白血球抗原である。HLA型分類を、潜在的骨髄ドナーと潜在的移植レシピエントとの間で行なって、これらの二者が、どれ程近いHLAマッチかを測定する。このマッチが近いほど、提供された骨髄と患者の身体が互いに反応することが少ない。用語ヒト白血球抗原又はHLAは、白血球細胞及び他のドナーと患者をマッチさせるために利用される組織の表面で見出されるタンパク質をいう。例えば、患者と潜在的ドナーは、HLA-A、B及びDRなどのHLA抗原について試験された白血球細胞を有しうる。各個人は、これらの抗原を二組有する。この理由のために、患者とマッチすることは、無関係の個人よりも兄弟姉妹について一層ありそうなことであり、同じ人種及び民族的背景の人について互いにマッチすることは、一層ありそうなことである。III.単離方法の典型的具体例本発明の一つの特徴は、インビボ又はインビトロの細胞において又は細胞を含まない混合物において、RNAi酵素を誘導する又は異所的に活性化することによって、RNAiを強化する方法を提供する。好ましい態様においては、RNAi活性物質は、活性化されるか、インビトロで又は生物体一個体の部分として供することのできる哺乳類細胞例えばヒト細胞に添加される。他の態様においては、培養中の真核細胞一般卵母細胞を除くを用いて主題の方法を実施する。例えば、組換えを行って発現することによって、Dicer酵素を活性化することもできるし、あるいは、i内因性遺伝子の発現を誘導し、ii分解を防ぐようにタンパク質を安定させ及び/又はiiiKcat、Km又はその両方を変化させることによって活性を増加するようにアロステリックに酵素を改変する、作用物質を用いて活性化することもできる。A.Dicer及びArgonaut活性物質ある態様においては、活性化されたRNAi酵素の少なくとも1個がDicer又はその同族体である。ある好ましい態様においては本発明の方法は、Dicerの異所的活性化を提供する。ここでいうDicerとは、aRNAi応答の媒介となり、b配列番号2又は4に対して少なくとも50の、より好ましくは少なくとも75、85、90又は95の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、及び/又は2×SSC、22°Cさらに好ましくは0.2×SSC、65°Cの洗浄条件下で配列番号1又は3で表されるヌクレオチドとハイブリダイズする核酸によってコードされうるタンパク質のことをいう。従って本方法は、Dicerが組換えにより発現されたさもなくば異所的に活性化された細胞に、dsRNA構築物を導入することを包含する。ある態様においては、活性化されたRNAi酵素の少なくとも1個がArgonaut又はその同族体である。ある好ましい態様においては本発明の方法は、Argonautの異所的活性化を提供する。ここでいうArgonautとは、aRNAi応答の媒介となり、b図24に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも50の、より好ましくは少なくとも75、85、90又は95の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質のことをいう。従って本方法は、Argonautが組換えにより発現されたさもなくば異所的に活性化された細胞に、dsRNA構築物を導入することを包含する。本発明は更に、少なくとも1個の転写調節配列に操作可能に連結した、Dicer又はArgonautポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。操作可能に連結したとは、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に連結されることを意味する。調節配列は当分野で公知のものであり、主題のDicer又はArgonautタンパク質を直接発現するものが選択される。従って転写調節配列の語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素を含む。そのような調節配列については、Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185AcademicPressSanDiegoCA1990に記載がある。例えば、様々な発現制御配列、すなわち操作可能に連結したときにDNA配列の発現を制御する配列を、これらのベクター内で用いて、本発明のDicer又はArgonautポリペプチドをコードするDNA配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列の例としては、ウイルス性LTRモロニーマウス白血病ウイルスのLTRなど、SV40の初期及び後期プロモーター、アデノウイルス又はサイトメガロウイルス最初期プロモーター、lac系、trp系、TAC又はTRC系、T7RNAポリメラーゼによって発現が誘導されるT7プロモーター、ファージλの主要オペレーター及びプロモーター領域、fd外殻タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーターPho5など、酵母菌α-交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、原核細胞又は真核細胞あるいはそれらのウィルスの遺伝子発現を制御することが知られている他の配列、及びそれらの様々な組合せが挙げられる。なお、形質転換される宿主細胞の選択及び/又は発現されるべきタンパク質の種類といった要因に応じて、発現ベクターの設計が変わることは理解されよう。その上更に、ベクターの複製数、その複製数を制御する能力、及びベクターによってコードされる他のタンパク質例えば抗生物質マーカーの発現も、考慮に入れられるべきである。組換えDicer又はArgonaut遺伝子は、原核細胞、真核細胞又はその両方での発現に好適なベクター内に、Dicer又はArgonautポリペプチドをコードする核酸を連結することによって作製することができる。主題のDicer又はArgonautポリペプチドの組換え体の作製に用いられる発現ベクターとしては、プラスミド及び他のベクターが挙げられる。例えば、Dicer又はArgonautポリペプチドの発現に好適なベクターの例として、pBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミド及びpUC由来プラスミドなどの、原核細胞大腸菌などでの発現に用いられるプラスミドが挙げられる。酵母菌内には、組換えタンパク質発現用のベクターが数多く存在する。例えばYEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2及びYRP17は、遺伝子構築物をS.cerevisiaeに導入するのに有用なクローニング及び発現手段である[例えばBroach他1983、ExperimentalManipulationofGeneExpression、MInouye編、AcademicPressp83参照。参照して説明に代える]。これらのベクターは、pBR322oriの存在によって大腸菌内で、又、酵母菌2ミクロンプラスミドの複製決定因子によってS.cerevisiae内で、複製することができる。加えて、アンピシリンなどの薬剤耐性マーカーを用いることができる。例証的な態様においては、Dicer又はArgonaut遺伝子のコード配列をサブクローン化することによって作製した発現ベクターを利用して、Dicer又はArgonautポリペプチドを組換え技術で作製することができる。好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核細胞配列と、真核細胞内で発現される1種以上の真核細胞転写ユニットとの両方を含む。真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例としては、pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及びpHyg由来ベクターが挙げられる。これらのベクターの幾つかは、原核細胞と真核細胞との両方における複製及び薬剤耐性選択性を促進するために、菌プラスミド例えばpBR322由来の配列で改変することができる。或いは、ウシパピローマウイルスBPV-1又はエプスタイン-バーウイルスpHEBo、pREP由来及びp205等のウイルスの派生物を、真核細胞におけるタンパク質の一過的発現に用いることができる。プラスミドの調製と、宿主生物の形質転換に用いられている様々な方法は、当分野で公知である。原核細胞及び真核細胞に好適な他の発現系並びに遺伝子組換え法については、Sambrook、Fritsch及びManiatis篇、MolecularCloningALaboratoryManual第2版ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989第16章及び第17章を参照できる。更に別の態様においては主題の発明は、ゲノムDNAの相同組換えによって、内因性Dicer又はArgonaut遺伝子の転写調節配列を変える遺伝子活性化構築物を提供する。例えば、遺伝子活性化構築物は、Dicer又はArgonaut遺伝子の内因性プロモーターを異種プロモーター例えばDicer又はArgonaut遺伝子の構成的発現を引き起こす、或いはDicer又はArgonautの正常な発現パターンとは異なる条件下で、遺伝子の誘導発現を引き起こすプロモーターに置き換えることができる。遺伝子活性化構築物については様々なタイプが可能である[例えばtheTranskaryoticTherapiesIncのPCT公報WO93/09222、WO95/31560、WO96/29411、WO95/31560及びWO94/12650参照]。好ましい態様においては、遺伝子活性化構築物として用いられるヌクレオチド配列は、1組換えを誘導する、内因性Dicer又はArgonaut遺伝子のある部分からのDNAエキソン配列、イントロン配列、プロモーター配列等と、2遺伝子活性化構築物の組換えに際して、ゲノムDicer又はArgonaut遺伝子のコード配列に操作可能に連結される複数の異種転写調節配列とを包含しうる。Dicer又はArgonaut産生細胞培養の作製用としては、細胞内のノックアウト構築物を検出するために、構築物がレポーター遺伝子を更に含んでいてもよい。遺伝子活性化構築物は細胞に挿入され、天然Dicer又はArgonaut遺伝子と操作可能に関連するように異種調節配列を提供するような位置関係で、細胞のゲノムDNAと統合される。そのような挿入は、相同組換えによって得られる。すなわち、内因性Dicer又はArgonaut遺伝子配列と相同性を有する活性化構築物の組換え領域が、ゲノムDNAにハイブリダイズし、ゲノムDNAの相当部位に構築物が統合されるようにゲノム配列と結合する。組換え領域又は標的配列の語は、ゲノム遺伝子配列例えばゲノム遺伝子の5’フランキング配列を含むに実質的に同一な又は実質的に相補的であり、かつゲノム配列と標的導入遺伝子構築物との間の相同組換えを促進することのできる配列を有している、遺伝子活性化構築物の断片すなわち部分のことをいう。ここでいう交換領域の語は、組換え領域とゲノム配列との相同組換えに続いて、内因性染色体位置内に統合される活性構築物の部分を意味する。異種調節配列例えば交換領域内に提供される異種調節配列は、プロモーター例えば構成又は誘導プロモーター、エンハンサー、負の調節因子、遺伝子座制御領域、転写因子結合部位、又はそれらの組合せから選択される、1種以上の要素を含むことができる。標的遺伝子の発現をインビボで制御するのに用いることのできるプロモーター/エンハンサーの例としては、サイトメガロウイルスCMVプロモーター/エンハンサー[Karasuyama他1989JExpMed169:13]、ヒトβ-アクチンプロモーター[Gunning他1987PNAS84:48314835]、マウス乳癌ウイルス末端反復配列MMTVLTRに存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター[Klessig他1984MolCellBiol4:13541362]、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列MuLVLTR[Weiss他1985RNATumorVirusesColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork]、SV40初期又は後期領域プロモーター[Bernoist他1981Nature290:304310;Templeton他1984MolCellBiol4:817;及びSprague他1983JVirol45:773]、ラウス肉腫ウイルスRSVの3’末端反復配列に含まれているプロモーター[Yamamoto他1980Cell22:787797]、単純性疱疹ウイルスHSVチミジンキナーゼプロモーター/エンハンサー[Wagner他1981PNAS82:356771]及び単純性疱疹ウイルスLATプロモーター[Wolfe他1992NatureGenetics1:379384]が挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に他の態様においては、交換領域は例えば発現を活性化するために天然遺伝子の負の転写制御因子を単に除去するか、例えば標的遺伝子の発現を阻害するために正の制御因子を除去する。B.細胞/生物体標的遺伝子を有する細胞は、あらゆる生物体例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア又は真菌に由来するものであってもよいし、あるいはあらゆる生物体に含んだ状態で用いてもよい。dsRNA構築物はインビボ又はインビトロのいずれで合成してもよい。細胞の内因性RNAポリメラーゼはインビボでの転写を媒介することができるし、あるいはクローニングしたRNAポリメラーゼを用いてインビボ又はインビトロで転写することもできる。インビボで導入遺伝子から二本鎖転写物を作製する際には、調節領域を用いて複数のRNA鎖を転写してもよい。その上、dsRNAは、ヘアピンを形成するRNA鎖を転写し、そうして、dsRNAを生成することによって生成することができる。古典的な遺伝子モデルではなかった生物体内での遺伝子操作が可能になる。特異的な標的遺伝子破壊物を迅速に検定することができるので、育種及びスクリーニングプログラムをより早く行うことが可能になる。遺伝子破壊を用いて、標的遺伝子の機能を発見したり、標的遺伝子が病理状況の原因又は回避に関与している疾病モデルを構築したり、費用の面で改良された生物体の産生することが可能である。標的遺伝子を有する細胞は、あらゆる生物体に由来するものであってもよいし、あるいはあらゆる生物体に含んだ状態で用いてもよい。生物体は植物、動物、原生動物、バクテリア、ウイルス又は真菌であってもよい。植物は単子葉植物、双子葉植物又は裸子植物であってもよい;動物は脊椎動物又は無脊椎動物であってもよい。好ましい微生物には、農業に用いられているもの、工業的に用いられているものが含まれ、植物又は動物の病原となるものがある。真菌には、糸状菌と酵母菌の形態両方の生物体が含まれる。植物の例として、シロイヌナズナ;農作物例えばアルファルファ、大麦、豆、トウモロコシ、綿、アマ、エンドウ、セイヨウアブラナ、イネ、ライ麦、ベニバナ、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、タバコ及び小麦;野菜例えばアスパラガス、ビート、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、キュウリ、ナス、レタス、タマネギ、コショウ、ジャガイモ、パンプキン、ハツカダイコン、ホウレンソウ、カボチャ、タロイモ、トマト及びズッキーニ;果物及び堅果例えばアーモンド、リンゴ、アプリコット、バナナ、セイヨウヤブイチゴ、ブルーベリー、カカオ、サクランボ、ココナッツ、ツルコケモモ、ナツメヤシ、フェイジョア、ハシバミ、ブドウ、グレープフルーツ、グアバ、キーウィ、レモン、ライム、マンゴ、メロン、ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、トケイソウ、モモ、ピーナツ、ナシ、パイナップル、ピスタチオ、プラム、キイチゴ、イチゴ、タンジェリン、クルミ及びスイカ;及び観賞植物例えばハンノキ、トネリコ、ポプラ、ツツジ、カバノキ、ツゲ、ツバキ、カーネーション、キク、ニレ、モミ、キヅタ、ジャスミン、ビャクシン、カシ、ヤシ、ポプラ、マツ、アカスギ、ロドデンドロン、バラ及びゴムが挙げられる。脊椎動物の例としては、魚類及び哺乳類ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、齧歯類、ハムスター、マウス、ラット、霊長類及びヒトが挙げられる。無脊椎動物の例としては、線虫、その他の寄生虫、ショウジョウバエ及び他の昆虫が挙げられる。代表的な線虫の属としては、動物に寄生するもの例えば鉤虫属、アスカリジア属、回虫属、ブノストムム属、線虫属、毛細線虫属、シャベルティア属、クーペリア属、ディクチオカウルス属、ハエルノンカス属Haernonchus、ヘテラキス属、ネマトジルス属、腸結筋虫属、オステルタジア属、蟯虫属、ウマカイチュウ属、円虫属、イヌカイチュウ属、鞭虫属、毛様線虫属、トリコネマ属Tflichonema、トキソカラ属、ウンシナリア属及び植物に寄生するもの[例えばマツノザイセンチュウ属、クリコネリエラ属Criconerriella、クキセンチュウ属、ジャガイモシストセンチュウ属、ナミラセンチュウ属Helicotylenchus、シストセンチュウ属、土壌線虫属Longidorus、キタネコブセンチュウ属、ニセネコブセンチュウ属、ピンセンチュウ属Paratylenchus、ネグサレセンチュウ属、ネモグリセンチュウ属Radopholus、ニセフクロセンチュウ属Rotelynchus、ハリセンチュウ及びジフィネマ属Xiphinema]が挙げられる。代表的な昆虫の目としては、コウチュウ目、ハエ目、チョウ目及びヨコバイ亜目が挙げられる。標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞由来又は体細胞由来であってもよく、全能性又は多能性であってもよく、分割性又は非分割性であってもよく、柔組織性又は上皮性のものであってもよく、不死化した又は形質転換を起こしたものであってもよい。細胞は幹細胞又は分化細胞であってもよい。分化した細胞の種類としては例えば含脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血球、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺又は外分泌腺の細胞が挙げられる。C.標的となる遺伝子標的遺伝子は、細胞由来の遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子であってもよいし、或いは病原体に感染した後の細胞内に存在する、病原体の遺伝子であってもよい。本方法を行うと、標的遺伝子の種類及び運搬される二本鎖RNA物質の量に応じて、標的遺伝子の機能が部分的に又は完全に喪失しうる。物質投与をより少ない量で行い、dsRNA投与後により長い時間置くことで、より少ない量の細胞が阻害される。細胞内における遺伝子発現を定量することによって、標的mRNAの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳のレベルにおける阻害量が同様に示されうる。遺伝子発現の阻害とは、標的遺伝子に由来するタンパク質及び/又はmRNA産物の量における不在又は観察可能な減少のことをいう。特異性とは、細胞の他の遺伝子に明らかな影響を与えることなく標的遺伝子を阻害する能力のことをいう。阻害の結果は、細胞又は生物体の外的な特性を調べることによって下記実施例参照、又は以下のような生化学的方法によって確認することができる。RNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイを用いた遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、酵素結合免疫収着剤検定法ELISA、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイRIA、他のイムノアッセイ及び蛍光励起細胞分析FACSなどである。細胞系又は生物体一個体におけるRNA媒介阻害については、タンパク質産物を容易に検定することのできる遺伝子発現レポーター又は薬剤耐性遺伝子を用いて、有利に調べることができる。そのようなレポーター遺伝子の例としては、アセトヒドロキシ酸生成酵素AHAS、アルカリホスファターゼAP、β-ガラクトシダーゼLacZ、β-グルコロニダーゼGUS、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、緑色蛍光タンパク質GFP、セイヨウワサビペルオキシダーゼHRP、ルシフェラーゼLuc、ノパリン生成酵素NOS、オクトピン生成酵素OCS及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、フォスフィノスリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに耐性を与える、複数の選択マーカーを用いることができる。遺伝子発現を定量することによって、用いたアッセイの種類に応じて、本発明の処理を行っていない細胞と比較して10、33、50、90、95又は99を超える阻害度を測定することが可能になる。物質投与をより少ない量で行い、dsRNA投与後により長い時間置くことで、より少ない量の細胞が阻害される例えば少なくとも10、20、50、75、90又は95の標的細胞。細胞内における遺伝子発現を定量することによって、標的mRNAの蓄積レベル又は標的タンパク質の翻訳レベルにおける阻害量が同様に示されうる。例えば、細胞における遺伝子産物の量を調べることによって、阻害効率を検定することができる。抑制性二本鎖RNAに用いられる領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによってmRNAを検出することもできるし、あるいは翻訳されたポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対して作製した抗体を用いて検出することもできる。ここに記載するように、本発明は特定の標的遺伝子又はヌクレオチド配列に限定されるものではない。しかし例として以下の標的遺伝子類が可能である。発生遺伝子例えば接着性分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Writファミリー、Paxファミリー、Wingedhelixファミリー、Hoxファミリー、サイトカイン/リンフォカイン及びそれらの受容体、増殖/分化因子及びそれらの受容体、神経伝達物質及びそれらの受容体;癌遺伝子例えばABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3及びYES;癌抑制遺伝子例えばAPC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53及びWTI;及び酵素例えばACCシンターゼ及びオキシダーゼ、ACP不飽和化酵素及び水酸化酵素、ADP-グルコースピロフォリラーゼ、ATPアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン生成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、DNA及びRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、顆粒結合澱粉生成酵素、GTPアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン生成酵素、オクトピン生成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調整物質生成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼpullanase、レコンビナーゼ、逆転写酵素、RuBisCo、トポイソメラーゼ及びキシラナーゼなどである。D.dsRNA構築物dsRNA構築物は、1種以上の重合リボヌクレオチド鎖を包含してもよい。構築物は、リン酸-糖主鎖又はヌクレオシドのどちらかの改変を含んでいてもよい。例えば、天然RNAのホスホジエステル結合を改変して、少なくとも1個の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含ませるようにすることができる。dsRNAによってある種の生物体中に起こる一般的なパニック応答を回避しつつ、特異的な遺伝子阻害を可能にするように、RNA構造の改変を調整することができる。同様に、アデノシンデアミナーゼの活性物質を阻害するように、塩基を改変してもよい。dsRNA構築物は、酵素によってあるいは部分的/全体的有機合成によって産生することもできる。インビトロの酵素的又は有機的合成によって、あらゆる改変リボヌクレオチドを導入することができる。dsRNA構築物は、細胞の中にすなわち細胞内に直接導入してもよいし、あるいは細胞外の腔や間隙内、物体の循環系内に導入してもよいし、経口で導入してもよいし、或いはRNAを含む溶液に生物体を浸して導入してもよい。経口導入法の例としては、生物体用の食物にRNAを直接混合する方法や、食物として用いられる種を、RNAを発現するように遺伝工学的に処理して、対象の生物体に食物として与える方法が挙げられる。核酸を導入する物理的な方法としては、RNA溶液の、細胞内への直接注射又は生物体への細胞外注射が挙げられる。二本鎖構造は、1種の自己相補的RNA鎖で構成されてもよいし、2種の相補的RNA鎖で構成されてもよい。二本鎖の形成は、細胞内で誘導されてもよいし、細胞外で誘導されてもよい。RNAは、細胞1個につき少なくとも1個の構築物となる量で導入することができる。二本鎖物質の投与量が多いほど例えば細胞1個につき少なくとも5、10、100、500又は1000個、より効力のある阻害が得られる。少ない投与量も、特定の用途には有用である。RNAの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害の標的となるという点において、阻害は配列特異的である。標的遺伝子のコード配列又は非コード配列の一部分と同一のヌクレオチド配列を含むdsRNA構築物が、阻害には好ましい。標的配列と比べて挿入、欠失及び一点突然変異を含むRNA配列も、阻害に有効であることが判明している。従って、公知の配列比較及び整列アルゴリズム[Gribskov及びDevereuxSequenceAnalysisPrimerStocktonPress1991参照。ここに参照して説明に代える]を用い、ヌクレオチド配列間の差異百分率を計算することによって[例えばBESTFITソフトウェアプログラムに用いられているスミス-ウォーターマンアルゴリズムにおいてデフォルト値を用いてウィスコンシン大学遺伝計算グループ]、配列同一性を最適化することができる。抑制性RNAと標的遺伝子の部分との配列同一性が90を超える又は100であることが好ましい。あるいは、RNAの二本鎖領域は、その機能から、標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズする例えば400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA中で、12-16時間の50°C又は70°Cハイブリダイゼーションを行い、次いで洗浄を行うことのできるヌクレオチド配列として定義することができる。ある好適具体例において、dsRNAの長さは、少なくとも20、21又は22ヌクレオチド長であり、例えば、Dicer依存性開裂により生成されるRNA産物の大きさに対応している。ある具体例において、dsRNA構築物の長さは、少なくとも25、50、100、200、300又は400塩基である。ある態様においては、dsRNA構築物は400-800塩基の長さである。RNAと標的遺伝子との配列同一性が100であることは、本発明の実施には必須条件ではない。従って、遺伝子突然変異、株の多型性又は進化上の発散などを原因として起こりうる、配列上の変異を許容できるという利点を本発明は有する。dsRNA構築物はインビボ又はインビトロのいずれで合成してもよい。細胞の内因性RNAポリメラーゼはインビボでの転写を媒介することができ、あるいはクローニングしたRNAポリメラーゼを用いてインビボ又はインビトロで転写を行うこともできる。インビボでの導入遺伝子又は発現構築物からの転写に際しては、調節領域例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライシングドナー及びアクセプター、ポリAを用いて複数のdsRNA鎖を転写してもよい。阻害の標的化を、器官、組織又は細胞種における特異的な転写;環境条件による刺激例えば感染、ストレス、温度、化学的誘発物質;及び/又はある成長段階又は成長時期における遺伝子工学的転写によって、行うことができる。RNA鎖はポリA化されていてもいなくてもよい。又、RNA鎖は、細胞の有する翻訳系によってポリペプチドに翻訳されることができてもできなくてもよい。dsRNA構築物は手動又は自動の反応により、化学的に又は酵素的に合成されてもよい。dsRNA構築物は細胞のRNAポリメラーゼによって合成されてもよいしバクテリオファージRNAポリメラーゼ例えばT3、T7、SP6によって合成されてもよい。発現構築物の使用と作製については、当分野で公知である更にWO97/32016;米国特許第5,593,874号、第5,698,425号、第5,712,135号、第5,789,214号及び第5,804,693号;及び本願明細書に引用した文献参照。化学的に合成する場合又はインビトロで酵素によって合成する場合、細胞に導入する前にRNAを精製してもよい。例えば溶媒又は樹脂を用いる抽出、沈降、電気泳動、クロマトグラフィー又はそれらの組合せによって、混合物からRNAを精製することができる。あるいは、試料の処理による構築物の損失を避けるために、dsRNA構築物に全く精製を行わなくてもよいし、最少限の精製を行ってもよい。dsRNA構築物は貯蔵のために乾燥してもよいし、水溶液に溶解してもよい。二本鎖のアニーリング及び/又は安定化を促進するために、溶液が緩衝液又は塩を含んでいてもよい。核酸を導入する物理的な方法の例としては、dsRNA構築物を含む溶液の注入、dsRNA構築物で被覆された粒子の打ち出し、RNA溶液中への細胞又は生物体の浸漬、又はdsRNA構築物の存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウイルス粒子に封入したウイルス性構築物は、細胞内への発現構築物の効率的な導入と、発現構築物によりコードされるdsRNA構築物の転写との両方を達成しうる。脂質を媒介する担体輸送、化学物質リン酸カルシウムなどを媒介する輸送など、当分野で他に知られる、細胞への核酸導入方法を用いてもよい。従って、細胞によるRNA吸収量の増加;二本鎖アニーリングの促進;アニールした鎖の安定化;又は標的遺伝子阻害の促進から選ばれる1種以上の動作を行う成分と共に、dsRNA構築物を導入してもよい。E.用途例本発明の1つの用途としては、二本鎖RNAを用いて未知の機能を有する標的遺伝子の活性を阻害することを包含する、生物体、特に高等真核生物における遺伝子機能を同定する方法が挙げられる。突然変異体の単離に時間と手間のかかる従来の遺伝子スクリーニングの代わりに、本発明を用いて標的遺伝子活性の量を低減し及び/又はその活性の時期を変えることによって、機能ゲノム化学から未知の遺伝子機能を調べることができる。本発明を用いることで、製薬の潜在的な標的の調査、発生に関連した通常及び病理事象の理解、出生後発達/エイジングに関与するシグナル経路の決定などが可能になる。哺乳動物ゲノムの全配列などの、ゲノム及び発現遺伝子源からのヌクレオチド配列情報が急速に解明されているが、細胞又は生物体一個体における遺伝子機能の調査に、本発明を組み合わせることができる。特定のコドンを用いるのに適した生物体を選択し、配列データベースから関連の遺伝子産物を探し出し、遺伝特性の連鎖地図をヌクレオチド配列の由来する物理的地図に関連させ、人工知能法を用いることによって、そのような配列決定で得られたヌクレオチド配列から、推定の開いた読み枠を定義することができる。単純な検定としては、発現された配列標識ESTから得られる部分配列に従って、遺伝子発現を阻害するものがある。成長、発生、代謝、病害抵抗性、又は他の生物学的プロセスにおける機能上の改変は、ESTの遺伝子産物の有する通常の役割を示す。標的遺伝子を含む未処理細胞/生物体内へのdsRNA構築物の導入が容易なので、本発明を高処理量スクリーニングHTSに用いることができる。例えば、標的細胞/生物体に由来する遺伝子ライブラリーの挿入物の両脇をはさむプライマーを用いた増幅反応によって、二本鎖RNAを産生することができる。挿入物は、ゲノムDNA又はmRNAに由来するもの例えばcDNA及びcRNAであってもよい。ライブラリーからの個々のクローンは、別々の反応で複製して単離することができるが、本発明の実施に必要な工程数を最小限におさえ、工程の自動化をはかるために、好ましくはライブラリーを別個の反応容器例えば96ウェルミクロ滴定プレートに保持する。典型的具体例において、主題の発明は、RNAi構築物のアレイに整列されたライブラリーを提供する。このアレイは、マルチウェルプレートなどの溶液の形態であってよいし、又は細胞が成長することのできる固体基質上にプリントされたものであってもよい。説明のために、異なる発現遺伝子を阻害することのできる二本鎖RNAを含む溶液をミクロ滴定プレート上の整列した各ウェルに入れることができ、各ウェル内において、標的遺伝子活性を阻害したことによって未処理の細胞/生物体に起こる、動作又は発達における変化を調べることができる。増幅されたRNAは標的遺伝子を含む細胞/生物体に直接に投与又は注入することができる。一具体例において、主題の方法は、RNAi構築物の整列されたライブラリーを利用して、宿主細胞に致死的なRNAiの組合せをスクリーニングする。致死性は、実験遺伝学の根本原理である。合成致死性は、個別的には生物体に許容されるが組み合わさると致死的となる2つの突然変異の特性を述べるものである。主題のアレイを利用して、他の遺伝子の変化と組み合わさると致死的である機能喪失変異を同定することができる。これを達成するために、培養細胞を利用して表現型アレイを造ることができる。遺伝子のセット例えば宿主細胞ゲノムの各々の発現を、RNA干渉を利用して個別に組織的に破壊することができる。オンコジーン及び腫瘍サプレッサー経路における変化との組合せを利用して、合成致死的相互作用を同定することができ、それは、新たな治療標的を同定することができる。ある具体例において、これらのRNAi構築物は、標的遺伝子を含む細胞/生物体に直接供給又は注射することができる。あるいは二本鎖RNAは、ライブラリーを作製するのに用いた発現構築物からインビボ又はインビトロで転写することによって産生することもできる。構築物はライブラリーの個別のクローンとして複製することができ、転写されてRNAを産生する。次いで標的遺伝子を含む細胞/生物体に各クローンを投与又は注入することができる。遺伝子活性が阻害された際に標的遺伝子が細胞/生物体に与えた影響から、標的遺伝子の機能を検定することができる。このスクリーニングを調整して、小さな対象物哺乳類、特に霊長類、及び最も好ましくはヒト由来の組織培養細胞を大量に処理することができる。RFLP又はQTL分析によって生物体の特性が遺伝的多型に関連していると判明した場合には、本発明を用いて、遺伝的多型が特性の直接的原因となっているかどうかについて調べることができる。例えば、そのような遺伝的多型の付近に遺伝的多型又は配列を定義する断片を増幅してRNAを産生し、二本鎖RNAを生物体又は細胞に導入して、特性における変化が阻害に相関しているかどうかを調べることができる。もちろんこの種の検定には、例えば、標的遺伝子の阻害は致死を引き起こす、標的遺伝子の阻害からは観察可能な結果が得られないことがある、断片は標的遺伝子を阻害することのできないヌクレオチド配列を含む、あるいは標的遺伝子の活性物質は重複する、など細かなことであるが負の結果も生じうる。本発明は必須遺伝子の阻害に有用である。そのような遺伝子は特定の発達段階又は特別の細胞区画若しくは組織のみにおいて、細胞又は生物体の生存能力に必要とされていると考えられる。標的遺伝子の活性物質が生存能力に必要でない時点又は場所において、その活性物質を阻害することによって、条件突然変異の機能的同等物を産生することができる。本発明によって、標的ゲノム内に恒久突然変異を導入することなく、発達の特定の時点でかつ生物体の特定の場所において、RNAを付加することができる。本発明は、遺伝子重複のために他の方法を利用して阻害するのが困難であった遺伝子の阻害を可能にするのに有用でありうる。本発明を利用して複数のdsRNAを細胞又は生物体に送達することができるので、複数の遺伝子と同一又は類似のdsRNAを送達することができる。特徴的なエキソンを用いることによって区別可能な転写物ファミリーが、選択的スプライシングによって産生される場合、本発明は適当なエキソンを通じた阻害を標的とし、転写物ファミリーの機能を特異的に阻害する又は特異的に区別するすることができる。例えば、選択的にスプライシングされた膜貫通ドメインを含むタンパク質因子は、膜結合の形態と分泌形態との両方で発現される可能性がある。膜貫通ドメインの前で翻訳を終結させるナンセンス突然変異を単離するかわりに、本発明に従い、膜貫通ドメインを含むエキソンを標的として膜結合ホルモンの発現を阻害することによって、分泌ホルモンのみを有する機能的産物を調べることができる。即ち、主題の方法を、スプライシング変異体の選択された消耗につき利用することができる。本発明は単独で用いてもよいし、試料又は被験体を調べるためのインビトロ又はインビボでのRNA導入を実施するのに必要な少なくとも1種の試薬を含むキットの一部として用いてもよい。好ましい成分はdsRNA及びdsRNAの導入を促進するビークルである。そのようなキットは、ユーザーが本発明を実施するために更に説明書を含んでいてもよい。あるいは商業的又は医療的に有益な結果例えば病原体又はその発病効果に対する耐性、改良された発達、又は新規な発達パターンを得るために、生物体を遺伝子工学処理してdsRNAを産生するようにしてもよい。IV.実施例ここまで一般的に説明した本発明を、下記実施例を参照してより詳しく説明するが、実施例は単に本発明の特定の特徴及び態様を例証するのが目的であって、本発明を限定すると解されるべきではない。実施例1:RNAに誘導されるヌクレアーゼはRNAi遺伝子サイレンシングの媒介となるC.エレガンス、ショウジョウバエ、プラナリア、ヒドラ、トリパノソーマ、菌類及び植物を含む様々な生物体において、二本鎖RNAを導入すると配列特異的に遺伝子発現が阻害されるGeneandDevelopment13139141;SanchezAlvarado及びNewmarkPNAS9650495054;Lohmann等DevelopmentalBiology214211214;Cogoni及びMacinoNature399166169;Waterhouse等PNAS951395913964;Montgomery及びFireTrendsGenet14225228;Ngo等PNAS951468714692。RNA干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれるこれらの応答は、ウイルスに対する防御を提供するか、転位を調節するか、あるいは遺伝子発現を調節するGeneandDevelopment13139141;Montgomery及びFireTrendsGenet14225228;Tabara等Cell99123132;Ketting等Cell99133141;Ratcliff等Science27615581560。この遺伝子現象の機構を解明するために、本発明者らは生化学的方法を用いた。本実施例では、特異的な二本鎖RNAでショウジョウバエ培養細胞をトランスフェクトすることによって機能損失表現型が得られることを示す。これは同族の細胞メッセンジャーRNAのレベルが顕著に低減することに一致する。トランスフェクト細胞の抽出物は、トランスフェクト二本鎖RNAに相同性を有する外因性転写物を特異的に分解するヌクレアーゼ活性物質を含む。この酵素は必須RNA成分を含む。部分的に精製した後、基質mRNAとの相同性を通じて酵素に特異性を与える別個の~25ヌクレオチドRNAと共に、配列特異的ヌクレアーゼを分別した。二本鎖RNAdsRNAはショウジョウバエを含む数多くの生物体において遺伝子サイレンシングを誘導することができるがCell9510171026;Misquitta及びPatersonPNAS9614511456、この現象を説明する機構のほとんどは解明されていない。従って本発明者らはこの機構を研究することのできる、生化学的取り扱いが可能なモデルの作製を試みた。lacZ発現ベクターを用いてショウジョウバエS2培養細胞を一過的にトランスフェクトした結果、β-ガラクトシダーゼ活性が原位置検定によって容易に検出された図1a。この活性は、lacZ配列の最初の300ヌクレオチドに相当するdsRNAを用いた同時形質移入によって顕著に減少したが、一方、対照dsRNACD8図1aあるいはセンス又はアンチセンスいずれかの方向の一本鎖RNAデータ示さずを用いた同時形質移入では、影響がほとんど又は全く見られなかった。これは、培養細胞における遺伝子発現をdsRNAが配列特異的に阻害しうることを示している。RNA干渉RNAiを用いて内因性遺伝子が標的化できるかどうかを調べるために、ショウジョウバエサイクリンE細胞周期のS期への進行に必須の遺伝子の最初の540ヌクレオチドに相当するdsRNAでS2細胞をトランスフェクトした。対数期成長の間、未処理のS2細胞は主にG2/Mにとどまっていた図1b。lacZdsRNAでトランスフェクトした場合には細胞周期分布に影響はなかったが、サイクリンEdsRNAでトランスフェクトした場合にはG1期細胞周期で停止した図1b。サイクリンEdsRNAにより引き起こされるこの応答は、長さに依存していた。540及び400ヌクレオチドの二本鎖RNAによる影響は大きかったが、それに比較して200及び300ヌクレオチドのdsRNAによる影響は低かった。50又は100ヌクレオチドの二本鎖サイクリンERNAは本発明者らによる検定では不活性であり、一本鎖アンチセンスサイクリンERNAによるトランスフェクションは実質的に影響がなかった。RNAiの顕著な特徴のひとつとして、dsRNAに相同性を有するmRNA量の低減が挙げられる。サイクリンEdsRNAでトランスフェクトされた細胞複数個集団では、対照細胞と比較して、内因性サイクリンEmRNAが減少していた図1c。同様に、fizzy後期移行促進複合体APCの成分又はサイクリンAS、G2及びMで作動するサイクリンに相同性を有するRNAでトランスフェクトしたところ、同族のmRNA量が減少した図1c。サイクリンAdsRNAでトランスフェクトした細胞においてfizzymRNAが少量の低減をみせたが、これはおそらく、分裂周期中のfizzy転写量の低い時点で停止したことが原因と思われるCurrentBiology8R637R639;Kramer等CurrentBiology812071210。これらの結果は、ショウジョウバエ培養細胞における遺伝子機能を探求する方法として、RNAiが一般的に適用可能であることを示している。特定のdsRNAをショウジョウバエ細胞にトランスフェクトした際に観察されるmRNA量の減少については、転写又は転写後レベルでの影響によって説明できる。他の系から得られたデータは、dsRNA応答の幾つかの因子がmRNAに直接影響を与えていることを示しているSharpGeneandDevelopment13139141;Montgomery及びFireTrendsGenet14225228。従ってRNAiを少なくとも部分的に利用した、細胞を用いないアッセイの構築を試みた。サイクリンE又はlacZのいずれかに相当するdsRNAでS2細胞をトランスフェクトした。細胞抽出物をlacZ又はサイクリンEの合成mRNAと共にインキュベートした。540ヌクレオチドサイクリンEdsRNAでトランスフェクトした細胞から調製した抽出物は、サイクリンE転写物を効率的に分解した。一方、lacZ転写物はこれらの溶解産物において安定していた図2a。それとは逆に、lacZdsRNAでトランスフェクトした細胞から得た溶解産物は、lacZ転写物を分解したが、サイクリンEmRNAは未反応のままであった。これらの結果は、RNAiが配列特異的ヌクレアーゼ活性物質の産生を通じて、標的mRNAを分解することを示している。この酵素をRISCRNA誘導サイレンシング複合体と称する。分解過程において、中間物と思われるものが何度か観察されたが図2参照、開裂による最終生成物で安定したものが存在しないということは、それがエキソヌクレアーゼおそらくエンドヌクレアーゼに結合しているであることを示している。しかし、RNAiヌクレアーゼが内ヌクレオチド結合分解性の切断を最初に行い、抽出物中の非特異的エキソヌクレアーゼが分解過程を完了させるということもありうるEMBOJ7427434。加えて、lacZをインビトロで標的にする抽出物を作製できるということは、内因性遺伝子の存在がRNAi応答には必要ないことを意味している。dsRNA誘導の配列特異的ヌクレアーゼ活性物質に必要な基質条件を調べるために、540ヌクレオチドサイクリンEdsRNAでトランスフェクトした細胞由来の抽出物と共に、様々なサイクリンE由来転写物をインキュベートした図2b、c。トランスフェクトされたdsRNAについて、長いものが必須条件であることが上記で観察されたのと同様に、RNAiヌクレアーゼ活性も、RNA基質の寸法に依存することが示された。標的となる領域を僅かに伸長した600ヌクレオチド転写物図2bと全コード配列を含む~1キロベースkbの転写物データ示さずとの両方が、抽出物によって完全に破壊された。驚くべきことに、短い基質は効率的には分解されなかった。300又は220ヌクレオチド転写物のいずれかにおいて活性の減少が観察され、本検定においては100ヌクレオチド転写物はヌクレアーゼに対して耐性を有していた。これは位置効果のみによるものではない。というのはトランスフェクトしたdsRNAの他の部分に由来する~100ヌクレオチド転写物が同様の動作を見せたデータ示さずからである。予測される通りに、抽出物中に存在する複数のヌクレアーゼ活性物質は、サイクリンEmRNAアンチセンス鎖を認識することもできた。ここでも又、標的となる領域の実質的部分を含む基質は効率的に分解されたが、一方、短い相同配列鎖~130ヌクレオチドを含むものは、効率的に認識されなかった図2c、as600。センス及びアンチセンス鎖の両方について、トランスフェクトされたdsRNAと相同性を有さない転写物図2b、Eout;図2c、as300は分解されなかった。標的となる領域を超えてヌクレアーゼの特異性が移動したという可能性を否定できないが、dsRNAに相同性を有さない転写物の耐性は、C.エレガンスから得たデータに一致した。未反応の多シストロン性mRNAが容易に検出できるにもかかわらず、上流シストロンに相同性を有する二本鎖RNAは、結合した下流シストロンにほとんど又は全く影響を与えなかったScience282430432;Bosher等Genetics15312451256。その上更に、インビボでのRNAi応答を誘導するのに用いられたものと同一のdsRNAに対して、ヌクレアーゼは不活性であった図2b。インビトロ系において5’キャップとポリA末端を有する転写物はキャップを有さない又はポリAを有さないRNAの場合と同様に効率的に分解され、従ってインビトロ系において、5’キャップとポリA末端のどちらも必要ではなかった。dsRNAによって誘導される遺伝子サイレンシングは、配列特異的である。特異性を決定する機構について妥当と思われるものとして、サイレンシングを遂行する複合体内に核酸ガイド配列が合体することが考えられるScience286950952。この考えに一致して、抽出物をCa2依存性ヌクレアーゼ小球菌ヌクレアーゼで予め処理すると、これらの抽出物の、同族mRNAを破壊する能力が失われる図3。非特異的RNA酵母菌運搬RNAなどを添加しても、活性は回復しなかった。小球菌ヌクレアーゼはDNAとRNAの両方を分解できるが、DNアーゼIで抽出物を処理しても影響はなかった図3。しかし配列特異的ヌクレアーゼ活性は、タンパク質を必要としたデータ示さず。これらの結果は、RNAiヌクレアーゼが、RNAとタンパク質成分との両方を必要とするリボ核タンパク質であるという可能性を支持している。生化学分画法の結果下記参照は、これらの成分が添加後に標的mRNA上に蓄積されず抽出物に結合するという点で一致する。植物において、相互抑制効果の現象は、発現抑制される遺伝子に相当する小さな~25ヌクレオチドRNAの存在に関連していたScience286950952。同様のRNAがショウジョウバエに存在し、基質の選択に際して配列特異的ヌクレアーゼを誘導するという可能性を調べるために、複数の分画段階で本発明の活性物質を部分的に精製した。未処理の抽出物は、配列特異的ヌクレアーゼ活性物質と、トランスフェクトされたdsRNAに相同性を有する多量の異種RNAとの両方を含んでいた図2及び図4a。高速遠心分離段階で、RNAiヌクレアーゼがリボソームと共に分別された。活性物質は高塩分で処理することで抽出することができ、リボソームは遠心分離を更に行うことによって除去できる。陰イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーを可溶性ヌクレアーゼについて行ったところ、はっきりとした活性物質のピークが得られた図4b、サイクリンE。この特異性は異種mRNAに対しては不活性だった図4b、lacZ。活性画分は更に、サイクリンE標的に相同性を有する、25ヌクレオチドのRNA種を含んでいた図4b、ノーザン分析。ノーザンブロットで観察されたバンドは、センス及びアンチセンスサイクリンE配列の両方に特異的なプローブを用いて、ならびにdsRNAに独特な部分に由来するプローブを用いて検出することができるデータ示さずので、別個のRNAファミリーを表すと考えられる。現在のところ、25ヌクレオチドRNAがヌクレアーゼ複合体中に二本鎖の形状で存在するのか一本鎖の形状で存在するのかは判明していない。RNA干渉は、dsRNA免疫応答に類似した、外因性及び内因性両方のdsRNAに対する適応性の防御を可能にする。本発明者らによるデータ及び他の研究者らによるデータScience286950952は、抗原のプロセッシングと類似した方法で、細胞中に存在するdsRNAが、プロセッシング又は複製のいずれかを通じて、個別の寸法を有する小さな特異的決定子に変換されるというモデルと一致する。dsRNA依存性遺伝子サイレンシングの転写後成分は、配列認識に基づく特異的メッセージを標的とするガイドとしてこれらの小さなRNAを組み込む、配列特異的ヌクレアーゼによって達成されるということを、本発明者らによる結果は示唆している。様々な植物動物において、同一寸法の推定特異性決定子が存在するScience286950952ということから、dsRNAに誘導される転写後遺伝子サイレンシングの機構及び成分の両方が様々な生物体に保存されていると思われる。植物において、dsRNAは転写後遺伝子サイレンシングを誘導するだけでなく、クロマチンリモデリングと転写抑制も誘導するEMBOJ1763856393;Jones等PlantCell1122912301。遺伝子サイレンシング機構の保存が転写レベルにおいても存在するのかどうか、これらの同じdsRNA由来ガイド配列によって配列特異的にクロマチンリモデリングが誘導できるのかどうか、という点について調べるのが課題である。方法細胞培養及びRNA法S2細胞JEmbryolExpMorpho27353365を、90シュナイダー昆虫培養基Sigma、10熱不活化胎児ウシ血清FBSにおいて27°Cで培養した。リン酸カルシウム共沈によって、細胞をdsRNA及びプラスミドDNAでトランスフェトしたPNAS8070957098。脂質試薬例えばSuperfect、Qiagenを用いて細胞をトランスフェクトした場合と、同一の結果が得られた。FACS分析用に、緑色蛍光タンパク質GFP-US9融合タンパク質の発現を誘導するベクターで細胞を更にトランスフェクトしたExpCellRes248322328。これらの細胞を90氷冷エタノール内で固定し、ヨウ化プロピジウムで25μg/mlにて染色した。EliteフローサイトメーターCoulterを用いてFACSを行った。ノーザンブロット用に、対照の相補的DNARP49を用いたオーバープローブoverprobingブロットによって等量を保持した。dsRNAの作製では、テンプレートの各末端にT7プロモーター配列を含むように、ポリメラーゼ連鎖反応によって転写テンプレートを作製した。RNAはRiboMaxキットPromegaを用いて調製した。RNAが二本鎖であることを、リボヌクレアーゼIIIA.Nicholsonによる寄贈に対して完全な感応性を有することから確認した。標的mRNA転写物を、リボプローブキットPromgegaを用いて合成し、使用前にゲルで精製した。抽出物の調製対数期のS2細胞を15cm組織培養皿に入れ、30μgのdsRNA及び30μgの担体プラスミドDNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を5mMEGTAを含むPBS中に採取し、PBSで2回洗浄し、低張性緩衝液[10mMHEPESpH7.3、6mMβ-メルカプトエタノール]で1回洗浄した。完全プロテアーゼ阻害剤Boehringer及び0.5単位/mlのRNasinPromgegaを含む0.7充填細胞容積の低張性緩衝液に細胞を懸濁した。B型ペッスルを備えるダンス型ホモジェナイザーで細胞を破壊し、溶解産物を30,000gで20分間遠心分離にかけた。20mMHEPESpH7.3、110mMKOAc、1mMMgOAc2、3mMEGTA、2mMCaCl2、1mMDTTを含むインビトロアッセイに、上澄みを用いた。10,000c.p.m.の合成mRNA基質を更に含む10μlアッセイに、5μlの抽出物を用いた。抽出物分画法抽出物を200,000gで3時間遠心分離にかけ、得られたペレットリボソームを含むを1mMMgCl2及び300mMKOAcを含む低張生緩衝液で抽出した。抽出した物質を100,000gで1時間回転させ、得られた上澄みを、緩衝液A[20mMHEPESpH7.0、1mMジチオスレイトール、1mMMgCl2]におけるKCl勾配を用いて、Source15QカラムPharmaciaで分別した。画分を、上記したようにヌクレアーゼ活性について調べた。ノーザンブロット法として、画分をプロテイナーゼK/SDSで処理し、フェノールで抽出し、15アクリルアミド8M尿素ゲル上で分解した。RNAをHybondN上に電気ブロッティングし、サイクリンEmRNAに由来する鎖特異的リボプローブの存在を調べた。500mMNaPO4pH7.0、15ホルムアミド、7SDS、1BSA中でハイブリダイゼーションを実施した。ブロットを1SSC中にて37-45°Cで洗浄した。実施例2:RNA干渉の開始段階における二座bidentateリボヌクレアーゼの役割蠕虫、菌類及び植物における遺伝子学的研究によって、二本鎖RNAに誘導される遺伝子サイレンシングに必須のタンパク質群がこれまでに同定されている。これらには、ARGONAUTEファミリー例えばRDE1、QDE2Cell99123132;Catalanotto等Nature404245;Fagard等PNAS971165011654、recQファミリーヘリカーゼMUT-7、QDE3Cell99133141;Cogoni及びMacinoScience28623422344及びRNA依存性RNAポリメラーゼ例えばEGO-1、QDE1、SGS2/SDE1Nature399166169;Smardon等CurrentBiology10169178;Mourrain等Cell101533542;Dalmay等Cell101543553がある。これらの役割と考えられるものがこれまでに提案されてはいるが、これらの遺伝子のいずれについてもサイレンシング工程における機能は確定していない。これまでの生化学的研究では、mRNAを標的として分解する多成分ヌクレアーゼによってPTGSが行われるということが示唆されているNature404293296;Zamore等Cell1012533;Tuschl等GenesandDevelopment1331913197。本発明者らは、この複合体の特異性が、mRNA基質に相同な性を有する小さなガイド配列の組み込みに由来するであろうことを示したNature404293296。元々は植物において、積極的な発現抑制導入遺伝子であると同定されたScience28629502これらの~22ntRNAを、ショウジョウバエ胚から調製した抽出物を用いてインビトロRNAiの間に作製することが行われているCell1012533。推定ガイドRNAもショウジョウバエS2細胞からの抽出物内に作製することができる図5a。転写後遺伝子サイレンシングの機構を理解するという目的から、RNAiの各段階を実施する酵素を同定するために、生化学分画と候補遺伝子の両方の方法を用いた。本発明者らによるこれまでの研究では、RNA干渉を実施する物質であるヌクレアーゼRISCの部分的精製に成功している実施例1参照。この酵素はdsRNAを用いたトランスフェクションによってインビボでRNAiが誘導された、ショウジョウバエS2細胞から単離された。従ってまず、RISC酵素とdsRNAから22merへのプロセッシングを通じてRNAiを誘導する酵素とが別の活性物質であるかどうかを調べた。RISC活性物質は高速遠心分離100,000xg、60分間によって抽出物から区別されたが、22merを産生する活性物質は上澄みに残っていた図5b、c。この単純な分画法の結果は、RISCと22mer産生活性物質とは分離でき、従って別の酵素であることを示している。しかしこれらはサイレンシング過程のある時点で相互に作用するようである。リボヌクレアーゼIIIファミリーは、二本鎖RNAに特異性を示す数少ないヌクレアーゼの一つであるFEMSMicrobiolRev23371390。ショウジョウバエ及びC.エレガンスのゲノムを分析したところ、リボヌクレアーゼIII酵素には数種類あることがわかった。1種類目は、1個のリボヌクレアーゼIIIシグナチャーモチーフと1個の二本鎖RNA結合ドメインdsRBD;例えばRNC_CAEELを含む標準的なリボヌクレアーゼIIIである。2種類目は、Droshaに代表されるGene245213221、2個のリボヌクレアーゼIIIモチーフと1個のdsRBDを含むショウジョウバエ酵素であるC.エレガンスのCeDroshaなど。3種類目は、2個のリボヌクレアーゼIIIシグナチャーと1個のアミノ末端ヘリカーゼドメインを含むものである例えばショウジョウバエCG4792、CG6493、C.エレガンスK12H4.8など。これらはBassによってRNAiヌクレアーゼ候補として提案されているものであるCell101235238。これら3種類の代表的なものが、dsRNA基質から別個の~22ntのRNAを産生する能力を有するかどうかを調べた。精製された菌リボヌクレアーゼIIIで500ntサイクリンEdsRNAを部分消化することによって、生成物の塗沫を作製した。又、ほぼ完全な消化を行って~11-17ヌクレオチドRNAの異種群を作製した図示せず。二重のリボヌクレアーゼIII酵素を調べるために、T7エピトープ標識付けされたDrosha及びCG4792を調製した。トランスフェクトされたS2細胞内でこれらを発現し、抗体アガロース複合体を用いた免疫沈降反応によって単離した。dsRNAをCG4792免疫沈降で処理したところ、S2又は胚抽出物において産生されたものと類似の~22nt断片が得られた図6a。数種の遺伝子に由来するdsRNAを同等に処理したので、抽出物中の活性物質と免疫沈降中の活性物質とのいずれとも、RNA基質の配列に依存していなかった付録1参照。DroshaとDExHボックスヘリカーゼHomelessGenesandDevelopment924952508;図6a、b参照の免疫沈降とにおいて、負の結果が得られた。ウエスタンブロット法によって、各標識タンパク質が同様に発現され免疫沈降することが確認された付録2参照。従ってCG4792が、dsRNAから~22ntガイド配列を産生することによって、RNA干渉の開始段階を誘導するとの結論を得た。dsRNAを均一寸法の小さなRNAに消化する能力から、この酵素をDicerDcrと称する。DicermRNAは胚、S2細胞及びハエ成虫において発現されるが、これはこれらの生物体全てにおいて機能的RNAi機構が存在することと一致する付録3参照。Dicerが、dsRNAからガイドRNAを産生する役割を果たすヌクレアーゼである、という可能性があることから、Dicerタンパク質Dicer-1、CG4792のカルボキシ末端に対する抗血清を作製した。この抗血清を用いると、dsRNA基質から~22ntRNAを産生した、ショウジョウバエ胚抽出物又はS2細胞溶解産物のいずれかから、ヌクレアーゼ活性物質を免疫沈降することができる図6C。Dicer-1酵素によって産生される推定ガイドRNAは、抽出物内に産生される22mer及びRISC酵素に関連する22merと完全に一致して移動した図6D、F。ショウジョウバエ胚抽出物においてガイドRNA産生する酵素がATP依存性であることが、これまでの研究で示されているCell1012533。この補因子を喪失させたところ、dsRNA消化量は~6分の1と低くなり、移動度が少し低いRNAが産生された。興味深いことに、Dicer-1免疫沈降とS2細胞からの抽出物との両方が、~22merの産生にATPを必要とした図6D。ATPを枯渇させた胚抽出物においては移動度の低い生成物の蓄積が繰り返し観察されたが、上記の場合においては観察されなかった。ヌクレアーゼがATPを必要とするということは非常に希な特性である。この必要性から、ガイドRNAの展開と基質に沿った転座との両方ににおいてヘリカーゼドメインがATP加水分解のエネルギーを利用することで、酵素がdsRNAに積極的に作用しているという仮説がたてられる。C.エレガンス及びショウジョウバエにおけるRNA干渉の効率的な誘導には、幾つかの必要条件がある。例えば、開始RNAは二本鎖であり数百のヌクレオチド長でなければならない。これらの必須条件がDicerによるものかどうかを調べるために、抽出物と免疫沈降した酵素との有する、様々なRNA基質を消化する能力について特徴を調べた。Dicerは、長さにかかわらず一本鎖RNAに対して不活性であった付録4参照。酵素は200及び500ヌクレオチドdsRNAの両方を消化したが、短い基質については顕著に低い活性を示した付録4参照。35ヌクレオチドの短い二本鎖RNAは、非常に非効率的ではあったが、酵素で切断することが可能であったデータ示さず。これに対して、大腸菌リボヌクレアーゼIIIはdsRNAを35又は22ヌクレオチドに完全に消化することができたデータ示さず。これらの結果は、Dicer酵素が有する基質の選択性が、RNAiの寸法依存性に、完全にではないとはいえ寄与していることを示唆している。Dicer酵素が実際に、インビボでのRNAiに役割を果たしているかどうかを調べるために、Dicer活性物質をS2細胞から枯渇させるとdsRNA誘導遺伝子サイレンシングにどのような影響があるかを調べた。2種のショウジョウバエDicer遺伝子CG4792及びCG6493に相同性を有するdsRNAの混合物で、S2細胞をトランスフェクトしたところ、全細胞溶解産物とDicer-1免疫沈降とのいずれにおいても、Dicer活性物質の量が~6-7分の1に減少した図7A、B。対照dsRNAマウスカスパーゼ9によるトランスフェクションでは影響が見られなかった。Dicerをノーザンブロット法で調べた場合にも、数量的に同様の結果が得られた図示せず。このようにDicerを喪失させた場合、それに引き続いて、RNAiによる外因性GFP導入遺伝子を発現抑制する、細胞の能力が実質的に失われた図7C。これらの結果は、DicerがインビボRNAiに関与していることを示している。サイレンシングの完全な阻害が得られなかったということは、Dicerそれ自身がRNAiに必須であるの不完全な抑制に由来すると考えられる。あるいはインビボにおいてガイドRNAが1種以上の機構によって例えばRNA依存性RNAポリメラーゼの作用を通じて産生されうることを示している。本発明者らの研究結果は、RNA干渉の工程が少なくとも2つの異なる段階に分けられることを示している。このモデルによると、Dicerによって二本鎖RNAが~22ヌクレオチドガイド配列にプロセスされることでPTGSは始まると考えられるが、別のDicer関連ヌクレアーゼがこの工程に関与しているという可能性をはっきりと除外できない。これらのガイドRNAは一本鎖mRNAを分解の標的とする別のヌクレアーゼ複合体RISC内に組み込まれると考えられる。このモデルの意味するところは、ガイド配列それ自体は、応答を誘導するdsRNAに直接に由来しているということである。このモデルと一致して、トランスフェクションでS2細胞に導入した32P標識外因性dsRNAが、22merとしてRISC酵素に組み込まれることを本発明者らは実証した図7E。しかしRNA依存性RNAポリメラーゼが、一度産生されると22merを増幅する、あるいはガイドRNAを産生する別の方法を提供する、という可能性を除外できない。Dicer酵素の構造から、dsRNAの配列に関係なく、酵素が別個の寸法の断片を産生するという機構が考えられる付録1、図8a参照。菌リボヌクレアーゼIIIは、基質に対して二量体として作用することがこれまでに確認されているFEMSMicrobiolRev23371390;Robertson等JBiolChem2438291;DunnJBiolChem25138073814。同様に、二量体のDicer酵素が、dsRNAを~22nt断片に開裂するのに必要であると考えられる。ある1つのモデルによると、開裂間隔は、Dicer酵素内の2個のリボヌクレアーゼIIIドメインの物理的な配置によって決定される図8a。もっともらしい別のモデルからは、1個のDicerタンパク質における2個のRIIIドメインによって、単一位置で開裂が誘導されうるということが考えられる。22ヌクレオチド間隔は、隣接するDicer酵素の相互作用によって、あるいはmRNA基質に沿った転座によって起こると考えられる。一体的なヘリカーゼドメインの存在は、Dicer開裂の産物が、RISC酵素それ自体に組み込まれた一本鎖22merである可能性を示唆している。Dicerファミリーの顕著な特徴として、進化上の保存が挙げられる。同族体がC.エレガンスK12H4.8、シロイヌナズナ例えばCARPELFACTORYDevelopment12652315243、T25K16.4、AC012328_1、哺乳類ヘリカーゼ-MOIBiochimBiophysActa1490163169及びS.pombeYC9A_SCHPOに見られる図8b参照、配列の比較について付録6、7参照。実際に、ヒトDicerファミリーはdsRNA基質から~22ntRNAを産生することができるが付録5、このことは、これらの構造的に類似したタンパク質は全て、類似した生化学的機能を有している可能性を示唆している。外因性dsRNAがマウス初期胚の遺伝子機能に影響を与えることがこれまでに実証されておりNatureCellBiology27075、本発明者らの研究結果は、進化上保存されたRNAi機構によって上記調節が遂行されることを示唆している。リボヌクレアーゼIII及びヘリカーゼのモチーフに加えて、Pfamデータベースを研究した結果は、各Dicerファミリーが更にZAPドメインを含んでいることを示している図8cProteins28405420。この配列は、C.エレガンスRde-1及びアカパンカビQde-2Cell99123132;Catalanotto等Nature404245における突然変異によるRNAiに関係があるとされてきたZwille/ARGONAUTE/Piwiファミリーにおける保存のみに基づいて定義されていた。このドメインの機能は解明されていないが、興味深いことにこの相同的領域は、dsRNA依存性サイレンシングに関与する2つの遺伝子ファミリーに限定されている。ARGONAUTEファミリー及びDicerファミリーの両方は、一般的な生物学的工程、主に幹細胞の予定運命の決定に関係があるとされている。シロイヌナズナにおけるDicerファミリーである、CARPELFACTORYの低次形態対立遺伝子は、花の分裂組織における増殖率の増加によって特徴付けられるDevelopment12652315243。この表現型と他の多くの特徴が、シロイヌナズナARGONAUTEago1-1突然変異体と共通しているEMBOJ17170180CKidner及びRMartiennsenprescomm。これらの遺伝子分析は、RNAiが異常なRNAに対する防御応答応答以上のものであり、内因性遺伝子の調節において重要な役割も果たしているということの証拠にもなっている。ここまで、RNAi開始段階における触媒としてDicerを同定し、この非常に変わった遺伝子調節機構の、生化学的な原理を解明してきた。他の生物体から、特に哺乳類から保存されているファミリーのメンバーが、dsRNA媒介遺伝子調節においても重要な役割を果たしているかどうかを調べるのが重要であると考えられる。方法プラスミド構築物。バークレーショウジョウバエゲノム計画で配列決定されたESTから、Droshaをコードする全長cDNAをPCRによって得た。HomelessクローンはGillespie及びBergワシントン大学により寄贈されたものを用いた。T7エピトープ標識をPCRにより各アミノ末端に添加し、特に昆虫細胞内での発現用として企図されたレトロウイルスベクターE.Bernstein、未発表であるpRIP内に、標識cDNAをクローンした。このベクターでは、発現はOrgyiapseudotsugataIE2プロモーターInvitrogenによって誘導される。CG4792/DicerのcDNAが入手できないので、ゲノムクローンをバクミドBACR23F10;ロズウエルパーク癌研究所人類遺伝学部のBACPACリソースセンターより入手から増幅した。ここでも増幅中に、T7エピトープ標識をコード配列のアミノ末端に付加した。HaCaT細胞GJH、未発表より調製したcDNAライブラリーから、ヒトDicer遺伝子を単離した。T7標識付けされた全コード配列を、ヒト細胞LinX-A内で発現するために、pCDNA3Invitrogen内にクローンした。細胞培養及び抽出物の調製。S2及び胚の培養。10熱不活化胎児ウシ血清Gemini及び1抗生物質-抗真菌性溶液GibcoBRLを添加したシュナイダー昆虫培養基において、S2細胞を27°C、5CO2中で培養した。10×106細胞/mlにて抽出調製物から細胞を回収した。細胞をPBSで1回洗浄し、低張性緩衝液[10mMHepespH7.0、2mMMgCl2、6mMβME]中に再懸濁し、ダンス型ホモジェナイザーで細胞を破壊した。細胞溶解産物を20,000xgで20分間回転させた。抽出物を-80°Cで貯蔵した。標準的な方法を用いてショウジョウバエ胚をハエ飼育容器内で飼育し、12時間ごとに回収した。50Chlorox漂白剤中で胚膜を除去し、蒸留水で徹底的に洗浄した。細胞溶解緩衝液10mMHepes、10mMKCl、1.5mMMgCl2、0.5mMEGTA、10mMβ-グリセロリン酸塩、1mMDTT、0.2mMPMSFを胚に添加し、組織破砕器内で破砕して抽出物を調製した。溶解産物を200,000xgで2時間回転させ、-80°Cで冷凍した。ヒト293細胞由来の高度にトランスフェクト可能なLinX-A細胞LinXie及びGJH、未発表をDMEM/10FCSに保持した。トランスフェクション及び免疫沈降。リン酸カルシウム法Nature404293296を用いてS2細胞をトランスフェクトした。インシトゥβ-ガラクトシダーゼ検定を用いて対照をモニターしたところトランスフェクション率は~90であった。リン酸カルシウムを用いた共沈によって、LinX-A細胞もトランスフェトした。免疫沈降反応については、様々なクローンで細胞~5×106/IPをトランスフェクトし、3日後にIP緩衝液[125mMKOAc、1mMMgOAc、1mMCaCl2、5mMEGTA、20mMHepespH7.0、1mMDTT、1NP-40に完全プロテアーゼ阻害剤Rocheを加えたもの]中で溶解した。溶解産物を14,000xgで10分間回転させ、上澄みをT7抗体-アガロースビーズNovagenに添加した。抗体結合を4°Cにて4時間進行させた。ビーズを遠心分離にかけ、溶解緩衝液で3回洗浄し、反応緩衝液で1回洗浄した。ショウジョウバエDicer-1CG4792のC末端8アミノ酸に相当するKLH-複合ペプチドを用いて、Dicer抗血清をウサギ内で作製した。開裂反応。RNAの調製。T7プロモーター配列をそれぞれ含む正方向及び逆方向プライマーを用いたPCRによって、dsRNA内に転写されるテンプレートを作製した。リボプローブPromegaキットを用いてRNAを産生し、32P-UTPを用いた転写反応で均一に標識化した。一本鎖RNAを1アガロースゲルから精製した。dsRNA開裂。20mMHepespH7.0、2mMMgOAc、2mMDTT、1mMATP及び5SuperasinAmbionを含む反応溶液中でdsRNAと共に、5μlの胚又はS2抽出物を30°Cで1時間インキュベートした。最小体積の反応緩衝液ATP及びSuperasinを含むとdsRNAとを、反応緩衝液で予め洗浄したビーズ上記参照に添加したことを除いては、同様に免疫沈降を処理した。ATPを喪失させるために、dsRNAの付加前に、2mMグルコース及び0.375UヘキソキナーゼRocheと共にショウジョウバエ胚抽出物を30°Cで20分間インキュベートした。ノーザン及びウエスタン分析。TrizolLifetechを用いて、ショウジョウバエ胚0-12時間、ハエ成虫及びS2細胞から全RNAを調製した。磁性オリゴdTビーズDynalを用いる親和性選択によって伝達RNAを単離した。RNAを変性ホルムアルデヒド/アガロースゲル上で電気泳動し、ブロットし、Dicerに相当するランダムに用意されたDNAをプローブとして調べた。ウエスタン分析用に、IP緩衝液中で抗T7抗体-アガロース複合体を用いて、全細胞溶解産物からT7標識タンパク質を免疫沈降した。レムリ緩衝液中で沸騰させることによってビーズからタンパク質を剥離し、8SDS-PAGE上で電気泳動によってタンパク質を分離した。ニトロセルロース上に移転させた後、HRP結合抗T7抗体Novagenと化学発光検出Supersignal、Pierceを用いてタンパク質を可視化した。DicerのRNAi。マウスカスパーゼ9に相当するdsRNA又はショウジョウバエDicer-1及びDicer-2CG4792及びCG6493に相当する2種のdsRNAの混合物のいずれかで、ショウジョウバエS2細胞をトランスフェクトした。最初のトランスフェクションから2日後、GFP発現プラスミドと、ルシフェラーゼdsRNA又はGFPdsRNAのいずれかとの混合物を用いて上記した方法で細胞を再度トランスフェクトしたNature404293296。第2のトランスフェクションから3日後にDicer活性又は蛍光について細胞を検定した。蛍光細胞を固定した後、細胞の定量化をCoulterEPICS細胞選別機で行った。対照トランスフェクションを行ったところ、Dicer活性物質は、カスパーゼ9dsRNAの導入による影響をうけなかった。実施例3:RNA干渉用ヘアピン構築物作製の単純化した方法多くのモデル生物体において、二本鎖RNAが効率的で特異的に遺伝子機能を抑制することが示されているBosher及びLabouesseNatureCellBiology2E31E36。RNA干渉又は転写後遺伝子サイレンシングと称されるこの応答は、C.エレガンス、ショウジョウバエ、植物及び他の数多くの系において、非常に効率的な逆遺伝学的手段として用いられている。これらの場合において、二本鎖RNAは注入、トランスフェクション又は食物供給として導入することができる。しかし全ての場合において、応答は一過的かつ全身性である。近年、遺伝子発現を用いた安定した干渉が、スナップバック又はヘアピン構造を形成するRNA発現によって達成されているFortier及びBeloteGenesis26240244;Kennerdell及びCarthewNatureBiotechnology18896898;Lam及びThummelCurrentBiology10957963;Shi等RNA610691076;Smith等Nature407319320;Tavernarakis等NatureGenetics24180183。この構造は、遺伝子発現の安定したサイレンシングを可能にするだけでなく、トリパノソーマ及びショウジョウバエ成虫について報告されている誘導性サイレンシングを可能にする潜在能力があるFortier及びBeloteGenesis26240244;Lam及びThummelCurrentBiology10957963;Shi等RNA610691076。サイレンシング誘導に必要な長い逆向き反復配列を含む菌プラスミドの作製が困難なことから、この方法は幾分実施しにくい。最近の報告では、望ましい構築物を同定するために1,000個以上の推定クローンをスクリーンしたとあるTavernarakis等NatureGenetics24180183。ヘアピン構造が存在するとしばしばプラスミド組換えが誘導されるが、これは部分的には、十字型DNA構造を認識し開裂する大腸菌sbcタンパク質によるものであるConnelly等GenesCell1285291。本発明者らは本質的に逆向き反復配列のクローニングを必要としないヘアピンの作製方法を開発した。その代わりに、発現抑制される遺伝子断片を直列反復としてクローン化し、インビトロ又は潜在的にはインビボのいずれかで、部位特異的レコンビナーゼを処理することによって逆転を得る図27参照。組換えに続いて、未処理のSBC系を欠く菌株DL759中で、逆向き反復配列構造は安定である。本発明者らはこの方法を用いて数多くのヘアピン発現構築物を作製したが、いずれもショウジョウバエ細胞における遺伝子サイレンシングを誘導した。下記の実施例において、我々は、この方法を利用して、長いdsRNAを様々な哺乳動物細胞型において発現させる。我々は、かかる長いdsRNAが、様々な細胞型においてRNAiを媒介することを示す。加えて、図27に記載したベクターは選択マーカーを含むので、この方法で生成されたdsRNAは、細胞中で安定に発現されうる。従って、この方法は、細胞におけるRNA抑制の一過性の効果の試験だけでなく、安定で且つ長期的なRNA抑制の効果の試験をも可能にする。方法:ヘアピンRNAを発現するプラスミドを、GFPコード領域の最初の500塩基対をpRIP-FLIPのFLIPカセット中に直列反復としてクローン化することによって構築した。このFLIPカセットは、2つの有向クローニング部位を含み、その2番目のものはLoxP部位と隣接している。これらのクローニング部位の間に存在するゼオシン遺伝子は、選択及び安定性を維持する。ヘアピン生成のための逆向き反復を造るために、直列反復クローンを、インビトロでCreレコンビナーゼに曝し、その後、DL759大腸菌にトランスフォームした。これらの細菌は、十字形構造を含むDNAの複製を可能にし、それらは、逆向き反復を形成する傾向がある。実施例4:長いdsRNAは、哺乳動物細胞における遺伝子発現を抑制する以前の実験は、ヘアピンの構築によるものを含む様々な方法を利用して生成されたdsRNAがショウジョウバエ細胞における遺伝子発現を抑制することができることを示した。我々は、今や、dsRNAが培養哺乳動物細胞における遺伝子発現をも抑制することができるということを示す。加えて、RNAiの遺伝学的ツールとしての力は、遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力によって大いに増進される。それ故、我々は、長いdsRNAをRNAiトリガーとして利用することのできる哺乳動物細胞を同定する努力を、それらの同じ細胞株が安定なサイレンシングストラテジーの開発の基盤を提供することを期待して引き受けた。我々は、RNA抑制が、長いヘアピンの哺乳動物細胞株における安定な発現によって媒介されうることを示す。培養哺乳動物細胞における遺伝子発現の安定なサイレンシングを工学処理する能力は、一時的な遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす能力に加えて、多くの重要な応用を有する。A.多能性マウスP19細胞におけるRNAi我々は、先ず、このアプローチを遺伝子機能を調べるためのツールとして開発すること及びdsRNAに誘導されるサイレンシングの機械論的研究が哺乳動物の系に広がること可能にすることの両方のために、長いdsRNAトリガーが、培養マウス細胞において配列特異的なサイレンシングを誘導することができるかどうか測定することを探索した。それ故、我々は、前のマウス胎児における研究を、多能性の胎児細胞型におけるRNAi様機構を探索することにより広げることを試みた。我々は、胎児起源の多くの細胞株を、遺伝子発現の一般化された抑制がdsRNAの導入に際して起きる程度について調べた。アッセイ時に、我々は、dsRNAの、GFPの発現に対する効果を試験した。予想されるように、ヒト胎児の腎臓細胞及びマウス胎児繊維芽細胞の両者において、GFP発現が、同時トランスフェクトされたdsRNAの配列に関係なく、事実上排除された。幾つかの多能性の奇形癌腫及び奇形腫細胞株において、PKR応答が減衰されたが、依然として明らかであった。しかしながら、対照的に、非相同性のdsRNAのトランスフェクションは、マウス胎児幹細胞又はp19胎児癌細胞において、レポーター遺伝子の発現に対して効果を有しなかった。P19胎児癌細胞の、GFPのコード鎖の最初の約500ntに対応する同起源のdsRNAの存在下でのGFPによるトランスフェクションは、著しく異なる効果を有した。GFP発現は、同時トランスフェクトされた細胞の殆どにおいて排除され、これは、これらの培養マウス細胞が、我々が前に培養ショウジョウバエS2細胞で示したものと似た方法でdsRNAに応答しうることを示唆している。dsRNAが配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導することのできる程度を定量するために、我々は、最初にショウジョウバエ胚抽出物においてRNAiを示すのに利用されたものに類似した二連のルシフェラーゼレポーターアッセイを利用した。P19EC細胞を、別個にホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現を指示する2つのプラスミドの混合物でトランスフェクトした。これらをdsRNAを伴わずに、ホタルルシフェラーゼの最初の約500ntに対応するdsRNAを伴って、又は対照としてのGFPの最初の約500ntに対応するdsRNAを伴って同時トランスフェクトした。GFPdsRNAを伴う同時トランスフェクションは、ホタル/ウミシイタケ活性比及び両活性の絶対値の両方でdsRNAなしの対照と類似したルシフェラーゼ活性を与えた。対照的に、ホタルルシフェラーゼdsRNAを受けた細胞において、ホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼ活性の比は、最大で30倍減少した。比較のために、我々は、ショウジョウバエS2細胞において同じ実験のセットを行なった。定性的に類似の結果が得られたが、サイレンシング応答は、一層強かった。同レベルのdsRNAにおいて、S2細胞は、ホタルルシフェラーゼ活性を事実上バックグラウンドレベルまで抑制した。dsRNAがウミシイタケルシフェラーゼと相同である相補性実験をも行なった。再び、この場合、ウミシイタケ酵素の発現の抑制は、約10倍であった。従って、P19細胞におけるdsRNA応答は、弾力的であり、サイレンシング機構は、試験したレポーターの何れかに対するdsRNAに順応した。我々は、この応答がdsRNAに特異的であるかどうかを試験するために2つのアプローチを採用した。精製RNアーゼIIIによる、トリガーのトランスフェクション前の前処理は、サイレンシングを引き起こすその能力を大いに減少させた。その上、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼに対する一本鎖アンチセンスRNAによる細胞のトランスフェクションは、レポーターの発現に対して殆ど又は全く効果を有しなかった。総合して考えると、これらの結果は、二本鎖RNAは、強く且つ特異的なサイレンシング応答をP19胎生期癌細胞において引き起こすという強い指示を与えた。効率的なサイレンシングは、比較的低濃度のdsRNAによって引き起こすことができた。この応答は、濃度依存性であり、約20倍の最大抑制が培養培地1ml当たり1.5μgの投与量で達成された。サイレンシングは、迅速に確立されて、トランスフェクションの9時間後まで明らかであった。その上、この応答は、抑制の程度を有意に変えることなく、dsRNAの単一投与後に、最大で72時間持続した。図30は、更に、RFP又はGFPを同時トランスフェクトされた野生型P19細胞を示している。RFP又はGFRの強い発現は、それぞれ、トランスフェクションの約42時間後であることに注意されたい。我々は、500nt.GFPヘアピンを安定に発現するP19クローンを単離した。かかるクローンを、次いで、RFP又はGFPでトランスフェクトして、RFP又はGFPの発現をこれらの細胞の視覚的検査により評価した。左パネルは、500ntGFPヘアピンがP19細胞におけるGFPの発現を特異的に抑制することを示している。B.胎児幹細胞におけるRNAidsRNAに対する配列特異的応答の存在がP19細胞の特性であるのかどうか、又はそれは正常なマウス胎児細胞にも拡張されるのかどうかを評価するために、我々は、類似のサイレンシングアッセイをマウス胎児幹細胞において行なった。同起源でないdsRNAによる胎児幹細胞の同時トランスフェクションは、再び、絶対値においても、ウミシイタケのホタルに対するルシフェラーゼ活性の比についても劇的効果を有しなかった。しかしながら、ホタル又はウミシイタケの何れかのルシフェラーゼdsRNAのトランスフェクションは、劇的且つ特異的に、標的酵素の活性を減少させた。この結果は、RNAiが正常な胎児幹細胞を含む胎児起源の多数のマウス細胞型において機能しうることを示唆している。通常、遺伝的モザイク動物の生成のために利用される細胞型においてサイレンシングを引き起こす能力は、培養又は再構成動物モデルの両者におけるサイレンシングの生物学的効果を結局試験する可能性を示唆する。ES細胞をRNAiによって上首尾に操作する我々の能力は、トランスジェニック及びノックアウトマウスの生成におけるRNAiの利用を可能にする。C.マウス体細胞におけるRNAiRNAiエフェクター経路が哺乳動物の体細胞に存在することは、siRNAの一過性サイレンシングを誘導する能力に基づいて、ありそうなことである。その上、我々は、RNAiイニシエーター及びエフェクター経路が長いdsRNAトリガーに応答してサイレンシングを実施することのできる胎児細胞に明らかに存在することを示した。それ故、我々は、RNAi機構が幾つかの体細胞株において無傷で存在しうるかどうかを試験することを求めている。ルシフェラーゼレポーターを長いdsRNAトリガーと共に有するHeLa細胞のトランスフェクションは、RNA配列に関係なく活性の殆ど完全な抑制を生じた。マウス筋芽細胞株C2C12において、我々は、2つの応答の混合に注意した。ホタルルシフェラーゼに相同なdsRNAは、配列特異的な効果を引き起こし、同起源の約21ntのsiRNAでのトランスフェクションに際して認められたものより僅かに強い程度の抑制を生じた。しかしながら、長いdsRNAトリガーを用いた場合には、特異的効果が、おそらく、PKR活性化の故に、レポーター遺伝子発現の一般化された抑制に重ねられた。多くの哺乳動物ウイルスは、効率的感染の助けとして、PKRをブロックする能力が進化した。例えば、アデノウイルスは、結合に関してdsRNAを模倣するがPKRの活性化に関しては模倣しないVARNAを発現する。ワクシニアウイルスは、2つのストラテジーを利用してPKRを回避する。第一のストラテジーは、dsRNAに結合してマスクするE3Lの発現である。第二のストラテジーは、PKRに結合し、この酵素、eIF2αの天然の基質を模倣する能力によって阻害するK3Lの発現である。K3L発現を指示するベクターでのC2C12細胞のトランスフェクションは、dsRNAに応答してのレポーター遺伝子の一般化された抑制を減衰させる。しかしながら、このタンパク質は、RNAiによる特異的阻害の大きさに影響を有しなかった。図33は、更に、Hela細胞、CHO細胞、及びP19細胞において行なった一過性同時トランスフェクションアッセイの結果を示している。これらの細胞株を、各々、フォティナスピラリス及びレニラレニフォルミスルシフェラーゼを発現するプラスミドでトランスフェクトした。これらの細胞株を、更に、ホタルルシフェラーゼ又はdsGFPに対応する400ngの500ntdsRNAでトランスフェクトした。その結果は、dsRNAが、多くの培養哺乳動物細胞方において抑制を特異的に媒介することができることを示している。これらの結果は、少なくとも幾つかの細胞株及び/又は細胞型においてdsRNAに対する応答の非特異的ブロッキングが遺伝子機能の研究のために長いdsRNAを利用することを可能にするという可能性を高めた。これは、ここに記載したように、ウイルスインヒビターの利用により、又は望ましくない応答を欠くように遺伝的に改変された動物から単離された細胞の利用によって達成されうる。D.RNAiを利用する遺伝子発現の安定した抑制今日まで、dsRNAは、培養哺乳動物細胞又は胎児において、配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導するために一過性の様式でのみ利用されてきた。しかしながら、遺伝子操作の最も強力な応用は、安定な変異体の創生によってのみ実現される。長いdsRNAの利用によってサイレンシングを誘導する能力は、ヘアピンRNAの強化された発現によって安定なサイレンシグが達成されたショウジョウバエ、植物及びC.エレガンスなどのモデル系から哺乳動物細胞の仕事へ移行する機会を与える。P19EC細胞を、対照用ベクターにより、又は約500ntのGFPヘアピンRNAの、RNAポリメラーゼIIプロモーターからの発現を指示する発現ベクターによってトランスフェクトした。何れかの構築物を安定に組み込んだ細胞から生じたコロニーを選択して、クローン性細胞株へと拡大させた。各細胞株を、持続的RNAiにつき、2つのレポーター遺伝子の混合物による一過性の同時トランスフェクションによってアッセイした。対照用ベクターを安定に組み込んだクローン化P19EC細胞のトランスフェクションは、何ら特異的なサイレンシング応答の存在しない場合に予想されるように、等しい数の赤色細胞と緑色細胞を生じたが、GFPヘアピンRNAを発現する細胞は、非常に異なる結果を与えた。これらの細胞は、dsREDタンパク質を、対照用ベクターを含む細胞で認められたものに匹敵する効率で発現した。しかしながら、これらの細胞は、同時トランスフェクトされたGFPレポーターを発現することができなかった。これらのデータは、ヘアピンdsRNAの連続的発現が、標的遺伝子の安定な配列特異的なサイレンシングを引き起こすことができるという強い指示を与える。ショウジョウバエS2細胞及びC.エレガンスにおいて、RNAiは、dsRNAを約22ntのsiRNAに処理するDicer酵素により開始される。両方において、標的Dicerに対するdsRNAの利用によるS2細胞及びC.エレガンス実験は、RNAi応答を抑制する。DicerがP19細胞におけるヘアピン誘導される遺伝子サイレンシングにおいて中心的役割を演じるかどうかを、GFPヘアピン構築物で安定にトランスフェクトされたP19細胞に、マウスDicerdsRNAをトランスフェクトすることによって試験した。DicerdsRNAによる処理は、GFPの抑制解除を生じたが、対照用dsRNAでは生じなかった。E.dsRNAは、転写後サイレンシングを誘導するRNAiの鍵となる特徴は、それが、その効果を、標的mRNAの破壊によって、転写後レベルで発揮することである。dsRNAがマウス細胞において転写後機構によってサイレンシングを誘導したかどうかを試験するために、我々は、最初にショウジョウバエ胚抽出物におけるRNAi応答を特性決定するために用いられたものと同じアッセイを利用した。我々は、ウミシイタケ及びホタルのルシフェラーゼに対応するキャップを有するmRNAのインビトロ翻訳についてコンピテントなP19細胞ECから溶解物を調製した。これらの抽出物への非特異的dsRNAの添加は、ルシフェラーゼ発現の絶対量又はホタル対ウミシイタケのルシフェラーゼの比に対して実質的な効果を有しなかった。対照的に、ホタルルシフェラーゼと相同なdsRNAの添加は、劇的な投与量依存性の抑制活性を誘導した。dsRNAのアンチセンス鎖にのみ対応するRNAの添加は、殆ど効果を有しなかったし、dsRNAサイレンシングトリガーのRNアーゼIIIによる前処理は、インビトロでサイレンシングを誘導するその潜在能力を大いに低下させた。RNAiの第二の顕著な特徴は、サイレンシングの特異性を決定する小さいsiRNAの生成である。我々は、かかるRNA種がP19細胞抽出物においてdsRNAから生成されることを見出したが、これは、マウスのDicer活性の存在を示している。これらの種は又、GFPヘアピンRNAを安定に発現する細胞においても生成された。総合して考えると、dsRNA誘導されるサイレンシングの転写後の性質は、dsRNAがマウス細胞において月並みなRNAi機構によって遺伝子発現を抑制することを強く示唆する。F.RNAi媒介の遺伝子サイレンシングは、特異的でありdsRNAを必要とする我々は、実験を行なって、インビトロ系で認められた抑制的効果が二本鎖RNAに特異的であることを確認した。簡単にいえば、上で概説した方法に従って実験を行なった。ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼに対応するdsRNA、一本鎖RNA又はアンチセンスRNAの何れかを翻訳反応に加えた。30°Cで1時間行なった反応の後に、二連のルシフェラーゼアッセイを、アナリティカルサイエンティフィックイントゥルメンツモデル3010ルミノメーターを利用して行なった。図36は、これらの実験の結果をまとめたものであり、このインビトロアッセイで認められた遺伝子発現の抑制がdsRNAに特異的であることを示している。これらの結果は、更に、dsRNAが、この哺乳動物のインビトロ系における遺伝子発現を、転写後サイレンシングと一致する仕方で抑制するという結論を支持する。G.dsRNAに浸した哺乳動物細胞は、遺伝子サイレンシングを生じる無脊椎動物における転写後サイレンシングの研究は、dsRNAのトランスフェクション又はインジェクションが抑制作用を達成するのに必須でないはことを示した。例えば、C.エレガンスにおけるdsRNA抑制は、線虫をdsRNAに浸すか又は関心あるdsRNAを発現する細菌を給餌することによって認められうる。我々は、哺乳動物細胞におけるdsRNA抑制がdsRNAのトランスフェクションなしで認められうるかどうかの問題を扱った。かかる結果は、dsRNA抑制を哺乳動物細胞において容易に利用するための更なる潜在的能力を与え、トランスフェクトするのが困難であった細胞型における遺伝子発現を抑制するためのdsRNAの利用をも可能にするであろう。P19細胞を、6ウェル組織培養プレート中の培地中で約60集密まで生育させた。ホタルdsRNAの濃度を変化させてこれらの培養物に加えて、細胞を、生育培地dsRNA中で、12時間にわたって培養した。次いで、細胞をホタル又はウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミドで、上で詳述したように、トランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、トランスフェクションの12時間後に、アナリティカルサイエンティフィックインストゥルメンツモデル3010ルミノメーターを利用して行なった。図37は、これらの結果をまとめたものであり、それは、dsRNAが哺乳動物細胞においてトランスフェクションなしで遺伝子発現を抑制することができることを示している。dsRNAの存在下での細胞培養は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の投与量依存性の抑制を生じた。方法:細胞培養。P19マウス胎生期癌細胞を10熱不活化FBS及び1抗生物質/抗真菌性溶液を補ったα-MEM中で培養した。マウス胚性幹細胞を、ESgroを含むDMEM中で、製造者の指示に従って培養した。C2C12マウス筋芽細胞を10熱不活化FBS及び1抗生物質/抗真菌性溶液を補ったDMEM中で培養した。RNA調製法。dsRNAの生成のために、転写のためのテンプレートをPCRにより生成した;それらは、T7プロモーター配列をテンプレートの各末端に含んだ。dsRNAを、RiboMaxキットを利用して調製した。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼのmRNA転写物を、Riboprobeキットを利用して合成し、使用前にゲル精製した。トランスフェクション及び遺伝子サイレンシングアッセイ。細胞を、示した量のdsRNA及びプラスミドDNAで、FuGENE6を利用して、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。細胞を、50~70集密で、ウェル当たり1又は2mlの培地を含む12ウェルプレート中でトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、細胞を、ホタルルシフェラーゼをSV40プロモーターの制御下に含むプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼをSV40初期エンハンサー/プロモーター領域の制御下に含むプラスミドで同時トランスフェクトすることにより行なった。これらのプラスミドを、pGL3-control対pRL-SV40の比1:1又は10:1を利用して同時トランスフェクトした。両比とも同じ結果を生じた。幾つかの実験について、細胞を、増進されたグリーン蛍光タンパク質-US9融合タンパク質又はレッド蛍光タンパク質の発現を指示するベクターでトランスフェクトした。S2細胞におけるRNAiを記載されたように行なった。ヘアピンRNAを発現するプラスミドを、EGFPコード領域の最初の500bpをpRIP-FLIPのFLIPカセット中に直列反復としてクローン化することにより構築した。このFLIPカセットは、2つの向きのクローニング部位を含み、その2番目のものは隣接LoxP部位に変異を生じさせる。ゼオシン遺伝子は、選択を維持し、そうして、FLIPカセットの安定性を維持する。このEGFP直列反復を含むFLIPカセットを、pcDNA3中にサブクローン化した。ヘアピン生成のために逆向き反復を造るために、EGFP直列反復クローンをCreレコンビナーゼにインビトロで曝し、その後、DL759大腸菌にトランスフォームした。これらの細菌は、十字形構造を含むDNAの複製を可能にし、該構造は、逆向き反復から形成される傾向がある。DL759トランスフォーマントを、逆向き反復を含むプラスミドにつきスクリーニングした。Dicerのサイレンシングを、マウスDicer遺伝子のエキソン25を含み、ヒトDicercDNAのヌクレオチド5284~5552に対応するdsRNAを利用して達成した。インビトロ翻訳及びインビトロDicerアッセイ。対数増殖期の細胞を、5mMEGTAを含むPBS中に採集してPBS中で2回洗い、低張緩衝液で一回洗った。細胞を、完全プロテアーゼインヒビター及び0.5単位/mlのRNアーゼを含む低張緩衝液の0.7充填細胞容積で懸濁させた。細胞をB型ペッスルを備えたダンス型ホモジェナイザー内で破壊し、溶解物を30,000×gで20分間遠心分離した。上清を、キャップ付きm7GpppGホタル及びウミシイタケルシフェラーゼmRNAを含むインビトロ翻訳アッセイ又は、32P標識dsRNAを含むインビトロDicerアッセイで利用した。インビトロ翻訳アッセイについて、5μlの抽出物を、1μgのdsRNA/10mMDTT/0.5mMスペルミジン/200mMHepes、3.3mMMgOAc/800mMKOAc/1mMATP/1mMGTP/4単位のRnasin/215μgのクレアチンホスフェート/1μgのクレアチンホスフェートキナーゼ/1mMアミノ酸と共に、100ngのホタル及びウミシイタケmRNAと混合した。反応を1時間30°Cで行ない、1×受動溶解緩衝液の添加により止めた。次いで、抽出物を、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。Dicer活性についてのインビトロアッセイを、記載されたように行なった。安定なサイレンシング株の構築。P19細胞の10センチメートルプレートを、5μgのGFPヘアピン発現プラスミドでトランスフェクトし、安定なインテグラントを14日間G-418を利用することにより選択した。クローンを選択してGFPのサイレンシングにつきスクリーニングした。実施例5:siRNA合成のための組成物及び方法以前の結果は、短い合成RNAが効率的にRNA抑制を誘導することができるということを示していた。短いRNAは非特異的PKR応答を活性化しないので、それらは、ある範囲の細胞型における遺伝子発現を効率的にスクリーニングする手段を提供する。しかしながら、siRNAに関する当分野の現状は、幾つかの制約を有している。第一に、siRNAは、現在、高いコストで化学合成されている。かかる高コストは、siRNAを、小さい研究室又は大規模なスクリーニングにとって実際的でないものにしている。従って、当分野には、siRNAを低コストで生成する方法に対する要求がある。我々は、siRNAの、T7ポリメラーゼによる合成のための組成物及び方法を提供する。このアプローチは、標準的RNA転写反応と一致するコストでのsiRNAの効率的合成を可能にする。この大いに低減されたコストは、siRNAの利用を、小さい研究室にとって妥当なアプローチとし、大規模なスクリーニングプロジェクトにおけるそれらの利用をも容易にする。図38は、T7ポリメラーゼを利用するsiRNAの製造方法を示している。簡単にいえば、T7ポリメラーゼを利用して、センス及びアンチセンス転写物の両方を転写する。次いで、これらの転写物をアニールさせて、siRNAを与える。当業者は、任意の利用可能なRNAポリメラーゼを容易にT7の代わりに利用してこの発明を行なうことができるということを認めるであろう。このアプローチは、単一のsiRNA種の生成並びにsiRNAライブラリーの生成に従順である。かかるsiRNAのライブラリーは、細胞ベースの表現型スクリーニング及び遺伝子アレイベースのスクリーニングを含む多くの高スループットスクリーニングにおいて利用することができる。実施例6:短いヘアピンRNAの生成及びかかる短いヘアピンを利用する遺伝子発現の抑制小さい、内因的にコードされるヘアピンRNAは、RNAi機構のエレメントによって遺伝子発現を調節することができるという理解の後に、我々は、この生物学的機構を所望の標的遺伝子の調節のために利用することを探求してきた。ここに、我々は、短いヘアピンRNAが配列特異的な遺伝子サイレンシングを哺乳動物細胞において誘導することができることを示す。これは、通常、siRNAを用いて行なわれるので、サイレンシングを、外因的に合成されたヘアピンを細胞にトランスフェクトすることによって引き起こすことができる。しかしながら、サイレンシングは又、shRNAの内因性の発現によっても引き金を引かれうる。この観察は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を安定に抑制するためにRNAiが利用される連続的細胞株の生成への扉を開く。その上、類似のアプローチが、トランスジェニック動物の創出に効力があること及び、潜在的に、所望の効果を生じるために遺伝子機能の長期間の抑制が必須である治療ストラテジーにおいて効力があることが判るであろう。幾つかのグループは、遺伝子サイレンシングの内因性トリガー、特に、小さい一過性のRNAlet-7及びlin-4が、少なくとも部分的に、RNAi経路を介して機能することを示している。特に、これらの小さいRNAiは、Dicerにより処理されて成熟型の約21nt形態になるヘアピン前駆体によってコードされる。その上、C.エレガンスにおける遺伝学的研究は、stRNA機能におけるArgonauteファミリータンパク質の必要性を示している。特に、alg-1及びalg-2は、stRNAプロセッシング及びそれらの下流のエフェクターの機能の両方に関係する。我々は、最近、RISCの構成要素がArgonauteファミリーのメンバーであることを示したが、これは、stRNAが、mRNA安定性よりもmRNA翻訳を調節するRISC様複合体を介して機能しうるモデルを思いつかせる。A.短いヘアピンRNAが引き金を引く、ショウジョウバエ細胞における遺伝子サイレンシング我々は、我々がこれらの小さい、内因的にコードされたヘアピンRNAを新しい目標として、選択した遺伝子を調節することができる可能性を試験することを望んだ。長いdsRNAが引き金を引くかsiRNAが引き金を引くかによらず、一般に、RNAiは、哺乳動物細胞よりもショウジョウバエS2細胞での遺伝子発現の抑制において一層強力である。それ故、我々は、このモデル系を、短いヘアピンRNAの遺伝子サイレンシングのインデューサーとしての効力を試験するために選択する。stRNAも最近発見されたmiRNAの兄弟グループも、完全なヘアピン構造を形成する。実際、これらのRNAの各々は、幾つかの突き出たヌクレオチドをそれらのむしろ短い幹構造中に含むことが予想されている。これらの突き出たヌクレオチドの位置及び特性は、進化を通して保存され、少なくともmiRNAのサブセット中で保存されてきたので、我々は、これらの予想される構造的特長を保存する新たに目標とされたmiRNA模倣物をデザインすることを探求した。これらのlet-7及びlin-4miRNAのみが、公知のmRNA標的を有する。両方の場合において、調節された転写物中の結合部位に対する対合は不完全であり、lin-4の場合には、突き出たヌクレオチドの存在は、抑制に対して臨界的である。それ故、我々は、標的基質と不完全に対合するshRNAをもデザインした。これらのshRNAのサブセットは、図39Aに描いてある。多数のshRNA変異体の迅速な試験及び抑制の効力の定量的比較を可能にするために、我々は、ショウジョウバエ抽出物及び哺乳動物細胞の両方におけるRNAiのアッセイのために前に記載したように、二連のルシフェラーゼレポーターシステムを利用することを選択する。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドの、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と相同な長いdsRNA又はsiRNAとの同時トランスフェクションは、ホタルルシフェラーゼの約95の抑制を、ウミシイタケルシフェラーゼに対する影響を伴わずに生じた。ホタルルシフェラーゼは又、相同なshRNAとの同時トランスフェクションによっても特異的に発現抑制されえた。最も強力なインヒビターは、基質に対する完全な相同性を有する単一のヘアピン構造よりなるものであった。幹内の又は基質認識配列内のG-U塩基対の導入は、殆ど又は全く効果を有しなかった。これらの結果は、短いヘアピンRNAが、ショウジョウバエS2細胞において、siRNAと類似の能力を有して、遺伝子サイレンシングを誘導することができることを示している。しかしながら、我々のショウジョウバエS2細胞におけるRNA干渉の初期の観察において、我々は、サイレンシングの、dsRNAトリガーの長さへの深い依存性に注意した。実際、約200ntより少ないdsRNAは、非常に効率悪く引き金を引いた。サイレンシングは、長いdsRNAを約22ntのsiRNAに処理するRNアーゼIIIファミリーのヌクレアーゼであるDicerによって開始される。サイレンシングのイニシエーターとしての変化する能力と合致して、長いdsRNAは、Dicer酵素によって、短いRNAよりずっと容易に処理される。それ故、我々は、shRNAがDicer酵素の基質であるかどうかを試験した。我々は、前に、let-7及び他のmiRNAがDicerにより、短い、ヘアピンでないdsRNAと比べて予想外の高効率で処理されることに注意した。同様に、Dicerは、ホタルルシフェラーゼを標的とするshRNAを、それらが天然のDicer基質を模倣するようにデザインされたか単なるヘアピン構造であるかにかかわらず、効率的に処理した。これらのデータは、組換えshRNAがDicerによってsiRNAへと処理されうること及びこれらの短いヘアピンがRNAiを介する遺伝子サイレンシングの引き金を引くという考えと一致することを示唆している。B.短いヘアピンRNAは、哺乳動物細胞において遺伝子サイレンシングを活性化した哺乳動物細胞は、RNAiの適用を妨げることが予想される幾つかの内因性システムを含んでいる。これらの内の主たるものは、dsRNA活性化プロテインキナーゼ、PKRであり、これは、EIF-2αのリン酸化によって翻訳の一般的抑制を達成する。これらの活性化及び他のdsRNA応答性経路は、一般に、おそらくアロステリックアクチベーター上での二量体形成を可能にする30bpを超える長さの二本鎖を必要とする。Dicer生成物を模倣する小さいRNAのsiRNAは、おそらく、少なくとも部分的にそれらのサイズの故に、この制限を逃れて、特異的サイレンシングの引き金を引く。しかしながら、siRNAの特徴を欠く短い二本鎖RNAは、効率的に、ショウジョウバエS2細胞においてサイレンシングを誘導することができるが、哺乳動物細胞ではできない。内因的にコードされたmiRNAも又、ので、それらのサイズの故に、そしておそらくそれらの二本鎖構造の不連続性の故にも、PKR監視機構を回避することができる。30bp未満のshRNAがショウジョウバエS2細胞におけるRNAiの効果的なインデューサーであると仮定して、我々は、これらのRNAが配列特異的なサイレンシングを哺乳動物細胞においても誘導することができるかどうかを試験した。ヒトの胎児の腎臓細胞を、化学合成したshRNAとホタル及びウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミド混合物とで同時トランスフェクトした。S2細胞で認められたように、shRNAは、遺伝子サイレンシングの効果的なインデューサーであった。もう一度、let-7を模倣するようにデザインされたヘアピンは、一貫して単なるヘアピンRNAより効果的でなく、shRNAのアンチセンス鎖とmRNA標的の間のミスマッチの導入は、サイレンシングを完全に破壊した。全体的に、shRNAは、siRNAより幾らか低強度のサイレンシングトリガーであった。ホタルルシフェラーゼに相同なsiRNAは、日常的に、遺伝子発現の約90~95の抑制を生じたが、shRNAにより達成された抑制レベルは、平均80~90に及んだ。我々は、siRNAについても認めたが、このサイレンシングトリガーの能力の最も重要な決定基は、その配列である。我々は、siRNAとshRNAの両者の凡そ50が遺伝子発現の抑制に関して有能であることを見出す。しかしながら、標的mRNAの予想された構造の分析もsiRNA二本鎖若しくはshRNAヘアピン中の別の構造の分析も、遺伝子発現の効果的なインヒビターの選択のための予測値であると判明した。我々は、29bpを含むshRNA二本鎖を標準として採用した。しかしながら、へリックスのサイズは、能力の有意の喪失を伴わずに約25ntに減少しうる。22bpほどの短い二本鎖でも、依然として、検出可能なサイレンシングを引き起こすことができるが、一層長い二本鎖ほど効率的ではない。何れの場合でも、我々は、内部対照レポーターの減少を観察しなかったが、これは、非特異的dsRNA応答の誘導と合致する。shRNAの遺伝子サイレンシングを誘導する能力は、293T細胞に限られなかった。同様の結果が、ヒト癌細胞、トランスフォームされたサルの上皮細胞、マウス繊維芽細胞及び二倍体ヒト繊維芽細胞を含む様々な他の哺乳動物細胞株においても認められた。C.T7RNAポリメラーゼを利用する遺伝子発現の効果的インヒビターの合成遺伝子サイレンシングを引き起こすためのsiRNAの利用は、哺乳動物細胞における遺伝子機能を研究するための標準的方法論に発展しつつある。今まで、siRNAは、専ら化学合成により生成されてきた。しかしながら、このアプローチに関するコストは、重大であり、多数の遺伝子の機能を並行して研究するためのツールとしてのその潜在的有用性を制限している。短いヘアピンRNAは、おそらくインビボでDicerによりプロセッシングを受けて活性なsiRNAになる。そうして、これらは、ヌクレオチドオーバーハング及びホスフェート末端の両者に関して、一層許容されうる末端構造でありうる。それ故、我々は、shRNAが、T7RNAポリメラーゼによるインビトロ転写によって調製されうるかどうかを試験した。化学的RNA合成により調整されたものに類似したsiRNA及びshRNAを生成することが予想される転写のためのテンプレートをDNA合成によって調製した。これらを、S2細胞及びヒト293細胞の両者における効力につき試験した。全体的に、T7で合成されたヘアピン又はsiRNAの性能は、化学合成により生成されたものの性能と、阻害の程度に関しても異なる配列の相対的効率に関してもぴったり一致した。しかしながら、T7ポリメラーゼは、2つのグアノシン残基から開始することを好むので、インビトロ転写されるsiRNAをデザインする場合には、開始のコンテキストを考えることは重要であった。対照的に、shRNAは、Dicerにより処理されるが、転写物の5’末端へのこれらの塩基の添加に耐性である。ショウジョウバエ胚抽出物における研究は、siRNAが、RNアーゼIIIファミリーヌクレアーゼによる生成と一致して、5’リン酸化末端を有することを示している。インビトロで、この末端は、合成RNAオリゴヌクレオチドによるRNAiの誘導に臨界的である。化学的に合成されたsiRNAは、リン酸化されておらず、トランスフェクション前のインビトロでの5’ホスフェート基の酵素的付加は、サイレンシング効果の能力を増大させない。これは、リン酸化末端の必要性が哺乳動物細胞では一層厳しくないこと又はキナーゼがインビボでsiRNAを効率的にリン酸化することを示唆する。しかしながら、T7RNAポリメラーゼにより合成されたRNAは、5’三リン酸化末端を有する。それ故、我々は、T7ポリメラーゼによってsiRNAを合成した後に、インビトロでピロホスファターゼで処理して該末端を改変してsiRNAのそれに似させる可能性を調べた。驚くべきことに、一リン酸化siRNAは、遺伝子サイレンシングの誘導において、三リン酸末端を有する転写産物と同じくらい強力であった。これは、一リン酸化末端の必要性が哺乳動物細胞においては一層厳しくないこと又はsiRNAが適当な末端構造を達成するようにインビボで改変されていることを示唆しうる。総合すると、我々のデータは、shRNA及びsiRNA二本鎖の両者が、インビトロでT7RNAポリメラーゼを用いる合成によって調製されうることを示唆している。これは、哺乳動物細胞におけるRNAiのコストを有意に減少させ且つRNAiの全ゲノム規模に対する応用への道を舗装する。D.小さいヘアピンRNAのインビトロでのRNAポリメラーゼIIIによる転写siRNAが哺乳動物細胞における遺伝子機能をプローブ検査するための紛れもなく有効なツールであるにもかかわらず、それらの抑制効果は、限られた持続時間の限定によるものである。siRNAの送達は、多くの一過性トランスフェクション方法論の何れかにより達成することができ、抑制ピークのタイミング及びサイレンシングが崩壊するにつれてのタンパク質レベルの回復の両者は、細胞型及び標的遺伝子の両者によって変化しうる。それ故、siRNAに対する一つの限界は、所望の標的の発現が安定に抑制される連続的細胞株の開発である。長い二本鎖構造よりなるヘアピンRNAは、植物、C.エレガンス、及びショウジョウバエにおいて、安定な遺伝子サイレンシングの有効なトリガーとして明らかとなってきた。我々は、最近、培養哺乳動物細胞における遺伝子発現の、長いヘアピンRNAの連続的発現による安定な抑制を示した。しかしながら、このアプローチの範囲は、かかるヘアピンの、検出可能なPKR応答のない細胞だけでの発現の必要性により制限された。原則として、shRNAは、かかる制限を回避して、哺乳動物体細胞におけるRNAによる安定な抑制を引き起こすためのツールを提供することができた。この可能性を試験するために、我々は、最初に、ホタルルシフェラーゼshRNAをコードする配列をCMVベースの発現用プラスミド内にクローン化した。これは、ヘアピンが、ベクター配列及びポリによって5’及び3’末端の両方に及んでいるキャップ付きポリアデニル化RNAポリメラーゼII転写物を生成することを予想させた。この構築物は、293T細胞でのサイレンシングアッセイにおいて完全に不活性であった。化学的に及びT7により合成されたshRNAについての我々の研究において、我々は、有意の一本鎖の伸長の存在がshRNAの効力を低下させることに気付いた。それ故、我々は、一層限定されたヘアピンRNAを生成する努力において選択的プロモーターストラテジーの利用を探究した。特に、RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、よく規定された開始部位及び停止部位を有しており、様々な小さい安定なRNA種を自然に生成する。多くのPolIIIプロモーターは、転写される領域に必須エレメントを含んでいるが、それらの有用性を我々の目的に限るならば、クラスIIIプロモーターは、専ら転写されないプロモーター配列を利用する。これらの内で、U6snRNAのプロモーター及びH1RNAのプロモーターは、よく研究されている。便利なクローニング部位をU6snRNAプロモーターの直後に位置させることにより、我々は、遺伝子サイレンシングのために短いヘアピンを利用する発現ベクターのpShh-1を構築した。このベクター内に、ホタルルシフェラーゼに由来する2つのshRNA配列の何れかを合成オリゴヌクレオチドからクローン化した。これらを、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ発現用プラスミドと共に293T細胞中に同時トランスフェクトした。これら2つのコードされたshRNAの一方は、ホタルルシフェラーゼの効果的サイレンシングを、内部対照の発現を変えることなく引き起こした。第二のコードされたshRNAも又、生成した。両方の場合において、サイレンシングは、shRNAのプロモーターに対して正しい向きでの挿入に依存していた。shRNA自体は左右対称であっても、正しくない向きでの挿入は、PolIII停止に影響を与え、5’及び3’側の両方に一本鎖伸長を有するヘアピンの生成が予想される。同様の結果が、HeLa、COS-1、NIH3T3及びIMR90を含む多くの他の哺乳動物細胞においても得られた。しかしながら、pShh1-Ff1は、ヒトU6プロモーターが不活性なショウジョウバエ細胞において、ルシフェラーゼレポーターの抑制を達成することができなかった。E.Dicerは、shRNA媒介の遺伝子サイレンシングに必要であるプラスミドにコードされたshRNAが哺乳動物RNAi経路を介して遺伝子サイレンシングをもたらすかどうかの限定試験として、我々は、抑制の、RNAi経路の必須構成要素への依存性を評価した。我々は、pShh1-Ff1を、ヒトのDicerと相同なsiRNAと共にトランスフェクトした。図43は、DicersiRNAによる細胞の処理が、pShh1-Ff1により誘導されたサイレンシングを完全に低下させることができることを示している。無関係のsiRNAの添加は、pShh1-Ff1による抑制の程度に影響を有しなかった。重要なことに、DicersiRNAは、ホタルルシフェラーゼのsiRNA誘導されたサイレンシングに対して何の効果も有しなかった。これらの結果は、stRNA及び長いdsRNAにより引き起こされるものと類似するRNAi経路を介したshRNAの作用と一致している。その上、それは、siRNA媒介のサイレンシングがDicer酵素の涸渇に対して一層感受性でないことを示唆している。F.shRNA媒介の内因性遺伝子の安定な遺伝子サイレンシングコードされた短いヘアピンの最終的有用性は、生じた表現型の研究を可能にする安定な変異体の創出にある。それ故、我々は、我々が、安定な抑制によって細胞表現型を造ることができるかどうかを試験した。一次マウス胎児繊維芽細胞におけるrasオンコジーンの活性化されたアレルの発現は、最終的表現型としての複製老化に似た安定な成長停止状態を誘導する。細胞は、分裂を止めて、典型的な大きい平らな形態を呈している。老化は、p53腫瘍サプレッサー経路を不活性化する突然変異によって計数することができる。ベクターにコードされたshRNAの内因性細胞遺伝子を安定に抑制する能力の試験として、我々は、マウスp53遺伝子を標的とするヘアピンを生成した。図44に示したように、pBabe-RasV12をトランスフェクトしたMEFは、空の対照用ベクターを同時トランスフェクトした場合、増殖できず、老化した形態を示している。Serrano等によって以前に注意されたように、最終的に停止した状態は、培養において薬物選択した細胞の100において、トランスフェクション後8日までに達成される。しかしながら、活性化ras発現用構築物のpShh-p53との同時トランスフェクションに際しては、細胞は、培養において、老化した形態を採用できないだけでなく増殖する能力を最低数週間維持する薬物選択から現れた。これらのデータは、shRNA発現構築物を、選択した標的遺伝子が安定に抑制される連続的哺乳動物細胞株の創出のために利用することができることを強く示唆している。G.複数のヘアピンRNAの同時導入は、相乗作用を生じない短いヘアピンが遺伝子発現を抑制する機構を更に理解することを意図して、我々は、細胞を、ホタルルシフェラーゼに対応する2つの異なる短いヘアピンの混合物でトランスフェクトすることの効果を調べた。図45は、細胞をかかる短いヘアピンの混合物に曝した場合に得られるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現の抑制に対する相乗作用がないことを示唆する実験結果をまとめたものである。方法:細胞培養。HEK293T、HeLa、COS-1、MEF及びIMR90細胞を、10熱不活化ウシ胎児血清及び1抗生物質/抗真菌性溶液を補ったDMEM中で培養した。NIH3T3細胞を、10熱不活化仔ウシ血清及び1抗生物質/抗真菌性溶液を補ったDMEM中で培養した。RNAの調製法。shRNAとsiRNAの両方を、インビトロで、化学合成したDNAオリゴヌクレオチドテンプレート及びT7メガショートスクリプトキットを利用して生成した。転写用テンプレートを、それらがT7プロモーター配列を5’末端に含むようにデザインした。インビトロDicerプロセッシングにかけられるshRNA転写物をリボプローブキットを利用して合成した。化学合成されたRNAは、DharmaconIncから得た。トランスフェクション及び遺伝子サイレンシングアッセイ。細胞を、示した量のsiRNA、shRNA及びプラスミドDNAで、標準的リン酸カルシウム手順を6ウェルプレート中で50~70集密で利用してトランスフェクトした。二連のルシフェラーゼアッセイを、細胞を、ホタルルシフェラーゼをSV40プロモーターの制御下に含むプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼをSV40初期エンハンサー/プロモーター領域の制御下に含むプラスミドで同時トランスフェクトすることにより行なった。プラスミドを、pGL3-Control対pRL-SV40の比1:1を利用して同時トランスフェクトした。S2細胞におけるRNAiを、以前に記載されたように行なった。安定なサイレンシングのために、一次MEFを、製造者の奨めに従って、pBabe-Ha-rasV12及びpShh-p53と共にFugene6を利用して同時トランスフェクトした。選択を、活性化Ha-rasV12プラスミドの存在について行なった。pShh-p53プラスミドは、過剰に存在した。我々は、今や、GATEWAYシステムと両立するU6プロモーターベクターを生成したが、これを利用して、shRNA発現カセットを、シス結合した選択マーカーを有する様々なレシピエントベクター中に運ぶことができる。その上、我々は、レトロウイルスベクターを利用するshRNAの送達を確認した。最新のプラスミド情報は、httpwwwcshlorgpublicsciencehannonhtmlで得ることができる。ヘアピンRNAを発現するプラスミド。-265から1までのU6プロモーター領域をPCRにより増幅し、pBSSK中へのクローニングのために、5’KpnI及び3’EcoRV部位を付加した。リンカー/ターミネーターオリゴヌクレオチドセットを、プロモーター構築物中にクローン化して、新たな配列の挿入のためのEcoRV部位を有するU6カセットを生じた。このベクターは、pShh1と命名された。標的遺伝子と相同な19~29塩基を有するshRNAをコードする鈍端の二本鎖DNAオリゴヌクレオチドを、EcoRV部位に連結して発現構築物を生成させた。このFf1を構築するために利用したオリゴヌクレオチド配列は:TCCAATTCAGCGGGAGCCACCTGATGAAGCTTGATCGGGTGGCTCTCGCTGAGTTGGAATCCATTTTTTTTであった。この配列は、配列GGATが先行しており、ベクターによって供給され、PolIIIターミネーターとして5つより多くのTの領域を含んでいる。インビトロDicerアッセイ。Dicer活性についてのインビトロアッセイを、記載されたように行なった。実施例7:コードされた短いヘアピンは、インビボで機能する本発明の目的は、遺伝子発現の特異的抑制において利用するためのsiRNA及び短いヘアピンを生成する方法を改良することである。実施例6は、siRNA及び短いヘアピンが、遺伝子発現の特異的抑制に大いに効果的であることを示している。従って、短いヘアピン及びsiRNAを利用して達成することのできる遺伝子発現の効率的抑制を、かかるRNAをプラスミド上にコードして一時的又は安定に発現させる方法と合わせることは有利であろう。図46は、プラスミド上にコードされた短いヘアピンが遺伝子発現の抑制に有効であることを示している。ホタルルシフェラーゼに対応する29ヌクレオチドのヘアピンをコードするDNAオリゴヌクレオチドを、U6プロモーターを含むベクターに挿入した。3つの独立した構築物を、293T細胞におけるホタルルシフェラーゼ遺伝子発現を特異的に抑制する能力について調べた。siOligo1-2、siOligo1-6及びsiOligo1-19は、各々、siRNAと同じくらい効果的に、遺伝子発現を抑制した。対照的に、siOligo1-10は、遺伝子発現を抑制しなかった。加えて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の異なる部分を標的とする独立した構築物は、何れの無機の遺伝子発現をも効果的に抑制しなかった。図46にまとめた結果は、プラスミド上にコードされたsiRNA及び短いヘアピンの一過性の発現が、遺伝子発現を効率的に抑制することができることを示している。当業者は、ある範囲のベクターから一過性又は安定した発現のためにsiRNA又は短いヘアピンを選択することができる。短いdsRNAを安定に発現させるためのベクター及びストラテジーの非制限的例を図47~49に与える。実施例8:PKR応答の非存在下でのdsRNA抑制幾つかの細胞型における遺伝子発現を抑制するためのRNAiの利用に対する一つの潜在的障害は、長いdsRNAによって引き金を引かれうる非特異的PKR応答である。多くの哺乳動物ウイルスは、潜在的宿主細胞への感染を助けるために、PKRをブロックする能力を隠してきた。例えば、アデノウイルスは、dsRNAを模倣するがPKR応答を活性化しないRNAを発現する。ワクシニアウイルスは、次の2つのストラテジーを利用してPKRを回避する:dsRNAに結合してマスクするE3Lの発現;天然のPKR基質のeIF2αを模倣するK3Lの発現。ウイルスがPKR応答を回避する機構の我々の理解は、我々が、遺伝子発現を長いdsRNAによって抑制するのが有利でありうる細胞型におけるPKR応答を回避するアプローチをデザインすることを可能にする。可能なアプローチは、細胞を、プロテインキナーゼRNA活性化アポトーシスを阻害する薬剤で処理すること例えばPKRの発現を阻害し、その破壊を引き起こし、及び/又はPKRのキナーゼ活性を阻害する薬剤での処理を含む。従って、かかる細胞型における遺伝子発現のRNAi抑制は、先ずPKR応答を阻害し、その後、標的遺伝子と同じか又は類似のdsRNAを送達することを含みうる。A.マウス筋芽細胞株C2C12において、我々は、これらの細胞が、特異的又は非特異的な応答の混合物を有する長いdsRNAに応答するということに注意した。非特異的PKR応答を減衰させるために、一方で、長いdsRNAのために、丈夫な、特異的な抑制を維持しつつ、C2C12細胞は、K3L発現を指示するベクターをトランスフェクトされた。この更なるステップは、PKR応答を上首尾に減衰させたが、K3Lタンパク質の発現は、特異的阻害の程度に影響を有しなかった。B.しかしながら、かかる2ステップのアプローチの効力は、以前には示されなかったので、dsRNA抑制がPKR応答を有する細胞において可能でないということが、以前は可能であった。図50は、かかる2ステップのアプローチが可能であり、丈夫な、特異的なdsRNAが媒介する抑制が、前に丈夫なPKR応答を有した細胞において可能であるということを示す結果をまとめてある。簡単にいえば、二連のルシフェラーゼアッセイを、上に詳述したように行なった。これらの実験を、E13.5PKR-/-マウス胎児から収穫したPKR-/-MEFを利用して行なった。MEFは、典型的に、丈夫なPKR応答を有し、それ故、長いdsRNAでの処理は、典型的に、遺伝子発現及びアポトーシスの非特異的抑制を生じる。しかしながら、トランスフェクションの12、42及び82時間後に調べたPKR-/-細胞において、dsレニラルシフェラーゼRNAの発現は、レニラレニフォルミスルシフェラーゼの発現を特異的に抑制する。この抑制は、経時的に安定である。これらの結果は、非特異的PKR応答を、dsRNAにより媒介される遺伝子発現の特異的抑制に影響を与えずにブロックできることを示している。これは、長いdsRNAに対する非特異的PKR応答の混乱した影響のために以前には扱いににくかったものを含む種々の細胞型範囲において遺伝子発現を抑制するための長いdsRNAの利用を可能にする。実施例9:非コード配列に対応するdsRNAを利用する遺伝子発現の抑制RNAiを駆動する機構の現在のモデルは、dsRNA構築物が、関心ある遺伝子に対応するコード配列を含まなければならないことを示唆してきた。証拠は、かかるコード配列が内因性コード配列に対して完全にマッチする必要はないことを示してきたが、dsRNA構築物がコード配列に対応しなければならないと広く考えられてきた。我々は、従来技術の教示に反対する証拠を提供し、遺伝子の非コード領域に対応するdsRNAが遺伝子機能をインビボで抑制することができることを示す。これらの結果は、それらが非コード配列と同じか又は類似するdsRNAが抑制を媒介することができることを示すからだけでなく、我々がdsRNA技術をマウスモデルにおいて利用して遺伝子発現のインビボでの抑制を示すので重要である。我々は、マウスチロシナーゼ遺伝子プロモーターの4つのセグメントに対応する二本鎖RNAを生成した。これらのセグメントの3つは、近位プロモーターに対応し、1つは、エンハンサーに対応している。このチロシナーゼ遺伝子は、メラニン生合成経路に含まれる速度制限酵素をコードするPigmentCellResearch14328336。従って、チロシナーゼ遺伝子の抑制は、色素形成を阻害することが予想される。上記のプロモーターセグメントの各々に対応する二本鎖RNAを、受精卵の前核に注入した。19日後に仔マウスが生れた。全部で、42/136の胎児が分娩に至った。この数は、導入遺伝子について予想された範囲内である。42匹中の2匹の仔マウスは、誕生時に全く色素がなく、これは、チロシナーゼ機能の抑制と一致している。方法:チロシナーゼ遺伝子の非コードプロモーター領域からのdsRNA。マウスチロシナーゼ遺伝子プロモーターの4つのセグメントを、T7RNAポリメラーゼプロモーターをPCR生成物に組み込むプライマーを利用してPCRによって増幅した。マウスチロシナーゼ遺伝子の5’隣接領域の配列は、GeneBankから得た。チロシナーゼエンハンサーの配列も又、GenBankから得た。用いたプライマーの配列は、次の通りであった:T7RNAポリメラーゼプロモーターの配列は、太字で示されていることに注意されたいチロシナーゼエンハンサー:-1404~-1007:-1003~-506:-505~-85:PCR生成物を、1TAEアガロースゲルから、QiaExIIGelExtractionキットを利用して精製した。二本鎖RNAを、これらのテンプレートから、T7-メガショートスクリプトキットを利用して生成した。酵素及び組み込まれなかったヌクレオチドを、QiaquickMinElutePCR精製キットを利用して除去した。RNAを2回フェノール/クロロホルム抽出して、エタノール沈殿させた。ペレットを、注射用緩衝液、0.15nMEDTAに20ng/μlの濃度で再懸濁して、1TAEアガロースゲル上で泳動して完全性を確認した。マウスの作成:上記のプライマーセットの各々からの二本鎖RNAの等量混合物を、C57BL6Jマウスからの受精卵の前核に注入した。全部で136の注入を行ない、34の胎児を4匹の偽妊娠CD-1雌の各々に移植した。19日後に仔マウスが生れた。全部で、42/136の胎児が分娩に至った。2/42匹の仔マウスが、誕生時に全く色素を有しなかった。非コード配列と同じか又は類似のdsRNAにより媒介されたRNAiが、コード配列と同じか又は類似のdsRNAの存在下で認められたPTGSと同じ機構によって作動するのかどうかは明らかでない。しかしながら、これらの結果が、最終的に、類似の機構であることが明らかとなっても異なる機構であることが明らかになっても、インビトロ又はインビボで少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する本発明の組成物及び方法のすばらしい有用性は減少しない。本発明は、20~500ntに及ぶ長さのdsRNAが、標的遺伝子の発現を、インビトロ及びインビボで、容易に抑制することができることを示している。その上、本発明は、dsRNAを、ヘアピンの形成を含む様々な方法を利用して生成することができること及びこれらのdsRNAが、安定に又は一過性で発現されうることを示している。最終的に、本発明は、非コード配列と同じか又は類似のdsRNAが標的遺伝子発現を抑制することができることを示している。実施例10:成体マウスにおけるRNA干渉RNA干渉は、相同な遺伝子の配列特異的サイレンシングによって二本鎖RNAに応答する進化的に保存された監視機構である。ここで、我々は、導入遺伝子の発現を成体マウスにおいて、合成の小型干渉性RNAにより及びDNAテンプレートからインビボで転写された小さいヘアピンRNAによって抑制することができることを示す。我々は又、インビボでのRNA干渉によりC型肝炎ウイルスに由来する配列の効果的なターゲティングを示すことにより、この技術の治療用潜在能力をも示す。小型の干渉性RNAは、RNA干渉経路の中間体を模倣し、遺伝子を体細胞において非特異的抑制を活性化することなく二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼにより発現抑制することができる。siRNAも又、遺伝子発現をインビボで阻害するかどうかを研究するために、我々は、流体力学的トランスフェクション法の改変を利用して、裸のsiRNAを成体マウスの肝臓へ送達した。ホタルルシフェラーゼから送達されたsiRNA又は無関係のsiRNAを、ルシフェラーゼ発現プラスミドと同時注入した。我々は、ルシフェラーゼ発現を生きた動物において全身イメージングを利用してモニターし、それがレポータープラスミド投与量に依存するということを見出した。各実験において、同時注入したヒトα-1アンチトリプシンプラスミドの血清測定値は、トランスフェクション効率を標準化するのと非特異的翻訳阻害をモニターするのに役立った。72時間後のhAATの平均血清濃度は、すべてのグループにおいて同様であった。我々の結果は、成体マウスにおけるルシフェラーゼ発現の特異的なsiRNA媒介の阻害があること及び無関係のsiRNAが何の効果も有しないことを示している。11の独立した実験において、ルシフェラーゼsiRNAは、ルシフェラーゼ発現を平均81だけ減らした。これらの発見は、RNAiが遺伝子発現を成体マウスにおいてダウンレギュレートできることを示している。RNAiは、培養においてRSウイルスRNAを分解するので、我々は、RNAiがマウスで発現されたヒトの病原性RNA即ちC型肝炎ウイルスに向けられるかどうかを研究した。HCVの感染は、米国及び欧州における肝臓移植の最も一般的な理由である。我々は、このウイルスのNS5B領域をルシフェラーゼRNAと融合させて、RNAiを同時トランスフェクションによってインビボでモニターした。NS5B領域を標的とするsiRNAは、キメラのHCVNS5Bタンパク質-ルシフェラーゼ融合物からのルシフェラーゼ発現を75だけ減少させた。この結果は、RNAiを他の重大なヒト病原体に対する治療として利用することが可能であることを示唆している。我々の結果は、siRNAがマウスにおいて機能的であることを示しているが、送達には、主要な障害が残っている。siRNAと異なり、機能的な小さいヘアピンRNAは、インビボで、DNAテンプレートから、RNAポリメラーゼIIIプロモーターを利用して発現されうるし;それらは、遺伝子抑制の誘導において、siRNAほどに効果的である。同起源のshRNAの発現は、ルシフェラーゼの発現を、3つの独立した実験で、最大で98阻害し、平均で92.8抑制した。空のshRNA発現ベクターは何の効果も有しなかったし;shRNA挿入物の向きの逆転は、RNAポリメラーゼIIIによる停止を変化させて不適当に構造化されたshRNAを生成するので、遺伝子サイレンシングを妨げる。これらの発見は、プラスミドにコードされたshRNAは、強力且つ特異的なRNAi応答を成体マウスにおいて誘導することができることを示している。RNAiは、機能的ゲノミクスにおいて及びデザイナードラッグの標的の同定において応用を見出しうる。それは、遺伝子のグループを同時に、時間を浪費する交配を必要とせずに無力にすることができるので、遺伝子破壊マウスよりも一層将来有望なシステムである。遺伝子治療は、現在、外因性タンパク質の異所的発現に依存しているが、RNAiは、最終的に、この機能獲得アプローチを、疾病関連遺伝子をshRNAの発現を指示するDNA構築物によって発現抑制することにより補完することができる。RNAi送達の我々の方法は又、臨床関連において、ウイルス性及び非ウイルス性の遺伝子トランスファー用ベクターの開発を利用するようにあつらえることもできよう。実施例11:マウスにおけるRNAiの生殖細胞系列への伝達マイクロRNA分子は、哺乳動物を含む多くの真核生物で見出されている小さい、非コードRNA分子である。miRNAは、特徴的な二次構造を共有し、短いヘアピンRNAを形成している。遺伝学的及び生化学的研究は、miRNAがDicerにより処理されて成熟型になり、RNAに媒介される干渉及び関連する経路によって機能して、標的遺伝子の発現を調節するということを示してきた。最近、我々及び他の研究者は、miRNAを改造して、哺乳動物細胞における遺伝子発現の実験操作をできるようにし、これらの合成のサイレンシングトリガーを短いヘアピンRNAと名付けた。shRNAによるサイレンシングは、RNAi機構を必要とし、RNAiの特徴である小さい干渉性RNAの生成と相関する。shRNAの発現は、一過性の又は安定なサイレンシングを誘出することができる。shRNA発現ベクターは又、遺伝子サイレンシングを、一過性送達後に成体マウスにおいても誘導する。しかしながら、shRNAがマウスにおいて存続可能な遺伝学的ツールであるためには、遺伝子発現の安定な操作が必須である。Hemannとその同僚は、shRNA発現カセットの造血幹細胞へのレトロウイルスによる送達後に、インビボでの遺伝子発現の長期間の抑制を示した。ここで、我々は、マウス生殖細胞系列を通過したshRNA発現カセットが遺伝性の遺伝子発現抑制を強制できるかどうかを試験することを追求した。我々は、チロシナーゼ、ミオシンVIIa、Bmp-5、Hoxa―10、ホモゲンチザーテ1,2-ジオキシゲナーゼ、Hairless及びメラノコルチン1レセプターをコードする遺伝子を含む、予想された表現型を有する様々な標的に向けたshRNAを利用して標準的遺伝子導入アプローチにより始めた。遺伝子当たり3つの構築物を線状化して、前核に注入してトランスジェニック創出動物を生成した。我々は幾らかの動物における導入遺伝子の存在に注意したが、事実上、何れも、標的遺伝子の低次形態対立遺伝子について予想された明確な又は再生可能な表現型を示さなかった。それ故、我々は:培養胚性幹細胞における標的遺伝子に対するshRNA及びその活性の存在を確認してから、それらの細胞がキメラ動物においてインビボで抑制を維持したかどうかを問うという別のアプローチをとることを決定した。我々は又、かかる細胞が、機能的RNAi誘導性構築物を、マウス生殖細胞系列を通して送ることができるかどうかを試験することを計画した。これらの研究のために、我々は、DNA修復において一つの役割を有することが提案されている新規な遺伝子Neil1を調べることを選択する。酸化によるダメージは、ヒトにおける毎日細胞当たり10,000箇所のDNA損傷を説明し、発癌、加齢及び虚血後の組織損傷に寄与していると考えられている。酸化によるDNA損傷は、無塩基部位、鎖切断及び少なくとも20の酸化された塩基を含み、これらの多くは、細胞障害性であり前突然変異誘発性である。DNAN-グリコシラーゼは、特異的塩基の認識及び糖塩基結合の開裂による損傷塩基の解離により塩基切除修復経路を開始する。Neil遺伝子は、大腸菌に由来するタンパク質のFpg/Neiファミリーと関連する哺乳動物のDNAN-グリコシラーゼの新たに発見されたファミリーである。Neilは、DNAから、チミジングリコール、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン及び4,6-ジアミノ-5-ホルミドピリミジンを含む酸化されたピリミジン及び開環したプリンの広いスペクトルを認識して除去する。Tg、FapyG及びFapyAは、電離放射線により生成される最も一般的な酸化された塩基中にあり、複製DNAポリメラーゼをブロックし、更に、細胞死を引き起こすことができる。Nth1及びOgg1グリコシラーゼは、各々、Neilの基質と重複する酸化されたDNA塩基のサブセットを除去する。しかしながら、Nth1又はOgg1にヌル変異を有するマウスは、生存可能であり、Neil1活性が、Nth1又はOgg1の喪失を軽減している可能性を高めている。最近、Nth1マウスの残留Tg-DNAグリコシラーゼ活性が、Neil1として同定された。我々は、Neil1コード領域の5’末端の近くの配列を標的とする単一のshRNA発現ベクターを構築した。このベクターを、マウスの胚性幹細胞にエレクトロポレーションにより導入して、個々の安定なインテグラントを、Neil1タンパク質の発現について試験した。大多数の細胞株は、Neilタンパク質の約80減少を示したが、これは、Neil1mRNAレベルにおける同様の変化と相関している。これらの細胞は、電離放射線に対する感受性において約2倍の増加を示したが、これは、DNA修復におけるNeil1の役割と一致する。2つの独立のES細胞株を、BL/6胚盤胞に注入して、幾らかの高いパーセンテージのキメラが得られた。これらのキメラを異系交配させて、shRNA発現構築物の生殖細胞系列への伝達が、多くのF1子孫において記録された。ES細胞で認められたNeil1のサイレンシングが正確に伝達されたかどうかを決定するために、我々は、Neil1mRNA及びタンパク質レベルを調べた。両方とも、工学処理されたES細胞において認められたものとほぼ同じ程度減少した。RNAi経路で認められたこれと一致して、我々は、shRNA発現ベクターを有するF1動物においてshRNA配列に対応するsiRNAの存在を検出したが、このベクターを欠くものにおいては検出しなかった。前述のデータは、shRNAを利用して、RNAiが標的遺伝子を発現抑制した生殖細胞系列のトランスジェニックマウスを造ることができることを示している。これらの観察は、標準的なノックアウト方法論に対する補完としてのRNAiの利用への扉を開き、生きた動物において感心ある遺伝子の抑制の結果を迅速に評価する手段を提供する。アクチベーター依存性U6プロモーターと組み合わせて、shRNAの利用は、最終的に、マウスにおける遺伝子発現の組織特異的な、誘導性のそして可逆的な抑制のための方法を与えるであろう。V.同等物当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、日常的実験を利用して確認することができよう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。上で引用した参考文献及び刊行物のすべてを、参考として、本明細書中に援用する。"