"ウシがブラキスパイナ症候群BSに罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムDNAを分析することにより判定するための方法であって、aウシから得られた前記ゲノムDNAを含有する生体材料のサンプルからDNAを抽出する工程、bウシbTau4.0、第21染色体上のヌクレオチド20537017番~20540346番の区間における欠失に関して前記DNAの遺伝子型を判定する工程、およびc前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程を含んでなる、方法。ウシがブラキスパイナ症候群BSに罹患しているか否か、またはそのキャリアであるか否かを、そのゲノムRNAを分析することにより判定するための方法であって、aウシから得られた前記ゲノムRNAを含有する生体材料のサンプルからRNAを抽出する工程、bウシbTau4.0、第21染色体上のヌクレオチド20537017番~20540346番の区間における欠失に関して前記RNAの遺伝子型を判定する工程、およびc前記動物がブラキスパイナ突然変異を有しているか否かを判定する工程を含んでなる、方法。ウシがaブラキスパイナに罹患しているか否か、bブラキスパイナを有するか否か、またはc前記疾患のキャリアであるか否かを判定することをさらに含んでなる、請求項1または2に記載の方法。遺伝子型判定工程bが、ブラキスパイナ遺伝子座に連鎖している遺伝子マーカーをさらに含んでなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。判定工程cが連鎖解析または関連解析をさらに含んでなる、請求項4に記載の方法。サンプルが血液、精子、毛根、乳汁、体液、および/または有核細胞を含む組織からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。ウシがボースタウルスから選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。ウシがホルスタイン種、フリージアン種およびホルスタイン-フリージアン交配種、ブリティッシュおよび/またはオランダフリージアン種からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。ウシにおける高い繁殖力のためのマーカー利用選抜またはゲノム選抜を行うための、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法の使用。ブラキスパイナ突然変異の検出のための方法であって、aウシから得られたサンプルから単離されたDNAを、ウシbTau4.0、第21染色体上のヌクレオチド20537017番~20540346番の区間における欠失に対する特異的プライマーにより増幅すること、およびb前記ウシがブラキスパイナ突然変異を有するか否かを判定することを含んでなる、方法。前記特異的プライマーが配列番号5および6に示されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項10に記載の方法。配列番号3および4に示される特異的プライマーをさらに含んでなる、請求項10または11に記載の方法。aiブラキスパイナ遺伝子座を突然変異に対する特異的プローブで標識する工程をさらに含んでなる、請求項10~12のいずれか一項に記載の方法。前記プローブが蛍光団をさらに含んでなる、請求項13に記載の方法。前記蛍光団が6-カルボキシフルオレセインFAM、ヘキサクロロフルオレセインHEX、またはフルオレセインイソチオシアネートFITCである、請求項13または14に記載の方法。前記プローブが消光剤または内部消光剤をさらに含んでなる、請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。発明の詳細な説明自己接合性マッピングは、2.5MbのBTA21区間のブラキスパイナ遺伝子座の位置を決定する2008年1月~2009年12月の間に、本発明者らは、ブラキスパイナを有すると診断された6頭のホルスタイン-フリージアン種の仔牛から生体材料を得た。これまでに報告されている場合としては例えば、4、これらの6頭の罹患動物は父方および母方において、かつての一般的人工授精AIホルスタイン-フリージアン種の雄牛であるスィートヘブントラディションに遡った。標準的手順を用いてゲノムDNAを抽出し、従前に記載されているウシ50KSNPアレイ3を用いて遺伝子型の判定を行う。ブラキスパイナが実際に常染色体劣性欠損として遺伝し、ホルスタイン-フリージアン種で遺伝的にホモであるとすると系統分析から示唆、この6症例は、原因となる突然変異を包含する共通のハプロタイプの同型接合であると予想される。本発明者らは、ASSISTプログラム3および対照として15頭の健常なホルスタイン-フリージアン種雄牛を用いて自己接合性マッピングを行い、第21染色体BTA21上に全ゲノムで単一の有意なピークp<0.001を同定した。この共通のハプロタイプは、56の注釈付き遺伝子を包含する2.46MbbTau4.0:20,132,767~22,588,403にわたる図1。標的全ゲノムリセンテンシングはFANCI遺伝子における原因3.3Kbブラキスパイナ欠失を同定する前記区間の56遺伝子のいくつかは、マウスにおいてノックアウトされると、胚致死を引き起こすことが知られている。本発明者らは、症例および対照のゲノムDNAから対応するオープンリーディングフレームORFを増幅したが、明らかな破壊を示すDNA配列変異体DSVは見つからなかった。次に、本発明者らは、2.46Mb区間全体の標的シーケンシングを行った。注文配列捕捉アレイRocheNimblegenをウシbTau4.0ビルドに基づいて設計し、これを用いて2頭の罹患個体の全ゲノムDNAから対応する配列を富化した後に、IlluminaGAIIx装置にてペアードエンドシーケンシング2×36bpを行った。得られた配列出力を、Mosaikを用いてbTau4.0ビルドにマッピングした。標的領域において、非反復塩基のカバー率は第1サンプルでは平均90.45範囲:0~336、第2サンプルでは61.28範囲:0~189であり、標的領域外の第1サンプルの0.01範囲:0~24および第2サンプルの0.01範囲:0~104と比較される。カバー率が10を超える標的非反復塩基の割合は両サンプルとも0.12であった。本発明者らはGigaBayesソフトウエアGaborT.Marth、ボストン大学、httpbioinformaticsbcedumarthlabを用いてDSVを同定し、全部で2,940DSVに対して2,368のSNPおよび572のindelを検出した。これらのうち1,032は、ホルスタイン-フリージアン種以外の品種でこれまでに報告されているDSVに相当し、従って、候補となる原因突然変異としては排除した。残りの1,908のDSVのうち一つだけが、ミオシン軽鎖キナーゼ様タンパク質をコードするLOC516866遺伝子においてセリンからグリシンへの置換を引き起こすコードであった。このDSVは、ブラキスパイナの基礎にある信頼できる候補突然変異であるとは考えられなかった。次に、本発明者らは、一つのブラキスパイナ症例および3つの無関係の健常対象の自己連結した4.8Kb±0.35Kb断片からメイトペアライブラリーを作成し、各動物についてIllu1minaGAIIx装置にて3.7Gb未満の配列を作成した。得られた出力を、Burrows-WheelerAlignerBWA10を用いてbTau4.0ビルドにマッピングし、これらのアライメントをIntegrativeGenomicsViewerIGV11で表示した。2.46Mbの区間にマッピングされたこれらのリードの分析を行ったところ、FANCIファンコニ貧血相補群I遺伝子を含んでなる37のうちのエキソン25~27を取り去る3.3Kbの欠失が容易に明らかとなった。この領域における通常の均一なカバー率を示す3つの対照とは対照的に、この欠失は、bTau4.0ビルド上に~8Kb離れてマッピングされる27メイトペアのクラスターから、また、ブラキスパイナ症例の欠失セグメントにマッピングされるリードの完全な不在から明らかであった。罹患個体から捕捉された配列出力の遡及的解析を行ったところ、正確に同じ位置におけるカバー率の急低下が確認された。本発明者らは、罹患動物およびキャリア動物のゲノムDNAからの409bp産物の豊富な増幅を可能とするが、同品種またはその他の品種からの無関係の健常対照からは増幅させない、推定欠失にわたるプライマー対を設計した。このアンプリコンのシーケンシングにより欠失切断点が定義され、3,329bpの欠失が確認された図2A。罹患個体から捕捉された配列出力の遡及的解析により、いくつかのリードブリッジングが同定され、切断点が確認された。逆に、欠失内で設計されたプライマー対は、健常個体に比べて罹患個体のDNAからの増幅は見られなかった。エキソン25~27の欠失がmRNAのエキソン24および28の近位で起こるとすれば、3.3Kbの欠失は、877番アミノ酸においてフレームシフトが起こり、451カルボキシ末端アミノ酸が26残基長の非正統的ペプチドで置換されると推定される。さらに、次のエキソン28内の停止コドンは、ナンセンス変異依存RNA分解を引き起こすと思われる図2B。そのホモログであるFANCD2を用いると、FANCIタンパク質は障害誘導性のクロマチンフォーカスに局在するID複合体を形成する。FANCIは、DNA鎖間架橋修復に不可欠である。FANCD2同様、FANCIは、ユビキチンリガーゼFAコア複合体によりモノユビキチン化され、ATM/ATRキナーゼによりホスホリル化される例えば、12。FANCI遺伝子のミスセンス、ナンセンスおよびスプライス部位変異体は、ヒトにおけるファンコニ貧血FA症例の~2の基礎にある12、13。FA患者は、成長遅滞、骨格異常、腎臓、心臓、消化管および生殖器官の奇形ウシブラキスパイナを想到、ならびに骨髄不全、癌の早期発症および若年での死亡を含む異質な症状を呈する。3.3KbFANCI欠失を直接調査する診断検査の開発およびその因果関係の確認本発明者らは、変異型および野生型対立遺伝子を同時に調査する5’エキソヌクレアーゼ遺伝子型判定アッセイを開発した。このアッセイでは、野生型PCRプライマー対としての5’-TGTTAGCCCAGCAGAGGA-3’配列番号3および5’-ATTCTGAATCCACTAGATGTC-3’配列番号4と、変異型PCRプライマー対としての5’-GCACACACCTATCTTACGGTAC-3’配列番号5および5’-GGGAGAAGAACTGAACAGATGG-3’配列番号6の組合せ、ならびにプローブとしての5’HEX-AGTCCCAGTGTGGCTAAGGAGTGA-3’IABkFQ野生型配列番号7および5’FAM-CCATTCCAC/ZEN/CTTTCTATCCGTGTCCT-3’IABkFQ変異型配列番号8IntegratedDNATechnologies、Leuven、Belgiumを用いる。対立遺伝子識別反応は、ABI7900HT装置AppliedBiosystems、FostersCity、CAにて、終濃度250nMの各プローブ、500nMの野生型プライマー、350nMの変異型プライマー、TaqmanUniversalPCRMasterMixIXAppliedBiosystems、FostersCity、CAおよび10ngのゲノムDNAを含む2.5μl容量で40サイクル行った。典型的な結果を図3に示す。予想されたように、利用可能な総てのブラキスパイナ症例は、これらの試験により、前記欠失に関して同型接合であることが示された。この欠失は、ホルスタイン以外の10品種に相当する131頭の父方健常動物のサンプルには存在しないことが分かった。次に、本発明者らは、3,038頭の健常ホルスタイン-フリージアン種動物の無作為サンプルの遺伝子型を判定した。前記欠失のキャリアはこれらのサンプルの7.4を占めたが、同型接合であることが分かった動物は存在しなかった。ハーディワインベルグ平衡を仮定すると、3,038個体のサンプル中に同型接合動物が存在しない確率は5未満であった。このことは、この突然変異の同系接合性は正常な健康個体とは適合しない、すなわち、3.3KbFANCI欠失が原因であるということを強く示唆する。参考文献"