"InternationalDepositAuthorityInterlabCellLineCollectionイタリア、ジェノバに、寄託アクセッション番号PD10002として寄託されるハイブリドーマ。請求項1に記載のハイブリドーマによって産生されるマウス抗-HMGB1モノクローナル抗体、またはそのフラグメントおよび誘導体。重鎖の可変領域が、配列番号2に対応するヌクレオチド配列、および配列番号4に対応するアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントおよび誘導体を有する請求項2に記載のマウス抗HMGB1モノクローナル抗体。軽鎖の可変ドメインが、配列番号3に対応するヌクレオチド配列、および配列番号5に対応するアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントおよび誘導体を有する請求項2に記載のマウス抗HMGB1モノクローナル抗体。診断剤としての使用のための、請求項2~4のいずれか1項に記載のマウス抗HMGB1モノクローナル抗体。治療剤としての使用のための、請求項2~4のいずれか1項に記載のマウス抗HMGB1モノクローナル抗体。活性成分および薬学的に生理活性の賦形剤として、請求項2~4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物。従って、本発明の目的は、HMGB1に特異的であり、具体的には、炎症性細胞に向かうその化学走化性活性を妨害し得る、新規なモノクローナル抗体の開発である。本発明は、細胞株およびハイブリドーマに関する国際寄託機関InternationalDepositAuthorityforcelllinesandhybridomasInterlabCellLineCollectionICLCジェノバイタリアのIstitutoNazionaleperlaRicercasulCancroのコア施設であるに、寄託アクセッション番号PD10002として、2010年12月22日に寄託されたハイブリドーマに関する。本発明によって生成されるハイブリドーマHG-HMGB1は、DPH1.1としても規定されるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体mAbを産生する。本発明のさらなる態様は、HG-HMGB1ハイブリドーマから産生されるマウスネズミ科murine抗HMGB1モノクローナル抗体、またはそのフラグメントおよび誘導体である。本発明はまた、マウス抗HMGB1モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列を提供する。本発明のなおさらなる態様は、HG-HMGB1ハイブリドーマから産生されるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体を含む細胞またはベクターである。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号2に対応するヌクレオチド配列、および配列番号4に対応するアミノ酸配列を有する。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号3に対応するヌクレオチド配列、および配列番号5に対応するアミノ酸配列を有する。本発明はさらに、診断剤としての使用のためのマウス抗HMGB1モノクローナル抗体に関する。本発明はなおさらに、治療剤としての使用のためのマウス抗HMGB1モノクローナル抗体に関する。さらなる態様は、活性成分および薬学的に生理活性の賦形剤として、本発明のマウス抗HMGB1モノクローナル抗体を含む薬学的組成物である。本発明の詳細な説明にさらに記載されるように、本発明の薬学的組成物は、HMGB1の化学走化性活性の阻害に特異的であるという利点を有する。本発明の特徴および利点は、下に報告される詳細な説明から、例示的かつ非限定的な目的で示される実施例から、および添付の図1~6から明らかである。本発明は、細胞株およびハイブリドーマに関する国際寄託機関InternationalDepositAuthorityforcelllinesandhybridomasInterlabCellLineCollectionICLCジェノバイタリアのIstitutoNazionaleperlaRicercasulCancroのコア施設であるに、寄託アクセッション番号PD10002として、2010年12月22日に国際的に寄託されたハイブリドーマHB-HMGB1に関する。本発明によって生成されるハイブリドーマHG-HMGB1は、マウスネズミ科抗HMGB1モノクローナル抗体mAbを産生する。このハイブリドーマを調製するために用いられる免疫動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギおよびウマを挙げることが可能で、なかでもマウスを用いることが好ましい。マウスが用いられる場合、その株は、特に限定されないが、BALB/cマウスを用いることが好ましい。本発明のさらなる態様は、HG-HMGB1ハイブリドーマから産生されるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体またDPH1.1としても規定される、またはそのフラグメントおよび誘導体である。本明細書に用いられる規定のモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体、または任意のヒト化抗HMGB1その配列はDPH1.1に由来するか、またはHG-HMGB1ハイブリドーマから産生される任意の抗体に由来するが挙げられる。具体的には、このモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体は、Fab,Fab’、Fab2およびsFvフラグメントによって例示され、本発明の抗体における配列は、IgGサブクラスに限定はしないが、IgM、IgE、IgD、IgEなどを含む、ヒト由来、または他の哺乳動物種由来の抗体の配列を置き換えている。本発明の実施形態におけるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的方法によって抗原としてHMGB1Agを用いて動物を免疫すること、次いで、免疫された動物の細胞を用いてハイブリドーマを調製することによって得ることができる。本発明のDPH1.1モノクローナル抗体は、ハイブリドーマHB-HMGB1によって産生される。本発明はまた、マウス抗HMGB1モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列を提供する。各々の重鎖は、2つの領域、定常領域および可変領域を有する。重鎖の定常領域は、第12染色体NCBI参照配列:NG_005838.1上のMusmusculus免疫グロブリン重鎖複合体Ighに相当する。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号2に相当するヌクレオチド配列および配列番号4に相当するアミノ酸配列を有する。軽鎖は、2つの連続するドメインを有する:1つの定常ドメインおよび1つの可変ドメイン。この定常ドメインは、第6染色体NCBI参照配列:NG_005612上のMusmusculus免疫グロブリンκ鎖複合体Igkに相当する。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号3に相当するヌクレオチド配列、および配列番号5に相当するアミノ酸配列を有する。本発明の目的に関して、HMGB1モノクローナル抗体mAbは、以下のような対応する配列番号を有する:配列番号1は、HMGB1由来の17マーのペプチドP1のアミノ酸配列KGKPDAAKKGVVKAEKSに相当する;配列番号2は、DPH1.1[musmusculus]の重鎖の可変領域のcDNAのヌクレオチド配列に相当する;ここで:太字の配列は、VHSM7マウス生殖細胞系列ゲノム遺伝子座中のV重鎖エキソンに相当し、イタリック体の配列は、多様性領域に相当し、下線を付された配列は、マウス生殖細胞系列IGHJ4ゲノム遺伝子座に相当する。cDNAとゲノム遺伝子座との間の対応は、期待どおり、ほぼB細胞成熟の間に導入された変位に起因する。配列番号3は、DPH1.1,[musmusculus]の軽鎖の可変ドメインのcDNAのヌクレオチド配列に相当する;ここで:太字の配列は、マウス生殖細胞系列ゲノム遺伝子座におけるIgkv8-27κ軽鎖Vエキソンに相当し、イタリック体の配列は、マウス生殖細胞系列IGKJ5ゲノム遺伝子座に相当する。配列番号4は、DPH1.1,[musmusculus]の重鎖の可変領域のアミノ酸配列に相当する;ここで太字配列は、VBASE2のウェブサイトhttp://www.vbase2.org/を通じて特定されるとおり、それぞれCDR領域1、2および3に相当する。配列番号5は、DPH1.1,[musmusculus]の軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列に相当する;ここで太字配列は、VBASE2のウェブサイトhttp://www.vbase2.org/を通じて特定されるとおり、それぞれ、CDR領域1、2および3に相当する。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体は、マウス、ヒトおよびほとんどの他の哺乳動物で同一である、配列KGKPDAAKKGVVKAEKSによって提示される、HMGB1の公知のエピトープに特異的であり、HMGB1に対して配列中で80同一であるHMGB2を含む他のタンパク質と示す交差反応性が最小である。抗HMGB1mAbの特異性は、実際は、以下の哺乳動物HMGB1遺伝子に関して見られるが、ただしこれには限定されない:-Homosapiens,ここでHMGB1は、以下の参照配列RefSeqを有する:NM_002128.4→NP_002119.1;-MusmusculusHMGB1:NM_010439.3→NP_034569.1;-RattusnorvegicusHMGB1NM_012963.2→NP_037095.1;-BostaurusHMGB1:NM_176612.1→NP_788785.1;-EquuscaballusHMGB1:NM_001081835.1→NP_001075304.1。従って、本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体の利点は、多くの哺乳動物種で同一であるHMGB1のエピトープに特異的であるということである。本発明によるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体のさらなる利点は、HMGB1に対して配列中で80同一であるHMGB2を含めむ他のタンパク質と示す交差反応性が最小であるということである。マウス抗HMGB1モノクローナル抗体DPH1.1のなおさらなる利点は、HMGB1-誘発性細胞遊走をブロックできるということである。この予期されない利点は、重要である。なぜなら組織損傷の部位に対する炎症性細胞の補充は、急性および慢性の炎症の原因および持続における重要な要素であるからである。幹細胞からのHMGB1放出は、肝臓中へPMNを補充することに寄与するということ、およびDPH1.1mAbでのHMGB1の中和は、PMNの補充を低減することがこの実施例で示される。本発明によるDPH1.1mAbは有利には、細胞遊走をブロックし、特に、インビボにおいて、同様にインビトロにおいて、多形核白血球の補充を低減することが示された。従って、肝炎の重篤度血中のsALT値で測定は低減される。本発明のなおさらなる態様は、HG-HMGB1ハイブリドーマから産生されるマウス抗HMGB1モノクローナル抗体を含む細胞またはベクターである。本発明はさらに、診断剤としての使用のためのモノクローナル抗体に関する。主な診断剤は、X線造影調製物、放射性同位体および色素である。診断剤は、多くの異なる身体部分の画像を作製するために用いられ得る。本発明のモノクローナル抗体は、HMGB1の検出および/または定量のためにイムノアッセイで用いてもよい。なぜなら、モノクローナル抗体は、例えば、HMGB1タンパク質未修飾または翻訳後修飾されるかのいずれかを含有すると疑われるサンプル中で、マウス、ヒトおよび他の哺乳動物において同一であるエピトープを認識するという利点を有するからである。このようなイムノアッセイは、外傷、組織損傷、急性および慢性の炎症、自己免疫疾患全身性紅斑性狼瘡を含むに関連する病原体の臨床診断において、ならびに血液生成物のスクリーニングにおいて用いられてもよい。本発明はなおさらに、治療剤としての使用のためのモノクローナル抗体に関する。標的療法は、医薬の多くの研究の中心である。病理学的に関連する抗原を標的する生物学的治療では、多くの種類の病気における生存の改善の期待がもたらされる。腫瘍特異的な抗原は、癌治療に関する期待で例えば、広範に研究された。本発明によるmAbは、HMGB1の化学走化性活性の阻害がかかわる、これには限定されないが、肝炎、外傷、感染、関節炎、虚血、臓器移植を含む病理の治療において有用である。さらなる態様は、活性成分および薬学的に生物活性の賦形剤として本発明のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物である。本発明の薬学的組成物は、HMGB1の化学走化性活性の阻害に特異的であるという利点を有する。実施例1モノクローナル抗体の調製:マウスの免疫およびハイブリドーマ生成マウスHMGB1に特異的なマウスモノクローナルIgG1DPH1.1Abは、HMGB1由来の17マーのペプチドP1KGKPDAAKKGVVKAEKS配列番号1の3回の皮下用量0.2mg/マウスによって2週の間隔で、C57BL/66週齢の雌性マウスに注射することによって生成した。本発明によるハイブリドーマHG-HMGB1を、標準的な技術によって、脾細胞から、およびヒポキサンチン-アミノプテリン-チミンHAT感受性骨髄腫P3/NSI/1-AG4-1細胞から生成して、免疫原に対してELISAによって試験した。実施例2モノクローナル抗体の調製:ハイブリドーマの培養ハイブリドーマコロニーを、15FCSおよびHATを添加したRPMI1640培地中で10日間増殖させて、顕微鏡分析後に手動で選択する。コロニーのHMGB1陽性を、コロニー上清のELISA分析によってモニターした。陽性のコロニーを、より大きいウェルに移して、2回の限界希釈に供した。安定かつ不死化されたDPH1.1ハイブリドーマクローンを得た。DPH1.1クローンを、標準的な技術を用いて、効率的なタンパク質発現のために使い捨てのバイオリアクター中で3か月間増殖させ、上清を収集した。モノクローナル抗体を得るための上清の精製を、PROTAクロマトグラフィーカラムで行った。従って、モノクローナル抗体抗HMGB1を、95の純度の割合で得た。モノクローナル抗体抗HMGB1をさらに、クロマトグラフィー精製継代によって100の純度までさらに精製した。実施例3免疫蛍光による抗-HMGB1AbDPH1.1mAbの特性評価および特異性試験DPH1.1mAbの特異性は、ウエスタンブロット分析図1および免疫蛍光図2の両方によってモニターした。抗HMGB-1AbDPH1.1Abの特性評価およびウエスタンブロットによる特異性試験抗HMGB-1mAbDPH1.1またはコントロールの抗BoxAmAbコントロールのいずれかとともにインキュベートした、HMGB1の組み換えBoxAドメイン陰性コントロールのウエスタンブロットを行った。要するに、500ngまたは100ngの組み換えHMGB1および陰性コントロールHMGB1の組み換えBoxAドメインHMGBiotech,イタリア、ミラノMilan,Italyを、記載どおりゲル電気泳動膜によって分離して、膜に移したScaffidiら、2002。結果図1で明らかなように、本発明による抗HMGB1mAbDPH1.1は、組み換えHMGB1に特異的に結合するが、BoxAドメインには結合しない。免疫蛍光DPH1.1mAb、抗BoxAmAbHMGBiotech,イタリア、ミラノMilan,Italyおよびヤギ抗マウスIgG1AbBDPharMingenを、1μg/mlの希釈で適用した。免疫蛍光は、野性型マウスまたはHmgb1-/-マウスのいずれかに由来するマウス胚性線維芽細胞MEFで、記載されたとおりScaffidiら、2002行った。DPH1.1mAbおよびAlexaFluor633-標識ヤギ抗マウスIgG1AbBDPharMingenを、50μg/mlの希釈で適用した。結果図2で明らかなように:Hmgb1-/-マウス由来のマウス胚性線維芽細胞のみを、抗HMGB1モノクローナル抗体DPH1.1で染色した。実施例4遊出アッセイDPH1.1mAbのインビトロ活性を、記載のようなトランスウェル遊走アッセイでモニターしたPalumboら、2009。要するに、組み換えHMGB1を、30ng/mlの濃度で下のチャンバに添加した。DPH1.1mAbのまたは無関係のアイソタイプの適合したmAbの漸増濃度を、5万個の3T3細胞に添加した。細胞遊走を、改変Boydenチャンバアッセイによって評価した。Boydenチャンバを、37°Cで、5CO2中で3時間インキュベートした。フィルターの上部に残っている細胞を、機械的に除去した。フィルター下部に遊走した細胞を、エタノールで固定して、GiemsaSigma-Aldrichで染色し、1フィルターあたり10個の無作為のフィールドでカウントした。各々のアッセイを、二連で行い、独立して少なくとも3回繰り返した。結果:図3で明らかなように、漸増濃度のDPH1.1mAbは予期せぬことに、細胞遊走を阻害する。これらの結果によって、HMGB1の惹起する細胞遊走をブロックするDPH1.1mAbの驚くべき効果が示される。実施例5インビボ実験:炎症性細胞の補充本発明者らは、HMGB1タンパク質の放出によって炎症性細胞が肝臓中に補充されることを以前に示したSitiaら、1997。炎症性細胞の補充は、クロドロネートClo-Lでのマウスの処理によって得ることができる、肝臓からのクッパー細胞KCの除去によって増幅され得る。HMGB1の効果を増幅するために、本発明者らは、HBVトランスジェニックマウスからクッパー細胞KCを取り出し、本発明者らは、HBVこれは、マウスで急性肝炎を生じるに対して免疫されたマウス由来のCD8T細胞をそれらに注射した。これらのマウスでは、本発明者らは、クロドロネートで処理していないマウスよりもかなり多数の肝臓内のPMNを見出した図4。本発明者らはまた、クロドロネートで処理してないマウスと比較して、多形核白血球PMNに隣接しているかまたはそれによって囲まれる細胞質HMGB1を発現するより多くの肝細胞を見出した図5Aおよび図5B。結果KCの除去によって、KCが除去されなかった場合にマウスで通常みられたものを上回って肝細胞中の細胞質HMGB1の蓄積および肝臓内PMN浸潤が促進された。DPH1.1投与の効果本発明者らは、DPH1.1mAbの投与の効果を試験した。DPH1.1mAbで処理したマウスの肝臓が、細胞質HMGB1を発現する幹細胞をより多く含むほど示さず、sALT値はより高くなるが図6A、浸潤性のPMNの数は減った図6B。結果これらの結果によって、肝細胞からのHMGB1の遊離は、肝臓へのPMN補充に寄与すること、およびDPH1.1でのHMGB1の中和は、PMNの補充および肝炎を低減することが示される。本発明によるDPH1.1mAbは、インビボで、またインビトロでも同様にHMGB1へ向かう細胞遊走をブロックする。方法:マウス。HBV複製コンピテントなトランスジェニックマウス系統1.3.32は、以前に記載されているGuidottiら、1995。系統1.3.32近交系C57BL/6,H-2bを、B10.D2マウスH-2dと交配して、H-2d-制限B型肝炎表面抗原HBsAg-特異的CD8T細胞株の注射の前にH-2bxdF1ハイブリッドを作製した。C57BL/6およびB6.PL-Thy1a/CyJThy-1.1マウスは、TheScrippsResearchInstituteの繁殖コロニーから、またはCharlesRiverLaboratoriesCalco,Italyから購入した。HBVを複製する、骨髄キメラホスホグリセラートキナーゼPGK-GFPマウスは、PGK-GFP由来のBM細胞H-2bxdF1ハイブリッド,MicheleDePalma,SanRaffaeleScientificInstitute,Milan,Italyより贈呈を、照射した1.3.32HBVマウスに移植することによって創出した。Thy-1.1マウスを、前に記載のようにIannaconeら、2005、一旦、B10.D2マウスと交配して、その後にプラスミドDNA-コードの、およびワクシニアウイルス-コードのHBsAgで免疫した。全ての実験で、マウスは、年齢8週、性別雄性について適合されており、および系列1.3.32の場合は、実験操作前の血清の肝炎Be抗原HBeAgレベルについて適合されていた。全ての動物は、厳密な遮蔽条件下で、無菌室で飼育した。これらの研究は、サンラファエロ科学研究所SanRaffaeleScientificInstituteの動物審査委員会AnimalReviewBoardが承認した。HBV-特異的CD8T細胞の注入。HBV特異的なCD8T細胞株は、記載されたように、免疫された非トランスジェニックThy-1.1×B10.D2雄性マウスの脾臓細胞由来であったIannaconeら、2005。インビトロの刺激の3週間後、細胞を、フローサイトメトリーによって抗原特異性について試験した。HBsAgのイムノドミナントなペプチドエピトープEnv28-39に対して95を上回って特異的なCD8細胞Andoら、1994を、種々の用量0.5×107細胞/マウス,107細胞/マウスまたは5×107個の細胞/マウスで、1.3.32マウス中に静脈内注射した。1、2、3または5日後、マウスを殺傷して、その肝臓を灌流させて、組織学的分析およびフローサイトメトリー分析のために回収するか、またはそれらを液体窒素中で急速凍結して、その後の分子分析のために-80°Cで保管した。KCの枯渇。KC枯渇は、CD8T細胞移入の3日前にクロドロネート含有リポソームClo-L,RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Germanyから贈呈の200μlの静脈内注入によって達成した。上記の説明および上で注記された実施例から、記載の生成物によって獲得され、本発明によって得られる利点は明白である。参考文献AndoK、GuidottiLG、CernyA、IshikawaT、ChisariFV1994、組織抗原に対するCTLのアクセスは、インビボでは制限されるCTLaccesstotissueantigenisrestrictedinvivo.JImmunol.1994Jul15;1532:482~8。BianchiME2009HMGB1は交友を愛するHMGB1lovescompany.JLeukocBiol86:573~6BianchiMEおよびManfrediAA.2009免疫学。内外の危険Immunology.Dangersinandout。Science323:1683-4FerrariS、FinelliP、RocchiM、BianchiMEJuly1996.ヒト高移動度群1タンパク質HMG1をコードする活性遺伝子は、イントロンを含み、第13染色体をマッピングするTheactivegenethatencodeshumanhighmobilitygroup1proteinHMG1containsintronsandmapstochromosome13.Genomics352:367~71。Guidotti,L.G.、B.Matzke、H.Schaller、およびF.V.Chisari.1995.トランスジェニックマウスにおける高レベルB型肝炎ウイルス複製High-levelhepatitisBvirusreplicationintransgenicmice。JVirol69:6158~6169Iannacone,M.、G.Sitia、M.Isogawa、P.Marchese、M.G.Castro、P.R.Lowenstein、F.V.Chisari、Z.M.Ruggeri、およびL.G.Guidotti.2005.血小板は細胞傷害性Tリンパ球誘導性の肝障害を媒介するPlateletsmediatecytotoxicTlymphocyteinducedliverdamage.Naturemedicine11:1167~1169Palumbo,R.、F.DeMarchis、T.Pusterla、A.Conti,M.Alessio、およびM.E.Bianchi.2009.SrcfamilykinasesarenecessaryforcellmigrationinducedbyextracellularHMGB1.JLeukocBiol86:617~623。Scaffidi,P.、T.Misteli、およびM.E.Bianchi.2002.壊死細胞によるクロマチンタンパク質HMGB1の放出は、炎症を誘発するReleaseofchromatinproteinHMGB1bynecroticcellstriggersinflammation、Nature418:191~195。SitiaG、IannaconeM、MuellerS、BianchiMEおよびGuidottiLG2007HMGB1インヒビターでの処理は、HBVトランスジェニックマウスにおいてCTL誘発性の肝疾患を低減するTreatmentwithHMGB1inhibitorsdiminishesCTL-inducedliverdiseaseinHBVtransgenicmice.JLeukocBiol81:100~7WangH、BloomO、ZhangM、VishnubhakatJM、OmbrellinoM、CheJ、FrazierA、YangH、IvanovaS、BorovikovaL、ManogueKR、FaistE、AbrahamE、AnderssonJ、AnderssonU、MolinaPE、AbumradNN、SamaA、TraceyKJJuly1999.マウスでのエンドトキシン死亡率の後期メディエーターとしてのHMG-1HMG-1asalatemediatorofendotoxinlethalityinmice。Science2855425:248~51。YangH、HreggvidsdottirHS、PalmbladK、WangH、OchaniM、LiJ、LuB、ChavanS、Rosas-BallinaM、Al-AbedY、AkiraS、BierhausA、Erlandsson-HarrisH、AnderssonU、TraceyKJJune2010.トール様レセプター4にHMGB1が結合するためおよびマクロファージサイトカイン放出の活性化のために重要なシステインが必要であるAcriticalcysteineisrequiredforHMGB1bindingtoToll-likereceptor4andactivationofmacrophagecytokinerelease。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10726:11942~7。YangH,TraceyKJ2010.炎症におけるHMGB1標的TargetingHMGB1ininflammation.Biochim.Biophys.Acta17991-2:149~56。"