"真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定する方法であって、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。変異サッカロミセスセレビシエ細胞Δtrk1、Δtrk2、Δtok1で遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1のスイッチが切られている請求項1に記載の方法。真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項1または2のいずれかに記載の方法。真核細胞カリウムチャネルがHERG1、Kv15またはgpIRK1である請求項1~3のいずれかに記載の方法。真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項1~4のいずれかに記載の方法。真核細胞カリウムチャネルが酵母の発現プラスミドに存在する請求項1~5のいずれかに記載の方法。変異サッカロミセスセレビシエ細胞が増殖レポーターを構成的に発現する請求項1~6のいずれかに記載の方法。真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす被検物質が変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する請求項1~7のいずれかに記載の方法。真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用が、変異サッカロミセスセレビシエ細胞の細胞数を測定することによって決定される請求項1~7のいずれかに記載の方法。細胞数が、構成的に発現された増殖レポーターの蛍光または化学発光により決定される請求項9に記載の方法。内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞。遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1のスイッチが切られている変異サッカロミセスセレビシエ細胞。DSM13197として寄託された変異サッカロミセスセレビシエ細胞。サッカロミセスセレビシエ細胞が真核細胞カリウムチャネルを異種発現する請求項11~13のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項11~14のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。真核細胞カリウムチャネルがHERG1、Kv15またはgpIRK1である請求項11~15のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項11~16のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現せず、前記遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1がノックアウトによって破壊されている変異サッカロミセスセレビシエ細胞の作製方法。真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制する物質を特定するための、請求項11~17のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞の使用。真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし、そして前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。請求項11~17のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞を含む検査キット。真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を請求項1~10のいずれかに記載の方法を利用して特定し前記阻害物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加することからなる医薬の製造方法。請求項20または21に記載の方法を利用して真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し前記活性化物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加することからなる医薬の製造方法。しかしながら、例えばヒトのチャネルHERG1またはKv15は5mMのKClでΔtrk1Δtrk2の致死的表現型を相補できず、したがってスクリーニングできないので、多数の真核細胞のカリウムチャネルおよびカリウムチャネルの作用を改変できる物質の特定に関する研究が困難になっている。本発明は真核細胞のカリウムチャネルの阻害物質を特定する方法に関し、本方法では、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い;真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ;前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし;さらに前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の影響を決定する。本方法で用いる変異サッカロミセスセレビシエ細胞では、遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1配列番号1、配列番号2および配列番号3は、好ましくはノックアウトによってスイッチが切られておりΔtrk1、Δtrk2、Δtok1、好ましくは遺伝子の大部分が欠失している。本方法で用いる真核細胞カリウムチャネルは、調べようとしているカリウムチャネル、その阻害物質または活性化物質を特定しようとしているチャネルである。例えば、真核細胞カリウムチャネルは、ヒトHERG1、ヒトKv15、ヒトROMK2またはgpIRK1モルモットチャネルである。真核細胞カリウムチャネルは、好ましくは問題のカリウムチャネルの天然の配列、例えば配列番号4、配列番号5、配列番号7ROMK2または配列番号6の配列の1つによってコードされるものを有する。しかしながら、カリウムチャネルの天然の配列はまた改変、例えば変異させたものでもよい。好ましくは、真核細胞カリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列は、酵母の発現プラスミド、例えばp423GPD3、またはベクター例えばpRS42xまたはpRS32xシリーズに組み込まれ、前記組換え発現プラスミドは変異サッカロミセスセレビシエ細胞に導入される。前記方法は、真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす物質を特定することを目的とする。これらの物質は変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する。異種発現された真核細胞カリウムチャネルを抑制する被検物質は、前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞は内在性カリウムチャネルを発現しないので、その分裂および成長を非常に困難にさせるか、または遅らせるか、または本発明の実施態様では致死させる。被検物質の作用は、例えば光学密度を600nmで測定するか、または変異サッカロミセスセレビシエ細胞で構成的に発現される増殖レポーターを用いて直接測定することができる。前記構成的に発現される増殖レポーターは、好ましくは、それ自体蛍光もしくは化学発光を示す蛋白質、または蛍光もしくは化学発光シグナルを生じる反応に加わる蛋白質をコードする。前記増殖レポーターをコードする配列は、好ましくはベクター由来である。適当な増殖レポーターは、例えばβ-ガラクトシダーゼのLacZ遺伝子または酸性ホスファターゼPH03両方とも構成的酵母プロモーターの制御下で発現されるである。測定可能な蛍光または化学発光によって変異サッカロミセスセレビシエ細胞数に関する結果が得られる。蛍光もしくは化学発光が全くないかまたは少ない場合は、問題のサンプルに含まれる変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ないことになる。変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ない場合は、被検物質は真核細胞のカリウムチャネルに対して抑制作用を有することになる。前述の方法は特に容易な自動化を可能にし、平行的に多数の物質の検査を実施することができる。本発明の特定の実施態様では、2つまたは3つ以上の方法が比較的態様で実施され、その場合2つまたは3つ以上のサッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。これらの変異サッカロミセスセレビシエ細胞は好ましくは同じ量の被検物質と一緒にインキュベートされるが、前記細胞は問題の真核細胞カリウムチャネルを種々の程度に発現する。本発明のまた別の実施態様では、問題の真核細胞カリウムチャネルの発現は同程度であるが、異なる量の被検物質と一緒にインキュベートされた変異サッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。本発明の特徴はまた、内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞である。さらに別の特徴は、遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1のスイッチが切られた変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記遺伝子は、好ましくはそれら全体または一部分がノックアウトによって除去されている。さらにまた別の特徴は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従いドイツ微生物および培養細胞コレクションDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHMascheroderWeg1bD38124Braunschweigに寄託された変異サッカロミセスセレビシエに関する寄託番号DSM13197。本発明の特徴は真核細胞カリウムチャネルを異種発現する変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記真核細胞カリウムチャネルは、好ましくはヒトカリウムチャネル例えばHERG1、Kv15、またはgpIRK1またはヒトKv4.3[GenbankAccessionNumberAF187963]、TASK[GenbankAccessionNumberAF006823]またはROMK2[GenbankAccessionNumberU12542]で、前記カリウムチャネルは天然の配列を有していてもよいし、また変異していてもよい。本発明はまた変異サッカロミセスセレビシエ細胞の製造方法に関する。前記細胞はカリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現せず、遺伝子TRK1、TRK2およびTOK1はノックアウトにより破壊されているかまたは欠失している。本変異サッカロミセスセレビシエ細胞は、例えば、真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制または活性化させる物質を特定する方法で用いることができる。また前記細胞は、例えば毒性物質の決定に用いることができる検査キットの部分でもよい。本発明はまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い;真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ;前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュヘ ゙ートし;さらに前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。本発明はさらにまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、3つの内在性カリウムチャネルTRK1、TRK2およびTOK1を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い;真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ;前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし;さらに前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定し;前記阻害物質を公知の化学的方法によって製造または単離し;さらに生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加する。本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し;前記活性化物質を公知の化学的方法によって製造または単離しさらに生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加する。添付図面において:図1は、三重ノックアウトを証明するための診断PCRを示す。ゲルの段/レーンの説明については実施例2の三重ノックアウトを参照されたい。図2は、規定のKCl濃度を含むpH65のDPM培地でのYM168株Δtrk1Δtrk2およびYM182株Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖を示す。図3は、5mMのKCl2mMのRbClを含むDPM培地pH65でのYM189株およびYM190株Δtrk1Δtrk2並びにYM194株およびYM195株Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖を示す。図4は、5mMのKCl2mMのCsClを含むDPM培地pH65でのYM189株およびYM191株Δtrk1Δtrk2並びにYM194株およびYM196株Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖を示す。図5は、5mMのKCl1mMのRbClを含むDPM培地pH65でのYM194株およびYM195株Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖を示す。KON=コントロール図6は、5mMのKCl1mMのCsClを含むDPM培地pH65でのYM194株およびYM196株Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖を示す。KON=コントロール図7は、活性化物質として05mMのCsClが存在する96ウェルELISAプレートのDPM-HIS/-TRP5mMKCl培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルHERG1の発現を示す。それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度30μMで用いた。細胞密度の測定のために、市販のLacZレポーター系pYX232IngeniusCatNoMBV03210で分析酵母株を形質転換した。LacZレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターTPIの制御下にあった。LacZ酵素活性は、市販のアッセイ系TROPIXを用いて24時間後の化学発光を検出することによって測定した出発培養密度:001OD620。値は各事例で4つの測定値の平均±SDに一致する。2つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。図8は、活性化物質として05mMのCsClが存在する96ウェルELISAプレートのDPM-HIS5mMKCl培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルHERG1の発現を示す。それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度30μMで用いた。細胞密度は、620nmの波長で光学密度を測定することによって38時間増殖後に測定した出発培養密度:003OD620。値は各事例で4つの測定値の平均±SDに一致する。図9は、05mMのCsClが存在する96ウェルELISAプレートのDPM-HIS/-TRP5mMKCl培地におけるサッカロミセスセレビシエの増殖を示す。それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度30μMで用いた。細胞密度の測定のために、市販のLacZレポーター系pYX232IngeniusCatNoMBV03210で分析酵母株を形質転換した。LacZレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターTPIの制御下にあった。LacZ酵素活性は、市販のアッセイ系TROPIXを用いて24時間後の化学発光を検出することによって測定した出発培養密度:001OD620。値は各事例で4つの測定値の平均±SDに一致する。2つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。図10は、05mMのKClまたは80mMのKClが存在する96ウェルELISAプレートのDPM培地におけるサッカロミセスセレビシエ野生型株の増殖を示す。それぞれの事例で阻害物質、ジプラシドンおよびピモジドを最終濃度30μMで用いた。細胞密度は、620nmの波長で光学密度を測定することによって24時間増殖後に測定した出発培養密度:001OD620。値は各事例で4つの測定値の平均±SDに一致する。図11は、5mMのKClおよび活性化物質として05mMのCsClが存在するDPM-HIS培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルHERG1の発現を示す。1:陰性コントロールとしてブランクベクターp423GPDが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。2:陽性コントロールとしてp423GPD-TRK1が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。3:p423GPD-HERG1が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。4:p423GPD-HERG1が発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本明細書で説明されている段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい。図12は、5mMのKClおよび活性化物質として2mMのRbClが存在するDPM-HIS培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルKv15の発現を示す。1:陰性コントロールとしてブランクベクターp423GPDが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。2:陽性コントロールとしてp423GPD-TRK1が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。3:p423GPD-Kv15が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。4:p423GPD-Kv15が発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本願明細書で説明されている段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい。図13は、96ウェルELISAプレートのDPM-HIS5mMKCl培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルROMK2の発現および陰性コントロールとしての酵母ベクターp423GPDの発現を示す。細胞密度は、620nmの波長で光学密度を測定することによって24時間増殖後に測定した出発培養密度:001OD620。値は各事例で4つの測定値の平均±SDに一致する。図14は、p423GPD-ROMK2のプラスミドマップを示す。材料および株培地:YPD完全酵母培地:1バクトBacto酵母抽出物、2バクトペプトン、2バクト寒天、2グルコース。SC合成完全培地:067バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、2グルコース。胞子形成培地:1酢酸カリウム、アミノ酸。5-FOA培地:067バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、ウラシル50μg/mL、2糖ガラクトースまたはグルコース、015-FOA。全ての培地は次の文献に記載されている:GRFinketal1991。アミノ酸ドロップアウトミックス:L-アラニン2g;L-アルギニン2g;L-アスパラギンH2O227g;L-アスパラギン酸2g;L-システインHCl26g;L-グルタミン2g;L-グルタミン酸2g;グリシン2g;ミオイノシトール2g;L-イソロイシン2g;L-メチオニン2g;PABA0.2g;L-フェニルアラニン2g;L-セリン2g;L-スレオニン2g;L-チロシン2g;L-バリン2g。マーカーアミノ酸用ストック溶液:mMg/Lアデニン30553加熱60°C未満ロイシン1001312加熱リジン1001826-ヒスチジン601257-トリプトファン40817-ウラシル2022405NaHCO3溶液中で加熱ビタミン原液50mL:ビオチン20μg/L;パントテン酸カルシウム40μg/L;チアミン40μg/L。限定カリウム培地DPM:15L用2×原液:2HPO48mM32g2SO429mM115gMgSO42mM08gまたは1M原液6mLCaCl202mM90μgまたは05M原液12mLビタミン原液120μLアミノ酸ドロップアウトミックス6gリジン100倍原液330mLアデニン09mM100倍原液30mL→上記をHClでpH65または他のpHとしオートクレーブする。グルコース240原液よりKCl1M原液より必須アミノ酸Lys/Adeは除外は原液から寒天緩衝液および溶液:TE緩衝液:トリス/HCl10mM;EDTA1mM;TAE緩衝液:トリス40mM;EDTA1mM;酢酸02mM;SSC緩衝液:NaCl3M;クエン酸ナトリウム2H2O03Mゲルローディング緩衝液:ブロムフェノールブルー005;スクロース40;EDTA01M;SDS05ハイブリダイゼーション緩衝液:SSC5x;SDS01;硫酸デキストラン5;停止試薬1:20;緩衝液A:トリス-HCl100mM;NaCl300mM;脱プリン溶液:HCl025M;変性溶液:NaCl15M;NaOH05M;中和溶液:NaCl15M;トリスpH8005M。オリゴヌクレオチドPCRプライマー:ベクター:細菌ベクター酵母ベクター株:細菌株:DH5α;ワンショットOneShotTMTOP10酵母株:この実験のために作製した全ての酵母株は以下の二倍体野生型株をベースにしている:W303MATa/αade2.his3-11-15,leu2-3-112,trp1-1,ura3-1,can1-100;ATCC208352以下の酵母株を作製した:カリウムチャネルクローン:A系統名KCNA5別称Kv1.5,HK2,HPCN1種類電圧開閉カリウムチャネル、shaker関連サブファミリー、遅延整流チャネル染色体上の位置12p1332-p1331登録番号NIDg4504818蛋白質613アミノ酸、67kD組織内分布心臓、膵臓ランゲルハンス島およびインスリノーマ同族体mKcna5、70がhHCN4と相同参考文献、HAC1種類過分極-活性化および環状ヌクレオチド開閉カリウムチャネル、電圧開閉カリウムチャネルのサブファミリーに属する染色体上の位置19p133登録番号NIDg4996893蛋白質889アミノ酸機能ペースメーカー組織内分布脳、心臓同族体mHcn2Musmusculus参考文献ALudwigetal1999C系統名KCNH2別称HERG1より長いスプライス変種種類電圧開閉カリウムチャネル、eag関連サブファミリーメンバー番号2染色体上の位置7q35-q36登録番号NIDg4557728特性Kチャネル調節因子1によってチャネル活性化が促進参考文献MTaglialatelaetal1998TItohetal1998D系統名KCNJ2モルモット別称Kir2.1,IRK1種類内向き整流カリウムチャネル組織内分布脳、心臓、肺臓、腎臓、胎盤、骨格筋参考文献WTangetal1995方法:ROMK2後記のROMK2の配列を参照されたいPCR:パワースクリプトポリメラーゼ用プロトコル:ローワー:3μLのH2O;25μLの10×オプチパフォームOptiPerformIII緩衝液pH92;10μLの125mMdNTP;15μLの前進プライマー20pmol/μL;15μLの逆方向プライマー20pmol/μL;15μLの50mgMgCl2=125mM;5μLの5×オプチザイムOptiZymeエンハンサーアッパー試薬用混合物35μL:23μLのH2O;35μLの10×オプチパフォームOptiPerformIII緩衝液;15μLの50mMMgCl2;05μLのパワースクリプトDNAポリメラーゼ;7μLの5×オプチザイムOptiZymeエンハンサー。PCRプログラムホットスタート:1.94°Cで1分2.94°Cで1分3.50~55°Cプライマーによるで15分4.69~72°Cポリメラーゼによるで4分5.2番から27回繰り返す6.4°C∞7.終了アンプリタックAmpliTaqポリメラーゼPerkinElmer用プロトコル:アッパー試薬用ミックスホットスタートプロトコル:181μLのH2O;42μLの10×緩衝液II;167μLのdNTP;25μLの前進プライマー;25μLの逆方向プライマー;6μLの25mMMgCl2:42μLのH2O;5μLの10×緩衝液II;1μLのアンプリタックAmpliTaqポリメラーゼ;2μLの鋳型。DNAの精製PCR反応物の精製:PCR増幅生成物の精製はキットHighPurePCRProductPurificationKitを用いて実施した。フェノール抽出:サンプル容積をTE緩衝液で200μLにする。200μLのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール25:24:1を加え、混合し、最大速度で1分間遠心する。上部相を新しいエッペンドルフ試験管に移し、200μLのクロロホルム/イソアミルアルコールを加え、混合し1分間遠心する。上部相を取り出しエタノールで沈殿させる。エタノール沈殿:約200μLのサンプル容積に5μLの5MNaClおよび20μLの3MNaAcpH57をピペットで加える。25容の100エタノールを添加して混合し、少なくとも30またはそれ以上-20°Cで静置する。4°Cで10分間遠心し、ペレットを170μLの70冷エタノールで洗浄する。3分間遠心し、ペレットを37°Cで乾燥させ、さらに30μLのH2Oに再懸濁させる。大腸菌EcoliのプラスミドDNAの単離:大腸菌オーバーナイト培養のプラスミドDNAの単離はキアゲンを用いて実施した。サッカロミセスセレビシエのDNAの調製:前記酵母細胞を10mLのYPDで一晩30°Cでインキュベートし、次の朝、3000rpmで10分間遠心し、ペレットを1Mソルビトール、01MEDTApH75の500μLに再懸濁し、エッペンドルフ試験管に移す。50μLのザイモラーゼzymolaseソルビトール/EDTA中に5mg/mLを添加し、37°Cで1時間インキュベートし、さらに1分間遠心する。50mMトリス、20mMのEDTApH74500μLにペレットを再懸濁する。50μLの10SDSを添加し、完全に混合し、さらに65°Cで30分間インキュベートする。5MのKAc200μLを加え、氷上に1時間置き、10分間遠心する。上清約650μLを新しいエッペンドルフ試験管に移し、1容量のイソプロパノールを加え、穏やかに混合し、さらに5分間静置する。簡単に遠心するか、または沈殿したDNAをガラスのかぎ棒で抜き取り、空気中で前記ペレットを乾燥させる。ペレットまたはDNAを150μLのTE緩衝液に再懸濁し、65°Cで10分間溶解させる。DNAクローニング:全てのDNAクローニングは標準的なプロトコルにしたがって実施した。酵母の形質転換酢酸リチウム法:形質転換しようとする酵母株を5mLの適当な培養液中で一晩30°Cでシェーカー上でインキュベートする。次の朝前記オーバーナイト培養を適当な培養液で希釈しOD600=0405、さらに2時間シェーカー上で30°CでインキュベートするOD600=0408。2500rpmで3分間遠心し、25mLの滅菌H2Oでペレットを洗浄する。2500rpmで3分間遠心し、1mLのLITE100mMのLiAc,TEpH75に再懸濁し、懸濁液をエッペンドルフ試験管に移す。RTで5分間インキュベートし、15秒間遠心するQuickspin。100mMのLiAc1mLでペレットを洗浄しquickspin、細胞濃度に応じてペレットを200400μLの100mMLiAcに再懸濁して50μLの部分標本に分ける。表示の順番どおりに以下を加える:240μLのPEG50、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する;36μLの1MLiAc、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する;10μLの一本鎖精子DNA-20°Cで保存;使用前に80-90°Cで10分間加熱してから氷に移す;2~3μgのプラスミドDNAまたはノックアウトトランスフォーメーションの場合には8~10μLのミニプレップMiniprep、ピペットで穏やかに懸濁物を混合し;形質転換反応物をオーバーヘッド回転装置で低速で30°C30分間インキュベートする;42°C15分間形質転換反応;クィックスピンで遠心、ペレットを200μLのTE緩衝液に再懸濁ノックアウトの場合は300μLのYPDにペレットを再懸濁し、オーバーヘッド回転装置で30°Cで4時間インキュベートする;寒天平板当たり100μLノックアウトのばあいは全反応物を平板培養し、30°Cで3~4日間インキュベート。配列決定:ABIPRISMred.プロトコルII/AmpliTaqFS14BigDyeターミネーター反応物:プレミックス2μLDNA鋳型ssDNA50ngdsDNA250ngPCR生成物0.2-5kB10-50ngプライマー3~10pmolH2Oで最終容積10μLサーモサイクラープロトコル25サイクル:1.96°Cで15秒間2.96°Cで15秒間3.55°Cで10秒間4.60°Cで4分間5.2.に戻って24サイクル6.4°C∞7.終了精製反応セントリセップスピンカラムCentriSepSpinColum:カラムを750μLのH2Oで30分間予め膨潤させ、液体を排出させて2分間3000rpmで遠心する。反応物をH2Oで20μLにしてカラムに適用し、2分間3000rpmで遠心する。サンプル適用:配列決定試験管に、4μLのセントリセップCentriSep溶出液20μLのTSR鋳型抑制試薬、90°Cで2分間。サザンブロット:DNAプローブを適当な制限酵素で消化、ゲル電気泳動で分離し、ゲルから抽出する。ゲノムDNAを適当な制限酵素で一晩消化し、ゲル電気泳動で分離する1アガロースゲル。ゲルの前処理:アガロースゲルからローディングウェルを取り出す。アガロースゲルを025MのHClで15分間脱プリン処理し、続いて蒸留水で2回洗浄する。アガロースゲルを05MのNaOHで30分間変性させ、ヴァキュームブロッターモデル785VaccumBlotterModel785BioRadを用いてビニールシートの中央に移し、ウィンドーウィンドーシールを切り取り、ナイロン膜と濾紙の端を切り揃え各々の事例でゲルより05cm小さい、ナイロン膜の端を蒸留水で湿らし各々の事例でビニールシートの小窓より05cm広い、続いてナイロン膜および濾紙をトランスファー溶液で湿らす。装置の構築下から上へ:ベースユニット、真空土台部、多孔性真空スラブ、濾紙、ナイロン膜、ビニールウィンドー、アガロースゲル、最終フレーム、蓋。バイオラッドBioRad真空ポンプを10分間予熱し、真空を適用する16932Pa5インチHg。端に沿ってゲルを穏やかに圧迫する。トランスファー溶液約1L、10×SSCを上部液だめに入れる;移動時間:90分;真空のスイッチを切り、ナイロン膜を取り出し、5分間2×SSCで洗浄し、続いて濾紙の間で風乾させる。DNA固定:ナイロン膜をUV透過性の密着フィルム上に置き、陽性コントロールとして端にプローブを適用する;UVストラタリンカーに入れ架橋を開始させる1200000J→0;膜は粘着フィルム内またはワットマン濾紙の間で室温または4°Cで保存することができる。ジーンイメージランダムプライムラベリングモジュールAmersham:DNAプローブの標識:DNAプローブを96°Cで5分間変性させヒートショック、その後氷上に置く。10μLの反応ミックスヌクレオチドミックス5×、トリス-HClpH78中のフルオレセイン-11-dUTP,dATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、2-メルカトエタノールおよびMgCl2;5μLのプライマーRandomNonamers、1μLの酵素溶液クレノーフラグメント、5単位/mL;22μLの変性DNAプローブ;12μLのH2O。2時間37°Cでインキュベートし、2μLのO5MEDTA=20mMを添加し、部分標本を-20°Cで保存する。標識効率の確認:5×ヌクレオチドミックスをTE緩衝液で1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250および1/500に希釈し;ナイロン膜の細片に5μLのDNAプローブを5μLの1/5希釈と一緒に適用してさっと吸収させ、予め温めておいた2×SSCで60°Cで15分間洗浄し;1/5希釈を除いた残りの溶液を参照用膜細片に適用し、両方の膜細片をUV光の下で観察し、サンプルの濃さを決定する。ハイブリダイゼーション:ナイロン膜ブロットを温かいハイブリダイゼーション緩衝液03mL/cm2で、回転オーブンで60°C2時間予備ハイブリダイズさせ;緩衝液を除きその10mLを残す。DNAプローブを変性させ96°Cで5分間、続いて氷上で冷却;プローブを前記10mLの緩衝液とともにブロット上に加え、回転オーブンで60°Cで一晩ハイブリダイズさせる。洗浄工程:温かい1×SSC,01w/vSDS中でプラットフォームシェーカー上で15分;温かい05×SSC,01w/vSDS中でプラットフォームシェーカー上で15分。ジーンイメージCDP-スターディテクションモジュールAmersham:停止および抗体反応:シェーカーの上で、緩衝液A中の停止試薬1/10希釈中で1時間室温でブロットをインキュベートする。抗体溶液アルカリ性ホスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体、5000×を05w/vBSA/緩衝液Aでブロットシールと一緒に金属薄片中で希釈し、さらにシェーカー上で1時間室温でインキュベートする。10分間緩衝液A中の03トゥイーンTween20で3回洗浄して未結合抗体溶液を除去する。シグナル発生および検出:洗浄緩衝液を排出し、ブロットを密着フィルム上に置き、5mLの検出試薬を適用し、2~5分反応させ、再度排液しアルカリ性ホスファターゼは発光を引き起こす;密着フィルムで包み、暗室の赤色光の中でフィルムハイパーフィルムMPAmershamを用い、フィルムカセットBioMaxKodak中で05~2時間露光させ、現像してスキャンする。ブロットは4°Cで密着フィルム中で保存できる。実施例1:特異的欠失カセットの構築欠失は全て標準的な方法によって実施したGRFinketal1991AWachetal1994UGuldeneretal1996ALGoldsteinetal1999。各々約500bpのフラグメントそれぞれは遺伝子の初めと終わりの領域をもつを以下のプライマーを用いてPCRにより増幅させた:TRK1の場合はTRK1FLBamHIFo、TRK1FLPstIRe、TRK1FLPstIFoおよびTRK1FLXhoIRe、TRK2の場合はTRK2DEL5FoB、TRK2DEL5Re、TRK2DEL3FoおよびTRK2DEL3Re、並びにTOK1の場合はTOK1DEL5Fo、TOK1DEL5Re、TOK1DEL3FoおよびTOK1DEL3Re23章参照。増幅させた末端は後の酵母ゲノムへの正確な組み込みを可能にする。酵母株w303a/αまたはw303a/αΔtrk1はDNA鋳型として機能する。実施例2:単一、二重、三重変異体の構築実施例2a:単一ノックアウトTRK1、TRK2およびTOK1のための構築欠失カセットでそれぞれ二倍体酵母株YM96MATa/MATαを形質転換した。ゲノムへの欠失カセットの組み込みは、-URA/Glcでtrk1変異体YM123/124を、さらにYPD/ジェニチシンでtrk2変異体YM158-161およびtok1変異体YM154-157を増殖させることによって確認した。なぜならば、TRK1欠失カセットのURA3マーカーは-URA培地での増殖を可能にし、TRK2またはTOK1のKANマーカーはゲネチシンgeneticinでの増殖を可能にするからであるGRFinketal1991。陽性コロニーを胞子形成平板にレプリカ平板培養により移し、ここで栄養成長を行わずに18-24時間後にMATa/MATα二倍体細胞は胞子を形成する。それらをザイモラーゼで処理し、再びYPD上で増殖させた後、解剖顕微鏡を用いていくつかのコロニーの四分子を個々の4つの胞子に分割する。胞子コロニーの交配型を交配テスター株との交配によって決定したGRFinketal1991。欠失カセットの有無についての選別は、trk1については-URA培地、trk2およびtok1についてはゲネチシン含有培地でのレプリカ平板培養によって実施した。酵母のDNA調製によって形質転換体のゲノムDNAを得た後で、結果を診断用PCRおよびサザンブロットによって確認した。実施例2b:二重ノックアウトTOK1欠失カセットで一倍体Δtrk1酵母株YM123およびYM124を形質転換し、YPD/ゲネチシンでの増殖によりTOK1欠失カセットの組み込みについて選別した。結果は診断用PCRおよびサザンブロットにより確認した。グリセロール培養は以下の株を用いて実施した:URA3、KANΔtrk1Δtok1株YM140、YM141、YM143およびYM144。単一コロニーをパッチとして画線培養し、5-FOA上にレプリカ培養し、TRK1欠失カセットからURA3マーカーおよびhisGリピートを排除したコロニーを選別したGRFinketal1991。したがって、ウラシル合成のためのURA3遺伝子TRK1でを欠いたコロニーはいずれも-URA/Glcでは増殖せず、一方、TOK1欠失カセット中の耐性遺伝子により全てのコロニーがYPD/gen上で生存する。ゲノムからKanマーカーを除去するために、-URA3変異体をプラスミドpSH47で形質転換した。前記pSH47にはCreリコンビナーゼおよびウラシル合成URA3のための遺伝子が存在する。陽性形質転換体は-URA/Glcで増殖し、したがって-URA/Gal液体培地でのインキュベーションによってCreリコンビナーゼを誘発することが可能であった。この方法で、Kanマーカーは1つのloxPリピートとともに排除され、1つのloxPは保持される。オーバーナイト培養でOD600=5となった後で、1:10000および1:50000の希釈を-URA/Galで平板培養した。YPD/genでレプリカ培養した単一コロニーパッチは増殖を示さなかったこれはKanマーカーの排除は成功であったことを示している。プラスミドpSH47を除去するために、その後、細胞を5-FOAで2回選別を繰り返した。グリセロール培養は-ura-kanΔtrk1Δtok1株YM162、YM163およびYM164を用いて実施した。実施例2c:三重ノックアウトYPDでのオーバーナイト培養を単一Δtrk1Δtok1コロニーYM162およびYM164を用いて開始し、次の日、BsiWISpeI消化TRK2欠失カセットで形質転換し、YPD/KCl/ジェネチシンで平板培養した。酵母DNAを調製した後、この三重ノックアウトを診断用PCRおよびサザンブロットで確認した。実施例3:ヒトカリウムチャネルのサブクローニング並びに二重および三重変異体の形質転換ヒト遺伝子HERG、HCN2、Kv1.5および陽性コントロールとしてTRK1、IRK1モルモットをそれらを含むプラスミドHERGはpcDNAのBamHI間に、HCN2はpTLNのNcoIXhoI間に、Kv15はpcDNA31のNheIEcoRI間に、IRK1はpSGEMのBamHIEcoRI間に存在から制限酵素を用いて切断して切り出し、ゲル電気泳動によって分離し、さらにゲルから抽出した。個々のヒトカリウムチャネルを酵母ベクターp423-GPD3DMumbergetal1995VRonickeetal1997に連結し、大腸菌を形質転換した。プラスミド調製物のコントロール消化および配列決定によって前記のヒト遺伝子が組み込まれたクローンを特定することができた。続いてこれらのプラスミドでΔtrk1Δtrk2二重ノックアウトおよびΔtrk1Δtrk2Δtok1三重ノックアウトを形質転換し、-HIS/80mMKCl上で平板培養した。実施例4:ノックアウト株の性状決定実施例4a:種々のK濃度およびpH値の培養平板上での二重および三重変異体の増殖種々のノックアウトのカリウム要求の相違を比較するために、酵母株YM182、YM168およびYM97WTを、種々のK濃度およびpH値をもつDPM平板でインキュベートした。この目的のために、グリセロール培養のパッチを先ず最初に100mMKCl/pH65に画線培養した。2日間増殖させた後、50mM、30mMおよび5mMKClでレプリカ平板培養を実施した。この実験によって、YM168株Δtrk1Δtrk2およびYM182株Δtrk1Δtrk2Δtok1の両株は50mMおよび30mMのKClで生存可能であることが示された。さらに、YM182株はYM168株よりも30mMのKClの存在下でより良好に増殖することが判明した。この2つの株のいずれも、野生型株YM97とは対照的に5mMのKClの存在下で生存できなかった。pH依存性を調べるために、前記3株をさらに100mMおよび5mMKCl/pH50並びに100mMおよび5mMKCl/pH40上でレプリカ平板培養した。この実験は、YM168およびYM182はいずれもpH40では100mMKClでも5mMKClでも生存できないことを示した。pH50で100mMKClでは、YM168の増殖欠損はYM182の場合よりも激しい。ベクターpRS416GALのTRK1の発現は、YM168株Δtrk1Δtrk2およびYM182Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を完全に補完する。実施例4b:種々のK濃度の液体培地での二重および三重変異体の増殖YM168株Δtrk1Δtrk2およびYM182株Δtrk1Δtrk2Δtok1以後の全ての実験はこれらを基準にしているの性状を調べるために、これら酵母株の液体培養中の増殖態様を調べた。最初に、オーバーナイト培養をDPM/80mMKCl中で開始させ、次の朝、DPM/5mMKClおよびDPM/15mMKClで前記培養をOD=005にした。それぞれ規定の間隔後に600nmでの光学密度を光度計により決定した。これらの実験によって、YM182株の増殖欠損は、5mMKClおよび15mMKClではYM168よりも強くないことが判明した。実施例5:二重および三重ノックアウトのヒトカリウムチャネルの性状決定実施例5a:培養平板のK欠乏の補完能力YM168Δtrk1Δtrk2およびYM182Δtrk1Δtrk2Δtok1の各株を、酵母発現ベクターとしてp423-GPD3中のヒトカリウムチャネルKv15;YM190およびYM195およびHERG1;YM191およびYM196でそれぞれ形質転換した。gpIRK1WTangetal1995;YM193およびYM198は酵母発現ベクターp423-GPD3中の陽性コントロールとして機能したDMumbergetal1995VRonickeetal1997。ブランクベクターp423-GPD3YM189およびYM194は陰性コントロールとして機能した。形質転換酵母株を-HIS/80mMKCl上で平板培養した。この後、単一コロニーのパッチをDPM/5mMKClpH65上でレプリカ平板培養し、カリウム欠乏を補完する能力を調べた。これらの実験によって、p423-GPD3の陽性コントロールgpIRKYM193およびYM198は完全に二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完することが示された。陰性コントロールとしてのブランクベクターp423-GDP3YM189およびYM194はこの増殖欠損を補完することができない。ヒトカリウムチャネルKv15は三重ノックアウトの増殖欠損を補完するが、陽性コントロールgpIRKよりはるかに効率が悪い。さらにまた、ヒトカリウムチャネルKv1.5は二重ノックアウトΔtrk1Δtrk2を補完しない。与えられた実験条件下では、HERGチャネルは二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完しない。実施例5b:活性化物質が存在する培養平板での増殖種々のカリウムチャネルに対する活性化物質の作用を示すために、上記の株を以下の特定の活性化物質を含む培地中でインキュベートした。Kv15:Rbは過分極相を延長させる。これは、内向きのKの流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。HERG:Csは過分極相を延長させる。これは、内向きのKの流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。このチャネルはCsによって抑制される。IRK1:Csはこのチャネルを阻害する。p423-GPD3-Kv15を用いた実験によって、ヒトKv15チャネルは、2mMRbClの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された図3。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い図3。これは実施例6aで示される結果と一致する。p423-GPD3-HERGを用いた実験によって、ヒトHERG1チャネルは、2mMCsClの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された図4。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い図4。これは実施例6aで示される結果と一致する。実施例5c:液体培養液中のRbClの存在下におけるΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体のKv1.5による補完酵母株YM194およびYM195を1mMのRbClを含むDPM/-HIS/5mMKCl中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、10mLのオーバーナイト培養をDPM/-HIS/80mMKCl中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてOD600を005にした最終容積:20mL。600nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。これらの実験は、TRK1、TRK2およびTOK1を欠く酵母株におけるベクターp423-GPD3のKv15の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完することができることを明瞭に示した。さらに別の実験で、Kv15およびgpIRKによる増殖欠損の補完は2mMのCsClの存在下で抑制されることが示された。実施例5d:液体培地中のCsCl存在下でのΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体におけるHERG1チャネルによる補完酵母株YM194およびYM196を1mMのCsClを含むDPM/-HIS/5mMKCl中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、10mLのオーバーナイト培養をDPM/-HIS/80mMKCl中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてOD600を0.05にした最終容積:20mL。600nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。これらの実験は、TRK1、TRK2およびTOK1を欠く酵母株におけるベクターp423-GPD3のHERG1の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完できることを明瞭に示した。実施例6:三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1における全ての増殖アッセイは、各事例で表示したpHおよびカリウム濃度で増殖培地DPM規定カリウム培地で実施した。ヒトHERG1Kチャネルの阻害物質として用いられた物質は、テルフェナジンα-4-tert-ブチルフェニル-4-α-ヒドロキシ-αフェニルベンジル-1-ピペリジンブタノール;HMR、ピモジド1-44-bisP-フルオロフェニルブチル-4-2-オキソ-1-ベンゾイミダゾリニル-ピペリジン;SigmaCatNoP100、ジプラシドン5-2-[4-12-ベンゾイソチアゾール-3-イルピペラジノ]-エチル-6-クロロ-13-ジヒドロ-2H-インドール-2-オン;HMR、ロラタジンエチル4-8-クロロ-56-ジヒドロ-11H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b-]ピペリジン-11-イリデン-1-ピペリジンカルボキシレート;HMRおよびセルティンドール1-2-[4-[5-クロロ-1-4-フルオロフェニル-1H-インドール-3-イル]-1-ピペリジニル]エチル-2-イミダゾリジノン;HMRであったERichelson1996ERichelson1999EDelponetal1999TKobayashietal2000MDDrichetal2000。カリウムチャネルに対して抑制作用をもたないはずの物質、ジフェニルヒドラミンSigmaCatNoD3630およびフェキソフェナジン4-[ヒドロキシ-4-[4--1-ピペリジニル]ブチル]-α,α-ジメチルベンゼン酢酸ヒドロクロリド;HMRMTaglialatelaetal1999LMDuBuske1999もまた用いた。全ての物質はDMSOに溶解し、最終濃度30μMで使用した。コントロールとして、前記物質を含まない0.5の同じ最終濃度のDMSOを有する細胞、DMSOが添加されていない細胞、物質が添加されていない細胞を測定した。図1および2に示したように、ヒトHERG1チャネルは、5mMKClのみを含む培地で三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができる。テルフェナジン、ピモジド、ジプラシドン、セルティンドールおよびロラタジンの存在下では、ヒトHERG1チャネルは、もはや5mMKClのみを含む培地では三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができない。実施例7:酵母の3つの内在性カリウムチャネル蛋白質を全て発現する野生型株をテルフェナジン、ピモジド、ジフェニルヒドラミン、ジプラシドン、ロラタジン、フェキソフェナジンおよびセルティンドールとともにインキュベートしたとき、テルフェナジン、ロラタジンおよびセルティンドールはヒトHERG1チャネルの特異的阻害物質であることが示された図9。この結果によれば、ピモジドおよびジプラシドンはむしろ非特異的阻害物質であると考えるべきである。このことは、これらの物質はおそらくヒトHERG1チャネルだけでなくサッカロミセスセレビシエの内在性カリウムチャネルもまた抑制することを意味している。しかしながら、この結果は、これら物質について認められた抑制作用は、酵母細胞の増殖に必須の他の物質の抑制に起因する可能性を排除することができなかった。この可能性を調べるために、80mMのKClを含む増殖培地でこれらの物質の作用も調べた。これらの結果図10によって、ピモジドは、非特異的態様で内在性カリウムチャネルTRK1およびTRK2の活性を抑制することが明らかになった。より高いカリウム濃度で抑制作用が認められないことによって、ピモジドは酵母細胞で不変的な毒性作用をもたないと結論することができる。対照的に、ジプラシドンはより高いカリウム濃度でさえ酵母細胞の増殖を抑制し、したがってサッカロミセスセレビシエに対する毒性作用をもつことが明らかになった。この作用に必須である酵母の標的蛋白質はまだ特定されていない。結論として、上記の実験は、前述の系によって、ヒトカリウムチャネルを特異的に抑制する物質を実際にサッカロミセスセレビシエで特定することができることを示した。前記の結果は図10に示されている。実施例8:ヒトカリウムチャネルHERG1およびKv15は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しない図11および図12。結果:図11および図12図11および12は、ヒトカリウムチャネルHERG1およびKv15は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しないことを示している各事例について図11および12の第4の部分。陰性コントロール、すなわち三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるブランクベクターp423GPD各事例について図11および12の第1の部分と比較したとき、増殖が改善されていないことが示されている。二重変異体Δtrk1Δtrk2の陰性コントロールp423GPDは表示されていないが、三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の陰性コントロールp423GPDと異ならない。対照的に、ヒトカリウムチャネルHERG1およびKv15は三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完する各事例について、図11および12の第三の部分。実施例9:ヒトカリウムチャネルROMK2;配列番号31、hROMK2を酵母ベクターp423GPDでサブクローニングし、三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1を形質転換した。この実験によって、前記ヒトカリウムチャネルもまた三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができることが示された。このヒトカリウムチャネルが二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完できるか否かはまだ調べられていない。ROMK2チャネルを特異的に抑制する物質はまだ判明していない。前記の結果は図13に示されている。参考文献CurranMELandesGMandKeatingMTMolecularcloningcharacterizationandgenomiclocalizationofahumanpotassiumchannelgeneGenomics12729737DascalNSchreibmayerWLimNFWangWChavkinCDiMagnoLLabarcaCKiefferBLGaveriauxRuffCandTrollingerDAtrialGproteinactivatedKchannelexpressioncloningandmolecularpropertiesProcNatlAcadSciUSA90102351O239FairmanCZhouXandKungCPotassiumuptakethroughtheTOK1KchannelinthebuddingyeastJMembrBiol168149157FedidaDChenFSandZhangXThe1997StevensonAwardLectureCardiacKchannelgatingcloneddelayedrectifiermechanismsanddrugmodulationCanJPhysiolPharmacol767789FinkGRandGuthrieCGuidetoYeastGeneticsandMolecularBiologyGuthrieCandFinkGR1991AcademicPresssIncMethodsinEnzymologyRefTypeBookWholeGaberRFStylesCAandFinkGRTRK1encodesaplasmamembraneproteinrequiredforhighaffinitypotassiumtransportinSaccharomycescerevisiaeMolCellBiol828482859GoldsteinALandMcCuskerJHThreenewdominantdrugresistancecassettesforgenedisruptioninSaccharomycescerevisiaeInProcessCitationYeast1515411553GoldsteinSAPriceLARosenthalDNandPauschMHORK1apotassiumselectiveleakchannelwithtwoporedomainsclonedfromDrosophilamelanogasterbyexpressioninSaccharomycescerevisiaepublishederratumappearsinProcNatlAcadSciUSA1999Jan596318ProcNatlAcadSciUSA931325613261GuldenerUHeckSFielderTBeinhauerJandHegemannJHAnewefficientgenedisruptioncassetteforrepeateduseinbuddingyeastNucleicAcidsRes2425192524IkedaKKobayashiKKobayashiTIchikawaTKumanishiTKishidaHYanoRandManabeTFunctionalcouplingofthenociceptinorphaninFQreceptorwiththeGproteinactivatedKchannelBrainResMolBrainRes45117126ItohTTanakaTNagaiRKamiyaTSawayamaTNakayamaTTomoikeHSakuradaHYazakiYandNakamuraYGenomicorganizationandmutationalanalysisofHERGageneresponsibleforfamiliallongQTsyndromeHumGenet102435439JanLYandJanYNClonedpotassiumchannelsfromeukaryotesandprokaryotesAnnuRevNeurosci209112391123JelacicTMSimsSMandClaphamDEFunctionalexpressionandcharacterizationofGproteingatedinwardlyrectifyingKchannelscontainingGIRK3JMembrBiol169123129KetchumKAJoinerWJSellersAJKaczmarekLKandGoldsteinSAAnewfamilyofoutwardlyrectifyingpotassiumchannelproteinswithtwoporedomainsintandemNature376690695KoCHBuckleyAMandGaberRFTRK2isrequiredforlowaffinityKtransportinSaccharomycescerevisiaeGenetics125305312KoCHandGaberRFTRK1andTRK2encodestructurallyrelatedKtransportersinSaccharomycescerevisiaeMolCellBiol1142664273KuboYReuvenyESlesingerPAJanYNandJanLYPrimarystructureandfunctionalexpressionofaratGproteincoupledmuscarinicpotassiumchannelseecommentsNature364802806LudwigAZongXStieberJHullinRHofmannFandBielMTwopacemakerchannelsfromhumanheartwithprofoundlydifferentactivationkineticsEMBOJ1823232329MadridRGomezMJRamosJandRodriguezNavarroAEctopicpotassiumuptakeintrk1trk2mutantsofSaccharomycescerevisiaecorrelateswithahighlyhyperpolarizedmembranepotentialJBiolChem2731483814844MainMJBrownJBrownSFraserNJandFoordSMTheCGRPreceptorcancoupleviapertussistoxinsensitiveandinsensitiveGproteinsFEBSLett441610MumbergDMullerRandFunkMYeastvectorsforthecontrolledexpressionofheterologousproteinsindifferentgeneticbackgroundsGene156119122MyersAMPapeLKandTzagoloffAMitochondrialproteinsynthesisisrequiredformaintenanceofintactmitochondrialgenomesinSaccharomycescerevisiaeEMB0J420872092NakamuraRLAndersonJAandGaberRFDeterminationofkeystructuralrequirementsofaKchannelporeJBiolChem27210111O18RoberdsSLandTamkunMMCloningandtissuespecificexpressionoffivevoltagegatedpotassiumchannelcDNAsexpressedinratheartProcNatlAcadSciUSA8817981802RonickeVGraulichWMumbergDMullerRandFunkMUseofconditionalpromotersforexpressionofheterologousproteinsinSaccharomycescerevisiaeMethodsEnzymol28331322313322SanguinettiMCandZouAMolecularphysiologyofcardiacdelayedrectifierKchannelsHeartVesselsSuppl12170172SchreibmayerWDessauerCWVorobiovDGilmanAGLesterHADavidsonNandDascalNInhibitionofaninwardlyrectifyingKchannelbyGproteinalphasubunitsNature380624627SmithFWEalingPMHawkesfordMJandClarksonDTPlantmembersofafamilyofsulfatetransportersrevealfunctionalsubtypesProcNatlAcadSciUSA9293739377SnydersDJTamkunMMandBennettPBArapidlyactivatingandslowlyinactivatingpotassiumchannelclonedfromhumanheartFunctionalanalisisafterstablemammaliancellcultureexpressionJGenPhysiol101513543TaglialatelaMCastaldoPPannaccioneAGiorgioGandAnnunziatoLHumanetheragogorelatedgeneKchannelsaspharmacologicaltargetspresentandfutureimplicationsBiochemPharmacol5517411746TangWRuknudinAYangWPShawSYKnickerbockerAandKurtzSFunctionalexpressionofavertebrateinwardlyrectifyingKchannelinyeastMolBiolCell61231124OWachABrachatAPohlmannRandPhilippsenPNewheterologousmodulesforclassicalorPCRbasedgenedisruptionsinSaccharomycescerevisiaeYeast10179318O8WangQChenQandTowbinJAGeneticsmolecularmechanismsandmanagementoflongQTsyndromeAnnMed305865WildeAAandVeldkampMWlonchannelstheQTintervalandarrhythmiasPacingClinElectrophysiol2020482051WischmeyerEDoringFSpauschusAThomzigAVehRandKarschinASubunitinteractionsintheassemblyofneuronalKir30inwardlyrectifyingKchannelsMolCellNeurosci9194206YamadaMInanobeAandKurachiYGproteinregulationofpotassiumionchannelsPharmacolRev50723760BockJHShuckMEBenjaminCWCheeMBienkowskiMJandSlightomJLNucleotidesequenceanalysisofthehumanKCNJ1potassiumchannellocusGene188916DelponEValenzuelaCandTamargoJBlockadeofcardiacpotassiumandotherchannelsbyantihistaminesDrugSaf21Suppl1118discussion8171118DriciMDandBarhaninJCardiacKchannelsanddrugacquiredlongQTsyndromeTherapie55185193DuBuskeLMSecondgenerationantihistaminestheriskofventriculararrhythmiasClinTher21281295ItohTTanakaTNagaiRKikuchiKOgawaSOkadaSYamagataSYanoKYazakiYandNakamuraYGenomicorganizationandmutationalanalysisofKVLQT1ageneresponsibleforfamiliallongQTsyndromeHumGenet103290294KobayashiTIkedaKandKumanishiTInhibitionbyvariousantipsychoticdrugsoftheGproteinactivatedinwardlyrectifyingKchannelsexpressedinXenopusoocytesBrJPharmacol12917161722RichelsonEPreclinicalpharmacologyofneurolepticsfocusonnewgenerationcompoundsJClinPsychiatry57Suppl11411411RichelsonEReceptorpharmacologyofneurolepticsrelationtoclinicaleffectsseecommentsJClinPsychiatry60Suppl10514514ShuckMEBockJHBenjaminCWTsaiTDLeeKSSlightomJLandBienkowskiMJCloningandcharacterizationofmultipleformsofthehumankidneyROMKpotassiumchannelJBiolChem2692426124270TaglialatelaMCastaldoPPannaccioneAGiorgioGGenoveseAMaroneGandAnnunziatoLCardiacionchannelsandantihistaminespossiblemechanismsofcardiotoxicityClinExpAllergy29Suppl31829182189"