"宿主細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、5’から3’方向に、a前記宿主細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、b6-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ酵素MGMT、EC2.1.1.63、その触媒ドメインまたは突然変異体、およびc組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質またはその同族体である、請求項1に記載の発現ベクター。前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項1に記載の発現ベクター。前記オープンリーディングフレームが、前記ペプチドシグナルと同じ宿主細胞において機能的である誘導プロモーターと機能的に連結されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記分泌ペプチドシグナルおよび前記誘導プロモーターが無脊椎動物細胞、好ましくは、昆虫細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞において機能的である、請求項1~4のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記分泌ペプチドシグナルおよび前記誘導プロモーターが脊椎動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞またはそれらの誘導体において機能的である、請求項1~5のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記組換えタンパク質が診断用および/または治療用タンパク質および/またはポリペプチドからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記診断用および治療用タンパク質および/またはポリペプチドが、-細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、より好ましくは、デング熱ウイルス、日本脳炎JEウイルス、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、黄熱YFウイルス、ウスツUSUウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎MVEウイルス、ベッセルブロンWSLウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイルWNウイルス由来のEDIIIタンパク質、またはリフトバレー熱RVFウイルスもしくはトスカナTOSウイルス由来の核タンパク質N、またはチクングニアウイルス由来のE2エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのEエンベロープタンパク質の可溶型、および-血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、治療用酵素およびモノクローナル抗体およびサイトカイン、-抗腫瘍タンパク質、-微生物、ウイルスおよび/または寄生虫ポリペプチド、-癌抗原などの抗原からなる群から選択される、請求項7に記載の発現ベクター。前記診断用および治療用タンパク質がIFNα、グランザイムM、FasL、SSX2、NERCMSL、hSULF2ΔTMDおよびCNTN4からなる群から選択される、請求項7に記載の発現ベクター。前記MGMT酵素が配列番号3または配列番号68のDNA配列によりコードされている、請求項1~9のいずれか一項に記載の発現ベクター。前記MGMT酵素突然変異体が配列番号1または配列番号47のDNA配列によりコードされている、請求項1~9のいずれか一項に記載の発現ベクター。少なくとも1つのペプチド切断部位をさらにコードし、それが好ましくはMGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインと組換えタンパク質との間に位置する、請求項1~11のいずれか一項に記載の発現ベクター。標識をさらにコードし、それが好ましくは組換えタンパク質のC末端に位置する、請求項1~12のいずれか一項に記載の発現ベクター。スペーサー配列をさらにコードし、それが好ましくは前記MGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインと前記組換えタンパク質との間、かつ/または前記組換えタンパク質と前記標識との間に位置する、請求項1~13のいずれか一項に記載の発現ベクター。-ペプチドBiP昆虫シグナル、-配列番号2のSNAPタンパク質、-請求項9に定義される組換えタンパク質、-エンテロキナーゼペプチド切断部位、-ポリヒスチジン標識、および-アミノ酸配列グリシン-グリシン-グリシン-セリンGGGSを有する2つのスペーサー配列をコードする、請求項1に記載の発現ベクター。-BiP様ペプチドシグナル、-配列番号2のSNAPタンパク質、-請求項9に定義される組換えタンパク質、-proTEVペプチド切断部位、-ポリヒスチジン標識、および-アミノ酸配列グリシン-グリシン-グリシン-セリンGGGSを有する2つのスペーサー配列をコードする、請求項1に記載の発現ベクター。宿主細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、5’から3’方向に、aBiP様ペプチドシグナル、b配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、c2つのproTEVペプチド切断部位、dポリヒスチジン標識、およびeアミノ酸配列グリシン-グリシン-グリシン-セリンGGGSを有する2つのスペーサー配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。好ましくは配列番号59または配列番号69を含んでなる、請求項1~17のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなるプラスミドにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞。細菌、好ましくは、大腸菌細胞である、請求項18に記載の安定にトランスフェクトされた組換え細胞。細菌、昆虫細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞またはそれらの誘導体;哺乳動物細胞、より好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞、PER.C6細胞またはそれらの誘導体;および鳥類細胞、例えば、EBx細胞、好ましくは、EB66細胞またはそれらの誘導体である、請求項18に記載のトランスフェクトされた組換え細胞。請求項1~17のいずれか一項に定義される発現ベクターを生産するための、請求項18~20のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。組換えタンパク質を生産するための、請求項18~20のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。ペプチド分泌シグナルと、6-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ酵素MGMT、EC2.1.1.63、その突然変異体または触媒ドメインとを含んでなる、融合ポリペプチド。前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項23に記載の融合ポリペプチド。前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質またはその同族体である、請求項23に記載の融合ポリペプチド。前記MGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインのC末端に組換えタンパク質をさらに含んでなる、請求項23~25のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。前記組換えタンパク質のC末端に位置する標識、好ましくは、ポリヒスチジン標識をさらに含んでなる、請求項26に記載の融合ポリペプチド。請求項1~5および7~14のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定トランスフェクトされた、無脊椎動物組換え細胞。昆虫細胞である、請求項28に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。キイロショウジョウバエ細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞である、請求項29に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。i前記発現ベクターが、-配列番号19、または2010年8月19日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランスパリに番号CNCMI-4357として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、-配列番号22、または2010年10月27日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4381として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、-配列番号21、または2010年10月27日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4382として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、-配列番号9、または2010年9月29日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4368として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、-配列番号20、または2010年9月29日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4369として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、-配列番号10または59または69を含んでなる請求項17のベクター、-配列番号64、または2011年12月9日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4581として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、-配列番号71のベクター、-配列番号55、配列番号57もしくは72もしくは74、配列番号77、79もしくは81、配列番号89、配列番号84もしくは86、配列番号92、または配列番号96を含んでなる請求項9のベクターからなる群から選択されるか、あるいはiiそれが、-2010年8月19日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4357として寄託された細胞、-2010年10月27日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4381として寄託された細胞、-2010年10月27日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4382として寄託された細胞、-2010年9月29日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4368として寄託された細胞、-2010年9月29日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所に番号CNCMI-4369として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4565として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4566として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4567として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4568として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4569として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4570として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4571として寄託された細胞、-2011年12月5日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4572として寄託された細胞、-2011年12月8日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4576として寄託された細胞、-2011年12月8日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4577として寄託された細胞、-2011年12月8日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4578として寄託された細胞、-2011年12月8日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4579として寄託された細胞、-2011年12月8日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4580として寄託された細胞、-2011年12月9日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4583として寄託された細胞、-2011年12月9日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4584として寄託された細胞、-2011年12月9日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4585として寄託された細胞、および-2011年12月9日にtheCentreNationaldeCultureetdeMicroorganismesCNCM,パスツール研究所フランス75724パリセデックス15リュデュドクトールル25に番号CNCMI-4586として寄託された細胞からなる群から選択される請求項30に記載の安定にトランスフェクトされたS2細胞。請求項1~4、6~14、および16~17のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた、脊椎動物組換え細胞。哺乳動物細胞、好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞またはそれらの誘導体である、請求項32に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。前記発現ベクターが、配列番号57もしくは72もしくは74目的タンパク質がIFNαである場合、配列番号77、79もしくは81目的タンパク質が癌抗原SSX2である場合、配列番号55目的タンパク質がグランザイムMである場合、配列番号89目的タンパク質がFasLである場合、配列番号84もしくは86目的タンパク質が癌抗原NERCMSLである場合、または配列番号92目的タンパク質がコンタクチンCNTN4である場合、または配列番号96目的タンパク質がhSULF2ΔTMDである場合を含んでなる請求項9のベクターである、請求項32または33に記載の安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。組換えタンパク質の発現を増強する方法であって、前記タンパク質およびペプチド分泌シグナルを、酵素6-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ酵素MGMT、EC2.1.1.63、その突然変異体または触媒ドメインとともに共発現させることを含んでなり、前記共発現が好ましくは無脊椎動物細胞で行われる、方法。前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質である、請求項35に記載の方法。前記MGMT突然変異体酵素が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項35に記載の方法。細胞培養において組換えタンパク質を生産する方法であって、a請求項1~16の発現ベクターを提供すること、b前記発現ベクターを宿主細胞に導入すること、c前記宿主細胞に導入されたヌクレオチドの発現を可能として組換えタンパク質を生産することを含んでなる、方法。前記組換えタンパク質が、回収された細胞培養上清の少なくとも40mg/Lまたはそれを上回って発現される、請求項35~38のいずれか一項に記載の方法。複製ベクターまたは欠陥ベクターを感染させた宿主細胞において異種タンパク質の生産を増強するための、6-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ酵素MGMT、EC2.1.1.63、その突然変異体または触媒ドメインの使用。前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質である、請求項40に記載の使用。前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質である、請求項40に記載の使用。保存培地中、血漿中もしくはバッファー中での組換えタンパク質の半減期を改善するため、薬剤もしくはワクチンとして用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するため、または診断キットで用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するために、組換えタンパク質と融合または結合される保護ポリペプチドとしての、6-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ酵素MGMT、EC2.1.1.63、その突然変異体または触媒ドメインの使用。前記組換えタンパク質がインスリン、IFNα、グランザイムM、SSX2、FasL、エンドスルファターゼhSULF、コンタクチンおよびメソテリンNERMCSLの中から選択される、請求項43に記載の使用。1.プラスミドの構築1.1.プラスミドpMT/BiP/V5-HisAを使用した。このプラスミドは3642ヌクレオチドを含み、下記の特徴を含む:メタロチオネインプロモーター:塩基412~778、転写開始:塩基778、MTフォワードプライミング部位:塩基814~831、BiPシグナル配列:塩基851~904配列番号11、多重クローニング部位:塩基906~999、V5エピトープタグ:塩基1003~1044、ポリヒスチジン領域:塩基1054~1074、BGHリバースプライミング部位:塩基1094~1111、SV40後期ポリアデニル化シグナル:塩基1267~1272、pUC起点:塩基1765~2438相補鎖、blaプロモーター:塩基3444~3542相補鎖、アンピシリンbla耐性遺伝子ORF:塩基2583~3443相補鎖。また、pUC57Ampベクターも、本発明の目的で使用可能である。このベクターは下記のものを含んでなる。独特なクローニング部位EcoRI、メタロチオネインプロモーター、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、翻訳開始コドンATG、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド配列番号15、2つのリピート配列と3’末端ステム-ループが削除された、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、S40ポリAシグナルモチーフ、独特なクローニング部位ApaI。1.2.SNAPのクローニング配列番号2のSNAPタンパク質配列をコードするDNAの増幅を、5’-SNAPプライマーと3’-MCSプライマーの組合せを用い、PCRにより、pMT/BiP/CHIK.sE2SNAPタグを鋳型として行った。プライマー5’-SNAP:配列番号7プライマー3’-MCS:配列番号8次に、このPCR産物をBglIIおよびNotIで消化し、DES系において線状化プラスミドp/MT/BiP/V5-Aの独特なBglIIMCSの5’末端部位とNotIMCSの3’末端部位の間に挿入した。得られたプラスミドは配列番号9のpMT/BiP/SNAP-Hisタグベクターであり、下記のものを含んでなる:配列番号11の昆虫ssBiP配列、配列番号1のSNAPDNA配列、配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、EcoRV-SmaI制限部位、制限部位の下流に位置する、His6タグをコードするDNA配列番号14、iエンハンサー配列とEcoRV-SmaI制限部位の間、およびiiEcoRV-SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列。また、pMT/BiP/SNAP-Hisタグベクターは、pUC57骨格から得ることもでき、配列番号10の配列を有するベクターが得られる。このベクターは下記のものを含んでなる:独特なクローニング部位EcoRI、メタロチオニンプロモーター、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、翻訳開始コドン、配列番号15の、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、配列番号47のSNAPDNA配列、外来配列をインフレームで挿入するためのSmaI/XmaIにおける独特なクローニング部位EcoRV、SNAPエンハンサーDNAとクローニング部位の間に位置する、配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA配列番号14、エンハンサー配列とEcoRV-SmaI制限部位の間、およびiiEcoRV-SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、2つの翻訳停止コドン、2つのリピート配列と3’末端ステム-ループが削除された、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、S40ポリAシグナルモチーフ、および独特なクローニング部位ApaI。また、pMT/BiP様/SNAP-Hisタグベクターは、独特なEcoRV部位とHindIII部位の間に配列番号59図8も参照が挿入されたpUC57骨格から得ることもできる。このベクターは配列番号64の配列を有する。このベクターは下記のものを含んでなる:独特なクローニング部位EcoRI、メタロチオニンプロモーター、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、翻訳開始コドン、配列番号15の、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、配列番号47のSNAPDNA配列、外来配列をインフレームで挿入するための独特なクローニング部位BamHI、EcoRV、ApaIおよびXmaI、SNAPエンハンサーDNAとHisタグの間に位置する、配列番号52の2つのproTEV切断部位、ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA配列番号14、iエンハンサー配列とEcoRV-SmaI制限部位の間、およびiiApaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、2つの翻訳停止コドン、2つのリピート配列と3’末端ステム-ループが削除された、西ナイルウイルスIS-98-ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、S40ポリAシグナルモチーフ、および独特なクローニング部位ApaI。1.3.目的遺伝子のクローニング1.3.1.リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質NRVF-NRFV-Nタンパク質配列をコードするcDNAに対する突然変異誘発を、下記に挙げた5’-Nプライマーと3’-N’プライマーの組合せを用いてPCRにより行った。プライマー5’-N:配列番号17プライマー3’-N:配列番号181.3.2.非ウイルスタンパク質、例えば、インターフェロンIFNα1またはグランザイムM配列番号32のヒトIFNα1タンパク質配列も使用可能である。配列番号54のヒトグランザイムMタンパク質配列も使用可能である。グランザイムMは、その基質をMetまたはLeuの後で優先的に切断するキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。グランザイムMは、活性化された内在性のエフェクターであるナチュラルキラー細胞で構成的に発現される。このプロテアーゼはまた、抗ウイルス性および抗腫瘍性も有する。1.4.pMT/BiP/SNAP-HisタグベクターまたはpMT/BiP様/SNAP-Hisタグベクターへのタンパク質コード遺伝子の挿入による、pMT/BiP/SNAP-タンパク質-HisタグベクターまたはpMT/BiP様/SNAP-タンパク質-Hisタグベクターの取得1.4.1.RVF.N1.3.1.項で得られたPCR産物をBssHIIおよびAgeIで消化し、1.2.項で得られた線状化プラスミドp/MT/BiP/SNAP-Hisタグの、独特なBssHIISNAP遺伝子の3’末端部位とAgeIシャトルベクターのMCSの3’末端の間に挿入した。得られるプラスミドは例えば、pMT/BiP/SNAP-RVF.N/Hisタグ配列番号19である。1.4.2.種々のフラビウイルスのEDIIIタンパク質組換えフラビウイルス抗原に基づくELISAまたは免疫ブロット試験の特異性を高めるために、Eタンパク質の抗原ドメインIIIEDIIIは有望なアプローチであると思われる。西ナイルWNウイルス、ウスツUSUウイルス、日本脳炎JEウイルス、ダニ媒介脳炎TBEウイルス、デング熱血清型1~4DEN-1、-2、-3、-4ウイルスおよび黄熱YFウイルスからの組換えEDIIIの製造に関して、本発明の方法を用いて試験した。人畜共通のWN、USUおよびJEウイルスは、JE血清型群に属す。ショウジョウバエS2誘導発現系DES、Invitrogenは、無脊椎動物細胞におけるフラビウイルス由来の個々のEDIIIの大量生産のために選択されたものである。フラビウイルスWN、USU、JE、TBE、DEN-1~DEN-4、およびYF由来Eタンパク質の全長ドメインIIIをコードする合成遺伝子を配列番号23~配列番号31に一覧化する。EDIII配列を、1.2.で得られたプラスミドpMT/BiP/SNAP-Hisタグ中のSNAPタンパク質のC末端にインフレームで融合させ、融合タンパク質SNAP-EDIIIを作出した。1.4.3.IFNαプラスミドpMT/BiP/SNAP-IFN-Hisタグ図4参照およびpMT/BiP様/SNAP-IFN-Hisタグ図8の詳細を参照を得た。1.4.4.グランザイムMプラスミドpMT/BiP/SNAP-GrM-Hisタグを得た図6の詳細を参照。2.宿主細胞へのトランスフェクション2.1.S2細胞へのトランスフェクション得られたプラスミドpMT/BiP/SNAP-タンパク質-HistagHistagで終わる分泌融合タンパク質としてのSNAPタグを有するタンパク質の生産を可能とするは、選択マーカーpCo-BlastとともにS2細胞に同時トランスフェクトし、アンピシリン耐性を示す安定なS2/sSNAP-タンパク質-Histag細胞株を作出した。スピナー1000mlで増殖させた安定なS2細胞株を重金属カドミウムCd2で10日間刺激し、細胞外培地からタンパク質を濃縮および精製した。重金属カドミウムで10日間誘導した後に、安定なS2/sSNAP-タンパク質-Hisタグ細胞の上清には、分泌された、SNAPタグを有するタンパク質の蓄積が見られた。ヤギ血清抗Hisタグを用いた免疫ブロットアッセイにより、細胞外の、SNAPタグを有するタンパク質を検出することができる図2B、3B、4B、6C参照。2.2.HeLa細胞へのトランスフェクションこのプラスミドpMT/BiP様/SNAP-IFN-HistagをHeLa細胞にトランスフェクトした。抗SNAP抗体を用いた免疫ブロットアッセイにより、細胞外の、SNAPタグを有するIFNを検出することができる図7B参照。3.組換えタンパク質の精製細胞外の、HisタグおよびSNAPタグを有するタンパク質を、金属キレート樹脂およびHLPC法を用いて精製した。3.1.RVF-NおよびTOS-NRVF-NPlateForme5ProductiondeProteinesrecombinantesetdAnticorpsとの共同研究において、2リットルのS2/sSNAP-RVFV.N-Histag細胞上清から、Cd2刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が97mgもの量で得られた。TOS-NPlateForme5ProductiondeProteinesrecombinantesetdAnticorpsとの共同研究において、2リットルのS2/sSNAP-TOS.N-Histag細胞上清から、Cd2刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が41mgもの量で得られた。3.2.可溶性IFNα1可溶性IFNα1タンパク質は、エンテロキナーゼ酵素Novagenキットを用いて切断することにより、SNAPタグから遊離させた。3.3.種々のフラビウイルス由来の抗原EDIII:フラビウイルスEタンパク質デング熱[DEN]、西ナイル[WN]、日本脳炎[JE]、ウスツ[USU]、ダニ媒介脳炎[TBE]、黄熱[YF]、マレー脳炎[MVE]、ベッセルブロン[WSL]、ロシオ、ジカ由来のドメイン抗原IIIectoM:1型デング熱ウイルス由来Mタンパク質のエクトドメインRVF由来N遺伝子:リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質N主要ウイルス抗原TOS由来N遺伝子:トスカナウイルスの核タンパク質N主要ウイルス抗原WN由来sE:西ナイルウイルス由来エンベロープEタンパク質の可溶型CHIK由来sE2:チクングニアウイルス由来エンベロープE2タンパク質の可溶型SNAP-IFNΑI:SNAPと融合したインターフェロン-α13.4.グランザイムMの生産7日で、1リットルの培養上清当たり10mgのSNAP-GrMタンパク質が回収された。精製工程後、連結されたGrM酵素によるSNAPタンパク質の切断に対応する3つの形態のSNAP-GrMが検出された図6C参照。このことは、ヒトプロテアーゼは本発明の方法により生産された後にも活性があることを明らかに意味する下記参照。4.SNAPタグを有するタンパク質の制御特異的抗体目的タンパク質および/またはHisタグ標識を認識するを用いた免疫ブロットアッセイは、細胞外の、SNAPタグを有するタンパク質の実質的生産を検出した:免疫ブロットアッセイは、ヤギ血清抗Histagを用いて、細胞外の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を検出した図2B。RVF.Nに対するヒトおよびマウス免疫血清は、組換え型の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を特異的に認識する。特異的マウスポリクローナル血清を用いた免疫ブロットアッセイは、組換えWNとUSUEDIIIの間で、高いレベルの配列類似性にもかかわらず交差反応性を示さなかった。よって、最近ヨーロッパでは可能性のある出現アルボウイルスとしてUSUウイルス、およびそれより少ないがJEウイルスが特定されていることから、WNV、JE、USUから分泌された可溶性SNAP-EDIIIは、JE血清型群のメンバーの特異的診断のための組換えウイルス抗原として好適である。5.SNAPタグを有する組換えタンパク質の活性誘導を受けたS2/SNAP-IFNα1細胞から分泌された可溶性組換えSNAP-IFNα1はCHIKVに対して強い抗ウイルス効果を示す誘導10日後に、Cd2刺激S2/SNAP-IFNα15×106細胞/mlの上清5mlを回収した。細胞上清に対して、抗Hisタグ抗体を用いた免疫ブロットにより、可溶性SNAP-IFNα1タンパク質の蓄積が見られた下記参照。SNAP-IFNα1の抗ウイルス活性を、ルシフェラーゼLuc遺伝子を発現するチクングニアウイルスに感染させたHeLa細胞で評価した。感染6時間後にLuc活性を測定した。HeLa細胞における、CHIKVに対するその強力な抗ウイルス作用が知られるIFNαcon1インファゲンを内部アッセイとして使用した。Cd2刺激S2/SNAP-Tos.Nトスカナウイルス由来Nタンパク質の上清を陰性対照として用いた。図4Cに示されたグラフは、1μlの分泌SNAP-IFNα1または0.1μgのインファゲンが感染宿主細胞内でのCHIKV複製を抑制できたことを示す。このグラフには、SNAP-IFNαの用量依存効果が示される。0.1μlの可溶性SNAP-IFNα1または0.01μgのインファゲンでなお20のLuc活性が見られた。SNAP-TOS-Nを用いた場合には、試験したより高い用量でも抗ウイルス作用は見られなかった。グランザイムMは、S2細胞の上清で産生された場合、活性型となるこれまでに述べたように、ベクターpMT/BiP/SNAP-GrM-HisタグでトランスフェクトされたS2細胞の上清では、3つの形態のSNAP-GrMが検出された図6C参照。これらの3つの形態は、連結されたGrM酵素によるSNAPタンパク質の切断に対応する。SNAPは実際にGrMの3つの潜在的切断部位を含んでいる図6B参照。抗His抗体または抗SNAP抗体のいずれかを用いたイムノアッセイでは、これらの3つの形態が実際に分泌された融合タンパク質SNAP-GrMの断片であることが明らかになった。小さい形態35kDaは、精製過程でSNAPの大部分が欠損したGrMに相当する。これらの結果は、本発明の系によって生産されたGrMプロテアーゼが、SNAPタンパク質と連結されているものの活性があることを明らかに示す。活性型のヒトプロテアーゼは組換え生産するのが極めて難しいことが知られているので、このことは実に興味深いことである。hSULF-2ΔTMDは、HEK293細胞の上清で産生された場合、活性型となる組換えプラスミドpcDNA3/DeSNAPuniv-hSULF-2ΔTMDでトランスフェクトされたHEK-293細胞からhSULF-2ΔTMDが発現および精製された図13A参照。上清中に得られたhSULF-2ΔTMDポリペプチドの酵素活性を次のように評価した。HEK293細胞をpcDNA3/DeSNAP-hSULF2ΔTMDで一時的にトランスフェクトした。2日後に、細胞上清のアリコートを50mMTrispH7.5中20mMの非蛍光偽基質4-メチルウンベリフェロン4-MUSとともにインキュベートし、20mMMgCl2をこの酵素細胞馴化培地中とともに、96ウェルプレートにて37°Cで2~4時間インキュベートした1:1、V/V。この酵素反応を、1.5MNaHCO3/Na2CO3pH10.5を加える1:1v/vことによって停止させ、蛍光生成物である4-メチルウンベリフェロンを蛍光計励起:360nmによりモニタリングした。細胞上清中のSULF活性を460nmでの光学密度ODで測定した。興味深いことに、図13Bに示されるように、分泌されたタンパク質SNAPと連結しているかは活性型である。6.SNAPタグを有する組換えタンパク質の安定性驚くことに、SNAPペプチドを含んでなる融合タンパク質はその不在の場合よりもinvitroにおいてはるかに安定であることが見出された。精製度の高いCHIK.sE2-SNAPタンパク質、SNAP-WN.EDIIIタンパク質およびSNAP-IFNΑIタンパク質を、無菌PBS中0.1mg/mlVol:0.1mlの不飽和濃度で、-80°C、4°C、25°Cもしくは37°Cで4日間、または同じ温度で2ヶ月間インキュベートした。タンパク質サンプル1μgをSDS-PAGE4~12で分離し、PageBlueタンパク質染色溶液Fermentasを用いて、クーマシーブリリアントブルーG-250色素で可視化した。図10AおよびBは、3つの異なる融合タンパク質のinvitro安定性を比較することによって得られた結果を示す。重要なことは、4°Cで2ヶ月後、また、室温25°Cまたは37°Cで4日間インキュベーション後も、総ての融合タンパク質が完全な状態を呈していたことである。特に、IFNは体温37°Cで4日後も影響を受けず、37°Cで2ヶ月後にもなお観察されたことから、それをSNAPと連結することでinvivo安定性が著しく高められると思われる。7.S2細胞により産生されたSNAP-RVF.Nのinvitro検出上述のプロトコールに従って産生されたSNAP-RVF.N融合タンパク質を、感染ヒツジの血清中の抗RVF.N抗体を検出するための診断ツールとして用いた。これらの融合タンパク質を、市販の検出キットBDSL製のRVFIgG検出キットおよびIdVet製のRVFmulti-speciesを用いて試験および比較した。試験は46のヒツジ血清で行ったなお、これらのヒツジはRVFワクチンで免疫化したものであった。SNAP-RVF.N融合タンパク質をウェルの底に直接コーティングするか、またはビオチン化して、ストレプトアビジンをコーティングしたウェルに加えた。PBS中0.2μgの高純度組換え抗原SNAP-RVF.N濃度:2μgタンパク質/mlで4°Cにて一晩直接コーティングしたマイクロ滴定96ウェルプラークを用いた直接的ELISA法により、抗RVF抗体を検出した。飽和後、希釈した血清をSNAP-RVF.Nとともにインキュベートした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗IgGを二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼ基質系を用いてELISAを行い、光学密度ODを450nmで測定した。サンプル血清は、そのODが非免疫血清のODの2倍であった場合に陽性とみなした。興味深いことに、これらの結果は、SNAP-RVF.N融合タンパク質が、ウェルに直接コーティングした場合には、市販のタンパク質と同じ感受性および特異性を与えることを示す示されていない。これらの結果は、それらのタンパク質をビオチン化した場合には再現しない。自然に免疫を獲得したウシから得られた血清でも同様の結果が得られたデータは示されていない。これらの結果は、本発明の融合タンパク質が、生体サンプルにおいてウイルス感染または細菌感染を同定するための診断ツールとして使用可能であることを示す。8.マルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイ本発明において、体液中のアルボウイルスに対する抗体の迅速かつ同時検出のためにマルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイが開発された。この系はxMAP技術Luminexcorporationに基づくものであり、特異的ヒト免疫グロブリンの捕捉試薬として抗原をコーティングしたマイクロスフェアの混合物を使用する。異なるマイクロスフェアセットMagplex、Luminexcorporationを精製MGMT融合タンパク質、すなわち、第3.3節に記載のSNAPタグを有するウイルス組換えタンパク質:sSNAP-DV1.EDIII、sSNAP-DV2.EDIII、sSNAP-DV3.EDIII、sSNAP-DV4.EDIII、sSNAP-WN.EDIII、sSNAP-JE.EDIII、sSNAP-USU.EDIII、sSNAP-TBE.EDIII、sSNAP-YF.EDIII、sSNAP-MVE.EDIII、sSNAP-ロシオ.EDIII、sSNAP-WSL.EDIII、sSNAP-ジカ.EDIII、SNAP-DV1ectoM、sSNAP-N.RVF、sSNAP-N.TOS、およびCHIK.sE2-SNAPと連結した。組換え抗原は、MGMTタンパク質の基質をリンカーとして用いてカルボキシルマイクロスフェア表面に共有結合させBG-PEG-NH2、NewEnglandBiolabs、それにより、標準的アミンカップリング手順に比べて抗体捕捉効率を高めた。抗SNAPタグ抗体および特異的マウスモノクローナル抗体を用いた技術のバリデーションにより、カップリング効率を確認し、長期の抗原安定性最大6ヶ月を証明した。ビーズコーティングその後の抗体捕捉には任意のペプチドまたはポリペプチドが使用可能であるので、この適用はウイルス抗原に限定されない。参考文献"