"明細書に記載の発明。発明の要旨本発明は、ボツリヌス神経毒素に結合し、かつボツリヌス神経毒素を中和する抗体に関する。本発明者らは、ボツリヌス神経毒素BoNT血清型の特に有効な中和は、特定の神経毒素血清型の2種以上のサブタイプを、高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成され得ることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する2種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得るが、特定の実施形態において、各々の抗体が少なくとも2種のBoNTサブタイプと交差反応性である場合、よりさらに効率的な中和が、1種以上の抗体の使用によって達成される。特定の実施形態において、本発明は、2種以上のBoNTサブタイプ例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などを高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。したがって、1つの実施形態において、本発明は、哺乳動物例えば、ヒトにおいてボツリヌス神経毒素を中和する方法を提供する。この方法は、代表的に、上記哺乳動物にBoNT血清型に対する少なくとも2種の異なる中和抗体を投与する工程を包含し、上記2種の抗体のうちの少なくとも1種は、上記BoNT血清型例えば、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/Fなどのうちの少なくとも2種の異なるサブタイプを、約10nMより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、およびBoNT/A4からなる群より選択される少なくとも2種の異なるサブタイプを、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1およびBoNT/A2を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、両方の抗体は、上記サブタイプのうちの少なくとも1種、好ましくは上記サブタイプのうちの少なくとも2種を、同時に結合する。特定の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3例えば、図18および図26、表2および/または表13を参照のことからなる群より選択される少なくとも1種のCDR、少なくとも2種のCDR、少なくとも3種のCDR、少なくとも4種のCDR、少なくとも5種のCDR、または少なくとも6種のCDRを含む。種々の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を含み、このVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される。種々の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、このVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される。特定の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3、ならびにVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、このVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択され、このVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、ING1、およびING2からなる群より選択される抗体より選択されるVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む。種々の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも1種は、単鎖FvscFv、IgG、IgA、IgM、Fab、Fab’2、またはscFv’2である。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される。種々の実施形態において、本発明は、C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1、および/またはING2からなる群より選択される抗体によって特異的に結合されるエピトープに特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態において、上記抗体は、1種または好ましくは2種以上のボツリヌス神経毒素サブタイプ例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などに結合し、そしてそれを中和する。上記抗体は、実質的に任意の哺乳動物の動物型例えば、マウス、ヒト、ヤギ、ウサギの抗体またはキメラ例えば、ヒト化の抗体であり得るが、この抗体は、最も好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。1つの実施形態において、上記抗体は、表2および/または表6、および/または表9および/または表13、および/または図26に記載される重鎖可変領域VHの相補性決定領域CDRあるいはその保存的置換体のうちの少なくとも1種より好ましくは少なくとも2種、および最も好ましくは少なくとも3種を含む。別の実施形態において、上記抗体は、表2および/または表6、および/または表9および/または表13、および/または図26に記載される軽鎖可変領域VLの相補性決定領域CDRあるいはその保存的置換体のうちの少なくとも1種より好ましくは少なくとも2種、および最も好ましくは少なくとも3種を含む。なお別の実施形態において、上記抗体は、表2および/もしくは表6、および/もしくは表9および/もしくは表13、および/もしくは図26に記載される重鎖可変領域VHの相補性決定領域CDRまたはその保存的置換体のうちの少なくとも1種より好ましくは少なくとも2種、および最も好ましくは少なくとも3種、および表2および/もしくは表6、および/もしくは表9および/もしくは表13、および/もしくは図26に記載される軽鎖可変領域VLの相補性決定領域CDRまたはその保存的置換体のうちの少なくとも1種より好ましくは少なくとも2種、および最も好ましくは少なくとも3種、ならびに/あるいは表2および/もしくは表6、および/もしくは表9および/もしくは表13、および/もしくは図26に記載されるVLフレームワーク領域またはVHフレームワーク領域のうちの1種、2種もしくは3種を含む。特定の好ましい抗体としては、C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D12、および/または5G4が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい抗体としては、IgG、単鎖FvscFvが挙げられる一方で、他の好ましい抗体としては、IgG、IgA、IgM、Fab、Fab’2、scFv’2などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、上記抗体は、多価であり得る。上記抗体は、2種のscFvフラグメントから構成される融合タンパク質を含み得る。本発明はまた、薬理学的賦形剤中に本明細書中に記載されるボツリヌス神経毒素-中和抗体の1種以上を含む組成物を提供する。本発明はまた、BoNT-中和エピトープを提供する。特定の好ましいエピトープとしては、C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、CR2、RAZ1、ING2、1D11、2G11、3D12、および/または5G4によって特異的に結合されるBoNT/AHCエピトープが挙げられる。特定の好ましいポリペプチドは、完全長BoNTではなく、そしてより特に好ましいポリペプチドは、完全長BoNTHcフラグメントではない。したがって、最も好ましいエピトープは、少なくともアミノ酸4、好ましくは少なくとも6アミノ酸、より好ましくは少なくとも8アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも10アミノ酸、12アミノ酸、14アミノ酸、または15アミノ酸さえもの長さを有する好ましい下位配列を有するBoNT/AHCの下位配列またはフラグメントである。この関連において、HuC25およびその誘導体AR1、AR2、AR3、AR4、およびCR1が、N末端であるHCドメインを結合する一方で、3D12/RAZ1は、C末端であるHCドメインを結合することに、留意する。これらのエピトープは、いずれも直鎖ではない。例えば、本発明は以下の項目を提供する。項目1哺乳動物においてボツリヌス神経毒素を中和する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、BoNT血清型に対する少なくとも2種の異なる中和抗-抗体を投与する工程を包含し、該2種の抗体のうちの少なくとも1種は、該BoNT血清型のうちの少なくとも2種の異なるサブタイプを、約10nMより大きい親和性で結合する、方法。項目2前記BoNT血清型は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、およびBoNT/Fからなる群より選択される、項目1に記載の方法。項目3前記BoNT血清型は、BoNT/AまたはBoNT/Bである、項目1に記載の方法。項目4前記BoNT血清型は、BoNT/Aである、項目1に記載の方法。項目5前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1、BoNT/A2、およびBoNT/A3からなる群より選択される少なくとも2種の異なるサブタイプを、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、項目4に記載の方法。項目6前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1およびBoNT/A2を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、項目4に記載の方法。項目7前記抗体は、1mgの抗体あたり少なくとも10,000マウスLD50を中和する、項目1、2、3、または4に記載の方法。項目8両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも1種を同時に結合する、項目1または4に記載の方法。項目9前記抗体は、1mgの抗体あたり少なくとも10,000マウスLD50を中和する、項目8に記載の方法。項目10前記抗体は、それぞれ、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、項目1に記載の方法。項目11前記抗体は、それぞれ、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、項目1に記載の方法。項目12前記抗体は、それぞれ、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、項目1に記載の方法。項目13前記抗体は、それぞれ、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目1に記載の方法。項目14前記抗体は、それぞれ、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3、ならびにVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択され、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目1に記載の方法。項目15前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む、項目1に記載の方法。項目16前記抗体のうちの少なくとも1種は、単鎖FvscFvである、項目15に記載の方法。項目17前記抗体のうちの少なくとも1種は、IgGである、項目15に記載の方法。項目18前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fabである、項目15に記載の方法。項目19前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fab’2である、項目15に記載の方法。項目20前記抗体のうちの少なくとも1種は、scFv’2である、項目15に記載の方法。項目21前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、項目1に記載の方法。項目22前記抗体のうちの少なくとも2種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、項目1に記載の方法。項目23ボツリヌス神経毒素BoNTを中和するための組成物であって、該組成物は、BoNT血清型に対する少なくとも2種の異なる中和抗体を含み、該2種の抗体のうちの少なくとも1種は、該BoNT血清型の少なくとも2種の異なるサブタイプを、約10nMより大きい親和性で結合する、組成物。項目24前記BoNT血清型は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、およびBoNT/Fからなる群より選択される、項目23に記載の組成物。項目25前記BoNT血清型は、BoNT/AまたはBoNT/Bである、項目23に記載の組成物。項目26前記BoNT血清型は、BoNT/Aである、項目23に記載の組成物。項目27前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1、BoNT/A2、およびBoNT/A3からなる群より選択される少なくとも2種の異なるサブタイプを、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、項目23に記載の組成物。項目28前記抗体のうちの少なくとも1種は、BoNT/A1およびBoNT/A2を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、項目23に記載の組成物。、項目29両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも1種を同時に結合する、項目23または26に記載の組成物。項目30前記抗体は、それぞれ、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、項目23に記載の組成物。項目31前記抗体は、それぞれ、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、項目23に記載の組成物。項目32前記抗体は、それぞれ、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、項目23に記載の組成物。項目33前記抗体は、それぞれ、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目23に記載の組成物。項目34前記抗体は、それぞれ、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメイン;ならびにVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目23に記載の組成物。項目35前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む、項目23に記載の組成物。項目36前記抗体のうちの少なくとも1種は、単鎖FvscFvである、項目35に記載の組成物。項目37前記抗体のうちの少なくとも1種は、IgGである、項目35に記載の組成物。項目38前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fabである、項目35に記載の組成物。項目39前記抗体のうちの少なくとも1種は、Fab’2である、項目35に記載の組成物。項目40前記抗体のうちの少なくとも1種は、scFv’2である、項目35に記載の組成物。項目41前記抗体のうちの少なくとも1種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、項目23に記載の組成物。項目42前記抗体のうちの少なくとも2種は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される、項目23に記載の組成物。項目43前記抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤中にある、項目23に記載の組成物。項目44前記組成物は、単位投薬処方物である、項目43に記載の組成物。項目45ボツリヌス神経毒素BontAを中和する抗体であって、該抗体は、少なくとも2種の異なるBontAサブタイプを、各サブタイプに対して約10nMより大きい親和性で結合する、抗体。項目46前記抗体は、前記BontA1サブタイプおよび前記BontA2サブタイプの両方を、それぞれ、約10nMより大きい親和性で結合する、項目45に記載の抗体。項目47前記抗体は、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、項目45に記載の抗体。項目48前記抗体は、RAZ1VLCDR1、RAZ1VLCDR2、RAZ1VLCDR3、RAZ1VHCDR1、RAZ1VHCDR2、RAZ1VHCDR3、1D11VLCDR1、1D11VLCDR2、1D11VLCDR3、1D11VHCDR1、1D11VHCDR2、1D11VHCDR3、2G11VLCDR1、2G11VLCDR2、2G11VLCDR3、2G11VHCDR1、2G11VHCDR2、2G11VHCDR3、5G4VLCDR1、5G4VLCDR2、5G4VLCDR3、5G4VHCDR1、5G4VHCDR2、5G4VHCDR3、3D12VLCDR1、3D12VLCDR2、3D12VLCDR3、3D12VHCDR1、3D12VHCDR2、3D12VHCDR3、CR1VLCDR1、CR1VLCDR2、CR1VLCDR3、CR1VHCDR1、CR1VHCDR2、CR1VHCDR3、CR2VLCDR1、CR2VLCDR2、CR2VLCDR3、CR2VHCDR1、CR2VHCDR2、CR2VHCDR3、ING1VLCDR1、ING1VLCDR2、ING1VLCDR3、ING1VHCDR1、ING1VHCDR2、ING1VHCDR3、ING2VLCDR1、ING2VLCDR2、ING2VLCDR3、ING2VHCDR1、ING2VHCDR2、およびING2VHCDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、項目45に記載の抗体。項目49前記抗体は、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、項目45に記載の抗体。項目50前記抗体は、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目45に記載の抗体。項目51前記抗体は、RAZ1VHドメイン、CR1VHドメイン、CR2VHドメイン、ING1VHドメイン、ING2VHドメイン、1D11VHドメイン、2G11VHドメイン、3D12VHドメイン、および5G4VHドメイン;ならびにVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、RAZ1VLドメイン、CR1VLドメイン、CR2VLドメイン、ING1VLドメイン、ING2VLドメイン、1D11VLドメイン、2G11VLドメイン、3D12VLドメイン、および5G4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目45に記載の抗体。項目52前記抗体は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、1D11、2G11、3D12、および5G4からなる群より選択される抗体より選択されるVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む、項目45に記載の抗体。項目53前記抗体は、RAZ1VHおよびRAZ1VLを含む、項目45に記載の抗体。項目54前記抗体は、CR1VHおよびCR1VLを含む、項目45に記載の抗体。項目55前記抗体は、CR2VHおよびCR2VLを含む、項目45に記載の抗体。項目56前記抗体は、ING1VHおよびING1VLを含む、項目45に記載の抗体。項目57前記抗体は、ING2VHおよびING2VLを含む、項目45に記載の抗体。項目58前記抗体は、1D11VHおよび1D11VLを含む、項目45に記載の抗体。項目59前記抗体は、2G11VHおよび1G11VLを含む、項目45に記載の抗体。項目60前記抗体は、5G4VHおよび5G4VLを含む、項目45に記載の抗体。項目61前記抗体は、3D12VHおよび3D12VLを含む、項目45に記載の抗体。項目62前記抗体は、単鎖FvscFvである、項目45に記載の抗体。項目63前記抗体は、IgGである、項目45に記載の抗体。項目64前記抗体は、Fabである、項目52に記載の抗体。項目65前記抗体は、Fab’2である、項目45に記載の抗体。項目66前記抗体は、scFv’2である、項目45に記載の抗体。項目67前記抗体は、RAZ1、CR1、CR2、ING1、ING2、3D12、1D11、2G11、および5G4からなる群より選択される、項目45に記載の抗体。項目68ボツリヌス神経毒素BontAを結合する抗体であって、該抗体は、AR2VLCDR1、AR2VLCDR2、AR2VLCDR3、AR2VHCDR1、AR2VHCDR2、AR2VHCDR3、AR3VLCDR1、AR3VLCDR2、AR3VLCDR3、AR3VHCDR1、AR3VHCDR2、AR3VHCDR3、AR4VLCDR1、AR4VLCDR2、AR4VLCDR3、AR4VHCDR1、AR4VHCDR2、およびAR4VHCDR3からなる群より選択される少なくとも1種のCDRを含む、抗体。項目69前記抗体は、AR2VLCDR1、AR2VLCDR2、AR2VLCDR3、AR2VHCDR1、AR2VHCDR2、AR2VHCDR3、AR3VLCDR1、AR3VLCDR2、AR3VLCDR3、AR3VHCDR1、AR3VHCDR2、AR3VHCDR3、AR4VLCDR1、AR4VLCDR2、AR4VLCDR3、AR4VHCDR1、AR4VHCDR2、およびAR4VHCDR3からなる群より選択される少なくとも3種のCDRを含む、項目68に記載の抗体。項目70前記抗体は、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、AR2VHドメイン、AR3VHドメイン、およびAR4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択される、項目68に記載の抗体。項目71前記抗体は、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、AR2VLドメイン、AR3VLドメイン、およびAR4VLドメインからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目68に記載の抗体。項目72前記抗体は、VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3、ならびにVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含み、該VHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3は全て、AR2VHドメイン、AR3VHドメイン、およびAR4VHドメインからなる群より選択されるVHドメインより選択され、該VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3は全て、AR2VLドメイン、AR3VLドメイン、およびAR4VLからなる群より選択されるVLドメインより選択される、項目68に記載の抗体。項目73前記抗体は、AR2、AR3およびAR4からなる群より選択される抗体より選択されるVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む、項目68に記載の抗体。項目74前記抗体は、単鎖FvscFvである、項目68に記載の抗体。項目75前記抗体は、IgGである、項目68に記載の抗体。項目76前記抗体は、Fabである、項目68に記載の抗体。項目77前記抗体は、Fab’2である、項目68に記載の抗体。項目78前記抗体は、scFv’2である、項目68に記載の抗体。項目79前記抗体は、AR2、AR3およびAR4からなる群より選択される、項目68に記載の抗体。項目80項目45~79のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。項目81項目45~79のいずれかに記載の抗体をコードする核酸を含む細胞。項目82ボツリヌス神経毒素を中和するためのキットであって、該キットは、項目23~44のいずれかに記載の組成物;およびボツリヌス神経毒素を中和するための該組成物の使用を教示する指示資料;を備える、キット。項目83前記組成物は、使い捨て可能な注射器中に保存される、項目82に記載のキット。定義BoNTポリペプチドとは、ボツリヌス神経毒素ポリペプチド例えば、BoNT/Aポリペプチド、BoNT/Bポリペプチド、BoNT/Cポリペプチドなどをいう。BoNTポリペプチドとは、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントをいい得る。したがって、例えば、用語BoNT/Aポリペプチドとは、完全長BoNT/AA型の血清型のClostridiumbotulinumによって産生される神経毒素またはそのフラグメント例えば、Hcフラグメントのいずれかをいう。HCフラグメントは、BoNT/Aの約50DaのC末端フラグメント残基873~1296であるLacyおよびStevens1999J.Mol.Biol.、291:1091-1104である。BoNT血清型とは、標準的な公知のBoNT血清型例えば、BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/Fなどのうちの1種をいう。BoNT血清型は、アミノ酸レベルにて約35程度の低さ例えば、BoNT/EとBoNT/Fとの間でから最大でアミノ酸レベルにて約66例えば、BoNT/A対BoNT/CまたはBoNT/Dについてで互いに異なる。したがって、BoNT血清型は、アミノ酸レベルにて約35~66で互いに異なる。用語BoNTサブタイプ例えば、BoNT/A1Aサブタイプとは、示差的な抗体結合をもたらすのに互いに十分に異なる、特定の血清型例えば、A、C、D、Fなどのボツリヌス神経毒素遺伝子配列をいう。特定の実施形態において、上記サブタイプは、アミノ酸レベルにて、少なくとも2.5、好ましくは少なくとも5、または10、より好ましくは少なくとも15または20で互いに異なる。特定の実施形態において、上記サブタイプは、アミノ酸レベルにて、35以下、好ましくは31.6以下、より好ましくは30以下または25以下、より好ましくは約20未満または約16未満で互いに異なる。特定の実施形態において、BoNTサブタイプは、アミノ酸レベルにて、少なくとも2.6、より好ましくは少なくとも3、そして最も好ましくは少なくとも3.6で互いに異なる。BoNTサブタイプは、代表的に、アミノ酸レベルにて、約31.6未満、より好ましくは約16未満で互いに異なる。中和とは、ボツリヌス神経毒素例えば、BoNT/Aの毒性の測定可能な減少をいう。用語高親和性は、抗体に関連して使用される場合、少なくとも約10-8M、好ましくは少なくとも約10-9M、より好ましくは少なくとも約10-10M、そして最も好ましくは少なくとも約10-11Mの親和性KDでその標的に特異的に結合する抗体をいう。特定の実施形態において、高親和性抗体は、約1nM~約5pMの範囲のKDを有する。以下の略語が、本明細書中で使用される:AMP、アンピシリン;BIG、ボツリヌス免疫グロブリン;BoNT、ボツリヌス神経毒素;BoNT/A、BoNTA型;CDR、相補性決定領域;ELISA、酵素結合イムノソルベントアッセイ;GLU、グルコース;HBS、HEPES緩衝化生理食塩水10mMHEPES、150mMNaCl[pH7.4];Hc、BoNT重鎖のc末端ドメイン結合ドメイン;HN、BoNT重鎖のN末端ドメイントランスロケーションドメイン;IgG、免疫グロブリンG;IMAC、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー;IPTG、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド;KAN、カナマイシン;Kd、平衡定数;koff、解離速度定数;kon、会合速度定数;MPBS、PBS中の脱脂粉乳;NTA、ニトリロ三酢酸;PBS、リン酸緩衝化生理食塩水25mMNaH2PO4、125mMNaCl[pH7.0];RU、共鳴単位resonanceunit;scFv、単鎖Fv抗体フラグメント;TPBS、PBS中の0.05容量/容量Tween20;TMPBS、MPBS中の0.05容量/容量Tween20;TU、形質導入単位transducingunit;VH、免疫グロブリン重鎖可変領域;VK、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域;VL免疫グロブリン軽鎖可変領域;wt、野生型。用語ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質は、隣接する残基のα-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基の線系列を示すために、本明細書中で交換可能に使用される。アミノ酸残基は、好ましくは、天然においてL異性体形態である。しかし、D異性体形態の残基は、所望の機能特性がそのポリペプチドによって維持される限り、任意のL-アミノ酸残基を置換し得る。さらに、20種の標準的なアミノ酸に加えて、アミノ酸は、改変されたアミノ酸および異常unusualなアミノ酸を含み、それらのアミノ酸としては、37CFR1.822b4に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりにおけるダッシュが、個以上のアミノ酸残基からなるさらなる配列に対するペプチド結合、またはカルボキシル末端基またはヒドロキシル末端基に対する共有結合のいずれかを示すことに留意すべきである。本明細書中で使用される場合、抗体とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる1種以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらは、次に、免疫グロブリンのクラスであるIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを、それぞれ、規定する。代表的な免疫グロブリン抗体構造単位は、テトラマーを構成することが公知である。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対は、1個の軽鎖約25kDおよび1個の重鎖約50~70kDを有する。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100~110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。用語可変軽鎖VLおよび可変重鎖VHとは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。抗体は、インタクトな免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる分解によってもたらされる十分に特徴付けられた多くのフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結より下流で抗体を分解してFab’2をもたらし、Fabのダイマーそれ自体は、ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合される軽鎖である。Fab’2は、温和な条件下で還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結が破壊され得、それによって、Fab’2ダイマーは、Fab’モノマーへと変換される。そのFab’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の部分を有するFabである他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、FundamentalImmunology、W.E.Paul、編、RavenPress、N.Y.1993を参照のこと。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の分解の用語において定義される一方で、当業者は、このようなFab’フラグメントは、化学的か、または組換えDNA方法論を利用することによるかのいずれかで、デノボで合成され得ることを認識する。したがって、本明細書中で使用される場合、用語抗体はまた、完全な抗体の改変によって産生される抗体フラグメント、または組換えDNA方法論を使用してデノボで合成される抗体フラグメントを含む。好ましい抗体としては、Fab’2、IgG、IgM、IgA、および単鎖抗体より好ましくは、単鎖FvscFv抗体が挙げられ、ここで可変重鎖および可変軽鎖は、直接的か、またはペプチドリンカーを介して一緒に連結されて、連続したポリペプチドを形成する。抗原結合部位または結合部分とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖Hおよび軽鎖LのN末端の可変領域Vのアミノ酸残基によって形成される。重鎖のV領域内および軽鎖のV領域内の3個の高度に分岐divergentしたストレッチは、超可変領域と称され、それは、フレームワーク領域またはFRとして公知である、より保存された隣接するストレッチの間におかれる。したがって、用語FRとは、免疫グロブリン中の超可変領域の間であり、かつ免疫グロブリン中の超可変領域に隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の3個の超可変領域および重鎖の3個の超可変領域は、三次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この表面は、標的の抗原の認識およびそれに対する結合を媒介する。重鎖および軽鎖の各々の3個の超可変領域は、相補性決定領域またはCDRと称され、そしてそれらの超可変領域は、例えば、Kabatら.Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest、第4版.U.S.Dept.HealthandHumanServices、PublicHealthServices、Bethesda、MD1987によって特徴付けられる。S25抗体とは、クローンS25によって発現される抗体、またはクローンs25によって発現される抗体と同一のCDRを有し、そして好ましくはクローン25によって発現される抗体と同一のフレームワーク領域を必ずしも有することはない他の様式において合成される抗体をいう。同様に、抗体C25、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、ING1、CR1、RAZ1、またはING2とは、対応するクローンによって発現される抗体、および/または参照された抗体と同一のCDRを有し、そして好ましくは参照された抗体と同一のフレームワーク領域を必ずしも有することはない他の様式において合成される抗体をいう。本明細書中で使用される場合、用語免疫学的結合および免疫学的結合特性とは、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有結合的相互作用の型をいう。免疫学的結合の相互作用の強度および親和性は、その相互作用の解離定数Kdに関して表され得、ここでより小さいKdは、より大きい親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量され得る。1つのこのような方法は、抗原結合部位/抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、ここでこの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向における速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、会合速度onrate定数Konおよび解離速度offrate定数Koffの両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Koff/Konの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの消去を可能にし、したがって、解離定数Kdに等しい。一般に、Daviesら、Ann.Rev.Biochem.、59:439-4731990を参照のこと。BoNT-中和抗体とは、1種以上のボツリヌス神経毒素例えば、BoNT/A1、BoNT/A2などに結合し、かつその結合によってBoNT神経毒素の毒性を減少させる抗体をいう。したがって、例えば、用語BoNT/A-中和抗体は、本明細書中で使用される場合、BoNT/Aポリペプチド例えば、BoNT/A1ポリペプチド特定の実施形態において、BoNT/AポリペプチドのHCドメインに特異的に結合し、かつその結合によってBoNT/Aポリペプチドの毒性を減少させる抗体をいう。減少した毒性は、麻痺が発生した回数の増加および/または本明細書中に記載されるような致死投薬量例えば、LD50として測定され得る。BoNT-中和抗体に由来する抗体としては、その配列が本明細書中で明確に提供される抗体が挙げられるが、これらに限定されない。BoNT-中和抗体に由来する抗体は、好ましくは、約1.6×10-8またはそれより良好な結合親和性を有し、そしてその抗体は、ボツリヌストキソイド、ボツリヌス毒素、またはBoNTフラグメントによって免疫化された哺乳動物マウスおよびヒトが挙げられるから得られた重鎖可変領域VH遺伝子および軽鎖可変領域VL遺伝子から構築された、ファージまたは酵母上に提示される単鎖Fvフラグメントのライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得、このライブラリーにおいて、公知のBoNT-中和可変重鎖VHが、多様な可変軽鎖VLと組み合わせて発現されるか、または逆に、公知のBoNT-中和可変軽鎖が、多様な可変重鎖VHと組み合わせて発現される。BoNT-中和抗体としてはまた、本明細書中に記載されるような可変重鎖または可変軽鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2またはCDR3に変異を導入することによってもたらされる抗体が挙げられる。最終的に、BoNT-中和抗体としては、本明細書中に記載されるBoNT-中和抗体およびそれらの誘導体に適用されるようなこれらの改変方法の任意の組み合わせによってもたらされる抗体が挙げられる。中和エピトープとは、中和抗体によって特異的に結合されるエピトープをいう。単鎖FvscFvまたはscFvポリペプチドは、直接連結されたかまたはペプチドをコードするリンカーによって連結されたかのいずれかであるVH-コード配列とVL-コード配列とを含む核酸から発現され得る、共有結合したVH::VLヘテロダイマーである。Hustonら、1988Proc.Nat.Acad.Sci.USA、85:5879-5883。天然に集合するが化学的に分離した抗体V領域由来の軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、三次元構造に折り畳まれるscFv分子に変換するための多くの構造は、実質的に、抗原結合部位の構造に類似する。例えば、米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号および同第4,956,778号を参照のこと。1つの分類の実施形態において、組換え体設計方法は、抗体可変領域由来の2つの天然に結合するが化学的に分離した重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖を、ネイティブな抗体構造に実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるscFv分子に変換するのに適した化学構造リンカーを開発するために使用され得る。設計の基準は、一方の鎖のC末端と他方の鎖のN末端との間に距離を空ける適切な長さの決定を含み、ここでリンカーは、一般に、コイルする傾向にないか、または二次構造を形成する傾向にない小さい親水性アミノ酸残基から形成される。このような方法は、当該分野において記載されている。例えば、Hustonらに対する米国特許第5,091,513号および同第5,132,405号;ならびにLadnerらに対する米国特許第4,946,778号を参照のこと。この関連で、リンカーの設計の第1の一般的な工程は、連結されるのにふさわしい部位の同定を包含する。VHポリペプチドドメインおよびVLポリペプチドドメインの各々における適切な連結部位としては、そのポリペプチドドメインからの残基の最小限の損失を生じる部位、分子の安定性に対する必要性と一致する最小限の数の残基を含むリンカーを必要とする部位が挙げられる。部位の対は、連結されるギャップを定義する。1つのドメインのC末端を次のドメインにN末端に対する連結するリンカーは、一般に、非構造立体配置を仮定する生理学的溶液中の疎水性アミノ酸を含み、そして好ましくはVH鎖およびVL鎖の適切な折り畳みを妨げ得る大きな側鎖を有する残基を含まない。したがって、本発明における適切なリンカーは、一般に、グリシン残基およびセリン残基の交互のセットのポリペプチド鎖を含み、そして可溶性を増強するために挿入されるグルタミン酸残基およびリジン残基を含み得る。本発明における1つの特定のリンカーは、アミノ酸配列[Gly4Ser]3配列番号1を有する。別の特に好ましいリンカーは、[Ser4Gly]配列番号2の2回または3回の繰り返しを含むアミノ酸配列例えば、[Ser4Gly]3配列番号3などを有する。このようなリンカー部分をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して容易に提供され得る。例えば、Sambrook、前出を参照のこと。抗体に関する場合、語句タンパク質に特異的に結合するまたはと特異的に免疫反応性とは、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団の存在下において上記タンパク質の存在を決定する結合反応をいう。したがって、設計されたイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に顕著な量で結合しない。このような条件下におけるタンパク質に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、BoNT/A-中和抗体は、BoNT/Aタンパク質に対して惹起され得、BoNT/Aタンパク質に特異的に結合し、そして組織サンプル中に存在する他のタンパク質に結合しない。種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式およびイムノアッセイ条件の記載については、HarlowおよびLane、1988Antibodies、ALaboratoryManual、ColdSpringHarborPublications、NewYorkを参照のこと。用語保存的置換は、分子の活性特異性または結合親和性を実質的に変化させないアミノ酸置換を反映するために、タンパク質またはペプチドに対する参照において使用される。代表的に、保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の同様の化学的特性例えば、電荷または疎水性を有する別のアミノ酸での置換を含む。以下の6種の群は、それぞれ、互いに対する代表的な保存的置換であるアミノ酸を含む:1アラニンA、セリンS、トレオニンT;2アスパラギン酸D、グルタミン酸E;3アスパラギンN、グルタミンQ;4アルギニンR、リジンK;5イソロイシンI、ロイシンL、メチオニンM、バリンV;および6フェニルアラニンF、チロシンY、トリプトファンW。詳細な説明本発明は、ボツリヌス神経毒素A型特定の実施形態において、他のボツリヌス神経毒素血清型例えば、B、C、D、E、Fなどに特異的に結合し、そしてそれを中和する新規の抗体を提供する。ボツリヌス神経毒素は、嫌気性細菌Clostridiumbotulinumによって産生される。ボツリヌス神経毒素中毒ボツリヌス中毒は、多くの状況contextにおいて生じ、その状況としては、食中毒食物媒介性ボツリヌス中毒、感染した創傷創傷ボツリヌス中毒、ならびに芽胞の摂取および乳児の腸管における毒素の産生に由来する乳児ボツリヌス中毒が挙げられるが、これらに限定されない。ボツリヌス中毒は、代表的に脳神経の関与によって始まり、そして四肢を含んで末端に進行する麻痺性疾患である。急性の場合において、ボツリヌス中毒は、致命的であり得る。ボツリヌス神経毒素BoNTはまた、ボツリヌス神経毒素BoNTはまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性Arnonら、2001JAMA285:1059-1070に起因して、CentersforDiseaseControlCDCによって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する6種の脅威因子CategoryAagentのうちの1種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにBoNTを生産しUNSecurityCouncil1995、前出;Bozheyeva1999、前出、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにBoNTを使用することを試みたArnonら2001、前出。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。最近、種々のBoNT血清型の複数のサブタイプが存在することが見出されている。さらに、本発明者らは、例えば、BoNT/A1サブタイプを結合する多くの抗体がBoNT/A2サブタイプを結合しないことなどが、さらに見出した。本発明者らは、ボツリヌス神経毒素BoNTのサブタイプの特に効率的な中和が、特定のBoNT血清型の2種以上のサブタイプを高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成されることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する2種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得る一方で、これは、より低い有効性であり、効率的ではなく、そして実用的ではない。BoNT治療は、BoNTの高い毒性を鑑みると、望ましくは、非常に強力である。所与のBoNT血清型を、必要とされる効力以下ならびに図5、6、16、および17を参照のことによって中和するために複数の抗体を使用することが、一般的には必要であるので、必要とされる抗体の数は、各サブタイプに対して異なる抗体を使用することが必要である場合、製造の観点から、非常に大きいものである。混合物中の抗体の数の増加はまた、効力を減少さる。したがって、例えば、4種の抗体2種がA1毒素を中和し、そして2種がA2毒素を中和するの混合物の場合、それらの抗体の50のみが、所与の毒素を中和する。対照的に、2種の抗体その両方が、A1毒素およびA2毒素を中和するの混合物は、いずれの毒素に対しても100の活性を有し、そして製造がより簡単である。例えば、2種のBoNT/AサブタイプA1、A2に対して、強力な中和は、2種~3種の抗体によって達成され得る。異なる抗体が、BoNT/A1とBoNT/A2との中和に必要とされる場合、4種~6種の抗体が、必要とされる。その複雑性は、さらなるサブタイプに対してさらに増大する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、2種以上のBoNTサブタイプ例えば、BoNT/A1、BoNT/A2などを高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。BoNT/A1およびBoNT/A2の両方を高親和性で結合する抗体の例としては、本明細書中に記載されるCR1、RAZ1、ING1、およびING2が挙げられるが、これらに限定されない。中和抗体を組み合わせ始めるときに、上記抗体の組み合わせの効力が劇的に増大することもまた、驚くべき発見であった。この増大は、治療用途に必要とされる効力のボツリヌス抗体をもたらすことを可能にする。2種のモノクローナル抗体および3種のモノクローナル抗体を組み合わせ始める場合、認識される特定のBoNTエピトープは、重要ではなくなることもまた、驚くべきことであった。したがって、例えば、実施例5に示されるように、BoNTのトランスロケーションドメインおよび/または触媒ドメインに結合する抗体が、中和活性を有し、互いと組み合わせた場合、またはBoNTレセプター結合ドメインHCを認識するmAbと組み合わせた場合のいずれかが、BoNT活性の中和に有効であった。したがって、特定の実施形態において、本発明は、BoNT上の重複しないエピトープを結合する少なくとも2種より好ましくは、少なくとも3種の高親和性抗体を含む組成物を企図する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2、および/またはこれらの抗体由来の1種以上のCDRを含む抗体、および/またはこれらの抗体の変異体例えば、ING1の1D11変異体、2G11変異体、および5G4変異体例えば、図19Bを参照のことを含む1種以上の抗体からなる群より選択される、2種以上好ましくは、3種以上の異なる抗体を含む組成物を企図する。上に示されるように、特定の実施形態において、本発明によって提供される抗体は、1種以上のボツリヌス神経毒素A型BoNT/Aサブタイプに結合し、そしてそれを中和する。この文脈において、中和とは、BoNT/Aの毒性の測定可能な減少をいう。毒性のこのような減少は、当業者に周知の多くの方法によってインビトロで測定され得る。1つのこのようなアッセイは、片側横隔膜調製物における単収縮張力の減少の所与の例えば、50までの時間を測定することを包含する。毒性は、例えば、1種以上の推定上の中和抗体の存在下での試験動物例えば、マウスのボツリヌス神経毒素A型におけるLD50としてインビボで決定され得る。上記中和抗体は、投与前にボツリヌス神経毒素と組み合せられ得るか、あるいは上記動物は、その神経毒素の投与前か、その神経毒素の投与と同時か、またはその神経毒素の投与後に上記抗体を投与され得る。本発明の抗体が、ボツリヌス神経毒素A型を中和するように作用する場合、それらの抗体は、ボツリヌス神経毒素中毒に関連する病理の処置において有用である。上記処置は、本質的に、中毒になった生物体例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に、BoNT中毒の症状を中和例えば、緩和または排除するのに十分な1種以上の中和抗体の量を投与することを包含する。このような処置は、最も所望され、かつ急性症例例えば、肺活量が、30~40未満であり、そして/あるいは麻痺が、迅速に進行しており、そして/あるいは絶対的または相対的な高炭酸ガス血症を伴う低酸素血症が、存在する場合において有効である。これらの抗体はまた、示されるよりも穏やかな症状を伴う初期症例を処置するため進行を予防するために使用されえるか、または予防的軍隊が危険な状況に向かう兵士について想定する使用にさえ使用され得る。上記中和抗体による処置は、他の治療例えば、抗生物質による処置に対する補助として提供され得る。本発明によって提供される抗体は、ボツリヌス中毒A型毒素の迅速な検出/診断のために使用され得、そしてそれによって、先の検査室診断を補完および/または置換し得る。別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス神経毒素A型中和抗体によって特異的に結合されるエピトープを提供する。これらのエピトープは、他の抗体本明細書中に記載されるようなBoNT/A中和抗体を、単離および/または同定および/またはスクリーニングするために使用され得る。I.ボツリヌス神経毒素BoNT中和抗体の効力特定の理論に拘束されることはないが、ボツリヌス中毒ウマおよびヒトを処置するために使用される現在の抗毒素は、約5000マウスLD50/mgヒトの効力および55,000マウスLD50mgウマの効力を有すると考えられる。本発明者らの計算に基づいて、本発明者らは、商業的に望ましい抗毒素は約10,000~100,000LD50/mgより大きい効力を有すると考える。本明細書中に記載される抗体の組み合わせ例えば、2種または3種の抗体は、この効力を満たす。したがって、特定の実施形態において、本発明は、1mgの抗体あたり少なくとも約10,000マウスLD50、好ましくは1mgの抗体あたり少なくとも約15,000マウスLD50、より好ましくは1mgの抗体あたり少なくとも約20,000マウスLD50、そして最も好ましくは1mgの抗体あたり少なくとも約25,000マウスLD50を中和する抗体および/または抗体の組み合わせを提供する。II.ボツリヌス神経毒素BoNT中和抗体特定の好ましい実施形態において、1種しかし、より好ましくは少なくとも2種のBoNTサブタイプに結合するBoNT中和抗体が、選択される。多くのサブタイプが、各BoNT血清型に関して公知である。したがって、例えば、BoNT/Aサブタイプとしては、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などが挙げられるが、これらに限定されない例えば、図11を参照のこと。例えば、BoNT/A1サブタイプとしては、62A、NCTC2916、ATCC3502、およびHallhyperHallAllerganが挙げられるが、これらに限定されないこと、ならびにBoNT/A1サブタイプは、同一アミノ酸で99.9~100の同一性であること、ならびにBoNT/A1サブタイプは、サブタイプA1として分類されていることもまた、示される図12A。BoNT/A2配列Kyoto-FおよびFRI-A2HWillemsら、1993Res.Microbiol.144:547-556は、アミノ酸レベルで100同一である。本発明者らがA3と称している別のBoNT/Aサブタイプは、スコットランドにおける感染で多くの者を殺したLochMareeと称される株によって産生される。本発明者らは、A1毒素およびA2毒素の両方と交差反応する本明細書中に記載される3種の抗体表1を参照のことがまたA3毒素と交差反応するというデータを有するこれらは、CR1、ING1、およびRAZ1である。別のBoNT/A毒素本発明者らがを同定したを、本発明者らは、A4と称する。それは、B毒素およびA毒素の両方を産生するクロストリジウム属の二価の株によって産生される。同様に、図11に示されるように、多くのサブタイプはまた、血清型B、C、E、およびFに関して公知である。本明細書中に記載される方法を使用して、血清型内の2種以上のサブタイプと交差反応性である例えば、選択された/操作された高親和性抗体が産生され得ることが、見出された。さらに、特定の理論に拘束されることはないが、これらの交差反応性である抗体は、実質的に、ボツリヌス神経毒素の中和においてより効率的である1種以上の異なる中和抗体を組み合わせて使用した場合ことが、明らかである。多くの原始的に交差反応性である抗体についての可変重VHドメインの配列および可変軽VLドメインの配列は、表2ならびに図18および図19に示される。上に示されるように、抗体CR1、RAZ1、ING1、およびING2が、BoNT/A1サブタイプおよびBoNT/A2サブタイプに対して交差反応性である一方で、抗体CR1、ING1、およびRAZ1は、さらに、BoNT/A3サブタイプに対して交差反応性である。抗体CR1は、例えば、実施例4に記載されるように、ヒト化C25HuC25の変異および選択によって産生されたAR2の誘導体。上記抗体は、A1サブタイプおよびA2サブタイプの両方に対して変異ならびに選択された。同様に、抗体3D12の変異例えば、実施例2を参照のことは、RAZ1をもたらした。酵母における免疫性scFvライブラリーの選択は、ING1およびING2をもたらした。表1.操作した抗体についての結合データ表2ならびに図18および図19は、交差反応性である抗体RAZ1、CR1、ING1、およびING2のVH領域ならびにVL領域についてのアミノ酸配列情報を提供する。同様の情報が、BoNT/A1サブタイプに特異的に結合する抗体AR2およびAR3について提供される。さらに、配列情報が、S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1V、WR1T、3-1、3-8、および/または3-10について本明細書中で提供される例えば、表6ならびに/または表11および/もしくは表13を参照のこと。表2.成熟した親和性であり、交差反応性であり、かつ/または改変された抗体についてのアミノ酸配列完全な重鎖についての配列は、重鎖フレームワーク1重鎖CDR1重鎖フレームワーク2重鎖CDR2重鎖フレームワーク3重鎖CDR3重鎖フレームワーク4である。完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク1軽鎖CDR1軽鎖フレームワーク2軽鎖CDR2軽鎖フレームワーク3軽鎖CDR3軽鎖フレームワーク4である。本明細書中に提供される教示および配列情報を用いて、可変軽鎖および可変重鎖は、単鎖Fv抗体を形成するために、直接的か、またはリンカー例えば、Gly4Ser3、配列番号181を介して連結され得る。種々のCDR領域および/またはフレームワーク領域は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、多価抗体などを形成するために使用され得る。III.BoNT中和抗体の調製A.BoNT中和抗体の組換え発現本明細書中に提供される情報を用いて、本発明のボツリヌス神経毒素中和抗体は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製される。例えば、本明細書中に提供されるポリペプチド配列例えば、表2および/または表6および/または表9および/または表13を参照のことは、BoNT/A-中和抗体をコードする適切な核酸配列を決定するために使用され得、次いでその核酸配列は、1種以上のBoNT-中和抗体を発現するために使用される。上記核酸配列は、当業者に周知の標準的な方法にしたがって、種々の発現系に対して好ましい特定のコドンを反映するために最適化され得る。提供される配列情報を用いて、上記核酸は、当業者に公知の多くの標準的な方法にしたがって合成され得る。オリゴヌクレオチド合成は、好ましくは、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機において実施されるNeedham-VanDevanterら、1984NucleicAcidsRes.12:6159-6168か、またはオリゴヌクレオチドは、Beaucageらによって記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法Beaucageら、1981TetrahedronLetts.2220:1859-1862を使用して手動で合成される。一旦BoNT/A-中和抗体をコードする核酸が合成されると、その核酸は、標準的な方法にしたがって増幅および/またはクローニングされ得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該分野において公知である。組換え核酸の構築に適した広範な種々のクローニング法およびインビトロ増幅法は、当業者に公知である。多くのクローニング実行により当業者を導くのに十分なこれらの教示および説明の例は、BergerおよびKimmel、GuidetoMolecularCloningTechniques、MethodsinEnzymology、第152巻、AcademicPress,Inc.、SanDiego、CABerger;Sambrookら、1989MolecularCloning-ALaboratoryManual第2版、第1巻~第3巻、ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress、NY、Sambrook;ならびにCurrentProtocolsinMolecularBiology、F.M.Ausubelら編、CurrentProtocols、GreenePublishingAssociates,Inc.とJohnWileySons,Inc.との間の共同企業体、1994、補遺Ausubelに見出される。組換え免疫グロブリンを産生する方法はまた、当該分野において公知である。Cabilly、米国特許第4,816,567号;およびQueenら、1989Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、Qβ-レプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼを媒介する技術を含むインビトロ増幅法により当業者を導くのに十分な技術の例は、Berger、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullisら、1987米国特許第4,683,202号;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsInnisら編AcademicPressInc.SanDiego、CA1990Innis;ArnheimLevinson1990年10月1日CEN36-47;TheJournalOfNIHResearch19913、81-94;Kwohら、1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86、1173;Guatelliら、1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87、1874;Lomellら、1989J.Clin.Chem35、1826;Landegrenら、1988Science241、1077-1080;VanBrunt1990Biotechnology8、291-294;WuおよびWallace、1989Gene4、560;ならびにBarringerら、1990Gene89、117に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載される。一旦BoNT/A-中和抗体についての核酸が単離およびクローニングされると、当業者に公知である種々の組換え的に操作された細胞においてその遺伝子を発現し得る。このような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状真菌、特に、バキュロウイルスベクターを利用する昆虫、および哺乳動物細胞が挙げられる。当業者はBoNT/A-中和抗体の発現に利用可能な多くの発現系に精通していることが、予想される。簡単にまとめると、BoNT/A-中和抗体をコードする天然の核酸または合成の核酸の発現は、代表的に、その抗体をコードする核酸をプロモーターこれは、構成的または誘導性のいずれかであるに作動可能に連結し、そしてこの構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。上記ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および組込みに適切であり得る。代表的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにBoNT/A-中和抗体をコードする核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。上記ベクターは、必要に応じて、一般的な発現カセットを含有し、その発現カセットは、少なくとも1つの独立したターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方においてそのカセットの複製を可能にする配列すなわち、シャトルベクター、ならびに原核生物系および真核生物系の両方に対する選択マーカーを含む。Sambrookを参照のこと。クローニングされた核酸の高い発現レベルを得るために、代表的には転写を指揮する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写/翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが、一般的である。E.coliにおいてこの目的に適した調節領域の例は、Yanofsky1984J.Bacteriol.、158:1018-1024によって記載されるようなE.coliトリプトファン生合成経路のプロモーター領域およびオペレーター領域、ならびにHerskowitzおよびHagen1980Ann.Rev.Genet.、14:399-445によって記載されるようなλファージの左方向プロモーターleftwardpromoterPLである。E.coli中に形質転換されたDNAベクター中に選択マーカーを含むこともまた、有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子が挙げられる。例えば、E.coliにおいて使用するための選択マーカーに関する詳細については、Sambrookを参照のこと。BoNT/A-中和抗体を発現するための発現系は、E.coli、バシラス種Palvaら、1983Gene22:229-235;Mosbachら、Nature、302:543-545およびサルモネラ属を使用して利用可能である。E.coli系が、好ましい。原核生物細胞によって産生されるBoNT/A-中和抗体は、適切な折り畳みのために、カオトロピック剤への曝露を必要とし得る。例えば、E.coliからの精製の間に、発現したタンパク質は、必要に応じて、変性され、次いで復元される。これは、例えば、上記細菌によって産生された抗体をカオトロピック剤例えば、グアニジンHClにおいて可溶化することによって達成される。次いで上記抗体は、緩徐な透析またはゲル濾過のいずれかによって復元される。米国特許第4,511,503号を参照のこと。哺乳動物細胞中に遺伝子をトランスフェクトし、そして哺乳動物細胞中で発現させる方法は、当該分野において公知である。核酸を用いて細胞を形質導入することは、例えば、ベクターの宿主範囲内の細胞によってBoNT/A-中和核酸を含むウイルスベクターを培養incubateすることを含み得る。例えば、Goeddel1990MethodsinEnzymology、第185巻、AcademicPress,Inc.、SanDiego、CAまたはKrieger1990GeneTransferandExpression--ALaboratoryManual,StocktonPress、NewYork、N.Y.およびその中に引用される参考文献を参照のこと。組織サンプルまたは血液サンプル由来の細胞株および培養細胞を含む本発明において使用される細胞の培養は、当業者に周知である例えば、Freshney1994CultureofAnimalCells、aManualofBasicTechnique、第3版、Wiley-Liss、N.Y.およびその中に引用される参考文献を参照のこと。抗体を使用および操作するための方法は、Coligan、1991CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene、NY;HarlowおよびLane1989Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborPress、NY;Stitesら編BasicandClinicalImmunology第4版LangeMedicalPublications、LosAltos、CA、およびその中に引用される参考文献;Goding1986MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice第2版AcademicPress、NewYork、NY;ならびにKohlerおよびMilstein1975Nature256:495-497に見出される。ボツリヌス神経毒素A型に対して特異的であるBoNT/A-中和抗体は、1×10-8Mまたはそれより良好なKDを有し、好ましい実施形態では、1nMまたはそれより良好なKDを有し、そして最も好ましい実施形態では、0.1nMまたはそれより良好なKDを有する。1つの好ましい実施形態において、BoNT/A-中和抗体遺伝子例えば、BoNT/A-中和scFv遺伝子は、発現ベクターpUC119mycHisTomlinsonら、1996J.Mol.Biol.、256:813-817または発現ベクターpSYN3中にサブクローニングされ、これらの発現ベクターは、そのscFvのC末端にヘキサヒスチジンタグの付加をもたらして、精製を容易にする。BoNT/A-中和抗体のクローニングおよび精製のための詳細なプロトコルは、実施例1に提供される。B.全ポリクロ-ナル抗体または全モノクロ-ナル抗体の調製本発明のBoNT中和抗体は、個体、対立遺伝子、株、または種の改変体、およびそのフラグメントそれらの天然に存在する完全長形態および組換え形態の両方においてを含む。特定の実施形態において、好ましくは抗体は、本明細書中に記載される抗体例えば、S25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、CR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1、および/またはING2によって結合される1種以上のエピトープを結合するために選択される。特定の好ましい抗体は、2種以上のBoNTサブタイプ例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などと交差反応性である。上記抗体は、それらのネイティブな構造またはネイティブではない構造において生じ得る。抗イデオタイプ抗体もまた、産生され得る。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を作製する多くの方法は、当業者に公知である。以下の考察は、利用可能な技術の一般的な外観として存在する;しかし、当業者は、以下の方法における多くのバリエーションが公知であることを認識する。1ポリクロ-ナル抗体の産生ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。簡単にいうと、免疫原例えば、BoNT/A1もしくはBoNT/A2、BoNT/A1HcもしくはBoNT/A2Hc、またはBoNT/A1下位配列もしくはBoNT/A2下位配列本明細書中に開示されるクローンS25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、および/もしくはCR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1、ならびに/またはING2によって発現される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列が挙げられるが、これに限定されない、好ましくは精製されたポリペプチド、適切なキャリア例えば、GST、キーホールリンペットヘモシアニンなどとカップリングされたポリペプチド、または組換えワクシニアウイルス米国特許第4,722,848号を参照のことなどの免疫化ベクターに組み込まれるポリペプチドは、アジュバントと混合され、そして動物は、その混合物によって免疫化される。上記免疫原調製物に対する哺乳動物の免疫応答は、試験採血testbleedを行い、そして目的のポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによってモニタリングされる。免疫原に対して適切に抗体の高い力価が得られる場合、血液が動物から回収され、そして抗血清が調製される。さらに上記BoNT/Aポリペプチドに対して反応性である抗体を濃縮するために、上記抗血清の分別が、行われる例えば、Coligan1991CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene、NY;ならびにHarlowおよびLane1989Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborPress、NYを参照のこと。本明細書中に記載される中和エピトープに特異的に結合する抗体は、本明細書中に記載される選択技術を使用してポリクローナル血清から選択される。2モノクロ-ナル抗体の産生いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主例えば、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒトなどからモノクローナル抗体を調製することが、望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Stitesら編BasicandClinicalImmunology第4版LangeMedicalPublications、LosAltos、CA、およびその中に引用される参考文献;HarlowおよびLane、前出;Goding、1986MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice第2版AcademicPress、NewYork、NY;ならびにKohlerおよびMilstein、1975Nature256:495-497に見出される。簡単にまとめると、モノクローナル抗体の産生は、免疫原例えば、BoNT/A、BoNT/AHc、またはBoNT/A下位配列本明細書中に開示されるクローンS25、C25、C39、1C6、3D12、B4、1F3、HuC25、AR1、AR2、WR1V、WR1T、3-1、3-8、3-10、および/もしくはCR1、RAZ1、1D11、2G11、5G4、ING1、ならびに/またはING2によって発現される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列が挙げられるが、これに限定されないを動物に注射することによって進行する。次いで動物は、屠殺され、および細胞が、その脾臓から採取され、その細胞は、骨髄腫細胞と融合される。その結果は、インビトロで再生可能であるハイブリッド細胞またはハイブリドーマである。次いでそのハイブリドーマの集団は、個々のクローンその各々は、上記免疫原に対して単一の抗体種を分泌するを単離するためにスクリーニングされる。この様式において、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質において認識される特定の部位に応じてもたらされる免疫動物由来の、不死化されかつクローニングされた単一のB細胞の産物である。不死化の代替方法は、エプスタイン-バーウイルス、癌遺伝子、もしくは、レトロウイルス、または当該分野で公知の他の方法を用いた形質転換を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、BoNT抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物好ましくは、哺乳動物宿主の腹膜腔への注入を含む種々の技術によって向上する。本発明の抗体は、改変を伴ってか、または改変を伴わずに使用され、そしてその抗体は、キメラ抗体例えば、ヒト化マウス抗体を含む。IV.BoNT中和抗体の改変A.ファ-ジディスプレイは抗体の親和性を増大させるために使用され得るより高い親和性の抗体を作製するために、結合scFv例えば、表2、および/または表6、および/または表9および/または13の配列に基づく変異scFv遺伝子レパートリーが、作製され得、そしてファージの表面上に発現され得る。細菌に感染するウイルスバクテリオファージまたはファージの表面上での抗体フラグメントの提示は、広範な親和性および動態特性を有するヒトまたは他の哺乳動物の抗体例えば、scFvを産生することを可能にする。ファージの表面上に抗体フラグメントを提示するファージディスプレイために、抗体フラグメント遺伝子は、ファージ表面タンパク質例えば、pIIIをコードする遺伝子中に挿入され、そして抗体フラグメント-pIII融合タンパク質は、そのファージ表面上に発現されるMcCaffertyら、1990Nature、348:552-554;Hoogenboomら、1991NucleicAcidsRes.、19:4133-4137。上記ファージの表面上の抗体フラグメントは機能的であるので、抗原結合性抗体フラグメントを有するファージは、抗原親和性クロマトグラフィーによって、結合しないファージまたはより低い親和性のファージから分離され得るMcCaffertyら、1990Nature、348:552-554。ファージの混合物は、アフィニティーマトリックスに結合され得、結合しないファージまたはより低い親和性のファージは、洗浄することによって除去され、そして結合したファージは、酸またはアルカリを用いた処理によって溶出される。抗体フラグメントの親和性に依存して、20倍~1,000,000倍の濃縮係数が、単一のラウンドの親和性選択によって得られる。溶出したファージまたは下に記載されるような溶出したファージの改変された改変体を細菌に感染させることによって、より多くのファージが、増殖し得、そしてそのファージは、別のラウンドの選択に供され得る。この方法において、1ラウンドにおける1000倍の濃縮は、2ラウンドの選択において1,000,000倍になるMcCaffertyら、1990Nature、348:552-554。したがって、各ラウンドにおける濃縮が低い場合でも、複数のラウンドの親和性選択は、稀なファージ、および結合性抗体の配列をコードする含まれる遺伝子材料の単離をもたらすMarksら、1991J.Mol.Biol.、222:581-597。ファージディスプレイによって提供される遺伝子型と表現型との間の物理的関連は、100,000,000クローン程度の大きさのライブラリーを用いた場合でさえ、抗原に対する結合について抗体フラグメントライブラリーの全てのメンバーを試験することを可能にする。例えば、抗原に対する複数のラウンドの選択の後、30,000,000クローンあたり1クローンのみの頻度で生じた結合性scFvは、回収されたId.。1鎖のシャッフリング変異scFv遺伝子レパートリーを作製するための1つのアプローチは、結合性scFv由来のVH遺伝子またはVL遺伝子のいずれかをVH遺伝子のレパートリーまたはVL遺伝子のレパートリーで置換すること鎖シャッフリングを包含するClacksonら、1991Nature、352:624-628。このような遺伝子レパートリーは、結合性scFvと同じであるが、点変異を有する生殖系列遺伝子に由来する多くの変異する遺伝子を含むMarksら、1992Bio/Technology、10:779-783。軽鎖シャッフリングまたは重鎖シャッフリングおよびファージディスプレイを使用して、例えば、BoNT/A1/BoNT/A2-中和抗体フラグメントの結合アビディティは、劇的に増大され得る例えば、Marksら、1992Bio/Technology、10:779-785ハプテンフェニルオキサゾロンphoxを結合したヒトscFv抗体フラグメントの親和性が、300nMから15nM20倍に増大したを参照のこと。したがって、BoNT-中和抗体の親和性を変化させるために、公知のBoNT-中和抗体例えば、CR1、RAZ1、ING1、ING2のVH遺伝子とVL遺伝子レパートリー軽鎖シャッフリングとを含む変異scFv遺伝子レパートリーが、作製される。あるいは、公知のBoNT-中和抗体例えば、CR1、RAZ1、ING1、ING2のVL遺伝子と、VH遺伝子レパートリー重鎖シャッフリングとを含むscFv遺伝子レパートリーが、作製される。上記scFv遺伝子レパートリーは、ファージディスプレイベクター中にクローニングされ例えば、pHEN-1、Hoogenboomら、1991NucleicAcidsRes.、19:4133-4137、そして形質転換後に、形質転換体のライブラリーが、得られる。ファージは、調製および濃縮され、そして選択は、実施例に記載される通りに行われる。抗原の濃度は、選択の各ラウンドにおいて減少され、選択の最後のラウンドで所望のKdより低い濃度に達する。これは、親和性に基づくファージの選択をもたらすHawkinsら、1992J.Mol.Biol.226:889-896。2位置指定突然変異誘発によるBoNT中和抗体の親和性の増大抗原に接触するアミノ酸側鎖の大部分は、相補性決定領域CDRVHにおいて3個CDRl、CDR2、およびCDR3およびVLにおいて3個CDRl、CDR2、およびCDR3に位置するChothiaら、1987J.Mol.Biol.、196:901-917;Chothiaら、1986Science、233:755-8;Nhanら、1991J.Mol.Biol.、217:133-151。これらの残基は、抗原に対する抗体の親和性を担う大部分の結合エネルギー論に寄与する。他の分子において、リガンドに接触するアミノ酸を変異させることは、1つのタンパク質分子の、その結合パートナーに対する親和性を増大させる有効な手段であることが、示されているLowmanら、1993J.Mol.Biol.、234:564-578;Wells1990Biochemistry、29:8509-8516。したがって、CDRの変異ランダム化、およびBoNT/A、BoNT/AHCまたは本明細書中で同定されるそれらのエピトープに対するスクリーニングは、改良された結合親和性を有するBoNT/A-中和抗体を産生するために使用され得る。特定の実施形態において、各CDRは、例えば、テンプレートとしてS25Kd=7.3×10-8Mを使用して、別個のライブラリーにおいてランダム化される。親和性の測定を単純化するために、より高い親和性のscFvよりもむしろ、S25または他のより低い親和性のBoNT/A-中和抗体が、テンプレートとして使用される。各CDRライブラリー由来の最も高い親和性の変異体のCDR配列は、親和性の相加的な増大を得るために組み合わせられる。同様のアプローチは、ヒト成長ホルモンhGHの成長ホルモンレセプターに対する親和性を、増大1500倍を上回る3.4×10-10から9.0×10-13Mさせるために使用されているLowmanら、1993J.Mol.Biol.、234:564-578。BoNT-中和抗体の親和性を増大させるために、1個以上のCDRに位置するアミノ酸残基例えば、VLCDR3に位置する9個のアミノ酸残基は、混ぜられたdopedオリゴヌクレオチドを合成することによって部分的にランダム化され、このオリゴヌクレオチドにおいて、野生型ヌクレオチドが、例えば、49の頻度で生じた。上記オリゴヌクレオチドは、BoNT-中和scFv遺伝子の残部を、PCRを用いて増幅するために使用される。例えば、1つの実施形態において、VHCDR3がランダム化されるライブラリーを作製するために、BoNT-中和抗体のVHフレームワーク3にアニーリングし、そしてBoNT-中和抗体のVHCDR3とフレームワーク4の一部とをコードするオリゴヌクレオチドが合成される。ランダム化される4つの位置において、配列NNSが、使用され得、Nは、任意の4個のヌクレオチドであり、そしてSは、CまたはTである。このオリゴヌクレオチドは、BoNT/A-中和抗体のVH遺伝子を、PCRを使用して増幅するために使用され、このことは、変異BoNT-中和抗体VH遺伝子レパートリーを作製する。PCRは、BoNT-中和抗体軽鎖遺伝子によってVH遺伝子レパートリーをスプライシングするために使用され、そして得られたscFv遺伝子レパートリーは、ファージディスプレイベクター例えば、pHEN-1またはpCANTAB5E中にクローニングされる。ライゲーションされたベクターDNAは、エレクトロコンピテントE.coliを形質転換してファージ抗体ライブラリーを産生するために使用される。より高い親和性の変異scFvを選択するために、ファージ抗体ライブラリーの選択の各ラウンドは、実施例に記載されるように、1種以上のBoNTサブタイプの漸減量に対して行なわれる。代表的に、選択の第3ラウンドおよび第4ラウンドから得た96個のクローンは、96ウェルプレートにおけるELISAによって、所望の抗原例えば、BoNT/A1および/またはBoNT/A2に対する結合についてスクリーニングされ得る。例えば、10ml培養において、例えば、20個~40個のELISAポジティブクローンからscFvが、発現され、ペリプラズムが、回収され、そしてscFvのkoffが、BIAcoreによって決定される。最も遅いkoffを有するクローンは、配列決定され、そしてそれぞれ固有のscFvは、適切なベクター例えば、pUC119mycHis中にサブクローニングされる。そのscFvは、培養において発現され、そして本明細書中に記載されるように精製される。精製されたscFvの親和性は、BIAcoreによって決定される。3BoNT中和scFv’2ホモダイマ-の作製BoNT-中和scFv’2抗体を作製するために、2種のBoNT-中和scFvが、リンカー例えば、炭素リンカー、ペプチドなどまたは例えば、2つのシステインの間のジスルフィド結合のいずれかを介して連結される。したがって、例えば、ジスルフィド結合したBoNT/A-中和scFvを作製するために、システイン残基が、BoNT/A-中和scFvのカルボキシ末端におけるmycタグとヘキサヒスチジンタグとの間の位置指定突然変異誘発によって導入され得る。正しい配列の導入は、DNA配列決定によって検証される。好ましい実施形態において、上記構築物は、pelBリーダーが発現したscFvをペリプラズムに指向させ、かつBoNT/A-中和変異scFvを導入するためのクローニング部位NcolおよびNotlが存在するようなpUC119中にある。発現したscFvは、そのC末端にmycタグを有し、その後ろに2個のグリシン、システイン、次いでIMACによる精製を容易にする6個のヒスチジンを有する。2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成後、2つのscFvは、互いから26アミノ酸2つの11アミノ酸のmycタグおよび4個のグリシンによって隔てられる。この構築物から発現され、IMACによって精製されたscFvは、モノマーのscFvを優勢に含み得る。scFv’2ダイマーを産生するために、そのシステインは、1MMβ-メルカプトエタノールと一緒にインキュベートすることによって還元され、そしてそのscFvの半分は、DTNBの添加によってブロックされる。ブロックされたscFvおよびブロックされていないscFvは、一緒にインキュベートされてscFv’2を形成し、そして得られた物質は、必要に応じて、ゲル濾過によって分析され得る。BoNT-中和scFv’モノマーおよびBoNT-中和scFv’2ダイマーの親和性は、必要に応じて、本明細書中に記載されるようにBIAcoreによって決定され得る。特に好ましい実施形態において、上記scFv’2ダイマーは、リンカーより好ましくは、ペプチドリンカーを介して上記scFvフラグメントを連結することによって作製される。これは、当業者に周知の広範な種々の手段によって達成され得る。例えば、1つの好ましいアプローチは、Holligerら、1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444-6448によって記載されるWO94/13804もまた参照のこと。代表的に、リンカーは、PCRクローニングによって導入される。例えば、5アミノ酸のリンカーG4S、配列番号4をコードする合成オリゴヌクレオチドが、BoNT/A-中和抗体VH遺伝子およびBoNT/A-中和抗体VL遺伝子をPCR増幅するために使用され得、次いでこれらの遺伝子は、BoNT/A-中和ダイアボディdiabody遺伝子を作製するために一緒にスプライシングされる。次いでこれらの遺伝子は、適切なベクター中にクローニングされ、発現され、そして当業者に周知の標準的な方法によって精製される。4BoNT中和scFv2分子、BoNT中和Fab分子、およびBoNT中和Fab’2分子の調製BoNT-中和抗体例えば、BoNT/A1-A2-中和scFvまたはより高い親和性を有する改変体は、サイズおよび価についての改変体を作製するのに適したテンプレートである。例えば、BoNT/A1-A2-中和scFv’2は、上に記載されるような親scFv例えば、CR1、RAZ1、ING1、ING2などから作製され得る。scFv遺伝子は、適切な制限酵素を使用して切除され得、そして本明細書中に記載されるような別のベクター中にクローニングされ得る。1つの実施形態において、発現したscFvは、そのC末端にmycタグを有し、その後ろに2個のグリシン、システイン、次いでIMACによる精製を容易にする6個のヒスチジンを有する。2つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成後、2つのscFvは、互いから26アミノ酸2つの11アミノ酸のmycタグおよび4個のグリシンによって隔てられるはずである。scFv’2ダイマーを産生するために、そのシステインは、1mMβ-メルカプトエタノールと一緒にインキュベートすることによって還元され、そしてそのscFvの半分は、DTNBの添加によってブロックされる。ブロックされたscFvおよびブロックされていないscFvは、一緒にインキュベートされてscFv’2を形成し、そのscFv’2は、精製される。より高い親和性のscFvが単離される場合、それらの遺伝子は、同様に、scFv’2を構築するために使用される。BoNT/A-中和Fabは、Betterら、1988Science、240:1041-1043によって記載されるベクターと同様の発現ベクターを使用して、E.coliにおいて発現される。BoNT/A-中和Fabを作製するために、そのVH遺伝子およびVL遺伝子は、PCRを使用してscFvから増幅される。そのVH遺伝子は、IgGCH1ドメインをVH遺伝子の下流かつVH遺伝子とインフレームで提供する発現ベクター例えば、細菌発現ベクターに基づくPUC119中にクローニングされる。そのベクターはまた、lacプロモーター、発現したVH-CH1ドメインをペリプラズムに指向させるpelbリーダー配列、発現した軽鎖をペリプラズムに指向させる遺伝子3リーダー配列、および軽鎖遺伝子のためのクローニング部位を含む。正しいVH遺伝子を含むクローンは、例えば、PCRフィンガープリントによって同定される。上記VL遺伝子は、PCRを使用してCL遺伝子に対してスプライシングされ、そしてVHCH1遺伝子を含むベクター中にクローニングされる。B.中和抗体の選択好ましい実施形態において、BoNT-中和抗体の選択ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、免疫法、ハイブリドーマ技術などによって産生されたかにかかわらずは、得られた抗体を、適切な抗原に対する特異的結合についてスクリーニングすることを包含する。簡単な場合において、適切な抗原としては、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3HC、BoNT重鎖のC末端ドメイン結合ドメイン、BoNT/A3ホロ毒素、または組換えBoNTドメイン例えば、HC結合ドメイン、HN輸送ドメイン、またはLC軽鎖が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、上記中和抗体は、1種以上の本明細書中に記載される抗体によって認識されるエピトープの特異的結合に関して選択される。選択は、当業者に周知の多くの方法のうちのいずれかによるものであり得る。好ましい実施形態において、選択は、所望の標的例えば、BoNT/AまたはBoNT/AHCに対する例えば、イムノチューブMaxisorp、Nuncを使用した免疫クロマトグラフィーによるものである。別の実施形態において、選択は、表面プラズモン共鳴システム例えば、BIAcore、Pharmacia単独、または1種以上の本明細書中に記載される抗体によって特異的に結合されるエピトープに結合する抗体との組み合わせのいずれかにおける、BoNTHCに対するものである。選択はまた、酵母ディスプレイライブラリーに対してフローサイトメトリーを使用して行われ得る。1つの好ましい実施形態において、酵母ディスプレイライブラリーは、BoNT/Aの両方のサブタイプに高親和性で結合する抗体を得るために、最初にBoNT/A1、次いでBoNT/A2に対して連続的に選択される。このことは、他のサブタイプについて繰り返され得る。ファージディスプレイに関して、結合の分析は、抗体フラグメント遺伝子と抗体フラグメント遺伝子IIIとの間にアンバーコドンを含めることによって単純化され得る。これは、単に宿主細菌株を変化させることによって、提示された抗体フラグメントと可溶性抗体フラグメントとの間で容易に切り換えることを可能にする。ファージがE.coliのsupEサプレッサ株中で増殖される場合、抗体遺伝子と抗体遺伝子IIIとの間のアンバー終止コドンは、グルタミンとして読み取られ、そして抗体フラグメントは、ファージの表面上に提示される。溶出したファージが非サプレッサ株に感染させるために使用される場合、上記アンバーコドンは、終止コドンとして読み取られ、そして可溶性抗体は、その細菌からペリプラズムおよび培養培地中に分泌されるHoogenboomら、1991NucleicAcidsRes.、19:4133-4137。抗原に対する可溶性scFvの結合は、ELISA例えば、そのscFvにおけるC末端のmycペプチドタグを認識するマウスIgGモノクローナル抗体例えば、9El0を使用し、例えば、次いで検出可能な標識例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化したポリクローナル抗マウスFcと一緒にインキュベートするによって、検出され得るEvanら、1985Mol.CellBiol.、5:3610-3616;Munroら、1986Cell、46:291-300。上に示されるように、BoNT-中和抗体の精製は、scFv遺伝子を、そのscFvのC末端の端におけるmycペプチドタグその後にヘキサヒスチジンタグを伴うの付加を生じる発現ベクター例えば、発現ベクターpUC119mycHIS中にクローニングすることによって容易にされ得る。上記ベクターはまた、好ましくは、上記scFvの発現を細菌のペリプラズムリーダー配列が、切断されるに指向させるペクチン酸リアーゼリーダー配列をコードする。これは、ネイティブの適切に折り畳まれたscFvを細菌のペリプラズムから直接回収することを可能にする。次いで上記BoNT-中和抗体は、発現され、そして固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して細菌の上清から精製される。C.1種以上のBoNTサブタイプに対するBoNT中和抗体の親和性の増大上で説明される通り、増大したアビディティについての選択は、目的とする1種以上の標的例えば、BoNT/Aサブタイプまたはそのドメイン例えば、Hcまたは他のエピトープに対するBoNT-中和抗体または改変されたBoNT-中和抗体の親和性を測定することを包含する。このような測定を行なう方法は、本明細書中に提供される実施例において詳細に記載される。簡潔には、例えば、BoNT/A-中和抗体のKdおよびBoNT/Aに対する結合の動態は、BIAcore表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーにおいて決定される。この技術に関して、抗原は、質量における変化を検出し得る誘導体化されたセンサーチップにカップリングされる。抗体が上記センサーチップ上に通される場合、抗体は、定量可能である質量の増加を生じる抗原に結合する。抗体濃度の関数としての会合速度の測定が、会合速度定数konを計算する為に使用され得る。会合相の後、緩衝液が、上記チップ上に通され、そして抗体の解離の速度koffが決定される。Konは、代表的に、1.0×102~5.0×106の範囲で測定され、そしてkoffは、1.0×10-1~1.0×10-6の範囲で測定される。次いで平衡定数Kdが、koff/konとして算出され、したがって平衡定数Kdは、代表的に、10-5~10-12の範囲で測定される。この様式で測定された親和性は、蛍光消光滴定によって溶液において測定された親和性と良好に相関する。ファージディスプレイおよび選択は、一般に、より高い親和性の変異scFvの選択をもたらすMarksら、1992Bio/Technology、10:779-783;Hawkinsら、1992J.Mol.Biol.226:889-896;Riechmannら、1993Biochemistry、32:8848-8855;Clacksonら、1991Nature、352:624-628が、それらは恐らく、親和性において6倍未満の差を有する変異体の分離をもたらさないRiechmannら、1993Biochemistry、32:8848-8855。したがって、迅速な方法、選択後に単離された変異scFvの相対的親和性を推定するために必要とされる。増大した親和性は、主にkoffの減少から生じるので、koffの測定は、より高い親和性のscFvを同定するはずである。koffは、細菌のペリプラズム中の精製されていないscFvに対するBIAcoreにおいて測定され得る。なぜなら発現レベルは、適当な結合シグナルを与えるのに十分高く、そしてkoffは、濃度とは無関係であるからである。ペリプラズムのscFvと精製されたscFvとについてのkoffの値は、代表的に、ほぼ一致する。V.ヒト抗体またはヒト化キメラ抗体の産生上に示されるように、本発明のBoNT-中和抗体は、治療目的例えば、ボツリヌス中毒の処置のために、生物体例えば、ヒト患者に投与され得る。それらが惹起された種以外の生物体に投与された抗体は、免疫原性であり得る。したがって、例えば、ヒトに繰り返し投与されたマウス抗体は、しばしばその抗体に対する免疫学的応答例えば、ヒト抗マウス抗体HAMA応答を誘導する。これは、代表的に、それらの抗体が繰り返し利用されないので、本発明の非ヒト抗体に関して問題ではないが、その抗体の免疫原特性は、その抗体の一部または全部を、特徴的に、ヒト配列へと変え、それによってそれぞれキメラ抗体またはヒト抗体を産生することによって減少される。A.キメラ抗体キメラ抗体は、ヒト部分と非ヒト部分とを含む免疫グロブリン分子である。より具体的に、キメラ抗体の抗原結合領域または可変領域は、非ヒト供給源例えば、マウスに由来し、そして生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに与えるそのキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源に由来する。上記キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって与えられるエフェクター機能とを有するべきである。抗体をもたらす多数の方法は、当業者に周知である例えば、米港特許第5,502,167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693号、同第5,354,847号、同第5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,169,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、および同第4,975,369号を参照のこと。一般に、キメラ抗体を産生するために使用される手順は、以下の工程いくつかの工程の順序は、交換され得るからなる:a抗体分子の抗原結合部分をコードする正しい遺伝子セグメントを同定およびクローニングする工程;この遺伝子セグメントVDJとして公知の、重鎖についての可変性であり、多様性であり、そして連結性の領域、またはVJ、軽鎖についての可変性であり、結合性である領域あるいは単純にV領域または可変領域は、cDNA形態またはゲノム形態のいずれかであり得る;b定常領域またはその所望の部分をコードする遺伝子セグメントをクローニングする工程;c完全なキメラ抗体が転写可能な形態および翻訳可能な形態でコードされるように、可変領域をその定常領域にライゲーションする工程;dこの構築物を、選択マーカーおよび遺伝子制御領域例えば、プロモーター、エンハンサーおよびポリA付加シグナルを含むベクター中にライゲーションする工程;e宿主細胞例えば、細菌中でこの構築物を増幅する工程;fそのDNAを真核生物細胞ほとんどの場合、哺乳動物のリンパ球中に導入する工程トランスフェクション;ならびにキメラ抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程。いくつかの異なる抗原結合特異性の抗体は、キメラタンパク質を産生するためにこれらのプロトコルによって操作された例えば、抗TNP:Boulianneら、1984Nature、312:643;および抗腫瘍抗原:Sahaganら、1986J.Immunol.、137:1066。同様に、数種の異なるエフェクター機能は、新しい配列をその抗原結合領域をコードする配列に結合することによって達成された。これらのうちのいくつかは、酵素Neubergerら、1984Nature312:604、別の種由来の免疫グロブリン定常領域、および別の免疫グロブリン鎖の定常領域Sharonら、1984Nature309:364;Tanら、1985J.Immunol.135:3565-3567を含む。1つの好ましい実施形態において、組換えDNAベクターは、BoNT/A-中和抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用される。新規の組換えDNAベクターは、上記細胞株において免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子の全部または一部を置換するために置換遺伝子例えば、置換遺伝子は、ヒト免疫グロブリンの定常領域、特定の免疫グロブリンのクラス、または酵素、毒素、生物学的に活性なペプチド、増殖因子、インヒビター、または薬物、毒素、もしくは他の分子などへの結合体化を容易にするリンカーペプチドの全部あるいは一部をコードし得る、および抗体産生細胞内での免疫グロブリン配列に関する標的化された相同組換えを可能にする標的配列を含む。別の実施形態において、組換えDNAベクターは、所望のエフェクター機能例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用され、この場合において、その組換えベクター中に含まれる置換遺伝子は、BoNT/A-中和抗体の領域の全部または一部をコードし得、そして組換えベクター中に含まれる標的配列は、抗体産生細胞内での相同組換えおよび標的化された遺伝子改変を可能にする。いずれかの実施形態において、可変領域または定常領域の一部のみが置換される場合、得られたキメラ抗体は、同じ抗原を規定し得、そして/あるいは変更または改良されたにもかかわらず同じエフェクター機能を有し、その結果、そのキメラ抗体は、より大きい抗原特異性、より大きい親和性結合定数、増大したエフェクター機能、またはトランスフェクトされた抗体産生細胞株による増大した分泌および産生などを示し得る。実施される実施形態に関係なく、選択マーカーによる組み込まれたDNAについての選択の工程、キメラ抗体産生についてのスクリーニングの工程、および細胞クローニングの工程は、そのキメラ抗体を産生する細胞のクローンを得るために使用され得る。したがって、モノクローナル抗体に対する改変をコードするDNAの一部は、B細胞株またはハイブリドーマ細胞株内で、発現される免疫グロブリン遺伝子の部位を直接的に標的化し得る。任意の特定の改変についてのDNA構築物は、任意のモノクローナル細胞株またはハイブリドーマのタンパク質産物を変化させるために使用され得る。このような手順は、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子の両方を、有用な抗原特異性を発現する各B細胞クローンからクローニングするという、コストと時間の掛かる作業を回避する。可変領域遺伝子をクローニングする工程を回避することに加えて、キメラ抗体の発現のレベルは、その遺伝子が、ランダムな位置にある場合よりもむしろ、その天然の染色体の場所にある場合に、より高いはずである。キメラヒト化抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第5,482,856号に見出され得る。B.ヒト抗体およびヒト化抗体別の実施形態において、本発明は、ヒト化抗BoNT-中和抗体または完全ヒト抗BoNT-中和抗体例えば、HuC25、RAZ1、CR1、ING1、ING2などを提供する。ヒト抗体は、全体的に、特徴としてヒトポリペプチド配列からなる。本発明のヒトBoNT-中和抗体は、広範な種々の方法を使用して産生され得る概説については、例えば、Larrickら、米国特許第5,001,065号を参照のこと。特定の好ましい実施形態において、本発明の完全ヒトscFv抗体は、完全ヒト単鎖例えば、scFvライブラリーの改変およびスクリーニングによって得られる。したがって、特定の実施形態において、完全ヒト抗体は、本明細書中に記載されるようなファージディスプレイ法および/または酵母ディスプレイ法を使用して産生される。完全ヒト遺伝子ライブラリーを産生する方法は、当業者に周知である例えば、Vaughnら、1996NatureBiotechnology、143:309-314、Marksら、1991J.Mol.Biol.、222:581-597、およびPCT/US96/10287を参照のこと。別の実施形態において、本発明のヒトBoNT-中和抗体は、トリオーマ細胞において産生され得る。次いで上記抗体をコードする遺伝子は、クローニングされ、そして他の細胞特に、非ヒト哺乳動物細胞において発現される。トリオーマ技術によってヒト抗体を産生するための一般的アプローチは、Ostbergら、1983Hybridoma2:361-367;Ostberg、米国特許第4,634,664号;およびEngelmanら、米国特許第4,634,666号によって記載されている。この方法によって得られた抗体産生細胞株は、トリオーマと称される。なぜならそれらは、3種の細胞;2種のヒト細胞および1種のマウス細胞に由来するからである。トリオーマは、ヒト細胞から作製された通常のハイブリドーマよりも安定に抗体を産生することが見出されている。トリオーマ細胞の調製は、最初に、マウス骨髄腫細胞株と免疫化されていないヒト末梢Bリンパ球との融合を必要とする。この融合は、ヒト染色体およびマウス染色体の両方を含む外因性ハイブリドーマ細胞をもたらすEngelman、前出を参照のこと。抗体を分泌する能力を失った外因性細胞が、選択される。好ましくは、8-アザグアニンに耐性である外因性細胞が、選択される。このような細胞は、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンHAT培地またはアザセリン-ヒポキサンチンAH培地において増殖できない。抗体を分泌する能力は、上記外因性細胞と、BoNTポリペプチド例えば、BoNT/A、BoNT/AHc、BoNT/A下位配列本明細書中に記載される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列などが挙げられるが、これらに限定されないに対して免疫化されたBリンパ球との間のさらなる融合によって与えられる。上記Bリンパ球は、ヒトドナーの脾臓、血液またはリンパ節から得られる。特定の抗原またはエピトープに対する抗体が所望される場合、免疫原として、ポリペプチド全体よりもむしろ抗原またはそのエピトープを使用することが、好ましい。あるいは、Bリンパ球は、免疫化されていない個体から得られ、そしてそのBリンパ球は、インビトロでBoNTポリペプチド、またはそのエピトープによって刺激される。さらなるバリエーションにおいて、Bリンパ球は、感染した個体、またはそうでなければ免疫化された個体から得られ、次いでBリンパ球は、約7日間~14日間にわたるBoNTポリペプチドに対する曝露によってインビトロで超免疫化される。上記手順のうちの1つによって調製された免疫化されたBリンパ球は、周知の方法によって外因性ハイブリッド細胞と融合される。例えば、その細胞は、40~50のMW1000~4000のポリエチレングリコールによって約37°Cにて約5~10分間処理される。細胞は、上記融合混合物から分離され、そして所望のハイブリッドに対して選択的な培地中で増殖される。上記外因性ハイブリッド細胞が8-アザグアニンに対して耐性である場合、不死化トリオーマ細胞は、HAT培地またはAH培地における継代によって簡便に選択される。他の選択手順は、当然に、融合に使用された細胞の性質に依存して可能である。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、BoNTポリペプチドまたはそのエピトープに結合する能力について、トリオーマ培養培地をアッセイすることによって同定される。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマは、限界希釈技術によってサブクローニングされ、そしてそのトリオーマは、培養培地中でインビトロで増殖されるか、または選択された宿主動物中に注射され、そしてインビボで増殖される。次いで得られたトリオーマ細胞株は、BoNTポリペプチドまたはそのエピトープを結合する能力について試験される。抗体は、得られた培養培地または体液から、従来の抗体分別手順例えば、硫酸アンモニウム沈殿、DEAEセルロースクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって分離される。トリオーマは、遺伝的に安定であるが、それらは、非常に高いレベルで抗体を産生しない。発現レベルは、そのトリオーマ由来の抗体遺伝子を1つ以上の発現ベクター中にクローニングし、そしてそのベクターを、細胞株例えは、組換え免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンの発現に代表的に使用される細胞株に形質転換することによって増大し得る。抗体の収量の増加とともに、このストラテジーは、免疫グロブリンが、ヒトの成分を有ず、それによってヒト細胞株のために必要とされる特に大規模なウイルススクリーニングに供される必要がない細胞株から得られるというさらなる利点を提供する。トリオーマ細胞株によって分泌される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、当該分野で公知であるポリメラーゼ連鎖反応PCRが挙げられるが、これに限定されない方法によってクローニングされる例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarbor、N.Y.、1989;BergerおよびKimmel、MethodsinEnzymology、第152巻:GuidetoMolecularCloningTechniques、AcademicPress,Inc.、SanDiego、Calif.、1987;Coら、1992J.Immunol.、148:1149を参照のこと。例えば、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、トリオーマのゲノムDNAまたは上記トリオーマのRNAの逆転写によって産生されたcDNAからクローニングされる。クローニングは、クローニングされるべき遺伝子もしくは遺伝子のセグメントと隣接flankするかまたは重複する配列とハイブリダイズする、PCRプライマーの使用を含む従来の技術によって達成される。代表的に、組換え構築物は、トリオーマ細胞株によって発現される免疫グロブリンの完全なヒト免疫グロブリン重鎖および/または完全なヒト免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAセグメントを含む。あるいは、一次抗体遺伝子の一部のみをコードするDNAセグメントが、産生され、その部分は、結合活性および/またはエフェクター活性を有する。他の組換え構築物は、他の免疫グロブリン遺伝子のセグメント特に、他のヒト定常領域配列重鎖および/または軽鎖のセグメントに融合されたトリオーマ細胞株免疫グロブリン遺伝子のセグメントを含む。ヒト定常領域配列は、種々の参照供給源から選択され得、その供給源としては、Kabatら、1987SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesに列挙される供給源が挙げられるが、これらに限定されない。BoNT/A-中和免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするDNAセグメントに加えて、他の実質的に同種の改変された免疫グロブリンは、当業者に公知の種々の組換えDNA技術例えば、位置指定突然変異誘発を利用して容易に設計および製造され得るGillmanおよびSmith、1979Gene、8:81-97;Robertsら、1987Nature328:731-734。このような改変されたセグメントは、通常、抗原結合能および/またはエフェクター機能を保持する。さらに、上記改変されたセグメントは、通常、ストリンジェントな条件下でこれらの配列に対するハイブリダイゼーションを妨げるために、本来のトリオーマゲノム配列からそれほど違わずに変えられる。なぜならば、多くの遺伝子のように、免疫グロブリン遺伝子は、分離した機能的領域各々が、1つ以上の異なる生物学的活性を有するを含み、その遺伝子は、新規の特性または特性の新規の組み合わせを有する融合タンパク質例えば、免疫毒素を産生するために、他の遺伝子由来の機能的領域に融合され得る。上記ゲノム配列は、本明細書中に記載されるような標準的な方法によってクローニングおよび発現され得る。抗体産生のための他のアプローチは、ヒト血液のインビトロでの免疫化を含む。このアプローチにおいて、ヒト抗体を産生し得るヒト血液リンパ球が、産生される。ヒト末梢血液が、患者から収集され、そしてそのヒト末梢血液は、単核細胞を回収するために処理される。次いでサプレッサT細胞が、除去され、そして残りの細胞は、組織培養培地に懸濁され、その組織培養培地は、抗原および自己血清、ならびに好ましくは、非特異的なリンパ球活性化因子を添加される。次いで細胞は、それらが所望の特異的抗体を産生するような時間の期間にわたってインキュベートされる。次いで細胞は、その細胞株を不死化し、それによって抗体の継続的な産生を可能にするためにヒト骨髄腫細胞に融合され得る米国特許第4,716,111号を参照のこと。別のアプローチにおいて、ヒトBoNT-中和抗体を産生するマウス-ヒトハイブリドーマが、調製される例えば、米国特許第5,506,132号を参照のこと。他のアプローチとしては、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように形質転換されたマウスの免疫化、およびファージディスプレイのスクリーニングが挙げられるVaughanら、前出。VI.中和エピト-プにおける交差反応性についてのアッセイ好ましい実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載される抗体例えば、S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2などによって認識される1種以上のエピトープに特異的に結合する。換言すれば、特に好ましい抗体は、これらの抗体のうちの1種以上と交差反応性である。交差反応性についてアッセイする手段は、当業者に周知である例えば、Dowbenkoら、1988J.Virol.62:4703-4711を参照のこと。これは、固体支持体に結合した1種以上の単離された標的BoNTポリペプチド例えば、BoNT/A1および/またはBoNT/A2、またはその毒素の組換えドメイン例えば、Hcを提供し、そして標的BoNTペプチドに対する結合について、試験抗体の、例えば、S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、および/またはING2などと競合する能力をアッセイすることによって確認され得る。したがって、競合結合形式のイムノアッセイは、好ましくは、交差反応性の決定のために使用される。例えば、1つの実施形態において、BoNT/A1および/またはBoNT/A2HCポリペプチドは、固体支持体に固定化される。上記アッセイに加えられる試験されるべき抗体例えば、ファージディスプレイライブラリーからの選択によってもたらされるは、S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、ING2などの、固定化されたBoNTポリペプチドに結合する抗体と競合する。上記固定化されたタンパク質に対するS25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、および/またはING2などの抗体の結合と競合する試験抗体の能力が、比較される。次いで上記タンパク質の交差反応性のが、標準的な計算法を使用して算出される。試験抗体が、S25、C25、C39、1C6、1F3、CR1、3D12、RAZ1、ING1、および/またはING2などの抗体のうちの1種以上と競合し、そして約1×10-8Mに匹敵するかまたはそれ以上の、同じ標的との結合親和性を有する場合、その試験抗体は、BoNT-中和抗体であると予想される。特に好ましい実施形態において、交差反応性は、BIAcoreにおいて表面プラズモン共鳴を使用して行なわれる。BlAcoreフローセルにおいて、上記BoNTポリペプチド例えば、BoNT/A1および/またはBoNT/A2Hcは、実施例に記載されるようなセンサーチップ例えば、CM5にカップリングされる。5μl/分の流速を用いて、100nM~1μMの抗体の滴定が、ほぼ飽和した表面を生じる抗体濃度を決定するために、約5分間にわたってフローセル表面上に注入される。次いでエピトープマッピングまたは交差反応性が、完全に近い飽和および少なくとも100RUの結合された抗体を生じる濃度にて、抗体の対を使用して評価される。結合された抗体の量は、対の各メンバーについて決定され、次いでその2種の抗体は、個々の抗体の測定のために使用された濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合される。異なるエピトープを認識する抗体は、一緒に注入された場合に、RU結合において本質的に相加的な増加を示す一方で、同一のエピトープを認識する抗体は、RUの最小限の増加のみを示す実施例を参照のこと。特に好ましい実施形態において、抗体は、一緒に注入されたときに、それらが本質的に相加的な増加好ましくは、少なくとも約1.4の因数による増加、より好ましくは、少なくとも約1.6の因数による増加、および最も好ましくは、少なくとも約1.8または2の因数による増加を示す場合、交差反応性であるといわれる。所望のエピトープにおける交差反応性は、多くの他の標準的な技術によって確認され得る例えば、Geysenら、1987J.Immunol.Meth.102、259-274を参照のこと。この技術は、多数の重複するBoNTペプチドの合成を包含する。次いでその合成されたペプチドは、原型の抗体例えば、CR1、RAZ1、ING1、ING2などのうちの1種以上に対してスクリーニングされ、そしてこれらの抗体によって特異的に結合される特徴的なエピトープは、結合特異性および結合親和性によって同定され得る。そのようにして同定されたエピトープは、交差反応する抗体を同定するために、本明細書中に記載されるような競合アッセイに都合よく使用され得る。エピトープマッピングのためのペプチドは、マルチピンMultipinペプチド合成技術を使用して好都合に調製され得る例えば、Geysenら1987、Science、235:1184-1190。1種以上のBoNTサブタイプの公知の配列例えば、Atassiら、1996J.Prot.Chem.、7:691-700およびその中に引用される参考文献を参照のことを使用して、重複するBoNTポリペプチド配列は、1つ以上の96ウェル微量試験プレートのアレイ中のプラスチックピン上に、連続的な様式で個別に合成され得る。このマルチピンペプチドシステムを使用したエピトープマッピングのための手段は、米国特許第5,739,306号に記載される。簡潔には、上記ピンは、最初に、PBS中に2のウシ血清アルブミンおよび0.1のTween20を含むプレコーティング緩衝液を用いて、室温にて1時間処理される。次いで上記ピンは、プレコーティング緩衝液中の抗体例えば、2μg/mlを含む96ウェル微量試験プレートの個々のウェルに挿入される。インキュベーションは、好ましくは、室温にて約1時間である。上記ピンは、PBST中で洗浄例えば、10分間ごとに3回のリンスされ、次いで1:4,000希釈にて100μlのHRP結合体化ヤギ抗マウスIgGFcJacksonImmunoResearchLaboratoriesを含む96ウェル微量試験プレートのウェル中で、室温にて1時間インキュベートされる。上記のようにピンが洗浄された後、そのピンは、呈色反応のために、ジアンモニウム2,2’-アジノ-ビス[3-エチルベンズチアゾリン-b-スルホネート]ABTSとH2O2とのペルオキシダーゼ基質溶液KirkegaardPerryLaboratoriesInc.、Gaithersburg、Md.を含むウェル中に室温にて30分間置かれる。そのプレートは、492nmのバックグラウンド吸収波長に対して、405nmにてプレートリーダー例えば、BioTekELISAプレートリーダーによって読み取られる。発色を示すウェルは、S25抗体、C25抗体、C39抗体、1C6抗体、または1F3抗体を含むこのようなウェルにおけるBoNT/AHCペプチドの反応性を示した。VII.抗BoNT抗体の中和活性についてのアッセイ本発明の好ましい抗体は、ボツリヌス神経毒素A型の毒性を中和減少または排除するために、個別かまたは組み合わせで作用する。中和は、インビボまたはインビトロで評価され得る。インビボ中和測定は、単純に、BoNT神経毒素の投与に起因する死亡率例えば、LD50または他の標準的な測定基準における、中和活性について試験される1種以上の抗体の存在に起因する変化を測定することを包含する。上記神経毒素は、試験生物体例えば、マウスに直接投与され得るか、またはその生物体は、ボツリヌス中毒感染を有し得る例えば、Clostridiumbotulinumに感染する。上記抗体は、BoNT神経毒素の感染もしくは試験動物の感染の前、その間、またはその後に投与され得る。進行の速度、または死亡率の減少は、上記抗体が中和活性を有すること示す。中和活性についての1つの適切なインビトロアッセイは、片側横隔膜調製物を用いるDeshpandeら、1995Toxicon、33:551-557。簡潔には、左右の横隔神経の片側横隔膜調製物は、生理的溶液中に懸濁され、そして一定温度例えば、36°Cに維持される。横隔神経は、例えば、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて超最大に刺激される。等尺性単収縮張力が、チャートレコーダーに接続された力変位変換器例えば、GrassModelFT03によって測定される。精製された抗体は、精製されたBoNT例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/Bなどと一緒に室温にて30分間インキュベートされ、次いで組織のバスtissuebathに添加され、約2.0×10-8Mの抗体最終濃度および約2.0×10-11MのBoNT最終濃度を生じる。研究された各抗体について、50の単収縮張力減少までの時間が、決定される例えば、BoNT単独に対して3回および抗体BoNTに対して3回。所定arbitraryの例えば、50単収縮の減少までの時間の間の差が、標準的なレベルの有意性例えば、0.05未満のP値が、有意と見なされるにおける標準的な統計分析例えば、両側t検定によって決定される。VIII.診断アッセイ上で説明されるように、本発明の抗BoNT抗体は、BoNT毒素例えば、BoNT/A1毒素のインビボ検出またはインビトロ検出に使用され得、したがって、本発明の抗BoNT抗体は、ボツリヌス中毒の診断例えば、確認診断において有用である。生物体から得られた生物学的サンプル中のBoNTの検出および/または定量は、その生物体のClostridiumbotulinum感染を示す。BoNT抗原は、患者から得られた生物学的サンプル例えば、細胞、または患者から得られた組織サンプルにおいて定量され得る。本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルは、BoNT濃度を含む生物学的組織または生物学的流体のサンプルであり、そのBoNT濃度は、Clostridiumbotulinum感染と相関し得、そしてClostridiumbotulinum感染を示し得る。好ましい生物学的サンプルとしては、血液、尿、唾液、および組織生検が挙げられる。上記サンプルは、代表的に、ヒト患者から採取されるが、上記アッセイは、一般には哺乳動物例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシおよびブタ、ならびに最も具体的には霊長類例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク、およびヒヒおよびげっ歯類例えば、マウス、ラット、およびモルモットに由来する細胞中のBoNT抗原を検出するために使用され得る。組織サンプルまたは流体サンプルは、当業者に周知の標準的な方法最も代表的には、生検または静脈穿刺によって患者から単離される。上記サンプルは、必要に応じて、適切な緩衝溶液中に希釈することによって前処理必要な場合されるか、または濃縮される所望される場合。種々の緩衝剤例えば、リン酸塩、Trisなどのうちの1つを生理的pHにおいて用いる任意の多くの標準的な緩衝水溶液が、使用され得る。A.免疫学的結合アッセイBoNTポリペプチド例えば、BoNT/A1、BoNT/A2などは、本発明の抗BoNA抗体のうちの1種以上をそのBoNTポリペプチドに特異的に結合する捕捉因子として利用するイムノアッセイにおいて検出され得る。本明細書中で使用される場合、イムノアッセイは、分析物例えば、BoNT/Aを特異的に結合する抗体例えば、BoNT/A-中和抗体を利用するアッセイである。上記イムノアッセイは、他の物理的特性または化学的特性とは対照的に標的例えば、1種以上のBoNT/Aサブタイプに対する1種以上の抗BoNT抗体の結合によって特徴付けられて、そのBoNT分析物を単離し、標的とし、そして定量する。BoNTマーカーは、多くの十分に認識される任意の免疫学的結合アッセイ例えば、米国特許第4,366,241号;同第4,376,110号;同第4,517,288号;および同第4,837,168号などを参照のことを使用して、検出および定量され得る。一般的なイムノアッセイの概説については、MethodsinCellBiology第37巻:AntibodiesinCellBiology、Asai編、AcademicPress,Inc.NewYork1993;BasicandClinicalImmunology第7版、StitesおよびTerr編、1991も参照のこと。本発明のイムノアッセイは、任意の多くの構成において行われ得る例えば、Maggio編1980EnzymeImmunoassayCRCPress、BocaRaton、Florida;Tijan1985PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays、LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology、ElsevierSciencePublishersB.V.、Amsterdam;HarlowおよびLane、前出;Chan編、1987Immunoassay:APracticalGuideAcademicPress、Orlando、FL;PriceおよびNewman編、1991PrinciplesandPracticeofImmunoassaysStocktonPress、NY;ならびにNgo編、1988NonisotopicImmunoassaysPlenumPress、NYに概説されるものを参照のこと。イムノアッセイは、しばしば、捕捉因子と分析物とによって形成された結合性複合体例えば、BoNT/A-中和抗体/BoNT/A複合体に特異的に結合し、そしてそれを標識する標識因子を利用する。上記標識因子は、それ自体、抗体/分析物複合体を含む部分の1つであり得る。したがって、例えば、上記標識因子は、標識されたBoNT/Aポリペプチドまたは標識された抗BoNT/A抗体であり得る。あるいは、上記標識因子は、必要に応じて、BoNT抗体、BoNTペプチド、抗体/ポリペプチド複合体、またはBoNTポリペプチドもしくは抗BoNT抗体に共有結合される改変された捕捉基例えば、ビオチンに特異的に結合する第3の部分例えば、別の抗体である。1つの実施形態において、上記標識因子は、抗BoNT抗体に特異的に結合する抗体である。このような因子は、当業者に周知であり、そしてこの因子は、最も代表的に、抗BoNT抗体が得られる特定の動物種の抗体を特異的に結合する標識された抗体例えば、抗種抗体を含む。したがって、例えば、上記捕捉因子がヒト由来のBoNT/A-中和抗体である場合、上記標識因子は、マウス抗ヒトIgGすなわち、ヒト抗体の定常領域に特異的な抗体であり得る。免疫グロブリン定常領域を特異的に結合し得る他のタンパク質例えば、連鎖球菌性プロテインAまたは連鎖球菌性プロテインGもまた、上記標識因子として使用される。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、多様な種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性の反応性を示す一般に、Kronvalら、1973J.Immunol.、111:1401-1406、およびAkerstromら、1985J.Immunol.、135:2589-2542などを参照のこと。上記アッセイ全体を通して、インキュベーション工程および/または洗浄工程は、試薬の各組み合わせの後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約5秒間~数時間好ましくは約5分間~約24時間で変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、上記アッセイは、周囲温度にて実施されるが、そのアッセイは、5°C~45°Cのような温度の範囲にわたって行われ得る。1非競合的アッセイ形式BoNT神経毒素例えば、BoNT血清型および/またはBoNTサブタイプを検出するためのイムノアッセイは、特定の実施形態において、競合的かまたは非競合的かのいずれかである。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物この場合において、BoNTポリペプチドの量が直接測定されるアッセイである。1つの好ましいサンドイッチアッセイにおいて、例えば、上記捕捉因子例えば、抗BoNT抗体は、その捕捉因子が固定化される固体基材に、直接的かまたは間接的に結合される。これらの固定化された抗BoNT抗体は、試験サンプル例えば、血液サンプル中に存在するBoNTポリペプチドを捕捉する。そのようにして固定化されたBoNTポリペプチドは、次いで、標識因子例えば、標識を有するBoNT/A-中和抗体によって結合される。あるいは、二次抗体は、標識を欠き得るが、その二次抗体は、次に、第2の抗体が得られる種の抗体に特異的な標識された第3の抗体によって結合され得る。遊離の標識された抗体は、洗い流され、そして残りの、結合され、標識された抗体が、検出される例えば、その標識が放射性である場合、γ線検出器を使用する。2競合的アッセイ形式競合的アッセイにおいて、サンプル中に存在する分析物例えば、BoNT/Aの量は、そのサンプル中に存在する分析物によって捕捉因子例えば、BoNT/A-中和抗体から置換されたまたは追い出されたcompetedaway、添加された外因性分析物の量を測定することによって間接的に測定される。例えば、1つの競合的アッセイにおいて、既知の量のBoNT/Aが、定量されていない量のBoNT/Aを含む試験サンプルに添加され、そしてそのサンプルは、捕捉因子例えば、BoNT/Aを特異的に結合するBoNT/A-中和抗体と接触される。BoNT/A-中和抗体に結合する添加されたBoNT/Aの量は、試験サンプル中に存在するBoNT/Aの濃度に反比例する。上記BoNT/A-中和抗体は、固体基材上に固定化され得る。上記BoNT/A-中和抗体に結合されたBoNT/Aの量は、BoNT/A-BoNT/A-中和抗体複合体に存在するBoNT/Aの量を測定すること、あるいは残りの複合体形成していないBoNT/Aの量を測定することのいずれかによって決定される。B.非特異的結合の減少当業者は、イムノアッセイ中および分析物の精製の間に非特異的結合を減少させることがしばしば望ましいということを、認識する。上記アッセイが、例えば、BoNT/Aポリペプチド、BoNT/A-中和抗体、または固体基材上に固定化された他の捕捉因子を含む場合、その基材の非特異的結合の量を最小限にすることが、望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。代表的に、これは、上記基材をタンパク質様組成物によってコーティングすることを包含する。特に、タンパク質組成物例えば、ウシ血清アルブミンBSA、脱脂粉乳、およびゼラチンが、広く使用される。C.基材上述の通り、上記アッセイに依存して、BoNTポリペプチド、抗BoNT抗体などを含む種々の成分は、必要に応じて、固体表面に結合される。種々の固体表面に生体分子を固定化するための多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、上記固体表面は、膜例えば、ニトロセルロース、マイクロタイターディッシュ例えば、PVC、ポリプロピレン、またはポリスチレン、試験管ガラスまたはプラスチック、ディップスティックdipstick例えば、ガラス、PVC、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど、微量遠心管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属ビーズもしくはポリマービーズであり得る。所望の成分は、非特異的結合によって、共有結合されても、非共有結合的に連結されてもよい。広範な種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー天然および合成の両方は、上記固体表面のための材料として用いられ得る。例示のポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ4-メチルブテン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリビニルブチレート、ポリ二フッ化ビニリデンPVDF、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロースなどが挙げられる。用いられ得る他の材料としては、紙、ガラス、セラミック、金属、半金属、半伝導性材料、セメントなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成する物質例えば、タンパク質例えば、ゼラチン、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドが、使用され得る。いくつかの水相を形成するポリマー例えば、デキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤例えば、リン脂質、長鎖12~24個の炭素原子のアルキルアンモニウム塩などもまた、適切である。固体表面が有孔である場合、種々の孔径が、その系の性質に依存して用いられ得る。上記表面の調製において、複数の異なる材料が、例えば、種々の特性を得るために積層laminateとして用いられ得る。例えば、タンパク質コーティング例えば、ゼラチンは、非特異的結合を回避するため、共有結合による結合体化を容易にするため、シグナル検出を増強するためなどに使用され得る。化合物と上記表面との間に共有結合が望まれる場合、その表面は、通常、多官能性polyfunctionalであるか、または多官能性にされ得る。上記表面上に存在しかつ連結のために使用され得る官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられ得る。広範な種々の化合物を種々の表面に連結する様式は、周知であり、そして文献において十分に例示される。例えば、ImmobilizedEnzymes、IchiroChibata、HalstedPress、NewYork、1978、およびCuatrecasas、1970J.Biol.Chem.2453059を参照のこと。共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合するための種々の方法が、使用され得る。非共有結合は、代表的に、上記表面への化合物の非特異的吸着である。代表的に、上記表面は、標識されたアッセイ成分の非特異的結合を防止するために、第2の化合物によってブロックされる。あるいは、上記表面は、その表面が、1つの成分を非特異的に結合するが、別の成分を顕著に結合しないように設計される。例えば、レクチン例えば、コンカナバリンAを有する表面は、炭水化物含有化合物を結合するが、糖化を欠く標識されたタンパク質を結合しない。アッセイ成分の非共有結合に使用するための種々の固体表面は、米国特許第4,447,576号および同第4,254,082号に概説される。D.他のアッセイ形式BoNTポリペプチドまたは抗BoNT抗体例えば、BoNT/A中和抗体はまた、当業者に周知である任意の多くの他の手段によって検出および定量され得る。これらとしては、分析に関する生化学的方法例えば、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィーHPLC、薄層クロマトグラフィーTLC、超拡散hyperdiffusionクロマトグラフィーなど、および種々の免疫学的方法例えば、流体沈降反応またはゲル沈降反応、免疫拡散法一次元または二次元、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイRIA、酵素結合イムノソルベントELISA、免疫蛍光アッセイなどが挙げられる。ウェスタンブロット分析および関連する方法もまた、サンプル中のBoNTポリペプチドの存在を検出および定量するために使用され得る。上記技術は、一般に、ゲル電気泳動によって、分子量に基づいてサンプル産物を分離すること、分離した産物を適切な固体支持体例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターに転写すること、およびいずれかのBoNTポリペプチドを特異的に結合する抗体と一緒にそのサンプルをインキュベートすることを包含する。その抗体は、固体支持体上の目的とする生物学的因子に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識されるか、あるいはこれらの抗体は、BoNTポリペプチドを結合する抗体に特異的に結合する標識された抗体例えば、マーカー遺伝子に対する抗体がヒト抗体である標識されたヒツジ抗ヒト抗体を使用して、続いて検出される。他のアッセイ形式としては、リポソームイムノアッセイLIAが挙げられ、リポソームイムノアッセイは、特定の分子例えば、抗体を結合し、かつ封入した試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。放出された化学物質は、次いで、標準的な技術によって検出されるMonroeら、1986Amer.Clin.Prod.Rev.5:34-41を参照のこと。E.抗BoNT例えば、BoNT/A中和抗体の標識化抗BoNT抗体は、当業者に公知である任意の多くの方法によって標識され得る。したがって、例えば、上記標識因子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質もしくは複合体例えば、本明細書中に記載されるもの、またはポリマー例えば、親和性マトリックス、炭水化物または脂質であり得る。検出は、任意の公知の方法によって進行し、その方法としては、免疫ブロット法、ウェスタン分析、ゲル易動度シフトアッセイ、放射性マーカーまたは生物発光マーカーの追跡、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、ストップトフロー分光法、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、またはサイズおよび/また電荷の変化に基づいて分子を追跡する他の方法が挙げられる。上記アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な群は、本発明の重要な局面ではない。上記検出可能な群は、検出可能な物理特性または化学特性を有するあらゆる材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、そして一般に、このような方法において有用な任意の標識は、本発明に適用され得る。したがって、標識は、分光器的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ例えば、DynabeadsTM、蛍光色素例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッドTexasred、ローダミンなど、放射性標識例えば、3H、125I、35S、14C、または32P、酵素例えば、LacZ、CAT、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびマーカー遺伝子産物としてかまたはELISAにおいてのいずれかで検出可能な酵素として一般に使用される他の酵素、および比色定量標識例えば、金コロイドまたは有色ガラスビーズまたはプラスチック例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどビーズが挙げられる。上記標識は、当該分野で周知の方法によって、直接的かまたは間接的に上記アッセイの所望の成分にカップリングされ得る。上に示されるように、広範な種々の標識が、使用され得、標識の選択は、必要とされる感度、化合物の結合体化の容易さ、安定性の必要条件、利用可能な器械使用、および廃棄の規定に依存する。非放射性ラベルは、しばしば、間接的手段によって連結される。一般に、リガンド分子例えば、ビオチンは、分子に共有結合される。次いでそのリガンドは、固有に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合されるかのいずれかである抗リガンド例えば、ストレプトアビジン分子に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドが、使用され得る。リガンドが天然の抗リガンド例えば、ビオチン、チロキシン、およびコルチソルを有する場合、そのリガンドは、標識された天然に存在する抗リガンドと関連して使用され得る。あるいは、任意のハプテン化合物または抗原化合物は、抗体と組み合わせて使用され得る。上記分子はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合体化によってシグナルを発生する化合物に直接的に結合体化され得る。標識として目的の酵素は、主に、ヒドロラーゼ特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ特に、ペルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および2,3-ジヒドロフタラジンジオン例えば、ルミノールが挙げられる。使用され得る種々の標識化システムまたはシグナル生成システムの概説については、米国特許第4,391,904号これは、本明細書中に参考として援用されるを参照のこと。標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、上記標識が放射性標識である場合、検出のための手段は、シンチレーション計数器または写真フィルムオートラジオグラフィーなどの場合を含む。上記標識が蛍光標識である場合、それは、光の適切な波長を用いてその蛍光色素を励起し、そして得られた蛍光を、例えば、顕微鏡、視診、写真フィルム、電子的検出器例えば、電子結合素子CCDまたは光電子倍増器などの使用により検出することによって検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に対して適切な基質を提供し、そして得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色定量標識は、その標識に付随する色を観察することによって簡単に検出され得る。したがって、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化された金は、しばしば、桃色を示すが、種々の結合体化されたビーズは、そのビーズの色を示す。いくつかのアッセイ形式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、BoNTペプチドの存在を検出するために使用され得る。この場合において、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式において、その成分は、標識される必要がなく、そして上記標的抗体の存在は、単純な視診によって検出される。IX.薬学的組成物本発明のBoNT-中和抗体は、例えば、内因性の疾患プロセスによってか、または化学的/生物学的な兵器によってもたらされたボツリヌス中毒の進行を緩和するのに有用である。代表的に、1種の抗体または好ましくは2種以上の異なる抗体を含む組成物は、その必要がある哺乳動物例えば、ヒトに投与される。本発明者らは、ボツリヌス神経毒素BoNTのサブタイプの特に効率的な中和が、特定のBoNT血清型の2種以上のサブタイプを高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成されることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する2種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得る一方で、これは、より低い有効性であり、効率的ではなく、そして実用的ではない。BoNT治療は、BoNTの高い毒性を鑑みると、望ましくは、非常に強力である。所与のBoNT血清型を、必要とされる効力以下ならびに図5、6、16、および17を参照のことによって中和するために複数の抗体を使用することが、一般的には必要であるので、必要とされる抗体の数は、各サブタイプに対して異なる抗体を使用することが必要である場合、製造の観点から、非常に大きいものである。混合物中の抗体の数の増加はまた、効力を減少させ、したがって4種の抗体2種がA1毒素を中和し、そして2種がA2毒素を中和するの混合物の場合、それらの抗体の50のみが、所与の毒素を中和する。対照的に、2種の抗体その両方が、A1毒素およびA2毒素を中和するの混合物は、いずれの毒素に対しても100の活性を有し、そして製造がより簡単である。例えば、2種のBoNT/AサブタイプA1、A2に対して、強力な中和は、2種~3種の抗体によって達成され得る。異なる抗体が、BoNT/A1とBoNT/A2との中和に必要とされる場合、4種~6種の抗体が、必要とされる。その複雑性は、さらなるサブタイプに対してさらに増大する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、2種以上のBoNTサブタイプ例えば、BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3などを高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。中和抗体を組み合わせ始めたとき、上記抗体の組み合わせの効力が劇的に増大することもまた、驚くべき発見であった。これはこの増大は、治療用途に必要とされる効力のボツリヌス抗体をもたらすことを可能にする。2種のモノクローナル抗体および3種のモノクローナル抗体を組み合わせ始める場合、認識される特定のBoNTエピトープは、重要ではなくなることもまた、驚くべきことであり、したがって、例えば、実施例5に示されるように、BoNTのトランスロケーションドメインおよび/または触媒ドメインに結合する抗体が、中和活性を有し、互いと組み合わせた場合、またはBoNTレセプター結合ドメインHCを認識するmAbと組み合わせた場合のいずれかが、BoNT活性の中和に有効であった。したがって、特定の実施形態において、本発明は、BoNT上の重複しないエピトープを結合する少なくとも2種より好ましくは、少なくとも3種の高親和性抗体を含む組成物を企図する。特定の実施形態において、本発明は、3D12、RAZ1、CR1、ING1、ING2、および/またはこれらの抗体由来の1種以上のCDRを含む抗体、および/またはこれらの抗体の変異体例えば、ING1の1D11変異体、2G11変異体、および5G4変異体を含む1種以上の抗体からなる群より選択される、2種以上好ましくは、3種以上の異なる抗体を含む組成物を企図する。本発明のBoNT-中和抗体は、予防的処置および/または治療的処置について、非経口投与、局所topical投与、経口投与、または局所local投与例えば、エアロゾルによるか、または経皮的であるに有用である。薬学的組成物は、投与の方法に依存して、種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位投薬形態としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジが挙げられる。本発明の薬学的組成物を含む抗体は、経口で投与される場合、好ましくは分解から保護される。これは、代表的に、抗体を組成物と複合体形成させて酸による加水分解および酵素による加水分解に対して抵抗性にすること、または適切に抵抗性であるキャリア例えば、リポソーム中にその抗体をパッケージ化することのいずれかによって達成される。分解からタンパク質を保護する手段は、当該分野において周知である。本発明の薬学的組成物は、非経口投与例えば、静脈内投与あるいは体腔または器官の管腔への投与に関して特に有用である。投与のための組成物は、一般的に、薬学的に受容可能なキャリア好ましくは、水性キャリアに溶解された1種以上のBoNT-中和抗体の溶液を含む。種々の水性キャリアが、使用され得る例えば、緩衝化した生理食塩水など。これらの溶液は、無菌であり、そしてその溶液は、一般に、望まれない溶液を含まない。これらの組成物は、従来の周知である滅菌技術によって滅菌され得る。その組成物は、生理学的組成物に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可能な補助的な物質例えば、pHを調整しかつ緩衝化する薬剤、毒性を調整する薬剤など例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの処方物中のBoNT/A-中和抗体の濃度は、広範に変動し得、そしてその濃度は、選択させた特定の投与様式および患者のニーズに従って、主に流体容量、粘度、体重などに基づいて選択される。したがって、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、1日に患者1個体あたり約0.1~10mgである。1日に患者1個体あたり約1mgから最大で約200mgの投薬量が、使用され得る。非経口投与が可能な組成物を調製する方法は、当業者にとって公知であるか、または当業者にとって明らかであり、そしてRemington’sPharmaceuticalScience、第15版、MackPublishingCompany、Easton、Pennsylvania1980のような刊行物においてより詳細に記載される。本発明のBoNT-中和抗体またはそのカクテルを含む組成物は、一般に、治療的処置のために投与される。好ましい薬学的組成物は、BoNT毒素を中和緩和または排除するのに十分な投薬量で投与されるすなわち、BoNT中毒ボツリヌス中毒の症状を減少させるか、または排除する。このことを達成するのに適した量は、治療有効量として定義される。この用途に有効な量は、疾患の重症度および患者の健康の一般的状態に依存する。上記組成物の単回投与または複数回投与は、患者に必要とされかつ許容されるような投薬量および頻度に依存して投与され得る。あらゆる事象において、上記組成物は、患者を有効に処置するために、本発明の抗体の十分な定量を提供するべきである。X.診断または処置のためのキット別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス中毒の処置またはClostridiumbotulinum感染の検出/確認のためのキットを提供する。キットは、代表的に、本発明の1種以上の抗BoNT抗体例えば、薬学的用途のためのBoNT-中和抗体を含む。診断用途に関して、抗体は、必要に応じて、標識され得る。さらに、上記キットは、代表的に、ボツリヌス中毒の症状の処置においてBoNT-中和抗体を使用する手段を開示する指示資料を備える。上記キットはまた、そのキットが設計される特定の用途を容易にするために、さらなる成分を含み得る。したがって、例えば、キットがBoNTサブタイプの診断の検出のために1種以上の抗BoNT抗体を含む場合、その抗体は標識され得、そしてそのキットはその標識を検出する手段例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次標識例えば、ヒツジ抗ヒト抗体などをさらに含み得る。上記キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。特定の実施形態において、ボツリヌス中毒の処置のために提供されるキットは、1種以上のBoNT中和抗体を含む。上記抗体は、別個に提供されても、一緒に混合されてもよい。代表的に、抗体は、無菌の薬学的に受容可能な賦形剤中に提供される。特定の実施形態において、上記抗体は、送達デバイス例えば、使い捨て可能な注射器に予め充填されて提供され得る。上記キットは、必要に応じて、抗体の使用、推奨される投薬量、禁忌conterindicationなどを教示する指示資料を備え得る。以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、そして限定を目的として提供されない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるように変更または改変され得る種々の決定的ではないパラメータを容易に認識する。実施例1:ボツリヌス神経毒素中和抗体材料および方法A.オリゴヌクレオチドの設計科特異的なマウスVHおよびマウスVKのプライマーを、再配列した完全長V遺伝子を増幅するために、ヒトV遺伝子プライマーについて先に記載Marksら、1991J.Mol.Biol.222:581-597;Marksら、Eur.J.Immunol.21:985-991されるように設計した。簡潔には、マウスVHDNA配列およびVKDNA配列を、KabatKabatら、1991Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest、U.S.DepartmentofHealthandHumanServices、U.S.GovernmentPrintingOffice、Bethesda、MDおよびGenBankデータベースから収集し、アライメントし、そして科によって分類し、そして科特異的プライマーを、フレームワーク1を含む第1の23ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。同様に、JH遺伝子セグメントに特異的なプライマーおよびJK遺伝子セグメントに特異的なプライマーを、4種のJH遺伝子セグメントおよび5種のJK遺伝子セグメントKabatら、前出の各々を含む最後の24ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。B.ベクターの構築ベクターpSYN3を構築するために、1.5kbのスタッファーstufferフラグメントを、プライマーLMB3Marksら、1991Eur.J.Immunol.21:985-991、およびE-タグバックtagback5’-ACCACCGAATTCTTATTAATGGTGATGATGGTGGATGACCAGCCGGTTCCAGCGG-3’、配列番号5を用いたPCRを使用して、pCANTAB5EPharmaciaBiotech、Milwaukee、WI.から増幅した。上記DNAフラグメントを、SfiIおよびNotfを用いて設計し、ゲル濾過し、そしてSfiIおよびNotIによって消化したpCANTAB5Eにライゲーションした。ライゲーションしたDNAを、EscherichiacoliTGlGibson、1991StudiesontheEpstein-Barrvirusgenome.UniversityofCambridge、Cambridge、U.K.を形質転換するために使用し、そして正しい挿入物を含むクローンを、DNA配列決定することによって同定した。得られたベクターは、ファージに提示されたscFvを、E.coliのペリプラズムにC末端Eエピトープタグその後にヘキサヒスチジンタグを伴うを有するネイティブなscFvとして分泌させるためのSfiI-NotIフラグメントまたはMcol-NotIフラグメントとしてサブクローニングすることを可能にする。C.免疫法ライブラリー1の構築のために、BALB/cマウス16g~22gを、純粋なBoNT/AHcOphidianPharmaceuticals、Madison、WI.を用いて、0週間目、2週間目、および4週間目に免疫化した。各動物に、ミョウバンに吸着された材料の1μgPierceChemicalCo.、Rockford、IL.を、0.5mlの容量で皮下に与えた。マウスを、第2の免疫化の2週間後に、純粋なBoNT/Aの100,000の50致死量によってチャレンジし、そしてその1週間後に屠殺した。ライブラリー2の構築のために、CD-1マウス16g~22gを、純粋なBoNT/AHcを用いて、0週間目、2週間目、および4週間目に免疫化し、そして第3の免疫化の2週間後に屠殺した。両方のライブラリーに関して、脾臓を、屠殺の直後に取り出し、そして全RNAを、Cathalaら、1993DNA2:329の方法によって抽出した。D.ライブラリーの構築第1のcDNA鎖を、免疫グロブリンmRNAをそれぞれ10pmolのオリゴヌクレオチドMIgGl、MIgG3、およびMCK表3と特異的にプライミングさせたことを除いて、Marksら、1991J.Mol.Biol.222:581-597において先に記載される通りに約10μgの全RNAから合成した。ライブラリー1の構築のために、再配列したVH遺伝子およびVK遺伝子を、市販のVH逆方向プライマーおよびVK逆方向プライマーならびにJH順方向プライマーおよびJK順方向プライマーRecombinantPhageAntibodySystem;PharmaciaBiotechを使用することによって第1のcDNA鎖から増幅した。ライブラリー2のために、科特異的なVH逆方向プライマーとVK逆方向プライマーとの等モル混合物を、ライブラリーの多様性を増大させる試みにおいて、JH遺伝子セグメントに特異的なプライマーまたはJK遺伝子セグメントに特異的なプライマーの等モル混合物と組み合わせて使用した上記のオリゴヌクレオチドの設計を参照のこと。再配列したVH遺伝子および再配列したVK遺伝子を、5μlの第1のcDNA鎖反応混合物、適切な逆方向プライマーの20pmolの等モル混合物、適切な順方向プライマーの20pmolの等モル混合物、各250μmのデオキシヌクレオチド三リン酸、1.5mmのMgCI2、1mlあたり10μgのウシ血清アルブミン、および1μl5Uの製造業者によって供給される緩衝液中のThermusaquaticusTaqDNAポリメラーゼPromegaを含む50μlの反応混合物中で、別々に増幅した。その反応混合物に、パラフィン油Sigmaを積層overlayし、そしてそれを、95°Cにて1分間、60°Cにて1分間、および72°Cにて1分間で30回のサイクルに供した。反応生成物を、ゲルで精製し、DEAE膜を使用することによってそのゲルから単離し、高塩濃度の緩衝液を用いてその膜から溶出させ、エタノール沈殿し、そして20μLの水に再懸濁したSambrookら、1989Molecularcloning;alaboratorymanual、第2版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、N.Y.。表3.マウス免疫グロブリン遺伝子のPCRのために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーScFv遺伝子レパートリーを、オーバーラップ伸長によるスプライシングを使用することによって、精製したVH遺伝子レパートリーおよび精製したVK遺伝子レパートリーならびにリンカーDNAから組み立てた。リンカーDNAは、ペプチド配列Gly4Ser3、配列番号181Hustonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883をコードし、そしてそのリンカーDNAは、再配列したVH遺伝子の3’末端および再配列したV.遺伝子の5’末端に相補的であった。そのVHDNAおよびVKDNA各1.5μgを、各250μmのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む25μlのPCR混合物、1.5mMのMgCl、1mlあたり10μgのウシ血清アルブミン、および1μl5Uの製造業者によって供給された緩衝液中のTaqDNAポリメラーゼPromegaを含む混合物中で、500ngのリンカーDNARecombinantPhageAntibodySystem;PharmaciaBiotechと合わせ、そしてその混合物を、これらのフラグメントを連結するために、94°Cにて1分間、62°Cにて1分間、および72°Cにて1分間で10回のサイクルに供した。フランキングflankingオリゴヌクレオチドプライマーRS、ライブラリーIについては、RecombinantPhageAntibodySystemキットにおいて提供され、そしてライブラリー2については、VHSfiプライマーとJKNotプライマー[表3]との等モル混合物において提供されるを、添加し、そしてその反応混合物を、94°Cにて1分間、55°Cにて1分間、および72°Cにて1分間で33サイクルに供して制限酵素部位を付与した。ScFv遺伝子レパートリーを、上に記載したようにゲルで精製し、SfifおよびNotlを用いて消化し、そして電気溶出によって精製し、そして1μgの各レパートリーを、SfilおよびNotlを用いて消化した1μgのpCANTAB5EベクターPharmaciaBiotechライブラリー1または1μgのpHEN-1Hoogenboomら、1991NucleicAcidsRes.19:4133-4137ライブラリー2のいずれかにライゲーションした。そのライゲーション混合物をフェノール-クロロホルム抽出によって精製し、エタノール沈殿し、20μlの水に再懸濁し、そして2.5μlのサンプルを、50μlのE.coliTGIGibson、1984、StudiesontheEpstein-Barrvirusgenome.UniversityofCambridge、Cambridge、U.K.にエレクトロポレーションしたDowerら、1988NucleicAcidsRes.16:6127-6145。細胞を、1mlのSOCSambrookら、前出中で30分間増殖させ、次いで1mlあたり100μgのAMPおよび1重量/容量のGLUTYE-AMP-GLUを含むTYEMiller、1972Experimentsinmoleculargenetics.、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、N.Y.培地上にプレーティングした。コロニーを、-70°Cにて保存するために、上記プレートから、100μgのAMP/ml、1GLU2×TY-AMP-GLU、および15容量/容量のグリセロールを含む5mlの2×TYブロスMiller、1972、前出中にこすり落とした。ライブラリーのクローニング効率および多様性を、Marksら、1991Eur.J.Immunol.、21:985-991によって記載されるように、PCRスクリーニングGussowら、1989、NucleicAcidsRes.17:4000によって決定した。E.ファージの調製上記ライブラリーからプラスミド粒子をレスキューrescueするために、10mlの2×TY-AMP-GLUに、上記ライブラリーストック由来の適切な容量の細菌約50~100μlを接種して0.3~0.5のA600を与え、そして細菌を、37°Cにて振盪しながら30分間増殖させた。約1012PFUのVCS-Ml3Stratagene粒子を、添加し、そしてその混合物を、4°Cにて一晩インキュベートした。チューブを、2MPBSを用いて37°Cにて1時間ブロックし、そして選択、洗浄、および溶出を、5.0×1012TU/mlの濃度にてファージを使用することにより、参考文献35に記載される通りに正確に行った。溶出したファージの3分の1を使用して対数増殖期のE.coliTGIの10mlに感染させ、そのE.coliTGIを、上に記載したようにTYE-AMP-GLU上にプレーティングした。レスキュー-選択-プレーティングの周期を、3回繰り返し、その後、クローンを、ELISAによって結合について分析した。ライブラリーをまた、可溶性BoNT/AHcに対して選択した。ライブラリー1について、1.0mgのBoNT/AHc700μg/mlを、ビオチン化RecombinantPhageSelectionModule;Pharmaciaし、そして製造業者によって推奨される通りに精製した。選択の各ラウンドについて、1mlのファージ約1013TUを、4の脱脂粉乳、0.05のTween20、および1mlあたり10μgのビオチン化BoNT/AHcを含む1mlのPBSと混合した。室温にて1時間おいた後、抗原に結合したファージを、Schierら、1996J.Mol.Biol.、255:28-43によって記載されるように、ブロックされたストレプトアビジンによってコーティングしたM280磁性ビーズダイナビーズDynabeads;Dynal上に捕捉した。ダイナビーズを、合計で10回TPBS中で3回、TMPBS中で2回、PBS中で2回、MPBS中で1回、およびPBS中で2回以上洗浄した。結合したファージを、100μlの100mMトリエチルアミンと一緒に5分間インキュベートすることによってダイナビーズから溶出させ、そしてそのファージを、1MのTris-HClpH7.5によって中和し、そしてその溶出物の3分の1を使用して、対数増殖期のE.coliTG1に感染させた。ライブラリー2について、親和性によって駆動する選択Hawkinsら、1992J.Mol.Biol.226:889-896;Schierら、1996、前出を、選択のために使用される可溶性BoNT/AHcの濃度を減少させるラウンド1については10μg/ml、ラウンド2については1μg/ml、およびラウンド3については10ng/mlことによって行なった。可溶性BoNT/AHcを、C末端のヘキサヒスチジンタグを介して200μlのNi2-NTAQiagenに捕捉した。捕捉後、そのNi2-NTA樹脂を、合計で10回TPBS中で5回およびPBS中で5回洗浄し、結合したファージを、上に記載したように溶出させ、そしてその溶出物を、対数増殖期のE.coliTGIに感染させるために使用した。F.結合物binderの初回の特徴付けBoNT/A、BoNT/AHc、およびBoNT/AHNに対する結合についての初回分析Chenら、1997Infect.Immun.65:1626-1630を、発現したscFvを含む細菌の上清を使用したELISAによって行なった。scFvの発現DeBellisら、1990NucleicAcidsRes.18:1311を、marksら、1991J.Mol.Biol.、222:581-597によって記載される通りに、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて行なった。ELISAのために、マイクロタイタープレートFalcon3912を、PBS10μg/ml中のBoNT/A、BoNT/AHc、またはBoNT/AHNのいずれかによって4°Cにて一晩コーティングし、次いで2MPBSを用いて室温にて1時間ブロックした。発現したscFvを含む細胞の上清を、ウェルに添加し、そして室温にて1.5時間インキュベートした。プレートを、6回TPBSで3回およびPBSで3回洗浄し、そしてscFvの結合を、Marksら、1991J.Mol.Biol.、222:581-597およびSchierら、1996Gene169:147-155によって記載される通りに、抗mycタグ抗体9E10;SantaCruzBiotechnologyまたは抗E抗体PharmaciaBiotechおよびペルオキシダーゼ結合体化抗マウスFc抗体Sigmaのいずれかを使用することによってそれらのC末端ペプチドタグpCANTAB5E中のライブラリー1については、Eエピトープタグ、およびpHEN-1中のライブラリー2については、mycエピトープタグ[Munro、ら、1986Cell46:291-300]によって検出した。固有に結合するscFvの数を、BstN1のフィンガープリントおよびDNA配列決定によって決定した。G.scFvのサブクローニング、発現、および精製精製を容易にするために、scFv遺伝子を、上記scFvのC末端の端におけるヘキサヒスチジンタグの付加を生じる発現ベクターpUC119mycHisSchierら、1995J.Mol.Biol.、263:551-567またはpSYN3中にサブクローニングした。適切なファージミドのうちの1つを有するE.coliTG1の200ミリリットル培養物を、増殖させ、scFvの発現を、IPTGDeBellis、ら、1990、NucleicAcidsRes.18:1311を用いて誘導し、そしてその培養物を、25°Cにて一晩増殖させた。scFvを、ペリプラズムから回収しBreitling、ら、1991Gene104:147-153、IMACローディング緩衝液50mMのリン酸ナトリウム[pH7.5]、500mMのNaCl、20mMのイミダゾールに対して4°Cにて一晩透析し、次いで0.2μm孔径のフィルターを通して濾過した。scFvを、Schierら、1995、前出によって記載される通りに、IMACHochuliら、1988Bio/Technology6:1321-1325によって精製した。ダイマーでありかつ凝集したscFvからモノマーのscFvを分離するために、サンプルを、遠心濃縮器Centricon10;Amiconにおいて1ml未満の容量まで濃縮し、そしてHBSを使用することによってSuperdex75カラムPharmacia上で分画した。最終調製物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアリコートをアッセイすることによって評価した。タンパク質バンドを、クマーシーブルー染色によって検出した。濃度を、1.0のA280が0.7mg/mlのscFv濃度に対応すると仮定して分光測光法によって決定した。H.親和性および結合動態の測定精製したscFvのKdを、BIAcorePharmaciaBiosensorABにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって決定した。BIAcoreフローセルにおいて、約600RUのBoNT/AHc10mM酢酸ナトリウム[pH4.5]中に15μg/mlを、N-ヒドロキシスクシニミド-N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド化学Johnsonら、1991Anal.Biochem.198:268-277を使用することによってCM5センサーチップにカップリングした。このカップリングしたBoNT/AHcの量は、100~175の最大RUの結合されたscFvをもたらした。scFvの結合後の表面の再生のために、5μlの4MMgCl2を注入し、ベースラインへの回帰をもたらした。上記表面を、これらの再生条件下で20~30回再使用した。会合を、50~1,000nMの範囲の濃度で5μl/分の連続的な流れにおいて測定した。konを、lndR/dt/t対濃度のプロットから決定した。ここでRは、応答であり、そしてtは、時間であるKarlssonら、1991J.Immunol.Methods145:229-240。koffを、30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定したKarlssonら、1991J.Immunol.Methods145:229-240。Kdを、koff/konとして算出した。I.エピトープマッピングエピトープマッピングを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって行なった。BlAcoreフローセルにおいて、約1,200RUのBoNT/AHcを、上に記載したようにCM5センサーチップにカップリングさせる。5μl/分の流速を用いて、100nM~1μMのscFvの滴定を、ほぼ飽和した表面を生じる抗体濃度を決定するために、約5分間にわたってフローセル表面上に注入した。エピトープマッピングを、完全に近い飽和および少なくとも100RUの結合された抗体を生じる濃度にて、scFvの対を使用して行った。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するscFvは、一緒に注入した場合に、RU結合において相加的な増加を示し図2パネルA、一方で、同一のエピトープを認識するscFvは、RUの最小限の増加のみを示した図2パネルB。J.インビトロ中和研究適切なインビトロ中和研究はを、Deshpandeら、1995Toxicon33:551-557によって記載されるように、マウス片側横隔膜調製物を使用することによって行った。簡潔には、左右の横隔神経の片側横隔膜調製物を、雄CD/1マウス25~33gから切除し、そして生理的溶液135mMNaCl、5mMKCl、15mMNaHCO3、1mMNa2HPO4、1mMMgCl2、2mMCaCl2、および11mMGLUに懸濁した。インキュベーションバスを、95O2-5CO2を用いて泡立て、そして36°Cの一定温度に維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて超最大に刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器ModelFT03;Grassによって測定した。精製したscFvを、精製したBoNT/Aと一緒に室温にて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、2.0×10-8MのscFv最終濃度および2.0×10-11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。研究した各scFvについて、50の単収縮張力減少までの時間を、BoNT/A単独について3回測定し、そしてscFvBoNT/Aについて3回測定した。S25とC25との組み合わせを、各2.0×10-8Mの最終濃度にて研究した。50の単収縮減少までの時間の間の差を、有意と見なされる0.05未満のP値を用いて両側t検定によって決定した。表4.ファージ抗体ライブラリー由来のクローンの結合の頻度aポジティブクローンの数/クローンの総数として表される。BoNT/AおよびBoNT/AHcに対する選択について、ELISAを、それぞれ、固定化したBoNT/Aおよび固定化したBoNT/AHcに対して行った。ND、行った選択から決定されなかったデータ。bBoNT/AHcで2回、かつBoNT/Aで1回免疫化したマウスに由来する。cイムノチューブ選択を、イムノチューブ上に吸着させた抗原を用いて行った。dビオチン化選択を、ストレプトアビジン磁性ビーズ上の捕捉を用いて、溶液中で行った。eBoNT/AHcで3回免疫化したマウスに由来する。fNi2-NTA選択を、Ni2-NTA上の捕捉を用いて、溶液中で行った。結果A.ファ-ジ抗体ライブラリーの構築および特徴付け2つのファージ抗体ライブラリーを、免疫化したマウスのVH遺伝子およびVK遺伝子から構築した図1。ライブラリー1について、マウスを、BoNT/AHCを用いて2回免疫化し、そして100,000のBoNT/Aの50致死量を用いた第2の免疫化の2週間後にチャレンジした。BoNT/Aチャレンジで生存したマウスを、1週間後に屠殺した。その脾臓を、屠殺直後に取り出し、そして全RNAを、調製した。ライブラリー構築のために、IgG重鎖mRNAおよびκ軽鎖mRNAを、特異的にプライムし、第1のcDNA鎖を、合成した。VH遺伝子レパートリーおよびVK遺伝子レパートリーを、PCRによって増幅し、そしてVHプライマー、JHプライマー、VKプライマー、およびJKプライマーを、ファージ抗体システムにおいて提供した。VH遺伝子レパートリーおよびVK遺伝子レパートリーを、15アミノ酸のペプチドリンカーG4S3配列番号182をコードする合成DNAを使用することによって、scFv遺伝子レパートリーを作製するためにランダムに一緒にスプライシングした。各scFv遺伝子レパートリーを、ファージディスプレイベクターpCANTAB5EPharmacia中に別個にクローニングした。形質転換後、2.1×106メンバーのライブラリーを得た。上記クローンのうちの90は、PCRスクリーニングによって決定したところ、scFv遺伝子に関して適切なサイズの挿入物を有し、そしてそのクローンされたscFv遺伝子は、PCRフィンガープリントによって決定したところ、多様性であった。ライブラリー1からの10個の非選択的なクローンのDNA配列決定は、全てのVH遺伝子が、マウスVH2ファミリーに由来すること、ならびに全てのVK遺伝子がマウスVK4ファミリーおよびマウスVK6ファミリーに由来することを示したKabatら、1991、前出。この観察されたV遺伝子の偏りに基づいて、科特異的VHプライマーおよび科特異的VKプライマーを、JH遺伝子セグメント特異的プライマーおよびJK遺伝子セグメント特異的プライマーと一緒に設計した表3。次いでこれらのプライマーを、第2のファージ抗体ライブラリーを構築するために使用した。ライブラリー2について、マウスを、BoNT/AHcで3回免疫化し、そして第3の免疫化の2週間後に屠殺した。そのマウスは、脾臓を回収される前にBoNT/Aによってチャレンジされなかった。なぜならこれは、非Hc結合抗体の産生を生じるからである以下のファージ抗体の選択および最初の特徴付けを参照のこと。上記脾臓を回収し、そしてファージ抗体ライブラリーを、VH特異的プライマー、JH特異的プライマー、VK特異的プライマー、およびJK特異的プライマーを使用したことを除いて、上に記載したように構築した。形質転換後、1.0×106メンバーのライブラリーを得た。95のクローンは、PCRスクリーニングによって決定したところ、scFv遺伝子についての適切なサイズの挿入物を有し、そして上記クローンしたscFv遺伝子は、PCRフィンガープリントによって決定したところ多様性であったデータ示さず。ライブラリー2由来の10種の選択されていないクローンのDNA配列決定は、ライブラリー1において観察されるよりも大きい多様性を示し;VH遺伝子は、VH1、VK2ファミリー、およびVK3ファミリーに由来し、そしてVK遺伝子は、VK2ファミリー、VK3ファミリー、VK4ファミリー、およびVK6ファミリーKabatら、1991前出に由来した。B.ファ-ジ抗体の選択および最初の特徴付けBoNT/A結合ファージ抗体を単離するために、ファージを、上記ライブラリーからレスキューし、そして精製したBoNT/Aまたは精製したBoNT/AHcのいずれかに対して選択した。選択を、Hcに加えてホロ毒素に対して行った。なぜなら組換え毒素Hcホロ毒素におけるHcの立体構造を模倣する程度が明確でなかったからである。BoNT/AバインダーおよびBoNT/AHcバインダーについての選択を、ポリスチレンに吸着させた抗原に対して行った。さらに、Hc結合ファージを、ビオチン化Hcについて、ストレプトアビジン磁性ビーズに対する捕捉ライブラリー1についてまたはヘキサヒスチジンタグ化Hcに対する捕捉、Ni2-NTAアガロースに対する捕捉ライブラリー2についてを用いて溶液中で選択した。溶液中の選択を、ポリスチレンに吸着されたタンパク質に対する選択がネイティブなタンパク質を認識しないファージ抗体をもたらし得るという本発明者らの先の観察Schierら、1995Immunotechnology、1:73-81に基づいて利用した。溶液中の選択を、本発明者らが上記毒素を、交差反応性を破壊せずに首尾よくビオチン化できなかったことに起因して、ホロ毒素に対して行わなかった。2~3ラウンドの選択後、少なくとも67の分析したscFvは、選択のために使用した抗原に結合した表2。固有のscFvの数を、DNAフィンガープリント、その後のDNA配列決定によって決定し、そして各scFvの特異性を、純粋なBoNT/Aおよび組換えBoNT/AHcに対するELISAによって決定し、そしてBoNT/Aに結合するが、HcまたはHNに結合しないHNscFvを、その軽鎖触媒ドメインに結合すると仮定した。合計で33種の固有のscFvを、Hcによって免疫化し、かつBoNT/Aによってチャレンジしたマウスから単離した表5、ライブラリー1。ライブラリー1をホロ毒素について選択した場合、25種の固有のscFvが、単離された。しかし、これらおscFvのうちの2種のみが、Hcを結合し、軽鎖を結合し、かつHNを結合する部分を有したHathawayら、1984J.Infect.Dis.150:407-412。上記2種のHc結合scFvは、同様のエピトープを認識する他のscFvと同じく発現せず、したがってそれらは、親和性または中和能に関して特徴付けられなかった以下を参照のこと。Hcについてのライブラリー1の選択は、8種のさらなる固有のscFvをもたらした表3および4。全体として、しかし、Hcについて選択されたscFvの50だけがまた、ホロ毒素を結合した。この結果は、Hc表面のかなりの部分がホロ毒素に到達できない可能性があることを示唆する。あるいは、scFvは、ホロ毒素に存在しないHc立体構造を結合し得る。Hcのみによって免疫化したマウス由来ライブラリー2の、ホロ毒素ついて選択した全てのscFvはまた、Hcを結合した。しかし、ライブラリー1に関するように、Hcについて選択したscFvの50だけが、ホロ毒素を結合した。全てにおいて、18種の固有のHc結合scFvを、ライブラリー2から単離し、合計で28種の固有のHc結合scFvをもたらした表5および6。同一の配列または関連した配列のscFvを、溶液中で、ポリスチレンおよびHcに対して固定化したHcの両方について単離した。したがって、Hcの場合において、選択の方法は、重要ではなかった。表5.ファージ抗体ライブラリーから選択されたBoNT結合scFvの特異性C.エピトープマッピング全28種の固有のHc結合scFvを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用してエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも100RUの結合されたscFvを生じる濃度にてscFvの対を用いて行った。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するscFvは、一緒に注入した場合に、RU結合において相加的な増加を示し図2パネルA、一方で、同一のエピトープを認識するscFvは、RUの最小限の増加のみを示した図2パネルB。この技術によって、28種のscFvのマッピングは、Hcに対して認識される4種の重複しないエピトープをもたらした表6。エピトープ1およびエピトープ2のみを認識するscFvを、ライブラリー1から得たが、全4種のエピトープを認識するscFvを、ライブラリー2から得た。同じエピトープを認識するscFvC1およびS25;C9およびC15;1E8および1G7;1B6および1C9;C25およびC39;2G5、3C3、3F4、および3H4;1A1および1F1;1B3および1C6;1G5および1H6;1F3および2E8の多くは、VHCDR3およびVH遺伝子セグメントの高レベルの相同性によって証明されるような、同じV-D-J再配列に由来するVHドメインを有した表6。これらのscFvは、体細胞超変異またはPCRエラーによって導入される置換によってのみ異なる。エピトープ1およびエピトープ2について、同じエピトープを認識するscFvの大部分または全ては、同一か、または非常に類似したVH遺伝子セグメントに由来するが、VHCDR3の長さおよび配列に関して著しく異なるエピトープ1については9種のscFvのうちの5種;エピトープ2については8種のscFvのうちの8種表6。これらは、異なるマウス由来のscFvを含む。主要なレパートリーにおけるVHCDR2配列中の多様性の大きな程度Tomlinsonら、1996J.Mol.biol.、256:813-817に鑑みて、特定のVH遺伝子セグメントは、特定の病原性の抗原性形状を認識し得る結合部位を形成するそれらの能力に関して進化した可能性がある。対照的に、より大きい構造のバリエーションは、再配列したYK遺伝子において生じるようである。例えば、3種の異なる生殖系列遺伝子およびCDR1主鎖の立体構造Chothiaら、1987J.Mol.Biol.196:901-917は、全てのVH遺伝子が同じ生殖系列遺伝子に由来するエピトープ21について観察される。鎖の対形成におけるこのような乱雑は、以前に報告されているClacksonら、1991Nature352:624-628。D.親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和を、各エピトープに対する1つの代表的なscFv結合について決定した。各エピトープに関して、さらなる研究のために選択したscFvは、エピトープマッピング研究の間に決定したように、高い発現レベルと緩徐なkoffとの最適な組み合わせを有した。研究した4種のscFvについてのKdは、7.3×10-8Mと1.1×10-9Mとの間の範囲であり表7、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルIgGについて報告されたものFooteら、1991Nature352:530-532に匹敵する値であった。C25は、抗ボツリヌス毒素抗体について報告された最も高い親和性Kd=1.1×10-9Mを有する。scFvの間で、konは、84倍を上回って異なり、そしてkoffは、33倍を上回って異なった表7。インビトロ毒素中和を、マウス片側横隔膜調製物を使用し、そしてBoNT/A単独および2.0×10-8MのscFvの存在下において、50の単収縮張力減少までの時間を測定することによって決定した。値を、50の単収縮減少までの時間において報告する。エピトープ1S25およびエピトープ2C25に対するscFvの結合は、神経麻痺までの時間を著しく延長させた:それぞれ、1.5倍152および2.7倍270表7および図3。対照的に、エピトープ3およびエピトープ4に対するscFvの結合は、神経麻痺までの時間に対する有意な効果を有さなかった。S25とC25との混合物は、神経麻痺までの時間に対して有意な相加的効果を有し、50の単収縮減少までの時間を3.9倍390増大させた。表6.認識したエピトープによって分類したBoNT/AHC結合scFvのVHおよびVLの推定タンパク質配列表7.ファージ抗体ライブラリーから選択されたscFvの、親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和の結果akonおよびkoffを、表面プラズモン共鳴によって測定し、そしてKdを、koff/konとして算出した。b20nMscFv20pMBoNT/Aを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける、BoNT/A単独についての時間と比較した50の単収縮減少までの時間分。C25S25組み合わせに関して、各20nMのscFvを使用した。各値は、少なくとも3回の観察の平均±SEMである。cBoNT/Aと比較してp<0.01。dC25と比較してp<0.05。考察BoNTは、単一のジスルフィド結合によって連結した重鎖および軽鎖からなる。その毒素のそのカルボキシ末端半部は、特定の膜レセプターに結合して内部移行をもたらす一方で、そのアミノ末端半部は、エンドソームからサイトゾルへの毒素のトランスロケーションを媒介する。その軽鎖は、シナプス伝達の不全および麻痺を生じる、必須のシナプトソームタンパク質を切断する亜鉛エンドペプチダーゼである。有効な免疫療法は、そのレセプターに対する毒素の結合を阻害しなければならない。なぜならば他の2つの毒素分画は、細胞内で発生するからである。結合を媒介するHc上のエピトープの同定は、受動免疫療法のためのより良好なワクチンの設計および高力価の中和モノクローナル抗体または中和抗体の開発の両方のために、必須の第1工程である。この研究のために、本発明者らは、組換えBoNT/AHcを用いた免疫化によって中和エピトープに対する免疫応答を導くことを試みた。これは、その細胞レセプターに対する毒素の結合を妨げる抗体の産生をもたらすべきである。このアプローチの1つの制限は、組換えHcがホロ毒素におけるHcの立体構造を模倣する程度である。Hcについて選択された抗体の50がホロ毒素を認識するという事実は、その分子の大部分に対する著しい構造的相同性を示唆する。Hcについて選択された抗体の50は、ホロ毒素を結合しないが、これは、他の毒素ドメインに対するHc表面のかなりの部分のパッキングpackingから生じ得る。しかし、本発明者らの結果は、これらの抗体のいくつかがホロ毒素に存在しないHc立体構造を結合しているという可能性、またはホロ毒素中に存在する立体構造的なエピトープが組換えHcに存在しないという可能性を除外しない。これは、特定の立体構造的なエピトープに対する抗体の産生の失敗を生じ得る。それにもかかわらず、Hcを用いた免疫化および選択は、ホロ毒素を結合するモノクローナル抗体の大きなパネルの単離をもたらした。対照的に、ホロ毒素またはトキソイドを用いた免疫化後に単離されたモノクローナル抗体は、他の毒素ドメインHNまたは軽鎖、または粗毒素調製物およびトキソイド中に存在する非毒素タンパク質に結合する上記のライブラリー1からの結果、およびEmanuelら、1996j.Immunol.Meth.、193:189-197を参照のこと。最も大きい数の可能なモノクローナル抗体を産生および特徴付けするために、本発明者らは、ファージディスプレイを使用した。このアプローチは、結合に関して、数百万の抗体の作製およびスクリーニングを可能にする。得られた抗体フラグメントは、既にクローニングされ、そして固有の抗体の数を同定するために容易に配列決定され得る。E.coliにおける発現レベルは、代表的に、C末端にヘキサヒスチジンタグを付与するベクター中にサブクローニングした後、IMACによって容易に精製され得るミリグラムの量のscFvを産生するのに適切である。最終的に、VH遺伝子およびVL遺伝子は、完全なIcG分子を構築するためにサブクローニングされ得、ヒト化抗体を構築するためにグラフトされるか、または超高親和性の抗体を作製するために変異させられる。このアプローチによって、28種の固有のモノクローナル抗BoNT/AHc抗体を、産生および特徴付けした。上記抗体の配列は、様々であり、3種の異なるVH遺伝子ファミリー、少なくとも13種の固有のV-D-J再配列、および3種のVK遺伝子ファミリーからなる。BoNT/AHc抗体のこの大きなパネルの産生は、免疫化および選択に使用した抗原BoNT/AHcの選択の結果であった。例えば、五価トキソイドによって免疫化したマウスのV遺伝子から構築したFabファージ抗体ライブラリーは、純粋な毒素この場合では、BoNT/Bを結合する2種のみのFabをもたらした。そのFabの大部分は、トキソイド中に存在する非毒素タンパク質Emanuelら、J.Immunol.Methods193:189-1971996を結合した。上記抗体の配列多様性にかかわらず、エピトープマッピングは、4種のみの重複しないエピトープを示した。エピトープ1およびエピトープ2は、免疫優勢であり、28種の上記抗体のうちの21種75によって認識された。興味深いことに、免疫優勢なBoNT/AHcペプチドの非立体構造的なエピトープのほぼ同じ数3種~5種が、五価トキソイドによる免疫化後のマウスポリクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体、ならびにホルムアルデヒドで不活化したBoNT/Aによる免疫化後のウマポリクローナル抗体Atassi、1996J.ProteinChem.、15:691-699によって認識される。scFv結合エピトープ1およびscFv結合エピトープ2は、マウス神経筋接合部における毒素誘導性の神経麻痺の部分的拮抗をもたらした。一緒に投与した場合、上記2種のscFvは、神経麻痺までの顕著に増加する時間を伴う相加的効果を有した。これらの結果は、BoNT/AHc上の2つの固有のレセプター結合部位の存在と一致する。BoNT/Aレセプターは、正式に同定されていなかったが、この結果は、リガンド結合研究の結果と一致し、この結果はまた、毒素上のレセプター結合部位の2つのクラス高親和性および低親和性を示し、そして毒素結合についての二重レセプターモデルMontecucco、1986TrendsBiochem.Sci.11:314-317をもたらした。しかし、これらの部位の両方がHc上にあるか否かは、議論の余地がある。2つの研究において、BoNT/AHcは、結合および神経筋麻痺を阻害Blackら、1986J.CellBiol.103:521-534;Blackら、1980Am.J.Med.69:567-570したのに対して、Daniels-Holgateら、1996J.Neurosci.Res.44:263-271は、BoNT/AHcは運動神経末端における結合を阻害したが、マウス神経筋接合部における毒素誘導性の神経麻痺に対する拮抗作用を有さなかったことを示した。本発明者らの結果は、毒素の内部移行および毒性をもたらすHc上の2つの生産的なレセプター結合部位の存在と一致する。scFvの効力における差は、レセプター結合部位に対するHcの親和性における差を反映し得るか、またはHcに対するscFvの親和性における10倍より大きい差を反映し得る。最後に、本発明者らは、任意の上記scFvが細胞表面に対する毒素の結合を実際にブロックすることを正式に示さなかった。神経麻痺までの時間において観察された効果は結合後の事象の妨害によって生じることが、考えられる。マウス片側横隔膜アッセイにおける毒素誘導性の神経麻痺のscFv拮抗は、2.0×10-9Mのポリクローナルウマ抗毒素PerImmuneInc.について観察されたもの神経麻痺までの時間の7.5倍の延長より低かった。この差は、さらなる結合部位をブロックする必要性、抗体の親和性もしくはアビディティにおける差、または結合できない凝集した毒素をもたらす交差反応効果に起因し得る。抗体結合の親和性はまた、重要な因子であるようである。なぜならば、上記毒素は、高親和性でそのレセプターに結合しWilliamsら、1983Eur.J.Biochem.、131:437-445、そして内部移行によって細胞の内側に濃縮され得るからである。注目すべきは、最も強力なscFvがHcに対する最も高い親和性を有することである。同じ中和エピトープを認識するが、異なるKdを有する本明細書に記載される他のscFvの有用性は、親和性の重要性を規定することに役立つはずである。しかし、これらのscFvは、多くのアミノ酸によって異なり、そしてまた良好な特異性において異なり得、それは、結果の解釈を困難にする。あるいは、ファージディスプレイと組み合わせた突然変異誘発は、配列中の数個のアミノ酸のみによって異なるが、親和性において数桁で変動するscFvの産生をもたらし得るSchierら、1996J.Mol.Biol.、263:551-567。同じアプローチは、抗体親和性をピコモル範囲Id.に増大させるために使用され得る。中和についての判断基準goldstandardは、抗体と同時注入した毒素の致死的効果に対するマウスの保護である。インビトロ保護とインビボ保護との間の関係は、正式に確立されていないが、ウマ抗毒素は、両方の型のアッセイにおいて毒素を強力に中和する上記、およびHathewayら、1984J.Infect.Dis.、150:407-412を参照のこと。この関係は本明細書中で報告されるscFvに関して保たれると考えられ、そしてこれは、実験的に検証され得る。このような研究は、小さい25kDascFv抗体フラグメントによって可能ではない。小さいサイズのscFvは、迅速な再分布相における半減期は2.4~12分間である、およびクリアランスβ相における半減期は、1.5~4時間である、および迅速に検出不可能になる抗体レベルをもたらしHustonら、1996J.Nucl.Med.40:320;Schierら、1995Immunotechnology、1:73-81、一方で、毒素レベルは、おそらく高いままであるHildebrandら、1961Proc.Soc.Exp.Biol.Med.107-284-289。インビボ研究の実施は、scFvのVH遺伝子およびVL遺伝子から完全なIgG分子を構築することによって容易にされる。ヒト定常領域の使用は、マウスモノクローナルよりも低い免疫原性であり、かつ現在使用されるウマ抗毒素よりもずっと低い免疫原性であるキメラ抗体をもたらす。免疫原性は、ヒト化抗体を産生するために、CDRグラフティングによってさらに減少され得る。実施例2:組換えオリゴクロ-ナル抗体によるボツリヌス神経毒素の強力な中和芽胞形成細菌Clostridiumbotulinumは、ボツリヌス神経毒素BoNT公知である最も有毒な物質Gill、1982Microbiol.Rev.46:86-94を分泌する。上記タンパク質毒素は、3つの機能的ドメインを含む重鎖および軽鎖からなるSimpson、1980J.Pharmacol.Exp.Ther.212:16-21;MontecuccoおよびSchiavo1995Q.Rev.Biophys.28:423-472;Lacyら、1998Nat.Struct.Biol.5:898-902。重鎖の末端部分HCは、シナプス前ニューロン上のシアロガングリオシドレセプターおよび推定上のタンパク質レセプターに結合する結合ドメインを含み、その結合は、毒素のエンドサイトーシスを生じるDollyら、1984NatureLondon307:457-460;Montecucco、1986TrendsBiochem.Sci.11:315-317。重鎖のN末端部分HNは、毒素にエンドソームを回避させるトランスロケーションドメインを含む。軽鎖は、血清型に依存してSNARE複合体の異なるメンバーを切断する亜鉛エンドペプチダーゼであり、その切断は、神経筋伝達のブロックをもたらすSchiavoら、1992NatureLondon359:832-835;Schiavoら、1993J.Biol.Chem.268:23784-23787。7種のBoNT血清型A~G;LacyおよびStevens、1999J.Mol.Biol.291:1091-1104が存在し、そのうちの4種A、B、E、およびFは、ヒト疾患のボツリヌス中毒を引き起こすArnonら、2001J.Am.Med.Assoc.285:1059-1070。ボツリヌス中毒は、弛緩性麻痺によって特徴付けられ、直ちに致命的でない場合、ボツリヌス中毒は、集中治療室および機械換気における長期の入院を必要とする。上記毒素の強力な麻痺性能は、頸部ジストニア、脳性麻痺、外傷後の脳傷害、および脳卒中後の痙攣を含む過剰活性筋の状態の範囲を処置するための医薬としての低用量での使用をもたらしているMahantら、2000J.Clin.Neurosci.7:389-394。BoNTはまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性Arnonら、2001J.Am.Med.Assoc.285:1059-1070に起因して、CentersforDiseaseControlCDCによって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する6種の脅威因子threatagentCategoryAagentのうちの1種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにBoNTを生産しUnitedNationsSecurityCouncil1995Tenthreportoftheexecutivecommitteeofthespecialcommissionestablishedbythesecretary-generalpursuanttoparagraph9bIofsecuritycouncilresolution6871991,andparagraph3ofresolution6991991ontheactivitiesoftheSpecialCommisionUnitedNationsSecurityCouncil、NewYork;Bozheyevaら1999FormersovietbiologicalweaponsfacilitiesinKazakhstan:past、present、andfuture.CenterforNonproliferationStudies、MontereyInstituteofInternationalStudies、Monterey、CA、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにBoNTを使用することを試みたArnonら、2001J.Am.Med.Assoc.285:1059-1070。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。ボツリヌス中毒の予防または処置のための特定の低分子薬物は、存在しないが、研究的な五価トキソイドワクチンは、CDCから利用可能でありSiegel1988J.Clin.Microbiol.26:2351-2356、そして組換えワクチンが、開発中であるByrneおよびSmith、2000Biochimie82:955-966。それにもかかわらず、多くの民間人または軍人のワクチン接種は、疾患または曝露の希少性、およびワクチン接種がBoNTのその後の医学的使用を妨げるという事実に起因して行われない。曝露後のワクチン接種は、疾患の迅速な発症に起因して役に立たない。毒素中和抗体Abは、曝露前または曝露後の予防のためか、あるいは処置のために使用され得るFranzら、1993Pp.473-476、B.R.DasGupta編、BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects、編、DasGupta、B.R.Plenum、NewYork。少量のウマ抗毒素およびヒトボツリヌス免疫グロブリンの両方が、存在し、そして現在、それらは、それぞれ、成人ボツリヌス中毒BlackおよびGunn、1980Am.J.Med.、69:567-570;Hibbsら、1996Clin.Infect.Dis.23:337-340および乳児ボツリヌス中毒Arnon、1993Pp.477-482、BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects、編、DasGupta、B.R.Plenum、NewYorkを処置するために使用される。組換えモノクローナル抗体mAbは、感染症の危険性を含まず、かつ血漿瀉血にヒトドナーを必要としない抗毒素の無制限の供給を提供し得る。このようなmAbは、妥当なコストにおける適切な数の用量を提供するために、高い効力でなければならない。いくつかの場合において、ポリクローナルAbの効力は、単一のmAbにおいて再利用され得るLangら、1993J.Immunol.151:466-472。BoNTの場合において、強力な中和mAbは、依然としてもたらされていない:単一のmAbは、マウスにおける毒素の50致死量LD50の多くても10倍~100倍にて中和するPlessら、2001Infect.Immun.69:570-574;Hallisら、1993Pp.433-436、BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects、編、DasGupta、B.R.、Plenum、NewYork。この例において、本発明者らは、BoNT血清型ABoNT/Aが、2種または3種のmAbを組み合わせることによってインビトロおよびインビボで非常に強力に中和され得、このことがボツリヌス中毒ならびに他の病原体および生物学的脅威因子によって引き起こされる疾患を予防および処置するための薬物への手段を提供すること示す。方法IgGの構築C25単鎖可変フラグメントscFv、S25単鎖可変フラグメント、および3D12単鎖可変フラグメントのVH遺伝子を、プライマー対GTCTCCTGAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT配列番号183、およびGTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTC25、配列番号184、GTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTGAAGCTGCAGCAGTCAS25、配列番号185、またはGTACCAACGCGTGTCTTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT3D12、配列番号186のいずれかを用いてPCRを使用することによって各ファージミドDNAから増幅した。DNAを、Mlu1およびNheIで消化し、N5KG1Val-LarkMitchReff、IDECPharmaceuticals、SanDiegoの贈呈にライゲーションし、正しいVHを含むクローンを、DNA配列決定によって同定した。C25scFv、S25scFv、および3D12scFvのV_遺伝子を、プライマー対TCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGAGCTCACTCAGTCT配列番号187およびCTGGAAATCAAACGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTC25、配列番号188、TCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGAGCTCACTCAGTCT配列番号189およびCTGGAAATCAAACGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTS25、配列番号190、またはTCAGTCGTTGCATGTACTCCAGGTGCACGATGTGACATCGTGATGACCCAGTCT配列番号191およびCTGGAAATCAAACGTACGTTTTATCTCCAGCTTGGT3D12、配列番号192を用いて各ファージミドDNAから増幅し、pCR-TOPOInvitrogen中にクローニングし、そして正しいV_を含むクローンを、DNA配列決定によって同定した。V_遺伝子を、DraIIIおよびBsiWIを用いてpCR-TOPOから切り出し、そして適切なVH遺伝子を含むDraIII消化およびBsiWI消化を行ったN5KG1Val-LarkDNAにライゲーションした。正しいVH遺伝子と正しいVκ遺伝子とを含むクローンを、DNA配列決定によって同定し、そしてベクターDNAを、エレクトロポレーションによってCHODG44細胞をトランスフェクトするために使用した。安定な細胞株を、G418中で選択することによって確立し、そして1Lスピナーフラスコ中に拡大培養した。IgGを含む上清を、回収し、限外濾過によって濃縮し、そしてプロテインGPharmaciaに対して精製した。IgG親和性およびIgG結合動態の測定IgG結合動態を、BIAcorePharmaciaBiosensorにおける表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてKdを算出ために使用した。約200~400応答単位responseunitの精製したIgG10mMアセテート中の10~20μg/ml、pH3.5~4.5を、N-ヒドロキシスクシニミド-N-エチル-N’-ジメチルアミノプロピル-カルボジイミド化学を使用することによってCM5センサーチップにカップリングさせた。精製したBoNT/AHCについての会合速度定数を、50~800nMの範囲の濃度を使用して、15μl/分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数konを、lndR/dt/t対濃度のプロットから決定した。解離速度定数koffを、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。Kdを、koff/konとして算出した。インビトロ毒素中和の測定横隔神経片側横隔膜調製物を、雄CD-1マウス25~33gから切除し、そして135mMNaCl、5mMKCl、1mMNa2PO4、15mMNaHCO3、1mMMgCl2、2mMCaCl2、および11mMグルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、95O2、5CO2を用いて泡立て、そして36°Cに維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて刺激した。等尺性単収縮張力を、力変位変換器ModelFT03、Grassを用いて測定した。精製したIgG抗体を、BoNTAと一緒に室温にて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、6.0×10-8MS25単独および3D12単独または2.0×10-8MC25単独のIgG最終濃度および2.0×10-11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。IgGの対に関して、各IgGの最終濃度を、50減少させ、そして全3種のIgGの混合物の研究に関して、各IgGの濃度を、67減少させた。インビボ毒素中和の測定50マイクログラムの適切なIgGを、0.5ml総容量のゼラチンリン酸緩衝液中のBoNT/A神経毒素Hall株の示された数のマウスLD50に添加し、そしてRTにて30分間インキュベートした。Abの対に関して、25μgの各Abを添加し、そして3種のAbの組み合わせに関して、16.7μgの各Abを添加した。次いでその混合物を、雌CD-1マウス16~22gに対してi.p.に注射した。マウスを、10の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の5日後に決定した。mAbの溶液親和性の測定平衡結合研究を、抗体と抗原との反応混合物中の占有されていない結合部位を有する抗体を定量するためにKinExAフロー蛍光光度計を使用して行った。1種、2種、または3種の異なる抗体から構成される反応混合物を用いた研究を、それぞれ、342pM、17.2pM、および17.2pMの抗体の総濃度を含むHepes緩衝化生理食塩水pH7.4において行った。全ての場合において、可溶性の毒素の濃度を、0.1未満から10倍を超える見かけのKdの値まで変化させた12の濃度、最小。1種、2種、または3種の異なる抗体から構成される反応混合物を、平衡が達成されたこと確保するために、25°Cにて、それぞれ0.5時間、3時間、および17時間インキュベートした。結果BoNT/Aを中和し得るmAbを産生するために、本発明者らは、先に、組換えBoNT/A結合ドメインHCによって免疫化したマウス由来のscFvファージ抗体ライブラリー、および五価ボツリヌストキソイドAmersdorferら、1997Infect.Immun.65:3743-3752;Amersdorferら、2002Vaccine20:1640-1648によって免疫化したヒト由来のscFvファージ抗体ライブラリーを産生した。これらのライブラリーから100種より多い固有のmAbをスクリーニングした後、BoNT/AHC上の重複しないエピトープを結合し、かつインビトロで毒素を中和するマウス片側横隔膜モデルにおいて神経麻痺までの時間を延長する;Amersdorferら、1997Infect.Immun.65:3743-3752;Amersdorferら、2002Vaccine20:1640-1648、scFvの3つの群を、同定した。インビトロ毒素中和は、重複しないエピトープを結合する2種のscFvを組み合わせた場合、顕著に増大した。インビボ毒素中和は、血清からの25kDaのscFvの迅速なクリアランスColcherら、1990J.Natl.CancerInst.82:1191-1197に起因して決定できなかった。インビボBoNT神経毒素中和を評価するために、IgGを、インビトロで毒素を中和した3種のBoNT/AscFvのVH遺伝子およびV_遺伝子から構築した。VH遺伝子およびVκ遺伝子を、哺乳動物発現ベクター中に連続的にクローニングし、VκへのヒトCκ遺伝子の融合およびVHへのヒトγ1遺伝子の融合をもたらした。安定に発現する細胞株を確立し、そしてIgGを、マウスV-ドメインおよびヒトC-ドメインを有するキメラIgGマウスscFvC25およびマウスscFvS25について、ならびに完全ヒトIgGヒトscFv3D12についてを産生する上清から精製した。IgGの平衡結合定数Kdを測定し、そしてその平衡結合定数は、それらが由来したscFvの結合定数に少なくとも匹敵することが見出された表8。上記IgGのうちの2種S25および3D12の抗原結合親和性は、概して会合速度定数konの増大に起因して、対応するscFvについての抗原結合親和性よりも顕著に高かったより低いKd。本発明者らは、これは上記分子の安定性の増大を反映し、機能的な抗体の濃度が増加すると仮定する。表8.BoNT/AIgGならびに上記IgGが由来したscFvについての、会合速度定数konおよび解離速度定数koffならびに平衡解離定数KdIgGによるインビトロ毒素中和を、マウス片側横隔膜アッセイDesphandeら、1995Toxicon33:551-557において決定した。毒素単独と比較して、3種のIgGの各々は、神経麻痺までの時間を顕著に増大させ、C25は、最も強力であった図4。毒素中和における顕著な相乗効果が、IgGの対を研究した場合に観察された。これらの研究のために、その高い効力および片側横隔膜調製物が8時間の寿命を有するという事実に起因して、研究したC25IgGの濃度を3倍~20nMに減少させる必要があった。IgGの各対は、いずれかの単一のIgGについての時間と比較して、神経麻痺までの時間を顕著に増大させた図4。全3種のIgGの混合物は、神経麻痺までの時間をさらに増大させたが、この差は、研究した横隔膜の少ない数に起因して、抗体の対と比較した場合に統計的有意性に到達しなかった。インビボ毒素中和を、マウスアッセイを使用して研究し、このアッセイにおいて、毒素およびAbを予め混合し、そしてi.p.に注射し、そして死亡までの時間および生存するマウスの数を決定したSheridanら、2001Toxicon39:651-657。50マイクログラムの単一の各mAbは、死亡までの時間を延長したが、20LD50によってチャレンジしたマウスを保護できなかった図5A。対照的に、mAbの任意の対は、100LD50の毒素によってチャレンジしたマウスを完全に保護した図5B。500LD50において、mAbの対のうちの2種S253D12またはC25S25を受容したマウスの大部分が、死亡したのに対し、C253D12の対を受容したマウスの80は、生存した図3。全3種のmAbオリゴクローナルAbの混合物を受容した全てのマウス500LD50の毒素によってチャレンジしたは、生存した図6。これらの研究において、投与したAbの総量を、マウス1匹あたり50μgにて一定に保った。効力を決定するために、mAb対およびオリゴクローナルAbを、漸増用量の毒素において研究した図6。最も強力なmAb対C253D12は、2,500LD50によってチャレンジしたマウスの生存を伴わずに、1,000LD50によってチャレンジしたマウスの90を保護した。対照的に、オリゴクローナルAbは、20,000LD50の毒素によってチャレンジした10匹のマウスのうちの5匹の生存を伴って、5,000LD50の毒素によってチャレンジした全てのマウスを完全に保護した。上記オリゴクローナルAbの効力を、標準的なマウス中和バイオアッセイHathewayおよびDang、1994Pp.93-107、TherapywithBotulinumToxin、編、Jankovic,J.,Dekker、NewYorkの改変を使用して滴定し、そして乳児ボツリヌス中毒を処置するために使用されるヒトボツリヌス免疫グロブリンArnon、1993Pp.477-482、BotulinumandTetanusNeurotoxins:NeurotransmissionandBiomedicalAspects、編、DasGupta、B.R.Plenum、NewYorkよりも90倍強力である45国際単位IU/mgのAbであると決定した。定義によれば、1IUは、10,000LD50のBoNT/A毒素を中和するBowmer1963Bull.W.H.O.29:701-709。2つの可能な機構が、mAbを組み合わせた場合に観察される効力の増大を説明し得る:毒素に対するAb混合物の機能的結合親和性の増大および/または細胞レセプターに結合する毒素表面のブロックの増大。機能的結合親和性に対する抗体を組み合わせることの効果を決定するために、見かけのKdを、フロー蛍光光度計を使用して溶液の反応混合物中に残存する遊離の抗体を定量することによって、単一の各mAb、mAbの対、および全3種のmAbの混合物について決定した。単一のmAbについて、均一な溶液において測定した抗原結合親和性溶液中の抗原および抗体の両方;図7は、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴抗体が固定化され、そして抗原のみが溶液中にあるによって測定したものよりも低かったより高いKd表8。最も大きいインビトロでの効力を示した抗体C25を、抗体3D12と等モル量で混合し、得られたAbの組み合わせは、上記毒素に65pMの見かけのKd個々の抗体単独を用いて観察されたものよりも200倍および10倍高い親和性より低いKdで結合した。その混合物に対する等モル量の第3のmAbS25の添加は、見かけの親和性を18pMまでさらに増大させた。C25とS25との等モル混合物は、親和性のより小さい2倍の増大をもたらし、このことは、この対がC25と3D12との組み合わせよりもインビボで強力でない理由を説明し得る。複数のmAbによって観察された機能的親和性の増大は、第2のmAbおよび第3のmAbのより高い親和性での結合をもたらす、第1のmAbの結合において生じる毒素の立体構造の変化、または一価抗原から多価抗原へと毒素を変化させるmAb結合のいずれかに起因し得るMoyleら、1983J.Immunol.131:1900-1905。これは、アビディティ効果、および親和性の増大をもたらす。アビディティ効果は、多価抗原例えば、細胞表面に対するIgG結合に関して十分に認識および特徴付けされているCrothersおよびMetzger、1972Immunochemistry9:341-357が、溶液中で生じるものとしては十分に理解されていない。測定したKdの増大は、mAb対およびオリゴクローナルAbについて観察されたインビボでの効力の増大と一致する。平衡結合方程式の再構成:遊離の毒素/結合した毒素=Kd/[血清抗体]2mlのマウス血液容量を仮定すると、その血清抗体濃度は、マウスが50μgのAbを受容する場合、160nMである。毒素の投与される量は、LD50の高倍数である結合した毒素~投与される毒素。したがって、上記方程式は、遊離の毒素/投与される毒素=Kd/160nMヘと単純化される。50のマウスの死亡をもたらす投与される毒素の量を決定するために、遊離の毒素の量を1LD50に置換し、そして投与される毒素について解き、方程式:投与される毒素LD50=1LD50×160nM/Kdを得る。C25について解Kdを使用して、50のマウスが生存する推定される毒素用量は、16LD50である投与される毒素=1LD50×160nM/10nM。この計算がC25Abと3D12Abとの対、およびオリゴクローナルAbに適用される場合、抗体を組み合わせることにおける効力の増大の大きさは、機能的親和性の増大と平行する表9。表9.組換え抗体による、観察された毒素中和および予測される毒素中和オリゴクローナルAbによる強力な毒素中和のための第2の可能な機構は、細胞レセプターに結合する毒素結合ドメイン表面上の複数のエピトープをブロックする必要性である。毒素は、毒素結合ドメイン上の少なくとも2つの部位を介して細胞レセプターに結合すると仮定されているDollyら、1984NatureLondon307:457-460;Montecucco、1986TrendsBiochem.Sci.11:315-317。これらとしては、ガングリオシド結合部位および推定上のタンパク質レセプター結合部位が挙げられる。実際に、空間的に離れた2つのガングリオシド結合部位は、類似の破傷風毒素の共結晶構造において観察されておりFotinouら、2001J.Biol.Chem.276:32274-32281、そして重複しない破傷風毒素エピトープを結合するmAbは、GT1bガングリオシドに対する毒素の結合をブロックし得るFitzsimmonsら、2000Vaccine19:114-121。本発明者らの先のエピトープマッピング研究は、BoNT結合ドメインHCの広い部分をブロックする複数のmAbと一致するMullaneyら、2001Infect.Immun.69:6511-6514。上記mAbのうちの2種S25および3D12は、BoNTHCのC末端サブドメインを結合する。C25mAbは、BoNTHCのN末端サブドメイン由来の配列およびC末端サブドメイン由来の配列からなる立体構造的なエピトープを結合する。上記エピトープマッピングと一致する1つのモデルは、上記3種のmAbエピトープを、同じHCの面上に配置し、そしてその面は、推定上の細胞ガングリオシドレセプターGT1bに対する公知のドッキング部位と重なるMullaneyら、2001Infect.Immun.69:6511-6514。考察結論として、本発明者らは、6種のクラスA細菌兵器のうちの1種であるBoNT/Aが3種のみのmAbからなるオリゴクローナルAbによって強力に中和され得ることを示した。オリゴクローナルAbは、超免疫ヒトグロブリンよりも90倍強力であり、そして超免疫モノ血清型ウマA型抗毒素の効力に近づくSheridanら、2001Toxicon39:651-657。したがって、ポリクローナル血清の効力は、3種のみの重複しないエピトープを結合するmAbに逆重畳deconvoluteし得るか、またはそのmAbに戻り得る。この相乗効果は、上記3種のmAbに対し、任意の単一のmAbの効力と比較して20,000倍よりも大きい効力の増大をもたらす。他のものは、破傷風毒素またはHIV感染の中和におけるモノクローナル抗体の間の相乗作用を、先に示した。破傷風毒素の場合において、3種~4種のモノクローナル抗体の組み合わせは、インビボ毒素中和の効力を、200倍まで増大させたVolkら、1984Infect.Immun.45:604-609。HIVの場合において、3種または4種のmAbの組み合わせは、個々のmAbと比較して、ウイルス中和の効力を10倍に増大させたZwickら、2001J.Virol.75:12198-12208。したがって、本発明者らの観察は、多くのシステムにおいて一般的であると分かっているようである。しかし、本発明者らは、増大した効力が、毒素中和の場合において、混合抗体の機能的親和性の大きな増大によって生じるようであることを示す。このような機構がウイルス中和について真実のままであるか否かは、不明確である。毒素に対するポリクローン性の体液性免疫応答が、数種のみの重複しないエピトープを結合するAbによって機能的に優勢になると、仮定し得る。効力の増大は、個々のmAbと比較して、オリゴクローナルAbのKdの大きな減少から主に生じるようであり、そしてまた細胞レセプターと相互作用する毒素表面のより大きいブロックを表す。このような機構は、溶液中で多くの抗原に対して一般的に適用可能であり得、このことは、オリゴクローナルAbがmAbよりも強力な抗原中和のための一般的手段を提供し得ることを示唆する。C25mAbのKdをほぼpMに操作することによって同様の効力を達成することは、可能であり得るが、オリゴクローナルAbは、強力な抗毒素への、より単純であり、より迅速な手段を提供する。オリゴクローナルAbはまた、BoNT/A中毒の予防および処置のための薬物の安全かつ無制限な供給を提供する。上記Abは、キメラIgGまたはヒトIgGのいずれかからなるので、生産は、安全な抗毒素の備蓄をもたらすために直ぐに拡大され得る。あるいは、本発明者らは、既に、キメラS25IgGを完全ヒトIgGによって置換しており、そしてオリゴクローナルAbの効力を2倍よりも大きく増大させた。研究は、キメラC25を完全ヒトホモログによって置換するために行なわれている。キメラmAb、ヒト化mAb、およびヒトmAbは、治療因子その産生の手段が公知であるのさらに重要になっているクラスを代表する。10種のmAbが、FDAによって、ヒトの治療について認可されおり、そして70種より多い他のmAb治療薬が、臨床試験中であるReichert、2001Nat.Biotechnol.19:819-822。4週間までの排泄半減期によって、Abは、毒素からの数ヶ月間の保護を提供し得るか、または処置のために使用され得る。オリゴクローナルAbは、他のBoNT毒素血清型、および他のクラスA因子に適用可能である。炭疽は、毒素媒介性疾患であり、そしてAbがこの因子に関して保護的であることを、示しているLittleら、1997Infect.Immun.65:5171-5175;Beedhamら、2001Vaccine19:4409-4416。ワクシニア免疫グロブリンは、痘瘡または免疫無防備状態の宿主のワクチン接種から生じる合併症を、予防または処置するために使用され得るFeery、1976VoxSang.31:68-76。Abはまた、出血熱ウイルスによって引き起こされる悪疫および疾患に対して有用であり得るHillら、1997Infect.immun.65:4476-4482;Wilsonら、2000Science287:1664-1666。本発明者らのデータは、BoNTならびに細菌戦および生物テロリズムの他の因子に対抗するためのオリゴクローナルAbの迅速な開発および評価を支援する。実施例3免疫性ヒトファージライブラリーおよび非免疫性ヒトファージライブラリー由来の抗ボツリヌスA型抗体の遺伝的比較ならびに免疫学的比較ボツリヌス中毒における抗体応答を理解することは、ワクチン設計および受動的予防のために重要である。この活性を調査するために、本発明者らは、ファージディスプレイを使用して、分子レベルでBoNT/Aボツリヌス神経毒素血清型A結合ドメインHCに対する免疫応答を研究した。上記scFv抗体を、a五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア、ならびにb非免疫のヒト末梢血リンパ球およびヒト脾臓細胞から調製したV遺伝子レパートリーから単離した。ボツリヌス結合scFvを発現する血清型特異的ファージの大きなパネルを、両方のライブラリーから選択し得る。BoNT/AHCに対する免疫scFvバインダーbinderのエピトープマッピングは、驚くべきことに、2つの異なる群クラスターIおよびクラスターIIに対応した立体構造的なエピトープを認識する限定された数のscFvを示した。クラスターI由来のscFvのみが、マウス片側横隔膜アッセイにおいて中和活性を示した。非免疫性ライブラリーに由来する抗BoNT/AHCクローンは、便宜的に、クラスターIII~XIにグループ分けされ得、そして重複するエピトープを、クラスターIまたはクラスターIIと共有しないようであった。さらに、それらは、生物学的に顕著な濃度で毒素を中和しないことを示した。したがって、本発明者らは、五価ボツリヌストキソイドに基づくワクチンが結合ドメインHC上に露出した限定された数の免疫優勢なエピトープに対する体液性免疫応答を導くことを、示唆する。導入ボツリヌス毒素は、Clostridium属に属する多くの細菌種によって産生される7種の異なる血清型A~Gとして存在する麻痺性神経毒素であるHatheway、1989Pp.3-24、SimpsonLL、編集者、Botulinumneurotoxinandtetanustoxin.SanDiego:AcademicPress。それらは、単鎖タンパク質Mr:150,000として産生され、そしてジスルフィド結合および非共有結合によって1つに保たれる2つの鎖重鎖Mr:100,000および軽鎖Mr:50,000の形成をもたらす限定的なタンパク質分解によって完全に活性化されるNiemann、1991Pp.303-348、AloufJE、FreerJH、編集者、Sourcebookofbacterialproteintoxins.NewYork:AcademicPress;Simpson、1990JPhysiol.84:143-151。中毒は、クロストリジウム属に汚染された食物の摂取食物媒介性ボツリヌス中毒、乳児の腸管感染乳児ボツリヌス中毒、および創傷の深部皮下の感染創傷ボツリヌス中毒によって生じる。ヒトボツリヌス中毒は、A型、B型、およびE型によって最も頻繁に引き起こされ、そして稀にFによって引き起こされるDowell、1984RevInfectDis.、6第1補遺:202-207;BotulisumintheUnitedStates.Handbookforepidemiologists,cliniciansandlaboratoryworkers.Atlanta、CenterforDiseaseControl、1980。BoNTボツリヌス神経毒素血清型は、コリン作動性神経終末に対して優先的に作用して、アセチルコリンの放出をブロックするHabermannら、1986CurrTopMicrobiolImmunol.、129:93-179;Montecuccoら、1994MolMicrobiol.、13:1-8。BoNTの作用は、3つの工程を包含するSimpson、1986AnnRevPharmacolToxicol.、26:427-453:1重鎖のC末端HCを介したシナプス前膜上のレセプターに対する結合;2重鎖のN末端HNを介した、軽鎖のサイトゾル中へのトランスロケーション;および3軽鎖の亜鉛プロテアーゼ活性による、シナプス小胞のドッキングおよび融合タンパク質複合体における1つ以上の重要な成分の切断Montecuccoら、1994MolMicrobiol.、13:1-8;Schiavo、1992JBiolChem.、267:23479-23483;Schiavoら、1995CurrTopMicrobiolImmun.195:257-275。受動免疫療法は、ヒトの病原体およびそれらの毒素に対する有益な予防的アプローチならびに治療的アプローチとして確立されている概説については、Gronskiら、1990MolImmunol.28:1321-1332およびCross1997P.97、CryzSJ、編集者、Immunotherapyandvaccines.Weinheim、Germany:VCHVerlagsgesellschaftを参照のこと。ボツリヌス中毒の場合において、BoNT重鎖のC末端ドメインHCを認識する抗体調製物は、その細胞レセプターに対するその毒素の結合を妨げる得ると考えられる。組換えHCによるマウスの免疫化は、1,000,000マウスi.p.LD50までのチャレンジ用量に対して、インビボでの良好な保護を提供したClaytonら、1995InfectImmun.、63:2738-2742;Byrneら、1998InfectImmun.、66:10。ウマ血漿由来のポリクローナル抗ボツリヌス抗体調製物ウマHIGは、過去において、80より多い成人ボツリヌス中毒患者に投与されてきたMiddlebrookおよびBrown、1995CurrTopMicrobiolImmun.、195:89-122;Tacketら、1984AmJMed.、76:794-798;Morris1981P.15In:LewisGEjr、編集者、Biomedicalaspectsofbotulism.NewYork:AcademicPress。ポリクローナル抗体調製物によって認識される多数の異なるエピトープは、通常、保護的な抗体の存在を確実にし、その存在は、通常、全抗体の小さい亜集団である。予防に関して、ウマ抗体は、曝露前に投与された場合に最も有効であるが、曝露後24時間まで、疾患を予防し得るMiddlebrookandBrown1995CurrTopMicrobiolImmun.、195:89-122。しかし、ウマ抗毒素の投与は、症例のうちの9において血清病およびアナフィラキシーなどの有害作用を引き起こし得るBlackおよびGunn、1980AmJMed.69:567-570。最近の努力は、免疫化したボランティアドナーの血清から調製したヒト免疫グロブリンヒトBIGの産生に集中しているArnon、1993Pp.477-482、DasGuptaBR、編集者、Botulinumandtetanusneurotoxins,neurotransmissionandbiomedicalaspects.NewYork:PlenumPress。中和モノクローナル抗体特に、ヒト起源のものである場合は、抗体の無制限の供給源を提供し、そしてヒトまたはウマからの抗体の調製を置換する。本発明者らは、BoNTを中和し得るモノクローナル抗体を産生するために、抗体ファージディスプレイを使用したHoogenboomら、1991NuclAcidsRes.、19:4133-4137;McCaffertyら、1990Nature、348:552-554;SkerraおよびPluckthun、1988Science、240:1038-1041。免疫化したマウスから構築したファージ抗体ライブラリーを使用して、本発明者らは、BoNT/AHC上の2つの重複しない中和エピトープを結合するモノクローナルの2種のセットを同定したAmersdorferら、1997Infect.Immun.、65:3743-3752。本発明の例において、本発明者らは、五価ボツリヌストキソイドA~Eによって免疫化したヒトボランティアから構築したファージ抗体ライブラリーから選択したモノクローナル抗体の特徴付けを記載する。これらのモノクローナル抗体の親和性、およびこれらのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを、非免疫性ヒトファージライブラリーから選択したモノクローナル抗体の親和性および非免疫性ヒトファージライブラリーから選択したモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと比較した。その結果は、さらなる中和エピトープを同定し、そしてボツリヌス中毒の予防および処置のために完全ヒト抗体を産生する経路を提供する。材料および方法免疫性V遺伝子抗体ライブラリーおよび非免疫性V遺伝子抗体ライブラリー免疫性ファージ抗体ライブラリーの構築のために、ヒトボランティアは、五価ボツリヌストキソイドA型~五価ボツリヌストキソイドE型MichiganDepartmentofPublicHealthによる免疫化を受容した。上記ボランティアを、0週間目、2週間目および12週間目において、0.5mlの五価トキソイドによって免疫化し、そして1年後に0.5mlのトキソイドによって追加免疫した。BoNT/Aに対する中和の力価を、マウス血清中和バイオアッセイを使用して測定したHathewayら、1984JInfectDis.、150:407-412。PBLを、Histopaque1077における遠心分離によって単離し、そしてRNAを、改変したCathalaらの方法Cathalaら、1983DNA、2:329-335を使用して調製した。第1のcDNA鎖を、重鎖についてのIgG定常領域プライマー、または軽鎖についてのκ定常領域プライマーおよびλ定常領域プライマーを使用して、1.0×108個のB細胞から調製したRNAから作製した[26]。VH遺伝子、Vκ遺伝子およびVλ遺伝子を、記載Marksら、1991JMolBiol.、222:581-597される通りに、第1のcDNA鎖から増幅した。PCR産物を、ゲルで精製し、そのゲルからの抽出後にエタノール沈殿し、そして先に記載される通りに、scFv遺伝子レパートリーを構築するために使用したId.。そのscFv遺伝子レパートリーを、ゲルで精製し、次いで付与した制限酵素部位を含むフランキングオリゴヌクレオチドによって再度増幅するために、テンプレートとして使用したId.。scFv遺伝子レパートリーVH-Vκ、VH-Vλを、ゲルで精製し、SfiIおよびNotIを用いて消化し、フェノール/クロロホルムを用いて抽出し、そしてSfiIおよびNotIを用いて消化したベクターpCANTAB-5EPharmaciaBiotech、Milwaukee、WIにライゲーションしたSambrookら、1991NewYork:ColdSpringHarborLaboratory。そのライゲーション混合物を、フェノール/クロロホルムを用いて抽出し、エタノール沈殿し、そして50μlのE.coliTG1細胞中にエレクトロポレーションしたGibson、1984UniversityofCambridge:studiesontheEpstein-Barrvirusgenome。細胞を、100_g/mlのアンピシリンと1w/vグルコースとを含むTYEプレート上にプレーティングした。コロニーを、-70°Cにて保存するために、そのプレートから、100μg/mlのアンピシリンと、1w/vグルコースと15v/vグリセロールとを含む2mlの2×TY中にこすり落とした。4種の形質転換体由来の産物は、7.7×105個の個別の組換え体からなるライブラリーをもたらした。非免疫性ライブラリーに関して、6.7×109個のメンバーを含む先に報告されたファージ上に提示されたヒト単鎖抗体ライブラリーを、利用したSheetsら、1997ProcNatl.AcadSciUSA、95:6157-6162。ファージの調製および選択両方のライブラリー由来のプラスミド粒子を、先に記載される通り、VCS-M13ヘルパーファージStratageneを用いたレスキューによって調製したMarksら、1991JMolBiol.、222:581-597。ファージ粒子を、精製し、そして2回のPEG沈殿によって濃縮しSambrookら、1991NewYork:ColdSpringHarborLaboratory、2mlのリン酸緩衝化生理食塩水PBS:25mMNaH2PO4、125mMNaCl、pH7.4中に再懸濁し、そして0.45μmフィルターNalgeneを通して濾過して、約1013形質導入単位TU/mlの力価を達成した。ライブラリーを、PBSpH7.4中の、2mlのBoNT血清型A、B、C、およびE各50μg/ml、またはBoNT/AHC50μg/mlによって4°Cにて一晩コーティングした75mm×12mmイムノチューブNunc、Maxisorbを使用して選択したEmanuelら、1996JImmunolMeth.、193:189-97。チューブを、PBS中の2脱脂粉乳によってRTにて1時間ブロックし、次いで選択手順、洗浄手順および溶出手順を、先に記載される通り、5.0×1012TU/mlの濃度にてファージを使用して行ったMarksら、1991JMolBiol.、222:581-597。500μlのその溶出したファージを使用して、2×TY-AMP-Gluプレート上にプレーティングした10mlの対数増殖するE.coliTG1に感染させた。ファージを、レスキューし、上に記載したように濃縮し、そして次の選択ラウンドのために使用した。レスキュー-選択-プレーティングの周期を、代表的に、4ラウンド繰り返した。ELISAスクリーニングおよびフィンガープリント選択の各ラウンド後、単一のアンピシリン耐性コロニーを使用して、150μlの2×TY-AMP-0.1グルコースを含むマイクロタイタープレートウェルに接種した。その細菌を、約0.9のA600を与えるように増殖させ、そしてscFv発現を、イソプロピル-β-d-チオガラクト-ピラノシドIPTGを1mMの最終濃度まで添加することによって誘導したDeBellisおよびSchwartz、1990NuclAcidsRes.18:1311。細菌を、25°Cにて振盪しながら一晩増殖させ、その細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして可溶性のscFvを含む上清を、回収した。BoNTおよびBoNT/AHCに対する結合についてのscFvのスクリーニングを、PBSpH7.4中の10μg/mlの抗原を用いてコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートFalcon3912において行なった。非免疫性ライブラリーに由来するscFvを、記載GriffithsおよびMalmqvist、1993EMBOJ.12:725-734通りに、その後にペルオキシダーゼ結合体化抗マウスFc抗体Sigmaを伴うC末端mycタグMunroおよびPelham、1986Cell、46:291-300を認識するマウスモノクローナル抗体9E101μg/mlSantaCruzBiotechnology、CAを使用して検出した。免疫性ライブラリーに由来するscFvを、ペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗体抗E2.5μg/mlPharmaciaBiotechを使用して検出した。その反応を、30分後にNaF3.2mg/mlを用いて停止させ、そしてA405nmを、測定した。固有のクローンの数を、PCR-フィンガープリントMarksら、1991JMolBiol.222:581-597を行い、次いで各フィンガープリントパターンからの少なくとも2つのクローンのVH遺伝子およびVL遺伝子のDNA配列決定を行なうことによって決定した。抗体の特異性を、10μg/mlのBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/E、BoNT/AHCおよび血清型Aの組換えトランスロケーションドメインBoNT/AHNを用いてコーティングしたウェルを使用して、上記の通りに行ったELISAによって決定した。クローンを、それらがバックグラウンドよりも少なくとも5倍高いシグナルを与えた場合、選択した抗原に対して特異的であるものとして同定した。scFvのサブクローニング、発現および精製ELISAによって決定したところのBoNT/AおよびBoNT/AHCを結合するscFv抗体を、そのscFvのC末端にてヘキサヒスチジンタグの融合を生じる発現ベクターpUC119Sfi-NotmycHis中にサブクローニングしたSchierら、1995Immunotech.、1:73-81。そのscFvを、発現させ、そして先に記載される通りに固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製しSchierら、1996JMolBiol.、255:28-43、そして精製したモノマーのscFvの濃度を、1.0のA280nmが0.7mg/mlのscFv濃度に相関すると仮定して分光測光法によって決定した。エピトープマッピングおよび親和性の決定エピトープマッピング研究および動態研究を、BIAcorePharmaciaBiosensorにおける表面プラズモン共鳴を使用して行なった。BIAcoreフローセルにおいて、約600共鳴単位RUのBoNT/AHC10mM酢酸ナトリウムpH4.5中の15μg/mlを、NHS-EDC化学Johnsonら、1991AnalBiochem.、198:268-277を使用して、CM5センサーチップにカップリングさせた。カップリングしたBoNT/AHCのこの量は、100~175RUのscFvRUmaxをもたらした。その表面を、scFvの結合後に4MMgCl2を使用して再生した。エピトープマッピング研究のために、対の各メンバーに結合されたscFvの量RUを決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合したAmersdorferら、1997Infect.Immun.、65:3743-3752。scFvのKdを、BIAcoreにおいて決定した会合速度定数konおよび解離速度定数koffから算出したKd=koff/kon。会合を、50~1000nMのscFvの濃度範囲を使用して、5μl/分の連続的な流れにおいて測定した。そのkonを、lndR/dt/t対濃度のプロットから決定したKarlssonら、1991JImmunolMeth.、145:229-240。そのkoffを、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用することによって、分析したscFvの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。インビトロバイオアッセイインビトロ中和研究を、先に記載される通り、マウス片側横隔膜調製物を使用して行なったDesphande、1995Toxicon、33:551-557。横隔神経-片側横隔膜調製物を、雄CD/1マウス25~33gから切除し、そして135mMNaCl、5mMKCl、1mMNa2PO4、15mMNaHCO3、1mMMgCl2、2mMCaCl2、および11mMグルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、95O2、5COを用いて泡立て、そして36°Cに維持した。横隔神経を、0.2ms持続時間の四角波で0.05Hzにて刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器ModelFT03、Grassを用いて測定した。精製したscFv抗体を、BoNT/Aと一緒にRTにて30分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、2.0×10-8MのscFv最終濃度および2.0×10-11MのBoNT/A最終濃度をもたらした。毒素誘導性の麻痺を、最初の筋肉単収縮の50の減少として規定した。延長の比を、上記抗体による50の減少をBoNT/Aの50の減少で除算した値から算出した。3D12とC25との組み合わせを、各2.0×10-8Mの最終濃度において研究した。50の単収縮減少までの時間の間の差を、有意である0.05未満のP値を用いて両側t検定を使用して決定した。ボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素ドメインの調製精製したボツリヌス毒素血清型A、B、CおよびE150kDaを、USAMRIIDから得た。ボツリヌス毒素A型の結合ドメインBoNT/AHCを、E.coliで発現させ、そしてC末端のHis6タグを利用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィーIMACOphidianPharmaceuticals,Inc.によって精製した。ボツリヌス毒素A型のトランスロケーションドメインBoNT/AHNは、Dr.R.StevensUC-Berkeley、CAからの贈呈であった。表10.免疫性ファージディスプレイライブラリーおよび非免疫性ファージディスプレイライブラリーから選択したBoNT結合scFvの特異性結果免疫性ファージディスプレイライブラリーの合成のためのストラテジー五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア由来のPBLを、scFvファージ抗体ライブラリーを産生するために使用した。上記ドナーのポリクローナル血清は、マウス中和バイオアッセイHathewayら、1984JInfectDis.、150:407-412において、2.56IU国際単位の力価でBoNT/Aに対して保護的であった。VH遺伝子およびVL遺伝子を、RNAから増幅し、スプライシングしてscFv遺伝子レパートリーを作製し、そしてそれを、pCANTAB-5E中にクローニングして7.7×105個の形質転換体のファージ抗体ライブラリーを作製した。15個のランダムに選択したクローンのPCRスクリーニングは、全てが、生殖系列遺伝子特異的な軽鎖プライマーによって決定したところ、完全長の挿入物66がVκ軽鎖を有し、そして34がVλ軽鎖を有するを保有することを示したデータ示さず。ファージ抗体ライブラリーの選択およびELISAスクリーニング免疫性ライブラリーおよび大きな非免疫性ヒトファージ抗体ライブラリーの両方Sheetsら、1997ProcNatl.AcadSciUSA、95:6157-6162を、BoNT血清型A、B、C、EおよびBoNT/AHCに対して選択した。BoNT/AまたはBoNT/AHCに対する3ラウンドの選択後、上記免疫性ライブラリー由来のELISAポジティブクローンの頻度は、それぞれ、79および100であった。ELISA陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。BoNT/AまたはBoNT/AHCに対する3ラウンドの選択後、上記非免疫性ライブラリー由来のELISAポジティブクローンの頻度は、それぞれ、28および94であった。ELISA陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。固有のscFvの数を、DNAフィンガープリントを行ない、次いでDNA配列決定を行なうことによって決定し、そして各scFvの特異性を、ELISAによって決定した。各選択からの100個のクローンのスクリーニングにおいて、48種の固有の抗体23種のBoNT/A、16種のBoNT/B、6種のBoNT/Cおよび3BoNT/Eを、上記免疫性ライブラリーから同定し、そして27種の固有の抗体14種のBoNT/A、5種のBoNT/B、5種のBoNT/Cおよび3種のBoNT/Eを、上記非免疫性ライブラリーから同定した表10。各BoNT/AscFvの詳しい特異性を、組換えBoNT/AHCドメインおよび組換えBoNT/AHNドメインに対するELISAによって決定した図8。毒素に対する選択後に単離された23種の免疫性BoNT/A抗体のうち、6種3A6、3D12、2A1、3B8、3F10、2B11が、BoNT/AHCに結合し、4種3D4、3A11、4A4、3G4が、BoNT/AHNに結合し図8A、そして残りの13種の抗体は、おそらく、上記軽鎖Chenら、1997InfectImmun.、65:1626-1630結合した。これらの知見は、ボツリヌストキソイドによる免疫化が、HCドメインまたはHNドメインに対する数種の抗体によって上記軽鎖に対する免疫応答を導くことを示唆する。BoNT/AHCに対する上記ライブラリーの選択は、単一の固有の抗体2A1のみをもたらし、この抗体は、毒素で選択したクローン3D12および3D6とクローン的に関連した表11。6個の抗HCクローンのVL遺伝子使用を分析した場合、全てが、Vκ1遺伝子ファミリーを使用することを見出した表11が、上記ライブラリーは、2/3のVκ軽鎖遺伝子および1/3のVλ軽鎖遺伝子を含んだ。BoNT/Aホロ毒素に対する非免疫性ライブラリーの選択は、4種の抗体をもたらしたが、これらは、いずれもBoNT/AHCを結合しなかった。BoNT/AHCに対する上記ライブラリーの選択は、10種の固有のscFvをもたらし、それらは、Vκ軽鎖遺伝子またはVλ軽鎖遺伝子の両方を使用した表11。全体として、これらのscFvのうちの50のみが、ホロ毒素を結合し、HC表面のかなりの部分が上記ホロ毒素に埋もれるという観察Lacyら、1998NatStructBiol.、5:898-902と一致した。全てのscFv抗体は、血清型特異的かつドメイン特異的であり、ELISAによって決定したところ、BoNT/AHCドメインおよびBoNT/AHNドメインに結合した非免疫性ライブラリー由来の2B11を除いて、交差反応性は、観察されなかった図8B。表11.BoNT/AおよびBoNT/AHCに対して選択した免疫性ライブラリーならびに非免疫性ライブラリーから単離されたヒトscFv抗体についてのCDR3-配列および親和性aaヒト生殖系列のVHセグメント、VκセグメントおよびVλセグメントは、V-BASEデータベースMRCCentreforProteinEngineering、Cambridge、UKにおいて詳述されるように割り当てられている。列挙したクローン同一のVHCDR3領域またはVLCDR3領域を有するは、生殖系列遺伝子とのそれらの相違によって示されるように、異なるCDR1領域、CDR2領域およびフレームワーク領域を示した;アクセッションは、番号AF090405~AF090420を伴ってGenBankによって行われ得る。bBoNT/Aに対して選択したライブラリー。cBoNT/AHCに対して選択したライブラリー。BoNT/AHC特異的抗体フラグメントのエピトープマッピングBoNT/AHC結合scFvを、認識された重複しないエピトープの数を決定するためにエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも100RUの結合されたscFvを生じる濃度にて、scFvの対を研究するBIAcoreTMにおける表面プラズモン共鳴を使用して行なった。結合されたscFvの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその2種のscFvを、個々のscFvの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。同一のエピトープを認識する抗体は、一緒に注入した場合に、結合されたRUの最小限の増大を示し図9A、一方で、異なるエピトープを認識するscFvは、RUの相加的な増大を示した図9B。表2および表3に示したように、クラスターIと称されるscFv3A6、scFv3D12およびscFv2A1は、VH遺伝子セグメントおよびVL遺伝子セグメントそれぞれ、DP50およびL12の高い相同性を共有し、そして重複するエピトープを認識する。それらは、体細胞変異によって導入される重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子における変異によってのみ、配列において異なる。クラスターIIと称されるscFv3B8およびscFv3F10は、クラスターIと比較して、異なるエピトープに結合する抗体の第2のセットを形成する。可能な固有のエピトープを示すクローン2B11は、乏しい発現レベルに起因して分析できなかった。上記非免疫性ライブラリーに由来するscFv抗体を分析したとき、本発明者らは、全てが、表3に示したような、クラスターIII~クラスターXIと称される固有のエピトープに結合したことを見出した。上記非免疫性ライブラリーのメンバークラスターIII~クラスターXIは、上記免疫性ライブラリーのメンバークラスターIおよびクラスターIIと重複しない結合を示した。上記免疫性scFvおよび非免疫性scFvの両方によって認識されるエピトープは、2種の先に報告されたマウスscFvC25およびS25Amersdorferら、1997Infect.Immun.、65:3743-3752によって結合されるエピトープと重複しない。反応速度測定および中和アッセイkonおよびkoffを、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを、平衡解離定数を算出するために使用した。上記免疫性ライブラリーから選択したscFvは、3.69×10-8Mおよび7.8×10-9MのKdを有し、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルIgGについて報告されたものFooteおよびMilstein、1991Nature、352:530-532に匹敵する値であった表12。非免疫性scFvは、4.6×10-7M~2.61×10-8Mの範囲の、より低いKdを有した。毒素誘導性の神経麻痺を中和するscFvの能力を決定するために、インビトロ研究を、横隔神経-片側横隔膜調製物を使用して、各エピトープクラスター由来の1つの代表的なメンバーについて行なった。値を、BoNT/A単独および2.0×10-8MのscFvの存在下における50の単収縮減少までの時間で報告した。表12ならびに図10Aおよび図10Bに示した通り、異なる抗BoNT/AHCscFvの中和における有意な差が、使用したライブラリーに依存して見出された。上記免疫性ライブラリーから、3D12クラスターIが、神経麻痺までの時間を有意に1.5倍延長したのに対して、3F10クラスターIIは、毒素中和に対する効果を示さなかった。上記非免疫性ライブラリーのうちの代表的なものクラスターIII~クラスターXIは、1.8×10-7Mの最終濃度におけるクラスターIII~クラスターXIの全てのメンバーの組み合わせの後でさえも、上記片側横隔膜アッセイにおいて保護的効果を示さなかった。3D12クラスターIと先に単離されたマウスscFvC25Amersdorferら、1997Infect.Immun.、65:3743-3752との組み合わせを使用する場合、麻痺までの時間は、3.2倍まで有意に増大し、このことは、毒素中和に対する相乗効果を示した。本発明者らは、マウスscFvS25とマウスscFv3D12とによる同様の相乗作用を観察したデータ示さず。表12.ファージ抗体ライブラリーから選択したscFvの、親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和の結果a変動するkonおよびkoffを、表面プラズモン共鳴によって測定し、そしてKdを、koff/konとして算出した。b20nMscFv20pMBoNT/Aを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける50の単収縮減少までの時間分を、BoNT/A単独についての時間と比較した。各値は、少なくとも3回の観察の平均±S.E.M.である。cBoNT/Aに対して選択したライブラリー。dBoNT/Aと比較してP<0.01。e有意ではない。fBoNT/AHCに対して選択したライブラリー。gBoNT/AHCと比較してP<0.01。考察本発明者らは、BoNT/AHCの組換え結合ドメインを用いたマウスの免疫化が、免疫応答を、シナプス前毒素レセプターに対するHC結合に関与するエピトープを結合する抗体の産生に導くことを、先に示したAmersdorferら、1997Infect.Immun.、65:3743-3752。これらの実験は、scFvによる毒素の中和が、レセプター結合部位に関して上記ホロ毒素と競合するscFvの親和性および能力の両方に相関し得ることを示した。ここで、本発明者らは、BoNT/Aに対するヒト体液性免疫応答および非免疫応答をマッピングするために、免疫性ファージディスプレイライブラリーおよび非免疫性ファージディスプレイライブラリーを使用することによって、より系統的なアプローチを実施した。上記2種の抗体ライブラリーのための抗体遺伝子の供給源は、a五価トキソイドA~Eによって免疫化したヒトボランティアのPBL、ならびにb非免疫性の末梢血リンパ球および脾臓細胞であった。このアプローチの1つの制限は、これらの研究のために用いる1人のヒトドナーが、ボツリヌス中毒に対する曝露の際にもたらされる広範な遺伝的多様性を示す程度である。マウスおよびヒトにおける体液性免疫応答がむしろ限定された数の保護的エピトープをもたらしたという事実は、保護を与える抗原性エピトープの顕著な保存を示唆する。選択手順は、4種の固定化されたボツリヌス神経毒素血清型A、B、C、およびEに対して両方のコンビナトリアルライブラリーをパニングすることを包含する。3回~4回のパニング周期の後、この順序BoNT/A、BoNT/B、BoNT/CおよびBoNT/Eで漸減する頻度で、各血清型に対する抗体を両方のライブラリーから得た。バインダーの同様の頻度はまた、BoNT/Bを除いて、非免疫性ライブラリーについて観察された。これらの結果は、SiegelSiegel、1989JClinMicrobiol.、26:2351-2356の知見と相関し、Siegelは、ボツリヌス五価トキソイドの25人のヒトレシピエントからの血清標本を研究した。種々の血清型の免疫原性を、マウス血清中和バイオアッセイによって決定した--血清型Aは、5.7IU/mlと51.6IU/mlとの間の範囲であり、次いで血清型Bは、0.78IU/ml~18IU/mlであり、そして血清型Eは、0.61IU/ml~10IU/mlであった。トキソイドを用いたヒトの免疫化は、HCを結合するより少ない抗体と共に、概して上記毒素軽鎖に対する抗体の産生をもたらした。同様の結果が、BoNT/AHCを用いてマウスを免疫化し、次いでホロ毒素によって追加免疫した後に観察された。抗体の中和活性は、概して、HCによる細胞レセプター結合をブロックすることによって生じるので、これらの分析は、HCワクチンが毒素ベースのワクチンよりも保護的であるより多くのHC抗体が、産生されるからであることを示す。ヒト免疫性HCscFvは、少なくとも2種の重複しないエピトープを認識した。これらのエピトープクラスターIのうちの1種を結合するscFvは、インビトロで毒素を中和し得た。毒素中和の効力は、クラスターIを結合するscFvを、2種の重複しないHCエピトープのうちのいずれか1種を結合する免疫性マウスscFvと組み合わせた場合、増大した。この結果は、HCが、複数の細胞レセプターのいずれかとドッキングすること、またはドッキングが、広範な表面領域にわたって起きることを示唆するMullaneyら、2001InfectImmun.、69:6511-6514。HCを認識するヒトscFvのレパートリーを、BoNT/Aに対する大きな非免疫性ライブラリーを選択することによって他のエピトープクラスターIII~クラスターXIの範囲に拡大した。興味深いことに、この結果は、一次免疫レパートリーは、溶媒が接近可能な抗原の領域の多くを認識し得る抗体を含むが、免疫化は、限定された数の免疫優勢なエピトープに対するこの認識を導くという概念と一致する。しかし、非免疫性ライブラリーから得られた抗体の全ては、非中和エピトープを指向したまたは少なくとも、毒素をインビトロで中和しなかった。中和の不全に関する1つの説明は、そのレセプターに対する上記毒素の高親和性0.3~2.3nMSchengrund、1999JToxicolToxinRev.、18:35-44での相互作用と比較して、上記HCドメインに対する抗体例えば、2B10、2E6、2B1、3D1の低い親和性107~460nMの範囲であるに起因し得た。結論として、本発明者らは、ここで、ボツリヌス神経毒素およびそれらのサブドメインに対して特異的なヒト抗体の、免疫性ヒトドナーおよび非免疫性ヒトドナーから調製したコンビナトリアルライブラリーを使用した首尾よい単離を報告する。感染症または病原体を有する任意の者の抗体レパートリーをスクリーニングするためのファージディスプレイの使用は、治療的潜在性および調査における潜在性を有するヒトモノクローナル抗体の非常に大きなプールの利用を可能にする。実施例4より高い親和性に関して進化した中和抗体ボツリヌス中毒の検出および処置を改良するために、分子進化および酵母ディスプレイを、BoNT血清型ABoNT/Aを結合する2種の中和単鎖FvscFv抗体HuC25および3D12の親和性を増大させるために使用した。mAbHuC25の親和性の成熟BoNT/Aに対するHuC25の親和性を、一連の変異酵母ディスプレイライブラリーを使用して連続的に増大させた図20。第1に、HuC25遺伝子を、NcoI-NotIフラグメントとして酵母ディスプレイベクターpYD2中にサブクローニングした。上記scFv遺伝子は、酵母表面上に首尾よく提示され、そして提示されたscFvの純粋なBoNT/Aに対するKDを、フローサイトメトリーによって決定し、そのKDは、8.44×10-10Mであった図21。これは、BIAcoreにおけるSPRを使用して先に測定したような、組換えBoNT/AHCに対する精製したHuC25scFvの結合について測定したKD1.4×10-9Mに匹敵する。次いでHuC25scFv遺伝子を、誤りを起こしやすい条件を使用したPCRによってランダムに変異させ、そして得られた遺伝子レパートリーをギャップ修復を使用してpYD2中にクローニングして、2.0×105個の形質転換体のライブラリーを作製した図20。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでscFvディスプレイの頻度27および抗原結合の頻度3.65についてフローサイトメトリーによって分析した。次いで上記ライブラリーを、漸減濃度の純粋なBoNT/Aを使用して4ラウンドの選択に供した。上記scFv遺伝子を、選別の最終ラウンド後に得られた6種の個々のクローンからPCRで増幅し、それは、1種の固有の配列AR1の存在を示した図18。scFvディスプレイに含まれるAR1クローンを、増殖させ、そしてBoNT/Aに対する提示されたscFvのKDを、測定し、そのKDは、1.69×10-10MHuC25からの5倍の改良であった図21。親和性をさらに増大させるために、2つの変異酵母ディスプレイライブラリーを、AR1の配列に基づいて構築した。一方のライブラリーについて、AR1scFv遺伝子を、誤りがちのPCRを使用することにってランダムに変異させた;第2のライブラリーについて、位置指定突然変異誘発を、L3における4アミノ酸SNEDを多様化するために使用した。このループを、突然変異誘発のために選択した。なぜならば、これは、ここで変異が親和性を増大させ得ることがAR1の選択から示され、そして誤りを起こしやすい方法がこのループにおいて完全にサンプリングされた変異を有さなかった可能性があったからである。4ラウンドの選択を、各ライブラリーに対して行い、最終ラウンドの解離速度選択ofoffrateselectionを、精製したBoNT/Aを用いて標識化し、次いで再結合を防止するためにBoNT/A結合ドメインHCの存在下において12時間の解離を行なうことによって実施した。次いでBoNT/A標識化酵母を、その毒素の触媒ドメインを結合するmAb7C1を使用して選別した。選別の最終ラウンド由来の個々のクローンのスクリーニングは、その位置指定型ライブラリーに対して野生型AR1配列のみを示し、これは、L3が既に最適化されたことを示唆した。上記誤りを起こしやすいライブラリーから、単一の固有のクローンを、単離しAR2、図18、酵母が提示したscFvとしてのそのKDを、決定し、そのKDは、6.14×10-11M親AR1からの2.8倍の増大であった図21。さらなる酵母ディスプレイライブラリーを、AR2の親和性をさらに増大させるために作製した。これらは、ランダム変異をAR2遺伝子に導入し、かつ2つの位置指定型ライブラリーがH1における5アミノ酸またはL2における4アミノ酸のいずれかを多様化したAR2の配列に基づくライブラリーを含んだ。ライブラリーを、AR1の選択について記載したストラテジーを使用して純粋なBoNT/Aに対して選択し、個々のコロニーを、配列決定し、そして酵母が提示した固有のscFvの親和性を、測定した。より高い親和性のクローンは、誤りを起こしやすいライブラリーまたはL2変異体のライブラリーから同定されなかった。より高い親和性の2種のクローンAR3およびAR41.9×10-11MのKDおよび2.3×10-11MのKDAR2からの親和性の約3倍の増大、図21を、H1ライブラリーから同定した図18。mAb3D12の親和性の成熟親和性の成熟のために、3D12scFv遺伝子を、ファージミドベクターpCANTAB5Eから、NcoI-NotIフラグメントとして酵母ディスプレイベクターpYD2中にクローニングした。次いでランダム変異を、誤りを起こしやすい条件下でPCRを使用して3D12scFv遺伝子に導入し、そして得られた遺伝子レパートリーを、ギャップ修復を使用してpYD2中にクローニングして、2.1×106個の形質転換体のライブラリーを作製した。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでscFvディスプレイの頻度27および抗原結合の頻度3.65についてフローサイトメトリーによって分析した。次いで上記ライブラリーを、漸減濃度の純粋なBoNT/Aを使用して5ラウンドの選択に供した。次いで最終ラウンドの解離速度選択を、精製したBoNT/Aを用いて標識化し、次いで再結合を防止するためにBoNT/A結合ドメインHCの存在下において15時間の解離を行なうことによって実施した。次いでBoNT/A標識化酵母を、その毒素の触媒ドメインを結合するmAb7C1を使用して選別した。上記scFv遺伝子を、選別の最終ラウンド後に得られた6種の個々のコロニーからPCRで増幅し、これは、3種の固有の配列の存在表13、クローン3-1RAZ1としても公知である、図19A、クローン3-8、およびクローン3-10を示した。固有の各クローンを、増殖させ、scFvディスプレイを、誘導し、そしてBoNT/Aに対する提示されたscFvのKDを、野生型3D12scFvと一緒に、フローサイトメトリーを使用して測定した、全3種の変異scFvは、野生型3D12scFvよりも高い親和性を有した。最も高い親和性のscFvRAZ1、図21におけるKDに関して、変異は、そのVL内でCDR1、CDR2、およびCDR3中に全体的に位置した図19A。表13.成熟した親和性の抗体および/または改変した抗体についてのアミノ酸配列完全な重鎖についての配列は、重鎖フレームワーク1重鎖CDR1重鎖フレームワーク2重鎖CDR2重鎖フレームワーク3重鎖CDR3重鎖フレームワーク4である。完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク1軽鎖CDR1軽鎖フレームワーク2軽鎖CDR2軽鎖フレームワーク3軽鎖CDR3軽鎖フレームワーク4である。酵母が提示したscFvのIgGへの変換の、親和性に対する影響多くの免疫学的アッセイ、およびインビボ中和研究のために、IgGを利用する必要がある。したがって、本発明者らは、二重CMVプロモーターによって駆動する哺乳動物発現ベクター中にVH遺伝子およびVk遺伝子を連続的にクローニングすることによって、HuC25、AR1、AR2、AR3、AR4、3D12、およびRAZ1を、ヒトγ1定常領域およびヒトκ定常領域からなる完全長IgGに変換した。安定なCHODG44細胞株を、7種の抗体の各々について確立し、そしてIgGを、上記7種の抗体のうちの6種について5~20mg/Lの収量で細胞培養上清から精製した。本発明者らは、顕著な量のAR3IgGを、全く発現させることができなかった。各IgGの親和性を、反応速度排除分析kineticexclusionanalysisKinexaによって測定した。HuC25ファミリーの変異体の親和性およびRAZ1の親和性は、酵母が提示したscFvよりも、IgGとして顕著に高かったが、そのIgGの親和性の相対的増大は、酵母が提示したscFvに対して決定した相対的親和性と一致した表14。例えば、AR4scFvは、酵母ディスプレイによるHuC25scFvよりも37倍高い親和性を有し、そしてAR4IgGは、Kinexaによって測定したところ、HuC25IgGよりも34倍高い親和性を有した。RAZ1scFvは、酵母ディスプレイによる3D12scFvよりも45倍高い親和性を有し、そしてRAZ1IgGは、Kinexaによって測定したところ、3D12IgGよりも35倍高い親和性を有した。表14.A1毒素およびA2毒素に対する抗体の親和性フローサイトメトリーによるBoNT/Aの検出における親和性の影響酵母上に提示されたより高い親和性のscFvは、酵母が提示したより低い親和性のscFvと比較して、顕著により低い濃度のBoNT/Aを検出できた図22。最も高い親和性のscFvAR4は、0.1pM他の増幅されないBoNT検出システムについて報告されたものよりも低い値程度に低いBoNT/Aを検出できた。したがって、その結果は、検出感度を増加させるための漸増する抗体親和性の有用性を立証する。BoNT/Aの中和に対する親和性の影響野生型抗体およびより高い親和性の抗体を、インビボマウス中和アッセイにおいて研究した。単一の抗体に関して、より高い親和性は、腹腔内にBoNT/Aをチャレンジしたマウスの保護の小さい増大約2倍をもたらし図23、最も高い親和性のAR抗体は、100マウスLD50の毒素に対する完全な保護を提供したが、200LD50に対しては完全な保護を提供しなかった。2種の抗体を組み合わせた場合、保護は、顕著に増大し、AR43D12の組み合わせは、保護の約2倍2500LD50から5000LD50までの増加を提供した。RAZ1を、その抗体の対において3D12に対して置換した場合、保護は、AR4とRAZ1との組み合わせについて、10,000マウスLD50を超えて見られた。したがって、そのデータは、抗体の組み合わせにおいてより高い親和性の抗体を使用することがより強力な毒素中和を生じることを示す。これは、3種の抗体の組み合わせについて、よりさらに明確である表15。表15.抗体の組み合わせの中和の効力ここで、HuC25/B4/3D12またはRAZ1の組み合わせにおける、より高い親和性のRAZ1による3D12の置換は、10,000LD50チャレンジ用量の毒素における完全な保護を提供する。上記組み合わせにおける野生型3D12に関して、10,000LD50にてチャレンジしたマウスは、生存しない。より高い親和性のING1によるB4の置換、およびより高い親和性のCR1によるHuC25の置換は、10,000LD50チャレンジ用量の毒素における80の生存を依然として伴いつつ、抗体用量の50ugから1ugまでの減少を可能にする。したがって、抗体の組み合わせにおいて使用される単一の抗体の親和性を増大させることは、効力を増大させ、かつ抗体用量の減少を可能にする。実施例5ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーションは、抗体結合および中和に影響する材料および方法毒素遺伝子配列NCBIデータベースおよびMedlineを、ボツリヌス神経毒素遺伝子またはボツリヌス神経毒素タンパク質の公開された配列あるいは記録された配列を同定するために検索した。クロストリジウム属の株FRI-A2Hの神経毒素遺伝子を、この研究のために配列決定した調製における書き写し。Clostridial株の神経毒素遺伝子配列は、MichaelPeckからの贈呈であった。遺伝子配列を、ベクターNTIInvitrogen、SanDiego、CA中に入れ、翻訳させ、血清型によって分類し、そして整列した。系統樹を、ClustalWを使用して構築した。毒素および抗体精製した純粋でありかつ複合体形成したボツリヌス神経毒素A1HallhyperおよびA2FRI-A2Hを、MetabiologicsIncMadison、WIから購入した。抗体S25およびC25を、免疫化されたマウスAmersdorferら、1997Infect.Immun.65:3743-3752;Nowakowskiら、2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99:11346-50のV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。抗体3D12を、免疫化されたヒトボランティアドナーAmersdorferら、2002Vaccine20:1640-1648;Amersdorferら、1997Infect.Immun.65:3743-3752のV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。抗体B4を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の免疫化されたトランスジェニックマウスXenoマウスI.GerenおよびJ.D.Marksが考案したのV遺伝子から構築した単鎖Fvファージディスプレイライブラリーから得た。これら4種の抗体の各々のV遺伝子を、先に記載される通りに、ヒトIgG1定常領域およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングしたNowakowskiら、2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99:11346-50。安定なCHODG44細胞株を確立し、そしてIgGを、先に記載される通りに、プロテインGを使用して精製したNowakowskiら、2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99:11346-50。抗体の純度および濃度を、SDS-PAGEおよび280nmにおける吸光度によって決定した。抗体9D8マウスIgG1/κおよび7C1マウスIgG1/κを、rBoNT/AHCによって免疫化し、そしてBoNT/A毒素によって追加免疫したマウスから産生したハイブリドーマから得た。IgGを、プロテインGを使用してハイブリドーマ上清から精製し、そして純度および濃度を、SDS-PAGEおよびBCAアッセイPierceChemicalCo.によって決定した。次なる研究のために、IgG抗体を、約1~3mg/mlにてPBSpH7.4中に保存した。毒素捕捉ELISA毒素捕捉ELISAのために、96ウェルマイクロタイタープレートImmunolon2、Dynatechを、2μg/mlの抗体を用いて4°Cにて一晩コーティングした。5脱脂乳-PBSにおいて30分間ブロックした後、毒素を、100nMから1pMまで、二連で3.2倍希釈half-logdilutionに適用し、そして37°Cにて90分間インキュベートした。プレートを、洗浄し、そしてウマ抗BoNT抗体PerImmuneと一緒にインキュベートし、0.2IU/mlまで希釈し60分間、次いで洗浄し、そして1:1000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼKPLに結合体化したヤギ抗ウマ抗体と一緒に60分間インキュベートした。プレートを、ABTSKPLによって発色させた。バックグラウンドコントロールの減算後の405nmにおける平均吸光度を、毒素濃度に対してプロットした。毒素に対する抗体親和性の測定精製したBoNT/A1毒素または精製したBoNT/A2毒素についてのIgG会合速度定数およびIgG解離速度定数を、BIAcore1000PharmaciaBiosensorにおける表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを使用して、先に記載される通りにKDを算出したNowakowskiら、2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99:11346-11350。簡潔には、約100~400RUの精製したIgG10mMアセテートpH3.5~4.5中の10~20ug/mlを、NHS-EDC化学を使用してCM5センサーチップにカップリングさせた。精製したBoNT/A1神経毒素または精製したBoNT/A2神経毒素についての会合速度定数を、50~800nMの範囲の毒素濃度を使用して、15μl/分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数konを、lndR/dt/t対濃度のプロットから決定した。解離速度定数koffを、再結合を防止するために30μl/分の流速を使用して、分析した毒素の最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。KDを、koff/konとして算出した。インビボ毒素中和の測定50μgの適切なIgGを、0.5ml総容量のゼラチンリン酸緩衝液中のBoNT/A1神経毒素複合体Hall株の示された数のマウスLD50またはBoNT/A2神経毒素複合体FRI-A2H株の示された数のマウスLD50に添加し、そしてRTにて30分間インキュベートした。mAbの対に関して、25μgの各mAbを添加し、そして3種のmAbの組み合わせに関して、16.7μgの各mAbを添加した。次いでその混合物を、雌CD-1マウス受領時に16~22gに対して腹腔内に注射した。マウスを、10の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の5日後に決定した。マウスを使用した研究を、動物保護法および他の連邦法令ならびに動物および動物に関する実験に関する規制に従って行い、そしてこの研究は、GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals、NationalResearchCouncil、1996に記述される原則を遵守する。この調査が行われた施設は、AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareInternationalによって完全に認定される。結果ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーション毒素血清型内の配列変異性の程度を決定するために、60種の公開された神経毒素配列を示す文献を、検索した。このデータは、49種の完全な毒素遺伝子配列および11種の部分的な毒素遺伝子配列を含んだ表16。上記49種の完全な配列を、血清型によって分類し、整列し、そして配列同一性の程度を決定した表17および図11。分析した49種の配列のうち、7種のBoNT/A、9種のBoNT/B、6種のBoNT/C、5種のBoNT/D、17種のBoNT/E、4種のBoNT/F、および1種のBoNT/Gが存在した。血清型内で、2つの型の毒素遺伝子配列が、観察された;互いに実質的に同一である配列下記参照およびアミノ酸レベルで少なくとも2.6異なる配列。このような配列変異性は、1種より多い毒素遺伝子が配列決定されている全6種の血清型BoNTA、BoNTB、BoNTC、BoNTD、BoNTE、およびBoNTF内で観察された。血清型内で、変異性は、高くてBoNT/Fについての32~低くてBoNT/Eについての2.6の範囲であった表17。3種のBoNTC/Dモザイク株および2種のBoNTD/Cモザイク株を、配列決定した。これらの株は、代表的に、それらの親血清型に対応した軽鎖およびN末端の重鎖を含み、その神経毒素配列の末端の3分の1は、そのモザイク株の代わりの血清型との強力であるが、絶対的ではない同一性を有する表16。表16.配列分析において使用したクロストリジウム属の株:アクセッション番号は、NCIヌクレオチドデータデースからのものである90より多くのヒトボツリヌス中毒を引き起こす2種の毒素血清型BoNT/AおよびBoNT/BControl、1998BotulismintheUnitedStates、1899-1998.Handbookforepidemiologists、clinicians,andlaboratoryworkers.Atlanta、GeorgiaU.S.DepartmentofHealthandHumanServices、PublicHealthService:downloadableatwww.bt.cdc.gov/agent/botulism/index.aspにてダウンロード可能であるを、より詳細に分析した。7種の公開されたBoNT/A毒素配列のうち、5種62A、NCTC2916、ATCC3502、およびHallhyperHallAllerganは、実質的に同一99.9~100の同一性であり、そしてそれらは、サブタイプA1として分類されている図12A。他の2種のBoNT/A配列Kyoto-FおよびFRI-A2Hは、100同一であり、そしてサブタイプA2として分類されている図12A。A1毒素は、A2毒素と10.1異なり、これは、レセプター結合ドメインC末端重鎖、HC中の配列における最も大きな相違である表18。数かより多いことに加えて、HCアミノ酸の相違は、毒素表面上に露出した溶媒が接近可能なアミノ酸に存在する傾向にあった図12B。多くのこれらの相違は、推定上のガングリオシド結合部位の周りに集まっていた図12B。触媒ドメイン軽鎖の配列は、より保存されており表18、1は、より埋められるようである相違を有する図12B。表17.クロストリジウム属のボツリヌス神経毒素遺伝子配列の分類:サブタイプを、アミノ酸レベルにて少なくとも2.6異なるものとして規定した表18.BoNTA1株とBoNTA2株との間のアミノ酸同一性9種の公開されたBoNT/B配列は、DNAの相同性およびタンパクの質相同性に基づいて4種のサブタイプにグループ分けされ得た図13。これらの群は、二価BoNT/BBoNTAb1436、BoNTAb588、BoNTAb593、およびBoNTBf3281、BoNT/B1BoNT/BDanish、BoNT/B2BoNT/B株111、および非タンパク質分解性BoNT/BBoNT/BEklundを含んだ。これらの毒素は、その軽鎖と比較して、その重鎖においてより大きい相違を伴って、アミノ酸レベルにて互いと3.6~7.7異なる表19。表19.BoNTB株の間のアミノ酸同一性BoNT/A毒素配列バリエーションおよび抗体結合の影響免疫の認識に対するBoNT/A毒素配列変異性の影響を決定するために、本発明者らは、捕捉ELISAによって、BoNT/A1に対して惹起された6種のモノクローナル抗体のBoNT/A1およびBoNT/A2に結合する能力を測定した。純粋な神経毒素および神経毒素複合体の両方に対する結合を、決定した。4種のmAb3D12、C25、B4、およびS25は、組換えHCに対するELISAによって決定したところ、BoNT/AHC上の重複しないエピトープを結合した。3D12およびS25は、先に、BoNT/AHCのC末端サブドメインに対してエピトープマッピングされており、一方で、C25は、2つのHCサブドメインによって形成された複合体エピトープを認識するMullaneyら、2001Inf.Immun.、69:6511-6514。1種のmAb9D8は、組換えHNに対するELISAによって決定したところ、BoNT/AトランスロケーションドメインHNを結合したデータ示さず。1種のmAb7C1は、組換え軽鎖に対するELISAによって決定したところ、BoNT/A軽鎖を結合した。BoNT/AHCを結合した4種の抗体のうちの3種は、BoNT/A2毒素と比較して、BoNT/A1毒素に対する結合において著しい減少を示した図14。対照的に、非HC結合mAbは、かなりのELISAシグナルを、A1毒素およびA2毒素の両方において示した図15。A1毒素およびA2毒素に対する結合における差を定量するために、平衡解離定数および結合速度動態を、精製したA1毒素および精製したA2毒素に対する各mAbの結合について測定した表17。全てのmAbは、A1毒素を高親和性6nMと0.17nMとの間の範囲のKDで結合した。A2毒素に対する減少した結合を示した捕捉ELISAによる3種のmAbC25、S25、およびB4は、A1毒素と比較して、A2毒素に対する親和性の553倍~1200より大きい減少を示した。BoNT/A2に対するB4mAb結合についてのKDすることは、非常に低い親和性結合に起因して不可能であった。親和性の減少の大部分は、会合速度定数の大きな減少に起因した表20。対照的に、3種のmAb3D12、9D8および7C1は、A1毒素およびA2毒素の両方に対するかなりの高親和性を示した。表20.BoNT/A1およびBoNT/A2に対するBoNT/AIgG結合についての、会合速度定数konおよび解離速度定数koffならびに平衡解離定数Kd:会合速度定数および解離速度定数を、BIAcoreにおける表面プラズモン共鳴によって決定しそしてKDを、koff/konとして算出したNM=測定不能A1神経毒素およびA2神経毒素の中和に対する抗体結合の影響本発明者らは、先に、本明細書で記載した3種のmAb3D12、S25、およびC25のBoNT/A1毒素に対するインビボ中和能を研究した。BoNT/A1の顕著なインビトロ中和を示すにもかかわらず、これら3種のmAbは、50ugの抗体を受容し、かつ20マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジしたマウスの顕著なインビボ保護を示さなかった10~20のみの生存Nowakowskiら、2002Proc.Natl.Acad.Sci.USA、99:11346-11350。同様に、本明細書で報告した残りの3種のmAbは、マウスを20マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジした場合に、顕著なインビボ保護を示さなかった10~20のみの生存、データ示さず。本発明者らは、mAbを組み合わせた場合のインビボ保護における顕著な相乗作用を先に報告したので、本発明者らは、mAbの対およびトリプレットのインビボで毒素を中和する能力を研究した。先に観察した通り、抗体の対は、単一のmAbよりも顕著に大きいBoNT/A1中和を示し、さらに大きい効力が、3種のmAbの組み合わせについて観察された図16および17A。相乗効果は、1種のみの結合ドメイン抗体を含んだmAb対C259D8または非結合ドメイン抗体を含んだmAb対9D87C1図16、または1種のみの結合ドメイン抗体を含んだ3種のmAbの組み合わせC259D87C1図17Aについて観察された。BoNT/A2毒素の中和に関して、BoNT/A2を高親和性で結合したmAbを含むmAbの対またはトリプレットのみが、中和について顕著な相乗作用を示した図17B。最も強力なmAbのトリプレット3D129D87C1は、10,000マウスLD50のA1毒素またはA2毒素のチャレンジからマウスを完全に保護できた。この組み合わせ3D129D87C1は、A1毒素の中和について3種の結合ドメインmAbの組み合わせC253D12B4ほど強力ではなく、一方で、1種のみの結合ドメインmAbは、A2毒素を任意の親和性で結合し、そして結果として、C253D12B4のトリプレットは、200マウスLD50未満のA2毒素を中和した。考察49種の公開された完全なボツリヌス神経毒素配列の分析は、毒素遺伝子配列が、血清型内で、実質的に同一であるかまたはアミノ酸レベルで互いと少なくとも3.6異なるかのいずれかであったことを示した。本発明者らは、この最小限の相違3.6を有するそれらの毒素を、所与の血清型のサブタイプであると称している。このような分析は、1種より多くの毒素遺伝子が配列決定されている6種の血清型について、平均で2.8個のサブタイプを示した1種の血清型あたり2個~4個の範囲のサブタイプ。この分析は、おそらく、最も頻繁な毒素サブタイプを示す一方で、さらなる毒素サブタイプが、同定され続ける比較的少数の配列決定された毒素遺伝子が与えられる1種の血清型あたり平均で8種の毒素遺伝子ようである。毒素サブタイプの重要性は、診断的検査および毒素の治療の開発に対するそれらの影響である。明確には、ヌクレオチド多型性のこのレベルは、DNAプローブベースのアッセイ例えば、PCRに影響し得る。重要なことに、アミノ酸置換の程度は、ELISAおよび他の免疫学ベースの診断的試験に使用されるモノクローナル抗体の結合に影響し得る。本発明者らは、BoNT/A1サブタイプとBoNT/A2サブタイプとの間の10のアミノ酸の相違が、分析した6種のモノクローナル抗体のうちの3種の結合親和性およびELISAシグナルに対して劇的な影響を有することを明確に示した。興味深いことに、mAb親和性の減少についての動態の基礎は、概して、解離速度定数の増加よりもむしろ会合速度定数の減少に起因する。毒素アミノ酸配列における相違のポリクローナル抗体の結合に対する影響は、未知である。明確には、免疫学的認識に基づく毒素アッセイは、異なる毒素サブタイプを使用して検証される必要がある。結合親和性の差は、インビボ毒素中和の効力の顕著な差へと変化する。本発明者らは、単一のmAbによる強力なインビボ毒素中和を観察しなかったので、本発明者らは、mAbの組み合わせの効力に対する毒素配列のバリエーションの影響を研究した。結合研究と同様に、A1サブタイプおよびA2サブタイプの両方に強固に結合するmAbの組み合わせのみが、インビボで強力に毒素を中和した。したがって、効力に対するサブタイプ変異性の影響は、抗体ベースの毒素治療の開発において、このような治療がオリゴクローナル性であるかポリクローナル性であるかにかかわらず評価されなくてはならない。同様に、単一のサブタイプに基づく毒素ワクチンは、関連するサブタイプから保護するそれらの能力について評価される必要があり得る。これらの研究における予想外の発見は、BoNTのトランスロケーションドメインおよび/または触媒ドメインに対するmAb結合が、互いと組み合わせたか、またはBoNTレセプター結合ドメインHCを認識するmAbと組み合わせたかのいずれかの場合に、中和活性を有したことであった。中和活性はまた、破傷風毒素の触媒ドメインKozakiら、1995Microbiol.Immunol.、39:767-774を結合するmAbおよびリシンLangら、1993J.Immunol.151:466-472を結合するmAbについて報告されている。BoNTレセプター結合ドメインに結合しないmAbは、細胞レセプターに対するBoNT結合ドメインエピトープの相互作用、およびその後のBoNTのエンドサイトーシスを厳密にブロックできないので、それらが中和に寄与する機構は、未知のままである。可能性としては、複数のmAbの結合の際の循環からのBoNTのクリアランスの上昇Montero-Julianら、1995Blood85:917-924、立体化学的な効果によるレセプター結合の妨害、必要とされる細胞内の毒素プロセスエンドソーム脱出または触媒活性の妨害KoriazovaおよびMontal、2003Nat.Struct.Biol.、10:13-18、および/またはBoNT細胞内輸送の変化が挙げられる。上記機構にかかわらず、非結合ドメインmAbの毒素を中和する能力は、中和mAbの産生に利用可能なエピトープの数を顕著に増加させ、全てのBoNTサブタイプを結合および中和するmAbの発見の尤度を増加させる。本発明者らは、抗体結合および単一の血清型BoNT/Aについての中和に対する配列変異性の影響のみを研究したが、3種の血清型BoNT/C、BoNT/D、およびBoNT/Fは、BoNT/A1とBoNT/A2との間の10より大きい相違10.7~31.6で互いと異なるサブタイプを有する。これらの3種の血清型に関して、免疫の認識に対する配列変異性の影響は、BoNT/Aの影響より大きいようである。2種の血清型BoNT/BおよびBoNT/Eについて、配列変異性は、BoNT/Aについて観察されるものより低い2.6~7.6。このレベルの配列変異性の影響は、評価される必要があるが、それは、BoNT/B毒素に結合するmAbの以前の評価Gibsonら、1988J.Appl.Bacteriol.、64:285-291;Kozakiら、1998Infect.Immun.、66:4811-4816およびBoNTEに結合するmAbの以前の評価Kozakiら、1986Infect.Immun.、52:786-791において示される通り、明確に、mAb結合に影響し得る範囲にある。結論として、本発明者らは、7種のボツリヌス神経毒素血清型のうちの6種内でかなりの配列変異性が存在することを報告し、そしてこのレベルの変異性が抗体結合および中和に著しく影響し得ることを示す。このような毒素の多様性の完全な範囲を決定することは、ボツリヌス毒素の免疫学的なアッセイ、治療およびワクチンの開発において重要な工程である。一旦配列変異性が規定されると、いくつかのこれらの毒素改変体は、検出アッセイ、治療、およびワクチンの確認のために生産される必要があるようである。実施例6BoNT/AサブタイプA1、A2、およびA3の交差中和crossneutralizationのために選択され、そして進化させた中和抗体ボツリヌス神経毒素BoNT/Aが挙げられるの異なるサブタイプの発見は、診断的抗体および治療的抗体の開発に対する挑戦をもたらす。理想的には、mAbまたはmAbの混合物は、異なるBoNTサブタイプの大部分または全てに結合し、そしてそれらを検出/中和する。これは、いくつかのサブタイプの検出に失敗しなかった検出システムをもたらす。治療的抗体について、交差反応性は、その抗体が上記サブタイプの1種以上を中和し損なわないことを確実にする。BoNT/A1およびBoNT/A2に結合する抗体の選択BoNT/A1およびBoNT/A2を結合し得るモノクローナル抗体を産生するために、免疫性ファージscFv抗体ライブラリーまたは免疫性酵母scFv抗体ライブラリーを、最初はBoNT/A1に対し、次いでBoNT/A2に対して連続的に選択した。複数のラウンドの選択後、ファージ抗体または酵母抗体を、両方のBoNTサブタイプに対する結合についてスクリーニングした。2種のscFv抗体を、BoNT/A1およびBoNT/A2の両方を匹敵する親和性で結合した抗体を同定したING1、scFvKDBoNT/A1=1.17×10-9M;scFvKDBoNT/A2=1.18×10-9M:およびING2、scFvKDBoNT/A1=4.17×10-10M;scFvKDBoNT/A2=4.5×10-10M。ING1およびING2の配列については、表13を参照のこと。インビボ研究のために、これら2種のscFvを、IgGに変換した。そのIgGは、A1BoNTおよびA2BoNTの両方に対して、高親和性の結合を維持した表21。表21.BoNT/A1およびBoNT/A2の両方を高親和性で結合する交差反応性であるIgGの親和性:親和性および結合動態を、フロー蛍光定量法によって決定したBoNT/A1およびBoNT/A2の両方を高親和性で結合し得るHuC25改変体の産生HuC25もそのより高い親和性の誘導体も、BoNT/A2を高親和性で結合するboNt/A1およびBoNT/A2に対するAR2の親和性については、表22を参照のこと。BoNT/A2に対する親和性を増大させるために、本発明者らは、より高い親和性の改変体AR2を用いて開始した。IgGとしてのこの抗体は、10,000より多い、BoNT/A1よりも低い親和性をBoNT/A2に対して有し、そしてBoNT/A2に対する2.0×10-7Mの非常に低い親和性を有する表22。表22.BoNT/A1およびBoNT/A2に対するAR2IgGならびに酵母が提示したscFvの親和性および結合動態AR2変異体のライブラリーを、スパイクオリゴヌクレオチドspikedoligonucleotideまたは誤りがちのPCRを使用して産生し、そしてその変異体は、scFvとして酵母の表面上に提示された。ライブラリーを、最初はBoNT/A1に対し、そしてBoNT/A2に対して連続的に選択し、変異体WR1TKDBoNT/A2=3.7nM、WR1VKDBoNT/A2=9.0nMおよびCR1KDBoNT/A2=850pMを産生した配列については表20。最も高い親和性のscFvであるCR1を、IgGに変換し、そのIgGは、親AR2IgGと比較して、約80倍の、より高い親和性をBoNT/A2毒素に対して有し、一方でBoNT/A1に対するその親和性もまた約10倍増大した表23。BoNT/A2に対する親和性をさらに増大させるために、CR1scFv遺伝子を、ランダムに変異させ、酵母上に提示させ、そしてより高い親和性のscFvを、BoNT/A1およびBoNT/A2に対して連続的に選択し、変異体CR2をもたらした配列については、配列表または表13を参照のこと。IgGへの変換後、CR2は、CR1よりも約6倍高い親和性をBoNT/A2に対して有し、そしてBoNT/A1に対して高親和性の結合を維持した表23。表23.フロー蛍光定量法によって決定した場合の、BoNT/A1およびBoNT/A2に対するAR2IgG、CR1IgG、ならびにCR2IgGの親和性および結合動態BoNT/A2に対するより高い親和性を有する抗体は、BoNT/A2を高い効力で中和する実施例5において、抗体HuC25と、B4と、3D12との組み合わせの50ugが40,000マウスLD50のBoNT/A1しかし、200LD50未満のBoNT/A2を中和し得ることを示した。B4もHuC25も、BoNT/A2を高親和性で結合した。したがって、本発明者らは、HuC25に由来するがBoNT/A1およびBoNT/A2に対して高親和性を有するCR1抗体RAZ1、およびING1またはING2のいずれかと組み合わせたの、BoNT/A1およびBoNT/A2を中和する能力を研究した。50ug全抗体の抗体用量を使用して、CR1RAZ1ING1またはING2のいずれかの組み合わせは、40,000マウスLD50のBoNT/A1によってチャレンジしたマウスを完全に保護した。同用量の抗体は、BoNT/A2によってチャレンジしたマウスの顕著な保護を示し、組み合わせCR1RAZ1ING1が、最も強力であり、それは、40,000マウスLD50のBoNT/A2によってチャレンジしたマウスを完全に保護した図25。したがって、本発明者らは、複数のBoNTサブタイプこの場合において、BoNT/A1およびBoNT/A2を高親和性で結合し得る抗体を産生し、そして進化させることが可能であること、およびこれが、抗体が組み合わせられる場合に強力な中和をもたらすことを示した。本明細書中に記載される実施例および実施形態は例示をのみを目的としていること、ならびにそれらを考慮した種々の改変および変更は当業者に対して示唆され、かつ本願の精神および全範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが、理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される。"