無血清培地で、胚様体を形成させず、かつ異種細胞と共培養することなく多能性幹細胞を培養する工程を含む、中胚葉細胞の製造方法。BMP4およびVEGFを含むサイトカインを無血清培地へ添加する、請求項1に記載の方法。前記中胚葉細胞を製造する方法は以下の工程を含む、請求項2に記載の方法。1BMP4を含む無血清培地で多能性幹細胞を培養する工程、および2工程1で得られた細胞をVEGFを含む無血清培地で培養する工程。工程2の無血清培地がさらにSCFを含む、請求項3に記載の方法。工程1および2の無血清培地がさらにWnt3aを含む、請求項3に記載の方法。前記中胚葉細胞を製造する方法は、以下の工程を含む、請求項5に記載の方法。1BMP4を含み、Wnt3aを含まない培地で多能性幹細胞を培養する工程、2工程1で得られた細胞をBMP4およびWnt3aを含む培地で培養する工程、および3工程2で得られた細胞をVEGFおよびWnt3aを含む培地で培養する工程。前記培養は、Matrigel商標でコートされた培養器で行われる、請求項3に記載の方法。前記工程1が4日間行われる、請求項3に記載の方法。前記工程2が2日間行われる、請求項3に記載の方法。前記工程1が1日間行われる、請求項6に記載の方法。前記工程2が3日間行われる、請求項6に記載の方法。前記工程3が2日間行われる、請求項6に記載の方法。前記中胚葉細胞が、KDR陽性およびCD34陽性細胞を含む、請求項1に記載の方法。a請求項1に記載の方法で中胚葉細胞を製造する工程、およびbaの中胚葉細胞から造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球を製造する工程を含む、造血幹細胞、造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球の製造方法。前記工程bは工程aで得られた中胚葉細胞を造血因子の存在下で培養することによって行われる、請求項14に記載の方法。前記造血因子が、SCF、TPO、EPO、IL3、Flt3ligand、FP6およびGCSFからなる群より選ばれる、請求項15に記載の方法。前記工程bが9日以上の間行われる、請求項14に記載の方法。本発明を以下に詳細に説明する。本発明は、上記のとおり、無血清培地で、胚様体を形成させずに、かつ、異種細胞と共培養することなく多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞から中胚葉細胞を製造する方法に関する。<多能性幹細胞>本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞、精子幹細胞GS細胞、胚性生殖細胞EG細胞、人工多能性幹細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。胚性幹細胞ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚例えば胚盤胞の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見されNature292154156、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立されたScience28211451147JAThomsonetalProcNatlAcadSciUSA9278447848JAThomsonetalBiolReprod55254259JAThomsonandVSMarshallCurrTopDevBiol38133165。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子、塩基性線維芽細胞成長因子などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばHSuemorietalBiochemBiophysResCommun345926932MUenoetalProcNatlAcadSciUSA10395549559;HSuemorietalDevDyn222273279HKawasakietalProcNatlAcadSciUSA9915801585などに記載されている。ES細胞作製のための培地として、例えば01mM2メルカプトエタノール、01mM非必須アミノ酸、2mMLグルタミン酸、20KSR及び4ngmlβ‐FGFを補充したDMEMF12培地を使用し、37°C、2CO298空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができるNatBiotechnol26215224。また、ES細胞は、3~4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mMCaCl2及び20KSRを含有するPBS中の025トリプシン及び01mgmlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct34、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてRealTimePCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT34、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができるNatBiotechnol26443452。ヒトES細胞株である例えばKhES1、KhES2及びKhES3は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。精子幹細胞精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつBiolReprod69612616KShinoharaetalCell11910011012。神経膠細胞系由来神経栄養因子を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる実験医学26巻5号41~46頁羊土社。胚性生殖細胞胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうるCell70841847JLResnicketalNature359550551。人工多能性幹細胞人工多能性幹細胞は、ある特定の再プログラミング因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞であるKTakahashiandSYamanakaCell126663676KTakahashietalCell131861872JYuetalScience31819171920NakagawaMらNatBiotechnol26101106;国際公開WO2007069666。再プログラム化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であれば良く、特に限定されないが、例えばOCT34、SOX2及びKLF4;OCT34、KLF4及びCMYC;OCT34、SOX2、KLF4及びCMYC;OCT34及びSOX2;OCT34、SOX2及びNANOG;OCT34、SOX2及びLIN28;OCT34及びKLF4などの組み合わせである。これらの因子は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター以上、Cell126pp6636762006Cell131pp8618722007Science318pp191719202007、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子、βグルクロニダーゼ、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、再プログラミング化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する再プログラミング化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にloxP配列を有してもよい。再プログラム化に際して、誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼHDAC阻害剤[例えば、バルプロ酸795797、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA例、HDAC1siRNASmartpoolO、HuSH29mershRNAConstructsagainstHDAC1等等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤例えば5’azacytidineNatBiotechnol26795797、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX01294等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA例、G9asiRNA等等の核酸性発現阻害剤など]、Lchannelcalciumagonist、p53阻害剤例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA、UTF1、WntSignaling例えばsolubleWnt3aCellStemCell3132135、2iLIF22372247、miR2913p、miR294、miR295などのmiRNA等を使用することができる。iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば10~15FBSを含有するDMEM、DMEMF12又はDME培地これらの培地にはさらに、LIF、penicillinstreptomycin、puromycin、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。、bFGF又はSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地又は霊長類ES細胞培養用培地例えば霊長類ヒトサルES細胞用培地、リプロセル、京都、日本、などが含まれる。培養法の例としては、たとえば、37°C、5CO2存在下にて、10FBS含有DMEM又はDMEMF12培地上で体細胞と再プログラム化因子を接触させ約4~7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞上にまきなおし、体細胞と再プログラム化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30~約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。あるいは、その代替培養法として、37°C、5CO2存在下にて、フィーダー細胞上で10FBS含有DMEM培地これにはさらに、LIF、ペニシリンストレプトマイシン、ピューロマイシン、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。で培養し、約25~約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、通常、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103~約5×106細胞の範囲である。マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地選択培地で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。本明細書中で使用する体細胞なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞をいう。体細胞には、非限定的に、胎児の体細胞、新生児の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含されるし、さらにまた、組織幹細胞や組織前駆細胞も包含される。具体的には、体細胞は、非限定的に、例えば1神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞体性幹細胞、2組織前駆細胞、3リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞皮膚細胞等、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞などを包含する。核移植により得られたクローン胚由来のES細胞ntES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有しているTWakayamaetalScience292740743SWakayamaetalBiolReprod72932936JByrneetalNature450497502。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がntES細胞である。ntES細胞の作製のためには、核移植技術JBCibellietalNatureBiotechnol16642646とES細胞作製技術との組み合わせが利用される実験医学26巻5号47~52頁。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。<多能性幹細胞の中胚葉細胞への分化誘導方法>本発明において、中胚葉とは、発生の過程で体腔およびそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓血管血管内皮も含む、血液血液細胞も含む、リンパ管や脾臓、腎臓および尿管、性腺精巣、子宮、性腺上皮をつくる能力を有した細胞から構成される胚葉を包含する。例えば、T、KDR、FOXF1、FLK1、BMP4、MOX1およびSDF1のようなマーカーの発現により示される。好ましくは、TおよびKDRを発現する細胞である。本発明において、中胚葉細胞は他の細胞と分離される必要はない。中胚葉細胞は造血幹細胞や造血前駆細胞とともに含まれていてもよい。本発明において、造血幹細胞とは、T細胞、B細胞、赤血球、血小板、好酸球、単球、好中球、好塩基球などの成熟血液細胞を作り出す能力を有し、かつ自己複製能を有する細胞をいう。また上記造血前駆細胞とは造血幹細胞より分化が進み、細胞の分化の方向が決定した細胞であり、自己複製能をもたない細胞をいう。いずれの細胞も、例えば、特に限定されないが、KDR、CD34、CD90およびCD117のようなマーカーの発現により示される。本発明の多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化誘導方法においては、多能性幹細胞は、無血清培地で、胚様体を形成させず、かつ、異種細胞と共培養せずに培養される。血清としてはヒト血清、サル血清、ウシ胎児血清、ウシ血清、ブタ血清、ウマ血清、ロバ血清、ニワトリ血清、ウズラ血清、羊血清、ヤギ血清、イヌ血清、ネコ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清及びマウス血清が例示され、血清を用いない培養条件とは、上記血清を含まない培地で培養することを意味し、好ましくは培地に含有される成分が明確であり、より好ましくは、アルブミンまたはアルブミン代替物、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、インシュリンまたはインシュリン代替物、および亜セレン酸のいずれか一つを含有した培地で培養してもよい。本発明において、好ましい培地とは、基本培地に、さらにサイトカインを加えて作製されてもよい。ここで、基本培地には、最小必須培地MEM、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、イスコフ改変ダルベッコ培地IMDM、HematopoieticStemCellExpansionMediumなどを用いてもよい。本発明において、好ましい培地は、インスリン、トランスフェリンおよびセレニウムを含むStemlineIIである。StemlineIIはSigmaAldrichCorporationから製品番号S0192として購入できる。インスリン、トランスフェリンおよびセレニウムの混合物はSigmaAldrichCorporationからITSXサプリメントとして購入できる。分化効率の観点から、培養は低酸素条件で行われてもよい。本発明において、低酸素条件とは、20未満、好ましくは10未満、より好ましくは5未満であるただし、これらには限定されない。より好ましくは、本発明の方法において、多能性幹細胞は下記の工程により培養され、中胚葉細胞を生成する。1多能性幹細胞をBMP4を含む無血清培地で培養する、および21で得られた細胞をVEGFを含む無血清培地で培養する。上記方法において、工程2の培地はさらにSCFを含むことが好ましい。他の態様では、上記方法において、工程1および2の培地は、さらにWnt3aを含む。さらに好ましくは、上記中胚葉細胞の製造方法は、次の工程を含む。i多能性幹細胞をBMPの存在下、Wnt3aなしで培養する、工程で得られた細胞をBMP4とWnt3aの存在下で培養する、および工程iiで得られた細胞をVEGFとWnt3aの存在下で培養する。工程2または工程iiiの後に得られた細胞は、中胚葉細胞に加えて、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞をいくらか含む。しかしながら、工程2または工程iiiで得られた中胚葉細胞から造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞への分化を誘導するためには、工程2または工程iiiで得られた中胚葉細胞を造血因子の存在下で培養することが好ましいまたは。この工程またはは、工程2または工程iiiで得られた中胚葉細胞を骨髄系細胞、巨核球、赤血球および/または好中球に分化誘導するために好ましい工程である。造血因子とは、血球の分化増殖を促進する因子であり、ステムセルファクター、コロニー刺激因子ColoneyStimulatingFactor、顆粒球コロニー刺激因子GranulocyteCSF、エリスロポエチンErythropoietin、インターロイキン類、トロンボポエチンThrombopoietinTPOおよびFlt3リガンドなどがある。ここで、インターロイキン類は、白血球から分泌されるタンパク質で、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、およびIL9などを含む30種以上がある。また、本発明においてインターロイキン類には、IL6レセプターとIL6の融合蛋白質特開2001-161350を含んでも良い。本発明において、造血因子は好ましくはSCFTPOEPOIL3Flt3ligandFP6およびGCSFからなる群より選択され、本発明において、造血因子は、好ましくは、SCF、TPO、IL3、Flt3ligandおよびGCSFもしくはSCF、TPO、IL3、FP6およびEPOの組み合わせ、またはSCFIL3およびGCSFの組み合わせである。培地に添加される各サイトカインの濃度は、目的の細胞が得られる濃度であれば特に問わないが、BMP4の場合は、5ngmlから50ngmlでもよく、好ましくは、20ngmlから40ngmlである。Wnt3aの場合は、5ngmlから50ngmlでもよく、好ましくは、10ngmlから20ngmlである。VEGFの場合は、5ngmlから50ngmlでもよく、好ましくは、10ngmlから20ngmlである。SCFの場合は、20ngmlから100ngmlであり、好ましくは、50ngmlである。IL3の場合は、5ngmlから50ngmlであり、好ましくは、10ngmlである。TPOの場合は、5ngmlから50ngmlであり、好ましくは、5ngmlである。Flt3リガンドの場合は、10ngmlから200ngmlであり、好ましくは、50ngmlである。GCSFの場合は、20ngmlから100ngmlであり、好ましくは、50ngmlである。FP6の場合は、20ngmlから100ngmlであり、好ましくは、50ngmlである。EPOの場合は、1IUmlから20IUmlであり、好ましくは、25IUmlである。各サイトカインの存在下での培養期間は、上記工程1の場合は、2日以上であり、4日以上が好ましく、4日がより好ましい。上記工程2の場合は、2日以上であり、2日がより好ましい。上記工程の場合は、1日以上であり、好ましくは、1日以上6日以下であり、より好ましくは、約1日である。上記工程iiの場合は、2日以上であり、好ましくは、2日以上8日以下であり、より好ましくは、約3日である。上記工程iiiの場合は、1日以上であり、好ましくは、1日以上6日以下であり、より好ましくは約2日である。4造血因子を添加は、5日以上であり、中胚葉細胞から、さらに骨髄系細胞、巨核球および赤血球を製造するためには、より長期間であることが好ましい。胚様体とは、多能性幹細胞を浮遊培養中に観察される胚状の形態を示す細胞塊であり、中でも受精卵以外の細胞から誘導され、受精卵からの胚発生と極めて類似した形態発生をたどる構造物である。胚様体を形成しない培養条件とは、より具体的には接着培養を意味する。本発明の接着培養において、細胞を接着させる前に、培養皿へ予めゼラチン、ヒアルロン酸、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エナクチン等をコートしてもよく、好ましくは、GrowthfactorreducedMatrigelBDBiosciencesをコートした培養皿を用いることである。異種細胞とは、多能性幹細胞の由来となった動物種とは異なる細胞を意味し、より好ましくは対象となる多能性幹細胞以外の細胞を意味する。ヒト多能性幹細胞を用いる場合、異種細胞は、非ヒト細胞である。本発明の製造方法では、中胚葉細胞の製造を目的としているが、中胚葉細胞がその一部に含まれていればよく、中胚葉前駆細胞、中内胚葉細胞、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞、骨髄系細胞、巨核芽細胞、血小板、顆粒球、赤芽球、赤血球、血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞を含有していても良い。本発明において、骨髄系細胞とは、好酸球、単球、好中球および好塩基球を生成しうる細胞を意味する。これらの細胞は、CD45CD19CD13CD33およびMPOのようなマーカーマーカーの種類は限定されないの発現によって検出することができる。本発明において、巨核球とは、血小板を生成しうる細胞を意味する。これらの細胞は、CD41a41bおよび42bのようなマーカーマーカーの種類は限定されないの発現によって検出することができる。本発明において、赤血球とは、ヘモグロビンに富んでおり、ヘモグロビンのαglobinεglobinγglobinおよびβglobinのようなマーカーマーカーの種類は限定されないの発現によって検出することができる。成熟した赤血球の場合は、αglobinおよびβglobinが好ましいマーカーである。本発明において、好中球はCD16のようなマーカーマーカーの種類は限定されないの発現によって検出することができる。本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。細胞および培養ヒトES細胞KhES1およびKhES3は、京都大学再生医科学研究所より受領し、従来の方法で培養したSuemoriHetalBiochemBiophysResCommun345926322006。ヒトiPS細胞253G1、253G4、207B6および207B7は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養したTakahashiKetalCell131861722007およびNakagawaMetalNatBiotechnol2610162008。実施例1造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞を含む中胚葉への分化誘導図1Aに記載のStepAおよびStepBのスキームにて、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞を含む中胚葉を作製した。詳細には、未分化状態に維持したKhES3をGrowthfactorreducedMatrigelBDBiosciencesコートディッシュ上で、StemlineIIS0192SigmaにITSXGibcoを添加した培地へ、20ngmlのBMP4を加えた培地で1日間培養した後、さらに10ngmlのWnt3aを加えた培地でさらに3日間培養した。続いて、StemlineIIへITSXを添加した培地へ10ngmlのWnt3aと10ngmlのVEGFを加えた培地へ交換した後、2日間培養した。その結果、3日目もしくは4日目より中胚葉マーカーであるTおよびKDRならびに胚体内胚葉マーカーであるMixl1の発現が確認された図1Bおよび図2。またこの時、未分化マーカーであるOct34およびNanogの発現が消失することも確認された。Tの発現を指標としてBMP4およびWnt3aの最適濃度を検討したところ、BMP4は、20ngml以上であることが望ましいことが確認された。同様に、Wnt3aは、10ngml以上であることが望ましいことが確認された図3。尚、BMP4の阻害剤であるNogginを添加するとTの発現が消失することから、BMP4は分化誘導に必須であることが確認された。続いて、分化誘導の各日数における細胞の変化をフローサイトメーターを用いて検討したところ、分化誘導した中胚葉には、KDR陽性CD34陽性CD45陰性細胞が含まれていることが確認された図4。以上より、本分化誘導法を用いることで、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞を含む中胚葉を誘導できることが確認された。骨髄系細胞、巨核球および赤芽球細胞への分化誘導上記の方法で得られた中胚葉を骨髄系誘導因子カクテルCocktailA50ngmLSCF、5ngmLTPO協和発酵キリン、50ngmLIL3、50ngmLFlt3ligandおよび50ngmLGCSF協和発酵キリンまたは巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルCocktailB50ngmLSCF5ngmLTPO50ngmLIL350ngmLFP6協和発酵キリンおよび25IUmLEPO協和発酵キリンを用いて、5日毎に培地を交換して、図1Aに記載のStepCのように分化誘導を行った。すると、8日目よりコロニーの外側に嚢状の構造物が出現した図5。続いて12日から15日目に、浮遊する血液様細胞を確認した。これらの血液様細胞の細胞系列を調べるため、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導30日目の細胞へメイギムザ染色、MPO染色および免疫染色を行った図6A。その結果、骨髄系誘導因子カクテルを用いた場合は、そのほとんどが骨髄単球性細胞系列であり、一部MPO染色陽性細胞であった。一方、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた場合は、骨髄単球性細胞系列だけでなく、ヘモグロビン陽性の赤血球細胞やCD41陽性の巨核芽球などを含む多数の血液細胞系列へと分化誘導されていた。続いて、分化誘導30日目の細胞をフローサイトメトリーにより詳細にその系列を調べたところ、骨髄系誘導因子カクテルを用いた場合は、そのほとんどがCD13陽性CD45陽性の骨髄単球性細胞系列であった図6B。一方、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた場合は、CD235GlycophorinA陽性およびまたはCD45陽性の骨髄単球性細胞系列であった。これらの細胞系列への分化誘導は、ES細胞およびiPS細胞の細胞株の種類に関係なく、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導30日目では、いずれの細胞株を用いてもほぼ同様の結果であった図7。赤血球への分化誘導巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導により得られた浮遊した赤血球様細胞をメイギムザ染色や免疫染色を用いて詳細に確認した図8および図9。15日間の分化誘導では、有核のεグロビン陽性の細胞であった。一方、30日間の分化誘導では、明らかに形状が小さくなっており、一部脱核した細胞も見られた。この時、εグロビン陽性の細胞は減少し、γグロビンおよびβグロビン陽性細胞が出現した。さらに、45日間の分化誘導では、脱核された細胞が散見され、αグロビンおよびβグロビン陽性細胞が出現した。以上より、本分化誘導法により、造血前駆細胞から赤血球へとの段階的な誘導が可能であった。造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞への分化誘導の確認造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞が、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導により得られていることをフローサイトメトリーでCD34およびCD117cKitの発現を確認した図10。分化誘導15日目では両マーカーを発現した細胞が多く、分化誘導25日目までこれら2つのマーカーが発現した細胞が存在していることから、未熟な造血系細胞が培養されたことが確認された。SCF、TPO、IL3、GCSFおよびEPOを含むメチルセルロース培地を用いて、分化誘導した細胞のコロニー形成試験を行った。代表的なCFUMix、BFUE、CFUGMおよびCFUGを図11Aに示した。また、経時的なこれらのコロニー形成の変化を図11Bに示した。コロニー数は、8日目から10日目まで増加し、その後減少した。また、CFUMix、BFUEおよびCFUMが15日目まで見られたが、次第に、CFUGMおよびCFUGへと変化した。さらに、フローサイトメーターを用いて、巨核芽球赤芽球系誘導因子カクテルを用いた分化誘導20日目の細胞において、CD34、CD90およびCD38の発現を確認したところ、CD34陽性CD90陽性CD38陰性であった図12。以上のように分化誘導を続けることで多種類の細胞系列が誘導されることや各マーカーの発現パターンから、本分化誘導法を用いることで、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞が得られていたと確認された。続いて、分化誘導6日目、8日目および10日目に存在するKDR陽性CD34陽性細胞が、CD45陽性細胞または内皮細胞へと直接分化することを確認するため、GFPを強制発現させたKhES3由来のKDR陽性CD34陽性細胞、KDR陽性CD34陰性細胞、KDR陰性細胞を、GFPを発現していないKhESを同様に分化させた細胞上で培養し、GFP陽性細胞をトレースすることで、ES細胞からの分化途中経過の環境下でどの分画の細胞が中胚葉細胞もしくは中胚葉前駆細胞へ分化しやすいのかを調べた図13。すると、KDRを発現している細胞において、血球もしくは内皮細胞への分化誘導が多く見られた。従って、本方法で分化誘導したKDR陽性細胞には造血能を有する中胚葉前駆細胞が含まれていることが確認された。実施例2造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞を含む中胚葉への分化誘導GrowthfactorreducedMatrigelコートディッシュ上で2日間未分化状態を維持したKhES1またはKhES3を、StemlineIIにITSXを添加しさらに20ngmlのBMP4を添加することによって調製された培地で、5酸素条件で4日間培養した。その後、培地をStemlineIIにITSX、40ngmlVEGFおよび50ngSCFを加えた培地に交換し、細胞を5酸素条件で2日間培養した。次いで、KDRおよびCD34陽性の細胞をフローサイトメトリーによって確認した図14。このようにして、本発明の分化誘導方法により、造血幹細胞およびまたは造血前駆細胞を含む中胚葉が誘導できることが確認できた。好中球への分化上記方法で得られた中胚葉を、StemlineIIにITSX、50ngSCF、50ngIL3および50ngGCSFを加えた培地を用い、該培地を4~5日ごとに交換しながら分化誘導した。その結果、細胞は、9日後には、好中球に分化誘導された。