"黄熱病ウイルスYFVprMEポリペプチドをコード化する遺伝子カセットを備える、組み換え改質ワクシニアウイルスAnkaraMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:2に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:5に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:6に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:7に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:8に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:9に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットは、配列番号:10に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項2に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項3に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項4に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項5に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH6プロモーターの制御下である、請求項6に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH7プロモーターの制御下である、請求項7に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH8プロモーターの制御下である、請求項8に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項1に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項2に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項3に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項4に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項5に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項6に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項7に記載の組み換えMVA。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項8に記載の組み換えMVA。配列番号:1に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを備える組み換えMVA。配列番号:3に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを備える組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項1に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項2に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項3に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項4に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項5に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項6に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項7に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項8に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項9に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項10に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項11に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項12に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項13に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項14に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項15に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項16に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項17に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項18に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項19に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項20に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項21に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項22に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項23に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項24に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項25に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.においてMVAに挿入される、請求項26に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項1に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項2に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項3に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項4に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項5に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項6に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項7に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項8に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項9に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項10に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項11に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項12に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項13に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項14に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項15に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項16に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項17に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項18に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項19に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項20に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項21に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項22に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項23に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項24に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項25に記載の組み換えMVA。前記prME遺伝子カセットは、欠失III領域においてMVAに挿入される、請求項26に記載の組み換えMVA。請求項1~79のいずれか一項に記載の組み換えMVAを含む薬学的組成物。請求項77または78に記載の組み換えMVAを含む薬学的組成物。個人におけるYFVに対する免疫反応を惹起する方法であって、請求項1~79のいずれか一項に記載の組み換えMVAを含む薬学的組成物を前記個人に投与することを含む、方法。前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項81に記載の方法。個人におけるYFVに対する免疫反応の惹起における使用のための薬学的組成物であって、請求項1~79のいずれか一項に記載の組み換えMVAを含む薬学的組成物を前記個人に投与するステップを含む、方法。前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項83に記載の薬学的組成物。配列番号:1に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを発現する組み換えMVAを生成する方法であって、a一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、MVAに感染させるステップと、b配列番号:1に示されるprME遺伝子カセットを備え、またMVAゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、c前記感染した細胞における前記MVAの複製中に、前記プラスミドを前記MVAゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、前記prME遺伝子カセットを前記非必須領域における前記MVAゲノムに挿入するステップと、d生成される前記組み換えMVAを得るステップと、を含む方法。配列番号:3に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを発現する組み換えMVAを生成する方法であって、a一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、MVAに感染させるステップと、b配列番号:3に示されるprME遺伝子カセットを備え、またMVAゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、c前記感染した細胞における前記MVAの複製中に、前記プラスミドを前記MVAゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、前記prME遺伝子カセットを前記非必須領域における前記MVAゲノムに挿入するステップと、d生成される前記組み換えMVAを得るステップと、を含む方法。前記非必須MVA領域は、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.である、請求項85に記載の方法。前記非必須MVA領域は、欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.である、請求項86に記載の方法。前記非必須MVA領域は、欠失III領域である、請求項85に記載の方法。前記非必須MVA領域は、欠失III領域である、請求項86に記載の方法。黄熱病ウイルスYFVprMEポリペプチドをコード化する遺伝子カセットを備える、組み換えD4R-欠損ワクシニアウイルスdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:2に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:5に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:6に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:7に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:8に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:9に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットは、配列番号:10に示されるYFVprMEアミノ酸配列をコード化する、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項92に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項93に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項94に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項95に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項96に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項97に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、mH5プロモーターの制御下である、請求項98に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項91に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項92に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項93に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項94に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項95に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項96に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項97に記載の組み換えdVV。前記遺伝子カセットからの前記YFVprMEポリペプチドの発現は、selPプロモーターの制御下である、請求項98に記載の組み換えdVV。配列番号:1に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを備える組み換えdVV。配列番号:3に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを備える組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項91に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項92に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項93に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項94に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項95に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項96に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項97に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項98に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項99に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項100に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項101に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項102に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項103に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項104に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項105に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項106に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項107に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項108に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項109に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項110に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項111に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項112に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項113に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項114に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項115に記載の組み換えdVV。前記prME遺伝子カセットは、dVVにおけるD4R遺伝子を置き換える、請求項116に記載の組み換えdVV。請求項91~142のいずれか一項に記載の組み換えdVVを含む薬学的組成物。請求項141または142に記載の組み換えdVVを含む薬学的組成物。個人におけるYFVに対する免疫反応を惹起する方法であって、請求項91~142のいずれか一項に記載の組み換えdVVを含む薬学的組成物を前記個人に投与することを含む、方法。前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項145に記載の方法。個人におけるYFVに対する免疫反応の惹起における使用のための薬学的組成物であって、請求項91~142のいずれか一項に記載の組み換えdVVを含む薬学的組成物を前記個人に投与するステップを含む、方法。前記薬学的組成物が単回用量として投与される、請求項147に記載の薬学的組成物。配列番号:1に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを発現する組み換えdVVを生成する方法であって、aD4R-補完細胞株を、野生型ワクシニアウイルスVVに感染させるステップと、b配列番号:1に示されるprME遺伝子カセットを備え、また野生型VVゲノムのD3RおよびD5R領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、c前記D4R-補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、前記プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように前記感染した細胞を成長させ、それにより、前記prME遺伝子カセットを前記D3R領域と前記D5R領域との間の前記ウイルスゲノムに挿入するステップと、d生成される前記組み換えdVVを得るステップと、を含む方法。配列番号:3に示されるYFV-17DprME遺伝子カセットを発現する組み換えdVVを生成する方法であって、aD4R-補完細胞株を、野生型VVに感染させるステップと、b配列番号:3に示されるprME遺伝子カセットを備え、VVゲノムのD3RおよびD5R領域と相同性の遺伝子カセットの側面に位置するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、c前記D4R補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、前記プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように前記感染した細胞を成長させ、それにより、前記prME遺伝子カセットを前記D3R領域と前記D5R領域との間の前記ウイルスゲノムに挿入するステップと、d生成される前記組み換えdVVを得るステップと、を含む方法。前記D4R-補完細胞株は、ウサギRK44.20細胞株またはアフリカミドリザルcVero-22細胞株である、請求項149に記載の方法。前記D4R-補完細胞株は、ウサギRK44.20細胞株またはアフリカミドリザルcVero-22細胞株である、請求項150に記載の方法。詳細な説明本発明は、YFVに対する免疫反応を生成するのに有用な組み換えウイルス本明細書において組み換えウイルスベクターとも呼ばれるを提供する。組み換えウイルスは、非複製ワクシニアウイルス、MVAおよびdVVに基づき、YFVprMEポリペプチドをコード化する。投与されると、組み換えウイルスは、17Dワクチンに類似したレベルでYFV特異的液性および細胞性免疫反応CD8およびCD4T細胞反応を惹起し、野生型ワクシニアウイルスでの事前免疫化の後であっても致死的YFV負荷に対しマウスを防御する。さらに、組み換えウイルスは、17Dワクチンと比較して、マウスにおける改善された安全性プロファイルを示す。したがって、組み換えウイルスは、人間におけるワクチンとして有用であることが企図される。本発明の組み換えウイルスにおけるオープンリーディングフレームによりコード化されたprMEアミノ酸配列は、例えば、配列番号:2に示されるYFV-17DprMEアミノ酸配列;配列番号:5に示されるPasteur17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankCAB37419.1から;配列番号:6に示されるYFVYFV17D-213prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54268.1から、配列番号:7に示される南アフリカ17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC35907.1から、配列番号:8に示されるYFVワクチン株17DDprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54267.1から、配列番号:9に示されるYFV株AsibiprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAT58050または配列番号:10に示されるフランス内臓向性YFV株prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAA99713.1からであってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組み換えウイルスにおけるオープンリーディングフレームによりコード化されたprMEポリペプチドの配列は、配列番号:2、5、6、7、8、9または10と異なってもよいが、prMEポリペプチドは、組み換えウイルスが個人に投与されると防御免疫反応を惹起する能力を維持する。これらの実施形態において、prMEポリペプチドは、配列番号:2、5、6、7、8、9または10と、約80、約85、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約95、約97、約98または約99同一であってもよい。本発明の組み換えウイルスにおいて、YFVprMEポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、ヒト細胞のためにコドン最適化されてもよい。これらの実施形態において、自然発生YFVprMEオープンリーディングフレームにおけるコドンの1つ以上または全ては、コドン最適化YFVprMEオープンリーディングフレームにおいて、ヒト細胞内の遺伝子において頻繁に使用されるコドン好ましいコドンと呼ばれることがあると置き換えられている。コドン最適化は、一般に、細胞内のポリペプチドの発現を高めるために、組み換え遺伝子発現の領域に使用されている。本発明の組み換えウイルスにおけるYFVprMEポリペプチドをコード化する遺伝子カセットは、組み換えワクシニアウイルスにおいて機能するすなわち、オープンリーディングフレームの転写を方向付けるプロモーターの制御下のすなわち、動作可能に結合したYFVprMEオープンリーディングフレームを含む。例示的実施形態において、遺伝子カセットからのprMEポリペプチドの発現は、強固な早期/後期ワクシニアウイルスmH5プロモーターまたは合成早期/後期lPプロモーターの制御下であるChakrabarti、Sisler、およびMoss1997。一態様において、本発明は、YFVprME遺伝子カセットを備える組み換え改質ワクシニアウイルスAnkaraMVAを提供する。例示された一実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号:1に示されるように、ヒトコドン最適化YFV-17DprMEオープンリーディングフレームに動作可能に結合した強固な早期/後期ワクシニアウイルスプロモーターmH5、およびワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを備える。オープンリーディングフレームによりコード化されたprMEアミノ酸配列は、配列番号:2および配列番号:4に示されている。prMEオープンリーディングフレームのコドン最適化配列は、YFV-17Dワクチン株ゲノム受託番号NC_002031のヌクレオチド419~2452に対応する。例示された別の実施形態において、配列番号:3に示されるような遺伝子カセットは、同じヒトコドン最適化prMEオープンリーディングフレームに動作可能に結合した合成早期/後期プロモーターselPChakrabarti、Sisler、およびMoss1997を含む。他の実施形態において、prMEポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、配列番号:2に示されるYFV-17DprMEアミノ酸配列をコード化する任意のヒトコドン最適化オープンリーディングフレームであってもよい。さらに他の実施形態において、組み換えMVAYFVprME遺伝子カセットは、配列番号:5に示されるPasteur17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankCAB37419.1から;配列番号:6に示されるYFVYFV17D-213prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54268.1から、配列番号:7に示される南アフリカ17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC35907.1から、配列番号:8に示されるYFVワクチン株17DDprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54267.1から、または配列番号:9に示されるYFV株AsibiprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAT58050から、配列番号:10に示されるフランス内臓向性YFV株prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAA99713.1からをコード化してもよい。ポリペプチド配列は、上記段落[0012]において議論したように変動し得る。prMEポリペプチド配列をコード化するオープンリーディングフレームはまた、ヒトコドン最適化配列であってもよい。遺伝子カセットの発現は、例えば、強固な早期/後期ワクシニアウイルスmH5プロモーターまたは合成早期/後期selPプロモーターの制御下であってもよい。prME遺伝子カセットは、ゲノムの非必須領域、例えば欠失I領域、欠失II領域、欠失III領域、欠失IV領域、チミジンキナーゼ遺伝子座、D4/5遺伝子間領域、またはHA遺伝子座.におけるMVAに挿入されてもよい。例示された実施形態において、挿入は、欠失III領域内である。組み換えMVAは、NationalInstitutesofHealthから得られるMVA74LVD6等の牛海綿状脳症BSEを含まないMVAから得られる。YFVprME遺伝子カセットを発現する組み換えMVAは、当技術分野における標準的方法に従って薬学的組成物として製剤化され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに賦形剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストロースまたはマンニトールの5水溶液、およびエマルジョン、例えば油/水または水/油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および/またはアジュバントを含む。好適な薬学的担体および製剤は、Remington’sPharmaceuticalSciences,19thEd.MackPublishingCo.,Easton,1995に記載されている。組成物に有用な薬学的担体は、活性薬剤の意図される投与形態に依存する。本発明は、個人におけるYFVに対する免疫反応を惹起する方法であって、薬学的組成物を前記個人に投与することを含む方法を提供する。この方法において、薬学的組成物は、単回用量、2回用量または複数回用量として投与されてもよい。本明細書において例示されるように、組み換えMVAの105TCID50の単発投与は、マウスにおいて、YFV-17Dの単回用量104TCID50に匹敵する防御を惹起した。人間における免疫化ルートは、筋肉内i.m.または皮下s.c.であってもよい。人間の免疫化用量の範囲は、約106~約109PFUであってもよい。本発明の方法は、個人における液性および細胞性免疫反応を惹起する。さらに、本発明の実施形態において、方法は、個人における防御免疫反応を惹起する。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が熱病をもたらさないようであってもよい。熱病は、発熱、倦怠感、腰痛、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労等の症状を含む。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が、例えば、発熱、嘔吐、上腹部痛、出血性素因、黄疸、ならびに肝不全および腎不全を特徴とする、感染症の第3段階をもたらさないようであってもよい。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が致死的な感染症をもたらさないようであってもよい。また、YFVprME遺伝子カセットを発現する組み換えMVAを生成する方法であって、a一次ニワトリ胚細胞または永久鳥類細胞株を、MVAに感染させるステップと、bprME遺伝子カセットを備え、またMVAゲノムの非必須領域と相同性の遺伝子カセットに隣接するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、cニワトリ細胞におけるMVAの複製中に、プラスミドをMVAゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、prME遺伝子カセットを非必須領域におけるMVAゲノムに挿入するステップと、d生成される組み換えMVAを得るステップと、を含む方法が提供される。例示的なニワトリ胚細胞は、米国特許第5,391,491号に記載されている。Slavik、Ciampor、およびMayer1983。他の鳥類細胞例えば、DF-1もまた企図される。この方法において、非必須MVA領域は、欠失I領域、欠失II領域Meyer、Sutter、およびMayr1991、欠失III領域Antoineら1996、欠失IV領域Meyer、Sutter、およびMayr1991Antoineら1998、チミジンキナーゼ遺伝子座Mackett、Smith、およびMoss1982、D4/5遺伝子間領域Holzerら1998、またはHA遺伝子座Antoineら1996である。例示された一実施形態において、挿入は、欠失III領域内である。遺伝子は、任意の他の好適なゲノム領域またはゲノム間領域に追加的に挿入されてもよい。別の態様において、YFVprME遺伝子カセットを発現する組み換えD4R-欠損ワクシニアウイルスdVVが提供される。例示された一実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号:1に示されるように、ヒトコドン最適化YFV-17DprMEオープンリーディングフレームに動作可能に結合した強固な早期/後期ワクシニアウイルスプロモーターmH5、およびワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを備える。オープンリーディングフレームによりコード化されたprMEアミノ酸配列は、配列番号:2および配列番号:4に示されている。prMEオープンリーディングフレームの配列は、YFV-17Dワクチン株ゲノム受託番号NC_002031のヌクレオチド419~2452に対応する。別の実施形態において、配列番号:3に示されるような遺伝子カセットは、同じヒトコドン最適化prMEオープンリーディングフレームに動作可能に結合した合成早期/後期プロモーターselPChakrabarti、Sisler、およびMoss1997を含む。prME遺伝子カセットは、複製ワクシニアウイルスVVにおけるD4R遺伝子を置き換えてもよく、または、dVVの非必須領域に挿入されてもよい。他の実施形態において、組み換えdVVにおけるprMEポリペプチドをコード化するオープンリーディングフレームは、配列番号:2に示されるYFV-17DprMEアミノ酸配列をコード化する任意のヒトコドン最適化オープンリーディングフレームであってもよい。さらに他の実施形態において、組み換えdVVYFVprME遺伝子カセットは、配列番号:5に示されるPasteur17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankCAB37419.1から;配列番号:6に示されるYFVYFV17D-213prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54268.1から、配列番号:7に示される南アフリカ17D-204YFVワクチンprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC35907.1から、配列番号:8に示されるYFVワクチン株17DDprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAC54267.1から、配列番号:9に示されるYFV株AsibiprMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAT58050から、または配列番号:10に示されるフランス内臓向性YFV株prMEポリペプチド配列NCBIGenbankAAA99713.1からをコード化してもよい。ポリペプチド配列は、上記段落[0012]において議論したように変動し得る。prMEポリペプチド配列をコード化するオープンリーディングフレームはまた、ヒトコドン最適化配列であってもよい。遺伝子カセットの発現は、例えば、強固な早期/後期ワクシニアウイルスmH5プロモーターまたは合成早期/後期selPプロモーターの制御下であってもよい。YFVprME遺伝子カセットを発現する組み換えdVVは、薬学的組成物として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに賦形剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水、デキストロースまたはマンニトールの5水溶液、およびエマルジョン、例えば油/水または水/油エマルジョン、ならびに様々な種類の湿潤剤および/またはアジュバントを含む。好適な薬学的担体および製剤は、Remington’sPharmaceuticalSciences,19thEd.MackPublishingCo.,Easton,1995に記載されている。組成物に有用な薬学的担体は、意図される投与形態に依存する。本発明は、個人におけるYFVに対する免疫反応を惹起する方法であって、薬学的組成物を前記個人に投与することを含む方法を提供する。この方法において、薬学的組成物は、単回用量、2回用量または複数回用量として投与されてもよい。人間における免疫化ルートは、i.m.またはs.c.であってもよい。免疫化用量の範囲は、約106~約109PFUであってもよい。本発明の方法は、個人における液性および細胞性免疫反応を惹起する。さらに、本発明の実施形態において、方法は、個人における防御免疫反応を惹起する。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が熱病をもたらさないようであってもよい。熱病は、発熱、倦怠感、腰痛、頭痛、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労等の症状を含む。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が、例えば、発熱、嘔吐、上腹部痛、出血性素因、黄疸、ならびに肝不全および腎不全を特徴とする、感染症の第3段階をもたらさないようであってもよい。防御免疫反応は、個人のYFVへの後の暴露が致死的な感染症をもたらさないようであってもよい。また、YFVprMEを発現する組み換えdVVを生成する方法であって、aD4R補完細胞株を、野生型VV例えばLister/Elstree株に感染させるステップと、b遺伝子カセットを備え、野生型VVゲノムのD3RおよびD5R領域と相同性の遺伝子カセットに隣接するDNAを備えるプラスミドを、感染した細胞に形質移入するステップと、cD4R補完細胞株におけるウイルスゲノムの複製中に、プラスミドをウイルスゲノムと再結合させるように細胞を成長させ、それにより、prME遺伝子カセットをD3R領域とD5R領域との間のウイルスゲノムに挿入するステップと、d生成される組み換えdVVを得るステップと、を含む方法が提供される。D4R補完細胞株は、ウサギRK44.20細胞株HolzerおよびFalkner1997、アフリカミドリザルcVero-22細胞株Mayrhoferら2009、またはトランスのVVD4R遺伝子産物を提供するVVに許容される任意の他の細胞株であってもよい。17Dワクチンと比較して、本発明の組み換えワクシニアウイルスは、免疫力のない個人における禁忌を回避し、また、人間において複製可能でないため、向神経性および内臓向性ワクチン関連有害事象を惹起し得ない。実施例本発明は、以下の実施例により例示されるが、実施例1および2は、それぞれ、YFV株の膜およびエンベロープprMEタンパク質の前駆体をコード化するコドン最適化遺伝子の、非複製改質ワクシニアウイルスAnkaraへの、およびD4R-欠損ワクシニアウイルスへの挿入の様々な実施形態を説明する。実施例3および4は、様々な細胞における組み換えウイルスからの遺伝子カセットの発現を示す。実施例5および6に記載の実験においては、マウスモデルにおける免疫原性および防御について組み換えウイルスを評価し、市販のYFV-17Dワクチンと比較した。組み換え生ウイルスは、105TCID50の単回低免疫化用量後で既に致死的負荷に対する完全防御をもたらし、実質的な量のガンマインターフェロン分泌CD4-および機能的に活性なCD8T細胞を誘導した。実施例7は、野生型ワクシニアウイルスに対する既存の免疫が、防御に悪影響を及ぼさなかったことを示している。実施例8は、従来の17Dワクチンとは異なり、組み換えウイルスのいずれも、マウスへの脳内投与後の病的状態または死亡を引き起こさず、高い安全性プロファイルを示すことを示している。実施例1組み換えウイルスMVA-YFの構築および特性決定黄熱病株17DのprMEコード化配列CDSを発現する組み換えMVAを構築し、MVA-YFと命名した。ワクシニアウイルス早期/後期mH5プロモーターWyattら1996の制御下のprMECDSを、化学的に合成した。これにより、元の配列に存在するポックスウイルス早期転写停止シグナル5TNTの除去、およびアミノ酸配列の改質なしに人間における高い発現レベルを達成するためのヒトコドンの使用のためのオープンリーディングフレームの最適化が可能になった。mH5プロモーターを含む遺伝子カセットの配列は、配列番号:1に示される。MVA-YFを生成するために、コドン最適化共発現カセットを、新たに構築した伝達プラスミドpd3-lacZ-gptに挿入し、プラスミドpd3-lacZ-mH5-YFprMEco図1Aiを得た。このプラスミドは、相同的組み換えにより、外来遺伝子をMVAの欠失IIIdelIII領域に誘導する。MVAゲノムのdelIII領域への組み換えのための伝達プラスミド図1Aiiは、以下のステップi~vにおいて構築した。ipd3-ScriptPre1。delIII領域の左および右隣接部は、右隣接部にはオリゴヌクレオチドoYF-85’-GTTAACAGTTTCCGGTGAATGTGTAGATCCAGATAGT-3’配列番号:11およびoYF-95’-GAAGACGCTAGCACTAGTGCGGCCGCTTTGGAAAGTTTTATAGG-3’配列番号:12を、また左隣接部にはoYF-105’-GCGGCCGCACTAGTGCTAGCGTCTTCTACCAGCCACCGAAAGAG-3’配列番号:13およびoYF-115’-CGTACGTTATTATATCCATAGGAAAGG-3’配列番号:14を使用して、野生型MVAのゲノムDNAからPCRにより増幅した。鋳型としてこれらの2つの断片を、またプライマーoYF-11およびoYF-8を用いて、重複PCRを行った。断片をベクターpPCR-ScriptAmpSKStratageneにクローン化し、プラスミドpd3-ScriptPre1を得た。iipd3-dlacZ/Notr-MCS。残りのlacZ配列およびpPCR-Script-AmpSKプラスミドのPos.1617におけるNotI制限酵素認識部位を、BamHI、BsmFIまたはBsiWIにより除去し、Eel136II、マングビーン消化に続く平滑末端再連結により、プラスミドpd3-dlacZ/Notrを得た。ワクシニアDNA断片間に複数のクローニング部位NheI、HindIII、AluI、BamHI、StuI、SpeI、XhoI、NotIを導入するために、プラスミドをNheIおよびNotIで切断し、アニールされたオリゴヌクレオチドoYF-505’-CTAGCGACAAGCTTGCAGGATCCACTAGGCCTATAACTAGTCCGCTCGAGATTGC-3’配列番号:15およびoYF-515’GGCCGCAATCTCGAGCGGACTAGTTATAGGCCTAGTGGATCCTGCAAGCTTGTCG-3’配列番号:16からなるリンカーを導入し、pd3-dlacZ/Notr-MCSを得た。iiipDW2-repeat-delIII。プラーク精製中の内部相同的組み換えにより、lacZ/gpt遺伝子カセットの除去を促進するために、左MVA隣接部のdelIII自己反復RStaibら2000を生成した。オリゴヌクレオチドoYF-485’-CGCCGTCGACTATATTAGACAATACTACAATTAAC-3’配列番号:17およびoYF-495’-ATATGGATCCTCTACCAGCCACCGAAAG-3’配列番号:18を使用して、delIII自己反復220bpをpd3-ScriptからのPCRにより増幅し、gpt/lacZ遺伝子カセットの下流側のpDW2のSalI部位とBamHI部位との間でクローン化したHolzerら1998。ivpd3-lacZ-gpt。HindIIIおよびBamHI制限酵素認識部位を使用して、pDW2-repeat-delIIIのlacZ/gptdelIII自己反復断片をpd3-lacZ/Notr-MCSにクローン化し、pd3-lacZ-gptを得た。vpd3-lacZ-mH5-YFprMEco。強固な早期/後期ワクシニアウイルスプロモーターmH5の制御下のYFVprMEYFprMEco遺伝子受託番号NC_002031をコード化するオープンリーディングフレームRiceら1985を、ヒトコドンの使用coのために最適化し、合成したGeneart、レーゲンスブルグ、ドイツ。合成配列は、ワクシニアウイルス早期転写停止シグナルを含まず、そのようなシグナルは、コード化領域のすぐ下流側に導入された。発現カセットを、pd3-lacZ-gptのSpeI/NotI部位に挿入し、pd3-lacZ-mH5-YFprMEco図1Aiを得た。組み換えMVA-YFの構築および精製は、以下のように行った図1AII。20マイクログラムのpd3-lacZ-mH5-YFprMEcoプラスミドを、リン酸カルシウム沈澱によりMVA感染一次ニワトリ胚細胞CECに形質移入した。CECは、12日齢ニワトリ胚から生成され、5ウシ胎仔血清FCS、100UI/mlPen/StrepLonzaおよび100UI/mlNEAALonzaを含有するMedium199Gibco中で成長させたものである。組み換えウイルスは、以前に説明されたようにScheiflinger、Dorner、およびFalkner1998一時的マーカー安定化法を使用して選択された。精製MVA-YFクローンを、CEC中で大規模伝播用に展開した。数ラウンドのプラーク精製後、最初は選択的圧力を用いて、次いで用いずにWyattら1996、MVA-YFウイルスと指定される最終的組み換えウイルスを得た図1Aii。このウイルスは、MVAdelIII挿入部位においてワクシニアウイルスmH5プロモーターにより制御されたprMEを含有し、追加的な外来配列を含まない。代替として、pd3-lacZ-mH5-YFprMEcoと等価であるが、mH5プロモーターの代わりにSacI/SpeI制限酵素認識部位間に合成E/LプロモーターselPを含有するプラスミドChakrabartiら1997を構築した。selPプロモーターは、オリゴヌクレオチドoYF-395’-CTAGTGGATCTAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAGAGCT-3’配列番号:19およびoYF-405’-CTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTAGATCCA-3’配列番号:20をアニールすることにより生成した。遺伝子カセットの配列は、配列番号:3に示される。selPプロモーターの制御下のYFVprME遺伝子カセットを有する組み換えMVA-YFの構築および精製は、段落[0036]において説明したように行った。pd3-lacZ-mH5-YFprMEcoプラスミドの代わりに、pd3-lacZ-selP-YFprMEcoプラスミドを導入に使用した。別の代替として、外来遺伝子をMVAのHA遺伝子座に方向付けるために、mH5またはselPプロモーターの制御下のYFprMEcoカセットを、それぞれ伝達プラスミドpHA-vAScheiflingerら1998のXhoI/SnaBI制限酵素認識部位間に挿入し、それぞれプラスミドpHA-mH5-YFprMEcoまたはpHA-selP-YFprMEcoを得た。同様に相同的組み換えを行い、MVA-mH5YFまたはMVA-selPYFと命名される、代替の挿入部位を有する組み換えMVA-YFを生成した。組み換えウイルスからの野生型MVAの不在は、PCR分析および二重免疫染色アッセイにより確認した。PCR分析では、隣接領域において欠失III統合部位に結合し、MVA-YFを有する3490bpのフラグメント、および野生型MVAを有する1298bpの断片をもたらすプライマー対を選択した。このアッセイは、組み換えMVA-YF株が、1000PFUの組み換えウイルス中約1PFUの汚染物質の検出限界において、親野生型ウイルスを含まないことを裏付けたデータは示さず。YF抗原を発現する能力を失った潜在的な汚染野生型ウイルスまたは組み換え型を検出するために、DF-1細胞またはcVero22細胞Mayrhoferら2009を6ウェルプレート内で培養し、10、100または1000PFUの組み替え型に感染させた。野生型ウイルスならびに野生型ウイルスおよびそれぞれの組み換え型の混合物を、対照として使用した。5CO2中での37°Cで1時間のインキュベーション後、ウイルス接種材料を吸引し、5FCSを加えたDMEMを含む3mlの0.5カルボキシメチルセルロース重層培地を、各ウェルに添加した。4日間のインキュベーション後、重層培地を除去し、メタノール/アセトン1:1で細胞を固定した。YFVEタンパク質発現物質のプラークを検出するために、YFV-17Dに対するgp抗血清を使用した。ヤギ抗モルモットホースラディッシュペルオキシダーゼ共役IgGJacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.を、二次抗体として使用した。ニッケルを含むジアミノベンジジンDAB溶液VectorLaboratoriesでプラークを可視化し、黒色プラークを得た。ME発現のないMVAプラークを検出するために、ポリクローナルウサギ抗ワクシニアウイルス血清を使用したロット番号AVVSKP26012006。二次抗体は、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ共役IgGJacksonIncであった。ニッケルを含まないDAB溶液でプラークを可視化し、褐色プラークを得た。黒色および褐色プラークを、視覚的に計数した。MVA-YF感染細胞は、prMEタンパク質を発現する組み換え型を表す一様に黒色の巣を示したが図2A、これは、株が野生型MVAまたはprME発現を有さない任意の異常な組み換え型非発現物質を含まないことを示唆している。野生型MVA対照においては、褐色の巣のみが見られ図2B、一方MVA-YF/MVAスパイク対照は、明確に区別可能な褐色および黒色の巣を、予測される割合で含有した図2C。実施例2組み換えウイルスdVV-YFの構築および特性決定並行して、コドン最適化prMECDSを発現するD4R-欠損ワクシニアウイルスdVVを生成し、dVV-YFと命名した。この目的のために、mH5-prMEカセットをプラスミドpDW2に挿入し、pDW-mH5-YFprMEco図1Biを得た。D4R-欠損ワクシニアウイルスの生成のために、プラスミドpDW-2Holzerら1998の誘導体を構築した。pDW-2は、相同的組み換えのためのD3RおよびD5R遺伝子のワクシニアウイルスゲノム配列、ならびに一時的選択および青色プラークスクリーニングを可能とするタンデムDNA反復間に位置するlacZ/gptマーカーカセットを含有する。合成mH5-YFprMEco遺伝子カセットを、プラスミドpDW-2のXhoI/NotI部位に挿入し、pDW-mH5-YFprMEco図1Biを得た。プロモーターおよびprME遺伝子カセットの配列を、配列分析により検証した。このプラスミドを使用して非複製ウイルスdVV-YFを構築したが、YFVprME発現カセットは、ワクシニアD3R遺伝子とD5R遺伝子との間に挿入され、必須D4R遺伝子を置き換える。D4R補完cVero22細胞を野生型VV株Lister/ElstreeAmericanTypeCultureCollectionからのVR-862に感染させること、組み換えプラスミドの形質移入、および数ラウンドのプラーク精製により、組み換えウイルスを生成した。dVV-YF図1Bii。組み換え複製欠損ワクシニアウイルスdVV-YFを生成するために、20マイクログラムのpDW2-mH5-YFprMEcoを、ワクシニアウイルスLister/Elstree感染cVero22細胞に導入したMayrhoferら2009。以前に説明されているようにプラーク精製を行ったHolzerおよびFalkner1997。この手順により得られた欠損dVV-YFの精製された分離株を、cVero細胞において大規模に増幅し、さらなる特性決定に供した。これらのステップにより、dVV-YFと命名される複製欠損組み換えウイルスが得られた図1Bii。組み換え型は、PCRにより特性決定されるように、いかなるマーカー遺伝子も有さない意図される遺伝子構造を有した。これは、野生型細胞においては成長不能であり、二重免疫染色により分析された全てのプラークは、prMEタンパク質を発現したデータは示さず。実施例3許容細胞における抗原発現MVA-YFによるprME発現パターンを、まずMVA複製に許容される条件下で試験した。この目的のために、鳥類DF-1細胞を、MVA-YF、または対照としての野生型MVAもしくはYFV-17D17D市販のワクチンStamaril、Sanofi/Pasteurに、0.01MOIで感染させた。感染細胞を4日間インキュベートし、ポリクローナル抗YFV-17D抗血清を使用して、全細胞溶解物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析により調査した。MVA-YFおよびdVV-YF組み換え型によるprMEタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングにより評価した。許容条件下での発現を分析するために、DF-1細胞、または、欠損組み換え型の場合、cVero細胞を、0.01のMOIに4日間感染させた。非許容条件下での分析のために、HeLaまたはSol8細胞を、10のMOIに72時間感染させた。並行して、細胞を対照としての対応する野生型ワクシニアウイルスまたはYFV-17Dに感染させた。超音波処理および熱処理された細胞溶解物を、12ポリアクリルアミドゲルBio-Rad,Inc上に投入し、ニトロセルロース膜Invitrogen,Inc上にブロットした。prMEタンパク質を検出するために、YFV-17Dに対するポリクローナルモルモットgp抗血清を使用した。ヤギ抗モルモットホースラディッシュペルオキシダーゼ共役IgGJacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.を、二次抗体として使用した。YFV-17D感染HeLa細胞MOI0.01で3日間は、陽性対照として機能した。図3Aに示されるように、組み換えMVA-YFにより発現されたYFエンベロープEタンパク質レーン1は、フラビウイルスEタンパク質の予測されるサイズLindenbachBD、ThielHJ、およびRiceCM2007である50kDaサイズ範囲において、単一バンドとして表れた。同一のバンドは、17D対照レーン5においても検出可能であった。組み換えMVAのEタンパク質発現レベルは、YFV-17D感染レーン4の場合よりも高かった。鳥類DF-1細胞におけるYFV-17Dの低い発現レベルは、繰り返し見られた。また、HA遺伝子座におけるYFprMEcoカセットを有する組み換えMVA-YFの発現パターンを、ヒト細胞株において研究した。mH5またはselPプロモーターの制御下のprMEco発現を分析するために、それぞれ、ヒトHeLa細胞を10のMOIのMVA-selPYFに2度感染させた。感染細胞を1日間インキュベートし、抗YFV抗血清を使用して、全細胞溶解物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析により調査した。HeLa細胞において、同程度の量のEタンパク質が、MVA-mH5YFおよびMVA-selPYF感染において見られたデータは示さず。D4R-欠損ワクシニアの複製を支持するdVV-YFによるprME発現を調査するために、補完Vero細胞株cVero22を、0.01のMOIでdVV-YFまたは対照としてのdVV野生型ウイルスもしくはYFV-17Dに感染させた。さらなるステップは、上述のように行った。図3Bに示されるように、組み換えdVV-YFレーン1は、YFV-17Dウイルスレーン4と同様に、感染cVero22細胞においてEタンパク質を発現した。実施例4非許容細胞における抗原発現組み換えMVA-YFおよびdVV-YFを、免疫反応を惹起するための人間における使用のために設計し、マウス防御モデルにおいて有効性を評価した。マウスおよび人間の生体において、これらのウイルスは複製しない。ウイルス複製が存在しないにもかかわらず、YFVタンパク質発現は、効率的な免疫反応の惹起のために妥当なレベルで生じるべきである。この理由のために、組み換えMVA-YFおよびdVV-YFの両方に非許容性の人間およびマウス細胞株における発現パターンもまた研究した。マウス筋肉Sol8または人間HeLaの細胞を、10のMOIのMVA-YFまたはdVV-YF、および対応する対照に感染させた。感染細胞を2日間インキュベートし、抗YFV抗血清を使用して、全細胞溶解物をSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析により調査した。Sol8筋肉細胞における発現は、マウスが筋肉内注射i.m.で免疫化される選択されたマウス負荷モデルにおいて、標的細胞型を反映すべきである。図4Aに示されるように、組み換えMVA-YFレーン1およびdVV-YFレーン2は、同程度の量でEタンパク質を発現した。陰性対照レーン3~5において予測されるように、YFVタンパク質は検出不可能であった。この設定において、YFV-17D陽性対照レーン6によるEタンパク質発現は、検出限界を下回っていた。HeLa細胞図4Bにおいても、MVA-YFレーン1およびdVV-YFレーン2感染において同程度の量のEタンパク質が見られた。YFV-17D感染細胞レーン6は、同程度の量のEタンパク質を示した。したがって、非複製MVA-YFまたはdVV-YFで予防接種した人間において、有意なレベルでのYFV抗原の正しい発現が予測され得る。実施例5マウスにおける防御研究次に、YFV-17Dウイルスでの致死的i.c.負荷に対しマウスを防御する組み換えMVA-YFおよびdVV-YFの能力を分析した。全ての動物実験は、InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeIACUCにより見直され、オーストリア規制当局により承認された。全ての動物実験は、動物実験に関するオーストリア法およびAssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareAAALACにより規定された指針に従って行われた。動物は、AAALAC公認の施設において飼育された。6匹のBalb/cマウスCharlesRiverの群を、PBS-0.01ヒト血清アルブミンHSA緩衝液中50μlの体積で、1×102~1×105TCID50の用量範囲にわたるMVA-YFまたはdVV-YFの単回筋肉内注射で免疫化した。対照群を、PBS-0.01HSA中50μlの体積で、1×106TCID50の野生型MVA、dVVもしくは陰性対照としてのPBS、および陽性対照としての1×104TCID50人間に対する用量と同等のYFV-17Dで、またはPBS緩衝液で免疫化した。マウスを、予防接種後21日目に、1×105TCID50>1000マウス致死用量50LD50のTBS-0.01HSA緩衝液中YFV-17Dで脳内i.c.負荷し、臨床症状および生存率について14日または21日間監視した。9週齢のマウスにおけるLD50を、約83TCID50であると決定したデータは示さず。MVA-YFによる防御は、明らかに用量依存性であった図5A。動物当たり1×105TCID50の最高用量は、完全な防御を与え、1×102の最低用量であっても、動物の50超を防御した。また、dVV-YF群図5Bにおいて、防御は用量依存性であり、1×105TCID50の最高免疫化用量において100生存率であった。しかしながら、より低い用量は、組み換えMVA-YFと同様に防御しなかった。1×102TCID50の用量は、30未満を防御した。野生型ワクシニアウイルスまたはPBSを注射した全ての陰性対照群は、死亡したか、または最大20の低い生存率を示した。予測されたように、YFV-17Dで免疫化した群において、完全な防御が見られた図5C。防御の相関を明確化するために、中和抗体力価を、負荷前血清において19日目に分析した。単回用量での予防接種後、PRNT50力価は低かった。これは、最高免疫用量までの組み換えウイルスによる予防接種だけでなく、YFV-17Dによる予防接種に対しても事実であった。したがって、マウスに対し、104、106、107TCID50のMVA-YFもしくはdVV-YFまたは陽性対照としての104および106TCID50のYFV-17Dウイルスの単回または2回用量の接種を施す第2の実験を行った。さらに、マウスを、陰性対照としての1×107TCID50の空MVAまたはdVVベクターの2回用量で免疫化した。血清を、一次免疫化後42日目に採取し、PRNT50アッセイにより、YFV中和抗体について分析した。ウェル当たり約3×105個のVero細胞を、6ウェルプレートに播種し、一晩培養してコンフルエントな単層を得た。血清を、56°Cで30分間補体不活性化した。予防接種前の血清を、1:10希釈で試験し、これに100PFUのYFV-17Dを添加した。予防接種後の血清の連続2倍希釈液を、100PFUのYFV-17D株と混合し、4°Cで一晩インキュベートした。ウイルスおよび血清の混合物を、Vero細胞単層に添加し、37°Cで1時間インキュベートした。ウイルス/血清混合物を、0.75カルボキシメチルセルロース-DMEM溶液で置き換え、4日間インキュベートし、上述のように免疫染色により可視化した。中和抗体力価は、予防接種前の血清に比べて少なくとも50ウイルスプラークの数を低減した最大血清希釈の逆数である。以下の表1に示されるように、両方の組み換えワクチンは、105TCID50の1回の適用後、100防御を誘導したが、PRNT50力価は、107TCID50の最高用量後であっても測定不可能であるか、または僅かしか測定されなかった。YFV-17Dワクチンのみが、104および106TCID50の単回用量投与後に、測定可能な中和力価を誘導した。MVAYFおよびdVVYFでの第2の予防接種後、中和力価は、用量依存的に検出可能であった。ここで、MVA系ワクチンは、平均して、dVV-YFワクチンよりも幾分高い力価を示した。YFV-17Dワクチンで最も高い中和力価が誘導され、野生型MVAおよびdVV免疫化マウスにおいてPRNT50は測定不可能であった。実施例6マウスにおけるエンベロープタンパク質特異的T細胞の誘導液性免疫反応の惹起およびエンベロープタンパク質に対する中和抗体の生成は、生YFV-17Dワクチンでの予防接種後の大きな防御機序を示すがMonath1986;MonathおよびBarrett2003、細胞性免疫反応もまた、感染に対する防御において重要な役割を果たすと考えられるLiuおよびChambers2001;Coら2002;vanderMostら2002;MonathおよびBarrett2003;Maciel,Jr.ら2008。最近、YFV-17Dワクチンにより惹起されるT細胞反応が特性決定されたMaciel,Jr.ら2008。この報告において、BALB/cH2dマウスが17Dワクチン株を接種され、CD8-およびCD4特異的エピトープが調査されたMaciel,Jr.ら2008。MVA-YFまたはdVV-YF予防接種後のT細胞反応をYFV-17Dワクチンと比較するために、ワクシニアウイルス組み換え型または対応する対照でマウスを2回免疫化した0週目および3週目。28日目に脾細胞を調製し、YFエンベロープから得られたCD8-およびCD4-特異的ペプチドでinvitroで刺激したMaciel,Jr.ら2008。IFN-γ生成T細胞のパーセンテージを、FACSに基づく細胞内サイトカインアッセイにより決定した。上述のようにマウスを免疫化し、免疫化後28日目に脾臓を採取し、脾細胞懸濁液を調製した。以前に説明されたようにMayrhoferら.2009、フローサイトメトリーによるIFN-γ反応アッセイおよび特異的CD8T細胞によるペプチドパルス標的細胞の死滅の分析を使用して、ワクチン特異的細胞媒介免疫を評価した。以下の以前に説明されたMaciel,Jr.ら2008黄熱病エンベロープタンパク質からの合成ペプチドを使用して、脾細胞を刺激した:E57~71、E129~143、E133~147CD4T細胞により認識される15merペプチドおよびE60~68、E330~338、E332~340CD8T細胞により認識される9merペプチド。prME発現組み換えMVA-YF、dVV-YFにより、および対応する対照により得られた2つの独立した実験のCD4特異的反応Th1の結果を、図6Aに示す。ペプチドE4~E6による刺激後、組み換えMVA-YFは、CD4陽性IFN-γ生成T細胞の最も高い頻度を誘導し、一方、dVV-YFおよびYFV-17Dは、幾分低いが一般に同程度の量の特異的CD4T細胞を誘導する。予測されるように、野生型対照は、有意な反応を誘導しなかった。Eペプチドによるinvitro刺激後の組み換え型および対照により誘導されたワクチン特異的CD8T細胞の頻度を、図6Bに示す。最大5のCD8T細胞が、免疫優性ペプチドE1に反応した。ワクチン特異的CD8T細胞の最高頻度は、MVA組み換え型、続いてdVV-YFにより免疫化されたマウスにおいて検出された。YFV-17DワクチンによるCD8T細胞活性化は、組み換え型によるものよりもはるかに低いレベルであった。エンベロープ特異的CD8T細胞が機能的に活性であったこと、および特異的YFVエンベロープペプチドでパルスされた標的細胞を死滅させることを検証するために、蛍光技術に基づく細胞毒性Tリンパ球CTL死滅アッセイを使用したHermansら2004。この目的のために、脾細胞をペプチド提示および染料標識化標的および対照細胞でインキュベートした。脾細胞の接種後の対照細胞の低減に対するペプチドパルス標的細胞の低減は、機能性CTLの存在を示す。E1パルス標的細胞においてのみ、有意なCTL特異的死滅図6Cが誘導された。MVA-YF36±0、dVV-YF48±23およびYFV-17D38.5±16.5で免疫化された群においては、死滅は同程度であった。要約すると、MVAおよびdVV組み換え型、ならびにYFV-17Dワクチンでの免疫化は、機能的に有効なCTLを誘導した。実施例7防御に対する既存の免疫の影響人間集団の一部が以前の予防接種に起因するワクシニアウイルスに対する免疫を有すると仮定すると、天然痘予防接種を受けているかまたはMVA組み換えワクチンで予防接種されているかに関わらずCebereetら2006;Bejonetら2007;Harropら2008;Brookesら2008、ベクターに対する既存の免疫の、組み換えワクチンによる防御に対する影響を分析することが重要である。ワクシニアウイルスに対する以前の暴露が組み換え型の有効性に影響するか調査するために、Balb/cマウスを、まず2×106TCID50野生型MVA単回および2回用量またはワクシニアウイルスLister/Elstreeのそれぞれで免疫化した。3ヵ月後、動物を、1×103TCID50の最適以下の単回または2回用量で、または1×105TCID50の通常防御用量のMVA-YF、dVV-YF、および対応する対照で予防接種した。最後に、動物を1,000倍を超えるLD50YFV-17Dで負荷した。実験計画および結果は、以下の表2に概説される。MVA-YFでの免疫化前、血清を採取してワクシニアウイルス特異的中和抗体力価PRNT50を決定した。ワクシニアウイルスに対する中和抗体の試験は、上述のように行ったが、ただし、ワクシニアウイルス株Lister/ElstreeATCCVR862を標的ウイルスとして使用し、中和は37°Cで1時間行った。VVプラークを、クリスタルバイオレット溶液で染色した。事前予防接種なし図7Aでの単回最適以下用量のMVA-YFを得た全ての動物は、負荷後に死亡した表2、第4群。興味深いことに、野生型ワクシニアウイルスで予防接種されたマウス第1~3群は、事前予防接種なし第4群の動物と比較して、防御の増加を示した。最善の防御は、ワクシニアウイルスLister/Elstree株83;第1群で予防接種された動物、続いて単回50;第2群または2回17;第3群用量MVA野生型を得た群において誘導された。しかしながら、ワクシニアウイルス特異的中和抗体力価表2と防御の程度との間に相関は観察されなかった。2回用量のMVA-YFで免疫化された群においては、野生型ウイルスによる異なる事前予防接種の効果は見られなかった図7B、表2、第5~8群。既存の免疫なし58生存率またはありVVPRNT50160~800、50~60生存率の群において、同程度の防御が達成された。さらに、最適用量の1×105TCID50MVA-YFは、MVAに対する既存の免疫VVPRNT50320にも関わらず、まだ100防御を誘導することができることが確認された第9、10群。したがって、既存の抗ワクシニアウイルス免疫は、致死的YFV-17D負荷に対するMVA-YFの防御に対する悪影響を有さなかった。実施例8MVA-YFおよびdVV-YFの安全性prME遺伝子の導入がワクシニアウイルスベクターの伝染力を改変し得る可能性を考慮して、ワクチンの安全性プロファイルを試験した。この目的のために、Balb/cマウスに、1×105~1×107TCID50MVA-YF、dVV-YFの高用量、および対応する野生型ウイルスでi.c.で負荷した。YFV-17Dワクチンによる組み換え型の安全性プロファイルも比較するため、1×101~1×103TCID50のYFV-17Dを脳内投与した。ワクシニアウイルス負荷群において、1×107TCID50図8Aの最高用量で完全な生存率が見られた。さらに、野生型ワクシニアベクターと組み換え型との間に差はなかった。YFV-17D負荷マウスとは対照的に、非常に低い用量の1×102TCID50YFV-17Dは、65死亡率を誘導し、1×103TCID50は、マウスの100を死亡させた図8B。結論として、非複製ワクシニア系ワクチンは安全であり、非常に高い用量でもマウスを死亡させない。さらに、prME遺伝子の導入は、ワクシニアベクターの安全性プロファイルを改変せず、一方低用量のYFV-17Dワクチンは、i.c.投与後にマウスを死亡させた。上述の実施例により本発明を例示したが、その変形例は当業者に明らかである。したがって、以下の特許請求の範囲に記載のもの以外の限定は、本発明に付与されるべきではない。"