"少なくとも1つのアンチセンスmiRNAおよび少なくとも1つのさらなる組成物を含む、組成物であって、アンチセンスmiRNAが、少なくとも1つのコアMMRタンパク質を下方制御することが可能なmiRNAに対してアンチセンスであり、そして少なくとも1つのさらなる組成物がMMR関連疾患を治療するのに有用である、前記組成物。少なくとも1つのさらなる組成物が:化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブpanitumab;ザルツママブzalutumamab;ニモツザマブnimotuzamab;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。アンチセンスmiRNAがmiRNA-155である、請求項1に記載の組成物。少なくとも1つのコアMMRタンパク質が:hMSH1;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択される、請求項4に記載の組成物。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む、試験試料中のMMR機能不全細胞を同定する方法であって、示差的に発現されたmiRNA-155のレベルが、試験試料を、MMR機能不全細胞を含有するものとして同定する、前記方法。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む、被験体がMMR突然変異細胞を有するか、または発展させるリスクがあるかを診断する方法であって、示差的に発現されたmiRNA-155のレベルが、被験体を、MMR突然変異細胞を有するか、または発展させるリスクがあるかのいずれかであるとして診断する、前記方法。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む、被験体がリンチ症候群を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、示差的に発現されたmiRNA-155のレベルが、被験体を、リンチ症候群を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであるとして診断する、前記方法。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む、被験体が遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、示差的に発現されたmiRNA-155のレベルが、被験体を、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであると診断する、前記方法。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む、被験体が癌を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、示差的に発現されたmiRNA-155のレベルが、被験体を、癌を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであるとして診断し、癌が:結腸直腸癌;子宮内膜癌;卵巣癌;胃癌;および尿道上皮癌からなる群より選択される、前記方法。試験試料中のmiRNA-155のレベルを対照のmiRNA-155のレベルと比較する工程を含む:患者において予後診断を提供する方法であって、下方制御されたmiRNA-155のレベルが、劣った予後であることを示す、前記方法。請求項1に記載の組成物の薬学的有効量を投与する工程を含む、MMR機能不全の治療が必要な患者においてMMR機能不全を治療する方法。MMR機能不全が:神経芽細胞腫;肺癌;胆管癌;非小細胞肺癌;肝細胞癌;リンパ腫;上咽頭癌;卵巣癌;頭頸部扁平上皮癌;扁平細胞子宮頸癌;胃癌;結腸癌;子宮頸癌;胆嚢癌;前立腺癌;乳癌;精巣胚細胞腫瘍;大細胞リンパ腫;濾胞性リンパ腫;結腸直腸癌;悪性胸膜中皮腫;神経膠腫;甲状腺癌;基底細胞癌;T細胞リンパ腫;t8;17前リンパ球性prolyphocytic白血病;骨髄異形成症候群;膵臓癌;t5;14q35.1;q32.2白血病;悪性線維性組織球腫;胃腸間質腫瘍;および肝芽腫からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。治療される癌が:結腸直腸癌;子宮内膜癌;卵巣癌;胃癌;および尿路上皮癌からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。アンチセンスmiRNAの薬学的有効量を投与する工程を含む、癌の治療を必要とするMMR機能不全患者において癌を治療する方法であって、アンチセンスmiRNAがmiRNA-155に対してアンチセンスである、前記方法。治療される癌が:結腸直腸癌;子宮内膜癌;卵巣癌;胃癌;および尿路上皮癌からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。アジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブ;ザルツママブ;ニモツザマブ;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される化合物からなる群より選択される化合物を投与する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。請求項1に記載の組成物のアポトーシス有効量を導入する工程を含む、MMR機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための方法。アンチセンスmiRNAのアポトーシス有効量を導入する工程を含む、MMR機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アンチセンスmiRNAがmiRNA-155に対してアンチセンスである、前記方法。細胞が、少なくとも1つの下方制御されたコアMMRタンパク質のために機能不全であり、該タンパク質が:hMSH2;hMSH6;およびhMLH1からなる群より選択される、請求項19に記載の方法。細胞がマイクロサテライト不安定性のために機能不全である、請求項19に記載の方法。化学療法薬剤;幹細胞;AG1478;ゲフィチニブ;エルロチニブ;セツキシマブ;パニツマブ;ザルツママブ;ニモツザマブ;マツズマブ;およびラパチニブからなる群より選択される化合物を導入する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。MMR機能不全細胞培養にアンチセンスmiRNA-155を導入し;MMR機能不全細胞培養に試験組成物を導入し;そしてアポトーシスを誘導する試験組成物を薬学的に有用な組成物として同定する工程を含む、薬学的に有用な組成物を同定するための方法。患者から得られたMMR機能不全疾患細胞試料においてmiR-155の発現レベルを検出する工程を含む、MMR機能不全疾患と診断された患者の臨床転帰を予測する方法であって、対照と比較してmiR-155レベルの1.5倍またはそれより高い増加が、MMR機能不全状態との組み合わせにおいて、生存の減少を予測する、前記方法。候補剤をinvitroでスクリーニングして、miR-155の発現を減少させる剤を選択し、それによってMMR機能不全疾患の治療のための剤を同定する工程を含む、MMR機能不全疾患の治療のための療法剤を同定する方法。miR-155の少なくとも1つの分子同定因子を含む、示差的に発現されるmiR-155をMMR機能不全疾患において同定するためのキット。miR-155の少なくとも1つの分子同定因子を含む、示差的に発現されるmiR-155を肺癌において同定するためのキットであって、前記分子同定因子が:プローブ;プライマー;抗体;または小分子からなる群より選択される、前記キット。0056本発明は、したがって、これらの新規発見に関する材料および方法を提供する。特に、本明細書に記載するような、そして当業者に知られているであろうような、こうした障害を治療するのに有用な組成物を提供する。治療に有用なさらなる組成物を同定する方法、診断法、予後診断を提供する方法、アポトーシスを誘導する方法等もまた提供する。これらの発見に関連する研究ツール、特にキット等もまた提供する。0057定義0058DNAデオキシリボ核酸0059mRNAメッセンジャーRNA0060PCRポリメラーゼ連鎖反応0061プレmiRNA前駆体マイクロRNA0062qRT-PCR定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応0063RNAリボ核酸0064前述の一般的な説明および以下の詳細な説明のどちらも例示および説明のためのみであり、そして本解説の範囲を限定することは意図されないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用には、別に言及しない限り、複数形が含まれる。0065単語aまたはanの使用は、請求項および/または明細書において、用語含むcomprisingと組み合わされて用いられる場合、1を意味することも可能であるが、1またはそれより多く、少なくとも1つ、および1つまたは1より多いの意味とも一致する。0066また、含むcomprise、含有するcontainおよび含まれるinclude、または例えば限定されるわけではないが、comprises、containedおよびincludingなどのこれらの根となる語の修飾の使用は、限定的であると意図されていない。用語および/またはは、前および後の用語が、ともに用いられてもまたは別個に用いられてもよいことを意味する。限定としてではなく、例示のため、Xおよび/またはYは、XまたはYまたはXおよびYを意味することも可能である。0067miRNAはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。これに関連して、用語遺伝子は、簡単にするために、所定のmiRNAに関する前駆体miRNAをコードするゲノム配列を指すよう用いられる。しかし、本発明の態様は、その発現に関与するmiRNAのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含むことも可能である。0068用語miRNAは、一般的に、一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において実施される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域に対して、または別の核酸に対して、部分的に鎖の長さに渡って10~50相補的な、実質的に鎖の長さに渡って50を超えるが100未満相補的な、または完全に相補的な領域またはさらなる鎖もまた含むであろう。したがって、核酸は、分子を含む特定の配列の相補的または自己相補的鎖単数または複数あるいは相補体単数または複数を1またはそれより多く含む分子を含んでもよい。例えば、前駆体miRNAは、最大100相補的な自己相補性領域を有してもよく、本発明のmiRNAプローブは、ターゲットに対して少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、または100相補的であることも可能である。0069用語その組み合わせは、本明細書において、該用語に先行して列挙される項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、A、B、C、またはその組み合わせは:A、B、C、AB、AC、BC、またはABC、そして特定の背景において順序が重要である場合、BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC、またはCBAの少なくとも1つを含むよう意図される。0070別に示さない限り、技術用語は、慣用的な用法にしたがって用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、BenjaminLewin,GenesV,OxfordUniversityPress発行,1994ISBN0-19-854287-9;Kendrewら監修,TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.発行,1994ISBN0-632-02182-9;およびRobertA.Meyers監修,MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.発行,1995ISBN1-56081-569-8に見出されうる。0071本開示の多様な態様の概観を容易にするため、以下に特定の用語の説明を提供する:0072補助療法:一次治療の効果を改善するため、一次治療と組み合わせて用いる治療。0073臨床転帰:疾患または障害の治療後、あるいは治療の非存在下での、患者の健康状態を指す。臨床転帰には、限定されるわけではないが、死亡までの時間の長さの増加、死亡までの時間の長さの減少、生存可能性の増加、死亡リスクの増加、生存、無病生存率、慢性疾患、転移、進行性または侵襲性疾患、疾患再発、死亡、および療法に対する好ましいまたは劣った反応が含まれる。0074対照:対照は、実験試料、例えば患者から得た腫瘍試料と比較するために用いられる試料または標準を指す。0075サイトカイン:他の細胞の挙動に影響を及ぼす、非常に多様な造血細胞および非造血細胞によって産生される、タンパク質。サイトカインは、自然および適応免疫反応の両方に重要である。0076生存減少:本明細書において、生存減少は、患者の死亡までの時間の長さの減少、または患者の死亡リスクの増加を指す。0077発現レベルの検出:例えばmiRまたはmiRNA発現レベルの検出は、試料に存在するmiRまたはmiRNAの量を定量化することを指す。特異的miR、または任意のマイクロRNAの発現の検出は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載する任意の方法を用いて、例えばqRT-PCRによって、達成可能である。miR発現の検出には、miRNAの成熟型またはmiRNA発現と相関する前駆体型のいずれかの発現を検出することが含まれる。典型的には、miRNA検出法は、配列特異的検出、例えばRT-PCRによるものを含む。当該技術分野において公知であり、そして配列番号にあるように本明細書において提供される前駆体および成熟miR核酸配列を用いて、miR特異的プライマーおよびプローブを設計することも可能である。0078マイクロRNAmiRNA遺伝子発現を制御する一本鎖RNA分子。マイクロRNAは、一般的に、長さ21~23ヌクレオチドである。マイクロRNAは、プリmiRNAとして知られる一次転写物から、前駆体プレmiRNAと呼ばれる短いステム-ループ構造にプロセシングされ、そして最終的に、機能性の成熟マイクロRNAにプロセシングされる。成熟マイクロRNA分子は、1またはそれより多いメッセンジャーRNA分子に部分的に相補的であり、そしてその主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。マイクロRNAは、RNAi経路を通じて、遺伝子発現を制御する。0079miR発現:本明細書において、低いmiR発現および高いmiR発現は、試料中に見られるmiRNAのレベルを指す、相対的用語である。いくつかの態様において、低いおよび高いmiR発現は、対照試料および試験試料の群におけるmiRNAレベルの比較によって決定される。低発現および高発現は、次いで、試料中のmiの発現が、平均または中央値miR発現レベルより上高いまたは下低いであるかに基づいて、各試料に割り当てられることも可能である。個々の試料に関して、高いまたは低いmiR発現は、高発現または低発現を有することが知られる対照または参照試料に対して試料を比較することによって、あるいは標準値に対して比較することによって、決定可能である。低いおよび高いmiR発現には、miRNAの前駆体または成熟型いずれか、あるいは両方の発現が含まれてもよい。0080患者:本明細書において、用語患者には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。治療に好ましい患者はヒトである。患者および被験体は、本明細書において、交換可能に用いられる。0081薬学的に許容されうるビヒクル:本開示において有用な薬学的に許容されうるキャリアービヒクルは、慣用的である。Remington’sPharmaceuticalSciences,E.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,第15版1975は、1またはそれより多い療法化合物、分子または剤の薬学的送達に適した組成物および配合物を記載する。0082一般的に、キャリアーの性質は、使用する投与の特定の様式に応じるであろう。例えば、非経口配合物は、通常、薬学的および生理学的に許容されうる液体、例えば水、生理学的食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む、注射可能液体を含む。固形組成物例えば粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル型に関しては、慣用的な非毒性固形キャリアーには、例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれることも可能である。生物学的に中性のキャリアーに加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。0083疾患の予防、治療または寛解:疾患の予防は、疾患の完全な進展を阻害することを指す。治療は、疾患が進展し始めた後、疾患の徴候または症状、あるいは病的状態を寛解させる療法的介入を指す。寛解は、疾患の徴候または症状の数または重症度の減少を指す。0084スクリーニング:本明細書において、スクリーニングは、こうした疾患に影響を及ぼす候補剤を評価し、そして同定するために用いられるプロセスを指す。当該技術分野において公知であり、そして本明細書に記載する多くの技術のいずれか1つを用いて、例えばマイクロアレイ分析によって、またはqRT-PCRによって、マイクロRNAの発現を定量化してもよい。0085小分子:典型的には、約1000ダルトン未満、またはいくつかの態様において約500ダルトン未満の分子量を持つ、ターゲット分子の活性を何らかの測定可能な度合いに調節することが可能な分子。0086療法:診断および治療の両方を含む一般的な用語。0087療法剤:被験体に適切に投与された際、所望の療法的または予防的効果を誘導することが可能な、化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。0088本明細書において、候補剤は、療法剤として機能可能であるかどうかを決定するスクリーニングのために選択された化合物である。インキュベーションするには、剤が細胞または組織と相互作用するのに十分な長さの時間が含まれる。接触させるには、固形または液体型の剤を細胞または組織とインキュベーションすることが含まれる。細胞または組織を剤で治療するには、剤を細胞または組織と接触させるかまたはインキュベーションすることが含まれる。0089療法的有効量:剤で治療している被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するのに十分な、規定の医薬または療法剤の量。剤の有効量は、限定されるわけではないが、治療される被験体または細胞、および療法組成物の投与方式を含む、いくつかの要因に応じるであろう。0090本発明の方法のいくつかの態様において、対照の使用が望ましい。これに関連して、対照は、同じ患者から得られる非癌性組織試料、または健康な被験体、例えば健康な組織ドナーから得られる組織試料であってもよい。別の例において、対照は、歴史的な値から計算される標準である。腫瘍試料および非癌性組織試料は、当該技術分野において公知の任意の方法にしたがって得られうる。例えば、腫瘍および非癌性試料は、切除を受けている癌患者から得られうるし、またはこれらは、皮下注射を用いた抽出によって、顕微解剖によって、またはレーザーキャプチャーによって得られうる。対照非癌性試料は、例えば、屍体ドナーからまたは健康なドナーから得られうる。0091いくつかの態様において、スクリーニングは、細胞と候補剤とを接触させることを含む。細胞は、患者から得られる初代細胞であってもよいし、あるいは細胞は不死化または形質転換細胞であってもよい。0092候補剤は、任意のタイプの剤、例えばタンパク質、ペプチド、小分子、抗体または核酸であってもよい。いくつかの態様において、候補剤はサイトカインである。いくつかの態様において、候補剤は小分子である。スクリーニングには、ハイスループットスクリーニング、および個々の候補剤または候補剤の小群をスクリーニングすることの両方が含まれる。0093マイクロRNA検出0094本明細書のいくつかの方法において、試料中に存在するmiRNAを同定することが望ましい。0095前駆体マイクロRNAプレmiRNAおよび成熟miRNAの配列は、例えばSangerInstituteによってオンラインで利用可能なmiRBaseデータベースを通じて公的に入手可能であるGriffiths-Jonesら,NucleicAcidsRes.36:D154-D158,2008;Griffiths-Jonesら,NucleicAcidsRes.34:D140-D144,2006;およびGriffiths-Jones,NucleicAcidsRes.32:D109-D111,2004を参照されたい。現在開示される好ましいファミリーメンバーの前駆体および成熟型の配列を本明細書に提供する。0096RNA発現の検出および定量化は、当該技術分野において周知であり例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公報第2006/0211000号および第2007/0299030号を参照されたい、そして以下に記載する多くの方法の任意の1つによって達成可能である。RNAファミリーメンバーに関する既知の配列を用いて、特異的プローブおよびプライマーを、以下に記載する検出法で使用するために必要に応じて設計することができる。0097いくつかの場合、RNA検出法は、試料、例えば細胞または組織試料からの核酸の単離を必要とする。当該技術分野において公知の任意の適切な技術を用いて、RNAおよび特にmiRNAを含む核酸を単離することも可能である。例えば、RNAの単離には、フェノールに基づく抽出が一般的な方法である。フェノールに基づく試薬は、細胞および組織破壊ならびにそれに続く混入物質からのRNAの分離のため、変性剤およびRNアーゼ阻害剤の組み合わせを含有する。フェノールに基づく単離法は、10~200ヌクレオチドの範囲で、RNA種例えば前駆体および成熟miRNA、5Sおよび5.8SリボソームRNArRNA、およびU1核内低分子RNAsnRNAを回収することも可能である。さらに、TRIZOLTMまたはTRI試薬TMを用いるものなどの抽出法は、高分子および低分子のすべてのRNAを精製するであろうし、そしてmiRNAおよび低分子干渉RNAsiRNAを含有する生物学的試料から総RNAを単離するのに有効な方法である。0098いくつかの態様において、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学的試料の平行分析を可能にする、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の顕微鏡レベルの秩序だったアレイである。DNAマイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライドまたは微小球体サイズのビーズであってもよい固体支持体に化学的に付着した捕捉プローブとして知られる、異なる核酸プローブからなる。マイクロアレイは、例えば、多数のメッセンジャーRNAmRNAおよび/またはmiRNAの発現レベルを同時に測定するために使用可能である。0099細かい先端のピンを用いたガラススライド上へのプリンティング、あらかじめ作製されたマスクを用いたフォトリソグラフィ、ダイナミックマイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィ、インクジェットプリンティング、または微小電極アレイ上の電気化学を含む、多様な技術を用いて、マイクロアレイを製造してもよい。00100例えば、miRNAのマイクロアレイ分析これらの方法は、任意のRNA分析のため、修飾型で使用可能であるがは、当該技術分野において公知の任意の方法にしたがって達成可能である例えば、各々、参照により本明細書に援用される、PCT公報第WO2008/054828号;Yeら,Nat.Med.94:416-423,2003;Calinら,N.Engl.J.Med.35317:1793-1801,2005を参照されたい。一例において、細胞または組織試料からRNAを抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、総RNAから低分子RNA18~26ヌクレオチドのRNAをサイズ選択する。低分子RNAの5’端および3’端にオリゴヌクレオチドリンカーを付着させ、そして生じた連結産物を、増幅10周期のRT-PCR反応のテンプレートとして用いる。センス鎖PCRプライマーは、その5’端に付着したフルオロフォアを有し、それによって、PCR産物のセンス鎖を蛍光標識する。PCR産物を変性させ、そして次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するmiRNA捕捉プローブ配列に相補的である、ターゲット核酸と称されるPCR産物が、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。次いで、マイクロアレイレーザースキャナーを用いて励起された際、スポットが蛍光を生じるであろう。次いで、いくつかの陽性および陰性対照、ならびにアレイデータ標準化法を用いて、特定のmiRNAのコピー数に関して、各スポットの蛍光強度を評価して、これによって、特定のmiRNAの発現レベルの評価が得られるであろう。00101別の方法において、細胞または組織試料から抽出した、低分子RNA分画miRNAを含むを含有する総RNAを、低分子RNAのサイズ選択なしに直接用いて、そしてT4RNAリガーゼおよびいずれかに蛍光標識された短いRNAリンカーを用いて3’端標識する。30°Cで2時間インキュベーションすることによって、RNA試料を標識した後、T4RNAリガーゼを80°Cで5分間熱不活性化する。アレイ上の対応するmiRNA捕捉プローブ配列に相補的である、フルオロフォア標識されたmiRNAは、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。マイクロアレイスキャニングおよびデータプロセシングを上述のように行う。00102スポット型オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、既製型オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびスポット型長鎖オリゴヌクレオチドアレイを含む、使用可能ないくつかのマイクロアレイがある。スポット型オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、捕捉プローブは、miRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。このタイプのアレイを、典型的には、2つの異なるフルオロフォアで標識された、比較しようとする2つの試料例えば非癌性組織および癌性または試料組織由来のサイズ選択された低分子RNAの増幅されたPCR産物とハイブリダイズさせる。あるいは、低分子RNA分画miRNAを含むを含有する総RNAを2つの試料から抽出し、そして低分子RNAのサイズ選択なしに直接用いて、そしてT4RNAリガーゼおよび2つの異なるフルオロフォアで標識された短いRNAリンカーを用いて3’端標識する。試料を混合し、そして1つの単一マイクロアレイにハイブリダイズさせ、これを次いでスキャンし、1つのアレイにおいて、上方制御されたおよび下方制御されたmiRNA遺伝子の視覚化を可能にすることも可能である。00103既製型のオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは単一チャネルマイクロアレイにおいて、プローブは、既知のまたは予測されるmiRNAの配列にマッチするよう設計される。完全ゲノムをカバーする、商業的に入手可能な設計がある例えばAffymetrixまたはAgilentから入手可能。これらのマイクロアレイは、遺伝子発現の絶対値の概算を提供し、そしてしたがって、2つの条件の比較には、2つの別個のマイクロアレイの使用が必要である。00104スポット型長鎖オリゴヌクレオチドアレイは、50~70量体のオリゴヌクレオチド捕捉プローブで構成され、そしてインクジェットまたはロボットプリンティングのいずれかによって製造される。短鎖オリゴヌクレオチドアレイは、20~25量体オリゴヌクレオチドプローブで構成され、そしてフォトリソグラフィ合成Affymetrixによって、またはロボットプリンティングによって製造される。00105いくつかの態様において、定量的RT-PCRの使用が望ましい。定量的RT-PCRqRT-PCRは、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために用いられるポリメラーゼ連鎖反応の修飾法である。qRT-PCRは、一般的に、遺伝子配列、例えばmiRが試料中に存在するかどうか、そして存在する場合、試料中のコピー数を決定する目的のために用いられる。miRNAを含む核酸分子の発現を決定可能なPCRの任意の方法が、本開示の範囲内に属する。当該技術分野において公知のqRT-PCR法のいくつかの変型があり、このうち3つを以下に記載する。00106定量的ポリメラーゼ連鎖反応のための方法には、限定されるわけではないが、アガロースゲル電気泳動、SYBRグリーン二本鎖DNA色素の使用、および蛍光レポータープローブの使用を通じたものが含まれる。後の2つは、リアルタイムで分析可能である。00107アガロースゲル電気泳動を用いる場合、濃度が既知である類似サイズの増幅用ターゲットDNAの部分とともに、未知の試料および既知の試料が調製される。両方の反応を、同一条件で、同じ時間、泳動する好ましくは、同じプライマー、または少なくとも類似のアニーリング温度のプライマーを用いて。アガロースゲル電気泳動を用いて、元来のDNAおよび残ったプライマーから反応産物を分離する。既知のおよび未知の試料の相対量を測定して、未知の量を決定する。00108SYBRグリーン色素の使用は、アガロースゲル法よりも正確であり、そしてリアルタイムで結果を生じることも可能である。DNA結合色素は、すべての新規合成二本鎖DNAに結合し、そして蛍光強度の増加を測定し、こうして、最初の濃度の決定を可能にする。しかし、SYBRグリーンは、いかなる予期されぬPCR産物も、ならびにプライマー二量体も含む、すべての二本鎖DNAを標識し、複雑な事態およびアーチファクトを導く可能性がある。蛍光二本鎖DNA色素を添加して、反応を通常通り調製する。反応を実行し、そして蛍光レベルを監視する色素は、二本鎖DNAに結合した際にのみ蛍光を生じる。標準試料または標準曲線を参照すると、PCR中の二本鎖DNA濃度が決定可能である。00109蛍光レポータープローブ法は、プローブ配列のみの定量化、およびすべての二本鎖DNAの定量化を行わないように、配列特異的核酸に基づくプローブを用いる。これは一般的に、蛍光レポーターおよび隣接する位置に保持される消光剤を伴うDNAに基づくプローブいわゆる二重標識プローブで実行される。レポーターが消光剤に非常に近接していると、蛍光が妨げられ;プローブが破壊された際にのみ、蛍光が検出される。このプロセスは、ポリメラーゼの5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性に依存する。00110リアルタイム定量的PCR反応は、二重標識プローブを添加して調製される。二本鎖DNAテンプレートが変性すると、プローブは、テンプレートDNAの目的の領域において、プローブの相補配列に結合することができる。PCR反応混合物を加熱してポリメラーゼを活性化させると、ポリメラーゼは、プライミングされた一本鎖テンプレートDNAに対する相補鎖を合成し始める。重合が続くにつれて、ポリメラーゼは相補配列に結合したプローブに到達し、次いで、ポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性のためプローブが加水分解されて、それによって、蛍光レポーターおよび消光剤分子が分離される。この結果、蛍光が増加し、これを検出する。リアルタイムPCR反応の熱サイクリング中、各PCR周期中に加水分解された二重標識プローブから放出された蛍光の増加を監視し、これによって、最終の、そしてしたがって最初のDNA量の正確な決定が可能になる。00111いくつかの態様において、insituハイブリダイゼーションの使用が望ましい。insituハイブリダイゼーションISHは、核酸ハイブリダイゼーション技術を単細胞レベルに適用および外挿し、そして細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学と組み合わされて、形態の維持ならびに細胞マーカーの維持および同定を可能にし、そして集団、例えば組織および血液試料内の特定の細胞に対する配列の位置決定を可能にする。ISHは、相補核酸を用いて、組織の一部または切片においてinsitu、あるいは組織が十分に小さい場合は全組織においてホールマウントISH、1またはそれより多い特定の核酸配列を位置決定するタイプのハイブリダイゼーションである。RNAISHを用いて、組織における発現パターン、例えばmiRNAの発現をアッセイすることも可能である。00112試料細胞または組織を処理して、浸透性を増加させ、プローブ、例えばmiRNA特異的プローブが細胞に進入するのを可能にする。処理した細胞にプローブを添加して、適切な温度でハイブリダイズを可能にし、そして過剰なプローブを洗い流す。相補プローブを放射性、蛍光または抗原性タグで標識し、これによって、オートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡またはイムノアッセイを用いて、組織におけるプローブの位置および量を決定することも可能である。試料は、本明細書に記載するような任意の試料、例えば非癌性または癌性組織試料であってもよい。miR-155ファミリーメンバーの配列は公知であるため、プローブがmiR-155に特異的に結合するように、それに応じてmiR-155プローブを設計することも可能である。00113いくつかの態様において、insituPCRの使用が望ましい。insituPCRは、ISH前の、ターゲット核酸配列のPCRに基づく増幅である。RNAの検出のため、細胞内逆転写工程を導入して、insituPCRの前にRNAテンプレートから相補DNAを生成する。これによって、低コピーRNA配列の検出が可能になる。00114insituPCRの前に、細胞または組織試料を固定し、そして透過処理して、形態を保持し、そして増幅しようとする細胞内配列へのPCR試薬のアクセスを可能にする。次に、懸濁液中に保持された無傷細胞において、あるいは直接、細胞遠心分離調製物またはガラススライド上の組織切片においてのいずれかで、ターゲット配列のPCR増幅を行う。前者のアプローチでは、慣用的なサーマルサイクラーを用いて、PCR反応混合物中に懸濁された固定細胞を熱サイクリングする。PCR後、細胞をガラススライド上に細胞遠心分離して、ISHまたは免疫組織化学によって細胞内PCR産物を視覚化する。ガラススライド上のinsituPCRは、カバースリップ下で、試料にPCR混合物を重層して、これを次いで密封して、反応混合物の蒸発を防止することによって行われる。ガラススライドを慣用的なまたは特別に設計されたサーマルサイクラーのいずれかの加熱ブロック上に直接置くことによって、あるいは熱サイクリングオーブンを用いることによって、熱サイクリングを達成する。00115細胞内PCR産物の検出は、一般的に、2つの異なる技術、PCR産物特異的プローブを用いたISHによる間接的insituPCR、または熱サイクリング中にPCR産物内に取り込まれている標識ヌクレオチド例えばジゴキシゲニン-11-dUTP、フルオレセイン-dUTP、3H-CTPまたはビオチン-16-dUTPの直接検出を通じた、ISHを伴わない直接的insituPCRの一方によって達成される。00116予後の予測マーカーとしての、および療法剤の同定のための、示差発現miRおよびmiRNAの使用。本明細書において、状態の指標を伴う、miR-155の特定の発現パターンは、特定の患者における生存予後の予測因子であることを開示する。本明細書において、劣った予後は、一般的に、生存の減少、あるいは言い換えると、死亡リスクの増加または死亡までの時間の減少を指す。劣った予後はまた、疾患の重症度の増加、例えば他の臓器への癌の蔓延転移の増加を指すことも可能である。1つの態様において、それぞれのマーカーは、対照に比較して少なくとも1.5倍の発現の増加または減少を示す。他の態様において、劣った予後は、野生型腫瘍対照値に比較して、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、または少なくとも4倍のマーカーの増加または減少によって示される。00117疾患の治療のための療法剤を同定する、候補剤のスクリーニング法が当該技術分野において周知である。RNAおよびタンパク質の発現レベルを検出する方法が当該技術分野において公知であり、そして本明細書に記載され、これらは例えば、限定されるわけではないが、マイクロアレイ分析、RT-PCRqRT-PCRを含む、insituハイブリダイゼーション、insituPCR、およびノーザンブロット分析である。1つの態様において、スクリーニングは、ハイスループットスクリーンを含む。別の態様において、候補剤は、個々にスクリーニングされる。00118候補剤は任意のタイプの分子であってもよく、例えば限定されるわけではないが、癌疾患状態単数または複数を直接的または間接的のいずれかで改善しうる、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、小分子、化学薬品、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、または任意の他のタイプの分子であってもよい。00119典型的には、内因性遺伝子、miRNAまたはmRNAは、細胞内で調節される。特定の態様において、核酸配列は、表1に列挙する1またはそれより多いmiRNA配列に対して、核酸配列が少なくとも70、75、80、85、90、95、または100同一である、少なくとも1つのセグメントを含む。内因性遺伝子、miRNA、またはmRNAの発現またはプロセシングの調節は、mRNAのプロセシングの調節を通じてであってもよく、こうしたプロセシングには、細胞内での転写、輸送および/または翻訳が含まれる。調節はまた、細胞、組織、または臓器内でのmiRNA活性の阻害または増進によっても達成可能である。こうしたプロセシングは、コードされた産物の発現またはmRNAの安定性をもたらす可能性がある。さらに他の態様において、核酸配列は、修飾核酸配列を含んでもよい。特定の側面において、1またはそれより多いmiRNA配列は、修飾された核酸塩基または核酸配列を含んでもよい。00120本発明の方法において、ひとたび細胞内に入ったら、対応するmiRNAとして機能する核酸分子を細胞または生物に投与することによって、細胞または他の生物学的物質、例えば生物患者を含むに、miRNAまたは特定のmiRNAに対応するmiRNA分子を提供できることが理解されるであろう。細胞に提供する分子の形態は、細胞内に入るとすぐにmiRNAとして作用する形態でなくてもよい。したがって、いくつかの態様において、合成miRNAまたは非合成miRNA、例えば細胞のmiRNAプロセシング機構にアクセスした時点で、成熟型の、そして活性型のmiRNAにプロセシングされるものを、生物学的物質に提供することが予期される。特定の態様において、生物学的物質に提供されるmiRNA分子が、成熟miRNA分子ではなく、miRNAプロセシング機構にアクセス可能になった際に、成熟miRNAにプロセシングされうる核酸分子であることが特に予期される。用語非合成は、miRNAの背景において、本明細書に定義するように、miRNAが合成ではないことを示す。さらに、合成miRNAの使用に関する本発明の態様において、対応する非合成miRNAの使用もまた、本発明の側面であると見なされ、そしてその逆もまた当てはまることが予期される。剤を提供するという用語は、患者に剤を投与することを含むよう用いられる。00121特定の態様において、方法にはまた、細胞または生物においてmiRNAを標的化して調節することもまた含まれる。用語miRNAを標的化して調節するとは、選択されたmiRNAを調節するために本発明の核酸が使用されるであろうことを意味する。いくつかの態様において、標的化miRNAを細胞または生物に効果的に提供する、標的化miRNAに対応する合成または非合成miRNAを用いて、調節が達成される陽性調節。他の態様において、標的化miRNAを細胞または生物において有効に阻害するmiRNA阻害剤を用いて、調節が達成される陰性調節。00122いくつかの態様において、標的化されて調節されるmiRNAは、疾患、状態、または経路に影響を及ぼすmiRNAである。特定の態様において、標的化miRNAの陰性調節によって治療が提供可能であるため、miRNAは標的化される。他の態様において、標的化miRNAの陽性調節によって治療が提供可能であるため、miRNAは標的化される。00123本発明の特定の方法において、選択されるmiRNA調節因子を、標的化miRNAの調節に関連する治療が必要とされるか、あるいは本明細書に論じる生理学的または生物学的結果例えば特定の細胞経路に関するもの、または細胞生存減少のような結果が必要とされる、細胞、組織、臓器または生物集合的に生物学的物質に投与するさらなる工程がある。その結果、本発明のいくつかの方法において、miRNA調節因子単数または複数によって提供可能な治療が必要な患者を同定する工程がある。いくつかの態様において、miRNA調節因子の有効量を投与してもよいことが予期される。特定の態様において、生物学的物質に与えられる療法的利点があり、ここで、療法的利点は、疾患または状態に関連する1またはそれより多い状態または症状の改善、あるいは疾患に関連する予後、期間、または状態の改善を指す。療法的利点には、限定されるわけではないが、疼痛の減少、死亡率の減少、症状の減少が含まれると予期される。例えば、癌に関して、療法的利点は、腫瘍増殖の阻害、転移の防止、転移数の減少、癌細胞増殖の阻害、癌細胞増殖の阻害、癌細胞における細胞死の誘導、癌細胞近傍の血管新生の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、疼痛の減少、再発リスクの減少、癌細胞における化学感受性または放射感受性の誘導、寿命の延長、および/または癌に直接または間接的に関連する死亡の遅延でありうることが予期される。00124さらに、伝統的な療法または予防剤と組み合わせて、患者に、療法の一部として、miRNA組成物を提供してもよいことが予期される。さらに、療法の背景で論じられる任意の方法を、特に、潜在的に療法が必要とされるか、あるいは療法が必要とされる状態または疾患のリスクがあると同定される患者において、予防として適用してもよいことが予期される。00125さらに、本発明の方法は、miRNAに対応する1またはそれより多い核酸および療法薬剤を使用することに関する。核酸は、薬剤の効果または有効性を増進させ、いずれかの副作用または毒性を減少させ、薬剤の生物学的利用能を修飾し、そして/または必要な投薬量または頻度を減少させることも可能である。特定の態様において、療法薬剤は、癌療法剤である。その結果、いくつかの態様において、患者において癌を治療する方法であって、癌療法剤、および癌療法剤の有効性を改善するかまたは非癌細胞を保護する、少なくとも1つのmiRNA分子の有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法がある。癌療法にはまた、化学薬品および放射線に基づく治療の両方を含む多様な併用療法も含まれる。併用化学療法には、限定されるわけではないが、例えば、ベバシズマブ、シスプラチンCDDP、カルボプラチン、EGFR阻害剤ゲフィチニブおよびセツキシマブ、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、COX-2阻害剤例えばセレコキシブ、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシンアドリアマイシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシドVP16、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、タキソテール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、あるいは前述のものの任意の類似体または誘導変異体が含まれる。00126一般的に、miRNAの阻害剤を提供して、成熟miRNAに対応する核酸分子が提供された際と比較して反対の効果を達成することも可能である。同様に、成熟miRNAに対応する核酸分子を提供して、miRNAの阻害剤が提供された際と比較して反対の効果を達成することも可能である。例えば、細胞増殖を増加させるmiRNA分子を細胞に提供して、増殖を増加させることも可能であるし、またはこうした分子の阻害剤を細胞に提供して、細胞増殖を減少させることも可能である。本発明は、本明細書に開示する異なるmiRNA分子およびmiRNA阻害剤で観察される、異なる生理学的効果の背景における、これらの態様を予期する。これらには、限定されるわけではないが、以下の生理学的効果が含まれる:細胞増殖の増加および減少、アポトーシスの増加または減少、形質転換の増加、細胞生存度の増加または減少、生存細胞数の減少または増加、ならびに細胞周期の特定の期の細胞数の増加または減少。本発明の方法は、一般的に、1またはそれより多い異なるmiRNA分子に対応する1またはそれより多い異なる核酸分子を提供するかまたは導入する工程を含むことが予期される。以下の、少なくとも以下の、または最大で以下の数の異なる核酸分子を提供するかまたは導入してもよいことが予期される:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそこから導き出される任意の範囲。これはまた、細胞内に提供または導入可能な異なるmiR分子の数にも当てはまる。00127miRNA-15500128MMR機能不全から生じるミューテーター表現型は、癌進行を促進する、さらなる遺伝子突然変異の獲得を誘導する。生殖系列突然変異に加えて、コアMMRタンパク質発現の減少または非存在を生じる多くの病原性事象があり、それにはプロモーターメチル化、およびヒストンアセチル化減少、ならびに炎症および低酸素などの微小環境要因が含まれる。本発明者らの結果は、miR-155が、コアMMRヘテロ二量体タンパク質MSH2-MSH6およびMLH1-PMS2の下方調節を引き起こすことによって、この多要因制御において役割を果たすことを示す。miR-155によって、これらの必須のMMR構成要素を同時に阻害すると、突然変異誘発表現型が引き起こされる。00129いかなる特定の理論にも束縛されることなく、全MMR系にmiR-155が発揮する驚くべき効果は、2つの異なる現象の結果のようである。第一に、MMRタンパク質安定性は、これらがヘテロ二量体を形成する能力に関連する;したがって、hMSH2およびhMLH1タンパク質の喪失は、それぞれのヘテロ二量体複合タンパク質の不安定化を生じる。第二に、miR-155は、コアMMRタンパク質の下方制御を標的とするようである。これらの制御および安定性の変化は、一緒に、突然変異率の有意な増加を生じる。本発明者らは、miR155が他の関連DNA修復タンパク質に影響を及ぼし、関連しないゲノムプロセスによるMMR欠損の表現型効果を増進する可能性を排除することは不可能である。00130miR-155によるMMRタンパク質の不完全抑制は、癌における腫瘍抑制遺伝子に特有ではない。大腸腺腫症APC遺伝子の1つの対立遺伝子の発現の部分的な50減少は、結腸直腸癌の進展に関連付けられている。さらに、トランスフォーミング増殖因子β受容体ITGFBR1遺伝子の単一の対立遺伝子の発現減少がCRCに関連付けられている。マイクロRNAは、近年、対立遺伝子および遺伝子の発現制御に関与するトランス活性化要素として提唱されている。本発明者らの結果は、MMR遺伝子の非メンデル制御におけるmiRNAの役割を強く裏付ける。00131miRNA制御の複雑性は、組織特異性によって、そしてターゲット配列において可能性のある多型によって増加する。例えば、hMLH1の3’UTRにおける後天性突然変異は、急性骨髄性白血病患者における疾患再発と関連付けられている。本発明者らは、MMRターゲット遺伝子の3’UTRにおける後天性突然変異と組み合わされたmiR-155の過剰発現が、これらの選択された患者におけるMSIの進展にさらに寄与している可能性を排除することは不可能である。さらに、MMR遺伝子のよく定義された突然変異および/またはエピジェネティックな不活性化は、MSI腫瘍の特定のサブセット、例えば炎症性腸疾患に関連するCRCおよびHIV感染に関連する非ホジキンリンパ腫では、あまり頻繁でないようである。コアMMR遺伝子の下方制御を立証する本発明者らの研究によって、これらの癌に関する潜在的な代替発病機構は、miR-155の過剰発現でありうることが示唆される。00132本発明者らは、CRCにおいてmiR-155およびMMRタンパク質の発現の間の逆相関を観察したが、miR-155発現が増加したすべての腫瘍が、MSIによって特徴付けられるわけではない。ヒト細胞において、miRNAおよび遺伝子発現の細かいチューニングに関与する閾値発現効果またはサベージループsavageloopを含む、miR-155によるコアMMRタンパク質の異なる制御に、いくつかの因子が寄与している可能性もある。00133MMR不全腫瘍の患者は、大部分が、優れた予後によって特徴付けられるが、MMR能がある腫瘍の患者と比較した場合、5-フルオロウラシルアジュバント化学療法後の生存利益はより低い。コアMMRタンパク質の下方制御に寄与するmiR-155の役割によって、miR-155が、癌患者の予後診断および療法において、重要な層化因子である可能性もあることが示唆される。miR-155発現は、標準的な試験が確証的な診断を提供しないMSI腫瘍の病因学において、さらなる分析試験となることも可能である。00134本開示全体を通じて、多様な刊行物、特許および公開特許明細書が、同定する引用によって参照とされる。これらの刊行物、特許および公開特許明細書は、本発明が属する技術分野の状態をより詳細に記載するために、参照により本開示に援用される。00135本発明は、続く実施例においてさらに定義され、この中で、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量により、そして度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のみのために提供されることが理解されるべきである。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を解明することができ、そして本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく、多様な用法および条件に適応させるために、本発明の多様な改変および修飾を行うことも可能である。00136実施例00137実施例1.00138用いた材料および方法00139細胞培養およびトランスフェクション00140Colo-320DM、HCT-116およびDLD-1結腸直腸癌CRC細胞AmericanTypeCultureCollectionATCCバージニア州マナサスを、RPMI1640Gibco、カリフォルニア州カールスバッド中で培養し、MV4-11B骨髄単球性白血病細胞ATCCバージニア州マナサスおよびパッケージング細胞293TNSystemBiosciences、カリフォルニア州マウンテンビューをDMEMGibco、カリフォルニア州カールスバッド中で増殖させた。すべての細胞に、抗生物質を加えた10ウシ胎児血清Sigma、ミズーリ州セントルイスを補充した。マイコプラズマ混入に関して、細胞を定期的に、そして機能実験の前にチェックし、そして常に陰性であることが見出された。製造者のプロトコルにしたがってLipofectamine2000Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッドを用いることによって、細胞を6ウェルプレート中でトランスフェクションした。過剰発現研究のため、特異的miRNAまたは対照前駆体オリゴヌクレオチドをAmbionテキサス州オースティンから購入し、そして100nMで用いた。サイレンシング実験のため、miRCURYLNATMアンチmiR-155または対照miRCURYノックダウンプローブExiqon、デンマークベドベッグを100nMで用いた。以下に記載するように、定量的リアルタイムPCRによって、48時間後、miRNA発現を検証した。全長MLH1およびMSH6cDNAをコードするプラスミドをOrigeneから購入した。QuikChange部位特異的突然変異誘発キットStratagene、カリフォルニア州サンディエゴを用いて、miR-155シード領域に関するMLH1およびMSH6突然変異体を調製した。0.3x106細胞を6ウェルプレートに植え付け、そして1μgのWTまたは突然変異cDNAコーディングプラスミドおよび1μgのmiR-155コーディングベクターまたは空ベクターを用いて、24時間後にトランスフェクションし、36時間後に細胞を採取して、そしてウェスタンブロッティングによって溶解物を分析した。00141ルシフェラーゼアッセイ00142hMLH1、hMSH2およびhMSH6の3’-UTRおよび/またはCDS中の予測されるmiRNA結合部位を、以下のように、ホタルfireflyルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。特異的プライマー以下の表2を用いたPCRによって、SW-480細胞から、相補DNAcDNAを増幅した。00143次いで、産物をSpeIおよびSacIINewEnglandBiolabsマサチューセッツ州イプスウィッチで消化し、そしてホタルルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンのすぐ下流にSpeIおよびSacII部位を有するように先に修飾したpGL3対照ベクターPromega、ウィスコンシン州マディソン内に挿入した。各単一遺伝子に関して、突然変異miRNA認識配列を含むレポーター構築物を構築したMUT-155。hMSH23’UTRおよびhMLH13’UTR結合部位に関して、QuikChange部位特異的突然変異誘発キットを用いて、miR-155のシードに相補的な配列を欠失させた。すべての他のmiR-155シード領域に関しては、シード領域相補部位を排除するため、予測されるmiRNA結合部位の上流または下流に位置するプライマーを用いて、突然変異構築物を得た。プライマー配列を表2に提示する。00144Colo-320DM細胞を、12ウェルプレート中、1μgのpGL3ホタルルシフェラーゼレポーター対照ベクター、0.1μgのphRL-SV40対照ベクターPromega、ウィスコンシン州マディソン、および100nMmiRNAまたは対照前駆体で同時トランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、二重ルシフェラーゼアッセイPromegaを用いることによって、ホタルおよびウミシイタケRenillaルシフェラーゼ活性を続いて測定した。00145ウェスタンブロッティング00146イムノブロッティング分析のため、プロテアーゼ阻害剤を加えた氷冷細胞溶解緩衝液CellSignalingTechnologyInc.マサチューセッツ州ダンバースで細胞を溶解した。等量のタンパク質を分離し、そして4XSDS-PAGE試料緩衝液と混合し、4-20および7.5直線勾配Tris-HCLCriterionPrecastGelsBio-Rad中で電気泳動し、そしてニトロセルロースまたはPVDF膜Bio-Radにトランスファーした。0.05Tween20を含有するTris緩衝生理食塩水、pH7.4中の5脱脂粉乳で膜をブロッキングし、そして製造者の指示にしたがって、一次および二次抗体とインキュベーションした。以下の一次抗体を用いた:マウスモノクローナル抗MSH21:200、Invitrogen、マウスモノクローナル抗MSH61:500、BDBiosciencesカリフォルニア州サンノゼ、マウスモノクローナル抗MLH11:200、Invitrogen、ウサギポリクローナル抗MLH1マウス実験のために用いられる1:200SantaCruzBiotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ、マウスモノクローナル抗アクチン1:5000、Sigma、マウスモノクローナル抗GAPDH1:1000、SantaCruzBiotechnology。MLH1およびMSH6に対するN末端一次抗体1/500Sigma。00147成熟miRNAおよび遺伝子に関するリアルタイムPCR00148TrizolInvitrogenで総RNAを単離した。一試験管TaqManマイクロRNAアッセイによって成熟miRNAを評価し、一方、目的のmRNAの発現を、以下のプローブを用いた遺伝子発現アッセイによって評価した:hMLH1=Hs00979923_m1、hMSH2=Hs00953523_m1、hMSH6=Hs00943001_m1AppliedBiosystems、カリフォルニア州フォスターシティ。miRNA発現を、ヒトにおいてはRNU44およびRNU48、そしてマウス細胞においてはsnoR-135のものに対して標準化した。遺伝子発現をビンキュリンに対して標準化した。テンプレート不含対照およびRTを除いた対照を含めて、すべてのレトロトランスクリプターゼRT反応をGeneAmpPCR9700サーモサイクラーAppliedBiosystemsにおいて行った。別に明記しない限り、各試料を3つ組で試験した。00149ノーザンブロッティング00150成熟miRNA検出のため、先に記載されているようにアクリルアミドノーザンブロッティングを行った。00151miR-155を過剰発現する安定クローンの生成00152Colo-320DM細胞を、2つの異なるプロモーターの制御下で全長miR-155およびGFP遺伝子を含有するpCDH-CMV-MCS-EF1-miRNA発現プラスミドに安定感染させたSystemBiosciences、カリフォルニア州マウンテンビュー。空ベクターを対照として用いた。プレmiR-155発現および対照構築物を、293TNパッケージング細胞株中、pPACKH1レンチベクターパッケージングプラスミド混合物SystemBiosciencesでパッケージングした。PEG-itTMウイルス沈殿溶液を用いてウイルスを濃縮し、そしてUltraRapidレンチウイルス力価キットSystemBiosciencesを用いて、力価を分析した。FACS分析によって、感染細胞を選択したFACSCalibur、BectonDickinsonImmunocytometrySystems。蛍光顕微法によって>90の感染効率を検証し、そしてmiR-155発現に関するリアルタイムPCRによって、さらに確認した。00153組織病理評価00154腫瘍タイプ腺癌および粘液性腺癌および分化等級をWHO基準にしたがって決定した。顕著な固形増殖パターンおよび穏やかなまたは中程度の核多形性を持つ癌を髄様腺癌3と分類した。00155免疫組織化学分析00156先に記載されている分析法にしたがって、MLH1およびPMS2発現の免疫組織化学分析を行った。核内MLH1またはMSH2発現の完全な喪失を示す腫瘍を、MLH1陰性またはMSH2陰性と分類した。正常上皮細胞、リンパ球、および間質細胞の核免疫染色は、各場合で、内部陽性対照として働いた。臨床データおよびMSI状態の知識を持たない2人の病理学者によって、すべての腫瘍を独立に評価した。00157組織収集00158倫理委員会の認可後、IstitutoScientificoRomagnoloperloStudioelaCuradeiTumori、イタリアメルドラで、CRCの83の連続症例由来の腫瘍および正常隣接組織から、新鮮凍結組織を収集した。タンパク質およびRNA抽出のための細胞溶解物を上述のように抽出した。00159レーザーキャプチャー顕微解剖LCM00160OSULaserCaptureMicrodissectionandImageAnalysisCoreFacilityで、LCMを行った。00161MLH1およびPMS2配列決定00162CRC患者由来のDNAを増幅し、そして配列決定した。3730DNA分析装置およびABIPrismBigDyeターミネーターサイクル配列決定キット、バージョン3.1を配列決定分析に用いた。データ収集ソフトウェアv3.0および配列決定分析ソフトウェアv5.2を用いた。施設倫理委員会の認可後、患者情報および組織を収集した。00163実施例200164トランスフェクション00165Lipofectamine2000Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッドを用いることによって、Colo-320DM、HCT-116、およびDLD1細胞をトランスフェクションし、一方、製造者の指示にしたがって、miR-155過剰発現のためのMV4-11レンチウイルスベクターおよび空ベクターをSystemBiosciencesカリフォルニア州マウンテンビューによって生成した。診断プライマーを用いた遺伝子型決定分析によって、マイクロサテライト不安定性を評価した。MSI患者由来のゲノムDNAを配列決定した。統計分析:別に示さない限り、結果を平均±標準誤差S.E.M.として表す。両側スチューデントt検定を用いて、群間の比較を行った。pが0.05より小さい場合、有意と認めた。Pearson相関に関しては、GraphpadPrismv5.0GraphpadSoftwareInc.分析を用いた。00166実施例300167hMLH1、hMSH2およびhMSH6は、miR-155のターゲットである。00168本発明者らは、insilico予測モデルを用いて、コアMMR遺伝子のmRNAにおけるmiR-155に関する潜在的な結合部位を同定した。RNAhybridを用いて、hMLH1中に2つの推定上の部位が見出されBiBiServ、ドイツ;NCBINM_000249.2、一方はNCBINM_000249.2の3’-UTR中であり、そしてもう一方は、コーディング領域CDS中であり;TargetScanを用いてhMSH2の3’-UTR中に1つの部位が見出されWhiteheadInstitute、MIT;NCBINM_000251.1;そしてRNAhybridを用いて、hMSH6のCDS中に1つの部位が見出されたBiBiServ、ドイツ;NCBINM_000179.2図1A;図6。00169機能性スクリーンとして、本発明者らは、MLH1、MSH2またはMSH6の予測されるmiR-155シード領域を含むコーディング領域および3’領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にサブクローニングし、そしてルシフェラーゼタンパク質活性を記録した。本発明者らは、これらの研究のため、MMR能があるcolo-320DMCRC細胞を使用したが、これは、該細胞がmiR-155の低い基底レベルを含有するためである。Colo-320DM細胞を、ルシフェラーゼレポーター構築物で、そしてmiR-155前駆体プレmiR-155または対照前駆体プレmiR対照でトランスフェクションした。00170本発明者らは、MLH1、MSH2またはMSH6のmiR-155シード領域を含有する構築物を用いて、プレmiR-155の存在下、それぞれルシフェラーゼ活性の37、38および24の減少を観察したp<0.001;図1Bb;各々に関するWTを参照されたい。構築物がmiR155シード領域の欠失を含有する場合には、ルシフェラーゼ活性において変化は見られなかった図1B;各構築物に関するMUT-155を参照されたい。興味深いことに、hMLH1遺伝子中の個々のmiR-155結合部位の影響は相加的であるようであった図1B;hMLH1MUT-1553’-UTRおよびMUT-155CDSをWTに比較されたい。00171リボソームは、CDSターゲット部位からmiRNA-RISC複合体を外す。00172このプロセスの結果、マイクロRNAがターゲットタンパク質を調節することが不可能になる。MLH1およびMSH6はどちらもCDSシード領域を含有する図1;図6。00173miRNA-RISC置換の可能性を調べるため、本発明者らは、MLH1を欠如する細胞株HCT116またはMSH6を欠如する細胞株DLD1を、miR-155前駆体を伴いまたは伴わず、対応する全長cDNAを含有する哺乳動物発現ベクターで同時トランスフェクションし、そしてタンパク質発現を調べた図7。00174本発明者らは、hMLH1およびhMSH6cDNA配列中のCDSmiR-155ターゲット部位を欠失させて、発現がmiRNA-RISCリボソーム置換によって影響を受けるかどうかを決定した。CDSmiR-155シード配列のインフレーム欠失は、一部切除hMLH1およびhMSH6タンパク質を生じた図7;160kDhMSH6のサイズ減少は、より長いゲル泳動においてのみ検出可能である。MMRcDNAとmiR-155発現ベクターを同時トランスフェクションすると、hMLH1およびhMSH6タンパク質の下方制御が生じた図7;hMLH1WTおよびhMSH6WTを参照されたい。cDNAからCDSmiR-155シード配列を欠失させると、hMLH1発現の部分的回復が生じ図7;hMLH1MUTCDSを参照されたい、そしてhMSH6発現の完全な回復が生じた図7;hMSH6MUTを参照されたい。hMLH1CDSおよび3’-UTRシード配列の両方の突然変異は、hMLH1タンパク質発現の完全な回復を生じた図7;hMLH1二重突然変異体を参照されたい。これらの結果は、hMLH1およびhMSH6由来のmiR-155シード配列を含有するルシフェラーゼに基づく系図1Bと定性的に同様であり、そしてmiRNA-RISCリボソーム置換がMMRタンパク質のmiR-155調節において問題である可能性が低いことを示す。00175内因性MMR遺伝子およびタンパク質発現に対するmiR-155の影響をcolo-320DM細胞において調べた図2。トランスフェクションされたcolo-320DM細胞に関して、定量的PCRqPCRによって、スクランブルプレmiR対照に比較したプレmiR-155の一貫した増加を決定した図2A。00176本発明者らは、hMLH1、hMSH2およびhMSH6のmRNA発現が、プレmiR-155過剰発現によって影響を受けないことを見出した図2B、白色および青色バーを比較されたい。対称的に、hMLH1、hMSH2およびhMSH6タンパク質は、プレmiR-155でトランスフェクションされた細胞において、それぞれ、53±14p=0.02、37±10p=0.01および32±7.4p=0.004減少した図2C;左のパネル、右のパネルの白色および青色バーを比較されたい。00177本発明者らがmRNA発現における変化を検出可能であることを保証するため、colo-320DM細胞において、siRNAノックダウン研究を行った図2Bおよび2C。本発明者らは、予期されるように、mRNA発現のsiRNAMMR遺伝子特異的減少を見出した図2B;左斜線、薄青色、右斜線のバー。mRNAの減少は、対応するMMRタンパク質の減少に置き換えられた図2C;左斜線、薄青色、右斜線のバー。さらに、本発明者らは、hMSH6タンパク質の安定性が、hMSH2タンパク質の発現と関連することを見出した。これらの結果は、miR-155が翻訳後阻害によって、MMRタンパク質に対する最大の影響を発揮することを示す。00178miR-155によるMMRタンパク質の調節を確認するため、本発明者らは、miR-155を過剰発現するMV4-11細胞を調べた図8。これらの研究において、MV4-11細胞を、miR-155ノックダウンをターゲットとする配列特異的ロックト核酸LNA修飾オリゴヌクレオチドアンチmiR-155;Ambionならびに対照LNAアンチmiRNAでトランスフェクションした。LNAアンチmiR-155オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした際、非特異的LNAアンチmiR対照に比較して、qPCRによって、miR-155の6.7倍の減少が観察され図1A、これをノーザンブロット分析によって確認した図6B。00179本発明者らはまた、ウェスタンブロット分析によって、LNAアンチmiR対照トランスフェクションに比較して、LNAアンチmiR-155でトランスフェクションしたMV4-11細胞では、hMLH1、hMSH2、およびhMSH6タンパク質が増加することも観察した図8。colo-320DMmiR-155過剰発現データと合わせて、これらの結果は、細胞miR155レベルが、コアMMRタンパク質の発現に対して直接影響を有することを示唆する。00180実施例400181miR-155の過剰発現は、ミューテーター表現型を誘導する。00182MMR制御に対するmiR-155の生物学的役割を評価するため、本発明者らは、miR-155を過剰発現するColo-320DMCRC細胞の作製済み安定クローンに対するレンチウイルスベクター系を用いた図3。本発明者らは、MLH1、MSH2およびMSH6タンパク質発現が、空ベクターを発現する細胞Colo-空;図3Bに比較して、miR-155を過剰発現するColo-155DM細胞Colo-155において、それぞれ、72、42および69減少することを見出した。本発明者らはまた、MSH6mRNAの減少も観察した図3C。転写に対する直接の影響の可能性は低いため、これらの結果は、miR155がMSH6プロモーターからの転写に影響を及ぼす他の制御因子をターゲットとする可能性があることを示す。00183単純反復配列の長さの変動マイクロサテライト不安定性またはMSIは、MMR欠損の診断指標である。本発明者らは、miR-155を過剰発現しているColo-320DM細胞におけるMSIを調べた図3D。特徴の3つすべてを調べた図3D。これらの結果は、miR-155過剰発現が、減少したまたは欠如したコアMMR機能と一致した複製エラーを誘導することを示す。00184実施例500185miR-155発現は、CRC組織において、hMLH1およびhMSH2と逆相関する。00186本発明者らは、CRCの70の任意抽出症例および5つの良性腸病変を含有する組織マイクロアレイにおいて、miR-155、MLH1およびMSH2の発現を調べた。LNAアンチmiR-155または非特異的LNAアンチmiR対照をhMLH1またはhMSH2に対する免疫組織化学IHC抗体と組み合わせる同時標識法を用いた。miR-155およびMMRタンパク質発現は、それぞれ細胞の>15または>5で検出された際に陽性とスコア付けされた図9Aおよび図9B。00187CRCの50より多くは、miR-155の発現上昇を示した図9C。hMSH2およびhMLH1発現の減少は、それぞれ、CRCの28および22で観察された図9C。miR-155とMSH2またはMLH1との同時発現は、逆相関を示し、r値はMSH2に関して-0.74p<0.001であり、そしてMLH1に関して-0.6p<0.001であった。miR-155は、CRC組織の67でhMSH2と、そしてCRC組織の50でhMLH1と、同時発現されなかった。分析をmiR-155陽性CRC組織でのみ行うと、hMLH1p=0.0003およびhMSH2p=0.001の両方に関して、有意な逆相関がなお明らかであった。50より高いmiR-155発現を有する組織の下位群において、なお逆相関があり、r値は、MSH2に関して-0.7p<0.0002であり、そしてMLH1に関して-0.55p<0.005であった。興味深いことに、miR-155およびhMSH2またはhMLH1のいずれかに関して陽性であるCRC組織において、同じ癌巣における同時発現は決して観察されなかった図9A。00188本発明者らは、癌および正常隣接組織が入手可能である、83の新鮮凍結腫瘍のコホートにおけるmiR-155およびMMRタンパク質発現を調べた図9B。本発明者らは、qPCR分析によって腫瘍および関連正常組織を調べ、そしてmiR-155発現が、標本のうち1822で2倍より多く増加したことを見出した。これらの試料のうち18に関して、腫瘍および関連正常組織において、ウェスタンブロット分析によって、hMLH1およびMSH2タンパク質の発現を決定した。hMLH1発現の明らかな減少が1267で観察され、一方、hMSH2発現の明らかな減少は標本のうち1161で観察された図9B。00189MMR発現に対する明らかでない影響の閾値は、miR-155発現レベルが関連する正常組織に比較して3倍の増加より低下した際に生じるようであった図9B;赤線。一般的に、この閾値より高いmiR-155発現は、hMLH1およびhMSH2の両方の発現を下方制御させるようであった。組織アレイ研究と組み合わせると、これらの結果は、ヒト腫瘍におけるmiR-155過剰発現が、コアMMRタンパク質hMLH1およびhMSH2の下方制御を生じることを強く示す。00190実施例600191MSI腫瘍におけるMMR制御解除の原因としてのmiR-155発現00192MSIは、コアMMR遺伝子の1つの両対立遺伝子の不活性化後に獲得される。LS/HNPCCキャリアーにおいて、突然変異の大部分が、hMSH2およびhMLH1遺伝子中に見られる。LS/HNPCC患者においてMSI腫瘍を導く第二のヒットは、大部分が、影響を受けない対立遺伝子のヘテロ接合性喪失LOHまたは体細胞突然変異の結果である。CRCにおいて、LS/HNPCCは、MSI腫瘍の2~5を占める。孤発性CRC腫瘍のおよそ10~15がMSIを示し、これは大部分90が、hMLH1プロモーターの2対立遺伝子不活性化の結果である。任意抽出の一連の1066のCRC患者において、13512.7がMSIを示すことが見出された。これらのうち235.9がコアMMR遺伝子の1つに生殖系列突然変異を有すると決定され、そして10678.5がhMLH1プロモーターのメチル化を含有することが見出された。これらのMSI腫瘍のおよそ5が、コアMMRタンパク質の少なくとも1つの発現喪失を示し、明らかな遺伝子またはエピジェネティック上の原因はなかった。00193本発明者らは、MSI、ならびに少なくともhMLH1およびhPMS2のIHC発現喪失を示す一連の40のCRC腫瘍を遡及的に調べた。これらのCRC腫瘍のうち34が、hMLH1遺伝子配列における突然変異またはhMLH1プロモーターのメチル化を有することが見出された。本発明者らは、腫瘍および隣接正常組織のレーザーキャプチャー顕微解剖に続くqPCRによるmiR-155発現分析に十分な試料を保有する、6つの標本を調べた表1。001941つの標本は非常にわずかな組織しか含有しなかったため、本発明者らはinsituおよびIHC分析によって、miR-155およびhMLH1発現を調べた図5。残りのMSI腫瘍6つはすべて、隣接正常組織に比較して、少なくとも2倍のmiR-155発現増加を示した表1。00195これらの標本におけるmiR-155の過剰発現は、腫瘍等級または病期とは相関しなかった。試料のうち3つは、一般的にhMLH1および/またはhMSH2の発現減少を生じる3倍の閾値を超えるmiR-155の増加を有した。さらに、CR78は、腫瘍組織の>50でmiR-155の発現上昇、および対応するhMLH1の発現喪失を示した図5Aおよび5B。これらの結果は、未知のMMR欠損を伴うMSI腫瘍が、miR-155過剰発現の結果として生じる可能性があるという結論と一致する。00196表1:MSI-H、MLH1/PMS2突然変異陰性およびMLH1プロモーターメチル化陰性CRCの特徴。臨床病理特性:腺=腺癌NAS;管-粘液=粘液構成要素を伴う腺癌<50:粘液=粘液性腺癌、粘液構成要素>50;髄様=髄様腺癌。レーザーキャプチャー顕微解剖による材料収集後、腫瘍対隣接正常組織におけるmiR-155発現比として、miR-155倍変化を計算した。00197実施例700198療法/予防法および組成物00199本発明は、有効量の療法剤、すなわち本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ウイルスベクター、Tcl1模倣体またはTcl1アンタゴニストを被験体に投与することによる、治療法および予防法を提供する。好ましい側面において、療法剤は実質的に精製される。被験体は、好ましくは動物であり、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ニワトリ等の動物が含まれ、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。00200多様な送達系、例えばリポソーム中の被包、微小粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築等が知られ、そしてこれらを用いて、本発明の療法剤を投与する。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、および経口経路が含まれる。化合物は、任意の好適な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜裏打ち例えば口腔粘膜、結腸および腸粘膜等を通じた吸収によって投与され、そして他の生物学的活性剤とともに投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内およびクモ膜下腔内注射を含む、任意の適切な経路によって中枢神経系内に導入することが望ましい可能性もあり;脳室内注射は、例えばオマヤリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にされうる。00201特定の態様において、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい可能性もあり;これは、限定ではなく例として、手術中の局所注入、局部適用、例えば手術後の創傷ドレッシング材と組み合わせたものによって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、または移植物によって達成可能であり、移植物は、シラスティックsialastic膜等の膜またはファイバーを含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものである。1つの態様において、投与は悪性腫瘍または新生物または新生物発生前の組織の部位または以前の部位での直接注射による。00202療法剤がタンパク質療法剤をコードする核酸である特定の態様において、核酸を、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして細胞内になるように投与するか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、あるいは核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与することによって、invivoで投与して、そのコードされるタンパク質の発現を促進する。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入し、そして発現させるために相同組換えによって宿主細胞DNA内に組み込ませてもよい。00203本発明はまた、医薬組成物も提供する。こうした組成物は、療法的有効量の療法剤、および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む。こうしたキャリアーには、限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれる。キャリアーおよび組成物は無菌であってもよい。配合物は、投与様式に適しているであろう。00204組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤もまた含有してもよい。組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、徐放配合物、または粉末であってもよい。組成物は、伝統的な結合剤およびキャリアー、例えばトリグリセリドとともに、座薬として配合されてもよい。経口配合物には、標準的キャリアー、例えば薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれてもよい。00205好ましい態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、ルーチンの方法にしたがって配合される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物にはまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤、例えばリグノカインも含まれる。一般的に、成分は、別個に、または単位投薬型中でともに混合されてのいずれかで、例えば気密性密封容器、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ中で、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分配される。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルが提供される。00206本発明の療法剤は、中性または塩型として配合される。薬学的に許容されうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの未結合アミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、エタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの未結合カルボキシル基で形成されるものが含まれる。00207特定の障害または状態の治療に有効であろう本発明の療法剤の量は、障害または状態の性質に依存するであろうし、そして標準的臨床技術によって決定される。さらに、場合によって、invitroアッセイを使用して、最適な投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物中で使用すべき正確な用量は、また、投与経路、および疾患または障害の深刻さにも応じるであろうし、そして医師の判断および各患者の状況にしたがって決定される。しかし、静脈内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性化合物約20~500マイクログラムである。鼻内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、約0.01pg/kg体重~1mg/kg体重である。有効用量は、invitroまたは動物モデル試験系に由来する用量-反応曲線から外挿可能である。00208本発明はまた、本発明の医薬組成物の1またはそれより多い成分を充填した1またはそれより多い容器を含む薬学的パックまたはキットも提供する。場合によって、こうした容器単数または複数には、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形式の通知が付随し、該通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の政府機関による認可を反映する。00209実施例800210癌患者を治療する方法00211本実施例は、本明細書の組成物での治療に好ましい反応を有する可能性が高い患者を選択し、そして治療する方法を記載する。00212癌と診断された患者は、通常、まず、治癒を目指して組織切除を受ける。腫瘍試料は、患者から除去された組織の部分から得られる。次いで、当該技術分野に周知の低分子RNA抽出に適した任意の方法を用いて、例えばTRIZOLTMを用いることによって、RNAを組織試料から単離する。次いで、場合によって遺伝子分析と組み合わせて、miR21または開示されている他の示差的に発現されるmiRNAに特異的なプライマーを用いて、精製RNAをRT-PCRに供する。これらのアッセイを実行して、腫瘍中の関連RNAの発現レベルを決定する。示差的に発現されるmiRの発現パターンが決定された場合、特に、突然変異状態が確認された場合、患者は、本明細書の組成物での治療の候補である。00213したがって、当該技術分野において公知の方法にしたがって、患者を組成物の療法的有効量で治療する。組成物の用量および投薬措置は、多様な要因、例えば患者の健康状態および癌の病期に応じて変化するであろう。典型的には、治療は、長期に渡る多くの投薬で投与される。00214実施例9:00215癌患者を診断する方法002161つの特定の側面において、本明細書において、被験体が、癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有するかどうかを診断する方法を提供する。該方法には、一般的に、対照に比較してmiR-155の示差的miR発現パターンを測定する工程が含まれる。示差的miR発現パターンが確認された場合、結果は、被験体が癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有することの指標となる。特定の態様において、ノーザンブロット分析を用いて、少なくとも1つの遺伝子産物のレベルを測定する。また、特定の態様において、試験試料中の少なくとも1つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するmiR遺伝子産物のレベルより低く、そして/または試験試料中の少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するmiR遺伝子産物のレベルより高い。00217実施例10:00218miR遺伝子産物の測定00219被験体から得られた試験試料由来のRNAを逆転写して、1組のターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを提供し;miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにターゲットオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;そして対照試料から作成されたハイブリダイゼーションプロファイルに、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを比較することによって、少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルを測定してもよい。少なくとも1つのmiRNAのシグナルの変化は、被験体が、肺癌、特にEGFR突然変異肺癌を有するか、または該癌を進展させるリスクを有するかいずれかであることの指標となる。00220実施例11:00221診断および療法適用00222別の側面において、本明細書において、少なくとも1つのmiRNAのシグナルが、対照試料から生成されるシグナルに比較して、制御解除されている例えば下方制御されているおよび/または上方制御されている場合、被験体において癌を治療する方法を提供する。00223また本明細書おいて、被験体から得られる試験試料からRNAを逆転写して、1組のターゲットオリゴデオキシヌクレオチドを提供し;miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにターゲットオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;そして対照試料から作成されたハイブリダイゼーションプロファイルに、試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルを比較することによって、被験体が、被験体における1またはそれより多い不都合な予後マーカーに関連する癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有するかを診断する方法も提供する。シグナルの変化は、被験体が、癌を有するか、または癌を進展させるリスクを有するかいずれかであることの指標となる。00224実施例12:00225キット00226本明細書に記載する組成物はいずれも、キット中に含まれてもよい。限定されない例において、miRNAを単離し、miRNAを標識し、そして/またはアレイを用いてmiRNA集団を評価するための試薬がキット中に含まれる。該キットにはさらに、miRNAプローブを生成するかまたは合成するための試薬も含まれてもよい。したがって、キットは、適切な容器手段中に、標識ヌクレオチドまたは続いて標識される非標識ヌクレオチドを取り込むことによってmiRNAを標識するための酵素を含むであろう。キットにはまた、1またはそれより多い緩衝剤、例えば反応緩衝剤、標識緩衝剤、洗浄緩衝剤、またはハイブリダイゼーション緩衝剤、miRNAプローブを調製するための化合物、およびmiRNAを単離するための構成要素も含まれてもよい。他のキットには、miRNAに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素が含まれてもよく、そしてしたがって、例えば固体支持体が含まれてもよい。00227アレイを含む任意のキット態様に関して、本明細書中の配列いずれかのすべてまたは一部に同一であるかまたは相補的である配列を含有する核酸分子が存在してもよい。00228キットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥型のいずれかでパッケージングされてもよい。キットの容器手段には、一般的に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が含まれるであろうし、この中に構成要素を入れることも可能であり、そして好ましくは適切にアリコットすることも可能である。キット中に1より多い構成要素がある場合標識試薬および標識を一緒にパッケージングしてもよい、キットはまた、一般的に、第二、第三のまたは他のさらなる容器も含有するであろうし、その中にさらなる構成要素を別個に入れてもよい。しかし、構成要素の多様な組み合わせがバイアル中に含まれてもよい。本発明のキットにはまた、典型的には、核酸を含有するための手段、および商業的に販売するために緊密に閉じ込められたあらゆる他の試薬容器も含まれるであろう。こうした容器には、所望のバイアルを中に保持する、インジェクションまたは吹き込み成形プラスチック容器が含まれてもよい。00229キットの構成要素を1および/またはそれより多い液体溶液中に提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が1つの好ましい溶液である。キット中に含まれてもよい他の溶液は、混合試料からmiRNAを単離し、そして/または濃縮する際に関与する溶液である。00230しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末単数または複数として提供されてもよい。試薬および/または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、適切な溶媒の添加によって粉末を元に戻すことができる。溶媒がまた、別の容器手段中でも提供可能であることが想定される。キットにはまた、標識miRNAの単離を容易にする構成要素も含まれてもよい。キットにはまた、miRNAを保存または維持する、あるいは分解に対して保護する構成要素も含まれてもよい。構成要素は、RNアーゼ不含であってもよいし、またはRNアーゼに対して保護してもよい。00231また、キットは、一般的に、適切な手段中に、各個々の試薬または溶液のための別個の容器を含んでもよい。キットにはまた、キット構成要素とともに、キット中に含まれていない任意の他の試薬を使用するための指示書も含まれてもよい。指示書には、実行可能な変動が含まれてもよい。こうした試薬は本発明のキットの態様であることが予期される。また、キットは、上記に同定された特定の項目に限定されず、そしてキットには、miRNAの操作または性質決定に用いる任意の試薬が含まれてもよい。00232本発明のスクリーニングまたはプロファイリング法またはキットにおいて、miRNAアレイの背景で論じられる任意の態様をより一般的に使用してもよいこともまた予期される。言い換えると、特定のアレイ中に含まれてもよいものを記載する任意の態様を、より一般的にmiRNAプロファイリングの背景で実施してもよく、そしてアレイ自体を伴う必要はない。00233任意のキット、アレイまたは他の検出技術またはツール、あるいは任意の方法が、これらのmiRNAのいずれかに関するプロファイリングに関与できることもまた予期される。また、miRNAアレイの背景で論じられる任意の態様を、本発明の方法において、アレイ形式を伴ってまたは伴わずに実行することも可能であることが予期される;言い換えると、miRNAアレイ中の任意のmiRNAを、当業者に知られている任意の技術にしたがって、本発明の任意の方法において、スクリーニングまたは評価することも可能である。アレイ形式は、実行しようとするスクリーニング法および診断法に必要ではない。00234療法、予後診断、または診断適用のためにmiRNAアレイを用いるためのキットおよびこうした使用が、本明細書において、本発明者らに予期される。キットには、miRNAアレイ、ならびに、アレイ上のmiRNAに関する標準または規準化miRNAプロファイルに関する情報が含まれてもよい。また、特定の態様において、対照RNAまたはDNAがキットに含まれてもよい。対照RNAは、標識および/またはアレイ分析のための陽性対照として使用可能なmiRNAであってもよい。00235本解説の方法およびキットは、本明細書において、広くそして一般的に記載されている。一般的な開示に属するより狭い種および下位のグループ分けの各々もまた、本解説の一部を形成する。排除される物質が具体的に本明細書に列挙されるかどうかにかかわらず、条件付で、または属から任意の主題を除く負の限定付きで、これには、本解説の一般的な説明が含まれる。00236実施例1300237アレイ調製およびスクリーニング00238本明細書においてはまた、miRNAアレイの調製および使用も提供され、該miRNAアレイは、複数のmiRNA分子または前駆体miRNA分子に完全にまたはほぼ相補的であるかまたは同一であり、そして空間的に分離された構成で、支持体物質上に配置された、核酸分子プローブの秩序だったマクロアレイまたは該核酸分子のマイクロアレイである。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、最大10,000の核酸分子が、典型的には1~4平方センチメートルの領域内に適合可能であるように、核酸プローブをより密に配置する。00239マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド等を、支持体上にスポットするか、または支持体上のその場でオリゴヌクレオチド配列を製造することによって製造することも可能である。スポットまたは製造される核酸分子は、平方センチメートルあたり最大約30の非同一核酸分子、またはより高密度で、例えば平方センチメートルあたり最大約100またはさらに1000の高密度マトリックスパターンに適用可能である。マイクロアレイは、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対称的に、典型的には、固体支持体としてコーティングガラスを用いる。miRNA相補核酸試料の秩序だったアレイを有することによって、各試料の位置をトラッキングし、そして元来の試料に関連付けることも可能である。00240複数の別個の核酸プローブが固体支持体表面に安定して付随する、多様な異なるアレイデバイスが当業者に知られている。アレイのための有用な支持体には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。アレイは、平均プローブ長、配列またはプローブのタイプ、プローブおよびアレイ表面間の結合の性質、例えば共有または非共有等を含む、多くの異なる点で多様であることも可能である。本明細書記載の標識法およびスクリーニング法、ならびにアレイは、プローブがmiRNAを検出することを除いて、任意のパラメータに関して有用性が限定されるわけでなく;その結果、miRNAアレイの多様な異なるタイプとともに、方法および組成物を使用することも可能である。00241本発明者らの発明の原理を適用可能な多くのありうる態様を考慮して、例示される態様は、本発明の好ましい例であるのみであり、そして本発明の範囲に対する限定として解釈すべきでないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、これらの請求項の範囲および精神内に属するものすべてを請求する。00242本発明は多様なおよび好ましい態様に言及して記載されているが、多様な改変が実施されてもよく、そして本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、同等物がその要素に対して代用されてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の解説に適合させるように、多くの修飾が行われてもよい。したがって、本発明は、本発明を実行するために予期される本明細書に開示された特定の態様に限定されるものでなく、本発明は、特許請求の範囲内に属するすべての態様を含むであろうことが意図される。"