"亜鉛-α2-糖タンパク質ZAG、ZAG変異型、修飾されたZAG、またはその機能的断片を含む、製剤。前記ZAGが、哺乳類由来である、請求項1に記載の製剤。前記ZAGが、ヒト由来である、請求項2に記載の製剤。前記ZAGが、配列番号1に記載のアミノ酸配列から成る、請求項3に記載の製剤。前記ZAGが、非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4に記載の製剤。前記ZAGが、溶解性または安定性を増加させるように、シアル酸付加、PEG化、または修飾されている、請求項5に記載の製剤。前記ZAGが、組み換えまたは合成である、請求項1に記載の製剤。前記修飾されたZAGが、欠失、付加、または保存的置換から選択される、アミノ酸配列に対する1つまたは複数の変異を有する、野生型ZAGアミノ酸配列から成る、請求項1に記載の製剤。前記ZAGが、リーダー配列および後続配列のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の製剤。前記ZAGが、グリコシル化されている、請求項5に記載の製剤。前記ZAGが、翻訳後修飾の結果としてグリコシル化されている、請求項10に記載の製剤。前記機能的断片が、タンパク質分解、化学分解、または折り畳みドメイン保存断片化によって生成される、請求項1に記載の製剤。少なくとも5、10、25、50、100mgのZAGを含む、請求項1に記載の製剤。製薬上許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の製剤。β3作動薬およびβ-アドレナリン受容体β-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項1に記載の製剤。前記β-AR拮抗薬が、β2-アドレナリン受容体β2-AR拮抗薬、β1-アドレナリン受容体β1-AR拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。前記β3作動薬が、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロンAmibegron、ソラベグロンSolabegron、ネビボロールNebivolol、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967から成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項16に記載の製剤。前記β-AR拮抗薬が、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項15に記載の製剤。インスリン、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、またはその類似体から選択される、血糖降下薬をさらに含む、請求項1に記載の製剤。液体、ペースト、粉末、乳剤、懸濁液、または固形の形態である、請求項1に記載の製剤。噴霧剤、錠剤、凍結乾燥粉末、半固形ゲル、舌下製剤、即時融解型製剤、口腔製剤、液体製剤、トローチ剤、フィルム、咀嚼製剤、矯味製剤、または発泡製剤としての経口投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、または半固形ゲルを含む、鼻腔内または肺投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。噴霧剤、液体、ペースト、乳剤、懸濁液、凍結乾燥粉末、クリーム、軟膏、または半固形ゲルを含む、局所投与に好適な形態である、請求項1に記載の製剤。自己注射器、ポンプ圧送装置、充填済みシリンジ、および無針技術による注射に好適である、請求項1に記載の製剤。前記製剤が押し出される、請求項1に記載の製剤。食物繊維源をさらに含む、請求項1に記載の製剤。タンパク質源をさらに含む、請求項1に記載の製剤。微量栄養素、栄養補助食品、栄養素、食用化合物、および香味料のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1に記載の製剤。リン酸塩、トリス、アルギニン、グリシン、Tween80、スクロース、トレハロース、マンニトール、カゼインタンパク質、およびそれらの誘導体から成る群から選択される、1つまたは複数の賦形剤をさらに含む、請求項1に記載の製剤。存在する場合、リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、約15mM~300mMである、請求項30に記載の製剤。リン酸塩、トリス、アルギニン、およびグリシンの濃度が、独立して、20mM、150mM、または250mMである、請求項31に記載の製剤。存在する場合、前記Tween80の濃度が、約0.01~0.1である、請求項1に記載の製剤。前記Tween80の濃度が、0.01、0.05、または0.1である、請求項33に記載の製剤。存在する場合、前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、約0.1~5である、請求項30に記載の製剤。前記スクロース、トレハロース、およびマンニトールの濃度が、独立して、0.1、1.0、または5.0である、請求項35に記載の製剤。前記1つまたは複数の賦形剤が、カゼインである、請求項30に記載の製剤。前記栄養補助食品が、A1およびA2βカゼインから成る群から選択される、請求項30に記載の製剤。前記ZAG、ZAG変異型、修飾されたZAG、またはその機能的断片が、ポリマーとして存在する、請求項1に記載の製剤。請求項1に記載の製剤を含む、食品添加物または栄養補助食品。請求項1に記載の製剤と併せて、消費可能な担体を含む、食品または栄養補助食品。前記消費可能な担体が、クッキー、ブラウニー、クラッカー、朝食バー、エナジーバー、シリアル、またはケーキである、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。前記消費可能な担体が、飲料である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。前記消費可能な担体が、肉製品である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。前記肉製品が、培養肉である、請求項40に記載の食品添加物または栄養補助食品。製剤を哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項1~39または1~45のいずれか1項に記載の製剤を、前記哺乳類対象に投与することを含む、方法。前記対象が、ヒトである、請求項46に記載の方法。前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項51に記載の方法。前記製剤が、1日2回投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、3日に1回投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、週1回投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、月1回投与される、請求項46に記載の方法。前記製剤が、β3作動薬およびβ-アドレナリン受容体β-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項46に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、β2-アドレナリン受容体β2-AR拮抗薬、β1-アドレナリン受容体β1-AR拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、請求項57に記載の方法。前記β3作動薬が、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967から成る群から選択される、請求項58に記載の方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項58に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項57に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR作動薬が、同時に投与される、請求項58に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項58に記載の方法。前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項57に記載の方法。前記製剤が、前記β3-ARの投与前または投与後に投与される、請求項58に記載の方法。前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項46に記載の方法。前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項46に記載の方法。前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸NEFA、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項46に記載の方法。前記対象の代謝が変調している、請求項46に記載の方法。亜鉛-α2-糖タンパク質ZAGを哺乳類対象に送達するための方法であって、請求項1~39または1~45のいずれか1項に記載の製剤を、経口投与によって前記対象に送達することを含む、方法。前記対象が、ヒトである、請求項70に記載の方法。前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項74に記載の方法。前記製剤が、1日2回投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、3日に1回投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、週1回投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、月1回投与される、請求項70に記載の方法。前記製剤が、β3作動薬およびβ-アドレナリン受容体β-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項70に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、β2-アドレナリン受容体β2-AR拮抗薬、β1-アドレナリン受容体β1-AR拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、請求項80に記載の方法。前記β3作動薬が、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967から成る群から選択される、請求項81に記載の方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項81に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項80に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR作動薬が、同時に投与される、請求項81に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項81に記載の方法。前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項80に記載の方法。前記製剤が、前記β3-ARの投与前または投与後に投与される、請求項81に記載の方法。前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項70に記載の方法。前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項70に記載の方法。前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸NEFA、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項70に記載の方法。前記対象の代謝が変調している、請求項70に記載の方法。対象の内因性亜鉛-α2-糖タンパク質ZAG値を増加させるための方法であって、請求項1~39または1~45のいずれか1項に記載の前記製剤を前記対象に投与することを含む、方法。前記対象が、ヒトである、請求項93に記載の方法。前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、少なくとも10日間連日投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、少なくとも21日間連日投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、1年を超えて連日投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、2年を超えて連日投与される、請求項98に記載の方法。前記製剤が、1日2回投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、3日に1回投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、週1回投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、月1回投与される、請求項93に記載の方法。前記製剤が、β3作動薬およびβ-アドレナリン受容体β-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項93に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、β2-アドレナリン受容体β2-AR拮抗薬、β1-アドレナリン受容体β1-AR拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、請求項104に記載の方法。前記β3作動薬が、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967から成る群から選択される、請求項104に記載の方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項105に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項105に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR作動薬が、同時に投与される、請求項104に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR拮抗薬が、同時に投与される、請求項105に記載の方法。前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項104に記載の方法。前記製剤が、前記β3-ARの投与前または投与後に投与される、請求項105に記載の方法。前記製剤が、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に投与される、請求項93に記載の方法。前記対象が、筋委縮、筋肉減弱症、糖尿病、悪液質、筋力低下、リポジストロフィー、または肥満と関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項93に記載の方法。前記対象が、インスリン抵抗、低血糖、血漿中高値の遊離脂肪酸NEFA、トリグリセリド、またはグルコースと関連付けられる1つまたは複数の症状を有する、請求項93に記載の方法。前記対象の代謝が変調している、請求項93に記載の方法。対象において悪液質の症状を改善する方法であって、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含み、治療後に、悪液質に関連する症状の改善がある、方法。前記症状の改善が、治療前の体重減少と比較して、体重減少の減少または低減を含む、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、連日投与される、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、1日2回投与される、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、週1回投与される、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、月1回投与される、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、静脈内、皮下、舌下、鼻腔内、経口、頬側投与されるか、または吸入によって投与される、請求項117に記載の方法。前記阻害剤が、β3拮抗薬、β2拮抗薬、β1拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項117に記載の方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項124に記載の方法。前記抗体が、グリコシル化されている、請求項117に記載の方法。前記対象が、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、または加齢性筋肉減弱症を有する、請求項117に記載の方法。体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法であって、配列番号1に示される配列を有する前記ポリペプチドの阻害剤の治療上有効な薬用量を、単独で、またはβアドレナリン受容体β-AR拮抗薬およびβ3アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される1つまたは複数の薬剤と併せて、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項128に記載の方法。前記ポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項128に記載の方法。哺乳類対象において、糖尿病または肥満の症状を改善する方法であって、請求項1~39または1~45のいずれか1項に記載の治療上有効な薬用量の製剤を、インスリン、グルカゴン様ペプチド-1GLP-1、またはその類似体から選択される血糖降下薬と併せて、任意の順序で、または同時に、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法。前記対象がヒトである、請求項131に記載の方法。前記製剤が、静脈内、経口、頬側、舌下、鼻腔内、経皮、皮下、筋肉内、局所投与されるか、または吸入によって投与される、請求項131に記載の方法。前記製剤が、β3作動薬およびβ-アドレナリン受容体β-AR拮抗薬から成る群から選択される、1つまたは複数の薬剤と併せて投与される、請求項131に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、β2-アドレナリン受容体β2-AR拮抗薬、β1-アドレナリン受容体β1-AR拮抗薬、およびβ3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬から成る群から選択される、請求項134に記載の方法。前記β3作動薬が、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967から成る群から選択される、請求項134に記載の方法。前記β3-AR拮抗薬が、SR59230Aである、請求項135に記載の方法。前記β-AR拮抗薬が、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールから成る群から選択される、請求項135に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR作動薬が同時に投与される、請求項134に記載の方法。前記製剤および前記β3-AR拮抗薬が同時に投与される、請求項135に記載の方法。前記製剤が、前記β3作動薬の投与前または投与後に投与される、請求項134に記載の方法。前記製剤が、前記β3-ARの投与前または投与後に投与される、請求項135に記載の方法。哺乳類対象において、亜鉛-α2-糖タンパク質ZAG活性を監視する方法であって、a請求項1~39または1~45のいずれか1項に記載の製剤を、前記対象に経口投与することと、bZAG活性のレベルを検出し、それによって前記対象のZAG活性を監視することと、を含む、方法。前記対象がヒトである、請求項143に記載の方法。ZAG活性が、体温、血糖値、尿中グルコース値、および/もしくは血漿ZAG値、またはグリセロ本発明は、抗ヒト亜鉛-α2-糖タンパク質ZAG抗体が、悪液質のモデルにおいて体重減少を低減するという観測に基づく。そのようにして、本発明は、対象の悪液質状態において、体重減少を防ぐための方法を提供する。悪液質の対象において、体重減少の低減をもたらす複合処置法も提供される。本明細書では、哺乳類を処置する、および/またはヒトもしくは動物の食事を補助するための製剤および方法が提供される。この方法は、記載される製剤のうちの1つまたは複数を、所定の期間および/または所定の順序で摂取することを含み得る。製剤のうちの1つまたは複数を含むキットも提供される。そのようにして、本発明は、組み換え亜鉛-α2-糖タンパク質ZAGが、食事の摂取に影響することなく、対象において体重の減少およびインスリン応答性の増加を生じさせるという観測に基づく。本組成物および方法について説明する前に、そのような組成物、方法、および条件は変化し得るため、本発明は、記載される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されないことを理解されたい。また本発明の範囲は、添付の請求項においてのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定するものではないことも理解されたい。本明細書および添付の請求項において使用するとき、単数形a、an、およびtheは、文脈上明示的に別段の指示がない限り、複数形の照応を含む。したがって、例えば、方法に関する言及は、本明細書に記載される種類の1つまたは複数の方法、および/またはステップを含み、本開示等を読むことによって当業者に明らかとなるであろう。別段の定めがない限り、本明細書で使用するすべての技術的および化学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または相当する任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができ、好適な方法および材料についてここで説明する。ZAGの完全アミノ酸配列は、T.Arakiら1988によるCompleteaminoacidsequenceofhumanplasmaZinc-α2-glycoproteinanditshomologytohistocompatibilityantigensという表題の論文Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85,679~683において報告され、糖タンパク質は、3つの個別のドメイン構造A、B、およびCを有し、3つのグリコシル化部位において、N結合型グリカンと一緒に2つのジスルフィド結合を含む、276アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖で構成されるものとして示された。ポリペプチド成分のこのアミノ酸配列は、添付の図面の図10に示される。いくつかの後次出版物は、ヒトZAGの組成物が、異なる体液または組織から単離されると、いくらか変化し得ることを示したが、この材料の全調製物は、実質的に同一の免疫学的特性を有する。H.Ueyamaら1991によってCloningandnucleotideofahumanzinc-α2-glycoproteincDNAandchromosomalassignmentofitsgeneBiochem.Biophys.Res.Commun.177,696-703において報告されるように、ZAGのcDNAは、ヒト肝臓および前立腺ライブラリから単離され、またUeyamaら1993によってMolecularcloningandchromosomalassignmentofthegeneforhumanzinc-α2-glycoproteinBiochemistry32,12968~12976において報告されるように、遺伝子も単離された。H.Ueyamaらは、J.Biochem1994116,677~681において、ラットおよびマウス肝臓から得たZAGcDNAに関する研究についても説明し、対応するmRNAによって発現された糖タンパク質と一緒に、配列決定し、ヒト材料と比較した。異なる種から予想されるように、詳細な差が認められたが、高度のアミノ酸配列相同は、ヒト対照物と50を超える同一性糖タンパク質のドメインB内で70を超える同一性を有することがわかった。再度、ヒトとラットおよびマウスZAGとの間に共通の免疫学的特性が観測された。上述の精製されたZAGは、実質的にOhkuboらによって説明される方法に従って、新鮮なヒト血漿から調製されたOhkuboetal.1988′′Purificationandcharacterisationofhumanplasmazinc-α2-glycoprotein′′Prep.Biochem.,18,413-430。当然のことながら、場合によっては、ZAGまたは抗ZAG抗体の単離された脂質動員因子の断片は、活性を失うことなく産生されてよく、この活性に実質的に影響しない様々な付加、削除、または置換が行われてよい。そのようにして、本発明の方法は、抗ZAG抗体の機能的断片の使用も含む。これらの治療用途で使用される抗体またはその断片は、例えば、恐らく亜鉛-α2-糖タンパク質の既知のcDNA配列に基づいて、当該技術分野においてよく知られている、組み換えDNA技術によってさらに産生されてよく、例えば、その技術は、H.Ueyamaetal.1994′′StructureandExpressionofRatandMousemRNAsforZn-α2-glycoprotein′′J.Biochem.,116,677-681において公開されている。さらに、これらの治療用途で使用される抗体または断片は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化等、ならびに自然発生および非自然発生に関わらず、当該技術分野において知られている他の修飾をさらに含んでよい。本明細書で使用するとき、ZAGポリペプチドまたはタンパク質は、それらの生物学的機能を保持する、野生型タンパク質の変異体を含む。そのようにして、ZAGタンパク質の残基のうちの1つまたは複数は、変異体がその天然の生物活性を保持する限り、変異体または短縮タンパク質を産出するように改変することができる。同類アミノ酸置換には、例えば、酸性アミノ酸としてアスパラギン酸-グルタミン酸、塩基性アミノ酸としてリシン/アルギニン/ヒスチジン、疎水性アミノ酸としてロイシン/イソロイシン、メチオニン/バリン、アラニン/バリン、親水性アミノ酸としてセリン/グリシン/アラニン/トレオニンが挙げられる。同類アミノ酸置換は、側鎖に基づく分類も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリンの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸の置換、トレオニンとセリンの置換、またはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸の置換は、得られる変異型ポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは妥当である。本発明の範囲内であるアミノ酸置換は、一般に、a置換領域におけるペプチド骨格の構造、b標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、またはc側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果が著しく異ならない置換を選択することによって達成される。しかしながら、本発明は、非同類置換を有する変異型も包含する。用語ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すという別段の区別がない限り、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通して翻訳後に修飾されるタンパク質も含む。上述されるように、本発明は、ZAGポリペプチドまたはタンパク質の機能的断片の使用を含む。機能的断片は、体重減少と関連付けられた活性を有するか、または影響を及ぼすこと、血糖値を低下させること、体温を上昇させること、グルコース組織の取り込みを改善すること、Bet3受容体の発現を増加させること、ZAGの発現を増加させること、Glut4の発現を増加させること、および/またはUCP1およびUCP3の発現を増加させることによって、一部特性化される。したがって、用語機能的断片は、本明細書で使用するとき、ZAGの1つまたは複数の生物学的機能を保持するポリペプチドを指す。そのようなZAGポリペプチドの機能的断片を同定するための方法は、当該技術分野において一般に知られている。本明細書で使用するとき、用語抗体は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語は、キメラ抗体例えば、ヒト化マウス抗体およびヘテロ共役抗体例えば、二重特異性抗体等の遺伝子工学的形態も含む。用語抗体は、抗体の抗原結合形態も含み、抗原結合能力を有する断片例えば、Fab、Fab2、Fab、Fv、およびrIgGを含む。PierceCatalogandHandbook,1994-1995PierceChemicalCo.,Rockford,Illも参照されたい。例えば、Kuby,J.,Immunology,3.sup.rdEd.,W.H.FreemanCo.,NewYork1998も参照されたい。この用語は、組み換え単鎖Fv断片scFvも指す。用語抗体は、二価または二特異性分子、二量体、三量体、および四量体も含んでよい。二価および二特異性分子は、例えば、Kostelnyetal.1992JImmunol148:1547,PackandPluckthun1992Biochemistry31:1579,Hollingeretal.,1993,supra,Gruberetal.1994JImmunol:5368,Zhuetal.1997ProteinSci6:781,Huetal.1996CancerRes.56:3055,Adamsetal.1993CancerRes.53:4026,andMcCartney,etal.1995ProteinEng.8:301において説明される。特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、ファージまたは類似するベクターにおける組み換え抗体のライブラリの選択等の組み換え法によって例えば、Huseetal.,Science246:1275-12811989、Wardetal.,Nature341:544-5461989、およびVaughanetal.,NatureBiotech.14:309-3141996を参照、または抗原もしくは抗原をコードするDNAを用いて動物に免疫付与することによって生成することができる。典型的に、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、退場領域および可変領域を含有する領域はドメインとしても知られる。軽鎖および重鎖可変領域は、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる、3つの超可変領域によって中断される、4つのフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの範囲が定義される。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種ないで比較的保存される。組成軽鎖および重鎖の複合フレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、3次元空間においてCDRを配置および整列させるように機能する。CDRは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のCDRは、典型的にCDR1、CDR2、およびCDR3と称されN末端を発端として連続的に付番される、典型的に特定のCDRが位置付けられる鎖によっても同定される。したがって、VHCDR3は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置付けられるが、VLCDR1は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインから得たCDR1である。VHまたはVHに対する言及は、Fv、scFv、またはFabの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。VLに対する言及またはVLは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、Fv、scFv、dsFv、またはFabの軽鎖を含む。自然発生するクラスのIgG抗体定常領域に実質的に同一の定常領域を有する抗体は、存在する任意の定常領域が、自然発生するクラスのIgG抗体の定常領域のアミノ酸配列に対して、実質的に同一である、すなわち、少なくとも約85~90、好ましくは少なくとも95同一である抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。用語モノクローナル抗体は、それが産生される方法ではなく、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する、抗体を指す。本発明に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージ表示技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野における多様な技術を使用して調製されてよい。例えば、モノクローナル抗体は、当業者を含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、例えば、HarlowandLane,′′Antibodies:ALaboratoryManual,′′ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork1988、Hammerlingetal.,in:′′MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomas,′′Elsevier,N.Y.1981,pp.563-681いずれも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれるにおいて教示される。したがって、いくつかの実施形態では、発明の抗体がキメラ化、霊長類化、ヒト化、またはヒト抗体であり得る。キメラ抗体は、免疫グロブリン分子であり、a定常領域もしくはその一部は、抗原結合部位可変領域が異なるか、もしくは改変されたクラス、エフェクタ機能および/もしくは種、あるいはキメラ抗体に新しい特性を付与する全体的に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等に結合するように改変、置換、または交換されるか、またはb可変領域もしくはその一部は、異なるか、もしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、または交換される。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Morrison,Science229:1202-12071985、Oietal.,BioTechniques4:214-2211986、Gilliesetal.,J.Immunol.Methods125:191-2021989、米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、および同第4,816,397号を参照されたい参照によりそれら全体が本明細書に援用される。用語ヒト化抗体またはヒト化免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体から少なくとも1つ、好ましくはすべての相補性決定領域CDRを含む免疫グロブリンを指し、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約85~90、好ましくは少なくとも95同一である。したがって、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、恐らくCDRを除いて、1つまたは複数の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり米国特許第4,816,567号、実質的に製上でないヒト可変ドメインは、非ヒト種の対応する配列によって置換されている。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体の対応する残基と置換されて、抗原結合を改変、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野においてよく知られる方法、例えば、CDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって同定され、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定して、特定位置における異常なフレームワーク残基を同定する。例えば、米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、同第6,180,370号を参照されたいそれぞれ参照によりその全体が援用される。抗体は、例えば、CDRグラフト化欧州特許第EP239,400号、PCT公開第WO91/09967号、米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、および同第5,585,089号、ベニヤまたは再舗装欧州特許第EP592,106号、第EP519,596号、Padlan,Mol.Immunol.,28:489-4981991、Studnickaetal.,Prot.Eng.7:805-8141994、Roguskaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-9731994、および鎖シャッフリング米国特許第5,565,332号を含む、当該技術分野において知られる多様な技術を使用してヒト化され得るすべて参照によりそれら全体が本明細書に援用される。ある実施形態において、完全なヒト抗体が、ヒト患者の治療的処置に望ましい場合がある。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する、上述のファージ提示法を含む、当該技術分野において知られる多様な方法によって製造され得る。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号、ならびにPCT公開第WO98/46645号、同第WO98/50433号、同第WO98/24893号、同第WO98/16654号、同第WO96/34096号、同第WO96/33735号、および同第WO91/10741号を参照されたいそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される。ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できる、遺伝子導入マウスを使用して産生することもできる。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、LonbergandHuszar,Int.Rev.Immunol.13:65-931995を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルに関する詳細な論考については、例えば、PCT公開第WO98/24893号、同第WO92/01047号、同第WO96/34096号、同第WO96/33735号、欧州特許第0598877号、米国特許第5,413,923号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,569,825号、同第5,661,016号、同第5,545,806号、同第5,814,318号、同第5,885,793号、同第5,916,771号、および同第5,939,598号を参照されたい参照によりそれら全体が本明細書に援用される。さらに、Abgenix,Inc.Fremont,Calif.およびMedarexPrinceton,N.J.等の企業は、上述の技術に類似する技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに関与し得る。選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、誘導選択と称される技術を使用して生成され得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するJespersetal.,Biotechnology12:899-9031988。用語霊長類化抗体は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を産生するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第5,658,570号、同第5,681,722号、および同第5,693,780号を参照されたい参照によりそれら全体が本明細書に援用される。本明細書で使用するとき、用語エピトープまたは抗原決定基は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープはいずれも、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並列された非隣接アミノ酸から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒への曝露により保たれるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に、変性溶媒での処置により失われる。エピトープは、典型的に、少なくとも3個、より通常は少なくとも5個または8~10個のアミノ酸を固有の空間構造に含む。エピトープの空間構造を決定する方法には、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,Vol.66,GlennE.Morris,Ed1996を参照されたい。IgGクラスの抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4の抗体を指す。重鎖および軽鎖におけるアミノ酸残基の付番は、EUインデックスのものであるKabat,etal.,′′SequencesofProteinsofImmunologicalInterest′′,5thed.,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991、EU付番スキームが本明細書で使用される。ポリクローナル抗体を調製する方法は、熟練者に知られている。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤および必要に応じてアジュバントを1回または複数回注射することによって、哺乳動物において生育され得る。典型的に、免疫剤および/またはアジュバントは、複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳類に注射される。免疫剤は、核酸またはその機能的断片によってコードされる、配列番号1に示されるポリペプチド等のタンパク質を含んでよい。免疫付与される哺乳類において免疫原性であることが知られるタンパク質に免疫剤を共役させるために有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含むが、それらに限定されない。用いられ得るアジュバントの例には、フロイントの完全アジュバントおよびMPL-TDMアジュバントが挙げられるモノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート。免疫付与プロトコルは、過度の実験を行うことなく、当業者によって選択され得る。あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、KohlerMilstein,Nature256:4951975に記載のものを使用して調製されてよい。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、典型的に、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生可能なリンパ球を誘発するように、免疫剤で免疫付与される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫付与されてよい。免疫剤は、典型的に、配列番号1またはその機能的断片に示されるポリペプチドを含む。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリを含む、当該技術分野において知られる様々な技術を使用して産生され得るHoogenboomWinter,J.Mol.Biol.227:3811991;Marksetal.,J.Mol.Biol.222:5811991。Coleら、およびBoernerらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも使用可能であるColeetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,p.771985およびBoerneretal.,J.Immunol.1471:86-951991。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を形質転換動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって製造され得る。惹起時に、遺伝子再配置、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むあらゆる観点において、ヒトに見られるものに極めて類似する、ヒト抗体産生が観測される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学出版物、Marksetal.,Bio/Technology10:779-7831992、Lonbergetal.,Nature368:856-8591994、Morrison,Nature368:812-131994、Fishwildetal.,NatureBiotechnology14:845-511996、Neuberger,NatureBiotechnology14:8261996、LonbergHuszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-931995において説明されている。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖FvscFvである。scFv抗体のVHおよびVL領域は、折り畳まれて2つの鎖抗体に見られるものに類似する抗原結合部位を形成する単鎖を含む。一旦折り畳まれると、非共有相互作用が単鎖抗体を安定させる。いくつかの抗体実施形態のVHおよびVL領域は、一緒に直接結合することができ、当業者であれば、これらの領域が1つまたは複数のアミノ酸から成るペプチドリンカーによって分離され得ることを理解するであろう。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Hustonetal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA8:58791988、Birdetal.,Science242:42361988、Glockshuberetal.,Biochemistry29:13621990、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,132,405号、およびStemmeretal.,Biotechniques14:256-2651993を参照されたい。概して、ペプチドリンカーは、領域を結合するか、またはVHとVLの間のいくらかの最小距離もしくは他の空間関係を保存することを除いて、特異的な生物活性を有しない。しかしながら、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折り畳み、正味電荷、または疎水性等の分枝のいくつかの特性に影響するように選択されてよい。単鎖FvscFv抗体は、50個を超えないアミノ酸、一般に40個を超えないアミノ酸、好ましくは30個を超えないアミノ酸、およびより好ましくは20個を超えないアミノ酸の長さのペプチドリンカーを随意に含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser配列番号:7、好ましくは2、3、4、5、または6個のそのような配列のコンカテマーである。しかしながら、当然のことながら、リンカー内でいくつかのアミノ酸置換が行われ得る。例えば、バリンはグリシンと置換することができる。scFv抗体を製造する方法は説明されている。Huseetal.,上記、Wardetal.上記、およびVaughanetal.,上記を参照されたい。つまり、免疫付与された動物のB細胞から得たmRNAを単離し、cDNAを調製する。cDNAは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅される。PCR生成物を精製し、核酸配列を結合する。リンカーペプチドが所望される場合、ペプチドをコードする核酸配列を重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入される。scFvをコードする核酸がベクターに挿入され、適切な宿主細胞において発現される。所望の抗原に特異的に結合するscFvは、典型的にファージ提示ライブラリのパニングによって見出される。パニングは、いくつかの方法のうちのいくつかによって行われ得る。パニングは、所望の抗原をそれらの表面上に発現する細胞を使用するか、または所望の抗原で被覆された固体表面を使用して便宜的に行われ得る。便宜上、表面は磁気ビーズであり得る。非結合ファージは、固体表面から洗い流され、結合ファージは溶出される。ZAGおよび/またはその断片は、米国特許第6,890,899号および同第7,550,429号、ならびに米国公開第2010/0173829号において開示されるように、哺乳類における体重減少または肥満の減少をもたらすことが以前に示されているそれぞれの全体内容は、参照により本明細書に援用される。一実施形態において、本発明は、抗ZAG抗体および/またはその機能的断片が、悪液質のモデルにおける体重減少を低減することを証明する。したがって、本発明の方法は、悪液質に関連する症状および/または筋肉消耗疾患と関連付けられる疾患に対して検出可能な効果を提供すると考えられる。したがって、一態様では、本発明は、対象における悪液質の症状を改善する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号1に示される配列を有するポリペプチドの生物活性の阻害剤を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、治療レジメンは、数ヶ月例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月または数年であってよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、最長21日またはそれ以上の期間投与される。別の実施形態において、症状の改善は、治療開始から数日例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日、数週間例えば、1、2、3、もしくは4週間、または数ヶ月例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月以内に検出可能である。別の実施形態において、治療レジメンは、約10日であり、治療後に悪液質に関連する症状の改善が見られる。別の実施形態において、治療レジメンは、約21日であり、治療後に悪液質に関連する症状の改善が見られる。さらに、米国公開出願第2006/0160723号参照によりその全体が本明細書に援用されるに開示されるように、ZAGおよび/またはその断片の類似特徴を有する脂質動員薬も使用して、哺乳類の体重減少または肥満の減少をもたらすことが観測された。最後に、ZAGおよび/またはその機能的断片は、脂肪細胞および骨格筋のインスリン応答性を増加させ、治療中に体重減少または肥満の減少が観測されるか否かに関わらず、タンパク質分解の減少と併せて、タンパク質合成の増加を通して、筋肉量の増加をもたらす米国第12/614,289号、参照により本明細書に援用される。さらに、β3作動薬は、齧歯類において有効なインスリン感作薬であると報告され、それらがヒトにおいて血糖値を減少させる能力は、調査の対象となっている。β3作動薬アドレナリン受容体の活性は、脂肪酸化を刺激し、それによって、インスリンシグナル伝達を調節する脂肪アシルCoAおよびジアシルグリセロールを含む代謝物の細胞内濃度を低下させる。さらに、本明細書では、これらの薬剤に対して使用可能なあるカテゴリーのβ3受容体が、消化系、特に口、咽頭、食道、および胃に位置することを前提として、所定のβ3受容体作動薬は、臨床試験において成功していない可能性があり、結果として作動薬は、これらの受容体の大部分に対して、あるとしても最小限に曝露されると考えられる。この理論は、β3作動薬治療薬のいくつかが有用であるが、血漿空間におけるバイオアベイラビリティが制限されることが認められたという観測によって支持される。本明細書において多数の製剤が提供される。製剤は、例えば、液体、固体、ゲル、乳化剤、粉末、錠剤、カプセル、またはゲルキャップ例えば、ソフトまたはハードゲルキャップ等の任意の形態であり得る。製剤は、典型的に、精製、単離、または抽出例えば、植物から、または合成された1つまたは複数の組成物を含み、食事の補助食品として使用されるとき、複合されて利点を提供する例えば、栄養的利点に加えて健康効果。所定の実施形態において、製剤または製剤に提供される材料の1日当たりまたは1食当たりの推奨量は、本明細書に記載され得る。場合によっては、当業者によって認識されるように、そのような製剤の1日当たりまたは1食当たりの推奨量を提供するために、例えば、粉末をカプセルに、錠剤をカプセルに、ゲルキャップを錠剤に、ゲルキャップをカプセルに、粉末をゲルキャップに、または任意のそのような組み合わせで置換することによって、製剤の形態を変えることができる。いずれの製剤も、当業者によってよく知られている方法を使用して、例えば、列挙される材料を適量で混合することによって調製することができる。製剤に含める材料は、一般に市販されている。したがって、一態様において、本発明は、ZAGまたはその機能的断片を含む製剤を提供する。例えば、ZAGは、哺乳類ZAG例えば、配列番号1に示されるヒトZAGまたはその断片であってよい。しかしながら、ZAGが野生型ZAGの活性を保持することを前提として、ZAGは任意の源に由来し得ることを理解されたい。一実施形態において、さらには、1つまたは複数の補助材料から成る、製薬上許容される担体を含む。用語対象は、本明細書で使用するとき、対象方法が行われる任意の個人または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってよい。したがって、齧歯類マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む農場動物、および霊長類サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む他の動物は、対象の定義内に含まれる。悪液質は、一般に、多数の疾患状態と関連付けられ、重傷疾患および慢性炎症性疾患と関連付けられる急性炎症過程、癌、AIDS、敗血症、COPD、腎不全、関節炎、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、加齢性筋肉減弱症、重症外傷例えば、下肢の整形外科的固定化、代謝性アシドーシス、脱神経萎縮、および体重減少を含む。用語治療上有効な薬用量または有効量は、研究者、獣医、医師、または他の臨床家が求める組織、システム、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、化合物または医薬組成物の量を意味する。いくつかの実施形態において、本発明の製剤は、連日経口投与されるものである。しかしながら、他の投与形態も等しく包含される。本明細書で使用するとき、用語投与または投与することは、本発明の化合物または医薬組成物を、治療を必要とする対象に提供する動作を含むと定義される。本明細書で使用するとき、フレーズ非経口投与および非経口投与されるは、腸内および局所投与以外の、通常、経口または注射による投与モードを意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜内、被膜内、眼球内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内注射および注入を含む。本明細書で使用するとき、フレーズ全身投与、全身的に投与される、末梢投与および末梢投与されるは、中枢神経系への直接投与を除いて、化合物、薬物、または他の材料が対象の体系に入るように投与することを意味し、したがって代謝および他の類似過程、例えば、皮下投与を対象とする。そのようにして、一実施形態において、抗ZAG抗体、その断片、および/または本発明の製剤は、吸入、鼻腔内、頬側、舌下、静脈内、筋肉内、および/または経口によって対象に投与される。別の実施形態において、抗体またはその組成物は、即時融解型組成物、持続放出型組成物、および同類のもので製剤される。本明細書で使用するとき、用語改善するまたは治療するは、行われる動作の結果として、悪液質と関連付けられる臨床兆候および/または症状が低減することを意味する。監視される兆候または症状は、悪液質の特徴であって、熟練した臨床医によく知られており、それらの兆候および状態を監視するための方法も同様である。脂肪/筋肉量の減少に加えて、悪液質と関連付けられる例示の症状には、これらに限定されないが、健常な対照または悪液質を有しない対象と比較して、熱、頭痛、慢性痛、体の不快感、失神、熱と関連付けられる発作、ショック、動悸、心雑音、壊疽、鼻出血、喀血、咳、呼吸困難、喘鳴、過呼吸および低換気、口呼吸、しゃっくりおよび胸痛、腹痛、吐き気または嘔吐、胸焼け、口臭および鼓腸が挙げられる。そのようにして、悪液質に関連する症状の改善は、これらに限定されないが、対象の体重減少を減少または低減すること、および上に列挙された症状のうちの1つまたは複数を改善することを含む。場合によっては、減少は特定アッセイの検出レベルを下回って低減され得るため、本明細書で使用するとき、用語低減するおよび阻害するは一緒に使用される。そのようにして、発現レベルまたは活性が、アッセイの検出レベルを下回って低減されるか、または完全に阻害されるか、は必ずしも明らかでない場合がある。それにも関わらず、本方法に従って治療した後、対象の体重減少量が治療前のレベルから少なくとも低減されたことは明らかに決定可能となる。ZAGは、多数の生物学的役割が考えられるが、脂肪動員および利用を調節するアジポカインとしてのその役割は、身体組成を調節することにおいて最も重要である。以前の研究は、タンパク質合成の増加が、β-アドレナリン受容体との相互作用による循環AMPの増加に起因するが、タンパク質分解の減少は、ユビキチン-プロテアソームタンパク質分解経路の活性の低減に起因することを示唆した。db/dbマウスにおける研究は、インスリン耐性が、ユビキチン-プロテアソーム経路の活性の増加を通して筋肉消耗を引き起こすことを示す。PKRおよびeIF2αの両方のリン酸化の増加は、翻訳開始を遮断することによってタンパク質合成を低減するが、PKRの活性は、核因子-κBNF-κBの活性を通してタンパク質分解を増加させ、プロテアソームサブユニットの発現を増加させる。高細胞外グルコースの存在下で筋管を使用するインビトロ研究は、PKRの活性がp38MAPKの活性および活性酸素種ROSの形成をもたらすことを示した。p38MAPKは、Ser-505においてcPLA2をリン酸化および活性し、ROSの源であるアラキドン酸の放出をもたらす。骨格筋におけるp38MAPKの過反応は、食餌性肥満のモデルにおいて観測された。さらに、カスパーゼ-3活性は、糖尿病の動物の骨格筋において増加することが示され、これはPKRを開裂して活性に至り得るため、シグナル伝達系の一部であり得る。理論に縛られることなく、ZAGがこれらのシグナル伝達経路を減衰させる能力は、筋肉量を増加させるその能力に関する説明を提供する。そのようにして、抗ZAG抗体は、悪液質状況において筋肉量の減少を抑えることが証明される。したがって、別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の食事を補足する方法を提供する。この方法は、ZAGポリペプチドまたはその断片を対象に投与することを含む。別の実施形態において、方法は、ZAGポリペプチド、例えば、配列番号1に記載のヒトZAGポリペプチドを含む製剤を摂取することを含む。製剤は、単独で、または任意の他の既知の製剤と併せて、任意の順序かつ異なる相対期間で摂取され得る。所定の実施形態では、所定の製剤を他の製剤の前に使用するが、他の製剤は同時に摂取される。したがって、ZAGは、脂肪分解ホルモンによって誘発されるものに類似して、GTPに依存する過程において、マウスの白色脂肪細胞の脂肪分解を誘発することができる脂質動員因子として同定される。本明細書に提示されるデータは、ラットZAGとヒトZAGとの間の配列相同がわずか59.4であるという事実にも関わらず、ZAGがラット脂肪細胞において同様の使用分解作用を有し、さらに成熟雄ラットにおいて体重および屠体脂肪の減少をもたらすことを示すことによって、これらの所見を支持する。ZAGは、ブドウ糖負荷試験において、血漿インスリン値の低減および応答の向上を含む、糖尿病状態の代謝特徴の一部にも対抗する。したがって、別の態様において、本発明は、対象の血漿インスリン値を減少させる方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量の配列番号1に示される配列を有するポリペプチド、またはその断片を対象に投与することを含む。一実施形態において、血漿インスリンの減少は、治療開始から3日以内に起こる。別の実施形態において、治療レジメンは、10日またはそれ以上投与される。別の実施形態において、治療レジメンは、21日またはそれ以上投与される。さらに、ZAGは、成体雄マウスにおけるグルコース酸化の増加および組織グルコース代謝率の増加を示した。このグルコース利用の増加は、ZAG投与されたob/obマウスの血糖およびインスリン値の両方の低下を説明する。トリグリセリドの利用もまた、ZAG投与されたマウスにおいて増加し、これは脂肪分解の増加を示す血漿グリセロールの増加に関わらず、血漿非エステル化脂肪酸NEFAおよびトリグリセリドTGの低下を説明する。脂質利用の増加は、BATにおけるUCP1およびUCP3、ならびに骨格筋におけるUCP3の発現の増加から予想され、結果として体温の上昇をもたらす。したがって、ZAGは、脂肪分解ホルモンによって誘発されるものと同様に、GTPに依存する過程において、マウスの白色脂肪細胞の脂肪分解を誘発することができる脂質動員因子として同定される。そのようにして、一実施形態において、高血糖に関連する症状の改善は、治療中に約0.5°C~約1°Cの体温上昇も含む。一実施形態において、体温の上昇は、治療開始から4日以内に起こる。別の実施形態において、ZAGの存在の結果として、血糖を管理する必要があるインスリンがより少量であるため、高血糖と関連付けられた症状の改善は、治療前の膵インスリン値と比較して、膵インスリンの増加も含む。ZAGは、血漿インスリン値の減少およびブドウ糖負荷試験における応答の向上を含む、糖尿病状態の代謝特徴の一部に対抗することも示される。さらに、ZAGは、β3-アドレナリン刺激剤の脂肪分解作用に対する精巣上体脂肪細胞の応答性を高める。ZAGは、肥満インスリン抵抗状態において低減することが認められた精巣上体脂肪組織におけるHSLおよびATGLの発現も増加させる。HSLおよびATGLの発現を調節する因子は知られていない。しかしながら、特定のERK阻害剤であるPD98059は、ZAGに応答してHSL発現を下方調節し、この過程におけるMAPKの役割を示唆している。MAPKホスファターゼ-1を欠失するマウスは、WATにおけるERKおよびp38MAPKの活性を増加させ、エネルギー消費の増強に起因して、食餌性肥満に耐性がある。以前の研究は、骨格筋のUCP3のZAG誘発性の発現におけるMAPKの役割を示唆した。ERK活性は、HSLのセリン残基、例えばSer-600、タンパク質キナーゼAによってリン酸化された部位の1つをリン酸化することによって、脂肪細胞における脂肪分解を調節し得る。本明細書に提示される結果は、ラットへのZAG投与が、ラットにおけるATGLおよびHSLの発現も増加させることを示す。ATGLノックアウトマウスは、正常なインスリン感受性を示したが、大きな脂肪沈着を有し、イソプロテレノールに応答して、WATからのNEFA放出を減少させるため、ATGLは肥満の過剰な脂肪貯蔵において重要であり得る。対照的に、HSLヌルマウスは、通常の食事を与えられると、野生型動物に類似する体重を有した。しかしながら、ATGLおよびHSLの両方の発現は、インスリン感受性状態と比較して、肥満のインスリン抵抗状態のヒトWATにおいて低減し、体重減少はmRNAおよびタンパク質値も減少させた。エネルギーシンクなしで遊離NEFAは、脂肪細胞内のトリグリセリドに再合成されるため、脂肪分解の刺激単独では、体脂肪貯蔵を消耗しない。体脂肪を低減するために、ZAGは、血漿グリセロールの増加によって示されるように、脂肪分解を高めるだけでなく、トリグリセリドおよびNEFAの血漿値の減少によって示されるように、脂質利用も増加する。ZAGで処置されたラットの体温が0.4°C上昇したことから明らかなように、このエネルギーは、熱に向けられる。エネルギー利用の増加は、UCP1の発現の増加から生じる可能性が最も高く、ZAGの投与後のBATおよびWAT両方において示された。UCP1の発現の増加は、BATにおける熱発生の一次基質であるため、NEFAの血漿レベルを減少させると予想される。BATは、グルコース利用のための高い能力も有し、これは血糖の減少を部分的に説明し得る。さらに、骨格筋およびWATにおいてGLUT4の発現が増加し、インスリンの存在下で、グルコースの取り込みの増加を媒介する助けとなる。ZAGで処置されたマウスにおいて、脳、心臓、BAT、および腓腹筋によるグルコース利用/参加が増加し、D-[U-14C]グルコースならびに[14Cカルボキシ]トリオレイン図24からの14CO2の産生も増加した。ZAG投与後、ob/obマウスのBATによる酸素の取り込みも3倍増加した。ZAGは、精巣上体脂肪細胞におけるHSLの発現を増加させたが、皮下または内臓脂肪細胞のいずれかにおいて増加はなかった。同様の状況は、脂肪トリグリセリドリパーゼATGLの発現とともに観測された。HSLおよびATGLの発現は、ERKの活性リン酸形態の発現と相関した。脂肪分解の増加と相関する精巣上体脂肪細胞におけるHSLおよびATGLの発現は、β3作動薬、BRL37344に応答する。この結果は、ZAGがβ3作動薬と相乗的に作用し得ることを示唆し、また抗ZAG抗体がβ3拮抗薬と相乗的に作用し得ることを示唆する。本明細書で使用する、用語作動薬は、完全または部分的薬理反応を誘発することができる薬剤または類似体を指す。例えば、作動薬は、生産的に受容体に結合し、それに対する生理的反応を模倣し得る。本明細書で使用する、用語拮抗薬は、受容体に結合する際に生物学的反応事態を誘発しないが、作動薬媒介性反応を遮断または抑制する、薬剤または類似体を指す。本発明の方法および製剤は、抗ZAG抗体、またはその機能的断片を、例えばBRL37344であるが、それに限定されないβ3拮抗薬、またはβ3作動薬と併せて投与することを含んでよい。本発明において使用され得るβ3作動薬の例には、これらに限定されないが、エピネフリンアドレナリン、ノルエピネフリンノルアドレナリン、イソプロテネロール、イソプレナリン、プロプラノロール、アルプレノロール、アロチノロール、ブシンドロール、カラゾロール、カルテオロール、クレンブテロール、デノパミン、フェノテロール、ナドロール、オクトパミン、オキシプレノロール、ピンドロール、[シアノピンドロール]、サルブテロール、サルメテロール、テラトロール、テクラジン、トリメトキノロール、3-ヨードトリメトキノロール、3,5-ヨードトリメトキノロール、アミベグロン、ソラベグロン、ネビボロール、AD-9677、AJ-9677、AZ-002、CGP-12177、CL-316243、CL-317413、BRL-37344、BRL-35135、BRL-26830、BRL-28410、BRL-33725、BRL-37344、BRL-35113、BMS-194449、BMS-196085、BMS-201620、BMS-210285、BMS-187257、BMS-187413、BMS-187413のSO3HのCONH2置換、BMS-181413のラセミ化合物、CGP-20712A、CGP-12177、CP-114271、CP-331679、CP-331684、CP-209129、FR-165914、FR-149175、ICI-118551、ICI-201651、ICI-198157、ICI-D7114、LY-377604、LY-368842、KTO-7924、LY-362884、LY-750355、LY-749372、LY-79771、LY-104119、L-771047、L-755507、L-749372、L-750355、L-760087、L-766892、L-746646、L-757793、L-770644、L-760081、L-796568、L-748328、L-748337、Ro-16-8714、Ro-40-2148、--RO-363、SB-215691、SB-220648、SB-226552、SB-229432、SB-251023、SB-236923、SB-246982、SR-58894A、SR-58611、SR-58878、SR-59062、SM-11044、SM-350300、ZD-7114、ZD-2079、ZD-9969、ZM-215001、およびZM-215967が挙げられる。本発明において使用され得るβ-AR拮抗薬の例には、これらに限定されないが、プロプラノロール、--プロプラノロール、-プロプラノロール、プラクトロール、--プラクトロール、-プラクトロール、CGP-20712A、ICI-118551、--ブプラノロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、ネビボロール、メトプロロール、アセブトロール、カルテオロール、ペンブトロール、ピンドロール、カルベジロール、ラベタロール、レボブノロール、メチプラノロール、ナドロール、ソタロール、およびチモロールが挙げられる。ZAGによるラット脂肪細胞における脂肪分解の誘発は、β3-ARを通して媒介されることが示唆され、脂肪組織および除脂肪体重に対するZAGの効果もまた、β3-ARを刺激する能力に起因し得る。ZAGによるUCP1発現の誘発は、β3-ARとの相互作用を通して媒介されることが示された。WATにおけるUCP1の発現の増加は、β3-AR作動薬CL316,243によって生じるとき、茶色脂肪細胞前駆体のリモデリングによるβ3-ARの効果でもあり得る。ノックアウトマウスを使用して、β3-AR刺激の抗肥満効果は、主にBATにおけるUCP1に主に起因し、WATから放出されたNEFAのUCP1依存性分解によるUCP2およびUCP3によるところは少ない。動物の末梢組織へのグルコース取り込みは、寒冷暴露によって刺激され、この効果もまたβ3-ARによって媒介される。しかしながら、β3-ARは、ヒト皮下腹部脂肪組織内の脂肪分解および栄養血流の管理において、β1およびβ2-ARサブタイプよりも目立たない役割を果たすため、β3-ARを標的とすることは、齧歯類よりもヒトにおいてより困難であった。しかしながら、このβ3-AR作動薬に関わらず、CL316,243は、健康な若い雄候補対象において脂肪酸化の増加を示した。これは、BATから得た血漿膜におけるβ3-ARの数を増加させるβ-アドレナリン受容体の能力に起因し得る。したがって、別の態様において、本発明は、悪液質または筋肉消耗と関連付けられる疾患に起因する体重減少の低減をもたらすように対象を治療する方法を提供する。この方法は、治療上有効な薬用量のβ3拮抗薬を、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドに結合する抗体、またはその断片と併せて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態において、治療上有効な薬用量のβ3-AR拮抗薬を、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドに結合する抗体、またはその断片と併せて、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。脂肪組織におけるZAG発現は、パラクリン様式で作用することによって、循環するZAGよりも局所的により重要であり得る。したがって、ヒトでは、内臓脂肪および皮下脂肪におけるZAGのmRNA値は、BMIと負の相関を持つが、ELISAによって決定される脂肪量およびインスリン抵抗、血清値、は、脂肪症のパラメータBMIおよび腰囲およびインスリン抵抗と正に相関した。したがって、ZAGが腓腹筋、WAT、およびBATにおいてそれ自体の発現を誘発する能力は、脂肪分解およびエネルギー利用を増加させる能力に重要であり得る。発明の様々な実施形態において、ZAG、β3-AR作動薬、およびβ-AR拮抗薬を複合する目的は、対象の治療目的および状態に応じて異なる。β3-AR機構を活性化して、所望の脂肪分解、グルコース消費、インスリン感作、タンパク質合成、エネルギー消費の増加等を達成することが望ましい一実施形態では、肥満または糖尿病の治療を伴う。この状況において、一部の対象では、投与されたZAG、またはどちらかといえばβ-3AR作動薬が、β-1ARまたはβ-2ARの1つまたは複数において、いくらかの望ましくない活性を呈し、副作用または所望の有効性の消失をもたらすことが観測され得る。次いで、この状況は、β-1ARまたはβ-2ARにおける望ましくない活性を防ぐように、古典β遮断薬と称されることもあるβ-AR拮抗薬の追加投与を必要とする。これらのβ-AR拮抗薬を選択して、必須ではないが、好ましくは、副作用または有効性の軽減と関連付けられる、受容体サブタイプβ-1ARまたはβ-2ARの1つを遮断する。別の実施形態は、悪液質の治療を伴う。異なる疾患によって引き起こされる悪液質において、および所与の疾患を有する対象の集団内で、異なる程度の悪液質が異なる比率の筋肉減少および脂肪減少とともに観測される。別の態様において、悪液質対象は、筋肉量の減少を被っているが、脂肪の減少はないか、またはある程度の脂肪減少を伴う場合がある。筋肉減少は、典型的に、より臨床的に望ましくない転帰であり、ZAGを利用して、ZAGで処置された悪液質動物において起こる筋肉構築の一部を引き起こす一方で、ある程度の脂肪減少を引き起こすことが所望され得る。したがって、そのような対象をZAG、β-3AR作動薬、および任意に上述のβ-AR拮抗薬で処置することは、筋肉量を増加させ得る。別の態様において、悪液質対象は、脂肪量の減少を被っているが、筋肉の減少はないか、またはある程度の筋肉減少を伴う場合がある。この場合、臨床的観点から、脂肪の減少を遮断することが望ましい場合があるため、ZAGによって引き起こされる作用を遮断し、したがってβ-3ARの下流作用を減少させるために、ZAGに特異的な抗体の投与が使用される。別の実施形態において、脂肪量が対象の正常分布に不均衡であり、脂肪量の減少が所望される、リポジストロフィーの治療を伴う。この場合、最初の状況に類似する理由から、ZAG、β-3AR作動薬、およびβ-AR拮抗薬のうちの1つまたは複数の投与が所望される。すべての方法は、1つまたは複数の付属材料で構成される、製薬上許容される担体と活性成分とを関連付けるステップをさらに含んでよい。そのようにして、本発明は、悪液質に関連する症状を有する対象を治療する際に使用するための医薬組成物も提供する。一実施形態において、組成物は、治療上有効な薬用量の上述の抗ZAG抗体、またはその機能的断片を、製薬上許容される担体、賦形剤の希釈液とともに、活性組成として含む。対象に投与するための組成物を製剤するための製薬上許容される担体は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、水等の水溶液、生理活性生理食塩水、または他の溶媒もしくは媒体例えば、グリコール、グリセロール、オリーブオイル等の油、または注射可能な有機エステル等の水溶液を含む。製薬上許容される担体は、例えば、複合体の吸収を安定化または増加させるように作用する、生理学的に許容される化合物を含有し得る。そのような生理学的に許容される化合物には、例えば、炭水化物グルコース、スクロース、またはデキストラン等、抗酸化剤アスコルビン酸またはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。さらに、そのような生理学的に許容される化合物は、担体が所望の投与経路例えば、静脈内、皮下、経口等と適合することを条件として、さらに塩形態であってよいすなわち、Ca2、Mg2、Na、NH4等の対イオンと均衡される。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む、製薬上許容される担体の選択は、例えば、治療薬の物理化学的特徴、および組成物の投与経路例えば、経口または静脈内等の非経口、および注射、挿管、または当該技術分野において知られる他のそのような方法に依存することがわかるであろう。医薬組成物は、診断試薬、付加的栄養物質、毒素、または治療薬、例えば、癌の化学療法薬および/またはビタミン等の第2のまたはそれ以上の化合物を含有することもできる。本発明の製剤は、1つまたは複数の賦形剤を含んでもよい。製剤に含まれ得る製薬上許容される賦形剤は、クエン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質等の干渉液、血清アルブミン、コラーゲン、およびゼラチン等のタンパク質、EDTAまたはEGTA、および塩化ナトリウム等の塩、リポソーム、ポリビニルピロリドン、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロール等の糖、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール例えば、PEG-4000、PEG-6000、グリセロール、およびグリシンまたは他のアミノ酸である。製剤とともに使用するための緩衝液系には、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、およびリン酸塩緩衝液が挙げられる。経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェット、錠剤、またはトローチ等の個別の単位として提示されてよく、それぞれ既定量の活性化合物を粉末または顆粒の形態で、またはシロップ、エリキシル、ドラフトの乳液等の水溶液または非水溶液中の活性化合物の懸濁液として含有する。栄養補助製剤は、健康および/または体重減少を促進することが知られている、任意の数の追加材料をさらに含むことができる。例示の追加材料には、これらに限定されないが、低血糖材料、例えば、炭水化物源、タンパク質源、および食物繊維源が挙げられる。そのような低血糖材料は、食欲を減退させ、1日のカロリー摂取の減少をもたらすことが示された。栄養補助剤の重要なマクロ栄養素は、満腹および後次の体重減少に最大の影響を有するため、炭水化物である。本明細書で使用するとき、飽満とは、食事間の満腹感を指し、満腹は、食事の進行中に発展し、食事の終了に寄与する満腹感を指す。低血糖インデックスの食事は、血糖およびインスリンのわずかな上昇、ならびにより高いグルカゴン濃度を引き起こして、飽満を促進し、高血糖インデックスの炭水化物よりも消化および吸収に時間がかかるため、より高い血糖インデックスの炭水化物を含有する食品よりも良好に体重増加を防ぐ。血糖インデックスは、炭水化物を含有する食品の摂取後の血糖における後次上昇を予測するシステムであるAnderson,J.S.etal.,ModernNutritioninHealthandDisease,ch.70:1259-861994、Wolever,T.M.S.etal.,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-541991、Wolever,T.M.S.etal.,Diab.Care,12:126-321990。血糖インデックスは、食後の炭水化物の吸収率を特性化する。白いパンまたはグルコースのいずれかである、試験食品から得た50gの炭水化物の消費後2時間の血糖反応下の面積を標準曲線下の面積で割ったものとして定義される。血糖インデックス炭水化物は、食品の消化後2時間以内に最高ピーク循環グルコースを有する。逆に、低血糖インデックス炭水化物は、より低いピークグルコースおよびより小さい曲線下面積をもたらす。多くの要因が、食品の血糖インデックスを決定する。これらには、炭水化の種類、線維、タンパク質、および脂肪含有物、ならびに調製方法過度に調理した食品はより高い反応を引き起こす。一般に、高血糖インデックス炭水化物は、高度に精製され、ラクトース、スクロース、またはフルクトースと比較して、比較的多量のグルコースまたはスターチを有する。またそれらは、可溶性繊維において低い。繊維の包含は、繊維が胃内の食物でゲルを形成することによって、体重減少を促進する方法に起因して重要である。このゲル化作用は、胃内容排出率、したがって飽満を促進する消化率を減少させる。飽満に影響する他の要因は、炭水化物の量、炭水化物の複雑性、および炭水化物と同時に食べられる食品例えば、繊維、タンパク質、脂肪であるLudwig,D.S.,JNutr.,130:280S-3S2000、Wolever,T.M.S.etal.,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-541991、Wolever,T.M.S.etal.,Diab.Care,12:126-321990。パンおよびジャガイモは、豆よりも血糖を上昇させる。炭水化物と同時に摂取される、炭水化物を含まないか、または消化不可能な炭水化物を含む他の食品例えば、脂肪、繊維、およびタンパク質は、食後の血糖およびインスリン値を低減するWolever,T.M.S.,etal.,Am.J.Clin.Nutr.,54:846-541991。低血糖インデックスの炭水化物源は、単一の炭水化物または複合によって提供され得る。炭水化物源は、繊維源をさらに提供することができ、天然甘味料、フルクトース、大麦、コンニャクマンナン、オオバコ、およびそれらの組み合わせであってよい。タンパク質源は、高い生物価であり、以下のうちの少なくとも1つから選択される乳清タンパク質濃度、カゼイン、大豆、ミルク、卵、およびそれらの複合。さらに、栄養補助食品は、ミクロ栄養素、ビタミン、ミネラル、栄養補助食品例えば、ハーブ、栄養素、乳化剤、香味剤、および食用化合物を含んでよい。一実施形態において、栄養補助製剤は、栄養補助製剤を甘くするための炭水化物をさらに含んでよい。栄養補助製剤を甘くするために有用な例示の炭水化物には、これらに限定されないが、フルクトース、蒸発サトウキビジュース、イヌリン、アガヴェ、ハチミツ、メープルシロップ、玄米シロップ、麦芽シロップ、デーツ糖、果汁濃縮液、および混合果汁濃縮液が挙げられる。本発明における使用に適切であり得る食物繊維には、これらに限定されないが、セルロース、シード、半セルロース例えば、ブラン、ホールグレイン、ポリフルクトース例えば、イヌリンおよびオリゴフルクタン、ポリサッカリドガム例えば、ラーチアラビノガラクタン、オートミール、バーリー、ペクチン、リグニン、難消化性デンプンが挙げられる。適切な繊維源の例には、これらに限定されないが、麦ブラン、セルロース、コーンブラン、グアー、ペクチン、およびサイリウムが挙げられる。タンパク質源は、栄養製剤において利用される任意の適切なタンパク質であってよく、乳清タンパク質濃縮、乳清粉末、卵、大豆タンパク質、大豆タンパク質単離体、カゼイン酸塩例えば、カゼインナトリウム、カゼインカルシウムナトリウム、カゼインカルシウム、およびカゼインカリウム、動物および植物タンパク質、ならびにそれらの混合物を含み得る。タンパク質源を選択するとき、タンパク質の生物価を最初に考慮すべきであり、最高の才物値がカゼイン酸、乳清、ラクトアルブミン、大豆、脱ラクトース乳固形分、卵アルブミン、および全卵タンパク質において見出される。これらのタンパク質は、高い生物価を有し、つまり高比率の必須アミノ酸を有する。栄養補助剤は、他のビタミン、ミネラル、抗酸化剤、繊維例えば、イチョウ、朝鮮人参、および他の栄養補助剤のうちの1つまたは組み合わせを含有することもできる。これらの材料の1つまたはいくつかを選択することは、製剤設計、消費者、および末端ユーザの選好の問題である。本発明の栄養補助剤に添加されるこれらの材料の量は、当業者には容易にわかり、そのような量の指針は、小児および成人のRDAおよびDRI食事基準摂取量用量によって提供され得る。添加され得るビタミンおよびミネラルには、これらに限定されないが、リン酸カルシウムまたは酢酸塩、三塩基、リン酸カリウム、二塩基、硫酸マグネシウムまたはオキシド、塩塩酸ナトリウム、塩酸カリウムまたは酢酸塩、アスコルビン酸、オルトリン酸鉄、ナイアシンアミド、硝酸亜鉛またはオキシド、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、リボフラビン、β-カロテン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロミウムまたはピコリン酸塩、ヨウ化カリウム、セレニウム、セレン酸ナトリウム、モリブデンさんナトリウム、フィロキノン、ビタミンD3、シアノコバラミン、亜セレン酸ナトリウム、硫酸銅、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンB6およびその塩酸塩、ビタミンC、イノシトール、ビタミンB12、ヨウ化カリウムが挙げられる。単位供給当たりの他の材料の量は、設計の問題であり、患者に連日投与される栄養補助剤の単位供給の総数に依存する。他の材料の総量は、部分的に、患者の状態にも依存する。好ましくは、他の材料の量は、RDAまたはDRI量の分数または倍数である。例えば、栄養補助製剤は、単位用量当たりのビタミンおよびミネラルの50RDI1日の基準摂取量を含み、患者は1日当たり2単位を消費する。香味剤、着色剤、スパイス、ナッツ等を生成物に組み込むことができる。香味剤は、香味付けされた抽出物、揮発油、チョコレート味例えば、非カフェインココアもしくはチョコレート、キャロブ等のチョコレート代用物、ピーナッツバター味、クッキークラム、クリスプライス、バニラまたは任意の市販の香味剤の形態であり得る。香味剤は、混合されたトコフェロールで保護され得る。有用な香味剤の例には、これらに限定されないが、純粋なアニス抽出物、模造バナナ抽出物、模造チェリー抽出物、チョコレート抽出物、純粋なレモン抽出物、純粋なオレンジ抽出物、純粋なペパーミント抽出物、模造パイナップル抽出物、模造ラム抽出物、模造イチゴ抽出物、もしくは純粋なバニラ抽出物、または揮発油例えば、ヤシ油、ベイ油、ベルガモット油、シーダー油、チェリー油、クルミ油、シナモン油、クローブ油、またはペパーミント油、ピーナッツ油、チョコレート香味剤、バニラクッキークラム、バタースコッチもしくはトフィーが挙げられる。好適な実施形態において、栄養補助製剤は、ベリーまたは他の果実フレーバーを含有する。食物組成物は、例えば、バーとして製造される場合、ヨーグルトコーティングでさらにコーティングされてよい。乳化剤は、最終製品の安定性のために添加されてよい。適切な乳化剤の例には、これらに限定されないが、レシチン例えば、卵または大豆由来、ならびに/またはモノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。他の乳化剤は、当業者に容易に明らかであり、適切な乳化剤の選択は、部分的に製剤および最終製品に依存する。製品の貯蔵寿命を延長するために、保存剤が栄養補助剤に添加されてもよい。好ましくは、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸ナトリウム、または二ナトリウムカルシウムEDTA等の保存剤が使用される。上述の炭水化物に加えて、栄養補助食品は、人工甘味料、例えば、サッカリド、シクラメート、アスパルタミン、アスパルテーム、アセスルファームK、および/またはソルビトールを含有し得る。そのような人工甘味料は、栄養補助食品が過体重または肥満の個人、または高血糖になりやすいII型糖尿病の個人を対象とする場合に望ましいことがある。本発明の栄養補助食品は、製薬上許容される形態のビタミン、ミネラル、および上述される他の栄養素それらの塩を含むを使用して製剤されてよい。それらは、任意で、水、ミルク、ジュース、ソーダ、スターチ、植物油、塩溶液、ヒドロキシメチルセルロース、炭水化物等であるが、それらに限定されない生理学的に許容される担体を含む、カプセル、錠剤、粉末、懸濁液、ゲル、または液体に製剤されてよい。一実施形態において、栄養補助食品は、例えば、消費可能な液体ミルク、ジュース、ソーダ、水等と混合するための粉末、または他の栄養液または食品に混合するための消費可能なゲルもしくはシロップとして製剤されてよい。粉末形態は、特に消費者の興味をそそり、投与および日常レジメンに組み込むことが容易であるため、患者コンプライアンスの機会を給える。本発明の栄養補助食品は、他の食品または液体とともに製剤されて、前処理した補助食品例えば、1回分の朝食バー、エナジーバー、パン、クッキー、ブラウニー、クラッカー、シリアル、ケーキ、または飲料等を提供し得る。したがって、栄養補助製剤は、栄養補助食品として、または食品等の消費可能な担体に対する添加物として投与されてよい。組成物は、後に調理されるか、または焼かれる食品に組み込まれてもよい。組成物の成分は、非酸化状態を維持するために構造的に安定し、焼くかまたは調理するために必要な温度で熱安定性である。そのような飲料を製造するために、材料を乾燥させ、水または上述される他の消費可能な液体に容易に溶解できるようにする。飲料は、少なくとも食事の1時間半前に消費される場合、満腹感を助ける能力に起因して、好ましい栄養補助形態である。そのような食品バーを製造するために、ミキサー内で乾燥材料を液体材料に添加し、生地段階に到達するまで混合して、生地を押出機に入れて押し出し、押し出された生地を適切な長さにカットして、製品を冷蔵する。他の食品または飲料を製造するために、本発明の栄養補助食品を含む材料を伝統的な製剤に添加することができるか、またはそれらを伝統的な材料の代わりに使用することができる。食品製造における当業者であれば、本発明の目的を考慮して、適切な食品/飲料を設計することができるであろう。栄養補助食品は、プディング、砂糖菓子すなわち、飴、栄養飲料、アイスクリーム、冷凍菓子およびノベルティ、または焼かれるか、もしくは焼かれていない押出食品例えば、バー等の多様な形態で製造することができる。一実施形態において、栄養補助食品は、飲料用の粉末または焼かれていない押出栄養バーの形態である。一実施形態において、消費可能な担体は、肉製品、例えば、天然または培養肉である。培養肉としても知られるインビトロ生成肉は、完全な生きた動物の一部ではない動物の肉である。インビトロ生成肉を開発する過程は、筋肉細胞を採取し、細胞が肉の大部分に成長するのを助けるタンパク質を適用することを伴う。初期細胞が得られると、ヨーグルト培養の産生と同様に、追加の動物は必要とされない。一実施形態において、インビトロ生成肉の産生において、構造化筋肉の産生は、弛緩筋肉細胞よりもはるかに困難である。筋肉は、筋線維、複数核を有する長細胞から成る。そのような細胞は、それ自体によって増殖しないが、前駆体細胞が溶解すると生じる。前駆体細胞は、胚性幹細胞または衛星細胞、筋組織内の特化された幹細胞であり得る。理論的に、それらをバイオリアクターにおいて培養した後、それらを溶解することは比較的単純である。しかしながら、実際の筋肉の増殖の場合、細胞は、その場で増殖しなければならず、増殖細胞付近に栄養および酸素を送達するとともに、老廃物を除去するための血液供給に類似する還流システムを必要とする。さらに、脂肪細胞等の他の細胞型は増殖する必要がなく、化学伝達物質は、構造に関する手掛かりを増殖組織に提供する必要がある。最後に、筋肉組織は、適切に発育するために、物理的に伸長されるか、または運動する必要がある例えば、米国特許第6,835,390号、および公開国際出願第WO99/31222を参照されたいいずれも参照により本明細書に援用される。さらに別の実施形態において、本発明は、組み換えZAGの付加が不要であるように、十分な量のZAGを発現させるように設計される培養肉を含む。材料は、単一製剤で投与され得るか、または別個に投与することができる。例えば、苦味のある材料は、栄養組成自体例えば、粉末またはバーに組み込むよりも、その味を隠す形態例えば、カプセルまたはピル形態で投与することが望ましい場合がある。したがって、本発明は、発明の栄養組成の材料のうちの1つまたは複数を充填した1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。任意に、そのような容器と、医薬品または栄養補助食品の製造、使用、または販売に関する政府機関の規定に基づく形態における通知を関連付けることができ、この通知は、ヒト投与に対する製造、使用、または販売に関する機関の承認を範囲する。パックまたはキットには、投与の形態、投与の順序例えば、別個、連続、または同時等に関する情報をラベル付けすることができる。パックまたはキットは、患者に治療を受けるように思い出させるための手段も含んでよい。パックまたはキットは、複合療法の単会投与であり得るか、または複数の単位用量であり得る。特に、薬剤は、別個であるか、任意の組み合わせで一緒に混合されるか、製剤または錠剤で提示され得る。ブリスターパックまたは他の分注手段に組み立てられた薬剤が好適である。一実施形態において、製剤は、約1.0mg~1000mgのZAGを含む。別の実施形態において、製剤は、約1.0mg~約500mgのZAGを含む。別の実施形態において、製剤は、約1.0mg~約100mgのZAGを含む。別の実施形態において、製剤は、約1.0mg~約50mgのZAGを含む。別の実施形態において、製剤は、約1.0mg~約10mgのZAGを含む。別の実施形態において、製剤は、約5.0mgのZAGを含む。したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に定義されるように、悪液質または筋肉消耗疾患と関連付けられる疾患に関連する症状および/または状態を治療するためのヒト薬剤において有用な薬剤を製造するための、抗ZAG抗体またはその機能的断片を提供する。一実施形態において、本発明の製剤は、経口投与される。そのような実施形態において、製剤は、任意の他の投与経路として少なくとも70、75、80、85、90、95、または100有効である。本発明の方法を実践する際に投与される製剤の総量は、単回投与として、ボーラスとして、または比較的短期間の摂取によって対象に投与することができるか、または複数容量が長期間にわたって投与される例えば、1日1回、1日2回等、分画治療プロトコルを使用して投与され得る。当業者であれば、製剤の量が、対象の年齢および一般健康状態、ならびに投与経路および投与される処置数を含む多くの要素に依存することがわかるであろう。これらの要素に照らして、熟練者は、必要に応じて特定用量を調整する。一般に、医薬組成物の製剤ならびに投与経路および頻度は、第I相および第II相臨床試験を使用して決定される。したがって、所定の実施形態において、本発明の方法は、間隔治療レジメンを含み得る。ob/obマウスにおけるZAGの長期連日投与は、連続的な体重減少をもたらすことが観測された。そのようにして、一実施形態において、ZAGまたは抗ZAG抗体の単独治療または1もしくは複数のβ-AR拮抗薬もしくはβ3-AR作動薬との併用治療は、1日おきに投与される。別の実施形態において、治療は2日おきに投与される。別の実施形態において、治療は3日おきに投与される。別の実施形態において、治療は4日おきに投与される。以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに示すために提供されるが、本発明の範囲を制限するものではない。それらは使用され得るものの典型であるが、当業者に知られている他の手順、方法、または技術も代替として使用されてよい。実施例1亜鉛-α2-糖タンパク質は高血糖を減衰させる亜鉛-α2-糖タンパク質ZAGが肥満および高血糖を減衰させる能力を評価するために、ob/obマウスに投与したところ、体重減少を誘発し、体温が上昇したエネルギー消費の増加を示唆する。茶色脂肪組織における非共役タンパク質-1および-3の発現が増加する一方で、脂肪分解の増加を示す、グリセロールの増加にも関わらず、グルコース、トリグリセリド、および非エステル化脂肪酸の血清レベルが減少した。血漿インスリンは減少し、静脈内グルコースに対する応答が改善するとともに、脂肪細胞および骨格筋へのグルコースの取り込みが増加した。精巣上体脂肪細胞におけるホルモン感受性リパーゼの発現が増加した。タンパク質合成の増加および分解の減少に起因して、骨格筋量が増加した。これは、ZAGが高血糖の治療において有効であり得ることを示唆する。ダルベッコ変法イーグル培地DMEMおよびフリースタイル培地は、InvitrogenPaisley,UKから購入し、ウシ胎仔血清は、BioseraSussex,UKから購入した。2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースsp.act.1.85GBqmmol-1およびL-[2,6-3H]フェニルアラニンsp.act.37Bqmmol-1は、AmericanRadiolabeledChemicalsCardiff,UKから購入した。リン酸Thr-202および全ERK1、全p38MAPK、リン酸HSLSer-552、グルコース輸送体4GLUT4、脂肪トリグリセリドリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼ、およびリン酸PLA2Ser-505ならびにヒトATGLに対するウサギポリクローナル抗体は、AbcamCambridge,UKから購入した。完全長ヒトZAGに対するマウスモノクローナル抗体は、SantaCruzCalifornia,USAから購入し、ミオシン重鎖II型に対するマウスモノクローナル抗体は、NovacastraLeicaBiosystemsを介して、Newcastle,UKから購入した。20Sプロテアソームα-サブユニットおよびp42に対するマウスモノクローナル抗体は、AffinitiResearchProductsExeter,UKから購入した。リン酸Thr-180/Tyr-182p38MAPKに対するマウスモノクローナル抗体、全およびリン酸Thr-451PKRに対するウサギポリクローナル抗血清、全eIF2αに対するリン酸Ser-162eIF2αは、NewEnglandBiosciencesHerts,UKから購入した。UCP1、UCP3、および全PKRに対するポリクローナルウサギ抗体、ならびにPHOSPHOSAFE商標抽出試薬は、CalbiochemMerkChemicalsを介して、Nottingham,UKから購入した。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギ抗体およびウサギ抗マウス抗体は、DakoCambridge,UKから購入した。マウスβ-アクチンに対するポリクローナルウサギ抗体およびトリグリセリドアッセイキットは、SigmaAldrichDorset,UKから購入した。HybondAニトロセルロース膜および強化化学発光ECL開発キットは、AmershamPharmaciaBiotechBucks,UKから購入した。NEFAのWAKO色分析キットは、AlphaLaboratoriesHampshire,UKから購入し、マウスインスリンELISAキットは、DRGMarburg,Germanyから購入した。グルコース測定は、BootsNottingham,UK血漿グルコースキットを使用して行った。組み換えZAGの産生HEK293F細胞は、発現ベクトルpcDNA3.1において、完全長ヒトZAGcDNAで形質転換され、空気中5CO2の雰囲気下37°Cで、FreeStyle培地内で維持された。採取されたZAGを培地に分泌し、最大タンパク質値16μgmL-1を培養の14日後に得た。ZAGを精製するために、培地200mLを700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、10kDaカットオフを有するAmiconUltra-15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。濃度約2mgタンパク質を、20mLの10mMトリスpH8.8に懸濁された2gDEAEセルロースに添加し、2時間4°Cで攪拌した。DEAEセルロースはZAGに結合し、遠心分離1500gで15分間によって沈降させて、0.3MNaClを含有する20mL10mMのTrispH8.8とともに、30分間4°Cで攪拌してZAGを溶出した。溶出液を洗浄し、Amicon遠心分離フィルタを使用して、滅菌PBS中体積1mLに濃縮した。精製されたZAGは、LALPyrogent単一試験キットLonza,Bucks,UKを用いて決定されるように、内毒素を含まない。細胞培養およびZAGの精製白色脂肪細胞の単一セル懸濁液を、前述のように95酸素:5CO2の雰囲気下、1.5mgmL-1コラゲナーゼおよび4ウシ血清アルブミンを含有するKrebs-Ringer生物源炭酸塩緩衝液中、37°Cで2時間培養することによって、粉砕した脂肪沈着物から調製した。経時的研究の場合、脂肪細胞は、10ウシ胎仔血清を含有するDMEM中、105細胞mL-1の濃度で懸濁され、大気中10CO2の雰囲気下、37°Cで維持された。プラスミド含有ヒトZAGで形質転換されたヒト293細胞を、105細胞mL-1の濃度で、FreeStyle培地に播種し、大気中5CO2の雰囲気下、37°Cで維持した。最大タンパク質値16μgmL-1は、14日間の培養後に得られた。次いで培地200mLを700gで15分間遠心分離して細胞を除去し、10kDaカットオフを有するAmiconUltra-15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。試料約2mgのタンパク質濃度を測定した後、20mLの10mMトリスpH8.8に懸濁した2gDEAEセルロースに加え、4°Cで2時間攪拌した。負に電荷されたZAGは、DEAEセルロースに結合し、遠心分離1500gで15分間によって沈殿させ、0.3MNaClを含有する20mLの10mMトリスpH8.8とともに、4°Cで30分間攪拌することによって溶出した。上澄みを洗浄し、Amicon遠心分離フィルタを使用して、滅菌PBS中で体積1mLに濃縮した。動物-マウス本研究では、アストン大学で維持されたコロニーからの同型肥満ob/obマウスを使用した。アストンob/obマウスの起源および特徴は、以前に説明されている。雄マウス20~21週齢、体重90~100gを、22±2°Cに空調管理された12時間:12時間の明暗周期の部屋において、ケージ当たり3匹に分類し、ラットおよびマウス飼育餌SpecialDietServices,Witham,UKおよび水道水を不断給餌した。それらは、PBS100μL中のZAG35μgを1日2回静脈内投与によってマウスに投与し、体重および食物/水の摂取を連日監視した。対照マウスは、PBSを単独投与された。直腸体温計RSComponents,Northants,UKを使用することによって、体温を連日測定した。すべての動物実験は、英国動物科学的処置法1986に従って行った。ZAGの投与後に悪影響は認められなかった。動物-ラット体重540±82.5gの成熟雄ウィスターラット独自のコロニーから得た1年齢を個別に収容し、1日1回静脈注射により、PBS100μL中のZAG体重100g当たり50μg、または対照としてPBS100μLで処置した。食餌および水の摂取ならびに体重の両方を連日測定した。動物は、食餌SpecialDietServices,Essex,UKおよび水への自由なアクセスを不断で付与した。BritishHomeOfficeによって付与された快適な条件下で動物実験を行った。10日間の処置後に、動物を絶命させて身体組成を測定した。一定体重が得られるまで、80~90°Cで7日間、動物を加熱した。次いで湿重量と乾燥重量との差から含水量を測定した。Lundholmら14によって記載される、クロロホルム:メタノール1:1、エタノール/アセトン1:1、およびジエチルエーテルそれぞれ120mLの配列を使用して、乾燥屠体から脂質を抽出した。溶媒を蒸発させて脂肪を計量した。非脂肪屠体量は、屠体の初期重量と水/脂肪重量との差として計算した。脂肪分解アッセイアッセイされる試料は、1mLのKrebs-Ringer重炭酸緩衝液pH7.2中で2時間、105~2×105脂肪細胞で培養した。放出されたグリセロールの濃度は、Wielandの方法によって酵素的に測定したWieland,O.GlycerolUVmethod.InMethodsofEnzymaticAnalysised.Bergmeyer,H.U.AcademicPress,London,UK,pp1404-1409,1974。脂肪細胞を単独で含有する対照試料を分析して、同時グリセロール放出を測定した。活性は、放出されたグリセロールμmol/105脂肪細胞/2時間として表した。血清代謝産生物の測定非エステル化脂肪酸NEFAを、Wako-ASC-ACODキットWakoChemicalGmbH、Neuss,Germanyを使用して測定した。トリグリセリドは、トリグリセリドキットSigmaChemicalCo.,Poole,UnitedKingdomおよび3-ヒドロキシブチラートを使用して、定量酵素測定キットSigmaによって測定した。グルコースは、グルコースアナライザを使用して測定しBeckman,Irvine,Calif.、グリセロールは、′′MethodsofEnzymaticAnalysis′′Ed.Bergmeyer,H.U.Vol.3,pp1404-1409,publishedbyAcademicPress,London1974に記載される、Wielandの方法を使用して酵素的に測定した。マウス脂肪細胞血漿膜の単離典型的な手順において、白色脂肪細胞は、250mMスクロース、2mMエチレングリコールビスβ-アミノエチルエーテル-N,N,N,NEGTA、10mMトリス-HClpH7.4中で細胞を洗浄したことを除いて、上記のとおりマウスの精巣上体脂肪パッドから単離した。脂肪細胞は、20mLの上記緩衝液中に懸濁し、少なくとも10回、Swinnyフィルタを通して吸引することによって均質化した。次いで、細胞ホモジネートを300gで5分間遠心分離し、脂肪ケーキを表面から除去して、残りのペレットおよび遊泳物を清潔な管に移した。これらを30,000gで1時間、4°Cで遠心分離し、形成された膜ペレットをスクロース緩衝液200~400μL中に懸濁した。血漿膜は、自己形成勾配のPERCOLL商標コロイドシリカ粒子上の他のオルガネラ膜から分離した。組成は、250mMスクロース、2mMEGTA、10mMトリス-HClpH7.4PERCOLL商標、および2Mスクロース、8mMEGTA、80mMトリス-HClpH7.4であり、32:7:1の比で、膜懸濁液と一緒に混合した総容積8mL。この混合液を10,000gで30分間、4°Cで遠心分離した。勾配を0.75mL部分に分画し、コハク酸デヒドロゲナーゼ、NADH-サイトクロームc還元酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ、および5-ヌクレオチダーゼの存在について各部分を分析し、血漿膜分画を位置付けた。膜分画は、150mMNaCl、1mMEGTA、10mMトリス-HClpH7.4中に再懸濁し、10,000g、4°Cで2分間遠心分離した。このプロセスを2回繰り返した。次いで、線状された血漿膜を10mMトリス-HClpH7.4、250mMスクロース、2mMEGTA、および4μMフェニルメチルスルホニルフッ化物PMSF中、1~2mg/mLで希釈し、液体窒素中で急速冷凍して、使用するまで-70°Cで保存した。ラット脂肪細胞における脂肪分解活性白色脂肪細胞は、記載されるように、コラゲナーゼ消化を使用して、雄ウィスターラット400gの微粉砕された精巣上体脂肪組織から調製したBeckSA,etal.Productionoflipolyticandproteolyticfactorsbyamurinetumor-producingcachexiainthehost.CancerRes47:5919-5923,1987。脂肪分解活性は、105-2×105脂肪細胞を2時間、1mLKrebs-Ringer重炭酸緩衝液pH7.2を培養することによって測定し、脂肪分解の程度は、放出されたグリセロールを測定することによって決定したWielandO.GlycerolUVmethod.MethodsofEnzymaticAnalysis,editedbyBergmeyerHU.AcademicPress,London,pp1404-1409,1974。同時グリセロール放出は、脂肪細胞単独を培養することによって測定した。脂肪分解活性は、放出されたグリセロールμmol/105脂肪細胞/2時間として表した。ゲル電気泳動ゲルは、Laemmliの方法に従って調製し、一般に5濃縮ゲルおよび15SDS-PAGE溶解ゲル変性もしくは還元状態、または10SDS-PAGE溶解ゲル非変性もしくは非還元状態で構成される。試料は、1~5μg/レーンで負荷した。バンドは、クマシーブリリアントブルーR-250またはシルバーのいずれかで洗浄することによって可視化した。試料は、5分間100°Cで、0.0625Mトリス-HClpH6.8、10グリセロール、1SDS、0.01ブロモフェノールブルー、および52-メルカプトエタノール中で加熱することによって、還元状態のために調製した。脂肪細胞へのグルコース取り込み単離した脂肪細胞5×104を、1mLのKrebs-Ringer重炭酸緩衝液pH7.2KRBS中で2回洗浄し、10分間室温で、18.5MBq2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを含有する0.5mLのKRBS中で、最終濃度0.1mMになるまでさらに培養した。取り込みは、1mLの氷冷された無グルコースKRBSを添加することによって終了させ、細胞を1mLのKRBSで3回洗浄し、0.5mL1MNaOHの添加によって溶解して、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定する前に、少なくとも1時間室温で放置した。腓腹筋へのグルコースの取り込み腓腹筋は、Krebs-Henseleit重炭酸緩衝液中で45分間、37°Cで培養し、次いでさらに10分間、185MBq2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを含有する5mLのKrebs-Henseleit緩衝液中で、最終濃度0.1mMになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、0.9NaCl中で5分間洗浄した後、0.5mL1MNaOHに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。ヒラメ筋へのグルコースの取り込みヒラメ筋は、Krebs-Henseleit重炭酸緩衝液中で45分間、37°Cで培養した後、さらに10分間、185MBq2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースおよび非放射性2-デオキシ-D-グルコースを含有する5mLのKrebs-Henseleit緩衝液中で、最終濃度0.1mMになるまで培養した。次いで、筋肉を除去し、0.9NaCl中で5分間洗浄した後、0.5mL1MNaOHに溶解し、液体シンチレーションカウントによって放射性を測定した。筋肉内のタンパク質合成および分解筋肉におけるタンパク質合成および分解を測定するための方法は、以前に説明されているSmith,K.L.Tisdale,M.J.Increasedproteindegradationanddecreasedproteinsynthesisinskeletalmuscleduringcancercachexia.Br.J.Cancer67,680-6851993。結紮を使用して腓腹筋を切除し、フェノールレッドを欠失するRPMI1640培地中で30分間、37°Cで培養し、O2:CO219:1で飽和させた後、PBSで洗浄した。L-[2,6-3H]フェニルアラニン640MBqを酸不溶性材料に組み込むことによって、2時間の期間を使用してタンパク質合成を測定し、筋肉を37°CでRPMI/640中、フェノールレッドの非存在下で培養し、O2:CO219:1で飽和させた。次いで、筋肉を非放射性培地中で洗浄し、ブロットして、2過塩酸中で均質化した。タンパク質合成率は、タンパク質結合放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることによって計算した。タンパク質分解は、5mMグルコースおよび0.5mMシクロヘキシミドを含有する、3mLの酸化Krebs-Henseleit緩衝液pH7.4中で2時間にわたる腓腹筋からのチロシンの放出によって測定した。プロテアソームおよびカスパーゼ活性の測定プロテアソームのキモトリプシン様活性は、筋管に関して以前に説明されるように蛍光発生基質N-スクシニルLysLysValTyr.AMC配列番号2からの励起波長360nm、および放出波長460nmにおいて、7-アミド-4-メチルクマリンAMCの放出を測定することによって、経口分析的に測定したWhitehouse,A.S.Tisdale,M.J.Increasedexpressionoftheubiquitin-proteasomepathwayinmurinemyotubesbyproteolysis-inducingfactorPIFisassociatedwithactivationofthetranscriptionfactorNF-κB.Br.J.Cancer89,1116-11222003。腓腹筋は、20mMトリスpH7.52mMATP、5mMMgCl2、および50mMDTT中、4°Cで均質化し、超音波分解して、18,000gで10分間、4°Cで遠心分離して、不溶性材料をペレット化し、得られた上澄みを使用して、プロテアソーム阻害剤ラクタシスチン10μMの存在または非存在下でキモトリプシン様酵素活性を測定した。ラクタシスチン抑制性活性のみが真のプロテアソーム活性であると見なされた。カスパーゼ-3の活性は、AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC配列番号3の放出によって測定し、カスパーゼ-8の活性は、特定基質Z-IleGluPheThrAsp-AFC配列番号4からの7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンAFCの放出によって、上記からの上澄み50μgタンパク質、およびカスパーゼ-3または-8基質10μMのいずれかを使用して、1時間37°Cで、カスパーゼ-3AcAspGluValAsp-CHO配列番号5またはカスパーゼ-8IleGluPheThrAsp-CHO配列番号6阻害剤100μMの存在または非存在下で測定した。AFCに起因する蛍光の増加は、上記のとおり測定したが、AFCに起因する蛍光の増加は、励起波長400nmおよび放出波長505nmで測定した。カスパーゼ阻害剤の存在および非存在下での値の差は、活性の測定値であった。ウェスタンブロット分析新しく切除された腓腹筋をPBS中で洗浄し、PHOSPHOSAFE商標抽出試薬中で5分間、室温で溶解した後、4°Cで超音波処理した。溶解物を18,000gで5分間、4°Cで遠心分離することによって取り除き、サイトゾルタンパク質5μgの試料を12ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動上、180Vで約1時間溶解した。この後、0.45μmのニトロセルロース膜への転移が続き、次いで、トリス緩衝食塩水中の5MarvelpH7.5を用いて、4°Cで一晩遮断した。一次および二次抗体の両方を、抗ミオシン1:250を除いて、1:1000の希釈で使用した。室温で1時間培養し、ECLによって展開した。ブロットを密度計によって走査して差を定量した。ZAGまたはPBSで5日間処置されたラットから切除した精巣上体WAT、BAT、および腓腹筋の試料を、0.25Mスクロース、1mMHEPESpH7.0、および0.2MEDTA中で均質化した後、10分間4,500rpmで遠心分離した。サイトゾルタンパク質10μgの試料は、12ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上で溶解し、次いでトリス緩衝食塩水中の5MarvelpH7.5を用いて、4°Cで一晩遮断された、0.45μmニトロセルロース膜の上にタンパク質を移し、PBS中0.1Tweenによる15分の洗浄を4回行った後、二次抗体を用いた培養を1時間室温で行った。ECLによって展開した。統計解析結果は、少なくとも3回の複製実験の平均±SEMとして示される。群間平均の差は、一元配置分散分析ANOVAに続いて、テューキー-クレーマー多重比較試験によって決定した。0.05未満のP値が有意であると見なされた。結果-マウスZAGの精製は、95を超える純度の生成物を生じ図1A、免疫ブロットによってZAGとして確認された図1B。ZAGは、精巣上体脂肪細胞において脂肪分解を刺激したが図1D、脂肪分解効果は、基礎値よりは著しく上昇したが、皮下および内臓沈着物の両方から得た脂肪細胞において大幅に低減した図1E。任意の脂肪細胞群において、イソプレナリンとZAGとの間の脂肪分解の刺激の程度に有意な差は認められなかったが、ZAGは、モルベースでイソプレナリンよりも強力に脂肪分解を誘発した。5日間にわたるob/obマウスの体重に対するZAGの効果は、図1Fに示される。対照動物は、体重が安定したままであったが、ZAGで処置された動物は、進行性の体重減少を示し、実験の間に等しい食餌PBS32±3.1g、ZAG30±2.5gおよび水PBS140±8.2mL、ZAG135±3.2mLを摂取したにも関わらず、5日後、群間に3.5gの重量差が見られた。ZAG投与から4日後、0.4°Cの著しい体温上昇が見られ図1G、基礎代謝率の増加を示す。血漿代謝産生物価の測定は、ZAG処置された動物における大社基質の利用の増加を示唆する表1。したがって、ZAG処置された動物において、脂肪分解の増加を示すグリセロール濃度の増加が見られたにも関わらず、血漿グルコース、トリグリセリドTGおよび非エステル化脂肪酸NEFAが著しく減少した。血漿インスリン値が36減少したことは、ZAGが糖尿病状態を低減することにおいて有効であることを示唆する。様々な組織におけるZAGmRNA値は図1Cに示される。表1120時間のZAGで処置されたob/obマウスにおける血漿代謝産生物およびインスリン値これを調査するために、ZAG投与から3日後、給餌された動物にブドウ糖負荷試験を行った図2A。PBS対照において血糖値が著しく上昇したが、ZAG処置された動物ではわずかに上昇したに過ぎず、研究の経過を通して、対照群よりも著しく低いままであった。さらに、血漿インスリン値は、研究の開始時に、ZAG処置された動物において著しく低く、60分の観測中もそのままであった図2B。ZAG投与は、インスリンの非存在下で、精巣上体、内臓、および皮下脂肪細胞のグルコースの取り込みを増加させ、低1nMインスリンの存在下で、精巣上体および内臓脂肪細胞へのグルコースの取り込みも増加させた。図2C。腓腹筋へのグルコースの取り込みもまた、インスリン100nMの非存在および存在下の両方で、ZAG処置された動物において著しく増強された図2D。ZAG処置されたマウスの腓腹筋におけるグルコースの取り込みは、非処置動物におけるインスリン応答よりも優れていた。ZAG投与は、骨格筋萎縮に対する高血糖の効果も減衰させた。したがって、ZAGで処置されたob/obマウスは、腓腹筋およびヒラメ筋の両方の湿重量において著しい増加を示した表1。これは、ヒラメ筋におけるタンパク質合成の2倍以上の増加図3Aおよびタンパク質分解の60減少と関連付けられる図3B。ZAGで処置されたマウスから得た腓腹筋は、プロテアソームキモトリプシン様酵素活性の減少を示し図3C非肥満マウスにおいて認められるものと著しく異なっていなかった、20Sプロテアソームα-サブユニット図3Dおよびp42、19S調節因子のATPaseサブユニット図3Eの両方の発現の減少は、ユビキチン-プロテアソーム経路の活性の減少を示唆する。ミオシン値は、ZAG処置されたマウスにおいて増加したが図3F、アクチン値は、変化しなかった図3G。さらに、dsRNA依存性タンパク質キナーゼPKR図4Aおよび真核開始因子2αeIF2α図4Bのリン酸化形態の値の減少が見られ、これは、腫瘍異化因子によって誘発された筋委縮および高い細胞外グルコース値に関与することが示された。ホスホリパーゼA2PLA2図4C、p38ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ図4D、ならびにカスパーゼ-3および-8図4Eを含む、この経路における他の酵素もまた、ZAGで処置されたob/obマウスの腓腹筋において減衰された。これらの変化は、ZAGに応答する筋肉内の異化シグナル伝達の減少に比例した。イソプレナリンではないZAGは、細胞外シグナル調節キナーゼERK阻害剤PD9805914によって完全に減衰された脂肪細胞において、リン酸HSLの発現を増加させた。ZAGは、精巣上体脂肪細胞においてHSLの発現を増加させたが、皮下または内臓脂肪細胞のいずれかにおいて増加は見られなかった図5B~5D。同様の状況は、脂肪細胞トリグリセリドリパーゼATGLの発現とともに観測された図5E~5G。HSLおよびATGLの発現は、ERKの活性リン酸形態の発現と相関した図5H~5J。精巣上体脂肪細胞におけるHSLおよびATGLの発現は、β3作動薬、BRL37344に対する脂肪分解反応の増加と相関した図5K。この結果は、ZAGがβ3作動薬と相乗作用し得ることを示唆する。以前に報告されたように、ZAGの投与は、脂肪組織におけるその発現を増加させた図6A。ZAGの発現は、ZAGの非存在下でさらに3日間の組織培養中も上昇したままであった図6B。HSLの発現は、ZAGの非存在下でさらに3日間の組織培養中も上昇した図6C。ZAGの投与は、BAT図6DにおけるUCP1図6DおよびUCP3図6Eの発現、ならびに骨格筋図6FにおけるUCP3の発現を増加させた。非共役タンパク質の発現の増加は、観測されるように、代謝基質を熱に変化させると予想された図1G。21日後、ob/obマウスにおける血漿代謝産生物価が観測され表2、表3に示されるパラメータを監視した。血糖値のさらなる低下2.03~15.2mMおよびグリセロールの上昇が観測され、対照が以前よりも低いため、より多いように見える。5日目と比較して、21日目に、NEFA、TG、またはインスリンの変化は観測されなかった表1。ZAG処置された動物の膵臓にははるかに多くのインスリンが存在することがわかり、インスリン産生の低下に起因しないが例えば、膵臓β細胞に対する毒素によって起こる、むしろZAG処置された動物の血糖を管理するために必要なインスリンはより少量であるという事実に起因する、血漿インスリンの低下を示す。表221日目のZAGで処置されたob/obマウスにおける血漿代謝産生物およびインスリン値表321日目のZAGで処置されたob/obマウスにおいて監視されたパラメータさらに、ob/obマウスの体温は、4日以内に0.5°C~1°C上昇し図1G、最大体重を喪失する直前に、38.1°Cでピークに達した図7。これは、茶色脂肪組織の重量と相関し、対照における0.33±0.12gからZAG処置された動物における0.52±0.08gに増加する図7。腓腹筋の重量もまた0.2±0.05gから0.7±0.1gに増加したが、尿中グルコース分泌の進行性の減少が見られた図8Aおよび8B。結果-ラットイソプレナリンと比較して、ラット精巣上体脂肪細胞に対するヒトZAGの脂肪分解効果は、図11に示される。233~700nMの濃度で、ZAGはグリセロール放出の用量依存的な増加をもたらしたが、抗ZAGモノクローナル抗体によって減衰され、作用の特異性を示す。ラット脂肪細胞における脂肪分解の程度は、マウスにおいて以前に報告されたものに類似していた。マウスの場合と同様に、ZAGの脂肪分解効果は、β3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬SR59230Aによって完全に減衰され、ZAGの作用がβ3-ARによって媒介されたことを示唆する。これらの結果は、ZAGがラットにおいて脂肪減少を誘発する際に有効であり得ることを示唆する。成体雄ウィスターラット540±83gの体重に対するZAG50μg/体重100gの単回連日静脈内注射の効果は、図12Aに示される、同一容量の溶媒PBSを投与された対照ラットと比較して、ZAGを投与されたラットは、進行性の体重減少を示したが、10日後、PBSで処置された白色ラットは、13gの体重増加を示し、ZAGで処置された動物は、5gの体重減少を示した表4。研究の経過中、2つの群間に食餌ZAG:102±32g、PBS:98±25gまたは水ZAG:135±35mL、PBS:125±25mLの摂取に差は見られなかったが、ZAGで処置された動物は、一定して0.4°Cの対応上昇を示し、これはZAGの最初の投与から24時間以内に顕著であり図12B、これはエネルギー消費の上昇を示す。身体組成分析表4は、ZAGによって誘発された体重減少が、屠体脂肪の減少に起因するこおを示し、除脂肪体重の著しい増加によって部分的に相殺された。ZAGで処置されたラットにおいて、血漿グリセロール濃度が50増加し表5、脂肪分解の増加を示したが、非エステル化脂肪酸NEFAの血漿値は55減少し、利用の増加を示唆した。グルコースおよびトリグリセリドの血漿値もまた36~37減少し表5、これも利用の増加を示唆した。ZAGで処置されたラットの精巣上体脂肪細胞への2-デオキシグルコースの取り込みは、10日間で著しく増加したが、これはインスリンの存在下で増加した図12C。しかしながら、インスリンの存在下、ZAGまたはPBSで処置された動物から得た脂肪細胞へのグルコースの取り込みには著しい差が見られなかった図12C。PBS対照と比較して、ZAGで処置されたラットの腓腹筋およびBATへのグルコースの取り込みの増加はわずかで顕著ではなかったが、インスリンの存在下での取り込みは著しく増加した図12D。これらの結果は、BAT、WAT、および骨格筋による利用の増加に起因することを示唆し、3つの組織すべてにおいてグルコース輸送体4GLUT4の発現が増加したことによって支持される図13。表4PBSまたはZAGのいずれかで処置した後の雄ラットの身体組成PBSで処置された動物との差は、a、p<0.05またはb、p<0.01として示される。表5PBSまたはZAGのいずれかで10日間処置されたラットの血漿代謝産生物およびインスリン値PBSで処置された動物との差は、a、p<0.05、b、p<0.01、またはc、p<0.001として示される。ZAGの投与は、BATおよびWATの両方において、非共役タンパク質UCP-1および-3の発現を約2倍増加させ図13Aおよび13B、基質利用の増加に寄与する。ZAGで処置されたラットにおいて、精巣上体脂肪組織における脂肪分解酵素脂肪トリグリセリドリパーゼATGLおよびホルモン感作リパーゼHSLの発現も2倍増加した図15。ATGLは、主にジアシルグリセロールを形成するトリアシルグリセロール分子において結合された第1のエステルの加水分解に関与するが、モノアシルグリセロールへのその変換は、HSLによって行われる。ZAGの発現も、ZAGで処置されたラットの骨格筋図16A、WAT図16B、およびBAT図16Cにおいて10日間に著しく増加し、外因性ZAGが、末梢組織におけるそれ自体の産生を促進することを示す。ZAGを投与されたラットの腓腹筋において、α-サブユニット上にdsRNA依存性タンパク質キナーゼPKRおよび真核開始因子2eIF2の両方のリン酸化形態の発現が著しく減少したが、総量は変化しなかった図17Aおよび17B。同様の変化は、ZAGを投与されたob/obマウスにおいて観測され未公開の結果、骨格筋におけるタンパク質分解の抑制およびタンパク質合成の増加と一致した。実施例2亜鉛-α2-糖タンパク質の間隔投与ob/obマウスにおけるZAGの長期連日投与は、体重減少の停止をもたらすことが観測された。そのようにして、3~4日の中断後にZAGを再注入することは、継続的な体重減少および高血糖に関連する症状の改善をもたらすことがわかった。理論に縛られるわけではないが、対象が過剰なZAGを受容する場合があるか、またはTNFの場合にみられるように、受容体脱感作が見られる。各群の2匹のマウスを用いてパイロット研究を行い、ZAG送達の最適スケジュールを決定した。約3週間で、90gのマウスから8~10gの多重減少が観測された。脂肪細胞は、ZAG投与から5日後にマウスから除去され、ZAGの非存在下で培養した後、イソプレナリンisoに対するそれらの応答性を測定した図9。isoに対する応答は、ZAGで処置されたマウスにおいてより高く、これはさらに4日間継続した後ZAGおよびHSLの発現が増加したとき、5日目にPBS対照の値まで下降した発現が増加しないとき。実施例3亜鉛-α2-糖タンパク質はob/obマウスにおける筋委縮を減衰させるこの実施例は、新しく発育されたインビトロモデルを使用して、ZAGがob/obマウスの筋委縮を減衰させる機構を証明するRusselletal,Exp.CellRes.315,16-25,2009。これは、高濃度のグルコース10または25mMに供されるマウス筋管を利用する。図18に示されるように、高グルコースは、タンパク質分解の増加を刺激し図18A、タンパク質合成を抑制するが図18B、これらの効果はいずれもZAG25μg/mLによって完全に減衰された。したがって、拮抗薬SR59230Aを使用して、ZAGの効果がβ3-ARによって媒介されるか否かを決定した。しかしながら、SR化合物すなわち、SR59230Aは、β作動薬としても作動することができ、これらの実験においても同様であると思われた。したがって、10および25mMグルコースによって誘発されるタンパク質分解は、ZAGおよびSR化合物の両方によって減衰され、その組み合わせは、拮抗薬よりも付加的であった図19。タンパク質合成の場合図20、SR化合物は、ZAGと同様に好転の証拠がないように思われるが、10mMのグルコースを用いると、SR化合物はタンパク質合成の抑制の増加をもたらす。実施例4亜鉛-α2-糖タンパク質はROS形成を減衰させる活性酸素種ROSの製剤は、高い糖負荷によって誘発されるタンパク質分解において重要であることが示された。図21のデータは、ZAGが、タンパク質分解の減少に対応して、グルコースによって産生されるROSの増加を完全に減衰させることを示す図18A。高グルコースはまた、ob/obマウスの骨格筋において見られるように、PKRの活性リン酸化図22A、およびeIF2αの後次リン酸化図22Bも誘発し、これもZAGによって減衰された。これらの結果は、インビトロモデルが、ZAGが分子レベルで筋肉量に影響する様子を研究に有用となることを示唆する。実施例5亜鉛-α2-糖タンパク質はインスリン抵抗を増加させるインスリン抵抗試験もまた、ZAGを3日間投与されたob/obマウスにおいて行った図23。2つの用量のインスリン10および20U/kgを腹腔内注射によって動物に投与し、血糖値を次の60分間に測定した。図23Aに見られるように、ZAGで処置された動物は、PBSを付与された動物よりもインスリン10U/kgに対する高い感受性を示した。高濃度のインスリン20U/kgにおいて、この差は消失した図23B。20U/kgPBSのグルコース消失曲線は、10U/kgZAGとほぼ同一であったが、この用量レベルで、ZAGは、インスリンの必要性を50低減するが、これは、より多くのインスリンを付与することによって克服することができる。実施例6抗-亜鉛-α2-糖タンパク質抗体は体重減少を低減する図26~29に示されるデータは、β3作動薬、BRL37344が単独で、および抗ZAG抗体と併せて、50μg/日で連日投与された研究から得た。投与から24時間以内に、抗体を投与されたマウスは、BRL37344を投与されたマウスと比較して、体重減少の低減を示した。実施例75日間の亜鉛-α2-糖タンパク質投与5日間の研究を行い、ZAGを35μg/日で5日間、連日静脈内投与した。実験の終了時に、組織を除去およびブロットするか、または単離された脂肪細胞を用いて機能的アッセイを行った。図6Aに見られるように、ZAG投与は、精巣上体ep、皮下sc、および内臓vis脂肪におけるその発現を約2倍増加させた。ep脂肪細胞を調製し、組織培養RPMI164010FCS中で維持したとき、培養培地にZAGが添加されなかった場合でさえも、ZAG発現がさらに3日間維持された図6B。さらに、ZAGで処置したマウスから得た脂肪細胞は、イソプレナリン10μMに対する反応の増加を示し、これもまたZAGの非存在下、組織培養中で4日間維持された図9。イソプレナリンに対する反応の増加は、ZAGによるHSLの発現の増加に起因し、これもまた、ZAGの非存在下で4日間、組織培養において維持された図6C。これらの結果は、ZAGが取り除かれ、したがって連日投与する必要がない場合に、ZAGの効果がさらに3日間維持されることを示す。実際に、上述されるように、過剰なZAGは、反応の増加よりもむしろ抵抗をもたらす可能性が高い。HSLの発現の増加は、ATGLと同様に図5E~5G、5日後のep脂肪細胞ZAGにおいてのみ見られた図5B~5D。ep脂肪組織のみにおいて、pERKの発現の増加が見られ図5H~5J、pERKの阻害剤PD9805910μMは、ZAGによって3時間培養されたep脂肪細胞において、HSLの発現の増加を減衰させた図5A。ZAGは、BAT図6Dおよび6Eならびに筋肉図6FにおいてUCP1およびUCP3の発現を増加させ、これは体温の上昇を説明するものであり、脂肪分解の増加に関わらず、血清中のTGおよびNEFAは低下する。実施例8亜鉛-α2-糖タンパク質の抗肥満および抗糖尿病効果におけるβ-アドレナリン受容体の役割研究の目標は、β-アドレナリン受容体β-ARが、亜鉛-α2-糖タンパク質ZAGの抗肥満および抗糖尿病効果において役割を果たすか否かを決定することである。これは、ヒトβ1-、β2-、β3-ARで形質転換されたCHO-K1細胞、およびob/obマウスにおいて調査された。β3-ARで形質転換されたCHO-K1細胞において、サイクリックAMP産生を刺激するZAGの最低濃度は、350nMであったが、β2-ARで形質転換された細胞には、より高い濃度580nMが必要とされ、β1-ARで形質転換された細胞において、サイクリックAMPの増加は見られなかった。これは、β3-AR46±4nMおよびβ2-AR71±2nMに結合するためのKd値と相関したが、β1-ARへの結合は見られなかった。生物学的活性を破壊するZAGの凍結-解凍は、β2-、およびβ3-ARへの結合を排除した。ZAGによるob/obマウスの処置は、腓腹筋、ならびに白色および茶色脂肪組織においてβ3-ARのタンパク質発現を増加させたが、β1-、およびβ2-ARの発現に対する効果を有しなかった。体重および尿中グルコース分泌の低減、体温の上昇、経口ブドウ糖負荷試験における最適血漿グルコースおよびインスリン値の低減、ならびに骨格筋および脂肪組織へのグルコース輸送の刺激に対するZAGの効果は、非特異的β-AR拮抗薬プロパノロールによって完全に減衰された。これらの結果は、ob/obマウスにおける体重およびインスリン感受性に対するZAGの効果が、β-3ARまたは場合によってはβ2-ARを通して呈されることを証明する。亜鉛-α2-糖タンパク質ZAGは、癌悪液質における脂肪組織の喪失に関与すると考えられる、脂質動員因子LMFのトリプシン断片が、ZAGに対するアミノ酸配列において同一であることが示されたとき、脂質代謝において役割を果たすことが最初に認識された。ZAGおよびLMFはいずれも、免疫学的に同一であり、いずれもマウス脂肪細胞における脂肪分解を、同一量、同一濃度、およびGTP依存性過程におけるアデニリルシクラーゼの活性によって、刺激することが示された。初期研究は、悪液質を開始する腫瘍は、高レベルの発現を示したため、ZAGが腫瘍から発生することを示唆したが、悪液質を誘発しなかった他の腫瘍は発現を示さなかった。その後の研究は、ZAGが、肝臓、茶色脂肪組織BATおよび白色脂肪組織WATを含む正常組織においても産生されることを示したため、ZAGはアジポカインとして分類することができる。さらに、悪液質マウスおよびヒトの両方において、WATにおけるZAGmRNAの発現は、それぞれ10倍および2.7倍増加することがわかった。悪液質患者において、ZAGmRNAは、体重指数BMIとの負の相関を示したが、体重減少および血清グリセロール値とは正の相関を示した。対照的に、WAT中のZAGmRNA値は、肥満において下方調整され、脂肪量、BMI、血漿インスリンおよびレプチンと負の相関を持つことが示された。ZAGによるob/obマウスの処置は、体重および脂肪量を減少させ、血漿グルコース値、インスリン、および非エステル化脂肪酸NEFAを減少させること、インスリン感作を向上させること、および筋肉量を増加させることを含む、インスリン抵抗のパラメータを向上させた。血清ZAG値は、肥満のヒトおよびマウスの場合と同様に、通常食を給餌されたマウスよりも高脂肪食を給餌されたマウスにおいて、著しく低いことがわかった。マウスにおけるZAGの過剰発現は、体重および精巣上体脂肪の重量の両方を低減したが、ZAGノックアウト動物は、特に高脂肪食を給餌されたとき、体重の増加を示した。これらの結果は、レプチン等のZAGが、脂肪量と密接に関連することを示唆する。しかしながら、レプチンは、脂肪量と正の相関を持つが、ZAGは負の相関を持つ。ZAGの脂肪分解効果は、β3-アドレナリン受容体β3-AR拮抗薬、SR59230Aによって減衰されることが示されたが、LMFは、高親和性部位Kd78±4.5nMを介してβ3-ARに結合することが示された。これらの結果は、ZAGによって媒介された脂肪分解が、β3-ARを介して呈されることを示唆する。この研究は、ZAGの作用において、β3-ARの役割を調べると同時に、β1-およびβ2-ARへの結合、ならびにZAGの抗肥満および抗糖尿病効果におけるβ-ARの役割を決定する。FCSウシ胎仔血清は、BioseraSussex,UKから取得し、DMEMダルベッコ変法イーグル培地は、PAASomerset,UKから取得し、Freestyle培地およびSuperscriptII逆転写酵素は、InvitrogenPaisley,UKから購入した。2-[1-14C]デオキシ-D-グルコースsp.act.1.85GBqmmol-1は、AmericanRadiolabeledChemicalsCardiff,UKから購入した。Na[125I]特異的放射能>17Cimg-1は、PerkinElmerLimitedから購入した。β3-ARに対するニワトリポリクローナル抗体ならびにβ1-ARおよびβ2-ARに対するウサギポリクローナル抗体は、AbcamCambridge,UKから購入し、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ニワトリ抗体は、SantaCruzUSAから購入した。UCP1およびUCP3に対するポリクローナルウサギ抗体は、CalbiochemMerckChemicalsを経由して、Nottingham,UKから購入した。ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギ抗体は、DakoCambridge,UKから得た。マウスβ-アクチンに対するポリクローナルウサギ抗体、トリ試薬、およびプロパノロールは、SigmaAldrichDorset,UKから得た。HybondAニトロセルロース膜は、GEHealthcareBucks,UKから得た。パラメータサイクリックAMPアッセイキットは、NewEnglandBiolabsHitchin,UKから購入した。ヨードビーズおよび増強化学発光ECL開発キットは、ThermoScientificNorthumberland,UKから購入した。マウスインスリンELISAキットは、DRGMarburg,Germanyから購入し、グルコース測定は、BootsNottingham,UK血漿グルコースキットを使用して行った。逆転写のためのプライマーおよびEasy-A単管RT.PCRシステムは、AgilentTechnologiesCheshire,UKから購入した。動物平均体重71gの肥満ob/ob高血糖マウスを飼育した。これらの動物の背景は、以前に説明されBaileyCJ,etal.InfluenceofgeneticbackgroundandageontheexpressionoftheobesehyperglycaemicsyndromeinAstonob/obmice.IntJObes6:11-21,1982、C57BL/6Job/obマウスよりも重篤な形態の糖尿病を呈する。雄マウス約20週齢は、ケージ当たり3匹に分類され、空調管理された部屋において22±2°Cで、ラットおよびマウス飼育食餌SpecialDietServices,Witham,UKおよび水道水の不断給餌で維持された。ZAG50μg、静脈内、100μLPBS中またはPBSを、プロパノロールの存在または非存在下で40mgkg-1、po、連日マウスに連日投与し、体重および食餌/水の摂取、ならびに尿中グルコース分泌を決定し、直腸体温計の使用によって体温を決定したRSComponents,Northants,UK。ブドウ糖負荷試験は、3日目に行った。グルコース100μLの体積中1gkg-1を、12時間断食した動物に経口投与した。グルコース投与から15、30、60、および120分後に、血液試料を尾静脈から採取し、グルコースおよびインスリンの測定に使用した。実験の最後に、動物を頸椎脱臼によって絶命させて、組織を除去し、液体窒素中で急速冷凍して、-80°Cで維持した。組み換えヒトZAGの産生ヒトZAGを含有するpcDNA3.1で形質転換されたHEK293F細胞は、ネオマイシン50μgmL-1を含有するFreestyle培地内で、大気中5CO2の雰囲気下で維持された。2週間の増殖後、遠心分離700gで15分間によって除去し、培地を10kDaカットオフM.W.を有するAmiconUltra-15遠心分離フィルタを使用して、体積1mLの滅菌PBSに濃縮した。ZAGは、高い電気陰性度を有するため、説明されるとおりRussellSTandTisdaleMJ,Antidiabeticpropertiesofzinc-α2-glycoproteininob/obmice.Endocrinol151:948-957,2010、DEAEセルロースに結合することによってZAGを精製し、0.3MNaClで溶出した。この方法によって産生されるZAGは、LALPyrogent試験キットLonzaによって測定されるように、純度が95を超え、内毒素を有しない。精製されたZAGは、PBS中4°Cで保存した。ZAGの[125I]標識洗浄および乾燥した1つのヨードビーズを、PBS中でNa[125I]1mCi/100μgタンパク質を用いて5分間培養した後、ZAG100μgタンパク質を添加し、さらに15分間放置した。ヨードビーズの除去によって反応を終了させる一方で、0.1MNaIで溶出されたSephadexG25を使用して、遊離Na[125I]を除去した。Mr10,000のフィルタカットオフを有するMicroconミクロ濃縮器を使用して、PBSに対して[125I]ZAGを濃縮した。[125I]ZAGの特異的活性は、8Cimgタンパク質1であった。結合研究およびサイクリックAMPの測定ヒトβ1-およびβ2-ARで形質転換されたCHO-K1細胞は、ノッティンガム大学UKから取得し、一方β3-ARで形質転換されたCHOK1細胞は、AstraZenecaMacclesfield,Cheshire,UKから取得した。遺伝子発現は、ハイグロマイシンの管理下にあり、β-ガルレポーター構成と一緒に、G418に対する抵抗のために選択された。それらは、2mMグルタミン、ハイグロマイシンB50mgmL-1、G418200mgmL-1、および10FCSが捕捉されたDMEM中、大気中10CO2の雰囲気下で維持された。サイクリックAMP産生に対する作動薬の効果を決定するために、1mLの栄養培地を含有する24ウェルプレートにおいて細胞を増殖させた。図51に示される濃度でZAGまたはイソプロテレノールを細胞に添加し、培養を30分間継続した。培地を除去し、0.5mLの20mMHEPESpH7.5、5mMEDTAおよび0.1mMイソブチルメチルキサンチンと置換して、プレートを沸騰した湯浴上で5分間加熱し、氷で10分間冷却した。サイクリックAMPの濃度は、ELISAアッセイを用いて測定した。結合研究の場合、細胞を0.5MMgCl2を含有する2mMトリスHCl、pH7.5中で超音波処理し、粗全体膜を遠心分離13,000g、15分によって4°Cでペレット化した。結合研究は、0.5mMMgCl2を含有する0.4mLの50mMトリスHClpH7.5中で膜500μgタンパク質を60分間37°Cで、様々な濃度の[125I]ZAG3,000~15,000cpmを用いて、100μMの非標識ZAGの非存在または存在下で培養することによって行った。次いで膜は、13,000gで20分間遠心分離することによって沈殿させ、上澄みを除去して、ペレットに結合される[125I]を、PackardCorbraModel5005Auto-γカウンターを使用して定量した。結合は、非線形回帰分析を使用して分析したGraphPadPrism,Version5.04。特定の結合は、非放射性ZAGによって置換される標識ZAGの量として見なされた。RNA単離およびRT-PCR3つのCHO-K1細胞におけるβ1-、β2-、およびβ3-ARに対するmRNA転写の定量化は、既に説明されている方法論に基づくMoniotteS,etal.Real-timeRT-PCRforthedetectionofbeta-adrenoceptormessangerRNAsinsmallhumanendomyocardialbiopsies.JMolCellCardiol33:2121-2133,2001。全RNAをトリ試薬で抽出し、光度分析によって定量化して、800±34ngの全RNAを、SuperscriptII逆転写酵素を使用し、43°Cで50分間プライマーとして2000pmolランダムヘキサマーと一緒に逆転写した。プローブ配列を選択して、マッチングプライマー対より約10°C低いTmSを得た。PCRは、製造者の指示にしたがって、Easy-A単管RT.PCRシステムを使用して行った。PCR条件は、95°Cで10分間の変性、42~65°Cのアニーリングステップ、および68°Cで2分間の延長ステップ、および68°Cで10分間の最終延長を含んだ。40サイクルの増幅があった。β-ARmRNAの発現は、StratagenesMxPro,QPCRソフトウェアv3.00を使用して、Δ-CT法によって測定された。ウェスタンブロット分析WAT、BAT,心臓、および腓腹筋を解凍し、PBS中で洗浄して、室温で5分間、Phosphasafe商標抽出試薬に溶解した後、4°Cで超音波処理した。18,000gで5分間、4°Cで遠心分離することによって形成された上澄みをウェスタンブロットに使用した。サイトゾルタンパク質UCPの場合5μg、β-ARの場合20μgを、180Vで約1時間、電気泳動によって12ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で溶解し、4°Cで一晩、トリス緩衝食塩水pH7.5中の5w/v非脂肪粉乳Marvelで遮断された0.45μmニトロセルロース膜の上に移した。一次抗体を添加する前に、0.1Tween20緩衝食塩水中で15分間洗浄した。一次抗体および二次抗体の両方は、1:1000の希釈で使用した。室温で1時間培養し、ECLによって発育した。濃度計によってブロットを走査し、差を定量化した。脂肪組織および骨格筋へのグルコースの取り込み新たに単離された精巣上体脂肪細胞および腓腹筋への2-[1-14C]デオキシ-D-グルコース2-DGの取り込みは、以前に説明されるように測定したRussellSTandTisdaleMJ,Antidiabeticpropertiesofzinc-α2-glycoproteininob/obmice.Endocrinol151:948-957,2010。統計解析結果は、少なくとも3つの複製実験の平均±SEMとして示される。群間の平均の差は、一元配置分散分析ANOVAに続いて、テューキー-クレーマー多重比較試験によって決定した。0.05未満のP値が有意であると見なされた。ヒトβ1、β2、およびβ3-ARで形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMP産生に対するヒトZAGの効果は、図51に示される。低濃度では最高460nM、β3-ARで形質転換された細胞においてのみサイクリックAMP産生が特異的に刺激された図51A。しかしながら、580nMでは、β2-ARで形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMP値の著しい増加も見られたが、変化の程度は、β3-ARで形質転換された細胞の場合よりも少なかった。任意のZAG濃度において、β1-ARで形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMPは増加しなかった図51A。対照的に、イソプレナリン10μMは、β1-、β2-、およびβ3-ARで形質転換されたCHO細胞におけるサイクリックAMP値の著しい増加を示し、β-ARの3つのイソフォームに対する特異性の欠如を示す図51B。β1-、β2-、およびβ3-ARを通して、イソプレナリンによるサイクリックAMPの増加は、SR59230Aによって減衰され、β3-ARに対するこの薬剤の特異性の欠如を示す。β-ARの発現が3つの細胞系において同一であるか否かを決定するために、説明されるRT-PCRによって、β1-AR、β2-AR、およびβ3-ARのmRNA値を測定したMoniotteS,etal.Real-timeRT-PCRforthedetectionofbeta-adrenoceptormessangerRNAsinsmallhumanendomyocardialbiopsies.JMolCellCardiol33:2121-2133,2001。図51Cのデータは、各β-ARの発現レベルが、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに関して同一であることを示す。さらに、アデニル酸シクラーゼの値もまた、ホルスコリンの存在下でのサイクリックAMP産生によって決定されるように、3つの細胞系において同様であった図51D。これらの結果は、3つの細胞系におけるβ-ARの間の比較が有効であることを示唆する。3つのβ-ARに対するZAGの結合親和性は、125I標識されたZAGおよびCHO-K1、β1、β2、およびβ3細胞からの粗膜を使用して測定した図51E、F、およびG。非線形回帰分析を使用してデータを評価し、KdおよびBmax値を示す。図51Aに示されるように、結合データは、ZAGによるサイクリックAMP産生の刺激を反映する。したがって、ZAGは、主にβ3-AR高Bmaxおよび最低Kdに結合し、β2-ARBmaxはβ3-ARの20、Kdはβ3-ARの2倍に対してはそれよりも少なく、β1-ARに対してはまったく結合しなかったBmaxなし、高Kd。非特異的結合は、100μMの非標識ZAGの存在下で、[125I]ZAGを結合することによって測定され、これらの値を総結合から控除して、特異的結合値を得た。ZAGの脂肪分解活性は、恐らくタンパク質の構造変化に起因して、単一の凍結解凍サイクルによって破壊されることが示された図51H。これがβ-ARへの結合を破壊したか否かを決定するために、2つの実験を行った。i凍結/解凍された[125I]ZAGを結合研究に使用し、β2-およびβ3-ARへの結合を完全に減衰した図51FおよびG。ii上記非特異的結合の測定の場合と同様に、凍結/解凍された非標識ZAGを[125I]ZAGとの競合アッセイに使用した。新鮮な非標識ZAGとは対照的に、これは、β2-ARまたはβ3-ARに結合するためのKdまたはBmaxのいずれかに対する効果を有しない。これらの結果は、β-ARへの結合を防ぐことによって、凍結/解凍ZAGが生物活性を破壊することを示唆する。体重およびインスリン感作に対するZAGの効果がβ-ARとの相互作用に起因するか否かを決定するために、以前に報告されているようにRussellSTandTisdaleMJ,Antidiabeticpropertiesofzinc-α2-glycoproteininob/obmice.Endocrinol151:948-957,2010、非特異性β-AR拮抗薬プロパノロール40mgkg-1、po、連日の非存在および存在下、ob/obマウスをZAG50μg、iv、連日で処置した。β3-AR作動薬の効果に対抗するためにより高いレベルが必要とされるため、この用量レベルは、β2-AR作動薬とともに一般に用いられるレベルよりも高いLiuYLandStockMJ,Acuteeffectsofthebeta3-adrenoreceptoragonist,BRL35135,ontissueglucoseutilisation.BrJPharmacol.114:888-894,1995。プロパノロールは、ZAGによってもたらされた体重の減少を完全に減衰したが図52A、プロパノロール単独で処置された動物は、PBS対照のような大幅な体重増加を示さなかった。以前に報告されているようにRussellSTandTisdaleMJ,Antidiabeticpropertiesofzinc-α2-glycoproteininob/obmice.Endocrinol151:948-957,2010、ZAGで処置されたマウスは、体温の増加を示し図52B、これは、尿中のグルコース分泌の減少に見られるように、プロパノロールによって完全に減衰された図52C。ZAG単独では、肝脂肪に対する効果を有しなかったが、いくらかのグリコーゲンの増加が見られた図52D。またプロパノロールは、ピーク血漿グルコース値、経口ブドウ糖負荷試験においてZAGによって誘発されたグルコース曲線下の面積AUC図53A、ならびに対応するピーク血漿インスリン値の減少図53Bも遮断した。ZAGで処置された動物は、インスリンの存在下10nM、腓腹筋へのグルコース取り込みの増加を示し図53C、これは、プロパノロールを受容しているマウスから得た腓腹筋において完全に減衰された。ZAGで処置されたマウスから得た精巣上体脂肪細胞は、インスリンの非存在および存在下で、グルコース取り込みの増強も示し図53D、これもまたプロパノロールで処置された動物において完全に減衰された。ZAGによってもたらされたトリグリセリドTGおよび非エステル化脂肪酸NEFAの血漿値の減少もプロプラノロールによって減衰された図53EおよびF。これらの結果は、ZAGの生物学的効果が、β-ARを通して媒介されることを示唆する。ZAGがインスリンシグナル伝達を増加し得るか否かを決定するために、Glut4発現に対する効果を測定した。インスリンおよびZAGはいずれも、腓腹筋図53GおよびWAT図53HにおいてGlut4の発現を増加させたが、この組み合わせは、インスリン単独でのそれを上回る増加をもたらさなかった。これらの結果は、ZAGがインスリンと同一のシグナル伝達経路に影響するが、インスリンシグナル伝達を増加させないことを示唆する。多数のβ3-作動薬は、β3-ARの発現を増加させることが知られている。ZAGが同一の効果を有するか否かを決定するために、ZAGによるob/obマウスの処置の5日後に、組織β3-ARの発現をウェスタンブロットによって定量化した。図54の結果は、腓腹筋におけるβ3-AR発現の2倍増加図54A、BATにおける89の増加図54B、およびWATにおける85の増加図54Cを示す。対照的に、腓腹筋図55AまたはWAT図55Bのいずれかにおいてβ1-ARまたはβ2-ARの発現、および心臓におけるβ1-ARの発現図55Cに変化はないが、β2-ARにはわずかな増加が見られ、有意に達した図55C。BATおよびWATにおけるβ3-ARの発現の増加図54は、UCP1の発現の増加に至ると予想され、ZAG投与後にBAT図56AおよびWAT図56Bの両方において観測される。インビトロ実験は、ZAGによるUCP3の発現の誘発が、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼMAPKK阻害剤PD98059によって減衰されたことを示し、この過程におけるMAPKの関与を示唆した。以前の研究は、ZAGで処置したマウスのWATにおけるERK発現の増加を示した。これは、観測されたように、WATにおけるUCP3の発現の増加に至ると予想された図56C。ZAG投与後のob/obマウスの骨格筋におけるUCP3の増加も以前に報告されている。UCPの発現の増加は、脂肪組織から放出されたNEFAのシンクを提供し、以前に報告されているように熱を発生する。さらに、ZAGによる処置は、骨格筋におけるAMPKの発現の増加をもたらし図56D、長鎖脂肪酸の酸化の増加に至り、トリグリセリドの合成に対するアベイラビリティを減少させるとともに、GLUT4の発現の増加を通してグルコースの取り込みを刺激する。この研究は、ZAGが主にβ3-ARに結合し、β2-ARに対しては中間結合し、β1-ARには結合しないことがわかった。ヒトβ3-ARは、β1-ARに対するアミノ酸配列において51相同であり、β2-ARに対して46相同である。β3-ARに結合するZAGのBmaxは、β2-ARの約3倍であるが、Kdは約半分である。β3-ARに結合するためのZAGのKdは、部分的作動薬であるCGP12177よりも約100倍低く、Bmaxはわずかに低い。これらの結果は、天然ZAGに対する非等価結合活性を有し得る[125I]ZAGを使用して得られ、Kdの推定値以上または未満になり得る。ZAGを用いる研究の大部分は、齧歯類において実行されたが、ヒトβ3-ARと齧歯類β3-ARとの間には差がある。したがって、BRL37344は、ヒトβ3-ARを介してアデニリルシクラーゼを刺激することにおいて、齧歯類β3-ARよりも有効性は低いが、CGP12177は、ヒトβ3-ARにおいて有効な作動薬であるが、ラットβ3-ARでは有効でない部分的作動薬である。ZAGがどのようにβ3-ARおよびβ2-ARに結合する一方でβ1-ARに結合しないかは知られていないが、結合は単一の冷凍/解凍サイクルによって破壊されるため、タンパク質の構造は非常に重要であり、マウス脂肪細胞における脂肪分解を刺激するZAGの能力も同様である。Kd値は、脂肪分解の刺激およびZAGによるサイクリックAMP産生に対する研究からいずれも予想される範囲内である。しかしながら、それらは、ELISAを使用して報告されるヒト血漿濃度よりも10倍以上低いが600nM、質量分析を使用して報告されるものに相当する85nM。前者の値が真である場合、ZAGは、正常な血漿濃度でβ2-およびβ3-ARを最大限に刺激しているというのは明らかに誤りである。抗ZAG抗体に結合する他の構成要素が存在し、明らかに高い濃度を付与し得るため、ELISAを使用してZAGの血漿濃度を解釈する際には、注意が必要である。したがって、ZAGは、増加量の尿ZAGを含有する試料において明らかに高い値を付与する、モノクローナル抗ヒトエリトロポエチン抗体に対して非特異的に結合することが示された。ob/obマウスモデルにおける肥満および糖尿病に対するZAGの効果は、β3-ARに結合するその能力に起因し得る。したがって、β3-AR作動薬は、ZAGに類似する齧歯類モデルにおいて抗肥満効果を示し、WATデポーからのトリグリセリドの移動の増加、脂肪酸化の増加、およびBAT媒介性発熱の増加を誘発し、結果として体脂肪の選択的低減および除脂肪量の保存をもたらした。ZAGと同様に、β3-AR作動薬の抗糖尿病効果は、抗肥満効果から独立し、体重減少を誘発しない投与量で発生する。β3-AR作動薬BRL35135によるob/obマウスの処置は、血漿グルコース値を正常化し、血漿インスリンおよび非エステル化脂肪酸NEFA値を著しく減少させた。ZAGと同様に、BRL35135は、インスリンの作用から独立して、骨格筋、BAT、WAT、心臓および横隔膜の3種へのグルコース取り込みを刺激した。別のβ3-作動薬L-796568は、単回投与として投与されると、肥満のヒトにおける脂肪分解およびエネルギー消費を増加させた。しかしながら、28日間の処置は、トリアシルグリセロール濃度を低下させたが、主要な脂肪分解または発熱効果を有しなかった。これは、ヒトにおけるβ3-AR反応組織の不十分な動員、または慢性投与に伴うβ3-ARの下方調節に起因し得る。ヒト皮下腹部脂肪組織における研究は、β3-ARが齧歯類において見られるよりも脂肪分解の管理において果たす役割が弱いこと、および脂質の動員が主にβ1およびβ2-ARサブタイプを通してであることを示す。したがって、ZAGは、ヒトにおいて、β3-ARよりもβ2-ARを介してその効果を発揮し得る。この研究は、プロパノロール、非特異的β-AR拮抗薬が、高用量で投与されると、体重および尿中グルコース分泌の減少、体温の上昇、経口ブドウ糖負荷試験におけるグルコースに対する反応の改善、およびob/obマウスの骨格筋およびWATへのグルコースの取り込みの増加において、ZAGの効果を減衰させることを示した。さらに、WATにおいて脂肪分解を誘発するZAGの能力を破壊し、老齢の肥満マウスにおいて体脂肪を低減させる凍結-解凍もまた、ヒトβ2-およびβ3-ARに結合するその能力を完全に減衰させる。これらの結果は、ZAGの抗肥満および抗糖尿病効果が、β-ARを通して媒介されることを確認する。この研究は、ob/obマウスに対するZAGの投与が、BAT、WAT、および骨格筋において、β3-ARタンパク質の発現を増加させることも示した。この効果は、他のβ3-AR作動薬を用いても見られる。したがって、β3-AR作動薬BRL35135によるob/obマウスの長期処置は、BATにおいてβ3-ARmRNAの2倍増加をもたらした。同様の効果は、別のβ3-AR作動薬CL316243をザッカーfa/faラット、および成人の脂肪細胞において用いた場合に報告された。したがって、ZAGがβ3-ARの発現を誘発する能力は、肥満および糖尿病に対するその効果を増強する。肥満対象に見られるβ-AR媒介性脂肪分解および脂肪酸化の低減は、低いZAG値に起因する場合があり、ZAGの投与は感受性を向上させ得る。明らかに、ob/obマウスへのZAG投与は、β3-AR作動薬、BRL37344の脂肪分解効果に対する精巣上体脂肪細胞の感受性を高めた。β3-ARの発現を誘発するZAGの能力は、β3-AR作動薬CL316243の脂肪分解効果に対するZAGノックアウトマウスから得た脂肪組織の反応の欠如を説明する。ノックアウトマウスを使用して、β3-AR刺激の抗肥満効果は、WATから放出された脂肪酸のUCP-1依存性分解を経由することが示された。近年まで、BATは、齧歯類およびヒト新生児に限定されると考えられていた。しかしながら、3つの独立した研究は、決定的に、主に下顎部および鎖骨の筋肉の背後にある成人のにおいて、ならびに胸部腹部の脊椎に沿ってBATを同定した。β3-AR作動薬は、BATへのWATのリモデリングを刺激することが示され、組織学的に、またはUCP1の外観によって決定された。ZAGに応答するWAT内のUCP1の外観は、同様の過程を開始することを示唆する。以前の研究は、ZAGによるUCP1の誘発におけるβ3-ARの役割を示唆した。β3-AR作動薬は、サイクリックAMP/タンパク質キナーゼAの下流でp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼp38MAPKの刺激を介して、BATにおけるUCP1の上方調節を誘発して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体PPARγコアクチベータ1PCG-1α、ならびにATF-2の活性化リン酸化をもたらし、UCP1増強剤のCREおよびPPAR要素を従事させることが示された。ZAGは、β3-ARに対して選択的作動薬活性を有する、自然発生するリガンドである。ごくわずかなタンパク質がそのような活性を示すが、降圧ペプチドアドレノメデュリンもβ3-ARを活性化し、回腸筋の弛緩をもたらす。ZAGは、正常なカテコールアミン作動薬よりもはるかに大きいため、活性がアロステリック調節を介して発生することが可能である。しかしながら、LMFを使用する以前の研究は、プロプラノロールによって完全に減衰されるように結合することが示され、β3-ARとの直接相互作用を示唆する。証拠は、脂肪分解因子のトリプシン断片Mr約5kDaが依然として生物学的に活性であることを示唆したため、ZAG分子の一部のみが、結合に必要である可能性がある。セリンヒドロキシル等のアミノ酸の所定の群は、カテコールアミンとβ3-ARとの間に見られる水素結合相互作用を模倣することが可能である。分子モデリング研究は、関与する相互作用に関するさらなる情報を提供し得る。BRL37344等のβ3-AR作動薬は、脂肪細胞におけるZAG発現の増加を示し、ZAGによるZAG発現の誘発は、β3-ARを介して発生することも示唆された。したがって、β3-ARは、ZAGの産生および生物学的効果の両方に重要であり、ZAGは、β2-およびβ3-ARの天然作動薬である。実施例9悪液質の処置に対する骨格筋合成の亜鉛-α2-糖タンパク質研究の目標は、ZAGで処置されたとき、ob/obマウスにおける正味タンパク質獲得の機構を探索することである。いくつかのZAG処置実験において、ob/obマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、同時に相殺量の筋肉量をタンパク質として得ることが観測される。タンパク質合成は、フェノールレッドの非存在下、37°Cで2時間培養することにより、酸不溶性材料へのL-[2,6-3H]フェニルアラニンの組み込みによって測定し、O2CO295:5で飽和した。タンパク質合成率は、タンパク質結合放射能の量を酸可溶性放射能の量で割ることによって計算した。タンパク質分解は、5mMグルコースおよび0.5mMシクロヘキシミドを含有する酸化Krebs-Henselit緩衝液中で2時間以上、腓腹筋からチロシン21を放出することによって測定した。図30に示される結果は、骨格筋における正味タンパク質獲得が、タンパク質分解の減速およびタンパク質合成の増加の両方の結果であることを示す。実施例10体重減少およびグルコース低減のための亜鉛-α2-糖タンパク質の経口投与研究の目標は、長期にわたる脂肪減少ならびに血漿および尿中グルコース値の低下を介して、およびZAGの経口投与によって体重減少を生じる、ZAGの能力を探索することである。驚くべきことに、経口投与された組み換えヒトZAGは、組み換えヒトZAGの静脈内投与として同一の反応群を生じることができ、体内の消化空間から血漿空間に進入せずにそれを行うことができた。新規の作用機構は、消化空間に存在する組み換えヒトZAGのシグナルを形質導入するように作動し、図34および35に見られるように、血漿空間、WAT、および他の組織における内因性マウスZAGの生成を引き起こす。50μg/日のrhZAGをアストンob/obマウスに経口投与した。経口投与は、水の消費を5mL/日と想定し、その想定に基づいて、50μg/日用量を達成するようにZAGを添加することによって得られた。所与の日における消費の変動を訂正する試みは為されなかった。ZAGの経口投与は、概して、静脈投与によって得られた結果を複製する。この広範囲の効果には、大幅な体重減少図31、36、41、47、エネルギー消費の増加を象徴する体温のわずかな上昇図32、37、43、尿および血漿グルコースの低下図33、42、および経口ブドウ糖負荷試験に対する反応の著しい向上図40、48が挙げられる。作用機構は、決定的な相違はあるが、静脈注射のそれを模倣する。これらの機構は、WAT、BAT、血漿、肝臓、および骨格筋における広範囲の同一の反応があるという点で類似している。決定的な差異は、経口投与されたrhZAGは、血液および体内の臓器によって占拠される空間に決して進入しないことである。代わりに、投与されたrhZAGは、消化系空間に滞留し、胃内に24時間以上存続する。機構における驚くべき決定的な差異は、動物がその内因性ZAGを形成することによって、rhZAGの経口投与に反応することであり、上に列挙された後続の反応群を媒介する。3つの実験を以下に説明する。実験18日間の経口ZAG研究:50μgのZAGを飲料水に混ぜて連日経口投与した。体重減少、体温の上昇、および尿中グルコースの低下が起こったことが観測された。血清およびWAT中のマウスZAGの増加は、血清中のrhZAGの非存在下で、経口投与されたrhZAGがマウスZAGの発現を上方調節することを証明する。実験28日間の経口ZAGプロプラノロール研究:50μgのZAGを、プロプラノロールの存在および非存在下で連日投与した。プロパノロールは、負荷試験において、体重および血糖の減少を含むZAGの効果のすべてを遮断し、体温の上昇および血漿マウスZAGの上昇も遮断して、これがβアドレナリン受容体を介して起こることを確認する。プロプラノロールは、ZAGによる体重減少ならびに体温の上昇を完全に減衰する。rhZAGの経口投与後に、血清中のマウスZAGの上昇を防ぐことによってこれを行うと考えられる。第2のブロットは、rhZAGが血流に移行することなく、消化管内に隔離されたままである場合に予想されるように、血清中にrhZAGは存在しないことを示す。したがって、経口ZAGは、消化管βアドレナリン受容体に結合することによって作用し、血清ZAGの上昇、ならびに結果として起こる体重および血糖に対する効果をもたらす。図38は、rhZAGによる経口処置に起因して、プロプラノロールがマウス血清ZAGの増加を遮断することを示す。追加として、図39は、ヒトZAGがマウス血清において検出されないことを示す。実験3経口研究:ZAGを長期間にわたって連日経口投与し、30日目から始めて、処置群から回復群を分離したデータ図示せず。体重減少、体温、および尿中グルコースの減少は、静脈内注射によって得られた結果を模倣および拡張する。動物は、研究の中間で13.5も体重が減少した。処置研究期間の半分が経過した後、処置された動物は以下を示した。尿中グルコースにおいて、12日経過後に対照に対して50の回復が起こり、研究期間の終了までに尿中グルコースの対照値に対して完全な回復が起こったデータ図示せず。体重減少は13.5に達し、研究の最終日に、動物は対照体重に対してわずか46回復したデータ図示せず。静脈内投与されるときのZAGの作用と同様に、経口投与されたZAGは、体重減少を引き起こしたが、活性の図示せず、食餌の消費データ図示せず、または水の消費データ図示せずに変化は見られなかった。実施例11亜鉛-α2-糖タンパク質の投与は、体脂肪の減少および骨格筋の筋肉量の同時獲得を達成する。いくつかの実験において、ob/obマウスは、大幅に体脂肪が減少するが、相殺量の筋肉量をタンパク質として同時に獲得することが観測された。これについて探索したところ、正味タンパク質獲得は、タンパク質分解の減速およびタンパク質合成の同時増加に起因する図30。実施例12静脈内投与と比較した亜鉛-α2-糖タンパク質の経口投与研究の目標は、様々な投与経路を介したZAGの有効性を比較することである。50μgのZAGまたはPBS対照をマウスに経口投与した。結果は、図31、32、338日間の経口ZAG研究、図36、37、408日間の経口ZAGプロプラノロール研究、および図47、48強制経口ZAG研究において示される。これらの反復研究で示されるように、ZAGは、予想外に、投与されたZAGの全身吸収を必要とすることなく、単にマウスの飲料水に低用量のZAGを混合することによって経口投与されるとき、体重変化をもたらすことにおいて有効であることが示された。インスリン等のタンパク質の典型的な経口用量は、同一レベルの有効性を達成するために、静脈内用量の最高10倍またはメガ用量を必要とする場合があり、そのような制限された有効性は、そのようなタンパク質の全身吸収を必要とする。追加のデータが生成され表6、驚くべきことに、ZAGの経口投与が、正確に同一用量で静脈内投与の体重減少の有効性の75をも達成した。また投与の5日後に、尿中グルコースを低下させる有効性は、経口または静脈内投与されたときと等しく良好である。rhZAGによる経口投与は、図34、35、および38に示されるように、それに応じて動物に内因性ZAGを生成させる。プロプラノロールは、rhZAGの経口処置に起因して、マウス血清ZAGの増加を遮断するが図38、投与されたヒトZAGは、血漿中に見出されない図39。図38は、プロプラノロールの非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清中の抗マウスZAGを使用したZAGのウェスタンブロットである。ヒトZAGは、マウス血清において検出されない。図39は、プロプラノロールの非存在または存在下、ZAGの存在および非存在下で処置されたマウスから得たマウス血清中の抗ヒトZAGを使用するZAGのウェスタンブロットである図39。表68または20日間のROAによる70gのob/obマウスにおける50μg/日のZAGの連日投与に起因する体重減少および同一期間にわたる静脈投与の場合の減少事実上飲料水胃に至る消化系経路口、咽頭、食道をバイパスして、ZAG用量を胃内に直接強制配置する。カゼインは、ZAGとともに飲料水中に含まれた。本発明は、上記実施例を参照して説明されたが、修正および変型が本発明の主旨および範囲内に包含されることを理解されたい。したがって、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。"