"アミノ酸配列EQLKKSKTLを有し、かつアミノ酸数が15個以下であるポリペプチドを含む医薬組成物。前記ポリペプチドのアミノ酸数が12個以下であることを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。前記ポリペプチドが環状構造を有することを特徴とする請求項1~2のいずれか1項に記載の医薬組成物。前記ポリペプチドがアミノ酸配列CEQLKKSKTLCを有することを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。前記ペプチドが環状構造を有することを特徴とする請求項4に記載の医薬組成物。炎症性疾患の治療に使用するための、先行する請求項のいずれかに記載の医薬組成物。アテローム性動脈硬化性疾患の治療に使用するための、請求項1~5のいずれかに記載の医薬組成物。アミノ酸配列QLKを含むエピトープに特異的に結合する抗体。アミノ酸配列EQLKKの少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合することを特徴とする請求項8に記載の抗体。アミノ酸配列VMEQLKKSKTLFSの少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合することを特徴とする請求項8または9に記載の抗体。Mac-1とCD40Lとの結合を阻害する抗体。請求項8~11のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。アテローム性動脈硬化性疾患の治療に使用するための、請求項12に記載の医薬組成物。本発明において、上記の相互作用および治療のためのその使用は分子レベルで特徴付けられており、特徴的なCD40L結合部位として、Mac-1Iドメイン内のα1ヘリックスとβシートBとの間の表面露出ループに存在するアミノ酸配列E162~L170が同定されている。好適かつ安定な阻害性ペプチド以下、cM7と称するを用いたCD40L/Mac-1結合のターゲティングによって、マウスにおける炎症およびアテローム性動脈硬化病変形成を特異的かつ最も効果的に抑制できることが立証された。したがって、CD40L/Mac-1相互作用を特異的に抑制することは、CD40リガンドの機能全体を阻害するという望ましくない作用を引き起こすことなくアテローム性動脈硬化症および他の慢性炎症性疾患を治療できる新規かつ魅力的な抗炎症療法であると考えられる。慢性炎症はアテローム性動脈硬化症を引き起こす。当初T細胞に関連して報告された腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであるCD40Lは、アテローム形成の主要調節因子として関与している。CD40Lの機能をブロックすると、アテローム性動脈硬化プラークの形成およびその進行が低減されるだけでなく、病変における単球数および脂質量が抑制され、かつヒトにおける安定なプラークに一般的に見られる膠原線維および平滑筋細胞が増加する。さらにCD40Lは、プラークの破壊に関与するコラゲナーゼの発現と、プラーク崩壊後の血栓形成のトリガーとなる組織因子の発現とを単球/マクロファージにおいて増大させる。驚くべきことにCD40Lは、骨髄由来細胞のCD40Lの関与やCD40Lの古典的レセプターであるCD40とは無関係に、アテロームの形成を促進させることが以前に報告されている。これらの知見は、CD40LがCD40以外のレセプターと相互作用することにより、内皮細胞や平滑筋細胞などの血管細胞において一定の役割を果たしていることを示唆している。本発明は、白血球インテグリンMac-1免疫性、炎症および止血に関与する様々な公知のリガンドと相互作用する接着レセプターとCD40Lとの相互作用に関する。中和抗体によりMac-1を阻害すると、単球の動員が阻害され、アテローム性動脈硬化病変の形成が顕著に抑制された。本発明においては、Mac-1とCD40Lとの相互作用を期待される治療用途に用いることとする。炎症はアテローム性動脈硬化症などの多くの慢性疾患を引き起こすが、炎症を選択的に抑制する治療法は現在ほとんど存在しない。アテローム性動脈硬化症に関して、スタチン類様々な抗炎症作用を発揮する脂質低下剤は上記のような選択的抑制を治療に応用できる可能性を垣間見させるものである。別種の薬剤であるCox-2阻害剤は極めて広範な治療効果を示す良い例であるが、副作用のない抗炎症薬を開発することの難しさを示す例でもある。また、CD40Lなどのサイトカインの全体的な阻害をターゲットとした従来のコンセプトは、急性または長期的な副作用が見られたことにより概して失敗に終わっている。本発明は、アミノ酸配列が明確に定義されたエピトープと特異的に結合する低分子ペプチド阻害剤および/または抗体を使用したCD40L/Mac-1相互作用の特異的阻害、ならびに医薬組成物におけるこれらの使用に関する。配列EQLKKSKTLを含む上記ペプチドはMac-1Iドメインの一部分を模倣しているため、CD40L上の対応領域に結合する。上記抗体は修飾後の該ペプチド配列を認識するため、Mac-1上のEQLKKSKTLに結合する。本発明に関連するアミノ酸配列は本発明を完成する過程において同定された。本発明のポリペプチドはアミノ酸配列EQLKKSKTL配列番号1を含む。本発明において、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを使用することが必須である。しかしながら、たとえば上記アミノ酸配列に含まれる1つのアミノ酸を置換して、上記アミノ酸配列をわずかに修飾することも可能である。アミノ酸を置換しても、アミノ酸の極性は維持される。これは、疎水特性または親水特性を有するアミノ酸を、同じ特性を有する別のアミノ酸で置換することを意味する。たとえば、ロイシン残基をイソロイシン残基で置換したり、ロイシン残基をアルギニンで置換することが可能である。配列番号1のアミノ酸配列のうち1つアミノ酸のみを置換することが好ましい。別の修飾方法として、欠失させてもペプチドの生物学的活性が維持されるようなアミノ酸を1つまたは場合によって2つ欠失させることができる。しかしながら、欠失させることが可能なアミノ酸がどれであるのかを注意深く見極めなければならず、ペプチド活性を注意深くモニターする必要がある。上記ポリペプチドが有するアミノ酸は15個以下であり、12個以下であることがより好ましい。本発明のポリペプチドは、その生物学的活性に悪影響を及ぼさないアミノ酸をN末端および/またはC末端にさらに含んでいてもよい。実験により、上記ペプチド配列のうち最も重要な部分はおそらくアミノ酸モチーフQLKであろうことが示されている。したがって、医療目的に使用され得る抗体は上記モチーフQLKを認識するものであることが好ましい。別の好ましい実施形態では、抗体が認識するモチーフはEQLKKである。また、このモチーフは環状構造すなわちCEQLKKCで使用することもできる。医薬組成物に使用するポリペプチドは、患者体内における分解に対して安定化されていなければならない。通常のペプチド分解が阻害または少なくとも遅延されるようにペプチド構造を化学的に修飾して安定化させる。別の好ましい方法では、所望の生物学的作用を保持させたままペプチドを環状化して安定化させる。環状ペプチド構造の利点は、分解が遅延することによりバイオアベイラビリティが増強されることである。好ましい実施形態では、上記ペプチドはアミノ酸配列CEQLKKSKTLC配列番号2を有する。さらに別の手法では、N末端またはC末端を修飾する。興味深い方法の1つでは、上記ペプチド分子にポリエチレングリコールPEG単位を直接結合させるか、好ましくはリンカーを介してPEG単位を結合させる。この方法により、ペプチド分子の安定性が向上するという利点が得られる。さらに、修飾されたペプチド分子は、患者の体内にとどまる時間が長くなるためバイオアベイラビリティが改善される。しかしながら、ペプチドの標的部位への結合を阻害するような立体配座の変化を伴う修飾を行ってはならない。さらに別の実施形態では、上記ペプチド配列はペプチド類似体によって少なくとも部分的に置換されている。本発明の医薬組成物は当業者によく知られている適切な形態で投与することができる。本発明の組成物は、経口剤または適切な注射剤の形態で投与することができる。さらに、クリームまたは軟膏剤の形態で局所投与することも可能である。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、安定化剤、pH調整剤、保存剤などの、医薬組成物に一般に用いられる添加剤を含む。本発明の医薬組成物は、炎症性疾患および/またはアテローム性動脈硬化性疾患の治療に使用することが好ましい。具体的には、本発明の組成物は、冠動脈疾患、関節リウマチ、ループス、喘息などの慢性炎症性疾患の治療に好適に使用することができ、これらの他にも、CD40Lが関与するとされるあらゆる病態の治療に好適に使用できる可能性がある。別の実施形態では、本発明は、アミノ酸配列VMEQLKKSKTLFS配列番号3の少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合する抗体に関する。この抗体はヒト化抗体であることが好ましい。このような抗体は、マウス抗体のヒト化によって調製することができる。あるいは、いわゆるファージディスプレー法によって得ることもできる。抗体が認識するエピトープは判明しているため、このような抗体は容易に得ることができる。このような抗体は、上記の配列に含まれているエピトープに特異的に結合し、Mac-1のCD40Lへの接着を阻害する。この抗体はIgG抗体であることが好ましい。別の実施形態では、結合フラグメントFabを使用することもできる。このような機能的に活性な抗体部位も抗体に包含されると理解される。本発明の開示によるペプチドベースの治療法によって、上記の問題点のいくつかが克服されうる。CD40Lは、CD40、ならびにインテグリンであるαIIbβ3、Mac-1αMβ2およびαVβ1を含む少なくとも4つの異なるレセプターを有する。本発明では、CD40Lのレセプター依存性特性に対して特異的な新規の選択的阻害剤を使用する。同様の方法を用いて、他の相互作用パートナーならびにこれらの相互作用パートナーに割り当てられた、炎症、免疫性、および止血における機能を選択的にブロックすることによって、種々のCD40L依存性病態のテーラーメイド薬の開発が可能となりうる。配列番号2で示される好ましい環状ポリペプチドcM7は、CD40L/Mac-1結合の阻害およびこの結合の下流効果炎症性遺伝子の発現、炎症性細胞の動員、アテロームの形成などに対して効果的かつ特異的であった。したがって、cM7はアテローム性動脈硬化症などの慢性炎症性疾患に対抗するための有益な新規の治療法であると考えられる。本発明のポリペプチドが、望ましくない他の非特異的副作用を引き起こすことなく、CD40L/Mac-1相互作用を特異的に阻害できたことは驚くべき結果の1つであった。具体的には、インビボにおいて本発明のポリペプチドはCD40L/GPIIb/IIIaを介した血栓形成を阻害しなかった。本願において開示されるこのような結果は、CD40Lのブロッキングにより治療を行うというコンセプトを支持するものである。CD40L全体の阻害をターゲットとした従来公知のコンセプトは、急性または長期的な副作用により失敗に終わっている。具体的には、臨床データより、血栓を不安定な状態にする可能性が最も高い血栓塞栓性合併症を引き起こすことが明らかとなっている[AndreらNatMed8pp247252]。これに対し、本発明のポリペプチドおよび抗体によって達成されるCD40L/Mac-1相互作用の特異的阻害は、血栓の安定性にほとんど影響を与えなかった。具体的には、cM7はインビトロにおいてCD40-CD40L結合を阻害せず、Th1/Th2表現型などの基本的な免疫学的特性の変化を誘導しなかった。実験の結果を図にまとめ、図の説明においてより詳細に記載した。図1に、Mac-1Iドメイン内の特徴的部位へのCD40Lの結合を示す。aIドメインをその結晶構造INA5に基づき、リボン図左およびM1~M8に対応する直鎖状ペプチドを備えた水和表面モデル右で示す。b固相結合アッセイにおいて組換えCD40Lは固相化Iドメインに特異的に結合した。cIドメインは固相化CD40Lに濃度依存的に結合した。グラフに挿入した図は、クマシーブルー染色アクリルアミドゲル上の精製組換えCD40LおよびIドメインを示す。Mac-12LPM19c、ICRF44、CD40L40804、24-31またはLFA-1HI111を特異的にブロックする種々のクローンついて、固相化フィブリノゲンdまたはCD40LeへのMac-1発現CHO細胞の接着をブロックする能力を試験した。低分子ペプチド阻害剤M1~M850μMを使用してCD40Lの結合をブロックした。f固相結合アッセイにおいて、CD40Lの固相化Iドメインへの結合をブロックしたM1~M8の配列は表1に示す。g接着アッセイにおいて、活性化THP-1細胞の固相化CD40Lへの接着をブロックした。hフローサイトメトリーにおいて、新たに単離したヒト顆粒球および単球への蛍光標識CD40Lの結合をブロックした。i高吸収性プラスチックプレートにペプチドM1~M8を固相化し、ビオチン化CD40Lを直接結合させ、その結合を定量した。jMac-1発現CHO細胞へのCD40Lの結合をブロックする能力について、Iドメインペプチド50μMに対してもフローサイトメトリーによる試験を行い、その結果を代表的なドットプロットで示した。データは少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMで示したb,c,d,e,f,g,i。hには健康な男性ドナー3名が含まれていた。n.b.は結合しなかったことを示す。図2に、インビトロおよびインビボにおいてペプチド拮抗剤の特性を評価した結果を示す。aCD40L/Mac-1結合部位を模倣するペプチドM7を固相結合アッセイにおいて評価したところ、ペプチドM7はCD40Lの固相化Iドメインへの結合を濃度依存的に阻害していた。bインビボでの使用に最適化されたcM7特異的ペプチド阻害剤M7の環状変異体は、動的フローチャンバーアッセイにおいてMac-1発現CHO細胞株の固相化CD40Lへの接着を阻害した。cM7の特異性は、cM7が別のMac-1リガンドであるICAM-1cおよびGPIbαdへのMac-1発現細胞の接着をブロックしなかったのに対し、GPIbαに特異的なコントロールペプチドM2がGPIbαへの接着を効果的にブロックしたことにより実証された。ecM7およびscM7は、固相化CD40-FcフラグメントへのCD40Lの結合に影響を及ぼさなかった。これに対し、抗CD40ブロッキング抗体は濃度依存的に分子間相互作用をブロックした。fFITC標識cM7はCD40L導入マウス線維芽細胞と特異的に結合したが、mock導入線維芽細胞とは結合しなかったことがフローサイトメトリーにより示された。g腹腔内注射したcM7の薬物動態を示す。h腹腔内注射したcM7は、scM7と比較して、化学誘引物質MCP-1の血漿中濃度を低下させかつi防御性IL-10の血漿中濃度を増加させることによって、TNF-α誘導性炎症反応を抑制した1群あたりn=8。jcM7で処置した動物の顆粒球において酸化ストレスが低減された。k,lcM7注射後に血小板P-セレクチンの発現が低下したこと、血小板-白血球凝集塊が減少したことから、血小板の活性化が抑えられたことが分かる。データは少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMで示した。図3に、インビトロおよびインビボにおけるCD40L/Mac-1相互作用の炎症性細胞動員への寄与を示す。aWT野性型マウス1群あたりn=6を特異的ペプチド阻害剤cM7で処置すると、非特異的ペプチドコントロールscM7または生理食塩水の注射により処置した場合と比較して、チオグリコール酸塩により惹起される腹膜腔への白血球の動員が阻害された。CD40L-/-マウス1群あたりn=6においては、ペプチドによる処置の効果は見られなかった。bTNF-αでプライミングしたヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECにMac-1発現CHO細胞を接着させた。これらの細胞はいずれも、抗Mac-1抗体、抗CD40L抗体または抗LFA-1抗体で選択的にブロッキングした。c抗CD40L抗体は、抗ICAM-1抗体または抗Mac-1抗体とほぼ同程度にヒト単球のHUVECへの動的接着をブロッキングしたn≧4。dフロー条件下においては、フィブリノゲンと比較してより多くのMac-1-CHO細胞が固相化CD40Lと接着した。e~gCD40L欠損内皮細胞ECと相互作用させた場合、野生型内皮細胞と相互作用させた場合と比較して、接着マウス白血球数およびローリングマウス白血球数は減少した1群あたりn=5。平均白血球ローリング速度はCD40L欠損内皮細胞において増加した。hCD40Lの欠損は、接着分子ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1およびP-セレクチンの表面発現を抑制しなかった。i生物顕微鏡検査において、TNF-αを攻撃感染させたマウスの白血球の接着jおよびローリングkは、cM7n=10の腹腔内注射によって阻害されたが、scM7n=9または生理食塩水n=12の腹腔内注射では阻害されなかった。l生物顕微鏡検査において、cM7の静脈注射は白血球ローリングを直接的に阻害した。データは平均値±SEMで示した。スケールバーは20μmを示すi。図4に、マウスにおけるCD40L/Mac-1相互作用の特異的ブロッキングによりアテローム性動脈硬化症が抑制されることを示す。20週間にわたりLDLr-/-マウスに高コレステロール食餌を与えた。CD40L/Mac-1相互作用に対する特異的阻害剤cM7n=13、非特異的ペプチドコントロールscM7n=12、または生理食塩水n=12を1週あたり3回マウスに注射した。acM7は、scM7またはペプチドコントロールと比較して、大動脈基部における血管内膜病変の面積を顕著に縮小させた。bcM7による処置によって腹大動脈における脂質沈着が減少した。cオイルレッドO陽性面積の定量により評価したところ、コントロールによる処置と比較して、cM7で処置した動物の大動脈基部における脂質含量が減少していた。アテローム性動脈硬化プラーク内のマクロファージ数dおよび平滑筋細胞数e、ならびにコラーゲン含有量fを免疫組織化学的方法によって定量した。g安定なコラーゲン線維と不安定なコラーゲン線維との相対分布を、ピクロシリウスレッド染色を使用した偏光顕微鏡法によって測定した。cM7で処置したマウスは、scM7または生理食塩水で処置したマウスと比較して、赤色に染色された安定なコラーゲン線維のパーセンテージが顕著に高かった生理食塩水に対してはp=0.0081、scM7に対してはp=0.0140;1群あたりn≧9。アテローム性動脈硬化病変の切片中のT細胞含有量hおよび増殖マーカーKi-67iを定量した。データは平均値±SEMで示し、オイルレッドO特異的染色b、Mac-3特異的染色c、α-アクチン特異的染色e、ピクロシリウスレッド特異的染色fの代表的な画像、ならびにオイルレッドO染色した代表的な大動脈enface正面標本を右側に示した。スケールバーは1000μma,b、および200μmc,e,fを示す。図5Mac-1Iドメイン組換え変異体およびCD40L組換え変異体の細菌発現aαMIドメインをコードするヒトMac-1アミノ残基R115~S340を、細菌発現システムを用いて可溶性Hisタグ融合タンパク質~28kDaとして生成させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーIMACで精製した。bさらに、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび塩化ナトリウム濃度を上昇させることにより夾雑した細菌性タンパク質を除去した。クマシー染色によってIドメインの単離を確認し、Iドメインを含む溶出画分をプールし、PBSに対して透析した。cヒトCD40LE108~L261のTNF相同領域を、c-mycタグおよびHisタグを融合させたタンパク質として生成させた。このタンパク質~19kDaを不溶性封入体から抽出し、IMACで精製し、次いでPBSに対して透析することによってリフォールディングした。SDSポリアクリルアミドゲルによって評価したところ、上記いずれのタンパク質調製物の純度も>95であった。それぞれの記号は、W洗浄画分、FTカラムフロースルー、E溶出画分、Mタンパク質サイズマーカーを示す。図6インビトロおよびインビボにおけるcM7を用いたペプチド処置は、細胞のアポトーシスおよび細胞毒性を引き起こさなかった。a,bチオグリコール酸塩によって腹膜腔に動員されたマクロファージに、腹腔内注射によりcM7、scM7および抗Mac-1ブロッキング抗体M1/70のいずれかを攻撃感染させた。4時間後、腹腔浸出液細胞を採取し、アネキシンVの結合およびヨウ化プロピジウムの取り込みを定量した。インビボにおいてscM7と比較したところ、cM7による処置では細胞のアポトーシスもネクローシスも増加しなかった。これに対して、抗体による処置では、腹腔マクロファージのアポトーシスおよびネクローシスのパーセンテージは顕著に高かった。c,dインビトロにおいて増殖させたヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを、cM7またはscM7とともにインキュベートし、これとは別にCD40Lと組み合わせてcM7、scM7、または抗CD40ブロッキング抗体とともにインキュベートした。カスパーゼ3/7活性によって評価したところ、24時間にわたるペプチドでの処置は細胞傷害性を誘導しなかった。内皮細胞のアポトーシスをLDHの放出によって測定したところ、CD40LでプライミングしたHUVECをcM7とともにインキュベートした場合にアポトーシスがわずかに増加したことが判明した。データは少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMで示した。図7インビトロにおいて、Mac-1IドメインのCD40L結合部位を特異的に認識するモノクローナル抗体によって白血球動員が調節される。マウスを直鎖状ペプチドV160~S172で免疫化した。aクローンRC3は、固相化ペプチドM7に特異的に結合したが、スクランブルペプチドsM7およびMac-1IドメインフラグメントM8には結合しなかった。b抗M7は、Iドメイン全体に対するブロッキング抗体クローン2LPM19cと同程度にMac-1発現CHO細胞の固相化CD40Lへの接着を阻害した。Iドメイン全体をブロッキングするとCHO細胞はフィブリノゲンに接着しなかったが、直鎖状ペプチドV160~S172をブロッキングした場合にはフィブリノゲンに接着した。c動的フローチャンバーアッセイにおいて対応するIgGコントロールと比較したところ、抗M7による処置は、単層コンフルエント活性化内皮細胞へのマウスRAW246.7細胞の接着をブロックした。データは少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMで示した。図8に、インビボにおけるcM7処置が炎症の代表的特性に及ぼす影響を示す。CD40L/Mac-1相互作用に特異的な阻害剤であるcM7または非特異的ペプチドコントロールscM7を腹腔内注射することにより、C57/B6マウスを処置した。炎症状態はTNF-αを注射することにより誘導した。a~cCXCL-1=MCP-1およびRANTESは炎症性細胞に関与することによりアテローム性動脈硬化症を含む炎症性疾患を引き起こすケモカインであるが、急性炎症モデルTNF-αの攻撃感染によるサイトカイン産生に本発明の化合物を投与するとCXCL-1=MCP-1およびRANTESの濃度が低下した。一方、抗炎症性TH2サイトカインIL-10は増加傾向が見られた。アテローム性動脈硬化症を発症したマウスにおいてはサイトカイン濃度の全身的な調節はほとんど行われないため、急性期モデルを選択した。cM7処置マウスにおいて、ケモカインであるCXCL-1およびRANTESの血漿中濃度は、炎症性状態が緩和される方向にシフトしたが、防御性IL-10の血漿中濃度は増加傾向が見られた。d~e白血球サブセットの活性化は、接着分子であるICAM-1、ICAM-2、およびP-セレクチンの表面発現をフローサイトメトリーで定量することにより評価した。両群について、TNF-αの誘導による単球g、好中球hおよびGr-1陽性炎症性単球iの動員を測定した。データは1群あたり8匹のマウスを用いて得られた平均値±SEMで示した。図9インビボにおける長期的ペプチド処置が免疫学的特性に及ぼす影響を示す。LDLR-/-マウスに高コレステロール食餌を与え、ペプチド阻害剤cM7、コントロールペプチドscM7または生理食塩水を20週間にわたって1週あたり3回注射した。a~fサイトカインIL-6、IL-1、IL-12、TNF-αおよびIFN-γの血漿中レベルをcytometricbeadassayによって定量した。T細胞亜集団g~h、B細胞iおよびGr-1陽性炎症性単球jはフローサイトメトリーによって定量した。実施例1組換えタンパク質の発現Mac-1のアミノ酸配列R115~S340をコードするDNA配列をpET20bノバジェンに挿入し、次いでNi-NTA固定化金属アフィニティークロマトグラフィーキアゲンおよびQセファロースGEヘルスケアを使用した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製することにより、Mac-1IドメインをHisタグ融合タンパク質として得た。また、アミノ酸配列E108~L261をコードするDNAをpHOG-2134に挿入することにより、Hisタグおよびc-mycタグを融合させたタンパク質としてCD40Lを得た。得られたCD40LはNi-NTA固定化金属アフィニティークロマトグラフィーで精製した。C末端にHisタグを含む融合タンパク質である上記のMac-1Iドメインは以下のようにして得た。5’-AGAAGTTCCCAGAGGCCCT-3’配列番号4および5’-GAGTGCGGCCGCGGCAGCGCTGAAGCCTTCCTG-3’配列番号5で示されるプライマーを使用したPCRに基づく方法により、Mac-1のアミノ酸配列R115~S340をコードするDNA配列を発現ベクターpET20bノバジェンに挿入した。テンプレートとして、ヒトMac-1のαチェーン全体を構造的に発現したCHO細胞株を使用した。得られたPCRフラグメントはpGEMTプロメガにクローニングした後、NcoIおよびNotIニューイングランドバイオラボで切断し、NcoI-NotI線状化pET20bに挿入した。この発現ベクターをBL-21DEStarインビトロジェンに導入して形質転換させ、0.5mMIPTGシグマを添加して発現させた。得られたタンパク質をBugBuster溶解試薬ノバジェンで抽出し、次いで標準的なFPLCシステムGEヘルスケアにおいてNi-NTA固定化金属アフィニティークロマトグラフィーキアゲンで精製した。250nMイミダゾールシグマで標的タンパク質を溶出した後、Mac-1Iドメイン~28kDaを含む画分を20mMトリス-Clおよび20mMNaClpH8.0に対して透析し、Q-セファロースカラムGEヘルスケアを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。また、三量体化ドメインならびにN末端にHisタグおよびc-mycタグを含む融合タンパク質である上記CD40Lは以下のようにして得た。アミノ酸配列E108~L261をコードするDNA配列は、5’-CCTAGGCGGCCGCTATCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGAC-3’配列番号6および5’-CTTCTAGAAAACAGCTTTGAAATGCAAAAAGA-3’配列番号7で示されるプライマーを使用したPCRにより増幅した。テンプレートとして、ヒトCD40LをコードするcDNAクローンオリジーンを使用した。Hisタグおよびc-mycタグは、5’-CCGGCCATGGCCGAACAAAAGCTGATCTCAGAAGAAG-3’配列番号8および5’-TGAGGTACCTAGGTGATGGTGATGGTGATGTGAG-3’配列番号9で示されるプライマーを使用して増幅した。三量体化ドメインのテンプレートとしては、5’-ATGAAACAGATTGAAGATAAAATTGAAGAAATTCTGAGCAAAATTTATCATATTGAAAACGAAATTGCGCGTATTAAAAAACTGATTGGAGAA-3’配列番号10で示されるプライマーを使用した。上記のPCRフラグメントはすべてpGEMTにクローニングし、NcoIおよびKpnIHisタグおよびc-mycタグ、KpnIおよびXbaI三量体化モチーフ、ならびにXbaIおよびNotICD40Lでそれぞれ切断した。次いで、これらのフラグメントを、発現ベクターpHOG-21SchwarzらCircRes2006p2533にクローニングし、細菌株TG-1プロメガに導入して形質転換させた。1mMIPTGの誘導によりCD40Lを発現させた。このタンパク質を不溶性封入体として抽出した後、7M尿素、100mMNaH2PO4、100mMトリス-Cl、pH8.0中で溶解し、Ni-NTA固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって変性条件下で精製した。尿素濃度を徐々に低下させて透析することによってCD40Lをリフォールディングした。得られたMac-1IドメインおよびCD40Lは、最終的にPBSに対して透析し、使用するまで-80°Cで保存した。これらの組換えタンパク質をSDSゲル電気泳動によって評価したところその純度はいずれも>90だった。Mac-1リガンド、たとえば、フィブリノゲン、ICAM-1、GPIbα、RAGE、C3bi、ヘパリンなどの大部分は、Mac-1IドメインMac-1のαMサブユニット内に含まれる200個以下のアミノ酸からなる配列図1aに結合するため、IドメインもCD40Lの結合パートナーとして機能していると仮定した。この仮説を検証するため、図5に示すIドメインおよびCD40Lの組換え変異体を作成した。固相結合アッセイでは、可溶性CD40Lおよび固定化CD40Lのいずれも、単離したIドメインに特異的に結合した図1b,c。このときのKd値は~66nMであったことから、この相互作用の親和性は、CD40LとαIIbβ3との結合の親和性~30nMに匹敵するほど高いことが示された。CD40Lの結合部位を同定するために、表1に示したMac-1Iドメインの水和表面に由来する直鎖状ペプチドM1~M8を用いてペプチドマッピングを行った。単離したMac-1Iドメインの固相化CD40Lへの結合を評価した最初の固相結合アッセイでは、Mac-1フラグメントM3、M4、M5およびM7が阻害剤候補として見出された図1f。細胞膜環境においてMac-1タンパク質全体を用いたより生理学的な条件においては、M7がTHP-1細胞のCD40Lへの接着を最も効果的にブロックした。この阻害の程度は、Iドメイン全体に対するブロッキング抗体による阻害と同程度であった図1g。また、M7はフローサイトメトリーにおいてヒト顆粒球および単球へのCD40Lの結合をブロックした唯一のペプチドであった図1h。さらに、M7は固相結合アッセイにおいてCD40Lへの直接結合を媒介し図1i、活性化Mac-1を構造的に発現したチャイニーズハムスター卵巣細胞Mac-1-CHOへのCD40Lの結合を中和した図1j。M7は濃度依存的にCD40LのIドメインへの結合をブロックし、そのIC50は~4μMであった図2a。興味深いことに、ペプチドM7に対応する、Mac-1Iドメイン内のアミノ残基配列E162~L170は、Mac-1の三次構造においてα1ヘリックスとβシートBとの間の表面露出ループに存在しており、他のMac-1リガンドGPIbα、NIF、C3bi、ICAM-1またはフィブリノゲンの結合には関与していない。このことは、上記のアミノ残基配列が特徴的なCD40L結合部位であり、この相互作用を選択的にブロックできる可能性があることを示唆している。2つの隣接したシステイン残基を付加し、次いで環化cM7することによってペプチドM7を修飾し、インビボにおける血漿中安定性を高めた。コントロールとしてスクランブルペプチドscM7を使用した表1参照。上記のペプチド阻害剤cM7の特異性を評価するために、フローチャンバーにおいて、種々のMac-1リガンドへのMac-1-CHO細胞の接着を試験した。cM7はCD40Lへの細胞接着を強力にブロックしたが図2b、ICAM-1およびGPIbαへの細胞接着には何ら影響を及ぼさなかった図2c,d。これに対し、M7ではなくM2は以前に報告されているようにMac-1とGPIbαとの相互作用をブロックしたが、CD40L/Mac-1結合には影響を及ぼさなかった。また、cM7は、CD40とCD40Lとの結合には影響を及ぼさなかった図2e。さらに、図6に示すように、cM7による処置は、インビトロにおいてもインビボにおいてもアポトーシスや細胞毒性を誘導することはなく、忍容性の高い薬剤であることが示唆される。CD40L/Mac-1結合におけるE162~L170領域の重要性をさらに具体的に検証するため、ペプチドV160~S172に対するモノクローナル抗体抗M7と称すを作成した。ヒトMac-1Iドメインの配列V160~S172に対応するペプチドに特異的な抗体抗M7と称すは、ジフテリアトキソイドMonashAntibodyTechnologiesFacility、モナシュ大学、メルボルン、オーストラリアを結合させたペプチド配列C-VMEQLKKSKTLFS-NH2配列番号3でマウスを免疫化することによって得られた。固相アッセイを行ったところ、この抗血清と固相化ペプチドM7との結合性は高いことが確認された。この抗体は、M7と特異的に結合したが、スクランブルペプチドsM7とは結合せず、M7と同等の長さを有する別のMac-1フラグメントであるM8とも結合しなかった。抗M7は、Mac-1-CHO細胞の固相化CD40Lへの接着をブロックしたが、フィブリノゲンへの接着はブロックしなかった図7。さらに、FITCで標識したcM7は、CD40Lを過剰発現したマウス線維芽細胞に濃度依存的に結合したが、mock導入コントロール細胞には結合しなかった図2f。実施例2固相結合アッセイブロッキングペプチドの存在下または非存在下で、組換えCD40Lを固相化Mac-1Iドメインとともにインキュベートした。sCD40Lの結合は、抗cmyc-HRPインビトロジェンおよびTMB基質ピアスを添加し、比色反応によって検出した。これとは別に、CD40LProvitroを固相化し、次いで組換えMac-1Iドメインの結合を抗His-ビオチンキアゲンおよびHRP結合ストレプトアビジンピアスを添加して定量した。固相化ペプチドへの結合においては、CD40Lをミクロビオチン化キットシグマでビオチン化した。評価したすべてのペプチドの等モル濃度混合物を本アッセイのポジティブコントロールとして使用した。組換えMac-1IドメインをPBS中において96ウェルプレートNuncに4°Cで一晩かけて固相化した。2BSA/PBSでブロッキングした後、PBSで洗浄し、組換えCD40Lを図に示した濃度でウェルに加え、37°Cで2時間インキュベートした。ペプチドM1~M8の効果は、これらのペプチド50μMの存在下でCD40L10μg/mlをインキュベートすることによって評価した。結合しなかったCD40Lを0.1ツウィーン20/PBSで洗浄することにより除去した後、抗c-myc-HRPインビトロジェンを加え、室温で2時間インキュベートした。TMB基質ピアスを加えて比色反応を450nmで測定することにより結合を定量した。これとは別に、HisタグProvitroを付加していないCD40Lを上記と同様に固相化し、ブロッキングした。抗His-ビオチンモノクローナル抗体キアゲンおよびHRP結合ストレプトアビジンピアスを添加し、比色反応を450nmで測定することにより組換えMac-1Iドメインの結合を定量した。Mac-1Iドメインの特異的結合は、CD40Lコーティングウェルの測定値からBSAコーティングウェルの測定値を差し引いて求めた。Kdは、PrismソフトウェアGraphpadによる非線形回帰モデル1部位結合双曲線モデルを使用して評価した。CD40Lのペプチドへの結合を定量するために、ペプチドを50mM炭酸ナトリウムpH10.6中において96ウェルプレートに4°Cで一晩かけて固相化した。メーカーの説明書に従ってCD40Lをミクロビオチン化キットシグマでビオチン化し、HRP結合ストレプトアビジンピアスを用いて比色反応により検出した。評価したすべてのペプチドの等モル濃度混合物をポジティブコントロールとして使用した。BSAコーティングウェルの吸光度をネガティブコントロールとして使用し、これを差し引いた。実施例33.1動的接着アッセイおよび静的接着アッセイ96ウェルプレートNuncをsCD40Lでコーティングし、活性化Mac-1を構造的に発現したCHO細胞以前に報告されているものまたはTHP-1細胞とともにインキュベートした。20~50分間かけて細胞を接着させた。この細胞をブロッキング抗体10μg/mlとともにプレインキュベートした。図に示すように、アッセイはペプチド50μMの存在下で行った。透過バッファー6mg/mlホスファターゼ基質シグマ、1トリトンX-100、50mM酢酸ナトリウムpH5.5を添加して、接着した細胞を比色反応により定量した。これとは別に、接着細胞数をカウントした。マウス内皮細胞を以前に報告されている方法で単離した。CFDA-SEインビトロジェンを取り込ませたMac-1発現CHOを45分間かけて接着させ、蛍光顕微鏡下で定量した。動的な接着アッセイを行うため、35mmディッシュを、1BSA、CD40L、GPIbαAbnova、フィブリノゲンシグマまたはICAM-1RDシステムズでコーティングした。上記のペプチド1μMまたは抗体10μg/mlの存在下、パラレルフローチャンバーシステムGlycotechを用い、図に示したずれ速度において接着細胞数およびローリング細胞数を定量した。これとは別に、単離マウス内皮細胞上における腹腔滲出細胞の接着およびローリングを観察した。3.2静的接着アッセイPBS中sCD40L10μg/mlで96ウェルプレートNuncを4°Cで一晩かけてコーティングした。結合しなかったCD40LをPBSで洗浄することにより除去した後、0.1アガロースを用いてプレートを室温で1時間ブロッキングし、PBSで洗浄した。CD40Lに対するブロッキング抗体10μg/mlを図に示した濃度でウェルに添加し、室温で15分間インキュベートし、PBSで洗浄した。活性化Mac-14を構造的に発現したCHO細胞またはTHP-1細胞をCD11bまたはCD11aに対する機能ブロッキング抗体10μg/mlとともに室温で15分間プレインキュベートした。上記の細胞5×104個/ウェルを37°Cで20~50分間かけて接着させた。静的接着アッセイは図に示すように50μMのペプチド存在下で行った。結合しなかった細胞をPBSで洗浄することにより除去した後、透過バッファー6mg/mlホスファターゼ基質シグマ、1トリトンX-100、50mM酢酸ナトリウムpH5.5を添加して、37°Cで1時間インキュベートし、比色反応を405nmで測定することにより接着細胞を定量した。これとは別に、顕微鏡ツァイス下で接着細胞数をカウントした。これとは別に、実験前にヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを50ng/mlTNF-αで刺激した。メーカーのプロトコルに従って、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステルCFDAインビトロジェンをMac-1発現CHOに取り込ませた。HUVECまたはCHO細胞を図に示したブロッキング抗体10μg/mlを用いて選択的にインキュベートし、洗浄後、CHO細胞をHUVECに37°Cで35分間かけて接着させた。接着しなかった細胞をPBSで洗浄することにより除去した後、接着細胞数を蛍光顕微鏡下でカウントした。実施例44.1フローサイトメトリー以前に報告されている方法Zirlikら,2007で、フローサイトメトリー分析、血小板活性化アッセイ、および白血球-血小板凝集塊の定量を行った。CD40L発現マウス線維芽細胞へのcM7の結合は、FITC結合cM7を定量することにより測定した。Mac-1発現CHO細胞またはヒト白血球へのCD40Lの結合は、これらの細胞をCD40L10μg/mlとともにインキュベートした後、次いで抗PentaHis抗体キアゲンを用いて検出した。4.2ラミナーフローチャンバーアッセイ動的接着アッセイは以下のようにして行った。1BSA、CD40L、GPIbαAbnova、ICAM-1RDシステムズまたはフィブリノゲンシグマをそれぞれ10μg/mlおよび30μg/mlの濃度で使用して、35mmディッシュを4°Cで一晩かけてコーティングした。0.5dyn/cm2静脈の流速から15dyn/cm2動脈の流速まで流速を増加させながらパラレルフローチャンバーシステムGlycotechでMac-1発現CHO細胞の接着およびローリングについて試験を行った。細胞の定量には、顕微鏡オリンパスを用いた。図から分かるように、図示したペプチド1μMまたは抗体10μg/mlの存在下、図示したずれ速度において阻害剤の効果を試験した。これとは別に、上記と同様にマウス内皮細胞を単離しTNF-αで刺激した。単離マウス内皮細胞上における腹腔滲出細胞の接着およびローリングを上記と同様に定量した。ローリング速度はImagePro細胞追跡ツールメディアサイバネティクスを使用して算出した。4.3フローサイトメトリー以前に報告されている方法QuezadaらAnnRevImmunolpp307328で、フローサイトメトリー分析、血小板活性化アッセイ、および白血球-血小板凝集塊の定量を行った。以下に簡潔に記載する。マウスの血液サンプルを心臓穿刺によって得た。赤血球は、155mMNH4Cl、5.7mMK2HPO4、0.1mMEDTA、pH7.3中で溶血させた。白血球は0.1BSA/PBS中に再懸濁し、Fcレセプターは抗CD16/CD32抗体Ebioscienceでブロッキングした。エピトープ特異的蛍光活性化細胞ソーティングFACSCaliburBD用抗体としては、抗CD11b、抗CD115、抗Gr-1、抗CD4、抗CD8、抗CD20、抗CD41、抗CD62P、抗CD54、抗CD102および抗CD106すべてEbioscienceから入手を含むものを使用した。CD40L導入マウス線維芽細胞またはmock導入マウス線維芽細胞へのcM7の結合は、図示した濃度のFITC-cM7と細胞とを37°Cで30分間インキュベートし、次いでFL-1チャネルにおいて蛍光を定量することにより測定した。Mac-1発現CHO細胞またはヒト白血球へのCD40Lの結合は、Ca2/Mg2添加PBS中でHisタグCD40L融合タンパク質10μg/mlとともに37°Cで30分間インキュベートすることによって行い、次いでAlexa488標識抗PentaHisキアゲンで検出した。ヒト単球および顆粒球は前方散乱および側方散乱における特性に基づいてゲーティングした。内皮細胞における接着分子の発現を分析するため、細胞をTNF-αで24時間刺激し、アクターゼシグマを使用して剥離し、蛍光色素結合抗体とともにインキュベートした。実施例5攻撃感染によるサイトカイン産生8週齢のC57BL/6Jマウスに、TNF-αRDシステムズ200ngと、ペプチドcM7もしくはscM7のいずれか100μgまたはこれと等容量の滅菌生理食塩水とを腹腔内注射した。5時間後、マウスをCO2で安楽死させた。腹膜腔を2mlのPBSでフラッシングし、上清をスクリーニングしてサイトカインを得た。血液は心臓穿刺によって回収した。メーカーの説明書に従い、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、KCおよびRANTESの血漿中濃度をCytometricBeadArrayCBABDバイオサイエンスで測定した。末梢血の白血球および血小板の活性化は上記と同様にフローサイトメトリーによって評価した。実施例6酸化ストレスアッセイメーカーの説明書に従ってマウス白血球をジヒドロローダミンインビトロジェンとともにプレインキュベートし、活性酸素ストレスの発生をフローサイトメトリーでモニターした。実施例8マウス腹膜炎モデルWTマウスまたはCD40L-/-マウスジャクソン研究所に4チオグリコール酸塩培養液シグマ2mlを注射した。15時間後、PBSで腹膜腔をフラッシングすることにより腹腔洗浄を行った。赤血球を溶血させた後、腹腔滲出細胞PEC数を定量した。実施例9生物顕微鏡検査手術の5時間前にマウスTNF-αRDシステムズ200ngとペプチド100μgとを滅菌生理食塩水に溶解し、手術の5時間前にマウスの腹腔内に注射した。塩酸ケタミンエセックスおよびキシラジンバイエルをそれぞれ187.5mg/kg体重および62.5mg/kg体重の用量で腹腔内注射することによりマウスに麻酔をかけた。以前に報告されている方法IezziらPNASpp876881で精巣挙筋を露出させた。いくつかの実験のために、カテーテルを頚静脈に留置し、顕微鏡で観察しながらペプチドを投与した。温度調整した36°C生理食塩水で精巣挙筋を表面灌流した。マウスの体温を維持するため、マウスをヒーティングパッド上に乗せた。生理食塩水用液浸対物レンズWプランアポクロマート20x/1.0DICIR、カールツァイスおよび高感度カメラシステムAxioCamMRm、カールツァイスを取り付けた生物顕微鏡AxioScopeVario、カールツァイスで各回30秒間映像を録画した。ローリング白血球数は、赤血球よりも遅い速度で移動する白血球の数と定義した。白血球のローリング速度は、各時間点において白血球が細静脈の所定の長さをローリングするのに必要な平均時間を測定することによって求めた。また、接着白血球は少なくとも30秒間静止している細胞と定義した。ローリング白血球数および接着白血球数は評価者盲検により定量した。実施例10アテローム形成試験高コレステロール食餌HCDを与えた8週齢の雄性LDLレセプター欠損LDLr-/-マウスジャクソン研究所を、用量100μgのペプチドcM7もしくはscM7PeptideSpecialtyLaboratoryまたは滅菌生理食塩水を1週間あたり3回腹腔内注射することにより処置した。20週間後、血液サンプルを採取し、白血球亜集団のフローサイトメトリー分析、コレステロールおよびトリグリセリドの血漿中濃度の測定、血漿中サイトカインおよびケモカインの測定を行った。血圧は非侵襲性血圧測定器NIBPハーバードアパラタスで測定した。マウスを安楽死させ、大動脈基部および大動脈弓をOCTOCT化合物ティシューテック中で凍結した。胸大動脈および腹大動脈は10緩衝ホルマリンで固定した。マウス大動脈組織のクリオスタット連続切片6μmをアセトンで固定し、空気乾燥した。非特異的結合は生物種に適した5正常血清ベクターラボラトリーズでブロッキングした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、かつ生物種に適合する5正常血清を添加した一次抗体とともに切片をインキュベートした。二次抗体とともにインキュベートし、次いでアビジン-ビオチン複合体ABCベクターラボラトリーズとともにインキュベートした。抗体の結合は3-アミノ-9-エチルカルバゾールAECダコで可視化し、ギルのヘマトキシリン液シグマアルドリッチで対比染色した。コントロール染色として、各IgGアイソタイプPharmingenダコによる染色を行った。マクロファージ特異的染色にはラット抗マウスMac-3抗体を使用し、平滑筋細胞特異的染色には抗α-アクチン抗体を使用したダコ。I型コラーゲンを可視化するために、0.1ピクロシリウスレッドポリサイエンスの飽和ピクリン酸水溶液を新たに調製し、この溶液中でホルマリン固定凍結切片を4時間インキュベートした。0.01NHClおよび蒸留水でリンスした後、切片を70エタノール中で脱水し、Permountベクターラボラトリーズで封入した。ピクロシリウスレッド染色は偏光顕微鏡法で分析した。ピクロシリウスレッド染色において評価されるコラーゲン線維の色は、コラーゲン線維の太さによって異なり、緑色細い線維から黄色、橙黄色、赤色太い線維へと変化するため、染色したコラーゲン切片の色の分布を定量した。脂質の沈着は、大動脈切片または腹大動脈のenface正面標本をホルマリンで固定した後、オイルレッドOで染色することによって測定した。大動脈病変の組成を定量するため、すべてのマウスを対象に、大動脈組織切片の分析を顕微鏡下で実施した。大動脈基部においては、右冠動脈口に隣接した大動脈弁の3つの弁葉すべてについて断面像を得て病変の面積を分析した。大動脈壁全体の面積、大動脈基部の病変の面積、およびマクロファージ、脂質、SMCまたはコラーゲンが染色された面積のパーセンテージを、コンピューターを使用した画像定量ImageProメディアサイバネティクスにより測定した。実施例1111.1ペプチド阻害剤の薬物動態C57BL/6JマウスにFITC標識cM7を腹腔内注射した。図に示した時間点において血漿サンプル中の蛍光を蛍光プレートリーダーSpectramaxで測定した。血漿サンプルで希釈したCM7-FITCをスタンダードとして使用した。11.2構造モデリングMac-1Iドメインの構造を、Siriusvisualizationsystem1.2サンディエゴスーパーコンピューターセンターおよびMac-1Iドメインの結晶学的データセットPDBID:1NA5を使用して可視化した。11.3抗体およびペプチド購入したエピトープ特異抗体は、抗ヒトCD11b、クローン2LPM19cサンタクルーズバイオテクノロジー;抗ヒトCD11b、クローンICRF44Biolegend;抗ヒトCD11a、クローンHI111Biolegend;抗ヒトCD40L、クローン24-31Calbiochem;抗ヒトCD40L、クローン40804RDシステムズ;および抗ヒトICAM-1、クローンBBIG-I1RDシステムズであった。ペプチドは、PeptideSpecialtyLaboratoriesハイデルベルクにおいて合成したペプチドをHPLCで精製し、可能であれば環化した。分子量は質量分析により測定した。ペプチドの純度は>95であった。11.4細胞培養ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECはロンザ社から購入し、20ウシ胎仔血清FCS、1ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1ファンギゾン、1非必須アミノ酸NEAA、1ピルビン酸Na、1ヘパリン、および1ECGSを含むM199において増殖させた。単球性THP-1は、1ペニシリン/ストレプトマイシン、10FCS、0.05mM2-メルカプトエタノールを含むRPMI1640において培養した。活性化Mac-1を構造的に発現したCHO細胞は以前に報告されているものであるが、このCHO細胞を、1ペニシリン/ストレプトマイシン、10FCS、1NEAA、1L-グルタミン、125μg/mlゼオシン、70μg/mlジェネティシンを含むDMEMにおいて培養した。CD40L導入マウス線維芽細胞およびmock導入マウス線維芽細胞はK.Zirlik博士フライブルク大学血液学部フライブルク、ドイツから提供されたものであり、1ペニシリン/ストレプトマイシン、10FCS、1NEAA、1L-グルタミン、125μg/mlを含むDMEMにおいて培養した。11.5マウス内皮細胞の単離マウス内皮細胞を単離するために、野性型またはCD40L-/-のマウスいずれもC57BL/6JをCO2で安楽死させ、肺、心臓、脳および肝臓を無菌操作により採取し、カミソリの刃で細かく刻み、0.2I型コラゲナーゼ/1BSAWorthingtonレークウッド、ニュージャージー州およびシグマセントルイス、ミズーリ州中において37°Cで90分間消化した。0.1BSAで洗浄後、70μmのナイロンメッシュで濾過し、0.1BSAに細胞を再懸濁し、ヒツジ抗ラットDynabeadsDynalBiotechオスロ、ノルウェーを結合させた抗マウスCD31抗体とともに室温で10分間インキュベートした。次いで、magneticparticleconcentratorDynalBiotechを使用して細胞を分離して3回洗浄し、ゼラチンコートプレートに播種した。細胞がコンフルエントに達した後、ラット抗マウスICAM-2抗体BDPharmingenを用いて2回目の磁気ソーティングを行った。20ウシ胎仔血清FBS、1ピルビン酸ナトリウム、1ヘパリン、1ウシ内皮細胞増殖因子、0.6NEAAおよび1ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEMにおいて細胞を増殖させ、この細胞を実験の24時間前まで0.1FBSを添加したM-199中で保存した。12.実施例の結果上記の実験の結果は図にまとめ、図の説明において詳細に記載した。さらに、以下により詳細に説明する。インビボにおいてペプチドを治療目的で使用するためには血漿中濃度が適切でなければならない。腹腔内注射後、cM7の血漿中濃度は30分間~4時間維持された図2g。インビボにおいてこのペプチド阻害剤が炎症性機能を効果的に調節するかどうかを試験した。cM7でマウスを処置後TNF-αを攻撃感染させると、腹腔内の血漿成分中MCP-1の発現レベルが低下し、CXCL-1およびRANTESについても同様の傾向が見られたが、血漿中および腹水中IL-10レベルは上昇した図2h,i;図8a~c。さらに、cM7による処置によって、TNF-αの誘導による顆粒球のオキシダティブバーストが抑制され図2j、血小板L-セレクチンの発現が低減され、顆粒球/単球と血小板との凝集塊が減少した図2k,l。このことにより、本発明の薬剤の様々な抗炎症性特性が実証された。Mac-1は炎症性疾患において接着因子として機能することが従来知られているため、cM7は炎症性細胞動員を制限しうると仮定した。この仮定どおり、チオグリコール酸塩により惹起された腹膜細胞の蓄積がcM7によって強力に低減されたことが野生型マウスにおいて確認されたが、CD40L-/-マウスにおいては低減されなかった図3a。機械論的に、Mac-1-CHO細胞およびヒト内皮細胞ECの接着は、それぞれMac-1のCHO細胞への接着またはCD40Lの内皮細胞への接着を選択的にブロックすることによって阻害できると考えられるが、この逆は成り立たない。したがって、内皮細胞のCD40Lと白血球のMac-1との相互作用は本発明のペプチドの標的として最も適切であると言える。抗CD40Lによる処置によって、抗ICAM-1または抗Mac-1による処置と同程度に接着が阻害された図3c。フィブリノゲンとは異なり、CD40Lは生理学的なフロー条件下においてより多くの細胞と結合した図3d。CD40L欠損内皮細胞では、フローチャンバーにおけるマウス白血球の動員が強力に阻害されたが図3e~g、これは接着分子の発現を変化させたことによるものではなかった図3h。同様に、抗M7は白血球の活性化内皮細胞への接着を阻害した図7。さらに、TNF-αを攻撃感染させたマウスの精巣挙筋血管におけるローリングおよび強固な接着は、cM7の腹腔内注射によって強力に抑制されたが図3i~k、血圧、白血球数、および血小板数は変化しなかった表2参照。cM7を静脈内注射したところ、同様のデータが得られた図3l。上記のデータを総合すると、インビボにおいて白血球動員を強力に調節するCD40L/Mac-1相互作用は、cM7によって効果的かつ特異的にターゲティングされると言える。単球の動員は、多くの慢性炎症性疾患の発症および進行に大変重要な役割を果たしている。したがって、ペプチド阻害剤がインビボにおいてマウスのアテローム性動脈硬化症を緩和できるかを試験した。高コレステロール食餌を20週間にわたり与えたLDLr-/-マウスをcM7で処置したところ、大動脈洞および腹大動脈に形成された病変が顕著に縮小された図4a,4b。さらに、単に大きさが縮小されただけではなく、cM7により処置されたマウスのアテローム性動脈硬化プラークに含まれたマクロファージの数および蓄積した脂質は顕著に少なく、平滑筋細胞数は増加していた図4c~e。処置群およびコントロール群のいずれにおいてもプラーク内のコラーゲン含有量は増加していたが図4f、cM7により処置したマウスのプラークには安定な太いコラーゲン線維がより多く含まれていた図4g。これらの結果から、CD40Lの遺伝学的または治療的な阻害によってアテローム性動脈硬化病変の形成が抑制され、プラークがより安定な形態へとリモデリングされることが示された。cM7よる長期処置後、T細胞数、B細胞数、Th1/Th2表現型を表すサイトカインIL-10、IL-12またはINF-γ濃度などの免疫学的特性においてはいかなる変化も観察されなかった図9。脂質濃度、体重、白血球サブセット、血圧、サイトカイン濃度およびケモカイン濃度に変化は見られなかった表3参照。実施例12インビボ血栓モデルにおいて潜在的副作用を調査した。3~4週齢のC57BL/6Jマウスに、滅菌生理食塩水100μl、ペプチドcM7、scM7および図に示した抗体のいずれかを腹腔内注射した。腸間膜細動脈を調査対象として選択し、塩化鉄で傷害を誘導した。ローダミン3Gを眼窩後方に注射することによって血小板を染色し、生物顕微鏡AxioScopeVario、カールツァイスで観察した。血管閉塞時間および血栓塞栓形成率を分析した。以前に報告されている方法Andreら,LocCitで尾部出血時間を測定した。図10に、マウスにおいてCD40/Mac-1相互作用は血栓形成および血栓の安定化を媒介しないことを示す。塩化鉄によりC57BI/6野生型マウスに傷害を誘導し、ペプチドcM7、scM7100μg、Mac-1、CD40L、またはCD40に対するブロッキング抗体100μg、IgGアイソタイプコントロール100μg、および生理食塩水のいずれかを注射し、尾部出血時間Aおよび腸間膜細静脈におけるインビボ血栓形成B~Dを評価した。血栓塞栓形成率は1分間あたりの塞栓形成頻度C,Dと定義した。データは1群あたり少なくとも4匹のマウスを用いて得られた平均値±SEMで示した。スケールバーは200μmを示す。CD40Lの止血作用は、CD40または血小板インテグリンGPIIb/IIIaαIIbβ3との相互作用に依存するAndreら,loccit。この相互作用を阻害するための従来の治療戦略においては、CD40L全体を中和する抗体が使用されていたため、血栓塞栓性合併症が引き起こされていた。本発明者らの研究においても抗CD40Lブロッキング抗体による処置により尾静脈出血時間が顕著に延長されて74±12n≧4、p=0.04増加し、このことによって従来の研究結果が確認された。興味深いことに、cM7による選択的ブロッキングでは出血時間に変化は見られず図10A、これによってCD40L/Mac-1相互作用がCD40Lの炎症性経路に特異的であることが示唆された。これに従い、cM7は動脈血栓症モデルにおける血管閉塞時間を延長させなかったが、抗CD40Lによる処置および抗CD40による処置は、腸間膜細動脈における血栓形成を悪化させ、閉塞時間は抗CD40Lにより113±22n=5、p=0.005延長し、抗CD40により116±22n=4、p=0.05延長した図10B。さらに、cM7によるCD40L/Mac-1相互作用の破壊では、血栓塞栓形成率n=5、p=0.005がわずかに増加したが、このような影響は、塞栓形成率が抗CD40Lによる処置によって339±38n=6、p=0.001増加し、抗CD40による処置によって173±40n=3、p=0.008増加したことと比較すると、無視できるものであった。興味深いことに、抗Mac-1中和抗体による処置でも塞栓形成率が131±41n=4、p=0.03、図10C,D増加したが、その程度は小さかった。CD40LはMac-1Iドメイン内の特徴的な領域に特異的に結合することが上記のデータにより示された。本明細書において開示されたペプチドは、Mac-1とCD40Lとの結合をブロックしたが、他のレセプター/リガンド相互作用のいくつかにおいては影響を及ぼさなかった。したがって、本明細書において開示されたペプチドおよび抗体は、望ましくない副作用のない薬剤として使用することができる。"