"UGT91D2ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホスト。前記UGT91D2ポリペプチドがUGT91D2e又はUGT91D2mである、請求項1に記載の組換えホスト。前記UGT91D2ポリペプチドが少なくとも90の同一性をSEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して有する、請求項1又は2に記載の組換えホスト。前記UGT91D2ポリペプチドが少なくとも95の同一性をSEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して有する、請求項3に記載の組換えホスト。前記UGT91D2ポリペプチドが少なくとも99の同一性をSEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して有する、請求項4に記載の組換えホスト。前記ホストが微生物である、請求項1乃至5のいずれかに記載のホスト。前記微生物がサッカロミセスである、請求項6に記載のホスト。前記サッカロミセスがサッカロミセス-セレビジエである、請求項6に記載のホスト。前記微生物がエシェリヒア-コリである、請求項6に記載のホスト。前記ホストが植物又は植物細胞である、請求項1乃至5のいずれかに記載のホスト。前記植物又は植物細胞がステビア、フィスコミトレラ、又はタバコ植物又は植物細胞である、請求項10に記載のホスト。前記ステビア植物又は植物細胞がステビアレバウディアナ植物又は植物細胞である、請求項11に記載のホスト。前記ポリペプチドが少なくとも一つのアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含む、請求項1乃至12のいずれかに記載のホスト。前記ポリペプチドがアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含む、請求項1乃至13のいずれかに記載のホスト。前記ポリペプチドが、SEQIDNO5に対してアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343に含む、請求項14に記載のホスト。前記ポリペプチドが、SEQIDNO5に対してフェニルアラニンを残基30に、グルタミンを残基93に、バリンを残基99に、フェニルアラニンを残基122に、チロシンを残基140に、システインを残基142に、スレオニンを残基148に、アラニンを残基153に、セリンを残基156に、メチオニンを残基195に、グルタミン酸を残基196に、グルタミン酸を残基199に、メチオニンを残基211に、フェニルアラニンを残基221に、アラニンを残基286に、アスパラギンを残基427に、又はアラニンを残基438に含む、請求項14に記載のホスト。前記ポリペプチドがSEQIDNO95のアミノ酸配列を含む、請求項1乃至15のいずれかに記載のホスト。前記ポリペプチドがSEQIDNO5のアミノ酸配列を含む、請求項1乃至12のいずれかに記載のホスト。SEQIDNO3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有するUGT85Cポリペプチドをコードする組換え遺伝子を更に含む、請求項1乃至18のいずれかに記載のホスト。前記UGT85Cポリペプチドが一つ以上のアミノ酸置換をSEQIDNO3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に含む、請求項19に記載のホスト。SEQIDNO7に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を更に含む、請求項1乃至20のいずれかに記載のホスト。前記UGT76Gポリペプチドが、一つ以上のアミノ酸置換をSEQIDNO7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有する、請求項21に記載のホスト。SEQIDNO3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有すると共に、一つ以上のアミノ酸置換をSEQIDNO3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に有するUGT85Cポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換えホスト。前記ポリペプチドが、置換をSEQIDNO3の残基13、15、60、270、289、及び418に含む、請求項23に記載のホスト。前記ポリペプチドがa置換をSEQIDNO3の残基13、60、及び270に;b置換をSEQIDNO3の残基60及び87に;c置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、243、及び270に;d置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、243、270、及び441に;e置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、389、及び394に;f置換をSEQIDNO3の残基65、71、270、及び289に;g置換をSEQIDNO3の残基15及び65に;h置換をSEQIDNO3の残基65及び270に;i置換をSEQIDNO3の残基65及び440に;j置換をSEQIDNO3の残基65及び441に;k置換をSEQIDNO3の残基65及び418に;l置換をSEQIDNO3の残基220、243、270、及び334に;又はm置換をSEQIDNO3の残基270及び289に含む、請求項23に記載のホスト。SEQIDNO7に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有すると共に、一つ以上のアミノ酸置換を残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホスト。前記ポリペプチドがa置換をアミノ酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び291に;b置換を残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び291に;又はc置換を残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に、有する、請求項26に記載のホスト。前記ホストが微生物である、請求項23乃至27のいずれかに記載のホスト。前記微生物がサッカロミセスである、請求項28に記載のホスト。前記サッカロミセスがサッカロミセス-セレビジエである、請求項29に記載のホスト。前記微生物がエシェリヒア-コリである、請求項28に記載のホスト。前記ホストが植物又は植物細胞である、請求項23乃至27のいずれかに記載のホスト。前記植物又は植物細胞がステビア、フィスコミトレラ、又はタバコ植物又は植物細胞である、請求項32に記載のホスト。前記ステビア植物又は植物細胞がステビアレバウディアナ植物又は植物細胞である、請求項33に記載のホスト。前記ホストがUGT74G1ポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項1乃至34のいずれかに記載のホスト。前記UGT74G1ポリペプチドをコードする前記遺伝子が組換え遺伝子である、請求項35に記載のホスト。前記ホストが、iゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;ii二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又は、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;iiiカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;及びivステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、のうちの一つ以上を更に含む、請求項1乃至36のいずれかに記載のホスト。前記ホストが、v切断型HMGCoAをコードする遺伝子;viCPRをコードする遺伝子;viiラムノースシンセターゼをコードする遺伝子;viiiUDPグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子;及びixUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、のうちの一つ以上を更に含む、請求項1乃至37のいずれかに記載のホスト。i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、又はixの遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子である、請求項38に記載のホスト。i、ii、iii、及びivの遺伝子のそれぞれが組換え遺伝子である、請求項37に記載のホスト。SEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸。前記ポリペプチドが少なくとも95の同一性をSEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して有する、請求項41に記載の核酸。前記ポリペプチドが少なくとも99の同一性をSEQIDNO5に記載のアミノ酸配列に対して有する、請求項41又は請求項42に記載の核酸。前記ポリペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含む、請求項41乃至43のいずれかに記載の核酸。前記ポリペプチドがアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含む、請求項41乃至44のいずれかに記載の核酸。前記ポリペプチドが、SEQIDNO5に対してアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343に含む、請求項41乃至45のいずれかに記載の核酸。前記ポリペプチドが、SEQIDNO5に対してフェニルアラニンを残基30に、グルタミンを残基93に、バリンを残基99に、フェニルアラニンを残基122に、チロシンを残基140に、システインを残基142に、スレオニンを残基148に、アラニンを残基153に、セリンを残基156に、メチオニンを残基195に、グルタミン酸を残基196に、グルタミン酸を残基199に、メチオニンを残基211に、フェニルアラニンを残基221に、アラニンを残基286に、アスパラギンを残基427に、又はアラニンを残基438に含む、請求項41乃至45のいずれかに記載の核酸。SEQIDNO5のアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を持つアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。iゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;ii二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又は、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;iiiカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;及びivステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、を含み、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子である、組換えホスト。前記ホストが、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養された場合に、ステビオールを生成する、請求項49に記載のホスト。前記ステビオールが、前記条件下で培養されたときに少なくとも1mg/Lの培養基まで蓄積する、請求項50に記載のホスト。前記ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼが、SEQIDNO121128に示されたアミノ酸配列に一つに対して90を超える配列同一性を有する、請求項49乃至51のいずれかに記載のホスト。前記コパリルジホスフェートシンターゼが、SEQIDNO129131に示されたアミノ酸配列に対して90を超える配列同一性を有する、請求項42乃至52のいずれかに記載のホスト。前記カウレンシンターゼが、SEQIDNO132135に示されたアミノ酸配列の一つに対して90を超える配列同一性を有する、請求項49乃至53のいずれかに記載のホスト。前記カウレンオキシダーゼが、SEQIDNO138141に示されたアミノ酸配列の一つに対して90を超える配列同一性を有する、請求項49乃至54のいずれかに記載のホスト。前記ステビオールシンセターゼが、SEQIDNO142146に示されたアミノ酸配列の一つに対して90を超える配列同一性を有する、請求項49乃至55のいずれかに記載のホスト。切断型HMGCoAをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至56のいずれかに記載のホスト。CPRをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至57のいずれかに記載のホスト。UGT74G1ポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至58のいずれかに記載のホスト。UGT85C2ポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至59のいずれかに記載のホスト。UGT76G1ポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至60のいずれかに記載のホスト。UGT91D2ポリペプチドをコードする遺伝子を更に含む、請求項49乃至61のいずれかに記載のホスト。前記ホストが、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一つのステビオールグリコシドを生成する、請求項59乃至62のいずれかに記載のホスト。前記ステビオールグリコシドが、ステビオール13Oグルコシド、ステビオール19Oグルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、及びダルコシドAから成る群より選択される、請求項63に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドが、前記条件下で培養されたときに少なくとも1mg/Lの培養基まで蓄積する、請求項64に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドが、前記条件下で培養されたときに少なくとも10mg/Lの培養基まで蓄積する、請求項65に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドが、前記条件下で培養されたときに少なくとも20mg/Lの培養基まで蓄積する、請求項66に記載のホスト。iデオキシキシルロース5ホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;iiD1デオキシキシルロース5ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする遺伝子;iii4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールシンターゼをコードする遺伝子;iv4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールキナーゼをコードする遺伝子;v4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトール24シクロジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;vi1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;vii1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートレダクターゼをコードする遺伝子、のうちの一つ以上を更に含む、請求項49乃至67のいずれかに記載のホスト。ixアセトアセチルCoAチオラーゼをコードする遺伝子;x切断型HMGCoAレダクターゼをコードする遺伝子;xiメバロネートキナーゼをコードする遺伝子;xiiホスホメバロネートキナーゼをコードする遺伝子;xiiiメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、のうちの一つを更に含む、請求項49乃至68のいずれかに記載のホスト。前記遺伝子のうちの一つ以上の発現が誘導性である、請求項49乃至69のいずれかに記載のホスト。前記ホストが微生物、植物、又は植物細胞である、請求項49乃至70のいずれかに記載のホスト。前記ホストがサッカロミセス-セレビジエである、請求項71に記載のホスト。a請求項71又は請求項72に記載のホストと、前記遺伝子が発現するような条件下で培養基中で成長させるステップと、b前記ホストによって生成されたステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップとを含む、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する方法。前記成長させるステップが、前記遺伝子の一つ以上の発現を誘導するステップを含む、請求項73に記載の方法。前記ステビオール又はステビオールグリコシドがステビオール13Oグルコシド、ステビオール19Oグルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、及びダルコシドAから成る群より選択される、請求項73又は74に記載の方法。i二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はiiコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;を含み、前記コパリルジホスフェートシンターゼ及び前記カウレンシンターゼの発現時にentカウレンを生成する、を含む、組換えサッカロミセス株。SEQIDNO1825、3436、443、48、49、5255、6064、7072、77、又は79に示されたヌクレオチド配列の一つに対して90を超える配列同一性を有する、単離された核酸。iUGT74G1をコードする遺伝子;iiUGT85C2をコードする遺伝子;iiiUGT76G1をコードする遺伝子;及びivUGT91D2をコードする遺伝子、を含み、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子である、組換えホスト。前記遺伝子のそれぞれが組換え遺伝子である、請求項78に記載のホスト。前記ホストが、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一つのステビオールグリコシドを生成する、請求項78又は79に記載のホスト。a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;dゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を更に含む、請求項78乃至80のいずれかに記載のホスト。前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドAである、請求項78乃至81のいずれかに記載のホスト。UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、UGT91D2e又はUGT91D2mのアミノ酸配列に対して90を超える配列同一性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸。UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、UGT91D2e又はUGT91D2mのアミノ酸配列に対して90を超える配列同一性を有する、単離されたポリペプチド。ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質を有する、請求項78乃至81のいずれかに記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。iUGT91D2をコードする組換え遺伝子;iiUGT74G1をコードする組換え遺伝子;iiiUGT85C2をコードする組換え遺伝子;及びivUGT76G1をコードする組換え遺伝子、及びvラムノースシンセターゼをコードする遺伝子、を含み、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一つのステビオールグリコシドを生成する、組換えホスト。a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を更に含む、請求項86に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドC又はダルコシドAである、請求項86又は87に記載のホスト。重量で総ステビオールグリコシドの15を超えるレバウディオサイドCと、ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質とを有する、請求項86又は87に記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。重量で総ステビオールグリコシドの15を超えるダルコシドAと、ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質とを有する、請求項86又は87に記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。iUGT91D2をコードする組換え遺伝子;iiUGT74G1をコードする組換え遺伝子;iiiUGT85C2をコードする組換え遺伝子;及びivUGT76G1をコードする組換え遺伝子、を含み、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一つのステビオールグリコシドを生成する、組換えホスト。a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を更に含む、請求項91に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドD又はレバウディオサイドEである、請求項91又は92に記載のホスト。重量で総ステビオールグリコシドの4を超えるレバウディオサイドDと、ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質とを有する、請求項91又は92に記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。重量で総ステビオールグリコシドの4を超えるレバウディオサイドEと、ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質とを有する、請求項91又は92に記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。iUGT91D2をコードする組換え遺伝子;iiUGT74G1をコードする組換え遺伝子;iiiUGT85C2をコードする組換え遺伝子;ivUGT76G1をコードする組換え遺伝子;vUDPグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子;及びviUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、を含み、前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一つのステビオールグリコシドを生成する、組換えホスト。a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を更に含む、請求項96に記載のホスト。前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドFである、請求項96又は97に記載の微生物。重量で総ステビオールグリコシドの4を超えるレバウディオサイドFと、ステビア抽出物に比べて減少したレベルのステビア植物由来混入物質とを有する、請求項96又は97に記載のホストにより生成されたステビオールグリコシド組成物。a前記遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で、請求項86乃至88、91乃至93、又は96乃至98のいずれかに記載のホストを培養基中で成長させるステップと、b前記ホストによって生成されたステビオールグリコシド組成物を回収するステップであって、前記組成物がレバウディオサイドA、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF又はダルコシドAについて、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較して濃縮される、ステップとを含む、ステビオールグリコシド組成物を生成する方法。前記微生物によって生成された前記ステビオールグリコシド組成物が、ステビア抽出物に比較して減少したレベルのステビア植物由来混入物質を有する、請求項100に記載の方法。レバウディオサイドA、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF又はダルコシドAが、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較して濃縮されているステビオールグリコシド組成物を含む食品。ある多型が形質変換に関係しているかどうかを明らかにする方法であって、a一植物集団の一つ以上の遺伝子多型が、SEQIDNO5に示されたポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座と関係しているかどうかを判定するステップと、b前記植物集団における前記形質の変換と、前記植物集団における前記一つ以上の遺伝子多型の存在との間の相関関係を測定することで、前記一つ以上の遺伝子多型が、前記形質の変化と関係しているかどうかを明らかにするステップと、を含む、方法。植物株を作製する方法であって、a一植物集団の一つ以上の遺伝子多型が、SEQIDNO5に示されたポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座と関係しているかどうかを判定するステップと、b前記遺伝子多型の少なくとも一つの存在が形質変化に関係している、前記集団内の一つ以上の植物を特定するステップと、c前記特定された植物の一つ以上を、それ自体又は異なる植物に交配して種子を生じさせるステップと、d前記種子から成長させた少なくとも一つの後代植物をそれ自体、又は異なる植物に交配するステップと、eステップc及びdを更に0-5世代繰り返すことで前記植物株を作製するステップであって、この場合、前記遺伝子多型の少なくとも一つが前記植物株中に存在する、ステップとを含む、方法。第二の糖部分を、ステビオールグリコシド中のグルコースのC2に移動させる方法であって、前記ステビオールグリコシドをUGT91D2ポリペプチド及びUDP糖に、前記第二の糖の前記ステビオールグリコシドへの移動に適した反応条件下で接触させるステップを含む、方法。前記UGT91D2ポリペプチドが、SEQIDNO5に示されたアミノ酸配列に少なくとも90の同一性を有する、請求項105に記載の方法。前記UGT91D2ポリペプチドが、SEQIDNO5に示されたアミノ酸配列に少なくとも95の同一性を有する、請求項106に記載の方法。前記UGT91D2ポリペプチドが、SEQIDNO5に示されたアミノ酸配列に少なくとも99の同一性を有する、請求項107のいずれかに記載の方法。前記ポリペプチドが、少なくとも一つのアミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含む、請求項105乃至108のいずれかに記載の方法。前記ポリペプチドが、アミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含む、請求項105乃至109のいずれかに記載の方法。前記ステビオールグリコシドが、ステビオール13Oグルコシド、ルブソシド、ステビオシド、及びレバウディオサイドAから成る群より選択される、請求項105乃至110のいずれかに記載の方法。前記ステビオールグリコシドがルブソシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そしてステビオシドが、前記第二のグルコース部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そしてレバウディオサイドEが、前記第二のグルコース部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、ステビオシドを前記UGT91D2ポリペプチド及びUGT76G1ポリペプチドに、レバウディオサイドDを生成するために適した反応条件下で接触させる、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがステビオール13Oグルコシドであり、ステビオール12ビオシドが、前記第二のグルコース部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがステビオール13Oグルコシドであり、ステビオール12キシロビオシドが、前記第二の糖部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがステビオール13Oグルコシドであり、ステビオール12ラムノビオシドが、前記第二の糖部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドAであり、レバウディオサイドDが、前記第二のグルコース部分が移動すると生成される、請求項111に記載の方法。ステビア植物中にポリヌクレオチドの存在を判定する方法であって、a少なくとも一つのプローブ又はプライマーペアをステビア植物由来の核酸に接触させるステップであって、前記プローブ又はプライマーペアが、UGTポリペプチドとコードするポリヌクレオチドに特異的であり、前記UGTポリペプチドがSEQIDNO5、SEQIDNO1、SEQIDNO3又はSEQIDNO7に対して少なくとも90の配列同一性を有する、ステップと、b前記ポリヌクレオチドが前記ステビア植物中に存在するかどうかを判定するステップとを含む、方法。ステビア生物試料を遺伝子型決定するキットであって、SEQIDNO5、SEQIDNO1、SEQIDNO3又はSEQIDNO7に対して少なくとも90の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーペア、又は前記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ、を含む、キット。概要ここでは、発現させるとステビオール生成される一種以上の生合成遺伝子を含む、微生物などの組換えホストを提供する。このような遺伝子には、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、カウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;及びステビオールシンターゼをコードする遺伝子がある。組換えホストには、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子の代わりに、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子を含めることができる。遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。いくつかの実施態様では、前記組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子を含む。組換えホストは更に、切断型HMGCoAレダクターゼをコードする遺伝子及び/又はCPRをコードする遺伝子を含むことができる。前記遺伝子のうちの一つ以上の発現は誘導性であってもよい。ある局面では、本書類は、UGT91D2ポリペプチド例えばUGT91D2e又はUGT91D2mポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。UGT91D2ポリペプチドは、SEQIDNO5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性例えば95又は99の同一性を有することができる。UGT91D2ポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含むことができる。例えば、UGT91D2ポリペプチドは、アミノ酸置換をSEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一個以上の残基に含むことができる。ある実施態様では、UGT91D2ポリペプチドは、SEQIDNO5においてアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343に含む。ある実施態様では、UGT91D2ポリペプチドは、SEQIDNO5においてフェニルアラニンを残基30に、グルタミンを残基93に、バリンを残基99に、フェニルアラニンを残基122に、チロシンを残基140に、システインを残基142に、スレオニンを残基148に、アラニンを残基153に、セリンを残基156に、メチオニンを残基195に、グルタミン酸を残基196に、グルタミン酸を残基199に、メチオニンを残基211に、フェニルアラニンを残基221に、アラニンを残基286に、アスパラギンを残基427に、又はアラニンを残基438に含む。当該ポリペプチドはSEQIDNO5又はSEQIDNO95のアミノ酸配列を有することができる。ここで更に解説するホストは、SEQIDNO3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有するUGT85Cポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。例えば、UGT85Cポリペプチドは、一箇所以上のアミノ酸置換を、SEQIDNO3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に含むことができる。ここで更に解説するホストは、SEQIDNO7に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。例えば、UGT76Gポリペプチドは、一箇所以上のアミノ酸置換を、SEQIDNO7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に含むことができる。本書類は更に、SEQIDNO3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有すると共に、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQIDNO3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に有するUGT85Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。例えば該UGT85Cポリペプチドは、置換をSEQIDNO3の残基13、15、60、270、289、及び418に含むことができる。例えば該UGT85Cポリペプチドはa置換をSEQIDNO3の残基13、60、及び270に;b置換をSEQIDNO3の残基60及び87に;c置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、243、及び270に;d置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、243、270、及び441に;e置換をSEQIDNO3の残基65、71、220、389、及び394に;f置換をSEQIDNO3の残基65、71、270、及び289に;g置換をSEQIDNO3の残基15及び65に;h置換をSEQIDNO3の残基65及び270に;i置換をSEQIDNO3の残基65及び440に;j置換をSEQIDNO3の残基65及び441に;k置換をSEQIDNO3の残基65及び418に;l置換をSEQIDNO3の残基220、243、270、及び334に;又はm置換をSEQIDNO3の残基270及び289に含むことができる。別の局面では、本書類は、SEQIDNO7に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を有すると共に、一箇所以上のアミノ酸を残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。例えば該UGT76Gポリペプチドは、a置換をアミノ酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び291に;b置換を残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び291に;又はc置換を残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有することができる。ここに解説されたホストはいずれも、更にUGT74G1ポリペプチドをコードする遺伝子例えばUGT74G1ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。ここで解説するホストのいずれも、更にiゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;ii二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;iiiカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;ivステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;v切断型HMGCoAをコードする遺伝子;viCPRをコードする遺伝子;viiラムノースシンセターゼをコードする遺伝子;viiiUDPグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子;及びixUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、のうちの一つ以上を含むことができる。i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、又はixのうちの少なくとも一つは組換え遺伝子であってよい。いくつかの実施態様では、i、ii、iii、及びivの遺伝子のそれぞれは組換え遺伝子である。更に本書類は、SEQIDNO5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の配列同一性例えば少なくとも95又は99の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸も特徴とする。該ポリペプチドは、少なくとも一箇所のアミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含むことができる。該ポリペプチドは、アミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含むことができる。該ポリペプチドは、SEQIDNO5においてアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343に含むことができる。いくつかの実施態様では、該ポリペプチドは、SEQIDNO5においてフェニルアラニンを残基30に、グルタミンを残基93に、バリンを残基99に、フェニルアラニンを残基122に、チロシンを残基140に、システインを残基142に、スレオニンを残基148に、アラニンを残基153に、セリンを残基156に、メチオニンを残基195に、グルタミン酸を残基196に、グルタミン酸を残基199に、メチオニンを残基211に、フェニルアラニンを残基221に、アラニンを残基286に、アスパラギンを残基427に、又はアラニンを残基438に含む。別の局面では、本書類は、SEQIDNO5のアミノ酸配列に対して少なくとも90の同一性を持つアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを特徴とする。更に本書類は、iゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;ii二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;iiiカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;及びivステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;但しこの場合、前記遺伝子のうちの少なくとも一つを含む組換えホストも特徴とする。該ホストは、遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにステビオールを産生することができ、また培養基中で少なくとも1mgLまで蓄積することができる。該ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼは、SEQIDNO121128に示すアミノ酸配列の一つに対して90を超える配列同一性を有することができる。コパリルジホスフェートシンターゼは、SEQIDNO129131に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して90を超える配列同一性を有することができる。カウレンシンターゼは、132135に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して90を超える配列同一性を有することができる。カウレンオキシダーゼは、138141に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して904を超える配列同一性を有することができる。ステビオールシンセターゼは、SEQIDNO142146に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して90を超える配列同一性を有することができる。該ホストは更に、切断型HMGCoAをコードする遺伝子及び/又はCPRをコードする遺伝子を含むことができる。該組換えホストのいずれも、UGT74G1ポリペプチド、UGT85C2ポリペプチド、UGT76G1ポリペプチド、又はGT91D2ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの一つ以上を含むことができる。該組換えホストのいずれも、遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該ステビオールグリコシドは、ステビオール13Oグルコシド、ステビオール19Oグルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、及びダルコシドAから成る群より選択することができる。ステビオールグリコシドは、前記条件下で培養されたときに培養基中1少なくとも1mg/リットル例えば少なくとも10mgリットル又は20mgリットルまで蓄積させることができる。組換えホストのいずれも更に、iデオキシキシルロース5ホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;iiD1デオキシキシルロース5ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする遺伝子;iii4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールシンターゼをコードする遺伝子;iv4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールキナーゼをコードする遺伝子;v4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトール24シクロジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;vi1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子;又はvii1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートレダクターゼをコードする遺伝子のうちの一つ以上を含むことができる。組換えホストはいずれも更に、ixアセトアセチルCoAチオラーゼをコードする遺伝子;x切断型HMGCoAレダクターゼをコードする遺伝子;xiメバロネートキナーゼをコードする遺伝子;xiiホスホメバロネートキナーゼをコードする遺伝子;xiiiメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のうちの一つを含むことができる。ここで解説するホストのいずれにおいても、該遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導性とすることができる。ここで解説するホストはいずれも微生物例えばサッカロミセスセレビジエなどのサッカロミセス属、又はエシェリヒアコリ、又は植物もしくは植物細胞例えばステビアレバウジアナ原語:Steviarebaudianaなどのステビア、フィスコミトレラ原語;Physcomitrella、又はタバコ植物もしくは植物細胞であってよい。別の局面では、本書類は、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する方法を特徴とする。本方法は、遺伝子が発現するような条件下で、ここで解説するホストを培養基中で成長させるステップと;該ホストによって産生されたステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップとを含む。前記の成長させるステップは、当該遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導するステップを含むことができる。該ステビオール又はステビオールグリコシドは、ステビオール13Oグルコシド、ステビオール19Oグルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、バウディオサイドF、及びダルコシドAから成る群より選択される。また、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する方法もここで提供する。本方法は、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ、コパリルジホスフェートシンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸13ヒドロキシラーゼ遺伝子、及び選択的にUGT74G1及び/又はUGT85C2遺伝子が発現するような条件下で、微生物を培養基中で成長させるステップと、該微生物によって産生されたステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップとを含む。当該の微生物はサッカロミセス種であってよい。いくつかの実施態様では、前記の成長させるステップは、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ、コパリルジホスフェートシンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸13ヒドロキシラーゼ、UGT74G1及びUGT85C2遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導するステップを含む。いくつかの実施態様では、前記の回収するステップは、HPLCによってステビオール又はステビオールグリコシドを培養基から精製するステップを含む。当該のステビオール又はステビオールグリコシドはステビオール、ルブソシド、レバウディオサイドC、レバウディオサイドF、又はダルコシドAであってよい。更にここでは、発現するとentカウレンが産生される一種以上の生合成遺伝子を含む、組換えサッカロミセス株を提供する。該生合成遺伝子は、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又は、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子含む。当該の株は、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼを発現したときにentカウレンを産生する。別の局面では、本書類は、SEQIDNO1825、3436、443、48、49、5255、6064、7072、77、又は79に示すヌクレオチド配列の一つに対して90を超える配列同一性例えば95又は99を超える配列同一性を有する単離された核酸を特徴とする。更に本書類は、iUGT74G1をコードする遺伝子;iiUGT85C2をコードする遺伝子;iiiUGT76G1をコードする遺伝子;及びivUGT91D2をコードする遺伝子を含み、但しこの場合、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子であるような組換えホストを特徴とする。いくつかの実施態様では、該遺伝子のそれぞれは組換え遺伝子である。該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該ホストは更に、a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。当該のステビオールグリコシドはレバウディオサイドA、レバウディオサイドD又はレバウディオサイドEであってよい。本書類は更に、このようなホストによって産生されるステビオールグリコシド組成物も特徴とする。該組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で4を超えるレバウディオサイドDと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で4を超えるレバウディオサイドEと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。更に、UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、UGT91D2e及びUGT91D2mのアミノ酸配列に対して90を超える配列同一性を有するポリペプチドや、UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、UGT91D2e又はUGT91D2mのアミノ酸配列に対して90を超える配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸を、ここでは特徴とする。本書類は更に、ここで解説するホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有する。別の局面では、本書類は組換えホストを特徴とする。該ホストは、iUGT91D2をコードする組換え遺伝子;iiUGT74G1をコードする組換え遺伝子;iiiUGT85C2をコードする組換え遺伝子;ivUGT76G1をコードする組換え遺伝子;及びvラムノースシンセターゼをコードする遺伝子を含み、但しこの場合、該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生する。該ホストは更に、a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドC又はダルコシドAであってよい。本書類は更に、このようなホストによって産生されるステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で15を超えるレバウディオサイドCと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。このようなホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、重量で総ステビオールグリコシドの15を超えるダルコシドと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。本書類は更に組換えホストを特徴とする。該ホストは、iUGT91D2をコードする組換え遺伝子;iiUGT74G1をコードする組換え遺伝子;iiiUGT85C2をコードする組換え遺伝子;ivUGT76G1をコードする組換え遺伝子;vUDPグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子;及びviUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、を含み、但しこの場合、該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生する。該ホストは更に、a二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子;bカウレンオキシダーゼをコードする遺伝子;cステビオールシンセターゼをコードする遺伝子;及びdゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドFであってよい。本書類は更に、このようなホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で4を超えるレバウディオサイドFと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。別の局面では、本書類は、ステビオールグリコシド組成物を生成する方法を特徴とする。本方法は、当該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下でここに解説するホストを培養基中で成長させるステップと;該ホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物を回収するステップとを含み、但しこの場合、該回収された組成物は、レバウディオサイドA、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF又はダルコシドAについて、野生型のステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較して濃縮される。該ホスト例えば微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。本書類は更に、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較してレバウディオサイドA、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF又はダルコシドAが濃縮されたステビオールグリコシド組成物を含む食品を特徴とする。別の局面では、本書類は、多型が形質におけるばらつきと関係するのかどうかを識別する方法を特徴とする。本方法は、ある植物集団中の一つ以上の遺伝子多型が、SEQIDNO5に示すポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座に関連するかどうかを判定するステップと;該集団中の植物の形質のばらつきと、該集団中の植物の一つ以上の遺伝子多型の存在との間の相関関係を測定することで、前記一つ以上の遺伝子多型が形質のばらつきと関連するかどうかを判定するステップとを含む。更に別の局面では、本書類は、植物株を作製する方法を特徴とする。本方法は、植物集団中の一つ以上の遺伝子型が、SEQIDNO5に示すポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座と関連するかどうかを判定するステップと;遺伝子多型のうちの少なくとも一つの存在が形質のばらつきと関連するような一つ以上の植物を集団中で識別するステップと;識別された植物の一つ以上をそれ自体又は異なる植物と交配することで種子を作製するステップと;前記種子から成長させた少なくとも一つの後代植物を、それ自体又は異なる植物に交配するステップと;前記交配ステップを更に0-5世代、繰り返すことで、前記植物株を作製するステップであって、但し、遺伝子多型のうちの少なくとも一つが前記植物株中に存在する、ステップとを含む。更に本書類は、第二の糖部分を、ステビオールグリコシド中のグルコースのC2に移動させる方法も特徴とする。本方法は、ステビオールグリコシドをUGT91D2ポリペプチド及びUDP糖に、前記第二の糖部分のステビオールグリコシドへの移動に適した反応条件下で接触させるステップを含む。該UGT91D2ポリペプチドは、SEQIDNO5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90の配列同一性例えば少なくとも95又は99を有することができる。該UGT91D2ポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含むことができる。該UGT91D2ポリペプチドはアミノ酸置換を、SEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含むことができる。該ステビオールグリコシドはステビオール13Oグルコシド、ルブソシド、ステビオシド、及びレバウディオサイドAから成る群より選択することができる。該ステビオールグリコシドはルブソシドでよく、そして前記第二の糖部分はグルコースであり、そしてステビオシドは、前記第二の糖部分が移動したときに生成される。該ステビオールグリコシドはステビオシドであってよく、そして前記第二の糖部分はグルコースであってよく、そしてレバウディオサイドEは、前記第二のグルコース部分が移動したときに生成される。該ステビオールグリコシドはステビオシドであってよく、但しこの場合、ステビオシドは、レバウディオサイドDを生成するのに適した反応条件下でUGT91D2ポリペプチド及びUGT76G1ポリペプチドに接触させる。該ステビオールグリコシドはステビオール13Oグルコシドであってよく、そして前記第二のグルコース部分の移動したときにステビオール12ビオシドが生成される。該ステビオールグリコシドはステビオール13Oグルコシドであってよく、そして前記第二の糖部分が移動したときにステビオール12キシロビオシドが生成される。該ステビオールグリコシドはステビオール13Oグルコシドであってよく、そして前記第二の糖部分が移動したときにステビオール12ラムノビオシドを生成させることができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドAであってよく、そして第二のグルコース部分が移動したときにレバウディオサイドDが生成される。別の局面では、本書類は、ステビア植物中のポリヌクレオチドの存在を判定する方法を特徴とする。本方法は、少なくとも一種のプローブ又はプライマーペアをステビア植物由来の核酸に接触させるステップであって、但しこの場合の前記プローブ又はプライマーペアは、UGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的であり、該UGTポリペプチドは、SEQIDNO5、SEQIDNO1、SEQIDNO3又はSEQIDNO7に対して少なくとも90の配列同一性を有する、ステップと、前記ポリヌクレオチドが前記植物中に存在するかどうかを判定するステップとを含む。更に本書類は、ステビア生物試料を遺伝子型判定するためのキットも特徴とする。本キットは、SEQIDNO5、SEQIDNO1、SEQIDNO3又はSEQIDNO7に対して少なくとも90の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーペア、又は、同ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ、を含む。更にここでは、その発現が一種以上のステビオールグリコシドの産生につながる一種以上の生合成遺伝子を含む組換え微生物を提供する。該生合成遺伝子は、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子、ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、並びにUGT74G1及び/又はUGT85C2をコードする遺伝子を含む。前記遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該微生物は、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子を、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子の代わりに含むことができる。前記組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生する。該ステビオールグリコシドはルブソシド、レバウディオサイドC、レバウディオサイドF、ダルコシドB、又はダルコシドAであってよい。組換え微生物は、例えばサッカロミセスセレビジエなどのサッカロミセス属であってよく、そしてEXG1及びEXG2グリコシドヒドロラーゼ活性を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができ、そしてエルゴステロール生合成を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができる。該サッカロミセス属は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにルブソシドを産生する。該ルブソシドは、少なくとも10mgl培養基1リットルまで蓄積することができる。該サッカロミセス属は、CEY171、CEY191、又はCEY213と指名されたサッカロミセスセレビジエ株であってよい。該組換え微生物は更に、SM12UGTをコードする遺伝子及びUGT76G1をコードする遺伝子を含むことができ、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにステビオールグリコシドを産生することができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドAであってよい。更にここでは、その発現が少なくとも一種のステビオールグリコシドの産生につながるような一種以上の生合成遺伝子を含む組換え微生物を提供する。該生合成遺伝子は、SM12UGTをコードする遺伝子、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT76G1をコードする遺伝子、及びUGT85C2をコードする遺伝子を含む。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにレバウディオサイドA又はレバウディオサイドBを産生する。該レバウディオサイドA又はレバウディオサイドBは、培養基中で少なくとも1mgLまで蓄積することができる。更にここでは、組換えUGT91D2遺伝子など、UGT91D2ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。更にここでは、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子、ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT85C2をコードする遺伝子、UGT76G1をコードする遺伝子、及びUGT91D2をコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに、例えばレバウディオサイドA、レバウディオサイドB、及び/又はレバウディオサイドFなど、少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該組換え微生物は、このような条件下で培養されたときに培養基1リットル当り少なくとも20mgのステビオールグリコシドを蓄積することができる。該組換え微生物は、サッカロミセスセレビジエなどのサッカロミセス属であってよく、EXG1及びEXG2グリコシドヒドロラーゼ活性を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らすような一つ以上の遺伝子改変を有することができ、そしてエルゴステロール生合成を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができる。更にここでは、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT85C2をコードする遺伝子、UGT76G1をコードする遺伝子、及びUGT91D2をコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに、例えばレバウディオサイドA又はレバウディオサイドBなどのステビオールグリコシドを産生することができる。レバウディオサイドA又はレバウディオサイドBは培養基中で少なくとも15mgLまで蓄積することができる。上記の組換え微生物は更に、デオキシキシルロース5ホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、及び/又はD1デオキシキシルロース5ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする遺伝子、及び/又は4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールシンターゼをコードする遺伝子、及び/又は4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールキナーゼをコードする遺伝子、及び/又は4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトール24シクロジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、及び/又は1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、及び/又は1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートレダクターゼをコードする遺伝子を含むことができる。上記の組換え微生物は更に、アセトアセチルCoAチオラーゼをコードする遺伝子、及び/又は切断型HMGCoAレダクターゼをコードする遺伝子、及び/又はメバロネートキナーゼをコードする遺伝子、及び/又はホスホメバロネートキナーゼをコードする遺伝子、及び/又はメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むことができる。他に定義しない限り、ここで用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。ここで解説するものと同様又は均等な方法及び材料を用いて本発明を実施することもできるが、適した方法及び材料を以下に解説する。ここで言及するすべての公開文献、特許出願、特許、及び他の参考文献の全文を、引用をもってここに援用することとする。矛盾する場合は、定義も含む本明細書を上位とする。加えて、該材料、方法、及び例は単に描写のみであり、限定を意図したものではない。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明白であろう。出願人は、特許法における標準的な慣例に従って移行的な文言含む、から基本的に成る、又はから成るを用いることで、いずれかの開示された発明を代替的に請求の範囲とする権利を保持する。詳細な説明二種のグリコシド、ステビオシド及びレバウディオサイドAが、市販のステビア抽出物中の主な化合物である。ステビオシドAはレバウディオサイドAよりも苦く、甘みが少ないと報告されているため、抽出物製剤中ではレバウディオサイドAが高率であることが好ましい。しかしながら、ステビア抽出物の組成はロット毎に、植物が成長した土壌及び気候に応じて様々である。原料となった植物、気候条件、及び抽出プロセスに応じて、市販の製品中のレバウディオサイドAの量は、総ステビオールグリコシド含有量の20乃至97、典型的には50-80であり、ときには総ステビオールグリコシドの95-97を超えると報告されている。更に、他のステビオールグリコシドが、量は様々ではあるがステビア抽出物中に存在しており、これが、ステビア抽出物からの抽出及び精製により一貫した食味プロファイルを持つ甘味料を製造できるかどうかを更に複雑にしている。例えばレバウディオサイドBは典型的には1-2未満、存在するが、他方、レバウディオサイドCは、7-15という高いレベルで存在する。レバウディオサイドDは典型的には、総ステビオールグリコシドの2未満のレベルで存在し、そしてレバウディオサイドFは典型的には3.5未満、組成物中に存在する。更に微量の副次的なステビオールグリコシドが、ステビア抽出物の香味プロファイルに影響することが報告鎖rている。加えて、ステビア植物の混入物質の中には、大変低濃度であっても、市販の植物抽出物のいくつかに異風味を提供しかねないものがあると考えられる。本書類は、ステビオールの合成に有用なポリペプチドを発現する植物細胞、植物、又は微生物などの組換えホストを開発することができるという発見に基づく。更に、このようなホストは、ルブソシド及びレバウディオサイドAなどのステビオールグリコシドを生成するのに適したウリジン5ジホスホグリコシルトランスフェラーゼを発現することができる。組換え微生物は特に有用なホストである。これらの生合成ポリペプチドを多様な微生物シャシスで発現させることにより、ステビオール及びそのグリコシドを、一貫した、再現可能な態様で、糖類、グリセロール、CO2、H2、及び日光などのエネルギー及び炭素源から生成することができる。組換えホストによって産生される各ステビオールグリコシドの比率は、予め選択された生合成酵素をホストに導入し、それらを適したレベルで発現させることで調節することができ、こうして一貫した食味プロファイルを持つ甘味料組成物を提供することができる。更に、組換えホストによって産生されるステビオールグリコシドの濃度は、ステビア植物中で産生されるステビオールグリコシドのレベルよりも高くなるため、下流の精製の効率を高めると予測される。このような甘味料組成物は、ステビア抽出物中に存在する混入物質量に比較して、植物ベースの混入物質をほとんど、又は全く含有しない。該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子、つまり、使用に向けて選択された種又は株に応じた特定の組換え遺伝子である。ステビオール及びグリコシド生成率を増加させる、エネルギー及び炭素源がステビオール及びグリコシドに転化される高率を高める、及び/又は、細胞培養株又は植物からの生産性を高めるために、更なる遺伝子又は生合成モジュールを含めることができる。このような更なる生合成モジュールには、テルペノイド前駆体、イソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリルジホスフェートの合成に関与する遺伝子がある。更なる生合成モジュールには、テルペンシンターゼ及びテルペンシクラーゼ遺伝子、例えばゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ及びコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子がある、これらの遺伝子は内因性の遺伝子でも、又は組換え遺伝子でもよい。I.ステビオール及びステビオールグリコシド生合成ポリペプチドA.ステビオール生合成ポリペプチドジテルペンステビオール及び多様なステビオールグリコシドを含め、ステビア抽出物に見られる化合物のいくつかの化学構造を図3に示し、CAS番号を下の表Aに示す。更にHarrietWallinFoodAgricOrgによって作製されたステビオールグリコシド化学及的及び技術的評価69thJECFAも参照されたい。微生物などのホストで特定の遺伝子を発現させると、そのホストに対してステビオール合成能がもたらされることが発見されている。以下に更に詳細に論じるように、このような遺伝子のうちの一つ以上が、ホストには天然で存在するかも知れない。しかしながら典型的には、このような遺伝子の一つ以上は、それらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。ステビオールを生成する生合成経路は、ゲラニルゲラニルジホスフェートの形成、コパリルジホスフェートへの環化、続く酸化及び水酸化によるステビオールの形成、を含む。図1を参照されたい。このように、組換え微生物におけるゲラニルゲラニルジホスフェートのステビオールへの転化は、カウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子、及びステビオールシンセターゼをコードする遺伝子の発現を含む。ステビオールシンセターゼはカウレン酸13ヒドロキシラーゼとしても知られる。適したKSポリペプチドが公知である。例えば、適したKS酵素には、ステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、ジーメイス原語:Zeamays及びポピュラストリコカルパ原語:Populustrichocarpaによって産生されるものがある。SEQIDNO132135を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳述する。例えば表3及びSEQIDNO4047を参照されたい。適したKOポリペプチドが公知である。例えば、適したKO酵素には、ステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana、ギベレラフジコロイ原語:Gibberellafujikoroi及びトラメテスヴェルシコロー原語:Trametesversicolorが産生するものがある。SEQIDNO138141を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、以下により詳細に解説する。例えば表5及びSEQIDNO5259を参照されたい。適したKAHポリペプチドが公知である。例えば、適したKAH酵素には、ステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana、ヴィティスヴィニフェラ原語:Vitisvinifera及びメディカゴトルンキュラタ原語:Medicagotrunculataが産生するものがある。例えばSEQIDNO142146;米国特許公報No20080271205;米国特許公報No20080064063及びGenbank受託番号Nogi189098312を参照されたい。アラビドプシサリアナ由来の該ステビオールシンセターゼはCYP714A2と分類される。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳細に解説する。例えば表6及びSEQIDNO6069を参照されたい。いくつかの実施態様では、組換え微生物は、KO及び/又はKAHポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有する。このような微生物は典型的には、チトクロームP450レダクターゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有するが、それはなぜなら、KO及び/又はKAHポリペプチドの特定の組合せには、外因性のCPRポリペプチドの発現が必要である。具体的には、植物由来のKO及び/又はKAHポリペプチドの活性は、外因性CPRポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有させることにより、著しく増加させることができる。適したCPRポリペプチドが公知である。例えば、適したCPR酵素には、ステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana、及びギベレラフジクロイ原語:Giberellafujikuroiが産生するものがある。例えばSEQIDNO147149を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、以下により詳細に解説する。例えば表7及びSEQIDNO7075を参照されたい。これらの遺伝子を組換え微生物で発現させると、ゲラニルゲラニルジホスフェートがステビオールに転化する。B.ステビオールグリコシド生合成ポリペプチドいくつかの実施態様では、ここで解説する組換えホストは、ステビオールをステビオールグリコシドに転化させることができる。このようなホスト例えば微生物は、UGTとしても知られる一つ以上のUDPグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有する。UGTは単糖単位を活性化したヌクレオチドの糖が受容部分、この場合はステビオール又はステビオール誘導体上の-OH又は-COOH部分に移動させる。UGTは、配列ホモロジーに基づいてファミリー及びサブファミリーに分類されている。LietalJBiolChem27643384343B1ルブソシド生合成ポリペプチドルブソシドの生合成はステビオールの13OH及び19COOHのグリコシル化を含む。図2Aを参照されたい。微生物などの組換えホストにおけるステビオールのルブソシドへの転化は、グルコース単位をそれぞれステビオールの13OH又は19COOHに移動させる、UGT85C2及び74G1をコードする遺伝子の発現によって達成し得ることが発見された。このように、適したUGT85C2は、ウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール13OHトランスフェラーゼ及びウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール19Oグルコシド13OHトランスフェラーゼとして機能する。機能的なUGT85C2ポリペプチドは更に、ステビオール及びステビオール19Oグルコシド以外のステビオールグリコシド基質を用いるグルコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。適したUGT74G1ポリペプチドは、ウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール19COOHトランスフェラーゼ及びウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール13Oグルコシド19COOHトランスフェラーゼとして機能する。機能的なUGT74G1ポリペプチドは更に、ステビオール及びステビオール13Oグルコシドステビオール以外のグリコシド基質を利用する、又はウリジンジホスフェートグルコース以外のドナーから糖部分を移動させる、グリコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。機能的UGT74G1及び機能的UGT85C2を発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えたときにルブソシド及び両ステビオールモノシド即ちステビオール13Oモノグルコシド及びステビオール19Oモノグルコシドを産生することができる。このような遺伝子の一つ以上が、ホスト内に天然で存在するであろう。しかしながら典型的には、このような遺伝子は、天然ではそれらを持たないホスト例えば微生物内に導入された組換え遺伝子である。ここで用いられる場合の組換えホストという用語は、そのゲノムが、少なくとも一つの導入されたDNA配列によって増強されたホストを言うものと意図されている。このようなDNA配列には、限定はしないが、天然では存在しない遺伝子、通常はRNAに転写されたい、又はタンパク質に翻訳発現されないDNA配列、及び非組換えホストに導入したい他の遺伝子又はDNA配列が含まれる。典型的には、ここで解説される組換えホストのゲノムは、一つ以上の組換え遺伝子の安定な導入を通じて増強されると理解されよう。一般的には、導入されるDNAは、当該DNAのレシピエントであるホスト内には元々ないものであるが、ホストからDNA部分を単離した後、例えば遺伝子産物の生成を高めるため、又は、遺伝子の発現パターンを変えるためなど、同じホスト内にそのDNAの一つ以上の付加的なコピーを導入することも、本発明の範囲内にある。場合によっては、導入されたDNAは、例えば相同組換え又は部位指名変異誘発などにより、内因性の遺伝子又はDNA配列を修飾又は更には置換することとなろう。適した組換えホストには、微生物、植物細胞、及び植物がある。用語組換え遺伝子とは、同じもしくは類似の遺伝子又はDNA配列がこのようなホスト内に既に存在しているかどうかに関係なく、レシピエントのホスト内に導入される遺伝子又はDNA配列を言う。この文脈での導入された又は増強されたは当業では、人の手によって導入された又は増強されたことを意味するとして公知である。従って、組換え遺伝子は、別の種由来のDNA配列であってよく、あるいは、同じ種に由来する又は同じ種に存在するが、組換えホストを形成するために遺伝子操作法によってホストに導入されたDNA配列であってもよい。ホストに導入される組換え遺伝子は、形質転換させようとするホストに通常存在するDNA配列に同一であってよく、そして導入されると、当該DNAの一つ以上の更なるコピーを提供することで、そのDNAの遺伝子産物の過剰発現又は修飾された発現が可能になることは理解されよう。適したUGT74G1及びUGT85C2ポリペプチドにはステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudianaが産生するものがある。ステビア由来の機能的なUGT74G1及びUGT85C2ポリペプチドをコードする遺伝子が、RichmanetalPlantJ415667で報告されている。S.レバウディアナUGT74G1及びUGT85C2ポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれSEQIDNO1及び3に示す。酵母での発現に至適化させてあるUGT74G1及びUGT85C2をコードするヌクレオチド配列をそれぞれSEQIDNO2及び4に示す。更にそれぞれ実施例17及び18で解説されたUGT85C2UGT74G1バリアントを参照されたい。いくつかの実施態様では、組換えホストは微生物である。ルブソシドを産生させるために、組換え微生物をステビオールを含有する培地上で成長させることができる。しかし他の実施態様では、該組換え微生物は、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及び/又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の組換え遺伝子を発現するものである。このように、UGT74G1及びUGT85C2遺伝子に加えてCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及びKAH遺伝子を含有する微生物は、培養基中にステビオールを含める必要なく、ステビオールモノシド及びルブソシドの両方を産生することができる。いくつかの実施態様では、組換え微生物は更に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする組換え遺伝子を発現する。適したGGPPSポリペプチドが公知である。例えば適したGGPPS酵素には、ステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、ギベレラフジクロイ原語:Gibberellafujikuroi、ムスムスカルス原語:Musmusculus、サラシオシラシュードナナ原語:Thalassiosirapseudonana、ストレプトミセスクラブリジェルス原語:Streptomycesclavuligerus、スルフロブスアシドカルダリウス原語:Sulfulobusacidocaldarius、シネココッカス原語:Synechococcus種及びアラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthalianaが産生するものがある。SEQIDNO121128を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳述する。表1及びSEQIDNO1833を参照されたい。いくつかの実施態様では、組換え微生物は更に、例えば以下に論じるメチルエリスリトール4ホスフェート経路の遺伝子又はメバロネート経路の遺伝子など、ジテルペンの生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を発現する。B.2レバウディオサイドA生合成ポリペプチドレバウディオサイドAの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドAは、13Oステビオールモノシドを形成する、ステビオーモノシドの13OHのグルコシル化、ステビオール12ビオシドを形成する、ステビオールモノシドの13OグルコースのC2’のグルコシル化、ステビオシドを形成する、ステビオール12ビオシドのC19カルボキシルのグルコシル化、及びステビオシドのC13OグルコースのC3’のグルコシル化によって形成することができる。各グルコシル化反応を行わせる順序は様々であってよい。図2Aを参照されたい。組換えホスト内でのステビオールのレバウディオサイドAへの転化は、以下の機能的UGT74G1、85C2、76G1及び91D2をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見された。このように、これら4つのUGTを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えられたときにレバウディオサイドAを産生することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、天然ではそれらを持たない微生物に導入された組換え遺伝子である。更に、ここでSM12UGTと指名されたUGTはUGT91D2に置換することができることも発見されている。適したUGT74G1及びUGT85C2ポリペプチドには、上に論じたものがある。適したUGT76G1はグルコース部分を、受容側分子であるステビオール12グリコシドのC13OグルコースのC3部分に加える。このように、UGT76G1は、例えばウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール13O12グルコシドC3’グルコシルトランスフェラーゼ及びウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール19Oグルコース、13O12ビオシドC3’グルコシルトランスフェラーゼなどとして機能する。機能的なUGT76G1ポリペプチドはまた、例えばステビオールラムノシド及びステビオールキシロシドなど、グルコース以外の糖を含有するステビオールグリコシド基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。図2A、2B、2C及び2Dを参照されたい。適したUGT76G1ポリペプチドには、S.レバウディアナによって産生され、RichmanetalPlantJ415667に報告されたものがある。S.レバウディアナUGT76G1ポリペプチドのアミノ酸配列をSEQIDNO7に示す。SEQIDNO7のUGT76G1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、酵母での発現に向けて至適化されており、SEQIDNO8に示されている。更に実施例18に示すUGT76G1バリアントも参照されたい。適したUGT91D2ポリペプチドは、ウリジン5’ジホスホグルコシルステビオール13Oグルコシドトランスフェラーゼステビオール13モノグルコシド12グルコシラーゼとも言及されるとして機能して、受容側分子であるステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2’にグルコース部分を移す。典型的には、適したUGT91D2ポリペプチドは、ウリジン5’ジホスホグルコシルルブソシドトランスフェラーゼとしても機能することで、受容側分子ルブソシドの13OグルコースのC2’にグルコース部分を移す。機能的なUGT91D2ポリペプチドはまた、ステビオール13Oグルコシド及びルブソシド以外のステビオールグリコシド基質を利用する反応も触媒するであろう。例えば機能的なUGT91D2ポリペプチドはステビオシドを基質として利用して、グルコース部分を19Oグルコース残基のC2’に移すことでレバウディオサイドEを生成するであろう。更に機能的なUGT91D2ポリペプチドレバウディオサイドAを基質として利用して、19Oグルコース残基のC2’にグルコース部分を移してレバウディオサイドDを生成するであろう。しかしながら、機能的なUGT91D2ポリペプチドは典型的には、グルコース部分を、13結合グルコースをC13位に有するステビオール化合物には移さないであろう。即ち、グルコース部分のステビオール13ビオシド及び13ステビオシドへの移動は起きない。機能的なUGT91D2ポリペプチドは、ウリジンジホスフェートグルコース以外のドナーから糖部分を移動させることができる。例えば、機能的なUGT91D2ポリペプチドはウリジン5’ジホスホDキシロシルステビオール13Oグルコシドトランスフェラーゼとして働き、キシロース部分を受容側分子ステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2’に移動させることができる。別の例として、機能的なUGT91D2ポリペプチドはウリジン5’ジホスホLラムノシルステビオール13Oグルコシドトランスフェラーゼとして働き、ラムノース部分を受容側分子ステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2に移動させることができる。適した機能的なUGT91D2ポリペプチドには、例えばUGT91D2e及びUGT91D2mと指名されたポリペプチドなど、ここに開示されたものがある。ステビアレバウディアナ由来の例であるUGT91D2eポリペプチドのアミノ酸配列をSEQIDNO5に示す。SEQIDNO6は、酵母での発現に向けてコドンを至適化されたSEQIDNO5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。SEQIDNO5のポリペプチドをコードするS.レバウディアナヌクレオチド配列をSEQIDNO9に示す。S.レバウディアナ由来の例であるUGT91D2mポリペプチドのアミノ酸配列をSEQIDNO10及び12に示すが、それぞれSEQIDNO11及び13に示す核酸配列にコードされている。更に、例えばアミノ酸残基206、207、及び343に置換を含有するバリアントなど、実施例16のUGT91D2バリアントも参照されたい。上に示したように、ここでSM12UGTと指名したUGTは、UGT91D2に置換することができる。適した機能的なSM12UGTポリペプチドには、イプモエアパープレラ原語:Ipomoeapurpurea日本の朝顔が産生する、MoritaetalPlantJ42353363に記載されたものがある。I.パープレラIP3GGTポリペプチドをコードするアミノ酸配列をSEQIDNO76に示す。SEQIDNO77は、酵母での発現に向けてコドン至適化されたSEQIDNO76のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。もう一つの適したSM12UGTポリペプチドは、R25S変異を有するBp94B1ポリペプチドである。OsmanietalPlantPhys14812951308及びSawadaetalJBiolChem280899906を参照されたい。ベリスペレニス原語:Bellisperennis赤色デージーUGT94B1ポリペプチドをコードするアミノ酸配列をSEQIDNO78に示す。SEQIDNO79は、酵母での発現に向けてコドン至適化されたSEQIDNO78のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。いくつかの実施態様では、組換え微生物は、レバウディオサイドAを産生させるためにステビオール13Oグルコシド又はステビオール19Oグルコシドを含有する培地上で成長させる。このような実施態様では、該微生物は、機能的UGT91D2、機能的UGT74G1及び機能的UGT76G1をコードする遺伝子を含有及び発現し、その一方又は両者がステビオールモノシド又はルブソシドであるステビオールを培地に与えたときにレバウディオサイドAを産生することができる。他の実施態様では、組換え微生物は、レバウディオサイドAを産生させるために、ルブソシドを含有する培地上で成長させる。このような実施態様では、当該の微生物は、機能的UGT91D2及び機能的UGT76G1をコードする遺伝子を含有及び発現し、培養基にルブソシドを与えたときにレバウディオサイドAを産生することができる。他の実施態様では、当該の組換え微生物は、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及び/又はKAH遺伝子など、ステビオールの生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及びKAH遺伝子を、UGT74G1、UGT85C2、UGT91D2遺伝子及びUGT76G1遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドAを産生することができる。いくつかの実施態様では、当該の組換え微生物は更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させ、レバウディオサイドA生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、当該の組換え微生物は更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。B.3ダルコシドA及びレバウディオサイドC生合成ポリペプチドレバウディオサイドC及び/又はダルコシドAの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化及びラムノシル化が関与する。具体的には、ダルコシドAは、ステビオール13Oグルコシドを形成する、ステビオールの13OHのグルコシル化と、12ラムノビオシドを形成する、ステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2’のラムノシル化と、12ラムノビオシドのC19カルボキシルのグルコシル化によって形成することができる。レバウディオサイドCは、ダルコシドAのC13OグルコースのC3’のグルコシル化によって形成することができる。各グリコシル化反応を起こさせる順序は様々であってよい。図2Bを参照されたい。組換えホスト中でのステビオールのダルコシドAへの転化は、以下の機能的なUGT:85C2、91D2、及び74G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見された。このように、これら三つのUGT及びラムノースシンターゼを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えたときにダルコシドAを産生することができる。代替的には、二つのUGT、91D2及び74G1とラムノースシンセターゼを発現する組換え微生物は、モノシドであるステビオール13Oグルコシド又はステビオール19Oグルコシドを培地に加えたときにダルコシドAを産生することができる。同様に、ステビオールのレバウディオサイドCへの組換え微生物中での転化は、ステビオールを与えたときにUGTs85C2、91D2、74G1、及び76G1並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、ステビオール13Oグルコシドを与えたときにはUGTの91D2、74G1及び76G1、並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、ステビオール19Oグルコシドを与えたときにはUGTの85C2、91D2及び76G1、並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、あるいはルブソシドを与えたときにはUGTの91D2及び76G1並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、天然ではこれらを持たない微生物中に導入された組換え遺伝子である。適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1及びUGT85C2ポリペプチドには、ここで論じる機能的UGTポリペプチドがある。ラムノースシンセターゼにより、ステビオール化合物受容側のラムノシル化のためのUDPラムノースドナー量が植える。適したラムノースシンセターゼには、例えばA.サリアナRHM2遺伝子の産物など、アラビオドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthalianaが産生するものがある。いくつかの実施態様では、UGT79B3ポリペプチドをUGT91D2ポリペプチドに置換する。適したUGT79B3ポリペプチドには、invitroでステビオール13Oモノシドをラムノシル化することができる、アラビオドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthalianaが産生するものがある。A.サリアナUGT79B3はグルコシル化化合物をラムノシル化して12ラムノシドを形成することができる。アラビドプシスサリアナ原語:ArabidopsisthalianaUGT79B3のアミノ酸配列をSEQIDNO150に示す。SEQIDNO150のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をSEQIDNO151に示す。いくつかの実施態様では、レバウディオサイドCを、invitro法を用い、適したUDP糖又はUDP糖再生のための無細胞系を提供しながら、生成することができる。例えばJewettMCCalhounKAVoloshinAWuuJJandSwartzJRinMolecularSystemsBiology4article220によるAnintegratedcellfreemetabolicplatformforproteinproductionandsyntheticbiologyを参照されたい。反応は一緒に行われても、段階的に行われてもよい。例えば、レバウディオサイドCは、ルブソシドから、化学量論的量のUDPラムノース及びUGT91d2eを添加した後、UGT76G1及び過剰もしくは化学量論的量のUDPグルコースを添加することで生成できよう。いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を向上させる。他の実施態様では、組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及び/又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及びKAH遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2遺伝子及びUGT76G1遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基中にステビオールを添加する必要なく、レバウディオサイドCを産生することができる。加えて、当該の組換えホストは典型的にはラムノースシンセターゼをコードする内因性又は組換え遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ステビオール化合物受容側のラムノシル化のためのUDPラムノースドナー量を増加させるために有用である。適したラムノースシンセターゼには、A.サリアナRHM2遺伝子の産物など、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthalianaが産生するものがある。当業者であれば、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節したり、UDPラムノースの利用能を調節したりすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子、及びステビオールグリコシド生合成遺伝子の転写調節は、当業で公知の技術を用い、転写活性化及び抑制の組合せによって達成することができる。invitro反応の場合、当業者であれば、様々なレベルのUGT酵素を組み合わせて添加すること、あるいは、様々なUGTSを組み合わせた場合の相対的な活性に影響する条件下で添加することが、所望の比率の各ステビオールグリコシドに向けて合成を指向させることを認識することであろう。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させるため、レバウディオサイドA合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPSを更に含有及び発現する。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、entカウレン酸又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにする又は減少させることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させるための遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスを、ERG9遺伝子の下方調節により減らしてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節すると、entカウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させられよう。カロテノイド産生生物においては、ステビオールへのフラックスは、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させられよう。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、総ステビオールグリコシドの、例えば少なくとも20のレバウディオサイドC,30-40のレバウディオサイドC、40-50のレバウディオサイドC、50-60のレバウディオサイドC、60-70のレバウディオサイドC、70-80のレバウディオサイドC、80-90のレバウディオサイドCなど、少なくとも15を超えるレバウディオサイドCを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば90-99のレバウディオサイドCなど、少なくとも90のレバウディオサイドCを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオールグリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、ステビオールラムノビオシド、レバウディオサイドA、及びダルコシドAなど、図2A及びBに示されたものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホストによって産生されるレバウディオサイドC濃縮組成物を更に精製することができ、こうして精製されたレバウディオサイドC又はダルコシドAを、次に他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合して、所望の香味系又は甘味組成物を得てもよい。例えば、組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドC濃縮組成物を、異なる組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドA、F、又はD濃縮組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドA、F、又はDと、又はinvitroで生成されたレバウディオサイドA、F、又はDと配合することができる。B.4レバウディオサイドE及びレバウディオサイドD生合成ポリペプチドレバウディオサイドE及び/又はレバウディオサイドDの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドEは、ステビオール13Oグルコシドを形成する、ステビオールの13OHのグルコシル化、ステビオール12ビオシドを形成する、ステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2のグルコシル化、12ステビオシドを形成する、12ビオシドのC19カルボキシルのグルコシル化、及び、レバウディオサイドEを形成するために、12ステビオシドの19OグルコースのC2’のグルコシル化によって形成することができる。レバウディオサイドDは、レバウディオサイドEのC13OグルコースのC3’のグルコシル化によって形成することができる。各グルコシル化反応を行う順序は様々であってよい。例えば、19OグルコースのC2’のグルコシル化は経路の最後のステップであってよく、この場合レバウディオサイドAは経路の中間産物である。図2Cを参照されたい。組換えホストにおけるステビオールのレバウディオサイドDへの転化は、以下の機能的UGT:85C2、91D2、74G1及び76G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見されている。このように、これらの4つのUGTを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを添加したときにレバウディオサイドDを産生することができる。代替的には、二つの機能的なUGTである91D2及び76G1を発現する組換え微生物は、ルブソシド又は12ステビオシドを培地に与えたときにレバウディオサイドDを産生することができる。別の代替案として、三つの機能的なUGTである74G1、91D2及び76G1を発現する組換え微生物が、培地にモノシドであるステビオール13Oグルコシドを与えたときにレバウディオサイドDを産生することができる。同様に、ステビオール19OグルコシドのレバウディオサイドDへの組換え微生物中での転化は、ステビオール19Oグルコシドを与えたときに、UGTである85C2、91D2及び76G1をコードする遺伝子の発現により達成することができる。典型的には、これらの遺伝子のうちの一つ以上は、これらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1及びUGT85C2ポリペプチドには、ここで論じた機能的UGTポリペプチドがある。いくつかの実施態様では、UGT79B3ポリペプチドを上に論じたようにUGT91に置換する。いくつかの実施態様では、レバウディオサイドD又はレバウディオサイドEを、適したUDP糖又はUDP糖再生のための無細胞系を提供しつつ、invitro法で生成することができる。例えばJewettMCetalMolecularSystemsBiologyVol4article220を参照されたい。複数の反応を有する転化を一緒に行っても、又は段階的に行ってもよい。レバウディオサイドDは、市販の濃縮済み抽出物であるレバウディオサイドAから生成しても、あるいは、化学量論的又は過剰量のUDPグルコース及びUGT91D2eを添加することで生合成を通じて生成してもよい。いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を向上させる。当業者であれば、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節することにより、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子及びステビオールグリコシド生合成遺伝子の転写調節は、当業者に公知の技術を用いて転写活性化及び抑制の組合せを行うことにより、達成することができる。invitro反応の場合、当業者であれば、異なるレベルのUGTを組み合わせて、又は、様々なUGTSを組み合わせたときの相対的活性に影響を与える条件下で添加すると、各ステビオールグリコシドの所望の比率に向けて合成が指向されることを認識されよう。当業者であれば、13Oグルコシド反応基質レバウディオサイドA及びステビオシドと比較したときに、19Oグルコシド反応に対してより高い活性を有するジグリコシル化酵素を用いれば、より高率のレバウディオサイドD又はEあるいはより効率的なレバウディオサイドD又はEへの転化を得ることができることを認識されよう。他の実施態様では、当該の組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及び/又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及びKAH遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2遺伝子及びUGT76G1遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドE及びDを産生することができる。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させ、ステビオール生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、entカウレン酸又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させる遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスは、ERG9遺伝子の下方調節によって減少させてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節してentカウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させてもよい。カロテノイド産生生物では、ステビオールへのフラックスを、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させてもよい。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、重量で総ステビオールグリコシドの、例えば少なくとも4のレバウディオサイドD、少なくとも5のレバウディオサイドD、10-20のレバウディオサイドD、20-30のレバウディオサイドD、30-40のレバウディオサイドD、40-50のレバウディオサイドD、50-60のレバウディオサイドD、60-70のレバウディオサイドD、70-80のレバウディオサイドDなど、少なくとも3を超えるレバウディオサイドDを有するレバウディオサイドD濃縮ステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば90-99のレバウディオサイドDなど、少なくとも90のレバウディオサイドDを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオールグリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、レバウディオサイドA、レバウディオサイドE及びステビオシドなど、図2Cに示すものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホスト例えば微生物によって産生されるレバウディオサイドD濃縮組成物を更に精製することができ、こうして精製されたレバウディオサイドD又はレバウディオサイドEを次に、他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合して、所望の香味系又は甘味組成物を得ることができる。例えば、組換えホストによって産生されるレバウディオサイドD濃縮組成物を、異なる組換えホストによって産生されたレバウディオサイドA、C、又はF濃縮組成物に、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドA、F、又はCに、又はinvitroで生成されたレバウディオサイドA、F、又はCに配合することができる。B.5レバウディオサイドF生合成ポリペプチドレバウディオサイドFの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化及びキシロシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドFは、ステビオール13Oグルコシドを形成する、ステビオールの13OHのグルコシル化、ステビオール12キシロビオシドを形成する、ステビオール13Oグルコシドの13OグルコースのC2’のキシロシル化、12ステビオキシルオシドを形成するための、12キシロビオシドのC19カルボキシルのグルコシル化、及び、レバウディオサイドFを形成するための、12ステビオキシルオシドのC13OグルコースのC3’のグルコシル化によって形成することができる。各グリコシル化反応を行わせる順序は様々であってよい。図2Dを参照されたい。組換えホストでのステビオールのレバウディオサイドFへの転化は、以下の機能的UGTである85C2、91D2、74G1及び76G1をコードする遺伝子と、内因性もしくは組換えにより発現されたUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼにより達成することができることが発見されている。従って、これらのs4種のUGTを内因性もしくは組換えUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼと一緒に発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えるとレバウディオサイドFを産生することができる。代替的には、二つの機能的なUGTである91D2及び76G1を発現する組換え微生物には、培地にルブソシドを添加した場合にレバウディオサイドFを産生させることができる。別の代替案として、機能的なUGT76G1を発現する組換え微生物は、12ステビオールハムノシドを与えたときにレバウディオサイドFを産生することができる。別の代替案として、三つの機能的UGTである74G1、91D2及び76G1を発現する組換え微生物は、モノシドであるステビオール13Oグルコシドを培地に加えたときにレバウディオサイドFを産生することができる。同様に、組換え微生物におけるステビオール19OグルコシドのレバウディオサイドFへの転化は、whenfedステビオール19Oグルコシドを与えたときに、UGTの85C2、91D2及び76G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、これらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1及びUGT85C2ポリペプチドには、ここで論じる機能的UGTポリペプチドがある。いくつかの実施態様では、UGT79B3ポリペプチドを、上に論じたようにUGT91に置換する。UDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼは、ステビオール化合物受容体側のキシロシル化のためのUDPキシロースドナー量を増加させる。適したUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼには、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana又はクリプトコッカスネオフォルマンス原語:Cryptococcusneoformansが産生するものがある。例えば、適したUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、それぞれA.サリアナUGD1遺伝子及びUXS3遺伝子にコードさせることができる。OkaandJigamiFEBSJ27326452657を参照されたい。いくつかの実施態様では、レバウディオサイドFは、適切なUDP糖、又はUDP糖の再生用の無細胞系を提供しつつinvitro法を用いて生成させることができる。例えばJewettMCetalMolecularSystemsBiologyVol4article220を参照されたい。反応は一緒に行われても、又は段階的に行われてもよい。例えばレバウディオサイドFは、化学量論量のUDPキシロース及びUGT91D2eを添加した後、UGT76G1及び過剰又は化学量論量のUDPグルコースを添加することによってルブソシドから生成されよう。いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を高める。他の実施態様では、当該の組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及び/又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS遺伝子、KS遺伝子、KO遺伝子及びKAH遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2遺伝子及びUGT76G1遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドFを産生することができる。加えて、当該の組換えホストは典型的には、UDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする内因性又は組換え遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ステビオール化合物受容側のキシロシル化のために提供されるUDPキシロースドナー量を増加させるために有用である。適したUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼには、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana又はクリプトコッカスネオフォルマンス原語:Cryptococcusneoformansが産生するものがある。例えば、適したUDPグルコースデヒドロゲナーゼ及びUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを、それぞれA.サリアナUGD1遺伝子及びUXS3遺伝子にコードさせることができる。OkaandJigamiFEBSJ27326452657を参照されたい。当業者であれば、、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節したり、UDPキシロースの利用能を調節したりすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子の転写調節は、当業で公知の技術を用い、転写活性化及び抑制の組合せによって達成することができる。invitro反応の場合、当業者であれば、様々なレベルのUGT酵素を組み合わせて添加すること、あるいは、様々なUGTSを組み合わせた場合の相対的な活性に影響する条件下で添加することが、所望の比率の各ステビオールグリコシドに向けて合成を指向させることを認識することであろう。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させるため、ステビオール生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、該組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、entカウレン酸又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させるための遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスを、ERG9遺伝子の下方調節により減らしてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節すると、entカウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させられよう。カロテノイド産生生物においては、ステビオールへのフラックスは、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させられよう。いくつかの実施態様では、該組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP経路の遺伝子など、ジテルペン生合成に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば少なくとも5のレバウディオサイドF、少なくとも6のレバウディオサイドF、1020のレバウディオサイドF、2030のレバウディオサイドF、3040のレバウディオサイドF、4050のレバウディオサイドF、5060のレバウディオサイドF、6070のレバウディオサイドF、7080のレバウディオサイドFなど、重量で総ステビオールグリコシドの少なくとも4を超えるレバウディオサイドFを有するレバウディオサイドF濃縮ステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば90-99のレバウディオサイドFなど、少なくとも90のレバウディオサイドFを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオールグリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、ステビオールキシロビオシド、レバウディオサイドA、ステビオキシロシド、ルブソシド及びステビオシドなど、図2A及びDに示すものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホストによって産生される該レバウディオサイドF濃縮組成物を、他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合することで所望に香味系又は甘味組成物を得ることができる。例えば、組換えホストによって産生されるレバウディオサイドF濃縮組成物を、異なる組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドA、C、又はD濃縮組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドA、C、又はDと、又はinvitroで生成されたレバウディオサイドA、C、又はDと配合することができる。C.他のポリペプチドその発現が、ステビオール又はステビオールグリコシドのより効率的な又は大規模な生成を容易にする更なるポリペプチドの遺伝子も組換えホストに導入することができる。例えば、組換え微生物、植物、又は植物細胞に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼGGPPS、GGDPSとも言及されるをコードする一つ以上の遺伝子を含有させることができる。別の例として、該組換えホストはラムノースシンセターゼをコードする一つ以上の遺伝子、又は、UDPグルコースデヒドロゲナーゼ及び/又はUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする一つ以上の遺伝子を含有することができる。別の例として、組換えホストは更に、チトクロームP450レダクターゼをコードする一つ以上の遺伝子を含有することもできる。組換えCPRを発現させると、NADPHを再生するNADPの循環を促すが、このNADPHはテルペノイド生合成のためのコファクターとして用いられる。他の方法を用いてNADHPレベルを再生することもできる。NADPHに制限ができる状況では、株を更に改変して、外因性のトランスデヒドロゲナーゼ遺伝子を含めることができる。例えばSaueretalJBiolChem2796613-6619を参照されたい。所望のコファクターレベルが増加するようにNADHNADPHの比を減少させる又は改変するための他の方法が当業者に公知である。別の例として、該組換えホストは、MEP経路又はメバロネート経路中の一つ以上の酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有することができる。このような遺伝子は、ジテルペン生合成経路への炭素のフラックスを増やすことができ、こうして該経路で生成されたイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリルジホスフェートからゲラニルゲラニルジホスフェートを産生することができるため、有用である。こうして産生されたゲラニルゲラニルジホスフェートを、ステビオール及びステビオールグリコシドの生合成へ向けて、ステビオール生合成ポリペプチド及びステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの発現のおかげで指向させることができる。C.1MEP生合成ポリペプチドいくつかの実施態様では、組換えホストは、イソプレノイド生合成のためのメチルエリスリトール4ホスフェート経路に関与する酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有する。MEP経路の酵素には、デオキシキシルロース5ホスフェートシンターゼ、D1デオキシキシルロース5ホスフェートレダクトイソメラーゼ、4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールシンターゼ、4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトールキナーゼ、4ジホスホシチジル2CメチルDエリスリトール24シクロジホスフェートシンターゼ、1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートシンターゼ及び1ヒドロキシ2メチル2ブテニル4ジホスフェートレダクターゼがある。一つ以上のDXS遺伝子、DXR遺伝子、CMS遺伝子、CMK遺伝子、MCS遺伝子、HDS遺伝子、及び/又はHDR遺伝子を組換え微生物に導入することができる。Rodriguez-ConcepcionandBoronatPlantPhys13010791089を参照されたい。DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDS及び/又はHDRポリペプチドをコードする適した遺伝子には、E.コリ原語:Ecoli、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana及びシネココッカスレオポリエンシス原語:Synechococcusleopoliensisが産生するものがある。DXRポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば米国特許第7335815号に解説されている。C.2メバロネート生合成ポリペプチドsいくつかの実施態様では、組換えホストは、イソプレノイド生合成のためのメバロネート経路に関与する酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有する。ホスト内に導入するのに適した遺伝子は、切断型3ヒドロキシ3メチルグルタリルCoAレダクターゼなど、メバロネート経路中の酵素をコードする、及び/又はメバロネートキナーゼをコードする遺伝子、及び/又はホスホメバロネートキナーゼをコードする遺伝子、及び/又はメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子などである。このように、一つ以上のHMGCoAレダクターゼ遺伝子、MK遺伝子、PMK遺伝子、及び/又はMPPD遺伝子を、微生物などの組換えホストに導入することができる。メバロネート経路ポリペプチドをコードする適した遺伝子が公知である。例えば、適したポリペプチドには、E.コリ原語:Ecoli、パラコッカスデニトリフィカンス原語:Paracoccusdenitrificans、サッカロミセスセレビジエ原語:Saccharomycescerevisiae、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana、キタサトスポラグリセオーラ原語:Kitasatosporagriseola、ホモサピエンス原語:Homosapiens、ドゥロソフィラメラノガスター原語:Drosophilamelanogaster、ガルスガルス原語:Gallusgallus、ストレプトミセス種、KO3988、ニコチアナアテヌアータ原語:Nicotianaattenuata、キタサトスポラグリセオーラ原語:Kitasatosporagriseola、ヘヴェアブラジリエンシス原語:Heveabrasiliensis、エンテロコッカスファーシウム原語:Enterococcusfaecium及びハエモトコッカスプルヴィアリス原語:Haematococcuspluvialisが産生するものがある。例えば米国特許第7183089号、第5460949号、及び第5306862号を参照されたい。D.機能的ホモログ上述したポリペプチドの機能的ホモログは、ステビオール又はステビオールグリコシドを組換えホストで産生させる使用にも適している。機能的ホモログとは、基準ポリペプチドに対して配列類似性を有すると共に、基準ポリペプチドの生化学的もしくは生理的機能のうちの一つ以上を持つポリペプチドである。機能的ホモログ及び基準ポリペプチドは天然発生型のポリペプチドであってよく、当該の配列類似性は収束又は発散進化事象を原因としてよい。従って、機能的ホモログは時には文献中ではホモログ又はオーソログ、又はパラログとして指名される。野生型コーディング配列の変異体にコードされたポリペプチドなど、天然発生型の機能的ホモログのバリアントはそれら自体、機能的なホモログである場合がある。機能的ホモログはまた、あるポリペプチドのコーディング配列の部位指定変異誘発法によって作ることも、又は、異なる天然発生型ポリペプチドのコーディング配列を由来とするドメインを組み合わせるドメインスワッピングことで作ることもできる。ここに解説する機能的UGTポリペプチドをコードする遺伝子を改変する技術は公知であり、その中には、とりわけ、指定進化技術、部位指定変異誘発技術及びランダム変異誘発技術があり、所望の態様でポリペプチドの特異性を増すため、基質特異性を変えるため、発現レベルを変えるため、細胞レベル化位置を変えるため、又はポリペプチド:ポリペプチド相互作用を修飾するために有用であろう。このような改変されたポリペプチドは機能的なホモログと見なされる。機能的ホモログという用語は、時には、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。機能的なホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチドの配列アライメントの解析によって同定することができる。例えばヌクレオチド又はポリペプチドのデータベースに対してクエリを行うと、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列解析には、GGPPS、CDPS、KS、KO又はKAHアミノ酸配列を基準配列として用いた非重複データベースのBLAST、レシプロカルBLAST、又はPSIBLAST解析を含めることができる。場合によってはアミノ酸配列が該ヌクレオチオ配列から演繹される。データベース中で、40を超える配列同一性を有するポリペプチドは、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適性について更なる評価を行う候補である。アミノ酸類似性は、例えば疎水性残基一つの別のものへの置換や、あるいは、一つの極性の残基の別のものへの置換など、保存的アミノ酸置換を許容する。必要であれば、更なる評価に向けた候補数を狭めるために、このような候補の手による検査を行うことができる。手による検査は、例えば保存された機能的ドメインなど、ステビオール生合成ポリペプチド中に存在するドメインを有するように見える候補を選抜することにより、行うことができる。保存領域は、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内で、反復された配列であるか、何らかの二次構造例えばらせん及びベータシートを形成しているか、正又は負に帯電したドメインを確立しているか、あるいはタンパク質モチーフ又はドメインを表しているような領域を位置特定することにより、同定することができる。例えばワールドワイドウェブ上で多種のタンパク質モチーフ及びドメインについてコンセンサス配列を述べたPfamウェブサイトをsangeracukSoftwarePfamandpfamjaneliaorgで参照されたい。Pfamデータベースに含まれた情報は、SonnhammeretalNuclAcidsRes26320322SonnhammeretalProteins28405420及びBatemanetalNuclAcidsRes27260262に解説されている。保存領域は更に、環系の近い主を由来とする同じ又は関連するポリペプチドの配列をアライメントすることでも決定することができる。関係の近い種とは好ましくは、同じファミリーを起源とするとよい。いくつかの実施態様では、二つの異なる種を由来とする配列のアライメントが充分である。典型的には、少なくとも約40のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存領域を同定するためには有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも45のアミノ酸配列同一性例えば少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、又は少なくとも90のアミノ酸配列同一性を示す。いくつかの実施態様では、保存領域は少なくとも92、94、96、98、又は99のアミノ酸配列同一性を示す。例えば、組換えホストでステビオールグリコシドを産生させるのに適したポリペプチドには、UGT91D2e、UGT91D2m、UGT85C、及びUGT76Gに機能的ホモログがある。このようなホモログは、UGT91D2e、UGT91D2m、UGT85C、又はUGT76Gのアミノ酸配列に対して90を超える例えば95又は99配列同一性を有する。UGT91D2、UGT85C、及びUGT76Gポリペプチドのバリアントは、典型的には、例えば7か所以下のアミノ酸置換、5か所の又は保存的なアミノ酸置換、又は1乃至5か所の置換など、10か所以下のアミノ酸置換を一次アミノ酸配列内に有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、UGT91D2、UGT85C、及びUGT76Gポリペプチドのバリアントは、10か所以上のアミノ酸置換例えば10、15、20、25、30、35、10-20、10-35、20-30、又は25-35か所のアミノ酸置換などを有することができる。該置換は保存的であってよく、あるいはいくつかの実施態様では、非保存的置換であってもよい。UGT91D2eポリペプチドの非保存的変更の非限定的な例には、グリシンのアルギニンへの変更、及びトリプトファンのアルギニンへの変更がある。UGT76Gポリペプチドの非保存的置換の非限定的な例には、バリンのグルタミン酸への置換、グリシンのグルタミン酸への置換、グルタミンのアラニンへの置換、及びセリンのプロリンへの置換がある。UGT85Cポリペプチドへの変更の非限定的な例には、ヒスチジンのアスパラギン酸への変更、プロリンのセリンへの変更、リジンのスレオニンへの変更、及びスレオニンのアルギニンへの変更がある。いくつかの実施態様では、有用なUGT91D2ホモログは、ポリペプチドのうちで予測されるループの外側にある領域にアミノ酸置換例えば保存的アミノ酸置換を有することができ、例えば残基2026、3943、8895、121124、142158、185198、及び203214はSEQIDNO5のN末端ドメイン中の予測されるループであり、そして残基381386はC末端ドメイン中の予測されるループである。例えば有用なUGT91D2ホモログは、gcaninclude少なくとも一箇所のアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基119、2738、4487、96120、125141、159184、199202、215380、又は387473に含むことができる。いくつかの実施態様では、UGT91D2ホモログはアミノ酸置換をSEQIDNO5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に有することができる。例えば、UGT91D2機能的ホモログはアミノ酸置換を、SEQIDNO5の、例えば残基206のアルギニン、残基207のシステイン、及び残基343のアルギニンなど、残基206、207、及び343のうちの一つ以上に有することができる。SEQIDNO95を参照されたい。UGT91D2の他の機能的なホモログは、SEQIDNO5の以下:残基30のチロシン又はフェニルアラニン、残基93のプロリン又はグルタミン、残基99のセリン又はバリン、残基122のチロシン又はフェニルアラニン、残基140のヒスチジン又はチロシン、残基142のセリン又はシステイン、残基148のアラニン又はスレオニン、残基152のメチオニン、残基153のアラニン、残基156のアラニン又はセリン、残基162のグリシン、残基195のロイシン又はメチオニン、残基162のグルタミン酸、残基199のリジン又はグルタミン酸、残基211のロイシン又はメチオニン、残基213のロイシン、残基221のセリン又はフェニルアラニン、残基253のバリン又はイソロイシン、残基286のバリン又はアラニン、残基427のリジン又はアスパラギン、残基438のアラニン、残基462のアラニン又はスレオニンのいずれかのうちの一つ以上を有することができる。実施例11及び16、並びに表12及び14を参照されたい。有用なバリアントUGT91D2ポリペプチドは、図8に示す通りのアライメントに基づいて構築することもできる。いくつかの実施態様では、有用なUGT85Cホモログは、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQIDNO3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に有することができる。有用なUGT85Cホモログの非限定的な例には、残基65に;残基15、270、418、440、又は441と組み合わせて残基65に;残基13、15、60、270、289、及び418に;残基13、60、及び270の置換;残基60及び87の置換;残基65、71、220、243、及び270の置換;残基65、71、220、243、270、及び441の置換;残基65、71、220、389、及び394の置換;残基65、71、270、及び289の置換;残基220、243、270、及び334の置換;又は残基270及び289の置換SEQIDNO3に対してを有するポリペプチドがある。実施例17及び表5を参照されたい。いくつかの実施態様では、有用なUGT76Gホモログは、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQIDNO7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有することができる。有用なUGT76Gホモログの非限定的な例には、SEQIDNO7に対して残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び291に;残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び291に;又は残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に、置換を有するポリペプチドがある。実施例18及び表16を参照されたい。UGT91D2eなどの基質特異性を改変するための方法は当業者には公知であり、その中には、限定はしないが、部位指定/合理的変異誘発法、ランダム指定進化法、及びランダム変異誘発法/飽和技術を酵素の活性部位近傍で行う組合せ法がある。例えばSarahAOsmanietalPhytochemistry70325-347を参照されたい。候補配列は典型的には、例えば基準配列の長さの、82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、又は200パーセントなど、基準配列の長さの80パーセント乃至200パーセントである長さを有するものである。基準核酸又はポリペプチドの対するいずれかの候補核酸又はポリペプチドのパーセント同一性は以下の通りにして判断することができる。基準配列例えば核酸又はアミノ酸配列を一つ以上の候補配列に、核酸又はポリペプチド配列のアライメントをそれらの全長にわたってアライメントするグローバルアライメントことができるようにするコンピュータプログラムClustalWバージョン183、デフォルトパラメータを用いてアライメントする。ChennaetalNucleicAcidsRes313497500。ClustalWは、基準配列と一つ以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、同一性、類似性、及び違いが判断できるように、それらをアライメントする。一つ以上の残基のギャップを、基準配列、候補配列、又は両者に挿入することで配列アライメントを最大にすることができる。核酸配列のペアワイズアライメントを高速で行うためには、以下のデフォルトパラメータを用いる:ワードサイズ:2;ウィンドウサイズ:4採点方法:パーセンテージ;トップダイアゴナル数:4;及びギャップペナルティ:5。拡散配列の多重アライメントには以下のパラメータを用いる:ギャップオープニングペナルティ:100;ギャップエクステンションペナルティ:50;及びウェイト遷移:イェス。タンパク質配列を高速でペアワイズアライメントするには以下のパラメータを用いる:ワードサイズ:1;ウィンドウサイズ:5;採点方法:パーセンテージ;トップダイアゴナル数:5;ギャップペナルティ:3。タンパク質配列の多重アライメントには以下のパラメータを用いる:ウェイトマトリックス:blosum;ギャップオープニングペナルティ:100;ギャップエクステンションペナルティ:005;疎水性ギャップ:on;親水性残基Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、及びLys;残基特異的ギャップペナルティ:on。ClustalWアウトプットは配列間の関係を反映する配列アライメントである。ClustalWはワールドワイドウェブ上の例えばベイラーカレッジオブメディスンサーチローンチャーサイト及びワールドワイドウェブ上のヨーロピアンバイオインフォーマティックスインスティテュートサイト上で作動させることができる。候補核酸又はアミノ酸配列の基準配列に対するパーセント同一性を判定するには、配列をClustalWを用いてアライメントし、アライメント中の同一なマッチ数を基準配列の長さで除算し、その結果に100を乗算する。パーセント同一性の数値は10分の1で四捨五入することができることは留意されたい。例えば、7811、7812、7813、及び7814は781に切り下げることができるが、7815、7816、7817、7818、及び7819は782に切り上げられる。機能的UGT91D2ポリペプチドには、UGT91D2により行われるグルコシル化又は他の酵素活性に関与しない付加的なアミノ酸を含めることができ、このようなポリペプチドは、本来よりも長く成り得ることは理解されよう。例えば、UGT91D2ポリペプチドには、アミノ又はカルボキシ末端に加えられた精製タグ、葉緑体通過ペプチド、ミトコンドリア通過ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、又は分泌タグを含めることができる。いくつかの実施態様では、UGT91D2ポリペプチドには、例えば緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質など、レポーターとして機能するアミノ酸配列が含まれる。II.ステビオール及びステビオールグリコシド生合成核酸ここで解説するポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、当該ポリペプチドのコーディング配列を、このポリペプチドを発現させるのに適した一つ以上の調節領域に、センス方向で作動可能に連結させて含む。数多くの微生物が、ポリシストロンmRNA由来の複数の遺伝子産物を発現することができるため、複数のポリペプチドを、必要であればそれらの微生物の単一の調節領域の制御下で発現させることができる。当該配列の転写又は翻訳の調節にとって調節領域が有効であるような位置に調節領域及びコーディング配列があるときに、コーディング配列及び調節領域は作動可能に連結しているとみなされる。典型的には、モノシストロン遺伝子の場合、コーディング配列の翻訳読み取り枠の翻訳開始部位は、調節領域の1ヌクレオチド下流と約50ヌクレオチド下流との間に位置する。多くの場合、ここで解説するポリペプチドのコーディング配列は、組換えホスト以外の種で特定され、即ち異種の核酸である。このように、当該の組換えホストが微生物である場合、コーディング配列は、他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来又は動物由来であってよい。しかしながら、場合によっては、コーディング配列はホストにとって生来的な配列であり、その生物に再導入されるものである。生来的な配列はしばしば、例えば組換え核酸コンストラクト中で生来的な配列をフランクする非天然の調節配列など、外因性の核酸に連結された非天然配列の存在によって、天然発生型の配列から区別することができる。加えて、安定に形質転換した外因性の核酸は、典型的には、生来的な配列が見られる位置以外の位置に組み込まれる。調節領域とは、転写もしくは翻訳開始及び速度、並びに転写又は翻訳産物の安定性及び/又は移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を言う。調節領域には、限定はしないが、プロモータ配列、エンハンサ配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、5 ́及び3 ́非翻訳領域、転写開始部位、終了配列、ポリアデニル化配列、イントロン、及びこれらの組合せがある。調節配列は典型的には、少なくともコア基礎プロモータを含む。調節領域には更に、少なくとも一つの制御エレメント、例えばエンハンサ配列、上流エレメント又は上流活性化領域UARが含まれよう。調節領域は、当該配列の転写又は翻訳を調節するために調節領域が有効であるように調節領域及びコーディング配列を配置することにより、コーディング配列に作動可能に連結される。例えば、コーディング配列及びプロモータ配列を作動可能に連結するためには、コーディング配列の翻訳読み取り枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモータの1ヌクレオチド下流と約50ヌクレオチド下流との間に配置される。しかしながら、調節領域は、翻訳開始部位の約5000ヌクレオチド上流か、又は、翻訳開始部位の約2000ヌクレオチド上流に配置することができる。含めようとする調節領域の選択は、限定はしないが、特定の培養段階の間の効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、及び優先的な発現を含め、複数の因子に依る。当業者にとっては、コーディング配列に対して調節領域を適宜、選択及び配置することにより、コーディング配列の発現を調節することは慣例的な問題である。例えばイントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写終了因子、及び誘導性エレメントなど、二つ以上の調節領域が存在してもよいことは理解されよう。一つ以上の遺伝子を、別個の局面でステビオール及び/又はステビオールグリコシドを生成させるために有用なモジュールにして、組換え核酸コンストラクトで組み合わせることができる。複数の遺伝子をモジュール、特にポリシストロンモジュールにして組み合わせると、多様な種で該モジュールを使用することが容易になる。適した調節領域の挿入後にモジュールを幅広い種に導入することができるように、例えばステビオール生合成遺伝子クラスター又はUGT遺伝子クラスターをポリシストロンモジュールに組み合わせることができる。別の例として、各UGTコーディング配列が別々の調節領域に作動可能に連結してUGTモジュールを形成するように、UGT遺伝子クラスターを組み合わせることができる。このようなモジュールは、モノシストロン性の発現が必要であるか、又は好ましいような種で用いることができる。ステビオール又はステビオールグリコシド生成に有用な遺伝子に加え、組換えコンストラクトは典型的には複製開始点と、コンストラクトを適した種内で維持するための一つ以上の選択マーカーを含有する。遺伝子コードの縮重のために、数多くの核酸が、特定のポリペプチドを、即ち数多くのアミノ酸を、コードすることができ、当該アミノ酸のコドンとして役立つ二種以上のヌクレオチドトリプレットがあることは理解されよう。従って、特定のホストで最適な発現が得られるように、あるポリペプチドのコーディング配列中のコドンをそのホスト例えば微生物にとって最適なコドンバイアス表を用いて改変することができる。SEQIDNO1825、3436、4043、4849、5255、6064、及び7072は、酵母での発現が増加するように改変された、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成のための特定の酵素をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。単離された核酸として、これらの改変された配列は精製済みの分子として存在することができ、そして組換え核酸コンストラクト用のモジュールを構築する際の使用に向けてベクタ又はウィルス中に導入することができる。場合によっては、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成に向けて代謝中間産物を転用するために、内因性ポリペプチドの一つ以上の機能を阻害することが好ましい。例えば、スクアレンエポキシダーゼを下方調節するなどによりステビオール又はステビオールグリコシド生成を更に増加させるために、酵母でのステロール合成を下方調節することが好ましいことがある。別の例として、例えば二次代謝産物からグルコース部分を取り除くグリコヒドロラーゼなど、特定の内因性の遺伝子産物の分解機能を阻害することが好ましい場合もある。別の例として、グリコシル化ステビオシドの分泌が阻害されるように、ステビオールグリコシドの輸送に関与する膜トランスポーターの発現を阻害することができる。このような調節は、微生物の培養中の所望の期間、ステビオールグリコシドの分泌を阻害することでグリコシド生成物収穫時の収率を上げることができるという点で、有益であろう。このような場合、ポリペプチド又は遺伝子産物の発現を阻害する核酸を、株に導入する組換えコンストラクトに含めてもよい。代替的には、変異誘発法を用いて、その機能を阻害したい遺伝子の変異体を作ることができる。III.ホストA.微生物例えばグラム陰性細菌、酵母及び真菌など、数多くの原核生物及び真核生物が、ここで解説する組換え微生物を構築する際の使用に適している。ステビオール又はステビオールグリコシド産生株としての使用に選抜された種及び株をまず分析して、どの生成遺伝子がその株にとって内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを判断する。内因性の相対物が当該株中に存在しない遺伝子を一つ以上の組換えコンストラクトで集合させた後、欠失している機能を提供するために、該コンストラクトを株に導入する。原核生物及び真核生物種の例を下に更に詳述する。しかしながら、他の種も適するであろうことは理解されよう。例えば、適した種はアガリクス原語:Agaricus、アスペルギルス原語:Aspergillus、バシルス原語:Bacillus、カンジダ原語:Candida、コリネバクテリウム原語:Corynebacterium、エシェリヒア原語:Escherichia、フサリウム/ジベレラ原語:FusariumGibberella、クルイヴェロミセス原語:Kluyveromyces、レーティポルス原語:Laetiporus、レンティヌス原語:Lentinus、ファッフィア原語:Phaffia、ファネロカエテ原語:Phanerochaete、ピチア原語:Pichia、フィスコミトレラ原語:Physcomitrella、ロードツルラ原語:Rhodoturula、サッカロミセス原語:Saccharomyces、スキゾサッカロミセス原語:Schizosaccharomyces、スファセロマ原語:Sphaceloma、キサントフィロミセス原語:Xanthophyllomyces及びヤロウィア原語:Yarrowiaから選択される属であろう。このような属からの種の例には、レンチヌスチグリヌス原語:Lentinustigrinus、レーティポルススルフレウス原語:Laetiporussulphureus、ファネロカエテクリソスポリウム原語:Phanerochaetechrysosporium、ピチアパストリス原語:Pichiapastoris、フィスコミトレラパテンス原語:Physcomitrellapatens、ロードツルラグルティニス32原語:Rhodoturulaglutinis32、ロードツルラムチラギノサ原語:Rhodoturulamucilaginosa、ファフィアロードジマUBVAX原語;PhaffiarhodozymaUBVAX、キサントフィロミセスデンドローホウス原語:Xanthophyllomycesdendrorhous、フサリウムフジクロイ/ジベレラフジクロイ原語:FusariumfujikuroiGibberellafujikuroi、カンジダユティリス原語:Candidautilis及びヤロウィアリポリティカ原語:Yarrowialipolyticaから成る群より選択される属の中にあるであろう。いくつかの実施態様では、微生物はジベレラフジクロイ、クルイベロミセスラクティス原語:Kluyveromyceslactis、スキゾサッカロミセスポンベ原語:Schizosaccharomycespombe、アスペルギルスニゲール原語:Aspergillusniger、又はサッカロミセスセレビジエ原語:Saccharomycescerevisiaeなどのアスコミセートであってよい。いくつかの実施態様では、微生物はエシェリヒアコリ原語:Escherichiacoli、ロードバクタースファロイデス原語:Rhodobactersphaeroides、又はロードバクターカプスラトゥス原語:Rhodobactercapsulatusなどの原核生物であってよい。特定の微生物を用いると目的の遺伝子を高スループットでスクリーニング及び検査することができ、他方、所望の生産性又は成長上の特徴を持つ他の微生物をステビオールグリコシドの大規模生産に用いることができることは理解されよう。サッカロミセスセレビジエサッカロミセスセレビジエは、合成生物学で幅広く用いられているシャシー生物であり、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。S.セレビジエについて利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、及び他の情報があるため、生成物の収率を高めるために多様なモジュールの合理的にデザインすることができる。組換え微生物を作製する方法は公知である。ステビオール生合成遺伝子クラスターは、数多くの公知のプロモータのいずれかを用いて酵母で発現させることができる。テルペンを過剰産生する株が公知であり、ステビオール及びステビオールグリコシド生成で利用できるゲラニルゲラニルジホスフェートの量を増すために用いることができる。アスペルギルス種A.オリゼー原語:Aoryzae、A.ニジェール原語:Aniger及びA.ソジェー原語:Asojaeなどのアスペルギルス種は食品生産において幅広く用いられている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。ヌクレオチド配列はA.ニドゥランス原語:Anidulans、A.フミガトゥス原語:Afumigatus、A.オリザ原語:Aoryzae、A.クラバトゥス原語:Aclavatus、A.フラヴス原語:Aflavus、A.ニジェール原語:Aniger及びA.テレウス原語:Aterreusのゲノムについて入手可能であり、フラックスを高め、生成物の収率を増加させるべく内因性経路の合理的なデザイン及び改変が可能である。アスペルギルスについては代謝モデルや、転写研究及びプロテオミクス研究が進んでいる。A.ニジェールは、クエン酸及びグルコン酸などの数多くの食物成分の工業生産に向けて培養されており、従ってA.ニジェールなどの種は、ステビオール及びステビオールグリコシドなどの食物成分の生産にとって概して適している。実施例23は、アスペルギルスニドゥランスでのステビオールグリコシドの産生に関するクローニング法を解説している。エシェリヒアコリ合成生物学で幅広く用いられているもう一つのプラットフォーム生物であるエシェリヒアコリも、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。サッカロミセスと同様に、E.コリでも利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝についての詳細なコンピュータモデル及び他の情報があるため、生成物収率を高めるために多様なモジュールを合理的にデザインすることができる。サッカロミセスについて上述したものと同様な方法を用いて、組換えE.コリ微生物を作ることができる。アガリクス、ジベレラ、及びファネロケーテ種アガリクス、ジベレラ、及びファネロケーテ種は、培養で大量のジベレリンを産生することが知られているため、有用である。従って、大量のステビオール及びステビオールグリコシドを産生させるためのテルペン前駆体は、内因性遺伝子によって既に産生されている。このように、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組換え遺伝子を含有するモジュールを、このような属の種に、メバロネート又はMEP経路遺伝子を導入する必要なく、導入することができる。ロードバクター種ロードバクターを、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。E.コリと同様に、利用可能な変異体ライブラリーや適したプラスミドベクターがあるため、生成物の収率を高めるべく多様なモジュールを合理的にデザインすることができる。イソプレノイド経路は、カロテノイド及びCoQ10の産生増加のために、膜性細菌種のロードバクターに操作により導入されてきた。米国特許公報第20050003474号及び第20040078846号を参照されたい。E.コリについて解説したのと同様な方法を用いて組換えロードバクター微生物を作ることができる。フィスコミトレラ種フィスコミトレラコケは、懸濁培養で成長させたときに酵母又は他の真菌培養株に似た特徴を有する。この属は、他の細胞種では産生させるのが難しい植物二次代謝産物の産生のために重要な細胞種になりつつある。実施例22は、P.パテンス原語:Ppatensでの、ステビオールグリコシド経路中の活性UGT酵素の産生を解説する。A.植物細胞又は植物いくつかの実施態様では、ここで解説する核酸及びポリペプチドを、全体的ステビオールグリコシド産生を増加させる、あるいは、他のものに対して特定のステビオールグリコシドの産生の比率を濃縮するために、植物又は植物細胞に導入する。従って、ホストは、ここで解説した少なくとも一つの組換え遺伝子を含む植物又は植物細胞であってよい。植物又は植物細胞は、そのゲノムに組換え遺伝子を組み込ませることにより形質転換させることができ、即ち安定に形質転換させることができる。安定に形質転換した細胞は典型的には、導入された核酸を各細胞分裂で保持する。植物又は植物細胞はまた、組換え遺伝子がそのゲノムに組み込まれないように、一過性に形質転換させることもできる。一過性で形質転換した細胞は典型的には、導入された核酸の全部又は一部を各細胞分裂で失うため、導入された核酸は、充分な回数の細胞分裂後には娘細胞では検出され得ない。一過性で形質転換したトランスジェニック植物及び植物細胞と、安定に形質転換したトランスジェニック植物及び植物細胞は両者とも、ここで解説する方法において有用であろう。ここで解説する方法で用いられたトランスジェニック植物細胞は、植物全体の一部を成すものでも、又は全部を成すものでもよい。このような植物は、考慮された成長チャンバー、温室、又はフィールドのいずれかで、種にとって適した態様で成長させることができる。トランスジェニック植物は、例えば組換え核酸を他の株に導入する、組換え核酸を他の種に移す、又は他の望ましい形質を更に選択するためなど、特定の目的に好ましい通りに育種することができる。代替的には、トランスジェニック植物は、このような技術になじむ種のために栄養的に繁殖させることができる。ここで用いられる場合のトランスジェニック植物とは更に、後代が導入遺伝子を受け継ぐことを条件に、ある最初のトランスジェニック植物の後代を言う。トランスジェニック植物が産生した種子を成長させた後、自家受粉又は外部交雑自家受粉させると、核酸コンストラクトについてホモ接合型の種子を得ることができる。トランスジェニック植物は懸濁培養、又は組織もしくは器官培養で成長させることができる。本発明の目的のためには、固体及び/又は液体組織培養技術を用いることができる。固体の媒質を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を媒質中に直接配置するか、又は、フィルタ上に配置してから、媒質と接触するように配置することもできる。液体の媒質を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を、例えば液体の媒質と接触する多孔質のメンブレンなど、浮上させるデバイス上に配置することができる。一過性形質転換植物細胞を用いる場合、レポータ活性を有するレポータポリペプチドをコードするレポータ配列を形質転換手法に含め、レポータ活性又は発現に関する検定を、形質転換後の適した時点で行うことができる。検定を行うのに適した時間は、典型的には、例えば約1乃至14日後、約1乃至7日後、又は約1乃至3日後など、形質転換から約1乃至21日後である。一過性検定の使用は、様々な種において高速分析を行ったり、あるいはその発現が特定のレシピエント細胞で前もって確認されているような異種ポリペプチドの発現を確認したりするためには特に便利である。核酸を単子葉及び双子葉植物に導入する技術が当業で公知であり、その中には、限定はしないが、アグロバクテリウム媒介性形質転換、ウィルスベクター媒介性形質転換、エレクトロポレーション、及び、粒子ガン形質転換法、米国特許第5538880号;第5204253号;第6329571号;及び第6013863号がある。細胞又は培養組織を形質転換用のレシピエント組織として用いる場合、必要であれば、当業者に公知の技術により、形質転換後の培養株から植物を再生させることができる。一集団のトランスジェニック植物を、導入遺伝子の発現によってもたらされた形質又は表現型を有する集団のメンバーを求めて、スクリーニング及び/又は選抜することができる。例えば、単一の形質転換事象の後代集団を、所望の発現レベルのステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチド又は核酸を有する植物を求めてスクリーニングすることができる。物理的及び生化学的方法を用いて発現レベルを明らかにすることができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出用の関するサザン解析又はPCR増幅法;RNA転写産物を検出するためのノーザンブロット、S1RNase保護、プライマー伸長法、又はRTPCR増幅;ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素検定;及びペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、及び酵素結合免疫検定法がある。インシツーハイブリダイゼーション、酵素染色法、及び免疫染色法などの他の技術も、ポリペプチド及び/又は核酸の存在又は発現を検出するために用いることができる。参照した技術の全てを行う方法は公知である。代替法としては、独立した形質転換事象を含む植物集団を、ステビオールグリコシドの産生、又はステビオールグリコシドの修飾された生合成など、所望の形質を有する植物を求めて、スクリーニングすることができる。選抜及び/又はスクリーニングは、一世代以上にわたって、及び/又は二か所以上の地理的位置にわたって行うことができる。場合によっては、トランスジェニック植物を、トランスジェニック植物で所望の表現型を誘導する条件下、あるいは、所望の表現型を生じさせるのに必要な条件下で、成長させ、選抜することができる。加えて、選抜及び/又はスクリーニングは、当該植物によって当該表現型が呈されると予測される特定の発生段階で応用することができる。選抜及び/又はスクリーニングを行って、導入遺伝子のないコントロール植物に比べてステビオールグリコシドレベルに統計上有意な違いを有するトランスジェニック植物を選抜することができる。ここで解説する核酸、組換え遺伝子、及びコンストラクトを用いて、数多くの単子葉及び双子葉植物及び植物細胞系を形質転換させることができる。適した単子葉植物の非限定的な例には、例えば、米、ライ麦、モロコシ類、アワの類、小麦、トウモロコシ、及びオオムギなどの禾穀類がある。植物はアスパラガス、バナナ、又は玉ねぎなど、穀類以外の単子葉植物でもよい。また当該植物は、ステビアステビアレバウディアナ原語:Steviarebaudiana、大豆、綿、ひまわり、マメ、ゼラニウム、ホウレンソウ、又はタバコなどの双子葉類でもよい。場合によっては、当該植物は、細胞質及びミトコンドリア内に典型的に見られる、メバロネート経路などのフェニルホスフェート産生のための前駆体経路を含有してもよい。非メバロネート経路は植物色素体ではより頻繁に見られるDubeyetal2003JBiosci28637-646。当業者であれば、ステビオールグリコシド生合成が植物細胞の所望の位置で起きるように、リーダ配列を用いてステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの発現を適したオルガネルに標的設定できよう。当業者であれば、例えば必要であれば植物の葉に向けてなど、合成を命令するために適したプロモータを用いるであろう。発現は、所望であればカルス培養又は毛根培養などの組織培養で起こさせてもよい。ある実施態様では、ここで解説する一種以上の核酸又はポリペプチドをステビア例えばステビアレバウディアナに導入することで、全体的なステビオールグリコシド生合成が増加するようにするか、又は、全体的なステビオールグリコシド組成を、一種以上の特定のステビオールグリコシドについて選択的に濃縮されているようにする。例えば、以下のうちの一つ以上が発現するように、一種以上の組換え遺伝子をステビアに導入することができる:UGT91D酵素、例えばUGT91D2e例えばSEQIDNO5又は機能的なそのホモログ、UGT91D2m例えばSEQIDNO10;UGT85C酵素、例えば表15に挙げたバリアント、又はUGT76G1酵素、例えば実施例18に挙げたバリアント。核酸コンストラクトは典型的には、UGTポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結させた適したプロモーター例えば35S、e35S、又はssRUBISCOプロモータがある。核酸はステビアにアグロバクテリウム媒介性形質転換;プロトプラストへのエレクトロポレーション媒介性遺伝子移動;又は微粒子銃により導入することができる。例えばSinghetalCompendiumofTransgenicCropPlantsTransgenicSugarTuberandFiberEditedbyChittaranjanKoleandTimothyCHallBlackwellPublishingLtdpp97115を参照されたい。ステビア葉由来の微粒子銃の場合、パラメータは以下の通りであってよい:6cmの距離、1100psiHeの圧力、金粒子、及び一個の銃撃。ステビア植物は、上記のSinghetal2008が解説したように体細胞胚発生によって再生させることができる。具体的には、葉部分ほぼ12cm長を5乃至6週齢のinvitro培養植物から除去し、B5ビタミン、30gショ糖及び3gGelriteを添加したMS培地上でインキュベート向軸性を下することができる。24ジクロロフェノキシ酢酸を6ベンジルアデニン、キネチン、又はゼアチンと組み合わせて用いることができる。植え継ぎ培養8週間後に前胚の塊が現れる。植え継ぎ培養2乃至3週間以内に体細胞胚が培養株表面上に表れるであろう。胚は、BAを24D、aナフタレン酢酸、又はインドール酪酸と組み合わせて含有する培地で成熟させることができる。発芽して小植物を形成する成熟体細胞胚をカルスから切り出すことができる。小植物が3乃至4週齢に達した後、小植物をバーミキュライトを入れたポットに移し、6乃至8週間、馴化用成長チャンバー内で成長させ、温室に移動させることができる。ある実施態様では、ステビオールグリコシドをコメで産生させる。コメ及びトウモロコシは、アグロバクテリウム媒介性形質転換などの技術を用いて容易に形質転換させることができる。バイナリベクター系は、単子葉植物へのアグロバクテリウム外因性遺伝子導入に通常、用いられる。例えば米国特許第6215051号及び第6329571号を参照されたい。バイナリーベクター系においては、一つのベクターは目的の遺伝子例えばここで解説するUGTを含むTDNA領域を含有し、他方のベクターはvir領域を含有する非武装のTiプラスミドである。同時組み込みされるベクター及び移動可能なベクターも用いることができる。形質転換させる組織の種類及び予備処置、用いるアグロバクテリウムの株、播種の持続時間、アグロバクテリウムの過剰成長及び壊死の防止は、当業者であれば容易に調節することができる。コメの未熟胚細胞は、バイナリーベクターを用いて、アグロバクテリウムによる形質転換に向けて調製することができる。用いる培養基にはフェノール化合物を添加する。代替的には、真空浸潤法を用いて形質転換をプランタ内で行うことができる。例えばWO2000037663、WO2000063400、及びWO2001012828を参照されたい。IV.ステビオール及びステビオールグリコシドの生成法ここで解説する組換えホストを、ステビオール又はステビオールグリコシドの生成法で用いることができる。例えば、組換えホストが微生物である場合、当該方法には、ステビオール及び/又はステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現するような条件下で組換え微生物を培養基中で成長させるステップを含めることができる。当該組換え微生物を、供給バッチ又は連続プロセスで成長させてもよい。典型的には、組換え微生物を所望の温度で所望の時間、発酵槽内で成長させる。当該方法で用いられる特定の微生物に応じ、イソペンテニル生合成遺伝子及びテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子も存在してよく、発現させてもよい。基質や、例えばイソペンテニルジホスフェート、ジメチルアリルジホスフェート、ゲラニルゲラニルジホスフェート、カウレン及びカウレン酸などの中間生成物のレベルは、公開された方法に従って、培養基から分子起用の試料を抽出することにより、判定することができる。組換え微生物を所望の時間、培養で成長させた後、ステビオール及び/又は一種以上のステビオールグリコシドを、当業で公知の多様な技術を用いて培養株から回収することができる。組換えホストが植物又は植物細胞である場合、ステビオール又はステビオールグリコシドは、当業で公知の多様な技術を用いて、植物組織から抽出することができる。例えば、培養微生物又は植物組織の粗ライセートを遠心分離して上清を得ることができる。その結果得られた上清を次に、例えばC18カラムなどのクロマトグラフィーカラムに入れ、水で洗浄して親水性化合物を取り除いた後、目的の化合物をメタノールなどの溶媒で溶離させることができる。次に、この化合物を更に調整用HPLCで精製することができる。またWO2009140394を参照されたい。生成されるステビオール又はステビオールグリコシドの量は、例えば約1乃至約10mgl、約3乃至約10mgl、約5乃至約20mgl、約10乃至約50mgl、約10乃至約100mgl、約25乃至約500mgl、約100乃至約1500mgl、又は約200乃至約1000mglなど、約1mgl乃至約1500mglであってよい。概して、培養時間が長いと生成量が多くなるであろう。従って、組換え微生物を1乃至7日間、1乃至5日間、3乃至5日間、約3日間、約4日間、又は約5日間、培養することができる。ここで論じる多様な遺伝子及びモジュールは、一種の微生物でなく、二種以上の組換え微生物中にあってもよいことは理解されよう。複数の組換え微生物を用いる場合、それらを混合培養で成長させてステビオール及び/又はステビオールグリコシドを産生させることができる。例えば、第一の微生物はステビオールを産生するために一種以上の生合成遺伝子を含むことができ、他方、第二の微生物はステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。代替的には、それぞれ二種以上の微生物を別々の培養基中で成長させ、ステビオールなど、第一の培養基の生成物を第二の培養基中に導入して、次の中間生成物に、又はレバウディオサイドAなどの最終生成物に、転化させることができる。次に、第二の、又は最終的な微生物によって産生された生成物を回収する。いくつかの実施態様では、培養基以外の栄養源を用い、発酵槽以外の系を用いて組換え微生物を成長させることは認識されよう。ステビオールグリコシドは、異なる食品系で同等な性能を必ずしも有するわけではない。従って、選択されたステビオールグリコシド組成に合成を指向させる能力があることが好ましい。ここで解説する組換えホストは、特定のステビオールグリコシドについて選択的に濃縮され、一貫した食味プロファイルを有する組成物を生じることができる。従って、ここで解説する組換え微生物、植物、及び植物細胞により、ある食品に好ましい甘味プロファイルに合致するように調整されると共に、バッチ間で一貫した各ステビオールグリコシドの比率を有する組成物の生成が容易になる。ここで解説する微生物は、ステビア抽出物に見られる、望ましくない植物副産物を生じない。従って、ここで解説する組換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物を由来とする組成物から識別可能である。V.食品ここで開示する方法で得られるステビオール及びステビオールグリコシドを用いて、食品製品、ダイエット補助食品、及び甘味料組成物を作製することができる。例えば、レバウディオサイドAなどの実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、例えばアイスクリーム、炭酸飲料、果汁ジュース、ヨーグルト、焼成品、チューイングガム、硬質及び軟質キャンディー、及びソースなどの食品に含めることができる。実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、医薬製品、薬品、ダイエット補助食品及び栄養補助食品などの非食品製品にも含めることができる。実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、農業及びペット業の両方のための動物飼料にも含められよう。代替的には、ステビオール及び/又はステビオールグリコシドの混合物は、組換え微生物を別々に培養する、あるいは、それぞれが特異的ステビオール又はステビオールグリコシドを産生する異なる植物/植物細胞を成長させるステップと、各微生物又は植物/植物細胞から実質的に純粋な形でステビオール又はステビオールグリコシドを回収した後、該化合物を配合して、各化合物を所望の比率で含有する混合物を得るステップとにより、作製することができる。ここで解説する組換え微生物、植物、及び植物細胞により、現在のステビア製品に比較して、より精確かつ一貫した混合物を得ることができる。別の代替案では、実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、例えばサッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、又はアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に食品に取り入れることができる。他の甘味料に対するステビオール又はステビオールグリコシドの重量比は、最終的な食品中で満足な食味を達成できるように必要に応じて変えることができる。例えば米国特許公報第20070128311号を参照されたい。いくつかの実施態様では、該ステビオール又はステビオールグリコシドに、甘味修飾剤などの甘味例えば柑橘系を提供してもよい。例えば、食品中の糖分量を減少させられるように、特に糖質ベースの甘味料用に、レバウディオサイドCを甘味促進剤又は甘味修飾剤として用いることができる。ここで解説する組換え微生物、植物、又は植物細胞により作製された組成物を食品に取り入れることができる。例えば、組換え微生物、植物、又は植物細胞により作製されたステビオールグリコシド組成物を、ステビオールグリコシド及び食品の種類に応じて、乾燥重量を基本に、約20mgステビオールグリコシドkgの食品、乃至約1800mgステビオールグリコシドkgの食品、の範囲の量で、食品中に取り入れることができる。例えば、食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大500mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をデザート、低温菓子例えばアイスクリーム、乳製品例えばヨーグルト、又は飲料例えば炭酸飲料に取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大300mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を焼成品例えばビスケットに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大1000mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をソース例えばチョコレートシロップ又は植物製品例えばピクルスに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大160mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をパンに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大1600mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を硬質又は軟質キャンディーに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品1kg当り最大1000mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を加工果実製品例えばフルーツジュース、フルーツフィリング、ジャム、及びゼリーに取り入れることができる。例えば、このようなステビオールグリコシド組成物は、9099のレバウディオサイドAと、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する可能性があるが、乾燥重量ベースで、例えば100500mgkg、25100mgkg、2501000mgkg、50500mgkg又は5001000mgkgなど、251600mgkgを食品に取り入れることができる。このようなステビオールグリコシド組成物は、3を超えるレバウディオサイドBを有するレバウディオサイドB濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドB量が、乾燥重量ベースで例えば100500mgkg、25100mgkg、2501000mgkg、50500mgkg又は5001000mgkgなど、251600mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドB濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。このようなステビオールグリコシド組成物は、15を超えるレバウディオサイドCを有するレバウディオサイドC濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドC量が、乾燥重量ベースで例えば100600mgkg、20100mgkg、2095mgkg、20250mgkg、5075mgkg、又は5095mgkgなど、20600mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドC濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。このようなステビオールグリコシド組成物は、3を超えるレバウディオサイドDを有するレバウディオサイドD濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドD量が、乾燥重量ベースで例えば100500mgkg、25100mgkg、2501000mgkg、50500mgkg又は5001000mgkgなど、251600mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドD濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。このようなステビオールグリコシド組成物は、3を超えるレバウディオサイドEを有するレバウディオサイドE濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドE量が、乾燥重量ベースで例えば100500mgkg、25100mgkg、2501000mgkg、50500mgkg又は5001000mgkgなど、251600mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドE濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。このようなステビオールグリコシド組成物は、4を超えるレバウディオサイドFを有するレバウディオサイドF濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドF量が、乾燥重量ベースで例えば100600mgkg、25100mgkg、2595mgkg、5075mgkg又は5095mgkgなど、251000mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドF濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。このようなステビオールグリコシド組成物は、4を超えるダルコシドAを有するダルコシドA濃縮組成物であってよく、製品中のダルコシドA量が、乾燥重量ベースで例えば100600mgkg、25100mgkg、2595mgkg、5075mgkg又は5095mgkgなど、251000mgkgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のダルコシドA濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。いくつかの実施態様では、実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、卓上用甘味料又はカップ-フォー-カップ製品中に取り入れる。このような製品は典型的には、例えばマルトデキストリンなど、とうぎょうしゃに公知の一種以上の増量剤で適した甘味レベルまで希釈される。レバウディオサイドA、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、又はダルコシドについて濃縮されたステビオールグリコシド組成物は、卓上用に例えば乾燥重量ベースで製品1kg当り10000を30000mgのステビオールグリコシドなどにして、小袋中に梱包することができる。VI.植物の育種A.多型ここで解説する核酸例えばUGT91D2核酸間の多型を、植物遺伝子マッピング及び植物育種プログラムのマーカーとしてステビアで用いることができる。例えばYaoetalGenome199942657661を参照されたい。従って、ここで解説する多型を、その多型が形質変化に関係するかどうかを明らかにする方法で用いることができる。当該方法は、ステビア株又は集団中の形質変化と、それらの植物中の一つ以上の遺伝子多型との間の相関関係を測定することにより、その遺伝子多型が形質変化に関係するかどうかを明らかにするステップを含む。典型的には、当該の形質は、植物中に存在するステビオールグリコシドの総量であるが、当該の形質は特定のステビオールグリコシド、例えばレバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE、レバウディオサイドF、又はダルコシドAの量であってもよい。いくつかの実施態様では、該形質はステビオールの量、又はイソプレノイド前駆体の量である。形質と、多型マーカーの存在との間の統計上有意な相関関係は、例えばChi平方検定、スチューデントのt検定法、マンホイットニー検定、又はF検定などの適したパラメーター又は非パラメータ統計学を用いて判定される。例えばある植物中のレバウディオサイドAの量と、多型マーカーの存在との間の統計上有意な相関関係は、当該マーカーが、変化したレバウディオサイドAレベルの選抜のためのマーカー支援育種プログラムにおいて有用かも知れないことの指標となる。多型は、限定はしないが、制限断片長多型、無作為増幅多型DNA検出、増幅断片長多型、単一配列反復又はマイクロサテライトを含め、当業で公知の手段により検出できよう。多型の発見、検出、及び遺伝子型決定は文献に解説されている。例えばHenryedPlantGenotypingTheDNAFingerprintingofPlantsWallingfordCABIPublishingandPhillipsandVasiledsDNAbasedMarkersinPlantsDordrechtKluwerAcademicPublishersを参照されたい。例えば、SEQIDNO6、SEQIDNO9、又はSEQIDNO96に示す核酸配列又はその相補配列を由来とするプライマー又はプローブを用いて、所望のステビオールグリコシド組成物に相関する多型アレルを持つ一種以上の独立した植物を同定することができる。次にこれらの植物を、所望のステビオールグリコシド組成物に相関する他の位置で、多型アレルと複数の他のアレルとを組み合わせる育種プログラムで用いることができる。当業者にとっては明らかであるように、必要なマーカーの数及び種類は、選抜する形質や、各マーカーの相関の程度に応じて異なる。従って本方法は、いくつかの実施態様では、植物のゲノム中に複数の多型を検出することを含む。本方法は、前記の複数の多型を検出するステップの結果を、コンピュータで読み取り可能な媒体上に記憶するステップを更に含むであろうことは理解されよう。従って、いくつかの実施態様では、ステビア植物株又は集団を同定するための方法は、ステビア植物のための核酸試料を提供するステップと、試料中に存在する、SEQIDNO1、3、5、又は7に示すポリペプチドをコードする核酸に90以上の配列同一性を有するUGT遺伝子に相当する、ステビア植物の一領域を増幅するための増幅プライマーを提供するステップと、前記領域の増幅が起きるように、前記核酸試料に対して増幅プライマーを応用するステップと、増幅後の核酸試料中で、当該形質と相関する一つ以上の多型の存在に基づいて所望の形質を有する植物を同定するステップとを含む。いくつかの実施態様では、ステビア植物中でポリヌクレオチドの存在を判定するための方法は、少なくとも一つのプローブ又はプライマーペアを植物由来の核酸に接触させるステップを含む。該プローブ又はプライマーペアは、SEQIDNO1、3、5、又は7に対して少なくとも90の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的である。次に、ポリヌクレオチドの存在又は不在を判定する。ステビア植物の多型を検出し、遺伝子型を判定する方法に加え、本方法を行うのに適したキットや、本方法で作製されたデータを含有する、このような方法で作製されたコンピュータ読み取り可能な媒体も解説されている。ステビア植物試料を遺伝子型決定するためのキットは、SEQIDNO1、3、5、又は7に対して少なくとも90の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーペア、又は、同ポリヌクレオチドを特異的にハイブリダイズするプライマー、を含む。このようなキットは、典型的には、適した梱包材料内に容れられたプライマー又はプローブを有する。ここで解説する方法及びキットのいくつかの実施態様では、それぞれが特異的かつ規定されたゲノム位置の有無を認識することができる一つ以上の組のオリゴヌクレオチドを用いる。多倍数体ステビア株又は集団の場合、オリゴヌクレオチドの数が多い方が好ましい。下限は一方のオリゴヌクレオチドペアであり、上限は、本方法及び検査キットの所望の分解能によって設定される。ステビア植物由来のDNAへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、例えば末端トランスフェラーゼ及び従来の記録可能な標識などを適用して、いずれかの従来の標識系により、インシツーで記録されることが好ましい。インシツー標識付けの代わりとして、ハイブリダイズ後の試料DNAを固体の支持体から遊離させた後、固体の支持体に付着させた元のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれに対応する標識済みポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせてもよい。ハイブリダイゼーションは選択的には可逆的であり、固体の支持体は、再使用に向けてその元の状態に戻すことができるものでもよい。当該オリゴヌクレオチドがゲノムDNAにテンプレートとしてハイブリダイズしていることを条件に、標識後のジデオキシヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの末端に取り入れることができる。該オリゴヌクレオチドに適合する領域近傍のゲノム位置にあるヌクレオチド配列は既知であるため、取り入れられることになるその特定のヌクレオチドA、C、G、T又はUは既知である。共優性採点は、対になった、即ち二つ、又はパラレルの、即ち三つのフランキングオリゴヌクレオチド配列を用いて達成される。こうして得られる結果を、完全、空、失敗、又はヌルアレルとして記録し、ヘテロ接合型及び/又はホモ接合型遺伝子型間で区別するために用いることができる。例えば標識付け前又は標識付け後に、固体の支持体に付着したオリゴヌクレオチド配列に完全にハイブリダイズしていない試料DNAを取り除くために、洗浄及び消化を含む、選択的なハイブリダイゼーション後処置を提供する。ハイブリダイゼーションの有無は、典型的にはコンピュータ読み取り可能な媒体上へのハイブリダイゼーション状態の記録を可能にする方法を用いて記録される。B.育種プログラムステビアは典型的には外部交雑種であるが、自家受粉も時に観察される。従って、ステビア植物の育種プログラムは、典型的には、反復的選抜大量選抜、バルク選抜、及び異種交雑:のうちの一つ以上の使用を含む。これらの技術を育種プログラムで単独で用いることも、あるいは、一つ以上の他の技術と組み合わせて用いることもできる。YadavetalCanJPlantSci91127を参照されたい。それぞれ同定された植物を異なる植物に交雑して種子を作ることができ、この種子をその後、発芽させて後代植物を形成する。所望の表現型及び所望の多型を持つ一つ以上の後代植物から採った種子を合わせた後、無作為に交配させて、次に後代世代を形成する。多型アレルの残った結果的な植物集団で所望の安定性を達成するために、育種プログラムはこれらのステップを適宜0乃至5世代、繰り返すことができる。大半の育種プログラムにおいては、特定の多型アレルに関する解析を各世代で行うことになるであろうが、解析は、必要に応じて交互の世代で行うこともできる。後代植物の自家受粉は、自家受粉が実現可能なステビア株や集団で行ってよい。反復選抜は、植物集団を向上させるために植物育種プログラムで用いられる方法である。該方法は、個々の植物を互いに交差受粉させて後代を形成することを伴う。後代を成長させ、優れた後代を、個々の植物、半同胞後代、全同胞後代及び自家受粉後代を含む、いずれかの数の選抜法で選抜する。選抜された後代を互いに自家受粉又は交差受粉させて、別の集団のための後代を形成する。この集団を植え付け、再度、優れた植物を選抜して互いに自家受粉又は交差受粉させる。反復選抜は周期的プロセスであるため、必要に応じて何回も反復することができる。反復選抜の目的は集団の形質を向上させることである。こうして、向上した集団を、人工品種の作製を含め、商業用又は育種での使用に向けて新しい品種を得るための育種材料の源として用いることができる。人工品種は、複数の選択された品種を相互交配することで形成された後代である。人工種を作製するために用いられる親植物品種、集団、野生獲得物、生態型等の数は、少なくて10から多くて500まで、様々であろう。典型的には約100乃至300品種、集団等を、人工品種の親として用いる。人工品種の親種子作成区画から得た種子を農家に販売することができる。代替的には、親種子作成区画から得た種子を、親区画で作製された種子量及び種子の需要に応じて、1世代又は二世代の増殖を行わせることができる。大量選抜は、分子マーカー関連選抜法と組み合わせて用いると有用な技術である。大量選抜においては、個体から得た種子を、表現型又は遺伝子型に基づいて選抜する。その後これらの選抜された種子をバルクにし、次の世代を成長させるために用いた。バルク選抜には、植物集団をバルク区画で成長させて植物を自家受粉できるようにすることと、種子をバルクで収穫し、その後、バルクで収穫された種子試料を用いて次の世代を播種することが必要である。更に、自家受粉の代わりに、指向された受粉を育種プログラムの一部として用いることもできよう。このように、いくつかの実施態様では、ステビア植物株又は集団を作製する方法は、SEQIDNO1、3、5、又は7に対して少なくとも90同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する位置にある多型の存在が目的の形質の変異に関係するような一つ以上の植物を当該株又は集団で同定することを含む。次に、同定された植物をそれ自体又は異なるステビア植物と交配して種子を作り、該種子から成長させた少なくとも一つの後代植物を再度、それ自体又は異なるステビア植物と、更に0-5世代、交配して、多型を持つ株又は集団を作る。場合によっては、例えば疾患耐性についての選抜など、他の有用な形質についての選抜も行う。このような他の形質に関する選抜は、所望の多型アレルを持つ個々の植物の同定前、同定中、又は同定後に行うことができる。マーカー支援育種技術を他の種類の同定技術に加えて、又はその代替法として用いてもよい。本発明を更に、請求項に記載した本発明の範囲を限定しない以下の例で解説する。VI.実施例実施例1.カウレン生合成経路遺伝子の構築切断型パン酵母HMGCoAレダクターゼをコードするヌクレオチド配列を、酵母高コピー数エピソーム性プラスミドベクターに、コーディング配列が、アミノ酸メチオニンによって抑制され得るプロモーターに作動可能に連結すると共に、同プロモーターの転写制御下にあるようにクローニングした。米国特許第5460949号及び第5306862号を参照されたい。表1に示すGGPPS酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現用に改変しSEQIDNO1825、コーディング配列が、アミノ酸メチオニンによって抑制され得るプロモーターに作動可能に連結すると共に、同プロモーターの転写制御下にあるようにE.coliベクター内にクローニングした。各発現カセット含有プラスミド進入ベクターの名称も、表1に示されている。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQIDNO2633に示す。他の進入ベクターは、カサランサスロゼウス原語:Catharanthusroseus由来のEV270と指定される未改変のヌクレオチド配列、アスペルギルスニドゥランス原語:Aspergillusnidulans由来のC301と指定される未改変のヌクレオチド配列、及びキサントロフィロマイセスデンドロロウス原語:Xanthophyllomycesdendrorhous由来のC413と指定される未改変のヌクレオチド配列によって発現させたGGPPS酵素を用いて構築された。表2に示すCDPS酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変しSEQIDNO3436を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQIDNO3739に示す。他の進入ベクターは、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana由来のEV64と指定された未改変のヌクレオチド配列、ゼアメイス原語:Zeamays由来のEV65と指定された未改変のヌクレオチド配列、及び、ライコペルシコンエスキュレンタム原語:Lycopersiconesculentum由来のEV66と指定された未改変のヌクレオチド配列によって発現させたCDPS酵素を用いて構築された。表3に示すKS酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変しSEQIDNO4043を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQIDNO4447に示す。他の進入ベクターは、アラビドプシスサリアナ原語:Arabidopsisthaliana由来のEV70と指定された未改変のヌクレオチド配列、ククルビタマキシマ原語:Cucurbitamaxima由来のEV71と指定された未改変のヌクレオチド配列、及び、ククミスサティブス原語:Cucumissativus由来のEV72と指定された未改変のヌクレオチド配列によって発現させたKS酵素を用いて構築された。表4に示すCDPSKS融合酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現用に改変してSEQIDNO48及び49を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQIDNO50及び51に示す。表5に示すKO酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変してSEQIDNO5255を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQIDNO5659に示す。表6に示すKAH酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変してSEQIDNO6064を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQIDNO6569に示す。配列は米国特許公報No20080064063に示されている。表7に示すCPR酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変してSEQIDNO7072を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQIDNO7375に示す。実施例2――ステビオールグリコシド経路遺伝子の構築表8に挙げたUGT85C2及びUGT74G1酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する組込みベクターを酵母中に形質転換した。ゲノムにUGT85C2、又はUGT85C2及びUGT74G1が組み込まれた形質転換体が得られた。IP3GGT及びUGT94B1R25S酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変しSEQIDNO77及び79を参照されたい、酵母進入ベクター内にクローニングした。IP3GGT及びUGT94B1R25Sのアミノ酸配列をそれぞれSEQIDNO76及び78に挙げる。改変後のIP3GGTヌクレオチド配列を含有する高コピー数のエピソームベクターをpEF1155と指名した。改変後のUGT94B1R25Sヌクレオチド配列を含有する高コピー数のエピソームベクターをpEF1156と示した。実施例3――酵母株の構築EFSC301と指名された酵母株を内因性ERG9プロモーターを銅誘導性CUP1プロモーターと置換することで改変した。株EFSC301はEUROSCARF収集酵母株BY4742の誘導株である。ワールドワイドウェブunifrankfurtdefb15mikroeuroscarfdatabyhtmlを参照されたい。標準的な酵母成長培地においては、ERG9遺伝子は大変低いレベルでしか転写されないが、それは、このような培地での銅の濃度が低いからである。この株でエルゴステロール生成が減少すると、ステビオール生合成のために利用できるイソプレン単位量が増加する。該酵母株を更に、それぞれ強力な構成的GPD1プロモータの転写制御下に置かれたステビアUGT85C2及びUGT74G1遺伝子をゲノム組込みすることで改変した。表8を参照されたい。該株は、ステビアUGT85C2及びUGT74G1遺伝子のそれぞれ一つのコピーをMUS1241株ゲノムに組み込んだ状態で有する。実施例4――酵母におけるステビオールグリコシド経路遺伝子発現の解析酵母でのステビオールグリコシド生合成を調べるために、表1-7及び実施例1の36種の進入ベクターの発現カセットを連結反応で無作為に連鎖状にして、人工的な酵母染色体を作った。このプロセスを概略的に図5に示す。二つの異なる組の連結を行った。A組の連結は、表1-7に挙げた全ての遺伝子を含んだが、例外として二官能性のCDPSKS遺伝子表4は全く含めなかった。B組の連結は、表1-7に挙げた遺伝子を全て含んだが、例外として一官能性のCDPS及びKS遺伝子表2-3を全く含めなかった。30乃至200μgのDNAをカセット含有ベクターのそれぞれから調製した。遺伝子発現カセットを、制限酵素AscIによる消化で各ベクターから遊離させた。次に、カセットをT4リガーゼによる3時間の連結反応によりeYAC中に無作為に連鎖状にした。連鎖状化反応の成功は、反応混合物の粘度により評価した。なぜなら連鎖状化したDNAは粘度が高いからである。セントロメア、二つのテロメア、並びにLEU2及びTRP1選択マーカーを含有するDNAフラグメントアームを、連鎖状化した発現カセットの末端に加えることで、機能的eYACを作製した。酵母細胞壁をチモリアーゼ原語:zymoliase消化した後、CaCl2PEG緩衝液をで処理してeYACなどの大型分子にスフェロプラストを透過性にすることにより、eYACsをコンピテント酵母株MUS1243のスフェロプラスト中に形質転換した。形質転換後、酵母スフェロプラストを、細胞壁の再生が起き得る不活性の寒天ベースの固体培養基に包埋した。コロニーは接種から4乃至8日後に現れた。再生培地はアミノ酸ロイシン及びトリプトファンに欠けたため、酵母細胞中の二重武装eYACの存在について選択された。約3000の形質転換体が各組毎に得られた。各形質転換体を再画線し、酵母株マーカーと、eYACの両方の腕の遺伝子学的存在、即ちLEU2及びTRP1マーカーの存在について検査した。形質転換体のうちの97を超えるものが正しい遺伝子型を有していた。各形質転換体にCEY指定番号が与えられた。まず、メチオニンなしで2mlの合成完全培地SC中で各組の24個のCEYを24時間成長させて、eYACからの遺伝子発現を誘導した。24時間後、各培養株からの上清を採集し、LCMS液体クロマトグラフィ-結合質量分析法解析にかけてルブソシドの存在を調べた。ステビアUGT74G1及びUGT85C2遺伝子は各CEY形質転換体では同時発現するため、ステビオールが生成されたときの予想される最終生成物はルブソシドβDグルコピラノシルエステルである。B組のSEYのいずれも、検出可能なレベルのルブソシドを生成しなかったが、他方、A組のCEYのうちの7個は生成した。株CEY19が最高の生成株だった。CEY19は、ルブソシドのナトリウム付加物に相当するであろう、質量6652の化合物を生成した。質量6432の化合物も見られたが、これはおそらくはプロトン化したルブソシドに相当するであろう。6652の質量化合物をMSMSベースで分子分画したところ、ナトリウム付加物としてのステビオールモノシドに相当する5032の部分的質量が得られた。この化合物の質量、分画パターン、HPLCスペクトル、及び保持標準が、ステビア酵素85C2及び74G1を用いてステビオールのグルコシル化によりinvitroで生成されたルブソシド標準のそれにまさに相当したため、CEYで生成された化合物をルブソシドと判定した。ルブソシド生成に関する更なるスクリーニングA組の更なる95クローンと、B組の95クローンとをメチオニンなしで1mlのSC培地を入れた96深皿ウェルトレイで成長させた。これらの培養株のそれぞれから採った上清を二つのクローンのプールに配合し、LCMSで解析し、MSシグナル/ノイズ比を判定した。MSsn比は、相対的ルブソシド含有量の大体の尺度である。2種のCEYのプールがルブソシドを生成すると見出されたら、そのプールの各クローンを別々に解析した。その結果は、B組のCEYはいずれもルブソシドを生成せず、他方、A組の少なくとも28種のCEYが検出可能なレベルのルブソシドを生成したことを示した。ルブソシド生成CEYクローンに存在する遺伝子の同定eYACの遺伝子含有量とルブソシド生成とを相関づけるために、全ての可能なeYAC生成遺伝子の同様な大きさの断片05kbを増幅することができるPCRプロトコルを開発した。2025ntの内側プライマーを、同様なアニーリング温度を用いて全ての遺伝子を増幅できるように配置した。eYACDNAを含むゲノムDNAが、ルブソシド生成なし、ルブソシド生成率の低い、及びルブソシド生成率が高い乃至大変高いという、4種類のCEYから調製された。等モル量のこれらの14DNAプレパラートを用いて、分析的PCRを全ての37種の遺伝子について、これら14種のCEYや陽性及び陰性のコントロールに対して行った。全ての遺伝子が増幅されたが、例外として一つは、明らかにプライマーの失敗のために増幅されなかった。6種の高ルブソシド生成CEY株中に存在する遺伝子を表9に示す。8種の低又は無ルブソシド生成CEY株中に存在する遺伝子を表10に示す。実施例5――酵母株条件の改変最大のルブソシド生成を誘導する培養条件を判定するために、株CEY213で実験を行った。開始材料は、CEY213のグリセロール冷凍ストックだった。凍結細胞をまず、SC酵母培地をトリプトファン、ロイシン及びヒスチジンSCTLHなしで含有すると共に2mMのメチオニンを含有する寒天プレートから採った。2mMのメチオニンを含有する5mlの液体SCTLH培地2mMメチオニンに、CEY213酵母細胞の凍結ストックをループフルに播種した。CEY213でのeYAC発現をこれらの条件下で抑制した。細胞を30°Cで一晩、ゆっくりと振盪しながら成長させ、予備培養株と指名した。CEY213予備培養株を用いてメチオニンなしの2550mlのSC培地に播種したが、該培地においては、下に示すパラメータを変更した。成長条件のそれぞれの下でのルブソシド生成は、各培養基の500μlを遠心分離し、250μlの上清を新しい試験管に移し、250μlのメタノールを加え、完全に振盪し、10分間、最高速で遠心分離することで測定した。上清の一アリクォートをルブソシド生成についてLCMSで解析した。銅レベルCEY213予備培養株を、50μMのバトクプロインジスルホン酸を加えたSC培地で成長させた。バトクプロインジスルホン酸は成長培地中で銅をキレートする。CEY213中のERG9遺伝子は、発現がCUP1プロモーターによって制御されるように改変されている。培地中で銅レベルが減少すると、ERG9活性が更に低下することで、ステビオール生合成に利用できるイソプレン単位量が増加するであろう。成長培地中の銅イオンのキレート化は酵母培養株の成長に対して悪影響を有し、ルブソシド生成が比例して減少した。これらの結果は、銅のキレート化なしでも株CEY213はエルゴステロール生合成についてその最低速度状態にあり、それ以上のイソプレン単位があってもエルゴステロール生合成をステビオールグリコシド生成に向かわせることはできないことを示唆していた。グルコース利用可能なグルコースを2から4に二倍にすると、ルブソシド生成に効果があり、ルブソシド生成が約5乃至10、増加した。利用可能な窒素の制限CEY213予備培養株を、利用可能な窒素を制限した条件下で成長させた。培養酵母株の成長中の窒素を制限すると、エルゴステロールの生成が増加することが知られている。NH4SO4の濃度を4glから2、又は04glに減少させると、CEY213の成長速度は窒素量に比例して減少した。ルブソシド生成は成長の低下に比例して減少した。株の曝気CEY213をバッフル有又は無しのエルレンマイヤーフラスコ内で成長させた。その結果は、バッフルを用いて曝気を増加させたときでもせいぜい周辺的な効果しかなかったことを示していた。あったとしても、バッフルなしの曝気なしで生成が増加したことだった。開始時の光学密度、発酵時間及び成長温度培養は、予備培養株CEY213をOD60001又はOD60010にした二種の異なる光学密度で開始した。次に発酵を24、48、72又は144時間、20、25又は30°Cの温度で行わせた。図6に示すように、発酵開始時のバッチ培養の密度、発酵における、培養温度及び時間的長さは、組合せとなって、CEY213により生成されるルブソシドの量に著しい影響を与えた。このように、OD60010の開始密度で30°Cで144時間、培養株を成長させたところ、85mgsリットル以上のルブソシドが生成された。実施例6――ルブソシドの大規模生成CEY213を用いた一連の実験を、播種密度を様々にし、eYAC遺伝子カセット発現のタイミングを変えながら、3種類の酵母培地リッチ培地及び二種類の合成培地を用いて行った。バッチ発酵条件バッチ発酵を、CEY213予備培養株を遠心分離し、上清を廃棄し、100μMメチオニン及び4グルコースを含有する6リットルのSCTLH培地中に細胞を再懸濁させることにより、行った。OD600を10にバッフルなしの100mlエルレンマイヤーフラスコ内で調節し、細胞をゆっくり振盪しながら30°Cで144時間、成長させた。ルブソシドの回収発酵後、培養株を遠心分離し、上清を等量のメタノールと混合し、完全に振盪し、遠心分離して沈殿した物質を取り除いた。その結果の上清を、メタノールを溶出剤としたフラッシュC18シリカカラムクロマトグラフィで精製した後、調整用HPLCを行って、一つの主要な化合物を得、他方、更に一種の重要ではない化合物を検出した。精製済みの化合物を1H及び13CNMRで解析し、そのデータを図7に示す。化合物は、ルブソシドに関する1H及び13CNMR文献値との比較に基づき、ルブソシドであることが確認された。定量的分析では、CEY213発酵で128mgsリットルのルブソシドが生じたことが示された。実施例7――IP3GGT活性1.Invitroでのイポメアパープレア3GGTグリコシルトランスフェラーゼの酵素活性イポメアパープレア3GGTグリコシルトランスフェラーゼの、ステビオールを基質として用いたときの酵素活性をinvitroで判定した。ステビアレバウディアナUGT85C2及びIP3GGTグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子をそれぞれEcoliで発現させ、各酵素を精製した。酵素反応は二段階で行わせた。まず、05mMステビオール合計955mgsをほぼ05μgのUGT85C2酵素と一緒に16時間、30°Cで反応緩衝液1mMUDPグルコース、100mMTrisHCl、5mMMgCl2、1mMKCl、01Uulウシ小腸ホスファターゼを含有する中でインキュベートした。次に、ほぼ05μgのIP3GGT酵素を加え、反応混合液を更に20時間、30°Cでインキュベートした。反応生成物を分析したところ、ステビオールのステビオール13Oモノシドへの100の転化が示され、そのうちの25が更にグリコシル化してステビオ13O12ビオシドとなっていた。理論上のステビオール13O12ビオシド収率は約48mgだった。その後、反応混合液を調整用HPLCにかけると、25mgのステビオール13O12ビオシドが生成した。LCMSを用いると、精製済み化合物の質量はルブソシド及びステビオール13O13ビオシドとは異なる保持時間を有していた。精製済みの化合物を1HNMR、異核単一量子コヒーランスNMR及び異核多重結合相関関係NMR解析にかけると、当該化合物がステビオール13O12ビオシドであることが確認された。2.ステビオール又はステビオールモノシド供給酵母中のIP3GGTのinvivo発現IP3GGTが酵母で活性かどうかを判定するために、2μの高コピー数エピソーム性プラスミド、未改変のIP3GGTコーディング配列を強力なGPD1プロモータに作動可能に連結して含有するpMUS10を酵母株MUS1245中に導入した。MUS1245はUGT85C2発現カセットをゲノムに組み込ませて含有する。その結果の酵母株をヒスチジンなしのSC培地で成長させて、開始密度をOD60002として、IP3GGT発現プラスミドの継続的な存在について選抜した。ステビオール又はステビオールモノシドを培地に3mM、加えた。72時間、30°Cで成長させた後、培養上清をステビオール及びステビオールグルコシドの存在についてHPLCで検定した。LCMS解析では、ステビオールを供給した後では12グルコシル化ステビオール13Oグルコシドは検出されなかったことを示したが、ステビオール13Oモノシドは検出できたかも知れない。対照的に、低い、しかし検出可能な量のステビオール12ビオシドがMUS1245担持pMUS10によって、ステビオール13Oモノシド供給後に生成された。これらの結果は、天然イポメアパープレア3GGTコーディング配列はステビオールモノシドのステビオール12ビオシドのinvivoでの検出可能な転化を得るのに充分なレベルで酵母において発現することを示している。実施例8――酵母株の改変EXG1及びEXG2Sセレビジエはステビオール12及びステビオール13ビオシド中の12又は13糖結合を分解する酵素を含有していると考えられる。この可能性を検査するために、酵母株CEY213を3日間、30°Cで、二種のビオシドのそれぞれを01mM含有する培地上で成長させた。培養株のLCMS分析では、12ビオシドのレベルは安定しており、他方、13ビオシド中の13結合は検定の検出限界内では完全に加水分解しているように見えた。それぞれが一つの公知の又は推定上のグリコシドヒドロラーゼ遺伝子を破壊している25種のS.セレビジエ変異株を、それらのステビオールビオシド分解能について調べた。各酵母変異株の培養株を上に記載した通りに、ステビオール13ビオシドを含有する培地上で成長させ、LCMSで分析した。EXG1エキソ13βグルカナーゼ遺伝子に変異を持つ酵母株は、13ビオシド加水分解活性の大半を失っていることが見出された。酵母EXG1遺伝子のヌクレオチド配列はVazquezdeAldanaetalGene97173182で報告されている。EXG2遺伝子別のエキソ13βグルカナーゼに変異を持つ酵母株は加水分解活性に小さな減少を示していた。CorreaetalCurrentGenetics22283288。二重変異酵母株exg1exg2を作った。この二重変異株をステビオール13ビオシドを含有する培地上で成長させたところ、ビオシドの加水分解は何も検出されなかった。実施例9-ステビオール生合成の力価増加実施例4及び表11で検査された異なる酵素クラスのそれぞれから採った個々のクローンをeYAC技術を用いて調べて、イソペンテニルピロホスフェート及びファルネシルピロホスフェートからのステビオールの最大の生成を示した特定のクローンを同定した。GGPPS、KO及びKAH酵素は、eYACs上で個別に、又はGGPPS酵素の場合、個別又は二種のプール中例えばシネココッカス種S.アシドカルダリウスGGPPS又はアスペルギルスニドゥランスGGPPSのみで、S.セレビジエ株にステビオール経路中の残った酵素ステップの全てを発現させた状態で検査した。その結果は、シネココッカス種GGPPSクローンMM7SEQIDNO24にコードされているが最も効率的であったことを示した。アスペルギルスニドゥランス及びスルフロブスアシドカルダリウスからのGGPPSクローンもまた大変活性であった。その結果は更に、KO及びKAHクローンの中では、ステビアKOクローンMM18SEQIDNO52にコードされている及びA.サリアナKAHクローンMM24SEQIDNO62にコードされているでステビオール生成が最大であったことを示していた。米国特許公報第20080064063号実施例4に記載したS.セレビジエ株CEY213を、強力なGPD1プロモータに作動可能に連結させた、表11に示すCDPS又はKS遺伝子の一つを持つ高コピー数プラスミドで形質転換させた。予備実験では、CEY213でステビアレバウディアナCDPSを過剰発現させると、ルブソシド生成が、高コピー数CDPS1過剰発現プラスミドを欠くCEY213に比較して増加することが示された。該実験では更に、ステビアレバウディアナKOは検査された二種では最も活性なKOであることが示された。一貫して高レベルのステビオールグリコシド生成を見せる酵母株を構築するために、GGPPS10クローン、KO1クローン及びKAH3クローンを含有する発現カセットをS.セレビジエ株CENPK11161Aのゲノムに安定に組み込んだ。これらのカセットの発現を構成的GPD1及びTPI1プロモータで惹起した。加えて、KS1、CDPS1及びUGT74G1を含有する発現カセットを該ゲノムに安定に組み込んだ。しかし、その結果できた酵母株EFSC1751は、実施例6で解説した条件下で研究室規模で成長させたときにはいずれのステビオール19Oモノシドも生成しなかった。EFSC1751におけるステビオールグリコシド生成の欠如の基盤を調べるために、CDPS3、CDPS4、CDPS5及びCPR1遺伝子を単独又は組合せで株EFSC1751で発現させた。CPR1はステビアレバウディアナ由来であり、その配列はGenbank受託番号DQ2694544に見られる。その結果は、CPR1を、CDPS3、CDPS4又はCDPS5のいずれかと一緒に発現させた場合には、ステビオール19OモノシドがEFSC1751で生成された。同じ株でこれらの遺伝子単独ではいずれもいずれの生成も起きなかった。これらの結果は、ステビア酵素CDPS1のゲノム組込みされたコピーはこの酵母コンストラクトでは非機能的であり、他方、ブラジリゾビウム、アラビドプシス又はゼアCDPSクローンはこのコンストラクトで機能的であることを示している。加えて、このコンストラクト用の染色体中に組み込まれた該植物由来KAH及び/又はKO遺伝子は活性のために外因性のCPRを要したように思われる。ジベレラフジクロイ由来のCPRもまた、該植物由来KAH及び/又はKOポリペプチドと一緒に作用できるように思われる。二つの主なGGPPS候補であるGGPPS6及びGGPPS7を更に個別に、機能的ステビオールグリコシド経路を有するがGGPPS遺伝子を持たないS.セレビジエ株で調べた。次に形質転換体を19SMGの生成について、50DMSOで5分間沸騰させ、16000相対遠心分離力で5分間遠心分離した培養株試料のLCMS分析で分析した。GGPPS6発現プラスミドを含有する数多くの形質転換体が19SMGを生成していなかったことが見出された。GGPPS7を含有する形質転換体はほとんど得られなかったことから、GGPPS7は二種の酵素のより活性のものであり、そしてこの活性は毒性をもたらすに十分であり得ることも示された。例えば、GGPP生成における劇的な増加は、エルゴステロール生成などの下流の経路の枯渇と成り得るかも知れない。この仮説を検査するために、UPC21遺伝子をGGPPS7と同時発現させて、これらの細胞のエルゴステロール供給を試みることで、これが細胞成長を救助するかどうかを調べた。しかし細胞成長は救助されなかった。細胞毒性は更に、GGPP又はGGPP代謝産物の蓄積が原因かも知れない。この仮説を検査するために、CDPS5を更にGGPPS7発現酵母株で過剰発現させて、毒性がGGPP使用率増加で軽減されるかどうかを見た。CDPS5過剰発現はある程度は成長を救助するように思われた。なぜなら、この酵素をGGPPS7と一緒に過剰発現するプラスミドを持つ形質転換体が僅かなコロニーを生じたからである。形質転換体の数はそれでも低かった。同様な、しかしGGPPS7の代わりにGGPPS10を持つ株でCDPS5を過剰発現させたところ、ステビオールグリコシド生成が二倍になり、これらの結果をまとめると、CDPSは導入されたステビオールグリコシド生合成経路において制限的なボトルネックであることが示唆されているのかも知れない。要約すると、酵母培地2グルコースを加えた、30°Cでの試験管細胞培養株での24乃至72時間にわたる19SMG又はルブソシドの生成に基づくと、以下の結論がeYACコンストラクトで導かれた:KS1ステビアレバウディアナ、SEQIDNO40にコードされている、KO1S.レバウディアナ、SEQIDNO52にコードされている及びKAH1S.レバウディアナ又はKAH3アラビドプシスサリアナ、SEQIDNO62にコードされているはステビオール経路にとって最良の組合せであるようである。GGPPS7シネココッカス種はこのステップで最高量の活性を示すようであるが、下流のボトルネックが起きれば、過剰発現の結果、更に毒性にもつながり、ステビオールグリコシドの全体的な更なる低レベルにもつながり得る。CDPS及びCPR遺伝子アナログの全ての組合せを検査したところ、表11の3つのCPR全てが活性であったこと、そしてCPR1又はCPR3とCDPS5又はCDPS4との組合せが特に有用であることが見出された。CDPS5は、経路中で最適なCDPSであるようである。ステロール経路へのフラックスを減少させたレポータ株で組合せを更に検査することができる。ゼアメイス由来のCDPSCDPS5の活性を更に高くできるか、その可能性を調べるために、この遺伝子を、プラスチドシグナルペプチド有り又は無しにしたGPDプロモーターを用いて2ミクロン複数コピープラスミドから発現させて、標的決定配列を取り除いたときに細胞質内で活性が高くなるかどうかを判定した。ゼアメイス由来の、葉緑体シグナルペプチドを含有するCDPS5のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、それぞれSEQIDNO80及び81に挙げる。葉緑体シグナルペプチドはSEQIDNO80のヌクレオチド1150にコードされており、SEQIDNO81のアミノ酸1乃至50に相当する。プラスミドを、GGPPS10、CDPS5、KS1、KO1、KAH3、CPR1及びUGT74G1をゲノムに組み込んで有する安定なルブソシドプロデューサ株に導入し、強力な構成的GPD及びTPIプロモーターから発現させた。更に、株EFSC1859において、ERG9にコードされたスクアレンシンターゼの発現を、内因性プロモーターをCUP1誘導性プロモーターに置換することにより下方調節した。これらの遺伝子に加え、株EFSC1859は、2ミクロンの複数コピーベクター由来のUGT85C2をGPD1プロモータを用いて発現する。ルブソシド及び19SMGの生成を、LCMSで測定して生成レベルを推定した。プラスチドリーダー配列を除去してもステビオールグリコシド生成は野生型配列に比較して増加しなかった。しかしながら、この研究ではリーダー配列はステビオール経路機能を失わせることなく除去することができることが実証されている。同様に、プラスミドを、膜アンカー配列即ちSEQIDNO72のヌクレオチド463;SEQIDNO62のヌクレオチド487;及びSEQIDNO52のヌクレオチド1117なしのCPR3、KAH3及びKO1のために構築し、株EFSC1859内に、UGT85C2をプラスミドではなく染色体上に組み込んだ状態で導入した。これらの酵素はアンカー配列なしでも機能的であろうと予測される。実施例10-ステビオール13Oモノグルコシド12グルコシルトランスフェラーゼ配列の同定ステビアEST分析ステビアステビアレバウディアナ葉ESTデータベースのtBLASTN検索を、完全イポメアイポメアパープレアUGT79タイプUGT、ベリスUGT94B1、ステビアUGT79A2、ステビアUGT76G1及びステビアUGT91D1アミノ酸配列をクエリーとすることで、グリコシルトランスフェラーゼを主に含有することが公知の全てのファミリー1グリコシルトランスフェラーゼサブファミリ由来のUGTを表させるように用いて行った。以前には未解説のUGT遺伝子のための部分配列を同定した。該部分配列の一つはUGT79サブファミリー由来であり、一つはUGT76サブファミリー由来であり、そして二つはUGT91サブファミリー由来、そしてUGT71、72、78、84及び88サブファミリーのメンバーである。部分配列のうちの7つをステビアcDNA又はcDNAライブラリーを単離用のPCRテンプレートとして用いて単離した。加えて、UGT76サブファミリーの二つのステビアメンバーであるGenBank受託番号ACT334221の、76G1サブファミリーのメンバーと、GenBank受託番号ACM477341の、76G2サブファミリーのメンバーとを単離した。ピロ配列決定更なるUGTクローンを同定し、ステビアcDNAを以下の通りに用いてピロ配列決定を行うことで単離した。ステビアmRNAをステビアの葉からAmbion登録商標MicroPolyPurist登録商標mRNA調製キットを用いて調製した。各配列の5’及び3’末端にある21ヌクレオチドに同一なオリゴヌクレオチドプライマーによる分析的PCRを利用することで、品質コントロールとして逆転写mRNAをステビアレバウディオサイドA経路UGT遺伝子85C2、74G1及び76G1の存在について検査した。その後、増幅後の完全長mRNAをピロ配列決定及びコンティグ検定に用いた。平均長393ヌクレオチドの約34百万読み取りを行い、その結果の生配列を用いて25907配列コンティグを得た。合計ほぼ1500UGTの公共で入手可能なアミノ酸配列を含有するデータベースを構築した。配列決定されたUGTのうちの約150は、多種のサブファミリーから完全にアノテートされたUGTであった。残りの配列決定済みUGTは、これらのうちの部分的にアノテートされたホモログであった。BLASTX検索を、作製されたUGTデータベース11、ギャップコスト1に対するクエリーとして25907ステビアESTコンティグを用いて行った。その結果は、ステビア由来の90を超える未知のUGTの配列が、ピロ配列決定データベース中に存在することを示唆していた。この他には、UGT79サブファミリー又はUGT94サブファミリーのいずれもピロ配列決定データベース中で同定されなかった。しかし、当該分析では、UGT76及び91サブファミリーの新しいメンバーが示された。当該遺伝子のうちの1、2に関して、完全長配列データじゃピロ配列決定ESTデータからすぐに入手できた。以前に構築されたステビアプラスミドcDNAライブラリーを用いて、部分的配列データを得ていたメンバーの完全長配列を得た。各特異的部分UGT配列に同一なオリゴヌクレオチドプライマーを、ライブラリプラスミドベクター配列に同一なオリゴヌクレオチドプライマーに組み合わせた。これらのプライマーをPCRで用いて完全長生成物を得、この生成物をその後、配列決定した。該完全長配列に基づき、反応のテンプレートとしてステビアcDNAライブラリー由来の完全長UGT遺伝子を増幅するためにプルーフリーディングPCRポリメラーゼ酵素を用いて第二のPCRを用いて行った。この戦略を用い、UGT76サブファミリーの5つのメンバー、UGT91サブファミリーの6つのメンバーや、他のUGTサブファミリーの10のメンバーが単離された。ステビアESTデータベースから同定された7UGT、2つの公共から入手可能なステビアUGT76配列、及びピロ配列決定で同定された21のUGTのそれぞれをE.coli発現ベクターpET30A又はpETDuet内にクローニングして、自己分解プローンE.coli株XjA及びXjBで発現させた。これらのUGtの多数については、UGTタンパク質の発現の結果、封入体の形成が起きた。これらの封入体の形成を克服するために、これらのUGTのいくつかを低温発現株アークティックエキスプレスで発現させた。この系の発現に失敗したものについては、PCR生成物の共役invitro転写-翻訳PCRDNAキット用のTNT登録商標T7Quick、Promega社を試みて、残ったUGTを成功裏に発現できた。反応の効率は、35Sメチオニンで標識付け、SDSPAGE上での分離、及び、問題のUGTタンパク質の予測されるサイズのタンパク質バンドをホスホイメージング検出することで確認された。各クローン由来で、上述の通りに発現させたUGTポリペプチドを12グリコシル化活性について、ステビオール13Oモノグルコシドを基質として用いて検査した。25μLの反応で形成される全タンパク質のほぼ5分の1に相当する、Invitroで転写/翻訳されたタンパク質がinvitro反応で、05mMステビオール13Oモノグルコシドを基質として、反応緩衝液1mMUDPグルコース、100mMTrisHCl、5mMMgCl2、1mMKCl01Uμlのウシ小腸ホスファターゼを含有する中で用いられた。反応混合液は30°Cで20時間、インキュベートされた。次に反応混合液をLCMS分析でステビオール12ビオシドの存在について分析した。LCMS分析は、Phenomenex登録商標SynergyHydroRPカラムを取り付け、電子スプレー電離によりTSQクオンタムトリプル四極子質量分析計でハイフン付原語:hyphenatedされたAgilent1100SeriesHPLCsystemを用いて行われた。溶離は、MeCN及びH2Oを含有する移動相30°Cを用い、06→04ml分、5MeCNを4分間;04ml分、5→40MeCNを2分間;04ml分、40→55MeCNを11分間;04→10ml分、55→100MeCNを3分間から成る勾配を印加することで行われた。ステビオールビオシドはSIMをMw6652MNaで用いて検出された。検査された30UGT酵素のいずれも検出可能なステビオール13Oモノグルコシドグリコシル化活性を示さなかった。ピロ配列決定で同定された6つのUGT91メンバーのヌクレオチド配列をGenbank受託番号NoAY345980のステビアUGT91D1配列と比較した。ピロ配列決定で同定された6つの配列に比較して、このGenBank配列は12個の更なるアミノ酸をN末端にコードしているように見えた。UGT91D1ファミリーメンバーを活性について再検査するために、UGT91D1配列をステビア葉cDNAのPCR増幅により再単離した。その結果のPCR産物をプラスミドベクター内にクローニングし、各産物の酵素活性を上述した通り、:E.coli内でのGSTタグ付け発現、共役invitro転写/翻訳、及び/又は酵母でのinvivo発現により測定した。ステビオール12グルコシル化活性は、三つの方法のすべてにより一つのクローンから検出された。このクローンはUGT91D2eと指名された。UGT91D2eのアミノ酸配列をSEQIDNO5に挙げる。対照的に12グルコシル化活性は、受託番号AY345980と同じ配列を有するが、アミノ末端の12個のアミノ酸を欠くクローンからは検出されなかった。実施例11-UGT91D2e配列の分析UGT91D2eの配列バリアント図19Bに証左されるように、僅かな数のアミノ酸修飾が活性バリアントと、最も近い不活性のホモログとの間には存在する。MaetalShiYanShengWuXueBao2003361239及びBrandleetal上記がクローニングした91D1遺伝子は、RebA生合成に必要な12グリコシル化活性を示さなかった。どのアミノ酸が活性に必要なのかを確認するために、21個の単一部位指定変異体を、UGT91D2e中のアミノ酸が不活性なホモログ中の対応するアミノ酸に変化しているように、作製した。表12を参照されたい。加えて、位置364も変化しているように部位指定変異を作製した。変異体はQuikChange登録商標II部位指定変異誘発キットをメーカーのプロトコルカリフォルニア州サンタクララ、AgilentTechnologies社に従って用いて作製され、pGEX4TIベクターをXJb自己分解E.coli株カリフォルニア州オレンジ、ZymoResearch社中に導入した。ある変異体は、残基162がグリシンからアスパラギン酸には変化しないように作られた。変異酵素の活性を評価するために、基質供給実験をinvitroでE.coliで産生される単一のタンパク質を用いて行った。E.coli細胞を一晩、30°Cで成長させた後、3mMアラビノース及び01mMIPTGで誘導し、更に20°Cでインキュベートした。invitro検定については、細胞を一晩、20°Cで誘導し、凍結/解凍サイクルで溶解させ、粗細胞抽出物を、基質が5mMステビオール13Oグルコシド及び05mMルブソシドである酵素反応で用いた。その結果を、ステビオールモノグルコシド及びルブソシド基質について表12で示す。はジグリコシル化活性が検出されたことを示し、は活性が検出されなかったことを示し、そしてNAは、検定が行われなかったことを示す。記載された変異は91D2e配列の番号付けに基づく。遺伝子のいくつかはE.coliの封入体中で発現する傾向を有するため、E.coli実験で活性を示さなかったコーディング配列も、上記実施例10の通り、PCR産物の共役invitro転写-翻訳により、作製された。簡単に説明すると、5個の単一変異体のPCR増幅で得た2μLのDNAと野生型酵素を90分間、30°Cで、キットのマスター混合液及び1μLのL35Sメチオニンと一緒にして合計25μLの反応液にしてインキュベートした。各試料については、体積2μLの最終反応液をSDSPAGEゲルで泳動させた。SDSPAGEゲルの視覚的観察で判断したところ、6種のタンパク質すべてが同様なレベルの可溶性組換えタンパク質を示した。invitro翻訳タンパク質に関する結果は表12の右側に示されている。この表のパーセンテージは、基質及び生成物の相対的ピーク面積に基づく、基質から生成物への大体の転化量を示す。UGT91D2eに比較したときのジグリコシル化活性の大体の量は:T144Sは61、M152Lは262、L213Fは307、S364Pは43、そしてG384Cは147であることが、13SMGを基質として用いて見出された。ルブソシドの場合、UGT91D2eに比較したときのジグリコシル化活性の大体の量は、T144S、M152L、L213F、S364P、及びG384Cについて、それぞれ14、234、437、109及び352であることが見出された。これらの結果は、22のアミノ酸変異のうちの5つが、単独で行われたときには活性にとって甚だしく有害であることを示している。また、他の17の変異の組合せも、不活性又は活性消失につながる可能性もある。91D2e配列及び上述のバリアントを、At72B1、Mt85H2、VvGT1及びMt71G1Phytochemistry70325347と呼ばれるタンパク質とアライメントし、予想される三次構造アルファへリックス、ベータシート、及びコイル領域を分析することにより、変異の結果、ジグリコシル化活性が失われる可能性が高い領域を特定することができる。有害な最初の三つの変異は、ループであると考えられる領域にあるN末端ドメインに見られる。このN末端ドメインアミノ酸残基1240、特にN末端ドメインの予測されるループ領域アミノ酸2026、3943、8895、121124、142158、185198、及び203214は、グルコース受容体分子基質の結合を主に担うと考えられている。活性にとって有害だと思われる4番目の変異はアミノ酸381386に相当するC5ループと考えられる領域であるC末端ドメインに見られる。このループもまた、グルコース受容体基質特異性にとって重要だと考えられる。不活性、対、活性なルブソシドジグリコシラーゼ酵素を分かつ22個の変異の19個が、91D2eの予測される受容体基質結合領域の5つのアミノ酸内に位置する。従って、公開された91D1酵素は、UDPグルコースと代替的な受容体基質との間のグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒している可能性が高い。実施例12--酵母でのレバウディオサイドAの生成ステビオール供給酵母におけるレバウディオサイドAの生成ステビアUGTs91D2e、85C2、及び76G1の同時発現に向けて、ゲノム組込みされたUGT74G1発現カセットを含有する酵母株EFSC1580を3つの異なる2μ高コピーエピソームプラスミドに導入した。pMUS44、pMUS7及びpMUS9と指名された、この3つのプラスミドは、それぞれUGT91D2e、UGT85C2及びUGT76G1のコーディング配列を、強力なGPD1プロモーターに作動可能に連結させて含有する。その結果の酵母株をSC培地でウラシル、ヒスチジン、及びロイシンなしで成長させて、pMUS44、pMUS7及びpMUS9発現プラスミドの継続的な存在について選抜した。ステビオールを培地に最終濃度250μMまで加え、この株を30°Cで培養した。培養の18時間目及び72時間目に数アリクォートの上清及び細胞ペレットを、レバウディオサイドAの存在についてLCMSで分析した。LCMS分析は、Phenomenex登録商標SynergyHydroRPカラムトリプル4極子質量分析計にハイフン化したAgilent1100シリーズHPLCシステム米国デラウェア州、ウィルミントン、AgilentTechnologies社を用いて行われた。溶離は、MeCN001ギ酸及びH2Oを含有する移動相を用い、06→04ml分、5MeCNを4分;04ml分、40MeCNを2分;04ml分、40→55MeCNを11分;04→10ml分、55→100MeCNを3分、から成る勾配を印加することで行われた。ステビオールビオシドはSIMを用いて検出された。LCMSでは、pMUS44、pMUS7及びpMUS9を含有する株EFSC1580をステビオールの存在下で成長させたときに、検出可能な量のレバウディオサイドAが培養の18及び72時間目の上清で見られたことを示した。この生成物はレバウディオサイドA標準でで同時溶離し、予測される質量はMNa989と確認された。生成物の吸光度を、10μMのレバウディオサイドA標準の吸光度を比較することにより、細胞培養の上清中の蓄積が18時間目では6mgL超、そして72時間目では15mgL超と推定された。グルコース供給酵母でのレバウディオサイドA及びレバウディオサイドDの生成実施例4で解説した酵母株CEY213は、eYACから発現するステビオール生合成経路や、ゲノムに組み込まれたUGT74G1及びUGT85C2発現カセットを含有する。株CEY213は実施例6で解説した通り、ルブソシドを生成する。UGT91D2e及びUGT76G1の同時発現に向けて、株CEY213を2μ高コピーエピソーム性二重発現プラスミドのpMUS47で形質転換した。pMUS47プラスミドは、一つはUGT91D2eのコーディング配列を有し、他方はUGT76G1のコーディング配列を有する、2つの発現カセットを含有する。両方のコーディング配列は、強力な構成的GPD1プロモーターに作動可能に連結している。その結果の酵母株を、eYACの存在に関する選抜を維持するためにヒスチジン、ロイシン及びトリプトファンなしの、pMUS47の存在に関する選抜を維持するためにはウラシルなしの、そして最後にeYAC上に存在するプロモーターを抑制するためにメチオニン有りの、SC培地上で30°Cで一晩、予備培養した。翌日、細胞を洗浄し、eYACプロモーターの同様のために、同一ではあるがメチオニンなしの培地に移した。24時間及び99時間のインキュベーション後に試料を採集し、上清及び細胞ペレットを、レバウディオサイドA及びレバウディオサイドDの存在についてLCMSを上述した通りに用いて分析した。その結果は、検出可能な量のレバウディオサイドAが24時間目及び99時間目の上清の両者に見られたことを示していた。生成物はレバウディオサイドA標準で同時溶離し、予想される質量はMNa989であると確認された。生成物の吸光度を10μMのレバウディオサイドA標準に比較することにより、レバウディオサイドAの上清中への蓄積を、24時間目では3mgL超、そして99時間目では6mgL超と推定した。図9を参照されたい。その結果も、少量のステビオシド及びルブソシドが酵母細胞ペレット中に存在し、そして検出可能な量のステビオシド及びルブソシドが培養上清中に存在することを示していた。図9を参照されたい。その結果もまた、少量ではあるが検出可能な量のレバウディオサイドDが生成されたことを示しており、UGT91D2eは更なるグルコースをステビオシド生成性レバウディオサイドEの19Oグルコースに、又は、レバウディオサイドAの19Oグルコースに直接結合させることができることを示唆している。これらの結果はまた、UGT76G1はレバウディオサイドEを基質として受容することで、レバウディオサイドDを生成し得ることができることを示唆している。図2Cを参照されたい。実施例13--UGT配列のためのコドン最適化配列を持つレバウディオサイドAの生成GeneArt又はDNA20により提供された2つの方法を用いて、UGT91d2e、74G1、76G1、及び85C2の最適コーディング配列をデザインし、酵母での発現用に合成した。UGT91d2e、74G1、76G1、及び85C2のアミノ酸配列は変えなかった。4つの最適化UGT全てを持つ発現カセットを含有する高コピー数プラスミドを構築及び発現させ、それらの活性を、野生型配列を含有する同様な構築物の発現生成物に比較した。該プラスミドを汎用ウォッチメーカー株EFSC301に導入した。UGTを高コピー2μベクターに入れて挿入し、強力な構成的プロモーターから発現させた。一晩成長させ、OD600が025になるように新鮮な培地に再播種した後、培養基に25μMのステビオールを添加し、ルブソシド19SMG及びRebAの生成を培地中で24時間後に測定した。この実験を繰り返したが、それは部分的には、19SMGが一番目の試料の一つでは検出不能だったからである。下の表13に示す、2つの別々の実験結果は、コドン最適化UGTの8種すべてが活性であったことを示している。しかしながら、各戦略においてコドン最適化UGTの少なくとも一つのための酵素発現は、当該コンストラクトを作製するのに用いた新しんコドン最適化アルゴリズムで減少していた。GeneArt改変コンストラクトペプチドの鎖に融合した。p53タンパク質モチーフはヒトではMDM2タンパク質と相互作用するLietalJMolBiol201039820013を参照されたい。DNA20コドン最適化UGT85C2、91D2e、74G1及び76G1をインフレームでヒトタンパク質MDM2遺伝子受託番号ABT17086の最初の158アミノ酸に融合した。小型のGSリッチなリンカー領域もUGTのN末端メチオニンの直前に融合した。未融合の、PMIMDM2結合の親和性は、高親和結合を表す低nM範囲にある。上記のコンストラクトで形質転換させた酵母細胞は、N末端で85C2タンパク質に融合された4XPMIペプチド反復配列近傍にUGTタンパク質スカフォールドを生成することが期待されるTRP1を欠失させた研究室用酵母株BY4741を、ヒトMDM2タンパク質の最初の158アミノ酸のインフレーム融合をN末端に持つステビアレバウディアナUGT74G1、76G1及び91D2eを発現し、そして合成PMIペプチドの4反復配列のN末端インフレーム融合を持つステビアレバウディアナUGT85C2を発現する発現プラスミドp423426GPD119122で形質転換した。85C2、74G1、91D2e、及び76G1融合タンパク質のアミノ酸配列については、それぞれSEQIDNO88、90、92、及び94を参照されたい。該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列については、SEQIDNO89、92、93、及び95を参照されたい。この酵母株及びコントロール株いずれの融合もなしで4種のUGTを発現するを一晩、プラスミドの存在について選抜する合成酵母培地で成長させ、その翌日、合成酵母培地を含有する96深皿トレイに細胞密度がOD600で1になるように移した。最終濃度100μMのステビオールを加えた。72時間後、試料を採取し、実施例12で解説したようにLCMSで分析した。図10A及び10Bに示すように、多様な融合タグと一緒に発現させた場合、UGTは酵母で活性であった。実施例15-UGT91D2e活性更なるサブファミリー91UGTを、遺伝子バックグラウンドの異なる3種類のステビア源から作製したcDNAライブラリー製剤を用いてクローニングした。UGT91D191D2eに同一なオリゴヌクレオチドプライマーをcDNA製剤のPCR増幅に用い、その結果得られた、サイズの正しいPCR産物を、適したプラスミドベクター内にクローニングした。各実験から得た多くのクローンを配列決定すると、その配列決定の結果は、配列に僅かな変更を持つUGT91D核酸も増幅可能であろうことを示していた。UGT91D2eに対して配列の違いが最も大きい20種のUGT91Dバリアントをinvitro転写-翻訳で発現させた後、ステビオール13Oモノグルコシド12グルコシル化活性について酵素検査した。バリアントのうちの一つが弱い12ビオシドグルコシル化活性を示し、残りのものは何の検出可能なグルコシル化活性も示さなかった。従って、UGT91D2ポリペプチドはステビアにおいて主なステビオール13Oモノグルコシド12グルコシル化酵素であるようである。UGT91D2eの酵素活性共役invitro転写-翻訳で作製されたUGT91D2eをinvitro酵素検定でステビオール13Oモノグルコシドのキシロシル化及びラムノシル化能について、UDPキシロース又はUDPラムノースをUDPグルコースではなく糖供与体として用いて検査した。キシロシル化検定は以下の通りに行われた:3mMUDPグルクロン酸をほぼ1μgのアラビドプシスサリアナにコードされたUDPグルクロン酸デカルボキシラーゼUXS3、1mMDTT、6μgBSA、1mMMgCl2、及び1ウシ小腸ホスファターゼと混合した。この反応混合液を30分間、30°Cでインキュベートして、UDPグルクロン酸がUDPキシロースに転化するようにした。その後、15mMステビオール13Oモノグルコシド基質及びほぼ05μgの、実施例9に解説した通りに作製されたUGT91D2e酵素を混合液に添加し、この混合液を30°Cで更に20時間、インキュベートした。ラムノシル化検定は以下の方法で行われた:3mMUDPグルコースを、それぞれ06μgの、アラビドプシスサリアナにコードされたRHM2ラムノースシンセターゼのN末端及びC末端部分、100mMTrisHCl、1mMDTT、15mMNADPH、15mMNAD、6μgのBSA、1mMMgCl2、及び1ウシ小腸ホスファターゼと混合した。この反応混合液を30分間、30°Cでインキュベートして、UDPグルコースがUDPラムノースに転化するようにした。次に、15mMのステビオール13Oモノグルコシド基質及びほぼ05μgのUGT91D2e酵素を混合液に添加し、この混合液を30°Cで更に20時間、インキュベートした。その結果は、UGT91D2eはステビオール13Oモノグルコシド基質のキシロシル化をUDPグルコースで観察される速度の約半分から3分の1の速度で行うことができ、こうしてレバウディオサイドFの前駆体である12キシロシル化ステビオール13Oモノシドを形成することができることを示していた。UGT91D2eはステビオール13Oモノグルコシド基質のラムノシル化を、UDPグルコースで観察されるのとほぼ同じ速度で行うことができ、こうしてレバウディオサイドCダルコシドBの前駆体である12ラムノシル化ステビオール13Oモノシドを形成することができた。これらの結果は、適した前駆体分子の合成され、そして適したUGTがinvivoで発現されれば、レバウディオサイドF及びCがinvivoで生成されるはずであることを示している。図2B及び2Dを参照されたい。UGT91D2eを更に、ステビオール13Oモノグルコシド以外の基質、即ちルブソシドステビオール13ビオシド及び13ステビオシドの12グルコシル化能についてinvitroで検査した。その結果は、UGT91D2eは、13結合グルコースが存在するとき例えばステビオール13ビオシド及び13ステビオシドには活性ではなかったが、UGT91D2eは19O位置の一次グルコシル化に関係なく活性であることを示していた。これらの結果は、ステビオール13ビオシド及び13ステビオシドはrebA形成のためにinvivoステビア経路に存在している訳ではない可能性が高いことを示唆している。図2A及び3を参照されたい。実施例16-UGT91Dホモログ様々な生態型のS.レバウディアナは遺伝的に多様である。様々なステビアRNA受託株から採った91Dの96クローンを調査すると、SEQIDNO9に示した91D2eのヌクレオチド配列を参照して番号付けすると、調査された6つの生態型間で多くのアミノ酸変化が判明した例えばヌクレオチド74、89、131、137、278、295、331、365、395、418、425、431、442、454、458、466、485、583、587、595、614、616、631、637、662、664、671、857、867、919、989、1000、1090、1150、1232、1281、1313、1354、そして1369。これらの多型からのいくつかの更なる変化が認められたが、それらは配列決定又はPCRエラーが原因である可能性が高く、特に多型が一回しか見られなかった場合はそうである。20種類のコーディング領域を更なる分析に向けて選んだ。単離されたクローンの解説については表14を参照されたい。表14のアミノ酸の番号付けはSEQIDNO5に記載したUGT91D2eのアミノ酸配列に基づく。表14のクローンの全てを、13SMGを基質として用いて活性について検査した。クローン5は弱い12グリコシル化活性を有していたが、他方、残りの19種は検査条件下では活性を有さないようだった。クローン5の配列はSEQIDNO95に記載した通りであり、以下の変異を野生型UGT92D2eG206R、Y207C、及びW343Rに対して持つ。実施例17-UGT85Cホモログ6つの異なるS.レバウディアナ生態型由来のUGT85Cの遺伝的多様性を調べて、ステビオールグリコシド生成経路において同じ又は亢進した活性を有するホモログを同定した。UGT85C遺伝子に特異的なPCRプライマーをデザインし、PCR反応をcDNAに対して行った。その結果得られたPCR産物をクローニングし、96個のクローンを配列決定した。アミノ酸多型をマッピングし、多様な共通の多型表示を持つ16個のUGT85Cクローンを選んだ。表15を参照されたい。更なる改変がいくつかのクローンでは認められたが、PCRエラーが原因かも知れず、あるいは共通の多型ではないかも知れない。多型は、受託番号AY3459781に記載された野生型S.レバウディアナUGT85Cヌクレオチド配列のヌクレオチド及びアミノ酸番号付けで解説されている。クローンはPCR産物の共役invitro転写-翻訳を通じて発現させ、基質ステビオール及びステビオール19Oグルコシドに対しるグリコシル化能について、前の実施例で解説した通りに検定した。クローン1、4、16、17、19、20、21、26、29、30、31、37、及び39から生まれたUGT85Cは可溶性であり、90分検定で19SMGをルブソシドに転化させることができた。クローン27から生じたUGT85Cは不溶性とみなされた。クローン2及び33から生じたUGT85Cは不溶性とみなされたが、微量のルブソシドが、タンパク質バンドが見えなかったにも関わらず、生成された。これらの実験は個別に3回、行われた。この実験では、以下のアミノ酸変異では活性消失につながらなかったことを示している:V13F、F15L、H60D、A65S、E71Q、I87F、K220T、R243W、T270M、T270R、Q289H、L334S、A389V、I394V、P397S、E418V、G440D、及びH441N。活性なクローンで見られた更なる変異には、クローン37のK9E、クローン26のK10R、クローン2のQ21H、クローン30のM27V、クローン4のL91P、クローン31のY298C、クローン37のK350T、クローン1のH368R、クローン19のG420R、クローン4のL431P、クローン16のR444G、及びクローン30のM471Tがある。検査されなかった唯一の共通の多型は、両者ともかなり保存的な置換であるT270A及びI336Tであった。クローン17はUGT85Cに比較して6480アミノ酸分という最大の変化を起こしていた。変化可能と思われる1720アミノ酸はアミノ酸レベルではほぼ4の違いとなる。一般的には、85C間の遺伝子多様性は低く、表15に記載した共通の多型を持つ85Cホモログの全てが活性である可能性が高い。実施例18-UGT76Gホモログ6つの異なるS.レバウディアナ生態型由来のUGT76Gの遺伝的多様性を調べて、ステビオールグリコシド生成経路において同じ又は亢進した活性を有するホモログを同定した。UGT76G遺伝子に特異的なPCRプライマーをデザインし、PCR反応をcDNAに対して行った。その結果得られたPCRフラグメントをクローニングし、96個のクローンを配列決定した。共通のアミノ酸多型をマッピングし、アミノ酸番号でR10S、I16L、F22V、M29I、K52S、V74KE、P80S、L85A、V87SG、L91P、I92F、I93F、H96Y、G97R、L108V、E113D、G116E、A123T、Q125A、I126L、Y128H、T130A、L142I、V145M、S147N、N151T、F152I、H153L、H155Y、V156D、Q160L、E163D、L167F、P169L、K188N、K191Q、C192SF、S193GA、F194Y、M196N、K198Q、K199、Y200、Y203I、F204L、E205G、N206K、I207M、T208I、V217IF、E226Q、S228P、L230V、V233I、I234T、E236D、I237F、S253P、P266Q、S273P、R274S、G284TA、T285S、2873bp欠失、R298H、P326A、L330V、G331A、P341L、L346I、S376L、D377A、G379A、L380F、S438P、及びK441Nを含め、多様な共通の多型表示を持つ16個のUGT76Gクローンを選んだ。概して、76G間には大変高い多様性があった。クローンをinvitro翻訳を通じて発現させ、前の実施例で解説した通りにグリコシル化活性について05mMステビオール13Oグルコシド及び05mMステビオシドを基質として用いて検定した。反応は90分間、30°Cで行わせた。ステビオール13Oグルコシドを基質として用いたときに、天然の76G1活性が、76GC4、76GG7及び76GH12と指名された三つの新しい76Gに、13ビオシドの形成によって見られた。この場合の活性は機能的76G1である陽性コントロールに匹敵すると判定された。クローン76GG7及び76GH12は、コントロールよりも僅かに高いレベルのRebAを生成したが、76GC4はコントロールよりも僅かに少ないRebAを有していた。これらのクローン中の変化数は、コントロール酵素に比べるとアミノ酸レベルでは約7の違いとなる。SEQIDNO98、100、及び102はそれぞれアミノ酸配列で76GC4、76GG7、及び76GH12と記載されている。SEQIDNO97、99、及び101はそれぞれ76GC4、76GG7、及び76GH12をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。SEQIDNO98、100、及び102はそれぞれ76GC4、76GG7、及び76GH12のアミノ酸配列を記載したものである。SEQIDNO97、99、及び101は、それぞれ76GC4、76GG7、及び76GH12をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。表16は、活性を有する76Gクローンのアミノ酸変化を野生型酵素に比較して要約したものである。活性クローンには数多くの重複する多型があるため、これらの多型は酵素の活性消失を引き起こさないと予測される。例えば位置80でのP→S変異、又は位置22でのF→V変異など、特定の変異は不活性なクローンには頻繁にあるようである。実施例19-切断型酵母HMGCoAレダクターゼ及び他のHMGCoAレダクターゼの発現S.セレビジエにおいては、メバロネート経路は、例えば酵素3ヒドロキシ3メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼのレベルなどで大きな調節を受けている。切断型HMGCoAレダクターゼを発現させることは、PPP生成に向かうフラックスを酵母で増加させることのできる方法の一つである。例えば、酵母でtHMG1を発現させるとβカロテンの劇的な過剰産生が起きた。Verwaaletal2007ApplEnvironMicrobiol734342を参照されたい。興味深いことに、このような酵母は、予測されたような固体成長培地上での暗いオレンジ色の着色は示さず、おそらくは中間生成物のフィトエンが更に高い過剰産生したために、強い黄色を示した。HMGCoAレダクターゼの発現を用いてステビオール及びステビオールグリコシド経路へのフラックスを亢進し得るかどうかを調べるために、イソプレノイドフラックスを検査するための酵母レポーター株を、ERG9遺伝子の固有のプロモーターをCUP1プロモーターに置換することで調製した。2010年5月20日の出願の米国特許出願No61346853号を参照されたい。酵母株を作製するのに用いた遺伝子を表17に示す。ソース生物由来の遺伝子は、DNA20Inc登録商標に従って最適化されたコドンだった。細胞内プレニルホスフェート利用能を観察する目的で、プレニルホスフェートをβカロテンに転化させるために必要な三つの酵素キサントフィロミセスデンドロロウス由来のGGPPシンターゼ、X.デンドロロウス由来のフィトエンシンターゼ及びベータカロテンシンターゼ、並びにニューロスポラクラッサ由来のゼータカロテンシンターゼ及びデルタカロテンシンターゼのための遺伝子を持つ遺伝子発現カセットメチオニン抑制性プロモーターを含有する高コピー数プラスミドを有するコンストラクトを作製した。Verwaaletal2007上記;及び米国特許出願第61346853号を参照されたい。酵母tHMG1を、βカロテンを生成するCENPKベースの酵母株で発現させることで、オレンジから明るい黄色に色を変化させた。興味深いことに、アルテミシアアヌア、トリパノソーマクルジ、及びスタフィロコッカスアウレウス由来の完全長HMGや、シュードモナスメヴァロニ及びアルケオグロブスフルギドゥス由来のNADH依存的HMGを発現させると同様な結果が生じたことから、これらの遺伝子は酵母でメバロネート経路を通じたフラックスも向上させることが示された。最後に、同じ色の変化はリーシュマニアインファンツムアセチルCoACアセチルトランスフェラーゼ表17に記載されたメバロネート経路の一番目の酵素又は天然S.セレビジエ又はB.サチィリス受託番号YP004204141パントテン酸塩キナーゼアセチルCoA生成を増加させることが公知の過剰発現後で見られた。これらの実験での色の変化が実際に高GGPP利用能が原因かどうかを検査するために、酵母tHMG1、Pメバロニ及びS.アウレウスHMG、又はB.サティリスパントテン酸キナーゼを安定な19SMGプロデューサー株で発現させた。これらのコンストラクトのいずれも、検査条件下では19SMG又はルブソシド生成の増加をもたらさないようだった。メバロネートを酵母レポータ株に供給しても、ルブソシド生成は増加しなかった。しかし、ルブソシドレポーター株はERG9にコードされた、エルゴステロール生合成に向かうフラックスを減らすようには遺伝子改変されていなかった。ベータカロテン生成にとって有益であることが見出されたHMGレダクターゼ遺伝子及び他のメバロネート経路遺伝子を用いてエルゴステロール生成に向かうフラックスを制御すると、ステビオールグリコシド生成が増加するであろうと予測される。実施例20-RebCのinvivoでの生成前駆体分子からのレバウディオサイドC、ステビオール13Oグルコピラノシル12ラムノシドへの合成はinvitroで実施例15で示された。この実施例では、ステビオール13OモノグルコシドをUDPグルコース及びアラビドプシスサリアナRHM2酵素位置タグAT1G53500及びUGT91D2eと一緒に、基質として用いた。図2Bに示す経路を更に実証するために、ステビオールからのレバウディオサイドCの生成をinvivoで達成した。レバウディオサイドCを生成することができる酵母株を構築し、レバウディオサイドC及びレバウディオサイドAの生成をLCMSで検定した。改変されたサッカロミセスセレビジエ株BY4742を構築し、EYS5837Aと指名した。BY4742の使用はNaesbyetalMicrobCellFact845によって解説済みである。4種類のUGT全てGPDプロモーターを持つiinプラスミドで構成的に発現させた。この種類の株はNaesbyetAlMicrobCellFact845によって解説済みである。UGT85C2をプラスミドP423GPDに挿入し、UGT74G1をP424GPD中にクローニングし、UGT91D2e及びUGT76G1の両者をP425GPD中にクローニングしたが、91D2eは元の多重クローニング部位に配置し、76G1は更なるGPDプロモーター及びCYCターミネーターと一緒に挿入した。その結果の株を、CPDプロモーターから発現するRHM2遺伝子を含有するプラスミドP426GPDで形質転換した。この株を、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシルを各SC培地上で24時間、成長させた。次に、培養株をOD600が04になるように、25μMのステビオールを含有する新鮮な培地上に再播種し、酵母を更に72時間、成長させてから、レバウディオサイドCが上清及び細胞ペレット上に存在するかどうかを検出した。レバウディオサイドCは本物のレバウディオサイドC標準を用いて定量された。合計で127μM±036μMのRebCを上清中に検出した。同様に、317μM±109μMのRebAを細胞ペレット中に検出した。当業者であれば、RebC対RebAの様々な比を、RHM2酵素の活性の調節及び/又はUDPラムノース反応にとってより高い活性を持つUGT91D2e又はUGT76G1様酵素の使用によって得ることができることを認識されよう。代替的なUGTは野生型酵素の変異誘発型であっても、又は、発見イニシアティブを通じて得られた特有の酵素であってもよい。当業者であれば、レバウディオサイドAをグルコースから生成することのできる酵母株、例えば実施例12でUGT91D2e及びUGT76G1を含有するプラスミドで形質転換させた株CEY213など、は、ベクターを通じて、又は染色体内に組み込むなどして、RHM2遺伝子を追加することにより、レバウディオサイドCを生成するであろうことを認識されよう。実施例21――エシェリヒア-コリで発現されるUGTを用いたステビオールグリコシドの生成グラム陰性細菌でのUGT酵素の活性UGTs91D2e、74G1、76G1、及び85C2の野生型遺伝子を、E.coliXjB自己分解BL21細胞に、Novagen社のpET30ベクター系を用いて個々にクローニングし、例外としてはUGT91D2eはpGEX4T1ベクター内にクローニングされた。同様なクローニングを実施例7及び10に記載する。ベクターは全て、IPTG誘導性プロモーターを用いている。プラスミドDNAを業者の解説通りに化学的コンピテント細胞内に導入した。所望の抗生物質耐性を示す形質転換体を一晩、30°Cで、NZCYM培地及び抗生物質を用いた2mL培養株にして成長させた。invivo供給については、5つの培養株を成長させた:UGT91d2e、74G1、76G1、及び85C2を個別に、そして4種クローンのすべての混合物である。翌日、培養株を誘導して最終濃度を03mMIPTG及び3mMアラビノースにし、2日間、20°Cで、50μMのステビオール又は50μMルブソシドの存在下で成長させた。温度を30°Cまで上昇させ、細胞を更に1日、成長させた。次に細胞を4000rpmで5分間の遠心分離で採集し、上清をLCMS分析に向けて取り除いた。細胞を50DMSO中に再懸濁させ、80°Cで5分間、溶解させ、そのライセートをLCMSで分析した。invitro検定では、所望の抗生物質耐性を示す形質転換体を一晩、30°Cで、NZCYM培地及び抗生物質を用いて2mLの培養株にして成長させた。翌日、培養株を誘導して最終濃度を03mMIPTG及び3mMアラビノースにし、24時間、20°Cで成長させた。次に、細胞を4000rpmで5分間、遠心分離して採集し、200LのGT緩衝液及び3錠100mlの完全mini、プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁させ、エッペンドルフ試験管に移し、過流し、80°Cで1.5時間、凍結させた。細胞を氷上で解凍し、室温に3分間、放置した。適宜半分解糖したときに、15μlの014mgmlH2ODNase溶液30μlの005MMgCl2を各試験官に加え、試料をほぼ5分間、室温でインキュベートした。細胞を最高速で5分間、遠心分離した。100μLの上清ライセートを新鮮なマイクロ遠心管に移し、100μLのグリセロールを加えた。1515μLのH2O、75μLの4X緩衝液、03μLのFermentas社製FastAPTM、045μLの100mMストックのUDPグルコース、06μLの基質ステビオール又はルブソシド及び6μLの上記の粗酵素製剤を加えることで酵素検定を行った。UGT74G1、UGT85C2や、全4種のUGT混合物をステビオールと一緒にインキュベートした。UGT76G1及び85C2をルブソシドと一緒にインキュベートした。該酵素検定を一晩、37°Cでインキュベートした。4000rpmで5分間、遠心分離した後、30μLの試料を、新鮮な96ウェルプレートに移し、30μLのDMSOを添加した。次に試料をLCMS分析にかけた。同様なinvitro実験を、更にステビオール12ビオシドUGT76G1及びUGT74G1に又はレバウディオサイドBUGT74G1にを基質として用いて行った。invivo供給では何の活性も検出されなかった。表18は、invitro検定の結果を示す。これらの結果は、UGT酵素はすべてE.coli細胞で活性であることを示している。しかし、基質は容易には細胞質内に輸入されないのかも知れない。ステビオールが前駆体経路からE.coli内で生成されるのであれば、多様なステビオールグリコシド生成物の生成がグルコースから実現可能であろうと予測される。僅かに重複する基質特異性を有する74G1及び85G1UGTはステビオールから単独でルブソシドを生成することができるとは予測されない。4種の粗酵素製剤の混合物は大変低レベルのモノシドを生じたが、このことは、ジ及びトリグリコシドへの転化が効率的であることを示している。UGT91D2eについては、用いられた製剤は、長期間の保存後にその元の活性のいくらかを失っていた。当該酵素の新鮮な製剤であれば高レベルのレバウディオサイドAを生じたであろうと予測される。実施例22-フィスコミトレラパテンスにおけるステビオールグリコシドの生成コケ類細胞での供給実験UGT91d2e、74G1、76G1、及び85C2の遺伝子をフィスコミトレラパテンスに、米国特許公報No20100297722に解説されたpTHUbiGatewayベクター系を用いてクローニングした。このベクターは強力なトウモロコシユビキチンプロモーターを用いている。PCrプライマーは、開始コドンの上流にCACCを付加して、前記の例天然配列中のコーディング領域を増幅するようにデザインされた。プラスミドDNAをSwaIで消化し、プロトプラストへの導入に用いた一般的にはほぼ05x106のプロトプラスト。所望の耐性を示す形質転換体を1日、10mLの培養株にして成長させた後、ステビオール、ルブソシド、又は緩衝液DMSOのいずれかを、表19に示すように供給した。基質を含有する緩衝液を05mL、10mLの培養株毎に加え、最終濃度01のDMSO、50μMのステビオール又はルブソシド、及び0125mMのホスフェート緩衝液を培養株に加えた。陽性コントロールでは、eYFPをステビオール又は緩衝液のみ及びDMSOの存在下で発現させた。培養株を更に2日間、成長させてから細胞を分離し、更なる分析まで液体窒素中で凍結させた。いくつかの場合では複数のUGT含有プラスミドを同じプロトプラスト細胞中に導入して、コケ細胞内で複数のステップの転化を描き出した。蛍光シグナル観察で測定したところ、発現はコントロール試験管1及び2で陽性であった。実験で得た上清をLCMSで分析した;200μLの各上清試料を等容の50パーセントDMSOと混合した。試料を過流し15700相対遠心力、10分間、100マイクロリットルのその結果の上清をLCMSで分析した。プロトプラストペレットを氷上で解凍し、3錠100mlの完全Miniプロテアーゼ阻害剤を含有する10mMTrisHClpH8を最終容積150μLに達するまで加えた。溶液を二つに分割した:75μLを新しい試験管に移し、プロトプラストをペレットにした15700相対遠心力、1分間。ペレットを75μLのMilliQ水で解凍してから、150μLのDMSOに再懸濁させた。次に試料を加熱し、過流し、遠心分離した15700相対遠心力、10分間。50μLのその結果の上清をLCMSで分析した。上清にもペレットにもステビオールグリコシド生成は全く検出できなかった。ステビオール及びルブソシドがコケ細胞内に輸送され得るかどうかは不明である。ペレット抽出物のinvitro供給Invitro供給実験を試料1、3、4、5、6、11、13及び17で行った。ガラス製ビーズを残った75μLの元の再懸濁液に加え、プロトプラストを、それぞれ2分間の3回、摂氏4度で過流させ、過流間な氷上に保存することで機械的に溶解させた。試料を過流し、6μLの結果的な上清をinvitro酵素反応で用いた。酵素反応については、FastAPTMホスファターゼFermentas社を用い03U反応、UDPグルコース:基質比は5だった。試料にステビオール又はルブソシドを表20に従って供給した。反応液を30°Cで一晩、インキュベートした。インキュベート後、等量のDMSOを試料に加え、混合した後、試料を過流し、30μLのその結果の上清をLCMSで分析した。LCMS分析では、UGT76G1によるルブソシドの13ステビオシドへの転化が示された。他のステビオールグリコシドはどれも、検出不能だった。UGTの可溶性の発現がフィスコミトレラで起きたかどうかは不明である。一つのUGTがコケ細胞で活性であれば、発現が起きれば、他も活性であろうと予測される。加えて、クローニングを一過性の態様で行った。遺伝子が安定に組み込まれれば、検査した場合にUGT活性について活性な更なるクローンが生じるであろうと期待される。組換えタンパク質の可溶性の発現を増加させるための方法が当業者に公知である。代替的なプロモーター、リボゾーム結合部位、コドン使用率、シャペロンとの同時発現、及び、温度変化が、組換えタンパク質の可溶性発現を増加させる方法の非限定的な例である。実施例23――アスペルギルスニドゥランスでのステビオールグリコシドの生成真菌細胞におけるUGT酵素の活性UGT91D2e、74G1、76G1、及び85C2の天然遺伝子をアスペルギルスニドゥランス中に、PCR作成発現カセット及びUSERベクター系を用いてクローニングした。クローニング法はHansenetal、ApplEnvironMicrobiol7730443051に解説されている。簡単に説明すると、各UGTをコードするヌクレオチド配列を、構成的PgpdAプロモーターとTtrpCターミネーターとの間に、ゲノム組込みのために付加的な二つの標的決定配列と、選択マーカーとしてのargBとを含有するベクターに入れて挿入した。プラスミドDNAをA.ニドゥランスプロトプラスト内にNielsenetalFungalGenetBiol4354-64及びJohnstoneetalEMBOJ413071311に従って導入した。所望の耐性を示す形質転換体を48時間、最小培地1グルコース10mMNaNO3鉱物混合物を用いた150mL培養株にして成長させた。菌糸体をガラス製ビーズで潰して調製した細胞ライセートを用いて、個々のUGTの活性をinvitroで判定した。74G1及び85C2を発現する株の細胞ライセートを05mMステビオールと一緒にインキュベートし、76G1及び91D2eを発現する株を05mMステビオール13Oグルコシドと一緒に24時間、インキュベートし、その上清を更にLCMSを用いて分析した。ステビオールグリコシドは全く検出されなかった。UGT酵素の可溶性の発現が達成されたかどうかは不明である。なぜならこれらの生成物は典型的にはSDSPAGE上では不可視だからである。アスペルギルス及びサッカロミセスは両者とも真菌であるため、更なる実験で活性なクローンができると予測される。組換えタンパク質の可溶性の発現を増加させる方法は当業者に公知である。代替的なプロモーター、誘導物質レベル、リボゾーム結合部位、コドン使用率、シャペロンとの同時発現、及び、温度変化が、組換えタンパク質の可溶性発現を増加させる方法の非限定的な例である。他の実施態様本発明をその詳細な説明と併せて解説してきたが、前述の記載は本発明の描写するものであって、限定するものとは意図されておらず、本発明の範囲は付属の請求項の範囲によって規定される。他の態様、長所、及び改変は以下の請求項の範囲内にある。"