"配列番号273に記載の連続したアミノ酸配列を含む、15~30アミノ酸長の腫瘍関連ペプチド。ペプチドが、配列番号273のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の腫瘍関連ペプチド。ヒト主要組織適合抗原複合体MHCクラスIIの分子のHLA-DR4に結合する能力を有する、請求項1または2に記載の腫瘍関連ペプチド。ペプチドがHLA-DRに結合する場合に、結合した該ペプチドが、配列番号273に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識する細胞傷害性Tリンパ球CTLの産生を誘導可能である、請求項3に記載の腫瘍関連ペプチド。該ペプチドが非ペプチド結合を包含する、請求項1~4のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。該ペプチドが、HLA-DR抗原関連インバリアント鎖IiのN末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質である、請求項1~5のいずれかに記載の腫瘍関連ペプチド。請求項1~6のいずれか1つに記載ペプチドをコードする核酸。DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA若しくはそれらの組合せである、請求項7に記載の核酸。請求項7または8に記載の核酸を発現することが可能な発現ベクター。請求項7または8に記載の核酸または請求項9に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。組換えAwells細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。請求項1~6のいずれか1つに記載の腫瘍関連ペプチドの製造方法であって、請求項11に記載の宿主細胞を培養すること、および該ペプチドを宿主細胞若しくはその培地から単離することを含んでなる、製造方法。請求項1~6のいずれか1つに記載の腫瘍関連ペプチド、および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。医薬品での使用のための、請求項1~6のいずれか1つに記載の腫瘍関連ペプチド。請求項1~6のいずれか1つに記載の腫瘍関連ペプチドを含んでなる癌ワクチン。請求項1~4のいずれかに示されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、有効量患者に投与されることにより抗標的細胞免疫応答を誘導する請求項1~6のいずれか1つに記載のペプチドを含む、標的細胞の死滅剤。請求項1~4のいずれかに示されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤の製造における、請求項1~6のいずれか1つに記載の腫瘍関連ペプチドの使用。活性化型細胞傷害性Tリンパ球CTLのinvitroの製造方法であって、前記CTLを抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間、適する抗原提示細胞の表面上に発現された抗原を負荷したヒトクラスIIMHC分子とCTLをinvitroで接触させることを含んでなり、該抗原が請求項1~6のいずれか1つに記載のペプチドである、製造方法。該抗原が、十分な量の該抗原を抗原提示細胞と接触させることにより、適する抗原提示細胞の表面上で発現されたクラスIIMHC分子に負荷される、請求項18に記載の方法。抗原提示細胞が請求項9に記載の発現ベクターを含んでなる、請求項18に記載の方法。クラスIIMHC分子がHLA-DR4である、請求項18~20のいずれか1つに記載の方法。請求項1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、請求項18~21のいずれか1つに記載の方法により製造された活性化型細胞傷害性Tリンパ球CTL。請求項1~4のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するT細胞受容体TCRであって、該TCRが、請求項21若しくは22の細胞傷害性Tリンパ球CTLから得られるか、または該TCRと機能上同等な分子である、TCR。請求項22または23に記載のT細胞受容体TCRをコードする核酸。請求項22または23に記載のT細胞受容体TCRを発現することが可能な発現ベクター。請求項1~4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、有効量患者に投与される請求項22若しくは23に定義されるところの細胞傷害性Tリンパ球CTLを含む、標的細胞の死滅剤。請求項1~4のいずれかに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤であって、請求項22若しくは23に定義されるところのT細胞受容体TCRまたは当該TCRと機能上同等な分子をコードする核酸が導入された、患者から得られた細胞傷害性Tリンパ球CTLを含む、標的細胞の死滅剤。標的細胞が癌細胞である、請求項16、26および27のいずれか1つに記載の患者における標的細胞の死滅剤。癌が、請求項1~4のいずれかに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する腎癌である、請求項28に記載の患者における標的細胞の死滅剤。請求項1~4のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを患者中で異常に発現している標的細胞の死滅剤の製造における、請求項22または23に定義されるところの細胞傷害性Tリンパ球CTLの使用。本発明により、この目的は、添付された配列表の配列番号1ないし配列番号338のいずれかの少なくとも1の配列を含んでなるペプチドの群から選択される腫瘍関連ペプチドを提供することにより解決されるものであって、該ペプチドはヒト主要組織適合遺伝子複合体MHCクラスIIの分子に結合する能力を有する。本発明はさらに、抗腫瘍免疫応答を導き出すためのワクチン組成物で使用し得る、ヒト腫瘍細胞株、とりわけ腎癌細胞株のHLAクラスII分子由来の338種の新規ペプチド配列に関する。該新規ペプチド配列は、定義された例えば腫瘍関連抗原の未知の天然にプロセシングされたHLAクラスIIリガンドの同定のための新たなかつ一般に応用可能な組合せアプローチにより同定された。従って、ペプチドに基づく免疫療法の新たなかつ有望な候補が、著しく興味深い腫瘍抗原の選択およびそれに由来するペプチド配列の慎重な決定を包含する様式で同定された。本発明の第一の局面は、配列番号1ないし配列番号338若しくはそれらのバリアントのいずれかのアミノ酸配列を含んでなるペプチドを提供するが、但し、該ペプチドは、該アミノ酸配列が由来する無傷のヒトポリペプチドすなわち遺伝子座連関ID受入番号、下の付属の表を参照されたいに列挙されるところの完全長配列の1つでない。下に本明細書に下述されるとおり、本発明の基礎を形成するペプチドは、MHCクラスIIをもつ細胞Awells細胞により提示されるとして全部が同定された。従って、これらの特定のペプチド、ならびに該配列を含有する他のペプチドすなわち派生ペプチドは、こうした応答が誘導されるであろう程度が個々のペプチドごとに変動するかもしれないが、おそらく全部が特異的T細胞応答を導き出すであろう。差異は、例えば前記ペプチド中の突然変異により引き起こされ得る下を参照されたい。当業者は、とりわけ本明細書の実施例およびそれぞれの文献を参照して、個々のペプチドにより応答が誘導される程度を決定するために適用し得る方法を知っている。好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号1ないし配列番号338若しくはそれらのバリアントのいずれかのアミノ酸配列より本質的になる。より本質的になることは、本発明のペプチドが、配列番号1ないし配列番号338若しくはそれらのバリアントのいずれかの配列に加えて、結合モチーフを含んでなるペプチドのコア配列および免疫原性Tヘルパーエピトープとして機能する、ペプチドの形成部分で必須ではないアミノ酸の付加的なNおよび/若しくはC末端に位置するひと配列stretchを含有することを意味している。にもかかわらず、これらのひと配列は、本発明のペプチドの細胞中への効率的な導入を提供するために重要であり得る。本発明の一態様において、本発明のペプチドは、NCBI、GenBank受入番号X00497Strubin,M.、Mach,BとLong,E.O.ThecomletesequenceofthemRNAfortheHLA-DR-associatedinvariantchainrevealsapolypeptidewithanunusualtransmembranepolarityEMBOJ.34、869-8721984に由来するところのHLA-DR抗原関連インバリアント鎖p33、以下でIiの80のN末端アミノ酸を含んでなる。所定のアミノ酸配列のバリアントにより、われわれは、ペプチドが、該所定のアミノ酸配列よりなるペプチドと実質的に同じ方法でHLA分子に結合することがなお可能であるような、アミノ酸残基の例えば1若しくは2個の側鎖が例えばそれらを別の天然に存在するアミノ酸残基の側鎖若しくは何らかの他の側鎖で置換することにより変えられることを意味している。例えば、ペプチドは、それが、HLA-DRのような適するMHC分子と相互作用しかつそれを結合する能力を改良しない場合は少なくとも維持するように、また、それが、本発明の局面で定義されるところのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを異常に発現する細胞を認識かつ死滅させ得る活性化型CTLを生成させる能力を改良しない場合は少なくとも維持するように、改変しうる。以下で記述されるところのデータベースに由来し得るとおり、HLA-DR結合ペプチドのある位置は、典型的に、HLAの結合溝の結合モチーフに嵌るコア配列を形成するアンカー残基である。これらおよびHLA-DRの結合に関与する他の残基の改変は、CTL認識を変えることなく結合を高めうる。T細胞受容体と相互作用するのに不可欠でないアミノ酸残基は、その組み込みがT細胞反応性を実質的に遂げずかつ関連するMHCへの結合を除外しない別のアミノ酸での置換により改変し得る。従って、与えられる条件から離れて、本発明のペプチドは、与えられるところのアミノ酸配列またはそれらの一部分若しくはバリアントを包含するいかなるペプチドその用語によりオリゴペプチド若しくはポリペプチドを包含するでもありうる。これらのペプチドが、ある種のHLA特異的アミノ酸モチーフ、ならびに場合によってはコア配列の機能を妨害しないすなわちペプチドおよびT細胞の相互作用にとって不適切と思われないNおよび/若しくはC末端の延長を有するコア配列から構成されることが、MHCクラスIIで提示されるペプチドについてさらに既知である。該Nおよび/若しくはC末端の延長は、それぞれ長さが1ないし10アミノ酸の間であり得る。従って、本発明の好ましいペプチドは、9と30アミノ酸の間の全体長さを表す。これらのペプチドを、MHCクラスII分子を添加するために直接使用し得るか、若しくは、該配列を下の記述によるベクターに該配列をクローン化し得るかのいずれかである。これらのペプチドは、細胞内でより長いペプチドのプロセシングの最終産物を形成するため、より長いペプチドを同様に使用し得る。本発明のペプチドはいかなる大きさのものであってもよいが、しかし、典型的にはそれらは分子量が100000未満、好ましくは50000未満、より好ましくは10000未満、および典型的には約5000でありうる。アミノ酸残基の数に関して、本発明のペプチドは、1000残基未満、好ましくは500残基未満、より好ましくは100残基未満を有しうる。約12アミノ酸残基より大きいペプチドを使用してMHC分子に直接結合する場合は、コアHLA結合領域に隣接する残基が、MHC分子の結合溝に特異的に結合するか若しくはCTLにペプチドを提示する該ペプチドの能力に実質的に影響を及ぼさないものであることが好ましい。しかしながら、これらのより大きいペプチドは抗原提示細胞により断片化されうるため、上で既に示したとおり、とりわけポリヌクレオチドによりコードされる場合は、より大きいペプチドを使用しうることが認識されるであろう。MHCリガンド、モチーフ、バリアントのペプチドの例、ならびにNおよび/若しくはC末端の延長のある種の例は、例えば、http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/のデータベースSYFPEITHIRammenseeH、BachmannJ、EmmerichNP、BachorOA、StevanovicS.SYFPEITHI:detabaseforMHCligandsandpeptidemotifs.Immunogenetics.1999Nov;503-4:213-9.総説、および本明細書に引用されるところの参考文献由来であり得る。制限しない例として、該データベース中のHLA-DRのある種のペプチドは、Igκ鎖の188-203由来のKHKVYACEVTHQGLSSKovatsらEurJImmunol.1997Apr;274:1014-21;Igκ鎖の145-159由来のKVQWKVDNALQSGNSKovatsらEurJImmunol.1997Apr;274:1014-21、GAD65の270-283由来のLPRLIAFTSEHSHFEndlらJClinInvest.1997May15;9910:2405-15、若しくはGAD65の556-575由来のFFRMVISNPAATHQDIDFLIEndlらJClinInvest.1997May15;9910:2405-15である。加えて、ペプチドは、bcr-ablの210kDの融合タンパク質由来のATGFKQSSKALQRPVAStenBoschらBlood.1996Nov;889:3522-7、HCV-1N33の28-41DiepolderらJVirol.1997Aug;718:6011-9由来のGYKVLVLNPSVAAT、若しくはHIV-1HXB2RTの326-345由来のFRKQNPDIVIQYMDDLYVGvanderBurgらJImmunol.1999Jan1;1621:152-60の場合でのような、抗原の変異された配列にもまた由来し得る。全部のアンカーアミノ酸Friedeら、BiochimBiophysActa.1996Jun7;13162:85-101;SeeteらJImmunol.1993Sep15;1516:3163-70.;HammerらCell.1993Jul16;741:197-203.、およびHammerらJExpMed.1995May1;1815:1847-55を参照されたい。HLA-DR4の例としてを太字で示し、推定のコア配列に下線を付けている。全部の上述されたペプチドは、所定のアミノ酸配列のバリアントという用語により包含される。ペプチドにより、われわれは、アミノ酸がペプチド-CO-NH-結合により結合されている分子のみならず、しかしまたペプチド結合が反転されている分子も包含する。こうしたretro-inversoペプチド模倣物は、例えばMeziereら1997J.Immunol.159、3230-3237引用することにより本明細書に組み込まれるに記述されるもののような当該技術分野で既知の方法を使用して作成しうる。このアプローチは、バックボーンを伴いかつ側鎖の指向を伴わない変更を含有する擬似ペプチドを作成することを必要とする。Meziereら1997は、少なくともMHCクラスIIおよびTヘルパー細胞応答にこれらの擬似ペプチドが有用であることを示す。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含有するretro-invesoペプチドは、タンパク質分解に対しはるかにより抵抗性である。典型的には、本発明のペプチドは、抗原提示細胞中で発現される場合に、適切なMHC分子に結合することが可能でありそして適する細胞により提示されかつ適するT細胞応答を導き出しうるフラグメントが生じられるように、プロセシングされうるものである。該ペプチドから生じられるフラグメントもまた本発明のペプチドでありうることが認識されるであろう。便宜的に、本発明のペプチドは、所定のアミノ酸配列またはそれらの一部分若しくはバリアントを包含する一部分、および何らかの所望の特性を賦与するさらなる一部分を含有する。例えば、さらなる部分は、さらなるT細胞エピトープ第一のT細胞エピトープ含有部分と同一のポリペプチド由来であろうとそうでなかろうとを包含しうるか、または、それは担体タンパク質若しくはペプチドを包含しうる。従って、一態様において、本発明のペプチドは、切断型のヒトタンパク質、または、タンパク質フラグメントおよび別のポリペプチド部分の融合タンパク質であるが、但し、ヒト部分は1種もしくはそれ以上の発明のアミノ酸配列を包含する。とりわけ好ましい一態様において、本発明のペプチドは、本発明のアミノ酸配列、および最低1個のさらなるT細胞エピトープを包含し、該さらなるT細胞エピトープは、腫瘍関連抗原を異常に発現する腫瘍の型に向けられたT細胞応答の産生を助長することが可能である。従って、本発明のペプチドは、ワクチンとしてもまた使用し得るいわゆる数珠状構造beadsonastringポリペプチドを包含する。いくつかの応用において、本発明のペプチドを直接使用しうるすなわち、それらは患者の細胞若しくは患者に与えられる細胞中でのポリヌクレオチドの発現により産生されないことが以下から認識されるであろう。こうした応用において、ペプチドが100残基未満を有することが好ましい。本発明のペプチドがHLA-DRに結合することが可能である場合が好ましい。ペプチドがHLA-DR4に選択的に結合する場合がとりわけ好ましい。本発明のペプチドは、本発明の本ペプチドの基礎を形成するポリペプチドを異常に発現する細胞を標的としかつ死滅させるための免疫療法の方法でとりわけ有用である。所定のアミノ酸配列よりなるこれらの特定のペプチドはHLA-DRに結合するため、本発明のペプチドが、HLA-DRに結合し、かつ、そのように結合された場合に、HLA-DR-ペプチド複合体が、適する抗原提示細胞の表面上に存在する場合に所定のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するCTLの産生を導き出すことが可能であることが好ましい。本発明の一態様において、本発明のペプチドは、NCBI、GenBank受入番号X00497に由来するところのHLA-DR抗原関連インバリアント鎖p33、以下でIiの80のN末端アミノ酸を含んでなる。異常に発現されるにより、われわれは、該ポリペプチドが正常な発現レベルに比較して過剰発現されている、若しくは、腫瘍が由来する組織中で該遺伝子がサイレントであるがしかし腫瘍中でそれが発現されるという意味を包含する。過剰発現されるにより、われわれは、該ポリペプチドが正常組織中に存在するレベルの最低1.2倍;好ましくは正常組織中に存在するレベルの最低2倍、およびより好ましくは最低5若しくは10倍のレベルで存在することを意味している。ペプチド少なくともアミノ酸残基間のペプチド結合を含有するものは、Luら1981J.Org.Chem.46、3433およびその中の参考文献により開示されたところの固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミドモードにより合成しうる。一時的なNアミノ基保護は9-フルオレニルメチルオキシカルボニルFmoc基により提供される。この高度に塩基不安定性の保護基の反復切断は、N,N-ジメチルホルムアミド中20ピペリジンを使用して遂げられる。側鎖の官能性は、それらのブチルエーテルセリン、トレオニンおよびチロシンの場合、ブチルエステルグルタミン酸およびアスパラギン酸の場合、ブチルオキシカルボニル誘導体リシンおよびのヒスチジンの場合、トリチル誘導体システインの場合ならびに4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル誘導体アルギニンの場合として保護しうる。グルタミン若しくはアスパラギンがC末端残基である場合、側鎖のアミド官能性の保護に4,4-ジメトキシベンズヒドリル基が利用される。固相支持体は、3種の単量体、ジメチルアクリルアミドバックボーン単量体、ビスアクリロイルエチレンジアミン架橋剤およびアクリロイルサルコシンメチルエステル官能性化剤から構成されるポリジメチル-アクリルアミドポリマーに基づく。使用されるペプチドから樹脂の切断可能な結合剤は、酸不安定性の4-ヒドロキシメチル-フェノキシ酢酸誘導体である。全部のアミノ酸誘導体は、アスパラギンおよびグルタミン反転N,N-ジシクロヘキシル-カルボジイミド/1ヒドロキシベンゾトリアゾールに媒介されるカップリング手順を使用して付加されるを除き、それらの予め形成された対称性の無水物誘導体として付加される。全部のカップリングおよび脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸若しくはイソチン試験手順を使用してモニターする。合成の完了に際し、50スカベンジャー混合物を含有する95トリフルオロ酢酸での処理による側鎖保護基の同時の除去で、樹脂支持体からペプチドを切断する。一般に使用されるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、正確な選択は合成されているペプチドの構成アミノ酸に依存する。トリフルオロ酢酸は、ジエチルエーテルとのその後の摩砕を用いる真空中での蒸発により除去されて、粗ペプチドを提供する。存在するいかなるスカベンジャーも、水相の凍結乾燥に際してスカベンジャーを含まない粗ペプチドを提供する単純な抽出手順により除去される。ペプチド合成のための試薬は、一般に、Calbiochem-NovabiochemUKLtd.、NottinghamNG72QJ、UKから入手可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および通常は逆相高速液体クロマトグラフィーのようないずれか1つの技術若しくはそれらの組合せにより遂げることができる。ペプチドの分析は、酸加水分解後の薄層クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アミノ酸分析を使用して、ならびに、高速原子衝撃FAB質量分析、ならびにMALDIおよびESI-Q-TOF質量分析により実施しうる。本発明のさらなる一局面は、本発明のペプチドをコードする核酸例えばポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA若しくはそれらの組合せであることができ、また、それは、それが該ペプチドをコードする限りはイントロンを含有しても若しくはしなくてもよい。もちろん、それは、ポリヌクレオチドによりコード可能である、天然に存在するペプチド結合により結合された天然に存在するアミノ酸を含有するペプチドのみである。本発明のなおさらなる一局面は、本発明のポリペプチドを発現することが可能な発現ベクターを提供する。例えば相補的付着端を介してベクターにポリヌクレオチド、とりわけDNAを作動可能に連結するための多様な方法が開発された。例えば、相補的ホモポリマー領域を、ベクターDNAに挿入されるべきDNAセグメントに付加し得る。ベクターおよびDNAセグメントをその後、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合により結合して組換えDNA分子を形成する。1個若しくはそれ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ベクターへのDNAセグメントの一代替結合方法を提供する。前に記述されたところのエンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるDNAセグメントを、バクテリオファージT4DNAポリメラーゼ若しくは大腸菌E.coliDNAポリメラーゼIで処理し、これらの酵素は突出している3一本鎖末端をそれらの3-5-エキソヌクレアーゼ活性で除去し、そしてそれらのポリメラーゼ活性でくぼんだ3端を埋める。これらの活性の組合せは従って平滑端のDNAセグメントを生成する。該平滑端セグメントをその後、バクテリオファージT4DNAリガーゼのような平滑端DNA分子の核酸連結を触媒することが可能である酵素の存在下で、モル濃度大過剰のリンカー分子とともにインキュベートする。従って、該反応の生成物はそれらの端にポリマーリンカー配列を運搬するDNAセグメントである。これらのDNAセグメントをその後、適切な制限酵素で切断し、そして、該DNAセグメントの末端と適合する末端を生じる酵素で切断した発現ベクターに連結する。多様な制限酵素部位を含有する合成リンカーは、InternationalBiotechnologiesInc、米国コネチカット州ニューヘイブンを包含する多数の供給源から商業的に入手可能である。本発明のポリペプチドをコードするDNAの望ましい一改変方法は、Saikiら1988Science239、487-491により開示されたところのポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法は、例えば適する制限部位で設計することにより、適するベクターにDNAを導入するのに使用しうるか、若しくは、それを使用して、当該技術分野で既知であるところの他の有用な方法でDNAを改変しうる。この方法において、酵素で増幅されるべきDNAは、該増幅されたDNAにそれら自身が組み込まれる2種の特異的プライマーにより隣接される。前記特異的プライマーは、当該技術分野で既知の方法を使用して発現ベクターにクローン化するのに使用し得る、制限酵素認識部位を含有しうる。DNA若しくはレトロウイルスベクターの場合はRNAがその後、適する宿主中で発現されて、本発明の化合物を含んでなるポリペプチドを産生する。従って、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするDNAを、本明細書に含有される教示を鑑みて適切に改変された既知技術に従って使用して発現ベクターを構築することができ、この発現ベクターをその後、本発明のポリペプチドの発現および産生のため適切な宿主細胞を形質転換するのに使用する。こうした技術は、Rutterらに1984年4月3日に発行された米国特許第4,440,859号、Weissmanに1985年7月23日に発行された同第4,530,901号、Crowlに1986年4月15日に発行された同第4,582,800号、Markらに1987年6月30日に発行された同第4,677,063号、Goeddelに1987年7月7日に発行された同第4,678,751号、Itakuraらに1987年11月3日に発行された同第4,704,362号、Murrayに1987年12月1日に発行された同第4,710,463号、Toole,Jr.らに1988年7月12日に発行された同第4,757,006号、Goeddelらに1988年8月23日に発行された同第4,766,075号、およびStalkerに1989年3月7日に発行された同第4,810,648号明細書それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれるに開示されるものを包含する。本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするDNA若しくはレトロウイルスベクターの場合はRNAは、適切な宿主への導入のために多様な他のDNA配列に結合しうる。伴companionDNAは、宿主の性質、宿主細胞への該DNAの導入の様式、およびエピソーム維持が望ましいか若しくは組込みが望ましいかに依存することができる。一般に、DNAは、プラスミドのような発現ベクターに、発現のための適正な向きおよび正しい読み枠で挿入する。必要な場合は、DNAは所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節性の制御ヌクレオチド配列に連結しうるが、こうした制御配列は発現ベクターで一般に利用可能である。ベクターをその後、標準的技術により宿主に導入する。一般に、宿主の全部がベクターにより形質転換されるわけではない。従って、形質転換された宿主細胞を選択することが必要となる。一選択技術は、抗生物質耐性のような、形質転換された細胞中の選択可能な特質をコードするいずれかの必要な調節領域とともに、DNA配列を発現ベクターに組み込むことを伴う。あるいは、こうした選択可能な特質の遺伝子は、所望の宿主細胞を共形質転換するのに使用する別のベクター上にあってよい。本発明の組換えDNAにより形質転換された宿主細胞をその後、ポリペプチドの発現を可能にするための本明細書に開示される教示を鑑み、十分な時間、および当業者に既知の適切な条件下で培養し、ポリペプチドをその後回収してよい。細菌例えば大腸菌E.coliおよび枯草菌Bacillussubtilis、酵母例えば出芽酵母Saccharomycescerevisiae、糸状菌例えばアスペルギルス属Aspergillus、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を包含する多くの発現系が既知である。好ましくは、該系はAwells細胞であってよい。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写を起こさせる、DNA配列により形成される発現調節領域である。模範的な細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列は、典型的に、本発明のDNAセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクター中に提供されている。典型的な原核生物ベクタープラスミドは、BioradLaboratoris、米国カリフォルニア州リッチモンドから入手可能なpUC18、pUC19、pBR322およびpBR329、ならびにPharmacia、米国ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なpTrc99AおよびpKK223-3である。典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia、米国ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なpSVLである。このベクターは、クローン化した遺伝子の発現を駆動するのにSV40後期プロモーターを使用し、最高レベルの発現はCOS-1細胞のようなT抗原産生細胞で見出される。誘導可能な哺乳動物発現ベクターの一例は、またPharmaciaから入手可能なpMSGである。このベクターは、クローン化した遺伝子の発現を駆動するために、マウス乳癌ウイルス末端反復配列のグルココルチコイドで誘導可能なプロモーターを使用する。有用な酵母プラスミドベクターはpRS403-406およびpRS413-416であり、そして一般にStratageneCloningSystems、LaJolla、CA92037、USAから入手可能である。プラスミドpRS403、pRS404、pRS405およびpRS406は酵母組込み型プラスミドYIpであり、そして酵母の選択可能なマーカー、HIS3、TRP1、LEU2およびURA3を組み込む。プラスミドpRS413-416は酵母セントロメアプラスミドYcpである。多様な宿主細胞との使用のための他のベクターおよび発現系が当該技術分野で公知である。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換された宿主細胞にも関する。該宿主細胞は原核生物若しくは真核生物のいずれかであり得る。細菌細胞はいくつかの環境で好ましい原核生物宿主細胞であることができ、そして、典型的には、例えば、BethesdaResearchLaboratoriesInc.、米国メリーランド州ベセスダから入手可能な大腸菌E.coli株DH5、および米国メリーランド州ロックビルのAmericanTypeCultureCollectionATCCから入手可能なRR1NoATCC31343のような大腸菌E.coliの株である。好ましい真核生物宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル若しくはヒト線維芽および腎細胞株からのもののような脊椎動物細胞を包含する。酵母宿主細胞は、StratageneCloningSystems、LaJolla、CA92037、米国から一般に入手可能であるYPH499、YPH500およびYPH501を包含する。好ましい哺乳動物宿主細胞は、CCL61としてATCCから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、CRL1658としてATCCから入手可能なNIHSwissマウス胚細胞NIH/3T3、CRL1650としてATCCから入手可能なサル腎由来COS-1細胞、およびヒト胎児由来腎臓細胞である293細胞を包含する。好ましい昆虫細胞はバキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトし得るSf9細胞である。本発明のDNA構築物での適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターの型に典型的に依存する公知の方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohenら1972Proc.Natl.Acad.Sci.USA69、2110およびSambrookら1989MolecularCloning,ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Shermanら1986MethodsInYeastGenetics,ALaboratoryManual、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに記述されている。Beggs1978Nature275、104-109の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、こうした細胞のトランスフェクションにおいて有用な試薬、例えばリン酸カルシウムおよびDEAE-デキストラン若しくはリポソーム製剤が、StratageneCloningSystems、若しくはLifeTechnologiesInc.、Gaithersburg、MD20877、米国から入手可能である。電気穿孔法もまた細胞を形質転換および/若しくはトランスフェクトするのに有用であり、また、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞および脊椎動物細胞を形質転換するために当該技術分野で公知である。成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のDNA構築物を含有する細胞は、公知の技術により同定し得る。例えば、本発明の発現構築物の導入から生じる細胞を、本発明のポリペプチドを産生させるために増殖させ得る。細胞を収集かつ溶解し得、そしてそれらのDNA内容物を、Southern1975J.Mol.Biol.98、503若しくはBerentら1985Biotech.3、208により記述されたもののような方法を使用して、該DNAの存在について検査し得る。あるいは、上清中の外タンパク質の存在を、下述されるところの抗体を使用して検出し得る。組換えDNAの存在について直接アッセイすることに加え、成功裏の形質転換は、組換えDNAがタンパク質の発現を指図することが可能である場合に、公知の免疫学的方法により確認し得る。例えば、発現ベクターで成功裏に形質転換された細胞は、適切な抗原性を表すタンパク質を産生する。形質転換されていることが疑われる細胞のサンプルを収集し、そして、適する抗体を使用してタンパク質についてアッセイする。従って、形質転換された宿主細胞それら自身に加え、本発明はまた、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナルクローン的に均一な培養物、若しくはモノクローナル培養物由来の培養物も企図している。本発明のある種の宿主細胞、例えば細菌、酵母および昆虫細胞が、本発明のペプチドの製造で有用であることが認識されるであろう。しかしながら、他の宿主細胞がある種の治療方法で有用でありうる。例えば、樹状細胞のような抗原提示細胞は、それらが適切なMHC分子に負荷されうるような本発明のペプチドを発現させるために有用に使用しうる。本発明のさらなる一局面は、静脈内i.v.注入、皮下s.c.注入、皮内i,d.注入、腹腔内i.p.注入、筋肉内i.m.注入のためのペプチドの製造方法を提供する。好ましいペプチド注入方法はs.c.、i.p.およびi.v.である。好ましいDNA注入方法は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.およびi.v.である。1から500mgのペプチド若しくはDNAの用量を与えうる。本発明のさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、有効量の本発明のペプチド、または有効量の前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは発現ベクターを患者に投与することを含んでなり、前記ペプチドの該量または前記ポリヌクレオチド若しくは発現ベクターの量は、前記患者で抗標的細胞免疫応答を惹起するのに有効である。標的細胞は、典型的に腫瘍若しくは癌細胞である。ペプチド若しくはペプチドをコードする核酸は腫瘍若しくは癌ワクチンを構成する。それは患者に、冒された器官に直接投与しうるか、またはその後患者に投与される該患者由来の細胞若しくはヒト細胞株にexvivoで適用しうるか、または、その後患者に再投与される該患者由来の免疫細胞からの亜集団を選択するためにinvitroで使用しうる。核酸をinvitroで細胞に投与する場合、インターロイキン-2のような免疫刺激サイトカインを共発現するようにトランスフェクトすることが細胞に有用でありうる。該ペプチドは、実質的に純粋であっても、若しくはDetoxのような免疫刺激アジュバントと組合せても、若しくは免疫刺激サイトカインとともに使用しても、若しくは適する送達系、例えばリポソームを用いて投与してもよい。該ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシアニンKLH若しくはマンナンのような適する担体にも複合しうるWO95/18145号、およびLongeneckerら1993Ann.NYAcad.Sci.690、276-291を参照されたい。該ペプチドはまた、標識しても、若しくは融合タンパク質であっても、若しくはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明で示されるペプチドが発現されてCD4CTLを刺激する。しかしながら、刺激は、CD4T細胞により提供される援助の存在下でより効率的である。従って、ハイブリッド分子の融合パートナー若しくは区分は、CD4T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。CD4を刺激するエピトープは当該技術分野で公知であり、そして破傷風トキソイド中で同定されたものを包含する。該ポリヌクレオチドは、実質的に純粋であっても、または適するベクター若しくは送達系に含有されてもよい。適するベクターおよび送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、若しくは1種以上のウイルスの要素を含有するハイブリッドに基づく系のようなウイルスを包含する。ウイルス以外の送達系は、DNA送達の技術分野で公知であるところの陽イオン性脂質および陽イオン性ポリマーを包含する。遺伝子銃を介するような物理的送達もまた使用しうる。該ペプチド、若しくは該核酸によりコードされるペプチドは、例えば、CD4T細胞を刺激する破傷風トキソイドからのエピトープをもつ融合タンパク質でありうる。癌ワクチンでの使用のためのペプチドはいかなる適するペプチドでもありうる。とりわけ、それは適する9merペプチド、あるいは適する7mer若しくは8mer若しくは10mer若しくは11merペプチドまたは12merでありうる。より長いペプチドもまた適しうるが、しかし付属の表1に記述されるところの9mer若しくは10merペプチドが好ましい。適切には、患者に投与されるいかなる核酸も無菌でありかつ発熱性物質を含まない。裸のDNAは筋肉内若しくは皮内若しくは皮下に与えうる。ペプチドは筋肉内、皮内若しくは皮下に与えうる。ワクチン接種は専門の抗原提示細胞により刺激されるCTL応答をもたらし、CTLが一旦刺激されれば、腫瘍細胞中でのMHC発現の増強において一利点が存在しうる。注入の部位、ターゲッティングベクターおよび送達系の使用、または患者からのこうした細胞集団の選択的精製およびペプチド若しくは核酸のexvivo投与のいずれかにより、ワクチンの標的を特定の細胞集団、例えば抗原提示細胞に向けることもまた有用でありうる例えば、樹状細胞を、Zhouら1995Blood86、3295-3301;Rothら1996Scand.J.Immunology43、646-651に記述されるとおり選別しうる。例えば、ターゲッティングベクターは、適する場所での抗原の発現を指図する組織若しくは腫瘍特異的プロモーターを含みうる。本発明のさらなる一局面は、従って、有効量の本発明のペプチドを含んでなるか若しくはこうしたペプチドをコードする核酸を含んでなる、癌、または癌若しくは腫瘍細胞に対し有効なワクチンを提供する。ワクチンが核酸ワクチンである場合がとりわけ好ましい。ポリペプチドをコードするDNAワクチンのような核酸ワクチンでの接種がT細胞応答につながることが既知である。便宜上、核酸ワクチンは、いかなる適する核酸送達手段も含みうる。核酸、好ましくはDNAは裸でありうるすなわち投与されるべき他の成分を実質的に含まないか、または、それはリポソーム中で若しくはウイルスベクター送達系の一部として送達されうる。樹状細胞による核酸の取り込みおよびコードされるポリペプチドの発現が、免疫応答のプライミングの機構でありうると考えられるが、しかしながら、樹状細胞はトランスフェクトされなくてもよいがしかしなお重要である。それらは、トランスフェクトされた細胞からの発現されたペプチドを組織中に取り込みうるからである。DNAワクチンのようなワクチンが筋中に投与される場合が好ましい。ワクチンが皮膚に投与される場合もまた好ましい。核酸ワクチンはアジュバントを伴わずに投与してもよい。核酸ワクチンはまた、BCG若しくは明礬のようなアジュバントとともにも投与しうる。他の適するアジュバントは、サポニン由来であるAquilaのQS21スティミュロンstimulonAquilaBiotech、米国マサチューセッツ州ウースター、ミコバクテリウム抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、ならびにRibiのDetoxのような特許のアジュバントを包含する。別のサポニン由来アジュバント、QuilAもまた使用しうるSuperfos、デンマーク。核酸ワクチンがアジュバントを伴わずに投与される場合が好ましい。フロイントのアジュバントのような他のアジュバントもまた有用でありうる。キーボールリンペットヘモシアニンに、好ましくはまたアジュバントと複合させたペプチドを与えることもまた有用でありうる。癌のペプチドヌクレオチド媒介性の免疫療法は、Conryら1996SeminarsinOncology23、135-147;Condonら1996NatureMedicine2、1122-1127;Gongら1997NatureMedicine3、558-561;Zhaiら1996J.Immunol.156、700-710;Grahamら1996IntJ.Cancer65、664-670;およびBreastCancer,Advancesinbiologyandtherapeutics、Calvoら編、JohnLibbeyEurotext中、Burchellら1996pp309-313それらの全部は引用することにより本明細書に組み込まれるに記述されている。本発明のなおさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞を死滅させるための医薬品の製造における、本発明のペプチド、またはこうしたペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは発現ベクターの使用を提供する。本発明のさらなる一局面は、invitroでの活性化型細胞傷害性Tリンパ球CTLの製造方法を提供し、該方法は、CTLを、適する抗原提示細胞の表面上に発現された、抗原負荷ヒトクラスIIMHC分子と、前記CTLを抗原該抗原は本発明のペプチドである特異的様式で活性化するのに十分な時間、invitroで接触させることを含んでなる。適しては、CTLは、好ましくはTH1型のCD4ヘルパー細胞である。MHCクラスII分子は、いかなる適する細胞の表面上に発現されてもよく、また、細胞がMHCクラスII分子を天然に発現しないその場合、該細胞はこうした分子を発現するようトランスフェクトされるか、またはそれが発現する場合はそれが抗原プロセシング若しくは抗原提示経路に欠陥があるものである場合が好ましい。こうして、MHCクラスII分子を発現する細胞が、CTLを活性化する前に選ばれたペプチド抗原で実質的に完全に予備刺激されることが可能である。抗原提示細胞若しくは刺激体stimulator細胞は、典型的にその表面上に1個のMHCクラスII分子を有し、そして、好ましくは、前記MHCクラスII分子に選択された抗原をそれ自身負荷することが実質的に不可能である。より詳細に下述されるとおり、MHCクラスII分子は、選択された抗原をinvitroで容易に負荷されうる。好ましくは、該哺乳動物細胞は、TAPペプチド輸送体を欠くか、若しくはその低下されたレベルを有するか、若しくはその低下された機能を有する。TAPペプチド輸送体を欠く適する細胞は、T2、RMA-SおよびショウジョウバエDrosophila細胞を包含する。TAPは、抗原プロセシングに関与する輸送体TransporterAssociatedwithantigenProcessingである。ヒトペプチド負荷欠損細胞株humanpeptideloadingdeficientcelllineT2は、カタログ番号CRL1992で、AmericanTypeCultureCollection、12301ParklawnDrive、Rockville、Maryland20852、USAから入手可能であり;ショウジョウバエDrosophila細胞株Schneider株2は、カタログ番号CRL19863でATCCから入手可能であり;マウスRMA-S細胞株は、KarreとLjunggren1985J.Exp.Med.162、1745引用することにより本明細書に組み込まれるに記述されている。便宜上、前記宿主細胞は、トランスフェクション前にMHCクラスI分子を実質的に発現しない。刺激体細胞が、B7.1、B7.2、ICAM-1およびLFA3のいずれかのようなT細胞共刺激に重要な分子を発現する場合もまた好ましい。多数のMHCクラスII分子および共刺激体分子の核酸配列は、GenBankおよびEMBLデータベースから公的に入手可能である。さらなる一態様において、HLA分子の組合せもまた使用しうる。複数のCD8CTLエピトープの送達のための組換え多エピトープワクチンの使用は、Thomsonら1996J.Immunol.157、822-826およびWO96/03144号それらの双方は引用することにより本明細書に組み込まれるに記述されている。本発明に関して、単一のワクチン中に1種のペプチド若しくは1種のペプチドをコードする核酸を包含することが望ましいことができ、該ペプチドは、本発明のアミノ酸配列およびCD4T細胞を刺激するエピトープ破傷風トキソイドのようなをいずれかの順序で包含する。こうしたワクチンは、癌を処置するのにとりわけ有用であるとみられる。こうした数珠状構造ワクチンは、典型的にはDNAワクチンである。invitroでCTLを生成するのに多数の他の方法を使用しうる。例えば、Peoplesら1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92、432-436およびKawakamiら1992J.Immunol.148、638643に記述される方法は、CTLの生成で自己の腫瘍浸潤リンパ球を使用する。Plebanskiら1995Eur.J.Immunol.25、1783-1787は、CTLの製造で自己の末梢血リンパ球PLBを利用する。Jochmusら1997J.Gen.Virol.78、1689-1695は、ペプチド若しくはポリペプチドで樹状細胞をパルスすることを使用することによるか、または組換えウイルスへの感染を介する、自己CTLの製造を記述する。Hillら1995J.Exp.Med.181、2221-2228およびJeromeら1993J.Immunol.151、1654-1662は、自己CTLの製造でB細胞を利用する。加えて、ペプチド若しくはポリペプチドでパルスしたか、または組換えウイルスに感染させたマクロファージを、自己CTLの製造で使用しうる。同種異系細胞もまたCTLの製造に使用することができ、そして、この方法はWO97/26328号引用することにより本明細書に組み込まれるに詳細に記述されている。例えば、ショウジョウバエDrosophila細胞およびT2細胞に加え、CHO細胞、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞、細菌、酵母、ワクシニアに感染させた標的細胞のような他の細胞を使用して抗原を提示しうる。加えて、植物ウイルスを使用しうる例えば、外来ペプチドの提示のための多収性の系としてのササゲモザイクウイルスの開発を記述するPortaら1994Virology202、449-955を参照されたい。本発明のペプチドに向けられる活性化型CTLは治療で有用である。従って、本発明のさらなる一局面は、本発明の前述の方法により得ることができる活性化型CTLを提供する。本発明のなおさらなる一態様は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する活性化型CTLを提供する。好ましくは、該CTLはHLA/ペプチド複合体と相互作用例えば結合することにより前記細胞を認識する。該CTLは、有効な数の活性化型CTLを患者に投与する、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法で有用である。患者に投与されるCTLは、患者由来でありかつ上述されたとおり活性化しうるすなわちそれらは自己CTLである。あるいは、該CTLは患者からでないが、しかし別の個体からである。もちろん、該個体が健康な個体である場合が好ましい。健康な個体により、われわれは、個体が全般として良好な健康状態にある、好ましくは適確な免疫系を有する、およびより好ましくは、容易に試験かつ検出され得るいかなる疾患にも罹っていないことを意味している。活性化型CTLは、異常なポリペプチドを発現する細胞の認識に関与するT細胞受容体TCRを発現する。TCRをコードするcDNAが活性化型CTLからクローン化されかつ発現のためさらなるCTLに移入される場合が有用である。invivoで、本発明のCD4CTLの標的細胞は、腫瘍の細胞ときにMHCクラスIIを発現するおよび/若しくは腫瘍腫瘍細胞を取り囲む間質細胞ときにまたMHCクラスIIを発現するであり得る。本発明のペプチドに特異的な本発明のCTLクローンのTCRをクローン化する。CTLクローンでのTCRの使用は、iTCR可変領域特異的モノクローナル抗体、ならびにiiVaおよびVp遺伝子ファミリーに特異的なプライマーを用いるRTPCRを使用して決定する。CTLクローンから抽出したポリAmRNAからcDNAライブラリーを調製する。TCRaおよびP鎖のC末端部分、ならびに同定されたVaおよびPセグメントのN末端部分に特異的なプライマーを使用する。TCRaおよび鎖の完全なcDNAを高忠実度DNAポリメラーゼで増幅し、そして、増幅された産物を適するクローニングベクターにクローン化する。クローン化されたaおよびP鎖遺伝子を、Chungら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91、12654-12658により記述されるところの方法により、一本鎖TCRに集成しうる。この一本鎖構築物中で、VaJセグメントにVDJセグメントが続き、次いでCpセグメント、次いでCD3鎖の膜貫通および細胞質セグメントが続く。この一本鎖TCRをその後レトロウイルス発現ベクターに挿入する一団のベクターを、成熟ヒトCD8Tリンパ球を感染させかつ遺伝子発現を媒介するそれらの能力に基づいて使用しうる。すなわち、レトロウイルスベクター系Katが1つの好ましい可能性であるFinerら1994Blood83、43を参照されたい。高力価の両指向性レトロウイルスを使用して、腫瘍患者の末梢血から単離した、精製したCD8若しくはCD4Tリンパ球をRobertsら1994Blood84、2878-2889引用することにより本明細書に組み込まれるにより公表されたプロトコルに従って感染させる。抗CD3抗体を使用して、精製したCD8T細胞の増殖を誘発し、それは一本鎖TCRのレトロウイルス組込みおよび安定な発現を助長する。レトロウイルス形質導入の効率は、一本鎖TCRに特異的な抗体での感染させたCD8T細胞の染色により決定する。形質導入されたCD8T細胞のinvitro分析は、該TCR鎖が最初にクローン化された同種拘束性allo-restrictedCTLクローンで見られると同一の腫瘍特異的死滅をそれらが表すことを確立する。期待された特異性をもつ形質導入されたCD8T細胞の集団を、腫瘍患者の養子免疫療法に使用しうる。患者は、108ないし1011の間の自己の形質導入されたCTLで処置しうる。CD8と同様に、関連する構築物を運搬する形質導入されたCD4Tヘルパー細胞を生成させ得る。遺伝子をCTLに導入するための他の適する系は、Moritzら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91、4318-4322引用することにより本明細書に組み込まれるに記述されている。Eshharら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90、720-724、およびHwuら1993J.Exp.Med.178、361-366もまた、CTLのトランスフェクションを記述している。従って、本発明のさらなる局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を認識するTCRを提供し、該TCRは活性化型CTLから得ることができる。TCRだけでなく、TCRに機能上同等な分子が本発明に包含される。これらは、TCRと同一の機能を演じ得る、TCRに機能上同等であるいかなる分子も包含する。とりわけ、こうした分子は、Chungら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91、12654-12658引用することにより本明細書に組み込まれかつ上に言及されたにより記述されかつ上に引用される方法により作成されるところの、遺伝子的に操作された3ドメインの一本鎖TCRを包含する。本発明はまた、TCR若しくは機能上同等な分子をコードするポリヌクレオチド、および該TCR若しくはその機能上同等な分子をコードする発現ベクターも包含する。本発明のTCRを発現するのに適する発現ベクターは、本発明のペプチドの発現に関して上述されたものを包含する。しかしながら、発現ベクターがトランスフェクション後にCTL中でTCRを発現することが可能であるものであることが好ましい。本発明のなおさらなる一局面は、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、1患者からCTLを得る段階;2TCR若しくは上で定義されたところの機能上同等な分子をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入する段階;および3段階2で製造した細胞を患者に導入する段階を含んでなる。本発明のなおさらなる一局面は、本発明の第一若しくは第二若しくは第三の局面で定義されるところのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を標的とする、患者における標的細胞の死滅方法を提供し、該方法は、1前記患者から樹状細胞のような抗原提示細胞を得る段階;2前記抗原提示細胞を、本発明の第一若しくは第二若しくは第三の局面で定義されるところのペプチド、またはこうしたペプチドをコードするポリヌクレオチドとexvivoで接触させる段階;および3そのように処理した抗原提示細胞を患者に再導入する段階を含んでなる。好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。適切には、樹状細胞は、抗原ペプチドでパルスされている自己の樹状細胞である。抗原ペプチドは、適切なT細胞応答を生じさせるいかなる適する抗原ペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原からのペプチドでパルスした自己の樹状細胞を使用するT細胞療法は、Murphyら1996TheProstate29、371-380およびTjuaら1997TheProstate32、272-278に開示されている。さらなる一態様において、樹状細胞のような抗原提示細胞を、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。該ポリヌクレオチドはいかなる適するポリヌクレオチドであってもよく、そして、それが樹状細胞を形質導入し、従ってペプチドの提示および免疫の誘導をもたらすことが可能であることが好ましい。便宜上、ポリヌクレオチドはウイルスポリヌクレオチド若しくはウイルスに含まれうる。例えば、アデノウイルスで形質導入した樹状細胞は、MUC1に関して抗原特異的抗腫瘍免疫を誘導することが示されたGongら1997GeneTher.4、1023-1038を参照されたい。同様に、アデノウイルスに基づく系を使用することができ例えば、Wanら1997Hum.GeneTher.8、1355-1363を参照されたい;レトロウイスル系を使用することができSpechtら1997J.Exp.Med.186、1213-1221、およびSzabolcsら1997Blood、樹状細胞への粒子媒介性移入もまた使用することができTutingら1997Eur.J.Immunol.27、2702-2707;そしてRNAもまた使用しうるAshleyら1997J.Exp.Med.186、11771182。患者における標的細胞の死滅方法に関して、標的細胞が癌細胞、より好ましくは腎癌細胞であることがとりわけ好ましいことが認識されるであろう。本発明の方法により処置される患者がHLA-DRハプロタイプを有する場合がとりわけ好ましい。従って、好ましい一態様において、患者のHLAハプロタイプを処置の前に決定する。HLAハプロタイピングは、いずれの適する方法を使用して実施してもよく、こうした方法は当該技術分野で公知である。本発明は、とりわけ、活性のinvivoワクチン接種のため;invitroでの自己の樹状細胞の操作、次いでCTL応答を活性化するためのそのように操作した樹状細胞のinvivoでの導入のため;invitroで自己CTLを活性化し、次いで養子療法のためすなわちそのように操作したCTLを患者に導入する;および健康なドナーMHCマッチ若しくはミスマッチのからのCTLをinvitroで活性化し、次いで養子療法のための、本発明のペプチド若しくはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用を包含する。好ましい一態様において、本発明のワクチンは、腫瘍の形成を阻害若しくは抑制するために、単独で、若しくは別の癌治療との組合せのいずれかで宿主に投与する。ペプチドワクチンはアジュバントを伴わずに投与しうる。ペプチドワクチンはまた、BCG若しくは明礬のようなアジュバントとともに投与してもよい。他の適するアジュバントは、サポニン由来であるAquilaのQS21スティミュロンstimulonAquilaBiotech、米国マサチューセッツ州ウースター、ミコバクテリウム抽出物、および合成の細菌細胞壁模倣物、ならびにRibiのDetoxのような特許のアジュバントを包含する。別のサポニン由来アジュバント、QuilAもまた使用しうるSuperfos、デンマーク。フロイントのアジュバント若しくはGMCSFのような他のアジュバントもまた有用でありうる。好ましくはまたアジュバントとともにのキーホールリンペットヘモシアニンに複合させたペプチドを与えることもまた有用でありうる。本発明のペプチドはまた診断試薬としても使用し得る。該ペプチドを使用して、CTL集団中に、ペプチドに特異的に向けられているCTLが存在するかどうか、若しくはCTLが治療により誘導されるかどうかを分析し得る。さらに、前駆T細胞の増大を、規定されたペプチドに対する反応性を有するペプチドを用いて試験し得る。さらに、該ペプチドを、該ペプチドが由来する前記抗原を発現する腫瘍の疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用し得る。付属の表1に、同定されたところのペプチドを列挙する。加えて、該表に、ペプチドが由来するタンパク質、およびそれぞれのタンパク質中のペプチドのそれぞれの位置を指定する。さらに、国立衛生研究所の国立バイオテクノロジー情報センターNationalCentreforBiotechnologyInformationのGenbankに関するそれぞれの受入番号を示すhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。別の好ましい態様において、該ペプチドを白血球、とりわけTリンパ球の染色に使用する。この使用は、CTL集団中に、ペプチドに向けられている特異的CTLが存在するかどうかが証明されるはずである場合にとりわけ有利である。さらに、該ペプチドを、腫瘍性疾患若しくは障害における治療の進行を決定するためのマーカーとして使用し得る。別の好ましい態様において、該ペプチドを抗体の製造に使用する。ポリクローナル抗体は、該ペプチドの注入を介する動物の免疫化、および免疫グロブリンのその後の精製により、標準的様式で得ることができる。モノクローナル抗体は、例えば、MethodsEnzymol.1986、121、Hybridomatechnologyandmonoclonalantibodiesに記述されるような標準的プロトコルに従って製造し得る。本発明は、さらなる一局面において、本発明の前記ペプチドの1種若しくはそれ以上を含有する医薬組成物に関する。本組成物は、皮下、皮内、筋肉内のような非経口投与若しくは経口投与に使用する。このため、ペプチドを、薬学的に許容される、好ましくは水性の担体に溶解若しくは懸濁する。加えて、組成物は、緩衝剤、結合剤、膨潤剤、希釈剤、着香料、滑沢剤などのような賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインのような免疫刺激物質と一緒になっても投与し得る。こうした組成物中で使用し得る賦形剤の広範囲の一覧は、例えば、A.Kibbe、HandbookofPharmaceuticalExcipients、第3版、2000、AmericanPharmaceuticalAssociationandpharmaceuticalpressから採用し得る。組成物は、腫瘍性疾患の予防prevention、予防prophylaxisおよび/若しくは治療に使用し得る。配列番号1ないし配列番号388のいずれかを含んでなる本発明のペプチドの最低1種を含有する医薬組成物を、それぞれのペプチド若しくは抗原と関連づけられる腫瘍性疾患に罹っている患者に投与する。これにより、CTL特異的免疫応答を誘発し得る。本発明の別の局面において、2種若しくはそれ以上の本発明のペプチドの組合せを、直接の組合せで若しくは同一処置レジメン内でのいずれかでワクチンとして使用し得る。さらに、他のペプチド、例えばMHCクラスI特異的ペプチドとの組合せを使用し得る。当業者は、例えばinvitroでのT細胞の生成、ならびに、それらの効率および全体的な存在、ある種のペプチドに対するある種のT細胞の増殖proliferation、親和性および増殖expansion、ならびに例えばIFN-γ産生を分析することによるT細胞の機能性を試験することにより、免疫原性ペプチドの好ましい組合せを選択することが可能であろう下の実施例もまた参照されたい。通常、最も効率的なペプチドをその後、上述されたところの目的上、ワクチンとして組み合わせる。適するワクチンは、2、3、4、5、6、7、8若しくは10種の異なるペプチド、好ましくは4、5、6若しくは7種の異なるペプチド、および最も好ましくは6種の異なるペプチドを含有することができる。最後に、ワクチンは、処置されるべき患者が罹っている癌の特定の型、ならびに、疾患の状態、以前の処置レジメン、患者の免疫状態、およびもちろん該患者のHLAハプロタイプに依存し得る。Iiの80のN末端アミノ酸が、タンパク質をクラスIIプロセシング経路に向けるのに十分であることが示されたSanderson,S.、Frauwirth,K.とShastri,N.1995Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92、7217-7221、Wang、R.F.、Wang,X.、Atwood,A.C.、Topalian,S.L.とRosenberg,S.A.1999Science284、1351-1354。本発明の概念の例示的一証明を提供するため、発明者は、Iiの80のN末端アミノ酸および多様な悪性度と関連する例示的1抗原、サイクリンD1CCND1よりなる融合タンパク質を生成した。サイクリンD1は、サイクリン依存性キナーゼとの相互作用によりG1-S移行に関与する細胞周期調節物質である。さらに、サイクリンD1は癌原遺伝子であり、かつ、数種の腫瘍型で過剰発現されることが示されたHedberg,Y.、Davoodi,E.、Roos,G.、Ljungberg,B.とLandberg,G.1999Int.J.Cancer84、268-272、Vasef,M.A.、Brynes,R.K.、Sturm、M.、Bromley,C.とRobinson,R.A.1999Mod.Pathol.12、412-416、-Troussard,X.、Avet-Loiseau,J.、Macro,M.、Mellerin,M.P.、Malet,M.、Roussel,M.とSola,B.2000Hematol.J.1、181-185一方、それは、肝および高位腹部大動脈平滑筋を除くいかなる特定の分布も伴わず、大きな一団の健康な器官および組織中で低レベルで発現されるWeinschenk,T.、Gouttefangeas,C.、Schirle,M.、Obermayr,F.、Walter,S.、Schoor,O.、Kurek,R.、Loeser,W.、Bichler,K.H.、Wernet,D.ら2002CancerRes.62、5818-5827。示差的質量分析のアプローチにおいて、発明者は、トランスフェクトしたおよびトランスフェクトしていない細胞からの精製したHLAペプチドの質量スペクトルを比較し、そして、これらのHLAクラスIIリガンドの免疫原性の特徴を証明するために、目的の生じるペプチドをinvitroCD4Tヘルパー細胞プライミング実験で使用した。腫瘍関連抗原のTヘルパー細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫療法における重要な責務のままである。ここに、われわれは、腫瘍関連抗原の天然にプロセシングかつ提示されるMHCクラスIIリガンドを同定するための、MSによる示差的ペプチド分析から派生した、新しくかつ一般に応用可能な方法およびペプチドを報告する。このアプローチは、Ii鎖と目的のAgの間の融合タンパク質をコードするベクターでのAPCのトランスフェクション段階、HLAに結合したペプチドの溶出、および、トランスフェクトされない細胞との比較による、トランスフェクタントにより提示されるAg由来ペプチドのMS同定を初めて組合せる。さらに、われわれは、同定されたペプチドに対し誘導されたT細胞が、同族のAgを過剰発現するトランスフェクタントを特異的に認識することを示すことにより、該方法を検証し得た。同定されたペプチドはなお、invivoでそれらの免疫原性について試験されなければならないが、われわれのアプローチは、天然にプロセシングされるMHCクラスIIリガンドの正確な特徴付けに至る。従って、発明者は、腫瘍関連抗原の合成の重なるペプチド、若しくはクラスIエプトープ予測に比較して精度の低いエピトープ予測により選択された広範なペプチドのいずれかを試験することを回避する。invivoでのT細胞活性化を誘導することが不可能な潜在性T細胞エピトープの同定につながりうる困難なT細胞アッセイAnderton,S.M.、Viner,N.J.、Matharu,P.、Lowrey,P.A.とWraith,D.C.2002Nat.Immunol.3、175-181と対照的に、該研究は、提示されることが見出されている数種のペプチドに集中し得る。さらに、この方法を使用すれば、該ペプチドが天然にプロセシングされることを証明するために組換えAgを産生するか若しくはAgを発現する腫瘍細胞株を有することが必要でない。発明者は、EBVで形質転換したB細胞のクラスIIプロセシング区画中に腫瘍関連抗原を向けるためにIiのN末端を使用した。これを達成するため、われわれは、いかなる抗原もIiとの融合タンパク質として発現し得かつウエスタンブロット分析によりトランスフェクトされた細胞中のタンパク質の発現レベルを測定するためにわれわれを補助する、融通のきくベクターを構築した。IiのN末端が、タンパク質の標的をクラスIIプロセシング区画中に定めるのに十分であることが既に示されている。しかし、今日まで、これは、融合タンパク質をコードするcDNAライブラリーを使用して未知のAgを同定するためWang,R.F.、Wang,X.、Atwood,A.C.、Topalian,S.L.とRosenberg,S.A.1999Science284、1351-1354、若しくは既知のT細胞クローンの特異性を確認するためChaux,P.、Vantomme,V.、Stroobant,V.、Thielemans,K.、Corthals,J.、Luiten,R.、Eggermont,A.M.、Boon,T.とvander,B.P.1999J.Exp.Med.189、767-778に、卵アルブミンを使用したモデルでのみ記述されたSanderson,S.、Frauwirth,K.とShastri,N.1995Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92、7217-7221。われわれの知る限り、この方法は、既知の腫瘍関連抗原の天然に提示されたMHCクラスIIに結合したペプチドを同定するために以前に使用されていなかった。MALDI-MASによるトランスフェクトされたおよびトランスフェクトされていない細胞のクラスIIリガンドの示差的分析、ならびにESI-MSによる差次的に発現されたペプチドのさらなる特徴付けは、目的の抗原のクラスIIリガンドの簡単な同定方法をもたらす。ケラチン18融合タンパク質での細胞のトランスフェクションは、われわれの方法が目的の抗原に一般に応用可能であることを証明し、再度、われわれはまた、モデル導入遺伝子ケラチン18からのHLA-DRに提示されるペプチドを記述することも可能であった。発明者は、配列NPPSMVAAGSVVAAV配列番号1を有する免疫原性のHLA-DR4に提示されるサイクリンD1ペプチド抗原、ならびにトランスフェクトしたヒト腫瘍細胞株から溶出された337種の他のHLAクラスII関連ペプチドを同定した。サイクリンD1ペプチド、およびヒト腫瘍細胞株から同定した他のペプチドは、ヒト癌の処置のための治療的ワクチンの臨床開発のための可能な候補であるWeinschenk,T.、Gouttefangeas,C.、Schirle,M.、Obermayr,F.、Walter,S.、Schoor,O.、Kurek,R.、Loeser,W.、Bichler,K.H.、Wernet,D.ら2002CancerRes.62、5818-5827。本明細書に開示かつ記述されるところの本発明の特徴が、示されるところのそれぞれの組合せでのみならず、しかしまた、本発明の意図される範囲から離れることなく単独の様式でも使用し得ることが、理解されるべきである。本発明は今や、以下の図面、配列表および実施例を参照してより詳細に記述されることができる。以下の実施例は、具体的説明の目的上のみ提供され、そして本発明を制限することを意図していない。配列番号1ないし配列番号338は、本発明の、MHCクラスIIにより提示されるペプチドを含有するT細胞エピトープのペプチド配列を示す。配列番号339ないし配列番号350は、実施例で使用されるところのプライマーの配列を示す。本開示および本実施例に際して当業者に明らかであろうように、本発明はまた、免疫原性のHLA-DR4に提示された、配列NPPSMVAAGSVVAAV配列番号1を有するサイクリンD1ペプチド抗原およびケラチン18に関する以下の実施例で特異的に使用されるところの腫瘍関連抗原の他のエピトープにも関する。該実施例は、本発明を完全に可能にするために本発明の腫瘍関連抗原の全エピトープすなわち配列番号1ないし配列番号338の配列のいずれかを含んでなるに当業者により容易に適用され得る、一般的例および概要として見られるべきである。本出願を通じて使用される略語:Ab:抗体Ag:抗原APC:抗原提示細胞CD:表面抗原分類cpm:1分あたりカウントDC:樹状細胞EBV:エプスタイン-バーウイルスESI:エレクトロスプレーイオン化HLA:ヒト白血球抗原HPLC:高速液体クロマトグラフィーIFN:インターフェロンIi:インバリアント鎖CD74IL:インターロイキンMALDI:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化MHC:主要組織適合遺伝子複合体MS:質量分析法OD450:450nmの波長での光学密度PBMC:末梢血単核細胞PCR:ポリメラーゼ連鎖反応PHA:フィトヘマグルチニンSDS-PAGE:ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動S.I.:刺激指数TOF:飛行時間細胞および抗体ヒトBリンパ芽球様細胞株AwellsIHW-No.9090;HLA-DRB10401、HLA-DRB40101を、10FCSPan、独国アイデンバッハを含有しかつ2mML-グルタミンBioWhittaker、ベルギーヴェルヴィエ、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンBioWhittakerを補充したRPMI1640C.C.Pro、独国ノイシュタット培地中で維持した。トランスフェクトした細胞クローンに関しては0.8mg/mlのG418PAALaboratories、オーストリアリンツを添加した。安定形質転換体をAwells細胞の電気穿孔280V、975μF;GenePulserII、Biorad、独国ミュンヘンにより作製し、次いで制限希釈法を使用してクローン化した。抗体L243抗HLA-DRLampson,L.AとLevy,R.1980J.Immunol.125、293-299およびW6/32抗HLAクラスIBrodsky,F.M.とParham,P.1982J.Immunol.128、129-135を、プロテインA-セファロースビーズPharmacia、スウェーデンウプサラを使用してハイブリドーマ培養上清から精製した。Th細胞株は、10ヒトAB血清Pel-FreezClinicalSystems、LLC、米国ウィスコンシン州ミルウォーキーを含有しかつ100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン、2mML-グルタミンならびに50μMβ-メルカプトエタノールを補充したIMDMBioWhittaker中で誘導かつ培養した。フローサイトメトリー分析で使用した抗体はPharMingen米国カリフォルニア州サンディエゴからであった。プラスミドDNA構築物Iiの80のN末端アミノ酸を含有するcDNANCBI、GenBank受入番号X00497を、A.MelmsMalcherek,G.、Wirblich,C.、Willcox,N.、Rammensee,H.G.、Trowsdale,J.とMelms,A.1998Eur.J.Immunol.28、1524-1533から得たベクターpBluescriptIIKS41-1Stratagene、独国ハイデルベルクからPCR反応で増幅し、そして、5プライマーATCGAAGCTTCCAAGATGCACAGGAGGAGAAGC配列番号339および3プライマーATCGGGATCCTTTGTCCAGCCGGCCCTGCTG配列番号340を使用して、pcDNA3のHindIIIおよびBamHI部位にサブクローニングしたpcDNA3-Ii;Invitrogen、独国カールスルーエ。目的の遺伝子は、それぞれ、ケラチン18NCBI、GenBank受入番号X12881について5プライマーATCGGAATTCTGAGCTTCACCACTCGCTCC配列番号341および3プライマーATCGGCGGCCGCTTAATGCCTCAGAACTTTGGT配列番号342、ならびにサイクリンD1NCBI、GenBankX59798について5プライマーATCGGAATTCTGGAACACCAGCTCCTGTGC配列番号343および3プライマーATCGGCGGCCGCTCAGATGTCCACGTCCCGCAC配列番号344を使用して、悪性腎組織からのcDNAからPCR反応で増幅した。得られたcDNAを、TOPOTAクローニングInvitrogen、独国カールスルーエを使用してサブクローニングし、そして最後に、Ii配列とインフレームでpcDNA3-IiのEcoR1およびNotI部位に挿入した。リアルタイム定量的PCR細胞からのRNAを、製造元の推奨に従ってTRIzol試薬Invitrogen、独国カールスルーエを使用して単離した。cDNAを1μgの全RNAから合成した。リアルタイム定量的PCRqPCRを、ABIPRISM7000配列検出装置AppliedBiosystems、独国ダルムシュタットを使用して実施した。SYBRGreenPCRマスターミックスAppliedBiosystemsを、PCR増幅およびPCR産物のリアルタイム検出に使用した。プライマー配列は後に続くとおりである:18SrRNA、5プライマーCGGCTACCACATCCAAGGAA配列番号345および3プライマーGCTGGAATTACCGCGGCT配列番号346;ケラチン18、5プライマーGAGCCTGGAGACCGAGAAC配列番号347および3プライマーTTGCGAAGATCTGAGCCC配列番号348;サイクリンD1、5プライマーCACGATTTCATTGAACACTTCC配列番号349および3プライマーTGAACTTCACCATCTGTGGCAC配列番号350。PCR反応は300nMの各プライマーを含む20μl中で実施した18Sリバースプライマー:50nMのみ。全部のサンプルを二検体ずつ増幅した。多様な遺伝子についてのトランスフェクトした細胞と野性型細胞の間の発現の差違を、比較閾値周期comparativethresholdcycleCT法http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdfで読み出し可能を使用する相対定量により、PCR増幅曲線から計算した。18SリボソームRNAを標準化のための参照遺伝子として選んだ。融合タンパク質の検出融合タンパク質は、Iiのアミノ酸残基12-28に結合するmAbPIN.1Stressgen,Biomol、独国ハンブルクを使用するウエスタンブロット分析により検出した。簡潔には、細胞を記述されたHsieh,C.S.、deRoos,P.、Honey,K.、Beers,C.とRudensky,A.Y.2002J.Immunol.168、2618-2625とおり溶解し、ライセートをLaemmli添加液中で沸騰させ、12SDS-PAGEで分離し、そしてニトロセルロースメンブレンに転写した。BSAでの飽和段階後に、メンブレンをmAbPIN.11μg/mlとともに室温で1時間インキュベートした。タンパク質を、ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgGAmershamPharmacia、独国フライブルクを使用して可視化した。いくつかの場合には、トランスフェクトした細胞を、融合タンパク質のエンドソーム/リソソームターゲッティングを検討するために、10~100μMのクロロキンSigma、独国シュタインハイムの存在下で培養した。細胞をその後溶解し、そしてタンパク質を上述されたとおりウエスタンブロットにより検出した。Ii-ケラチン18もまた、免疫沈降、およびトリプシンでのその後のinsitu消化、次いで質量分析により検出した。簡潔には、細胞を記述されたHsieh,C.S.、deRoos,P.、Honey,K.、Beers,C.とRudensky,A.Y.2002J.Immunol.168、2618-2625とおり溶解し、そして、mAbPIN.1およびプロテインA-セファロースビーズPharmacia、スウェーデンウプサラとともにインキュベートした。セファロースペレットを洗浄し、Laemmli添加液中で沸騰させ、そして12SDS-PAGE上で泳動した。タンパク質のスポットをゲルから切り出し、そして、本質的には記述されたShevchenko,A.、Wilm,M.、Vorm,O.とMann,M.1996Anal.Chem.68、850-858とおり、トリプシンでinsituで消化した。その後分析は、MALDI-TOF質量分析計ReflexIII、BrukerDaltonik、独国ブレーメンで実施した。タンパク質の同一性を、ハイブリッド四重極直交加速型飛行時間タンデム質量分析計QStarPulsariQqoaTof;AppliedBiosystems-MDSSciex、独国ヴァイターシュタットに記録したタンデムMSスペクトルにより確認した。MHCクラスIIに結合したペプチドの溶出凍結細胞ペレット3.5ないし5×1010細胞を、以前に記述されたSchirle,M.、Keilholz,W.、Weber,B.、Gouttefangeas,C.、Dumrese,T.、Becker,H.D.、Stevanovic,S.とRammensee,H.G.2000Eur.J.Immunol.30、2216-2225とおり処理し、そして、ペプチドを、標準的プロトコルSeeger,F.H.、Schirle,M.、Keilholz,W.、Rammensee,H.G.とStevanovic,S.1999Immunogenetics49、996-999に従い、HLA-DR特異的mAbL243Lampson,L.A.とLevy,R.1980J.Immunol.125、293-299を使用して単離した。DR溶出したペプチドの分子分析ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィーHPLC、SMART装置、μRPCC2/C18SC2.1/10;AmershamPharmaciaBiotech、独国フライブルクにより分離し、そして、BrukerReflexIII質量分析計BrukerDaltonikを使用するMALDI-TOF質量分析MSにより画分を分析した。差次的に提示されたペプチドを、記述されたSchirle,M.、Keilholz,W.、Weber,B.、Gouttefangeas,C.、Dumrese,T.、Becker,H.D.、Stevanovic,S.とRammensee,H.G.2000Eur.J.Immunol.30、2216-2225ところのハイブリッド四重極直交加速型飛行時間タンデム質量分析計Q-TOF;Micromass、英国マンチェスターでのナノESIエレクトロスプレーイオン化タンデムMSによりさらに分析した。ペプチドの合成および分析ペプチドは、Fmoc/tBuストラテジーに従って、自動ペプチド合成機EPS221Abimed、独国ランゲンフェルトで合成した。TFA/フェノール/エタンジチオール/チオアニソール/水容量で90/3.75/1.25/2.5/2.5での1時間若しくは3時間アルギニン含有ペプチドの処理による樹脂の除去後に、ペプチドをメチル-ターシャリブチルエーテルmethyl-tert.butyletherから沈殿し、メチル-ターシャリブチルエーテルで1回およびジエチルエーテルで2回洗浄し、そして凍結乾燥前に水に再懸濁した。合成産物をHPLCVarianstar、Zinsseranalytics、独国ミュンヘンおよびMALDI-TOF質量分析future、GSG、独国ブルフザールにより分析した。80未満の純度のペプチドを分取用HPLCpreparativeHPLCにより精製した。単球由来樹状細胞末梢血単核細胞PBMCを、古典的手順に従い、HLA-DRB10408、HLA-DRB11101、HLA-DRB30202、HLA-DRB401陽性ドナーから調製した。樹状細胞DCは、使用した培地が血清を含まないX-VIVO15BioWhittakerであったことを除き、以前に記述されたBender,A.、Sapp,M.、Schuler,G.、Steinman,R.M.とBhardwaj,N.1996J.Immunol.Methods.196、121-135とおり、GM-CSFおよびIL-4の存在下で6日間培養したプラスチック付着性PBMCから得た。第6日に、未熟DCを、CD1a、CD11c、CD14、CD40、CD83、CD86、ならびにHLA-DRの細胞表面発現について、CELLQuestソフトウェアを伴うFACScalibur装置BectonDickinson、カリフォルニア州マウンテンビューでのフローサイトメトリーにより分析した。DCをその後、50μg/mlポリイノシン酸-ポリシチジル酸ポリI/C、AmershamPharmacia、スウェーデンウプサラおよび10ng/mlTNF-αPharMingenの存在下で更に2日間成熟させ、そして、CD14、CD80、CD83およびCD86の細胞表面発現についてフローサイトメトリーにより再度分析した。成熟DCは、CD80、CD83およびCD86分子の明瞭な上方制御を示した。ペプチド特異的Tヘルパー細胞の生成3×105の成熟DCに、10μMのペプチドNPPSMVAAGSVVAAVを24ウェルプレート中で2時間添加し、そして十分に洗浄した。その後、4×106の新鮮自己PBMCを、Th-1発生に有利であるために10ng/mlのIL-12p70の存在下でDCに添加した。PBMCを、10U/mlのIL-2および5ng/mlのIL-7の存在下で、ペプチドを負荷した照射した自己PBMCで毎週再刺激した。3および5回の再刺激後にT細胞を合わせ、そしてペプチドの存在下で自己PBMCに対し試験した。Tヘルパー細胞株をその後、1μg/mlのPHA、25~50U/mlのIL-2および5ng/mlのIL-7の存在下に、照射した同種PBMCで1~2週ごとに増幅し、そしてその後、トランスフェクトした細胞株の認識について試験した。3ないし4週ごとに、Tヘルパー細胞株を、10μMのペプチド、10U/mlのIL-2および5ng/mlのIL-7の存在下に、照射した自己PBMCで再刺激した。Tヘルパー細胞株の機能アッセイおよび特徴付けTヘルパー細胞活性化は、チミジン取り込みならびにサイトカイン分泌により推定されるところの細胞増殖により試験した。簡潔には、2×105細胞を、10μMのペプチド若しくは3μg/mlのPHAの存在若しくは非存在下に3検体ずつ96ウェルプレート中で2×105の照射した自己PBMCとともにインキュベートした。24時間後に2部分の50μlの上清を収集かつ凍結し、そして50μlの新鮮培地を細胞に添加した。54時間後に、50μlのトリチウム化チミジン含有培地0.074MBq/ウェル、HartmannAnalytic、独国ブラウンシュヴァイクを添加し、そして、チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンターMicrobeta、Wallac、独国フライブルクを使用して72時間に測定した。細胞増殖は、比:刺激したT細胞のcpmの平均/未刺激のT細胞のcpmの平均に対応する刺激指数S.I.として表す。IL-2分泌は、IL-2依存性CTLL-2細胞株を使用して測定した。簡潔には、104細胞を上清の存在下に20~24時間インキュベートした。その後、チミジン含有培地0.055MBq/ウェルを追加の7~8時間添加し、そしてチミジンの取り込みを上述したとおり測定した。結果はまたS.I.として表す。IFN-γ、IL-4およびIL-6分泌は、PharMingenからの抗体対およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを使用しかつ製造元の推奨に従ったサンドイッチELISAにより測定した。われわれは基質としてSupersensitiveTMBSigma、独国ドライゼンホーフェンを使用し、また、反応は2MH2SO4溶液を使用して停止した。OD450をその後測定し、そして結果は標準に従いpg/mlで表した。ペプチド特異的Tヘルパー細胞株によるサイクリンD1でトランスフェクトした細胞の認識トランスフェクタントに対するT細胞の検出可能な非自己反応の非存在を、多様な細胞数の照射したトランスフェクタントの存在下で該Tヘルパー株を生成させるのに使用したドナーからの新鮮PBMCを共培養することにより立証した。細胞増殖ならびにIL-2、IL-4、IL-6およびIFN-γ分泌を上述したとおり測定し、そして、さらなる実験で使用されるべきエフェクター/標的比をかように決定した。サイクリンD1由来の天然にプロセシングされたペプチドの認識は、サイクリンD1若しくは陰性対照としてのケラチン18のいずれかをコードするプラスミドでトランスフェクトした照射したAwells4×104細胞の存在下で、かつ、上で決定された細胞比に従って、ペプチド特異的Tヘルパー細胞株2×105細胞を共培養することにより試験した。10μMのペプチド若しくは3μg/mlのPHAの存在下の照射した自己PBMCが陽性対照としてはたらいた。細胞増殖ならびにIL-2およびIFN-γ分泌を上述したとおり測定した。いくつかの実験では、細胞を20μg/mlの精製したL243抗体の存在下で培養した。結果融合タンパク質を発現する細胞クローンの生成われわれは、挿入物の3端の後に一般的クローニング部位GCSが続いたような方法で、ベクターpcDNA3中にIiの80のN末端アミノ酸をコードするcDNAをクローン化した。これは、われわれに、Iiおよび目的の遺伝子の融合タンパク質を発現するための融通の利くベクターを与えた。Iiとインフレームで、われわれは、サイクリンD1のcDNA、ならびに対照としてのケラチン18をクローン化した。Awells細胞株を、電気穿孔法を使用して該2種の融合タンパク質をコードするベクターで安定にトランスフェクトした。その後、単細胞クローンを生成し、そして、それらの抗原発現についてmRNAおよびタンパク質レベルで試験した。野性型トランスフェクトされていない細胞株に比較して、最良のIi-ケラチン18クローンは、リアルタイム定量的PCR分析により測定されたとおり、5,700倍より多いケラチン18を発現し、また、最良のIi-サイクリンD1クローンは1,200倍より多いサイクリンD1を発現した。該データは18SリボソームRNAで標準化した。ウエスタンブロット分析において、PIN.1抗体を使用してIi融合タンパク質を検出した。Iiの2種のアイソフォームに対応する2本のバンドのみが検出された野性型Warmerdam,P.A.、Long,E.O.とRoche,P.A.1996J.Cell.Biol.133、281-291と比較して、期待された分子量を伴うIi-ケラチン18若しくはIi-サイクリンD1融合タンパク質を表す2個の付加的なバンドを各クローンで観察し得た図1。クローンAwells-Ii-ケラチン18の場合には、融合タンパク質が、免疫沈降、次いでトリプシンでのinsitu消化およびその後のMS/MS分析を介してもまた同定された。該クローンはまた、トランスフェクションおよびクローニング手順がそれを妨害したかどうかを決定するため、フローサイトメトリーによりそれらのHLAクラスIおよびクラスII細胞表面発現レベルについても試験した。双方のクローンは、トランスフェクトされていない細胞株と比較して、HLAクラスIおよびクラスII分子の正常な発現レベルを示した。融合タンパク質のエンドソーム/リソソームターゲティングIiのN末端が、タンパク質の標的をMHCクラスII経路に向けるのに十分であることが既に記述されているSanderson,S.、Frauwirth,K.とShastri,N.1995Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A92、7217-7221、Wang,R.F.、Wang,X.、Atwood,A.C.、Topalian,S.L.とRosenberg,S.A.1999Science284、1351-1354、Malcherek,G.、Wirblich,C.、Willcox,N.、Rammensee,H.G.、Trowsdale,J.とMelms,A.1998Eur.J.Immunol.28、1524-1533。われわれの構築物がAgプロセシングのその経路に実際に従ったかどうかを試験するため、われわれは、トランスフェクタントを、増大する量のクロロキンリソソームのpHを上げることによりタンパク質のリソソーム分解を阻害する細胞傷害性の薬物Kaplan,J.とKeogh,E.A.1981Cell24、925-932、Tietze,C.、Schlesinger,P.とStahl,P.1982J.Cell.Biol.92、417-424、Seglen,P.O.1983MethodsEnzymol.96:737-64.、737-764とともに4時間インキュベートした。細胞をその後溶解し、そして融合タンパク質をウエスタンブロットにより検出した。図2は、タンパク質バンドが、クロロキンの量を増大させるにつれてますます強くなることを示し、融合タンパク質の量がクロロキン濃度とともに増大することを示し、そして従って融合タンパク質がMHCクラスIIのタンパク質分解経路に従うことを提供する。HLA-DRに結合したペプチドの示差的質量分析各クローンおよびトランスフェクトされていない細胞株からの3.5ないし5×1010細胞を増殖させ、そして、HLA-DRに結合したペプチドを、以前に記述されたSeeger,F.H.、Schirle,M.、Keilholz,W.、Rammensee,H.G.とStevanovic,S.1999Immunogenetics49、996-999とおりにHPLCを介して単離かつ分離した。トランスフェクトされていない細胞株およびAwells-Ii-サイクリンD1クローンのHPLCクロマトグラムを比較した図3。HLA-DRで提示されるペプチドレパートリーの小さなほとんど定量的な差違は、図3に示されるところのわずかに異なるUV痕跡になった。われわれの実験から期待されたとおり、明瞭なUVシグナルは、トランスフェクタントにより独占的に提示されるペプチドに割り当て得なかった。Awellsとトランスフェクトした株の間のHLA-DR拘束性ペプチド提示のただわずかな差違は、HPLC画分の大部分が同一のパターンを含有したMALDI-TOF分析によってもまた可視的になった。図4は、ケラチン18でトランスフェクトした株から溶出されたペプチド混合物中にのみ存在しかつケラチン18由来ペプチドを表した顕著な個別のシグナルm/z:1732.96を含む唯一の画分の質量分析を示す。図5では、1370.1のm/zシグナルは、サイクリンD1トランスフェクタントからの独占的に提示される1ペプチドを示す。双方のペプチドをナノフローESIMS/MSタンデムMSによりより詳細に分析した。発明者は、それぞれ2種のトランスフェクトされた融合タンパク質由来のペプチドNPPSMVAAGSVVAAV配列番号1サイクリンD1198-212図6およびSHYFKIIEDLRAQI配列番号2ケラチン18126-139を同定することが可能であった。該配列を、対応する合成ペプチドの質量スペクトルにより確認した。ペプチド特異的Tヘルパー細胞株の生成および特徴付け新規のHLAクラスII由来の腫瘍関連および推定で免疫原性のペプチドの同定のための概念の証明を確立するために、同定されたサイクリンD1ペプチドに特異的なT細胞を、HLA-DR4樹状細胞に負荷した対応する合成ペプチドでのinvitro刺激により誘導した。それぞれ第3および5回のinvitro再刺激後に、Tヘルパー細胞株の特異性を試験した。T細胞を、図7上図に示されるとおりサイクリンD1ペプチドにより特異的に刺激した。T細胞は、サイクリンD1ペプチドを負荷した自己PBMCに応答して増殖したS.I.=5.4。陽性対照として、PHAは強いT細胞増殖を誘導したS.I.=330。発明者は次に、どの型のTヘルパー細胞Th1対Th2がペプチドに応答して刺激されたかを、サイトカインプロファイルを検査することにより分析した。図7下図に示されるとおり、T細胞はペプチドに応答して低い程度までとは言えIL-2を産生した一方、それらはPHA刺激に対しなお感受性であった。対照的に、ペプチドで誘導したT細胞刺激は、強いIFN-γ分泌3250pg/ml、図7Cをもたらしたが、しかしIL-4若しくはIL-6分泌をもたらさなかった。とは言え、T細胞はなお、PHAで誘導されるサイトカイン分泌に対しそれぞれ高度におよび中程度に感受性であった。HLA-DR4/サイクリンD1198-212に特異的なT細胞受容体でのCD4Tヘルパー細胞の最終的な非特異的活性化についての陰性対照としての無関係のペプチドでの刺激を表8に提示する。結論として、確立されたCD4Tヘルパー細胞株は、サイクリンD1198-212ペプチドに特異的でありかつTh1型のものである。この型は、腫瘍細胞の排除における特異的CD8キラーT細胞の援助においてとりわけ重要である。ペプチド特異的Tヘルパー細胞株は、サイクリンD1でトランスフェクトした細胞もまた認識するAwells細胞およびT細胞株は完全にHLAが適合しているわけではないため、われわれは最初に、双方を共培養することによりいずれかの非自己反応が生じ得るかどうかを試験した。簡潔には、多様な細胞数の照射したAwells-Ii-ケラチン18若しくはAwells-Ii-サイクリンD1トランスフェクタントを、T細胞ドナーからの固定した数のPBMCの存在下で共培養し、そして、細胞増殖ならびにIL-2、IL-4、IL-6およびIFN-γ分泌を測定した。中程度のT細胞増殖が高細胞数の双方のトランスフェクタントにより誘導されたが、しかし、サイトカイン分泌は観察されなかったデータは示されない。従って、われわれは、サイトカイン分泌の非存在下でわずかなT細胞増殖のみが観察された5/1というエフェクターT細胞/標的細胞比を使用することを決定した。結果として、サイトカイン分泌をもたらすT細胞活性化は、トランスフェクタントにより提示される同族の抗原によってのみ特異的に誘導され得た。サイクリンD1ペプチドに特異的なTヘルパー細胞株は、サイクリンD1タンパク質を過剰発現しそして該サイクリンD1ペプチドを天然にプロセシングしかつHLA-DR分子と共同して提示する、トランスフェクトされた細胞を認識することが可能であった。図8に示されるとおり、照射したAwells-Ii-サイクリンD1トランスフェクタントは、IL-2分泌により観察されたとおり、Tヘルパー細胞株を特異的に活性化することが可能であったS.I.=4.0。対照的に、Awells-Ii-ケラチン18トランスフェクタントT細胞刺激の陰性対照として使用され、かつ、HLA-DRと共同して無関係のケラチン18ペプチド126-139を提示することが知られているはT細胞活性化を誘導せず、ペプチド特異的Tヘルパー細胞株が同族の抗原を特異的に認識することを示した。さらに、これらの結果は、本発明で使用されるサイクリンD1ペプチドが、T細胞エピトープを含有する天然にプロセシングされたペプチドであることを証明する。この活性化は、HLA-DR特異的なブロッキングL243Abの存在により阻害され得た71.2。クラスII分子およびペプチド抗原サイクリンD1198-212を使用する活性化型細胞傷害性リンパ球CTLの製造ならびにそれらの投与活性化型細胞傷害性Tリンパ球CTLは、HLA-DRクラスII分子、およびサイクリンD1198-212配列番号1からのペプチドを使用して製造する。一般に、PCT特許出願WO93/17095号に記述される方法を使用してCTLを製造する。Awells細胞を使用してペプチド抗原をCTLに提示する。HLA-DR分子はAwells細胞により発現される。試験されるべきペプチドを、AppliedBiosystemsの合成機、ABI431A米国カリフォルニア州フォスターシティで合成し、そしてその後HPLCにより精製する。WO93/17095号に詳細に記述されるとおり、特異的細胞傷害性T細胞の生成のためinvitro条件を最適化するために、刺激体細胞の培養物を適切な培地中で維持する。刺激体細胞は、好ましくは無血清培地例えばExcell400中で維持されるAwells細胞である。活性化されるべき細胞、例えば前駆体CD4細胞との刺激体細胞のインキュベーション前に、ある量の抗原ペプチドを十分な量の刺激体細胞培養物に添加し、刺激体細胞の表面上で発現されるべきヒトクラスII分子に負荷されたようにする。十分な量のペプチドは、約200、および好ましくは200若しくはそれ以上のペプチドを負荷したヒトクラスIIMHC分子が、各刺激体細胞の表面上で発現されることを可能にする量である。刺激体細胞は、典型的に、20pg/ml超のペプチドとともにインキュベートする。休止期若しくは前駆体CD4細胞をその後、適切な刺激体細胞を含む培養物中で、CD4細胞を活性化するのに十分な時間インキュベートする。CD4細胞はかように抗原特異的様式で活性化される。刺激体細胞に対する休止期若しくは前駆体CD4エフェクター細胞の比は個体ごとに異なることがあり、また、個体のリンパ球の培養条件への従順さのような変数にさらに依存しうる。リンパ球:刺激体細胞Awells細胞の比は、典型的に約30:1ないし300:1の範囲にある。例えば、3×101のヒトPBLおよび1×106の生存Awells細胞を混合し、そして20mlのRPMI1640培地中で維持する。エフェクター/刺激体の培養物は、治療上使用可能な若しくは有効な数のCD4細胞を刺激するのに必要であるだけの時間維持する。最適な時間は典型的に約1と5日の間であり、プラトーすなわち最大の特異的CD4活性化レベルは一般に5日の培養後に観察される。CD4細胞のinvitro活性化は、典型的に、細胞株のトランスフェクション後短時間内に検出される。CD4細胞を活性化することが可能な、トランスフェクトされた細胞株での一過性発現は、トランスフェクション48時間以内に検出可能である。これは、ヒトクラスIIMHC分子を発現する形質転換細胞の安定若しくは一過性培養物のいずれも、CD4細胞の活性化において有効であることを明確に示す。活性化型CD4細胞は、それらの適切な相補リガンドに結合させるため、刺激体Awells細胞、刺激体細胞に負荷したペプチド、またはCD4細胞若しくはそのセグメントに特異的なモノクローナル抗体を使用して、刺激体細胞から効果的に単離しうる。抗体標識した分子をその後、免疫沈降若しくはイムノアッセイ法を介して、刺激体とエフェクター細胞の混合状態から抽出する。活性化型CD4細胞の有効な細胞傷害性の量は、invitroとinvivoの使用の間で、ならびにこれらのキラー細胞の最終的標的である細胞の量および型で変動し得、約1×106と1×1012の間の活性化型CTLを成人のヒトに使用する。活性化型CD4細胞は、処置されている個体への該CD4細胞の投与前に、Awells細胞培養物から収集する。Honsikへの米国特許第4,844,893号明細書およびRosenbergへの米国特許第4,690,915号明細書に例示されるもののような細胞成分の再導入方法を使用する。例えば、静脈内注入を介する活性化型CD8細胞の投与が適切である。表1:本発明で同定されたところの腫瘍関連Tヘルパー細胞ペプチドエピトープ"