"a植物において活性のある調節領域を含み、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部へ融合されたウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインを連続してコードするキメラのヌクレオチド配列へ、その調節領域が作動可能に連結された核酸を、植物または植物の一部の中へ導入し、外部ドメインが非インフルエンザウイルス三量体表面タンパク質からであり、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部に関して異種である工程と、b植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってVLPを産生する工程とを含む、ウイルス様粒子VLPを植物において産生する方法。前記ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインが、Retroviridae科、Rhabdoviridae科、Herpesviridae科、Coronaviridae科、Paramyxoviridae科、Poxviridae科またはFiloviridae科のウイルス科に由来する、請求項1に記載の方法。前記ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインが、Lentivirus属、Lyssavirus属、Varicellovirus属、Coronavirus属またはEbolavirus属に由来する、請求項1に記載の方法。前記ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインが、ヒト免疫不全ウイルスHIV、狂犬病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスVZV、重症急性呼吸器症候群SARSウイルス、エボラウイルス、麻疹、耳下腺炎、水痘、サイトメガロウイルス、エボラ/フィロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルスまたは天然痘に由来する、請求項1に記載の方法。前記ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインが、Fタンパク質、Sタンパク質、envタンパク質、Gタンパク質、Eエンベロープ糖タンパク質、Bエンベロープ糖タンパク質、Cエンベロープ糖タンパク質、Iエンベロープ糖タンパク質、Hエンベロープ糖タンパク質、GP糖タンパク質または赤血球凝集素に由来する、請求項1に記載の方法前記核酸が、導入工程工程aにおいて、植物において一過性に発現される、請求項1に記載の方法。前記核酸が、導入工程工程aにおいて、植物において安定的に発現される、請求項1に記載の方法。c植物を収穫しVLPを精製する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。1つまたは複数のシャペロンタンパク質、プロトンチャンネルタンパク質、プロテアーゼ阻害剤またはその組み合わせをコードするヌクレオチド配列の群から選択される1つまたは複数の追加の核酸が、導入工程工程aにおいて、植物へ導入される、請求項1に記載の方法。前記VLPが、ウイルス性のマトリックスタンパク質またはコアタンパク質を含有しない、請求項1に記載の方法。前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が、導入工程工程aにおいて、H5膜貫通ドメインおよび細胞質尾部またはH3膜貫通ドメインおよび細胞質尾部である、請求項1に記載の方法。請求項11に記載の方法によって産生されたVLP。植物特異的N-グリカンまたは修飾されたN-グリカンを持つキメラのウイルスタンパク質を含む、請求項12に記載のVLP。植物に由来する1つまたは複数の脂質を含む請求項12に記載のVLP。免疫反応の誘導のために効果的な用量の請求項12に記載のVLP、および薬学的に許容されるキャリアーを含む組成物。前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が、H5A/インドネシア/05/2005から得られ、配列番号:41において定義されたヌクレオチド配列を含むか、または前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が、H3A/ブリズベーン/10/2007から得られ、配列番号:42において定義された配列を含む、請求項1に記載の方法。以下の記述は好ましい実施形態である。本発明はウイルス様粒子VLPに関する。より具体的には、本発明は、キメラのウイルスタンパク質を含むVLP、および植物内のキメラのVLPを産生する方法に関する。VLPは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CTへ融合した、ウイルス三量体表面タンパク質ウイルス性三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインを連続して含む融合キメラのタンパク質を含む。ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインはTM/CTに関して異種である。TM/CTはインフルエンザ赤血球凝集素HAからのTM/CTである。ウイルス三量体表面タンパク質ウイルス性三量体表面タンパク質とも称されるは、エンベロープウイルスの表面上で三量体通常ホモ三量体の形態で見出されるタンパク質であり、各々のモノマーのC末端に配置される膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CTならびに各々のモノマーのN末領域に配置される外部ドメインを含む。ウイルス三量体表面タンパク質は糖タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。三量体は通常非共有結合された3つのタンパク質によって形成される巨大分子複合体である。理論により束縛されることは意図しないが、タンパク質の三量体化ドメインはかかる三量体の形成に重要であり得る。したがってウイルス三量体表面タンパク質またはその断片のモノマーは三量体化ドメインを含み得る。ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片は外部ドメインをさらに含む。三量体表面タンパク質の外部ドメインは外側の環境に曝露され、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部のドメインを含まない。本明細書において記述されるように、ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインはインフルエンザウイルスに由来しない。本明細書において記述されるように、ウイルス三量体表面タンパク質の断片が使用されるならば、ウイルス三量体表面タンパク質が三量体を形成する能力を保持することが好ましい。ウイルス三量体表面タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TM/CT、インフルエンザタンパク質のTM/CT、または両方は、当業者によって公知であるような方法を使用して容易に同定することができ、例えば、例えば膜貫通予測プログラムを使用してタンパク質のアミノ酸配列の疎水性の程度を決定すること例えばSwissInstituteofBioinformaticsによって操作されるExpertProteinAnalysisSystem;ExPASy.org;またはDenseAlignmentSurfaceMethod、CserzoM.,etal.1997,Prot.Eng.vol.10,no.6,673-676;LolkemaJ.S.1998,FEMSMicrobiolRev.22,no4,305-322、タンパク質のアミノ酸配列の疎水性プロファイルを決定すること例えばKyte-Doolittle疎水性プロファイル、三次元のタンパク質構造を決定することおよび膜中で熱力学的に安定している構造を同定すること例えば単一のαへリックス、複数の膜貫通αへリックスの安定した複合体、膜貫通βバレル、βヘリックス、または膜中で熱力学的に安定している他の構造によるものである。一旦同定されたならば、ウイルス三量体表面タンパク質のTM/CT領域は、以下で記述されるようにインフルエンザウイルスから得られる膜貫通および細胞質尾部と置き換えることができる。本発明の様々な実施形態に記載のキメラのVLPは、ウイルス性三量体表面タンパク質、またはウイルス性三量体表面タンパク質の断片を含み、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CTはインフルエンザHAから得られたTM/CTと置き換えられる。ウイルス三量体表面タンパク質はTM/CTに関して異種である。ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片は、Retroviridae科、Rhabdoviridae科、Herpesviridae科、Coronaviridae科、Paramyxoviridae科、Poxviridae科またはFiloviridae科のウイルスに由来し得るが、これらに限定されない。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えば、Lentivirus属、Lyssavirus属、Varicellovirus属、Coronavirus属またはEbolavirus属に由来し得る。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えばHIV、狂犬病ウイルス、VZV、RSV、SARSウイルス、エボラウイルス、麻疹、耳下腺炎、水痘、サイトメガロウイルス、エボラフィロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルスまたは天然痘に由来し得るが、これらに限定されない。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えば三量体表面タンパク質であり得、その生来の形態において膜貫通ドメイン/細胞質尾部を含み得る。それらは、例えば、以下のものであるが、それらに限定されない。a.Fタンパク質Paramyxoviridae科:RSV、麻疹、耳下腺炎、ニューカッスル病b.Sタンパク質Coronaviridae科:SARS;c.envタンパク質Retroviridae科:HIV;d.Gタンパク質Rhabdoviridae科:狂犬病;e.E、B、C、I、H等のエンベロープ糖タンパク質Herpesviridae科:VZV、サイトメガロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス;f.GP糖タンパク質Filoviridae科:エボラ、マールブルグ;g.赤血球凝集素Poxviridae科:痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス。本発明に従って使用することができる複数のウイルス三量体表面タンパク質の非限定例は、以下でより詳細に記述される。HIV本発明は、キメラのヒト免疫不全HIVタンパク質を含むVLP、およびキメラのHIVVLPを産生する方法を提供し、キメラのHIVタンパク質は、例えばHIVEnvタンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素HAの一部膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CT等との融合タンパク質を含む。本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのHIVタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明はキメラのHIVVLPを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのHIVタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのHIVVLPを産生することを含む。本発明は、キメラのHIVタンパク質を含むVLPをさらに提供する。VLPは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。狂犬病ウイルス本発明は、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質を含むVLP、およびキメラの狂犬病VLPを産生する方法も提供し、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質は、例えば狂犬病Gタンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素HAの一部膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CT等との融合タンパク質を含む。本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラの狂犬病ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明はキメラの狂犬病ウイルスVLPを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラの狂犬病ウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラの狂犬病ウイルスVLPを産生することを含む。本発明は、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質を含むVLPをさらに提供する。VLPは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。VZV本発明は、キメラの水痘帯状疱疹ウイルスVZVタンパク質を含むVLP、およびキメラのVZVVLPを産生する方法にも関し、キメラのVZVタンパク質は、例えばVZV糖タンパク質Eおよびインフルエンザ赤血球凝集素HAの一部膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CT等との融合タンパク質を含む。本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのVZVタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明はキメラのVZVVLPを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのVZVタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのVZVVLPを産生することを含む。本発明は、キメラのVZVタンパク質を含むVLPをさらに提供する。VLPは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。SARS本発明は、キメラの重症急性呼吸器症候群SARSウイルスタンパク質を含むVLP、およびキメラのHIVVLPを産生する方法にも関し、キメラのSARSタンパク質は、例えばSARS糖タンパク質Sおよびインフルエンザ赤血球凝集素HAの一部膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CT等との融合タンパク質を含む。本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのSARSタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明はキメラのSARSVLPを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのSARSウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのSARSVLPを産生することを含む。本発明は、キメラのSARSウイルスタンパク質を含むVLPをさらに提供する。VLPは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。エボラ本発明は、キメラのエボラウイルスタンパク質を含むVLP、およびキメラのエボラVLPを産生する方法にも関し、キメラのエボラウイルスタンパク質は、例えばエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素HAの一部膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CT等との融合タンパク質を含む。本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのエボラウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明はキメラのエボラVLPを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのエボラウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのエボラウイルスVLPを産生することを含む。本発明は、キメラのエボラウイルスタンパク質を含むVLPをさらに提供する。VLPは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。キメラ化およびVLP形成水疱性口内炎ウイルス狂犬病のようなラブドウイルスおよび単純ヘルペスウイルス水痘帯状疱疹ウイルスのようなヘルペスウイルスの両方は、VSP4依存性様式で出芽するTayloretalJ.Virol81:13631-13639,2007;Crumpetal.,J.Virol81:7380-7387,2007。VSP4がマトリックスタンパク質の後期ドメインと相互作用するので、出芽のために、および必然の結果としてVLP産生のために、マトリックスタンパク質が必要とされることを示唆する。しかしながら、本明細書において記述されるように、TM/CTドメインをインフルエンザHAのものにより置き換える場合、狂犬病およびVZVのVLPをマトリックスタンパク質なしに産生することができる。理論により束縛されることは意図しないが、これは、キメラ化が狂犬病およびVZVのVLP形成のためのマトリックスタンパク質の共発現に対する依存性を取り除き得ることを示唆する。上記のようなウイルス性三量体表面タンパク質の外部ドメインは、ウイルス三量体表面タンパク質がTM/CTに関して異種であるように、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインTM/CTへ融合される。TM/CTはインフルエンザ赤血球凝集素HAからのTM/CT、例えばH5またはH3からのTM/CTであり得、例えば、A/インドネシア/5/05サブタイプH5N1;H5/Indo;GenBankアクセッション番号ABW06108.1、H5A/ベトナム/1194/2004A-ベトナム;GenBankアクセッション番号ACR48874.1、H5A/アンホイ/1/2005A-アンホイ;GenBankアクセッション番号ABD28180.1;H3A/ブリズベーン/10/2007H3/Bri;GenBankアクセッション番号ACI26318.1、H3A/ウィスコンシン/67/2005A-WCN;GenBankアクセッション番号ABO37599.1であるがこれらに限定されない。複数のH3およびH5のTM/CT境界の配列はWO2010/148511参照として本明細書に援用される中に記述される。例えば、限定すると判断すべきではないが、TM/CTのためのアミノ酸配列は以下のものを含み得る。H5A/インドネシア05/2005TM/CT配列番号:41:QILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQCPJCIH3A/ブリズベーン/10/2007TM/CT配列番号:42:DWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICIおよび配列番号:41または42のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列。本発明において参照される特異的核酸配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において定義されるような1つまたは複数のヌクレオチド配列へハイブリダイズする配列に実質的に相同もしくは実質的に類似し得るか、またはその配列もしくは配列の相補物であり得る。もしかかる相同配列が、配列の1つもしくは複数の特性または本明細書において記述されるようなコードされた産物を示すならば、ヌクレオチドの少なくとも約70、より好ましくは75が、ヌクレオチド配列の定義された長さにわたってマッチするとき、配列は実質的に相同または実質的に類似する。例えば、H3もしくはH5から得られた膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインへ融合したウイルス三量体表面タンパク質からのものに実質的に相同な外部ドメイン、H3もしくはH5のTM/CTに実質的に相同でありウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインへ融合した膜貫通ドメインおよび細胞質尾部、またはウイルス三量体表面タンパク質からのものに実質的に相同なTM/CTおよび実質的に相同な外部ドメインの両方は、VLPを形成する。キメラタンパク質の正確な折り畳みは、タンパク質の安定性、多量体の形成、VLPの形成および機能に重要であろう。タンパク質の折り畳みは、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、折り畳まれるか、部分的に折り畳まれるか、または折り畳まれていないタンパク質と結合または一過的に会合するコファクターの利用可能性を含むが、これらに限定されない1つまたは複数の因子によって影響を受け得る。かかる配列類似性は、DNASIS内で提供されたもの等のヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定することができる例えば以下のパラメータを使用するが、これらに限定されない:GAPペナルティ5、トップダイアゴナル数5、固定GAPペナルティ10、k-タプル2、フローティングギャップ10およびウィンドウサイズ5。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法は、当該技術分野において周知であり、例えばSmithWaterman181,Adv.Appl.Math.2:482、NeedlemanWunschJ.Mol.Biol.48:443,1970、PearsonLipman1988,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444のアルゴリズム、およびこれらのアルゴリズムのコンピューターによる実施GAP、BESTFIT、FASTAおよびBLAST、NIHを介して利用可能によるもの、または手動式アライメントおよび目視検査例えばCurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubeletal.編、1995年サプリメントを参照によるもの、またはストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションManiatisetal.、MolecularCloningALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、1982年を参照を使用するものである。好ましくは、実質的に相同な配列は、分子の定義された長さにわたって、少なくとも約80および最も好ましくは少なくとも約90の配列類似性を示す。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、4×SSC中で65°Cで一晩約16~20時間からのハイブリダイゼーション、続いて0.1×SSC中で65°Cで1時間の洗浄、または0.1×SSC中で65°Cで各々20分もしくは30分間の2回の洗浄であり得る。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50ホルムアミド、4×SSC中で42°Cで一晩16~20時間、続いて0.1×SSC中で65°Cで1時間の洗浄、または0.1×SSC中で65°Cで各々20分もしくは30分間の2回または一晩16~20時間の洗浄、またはChurch水性リン酸緩衝液7SDS;0.5MNaPO4バッファーpH7.2;10mMEDTA中で65°Cのハイブリダイゼーション、そして0.1×SSC、0.1SDS中で50°Cで各々20分もしくは30分間のいずれかで2回の洗浄、またはユニーク配列領域のためには2×SSC、0.1SDS中で65°Cで各々20分もしくは30分間の2回の洗浄であり得る。キメラのポリペプチド、キメラのタンパク質、融合タンパク質、キメラのウイルス性タンパク質またはキメラのウイルス三量体表面タンパク質をコードする核酸は、キメラの核酸またはキメラのヌクレオチド配列として記述することができる。例えば、限定すると判断すべきではないが、キメラのHIVタンパク質、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質、キメラのVZVタンパク質、キメラのSARSまたはキメラのエボラウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子は、キメラのVLPとして記述することができる。キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチド融合タンパク質とも称されるによって、2つまたはそれ以上のソースからのアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドが意味され、例えば、ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片例えば、Fタンパク質例えばRSV、麻疹、耳下腺炎、ニューカッスル病、Sタンパク質例えばSARS、envタンパク質HIV、Gタンパク質狂犬病、E、B、C、I、H等のエンベロープ糖タンパク質VZV、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、GP糖タンパク質例えばエボラ、マールブルグ;赤血球凝集素例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルスからの外部ドメイン、および例えばHAのTM/CTは、単一のポリペプチドとして融合されるが、これらに限定されない。キメラのタンパク質またはポリペプチドは、残りのポリペプチドまたはタンパク質と同じまたは異種のシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドという用語は当該技術分野において周知であり、アミノ酸の短い約5~30アミノ酸配列を一般的には指し、一般的にはポリペプチドのN末で見出され、新しく翻訳されたポリペプチドが特定の細胞内小器官へ移行することを導けるか、またはポリペプチド鎖の特異的ドメインが他のドメインに対してポジショニングすることを補助できるものである。非限定例として、シグナルペプチドは、タンパク質が小胞体の中へ移行すること、および/またはN末近位ドメインが新生ポリペプチドの膜アンカードメインに対してポジショニングすることを補助して成熟タンパク質例えば、限定すると判断すべきではないが、成熟HAタンパク質の切断および折り畳みを補助することを標的とすることができる。シグナルペプチドSPはタンパク質またはウイルスタンパク質に対して生来のものであり得るか、またはシグナルペプチドは発現されるタンパク質またはウイルスタンパク質の一次配列に関して異種であり得る。タンパク質またはウイルスタンパク質は、1つまたは複数の異なるインフルエンザのタイプ、サブタイプまたは系統からのHAにバランスがとれた第1のインフルエンザのタイプ、サブタイプまたは系統からのシグナルペプチドを含むことができる。例えば、HAサブタイプBH1、H2、H3、H5、H6、H7、H9またはインフルエンザタイプBの生来のシグナルペプチドを使用して、キメラのウイルスタンパク質を植物システムにおいて発現させることができる。本発明のいくつかの実施形態において、SPはインフルエンザタイプB、H1、H3もしくはH5のもの;またはサブタイプHl/Bri、HlNC、H5/Indo、H3/BriもしくはB/Floのものであり得る。いくつかの実施形態において、SPは、HIVEnvタンパク質、狂犬病Gタンパク質、VZV糖タンパク質E、SARS糖タンパク質SまたはEboloaウイルスエンベロープ糖タンパク質のものであり得る。シグナルペプチドは非生来のもの、例えば、タンパク質、ウイルス性タンパク質、ウイルス三量体表面タンパク質もしくはウイルス三量体表面タンパク質以外のウイルスの赤血球凝集素、または植物、動物もしくは細菌のポリペプチドからのものであり得る。使用することができるシグナルペプチドの非限定例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDISP;アクセッション番号Z11499のヌクレオチド32~103のものである。したがって、本発明は、生来または非生来のシグナルペプチドを含むキメラのウイルスタンパク質、およびかかるキメラのウイルスタンパク質をコードする核酸を提供する。発現されたキメラのウイルスタンパク質の正確な折り畳みは、いくつかある特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、VLPの形成、キメラのウイルスタンパク質の機能、および抗体によるキメラのウイルスタンパク質の認識に重要であろう。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、細胞コンパートメント中のpH、折り畳まれるか、部分的に折り畳まれるか、もしくは折り畳まれていないタンパク質と結合もしくは一過的に会合するコファクターの利用可能性、1つもしくは複数のシャペロンタンパク質の存在、または同種のものを含むが、これらに限定されない1つまたは複数の因子によって影響を受け得る。熱ショックタンパク質Hspまたはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、それは、タンパク質合成、細胞内トラフィッキング、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の集合および脱集合、タンパク質の折り畳みならびにタンパク質脱凝集を含む様々な細胞のプロセス中に参加し得る。かかるシャペロンタンパク質の例は、Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、サイクロフィリン、ClpP、GrpE、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含むが、これらに限定されない例えば、Macario,A.J.L.,ColdSpringHarborLaboratoryRes.25:59-70.1995;Parsell,D.A.Lindquist,S.Ann.Rev.Genet.27:437-4961993;米国特許第5,232,833号を参照されたい。本明細書において記載されるように、シャペロンタンパク質例えばHsp40およびHsp70であるがこれらに限定されないを使用して、キメラのウイルスタンパク質の折り畳みを保証することができる。Hsp70の例は、哺乳類細胞からのHsp72およびHsc73、細菌、特に癩菌、結核菌およびウシ結核菌カルメットゲラン桿菌等:本明細書においてHsp71と称される等のマイコバクテリアからのDnaKを含む。大腸菌、酵母および他の原核生物からのDnaK、および真核生物シロイヌナズナ等からのBiPおよびGrp78Linetal.2001CellStressandChaperones6:201-208。Hsp70の特定の例はシロイヌナズナHsp70であるGenbank参照番号:AY120747.1によってコードされる。Hsp70は折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに加えてATPも特異的に結合することができ、それによってタンパク質複合体の集合および脱集合に加えてタンパク質を折り畳むことおよび折り畳みをほどくことにも参加する。Hsp40の例は、大腸菌およびマイコバクテリア等の原核生物からのDnaJならびにアルファルファ等の真核生物からのHSJ1、HDJ1およびHsp40を含むFrugisetal.,1999.PlantMolecularBiology40:397-408。Hsp40の特定の例はアルファルファMsJ1Genbank参照番号:AJ000995.1である。Hsp40は、他の細胞活性の中でも、タンパク質の折り畳み、熱耐性およびDNA複製における分子的シャペロンとしての役割を果たす。Hsps中でもHsp70およびコシャペロンHsp40は、合成が完了する前に、翻訳中のポリペプチドおよび新しく合成されたポリペプチドの安定化に関与する。理論により束縛されることは意図しないが、Hsp40は、折り畳まれていない新生のまたは新しく移行させられたポリペプチドの疎水性パッチへ結合し、したがってHsp70-ATP複合体がポリペプチドと相互作用することを促進する。ATP加水分解は、ポリペプチドとHsp70とADPとの間の安定した複合体の形成ならびにHsp40の放出を引き起こす。Hsp70-ADP複合体がポリペプチドの疎水性パッチと会合することは、他の疎水性パッチとの相互作用を防止し、不正確な折り畳みおよび他のタンパク質との凝集の形成を防止するHartl,FU.1996.Nature381:571-579中で概説される。生来のシャペロンタンパク質は低レベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進することができるが、発現レベルが増加するにつれて、生来のシャペロンの存在量が限定因子になり得る。アグロインフィルトレーションした葉におけるキメラのウイルスタンパク質の高レベルの発現は、サイトゾル中でキメラのウイルスタンパク質の蓄積を引き起こし、1つまたは複数のシャペロンタンパク質Hsp70、Hsp40またはHsp70およびHsp40の両方等の共発現は、誤って折り畳まれたタンパク質または凝集したタンパク質のレベルを低下させ、ウイルス様粒子の形成を可能にする三次構造および四次構造の特性を示すタンパク質の数を増加させることができる。したがって、本発明は、キメラのウイルスタンパク質をコードする第1の核酸が、シャペロンをコードする第2の核酸と共発現される、キメラのウイルスタンパク質VLPを植物において産生する方法も提供する。第1および第2の核酸は同じ工程で植物へ導入することができるか、または植物へ連続して導入することができる本発明に従うウイルス由来タンパク質から産生されたキメラのVLPは、ウイルス性マトリックスまたはコアタンパク質を含まない。ウイルス性マトリックスタンパク質はビリオン構造を組織化し維持するタンパク質である。ウイルス性マトリックスタンパク質は通常細胞膜と直接相互作用し、出芽プロセスに関与することができる。ウイルス性コアタンパク質は、ヌクレオカプシドの一部を構成し、典型的にはウイルス性核酸と直接会合するタンパク質である。ウイルス性マトリックスタンパク質またはコアタンパク質の例は、インフルエンザのM1タンパク質、RSVのMタンパク質およびレトロウイルスのgagタンパク質である。M1タンパク質はVLP調製の混入物であるRNAに結合することが公知であるWakefieldL.,andBrownleeG.G.,NuclAcidsres11:8569-8580,1989。キメラのVLP産物のための規制認可を得る場合RNAの存在は所望されず、したがってRNAを欠くキメラのVLP調製は有利だろう。本出願における調節領域、調節エレメントまたはプロモーターという用語の使用は、DNAもしくはRNAまたはDNAおよびRNAの両方のいずれかからなる遺伝子のタンパク質コーディング領域の常にではないが典型的には上流の核酸の一部を表わすことを意味する。調節領域が活性があり、対象となる遺伝子と作動可能に会合または作動可能に連結されている場合に、これは対象となる遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介することができるか、または発生過程でまたは時間的に遺伝子活性化を制御することができるだろう。調節領域は、プロモーターエレメント、基本プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外的な刺激に応答して誘導可能なエレメント、負の調節エレメント等のプロモーター活性を媒介するエレメント、または転写エンハンサーを含むことができる。本明細書において使用される時、調節領域は、転写後に活性のあるエレメント、例えば遺伝子発現を調整する調節エレメント翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列ならびにmRNA不安定デターミナント等も含むことができる。これらの後者エレメントのいくつかのものは、コーディング領域に対して近位に位置することができる。本開示のコンテキストにおいて、調節エレメントまたは調節領域という用語は、典型的には構造遺伝子のコード配列に対して常にではないが通常は上流5’のDNAの配列を指し、それはRNAポリメラーゼおよび/または転写を特定の部位で開始するのに必要とされる他の因子のための認識の提供によって、コーディング領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内または配列の3’に位置する他のヌクレオチド配列も、対象となるコーディング領域の発現の調節に寄与し得ることを理解すべきである。RNAポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供して特定の部位での開始を保証する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。すべてではないが大部分の真核生物プロモーターエレメントはTATAボックス通常は転写開始部位の約25塩基対上流にあるアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基ペアからなる保存された核酸配列を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基本プロモーターエレメントに加えて、遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント上でリストされるようなを含む。発生的に調節されるもの、誘導可能なもの、または構成的なものを含む複数のタイプの調節領域がある。発生的に調節される調節領域、またはその制御下の遺伝子の差異的発現を制御する調節領域は、特定の器官または器官の組織内でその器官または組織の発生の間の特異的な時間に活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は特異的な発生段階で特定の器官または組織内で優先的に活性があってもよく、それらは発生的に調節される様式で、または植物内の他の器官または組織において基底レベルで同様に活性があってもよい。組織特異的調節領域の例は、例えばナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む特異的な調節領域を参照されたいRasketal.,1998,J.PlantPhysiol.152:595-599;Bilodeauetal,1994,PlantCell14:125-130。葉特異的プロモーターの例はプラストシアニンプロモーターを含むUS7125978を参照されたい、これは参照として本明細書に援用される。誘導可能調節領域は、誘導物質に応答して1つまたは複数のDNA配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。誘導物質の非存在下においてDNA配列または遺伝子は転写されないだろう。典型的には、誘導可能調節領域へ特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は不活性形態で存在することができ、次いでそれは誘導物質によって直接または間接的に活性形態に転換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。誘導物質は、化学的薬剤タンパク質、代謝物質、増殖調節物質、除草剤またはフェノール化合物等、または熱、低温、塩もしくは有毒物質によって直接的にまたは病原体もしくは病因物質ウイルス等の作用を介して間接的に課された生理的ストレスであり得る。誘導可能調節領域を含有している植物細胞は、噴霧、散水、加熱または類似の方法等によって細胞または植物へ誘導物質を外部から適用することによって、誘導物質に対して曝露され得る。誘導可能調節エレメントは植物または非植物遺伝子のいずれかに由来し得る例えばGatz,C.andLenk,LR.P.,1998,TrendsPlantSci.3,352-358;参照として援用される。可能性のある誘導可能プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーターGatz,C.,1997,Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48,89-108;参照として援用される、ステロイド誘導可能プロモーターAoyama.T.andChua,N.H.,1997,Plant1.2,397-404;参照として援用されるおよびエタノール誘導可能プロモーターSalter,M.G.,etal,1998,PlantJournal16,127-132;Caddick,MX,etal,1998,NatureBiotech.16,177-180、参照として援用されるサイトカイニン誘導可能IB6およびCKI1遺伝子Brandstatter,I.andK.ieber,U.,1998,PlantCell10,1009-1019;Kakimoto,T.,1996,Science274,982-985;参照として援用されるおよびオーキシン誘導可能エレメント、DR5Ulmasov,T.,etal.,1997,PlantCell9,1963-1971;参照として援用されるを含むがこれらに限定されない。構成的調節領域は、植物の様々な部分を通しておよび植物発生を通して連続的に遺伝子の発現を導く。公知の構成的調節エレメントの例は、CaMV35S転写物Odelletal.,1985,Nature,313:810-812、コメアクチン1Zhangetal,1991,PlantCell,3:1155-1165、またはtms2米国5,428,147、参照として本明細書に援用される、およびトリオースリン酸イソメラーゼ1Xuet.al.,1994,PlantPhysiol.106:459-467遺伝子、トウモロコシユビキチン1遺伝子Cornejoetai,1993,PlantMol.Biol.29:637-646、シロイヌナズナユビキチン1および6遺伝子Holtorfetal,1995,PlantMol.Biol.29:637-646、およびタバコ翻訳開始因子4A遺伝子Mandeletal,1995,PlantMol.Biol.29:995-1004と結び付いているプロモーターを含む。本明細書において使用される時、構成的という用語は、必ずしも構成的調節領域の制御下の遺伝子がすべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現されることを示さないが、たとえ存在量の変動が多くの場合観察されても、遺伝子が広範囲の細胞タイプで発現されることを示す。構成的調節エレメントを他の配列とカップルさせて、それらが作動可能に連結されるヌクレオチド配列の転写および/または翻訳をさらに促進することができる。例えば、CPMV-HTシステムはササゲモザイクウイルスCPMVの非翻訳領域に由来し、結び付いているコード配列の増強された翻訳を実証する。生来のによって、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在するか、または野生型であることが意味される。作動可能に連結されたによって、特定の配列例えば対象となる調節エレメントおよびコーディング領域が直接または間接的に相互に作用して意図された機能遺伝子発現の媒介または調整等を実行することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。キメラのタンパク質またはポリペプチドは、ウイルスベースのDNAまたはRNAの発現システム、例えばコモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルスベースの増幅エレメントであるが、これらに限定されないものを含む発現システムにおいて発現させることができる。本明細書において記述されるような発現システムは、2分節ウイルスベースの発現カセットまたは2分節ゲノムを持つウイルスを含み得る。例えば、2分節ウイルスはComoviridaeコモウイルス科であり得る。Comoviridae科の属は、Comovirusコモウイルス、Nepovirusネポウイルス、Fabavirusファバウイルス、CheravirusチェラウイルスおよびSadwavirusサドワウイルスを含む。コモウイルスは、ササゲモザイクウイルスCPMV、ササゲシビアモザイクウイルスCPSMV、西洋カボチャモザイクウイルスSqMV、アカクローバ斑紋ウイルスRCMV、マメサヤ斑紋ウイルスBPMV、カブリングスポットウイルスTuRSV、ソラマメトゥルーモザイクウイルスBBtMV、ソラマメステインウイルスBBSV、ダイコンモザイクウイルスRaMVを含む。本発明の様々な態様に有用であり得るエンハンサーエレメントを含むコモウイルスRNA-2配列の例は、CPMVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_003550、RCMVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_003738、BPMVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_003495、CPSMVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_003544、SqMVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_003800、TuRSVRNA-2GenBankアクセッション番号NC_013219.1BBtMVRNA-2GenBankアクセッション番号GU810904、BBSVRNA2GenBankアクセッション番号FJ028650、RaMVGenBankアクセッション番号NC_003800を含むが、これらに限定されない。2分節コモウイルスのRNAゲノムのセグメントはRNA-1およびRNA-2と称される。RNA-1は複製に関与するタンパク質をコードし、一方RNA-2は細胞間移動のために必要なタンパク質および2つのカプシドタンパク質をコードする。使用することができる任意の好適なコモウイルスベースのカセットは、CPMV、CPSMV、SqMV、RCMVまたはBPMVを含み、例えば、発現カセットはCPMVベースである。発現カセットは、適切なプロモーターまたは宿主細胞において対象となる核酸の転写のための他の調節エレメントの制御下で、それに作動できるようにまたは作動可能に連結された対象となる核酸を含むヌクレオチド配列を指す。発現システムは、ジェミニウイルスからの増幅エレメント例えばマメ黄化矮小ウイルスBeYDVからの増幅エレメントも含むことができる。BeYDVは双子葉植物に適合したMastrevirusesマストレウイルス属に属する。BeYDVは1分節で単一ストランド環状DNAゲノムを有し、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数まで複製することができる。BeYDV由来DNAレプリコンベクターシステムは、植物で迅速な高収率のタンパク質産生のために使用されている。本明細書において使用される時、増幅エレメントという語句は、ジェミニウイルスゲノムの1つまたは複数の長い遺伝子間領域LIRの少なくとも一部を含む核酸セグメントを指す。本明細書において使用される時、長い遺伝子間領域は、ジェミニウイルスrepタンパク質による切り出しおよび複製を媒介することができるrep結合部位を含有する長い遺伝子間領域の領域を指す。いくつかの態様において、1つまたは複数のLIRを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域SIRをさらに含むことができる。本明細書において使用される時、短い遺伝子間領域は相補的ストランドMastreviruses属の短いIRSIRを指す。任意の好適なジェミニウイルス由来の増幅エレメントを本明細書において使用することができる。例えば、WO2000/20557;WO2010/025285;ZhangX.etal.2005,BiotechnologyandBioengineering,Vol.93,271-279、HuangZ.etal.2009,BiotechnologyandBioengineering,Vol.103,706-714、HuangZ.etal.2009,BiotechnologyandBioengineering,Vol.106,9-17;これらは参照として本明細書に援用されるを参照されたい。キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドはキメラのヌクレオチド配列からの転写物として産生することができ、キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドは合成後に切断され、必要に応じて会合して多量体タンパク質を形成する。したがって、キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドは、ジスルフィド架橋によって会合するサブユニットからなるタンパク質またはポリペプチドすなわち多量体タンパク質も含む。例えば、2つまたはそれ以上のソースからのアミノ酸配列を含むキメラのポリペプチドは、サブユニットへとプロセシングされ、サブユニットはジスルフィド架橋によって会合されてキメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドを産生することができる。本発明の様々な実施形態に記載のキメラのウイルスタンパク質は、インフルエンザHAからの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TM/CTを含む。TM/CTは、例えばB、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15およびH16タイプまたはサブタイプを含む、インフルエンザウイルスの任意のタイプ、サブタイプからの生来のHATM/CTであり得る。H1、H3、H5またはBタイプまたはサブタイプの非限定例は、A/ニューカレドニア/20/99サブタイプH1N1、H1A/カリフォルニア/04/09サブタイプH1N1、A/インドネシア/5/05サブタイプH5N1、A/ブリズベーン/59/2007、B/フロリダ/4/2006およびH3A/ブリズベーン/10/2007を含む例えばWO2009/009876;WO2009/076778;WO2010/003225;WO2010/003235を参照されたい、これらは参照として本明細書に援用される。さらに、TM/CTは、1、2、3、4もしくは5アミノ酸が欠失されるか、または1、2、3、4もしくは5アミノ酸の任意の種類のスペーサーまたはリンカー配列が添加されたこれらHATM/CTのいずれかであり得る。好ましくは、TM/CTはH5またはH3からのものであり、例えば、A/インドネシア/5/05サブタイプH5N1;H5/Indo;GenBankアクセッション番号ABW06108.1、H5A/ベトナム/1194/2004Aベトナム;GenBankアクセッション番号ACR48874.1、H5Aアンホイ/1/2005Aアンホイ;GenBankアクセッション番号ABD28180.1;H3、ブリズベーン/10/2007H3/Bri;GenBankアクセッション番号ACI26318.1、H3A/ウィスコンシン/67/2005A-WCN;GenBankアクセッション番号ABO37599.1であるが、これらに限定されない。複数のH3およびH5のTM/CT境界の配列はWO2010/148511参照として本明細書に援用される中に記述される。TM/CTのためのアミノ酸配列の非限定例は、配列番号:41および42ならびに配列番号:41または42のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を含む。アミノ酸変動はインフルエンザウイルスの赤血球凝集素において許容される。かかる変動は継続的に同定されている新しい株を提供する。新しい株間の伝染力は変動し得る。しかしながら、赤血球凝集素三量体の形成それは続いてVLPを形成するは維持される。したがって、本発明は、植物においてVLPを形成する、赤血球凝集素アミノ酸配列を含むキメラのウイルスタンパク質、または赤血球凝集素アミノ酸配列を含むキメラのウイルスタンパク質をコードする核酸を提供し、公知の配列および発生し得るバリアントHA配列を含む。ウイルス様粒子VLP、またはウイルス様粒子複数または、VLP複数という用語は、自己集合し、キメラのウイルスタンパク質等の構造タンパク質を含む構造を指す。VLPおよびキメラのVLPは、一般的には感染で産生されるビリオンに形態学的および抗原性的に類似するが、複製するための十分な遺伝情報を欠き、したがって非感染性である。VLPおよびキメラのVLPは植物宿主細胞を含む好適な宿主細胞において産生され得る。宿主細胞からの抽出後ならびに好適な条件下での単離およびさらなる精製に際して、VLPおよびキメラのVLPはインタクトな構造として精製することができる。本発明のキメラのVLPは、タンパク質をシアル化する能力を欠くことによって特徴づけられる宿主細胞において産生することができ、それらは例えば、植物細胞、昆虫細胞、菌類、および他の生物海綿、腔腸動物、環形動物、節足動物、軟体動物、線形動物、輪形動物、扁形動物、毛顎動物、触手動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、古細菌、または同種のものを含むである。例えば、Guptaetal.,1999.NucleicAcidsResearch27:370-372;Toukachetal.,2007.NucleicAcidsResearch35:D280-D286;Nakaharaetal.,2008.NucleicAcidsResearch36:D368-D371を参照されたい。本発明は、キメラのVLPが発現される細胞の原形質膜からの脂質エンベロープを得るキメラのVLPも提供する。例えば、キメラのウイルスが植物ベースのシステムにおいて発現されるならば、生じたキメラのVLPは植物細胞の原形質膜からの脂質エンベロープを得ることができる。一般的には、脂質という用語は脂溶性親油性の天然に存在する分子を指す。本発明のいくつかの態様に記載の植物において産生されるキメラのVLPは、植物由来脂質と複合体化することができる。植物由来脂質は、脂質二重層の形態であり、VLPを囲むエンベロープをさらに含むことができる。植物由来脂質はVLPが産生される植物の原形質膜の脂質成分を含むことができ、リン脂質、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドに加えて、脂溶性ステロールまたはステロールを含む代謝物質を含む。例は、ホスファチジルコリンPC、ホスファチジルエタノールアミンPE、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、グリコスフィンゴリピド、植物ステロールまたはその組み合わせを含む。植物由来脂質は、代わりに植物脂質と称することができる。植物ステロールの例は、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、δ-7-スチグマステロール、δ-7-アベナステロール、ダウノステロールdaunosterol、シトステロール、24-メチルコレステロール、コレステロールまたはβ-シトステロールを含む例えばMongrandetal.,2004を参照されたい。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、培養または細胞もしくは生物の増殖条件、または細胞が得られる種に応じて変動し得る。一般的には、β-シトステロールは最も豊富な植物ステロールである。細胞膜は、一般的には様々な機能のためのタンパク質と同様に脂質二重層を含む。特定の脂質の局在化した濃縮は脂質二重層において見出すことができ、脂質ラフトと称される。これらの脂質ラフトミクロドメインではスフィンゴ脂質およびステロールが濃縮され得る。理論により束縛されることは意図しないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の病原菌の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞または生物の他の構造成分細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックス等との相互作用において重要な役割を有することができる。植物内で産生されたVLPは、植物特異的N-グリカンを含むキメラのウイルスタンパク質を誘導することができる。したがって、本発明は植物特異的N-グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を含むVLPも提供する。さらに、植物におけるN-グリカンの修飾は公知であり例えば米国の60/944,344を参照されたい;参照として本明細書に援用される、修飾されたN-グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を産生することができる。修飾された糖鎖付加パターンを含む、例えばフコシル化、キシロシル化、もしくはフコシル化およびキシロシル化の両方が減少したN-グリカンを持つキメラのウイルスタンパク質を得ることができるか、またはタンパク質がフコシル化、キシロシル化もしくはその両方を欠き、増加したガラクトシル化を含む、修飾された糖鎖付加パターンを有するキメラのウイルスタンパク質を得ることができる。さらに、翻訳後修飾の調整例えば末端ガラクトースの添加は、キメラのウイルスタンパク質を発現する野生型植物に比較した場合、発現されたキメラのウイルスタンパク質のフコシル化およびキシロシル化の減少をもたらし得る。例えば、限定すると判断すべきではないが、修飾された糖鎖付加パターンを有するキメラのウイルスタンパク質の合成は、β-1.4ガラクトシルトランスフェラーゼGalTをコードするヌクレオチド配列と共にキメラのウイルスタンパク質を共発現することによって達成することができ、例えば哺乳類GalTまたはヒトGalT、しかしながら他のソースからのGalTも使用することができるがこれらに限定されない。GalTの触媒ドメインをN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼGNT1のCTSドメインすなわち細胞質尾部、膜貫通ドメイン、ステム領域へ融合して、GNT1-GalTハイブリッド酵素を産生することもでき、ハイブリッド酵素はキメラのウイルスタンパク質と共発現させることができる。キメラのウイルスタンパク質は、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIGnT-IIIをコードするヌクレオチド配列とも共に共発現することができ、例えば哺乳類GnT-IIIまたはヒトGnT-III、他のソースからのGalTも使用することができるがこれらに限定されない。加えて、GnT-IIIへ融合したGNT1のCTSを含むGNT1-GnT-IIIハイブリッド酵素も使用することができる。したがって、本発明は修飾されたN-グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を含むVLPも提供する。理論により束縛されることは意図しないが、キメラのウイルスタンパク質上の植物N-グリカンの存在は、抗原提示細胞によるキメラのウイルスタンパク質の結合を促進することによって、免疫反応を刺激することができる。植物のNグリカンを使用する免疫反応の刺激はSaint-Jore-Dupasetal.2007によって提唱されている。さらに、VLPの立体配座は抗原の提示のために有利であり、植物由来脂質層と複合体化された場合VLPのアジュバント効果を促進することができる。VLPは、例えば赤血球凝集分析、電子顕微鏡検査、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて査定され得る。サイズ排除クロマトグラフィーのために、全可溶性タンパク質は、凍結破砕された植物材料のサンプルを抽出バッファー中でホモジナイズすることPolytronによって植物組織から抽出することができ、不溶性物質は遠心分離によって除去される。氷冷アセトンまたはPEGによる沈殿も有益であり得る。可溶性タンパク質は定量化され、抽出物はSephacrylTMカラム例えばSephacryl商標S500カラムを通して通過させる。ブルーデキストラン2000をキャリブレーションスタンダードとして使用することができる。クロマトグラフィー後に、画分をイムノブロットによってさらに解析して、画分のタンパク質補体を決定することができる。分離された画分は、例えば上清遠心分離、沈降、または沈殿されたならばまたは濾液濾過されたならばであり得、タンパク質または上位構造タンパク質例えばロゼット様構造等またはより高次のおよびより高分子量の粒子VLP等について濃縮されている。分離された画分をさらにプロセシングして、例えば追加の遠心分離工程、沈殿、クロマトグラフィー工程例えばサイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー、タンジェンシャルフロー濾過またはその組み合わせによって、タンパク質または上位構造のタンパク質の単離、精製、濃縮、またはその組み合わせを行なう。精製されたタンパク質または上位構造タンパク質の存在は、例えば未変性PAGEもしくはSDS-PAGE、適切な検出抗体を使用するウエスタン分析、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡検査または当業者に明らかな他の方法によって確認することができる。溶出プロフィールは使用される溶出条件に応じて変動させることができる。図7、8Oおよび11Bは、キメラのVLPを含む植物抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー分析の溶出プロフィールの一例を示す。この事例において、キメラのHIV、キメラの狂犬病GおよびキメラのVZVウイルス三量体表面タンパク質を含むVLPは、カラムの空隙体積中に溶出し、ロゼット構造および高分子量構造はおよそ画分13~14に溶出し、より低分子量のものまたはキメラのウイルス三量体表面タンパク質の可溶性形態はおよそ15~およそ17の画分中に溶出する。VLPは任意の好適な方法例えば化学的抽出または生化学的抽出を使用して、精製または抽出することができる。VLPは、乾燥、熱、pH、界面活性剤およびデタージェントに対して比較的感受性が高い。したがって、収率を最大にし、細胞タンパク質によるVLP画分の汚染を最小限にし、タンパク質またはVLPおよび必要に応じて会合した脂質エンベロープまたは膜の完全性を維持する方法、細胞壁を緩めてタンパク質またはVLPを放出する方法を使用することが有用であろう。例えば、プロトプラストおよび/またはスフェロプラストを産生する方法を使用して例えばWO2011/035422を参照、参照として本明細書に援用される、本明細書において記述されるようなVLPを得ることができる。デタージェントまたは界面活性剤例えばSDSまたはトリトンX-100等の使用を最小限にするかまたは取り除くことは、VLP抽出の収率の改善のために有益であろう。次いで、VLPは、例えば電子顕微鏡またはサイズ排除クロマトグラフィーによって構造およびサイズについて上記のように査定することができる。本発明の1つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、本発明のヌクレオチド配列またはコンストラクトまたはベクターによって形質転換された任意の好適な植物宿主において発現させることができる。好適な宿主の例は、アルファルファ、キャノーラ、Erassica属の種、トウモロコシ、Nicotiana属の種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、カラスムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、コットン、および同種のものを含む農作物を含むが、これらに限定されない。本発明の1つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、3’非翻訳領域をさらに含むことができる。3’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる他の調節シグナルを含有するDNAセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常mRNA前駆体の3’末端へポリアデニル酸トラックの添加をもたらすことで特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルの変動は稀ではないが、一般的には基準型5’AATAAA-3’に対する相同性の存在によって認識される。好適な3’領域の非限定例は、アグロバクテリウム腫瘍誘導Tiプラスミド遺伝子ノパリンシンターゼNOS遺伝子等、植物遺伝子ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子等、リブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニットssRUBISCO;米国4,962,028;参照として本明細書に援用される、プラストシアニン発現の調節において使用されるプロモーター参照として本明細書に援用されるUS7,125,978中で記述されるのポリアデニル化シグナルを含有する3’の転写される非翻訳領域である。本発明の1つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、さらなるエンハンサー翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれかも必要に応じて含むことができる。エンハンサーは転写されている配列に対して5’または3’に位置することができる。エンハンサー領域は当業者へ周知であり、ATG開始コドンおよび隣接する配列または同種のものを含んでもよい。開始コドンは、存在するならば、コード配列のリーディングフレームと同位相インフレームであって、転写配列の正確な翻訳を提供することができる。本発明のコンストラクトは、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的DNA形質転換、微小注射、電気穿孔などを使用して、植物細胞の中へ導入することができる。かかる技法の総説については、例えばWeissbachandWeissbachMethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress、NewYorkVIII、421~463ページ1988;GeiersonandCorey、PlantMolecularBiology、第2版1988;およびMikiandIyer、FundamentalsofGeneTransferinPlants.PlantMetabolism、第2版DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell編、AddisonWesly,LangmansLtd.London、561~579ページ1997を参照されたい。他の方法は、直接的DNA取り込みリポソーム、電気穿孔の使用、例えばプロトプラスト、顕微注入、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、およびバキュームインフィルトレーションの使用をを含む。例えば、Bilang,etal.Gene100:247-250,1991、Scheidetal.Mol.Gen.Genet.228:104-112,1991、Guercheetal.PlantScience52:111-116,1987、Neuhauseetal.Theor.ApplGenet.75:30-36,1987、Kleinetal.,Nature327:70-731987;Howelletal.Science208:1265,1980、Horschetal.Science227:1229-1231,1985、DeBlocketal.,PlantPhysiology91:694-701,1989、MethodsforPlantMolecularBiologyWeissbachandWeissbach編、AcademicPressInc.、1988、MethodsinPlantMolecularBiologySchulerandZielinski編、AcademicPressInc.、1989、LiuandLomonossoffJVirolMeth,105:343-348,2002、米国特許第4,945,050号;第5,036,006号;および第5,100,792号、米国特許出願第08/438,666号1995年5月10日に出願および第07/951,715号1992年9月25日に出願その全ては参照として本明細書に援用されるを参照されたい。以下に記述されるように、一過性発現方法を使用して本発明のコンストラクトを発現させることができるLiuandLomonossoff,2002,JournalofVirologicalMethods,105:343-348を参照;参照として本明細書に援用される。あるいは、Kapilaetal.,1997参照として本明細書に援用されるによって記述されるような真空ベースの一過性発現方法を使用することができる。これらの方法は、例えばアグロ-イノキュレーションまたはアグロ-インフィルトレーション、シリンジインフィルトレーションの方法を含み得るが、これらに限定されない。しかしながら、上で指摘されるように、他の一過性方法も使用することができる。アグロ-イノキュレーション、アグロ-インフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望される核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば葉、植物の地上構造の一部茎、葉および花を含む、植物の他の一部茎、根、花または植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を通過した後、アグロバクテリアは感染し、細胞の中へt-DNAコピーを移行させる。t-DNAはエピソームとして転写され、mRNAは翻訳され、感染細胞中で対象となるタンパク質の産生を引き起こすが、核の内部へのt-DNAの通過は一過性である。形質転換した植物細胞の同定を支援するために、本発明のコンストラクトをさらに操作して植物選択マーカーを含めることができる。有用な選択マーカーは、抗生物質例えばゲンタマイシンおよびハイグロマイシン、カナマイシンまたは除草剤ホスフィノトリシン、グリホサート、クロロスルフロン等および同種のもの等の化学薬品に対する抵抗性を提供する酵素を含む。同様に、GUSβ-グルクロニダーゼ等の色変化またはルシフェラーゼまたはGFP等の発光によって識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用することができる。本発明がさらに考慮する部分は、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、植物細胞または種子である。植物細胞から植物全体を再生する方法も当該技術分野において公知である。一般に、形質転換された植物細胞は適切な培地抗生物質等の選択的薬剤を含有し得る中で培養され、選択マーカーを使用して形質転換された植物細胞の同定を促進する。いったんカルスが形成されたなら、芽形成は公知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることによって促進することができ、芽は植物の再生のための発根培地へ移される。次いで、植物は、種子または栄養繁殖技法の使用のいずれかから反復世代を確立するのに使用することができる。トランスジェニック植物は組織培養を使用せずに生成することもできる。本発明は以下のヌクレオチド配列を含む。表1。配列番号のリスト。本発明は以下の実施例においてさらに示されるだろう。実施例コンストラクト表2:HIVタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト表3:狂犬病ウイルスタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト表4:VZVタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト表5:SARSタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト実施例1:HIVタンパク質を持つ発現カセットの組立て2×35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFI-NOSコンストラクト番号995生来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を持つHIVConSΔCFIへ融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、2×35S-CPMV-HT発現システムの中へ以下のようにクローン化した。最初に、生来のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むHIVConSΔCFI遺伝子の核酸配列は、Liaoetal,2006,Virology353:268-282中で開示された配列に従ってGeneArtAGRegensburg、ドイツによって合成された。HIVConSΔCFIの核酸配列は図1A中で提示される配列番号:1。アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDISPヌクレオチド32~103;アクセッション番号Zl1499のシグナルペプチドを、Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法によってHIVConSΔCFIに連結した。PCRの第1のラウンドにおいて、コンストラクト番号540コンストラクト番号540の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図52、配列番号:61を参照をテンプレートとして用いて、プライマーIF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびSpPDI-HIVgp145.r図1C、配列番号:3を使用して、PDISPを含有する断片を増幅した。合成されたConSΔCFIセグメント図1A、配列番号:1をテンプレートとして使用して、プライマーIF-SpPDI-gp145.c図1D、配列番号:4およびWtdTm-gp145.r図1E、配列番号:5を使用して、生来のシグナルペプチドなしのConSΔCFIを含有する第2の断片を増幅した。PCRの第2のラウンドにおいて、テンプレートとしてのPCRの第1のラウンドからの両方のPCR産物と共に、プライマーIF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびWtdTm-gp145.r図1E、配列番号:5を使用した。生じたPCR産物をApaI制限酵素により消化し、ApaI-StuIにより消化された修飾した972のコンストラクトの中へクローン化した。修飾した972のアクセプタープラスミドコンストラクト番号972のオリジナルの配列については参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照を処理して、2×35Sプロモーターの上流のSbfI制限部位を取り除いた。SbfI部位をSbfIによるプラスミド972の消化によって取り除き、生じたプラスミドをT4DNAポリメラーゼにより処理して3’突出を除去し、処理したプラスミドを再ライゲーションして、SbfI部位なしの修飾した972のプラスミドを生じた。生じたコンストラクトに番号995を与えた図1F、配列番号:6。PDISP-HIVConSΔCFIのアミノ酸配列を図1G中で示す配列番号:7。995プラスミド表示を図1H中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。2×35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFIH3A/ブリズベーン/10/2007膜貫通ドメイン細胞質尾部-NOSコンストラクト番号997Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、HIVConSΔCFIへならびにH3A/ブリズベーン/10/2007の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、2×35S-CPMV-HT発現システムの中へクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、コンストラクト番号995図1F、配列番号:6をテンプレートとして使用して、プライマーIF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびIF-H3dTmgp145.r図2A、配列番号:8を使用して、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのPDISP-HIVConSΔCFIを含む断片を増幅した。コンストラクト番号776コンストラクト番号776の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図60、配列番号:69を参照をテンプレートとして使用して、プライマーGp145H3dTm.c図2B、配列番号:9およびH3dTm.r図2C、配列番号:10を使用して、H3A/ブリズベーン/10/2007の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびH3dTm.r図2C、配列番号:10をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第2のPCRの産物をApaIにより消化し、ApaIおよびStuIの制限酵素により消化されたコンストラクト番号995図1F、配列番号:6の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号997を与えた図2D、配列番号:11。PDISP-HIVConSΔCFI-A/ブリズベーン/10/2007H3TMCTのアミノ酸配列を図2E中で示す配列番号:12。997プラスミド表示を図2F中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。2×35S-CPMVHT-PDISP-HIVConSΔCFI-H5A/インドネシア/5/2005膜貫通ドメイン細胞質尾部-NOSコンストラクト番号999Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、HIVConSΔCFIへならびにH5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、2×35S-CPMV-HT発現システムの中へ以下のようにクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、コンストラクト番号995図1F、配列番号:6をテンプレートとして使用して、プライマーIF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびIF-H5dTmgp145.r図3A、配列番号:13を使用して、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのPDISP-HIVConSΔCFIを含む断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーGp145H5dTm.c図3B、配列番号:15およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-ApaI-SpPDI.c図1B、配列番号:2およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第2のPCRの産物をApaIにより消化し、ApaIおよびStuIの制限酵素により消化されたコンストラクト番号995図1F、配列番号:6の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号999を与えた図3D、配列番号:16。PDISP-HIVConSΔCFIA/インドネシア5/2005のH5TMCTのアミノ酸配列。TMCTを図3E中で示す配列番号:17。999プラスミド表示を図3F中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。プラストシアニン-P1-プラストシアニンコンストラクト番号172トマトブッシースタントウイルスTBSVからのP19サイレンシングサプレッサーをコードする配列を、アルファルファプラストシアニンプロモーターと3’UTRおよびターミネーターとの間に以下のようにクローン化した。コンストラクト番号R472組立てについては参照として本明細書に援用されるWO2010/003225A1およびR472プラスミドの表示についてはWO2010/003225A1の図86を参照を、制限酵素DraIII最初のATGの84塩基対上流およびSacI終止コドンの9塩基対下流により消化して、アルファルファプラストシアニンプロモーターからの84pbおよびTBSVP19サイレンシングサプレッサーのための配列コーディングを含む断片を取り出した。生じた断片を、事前にDraIIIおよびSacIにより消化したコンストラクト540組立てについては参照として本明細書に援用されるWO2010/003225および540プラスミドの表示については同じ特許の図6を参照の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号172を与えた配列番号:4A、図18。TBSVP19タンパク質のアミノ酸配列を図4B中で提示する配列番号:19。172プラスミド表示を図4C中で示す。植物バイオマス、イノキュラムおよびアグロインフィルトレーションの調製バイオマスおよび植物物質という用語は、本明細書において使用される時、植物に由来する任意の材料を反映することを意味する。バイオマスまたは植物物質は、植物全部、組織、細胞またはその任意の画分を含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物コンポーネント、細胞外植物コンポーネント、液体もしくは固体の植物抽出物、またはその組み合わせを含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはその組み合わせからの、植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはその組み合わせを含むことができる。植物の一部は植物物質またはバイオマスを含み得る。Nicotianabenthamiana植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。16/8の光周期および25°C昼/20°C夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の3週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の3週間温室中に放置して成長させる。各々のコンストラクトによりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、0.6~1.6の間のOD600に到達するまで、10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、20μMアセトシリンゴン、50μg/mlカナマイシンおよび25μg/mlカルベニシリンpH5.6を補足したYEB培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地10mMMgCl2および10mMMESpH5.6中で再懸濁し、4°Cで一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを2.5培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。N.benthamianaの植物全体を、20~40Torrの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで2分間置いた。収穫までの2~6日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて1:1比率で系統AGL1/172との共インフィルトレーションとして実行された。本明細書において記述されるような様々なコンストラクトを含むA.tumefaciens株は、AGL1接頭語の使用によって参照される。例えば、コンストラクト番号995図1Hを参照を含むA.tumefaciensはAGL1/995と称される。葉収穫および全タンパク質抽出インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、-80°Cで凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、3体積の冷50mMトリスpH8.0、0.15MNaCl、0.1トリトンX-100および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすることPolytronによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4°Cで10分間10,000gで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物上清を解析のために保存した。タンパク質分析およびイムノブロット清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、BradfordアッセイBio-Rad、Hercules、CAによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリドPVDF膜RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水TBST中の5スキムミルクおよび0.1ツイーン-20により4°Cで16~18時間、膜をブロッキングした。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で2μg/mlに1:2500で希釈したヤギポリクローナル抗gp120一次抗体Abcam、ab21179とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で1:10000で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギ二次抗体JIR705-035-147とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質RocheDiagnosticsCorporationとしてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。実施例2:生来およびキメラのHIVエンベロープタンパク質の植物における発現HIVConSΔCFIは、短縮された可変的ループ、切断部位の削除、融合ドメインおよびgp41における免疫優勢領域を備えたコンセンサスHIVグループのMエンベロープタンパク質である。モルモットにおいて野生型エンベロープタンパク質と類似するか、またはより大きな範囲および力価のクロスサブタイプ中和抗体を誘導することが実証されたLiaoetal.,Virology2006353:268-282。図5はこの研究において使用されるコンストラクトを示す。コンストラクト番号995において、生来のTM/CTを含む成熟HIVConSΔCFI以下Envと称されるについてのコーディング領域を、CPMV-HT発現システムの制御下に置いた。コンストラクト番号997および999において、HIVEnvのTM/CTドメインを、A/ブリズベーン/10/2007H3N2およびA/インドネシア/05/2005H5N1からのインフルエンザ赤血球凝集素HAのものによってそれぞれ置き換えた。すべての事例において、植物起源のシグナルペプチドアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼPDIタンパク質からのもので、生来のHIVEnvタンパク質シグナルペプチドを置換した。コンストラクト995、997および999からのHIVEnvの産生を、アグロインフィルトレーションしたNicotianabenthamiana植物において比較した。AGL1/995、AGL1/997およびAGL1/999によりインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物をウエスタンブロットによって解析し、結果を図6中で示し、レーン1~4は様々な量の組換えHIV-1gp160ab68171を含有する陽性対照;レーン5、陰性対照;レーン6~8、AGLl/995をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質;レーン9および10、AGLl/997をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質;レーン11および12、AGLl/999をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質である。図6中で示されるように、検出のために使用した条件において生来のHIVEnvの発現を検出することができず、植物におけるHIVEnvタンパク質について以前に報告された非常に低い蓄積レベルが確認されるRybickietal.,2010,PlantBiotechnologyJournal8:620-637。インフルエンザH3コンストラクト番号997またはH5コンストラクト番号999のものによってTM/CTドメインが置き換えられたEnvのキメラの形態は、生来の形態よりもはるかに高レベルで蓄積された。上で指摘されるように、番号997および番号999のコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。実施例3キメラのHIVEnvをウイルス様粒子へと集合させるコアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてVLPへと集合させるキメラのHIVEnvの能力も検討した。AGL1/997Env/H3およびAGL1/999Env/H5からのタンパク質抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いてEnv含有量についてヤギ抗gp120抗体を使用して溶出画分を分析した。図7A中で示されたウエスタンブロットは、AGL1/999をインフィルトレーションした植物からの抽出物について、溶出画分中のキメラのEnv/H5含有量が画分7~10においてピークに達することを示し、200万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。画分7~18における相対的タンパク質含有量の検討から、宿主タンパク質の大部分が画分11~18において溶出したことが明らかに示される図7B。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へとEnv/H5が集合することを示す。類似の結果がAGL1/997をインフィルトレーションした植物におけるEnv/H3について得られた。総合すれば、これらの結果は、キメラのHIVEnv/H5がアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合したことを実証する。これらの結果は、非インフルエンザ抗原へのインフルエンザHAのTM/CTドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するVLPを集合して放出するのに十分であることも実証する。実施例4:狂犬病タンパク質を持つ発現カセットの組立てC-2×35S-CPMVHT-PDISP-狂犬病糖タンパク質GRabGH5A/インドネシア5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TMCT-NOSコンストラクト番号1074;図8A、8H。Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合した狂犬病糖タンパク質GRabG外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン-P19-プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおける2×35S-CPMV-HT-PDISP-NOS発現システムの中へ以下のようにクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、合成されたRabG遺伝子Genebankアクセッション番号EF206707からのヌクレオチド3317~4891に対応する図8D、配列番号:34をテンプレートとして使用して、プライマーIF-RabG-S24.c図8B、配列番号:32およびRabGH5dTm.r図8C、配列番号:33を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのRabG外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーIF-H5dTm.c図8E、配列番号:35およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-RabG-S24.c図8B、配列番号:32およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。ClontechMountainView、CAによるIn-Fusion融合クローニングシステムを使用して、2×35S-CPMVHT-NOS発現システム中のアルファルファPDIシグナルペプチドと共に、生じた断片をインフレームでクローン化した。コンストラクト141図8F、8GをSbfIおよびStuI制限酵素により消化し、In-Fusion組立て反応のために使用した。コンストラクト番号141は、CPMVHTベースの発現カセット中への対象となる遺伝子のInFusionクローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のTBSVP19サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはpCAMBIAベースのプラスミドであり、左t-DNA境界から右t-DNA境界の配列を図中で8F示す配列番号:36。ベクター141の図式的な表示を図8G中で示す。生じたコンストラクトに番号1074を与えた図8H、配列番号:37。PDISP-RabG-A/インドネシア/5/2005H5TMCTのアミノ酸配列を図8I中で示す配列番号:38。1074プラスミド表示を図8A中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。BeYDVレプリカーゼ増幅システムの中のD-2×35S-PDISP-狂犬病糖タンパク質GRabGH5A/インドネシア/5/2005膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TMCT-NOSコンストラクト番号1094:図8L、8MDarveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合した狂犬病糖タンパク質GRabG外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン-P19-プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおけるBeYDVレプリカーゼ発現システム中の2×35S-CPMV-HT-PDISP-NOSの中へ以下のようにクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、合成されたRabG遺伝子Genebankアクセッション番号EF206707からのヌクレオチド3317~4891に対応する図8D、配列番号:34をテンプレートとして使用して、プライマーIF-RabG-S24.c図8B、配列番号:32およびRabGH5dTm.r図8C、配列番号:33を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのRabG外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーIF-H5dTm.c図8E、配列番号:35およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-RabG-S24.c図8B、配列番号:32およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。ClontechMountainView、CAによるIn-Fusionクローニングシステムを使用して、BeYDVレプリカーゼ増幅システムの中の2×35S-CPMVHT-NOS発現カセット中のアルファルファPDIシグナルペプチドと共に、生じた断片をインフレームでクローン化した。コンストラクト144をSbfIおよびStuI制限酵素により消化し、In-Fusion組立て反応のために使用した。コンストラクト番号144は、BeYDV増幅システムの中のCPMVHTベースの発現カセット中への対象となる遺伝子のInFusionクローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のTBSVP19サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはpCAMBIAベースのプラスミドであり、左t-DNA境界から右t-DNA境界の配列を図中で8J示す配列番号:39。ベクター144の図式的な表示を図8K中で示す。生じたコンストラクトに番号1094を与えた図8L、配列番号:40。PDISP-RabG-A/インドネシア/5/2005H5TMCTのアミノ酸配列を図8I中で示す配列番号:38。1094プラスミド表示を図8M中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。実施例5:キメラの狂犬病タンパク質の植物における発現Gタンパク質をPDISpとの融合で発現させたコンストラクト1071。コンストラクト1074は、PDISpおよびH5A/IndoTMCTドメインとの狂犬病Gタンパク質の融合物である。コンストラクト1094は、BeYDVrep、PDISpおよびH5A/IndoTMCTドメインとの狂犬病Gタンパク質の融合物である。コンストラクト1091は、PDISpおよびBeYDVrepとの狂犬病Gタンパク質の融合物である。Nicotianabenthamiana植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。16/8の光周期および25°C昼/20°C夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の3週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の3週間温室中に放置して成長させる。各々のコンストラクトコンストラクト1071、1071、1074、1091および1094によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、0.6~1.6の間のOD600に到達するまで、10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、20μMアセトシリンゴン、50μg/mlカナマイシンおよび25μg/mlカルベニシリンpH5.6を補足したYEB培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地10mMMgCl2および10mMMESpH5.6中で再懸濁し、4°Cで一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを2.5培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。N.benthamianaの植物全体を、20~40Torrの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで2分間置いた。収穫までの2~6日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて1:1比率で系統AGL1/172との共インフィルトレーションとして実行された。インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、-80°Cで凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、3体積の冷50mMトリスpH8.0、0.15MNaCl、0.1トリトンX-100および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすることPolytronによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4°Cで10分間10,000gで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物上清を解析のために保存した。清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、BradfordアッセイBio-Rad、Hercules、CAによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリドPVDF膜RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水TBST中の5スキムミルクおよび0.1ツイーン-20により4°Cで16~18時間、膜をブロッキングした。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中の0.5μg/μlのSantaCruzSE-57995一次抗体とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で1:10000で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスJIR、115-035-146二次抗体とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質RocheDiagnosticsCorporationとしてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。図8N中で示されるように、狂犬病Gタンパク質を、PDISpコンストラクト1071、BeYDVrepコンストラクト1094または1091、H5A/IndoTMCTドメインコンストラクト1074またはその組み合わせとの融合で発現させた。実施例6:キメラの狂犬病Gタンパク質のウイルス様粒子への集合コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてVLPへと集合させる狂犬病Gタンパク質の能力も検討した。コンストラクト1074またはコンストラクト1094を使用して形質転換された植物からのタンパク質抽出物を清澄化し、ゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いて狂犬病G含有量についてSantaCruzSE-57995一次抗体を使用して溶出画分を分析した。図8O中で示されたウエスタンブロットは、インフィルトレーションした植物からの抽出物で、コンストラクト1074を使用して産生されたタンパク質についての溶出画分中のキメラの狂犬病G5含有量が画分8~14においてピークに達し、コンストラクト1094を使用して調製されたタンパク質抽出物については画分8~12中で大部分のタンパク質の溶出が分画されることを示し、200万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へと狂犬病Gが集合することを示す。図9Aは、コンストラクト1074から発現された精製狂犬病Gタンパク質のイムノブロット分析を示す。図9Bは、VLP形態を示すコンストラクト1074の発現に由来する精製狂犬病Gタンパク質VLPの透過電子顕微鏡写真を示す。したがって、狂犬病Gはアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合した。これらの結果は、非インフルエンザ抗原狂犬病G等へのインフルエンザHAのTM/CTドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するVLPを集合して放出するのに十分であることも実証する。実施例7:SARSB-2×35S-CPMVHT-重症急性呼吸器症候群ウイルス糖タンパク質SSARSgSH5A/インドネシア/5/2005膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TMCT-NOSを持つ発現カセットの組立てコンストラクト番号916;図12A、12FDarveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したSARS糖タンパク質SSARSgS外部ドメインをコードする配列を、2×35S-CPMV-HT発現システムの中へ以下のようにクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、合成されたSARSgS遺伝子Genebankアクセッション番号AY278741.1からのヌクレオチド21492~25259に対応する;図12D、配列番号:28をテンプレートとして使用して、プライマーIF-wtSp-SARSgS.c図12B、配列番号:26およびIF-H5dTmSARSgS.r図12C、配列番号:27を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのRabG外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーSARSgSH5dTm.c図12E、配列番号:29およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-wtSp-SARSgS.c図12B、配列番号:26およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第2のPCRの産物をApaIおよびStuIにより消化し、ApaIおよびStuIの制限酵素により消化されたコンストラクト番号995図1F、配列番号:6の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号916を与えた図12F、配列番号:30。SARSgS-A/インドネシア/5/2005H5TMCTのアミノ酸配列を図12G中で示す配列番号:31。916プラスミド表示を図12A中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。実施例8:植物における産生を促進する因子の存在および非存在下でキメラのSARSによる発現実験野生型シグナルペプチドならびにH5A/Indo膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを持つSARSgS遺伝子を含むコンストラクト916を使用して、SARSタンパク質を発現させた。Nicotianabenthamiana植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。16/8の光周期および25°C昼/20°C夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の3週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の3週間温室中に放置して成長させる。各々のコンストラクトコンストラクト916によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、0.6~1.6の間のOD600に到達するまで、10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、20μMアセトシリンゴン、50μg/mlカナマイシンおよび25μg/mlカルベニシリンpH5.6を補足したYEB培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地10mMMgCl2および10mMMESpH5.6中で再懸濁し、4°Cで一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを2.5培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。N.benthamianaの植物全体を、20~40Torrの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで2分間置いた。収穫までの2~6日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて1:1比率で系統AGL1/172との共インフィルトレーションとして実行された。インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、-80°Cで凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、3体積の冷50mMトリスpH8.0、0.15MNaCl、0.1トリトンX-100および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすることPolytronによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4°Cで10分間10,000gで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物上清を解析のために保存した。清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、BradfordアッセイBio-Rad、Hercules、CAによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリドPVDF膜RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水TBST中の5スキムミルクおよび0.1ツイーン-20により4°Cで16~18時間、膜をブロッキングした。Imgenexの2μg/μlとのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。IMG-690一次抗体はTBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中である。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で1:10000で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ウサギIgGJIR、115-035-144二次抗体とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質RocheDiagnosticsCorporationとしてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。図12Hは重症急性呼吸器症候群SARSウイルスタンパク質Sのタバコにおける発現のイムノブロット分析を示す。コンストラクト916野生型シグナルペプチドならびにH5A/Indo膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを持つSARSgS遺伝子の発現が観察される。実施例9:VZVタンパク質を持つ発現カセットの組立てA-2×35S-CPMVHT-水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質EVZVgEH5A/インドネシア/5/2005膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TMCT-NOSコンストラクト番号946Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、HIVConSΔCFIへならびにH5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したVZV糖タンパク質EVZVgE外部ドメインをコードする配列を、2×35S-CPMV-HT発現システムの中へ以下のようにクローン化した。PCRの第1のラウンドにおいて、合成されたVZVgE遺伝子Genebankアクセッション番号AYO13752.1からのヌクレオチド3477~5348に対応する;図10C、配列番号:22をテンプレートとして使用して、プライマーIF-wtSp-VZVgE.c図10A、配列番号:20およびIF-H5dTmVZVgE.r図10B、配列番号:21を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのVZVgE外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーVZVgEH5dTm.c図10D、配列番号:23およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-wtSp-VZVgE.c図10A、配列番号:20およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第2のPCRの産物をApaIおよびStuIにより消化し、ApaIおよびStuIの制限酵素により消化されたコンストラクト番号995図1F、配列番号:6の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号946を与えた図A5、配列番号:A5。VZVgE-A/インドネシア/5/2005H5TMCTのアミノ酸配列を図10F中で示す配列番号:25。946プラスミド表示を図10G中で示す。このコンストラクトはM1タンパク質をコードしない。実施例10:キメラのVZVタンパク質の植物における発現水痘帯状疱疹ウイルスVZVEタンパク質の発現を、野生型シグナルペプチドおよびH5A/IndoTMCTドメインを持つVZVgE遺伝子を含むコンストラクト946を使用して実証した。Nicotianabenthamiana植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。16/8の光周期および25°C昼/20°C夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の3週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の3週間温室中に放置して成長させる。各々のコンストラクトコンストラクト946によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、0.6~1.6の間のOD600に到達するまで、10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、20μMアセトシリンゴン、50μg/mlカナマイシンおよび25μg/mlカルベニシリンpH5.6を補足したYEB培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地10mMMgCl2および10mMMESpH5.6中で再懸濁し、4°Cで一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを2.5培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。N.benthamianaの植物全体を、20~40Torrの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで2分間置いた。収穫までの2~6日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて1:1比率で系統AGL1/172との共インフィルトレーションとして実行された。インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、-80°Cで凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、3体積の冷50mMトリスpH8.0、0.15MNaCl、0.1トリトンX-100および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすることPolytronによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4°Cで10分間10,000gで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物上清を解析のために保存した。清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、BradfordアッセイBio-Rad、Hercules、CAによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリドPVDF膜RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水TBST中の5スキムミルクおよび0.1ツイーン-20により4°Cで16~18時間、膜をブロッキングした。一次抗体としてTBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中の1μg/μlのマウスモノクローナル抗体抗VZVgEタンパク質abcam、ab52549とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。二次抗体としてTBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で1:10000で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスJIR、115-035-146とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質RocheDiagnosticsCorporationとしてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。図11Aは、レーン7~9においてコンストラクト946からの水痘帯状疱疹ウイルスVZVEタンパク質の発現のイムノブロット分析を示すそれぞれ20、10および2gの抽出物。レーン1~5、陽性対照それぞれ500、100、50、10および5ngの組換えVZVgE;レーン6、陰性対照。コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてVLPへと集合させるVZVEタンパク質の能力も検討した。コンストラクト946を使用して形質転換された植物からのタンパク質抽出物を清澄化し、ゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いてVZVEタンパク質についてマウスモノクローナル抗体抗VZVgEタンパク質abcam、ab52549一次抗体を使用して溶出画分を分析した。図11B中で示されたウエスタンブロットは、インフィルトレーションした植物からの抽出物において、キメラのVZVEタンパク質溶出画分は画分10~13においてピークに達することを示し、VZVEタンパク質は200万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へとVZVEタンパク質が集合することを示す。したがって、VZVEタンパク質はアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合した。これらの結果は、非インフルエンザ抗原VZVEタンパク質等へのインフルエンザHAのTM/CTドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するVLPを集合して放出するのに十分であることも実証する。実施例11:キメラのエボラウイルス糖タンパク質GPを持つ発現カセットの組立てA-2×35S-CPMVHT-PDISP-ザイールエボラウイルスGPEboGPH5A/インドネシア/5/2005膜貫通ドメインおよび細胞質尾部TMCT-NOSコンストラクト番号1366Darveauetal.MethodsinNeuroscience26:77-851995によって示されたPCRベースのライゲーション方法を使用して、H5A/インドネシア/5/2005の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したザイール1995系統エボラウイルス糖タンパク質GPの外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン-P19-プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおける2×35S-CPMVHT-PDISP-NOS発現システムの中へ以下のようにクローン化した。エボラGP遺伝子は、野生型遺伝子配列GenBankアクセッション番号AY354458からのヌクレオチド6039~8069に対応するから、コドン使用およびGC含量について至適化した。隠れたスプライス部位、Shine-Delgarno配列、配列を不安定にするRNAおよび原核細胞リボゾーム侵入部位を、次いで至適化された配列から除去して、望まれない構造または配列を回避した。PCRの第1のラウンドにおいて、合成されたGP遺伝子図13C、配列番号:45をテンプレートとして用いて、プライマーIF-Opt_EboGP.s24c図13A、配列番号:43およびH5iTMCTOpt_EboGP.r図13B、配列番号:44を使用して、外部ドメインシグナルペプチドならびに膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしをコードする配列を含有する至適化されたGP遺伝子の断片を増幅した。コンストラクト番号972コンストラクト番号972の配列については、参照として本明細書に援用されるWO2010/003225の図94、配列番号:134を参照をテンプレートとして使用して、プライマーOpt_EboGPH5iTMCT.c図13D、配列番号:46およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15を使用して、インフルエンザA/インドネシア/5/2005からのH5の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第2の断片を増幅した。次いで両方の増幅からPCR産物を混合し、IF-Opt_EboGP.s24c図13A、配列番号:43およびIF-H5dTm.r図3C、配列番号:15をプライマーとして使用する増幅の第2のラウンドのために、テンプレートとして使用した。ClontechMountainView、CAによるIn-Fusionクローニングシステムを使用して、2×35S-CPMVHT-NOS発現システム中のアルファルファPDIシグナルペプチドと共に、生じたPCR産物をインフレームでクローン化した。コンストラクト1192図13EをSacIIおよびStuI制限酵素により消化し、In-Fusion組立て反応のために使用した。コンストラクト番号1192は、CPMVHTベースの発現カセット中への対象となる遺伝子のアルファルファPDIシグナルペプチドとインフレームでのInFusionクローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のTBSVP19サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはpCAMBIAベースのプラスミドであり、左t-DNA境界から右t-DNA境界の配列を図中で13F示す配列番号:47。生じたコンストラクトに番号1366を与えた図13G、配列番号:48。ザイール95エボラウイルスからのPDISP-GP-A/インドネシア/5/2005からのH5TMCTのアミノ酸配列を図13H中で示す配列番号:49。1366プラスミド表示を図13I中で示す。実施例12:キメラのエボラウイルスGPの植物における発現エボラウイルスEV糖タンパク質GPの発現を、野生型シグナルペプチドおよびH5A/IndoTMCTドメインを持つEVGP遺伝子を含むコンストラクト1366を使用して実証した。Nicotianabenthamiana植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。16/8の光周期および25°C昼/20°C夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の3週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の3週間温室中に放置して成長させる。各々のコンストラクトコンストラクト946によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、0.6~1.6の間のOD600に到達するまで、10mM2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES、20μMアセトシリンゴン、50μg/mlカナマイシンおよび25μg/mlカルベニシリンpH5.6を補足したYEB培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地10mMMgCl2および10mMMESpH5.6中で再懸濁し、4°Cで一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを2.5培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。N.benthamianaの植物全体を、20~40Torrの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで2分間置いた。収穫までの2~6日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、-80°Cで凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、3体積の冷50mMトリスpH8.0、0.15MNaCl、0.1トリトンX-100および1mMフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすることPolytronによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4°Cで10分間10,000gで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物上清を解析のために保存した。清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、BradfordアッセイBio-Rad、Hercules、CAによって決定した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリドPVDF膜RocheDiagnosticsCorporation、Indianapolis、IN上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水TBST中の5スキムミルクおよび0.1ツイーン-20により4°Cで16~18時間、膜をブロッキングした。一次抗体としてTBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中の150ng/mlの親和性精製したウサギ抗エボラGPザイールIBTBioservices、0301-012とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。TBS-0.1ツイーン20中の2スキムミルク中で1:7500で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体JIR11-035-144とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質RocheDiagnosticsCorporationとしてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。図13Jは、コンストラクト番号1366により形質転換された植物からのタンパク質抽出物におけるキメラのエボラウイルスGPの発現のイムノブロット分析を示す。得られた結果は、キメラのエボラGPが一過性に発現されることを示す。すべての引用は参照として本明細書に援用される。本発明は1つまたは複数の実施形態に関して記載された。しかしながら、請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行なえることは当業者に明らかだろう。"