"配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーに対するモノクローナル抗体。壊死マーカーが配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ポリペプチドから成る、請求項2記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマNITEABP1063YKERpC6707FCSによって産生される、請求項1または2記載のモノクローナル抗体。請求項1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いて壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。試料中に含まれる請求項1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、請求項4記載の方法。試料として全血又は血清を使用する、請求項4又は5記載の方法。壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、請求項4ないし6のいずれか一項に記載の方法。請求項4ないし7のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、請求項1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む該キット。配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用又は治療用コンジュゲート。請求項9に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット又は医薬組成物。しかしながら、各種の癌及び壊死巣に関連する様々な病変の検出診断において、特異性が高く有効に使用できるようなバイオマーカーは未だ得られていない。本発明者は壊死巣が栄養並びに酸素供給が低下した状態で起こることに着目し、壊死巣に特徴的なタンパク質あるいはその断片を、低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下で培養したヒト細胞から、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動2DDIGE、質量分析計MS、N末端アミノ酸分析法を用いた疾患プロテオミクス手法を用いて、上記のような汎用性を有する壊死マーカーとしての機能を有する、9種類の遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその断片を同定することに成功し、本発明を完成した。更に、上記タンパク質に対する抗体が乳癌と肺癌の病巣標本の切片における壊死巣を特異的に認識し、染め分けることが出来ることが確認された。更に、アイソトープ標識した該抗体が癌細胞を移植したヌードマウスの担癌部分の壊死叢周囲を特異的に認識し、イメージング可能であることが今回初めて示された。即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。[態様1]配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーに対するモノクローナル抗体。[態様2]壊死マーカーが配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の部分ポリペプチドから成る、態様2記載のモノクローナル抗体。[態様3]ハイブリドーマNITEABP1063YKERpC6707FCSによって産生される、態様1または2記載のモノクローナル抗体。[態様4]態様1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いて壊死マーカーの量を測定することにより、壊死巣を検出する方法。[態様5]試料中に含まれる態様1ないし3のいずれか一項に記載の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出する、態様4記載の方法。[態様6]試料として全血又は血清を使用する、態様4又は5記載の方法。[態様7]壊死巣が、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連することを特徴とする、態様4ないし6のいずれか一項に記載の方法。[態様8]態様4ないし7のいずれか一項に記載の方法に用いる検出キットであって、態様1ないし3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む該キット。[態様9]配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と90以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現産物から成る壊死マーカーと特異的に反応する化合物と標識化合物又は治療に有効な化合物から成る、画像診断用又は治療用コンジュゲート。[態様10]態様9に記載のコンジュゲートを活性成分として含む、画像診断用キット又は医薬組成物。試料において本発明の壊死マーカー量を測定することによって、各種固形癌、心筋梗塞又は脳梗塞の壊死巣組織のみならず、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎等の壊死巣、更に、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽あるいは閉塞性壊疽における壊死巣となる部位を検出することが可能となる。又、本発明の壊死マーカーであるタンパク質あるいはその断片に対する抗体は、乳癌と肺癌の病巣標本の切片における壊死巣を染め分けることが出来ることが確認され、これらはヒトの乳癌及び肺癌の壊死巣組織を陽性として検出可能な癌の壊死マーカーとして有用であることが具体的に示された。更に、アイソトープ標識した該抗体によって、癌細胞を移植したヌードマウスの担癌部分の壊死叢周囲を特異的に認識してイメージング可能であることが示された。本発明の壊死マーカーは、本明細書の実施例に記載したように、適当なヒト細胞例えば、子宮頸がん細胞株であるHeLa細胞株等の樹立培養細胞株を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られるヒト壊死細胞が発現するタンパク質と通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質を、当業者に公知の蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動2DDIGE、質量分析計MS、N末端アミノ酸分析法を用いた疾患プロテオミクス手法を用いて同定比較することにより得ることができる。従って、本発明は、疾患に関連する壊死を検出する壊死マーカーを同定する方法も提供する。従って、この方法は、ヒト細胞を低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件下の培養で誘導して得られる壊死細胞が発現するタンパク質と、通常の培養条件で培養した同細胞が発現するタンパク質とを比較して、該壊死細胞においてより高濃度で存在する高発現するタンパク質あるいはその断片限定分解物又は部分タンパク質を該壊死マーカー選択することを特徴とする。本明細書において、低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な条件とは、例えば、1x107個ml程度の細胞密度でチューブに蓋をした嫌気条件で培地交換せずに約1週間~2週間培養チューブ中で浮遊させて培養するような条件を意味する。一方、通常の培養条件とは、例えば、血清含有DMEM培地中で、2x104~1x105個mlの細胞密度で、37°C5CO2存在下95空気の気相、飽和湿度の条件で培養することを意味する。更に、より高濃度で存在する高発現するタンパク質とは、例えば、通常の培養条件で培養した細胞と比較して、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動において約2倍以上の蛍光強度があり、壊死が誘導された細胞内で経時的に増加するスポットに含まれるタンパク質を意味する。このような比較の結果、実施例に記載の表1に示すような、Peroxiredoxin4ERp29VDAC1AnnexinA2CalreticulinGRP78PDIA6HSP60及びERp57の9種類群の遺伝子産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドが、通常の培養条件で培養した正常なヒト細胞と比較して、ヒト壊死細胞において有意なレベルのより高濃度で存在することを初めて見出した。因みに、これらの遺伝子自体は公知であるが、それが、壊死組織に特異的に高発現することはこれまで知られていなかった。従って、上記の遺伝子の発現産物又は該発現産物に対する自己抗体は壊死マーカーとして有用である。このような壊死マーカーとして使用できる遺伝子の発現産物として、例えば、該遺伝子のmRNA,cDNA,若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドを挙げることが出来る。例えば、上記遺伝子が発現するタンパク質は、壊死組織に特異的に高発現する壊死巣特異的マーカータンパク質として有用である。より具体的には、上記の各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列として、夫々、以下のアミノ酸配列挙げることが出来る:1配列番号1~3のいずれかで示されるアミノ酸配列、21の各アミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は挿入されたアミノ酸配列、又は1の各アミノ酸配列と90以上、好ましくは95以上、更に好ましくは98以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、1の各アミノ酸配列とタンパク質としての同一の機能、活性、又は性質を示すアミノ酸配列。更に、該遺伝子がコードするタンパク質の部分ポリペプチドの一例として、実施例2で同定されたような、ERp29配列番号1~3のいずれかの部分ポリペプチドを挙げることができる。尚、2つのアミノ酸配列における配列の相同性同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。2つの配列における相同性は、配列間での同一である部位数の全部位全アミノ酸又は全塩基数に対する百分率で示される。上記の原理に従い、2つのアミノ酸配列における相同性は当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Karlin及びAltshulのアルゴリズムProc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,1990及びProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993により決定することが出来る。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltshulらによって開発されたJ.Mol.Biol.215:403-410,1990。さらに、GappedBLASTはBLASTより感度良く相同性を決定するプログラムであるNucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国NationalCenterforBiotechnologyInformationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。或いは、配列間の相同性として、TatianaA.Tatusovaらによって開発されたBLAST2SequencesソフトウェアFEMSMicrobiolLett.,174:247-250,1999を用いて決定した値を用いることも可能である。このソフトウェアは米国NationalCenterforBiotechnologyInformationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、blastpプログラムを用いパラメーターとしては、Opengap:11andextensiongap:1penalties,gapx_dropoff:50,expect:10,wordsize:3,Filter:ONを用いる。更に、高感度なFASTAソフトウェアW.R.PearsonandD.J.Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448,1988を用いて相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。本発明に係る壊死巣を検出する方法は、上記の本発明の壊死マーカー量を測定することを含むものである。より具体的には、例えば、1試料中に含まれる本発明の壊死マーカーから選択された一つ又はそれらの任意の組み合わせから成る壊死マーカーの濃度を測定し、その測定値が正常レベルよりも上昇していることを指標として壊死巣を検出することから成る。本発明方法に使用する試料としては、壊死巣からの上記発現産物が含まれているような生体由来の試料である限り、その由来形態等に特に制限は無いが、好適例として、全血又は血清を挙げることが出来る。本発明方法によって検出することができる壊死巣の種類由来組織等に特に制限はなく、例えば、各種固形癌、心筋梗塞、脳梗塞、壊死後性肝硬変、壊死性膵炎、壊死性筋膜炎、動脈硬化性壊疽、糖尿病性壊疽、又は、閉塞性壊疽に関連すること壊死巣を挙げることが出来る。上記各遺伝子の発現産物の発現量の測定は、測定方法原理に応じて、定量的、半定量的、又は定性的であり得る。指標となる上昇のレベルは、検出方法において用いた試料及び壊死マーカーの種類、測定手段方法の原理及び条件等において有意な差を示すものである。例えば、定量的な測定においては、正常レベルに対して、15倍以上とすることができる。上記遺伝子がコードするタンパク質又はその部分ポリペプチドの量は、当業者に公知の任意の方法で測定することが可能である。例えば、該適当な抗体を用いたウェスタンブロット等の免疫染色及びEIA等の各種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、MALDI-TOF/MS及びESIQ-TOF/MS法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。上記の方法の中でも、ウェスタンブロット法及びEIA等の酵素免疫測定法等の、該タンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的な抗体との抗原抗体反応によって該白質の発現量又はその部分ポリペプチドを測定する検査方法が好適である。更には、上記の各遺伝子の発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチドを抗原として用いて、該発現産物に対する自己抗体から成る壊死マーカーの量を抗原抗体反応によって測定する方法を挙げることができる。従って、上記抗体は、該タンパク質又はその適当な部分ポリペプチドペプチド断片又はそれらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に公知の適当な方法で調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体の場合には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法単クローン抗体、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年;MonoclonalAntibodyJamesWGodingthirdeditionAcademicPress1996等に記載の公知の細胞融合を用いる方法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。更に、遺伝子工学的手法によって調製することができる、キメラ抗体、ヒト化抗体、並びに、一本鎖抗体、重鎖CDR1~3を有する重鎖可変ドメインと、軽鎖CDR1~3を有する軽鎖可変ドメインとをリンカーで結合した構造からなる単鎖可変領域抗体断片、Fab断片抗体、及びFab’断片抗体等の低分子抗体等の当業者に公知の任意の形態を有する各種の人工抗体を挙げることが出来る。これらは当業者に公知の任意の方法によって容易に製造することができる。このような抗体には、酵素、放射性同位体、ナノ粒子、蛍光色素、及び金属原子等の当業者に公知の各種の標識物質で標識されているものも含まれる。又、上記遺伝子のmRNA又は、cDNAは、例えば、該遺伝子の塩基配列に基づき適宜設計したプライマー又はプローブを使用したRT-PCR法、リアルタイム逆転写PCRリアルタイムRT-PCR等の各種定量的PCR法、並びに各種のマイクロアレイDNAチップ法等の当業者に公知の方法で増幅検出することが出来る。PCR法で増幅された核酸分子の検出同定は、その塩基配列を直接決定する方法シークエンス法、又は電気泳動との組み合わせ等、適当な方法で行うことが出来る。上記のプライマー又はプローブの塩基配列は、鋳型との特異的な結合が可能となるような塩基数、例えば、15-40塩基、より具体的には、15-25塩基程度を有することが好ましく、更には、プライマー内でヘアピン構造をとったり、センス鎖とアンチセンス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。例えば、OligoTMのような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。本発明検出の方法に用いる検出キットは、本発明の壊死マーカーと特異的に反応する化合物を含むことを特徴とする。このような化合物の好適例として、上記の各種抗体を挙げることが出来る。本発明の検出キットは、測定対象又は測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来る。該キットは、その構成要素として、例えば、上記発現産物、例えば、タンパク質又はその部分ポリペプチドに特異的な抗体、若しくは該発現産物に対する自己抗体に対する抗原である該発現産物であるタンパク質又はその部分ポリペプチド、各種の二次抗体標識抗体、上記のmRNAcDNAの増幅用プライマー及びDNAチップ等で使用するハイブリダイゼーション用のプローブ例えば、10~100個程度の連続した塩基配列から成るのような、上記遺伝子の発現産物と特異的に反応する化合物を含むことができる。更に、上記キットには、その構成使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート容器等が含まれる。尚、PCR反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な標識物質として32P等の放射線標識、Cy3及びCy5のようなシアニン類、6-カルボキシフルオレッセインFAM、4,7,2’,4’,5’,7’-ヘキサクロロー6-カルボキシフルオレッセインHEX及びNEDアプライドシステムズジャパン社及び6-カルボキシ-X-ローダミンRox等の蛍光物質、並びに、化学発光物質等を挙げることが出来る。以上の各測定に使用する材料及び器具装置などは当業者に容易に入手可能であり、各測定操作の手順条件等は、使用する器具装置に添付のマニュアルに従うか、又は、使用する細胞の種類等のその他条件に応じて適宜設定することが出来る。更に、上記の壊死マーカーと特異的に反応する化合物、例えば、既に記載したような壊死マーカーに対する各種の抗体、と標識化合物又は治療に有効な化合物とから成る複合体は、例えば、PET又はSPECTのような画像診断用又は治療用医薬品コンジュゲート:複合体として有用である。核医学診断に有効な放射性核種としては、例えば、ポジトロン放出核種、ガンマ線放出核種を挙げることが出来る。更に、標識化合物としては、15O、13N,11C及び18Fのようなよう電子反β崩壊する核種を上げることが出来る。治療に有効な化合物としては、当業者に公知の任意の薬剤、例えば、抗腫瘍剤及び細胞傷害性のβ線などを放出する放射性核種を挙げることが出来る。従って、このようなコンジュゲートは画像診断用キットもしくは医薬組成物の有効成分と成り得る。このような医薬組成物は公知の製剤学的方法により製剤化することが可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。本発明化合物の含有率は、治療目的、投与経路、治療対象等に応じて、当業者が適宜決定することが出来る。以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することが可能である。致死表現型の単離:致死表現系を持つ細胞を同定するための種々の方法が存在する。壊死ネクローシス細胞またはアポトーシス細胞において、細胞形態、または細胞透過性の変化、つまり細胞膜の水泡化が観察される。種々の色素、染色および抗体が、そのような方法で利用可能であり、限定はしないで、ヨウ化プロピジウム、抗体Apo27およびカスパーゼ色素等が含まれる。トリパンブルーによる染色:トリパンブルーは青色の色素である。無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からトリパンブルーを排除するため、染色されない。死細胞および瀕死細胞の細胞膜は透過性があるため、細胞質が青色に染色される。ヨウ化プロピジウム染色:ヨウ化プロピジウムは蛍光のDNA間在分子である。無傷の膜を持つ生細胞は、細胞間区画からPIを排除するため、非蛍光である。死細胞および瀕死細胞はPIに対して易感染性で、透過性あるため、蛍光である。PI染色技法は壊死およびアポトーシス細胞に等しく利用される。アネキシンV:アネキシンVは、ホスファチジルセリンなどの陰イオン性リン脂質部位に結合する。生細胞の細胞膜は脂質二重層構造をとっており、細胞膜の内膜と外膜でリン脂質に偏りがあり、ホスファチジルセリンは通常内膜に局在している。多くの細胞がアポトーシスを起こしている時、この脂質は細胞外膜上に転位し、露出する。この転位により、外来より加えた蛍光共役アネキシンVが、脂質と相互作用することが可能となり、それによって、アポトーシスを起こしている細胞を標識することが可能である。そこで、蛍光共役アネキシンVに標識されない死細胞を分取することにより、壊死細胞を分離することが可能になる。実施例1:壊死巣細胞モデル系の作製本発明の方法は、壊死巣を形成している細胞モデルとしてネクローシスを誘導した細胞を必要とする。そこで、子宮頚がん細胞株のHeLa細胞にネクローシスを誘導し、壊死巣を形成する細胞モデル系を作製した。一般的に、HeLa細胞は接着性細胞であり、2x105~1x106個の細胞を10cm2シャーレ上で足場依存的に培養する。通常培養では血清含有DMEM培地10mlに、2x104~1x105個mlの密度で、37°C5CO2存在下95空気の気相、飽和湿度の条件で培養する。HeLa細胞は増殖能が高く、栄養豊富な血清含有DMEM培地中では、2~3日で10cm2シャーレがコンフルエントになるまで増殖する。HeLa細胞は癌細胞株なのでシャーレがコンフルエント状態になっても接触阻害はかからず増殖可能であるが、過剰に増殖させるとすみやかに細胞死を起こす。今回、HeLa細胞を1x107個mlという高密度、さらにチューブ中で浮遊させる足場なしの状態で、チューブに蓋をした嫌気条件で培地交換せずに1週間~2週間培養することにより、壊死巣に特徴的な低栄養、低酸素、高密度および足場非依存的な細胞の環境を再現した。11HeLa細胞へのネクローシス誘導HeLa細胞を10cm2シャーレで、100unitsmlペニシリンストレプトマイシンおよび10FBSを添加したDMEM培地中で通常培養した。増殖したHeLa細胞をトリプシンEDTAで10cm2シャーレから剥がし、氷冷したPBSで2回洗浄し、1x107個の細胞を15mlのチューブに移し、1mlの上記DMEM培地あるいは10FBSを添加しないDMEM培地中で15日間培養した。培地にはpH指示薬を添加し、細胞呼吸による酸素消費により酸素濃度の低下を3日目以降確認したが、蓋をしたまま培養を継続した。12致死表現型の単離121トリパンブルーによる染色ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBSで2回洗浄した。回収したHeLa細胞を氷冷したPBSで約1x106個mlになるように懸濁し、110容量の04トリパンブルーPBSバッファー溶液を加えて混和し、室温で3~5分間インキュベーションした後、顕微鏡下で観察した。無色の生細胞、青色に染色された死細胞および瀕死細胞数をそれぞれ計測した。上記の方法でネクローシスを誘導したHeLa細胞は、培養1日目後には、無血清DMEM培地で139、血清添加DMEM培地で206、培養2日目後には、無血清DMEM培地で795、血清添加DMEM培地で685、培養3日目後には、無血清DMEM培地で915、血清添加DMEM培地で812の細胞が青色に染色され死細胞であることが確認された。その後、15日間培養したが、約90の細胞集団が死細胞であることが確認された。122蛍光色素標識による死細胞の染色致死表現型を有する細胞には大別してネクローシスとアポトーシスプログラム細胞死が考えられる。壊死巣ではネクローシス細胞がアポトーシス細胞よりも比重が大きいと考えられ、細胞死を区別するため、さらに細胞を蛍光色素で染色した。ネクローシスを誘導したHeLa細胞を遠心分離して回収し、氷冷したPBSで2回洗浄した。回収した細胞にアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム:終濃度1μgml株式会社同仁化学研究所を含む染色Hepesバッファー溶液10mMHepesNaOH140mMNaCl5mMCaCl2100μlを加えて室温で10~15分間インキュベーションし、蛍光顕微鏡下励起光;488nm検出;515565nmで観察した。一方、10cm2シャーレに培養したHeLa細胞を、1mM過酸化水素を含む10FCS含有DMEM培地に代えて1時間培養し、氷冷したPBSで2回洗浄し、通常の10FCS含有DMEM培地に戻して5時間培養し、アポトーシスを誘導した。そのHeLa細胞を同様にAnnexinVFluosおよびPIで染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。10FCS添加DMEM培地で6日間培養してネクローシスを誘導したHeLa細胞は核がPIで染色された。一方、アポトーシスを誘導したHeLa細胞は、細胞膜付近がアネキシンVで強く染色され、一部の細胞は核もPIで染色された。通常培養から調製した生細胞はPIおよびアネキシンVのいずれにも染色されなかった。この結果から上記の方法で作製された死細胞は、ネクローシス細胞であることが確認された。実施例2:壊死巣特異的マーカー分子の同定21細胞抽出液の調製実施例1において10FCS添加DMEM培地でネクローシスを誘導して1日目~6日目のHeLa細胞および通常培養したHeLa細胞を回収し、氷冷したPBSで2回洗浄した。氷冷した5001000μlの可溶化バッファー20mMTrisHCl150mMNaCl1mMEDTA1NP40を加えて細胞を懸濁し、15mlチューブに移した。チューブを4°Cで30分間回転させながら細胞の可溶性画分を抽出し、15000rpmで15分間遠心分離し、その上清を細胞抽出液とした。回収した細胞抽出液を、2DCleanupkit80648451Amershamを用い、そのプロトコールに従って精製し、適量のlysisbuffer7MUrea2MThiourea4CHAPS5mM酢酸マグネシウムに溶解し、遠心分離した後、その上清を細胞抽出精製液とした。22タンパク質定量細胞抽出精製液に含まれるタンパク質をProteinAssay試薬を用い、そのプロトコールに従ってBradford法に基づき定量した。具体的には、細胞抽出精製液1μlに01NHCl1μlと精製水8μlを加えてサンプル溶液とした。タンパク質標準液としてBSA溶液23209Thermoを0251mgmlに希釈し、その1μlにlysisbuffer1μlと01NHCl1μlを加えて全量を10μlとした。同様に精製水8μlにlysisbuffer1μlと01NHCl1μlを加えてブランク溶液とした。それぞれのサンプル溶液、標準溶液およびブランク溶液に、5倍希釈したProteinAssay試薬を200μlずつ加えてよく混和し、室温で5分間放置した。ProteinAssay試薬を混和してから1時間以内に測定波長595nmで吸光度を測定し、BSA標準溶液の吸光度から検量線を求め、細胞抽出精製液に含まれるタンパク質量を算出した。23蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動2DDIGE法を用いたプロテオミクス解析通常培養およびネクローシスを誘導して1~6日目のHeLa細胞から調製した細胞抽出精製液25μgずつを、それぞれCy3およびCy5で別々に標識し、10mMLysineを加えて蛍光標識反応を停止した。Cy3およびCy5で標識したそれぞれのHeLa細胞抽出精製液を等量混合し、一次元電気泳動用サンプルバッファー0002ブロモチモールブルー溶液を加えてよく混合し、15000rpmで5分間遠心分離し、その上清をサンプル溶液とした。そのサンプル溶液中でpH311のイオン勾配を有する24cmの一次元目専用ゲルを12時間膨潤し、一次元目専用等電点電気泳動システム装置EttanIPGphor3IEFSystemGEHealthcareを用いて段階的に電圧をあげながら細胞抽出精製液に含まれるタンパク質を等電点電気泳動で分離した。次に10ポリアクリルアミドゲルを用いた二次元目の電気泳動により、細胞内可溶化タンパク質をさらに分子量で分離した。二次元電気泳動により分離した蛍光標識タンパク質はバリアブルイメージアナライザーTyphoonTRIOGEHealthcareで検出し、ゲルイメージは2DDIGE専用解析ソフトDeCyderを用いてスポットを解析し、それぞれの細胞内でのタンパク質発現を比較した。ネクローシスを誘導したHeLa細胞内で発現している約3000個のタンパク質スポットを解析した結果、ネクローシス誘導1日後には、通常培養のものと比較して発現が増加したタンパク質が06減少したものが04、3日後には増加したものが11、減少したものが34みられた。さらに、ネクローシスを誘導して6日後の細胞内可溶性画分のタンパク質の発現は、通常培養のそれと比較して、51のタンパク質が増加し、29が減少した。24質量分析法によるタンパク質の同定ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質をMALDTOFMSで同定した。具体的には、上記の二次元電気泳動後の10ポリアクリルアミドゲルをトリス、6アミノカプロン酸、メタノール系のバッファー溶液中で2mAcm2ゲル面積の定電流で90分間通電し、ゲル中のタンパク質を電気的にPVDF膜に転写した。PVDF膜上のタンパク質をクマシーブルーR35017051801GEHealthcareで染色して可視化し、目的とするスポットを剃刀で切り出し、1fmolのリシリルエンドペプチダーゼを加えて37°Cで16時間消化し、その断片化ペプチドをNuTip登録商標ピペットチップで精製し、MALDTOFMSVoyagerDETMPROABSCIEX社で解析した。得られたフラグメントをタンパク質解析用データベースと比較して、該タンパクに関する情報を得た。25N末端アミノ酸の解析ネクローシスを誘導したHeLa細胞で発現量の増加したタンパク質のN末端アミノ酸を、エドマン分解により順次分解して一次構造決定した。具体的には、上記の24で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜をクマシーブルーR350で染色し、目的とするスポットを剃刀で切り出し15mlチューブに移した。PVDF膜を少量のアセトニトリルで湿らせた後、1mlのMilliQ水を加えて激しく攪拌した後、MilliQ水を除く洗浄操作を5回繰り返し、全自動タンパク質一次構造解析装置PPSQ33A島津製作所でアミノ酸配列を自動解析した。その結果、壊死巣特異的マーカーとして同定されたタンパク質のうち、ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片について、以下に通り、N末端アミノ酸9個の一次配列を同定した。1ペルオキシレドキシン4:WETEERPRT2ERp29:LHTKGALPL以上の結果に基づき、通常培養のHeLa細胞と比較して2倍以上の蛍光強度があり、ネクローシスを誘導したHeLa細胞内で経時的に増加してくるスポットの中から、本発明の壊死マーカーとして、以下の表1に示すように、9種類群の壊死巣特異的マーカータンパク質限定分解および部分タンパク質を含むを同定した。尚、表1及び表2に掲載した群の中にはタンパク質が複数のGIGenBankIdentifier番号を有するものがある。これは該タンパク質およびそのプレカーサーや変異型が、マススペクトルにおいて同様な結果を示すからである。26ウエスタンブロッティング法によるタンパク質の同定質量分析法およびN末端アミノ酸分析により同定した表1に記載の壊死巣特異的マーカータンパク質のうち、市販抗体が入手可能な以下に示す5種類についてウエスタンブロッティング法で確認した。具体的には、上記の24で得られたタンパク質が転写されたPVDF膜の非特異吸着をブロックエースUKB80DSファーマを用いてブロッキングした後、PBSで至適濃度100~2000倍に希釈した一次抗体を加え、静かに振とうしながら室温で1時間反応させた。PBSTで3回洗浄後、ビオチン標識抗IgG抗体を加え、静かに振とうしながら室温で30分間反応させた。PBSTで3回洗浄後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体溶液を加えて静かに振とうしながら室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である33’Diaminobenzidine溶液を加え、発色シグナルが観察されたところでPVDF膜をMilliQ水に移して発色を停止させた。ネガティブコントロールとして、抗Bip抗体についてはそのブロッキングペプチド、抗ペルオキシレドキシン4、抗カルレティクリン及び抗ERp57各抗体に対しては抗マウスIgGコントロール抗体、抗ERp29抗体に対しては抗ウサギIgGコントロール抗体を用いて同様にウエスタンブロッティングを行った。使用した一次抗体:1ペルオキシレドキシン4:Peroxiredoxin4antibody7A1ab16943Abcam2ERp29:ERp29antibodyab40982Abcamスポット番号2:表1中では、配列番号2~4と標記3カルレティクリン:CalreticulinmousemAbab54922Abcamスポット番号54Bip:BipRabbitmAb3177CellSignalingスポット番号65ERp57:MonoclonalAntiERp57E5031SIGMAスポット番号9ウエスタンブロッティング法により、MSおよびN末端アミノ酸分析により同定された9つのスポットのうち5つのスポットは、それぞれペルオキシレドキシン4、ERp29、カルレティクリン、Bip、ERp57と確認された。実施例3:モノクローナル抗体の作製31免疫動物の感作および細胞融合壊死巣特異的マーカーとして同定されたタンパク質のうち、ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片については、実施例2で同定したN末端アミノ酸配列を基にして、各々の配列を認識するマウスモノクローナル抗体を作製した。ペルオキシレドキシン4断片またはERp29断片の上記N末端9アミノ酸残基と、そのC末端にキャリア高分子KLHとの結合のためシステイン残基を加えた10残基のペプチドを常法に従って約10mgずつ化学合成し、HPLCを用いて精製し、それら精製ペプチドを抗原ペプチドとした。その抗原ペプチドを常法に従ってKLHに架橋し、フロイント完全アジュバントRM6061、株式会社三菱化学ヤトロンと等量で混和してエマルジョン化したものを免疫原とし、メスのマウス一群2匹ずつにそれぞれ50μgずつ投与した。免疫感作はそれらの免疫原を2日おきに3回、マウスのフットパッドに皮下投与して10日間感作する短期免疫と、1週間おきに3回皮下投与して3週間感作する長期免疫を行った。短期免疫では、免疫開始から10日目にマウスの肥大したリンパ節をいくつか摘出し、その内部のリンパ球とミエローマ細胞P3U1との細胞融合を行なった。長期免疫では、免疫開始から21日目に短期免疫と同様にマウスリンパ節を摘出し、その内部のリンパ球とミエローマ細胞P3U1との細胞融合を行なった。その結果、ペルオキシレドキシン4断片あるいはERp29断片の抗原ペプチドにKLHを架橋したそれぞれの免疫原を、短期あるいは長期免疫したマウス2匹ずつから調製したリンパ球と、ミエローマ細胞株P3U1との細胞融合から、いずれも約800ウエルでコロニーが形成した。32ELISA法によるハイブリドーマのスクリーニング細胞融合後のハイブリドーマは96穴プレートで培養し、通常のHAT培地により選別した。コロニー形成がみられたウエルの培養上清について、免疫原の抗原ペプチドに結合する抗体を含むかどうか、ELISA法によってスクリーニングした。ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチドシステインまたはERp29断片N末端ペプチドシステインLHTKGALPLC、あるいは新たに化学合成してHPLCで精製したぺルオキシレドキシン4断片のN末端8残基ペプチドWETEERPRまたはERp29断片N末端8残基ペプチドLHTKGALPを200μgmlの濃度になるようにPBSで希釈し、その50μlずつを96穴イムノプレートMaxisorpNunc社に分注した。4°Cで一晩静置して合成ペプチドをプレートに固定し、PBSで2回洗浄し、ブロックエースを加えて室温で1時間ブロッキングした後、01TritonX100含有PBSPBSTで2回洗浄した。コロニー形成ウエルの培養上清100μlを加えて室温で1時間インキュベーションした後、PBSTで2回洗浄し、ビオチン標識抗マウスIgG抗体BA1400VEC社と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した。さらに、アビジンビオチン標識ペルオキシダーゼ複合体溶液と室温で30分間反応させ、PBSTで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である22’AzinobisABTSSK4500VEC社溶液を加えて室温で発色するまでインキュベーションし、マイクロプレートリーダーを用いて、測定波長405nmの吸光度を測定して各クローンにより生じる吸光度シグナルを評価した。タイターの高いウエルを選択して、限界希釈法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。ペルオキシレドキシン4断片を免疫したマウスから得たハイブリドーマ培養上清の一次スクリーニングの結果、ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド9アミノ酸残基にシステインを付加した抗原ペプチドを認識し、KLHを認識しない抗体産生ウエルは短期免疫で2個、長期免疫で33個得られた。同定したペルオキシレドキシン4断片のN末端は通常の限定分解で切断される部位とは異なっていたため、このN末端配列を認識する抗体は壊死巣特異的であり、さらに認識部位を限定するため、2種類のN末端をマスクしたネガティブスクリーニング用ペプチドWETEERPRTCGAVQGWETEERPRTCを常法に従って化学合成してHPLCで精製し、KLHと架橋したものを96穴プレートに固定してELISA法により二次スクリーニングを行った。その結果、同定したN末端WETEERPRTCを認識し、2種類のKLHに架橋したネガティブスクリーニング用ペプチドWETEERPRTCKLH、GAVQGWETEERPRTCKLH及びKLHを認識しない抗体産生ウエルが、一次スクリーニングで選択された中から、短期免疫で1個、長期免疫で31個得られた。その中で更に、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生ウエルは長期免疫で3個得られたが、短期免疫では得られなかった。そこで長期免疫マウスのハイブリドーマから、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生3ウエルを含め、タイターが高かったウエルを5個選択して限外希釈法によりクローニングし、抗ペルオキシレドキシン4特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを5クローン取得した。又、ERp29断片を免疫したマウスのハイブリドーマ上清の一次スクリーニングの結果、ERp29断片のN末端ペプチド9アミノ酸残基にシステインを付加した抗原ペプチドを認識し、KLHを認識しない抗体産生ウエルは短期免疫で39個、長期免疫で21個得られた。その中で、N末端8アミノ酸残基を認識する抗体産生ウエルは短期免疫で7個、長期免疫で5個得られ、その中からタイターの高いウエルを、短期免疫から2個、長期免疫から3個選択して限外希釈法によりクローニングし、抗ERp29断片特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを5クローン取得した。実施例4:モノクローナル抗体および市販抗体による壊死巣およびその周辺組織の免疫染色41組織免疫染色法ヒト乳がん組織の癌部と非癌部N5およびヒト肺がん組織の癌部と非癌部N5の組織切片を用いて、壊死巣特異的マーカータンパク質を認識する抗体を評価した。乳がん患者および肺がん患者由来組織サンプルのパラフィン包埋切片は株医学生物学研究所から入手した。各組織のパラフィン包埋切片は、キシレンおよびエタノールを用いて常法に従って脱パラフィンし、組織切片をPBSで3回洗浄し、10mMクエン酸バッファーで抗原を賦活化し、03H2O2中30分間静置して内在性のペルオキシダーゼを失活させた後、ウマ血清で非特異吸着をブロッキングした。壊死巣マーカーに対する抗体ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチドおよびERp29断片のN末端ペプチドを認識するモノクローナル抗体実施例3で最終的に得られた、夫々、5クローンの中の一つ、及び実施例2に記載の5種類の市販抗体をそれぞれPBSで至適濃度に希釈して、ブロッキング後の組織切片と室温でそれぞれ1時間反応させた後、PBSで3回洗浄し、ビオチン標識抗IgG抗体BA1400VEC社と室温で30分反応させた。組織切片をPBSで3回洗浄した後、アビジンービオチン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体と室温で30分間反応させ、PBSで3回洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質である33’Diaminobenzidine溶液を加え、室温で約2分間インキュベーションして組織を免疫染色した。発色した組織切片を蒸留水につけて反応を停止させた後、ヘマトキシリン液で対比染色を行い、非水性封入剤MGKS、松浪硝子工で封入した後、顕微鏡下で組織を観察した。組織免疫染色の結果を図2に示す。ペルオキシレドキシン4断片のN末端ペプチド、またはERp29断片のN末端ペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いて、ヒト乳がん組織の癌部と非癌部N5およびヒト肺がん組織の癌部と非癌部N5をそれぞれ免疫染色した結果、ヒト乳がん組織およびヒト肺がん組織の壊死巣、あるいはその周辺部の組織に於いて強い染色が認められたが、ヒト乳がんおよび肺がんの非癌部組織は染色されないかまたは染色されても弱かった。また、実施例2に記載の5種類の市販抗体一次抗体を用いて同様にヒト組織免疫染色した結果、それらの抗体はヒト乳がん組織およびヒト肺がん組織の壊死巣、あるいはその周辺部の組織に於いて強い染色が認められたが、ヒト非癌部では染色されないかまたは染色されても弱い同様の結果が得られた。上記抗ERp29特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのクローンの代表的なクローンとして、壊死マーカーである抗ヒトERp29断片に対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ名称:YKERpC6707FCSを千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、独立行政法人製品評価機構特許微生物寄託センターに、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託した。同センターから、受領番号NITEABP1063受領日:2011年1月20日として寄託されたことが確認された。実施例5:モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマYKERpC6707FCSの培養上清から抗ヒトERp29モノクローナル抗体をプロテインAカラムで精製した。即ち、PBSで平衡化したHiTrapAカラム1mlに培養上清を50ml添加し、PBS5mlでカラムを洗浄した後、017Mの緩衝液でカラムから溶出した。溶出画分は280nmの吸光度でモニタリングしながら1mlずつ分取し、吸光度の高い画分をブラッドフォード法で測定して精製モノクローナル抗体を得た。実施例6:モノクローナル抗体のアイソタイプの決定実施例5で精製した抗ヒトERp29モノクローナル抗体のアイソタイプをマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットで確認した。マニュアルに準じ、精製したモノクローナル抗体150μlを反応チューブに添加して室温で30秒反応させた。反応液をボルテックスミキサーでよく混和した後、アイソタイピングストリップを反応チューブに入れてアイソタイプを判定した。その結果、その結果、抗ヒトERp29モノクローナル抗体のアイソタイプはIgG2aκであった。実施例7:放射線標識モノクローナル抗体を用いる担癌マウスの癌部の検出1抗ヒトERp29モノクローナル抗体のIn111標識005MboratebufferpH85に溶解した各IgG抗体と005MboratebufferpH85に溶解したN2amino3pisothiocyanatophenylpropyltranscyclohexane12diaminepentaaceticacidを、分子量比で1対25の割合で混合し、37度で16時間反応させた。塩化インジウムを等量の1MacetatebufferpH60と混合し、室温で5分間静置した後、等量の上記DTPAとIgGの反応物を混合し、室温で30分静置した。セルロースアセテート電気泳動により、In111DTPAIgGとIn111DTPAに分離し、IgGに結合したDTPAの数を求めた。上記DTPAとIgGの反応物をSephadexG50担体にアプライし、未結合のDTPAを取り除き、DTPAIgGを精製した。この精製DTPAIgGを上述の方法により、In111標識し、SephadexG50担体により、未反応のIn111を除去したIn111DTPAIgGを使用し、以下の実験を実施した。図3は、セルロースアセテート電気泳動により精製前と精製後のDTPAIgGの泳動後のオートラジオグラフィーの写真を示す。2In111標識モノクローナル抗体とHeLa生細胞との反応5x105と5x106のHeLa細胞を1BSAPBAに懸濁し、In111DTPAIgGを加え、氷中で1時間インキュベートし、PBSで洗浄し、HeLa細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで測定した。その結果、標識した抗ヒトERp29モノクローナル抗体は、生きたHeLa細胞には結合しないことが明らかとなった。図4には、左が5x105のHeLa細胞に、右が5x106のHeLa細胞に夫々のIn111標識モノクローナル抗体Pで示すを接触させて結合させた特異的結合率を示す。IgG2a、E、IgG1はそれぞれ他の抗体を使用した陰性コントロールを示す。ERp29は細胞内蛋白質であることからHeLa細胞に結合しないことは合理的であり、次に示す担癌動物を用いた試験を進める上での一つの根拠となった。3In111標識モノクローナル抗体を用いた担癌マウスに於けるイメージングHeLa細胞をBALBcnunuマウスの皮下に移植し腫瘍を形成させた。50μCiの各In111DTPAIgGを尾静脈から投与し、投与後1、2、3、4日にレントゲンとガンマ線撮像を実施した。時間とともに腫瘍の一部にIn111DTPAIgGが集積することが明らかとなった。図5は、吸入麻酔をしてテープで固定して撮影した、担癌マウスのレントゲン像左とガンマ線撮像右を示す。図5では、左から1日目、2日目、3日目、4日目の各々レントゲン像左とガンマ線撮像右が並んでいる。図5の1から4日目の担癌マウスのレントゲン写真左では、充分に大きくなったヒト癌が右側の臀部付近に瘤状に写っている。また、ガンマ線撮像マウス像右では、ヌードマウスの腫瘍に明瞭な、特に2目から4日目でより明瞭な標識抗Rep29抗体の集積が認められた。4In111標識モノクローナル抗体の集積部位の確認In111DTPAIgG投与4日目の撮像終了後に、腫瘍を摘出し、凍結標本を複数作製し、作製した複数の標本のうち隣接標本でオートラジオグラフィーとヘマトキシリンエオシン染色HE染色を実施した。図6では、腫瘍の切片が、左からオートラジオグラフィー、HE染色、その2つの重ね合わせが並べてある。腫瘍切片のHE染色では、中央付近の壊死部は青色に乏しく弱いが赤色がかった色に、外側の正常な癌組織部位と中央を取り巻く壊死巣周辺部位は赤みがかった青色に染まっていた。図6に示される様に、摘出した腫瘍大きさ:約136mmX183mmの中央の壊死部を取り巻く壊死巣周辺部位にIn111DTPAIgGが選択的に集積することが明らかとなった。すなわち、オートラジオグラフィーとHE染色の写真を重ね合わせると、中央付近の壊死巣を取り巻く壊死巣周辺部位にIn111標識モノクローナル抗体の集積が認められると判断された。5In111標識モノクローナル抗体が集積する壊死巣周辺部の細胞の形態摘出した腫瘍の病理より、核が残っている壊死細胞にIn111DTPAIgGが集積し、核が脱落した壊死細胞には集積しないことが明らかとなった。このことは、壊死して時間があまり経過していない細胞及びその近傍に壊死マーカータンパク質が残存していることを示しているものと思われる。すなわち、図7では、中央付近の壊死部では細胞の形態がくずれて核が認められないこと、また壊死部周辺部では細胞の核が認められるが正常な癌細胞と形態が異なること、腫瘍の外側付近の周辺部は核と細胞質が明確であり正常な癌細胞の形態であることがわかる。図中の顕微鏡写真の中のバーは100ミクロンメーターを示す。"