FMDV抗原および、薬学的もしくは獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含む組成物。FMDV抗原が、FMDVP13C、FMDVP1、FMDVVP0、FMDVVP1、FMDVVP3、FMDVVP2およびFMDVVP4からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。FMDV抗原が、植物または微細藻類中で発現される、請求項1または2に記載の組成物。FMDV抗原が部分精製されている、請求項1~3のいずれか1つに記載の組成物FMDV抗原が実質的に精製されている、請求項1~3のいずれか1つに記載の組成物。FMDV抗原が、配列番号3、10、12、17、20、23、26または29に記載の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも80の配列同一性を有する、請求項1~5のいずれか1つに記載の組成物。FMDV抗原が、配列番号1、2、4、8、9、11、13、14、15、16、18、19、21、22、24、25、27、28、30~35に記載の配列に対して少なくとも70の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1~6のいずれか1つに記載の組成物。薬学的もしくは獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルが油中水型エマルションまたは水中油型エマルションである、請求項1~7のいずれか1つに記載の組成物。請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物の少なくとも1回の投与を含む、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類またはブタ類のFMDVに感受性を有する宿主のワクチン接種方法。プライムブースト投与プロトコルを含む、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類またはブタ類のFMDVに感受性を有する宿主のワクチン接種方法。プライムブースト投与が、請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物のプライム投与および、FMDV抗原を含みinvivoでFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物またはFMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチンまたは、FMDV抗原を含むかFMDV抗原を発現するDNAプラスミドワクチンもしくは組成物のブースト投与を含む、請求項10に記載の方法。プライムブースト投与が、FMDV抗原を含みinvivoでFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンもしくは組成物またはFMDVを含む不活化ウイルスワクチンまたはFMDV抗原を含むかFMDV抗原を発現するDNAプラスミドワクチンもしくは組成物のプライム投与および、請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物のブースト投与を含む、請求項10に記載の方法。プライムブースト投与が、請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物のプライム投与および、請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物のブースト投与を含む、請求項10に記載の方法。宿主がヒツジ類、ウシ類、ヤギ類またはブタ類である、請求項9~13のいずれか1つに記載の方法。植物または微細藻類中で発現され、実質的に精製されたFMDVポリペプチドであって、a配列番号3、10、12、17、20、23、26または29の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも80の配列同一性を有するアミノ酸配列b配列番号3、10、12、17、20、23、26または29のアミノ酸配列の保存的変種c配列番号3、10、12、17、20、23、26または29のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に特異的に結合する配列番号3、10、12、17、20、23、26または29のアミノ酸配列の少なくとも8つの連続アミノ酸を含む免疫原性フラグメントを含む前記ポリペプチド。配列番号1、2、4、8、9、11、13、14、15、16、18、19、21、22、24、25、27、28、30~35の配列に対して少なくとも70の配列同一性を有するDNAフラグメントを含むプラスミド。プラスミドが植物の形質転換用である、請求項16に記載のプラスミド。請求項17に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。FMDV抗原またはそのフラグメントもしくは変種を発現する遺伝子で安定的に形質転換されたウキクサ植物または微細藻類培養物。抗原またはそのフラグメントもしくは変種が、配列番号3、10、12、17、20、23、26または29の配列に対して少なくとも80の配列同一性を有する、請求項19に記載のウキクサ植物または微細藻類培養物。FMDV抗原の製造方法であって、ウキクサ植物またはウキクサ小塊培養物をウキクサ培地内で培養する工程であって、前記ウキクサ植物またはウキクサ小塊培養物は抗原を発現するように安定的に形質転換されており、前記抗原が前記抗原をコードする配列を含むヌクレオチド配列から発現される、前記工程および、培養物のバイオマスから前記抗原を採取する工程、を含む前記方法。DNAインサート、プラスミドおよび組換えウイルスベクターまたは植物ベクターの構築は、JSambrooketalに記載されている標準的分子生物学技術を用いて行った。FMDVを発現するウキクサ系統の作製およびスクリーニングウキクサに最適化されたFMDVP1および3C配列を製造し、親プラスミドにクローニングして、図6~9に示すMerEベクターを作成した。FMDVプロジェクトのために、4つの独立した構築物を設計した。表3は、作製し、スクリーニングしたトランスジェニック系統数のまとめを示す。図3は、FMDVインサートのための遺伝子構造の概略図を示す。3つの系統はP1カプシド3Cプロテアーゼを発現し、他の系統はP1カプシド抗原単独を発現する。FMDV抗原の発現を定量するために、ELISAおよびAgilentによる分析を用いた。発現されるタンパク質の正確なサイズを実証するためにウェスタンブロットを行った。解析および動物実験に使用するためのバイオマスを得るために、mRNA分析およびウェスタンブロットによって決定された最も強いFMDV血清型A24を発現するウキクサ系統を大規模容器中で増殖させた。表3FMDVMerE系統の系統作製およびそれに続くスクリーニングスクリーニング。144のトランスジェニックFMDV系統を発生させた。144のFMDVを発現する系統を発生させた後、組織におけるFMDV発現の相対レベルを測定するためにそれらをスクリーニングした。RNAドットブロットおよびリアルタイムrtPCRによってFMDVmRNAレベルを測定した。ウェスタンブロットおよびELISAを用いてFMDVタンパク質レベルを測定した。ブロットを試験するために標識P1領域を用いてRNAドットブロットによってFMDVを発現するウキクサ系統をスクリーニングした。高発現系統をリアルタイムrtPCRで確認した。mRNA定量方法間では妥当な一致が見られた。結果は、FMDVP1がウキクサで強く発現されていることを示している。方法。小さな研究容器中で2週間ウキクサ植物を増殖させ、得られた組織を採取し、液体N2中で瞬間凍結した。QiagenRNeasy96ウェルRNA抽出キットを用いて、凍結した組織試料100mgから全RNAを抽出した。RNAを定量し、ナイロン膜に真空移行させ、FMDV遺伝子配列のP1領域からの遺伝子フラグメントでプローブした。FMDV抗原を含む株からの粗組織抽出物を調製した。すべての段階を4°Cで行った。凍結したバイオマス100グラムに抽出緩衝液200mlを混合し、次いで、ワーリングブレンダー中で20秒バースト4回を用いてホモジナイズし、中間に10~20秒冷却した。4°Cで30分間、10000xgでホモジネートを遠心分離し、任意の大きな細胞の破片を除去するためにチーズクロスを通過させ、最後に酢酸セルロースフィルターを通過させて清澄化した。得られたホモジネートを、即時試験のために4°Cまたは氷冷で保存した。残ったホモジネートは、さらなる分析のために80°Cでアリコートにして凍結した。ウシ血清アルブミンを標準品として用い、Bradfordアッセイを用いて総可溶性タンパク質を測定した。P1を発現するウキクサ系統に関してタンパク質レベル分析を行った。2つの異なる抽出物からの2連試料を測定した。RNA結果。種々のFMDVトランスジェニック系統間で広範囲のRNA発現レベルが観察された。最も強いハイブリダイゼーションシグナルを示すトランスジェニック系統からのRNA発現を、次にリアルタイムrtPCRで確認した。これらの系統の相対的発現は、ドットブロットおよびPCR方法間で同等であることが示された。次いで、さらなるウェスタンブロット解析のために最上位系統を選択した。タンパク質結果。ELISA結果を表4にまとめ、デンシトメトリーおよびAgilent結果を表5にまとめる。図12はWB結果を示す。ここで矢印はFMDVバンドを示す。レーン1マーカー、2ショ糖精製FMDVA24不活化ウイルス、3ウキクサ野生型溶解物。レーン4~6MerE01を発現するウキクサ溶解物。レーン4~12MerE02を発現するウキクサ溶解物。MerE01を発現するウキクサ系統6および10は、適切に切断されたタンパク質を産生するようである。MerE02を発現するウキクサ系統は、顕著な量の未切断P1タンパク質と高分子量凝集種を産生するようである。表4MerE01系統のELISA定量結果表5ウキクサFMDVMerE01系統の発現レベル1同じMWでのWTバックグラウンドバンドは5μgml未満である。2Agilent分析による平均総可溶性タンパク質は21~23mgmlである。発明者らは、3Cプロテアーゼの発現が組換えウキクサに対して毒作用を発揮しており、例えばP1ポリペプチドのみを発現している組換えウキクサと比較して増殖および抗原産生の低下を引き起こしていることを観察した。従って新規構築物を作製したが、その一部は誘導性プロモーターによって駆動される3C発現カセットを含んでいる。3C発現の毒作用によって妨げられない場合、ウキクサは増殖し、強いレベルのP1を発現した。次いで、培養物が適切な密度に達した後、達成されたP1プールを種々のサブユニットに切断することが可能なように3Cの発現を誘発した。次いでサブユニットはプロトマー、五量体、そして最後にFMDウイルス粒子に会合することができた。これらの新規FMDVウキクサ発現構築物には、標準的単一遺伝子発現ベクターにおけるスーパープロモーターによって発現され駆動されるP13Cを組み込んだMerF01が含まれた。MerF02は、レムナジバNPRプロモーターを用いてP13Cを発現し、MerF03は、単一ベクターで異なるプロモーターを用いてP12Aおよび3Cを発現した。MerF04は、スーパープロモーターによって駆動されるP12Aを発現し、レムナジバNPRプロモーターによって駆動される3Cを発現した。MerF05は、P12Aおよび3Cを発現し、MerF06はP12Aおよび3Cを発現した。抗原調製物。ワーリングブレンダーまたはビードビーターを用いて粗抽出物を調製し、溶解物を遠心分離によって清澄化した。濃縮物を調製するために、清澄化溶解物を022μm滅菌フィルターによって濾過した。次いでこの材料を30KDaセントリコンフィルターを用いて濃縮し、invitroでの解析または動物実験に供した。シゾキトリウム属でのFMDV抗原の発現コドン最適化FMDVP1および3C遺伝子を発現ベクターpAB0018にクローニングする。FMDV遺伝子の特定の核酸配列は、シゾキトリウム属種での発現に最適化される。さらに、この発現ベクターは、シゾキトリウム属形質転換細胞への耐性を付与する選択マーカーカセット、導入遺伝子の発現を駆動するシゾキトリウム属ネイティブ遺伝子からのプロモーターおよびターミネーターを含む。エレクトロポレーション方法を用いるFDMV遺伝子を含む発現ベクターでの形質転換のために、宿主としてシゾキトリウム属種を用いる。シゾキトリウム属のトランスジェニック系統の冷凍ストックを、M5020中で集密状態まで増殖させる。増殖させたシゾキトリウム属培養物を50mLコニカルチューブに移し、3000gで15分間または100000gで1時間遠心分離する。得られたペレットおよび可溶性分画を発現分析および動物チャレンジ試験に用いる。ブタのワクチン接種安全性評価試験デザインに従って、0日目および21日目に、5匹、3群のブタにワクチン接種した。TS6アジュバントの詳細は、米国特許第7608279B2号および米国特許第7371395B2号において見出すことができる。安全性評価。ワクチン接種後に一般的全身性有害作用は認められなかったが、全ての群において、一過性の軽度ないし中等度の直腸温の上昇が認められた。ウキクサ群に関しては、局所の軽度ないし中等度の反応が認められた。本ワクチンは、全群に関して、全身的に許容された。表6ブタのワクチン接種試験デザイン畜牛のワクチン接種FMDVには感染していないが、以前にFMDVに対して免疫されていない普通の畜牛17匹を本試験に用いた。D1に、畜牛を3群、5匹の動物および1群、2匹の動物に割り当てた。D0に、首の左側に皮下経路でワクチン接種を行った。D21にチャレンジを投与し、最終観察はD29に行った。前述のように、FMDVA24P13Cを発現する試験ワクチンはTS6アジュバント中に製剤化した。抗原およびアジュバントの別々のバイアルは、投与前に5°Cで保存した。従って、バイアルの内容物は、抗原とアジュバントとを混合することによって即時に再構成された。再構成ワクチンの1回量は2mLであった。チャレンジ株は、02mLあたり10000ID50になるように調製されたFMD型A24ウイルスであった。チャレンジ株は、抗生物質を含むHanksMEM2ウシ胎児血清で希釈した。表7畜牛ワクチンの概要第21日に、すべての動物にキシラジンを投与して鎮静させ、舌の2か所に1か所あたり01mlで皮内経路でウイルス10000ID50をチャレンジした。第1日から第21日まで毎日、動物の一般的健康状態をチェックした。任意の臨床観察および投与した治療薬を記録した。動物の剖検結果は次のとおりであったウキクサ、試験的組換えワクチン1、試験的組換えワクチン2および対照。対照畜牛全2匹がFMD臨床徴候を示したので、本チャレンジ試験は有効性が検証された。さらに、試験的ワクチン2もまた明確なFMD徴候を示したので、陰性対照として用いることができる。ウキクサ群での畜牛は、十分には保護されなかったが、2匹の畜牛において臨床症状が軽減された。試験的ワクチン1群の2匹の畜牛は保護されたと考えられた。同様な発現系を用いた他の報告とこの結果は一致しており、無傷のVLPは免疫原性であり、悪性のFMDVに対する保護を提供できることが示唆された。1無傷のVLPの百分率を増加させる、および、2より優れた保護を提供するために免疫系に対して抗原がより近づきやすいように濃度精製戦略を改善することによって、ウキクサワクチンも改善されると考えられる。サンドイッチELISAによるFMDV抗原の解析FA24005E9Gおよびビオチン化M3を用いるサンドイッチELISAで、ウキクサで発現されるFMDVのinvitro解析を行った。1x粗抽出物、5xおよび10x濃縮粗抽出物に関する450nm630nmでの正の吸光度は、陽性対照としての不活化FMDVA24とよく一致しており、ウキクサ野生型から調製した粗抽出物は未検出のままであることを結果は示した。最大ODの50が得られる希釈液1ミリリットル当たりの常用対数としてELISA力価が測定された。表8は、1x抽出物よりも5xのほうがELISA力価が高いが10x抽出物とは等しいことを示しており、5x濃縮ウキクサ粗抽出物を畜牛チャレンジ試験に用いた。表8ELISA力価の概要本発明の好ましい実施形態を上記に詳細に説明してきたが、本発明の精神または範囲から逸脱することなく多くの見かけの変形が可能であるので、上記のパラグラフによって定義される本発明は、上記の説明で示された詳細な説明に限定されるものではないことが理解されるべきである。本願に引用した文書において引用または参照したすべての文書および本明細書で引用または参照したすべての文書および本明細書引用文書において引用または参照したすべての文書は、本明細書記載のまたは参照により本願に組み込まれる任意の文書における任意の製品のための任意の製造業者の使用説明書、解説、製品仕様書および製品シートと共に、これによって参照により本願に組み込まれ、本発明の実施に用いることができる。参考文献