SEQIDNos1と2またはSEQIDNos3と4であることを特徴とする一対のプライマー。表3-1と3-2にリストされる上流にある調節遺伝子および表3-1と3-2、そして表4とにリストされる下流にある調節遺伝子からなることを特徴とするGNMTノックアウトマウスの調節遺伝子データベース。a生存と増殖:PTEN、P13K、Akt1、GSK3βまたはβカテニン;bガン遺伝子:サイクリンD1、C-mycまたはC-ジュンそして、c腫瘍抑制遺伝子:Rbまたはp53。からなることを特徴とする肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベース。患者に効果的な量のグリシンNメチルトランスフェラーゼやGNMTを含むプラスミドを投与することを特徴とするアフラトキシンB1AFB1に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法。前記疾患は原発性肝細胞癌HCCであることを特徴とする請求項4に記載の方法。処置または予防はAFB1-DNA付加体形成を妨害することによってなされることを特徴とする請求項4に記載の方法。プラスミドは患者の体に直接施されることを特徴とする請求項4に記載の方法。グリシンNメチルトランスフェラーゼGNMTと医学的に、あるいは食物許容できるキャリアーpharmaceuticallyorfoodacceptablecarrierで構成するアフラトキシンB1AFB1に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできることを特徴とする合成物。GNMTが二量体形または四量体形であることを特徴とする請求項8に記載の合成物。主食作物の補助的な添加物であることを特徴とする請求項8に記載の合成物。米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物であることを特徴とする請求項10に記載の合成物。既に長い時間、悪性の絶対標識マーカーを発見しようとする多くの試みがなされている。腫瘍特異性や腫瘍に関わるタンパク質を特定しようとする他の試みは、直接測定や、そうしたタンパク質に対する特定の抗体を開発することによって、今現在も実施されている。それらは診断だけではなく、ガン細胞の破壊方策を提供する面においても有望なアプローチであると思われる。さまざまな物質が生体内に存在し集中するのは、特定のガンを起こす可能性があるということが報告されている。その例として、腫瘍胎児抗原例えば、アルファフェトプロテインや血清蛋白例えば、フェリチン、酵素、ポリアミン、異所性ホルモン、細胞のマーカー、レセプター、腫瘍に関わるウイルス抗原などが挙げられます。しかし、ガンの診断において最も一般的に用いられる方法は、上記の物質のものより、組織学に依存する。絶対標識マーカーが一つも発見されないことはガンの研究において大きな欠乏である。最近の観測では、発ガン現象に密接的に関連する物質を捜すことに、いくつかの予測が提供される。ガンは腫瘍遺伝子の起動と腫瘍抑制遺伝子の不活化をもたらすいくつかの遺伝子異常に起因すると認識されている。さらに、そうした腫瘍形成に関わる重要な遺伝子の弁別的な発現は、細胞の中の伝令RNA量で反映されることができる。大量のmRNAの中に効率のあるものを選出し変異要因のあるmRNAは、その差異を示すことのできる技術DDDifferentialDisplayから小さな要因の部分を分離し、それにより、腫瘍細胞及び正常細胞に違った要因が表面上に現される。世界で最も一般的なガンの1つである人間の肝細胞癌は、通常、肝硬変を誘発するウイルス感染や化学発ガン物質に接触することで起こる慢性炎症性肝疾患から成るものである。いくつかの地域では、肝細胞癌は主にウイルス感染B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスやアフラトキシンB1AFB1に汚染された食べ物、そして他の形で摂取されたアフラトキシンに起因する。アフラトキシンの代謝産物は、アスペルギラスフラバスAspergillusflavusとアスペルギラスパラシティカス菌類は高温多湿な環境での二次産物である。そうした遍在している菌類は米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物に影響する。生物学的なシステムに直面する科学物質、または外来異物AFB1などは代謝プロセスによって変えられることができる。解毒経路の第一相では、多環芳香族炭化水素と塩化炭化水素に誘発されるシトクロムP450アイソザイムは基質に一つの酸素原子を加え、生物活性はその偶発的な後遺症である。反応性中間体アフラトキシンB189エポキシドCYPアイソザイムから作られます、例えば、サイトクロームP450IA2とP450IIIA4は多くの動物の種の中で発ガン性を持っている。その肝臓のDNAとの共有結合は肝発ガンにおける重要なステップであることが示されている。最も重要な第二相酵素は、グルタチオンS転移酵素グループに属し、グルタチオンと潜在的に毒性を持っている求電子剤との化学結合を促進させ、それらの毒性を消失させる。その後、反応の良いアフラトキシンB189エポキシドは遺伝子を攻撃し損害を与える。生体内で形成するAFB1-DNA付加体は主にAFB1N7-グアニンである。AFB1はDNAと共有結合をし、p53遺伝子のコドン249における第三ポジションでの塩基それはAFB1による突然変異誘発がよく起こっているものだと考えられるで、GC→TAトランスバーションを誘発するということを指摘した報告は、少なくとも二つある。グリシンNメチルトランスフェラーゼは、グリシンからサルコシンを合成する作用を促進させる細胞内の酵素である。それによって、グリシンはSアデノシルメチオニンSAMeからメチル基を取得してサルコシンになり、その後、サルコシンデヒドロゲナーゼで水素を取り除かれてグリシンに戻すこともでる。後者の反応はエネルギーを生み出し、一つの炭素をSAMeから取り抜く。そのため、GMTはSAMe対Sアデノシルホモシステインの比率を調節することにおいて大切な役割を担うわけです。ネズミの肝臓のグリシンNメチルトランスフェラーゼにおける属性、例えば、飲食におけるメチオニンのレベルによって変動させられ関連させられているその活動状態と、メチオニンを多く摂取した食事による誘導性は、GNMTはSAMeの組織集合やメチオニンの代謝を管理することでも重要な役を果たすものと考えられる。しかし、GNMTは単なる生体内で代謝した全部のメチオニンの20に関わることが発見されたが、そのたんぱく質は発育十分なネズミやハツカネズミの肝臓に多くあり、ほとんどが肝臓であらゆる可溶性たんぱく質の1~3を占める。そのため、GNMTはほかの生理的な機能を発揮する可能性もあり、ネズミの肝サイトゾールから純化された葉酸結合蛋白と全く同じ様に働くものがあるということが発見された。近年、GNMTはサイトクロームP4501A1遺伝子における5フランキング領域と相互に作用する4S多環芳香族炭化水素結合蛋白であることは、ラハRahaとほかによって証明されている。また、GNMTは肝細胞で最も豊富で効率的なメチルトランスフェラーゼで、その活動はほかのメチルトランスフェラーゼに影響を与えることも可能である。例えば、tRNAメチルトランスフェラーゼは活動がGNMTに妨害されることができる。脂質動員合成物、例えば、SAMe及びその前駆物質であるメチオニンやコリン、ベタインはネズミやハツカネズミのモデルでさまざまな発ガン性物質に誘発される肝腫瘍の発展を予防できると、多くの実験室から研究結果が提出されている。GNMTは肝細胞におけるSAMeのレベルと密接な関連をもっており、そしてその酵素の活動がSAMeによって活性化されるかもしれないという発見により、GNMTは肝ガンに対する科学的予防経路の過程にかかわるとも考えられる。GNMT発現のレベルはヒト肝細胞ガンの細胞株CellLinesと腫瘍組織のどちらでも減少させることできるということが発表されている。人間のGNMT遺伝子は6p12染色体領域に集中され、その多型を特徴づけられる。いくつかのヒトGNMT遺伝子多型における遺伝子型分析は、肝細胞ガン組織のうちに36-47の遺伝子マーカーが染色体欠失という現象があることを示し、そしてGNMTはベンゾピレンBaPデトックス経路にかかわり、GNMT発現細胞で形成するBPDEDNA付加体を減らすことが発表されている。前の研究結果は、ネズミの肝サイトゾールでマルチプロテインmultipleproteinsはAFB1を化合させることができるということを指摘しています。AFB1結合にかかわる細胞質ゾルのたんぱく質は、輸送や代謝、発ガンせい性物質の作用において働く潜在力を持っている可能性がある。本発明はゲノムがグリシンNメチルトランスフェラーゼ遺伝子座における組み換えを行うことによって乱されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型wildtypeの表現型に相対しそのマウスの異常な肝臓機能からなる表現型が生じ、その乱される位置はSEQIDNo8におけるヌクレオチド5474875である。本発明は肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェントagentをスクリーニングする方法をも提供し、それはa本発明のノックアウトマウスを提供し、bある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、cそのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や非常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。本発明は一組のプライマーを提供する。それはSEQIDNos1と2、またはSEQIDNos1と2である。本発明はさらにGNMTノックアウトマウスにおける調節遺伝子群のデーターベースを提供する。本発明は肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データーベースをも提供する。本発明はさらにアフラトキシンB1AFB1に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法をある患者に提供し、その患者に効果的な量のグリシンNメチルトランスフェラーゼやGNMTを含むプラスミドを投与する。本発明はアフラトキシンB1AFB1によって引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物を提供し、それはグリシンNメチルトランスフェラーゼGNMTと医学的に、あるいは食物許容できるキャリアーpharmaceuticallyorfoodacceptablecarrierで構成する。現在の発明において、正常細胞と腫瘍細胞におけるGNMT遺伝子は有意差が見られることが明らかに分かる。本発明の目的は、GNMTの遺伝子発現の相対的なレベルを測定することによって細胞の異常を見つける方法を提供することである。さらにもう一つの目的は、異常な細胞にGNMTを送ることによって細胞の異常を修正する方法を提供することである。精神活性の薬をスクリーニングするのに役立ついくつかの非人間のトランスジェニック動物モデルが提供される。そうした動物は、遺伝子組み換えGNMT遺伝子を持っている。遺伝子における配列の改変は、削除または機能突然変異において他の喪失や、部位指定変異またはランダム変異によるヌクレオチド配列の持つ外来遺伝子の導入、ほかの種からの外来遺伝子の導入またはそれらの組合せなどが含まれます。遺伝子改変が行われたトランスジェニック動物はホモ接合性あるいはヘテロ接合性の可能性がある。GNMTは、AFB1処理の後で核移動を経る。本発明のテスト結果によると、AFB1はSAMeと同じ結合部位を争ってGNMTと結合することである。GNMTはAFB1DNA付加体形成を減らしAFB1処理を受けている細胞の生存率を促進することによってAFB1に誘発された細胞毒性を拮抗するという考えが実証された。最後に、GNMTトランスジェニックマウスモデルより発見された結果は、GNMTの過剰発現はAFB1に誘発された原発性肝細胞癌HCCに対して保護効果があるということが示されている。本発明は、患者にアフラトキシンB1に起因する病気を治療するか予防する方法を提供する。それは効果的量のグリシンNメチルトランスフェラーゼGNMTやGNMTを含んでいるプラスミドを患者に投与することから成る。好適な実施例において、その病気は原発性肝細胞癌HCCとなっている。現在の方法では、処置または予防は、AFB1DNA付加体の形成を妨害することによってなされる。遺伝子治療において、プラスミドはプラスミドワクチンとして見なすことができ、遺伝子治療における現在の技術によって患者の体に直接施されることができる。本発明は、ゲノムの混乱がneucleotidesにおけるSEQの5474875でNo8を確認することから発見したマウスの異常な肝機能から成立し、野生のタイプ表現型と比較して、表現型を生じるためにGlycineNメチル基転移酵素GNMT遺伝子座位を組み換えによって崩壊するノックアウトmouceを提供する。本発明はゲノムがグリシンNメチルトランスフェラーゼ遺伝子座における組み換えによって崩壊されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型wildtypeの表現型に相対し例のマウスの肝臓機能の異常からなる表現型が生じ、その崩壊はSEQIDNo8におけるヌクレオチド5474875で起こる。特に、ヌクレオチドはGNMTエクソン14とエクソン5の一部分である。グリシンNメチルトランスフェラーゼ活性の欠如の表現型は、野生型の表現型に相対して成熟したグリシンNメチルトランスフェラーゼの減少した量はその原因だと考えられる。ノックアウトマウスの準備において、グリシンNメチルトランスフェラーゼ遺伝子はヘテロローガスヌクレオチド配列例えばネオマイシンとの組み換えによって崩壊される。その中で異常な肝機能という用語は制限されないが、SアデノシルメチオニンSAMe、アラニンアミノトランスフェラーゼALTまたはアスパラギン酸オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼASTの上昇を含む。トランスジェニック動物ここで使われている導入遺伝子という用語は、哺乳類の細胞特に生きている動物の哺乳動物細胞株のゲノムに遺伝物質を人工的に挿入されたか挿入されようとしていることを説明する。導入遺伝子は細胞を変えるのに用いられる。それは、外来DNAの編入に次いで細胞における遺伝子の永遠的なものであるか一時的な変化望ましくは永遠的なものの遺伝子変化が誘発されるということを意味している。永遠的なものの遺伝子変化は、通常、細胞のゲノムにDNAの導入によって成し遂げられる。安定した統合を備えるベクターは、プラスミド、レトロウイルスと他の動物ウイルス、YACsなどを含みます。興味があるのはトランスジェニック哺乳類例えば牛やブタ、ヤギ、馬など、特に齧歯動物例えばネズミ、マウスなどである。トランスジェニック動物は染色体外遺伝因子として呈すか、その細胞、特に生殖細胞の全部または一部に安定的に結合される外来の核酸配列を包含します。明記しない限り、トランスジェニック動物は生殖系細胞系の細胞群が安定した変化を包含することが仮定される。その動物が最初に構成されている間、細胞のサブセットだけは変えられたゲノムを持っているキメラまたはキメラ動物は生み出される。キメラは主に繁殖目的で使われます。それによって望ましいトランスジェニック動物が生み出される。ヘテロ接合性の変異がある動物はキメラの繁殖によって生み出される。雄と雌のヘテロ接合体は一般的にホモ接合性の動物を生み出すように繁殖される。トランスジェニック動物は2つのグループに分類され、口語でノックアウトとノックインと呼ばれる。本発明では、ノックアウトは内在性GNMT遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が部分的であるか完全な機能損失を持っている。ノックインは内在性遺伝子から変えられた遺伝子配列と機能を得た導入遺伝子が導入されている。その二つは結合されるかもしれないが、その場合、天然に存在する遺伝子の能力が奪われ、そして変化した遺伝子型が導入される。ノックアウトにおいて、目標遺伝子発現は検知されることができないか、重要ではないことが望ましい。GNMT遺伝子のノックアウトとは、GNMT遺伝子のその機能がかなり減少されたということである。それによって、発現は検知されることができないか重要ではないレベルだけを呈している。それは様々な手段によって成し遂げられる可能性もあるが、崩壊したコーディング配列の導入、例えば一つまたは一つ以上の停止コドンの挿入やDNA断片の挿入などや、コーディング配列の削除、コーディング配列に代えて停止コドンの置換などはその例である。時には、外来の導入遺伝子配列は最終的にゲノムから削除され、変異を行う前の配列に真の変化を残す。異なるアプローチは、ノックアウトを達成するのに用いられると考えられる。天然の遺伝子は全部または一部の染色体削除が誘発されるかもしれないが、非コード領域特にプロモーター領域や、3’制御配列、エンハンサーの削除、またはGNMT遺伝子の発見を促進する遺伝子の削除などが含まれる。機能的なノックアウトは、天然の遺伝子の発現を妨害するアンチセンス構成物の導入によっても成し遂げられる可能性がある。ノックアウトは条件つきのノックアウトをも含む。例えば、目標遺伝子の変異は以下の状況で起こる:その動物が目標遺伝子変異を促進する物質にさらされること、目標遺伝子の位置で組み換えを促進する酵素の導入例えばCreloxシステムにおけるCre、または出生後に目標遺伝子変異を誘導する他の方法である。目標遺伝子のノックインは、宿主細胞ゲノムに変異を与え、天然のGNMT変えられた遺伝子の発現または機能に終わることを意味する。増加する異所性を含むか減少する発見は、目標遺伝子の追加したコピーの導入、または強化された内在性目標遺伝子のコピーの発見を提供する制御配列を有効に挿入するすることによって達成するとも考えられる。そうした変異は構造性的な条件つきなものと思われる。すなわち活性剤または抑制物質の存在に依存している。外来遺伝子は通常ホスト動物より異なる種から得たか、さもなければそのコーディングまたは非コーディング配列が変えられる。導入された遺伝子は野生型の遺伝子や、天然に存在する多型または遺伝的に操作られた配列である可能性も考えられる。例えばコーディングまたは非コーディング領域への削除や置換、または挿入が行われるということである。導入された配列は、GNMTポリペプチドをエンコードするとも考えられる。導入された遺伝子がコーディング配列である場合、それは通常、プロモーターそれは構成性的または誘導可能であるとも考えられるやホスト動物の発現において必要である他の制御配列に作動可能に連結operablylinkedされる。作動可能に連結されると言うことは適切な分子例えば転写活性化タンパク質が制御配列に結合される時、DNA配列と制御配列が遺伝子発現を可能にする方式で連結されたということである。興味があるがそれに制限していない特定の構築物は、アンチセンスGNMT遺伝子を含んでいる。アンチセンスGNMT遺伝子は天然のGNMT発現と優性阻害GNMT突然変異の発見、GNMT遺伝子の過剰発現を妨げるものです。検知されることができるマーカー、例えばlacZはその遺伝子座そこで発見の増加は簡単に検知された表現型の変化に終わるに導入する可能性がある。GNMT遺伝子で一連の小さな削除と/または置換がされると考えられる。それによって、DNA結合で異なるエクソンの役割や転写調節などを決定する。細胞におけるGNMTタンパク質の発見を提供するさもなければ、その細胞は正常に生み出されないことによって、細胞の行為の変化が誘発されることができる。相同的組換え用のDNA構築物は、少なくとも一部の望ましい遺伝子改変があるGNMT遺伝子を含んで、そして目標遺伝子座にホモロジーのある領域をも含んでいる。ランダムな統合用のDNA構築物は、組み換えを伝達するのにホモロジーのある領域を含む必要はない。便利なのは、正と負の選択用のマーカーは含まれる。目標とされている遺伝子改変のある細胞を相同的組換えを通して生み出す方法は技術artにおいて知られている。胚性幹細胞ES細胞を得るために、ES細胞系は使用されるか、あるいは、胚細胞は新たにホスト例えばマウス、ネズミ、モルモットなどから得られるとも考えられる。そのような細胞は適当な線維芽細胞層で発育するか、適当な成長因子例えば白血病抑制因子LIFが存在している時に発育する。ES細胞は性質転換されたとき、トランスジェニック動物を産むのに用いられる可能性もある。性質転換の後、そうした細胞は適切な培地でフィーダー細胞層の上にメッキをされる。その構築物を含んでいる細胞は、選択的な培地を使用することによって検知されるとも考えられる。コロニーは発育に十分な時間を経た後、選ばれて相同的組換えや構築物の統合の発生について分析されます。そうしたコロニーは陽性である場合、それから胚操作と胚盤胞注入において使われる可能性も考えられる。胚盤胞は生後4~6週間目の過剰排卵する雌から得られるものである。ES細胞はトリプシン処理され、そして、その改変された細胞は胚盤胞の割腔に注入される。注入の後、胚盤胞はそれぞれ偽妊娠の雌の子宮角に戻される。雌はその後、妊娠期間に入り、産まれた一腹の子が構築物を持っている変異細胞がスクリーンされる。胚盤胞とES細胞の異なる表現型に備えることによって、キメラの後代検定は、すぐに探知されることができる。したがって、本発明は本発明のノックマウスから備えられた細胞または細胞株を提供する。好適な実施例において、細胞または細胞株は幹細胞、ES細胞卵母細胞と胚細胞を含めているグループから選ばれる未分化細胞である。キメラ動物は改変された遺伝子の有無についてスクリーニングされ、そして改変されている雌および雄が交尾することによってホモ接合性の妊娠が生じます。もしその遺伝子変異は開発においてある程度で致死性を引き起こすならば、組織または臓器は同種異系間やコンジェニック系統における移植や移植片として、または試験管内invitro培養において維持されてもよいと考えられる。関心のゲノム配列は、リストアップされた配列の間で定められ、開始コドンと停止コドンの間で存在している核酸から成り、そして通常天然の染色体で存在する全てのイントロンを含みます。それは更に成熟したmRNAで見つけた3と5UTRuntranslatedregionsを含む可能性も考えられる。それは、特定の転写制御配列や翻訳制御配列例えばプロモーター、エンハンサーなど、そして転写領域の5または3端のどちらにおいて1kbより多い可能性があるのフランキングゲノムDNAを更に含むものとも考えられる。そのゲノムDNAは100kbpやより小さい断片として隔離され、非常なフランキング染色体配列を持っていないと考えられる。薬物をスクリーニングする分析評価本発明はさらに肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェントをスクリーニングする方法をも提供し、それはa本発明のノックアウトマウスを提供し、bある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、cそのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や異常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。そこから派生された被験者のトランスジェニック動物または細胞を用いることにより、GNMTポリペプチドと結合するか、それを調整するか、拮抗するか、苦しませるリガンドまたはサブストレートを識別することができる。そうしたポリペプチドに対して効果の思わしくない薬をスクリーニングすることにも関心がある。ヒト細胞に低い毒性を持つ薬品のスクリーニング評価について、特に興味があるものと思われる。多種多様な分析評価はその目的のために使われる可能性もあるが、生体内の行動研究や、投与後に薬剤の局在の識別、標識された試験管内のタンパク質タンパク質結合の分析評価、タンパク質DNA結合の分析評価、ゲルシフト法、タンパク質結合の免疫測定法などを含んでいる。特定の分析評価に従い、全動物、あるいはそこから派生された細胞が使われるかもしれません。細胞はある動物から新たに隔離されるかもしれないか、培養基において不死化にされるかもしれません。特に関心の細胞は、神経および脳組織を含む。ここで用いられる用語エージェントagentというのは、GNMTポリペプチドの生物学的作用に影響を及ぼす能力を持つ分子例えばタンパク質または医薬のことである。通常、複数の分析評価混合物は同時に異なるエージェント濃度でされることにより、そうした濃度に異なる反応を得る。一般的に、こうした濃度のうちに、1つがネガコンnegativecontrolの仕組みをしており、すなわちゼロ濃度や検知のレベル以下である。好適な実施例において、そのエージェントは原発性肝細胞癌HCCや、糖原病、肝臓形成異常または脂肪肝を予防するか、治療することに使われる。候補エージェントは、一般的に有機分子望ましくは50以上、およそ2500未満のダルトンの分子量を有する小さな有機化合物であるが、多数の化学的な種類chemicalclassesがある。候補エージェントはタンパク質特に水素結合と構造的な相互作用に必要な官能基から成り、一般的に少なくともアミン、またはカルボニル、水酸基、カルボキシル基それぞれ一つ持っており、望ましくはそうした化学の官能基のうちに、少なくとも2つを持つ。候補エージェントはしばしば周期的な炭素または複素環構造および/または芳香族構造または多環芳香族構造を含み、上記の官能基の一つまたは一つ以上の代用をする。候補エージェントは、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、派生物、構造類似物またはその組合せといった生体分子の間で発見されるが、それに制限してはいない。候補エージェントは、合成であるか天然合成物のライブラリを含む多種多様な源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物と生体分子におけるランダムで誘導された合成ランダム化されたオリゴヌクレオチドとオリゴペプチドの発現を含むに使えるいくつかの手段が考えられる。あるいは、細菌や菌類、植物、そして動物性抽出物の形として天然合成物のライブラリは、入手するか、すぐに生産される。その上、自然であるか総合的に生産されたライブラリと合成物は、従来の化学的や、物理的で、生化学的手段を通してすぐに改変されて、そして組合せライブラリを作成するのに用いられる可能性も考えられる。既知の薬理学的エージェントは構造類似物を生じるが、誘導された、又はランダムな化学改変、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、amidificationなどを受けるものとも考えられる。スクリーニングは既知の薬理活性化合物とその化学類似物に向けられると考えられる。既知の肝ガンに対する制ガン剤または肝病気に対する薬の中で、非常に抑制作用hepatoprotectiveeffectのある薬物に特に興味がる。ノックアウトマウスを準備するために、本発明は一対のプライマーをも提供する。それはSEQIDNos1と2またはSEQIDNos3と4である。本発明は、上流にある調整遺伝子upregulatoryと下流にある調節遺伝子downregulatoryを研究するために、GNMTノックアウトマウスにおける調節遺伝子のデータベースを更なる提供する。更なる本発明は、肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベースを提供し、それは生存と増殖:PTEN、PI3K、Akt1、GSK3βまたはβカテニンガン遺伝子:サイクリンD1、CmycまたはCジュンそして、腫瘍抑制遺伝子:Rbまたはp53。からなる。本発明はアフラトキシンB1AFB1に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物をも提供し、それはグリシンNメチルトランスフェラーゼGNMTと医学的に、あるいは食物許容できるキャリアーpharmaceuticallyorfoodacceptablecarrierで構成する。好適な実施例において、GNMTは二量体形成であるか四量体形成である。本発明の組み合わせは、主食作物例えば米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの補助的な添加物として適用されることができる。本発明は特定の方法論や、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物、記述された試薬に限られていないことは理解すべきである。そうしたものは、もちろん、変化させる可能性がある。もう一つ理解すべきことは、ここで使用される用語が特定の実施例を説明するという目的だけで使われ、本発明の範囲を制限しようとするのはその目的ではないということである。本発明は、添付した特許請求の範囲だけによって制限されるのである。本記載にあるものと添付した特許請求の範囲において使われているように、単数形と、と、そのといった言葉は複数の指示物を含み、又は、その文脈が明確に指摘するので、その点にも注意しなければならない。特に定義しない限り、ここで使用されるすべての専門的で科学的な用語は、本発明の属する技術art範囲における関連的技能を身につける人が理解しているのと同じ意味を持っている。ここに記述されている方法や装置、材料と類似したまたは同等したものは、すべて本発明の実施practiceまたはテストtestにおいて使われることができるが、現在説明するのは、望ましい方法や装置、材料である。ここに言及したすべての出版物は、細胞株や構築物、本発明に適用されるかもしれないそうした出版物で記述される方法といった例を、記述し明らかにする目的で言及した。上記に言及された、そして全篇のテキストを貫くそうした出版物は、本発明の出願年月日の前に発表されることだけで言及する。先行発明によって発明者がそのような発表に先だつ権利を許可されないものと解釈されるものではない。以下の実施例は関連する技術を身につけた者たちに本発明の製作および応用について全面的な説明を提供するために挙げられる。本発明の範囲を制限することを目的とはしない。使われる数例えば総計や温度、濃度などに関して正確さを確保しようという努力はされたが、若干の実験誤差と逸脱は許容できる。特に指摘しない限り、パーセントは重量百分比のことで、分子量は平均分子量、温度は摂氏の温度で、そして圧力は気圧を指す。目標ベクターを構築するために、ラムダλファージクローン32と53に代謝されるDNA断片は、プラスミドpBluescripIIKSに挿入されました。左アームleftarmはPstIを用いてファージクローン53から代謝され、pNeoベクターに挿入された。右アームrightarmはHincIIを用いてファージクローン32から代謝され、TKベクターに挿入された。右アームとTK遺伝子を含んでいる断片がNotIを用いて代謝され、左アームを含んでいるpNeoベクターに挿入されるこのによって目標ベクターを生み出す図1。マウスGNMT遺伝子のエクソン14およびエクソン5の一部分を入れ替えるネオマイシン遺伝子は、目標ベクターで2つのDNA断片31kbと37kbに挟まれる。チミジンキナーゼ遺伝子が負の選択マーカーとして使われた。図2A40μg目標ベクターは、AscIを用いて線形化され、エレクトロポーレーションによってES細胞129Sv派生系に導入された。サザンブロット分析を使って278個のクローンをスクリーニングした後図2B、組み換えクローンが隔離されマイクロインジェクション法によって胚盤細胞に注入された。そのため4匹の雄キメラマウスは生み出され、雌C57BL6マウスを育てるのに用いられた。アグーチAgoutiのF1世代は崩壊された対立遺伝子における生殖細胞系の伝送germlinetransmissionが検知されるために、PCRが用いられた。ヘテロ接合性のF1雄マウスが雌の野生型C57B6マウスと戻り交配されて、C57BL6ゲノム遺伝的背景を持つマウスC57BL6genomebackgroundmiceを生み出します。PCRは、野生型とGNMTヘテロ接合性、GNMTマウスを区別するために用いられ、下記のプライマーが使用された:GNMTにおいてGNMTF5GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGCとGNMTR5TTGCAGTCTGGCAAGTGAGCネオマイシンにおいてネオマイシンF5GTTCCTTGCGCAGCTGTGCTとネオマイシンR5CGGCCACAGTCGATGAATCC。正常のGNMT対立遺伝子はそうしたGNMTプライマーにより772bp断片を生じ、そして崩壊された対立遺伝子はそうしたネオマイシンプライマーにより409bp断片を生じた。図2C肝臓におけるGNMTタンパク質の発現は、サザンブロット分析で分析されたその結果が示したように、野生型と比較したら、GNMTマウスは肝臓におけるGNMT発現がおよそ50が減って、GNMTマウスはその肝臓でGNMTが検知されることができなかった。図2D生後11週間で、雄と雌の野生型とGNMT、GNMTマウス組ごとに6匹やそれ以上のマウスは表現型分析のために犠牲になった。SAMeとSAH濃度は、HPLCを用いて検知された。同性の野生型マウスに比べると、GNMTマウスは雄とも雌ともSAMeの肝臓濃度がかなり増えた。対照的に、GNMTマウスにおけるSAMeの肝臓濃度は野生型マウスより28倍低くて表1、そして雄と雌のGNMTマウスにおけるSAHの肝臓濃度は野生型マウスと類似している。したがって、SAMeSAHの比率は雄と雌のGNMTマウスにおいてそれぞれ42と67倍増えた表1。ホモシステインレベルは、そうした異なるマウスグループで不変のままだった。メチオニンレベルは、GNMTマウスにおいて野生型マウスよりその量が19~24倍多かった表1。表1野生型とGNMT欠損マウスにおける、肝臓でのSAMeとSAH濃度および血清ホモシステインとメチオニン濃度である。野生型肝腫瘍形成GNMTマウスの研究で、表現型GNMTマウスは12週目まで隔週ごとに磁気共鳴画像とソノグラムを使って追跡した。その結果は7匹の雌GNMTマウスのうち7匹の腫瘍が05mm以上成長したHCC、これは161ヶ月目のものと意味する。対照的に、我々が21ヶ月6匹の雄GNMTマウスの研究を追跡している中、一匹はHCCがあり、二匹は13ヶ月で早まって犠牲になり、他は不明確である。したがって、14ヶ月から15ヶ月の雌のGNMTマウスは、50二分の一がHCCを持っていた。21ヶ月から22ヶ月で、雌のGNMTマウスの6匹のうち6匹100はHCCが発達した。雄の18ヶ月から21ヶ月のGNMTマウスは75四分の三が肝小結節に発達があった。野生型肝腫瘍形成の雌GNMTマウスが指し示すものは、雄のGNMTマウスよりも深刻である。一方、375八分の三の雌GNMTマウスは血管腫が発達した。全ての雌GNMTマウスが脂肪変性に変化した中、雄GNMTマウスは三分の一だけだった。表2GNMTマウスは生後1321ヵ月目での肝腫瘍形成である。aマウスが犠牲になった年齢。b18ヶ月で二匹の雄の肝小結節が06cm以下で、一匹の雄には肝小結節がなかった。c二匹のマウスは軟弱過ぎたため、肝小結節を持たなかった。dこのマウスは麻酔処置によって犠牲になった。e21ヶ月で、肝臓にある小結節が超音波によって検出された。f18ヶ月で小結節は検出されなかった。g18ヶ月で05cmの小結節が検出された。h該当なし。マイクロアレイ分析は、GNMTノックアウトマウスと野生型マウスと代謝の違いを観察するのに適用された。野生型と比較したら、mRNAレベルにおいて雌のGNMT欠損マウスは1896個の遺伝子がかなり増加し、雄のGNMT欠損マウスは2429個の遺伝子がかなり増加した。そうした遺伝子のうち、それぞれ二倍以上変化した543個と843個の遺伝子は、更なる機能分析のために選ばれた。我々は、CrossPathプログラムhttpibssinicaedutwcrosspathを使い、KEGG経路データベースに基づいてそれらの遺伝子を機能によって分類した。表3と表4は、発現量の異なる遺伝子は発現量が二倍または二倍以上増加しているのが所定の経路で分類された機能的な経路を示した。それによって、雌と雄GNMT欠損マウスにおいて主な経路増加はPPARシグナル伝達経路および細胞周期で起こるものである。そのうえ、サイトカインcytokineサイトカイン受容体へのインタラクション及びMAPKシグナル経路は、雌と雄GNMT欠損マウスにおいて減少した。表5は、リアルタイム定量PCR法によってGNMTマウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のmRNA発現レベルvs同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのmRNA発現レベルの比率が測られることを示している。その結果は、GNMTマウスにおいていくつかの生存と増殖に関わる遺伝子はかなり減少し、そして三つのガン遺伝子は増加したことを示している。表31KEGG経路データベースによる生後11週間での雌と雄GNMT欠損マウスにおける調節遺伝子の機能的分類である。GNMT欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。表32生後1418ヵ月目でKEGG経路データベースによって機能的な分類をした雌と雄GNMTマウスにおける腫瘍と腫瘍に隣接した組織の調節遺伝子個数である。GNMTマウスにおいて腫瘍と腫瘍に隣接した組織と発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。表4KEGG経路データベースによる雌と雄GNMT欠損マウスにおける下流にある調節遺伝子downregulatorygenesの機能的分類である。GNMT欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。表5リアルタイム定量PCR法によってGNMTマウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のmRNA発現レベルvs同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのmRNA発現レベルの比率が測られることを示している。PTENphosphataseandtensinhomologはガン抑制遺伝子PTENで、PI3Kphosphatidylinositol3kinaseはホスファチジルイノシトール3キナーゼで、GSK3βglycogensynthasekinaseはグリコーゲンシンターゼキナーゼで、Rbretinoblastomaは網膜芽腫で、Tは腫瘍状組織で、TAは腫瘍に隣接した組織で、KOはGNMTマウスで、WTは野生型のマウスである。a生後11週間でGNMTマウス対野生型のマウスの遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のGAPDによって標準的にされた。b腫瘍に隣接した組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のGAPDによって標準的にされた。c腫瘍状組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。生データは内部統制のGAPDによって標準的にされた。GNMTマウスモデルがより発ガン物質に影響されやすいことを証明するために、マウスらに対してアフラトキシンB1AFB1を用いてテストした。AFB1は、以下の剤量で腹膜内に二回投与された:生後七日目で体重一グラム当たり10ugで、生後九週間で体重一グラム当たり40ugである。AFB1で処置されたすべて55の雌および57147の雄GNMTマウスには肝臓結節が検知されたが、AFB1で処置された野生型のマウスも溶媒トリカプリリン、tricaprylinで処置された他のグループも生後1314ヵ月目でまだ肝腫瘍が起こることはないと、その結果は示している。表6生後13ヵ月目でそれぞれ溶媒またはAFB1で処置された2匹の遺伝子型マウスgenotypesmiceの肝腫瘍形成である。HE染色でマウス肝臓部の組織薄片を見たら、AFB1で処置された野生型のマウスは異常が現れなかったが、AFB1で処置された雄のGNMTマウスにはデイスプラジア結節や早期HCC、脂肪結節が検知され図9AとB、そして雌のGNMTマウスには硬化性HCCSclenosingHCCや限局性脂肪沈着におけるデイスプラジア結節が検知された図9CとD。材料と方法:細胞培養および処置肝臓ガン細胞株[HA22TVGH]はWaxmanDJOConnorCGrowthHormoneRegulationofSexDependentLiverGeneExpressionMolecularEndocrinology202613によって作製されたもので、ヒト肝芽腫細胞株HepG2から取り出された安定発現クローンは、ModeAGustafssonJASexandtheLiver-AJourneyThroughFiveDecadesDrugMetabolismReviews38197207に基づいて作製されたものである。ChenSYetalGlycineNmethyltransferasetumorsusceptibilitygeneinthebenzopyrenedetoxificationpathwayCancerRes6436173623といった論文で述べた[SCG2]は、この実施例でも使われています。本発明で使われる細胞は、10のウシ胎児血清HyClone、特殊血清を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地DMEMで維持された。AFB1はDMSOで溶解され、処置が培養基において行われた。免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡培養されたHA22TVGH細胞はカバースリップの上に置かれて20mMのAFB1または01のDMSOで三時間処置された後、4のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化生理食塩水PBSpH74溶液Iによって室温で20分固定された。そうした細胞は透過溶液permeablizationsolution定着液Iに05のトリトンX100を加えたものの中で室温で5分培養された後、そのカバースリップはブロッキング液とともに室温で一時間インキュベート保温され、そしてウサギ抗GNMT抗血清1200とともにもう一時間インキュベートされた。FITC蛍光色素を共役しているヤギ抗ウサギIgG抗体Chemicon、Temecula、CA、USAが第二の抗体として使われた。核はヘキスト33258シグマアルドリッチで対比染色された。共焦点顕微鏡は、オリンパスFluoviewアルゴンとクリプトンスキャニングレーザーシステムと、Fluoviewイメージ分析ソフトウェアといった装備を整えているオリンパスIX70倒置蛍光顕微鏡を用いて実行された。LGAドッキングLGAがAFB1といろいろな形のGNMTとのインタラクションサイトを解明するのに用いられた。ソフトウェアのAutodock30が最も良いリガンド結合インタラクションを確認するのに使われた。前述のとおり、ネズミGNMTからのX線結晶学データがドッキングという目的に使われたのは、ネズミGNMTおよび人間のGNMTはアミノ酸配列で91のホモロジーhomologyを有しているからである。パラメータは、10runと50の集団サイズ、27000世代または25×105のエネルギー評価に達する停止基準を含んでいる先に出るのはどちらでも可能。二乗平均平方根偏差の群集構造Arootmeansquaredeviationconformationalclusteringの許容偏差値05Aはリガンドの結晶座標から計算されたものである。手続きの詳細は前のレポートを参照。細胞毒性評価MTT分析評価は、AFB1の細胞毒性効果を決めるのに用いられた。省略して表現すると、細胞は96穴プレートに播かれて培養されている。評価の時点において、培養液は10mLのMTT貯蔵液5mgmLを含んでいる100mLの新鮮液に穴ずつ替えられた。MTTで4時間細胞にラベルをつけたら、その新鮮液は穴ずつ100mLのDMSOに37°Cで10分替えられた。そのような試料を混合し540nMで吸光度を測定した。半數致死濃度LC50の測定に、7000個のHuH7細胞は96穴プレートに播き18時間培養した。細胞はそれぞれ異なる濃度のAFB1で処置され、そしてMTT分析評価は一連の時点において一組ごとに三回実行された。生存率は、実験群におけるOD値割る溶媒対照群におけるOD値によって計算される。そういった細胞毒性評価を行うために、5000個のHuH7細胞は異なる量のアデノウイルスまたはGNMTcDNAを有するレンチウイルスに8時間感染してから、その培養液を替えまた10時間培養される。72時間のAFB1処置の後、MTT分析評価は生存率を測定するのに実行された。AFB1DNA付加体は競合ELISA法で測量GNMTの保護効果を評価するために、安定SCG211細胞クローンまたはGNMT組み換えアデノウイルスに感染したHepG2細胞は一晩中10cmのペトリ皿で培養され、AFB1または01のDMSOで16時間処理されて、それからDNA抽出が行われた。すべての試料は、すべての開環型付加体adductsinringopenedformの中和を確実にするために、15mMのNa2CO3と30mMのNaHCO3pH96で37°Cで二時間処置された。HsiehLLetalImmunologicaldetectionofaflatoxinB1DNAadductsformedinvivoCancerRes4863286331という論文で述べてられているように、AFB1DNA付加体レベルは6A10抗体を使っている競合ELISA法で測定された。各々のELISA分析は三回実行された。吸光度なら490nMで測定した。pPEPCKex-flGNMTトランスジェニックの構築我々は肝臓と腎臓に特異的なトランスジェニックベクターであるpPEPCKexを使用しました。それはマウスホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーターと、03kbの合成イントロンsyntheticintron、06kbのヒト成長ホルモンポリAシグナルPolyASignalを含む。pPEPCKexflGNMTトランスジェニックプラスミドは、12kbのヒトGNMTcDNAをpPEPCKexベクターにおける制限酵素サイトであるNotIとXhoIに挿入することによって構築された。pPEPCKexflGNMTプラスミドをAscIで制限酵素消化後の線形43kbの断片はマイクロインジェクション法において使われた。GNMTTGマウスの生成GNMTTGマウスはFVB受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出され、特定病原フリーSpecificPathogenFreeの施設で育てられた。それらの尾は生後3週間での離乳期で切られた。ゲノムDNAは、プロテイナーゼKとドデシル硫酸ナトリウムを組み合わせた前処理法Promaga、そしてフェノールクロロホルム抽出法によって単離された。そして、そうしたTGマウスの遺伝子型はPCRで測定された。GNMTTGを見つけるために、668bpのヒトGNMT特異的なDNA断片はPCRプローブによって94°C30秒、60°C30秒、72°C1分といったサイクル条件でプライマーのGNMTF5’GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGC3’およびGNMTR5’GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTCTTGAGCAC3’を用いて30サイクルで増幅された。大量のAFB1の投与本発明で使われるAFB1は濃度02mgmLのトリカプリリンSigmaに溶かされたものである。生後7日目に各グループの6匹以上のマウスは腹膜内にアフラトキシンB1を注射しAFB110mgkg体重、そして2ヵ月後同じ投与量を追加した。そのプロトコルは前にGhebraniousとSellによって修正された。注射後9ヵ月で、そうしたマウスは病理検査のために犠牲になった。病理組織検査のために、器官肝臓と肺、腎臓を含むの5分の2は10のホルマリンで固定され;残りの器官はinsituハイブリダイゼーションやDNAとRNA、タンパク質分析のため、80°Cで保存された。RNA分析メーカーの指示に従い、全RNAはTRIzol試薬によって凍った組織から抽出された。全RNA試料のための量は分光光度計で定量化された。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは前述の通りに実行された。cDNAプローブはプラスミド912におけるヒトGNMT遺伝子によって作製され、相補的DNAはSuperScriptIIRNaseHReverseTranscriptaseKitを用いて肝臓RNA2mgから作り出された。GNMTのためのプライマー配列はF1GCGGCGGCCGCATGCTGGTGGAAGAGGGCとR1GCGCTCGAGTCAGTCTGTCCTCTTGAGCACで、βアクチンのためのプライマー配列はF2GTGGGGCGCCCCAGGCACCAとR2CTCCTTAATGTCACGCACGATTTCである。PCR条件は下記の通りである:94°Cで5分間のプレ変性predenaturation、94°C30秒と60°C30秒、72°C1分で30サイクルの増幅に次いで72°Cで10分の延長extensionを行った。ウエスタンブロット分析ウエスタンブロット分析を実行するために、10μgの全部の肝臓タンパク質抽出物は10のSDSPAGEによって分離され、PVDFpolyvinylidenedifluoride膜に転写された。その手順はWaxmanDJOConnorCGrowthHormoneRegulationofSexDependentLiverGeneExpressionMolecularEndocrinology202613に記述してある。その分析において、マウス抗GNMT単クローン性抗体mAB141はGNMT20を検出するのに用いられた。GNMT酵素活性分析この分析はCookRJWagnerCGlycineNmethyltransferaseisafolatebindingproteinofratlivercytosolProcNatlAcadSciUSA8136313634という論文で述べてある手順によって修正されたものである。それはGNMTTGマウスから採った肝臓組織のGNMT酵素活性を測るのに用いられた。一部分の肝臓は025Mの蔗糖と1mMのEDTA、1mMのアジ化ナトリウム、そして01mMのphenymethylsulfonylflourideを含んでいる3倍容量の氷冷リン酸バッファー10mM、pH70によって均質化された。30分間20000Xgで遠心分離された後、産物として生じた上清液は取り除かれ、2メルカプトエタノールは最終濃度10mMに加えられる。タンパク質の濃度を測ったら、250ugのタンパク質は100mMのトリスバッファーpH74と50mMのグリシン、023mMのSAMe、そして216uMのSアデノシル-L-[メチル-3H]-メチオニンSadenosylLmethyl3Hmethionine764Cimmolを有する100ulの反応混合物に加えられた。37°Cで30分培養した後、反応は10トリクロロ酢酸と5の活性炭との混合物50ulを添加することによって終了した。各反応は三回実行される。免疫組織化学的染色方法GNMTタンパク質に対する免疫組織化学による発現解析はモノクローナル抗体mAB141を1200希釈で使用することによって実施された。パラフィンに包埋した肝臓の部分4umはGNMT抗体とともに培養され、メーカーの指示に従いDABキットDakoCytomationで検出した。AFB1によって誘発されるGNMT核転座であるGNMTcDNAはHA22TVGH細胞にAFB1またはDMSO溶媒対照を16時間トランスフェクトした。図10AとB図10で示すように、GNMT分布は最初に細胞質に制限された図10Aが、AFB1処置図10Bの後で、細胞核に部分的に転位した。そうした結果は、AFB1およびBaPがGNMT核転座を誘発することを示した。また、それはAFB1で処置した細胞中でGNMTに核転座が生じたことを証明し、GNMTはAFB1DNA付加体の形成を減らす、そしてAFB1で処置した細胞の生存率を上昇させることができることを示した図10。AFB1DNA付加物形成は肝臓発ガンに関係する。そして、肝細胞におけるGNMTの減少がその発ガン物質に対する肝臓の敏感性を増やすことも証明された。したがって、GNMTはそうした環境発ガン物質に対する細胞の防衛機構に関係する。GNMTAFB1インタラクションのモデリングLarmarckian遺伝アルゴリズムとX線結晶学データの組合せはGNMTとAFB1間の物理的インタラクションを予測するのに用いられた。ネズミGNMTタンパク質はアミノ酸配列においてヒトGNMTタンパク質と91のホモロジーを持っているので、我々はネズミGNMTタンパク質に対するX線結晶学データによりAFB1ドッキング実験が行われた。表7で示すデータによると、AFB1はGNMTの二量体ProteinDataBankコード1D2Cと四量体1D2G形成と低い結合エネルギーレベルでそれぞれ941と1006kcalモル結合した。表7Larmarckian遺伝アルゴリズムを用いて行ったGNMTタンパク質とAFB1分子a間のドッキングの探索AFB1とSAMe985kcalモルに結合しないGNMT二量体1XVA間の結合エネルギーを、AFB1とすでにSAMe5325kcalモルに結合しているGNMT二量体間の結合エネルギーと比較したら、その結果はAFB1はSAMeと同じ結合部位を争ってGNMTと結合することを指摘する。AFB1分子およびBaPはGNMT二量体と四量体において分子配向性molecularorientationが少し違うが、分子バスケットmolecularbasket内部に同じ位置にある図11A。GNMTアミノ酸残基がAFB1Ala64とVal69、Leu136、Gly137、Ser139の極近くにあることは図11Bに示される。その実施例はGNMTの基質SAMe結合部位にAFB1結合性領域があること、そしてbAFB1はGNMTの二量体と四量体形成の両方とも結合することを指摘する。GNMT四量体1D2GのR175K変異体形成mutantformは、結合部位のすぐ近く5AにあるRK残基がGNMTAFB1集団構造clusterformationにほとんど効果を及ぼさないことを証明するのに用いられた表7。その結果は、GNMTが分子バスケットであるという議論と一致する。この独特の構造は、GNMTはSAMeだけでなくベンゾピレンBaPのような多環式芳香族炭化水素PAH分子と結合することができるという事実と一致していと考えられる。GNMTの結晶構造により、GNMTの活性部位の内面にある多くのチロシン残基33、44、177、194、220、242、283が他の残基とともに発ガン物質に相互作用している環境を提供する可能性もある。GNMTがAFB1とも結合することができることとも思われる。AFB1によって誘発された細胞毒性はGNMTによって拮抗されるMTT分析は細胞の生存率を判定するのに用いられた。細胞毒性分析の条件を最適化するために、HuH7細胞は一連の時点で異なる濃度のAFB1で処置された。図11Aで示すように、AFB1の半數致死濃度LC50は処置の持続時間によるものである。16mMに達するAFB1処置は細胞毒性効果が24時間以内で不分明である。しかし、処置の48時間後にHuH7細胞は4mMのAFB1で処置されたグループさえ、生存率がかなり下がった。72時間でAFB1のLC50はおよそ12mMである。AFB1処置を受けた細胞にGNMTの影響を判明するために、我々はGNMTcDNAを運んでいるアデノウイルスを感染させることによってHuH7細胞内でGNMTたんぱく質を発見した。AdGFPコントロールウイルスに感染しているHuH7細胞と比較したら、AFB1で処置されたHuH7細胞の生存率は少し増加したが、AdGNMTを投与すればかなり増加する図11B。類似した結果は、GNMT遺伝子がレンチウイルスベクターによって導入された別個のシステムで観察された図11C。そうした結果は、GNMTがAFB1処置によって誘導される細胞毒性効果に拮抗することができることを証明した。AFB1DNA付加体形成に対するGNMTの抑制影響AFB1DNA付加体形成に対するGNMTの影響を判明するために、我々は抗体6A10で競合酵素免疫測定法EIAを行うことによってAFB1DNA付加体形成を測り、HepG2細胞株SCG211とSCG2negから得る一対の安定クローンおよびGNMT組み換えアデノウイルスに感染されたHepG2細胞を利用する。細胞は、DNA抽出の前にDMSOと異なる濃度のAFB1で16時間処置されました。その間、明らかな細胞毒性効果がなかった。SCG211細胞中のAFB1DNA付加体の量は、SCG2neg細胞中のその量のおよそ50になった図11D。さらに、GNMT組み換えアデノウイルスadGNMTの感染によるGNMT過剰発見も、投与する方法によってAFB1DNA付加体形成を減らした図11E。AdGFPに感染された細胞と比較して、5MOIのAdGNMTに感染されたHepG2細胞は両方のAFB1濃度でも40を超えるAFB1DNA付加体形成の減少という結果となる。50MOIのAdGNMTに感染されたHepG2細胞はAFB1DNA付加体形成がおよそ70の減少が見られた。実験の結果は、抑制率に基づくAFB1DNA形成量によって計算された。それは、実験のデータにより、コントロール細胞AdGFPに感染されたSCG2neg細胞とHepG2細胞と比較して、GNMTを発現している細胞で形成したAFB1DNA付加体の数がかなり減少したことを指摘した。それは、GNMTにはAFB1DNA付加体形成を減らすことによってAFB1処置を受けた細胞に対する保護役割があることを証明した。GNMTTGマウスの作製生体内でAFB1によって誘発された発ガンに対するGNMTの影響を判明するために、ヒトGNMTトランスジェニックマウスTGモデルは作製された。GNMTTGマウスを生み出すのに用いられるプラスミドは図14aに示されたようにpPEPCKexflGNMTプラスミドである。それはマウスPEPCKプロモーターValeraAetalProcNatlAcadSciUSA91915191541994でヒトGNMT発現を駆動することができる。GNMTTGマウスはFVB受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出された。ノーザンブロット解析法は、ヒトGNMTが予想の通り、特にマウスの肝臓と腎臓で発見することを証明した図14B。GNMTTGマウスと野生型マウスのGNMTの発見プロフィールは、RTPCR法およびウエスタンブロット分析で測定されました。図12Aで示すように、野生型マウスは年齢増加とともにGNMTのmRNA表現レベルが増加し、生後7週間でプラトーに達した。特に一週目と3週目の時点で、GNMTTGマウスは野生型マウスよりGNMTmRNAの遺伝子発現レベルが高かった。そのうえ、ウエスタンブロット分析は示したが、生後一週間三週間で雄の野生型マウスはGNMTのタンパク質レベルが検知することが不可能だが、生後一週間で雌の野生型マウスはGNMTのタンパク質が低い発現レベルで検知されることができる。対照的に、雄と雌のGNMTTGマウスは両方とも生後一週間でタンパクの量がより高かった図12A。そうした結果は、生後13週間で野生型のマウスよりGNMTTGマウスのほうはGNMT発現が高いことを示した。さらに、我々はGNMTTGマウスでGNMT酵素活性を、野生型マウスで肝臓ライセートを検知した。生後九週と11週間でGNMTTGマウスにおけるGNMT酵素活性は野生型マウスよりかなり高かったp<005が、生後九週間での雄は唯一の例外である図12B。その実験において、GNMTTGマウスには特異的なダイエットが提供されなかった。特に生後一週目と3週目でGNMTTGマウスは野生型マウスより肝臓におけるGNMT遺伝子発見レベルが高く図12A、そして生後七週目でプラトーに達した。AFB1によって誘発された肝腫瘍形成はGNMTTGマウス体内で遮断GNMTTGマウスと野生型マウスは腹膜内にAFB1が投与され、生後11ヵ月目で犠牲になった。その雄と雌のマウスのかかる肝腫瘍の全体的な発病率は表八で見られた。表8AFB1溶媒で処置された2つの遺伝子型のマウスにおける肝腫瘍形成。AFB1で処置された雄と雌のGNMTTGマウスは両方とも肝腫瘍が形成しなかったが、AFB1で処置された6匹の雄の野生型マウスのうちで4匹67は肝腫瘍が形成された。また、溶媒tricaprylinで処置されたマウスは腫瘍が検知されなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼALT濃度は、生後11ヵ月目でGNMTTGマウスと野生型マウスの肝機能をモニターするために測定された。AFB1処置群において、雄の野生型マウスは雄のGNMTTGマウスより平均血清ALT値が高かったが、雌のGNMTTGマウスと野生型マウス間で差がなかった。病理検査は、AFB1処置を受けた雄の野生型マウスには異形成とHCCがある図13Aものの、AFB1処置を受けた雄のGNMTTGマウスは正常のパターンが観察される図13Bことを明らかにした。免疫組織化学的染色は、GNMTは正常の肝細胞の場合にはサイトゾールでその発現が豊かであった図13Dものの腫瘍細胞の場合にはそれが減少した図13Cことを証明しました。その現象は、ウエスタンプロット分析によって確認される図13Eし、ヒトHCCでも観察される。AFB1処置の実験では、マウスらはGNMTTGマウスにおけるGNMTの発現が野生型マウスより高かった時、AFB1を注射した。その結果は、GNMTTGマウスは雄とも雌とも肝腫瘍形成が出ないが、AFB1で処置された6匹の雄の野生型マウスのうちで4匹67は肝腫瘍が形成した表8ことを示しました。その実施例において、雄の野生型マウスにおける肝腫瘍形成率は10から67まで増加した。同じ処置手順で、雄のGNMTTGマウスは肝腫瘍形成が出なかった。さらに、GNMTタンパク質は低い濃度でもウエスタンプロット分析によって生後一週間という早い時期に雌マウスの肝臓で検知されることができる。そうしたGNMTタンパク質は保護効果を及ぼし雌の野生型マウス体内でAFB1によって誘発された肝腫瘍形成を防いだAFB1で処置された雌マウスは一匹も肝腫瘍が形成しなかった。その実験は、GNMTは雄のGNMTTGマウスをAFB1によって誘発された肝腫瘍形成から守ることができることも証明した。さらに、病理検査は、AFB1で処置された野生型マウスで形成した肝腫瘍はHCCであることを確認した図13A。免疫組織化学的染色およびウエスタンプロット分析から得た結果は、腫瘍組織におけるGNMT発現レベルが低下することを示した図13CとE。その結果は我々の前のヒトHCCに対する調査結果と首尾一貫しており、それに、発ガンに対するGNMT制御性においてマウスと人間は非常に類似していることを示唆した。したがって、GNMTは発ガンの予防において役に立つことが証明された。