本明細書に記載される発明。本発明により、以下が提供される。項目1細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製のための方法であって、インフルエンザウイルスによって感染され得る細胞が細胞培養において培養され、該細胞が、インフルエンザウイルスで感染され、そして感染後、ウイルス複製のために30~36°Cの範囲の温度で培養されることを含む、方法。項目2前記細胞が、感染後、ウイルス複製のために、32~34°Cの範囲の温度で培養される、項目1に記載の方法。項目3前記細胞が、感染後、ウイルス複製のために、33°Cで培養される、項目2に記載の方法。項目4前記細胞が脊椎動物の細胞である、項目2および3に記載の方法。項目5前記脊椎動物細胞がトリ細胞である、項目4に記載の方法。項目6前記細胞が雌鶏胚細胞である、項目5に記載の方法。項目7前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、項目4に記載の方法。項目8前記哺乳動物細胞が、ハムスター、ウシ、サル、またはイヌ細胞である、項目7に記載の方法。項目9前記インフルエンザウイルスによって感染され得る細胞が、接着性増殖する、項目1~8に記載の方法。項目10前記インフルエンザウイルスによって感染され得る細胞が、懸濁物において増殖する、項目1~8に記載の方法。項目11プロテアーゼを、インフルエンザウイルスで感染する前、間、または後に、前記培養細胞に添加する、項目1~10に記載の方法。項目12前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、項目11に記載の方法。項目13前記セリンプロテアーゼがトリプシンである、項目12に記載の方法。項目14前記インフルエンザウイルスの回収および単離が、感染の2~10日後に行われる、項目1~13のいずれかに記載の方法。項目15前記インフルエンザウイルスの回収および単離が、感染の2~7日後に行われる、項目14に記載の方法。項目16項目1~15に記載の方法によって入手可能なインフルエンザウイルス。項目17適切な場合、免疫応答を増大させる物質と組み合わせた、項目16に記載のインフルエンザウイルスを含むワクチン。項目18前記インフルエンザウイルスが、インタクトなウイルス粒子として存在する、項目17に記載のワクチン。項目19前記インフルエンザウイルスが、弱毒化ウイルスとして存在する、項目17に記載のワクチン。項目20前記インフルエンザウイルスが、分解ウイルス粒子として存在する、項目17に記載のワクチン。項目21前記ワクチンが、前記インフルエンザウイルスの単離されたタンパク質を含む、項目21に記載のワクチン。項目22項目16に記載のインフルエンザウイルスまたはこのようなインフルエンザウイルスの構成物を含む、診断用組成物。従って、本発明は、細胞培養における簡単かつ経済的なインフルエンザウイルスの複製を可能にし、そして高度に有効なワクチンを導く方法を提供する目的に基づく。この目的は、特許の請求の範囲に示された実施態様の提供によって達成される。従って、本発明は、細胞培養物におけるインフルエンザウイルスの複製のためのプロセスに関する。インフルエンザウイルスによって感染され得る細胞は細胞培養で培養され、この細胞はインフルエンザウイルスで感染され、そして感染の後にウイルス複製のために30~36°Cの範囲の温度で培養される。本発明のプロセスの好ましい実施態様において、ウイルス複製のための感染細胞の培養は、32~34°C、そして特に好ましくは33°Cで実施される。驚くべきことに、減少した温度での感染細胞におけるインフルエンザウイルスの複製によって、37°Cでの複製によって得られるウイルスよりも、ワクチンとして相当高い効率を有するウイルスが得られることが見出されている。37°Cでの複製細胞培養においてインフルエンザ複製のために通常使用される温度は、短時間で比較的高いウイルス収率に導くことが認められている。しかし、このように産生されたウイルスは、本発明のプロセスによって調製されたウイルスと比較すれば、ワクチンとして低い効率を有する。インフルエンザウイルスの複製に関する本発明のプロセスにおいて使用される細胞は、原則的に、細胞培養で培養され得、そしてインフルエンザウイルスによって感染され得る所望の任意の型であり得る。これらは、接着性増殖細胞または懸濁物中で増殖する細胞のいずれでもあり得る。好ましい実施態様において、細胞は脊椎動物細胞であり、詳細にはトリ細胞、そしてこの状況においては好ましくは雌鳥細胞例えば、雌鳥胚細胞である。なお好ましい実施態様において、細胞は哺乳動物細胞例えば、ハムスター、ウシ、サル、またはイヌ細胞である。好ましくは、腎臓細胞またはこれに由来する細胞株が使用される。適切なハムスター細胞の例は、BHK21FまたはHKCCの名前を有する細胞株である。可能なサル細胞は、例えば、VERO細胞であり、そして可能なウシ細胞はMDBK細胞株である。適切な腎臓細胞株の例は、イヌ腎臓由来のMDCK細胞株である。本発明の状況において、上記の腎臓細胞株MDCKからさらなる細胞株を樹立した。このさらなる細胞株は、無血清培地における懸濁物における増殖に適用され、それによって特に単純かつ効率的な培養およびウイルス複製を可能にする。この細胞株MDCK33016は、本発明のプロセスにおいて特に好ましく使用される。これは、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づき、国際寄託部署として承認されているブルンスウィックドイツ連邦共和国のGermanCollectionofMicroorganismsに、受託番号DSMACC2219で1995年6月7日に寄託された。本発明のプロセスにおける細胞の培養のために、当業者に公知の通常の方法特に、細胞培養におけるインフルエンザウイルス複製のためにすでに公知な方法が細胞培養に使用され得る。懸濁物中で増殖する細胞特に無血清培地中で培養され得る細胞を用いる本発明のプロセスの実施は、特に単純かつ効率的なウイルス複製を可能にする。懸濁物中での細胞の培養は、この場合、バッチプロセスおよび灌流系例えば、当業者に公知の細胞貯留系例えば、遠心分離、濾過、スピンフィルターなどを用いる攪拌容器発酵槽においての両方において行われ得る。細胞の培養は、原則として、好ましくはpH66~pH78の範囲、詳細にはpH68~pH73の範囲の調節されたpHで実施される。さらに、pO2値は、有利に調節され得、原則的に25と95との間、詳細には35と60空気飽和に基づくとの間である。懸濁物中で培養された細胞の感染は、好ましくは、バッチプロセスにおける細胞が約8~25×105細胞ml、または灌流系において約5~20×106細胞mlの細胞密度に達したときに行われる。接着性増殖細胞が用いられる場合、感染のために最適な細胞密度は特定の細胞株に依存する。インフルエンザウイルスでの細胞の感染は、好ましくは約00001~10、好ましくは0002~05のmoi多重感染度で行われる。赤血球凝集素の前駆体タンパク質HA0の切断、従って細胞へのウイルスの吸着をもたらすプロテアーゼの添加は、本発明に従い、インフルエンザウイルスでの細胞の感染の少し前、同時、または少し後に行われ得る。添加が感染と同時に行われる場合、プロテアーゼは感染されるべき細胞培養に直接または例えば、ウイルス接種と一緒に濃縮物として添加され得る。血清含有培地が培養に使用される場合、これはプロテアーゼ添加の前に除去されるべきである。プロテアーゼは好ましくはセリンプロテアーゼ、そして特に好ましくはトリプシンである。トリプシンが使用される場合、培養培地に添加される最終濃度は有利には1~200μgmlであり、好ましくは5~50μgml、そして特に好ましくは5~30μgmlである。感染の後に、感染細胞培養物はウイルスを複製させるために、詳細には最大細胞障害効果、または最大量のウイルス抗原が検出され得るまで、さらに培養される。このプロセスの好ましい実施態様において、複製されたインフルエンザウイルスの採取および単離は、感染から2~10日後、好ましくは3~7日後に行われる。これを行うために、例えば、細胞または細胞残基は、当業者に公知の方法の手段例えば、分離器またはフィルターによりにより、培養培地から分離される。これに続いて、培養培地中に存在するインフルエンザウイルスの濃縮が、当業者に公知の方法例えば、勾配遠心分離、濾過、沈殿などのようなにより行われる。本発明は、本発明のプロセスにより入手可能なインフルエンザウイルスにさらに関する。これは、ヒトまたは動物への投与のためのワクチンとして、公知の方法により処方され得る。上記ですでに説明したように、この型のインフルエンザウイルスは、細胞培養中で37°Cでの複製によって得られたインフルエンザウイルスよりも、ワクチンとして高い効率を有する。ワクチンとして得られたインフルエンザウイルスの免疫原性または効率は、当業者に公知の方法例えば、曝露実験における保護分与の手段により、またはウイルス中和抗体の抗体力価としてにより決定され得る。産生されたウイルスまたは抗原の量の決定は、例えば、当業者に公知の方法による赤血球凝集素の量の決定により行われ得る。例えば、切断赤血球凝集素は種々の種の赤血球例えば、雌鳥赤血球に結合することが知られている。これは、産生されたウイルスまたは形成された抗原の、適切な検出方法による単純かつ迅速な定量を可能にする。動物モデルにおける比較実験によって、本発明のインフルエンザウイルスは、37°Cで複製されたウイルスよりも有意に高い力価の中和抗体を産生し、これにより、インフルエンザウイルス感染に対する有意に良好な保護を付与することが実証された。動物モデルとしてマウスを用いる実験において、中和抗体の力価は、例えば、少なくともワクチン接種後42週間での1つの因子だけ37°Cで複製されたインフルエンザウイルスでの接種後の中和抗体の力価よりも高かった。接種後4週間で、中和抗体の力価は、少なくとも17の因子だけより高く、そしていくつかの場合では27倍高かった。ワクチン再接種を行う場合、本発明のインフルエンザウイルスを使用すれば、37°Cで複製されたインフルエンザウイルスと比較して、中和抗体の力価は60を越える因子だけ高くあり得る。従って、曝露実験における1000LD50致死用量50の投与量を使用する動物の生存率は、110から少なくとも810まで、好ましくは910まで、そして特に好ましくは1010100まで増大され得る。本発明はさらに、本発明のプロセスから入手可能なインフルエンザウイルスを含むワクチンに関する。この型のワクチンは、必要に応じて、ワクチンにたいして通常の添加剤、詳細には、免疫応答を増大する物質すなわち、いわゆるアジュバント例えば、種々の金属の水酸化物、細菌細胞壁の成分、油またはサポニン、およびさらに通常の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。。ウイルスは、ワクチン中にインタクトなウイルス粒子として、詳細には弱毒化生ウイルスとして存在し得る。この目的のために、ウイルス濃度は所望の力価に調節され、そして凍結乾燥されるか、または液体形態において安定化される。さらに好ましい実施態様において、本発明のワクチンは崩壊すなわち、不活性化された、またはインタクトだが不活性化されたウイルスを含み得る。この目的のために、ウイルスの感染性が、化学および/または物理的方法例えば、界面活性剤またはホルムアルデヒドによりによって破壊される。次いで、ワクチンは、抗原の所望の量まで調整され、そして可能なアジュバントの混合の後、または可能なワクチン処方の後、例えば、リポソーム、ミクロスフェアまたは徐放処方物として分配される。さらに好ましい実施態様において、本発明のワクチンは最後にサブユニットワクチンとして存在し得、すなわち、それは、定義された、単離ウイルス構成物、好ましくはインフルエンザウイルスの単離されたタンパク質を含有し得る。これらの成分は、当業者に公知の方法により、インフルエンザウイルスから単離され得る。より低い温度で調製された本発明のインフルエンザウイルスが、より高い温度で従来の方法に従って調製されたウイルスよりも高い抗原性を有するという差異は、診断目的のために使用され得る。従って、本発明はまた、適切である場合には、この分野で通常の添加剤および適切な検出剤と組み合わせて、本発明のインフルエンザウイルスまたはこのようなウイルスの成分を含む診断組成物に関する。実施例は、本発明を例示する。実施例133°CでのMDCK細胞におけるインフルエンザウイルスの複製MDCK細胞ATCCCCL34を、細胞培養ボトル2FCSを用いるEaglesMEMEMEM、37°Cで4日間のインキュベーションにおいて複製した。得られた濃厚な細胞ローンを、トリプシン溶液を用いて容器の壁から剥離し、細胞を単離し、そして細胞濃縮物を血清含有培地中に再懸濁した。細胞を、ローラーボトル200ml/ボトルにおいて5×105細胞/mlの細胞密度で接種し、そして37°Cで4rpmでインキュベートした。2日後、細胞にインフルエンザウイルスを感染させた。これを行うために、濃厚な細胞ローンの上の培地を除去し、そして無血清EMEMにより置換した。01のmoi感染多重度を有するインフルエンザウイルスAPR834および25μgmlの最終濃度のトリプシンを培地に添加した。いずれの場合も2つのローラーボトルを37°Cまたは33°Cでインキュベートした。ウイルス複製を、抗原の量赤血球凝集素単位として測定として決定し、そして感染性CCID50試験において測定として決定した。そして、これを表1に示す。示した比は、1:X希釈のウイルス収集物が依然として血球凝集特性を有することを意味する。血球凝集特性は、例えば、MayerらVirologischeArbeitsmethodenVirologicalWorkingMethods第1巻260~261頁またはGristDiagnosticMethodsinClinicalVirology72~75頁に記載のように決定し得る。CCID50値の決定は、例えば、PaulZellundGewebekulturCellandtissueculture395頁に記載される方法に従って実施し得る。実施例2懸濁物中での増殖に適応しており、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞株の調製懸濁培養における増殖に適切であり、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞株を、MDCK細胞ATCCCCL34MDCKから開始して選択した。この細胞は、研究室において少数回の継代のみにより、または数ヶ月かけて増殖させておいた。この選択を、16rpm付着性増殖細胞を有するローラーボトルについての習慣的な約3rpmの代わりで回転したローラーボトルにおける細胞の増殖により実施した。培地中に懸濁して存在する細胞の数回の継代後、懸濁物中で増殖している細胞株を得た。これらの細胞株にインフルエンザウイルスを感染させ、そしてこの株をどの株が最大のウイルス収量を生じるかについて選択した。16rpmでの最初の継代の間の懸濁物中での細胞の増殖速度の増加は、当業者に公知の選択系例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン、またはアラノシンおよびアデニンを個々にまたは組み合わせての添加により1~3回の継代にわたって達成される。懸濁物中で増殖している細胞の選択はまた、当業者に公知の他の撹拌細胞培養系例えば、撹拌フラスコにおいて可能である。懸濁物中での増殖に適応しており、そしてインフルエンザウイルスにより感染され得る細胞の例は、細胞株MDCK33016DSMACC2219である。実施例333°CでのMDCK33016細胞におけるインフルエンザウイルスの複製懸濁物中で増殖している細胞株MDCK33016DSMACC2219を、16rpmで回転するローラーボトルにおいて週に2回、1:8~1:12の分割割合で、Iscove培地中で37°Cで複製させた。移してから4日後、約70×105細胞/mlの細胞数を達成した。この4日齢の細胞培養物のインフルエンザ株APR834moi=01での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgmlの最終濃度で処理し、37°Cまたは33°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を3日間にわたって決定した表II。実施例433°CでのMDCK33016細胞DSMACC2219における種々のインフルエンザ株の複製細胞株MDCK33016DSMACC2219を、16rpmで回転するローラーボトルにおいて週に2回、1:8~1:12の分割割合で、Iscove培地中で37°Cで増殖させた。移してから4日後、約70×105~10×105細胞/mlの細胞数を達成した。この4日齢の細胞培養物の種々のインフルエンザ株moi約01での感染と同時に、細胞培養物をトリプシン25μgmlの最終濃度で処理し、33°Cでさらにインキュベートし、そしてウイルス複製を感染5日後に決定した表III。実施例5実験用インフルエンザワクチンの調製マウスにおける接種の後、ヒト病原性インフルエンザウイルスは、通常病理学的プロセスを伴う感染に至らず、その結果、マウスを用いる保護実験は、構築することが実験的に非常に困難である。しかし、インフルエンザウイルスAPR834株は、マウスに適応され、そして鼻腔内投与の後に、マウスにおいて用量依存性死亡を引き起こす。実験用ワクチンを、実施例3に由来するインフルエンザウイルスAPR83437°Cまたは33°Cで複製させたAPR8から調製した。細胞培養培地中のインフルエンザウイルスを、低速遠心分離2000g、20分、4°Cによって細胞および細胞フラグメントから分離し、そしてショ糖勾配遠心分離10~50wtwtの直線状ショ糖勾配、30000g、2時間、4°Cによって精製した。インフルエンザウイルス含有バンドを入手し、PBSで110に希釈し、そして20000rpmで沈殿させ、そして沈殿物をPBS容量:最初の細胞培養培地の50中に取り出した。インフルエンザウイルスを、ホルムアルデヒドで不活化した24時間の間隔で35強度ホルムアルデヒド溶液の0025の2回の添加、撹拌しながら20°Cでのインキュベーション。10匹のNMRIマウスの各々18~20gの重量に、皮下注射により0日目および28日目に各々03mlのこれらの不活化実験用ワクチンとともにインキュベートした。接種の2および4週間後、ならびにさらにワクチン再接種の1および2週間後に、血液を動物から採取して、APR834に対する中和抗体の力価を測定した。保護割合を決定するために、マウスを、ワクチン再接種実験の開始後6週間後に1000LD50致死量の50の鼻腔内投与によって2週間曝露した。実験の結果を表IVに編集した。これらの実験は、細胞培養において37°Cで複製した、高い抗原収量HA力価を伴うインフルエンザウイルスが、マウスにおいて低い中和抗体力価のみを誘導し、そしてかろうじて保護を提供し、一方、細胞培養において33°Cで複製した、同様に高い抗原収量HA力価を伴うインフルエンザウイルスは、マウスにおいて非常に高い中和抗体力価を誘導し、そして非常に良好な保護に至ったことを確証する。実施例633°CでのMDCK細胞におけるインフルエンザウイルスの複製および得られるワクチンの効力細胞株MDCKATCCCL34を、週に2回の18~112の分割割合で、細胞培養ボトル中で2FCSを有するEagleのMEMにおいて37°Cで複製させた。形質転換の4日後、高密度な細胞ローンが生じた。この培地から血清非含有EMEMへの変更の後、細胞培養物を、インフルエンザBBeijingmoi=01で感染させ、トリプシンを25μgmlの最終濃度で培地に添加し、そして感染細胞培養ボトルを、37°Cまたは33°Cのいずれかでインキュベートした。感染の4日後、実験用バッチ中のHA含量は両方とも256HA単位であった。細胞細胞残渣を除去するための低速遠心分離の後、上清中のウイルスを、ホルムアルデヒド24時間の間隔の35強度ホルムアルデヒド溶液の0025の2回の添加、攪拌しながら20°Cでのインキュベーションで不活化した。各実験セクションにおいて、添加したアジュバントは水酸化アルミニウムであった2強度Al3溶液の10最終濃度。これらの実験用ワクチンを用いて、各ケースにおいて、実験セクション当たり3匹のモルモット400~500gに02mlでの足底内ワクチン接種を与え、そしてその後に同じワクチンで4週間ワクチン再接種を与えた。ワクチンの効力を調査するために、血液サンプルを接種後の2、4および6週間採取し、そして赤血球凝集阻害試験および血清中和試験において試験した表Vを参照のこと。