"外来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が導入され発現されてなる形質転換哺乳動物細胞。該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を導入することにより発現したβ-N-アセチルグルコサミニダーゼが,ゴルジ体にて,その活性を示すものである,請求項1の形質転換哺乳動物細胞。該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が昆虫由来のものである請求項1又は2の形質転換哺乳動物細胞。該昆虫が麟翅目に属する昆虫である請求項3の形質転換哺乳動物細胞。麟翅目に属する該昆虫が夜盗蛾又はカイコ蛾である請求項4の形質転換哺乳動物細胞。該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ1遺伝子,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子,SfFDL遺伝子及びBmFDL遺伝子からなる群から選択される1又は2以上のものである,請求項5の形質転換哺乳動物細胞。所定の糖蛋白質を産生するように,該所定の糖蛋白質をコードする外来遺伝子が更に導入され,発現されてなる,請求項1~6の何れかの形質転換哺乳動物細胞。該所定の糖蛋白質をコードする外来遺伝子がヒト由来の遺伝子である請求項7の形質転換哺乳動物細胞。ヒト由来の該遺伝子がリソソーム酵素をコードするものである請求項8の形質転換哺乳動物細胞。該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼ,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α-グルコシダーゼ,N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ,イズロン酸2-スルファターゼ,α-L-イズロニダーゼ,α-ガラクトシダーゼA,ヘキソサミニダーゼ,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ,及びα-マンノシダーゼ,シアリダーゼからなる群から選択されるものである請求項9の形質転換哺乳動物細胞。該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼである請求項9の形質転換哺乳動物細胞。N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の全部又は一部がマンノース残基である糖蛋白質の製造方法であって,a請求項1~6の何れかの哺乳動物細胞を培養液中で培養して,糖蛋白質を発現させるステップ,及び,b上記ステップaで発現させた糖蛋白質を精製するステップを含んでなるものである,製造方法。請求項1~6の何れかの哺乳動物細胞に代えて,請求項7の哺乳動物細胞を用いるものである,請求項12の製造方法。該糖蛋白質をコードする外来遺伝子がヒト由来の遺伝子である請求項13の製造方法。ヒト由来の該遺伝子がリソソーム酵素をコードするものである請求項14の製造方法。該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼ,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α-グルコシダーゼ,N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ,イズロン酸2-スルファターゼ,α-L-イズロニダーゼ,α-ガラクトシダーゼA,ヘキソサミニダーゼ,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ,及びα-マンノシダーゼ,シアリダーゼからなる群から選択されるものである請求項15の製造方法。該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼである請求項15の製造方法。上記背景の下で,本発明の目的は,哺乳動物細胞,特にCHO細胞を用いて,N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端にマンノース残基を有する組換え体糖蛋白質を製造する新たな方法を提供することである。上記目的に向けた研究において,本発明者らは,高マンノース型糖鎖の合成が優勢に働いている昆虫細胞内での機構を,哺乳動物細胞に導入することを検討した。その結果,驚くべきことに,哺乳動物細胞にβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を導入して発現させた形質転換哺乳動物細胞を用いることにより,N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端にマンノース残基を有する組換え体糖蛋白質が得られることを見出し,本発明を完成した。すなわち,本発明は,以下を提供するものである。[1]外来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が導入され発現されてなる形質転換哺乳動物細胞。[2]該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を導入することにより発現したβ-N-アセチルグルコサミニダーゼが,ゴルジ体にて,その活性を示すものである,上記[1]の形質転換哺乳動物細胞。[3]該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が昆虫由来のものである上記[1]又は[2]の形質転換哺乳動物細胞。[4]該昆虫が麟翅目に属する昆虫である上記[3]の形質転換哺乳動物細胞。[5]麟翅目に属する該昆虫が夜盗蛾又はカイコ蛾である上記[4]の形質転換哺乳動物細胞。[6]該β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子が,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ1遺伝子,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子,SfFDL遺伝子及びBmFDL遺伝子からなる群から選択される1又は2以上のものである,上記[5]の形質転換哺乳動物細胞。[7]所定の糖蛋白質を産生するように,該所定の糖蛋白質をコードする外来遺伝子が更に導入され,発現されてなる,上記[1]~[6]のいずれかの形質転換哺乳動物細胞。[8]該所定の糖蛋白質をコードする外来遺伝子がヒト由来の遺伝子である上記[7]の形質転換哺乳動物細胞。[9]ヒト由来の該遺伝子がリソソーム酵素をコードするものである上記[8]の形質転換哺乳動物細胞。[10]該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼ,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α-グルコシダーゼ,N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ,イズロン酸2-スルファターゼ,α-L-イズロニダーゼ,α-ガラクトシダーゼA,ヘキソサミニダーゼ,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ,及びα-マンノシダーゼ,シアリダーゼからなる群から選択されるものである上記[9]の形質転換哺乳動物細胞。[11]該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼである上記[9]の形質転換哺乳動物細胞。[12]N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の全部又は一部がマンノース残基である糖蛋白質の製造方法であって,a上記[1]~[6]の何れかの哺乳動物細胞を培養液中で培養して,糖蛋白質を発現させるステップ,及び,b上記ステップaで発現させた糖蛋白質を精製するステップを含んでなるものである,製造方法。[13]上記[1]~[6]の何れかの哺乳動物細胞に代えて,上記[7]の哺乳動物細胞を用いるものである,上記[12]の製造方法。[14]該糖蛋白質をコードする外来遺伝子がヒト由来の遺伝子である上記[13]の製造方法。[15]ヒト由来の該遺伝子がリソソーム酵素をコードするものである上記[14]の製造方法。[16]該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼ,酸性スフィンゴミエリナーゼ,リソソーム酸性リパーゼ,酸性α-グルコシダーゼ,N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ,イズロン酸2-スルファターゼ,α-L-イズロニダーゼ,α-ガラクトシダーゼA,ヘキソサミニダーゼ,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ,及びα-マンノシダーゼ,シアリダーゼからなる群から選択されるものである上記[15]の製造方法。[17]該リソソーム酵素が,グルコセレブロシダーゼである上記[15]の製造方法。本発明により昆虫のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子で形質転換した哺乳類細胞は,それが産生する糖蛋白質のN-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基がマンノースとなる割合が増大するように形質が変化している。従って,当該細胞は,もともと有する内因性の糖蛋白質を,そのN-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の少なくとも一部が,又は全部が,マンノース残基となった形で産生する。また,外来の糖蛋白質遺伝子を導入して発現させる場合に,天然の哺乳類細胞の代わりにこの形質転換哺乳類細胞を用いれば,天然の哺乳類細胞を用いたのでは得られなかった,糖鎖の非還元末端に位置する残基の一部がマンノース残基である糖蛋白質を,又はより多くが,好ましくは全部がマンノース残基である糖蛋白質を産生させることができる。従って,本発明によれば,N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の割合を増大させた糖蛋白質を,昆虫細胞などを用いることなく製造することができる。従来,哺乳動物細胞を用いて製造した糖蛋白質は,N-グリコシド結合糖鎖として,複合型糖鎖を有するものであったため,その非還元末端に位置する残基をマンノース残基とするには,更に酵素処理などをする必要があったのに対し,本発明によれば,N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の全部又は一部がマンノース残基である糖蛋白質を直接得ることができる。従って,本発明の方法によれば,従来に比して効率的かつ容易に,マンノース残基をN-グリコシド結合糖鎖の非還元末端残基として有するものである糖蛋白質を得ることができる。また,本発明により得られる糖蛋白質は,例えば,標的細胞の表面に存在するマンノース受容体を介して細胞に取り込まれるべき医薬や,血中半減期が短くあるべき医薬などとして,有用である。本発明において,哺乳動物というときは,特に限定はなく,如何なる哺乳動物をも包含するが,好ましくはヒト,アフリカミドリザル等の霊長類,マウス,ラット,チャイニーズハムスター等のげっ歯類,ウサギ,イヌである。また,哺乳動物細胞というときは,哺乳動物由来の細胞であれば特に限定はなく,生体から取り出した臓器,筋組織,皮膚組織,結合組織,神経組織,血液,骨髄等から採取された細胞の初代培養細胞,継代培養細胞,及び継代培養しても形質が安定であるように株化された細胞のいずれであってもよい。また,細胞は正常細胞,癌化細胞のいずれであってもよい。特に好適に使用できる細胞は,チャイニーズハムスターの卵巣に由来するCHO細胞,ヒトの繊維芽細胞及びアフリカミドリザルの腎線維芽細胞に由来するCOS細胞である。本発明において,β-N-アセチルグルコサミニダーゼというときは,糖鎖の非還元末端に位置するβ-グリコシド結合したN-アセチルグルコサミン例えば上記構造式6,構造式7等の非還元末端に位置するN-アセチルグルコサミンを遊離させる活性を有する酵素のことをいう。また,β-N-アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子は,コードされるβ-N-アセチルグルコサミニダーゼが,上記酵素活性を有する限り,如何なるものでもよい。例えば,生物から直接に由来する野生型の遺伝子,野生型の遺伝子に塩基の置換,挿入,決失等の変異を加えた変異型の遺伝子,人工的に設計した遺伝子のいずれをも用いることができる。また,生物の種類についても,特に制限はなく,哺乳動物を含め如何なる生物由来のものをも用いることができるが,例えば,麟翅目Lepidopteraに属するカイコBombyxmori,夜盗蛾Spodopterafrugiperda,シャクトリムシGeometridae等,双翅目Dipteraに属するショウジョウバエDrosophila等の昆虫,バシラス属等の原核生物,線虫,酵母,放線菌,糸状菌,子嚢菌,坦子菌及び植物由来のものが好適に用いられる。このうち,昆虫,中でも麟翅目に属する昆虫,特に夜盗蛾又はカイコ蛾由来のものが好ましい。使用することのできる生物由来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の例として,夜盗蛾由来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ1,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子,SfFDL遺伝子,カイコ蛾由来のBmFDL遺伝子等がある。また,複数の生物由来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子断片を融合させて構築したβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を用いることもできる。本発明において,哺乳動物細胞で発現させるβ-N-アセチルグルコサミニダーゼは,当該細胞内でのN-グリコシド結合糖鎖の合成経路において,例えば上記構造式6,構造式7の非還元末端に位置するN-アセチルグルコサミンを遊離する酵素として機能するものである。したがって,該酵素は,哺乳動物細胞内でN-グリコシド結合糖鎖の合成が行われる細胞小器官であるゴルジ体にてその活性を示すものであることが望ましい。哺乳動物細胞内でこれら細胞小器官に局在化する蛋白質は,通常,そのアミノ酸配列中に局在化シグナルを有することが知られている。従って,本発明において導入するβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子としては,より積極的にこれら細胞小器官に局在化させるために,β-N-アセチルグルコサミニダーゼの酵素活性部位をコードする遺伝子断片と他のタンパク質の上記局在化シグナルをコードする遺伝子断片を融合させて構築したキメラ型のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子であるものを,用いることもできる。本発明において,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子による哺乳動物細胞の形質転換は,β-N-アセチルグルコサミニダーゼを哺乳動物細胞で発現させる目的で行うものであり,この目的が達成される限り如何なる方法を用いて行ってもよい。通常,該形質転換は,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを哺乳動物細胞に導入して行うことができる。このような発現ベクターは,哺乳動物細胞内でβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定はない。一般的に,発現ベクターは環状のプラスミドであり,これを環状のまま,又は,制限酵素で切断してから細胞に導入する。β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子は,哺乳動物細胞内で発現するように,遺伝子の発現を制御する発現ベクター内のプロモーターの下流に組み込まれる。このときプロモーターとして,サイトメガロウイルスCMV由来のプロモーター,SV40初期プロモーター,伸長因子1EF-1プロモーター等が使用できる。あるいは,該形質転換は,例えば哺乳動物細胞を,β-N-アセチルグルコサミニダーゼを発現する昆虫細胞等の細胞と融合させることにより行ってもよい。本明細書においては,このように融合された哺乳動物細胞も,本発明のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子で形質転換された哺乳動物細胞に含まれる。またこのとき,1種類に限らず複数の種類のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子により,哺乳動物細胞を形質転換させてもよい。本発明において,糖蛋白質をコードする外来遺伝子による哺乳動物細胞の形質転換は,哺乳動物細胞において,該糖蛋白質が産生されるようにする目的で行うものであり,この目的が達成される限り如何なる方法を用いて行ってもよい。該形質転換は,上記β-N-アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子による哺乳動物細胞の形質転換と同様に実施することができる。本発明において,発現ベクターに組み込まれる,糖蛋白質をコードする外来遺伝子について,特に限定はないが,好ましくは生体内に投与したときに,マンノース受容体を介して細胞に取り込ませる必要がある糖蛋白質をコードする遺伝子であり,特に好ましくはグルコセレブロシダーゼ,酸性スフィンゴミエリナーゼスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ等のリソソーム酵素をコードする遺伝子である。本発明の製造方法で得られたグルコセレブロシダーゼはゴーシェ病患者の,酸性スフィンゴミエリナーゼはニーマンピック病患者の,リソソーム酸性リパーゼはウォルマン病患者の,酸性α-グルコシダーゼ酸性マルターゼはポンぺ病患者の,N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼはマロトーラミー症候群患者の,イズロン酸2-スルファターゼはハンター症候群患者の,α-L-イズロニダーゼはハーラー症候群患者の,α-ガラクトシダーゼAはファブリ病患者の,酵素補充療法に用いることができる。その他,本発明の製造方法は,ヘキソサミニダーゼ,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ,α-マンノシダーゼ,シアリダーゼ等の酵素の製造に使用することができる。また,本発明において,哺乳動物細胞による糖蛋白質の産生は,外来遺伝子によらず,目的とする糖蛋白質産生能を有する哺乳動物細胞において,該糖蛋白質をコードする内因性遺伝子の発現量増大を誘導して行ってもよい。この場合の内因性遺伝子とは,使用する哺乳動物細胞のゲノム上に元々存在する遺伝子のことをいう。内因性遺伝子の発現量を増大するように誘導させる方法については,特に限定はなく,周知の方法を用いて行うことができる。例えば,内因性遺伝子の発現制御部位にサイトメガロウイルスCMV由来のプロモーター等を相同組換えにより導入する方法WO94/12650,特定の内因性遺伝子の発現制御部位にはたらき,その遺伝子の発現量を増大させるホルモン,成長因子,ビタミン,サイトカイン,インターロイキン等を培養液中に添加する方法がある。例えばステロイドホルモン,甲状腺ホルモン,レチノイン酸,ビタミンB等は,これらの受容体を介して,発現制御部位にホルモン応答配列を有する内因性遺伝子を活性化し,その発現量を増大させることができる。本発明の製造方法で得られる糖蛋白質は,N-グリコシド結合糖鎖の非還元末端に位置する残基の少なくとも一部又は全てがマンノース残基となるので,マンノース受容体を介して細胞内に取り込まれるのみならず,N-グリコシド結合糖鎖が複合型糖鎖である場合に比べて,生体内に投与したときの安定性,血液動態が変化したものとなる。従って,本発明は,糖蛋白質の生体内における安定性,血液動態を変化させる目的で使用することもできる。すなわち,複合型糖鎖の非還元末端のシアル酸は,生体内における糖蛋白質の安定性を高める効果があるのに対し,本発明は,例えば生体内に投与したときに血中半減期が短い糖蛋白質を得る目的で使用することができる。副作用の予想される医薬が生体内で長期に亘って存在することは,その副作用の発生を助長するおそれがある。そのような場合,本発明を用いることにより,比較的半減期の短い糖蛋白質からなる医薬を製造することができる。以下,実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが,本発明が実施例に限定されることは意図しない。pEneoベクター及びpEhygrベクターの構築pEFmycnucベクターインビトロジェン社を,KpnIとNcoIで消化し,EF1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCIneoインビトロジェン社を,BglII及びEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に,T4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して,pEneoベクターを構築した図1-1及び図1-2。pEneoベクターを,SfiI及びBstXIで消化し,ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1kbpの領域を切除した図2-1。pcDNA31Hygroインビトロジェン社を鋳型にしてプライマーHygSfi及びプライマーHygBstX5’AACCATCGTGATGGGTGCTATTCCTTTGC3’;配列番号2を用いて,PCR反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した図2-2。増幅したハイグロマイシン遺伝子を,SfiI及びBstXIで消化し,上記のpEneoベクターに挿入して,pEhygrベクターを構築した図2-3。グルコセレブロシダーゼ発現細胞の構築ヒト胎盤cDNAライブラリーATAKARA社を鋳型として,プライマーGBAMlu5’GCAATACGCGTCCGCCACCATGGAGTTTTCAAGTCCTTCCAGAGAGG3’;配列番号3及びプライマーGBANot5’GGACGCGGCCGCGAGCTCTCACTGGCGACGCCACAGGTAGG3’;配列番号4を用いて,PCRによりグルコセレブロシダーゼ遺伝子GBA遺伝子を増幅させた。この増幅させた遺伝子を制限酵素MluI及びNotIで消化し,pCIneoPromega社のMluIとNotI間に挿入し,これをpCIneoと名付けた。pCIneoに挿入したGBA遺伝子の塩基配列中に変異がないことを,DNAシーケンサーABI社を用いて確認した後,pCIneoを制限酵素MluI及びNotIで消化して,GBA遺伝子を切り出した。次いで,切り出したGBA遺伝子を,上記で構築した発現ベクターpEneoのMluIとNotI間に挿入し,これをGBA発現ベクターpEneoを用いて,夜盗蛾由来のSf9細胞Invitrogen社からトータルRNAを抽出精製し,SuperScriptChoiceSystemforcDNASynthesisを用いて,oligodTをプライマーとした逆転写反応を実施した。逆転写反応物を鋳型として,プライマーNAGase5’Sal5’CCGGTCGACCATGTTACGGCACGTAATATTGTTATTCG3’;配列番号5とプライマーNAGase5’Mlu5’ACCAATCAGTTTATAGGTGAT3’;配列番号6,及びプライマーNAGase3’Mlu5’GAAGTACACCCACAGAGGTC3’;配列番号7とプライマーNAGase3’Not5’GCTTGCGGCCGCCTAAAAGTAATTCCCTGTTACGCAAAATCC3’;配列番号8の各プライマーセットを用いて,PCRを実施し,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子を,5’側と3’側に2分割してそれぞれ増幅させた。5’側DNA断片を制限酵素SalI及びMluI,3’側DNA断片を制限酵素MluI及びNotIで消化し,5’側DNA断片をpCIneoのSalIとMluI間に,3’側DNA断片をpCIneoのMluIとNotI間に挿入し,それぞれpCIneo,pCIneoと名付けた。pCIneoに挿入したβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子の各断片に塩基配列中に変異がないことを,DNAシーケンサーABI社を用いて確認した後,pCIneoをSalIとMluI,pCIneoをMluIとNotIでそれぞれ切断し,5’側DNA断片と3’側DNA断片を切り出した。次いで,pBluescriptSK東洋紡社のSalIとNotI間に,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子の全長が構築されるように,5’側DNA断片と3’側DNA断片を組み込んだ。これをpBSKと名付けた。pBSKを,SalIとNotIで消化して,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子を切り出し,これを,上記で構築した発現ベクターpEhygrのSalIとNotI間に挿入し,これをβN-アセチルグルコサミニダーゼ3発現プラスミドpEhygrとした。GBA発現細胞へのβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子の導入GBA発現細胞に,pEhygrをエレクトロポレーションにより導入した後,該細胞を,200μMハイグロマイシン,及び500μgmLG418を含むCDOptiCHO培地で選択培養して,β-N-アセチルグルコサミニダーゼ3遺伝子により形質転換されたGBA発現細胞を得た。インゲンマメレクチンPHAL4及びPHAE4による選択培養インゲンマメレクチンにはL型とE型の2種類のサブユニットが存在し,L型は4本鎖複合型糖鎖を,E型はバイセクティング2本鎖複合型糖鎖構造を認識する。PHAL4はL型のみで4量体を形成し,PHAE4はE型のみで4量体を形成しているイソレクチンである。高濃度のこれらのレクチンで細胞を処理すると,非還元末端に位置するのがシアル酸残基である複合型糖鎖構造を有する膜蛋白質を介して,レクチンが細胞に結合し,これにより細胞は死滅する。また,レクチンにより細胞が架橋されて細胞が凝集する。一方,膜蛋白質の糖鎖構造が,非還元末端にマンノース残基を有するものに変化した場合,レクチンは細胞に結合できず,細胞は増殖可能である。GBA発現細胞にpEhygrをエレクトロポレーションにより導入した後に選択培養して得た上記形質転換細胞を,12μgmLのPHAL4JOilMills社と12μgmLのPHAE4JOilMills社を添加した培地,CDOptiCHO培地で培養することにより,当該形質転換細胞の中で複合型糖鎖を発現している細胞を死滅させるとともに凝集させ,非凝集細胞を回収した。回収した非凝集細胞を,GBAAcGlcNAcase3発現細胞とした。ウェスタンブロッティングによる糖鎖構造の解析GBA発現細胞及びGBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清を各約10μLずつSDSPAGE電気泳動10ゲルに供し,泳動終了後にニトロセルロース膜へ転写した。一次抗体にウサギ抗ヒトGBA抗体,二次抗体に標識化抗ウサギIgG抗体を用いて,膜上に転写されたGBAを検出した。GBA発現細胞とGBAAcGlcNAcase3発現細胞の各々の培養上清に含まれるGBAの泳動パターンを比較すると,前者に比べて後者では分子量の低下に伴う電気泳動距離の増加が認められた図3,レーン1及び5。GBA発現細胞の培養上清に含まれるGBAの糖鎖構造は,非還元末端がシアル酸である複合型糖鎖であると考えられたので,GBA発現細胞の培養上清にシアリダーゼNewEnglandBiolabs社,β1,4-ガラクトシダーゼNewEnglandBiolabs社,及びβ-N-アセチルグルコサミニダーゼNewEnglandBiolabs社を順次添加した。その結果,培養上清にこれら酵素を順次添加するにつれて,分子量の低下に伴う電気泳動距離の増加が認められた図3,レーン2~4。シアリダーゼ,β1,4-ガラクトシダーゼ,及びβ-N-アセチルグルコサミニダーゼは,糖鎖の非還元末端からシアル酸,ガラクトース及びN-アセチルガラクトサミンを除去する活性を有するので,この結果は,GBA発現細胞の培養上清に含まれるGBAの糖鎖構造が,複合型糖鎖であることを示す。また,β-N-アセチルグルコサミニダーゼで処理後のGBAのバンド図3,レーン4は,糖鎖の非還元末端がマンノースとなったGBAの泳動パターンを示す。このβ-N-アセチルグルコサミニダーゼで処理後のGBAのバンド図3,レーン4とGBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清に含まれるGBAのバンド図3,レーン5を比較すると,両者はほぼ同一の泳動パターンを示す。この結果は,GBAAcGlcNAcase3発現細胞で発現したGBAの糖鎖が,非還元末端にシアル酸を有する複合型糖鎖ではなく,非還元末端にマンノースを有するものであることを示唆する。すなわち,この結果は,哺乳動物細胞に導入した昆虫由来である非哺乳動物のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ3が,ゴルジ体にてその活性を示し,GBAの糖鎖修飾の過程で非還元末端に位置するN-アセチルグルコサミンを除き,糖鎖の非還元末端をマンノース残基とする酵素として機能することを示すものである。昆虫由来である非哺乳動物のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ3が,このように哺乳動物細胞内でも同様に機能することを示す報告は,これまでにない。グルコセレブロシダーゼの精製-第一工程疎水性カラムクロマトグラフィーGBA発現細胞とGBAAcGlcNAcase3発現細胞を各々培養し,培養液中から,以下の手順で,グルコセレブロシダーゼを精製した。まず培養液を遠心して培養上清を回収した。培養上清をメンブランフィルターでろ過した後,これにエチレングリコール,1MDTT及び250mM酢酸ナトリウムpH48を,終濃度が各々20エチレングリコール,5mMDTT及び50mM酢酸ナトリウムとなるように添加した。結合用緩衝液50mM酢酸ナトリウムpH48,20エチレングリコールで平衡化したHiTrapPhenylSepharoseFF5mLカラムに,培養上清を適用した後,10カラム容量の結合用緩衝液でカラムを洗浄した。次いで,結合用緩衝液と溶出用緩衝液50mM酢酸ナトリウムpH4820エチレングリコール50エタノールの混合比が1000から0100となるように,6カラム容量の直線的なグラジエントをかけてグルコセレブロシダーゼを溶出した。分画した溶出液の活性を下記の方法で測定し,GBA活性がある画分を回収した。なお,流速は全て15mL分とした。グルコセレブロシダーゼの精製-第二工程陽イオン交換カラムクロマトグラフィー上記第一工程で回収した画分に,同量の純水を加えて希釈し,更にこれにエチレングリコール,1MDTT及び250mM酢酸ナトリウムpH48を,終濃度が各々20エチレングリコール,5mMDTT及び50mM酢酸ナトリウムとなるように添加した。洗浄用緩衝液30mM酢酸ナトリウムpH56001Tween80で平衡化したHiTrapCMSepharoseFF1mLカラムに,上記画分を適用した後,10カラム容量10mLの洗浄用緩衝液でカラムを洗浄した。次いで,緩衝液A50mMクエン酸,001Tween80と緩衝液B50mMクエン酸ナトリウム001Tween80の混合比が,7525から496となるように,8カラム容量の直線的なグラジエントをかけ,更に緩衝液Aと緩衝液Bの混合比が496の緩衝液を,5カラム容量流してグルコセレブロシダーゼを溶出した。溶出液を1mLずつ分画して回収し,これに25μLずつ1Mマンニトールを加えて混合した。各画分のGBA活性を下記の方法で測定し,GBA活性がある画分を回収した。なお,流速は全て15mL分とした。GBA活性測定GBA活性測定は,PasmanikChorMetalBiochemJ3178188に記載された方法を参考にして実施した。リン酸4methylumbelliferyl4MUF,SigmaChemicalCo製を希釈用緩衝液0125NaTaurocholate,015TritonX100,01ウシ血清アルブミンを含む100mMリン酸カリウム緩衝液pH596に溶解した後,段階希釈して,2001005025125625及び3125mM濃度の標準溶液を作製した。4methylumbelliferylβDglucopyranosideSigmaChemicalCo製を,4mMの濃度となるように希釈用緩衝液に溶解し,これを基質溶液とした。検体は,必要に応じて,測定前に希釈用緩衝液を用いて希釈した。フルオロプレートF96に,4MUF標準溶液又は検体を10μLずつ加えた後,基質溶液を70μL加えて混合した。37°Cで1時間反応させた後,反応停止液として,50mMグリシンNaOH緩衝液pH106を200μLずつ各ウェルに加えた後,フルオロプレートリーダーを用いて,励起波長355nm,検出波長460nmの条件にて蛍光強度を測定した。4MUF標準溶液の蛍光強度から検量線を描き,各検体の蛍光強度を検量線に内挿して,活性nmolhmLを算出した。測定はduplicateで行い、平均値を測定値とした。マクロファージ細胞株NR8383を用いたGBAの細胞内取り込み量測定マクロファージ細胞株NR8383を用いたGBAの細胞内取り込み量測定は,ZhuYetalJPharmacolExpTher30870511に記載された方法を参考にして実施した。NR8383細胞ラット肺胞マクロファージ由来細胞株,ATCC番号:CRL2192を,15ウシ胎児血清FBSを含むKaighn’smodificationofHamsF12F12K培地Invitrogen社中で培養した。NR8383細胞がサブコンフルエント状態になった時点で,培地を,32μMConduritolBEpoxideCBECalbiochem社を含むF12K培地に交換し,一晩培養18時間以内して,NR8383細胞の内因性のGBAを失活させた。細胞を遠心して回収し,15FBSを含むF12K培地で3回洗浄した後,20mLの測定用培地25mMHEPESpH684mgmLウシ血清アルブミンを含むF12K培地に懸濁し,CO2インキュベーターにて25時間培養した。細胞を2つに分けて遠心して回収し,一方は5mLの測定用培地に再懸濁し,もう一方は5mLの50mgmLマンノースを含む測定用培地に再懸濁した。このときの細胞密度は,供に1×107cellsmLになるように調製した。培養チューブに各細胞懸濁液を190μLずつ分注し,そこにGBAの最終濃度が所定の濃度mUmLとなるように10μLずつGBAサンプルを加えて混合し,37°Cで2時間,振とう培養を実施した。このとき,GBAサンプルに代えて10μLの測定用培地を加えたものを,コントロールとして置いた。培養後,細胞を遠心により回収し,1mgmLマンナンナカライテスクを含むPBSで3回洗浄した。さらに,PBSで2回洗浄した後,150μLの細胞溶解液50mMリン酸カリウムpH65025TritonX1001×プロテアーゼインヒビターカクテルロシュ社で細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液中のGBA活性を,上記のGBA活性測定法により測定した。マンノースを含まない測定用培地で培養した細胞のGBA活性測定値から,マンノースを含む測定用培地で培養した細胞のGBA活性測定値を減じた値を,マクロファージ細胞内に取り込まれたGBAの量としたその結果,GBA発現細胞の培養上清に得られたGBAは,NR8383細胞内にほとんど取り込まれないが,GBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清に得られたGBAは,NR8383細胞内に取り込まれることがわかった。また,マクロファージ細胞内へのGBAの取り込み量を,コントロールにおけるGBAの活性測定値を100とし,コントロールに対する比として活性を表わした対照に対する。その結果,GBA発現細胞の培養上清に得られたGBAは,マクロファージ細胞内へほとんど取り込まれなかったが図4:グラフ2,GBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清に得られたGBAは,マクロファージ細胞内へ取り込まれた図4:グラフ1。また,GBA発現細胞の培養上清に得られたGBAを,順次,シアリダーゼNewEnglandBiolabs社,β1,4-ガラクトシダーゼNewEnglandBiolabs社,及びβ-N-アセチルグルコサミニダーゼNewEnglandBiolabs社で処理することにより,糖鎖の非還元末端をマンノースとしたGBAも,GBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清に得られたGBAと同様に,マクロファージ細胞内へ取り込まれた図4:グラフ3。また,マンノース存在下では,GBAのマクロファージへの取り込みが阻害された図4:グラフ4~6これらの結果は,GBAAcGlcNAcase3発現細胞を用いて発現させたGBAが,その糖鎖の非還元末端にマンノースを有するものであり,マクロファージ細胞膜上に存在するマンノース受容体を介して,効率よく細胞内に取り込まれることを示すものである。SfFDL及びBmFDL発現プラスミドの構築CHO細胞用にコドンを最適化した夜盗我由来のSfFDL遺伝子及びカイコ我由来のBmFDL遺伝子を,それぞれ化学合成した。SfFDL遺伝子の塩基配列を配列番号9に,それがコードするアミノ酸配列を配列番号10に,それぞれ示す。配列番号9の塩基配列において,塩基1~6はMluI部位,塩基14~1909はSfFDLコード配列,塩基1910~1917はNotI部位である。ここに,配列番号10のアミノ酸配列は,配列番号9の塩基配列のコード領域に対応するアミノ酸配列であり,天然のSfFDL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と同一である。また,BmFDL遺伝子の塩基配列を配列番号11に,それがコードするアミノ酸配列を配列番号12に,それぞれ示す。配列番号11の塩基配列において,塩基1~6はMluI部位塩基14~1909はBmFDLコード配列,塩基1910~1917はNotI部位である。ここに,配列番号12のアミノ酸配列は,配列番号11の塩基配列のコード領域に対応するアミノ酸配列であり,天然のBmFDL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と同一である。上記の各遺伝子をMluIとNotIで消化し,それぞれMluIとNotIで消化したpUC57ベクターに組み込んだ。次いで,SfFDL遺伝子とBmFDL遺伝子をpUC57ベクターからMluIとNotIで切り出し,上記で構築した発現ベクターpEhygrのMluIとNotIの間に,それぞれ組み込んだ。SfFDL遺伝子を組み込んだpEhygrを,SfFDL遺伝子現プラスミドpEhygr,BmFDL遺伝子を組み込んだpEhygrを,BmFDL遺伝子現プラスミドpEhygrとした。GBA発現細胞へのSfFDL及びBmFDL遺伝子の導入GBA発現細胞に,pEhygr又はpEhygrをそれぞれエレクトロポレーションにより導入した後,該細胞を,200μMハイグロマイシン,及び500μgmLG418を含むCDOptiCHO培地で選択培養して,SfFDL遺伝子及びBmFDL遺伝子により形質転換されたGBA発現細胞を得た。インゲンマメレクチンPHAL4及びPHAE4による選択培養上記の選択培養により得られた形質転換細胞を,12μgmLのPHAL4JOilMills社と12μgmLのPHAE4JOilMills社を添加した培地であるCDOptiCHO培地で培養することにより,当該形質転換細胞の中で複合型糖鎖を発現している細胞を死滅させるとともに凝集させ,非凝集細胞を回収した。回収した非凝集細胞を,SfFDL遺伝子により形質転換された細胞についてはGBASfFDL発現細胞,BmFDL遺伝子により形質転換された細胞についてはGBABmFDL発現細胞とした。SDSPAGEによる糖鎖構造の解析GBA発現細胞,GBAAcGlcNAcase3発現細胞,GBASfFDL発現細胞及びGBABmFDL発現細胞の培養上清を各約10μLずつSDSPAGE10ゲルに供し,泳動終了後にシンプリーブルーセーフステインInvitrogenによりタンパク質染色をした。また,インゲンマメレクチン処理前のGBAAcGlcNAcase3遺伝子による形質転換細胞,GBASfFDL遺伝子による形質転換細胞及びGBABmFDL遺伝子による形質転換細胞の培養上清も,同時にSDSPAGEに同条件で供した。GBAの泳動パターンを比較すると,GBASfFDL発現細胞とGBABmFDL発現細胞の培養上清に含まれるGBAの泳動パターンはGBAAcGlcNAcase3発現細胞のものと一致した図5。また,インゲンマメレクチン処理前のGBASfFDL遺伝子による形質転換細胞とGBABmFDL遺伝子による形質転換細胞の培養上清に含まれるGBAの泳動パターンもGBAAcGlcNAcase3発現細胞のものと部分的に一致したデータは示さない。これらの結果は,GBASfFDL発現細胞及びGBABmFDL発現細胞で発現したGBAが,GBAAcGlcNAcase3発現細胞したものと同様に,糖鎖の非還元末端にマンノースを有するものであることを示す。また,これらの結果は,哺乳動物細胞に導入した夜盗我由来のSfFDL及びカイコ蛾由来のBmFDLが,夜盗我由来のβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ3と同様に,ゴルジ体にてその活性を示し,GBAの糖鎖修飾の過程で非還元末端に位置するN-アセチルグルコサミンを除き,糖鎖の非還元末端をマンノース残基とする酵素として機能することを示すものである。すなわちこの結果は,哺乳動物細胞内で発現したSfFDL及びBmFDLが,哺乳動物細胞内でもゴルジ体の所定の位置に局在化され,その酵素活性を発揮するということを示すものである。GBASfFDL発現細胞及びGBABmFDL発現細胞の培養上清から得られたグルコセレブロシダーゼの細胞内取り込み量測定GBASfFDL発現細胞及びGBABmFDL発現細胞の培養上清から,上記の第一工程及び第二工程からなる精製方法により,それぞれGBAを精製した。これら精製されたGBAについて,上記の方法で,マクロファージ細胞株NR8383を用いたGBAの細胞内取り込み量測定を実施した。図6に示すように,GBASfFDL発現細胞の培養上清グラフ1及びGBABmFDL発現細胞の培養上清グラフ2から得られたGBAは,GBAAcGlcNAcase3発現細胞の培養上清グラフ3から得られたGBAとほぼ同じレベルで,NR8383細胞内に取り込まれることがわかった。また,これらの細胞内取込み効果は,培地中にマンナンを加えることにより阻害されたグラフ4~6。これらの結果は,GBASfFDL発現細胞及びGBABmFDL発現細胞を用いて発現させたGBAが,GBAAcGlcNAcase3発現細胞を用いて発現させたGBAと同様に,その糖鎖の非還元末端にマンノースを有するものであり,マクロファージ細胞膜上に存在するマンノース受容体を介して,効率よく細胞内に取り込まれることを示すものである。"