"NHR選好の糸状菌細胞のゲノムへの所定の部位に対するポリヌクレオチドの標的取込みの効率を増大させるための方法であって、前記ポリヌクレオチドが、前記所定の部位との相同の領域を有し、HRの方へ取込み経路を導くステップを含んで成る、方法。前記導くステップが、親糸状菌細胞の変異体を提供するステップを含んで成り、NHR/HR比が、同じ条件下で測定された前記親生物における前記比と比べ変異体において減少している、請求項1に記載の方法。前記導くステップが、NHRに関与する成分をコードする遺伝子に欠ける、かつ/またはNHRに関与する成分の減少したレベルを有する変異体を提供するステップを含んで成る請求項1または2に記載の方法。前記変異体が、好ましくは誘導性に、以下の遺伝子、すなわちhdfAまたはその相同体、hdfBまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも1つに欠け、かつ/または、好ましくは誘導性に、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも1つの減少した量を有する、請求項3に記載の方法。NHRに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている、請求項3または4に記載の方法。前記導くステップが、取込まれる前記ポリヌクレオチドに過剰な小さな二本鎖ポリヌクレオチドを添加するステップを含んで成る、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。前記導くステップが、前記タンパク質の阻害剤を添加することによってNHRにおいて活性の少なくとも1つのタンパク質の活性を減少させるステップを含んで成る、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記変異体がHRに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。NHR/HR比が50未満、好ましくは10未満、さらにより好ましくは1未満、かつ最も好ましくは0.001未満である糸状菌が使用される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。親糸状菌細胞の変異体であって、前記親生物がNHR選好を有し、NHR/HR比が、同じ条件下で測定された前記親生物における前記比と比べ変異体が減少している変異体。前記変異体が、NHRに関与する成分をコードする遺伝子を欠き、かつ/またはNHRに関与する成分の減少したレベルを有する、請求項10に記載の変異体。前記変異体が、好ましくは誘導性に、以下の遺伝子、すなわちhdfAまたはその相同体、hdfBまたはその相同体、あるいはその両方の少なくとも1つに欠け、かつ/または、好ましくは誘導性に、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質の少なくとも1つの減少した量を有する、請求項10または11に記載の変異体。前記生物のゲノムにおいて、NHRに関与する遺伝子が非機能的変異形によって置換されている請求項10~12のいずれか一項に記載の変異体。前記変異体がHRに関与する成分の増加したレベルを有する、請求項10~13のいずれか一項に記載の変異体。前記変異体が組換え変異体である、請求項10~14のいずれか一項に記載の変異体。NHR/HR比が50未満、好ましくは10未満、さらにより好ましくは1未満、かつ最も好ましくは0.001未満である糸状菌。目的とするポリペプチドをコードする目的とする遺伝子を含んで成るDNA配列を含んで成るDNA構成物で形質転換された請求項10~16のいずれか一項に記載の糸状菌。前記糸状菌が、アスペルギルス種、ペニシリウム種、またはトリコデルマ種である、請求項10~17のいずれか一項に記載の糸状菌。前記アスペルギルスが、アスペルギルスニゲル種またはアスペルギルスオリゼ種である、請求項18に記載の糸状菌。前記ペニシリウムが、ペニシリウムクリソゲヌム種またはペニシリウムシトリナム種である、請求項18に記載の糸状菌。請求項10~20のいずれか一項に記載の糸状菌が使用される、目的とするポリペプチドを産生するための方法。請求項10~21のいずれか一項に記載の糸状菌が使用される、代謝産物を産生するための方法。前記代謝産物がカルチノイド化合物またはベータラクタム化合物である、請求項22に記載の方法。配列番号2または5または19または22を有する単離DNA配列またはその相同体。請求項24に記載のDNA配列によってコードされた単離ポリペプチドまたはその相同体。実施例1:hdfAおよび/またはhdfB遺伝子の識別および削除ベクターの構成。アスペルギルスニゲル菌株CBS513.88のゲノムDNAを配列決定し、分析した。KU70およびKU80との相同体と注釈付きの翻訳タンパク質を有する2つの遺伝子を識別し、それぞれhdfAおよびhdfBと命名した。オープンリーディングフレームORFイントロンを有するおよび遺伝子の約1000bp5’および3’を含んで成るhdfAおよび/またはhdfB遺伝子座の配列が、配列表1および4に示されている。hdfAおよび/またはhdfBの遺伝子置換ベクターが、既知の原理に従って設計され、ルーチンのクローニング法に従って構成された図1および2を参照。本質的に、これらのベクターは、予定されたゲノム遺伝子座での相同的組換えのhdfORFの約1000bpフランキング領域を含んで成る。また、それらは、A.ニドゥランス双方向amdS選択マーカー、中間直接繰返しを含有する。これら削除ベクターの一般設計は、欧州特許第635574B号明細書および国際公開第98/46772号パンフレットにおいて既述されている。実施例2:アスペルギルスニゲルにおけるhdfA遺伝子の不活性化。削除ベクターpDEL-HDFAの直鎖DNA図1を単離して使用し、以前に記載された方法BiotechnologyofFilamentousfungi:TechnologyandProducts.1992年リードパブリッシングReedPublishing米国USA、第6章:Transformation113~156頁を使用することによりアスペルギルスニゲルCBS513.88を形質転換した。この直鎖DNAはhdfA遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、図3に示されているようにamdS遺伝子によってhdfA遺伝子を置換する。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、欧州特許第635574B号明細書に記載された標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロアセトアミド培地上にプレーティングし、amdSマーカーを失った菌株を選択した。発育コロニーをhdfA遺伝子座での取込みについてPCRで診断し、候補の菌株をhdfA遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。hdfA遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするDNA断片の約2.2kbサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約8個の菌株が、約400の初期形質転換体のプールからゲノムhdfA遺伝子の除去を示した。菌株dHDFAを不活性化したhdfA遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。実施例3:アスペルギルスニゲルにおけるhdfB遺伝子の不活性化。削除ベクターpDEL-HDFBの直鎖DNA図2を単離して使用し、アスペルギルスニゲル菌株CBS513.88を形質転換した。この直鎖DNAはhdfB遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、amdS遺伝子によってhdfB遺伝子を置換する図4。実施例2に記載されたものと同じ遺伝子置換法を使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロアセトアミド培地上にプレーティングし、amdSマーカーを失った菌株を選択した欧州特許第635574B号明細書。発育コロニーをhdfB遺伝子座での取込みについてPCRで診断し、候補の菌株をhdfB遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。hdfB遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするDNA断片の約2.6kbサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約7個の菌株が、約370の初期形質転換体のプールからゲノムhdfB遺伝子の除去を示した。菌株dHDFBを不活性化したhdfB遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。実施例4:アスペルギルスニゲルにおけるhdfAおよびhdfB遺伝子の不活性化。削除ベクターpDEL-HDFBの直鎖DNA図2を単離して使用し、実施例2で得られた菌株dHDFAを形質転換した。この直鎖DNAはhdfB遺伝子座でゲノムへ取込むことができ、したがって、amdS遺伝子によってhdfB遺伝子を置換する図4。実施例2に記載されたものと同じ遺伝子置換法を使用した。形質転換体をアセトアミド培地で選択し、標準の方法に従ってコロニーを精製した。胞子をフルオロアセトアミド培地上にプレーティングし、amdSマーカーを失った菌株を選択した。発育コロニーをhdfB遺伝子座での取込みについてPCRで診断し、候補の菌株をhdfB遺伝子の削除についてサザン分析で試験した。hdfB遺伝子の削除は、遺伝子座全体をカバーするDNA断片の約2.6kbサイズの削減によって検出可能であり、適切なプローブにハイブリダイズされた。約15個の菌株が、約380の初期形質転換体のプールからゲノムhdfB遺伝子の除去を示した。菌株dHDFABを不活性化したhdfAおよびhdfB遺伝子を有する代表的な菌株として選択した。実施例5:単一相同的組換えイベントの改善された標的DNAが予定された遺伝子座でアスペルギルスニゲルのゲノムへ取込みうる1つの機序は、単一相同的組換えによるものである。相同的DNAは、組換えによってゲノム位置で整列して取込む図5を参照。2つのベクターを使用し、実施例2、3、および4で得られたアスペルギルスニゲル菌株の単一相同的組換えによる標的効率を試験した。2つのベクターは、組換えおよび結果として生じる取込みを導くグルコアミラーゼglaA遺伝子座と相同の領域を含んで成る図5。かかる相同的取込みのために設計された第1のベクターはすでに以前に国際公開第02/45524号パンフレットに記載されているpGBFIN11-EPO。このベクターは、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を含有する。第2のベクターpGBFIN11-PLAは、A.オリゼからのホスホリパーゼA1PLA1をコードする遺伝子を含有する。この酵素をコードする遺伝子はすでに公表されているワタナベWatanabeIら、Biosci.Biotechnol.Biochem.1999年、63巻、5号、820-826頁。この遺伝子は、pGBFIN11-EPOにおけるプロリン特異的エンドプロテアーゼ遺伝子のクローニングのために国際公開第02/45524号パンフレットに記載されたのと同じ方法を使用してpGBFIN11へクローン化された。菌株CBS513.88、dHDFA、dHDFB、およびdHDFABを実施例2で既述された形質転換法に従ってpGBFIN11-EPOまたはGBFIN11-PLAプラスミドのいずれかで形質転換した。得られた結果は、使用された両方のプラスミドで同じであった。発明者らはそれぞれ、標的遺伝子座で取込まれたプラスミドによる形質転換体の5、10、10、および10を見出した。したがって、発明者らは、アスペルギルスニゲルにおける少なくとも1つのhdf遺伝子の不活性化が単一の相同的組換えイベントによってこれらの菌株の標的効率の大幅な増大をもたらすと結論づけた。実施例6:数種類の遺伝子座での二重相同的組換えイベントの改善された標的。さらに、ゲノムからの遺伝子をコードする多くのアミラーゼの不活性化のために設計された削除ベクターでのdHDFA菌株の形質転換によって標的効率を測定した。遺伝子フランキング領域を実質的に実施例1に記載されているようにクローン化し、結果として生じるベクターを線状化し、これを使用してCBS513-88およびdHDFA菌株のプロトプラストを形質転換した。標的頻度をPCR分析、および対応する遺伝子の不活性化を示す活性に基づくプレートアッセイによって測定した。後者は、0.4寒天を補充したPDAプレート上で形質転換体を増殖させ、その後にヨード/カリウムヨード溶液ルゴールLugol、シグマSigmaL6146による染色によって行われた。以下の表1でわかるように、PCR分析および/または対応する遺伝子の不活性化を示す活性に基づくプレートアッセイによって判定された標的頻度は、CBS513.88菌株で観察されたものに比べ大幅に改善された。これらの所見により、アスペルギルスニゲルにおける少なくとも1つのhdf遺伝子の不活性化が結果として二重相同的組換えによる取込みに対するベクターの標的効率の大幅な増大をもたらすという本発明者らの結論がさらに裏付けられる。実施例7:標的頻度に対するamyBII遺伝子の相同的フランキング領域のサイズ削減の効果。別個の一連の実験において、二重相同的組換えによる形質転換効率および標的頻度に対するフランキング領域長さの効果をさらに調査した。菌株CBS513.88およびdHDFAのプロトプラストを、可変長のamyBIIフランキング領域によってフランキングされたA.ニドゥランスamdSマーカーを含むPCR断片で形質転換した。表2に示されたデータは、増強された全体的な形質転換効率に加えて、統合的カセットの標的がdHDFA菌株においてはるかに改善されたことを明らかに示す。実施例8:ポリペプチドの表現型分析および製造。dHDFA、dHDFB、またはdHDFAB菌株の固体培地または振盪フラスコでの発育中の表現型の差異は確認されなかった。プラスミドpGBFIN11-EPOまたはpBGFIN-PLAで形質転換されたdHDFA、dHDFB、およびdHDFAB菌株はすべて、以下の方法に従って判定されるように培地へ活性酵素を分泌した。固体培地はポテトデキストロース寒天PDA培地ジフコDifco、ポテトデキストロース寒天POTATODEXTROSEAGAR、培養培地、カタログ番号213400、1996-1997年であった。振盪フラスコ実験を欧州特許第635574B号明細書に記載されているように培地100ml中、34°C下、および500mlバッフル付き振盪フラスコを使用してインキュベーター振盪機中170rpmで行った。発酵の4日後、試料を取り、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはホスホリパーゼ活性のいずれかに判定した。プロリン特異的エンドプロテアーゼのタンパク質分解活性を分光光度法で時間内にpH5および約37°Cで基質としてZ-グリGlyシン-プロProリン-pNAを使用して測定した。1Uプロリン特異的エンドプロテアーゼは、毎分Z-グリGlyシン-プロProリン-pNA1ミクロモルをpH5および37°C下に変換する酵素の量と定義されている。アスペルギルスニゲルPLA1からのホスホリパーゼPLA1活性を分光光度法で測定するために、人工的基質、すなわち、1,2-ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンdiC8、基質が使用される。PLA1はA1位で硫化物結合を加水分解し、チオオクタン酸を解離する。チオオクタン酸は、4,4ジチオピリジン呈色試薬、4-DTDPと反応し、4-チオピリドンを形成する。4-チオピリドンは、334nmの波長を有する放射線を吸収する4-メルカプトピリジンと互変異性平衡にある。同波長での吸光変化は測定される。1単位は、1nmolチオオクタン酸を1,2-ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンから毎分37°CおよびpH4.0で遊離する酵素の量である。基質溶液は、エタノール66ml当たりdiC81gを溶解し、酢酸バッファー264mlを添加することによって調製される。酢酸バッファーは、0.2トリトンTriton-X100を含有する0.1M酢酸バッファーpH3.85を含んで成る。呈色試薬は、11mM4,4-ジチオジピリジン溶液である。これは、2mlエッペンドルフ試料カップ中に4,4-ジチオジピリジン5.0mgを秤量し、エタノール1.00ml中に溶解することによって調製した。ミリQ水1.00mlを添加した。興味深いことに、色差またはコロニー外観など形態的変化は、CBS513.88から得られた形質転換体よりもdHDFA、dHDFB、およびdHDFAB菌株から得られた形質転換体で低頻度に生じた。これは無作為取込みNHRの削減によるものであり、したがって予想外の表現型の変化を阻止すると考えられる。実施例9:変異誘発による相同的組換えの改善された効率を有するペニシリウム変異体の単離遺伝子標的の改善された効率を有する変異体を単離するために、典型的な変異誘発と分子生物学の組合せを適用した。ペニシリウムクリソゲヌムCBS455.95胞子をYEPDジフコ製の2酵母抽出物、ジフコ製の1ペプトン、2グルコース中で胞子形成するコロニーから得た。これらの胞子を滅菌水道水中で洗浄し、ml当たり108分生子を含有する懸濁液10mlを254nmでUV照射にかけたシルバニアSylvania、15ワットブラックライトブルー管、モデルFT15T8/BLB。UV照射を7.5、15、または30分間当てると同時に、懸濁液をゆっくり振盪した。これらの異なる照射時間は、細胞における軽度、中等度、および強度の突然変異率レベルを得るために選択された。暗所での回収の1時間後、これら3時点からの細胞を2つの同等のアリコートに分けた。第1の試料を既述のように直接再胞子形成しヘルスバッハHersbach,GJM、ファンデンビークVanderBeek,CP、およびファンジユックVanDijck,PWM.ThePenicillins:properties,biosynthesisandfermentation.In:VandammeEJ編BiotechnologyofIndustrialAntibiotics45-140頁、マルセルデッカーMarcelDekker、ニューヨーク、もう一方の試料をYNB培地アミノ酸ジフコ、2.0w/vグルコースとともに0.67w/v酵母窒素塩基中で長い回収期間、胞子形成を導入する前に4時間、25°C下にインキュベートした。第3の変異誘発試料をYNB中で一夜、野生型胞子を発生させた後、滅菌水道水での2つの洗浄ステップによって得て、滅菌水道水中に再懸濁した。さらにUV照射を7.5、15、および30分間当てると同時に、懸濁液をゆっくり振盪した。これらの試料を上述したように暗所での回収の1時間後に直接、再胞子形成した。これらの望ましい変異体をこれら変異誘発集団から選択するために、変異誘発集団をYEPD培地に接種した。発芽後、細胞の発達を標準の光学顕微鏡を使用して追跡した。培養の平均菌糸が申し分なく発達している場合、細胞を収穫し、溶解酵素でインキュベートし、プロトプラストを得た。プロトプラストを機能的選択マーカーの発現カセットを有する2つのDNA断片、bleおよびamdSで形質転換された。遺伝子bleはフレオマイシンへの耐性を与えることが可能なタンパク質をコードするコラーKolarM、プントPuntPJ、ファンデンホンデルCA、シュワブSchwabH.TransformationofPenicilliumchrysogenumusingdominantselectionmarkersandexpressionofanEscherichiacolilacZfusiongene.Gene.1988年、621:127-34頁。遺伝子amdSは、細胞が唯一の窒素源としてアセトアミドで発育することを可能にするタンパク質をコードする欧州特許第635574B号明細書に記載。P.クリソゲヌムのプロトプラストへのDNAの移動に適用される方法は当技術分野で周知であり、フィンケルシュタインとボール編、Biotechnologyoffilamentousfungi,Technologyandproducts,Butterworth-Heinemann1992年、ベネットとラシュア編MoreGeneManipulationsinfungi、AcademicPress1991年、ターナー、ピューラー編、Biotechnology、第2完全改訂版、VHC1992年を含む多くの文献に記載されている。Ca-PEG介在プロトプラスト形質転換はEP635574号明細書に記載されているように使用される。ペニシリウムゲノムにおける特異的遺伝子座に対するこれらの発現カセットの標的取込みを選択するために、DNAの短い相同的伸長をDNA断片の両側でPCRによって添加した。3タイプの構成物を作った。すなわち、第1のタイプは30bpのDNAの相同的伸長を、第2のタイプは50bp、および第3は100bpを含有する。選択は、27の明確なバッチを規定する30、50、または100bpの相同的伸長を有する2つのDNA構成物bleおよびamdSで9つの胞子形成バッチから得られた変異体を形質転換することによって行った。ble遺伝子はniaD遺伝子座に標的され、それによって硝酸還元酵素遺伝子を破壊しゴウカRJ、ファンハルチングスフェルトW、ボーベンベルグRA、ファンデンホンデルCA、ファンゴルコムRF、Cloningofthenitrate-nitritereductasegeneclusterofpenicilliumchrysogenumanduseoftheniaDgeneasahomologousselectionmarker、JBiotechnol.、1991年9月、202:189-99頁、細胞が塩素酸塩に耐性となると、塩素酸塩を含有するプレートへの形質転換体の選択を導くことを可能にした。amdS遺伝子はsutB遺伝子座に標的され、それによって硫酸パーミアーゼ遺伝子を破壊しファンデカンプM、ピッツィニーニE、フォスA、ファンデアレンデTR、シュールスTA、ニューベルトRW、ターナーG、コーニングスWN、ドリーゼンAJ、SulfatetransportinPenicilliumchrysogenum:cloningandcharacterizationofthesutAandsutBgenes.、J.Bacteriol.1999年12月、18123:7228-34頁、セレン酸塩を含有するプレートへの形質転換体の選択を導くことを可能にした。形質転換体が最初に塩素酸塩で選択され、次いでセレン酸塩について試験された。さらに、選択マーカーの存在は、唯一の窒素源としてアセトアミドを含有するプレート欧州特許第635574B号明細書、次いでフレオマイシンを含有するプレートで証明された。対照野生型P.クリソゲヌムとしてCBS455.95も同じDNA断片で形質転換された。存在する両方の選択マーカーを有し、塩素酸塩およびセレン酸塩に対して耐性の変異体は改善された標的取込みを有する菌株である。"