"明細書中に記載の発明。発明の開示驚くべきことに、OMVワクチンへの規定された成分のさらなる添加が、それらの効果を有意に拡大することが見出された。従って本発明は、aNmB外膜調製物、およびb以下の1つ以上から選択される免疫原性成分を含む組成物を提供する:WO99/57280に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO99/36544に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO99/24578に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO00/66791に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;Tettelinら[Science2000287:18091815]に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;Parkhillら[Nature2000404:502-506]に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO97/28273に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO96/29412に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO95/03413に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO99/31132に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO99/58683に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;WO99/55873に開示されるタンパク質またはその免疫原性フラグメント;Neisseriameningitidisタンパク質PorA、TbpA、TbpB、PilC、OpA、またはOmp85。この組成物が、WO99/24578に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/24578に開示される以下の配列番号SEQIDからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたは以下の配列番号の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質:。この組成物が、WO99/36544に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/36544に開示される以下の配列番号SEQIDからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたは以下の配列番号の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質:。この組成物が、Tettelinら、に開示されるタンパク質すなわち、その文献で開示される遺伝子の1つによってコードされるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、NMB0001~NMB2160からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはこれらの2160個の遺伝子の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの2160個の遺伝子の1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、Parkhillら、に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、その文献で開示される2121個のコード配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはこれらの2121個の配列の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの2121個の配列の1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、WO99/57280に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/57280に開示される以下の配列番号SEQIDからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたは以下の配列番号の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または以下の配列番号のいずれか1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質:。この組成物が、WO99/28273に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO97/28273の図4または図13に開示されるタンパク質である。この組成物が、WO99/29412に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO96/29412に開示される配列番号1~8からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはこれらの配列番号の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、WO99/03413に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO95/03413に開示される配列番号1~23からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはこれらの配列番号の1つ以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のいずれか1つに対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、WO99/31132に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/31132に開示される配列番号2からなるアミノ酸配列を含むまたは配列番号2の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号2に対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、WO99/58683に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/58683に開示される配列番号2または配列番号4からなるアミノ酸配列を含むもしくは配列番号2または配列番号4の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、もしくは配列番号2または配列番号4に対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。この組成物が、WO99/55873に開示されるタンパク質を含む場合、好ましくはこのタンパク質は、WO99/55873に開示される配列番号2または配列番号4からなるアミノ酸配列を含むもしくは配列番号2または配列番号4の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、もしくは配列番号2配列番号4に対する配列同一性好ましくは、50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上を有する配列を含むタンパク質。OpaおよびPorAの詳細は、Wiertzら[Infect.Immun.199661:298-304]に見出され得る。PilCは、Nassifら[PNASUSA199491:3769-73]に開示されている。Omp85は、Manningら[Microb.Pathog199825:11-21]に開示されている。TbpAおよびTbpBは、Ala‘AldeenBorriello[Vaccine199614:49-53]に開示されており、Legrainら[ProteinExprPurif19956:570-578]にもまた開示されている。成分bにとって好ましいタンパク質は以下のようなものである:WO99/57280の配列番号3069~3074および3207~3241に代表されるタンパク質919その中の図23および実施例15もまた参照のこと;WO99/57280の配列番号869~874および3149~3178に代表されるタンパク質235その中の図20および実施例12もまた参照のこと;WO99/57280の配列番号3045~3056および3185~3206に代表されるタンパク質519その中の図22および実施例14もまた参照のこと;WO99/57280の配列番号793~804および3115~3148に代表されるタンパク質225その中の図19および実施例11もまた参照のこと;WO99/36544の実施例1配列番号1~6に代表されるタンパク質ORF40WO00/66741の図1もまた参照のこと;WO99/31132およびWO99/58683もまた参照のこと;WO99/57280の実施例9に代表されるタンパク質287その中の配列番号1199~1204、3103~3108、および3179~3184を参照のこと;WO99/24578の実施例77配列番号647~654に代表されるタンパク質ORF1WO99/55873および登録番号AJ242535もまた参照のこと;WO99/24578の実施例26配列番号215~226に代表されるタンパク質ORF4WO00/66741の図2もまた参照のこと;WO99/24578の実施例55配列番号457~466に代表されるタンパク質ORF46WO00/66741の図12もまた参照のこと。この組成物の成分bは、好ましくはNmBタンパク質である。成分bが、成分aのOMVが由来するNmB株とは異なる株由来のタンパク質を含むことが好ましいすなわち、成分aにおけるOMVが、好ましくは異なるNmB株由来の免疫原性成分bにより補充される。この成分の1つ以上またはそれらの全てが、AlOH3に吸着され得る。例えば、本発明は以下を提供する。項目1aN.meningitidis血清型B外膜調製物、およびb以下の1つ以上から選択される免疫原性成分を含む、組成物:WO99/57280に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/36544に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/24578に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO00/66791に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;Tettelinら[Science2000287:18091815]に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO97/28273に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO96/29412に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO95/03413に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/31132に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/58683に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/55873に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;Neisseriameningitidisタンパク質PorA、TbpA、TbpB、PilC、OpA、Omp85。項目2項目1に記載の組成物であって、前記成分bがNmBタンパク質である、組成物。項目3項目2に記載の組成物であって、前記NmBタンパク質が、タンパク質919、タンパク質235、タンパク質519、タンパク質225、タンパク質ORF40、タンパク質287、ORF1、ORF4、またはORF46である、組成物。項目4項目1~3のいずれかに記載の組成物であって、前記成分bが、前記成分aが由来するNmB株とは異なる株に由来するタンパク質を含む、組成物。項目5項目1~4のいずれかに記載の組成物であって、前記成分の1つ以上がAlOH3に吸着される、組成物。項目6項目1~5のいずれかに記載の組成物であって、前記成分aがOMVを含む、組成物。項目7項目6に記載の組成物であって、前記OMVが、NmB由来のデオキシコレート抽出物である、組成物。項目8項目1~7のいずれかに記載の組成物であって、前記成分aがAlOH3に吸着される、組成物。項目9項目1~8のいずれかに記載の組成物であって、該組成物が、以下の成分の1つ以上をさらに含む、組成物:Neisseriameningitidis血清型Aに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Cに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Yに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Wに対する防御抗原;Haemophilusinfluenzaeに対する防御抗原;pneumococcusに対する防御抗原;ジフテリアに対する防御抗原;破傷風に対する防御抗原;百日咳に対する防御抗原;Helicobacterpyloriに対する防御抗原;ポリオに対する防御抗原;および/またはB型肝炎ウイルスに対する防御抗原。項目10前記組成物がワクチンである、項目1~9のいずれかに記載の組成物。項目11医薬品として使用されるための、項目1~10のいずれかに記載の組成物。項目12以下のi、iiおよび/またはiiiの製造における項目1~11のいずれかに記載の組成物の使用。iNeisseria細菌に起因する感染を処置または防止するための医薬品;iiNeisseria細菌の存在またはNeisseria細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬;iiiNeisseria細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。項目13患者の処置方法であって、項目1~10のいずれか1項に記載の組成物の治療有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。項目14以下の1つ以上から選択される免疫原性成分を含む、細菌外膜調製物:WO99/57280に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/36544に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/24578に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO00/66791に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;Tettelinら[Science2000287:18091815]に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO97/28273に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO96/29412に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO95/03413に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/31132に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/58683に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;WO99/55873に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント;ならびに/あるいはNeisseriameningitidisタンパク質PorA、TbpA、TbpB、PilC、OpA、Omp85。外膜調製物の成分本発明の組成物は、NmB外膜調製物成分aを含む。これは、膜小胞OMVの形態が好ましい。NmB由来のOMVの調製物は、当該分野で周知である。適切な調製物を獲得するための方法は、例えば以下に開示されている:Claassenら[Vaccine199614:1001-1008];Cartwrightら[Vaccine199917:2612-2619];Peetersら[Vaccine199614:1009-1015];Fuら[BiotechnologyNY199512:170-74];Davisら[J.Immunol.Meth.1990134:215-225];Saundersら[Infect.Immun.199967:113-119];Draabickら[Vaccine200018:160-172];Morenoら[Infect.Immun.198547:527-533];Milagresら[Infect.Immun.199462:4419-4424]Naessら[Infect.Immun.199866:959-965];Rosenqvistら[Dev.Biol.Sand.199892:323-333];Hanebergら[Infect.Immun.199866:1334-41];Andersenら[Vaccine199715:1225-34];Bjuneら[Lancet1991338:1093-96]など。OMVは、好ましくはNmBからのデオキシコレート抽出物であるすなわち、NmBからデオキシコレート抽出によって獲得される。好ましい抽出プロトコルは、Fredriksenら[Production,characterizationandcontrolofMenB-vaccineFolkehelsa:anoutermembranevesiclevaccineagainstgroupBmeningococcaldisease1991NIPHAnn.142:67-80]に記載されるプロトコルである。OMVを抽出するための好ましい株は、N.meningitidisの44/76株B:15:P1.7,16:P5.5:L3,7,9である。OMV成分のさらなる詳細は、例えば、Bjuneら[Lancet19913388775:1093-96]、またはFredriksenら[CharacterizationofhighmolecularweightcomponentinMenB-vaccine‘Folkehelsa’,anoutermembranevesiclevaccineagainstgroupBmeningococcaldisease.PathobiologyandimmunobiologyofNeisseriaceaeの818-824頁Conde-Glezら編ISBN968-6502-13-0]に見出される。OMV成分は、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着され得る。好ましいタンパク質:アジュバントの比は、1:67wt/wtである。ヒトに対するワクチンの代表的な用量は、25μgのタンパク質、2μgのLPS、および1.67mgのAlOH3を含み、そして0.5mlの容量で三角筋に注射され得る。OMV成分例えば、デオキシコレート抽出によって獲得される成分は、特定の成分を除去するために処理され得る。例えば、発熱物質または毒素成分が除去され得る例えば、LPS。OMV成分は、Fredriksenら[PathobiologyandimmunobiologyofNeisseriaceaeの818-824頁]に記載される80kDaの抗原性成分を保持することが好ましい。より好ましくは、OMV成分は、以下のアミノ酸配列の1つ以上を含むタンパク質:配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13[もしくはi配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、または配列番号13と同一性の配列を有するタンパク質-特定の配列番号に基づき、配列同一性の程度は、好ましくは50を超える例えば、60、70、80、90、95、99以上変異体および対立遺伝子改変体が挙げられる、もしくはii配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、または配列番号13の免疫原性フラグメントを含むタンパク質-このフラグメントは、この配列由来の少なくともn個の保存性アミノ酸を含み、そして特定の配列に基づき、nは7以上例えば、8、10、12、14、16、18、20以上]を保持することが好ましい。成分aとbの配合成分aとbは、単純に成分aと外膜調製物を混合することにより例えば、ORF4とノルウェーOMVを混合することにより配合され得る。あるいは、それらは、外膜中で成分aを生成好ましくは、過剰生成するよう細菌を操作することにより配合され得る-このような組み換え細菌由来の外膜調製物は、成分aとbの両方を含む。この方法における操作のために適切な細菌として、Neisseriameningitidis任意の血清型または株、Neisserialactamica、Neisseriacinereaまたは任意の他の非典型的なNeisseriaが挙げられる。他のグラム陰性細菌例えば、E.coli、Salmonella、Shigella、Bordetella、Yersinia、Helicobacterなどもまた、用いられ得る。形質転換方法は、当該分野で周知である。多価ワクチン必要に応じて、本発明の組成物はまた、以下の成分の1つ以上を含み得る:Neisseriameningitidis血清型Aに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Cに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Yに対する防御抗原;Neisseriameningitidis血清型Wに対する防御抗原;Haemophilusinfluenzaeに対する防御抗原;pneumococcusに対する防御抗原;ジフテリアに対する防御抗原;破傷風に対する防御抗原;百日咳に対する防御抗原;Helicobacterpyloriに対する防御抗原;ポリオに対する防御抗原;および/またはB型肝炎ウイルスに対する防御抗原。これらの任意の成分の好ましい例は、以下のようなものである:Neisseriameningitidis血清型Aに対する多糖類抗原;Neisseriameningitidis血清型Cに対する多糖類抗原例えば、Costantinoら1992Vaccine10:691698;Neisseriameningitidis血清型Yに対する多糖類抗原;Neisseriameningitidis血清型Wに対する多糖類抗原;Haemophilusinfluenzaeに対する多糖類抗原;pneumococcusに対する多糖類抗原;ジフテリアトキソイド例えば、CRM197変異体[例えば、DelGuidiceら1998MolecularAspectsofMedicine19:170]からなる、ジフテリアに対する防御抗原;破傷風トキソイド[例えば、WassilakおよびOrenstein、Vaccinesの第4章PlotkinおよびMortimer編、1988]からなる、破傷風に対する防御抗原;百日咳ホロトキシンpertussisholotoxinPTおよび糸状血球凝集素filamentoushaemagglutininFHAを含む;必要に応じてパータクチンpertactinおよび/または凝集原2および3[例えば、Gustafssonら1996N.Engl.J.Med.334:349355;Rappuoliら1991TIBTECH9:232238]をさらに含む、百日咳に対する防御抗原;CagA例えば、WO93/18150、VacA例えば、WO93/19150、NAP例えば、WO99/53310、HopX例えば、WO98/04702、HopY例えば、WO98/04702、ウレアーゼの1つ以上を含む、H.pyloriに対する防御抗原;HBV表面抗原および/またはHBVコア抗原からなる、B型肝炎ウイルスに対する防御抗原。組成物が、ジフテリアに対する抗原を含む場合、破傷風およびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、破傷風に対する抗原を含む場合、ジフテリアおよびポリオに対する抗原を含むこともまた好ましい。組成物が、ポリオに対する抗原を含む場合、ジフテリアおよび破傷風に対する抗原を含むこともまた好ましい。百日咳トキシンは、毒性タンパク質であり、そして組成物中に存在する場合、好ましくは、解毒される。解毒は、化学的手段および/または遺伝子的手段によるものであり得る。好ましい解毒化変異体は、9K/129G二重変異体doublemutant[例えば、Rappuoli1997NatureMedicine3:374376]である。組成物が、異なる新生形態および成熟形態で存在するタンパク質を含む場合、このタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。例えば、NspA[WO96/29412;Martinら1997J.Exp.Med18511731183もまた参照のこと]が含まれる場合、シグナルペプチドを欠くこのタンパク質の成熟形態が、好ましくは、用いられる。組成物が、多糖類抗原を含む場合、この多糖類は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合体化される。治療、予防、診断本発明の組成物は、好ましくはワクチンである。本発明に基づくワクチンは、予防的すなわち感染を防止するであるか、または治療的すなわち、感染後の疾患を処置するであるかのいずれかであり得る。本発明はまた、医薬として好ましくはワクチンとしてまたは診断試薬として使用するための、本発明の組成物を提供する。本発明はまた、以下の製造における、本発明の組成物の使用を提供する:iナイセリア細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬;iiナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬;および/またはiiiナイセリア細菌に対する抗体を惹起し得る試薬。上記のナイセリア細菌は任意の種または菌株であり得る例えば、N.gonorrhoeaeが、好ましくはN.meningitidis特に、血清型BNmBであり得る。本発明はまた、治療的有効量の、本発明に従う組成物を患者に投与する工程を含む、患者の処置の方法を提供する。この方法は好ましくは免疫である。プロセスさらなる局面によれば、本発明は、種々のプロセスを提供する。N.meningitidis由来のOMVの抽出工程例えば、デオキシコレート抽出を含む、本発明の組成物を生成するためのプロセスが提供される。配列表この配列表における配列は以下のようなものである。発明を実施するための形態本発明を実行するために用いられ得る標準的な技術および手順例えば、ワクチン接種目的または診断目的のために、開示された配列を利用するためのの要旨は以下の通りである。この要旨は、本発明に対する限定ではなく、むしろ使用され得るが必ずしもそうではない例を与えるものである。総論本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている例えば、SambrookMolecularCloning;ALaboratoryManual、第2版1989;DNACloning、VolumesIandiiD.NGlover編1985;OligonucleotideSynthesisM.J.Gait編1984;NucleicAcidHybridizationB.D.HamesおよびS.J.Higgins編1984;TranscriptionandTranslationB.D.HamesおよびS.J.Higgins編1984;AnimalCellCultureR.I.Freshney編1986;ImmobilizedCellsandEnzymesIRLPress、1986;B.Perbal、APractialGuidetoMolecularCloning1984;theMethodsinEnzymologyseriesAcademicPress、Inc.、特に154巻および155巻;GeneTransferVectorsforMammalianCellsJ.H.MillerおよびM.P.Calos編1987、ColdSpringHarborLaboratory;MayerおよびWalker、編1987、ImmunochemicalMethodsinCellandMolecularBiologyAcademicPress、London;Scopes、1987ProteinPurification:PrinciplesandPractice、第2版Springer-Verlag、N.Y.、およびHandbookofExperimentalImmunology、VolumesI-IVD.M.WeirおよびC.C.Blackwell編1986。ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略号が、本明細書において使用される。本発明に用いられるタンパク質は、種々の手段例えば、組み換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成などによって、そして種々の形態例えば、ネイティブ、融合などで調製され得る。それらは好ましくは、実質的な純粋形態すなわち、実質的に他のNeisseriaタンパク質または宿主細胞タンパク質を含まないで調製される。本発明に用いられる核酸は、種々の方法例えば、化学合成によって、ゲノムまたはcDNAライブラリーから、生物自体から、などで調製され得、そして種々の形態例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなどをとり得る。用語核酸は、DNAおよびRNA、ならびにそれらのアナログ例えば、改変された骨格を含むアナログ、ならびにペプチド核酸PNAなども含む。定義Xを含む組成物は、組成物中のXYの合計のうちの少なくとも85重量がXであるとき、Yを実質的に含まない。好ましくは、Xは、組成物中のXYの合計のうちの少なくとも約90重量を、さらに好ましくは少なくとも約95重量を、または99重量さえも構成する。用語含むcomprisingは含むincludingおよびからなるを意味する。例えば、Xを含む組成物は、もっぱらXからなり得るか、またはXYのようなXに何かを付加したものも含み得る。用語異種とは、天然では一緒には見られない2つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子または調節領域例えば、プロモーターであり得る。異種成分は天然では一緒には見られないが、例えば、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときは、それらは一緒に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられた、同じタンパク質または異なるタンパク質由来の2つのエピトープである。複製起点とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要とされ得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列;およびCOS-7細胞で有効であるウイルスT抗原である。タンパク質間の同一性は、好ましくはMPSRCHプログラムOxfordMolecularにおいて、ギャップオープンペナルティー=12およびギャップエクステンションペナルティー=1のパラメータでのアファインギャップサーチを用いて実行されるSmith-Watermanホモロジーサーチアルゴリズムによって決定される。代表的に2つのタンパク質間の50以上の同一性が、機能的等価の指標と考えられる。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列が提供される核酸分子または領域の対立遺伝子改変体は、別のもしくは第2の単離体のゲノム中の本質的に同じ遺伝子座で生じ、かつ、例えば、変異または組換えにより生ずる天然のバリエーションに起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子または領域である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の5’または3’非翻訳領域例えば、調節制御領域での変化を含み得る例えば、米国特許第5、753、235号を参照のこと。発現系ナイセリアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系;例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母について使用される発現系において発現され得る。i.哺乳動物系哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼを結合し得、コード配列例えば、構造遺伝子のmRNAへの下流3’転写を開始し得る任意のDNA配列である。プロモーターは、転写開始領域これはコード配列の5’末端の近位に通常位置するおよびTATAボックス転写開始部位の25~30塩基対bp上流に通常位置するを有する。TATAボックスは、RNAポリメラーゼIIにその正しい部位においてRNA合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、TATAボックスの100~200bp上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれの方向にも作用し得るSambrookら1989ExpressionofClonedGenesinMammalianCells.、MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版。哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主域を有する;従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーターAdMLP、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される誘導可能かのいずれかであり得、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得る。上記のプロモーターエレメントと組み合わされたエンハンサーエレメントエンハンサーの存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結されたとき、転写を100倍まで刺激し得る調節DNA配列であり、合成は、通常のRNA開始部位で始まる。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反転flipped方向のいずれかで転写開始部位より上流もしくは下流に、またはプロモーターから1000ヌクレオチドを超える距離で位置するとき、活性であるManiatisら1987Science236:1237;Albertsら1989MolecularBiologyoftheCell、第2版。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、より広い宿主域を有するため、特に有用であり得る。例としては、SV40初期遺伝子エンハンサーDijkemaら1985EMBOJ.4:761およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復LTRに由来するエンハンサー/プロモーターGormanら1982bProc.Natl.Acad.Sci.79:6777およびヒトサイトメガロウイルスに由来するエンハンサー/プロモーターBoshartら1985Cell41:521が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になるSassone-CorsiおよびBorelli1986TrendsGenet.2:215;Maniatisら1987Science236:1237。DNA分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、DNA分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のN末端における最初のアミノ酸は常に、ATG開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、N末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製することにより、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得るプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス3部構成リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの3’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成されるBirnstielら、1985Cell41:349;ProudfootおよびWhitelaw1988Terminationand3’endprocessingofeukaryoticRNA.TranscriptionandsplicingB.D.HamesおよびD.M.Glover編;Proudfoot1989TrendsBiochem.Sci.14:105。これらの配列は、mRNAの転写を導き、そのmRNAは、そのDNAにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター/ポリアデニル化シグナルの例としては、SV40由来のものが挙げられるSambrookら1989Expressionofclonedgenesinculturedmammaliancells.MolecularCloning:ALaboratoryManual。通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライス供与部位およびスプライス受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント例えば、プラスミドのような、レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、SV40Gluzmam1981Cell23:175、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのT抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳動物レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン-バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用に哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用に原核生物の宿主内で、そのレプリコンが維持されることが可能である。このような哺乳動物-細菌シャトルベクターの例としては、pMT2Kaufmanら1989Mol.Cell.Biol.9:946およびpHEBOShimizuら1986Mol.Cell.Biol.6:1074が挙げられる。使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、およびDNAの核内への直接微量注入が挙げられる。発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、HeLa細胞、新生仔ハムスター腎臓BHK細胞、サル腎臓細胞COS、ヒト肝細胞癌細胞例えば、HepG2および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、AmericanTypeCultureCollectionATCCから入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。iiバキュロウイルス系タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる:バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を含む転移ベクター通常は細菌プラスミド;転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルスこれは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする;ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。転移ベクターにタンパク質をコードするDNA配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでこのベクターとウイルスゲノムとを組換えさせる。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Invitrogen、SanDiegoCAからキット形態MaxBacキットで市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてSummersおよびSmith、TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.15551987以下、SummersおよびSmithに十分に記載されている。タンパク質をコードするDNA配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに先立って、プロモーター、リーダー所望される場合は、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間置換intermediatetransplacement構築物転移ベクターに構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント;作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子;あるいは調節エレメントの同じセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間置換構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント例えば、プラスミドのような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅用の適切な宿主内で維持され得る。現在、外来遺伝子のAcNPVへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、pAc373である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計されている。これらのものとして、例えば、pVL985これは、ポリへドリンの開始コドンをATGからATTに変化させ、そしてそのATTから32塩基対下流に、BamHIクローニング部位を導入する;LuckowおよびSummers、Virology198917:31を参照のことが挙げられる。そのプラスミドはまた通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナルMillerら1988Ann.Rev.Microbiol.、42:177、および原核生物のアンピシリン耐性amp遺伝子、ならびに大腸菌においての選択および増殖のための複製起点を含む。バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスRNAポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列例えば、構造遺伝子のmRNAへの下流5’から3’方向の転写を開始し得る、任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは存在する場合は、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は調節されるか、または構成的であるかのいずれかであり得る。ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子Friesenら、1986TheRegulationofBaculovirusGeneExpression、TheMolecularBiologyofBaculovirusesWalterDoerfler編;EPO公開番号127839および155476;ならびにp10タンパク質をコードする遺伝子Vlakら、1988、J.Gen.Virol.69:765由来の配列が挙げられる。適切なシグナル配列をコードするDNAは、分泌昆虫タンパク質または分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子例えば、バキュロウイルスポリへドリン遺伝子Carbonellら1988Gene、73:409から誘導され得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されると思われるために、ヒトα-インターフェロンMaedaら、1985、Nature315:592;ヒトガストリン放出ペプチドLebacq-Verheydenら、1988、Molec.Cell.Biol.8:3129;ヒトIL-2Smithら、1985Proc.Nat’lAcad.Sci.USA、82:8404;マウスIL-3Miyajimaら1987Gene58:273;およびヒトグルコセレブロシダーゼMartinら、1988DNA、7:99をコードする遺伝子由来のリーダーのような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、または適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ATG開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、N末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。あるいは、天然では分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラDNA分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内へのトランスロケーションを指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードしている。タンパク質の発現産物前駆体をコードするDNA配列および/または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種DNAおよび野生型バキュロウイルスのゲノムDNAを同時形質転換通常は、同時トランスフェクションによってする。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの2~5kbの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種DNAを導入する方法は、当該分野で公知であるSummersおよびSmith、上記;Juら1987;Smithら、Mol.Cell.Biol.19833:2156;ならびにLuckowおよびSummers1989を参照のこと。例えば、その挿入は、相同二重交差組換えhomologousdoublecrossoverrecombinationにより、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内へであり得る;挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子内に設計された制限酵素部位内へであり得る。Millerら、1989、Bioessays4;91。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化した場合、このDNA配列は、ポリへドリン特異的配列が5’および3’の両側に隣接しており、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる約1と約5との間;それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定する方法が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別し得る視覚的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後の時期に、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大15μmの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染した細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスとを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させる。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在野性型ウイルスを示すまたは非存在組換えウイルスを示すによりスクリーニングする。CurrentProtocolsinMicrobiology2巻Ausubelら編16.8増補10、1990;SummersおよびSmith、上記;Millerら1989。組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された:Aedesaegypti、Autographacalifornica、Bombyxmori、Drosophilamelanogaster、Spodopterafrugiperda、およびTrichoplusianiWO89/046699;Carbonellら、1985J.Virol.56:153;Wright1986Nature321:718;Smithら、1983Mol.Cell.Biol.3:2156;およびFraserら、1989InVitroCell.Dev.Biol.25:225を一般に参照のこと。細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス/発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される;細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、上記SummersおよびSmithを参照のこと。改変した昆虫細胞をさらに、適切な栄養培地で増殖させる。この培地は、その改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度まで増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給しながら、栄養培地を連続的に循環させる必要がある。その産物は、クロマトグラフィー例えば、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど;電気泳動;密度勾配遠心;溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切な場合、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中にまた分泌された、または昆虫細胞の溶解から生じたあらゆる昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片例えば、タンパク質、脂質および多糖類を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。iii植物系当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第5、693、506号;米国特許第5、659、122号;および米国特許第5、608、143号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Zenk、Phytochemistry30:3861-38631991に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても見出され得る;Vaulcombeら、Mol.Gen.Genet.209:33-401987;Chandlerら、PlantMolecularBiology3:407-4181984;Rogers、J.Biol.Chem.260:3731-37381985;Rothsteinら、Gene55:353-3561987;Whittierら、NucleicAcidsResearch15:2515-25351987;Wirselら、MolecularMicrobiology3:3-141989;Yuら、Gene122:247-2531992。植物ホルモンジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、R.L.JonesおよびJ.MacMillin、Gibberellins:AdvancedPlantPhysiology、MalcolmB.Wilkins編1984PitmanPublishingLimited、London、21-52頁の中に見出され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献:Sheen、PlantCell、2:1027-10381990;Maasら、EMBOJ.9:3447-34521990;BenkelおよびHickey、Proc.Natl.Acad.Sci.84:1337-13391987。代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で作動するように設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望の植物宿主へDNAを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌/植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主域の原核生物の複製起点;原核生物の選択マーカー;および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介移入のためのTDNA配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出できない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、WilminkおよびDons、1993、PlantMol.Biol.Reptr、112:165-185に見られる。植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、および植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にするTi配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。さらなる機能をコードしている他のDNA配列はまた、当該分野で公知であるように、そのベクターの中に存在し得る。本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。2つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加え、以下のエレメントを含む;プロモーター領域、植物の5’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうかに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの5’末端および3’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパク質をコードする配列は、適切な場合、そのタンパク質のプロセシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得るあらゆる配列を欠いている。たいてい、転写開始領域は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子についてのものであるから、トランスロケーションを与えるシグナルペプチドを使用することにより、また、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。このようにして、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過して、種子の胚乳内へと至る。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌されることは必要とされないが、このことは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのような、宿主のスプライセオソームsplicosome機構よりプロセシングされて除去される配列を含むかどうかを決定することが望ましい。そのような場合、イントロン領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコードとして遺伝的メッセージの一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ReedおよびManiatis、Cell41:95-1051985。ベクターは、組換えDNAを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得るCrossway、Mol.Gen.Genet、202:179-185、1985。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得るKrensら、Nature、296、72-74、1982。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティックballistic穿通法であるKleinら、Nature、327、70-73、1987ならびにKnudsenおよびMuller、1991、Planta、185:330-336は、大麦胚乳の粒子の照射bombardmentによりトランスジェニック大麦を作製することを示している。さらに別の導入方法は、他の物体ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の易融な脂肪表面体のいずれかとのプロトプラストの融合であるFraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、1859-1863、1982。ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得るFrommら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824、1985。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレートされる。高電界強度での電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルスを形成する。プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、移入した遺伝子を含む完全な植物が回収される。実際に、全ての植物が、サトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹および他の樹木、マメ科植物および野菜という全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞または組織から再生され得ることが公知である。いくつかの適切な植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる:Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、Geranium、Manihot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atropa、Capsicum、Datura、Hyoscyamus、Lycopersion、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digitalis、Majorana、Cichorium、Helianthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinum、Hererocallis、Nemesia、Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、Browaalia、Glycine、Lolium、Zea、Triticum、Sorghum、およびDatura。再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根させ得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。グルタミン酸およびプロリンを培地に添加することもまた、特にコーンおよびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発達する。効率的な再生は培地、遺伝子型、および培養歴に依存する。これらの3つの変動要因が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され得、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない半分の種子または他の植物組織は、機械的に破壊されて細胞間および組織間のあらゆる分泌タンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁されて、可溶タンパク質が回収され得る。次いで、従来のタンパク質単離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、pH、酸素、および容量というパラメーターは、異種タンパク質の発現および回収を最適化するために慣用的な方法により調整される。iv.細菌系細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のRNAポリメラーゼに結合し得そしてコード配列例えば、構造遺伝子の下流方向3’方向へのmRNAへの転写を開始し得る、任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端に近接して配置される、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これは、RNA合成が開始する、隣接するRNAポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質がこのオペレーターに結合し、それによって、特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された誘導性の転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、この配列は、通常、存在する場合には、RNAポリメラーゼ結合配列の5’側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質CAPがあり、これは、EscherichiacoliE.coliにおけるlacオペロンの転写の開始を補助するRaibaudら1984Annu.Rev.Genet.18:173。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって、転写を増強するかまたは低下し得る。代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトースlacChangら.1997Nature198:1056およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファンtrpGoeddelら1980Nuc.AcidsRes.8:4057;Yelvertonら1981Nucl.AcidsRes.9:731;米国特許第4、738、921号;EPO公開番号036776および121775のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β-ラクタマーゼblaプロモーター系Weissmann1981Thecloningofinterferonandothermistakes.Interferon3I.Gresser編、バクテリオファージλPLShimatakeら1981Nature292:128およびT5米国特許第4、689、406号プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌またはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する米国特許第4、551、433号。例えば、tacプロモーターは、trpプロモーター配列、およびlacリプレッサーにより調節されるlacオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドtrp-lacプロモーターであるAmannら1983Gene25:167;deBoerら1983Proc.Natl.Acad.Sci.80:21。さらに、細菌プロモーターには、細菌のRNAポリメラーゼに結合しそして転写を開始させる能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合性のあるRNAポリメラーゼが結合され、原核生物においていくつかの遺伝子の高レベルの発現をもたらし得る。バクテリオファージT7RNAポリメラーゼ/プロモーター系は、連結したプロモーター系の例であるStudierら1986J.Mol.Biol.189:113;Taborら1985ProcNatl.Acad.Sci.82:1074。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびE.coliオペレーター領域から構成され得るEPO公開番号267851。機能性プロモーター配列に加え、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。E.coliにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン-ダルガルノSD配列と呼ばれ、そしてこれは、開始コドンATGおよび開始コドンの3~11ヌクレオチド上流に位置する長さ3~9ヌクレオチドの配列を含むShineら1975Nature254:34。SD配列は、SD配列とE.coliの16SrRNAの3’末端との間の塩基対形成により、リボソームへのmRNAの結合を促進すると考えられているSteitzら1979GeneticsignalsandnucleotidesequencesinmessengerRNA.BiologicalRegulationandDevelopment:GeneExpressionR.F.Goldberger編。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには、SD配列と真核生物遺伝子のATGとの間の距離を最適化することが、しばしば、必要とされるSambrookら1989ExpressionofclonedgenesinEscherichiacoli.MolecularCloning:ALaboratoryManual。DNA分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、そのDNA分子と直接的に連結され得、この場合、N末端の最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これは、ATG開始コドンによりコードされる。所望される場合、N末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、あるいは細菌性メチオニンN末端ペプチダーゼとのインビボインキュベーションまたはインビトロインキュベーションのいずれかによって、タンパク質から切断され得るEPO公開番号219237。融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内在性の細菌タンパク質あるいは他の安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列を、異種コード配列の5’末端に融合する。発現の際に、この構築物は、その2つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の5’末端に連結され得、そして細菌において発現され得る。この生じた融合タンパク質は、好ましくは、このバクテリオファージタンパク質をこの外来遺伝子から切断するためのプロセシング酵素Xa因子用の部位を保持するNagaiら1984Nature309:810。融合タンパク質はまた、lacZJiaら1987Gene60:197、trpEAllenら1987J.Biotechnol.5:93;Makoffら1989J.Gen.Microbiol.135:11、およびCheyEPO公開番号324647遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。この2つのアミノ酸配列の接合部でのDNA配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得るMillerら1989Bio/Technology7:698。あるいは、外来タンパク質はまた、細菌において外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラDNA分子を作製することによって、細胞から分泌され得る米国特許第4、336、336号。このシグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地グラム陽性細菌またはペリプラズム空間細胞の内膜と外膜との間に位置するグラム陰性細菌のいずれかに分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる、プロセシング部位が存在する。適切なシグナル配列をコードするDNAは、E.coli外膜タンパク質遺伝子ompAMasuiら1983、ExperimetalManipulationofGeneExpression;Ghrayebら、1984EMBOJ.3:2437およびE.coliアルカリホスファターゼシグナル配列phoAOkaら1985Proc.Natl.Acad.Sci.82:7212のような、分泌性細菌タンパク質の遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のBacillus株由来のα-アミラーゼ遺伝子のシグナル配列が、B.subtilis由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得るPalvaら1982ProcNatlAcadSciUSA79:5582;EPO公開番号244042。通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの3’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、mRNAの転写を指向し、このmRNAが、そのDNAによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列は、頻繁には、ステムループ構造を形成し得る、約50ヌクレオチドのDNA配列を含み、この構造が、転写の終結を補助する。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子例えば、E.coliのtrp遺伝子および他の生合成遺伝子由来の転写終結配列が挙げられる。通常、上記の構成要素プロモーター、シグナル配列もし所望ならば、目的のコード配列、および転写終結配列を含むが、発現構築物へと組み立てられる。発現構築物は、しばしば、宿主例えば、細菌において安定に維持し得る染色体外エレメント例えばプラスミドのような、レプリコンに維持される。このレプリコンは、複製系を有し、従って、これが、このレプリコンを、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約5~約200、そして通常、約10~約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約10個、そしてより好ましくは、少なくとも約20個のプラスミドを含む。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌ゲノム内に組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌染色体と相同な少なくとも1つの配列を含む。組み込みは、このベクターにおける相同なDNAと細菌染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のBacillus株からのDNAで構築した組み込みベクターは、Bacillus染色体に組み込まれる欧州特許公開番号127328。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、この細菌宿主において発現され得、そしてこれらには、薬物例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシンネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性を細菌に付与する遺伝子が含まれ得るDaviesら1978Annu.Rev.Microbiol.32:469。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるかまたは組み込みベクターへと展開されるかのいずれかの、選択マーカーmarketから構成される。発現ベクターまたは形質転換ベクター染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれもは、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた:BacillussubtilisPalvaら1982Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:5582;欧州特許公開番号036259および欧州特許公開番号063953;PCT公開番号WO84/04541、EscherichiacoliShimatakeら1981Nature292:128;Amannら1985Gene40:183;Studierら1986J.Mol.Biol.189:113;欧州特許公開番号036776、欧州特許公開番号136829および欧州特許公開番号136907、StreptococcuscremorisPowellら1988Appl.Environ.Microbiol.54:655;StreptococcuslividansPowellら1988Appl.Environ.Microbiol.54:655、Streptomyceslividans米国特許4、745、056。外因性DNAを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、CaCl2または他の薬剤例えば、2価の陽イオンおよびDMSOのいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。DNAはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと:[Massonら1989FEMSMicrobiol.Lett.60:273;Palvaら1982Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:5582;欧州特許公開番号036259および欧州特許公開番号063953;WO84/04541、Bacillus]、[Millerら1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:856;Wangら1990J.Bacteriol.172:949、Campylobacter]、Cohenら1973Proc.Natl.Acad.Sci.69:2110;Dowerら1988NucleicAcidsRes.16:6127;Kushner1978AnimprovedmethodfortransformationofEscherichiacoliwithCo1E1-derivedplasmidsGeneticEngineering:ProceedingsoftheInternationalSymposiumonGeneticEngineeringH.W.BoyerおよびS.Nicosia編;Mandelら1970J.Mol.Biol.53:159;Taketo1988Biochim.Biophys.Acta949:318、Escherichiacoli]、[Chassyら1987FEMSMicrobiol.Lett.44:173、Lactobacillus]、[Fiedlerら1988Anal.Biochem170:38、Pseudomonasの使用]、[Augustinら1990FEMSMicrobiol.Lett.66:203、Staphylococcus]、[Baranyら1980J.Bacteriol.144:698;Harlander1987TransformationofStreptococcuslactisbyelectroporationStreptococcalGeneticsJ.FerrettiおよびR.CurtissIII編;Perryら1981Infect.Immun.32:1295;Powellら1988Appl.Environ.Microbiol.54:655;Somkutiら1987Proc.4thEvr.Cong.Biotechnology1:412、Streptococcus]。v.酵母発現酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼに結合し得そしてコード配列例えば、構造遺伝子からmRNAへの下流の3’側の転写を開始し得る、任意のDNA配列である。プロモーターは、通常、コード配列の5’末端の近位に位置する、転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、RNAポリメラーゼ結合部位TATAボックスおよび転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列UASと呼ばれる第2のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。このUASは、調節された誘導性発現を可能にする。構成的発現は、UASの非存在下で生じる。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それによって、転写を増強または減少させ得る。酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる:アルコールデヒドロゲナーゼADH欧州特許公開番号284044、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPまたはGAPDH、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼPyK欧州特許公開番号329203。酸性ホスファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供するMyanoharaら1983Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1。さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある1つの酵母プロモーターのUAS配列を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、GAP転写活性化領域に連結されたADH調節配列米国特許第4、876、197号および同第4、880、734号が挙げられる。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、GAPまたはPyKのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ADH2、GAL4、GAL10またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターが挙げられる欧州特許公開番号164556。さらに、酵母プロモーターには、酵母RNAポリメラーゼと結合しそして転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に存在するプロモーターが含まれ得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる:Cohenら、1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:1078;Henikoffら1981Nature283:835;Hollenbergら1981Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96:119;Hollenbergら1979TheExpressionofBacterialAntibioticResistanceGenesintheYeastSaccharomycescerevisiae、PlasmidsofMedical、EnvironmentalandCommercialImportanceK.N.TimmisおよびA.Puhler編;Mercerau-Puigalonら1980Gene11:163;Panthierら1980Curr.Genet.2:109;。DNA分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、DNA分子と直接連結され得、その場合、この組換えタンパク質のN末端にある最初のアミノ酸は、常に、メチオニンであり、これが、ATG開始コドンによってコードされている。所望の場合、N末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、このタンパク質から切断され得る。融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルスおよび細菌の発現系においての、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のN末端部分をコードするDNA配列を、異種コード配列の5’末端に融合する。発現に際して、この構築物は、この2つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼSOD遺伝子を、外来遺伝子の5’末端に連結し、そして酵母において発現させ得る。この2つのアミノ酸配列の連結部にあるDNA配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、欧州特許公開番号196056を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域と共に作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る例えば、WO88/024066。あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成された融合タンパク質をコードする、キメラDNA分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。適切なシグナル配列をコードするDNAは、分泌性酵母タンパク質の遺伝子例えば、酵母インベルターゼ遺伝子欧州特許公開番号012873;日本国公開公報62、096、086およびA因子遺伝子米国特許4、588、684由来であり得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する欧州特許公開番号060057。好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これはプレシグナル配列、およびプロ領域の両方を含む。使用され得るこの型のα因子フラグメントは、完全長のプレ-プロα因子リーダー約83アミノ酸残基および短縮されたα因子リーダー通常約25~約50アミノ酸残基を含む米国特許4、546、083および4、870、008;欧州特許公開番号324274。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては、第1の酵母のプレ配列および第2の酵母α因子からのプロ領域を用いて作製される、ハイブリッドα因子リーダーが挙げられる例えば、PCT公開番号WO89/02463を参照のこと。通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの3’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、mRNAの転写を指向し、このmRNAが、そのDNAにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。通常、上記の成分プロモーター、リーダー所望の場合、目的のコード配列および転写終結配列を含むを、発現構築物に組み立てる。発現構築物は、しばしば、宿主例えば、酵母または細菌において安定に保持され得る染色体外エレメント例えば、プラスミドのような、レプリコンにおいて維持される。このレプリコンは、2つの複製系を有し得、従って、これが、例えば、発現のために酵母中で維持され、そしてクローニングおよび増幅のために原核生物宿主中で維持されることを可能にする。このような酵母-細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる:YEp24Botsteinら1979Gene8:17~24、pCl/1Brakeら1984Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:4642~4646、およびYRp17Stinchcombら1982J.Mol.Biol.158:157。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約5~約200、そして通常、約10~約150の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約10個、そしてより好ましくは、少なくとも約20個を有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得る。例えば、Brakeら、前出を参照のこと。あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも1つの配列を含み、そして好ましくは、この発現構築物に隣接する2つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なDNAと酵母の染色体との間の組換えから生じるようであるOrr-Weaverら1983MethodsinEnzymol.101:228~245。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するための適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座に指向され得る。Orr-Weaverら、前出を参照のこと。1つ以上の発現構築物が組み込まれ得、これが、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与えるRineら1983Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:6750。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメントとして存在し得るかこれは、ベクター全体の組み込みを生じる、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する2つのセグメントとして存在し得るこれは、発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る。通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、その形質転換された酵母株の選択を可能にする、選択マーカーを含み得る。選択マーカーとしては、、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子例えば、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1およびALG7ならびにG418耐性遺伝子が含まれ得、それぞれ、酵母細胞にツニカマイシンおよびG418に対する耐性を付与する。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、CUP1の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にするButtら1987Microbiol.Rev.51:351。あるいは、上記成分のうちのいくつかは、形質転換ベクターに組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるかまたは組み込みベクターに展開される、選択マーカーから構成される。発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、外因性DNAを酵母宿主に導入する発現ベクターおよび方法は、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた:CandidaalbicansKurtzら1986Mol.Cell.Biol.6:142、CandidamaltosaKunzeら1985JBasicMicrobiol.25:141、HansenulapolymorphaGleesonら1986J.Gen.Microbiol.132:3459;Roggenkampら1986Mol.Gen.Genet.202:302、KluyveromycesfragilisDasら1984J.Bacteriol.158:1165、KluyveromyceslactisDeLouvencourtら1983J.Bacteriol.154:737;VandenBergら1990Bio/Technology8:135、PichiaguillerimondiiKunzeら1985J.BasicMicrobiol.25:141、PichiapastorisCreggら1985Mol.Cell.Biol.5:3376;米国特許第4、837、148号および同第4、929、555号、SaccharomycescerevisiaeHinnenら1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929;Itoら1983J.Bacteriol.153:163、SchizosaccharomycespombeBeachおよびNurse1981Nature300:706、およびYarrowialipolyticaDavidowら1985Curr.Genet.10:380471;Gaillardinら1985Curr.Genet.10:49。外因性DNAを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの形質転換またはアルカリ陽イオンで処理したインタクトな酵母細胞の形質転換が含まれる。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば、以下を参照のこと:Kurtzら1986Mol.Cell.Biol.6:142;Kunzeら1985J.BasicMicrobiol.25:141;Candida;Gleesonら1986J.Gen.Microbiol.132:3459;Roggenkampら1986Mol.Gen.Genet.202:302;Hansenula;Dasら1984J.Bacteriol.158:1165;DeLouvencourtら1983J.Bacteriol.154:1165;VandenBergら1990Bio/Technology8:135;Kluyveromyces;Creggら1985Mol.Cell.Biol.5:3376;Kunzeら1985J.BasicMicrobiol.25:141;米国特許第4、837、148号および同第4、929、555号;Pichia;Hinnenら1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929;Itoら1983J.Bacteriol.153:163Saccharomyces;BeachおよびNurse1981Nature300:706;Schizosaccharomyces;Davidowら1985Curr.Genet.10:39;Gaillardinら1985Curr.Genet.10:49;Yarrowia。抗体本明細書中で使用される場合、用語抗体とは、少なくとも1つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。抗体結合部位は、内部表面形状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、3次元結合空間であり、これが、抗体と抗原の結合を可能にする。抗体は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、改変された抗体、単価抗体、Fabタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびNeisseriaのタンパク質の識別/同定に有用である。本発明のタンパク質に対する抗体ポリクローナルおよびモノクローナルの両方は、従来の方法によって調製され得る。一般に、このタンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理的食塩水好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバントに混合または乳化し、そして混合物または乳化物を非経口的に一般的に皮下、または筋肉内に注射することによって、行われる。50~200μg/注射の用量が、代表的に十分である。免疫は、一般的に、2~6週後に生理的食塩水好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いて中のタンパク質の1回以上の注射でブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製の容器へ採血し、その血液を25°Cで1時間インキュベートし、その後4°Cで2~18時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離例えば1、000g、10分間によって回収される。ウサギから、採血1回につき約20~50mlが得られ得る。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinNature1975256:495~96の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓および必要に応じていくつかの大きなリンパ節が取り出され、そして単一の細胞へ解離される。所望の場合、脾臓細胞は、非特異的付着細胞の回収後タンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへ細胞懸濁液を適用することによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するB細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落とされない。得られるB細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地例えばヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、HATにおいて培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異的に結合するかつ関連しない抗原に結合しない抗体の産生についてアッセイされる。選択されたMAb分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ例えば、組織培養瓶または中空線維リアクター中で、またはインビボマウスにおける腹水としてのいずれかで培養される。所望の場合、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる:発蛍光団、発色団、放射性原子特に32Pおよび125I、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、3、3’、5、5’-テトラメチルベンジジンTMBを青い色素へ変換するその能力分光光度計を用いて定量可能によって、検出される。特異的結合パートナーとは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGおよびプロテインA、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター-リガンド結合体を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、上記が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、125Iは、放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。HRPは、酵素として、またはMAbについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、MAbおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、MAbをビオチンで標識して、そして125Iで標識したアビジン、またはHRPで標識した抗ビオチンMAbで、その存在を検出し得る。他の並べ替えおよび可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で等価であると考えられる。薬学的組成物薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。本明細書において使用される場合、用語治療上有効な量とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療剤または治療剤の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。本発明の目的のために、有効な用量は、DNA構築物が投与される個体において、約0.01mg/kg~50mg/kgまたは0.05mg/kg~約10mg/kgのDNA構築物である。薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語薬学的に受容可能なキャリアとは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない、任意の薬学的キャリアをいい、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく、ゆっくり代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPub.Co.、N.J.1991にて入手可能である。治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製される;注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。送達方法一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得;特に、ヒト被験体が処置され得る。その組成物の直接送達は、一般的に、皮下、腹腔、静脈内、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間隙空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮transdermal適用または経皮transcutaneous適用例えば、WO98/20734を参照のこと、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーhyposprayが含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常薬学的に受容可能なキャリアとともに含み、このキャリアは、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生をそれ自体は誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物例えば、油小滴またはリポソーム、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤アジュバントとして機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、H.pyloriなどの病原体由来の毒素と結合体化され得る。この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、1アルミニウム塩ミョウバン例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど、2水中油懸濁処方物他の特定の免疫刺激薬剤例えば、ムラミルペプチド以下を参照のことまたは細菌細胞壁成分を含むか含まないを含むが、それらに限定されず、例えば、以下:a5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85必要に応じて、種々の量のMTP-PE以下を参照のことを含有するが、必要ではないを含み、モデル110YマイクロフルイダイザーMicrofluidics、Newton、MAのようなマイクロフルイダイザーを用いてμ未満の粒子へと処方された、MF59TMWO90/14837;Vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach、PowellおよびNewman編、PlenumPress1995の第10章;bμ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、10スクアレン、0.4Tween80、5プルロニックブロックポリマーL121、およびthr-MDP以下を参照のことを含有する、SAF、ならびにc2スクアレン、0.2Tween80、およびモノホスホリピドAMPL、トレハロースジミコレートTDM、および細胞壁骨格CWS、好ましくはMPLおよびCWSDetoxTMからなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分を含む、RibiTMアジュバント系RAS、RibiImmunochem、Hamilton、MT;3サポニンアジュバント例えば、StimulonTMCambridgeBioscience、Worcester、MAを使用し得るか、またはそれから粒子例えば、ISCOM免疫刺激性複合体を生成し得る;4完全フロイントアジュバントCFAおよび不完全フロイントアジュバントIFA;5サイトカイン例えば、インターロイキン例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12など、インターフェロン例えば、γインターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、腫瘍壊死因子TNFなど;および6その組成物の効力を強化するための免疫刺激剤として作用する他の物質を含むが、それらに限定されない。ミョウバンおよびMF59TMが好ましい。上記で言及したように、ムラミルペプチドは、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミンノル-MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンMTP-PEなどを含むが、それらに限定されない。免疫原性組成物例えば、免疫抗原/免疫原/ポリペプチド/タンパク質/核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバントは、代表的に、希釈剤例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを含有する。さらに、補助物質例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などが、このようなビヒクルにおいて存在し得る。代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射剤として調製され;注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。免疫学的有効量とは、個体へのその量の投与が、単回用量であれ、一連の用量の一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群例えば、非ヒト霊長類、霊長類など、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、医療的状況の処置する医師の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲にあり、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。免疫学的組成物は、従来のように、非経口的例えば、皮下、筋肉内または経皮transudermally/経皮transucutaneouslyのいずれかでの注射によるに投与される例えば、WO98/20734。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。タンパク質ベースのワクチンの代替として、DNAワクチンが使用され得る例えば、RobinsonおよびTorres1997SeminarsinImmunology9:271-283;Donnellyら1997AnnuRevImmunol15:617-648;本明細書以下を参照のこと。遺伝子送達ビヒクル本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは外因性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスAAVベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Jolly1994CancerGeneTherapy1:51-64;Kimura1994HumanGeneTherapy5:845-852;Connelly1995HumanGeneTherapy6:185-193;およびKaplitt1994NatureGenetics6:148-153を参照のこと。レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、これには、B型、C型およびD型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス例えば、NZB-X1、NZB-X2およびNZB9-1O’Neill1985J.Virol.53:160を参照のこと多栄養性レトロウイルス例えば、MCFおよびMCF-MLVKelly1983J.Virol.45:291を参照のこと、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。RNATumorViruses、第2版、ColdSpringHaroborLaboratory、1985を参照のこと。レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスLTRは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、tRNA結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る米国特許第5,591,624号を参照のこと。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによる、宿主細胞DNAへの部位特異的組込みのために構築され得るWO96/37626号を参照のこと。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製されWO95/30763号およびWO92/05266号を参照のこと、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株これは、ベクター細胞株またはVCLとも称されるを作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞例えば、HT1080細胞またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、4070Aおよび1504AHartleyおよびRowe1976J.Virol.19:19-25、エーベルソンATCC番号VR-999、フレンドATCC番号VR-245、グラフィー、グロスATCC番号VR-590、カーステンKirsten、ハーベイHarvey肉腫ウイルス、ならびにラッシャーATCC番号VR-998およびモロニーマウス白血病ウイルスATCC番号VR-190を含む。このようなレトロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCC、Rockville、Marylandから入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては、特許出願GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP0334301、WO89/02468;WO89/05349、WO89/09271、WO90/02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、WO91/02825、WO95/07994、米国特許第5,219,740号、同第4,405,712号、同第4,861,719号、同第4,980,289号、同第4,777,127号、同第5,591,624号に記載されるものが挙げられる。Vile1993CancerRes53:3860-3864;Vile1993CancerRes.53:962-967;Ram1993CancerRes53199383-88;Takamiya1992JNeurosciRes33:493-503;Baba1993JNeurosurg79:729-735;Mann1983Cell33:153;Cane1984ProcNatlAcadSci81;6349;およびMiller1990HumanGeneTherapy1もまた参照のこと。ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Berkner1988Biotechniques6:616およびRosenfeld1991Science252:431;ならびにWO93/07283、WO93/06223、およびWO93/07282を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、上記に参照される文書およびWO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/00655、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、WO96/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/06223、WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95/02697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241,WO95/25807、WO95/05835、WO94/18922およびWO95/09654において記載されるものが挙げられる。あるいは、Curiel1992Hum.GeneTher.3:147-154に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したDNAの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルスAAVベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、SrivastavaWO93/09239に開示されるAAV-2ベースのベクターである。最も好ましいAAVベクターは、2つのAAV逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブD配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも5つのネイティブなヌクレオチドおよび18までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも10のネイティブヌクレオチドから18までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは10のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてD配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。AAV逆方向末端反復のネイティブなD配列は、各AAV逆方向末端反復においてすなわち、各末端に1つの配列が存在する20の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、HP形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなD配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なAAVベクターは、pWP-19、pWN-1であり、これらは両方ともNahreini1993Gene124:257-262に開示される。このようなAAVベクターの別の例は、psub201Samulski1987J.Virol.61:3096を参照のことである。別の例示的なAAVベクターは、Double-DITRベクターである。Double-DITRベクターの構築は、米国特許第5,478,745号に開示される。なお他のベクターは、Carterの米国特許第4,797,368号およびMuzyczkaの米国特許第5,139,941号、Chartejeeの米国特許第5,474,935号ならびにKotinのWO94/288157に開示されるものである。本発明において使用可能なAAVベクターのなおさらなる例は、SSV9AFABTKneoであり、これは、AFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Su1996HumanGeneTherapy7:463-470に開示される。さらなるAAV遺伝子治療ベクターは、米国特許第5,354,678号、同第5,173,414号、同第5,139,941号、および同第5,252,479号に記載される。本発明の配列を含む遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター例えば、米国特許第5,288,641号、およびEP0176170Roizmanに開示されるものである。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターとしては、WO95/04139WistarInstituteに開示されるHFEM/ICP6-LacZ、Geller1988Science241:1667-1669ならびにWO90/09441およびWO92/07945に記載されるpHSVlac、Fink1992HumanGeneTherapy3:11-19に記載されるHSVUs3::pgC-lacZ、ならびにEP0453242Breakefieldに記載されるHSV7134、2RH105およびGAL4、ならびにATCCに受託番号ATCCVR-977およびATCCVR-260として寄託されたものが挙げられる。本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルスATCCVR-67;ATCCVR-1247、MiddlebergウイルスATCCVR-370、ロスリバーウイルスATCCVR-373;ATCCVR-1246、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスATCCVR923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532および米国特許第5,091,309号、同第5,217,879号、およびWO92/10578に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第08/405,627号1995年3月15日出願、WO94/21792号、WO92/10578号、WO95/07994号、米国特許第5,091,309号、および米国特許第5,217,879号に記載されるαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルスは、ATCCRockville、Marylandのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたαウイルスベクターを使用する米国特許出願番号08/679640号を参照のこと。DNAベクター系例えば、真核生物層状発現系もまた、本発明の核酸の発現に有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはWO95/07994を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、以下に由来するものが挙げられる:ポリオウイルス例えば、ATCCVR-58およびEvans、Nature3391989385およびSabin1973J.Biol.Standardization1:115に記載されるもの;リノウイルス例えば、ATCCVR-1110およびArnold1990JCellBiochemL401に記載されるもの;ポックスウイルス例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス例えば、ATCCVR-111およびATCCVR-2010ならびにFisher-Hoch1989ProcNatlAcadSci86:317;Flexner1989AnnNYAcadSci569:86、Flexner1990Vaccine8:17;米国特許第4,603,112号および同第4,769,330号ならびにWO89/01973号に記載されるもの;SV40ウイルス例えば、ATCCVR-305およびMulligan1979Nature277:108およびMadzak1992JGenVirol73:1533に記載されるもの;インフルエンザウイルス例えば、ATCCVR-797および米国特許第5,166,057号およびEnami1990ProcNatlAcadSci87:3802-3805;EnamiおよびPalese1991JVirol65:2711-2713およびLuytjes1989Cell59:110McMichael1983NEJMed309:13ならびにYap1978Nature273:238およびNature1979277:108もまた参照のことに記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス;EP-0386882およびBuchschacher1992J.Virol.66:2731に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス;麻疹ウイルス例えば、ATCCVR-67およびVR-1247ならびにEP-0440219に記載されるもの;アウラAuraウイルス例えば、ATCCVR-368;ベバルBebaruウイルス例えば、ATCCVR-600およびATCCVR-1240;カバスCabassouウイルス例えば、ATCCVR-922;チクングニヤウイルス例えば、ATCCVR-64およびATCCVR-1241;フォートモーガンFortMorganウイルス例えば、ATCCVR-924;ゲタウイルス例えば、ATCCVR-369およびATCCVR-1243;キジラガハKyzylagachウイルス例えば、ATCCVR-927;マヤロウイルス例えば、ATCCVR-66;ムカンMucamboウイルス例えば、ATCCVR-580およびATCCVR-1244;ヌヅムNdumuウイルス例えば、ATCCVR-371;ピクスナPixunaウイルス例えば、ATCCVR-372およびATCCVR-1245;トナテTonateウイルス例えば、ATCCVR-925;トリニティTrinityウイルス例えば、ATCCVR-469;ユナUnaウイルス例えば、ATCCVR-374;ワタロアWhataroaウイルス例えば、ATCCVR-926;Y-62-33ウイルス例えば、ATCCVR-375;オニョンニョンウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス例えば、ATCCVR-65およびATCCVR-1242;西部脳脊髄炎ウイルス例えば、ATCCVR-70、ATCCVR-1251、ATCCVR-622およびATCCVR-1252;ならびにコロナウイルス例えば、ATCCVR-740およびHamre1966ProcSocExpBiolMed121:190に記載のもの。本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したポリカチオン性縮合DNAかまたは連結してないポリカチオン性縮合DNA単独例えば、米国特許出願番号08/366,7871994年12月30日出願およびCuriel1992HumGeneTher3:147-154を参照のこと、リガンド連結DNA例えば、Wu1989JBiolChem264:16985-16987を参照のこと、真核生物細胞送達ビヒクル細胞例えば、米国特許出願番号08/240,0301994年5月9日出願および米国特許出願番号08/404,796を参照のこと、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃米国特許第5,149,655号に記載されるような、米国特許第5,206,152号およびWO92/11033に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合。さらなるアプローチは、Philip1994MolCellBiol14:2411-2418およびWoffendin1994ProcNatlAcadSci91:1581-1585に記載される。粒子媒介遺伝子移入が使用され得る例えば、米国特許出願60/023,867号を参照のこと。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド例えば、アシアロオロソムコイドWuおよびWu1987J.Biol.Chem.262:4429-4432に記載されるような、Hucked1990BiochemPharmacol40:253-263に記載されるようなインスリン、Plank1992BioconjugateChem3:533-539に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリンに連結された合成遺伝子移入分子例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合DNA結合カチオンとともにインキュベートされ得る。裸のDNAもまた、宿主細胞を形質転換するために使用され得る。例示的な裸のDNA導入方法は、WO90/11092および米国特許第5,580,859号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。DNAコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのDNAの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第5,422,120号、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445、およびEP-524,968に記載される。米国特許出願60/023,867に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリンに連結された、重合性DNA結合カチオン例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミンのような合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むDNAをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系例えば、Woffendinら1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA9124:11581-11585に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手動の遺伝子移入粒子銃米国特許第5,149,655号に記載されるような;移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用米国特許第5,206,152号およびWO92/11033に記載されるようなが挙げられる。例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第5,422,120号および同第4,762,915号;WO95/13796;WO94/23697;およびWO91/14445;EP-0524968;およびStryer、Biochemistry、236-240頁1975、W.H.Freeman、SanFrancisco;Szoka1980BiochemBiophysActa600:1;Bayer1979BiochemBiophysActa550:464;Rivnay1987MethEnzymol149:119;Wang1987ProcNatlAcadSci84:7851;Plant1989AnalBiochem176:420に記載されるものである。ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクルこの用語は上記に定義されるとおりであるを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約0.01mg/kg~50mg/kgまたは0.05mg/kg~約10mg/kgのDNA構築物である。送達方法一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、1被験体に直接;2エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて;または3組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、経皮的transdermallyもしくは経皮的transcutaneously、静脈内、または筋肉内の注射によって、あるいは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、腫瘍または病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。WO98/20734を参照のこと。エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばWO93/14778に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順:例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびDNAの核への直接の微量注入これらはすべて当該分野で周知であるで達成され得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および/またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。A.ポリペプチド1つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである:アシアロオロソムコイドASOR;トランスフェリン;アシアロ糖タンパク質;抗体;抗体フラグメント;フェリチン;インターロイキン;インターフェロン;顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、マクロファージコロニー刺激因子M-CSF、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原例えば、エンベロープタンパク質もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質例えば、RIIとして知られる熱帯熱マラリア原虫plasmodiumfalciparumのサーカムスポロゾイトcircumsporozoiteタンパク質由来の17アミノ酸ペプチド。B.ホルモン、ビタミンなど包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。C.ポリアルキレン、ポリサッカリドなどまた、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドとともに含まれ得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはDEAE-デキストランである。また、キトサンおよびポリ乳酸-コ-グリコリドD.脂質およびリポソーム所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るかまたは核酸を捕捉および維持し得る、リポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約1:1mgDNA:マイクロモル脂質であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、HugおよびSleight1991Biochim.Biophys.Acta.1097:1-17;Straubinger1983Meth.Enzymol.101:512-527を参照のこと。本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性正に荷電した調製物、アニオン性負に荷電した調製物および中性調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドDNAFelgner1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7416;mRNAMalone1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6077-6081;および精製した転写因子Debs1990J.Biol.Chem.265:10189-10192の細胞内送達を媒介することが示されている。カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、N[1-2、3-ジオレイルオキシプロピル]-N、N、N-トリエチルアンモニウムDOTMAリポソームは、GIBCOBRL、GrandIsland、NYからの商標リポフェクチンLipofectinの下で入手可能であるFegner前出もまた参照のこと。他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテースtransfectaceDDAB/DOPEおよびDOTAP/DOPEBoerhingerが挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、DOTAP1、2-ビスオレイルオキシ-3-トリメチルアンモニオプロパンリポソームの合成の記載について、Szoka1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:4194-4198;WO90/11092を参照のこと。同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、AvantiPolarLipidsBirmingham、ALから容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEなどが挙げられる。これらの物質はまた、適切な比率のDOTMA出発物質およびDOTAP出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。このリポソームとしては、多重膜リポソームMLV、小さな単膜リポソームSUV、または大きな単膜リポソームLUVが挙げられ得る。種々のリポソーム-核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Straubinger1983Meth.Immunol.101:512-527;Szoka1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:4194-4198;Papahadjopoulos1975Biochim.Biophys.Acta392:483;Wilson1979Cell17:77;DeamerおよびBangham1976Biochim.Biophys.Acta443:629;Ostro1977Biochem.Biophys.Res.Commun.76:836;Fraley1979Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:3348;EnochおよびStrittmatter1979Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:145;Fraley1980J.Biol.Chem.1980255:10431;SzokaおよびPapahadjopoulos1978Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:145;ならびにSchaefer-Ridder1982Science215:166を参照のこと。E.リポタンパク質さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド/ポリペプチドと共に含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、カイロミクロン、HDL、IDL、LDL、およびVLDLが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体例えば、アセチル化されたLDLが使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へのポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドと共に含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質A、B、C、D、およびEが単離および同定されている。少なくともこれらの2つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、AI、AII、AIV;CI、CII、CIIIによって命名されている。1つのリポタンパク質は、1つより多くのアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するカイロミクロンはA、B、C、およびEから構成され、時間が経てばこれらのリポタンパク質はAを欠失し、そしてCおよびEアポタンパク質を獲得する。VLDLは、A、B、C、およびEアポタンパク質を含み、LDLはアポタンパク質Bを含み;そしてHDLはアポタンパク質A、C、およびEを含む。これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Breslow1985AnnuRev.Biochem54:699;Law1986Adv.Exp.Med.Biol.151:162;Chen1986JBiolChem261:12918;Kane1980ProcNatlAcadSciUSA77:2465;およびUtermann1984HumGenet65:232に記載されている。リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール遊離およびエステル、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、カイロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Meth.Enzymol.1281986に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造を補助するように選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Meth.Enzymol.前出;Pitas1980J.Biochem.255:5454-5460およびMahey1979JClin.Invest64:743-750に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロ方法によってかまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現により組換え方法によって産生され得る。例えば、Atkinson1986AnnuRevBiophysChem15:403およびRadding1958BiochimBiophysActa30:443を参照のこと。リポタンパク質はまた、BiomedicalTechniologies、Inc.、Stoughton、Massachusetts、USAのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Zuckermannら、PCT/US97/14465にて見い出され得る。F.ポリカチオン性薬剤ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド/ポリペプチドを含む組成物中に、リポタンパク質を伴ってかまたはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なpHにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするために核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ適用、エキソビボ適用、およびインビボ適用のいずれも有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。以下は、ポリカチオン性薬剤として有用なポリペプチドの例である:ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例としては、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、DNA結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、DNAウイルス由来のコートタンパク質例えば、X174が挙げられる。転写因子もまた、DNAに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子例えば、C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、およびTFIIDは、DNA配列に結合する塩基性ドメインを含む。有機ポリカチオン性薬剤としては、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシンpurtrescineが挙げられる。ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から推定されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。有用な合成ポリカチオン性薬剤としては、例えば、DEAE-デキストラン、ポリブレンが挙げられる。LipofectinTM、およびlipofectAMINETMは、ポリヌクレオチド/ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。免疫診断アッセイ本発明のNeisseriaMenB抗原またはその抗原性フラグメントは、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得るまたは、逆に抗Neisseria抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る。十分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む内のNeisseriaMenBタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイは公知である;これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ例えば、ELASAアッセイである。免疫診断に適切であり、かつ適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質例えば、適切な緩衝液、塩溶液などならびにアッセイの説明書の適切なセットと共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。核酸ハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションとは、水素結合による2つの核酸配列の互いに対する会合をいう。代表的には、1つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、2つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子としては以下が挙げられる:溶媒のタイプおよび容量;反応温度;ハイブリダイゼーションの時間;撹拌;液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤Denhardt’s試薬またはBLOTTO;配列の濃度;配列の会合の速度を増大させる化合物硫酸デキストランまたはポリエチレングリコールの使用;およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Sambrookら前出第2巻、第9章、9.47~9.57頁を参照のこと。ストリンジェンシーとは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたTmより約120~200°C低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムDNAのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Sambrookら、9.50頁を参照のこと。例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、1ブロットされるDNAの複雑さ、および2プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメントの全量は、プラスミドまたはファージ消化物については0.1~1μg、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピー遺伝子については10-9~10-8gまで、10倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露時間、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、1μgの酵母DNAで開始し、2時間ブロットし、そして4~8時間108cpm/μgを用いてハイブリダイズして、わずか1時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、10μgのDNAで開始し、一晩ブロットし、そして108cpm/μgより多いプローブを用いて10硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約24時間露光時間を生じる。いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のDNA-DNAハイブリッドの融解温度Tm、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して100相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、ハイブリダイズする配列の長さおよび全GC含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る:Tm=8116.6log10Ci0.4[GC]-0.6ホルムアミド-600/n-1.5ミスマッチ。ここでCiは塩濃度一価イオンであり、そして塩基対内のハイブリッドの長さであるMeinkothおよびWahl1984Anal.Biochem.138:267/284からわずかに改変した。ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度すなわち、ストリンジェンシーが上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。一般的に、50ホルムアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに95~100相同であるプローブについて42°C、90~95相同性では37°C、85~90相同性については32°Cである。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。髄膜炎菌のmeningococcal80~85kDaのタンパク質の同定N.meningitidis血清型B由来の種々の外膜の小胞調製物は、約80~85kDaの成分を含んでいたことが観察された。このタンパク質を、SDS-PAGEゲルから精製し、そしてN末端を配列決定した配列番号1。抗体は、SDS-PAGEで精製した50より多くの様々な血清型および血清型のN.meningitidis株における等価のタンパク質と交差反応したタンパク質に対して惹起させた。N.gonorrhoeae、N.polysaccharia、およびN.lactamicaとの交差反応もまた、観察した。ワクチン接種された患者由来の免疫後血清もまた、このタンパク質と反応した。完全な遺伝子を、血清型BのN.meningitidis配列番号2からクローン化し、そしてコードされたタンパク質を、推定した配列番号3。上記のN末端の配列決定との比較により、シグナルペプチド配列番号4および成熟配列配列番号5を推定する。N.meningitidis血清型AおよびN.gonorrhoeaeにおける対応する遺伝子の同定血清型BのN.meningitidis配列に基づいて、N.meningitidis血清型AおよびN.gonorrhoeae由来の対応する遺伝子をクローン化し、そして配列決定したORFと称される。血清型AのN.meningitidis由来の完全な遺伝子を、配列番号6に示し、このコードされたタンパク質を配列番号7に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号8および配列番号9である。N.gonorrhoeae由来の完全な遺伝子を、配列番号10に示し、このコードされたタンパク質を配列番号11に示す。このシグナルペプチドおよび成熟配列は、配列番号12および配列番号13である。配列比較これらのタンパク質の配列を比較した。これらの配列は、高度に相同である。N.meningitidis血清型Bの配列およびN.gonorrhoeaeの配列は、797aaの重複において、95.4の同一性を示す:N.meningitidis血清型Aの配列およびBの配列は、797aaの重複において、99.9の同一性を示す:この高度な保存は、単一のタンパク質が、種々のNesseriae種に対する免疫応答を誘導し得ることを、示唆する。ワクチン上記のように同定されたこれらのタンパク質を発現させ、そして免疫化のために使用する。良好な免疫応答が、このタンパク質に対して観察される。配合ワクチンさらに、このタンパク質を、他の病原性生物に対する抗原とそれぞれ配合し例えば、血清型Cのmeningitisに対してカイロンポリサッカリドワクチン、そして免疫化のために使用した。良好な免疫応答が観察された。本発明は、実施例のみによって記載され、そして改変がなされ得るが、依然として本発明の範囲および意図内であることが理解される。さらなるNmB成分ノルウェーOMVワクチンNorwegianOMVvaccineによって誘導される防御は、効果的であるが、そのワクチンを作製するために用いられた株に限定される。このワクチンについての臨床試験は、10代のヒトにおいて29月後では57.2の有効性を獲得したのみであったが、IgG応答は、ほぼ100の患者で観察された[例えば、Rosenqvistら1995Infect.Immun.63:4642-4652]。驚くべきことに、ノルウェーOMVワクチンへの、さらなる規定された成分の添加が、その効果を有意に拡大することが見出された。ノルウェーワクチンは、NmB株2996に対する防御を誘導しない。2996株由来の規定されたタンパク質をノルウェーワクチンに添加し、そしてそのワクチンの効果が、驚くべき程度まで増大されたことを示した。さらに、NmC多糖類結合抗原[例えば、Constantinoら1992Vaccine10:691-698]の添加は、非常に有意な結果を与えた。この配合物の殺菌活性を、以下の表に示す:2996株グループ1に対するノルウェーOMVワクチンの無効性が、2996株由来の規定された抗原を添加することによって克服され得ることは、容易に判断され得る。NmBタンパク質287を用いた結果は、特に有効であった。従って、ノルウェーワクチンは、多数の異なる株由来のOMVを調製することを必要とせずに改善され得る。このワクチンはまた、異種MenB株に対する防御もまた提供し得る。2996株タンパク質を用いて調製された同じワクチンを、5つの他の株に対して試験した。力価は、以下の通りであった。第2の研究は、ノルウェーOMVに、以下のNmB株2996由来のタンパク質を補充した:-任意の融合パートナーなしにE.coliにおいて発現させた、タンパク質919-Hisタグ融合体としてE.coliにおいて発現させた、ORF1-GST融合体としてE.coliにおいて発現させた、タンパク質287-これら3つのタンパク質の混合物必要に応じてNmC結合体を有する。調製物を、AlOH3をと共にアジュバント化し、そして殺菌アッセイを用いて、同種株に対して試験した。結果は、以下の通りであった。抗原287を用いたさらなる研究ノルウェーOMVと抗原287との配合物を、さらに調査した。20μgの抗原287をノルウェーOMPワクチン15μgOMPAlOH3と配合し、そしてマウスを免疫するために用いた。抗体を殺菌アッセイにおいて試験した。そして、この抗体は、試験された全ての株に対して有効であった。この結果は、以下の通りであった。従って、ほぼ全ての場合において、OMVタンパク質287の配合物は、驚くべきことにOMV単独の結果よりも良好な結果を与えた。組み換えOMVE.coliを形質転換し、ORF1、ORF40、およびORF46を発現させた。組み換えE.coliから調製されたOMVは、N.meningitidisに対する殺菌性抗体を誘導し得た。ORF1、ORF40、およびORF462996株を、E.coliにおいてHisタグ融合体として発現させ、そして純粋なタンパク質、またはOMVの形態のいずれかで調製した。両方の調製物に対する殺菌性力価を、2996株をチャレンジに用いて試験した。異種チャレンジ株を用いる殺菌性力価もまた測定した。ORF46は、純粋形態で4096のMC58株に対する力価を与えるが、OMV形態の場合、この力価は、32000に上昇する。ORF1は、純粋形態で128のNmA株F6124に対する力価を与えるが、OMV形態の場合、この力価は、512に上昇する。ORF40は、純粋形態で512のMC58株に対する力価を与えるが、OMV形態の場合、2倍になる。これらのデータは、NmB抗原が、E.coliにおいてOMVとして調製される場合、免疫原性を保持することを示し、そしてさらに、この免疫原性は、実際に増強され得る。本出願は、例示のみの目的によって本発明を記載し、そして本発明の範囲および精神の中に維持される限り、改変がなされ得ることが理解される。"