"1内在的ホスホセリンホスファターゼSerBの活性が低下している組換え微生物を培養して、O-ホスホセリンOPSを生産するステップと、2O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSの存在下またはOPSSを発現する微生物の存在下で、前記ステップ1のOPSと硫化物とを反応させて、システインまたはその誘導体を生産するステップとを含む、システインまたはその誘導体の生産方法。前記ホスホセリンホスファターゼが配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。酵素活性のレベルが、以下からなる群より選択される技術を用いることによって、低下されている、請求項1に記載の方法:酵素をコードする染色体遺伝子の欠失;内在的遺伝子の活性を低下させるための、染色体遺伝子への変異の導入;内在的酵素の活性を低下させるように変異された遺伝子による、染色体遺伝子の置換;内在的遺伝子の活性を低下させるための、遺伝子の調節領域への変異の導入;およびmRNAの翻訳を阻害するための、遺伝子の転写物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入。内在的SerBの活性が妨害されている前記組換え微生物が、グリシンまたはセリンを含む培地で培養される、請求項3に記載の方法。前記培地が、0.1~10g/Lの量のグリシンを含む、請求項4記載の方法。前記培地が、0.1~5g/Lの量のセリンを含む、請求項4に記載の方法。前記組換え微生物が、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼSerAまたはホスホセリンアミノトランスフェラーゼSerCの活性を強化するようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記SerAが、野生型であるか、またはセリンフィードバック阻害に耐性の変異体である、請求項7に記載の方法。i前記SerAが、配列番号3~7に記載のアミノ酸配列からなる群より選択される1つのアミノ酸配列を有し、かつiiSerCが、配列番号8に記載のアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の方法。前記組換え微生物が、PhnCDE[PhnCホスホネート輸送のATP結合要素、EG10713-PhnDPnトランスポーターの周辺質結合タンパク質要素、EG10714-phnEアルキルホスホネートABCトランスポーターの膜内在性要素、EG11283]の活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、アルカリホスファターゼPhoAまたは酸ホスファターゼAphAの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼPntABの活性を強化するようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、O-アセチルセリン/システイン排出パーミアーゼYfiK、ホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質RhtB、およびトレオニン/ホモセリン排出タンパク質RhtCからなる群より選択される少なくとも1つの酵素の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。酵素活性のレベルが、以下からなる群より選択される技術を用いることによって、強化されている、請求項7、12、または13のいずれか一項に記載の方法:酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること;酵素活性を強化するように、遺伝子の調節領域に変異を導入すること;酵素を強化するように変異された遺伝子によって、染色体遺伝子を置換すること;および酵素活性を強化するように、染色体遺伝子に変異を導入すること。前記組換え微生物が、ホスホグリセリン酸ムターゼアイソザイムGpmA、GpmI、またはGpmBからなる群より選択される少なくとも1つの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、L-セリンデヒドラターゼISdaAの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、2-アミノ-3-ケトブチレート補酵素AリガーゼKblまたは転写因子IclRの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。前記組換え微生物が、アセチルCoAシンテターゼAcs、酢酸キナーゼAckA-ホスホトランスアセチラーゼPta、リンゴ酸シンターゼGGlcB、リンゴ酸デヒドロゲナーゼMaeB、グルタミン酸デヒドロゲナーゼGdhA、グリオキシル酸カルボリガーゼGlc、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ2GlxR、およびグリセリン酸キナーゼIIGlxKからなる群より選択される少なくとも1つの酵素の活性を強化するようにさらに改変されている、請求項1に記載の方法。Glc、GlxR、およびGlxKからなる群より選択される少なくとも1つの酵素の活性が強化されることにより、前記組換え微生物の糖消費および増殖が改善される、請求項18に記載の方法。前記組換え微生物が、エシェリキア属Escherichiaの種またはコリネ型Coryneformの細菌である、請求項1記載の方法。前記ステップ2の硫化物が、Na2S、NaSH、NH42S、H2S、Na2S2O3、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。前記ステップ2の硫化物が、変換反応で用いられるOPSモル濃度の0.1~3倍のモル濃度で用いられる、請求項1に記載の方法。前記ステップ2のOPSSが、アエロピュルムペルニクスAeropyrumpernix、マイコバクテリウムツベルクローシスMycobacteriumtuberculosis、マイコバクテリウムスメグマチスMycobacteriumsmegmatis、およびトリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisからなる群より選択される少なくとも1つの種に由来するものである、請求項1に記載の方法。前記OPSSが、ステップ2の変換率が高くなるようにさらに改変されている、請求項23に記載の方法。前記ステップ2の変換が、0.001~2mMのPLPピリドキサール-5-リン酸、0.001~100mMのDTTジチオスレイトール、およびそれらの組み合わせから選択される補助因子の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。前記システインまたはその誘導体を単離および精製するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。内在的SerBの活性が低下している、組換え微生物。SerCの活性またはセリンフィードバック阻害に耐性であるSerAの活性を強化するようにさらに改変されている、請求項27に記載の組換え微生物。PhnCDE、PhoA、およびAphAの中より選択される少なくとも1つの活性を低下させるようにさらに改変されている、請求項27に記載の組換え微生物。受託番号KCCM11103Pで寄託された、請求項27に記載の組換え微生物。本発明によれば、本発明者らは、集中的な研究により、L-システイン合成するためにOAS-特異的経路ではなくO-ホスホ-L-セリンOPS-特異的経路を有するアエロピュルムペルニクスAeropyrumpernix、マイコバクテリウムツベルクローシスMycobacteriumtuberculosis、およびトリコモナスバギナリスTrichomonasvaginalisにおいて、O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼphosphoserinesulfhydrylase;OPSSの存在を見出し非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9、さらに、C末端の5個のアミノ酸残基が除去された場合に、OPSをシステインに変換するにあたり、追加的な酵素の不在においてさえ硫黄ドナーとしてNa2Sを用いることができるマイコバクテリウムツベルクローシスのOPSSを見出した非特許文献6。本発明において、微生物は、その中にOPSを蓄積するように改変され、インキュベーション後、OPSS酵素の存在下、OPSをシステインに変換する。このような方法はかつてどこにも記述されたことがない。本発明の目的は、システインまたはその誘導体の生産方法を提供することである。本発明の別の目的は、O-ホスホセリンの生産のための組換え微生物を提供することである。本発明の方法により、O-ホスホセリンが組換え微生物によって高収率で生産され、かつ、システインへの変換に用いられる。本方法は、現状においては、より環境に優しく、そして、化学的合成方法よりもシステインの生産においてより高い効率を保障する。システインおよびその誘導体は、動物およびヒトの食品および食品添加物の生産に広く使用可能な本発明の発酵および生物変換によって生産される。本明細書において使用される、用語システイン変換とは、基質のO-ホスホセリンOPSから生産物のシステインへの変換をもたらすO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSの触媒反応をいい、すなわち、OPSからシステインに変換する触媒反応をいう。本明細書において使用される、用語システイン変換率とは、出発物質のOPSの量に対する生産物であるシステインの量の百分率をいう。最適な反応条件下で、OPS1モルはシステイン1モルに変換される。例えば、OPS100モルがシステイン100モルに変換される場合、システイン変換率は100である。一態様により、本発明は、1内在的ホスホセリンホスファターゼSerBの活性を低下させるように改変されている組換え微生物を培養して、O-ホスホセリンOPSを生産するステップと、2O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSの存在下またはOPSSを発現する微生物の存在下で、前記ステップ1のOPSと硫化物とを反応させて、システインまたはその誘導体を生産するステップとを含む、システインまたはその誘導体の生産方法を提供する。本方法において、ステップ1は、内在的ホスホセリンホスファターゼSerBの活性が減少した組換え微生物を培養するステップに関するものである。SerBは、OPSをL-セリンへと加水分解する活性を有するタンパク質である。したがって、内在的SerBの活性が減少した微生物はその中にOPSを蓄積することを特徴とする。SerBは、限定されないが、SerBの活性を示すいかなるアミノ酸配列をも含み得、好ましくは、配列番号1または2のアミノ酸配列を有し得る。しかし、SerBの活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用され、配列番号1または2のアミノ酸配列との好ましくは90またはそれ以上、より好ましくは96またはそれ以上、さらに好ましくは98またはそれ以上、および最も好ましくは99またはそれ以上の相同性を有する。減少したSerBの活性とは、改変前の菌種のSerB活性と比較したSerB活性の減少を意味し、かつSerBの破壊を含む。SerB活性を減少させる多様な方法が当該技術分野でよく知られている。代表例には、染色体上のserBの除去;内在的serBの活性を減少させるための、染色体上のserBへの変異の導入;内在的serBの活性を減少させるための、serBの調節領域への変異の導入;内在的SerBの活性を減少させるように改変した遺伝子による染色体上のSerBの置換;およびmRNAの翻訳を阻害するための、SerBの転写物に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれるが、SerBの活性を減少させる方法はこれらに限定されない。これらの技術は、本発明において他の酵素の活性を減少させるために適用することができる。内在的SerBの除去は、組換え微生物へのセリン栄養要求性の導入をもたらすため、培地はグリシンまたはセリンが補充されなければならない。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含有する酵母抽出物、またはトリプトンの形態で提供できる。グリシンは、0.1~10g/Lの濃度、好ましくは0.5~3g/Lの濃度で含まれる。セリンの場合には、精製されたセリン、セリンを含有する酵母抽出物、またはトリプトンの形態で提供できる。培養培地において、その濃度は0.1~5g/L、および好ましくは0.1~1g/Lの範囲である。本発明の一実施態様において、グリシンまたはセリンを含む培地で培養する時、内在的SerBの活性が妨害された、変異コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumまたは大腸菌が、野生型に比べて、より多量のOPSを生産することが分かった表2、3、6および7参照。さらに、本発明の組換え微生物は、強化されたホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼSerAまたはホスホセリンアミノトランスフェラーゼSerC活性を有することができる。SerAは、3-ホスホグリセレート3-phosphoglycerateを3-ホスホヒドロキシピルベート3-phosphohydroxypyruvateに変換する活性を有するタンパク質である。SerAは、野生型アミノ酸を有していても、またはセリンによるフィードバック阻害に耐性を示す変異アミノ酸配列を有していてもよいが、これに限定されない。好ましくは、SerAは、配列番号3~7のアミノ酸配列からなる群より選択される1つを有することができる。野生型SerAの活性またはセリンフィードバック阻害に耐性である変異SerAの活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用可能であるが、好ましくは90以上、より好ましくは96以上、さらに好ましくは98以上、最も好ましくは99以上の相同性を配列番号3~7のアミノ酸配列のうちの1つと共有する。フィードバック阻害に耐性である変異SerAとは、セリンまたはグリシンによるフィードバック阻害に関係なく維持されたまたは強化されたSerA活性を示す変異体を意味する。フィードバック耐性変異体は当該技術分野でよく知られている非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13、特許文献3。本発明の一実施態様において、フィードバック耐性serAがさらに導入された場合、破壊されたserBを有するコリネバクテリウムグルタミカムまたは大腸菌が、野生型に比べて、より多量のOPSを生産することが分かった表4および9参照。SerCは、3-ホスホヒドロキシピルベートをO-ホスホセリンに変換する活性を有するタンパク質である。SerCは、これに限定されないが、SerC活性を示す配列を含むことができ、そして、好ましくは、配列番号8のアミノ酸配列を有することができる。しかし、SerC活性を示す限り、いかなるアミノ酸配列も使用可能であるが、好ましくは90以上、より好ましくは96以上、さらに好ましくは98以上、そして、最も好ましくは99以上の相同性を配列番号8のアミノ酸配列と共有する。また、酵素活性を増加させ得るように変異がserCに導入されてもよい。本発明の一実施態様において、serCがさらに導入された時、破壊されたserBおよびフィードバック耐性serAを有するコリネバクテリウムグルタミカムまたは大腸菌が、野生型に比べて、より多量のOPSを生産することが分かった表9参照。また、O-ホスホセリンの細胞内取り込みまたは分解を行う本発明の組換え微生物の能力が減少し得る。具体的には、組換え微生物は、PhnC/PhnD/PhnEアルキルホスホネートABCトランスポーターPhnCDEオペロン、すなわち、ホスホネート輸送のATP結合要素PhnC;EG10713-Pnトランスポーターの周辺質結合タンパク質要素PhnD;EG10714-アルキルホスホネートABCトランスポーターの膜内在性要素PhnE;EG11283、アルカリホスファターゼPhoA、または酸ホスファターゼAphAの活性を低下させるように改変され得る。本発明の一実施態様において、組換え変異体からのさらなるPhnCDEオペロンの欠失は、OPS生産の増加をもたらすことが観察された表10。PhoAまたはAphA活性がさらに妨害された組換え微生物において、培養培地中のリン酸の濃度が低下する際にOPS分解が減少し始めた表12。さらに、フィードバック耐性serAまたはserCの導入がOPSの生産を増加させた表14~16。また、本発明の組換え微生物は、ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼPntAB;EC1.6.1.1活性の強化によってさらに特徴付けられ得る。以前に記載されたとおり非特許文献14、PntABは、細胞内のレドックスバランスredoxbalanceを調節するNADPH代謝に関与する。本発明の一実施態様において、PntAB活性がpntABの過剰発現によってさらに強化された組換え微生物は、OPS生産を増加させることが分かった表17。さらに、本発明の組換え微生物は、O-アセチルセリン/システイン排出パーミアーゼYfiK、ホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質RhtB;EG11469、またはトレオニン/ホモセリンラクトン排出タンパク質RhtC;EG11468の強化によって特徴付けられ得る。YfiKは、システインおよびOASを細胞外に排出するための排出輸送体として知られており非特許文献26、また、RhtBは、トレオニン前駆体であるホモセリン/ホモセリンラクトンの細胞外排出輸送体として働くことが報告された。さらに、RhtCは、トレオニンおよびホモセリンの排出輸送体として知られている。YfiK、RhtC、およびRhtB活性の強化は、OPS蓄積菌株の増殖およびOPS生産の増加を示した表18。酵素活性の強化は、関心対象の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加させること;酵素活性を強化するように、遺伝子の調節領域に変異を導入すること;酵素活性を強化するように改変された遺伝子によって、染色体遺伝子を置換すること;および酵素活性を強化するように、染色体遺伝子に変異を導入することを含む、多様な周知の方法を用いて、達成され得るが、これに限定されない。また、本発明の組換え微生物は、ホスホグリセリン酸ムターゼの減少した活性によってさらに特徴付けられ得る。ホスホグリセリン酸ムターゼは、GpmI、GpmA、およびGpmBの3つのアイソザイムとして存在し、そして、解糖プロセスにおいて3-ホスホグリセレートから2-ホスホグリセレートへの変換を担う。基質としての3-ホスホグリセレートの使用のために、これらの酵素は、3-ホスホヒドロキシピルベートの合成を触媒するSerAと競合関係にある。したがって、各酵素の活性の減少により、OPSの前駆物質である3-ホスホグリセレートが増加して、増加したレベルのOPS生産がもたらされることが観察された表19。本発明の組換え微生物において、L-セリンデヒドラターゼISdaA;EC4.3.1.17または2-アミノ-3-ケトブチレート補酵素AリガーゼKblもまた減少され得る。そのため、組換え微生物は、低い濃度のグリシンまたはセリンを含む培地で培養された場合でもOPS生産が維持されるかまたは増加することにより特徴付けられる表20。また、本発明の組換え微生物は、IclRの減少した活性によってさらに特徴付けられ得る。IclRは、グリオキシル酸バイパスオペロンglyoxylatebypassoperonであるaceBAKの発現を抑制する機能の転写因子である非特許文献15。それが除去された場合に、OPSの生産が増加することが観察された表21。さらに、本発明の組換え微生物は、iアセチルCoAシンテターゼAcs、ii酢酸キナーゼAckA-ホスホトランスアセチラーゼPta、iiiリンゴ酸シンターゼGGlcB、ivリンゴ酸デヒドロゲナーゼMaeB、vグルタミン酸デヒドロゲナーゼGdhA、viグリオキシル酸カルボリガーゼGlc、viiタルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ2GlxR、およびviiiグリセリン酸キナーゼIIGlxK、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される酵素活性の強化によってさらに特徴付けられ得る。本発明の具体的な実施態様において、生産されたNADHの消費に伴って蓄積されたアセテートを効果的に再使用するための、iAcsECNo.6.2.1.1;非特許文献16またはピルビン酸オキシダーゼモノマーPoxB;EC1.2.2.2、またはiiAckAおよびPtaEC2,3,1,8がさらに強化された場合に、本発明の組換え微生物がOPSの生産を増加させることが分かった表22。グリオキシレートからマレートの合成およびマレートからピルベートへの変換を触媒する機能を果たす、iiiGlcBECNo.2.3.3.9およびivMaeBEC1.1.137は、TCA回路を弱めることがあり、したがって、グルコースの消費およびO-ホスホセリンの生産を増加させるために使用される表23。本発明の一実施態様によれば、2-オキソグルタレートおよびNADPHからSerCの基質であるグルタメートの合成を触媒するvGdhA;EC1.4.1.2の強化は、微生物においてOPSを生産するための、より高い潜在力を付与する表17。viGlcEC4.1.1.47、viiGlxREC1.1.1.60、およびviiiGlxKEC2.7.1.31のすべては、グリオキシレートを3-ホスホグリセレートに変換することが知られており、すなわち、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼの基質のレベルを増加させるものである非特許文献17、非特許文献18、非特許文献19。本発明の組換え微生物は、Glc、GlxRおよびGlxKの活性がさらに強化された場合に、糖消費および増殖が向上した表24。本発明の組換え微生物は、SerBの活性の減少した、したがって、増加したレベルでOPSを生産する任意の微生物を意味する。このような条件を満たす場合、原核生物であれまたは真核生物であれ、いかなる微生物も本発明の範囲内である。なかでも、代表的なものとしては、腸内細菌またはコリネ型細菌がある。本発明において有用な微生物の例には、エシェリキア属Escherichiaの種、エルウィニア属Erwiniaの種、セラチア属Serratiaの種、プロビデンシア属Providenciaの種、コリネバクテリウム属Corynebacteriumの種およびブレビバクテリウム属Brevibacteriumの種が含まれ、より好ましくはエシェリキア属の種、最も好ましくは大腸菌である。一実施態様において、OPSを生産可能な組換え菌株は大腸菌CA07-0012と名付けられ、そして、大韓民国、ソウル、西大門、弘濟1、361-221所在の、韓国微生物保存センターに2011年10月12日に受託番号KCCM11212Pで寄託された。さらに、一実施態様において、OPSを生産可能な組換え菌株は大腸菌CA07-0022/pCL-prmf-serAG336V-serCと名付けられ、大韓民国、ソウル、西大門、弘濟1、361-221所在の、韓国微生物保存センターに2010年9月28日に受託番号KCCM11103Pで寄託された。本明細書における、用語CA07-0022/pCL-prmf-serAG336V-serCとはCA07-0022serAG336V/pCL-prmf-serAG336V-serCと交換可能に使用される。菌株は、1Lの発酵槽で80時間培養された後、19.5g/Lの濃度でO-ホスホセリンが生産された実施例35。本明細書において使用される、用語培養は、人工的に調節された条件下で微生物の増殖を意味するものである。培養方法は、当該技術分野においてよく知られた適切な培地および培養条件を用いて実施できる。当業者は採用された菌株に対応する培養方法を容易に調節することができる。例えば、それは、回分式batchtype、連続式、または流加式fed-batchtypeで実施できるが、これに限定されない。さらに、培養培地は炭素源を含む。炭素源の例としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、およびセルロースなどの糖および炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、およびココナッツ油などの油および脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸などの脂肪酸、グリセロールおよびエタノールなどのアルコール、ならびに酢酸などの有機酸が含まれる。これらの炭素源は、個別にまたは混合物として培養培地に提供され得る。窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウロモコシ浸漬液、大豆、および小麦タンパク質などの有機材料、または尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物が培養培地に含まれ得る。これらの窒素源は、個別にまたは混合物として使用できる。培地は、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム、またはリン源phosphoroussourceとしての対応するナトリウム塩を含むことができる。培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属塩を含むことができる。培養培地はさらに、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体を含むことができる。栄養素は、回分式または連続式で培地に添加できる。水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物は、培養する間、培養のpHを調整するために、適切な方法で培養培地に添加できる。さらに、培養する間、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤が、泡の形成を抑制するために使用される。さらに、好気性状態で培養培地を維持するために、酸素または酸素含有気体が培養培地に注入できる。嫌気性または微好気性microaerobic状態のために、窒素、水素、または二酸化炭素が通気なしに提供される。培養培地は、一般的に、27°C~37°Cの温度、および好ましくは30°C~35°Cの温度に維持され得る。培養期間については、関心対象の生産物が所望量で得られるまで維持可能であり、10~100時間の範囲が好ましい。培養培地から培養するステップの間に生産されたOPSのさらなる収集および回収のために、当該技術分野でよく知られた適切な方法が回分式、連続式または流加式培養である培養の種類に応じて選択できる。本発明の方法において、O-ホスホセリンからシステインまたはその誘導体への変換を誘導するために、ステップ2は、O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSの存在下またはOPSSを発現する微生物の存在下で、ステップ1のOPSと硫化物との反応をいう。硫化物は、pH、圧力および/または溶解度の差のため、当該技術分野で典型的に使用される固体形態は勿論のこと、液体または気体形態で提供できる。チオール基SHに変換できるものであれば、硫化物sulfide、S2-またはチオスルファトthiosulfate、S2O32-などの任意の硫黄化合物も本発明で使用できる。好ましくは、OPSにチオール基を提供することができる、Na2S、NaSH、H2S、NH42S、NaSHおよびNa2S2O3が使用できる。反応時に、システインまたはその誘導体1分子を提供するために、1つのチオール基が1つのOPS分子に提供される。このような酵素変換において、硫化物は、好ましくは、用いられるOPSと比べて、モル濃度で0.1~3倍、およびより好ましくは1~2倍添加できる。経済的な面で、チオール基を提供する硫化物およびOPSは、最も好ましくは、モル比率1:1で使用される。本発明の一実施態様において、Na2Sは硫黄源として使用された。Na2Sは、変換反応において使用されたOPSと比べて、モル濃度で1~3倍多く添加された。好ましくは、効果的にOPSをシステインに変換するために、モル濃度でOPSに比べて2倍多く提供される表34。本明細書において使用される用語O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSとは、OPSをシステインに変換するために、OPSO-ホスホセリンへのチオール基SHの転移を触媒する酵素をいう。酵素は、アエロピュルムペルニクス、マイコバクテリウムツベルクローシス、およびトリコモナスバギナリスで初めて見出された非特許文献7、非特許文献8。本明細書において使用される用語変異体は、表現型において遺伝的または非遺伝的変化を示す培養物または個体をいう。OPSSと共に使用される場合、用語変異体は、その活性が野生型と比較して効果的に強化され得るように遺伝的に変化したOPSS酵素を意味すると考えられる。本発明において、OPSS変異体は、OPSSをコードする核酸配列の一部分の欠失、置換または付加によって作製できる。本発明の一実施態様によれば、強化された活性を有するOPSS酵素は、マイコバクテリウムスメグマチスMycobacteriumsmegmatisのOPSS酵素のC末端の5個のアミノ酸残基を欠失させることにより作製された。OPSS変異体は、関心対象の酵素を高収率で得ることができるコドン最適化に基づいた遺伝子合成技術を利用することにより、酵素の発現に広く使用される大腸菌から得ることができる。あるいは、微生物に関する膨大な量の遺伝的情報のバイオインフォマティクスに基づいた有用な酵素資源のスクリーニング方法が、OPSS変異体を得るのに利用され得る。本発明の一実施態様において、システインを合成するために基質としてOPSを利用するOPSS酵素は、アミノ酸配列の相同性をスクリーニングすることにより多様な微生物から選択される。この点に関して、当該技術分野で適した培地および培養条件を利用して得られた細胞ペレットを溶解し、続いて、酵素を含む上清を精製してOPSS酵素を得た表26。さらに、高収率発現システムは、OPSS酵素を経済的に得るために開発された。T7プロモーターを用いるpETベクターは当該技術分野でよく知られている。しかし、本発明者らは、通常のシステムを用いる代わりに、CJ1システムと名付けられた特許文献4酵素発現システムを利用した。本発明の一実施態様において、T7プロモーターを含むpETシステムと、CJ1プロモーターを含むCJ1システムとの間でOPSSの発現レベルが同じ条件で比較された。その結果、CJ1システムは、pETシステムよりも高いOPSSの発現レベルを示した。しかも、OPSSの過剰発現は、pETシステムでは低い温度18°Cおよび長い時間を必要としたが、これに対し、pCL-pCJ1システムでは高い温度37°Cおよび短い時間を必要とした。好ましくは、pCL-pCJ1システムを用いてOPSSを得る実施例46。酵素活性の強化は、よく知られた多様な方法を用いて達成できる。例えば、OPSSをコードする遺伝子のコピー数を増加させる、強力なプロモーターを用いる、または遺伝的変異を導入することによって実施できる。OPSSの酵素変換の最適化は、当該技術分野でよく知られた様々な方法を用いて達成することができる。例えば、最適化は、最適温度およびpH、基質に対する阻害、基質濃度、温度安定性などのようなOPSSの特性を完全に理解することを基礎とすることができる。さらに、最適化は、最適なOPSS濃度、使用される基質の濃度に関する最適なバランス、酵素変換のためにSHを提供する硫黄化合物に対する選好度、特定の緩衝液に対する選好度、イオン生成の影響、および補助因子およびその最適な濃度のような、酵素変換に対する最適な条件によって決定できる。本発明の一実施態様において、前記言及した方法を利用することにより得られたOPSS酵素が特徴付けられ、そして、見出した特性に基づいて、酵素安定性を保障する、OPSからシステインへの高い変換率を有する経済的に有用な酵素変換プロセスが開発された。酵素変換プロセスにおいて、反応温度は37°Cから80°Cまで設定可能である。具体的には、古細菌Archeaに属する、Ape-OPSS配列番号12は、37°Cに比べて60°Cで増加した酵素活性を示し、60°Cで最適活性であり、酵素それ自体が高い熱安定性である。その反面、Msm-T配列番号10は、37°Cで最適活性を示し、そして、60°Cで熱処理すると活性が低下する。OPSS酵素は、pH範囲6.0~10.0で酵素活性を有することが観察された。Ape-OPSSは、pH7.4で最適活性を示した。pH8.0から9.0までにおいて最適活性を示すMsm-Tは、Ape-OPSSと比較して、より広いpH範囲で安定性を示した表28および31、ならびに図2および図3。補助因子として、0.001~2mMPLPピリドキサール5リン酸または0.001~100mMDTTが酵素変換に使用され得る。本発明の一実施態様において、システイン変換率は、25mMDTTまたは0.2mMPLPの存在下で2.3倍増加した。このように、DTTまたはPLPでの処理は、ステップ2のシステイン変換率における向上につながった。補助因子の添加は、増加した生産費用および増加した変換率を考慮して適切なレベルに設定された表30。OPSSに対する反応条件は、使用されるOPSの種類および濃度に応じて異なり得る。本発明の一実施態様において、純粋なOPS商業的に入手可能、ステップ1で作製された培養物から精製されたOPS、およびステップ1のOPSを含む培養物は、最適な変換率を提供するために様々な条件下で用いられた。結果的に、システイン変換率は、OPSSの種類および濃度、ならびに反応温度、ならびにOPSの種類および濃度に応じて異なった図5および図6、ならびに表35。本発明の方法は、さらに、ステップ2で生産されたシステインを単離および精製することを含み得る。酵素変換後、システインは、当該技術分野でよく知られた方法を用いて培養培地から単離および精製できる。当業者はシステインからシステイン誘導体を周知の方法を用いて化学的に合成することができる。システインは、NACN-アセチルシステインを提供するためにアセチル化剤と、およびSCMCS-カルボキシメチルシステインを提供するために基本条件下でハロ酢酸haloaceticacidと、容易に反応することができる。これらシステイン変異体は、咳、気管支炎、気管支喘息、および咽喉炎を治療する医薬材料として使用される。本発明において、微生物の発酵を通じて得られたOPSブロスは、システイン合成のための基質として使用される。微生物の発酵によって得られたOPSブロスは、商業的に入手可能な純粋OPSに比べて、OPSブロスが追加的に精製することなく使用できる点および変換に必要な補助因子PLPが発酵培養物から得られうる点で経済的な利点を有する。本発明の一実施態様において、変換プロセスは、50mMのOPSブロス、または60mMの精製されたOPSブロス、100mMNa2Sまたは120mMNa2S、および0.2mMPLPの反応条件下で50μg/mlのMsm-Tが使用された場合に、80もの高いシステイン変換率を保障するように開発された。高活性の酵素を用いた酵素的変換が、容易に最適化およびスケールアップできることは当業者にとって自明である。さらに他の態様として、本発明は、OPSの生産のためのSerBの活性が減少した組換え微生物を提供する。一実施態様において、組換え微生物は、セリンフィードバック耐性serAまたはserCの強化、またはPhnC/PhnD/PhnEアルキルホスホネートABCトランスポーターphnCDEオペロン、アルカリホスファターゼphoAおよび酸ホスファターゼaphAの中から選択される少なくとも1つの欠失を示す。好ましくは、OPSの生産のための組換え微生物は、受託番号KCCM11103PまたはKCCM11212Pで寄託された微生物である。より好ましくは、OPSの生産のための組換え微生物は、受託番号KCCM11103Pで寄託された微生物である。発明の形態本発明のさらなる理解は、例示的に説明する下記の実施例を通じて得ることができるが、本発明を限定するものと理解されてはならない。<O-ホスホセリンを生産するコリネバクテリウムの作製およびこれを用いたO-ホスホセリンの生産>ホスホセリンホスファターゼserB欠損コリネバクテリウム菌株の作製コリネバクテリウムグルタミカム13032は、O-ホスホセリンからL-セリンの合成を触媒する、ホスホセリンホスファターゼをコードするserB遺伝子配列番号13、EC3.1.3.3を欠失させることにより改変した。このために、serBの不活性化のための断片が構築された。これに関連し、プライマーは、本発明の組換え菌株13032-ΔserBの作製のために設計された。第一に、コリネバクテリウムグルタミカム13032のserB配列はNIHGenBankのデータに基づいて得られ、そして、プライマー配列番号22~27はserB配列を基本として合成された。部位特異的遺伝子破壊site-specificgenedisruptionのために、コリネバクテリウムグルタミカムにおいて複製されないpDCベクターが使用された。serBのオープンリーディングフレームが内部的に破壊されたpDC-ΔserBプラスミドが構築され、そして、コリネバクテリウムグルタミカム変異菌株において部位特異的serB遺伝子欠失の生成のために採用された。pDC-ΔserBの内部的遺伝子欠失は鋳型として提供されるコリネバクテリウムグルタミカムATCC13032のゲノムDNAで、配列番号22および23、そして、配列番号24および25のプライマー対を用いて交差PCR、そして、PCR産物の、pDCベクターへの導入によって生成された。得られた組換えプラスミドにより、電気穿孔法で野生型コリネバクテリウムグルタミカムを形質転換した非特許文献20。プラスミドは、1次組換え交差によって染色体に導入され、染色体から本来のserBを切り取るための2次組換え交差がこれに続いた。2次組換えの完了後に、serBの欠失変異を含むコリネバクテリウムグルタミカム形質転換体は、遺伝子特異的プライマー配列番号26および27の対を用いた診断PCRによって分析された。組換え菌株は、CB01-0047と名付けられた。ホスホセリンホスファターゼ欠損コリネバクテリウム菌株におけるO-ホスホセリン生産能アッセイコリネバクテリウムグルタミカム13032からserBの欠失でもたらされた、O-ホスホセリンが蓄積されると予想されていた変異菌株CB01-0047は、BHISプレートに塗抹され、そして、30°Cの培養器で一晩培養された。その後に、BHISプレート上に現れたコロニーは、表1に示した25mLの力価培地に白金耳を用いて接種され、そして、その後に、30°Cで48時間、200rpmで振とうしながら培養された。結果は下記の表2にまとめられている。表1表2CB01-0047菌株は、力価培地で非常に遅く増殖することが観察された。このような増殖遅延は、L-グリシン補充物の添加にもかかわらず向上しなかった。しかし、増殖はL-セリンの存在下で増加したものの、野生型に比べて、O-ホスホセリンの生産においては若干の増加だけが観察された。結果は下記の表3にまとめられている。表3コリネバクテリウム由来の変異ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼSerA遺伝子の構築3-ホスホグリセレートから3-ホスホヒドロキシピルベートの合成を触媒する酵素である、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼのそれぞれの変異をコードするコリネバクテリウムグルタミカム由来の遺伝子serAE235K配列番号14およびserA197Δ配列番号15が構築された。変異はセリンに対してフィードバック耐性feedbackresistant、FBRであることが報告された非特許文献13、特許文献3。serAE235Kは、ATCC13032のゲノムDNAにおける配列番号28~31のプライマーを用いたソーイングPCRsewingPCRによって得られたのに対し、serA197Δは、配列番号28~32のプライマー対を用いたPCRによって構築された。こうして得られたPCR産物は、Tblunt-serAE235KおよびTblunt-serA197Δと呼ばれる組換えベクターを構築するために、それぞれのTベクターに挿入された。その後、2つのベクターは、2つの断片serAE235KおよびserA197Δを提供するために、制限酵素EcoRVおよびXbaIで処理された。これら断片は、それぞれ同じ制限酵素で消化したpECCG117-Pcj7-GFP-ターミネーターベクターに挿入された。結果的に、2つの組換えベクターpECCG117-Pcj7-serAE235K、およびpECCG117-Pcj7-serA197Δが得られた。serAを過剰発現するコリネバクテリウム菌株の作製およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例3で構築された2つのコリネバクテリウム由来のFBR-serAプラスミドは、コリネバクテリウムグルタミカムCB01-0047に導入された。O-ホスホセリン生産能を評価するために、形質転換体はBHISプレートに塗抹され、30°Cで一晩培養された。その後に、BHISプレート上に現れたコロニーは、2g/LL-セリンをさらに含む、表1に示した25mLの力価培地に白金耳を用いて接種され、そして、その後に、30°Cで48時間、200rpmで振とうしながら培養された。結果は下記の表4にまとめられている。表4コリネバクテリウム由来のFBR-serAで形質転換されたコリネバクテリウムグルタミカム菌株において、表4に示したように、0.1から0.3g/Lまでの濃度でO-ホスホセリンの蓄積が観察された。<O-ホスホセリン生産大腸菌の作製およびこれを用いたO-ホスホセリンの生産>低下したホスホセリンホスファターゼSerB活性を有する大腸菌菌株の作製大腸菌は、O-ホスホセリンからのL-セリンの合成を触媒するホスホセリンホスファターゼをコードするserB遺伝子配列番号16を欠失させることにより改変した。欠失変異体大腸菌K12はワンステップの不活性化方法非特許文献21により作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。serB欠失菌株を作製するために、まず、配列番号33と配列番号34のプライマー対とpKD3プラスミド非特許文献21GenBankNoAY048742を用いてPCR反応を行い、その結果取得したPCR産物をpKD46非特許文献21GenBankNoAY048746を含む大腸菌K12のコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す菌株を対象にPCR反応を行い、serBの欠失を確認し、pCP20非特許文献21で形質転換して抗生物質耐性マーカーを除去した。得られた変異菌株は、CA07-0012と名付けた。また、ホスホセリンホスファターゼ活性を低下させるようにserBの開始コドンを改変した。クローニングは次のような方法で実施した。開始コドンがATGで始まる野生型SerB遺伝子は、大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型としてPCRによって取得し、開始コドンがCTGで始まる変異serBは、ソーイングPCRによって取得した。野生型serB増幅のPCRは配列番号35および36のプライマー対を用い、変異serB増幅のPCRは配列番号37~38のプライマー対を用いた。PCR産物はHindIIIで処理し、pccBAC1EpicentreのHindIII制限酵素サイトにクローニングし、pccBAC1-Pself-ATG-serB、pccBAC1-Pself-CTG-serBをそれぞれ構築した。野生型および変異型serBベクターをCA07-0012に導入し、ホスホセリンホスファターゼ活性を比較した。低下したSerB活性を有する大腸菌菌株のO-ホスホセリン生産能アッセイO-ホスホセリンが蓄積されると予想されるホスホセリンホスファターゼ欠損変異菌株をLBプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレート上に現れたコロニーを、表5に示す25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で48時間培養した。その結果を下記の表6にまとめている。表5表6また、O-ホスホセリンの生産能および菌株の増殖を向上させるために、CA07-0012を表5の力価培地に1g/LL-グリシンを添加して48時間培養した。その結果を下記の表7にまとめている。表7表7に示されたように、培地にL-グリシンを添加した場合、菌株の増殖率およびO-ホスホセリンの生産能が増加した。大腸菌由来の変異ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼSerA遺伝子を保有するベクターの構築3-ホスホグリセレートから3-ホスホヒドロキシピルベートへの合成を触媒する酵素である3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ各変異体をコードする大腸菌由来の遺伝子であるserAG336V配列番号18、serAG336V、G337V配列番号19、serAG336V、R338G配列番号20を作製した。変異体は、セリンに対してフィードバック耐性FBRであることが報告された非特許文献11、非特許文献12。大腸菌の染色体への変異遺伝子の導入は、ソーイングPCRを用いて行った。下記プライマーを用いて、変異が含まれたDNA断片を作製した。配列番号39および41のプライマーはSerA遺伝子に共通に用いた。serA遺伝子に変異を導入するために、serAG336Vは配列番号42、43のプライマー対を、serAG336V、G337Vは配列番号44、45のプライマー対を、serAG336V、R338Gは配列番号46、47のプライマー対を用いてPCRを行った。この時用いたプライマーは、NIHGenBankに登録されているK12W3110遺伝子GenBankアクセッション番号AP003471および周辺塩基配列に関する情報に基づいて合成した。大腸菌由来のserA、serA、および3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼserC遺伝子のクローニングserA配列番号17、EC1.1.1.95、serC配列番号21、EC2.6.1.52、serAG336V、serAG336V、G337V、およびserAG336V、R338Gのクローニングは次のように実施した。serAおよびserCは、大腸菌W3110のゲノムDNAにおけるPCRによって取得し、serAG336V、serAG336V、G337V、およびserAG336V、R338Gは実施例7のDNA断片を鋳型としてPCRによって取得した。serAに対してはPCRプライマーは配列番号48および49であり、serCに対しては配列番号50および51であった。PCR産物は、EcoRVおよびHindIIで処理した後、pCL1920ベクターGenBankNoAB236930に大腸菌のrmfプロモーターが挿入されている組換えpCL-Prmfベクターへとクローニングし、pCL-Prmf-serA、pCL-Prmf-serC、pCL-Prmf-serAG336V、pCL-Prmf-serAG336V、G337V、およびpCL-Prmf-serAG336V、R338Vとの名称の組換えベクターをそれぞれ作製した。また、serA、3種のserA変異体のうちの1つ、および/またはserCがオペロンを形成しているプラスミドである、pCL-Prmf-serA-RBSserC、pCL-Prmf-serAG336V-RBSserC、pCL-Prmf-serAG336V、G337V-RBSserC、およびpCL-Prmf-serAG336V、R338V-RBSserCを構築した。それぞれのプラスミドは、配列番号51および配列番号52のプライマーを用いてRBSserC断片を取得した後、pCL-Prmf-serA、pCL-Prmf-serAG336V、pCL-Prmf-serAG336V、G337V、およびpCL-Prmf-serAG336V、R338VベクターのHindIII制限酵素サイトにクローニングして作製した。大腸菌由来のserA、serA、およびserC強化菌株の作製およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例8で構築された8種のプラスミドでそれぞれCA07-0012を形質転換し、得られた組換え菌種をO-ホスホセリン生産能についてアッセイした。それぞれの菌株をLBプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレートに現れたコロニーを、表8の25mLの力価培地に接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で48時間培養した。結果を下記の表9にまとめている。表8表9表9のデータから明らかなように、大腸菌CA07-0012菌株をserAで形質転換した場合、O-ホスホセリンの生産性が増加した。各3種のserA変異体のいずれかが導入された場合、O-ホスホセリンの生産能はより増加した。また、serAまたは3種のserA変異体のうちの1つとserCとが同時に活性化された菌株の場合、O-ホスホセリンの生産能は、serAまたはserA単独が活性化された場合に比べてより高かった。変異体serAおよびserCが同時に活性化された菌株では、最も高いO-ホスホセリンの生産能が検出された。PhnC/PhnD/PhnEアルキルホスホネートABCトランスポーターphnCDEオペロン欠損大腸菌菌株の作製大腸菌において、PhnC/PhnD/PhnEアルキルホスホネートABCトランスポーターは、O-ホスホセリンを細胞質内に移動させることが知られている非特許文献22。PhnC/PhnD/PhnEアルキルホスホネートABCトランスポータータンパク質をコードするphnCDEオペロンを、serBが欠失した菌株から欠失させ、CA07-0016菌株を作製した。phnCDEの欠失のために、配列番号53と配列番号54のプライマー対を用いた。欠失方法は実施例5に記述したのと同様である。さらに、実施例8で構築されたpCL-Prmf-serAG336V-RBSserCをCA07-0016菌株に導入した。phnCDEオペロン欠損大腸菌菌株のOPS生産能アッセイ実施例10で作製されたCA07-0016菌株およびCA07-0016/pCL-Prmf-serAG336V-RBSserC菌株のO-ホスホセリン生産能を評価した。それぞれの菌株をLBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに現れたコロニーを、表8の25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で48時間培養した。結果を下記の表10にまとめている。表10表10に示したように、phnCDEオペロンが欠失した菌株の場合、OPSの生産性がわずかに増加した。アルカリホスファターゼphoA、酸ホスファターゼaphA欠損大腸菌菌株の作製ホスホセリンホスファターゼが欠損した菌株において、アルカリホスファターゼをコードするphoA遺伝子および酸ホスファターゼをコードするaphAをさらに欠損させた。phoA遺伝子を欠失させるためのDNA断片は、配列番号55および配列番号56のプライマー対を用いてpkD3プラスミドにおいてPCRを行うことにより取得し、aphA遺伝子を欠失させるためのDNA断片は、配列番号57および配列番号58のプライマー対を用いて前記と同様の方法で取得した。各欠失菌株を作製するための方法は実施例5に記述したのと同様である。phoAとaphAが両方とも欠失した菌株は、pKD46で再度形質転換したphoA欠失菌株のコンピテント細胞に、aphAを欠失させるためのDNA断片をエレクトロポレーションで導入することにより作成した。したがって、クロラムフェニコール耐性を示す細胞株を対象にPCR反応を行い、aphAの欠失を確認し、pCP20で形質転換して抗生物質耐性マーカーを除去した。得られた変異菌株およびその遺伝子型を下記の表11にまとめている。表11実施例8で構築されたpCL-Prmf-serAG336V-RBSserCを、実施例10と同様の方法で各欠失菌株に導入した。アルカリホスファターゼphoA、酸ホスファターゼaphA欠損大腸菌菌株のO-ホスホセリン分解能アッセイ実施例12で作製された菌株を用いてOPS生産能およびOPS分解不能度をアッセイした。それぞれの菌株をLBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに現れたコロニーを、表8の25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で72時間培養した。結果を下記の表12にまとめている。OPS分解不能度は、リン酸イオン分析により決定されるリン酸イオンレベルの変化によって評価した。表12表12に示されたように、aphA欠失菌株は、異常な増殖現象を示したが、phoAが欠失した菌株またはphoAおよびaphAの両方が欠失した菌株は、O-ホスホセリンの生産能がやや増加し、O-ホスホセリンの分解能が減少した。一方、phoAもaphAも欠失していない菌株では、72時間で、蓄積したO-ホスホセリンを、PO4レベルの増加を伴って分解した。phnCDEオペロン、phoA、およびaphA欠損菌株の作製serB欠損菌株CA07-0012は、phnC/phnD/phnEアルキルホスホネートABCトランスポーターをコードするphnCDE、アルカリホスファターゼをコードするphoA、および酸ホスファターゼをコードするaphAをさらに欠失させるように改変した。作製された菌株を下記の表13に提示する。実施例5に記述したワンステップの不活性化方法を利用して欠失変異体を作製した。表13実施例8で構築されたpCL-Prmf-serAG336V-RBSserCを、実施例10と同様の方法でそれぞれの欠損菌株に導入した。phnCDEオペロン、phoA、およびaphA欠損大腸菌菌株のO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例14で作製された菌株を用いてOPS生産能をアッセイした。それぞれの菌株をLBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに現れたコロニーを、表8の25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で72時間培養した。結果を下記の表14にまとめている。表14CA07-0020およびCA07-0022は、CA07-0012と比較して、OPS生産能が増加し、O-ホスホセリン分解能が減少したことが見出された。この特性は、pCL-Prmf-serAG336V-RBSserCにより追加的に形質転換した菌株でも検出された。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換serAを有する、phnCDEオペロン、phoA、およびaphA遺伝子欠損大腸菌変異体の作製CA07-0022において、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードするserAを、セリンに対してフィードバック耐性であることが報告されたserAG336V、serAG336V、G337V、またはserAG336V、R338Gで染色体上で下記のように置換した。serA遺伝子に各変異を導入するために、次のようにベクターを構築した。実施例7で作製されたserAG336V、serAG336V、G337V、およびserAG336V、R338Gにおいて配列番号40および配列番号41のプライマー対を用いてPCRを行った。PCR産物をSacIおよびBamHIで処理した後、pSG76CベクターのSacI、BamHIサイトにクローニングした。得られた組換えベクターで大腸菌BWを形質転換した後、LBプレートに塗抹した。プレートに現れたコロニーを塩基配列分析に供し、変異が導入された形質転換体を選択した。そこから、通常のプラスミドミニプレップ法を利用してプラスミドを取得した。得られたプラスミドは、導入された変異に応じてpSG76C-serAG336V、pSG76C-serAG336V、G337VおよびpSG76C-serAG336V、R338Gと名付けた。各大腸菌変異体は、文献に提示された方法非特許文献23によって作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。特に、serAG336V変異体を作製するために、pSG76C-serAG336VをCA07-0022のコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す菌株を対象にPCR反応を行い、serAG336V導入を確認した。菌種はpST76-ASceP非特許文献23で形質転換して抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。得られた菌株は、CA07-0022serAG336Vと名付けた。CA07-0022serAG336V菌株は、serAG336V、G337VおよびserAG336V、R338Gを得るためにpSG76C-serAG336V、G337VおよびpSG76C-serAG336V、R338Gで前記と同様の方法で形質転換し、それぞれCA07-0022serAG336V、G337VおよびCA07-0022serAG336V、R338Gと名付けた。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換serAを有する、phnCDEオペロン、aphA、およびaphA遺伝子欠損大腸菌変異体のO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例16で作製された菌株をO-ホスホセリン生産能についてアッセイした。それぞれの菌株をLBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに塗抹した後、33°Cの培養器で一晩培養した。LBプレートまたはLBスペクチノマイシンプレートに現れたコロニーを、表8の25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で48時間培養した。結果を下記の表15にまとめている。表15serAが、セリンに対してフィードバック耐性である遺伝子に変更された菌株は、増殖速度のいくらかの減少を示したが、O-ホスホセリン生産能の増加を示した。ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ置換serAを有し、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼが強化された、phnCDEオペロン、phoA、およびaphA欠損大腸菌菌株の作製およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例16で作製された菌株であるCA07-0022serAG336V、CA07-0022serAG336V、G337V、CA07-0022serAG336V、R338Gに、実施例8で作製されたpCL-Prmf-serCプラスミドをそれぞれ導入した。得られた変異体は、実施例9と同様の方法でO-ホスホセリン生産能を評価した。結果を下記の表16にまとめている。表16表16に示されたように、serCが活性化された菌株でO-ホスホセリンの生産能が向上したことが分かる。また、この現象は、serAが、セリンに対してフィードバック耐性である遺伝子に変更された菌株において、さらに明らかであった。ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼPntAB強化菌株の作製およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼGdhA含有ベクターの構築ピリミジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするpntABが上方制御された菌株を作製するために、pntABプロモーターを、変異体loxPシステム非特許文献24を用いてtrcプロモーターに交換した。ここでは、配列番号59と配列番号60のプライマー対とpmlox-trcrefプラスミドとを用いてPCR反応を行い、その結果得られたPCR産物を、pKD46を含むCA07-0022serAG336Vのコンピテント細胞にエレクトロポレーションで導入した。その後、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を対象にPCR反応を行い、プロモーターの置換を確認した後、pJW168非特許文献25で形質転換して抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。得られた菌株は、CA07-0022serAG336VPtrc-pntABと名付けた。このPCRに用いたプライマーは、NIHGenBankに登録されているK12W3110遺伝子GenBankアクセッション番号AP002223、AP002224および周辺塩基配列に関する情報に基づいて設計した。グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするgdhA遺伝子は、配列番号61と配列番号62のプライマー対を用いてPCR法によって増幅した。配列番号61および配列番号62のプライマーは、制限酵素サイトHindIIIを有している。これらのプライマーは、NIHGenBankに登録されているK12W3110遺伝子GenBankアクセッション番号AP002380および周辺塩基配列に関する情報に基づいて設計した。PCR法は、94°Cで3分間変性後、94°C30秒変性、56°C30秒アニーリング、72°C2分伸長を25回繰り返した後、72°Cで7分間伸長反応を行った。その結果、1714bp長のポリヌクレオチドを得た。PCR産物をHindIIIで処理した後、pCC1BACのHindIIIサイトにクローニングし、これを大腸菌DH5αに導入した後、LBプレートに塗抹した。得られたコロニーの塩基配列分析によって変異のないgdhAが導入されたコロニーを選択した後、通常のプラスミドミニプレップ法を用いてプラスミドを単離し、pCC1BAC-Pネイティブ-gdhAと名付けた。OPS生産菌株へのpntABおよびgdhAの導入およびOPS生産能アッセイpntABおよびgdhAが上方制御されたOPS生産菌株を作製するために、下記表のように、CA07-0022serAG336V菌株またはCA07-0022serAG336VPtrc-pntAB菌株を、pCL-Ptrc-serAG336V-serCおよびpCC1BAC-Pネイティブ-gdhAを個々にまたは組み合わせによって形質転換した。各形質転換体を33°Cの培養器でLBプレートで一晩培養した。コロニーを、表8の25mLの力価培地に1白金耳ずつ接種した後、これを33°C、200rpmで振とうしながら培養器で48時間培養した。表17表17に示されたように、pntABが上方制御された場合、菌株は、O-ホスホセリンの生産能が向上した。pntABとgdhAの両方が上方制御された場合、対照群に比べてO-ホスホセリンの生産能がさらに増加した。したがって、pntABおよびgdhAは、OPSの生産に重要な役割を果たすことが分かる。大腸菌O-アセチルセリン/システイン排出タンパク質ydeD、O-アセチルセリン/システイン排出パーミアーゼyfiK、ホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質rhtB、トレオニン/ホモセリン排出タンパク質rhtC、亜ヒ酸/アンチモナイトトランスポーターasrB、およびロイシン/イソロイシン/バリン輸送サブユニットlivHMをコードする遺伝子を保有するベクターの構築生成されたO-ホスホセリンが細胞外に放出されるためには、適切な排出因子が必要であるが、文献に報告されていない。そこで、本発明者らは、既に報告された多様なトランスポーター遺伝子の中から、O-アセチルセリン/システイン排出タンパク質をコードするydeD、O-アセチルセリン/システイン排出パーミアーゼをコードするyfiK非特許文献26、ホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質をコードするrhtB、トレオニン/ホモセリン排出タンパク質をコードするRhtC、亜ヒ酸/アンチモナイトトランスポーターをコードするasrB、ロイシン/イソロイシン/バリン輸送サブユニットをコードするlivHMの6種の遺伝子を選択し、クローニングして、評価した。それぞれの遺伝子は、大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより得た。ydeDには配列番号63および配列番号64、yfiKには配列番号65および配列番号66、rhtBには配列番号67および配列番号68、rhtCには配列番号69および配列番号70、asrBには配列番号71および配列番号72、livHMには配列番号73および配列番号74のプライマー対を用いた。各PCR産物をEcoRVおよびHindIIIで処理した後、pCL-Prmf-GFPのEcoRVおよびHindIII制限酵素サイトにクローニングして組換えベクターを得、pCL-Prmf-ydeD、pCL-Prmf-yfiK、pCL-Prmf-rhtB、pCL-Prmf-rhtC、pCL-Prmf-arsB、およびpCL-Prmf-livHMと名付けた。大腸菌YdeD、YfiK、RhtB、RhtC、AsrB、livHMコード遺伝子を保有するベクターの、O-ホスホセリン生産菌株への導入およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例21で構築された6種のプラスミドで、CA07-0022serAG336V菌株を形質転換し、実施例9と同様の方法でO-ホスホセリンの生産能を評価した。結果を下記の表18に提示する。表18表18に示されたとおり、ydeD、mdtG、またはlivHMで形質転換された菌株は、増殖速度の低下およびOPS生産能の低下を示したが、yfiK、rhtB、またはrhtC遺伝子で形質転換された菌株は、増殖速度およびOPS生成能が増加した表18。ホスホグリセリン酸ムターゼgpmI、gpmA、およびgpmB欠損菌株の作製CA07-0022serAG336Vから、ホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子であるgpmI、gpmA、およびgpmBを単独または組み合わせで欠失させ、それぞれ、CA07-0022serAG336VΔgpmI、CA07-0022serAG336VΔgpmA、CA07-0022serAG336VΔgpmB、CA07-0022serAG336VΔgpmIΔgpmA、CA07-0022serAG336VΔgpmAΔgpmB、およびCA07-0022serAG336VΔgpmIΔgpmAΔgpmB菌株を作製した。gpmA欠失菌株およびgpmB欠失菌株の作製方法は実施例5に記述したとおりであり、gpmAには配列番号75および配列番号76のプライマー対を、gpmBには配列番号81および配列番号82のプライマー対を用いた。gpmI欠失菌株の作製方法は、実施例16に記述したように、pSG76Cベクターを用いて終止コドンを含むgpmI変異を導入する方法を利用した。終止コドンを含むgpmI変異体は、K12W3110のゲノムDNAを鋳型として配列番号77~81のプライマーを用いてsewingPCRにより増幅し、pSG76のSacI/BamHIサイトにクローニングした。gpmI、gpmA、およびgpmB欠損菌株のOPS生産能アッセイ実施例23で作製された菌株を、実施例9で記述したのと同様の方法でOPSの生産能を評価した。結果を下記の表19にまとめている。表19表19に示されたとおり、gpmI、gpmA、およびgpmBのそれぞれを欠失させて他を欠失させなかった場合、母株と比較して変異菌株の糖消費は低下するが、OPS生産能は増加した。特に、gpmAとgpmBの両方を欠失させた菌株は、gpmAまたはgpmBのいずれかを欠失させた菌株と比べて、糖消費はほぼ同等であったが、OPS生産能が増加した。したがって、gpmI、gpmA、およびgpmBの欠失は、OPSの前駆物質である3-ホスホグリセレートの量を増加させ、したがってOPS生産を増加させることが分かった。2-アミノ-3-ケトブチレートCoAリガーゼkbl、L-セリンデアミナーゼIsdaA欠損菌株の作製CA07-0022serAG336Vから、2-アミノ-3-ケトブチレートCoAリガーゼをコードするkbl遺伝子、およびL-セリンデアミナーゼIをコードするsdaA遺伝子を欠失させ、それぞれ、CA07-0022serAG336VΔkbl、およびCA07-0022serAG336VΔsdaA菌株を得た。kbl欠失菌株およびsdaA欠失菌株の作製方法は実施例5に記述したとおりであり、kblには配列番号83と配列番号84のプライマー対を、sdaAには配列番号85と配列番号86のプライマー対を用いた。グリシン濃度よる、kbl/sdaA欠損菌株のODおよび糖消費アッセイ実施例25で作製された菌株を、グリシンを0~2.5g/Lの量で使用した以外は実施例9の表8に記述されたのと同じ培地条件で培養した場合の、OD、糖消費、およびO-ホスホセリン生産能について評価した。表20表20に示されたように、3種の菌株はいずれも培地内のグリシンレベルを増加させた場合にODおよび糖消費速度が増加した。特に、sdaA欠失菌株は、1g/Lのグリシン濃度でODおよび糖消費速度の顕著な増加を示した。また、kbl欠失菌株のOPS生産能は、2.5g/Lのグリシンの存在下、大きく向上した。iclR欠損菌株の作製CA07-0022serAG336Vから、転写因子のiclRを欠失させ、CA07-0022serAG336VΔiclR菌株を作製した。欠失変異菌株は、実施例5の方法と同様に、ワンステップの不活性化方法によって作製し、抗生物質耐性マーカー遺伝子を除去した。iclR欠失菌株の作製には、配列番号87と配列番号88のプライマー対を用いた。iclR欠損菌株のOPS生産能アッセイ実施例27で作製された菌株を、実施例9で記述したのと同様の方法でOPSの生産能を評価した。表21表21のデータから明らかなように、iclR欠失菌株のOPS生産能が増加したことが分かった。大腸菌アセチルCoAシンテターゼacs、ピルビン酸オキシダーゼモノマーpoxB、酢酸キナーゼackA、およびリン酸アセチルトランスフェラーゼptaを保有するベクターの構築O-ホスホセリン生産菌株においてアセテートの生成および再利用を増加させるために、アセチルCoAシンテターゼをコードするacs、ピルビン酸オキシダーゼモノマーをコードするpoxB、酢酸キナーゼをコードするackA、およびリン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするptsをそれぞれ保有する発現プラスミドを構築した。それぞれの遺伝子は、大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型としてpfuPCRを行うことにより取得した。acsには配列番号89および配列番号90、poxBには配列番号91および配列番号92、ackAおよびptaには配列番号93および配列番号94のプライマー対を用いた。得られた各PCR産物はHindIIIで処理した後、pCL1920に大腸菌rmfプロモーターを挿入して構築したpCL-Prmf-GFPベクターのEcoRVおよびHindIII制限酵素サイトにクローニングし、pCL-Prmf-acs、pCL-Prmf-poxB、およびpCL-Prmf-ackA-ptaを得た。その後、これらのプラスミドをEcoRIで処理し、Prmf-acs、Prmf-poxB、およびPrmf-ackA-ptaのDNA挿入断片を取得した後、pCC1BACEcoRICopyControlTMpcc1BACTMVector、Epicentre.Cat.Nos.CBAC311に導入し、それぞれ、pCC1BAC-Prmf-acs、pCC1BAC-Prmf-poxB、およびpCC1BAC-Prmf-ackA-ptaを構築した。大腸菌acs、poxB、ackA、pta強化OPS生産菌株の作製およびOPS生産能アッセイ実施例29で作製された3種のベクターでCA07-0022serAG336V菌株を形質転換し、実施例9と同様の方法でOPS生産能をアッセイした。表22表22に示されたように、poxBで形質転換された菌株の増殖速度は減少したが、acsまたはackA-ptaが導入された菌株は増殖速度およびOPS生産能が増加した。大腸菌リンゴ酸シンターゼAaceB、イソクエン酸リアーゼモノマーaceA、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼpckA、リンゴ酸シンターゼGglcB、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼmaeBを保有するベクターの構築リンゴ酸シンターゼAをコードするaceB遺伝子、およびイソクエン酸リアーゼモノマーをコードするaceA遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするpckA遺伝子、リンゴ酸シンターゼGをコードするglcB遺伝子、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするmaeB遺伝子をそれぞれ大腸菌で発現できるプラスミドを構築した。それぞれの遺伝子は、大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型としてpfuPCRを行うことにより取得した。aceBAには配列番号95および配列番号96、pckAには配列番号97および配列番号98、glcBには配列番号99および配列番号100、maeBには配列番号101および配列番号102のプライマー対を用いた。得られた各PCR産物はHindIIIで処理した後、pCL1920に大腸菌rmfプロモーターを挿入して構築したpCL-Prmf-GFPベクターのEcoRVおよびHindIII制限酵素サイトにクローニングし、pCL-Prmf-aceBA、pCL-Prmf-pckA、pCL-Prmf-glcB、およびpCL-Prmf-maeBを得た。大腸菌aceB、aceA、pckA、glcB、およびmaeB強化OPS生産菌株の作製およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例31で作製された4種のプラスミドでCA07-0022serAG336V菌株を形質転換し、実施例9と同様の方法でO-ホスホセリン生産能をアッセイした。表23表23に示されたように、aceBAで形質転換された菌株の場合、糖消費速度およびOPS生産能はやや減少し、pckAで形質転換された菌株の場合、増殖速度が顕著に低下した。glcBまたはmaeBが導入された菌株の場合、OPSの生産能は増加した。グリオキシル酸カルボリガーゼglc、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ2glxR、およびグリセリン酸キナーゼIIglxKを保有するベクターの構築グリオキシレートから3-ホスホグリセレートへの変換に関与する、グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするgcl、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ2をコードするglxR、およびグリセリン酸キナーゼIIをコードするglxKを下記のようにクローニングした。大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型とし、gclには配列番号103および104のプライマー対を、glxR-glxKには配列番号105~108のプライマー対を用いてPCRによって取得した。各PCR産物はEcoRVおよびHindIIIで消化した後、pCL1920に大腸菌rmfプロモーターを挿入して構築したpCL-Prmf-GFPベクターのEcoRVおよびHindIII制限酵素サイトにクローニングし、pCL-Prmf-gcl、pCL-Prmf-glxR-glxK、およびpCL-Prmf-glxR-glxK-Prmf-gclの組換えベクターを得た。glc、glxR、glxKを保有するベクターの、O-ホスホセリン生産菌株への導入およびO-ホスホセリン生産能アッセイ実施例33で構築された3種のプラスミドをCA07-0022serAG336Vに導入し、実施例9と同様の方法でO-ホスホセリンの生産能を評価した。その結果を下記の表24にまとめている。表24表24に示されたように、CA07-0022serAG336V菌株自体と比較して、gcl、glxR-glxK、およびglxR-glxK-gclでそれぞれ形質転換された菌株は、最終O-ホスホセリン生産能が減少したが、増殖速度および糖消費速度が増加した。特に、glxR-glxKが導入された菌株は増殖速度および糖消費速度が最も大きく増加した。O-ホスホセリン生産菌株の発酵槽での評価CA07-0022serAG336V/pCL-Prmf-serAG336V-serC菌株を、50μg/mLのスペクチノマイシンを含むMMYE寒天プレート2g/Lのグルコース、2mMの硫酸マグネシウム、0.1mMの塩化カルシウム、6g/Lのピロリン酸ナトリウム、0.5g/Lの塩化ナトリウム、3g/Lのリン酸二水素カリウム、10g/Lの酵母抽出物、18g/Lの寒天上で33°C、24時間培養した。得られたコロニーを各寒天プレートの領域の1/10から掻き取り、バッフルbaffleフラスコ中、50μg/mLのスペクチノマイシンを含む種培養培地10g/Lのグルコース、0.5g/Lの硫酸マグネシウム、3g/Lのリン酸二水素カリウム、10g/Lの酵母抽出物、0.5g/Lの塩化ナトリウム、1.5g/Lの塩化アンモニウム、12.8g/Lのピロリン酸ナトリウム、1g/Lのグリシンに接種して、30°Cで6時間200rpmで振とうしながら培養した。得られた種培養培地は、300mlの本培養培地で満たされた1Lの発酵槽に対して、本培養培地の容積の16に対応する量で接種し、培養を33°CでpH7.0で行った。本培養培地の組成は下記の表25に示した。表25培養中、培養培地にアンモニア水を添加してpH7.0に調整した。培養培地中のグルコースが枯渇したら、520g/Lのグルコース水溶液を添加して流加式発酵を行った。80時間の発酵後、HPLCで測定した結果、19.5g/LのO-ホスホセリンが生産された。<O-ホスホセリンOPSスルフヒドリラーゼOPSSの開発および特徴付け>OPSスルフヒドリラーゼOPSSの開発アエロピュルムペルニクス、マイコバクテリウムツベルクローシス、およびトリコモナスバギナリスでは、システイン合成の基質として、大腸菌におけるO-アセチルセリンOASとは異なりO-ホスホ-L-セリンOPSを用いる酵素であるO-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSを有すると報告されている非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9。前記文献の報告に基づき、本発明者らは、OPSをシステインへと変換する計2種のOPSスルフヒドリラーゼをアエロピュルムペルニクスおよびマイコバクテリウムツベルクローシスH37Rvから得た。前記2種の酵素のうち、マイコバクテリウムツベルクローシスH37Rv由来のOPSS酵素をアミノ酸相同性検索に用いた。その結果、マイコバクテリウムスメグマチスMC2155株、ロドコッカスジョスティRhodococcusjostiiRHA1、およびノカルジアファルシニカNocardiafarcinicaIFM10152由来の3種のOPSS酵素を確保した。それぞれの菌株からOPSSを取得するために、通常、酵素発現のために用いられるpET28aNovagenベクターシステムを構築した。5種の異なるOPSスルフヒドリラーゼ遺伝子のクローニングに用いた各鋳型およびプライマー、ならびに得られた組換えプラスミドは下記の表26にまとめている。表26に示した鋳型およびプライマーの適切な組み合わせを用いてPCR手法によってそれぞれのOPSS遺伝子を増幅した。PCR産物と、pET28aベクターとを、NdeIおよびHindIIIで消化37°C、3時間反応した。各遺伝子断片を、消化したpET28aベクターNovagenにライゲーションした。各OPSS遺伝子を保有する発現ベクターの構築は、塩基のシーケンシングにより確認した。酵素発現ベクターを大腸菌DE3に導入し、5種のOPSS酵素を発現できる菌株を作製した。酵素名は下記の表26に示している。表26酵素の発現は、pETシステム製造者の指示書Novagenに従って行った。平板LB培地からの各菌株の単一コロニーを、5mLのLBブロスに接種し、200rpmで振とうしながら37°Cで16時間培養した。この培養物を、新たな25mLのLBブロス250mL容量のフラスコに移し、OD600が0.5~0.6となるまで2~3時間同じ培養条件で培養し、その直後に1mMIPTGを培地に添加して、120rpmで振とうしながら18°Cで18時間培養して酵素の発現を誘導した。酵素は、HisSpintrapGEHealthcare社を用いてHis-tagについてNi-NTAカラムで精製した。14SDS-PAGE電気泳動で分析したところ、単離された5種のOPSS酵素のうち、1種Rjo-OPSSが封入体inclusionbodyで、4種が可溶性の形態で見出された。OPSスルフヒドリラーゼOPSSのシステイン合成活性アッセイO-ホスホセリンOPSからシステインへの合成を触媒する能力について、4種の微生物菌種から得たOPSスルフヒドリラーゼをアッセイした。アッセイ条件および方法cysM酵素アッセイについては、以前の文献の報告非特許文献7、非特許文献8、非特許文献9を参照した。用いた基質の量はmL単位で表す。酵素活性のアッセイ条件は下記の表27にまとめている。表27酵素以外の反応液を37°Cで5分間インキュベートし、その後、その反応液に精製OPSスルフヒドリラーゼ50mgを添加した。37°Cでインキュベートする間、所定の時間で酵素反応液100mLを取り出し、33.2TCA100mlと混合して反応を停止させた。酵素反応液中のシステイン濃度は、Gaitonde法で吸光度OD560を測定して定量した。下記表28では、4種の異なるOPSスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性をまとめている。OPSS酵素のシステイン変換力価を、反応時間でのシステイン変換率として表す。表28以前に報告非特許文献7、非特許文献9されたアエロピュルムペルニクスおよびマイコバクテリウムツベルクローシスH37Rvに由来するOPSスルフヒドリラーゼが、OPSを基質として用いてシステインを合成する活性を有していることを確認した。Mtb-OPSS酵素によるアミノ酸相同性検索によって得た新規マイコバクテリウムスメグマチスMC2155株由来のOPSスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性を初めて見出した。表28のデータから分かるように、Ape-OPSSは、1時間でOPSからシステインへの変換率が100近くに達した。以前に報告されたマイコバクテリウムツベルクローシスH37Rv由来のOPSSに基づいて酵素スクリーニング手法を通じて新たに選択されたMsm-OPSS酵素の最終変換率は43.7であり、Mtb-OPSSと比べて4.3倍高かった。一方、相同性検索によって得られた新規ノカルジアファルシニカIFM10152由来のOPSスルフヒドリラーゼは、O-ホスホセリンをシステインに変換する活性は不十分であった。C末端の5個のアミノ酸残基が切断されたMtb-OPSSおよびMsm-OPSSをコードするMtb-TおよびMsm-Tの作製マイコバクテリウムツベルクローシスH37Rv由来のOPSSMtb-OPSSは追加的な酵素であるmecおよびcysOの助けによりOPSからシステインへの変換を触媒するが、C末端の5個のアミノ酸が除去された場合、このような追加的な酵素の非存在下でさえ、S2-を有する硫黄源を用いてOPSをシステインに変換させることができると報告されている非特許文献6。前記文献の報告に基づいて、硫黄源としてS2-の存在下、OPSを迅速に変換することができるMtb-T配列番号11を得た。また、Mtb-OPSSとアミノ酸相同性を示すMsm-OPSS配列番号9から、Msm-Tをさらに得た。2種の酵素変異体を保有する発現ベクターを構築した。ここでは、マイコバクテリウムツベルクローシスH37RvおよびマイコバクテリウムスメグマチスのゲノムDNAを鋳型として、配列番号119、配列番号120、配列番号121、および配列番号122のプライマー対の存在下、pfuPCRを行った。得られたOPSS遺伝子断片はNdeIおよびHindIIIで処理し、同じ制限酵素で消化されたpET28aベクターにクローニングして、組換え発現ベクターpET28a-Mtb-TおよびpET28a-Msm-Tをそれぞれ構築した。この組換え発現ベクターを、大腸菌DE3に導入した。2種の変異OPSS酵素の発現は、14SDSPAGEによって確認した。この2種の変異OPSS酵素の発現および精製は、前記実施例36と同様の条件で行った。その結果、Mtb-T配列番号11およびMsm-T配列番号10を得た。Mtb-TおよびMsm-Tのシステイン変換活性アッセイC末端の5個のアミノ酸残基が欠失しているマイコバクテリウムツベルクローシスH37Rv由来OPSS変異体が、補助的な酵素の非存在下でさえ、S2-基を含有する硫黄源に対する増加した親和性を示すという報告非特許文献6に基づいて、Mtb-TおよびMsm-Tを得た。これらは、最終システイン変換率を測定して酵素活性を評価した。酵素活性は、実施例37と同じ条件および方法でアッセイした。生成されたシステインはGaitonde法で定量した。表29表29に示したように、マイコバクテリウムスメグマチスMC2155株由来OPSSのC末端の5個のアミノ酸残基が欠失しているMsm-Tは、1時間で100の率で基質からシステインへの変換が可能であった。O-ホスホセリンスルフヒドリラーゼOPSSは、そのアミノ酸配列が改変された場合、より効率的にL-システインの整合性を触媒することができる。OPSスルフヒドリラーゼ活性のための補助因子cofactorの要求性OPSSのシステイン変換に対する補助因子の影響を調べるために、PLPピリドキサール-5-リン酸およびDTTジチオスレイトールの存在下または非存在下においてMsm-Tのシステイン変換率を測定した。ここでは、50mMOPSブロスおよび100mMNa2Sを基質として25mMDTTまたは0.2mMPLPの存在下で、37°Cで30分間反応させた。生成されたシステインはGaitonde法で定量した。表30から分かるように、PLPとDTTの両方が存在しない場合と比べて、PLPとDTTの両方が存在する場合は、システイン変換率が2.3倍高かった。つまり、PLPとDTTの両方が、変換に対して正の影響を有することが観察された。表30OPSスルフヒドリラーゼ活性に対する温度の影響Ape-OPSSおよびMsm-Tの、温度によるシステイン変換率を調べた。37°Cおよび60°Cでの酵素活性を、反応2、5、10、30、および60分後に測定した。反応は100mMHepespH7.4、5mMOPS、10mMNa2S、0.2mMPLP、および50μg/mlCysMの条件で行った。生成されたシステインの量はGaitonde法で決定した。緩衝液のこの条件では、図2から分かるように、Ape-OPSSが37°Cで最も速い初期反応速度を示しただけでなく、60°CでMsm-Tよりも高い反応性を示した。OPSスルフヒドリラーゼの熱安定性Ape-OPSSおよびMsm-Tの熱安定性を分析した。酵素をそれぞれOPSブロスで2mg/mLの濃度に希釈し、37°Cおよび60°Cで10、30、60、120、および240分間熱処理した。その後、5mMOPS、10mMNa2S、0.2mMPLP、100mMHEPESpH7.4の条件で37°Cで30分間反応させた。この反応では、10μg/mlApe-OPSSおよび50μg/mlMsm-Tを用いた。生成されたシステインの量はGaitonde法で測定した。Ape-OPSSは、60°Cで4時間熱処理したにもかかわらず、そのインタクトな活性を維持していることが観察されたが、Msm-Tは、37°Cでは活性を維持したものの、60°Cで30分間の熱処理では、50活性が減少した。この結果を下記の表31に示す。表31また、OPSブロス中の実際の濃度である50μg/mLでMsm-Tを使用した場合の、37°Cで維持される酵素活性について調べた。Na2Sの非存在下、50μg/mLのMsm-Tを、50mMのOPSブロスおよび0.2mMPLPとともに37°Cで0.5、1、2、4、および6時間処理した。その後、Na2Sを添加して酵素反応を誘導した。30分間の反応後、Msm-Tの活性を測定した。生成されたシステインの量はGaitonde法で決定した。その結果、Msm-Tの活性は、OPSブロス中37°Cで2時間の反応後、50を下回るまで減少した表32。表32OPSスルフヒドリラーゼに対するpHの影響Ape-OPSSおよびMsm-Tの、pHによるシステイン変換率を調べた。100mMバッファーにおいて、それぞれ50μg/mLの濃度を有するApe-OPSSおよびMsm-Tを、37°Cで10分間反応に供した。ここでは、pH6.4/7.0/7.4/8.0のリン酸カリウムバッファー、pH7.0/7.4/8.0/8.5/8.8のTris-HClバッファー、pH8.0/8.5/9.0/10.0の炭酸ナトリウムバッファーを使用した。生成されたシステインの定量はGaitonde法で行った。図3に示されたように、Msm-Tは、バッファーに関係なくpH8.0~9.0の間で最も高い活性を示した。Ape-OPSSの場合、最も高い活性はリン酸カリウムpH7.4で検出され、バッファーごとに最適なpHは異なっていた。OPSスルフヒドリラーゼ活性に対するイオンの影響OPSS酵素活性に対するイオンの影響を下記のように調べた。5mMOPS、10mMNa2S、0.2mMPLP、および100mMHEPESpH7.4を含む反応混合液において、酵素を、NH42SO4[1、3、5、10、20g/L]、KH2PO4[0.5、1、2、4、8g/L]、またはNH4Cl[0.2、0.5、1、2g/L]の存在下、37°Cで30分間の反応に供した。Ape-OPSSおよびMsm-Tはそれぞれ、10μg/mLおよび50μg/mLの濃度で使用した。生成されたシステインの量はGaitonde法で決定した。反応混合液にNH42SO4またはKH2PO4を添加した場合、システイン変換率に変化はなかった。一方、下記表33から明らかなように、NH4Cl濃度が増加するにつれて、システイン変換率が減少した。特に、2g/LのNH4Clが添加された場合、最大酵素活性が70超減少した。つまり、NH4Clは、OPSスルフヒドリラーゼの変換活性に対して負の影響を有することが観察された。表33OPSスルフヒドリラーゼのシステイン合成活性に対する硫黄源の影響各酵素のシステイン合成活性に対する硫黄源の影響を調べるために実験を行った。各酵素50μg/mLApe-OPSS、50μg/mLMsm-Tを、5mMOPS、0.2mMPLP、および100mMHEPESを含む反応混合液中、10mMNa2S、NaSH、またはNa2S2O3の存在下、37°Cで1時間の反応に供した。生成されたシステインの量はGaitonde法で測定した。Ape-OPSSは、硫黄源としてNa2S2O3を選び、Msm-TはNa2Sを選ぶことが観察された。結果を下記の表34にまとめている。表34OPSスルフヒドリラーゼを保有する発現ベクターpCL-Pcj1システムの構築および大腸菌における発現pET28a-Msm-Tベクターを鋳型とし、配列番号123および124のプライマーを用いてPCRを行った。得られたPCR産物をEcoRVおよびHindIIIで処理し、pCL-PCJ1にクローニングして、組換えベクターpCL-PCJ1-Msm-Tを構築した。pETシステムとpCL-Pcj1システムとでMsm-Tの発現レベルの差を調べるために、酵素発現のための菌株を作製した。pETシステムはRosettaDE3に導入し、pCL-Pcj1システムはK12G菌株を用いた。酵素発現のために、LBプレートから得た単一コロニーを、5mLのLBブロスに接種し、200rpmで振とうしながら37°Cで16時間培養した。この培養物を、カナマイシンまたはスペクチノマイシンと0.2グルコースとを含む新たな25mLのLBブロス250mL容量のフラスコに移し、OD600が0.5~0.6となるまで培養した。その後直ちに、1mMのIPTGを培地に添加して酵素の発現を誘導した。200rpmで振とうしながら37°Cで培養する間、様々な培養時間8、16、24時間で酵素の発現レベルを測定した。2つのシステムでの酵素発現レベルは、14SDSPAGEで分析した図4。精製OPS発酵ブロスを用いた、OPSスルフヒドリラーゼによるシステイン合成Msm-TおよびApe-OPSSの、精製OPSからのシステイン変換率を調べた。OPS発酵ブロスから精製した60mMのOPSを、120mMNa2Sとともに、75μg/mLの各酵素および0.2mMのPLPの存在下、37°Cまたは70°Cで30、60、90、および120分間反応させた。Msm-Tは37°Cでのみ、Ape-OPSSは37°Cと70°Cの両方で反応を行った。生成されたシステインの量はGaitonde法で測定した。図5から明らかなように、精製OPS発酵ブロスは、システインへの酵素変換の基質として十分に役に立った。特に、精製OPS発酵ブロスを使用した際、70°Cでさえ、Ape-OPSSの変換率は増加した。OPS発酵ブロスを用いた、OPSスルフヒドリラーゼによるシステイン合成OPS発酵ブロスを基質として用いた場合の、酵素の濃度によるMsm-TおよびApe-OPSSのシステイン変換率を測定した。50mMのOPS発酵ブロスを、100mMNa2Sおよび0.2mMPLPの存在下、5μg/mLまたは50μg/mLの各Msm-TおよびApe-OPSSとともに37°Cで反応させた。生成されたシステインの量はGaitonde法で測定した。図6から明らかなように、50μg/mLのMsm-Tにおいて最も高い変換率が検出された。加えて、OPS発酵ブロスを基質として使用した際、Msm-Tの活性はApe-OPSSの活性よりも高かった。OPS濃度によるシステイン変換率Msm-Tの変換率に対するOPS濃度の影響を調べるために、それぞれOPS発酵ブロスに所定量の精製OPSを添加して変換反応を誘導した。酵素は50μgの量で使用した。反応液中のシステインの量はGaitonde法で測定した。Msm-Tは、OPSの濃度が約30g/Lの時に100もの高い変換率を示した。OPSの濃度が50g/Lを超えると、変換速度と変換率の両方が減少することが分かった。この結果から、OPS発酵ブロスを基質として用いる場合、OPSと酵素の間には最適な濃度比があることが分かる。表35システイン変換率Msm-T50ug"