配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドを合成する段階と、のポリヌクレオチドをピキアパストリス由来の発現ベクターに導入する段階と、前記組換え発現ベクターで形質転換させた酵母形質転換体を培養する段階と、前記段階から培養液を収得する段階と、を含むことを特徴とする極地酵母由来の結氷防止タンパク質またはこれを含む培養液の大量生産方法。前記段階でピキアパストリス由来の発現ベクターは、pPICZαAであることを特徴とする請求項1に記載の大量生産方法。前記段階の組換え発現ベクターは、pPICZαA-AY30であることを特徴とする請求項1に記載の大量生産方法。結氷防止タンパク質を発現する配列番号1の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。したがって、本発明は上述したような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、産業的に有用な活性型のAFPを大量に収得することができる方法を提供することにある。上述の目的を達成するために本発明は、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来のAFPをコードする遺伝子を酵母発現システムに最適化して変形させた組換えポリヌクレオチドを合成し、これを酵母発現システムを利用して発現させるAFPの大量生産方法を提供する。本発明による組換えAY30AFPの生産方法によれば、自然型AFPと類似な活性を有するAFPを大量に収得することができ、このような組換えAY30AFPまたはこれを含む培養液は、医療、軍需、冷凍食品産業及び冷害防止農作物貯蔵法などの産業で非常に多様に結氷防止用添加剤で有用に利用されることができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来のAY30AFPまたはこれを含む培養液を大量で生産する方法を提供する。前記方法は、ロイコスポリジウム属の極地酵母由来AY30AFPをコードする遺伝子を酵母発現システムに最適化して変形させた組換えポリヌクレオチドを合成する段階の組換えポリヌクレオチドを酵母由来の発現ベクターに導入する段階;前記組換え発現ベクターを含む形質転換体を培養する段階及び前記段階から培養液を収得する段階を含む。この時、前記段階のロイコスポリジウム属の極地酵母由来のAY30AFPをコードするDNA配列に対する情報は、Swiss-ProtTrEMBLに示されており、これを利用して酵母発現システムにあわせるコドンで最適化させた配列番号1の塩基配列を合成する。配列番号1の塩基配列は、真核細胞、特に、酵母から発現される場合、グリコシル化されたタンパク質を生産する特徴があるので、活性型のAY30AFPを収得することができる。また、前記段階の酵母由来の発現ベクターは、本発明の技術分野において公知されている酵母由来の発現ベクターを全て利用可能であるが、本発明ではピキアパストリス由来の発現ベクターを利用することが好ましくて、より好ましくは、pPICZαAを利用する。具体的に、pPICZαAは、アルコール酸化酵素プローモーターを利用して発現を誘導し、培養液で分泌を誘導する信号配列であるα-因子交配信号配列を有しているので、組換えポリヌクレオチドの発現時にN-末端に信号配列が連結されるようにして組換えAFPが培養液で分泌する効果がある。本発明では、配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチをpPICZαAに挿入して組換え発現ベクターのpPICZαA-AY30を製作し、これを次のように寄託した。寄託機関名:韓国生命工学研究院受託番号:KCTC11917BP受託日付:20110415以後、組換え発現ベクターのpPICZαA-AY30で酵母菌株を形質変換させた形質変換体を培養して組換えAY30AFPを収得する。この時、宿主酵母では、ピキアパストリスを利用することが好ましくて、具体的には、pPICZαA-AY30でピキアパストリス1033を形質変換させた形質変換体Ppastoris1033MutpPICZαA-AY30を提供する。宿主細胞を形質変換させる方法は、本発明が属する分野において公知されている方法を全て利用することができ、本発明では電気穿孔法を利用する。形質転換体の培養方法は、本発明が属する分野において通常の知識を有した当業者に公知されている酵母培養方法を全て利用可能である。本発明では、形質転換体を大量で増殖させた後、組換えAY30AFPの発現を誘導する。まず、形質転換体を大量で増殖させるために、種培養する段階と、種培養して得た培養液を醗酵培養のシードで使用する段階と、に分けて細胞培養を進行する。具体的に、種培養は、YPD培地で振蕩培養し、醗酵培養は、形質転換体の大量増殖のために、グリセロール、PTM1TraceSaltsなどの栄養分を含んだ培地を使用することが好ましい。培養温度は、15°C~35°C範囲を維持することが好ましくて、20°C以上の温度を維持するとき培養が最大に進行される。次に、本発明による形質転換体Ppastoris1033MutpPICZαA-AY30は、メタノールにより組換えAY30AFPの発現を始めるので、メタノール流加式培養でAFPの発現を誘導する。すなわち、醗酵培養で利用された栄養成分であるグリセロールの供給を終了し、グリセロールが全て消耗されて溶存酸素量の水準が増加する時点でメタノールを供給して組換えAY30AFPの発現誘導を始める。溶存酸素量の水準を20で維持することができない時は、メタノールの供給を中断し、溶存酸素量の水準が増加する時点でメタノールを更に供給する方式で発現誘導を進行する。本発明による組換えAY30AFPは、N-末端の信号配列により細胞外に分泌されるので、特に形質転換体を破砕しないで連続培養しながら組換えAY30AFPが含有された培養液を継続的に収得することができる長所がある。また、本発明は、形質転換体Ppastoris1033MutpPICZαA-AY30培養液またはそれから分離した組換えAY30AFPを添加して一定温度で試料の結氷を防止する方法を提供する。この時、前記一定温度は、試料あるいは試料を保管するための溶液の氷点より0~10°C低い温度を意味し、0~4°Cの低温で試料の結氷が効果的に阻害される。このような温度では、組換えAY30AFPが氷の再結晶化とを阻害して試料及び試料保管液の結氷を阻害する。前記試料は、冷凍食品、薬品、濃化学剤、色素及び生物学的材料などを含む。この時、冷凍食品では、アイスクリーム、冷凍果物、精肉など低い温度で保管する必要のある全ての冷凍あるいは低温保管食品を含む。具体的には、アイスクリーム、凍して食べるヨーグルト、アイスブランド、スラリーなどの冷凍デザート類において、AFPsは試料の氷点以下の温度で氷再結晶により大きい結晶が生成されることを防止することで、冷凍食品の氷結晶構造を微細に維持して冷凍食品の味と質を向上させる。また、冷凍果物、冷凍野菜及び精肉などの冷凍あるいは低温保管食品において、AFPsは、氷再結晶活性を通じて食品の冷凍時に大きい結晶が形成されて食品の元の状態が破壊されることで冷凍状態であるいは解凍後に摂取する場合食品の味と質が顕著に損傷されることを防止する。治療薬物、血漿及び組職培養のための哺乳動物細胞などのような生物学的材料では、冷凍と解凍過程により細胞の生存能を大きく減少され、臓器移植時に組職を冷凍させることは、生きている細胞の機能を深刻に損傷させるようになり、植物の冷害は、農業に深刻な問題を発生させるだけではなく、薬物は、厳格な温度条件で保存しなければ、薬効が破壊されるかむしろ危なくなることがある。このような場合、AFPsは、氷再結晶阻害活性を通じて生物学的試料が急激な温度変化に抵抗できるようにする。以下、実施例を通じて本発明を詳しく説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示することで、本発明の範囲がこれに限定されなるものではない。<実施例1>組換えポリヌクレオチドの合成及び形質転換体の製作1-1組換えポリヌクレオチドの合成本発明に使われた極地酵母は、ロイコスポリジウム属のAY30として、韓国海洋研究院敷設極地研究所で北極スヴァールバル群島のTvillingbenet湖で分離したものである。AY30AFPの全体遺伝子配列を利用して組換えAY30AFPのパキアパストリスでの円滑な発現のために、AY30遺伝子をパキアのコドンで最適化作業を実行した。人工遺伝子合成は、鋳型DNAなしに人工的に遺伝子を合成する方法として、化学的に合成が可能なオリゴヌクレオチドを利用してこれらの間の配列相同性に基礎した結合で希望するサイズのdoublestrandDNAを製造した。具体的には、オーバーラップ延長PCR方法で人工遺伝子を合成した。基本的な合成手続きは、オリゴヌクレオチドのデザイン及び合成、そしてオーバーラップ延長PCRを実行した後、クローニングとシークエンシング段階を経て行われた。その結果、配列目録1の塩基配列を含む組換えポリヌクレオチ配列を製作した。AY30AFPのDNA配列と組換えタンパク質発現のためにコドン最適化作業を実行したDNA配列との対応配列を、図2に示した。1-2組換え発現ベクターの製作パキアパストリスは、メタノールを栄養分で摂取する酵母菌株X33であり、組換えPpastorisX33Mut菌株のalcoholoxidasepromoterを利用してAFPAY30を大量生産した。前記1-1で合成した組換えポリヌクレオチド配列をAOX1を利用するpPICZαAの制限酵素サイトに挿入して組換え発現ベクターのpPICZαA-AY30を製作した。このような組換え発現ベクターは、2011年4月15日に韓国生命工学研究院の微生物資源センターに寄託した。1-3形質変換体の製作組換え発現ベクターのpPICZαA-AY30でPpastorisX33Mutを形質変換させるために電気穿孔法を利用した。pPICZαAにAY30AFPが挿入されたプラスミドDNAは、制限酵素SacΙを処理して菌株のgenomicDNAに挿入できる直鎖形態で準備した。形質転換のための菌株PpastorisX33Mutは、YPDに菌株を接種して30°Cで200rpmで18時間培養し、遠心分離を通じて細胞のみ分離した。分離された菌株は、ice-coldDWと1Mソルビトールに再懸濁した後、更に遠心分離する過程を各々2回ずつ実行して準備した。準備されたセルにプラスミドDNA3μgをよく交ぜて、アイスで10分間インキュベーションした。これをあらかじめ冷たく準備した01cmのエレクトロポレーションキュベッドに移してパルスを進行した後、すぐアイスに移した。ice-cold1Mソルビトールを入れて培養チューブに入れた後、YPDとともに30°Cで200rpmで1時間の間培養した。培養液を分株したYPD固体培地は、30°Cで3日間インキュベーションした。前記過程で形質転換体のPpastorisX33MutpPICZαA-AY30を収得した。<実施例2>酵母菌株の培養2-1種培養ロイコスポリジウム属AY30の培養は、NB培地で、2°Cの条件で7日間振蕩培養した。組換えAY30ポリヌクレオシドが発現される組換え形質転換体のPpastorisX33MutpPICZαA-AY30の種培養は、YPD培地で、30°Cを維持する振蕩培養器で250rpmの条件で一晩の間振蕩培養した。これを醗酵培養のシードで使用した。2-2醗酵培養組換え形質転換体のPpastorisX33MutpPICZαA-AY30の大量培養は、最大容量が7Lであるjarbottommagneticdrivefermentorと最大容量50Lの種菌発酵器がある最大容量500Lの発酵器を使用した。温度の測定記録は、発酵器の内部管部位の熱電対を利用した。溶存酸素量の測定は、滅菌されたpolarographicdissolvedoxygenelectrodeInProO2Sensorsを使用した。醗酵培地は、FermentationBasalSaltsMediumに、435mllPTM1TraceSaltsを添加して使用した。pHの調節は、蠕動ポンプを利用して酸と塩基を添加し、InPropHsensorを使用してpHを測定した。培養条件は、30°Cで15Lminで空気を供給し、600rpmで振蕩培養し、飽和溶存酸素量は20~30水準を維持した。pH条件は、アンモニア水を利用してpH5を維持した。醗酵培地にPpastorisX33MutpPICZαA-AY30を接種する前に消泡剤を少量添加し、培養のうち泡沫が発生すると、消泡剤を利用して泡沫を除去した。2-3グリセロール回分式及び流加式培養持続的に正常的な醗酵は、前記2-2で初期に添加されたグリセロールを消耗して菌体が育つ間進行されたし、急に溶存酸素量の水準が増加する時点を分析して初期グリセロールが全て消耗されたことを確認した。菌体濃度及びAFPの生産を増大させるためにグリセロール流加式培養を実施した。この時、12mllPTM1tracesaltsが含まれた50wvグリセロールを使用し、供給は、1815mlhrLの初期醗酵液の割合で設定した。グリセロール供給は、9時間の間進行し、細胞の量をOD600で測定したとき、グリセロール供給前の細胞濃度の3~4倍が増加する時点まで供給した。2-4メタノール流加式培養組換えAFPの発現誘導のために、グリセロールの供給を終了してグリセロールが全て消耗されて溶存酸素量の水準が増加する時点で、12mllPTM1tracesaltsが含まれた100メタノールを36mlhrLの初期醗酵液の割合で供給した。また、温度条件を30°C、25°C、20°C、15°Cの条件で進行した。溶存酸素量の水準が20を維持することができない時はメタノールの供給を中断し、溶存酸素量の水準が増加する時点では前記の割合でメタノールを供給した。その結果、培養液で分泌された組換えAFPが含有された細胞培養液を収得した。<実施例3>細胞含量の測定細胞含量の測定は、UV分光光度計を利用して600nmでの光学濃度を測定した。細胞乾燥重量は、1mlの培養液を遠心分離して09のNaCl溶液を利用して洗浄した後、80°Cの乾燥器で48時間の間乾かした後に測定した。各々の温度別に醗酵培養したOD値とDCW値を利用して醗酵条件の温度による相関関係を求めた。その結果、図3に示したように、時間の経過によるOD600値の変化は、初期は類似に始めて7日の経過した後には20°Cで一層よく培養された。30°Cと25°Cは、7日経過後に類似な傾向を示した。そして、4日が経過した時点から20°Cでの成長曲線が25°C、30°Cを追い越す傾向を示した。また、図4に示したセルのDCW結果もOD600の結果と同様に20°Cでの細胞量が一層多かった。<実施例4>総タンパク質含量の測定培養液の総タンパク質含量は、ウシ血清{けっせい}アルブミンを標準含量で設定してブラッドフォードタンパク質分析法を利用して測定した。具体的には、試料は、培養中に24時間単位で15mlの培養液を採取し、その中で1mlを使用して4°C、4500rpmの条件で5分間遠心分離して細胞と上清液を分離した。タンパク質標準含量の設定は、BSAを0μg、50μg、100μg、500μg、1000μg、2000μgで希釈したBSA溶液20μlをBradfordreagent1mlを添加して交ぜた後、5分間反応時間を与えてUV分光光度計を利用して595nmでの波長値を測定した後、タンパク質標準含量の関係式を求めた。試料も上の方法と同様な方法で、試料20μlを用いて、測定値をBSAを利用したタンパク質標準含量式に代入して全体タンパク質含量を求めた。その結果、図5に示したように、30°Cで培養したとき培養液の総タンパク質含量が高いことで確認された。<実施例5>SDS-PAGE分析培養中に24時間単位で培養液の上清液を採取して同量の2xSDSgelloadingbufferを混合して95°Cで試料を変性させた後、Laemmli法によってSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEでは、1xrunningbufferと12のseparatinggel、stackinggelを使用した。SDS-PAGEを前記のような方法で実行した後、ゲルを固定液を使用して固定し、酸化液を使用して酸化させた後、Schiff’sreagentを使用して染色し、還元液を使用して還元させた後、確認した。その結果、図6乃至図8に示したように、30°Cの温度条件で培養した試料に組換えAY30AFPが比較的多量で含有されていることを確認した。組換えAFPのグリコシル化を確認するために、組換えAFP発現の確認は、CBB染色液を使用して染色し、AFPのグリコシル化の確認は、過ヨウ素酸シッフ試薬を利用して確認した。この時、バクテリア発現システムで生産された組換えAY30AFPは、pColdIベクターを利用して大膓菌から発現したものである。その結果、図9及び図10に示したように、本発明によるPpastoris1033MutpPICZαA-AY30から発現された組換えAY30AFPは、本来のAFPのようにグリコシル化された活性型であることが確認された。<実施例6>ウェスタンブロット分析SDS-PAGEを実行した後、ゲル状のAFPをPVDFmembraneにトランスファーした。Ttransferbufferを使用して1000mMで1時間30分間トランスファーした。実行後、メンブレインをTBSbufferで2回洗浄した後、blockingbufferに1時間の間培養し、TBSTTbufferに2回洗浄した後、TBSbufferで1回洗浄して18000で希釈された1次抗体が含有されたblockingbufferに1時間培養した。その後、TBSTTbufferで2回、TBSbufferで1回洗浄した後、190000で希釈された2次抗体が含有されたblockingbufferで1時間培養し、TBSTTbufferで4回洗浄して、BCIPNBT-purpleLiquidSubstrateSystemで確認した。その結果、図11に示したように、ウェスタンブロット実験を通じて本発明のPpastoris1033MutpPICZαA-AY30から発現された組換えAFPとバクテリアから発現された組換えAFPのタンパク質が、nativeAFPとアミノ酸配列が同一なタンパク質である事実を確認した。<実施例7>AFPAY30の結氷防止活性分析AFPAY30による氷結晶形態の変化を観察するために、ナノリットル浸透圧計を使用した。具体的に、サンプルチャンバ内に液浸油を満たした後、測定試料をオイル上に載せた。サンプルチャンバをステージに乗せて-20°Cに急速冷凍させてから温度をゆっくり上昇させて氷結晶が大部分とけて観察対象結晶のみを残した。また、ステージの温度をゆっくり下りながら氷結晶の形成と温度を観察及び測定した。温度が降りても氷結晶が大きくならないで維持してから急激に結晶が成長する温度を測定して結氷防止活性を分析した。その結果、下記表1及び図12乃至図14のグラフに示したように、二つ異なる培養温度で生産された組換えAY30AFPは、結氷防止活性を有する活性型である事実を確認した。寄託情報