HSAを含まない安定なインターフェロンIFN含有液体医薬組成物であって、この組成物が、緩衝液と、界面活性剤と、等張剤と、酸化防止剤とを含む溶液である組成物。上記インターフェロンがIFNβである、請求項1に記載の組成物。上記IFNβがヒト組み換えIFNβである、請求項1または2に記載の組成物。上記緩衝液が、上記組成物のpHを特定のpHの±05単位の範囲内に維持するのに十分な量において存在しており、その特定のpHが約30~約50である、請求項1~3のいずれか1項に記載の組成物。上記pHが35±02である、請求項1~4のいずれか1項に記載の組成物。上記pHが45±02である、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物。上記緩衝液が、約5mM~500mMの濃度で存在している、請求項1~6のいずれか1項に記載の組成物。上記緩衝液が、約10mMの濃度で存在している、請求項1~7のいずれか1項に記載の組成物。上記緩衝液が酢酸塩緩衝液である、請求項1~8のいずれか1項に記載の組成物。上記等張剤がマンニトールである、請求項1~9のいずれか1項に記載の組成物。上記等張剤が、約05mgml~約500mgmlの濃度で存在している、請求項1~10のいずれか1項に記載の組成物。上記等張剤が、約55mgmlの濃度で存在している、請求項1~11のいずれか1項に記載の組成物。上記界面活性剤が、プルロニック登録商標F77、プルロニックF87、プルロニックF88、及びプルロニックF68から選択される、請求項1~12のいずれか1項に記載の組成物。上記界面活性剤がプルロニックF68である、請求項1~13のいずれか1項に記載の組成物。上記界面活性剤が、約001mgml~約10mgmlの濃度で存在している、請求項1~14のいずれか1項に記載の組成物。上記界面活性剤が、約1mgmlの濃度で存在している、請求項1~15のいずれか1項に記載の組成物。上記酸化防止剤がメチオニンである、請求項1~16のいずれか1項に記載の組成物。上記酸化防止剤が、約001~約50mgmlの濃度で存在している、請求項1~17のいずれか1項に記載の組成物。上記酸化防止剤が、約01mgmlの濃度で存在している、請求項1~18のいずれか1項に記載の組成物。上記インターフェロンが、約10μgml~約800μgmlの濃度で存在している、請求項1~19のいずれか1項に記載の組成物。上記インターフェロンが、約22、44、88、または264μgmlの濃度で存在している、請求項1~20のいずれか1項に記載の組成物。上記組成物が水溶液である、請求項1~21のいずれか1項に記載の組成物。静菌剤をさらに含む、請求項1~22のいずれか1項に記載の組成物。上記静菌剤がベンジルアルコールである、請求項1~23のいずれか1項に記載の組成物。上記静菌剤が、約01~約20の濃度で存在している、請求項1~24のいずれか1項に記載の組成物。上記静菌剤が、約02または約03の濃度で存在している、請求項1~25のいずれか1項に記載の組成物。請求項1~26のいずれか1項に記載の安定な無HSA液体医薬組成物の調製方法であって、算出量の界面活性剤と酸化防止剤と等張剤を緩衝溶液に添加した後、インターフェロンIFNを添加する操作を含んで成る方法。無菌状態において密封され、且つ使用時まで保管しておくのに適した容器であって、請求項1~26のいずれか1項に記載の液体医薬組成物を含んで成る容器。上記容器が、1回分の用量があらかじめ充填された注射器である、請求項28に記載の容器。上記容器がバイアルである、請求項28に記載の容器。上記容器が、オートインジェクタ用のカートリッジである、請求項28に記載の容器。上記容器が、1回分の用量または複数回分の投与用量を収容する容器である、請求項29または30に記載の容器。請求項23~26のいずれか1項に記載の医薬組成物を複数回投与するためのキットであって、請求項1~22のいずれか1項に記載の医薬組成物を充填した第1の容器と、静菌剤溶液を充填した第2のカートリッジを含んで成るキット。注射器にあらかじめ充填した1回用量の無HSAインターフェロンβ1a液体製剤11適合性の予備調査何種類かの賦形剤例えば酸化防止剤や界面活性剤が示す保護効果を確認するため、予備実験を行なった。なぜなら、ヒト血清アルブミンHSAを現在の製品から除去したことで、酸化と、凝集体の形成と、表面への吸着に関して製品が影響を受ける可能性のあることが予想されたからである。546mgmlのマンニトールと何種類かの賦形剤を含む酢酸ナトリウム緩衝液の中にインターフェロンβ1aが44mcgmlと88mcgmlの濃度で含まれる製剤を作った。賦形剤は、04のHSA、0012のLメチオニン、トゥイーン200005、0007、001、ポロキサマー188005、01、05である。このいろいろな組み合わせの製剤をストレス条件下40°Cで保管するか、撹拌するに置き、酸化RPHPLCで調べると凝集化SEHPLCで調べるを調べた。表DEP1と表DEP2に、40°Cで2週間保管した後の酸化と凝集化のレベルをまとめてある。インターフェロンβ1aと調べた両方の界面活性剤トゥイーン20とポロキサマー188を組み合わせると、それぞれのタイプの界面活性剤について、濃度に依存して酸化レベルが上昇した表DEP1、組み合わせ4~6、7~9。ポロキサマー188プルロニックF68、またはF68とも呼ばれるが05のレベルだと、薬剤物質が完全に分解する表DEP1、9。予想通り、合成からの残基として存在する可能性のある酸化種例えば過酸化物のため、より大きな分解速度がトゥイーン20に関して観察される。両方の界面活性剤をさまざまな濃度で調べたが、40°Cで保管するときには凝集化のレベルに影響を与えない表DEP2。表DEP3は、臨界ミセル濃度CMCで使用した両方の界面活性剤トゥイーン20とポロキサマー188が、5分間の撹拌によって誘導される凝集化を阻止するのに役立つことを示している。111物理化学的特性製品としての薬剤の品質にとって極めて重要であることが知られている物理化学的特性は、酸化の程度と、二量体/凝集体の量である。これらの特性を、上にまとめた適合性の研究を行なう際に考慮した。12賦形剤12110mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH35等張剤として546mgmlのマンニトールを含む10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH35は製品を安定化させる、それは、現在市販されている製品レビフ登録商標が以前に開発されたときにわかったことであり、そのことはヨーロッパ特許第759775号に記載されている。122ポロキサマー188ポロキサマー188またはプルロニックF68が製剤に01のレベルで含まれているため、製造中に薬剤物質が容器の表面に吸着することが阻止される。濃度をより大きくすると、製品の安定性にマイナスの影響を与える酸化が増える可能性があり、濃度をより小さくすると、吸着を制限する効果が小さくなる可能性がある。ポロキサマー188が製造中の薬剤物質の吸着を阻止する効果を、以下の研究によって明らかにした。すなわち、44mcgmlのインターフェロンβ1aを含む溶液を異なる3つの濃度の界面活性剤トゥイーン20とポロキサマー188またはHSAと組み合わせ、製造プロセスを実施し;いろいろな段階混合段階、殺菌濾過段階、充填段階でサンプルを採取して定量的RPHPLC法で調べた。以下のサンプルを採取した。濾過前BF1回目の濾過後AF12回目の濾過後AF2充填後T0における最終製品。結果を表DEP4に記載してあり、初期値すなわち濾過前の化合物溶液に対する回収率として表示してある。製造中の薬剤物質の吸着を阻止することに関し、ポロキサマー188はトゥイーン20よりも効果があるが、HSAとは同じ程度である。いろいろな供給者から入手したグレートの異なるポロキサマー188を用いて加速条件2週間、40°C下の酸化生成物について調べ、使用すべき品質を明らかにした。その結果、BASF社からのポロキサマー188が選択された。なぜならポロキサマー188は酸化レベルがより低く、医薬品グレードとして供給されているからである。結果を表DEP5にまとめてある。123Lメチオニン製剤にLメチオニンLMetを0012のレベルで入れ、酸化を制限した。この濃度の有効性は、Lメチオニンを含まない製剤と比較するとわかる。より高濃度005、01のLメチオニンは、安定性が同程度であった。40°Cで保管したときに検出された酸化生成物を表DEP6に示す。製剤の開発中に、Lメチオニンを含む製剤にいろいろな界面活性剤を組み合わせた場合に得られた安定性のデータ2~8°Cと25±2°Cで3ヶ月間から、酸化防止剤としてのLメチオニンの有効性を確認した。Lメチオニンは、0012のレベルで酸化防止剤として有効であり、現在の製品で観察されるのと同程度の安定性を保証することができる図12と図13を参照のこと。13薬剤製品131製剤の開発HSAを含まない新しいインターフェロンβ1a製剤を開発する際の焦点は、最終容器の中で予備実験の結果酸化防止剤としてのLメチオニンの有効性と、ポロキサマー188を含めることによる製造中の損失阻止を確認することであった。546mgmlのマンニトールを含む10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH35にインターフェロンβ1aが44mcgmlまたは88mcgml含まれた溶液を調製し、以下の賦形剤を添加した。トゥイーン200003、0007、002ポロキサマー188005、01、02Lメチオニン0、0012HSA04、現在の製剤であり、参照基準と表示する調べた製剤の組成を表DEP7に示す。以下に説明する手続きに従って製剤を作った。殺菌条件下で、WFIに溶かした必要量の賦形剤を薬剤物質インターフェロンβ1aと混合することにより、それぞれの製剤を90ml作った。次にその製剤を022μmの膜で濾過し2つの膜フィルタで2回濾過した、それぞれの溶液05mlを容積が1mlのハイパックガラス製注射器に充填した。バッチのサイズは注射器約180本であった。次に、製剤を2~8°C、25±2°C、40±2°Cで保管し、12週間まで40±2°Cで保管したサンプルについては6週間までの期間に関して安定性を調べた。開発中は以下の分析試験と分析方法を利用したこれら試験法の詳細については、実施例2を参照のこと。生物活性CPEバイオアッセイアッセイRPHPLC法酸化生成物RPHPLC法二量体/凝集体SEHPLC法とSDSPAGEpH電位差法浸透圧モル濃度凝固点降下測定。結果とその評価を表DEP8~表DEP17にまとめてある。直線回帰分析によって計算して表DEP9にまとめてある傾斜から、トゥイーン20を含むすべての製剤1、2、3、9を40°Cで保管すると、生物活性が低下することがわかる。生物活性の低下は、25°Cと2~8°Cで保管した製剤3と6界面活性剤の濃度が最大でも観察される。直線回帰分析によって計算して表DEP11にまとめてある傾斜から、トゥイーン20を含むすべての製剤1、2、3、9を40°Cで保管すると、失われるタンパク質がより多くなることがわかる。同じ傾向が、25°Cにおいてと、製剤5と6でも観察される。タンパク質含有量の顕著な減少が、2~8°Cにおいて、製剤1、2、3トゥイーン20を含む、4、5ポロキサマー188を含む、9トゥイーン20とLメチオニンを含むで起こる。直線回帰分析によって計算して表DEP13にまとめてある傾斜から、トゥイーン20を含む製剤は、ポロキサマー188を含む製剤と比べて酸化速度が大きいことと、酸化レベルはトゥイーン20の濃度に依存することがわかる。調べたさまざまな温度でLメチオニンが酸化を制限する効果は、製剤9トゥイーン20Lメチオニンを製剤3トゥイーン20と比較し、製剤10ポロキサマー188Lメチオニンを製剤6ポロキサマー188と比較することによってもわかる。直線回帰分析によって計算して表DEP15にまとめてある傾斜から、いろいろな温度で保管したときに全凝集体の含有量は顕著には増加しないことがわかる。保管してもpHのシフトは観察されない。調べた製剤の浸透圧モル濃度は適切な値である。製剤開発の結果に基づき、HSAを含まない以下の製剤を選択した。44または88mcgmlのインターフェロンβ1aが含まれた酢酸ナトリウム緩衝液pH35。この酢酸ナトリウム緩衝液pH35には、546mgmlのマンニトール1mgmlのポロキサマー188012mgmlのLメチオニンが含まれている。132過剰過剰量にはしなかった。133物理化学的特性と生物学的特性すでに述べたように、製剤開発の研究においてこれらの特性を考慮した。14製造法の開発141製造法の開発現在の製造方法を変更し、新しい製剤について実験室スケールのバッチを製造できるようにした。薬剤物質を諸成分と直接混合した後、工業スケールの方法と同じようになるよう、二重濾過を実施した。二重濾過では、殺菌濾過を行ない、次いでインライン濾過を行なった後に、注射器に充填する。次に、注射器に手で最終殺菌溶液を充填した。両方の濾過ステップと注射器充填ステップは層流下で実施した。この方法の各ステップについて以下に説明する。142事前の計算44mcgmlの溶液を得るのに必要な薬剤物質インターフェロンβ1aの量Dmg:Dmg44mcgml×90ml3960mcg396mg。Dmgに対応する薬剤物質インターフェロンβ1aの体積Bml:Bml396mg:バルクの滴定量mgml。44mcgmlの溶液を90ml得るのに必要な賦形剤溶液の体積Vml:Vml90mlBml。密度は約1gml1431Mの水酸化ナトリウム溶液の調製WFIの中に1Mの水酸化ナトリウムが含まれた溶液を調製した。144001Mの水酸化ナトリウム緩衝液pH35の調製適量の氷酢酸をWFIに添加し、1MのNaOHまたは希酢酸を用いてpHを35±02に調節した。この溶液にWFIを補足して最終体積にした。145賦形剤溶液の調製計算で求めた賦形剤マンニトール、トゥイーン20またはポロキサマー188、Lメチオニンの量を測り、必要量の001M酢酸ナトリウム緩衝液pH35に溶かした。次にpHを調べ、必要な場合には1MのNaOHまたは希酢酸を用いて値を35±02に調節した。次にこの溶液に001M酢酸ナトリウム緩衝液を補足し、最終体積にした。146薬剤物質溶液の混合薬剤物質インターフェロンβ1aの必要量Bgを必要量の賦形剤溶液Vgに添加し、穏やかに撹拌して均一にする。147薬剤物質溶液の第1回目の濾過次にこの混合溶液を、ステンレス鋼製ホルダの中に取り付けた02μmのナイロン膜アルティポアN6602μm、φ25cm、ポール社で窒素圧力最大1バール下にて濾過し、ガラス製ビーカーの中に回収する。148薬剤物質溶液の第2回目の濾過次に、前に濾過した溶液を新しい02μmのナイロン膜で同じ条件下にて再び濾過する。149注射器への充填容積1mlのガラス製注射器に05mlの最終溶液を殺菌充填する。1410この方法を実施している間の温度冷やしたWFIを用い、そして賦形剤溶液と混合した溶液を2~8°Cで保管することにより、このプロセス全体を通じて温度をできるだけ冷蔵条件に維持する。オートインジェクタに適したカートリッジ内の無HSAインターフェロンβ1a複数回用量液体製剤現在市販されている注射器入り製品からHSAを除去することを目的とした新しい無HSA製剤を開発しているとき、カートリッジに入った複数回用量の製品を開発する必要性が出てきた。複数回用量の製剤があれば、オートインジェクタを用いて自分で投与できるために患者の利便性が高まるであろう。最もよく用いられている静菌剤03のmクレゾール、05のフェノール、09のベンジルアルコールを活性物質と組み合わせて調べ、1回用量の製剤を開発している中で選択した注射器入り1回用量製剤と比較した44または88mcgmlのインターフェロンβ1aと、546mgmlのマンニトールと、1mgmlのポロキサマー188と、012mgmlのLメチオニンとが10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH35に含まれたもの。すると以下のことが観察された。細菌による汚染を阻止するため、それぞれの静菌剤が一般に使用されている濃度で含まれるようにすると、酸化形態が増加し、凝集化の劇的な増加が促進された。03のmクレゾールの場合と、05のフェノールと01のポロキサマー188を組み合わせた場合に、凝集化が劇的に増加した。製剤開発の予備段階で得られた情報に基づき、製剤の開発を、まず最初は、ベンジルアルコールとフェノールポロキサマー188はなし、ならびに添加する静菌剤クロロブタノール、フェニルエタノールに絞った。EDTAもベンジルアルコールと組み合わせて調べた。活性薬の酸化と凝集化が、観察された主な劣化経路であった。製剤に含まれるベンジルアルコールの量が減少すると製品の貯蔵寿命が延びることがわかった。この段階で調べた他のどの保存剤も、製品の安定性を顕著に向上させることはできなかった。製剤開発の最後に、以下に示す複数回用量の製品が候補となることが明らかになった。製剤B:264mcgのインターフェロンβ1aと、1638mgのマンニトールと、3mgのポロキサマー188と、036mgのLメチオニンと、6mgのベンジルアルコールとが10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH353mlに含まれたもの。製剤A:264mcgのインターフェロンβ1aと、1638mgのマンニトールと、3mgのポロキサマー188と、036mgのLメチオニンとが11mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH3527mlに含まれたものを、3のベンジルアルコールを含むWFIと混合することにより、最終的な複数回用量の製剤を得る。それぞれの候補製剤について実験室スケールの3つのバッチを作り、6ヶ月までの期間にわたって安定性を上に示した方法で調べた。どちらの候補製剤でも、2~8°Cで保管したときには顕著な劣化は起こらなかった。加速条件25°Cにしたときに起こる主な劣化は、酸化である。この研究の最後に、2つの複数回用量製剤候補が同程度の安定性プロファイルを持つことが明らかになった。製剤Bは、02のベンジルアルコールを含む複数回用量の製剤であり、そのまま使用できる。製剤Aは、03のベンジルアルコールを含む複数回用量の製剤であり、2つのカートリッジ一方は活性成分と賦形剤を含んでおり、もう一方は、最終状態にするのに必要な量のベンジルアルコールを含んでいるの内容物を混合した後に得られる。21研究の目的この研究の目的は、3mlのカートリッジにインターフェロンβ1aが264mcg含まれた無HSA複数回用量製剤を開発し、オートインジェクタで投与できるようにすることであった。22実験の部221材料インターフェロンβ1aセロノ社マンニトールDAB、PhEur、BP、USP、FCC、E421メルク社氷酢酸100GRメルク社水酸化ナトリウムのペレットGRメルク社ポロキサマー188ルトロールF68DAC、USPNF、BASF社生化学実験用Lメチオニンメルク社合成用mクレゾールメルク社合成用フェノールメルク社ベンジルアルコールPhEur、BP、NFメルク社クロロブタノールオールドリッチ社フェニルエタノールシグマ社メチルパラベンナトリウムBP、USPNFフォルメンティ社プロピルパラベンナトリウムBP、USPNFフォルメンティ社EDTA二ナトリウム塩フルカ社12プロパンジオール超高純度DAB、PhEur、BP、USPメルク社アセトニトリルメルク社トリフルオロ酢酸ベーカー社ヘプタフルオロブチル酸ピアース社222装置HPLCシステムウォーターズ社ミレニアム32ソフトウエアウォーターズ社浸透圧計オスモスタット030D、ゴノテック社pH計モデル654、メトローム社較正されたピペットジルソン社アルティポアN66、02μmナイロン膜、FTKNF、φ47cmポール社アルティポアN66、02μmナイロン膜、NR14225、φ142cmポール社ステンレス鋼製ホルダ、φ47cmとφ10cmサルトリウス社ステンレス鋼製タンクサルトリウス社C4カラム5μm046×25cmベーカー社C4カラム、スペルコシルLC3045μm046×25cmスペルコ社TSKカラム、G2000SWXL046×25cmトーソーハアス社23予備製剤の研究まず最初に、最もよく用いられている静菌剤03のmクレゾール、05のフェノール、09のベンジルアルコールを活性物質およびさまざまな賦形剤の混合物と組み合わせ、最終容器3mlのカートリッジの中で調べた。賦形剤の混合物は、酢酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液/マンニトール、酢酸塩緩衝液/マンニトール/Lメチオニン/ポロキサマー188である。さまざまな環境における活性物質の適合性を、40°Cで保管したときの酸化RPHPLCで調べると凝集化SEHPLCで調べるをもとにして調べた。この予備段階の各ステップで調べた製剤のまとめを表1に示してある。それぞれの静菌剤を含めた効果を、1回用量の製剤を開発している中で選択した注射器入り1回用量製剤基準と比較した44または88mcgmlのインターフェロンβ1aと、546mgmlのマンニトールと、1mgmlのポロキサマー188と、012mgmlのLメチオニンとが10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH35に含まれたもの。24製剤の開発製剤開発の予備段階で得られた情報に基づき、製剤の開発を、まず最初は、ベンジルアルコールとフェノールに絞った。添加する静菌剤クロロブタノール、フェニルエタノールとEDTAをベンジルアルコールと組み合わせた場合も調べた。HSAを含まない1回用量インターフェロンβ1a製剤に対応する比較用製剤MS3もカートリッジ内に調製し、参照基準として用いた。この段階で製造した製剤の組成単位はmgmlを表2~表5に示してある。製剤開発の最後に、以下に示す複数回用量の製剤候補が明らかになった。製剤B:546mgのマンニトールと、1mgのポロキサマー188と、012mgのLメチオニンと、2mgのベンジルアルコール02のベンジルアルコールとが10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH353mlに含まれた中に264mcgのインターフェロンβ1aが含まれているもの。製剤A:546mgのマンニトールと、1mgのポロキサマー188と、012mgのLメチオニンとが10mMの酢酸ナトリウム緩衝液pH3527mlに含まれた中に264mcgのインターフェロンβ1aが含まれているものを03mlの3ベンジルアルコールと混合し、最終的な複数用量の製剤ベンジルアルコールが03を得る。25保管効果のテストEPとUSPの薬局方に従って保管効果のテストを行ない、さまざまな濃度のベンジルアルコール02~09を含む複数回用量製剤のスクリーニングをした。インジケータとして黄色ブドウ球菌、黒色アスペルギルス、カンジダアルビカンスを選択し、最初のテストを行なった。製剤が酸性pHであること自体が細菌黄色ブドウ球菌に対する静菌効果を持っているという証拠と、カンジダアルビカンスのいくつかの菌株が小さなpH値約2でさえ生き延びるという事実から、カンジダアルビカンスをテストのための極めて重要なインジケータとして選択した。EPとUSP両方の薬局方に記載されている保存効果テストで認められる基準を適用した。26候補製剤261製剤A1バッチ当たり約140本のカートリッジからなる実験スケールのバッチを3つ作った。製剤の組成を表6に示す。活性成分を賦形剤溶液と混合した後、022μmのナイロン膜で濾過した。カートリッジに最終溶液27mlを充填した。濾過前、濾過後、充填後にサンプルを採取し、その間の活性成分の損失を調べた。サンプルを2~8°C6ヶ月、25±2°C3ヶ月、40±2°C1ヶ月で保管し、安定性を調べた。3のベンジルアルコールが含まれたWFIからなる実験スケールのバッチを6つ作り、活性成分を含むカートリッジと混合した。バッチの組成を表7に示す。必要量のベンジルアルコールをWFIに添加した後、022μmのデュラポア膜で濾過した。次に、カートリッジに05mlを充填し、最後にオートクレーブで殺菌した。サンプルを25±2°Cで保管し、ベンジルアルコールの含有量とpHを1ヶ月後まで調べた。262製剤B1バッチ当たり約500本のカートリッジからなる実験スケールのバッチを3つ作った。製剤の組成を表8に示す。活性成分を賦形剤溶液と混合した後、022μmのナイロン膜で濾過した。カートリッジに最終溶液3mlを充填した。濾過前、濾過後、充填後にサンプルを採取し、その間の活性成分の損失を調べた。サンプルを2~8°C6ヶ月、25±2°C6ヶ月、40±2°C3週間で保管し、安定性を調べた。263保管効果のテストEPとUSP薬局方に従い、両方の候補製剤の保管効果を調べた。27分析テストと分析法あとで説明する分析テストと分析法を利用し、実験室スケールの製剤の安定性を調べた:pH電位差測定。タンパク質定量アッセイRPHPLCC4、ワイドポアブチル5μlカラムベーカー社上でタンパク質の定量を行なう。波長は214nmに設定し、溶離は、以下の移動相と勾配を用いて1ml分にて行なう。A水/トリフルオロ酢酸01;Bアセトニトリル/トリフルオロ酢酸01;Cアセトニトリル勾配:0分70A30B0C50分70A30B0C60分58A42B0C150分57A43B0C300分46A54B0C350分45A55B0C400分40A60B0C401分20A80B0C450分20A80B0C450分0A0B100C500分0A0B100C501分70A30B0C650分70A30B0C保持時間65分サンプルの分析は、そのままのサンプル44mcgmlのサンプルを100μl注入するか、88mcgmlのサンプルに関しては同等なプラセボの中に希釈1:1したもの100μlを注入して行なう。参照基準となる標準材料を用いて得た標準曲線の00125mgml~02mgmlの範囲でサンプルの定量を行なう。酸化形態RPHPLC40°Cに維持したC4、スペルコシルLC304カラムスペルコ社上で酸化形態の定量を行なう。波長は208nmに設定し、溶離は、以下の移動相と勾配を用いて1ml分にて行なう。A水60/アセトニトリル40/ヘプタフルオロブチル酸014;B水20/アセトニトリル80/ヘプタフルオロブチル酸014;C水20/アセトニトリル80/トリフルオロ酢酸01勾配:0分70A30B0C5分70A30B0C58分62A38B0C曲線663分0A100B0C曲線168分0A0B100C曲線169分70A30B0C曲線6実行時間:96分70分26分平衡サンプルの分析を、そのままのサンプルを200μl88mcgmlのサンプル注入するか、400μl44mcgmlのサンプル注入して行なう。全凝集体SEHPLC凝集体の全含有量の検出を、TSKG2000SWXLカラムトーソーハアス社上で実施する。溶離は、アセトニトリル:水30:7002トリフルオロ酢酸を用いて05ml分にてアイソクラティックモードで実施する。波長は214nmに設定する。実行時間は20分である。サンプルの分析を、そのままのサンプルを100μl88mcgmlのサンプル注入するか、200μl44mcgmlのサンプル注入して行なう。生物活性インビトロバイオアッセイIFNβがウイルス水疱性口内炎ウイルスの細胞変性効果から細胞WISH細胞ヒト羊膜組織を保護することに基づく抗ウイルスアッセイを利用し、生物活性を測定する。浸透圧モル濃度凝固点降下測定調べる溶液で観察される凝固点の降下を測定することにより、浸透圧モル濃度を明らかにする。ベンジルアルコールアッセイGC法ベンジルアルコールを検出するGC法では、1点較正を利用する。そのとき、参照基準として、メルク社から供給されたベンジルアルコールを用いる。さらに内標準フェニルエチルアルコールを利用し、テストする両方のサンプルと、対照サンプル溶液と、標準溶液のピークの面積を規格化する。この方法は、スペルコポート80100メッシュ上の10カーボワックス20Mを用い、6フィート×2mmID鋼カラム上で実施する。検出装置はFID水素炎イオン化検出器である。結果は、ベンジルアルコール1ml当たりのmgを単位として表示する。271結果2711予備製剤ストレス条件40°C下で検出された酸化形態と全凝集体のレベルを表9と表10に示す。細菌による汚染を防止するためにそれぞれの静菌剤が一般に使用されている濃度で含まれるようにすると、1回用量の製剤参照基準と比較して酸化形態が増加し、凝集化の劇的な増加が促進された。05フェノールと01ポロキサマー188の組み合わせは、製品の安定性にマイナスの効果を及ぼした。なぜなら、凝集体が約40生成したからである製剤P、Q、R。03mクレゾールを用いると凝集体が増加して製品の安定性にマイナスの効果を及ぼしたため製剤I、それ以上開発することは止めた。2712製剤の開発安定性のデータ生データは、すべてこのセクションの表にまとめてある。直線回帰分析を利用してデータを評価した。27121ベンジルアルコールを含む製剤高濃度のベンジルアルコール09は、酸化形態と凝集体の含有量の両方に関して製品の安定性にマイナスの効果を及ぼした。そのことが図1~図6からわかる。図1からわかるように、ストレス条件40°C下では、ベンジルアルコールを09含む製剤MS1とMS2で酸化の増加がより大きい。図2からわかるように、加速条件25°C下では、ベンジルアルコールを含むすべての製剤で、ベンジルアルコールを含まない製剤MS3、参照基準と比べて酸化の増加が大きい。長期にわたって保管2~8°Cすると、ベンジルアルコールを09含む製剤MS1とMS2でより大きな酸化速度が観察された。それと同等の分解速度が、ベンジルアルコールを045未満含む製剤で検出された図3。凝集体のレベルに関しては以下のことが観察された。図4からわかるように、ストレス条件40°C下では、ベンジルアルコールを09含む製剤MS1とMS2で凝集体の増加が観察された。図5と図6からわかるように、加速条件かつ長期保管条件25°Cと、2~8°C下では、どの製剤でも凝集体の増加は観察されなかった。ベンジルアルコールを09含む製剤MS1とMS2で40°Cにて生物活性の低下が観察された。この現象は、同じサンプルを25°Cで保管した場合や2~8°Cで保管した場合には観察されない。どの温度で保管しても力価の低下は観察されなかった。どの温度で保管してもpHのシフトは起こらなかった。27122別の静菌剤フェノール、クロロブタノール、フェニルエタノールを含む製剤図7と図8からわかるように、フェノールMS4とMS5は、酸化形態に関して製品の安定性にマイナスの効果を及ぼしたが、クロロブタノールMS35とフェニルエタノールMS34とMS34bは、参照基準溶液MS3、静菌剤なしと同等の安定性を示した。全凝集体のレベルに関しては、図9に示したように、フェノールを含む製剤MS4とMS5で凝集体の劇的な増加がストレス条件40°C下で観察された。より低い温度25°Cと2~8°Cでは、凝集体の増加は起こらなかった。27123EDTAを含む製剤01~02のベンジルアルコールを含む製剤MS32、MS33、MS36にEDTAを添加しても酸化レベルは低下しなかった図10。01のEDTAと02のベンジルアルコールを含む製剤MS32、MS33では、加速条件下で凝集体のレベルの上昇が観察された図11。2~8°Cでは同等の劣化が観察された。27124保管効果に関する結果スクリーニング研究の結果から、カンジダアルビカンスについては少なくともベンジルアルコールが03以上の濃度ではUSPとEPの薬局方の基準が満たされていることがわかった。28候補製剤全データを以下のようにして評価した。各バッチについて直線回帰分析を行なった後、共分散分析P値025によってバッチ間の差異を評価した。保管によって差異が観察されなかったときには、正式の統計分析は行なわなかった。281候補A2811製造中の回収候補Aの製造中に回収したサンプル濾過前、濾過後、完成した製品に含まれるインターフェロンβ1aを表11にまとめてある。活性成分の顕著な損失は記録されなかった。2812活性薬の安定性異なる温度で保管した3つのバッチにおける酸化形態のレベルに関し、共通の傾斜と切片を計算した。統計分析の結果を表12に示す。全凝集体のレベルとアッセイに関して有意な差異は観察されなかった。そのため正式の統計分析は行なわなかった。3つのバッチで凝集体のレベルが異なるのは、製造に使用したバルク中でのレベルが異なるためである。282候補B2821製造中の回収候補Bの製造中に回収したサンプル濾過前、濾過後、完成した製品に含まれるインターフェロンβ1aを表13にまとめてある。活性成分の顕著な損失は記録されなかった。2822活性薬の安定性酸化形態のレベルを統計的に分析することによって以下のことがわかった。3つのバッチについて、40°Cにおける共通の傾斜と切片を計算した。共通の傾斜は142/週であり、共通の切片は272である。3つのバッチについて25°Cにおける共通の傾斜を計算することはできなかったP値0095。したがって最悪のケースMS3の結果を使用した。1ヶ月保管した後に酸化形態が117増加することが観察された027/週。3つのバッチについて2~8°Cにおける共通の傾斜を計算することはできなかったP値0016。したがって最悪のケースMS3の結果を使用した。1ヶ月保管した後に酸化形態が02増加することが観察された0047/週。全凝集体のレベルとアッセイに関して安定性のデータから有意な差異は観察されなかった。そのため正式の統計分析は行なわなかった。ストレス条件40°C下で保管しても、生物活性の低下は観察されなかった。29結論研究の最後に、2つの複数用量製剤候補が同程度の安定性プロファイルを持つことが明らかになった。候補製剤Bは、02のベンジルアルコールを含む複数回用量製剤であり、そのまま使用できる。製剤Aは、03のベンジルアルコールを含む複数回用量製剤であり、2つのカートリッジ一方は活性成分と賦形剤を含んでおり、もう一方は、最終状態にするのに必要な量のベンジルアルコールを含んでいるの内容物を混合した後に得られる。これらの候補溶液をより大きなpH45±02でも調べたが、安定性プロファイルに顕著な変化は見られなかった。出願人は、今や、IFN製剤のこのわずかに大きなpHが、皮下注射の局所的寛容性を増大させることを見いだした。したがってpHが45または47の上記2つの候補溶液は、患者のコンプライアンスに関して従来よりも大きな利点を提供することができよう。候補製剤Aの製造方法まず最初に、20gのペレット状水酸化ナトリウムを500gのWFIに溶かして1Nの水酸化ナトリウム溶液を調製した。次に、氷酢酸132gを約1800gのWFIに添加して0011Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02を調製した。この溶液のpHは、1NのNaOHを用いてpH35±02に調節した。次に、この溶液の最終重量を2000gにした。次に、1NのNaOHまたは50希酢酸を用い、pHを再び35±02に調節した。次に、この溶液の最終重量を2000gにした。最終溶液は以下のようにして調製した。賦形剤の計算値を計量し、必要量の11mM酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02に溶かし、この溶液のpHを調べて必要な場合には調節した。次に、必要量のrhインターフェロンβ1aCHO細胞が産生した組み換え体を添加した。11mM酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02を添加して最終重量にした。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べたサンプルBF第1回目の濾過前。次に、この最終溶液を、ステンレス鋼製ホルダの内部に取り付けた02μmの膜で濾過し、ガラス製ビーカーに回収した。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べた。上記のようにして濾過した最終溶液を、ステンレス鋼製ホルダの内部に取り付けた02μmの第2の膜で濾過した。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べた。3mlのガラス製カートリッジにこの最終溶液27mlを充填して漏れないようにした。この溶液は、3ベンジルアルコール溶液を含むWFIが収容されたカートリッジとそのまま混合することができる。候補製剤Bの製造方法まず最初に、20gのペレット状水酸化ナトリウムを500gのWFIに溶かして1Nの水酸化ナトリウム溶液を調製した。次に、氷酢酸132gを約1800gのWFIに添加して0011Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02を調製した。この溶液のpHは、1NのNaOHを用いてpH35±02に調節した。次に、この溶液の最終重量を2000gにした。次に、1NのNaOHまたは50希酢酸を用い、pHを再び35±02に調節した。次に、この溶液の最終重量を2000gにした。最終溶液は以下のようにして調製した。賦形剤の計算値を計量し、必要量の10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02に溶かし、この溶液のpHを調べて必要な場合には調節した。次に、必要量のrhインターフェロンβ1aCHO細胞が産生した組み換え体を添加した。10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH35±02を添加して最終重量にした。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べた。次に、この最終溶液を、ステンレス鋼製ホルダの内部に取り付けた02μmの膜で濾過し、ガラス製ビーカーに回収した。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べた。上記のようにして濾過した最終溶液を、ステンレス鋼製ホルダの内部に取り付けた02μmの第2の膜で濾過した。この最終溶液1mlを採取し、定量RPHPLCで調べた。3mlのガラス製カートリッジにこの最終溶液27mlを充填して漏れないようにした。参考文献1.研究グループ、TheLancet、1998年、第352巻、1498~1504ページ。2.CleggとBryant、ExpOpinPharmacother、2001年、第2巻、623~639ページ。3.DerynkR他、Nature、1980年、第285巻、542~547ページ。4.酵素学における方法、第78巻PestkaS編、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1981年の中のFamillettiPC、RubinsteinS、PestkaSによるインターフェロンのための簡便かつ迅速な細胞変性効果抑制アッセイ、387~394ページ。5.HultgrenC、MilichDR、WeilandO、SallbergM、1998年、抗ウイルス化合物リバビリンは、B型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルスによるウイルス特異的免疫応答においてTヘルパーTh1Th2サブセットのバランスを変化させる、JGenVirol、1998年、第79巻、2381~2391ページ。6.McCormickJB、KingIJ、WebbPA、ScribnerCL、CravenRB、JohnsonKM、ElliottLH、BelmontWilliamsR、ラッサ熱。リバビリンを用いた効果的な治療法、NEnglJMed、1986年1月2日号、第314巻、20~26ページ。7.MarkDF他、ProcNatlAcadSciUSA、第81巻、5662~5666ページ、1984年。8.酵素学における方法、第119巻PestkaS編、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1986年の中のPestkaSによるインターフェロンの規格と一般的な略号、14~23ページ。9.RubinsteinS、FamillettiPC、PestkaS、インターフェロンの簡便なアッセイ、JVirol、1981年、第37巻、755~758ページ。10.ShepardHM他、Nature、1981年、第294巻、563~565ページ。