"D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144、及びG147から選択される1つ又は複数のアミノ酸に変異を有するsprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有する上記組換えグラム陰性細菌細胞。変異体spr遺伝子が、D133A、H145A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、及びG147Cから選択される1つ又は複数の変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項1に記載の細胞。変異体spr遺伝子が、S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G、及びG147Cから選択される1つ又は複数の変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項2に記載の細胞。変異体spr遺伝子が、S95F及びY115Fの変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項3に記載の細胞。変異体spr遺伝子が、D133A、H145A、及びH157Aから選択される変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項2に記載の細胞。以下の変異遺伝子:a.シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子、b.低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子である、変異ptr遺伝子、c.低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である、変異OmpT遺伝子の1つ又は複数をさらに含んでいる、請求項1から5までのいずれか一項に記載の細胞。低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子を含んでおり、又はノックアウト変異Tsp遺伝子である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の細胞。細胞のゲノムが、変異spr遺伝子及び変異Tsp遺伝子以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、請求項7に記載の細胞。野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性、及び変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を有する組換えグラム陰性細菌細胞であって、細胞のゲノムが、野生型細胞及び変異spr遺伝子に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、上記組換えグラム陰性細菌細胞。変異体spr遺伝子が、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A、及びW174Rから選択される1つ又は複数の変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項9に記載の細胞。変異体spr遺伝子が、請求項1から5までのいずれか一項に記載の1つ又は複数の変異を有するsprタンパク質をコードする、請求項10に記載の細胞。遺伝子開始コドン、並びに/或いは遺伝子開始コドンの下流、及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでいるノックアウト変異Tsp遺伝子を有する、請求項1から11までのいずれか一項に記載の細胞。ノックアウト変異Tsp遺伝子が、遺伝子開始コドンに対するミスセンス変異及び任意選択によって1つ又は複数のさらなる点変異によって作り出された制限マーカー部位を含んでいる、請求項12に記載の細胞。ノックアウト変異Tsp遺伝子が配列番号3を含んでいる、請求項13に記載の細胞。大腸菌E.coliである、請求項1から14までのいずれか一項に記載の細胞。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、請求項1から15までのいずれか一項に記載の細胞。対象のタンパク質が、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項16に記載の細胞。抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントがTNFに特異的である、請求項17に記載の細胞。野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有し、変異体sprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子、及びTNFに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、組換えグラム陰性細菌細胞。低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子又はノックアウト変異Tsp遺伝子を含んでいる、請求項19に記載の細胞。請求項1から20までのいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を、培養培地中、対象の組換えタンパク質を発現させるのに有効な条件下で培養するステップと、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び/又は培養培地から対象の組換えタンパク質を回収するステップとを含む、対象のタンパク質を生成するための方法。対象のタンパク質を細胞から回収することをさらに含む、請求項21に記載の方法。対象のタンパク質がペリプラズム及び/又は上清から回収される、請求項22に記載の方法。本発明は、組換えタンパク質を生成するのに有利な手段を提供する代替のspr変異体を有する新たな細菌系統を提供する。本発明の第一の態様において、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、及びH157から選択される1つ又は複数のアミノ酸に変異を有するsprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有する組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。一実施形態において、細胞のゲノムは、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である。第二の態様において、本発明は、野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有し、sprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供し、細胞のゲノムは、野生型細胞及び変異spr遺伝子に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である。本発明の第一及び第二の態様が提供する細胞は、有利な増殖及びタンパク質生成の表現型を示す。第三の態様において、本発明は、上記に規定した組換えグラム陰性細菌細胞において対象のタンパク質を発現することを含む、対象のタンパク質を生成するための方法を提供する。本発明は、変異spr遺伝子を含んでいる対象のタンパク質を発現するのに適する組換えグラム陰性細菌細胞を提供し、この細胞は野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有する。本発明の第一の態様において、sprに対する新たな変異により、野生型細菌細胞及び変異Tsp遺伝子を有する細胞に比べて改善した細胞増殖の表現型を有する新たな系統がもたらされる。本発明は、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の増殖の表現型を抑制することができる新たなspr変異を同定するものである。本発明者らは、驚くべきことに、新たな変異sprを有し、低減したTsp活性を有する細胞は、野生型細胞又は変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞に比べて、増大した細胞増殖率及び増大した細胞生存期間を示すことを見出した。特に、新たなspr変異を有し、低減したTsp活性を有する細胞は、変異Tsp遺伝子を有する細胞に比べて低減した細胞溶解の表現型を示す。したがって、新たな系統は細胞からのタンパク質の漏出を低減し、変異Tsp遺伝子を有する細胞に比べて長期のペリプラズマの蓄積が可能となる。さらに、新たな変異体のsprを有し、低減したTsp活性を有する細胞は、野生型細菌細胞又は変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞に比べて、増大した対象のタンパク質の収率を示す。改善されたタンパク質の収率は、ペリプラズマタンパク質の収率でも、及び/又は上清のタンパク質の収率でもよい。一実施形態において、本発明の細胞は、細胞からの漏出の低減により、変異Tsp遺伝子を有する細胞に比べて改善されたペリプラズマタンパク質の収率を示す。組換え細菌細胞は、対象のタンパク質をより速い速度で生成するのが可能であり得、したがって同じ量の対象のタンパク質を、野生型細菌細胞、又は変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞に比べてより短い時間で生成することができる。対象のタンパク質の生成速度がより速いことは、例えば、タンパク質発現の誘導後最初の5時間、10時間、20時間、又は30時間にわたって細胞の最初の増殖期間にわたって特に重要であり得る。本発明による細胞が、ペリプラズム及び/又は培地において、対象のタンパク質のおよそ1.0g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.4g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、又は4.0g/Lの、最大の収率を発現するのが好ましい。本発明の第一及び第二の態様が提供する細胞は、対象のタンパク質、特にTspに対してタンパク質分解感受性である対象のタンパク質のタンパク質分解性を低減し得る、野生型細胞に比べて低減したTspのプロテアーゼ活性を有する。したがって、本発明の第一及び第二の態様が提供する細胞は、野生型細菌細胞に比べて、インタクトなタンパク質、好ましくは対象のタンパク質をより高い収率で提供し、タンパク質、好ましくは対象のタンパク質のタンパク質分解性フラグメントをより低い収率で提供し、好ましくはタンパク質分解性フラグメントを全く提供しないものであってもよい。本発明の第二の態様、及び本発明の第一の態様の好ましい実施形態において、細胞は、1つ又は複数のspr変異、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾を導入するのに必要とされるゲノムに対する最小の変異のみを有する。細菌細胞は、spr遺伝子に対する1つ又は複数の変異、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾が野生型細菌細胞と異なるにすぎない。細胞は、細胞の増殖及び/又は対象のタンパク質を発現する能力に対して有害な効果を有し得るいかなる他の変異も有さない。したがって、本発明の1つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対してさらなる遺伝子操作された変異を含んでいる細胞に比べて改善されたタンパク質発現及び/又は改善された増殖の特徴を表し得る。本発明が提供する細胞はまた、細胞のゲノムに対するさらなるかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成において用いるのにより適している。当業者であれば、発酵法、ELISA、及びタンパク質GHPLCを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて、それが望ましい収率の対象のタンパク質を有するか否かを見るために、候補の細胞クローンを試験することが容易にできる。適切な発酵法は、HumphreysDPら1997年、FormationofdimericFabsinE.coli:effectofhingesizeandisotype,presenceofinterchaindisulphidebond,Fab’expressionlevels,tailpiecesequencesandgrowthconditions.、J.IMMUNOL.METH.、209巻、193~202頁;BacklundE.、ReeksD.、MarklandK.、WeirN.、BoweringL.、LarssonG.、FedbatchdesignforperiplasmicproductretentioninEscherichiacoli、雑誌記事、ResearchSupportNon-U.S.Gov’tJournalofBiotechnology.、135巻4、358~65頁、2008年7月31日;ChampionKM.、NishiharaJC.、JolyJC.、ArnottD.、SimilarityoftheEscherichiacoliproteomeuponcompletionofdifferentbiopharmaceuticalfermentationprocesses.、[雑誌記事]Proteomics.、1巻9、1133~48頁、2001年9月;及びHornU.、StrittmatterW.、KrebberA.、KnupferU.、KujauM.、WenderothR.、MullerK.、MatzkuS.、PluckthunA.、RiesenbergD.、HighvolumetricyieldsoffunctionaldimericminiantibodiesinEscherichiacoli,usinganoptimizedexpressionvectorandhigh-cell-densityfermentationundernon-limitedgrowthconditions、雑誌記事、ResearchSupport、Non-U.S.Gov’tAppliedMicrobiologyBiotechnology.、46巻5~6、524~32頁、1996年12月に記載されている。当業者であれば、タンパク質GHPLC、円偏光二色性、NMR、X線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することも容易にできる。本発明を、次により詳しく記載する。本明細書に記載する実施形態は全て、別段の記載がなければ、本発明の第一、第二、及び第三の態様に関するものである。タンパク質及びポリペプチドの語は、文脈上別段の記載がなければ、本明細書において交換可能に用いられる。ペプチドは10個以下のアミノ酸を意味するものとされる。ポリヌクレオチドの語は、文脈上別段の記載がなければ、遺伝子、DNA、cDNA、RNA、mRNAなどを含む。本明細書で用いられる含んでいるcomprisingの語は、本明細書の文脈において含んでいるincludingと解釈されたい。非変異細胞又はコントロール細胞は、本発明の文脈において、本発明の組換えグラム陰性細胞と同じ型の細胞を意味し、細胞は上記の低減したTspタンパク質活性を有し、変異体spr遺伝子を有するように修飾されていない。例えば、非変異細胞は野生型細胞であってよく、あらゆる変異を導入する修飾の前の本発明の細胞と同じ宿主細胞の集団に由来してよい。細胞、細胞系、細胞培養物、及び系統の表現は交換可能に用いられる。変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型の表現は、本発明の文脈において、変異体のTsp遺伝子を抱く細胞によって表される表現型を意味する。典型的に、変異体のTsp遺伝子を含んでいる細胞は、特に高い細胞密度で溶解することができる。これらの細胞の溶解は、あらゆる組換えタンパク質の上清中への漏出をもたらす。変異Tsp遺伝子を有する細胞は、低いモル浸透圧濃度では熱感受性の増殖も示すことがある。例えば、40°C以上などの高温では、細胞は増殖率を示さず、若しくは低減した増殖率を示し、又は細胞は低浸透圧性の培地中で死滅する。同質遺伝子のの語は、本発明の文脈において、本発明の細胞のゲノムが、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、細胞が由来する野生型の細胞に比べて実質的に同じ、又は同じゲノム配列を有することを意味する。この実施形態において、細胞のゲノムはさらなる天然に存在しない変異又は遺伝子操作された変異を含んでいない。一実施形態において、本発明による細胞は、起こり得るあらゆる天然に存在する変異を考慮に入れて、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細胞に比べて実質的に同じゲノム配列を有し得る。一実施形態において、本発明による細胞は、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細胞に比べて正確に同じゲノム配列を有し得る。野生型の語は、本発明の文脈において、天然に存在することがあり、又は環境から単離され得るグラム陰性細菌細胞の系統を意味し、いかなる遺伝子操作された変異も保有しない。大腸菌の野生型系統の一例にはW3110-12系統などのW3110がある。あらゆる適切なグラム陰性細菌を、本発明の組換え細胞を生成するための親細胞として用いることができる。適切なグラム陰性細菌には、ネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、蛍光菌Pseudomonasfluorescens、軟腐病菌Erwiniacarotovora、シゲラShigella、肺炎桿菌Klebsiellapneumoniae、レジオネラニューモフィラLegionellapneumophila、緑膿菌Pseudomonasaeruginosa、アシネトバクターバウマンニイAcinetobacterbaumannii、及び大腸菌が含まれる。親細胞が大腸菌であるのが好ましい。本発明において大腸菌のあらゆる適切な系統を用いることができるが、K-12W3110などの野生型W3110系統を用いるのが好ましい。予め作り出され、組換えタンパク質を発現させるのに用いられるプロテアーゼ欠損細菌系統に付随する欠点は、プロテアーゼ欠損細菌系統が、大腸菌系統において、例えば、phoA、fhuA、lac、rec、gal、ara、arg、thi、及びproなど、細胞の代謝及びDNA複製に関与する遺伝子の追加の変異を含むことである。これらの変異は、細胞の増殖、安定性、組換えタンパク質発現収率、及び毒性に対する効果を含めた、宿主細胞に対する多くの有害効果を有し得る。これらのゲノムの変異を1つ又は複数有する系統、特にこれらの変異を多数有する系統は、細菌の増殖速度を、産業的なタンパク質生成に適さないレベルまで低減する適応度の喪失を表し得る。さらに、あらゆる上記のゲノムの変異は、予測不可能な有害な方法で、シス及び/又はトランスにおいて他の遺伝子に影響を及ぼし、それによって系統の表現型、適応度、及びタンパク質のプロファイルを変更し得る。さらに、大幅に変異した細胞を使用することは、商用、特に治療剤に使用するための組換えタンパク質を生成するのに一般に適さない、というのは、このような系統は一般的に欠陥のある代謝経路を有し、そのため最小の培地又は化学的に規定された培地において不十分にしか増殖せず、又は全く増殖しないことがあるからである。本発明の第二の態様による細胞は、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である。本発明の第一の態様による細胞は、変異spr遺伝子、及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、野生型細菌細胞に対してやはり同質遺伝子であるのが好ましい。変異を導入するのに、最小の変異だけが細胞のゲノムに対して行われる。細胞は、細胞の増殖及び/又は対象のタンパク質を発現する能力に対して有害な効果を有し得るいかなる他の変異も有さない。したがって、本発明の1つ又は複数の組換え宿主細胞は、ゲノム配列に対してさらなる遺伝子操作された変異を含んでいる細胞に比べて改善されたタンパク質発現及び/又は改善された増殖の特徴を示し得る。本発明が提供する細胞は、細胞のゲノムに対してさらなるかく乱を含んでいる細胞に比べて、治療用タンパク質の生成における使用にもより適する。好ましい一実施形態において、細胞は、変異spr遺伝子及び野生型細胞に比べてTspタンパク質活性を低減するのに必要とされる修飾以外、W3110系統などの野生型大腸菌細胞に対して同質遺伝子である。本発明の細胞は、対象のタンパク質をコードするポリペプチドを含んでいることが野生型細胞とさらに異なっていてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、外因性でも、又は内在性でもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞中に形質転換され、且つ/又は宿主細胞のゲノム中に組み込まれた適切な発現ベクター内に含まれていてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム中に挿入される実施形態において、本発明の細胞は、対象のタンパク質をコードする挿入されたポリヌクレオチド配列のために、野生型細胞とやはり異なる。ポリヌクレオチドが細胞における発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムに対して最小のかく乱を引き起こすのが好ましい。sprタンパク質は、大腸菌の膜結合ペリプラズムプロテアーゼである。sprタンパク質の野生型アミノ酸配列を、N末端にシグナル配列を有する配列番号21、及びアミノ酸26個のシグナル配列のない配列番号22において示すUniProt受諾番号P0AFV4による。本発明におけるsprタンパク質配列のアミノ酸番号付けはシグナル配列を含んでいる。したがって、sprタンパク質のアミノ酸1は、配列番号21に示す最初のアミノ酸Metである。変異spr遺伝子が細胞の染色体spr遺伝子であるのが好ましい。変異spr遺伝子は、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質をコードしている。変異Tsp遺伝子を有する細胞は、良好な細胞増殖速度を有し得るが、これらの細胞の1つの制限は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向があることである。したがって、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型は、特に高い細胞濃度で溶解する傾向がある。変異Tsp遺伝子を有する細胞も、低いモル浸透圧濃度で熱感受性の増殖を示す。しかし、本発明の細胞が有するspr変異は、変異したTsp遺伝子を有する細胞中に導入した場合、変異Tsp表現型を抑制し、したがって、細胞は、特に高い細胞密度で溶解の低減を表す。細胞の増殖の表現型は、当業者であれば、フラスコ振盪又は高い細胞密度の発酵技術の間に容易に測定することができる。細胞溶解の表現型の抑制は、特にペリプラズムにおいて増殖速度の改善及び/又は組換えタンパク質の生成から見ることができ、Tsp変異体及び野生型sprを有する細胞に比べて、spr変異体を有し低減したTsp活性を有する細胞によって示される。本発明の第一の態様及び第二の態様の好ましい一実施形態による細胞は、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、及びH157から選択される1つ又は複数のアミノ酸の変異、好ましくはC94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、及びH157から選択される1つ又は複数のアミノ酸の変異を有するsprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる。この実施形態において、sprタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。上記のアミノ酸の1つ又は複数の変異は、アミノ酸をコードするヌクレオチドの1個、2個、又は3個に対するあらゆる適切なミスセンス変異であってよい。変異は、アミノ酸残基を、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができる変異sprタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸へ変化させる。ミスセンス変異は、アミノ酸を、野生型アミノ酸に比べて異なるサイズであり、且つ/又は異なる化学性質を有するアミノ酸へ変化させることができる。一実施形態において、変異体のspr遺伝子は、C94A、S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D又はG、H145A、G147C、及びH157Aから選択される1つ又は複数の変異を有するsprタンパク質をコードする。一実施形態において、変異は、C94、H145、及びH157のアミノ酸残基の触媒三残基の1つ、2つ、又は3つに対するものであるSolutionNMRStructureoftheNlpC/P60DomainofLipoproteinSprfromEscherichiacoliStructuralEvidenceforaNovelCysteinePeptidaseCatalyticTriad、Biochemistry、2008年、47巻、9715~9717頁。したがって、変異spr遺伝子は、C94に対する変異、又はH145に対する変異、又はH157に対する変異、又はC94及びH145に対する変異、又はC94及びH157に対する変異、又はH145及びH157に対する変異、又はC94、H145、及びH157に対する変異を含んでいてよい。この実施形態において、sprタンパク質がいかなるさらなる変異も有さないのが好ましい。C94、H145、及びH157の1つ、2つ、又は3つが、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、C94、H145、及びH157の1つ、2つ、又は3つは、Gly又はAlaなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。したがって、sprタンパク質は、C94、H145、及びH157の1つ、2つ、又は3つの変異を有することができる。spr遺伝子が、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質を生成することが見出されているミスセンス変異H145Aを含んでいるのが好ましい。本明細書の置換変異体に対する呼称は、1つの文字とそれに続く1つの数字とそれに続く1つの文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を表し、2番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。好ましい一実施形態において、変異体のsprタンパク質は、N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、及びG147から選択される1つ又は複数のアミノ酸の変異、好ましくはS95、V98、Y115、D133、V135、及びG147から選択される1つ又は複数のアミノ酸の変異を含んでいる。この実施形態において、sprタンパク質がいかなるさらなる変異を有さないのが好ましい。したがって、変異spr遺伝子は、N31に対する変異、又はR62に対する変異、又はI70に対する変異、又はQ73に対する変異、又はS95に対する変異、又はV98に対する変異、又はQ99に対する変異、又はR100に対する変異、又はL108に対する変異、又はY115に対する変異、又はD133に対する変異、又はV135に対する変異、又はL136に対する変異、又はG140に対する変異、又はR144に対する変異、又はG147に対する変異を含んでいてよい。一実施形態において、変異体sprタンパク質は、アミノ酸:S95及びY115、又はN31、Q73、R100及びG140、又はQ73、R100及びG140、又はR100及びG140、又はQ73及びG140、又はQ73及びR100、又はR62、Q99及びR144、又はQ99及びR144に対する複数の変異を含んでいる。N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、及びG147の1つ又は複数のアミノ酸は、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されてよい。例えば、N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、及びR144の1つ又は複数は、Gly又はAlaなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。好ましい一実施形態において、sprタンパク質は、1つ又は複数の以下の変異を含んでいる:N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D又はV135G、L136P、G140C、R144C、及びG147C。sprタンパク質が1つ又は複数の以下の変異を含んでいるのが好ましい:S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D又はV135G、及びG147C。この実施形態において、sprタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。一実施形態において、sprタンパク質は、N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D又はV135G、L136P、G140C、R144C、及びG147Cから選択される変異を1つ有する。この実施形態において、sprタンパク質にいかなるさらなる変異もないのが好ましい。さらなる一実施形態において、sprタンパク質は、以下から選択される複数の変異を有する:S95F及びY115FN31Y、Q73R、R100G、及びG140C、Q73R、R100G、及びG140C、R100G及びG140C、Q73R及びG140C、Q73R及びR100G、R62C、Q99P及びR144C、又はQ99P及びR144C。変異体spr遺伝子が、H145A、H157A、及びD133Aから選択される変異を有するsprタンパク質をコードするのが好ましい。本発明の第二の態様において、変異Tsp遺伝子を含んでいる細胞の表現型を抑制することができるsprタンパク質をもたらすあらゆる適切な変異又は複数の変異をspr遺伝子に対して行うことができる。好ましくは、sprタンパク質は1つ又は複数の以下の変異を有することができる:N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A、及びW174R。一実施形態において、sprタンパク質は変異W174Rを含んでいない。spr遺伝子が、本発明の第一の態様に関して上記で論じた1つ又は複数の変異を含んでいるのが好ましい。本発明による細胞は、野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性を有する。野生型細胞に比べて低減したTspタンパク質活性の表現は、細胞のTsp活性が野生型細胞のTsp活性に比べて低減していることを意味する。細胞を、Tspの活性を低減するためにあらゆる適切な手段によって修飾することができる。一実施形態において、低減したTsp活性は、Tspをコードする内在性のポリヌクレオチド、及び/又は関連する制御発現配列の修飾に由来する。修飾は、Tsp遺伝子の転写及び翻訳を低減若しくは停止してもよく、又は野生型Tspタンパク質に比べて低減したプロテアーゼ活性を有する発現されたTspタンパク質を提供することができる。一実施形態において、関連する制御発現配列を修飾してTsp発現を低減する。例えば、Tsp遺伝子に対するプロモーターを変異させて遺伝子の発現を防いでもよい。好ましい一実施形態において、本発明による細胞は、低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子、又はノックアウト変異Tsp遺伝子を有する。染色体Tsp遺伝子が変異されているのが好ましい。本明細書で用いられるTsp遺伝子は、ペニシリン結合性タンパク質-3PBP3及びファージテイルタンパク質に対して作用することができるペリプラズムプロテアーゼであるプロテアーゼTspPrcとしても知られているをコードする遺伝子を意味する。野生型Tsp遺伝子の配列を配列番号1に示し、野生型Tspタンパク質の配列を配列番号2に示す。変異Tsp遺伝子、又はTspをコードする変異Tsp遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子、又はノックアウト変異Tsp遺伝子のいずれかを意味する。低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子の表現は、本発明の文脈において、変異Tsp遺伝子が野生型の非変異Tsp遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異Tsp遺伝子が、野生型の非変異Tspタンパク質のプロテアーゼ活性の50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、又は5以下を有するTspタンパク質をコードするのが好ましい。変異Tsp遺伝子が、プロテアーゼ活性を有さないTspタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体Tspを欠いているのではなく、即ち、Tsp遺伝子配列はあらゆる形態のTspタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をTsp遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるTspタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、Tspのプロテアーゼ活性が試験されるKeilerらIdentificationofActiveSiteResiduesoftheTspProtease、THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY、270巻48号、12月1日発行、28864~28868頁、1995年、KennethC.Keiler及びRobertT.Sauerにおいて記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。TspはKeilerら上述において、残基S430、D441、及びK455を含む活性部位を有すると報告されており、残基G375、G376、E433、及びT452はTspの構造を維持するのに重要である。Keilerら上述は、変異Tsp遺伝子S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A、及びT452Aには検出可能なプロテアーゼ活性がなかったという所見を報告している。変異Tsp遺伝子S430Cは野生型活性の約5~10を示したことがさらに報告されている。したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのTsp変異は、S430、D441、K455、G375、G376、E433、及びT452の1つ又は複数の残基に対するミスセンス変異などの変異を含むことがある。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのTsp変異が、活性部位の残基S430、D441、及びK455の1つ、2つ、又は3つ全てに対するミスセンス変異などの変異を含み得るのが好ましい。したがって、変異Tsp遺伝子は以下を含むことができる:S430に対する変異、又はD441に対する変異、又はK455に対する変異、又はS430及びD441に対する変異、又はS430及びK455に対する変異、又はD441及びK455に対する変異、又はS430、D441、及びK455に対する変異。S430、D441、K455、G375、G376、E433、及びT452の1つ又は複数が、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。適切な変異の例には、S430A、S430C、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A、及びT452Aがある。変異Tsp遺伝子は、活性部位残基に対する1つ、2つ、又は3つの変異を含むことができ、例えば、遺伝子は以下を含むことができる:S430A、若しくはS430C、及び/又はD441A及び/又はK455A若しくはK455H、若しくはK455R。Tsp遺伝子が点変異S430A又はS430Cを有するのが好ましい。ノックアウト変異Tsp遺伝子の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が、Tspタンパク質を欠く細胞を提供するために、野生型遺伝子によってコードされるTspタンパク質の発現を防ぐ1つ又は複数の変異を含んでいることを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳されない。ノックアウト変異Tsp遺伝子は、タンパク質の発現をもたらさないように、例えば、1つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異され得る。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のDNA配列を挿入することによってノックアウトされてよい。好ましい一実施形態において、Tsp遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のDNA配列を挿入することによって変異されない。この実施形態において、Tsp遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに/或いは遺伝子開始コドンの下流、及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってTspタンパク質の発現を防いでいてよい。開始コドンに対する変異は、開始コドンの1つ、2つ、又は3つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは、挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。Tsp遺伝子は、コード配列の5’末端に2つのATGコドンを含んでおり、ATGコドンの1つ又は両方はミスセンス変異によって変異されてよい。Tsp遺伝子は、図11bに示す通り、第2のATGコドンコドン3からTCGコドンに変異されてよい。Tsp遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンを含んでいる。ノックアウト変異Tsp遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び1つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。好ましい一実施形態において、Tsp遺伝子は第5のコドンからTを欠失するように変異されており、それによって、図11bに示す通り、コドン11及び16に終止コドンをもたらすフレームシフトを生じている。好ましい一実施形態において、図11bに示す通り、コドン21に第3のインフレーム終止コドンを作り出すように、Tsp遺伝子はAseI制限部位を挿入するように変異される。好ましい一実施形態において、ノックアウト変異Tsp遺伝子は配列番号3のDNA配列を有し、これは開始コドンの上流にATGAATの6個のヌクレオチドを含んでいる。配列番号3のノックアウト変異Tsp配列においてなされた変異を図11bに示す。一実施形態において、変異Tsp遺伝子は、配列番号3のヌクレオチド7から2048のDNA配列を有する。一実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、DsbCをコードする組換えポリヌクレオチドをさらに含んでいる。DsbCをコードするポリヌクレオチドは、細胞中に形質転換され、及び/又は宿主細胞のゲノム中に組み入れられた適切な発現ベクター上に存在していてよい。DsbCをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノム中に挿入される実施形態において、本発明の細胞はDsbCをコードする挿入されたポリヌクレオチド配列のために、野生型細胞とやはり異なる。DsbCをコードするポリヌクレオチドが細胞中の発現ベクター中にあり、それによって宿主細胞のゲノムの最小のかく乱をもたらすのが好ましい。本明細書で用いられる組換えポリペプチドは、組換えDNA技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。DsbCをコードするポリヌクレオチド配列は、細菌細胞中に見出されるDsbCをコードする内在性の配列に同一であってよい。或いは、DsbCをコードする組換えポリヌクレオチド配列は、例えば、EcoRI部位などの制限部位が除去された、及び/又はhisタグをコードする配列を有するなど、野生型DsbC配列の変異バージョンである。DsbCは、大腸菌におけるジスルフィド結合の形成を触媒する大腸菌のペリプラズムにおいて見出された原核生物のタンパク質である。DsbCは、236個シグナルペプチドを含むの長さのアミノ酸配列、及び分子量25.6KDaを有するUniProtNo.p0AEG6。DsbCは、1994年に始めて同定されたMissiakasら、TheEscherichiacolidsbCxprAgeneencodesaperiplasmicproteininvolvedindisulfidebondformation、TheEMBOJournal、13巻8号、2013~2020頁、1994年、及びShevchikら、CharacterizationofDsbC,aperiplasmicproteinofErwiniachrysanthemiandEscherichiacoliwithdisulfideisomeraseactivity、TheEMBOJounral、13巻8号、2007~2012頁、1994年。本発明の好ましい一実施形態において、組換えグラム陰性細菌細胞は、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子、並びに/或いは変異ptr遺伝子をさらに含んでおり、変異ptr遺伝子は低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子及び/又は変異OmpT遺伝子であり、変異OmpT遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である。一実施形態において、本発明は、a.変異spr遺伝子、b.低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子、又はノックアウト変異Tsp遺伝子、c.シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性、及び/又は変異OmpTを有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子変異OmpT遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である、を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。この実施形態において、細胞のゲノムが、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。一実施形態において、本発明は、a.変異spr遺伝子、b.低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子、又はノックアウト変異Tsp遺伝子、c.変異ptr遺伝子変異ptr遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIをコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子であり、且つ/又は変異OmpTであり、変異OmpT遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である、を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。この実施形態において、細胞のゲノムが、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。一実施形態において、本発明は、a.変異spr遺伝子、b.低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードする変異Tsp遺伝子、又はノックアウト変異Tsp遺伝子、c.シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子、d.変異ptr遺伝子変異ptr遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子である、e.任意選択によって変異OmpT変異Ompt遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である、を含んでいる細胞を提供する。この実施形態において、細胞のゲノムが、上記の変異以外は野生型細菌細胞に対して同質遺伝子であるのが好ましい。本発明の一実施形態において、細胞は変異DegP遺伝子を有する。本明細書で用いられるDegPは、DegPタンパク質HtrAとしても知られているをコードする遺伝子を意味し、DegPタンパク質はシャペロン及びプロテアーゼとしての二重機能を有するFamiliesofserinepeptidases、RawlingsND、BarrettAJ.、MethodsEnzymol.、1994年、244巻、19~61頁。非変異のDegP遺伝子の配列を配列番号7に示し、非変異のDegPタンパク質の配列を配列番号8に示す。低温でDegPはシャペロンとして機能し、高温でDegPはプロテアーゼとしての機能を優先するATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell、97巻3号、339~347頁、SpiessC、BeilA、EhrmannM、及びTheproteolyticactivityoftheHtrADegPproteinfromEscherichiacoliatlowtemperatures、Skorko-GlonekJら、Microbiology、2008年、154巻、3649~3658頁。細胞がDegP変異を含んでいる実施形態において、細胞におけるDegP変異は、シャペロン活性を有するが完全なプロテアーゼを有さないDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子を提供する。シャペロン活性を有するの表現は、本発明の文脈において、変異DegPタンパク質が、野生型の非変異のDegPタンパク質に比べて同じ、又は実質的に同じシャペロン活性を有することを意味する。変異DegP遺伝子が、野生型の非変異のDegPタンパク質のシャペロン活性の50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、又は95以上を有するDegPタンパク質をコードするのが好ましい。変異DegP遺伝子が、野生型DegPに比べて同じシャペロン活性を有するDegPタンパク質をコードするのがより好ましい。低減したプロテアーゼ活性を有するの表現は、本発明の文脈において、変異DegPタンパク質が、野生型の非変異のDegPタンパク質に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異DegP遺伝子が、野生型の非変異のDegPタンパク質のプロテアーゼ活性の50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、又は5以下を有するDegPタンパク質をコードするのが好ましい。変異DegP遺伝子が、プロテアーゼ活性のないDegPタンパク質をコードするのがより好ましい。細胞は、染色体のDegPを欠くのではなく、即ち、DegP遺伝子配列は、あらゆる形態のDegPタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をDegP遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるDegPタンパク質のプロテアーゼ及びシャペロンの活性は、当業者であれば、DegPのプロテアーゼ及びシャペロン活性がDegPの天然の基質であるMalS上で試験されるSpiessらにおいて記載されている方法ATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell、97巻3号、339~347頁、SpiessC、BeilA、EhrmannM、及びまたTheproteolyticactivityoftheHtrADegPproteinfromEscherichiacoliatlowtemperatures、Skorko-GlonekJら、Microbiology、2008年、154巻、3649~3658頁において記載されている方法などのあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。DegPはセリンプロテアーゼであり、アミノ酸残基His105、Asp135、及びSer210の触媒三塩基からなる活性中心を有するFamiliesofserinepeptidases、MethodsEnzymol.、1994年、244巻、19~61頁、RawlingsN及びBarrettA。シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのDegP変異は、His105、Asp135、及びSer210の1つ、2つ、又は3つに対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。したがって、変異DegP遺伝子は以下を含んでいてよい:His105に対する変異、又は、Asp135に対する変異、又は、Ser210に対する変異、又は、His105及びAsp135に対する変異、又は、His105及びSer210に対する変異、又は、Asp135及びSer210に対する変異、又は、His105、Asp135、及びSer210に対する変異。His105、Asp135、及びSer210の1つ、2つ、又は3つは、シャペロン活性、及び低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異されていてよい。例えば、His105、Asp135、及びSer210の1つ、2つ、又は3つは、Gly又はAlaなどの小型のアミノ酸に変異されてよい。さらなる適する変異は、例えば、Asp135がLys又はArgに変異され、極性のHis105がGly、Ala、Val、又はLeuなどの非極性のアミノ酸に変異され、小型の親水性のSer210がVal、Leu、Phe、又はTyrなどの大型又は疎水性の残基に変異されるなど、His105、Asp135、及びSer210の1つ、2つ、又は3つの、反対の性質を有するアミノ酸への変化である。DegP遺伝子が、図11cに示す通り、シャペロン活性を有するがプロテアーゼを有さないタンパク質を生成することが見出されている点変異S210Aを含んでいるのが好ましいATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.Cell、97巻3号、339~347頁、SpiessC、BeilA、EhrmannM。DegPは、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介する、PDZ1残基260~358及びPDZ2残基359~448の2つのPDZドメインを有するATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.、Cell、97巻3号、339~347頁、SpiessC、BeilA、EhrmannM。本発明の一実施形態において、degP遺伝子は、PDZ1ドメイン及び/又はPDZ2ドメインを欠失するように変異される。PDZ1及びPDZ2の欠失は、DegPタンパク質のプロテアーゼ活性の完全な喪失及び野生型DegPタンパク質に比べて低下したシャペロン活性をもたらし、PDZ1又はPDZ2いずれかの欠失は、野生型DegPタンパク質に比べて5のプロテアーゼ活性及び同様のシャペロン活性をもたらすATemperature-DependentSwitchfromChaperonetoProteaseinaWidelyConservedHeatShockProtein.、Cell、97巻3号、339~347頁、SpiessC、BeilA、EhrmannM。変異DegP遺伝子は、例えば、図11cに示す通り、同定及びスクリーニング方法において助けとなるためにAseIなど、サイレントの天然に存在しない制限部位も含んでいてよい。点変異S210A及びAseI制限マーカー部位を含んでいる変異DegP遺伝子の好ましい配列を配列番号9に提供し、コードされるタンパク質配列を配列番号10に示す。配列番号9の変異DegP配列になされた変異を図11cに示す。細胞が、シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子を含んでいる本発明の実施形態において、本発明が提供する1つ又は複数の細胞は、変異細胞に比べて細胞からの正確にフォールディングされたタンパク質の収率の改善を提供することができ、DegP遺伝子は、染色体欠損DegPなど、DegP発現を防ぐノックアウトDegPに対して変異されている。DegPの発現を防ぐノックアウト変異DegP遺伝子を含んでいる細胞においてDegPのシャペロン活性は完全に失われるが、本発明による細胞においてDegPのシャペロン活性は保持され、完全なプロテアーゼ活性は失われる。これらの実施形態において、本発明による1つ又は複数の細胞は、タンパク質のタンパク質分解性を防ぐようにプロテアーゼ活性は低減されており、宿主細胞におけるタンパク質において正確なフォールディング及び輸送を可能にするようにシャペロン活性は維持されている。当業者であれば、タンパク質GHPLC、円偏光二色性、NMR、X線結晶構造解析、及びエピトープ親和性測定方法など、当技術分野においてよく知られている方法を用いて、タンパク質が正確にフォールディングされているか否かを見るために分泌されたタンパク質を試験することが容易にできる。これらの実施形態において、本発明による1つ又は複数の細胞は、DegP発現を防ぐ変異ノックアウトDegP遺伝子を有する細胞に比べて細胞の増殖が改善されていてよい。理論によって拘泥しようとするものではないが、シャペロン活性を必要とする全てのタンパク質をプロセシングする細胞の能力を増大し得るシャペロン活性をDegPプロテアーゼが保持するため、細胞増殖の改善が示され得る。したがって、細胞の増殖及び再生に必要な正確にフォールディングされたタンパク質の生成は、DegPノックアウト変異を有する細胞に比べて本発明の1つ又は複数の細胞において増大し、それによって増殖を制御する細胞の経路を改善し得る。さらに、知られているDegPプロテアーゼ欠損系統は一般に温度感受性であり、約28°Cを超える温度では通常増殖しない。しかし、本発明による細胞は温度感受性ではなく、細菌からタンパク質を生成する工業規模に通常用いられる、およそ30°Cからおよそ37°Cの温度を含めた28°C以上の温度で増殖することができる。本発明の一実施形態において、細胞は変異ptr遺伝子を有する。本明細書で用いられるptr遺伝子は、高分子量のタンパク質を分解するプロテアーゼであるProteaseIIIをコードする遺伝子を意味する。非変異のptr遺伝子の配列を配列番号4に示し、非変異のProteaseIIIタンパク質の配列を配列番号5に示す。変異ptr遺伝子、又はProteaseIIIをコードする変異ptr遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする変異ptr遺伝子、又はノックアウト変異ptr遺伝子のいずれかを意味する。低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする変異ptr遺伝子の表現は、本発明の文脈において、変異ptr遺伝子が、野生型の非変異のptr遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異ptr遺伝子が、野生型の非変異のProteaseIIIタンパク質のプロテアーゼ活性の50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、又は5以下を有するProteaseIIIをコードするのが好ましい。変異ptr遺伝子がプロテアーゼ活性を有さないProteaseIIIタンパク質をコードするのがより好ましい。この実施形態において、細胞は染色体ptrを欠いておらず、即ち、ptr遺伝子配列は、あらゆる形態のProteaseIIIタンパク質の発現を防止するように欠失又は変異されていない。低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異がptr遺伝子中に導入されてよい。グラム陰性細菌から発現されたProteaseIIIタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。ノックアウト変異ptr遺伝子の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が1つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異ptr遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、1つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のDNA配列を挿入することによってノックアウトされてよい。好ましい一実施形態において、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のDNA配列を挿入することによって変異されない。ProteaseIII遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに/或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってProteaseIIIタンパク質の発現を防いでいる。標的のノックアウト遺伝子開始コドンに対する変異は開始コドンの機能の喪失を引き起こし、それによって標的の遺伝子は確実に、コード配列の開始に適切な開始コドンを含んでいない。開始コドンに対する変異は開始コドンの1つ、2つ、又は3つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。好ましい一実施形態において、ptr遺伝子は、図11aに示す通り、ATG開始コドンがATTに変化するように変異されている。ノックアウト変異ptr遺伝子は、或いは、又はさらに、遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンを含んでいてよい。ノックアウト変異ptr遺伝子が、開始コドンに対するミスセンス変異、及び1つ又は複数の挿入された終止コドンの両方を含んでいるのが好ましい。1つ又は複数の挿入された終止コドンがインフレーム終止コドンであるのが好ましい。しかし、1つ又は複数の挿入された終止コドンは、或いは、又はさらに、フレーム外out-of-frame終止コドンであってよい。1つ又は複数のフレーム外終止コドンは、フレーム外開始コドンが挿入又は欠失のフレームシフト変異によってインフレーム開始コドンに変化される場合に翻訳を停止するのに必要とされ得る。1つ又は複数の終止コドンが、ナンセンス点変異及びフレームシフト変異を含めたあらゆる適切な変異によって導入されてよい。1つ又は複数の終止コドンがフレームシフト変異及び/又は挿入変異によって、好ましくは遺伝子配列のセグメントを、終止コドンを含んでいる配列で置換することによって導入されるのが好ましい。例えば、終止コドンTAAを含んでいるAseI制限部位を挿入してもよい。好ましい一実施形態において、ptr遺伝子は、図11aに示す通り、AseI制限部位の挿入によって、インフレーム終止コドンを挿入するように変異される。好ましい一実施形態において、ノックアウト変異ptr遺伝子は配列番号6のDNA配列を有する。配列番号6のノックアウト変異ptr遺伝子配列においてなされた変異を図11aに示す。上記に記載したノックアウト変異は、標的のノックアウト遺伝子部位の上流又は下流の染色体DNAに対して最小のかく乱を引き起こし、又はかく乱を引き起こさず、外来のDNA例えば、対象のタンパク質、特に治療用タンパク質の発現に対する細胞の適合性に影響を及ぼし得る、抗生物質耐性マーカーの挿入及び保持を必要としないので有利である。したがって、本発明による1つ又は複数の細胞は、増殖の特徴の改善及び/又は外来DNAの遺伝子コード配列中への挿入によってプロテアーゼ遺伝子がノックアウトされた細胞に比べてタンパク質発現の改善を示すことがある。一実施形態において、本発明による細胞は変異OmpT遺伝子を有する。本明細書で用いられるOmpT遺伝子は、外膜プロテアーゼであるプロテアーゼOmpT外膜プロテアーゼTをコードする遺伝子を意味する。野生型の非変異OmpT遺伝子の配列は、SWISS-PROTP09169である。変異OmpT遺伝子、又はOmpTをコードする変異OmpT遺伝子に対する言及は、別段の指摘がなければ、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする変異OmpT遺伝子、又はノックアウト変異OmpT遺伝子のいずれかを意味する。低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする変異OmpT遺伝子の表現は、本発明の文脈において、変異OmpT遺伝子が野生型の非変異OmpT遺伝子に比べて完全なプロテアーゼ活性を有さないことを意味する。変異OmpT遺伝子は、野生型の非変異OmpTタンパク質のプロテアーゼ活性の50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、又は5以下を有するOmpTタンパク質をコードしていてよい。変異OmpT遺伝子は、プロテアーゼ活性を有さないOmpTタンパク質をコードしていてよい。この実施形態において、細胞は染色体OmpTを欠くのではなく、即ち、OmpT遺伝子配列はあらゆる形態のOmpTタンパク質の発現を防ぐように欠失又は変異されていない。低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するために、あらゆる適切な変異をOmpT遺伝子中に導入することができる。グラム陰性細菌から発現されるOmpTタンパク質のプロテアーゼ活性は、当業者であれば、KramerらIdentificationofessentialacidicresiduesofoutermembraneproteaseOmpTsupportsanovelactivesite、FEBSLetters、505巻2001年426~430頁及びDekkerらSubstrateSpecitificityoftheIntegralMembraneProteaseOmpTDeterminedbySpatiallyAddressedPeptideLibraries、Biochemistry、2001年、40巻、1694~1701頁において記載されている方法など、当技術分野におけるあらゆる適切な方法によって容易に試験することができる。OmpTは、KramerらIdentificationofactivesiteserineandhistidineresiduesinEscherichiacolioutermembraneproteaseOmpT、FEBSLetters、2000年、468巻、220~224頁において報告されており、これは、セリン、ヒスチジン、及び酸性残基をアラニンによって置換すると、Glu27、Asp97、Asp208、又はHis101ではおよそ10倍活性が低減し、Ser99ではおよそ500倍活性が低減し、Asp83、Asp85、Asp210、又はHis212ではおよそ10000倍活性が低減すると開示している。Vandeputte-RuttenらCrystalStructureoftheOuterMembraneProteaseOmpTfromEscherichiacolisuggestsanovelcatalyticsite、TheEMBOJournal、2001年、20巻18号、5033~5039頁は、Asp83-Asp85対及びHis212-Asp210対を含む活性部位を有すると開示している。さらに、KramerらLipopolysaccharideregionsinvolvedintheactivationofEscherichiacolioutermembraneproteaseOmpT、Eur.J.Biochem.、FEBS、2002年、269巻、1746~1752頁は、ループL4における変異D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K/K217G、K217T、及びR218Lは全て、酵素活性の部分的又はほぼ完全な喪失をもたらすことを開示している。したがって、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生成するためのOmpT変異は、E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101、E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212、G216、K217、R218、及びE250の残基の1つ又は複数に対するミスセンス変異などの変異を含んでいてよい。E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101、E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212、G216、K217、R218、及びE250の1つ又は複数は、低減したプロテアーゼ活性を有するタンパク質をもたらすあらゆる適切なアミノ酸に変異していてよい。例えば、E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101、E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212、G216、K217、R218、及びE250の1つ又は複数は、アラニンに変異していてよい。適切な変異の例には、E27A、D43A、D83A、D85A、D97A、S99A、H101A、E111A、E136A、E193A、D206A、D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K、K217G、K217T、R218L、及びE250Aがある。一実施形態において、変異OmpT遺伝子は、D210A及びH212A変異を含んでいる。D210A及びH212A変異を含んでいる適切な変異OmpT配列を配列番号23に示す。ノックアウト変異OmpT遺伝子の表現は、本発明の文脈において、遺伝子が1つ又は複数の変異を含んでおり、それによって、ノックアウト変異遺伝子によってコードされるタンパク質を欠く細胞を提供するように、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を引き起こさないことを意味する。ノックアウト遺伝子は、部分的又は完全に転写され得るが、コードタンパク質に翻訳され得ない。ノックアウト変異OmpT遺伝子は、タンパク質の発現を引き起こさないように、例えば、1つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異によるなど、あらゆる適切な方法において変異されてよい。例えば、遺伝子は、遺伝子コード配列中に、抗生物質耐性マーカーなどの外来のDNA配列を挿入することによってノックアウトされてよい。一実施形態において、OmpT遺伝子は、遺伝子開始コドン、並びに/或いは遺伝子開始コドンの下流及び遺伝子終止コドンの上流に位置する1つ又は複数の終止コドンに対する変異を含んでおり、それによってOmpTタンパク質の発現を防いでいる。開始コドンに対する変異は開始コドンの1つ、2つ、又は3つ全てのヌクレオチドのミスセンス変異であってよい。適切な変異ノックアウトOmpT配列を配列番号24に示す。或いは、又はさらに、開始コドンは挿入又は欠失のフレームシフト変異によって変異されてよい。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ompTを欠くなど、ノックアウト変異ompT遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体degPを欠くなど、ノックアウト変異degP遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、変異degP遺伝子を有さない。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ptrを欠くなど、ノックアウト変異ptr遺伝子を有さない。ノックアウト変異を含めた多くの遺伝子操作された変異は、上首尾に変異させた細胞の選択及び同定を可能にする抗生物質耐性マーカーの使用を伴う。しかし、上記で論じたように、抗生物質耐性マーカーの使用には数々の不都合がある。本発明のさらなる一実施形態は、抗生物質耐性マーカーを使用する上記の不都合を克服するものであり、変異Tsp遺伝子、変異spr遺伝子、及び任意選択によって変異DegP遺伝子、及び/又は変異ptr遺伝子、及び/又は変異OmpT遺伝子は1つ又は複数の制限マーカー部位を含むように変異される。制限部位は遺伝子中に遺伝子操作され、天然に存在しない。制限マーカー部位が有利であるのは、制限マーカー部位により、必要とされる染色体の変異を含んでいる正確に修飾されている細胞のスクリーニング及び同定が可能になるからである。1つ又は複数の変異プロテアーゼ遺伝子を有するように修飾された細胞は、天然に存在しない制限マーカー部位を含むゲノムDNAの領域を増幅するようにデザインされたオリゴヌクレオチド対を用いて、細胞溶解物からゲノムDNAのPCRによって分析することができる。増幅されたDNAを、次いで、天然に存在しない制限マーカー部位でDNAを消化することができる適切な制限酵素とインキュベートする前及び後にアガロースゲル電気泳動によって分析してもよい。制限酵素とインキュベートした後にDNAフラグメントが存在すれば、細胞が、1つ又は複数の変異遺伝子を有するように上首尾に修飾されたことを確認している。細胞が配列番号6のDNA配列を有するノックアウト変異ptr遺伝子を有する実施形態において、配列番号17及び配列番号18に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムDNAから天然に存在しないAseI制限部位を含むDNAの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムDNAを、AseI制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムDNA中の変異ptr遺伝子の存在を確認してもよい。細胞が、配列番号3のDNA配列又は配列番号3のヌクレオチド7から2048を有するノックアウト変異Tsp遺伝子を含んでいる実施形態において、配列番号15及び配列番号16に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムDNAから天然に存在しないAseI制限部位を含んでいるDNAの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムDNAを、AseI制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムDNA中の変異Tsp遺伝子の存在を確認してもよい。細胞が、配列番号9のDNA配列を有する変異DegP遺伝子を含んでいる実施形態において、配列番号19及び配列番号20に示すオリゴヌクレオチドプライマー配列を用いて、形質転換した細胞のゲノムDNAから天然に存在しないAseI制限部位を含んでいるDNAの領域を増幅してもよい。次いで、増幅したゲノムDNAを、AseI制限酵素とインキュベートし、ゲル電気泳動によって分析して、ゲノムDNA中の変異DegP遺伝子の存在を確認してもよい。1つ又は複数の制限部位を、1つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入することができる。制限部位を、上記に記載した通り、開始コドンの変異、及び/又は1つ若しくは複数の終止コドンを導入するような変異によって導入することができる。この実施形態が有利であるのは、制限マーカー部位が、導入されるノックアウト変異の直接的且つ独特なマーカーであるからである。AseI制限部位など、インフレームの終止コドンを含む制限マーカー部位を挿入してもよい。挿入される制限部位が制限マーカー部位及び終止コドンの両方として作用して遺伝子コード配列の完全な転写を防ぐので、これは特に有利である。例えば、終止コドンがAseI部位の導入によってptr遺伝子に導入される実施形態において、これは、図11aに示すように制限部位をまた作り出す。例えば、終止コドンがAseI部位の導入によってコドン21のTsp遺伝子に導入される実施形態において、これは、図11bに示すように、制限部位をまた作り出す。制限マーカー部位を、開始コドンに対する変異、及び任意選択によって1つ又は複数のさらなる点変異によって挿入してもよい。この実施形態において、制限マーカー部位がEcoRI制限部位であるのが好ましい。開始コドンに対する変異は制限マーカー部位も作り出すので、これは特に有利である。例えば、ptr遺伝子の開始コドンがATTに変更される実施形態において、これは、図11aに示すようにEcoRIマーカー部位をまた作り出す。例えば、Tsp遺伝子の開始コドンコドン3がATGからTCGに変更される実施形態において、図1bに示すように、コドン2のAACからAATへのさらなる点変異、及びコドン3のATGからTCGへの変異は、図11bに示すように、EcoRI制限マーカー部位を作り出す。細胞が変異OmpT遺伝子を有する本発明の実施形態において、1つ又は複数の制限部位を、1つ又は複数の欠失、挿入、点、ミスセンス、ナンセンス、及びフレームシフトの変異を含むあらゆる適切な変異によって導入してもよい。例えば、OmpT遺伝子が変異D210A及びH212Aを含んでいる実施形態において、これらの変異は、選択マーカーとして用いることができるサイレントのHindIII制限部位を導入する。DegP遺伝子及びspr遺伝子において、マーカー制限部位を、サイレントコドン変化を用いて導入してもよい。例えば、AseI部位をサイレントの制限マーカー部位として用いてもよく、変異DegP遺伝子に対して図11cに示すように、TAA終止コドンはフレーム外である。ptr遺伝子及び/又はTsp遺伝子が低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIII又はTspをコードするように変異されている本発明の実施形態において、1つ又は複数のマーカー制限部位を、サイレントのコドン変化を用いて導入してもよい。本発明による組換えグラム陰性細菌細胞はあらゆる適切な手段によって生成され得る。当業者であれば、染色体の遺伝子配列を、変異遺伝子配列で置換するのに用いることができる適切な技術を知っている。相同的組換えによって宿主の染色体中に組み込むのを可能にする適切なベクターを用いることができる。適切な遺伝子置換方法は、例えば、HamiltonらNewMethodforGeneratingDeletionsandGeneReplacementsinEscherichiacoli、HamiltonC.M.ら、JournalofBacteriology、1989年9月、171巻9号、4617~4622頁、SkorupskiらPositiveselectionvectorsforallelicexchange、SkorupskiK及びTaylorR.K.、Gene、1996年、169巻、47~52頁、KielらAgeneralmethodfortheconstructionofEscherichiacolimutantsbyhomologousrecombinationandplasmidsegregation、KielJ.A.K.W.ら、MolGenGenet、1987年、207巻、294~301頁、BlomfieldらAllelicexchangeinEscherichiacoliusingtheBacillussubtilissacBgeneandatemperaturesensitivepSC101replicon、BlomfieldI.C.ら、MolecularMicrobiology、1991年、5巻6、1447~1457頁、並びにRiedらAnnptI-sacB-sacRcartridgeforconstructingdirected,unmarkedmutationsinGram-negativebacteriabymarkerexchange-evictionmutagenesis、RiedJ.L.及びCollmerA.、Gene、57巻1987年、239~246頁に記載されている。相同組換え/置換を可能にする適切なプラスミドはpKO3プラスミドであるLinkら、1997年、JournalofBacteriology、179巻、6228~6237頁。上首尾に変異させた系統を、コロニーPCRDNA配列決定及びコロニーPCR制限酵素マッピングを含めた当技術分野においてよく知られている方法を用いて同定してもよい。細胞が2つ以上の変異染色体遺伝子を含んでいる実施形態において、変異遺伝子を、グラム陰性細菌中の同じ又は異なるベクター上に導入してもよい。一実施形態において、本発明によるグラム陰性細菌細胞は、染色体ompTを欠くなど、ノックアウト変異ompT遺伝子を有さない。本発明による細胞は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいてよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、外来性でも、又は内在性でもよい。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、宿主の染色体中に組み込まれてもよく、又は通常はプラスミドであるベクター中に非組入れnon-integratedであってもよい。一実施形態において、本発明による細胞は対象のタンパク質を発現する。対象のタンパク質は、本明細書の文脈において、通常は組換えポリペプチドである、発現用のポリペプチドを意味するものとされる。しかし、対象のタンパク質は、宿主細胞において内在性の遺伝子から発現される内在性タンパク質であってもよい。本明細書で用いられる、組換えポリペプチドは、組換えDNA技術を用いて構築又は生成されるタンパク質を意味する。対象のタンパク質は、外来性のベクターから発現された、内在性のタンパク質若しくはその変異バージョン例えば、減弱された生物学的活性を有するものに同一の外来性の配列であってよく、又はそのフラグメントであってよい。或いは、対象のタンパク質は、宿主細胞によって通常発現されない、異種性のタンパク質であってよい。対象のタンパク質は、治療用、予防用、又は診断用のタンパク質を含めたあらゆる適切なタンパク質であってよい。一実施形態において、対象のタンパク質は、炎症性疾患及び障害、免疫疾患及び障害、線維性障害、並びに癌を含めた疾患又は障害の処置において有用である。炎症性疾患又は障害、及び免疫疾患又は障害の語は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックルウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、SLE全身性エリテマトーデス、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、I型糖尿病、移植、及び移植片対宿主病を含む。線維性障害の語は、特発性肺線維症IPF、全身性硬化症又は強皮症、腎臓線維症、糖尿病性腎症、IgA腎症、高血圧、末期腎不全、腹膜線維症連続の外来腹膜透析、肝硬変、加齢黄斑変性ARMD、網膜症、反応性心臓線維症cardiacreactivefibrosis、瘢痕、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成、冠状動脈バイパス手術、関節形成術、及び白内障手術を含む。癌の語は、上皮から生じ、皮膚中又はより一般的には身体器官例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱、又は腸の内膜に見出される悪性の新たな増殖を含む。癌は、隣接の組織中に浸潤し、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳などの遠位の器官に広がる転移傾向がある。タンパク質は、タンパク質分解感受性のポリペプチド、即ち、自然状態又は分泌の間のいずれかにおいて、大腸菌などの1つ又は複数のグラム陰性細菌、プロテアーゼによって切断を受けやすく、切断に感受性であり、又は切断されるタンパク質であってよい。一実施形態において、対象のタンパク質は、DegP、ProteaseIII、及びTspから選択されるプロテアーゼに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼTspに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるDegP及びProteaseIIIに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるDegP及びTspに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、プロテアーゼであるTsP及びProteaseIIIに対してタンパク質分解感受性である。一実施形態において、対象のタンパク質は、DegP、ProteaseIII、及びTsPに対してタンパク質分解感受性である。タンパク質が真核生物のポリペプチドであるのが好ましい。本発明による細胞によって発現される対象のタンパク質は、例えば免疫原、2つの異種性のタンパク質を含む融合タンパク質、又は抗体であってよい。対象のタンパク質として用いるための抗体には、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、又はキメラ抗体が含まれる。抗体はあらゆる種からのものであってよいが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、又はヒト化フラグメントに由来しているのが好ましい。抗体は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、若しくはIgA又はサブクラスに由来していてよく、例えば、マウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ、若しくはヒトを含めたあらゆる種から得ることができる。抗体フラグメントの部分は、1つを超える種から得ることができ、例えば、抗体フラグメントはキメラであってよい。一例において、定常領域はある種からであり、可変領域は別の種からである。抗体は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子であってよく、又はそのフラグメント、例えば、PCT/GB2008/003331に記載されている通り、VH、VL、VHH、Fab、修飾Fab’、Fab’、Fab’2、Fv、scFvフラグメント、Fab-Fv、又は二重特異性抗体、例えば、Fab-dAbであってよい。抗体はあらゆる標的の抗原に特異的であってよい。抗原は、細胞に付随するタンパク質、例えば、細菌細胞、酵母菌細胞、T細胞、内皮細胞、若しくは腫瘍細胞などの細胞状の細胞表面タンパク質であってよく、又は可溶性タンパク質であってよい。対象の抗原はまた、疾患若しくは感染の間に上方制御されるタンパク質などのあらゆる医学的に関連のあるタンパク質、例えば、受容体であってよく、且つ/又はこれらの対応するリガンドであってもよい。細胞表面タンパク質の特定の例には、接着分子、例えば、β1インテグリンなどのインテグリン、例えば、VLA-4、E-セレクチン、Pセレクチン、若しくはL-セレクチン、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134OX40、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1、若しくはCSF1受容体、DPCR1、DPCR1、ヅヅリンdudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、ネクチン様2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胎児性抗原CEA、ヒト乳脂肪グロブリンHMFG1及び2、MHCクラスI及びMHCクラスII抗原、KDR及びVEGF、及び好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。可溶性抗原には、インターロイキン、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16、又はIL-17、例えば、IL17A及び/又はIL17F、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス抗原又はサイトメガロウイルス抗原、免疫グロブリン、例えば、IgE、インターフェロン、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子TNF以前は腫瘍壊死因子-αとして知られていた、腫瘍壊死因子-β、コロニー刺激因子、例えば、G-CSF又はGM-CSF、及び血小板由来増殖因子、例えば、PDGF-α及びPDGF-β、並びに好適な場合にはこれらの受容体が含まれる。他の抗原には、細菌の細胞表面抗原、細菌の毒素、ウイルス、例えば、インフルエンザ、EBV、HepA、B、及びC、生物テロ薬剤、放射性核種及び重金属、並びにヘビ毒及びクモ毒、及び毒素が含まれる。一実施形態において、対象の抗原の活性を機能的に変更するのに抗体を用いることができる。例えば、抗体は、前記抗原の活性を、直接的又は間接的に、中和し、拮抗するantagonize、又は作用しアゴナイズ:agonise得る。本発明は、低減したプロテアーゼ活性を有するTspタンパク質をコードし、又はノックアウト変異Tsp遺伝子である変異Tsp遺伝子、変異体sprをコードする変異体spr遺伝子、及びTNFに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞も提供する。好ましい一実施形態において、WO01/094585この内容は参照によって本明細書に組み込まれるに記載されている通り、本発明による細胞によって発現される対象のタンパク質は、抗TNF抗体、より好ましくは抗TNFFab’である。一実施形態において、ヒトTNFαに対する特異性を有する抗体は重鎖を含んでおり、可変ドメインは、CDRH1に対して配列番号26に示す配列、CDRH2に対して配列番号27若しくは配列番号32に示す配列、又はCDRH3に対して配列番号28に示す配列を有するCDRを含んでいる。一実施形態において、抗体は軽鎖を含んでおり、可変ドメインは、CDRL1に対して配列番号29に示す配列、CDRL2に対して配列番号30に示す配列、又はCDRL3に対して配列番号31に示す配列を有するCDRを含んでいる。上記に言及した配列番号26、及び配列番号28から配列番号32に示したCDRは、マウスモノクローナル抗体hTNF40に由来する。しかし、配列番号27はハイブリッドCDRからなる。ハイブリッドCDRは、マウスモノクローナル抗体hTNF40配列番号32からの重鎖CDR2の部分、及びヒトグループ3生殖系列V領域配列からの重鎖CDR2の部分を含んでいる。一実施形態において、抗体は重鎖可変ドメインは、CDRH1に対して配列番号26に示す配列、CDRH2に対して配列番号27若しくは配列番号32に示す配列、又はCDRH3に対して配列番号28に示す配列を有するCDRを含んでいる、及び軽鎖可変ドメインは、CDRL1に対して配列番号29に示す配列、CDRL2に対して配列番号30に示す配列、又はCDRL3に対して配列番号31に示す配列を有するCDRを含んでいるを含んでいる。一実施形態において、抗体は、CDRH1に対して配列番号26、CDRH2に対して配列番号27又は配列番号32、CDRH3に対して配列番号28、CDRL1に対して配列番号29、CDRL2に対して配列番号30、及びCDRL3に対して配列番号31を含んでいる。抗体がCDRH2に対して配列番号27を含んでいるのが好ましい。抗TNF抗体がCDRグラフト化抗体分子であるのが好ましい。好ましい一実施形態において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーCDRを含んでいる。抗体分子がヒトTNF以前はTNFαとして知られていたに対して特異性を有するのが好ましく、軽鎖は配列番号11の軽鎖可変領域を含んでおり、重鎖は配列番号12の重鎖可変領域を含んでいる。抗TNF抗体がFab又はFab’のフラグメントであるのが好ましい。ヒトTNFに対して特異性を有する抗体分子がFab’であり、配列番号13を含んでいる、又はそれからなる軽鎖配列、及び配列番号14を含んでいる、又はそれからなる重鎖配列を有するのが好ましい。発現後、抗体フラグメントを、例えば、エフェクター分子などの別の実体に対してコンジュゲートすることによってさらにプロセシングしてもよい。本明細書で用いられるエフェクター分子の語には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素例えば、細菌若しくは植物起源の酵素的に活性な毒素及びこれらのフラグメント、例えば、リシンricin及びそのフラグメント生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成の、又は天然に存在するポリマー、核酸及びこれらのフラグメント、例えば、DNA、RNA、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーターグループ、例えば、蛍光化合物又はNMR若しくはESR分光法によって検出され得る化合物が含まれる。エフェクター分子は、あらゆる適切な方法によって抗体又はそのフラグメントに付着していてよく、例えば、抗体フラグメントは、WO05/0031731又はWO05/003170これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられるに記載されている通り、少なくとも1つのエフェクター分子で付着するように修飾されていてよい。WO05/003171又はWO05/003170も適切なエフェクター分子も記載している。一実施形態において、所望により、抗体又はそのフラグメント、例えばFabをPEG化して必要とされる性質、例えば、抗体全体に類似の性質を有する生成物を生成する。例えば、抗体は、WO01/094585に記載されている通り、PEG化した抗TNFα-Fab’であってよく、好ましくは、重鎖のC末端終端でリシル-マレイミド由来の基lysyl-maleimide-derivedgroupでシステイン残基の1つに付着しており、リシル残基の2つのアミノ基の各々はこれを、分子量約20000Daを有するメトキシポリエチレングリコール残基に共有結合させており、その結果メトキシポリエチレングリコール残基の合計平均分子量は約40000Daであり、より好ましくはリシル-マレイミド由来の基は、[1-[[[2-[[3-2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル-1-オキソプロピル]アミノ]エチル]アミノ]-カルボニル]-1,5-ペンタンジイル]ビスイミノカルボニルである。細胞はまた、1つ又は複数のさらなる対象のタンパク質をコードするさらなるポリヌクレオチド配列を含んでいてよい。一実施形態において、野生型が精製の間に対象の組換えタンパク質と同時精製することが知られている1つ又は複数の大腸菌宿主タンパク質は、Humphreysら、EngineeringofEscherichiacolitoimprovethepurificationofperiplasmicFab’fragments:changingthepIofthechromosomallyencodedPhoS/PstSprotein、ProteinExpressionandPurification、37巻2004年、109~118頁及びWO04/035792これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられるにおいて記載されている通り、遺伝子修飾用に選択される。このような修飾された宿主タンパク質の使用により、これらが組換え抗体と最早同時精製されないように、選択された大腸菌タンパク質の物理的性質を変更することによって、大腸菌において生成された対象のタンパク質、特に抗体に対する精製プロセスが改善される。変更される大腸菌タンパク質が、リン酸結合性タンパク質PhoS/PstS、ジペプチド結合性タンパク質DppA、マルトース結合性タンパク質MBP、及びチオレドキシンの1つ又は複数から選択されるのが好ましい。一実施形態において、汚染性の宿主タンパク質の物理的性質は、アミノ酸タグをC末端又はN末端に添加することによって変更される。好ましい一実施形態において、変更される物理的性質は等電点であり、アミノ酸タグはC末端に付着するポリアスパラギン酸タグである。一実施形態において、前記タグの添加によって変更される大腸菌タンパク質は、ジペプチド結合性タンパク質DppA、マルトース結合性タンパク質MBP、チオレドキシン、及びリン酸結合性タンパク質PhoS/PstSである。詳しい一実施形態において、大腸菌のリン酸結合性タンパク質PhoS/PstSのpIは、アスパラギン酸残基を6個含んでいるポリアスパラギン酸タグPolyDをC末端に加えることよって7.2から5.1に低減される。単独で、又はN末端若しくはC末端にタグを加えることとの組合せのいずれかで、その物理的性質を変更するための、汚染性の大腸菌タンパク質の特定の残基の修飾も好ましい。このような変更は、pI又は疎水性を変更するためのタンパク質又はアミノ酸置換基のサイズを変更するための挿入又は欠失を含むことができる。一実施形態において、これらの残基はタンパク質の表面上に位置する。好ましい一実施形態において、タンパク質のpIを低減するために、PhoSタンパク質の表面残基が変更される。機能的なPhoSタンパク質を維持するために、リン酸塩の結合において重要であると関係付けられている残基Bass、US5,304,472を回避するのが好ましい。タンパク質の表面から遠くはなれて突出している、又は塩基性残基の大型の基である、若しくは塩基性残基の大型の基の近くにあるリシン残基を標的にするのが好ましい。一実施形態において、PhoSタンパク質はC末端に付着しているヘキサポリアスパラギン酸タグを有し、分子の反対の終端にある表面残基が置換用に標的にされる。選択されたリシン残基が、中性残基から酸性残基に変わる場合よりも大きな潜在的なpI変化を付与するようにグルタミン酸又はアスパラギン酸を置換するのが好ましい。本明細書における置換変異体に対する呼称は、文字とその後に続く数字、その後に続く文字からなる。最初の文字は野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定する。数字はアミノ酸置換が行われるアミノ酸位置を意味し、2番目の文字は野生型アミノ酸を置換するのに用いられるアミノ酸を指定する。本発明におけるPhoSの好ましい変異において、リシン残基K275、107、109、110、262、265、266、309、313は、単一変異又は複合変異としてグルタミン酸E又はグルタミンQに対して置換され、さらにリシンK318は、単一変異又は複合変異としてアスパラギン酸Dに対して置換されてよい。単独の変異がK262E、K265E、及びK266Eであるのが好ましい。複合変異がK265/266E及びK110/265/266Eであるのが好ましい。全ての変異が、C末端で付着しているポリアスパラギン酸PolyDタグと、任意選択によってK318D置換とも組み合わされるのがより好ましい。好ましい一実施形態において、変異は少なくとも2単位のpIにおける低減をもたらす。本発明の変異がPhoSのpIを7.2から約4と約5.5との間に低減するのが好ましい。本発明の一実施形態において、大腸菌のPhoSタンパク質のpIは、polyDK318D、polyDK265/266E、及びpolyDK110/265/266の変異を用いて、7.2からそれぞれ約4.9、約4.8、及び約4.5に低減される。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、好ましくは、成熟ポリペプチドのN末端に特異的な切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドとの融合物として発現されてよい。選択される異種性のシグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされるものでなければならない。天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物の宿主細胞では、シグナル配列は原核生物のシグナル配列によって置換されている。適切なシグナル配列には、OmpA、PhoA、LamB、PelB、DsbA、及びDsbCが含まれる。上記に列挙した成分の1つ又は複数を含んでいる適切なベクターの構築は、標準のライゲーション技術を用いるものである。単離したプラスミド又はDNAフラグメントを、必要とするプラスミドを生成するのに望ましい形態において、切断し、誂え、再ライゲーションre-ligatedする。一実施形態において、1つ又は複数の対象のタンパク質及び1つ又は複数の制御発現配列をコードする1つ又は複数のタンパク質コード配列を典型的に含んでいる対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するために、本発明において発現カセットが用いられる。1つ又は複数の制御発現配列はプロモーターを含んでいてよい。1つ又は複数の制御発現配列は、終止配列などの3’非翻訳領域も含んでいてよい。適切なプロモーターを以下により詳しく論じる。一実施形態において、本発明による細胞は、プラスミドなどのベクターを含んでいる。ベクターが上記に規定した1つ又は複数の発現カセットを含んでいるのが好ましい。対象のタンパク質が重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体である実施形態において、第1のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードし、第2のベクターが重鎖ポリペプチドをコードする、2つのベクターを細胞系にトランスフェクトしてもよい。或いは、ベクターが軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含んでいる、単一のベクターを用いてもよい。本発明において用いるためのベクターは、上記で定義した発現カセットを挿入することによって、適切なベクター中に生成することができる。或いは、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を指示するための制御発現配列がベクターに含まれていてよく、したがってポリヌクレオチドのコード領域だけがベクターを完成するのに必要とされ得る。本発明によるポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換するのに用いることができるベクターの例には:プラスミド、例えば、pBR322若しくはpACYC184、及び/又はウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾンが含まれる。多くの形態の発現ベクターが入手可能である。このようなベクターは、通常、プラスミドのDNA複製開始点、抗生物質の選択マーカー、プロモーター、及びマルチクローニング部位によって分離されている転写ターミネーター発現カセット、及びリボソーム結合部位をコードするDNA配列を含んでいる。本発明において用いられるプロモーターは、関連のポリヌクレオチドに直接連結していてよく、又は代替として好適な位置に、例えば、関連のポリペプチドが関連のプロモーターに挿入された場合に関連のプロモーターに対して作用することができるようなベクター中に位置していてよい。一実施形態において、プロモーターは、それに対してプロモーターが作用するポリヌクレオチドのコード部分の前に、例えば、ポリヌクレオチドの各コード部分の前の関連のプロモーターに位置している。本明細書で用いられる前はプロモーターが、コードするポリヌクレオチド部分に関して5プライムエンドに位置することを意味するものとされる。プロモーターは、宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なプロモーターには、Lac、tac、trp、PhoA、Ipp、Arab、Tet、及びT7が含まれる。用いられる1つ又は複数のプロモーターは誘導プロモーターであってよい。細菌系において用いるための発現ユニットは、対象のポリペプチドをコードするDNAに作動可能にリンクしているシャインダルガノS.D.リボソーム配列も一般に含んでいる。ポリヌクレオチド配列が、例えば、抗体軽鎖及び抗体重鎖など、2つ以上の対象のタンパク質に対するコード配列を2つ以上含んでいる本発明の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、mRNAの中央における翻訳開始を可能にする1つ又は複数の配列内リボソーム進入部位IRES配列を含んでいてよい。IRES配列は、コードされたポリペプチド配列を生成するためのmRNAの別々の翻訳を増強するためにコードするポリヌクレオチド配列間に位置していてよい。発現ベクターが、WO03/048208又はWO2007/039714これらの内容は参照によって本明細書に組み入れられるに記載されている抗体又はその抗原結合性フラグメントを生成するためのジシストロン性のメッセージも含んでいるのが好ましい。好ましくは、抗体の軽鎖をコードするDNAを含んでいる上流のシストロン、及び対応する重鎖をコードするDNAを含んでいる下流のシストロン、並びにジシストロン性の遺伝子間配列IGSが、IGS1配列番号34、IGS2配列番号35、IGS3配列番号36、及びIGS4配列番号37から選択される配列を含んでいるのが好ましい。ターミネーターは宿主細胞に対して内在性でも、又は外因性でもよい。適切なターミネーターはrrnBである。プロモーター及びターミネーター並びにタンパク質ターゲティング方法を含んでいるさらなる適切な転写レギュレーターは、StrategiesforAchievingHigh-LevelExpressionofGenesinEscherichiacoli、SavvasC.Makrides、MicrobiologicalReviews、1996年9月、512~538頁に見ることができる。抗体分子は、細胞から分泌されることもあり、又は適切なシグナル配列によってペリプラズムに対して標的化することもある。或いは、抗体分子は細胞の原形質内に蓄積することもある。抗体分子がペリプラズムに対して標的化するのが好ましい。ポリヌクレオチドに関して本明細書に記載する本発明の実施形態は、ベクター、発現カセット、及び/又はこれらに用いられる成分を含む宿主など、関連する態様をこれらに適用することができる限り、本発明の代替の実施形態に等しく適用されるものである。本発明の第三の態様にしたがって、本発明の第一の態様又は第二の態様において上記に記載した組換えグラム陰性細菌細胞において対象の組換えタンパク質を発現させることを含む、対象の組換えタンパク質を生成するための方法を提供する。本発明の方法において用いるのが好ましいグラム陰性細菌細胞及び対象のタンパク質は、上記に詳しく記載したものである。対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが外来性である場合、ポリヌクレオチドを当技術分野において知られているあらゆる適切な手段を用いて宿主細胞中に組み入れることができる。ポリヌクレオチドが、細胞中に形質転換される発現ベクターの部分として組み入れられるのが典型的である。したがって、本発明による細胞の一態様は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。ポリヌクレオチド配列を、塩化ルビジウム、PEG、又は電気穿孔を用いるなど、標準の技術を用いて細胞中に形質転換してもよい。本発明による方法は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで上首尾に形質転換されている安定な細胞の選択を促進する選択系も用いることができる。選択系は通常、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列の同時形質転換を使用する。一実施形態において、細胞中に形質転換された各ポリヌクレオチドは、1つ又は複数の選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでいる。したがって、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの形質転換、及びマーカーをコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドの形質転換は一緒に生じ、選択系を用いて所望のタンパク質を生成するこれらの細胞を選択することができる。1つ又は複数のマーカーを発現することができる細胞は、細胞中に組み入れられる選択系のポリペプチド/遺伝子又はポリペプチド成分によって付与される性質例えば、抗生物質耐性のために、例えば、毒素又は抗生物質の添加など、ある種の人工的に課せられた条件下で生存/増殖/繁殖することができる。1つ又は複数のマーカーを発現することができない細胞は、人工的に課せられた条件下で生存/増殖/繁殖することができない。人工的に課せられる条件は、所望により幾分強力であるように選択され得る。本発明においてあらゆる適切な選択系を用いることができる。典型的に、選択系は、例えば、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はアンピリシン耐性の遺伝子など、既知の抗生物質に対して耐性をもたらすベクターの1つ又は複数の遺伝子中に含まれていることに基づいていてよい。関連の抗生物質の存在下で増殖する細胞は、これらが抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子及び所望のタンパク質の両方を発現するように選択されてよい。一実施形態において、本発明による方法は、培地中で形質転換された細胞を培養し、それによって対象のタンパク質を発現させるステップをさらに含む。対象のタンパク質を発現させるために、本発明において、誘導可能な発現系又は構成的プロモーターを用いることができる。適切な誘導可能な発現系及び構成的なプロモーターは、当技術分野においてよく知られている。形質転換細胞を培養するのにあらゆる適切な培地を用いることができる。例えば、培地中で増殖するように上首尾に形質転換されている細胞だけを可能にするように、培地は抗生物質を含み得るなど、培地を特定の選択系に適応させてもよい。培地から得た細胞を、所望により、さらにスクリーニング及び/又は精製にかけてもよい。方法は、所望により対象のタンパク質を抽出及び精製する1つ又は複数のステップをさらに含むことができる。ポリペプチドを、原形質、ペリプラズム、又は上清からを含む、系統から回収することができる。タンパク質を精製するために用いる特定の方法単数又は複数はタンパク質のタイプに依存する。適切な方法には、イムノ-アフィニティカラム、又はイオン交換カラム上での分画化、エタノール沈澱、逆相HPLC、疎水性-相互作用クロマトグラフィー、シリカ上クロマトグラフィー、HAROSE及びDEAEなどのイオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、硫酸アンモニウム沈澱、及びゲルろ過が含まれる。抗体を、培養培地及び/又は原形質抽出物及び/又はペリプラズム抽出物から、従来の抗体精製手順、例えば、タンパク質A-セファロース、タンパク質Gクロマトグラフィー、タンパク質Lクロマトグラフィー、チオフィリックthiophilic、混合モード樹脂mixedmoderesins、Hisタグ、FLAGタグ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム、エタノール、又はPEG分画/沈澱、イオン交換膜、膨張床吸着クロマトグラフィーEBA、又は擬似移動床クロマトグラフィーなどによって適切に分離することができる。方法は、対象のタンパク質の発現量を測定し、高発現レベルの対象のタンパク質を有する細胞を選択するさらなるステップも含むことができる。方法は、抗体又は抗体フラグメントなどの対象のタンパク質のペグ化などの1つ又は複数のさらなる下流のプロセシングのステップも含むことができる。本明細書に記載する1つ又は複数の方法のステップを、バイオリアクターなどの適切な容器において組み合わせて行ってもよい。例1細胞系統MXE001ΔTspの生成MXR001系統を以下の通り生成した:Tspカセットを、SalI、NotI制限フラグメントとして、同様に制限したpKO3プラスミド中に移動させた。pKO3プラスミドは、温度感受性変異体のpSC101複製開始点RepAを、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いる。レバンスクラーゼをコードするsacB遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に致死的であり、したがってクロラムフェニコールマーカー及びpSC101開始点と一緒に用いて脱組込みde-integration及びプラスミドキュアリング事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されているHamiltonら、1989年、JournalofBacteriology、171巻、4617~4622頁、及びBlomfieldら、1991年、MolecularMicrobiology、5巻、1447~1457頁。pKO3系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主ゲノムから除去する。以下のプラスミドを構築した。EcoRI及びAseI制限マーカーを含んでいる、配列番号3に示すノックアウト変異Tsp遺伝子を含んでいるpMXE191。次いで、プラスミドを、Miller,E.M.及びNickoloff,J.A.におけるEscherichiacolielectrotransformation、MethodsinMolecularBiology、47巻、Nickoloff,J.A.編集、HumanaPress、Totowa、NJ、105巻1995年に見られる方法を用いて調製した、電気的コンピテント大腸菌W3110細胞中に形質転換した。1日目大腸菌細胞40μlを、冷却したBioRad0.2cm電気穿孔キュベット中、pKO3DNA10pg1μgと混合し、その後2500V、25μF、及び200Ωで電気穿孔した。2×PY1000μlを直ちに加え、30°Cのインキュベーター中で1時間、250rpmで振盪することによって細胞を回収した。細胞を2×PY中1/10に段階希釈し、その後100μlのアリコートを、クロラムフェニコール20μgを含み30°C及び43°Cに予め温めた2×PY寒天平板上に塗抹した。平板を30°C及び43°Cで一夜インキュベートした。2日目30°Cで増殖させたコロニーの数により電気穿孔の効果が推定されたが、43°Cの増殖を生存したコロニーは潜在的な組入れ事象を表している。43°Cの平板から単一のコロニーを拾い、2×PY10ml中に再懸濁した。この100μlを、ショ糖5w/vを含み30°Cに予め温めた2×PY寒天平板上に塗抹して単一のコロニーを生成させた。平板を30°Cで一夜インキュベートした。3日目ここでコロニーは、潜在的な同時の脱組込み及びプラスミドキュアリング事象を表す。脱組込み及びキュアリング事象が増殖における初期に生じた場合、大部分のコロニー塊はクローンとなる。単一のコロニーを拾い、クロラムフェニコール20μg/ml又は5w/vショ糖のいずれかを含む2×PY寒天上にレプリカプレーティングした。平板を30°Cで一夜インキュベートした。4日目ショ糖上で増殖し、且つクロラムフェニコール上で死滅した両方のコロニーは、潜在的な染色体の置換及びプラスミドキュアリング事象を表している。これらを拾い、変異特異的なオリゴヌクレオチドでPCRによってスクリーニングした。正確なサイズのPCR陽性のバンドを生じたコロニーを削除して、ショ糖5w/vを含む2×PY寒天上で単一のコロニーを生成し、平板を30°Cで一夜インキュベートした。5日目PCR陽性、クロラムフェニコール感受性、及びショ糖耐性の大腸菌の単一のコロニーを用いてグリセロール株、化学的コンピテント細胞を作製し、5’及び3’に隣接するオリゴとのPCR反応用のPCR鋳型として作用させて、Taqポリメラーゼを用いた直接DNA配列決定用のPCR生成物を生成した。オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、図1a、1b、及び1cに示す通り、天然に存在しないAseI制限部位を含んでいるTsp遺伝子の領域をPCR増幅することによって、変異Tsp遺伝子を有するゲノムDNAの上首尾な修飾を確認するために細胞系統MXE001を試験した。次いで、変異遺伝子における天然に存在しないAseI制限部位の存在を確認するために、AseI制限酵素でのインキュベートの前及び後に、DNAの増幅した領域をゲル電気泳動によって分析した。この方法を以下の通り行った。以下のオリゴを用いて、PCRを用い、MXE001及びW3110から調製した大腸菌細胞可溶化物からゲノムDNAを増幅した。細胞のコロニー1個を、1×PCRバッファー20μl中95°Cで10分間加熱することによって、可溶化物を調製した。混合物を室温に放冷し、次いで13200rpmで10分間遠心した。上清を除去し、細胞可溶化物のラベルを付けた。Tspオリゴ対を用いて各系統を増幅した。DNAを標準のPCR手順を用いて増幅した。5μlバッファー×1Roche1μldNTP混合物Roche、10mM混合物1.5μl5’オリゴ5pmol1.5μl3’オリゴ5pmol2μl細胞可溶化物0.5μlTaqDNAポリメラーゼRoche5U/μl38.5μlH2OPCRサイクル94°C1分94°C1分55°C1分30サイクル繰返し72°C1分72°C10分反応が完了したら25μlをAseIでの消化用に新たな微量遠心管に移した。PCR反応25μlに、H2O19μl、バッファー3NEB5μl、AseINEB1μlを加え、混合し、37°Cで2時間インキュベートした。残りのPCR反応に、ローディングバッファー×65μlを加え、20μlを0.8TAE200mlアガロースゲルInvitrogen上にローディングし、エチジウムブロマイド貯蔵液10ml/mlを5μlを加え、100ボルトで1時間泳動させた。サイズマーカーPerfectDNAマーカー0.1~12kb、Novagen10μlを最終レーンにローディングした。AseI消化が完了したら、ローディングバッファー×610μlを加え、20μlを0.8TAEアガロースゲルInvitrogen上にローディングし、エチジウムブロマイド10ml/ml貯蔵液を5μlを加え、100ボルトで1時間泳動した。サイズマーカーPerfectDNAマーカー0.1~12kb、Novagen10μlを最終レーンにローディングした。ゲルを両方ともUVトランスイルミネーターを用いて可視化した。増幅したゲノムフラグメントは、Tspに対して2.8kbの正確なサイズバンドを示した。引き続きAseIで消化させると、Tsp欠損系統MXE001に導入されたAseI部位の存在が確認されたが、W3110コントロールでは確認されなかった。MXE001:Tspプライマーセットを用いてゲノムDNAを増幅し、得られたDNAをAseIで消化して2.2kbps及び0.6kbpsのバンドを生成した。W3110のPCR増幅したDNAは、AseI制限酵素によって消化されなかった。例2spr変異体の生成spr変異を、相補性アッセイを用いて生成し選択した。spr遺伝子を、1000bpあたり1つから2つの変異を導入するClontech登録商標ランダム変異ダイバーシティPCRキットを用いて変異させた。変異sprPCRDNAを、spr変異体と一緒にCDP870Fab’を発現する誘導発現ベクター[pTTOCDP870]中にクローニングした。次いで、このライゲーションを、Miller,E.M.及びNickoloff,J.A.、Escherichiacolielectrotransformation、MethodsinMolecularBiology、47巻、Nickoloff,J.A.編集、HumanaPress、Totowa、NJ、105巻1995年において見られる方法を用いて、大腸菌系統MXE001ΔTsp中に電気的形質転換した。以下のプロトコールを用いた。電気的コンピテントMXE00140μl、ライゲーション2.5μlDNA100pgを0.2cm電気穿孔キュベット中に加え、以下の条件、2500V、25μF、及び200ΩでBioRadGenepulserXcellを用いて電気的形質転換を行った。電気的形質転換後、SOCInvitrogen1ml37°Cに予め加温を加え、穏やかに振盪して細胞を37°C1時間回復させた。細胞をHypotonic寒天酵母菌抽出物5g/L、トリプトン2.5g/L、寒天15g/L全てDifco上に塗抹し、40°Cでインキュベートした。コロニーを形成した細胞をHLB上に43°Cで再塗抹し、MXE001系統に対して低浸透圧条件下高温で増殖する能力の回復を確認した。選択したクローンからプラスミドDNAを調製し、配列決定してspr変異を同定した。この方法を用いて、sprタンパク質における、以下の通りΔTsp表現型を補足する8つの単一の変異、1つのダブル変異、及び2つの複数の変異を単離した:1.V98E2.D133A3.V135D4.V135G5.G147C6.S95F及びY115F7.I70T8.N31T、Q73R、R100G、G140C9.R62C、Q99P、R144C10.L108S11.L136P例3spr変異を有する変異体大腸菌細胞系統の生成例2で同定した1から5の個々の変異、並びにsprC94A、H145A、H157A及びW174Rの3つの触媒三残基の変異を用いて、複合のΔTsp/変異体spr系統を作製するための例1からのspr変異系統又はMXE001系統を作り出すために、いずれかの野生型W3110大腸菌系統遺伝子型:F-LAM-INrrnD-RRnE1rph1ATCCno.27325を用いて新たな系統を生成した。MXE001を作製するための例1に記載した通り、遺伝子置換ベクター系を用いて、pKO3相同組換え/置換プラスミドを用いて、以下の変異体の大腸菌細胞系統を作製したLinkら、1997年、JournalofBacteriology、179巻、6228~6237頁。変異体spr組入れカセットを、SalI、NotI制限フラグメントとして、同様に制限したpKO3プラスミド中に移動した。プラスミドは、温度感受性変異体のpSC101複製開始点RepAを、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いている。レバンスクラーゼをコードするsacB遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に対して致死的であり、したがってクロラムフェニコールマーカー及びpSC101開始点と一緒に脱組込み及びプラスミドのキュアリングの事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されているHamiltonら、1989年、JournalofBacteriology、171巻、4617~4622頁、及びBlomfieldら、1991年、MolecularMicrobiology、5巻、1447~1457頁。pKO3系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主のゲノムから除去する。SalI制限部位をクローン同定用に除去するspr配列内にサイレント変異を含んでいる変異spr遺伝子を含んでいる、下記に列挙するpK03ベクターを構築した。pMXE336、pK03sprS95F-SalIpMXE337、pK03sprY115F-SalIpMXE338、pK03sprG147C-SalIpMXE339、pK03sprD133A-SalIpMXE340、pK03sprV135D-SalIpMXE341、pK03sprV135G-SalIpMXE342、pK03sprV98E-SalIpMXE343、pK03sprC94A-SalIpMXE344、pK03sprH145A-SalIpMXE345、pK03sprH157A-SalIpMXE346、pK03sprW174R-SalI次いで、これらのプラスミドを、Miller,E.M.及びNickoloff,J.A.、Escherichiacolielectrotransformation、MethodsinMolecularBiology、47巻、Nickoloff,J.A.編集、HumanaPress、Totowa、NJ、105巻1995年に見られる方法を用いて調製した、化学的コンピテント大腸菌W3110細胞中に、又は例1からのMXE001系統中に形質転換して、表1に示す通り、複合のΔTsp/変異体spr系統を作製した。1日目電気的コンピテント大腸菌細胞又はMXE001細胞を、冷却したBioRad0.2cm電気穿孔キュベット中、pKO3DNA10pg1μgと混合し、その後2500V、25μF、及び200Ωで電気穿孔した。2×PY1000μlを直ちに加え、30°Cのインキュベーター中で1時間、250rpmで振盪することによって細胞を回収した。細胞を2×PY中1/10に段階希釈し、その後100μlのアリコートを、クロラムフェニコール20μgを含み30°C及び43°Cに予め温めた2×PY寒天平板上に塗抹した。平板を30°C及び43°Cで一夜インキュベートした。2日目30°Cで増殖させたコロニーの数により電気穿孔の効果が推定されたが、43°Cの増殖を生存したコロニーは潜在的な組入れ事象を表している。43°Cの平板から単一のコロニーを拾い、2×PY10ml中に再懸濁した。この100μlを、ショ糖5w/vを含み30°Cに予め温めた2×PY寒天平板上に塗抹して単一のコロニーを生成させた。平板を30°Cで一夜インキュベートした。3日目ここでコロニーは、潜在的な同時の脱組込み及びプラスミドキュアリング事象を表す。脱組込み及びキュアリング事象が増殖における初期に生じた場合、大部分のコロニー塊はクローンとなる。単一のコロニーを拾い、クロラムフェニコール20μg/ml又は5w/vショ糖のいずれかを含む2×PY寒天上にレプリカプレーティングした。平板を30°Cで一夜インキュベートした。4日目ショ糖上で増殖し、且つクロラムフェニコール上で死滅した両方のコロニーは潜在的な染色体の置換及びプラスミドキュアリング事象を表している。これらを拾い、SalI部位の喪失に対してPCRプラス制限消化によってスクリーニングした。正確なサイズのPCR陽性のバンド及びSalIによる消化に対する耐性を生じたコロニーを削除して、ショ糖5w/vを含む2×PY寒天上で単一のコロニーを生成し、平板を30°Cで一夜インキュベートした。5日目PCR陽性、クロラムフェニコール感受性、及びショ糖耐性の大腸菌の単一のコロニーを用いてグリセロール株、化学的コンピテント細胞を作製し、5’及び3’に隣接するオリゴとのPCR反応用のPCRテンプレートとして作用させて、Taqポリメラーゼを用いた直接DNA配列決定用のPCR生成物を生成して正確な変異を確認した。例4spr変異体系統における抗TNFFab’の発現例3において提供したspr変異体系統MXE008、MXE009、MXE012及びMXE017及び例1において提供したMXE001の系統を、CDP870Fab’に対する発現ベクター配列番号13に示す軽鎖配列及び配列番号14に示す重鎖配列を有する抗TNFFab’であるプラスミドpMXE117pTTOCDP870IGS2で形質転換したが、この発現ベクターは、Sambrookら、1989年、Molecularcloning:alaboratorymanual.、CSHLpress、N.Y.に見ることができる従来の制限クローニング法を用いて構築されたものである。プラスミドpMXE117pTTOCDP870又は40.4IGS17は以下の特徴:強力なtacプロモーター及びlacオペレーター配列を含んでいた。Fab軽鎖及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌OmpAタンパク質からのシグナルペプチドをコードするDNAを、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移動を指示する軽鎖及び重鎖両方の遺伝子配列5’末端に融合させた。転写を二重転写ターミネーターrrnBt1t2を用いて終結させた。lacIq遺伝子は構成的に発現されるLacIリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はIPTGの存在によって抑制解除が誘導されるまで、tacプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はp15Aであり、低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。系統の形質転換を、ChungC.Tら、Transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution.、PNAS、86巻、2172~2175頁1989年に見られる方法を用いて行った。例5フラスコ振盪培養物を用いた変異大腸菌系統における抗TNFFab’の発現spr変異体系統MXE008、MXE009、MXE012、及びMXE017を、抗TNFαFab’の増殖及び発現をW3110及びMXE001に対して比較するフラスコ振盪実験において試験した。用いたフラスコ振盪実験のプロトコールは以下の通りに行った:5mlフラスコ振盪実験単一のコロニーを拾って、10μg/mlのテトラサイクリンを加えた5mlLB中に入れ、250rpmで振盪しながら30°Cで一夜増殖させた。一夜の培養物を用いて、100mlプラステトラサイクリンに接種して0.1OD600即ち、4のODに対して100/4×0.1=100ml中に2.5mlとした。このマスター培養物を用いて、各時間点に対して培養試験管3×5mlを準備した。基準培養物1本をOD測定用の試料に準備した。最初は増殖を肉眼でモニタリングしながら培養物を30°C、250rpmで振盪し、次いで対照の培養物をサンプリングすることによって、0.5OD600の培養物を捕らえた通常約2時間。培養物が0.5を超えるODを達成したら、IPTGを各培養試験管に加えて濃度200μM0.04Mを25μlとした。誘導後必要とされる時間点例えば、1時間、2時間に培養試験管を取り除き、氷上に維持した。13200rpmで5分間遠心分離後、細胞ペレットをペリプラズマ抽出バッファー100mMTris.Cl/10mMEDTApH7.4200μl中に再懸濁した。ペリプラズマ抽出物を250rpm、30°Cで一夜撹拌した。翌日、抽出物を13200rpmで10分間遠心分離し、上清をデカントして捨て、ペリプラズマ抽出物として-20°Cで貯蔵した。使用済みの細胞ペレットは廃棄した。ELISA定量96ウェルELISAプレートを、PBS中2μg/mlのAB141ウサギ抗ヒトCH1、UCBで4°C一夜コーティングした。試料/コンジュゲートバッファーPBS、BSA0.2w/v、Tween200.1v/v300μgで3回洗浄後、プレート上で試料/コンジュゲートバッファー100μl中試料及び標準の1/2段階希釈を行い、プレートを室温で1時間、250rpmで撹拌した。洗浄バッファーPBS、Tween200.1v/v300μlで3回洗浄後、試料/コンジュゲートバッファー中1/1000希釈後、リビーリングrevealing抗体6062ウサギ抗ヒトκHRPコンジュゲートしたもの、TheBindingSite、Birmingham、英国100μlを加えた。次いで、プレートを室温で1時間、250rpmで撹拌した。洗浄バッファー3×300μlで洗浄後、TMB基質100μlを加えTMB溶液の50:50混合物Calbiochm:dH2O、自動プレートリーダーを用いてA630を記録した。好適なアイソタイプの精製Fab’標準と比較することによって、ペリプラズマ抽出物中のFab’の濃度を算出した。図1は、野生型W3110及びMXE001と比べたMXE008及びMXE009の改善された増殖を示す。図2は、野生型W3110及びMXE001と比べたMXE008及びMXE009系統からのFab’の改善された発現を示す。図5は、野生型W3110及びMXE001に比べた、MXE0012及びMXE017の改善された増殖を示す。図6は、野生型W3110及びMXE001に比べた、MXE0012及びMXE017の改善されたFab’の発現を示す。例6高密度発酵を用いたspr変異大腸菌系統の増殖及び変異大腸菌系統におけるFab’の発現MXE008、MXE009、MXE001系統及び野生型W3110細胞をプラスミドpMXE117で形質転換し、増殖及び抗TNFαFab’の発現と比べる発酵実験において試験した。増殖培地発酵増殖培地は、NaH2PO4H2O3.86g/l及びグリセロール112g/lを有するSM6E培地Humphreyら、2002年、ProteinExpressionandPurification、26巻、309~320頁に記載をベースとした。接種接種培養物を、テトラサイクリン10μg/mlを補った同じ培地中で増殖させた。培養物をおよそ22時間、撹拌しながら30°Cでインキュベートした。発酵発酵槽総容積2.5リットルに、接種培養物を0.3~0.5OD600に接種した。温度は増殖相の間は30°Cに維持し、誘導前に25°Cに下げた。溶存酸素濃度を、可変性の撹拌及びエアフローによって空気飽和を30上回って維持した。15v/vNH4OH及び10v/v濃H2SO4で自動滴定することによって、培養物のpHを7.0で制御した。10v/vStruktolJ673溶液SchillandSeilacherを加えることによって泡立ちを制御した。発酵の様々な段階で数々の添加を行った。バイオマス濃度がおよそ40OD600に到達したらマグネシウム塩及びNaH2PO4H2Oを加えた。誘導相の前及び間にNaH2PO4H2Oのさらなる添加を行って、確実にリン酸塩が過剰に維持されるようにした。発酵の初期に存在したグリセロールが枯渇したらおよそ75OD600、80w/wの継続的なグリセロールの供給を適用した。発酵における同じ時点に170μMのIPTGの供給を適用した。IPTG供給の開始を誘導の開始と理解した。発酵は、典型的に、グリセロール供給速度0.5から2.5ml/hの間の範囲で64~120時間行った。バイオマス濃度及び増殖速度の測定600nmでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。ペリプラズム抽出細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を-20°Cで保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー100mMTris-HCl、10mMEDTA、pH7.4中、元の培養体積に再懸濁した。およそ16時間、60°Cでインキュベートした後、遠心分離によって抽出物を澄明にし、上清分画を分析用に-20°Cで保持した。Fab’定量ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のFab’濃度を、Humphreysら、2002年、ProteinExpressionandPurification、26巻、309~320に記載されている通り、Fab’アセンブリーELISAによって、タンパク質GHPLCを用いて決定した。HiTrapタンパク質GHP1mlカラムGE-Healthcare又は同等物に分析物およそ中性のpH、30°C、0.2μmろ過を2ml/分でローディングし、カラムを20mMリン酸塩、50mMNaCl、pH7.4で洗浄し、次いで50mMグリシン/HClpH2.7の注入を用いてFab’を溶出した。溶出されたFab’をAgilient1100又は1200HPLCシステム上A280によって測定し、既知濃度の精製Fab’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。図3は、コントロールW3110及びMXE001と比べたMXE008及びMXE009の増殖プロファイルを示しており、これは、増殖プロファイルは、MXE001、MXE008、及びMXE009に対して最初のおよそ26時間にわたって実質的に同じであり、W3110に比べて全て高いことを示している。およそ26時間後、MXE001に対する増殖速度は細胞溶解のため低下する。しかし、spr変異体細胞系統であるMXE008及びMXE009は引き続き良好な増殖速度を示し、26時間後も溶解しない。図4は、コントロールW3110及びMXE001と比べた、大腸菌系統MXE008及びMXE009からのペリプラズム黒記号及び上清白記号からのFab’の合計収率を示す。MXE008及びMXE009系統は、W3110及びMXE001に比べて高いペリプラズマのFab’発現を示す。さらに、MXE001、並びにMXE008及びMXE009も、MXE001に比べて低い上清Fab’レベルを示し、MXE008及びMXE009においてMXE001に比べて低減した細胞溶解を示す。図7は、Fab’生成性の発酵の間のMXE001及びMXE008の増殖プロファイルを示す。データは、バイオマス蓄積の間、Δtsp系統MXE001に比べて、Δtspspr変異体系統MXE008の初期の増殖速度における小規模な増大、及び発酵の最後およそ20時間における、MXE001系統に比べたMXE008の非常に著しく増大した生存を図示するものである。図8は、Fab’生成性の発酵の間の、W3110、MXE001Δtsp、及びMXE008ΔtspsprD112Aに対するペリプラズマのFab’蓄積実線及び記号並びに培地のFab’蓄積点線及び白記号を示す。データは、MXE008系統ではMXE001系統に比べて初期のペリプラズマFab’蓄積において小規模な増大を図示しており、この増大はFab’蓄積段階の後半の間により顕著になる。MXE001におけるΔtsp変異に、MXE008におけるspr変異を加えることは、ΔtspMXE001系統で観察される漏出性の表現型に実質的に対抗する。この改善された性能は、MXE008系統ではMXE001系統に比べてより高いペリプラズマの収率をもたらし、MXE008系統ではMXE001系統に比べて培養培地中に漏出したFab’の低減した蓄積をもたらす。例7系統におけるDNA漏出及び総タンパク質量の決定dsDNAアッセイW3110、MXE001、MXE008、及びMXE012系統の上清中への二本鎖DNAの漏出を、Quant-ITPicogreendsDNAアッセイキットInvitrogen、Ref:P11496を用いて決定した。1~1000μg/mLの範囲に提供されたDNA標準を希釈することによって、検量線を調製した。蛍光の読みが方法の直線範囲に入るように500から1000倍、試料をTEバッファー中希釈した。96ウェルプレートにおいて、希釈試料又は標準100μLを、Picogreen試薬100μLと混合し、プレートを光線から保護して室温で5分間インキュベートした。蛍光の計数値を、励起フィルタ485nm、及び発光フィルタ535nmを用いて0.1秒間測定した。結果を図9に示す。タンパク質アッセイW3110、MXE001、MXE008、及びMXE012系統の総タンパク質濃度を、CoomassiePlusBradfordアッセイキットPierce、Ref:23236を用いて決定した。ウシ血清アルブミン標準を25~1000μg/mLの範囲にわたって希釈することによって、検量線を作成した。光学密度が方法の直線範囲内に入るように試料を水で希釈し5から10倍、試料又は標準の33μLをクーマシー試薬1mLと混合した。室温で10分間インキュベートした後、クーマシー試薬をブランクとして分光光度計上でOD595nmを読んだ。総タンパク質濃度を検量線に基づいて算出した。結果を図10に示す。本発明を、好ましい実施形態を参照にして特に示し、記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定される通り、本発明の範囲から逸脱することなしに形態及び詳細において様々な変更を行うことができることが理解されよう。"