"蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質がホモグルタミンを含む前記組成物。蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも75一致するアミノ酸配列を含む請求項1に記載の組成物。組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項1に記載の組成物。ホモグルタミンを直交tRNAO-tRNAに負荷する活性直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSの選択方法であって、1O-tRNAO-tRNAはO-tRNAを含む細胞集団のメンバーに直交性であると;2集団の1個以上の細胞においてO-tRNAにホモグルタミンを負荷する1個以上の活性O-RSメンバーを含む複数のO-RSと;3選択マーカーをコードし、O-tRNAにより認識される少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと;4ホモグルタミンを併有する細胞集団に選択を実施し、複数のRSを含まず且つO-tRNAを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性O-RSを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と;ターゲット細胞を選択することにより、活性O-RSを選択する段階を含む前記方法。O-tRNAにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットO-RSを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項4に記載の方法。選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項4に記載の方法。複数のRSが突然変異体RS、第1の種以外の1種以上の種に由来するRS、又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両者を含む請求項4に記載の方法。請求項4に記載の方法により同定された直交アミノアシルtRNAシンテターゼ。特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、少なくとも1個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と;ホモグルタミンを提供する段階を含み;前記細胞が更に、セレクターコドンを認識する直交tRNAO-tRNAと;O-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含み;更に、セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。O-RSがE444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項9に記載の方法。4塩基セレクターコドンを認識する第1の直交tRNAO-tRNAと;前記O-tRNAに第1の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと;終止セレクターコドンを認識する第2のO-tRNAと;第2のO-tRNAに第2の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第2のO-RSを含む翻訳系。4塩基セレクターコドンがAGGAである;終止コドンがUAGである;或いは翻訳系が細胞を含む;請求項11に記載の翻訳系。第1又は第2のO-tRNAが直交リシルtRNAリシルO-tRNA又はその修飾変異体である;或いは第1のO-tRNAが直交リシルtRNAリシルO-tRNA又はその修飾変異体であり、第2のO-tRNAが直交チロシルtRNAチロシルO-tRNA又はその修飾変異体である;請求項11に記載の翻訳系。少なくとも4塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含む核酸を更に含む請求項11に記載の翻訳系。4塩基セレクターコドンがAGGAであり、終止セレクターコドンがTAG又はUAGである;或いは核酸が発現されたRNAである;請求項14に記載の翻訳系。翻訳系が核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも2種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項14に記載の翻訳系。蛋白質がホモグルタミンを含む;或いは蛋白質がミオグロビンに相同である;請求項16に記載の翻訳系。ホモグルタミンを含む請求項11に記載の翻訳系。PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はその保存変異体をコードする核酸。配列番号24もしくは配列番号26又はその保存変異体に対応するtRNAを含むか又はコードする核酸。本発明は直交tRNAと直交アミノアシルtRNAシンテターゼを使用して蛋白質産物を生産する新規翻訳系を提供する。本発明は構築された翻訳系、翻訳系の使用方法、及び翻訳系により生産された翻訳産物に関する。この技術は本明細書に記載するような多数の用途に適用され、限定されないが、例えば、治療用製品、診断用試薬及び産業用酵素の生産が挙げられる。1側面において、本発明は直交リシルtRNAリシルO-tRNA又は前記O-tRNAの修飾変異体及び/又は直交リシルtRNAに1種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RS又は前記O-RSの修飾変異体を使用する翻訳系を提供する。所定態様では、翻訳系は細胞例えば大腸菌細胞内に含まれる。場合によりO-tRNAと結合されたアミノ酸は非天然アミノ酸、例えばホモグルタミンである。翻訳系の所定態様において、リシルO-tRNA、O-tRNAの変異体、O-RS、又はO-tRNAとO-RSの両者はPyrococcushorikoshiiPhKRSに由来する。翻訳系で使用される各種O-RSとしてはPhKRS、E444G、PhΔAD、及びPhΔADのI41及び/又はS268突然変異体が挙げられる。所定態様では、PyrococcushorikoshiiO-RSは大腸菌細胞で発現されると、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体の毒性以下の毒性を示す。リシルO-tRNA又は変異体O-tRNAは場合により4塩基コドン又はアンバーコドンの認識配列を含む。例えば、リシルO-tRNA又は変異体はAGGAの認識配列を含む。翻訳系の関連側面において、リシルO-tRNA又は変異体はCUXnXXXAA配列をもつアンチコドンループを使用する。この側面の所定態様では、CUXnXXXAA配列はCUCUAAA又はCUUCCUAAとすることができる。例としては、配列番号24又は配列番号26に記載の配列を含むリシルO-tRNA又はその変異体が挙げられる。本発明の所定態様では、O-RS、リシルO-tRNA又は変異体はE444G、PhΔAD、又はPhΔADのI41及び/又はS268突然変異体を配列番号24又は配列番号26のO-tRNAと併用する場合の少なくとも50の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。他の態様では、翻訳系は付加O-RSと付加O-tRNAを使用し、これらの付加成分はリシルO-tRNA又はO-tRNA変異体とリシルO-tRNA又はO-tRNA変異体に優先的に負荷するO-RSにより抑圧されるフレームシフトセレクターコドンとは異なるフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。他の態様では、翻訳系はターゲットポリペプチドをコードするターゲット核酸において4塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンの両者を抑圧する。4塩基セレクターコドンは場合によりAGGA配列を使用し、終止セレクターコドンは場合によりTAG又はUAG配列を使用する。所定態様では、翻訳系は4塩基セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む。翻訳系は場合によりターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む。例えば、この蛋白質はホモグルタミン残基を含むことができる。翻訳系は場合により4塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンをコードするターゲット核酸を含む。所定側面では、翻訳系はターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質は少なくとも2種の異なる非天然アミノ酸を含む。本発明は例えば4塩基セレクターコドンを認識する第1の直交tRNAO-tRNAと、前記O-tRNAに第1の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第1の直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと、終止セレクターコドンを認識する第2のO-tRNAと、第2のO-tRNAに第2の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第2のO-RSを使用する翻訳系を提供する。1態様では、4塩基セレクターコドンはAGGAであり、終止セレクターコドンはUAGである。場合により、翻訳系は細胞内に含まれる。翻訳系の所定態様では、第1又は第2のO-tRNAは直交リシルtRNAリシルO-tRNA又は修飾変異体である。場合により、第1のO-tRNAは直交リシルtRNAリシルO-tRNA又は適切な変異体であり、第2のO-tRNAは直交チロシルtRNAチロシルO-tRNA又は適切な変異体である。場合により、翻訳系は少なくとも4塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンをコードする核酸を含む。これらの態様では、4塩基セレクターコドンはAGGAとすることができ、終止セレクターコドンはTAG又はUAGとすることができ、翻訳すべき核酸は一般に発現されたRNAである。所定態様では、核酸によりコードされる蛋白質は少なくとも2種の異なる非天然アミノ酸例えばホモグルタミンと求電子性アミノ酸等の第2の非天然アミノ酸を含む。翻訳系は各種非天然アミノ酸の任意のものを含むことができ、例えばホモグルタミンが挙げられる。1例では、翻訳系内の蛋白質はミオグロビンに相同であるが、ホモグルタミン等の非天然アミノ酸を含む。本発明は限定されないが、PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はこれらの蛋白質の保存変異体のアミノ酸配列を含む組成物を提供する。本発明は同様に、PhKRS、E444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はこれらの配列の保存変異体をコードする核酸を提供する。本発明は配列番号24もしくは配列番号26又はこれらの配列の任意保存変異体に対応するtRNAを一部に含むか又は前記tRNAのみから構成される核酸を提供する。他の側面では、本発明は限定されないが、直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含む組成物を提供し、前記O-RSはO-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。このO-RSはPhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はこの蛋白質の任意保存変異体に対応する突然変異を含むことができる。所定態様では、前記O-RSはPhΔADのI41及び/又はS268突然変異体の少なくとも50の効率でO-tRNAを優先的にアミノアシル化する。所定態様では、O-RSはPyrococcushorikoshiiに由来する。O-RSとO-tRNAの両者が組成物中に存在する所定態様では、O-tRNAは4塩基セレクターコドン例えば、AGGA配列を認識する。上記組成物が細胞を含むか又は細胞内に存在する所定態様ではO-RSは例えば大腸菌細胞とすることができる細胞内で1種以上の核酸によりコードすることができる。組成物は翻訳系を含むことができる。細胞を含み、O-RSが前記細胞で1種以上の核酸によりコードされる組成物において、細胞は第1のセレクターコドンを認識する直交-tRNAO-tRNAとホモグルタミンを更に含むことができ、例えば前記O-RSはO-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、細胞は該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含むことができ、ターゲット核酸はO-tRNAにより認識されるセレクターコドンをコードする。O-tRNAは場合により配列番号24もしくは配列番号26に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列により完全又は部分的にコードされ、O-RSはE444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体に対応するアミノ酸配列、又は前記配列の任意保存変異体を含む。当然のことながら、本明細書に記載する任意核酸配列はRNA又はDNA形で表すことができ、従って、そうでないことが文脈から明らかな場合を除き、配列番号24又は25等の配列は明示しているか否かに拘わらず、場合によりRNA及び/又はDNA形を含む。所定態様では、O-RSとO-tRNAはE444G、PhΔAD、又はPhΔADのI41及び/又はS268突然変異体を配列番号24又は配列番号26のO-tRNAと併用する場合の少なくとも50の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。組成物が細胞を含む態様では、細胞は大腸菌細胞とすることができる。この組成物の細胞は異なる付加O-tRNA/O-RS対と異なる付加非天然アミノ酸を更に含むことができ、O-tRNAは第2のセレクターコドンを認識し、O-RSはO-tRNAを第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。細胞は場合により第1及び第2のセレクターコドンをコードするターゲット核酸を更に含むことができる。更に、この組成物の細胞はターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含むことができ、前記蛋白質は少なくとも2種の異なる非天然アミノ酸を含む。本発明は少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質も提供する。所定態様では、蛋白質は野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はこれらの蛋白質の任意部分の配列に少なくとも75一致するアミノ酸配列を含む。場合により、蛋白質は医薬的に許容可能なキャリヤーと併存している。別の側面では、本発明はホモグルタミンを直交tRNAO-tRNAに負荷する活性直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSの選択方法を提供する。これらの方法は細胞集団に選択を実施する第1段階を使用し、細胞は1O-tRNAO-tRNAはO-tRNAを含む細胞集団のメンバーに直交性であると;2集団の1個以上の細胞においてO-tRNAにホモグルタミンを負荷する1個以上の活性O-RSメンバーを含む複数のO-RSと;3選択マーカーをコードし、O-tRNAにより認識される少なくとも1個のセレクターコドンをコードするポリヌクレオチドと;4ホモグルタミンを併有する。この選択では、複数のRSを含まず且つO-tRNAを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性O-RSを含むターゲット細胞を集団から同定する。本方法の第2段階は活性O-RSを含むターゲット細胞を選択する選択操作である。本発明は更に前記選択法の任意のものにより同定された直交アミノアシルtRNAシンテターゼを提供する。これらの方法の所定態様では、O-tRNAにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットO-RSを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する。所定態様では、選択はポジティブ選択であり、選択マーカーはポジティブ選択マーカーである。これらの方法の各種態様では、複数のRSは各種起源の任意のものに由来することができ、限定されないが、突然変異体RS、第1の種以外の1種以上の種に由来するRS、又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両者が挙げられる。本発明は更に特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法を提供する。本方法は、少なくとも1個のセレクターコドンをコードし、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み、例えば細胞はセレクターコドンを認識する直交tRNAO-tRNAと、O-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを更に含み;更にホモグルタミンを提供する段階と;セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。この方法の1態様では、O-RSのアミノ酸配列はE444G、PhΔAD、PhΔADのI41及び/又はS268突然変異体、又はその保存変異体のアミノ酸配列を完全又は部分的に使用する。定義本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば細胞と言う場合には2個以上の細胞の組合せを含み、細菌と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。本欄及び本明細書の他の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。直交リシルtRNA:本明細書で使用する直交リシルtRNAリシル-O-tRNAとは該当翻訳系に直交なtRNAであり、tRNAは1天然に存在するリシルtRNAと同一であるか又は実質的に類似しているか、2自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するリシルtRNAから誘導されるか、31又は2の野生型又は突然変異体リシルtRNA配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、4野生型又は突然変異体リシルtRNAと相同であるか;5表1にリシルtRNAシンテターゼの基質として示す任意特定tRNAと相同であるか、あるいは6表1にリシルtRNAシンテターゼの基質として示す任意特定tRNAの保存変異体である。リシルtRNAはアミノ酸を負荷された状態でも負荷されない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、リシル-O-tRNAは場合によりコグネイトシンテターゼによりリジン以外のアミノ酸例えばアミノ酸ホモグルタミンを負荷アミノアシル化される。実際に、当然のことながら、本発明のリシル-O-tRNAは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。直交リシルアミノ酸シンテターゼ:本明細書で使用する直交リシルアミノ酸シンテターゼリシル-O-RSとは該当翻訳系においてリシル-O-tRNAをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。リシル-O-RSをリシル-O-tRNAに負荷するアミノ酸は天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本発明では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するリシルアミノ酸シンテターゼと同一もしくは相同であるか、又は表1にリシル-O-RSとして示すシンテターゼと同一もしくは相同である。例えば、リシル-O-RSは表1のリシル-O-RSの保存変異体とすることができ、及び/又は表1のリシル-O-RSと少なくとも50、60、70、80、90、95、98、99又はそれ以上配列が一致することができる。直交:本明細書で使用する直交なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、又は細胞の内在成分と共働できない分子例えば直交tRNAO-tRNA及び/又は直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを意味する。tRNA及びアミノアシルtRNAシンテターゼに関して直交とは、内在tRNAが内在tRNAシンテターゼと共働する場合に比較して直交tRNAが内在tRNAシンテターゼと共働できないか又は低効率でしか共働できず、あるいは、内在tRNAシンテターゼが内在tRNAと共働する場合に比較して直交アミノアシルtRNAシンテターゼが内在tRNAと共働できないか又は低効率でしか共働できず、例えば20未満、10未満、5未満、又は1未満の効率であることを意味する。直交分子は細胞中に機能的に正常な内在相補的分子をもたない。例えば、細胞中の直交tRNAがこの細胞の任意内在RSによりアミノアシル化される効率は内在tRNAが内在RSによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能である。別の例では、直交RSが該当細胞中の任意内在tRNAをアミノアシル化する効率は内在RSが内在tRNAをアミノアシル化する効率に比較して低いか又は検出不能である。第1の直交分子と共働する第2の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交tRNA/RS対は対照例えば対応するtRNA/RS内在対、又は活性直交対例えばチロシル直交tRNA/RS対の効率に対して所定の効率例えば45の効率、50の効率、60の効率、70の効率、75の効率、80の効率、90の効率、95の効率、又は99以上の効率で細胞において相互に共働する導入相補成分を含む。コグネイト:コグネイトなる用語は共同機能する成分、例えば直交tRNAと前記直交tRNAを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼを意味する。これらの成分は相補的であると言うこともできる。優先的にアミノアシル化する:優先的にアミノアシル化するなる用語はO-RSが他のtRNAに負荷する場合よりも高い効率で特定tRNAに所与アミノ酸を負荷することを意味する。例えば、O-RSはO-RSが非コグネイトtRNA例えばコグネイトO-tRNAを例えば突然変異により作製するための基質として使用されるtRNAをアミノアシル化する場合に比較して所定効率例えば70の効率、75の効率、85の効率、90の効率、95の効率、又は約99以上の効率でコグネイトO-tRNAに負荷することができる。セレクターコドン:セレクターコドンなる用語は翻訳プロセスでO-tRNAにより認識され、一般に内在tRNAにより認識されないコドンを意味する。典型例としては終止コドン、4塩基以上のコドン、及び/又は同等物が挙げられる。O-tRNAアンチコドンループは例えば発現されたRNA例えばmRNA中でセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸を翻訳系成分により翻訳中のポリペプチドに挿入する。例えば、本発明の1態様では、O-tRNAは4塩基コドン等のセレクターコドンを認識し、翻訳プロセスにより生産中のポリペプチドにホモグルタミン等の非天然アミノ酸を付加する。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン、4塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び/又は同等物を挙げることができる。サプレッサーtRNA:サプレッサーtRNAは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーRNAmRNAの読取りを変更するtRNAである。例えば、サプレッサーtRNAは例えば終止コドン、4塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。抑圧活性:本明細書で使用する抑圧活性なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳例えばフレームシフトをもたらすコドン例えばアンバーコドン又は4塩基以上のコドン等のセレクターコドンの翻訳読み飛ばしを行うtRNA例えばサプレッサーtRNAの能力を意味する。サプレッサーtRNAの抑圧活性は第2のサプレッサーtRNA又は対照系例えばO-RSをもたない対照系に比較して観察される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン例えばアンバーコドンに対する特定O-tRNA及びORSの抑圧百分率とは、O-tRNA、O-RS及びセレクターコドンをもたないポジティブ対照構築物に比較して、O-RSとO-tRNAを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー例えばLacZの活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性ポジティブ対照マーカーが所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Xをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、O-tRNAとO-RSを更に含む翻訳系で発現される以外はポジティブ対照マーカーが発現される条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すXの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にO-RSとO-tRNAにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、O-tRNA、O-RS及び/又はO-tRNA及び/又はO-RSにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含むバックグラウンド又はネガティブ対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精確にすることができる。このネガティブ対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β-ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のO-tRNAを含むプラスミドと共に誘導体化lacZプラスミド構築物はlacZ核酸配列中にセレクターコドンをもつを適当な生物例えば直交成分を使用することができる生物に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとしても導入することができる。細胞を培地で所望密度例えばOD600=約0.5まで増殖させ、例えばBetaFluor登録商標β-ガラクトシダーゼアッセイキットNovagenを使用してβ-ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化lacZ構築物から観察される値に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。翻訳系:翻訳系なる用語は成長中のポリペプチド鎖蛋白質にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、tRNA、シンテターゼ、mRNA等を挙げることができる。本発明のO-tRNA及び/又はO-RSは例えば非真核細胞例えば細菌例えば大腸菌、又は真核細胞例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び/又は同等物でinvitro又はinvivo翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。非天然アミノ酸:本明細書で使用する非天然アミノ酸なる用語は20種の標準天然アミノ酸の1種又は微量天然アミノ酸セレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び/又はアミノ酸類似体例えばホモグルタミンを意味する。~に由来:本明細書で使用する~に由来なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー:本明細書で使用するポジティブ選択又はスクリーニングマーカーなる用語は、このマーカーが存在する例えば発現、活性化等されると、このマーカーに対応する形質を含む細胞例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞が前記形質をもたない細胞から識別されるマーカーを意味する。ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー:本明細書で使用するネガティブ選択又はスクリーニングマーカーなる用語は、このマーカーが存在する例えば発現、活性化等されると、例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して前記性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。レポーター:本明細書で使用するレポーターなる用語は該当系のターゲット成分を同定及び/又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素例えばβ-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT等、蛍光スクリーニングマーカー例えば緑色蛍光蛋白質例えばGFP、YFP、EGFP、RFP等、ルミネッセントマーカー例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子例えばlacZ、β-gal/lacZβ-ガラクトシダーゼ、Adhアルコールデヒドロゲナーゼ、his3、ura3、leu2、lys2等を挙げることができる。真核生物:本明細書で使用する真核生物なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等、繊毛虫、植物例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。非真核生物:本明細書で使用する非真核生物なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌例えばEscherichiacoli、Thermusthermophilus、Bacillusstearothermophilus等、又は系統発生分類の古細菌例えばMethanococcusjannaschiiMj、MethanosarcinamazeiMm、MethanobacteriumthermoautotrophicumMt、Methanococcusmaripaludis、Methanopyruskandleri、Halobacterium例えばHaloferaxvolcanii及びHalobacterium種NRC-1、ArchaeoglobusfulgidusAf、PyrococcusfuriosusPf、PyrococcushorikoshiiPh、Pyrobaculumaerophilum、Pyrococcusabyssi、SulfolobussolfataricusSs、Sulfolobustokodaii、AeuropyrumpernixAp、Thermoplasmaacidophilum、Thermoplasmavolcanium等に属することができる。保存変異体:翻訳成分に関して本明細書で使用する保存変異体なる用語は翻訳成分を意味し、例えば類似する基本成分例えばO-tRNA又はO-RSと同様に機能するが、参照O-tRNA又はO-RSに比較して配列に変異をもつ保存変異体O-tRNA又は保存変異体O-RSが挙げられる。例えば、O-RSは相補的O-tRNA又は保存変異体O-tRNAを非天然アミノ酸例えばホモグルタミンでアミノアシル化するが、O-tRNAと保存変異体O-tRNAは同一配列をもたない。保存変異体は保存変異体が対応するO-tRNA又はO-RSに相補的である限り、例えば配列の1カ所、2カ所、3カ所、4カ所、又は5カ所以上に変異をもつことができる。選択又はスクリーニング物質:本明細書で使用する選択又はスクリーニング物質なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択/スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。~に応答して:本明細書で使用する~に応答してなる用語は本発明のtRNAがセレクターコドンを認識し、tRNAに担持される該当アミノ酸例えばホモグルタミン等の非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むプロセスを意味する。コードする:本明細書で使用するコードするなる用語は第1の分子又は配列とは異なる第2の分子又は配列の生産を導くためにポリマー巨大分子又は配列中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。1側面では、コードするなる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をDNA依存性DNAポリメラーゼによりコードするための鋳型として2本鎖DNA分子の1本の鎖を使用する半保存的DNA複製プロセスを意味する。別の側面では、コードするなる用語は第1の分子とは異なる化学的性質をもつ第2の分子の生産を導くためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、DNA分子は例えばDNA依存性RNAポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスによりRNA分子をコードすることができる。また、RNA分子は翻訳プロセスと同様にポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、コードするなる用語はアミノ酸をコードする三重項コドンにも適用する。所定側面では、RNA分子は例えばRNA依存性DNAポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりDNA分子をコードすることができる。別の側面では、DNA分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用するコードするとは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。ホモグルタミン等の付加合成アミノ酸を遺伝コードにinvivo付加するためには、翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼとtRNAから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して直交性のアミノアシルtRNAシンテターゼとtRNAの新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在tRNAによりデコードされない特定新規コドン例えばセレクターコドンのみをデコード又は認識するtRNAと、そのコグネイトtRNAを特定非天然アミノ酸例えばホモグルタミンのみで優先的にアミノアシル化又は負荷するアミノアシルtRNAシンテターゼが挙げられる。O-tRNAは内在シンテターゼでアミノアシル化されないことも望ましい。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する40種の内在tRNAのいずれをも実質的にアミノアシル化しないアミノアシルtRNAシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する21種の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交tRNAを含む。本発明では、4塩基セレクターコドンAGGAに応答してアミノ酸ホモグルタミンhGlnをミオグロビンに効率的且つ選択的に組込む古細菌tRNALys配列に由来する新規直交シンテターゼ/tRNA対の作製について報告する。hGlnによるフレームシフト抑圧は蛋白質収率又は細胞増殖速度にさほど影響せず、第2のO-tRNA-ORS対によるTAGの抑圧と相互に直交性であることが判明した。本発明では利用可能な三重項コドンの数も翻訳機構自体もコードの更なる拡張の有意障害とならないことを示す。非天然アミノ酸を四重項コドンでinvivoコードするためには、このコドンを固有に認識する直交tRNAO-tRNAとこのO-tRNAのみを該当非天然アミノ酸で固有にアミノアシル化する対応するシンテターゼを作製する必要がある。従来作製されている直交M.jannaschiiアンバーサプレッサーtRNAのアンチコドンループはコグネイトシンテターゼJYRSの主要認識成分であるので、4塩基コドンをデコードするようにこのループを拡張することは困難であった。JYRSのアンチコドン結合特異性を緩和することは可能であると思われるが、アンチコドン配列のみを使用してアンバーサプレッサーと4塩基サプレッサーを区別する相互に直交性の対を構築することは困難であると思われる。従って、本発明では、異なる起源の直交対を使用して2種以上の異なるセレクターコドンに応答して2種以上の異なる非天然アミノ酸をポリペプチドに同時に組込むことができるシステムを達成する。本発明は非天然アミノ酸例えばホモグルタミンを組込むために使用することができる付加直交tRNAアミノアシルtRNAシンテターゼ対例えばO-tRNA/O-RS対の組成物とその同定及び作製方法を提供する。本発明の代表的O-tRNAはO-tRNAにより例えばinvivoで認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質にホモグルタミンを組込むことができる。O-tRNAのアンチコドンループはmRNA上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸例えばホモグルタミンをポリペプチドのこの部位に組込む。本発明の直交アミノアシルtRNAシンテターゼはそのO-tRNAを特定非天然アミノ酸のみで優先的にアミノアシル化又は負荷する。直交tRNA/直交アミノアシルtRNAシンテターゼとその対1種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産に適した翻訳系は国際公開第WO2002/086075号、発明の名称直交tRNA-アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYLtRNASYNTHETAAIRS及びWO2002/085923号、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDSに記載されている。更に、国際出願第PCT/US2004/011786号出願日2004年4月16日参照。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交tRNAO-tRNAと、直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと、非天然アミノ酸本発明ではホモグルタミンがこのような非天然アミノ酸の1例である含む細胞例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができるを含み、O-RSはO-tRNAをホモグルタミンでアミノアシル化する。本発明の直交対はO-tRNA例えばサプレッサーtRNA、フレームシフトtRNA等とO-RSを含む。本発明は個々の成分も提供する。一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを抑圧すると言う。即ち、翻訳系の例えば細胞の内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のO-tRNAはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO-tRNAに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45、50、60、75、80、又は90以上の抑圧効率を含む。O-RSはO-tRNAをホモグルタミン等の該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにO-tRNA/O-RS対を使用し、ポリヌクレオチドはO-tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定の望ましい側面では、細胞は付加O-tRNA/O-RS対を含むことができ、付加O-tRNAは付加O-RSにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、O-tRNAの一方は4塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる4塩基コドンが各セレクターコドンを特異的に認識することができる。本発明の所定態様では、細胞例えば大腸菌細胞は直交tRNAO-tRNAと、直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと、ホモグルタミンと、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、ポリヌクレオチドはO-tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販invitro転写/翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなO-tRNA/ORS対及び非天然アミノ酸と併用することができる。1態様では、O-RSとO-tRNAの併用による抑圧効率はO-RSの不在下のO-tRNAの抑圧効率の例えば約5倍、10倍、15倍、20倍、又は25倍以上である。1側面では、O-RSとO-tRNAの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約35、40、45、50、60、75、80、又は90以上である。上述のように、本発明は場合により2種以上の非天然アミノ酸例えばホモグルタミンと別の非天然アミノ酸を組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のO-tRNA/O-RS対を含む。例えば、細胞は更に別の付加O-tRNA/O-RS対と第2の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加O-tRNAは第2のセレクターコドンを認識し、この付加O-RSはO-tRNAを第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、O-tRNA/O-RS対O-tRNAは例えばアンバーセレクターコドンを認識するを含む細胞は更に第2の直交対例えばロイシル、リシル、グルタミル等を含むことができる第2のO-tRNAは別のセレクターコドン、例えばオパール、4塩基コドン等を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。O-tRNA及び/又はO-RSは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するtRNAのライブラリー及び/又はRSのライブラリーを作製するか及び/又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するtRNA及び/又はRSの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交tRNA/アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製する1ストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する宿主に対して異種のtRNA/シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞tRNAに負荷しないことが挙げられ、異種tRNA候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種tRNAは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。直交対を作製するための第2のストラテジーはO-tRNA又はO-RSをスクリーニング及び/又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。直交tRNAO-tRNA本発明の直交tRNAO-tRNAはO-tRNAにより例えばinvivo又はinvitroで認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのホモグルタミン等の非天然アミノ酸の組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のO-tRNAは本明細書の配列表のO-tRNA配列に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO-tRNAに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45、50、60、75、80、又は90以上の抑圧効率を含む。抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β-ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のO-tRNAを含むプラスミドと共に誘導体化lacZプラスミド構築物はlacZ核酸配列中にセレクターコドンをもつを適当な生物例えば直交成分を使用することができる生物に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼもポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして導入することができる。細胞を培地で所望密度例えばOD600=約0.5まで増殖させ、例えばBetaFluor登録商標β-ガラクトシダーゼアッセイキットNovagenを使用してβ-ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化lacZ構築物から観察される値に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。本発明のO-tRNAの例を本明細書の配列表に記載する。代表的O-tRNA及びO-RS分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照されたい。更に、本明細書の核酸及びポリペプチド配列と変異体のセクションも参照。O-RSmRNA又はO-tRNA分子等のRNA分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミンTがウラシルUで置換されているコーディングDNAでは逆。塩基に付加修飾を加えてもよい。本発明は本明細書に記載する特定O-tRNAに対応するO-tRNAの保存変異体も含む。例えば、O-tRNAの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定O-tRNAと同様に機能し、適当な自己相補性によりtRNAL形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたないと共に野生型tRNA分子以外のものであることが望ましい分子が挙げられる。本明細書の核酸及びポリペプチド配列と変異体のセクションも参照。O-tRNAを含む組成物は更に直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含むことができ、O-RSはO-tRNAをホモグルタミン等の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、O-tRNAを含む組成物は更に例えばinvitro又はinvivo翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、O-tRNAにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの1種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の直交アミノアシルtRNAシンテターゼのセクションも参照。直交tRNAO-tRNAの作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたO-tRNAも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、O-tRNAは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体tRNAのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体tRNAは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。tRNAの所望ループ又は領域例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Dアーム又はループ、可変ループ、TPCアーム又はループ、tRNA分子の他の領域又はその組合せの特定位置例えば非保存位置又は保存位置、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、tRNAの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするような突然変異体tRNAのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループの突然変異が挙げられる。この方法は更にO-tRNAの末端への付加配列CCAの付加を含むことができる。一般に、O-tRNAは所望RSに対するその親和性を維持しながら、出発材料例えば複数のtRNA配列に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。前記方法は場合によりtRNA及び/又はアミノアシルtRNAシンテターゼの配列の類似性及び/又は推定相同性を分析し、特定生物について直交性であると思われるO-tRNA、O-RS及び/又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム例えばBLAST及びpileupプログラムを使用することができる。1例では、原核生物である大腸菌で使用するための潜在直交性翻訳成分を選択するためには、原核生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び/又はtRNAを選択する。一般に、O-tRNAは複数の潜在的O-tRNAのメンバーを含む第1の種の細胞集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルtRNAシンテターゼRSによりアミノアシル化される潜在的O-tRNAライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第1の種の細胞に直交性のtRNAプールが得られる。所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与する酵素例えばβ-ラクタマーゼ、検出可能な産物を付与する酵素例えばβ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT、例えば毒性物質例えばバルナーゼをコードするポリヌクレオチドの非必須位置例えば機能的バルナーゼを依然として産生する等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質例えばアンピシリン等の抗生物質の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング/選択を実施する。1態様では、選択物質の濃度を変動させる。例えば、サプレッサーtRNAの活性を測定するためには、セレクターコドンのinvivo抑圧例えばネガティブ選択マーカー例えばβ-ラクタマーゼ遺伝子blaをコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置例えばA184にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体例えばbla変異体を構築する。細胞例えば細菌をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交tRNAの場合には、抗生物質耐性例えばアンピシリン耐性はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。tRNAが非直交性の場合、又はtRNAに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質例えばアンピシリン耐性が観察される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のLB寒天プレートで増殖することができない細胞例えば細菌を選択する。毒性物質例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼの場合には、複数の潜在的tRNAのメンバーが内在宿主例えば大腸菌シンテターゼによりアミノアシル化されるとき即ち、宿主例えば大腸菌シンテターゼに非直交であるときには、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交tRNA又は非機能的tRNAを含む細胞は生存する。1態様では、所望生物に直交性のtRNAプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ-ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のtRNAプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトRSをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第2の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質例えばアンピシリンの存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるtRNAを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的tRNA、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないtRNAをもつ細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的tRNA、又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないtRNAを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、i内在宿主例えば大腸菌シンテターゼの基質ではなく;ii該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ;iii翻訳で機能的なtRNAは両者選択後に生存している。従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。上記方法における選択例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び/又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度例えばアンピシリン濃度を変動させる。本発明の1側面では、初期ラウンド中には所望活性を低くすることができるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択条件を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー条件を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復する。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一とすることができる。本発明ではセレクターコドンに応答してホモグルタミン等の非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分例えばO-tRNA、O-RS、及びO-tRNA/O-RS対を作製するために他の型の選択/スクリーニングも使用することができる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方としては、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーが挙げられる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティングFACS又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Francisco,J.A.ら,1993Productionandfluorescence-activatedcellsortingofEscherichiacoliexpressingafunctionalantibodyfragmentontheexternalsurface.ProcNatlAcadSciUSA.90:10444-8も参照。組換え直交tRNAの他の作製方法も例えば国際特許出願第WO2002/086075号、発明の名称直交tRNA-アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs;並びにUSSN60/479,931及び60/496,548、発明の名称真核遺伝コードの拡張EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODEに記載されている。Forsterら,2003ProgrammingpeptidomimeticsynthetasesbytranslatinggeneticcodesdesigneddenovoPNAS10011:6353-6357;及びFengら,2003,ExpandingtRNArecognitionofatRNAsynthetasebyasingleaminoacidchange,PNAS10010:5676-5681も参照。直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RS本発明のO-RSはO-tRNAをホモグルタミン等の非天然アミノ酸で優先的にinvitro又はinvivoアミノアシル化する。本発明のO-RSはO-RSを含むポリペプチド及び/又はO-RS又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系例えば細胞に提供することができる。例えば、O-RSの1例は本明細書の配列表及び実施例に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。別の例では、O-RS、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。代表的O-RS分子の配列については例えば本明細書の表及び実施例参照。本明細書の核酸及びポリペプチド配列と変異体のセクションも参照。O-tRNAと併用するための直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RS、例えばO-RSの同定方法も本発明の特徴である。例えば、1方法は第1の種の細胞集団について選択例えばポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は1複数のアミノアシルtRNAシンテターゼRSのメンバー例えば複数のRSは突然変異体RS、第1の種以外の種に由来するRS又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両方を含むことができると;2例えば1種以上の種に由来する直交tRNAO-tRNAと;3例えばポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のRSのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術により本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はO-tRNAをアミノアシル化する活性RSを含む。第1の種に由来する第1組のtRNAの活性RSによるinvitro又はinvivoアミノアシル化レベルを第2の種に由来する第2組のtRNAの活性RSによるinvitro又はinvivoアミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質例えば標識アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば標識ホモグルタミンにより測定することができる。第1組のtRNAに比較して第2組のtRNAをより効率的にアミノアシル化する活性RSを一般に選択することにより、O-tRNAと併用するための効率的最適化直交アミノアシルtRNAシンテターゼが得られる。この方法により同定されたO-RSも本発明の特徴である。アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはinvitro又はinvivoで実施することができる。例えば、invitroアミノアシル化アッセイは例えばHobenandSoll1985MethodsEnzymol.113:55-59に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。WO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みINVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS;及び国際出願第PCT/US2004/011786号出願日2004年4月16日も参照。同定されたO-RSを更に操作し、所望非天然アミノ酸例えばホモグルタミンのみをO-tRNAに負荷し、20種の標準アミノ酸を負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に基質特異性をもつ直交アミノアシルtRNAシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることにより各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーtRNAに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーtRNAを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化負荷するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばDNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。突然変異体O-RSのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体RSは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体RSのライブラリーは2種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さいサブライブラリーから作製することができる。RSのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物例えば真正細菌又は古細菌等の微生物に由来するtRNAシンテターゼのライブラリー例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー例えば米国特許第6,238,884号Shortら;米国特許第5,756,316号Schallenbergerら;米国特許第5,783,431号Petersenら;米国特許第5,824,485号Thompsonら;米国特許第5,958,672号Shortら参照を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択/スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、O-RSをコードする核酸を単離することができ;例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより突然変異O-RSをコードする1組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ;O-tRNAを非天然アミノ酸例えばホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する突然変異O-RSが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の1側面では、段階を複数回、例えば少なくとも2回実施する。O-tRNA、O-RS、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択/スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはO-RSを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択/スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び/又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の1種以上を含むこともできる。一般に、1種以上の変化は蛋白質を生産するために直交tRNA-tRNAシンテターゼ対を使用する生物における1個以上の遺伝子の突然変異に基づく。O-RSの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細についてはWO2002/086075、発明の名称直交tRNA-アミノアシルtRNAシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物MethodsandcompositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs;及び国際出願第PCT/US2004/011786号出願日2004年4月16日を参照されたい。資源及び宿主生物本発明の翻訳成分は一般に非真核生物に由来することができる。例えば、直交O-tRNAは非真核生物又は生物組み合わせ、例えばMethanococcusjannaschii、Methanobacteriumthermoautotrophicum、Halobacterium例えばHaloferaxvolcanii及びHalobacterium種NRC-1、Archaeoglobusfulgidus、Pyrococcusfuriosus、Pyrococcushorikoshii、Aeuropyrumpernix、Methanococcusmaripaludis、Methanopyruskandleri、MethanosarcinamazeiMm、Pyrobaculumaerophilum、Pyrococcusabyssi、SulfolobussolfataricusSs、Sulfolobustokodaii、Thermoplasmaacidophilum、Thermoplasmavolcanium等の古細菌や、Escherichiacoli,Thermusthermophilus,Bacillusstearothermphilus等の真正細菌に由来することができ、直交O-RSは非真核生物又は生物組み合わせ、例えばMethanococcusjannaschii、Methanobacteriumthermoautotrophicum、Halobacterium例えばHaloferaxvolcanii及びHalobacterium種NRC-1、Archaeoglobusfulgidus、Pyrococcusfuriosus、Pyrococcushorikoshii、Aeuropyrumpernix、Methanococcusmaripaludis、Methanopyruskandleri、Methanosarcinamazei、Pyrobaculumaerophilum、Pyrococcusabyssi、Sulfolobussolfataricus、Sulfolobustokodaii、Thermoplasmaacidophilum、Thermoplasmavolcanium等の古細菌や、Escherichiacoli,Thermusthermophilus,Bacillusstearothermphilus等の真正細菌に由来することができる。1態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等等の真核資源もO-tRNA及びO-RS資源として使用することができる。O-tRNA/O-RS対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。1態様では、O-tRNA/O-RS対は同一生物に由来する。あるいは、O-tRNA/O-RS対のO-tRNAとO-RSは異なる生物に由来する。1好適態様では、例えば大腸菌系翻訳系で古細菌Pyrococcushorikoshiiのリシルシンテターゼ/tRNA対を直交対として使用する。本明細書に記載するように、この対は4塩基セレクターコドンを認識するように修飾することができ、O-tRNAにホモグルタミン等の非天然アミノ酸を負荷するように修飾することができる。この直交対又はその修飾形を上記直交対例えば終止セレクターコドンを認識するように修飾された例えばMethanococcusjannaschiiに由来する直交対と組み合わせることができる。こうして、O-tRNA/O-RS対により各々認識される2個以上のセレクターコドンを含む前記蛋白質のコーディング核酸を付加することにより、該当翻訳系に2種の異なる非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産することができる。O-tRNA、O-RS又はO-tRNA/O-RS対はinvivo又はinvitro選択又はスクリーニングすることができ、及び/又はホモグルタミン又は他の該当非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞例えば非真核細胞、又は真核細胞で使用することができる。非真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えばEscherichiacoli、Thermusthermophilus、Bacillusstearothermphilus等の真正細菌や、Methanococcusjannaschii、Methanobacteriumthermoautotrophicum、Halobacterium例えばHaloferaxvolcanii及びHalobacterium種NRC-1、Archaeoglobusfulgidus、Pyrococcusfuriosus、Pyrococcushorikoshii、Aeuropyrumpernix、Methanococcusmaripaludis、Methanopyruskandleri、MethanosarcinamazeiMm、Pyrobaculumaerophilum、Pyrococcusabyssi、SulfolobussolfataricusSs、Sulfolobustokodaii、Thermoplasmaacidophilum、Thermoplasmavolcanium等の古細菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えば植物例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物、藻類、原生生物、真菌、酵母例えばSaccharomycescerevisiae、動物例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等等が挙げられる。本発明の翻訳成分を導入した細胞の組成物も本発明の特徴である。別の種で使用するためにある種でO-tRNA及び/又はO-RSをスクリーニングすることについては、国際出願第PCT/US2004/011786号出願日2004年4月16日も参照。セレクターコドン本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク3塩基コドン、ナンセンスコドン例えばアンバーコドンUAG又はオパールコドンUGA等の終止コドン、非天然コドン、少なくとも4塩基のコドン例えばAGGA、レアコドン等が挙げられる。例えば1個以上、2個以上、3個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して複数の異なる非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交tRNA/シンテターゼ対を使用することができる。1態様では、本方法はホモグルタミンを細胞にinvivo組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、4塩基セレクターコドンを認識し、O-RSによりホモグルタミンでアミノアシル化されるO-tRNAを作製する。このO-tRNAは翻訳系の内在アミノアシルtRNAシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して該当ポリペプチドをコードするターゲットポリヌクレオチドの該当部位にセレクターコドンを導入することができる。例えばSayers,J.R.ら1988,5’,3’Exonucleaseinphosphorothioate-basedoligonucleotide-directedmutagenesis.NucleicAcidsRes,791-802も参照。O-RS、O-tRNA及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばinvivoで併用すると、セレクターコドンに応答してホモグルタミンが組込まれ、特定位置にホモグルタミンを含むポリペプチドが得られる。ホモグルタミン等の非天然アミノ酸のinvivo組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、終止セレクターコドンであるUAGコドンの抑圧効率はO-tRNA例えばアンバーサプレッサーtRNAとUAGコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する放出因子1RF1の競合に依存するので、例えばO-tRNA例えばサプレッサーtRNAの発現レベルを増加するか又はRF1欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、UAGコドンの抑圧効率はO-tRNA例えばアンバーサプレッサーtRNAと終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する真核放出因子1例えばeRFの競合に依存するので、例えばO-tRNA例えばサプレッサーtRNAの発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、例えばジチオスレイトールDTT等の還元剤のように、放出因子作用を調節する付加成分も加えてもよい。例えばホモグルタミン等の非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、invitro蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンAGGはアラニンでアシル化された合成tRNAによるAlaの挿入に有効であることが分かっている。例えばMaら,Biochemistry,32:79391993参照。この場合には、合成tRNAは大腸菌に少量種として存在する天然tRNAArgと競合する。更に、生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Micrococcusluteusで割り当てられないコドンAGAがinvitro転写/翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばKowalandOliver,Nucl.Acid.Res.,25:46851997参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをinvivo使用するために作製することができる。セレクターコドンは更に拡張コドン例えば4、5、6塩基以上のコドン等の4塩基以上のコドンも含むことができる。4塩基コドンの例としては例えばAGGA、CUAG、UAGA、CCCU等が挙げられる。5塩基コドンの例としては例えばAGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。4塩基以上のコドンは例えば1又は複数の非天然アミノ酸例えばホモグルタミンを同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも4塩基コドン、少なくとも5塩基コドン、又は少なくとも6塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。4塩基コドンは256種が考えられるので、4塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Andersonら,2002ExploringtheLimitsofCodonandAnticodonSize,ChemistryandBiology,9:237-244;及びMagliery,2001ExpandingtheGeneticCode:SelectionofEfficientSuppressorsofFour-baseCodonsandIdentificationofShiftyFour-baseCodonswithaLibraryApproachinEscherichiacoli,J.Mol.Biol.307:755-769も参照。例えば、invitro生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために4塩基コドンが使用されている。例えばMaら,1993Biochemistry,32,7939;及びHohsakaら,1999J.Am.Chem.Soc.,121:34参照。2個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーtRNAを用いて2-ナフチルアラニンとリジンのNBD誘導体をストレプトアビジンに同時にinvitro組込むためにCGGGとAGGUが使用されている。例えばHohsakaら,1999J.Am.Chem.Soc.,121:12194参照。invivo試験では、MooreらはNCUAアンチコドンをもつtRNALeu誘導体がUAGNコドンNはU、A、G又はCであり得るを抑圧する能力を試験し、四重項UAGAはUCUAアンチコドンをもつtRNALeuにより13~26の効率でデコードすることができるが、0又は-1フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Mooreら,2000J.Mol.Biol.,298:195参照。1態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。本明細書の実施例では、AGGAセレクターコドンを認識し、蛋白質翻訳中にホモグルタミンを挿入する直交対について記載する。所与系では、セレクターコドンは更に天然3塩基コドンの1種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない又は殆ど使用しない。例えば、天然3塩基コドンを認識するtRNAをもたない系、及び/又は3塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が1個増えると、三重項コドン数は64から125に増す。第3の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるDNAへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばHiraoら,2002Anunnaturalbasepairforincorporatingaminoacidanaloguesintoprotein,NatureBiotechnology,20:177-182参照。Wu,Y.ら,2002J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630も参照。他の関連文献は以下に挙げる。invivo使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Bennerらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソC:イソG対である。例えばSwitzerら,1989J.Am.Chem.Soc.,111:8322;及びPiccirilliら,1990Nature,343:33;Kool,2000Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Koolらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Kool,2000Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602;及びGuckianandKool,1998Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でSchultz,Romerbergらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。PICS:PICS自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントKFによりDNAに効率的に組込むことができる。例えばMcMinnら,1999J.Am.Chem.Soc.,121:11586;及びOgawaら,2000J.Am.Chem.Soc.,122:3274参照。生体機能に十分な効率と選択性でKFにより3MN:3MN自己対を合成することができる。例えばOgawaら,2000J.Am.Chem.Soc.,122:8803参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。PICS自己対を複製するために使用できる突然変異体DNAポリメラーゼが最近開発された。更に、7AI自己対も複製することができる。例えばTaeら,2001J.Am.Chem.Soc.,123:7439参照。CuIIと結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Dipic:Pyも開発された。Meggersら,2000J.Am.Chem.Soc.,122:10714参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のtRNAを作製するためにこの性質を利用することができる。翻訳バイパス系を使用してホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。1翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。非天然アミノ酸本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び/又はピロリジンと20種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式I:により表される。非天然アミノ酸は一般に式Iをもつ任意構造であり、式中、R基は20種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。20種の天然アミノ酸の構造については、例えばL.Stryer著Biochemistry,第3版,1988,FreemanandCompany,NewYorkを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記20種のαアミノ酸以外の天然化合物又は、当然のことながら人工的に製造した合成化合物でもよい。本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸例えば天然又は非天然アミノ酸とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。非天然アミノ酸を蛋白質に組込むにあたって特に重要な点は、ホモグルタミンを組込むことができることである。他の非天然アミノ酸では、例えば、式IにおけるRは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び/又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖例えばポリエーテル又は例えば約5もしくは約10炭素長を上回る長鎖炭化水素等をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び1個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は光架橋基をもつ。1態様では、非天然アミノ酸はアミノ酸側鎖に結合した糖部分及び/又は他の糖鎖修飾をもつ。新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式II及びIII:の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Zは一般にOH、NH2、SH、NH-R’又はS-R’を含み、XとYは同一でも異なっていてもよく、一般にS又はOであり、RとR’は場合により同一又は異なり、一般に式Iをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したR基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式II及びIIIにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば20種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα-ヒドロキシ酸、α-チオ酸、α-アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α-炭素の置換は場合によりL、D又はα,α-ジ置換アミノ酸例えばD-グルタミン酸、D-アラニン、D-メチル-O-チロシン、アミノ酪酸等を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸例えばプロリン類似体や、3、4、6、7、8及び9員環プロリン類似体、β及びγアミノ酸例えば置換β-アラニン及びγ-アミノ酪酸が挙げられる。本発明のその他の非天然アミノ酸構造としては例えばメチレン又はアミノ基がα炭素に隣接してサンドイッチされているホモβ型構造が挙げられ、例えばホモβ-チロシン、α-ヒドラジノチロシンの異性体が挙げられる。例えば、下記参照。多くの非天然アミノ酸は天然アミノ酸例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等をベースとする。例えば、チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、C6-C20直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、O-メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α-ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ホモグルタミン、3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン、p-アセチル-L-フェニルアラニン、p-プロパルギルオキシフェニルアラニン、O-メチル-L-チロシン、L-3-2-ナフチルアラニン、3-メチルフェニルアラニン、O-4-アリル-L-チロシン、4-プロピル-L-チロシン、トリ-O-アセチル-GlcNAcβ-セリン、L-Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル-L-フェニルアラニン、p-アジド-L-フェニルアラニン、p-アシル-L-フェニルアラニン、p-ベンゾイル-L-フェニルアラニン、L-ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p-ヨードフェニルアラニン、p-ブロモフェニルアラニン、p-アミノ-L-フェニルアラニン、及びイソプロピル-L-フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は例えばWO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みInvivoincorporationofunnaturalaminoacidsの図16、17、18、19、26及び29に記載されている。非天然アミノ酸の化学的合成上記非天然アミノ酸の多くは例えばSigma米国やAldrichMilwaukee,WI,米国から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばFessendonとFessendon著OrganicChemistry1982,第2版,WillardGrantPress,BostonMass.;March著AdvancedOrganicChemistry第3版,1985,WileyandSons,NewYork;及びCareyとSundberg著AdvancedOrganicChemistry第3版,PartsAandB,1990,PlenumPress,NewYorkを参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばWO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みInvivoincorporationofunnaturalaminoacids;Matsoukasら,1995J.Med.Chem.,38,4660-4669;King,F.E.Kidd,D.A.A.1949ANewSynthesisofGlutamineandofγ-DipeptidesofGlutamicAcidfromPhthylatedIntermediates.J.Chem.Soc.,3315-3319;Friedman,O.M.Chatterrji,R.1959SynthesisofDerivativesofGlutamineasModelSubstratesforAnti-TumorAgents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.ら1988AbsoluteConfigurationoftheEnantiomersof7-Chloro-4[[4-diethylamino-1-methylbutyl]amino]quinolineChloroquine.J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.Frappier,F.1991GlutamineanaloguesasPotentialAntimalarials,.Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.Rapoport,H.1989Synthesisof4-SubstitutedProlinesasConformationallyConstrainedAminoAcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.Rapoport,H.1985SynthesisofOpticallyPurePipecolatesfromL-Asparagine.ApplicationtotheTotalSynthesisof-ApovincaminethroughAminoAcidDecarbonylationandIminiumIonCyclization.J.Org.Chem.1989:1859-1866;Bartonら,1987SynthesisofNovelα-Amino-AcidsandDerivativesUsingRadicalChemistry:SynthesisofL-andD-α-Amino-AdipicAcids,L-α-aminopimelicAcidandAppropriateUnsaturatedDerivatives.TetrahedronLett.43:4297-4308;及びSubasingheら,1992Quisqualicacidanalogues:synthesisofbeta-heterocyclic2-aminopropanoicacidderivativesandtheiractivityatanovelquisqualate-sensitizedsite.J.Med.Chem.35:4602-7が挙げられる。国際出願第PCT/US03/41346号、発明の名称蛋白質アレーProteinArrays出願日2003年12月22日も参照されたい。非天然アミノ酸の細胞取込み細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の1つである。例えば、αアミノ酸の電荷密度が高いと、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際出願第PCT/US03/41346号、発明の名称蛋白質アレーProteinArrays出願日2003年12月22日;及びLiu,D.R.Schultz,P.G.1999Progresstowardtheevolutionofanorganismwithanexpandedgeneticcode.PNASUnitedStates96:4780-4785における毒性アッセイ参照。取込みは種々の方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をinvivo生産する生合成経路を提供する方法である。非天然アミノ酸の生合成細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界例えば細胞中には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、WO2002/085923、前出の実施例に記載されているようなp-アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばGenbankから入手できる。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をinvitroもしくはinvivoで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるためには、酵素又は他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産又は新規シンテターゼを生産するように新規酵素及び/又は前記酵素の経路をinvitro又はinvivoで開発するためには、場合によりDNAシャフリングを使用する。例えばStemmer1994,RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling,Nature3704:389-391;及びStemmer,1994,DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連例えば相同遺伝子のファミリーをシャフリングする。このようなファミリー遺伝子シャフリング法の1例はCrameriら1998DNAshufflingofafamilyofgenesfromdiversespeciesacceleratesdirectedevolutionNature,3916664:288-291に記載されている。生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに新規酵素は例えばOstermeierら1999AcombinatorialapproachtohybridenzymesindependentofDNAhomologyNatureBiotech17:1205に記載されているようなハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーションincrementaltruncationforthecreationofhybridenzymes:ITCHYとして知られるDNA組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは1種以上のinvitro又はinvivo組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ostermeierら1999CombinatorialProteinEngineeringbyIncrementalTruncation,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3562-67,及びOstermeierら1999,IncrementalTruncationasaStrategyintheEngineeringofNovelBiocatalysts,BiologicalandMedicinalChemistry,7:2139-44も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸又は新規シンテターゼの生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダム化し、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸又は新規シンテターゼの生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はDelegraveYouvan1993BiotechnologyResearch11:1548-1552に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばArkinandYouvan1992Optimizingnucleotidemixturestoencodespecificsubsetsofaminoacidsforsemi-randommutagenesisBiotechnology10:297-300;又はReidhaar-Olsonら1991RandommutagenesisofproteinsequencesusingoligonucleotidecassettesMethodsEnzymol.208:564-86の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び/又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ非確率論的突然変異誘発と呼ぶことが多いを使用すると、酵素及び/又は経路成分を作製した後に、例えば非天然アミノ酸のinvivo生産のための1種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばShortNon-StochasticGenerationofGeneticVaccinesandEnzymesWO00/46344参照。このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である全ゲノムシャフリングと呼ぶことが多い。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸又はその中間体の生産能に関する生物例えば大腸菌又は他の細胞の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をinvivo生産するように細胞で既存及び/又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の文献に教示されている方法を適用することができる:Patnaikら2002GenomeshufflingoflactobacillusforimprovedacidtoleranceNatureBiotechnology,207:707-712;及びZhangら2002GenomeshufflingleadstorapidphenotypicimprovementinbacteriaNature,February7,4156872:644-646。例えば所望化合物を生産するように生物及び代謝経路を操作するための他の技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路操作アプローチを教示している文献の例としては、NakamuraandWhite2003Metabolicengineeringforthemicrobialproductionof1,3propanediolCurr.Opin.Biotechnol.145:454-9;Berryら2002ApplicationofMetabolicEngineeringtoimproveboththeproductionanduseofBiotechIndigoJ.IndustrialMicrobiologyandBiotechnology28:127-133;Bantaら2002Optimizinganartificialmetabolicpathway:EngineeringthecofactorspecificityofCorynebacterium2,5-diketo-D-gluconicacidreductaseforuseinvitaminCbiosynthesisBiochemistry,4120,6226-36;Selivonovaら2001RapidEvolutionofNovelTraitsinMicroorganismsAppliedandEnvironmentalMicrobiology,67:3645、及び他の多数の文献が挙げられる。使用する方法に関係なく、一般に本発明の人工生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度例えば天然細胞量で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにinvivo生産される典型濃度は約10mM~約0.05mMである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を操作し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりinvivo選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。ホモグルタミンを組込むための直交成分本発明はセレクターコドン例えば終止コドン、ナンセンスコドン、4塩基以上のコドン等に応答して成長中のポリペプチド鎖にホモグルタミンを例えばinvivoで組込むための直交成分の組成物と作製方法を提供する。例えば、本発明は直交tRNAO-tRNA、直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RS及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖にホモグルタミンを組込むために使用することができる。本発明の組成物は直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含み、前記O-RSはO-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、O-RSは配列番号1を含むアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。本発明の所定態様では、O-RSは配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも50の効率でO-tRNAを優先的にアミノアシル化する。O-RSを含む組成物は場合により更に直交tRNAO-tRNAを含むことができ、前記O-tRNAはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のO-tRNAは本明細書の配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO-tRNAに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45、50、60、75、80、又は90以上の抑圧効率を含む。1態様では、O-RSとO-tRNAの併用による抑圧効率はO-RSの不在下のO-tRNAの抑圧効率の例えば5倍、10倍、15倍、20倍、25倍以上である。1側面では、O-RSとO-tRNAの併用による抑圧効率はMethanococcusjannaschiiに由来する直交チロシルtRNAシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも45である。O-tRNAを含む組成物は場合により細胞例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞、及び/又は翻訳系を含むことができる。本発明は翻訳系を含む細胞例えば非真核細胞、又は真核細胞も提供し、前記翻訳系は直交tRNAO-tRNAと;直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと;ホモグルタミンを含む。一般に、O-RSは配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも50の効率でO-tRNAを優先的にアミノアシル化する。O-tRNAは第1のセレクターコドンを認識し、O-RSはO-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。1態様では、O-tRNAは配列番号2に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。1態様では、O-RSは配列番号1に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。本発明の細胞は場合により異なる付加O-tRNA/O-RS対と第2の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのO-tRNAは第2のセレクターコドンを認識し、このO-RSはO-tRNAを第2の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはO-tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。所定態様では、本発明の細胞は直交-tRNAO-tRNAと、直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSと、ホモグルタミンと、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む大腸菌細胞を含み、前記ポリヌクレオチドはO-tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、O-RSは本明細書に記載する任意O-RS配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも50の効率でO-tRNAを優先的にアミノアシル化する。本発明の所定態様では、本発明のO-tRNAは本明細書の配列表もしくは実施例に記載するポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、O-RSは本明細書の配列表に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。1態様では、O-RS又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。本発明のO-tRNA及び/又はO-RSは種々の生物例えば真核及び/又は非真核生物の任意のものに由来することができる。ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列表に記載するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工例えば人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドを含むか、及び/又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するtRNA又は対応するコーディング核酸と例えば少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98以上一致するポリヌクレオチド但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するtRNA又は対応するコーディング核酸以外のものとするを含み、前記tRNAはセレクターコドン例えば4塩基コドンを認識する。上記の任意のものと例えば少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98以上一致する人工ポリヌクレオチド及び/又は上記の任意のものの保存変異体を含むポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び/又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。O-tRNA/O-RS対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも1種のtRNAO-tRNAの作製方法は突然変異体tRNAのライブラリーを作製する段階と;セレクターコドンを認識できるように突然変異体tRNAのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的O-tRNAのライブラリーを提供する段階と、潜在的O-tRNAのライブラリーのメンバーを含む第1の種の第1の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルtRNAシンテターゼRSによりアミノアシル化される潜在的O-tRNAライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第1の種の細胞に対して直交性のtRNAプールが得られ、それにより少なくとも1種のO-tRNAが得られる。本発明の方法により作製されたO-tRNAも提供する。所定態様では、前記方法は更に第1の種の第2の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第1の種の細胞に対して直交性のtRNAプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルtRNAシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルtRNAシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すtRNAプールのメンバーを含むものについて細胞を選択又はスクリーニングすることにより、O-tRNAが得られる。所定態様では、第2の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ホモグルタミンをO-tRNAに負荷する直交アミノアシルtRNAシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第1の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、1複数のアミノアシルtRNAシンテターゼRS例えば複数のRSは突然変異体RS、第1の種以外の種に由来するRS、又は突然変異体RSと第1の種以外の種に由来するRSの両方を含むことができるのメンバーと;2例えば1種以上の種に由来する直交-tRNAO-tRNAと;3ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも1個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のRSのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞例えば宿主細胞を選択又はスクリーニングする。これらの選択/スクリーニングした細胞はO-tRNAをアミノアシル化する活性RSを含む。この方法により同定された直交アミノアシルtRNAシンテターゼも本発明の特徴である。ホモグルタミンを特定位置に組込んだ蛋白質を細胞例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は、少なくとも1個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ホモグルタミンを提供する段階と、少なくとも1個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置にホモグルタミンを組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交tRNAO-tRNAと;O-tRNAをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。本発明は例えばホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも75一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。核酸及びポリペプチド配列と変異体上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列例えばO-tRNA及びO-RS及びポリペプチドアミノ酸配列例えばO-RSと、前記配列を含む例えば組成物、系及び方法を提供する。前記配列例えばO-tRNA及びO-RSの例を本明細書に開示する本明細書の配列表及び実施例参照。しかし、当業者に自明の通り、本発明は例えば実施例や配列表に記載する厳密な配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ例えば適切なO-tRNA又はO-RSをコードする多数の関連及び非関連配列も提供する。本発明はポリペプチドO-RSとポリヌクレオチド例えばO-tRNA、O-RS又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルtRNAシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、1個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば本明細書の配列表に記載するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に本明細書の配列表又は実施例に記載するアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする天然ポリヌクレオチド以外の人工核酸も本発明のポリヌクレオチドである。1態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドとは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するtRNA又は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する任意tRNAもしくはそのコーディング核酸と例えば少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98以上一致する人工ポリヌクレオチド但し、天然に存在するtRNA以外のものも含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するtRNAのポリヌクレオチドと例えば少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98以上一致する人工ポリヌクレオチドも含む。所定態様では、ベクター例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等に本発明のポリヌクレオチドを組込む。1態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの1種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも1種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。保存変異遺伝コードの縮重により、サイレント置換即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、保存アミノ酸置換はアミノ酸配列中の1又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。特定核酸配列の保存変異とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率一般に5未満、より一般には4、2又は1未満のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は保存修飾変異である。従って、本発明のポリペプチド配列の保存変異としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に5未満、より一般には2又は1未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が同様の化学的性質例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は保存置換である。核酸ハイブリダイゼーション本発明の核酸の保存変異体を含めて本明細書の配列表に記載するような本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を無関係の核酸から識別する方法の1つである。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列表の配列により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して1又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも1/2の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約5倍~10倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも1/2である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。核酸は一般に溶液中で会合するときにハイブリダイズする。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはTijssen1993LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbespartIchapter2,Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,Elsevier,NewYork及びAusubel,前出に記載されている。HamesandHiggins1995GeneProbes1IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford,England,HamesandHiggins1及びHamesandHiggins1995GeneProbes2IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford,EnglandHamesandHiggins2はオリゴヌクレオチドを含むDNAとRNAの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。サザン又はノーザンブロットで100個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の1例は、50ホルマリンにヘパリン1mgを加え、42°Cで一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の1例は65°C、0.2×SSCで15分間洗浄するSSC緩衝液の説明についてはSambrook,前出参照。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の1例は40°C、2×SSCで15分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の5倍以上である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験においてストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはTijssen1993,前出やHamesandHiggins1及び2に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び/又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加によりハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約5倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。超ストリンジェント条件は特定プローブの熱融点Tmに等しくなるように選択される。Tmは規定イオン強度及びpH下で試験配列の50が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びpHで特定配列のTmよりも約5°C低くなるように高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも10倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも1/2で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも10倍、20倍、50倍、100倍又は500倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも1/2で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。ユニークサブ配列1側面では、本発明は本明細書に開示するO-tRNA及びO-RSの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は従来公知の任意tRNA及びRS核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したBLASTを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。同様に、本発明は本明細書に開示するO-RSの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は従来公知の任意RS配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。本発明はO-RSの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。配列比較、一致度及び相同度2種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して一致又は一致度百分率なる用語は2種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム又は当業者に入手可能な他のアルゴリズムの1種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。2種以上の核酸又はポリペプチド例えばO-tRNAもしくはO-RSをコードするDNA又はO-RSのアミノ酸配列に関して実質的に一致なる用語は2種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約60、約80、約90~95、約98、約99以上であることを意味する。このような実質的に一致する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても相同であるとみなす。少なくとも約50残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約100残基長の領域にわたって実質的一致が存在していることが好ましく、少なくとも約150残基又は比較する2配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。蛋白質及び/又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。同様に、核酸及び/又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、1個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、1種以上のホモグルタミン例えば非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に1個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の1個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に2種以上の核酸又は蛋白質又はその配列間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は25程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば30、40、50、60、70、80、90、95又は99以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法例えばデフォルトパラメーターを使用するBLASTP及びBLASTNは本明細書に記載し、一般に入手可能である。配列比較及び相同性判定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。比較のための最適な配列アラインメントは例えばSmithWaterman,Adv.Appl.Math.2:4821981の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanWunsch,J.Mol.Biol.48:4431970の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonLipman,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA85:24441988の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェアWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA、又は目視一般にAusubelら,後出参照により実施することができる。配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの1例はAltschulら,J.Mol.Biol.215:403-4101990に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアはNationalCenterforBiotechnologyInformationwww.ncbi.nlm.nih.gov/から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアTと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さWの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対HSPを識別する。Tを隣接単語スコア閾値と言うAltschulら,前出。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いHSPを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM1対のマッチ残基のリウォードスコア、常に>0及びNミスマッチ残基のペナルティースコア、常に<0を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ低下するか、累積スコアが1カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラムヌクレオチド配列用は語長W11、期待値E10、カットオフ100、M=5、N=4、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、BLASTPプログラムは語長W3、期待値E10、及びBLOSUM62スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用するHenikoffHenikoff1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915参照。配列一致度百分率の計算に加え、BLASTアルゴリズムは2配列間の類似性の統計分析も実施する例えばKarlinAltschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90:5873-57871993参照。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1尺度は2種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率PNである。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。突然変異誘発及び他の分子生物学技術本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはBergerandKimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,CABerger;Sambrookら,MolecularCloning-ALaboratoryManual第3版,Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,2001Sambrook及びCurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubelら編,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWileySons,Inc.,2003年補遺Ausubelが挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えばホモグルタミン、直交tRNA、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。例えばtRNA分子を突然変異させるため、tRNAのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、ホモグルタミンをコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、DNAシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA突然変異誘発、ギャップデュプレクスDNAを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限-選択及び制限-精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、2本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。1態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等により突然変異誘発を行うことができる。本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクションする。例えば、直交tRNA、直交tRNAシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも1個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者例えばシャトルベクターでカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び/又は組込みに適している。GilimanSmith,Gene8:811979;Robertsら,Nature,328:7311987;Schneider,B.ら,ProteinExpr.Purif.6435:101995;Ausubel,Sambrook,Bergerいずれも前出参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーションFromら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,58241985、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法Kleinら,Nature327,70-731987、及び/又は同等方法等の標準方法により細胞及び/又は微生物に導入する。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばATCCから入手でき、例えばATCCから刊行されたTheATCCCatalogueofBacteriaandBacteriophage1996Ghernaら編が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もSambrook前出,Ausubel前出及びWatsonら1992RecombinantDNASecondEditionScientificAmericanBooks,NYに記載されている。更に、MidlandCertifiedReagentCompanyMidland,TXmcrc.com、TheGreatAmericanGeneCompanyRamona,CA,世界ウェブgenco.com参照、ExpressGenInc.Chicago,IL,世界ウェブexpressgen.com参照、OperonTechnologiesInc.Alameda,CA、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸をオーダーメード又は標準注文することができる。遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。例えば後期核酸単離のための例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはFreshney1994CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版,Wiley-Liss,NewYorkとその引用文献;Payneら1992PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWileySons,Inc.NewYork,NY;GamborgandPhillipseds1995PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork及びAtlasandParksedsTheHandbookofMicrobiologicalMedia1993CRCPress,BocaRaton,FLが挙げられる。該当蛋白質及びポリペプチド例えば少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドと、2種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドも本発明の特徴である。賦形剤例えば医薬的に許容可能な賦形剤も蛋白質に添加することができる。場合により、本発明の蛋白質は翻訳後修飾を含む。ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は、少なくとも1個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を提供する段階を含み;細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交tRNAO-tRNAと;O-tRNAをホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼO-RSを含む。所定態様では、O-tRNAは本明細書の配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるO-tRNAに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約45、50、60、75、80、又は90以上の抑圧効率を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。本発明はホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等と少なくとも75一致しており、ホモグルタミン等の1種以上の非天然アミノ酸の導入によりターゲット蛋白質と相違するアミノ酸配列を含む。本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のO-tRNA/O-RS対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ホモグルタミンは蛋白質に組込まれる。国際出願第PCT/US2004/011786号、出願日2004年4月16日、発明の名称真核遺伝コードの拡張ExpandingtheEukaryoticGeneticCode;及びWO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みINVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDSはこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、O-tRNA/O-RS対を宿主例えば大腸菌に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができるホモグルタミン例えばチロシン又はフェニルアラニンアミノ酸の誘導体等の合成アミノ酸のinvivo蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はinvitro翻訳系に導入してもよいし、invivo系に導入してもよい。本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。1側面では、組成物は場合により、ホモグルタミンもしくは複数の非天然アミノ酸を含む蛋白質を例えば少なくとも10μg、少なくとも50μg、少なくとも75μg、少なくとも100μg、少なくとも200μg、少なくとも250μg、少なくとも500μg、少なくとも1mg、少なくとも10mg以上、又はinvivo蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中例えば約1nl~約100Lの任意の容量中に例えば少なくとも10μg蛋白質/l、少なくとも50μg蛋白質/l、少なくとも75μg蛋白質/l、少なくとも100μg蛋白質/l、少なくとも200μg蛋白質/l、少なくとも250μg蛋白質/l、少なくとも500μg蛋白質/l、少なくとも1mg蛋白質/l、又は少なくとも10mg蛋白質/l以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で大量例えば他の方法、例えばinvitro翻訳で一般に可能な量よりも多量に生産することも本発明の特徴である。ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、例えば蛋白質アレーのための部分へのターゲット等を変化させるように例えば蛋白質構造及び/又は機能の変化を調整するために実施することができる。ホモグルタミンを組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び/又は光化学的性質、触媒能、半減期例えば血清半減期、他の分子との例えば共有又は非共有反応性等の性質を改変する。少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質例えば抗体、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばDougherty,2000UnnaturalAminoAcidsasProbesofProteinStructureandFunction,CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652参照。更に、1種以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込み、例えばポリペプチドを固体支持体に固定するための分子タグを提供することができる。非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを使用してアレーを作製する方法の詳細については、例えばWangとSchultzの2003年12月22日付け出願、発明の名称蛋白質アレーPROTEINARRAYS、代理人整理番号54-000810PC参照。本発明の1側面では、組成物は少なくとも1個、例えば少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、又は少なくとも10個以上の非天然アミノ酸例えばホモグルタミン及び/又は他の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも1種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10種以上の異なる非天然アミノ酸を含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも1個がホモグルタミンで置換された蛋白質を含有する。2個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい例えば蛋白質は2個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、2個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい。3個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも1個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。本明細書に記載する組成物と方法を使用してホモグルタミン等の非天然アミノ酸を組込むか、又は複数の異なる非天然アミノ酸及び例えば1個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸をコードするほぼ任意蛋白質又はその部分を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に1個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、1種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはGenBank、EMBL、DDBJ及びNCBIが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等と例えば少なくとも60、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、又は少なくとも99以上一致しており、1種以上の非天然アミノ酸を含む。1種以上のホモグルタミンを組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際出願第PCT/US2004/011786号、出願日2004年4月16日、発明の名称真核遺伝コードの拡張ExpandingtheEukaryoticGeneticCode;及びWO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みINVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDSに記載されているものが挙げられる。1種以上のホモグルタミンを組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体抗体の詳細については後述する、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C-X-Cケモカイン例えばT39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF-4、MIG、カルシトニン、CCケモカイン例えば単球化学誘引蛋白質-1、単球化学誘引蛋白質-2、単球化学誘引蛋白質-3、単球炎症性蛋白質-1α、単球炎症性蛋白質-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40リガンド、Cキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子CSF、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン例えば上皮好中球活性化ペプチド-78、GROα/MGSA、GROβ、GROγ、MIP-1α、MIP-1δ、MCP-1、表皮増殖因子EGF、エリスロポエチンEPO、表皮剥離毒素A及びB、IX因子、VII因子、VIII因子、X因子、繊維芽細胞増殖因子FGF、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G-CSF、GM-CSF、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質例えばソニック、インディアン、デザート、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子HGF、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子IGF、インターフェロン例えばIFN-α、IFN-β、IFN-γ、インターロイキン例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等、ケラチノサイト増殖因子KGF、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子NIF、オンコスタチンM、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、PD-ECSF、PDGF、ペプチドホルモン例えばヒト成長ホルモン、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱外毒素A、B及びC、リラキシン、レニン、SCF、可溶性補体受容体I、可溶性I-CAM1、可溶性インターロイキン受容体IL-1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシンSEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、スーパーオキシドジスムターゼSOD、毒素性ショック症候群毒素TSST-1、チモシンα1、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子βTNFβ、腫瘍壊死因子受容体TNFR、腫瘍壊死因子αTNFα、血管内皮増殖因子VEGEF、ウロキナーゼ等が挙げられる。本明細書に記載するホモグルタミンのinvivo組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の1類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、DNA巻き戻し、プレmRNAスプライシング、RNAポリアデニル化及びRNA分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。本発明の蛋白質例えば1種以上のホモグルタミンを組込んだ蛋白質の1類としては発現アクチベーター例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン例えばIL-1、IL-2、IL-8等、インターフェロン、FGF、IGF-I、IGF-II、FGF、PDGF、TNF、TGF-α、TGF-β、EGF、KGF、SCF/c-キット、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1及びヒアルリン/CD44;シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物例えばMos、Ras、Raf及びMet;並びに転写アクチベーター及びサプレッサー例えばp53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、及びステロイドホルモン受容体例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、LDL受容体リガンド及びコルチコステロンが挙げられる。少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ酵素例えば産業用酵素又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ例えばp450類、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。これらの蛋白質の多くは市販されており例えばSigmaBioSciences2003カタログ及び価格表参照、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である例えばGenbank参照。例えば1種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って1種以上のホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、例えば非天然アミノ酸例えばホモグルタミンへのレポーター基例えばラベル又はラベル結合部位の付加による検出性、LD50又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること例えば経口利用性等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。他の各種蛋白質も本発明の1種以上のホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌例えばAspergillus、Candida種;細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌例えばStaphylococci例えばaureus又はStreptococci例えばpneumoniae;原生動物例えば胞子虫類例えばPlasmodia、根足虫類例えばEntamoeba及び鞭毛虫類Trypanosoma、Leishmania、Trichomonas、Giardia等;ウイルス例えばRNAウイルス例えばポックスウイルス例えばワクシニア、ピコルナウイルス例えばポリオ、トガウイルス例えば風疹、フラビウイルス例えばHCV、及びコロナウイルス、-RNAウイルス例えばラブドウイルス例えばVSV、パラミクソウイルス例えばRSV、オルトミクソウイルス例えばインフルエンザ、ブンヤウイルス及びアレナウイルス、dsDNAウイルス例えばレオウイルス、RNA→DNAウイルス即ちレトロウイルス、例えばHIV及びHTLV、及び所定のDNA→RNAウイルス例えばB型肝炎に由来する蛋白質において、1種以上のワクチン蛋白質中の1種以上の天然アミノ酸をホモグルタミンで置換することができる。昆虫耐性蛋白質例えばCry蛋白質、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素例えばリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ、RUBISCO、リポキシゲナーゼLOX及びホスホエノールピルビン酸PEPカルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質もホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。所定態様では、本発明の方法及び/又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド又はその部分は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも1個のセレクターコドン、少なくとも2個のセレクターコドン、少なくとも3個のセレクターコドン、少なくとも4個のセレクターコドン、少なくとも5個のセレクターコドン、少なくとも6個のセレクターコドン、少なくとも7個のセレクターコドン、少なくとも8個のセレクターコドン、少なくとも9個のセレクターコドン、10個以上のセレクターコドンを含む。該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えばホモグルタミンを組込むために1個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の突然変異誘発及び他の分子生物学技術のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、1個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、1種以上のホモグルタミンを挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体例えば突然変異体、変形を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち1種以上のホモグルタミンをコードする1個以上のセレクターコドンをもつ任意核酸も含む。ホモグルタミン酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交tRNA/RS対によるホモグルタミンのinvivo組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交tRNA、直交tRNAシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターを発現する1種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクションする。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、2成分を第1のベクターに配置し、第3の成分を第2のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。免疫反応性によるポリペプチドの定義本発明のポリペプチドは例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合にはホモグルタミンを含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の1つである。本明細書で使用する抗体なる用語は限定されないが、検体抗原と特異的に結合してこれを認識する1又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び1本鎖抗体等が挙げられる。Fabフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する抗体なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばPaul,FundamentalImmunology,4thEd.,1999,RavenPress,NewYork参照。イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの1種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント例えばフロイントアジュバントと共に免疫原性蛋白質を免疫する抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばHarlowandLane1988Antibodies.ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,NewYork参照。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はUSSN60/479,931、60/463,869、及び60/496,548、発明の名称真核遺伝コードの拡張ExpandingtheEukaryoticGeneticCode;WO2002/085923、発明の名称非天然アミノ酸のインビボ組込みINVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS;2003年1月16日付け特許出願、発明の名称糖蛋白質合成Glycoproteinsynthesis、USSN60/441,450;及び2002年12月22日付け特許出願、発明の名称蛋白質アレーProteinArrays、代理人整理番号P1001US00に記載されている。tRNA及びO-RS及びO-tRNA/O-RS対の使用本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のO-tRNA/O-RS対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ホモグルタミンは蛋白質に組込まれる。特許出願InvivoIncorporationofUnnaturalAminoAcids,WO2002/085923、発明者Schultzらはこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、O-tRNA/O-RS対を宿主例えば大腸菌に導入すると、前記対はセレクターコドン例えばアンバーナンセンスコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができるホモグルタミンのinvivo蛋白質例えばミオグロビン又は治療用蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はinvitro翻訳系に導入してもよいし、invivo系に導入してもよい。ホモグルタミンを組込んだ蛋白質は治療用蛋白質として使用することもできるし、蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用、蛋白質中の電子移動プロセス等の研究を助長するために使用することもできる。キットキットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも1種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはO-tRNAをコードするポリヌクレオチド配列、及び/又はO-tRNA、及び/又はO-RSをコードするポリヌクレオチド配列、及び/又はO-RSを収容する容器を含む。1態様では、キットは更にホモグルタミン含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。キット形態の生産に適した包装材料例えば容器等と本発明の任意組成物、系又は装置を組み合わせることもできる。以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。古細菌tRNALysに由来する直交シンテターゼ/tRNA対の作製PyrococcushorikoshiiのリシルtRNAシンテターゼから直交シンテターゼ-tRNA対を作製した。古細菌tRNAlys配列の多重配列アラインメントの一致に由来するアンバーサプレッサーtRNAを使用した処、32アンバー抑圧がβ-ガラクトシダーゼアッセイで観察された。従って、この対は大腸菌で非天然アミノ酸を蛋白質に選択的に組込むための高度に効率的なシステムである。20種の標準アミノ酸以外に付加アミノ酸を付加するように生物の遺伝コードを拡張するには、非天然アミノ酸を選択的に活性化し、前記アミノ酸を内在tRNAに転移しないアミノアシルtRNAシンテターゼと、前記非天然アミノ酸を受容し、内在シンテターゼにより負荷されないコグネイト直交tRNAの最低2種類の新規遺伝子が必要であるFurter,1998ProteinSci.,7:419-426。更に、tRNAは非コーディングコドン例えばナンセンス又はフレームシフトコドンに応答してアミノ酸を輸送する。これらの条件を満足するMethanococcusjannaschiiチロシルtRNAシンテターゼとコグネイトアンバーサプレッサーtRNAの対Wangら,2000J.Am.Chem.Soc.,122:5010-5011;Wangら,2001Science,292:498-500が同定されており、ケト含有アミノ酸Wangら,2003Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:56-61や光架橋性アミノ酸を含む各種非天然アミノ酸を大腸菌で効率的に高い信頼性で蛋白質に組込むために使用されているChinら,2002Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,99:11020-11024;ChinandSchultz,2002ChemBioChem,3:1135-1137。遺伝的にコードすることができる非天然アミノ酸の範囲と数を拡大するには、恐らく新規直交シンテターゼ-tRNA対と前記対をコードするための新規コドンが使用されると思われるMaglieryら,2001J.Mol.Biol.,307:755-769;Andersonら,2002Chem.Biol.,9:237-244。最近、MethanobacteriumthermoautotrophicumロイシルtRNAシンテターゼとHalobacterium種NRC-1に由来するコグネイト直交アンバー、オパール、及び4塩基サプレッサーtRNAから誘導される直交対を構築するために新規アプローチが採用されているAndersonandSchultz,2003Biochemistry,4232:9598-608。古細菌ロイシルtRNAの多重配列アラインメントのコンセンサス配列からこれらのサプレッサーtRNAを設計することにより、効率的な直交フレームシフトサプレッサーとオパールサプレッサーが得られた。頑丈な直交サプレッサーtRNAはCUXXXXAAアンチコドンループXXXXはコドンの逆相補配列であるをもち、ステム領域にミスペア塩基がなかった。本発明では古細菌tRNALys配列と古細菌PyrococcushorikoshiiのリシルtRNAシンテターゼに由来する効率的な直交シンテターゼ-tRNA対の合理的設計におけるこのコンセンサスサプレッサーストラテジーの使用を報告する。このtRNA/シンテターゼ対は大腸菌で直交サプレッサー対を構築するために魅力的な多数の特徴をもつ。大腸菌で使用する直交tRNAは大腸菌アミノアシルtRNAシンテターゼと交差反応すべきでない。原核生物と古細菌はtRNALys配列が類似しているが、識別塩基73が原核生物ではAであり、古細菌ではGであるIbbaら,1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:418-423ため、古細菌tRNAを大腸菌シンテターゼの基質として利用することができない。実際に、大腸菌全細胞溶解液は古細菌Halobacteriumcutirubrumに由来するtRNAをあまりアシル化しないことが分かったKwokandWong,1980Can.J.Biochem.,58:213-218。サプレッサーtRNAを構築するためには、アミノアシル化活性に悪影響を与えずにアンチコドンの配列を変化させることが考えられる。古細菌PyrococcushorikoshiiのリシルtRNAシンテターゼPhKRSによるtRNA認識に関する研究Teradaら,2002Nat.Struct.Biol.,9:257-262の結果、tRNAの認識を損なわずにアンチコドンを改変できることが判明した。従って、アンバーナンセンスコドンUAG等のコドンのサプレッサーtRNAをこれらのtRNAから構築できると思われる。更に、アミノアシルtRNAシンテターゼのアミノ酸特異性の変化を助長するために、古細菌タイプIリシルtRNAシンテターゼPhKRSの結晶構造は入手可能であるTeradaら,2002Nat.Struct.Biol.,9:257-262。PhKRSが大腸菌で直交性であるか否かを調べるためには、シンテターゼが大腸菌tRNAに有意程度まで負荷しないことを立証することが有用であった。PhKRSの遺伝子をゲノムDNAからPCR増幅し、プラスミドpBAD-Myc/HisAInvitrogenに挿入し、過剰発現させた。得られたPhKRS蛋白質を均質まで精製した。Halobacterium種NRC-1又は大腸菌に由来する全tRNAでアミノアシル化アッセイを実施した。Halobacterium種NRC-1とPyrococcushorikoshiiに由来するtRNALysの配列は高度に相同である図1。従って、好塩菌tRNAはPhKRSにより容易に負荷されると予想された。実際に、PhKRSは20分間に大腸菌全tRNAの14倍の量の好塩菌全tRNAに負荷する図2;10μM[tRNA]。PhKRSは大腸菌tRNAに弱く負荷することができるが、その程度は同一濃度の大腸菌全tRNAに対する大腸菌シンテターゼの活性の28分の1であり、バックグラウンド負荷の7倍に過ぎない。M.mariplaudisに由来する高度に相同の古細菌シンテターゼは大腸菌リシルtRNAシンテターゼを欠損するlysS/lysU二重突然変異体を弱くしか相補することができなかったIbbaら,1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:418-423。従って、PhKRSは大腸菌tRNAのinvivo負荷に関して内在大腸菌シンテターゼとあまり競合しないと思われる。PhKRSの直交性を更に特性決定するために、本発明者らはPhKRS遺伝子を構成的発現ベクターpKQに挿入しようと試みた。このプラスミドはリボソーム結合部位と、多重クローニング部位と、構成的グルタミンプロモーターの制御下のプラスミドpBAD-Myc/HisAInvitrogenに由来するrrnBターミネーターを含む。このプラスミドは更にColE1複製起点と、プラスミド維持用カナマイシン耐性選択マーカーを含む。残念ながら、野生型PhKRS遺伝子は構成的に発現させた場合に毒性であることが判明した。しかし、大腸菌で発現させた場合に低毒性を示す偶発的E444G突然変異体プラスミドpKQ-PhE444Gが同定された。E444G突然変異がこのシステムで明白な毒性を軽減するメカニズムは解明されていない。1つの可能性はこの突然変異がinvitroで観察される大腸菌tRNAの低レベルの異種間ミスチャージを防ぐと予想される。次段階はPhKRSにより負荷することができるナンセンスサプレッサーtRNAの構築であった。PhKRSで観察される弱いアンチコドン結合決定基はこの酵素が各種アンチコドン配列をもつtRNAを受容することを示唆しているTeradaら,2002Nat.Struct.Biol.,9:257-262。アンバー抑圧は大腸菌で最も十分に特性決定され且つ最も効率的な抑圧形態であるAndersonら,2002Chem.Biol.,9:237-244ので、本発明者らはコンセンサス配列から直交古細菌アンバーサプレッサーtRNAとしてAKCUAを構築したAndersonandSchultz,2003Biochemistry,4232:9598-608。GCGプログラムpileupを使用して入手可能なゲノム配列に由来する全古細菌tRNALys配列の多重配列アラインメントを実施した図1。整列させたtRNAのコンセンサス配列を決定し、クローバーリーフ構造図を作成した図3。次に、サプレッサー効率を低下させることがわかっているステム領域における非カノニカル塩基対又は塩基ミスマッチについて配列を調べたHouら,1992Biochemistry,31:4157-4160。tRNALysコンセンサス配列にこのようなミスペアは存在していなかった。CUCUAAAはアンバー抑圧に最適であることが分かっているYarusら,1986J.Mol.Biol..192:235-255ので、アンチコドンループをこの配列に置換した。設計したtRNA配列を合成オリゴヌクレオチドGenosysのオーバーラップ伸長により構築し、強力な構成的lppプロモーターの制御下にプラスミドpACGFPMaglieryら,2001J.Mol.Biol.,307:755-769のEcoRI-PstI制限部位間に挿入した。得られたプラスミドpAC-AKCUAは更にp15A複製起点とクロラムフェノコール耐性選択マーカーを含む。この潜在的直交シンテターゼ-tRNA対の抑圧効率を試験するために、GeneHogs大腸菌細胞InvitrogenをpKQ-PhE444G、pAC-AKCUA、及びlacZレポータープラスミドpLASC-lacZTAGAndersonandSchultz,2003Biochemistry,4232:9598-608で同時形質転換した。このプラスミドはpSC101から誘導され、アンピシリン耐性選択マーカーとlppプロモーターの制御下にβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を含む。lacZ遺伝子の許容部位である残基25には早期終結をもたらすアンバーコドンが存在する。アンバーサプレッサーtRNAの不在下では、pLASC-lacZTAGを含む細胞は25位にAAAリジンセンスコドンを含むプラスミドpLASC-lacZLysで観察されるβ-ガラクトシダーゼの0.17に過ぎす、プラスミドを含まない細胞の活性の2倍でしかない。AKCUAが内在大腸菌シンテターゼにより負荷できないならば、tRNAをpLASC-lacZTAGと同時発現させた場合にアンバー抑圧は殆ど認められないと思われる。pAC-AKCUAとpLASC-lacZTAGを含む細胞ではlacZlysの発現に対して1.7の抑圧しか認められない。PhKRSが直交tRNAに負荷できるならば、プラスミドpKQ-PhE444Gをこのシステムに導入すると、より高レベルのアンバー抑圧が認められると思われる。実際に、32の抑圧が認められる。比較として、大腸菌について従来記載されている直交M.jannaschii由来チロシンシンテターゼ-tRNA対の抑圧効率はコグネイトシンテターゼの存在下では18.5であり、このシンテターゼの不在下では0.2である。M.thermoautotrophicum由来ロイシンアンバー直交対はコグネイトシンテターゼの存在下と不在下で夫々33.2と1.5の抑圧効率であるAndersonandSchultz,2003Biochemistry,4232:9598-608。本実施例では、非天然アミノ酸の部位特異的大腸菌組込み用直交シンテターゼ-tRNA対として、タイプIリシルtRNAシンテターゼと古細菌tRNALys配列の多重配列アラインメントに由来するアンバーサプレッサーtRNAを同定した。PhKRS/AKCUA対で認められる高い効率32抑圧は効率的直交サプレッサーtRNAを構築するためにコンセンサス配列ストラテジーが有効であることを立証するものである。PhKRSの毒性を除去する非天然アミノ酸によるフレームシフト抑圧PyrococcushorikoshiiのタイプIリシルtRNAシンテターゼに由来する直交tRNAシンテターゼ対が大腸菌で使用するために開発されている。このシステムのtRNA部分は直交アンバーサプレッサーとして非常に良好に機能した。シンテターゼ-発現プラスミドpKQ-PhE444GはこのtRNAに負荷することができたが、依然として毒性効果が認められた。単独で発現させると、pKQ-PhE444Gを含む細胞はプラスミドを含まない細胞で観察される密度の56まで増殖した。レポータープラスミドpAC-AKCUA及びpAC-AKCUAも中程度の毒性を示し、71及び52まで増殖した。pKQ-PhE444GをプラスミドpAC-AKCUAと同時形質転換すると、細胞密度は17まで低下する。更に、β-ラクタマーゼレポータープラスミドpAC-AKCUAプラスミドpACKO-A184TAGの誘導体と同時発現させると、細胞密度は僅か5になる。従って、このシステムではtRNAとシンテターゼの両方に毒性があることが明らかである。更に、両者プラスミドで同時形質転換した細胞は生存率が劇的に低下するという相乗効果があると思われる。この問題に対処するために、PhKRSの低毒性突然変異体を検討した。PhKRSの点又は他の突然変異は負荷活性を維持しながらシンテターゼの毒性を低下できるのではないかと予想された。従って、pKQ-PhE444Gを化学的にコンピテントなXL1赤血球Stratageneに形質転換し、25μg/mLカナマイシンを添加したLB寒天プレートに細胞をプレーティングした。この株は形質転換プラスミドに高率の突然変異誘発を生じる数個のゲノム突然変異をもつ。約100個のコロニーをこのプレートから掻き取り、カナマイシンを補充した液体LB培地25mLで増幅した。pKQ-PhE444Gの非毒性突然変異体は野生型よりも迅速に増殖し、細胞の継代培養によりこれらの突然変異体が蓄積されるであろうと予想された。各段階で10000倍の希釈倍率で2回継代培養後に細胞からミニプレップし、プラスミドpAC-AKCUAを含むGenehog細胞に導入し、カナマイシン及びクロラムフェノコール各25μg/mLと各種濃度のアンピシリンを加えたLB寒天プレートにプレーティングした。90を上回る形質転換細胞が明白な毒性を示さず、1000μg/mLアンピシリンを加えたLB寒天プレート上で生存することができた。1500μg/mLアンピシリンでもコロニーの縮小が観察され、効率的なアンバー抑圧が示された。1個の突然変異体シンテターゼpKQ-PhKepを単離し、PhKRSオープンリーディングフレームの制限マッピングと配列決定により特性決定した。突然変異体遺伝子は残基S357の後に778bpの挿入配列を含むが、それ以外はプラスミドpKQ-PhE444Gと同一配列である。BLAST検索によると、この挿入配列はプラスミドp1658/97に由来するinsAcp1と注釈された配列と相同であるが、文献にこの配列の他の言及は認められず、この配列の起源は不明である。PhKRSの開始コドンから翻訳される場合に、この遺伝子の推定産物はS357の下流の6アミノ酸が短縮している。PhKRSの短縮が毒性の除去に関与しているか否かを試験するために、配列5’-CAGTGGAATTCAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3’をもつプライマーCA510Rを合成し、プラスミドpKQで短縮突然変異体を明示的に構築した。CA279とCA510Rを使用してプラスミドpKQ-PhKepをPCR増幅し、産物をプラスミドpKQのNcoI-EcoRI部位にサブクローニングした。得られたプラスミドpKQ-PhΔADpKQ-Ph510とも言うをプラスミドpAC-AKCUAと同時形質転換した処、得られた形質転換体はpKQ-PhKepで形質転換した細胞と同等のIC50をもち、明白な毒性をもたないことが判明した。残基S357後の短縮はPhKRSのアンチコドン結合ドメインを欠失させると思われるので、本発明者らはこの欠失がシンテターゼのtRNA認識特性にどのように影響するかを検討したいと思った。そこで、シンテターゼを過剰発現させ、invitroアミノアシル化アッセイを実施した。CA279とCA5115’-CATTGGAATTCGAGTAAGTTGGCAGCATCAC-3’を使用してpKQ-PhKepから遺伝子をPCR増幅し、pBAD-Myc/HisAのNcoI-EcoRI部位にC末端Myc/Hisタグとインフレームでサブクローニングした。蛋白質をNi-NTAクロマトグラフィーにより精製した。4塩基コドンと非天然アミノ酸による遺伝コードの拡張少数の例外を除き、全公知生物の遺伝コードは同一の20種の標準アミノ酸をコードするが、ユニークtRNA/アミノアシルtRNAシンテターゼ対、アミノ酸源、及びアミノ酸に特異的なユニークセレクターコドンさえあれば新規構成単位を付加することができるWangら,2001Expandingthegeneticcode.Science292:498-500。先に、本発明者らは夫々大腸菌Wangら,2003AdditionoftheketofunctionalgrouptothegeneticcodeofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:56-61;Santoroら,2002Anefficientsystemfortheevolutionofaminoacyl-tRNAsynthetasespecificity.Nat.Biotechnol.20:1044-8;Chinら,2002AdditionofaphotocrosslinkingaminoacidtothegeneticcodeofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024;Mehlら2003Generationofabacteriumwitha21aminoacidgeneticcode.J.Am.Chem.Soc.125:935-9と酵母Chinら2003Anexpandedeukaryoticgeneticcode.Science301:964-7において新規特性をもつ各種アミノ酸を遺伝的にコードするためにアンバーナンセンスコドンTAGを直交M.jannaschii及び大腸菌tRNA/シンテターゼ対と併用できることを示している。しかし、非コーディング三重項コドンの数は限られているため、任意生物によりコードされるアミノ酸の最終的な数は著しく制限される。本発明では、4塩基コドンAGGAに応答してアミノ酸ホモグルタミンhGlnをミオグロビンに効率的且つ選択的に組込む古細菌tRNALys配列に由来する新規直交シンテターゼ/tRNA対の作製について報告する。hGlnによるフレームシフト抑圧は蛋白質収率又は細胞増殖速度にさほど影響せず、TAGの抑圧と相互に直交性であることが判明した。本発明では利用可能な三重項コドンの数も翻訳機構自体もコードの更なる拡張の有意障害とならないことを示唆する。天然に存在する1フレームシフトサプレッサーには多数の例があり、グルタミンをコードするSu7に由来するUAGNN=A,G,C又はTサプレッサーCurranandYarus1987ReadingframeselectionandtransferRNAanticodonloopstacking.Science238:1545-50、スレオニンをコードするACCNのsufJ由来サプレッサーBossiandRoth1981Four-basecodonsACCA,ACCUandACCCarerecognizedbyframeshiftsuppressorsufJ.Cell25:489-96及びtRNALysとtRNAGlnに由来するCAAAサプレッサーO’Connor2002InsertionsintheanticodonloopoftRNA1GlnsufGandtRNALyspromotequadrupletdecodingofCAAA.NucleicAcidsRes.30:1985-1990か挙げられる。更に、遺伝的選択を使用して突然変異体tRNAの大きなライブラリーから大腸菌tRNASerUCCUサプレッサー等の効率的な4塩基及び5塩基コドンサプレッサーtRNAが同定されているMaglieryら,2001Expandingthegeneticcode:selectionofefficientsuppressorsoffour-basecodonsandidentificationofshiftyfour-basecodonswithalibraryapproachinEscherichiacoli.J.Mol.Biol.307:755-769;Andersonら,2002Exploringthelimitsofcodosaandanticodonsize.Chem.Biol.9:237-244;Hohsakaら,1999Incorporationoftwononnaturalaminoacidsintoproteinsthroughextensionofthegeneticcode.NucleicAcidsSymp.Ser.42:79-80;Hohsakaら,2001Five-basecodonsforincorporationofnonnaturalaminoacidsintoproteins.NucleicAcidsRes.29:3646-51;HohsakaandSisido2002Incorporationofnon-naturalaminoacidsintoproteins.Curr.Opin.Chem.Biol.6:809-15。非天然アミノ酸を四重項コドンでinvivoコードするためには、このコドンを固有に認識するtRNAとこのtRNAのみを該当非天然アミノ酸で固有にアミノアシル化する対応するシンテターゼを作製する必要がある。従来作製されている直交M.jannaschiiアンバーサプレッサーtRNAのアンチコドンループはコグネイトシンテターゼJYRSの主要認識成分であるので、4塩基コドンをデコードするようにこのtRNAを操作することは困難であった。JYRSのアンチコドン結合特異性を緩和することは可能であると思われるが、アンチコドン配列のみを使用してアンバーサプレッサーと4塩基サプレッサーを区別する相互に直交性の対を構築することは困難であると思われる。従って、異なる起源の2種の直交対を使用すれば2種の非天然アミノ酸をポリペプチドに同時に組込むことができるシステムが得られる可能性が高いが、新規直交tRNA-シンテターゼ対の開発が必要である。古細菌PyrococcushorikoshiiPhKRSのリシルシンテターゼ/tRNA対は、1原核生物のA73と古細菌のG73の保存により直交性であると思われIbbaら,1999SubstraterecognitionbyclassIlysyl-tRNAsynthetases:amolecularbasisforgenedisplacement.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:418-423、2PhKPSはtRNAアンチコドンループ置換の耐性株であるため、サプレッサーtRNAに負荷することができTeradaら,2002Functionalconvergenceoftwolysyl-tRNAsynthetaseswithunrelatedtopologies.Nat.Struct.Biol.,9:257-262、3アミノ酸特異性の変化を助長するために、PhKRSの結晶構造は入手可能であるTeradaら,2002Functionalconvergenceoftwolysyl-tRNAsynthetaseswithunrelatedtopologies.Nat.Struct.Biol.,9:257-262ので、本発明者らは候補直交対としてまずこの対に注目した。残念ながら、PhKRSは構成的に発現させた場合に毒性であることが判明した。しかし、突然変異誘発株XL1-redで継代培養した処、insAcp1と注釈されている778bp挿入エレメントにより残基S357の下流の6アミノ酸が短縮している非毒性変異体PhΔADが単離された。従って、アンチコドンループ結合ドメインが欠失しており、アンチコドンループ置換に起因すると思われる活性低下が更に最小になる。実施例1に詳細に記載したように、この短縮突然変異体が大腸菌で機能的且つ直交性であるか否かを調べるためには、シンテターゼがコグネイト古細菌tRNAに対する活性を維持しながら大腸菌tRNAに有意程度まで負荷できないことを立証することが有用であった。PhΔADとEcKRSの遺伝子をクローニングし、過剰発現させ、蛋白質を均質まで精製した。古細菌、Halobacterium種NRC-1又は大腸菌に由来する全tRNAのアミノアシル化をアッセイした。PhΔADは20分間に大腸菌全tRNAよりも多量の好塩菌全tRNAに負荷する図2;10μM[tRNA]。PhΔADは大腸菌tRNAに弱く負荷することができるが、その程度は同一濃度の大腸菌全tRNAに対する大腸菌シンテターゼの活性の28分の1であり、バックグラウンド負荷の7倍に過ぎない。更に、PhΔADは大腸菌リシルtRNAシンテターゼを欠損するlysS/lysU二重突然変異体であるPALΔSΔUTRpMAKlysU株Chenら,1994Propertiesofthelysyl-tRNAsynthetasegeneandproductfromtheextremethermophileThermusthermophilus.J.Bacteriol.176:2699-705を43°Cで相補することができなかった。しかし、大腸菌株HB101のlysU遺伝子座からクローニングしたEcKRSは正常増殖を生じた。従って、PhΔADはEcKRSに置換することができず、大腸菌tRNAのinvivo負荷に関して内在大腸菌シンテターゼとあまり競合しないと思われる。PhΔADが大腸菌で機能的であることを立証するために、本発明者らは直交アンバーサプレッサーtRNAによるβ-ラクタマーゼ抑圧アッセイをPhΔADに実施した。このアプローチでは、M.jannaschii直交対に従来開発されている選択スキームを使用することもできた。最近発表されたコンセンサス-サプレッサーストラテジーAndersonandSchultz,P.G.2003AdaptationofanOrthogonalArchaealLeucyl-tRNAandSynthetasePairforFour-base,Amber,andOpalSuppression.Biochemistry42:9598-608を使用してサプレッサーtRNACUAAKCUAを設計した。入手可能なゲノム配列に由来する全古細菌tRNALys配列の多重配列アラインメントを実施し、コンセンサス配列を決定した。アンチコドンループ配列をCUCUAAAに置換し、アンバーサプレッサーtRNAを得た図1。AKCUAの遺伝子を合成し、プラスミドpACKO-A184TAGAndersonandSchultz,P.G.2003AdaptationofanOrthogonalArchaealLeucyl-tRNAandSynthetasePairforFour-base,Amber,andOpalSuppression.Biochemistry42:9598-608に挿入し、アンバー抑圧効率を試験した。このプラスミドは許容部位A184にTAGコドンをもつβ-ラクタマーゼblaの遺伝子を含む。tRNAの不在下では、翻訳により観測可能な全長β-ラクタマーゼは得られず、5μg/mLアンピシリンに感受性であった。AKCUAと同時発現させた場合にはアンピシリン耐性の増加は認められず、tRNAは大腸菌シンテターゼにより負荷されないことが示唆された。PhΔADと同時発現させた場合には直交tRNAは負荷され、効率的なアンバー抑圧と1000μg/mLアンピシリンに対する耐性が得られた。従って、PhΔAD/AKCUA直交対は効率的な直交アンバー抑圧システムである。4塩基コドンAGGAを大腸菌tRNASerUCCUにより効率的に抑圧できることは従来示されている。この場合には、4塩基コドンの抑圧はサプレッサーtRNAの効率と毒性低下に関与すると思われるレアコドンAGGと競合性である。アンチコドンループをCUUCCUAAに置換することによりAKCUAからAGGAサプレッサーtRNAを設計し、プラスミドpACKO-A184AGGAに挿入した。pACKO-A184TAGと同様に、このプラスミドはA184位にAGGAコドンを含むため、翻訳できず、5μg/mLアンピシリンにしか耐性でなくなる。残念ながら、このtRNAは大腸菌シンテターゼに直交性ではなくなる。設計したtRNAを含む細胞はPhΔADの有無に拘わらず200μg/mLアンピシリンまで生存する。直交変異体を同定するために、本発明者らは1-4及び69-72位の受容体ステムの最後の4塩基対を同時にランダム化したライブラリーを構築したAndersonandSchultz,P.G.2003AdaptationofanOrthogonalArchaealLeucyl-tRNAandSynthetasePairforFour-base,Amber,andOpalSuppression.Biochemistry42:9598-608。これらのtRNAをPhΔADと同時発現させ、細胞を200μg/mLのアンピシリン選択2ラウンドにかけ、活性AGGAサプレッサーtRNAのプールを得た。直交変異体を同定するために、tRNAプラスミドを単離し、384個の各個クローンをPhΔADの不在下にアンピシリン感受性についてスクリーニングした。これらのうちで最も効率的な直交クローンはPhΔADの存在下に700μg/mLアンピシリンに耐性であるが、その不在下では5μg/mLまでしか生存しない。このtRNA,AKUCCUは多重受容体ステム置換と重要性が不明な偶発的A37C突然変異を含む図5。AGGAに応答してホモグルタミンを組込むためには、次にPhΔADの特異性を改変することが有用であった。ホモグルタミンはリジンと同等寸法であり、水素結合供与性と受容性の両者をもつので、改変シンテターゼの忠実度を試験するための初期ターゲットとして選択した。PhKRS結晶構造の試験によると、リジンのε-アミノ基を特異的に認識する残基はE41とY268の2種類だけである。PhΔADに由来する小活性部位ライブラリーの構築で飽和突然変異誘発によりこれらの残基を同時にランダム化した。hGln特異的シンテターゼをスクリーニングするために、本発明者らはAKCUAの遺伝子と、M1及びQ107位に2個のTAGコドンをもつT7RNAポリメラーゼ遺伝子と、T7プロモーターの制御下のGFPuvをコードするGFPレポータープラスミドpREP2-AKCUASantoroら,2002Anefficientsystemfortheevolutionofaminoacyl-tRNAsynthetasespecificity.Nat.Biotechnol.20:1044-8を使用した。pREP2-AKCUAとPhΔADで同時形質転換すると、T7RNAPのアンバーコドンは抑圧され、その結果、GFPuv発現と緑色蛍光が生じる。シンテターゼの不在下では細胞は白色である。従って、蛍光を観察することにより活性シンテターゼを含む細胞を同定することができる。細胞をpREP2-AKCUAで同時形質転換した後にhGlnを含むプレートにライブラリーを播種した。個々の緑色コロニーを単離し、非天然アミノ酸の存在下と不在下に増殖させ、蛍光にhGlnを必要とするクローンを同定した。スクリーニングした15個のコロニーのうち5個がhGlnを含むプレートで高い蛍光を示した。これらのうちで1個を除く全てがY268S置換を保存しており、これらのシンテターゼのうちで最も選択的なhGlnRSはI41とS268をもっており、更に特性決定した。5個のコロニーに対応する5種の突然変異体はPhΔADに比較して以下の配列置換があった。次に直交hGlnRS/AKTCCT対を使用してGly24→AGGA突然変異をもつミオグロビン蛋白質を発現させ、観察されるhGln依存性表現型が非天然アミノ酸の特異的組込みに起因するか否かを調べた。hGlnRSの不在下に突然変異体ミオグロビン遺伝子を発現させた場合には、検出可能な蛋白質は生産されなかった。hGlnRSと同時発現させた場合には、ミオグロビン1.8mg/mLが単離された。比較として、野生型ミオグロビン遺伝子を含むプラスミドpBAD-JYAMBを発現させた場合には、ミオグロビン3.8mg/mLが生産された。精製蛋白質のトリプシンフラグメントのMALDI-TOF分析の結果、推定質量1676.88Daに一致する質量1676.85Daのペプチドであることが判明した。24位にリジン又はグルタミンを含むペプチドの徴候は全く認められなかった。更に、AGGAに応答するhGln組込み中に毒性は殆ど認められなかった。アラビノース誘導の不在下のミオグロビン発現に使用した条件下における対数増殖中期に、GeneHogs細胞の倍加時間はhGlnを含む細胞の2倍である。増殖速度のこの低下はhGlnの存在下と不在下の両者で認められ、低毒性はAGGA抑圧よりもシンテターゼとtRNAの発現の結果であることが示唆された。従って、AGGAサプレッサーとレアAGGコドンの交差反応性はフレームシフト抑圧の実用化を制限しない。hGln残基を組込むためのAGGA抑圧によるミオグロビンの発現を図7Aに示す。同図は抗HisC末端抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。AK514tRNA、hGlnRSPhKRSAのhGln特異的変異体及びhGlnレーン2-5の全3成分の存在下のみにG24位にAGGAコドンをもつミオグロビン遺伝子Myo24AGGAから蛋白質が生産された。75位のアンバー抑圧によるミオグロビンMyo75TAGの発現はJYRSとそのコグネイトアンバーtRNAの存在下のみに可能であり、リシルとチロシルの対の相互直交性が立証されたレーン6-9。本発明者らは単一ポリペプチドでTAG及びAGGAの同時抑圧にPhΔAD/AKUCCU対とM.jannaschiiチロシンシンテターゼJYRSを併用する可能性を更に検討した。プラスミドpBK-JYRSでJYRSと同時発現させた場合には、pMyo-AKUCCUは検出可能なミオグロビンを生じなかった。従って、JYRSはAKUCCUに負荷することができない。逆に、本発明者らはPhΔADで負荷することによりプラスミドpBAD/JYAMB-4TAGからミオグロビンを発現させようと試みた。この発現プラスミドは4位にTAGコドンをもつミオグロビン遺伝子と直交tRNATyrであるJ17を含む。Mehlら2003Generationofabacteriumwitha21aminoacidgeneticcode.J.Am.Chem.Soc.125:935-9。JYRSと同時発現させると、3.8mg/mLのミオグロビンが生産され、PhΔADの存在下では蛋白質は観察されない。従って、PhΔADはJ17に負荷することができない。従って、これらのシンテターゼ/tRNA対は相互に直交性であり、交差反応せずに併用することができる。2種の非天然アミノ酸をミオグロビンに組込むために、Gly24→AGGAとAla75→TAGをもつ突然変異体ミオグロビンを発現する単一プラスミドでAKUCCUとJ17を併用した。第2のプラスミドではJYRSに由来するO-メチル-L-チロシン特異的シンテターゼOMeYRSChinら,2002AdditionofaphotocrosslinkingaminoacidtothegeneticcodeofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:11020-11024とhGlnRSを併用した。両方のプラスミドで同時形質転換した細胞を両者アミノ酸の存在下に増殖させた処、1.7mg/Lのミオグロビンが生産された。2種の非天然アミノ酸又はシンテターゼのいずれかを取り除くと、蛋白質は全く生産されなかった。ミオグロビンモデルシステムを使用して2種の異なる非天然アミノ酸を組込むための2種の直交tRNAシステムの同時使用を図7Bに示す。同図は抗HisC末端抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。リシルとチロシルの直交対の存在下に24位にAGGAコドンと75位にTAGコドンをもつミオグロビン遺伝子Myo24AGGA/75TAGから蛋白質を発現させた。hGlnRSとOMeTyrRSを使用することにより、単一ポリペプチドで24位のAGGA抑圧によりhGlnを組込み、75位のアンバー抑圧によりO-メチルチロシンOMeTyrを組込んだ。同図に示すように、両者アミノ酸が存在する場合のみ、更に両者リシル及びチロシル直交システムが存在する場合のみにポリペプチドが生産される。図7A及び7Bのウェスタンブロットで観察された結果は図8及び9に示す分析で更に確認される。図8は野生型ミオグロビンMyoWT;24位にリシンを含むと推定されると図7Aで生産された突然変異体ミオグロビン24AGGA;hGlnを含むと推定されるのトリプシンフラグメントのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間分析を示す。これらのミオグロビン種の分析を夫々上段と下段に示す。精製蛋白質のトリプシンペプチドフラグメントの分析の結果、推定質量1676.88Daに一致する質量1676.85Daのペプチドであることが判明した。24位にリジントリプシン消化ペプチドでPhKRSAの存在下に発現させた蛋白質からの実測質量950.46Da及び全長ペプチドの計算質量950.53又は1,661.91Da又はグルタミン計算質量1661.87Daを含むペプチドの徴候は全く認められなかった。図9は図7Bで生産された全長二重突然変異体のエレクトロスプレーMS分析を示す。MS分析によると、G24K及びA75Y置換をもつミオグロビンの計算質量18,518.3Daに比較して両者非天然アミノ酸を含むミオグロビンの質量は推定質量18,546.60SD0.81に一致する18,546.40DaSD0.11であることが判明した。要約すると、本発明者らは非天然アミノ酸のinvivo部位特異的組込みのためのフレームシフト抑圧の使用を立証した。更に、本発明者らはこのP.horikoshiiに由来するリシルtRNAシンテターゼとM.jannaschiiチロシルtRNAシンテターゼに由来する直交対の相互直交性を立証し、2種の非天然アミノ酸を単一ポリペプチドに同時に組込むことができることを示した。相互に直交性の反応手又はフルオロフォアアミノ酸の組込みを可能にするシンテターゼ変異体を同定することが可能であると思われる。このような材料を使用すると、フルオロフォア対をFRET試験のためにポリペプチドにinvivo組込むことが可能である。同様に、非天然ポリマーのリボソーム生産のためにα-ヒドロキシ酸等のアミノ酸以外の部分を組込むことも可能である。大腸菌で効率的に抑圧されるCCCU又はCUAG等の付加コドンを使用することができる。あるいは、限定的コドン縮重により大腸菌のゲノムを再合成することにより、43個までのコドンを再コーディングに利用可能にすることができる。材料と方法シンテターゼ遺伝子のクローニングと発現:AmericanTypeCultureCollectionから入手したP.horikoshiiATCC;700860からゲノムDNAを作製した。PhKRSをPCR増幅し、過剰発現用としてプラスミドpBAD/Myc-HisAInvitrogenのNcoI-EcoRI部位にクローニングした。構成的発現には、シンテターゼ遺伝子をグルタミンプロモーターの制御下にpGLNとpKQAndersonandSchultz2003AdaptationofanOrthogonalArchaealLeucyl-tRNAandSynthetasePairforFour-base,Amber,andOpalSuppression.Biochemistry42:9598-608にクローニングした。pBAD/Myc-HisAに由来するこれらのプラスミドは夫々アンピシリン耐性とカナマイシン耐性を付与する。同様に、EcKRSを大腸菌株HB101のlysU遺伝子座からクローニングした。QiagenQIAexpressionistキットについて記載されているプロトコールにより2YT培地で蛋白質を過剰発現させた後に100mMTris-HCl,pH7.5;100mMNaCl;及び10グリセロールで透析した。invitroアミノアシル化アッセイ:大腸菌全tRNAはRocheから購入し、好塩菌tRNAはRNA/DNAExtractionKitQiagenを使用してHalobacterium種NRC-1ATCC;700922から抽出した。アッセイは50mMTris-HCl、pH7.5、30mMKCl、20mMMgCl2、3mMグルタチオン、0.1mg/mLBSA、10mMATP、1μM[3H]リジンAmersham、750nMシンテターゼ、及び0、2、10、又は40μM全tRNAを含有する反応液20μL中にて37°Cで20分間実施した。相補分析:PhΔAD、EcKRSを発現させるため、又はシンテターゼを発現させないようにPALΔSΔUTRpMAKlysU細胞をpGLN誘導体で形質転換し、50μg/mLアンピシリンを加えたLB寒天プレートにて30°Cでレスキューした。PALΔSΔUTR株のシンテターゼ欠損増殖不良の43°C相補は抗体を加えないLB寒天プレート又は液体培地で実施した。GeneHogsの増殖を陽性対照として使用してシンテターゼ発現からの毒性効果の可能性を排除した。液体培地では、飽和培養液を新鮮な培地で10000倍に希釈し、600nmで8時間増殖をモニターした。ライブラリー構築:合成オリゴヌクレオチドGenosysのオーバーラップ伸長によりtRNAの遺伝子を構築し、pACKO-A184TAG又はpACKO-A184AGGAのEcoRI-PstI部位にサブクローニングした。pACYC184に由来するこれらのレポータープラスミドはp15A複製起点と、クロラムフェノコール耐性遺伝子と、tRNA遺伝子の発現を制御する強力な構成的プロモーターを含む。PhΔADに由来するライブラリーはプラスミドpKQでEIPCRにより構築したStemmerandMorris,S.K.1992EnzymaticinversePCR:arestrictionsiteindependent,single-fragmentmethodforhigh-efficiency,site-directedmutagenesis.Biotechniques13:214-20。プレミックスしたホスホロアミダイトをライブラリー構築のためのオリゴヌクレオチド合成中に使用した。ライブラリーダイバーシティは理論ダイバーシティの900倍であり、配列に偏りのないことが配列決定により示された。抑圧効率の測定:25μg/mLカナマイシン及びクロラムフェノコールと5~1000μg/mLの各種濃度のアンピシリンを補充したLB寒天培地にプレーティングすることにより抑圧効率を測定した。プレート当たり細胞100個未満の濃度で細胞をプレーティングした。2番目に高い濃度と2番目に低い濃度が報告値の20以内となるような一連のプレートのうちでコロニーを形成するために細胞が生存した最高濃度として効率を報告した。hGlnを含むミオグロビンの発現と特性決定:単一部位組込み実験用として、p15A複製起点と、クロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ、AKUCCU、及びマッコウクジラミオグロビンの遺伝子を使用してpMyo-AKUCCUを構築した。ミオグロビン遺伝子はアラビノースプロモーターの制御下におき、G24位にAGGAコドンを含む。2部位組込み用として、pMyo-AKUCCUでミオグロビン遺伝子のA74位にTAGコドンを導入することにより別のプラスミドを構築した。直交tRNATyrであるJ17を第2のlppプロモーターの制御下に加えた。シンテターゼhGlnRS及びAzPheRSをプラスミドpKQから独立グルタミンプロモーター下に発現させた。リジンを除く19種のアミノ酸各0.4mg/ml、ビタミン及び1mg/mlhGlnSigmaを補充したGMML培地で適当なシンテターゼとミオグロビンの発現プラスミドを含むGeneHogs細胞を37°CでOD600=0.7まで増殖させ、0.02アラビノースで誘導した後、飽和まで増殖させた。細胞を音波処理により溶解させ、ミオグロビンをQiagenQIAexpressionistキットで精製した。TSRIProteomicsFacilityでトリプシンフラグメントのMALDI-MS分析を実施した。代表的リシルO-RS及びリシルO-tRNA代表的O-tRNAを実施例及び/又は表1に示す。代表的O-RSも実施例及び/又は表1に示す。O-RSをコードする代表的ポリヌクレオチド又はその一部は実施例及び/又は表1に示すものが挙げられる。本発明の更に詳細、特に実験の詳細については、Anderson,JohnChristopher,PathwayEngineeringoftheExpandingGeneticCode,Ph.D.Dissertation,TheScrippsResearchInstitute[2003]を参照されたい。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び/又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。"