"抗LAT1モノクローナル抗体を有する、免疫組織学染法によって胃癌の悪性度を決定するために使用されるキット。該モノクローナル抗体は、ヒトLAT1アミノ酸残基の、N末端から1~52位を特異的に認識する、請求項1記載の胃癌の悪性度を決定するために使用されるキット。1.モノクローナル抗体の作成LAT1のN末端の52アミノ酸アミノ酸152に相当に対する抗ヒトLAT1モノクローナル抗体をハイスループットプロテオミクス法にて作成した2021。この方法で、特異的な抗LAT1モノクローナル抗体を作るハイブリドーマを得た。このハイブリドーマ細胞をマウスBALBcに腹腔内に注射した後に、腹水を回収してこれをアフィ二ティカラムを通して精製抗体を得た。2.患者と試料1993年6月より2003年4月までに北里大学東病院で外科的に切除された進行胃癌胃壁固有筋層内またはそれより深く浸潤87症例を収集した。切除された胃は全て、10フォルマリン固定し、腫瘍病変は5mmの厚さで全割して、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックから、4μm厚さの切片を作り、HE染色を施した。全ての症例は日本胃癌取り扱い規約に則り7、組織学的に診断した。87症例中、28例がスキルス型胃癌であった。残りの59症例は非スキルス型胃癌であったが、その内訳は高分化型腺癌11例、中分化型腺癌15例、充実性低分化型腺癌20例、非充実性低分化型腺癌10例、印鑑細胞癌3例であった。本発明者は、癌病変のLAT1発現に加えて、他に4群におけるLAT1発現を検索した。すなわち、正常胃粘膜20例gastrointestinalstromaltumor例や膵癌症例で胃粘膜に病変がないもの、腸上皮化生のない背景胃粘膜32例、腸上皮化生のある背景胃粘膜37例、及び胃腺腫36症例である。3.免疫組織化学既に報告されている方法に従って3、外科的に切除されてフォルマリン固定パラフィン包埋された組織の4μm厚さ切片を使って免疫組織学的染色を行った。使用した一次抗体、希釈、抗原賦活は表1にまとめた。簡潔に記載すると、組織切片を脱パラフィンし、1過酸化水素を含むメタノール中で30分間処理して、内因性peroxidaseをブロックした。その後、非特異的反応のブロックの為にProteinblockSerumFreeであらかじめ培養し、切片を一次抗体とともに37°Cで1時間培養した。さらにperoxidaseでラベルしたpolymer続いて抗マウスIgG抗体で各30分間培養し、33’diaminobenzidineで発色した。核はMeyerのヘマトキシリン溶液で対比染色した。4.免疫組織染色の評価LAT1の免疫反応性の評価はSinicropeの方法3の軽度変法を採用した。すなわち、癌細胞膜の免疫反応性をもとに、4カテゴリを次のように規定した。発現強さ0,反応なし;1弱くないしは点状に陽性;2中等度に細胞膜全体が陽性;3細胞膜全体が強く陽性。各症例で癌組織中における最も高いLAT1発現の強さを採用した。胃癌細胞での代表的なLAT1発現の強さを図1に示した。さらにLAT1発現の領域を全体の胃癌組織を観察してその百分率であらわした。すなわち、0陽性なし;1局所的110陽性;2部分的11303びまん性30以上とした。LAT1発現スコアはLAT1発現強さX発現領域の数値であらわした。p53発現は核に強く発現している領域を癌組織全体の百分率として、0陽性なし;1局所的110陽性;2部分的11303びまん性30以上と評価した。胃癌組織の粘液表現型の分類は、CD10MUC2MUC5AC及びMUC6の免疫組織化学的反応性によって行い、4カテゴリ、胃型G型、腸型I型、胃腸型GI型及び分類不可型U型を規定した910。いずれのマーカーにも陰性な癌はU型とした。Ki67陽性細胞は1000以上の有核細胞から陽性細胞を数え、そのをKI67標識率LIとした。5.統計学的解析各グループ間の比較はchisquaredMannWhitneyU或いはKruskalWallistestを必要に応じて適用した。患者の生存曲線の比較の有意差はlogranktestによった。LAT1Ki67LI及びp53の間での相関はSpearman’srankcorrelationcoefficienttestによって解析した。全ての総計学的解析にはStatViewsoftwareを採用し、p値が005以下を統計学的に有意とした。6.結果患者の特徴検索した胃癌患者症例は男性54,女性33からなっていた。年齢は33から85才にわたり、平均は60才であった。TNM分類11による病理学的進行度による症例の内訳は、pTIB17pTII17pTIIIA15pTIIIB4pTIV34症例であった。本研究における胃癌症例の臨床病理学的因子は表2にまとめた。87症例中、56例が胃癌で死亡した。分化型胃癌は12,未分化型胃癌は44例であった。12例の分化型胃癌の中,3例に肝転移、1例に肺転移を認めた。一方、44例の未分化型胃癌では、2例に肝転移、11例に腹膜播種1例に癌性リンパ管症を認めた。LAT1発現正常胃粘膜における腺か上皮のLAT1発現はごくわずかで、LAT1発現の強さは低値11±12平均±標準偏差図2aであった。しかし腸上皮化生のある背景胃粘膜では、LAT1発現強さはより強かった。胃腺腫でもLAT発現は認められ、粘膜固有層の下12よりも上12の方が強かった。胃癌では癌細胞膜に強く発現していた。分化型胃癌と未分化型胃癌の間でのLAT1発現に有意な差はなかった。しかし、非スキルス型胃癌はスキルス型胃癌に比べて、LAT1発現スコアが有意に高かった。またLAT1発現スコアは胃腺腫に比較して胃癌でより高かった。さらに胃腺腫や腸上皮化生のある背景胃粘膜におけるLAT1発現の強さは正常粘膜よりも有意に強かった。正常粘膜、腸上皮化生のある背景胃粘膜、胃腺腫及び胃癌の代表的なLAT1発現を図3に示した。胃癌の粘液表現型とLAT1発現粘液の4マーカー発現に基づいて、87症例を4カテゴリへ分類した。26例はG型、22例はI型、38例はGI型、1例がU型であった。これら4カテゴリの間でLAT1発現を比較したが、有意な違いをみとめなかった。リンパ節転移とLAT1発現との関連リンパ節転移のある症例は転移のない症例と比較して、癌細胞のLAT1発現の強さが高い傾向を認めた。さらにLAT1スコアはリンパ節転移例で転移のない症例と比較して有意に高かった。癌細胞のリンパ管や血管侵襲とLAT1発現とは有意な相関がみられなかったデータ省略。p53発現とLAT1発現との関連Spearman’srankcorrelationcoefficienttestによると、胃癌全症例でのp53スコアとLAT1発現の強さとの間には弱い相関を認めた。さらに胃癌全症例でのp53発現スコアとLAT1発現スコアとの間にも弱い相関を認めた。Ki67LIとLAT1発現との関連図4に示したように、胃癌におけるKi67LIは他の胃病変グループより高かった。胃癌全症例でのKi67LIとLAT1発現強さとの間に弱い相関を認めた。Ki67LIとLAT1発現スコアとの間には有意な相関を認めなかった。患者の生存曲線低及び高LAT1発現スコアで87症例を分けて生存曲線を比較した。全症例では、低LAT1スコア及び高LAT1スコア群で有意な差がなかった。しかし、非スキルス型胃癌では、高LAT1発現群は予後が有意に不良であった。特にstageIBとIIの非スキルス型胃癌に限定すると、高LAT1は予後が有意に不良であった。さらにI型を除いた胃癌症例及び未分化癌では、高LAT1スコア群が予後不良の傾向を示した。さらにスキルス型胃癌を除いた未分化癌33例では高LAT1スコア群が有意に予後不良であった。Coxhazardテスト87症例全体では、癌の進行度stageのみが予後規定因子であった。非スキルス型胃癌に限定すると、LAT1スコアとstageが単変量解析で、予後規定因子として認められた。続いて多変量解析でも両者は個々の独立した予後因子であった。文献1KanaiYSegawaHMiyamotoKUchinoHTakedaEEndouHExpressioncloningandcharacterizationofatransporterforlargeneutralaminoacidsactivatedbytheheavychainof4F2antigenJBiolChem199827323629322RajanDPKekudaRHuangWetalCloningandexpressionofablikeaminoacidtransporterfunctioningasaheterodimerwith4F2hcinsteadofrBATAnewcandidategeneforcystinuriaJBiolChem199927429005103SakataTFerdousGTsurutaTetalLtypeaminoacidtransporter1asanovelbiomarkerforhighgrademalignancyinprostatecancerPatholInt2009597184KobayashiHIshiiYTakayamaTExpressionofLtypeaminoacidtransporter1inesophagealcarcinomaJSurgOncol200590233385KairaKOriuchiNImaiHetalPrognosticsignificanceofLtypeaminoacidtransporter1and4F2heavychainexpressioninstageIpulmonaryadenocarcinomaLungCancer200966120266YanagidaOKanaiYChairoungduaAetalHumanLtypeaminoacidtransporter1characterizationoffunctionandexpressionintumorcelllinesBiochimBiophysActa200115142913027JapanesegastriccancerassociationJapaneseclassificationofgastriccarcinoma2ndEnglishEditionGastricCancer1199810248SinicropeFARuanSBClearyKRStephensLCLeeJJLevinBbcl2andp53oncoproteinexpressionduringcolorectaltumorigenesisCancerRes199555237419UeyamaHYaoTNakashimaYHirakawaKetalGastricadenocarcinomaoffundicglandtypeproposalforanewentityofgastricadenocarcinomaAmJSurgPathol2010346091910NakamuraTYaoTKabashimaANishiyamaKMaeharaYTsuneyoshiMLossofphenotypicexpressionisrelatedtotumourprogressioninearlygastricdifferentiatedadenocarcinomaHistopathology200543576711SobinLHGospodarowiczMKWittekindCUICCTNMClassificationofMalignantTumours7thed20097312NawashiroHOtaniNUozumiYetalHighexpressionofLtypeaminoacidtransporter1ininfiltratinggliomacellsBrainTumorPathol200522899113KimDKAhnSGParkJCKanaiYEndouHYoonJHExpressionofLtypeaminoacidtransporter1and4F2heavychaininoralsquamouscellcarcinomaanditsprecusorlesionsAnticancerRes2004241671514NakanishiKMatsuoHKanaiYLAT1expressioninnormallungandinatypicaladenomatoushyperplasiaandadenocarcinomaofthelungVirchowsArch20064481425015FragaSPinhoMJSoaresdaSilvaPExpressionofLAT1andLAT2aminoacidtransportersinhumanandratintestinalepithelialcellsAminoAcids2005292293316KairaKOriuchiNImaiHetalPrognosticsignificanceofLtypeaminoacidtransporter1expressioninresectablestageIIIInonsmallcelllungcancerBrJCancer200898742817NakanishiKOgataSKanaiYetalExpressionofLAT1predictsriskofprogressionoftransitionalcellcarcinomaoftheupperurinarytractVirchowsArch200745168169018ShennanDBThomsonJInhibitionofsystemLreducesthegrowthofculturedhumanbreastcancercellsOncolRep200820885919OdaKHosodaNEndouHetallTypeaminoacidtransporter1inhibitorsinhibittumorcellgrowthCancerSci2010101173920SawasakiTOgasawaraTMorisitaTEndoYAcellfreeproteinsynthesissystemforhighthrouphputproteomicsPNAS20029914652721DeMasiFChiarellaPWilhelmHetalHighthroughputproductionofmousemonoclonalantibodiesusingantigenmicroarraysProteomics20055407081"