"100ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-2に結合する標的結合物質。アンジオポエチン-1にも結合する請求項1に記載の標的結合物質。Tie2のリン酸化を抑制する請求項1に記載の標的結合物質。50ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-2に結合する請求項1に記載の標的結合物質。20ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-2に結合する請求項1に記載の標的結合物質。6ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-2に結合する請求項1に記載の標的結合物質。300ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-1に結合する請求項2に記載の標的結合物質。160ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-1に結合する請求項2に記載の標的結合物質。80ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-1に結合する請求項2に記載の標的結合物質。40ピコモラー未満のKdでアンジオポエチン-1に結合する請求項2に記載の標的結合物質。モノクローナル抗体である請求項1または2に記載の標的結合物質。完全ヒトモノクローナル抗体である請求項11に記載の標的結合物質。mAb3.19.3、mAb3.3.2またはmAb5.88.3である請求項12に記載の標的結合物質。医薬的に許容される担体に会合した請求項1または2に記載の標的結合物質。請求項1または2に記載の標的結合物質をコードする核酸分子。請求項15に記載の核酸分子を含むベクター。請求項16に記載のベクターを含む宿主細胞。動物における悪性腫瘍を治療する方法であって、当該治療を必要とする前記動物に請求項1または2に記載の標的結合物質の治療有効用量を投与するステップを含む、方法。前記動物がヒトである請求項18に記載の方法。前記標的結合物質がモノクローナル抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3である請求項18に記載の方法。前記悪性腫瘍が、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌からなる群から選択される請求項18に記載の方法。アンジオポエチン-2誘発性の血管形成を治療する方法であって、当該治療を必要とする動物に請求項1または2に記載の標的結合物質の治療有効用量を投与するステップを含む、方法。前記動物がヒトである請求項22に記載の方法。前記標的結合物質が完全ヒトモノクローナル抗体である請求項22に記載の方法。前記標的結合物質がアンジオポエチン-1に結合する請求項22に記載の方法。アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤であって、Tie-2のATP結合部位に結合しない拮抗剤。前記アンジオポエチン-1拮抗活性および前記アンジオポエチン-2拮抗活性が1分子に含まれる請求項26に記載の拮抗剤。前記アンジオポエチン-1拮抗活性および前記アンジオポエチン-2拮抗活性が2個以上の分子に含まれる請求項26に記載の拮抗剤。前記拮抗剤がTie-2受容体に結合する請求項26に記載の拮抗剤。前記拮抗剤がアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2に結合する請求項26に記載の拮抗剤。前記拮抗剤が抗体である請求項26~30のいずれか一項に記載の拮抗剤。前記拮抗剤がモノクローナル抗体である請求項31に記載の拮抗剤。前記拮抗剤が完全ヒトモノクローナル抗体である請求項32に記載の拮抗剤。前記拮抗剤が、前記完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3である請求項33に記載の拮抗剤。前記拮抗剤が、前記完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3と同じエピトープに結合する抗体である請求項32に記載の拮抗剤。悪性腫瘍の治療用薬剤の調製における請求項1または2に記載の標的結合物質の使用。前記悪性腫瘍が、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、および扁平上皮癌からなる群から選択される請求項36に記載の使用。前記標的結合物質がモノクローナル抗体である請求項36に記載の使用。前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体である請求項38に記載の使用。前記完全ヒトモノクローナル抗体が、完全ヒト3.19.3抗体、3.3.2または5.88.3である請求項39に記載の使用。要約本発明の実施形態は、アンジオポエチン-2に特異的に結合し、そこで腫瘍血管形成を阻害して腫瘍成長を低下させる標的結合物質に関する。これを実現可能にする機構が、Ang-2のその受容体Tie2への結合の阻害、Ang-2誘発性のTie2のシグナル伝達の阻害、またはAng-2のクリアランスの増加のいずれかを含む可能性があるとともにこれらに限定されず、これによりAng-2の有効濃度が低下する。本発明の一実施形態である標的結合物質は、Ang-2に結合しかつAng-2のTie2への結合を阻止する完全ヒト抗体である。さらに本発明の別の実施形態は、Ang-2およびAng-1に結合しかつAng-2誘発性のTie2リン酸化も阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。抗体は、100pM、30pM、20pM、10pMもしくは5pM未満のKdでAng-2に結合しうる。抗体は、表11に示される配列の1つを有する相補性決定領域CDRを有する重鎖アミノ酸配列を含みうる。当業者が容易にCDRの決定を行うことができる点は注目される。例えば、Kabatetal免疫学的対象のタンパク質の配列FifthEditionNIHPublication913242BethesdaMDvols13を参照のこと。本発明の一実施形態は、下記により詳細に考察される、Ang-2に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体3.3.2ATCC登録番号PTA-7258、3.19.3ATCC登録番号PTA-7260および5.88.3ATCC登録番号PTA-7259を含む。さらに別の実施形態は、Ang-2に結合しかつ表12に示される配列の1つを含むCDRを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。さらなる実施形態は、Ang-2に結合し、かつ表11に示されるCDR配列の1つを有する重鎖アミノ酸配列および表12に示されるCDR配列の1つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。特定の実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明のさらなる実施形態は、Ang-2への結合において本発明の完全ヒト抗体と交差競合する抗体、好ましくは表11に示されるCDR配列の1つを有する重鎖アミノ酸配列および表12に示されるCDR配列の1つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。本発明のさらなる実施形態は、本発明の完全ヒト抗体と同じAng-2上のエピトープに結合する抗体、好ましくは表11に示されるCDR配列の1つを有する重鎖アミノ酸配列および表12に示されるCDR配列の1つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。本発明のさらなる実施形態は、アンジオポエチン-2に特異的に結合する、規範的クラス1に対応する重鎖相補性決定領域1CDR1を含むヒトモノクローナル抗体を含む。本明細書において提供される抗体は、規範的クラス3に対応する重鎖相補性決定領域2CDR2、規範的クラス2に対応する軽鎖相補性決定領域1CDR1、規範的クラス1に対応する軽鎖相補性決定領域2CDR2、および規範的クラス1に対応する軽鎖相補性決定領域3CDR3も含みうる。本発明は、抗-Ang-2抗体を患者由来の生体試料と接触させるステップと、該試料における該抗体とAng-2の間の結合レベルを検出するステップと、を含む、患者試料におけるアンジオポエチン-2Ang-2レベルをアッセイするための方法をさらに提供する。より特定の実施形態では、生体試料は血液である。他の実施形態では、本発明は、抗体またはそれの機能断片、および医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、新生物または非新生物疾患に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-2Ang-2に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含む、血管形成関連疾患を患う動物を有効に治療する方法を含む。治療可能な血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆道癌胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および扁平上皮癌などの新生物疾患を含みうる。本発明のさらなる実施形態は、動物におけるアンジオポエチン-2Ang-2誘発性の血管形成を阻害する方法を含む。これらの方法は、Ang-2誘発性の血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、Ang-2に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体の治療有効用量を該動物に投与するステップと、を含む。本発明のさらなる実施形態は、動物における血管形成関連疾患の治療のための薬剤の調製における、アンジオポエチン-2Ang-2に特異的に結合するモノクローナル抗体の使用を含む。治療可能な血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および扁平上皮癌などの新生物疾患を含みうる。さらなる実施形態では、本明細書に記載のアンジオポエチン-2Ang-2に特異的に結合するモノクローナル抗体を、動物におけるアンジオポエチン-2誘発性の血管形成の有効治療のための薬剤の調製において使用してもよい。本明細書に記載の本発明の実施形態は、Ang-2に結合しかつAng-2の機能に作用するモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、Ang-2に対する高結合親和性、invitroおよびinvivoでのAng-2に対する中和能、およびAng-2誘発性の血管形成に対する阻害能を含む、治療的観点から見て所望の特性を備えた完全ヒト抗-Ang-2抗体および抗-Ang-2抗体製剤に関する。好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗体は、極めて高い親和性KdでAng-2に結合する。例えば、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13もしくは10-14M未満であるがこれらに限定されないKdまたはこれらの任意の範囲もしくは値でAng-2に結合可能なヒト、ウサギ、マウス、キメラまたはヒト化抗体である。本明細書に記載のように、KinExA登録商標および/またはBIACORE登録商標によって親和性および/または結合活性の測定値を測定してもよい。したがって、本明細書に記載の一実施形態は、Ang-2に結合する単離抗体またはそれらの抗体の断片を含む。当該技術分野で既知のように、抗体は、有利には、例えばポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および/または完全ヒト抗体であってもよい。本明細書に記載の本発明の実施形態は、これらの抗体を産生する細胞も提供する。本発明の別の実施形態は、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-3およびアンジオポエチン-4を含むがこれらに限定されない他のアンジオポエチン-2ファミリーメンバーに結合する完全ヒト抗体である。本明細書におけるさらなる実施形態は、Ang-2を伴うTie2への結合において本発明の完全ヒト抗体と交差競合する抗体である。本発明の一実施形態では、抗体は、アンジオポエチン-2に結合してそれを中和させ、かつアンジオポエチン-1にも結合してそれを中和させる。本発明の実施形態が抗体の任意の特定の形態または生成または産生の方法に限定されないことは理解されるであろう。例えば、抗-Ang-2抗体は、完全長抗体例えば、無傷のヒトFc領域を有するまたは抗体断片例えば、Fab、Fab’もしくはFab’2でありうる。さらに、抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ、あるいは抗体をコードする1つもしくは複数の遺伝子で形質転換または形質移入されている組み換え的に産生された細胞から作製されうる。本発明の他の実施形態は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、抗-Ang-2抗体をコードする単離核酸分子を有するベクターまたはかかる核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を含む。さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて抗-Ang-2抗体が産生された後、抗体が回収されるという条件下で宿主細胞を培養することによって抗体を産生する方法である。本発明の実施形態が、抗体産生のために宿主細胞に形質移入される場合の、抗体またはその断片の収量増加のために最適化される核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体断片をコードする任意の核酸分子も含むことは認識されるべきである。本明細書におけるさらなる実施形態は、哺乳動物をヒトAng-2またはその断片、および1つもしくは複数のオルソロガス配列またはそれらの断片で免疫することによってAng-2に対する高親和性抗体を産生する方法を含む。他の実施形態は、Ang-2に特異的に結合する単離抗体の生成および同定に基づく。Ang-2は、新生物疾患などの血管形成関連疾患において高レベルに発現される。Ang-2の生物学的活性を阻害することにより、Ang-2誘発性の血管形成および他の所望の作用が阻止されうる。本発明の別の実施形態は、本明細書に記載のように調製された抗体が患者試料中でのAng-2レベルを検出するのに用いられる、疾患または症状を診断する方法を含む。一実施形態では、患者試料は血液または血清である。さらなる実施形態では、リスク因子の同定、疾患の診断および疾患のステージングのための方法が示され、それは抗-Ang-2抗体を使用したAng-2の過剰発現の同定に関与する。本発明の別の実施形態は、血清または細胞を抗-Ang-2抗体と接触させ、その後にAng-2の存在を検出することによる、細胞内でのAng-2の発現に関連した症状を診断するための方法を含む。好ましい症状は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患を含む。別の実施形態では、本発明は、哺乳類の組織内、細胞内、または体液中のアンジオポエチン-2およびアンジオポエチンファミリーメンバーを検出し、血管形成関連疾患のスクリーニングを行うためのアッセイキットを含む。キットは、アンジオポエチン-2に結合する抗体および抗体とアンジオポエチン-2もし存在する場合との反応を示すための手段を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、Ang-2に結合する抗体は標識される。別の実施形態では、抗体は標識されていない一次抗体であり、かつキットは一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態では、手段は抗免疫グロブリンの標識二次抗体を含む。好ましくは、抗体は蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。さらに別の実施形態は、患者におけるAng-2の発現に関連した疾患または症状を、患者に抗-Ang-2抗体の有効量を投与することによって治療するための方法を含む。抗-Ang-2抗体を単独投与するかあるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。例えば、血管形成を遮断するAng-2抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物を腫瘍細胞増殖に対する直接阻害を示す薬剤と併用投与してもよい。方法をinvivoで実施してもよく、好ましくは患者はヒト患者である。好ましい実施形態では、方法は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患の治療に関する。別の実施形態では、本発明は、容器を含む製造物品を提供する。容器は、抗-Ang-2抗体を含有する組成物、およびAng-2の過剰発現によって特徴づけられる血管形成関連疾患を治療するのに組成物の使用が可能であることを示す添付文書またはラベルを含む。一部の実施形態では、抗-Ang-2抗体の患者への投与後、除去剤の投与により血液から循環する過剰な抗体が除去される。さらに別の実施形態は、血管形成関連疾患などの疾患の治療のための薬剤の調製における抗-Ang-2抗体の使用である。一実施形態では、血管形成関連疾患は、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの癌を含む。別の実施形態では、血管形成関連疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、肉腫、頭頚部癌、中皮腫、胆道癌胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍および膠芽細胞腫などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない。Ang-2は、血管形成の重要なオンスイッチon-switchである。したがって、この分子に対して拮抗することは、病態生理学的な進行を阻害し、それにより様々な血管形成依存性疾患に対する強力な治療として作用すると期待される。固形腫瘍およびそれらの転移に加え、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫などの血液悪性腫瘍は血管形成依存性でもある。過剰な血管成長は極めて多くの非新生物疾患に寄与する。これらの非新生物性の血管形成依存性疾患は、アテローム硬化症、血管腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管奇形例えば遺伝性出血性毛細血管拡張症HHT、またはオスラーウェーバー症候群、いぼ、化膿性肉芽腫、多毛症、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、乾癬、不正子宮出血、卵胞嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸困難、腹水、透析患者における腹膜硬化症、腹部手術に起因する接着形成、肥満、関節リウマチ、滑膜炎、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘、血友病関節、炎症性および感染性プロセス例えば肝炎、肺炎、糸球体腎炎、喘息、鼻ポリープ、肝再生、肺高血圧、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、白質軟化、血管新生緑内障、角膜移植片血管新生、トラコーマ、甲状腺炎、甲状腺腫脹、ならびにリンパ増殖性疾患を含む。詳細な説明本明細書に記載の本発明の実施形態は、Ang-2に結合するモノクローナル抗体に関する。一部の実施形態では、抗体はAng-2に結合し、かつAng-2のその受容体であるTie2への結合を阻害する。他の本発明の実施形態は、完全ヒト抗-Ang-2抗体、および治療的に有用な抗体製剤を含む。かかる抗-Ang-2抗体製剤は、好ましくは、Ang-2に対する強い結合親和性、invitroでのAng-2に対する中和能、およびinvivoでのAng-2誘発性の血管形成に対する阻害能を含む所望の治療的特性を有する。本発明の一実施形態は、Ang-2に結合しかつそれを中和するがAng-1に結合しない抗体を含む。別の実施形態では、抗体は、Ang-2とAng-1の双方に結合しても中和するのはAng-2のみである。別の実施形態では、抗体はAng-2とAng-1の双方に結合しかつAng-1とAng-2の双方のTie2への結合を中和する。本発明の実施形態は、抗-Ang-2抗体の単離された結合断片も含む。好ましくは、結合断片は完全ヒト抗-Ang-2抗体由来である。典型的な断片は、下記により詳細に記載されるように、Fv、Fab’または他の周知の抗体断片を含む。本発明の実施形態は、Ang-2に対する完全ヒト抗体を発現する細胞も含む。細胞の例として、ハイブリドーマ、またはチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、CHO細胞の変異体例えばDG44およびAng-2に対する抗体を産生するNS0細胞などの組み換え的に作製される細胞が挙げられる。CHO細胞の変異体についてのさらなる情報は、AndersenandReillyCurrentOpinioninBiotechnology15456462その全体が参照により本明細書中に援用される中に見出されうる。さらに、本発明の実施形態は、疾患の治療を目的としたこれらの抗体の使用方法を含む。抗-Ang-2抗体は、Ang-2媒介性のTie2シグナル形質導入を阻止することによって血管形成を阻害する場合に有用である。この阻害作用の機構は、Ang-2のその受容体Tie2への結合からの阻害、Ang-2誘発性のTie2シグナル伝達の阻害、またはAng-2のクリアランスの増加による、Tie-2への結合におけるAng-2の有効濃度の低下を含みうる。この阻害機構を介して治療可能な疾患は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺、胃、前立腺、乳房、卵巣、膀胱、肺、子宮、腎臓、結腸、膵臓、唾液腺、および結腸直腸の癌および腫瘍などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない。本発明の他の実施形態は、生物学的試料中のAng-2の量を特異的に測定するための診断アッセイを含む。アッセイキットは、かかる抗体を検出するために必要な標識を有する抗-Ang-2抗体を含みうる。これらの診断アッセイは、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、膠芽細胞腫、ならびに甲状腺癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、唾液腺癌、および結腸直腸癌などの新生物疾患を含むがこれらに限定されない血管形成関連疾患のスクリーニングにとって有用である。本発明の一態様によると、Tie-2のATP-結合部位に結合しない、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。本発明の別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2に結合する、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。本発明の別の態様によると、化合物でない、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。一実施形態では、アンジオポエチン-1拮抗活性およびアンジオポエチン-2拮抗活性が1分子内に含まれる、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。それ以外の実施形態では、アンジオポエチン-1拮抗活性およびアンジオポエチン-2拮抗活性が2分子以上の分子内に含まれる場合の拮抗剤が提供される。一実施形態では、iTie-2受容体、iiアンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2、iiiTie-2受容体-アンジオポエチン-1複合体、またはivTie-2受容体-アンジオポエチン-2複合体、あるいはこれらの任意の組み合わせに結合しうる、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。一実施形態では、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤は、アンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2および/またはTie-2に結合することにより、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2媒介性のTie-2シグナル形質導入を阻止し、それにより血管形成を阻害しうる。この阻害の作用機構は、i拮抗剤のアンジオポエチン-1への結合およびアンジオポエチン-1のその受容体であるTie-2への結合の阻害、ならびに/あるいはii拮抗剤のアンジオポエチン-2への結合およびアンジオポエチン-2のその受容体であるTie-2への結合の阻害、ならびに/あるいはiiiアンジオポエチン-1および/もしくはアンジオポエチン-2のクリアランスの増加により、Tie-2への結合に使用可能なアンジオポエチン-1および/もしくはアンジオポエチン-2の有効濃度が低下すること、あるいはアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対して拮抗するのに十分である、これらの任意の組み合わせ、を含みうる。理論的考察に縛られることを望むことなく、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗作用を可能にする機構は、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の受容体Tie-2への結合の阻害、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2誘発性のTie-2シグナル伝達の阻害、またはアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2のクリアランスの増加による、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の有効濃度の低下を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、抗体である、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤が提供される。好ましくは、抗体は、invitroおよびinvivoでアンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗することが可能である。好ましくは、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。より好ましくは抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。最も好ましくは、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3である。一実施形態では、完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3と同じ1つもしくは複数のエピトープに結合する抗体が提供される。本発明の一実施形態では、アンジオポエチン-1に結合しかつアンジオポエチン-1のTie-2への結合を阻止する完全ヒト抗体が提供される。本発明のさらに別の実施形態は、アンジオポエチン-1に結合しかつアンジオポエチン-1誘発性のTie2リン酸化を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は1ナノモラーnM未満のKdでアンジオポエチン-1に結合する。より好ましくは、抗体は500ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は100ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は30ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は20pM未満のKdで結合する。さらにより好ましくは、抗体は10もしくは5pM未満のKdで結合する。本発明の一実施形態では、アンジオポエチン-2に結合しかつアンジオポエチン-2のTie-2への結合を阻止する完全ヒト抗体が提供される。本発明のさらに別の実施形態は、アンジオポエチン-2に結合しかつアンジオポエチン-2誘発性のTie2リン酸化を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は1ナノモラーnM未満のKdでアンジオポエチン-2に結合する。より好ましくは、抗体は500ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は100ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は30ピコモラーpM未満のKdで結合する。より好ましくは、抗体は20pM未満のKdで結合する。さらにより好ましくは、抗体は10もしくは5pM未満のKdで結合する。一実施形態では、上記の抗体の軽鎖および/または重鎖を産生するハイブリドーマが提供される。好ましくは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および/または重鎖を産生する。より好ましくは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3の軽鎖および/または重鎖を産生する。あるいは、ハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3と同じ1つもしくは複数のエピトープに結合する抗体を産生する。一実施形態では、上記の抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。より好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体3.19.3の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子が提供される。本発明の一実施形態では、上で定義された抗体の軽鎖および/または重鎖をコードする、上記の1つもしくは複数の核酸分子を有するベクターが提供される。本発明の一実施形態では、上記ベクターを含む宿主細胞が提供される。あるいは、宿主細胞は2つ以上のベクターを含みうる。さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子の発現による抗体産生後に抗体が回収されるという条件下で宿主細胞の培養によって抗体を産生する方法である。本発明の一実施形態では、上記抗体をコードする少なくとも1個の核酸分子を少なくとも1個の宿主細胞に形質移入させるステップと、該宿主細胞内で核酸分子を発現させるステップと、該抗体を単離するステップと、を含む、抗体を作製する方法が提供される。本発明の別の態様によると、上記の拮抗剤を投与するステップを含む、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。本発明の別の態様によると、上記抗体を投与するステップを含む、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における疾患関連血管形成を治療する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における疾患関連血管形成を治療する方法が提供される。方法は、疾患関連血管形成に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。抗体を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における癌を治療する方法が提供される。方法は、癌に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する拮抗剤の治療有効量を投与するステップと、を含みうる。拮抗剤を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップを含む、哺乳動物における癌を治療する方法が提供される。方法は、癌に対する治療を必要とする動物を選択するステップと、該動物にアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の治療有効用量を投与するステップと、を含みうる。抗体を単独投与するか、あるいは追加抗体、化学療法薬または放射線療法と併用投与してもよい。本発明の別の態様によると、疾患関連血管形成の治療における薬剤の製造における、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤の使用が提供される。本発明の別の態様によると、疾患関連血管形成の治療における薬剤の製造における、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。好ましい実施形態では、本発明は、Tie-2受容体のみまたはそれに部分的に依存する腫瘍を有する患者における、アンジオポエチン-1またはアンジオポエチン-2に拮抗する場合での使用に特に適する。本発明の別の実施形態は、哺乳類の組織内、細胞内、または体液中でのアンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2を検出して血管形成関連疾患をスクリーニングするためのアッセイキットを含む。キットは、アンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2に結合する抗体、および抗体とアンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2との反応を、それが存在する場合には、示すための手段を含む。抗体は、モノクローナル抗体でありうる。一実施形態では、アンジオポエチン-2に結合する抗体は標識される。別の実施形態では、抗体は標識されていない一次抗体であり、キットは一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態では、手段は抗免疫グロブリンである標識二次抗体を含む。好ましくは、抗体は蛍光色素、酵素、放射性核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。抗-Ang-2抗体に関するさらなる実施形態、特徴などが、より詳細に下記に提供される。配列リスト本発明の実施形態は、下記の表1中に列挙される特異的な抗-Ang-2抗体を含む。この表では、各抗-Ang-2抗体の識別番号が対応する重鎖および軽鎖遺伝子の配列番号とともに報告される。各抗体には1つまたは2つの小数点によって分かれた2つもしくは3つの番号を含む識別番号が与えられている。大部分の抗体については、1つの小数点によって分かれた2つの識別番号のみが列挙される。しかし、ある場合には1つの抗体における数種のクローンが調製された。クローンは親配列と同一の核酸およびアミノ酸配列を有するが、2番目の小数点の右側の番号によって示されるクローン番号によってそれらを別々に挙げることが可能である。したがって、例えば、抗体5.35の核酸およびアミノ酸配列は、抗体5.35.1、5.35.2および5.35.3の配列と同一である。定義本明細書中で用いられる科学技術用語は、他に定義されない限り、当業者によって共通に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他が必要とされない限り、単数の用語が複数を含み、かつ複数の用語が単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の、細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質化学およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して用いられる命名法やそれらの技術は、当該技術分野で周知でありかつ共通に用いられるものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換においては、標準の技術例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションが用いられる。製造業者の仕様に従い、または当該技術分野で共通に成就した技術として、または本明細書に記載のように、酵素反応および精製技術が実施される。上記の技術および手順は、一般に、当該技術分野に周知の従来の方法に従い、かつ本明細書全体を通して言及および考察される様々な一般的な参考文献やより詳細な参考文献に記載のように実施される。例えば、参照により本明細書中に援用される、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualを参照のこと。本明細書に記載の、分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学と関連して用いられる命名法や、それらの実験手順および技術は、当該技術分野では周知でかつ共通に用いられるものである。化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤、および送達、ならびに患者の治療においては、標準の技術が用いられる。以下の用語は、本開示に準じて用いられる際、他に指示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。拮抗剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、小分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、RNA干渉RNAi、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、またはこれらの結合体もしくは融合タンパク質でありうる。RNAiのレビューの場合には、MilhavetOGaryDSMattsonMP62948Review、およびアンチセンスの場合には、OpalinskaJBGewirtzAMpe47を参照のこと。疾患関連血管形成は、腫瘍関連血管形成を例とする、任意の異常な望ましくないまたは病的な血管形成でありうる。血管形成関連疾患は、白血病、多発性骨髄腫またはリンパ腫などの非固形腫瘍を含み、かつメラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、膠芽細胞腫、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、胃癌、脳/CNS癌、頭頸部癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、睾丸癌、卵巣癌、皮膚癌、頚部癌、肺癌、筋肉癌、神経癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、外陰癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌、ならびに扁平上皮腫瘍などの固形腫瘍も含むがこれらに限定されない。化合物は約2000ダルトン未満の分子量を有する任意の小分子量化合物を示す。Ang-2という用語はアンジオポエチン-2分子を示す。中和という用語は、抗体に言及される場合、抗体における標的抗原の活性を除去するかまたは有意に減弱させる能力に関する。したがって、中和抗-Ang-2抗体は、Ang-2の活性を除去するかまたは有意に減弱させることが可能である。中和Ang-2抗体は、例えばAng-2のその受容体Tie2への結合を遮断することによって作用しうる。Tie2媒介性のシグナル形質導入は、この結合の遮断によって有意にまたは完全に除去される。理想的には、Ang-2に対する中和抗体は血管形成を阻害する。本明細書中で用いられる単離ポリヌクレオチドという用語は、その天然環境から単離されているポリヌクレオチドを意味するものとする。かかるポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、または合成物でありうる。単離ポリヌクレオチドは、好ましくは、天然では会合するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合されることがない。単離ポリヌクレオチドは、天然では連結されない別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されうる。さらに単離ポリヌクレオチドは、好ましくは天然でより大きな配列の一部として存在することはない。本明細書中で示される単離タンパク質という用語は、その天然環境から単離されているタンパク質を意味する。かかるタンパク質は、ゲノムDNA、cDNA、組換えDNA、組換えRNA、または合成起源あるいはそれらの一部の組み合わせに由来する場合があり、単離タンパク質は、その起源または由来源に基づいて、1天然に見出されるタンパク質と会合しないか、2マウスタンパク質を例とする同源由来の他のタンパク質を含有しないか、3異なる種由来の細胞によって発現されるか、または4天然に生じることがない。ポリペプチドという用語は、ポリペプチド配列における天然タンパク質、断片または類似体を示すための一般名称として本明細書中で用いられる。それ故、天然タンパク質、断片および類似体は、ポリペプチドに属する種である。本発明に従う好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子とκまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子とを含む組み合わせによって形成される抗体分子、およびその逆、ならびにそれらの断片および類似体を含む。本発明に記載の好ましいポリペプチドはまた、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはそれらの断片のみを含みうる。対象に適用される、本明細書中で用いられる天然という用語は、対象を天然に見出しうるという事実を示す。例えば、天然資源から単離可能でありかつ実験室または実験室以外で意図的に人手による修飾を受けていない、ウイルスを含む生物に内在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然である。本明細書中で用いられる作動可能に連結されるという用語は、成分がその意図に沿うように機能することを可能にする関連性の中にあるように示される成分の位置を示す。例えば、コーディング配列に作動可能に連結される対照配列は、対照配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が行われるような方法で連結される。本明細書中で用いられる対照配列という用語は、連結対象のコーディング配列の発現およびプロセシングを有効にするかまたはそれらに作用するのに必要なポリヌクレオチド配列を示す。かかる対照配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物におけるかかる対照配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物におけるかかる対照配列は一般にプロモーター、エンハンサー、イントロン、転写終結配列、ポリアデニル化シグナル配列、ならびに5’および’3非翻訳領域を含みうる。対照配列という用語は、最小限、存在が発現およびプロセシングに必須であるすべての成分を含むことが意図され、さらにリーダー配列および融合パートナー配列を例とする、存在が有利な追加成分を含んでもよい。本明細書中で示されるポリヌクレオチドという用語は、リボヌクレオチドかもしくはデオキシヌクレオチドといった少なくとも10塩基長のヌクレオチドの高分子形態またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形態、あるいはRNA-DNAヘテロ二本鎖を意味する。同用語はDNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。本明細書中で示されるオリゴヌクレオチドという用語は、天然および非天然の連結によって相互に連結された天然および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に200もしくはそれ未満の長さの塩基を含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10~60塩基長および最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20~40塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子変異体の構築における使用では二本鎖でありうるが、例えばプローブにおいては通常、一本鎖である。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。本明細書中で示される天然ヌクレオチドという用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書中で示される修飾ヌクレオチドという用語は、修飾または置換された糖類などを有するヌクレオチドを含む。本明細書中で示されるオリゴヌクレオチド連結という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエートphosphorodiselenoate、ホスホロアニロチオエートphosphoroanilothioate、ホスホラニラデートphosphoraniladate、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、LaPlancheetalNuclAcidsRes149081StecetalJAmChemSoc1066077SteinetalNuclAcidsRes163209ZonetalAntiCancerDrugDesign6539ZonetalOligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproachpp87108Stecetal米国特許第5151510号明細書UhlmannandPeymanChemicalReviews90543これらの開示は参照により本明細書中に援用されるを参照のこと。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて検出用標識を含んでもよい。本明細書中で示される選択的にハイブリダイズするという用語は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびこれらの断片は、非特異的核酸に対する大量の検出可能な結合を最小にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。極めて厳しい条件を採用することで、当該技術分野で既知であり本明細書中で考察される選択的ハイブリダイゼーション条件を得ることが可能である。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は少なくとも80になり、より典型的には、相同性は少なくとも85、90、95、99および100に高まることが好ましい。2つのアミノ酸配列は、もしそれらの配列間に部分的または完全な同一性が存在する場合には相同である。例えば、85の相同性とは、2つの配列におけるマッチングが最大であるように整列される場合、85のアミノ酸が同一であることを意味する。マッチングの最大化においては、マッチングする2つの配列のいずれかにおけるギャップが許容され、5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。あるいは、この用語が本明細書中で用いられる際、好ましくは2つのタンパク質配列または少なくとも長さが約30個のアミノ酸のポリペプチド配列由来のポリペプチド配列は、もしそれらが、変異データマトリックスおよび6以上のギャップペナルティを伴うALIGNプログラムを用いて標準偏差単位で5を上回るアラインメントスコアを有する場合、相同である。DayhoffMOinAtlasofProteinSequenceandStructurepp101110およびandSupplement2からこの巻までpp110を参照のこと。2つの配列またはそれらの部分は、より好ましくは、もしそれらのアミノ酸がALIGNプログラムを用いて最適に整列される場合に50よりも大きいかもしくはそれと等しい同一性を示すならば相同である。2つのオルソロガスな配列内には相同性の異なる領域がありうるということは理解されるべきである。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位は、非機能領域よりも高度の相同性を有しうる。~に対応するという用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に対して相同であるすなわち、同一であるが、厳密な進化的関連性はない、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するように本明細書中で用いられる。それに対し、~に相補的であるという用語は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部に対して相同であることを意味するように本明細書中で用いられる。例として、ヌクレオチド配列TATACは、参照配列TATACに対応し、参照配列GTATAに相補的である。参照配列、比較ウインドウ、配列同一性、配列同一性の百分率および実質的同一性といった用語は、2つ以上のポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の配列の関連性を示すのに用いられる。参照配列は配列比較における基準として用いられる規定された配列である。参照配列は、例えば配列リスト内に与えられる完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメントのようなより大きな配列のサブセットであるか、あるいは完全cDNAまたは遺伝子配列を含みうる。一般に、参照配列は、少なくとも18ヌクレオチド長または6アミノ酸長であり、少なくとも24ヌクレオチド長または8アミノ酸長であることが多く、かつ少なくとも48ヌクレオチド長または16アミノ酸長であることが多い。2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の各々は、12つの分子間での類似する配列すなわち完全ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部を含み、かつ22つのポリヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間での異なる配列をさらに含みうることから、2つもしくはそれより多くの分子間での配列比較は、典型的には2つの分子の配列を比較ウインドウにわたり比較することによって行われ、配列類似性の局所領域が同定および比較される。本明細書中で用いられる比較ウインドウは、少なくとも約18個の隣接ヌクレオチド位置または約6個のアミノ酸の理論上のセグメントを示し、ここではポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は少なくとも18個の隣接ヌクレオチド配列または6個のアミノ酸配列の参照配列と比較され、かつポリヌクレオチド配列の比較ウインドウ内部分は、2つの配列の最適なアラインメントにおいて付加または欠失を含まない参照配列と比べて20以下の付加、欠失、置換などすなわちギャップを含みうる。比較ウインドウを整列するための配列の最適なアラインメントを、SmithandWatermanAdvApplMath2482の局所的相同性localhomologyアルゴリズム、NeedlemanandWunschJMoIBiol48443の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonandLipmanProcNatlAcadSci852444の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease70におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAジェネティックスコンピュータグループGeneticsComputerGroup、575ScienceDr、マディソンMadison、ウィスコンシン州、GENEWORKS商標もしくはMACVECTOR登録商標ソフトウェアパッケージ、または検査によって行うことが可能であり、様々な方法によって得られる最良のアラインメントすなわち、比較ウインドウにわたり最高の百分率の相同性が得られるが選択される。配列同一性という用語は、2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウインドウにわたり同一であるすなわちヌクレオチド単位または残基単位を基準ことを意味する。用語配列同一性の百分率は、比較ウインドウにわたり2つの最適に整列された配列を比較し、マッチング位置の数を得るように同一の核酸塩基例えば、A、T、C、G、UもしくはIまたはアミノ酸残基における両配列内に存在する位置の数を判定し、マッチング位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数すなわちウインドウサイズで除し、その結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。本明細書中で用いられる実質的同一性という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも18個のヌクレオチド6個のアミノ酸位置、高頻度には少なくとも24~48個のヌクレオチド8~16個のアミノ酸位置からなる比較ウインドウにわたる参照配列と比べ、少なくとも85の配列同一性、好ましくは少なくとも90~95の配列同一性、より好ましくは少なくとも99の配列同一性を有する配列を含み、かつ配列同一性の百分率が、参照配列を、比較ウインドウにわたる参照配列の合計で20以下に及ぶ欠失または付加を含みうる配列と比較することによって計算されるといったポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示すことを意味する。参照配列は、より大きな配列のサブセットでありうる。本明細書中で用いられるように、20種の従来のアミノ酸およびそれらの略称は従来の用法に従う。ImmunologyASynthesis参照により本明細書中に援用されるを参照のこと。20種の従来のアミノ酸、α-,α-2基置換されたdisubstitutedアミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来アミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体例えばD-アミノ酸は、本発明のポリペプチドに適する成分でもありうる。非従来アミノ酸の例として、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸ならびにイミノ酸例えば4-ヒドロキシプロリンが挙げられる。本明細書中で用いられるポリペプチド表記では、標準の用法および慣例に従い、左方向はアミノ末端方向、右方向はカルボキシ末端方向である。同様に、他に特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端は5’末端、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は5’方向と称される。新生RNA転写物の5’から3’への付加の方向は転写方向と称され、RNAと同じ配列を有しかつRNA転写物の5’から5’末端へのDNA鎖上の配列領域は上流配列と称され、RNAと同じ配列を有しかつRNA転写物の3’から3’末端へのDNA鎖上の配列領域は下流配列と称される。ポリペプチドに適用される実質的同一性という用語は、2つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムGAPまたはBESTFITなどにより最適に整列される場合、少なくとも80の配列同一性、好ましくは少なくとも90の配列同一性、より好ましくは少なくとも95の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換物分だけ異なる。保存的アミノ酸置換物は、類似の側鎖を有する残基間の交換可能性を示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり;脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびトレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり;ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。本明細書中で考察されるように、アミノ酸配列における変異が、本明細書に記載の抗体または免疫グロブリン分子に対する少なくとも75、より好ましくは少なくとも80、90、95、および最も好ましくは99の配列同一性を維持するという条件で、本発明によって包含されるものとして、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変異についての検討がなされる。特に、保存的アミノ酸置換について検討がなされる。保存的置換物は、側鎖に関連しているアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般に、1酸性=アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩;2塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン;3非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および4非荷電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンといったファミリーに分かれる。より好ましいファミリーでは、セリンおよびトレオニンが脂肪族-ヒドロキシファミリーであり;アスパラギンおよびグルタミンがアミド含有ファミリーであり;アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが脂肪族ファミリーであり;かつフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩、トレオニンとセリンといった単独の置換、あるいはアミノ酸と構造的に関連したアミノ酸との類似の置換が、特にもし置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、生成分子の結合機能または特性に対して顕著な作用を有しないと予想することは理にかなっている。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に判定されうる。アッセイについては本明細書中に詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製されうる。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近辺に生じる。構造および機能ドメインを、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列データを公開または非公開の配列データベースと比較することによって同定してもよい。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を用いることで、既知の構造および/または機能を有する他のタンパク質内に生じる配列モチーフまたは予測されたタンパク質の高次構造ドメインが同定される。既知の三次元構造内に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は既知である。BowieetalScience253164。したがって、これらの例は、当業者が本明細書に記載の抗体に従う構造および機能ドメインを定めるのに使用可能な配列モチーフおよび高次構造を認識できることを示している。好ましいアミノ酸置換物は、1タンパク質分解に対する感受性を低減する、2酸化に対する感受性を低減する、3タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、4結合親和性を変更する、かつ5かかる類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与または改良するものである。類似体は、天然ペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含みうる。例えば、好ましくは、分子間接触を形成するドメイン外部のポリペプチド部分における天然配列において単一または複数のアミノ酸置換物好ましくは保存的アミノ酸置換物が得られうる。保存的アミノ酸置換により、親配列の構造的特徴が実質的に変化することがあってはならない例えば、アミノ酸の交換により、親配列内に存在するヘリックスが破壊されたり、親配列を特徴づける他のタイプの二次構造が破壊される傾向があってはならない。当該技術分野で既知のポリペプチドの二次および三次構造の例が、ProteinsStructuresandMolecularPrinciplesIntroductiontoProteinStructureおよびThorntonetatNature354105において記載され、これらの各々は参照により本明細書中に援用される。本明細書中で用いられるポリペプチド断片という用語は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを示すが、これは残存するアミノ酸配列が、例えば完全長cDNA配列から推定される天然配列内の対応する位置に一致する場合である。断片は、典型的には少なくとも5、6、8もしくは10アミノ酸長、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長、およびさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。本明細書中で用いられる類似体という用語は、推定されるアミノ酸配列の一部に対する実質的同一性を有し、かつ1適切な結合条件下でのAng-2への特異的結合、2適切なAng-2結合に対する遮断能、または3Ang-2活性に対する阻害能といった特性のうちの少なくとも1つを有する、少なくとも25個のアミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを示す。典型的には、ポリペプチド類似体は天然配列に対して保存的アミノ酸置換または付加もしくは欠失を含む。類似体は、典型的には少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも50アミノ酸長かまたはそれより長く、また多くは完全長の天然ポリペプチドと同じ長さでありうる。製薬業界では、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬として、一般にペプチド類似体が用いられる。非ペプチド化合物のこれらのタイプは、ペプチドミメティクスpeptidomimeticsまたはペプチドミメティクスpeptidomimeticsと称される。FauchereJAdvDrugRes1529VeberandFreidingerTINSp392andEvansetalJMedChem301229は、参照により本明細書中に援用される。かかる化合物は、コンピュータ化された分子モデリングを活用して開発されることが多い。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するペプチドミメティクスを使用することで、同等な治療効果または予防効果が得られる可能性がある。一般に、ペプチドミメティクスは、ヒト抗体などの模範的なポリペプチドすなわち生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチドに構造的に類似するが、当該技術分野で周知の方法により、場合によって-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-シスおよびトランス、-COCH2-、-CHOHCH2-、ならびに-CH2SO-からなる群から選択される連結によって交換された1つもしくは複数のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の1つもしくは複数のアミノ酸と同じタイプのD-アミノ酸との系統的置換例えば、L-リジンの代わりにD-リジンを用いることで、より安定なペプチドが生成されうる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異体を含む制限ペプチドが、当該技術分野で既知の方法RizoandGieraschAnnRevBiochem61387、参照により本明細書中に援用される。、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィドブリッジを形成可能な内部システイン残基を付加することによって生成されうる。本明細書中で用いられるように、抗体という用語は、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状および荷電分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも1つの結合ドメインからなるポリペプチドまたはポリペプチド群を示す。抗体は、典型的には2つの同一のポリペプチド鎖対合体を含む四量体形態を有し、各対合体は1つの軽鎖および1つの重鎖を有する。各軽鎖/重鎖対合体の可変領域が抗体結合部位を形成する。本明細書中で用いられるように、標的結合物質は、優先的に標的部位に結合する抗体またはその結合断片である。一実施形態では、標的結合物質は、1つの標的部位のみに対して特異的である。他の実施形態では、標的結合物質は、2つ以上の標的部位に対して特異的である。一実施形態では、標的結合物質はモノクローナル抗体であり、かつ標的部位はエピトープでありうる。組換えDNA技術あるいは無傷抗体の酵素切断または化学切断により、抗体の結合断片が生成される。結合断片は、Fab、Fab’、Fab’2、Fvおよび一本鎖抗体を含む。二重特異性bispecific抗体または二機能bifunctional抗体以外の抗体が有する結合部位の各々は同一であると理解されている。過剰な抗体が抗受容体に結合される受容体の量をinvitro競合結合アッセイにおける測定として少なくとも約20、40、60もしくは80、およびより通常では約85を超える分だけ減少させる場合、抗体は受容体の抗受容体に対する接着を実質的に阻害する。抗体は、単独のまたは既知の技術によってもたらされる他のアミノ酸配列と組み合わされた、オリゴクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR-移植抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗-イディオタイプ抗体、および可溶性もしくは結合形態で標識可能な抗体、ならびにそれらの断片、変異体または誘導体でありうる。抗体は、任意の種由来でありうる。抗体という用語は、本発明の抗体の結合断片も含み、典型的な断片は、Fv、Fab、Fab’、一本鎖抗体svFC、二量体可変領域ダイアボディーおよびジスルフィド安定化可変領域dsFvを含む。エピトープという用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体への特異的結合を可能にする任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面群surfacegroupingsからなり、常ではないが特異的な三次元構造的特性ならびに特異的な荷電特性を有しうる。抗体は、解離定数が1μM以下、好ましくは100nM以下および最も好ましくは10nM以下である場合、抗原に特異的に結合すると言われる。作用物質という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質からなる抽出物を意味するように本明細書中で用いられる。Ang-2ポリペプチドに関する活性のあるまたは活性は、天然Ang-2ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するAng-2ポリペプチドの一部を示す。本明細書中で用いられる場合の生物学的とは、天然Ang-2ポリペプチドの活性から得られる生物学的機能を示す。好ましいAng-2生物学的活性は、例えばAng-2誘発性の血管形成を含む。本明細書中で用いられる場合の哺乳動物は、哺乳動物と考えられる任意の動物を示す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。パパイン酵素による抗体の消化は、抗原-結合活性を全く有しないが結晶化能を有する、Fab断片およびFc断片としても知られる2個の同一の抗原-結合断片をもたらす。ペプシン酵素による抗体の消化は、抗体分子の2つのアームが連結されたままで2つの抗原結合部位を含むFab’2断片をもたらす。Fab’2断片は、抗原の架橋能を有する。本明細書中で用いられる場合のFvは、抗原-認識部位と抗原-結合部位の双方を保持する抗体の最小断片を示す。本明細書中で用いられる場合のFabは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含む抗体の断片を示す。mAbという用語はモノクローナル抗体を示す。本明細書中で用いられる場合のリポソームは、本発明のAng-2ポリペプチドまたはかかるAng-2ポリペプチドに対する抗体を含みうる薬剤の哺乳動物への送達にとって有用でありうる小さい小胞を示す。本明細書中で用いられる標識するまたは標識されたは、ポリペプチドに対する検出可能成分の添加、例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光またはビオチニル基標識される酵素標識を示す。放射性同位体または放射性核種は3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131Iを含み、蛍光標識はローダミン、ランタノイドの燐光体またはFITCを含み、かつ酵素標識は西洋わさびペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含みうる。本明細書中で用いられる医薬作用物質または薬剤という用語は、患者に適切に投与される場合に所望の治療効果を誘発可能な化学化合物または組成物を示す。本明細書における他の化学用語は、TheMcGrawHillDictionaryofChemicalTerms参照により本明細書中に援用されるに例示された当該技術分野での従来の用法に準じて用いられる。本明細書中で用いられるように、実質的に純粋なとは、対象種が支配的な存在する種でありすなわち、モルを基準としてそれは組成物中の任意の他の単独種よりも豊富に存在する、かつ好ましくは、実質的に精製画分が、存在するすべての高分子種のうちのモル基準で少なくとも約50が対象種に含まれる場合の組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する高分子種全体のうちの約80超、より好ましくは約85超、90超、95超、および99超を含むことになる。最も好ましくは、対象種は本質的に同質になるまで精製され従来の検出方法によっては組成物中で汚染物質種を検出できない、この場合、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。患者という用語は、ヒト被験者および獣医用veterinary被験者を含む。ヒト抗体および抗体のヒト化ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および/もしくは定常領域を有する抗体に関連する問題の一部を回避する。かかるマウスまたはラットの誘導タンパク質の存在により、患者によって抗体の速やかなクリアランスまたは抗体に対する免疫応答の生成がもたらされうる。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するため、齧歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生することを意図した機能性ヒト抗体遺伝子座の齧歯類、他の哺乳動物または動物への導入を介し、完全ヒト抗体を産生することが可能である。完全ヒト抗体を産生するための一方法は、高々1000kbであってそれより小さい大きさの生殖系で構成されたヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の断片を含むように設計されているマウスのXenoMouse登録商標株の使用によるものである。MendezetalNatureGenetics15146156およびGreenandJakobovitsJExpMed188483495を参照のこと。XenoMouse登録商標株は、アブジェニックスAbgenix,Inc.フレモントFremont、カリフォルニア州から入手可能である。マウスのXenoMouse登録商標株の作製については、さらに考察され、1990年1月12日に出願された米国特許出願第07466008号明細書、1990年11月8日に出願された米国特許出願第07610515号明細書、1992年7月24日に出願された米国特許出願第07919297号明細書、1992年7月30日に出願された米国特許出願第07922649号明細書、1993年3月15日に出願された米国特許出願第08031801号明細書、1993年8月27日に出願された米国特許出願第08112848号明細書、1994年4月28日に出願された米国特許出願第08234145号明細書、1995年1月20日に出願された米国特許出願第08376279号明細書、1995年4月27日に出願された米国特許出願第08430938号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08464584号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08464582号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08463191号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08462837号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08486853号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08486857号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08486859号明細書、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08462513号明細書、1996年10月2日に出願された米国特許出願第08724752号明細書、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08759620号明細書、2001年11月30日に出願された米国特許出願公開第20030093820号明細書、および米国特許第6162963号明細書、米国特許第6150584号明細書、米国特許第6114598号明細書、米国特許第6075181号明細書および米国特許第5939598号明細書、ならびに日本特許第3068180B2号明細書、日本特許第3068506B2号明細書および日本特許第3068507号明細書において示されている。1996年6月12日に公開された欧州特許第0463151B1号明細書、1994年2月3日に公表された国際公開第9402602号パンフレット、1996年10月31日に公表された国際公開第9634096号パンフレット、1998年6月11日に公表された国際公開第9824893号パンフレット、2000年12月21日に公表された国際公開第0076310号パンフレットも参照のこと。上で引用した特許、出願、および参考文献の各々の開示は、本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。代替アプローチでは、ジェンファームインターナショナルGenPharmInternational,Inc.を含むその他は、小遺伝子座minilocusアプローチを採用している。小遺伝子座アプローチでは、外来Ig遺伝子座がIg遺伝子座由来の断片個々の遺伝子の封入を通して模倣される。したがって、1つもしくは複数のVH遺伝子、1つもしくは複数のDH遺伝子、1つもしくは複数のJH遺伝子、μ定常領域、および通常は第2の定常領域好ましくはγ定常領域は、動物への挿入のためにコンストラクト内に形成される。このアプローチは、米国特許第5545807号明細書および米国特許第5545806号明細書、米国特許第5625825号明細書、米国特許第5625126号明細書、米国特許第5633425号明細書、米国特許第5661016号明細書、米国特許第5770429号明細書、米国特許第5789650号明細書、米国特許第5814318号明細書、米国特許第5877397号明細書、米国特許第5874299号明細書、および米国特許第6255458号明細書各々、LonbergandKay、米国特許第5591669号明細書および米国特許第6023010号明細書KrimpenfortandBerns、米国特許第5612205号明細書、米国特許第5721367号明細書および米国特許第5789215号明細書Bernsetal、米国特許第5643763号明細書ChoiandDunnおよび1990年8月29日に出願された米国特許出願第07574748号明細書、1990年8月31日に出願された米国特許出願第07575962号明細書、1991年12月17日に出願された米国特許出願第07810279号明細書、1992年3月18日に出願された米国特許出願第07853408号明細書、1992年6月23日に出願された米国特許出願第07904068号明細書、1992年12月16日に出願された米国特許出願第07990860号明細書、1993年4月26日に出願された米国特許出願第08053131号明細書、1993年7月22日に出願された米国特許出願第08096762号明細書、1993年11月18日に出願された米国特許出願第08155301号明細書、1993年12月3日に出願された米国特許出願第08161739号明細書、1993年12月10日に出願された米国特許出願第08165699号明細書、1994年3月9日に出願された米国特許出願第08209741号明細書GenPharmInternationalにおいて記載され、これらの開示内容は本明細書によって参照により援用される。欧州特許第0546073号明細書、国際公開第9203918号パンフレット、国際公開第9222645号パンフレット、国際公開第9222647号パンフレット、国際公開第9222670号パンフレット、国際公開第9312227号パンフレット、国際公開第9400569号パンフレット、国際公開第9425585号パンフレット、国際公開第9614436号パンフレット、国際公開第9713852号パンフレットおよび国際公開第9824884号パンフレット、ならびに米国特許第5981175号明細書も参照のことこれらの開示内容は本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。さらに、Tayloretal1992Chenetal1993Tuaillonetal1993Choietal1993Lonbergetal、TayloretalおよびTuaillonetalFishwildetalを参照のことこれらの開示内容は本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。キリンKirinは、マイクロセル融合により染色体の大きな切片または染色体全体が導入されている、マウスからのヒト抗体の産生についても明示している。欧州特許第773288号明細書および欧州特許第843961号明細書その開示内容は参照により本明細書中に援用されるを参照のこと。さらに、キリンKirinのTcマウスとメダレックスMedarexの小遺伝子座minilocusHumabマウスとの異種交配の結果であるKM商標-マウスが得られている。これらのマウスは、キリンKirinマウスのヒトIgHトランスクロモゾームtranschromosomeおよびジェンファームGenpharmマウスのκ鎖トランス遺伝子を有している491102。ヒト抗体をinvitro方法によって産生してもよい。適切な例として、ファージディスプレイCAT、モルフォシスMorphosys、ダイアクスDyax、バイオサイトBiosite/メダレックスMedarex、ゾーマXoma、シンフォジェンSymphogen、アレクションAlexion前プロリフェロンProliferon、アファームドAffimedリボソームディスプレイCAT、酵母ディスプレイなどが挙げられるがこれらに限定されない。抗体の調製本明細書に記載の抗体は、下記のようにXenoMouse登録商標技術の利用により調製された。そこでは、かかるマウスはヒト免疫グロブリン分子および抗体の産生能を有し、かつマウス免疫グロブリン分子および抗体の産生能が欠けている。この実施のために用いられる技術は、本明細書中の背景技術のセクションに開示される特許、出願、および参考文献にて開示されている。しかし、特にマウスおよびマウスからの抗体のトランスジェニックな生成の好ましい実施形態は、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08759620号明細書および1998年6月11日に公表された国際公開第9824893号パンフレットおよび2000年12月21日に公表された国際公開第0076310号パンフレットにおいて開示されており、これらの開示内容は本明細書によって参照により援用される。MendezetalNatureGenetics15146156その開示内容は本明細書によって参照により援用も参照のこと。かかる技術の使用により、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が産生されている。本質的にマウスのXenoMouse登録商標系に目的抗原例えばAng-2を免疫し、リンパ節細胞B細胞などを高度免疫したマウスから回収し、回収したリンパ球を骨髄性細胞系と融合して不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択し、目的抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を同定する。本明細書では、Ang-1およびAng-2に特異的な抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞系の作製のための方法が提供される。さらに本明細書では、かかる細胞系によって産生される抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の分析を含む、かかる抗体の特徴づけについて提供される。あるいは、骨髄腫細胞との融合によってハイブリドーマを産生する代わりに、B細胞を直接アッセイしてもよい。例えば、CD19B細胞を、高度免疫XenoMouse登録商標マウスから単離し、抗体分泌形質細胞内で増殖および分化する状態にしてもよい。次いで、細胞上清から得た抗体におけるAng-2免疫原に対する反応性についてELISAによってスクリーニングする。上清におけるAng-2の断片に対する免疫反応性についてもスクリーニングするならば、さらに抗体を、Ang-2に対する機能目的のドメインへの結合における異なる抗体をマッピングすることが可能であろう。Ang-1、Ang-3またはAng-4、他の関連するヒトケモカイン、ならびにラット、マウス、およびカニクイザルCynomolgusmonkeyなどの非ヒト霊長動物、種の交差反応性を判定するためのAng-2のオルソログに対してスクリーニング可能である。目的抗体を含有するウェルから得たB細胞は、個体または貯蔵されたウェル由来のハイブリドーマを作製するための融合を含む様々な方法、あるいはEBVへの感染または既知の不死化遺伝子による形質移入の後適切な培地に蒔くことによって不死化されうる。あるいは、所望の特異性を有する単一の形質細胞が分泌する抗体が次いで、Ang-1またはAng-2に特異的な溶血プラークアッセイ例えば、BabcooketalProcNatlAcadSciUSA93784348を参照を用いて単離される。溶解に対して標的化した細胞は、好ましくはAng-2抗原でコーティングしたヒツジ赤血球SRBCである。アンジオポエチン-1にも拮抗しうる抗体についてのスクリーニングでは、上記方法を同様に用い、アンジオポエチン-2をアンジオポエチン-1と置換してもよい。目的の免疫グロブリンおよび補体を分泌する形質細胞を含有するB細胞培養物の存在下でのプラークの形成は、目的の形質細胞周囲のヒツジ赤血球に特異的なAng-l/Ang-2媒介性の溶解を示す。プラークの中心における単一の抗原特異的な形質細胞を単離可能であり、抗体の特異性をコードする遺伝子情報が単一の形質細胞から単離される。逆転写後にPCRRT-PCRを用い、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするDNAをクローニングしてもよい。次いで、かかるクローニングしたDNAをさらに適切な発現ベクター、好ましくはpcDNAなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むかかるpcDNAベクターに挿入してもよい。次いで、生成したベクターを、HEK293細胞、CHO細胞を例とする宿主細胞に形質移入し、かつ、転写を誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するものとして改変した従来の栄養培地内で培養してもよい。一般に、融合ハイブリドーマによって産生された抗体は、完全ヒトκまたはλ軽鎖を有するヒトIgG2重鎖であった。本明細書に記載の抗体は、ヒトIgG4重鎖およびIgG2重鎖を有する。抗体は、IgG1を含む他のヒトイソタイプでもありうる。抗体は、典型的には、固相および溶相技術によって測定される場合、約10-6~約10-12Mもしくはそれ未満のKdを有する高い親和性を有していた。少なくとも10-11MのKDを有する抗体がAng-1および/またはAng-2の活性を阻害することが好ましい。理解されているように、抗体をハイブリドーマ細胞系以外の細胞系内で発現させてもよい。特定の抗体をコードする配列を用いて適切な哺乳類宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、ポリヌクレオチドをウイルスまたはウイルスベクターにパッケージングするステップと、宿主細胞にウイルスまたはベクターを形質導入するステップとを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の既知の方法、あるいは米国特許第4399216号明細書、第4912040号明細書、第4740461号明細書および第4959455号明細書これらの特許は本明細書によって参照によりその中に援用されるによって例示された当該技術分野で既知の形質移入方法により、形質転換を行ってもよい。用いられる形質転換方法は、形質転換対象の宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入するための方法は、当該技術分野では周知であり、デキストラン媒介性の形質移入、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性の形質移入、原形質融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを含む。発現のための宿主として使用可能な哺乳類細胞系は、当該技術分野では周知であり、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、ヒーラ細胞、ベイビーハムスター腎臓BHK細胞、サル腎臓細胞COS、ヒト肝細胞癌細胞例えばHepG2、ヒト上皮腎臓293細胞、および多数の他の細胞系を含むがこれらに限定されない、AmericanTypeCultureCollectionATCCから入手できる多数の不死化細胞系を含む。特定の好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有しかつ構成的なAng-2結合特性を有する抗体を産生するかの判定によって選択される。mAbにおけるアンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の活性に対する有意な中和能に基づき下記実施例にて示されるとおり、これらの抗体は、アンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2の発現に起因する症候および症状の治療において治療効果を有することになる。特定の実施形態では、本明細書における抗体および方法は、アンジオポエチン-1および/またはアンジオポエチン-2誘発性の血管形成に起因する症候の治療に関する。本発明の別の態様によると、アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、拮抗剤は抗体を含む。本発明の別の態様によると、アンジオポエチン-2の生物学的活性に対する拮抗剤と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、拮抗剤は抗体を含む。抗-Ang-2抗体は患者試料中でのAng-2の検出において有用であることから、本明細書に記載の病状に対する診断として有用である。さらに、下記実施例にて示されるとおりAng-2活性に対するそれらの有意な中和能に基づき、抗-Ang-2抗体は、Ang-2の発現に起因する徴候および症状の治療において治療効果を有する。特定の実施形態では、本明細書における抗体および方法は、Ang-2誘発性の血管形成に起因する徴候の治療に関する。さらなる実施形態は、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝細胞肝臓癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、大腸癌および膵臓癌などの新生物疾患を含む血管形成関連疾患を治療するための本明細書に記載の抗体および方法の使用を含む。治療投与および製剤本発明の実施形態は、疾患に対する治療にとって有用なAng-1とAng-2の双方に結合する1つもしくは複数の抗-Ang-2抗体の無菌医薬製剤を含む。かかる製剤であれば、Ang-2またはAng-1およびAng-2のその受容体Tie2への結合が阻害されることにより、例えば血清または組織のAng-1および/またはAng-2が異常に高まる場合の病的状態が有効に治療されることになる。抗-Ang-2抗体は、好ましくはAng-2を強力に中和させるのに十分な親和性を有し、かつ好ましくはヒトにおける低頻度の投与を可能にするのに十分な作用の持続時間を有する。抗-Ang-1/Ang-2抗体は、好ましくはAng-1およびAng-2を強力に中和させるのに十分な親和性を有し、かつ好ましくはヒトにおける低頻度の投与を可能にするのに十分な作用の持続時間を有する。作用の持続時間の延長により、皮下または筋肉内注射などの交互の非経口経路による投与計画において頻度を低下させ、便宜性を向上させることができる。無菌製剤を、例えば抗体の凍結乾燥および再構成の前後における無菌濾過膜を通す濾過によって作製することが可能である。抗体は通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中に保存されることになる。治療用抗体組成物は、一般に、皮下注射針で貫通可能なストッパーなどの製剤の回収を可能にするアダプタを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルを例とする、無菌のアクセスポートを具備する容器内に置かれる。抗体の投与経路は、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄腔内、吸入もしくは病変内経路あるいは下記のような徐放系による注射または注入といった既知の方法に従う。抗体は、好ましくは注入またはボーラス注射により連続投与される。治療的に使用されるべき抗体の有効量は、例えば治療目標、投与経路および患者の症状に依存することになる。したがって、治療者が最適な治療効果を得るという必要に応じて用量を滴定titerしかつ投与経路を変更することは好ましい。典型的には、臨床医は所望の効果を実現する用量に至るまで抗体を投与することになる。この治療の進捗は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のアッセイによって容易に監視される。本明細書に記載の抗体を医薬的に許容される担体を有する混合物中で調製してもよい。この治療組成物を静脈内にまたは経鼻的もしくは経肺的に、好ましくは液体もしくは粉末エアロゾル凍結乾燥として投与してもよい。要望どおり、組成物の非経口投与または皮下投与も可能である。治療組成物が全身投与される場合、それは無菌で、パイロジェンを含まず、pH、等張性および安定性について十分に配慮した非経口的に許容される溶液である必要がある。これらの条件は当業者には知られている。つまり、本明細書に記載の化合物の製剤剤形が、所望の精製度を有する化合物を生理学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、保存または投与用に調製される。かかる物質は、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、トリスHCl、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸性塩などの緩衝液;アスコルビン酸などの酸化防止剤;ポリアルギニンなどの低分子量約10残基未満ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸;セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの対イオンならびに/あるいはTWEEN、PLURONICSまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。注射用の無菌組成物を、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyに記載のような従来の薬務に従って調合してもよい。例えば、水またはゴマ、ピーナッツもしくは綿実油のような天然植物油またはオレイン酸エチルのような合成脂肪の媒体または同様のものなどの媒体中の活性化合物の溶解または懸濁が望ましい場合がある。公認された薬務により、緩衝液、保護剤、抗酸化剤などを混合してもよい。徐放性製剤の適切な例として、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、この場合の基質は成形物品、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例として、ポリエステル、LangeretalJBiomedMaterRes15167277およびLangerChemTech1298105によって記載されたヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3773919号明細書、EP58481号明細書、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタミン酸塩の共重合体SidmanetalBiopolymers22547556、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRONDepot商標などの分解性乳酸-グリコール酸共重合体乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア、ならびにポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸EP133988号明細書が挙げられる。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーが100日を超えて分子を放出可能である一方、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短期間に放出する。カプセル化タンパク質が体内に長期間残存する場合、それらは37°Cでの水分に暴露される結果として変性するかまたは凝集し、生物学的活性の低下および免疫原性の起こり得る変化を招く可能性がある。関与する機構によるタンパク質の安定化のために合理的な戦略を考え出してもよい。例えば、もし凝集機構がジスルフィド交換による分子間でのS-S結合の形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥化、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマー基質組成物の作製によって安定化が得られる可能性がある。徐放性組成物は、懸濁液中で結晶を維持可能な適切な調合物に懸濁される抗体の結晶製剤も含む。これらの製剤は、皮下または腹腔内に注射される場合、徐放効果をもたらしうる。他の組成物はリポソームによる捕捉抗体も含む。かかる抗体を含有するリポソームは、米国特許第DE3218121号明細書;EpsteinetalProcNatlAcadSciUSA8236883692HwangetalProcNatlAcadSciUSA7740304034EP52322号明細書;EP36676号明細書;EP88046号明細書;EP143949号明細書;EP142641号明細書;日本特許出願83118008号明細書;米国特許第4485045号明細書および第4544545号明細書;ならびにEP102324号明細書といったそれ自体既知の方法によって調製される。所定の患者に対する抗体製剤の用量は、重症度および疾患タイプ、体重、性別、食事、投与時間および経路、他の薬剤および他の臨床に関連する因子を含む、薬剤の作用を変更することで知られる様々な因子を考慮する担当医によって決定されることになる。治療有効用量は、invitro方法またはinvivo方法によって決定されうる。治療的に使用されるべき、本明細書に記載の抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路および患者の症状に依存することになる。したがって、最適な治療効果を得るという必要に応じて用量を滴定しかつ投与経路を変更することが治療者にとって好ましい。典型的な1日用量は、上記の因子に依存すれば、約0.001mg/kg~最大100mg/kgまたはそれより多い範囲でありうる。典型的には、臨床医は所望の効果が得られる用量に達するまで治療用抗体を投与することになる。この治療の進捗は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のように容易に監視される。本明細書における組成物および方法に従う治療実体therapeuticentitiesが製剤中に混合される適切な担体、賦形剤、および他の作用物質とともに投与されることで、移動、送達、耐性などの改善が可能になることは理解されるであろう。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞Lipofectin商標などを含有する脂質陽イオンまたは陰イオン、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルジョン、エマルジョンのカルボワックスcarbowax様々な分子量のポリエチレングリコール、半固体ゲル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が投与経路に生理的適合性および耐性を示すと仮定すると、上記混合物のいずれかは本発明による治療および療法において適切でありうる。BaldrickP医薬賦形剤の開発:前臨床的ガイダンスに対する必要性RegulToxicolPharmacol322108、WangW固体タンパク質医薬品の凍結乾燥および開発IntJPharm203160、CharmanWN脂質、脂肪親和性薬および経口薬の送達-いくつかの新しい概念JPharmSci8996778、Powelletal非経口製剤用賦形剤の概要PDAJPharmSciTechnol52238311、および薬剤師に周知の製剤、賦形剤および担体に関する追加情報についてのそれらの中の引用文献も参照のこと。併用本明細書中で定められる抗血管形成治療は、唯一の治療として適用されうる、または、本発明の化合物に加え、従来の手術、放射線療法または化学療法を含みうる。かかる化学療法は、抗腫瘍物質の以下のカテゴリのうちの1つもしくは複数を含みうる。i細胞増殖抑制剤、例として、抗エストロゲン例えばモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ例えばフルベストラント、抗アンドロゲン例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン、LHRH拮抗薬またはLHRH作動薬例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン、プロゲステロン例えば酢酸メゲストロール、アロマターゼ阻害薬例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエクスメスタンおよびフィナステリドなどの5レダクターゼの阻害剤など。ii癌細胞浸潤を阻害する作用物質例えば、マリマスタットのようなメタロプロテアーゼ阻害剤およびウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体機能の阻害剤。iii成長因子機能の阻害剤、例えばかかる阻害剤は、成長因子抗体、成長因子受容体抗体例えば、抗erbb2抗体トラスツズマブtrastuzumabハーセプチンHerceptin商標および抗erbb1抗体セツキシマブcetuximabC225、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば表皮成長因子ファミリーの阻害剤例えば、N3クロロ4フルオロフェニル7メトキシ63モルホリノプロポキシキナゾリン4アミンゲフィニチブgefitinib、AZDl839、N3エチニルフェニル6,7ビス2メトキシエトキシキナゾリン4アミンエルロチニブerlotinib、OSI774および6アクリルアミドN3クロロ4フルオロフェニル73モルホリノプロポキシキナゾリン4アミンCI1033などのEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えば血小板由来成長因子ファミリーの阻害剤、ならびに例えば肝実質細胞成長因子ファミリーの阻害剤を含む。iv例えば、血管内皮成長因子の作用を阻害する血管形成阻害薬例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシツマブbevacizumabアヴァスチンAvastin商標、抗-KDR抗体および抗-flt1抗体などの抗血管内皮成長因子受容体抗体、例えば国際公開第9722596号パンフレット、国際公開第9730035号パンフレット、国際公開第973285号パンフレット、国際公開第9813354号パンフレット、国際公開第0047212号パンフレットおよび国際公開第0132651号パンフレットの中に開示された化合物および他の機構によって機能する化合物例えばリノマイド、インテグリンavb3機能阻害剤およびアンギオスタチン。vコンブレタスタチンCombretastatinA4などの血管障害剤vasculardamagingagentおよび国際公開第9902166号パンフレット、国際公開第0040529号パンフレット、国際公開第0041669号パンフレット、国際公開第0192224号パンフレット、国際公開第0204434号パンフレットおよび国際公開第0208213号パンフレットの中に開示された化合物。vi例えば、抗rasアンチセンスのISIS2503など、上に列挙した標的に特異的なアンチセンス療法。vii例えば異常p53、異常BRCA1またはBRCA2などの異常遺伝子を交換するためのアプローチ、例えばシトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌性ニトロリダクターゼ酵素を用いたGDEPT遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法アプローチ、および例えば多剤耐性遺伝子療法など、患者の化学療法または放射線療法に対する耐性を増強するためのアプローチを含む遺伝子療法アプローチ。viii例えば、インターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインの形質移入など、患者腫瘍細胞の免疫原性を増強するためのエクスビボおよびinvivoアプローチ、T細胞アネルギーを低下させるためのアプローチ、サイトカインが形質移入された樹状細胞などの形質移入された免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカインが形質移入された腫瘍細胞系を用いるアプローチ、ならびに抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む免疫療法アプローチ。本発明の一実施形態では、本発明の抗血管形成治療は、血管内皮成長因子VEGFの作用を阻害する作用物質と併用される例えば、抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシツマブアヴァスチン登録商標、抗-KDR抗体および抗-fltl抗体などの抗血管内皮成長因子受容体抗体、国際公開第9722596号パンフレット、国際公開第9730035号パンフレット、国際公開第973285号パンフレット、国際公開第9813354号パンフレット、国際公開第0047212号パンフレットおよび国際公開第0132651号パンフレットの中に開示された化合物および他の機構によって機能する化合物例えばリノマイド、インテグリンavb3機能阻害剤およびアンギオスタチン;本発明の別の実施形態では、本発明の抗血管形成治療薬は、血管内皮成長因子受容体KDRのチロシンキナーゼ活性を阻害する併用剤例えばAZD2171またはAZD6474である。AZD2171に関するさらなる詳細は、WedgeetalCancerResearch654389400において見出されうる。AZD6474に関するさらなる詳細は、RyanWedgeBritishJournalofCancer92Suppl1S613において見出されうる。いずれの発行物もそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。本発明の別の実施形態では、完全ヒト抗体3.19.3、3.3.2または5.88.3は単独で併用されるかあるいはアヴァスチン商標、AZD2171またはAZD6474と併用される。かかる併用治療は、治療における個々の成分の同時、順次または分割投与を介して行われうる。かかる組合せ製品は、本発明の化合物、またはそれらの医薬的に許容される塩を上記の用量範囲内で、かつ他の医薬活性物質をその認可された用量範囲内で用いている。実施例行われた実験および得られた結果を含む以下の実施例は、あくまでも図示目的で提供され、本明細書における教示の際の限定として解釈されるべきではない。実施例1免疫および滴定TITERING免疫抗原としてRDシステムズRDSystems,Inc.ミネアポリスMinneapolis、ミネソタ州、カタログ番号623-AM/CFから入手した組換えヒトAng-2を使用した。XenoMouse登録商標マウスXenoMouse株XMG2およびXMG43C-1株、アブジェニックスAbgenix,Inc.、フレモントFremont、カリフォルニア州を順次免疫することにより、Ang-2に対するモノクローナル抗体を発現させた。XenoMouse動物を、すべての注射において足蹠経路を介して免疫した。各注射の全容量は、1マウス当たり50μl、1足蹠当たり25μlであった。1回目の注射をパイロジェンを含まないダルベッコPBSDPBS中の2.35μgの組換えヒトAng-2rhAng-2、カタログ番号623-AM/CF;ロット番号BN023202Aで行い、1マウス当たり10μgのCpGImmunEasyMouseAdjuvant15μl、カタログ番号303101;ロット番号11553042;キアゲンQiagenと1:1v/vで混合した。次いで、パイロジェンを含まないDPBS中の2.35μgのrhANG-2で6回追加免疫し、1マウス当たり25μgのAdju-Phosリン酸アルミニウムゲル、カタログ番号1452-250、バッチ番号8937、HCIバイオセクターHCIBiosectorおよび10μgのCpGとの混合後、アジュバントなしでパイロジェンを含まないDPBS中の2.35μgのrhAng-2で最後の追加免疫を行った。このプロトコルでは、0、3、6、10、13、17、20および24日目にXenoMouseマウスを免疫し、29日目に融合した。力価による収集のための動物の選択免疫したXenoMouseマウス由来の血清中の抗-Ang-2抗体力価をELISAによって測定した。つまり、組換えAng-21μg/mlを、AntigenCoatingBuffer0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.6NaHCO38.4g/L中、CostarLabcoatUniversalBindingPolystyreneの96ウェルプレートコーニングCorning、アクトンActon、マサチューセッツ州上に4°Cで一晩コーティングした。翌日、プレートを、バイオテックBiotek製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液1×PBS中、0.05Tween20で3回洗浄した。次いで、プレートを、200μl/ウェルのブロッキング緩衝液1×PBS中、0.5BSA、0.1Tween20、0.01チメロサールでブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。1時間のブロッキング後、プレートをバイオテックBiotek製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で3回洗浄した。Ang-2で免疫したXenoMouseマウスまたはナイーブXenoMouse動物由来の血清を、初期希釈率1:100から希釈率1:3での0.5BSA/PBS緩衝液で2通りに滴定した。最後のウェルを空のままにした。これらのプレートを室温で2時間インキュベートし、次いでプレートをバイオテックBiotek製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で3回洗浄した。ヤギ抗-ヒトIgGFcに特異的な西洋わさびペルオキシダーゼHRP、ピアースPierce、ロックフォードRockford、イリノイ州との結合抗体を最終濃度1μg/mlで添加して、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをバイオテックBiotek製プレートウォッシャーを使用して洗浄緩衝液で3回洗浄した。洗浄後、TMB発色基質BioFxBSTP-0100-01の添加により、10~20分間または陰性対照ウェルが呈色し始めるまでプレートを展開した。次いで、停止溶液TMBBioFxBSTP-0100-01用の650nM停止試薬、1ボトル当たりH2O100mlで再構成の添加によってELISAを停止した。650nmでの光学濃度から判定した各XenoMouse動物に特異的な力価を以下の表2および3に示す。力価値は血清の最大希釈の逆数であり、この場合、ODの読み取り値はバックグラウンドの2倍である、したがって、その数の増加に伴い、Ang-2に対する液性免疫応答が増大した。実施例2リンパ球、B細胞単離物、融合物の回収およびハイブリドーマの作製免疫マウスを頚部脱臼により犠牲にし、排出リンパ節を収集し、各コホートから貯蔵した。リンパ球様細胞をDMEM中で粉砕によって分離して細胞を組織から放出させ、細胞をDMEMに懸濁した。細胞を計数し、リンパ球1億個当たり0.9mlのDMEMを細胞ペレットに添加して細胞をゆっくりではあるが完全に再懸濁した。細胞1億個当たりCD90磁気ビーズ100μlを使用し、細胞を磁気ビーズとともに4°Cで15分間インキュベートすることによって細胞を標識した。最大108個の陽性細胞または最大2x109個の全細胞を含有する磁気標識した細胞懸濁液をLSカラム上に負荷し、カラムをDMEMで洗浄した。流出液全体をCD90-陰性画分これら細胞の大部分がB細胞であると予想されたとして収集した。上から得た洗浄された濃縮したB細胞と、ATCCのカタログ番号CRL1580から購入した非分泌性骨髄腫P3X63Agの8,653個の細胞とを1:1の比率で混合することによって融合を行った。細胞混合物を800×gでの遠心分離により緩徐にペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞をプロナーゼ溶液カルバイオケムCalBiochem、カタログ番号53702;PBS中0.5mg/ml2~4mLで2分間だけ処理した。次いで、FBS3~5mlを添加して酵素活性を停止させ、電気細胞融合溶液ECFS、0.3Mスクロース、シグマSigma、カタログ番号S7903、0.1mM酢酸マグネシウム、シグマSigma、カタログ番号M2545、0.1mM酢酸カルシウム、シグマSigma、カタログ番号C4705を用いて懸濁液を全容量40mlに調節した。遠心分離後、上清を除去し、細胞をECFS40mlに再懸濁した。この洗浄ステップを繰り返し、さらに細胞をECFSに再懸濁して濃度を2x106個の細胞/mlにした。フュージョンジェネレーターfusiongenetratorモデルECM2001、ジェネトロニックGenetronic,Inc.、サンディエゴSanDiego、カリフォルニア州を使用し、電気細胞融合を行った。以下の器具の設定値を用い、使用した融合チャンバの大きさは2.0mlであった。アラインメント条件:電圧50V、時間50秒電圧3000V、時間30μ秒で膜破壊融合後の保持時間:3秒ECF後、無菌条件下で融合チャンバから細胞懸濁液を注意深く取り出し、L-グルタミン、pen/strep、OPIオキサロ酢酸塩、ピルビン酸塩、ウシインスリンすべてシグマSigma製およびIL-6ベーリンガーマンハイムBoehringerMannheimを補充した同容量のハイブリドーマ培地DMEM、JRHバイオサイエンシーズJRHBiosciences、15FBSハイクローンHycloneを含む無菌チューブに移した。細胞を37°Cで15~30分間インキュベートし、次いで400×g1000rpmで5分間遠心した。細胞を、少容量のハイブリドーマ選択培地0.5×HAシグマSigma、カタログ番号A9666を補充したハイブリドーマ培地に緩徐に再懸濁し、96ウェルプレート当たり全部で5×106個のB細胞および1ウェル当たり200μlの最終プレーティングに基づき、より多くのハイブリドーマ選択培地によって容量を適切に調節した。細胞を緩徐に混合し、96ウェルプレートにピペッティングし、成長させておいた。7日または10日目、培地の半分を除去し、細胞にハイブリドーマ選択培地を補充した。実施例3ELISAによる候補抗体の選択培養の14日後、ハイブリドーマ上清におけるAng-2に特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングした。ELISAプレートフィッシャーFisher、カタログ番号12-565-136を、コーティング緩衝液0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.6、NaHCO38.4g/L中の50μl/ウェルのヒトAng-22μg/mlでコーティングし、次いで4°Cで一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液PBS中、0.05Tween20で3回洗浄した。200μl/ウェルのブロッキング緩衝液1×PBS中、0.5BSA、0.1Tween20、0.01チメロサールを添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。50μl/ウェルのハイブリドーマ上清と陽性および陰性対照とを添加し、プレートを室温で2時間インキュベートした。全体を通して用いた陽性対照はAng-2で免疫したXenoMouseマウス、XMG2Ang-2グループ1、足蹠fpN160-7由来の血清であり、陰性対照はKLHで免疫したXenoMouseマウス、XMG2KLHグループ1、足蹠fpL627-6由来の血清であった。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μl/ウェルの検出抗体のヤギ抗-huIgGFc-HRPカルタグCaltag、カタログ番号H10507を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートした。二次スクリーニングでは、IgGとIgκの双方における完全ヒト組成物を明らかにするため、一次スクリーニングにおける陽性を2通りにスクリーニングし、ここでは一方がhIgG検出用、他方がヒトIgκ軽鎖検出用ヤギ抗-hIgκ-HRPサザンバイオテクノロジーSouthernBiotechnology、カタログ番号2060-05であった。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μl/ウェルのTMBBioFXLab.カタログ番号TMSK-0100-01を添加し、プレートを約10分間陰性対照ウェルがようやく呈色し始めるまで展開させておいた。次いで、50μl/ウェルの停止溶液TMB停止溶液、BioFXLab.、カタログ番号STPR-0100-01を添加し、ELISAプレートリーダー上でプレートを450nmで読み取った。Ang-2に対して185種の完全ヒトIgGκ抗体を認めた。Ang-1と交差反応する抗体を除外するため、ELISAアッセイにて結合したすべての抗体におけるAng-1への結合についてELISAによりカウンタースクリーニングした。ELISAプレートフィッシャーFisher、カタログ番号12-565-136を、コーティング緩衝液0.1M炭酸塩緩衝液、pH9.6、NaHCO38.4g/L中、50μl/ウェルの組換えAng-12μg/ml、RDシステムズRDSystemsから入手、カタログ番号293-AN-025/CFでコーティングし、次いで4°Cで一晩インキュベートした。ここに記載の実験条件下で組換えAng-1分子をELISAプレート上に固定化した際、Ang-1に結合する抗体は全く見出されなかった。しかし、ここに記載のカウンタースクリーニングは技術的制約を有する。第1に、抗体は系物質由来であってもクローン化ハイブリドーマ由来ではない。系のほんの一部の割合を占めるにすぎない、特定のクローン由来の結合シグナルは、検出感度の閾値未満に収まりうる。第2に、抗原における特定のエピトープは、抗原の固定化によって誘発されるわずかな高次構造上の変化に起因し、この実験における抗体から逃れる可能性がある。これらのあらゆる理由を踏まえ、クローン抗体およびBiacoreシステムを用い、各抗体のAng-1に対する交差反応性についてさらに検討した実施例8参照。実施例8に記載のように、1種のクローンmAb3.19.3が事実上、ヒト組換えAng-1に対する強い交差反応性を有することが判明した実施例8、9および12。実施例4ANG-2のTIE2に対する結合の阻害上で考察したように、Ang-2はTie2受容体への結合によってその生物学的効果を発揮する。Ang-2/Tie2結合を阻害するモノクローナル抗体を、改良されたELISAを用いた競合結合アッセイによって同定した。使用したmAbは、Ang-2に特異的なハイブリドーマプールの消耗させた上清50mlからの微量精製micro-purification産物であった実施例3参照。96ウェルのNuncImmplates商標を、4°Cで一晩インキュベートすることにより、4μg/mlの組換えヒトTie2/Fc融合タンパク質RDシステムズRDSystems,Inc.、カタログ番号313-TI-100100μlでコーティングした。Skan商標Washer300StationスカトロンSKATRONで、リン酸塩緩衝生理食塩水PBSを用いてプレートを4回洗浄した。ウェルをABX-ブロッキング緩衝液PBS中、0.5BSA、0.1Tween、0.01チメロサール100μlによって1時間ブロッキングした。100ng/mlのビオチン化組換えヒトAng-2RDシステムズRDSystems,Inc.カタログ番号BT623を、100μg/mlの抗Ang-2mAbを有する場合または有しない場合として、各ウェルに添加した。プレートを室温で非結合分子が洗い落とされるまでの2時間インキュベートした。次いで、結合したビオチン化Ang-2を、100μl/ウェルのストレプトアビジン-HRP結合体を1:200で用い、室温で30分間インキュベートすることによって検出した。2回洗浄後、結合したストレプトアビジンをHRP基質RDシステムズRDSystems、カタログ番号DY998によって検出した。プレートを、反応終了のために450停止溶液100μl/ウェル、BioFX、カタログ番号BSTP-0100-01を添加するまでの30分間インキュベートした。SpectramaxPlusリーダーにより、450nmでの光吸光度を測定した。Ang-2よりも10倍モル過剰な可溶性組換えTie2/Fc融合タンパク質を陽性対照として用いた。この濃度で、Tie2/Fcは、Ang-2の固定化されたTie2への結合を80阻害した。恣意的な判断基準としてこれを用いると、Ang-2に結合するmAbの175種のうちの74種が阻害活性を示した。操作の便宜上、後続するハイブリドーマのクローニング用に上位27種の中和物を選択した。以下の標準の手順により、限界希釈法を用いて各ハイブリドーマをクローニングした。各ハイブリドーマから3種の姉妹クローンを収集した。各クローンにおいて、上記のように、ELISAを用いて上清におけるヒトAng-2への結合およびAng-1への対結合について試験し、各抗体がAng-2のみに特異的であることを保証した。消耗させた上清中のIgG濃度を測定し、各ハイブリドーマ由来の3種の姉妹クローンの中でも最高の収量を有する1種のクローンをIgG精製のために選択した。さらなる特徴づけを意図して、各上清から0.5~1mgのIgGを精製した。mAbにおけるAng-2のTie2への結合に対する阻害活性を定量化するため、競合結合アッセイを用い、上位27種の候補由来の精製mAbにおける力価を測定した。mAbの各濃度を2通りに試験した。GraphpadPrism商標グラフィックソフトウェアを用いたカーブフィッティングにより、濃度-応答の関連性を見出した非線形、S字形曲線。ソフトウェアにより、最大阻害有効性およびIC50効力を計算した。さらに検討するため、相対的に高い有効性と効力の双方を示す10種のモノクローナル抗体を選択した。これらの10種のmAbの有効性および効力について表4に列挙する。実施例5抗体のビニングBINNINGいずれの抗-Ang-2抗体であれば相互に交差競合し、Ang-2上の同じエピトープに結合する可能性が高いかを判定するため、エピトープビニングを行った。ビニングプロセスについては、米国特許出願公開第20030175760号明細書だけでなくJiaetalJImmunolMethods2889198にも記載され、いずれも全体が参照により援用される。つまり、ルミネックスLuminexのウェブサイト上に提供されているタンパク質共役プロトコルに従い、ルミネックスLuminex製ビーズをマウス抗-huIgGファーミンジェンPharmingen555784と共役させた。以下の手順を用い、未知の一次抗体に共役するのに前共役したビーズを調製し、光からビーズを保護した。未知の各上清に対して別々のチューブを使用した。公式nX210×50μl式中、n=試料の総数を用い、必要とされる上清容量を計算した。このアッセイでは、0.1μg/mlの濃度を用いた。ビードストックを緩徐にボルテックスし、上清中で1ウェル当たり50μl中で2500個の各ビードまたは0.5×105個のビーズ/mlの濃度に希釈した。試料を、暗所で室温の振とう機上で一晩インキュベートした。フィルタープレートを1ウェル当たり洗浄緩衝液200μlを添加することにより予め湿らせ、次いで吸引した。各ビード50μlをフィルタープレートの各ウェルに添加した。100μl/ウェルの洗浄緩衝液を添加して吸引することにより、試料を1回洗浄した。50μl/ウェルの抗原および対照をフィルタープレートに添加した。プレートを覆い、暗所の振とう機上で1時間インキュベートし、次いで試料を3回洗浄した。次いで、50μl/ウェルの未知の二次抗体を添加した。一次抗体に対して0.1μg/mlの濃度を用いた。次いで、プレートを、暗所で室温の振とう機上で2時間インキュベートし、次いで試料を3回洗浄した。1:500に希釈した50μl/ウェルのビオチン化マウス抗-ヒトIgGファーミンジェンPharmingen555785を添加し、試料を、暗所、室温での振とう下で1時間インキュベートした。試料を3回洗浄した。希釈率1:1000での50μl/ウェルのストレプトアビジン-PEを添加し、試料を、暗所、室温での振とう下で15分間インキュベートした。Luminex100上で2回の洗浄サイクルを実施した後、試料を3回洗浄した。各ウェル内の内容物をブロッキング緩衝液80μlに再懸濁した。数回のピペッティングにより試料を注意深く混合し、ビーズを再懸濁した。次いで、試料をLuminex100上で分析した。結果を以下の表5に示す。実施例6BIACORE分析を用いた抗-ANG-2抗体親和性の測定27種の精製モノクローナル抗体の低分解能スクリーニング標識不要の表面プラスモン共鳴SPRすなわちBiacoreを利用して抗原に対する抗体親和性を測定した。このため、CM5Biacoreチップ上に高密度のヤギ抗-ヒト抗体表面を通常のアミンカップリングを用いて調製した。すべての精製したmAbを、100μg/mlのBSAおよび10mg/mLのカルボキシメチルデキストランを含有するHBS-Pランニング緩衝液で約8μg/mlに希釈した。mAbのベースラインの安定化のために、42秒の接触時間および5分の洗浄時間を用いて分かれた表面上で各mAbを捕捉した。90.9nMのAng-2を全表面にわたって1分間注射した後、10分間解離させた。Ang-2注射の直前に対照フローセルからのシグナルを差し引きかつ緩衝液のベースラインドリフトを差し引くことにより2回参照される結合データを用意した。各mAbに対するAng-2結合データを各表面上に捕捉されたmAbの量に対して正規化し、27種のmAbについての正規化し、ドリフト補正した応答について判定した。データを1:1の相互作用モデルにグローバルに適合させ、結合速度を判定した。25°CでのAng-2結合の速度分析結果を以下の表に挙げる。mAbを親和性の最高から最低までランク付けしている。mAb5.101および5.86を除くすべてのmAbに対するkd結果の直後のアスタリスクは、これらのkdが遅いオフレートデータのオーダー値の特徴に対する最適な推定値として一定に保持されたことを示す。これらの試料における適合モデルでは、比較的短い解離時間を超えるオフレートにおいて測定可能な変化は全く検出されず、それ故、オンレートデータを適合させるのにkdが一定である必要があった。それらに対するデータは、約10-6秒-1のオーダーのkdでのシミュレーションではkdもよく適合することから、相互作用は上記報告よりも10倍またはそれより強い可能性があることを示した。100pM未満の親和性を有するmAbを用いた高分解能の速度実験のため、通常は解離データを4~6時間測定する。捕捉されたmAb表面からドリフトのアーチファクトを伴わずに測定可能な最大の解離時間は20分である。高親和性mAbにより、かかる比較的短時間にわたってほぼ無視できるシグナル減衰が測定されることから、kd推定値は2桁分だけ変化しうる。実施例7BIACORE分析を用いた抗-ANG-2抗体親和性の判定3種の精製モノクローナル抗体を用いたAng-2培地/高分解能スクリーニング精製したmAbs5.16、5.35および5.41を、10mM酢酸ナトリウム、pH5.0中で約8μg/mlに希釈した。次いで、希釈した各mAbを異なるフローセル表面CM5Biacoreチップ上に通常のアミンカップリングを用いて固定化した。オンレートデータ取得のため、90.9~0.71nMの範囲内の8つの濃度2倍希釈物のAng-2を、2回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に3通りに90秒間注射した後、4分間解離させた。各注射サイクルの後に10mMグリシン-HCl、pH1.5の9秒間パルスを2回施し、抗体表面を再生した。オフレートデータ取得のため、100μg/mlBSAを含有するHBS-Pランニング緩衝液中の3種の90.9nMのAng-2試料を上記のように注射し、8時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を3回の無注射サイクルと交互に行った。上記のように再生を行った。CLAMPDavidGMyszkaandThomasMortonCLAMP著作権:バイオセンサー動的データ解析プログラムabiosensorkineticdataanalysisprogramTIBS23149150を用い、データを質量移動を伴う1:1相互作用モデルにグローバルに適合させた。得られる結合定数を以下の表7に示す。8時間の解離時間にわたり有意なシグナル減衰を測定した。CLAMPに8時間の解離データを用いると、各mAbに対するkdをより合理的に推定することができる。ここでは5.16と5.35の双方に対するkdは約10-6秒-1である。次いで、以下の実施例8に記載のように、mAbのAng-1に対する親和性の測定により、抗体のAng-1に対する交差反応性について検討した。実施例8BIACORE分析を用いた抗-ANG-1抗体親和性の判定mAbのAng-1に対する親和性の測定により、抗体のAng-1に対する交差反応性についてさらに検討した。オンレートおよびオフレートの判定のため、ELISAに基づく対結合に記載のように実施例3Ang-1を固定化する代わりに、Ang-2mAbをCM5Biacoreチップに固定化して溶液中のAng-1を注射した。この実験では、下記のように3.3.2、3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3および3.19.3を含む6種のmAbを試験し、それらがAng-1といかに強く交差反応するかを判定した。6種の精製モノクローナル抗体の中分解能スクリーニング標識不要の表面プラスモン共鳴SPRすなわちBiacore2000機器を利用し、Ang-1に対する抗体親和性を測定した。このため、CM5Biacoreチップ上に高密度のヤギα-ヒト抗体表面を通常のアミンカップリングを用いて調製した。作製実験において、精製したmAbクローン3.19.3、3.3.2、5.88.3、5.86.1、3.31.2、5.16.3を、100μg/mlのBSAを含有するHBS-Pランニング緩衝液で約2.5~3.5μg/mlに希釈した。各mAbに対する捕捉レベルは約150RUであった。各捕捉サイクルの後に5分間の洗浄を行い、mAbのベースラインを安定化させた。ランニング緩衝液で87.4nMに希釈した単一のAng-1試料を、あらゆる捕捉表面にわたって1分間注射した。Ang-1がmAb3.19.3に結合することが判明したが、5種のmAbに対する結合については全く明らかでなかった。mAb捕捉レベルを500~600RUをはるかに超えるレベルまで上昇させかつ380nMのAng-1を1分間注射することにより、この実験を繰り返した。mAb3.19.3がAng-1に結合することが再び判明したAng-1だけがmAb3.19.3に対する結合活性を示したであったことから、このmAbのAng-1とAng-2の双方に対する親和性を判定した。Ang-1が上記発生実験の間に遅いオフレートを示したことから、中分解能の捕捉実験はkdを正確に推定するに十分なオフレートデータを記録しなかったのであろう。結果的には、高分解能のBiacore条件下でAng-1およびAng-2のmAb3.19.3に対する結合を測定した。実施例9高分解能BIACORE分析を用いたMAB3.19.3のANG-1およびANG-2に対する親和性の判定精製したmAb3.19.3を、10mM酢酸ナトリウム、pH4.0中で12.5μg/mlに希釈した。次いで、mAbをフローセル1~3CM5Biacoreチップ上に通常のアミンカップリングを用いて固定化し、フローセル4を参照フローセルとしておいた。オンレートデータ取得のため、100μg/mlのBSAを含有するHBS-Pランニング緩衝液中39.8~0.31nMの範囲内の8つの濃度2倍希釈物のAng-1を、2回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に3通りに90秒間100μL/分の流速で注射した後、4分間解離させた。各注射サイクルの後に10mMNaOHの6秒間パルスを施し、抗体表面を再生した。オフレートデータ取得のため、3種の19.9nMのAng-1試料を上記のように注射し、6時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を3回の無注射サイクルと交互に行った。上記のように再生を行った。CLAMPDavidGMyszkaandThomasMortonCLAMP著作権:バイオセンサー動的データ解析プログラムTIBS23149150を用い、データを質量移動に対する項目を含めた1:1相互作用モデルにグローバルに適合させた。精製したMAb3.19.3を用いたANG-2の高分解能Biacore試験精製したmAb3.19.3を、10mM酢酸ナトリウム、pH4.0で12.5μg/mlに希釈した。次いで、mAbをフローセル1~3CM5Biacoreチップ上に通常のアミンカップリングを用いて固定化し、フローセル4を参照フローセルにしておいた。オンレートデータ取得のため、100μg/mlのBSAを含有するHBS-Pランニング緩衝液中30.0~0.23nMの範囲内の8つの濃度2倍希釈物のAng-2を、2回の参照を意図した分散型の数回の緩衝液注射で無作為に3通りに90秒間100μL/分の流速で注射した後、4分間解離させた。各注射サイクルの後に15mMNaOHの6秒間パルスを施し、抗体表面を再生した。オフレートデータ取得のため、3種の15.0nMのAng-2試料を上記のように注射し、6時間にわたり解離データを記録した。試料の注射を3回の無注射サイクルと交互に行った。長い各オフレート注射サイクルの後に15mMNaOHの6秒間パルスを施し、各表面を再生した。CLAMPDavidGMyszkaandThomasMortonCLAMP著作権:バイオセンサー動的データ解析プログラムTIBS23149150を用い、データを質量移動に対する項目を含めた1:1相互作用モデルにグローバルに適合させた。結果および考察:MAb3.19.3を用いたANG-1およびANG-2の高分解能Biacore試験各抗原を用いて2つの別々の実験を行った。結果を以下の表8に示す。上記表におけるAng-2に対するkd値は、CLAMPソフトウェアに適合する1:1相互作用モデルの間には一定に保持されたことからアスタリスクが付いている。Ang-2実験において記録された解離シグナルが全く有意ではなかったことから、最適なオフレート推定値は、Kdを1×10-6秒-1で一定に保つことであった。Ang-2に対する長いオフレートデータは、実際にはデータ取得の6時間を超える上昇傾向を示した。この傾向は、2つの異なる機器をスーパークリーンsuperclean維持プロトコルに従った上でそれらを用い、2つの異なるセンサチップ上で反復された。mAb3.19.3のAng-1およびAng-2に対する結合親和性をより正確に測定するため、さらなる実験実施例10参照を実施し、mAb3.19.3のこれらの抗原に対するKdを測定した。興味深いことに、ELISAに基づく結合アッセイ実施例3において、Ang-1をELISAプレート上に固定化した場合、mAb3.19.3はAng-1に結合しなかった。この矛盾に対しては、Ang-1をプラスチック表面上に固定化した際、mAb3.19.3の結合にとって重要なわずかなエピトープが適切に暴露されなかったという説明が考えられる。しかし、Ang-1がBiacore実験条件下など、液相中に存在した際、このエピトープはmAb3.19.3に接近可能になり、結合が生じた。実施例10高分解能KINEXA結合平衡除外アッセイKINETICEXCLUSIONASSAYを用いたMAB3.19.3のヒトANG-2に対する親和性の判定高分解能Biacoreを用いてmAb3.19.3のヒトAng-2に対する親和性を測定した際実施例9、解離シグナルが全く有意でないことが判明した。Ang-2に対する長いオフレートデータは、データ取得の6時間にわたり上昇傾向を示す。このため、より信頼性の高いKd値を得ることを目標に、KinExA技術を用いてmAb3.19.3のヒトAng-2に対する結合のKDを測定した。このため、KinExA3000機器を利用した。第1に、1mL約271μgのストック用Ang-2RDシステムズRDSystems,Inc.、ロット番号BNO32510Aを、10mLの脱塩カラムピアースPierceD-Salt商標ポリアクリルアミドカラム、6000分子量カットオフ、ロット番号GF97965を用いて1×PBS、pH7.0に緩衝液交換した。C.ニックペースC.NickPaceによって記載されたタンパク質濃度測定方法PaceetalProteinScienceVol4241124231995を用いて貯蔵した画分の濃度を測定すると1.7μMであった。第2に、200mgのポリメチルメタクリレートPMMA、ロット番号206-01ビーズを450μL約122μgのストック用Ang-2と24°Cで一晩共役させた。次いで、ビーズを遠心し、ブロッキング緩衝液1×PBS、10mg/mlBSAで1回洗浄し、再度遠心し、次いでブロッキング緩衝液中、24°Cで1時間インキュベートした。ブロッキング後、ビーズを標準のKinExAビード用リザーバのバイアル内のHBS緩衝液0.01Mヘペス、0.15MNaCl、pH7.4約30mLで希釈し、機器上に置いた。Kdで制御される適定mAb3.19.3結合部位を有する25.3pMの濃度の12種の溶液を、Ang-2の濃度を増加させることにより適定した。試料調製のために緩衝液を交換したAng-2を用いた。各溶液における全容量は25mLであり、それを約24°Cで5日間平衡状態にした。容積測定用のガラス器具を使用して適定溶液を調製し、Ang-2の濃度を5.09nM~99.3fMに変化させた。これらの溶液の分析用に用いたKinExA機器の方法はPMMAビーズがガラス製キャピラリーに詰め込まれるビードパッキングステップからなり、平衡化溶液を、2通りに0.25mL/分で6分間1.5mL、ビードカラムに貫流させた。次いで、3.4nMの蛍光標識したCy-5ヤギ抗-ヒトFc特異的ポリクローナル抗体を、0.5mL/分で1分間、ビードパックbeadpackに貫流させて遊離結合部位をビーズ上に捕捉させてmAbを標識した。ビードパックからの蛍光放射を、620nmで励起した上で670nmで測定した。生成される蛍光測定値を、添付のKinExAソフトウェアパッケージバージョン1.0.3、セパダインSapidyne,Inc.を用い、全抗原濃度に対する遊離mAb結合部位に変換した。KinExAソフトウェアを用い、生成されるKDで制御される適定曲線を、ドリフト補正因子を含めた1:1平衡等温線に適合させた。データに最適に適合するKDの値は86.4pMであり、下側および上側の95信頼限界はそれぞれ64.3pMおよび98.7pMであった。mAbで制御される適定曲線は実行しなかった。実施例11HEK293細胞内で異所的に発現されるANG-2誘発性のTIE2リン酸化の遮断上で考察したように、Tie2は内皮細胞に特異的な受容体チロシンキナーゼである。血管内皮細胞を用いたinvitro実験では、Ang-1がTie2リン酸化を誘発する一方で、Ang-2はAng-1によって誘発された受容体のリン酸化を阻害することが示される。しかし、Tie2が線維芽細胞内など、異所的に発現される場合、Ang-2は、アンジオポエチン-2への長期の暴露または高濃度のアンジオポエチン-2への暴露を含むがこれらに限定されない特定の条件下でTie2リン酸化を誘発することも可能である。Ang-2誘発性のTie2リン酸化は、受容体がHEK293F細胞内で発現される場合にも生じる。抗-Ang-2mAbにおけるAng-2誘発性のTie2リン酸化に対する遮断能を、ヒトTie2受容体を形質移入したHEK293F細胞を用いて試験した。Tie2cDNAを有するプラスミドベクターpORK/pBS-SKをATCCから入手したカタログ番号69003、ジェンバンクGenbank配列BC033514。ヌクレオチド配列決定によってcDNAの正確さaccuracyを確認した。ヒトTie2をコードする3375bpのcDNAを含む3.9kbの断片をEcoRI消化によってベクターから取り出した。この断片を、標準の手順に従ってEcoRIで消化したpCR3.1ベクターに適切な方向でサブクローニングした。選択したプラスミドを標準プロトコルによって増幅して精製した。上記手順によって得たコンストラクトを含むTie2を、リン酸カルシウム形質移入方法によってHEK293F細胞に形質移入した。1×106個のHEK293F細胞を、37°C、5CO2下、1ゼラチンをコーティングした100mmの組織培養皿内で成長させた。形質移入までの2~3時間、細胞に新鮮培地を供給した。10μgのプラスミドDNAを248mMリン酸カルシウム溶液に溶解した。標準の手順を用いて形質移入を行った。0.5mg/mlのG418におけるインキュベーションにより、安定なトランスフェクタントを選択した。検出用にマウス抗-Tie2mAbRDカタログ番号MAB313およびヤギ抗-マウスIgG-PE結合抗体カルタグCaltag、カタログ番号M30004-4を使用したFACS分析により、Tie2を発現する安定なトランスフェクタントを同定した。Tie2リン酸化アッセイを行うため、HEK293F/Tie-2トランスフェクタントを、37°C、5CO2下の完全培地を有する、密度が2×106個の細胞/プレートの60mmの細胞培養皿内でサブコンフルエント状態に至るまで成長させた。各プレート内の完全培地を2mlの無血清培地に交換した。細胞をさらに16時間インキュベートした。次いで、培地を再び2mlの無血清培地に交換した。さらに2時間インキュベートした後、細胞を0.1mMオルトバナジン酸ナトリウムシグマSigma、カタログ番号S6508で20分間処理した。細胞を、100μg/mlのmAbの存在下または非存在下でAng-22μg/mlで処理した。処理を2通りに行った。Ang-2処理を施さない陰性対照を含めた。プレートを10分間氷上に置く間、細胞をバナジウム酸塩を含有する氷冷TBSですすぎ、300μl/プレートの冷却NP-40溶解緩衝液50mMヘペス、pH7.2、0.15MNaCl、10グリセロール、10mMピロリン酸塩、50mMNaF、1NP40、100U/mlアプロチニン、1mMPMSF、0.1mMオルトバナジウム酸塩、10μMロイペプチンおよび10μMペプスタチンAを補充で溶解させた。処理した細胞をプレートから氷上で予備冷却したマイクロチューブにこすり落とした。細胞ライセートを短時間、超音波処理し、卓上用微量遠心管内で12,000×g、4°Cで10分間遠心した。上清を新しいマイクロチューブ内に収集し、1~5μgの抗-Tie2mAbRDシステムズRDSystems,Inc.を上清に添加した後、4°Cで2時間ゆっくりと振とうした。50μlのImmunoPureImmobilizedProteinAピアースPIERCEカタログ番号20333を混合物に添加し、ロッキングプラットフォーム上で4°Cで少なくとも3時間インキュベートした。12,000×gで10分間の遠心分離によって複合体を収集した。上清を注意深く除去した後、複合体を4分間の遠心分離12,000×g、4°Cにより溶解緩衝液で2回洗浄した。ペレットを、β-メルカプトエタノールまたはDTTの1mMを含有する2×電気泳動試料用緩衝液インビトロジェンInvitrogen、カタログ番号LC-267650μlに再懸濁し、5分間の遠心分離12,000×g、4°C前に5分間沸騰させた。上清を新しいチューブに移した。試料をSDS-PAGEゲル例えば、4~20トリス-グリシンゲル、インビトロジェンInvitrogen、カタログ番号EC6025のウェルに負荷した。トリス-グリシン緩衝液系において電気泳動を行った。電気泳動後、標準プロトコルに従い、ゲルをPVDF膜インビトロジェンInvitrogen、カタログ番号LC2005上にブロットした。振とう下、室温で1時間のインキュベーションにより、チロシンリン酸化を、1μg/mlの4G10抗-ホスホチロシン抗体アップステートUpstate、カタログ番号05-321とプローブした後、1×TBST0.1Tween-20を含有するTBSで3回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼと結合したヤギ抗-マウスIgGサンタクルーズSantaCruz、カタログ番号sc-2302とともに希釈率1:10,000、室温で1時間インキュベートすることによって結合抗体を検出した後、SuperSignalWestDuraExtendedDurationSubstrate系ピアースPIERCEカタログ番号34075を用いて化学発光反応を高めた。次いで、ブロットをRestoreWesternBlotStrippingBufferピアースPIERCE、カタログ番号21059を用いて剥離し、RTKに対して特異的な抗体と再プローブして試料負荷の質について検証した。ヒトTie2がHEK293F細胞内で異所的に発現される場合、Tie2の自己リン酸化を検出できないことを発見した。Ang-22μg/ml処理に応答し、特異的mAbによって免疫沈降したTie2由来のリン酸化チロシン4G10に対するmAbにより、チロシンリン酸化の有意なレベルを検出した。試験したすべての抗-Ang-2mAbが100μg/mlの濃度でTie2リン酸化に対する明らかな阻害を示す一方、イソタイプ対照mAbは阻害作用を有しなかった図1。図1に示していないモノクローナル抗体5.103.1は類似の阻害作用を有した。Ang-2mAbにおけるinvitroでのAng-2誘発性のTie2リン酸化に対する阻害能をランク付けするため、Tie2リン酸化を検出するためのELISAに基づく定量可能な方法を確立した。つまり、細胞ライセートを、様々な濃度のmAbとともにAng-2で処理したHEK293F/Tie2トランスフェクタントから作製した。ライセート由来のTie2全体を、マウス抗-hTie-2mAbでコーティングした96ウェルのELISAプレート内で捕捉した。一次抗体4G10-HRPアップステートUpstateから購入およびHRP基質溶液を用い、リン酸化されたTie2を検出した。650nmでのODをSpectraMaxリーダーによって測定した。GraphpadPrism商標グラフィックソフトウェアを用いたカーブフィッティングにより、濃度-応答の関連性を見出した非線形、S字形曲線。図2に示すように、最大阻害有効性およびIC50効力を計算した。以下の表9に示されるように、EC50を計算した。上で報告したように、mAb3.19.3がAng-1と交差反応することが判明した。しかし、初期実験の結果では、mAb3.19.3によりアンジオポエチン-1誘発性のTie2リン酸化が阻害されることは判明しなかった。Ang-2がHUVEC内でTie2リン酸化を誘発しない一方、受容体がHEK293細胞内で異所的に発現される場合には確実なTie2リン酸化を誘発するという事実から明らかなように、Tie2の異所的な発現が、異なるリガンドによる活性化に対するその感受性に作用しうることは注目に値する。これらの結果を考慮し、mAb3.19.3がAng-1とAng-2の双方の細胞結合性のTie2に対する結合を阻害可能か否かについてより十分に検討するため、さらに実験を行った。さらに、以下の実施例12に記載のように、mAb3.19.3によるアンジオポエチン-1誘発性のTie2リン酸化の阻害についてより詳細に検討した。実施例12MAB3.19.3はアンジオポエチン-1のTIE-2に対する結合およびANG-1誘発性のTIE2リン酸化を阻害するmAb3.19.3はヒトAng-1と交差反応する実施例8および9。しかし初期実験では、mAb3.19.3がAng-1によって誘発されるTie2リン酸化を阻害しないことが示された。1確固たるTie2リン酸化シグナルを生成するのに、生理的濃度を大幅に上回る高濃度のAng-1が必要とされうる;または2HEK293内でのTie2の異所的な発現によるTie2の高次構造上の変化によって異なるリガンドに対するその感受性が変化しうるといった点により、矛盾を説明することが可能である。これらの仮定を試験するため、mAb3.19.3を、低濃度のAng-1またはAng-23nMが細胞表面のTie2に結合する場合の結合アッセイにおいて試験した。この実験では、mAb3.19.3がAng-1とAng-2の結合をいずれも阻害することが判明した。第2に、不死化内皮細胞EA.hy926/B3を用い、Ang-1誘発性のTie2リン酸化について検討した。下記により詳細に記載されるように、この実験結果は、mAb3.19.3がAng-1誘発性のTie2リン酸化を用量依存的に阻害することを示している。HEK293F/Tie2トランスフェクタントを、収集前に培養フラスコ内で95コンフルエント状態になるまで成長させておいた。FACS緩衝液中で400万個の細胞/mLの細胞懸濁液を調製し、次いで96-ウェルのポリプロピレンプレートに1ウェル当たり50μlで分注した。指示濃度を有するmAb3.19.3を細胞懸濁液に添加した。次いで、組換えヒトAng-1およびAng-2の溶液を細胞懸濁液に添加した後、室温で2時間インキュベートした。プレートを1,200rpmで5分間遠心することによって細胞を洗浄し、吸引によって上清を除去し、細胞を1ウェル当たり200μlのFACS緩衝液に再懸濁した。洗浄手順を2回繰り返した。次いで細胞を、FACS緩衝液で2μg/mlに希釈したマウス抗-6X-ヒスチジン抗体100μlに懸濁し、室温で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、100μlのPEと結合したヤギ抗-マウス-IgGに懸濁し、それをFACS緩衝液で1:100に希釈し、室温で30分間インキュベートした。試料の容量をFACS緩衝液で300μlにし、FACSCaliburを用いて測定した。結果を図3に図示し、表10にまとめる。示すとおり、可溶性のTie2/Fcがリガンドを遮断することによってAng-1とAng-2の双方の結合を用量依存的に阻害した一方で、イソタイプ対照mAbのPK16.3.1はいずれのリガンドの結合においても全く効果を有しなかった。mAb3.19.3は、Ang-1とAng-2の双方に対する濃度依存性の阻害を示した。興味深いことに、参照としてのTie2/Fcの効力に伴い、mAb3.19.3におけるAng-2への結合能はAng-1へのそれよりも高かった。これらの結果は、mAb3.19.3がヒトAng-1に結合するだけでなく、受容体Tie2に対するその結合を遮断することを示した。さらに下記に示すように、これは不死化内皮細胞内でのAng-1誘発性のTie2リン酸化の阻害により確認された。mAb3.19.3におけるAng-1誘発性のTie2リン酸化に対する阻害活性について以下のように定量した。図4および5に示すように、mAbは、抗体濃度の上昇に伴い、Tie2リン酸化の阻害を明らかに増大させることを示した。用量応答曲線のプロットにより、99nMでのIC50の計算値が得られる。アンジオポエチン-1リガンド刺激性のTie-2受容体リン酸化アッセイ容量2mlのDMEM;HAT;10FCS中の2.5×105個のEA.hy926細胞/ウェルを用い、EA.hy926/B3細胞を6つのウェルプレートに播種し、標準の哺乳類細胞の成長条件下で3日間インキュベートした。成長培地をFCSを含有しないDMEM2mlに交換し、細胞を全部で2時間にわたり血清飢餓にした。試験化合物をDMEM;1FCSで所望の最終濃度の2倍まで希釈した。血清飢餓にして1時間40分後、培地を細胞から除去し、1mlの試験化合物希釈物に交換した。同様に、処理していない対照化合物も処理することで、100のリガンド刺激の標準を示す試料が得られた。インキュベーションをさらに10分間継続した後、DMEM溶液中の10mMオルトバナジウム酸塩100μlを各ウェルに添加し、各ウェルにて最終濃度1mMのオルトバナジウム酸塩を得た。次いで、2時間にわたる血清飢餓期間の最後の10分間、細胞をインキュベートした。一旦2時間の血清飢餓期間が終了すると、1mlのアンジオポエチン-1DMEMで適切な濃度に希釈、1mMのオルトバナジウム酸塩を含有を各ウェルに添加し、37°Cでさらに10分間インキュベートした。次いで、6つのウェルプレートを、氷冷金属プレート上に置いて冷却したそれを氷上で保持した。細胞培地を除去し、細胞層を5mlの冷PBS;1mMのオルトバナジウム酸塩で洗浄した。1mlの氷冷溶解緩衝液20mMトリスpH7.6、150mMNaCl、50mMNaF、0.1SDS、1NP40、0.5DOC、1mMオルトバナジウム酸塩、1mMEDTA、1mMPMSF、30μl/mlアプロチニン、10μg/mlペプスタチン、10μg/mlロイペプチンを各ウェルに添加し、氷上に10~20分間放置した。細胞をセルリフターcelllifterを使用してプレートからこすり落とし、ライセート溶液全体を1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、氷上で保持した。次いで、試料を13000rpm、4°Cで3分間回転させ、後続の全ステップを4°Cで実施した。グライナーGreinerから入手した低タンパク質を結合するポリプロピレン製マイクロタイタープレート内でのBCAタンパク質アッセイピアースPierce、カタログ番号23225のために各ライセート50μlを保持した。キットに付属の標準アッセイ条件を用いてタンパク質濃度を測定した。さらに各試料ライセート800μlを、免疫沈降IPに備えた新たな2mlのエッペンドルフチューブに移した。15μl3mgの抗P-YサンタクルーズSantaCruzカタログ番号E2203をライセートに添加し、600μlのMagnabindビーズヤギ抗マウスIgG、ピアースPIERCEカタログ番号21354を添加する前に4°Cで2時間インキュベートしておいた。Magnabindビーズを以下のように調製した。必要容量を15mlの円錐チューブに移した。次いで、磁場の存在下にチューブを置き、液体を除去した。新しいPBSを元の容量を用いて添加し、ビーズを再懸濁した。このプロセスを2回繰り返した。次いで、ライセート含有溶液をビーズと混合し、チューブを回転ミキサー上、4°Cで一晩回転したままにした。試料を磁気に約1分間暴露し、液体を注意深く除去した。溶解緩衝液1mlを添加し、チューブを5分間回転させて洗浄した。洗浄ステップを2回繰り返した。液体を完全に除去し、ビーズを12μlの熱い94°C2×ラムリLaemmliローディング緩衝液bMEに再懸濁し、次いで室温で15分間静置しておいた。チューブを磁気に1分間暴露し、ビーズから単離した液体をPAGE/SDSゲル上で分析した。試料を、15ウェルで4~12ビストリスNuPAGE/MOPSゲルを用いたPAGE/SDSゲルノベックスNovexを用いて分析した。スロットごとに各免疫沈降物全部で12μlを負荷した。ゲルを200V/120mA/25ワットで55分間走らせ、次いで試料を、50V/250mAで1時間30分、ニトロセルロース膜上でウエスタンブロットした。次いで、全ブロットを、PBS-Tween中の5Marvelで、室温で1時間処理し、次いでPBS-Tweenで洗浄した。ウサギ抗Tie-2抗体サンタクルーズSantaCruzカタログ番号C1303を0.5Marvel/PBS-Tweenで1:500に希釈し、12.5mlを各ブロットに添加し、4°Cで一晩放置した。次いで、ブロットをPBS-Tweenで洗浄し、ヤギ抗ウサギ-PODダコDakoカタログ番号P04480.5Marvel/PBS-Tween中、1:5000に希釈を各ブロットに添加し、室温で1時間放置した。ブロットをPBS-Tweenで洗浄し、各ブロットを、12.5mL同容量の溶液AおよびBのSupersignalピアースPIERCEカタログ番号34080で10分間展開した。ブロットをX線カセットに移し、フィルムに露光した5秒/15秒/30秒/60秒/150秒露光。図4は、このアッセイの結果を示すウエスタンブロットである。この系では、mAb3.19.3によるアンジオポエチン-1刺激性のTie2リン酸化の阻害について観察した。次いで、各試料におけるフィルム上に見られる像をFluorSBioRadイメージアナライザーシステムを用いて評価した。ピクセル密度をOD/mm2として測定し、容量率で表した。容量率の結果を、BCAアッセイを用いて測定したタンパク質濃度および免疫沈降において用いられる各試料のライセート容量を用いた1mgのタンパク質/免疫沈降物に正規化した。各試料のリン酸化率を、各ゲル上の未処理の対照試料を100のリン酸化値として計算し、各試料の阻害率を100のリン酸化値それは0の阻害率を示すに対して計算した。図5はこれらの値のグラフ表示であり、アンジオポエチン-1刺激性のTie2リン酸化の阻害におけるIC50が99nMであることを示す。これらのデータを総合すれば、この系ではmAbがアンジオポエチン-1誘発性のTie2リン酸化を阻害することが示される。実施例13ANG-2抗体の構造分析抗体の可変重鎖および可変軽鎖を配列決定し、それらのDNA配列を決定した。抗-Ang-2抗体についての完全な配列情報を、ガンマ鎖とκ鎖の各々の組み合わせについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する配列リスト内に提供する。可変重鎖配列を分析し、VHファミリー、D-領域配列およびJ-領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、かつ生殖系VH、DおよびJ-領域配列と比較して体性超変異について評価した。表11は、抗体重鎖領域をそれらの同族の生殖系重鎖領域と比較した表である。表12は、抗体κ軽鎖領域をそれらの同族の生殖系軽鎖領域と比較した表である。免疫グロブリン鎖の可変V領域は、B細胞の個体発生の間に機能的な可変領域VHDJHまたはVKJKに連結される複数の生殖系DNAセグメントによってコードされる。Ang-2に対する抗体応答の分子的および遺伝的多様性について詳細に試験した。これらのアッセイは、抗-Ang-2抗体に特異的ないくつかのポイントを明らかにした。Ang-2に特異的な152種の別々の抗体の分析により、抗体が21種の異なる生殖系VH遺伝子由来であるという判定結果を得た。それらのうちの112種はVH3ファミリー由来であり、46種の抗体はVH3-33遺伝子セグメント由来である。表11および12はこの分析結果を示す。各ハイブリドーマから収集した姉妹クローン内のアミノ酸配列が同一であることが理解されるべきである。例えば、mAb3.19.3における重鎖および軽鎖配列は、mAb3.19および3.19.1における表11および12に示される配列と同一である。実施例14抗体の規範的クラスの判定チョチアChothiaらは、各免疫グロブリン鎖の超可変領域に対する規範的クラスcanonicalclassの観点における抗体構造について記載しているJMoIBiol1987Aug2019690117。種々の免疫グロブリンのFabおよびVL断片の原子構造を分析し、それらのアミノ酸配列とそれらの抗原結合部位の三次元構造の関連性について判定した。チョチアChothiaらは、主として超可変領域の主鎖高次構造を担う残基が、それらのパッキング、水素結合あるいは特異なファイ、プサイまたはオメガ高次構造をとる能力を通じて相対的に少ないことを見出した。これらの残基が超可変領域内および保存されたβ-シートフレームワーク内の部位に存在することが判明した。チョチアChothiaらは、未知の構造を有する免疫グロブリンの配列を調べることにより、多数の免疫グロブリンが、既知の構造の1つに大きさが類似する超可変領域および観察された高次構造を担う部位に追加的に含まれる同一の残基を有することを示している。彼らの発見は、これらの超可変領域が既知の構造における高次構造に近い構造を有することを意味した。超可変領域のうちの5種については、高次構造のレパートリーが比較的少数の別々の構造クラスに限定されるように見られた。これらの共通に生じる超可変領域の主鎖高次構造は規範的構造canonicalstructuresと称された。チョチアChothiaらによるさらなる研究Nature1989Dec212834287783およびその他MartinetalJMoIBiol1996Nov1526380015は、抗体の超可変領域の6種のうちの少なくとも5種における主鎖高次構造のレパートリーが少ないことを確認した。上記の各抗体のCDRにおける規範的クラスを判定するためにそれらを分析した。知られているように、規範的クラスが、抗体軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3とともに抗体重鎖のCDR1およびCDR2に限り割り当てられている。下記の表表13は分析結果をまとめている。規範的クラスデータは、HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3の形態であり、ここでHCDRは重鎖CDRを示しかつLCDRは軽鎖CDRを示す。したがって、例えば、1-3-2-1-5の規範的クラスは、規範的クラス1に分類されるHCDR1、規範的クラス3に分類されるHCDR2、規範的クラス2に分類されるLCDR1、規範的クラス1に分類されるLCDR2、および規範的クラス5に分類されるLCDR3を有する抗体を示す。抗体内のアミノ酸と各々の規範的クラスとして定義されたアミノ酸における同一性が70もしくはそれより大きい場合の特定の規範的クラスに対して割り当てを行った。同一性が70未満である場合、規範的クラスの割り当てをアスタリスクとしてマークし、各CDRの長さおよびデータの全体性に基づいて適切な規範的クラスの最良の推定がなされたことが示される。同じCDRの長さを有するマッチングする規範的クラスが全くない場合、規範的クラスの割り当てをYとしてマークする。各抗体に対して定義されたアミノ酸について、例えば上記のチョチアChothiaらによる記事の中に見出すことができる。表13では、各Ang-2抗体における規範的クラスデータが報告される。表14は、1クラス当たりの抗体の数に関する分析である。左カラム内に指定した特定の規範的クラスを有する抗体の数を右カラムに示す。実施例15ANG-2抗体のエピトープマッピングAng-2の活性を中和する27種の抗体の結合ドメインを分析した。組換えヒトAng-2をRDシステムズRDSystems623-ANから購入した。直接ELISAおよびウエスタンブロットにおいて、ヤギ抗-ヒトAng-2ポリクローナル抗体RDシステムズRDSystemsAF623におけるrhAng-2に対する認識能に応じて選択した。ポリクローナル抗体を、HRPと結合したストレプトアビジンで検出するためにビオチン化した。すべての制限酵素を、NewEnglandBiolabsから供給を受け、製造業者の使用説明書に従って使用した。スピンミニカラムspinminicolumnsインビトロジェンInvitrogen、カールズバッドCarlsbad、カリフォルニア州を使用してすべてのプラスミドDNAを精製した。クローニングおよび部位特異的変異誘発を目的として使用されるオリゴヌクレオチドプライマーをキアゲンQiagenオペロンOperonによって合成した。抗体:27種のハイブリドーマ由来のヒト抗Ang-2抗体を、rhAng-2のその受容体への結合に対するそれらの阻害能に基づいて選択した。抗体を以下の表15に挙げる。27種の中和抗-Ang-2抗体のドットブロットでのエピトープの特徴づけバイオドットBio-Dot精密濾過ユニットを使用し、RhAng-2RDシステムズRDSystemsをその天然または還元形態でニトロセルロース膜上にスポットした。ヒトAng-2に対して産生されたすべてのヒトモノクローナル抗体MAbは還元形態ではない非還元型Ang-2に結合しており、これはすべてのmAbがタンパク質の還元時には明らかに破壊される高次構造のエピトープを認識することを示した。Ang-1およびAng-2タンパク質のクローニングおよび発現mAbとAng-2との相互作用における構造的基礎をより十分に理解するため、1組のキメラAng-1/Ang-2分子を用いた。このアプローチでは、血管形成のファミリーメンバーが構造的に関連するという事実が利用される。Ang-2およびAng-1がそれらのタンパク質配列において60の相同性しか示さないが、両者はアミノ末端のコイルドコイルドメインとカルボキシル末端のフィブリノーゲン様ドメインとからなる同じ分子構造を共有する。ヒトAng-1およびAng-2のクローニング2つの選択的スプライシングを受けた形態のヒトAng-2cDNAをヒト臍静脈内皮細胞系HUVECから増幅した。Ang-2に特異的なプライマーを用いたHUVECcDNAのPCR増幅により、完全長Ang-21491bpと1330塩基対の変異体Ang-2443の双方が現れたJBC27518550。Ang-2443は、エクソンBおよびコイルドコイルドメインの欠失部分アミノ酸96~148の選択的スプライシングによって生成された変異体である。図6に示すように、両Ang-2cDNAをpCR3.1発現ベクターにクローニングし、293F細胞内で発現させた。ヒト乳腺細胞系MDA-MB-231から抽出した全RNAを用いたRT-PCRにより、ヒトAng-1cDNAを得た。1.5KbのcDNAをpCR3.1発現ベクターにクローニングし、一時的に形質移入された293F細胞の上清中で発現を検出した。ELISA抗体捕捉ELISAを用い、Ang-2およびAng-1cDNAの一時的形質移入から生成した上清への27種のmAbの結合について試験した。Ang-2、Ang-2443およびAng-1を、ヒトAng-2またはAng-1各々に対するヤギポリクローナル抗体でコーティングしたELISAプレートと結合させた。上位27種のヒトモノクローナル抗体の結合を、HRPと結合したヤギ抗-ヒト抗体とそれに続く比色用の西洋わさびペルオキシダーゼ基質増加させたK-BlueTMB基質、ネオゲンNeogenCorporationを用いて検出した。ELISAプレートの各ウェルの吸光度をマイクロプレートオートリ-ダー上にて450nmで測定した。293F細胞の形質移入293Fヒト胚腎細胞を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ修飾イーグル培地内の10ウシ胎仔血清中に維持した。リン酸カルシウムを用い、293F細胞を一時的に形質移入した。ELISAおよびウエスタンブロット分析のため、72時間時点で培地を収集し、濾過した。すべての27種の抗体はAng-2/Ang-2443抗原に特異的に結合することが判明した。ヒトAng-1との交差反応性は全く検出されなかった。Ang-2443タンパク質配列において欠失している、Ang-2のコイルドコイルドメインにおけるアミノ酸96~148を、27種の各抗体に対する結合ドメインとして除外した。Ang-1/Ang-2キメラ分子の構築インフレーム融合物のアンジオポエチンキメラタンパク質を構築するため、ヒトAng-1およびAng-2遺伝子に共通の制限切断部位を用いた。ヒトAng-1/2BsmI、Ang-2/1BsmI、Ang-1/2SspIおよびAng-2/1SspIの4種のコンストラクトを作製した。すべてのタンパク質を、ヒトAng-1およびAng-2に対するポリクローナル抗体を用いるELISAアッセイによって測定される検出可能なレベルで発現および分泌させた。アミノ酸連結点は以下の位置にある。BsmI-117Ang-2/119Ang-1SspI-353Ang-2/354Ang-11個のアミノ酸の違いは、ヒトAng-2では496個の残基が存在のに対してヒトAng-1では497個の残基が存在することに起因する。すべてのコンストラクトを、293F細胞内で発現させ、Ang-1およびAng-2に対するヤギ抗-ヒトポリクローナル抗体を用いて検出した。上位27種の抗体におけるキメラAng-1/2分子に対する結合能について試験した。すべての27種の抗体は、Ang-1/2BsmIコンストラクトのみに結合するという類似パターンを示した。これらの実験結果は、すべての抗体に対する結合ドメインが残基117~496の範囲に存在し、エピトープがアミノ酸353近傍にあるSspI融合Angタンパク質内で破壊される場合にはフィブリノーゲン結合ドメイン内に存在する可能性が最も高いことを示す。マウス/ヒトAng-2キメラ分子の構築Ang-2とAng-1が共有するアミノ酸同一性が約55であることから、キメラ分子のクローニング用に用いられる共通の制限部位を見出すことは困難であった。マウスおよびヒトにおけるAng-2はより類似性があり、約85の配列相同性を有する。pCMCsport発現ベクター内でクローニングされるマウスAng-2cDNAをインビトロジェンInvitrogenから購入した。27種の選択した抗体における組換えマウスAng-2との免疫反応性について試験した。27種のうちの6種がマウスAng-2と交差反応し、ここではヒトAng-2に対するそれらの免疫反応性は100であった。これはマウス抗原がヒトAng-2の免疫反応性の大部分を保持することを示しているデータを表16にまとめる。大部分の抗体がヒトAng-2抗原に特異的に結合しかつマウスAng-2と交差反応しないという知見に基づき、エピトープマッピングにおいてヒト-マウスキメラ系を選択した。Ang-2の様々なcDNAコンストラクトを作製し、哺乳類発現ベクターにクローニングした。マウス/ヒトAng-2のコンストラクトを、共通のStuI制限部位を用いて作製し、残基311でアミノ酸連結点を有するフィブリノーゲン結合ドメイン内に位置づけた。ヒトAng-2に特異的なすべてのmAbはマウス/ヒトAng-2StuIに結合することができ、これは結合ドメインが残基311~496の範囲のフィブリノーゲン結合ドメイン内に存在することを示す。結合ドメインの範囲を制限するため、マウスAng-2cDNA内のマウス配列をヒト断片StuI-TfiIに交換した新規コンストラクトを調製した図9。ヒトAng-2に特異的なすべての抗体はELISAでは陽性シグナルを示し、ヒトAng-2に対するそれらの免疫反応性が15~100であった。表17に示すように、固有のVH遺伝子として5.35.1VH3-20および5.28.1VH3-43を使用した2種の抗体の結合ドメインをアミノ酸310~400の領域にマッピングした。マウスAng-2と交差反応する抗体は100の反応性を示すと予想され、それらをマウス/ヒトキメラコンストラクトを用いてマッピングすることができなかった。部位特異的変異誘発異なる抗体の結合部位に関与する重要な残基を定めるため、ヒトAng-2の数個の残基を変異させ、ELISAアッセイにより抗体群全体の結合についてスクリーニングした。ELISAによって検出された直接結合が親和性における中小程度の違いに対して感受性を示さないことから、単一のアミノ酸の置換後に観察される結合上の変化が大きいと、抗体と相互作用する主要な部位が同定される可能性が高い。さらに、ヒトAng-2に対するポリクローナル抗体は各コンストラクトとの100の反応性を維持し、これは変異誘発の手続きによってAng-2分子を通じて広範な構造変化が全く誘導されなかったことを示す。位置345V345MでのValからMet、位置375H375QでのHisからGlnへの2つの独立した変化は、27種の抗体全部によって無視されたが、これはこれらの残基が反応性を示さないかまたはエピトープの高次構造上の変化にとって2つ以上のアミノ酸の置換を必要とすることを示す。位置365および367での2つの残基の変化により、単一の抗体Mab5.35.1の結合が劇的に変化した。5.35.1の配列分析では、VH3-20の固有の使用および重鎖および軽鎖の両鎖上の固有のCDR3が示された。図8では、Ang-2キメラ分子のすべての融合点および点突然変異が強調されている。図9は、マウスAng-1配列番号5、ヒトAng-1配列番号2、マウスAng-2配列番号4、およびヒトAng-2配列番号3のアミノ酸配列を比較したものである。矢印は疎水性のリーダー配列における切断部位を示す。矢印は、コイルドコイルおよびフィブリノーゲン様ドメインの境界を規定する。黒丸は保存システイン残基を示す画像はメゾンピエールMaisonpierreetal1997Science27755から取得。すべてのAng-2分子に対する結合データを以下の表16にまとめる。配列分析ソフトウェアツールを用い、かつ生殖系データベースに対するVH遺伝子のアラインメントにより、IgHおよびIgL配列の配列分析を行った。ソフトウェアでは、D因子、リーディングフレーム、N領域挿入、Pヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠損およびCDR3の長さも評価される。CR64に特異的な27種の別々の抗体の分析では、7種の生殖系VH遺伝子のみが得られ、それらの10種は同じVH1ファミリー由来であった。中和抗体の選択では、同じIgVHを発現する抗体および場合によって同じVHDJHの再配列ならびにH鎖およびL鎖の対合体が保存されることが示された。この知見は、任意の所定のエピトープにおいて生殖系レパートリーの数種のメンバーのみを用いることで対応するパラトープが形成され、かつ各抗原エピトープにおいて限定された数のL-およびH-鎖遺伝子が対をなすことで特異的なパラトープが形成されうることを示唆している。異なるモノクローナル抗体による類似のVH、VKおよび相補性決定領域CDR構造の反復使用は、すべてのAng-2に対する中和活性がフィブリノーゲン様ドメインに限定されかつプロコピオProcopioらによって公表された研究と一致しているという事実と関連があり、これはAng-2のTie2に対する作用がフィブリノーゲン様ドメインと関連があることを示している。エピトープマッピングデータは、モノクローナル抗体がフィブリノーゲン様ドメインの大部分を含む広範な界面を介してAng-2に結合することを示す。実施例16マウスANG-2との交差反応性の判定ELISAにより、抗-ヒトAng-2mAbのマウスAng-2に対する交差反応性について試験した。このため、マウスAng-2発現ベクターを構築し、真核細胞に一時的に形質移入してマウスAng-2を生成した。マウスアンジオポエチン-2mAng-2発現コンストラクトを、I.M.A.G.EコンソーシアムI.M.A.G.Econsortiumワールドワイドウェブimage.llnl.govを参照の販売業者であるリサーチジェネティクスResearchGeneticsから入手した。マウスAng-2cDNAジェンバンクGenBank登録番号BC027216、IMAGE:3494566は、肺腫瘍ライブラリであるライブラリNCICGAPLu29から得た。cDNAをSalI5’およびNotI3’部位を介してpCMV-SPORT6発現ベクターインビトロジェンInvitrogen、カールスバッドCarlsbad、カリフォルニア州にクローニングし、それは496個のアミノ酸の完全長マウスAng-2mAng-2オープンリーディングフレーム、ならびに全体で2471塩基対に及ぶ5’および3’非翻訳フランキング領域を含んだ。リン酸カルシウム法を用い、10μgの上記mAng-2プラスミドをHEK293F細胞に形質移入した。前日に、約1×106個のHEK293F細胞を10cmの組織培養プレート上に播種した。形質移入の5時間後または一晩経ってから培地を変え、細胞をもう2~3日成長させた後、分泌されたmAng-2タンパク質を含有する上清を収集した。RDシステムズRDSystemsから得たポリクローナル抗体カタログ番号AF623を用いたELISAにより、mAng-2の発現を確認した。96-ウェルのヌンクNunc製Immplateに各ウェル内のHEK293F/マウスAng-2トランスフェクタント100μlから収集した条件培地でコーティングした。プレートを4°Cで一晩インキュベートした後、SkanWasher300ステーションスカトロンSKATRONでリン酸塩緩衝生理食塩水を用いて4回洗浄した。ウェルを、ABX-ブロック緩衝液0.5BSA、0.1Tween、0.01チメロサール、PBS中100μlによって1時間ブロッキングした。適切な濃度を有しかつブロッキング緩衝液で希釈した抗-Ang-2mAbを100μl/ウェルの容量を有するウェルに添加し、室温で少なくとも1時間インキュベートした。mAbおよびそれらの各希釈物を2通りに試験した。2回洗浄後、結合mAbを、ヤギ抗-ヒトFc-HPPOと結合した抗体カルタグCaltag、コードH10507を室温で1時間にわたり1/1,000に希釈したものによって検出した。発色反応の検出を設定するため、PBSを用いてウェルを3回洗浄後、TMB基質TMB-マイクロウェル、BioFX、カタログ番号TMSK-1000-01100μlを添加した。650の停止溶液100μl/ウェル、BioFX、カタログ番号BSTP-0100-01を添加して反応を終了させる前に、プレートを30分間インキュベートした。SpectramaxPlusリーダーにより、650nmでの光吸光度を測定した。このアッセイでは、上位27種の中和mAbを試験した。光吸光度によると、モノクローナル抗体3.19.3、3.38、5.2.1、5.52.1、5.56.1および5.78.1が実験条件下でマウスAng-2に結合可能であることが示された。確認のため、ELISAによって各結合抗体を滴定した。mAbのLog濃度μg/mlに対してプロットした平均ODの650nm±S.D.値を図10に示す。クローン5.2.1、5.28.1、3.19.3および3.31.2を同図に示す。モノクローナル抗体5.2.1および3.19.3はマウスAng-2に用量依存的に結合し、約10μg/mlで飽和に達した図10。これら2種のmAbの結合曲線は、S字状の典型的な用量-応答の関連性曲線であった。クローン5.2.1および3.19.3を除くと、試験抗体の濃度範囲内では用量依存性および飽和が観察されなかった。この結果に基づき、mAb5.2.1および3.19.3のみがマウスAng-2に対する交差反応性を有すると見られた。実施例17マウスANG-2のヒトTIE2に対する結合の阻害モノクローナル抗体3.19.3を、マウスAng-2のヒトTie2への結合に対するその阻害能をさらに試験するために選択した。このため、ELISAプレートを4μg/mlのhTie2/FcRDシステムズRDSystems,Inc.100μl/ウェルでコーティングし、ウェルを通常どおり4°Cで一晩ブロッキングした。上記の293T/mAng-2トランスフェクタントの培養上清中で組換えマウスAng-2mAng-2を用いた。様々な濃度でmAb3.19.3を有するmAng-2を含有する上清100μlを予備コーティングしたウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。対照として、抗体と混合した組換えヒトAng-2RDシステムズRDSystems,Inc.も含めた。mAbの各濃度を3通りに試験した。結合したマウスおよびヒトAng-2を、マウスAng-2と交差反応するヤギ抗-ヒトAng-2ポリクローナル抗体サンタクルーズバイオテクノロジーSantaCruzBiotechnology、サンタクルーズSantaCruz、カリフォルニア州を用いて検出し、二次ウサギ抗-ヤギIgG-HRPと共役させた。HRP基質の添加から30分後にOD650を測定した。mAb3.19.3がヒトおよびマウスAng-2のヒトTie2への結合を用量依存的に阻害することが発見された図11。実施例18サル脈管構造との交差反応性の判定Ang-2が血管形成性の内皮細胞内で特異的に発現されることから、サル由来のこれらの細胞を、各抗体がサルAng-2と交差反応するか否かを間接的に判定するための一方法として、抗-Ang-2抗体で免疫組織化学染色を行った。サル由来の内皮細胞に富む卵巣組織を用いたこの実験において、実施例4表4に記載のように選択した上位10種の中和mAbについて試験した。完全に乾燥させた6μmの冷凍サルCynomolgusmacaque卵巣組織切片を4°Cのアセトンで5分間固定した。スライドをPBSで3回洗浄後、組織の内因性ペルオキシターゼを0.3H2O2で10分間ブロッキングした。次いで、組織をPBSで洗浄し、10μg/mlのヤギ抗-ヒトIgGFabで15分間ブロッキングした。組織切片をPBSで再洗浄後、10正常ヤギ血清で10分間処理した。血清を除去後、10種の抗-Ang-2mAbの各々10μg/mlを切片に適用し、2時間インキュベートした。結合したAng-2mAbを、15分間で10μg/mlのマウス抗-ヒトIgGを用いて検出した後、ペルオキシターゼと結合したヤギ抗-マウスIgGとともに30分間インキュベートした。最適な結果を得るため、顕微鏡観察下でAEC-基質系ダコDAKO、カタログ番号3464を用いて染色した。全部で10種のmAbが卵巣組織内の血管形成における血管内皮細胞を染色する一方、イソタイプ対照mAbは染色しないことが判明した。これにより、表4からの10種のmAbがサルAng-2と交差反応することが示された。実施例19マトリゲルプラグアッセイにおいてMAB3.19.3はinvivoで血管形成を阻害するinvivoでの抗-Ang-2モノクローナル抗体の抗血管形成の可能性を評価するため、マトリゲルプラグの血管形成アッセイを実施した。MCF-7細胞は、invitroで培養されるか、または免疫不全マウスに異種移植片として移植される場合、Ang-2を産生することが判明した。MCF-7をマトリゲルに混合し、ヌードマウスに皮下移植する場合、成長する頑丈な血管がゲルになることが判明した。マトリゲルプラグモデルを樹立するため、体重範囲が18~20gの6~8週齢雌BALB/c/nu/nuマウスチャールズリバーラボラトリーズCharlesRiverLaboratories、ウィルミントンWilmington、マサチューセッツ州を使用した。Ang-2抗体を有する場合または有しない場合での2×106個のMCF-7細胞を有する全体で0.5mLのマトリゲル、あるいはマトリゲル単独、Tie2/Fc、IgG2およびIgG4イソタイプ対照、ならびに抗-VEGFmAbを含む対照作用物質をヌードマウスの右脇腹に皮下注射した。各試験群においてマウス5匹を使用した。すべての試験mAbを100μg/mlの濃度に調節した。7日後、マトリゲルプラグを収集し、血管密度についてスコアリングした。このため、深麻酔下でマウスの頚部を脱臼させた。皮膚弁の被覆を除去することにより、マトリゲルプラグが暴露された。次いでマトリゲルプラグを取り出し、次いでデジタル画像を記録した。マトリゲルプラグを注意深く切除し、2つの部分に切断した。一方の部分をTissueTekで急速凍結し、もう一方を緩衝化ホルマリンに固定した。次いで、両部分を切片化のためにパラフィン包埋した。各マウス由来の切片を5~7μm厚で3つに切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。次いで、切片を位相差顕微鏡下で検査した。代表的な顕微鏡写真を記録し2枚のフレーム100倍および400倍、内皮細胞および血管の浸潤を記録した。冷凍マトリゲルプラグをCryocutミクロトームで切片化した10μm切片。マウス1匹当たり2つの別々の切片を作製し、染色に使用した。切片をBSA0.1でブロッキングし、次いでマウスに反応性を示すモノクローナル抗体で治療した。CD31をフィコエリスリンPhycoerythrin製造業者によって推奨された希釈物に結合させた。完全な洗浄後、切片を抗退色試薬anti-fadingreagentVectaShieldの下に置き、赤色フィルタを用いてUV顕微鏡下で観察した。代表的なデジタル画像を取得した2枚の画像、100倍および200倍の倍率。核をDAPIで対比染色した。CD31染色の免疫蛍光画像をスケルチナイゼーションSkeletinizationプログラムによって分析した。データを処理することで、各群における平均血管密度、節および長さが得られた。結果は、血管端部の数図12Aおよび血管長図12Bに対する抗-Ang-2抗体の作用を示す、図12Aおよび12Bに見出されうる。この実験は、マトリゲルに混合したMCF-7細胞が、マトリゲル単独の場合と比べて有意なレベルで血管形成を誘発可能であることを示した。誘発された血管形成を、陽性対照の抗-VEGF抗体により阻害することができた。血管形成は可溶性の組換えTie2/Fcタンパク質によっても有意に阻害され、これはMCF-7細胞により産生されたAng-2がこのモデルにおいて血管形成における役割を果たすことを示唆している。Tie2/Fcは、任意のAng-2への結合により、MCF-7細胞に暴露されるAng-2のレベルを有効に低下させることになった。IgG2イソタイプの陰性対照抗体PK16.1.3が血管形成にいかにして影響を与えるかは明白ではないが、この抗体は一部の異種移植片モデルでは腫瘍成長に干渉する場合があることも判明したデータは示さず。IgG4イソタイプ対照抗体は、このモデルでは血管形成に対する作用を全く有しなかった。図12Aおよび12Bに示すように、クローン5.88.3、3.3.2、3.19.3および5.28.1は血管形成を有意に阻害する一方P<0.05、VasculoGenにより実施したt-検定、その他が有する作用は少なめであった。Ang-2が腫瘍内の内皮細胞によって発現されることから、自己分泌型血管形成因子と考えられていることは周知である。しかし、Ang-2は、invitroおよびinvivoで多種の腫瘍細胞によって発現されることも判明している。ここで試験されたmAbは、3.19.3を除いてマウスAng-2と交差反応しない。このinvivoモデルでは、mAbは、マウスAng-2ではなくMCF-7細胞によって産生されたヒトAng-2に限り中和した。これらのmAbの阻害作用は、腫瘍に発現されるAng-2が傍分泌型血管形成因子でありうることを示唆している。mAbにおける全体的な抗血管形成活性は、部分的には、血管内皮に発現されるAng-2の中和に加えて腫瘍Ang-2の中和が原因であった。実施例20A431プリベンショナルpreventional異種移植片モデルにおけるMAB3.19.3の治療有効性の判定抗-Ang-2mAbクローン3.19.3はマウスAng-2に結合しただけでなく、マウスAng-2のヒトTie2への結合を阻害した。このモノクローナル抗体の抗腫瘍活性を、A431細胞系の使用により、ヒト皮膚扁平上皮癌のマウス異種移植片モデルにおいて試験した。A431細胞を、通常どおりフラスコ内で細胞がサブコンフルエント状態に至るまで培養した。免疫不全6~8週齢雌マウスBalb/c/nu/nuをモデル構築のために用いた。A431細胞を収集し、マトリゲルに懸濁した。5×106個の細胞を含有する細胞懸濁液をマウスの脇腹に皮内注射した。マウスを、1群当たりマウス11匹を含む異なる群に無作為化した。同日、マウスに0.5mgのmAb3.19.3またはイソタイプ対照抗体を腹腔内注射し、その後は週に2回注射した。各腫瘍の寸法を週に2回測定した。腫瘍の容量を容量=長さ×幅2×0.5cm3として計算した。図13に図示するように、mAb3.19.3は、A431異種移植片の腫瘍成長を著しく遅延させた。イソタイプ対照群の平均腫瘍体積が実験終了時には約1.5cm3に達した一方で、治療群における成長速度は10日後に顕著に低下し、平均腫瘍体積は終了時には約0.5cm3であった。23日後、T/C治療/対照の容量比は1/3であり、これは成長が66阻害されたことを示す。結果は、mAb3.16.3が、この実験で使用した用量で、マウスAng-2に結合しかつこのリガンドのその受容体Tie2への結合を遮断することにより、ヌードマウスにおけるA431異種移植片の成長を著しく遅延させることができたことを示唆している。マトリゲルプラグアッセイにより示されたように、モノクローナル抗体の抗腫瘍作用が宿主における血管形成の阻害に起因するという可能性は高い。さらに実施例22では、抗血管形成に関する作用機序を、腫瘍内の微小血管密度MVDを薬力学的マーカーとして用いて明示する。mAb3.19.3の作用機序は、Ang-2/Tie2結合およびそれに続くシグナル伝達におけるその遮断に限定されない場合がある。実施例7に示したように、このmAbは、Ang-1に結合し、Ang-1のTie2への結合を遮断することも判明している。興味深いことに、mAbはAng-1誘発性のTie2リン酸化も遮断する。Ang-1が血管成熟に関与することは知られている。Ang-1のTie2への結合における阻害についてmAb3.19.3の効力をAng-2に対して比較する場合実施例12、mAb3.19.3が主としてAng-2の拮抗剤であることは明白である。任意の特定の理論に縛られないとして、Ang-2およびAng-1からのシグナル伝達の2通りの遮断によって血管形成、ひいては腫瘍成長が傷害される可能性がある実施例21樹立した異種移植片モデルにおいてMAB3.19.3は腫瘍成長を阻害するAng-2は血管形成内皮細胞によって上方制御され、多種の腫瘍の進行と相関する。Ang-2/Tie2結合を遮断するモノクローナル抗体が血管形成を阻害し、それ故に腫瘍成長を阻害しうると仮定することは理にかなっている。この実験では、抗-Ang-2mAbの治療有効性を実証した。mAb3.19.3が交差反応しかつマウスAng-2/Tie2のシグナル伝達を中和することから、このmAbを選択し、腫瘍成長を阻害するinvivoでの有効性について実証した。抗-Ang-2mAb3.19.3が樹立した腫瘍も阻害するか否かを試験するため、A-431以外の腫瘍であるヒト結腸腺癌LoVo異種移植片モデルを用いた。mAb3.19.3の用量0.5、2および10mg/kgを週に2回、腹腔内投与した。平均容量0.2cm3の腫瘍が樹立されるまで、治療を開始しなかった。これらの樹立した腫瘍においては、mAb3.19.3はまた、イソタイプ対照と比べて阻害作用を示した。図14Aは、0.5および2mg/kgp値がそれぞれ0.022および0.027で79の阻害が得られたことを示し、かつ腫瘍成長に対して10mg/kgp=0.006で75阻害されることが判明した。平均容量0.2cm3に至るまでの成長を可能にしたヒト結腸腺癌SW480のさらなる異種移植片モデルにて、腫瘍成長阻害作用を再現した。mAb3.19.3が0.5mg/kgで顕著な作用を有する点は不明であったが、腫瘍移植の53日後、mAbは2および10mg/kgそれぞれp=0.003および0.006で腫瘍成長を60阻害した図14B。上記結果を要約すると、3つの試験モデルにおいて、抗-Ang-2mAb3.19.3は腫瘍成長を顕著に阻害した。興味深いことに、LoVoとSW480の双方はヒトAng-2を発現する。しかし、ヒトAng-2が腫瘍細胞によって発現されるという事実に反し、マウスAng-2との交差反応性を全く有しない他の2種のmAbは、腫瘍成長に対して顕著な阻害活性を示さなかったデータは示さず。これらの結果は、宿主Ang-2の拮抗剤が血管形成および腫瘍成長の遮断に必要であることを意味する。上で考察したように、Mab3.19.3はAng-1と交差反応する。しかし、mAb3.19.3のAng-1/Tie2結合に対する効力は、Ang-2/Tie2結合に対する効力よりもずっと低かった実施例12。このため、これらのモデルにて見られる治療有効性が主としてAng-2拮抗作用に起因すると結論づけることは理にかなっている。しかし、モデルにてinvivoでのAng-1の遮断を完全に除外することはできないと思われる。諸実験の全過程を通して、体重減少または出血などの明らかな毒性作用は全く観察されなかった。実施例22さらなる腫瘍異種移植片モデルにおけるMAB3.19.3のinvivoでの有効性9種の異なる腫瘍細胞系を用いたヒト癌のマウス異種移植片モデルにおいて、3.19.3モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を試験した。結腸腺癌Lovo、SW480、Colo205、HT29、HCT116、扁平上皮癌A431、肺癌Calu-6および乳腺癌MCF7、MDA-MB-231細胞を、細胞がサブコンフルエント状態に至るまで、フラスコ内で通常どおり培養した。モデルを構築するため、免疫不全7~10週齢雌マウスを使用した。細胞を収集し、マトリゲルに懸濁し、次いで各マウスに皮下注射した。次いで、マウスをマウス10~12匹を含むコホートに無作為化した。マウスに0.5mgのmAb3.19.3またはイソタイプ対照抗体を腹腔内注射し、その後は週に2回注射した。すべての実験において、イソタイプ対照抗体治療を含めた。各腫瘍の寸法を週に2回測定した。腫瘍の容量を容量=長さ×幅2×0.5cm3として計算した。HT29図15AおよびCalu6図15Bの異種移植片において、腫瘍成長阻害のグラフ比較を示す。表18に見られるように、mAb3.19.3は、試験対象の全部で7種の異種移植片皮下モデルと、用量および計画が最適化されていない同所性の両モデルとにおいて顕著な活性を示した。CD31の血管染色濃度を介し、MDA-MB-231腫瘍組織を分析した。閾値threshold法およびマニュアルグリッドカウンティングmanualgridcounting法により、CD31の染色濃度を測定した。1群当たり11の腫瘍および1腫瘍当たり少なくとも20枚の画像を分析した。図15Cに見られるように、3.19.3抗体によるマウスの治療により、CD31の染色濃度が対照IgG抗体の場合と比べて40低下した。これは双方の計数法で統計的に有意であり、片側T-検定によって閾値p<0.015およびマニュアルグリッドカウンティングp<0.00004であった。Colo205およびHCT116異種移植片については、エクスビボにおける組織上で類似するCD31血管の計数を行った。これらの試料はまた、CD31血管において同様の有意な低下を示した。実施例23血管形成関連疾患の治療における抗-ANG-2抗体の使用様々な固形腫瘍を有するヒト患者における抗-Ang-1および抗-Ang-2抗体治療のinvivoでの作用を判定するため、ヒト患者に有効量の抗-Ang-1および抗-Ang-2抗体を定期的に投与する。治療の間では一周期ごとに、ヒト患者を監視し、腫瘍成長が阻害されるか否かを判定する。治療後、抗-Ang-1および抗-Ang-2抗体による治療を受けている患者が、腫瘍の縮小、進行までの時間の遅延または生存期間の延長を含むがこれらに限定されない事柄のうちの1つもしくは複数において、治療を受けていない患者と比べて相対的に改善を有することが判明している。実施例24診断物質としての抗-ANG-2抗体の使用試料中でのAng-2抗原の検出試料中でAng-1またはAng-2抗原を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイELISAを構築することが可能である。アッセイでは、96-ウェルマイクロタイタープレートまたは384-ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルに、数時間かけてAng-1およびAng-2に特異的な一次完全ヒトモノクローナル抗体を吸着される。固定化抗体は、試験試料中に存在しうる抗原のいずれかに対する捕捉抗体としての機能を果たす。ウェルをすすぎ、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理し、分析物の非特異的吸着を阻止する。次いで、ウェルを抗原を含有すると考えられる試験試料または標準量の抗原を含有する溶液で処理する。かかる試料は、例えば、病理学的診断に有用と考えられる循環抗原レベルを有すると考えられる被験者から採取した血清試料でありうる。試験試料または標準試料をすすぎ落としてから、ビオチンとの結合によって標識された二次完全ヒトモノクローナル抗-Ang-1抗体および抗-Ang-2抗体でウェルを処理する。モノクローナルまたはマウスもしくは他の種を由来とするものであっても使用可能である。標識した抗-Ang-1および抗-Ang-2抗体は、検出抗体としての機能を果たす。過剰な二次抗体をすすぎ落としてから、アビジンと結合した西洋わさびペルオキシダーゼHRPおよび適切な発色基質でウェルを処理する。試験試料中の抗原の濃度を、標準試料から作成される標準曲線との比較によって判定する。このELISAアッセイは、試験試料中のAng-1およびAng-2抗原の検出において高度に特異的かつ極めて感受性の高いアッセイを提供する。患者におけるAng-2抗原濃度の測定ヒト血清中のAng-1およびAng-2レベルを定量するため、サンドイッチELISAを構築する。サンドイッチELISAから得た2種の完全ヒトモノクローナル抗-Ang-2抗体は、Ang-2分子上の異なるエピトープを認識する。あるいは、マウスもしくは他の種を由来とするモノクローナル抗体の使用が可能である。ELISAは以下のように行われうるが必ずしも以下のようではない。2μg/mLの濃度でのコーティング緩衝液0.1MNaHCO3、pH9.6中の捕捉抗-Ang-2抗体50μLをELISAプレートフィッシャーFisher上にコーティングする。4°Cで一晩インキュベーション後、プレートをブロッキング緩衝液PBS中、0.5BSA、0.1Tween20、0.01チメロサール200μLで25°Cで1時間処理する。プレートを、PBS洗浄緩衝液、WB中の0.05Tween20を用いて3回洗浄する。正常または患者血清クリノミクスClinomics、バイオリクライメーションBioreclaimationを、ブロッキング緩衝液を含有する50ヒト血清で希釈する。プレートを血清試料とともに4°Cで一晩インキュベート、WBで洗浄し、次いで100μL/ウェルのビオチン化検出抗-Ang-2抗体とともに25°Cで1時間インキュベートする。洗浄後、プレートをHRP-ストレプトアビジンとともに15分間インキュベートし、以前のように洗浄し、次いで、発色用のH2O2シグマSigma製現像液中の100μL/ウェルのo-フェニレンジアミンで処理する。反応を50μL/ウェルのH2SO42Mで停止させ、ELISAプレートリーダーを492nmで用いて分析する。血清試料中のAng-2抗原の濃度を、4つのパラメータカーブフィッティングプログラムを用いた精製Ang-2抗原の希釈物との比較によって計算する。参照による援用特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書中のすべての引用文献およびそれらの中の引用文献は、それらが既に引用されていない限り、本明細書によってそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。均等物前述の書面での明細書は、一等業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明によって検討されたベストモードを記載している。しかし、前述内容が本文中にいかに詳細に現れるとしても、本発明は多数の方法で実行可能であり、かつ本発明は添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の均等物に準じて解釈される必要があることが理解されるであろう。"