"クラミジアゲノム配列中に非クラミジア由来の外来DNA配列を有する組換えクラミジア。クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有するとともに非クラミジア由来の外来DNA配列を前記第一の領域と第二の領域との間に含むDNA断片をクラミジア内に導入し、当該DNA断片とクラミジアゲノムの間で相同組換えを行わせることにより得られた組換えクラミジア。クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有するとともに非クラミジア由来の外来DNA配列を前記第一の領域と第二の領域との間に含むDNA断片をクラミジア内に導入し、当該DNA断片とクラミジアゲノムの間で相同組換えを行わせる組換えクラミジアの製造方法。5’→3’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖DNAアニーリングタンパクの組み合わせを用いて、クラミジアゲノムを相同組換えにより組換えることを特徴とする、請求項3記載の組換えクラミジアの製造方法。5’→3’エキソヌクレアーゼがRecEまたはRedαであり、一本鎖DNAアニーリングタンパクがRecTまたはRedβであることを特徴とする、請求項4記載の組換えクラミジアの製造方法。プロモーター配列下流に5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列及び一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列を、同一プラスミド上に、又は、別個のプラスミド上に含むことを特徴とする、クラミジアゲノム組換え用プラスミド。5’→3’エキソヌクレアーゼがRecEまたはRedαであり、一本鎖DNAアニーリングタンパクがRecTまたはRedβであることを特徴とする、請求項6記載のクラミジアゲノム組換え用プラスミド。請求項6又は請求項7いずれか1項記載のプラスミドと、クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有し非クラミジア由来の外来DNA配列を含むDNA断片とを、クラミジア内に導入し、前記プラスミドがコードしているタンパク質をクラミジア内で発現させることにより、前記DNA断片をクラミジアゲノムに相同組換えする、組換えクラミジアの製造方法。本発明は、ゲノム配列中に外来DNAを有する組換えクラミジア、及びその製造方法を提供することを目的とする。上記目的を達成するために、発明者らは、クラミジアゲノムが高効率で相同組換えされる方法について鋭意研究を重ねた結果、recE遺伝子及びrecT遺伝子をコードする塩基配列を有するプラスミドと、クラミジアゲノム上の塩基配列と相同な領域を両端に含む二本鎖DNAをクラミジアに導入し、RecEタンパク質及びRecTタンパク質が発現する条件下で培養することにより、クラミジアゲノムを組み換えることに成功した。すなわち本発明は、以下のクラミジアゲノム組換え用プラスミド、及び、これを用いたクラミジアゲノムの相同組換え方法を提供する。1クラミジアゲノム配列中に非クラミジア由来の外来DNA配列を有する組換えクラミジア。2クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有するとともに非クラミジア由来の外来DNA配列を前記第一の領域と第二の領域との間に含むDNA断片をクラミジア内に導入し、当該DNA断片とクラミジアゲノムの間で相同組換えを行わせることにより得られた組換えクラミジア。3クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有するとともに非クラミジア由来の外来DNA配列を前記第一の領域と第二の領域との間に含むDNA断片をクラミジア内に導入し、当該DNA断片とクラミジアゲノムの間で相同組換えを行わせる組換えクラミジアの製造方法。45’→3’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖DNAアニーリングタンパクの組み合わせを用いて、クラミジアゲノムを相同組換えにより組換えることを特徴とする、3記載の組換えクラミジアの製造方法。55’→3’エキソヌクレアーゼがRecEまたはRedαであり、一本鎖DNAアニーリングタンパクがRecTまたはRedβであることを特徴とする、4記載の組換えクラミジアの製造方法。6プロモーター配列下流に5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列及び一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列を、同一プラスミド上に、又は、別個のプラスミド上に含むことを特徴とする、クラミジアゲノム組換え用プラスミド。75’→3’エキソヌクレアーゼがRecEまたはRedαであり、一本鎖DNAアニーリングタンパクがRecTまたはRedβであることを特徴とする、6記載のクラミジアゲノム組換え用プラスミド。86又は7いずれか記載のプラスミドと、クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有し非クラミジア由来の外来DNA配列を含むDNA断片とを、クラミジア内に導入し、前記プラスミドがコードしているタンパク質をクラミジア内で発現させることにより、前記DNA断片をクラミジアゲノムに相同組換えする、組換えクラミジアの製造方法。本発明は、クラミジアゲノム組換え用プラスミド及びこれを用いたクラミジアゲノムの相同組換え方法を提供する。本発明により、従来不可能であったクラミジアゲノムの組換えが可能となり、ゲノムプロジェクトで見出された機能未知タンパク質の機能解明や、病原遺伝子の破壊株取得によるクラミジアワクチンの製造等に大いに貢献することが可能となる。以下、発明を実施するための形態により、本発明を説明するが、本発明の概念に属する限りにおいて、かかる項目における記載事項に本発明が限定されることはない。1本発明組換えクラミジア本発明組換えクラミジアは、天然クラミジアゲノム配列中に非クラミジア由来の外来DNA配列を有する組換えクラミジアである。本発明において外来DNAとは、クラミジアゲノムに由来しないDNAを指し、物質生産及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子をコードするDNAや、クラミジア遺伝子破壊のために導入する人為的に作成されたDNAが挙げられるが、クラミジアゲノムに由来しないDNAであれば特に限定されない。かかる外来DNAを有するクラミジアは、たとえば以下に記載した本発明製造方法により得ることが出来る。2本発明製造方法本発明製造方法は、クラミジアゲノム配列の一部と相同な第一の領域及び第二の領域を有するとともに非クラミジア由来の外来DNA配列を前記第一の領域と第二の領域との間に含むDNA断片をクラミジア内に導入し、当該DNA断片とクラミジアゲノムの間で相同組換えを行わせることによる組換えクラミジアの製造方法である。本発明において相同組換えとは、1対の二本鎖DNAの相同な領域間で起こるDNA組換えを意味する。上記相同な領域とは、クラミジアゲノムDNA中の対応する領域と同一の塩基配列を有する領域、又は、該領域と相同組換えが生じる程度の配列同一性を有する領域を意味する。すなわち、前記第1の領域及び第2の領域には、クラミジアゲノムDNA中の対応する領域と同一の塩基配列を有するもののほか、該塩基配列のうち1若しくは複数の塩基が置換し及び/若しくは欠失し並びに/又は該塩基配列に1若しくは複数の塩基が挿入され及び/若しくは付加されたものであって、それらの数が相同組換え可能な程度の少数のものも包含される。具体的には、クラミジアゲノムDNA中の対応する領域と90以上、さらに好ましくは95以上、さらに好ましくは98以上、最も好ましくは100の同一性を有していることが好ましい。ここで、塩基配列の同一性とは、両者の塩基ができるだけ多く一致するように必要ならばギャップを挿入する両塩基配列を整列させ、不一致の塩基数を、全塩基数両者の配列で全塩基数が異なる場合には短い方の配列の全塩基数で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出することができる。特に、上記した置換、欠失、挿入及び/又は付加する塩基数の合計が10個未満のものが好ましい。相同な領域の長さとしては、第一の相同領域及び第二の相同領域ともに、少なくともそれぞれ15ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくともそれぞれ30ヌクレオチド、最も好ましくは少なくともそれぞれ50ヌクレオチドである。また、第一の領域と第二の領域の間のDNA配列としては、クラミジアのゲノムDNAに挿入しようとするあらゆるDNA配列を使用することが出来るが、相同組換えが起きたことを確認することが出来るように、クロラムフェニコール耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を使用することが好ましい。DNA断片をクラミジア内に導入する方法としては、特に制限はなく、当業者に既知の任意の方法を適宜選択することができる。例えばエレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、リポフェクション法等が挙げられる。相同組換えは、クラミジア内に導入したDNA断片とクラミジアゲノムとの間で相同組換えをさせることが可能であるタンパクであれば本発明製造方法に用いることが出来るが、たとえば5’→3’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖DNAアニーリングタンパクの組み合わせを用いて、クラミジアゲノムを相同組換えにより組換えることが、効率性の面から極めて好ましい。5’→3’エキソヌクレアーゼとは、一本鎖DNAを5’末端から3’末端方向へモノヌクレオチドを遊離させる働きを有する酵素を指す。本発明においては、racプロファージ由来のRecEや、ファージλ由来のRedα等、クラミジア内で発現し機能し得るものであれば、あらゆる種類の5’→3’エキソヌクレアーゼを使用することが出来る。一本鎖DNAアニーリングタンパクとは、相互に相同な領域を有する一本鎖DNAに結合するタンパク質であり、これらの一本鎖DNAの相同な領域間において、相同組換えを生じさせる働きを有するタンパク質を指す。本発明においては、racプロファージ由来のRecTや、ファージλ由来のRedβ、ファージP22由来のErf等、クラミジア内で発現し機能し得るものであれば、あらゆる種類の一本鎖DNAアニーリングタンパクを使用することが出来る。RecTとRedβは、機能的に類似していることが公知であるHalletal.J.Bacteriol.1751993277-287;MuniyappaandRadding,J.Biol.Chem.26119867472-7478;KmiecandHolloman,J.Biol.Chem.256198112636-12639。また、Erfタンパク質は、PoteeteandFentonJMolBiol1631983257-275およびその中の参考文献によって記載されており、RedβおよびRedTと機能的に類似することが知られているMurphyetal.,JMolBiol1941987105-117。大腸菌において、recEおよびrecT遺伝子またはredαおよびredβ遺伝子あるいはファージP22組換え系などの機能的に関連する遺伝子を発現させることにより、2つのDNA分子間での効果的な相同組換えが高頻度で生じることが報告されているKolodnerら、Mol.Microbiol.11199423-30;Fenton.A.C.andPottete.A.R.,Virology1341984148-160;Poteete.A.R.andFenton.A.C.,Virology1341984161-167。本発明はまた、RecE、RecT、Redα、RedβおよびErfとして上記で明確に同定される分子の機能的等価物でありかつ、本明細書中に記載されるような組換えを介する能力が残存するものであれば、あらゆるものを使用し得る。このような機能的等価物としては、バクテリオファージ中に存在する組換え系のエレメントのホモログラージDNAファージ、T4ファージ、T7ファージ、スモールDNAファージ、異性体ファージ、フィラメントDNAファージ、RNAファージ、Muファージ、P1ファージ、誘導体ファージおよびファージ様物が挙げられるが、これらに限定されない、ならびにウイルス中に存在する組換え系のエレメントの機能的ホモログ以下の群のいずれかに属する任意のウイルスが挙げられるが、これらに限定されない:植物ウイルス、昆虫ウイルス、酵母ウイルス、真菌ウイルス、寄生虫性微生物ウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、全ての肝炎ウイルス、カルシウイルス科、ノーウォーク群のウイルス、アストロウイルス科、アストロウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、フラビウイルス科、フラビウイルス、ペスチウイルス、コロナウイルス科、コロナウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ増大elevatingウイルスおよび関連ウイルス、ラブドウイルス科、ラブドウイルス、フィロウイルス科、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラミクソウイルス科、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、オルソミクソウイルス科、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、アレナウイルス、レオウイルス科、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルスcoltivirus、レトロウイルス、ヒトT細胞白血球ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レンチウイルス、パポバウイルス科papoviridae、ポリオーマウイルス科、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス科、パピローマウイルス、アデノウイルス科、アデノウイルス、パルボウイルス科、パルボウイルス、ヘルペスウイルス科、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、オナガザルヘルペスウイルス、Bウイルス、ポックスウイルス科、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス科、ならびに未分類の因子例えば、δ型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスFieldsVirology,ThirdEdition,editedbyB.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley,etal.Lippincott-RavenPublishers,PhiladelphiaPAUSA1996が挙げられる。上記の機能的等価物の特定の例示としては、野生型配列からのアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を含む、RecEタンパク質、RecTタンパク質、Redαタンパク質、Redβタンパク質またはErfタンパク質であり、かつ、相同組換えの機能を正常に発揮し得るものが挙げられる。そのような機能的等価物としては、好ましくは、野生型配列と少なくとも20以上、さらに好ましくは少なくとも40、50、60、70、80、90、95、98または99以上のアミノ酸配列同一性を有するものである。すなわち、本発明において使用し得る5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列及び一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列としては、例えばRecE及びRecTをコードする塩基配列が挙げられ、具体的にはrecE遺伝子塩基配列とrecT遺伝子塩基配列が一部重複した配列番号1の配列が挙げられるが、これとストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる。ストリンジェント条件下とは、01×SSC、05SDS中、好ましくは55°C、より好ましくは62°C、さらに好ましくは68°Cで30分の洗浄することを言い、具体的には、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、配列番号1と少なくとも60以上相同の塩基配列であり、好ましくは少なくとも70以上、さらに好ましくは少なくとも80以上相同の塩基配列である。Redα及びRedβをコードする塩基配列としては、例えば配列番号2及び配列番号3の配列が挙げられるが、これとストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる。ストリンジェント条件下とは、01×SSC、05SDS中、好ましくは55°C、より好ましくは62°C、さらに好ましくは68°Cで30分の洗浄することを言い、具体的には、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、配列番号1と少なくとも60以上相同の塩基配列であり、好ましくは少なくとも70以上、さらに好ましくは少なくとも80以上相同の塩基配列である。本発明におけるクラミジアゲノム組換え用プラスミドとしては、以下に挙げる本発明プラスミドを用いることが出来る。3本発明プラスミド本発明プラスミドは、プロモーター配列下流に5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列又は一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列を含むことを特徴とするプラスミドである。本発明プラスミドは、上述したように本発明方法により本発明クラミジアを調製するために用いることが出来るプラスミドである。かかる用途に用いることが出来る限りにおいて、本発明プラスミドは、5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列又は一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列のいずれかを有するが、取り扱いの利便性を考慮すると、両者をともに同一プラスミド中に有していることが好ましい。本発明プラスミドは、5’→3’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖DNAアニーリングタンパクを発現するように、これらの遺伝子配列の上流にプロモーター配列を有している。かかる本発明プラスミドに使用することが出来るプロモーター配列としてはlacプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター、cspAプロモーター、talプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、araBADプロモーター、又はgal1プロモーター等、クラミジア内で遺伝子の転写を誘導することが出来うるあらゆる種類のプロモーターを使用することが出来るが、好ましくは温度感受性プロモーターであり、λファージのPL、PRプロモーターが例示される。かかるプロモーターと、5’→3’エキソヌクレアーゼをコードする塩基配列及び一本鎖DNAアニーリングタンパクをコードする塩基配列とが適切に転写されタンパク質を発現するように配置することは、プラスミド構成を行うに際して当業者であれば比較的身近に使用する方法を適宜選択の上行うことが可能である。また、さらに本発明プラスミドは、本発明プラスミドの導入が適切にされていることを確認するためのマーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子をプラスミド上に配置しておくことも当業者であれば可能である。以下に具体的な実施例を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されることはない。大腸菌K12株由来のXL1blueのゲノムを鋳型として、recE遺伝子及びrecT遺伝子を増幅させるために、5’末端に制限酵素サイトsalIサイト、3’末端に制限酵素サイトXbaIサイトを付加したプライマー配列配列番号4、配列番号5を用いてPCR法によりDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、pMB1oriを持つpCL476プラスミドのmulticloningsiteに組み込んで、発現プラスミドを構築した。構築したプラスミドをpCLfrec1と命名する図1。クラミジアゲノム上の3型分泌装置コンポーネントyscC遺伝子を相同組換えにより破壊するために、クラミジアゲノム上の3型分泌装置コンポーネントyscC遺伝子の部分配列50ベースとクラミジアompA遺伝子MOMPをコードする遺伝子プロモーター配列を5’末端に付け加えたプライマー配列番号6、7を用いて、薬剤耐性遺伝子としてテトラサイクリンないしクロラムフェニコール耐性遺伝子をテンプレートとしたPCRを行うことで取得した。同様に、3型分泌装置コンポーネントlcrE遺伝子、yscN遺伝子についても実施した。Hela細胞にクラミジアを感染させて2日後、セルスクレイパーを用いて2グリセロール250μl中に細胞浮遊液を回収し、超音波破砕機でクラミジアを遊離した。Hela細胞の核を遠心で除去した後に、BioRad社Micropulserを用いて、エレクトロポレーション法により、pCLfrec1104μgと、上記PCR産物01μgを導入した。パルスはエクスポネンシャル波形15kV1回を2mmギャップのキュベットに時定数なしで加えた。DNA導入後、即座にSPG溶液022Msucrose38mMKH2PO486mMNaHPO449mMNaglutamate500μlを加えて44°Cで20分培養後、37°Cで2時間培養し再度Hela細胞に感染させた。クラミジアゲノムの組み換えは、yscC遺伝子の組み換え位置より上流の配列配列番号8と、テトラサイクリンないしクロラムフェニコール耐性遺伝子に相補的な配列配列番号9をそれぞれフォワードプライマーリバースプライマーとして用いたPCRを行い、その産物をさらに配列番号10、配列番号11を用いたnestedPCRを行って、遺伝子配列を決定することで確認した図2。同様にlcrE遺伝子、yscN遺伝子についても実施した。Glycogenhydrolase遺伝子glgXの破壊株の取得Glycogenhydrolase遺伝子の部分配列50ベースを5’末端に付け加えたプライマー配列番号12,13を用いて、マーカーとしてのクロラムフェニコール耐性遺伝子をテンプレートとしたPCRを行うことで、挿入DNA断片を取得した点以外は、実施例1と同様の方法によりクラミジア内に当該DNA断片を導入し、組換えを行った。組換えの確認は、glgX遺伝子の上流の配列配列番号14と、クロラムフェニコール耐性遺伝子に相補的な配列配列番号9をそれぞれフォワードプライマーリバースプライマーとして用いたPCRを行い、その産物をさらに配列番号15、配列番号11を用いたnestedPCRを行って、遺伝子配列を決定することで確認した図3。クラミジアの主要外膜タンパクMOMPをコードするompA遺伝子のプロモーター配列図4、P1、P2、及びP2bをつないだクロラムフェニコール耐性遺伝子をクラミジアに導入し、mRNAの転写量を測定した。すなわち、実施例1と同様の方法により、クラミジアゲノムのlcrE遺伝子の3’末端の位置に、図4に示したプロモーター配列P1、P2、又はP2bを上流に持つクロラムフェニコール耐性遺伝子を組み換えた変異株を作成し、Hela細胞への感染2日後のmRNA発現量をRTPCRで検討した。RNAは感染細胞全体からTrizolInvitrogenを用いて調整し、DNAaseIでDNAを切断した後、クロラムフェニコール耐性遺伝子に相補的なプライマー配列番号16、17を用いてRTPCRを行った。実施例1の方法によりlcrE遺伝子破壊株配列番号18、19を用いて作成した挿入DNA断片、yscC遺伝子破壊株、及び、yscN遺伝子破壊株配列番号20、21を用いて作成した挿入DNA断片を取得し、継代培養による相対存在量の比較を行った図5。相対存在量は、クラミジアを感染させたHela細胞ごとゲノムDNAを調整し、そのDNAをテンプレートして、RealTimePCRを行うことにより定量した。感染させたクラミジアは、遺伝子変異体と野生株の混合になるので、変異体の相対的存在量を定量して比較した。すなわち、変異体の量を、組み換え部分の5’隣接部分に相補的なフォワードプライマー配列番号22、配列番号8、配列番号23と挿入したクロラムフェニコール耐性遺伝子に相補的なリバースプライマー配列番号9、増幅される配列に相補的なTaqManprobe配列番号24を用いて定量した。感染しているクラミジア全体のゲノムコピー数をGroEL遺伝子のRealtimePCR配列番号25、配列番号26によって定量して、クラミジア全体の内の変異体の相対存在量を測定した。図5の結果から、これら3型分泌装置欠損株は再感染能が低いことが示され、これらの変異株のワクチンとしての使用可能性が示唆された。実施例1の方法によりテトラサイクリン耐性遺伝子を組み込んだlcrE遺伝子破壊株配列番号27、28を用いて作成した挿入DNA断片、及び、yscN遺伝子破壊株配列番号29、30を用いて作成した挿入DNA断片を取得し、01μgmlのテトラサイクリン存在下で数代継代培養して、テトラサイクリンによる選別ができることを確認した。図6。遺伝子破壊株の確認は、glgXの場合と同様にnestedPCRによって行った。すなわち、組み換え部分の5’隣接部分に相補的なフォワードプライマー配列番号22又は配列番号23と挿入したテトラサイクリン耐性遺伝子に相補的なリバースプライマー配列番号31を用いてPCRを行い、その産物をさらに配列番号32と、配列番号33又は配列番号34とを用いてnestedPCRを行った。"