"サルモネラ菌の検出及び/又は定量化のためのPNAプローブであって、配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3に対して少なくとも86の類似性を有する少なくとも1つの配列を含むことを特徴とする上記PNAプローブ。以下の配列、-配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’、-配列番号2-5’-TCAGGAGCTTCGCTT-3’、-配列番号3-5’-GGAGCTTCGCTTGCG-3’、-配列番号4-5’-TCAGGAGCTTCGCTTGC-3’、-配列番号5-5’-AGGAGCTCCGCTTGC-3’のうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項1に記載のPNAプローブ。rRNA、rDNA、又はサルモネラ菌のrRNAに相補的な配列における標的配列を検出できることを特徴とする、請求項1に記載のPNAプローブ。配列番号5-5’-TGCAGGATTCTCTGG-3’に対して少なくとも86の類似性を有する1つの配列をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のPNAプローブ。少なくとも1種類の検出可能部分に接続されていることを特徴とする、請求項1から4までのいずれか一項に記載のPNAプローブ。前記プローブの前記種類の検出可能部分が、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの1つから選択されることを特徴とする、請求項5に記載のPNAプローブ。前記フルオロフォアの群が、Alexaシリーズのフルオロフォア、AlexaFluorシリーズ、シアニン、5-及び-6カルボキシ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン、5-ROX5-カルボキシ-X-ローダミン、トリエチルアンモニウム塩のうちの少なくとも1つであることを特徴とする、請求項6に記載のPNAプローブ。請求項1から7までのいずれか一項に記載のプローブのうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、サルモネラ菌を検出するためのキット。以下の溶液、1つの固定液、1つのハイブリダイゼーション溶液、及び1つの洗浄液のうち少なくとも1つをさらに含むことを特徴とする、請求項8に記載のキット。前記固定液が、パラホルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、2~8wt/volのパラホルムアルデヒド及び25~90vol/volのエタノールを含むことを特徴とする、請求項9に記載のキット。前記ハイブリダイゼーション溶液がホルムアミドを含むことを特徴とする、請求項9に記載のキット。サルモネラ菌の検出のための方法であって、請求項1から7までに記載のPNAプローブを使用し、a.PNAプローブを生物学的試料と接触させるステップ、b.PNAプローブを、前記試料中に存在する微生物の標的配列とハイブリダイズさせるステップ、c.ハイブリダイゼーションを、前記試料の前記検出及び定量化の指標として検出するステップを含むことを特徴とする上記方法。前記生物学的試料が、血液、空気、食物、水又は生検から得られることを特徴とする、請求項12に記載の方法。前記ハイブリダイゼーションが蛍光により起こることを特徴とする、請求項12に記載の方法。生物学的試料中のサルモネラ属菌を検出するための方法に適用されることを特徴とする、請求項1から7までのいずれか一項に記載のPNAプローブの使用。生物学的試料中のサルモネラ属菌の検出に適用されることを特徴とする、請求項8から11までのいずれか一項に記載のキットの使用。本発明は、サルモネラ属の検出すなわち、同定又は定量化のためのペプチド核酸PNAプローブ、及びその方法に言及する。本発明において記載されるプローブは、微生物の23SrRNA、又は該rRNAに対応するゲノム配列を認識する。PNAプローブは、その構造に固有な生理化学的特徴を有し、FISHに基づく方法に適用された場合に、DNAを使用した場合よりも高速で、ロバスト性及び特異性が高い解析を可能にする。この方法の利点の1つは、プローブが各種の生物学的試料においてロバストに機能することであり、これは通常他の検出分子方法では起こらない。別の関連する側面は、検出に要求される時間である。本発明において開発された方法は、試料の種類によって解析に先立ち濃縮ステップが必要とされる場合でさえも、その他の分子方法に対して報告された最短時間に匹敵する。当該方法の迅速性及び信頼性は、臨床安全性の展望に対しても食品安全性の展望に対しても汚染及び/又は感染の適切且つ時宜を得た処置を決定することができる。本発明の別の態様は、敏速且つ簡単な形で広範囲の生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出を可能にする、蛍光insituハイブリダイゼーションFISH法への当該プローブの適用に基づいたキットの開発に関する。本発明の好ましい実施形態において、本明細書に記載されたPNAプローブは、サルモネラ菌のrRNA、rDNA、又はrRNAの相補的配列における標的配列の検出を可能にする。本発明の実施形態の1つは、サルモネラ菌の検出及び/又は定量化に使用されるPNAプローブであって、配列番号1の配列、15’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’に対して少なくとも86の類似性、好ましくは、配列番号1の配列、15’-AGGAGCTTCGCTTGC-3に対して87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100の類似性を有することを特徴とする上記PNAプローブの記載である。本発明のより好ましい実施形態において、前述の配列は、少なくとも1種類の検出可能部分に連結されている。使用される種類の検出可能部分は、中でも、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの1つから選択することができる。さらにより好ましい実施形態において、フルオロフォアの群は、中でも、Alexaシリーズのフルオロフォア、シアニン、5-及び-6カルボキシ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン、5-ROX5-カルボキシ-X-ローダミン、トリエチルアンモニウム塩のうちの少なくとも1つであり得る。生物学的試料におけるサルモネラ菌の有無の検出及び/又は定量化のためのキットは、さらに本発明の対象である。本発明のより好ましい実施形態において、当該キットは、以下の溶液、固定液、ハイブリダイゼーション溶液、及び洗浄液のうちの少なくとも1つをさらに示し得る。本発明のさらに別の好ましい実施形態において、固定液は、パラホルムアルデヒド及びエタノール、すなわち、2~8wt/volのパラホルムアルデヒド及び25~90vol/volのエタノールを含むことができ、並びに/又はハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアミドを含み得る。本発明のさらなる目的は、前述のPNAプローブを使用した、生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出のための、又はサルモネラ菌の検出のための方法であって、-PNAプローブを生物学的試料と接触させるステップ、-PNAプローブを、生物学的試料中に存在する微生物の標的配列とハイブリダイズさせるステップ、-ハイブリダイゼーションを、生物学的試料中の前述の検出及び定量化の指標として検出するステップを含む方法の記載であり、好ましくは、ハイブリダイゼーションは蛍光によって実行することができる。生物学的試料は、中でも、血液、空気、食物、水、生検、又は糞便から採取することができる。本発明のさらなる目的は、前述のPNAプローブの使用、前述のキットの使用、及び生物学的試料におけるサルモネラ菌の検出、又はサルモネラ菌の検出の方法に適用されることになる方法である。本発明は、サルモネラ菌株の検出又は定量化を目的とするPNAプローブ、試薬、方法、及びキットを含む。本明細書に記載されたPNAプローブは、rRNA、rRNAに対応するゲノム配列r、又はその相補的配列への結合を介したサルモネラ属の特異的検出を可能にする。DNAプローブに対してPNAプローブのより高い特異性は、関連するヌクレオチド配列の間のより優れた識別を可能にする。これは、選択された標的領域内にミスマッチ本発明に記載されたプローブの位置14のヌクレオチドを1つのみ示すサルモネラ菌に対して系統学的に関連する微生物がいくつか存在するため、当該プローブと特定の関係がある。この状況のいくつかの例は、シゲラShigellaの菌種、エルシニアエンテロコリチカYersiniaenterocoliticaの菌種、及び大腸菌EscherichiacoliK12の菌株である。本発明に記載されたPNAプローブは、以下のヌクレオチド配列、配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’を有した15ヌクレオチドを有する。しかし、検出に使用されることになるプローブは、前述の配列に対して少なくとも86の同一性を示し得る。このプローブは、蛍光insituハイブリダイゼーションFISH法による解析に適用され、サルモネラ菌陽性試料の場合には、蛍光顕微鏡を介して、又はフローサイトメトリーを介して、検出可能な蛍光信号を発光する。特定のソフトウェアを使用して、新たなPNA-FISH法プローブの開発を経験的に実行した。関連する微生物の配列に標的微生物のrDNA配列を一列に並べることによって、プローブ配列の選択を初めに行った。これは、潜在的に有用な領域の同定を可能にし、その領域は、次に、特異性、ハイブリダイゼーション温度、グアニン/シトシンの割合、結合自由エネルギー、及び二次構造等、他のパラメータに基づき評価される。プローブの設計及び合成後、固定化/透過処理、ハイブリダイゼーション、及び洗浄といったFISH法手順の3つのステップを、選択したプローブのために開発及び最適化しなくてはならない。この工程には、通常、以下のパラメータ、温度、ホルムアミド及びエタノールの濃度、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄の時間が含まれる。この工程の複雑さ及び多数の変数のため、配列ごとに方法を開発することが常に可能であるわけではなく、したがって、いくつかの代替物及び配列がテストされることが多くあるということに気がつくことが重要である。十分に成功したハイブリダイゼーションは、その後、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、又はリアルタイムPCRによって、微生物の有無に関する推測、及び微生物の濃度に関する推測でさえも可能にする。検出した蛍光信号は、一般的に、細菌の細胞質に存在する何十又は何百というrRNAコピーに対する小さいプローブの特異的結合の結果である。プローブ及び標的によって形成された安定した複合体の実在を報告するそのプローブの検出可能部分は、以下の群、コンジュゲート、分枝状検出システム、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、又は発光化合物のうちの1つから選択される。本発明に記載された方法は、前述の配列に類似の配列を有する少なくとも1つのPNAプローブとの試料の接触を含む。その結果、その解析は、表現型の特徴に基づく及び結果を生じるために何日か必要とするサルモネラ菌検出のための従来の方法に反対して決定的な結果を有する1つのテストに基づいている。生物学的試料に存在するサルモネラ菌を検出する、すなわち、見つける、同定する、又は測定するためにテストを実行するのに適したキットは、さらに本発明の目的である。当該キットは、insituハイブリダイゼーションテストを行うのに必要とされるPNAプローブ及び他の選択された試薬又は化合物を含む。より好ましい現実化において、サルモネラ菌の検出、同定、又は定量化のためのアッセイを行うのに適した当該キットは、固体液、ハイブリダイゼーション溶液、及び洗浄液をさらに含む。好ましくは、当該方法は、治療上の決定及び品質管理のための診断上の補助手段であるように意図される。したがって、サルモネラ菌同定のためのこの方法の実行は、細菌に対する適切な臨床処置、及び汚染源の早期特定を可能にする。スライド上に調製した試料に直接PNAプローブを適用することができ、それは、これらのプローブの適用が、ハイブリダイゼーション前の細胞膜の透過処理のために試薬又は酵素の使用を含まないためである。しかし、ハイブリダイゼーションにおいて頻繁に使用される化合物の一部が要求される。したがって、当該プローブは、通常、より扱いやすいキットに含まれる。所望のアプローチがフローサイトメトリーによるPNAFISH法解析を含む場合、同じハイブリダイゼーション化合物を使用して、当該プローブを懸濁液における試料に適用することができる。定義a本明細書において使用される場合、ヌクレオチドという用語は、核酸に関連づけられた技術を使用する者に一般的に知られ、その結果、核酸に特異的に結合するポリマーを生じる天然及び人工の分子を含む。bヌクレオチド配列という用語は、使用される場合、サブユニット、この場合はヌクレオチドを含有するポリマーのセグメントを意味するのと同じである。c標的配列という用語は、テストにおいて検出されるように意図されるサルモネラ菌のヌクレオチド配列を意味し、プローブのヌクレオチドの一部がハイブリダイズするように設計される。dPNAプローブという用語は、ヌクレオチド配列を有し、対象の微生物の標的配列とハイブリダイズするよう特異的なPNAのサブユニットのポリマーを意味する。PNA分子は、負の電荷をもつ糖リン酸骨格構造が、反復N-2-アミノエチルグリシン単位によりaキラルで電気的に中性に形成されたものによって置き換えられたDNA模倣物である。e検出可能部分という用語は、使用される場合、プローブに接続することができ、その結果、機器又は方法によってプローブを検出可能にする分子を意味する。f試料という用語は、検出のための微生物又は標的配列を含有し得るいかなる生物学的試料も意味する。試料は、臨床試料例えば、血液、尿、糞便等、食物試料例えば、肉、卵、乳幼児用調合乳、ミルク等、又は環境試料例えば、水であり得る。PNAプローブ設計:潜在的に有用なオリゴヌクレオチドを同定してプローブとして使用するために、国立バイオテクノロジー情報センターNCBIのウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/にて入手可能な17個の23SrRNA遺伝子配列を選んだ。この選択は、10個のサルモネラ菌配列を含有し、7つの亜種それぞれの代表的な菌株、及び関連する腸内細菌科に属する種由来の7つの他の菌株を含んだ図1。欧州バイオインフォマティクス研究所EBIにて入手可能なClustalWソフトウェアを使用して、配列を一列に並べ、対象の領域を選択した。6つの潜在的に有用な領域を同定し、該領域を、その後、NCBIBLASTソフトウェアにおいて、及びSILVArRNAデータベースプロジェクトソフトウェアProbeCheckにおいてテストして、最も多いサルモネラ菌配列が検出され且つ最も少ない非サルモネラ菌配列が検出されたプローブを見つけた。プローブの選択に対して、高いグアニン/シトシンの割合、二次構造のタイプ、及びハイブリダイゼーション温度等、他の判断基準も使用した。18bpの領域1つのみが、NCBIデータベースにおけるサルモネラ菌株全てを検出する能力を持つように見えた。この領域に対して、4つの可能なプローブを設計した。これらのプローブのうちの1つを、いかなる非サルモネラ菌配列ともハイブリダイズせず、且つ、60のGC塩基を含有したため選択した。前述の選択判断基準に従い、選んだ配列は、5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’であった。この配列は、菌株サルモネラ菌S.enterica亜種エンテリカ血清型チフィリウムLT2ATCC43971、受託番号U77920の23SrRNAの位置1873と1887との間でハイブリダイズする。菌株LT2における標的配列の最初の位置から、プローブをSalPNA1873と名付けた。その後、選んだ配列を合成し、オリゴヌクレオチドを、N末端にて、蛍光色素AlexaFluor594に付着させた。PNAプローブの性能に関する理論的評価:プローブの設計後、感度及び特異性に対する理論的価値を決定することによってその性能を評価した。rRNASILVAデータベースにおいて利用可能な前述のソフトウェアProbeCheckを用いて、これらのパラメータを評価した。この理論的推定のために、少なくとも1,900bpを有した良質の配列のみを含んだデータベースにおける全ての101のサルモネラ菌配列を考慮した。当該プローブを、大きなRNAサブユニットLSU、23S/28Sに対してデータベースに存在する全11,124の配列と一列に並べ、小さいサブユニットSSU、16S/18Sに対してもデータベースに対してテストし、あり得る16SrRNA配列とのクロスハイブリダイゼーションの実在を査定した。特異性を、nSs/TnS×100で計算した。式中nSnは、当該プローブとは反応しなかった非サルモネラ菌株の数を意味し、TnSは、検査した非サルモネラ菌株の総数である。感度を、Ss/TSs×100で計算した。式中Ssは、当該プローブによって検出したサルモネラ菌株の数を意味し、TSsは、データベースに存在するサルモネラ菌株の総数である。この検索は、データベースに実在する101のサルモネラ属菌配列のみを当該プローブSalPNA1873が検出したことを裏付けた。その結果、100の理論的特異性及び感度を得た表1。本研究において開発したプローブを以前に開発されたプローブと比較するために、プローブの理論的特異性及び感度をテストした。-Sal23S10Perry-O’Keefeら、2001-配列番号6;-Salm63Kutterら、2006-配列番号7;-Sal3Nordentoftら、1997-配列番号8;も、ProbeCheckソフトウェアを使用して査定した表1。これらの配列の理論的査定は、当該プローブの配列番号6、配列番号7、及び配列番号8がデータベースに実在する101の菌株のサルモネラ菌のうちそれぞれ95、73、及び96の配列を検出し、94、72、及び95の感度値に相当するということを示した。検出した非サルモネラ菌配列の数について、配列番号1及び配列番号8は、配列番号6及び配列番号7とは異なり、いかなる配列も検出しなかった。これらの値は、100配列番号1及び配列番号8、98.13配列番号6、並びに99.97配列番号7の特異性を推定することを可能にした。行った理論的評価によって、主に2つの態様、PNA分子の利点並びに本明細書に記載されたプローブの特異性及び感度の値のため当該プローブSalPNA1873がサルモネラ菌の検出を改善するということが示された。PNA分子は、プローブSal3及びSalm63に対するDNAFISH法の手順と比較した場合にFISH法の手順をより簡単且つより速くし、一方、実在するPNAプローブのうちいずれも、プローブSalPNA1873に対して得た特異性及び感度の理論的な値を超えない。本発明のPNAプローブは、好ましくは15ヌクレオチドを含み、配列番号1の配列-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’と少なくとも86同一でありえ、好ましくは、配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3’と87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100類似し得る。或いは、本発明は、当該プローブのヌクレオチド配列の変化も企図する。そのような変化は、中でも欠落、挿入を含み得る。例えば、以下の配列、-配列番号2-5’-TCAGGAGCTTCGCTT-3’、-配列番号3-5’-GGAGCTTCGCTTGCG-3’、-配列番号4-5’-TCAGGAGCTTCGCTTGC-3’、-配列番号5-5’-AGGAGCTCCGCTTGC-3’、の1つである。PNAプローブの検出可能部分:以下の例に限定されず、PNAプローブの検出可能部分は、中でもデキストランコンジュゲート、発色団、フルオロフォア、ラジオアイソトープ、酵素、ハプテン、化学発光化合物等、多様な種類の分子を含み得る。例として、フルオロフォアの分類の中で、使用するのに好ましいものはそれだけに限定されないが、Alexaシリーズのフルオロフォア、AlexaFluorシリーズ、シアニン、5-及び-6カルボキシ-2’,7’-ジクロロフルオレセイン、5-ROX5-カルボキシ-X-ローダミン、トリエチルアンモニウム塩である。方法:本発明は、本明細書に記載された15ヌクレオチドの領域、配列番号1と少なくとも86の相同性を有するヌクレオチド配列を使用してサルモネラ菌の存在を決定するための方法を示す。当該方法は、例1において示された不適切なハイブリダイゼーション条件又は適切なinsituハイブリダイゼーション条件において、本明細書に記載されたPNAプローブとの細菌の標的配列を有する試料の接触を含み得る。当該方法は、試料の調製必要に応じて濃縮ステップを含む、固定化、ハイブリダイゼーション、洗浄、及び結果の視覚化に分けることができる例1を参照。当該方法は、付着した細胞又は懸濁した細胞に対して行うことができる。ハイブリダイゼーション条件-最適化:以下のステップは、本発明を限定することのない、ハイブリダイゼーション条件のあり得る最適化である。PNAプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションに影響を与える要因がいくつかある。これらの要因は、ホルムアミド又は他の変性化学試薬の割合、塩濃度、したがってイオン強度、ハイブリダイゼーションの温度、洗浄剤濃度、pH等を含む。最適なハイブリダイゼーション条件を決定するために、種々の要因を固定する、且つ、所望の差別的程度が達成されるまで各要因を個々に変えることが必要であり得る。試料において標的配列が別の非標的配列から近いほど、より大きなストリンジェンシーの程度が、ハイブリダイゼーションに影響を与える多様な要因を定めるために必要とされる。本発明において、シゲラ種等の非標的配列は、標的配列と比較して異なるヌクレオチド1つのみを有し得、したがって、高い識別レベルが、非特異的ハイブリダイゼーションを回避するために必要である。本明細書に記載されたプローブに対して、以下の条件を検出した。-53°Cから59°Cのハイブリダイゼーション温度。スライド内でのハイブリダイゼーションに対しても懸濁液内でのハイブリダイゼーションに対しても最も強い蛍光信号を57°Cにて得た。-50から80に及ぶエタノール濃度を使用した固定化ステップ。しかし、信号強度において違いは観察されなかった。-ハイブリダイゼーション時間30、45、60、90分をテストしたが、短い時間は、長い時間と同じくらい効率的であった。前述のパラメータ全てを最適化した後、より強い蛍光信号を生じると発見された手順は以下の通りであった。蛍光顕微鏡観察のために、各細菌培養の塗抹標本を、充当したスライドにおいて調製した。次に、塗抹標本を、-4wt/volのパラホルムアルデヒドSigma社に10分間浸漬し、次に、50vol/volのエタノールにも10分間浸漬した。-試料を風乾し、次に、10wt/volの硫酸デキストランSigma社、10mMのNaClSigma社、30vol/volのホルムアミドSigma社、0.1wt/volのピロリン酸ナトリウムSigma社、0.2wt/volのポリビニルピロリドンSigma社、0.2wt/volのフィコールSigma社、5mMのEDTA二ナトリウムSigma社、0.1vol/volのトリトンX100Sigma社、50mMのTris-HClpH7.5;Sigma社、及び200nMのPNAプローブを含有する20μlのハイブリダイゼーション溶液で覆った。-試料を、カバーガラスで覆い、光から保護された小さい湿気箱に置き、57°Cで30分間インキュベートした。-その後、カバーガラスを取り除き、5mMのTrisBaseSigma社、15mMのNaClSigma社、及び1vol/volのトリトンX100pH10;Sigma社を含有する予熱した洗浄液57°Cにスライドを浸した。-洗浄ステップも、57°Cにて30分間実行した。後に、スライドを洗浄液から取り除き、同じインキュベーターにおいて約5分間、57°Cにて乾燥させた。-顕微鏡観察前に、非蛍光性のイマージョンオイルMerck社を一滴のせ、カバーガラスで覆った。顕微鏡検査の前にそのスライドを最長24時間暗所で保管した。ハイブリダイゼーションは、懸濁液においても行うことができる。ある場合には、この手順が、自己蛍光、すなわち、血液試料の場合には赤血球の自己蛍光、及び乳幼児用調合乳におけるタンパク質の自己蛍光をほぼ完全に除去するのに寄与する。この場合、滅菌水中でホモジナイズされた培養物が10,000×gを5分間遠心分離され、ペレットが500μlの4パラホルムアルデヒド中でホモジナイズされる。1時間後、パラホルムアルデヒドを取り除くために細胞を再度遠心分離し、ペレットが、500μlの50vol/volエタノール中でホモジナイズされる。-20°Cでの30分間のインキュベーション後、細胞は、200nMPNAプローブを有する100μlのハイブリダイゼーション溶液中で再度ホモジナイズされ、57°Cにて30分間インキュベートされる。ハイブリダイゼーションの後、細胞を遠心分離し、上記のように500μlの洗浄液中でホモジナイズし、57°Cにて30分間インキュベートした。最後に、細胞は、洗浄液を取り除くために遠心分離され、500μlの滅菌水中でホモジナイズされる。次に、20μlの細胞懸濁液は、蛍光に適した顕微鏡用スライド上に広げられるか、又は200μlが膜ポアサイズ0.2μm、ニトロセルロース、Whatman社を通して濾過される。得た信号が自己蛍光に関係していないということを調べるために、顕微鏡において利用可能な他のフィルターを用いて全ての試料を観察した。同時に、試料をDAPIで染色もし、試料に存在する全ての細胞が本発明において記載されたプローブSalPNA1873-配列番号1で標識されたことを確かめた。さらに、ハイブリダイゼーション溶液に対してプローブを添加することなく、手順のステップ全てに従い、各アッセイにおいてネガティブコントロールを行った。プローブの実験的特異性及び感度の試験ハイブリダイゼーション法を十分に最適化すると、PNAプローブの特異性及び感度の実験値をテストした。これに対して、当該手順を61の2つのサルモネラ菌種及び6つのサルモネラ菌亜種に属する代表的なサルモネラ菌株、並びに46の他の菌株に適用した。後者の菌株は、同じ科に属する25の分類学的に関連する菌株シゲラ、クレブシエラKlebsiella、シトロバクターCitrobacter、パンテアPantoea、エルシニア、エンテロバクターEnterobacter、大腸菌、及びセラチアSerratia、並びに異なる目シュードモナスPseudomonas、鋼ヘリコバクターHelicobacter及びカンピロバクターCampylobacter、又は門リステリアListeria及びブドウ球菌Staphylococcusにさえも属する21の菌株を含んだ。SalPNA1873-配列番号1によって検出されなかったサルモネラ菌亜種VIは別にして、残り59のサルモネラ菌株全てを検出したが、使用した他の種に対してハイブリダイゼーションは観察されなかった。3つのシゲラ種に対して、陽性の試料においてもプローブのない陰性の試料においても検出したこれらの菌株の強い自己蛍光信号のため、PNA-FISH法の結果を査定することは可能ではなかった。この結果は、類似のRNA配列を有するシゲラフレックスネリShigellaflexneriが当該プローブとはハイブリダイズしなかったため、プローブとシゲラ種との間の1ヌクレオチドのみの差に関連はない。さらに、エンテロコリチカ菌Y.enterocolitica及び大腸菌K-12等の他の種も、まさに同じ位置において1つのミスマッチのみを有し、交差反応は観察されなかった。この結果は、1ヌクレオチドのみのミスマッチを有する配列をPNAプローブが区別するのを可能にすると述べる他の著者による観察Petersenら、2004を支持する。これらの結果に基づいて、100の実験的特異性及び96.7の実験的感度を得た。濃縮:解析されることになる試料は、中でも、食物、生検、血液、水、糞便から得ることができる。サルモネラ菌を含有する試料は、通常、低い汚染レベルを示す。このため、検出工程を促進する濃縮ステップが推奨される。この濃縮ステップは、腸内細菌科及び/又はサルモネラ菌に対して複合富栄養培地から選択培地まで、いくつかのタイプの培地を使用して行うことができる。インキュベーション温度は、選んだ培地次第でありえ、推奨されるインキュベーション時間は、8から24時間であるべきである。本発明に記載されたPNAプローブを、4つの異なるタイプの試料、水、糞便、乳幼児用調合乳、及び血液においてテストした。各タイプの試料の解析において一般に使用される手順に従い試料を濃縮した。水及び糞便の試料の場合、国際標準化機構ISOによって推奨されるように、緩衝ペプトン水BPWを使用して16~18時間第1のプレ濃縮ステップを行った。この濃縮の後、当該プローブは、テストした試料全てにおけるサルモネラ菌の検出を可能にし、且つ、結果は、これらの試料に推奨されるISO法、それぞれ糞便並びに水の試料に対してISO6579:2002食物及び動物用飼料におけるサルモネラ菌の検出並びにISO6340:1995水質-サルモネラ菌の検出及び列挙によって得られたものと一致した。乳幼児用調合乳の場合には、同じタイプの試料におけるエンテロバクターサカザキEnterobactersakazakiiの検出に対して以前に示唆されたように、後者を水に溶解し1:10、37°Cにて8時間インキュベートした。血液試料の場合には、16~18時間の濃縮を37°Cにて、血液培養において一般に使用される培地TBS-トリプチケースソイブロスにおいて行った。濃縮後、スライド又は懸濁液において細菌検出を行った。ハイブリダイゼーションの前に、試料は、例えば乳幼児用調合乳のタンパク質又は赤血球のような一部の成分の自己蛍光の干渉を最小限にするために蒸留滅菌水において1対10に希釈されるべきである。サルモネラ菌を含有する全ての試料が、本発明に記載されたPNAプローブを使用して陽性であった。これらの実験は、当該PNAプローブを使用した検出方法が一般的に20時間未満に種々のタイプの試料におけるサルモネラ菌を検出することができたということを示してきた。さらに、8時間のみの濃縮ステップを行って1mlあたり1CFUのみを含有する試料を検出することができるということが示された。各タイプの試料に対して推奨された濃縮培地がテストされてきたけれども、濃縮ステップを標準化することが可能である。何人かの著者は、サルモネラ菌を含有する試料の濃縮に対して、高いレベルの競合微生物を有する試料に対してさえも普遍的な培地として緩衝ペプトン水BPWを使用することができるということを示してきている。使用される従来の方法に対する当該方法、又は前述の試料の比較は、PNA試料の実行がサルモネラ属の細菌の検出において少なくとも3日省くことができるということを示した。固体及び小型の試料の場合には、これらを、フラットブレードを用いた衝撃の機械的工程にさらし、試料を分解して、緩衝ペプトン水に細菌を放出するべきである。生検の場合には、試料は、3~5mのスライスにカットされ、スライド上に置かれ、濃縮ステップの必要なく、直接ハイブリダイズされる。サルモネラ菌の検出のために開発されたほとんどの方法は、PCR技術又は選択培地に基づいている。前者は、より技術的に大変な労力を要し、且つ通常、検出限界を改善するために濃縮ステップも必要とし、後者は、時間のかかる、且つ不正確な結果を与え得る12、34、38。本研究において示されたPNA-FISH法のプロトコールは、技術的にPCR法よりも労力を要さず、培養法よりも速く、且つより正確である。濃縮ステップは必要であるけれども、結果を得るために必要とされる全時間は、20時間未満12時間しかかからないPIFは除くであり、値は、PCRに基づく方法に対して報告されたものに類似するか、又はそれらよりも良くさえあった9、12、35、39。本明細書に記載された方法は、現在使用される培養に基づく技術に代わる、現存するサルモネラ菌プローブに代わる、且つ、PCR及びELISAのプロトコールにさえも代わる信頼できるものであることを実証した。本明細書に記載されたPNAプローブは、従来の培養技術と比較した場合に検出において3日省くのを可能にする、DNAであろうとPNAであろうと以前に記載されたプローブよりも高い特異性を示す表1を参照、且つ、一部の分子アプローチ、すなわちPCRにおいて抑制物質として作用する物質の存在によって影響されないことが示された。結果の視覚化:このステップは、使用したフルオロフォアに感受性があるフィルターを有したいかなる落射蛍光顕微鏡においても行うことができる。プローブの蛍光信号を検出することができない、顕微鏡に存在する他のフィルターを使用して、自己蛍光の非存在を確かめた。キット:本発明は、サルモネラ属由来の細菌の存在をテストすることを可能にするキットにも言及する。本発明のキットは、配列番号1と少なくとも86同一のPNAプローブ、及びテストを行うために選択された別の試薬又は組成物を含む。本発明のPNAプローブ、その特徴、方法、及びキットは、標的生物内に存在するか、又は内部には存在しない核酸配列の解析に適している。したがって、本発明は、生物の解析にも、興味の対象である生物から抽出されたか若しくは得られた核酸の解析にも使用することができ、標的配列の供給源は本発明に対する限定ではないということを意味する。以下の例は、本発明を実行するための種々の状況及びいくつかのステップを例示しており、そのうちのいずれの限定も意図することなく、発明の好ましい実施形態である。例1種々の試料臨床、食物、又は環境試料におけるサルモネラ属に属する細菌の検出配列:配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3AlexaFluor594に結合試料の調製:臨床、食物、又は環境試料に、PNAプローブの適用前に濃縮ステップを前もって施した。これは、通常サルモネラ菌が低い汚染レベルを示すためである。この濃縮ステップは、各試料に対して使用される従来の解析法に推奨された培地を使用して行うことができる。食物、動物用飼料、糞便、又は水の場合には、BPWを使用した。粉乳又は乳幼児用調合乳に対しては、滅菌水を使用して、1/10wt/volの比で粉を溶解した。血液試料に対しては、血液培養において一般的に使用される複合TSB培地を使用した。インキュベーション時間は、37°Cにて120rpmで8時間粉ミルク及び乳幼児用調合乳から16~18時間糞便、水、血液等に及んだ。異なる試料タイプの同時分析に対しては、37°Cにて120rpmで8時間BPWにおいて濃縮を行うことによって使用される方法が標準化されることが推奨される。8時間のインキュベーション後の陰性結果の場合には、PNAFISH法の解析が、一晩の濃縮16~18時間後に繰り返されるべきである。濃縮ステップに続いて、蛍光に適したスライドに培地を一滴のせた。そのスライドを、57°Cのインキュベーターオーブンに約5分間置くか、又は風乾するために放置した。濃縮ステップを必要としない試料は、固定化ステップにおける手順を開始するべきである。固定化:ハイブリダイゼーション工程の間の23SrRNAの損失を防ぐために、4のパラホルムアルデヒドwt/vol及び50のエタノールvol/volの溶液に試料をそれぞれ10分間浸漬した。ハイブリダイゼーション:固定化の後、次に試料を、10wt/volの硫酸デキストランSigma社、10mMのNaClSigma社、30vol/volのホルムアミドSigma社、0.1wt/volのピロリン酸ナトリウムSigma社、0.2wt/volのポリビニルピロリドンSigma社、0.2wt/volのフィコールSigma社、5mMのEDTA二ナトリウムSigma社、0.1vol/volのトリトンX100Sigma社、50mMのTris-HClpH7.5;Sigma社、及び200nMのPNAプローブを含有する一滴のハイブリダイゼーション溶液で覆った。その試料を、均一なプローブの広がりを保証するためにカバーガラスで覆い、ハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぐために光から保護された小さい湿気箱の中に置き、57°Cにて30分間インキュベートした。洗浄:ハイブリダイゼーションの時間の後、カバーガラスを取り除き、5mMのTrisBase、15mMのNaCl、及び1vol/volのトリトンX100pH10を含有する57°Cにて予熱した洗浄液にスライドを浸漬した。次に試料を、ハイブリダイゼーション温度にて30分間オーブンの中に置いた。その後、スライドを洗浄液から取り除き、同じインキュベーターにおいて約5分間、57°Cにて乾燥させた。顕微鏡での視覚化前に、非蛍光性のイマージョンオイルMerck社を一滴のせ、カバーガラスで覆った。顕微鏡検査の前にそのスライドを最長24時間の間暗所で保存した。結果:PNAプローブに結合した蛍光色素AlexaFluor594を検出する能力を持つフィルターを有した蛍光顕微鏡における観察を介して結果を得た。例2乳幼児用調合乳におけるサルモネラ属及びクロノバクター属の細菌の検出この例は、Almeidaら、2009において以前に開発されたクロノバクター属菌に対するプローブと共にサルモネラ属菌に対するプローブを使用する可能性を例示する。これら2つの属は、近年、最も頻繁な粉状の乳幼児用調合乳の汚染として同定され、その汚染は、新生児における菌血症、髄膜炎、及び壊死性腸炎の主原因である。これら2つのプローブは、非常に類似したハイブリダイゼーション温度を示し、且つ、マルチプレックスアッセイいくつかのプローブの同時使用において容易に使用することができる。配列:配列番号1-5’-AGGAGCTTCGCTTGC-3AlexaFluor594に結合配列番号6-5’-TGCAGGATTCTCTGG-3’AlexaFluor488に結合試料の調製:各乳幼児用調合乳10gを秤量し、90mlの滅菌水で水和させた。より多い量の乳幼児用調合乳を使用することができるが、1/10wt/volの比は維持する。その後、水和した試料を、37°Cにて120rpmで8時間インキュベートした。濃縮後、試料を採取し、1/10に希釈して、乳幼児用調合乳のタンパク質からの自己蛍光の干渉を最小限にした。最後に、希釈した試料を一滴、適したスライドにのせ、57°Cにて約5分間インキュベーターにおいて風乾した。ハイブリダイゼーション:ハイブリダイゼーションを、わずかな違いを1つ有して例1において記載したように行った。ハイブリダイゼーション溶液は、2つのプローブ、サルモネラ菌を検出するためのPNAプローブ、及びクロノバクターを検出するためのPNAプローブを、どちらも200nMの濃度で含有した。洗浄:例1に記載された手順に従って洗浄を行った。結果:PNAプローブに結合した蛍光色素AlexaFluor594及び488を検出するために充当したフィルターが備わった蛍光顕微鏡で試料を観察することによって、結果を得た。参考文献AlmeidaCNFAzevedoCIversenSFanningCWKeevilandMJVieira2009DevelopmentandapplicationofanovelpeptidenucleicacidprobeforthespecificdetectionofCronobactergenomospeciesinpowderedinfantformulaApplEnvironMicrobiol75292530PerryOKeefeHSRigbyKOliveiraDSorensenHSlenderJCoullandJJHyldigNielsen2001IdentificationofindicatormicroorganismsusingastandardizedPNAFISHmethodJournalofMicrobiologicalMethods47281292KutterSAHartmannandMSchmid2006ColonizationofbarleywithSalmonellaentericaandListeriasppFemsMicrobiologyEcology56262271NordentoftSHChristensenandHCWegener1997Evaluationofafluorescencelabelledoligonucleotidetideprobetargeting23SrRNAforinsitudetectionofSalmonellaserovarsinparaffinembeddedtissuesectionsandtheirrapididentificationinbacterialsmearsJournalofClinicalMicrobiology3526422648WO0227036A2Probesprobesetsmethodsandkitspertainingforthedetectionidentificationandorenumerationofbacteria"