"1以上のエピトープ結合ドメインに連結された少なくとも1つのペアード対になったVHVLドメインを含む抗原結合タンパク質であって、ここで、前記抗原結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合部位を含み、抗原結合部位の少なくとも1つは少なくとも1つのエピトープ結合ドメインにより提供されかつ抗原結合部位の少なくとも1つは少なくとも1つのペアードVHVLドメインにより提供され、そのまたはそれぞれのペアードVHVLドメインはHGFと特異的に結合しかつ配列番号92、94、96または98のVHアミノ酸配列を含むものである抗原結合タンパク質。そのまたはそれぞれのペアードVHVLドメインが配列番号100または102のVLアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。前記エピトープ結合ドメインに連結された2つのペアードVHVLドメインを含む、請求項1または2に記載の抗原結合タンパク質。各重鎖がペアードVHVLドメインの1つのVHを含む2つの重鎖、および各軽鎖がペアードVHVLドメインの1つのVLを含む2つの軽鎖を含むものであるIgGスキャフォールドを含む、請求項3に記載の抗原結合タンパク質。配列番号78、80、82または84のアミノ酸配列を含む2つの重鎖および配列番号86または88のアミノ酸配列を含む2つの軽鎖を含むものである抗体を含む、請求項3に記載の抗原結合タンパク質。前記エピトープ結合ドメインの1つが各重鎖のN末端またはC末端に連結された、請求項4または5に記載の抗原結合タンパク質。前記エピトープ結合ドメインの1つが各重鎖のC末端に連結された、請求項6に記載の抗原結合タンパク質。エピトープ結合ドメインが1~20アミノ酸のリンカーにより抗原結合ドメインに連結された、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。抗原結合タンパク質が1つ以上の抗原に対して特異性を有し、任意に、抗原結合タンパク質はHGFおよびVEGFに結合可能である、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがVEGFに対する特異性を有する、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。任意に、エピトープ結合ドメインの2つが同じ抗原に対して特異性を有する、4つのエピトープ結合ドメインを含むものである、請求項1~10のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質。4つの抗原結合部位を有する、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。少なくとも1つのエピトープ結合ドメインがさらに配列番号163~170または187~190、195または196に設定されたもののいずれか1つ、またはそれらのいずれかの多重もしくは組み合わせから選択されるリンカーを含むものである、請求項8に記載の抗原結合タンパク質。エピトープ結合ドメインの少なくとも1つがヒト血清アルブミンと結合する、請求項1~13のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。配列番号90、92、94、96または98のVHアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号100または102のVL配列を有する軽鎖を含む抗HGF抗体、ならびに、前記抗体と1~20個のアミノ酸を含むリンカーにより連結された、少なくとも1つのVEGFと特異的に結合するエピトープ結合ドメインを含むものである抗原結合タンパク質。請求項1~14のいずれか1項に記載の抗原結合タンパク質および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。本発明は、新規の抗ヒト増殖因子HGFアンタゴニスト、二重特異性HGFアンタゴニストおよび血管内皮増殖因子VEGFアンタゴニスト、ならびにかかるアンタゴニストの治療における利用に関する。さらに具体的に、本発明はマウス抗HGF抗体S260116C12本明細書では16C12としても特定したから誘導される新規ヒト化抗HGF抗体の一団に関する。本発明はまた、1つ以上のエピトープ結合ドメインに連結された少なくとも1つのペアード対になったVHVLドメインを含む抗原結合タンパク質に関し、ここで、前記抗原結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合部位を有し、そして、少なくとも1つの抗原結合部位はHGFもしくはVEGFと結合するか、または、少なくとも1つの抗原結合部位はHGFと結合しかつ少なくとも1つの抗原結合部位はVEGFと結合する。特に、ペアードVHVLドメインは16C12由来のVHおよびVL領域を含みうる。従って、第1の態様において、本発明は1以上のエピトープ結合ドメインに連結された少なくとも1つのペアードVHVLドメインを含む抗原結合タンパク質であって、抗原結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合部位を含み、抗原結合部位の少なくとも1つは少なくとも1つのエピトープ結合ドメインにより提供されかつ抗原結合部位の少なくとも1つは少なくとも1つのペアードVHVLドメインにより提供され、ここで、そのまたはそれぞれのペアードVHVLドメインはHGFと特異的に結合しかつ配列番号92、94、96または98のアミノ酸配列をもつVHを含む抗原結合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は配列番号21に記載の配列をもつCDRH3を含む抗HGF抗体を提供する。ある実施形態において、抗HGF抗体はCDRH1配列番号19、CDRH2配列番号20、CDRH3配列番号21、CDRL1配列番号22、CDRL2配列番号23、およびCDRL3配列番号24を含む。ある実施形態において、抗HGF抗体は配列番号90、92、94、96または98のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号100または102に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むものである。他の実施形態において、抗HGF抗体は配列番号76、78、80、82または84に記載の重鎖配列および配列番号86または88に記載の軽鎖配列を含むものである。他の態様において、本発明はリンカーによりエピトープ結合ドメインに連結された本発明の上記態様による抗HGF抗体であって、前記エピトープ結合ドメインがVEGFと特異的に結合するものである前記抗HGF抗体を提供する。ある実施形態において、エピトープ結合ドメインは、任意に、配列番号104、106、108、110、191、192、193または194に記載のアミノ酸配列、またはそれと80、85、90、95、98、または99以内の同一性のアミノ酸配列を有する、抗VEGF免疫グロブリン単一可変ドメインである。特別な実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは配列番号194のアミノ酸配列を有するドメイン抗体である。ある実施形態において、エピトープ結合ドメインは配列番号163、164、165、166、167、168、169、170、195または196に記載のアミノ酸配列を有するリンカーにより抗HGF抗体に連結されている。ある実施形態において、エピトープ結合ドメインは抗HGF抗体の重鎖と、任意に、そのCまたはN末端に連結される。他の態様において、本発明は、抗VEGFエピトープ結合ドメインに連結された抗HGF抗体を含む二重特異性抗原結合タンパク質を提供し、前記抗HGF抗体は少なくとも1つの配列番号21に記載のCDRH3を含み、ここで抗VEGFエピトープ結合ドメインは配列番号104、106、108、110、191、192、193または194に記載の配列を有するものである。ある実施形態において、抗HGF抗体はCDRH1配列番号19、CDRH2配列番号20、CDRH3配列番号21、CDRL1配列番号22、CDRL2配列番号23、およびCDRL3配列番号24を含む。ある実施形態において、抗HGF抗体は配列番号76、78、80、82または84のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号86または88に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むものである。特別な実施形態において、抗HGF抗体は配列番号78の重鎖可変ドメインおよび配列番号86の軽鎖可変ドメインを含むものである。他の態様において、本発明は配列番号90、92、94、96または98のアミノ酸配列のVHアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号100または102のVL配列を有する軽鎖を含む抗HGF抗体、ならびに、1~20個のアミノ酸を含むリンカーにより前記抗体に連結された少なくとも1つのVEGFと特異的に結合するエピトープ結合ドメインを含むものである抗原結合タンパク質を提供する。エピトープ結合ドメインは配列番号191、192、193または194のアミノ酸配列を有してもよい。特別な実施形態において、抗HGF抗体は配列番号92のVHアミノ酸配列と配列番号100のVLドメインを含む。また、本発明は、本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチド配列、および本明細書記載のうちのいずれかの抗原結合タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、等価のポリペプチド配列に相当するコード配列を示すが、このポリヌクレオチド配列を、開始コドン、適切なシグナル配列および停止コドンと共に発現ベクターに挿入することができることは理解されるであろう。本発明はさらに組み換え型の形質転換または形質移入した宿主細胞を提供し、この宿主細胞は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖、および軽鎖をコードした1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。さらに、本発明は本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の産生方法を提供し、この方法は、第1および第2のベクターを含む宿主細胞を適切な培地、例えば無血清培地中で培養するステップを含み、前記第1のベクターが本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の重鎖をコードしたポリヌクレオチドと、前記第2のベクターが本明細書記載のいずれかの抗原結合タンパク質の軽鎖をコードしたポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに本明細書記載の抗原結合タンパク質および製薬上許容可能なキャリアを含む医薬品組成物を提供する。定義本明細書で使われる用語タンパク質スキャフォールドは、これに制限されるものではないが、免疫グロブリンIgスキャフォールド,例えば、IgGスキャフォールドを含み、これは4鎖または2鎖抗体であってもよく、または抗体のFc領域のみを含んでもよく、あるいは1つまたは複数の抗体由来の定常領域を含んでもよい。また、この定常領域は、ヒトまたは霊長類起源であっても、ヒトまたは霊長類定常領域の人工キメラであってもよい。このようなタンパク質スキャフォールドは、1つまたは複数の定常領域の他に抗原結合性部位を含んでもよい。例えば、タンパク質スキャフォールドがIgG全体を含む場合もある。このようなタンパク質スキャフォールドは、他のタンパク質ドメイン、例えばエピトープ結合ドメインまたはScFvドメイン、等の抗原結合性部位を有するタンパク質ドメインに結合可能である。本発明の実施形態のVHおよびVLドメインまたは重鎖および軽鎖はタンパク質スキャフォールドの一部分として存在しうる。従って、一態様において、本発明は、1つ以上のエピトープ結合ドメインに連結された少なくとも1つのペアードVHVLドメインを含むタンパク質スキャフォールドを含む抗原結合タンパク質であって、ペアードVHVLドメインがHGFと特異的に結合し、かつエピトープ結合ドメインがVEGFと特異的に結合し、そして、少なくとも1つのペアードVHドメインが配列番号92、94、96または98のアミノ酸配列を含むものである、前記抗原結合タンパク質を提供する。ドメインは、他のタンパク質とは独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。通常、ドメインは領域タンパク質の多様な機能特性の原因であり、多くの場合、残りのタンパク質および/またはドメインの機能を失うことなく、付加、除去または他のタンパク質に移動可能である。抗体単一可変領域は、抗体可変ドメインの配列特性を含む、折り畳まれたポリペプチド領域である。従って、これは完全抗体可変ドメイン、および、例えば、1つまたは複数のループが抗体可変ドメインの特性を有しない配列、または切断されたまたはNやC末端延長部を含む抗体可変ドメイン、並びに少なくとも全長領域の結合活性と特異性を保持している可変ドメインの折り畳まれた断片、により置換された場合、等の修飾可変ドメインを含む。語句免疫グロブリン単一可変ドメインは、別の可変領域またはドメインに独立に抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変ドメインVH,VHH,VLを指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の、別の可変領域または可変ドメインと共にある種のフォーマット例えば、ホモまたはヘテロ多量体で存在できる。この場合、他の領域またはドメインは、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要ではないすなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは新たな可変ドメインとは独立に抗原に結合する。本明細書で使われる場合、ドメイン抗体またはdAbは、抗原に結合が可能な免疫グロブリン単一可変ドメインと同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、他の種、例えばげっ歯類例はWO0029004で開示,テンジクザメおよびラクダVHHdAb、等由来の単一抗体可変ドメインを含んでもよい。ラクダVHHはラクダ,ラマ,アルパカ,ヒトコブラクダ,およびグアナコ等の種由来の免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、これは元々軽鎖の欠けた重鎖抗体を産生する。このVHH領域は、当業者に利用可能な標準的な方法によりヒト化されてもよく、このような領域も本発明によるドメイン抗体と考えられる。本明細書で使われるVHはラクダVHHドメインを含む。NARVは、テンジクザメを含む軟骨魚類で特定された別のタイプの免疫グロブリン単一可変ドメインである。また、これらの領域は、新規抗原受容体可変領域通常、VNARまたはNARVと省略としても知られる。詳細は、MolImmunol44656665およびUS20050043519A参照。用語エピトープ結合ドメインは、別の可変領域またはドメインとは独立に、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばヒト、ラクダまたはサメの免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよく、または下記を含む群から選択された非免疫グロブリンスキャフォールドの誘導体であってもよい。CTLA-4Evibody;リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZ-領域アフィボディ,SpA,A-領域アビマー/マキシボディMaxibody;熱ショックタンパク質、例えばGroELとGroES;トランスフェリントランスボディTrans-body;アンキリンリピートタンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;C-タイプレクチン領域テトラネクチン;ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチンaffilin;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチンアドネクチン;このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。CTLA-4細胞毒性Tリンパ球関連抗原4は主にCD4T細胞上に発現するCD28ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Igフォールドを有する。抗体のCDRに対応するループは、異種の配列と置換して異なる結合特性を出すことができる。異なる結合特異性有するように操作されたCTLA-4分子は、Evibodyとして知られている。詳細は、JournalofImmunologicalMethods2483145を参照のこと。リポカリンは細胞外タンパク質ファミリーで、ステロイドビリンレチノイドおよび脂質、等の小さな疎水性の分子を輸送する。これらは、円錐形構造の開口端に多くのループがある強固なβ-シート二次構造を有し、これは別の標的抗原に結合するように操作できる。Anticalinはサイズが160-180アミノ酸で、リポカリン由来である。詳細は、BiochimBiophysActa1482337350US7250297B1およびUS20070224633を参照のこと。アフィボディは、黄色ブドウ球菌のプロテインA由来のスキャフォールドで、抗原結合するように操作できる。このドメインは約58アミノ酸のらせん状束からなる。ライブラリは表面残基の無作為化により生成されている。詳細は、ProteinEngDesSel17455462およびEP1641818A1を参照のこと。アビマーは、A-ドメインスキャフォールドファミリー由来の多ドメインタンパク質である。約35アミノ酸の未変性ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、A-ドメインファミリー中の天然変異の混ぜ合わせにより生成されている。詳細は、NatureBiotechnology2315561561andExpertOpiniononInvestigationalDrugs16909917を参照のこと。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは許容表面ループに挿入する操作により別の標的抗原に結合させることができる。操作したトランスフェリンスキャフォールドの例には、トランスボディがある。詳細は、JBiolChem2742406624073参照。設計アンキリンリピートタンパク質DARPinは、膜内在性タンパク質の細胞骨格への連結を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン由来である。アンキリンの一回の繰り返しは33残基のチーフで、2つのα-へリックスとβ-ターンを含む。これらは、各繰り返し中の一つ目のα-へリックスとβ-ターンの残基を無秩序化することにより標的抗原に結合するよう操作できる。これらの結合面を、分子の数を増やすことにより増加させることができる親和性成熟の方法。詳細は、JMolBiol332489503PNAS10017001705とJMolBiol36910151028およびUS20040132028A1参照。フィブロネクチンは、抗原に結合させるように操作できるスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトIII型フィブロネクチンFN3における15繰り返し単位の内の10番目のドメインの天然アミノ酸配列骨格からなる。β-サンドイッチの一端の3つのループは操作によりアドネクチンに特異的に目的治療標的を認識させることができる。詳細は、ProteinEngDesSel18435444US20080139791WO2005056764およびUS6818418B1参照。ペプチドアプタマーはコンビナトリアル認識分子で、定常性スキャフォールドタンパク質で構成され、このタンパク質の典型的例には、活性部位に挿入された制限付き可変ペプチドループを含むチオレドキシンTrxAがある。詳細は、ExpertOpinBiolTher5783797参照。ミクロボディは、長さ25-50アミノ酸の天然のマイクロタンパク質由来で、3-4システインブリッジを含む。マイクロタンパク質の例には、KalataB1、コノトキシンおよびノッティンknottinがある。マイクロタンパク質は、ループを有し、これをマイクロタンパク質全体の折り畳みに影響を与えないで25アミノ酸まで含有するように操作できる。操作されたノッティンドメインの詳細については、WO2008098796参照。他のエピトープ結合ドメインには、別の標的抗原の結合特性を操作するためのスキャフォールドとして使われてきたタンパク質、例えばヒトγ-クリスタリンおよびヒトユビキチンaffilin,ヒトプロテアーゼ阻害剤のkunitzタイプドメイン,Ras-結合タンパク質AF-6のPDZドメイン、サソリ毒カリブドトキシン,C-タイプレクチンドメインテトラネクチンがあるこれらは、HandbookofTherapeutic抗体の7章Non抗体ScaffoldsおよびProteinScience151427でレビューされている。本発明のエピトープ結合ドメインは、これらの代替タンパク質ドメイン由来であってもよい。本明細書で使われる用語ペアード対になったVHドメイン,ペアードVLドメイン,およびペアードVH/VLドメインは、それらのパートナー可変ドメインペアとペアの場合のみ抗原に特異的に結合する抗体可変ドメインを指す。いずれの対形成でも常に1つのVHと1つのVLがあり、用語ペアードVHドメインはVHパートナーを指し、用語ペアードVLドメインはVLパートナーを指し、用語ペアードVH/VLドメインは一緒の2つのドメインを指す。本明細書で使われる用語抗原結合タンパク質は、抗体、抗体断片、例えばドメイン抗体dAb,ScFv,FAb,FAb2,およびHGFおよび/またはVEGFに結合可能な他のタンパク質構築物を指す。抗原結合分子は少なくとも1つのIg可変ドメイン、例えば抗体,ドメイン抗体,Fab,Fab’,Fab’2,Fv,ScFv,二特異性抗体,mAbdAbs,アフィボディ,ヘテロコンジュゲート抗体または二重特異性抗体を含み得る。一実施形態では、抗原結合分子は抗体である。別の実施形態では、抗原結合分子はdAb、すなわち免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、異なるV領域またはドメインとは独立して、特異的に抗原またはエピトープに結合するVH,VHHまたはVLである。抗原結合分子は2つの標的に結合可能であってもよく、すなわち、二重標的タンパク質であってもよい。抗原結合分子は、抗体および抗原結合断片の組み合わせ、例えば、1つまたは複数のドメイン抗体および/またはモノクローナル抗体に連結された1つまたは複数のScFvsであってもよい。抗原結合分子はまた非免疫グロブリンドメイン、例えば下記を含む群から選択されたスキャフォールドの誘導体であるドメインを含み得る。CTLA-4Evibody;リポカリン;プロテインA由来分子、例えばプロテインAのZ-領域アフィボディ,SpA,A-ドメインアビマー/マキシボディMaxibody;熱ショックタンパク質、例えばGroELとGroES;トランスフェリントランスボディTrans-body;アンキリンリピートタンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;C-タイプレクチンドメインテトラネクチン;ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチンaffilin;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチンアドネクチン;このドメインは、HGFまたはVEGFに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。本明細書では、抗原結合タンパク質はヒトHGFおよび/またはVEGFに拮抗しおよび/または中和することができる。さらに、抗原結合タンパク質は、HGFおよび/またはVEGFに結合し、天然リガンドが受容体に結合および/または活性化しないようにすることにより、HGFおよび/またはVEGF活性をブロックしてもよい。本明細書では、VEGFアンタゴニストは、VEGFの少なくとも1つの活性を減少または排除することができる任意の化合物を含む。一例として、VEGFアンタゴニストは、VEGFに結合することができ、その結合は、VEGF活性を直接減少または排除することができ、または少なくとも1つのリガンドが受容体に結合するのをブロックすることにより間接的に作用することができる。本明細書では、HGFアンタゴニストは、HGFの少なくとも1つの活性を減少または排除することができる任意の化合物を含む。一例として、HGFアンタゴニストは、HGFに結合することができ、その結合は、HGF活性を直接減少または排除することができ、または少なくとも1つのリガンドが受容体に結合するのをブロックすることにより間接的に作用することができる。本発明の一実施形態では、抗原結合性部位は、Biacore登録商標で測定した場合に、少なくともKd値1mMで抗原に結合し、例えばKd値10nM,1nM,500pM,200pM,100pM,で各抗原に結合する。本明細書で使われる用語抗原結合性部位は、抗原に特異的に結合可能な構築物上の部位を指し、単一ドメイン,例えばエピトープ結合ドメインであっても、標準的抗体上に認められるペアードVH/VLドメインであってもよい。本発明の一部の態様では、単一鎖FVドメインが抗原結合部位を提供し得る。用語定常軽鎖は本明細書では、免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインを指す。発明の詳細な説明本発明はヒト増殖因子HGFアンタゴニストおよび/または血管内皮細胞増殖因子VEGFアンタゴニストを含む組成物を提供する。また、本発明は例えば、治療に使用するためのHGFアンタゴニストとVEGFアンタゴニストの組み合わせを提供する。本発明はまたHGFアンタゴニストをVEGFアンタゴニストと併用して投与することにより疾患を治療する方法を提供する。HGFアンタゴニストとVEGFアンタゴニストを別々に投与しても、順次投与しても、同時に投与してもよい。血管新生の阻害は、増殖する腫瘍への血液の供給を欠乏させるよって、酸素および栄養分を制限する目的で確立された治療アプローチである。複数の血管新生阻害剤が、前臨床癌モデルおよびいくつかの臨床試験で治療上確認されている。アバスチンBevacizumab,VEGFを標的とするモノクローナル抗体は、化学療法と併用して、転移性結腸直腸癌CRCおよび非小細胞肺癌NSCLCの治療のための一次治療として認可されており、多くの小分子化合物が前臨床および臨床開発中である。ある癌、例えば乳癌および結腸癌では、これらのような薬剤が、化学療法と併用して投与されると、疾患の進行を遅らせ、患者の生存期間を数ヶ月増加させるが、単独で投与した場合はそうではない。実際、いくつかの臨床試験では、Bevacizumabのみの治療は、化学療法CTプラス治療に比べ成績が劣るために早期に打ち切られた。当初、この所見は矛盾していると考えられた。というのも、腫瘍血液供給の減少が、CTを腫瘍に送達させることができる程度を制限することが示されていたからである。この所見を正当化する試みは、Bevacizumabの効果は腫瘍の特徴的に障害された血管系を正常化するという提案に基づく。血管正常化の仮定効果は、間質液圧IFPの減少であり、血流の増加およびCT薬の腫瘍のコアへの浸透が得られる。CTとの併用におけるBevacizumabの効果に対する別の理論は、VEGFの遮断は、栄養分および酸素供給を減少させ、アポトーシス促進性イベントを誘発し、これはCTにより誘導されたものを増強することを示唆する。インビボモデルでの最近の研究は、診療所で、VEGF経路の阻害を標的とする単独療法において使用される場合の、抗血管新生阻害剤の長期有効性の欠如をより明らかにし始めている。いくつかの報告が、そのようなアプローチの抗腫瘍効果を証明しているが、また、同時の腫瘍順応およびより悪性度の高い段階への進行も示し、侵襲性が高くなり、場合によっては、リンパおよび遠隔転移が増加する。そのため、癌細胞の酸素を欠乏させた低酸素結果は、原発腫瘍増殖に対する有益な効果に加えて、それを求めて他の場所へ腫瘍細胞を駆動すると考えられる。言い換えれば、新血管新生を効果的に阻害することにより、抗腫瘍効果および生存利益を生成させる抗血管新生療法は、さらに、浸潤および転移を増加させることにより腫瘍の表現型を変えることができる。他の報告は、低酸素は、癌細胞にMETを産生させ、HGF/MET媒介経路を介するシグナリングを増加させ、これにより、それらの細胞が高い運動性を有するようになり、遠隔部位まで移動するようになる転移拡散ことを示している。さらに、VEGF阻害剤単独の延長使用は、別の新血管新生経路の使用を促進する可能性があり、生存率の増加に伴い薬物耐性の可能性が広がる。よって、二重特異性分子は、単一の薬剤中で、HGF抗体の活性腫瘍増殖、血管新生および転移の抑制と、VEGF遮断の抗血管新生効果を組み合わせ、各成分を別個に使用した場合に比べいくつかの利点を有する。相乗効果の可能性があり、というのも、HGFおよびVEGFの同時中和は、細胞の低酸素への転移性応答を抑制することができ、一方、改善された血管新生制御を送達させる。さらに、これらの2つの活性を組み合わせると、患者の生存率が増加するように、単一薬剤抗血管新生治療に対する薬物耐性の可能性を制限することができる。このようなアンタゴニストは、抗体であっても、エピトープ結合ドメイン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよい。アンタゴニストは、別々の分子の組み合わせとして、同時に投与、すなわち同時投与co-administered、あるいは互いを例えば20時間以内、または15時間以内、または12時間以内、または10時間以内、または8時間以内、または6時間以内、または4時間以内、または2時間以内、または1時間以内、または30分以内、の投与のように24時間以内に投与してもよい。本発明において使用される他のHGFアンタゴニストは、抗c-MET抗体,例えばWO2009007427に記載される抗体を含む。本発明の他の態様においては、配列番号92、配列番号94、配列番号96または配列番号98から選択される重鎖可変配列を含む抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体である。抗原結合タンパク質は配列番号100または配列番号102から選択される軽鎖可変配列、または配列番号86または88の軽鎖を含みうる。本明細書に記載の本発明の一態様においては、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号191、配列番号192、配列番号193または配列番号194から選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態においては、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質であって、VEGFと結合し、例えば、VEGFと結合するエピトープ結合ドメインを含み、かつ配列番号104、配列番号106、配列番号108または配列番号110、配列番号191、配列番号192、配列番号193または配列番号194から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70、または少なくとも75、または少なくとも80または少なくとも85または少なくとも90または少なくとも95または少なくとも99配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである前記抗原結合タンパク質が提供される。抗原結合タンパク質はさらに本発明の上記態様による抗HGF抗体を含んでもよい。抗HGF抗体はリンカーによりVEGF特異的エピトープ結合ドメインと連結されていてもよい。一実施形態においては、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質であって、HGFと結合し、例えば、HGFと結合するエピトープ結合ドメインを含み、かつ配列番号76、配列番号78、配列番号80または配列番号82から選択される重鎖配列と少なくとも70、または少なくとも75、または少なくとも80または少なくとも85または少なくとも90または少なくとも95または少なくとも99配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである前記抗原結合タンパク質が提供される。本明細書に記載の本発明のさらなる実施形態において、抗原結合タンパク質はさらに、例えば、配列番号163~170、配列番号187~190、または配列番号195または196から選択されるリンカーを含んでもよい。さらなる実施形態において、アンタゴニストは2つ以上の抗原に結合可能な1つの分子として存在し、例えば、本発明は、HGFおよびVEGFに結合可能な、またはHGFおよびVEGFR2に結合可能な、またはcMETおよびVEGFに結合可能な二重標的化分子を提供する。本発明は1つ以上のエピトープ結合ドメインに連結されたペアードVHVLドメインを含む抗原結合タンパク質であって、少なくとも2つの抗原結合部位少なくともその内の1つはエピトープ結合ドメイン由来であり、またその内の少なくとも1つはHGFに結合するを有する前記抗原結合タンパク質を提供する。本発明は1つ以上のエピトープ結合ドメインに連結されたペアードVHVLドメインを含む抗原結合タンパク質であって、ペアードVHVLドメインは1つまたは複数のエピトープ結合ドメインに結合し、当該抗原結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合性部位を有し、少なくともその内の1つがエピトープ結合ドメイン由来であり、また少なくともその内の1つがペアードVH/VLドメイン由来であり、またこの抗原結合性部位の少なくとも1つがVEGFに結合する。このような抗原結合タンパク質は、1つまたは複数のエピトープ結合ドメイン例えばドメイン抗体に結合するペアードVHVL例えばモノクローナル抗体を含み、ここで結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合性部位を有し、その内の少なくとも1つがエピトープ結合ドメイン由来であり、また抗原結合性部位の少なくとも1つがHGFに結合する。また、本発明はこれを産生する方法および使用、特に治療で使用する方法に関する。本発明の抗原結合タンパク質はまたmAbdAbとも呼ばれる。本発明の抗原結合タンパク質は少なくとも2つの抗原結合性部位を有し、例えば2つの結合部位をの内、一つ目の結合部位は抗原上の第1のエピトープに特異性を有し、二つ目の結合部位は同じ抗原上の第2のエピトープに特異性を有する。さらなる実施形態では、4つの抗原結合性部位,または6つの抗原結合性部位,または8つの抗原結合性部位,または10個以上の抗原結合性部位を有する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は1以上の抗原に対して、例えば、2つ以上の抗原,例えば2つの抗原,または3つの抗原,または4つの抗原に対して特異性を有する。本発明の一実施形態では、エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン単一可変ドメインである。いずれかの本明細書記載の抗原結合タンパク質は1つまたは複数の抗原を中和することができ、例えばHGFの中和およびVEGFの中和も可能であることは、理解されるであろう。本発明の抗原結合タンパク質に関連して本明細書で使われる用語中和するおよびその文法的変形体は、本発明の抗原結合タンパク質の存在下、このような抗原結合タンパク質の無い場合の標的の活性に比較して、全体的または部分的に標的の生物活性が低下することを意味する。これに限定されないが、中和が、1つまたは複数のリガンドのブロッキング、受容体を活性化するリガンドの阻害、受容体の発現低下、またはエフェクター機能への作用、によるものであってもよい。中和のレベルはいくつかの方法、例えば、下記実施例において設定されるアッセイ法のいずれかを使用することにより、例えば、リガンドの受容体への結合の阻止を測定するアッセイ法において測定可能である。この測定法は、例えば実施例10に記載のように実施される。このアッセイでは、HGFの中和は、中和する抗原結合タンパク質の存在下でMETのリン酸化Metリン酸化はHGFにより刺激されるの減少を評価することにより測定される。このアッセイにおいて使用するのに好適なHGFタンパク質としてはNCBI参照配列:NM_000601.4UniProtIDP14210の配列を含むHGFタンパク質が挙げられる。VEGFの中和のレベルは、例えば、実施例11において記載されるアッセイにより測定することができる。このアッセイにおいて使用するのに好適なVEGFタンパク質としては、NCBI参照配列NP_001020539.2UniProtID:P15692を含むVEGF165が挙げられる。中和を評価する他の方法で、例えば中和する抗原結合タンパク質の存在下、リガンドとその受容体間の結合低下を評価することにより測定する方法は、当業者には既知であり、例えばBiacore登録商標アッセイがある。一実施形態においては、それ故に、HGFを中和するかまたはVEGFを中和する、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質が提供される。さらなる実施形態においては、HGFとVEGFの両方を中和する、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質が提供される。本発明の代わりの態様においては、本明細書に例示した抗原結合タンパク質と少なくとも実質的に同等の中和活性を有する抗原結合タンパク質が提供される。本発明の抗原結合タンパク質はHGFに対して特異性を有する、例えば、これらはHGFに結合可能なエピトープ結合ドメインを含む、および/またはこれらはHGFと結合するペアードVHVLを含む。抗原結合タンパク質はHGFに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はHGFに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗原結合タンパク質はVEGFに対して特異性を有する、例えば、これらはVEGFに結合可能なエピトープ結合ドメインを含む、および/またはこれらはVEGFと結合するペアードVHVLを含む。抗原結合タンパク質はVEGFに結合可能な抗体を含んでもよい。抗原結合タンパク質はVEGFに結合可能な免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態においては、本明細書に記載した抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。例えば、VEGFとの結合を、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号191、配列番号192、配列番号193または配列番号194から選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。例えば、HGFとの結合を、配列番号92、配列番号94、配列番号96または配列番号98から選択される可変重鎖配列を含む抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質が提供される。さらなる実施形態においては、HGFとVEGFの両方との結合を競合しかつ配列番号92、配列番号94、配列番号96または配列番号98、配列番号104、SEQIDNO106、配列番号108、配列番号110、配列番号191、配列番号192、配列番号193または配列番号194から選択される可変重鎖配列を含む抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態においては、VEGFと結合しかつ配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号191、配列番号192、配列番号193または配列番号194から選択される配列と少なくとも70、または少なくとも75、または少なくとも80または少なくとも85または少なくとも90または少なくとも95または少なくとも99配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は1つ以上の抗原に対して特異性を有し、例えば、HGFおよびVEGFと結合できる。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は、HGFおよびVEGFと同時に結合できる。一実施形態においては、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質であって、HGFと結合し、例えば、HGFと結合するエピトープ結合ドメインを含み、かつ配列番号76、配列番号78、配列番号80または配列番号82から選択される重鎖配列と少なくとも70、または少なくとも75、または少なくとも80または少なくとも85または少なくとも90または少なくとも95または少なくとも99配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである前記抗原結合タンパク質が提供される。例えば、実施例7に記載のような好適なアッセイを用いることにより、本明細書に記載の抗原結合タンパク質はいずれも2つ以上の抗原と同時に結合できることが理解されるであろう。かかる抗原結合タンパク質の例には、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に取付けられたHGFアンタゴニストであるエピトープ結合ドメイン、例えば、抗HGF免疫グロブリン単一可変ドメインを有する抗VEGF抗体が含まれる。かかる抗原結合タンパク質の例には、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に取付けられたVEGFアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインを有する抗HGF抗体が含まれる。例えば、配列番号76、78、80、82もしくは84に記載の重鎖配列および/または配列番号86もしくは88に記載の軽鎖配列を含む抗原結合タンパク質であって、重鎖および軽鎖の1つまたは両方がさらに1つ以上のVEGFにアンタゴニストとして作用しうる1つ以上のエピトープ結合ドメインを含む前記抗原結合タンパク質が含まれる。かかるエピトープ結合ドメインは配列番号181、182および配列番号104、106、108、110、191、192、193または194に記載のものから選択することができる。特別な実施形態において、抗原結合タンパク質は配列番号78の重鎖配列と配列番号86の軽鎖配列を含み、ここで、重鎖と軽鎖の1つまたは両方が、任意には重鎖が、さらにVEGFまたはVEGF受容体、任意にはVEGFにアンタゴニストとして作用可能なエピトープ結合ドメインを含む。特別な実施形態において、エピトープ結合ドメインは配列番号194に記載の配列を有する。エピトープ結合ドメインは、本明細書に記載のように、長さで1~20アミノ酸のリンカーを用いて抗原結合タンパク質に取付けてもよい。かかる抗原結合タンパク質の例には、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に取付けられたVEGF免疫グロブリン単一可変ドメインを含むエピトープ結合ドメインを有するHGF抗体、例えば、配列番号112~162に設定した重鎖配列および配列番号86または88に設定した軽鎖配列を有する抗原結合タンパク質が含まれる。一実施形態において、抗原結合タンパク質はVEGFアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインに連結された抗HGF抗体を含みうるのであって、ここで、前記抗HGF抗体は、配列番号78、82または84の重鎖配列および配列番号86の軽鎖配列を有する抗体、または配列番号48の重鎖配列および配列番号50の軽鎖配列を有する抗体、または配列番号52の重鎖配列および配列番号54の軽鎖配列を有する抗体、または配列番号56の重鎖配列および配列番号58の軽鎖配列を有する抗体と同じCDRを有する。一実施形態において、抗原結合タンパク質はVEGFアンタゴニストであるエピトープ結合ドメインに連結された抗HGF抗体を含みうるのであって、ここでその重鎖配列は配列番号112、114、115、117、118、123、125、126、131、133または134を含みかつその軽鎖は配列番号86または88を含む。本明細書で有用なHGF抗体のさらなる詳細はWO2005017107、WO2007143098およびWO2007115049に記載されている。かかる抗原結合タンパク質の例には、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に取付けられた抗VEGFエピトープ結合ドメインを有する抗HGF抗体が含まれ、ここで、VEGFエピトープ結合ドメインは配列番号104、106、108、110、191、192、193または194に記載されたVEGFdAb配列のいずれかから選択されるVEGFdAbが含まれる。一実施形態において、抗原結合タンパク質には、重鎖のC末端もしくはN末端または軽鎖のC末端もしくはN末端に取付けられた抗VEGFエピトープ結合ドメインを有する抗HGF抗体が含まれ、ここで、VEGFエピトープ結合ドメインは配列番号104、106、108、110、191、192、193または194に記載されたVEGFdAb配列のいずれかから選択されるVEGFdAbが含まれる。本明細書で使用する用語エフェクター機能は、1以上の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性活性ADCC、補体依存性細胞傷害性活性CDC媒介性応答、Fc媒介性食作用およびFcRnを介する抗体リサイクリングを意味する。IgG抗体については、ADCCおよびADCPを含むエフェクター機能は、重鎖定常域とFcγ受容体ファミリー免疫細胞の表面上に存在するとの相互作用により媒介される。ヒトにおいて、これらはFcγRICD64、FcγRIICD32およびFcγRIIICD16が含まれる。抗原と結合した抗原結合タンパク質の間の相互作用とFcFcγR複合体の形成は、細胞傷害性、免疫細胞活性化、食作用および炎症性サイトカイン放出を含むある範囲の効果を誘導する。抗原結合タンパク質の定常域と様々なFc受容体FcRとの間の相互作用が抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられている。有意な生物学的効果、特に抗体依存性細胞傷害性ADCC、補体の固定補体依存性細胞傷害性もしくはCDCおよび抗原結合タンパク質の半減期/クリアランスは、エフェクター機能の結果でありうる。通常、エフェクター機能を媒介する能力は抗原結合タンパク質の抗原との結合を必要とし、全ての抗原結合タンパク質が全てのエフェクター機能を媒介しうるのではない。エフェクター機能はいくつもの手法で測定することができ、例えば、FcγRIIIを介するナチュラルキラー細胞との結合またはFcγRIを介する単球/マクロファージとの結合でADCCエフェクター機能を測定する手法が含まれる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質のADCCエフェクター機能をナチュラルキラー細胞アッセイで評価することができる。かかるアッセイの例は、Shieldsetal2001TheJournalofBiologicalChemistryVol276p65916604;Chappeletal1993TheJournalofBiologicalChemistryVol268p2512425131;Lazaretal2006PNAS103;40054010に記載されている。CDC機能を決定するアッセイの例には、1995JImmMeth184:2938に記載のものが含まれる。ヒト定常域のいくつかのアイソタイプ、特にIgG4およびIgG2アイソタイプは、本質的にa古典的経路による補体の活性化;およびb抗体依存性細胞傷害性の機能を欠く。抗原結合タンパク質の重鎖定常域に対する様々な改変を所望のエフェクター特性に応じて行うことができる。特定の突然変異を含有するIgG1定常域はFc受容体との結合を低減し、それ故にADCCおよびCDCを低減することが別々に記載されているDuncanetalNature1988332;563564;LundetalJImmunol199114726572662;ChappeletalPNAS19918890369040;BurtonandWoofAdvImmunol199251184;MorganetalImmunology199586319324;HezarehetalJVirol2001751216112168。本発明の一実施形態においては、定常域を含んでその結果、ADCCおよび/または補体活性化またはエフェクター機能の低下した抗原結合タンパク質が提供される。かかる一実施形態においては、重鎖定常域は天然の無力化したIgG2またはIgG4アイソタイプ定常域または変異したIgG1定常域を含みうる。好適な改変の例はEP0307434に記載されている。一例として、アラニン残基の位置235および237における置換が挙げられるEU指数番号付けによる。残基Asn297における特定の突然変異またはグリコシル化の改変を含有するヒトIgG1定常域はまた、Fc受容体との結合を増強することが記載されている。いくつかの事例において、これらの突然変異はまた、ADCCおよびCDCを増強することが示されているLazaretalPNAS2006103;40054010;ShieldsetalJBiolChem2001276;65916604;NechanskyetalMolImmunol200744;18151817。本発明の一実施形態においては、かかる突然変異が239、332および330IgG1から選択される1以上の位置、または他のIgGアイソタイプにおける同等の位置に存在する。好適な突然変異の例はS239DおよびI332EおよびA330Lである。一実施形態においては、本明細書に記載の本発明の抗原結合タンパク質は位置239および332において、例えばS239DおよびI332Eにおいて突然変異があるか、または、さらなる実施形態においては、239および332および330から選択される3つ以上の位置、例えばS239DおよびI332EおよびA330Lにおいて突然変異があるEU指数番号付けによる。本発明の代わりの実施形態において、抗原結合タンパク質は改変グリコシル化プロファイルをもつ重鎖定常域を含み、その結果、抗原結合タンパク質は増強されたエフェクター機能を有する。例えば、その場合、抗原結合タンパク質は増強されたADCCもしくは増強されたCDCを有するかまたは増強されたADCCとCDCの両方のエフェクター機能を有する。改変グリコシル化プロファイルをもつ抗原結合タンパク質を産生するのに好適な技法の例は、WO2003011878、WO2006014679およびEP1229125に記載されており、これらは全て本発明の抗原結合タンパク質に応用することができる。本発明はまた、本発明による抗原結合タンパク質を産生する方法であって;a本明細書に記載の単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養するステップであって、組換え宿主細胞中のα16フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活化されている前記ステップ;およびb抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである前記方法を提供する。抗原結合タンパク質を生産するためのかかる方法は、例えば、BioWaIncPrincetonNJから入手しうるPOTELLIGENTTM技術システムを用いて実施することができて、その場合、FUT8遺伝子の機能性コピーを欠くCHOK1SV細胞は、機能性FUT8遺伝子をもつ細胞において産生される同一のモノクローナル抗体と比較して、より多くの増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性ADCC活性をもつモノクローナル抗体を産生する。POTELLIGENTTM技術システムの態様はUS7214775、US6946292、WO0061739およびWO0231240に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。当業者はまた、他の適当なシステムを認識するであろう。本発明の一実施形態においては、キメラ重鎖定常域を含む抗原結合タンパク質、例えば、少なくとも1つのIgG3由来のCH2ドメインをもつキメラ重鎖定常域を含み、その結果、抗原結合タンパク質は増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCCもしくは増強されたCDC、または増強されたADCCおよびCDC機能を有する抗原結合タンパク質が提供される。かかる一実施形態において、抗原結合タンパク質はIgG3からの1つのCH2ドメインまたはIgG3からの両方のCH2ドメインを含んでもよい。また、本発明による抗原結合タンパク質を産生する方法であって、a本明細書に記載の単離された核酸を含む発現ベクターここで、発現ベクターはIgG1とIgG3両方のFcドメインのアミノ酸残基を有するFcドメインをコードする核酸配列を含むを含む組換え宿主細胞を培養するステップ;およびb抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである前記方法が提供される。抗原結合タンパク質を産生するかかる方法は、例えば、BioWaIncPrincetonNJおよびKyowaHakkoKogyo現在、KyowaHakkoKirinCoLtdCo、Ltdから入手しうるCOMPLEGENTTM技術システムを用いて実施することができ、この方法では、組換え宿主細胞において、IgG1とIgG3の両方のFcドメインアミノ酸残基を有するキメラFcドメインをコードする核酸配列を有する発現ベクターが発現され、かかるキメラFcドメインを欠く他の同等の抗原結合タンパク質と比較してより大きい増強された補体依存性細胞傷害CDC活性を有する抗原結合タンパク質を産生する。COMPLEGENT技術システムの態様はWO2007011041およびUS20070148165に記載されていて、これらはそれぞれ本明細書に参照により組み込まれる。代わりの実施形態においては、配列特異的突然変異をIgG鎖のFc域中に導入することによりCDC活性を増加することができる。当業者はまた、他の適当なシステムも認識するであろう。当業者には、さらにエフェクター機能を増強するために、かかる改変を単独で用いるだけでなく、お互いを組み合わせて利用しうることは明らかであろう。本発明のかかる一実施形態においては、突然変異したキメラ重鎖定常域を含む重鎖定常域を含む抗原結合タンパク質が提供され、例えば、ここで、抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのIgG3からのCH2ドメインおよび1つのIgG1からのCH2ドメインを含み、ここで、IgG1CH2ドメインは239、332および330から選択される位置において1以上の突然変異を有し例えば、突然変異はS239D、I332EおよびA330Lから選択しうる、その結果、増強されたエフェクター機能、例えば、増強されたADCCまたは増強されたCDCのうちの1つ以上の機能を有する、例えば、増強されたADCCおよび増強されたCDCを有する、抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態においてはIgG1CH2ドメインは突然変異S239DおよびI332Eを有する。本発明の代わりの実施形態においては、キメラ重鎖定常域を含みかつ改変グリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質が提供される。かかる一実施形態において、重鎖定常域は少なくとも1つのIgG3からのCH2ドメインおよび1つのIgG1からのCH2ドメインを含みかつ改変グリコシル化プロファイルを有し、その結果、フコース対マンノースの比が08:3以下であり、例えば、抗原結合タンパク質は脱フコシル化され、その結果、前記抗原結合タンパク質は前記突然変異および改変グリコシル化プロファイルを欠く同等の抗原結合タンパク質と比較して増強されたエフェクター機能を有し、例えば、増強されたADCCまたは増強されたCDCのうちの1つ以上の機能を有する、例えば、増強されたADCCおよび増強されたCDCを有する。代わりの実施形態において、抗原結合タンパク質は少なくとも1つのIgG3CH2ドメインおよび少なくとも1つのIgG1からの重鎖定常ドメインを有し、ここで両方のIgGCH2ドメインは本明細書に記載の制限に従って突然変異している。本発明の一態様においては、本明細書に記載の本発明による抗原結合タンパク質を産生する方法であって、a本明細書に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養するステップであって、前記発現ベクターがさらにIgG1およびIgG3両方のFcドメインアミノ酸残基を有するキメラFcドメインをコードするFc核酸配列を含み、ここでα16フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が組換え宿主細胞において不活化されている前記ステップ;およびb抗原結合タンパク質を回収するステップを含むものである前記方法が提供される。抗原結合タンパク質を産生するかかる方法は、例えば、BioWaIncPrincetonNJから入手しうるACCRETAMABTM技術システムPOTELLIGENTTMとCOMPLEGENTTM技術システムを組み合わせたものを用いて実施し、キメラFcドメインを欠きかつオリゴ糖にフコースを有しその他は同等であるモノクローナル抗体と比較して、ADCCとCDCの両方の活性が増強された抗原結合タンパク質を産生することができる。本発明のさらに他の実施形態では、突然変異したキメラ重鎖定常域を含む抗原結合タンパク質であって、改変グリコシル化プロファイルを有しその結果、増強されたエフェクター機能を有する、例えば、増強されたADCCまたは増強されたCDCのうちの1つ以上の機能を有する前記抗原結合タンパク質が存在する。一実施形態において、前記突然変異は位置239および332および330から選択され、例えば、前記突然変異はS239DおよびI332EおよびA330Lから選択される。さらなる実施形態において、重鎖定常域は少なくとも1つのIgG3からのCH2ドメインおよび1つのIgG1からのCH2ドメインを含む。一実施形態において、重鎖定常域は改変グリコシル化プロファイルを有し、その結果、フコース対マンノースの比が08:3以下であり、例えば、抗原結合タンパク質は脱フコシル化され、その結果、前記抗原結合タンパク質は同等の非キメラ抗原結合タンパク質とまたは前記突然変異および改変グリコシル化プロファイルを欠く免疫グロブリン重鎖定常域と比較して増強されたエフェクター機能を有する。本発明の抗原結合タンパク質を改変する他の手法は、免疫グロブリン定常ドメインの改変またはFcRnFc受容体新生児結合ドメインによってかかるタンパク質のinvivo半減期を増加することに関わる。成人哺乳動物において、FcRn新生児Fc受容体としても知られるは、IgGアイソタイプと結合しかつ分解から救出する保護受容体として作用することにより血清抗体レベルの維持に重要な役割を果たす。IgG分子は内皮細胞によりエンドサイトーシスを受け、もしFcRnと結合すれば、循環中にリサイクルされる。対照的に、FcRnと結合しないIgG分子は細胞内に進入し、リソソーム経路に標的化されて分解される。新生児FcRn受容体は組織全体の抗体クリアランスおよび経細胞輸送に関わると思われるJunghansRP1997ImmunolRes162957およびGhetieetal2000AnnuRevlmmunol18739766を参照されたい。ヒトFcRnと直接相互作用することが確認されているヒトIgG1残基にはIle253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434およびHis435が含まれる。本節に記載したこれらの位置のいずれかのスイッチは、本発明の抗原結合タンパク質の血清半減期の増加および/またはエフェクター特性の改変を可能にする。本発明の抗原結合タンパク質は、FcRnに対する定常ドメインまたはそのフラグメントのアフィニティを増加するアミノ酸改変を有してもよい。治療および診断用のIgGおよび他の生体活性分子の半減期の増加は多くの利益を有し、それにはこれらの分子の投薬の量および頻度を減ずることが含まれる。一実施形態においては、それ故に、1つ以上のこれらのアミノ酸改変を有するIgG定常ドメインの全てまたは一部分FcRn結合部分、ならびに、かかる改変IgG定常ドメインとコンジュゲートした非IgGタンパク質または非タンパク質分子ここで、改変IgG定常ドメインの存在は抗原結合タンパク質のinvivo半減期を増加するを含む、本明細書に与えた本発明による抗原結合または融合タンパク質が提供される。PCT公開WO0042072は、改変FcRn結合アフィニティをもつ変異体Fc領域を含むポリペプチドを開示し、前記ポリペプチドは1以上のアミノ酸位置:Fc領域の238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、および447におけるアミノ酸改変を含み、ここでFc領域の残基の番号付けはEUインデックスKabatetalのそれによる。PCT公開WO02060919A2は、野生型IgG定常ドメインと比較して1つ以上のアミノ酸改変を含むIgG定常ドメインを含む改変IgGを開示し、前記改変IgGは野生型IgG定常ドメインを有するIgGの半減期と比較して増加した半減期を有し、ここで、1つ以上のアミノ酸改変は1つ以上の位置251、253、255、285290、308~314、385~389、および428~435においてである。Shieldsら2001JBiolChem2766591604はアラニン走査突然変異誘発を用いてヒトIgG1抗体のFc域中の残基を改変し、次いでヒトFcRnとの結合を評価した。アラニンへ変更した場合に、FcRnとの結合を効果的に抑止した位置にはI253、S254、H435、およびY436が含まれる。結合の低下が顕著でない他の位置は次の通りであった:E233~G236、R255、K288、L309、S415、およびH433。いくつかのアミノ酸位置は、アラニンに変えるとFcRn結合の改善を示した:これらのうち顕著なものはP238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424、およびN434である。多くの他のアミノ酸位置はFcRn結合にわずかな改善を示すD265、N286、V303、K360、Q362、およびA378かまたは変化がなかったS239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444、およびK447。最も顕著な効果は、FcRnとの結合が改善された組み合わせ変異体について見出された。pH60において、E380AN434A変異体は生来のIgG1と比較して8倍を超えるFcRnとの優れた結合を示し、E380Aの2倍およびN434Aの35倍に比較しえた。T307Aをこれに加えると、生来のIgG1と比較して12倍の改善をもたらした。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質はE380AN434A突然変異を含み、FcRnとの結合を増加した。DallAcquaら2002JImmunol169517180は、マウスFcRnに対するヒトIgG1ヒンジFcフラグメントファージディスプレイライブラリーの無作為突然変異誘発およびスクリーニングを記載している。彼らは位置251、252、254~256、308、309、311、312、314、385~387、389、428、433、434、および436の無作為突然変異誘発を開示した。IgG1ヒトFcRn複合体安定性の大きな改善がFcFcRn界面を横切るバンドに位置する残基M252、S254、T256、H433、N434、およびY436を置換することで起こり、そしてより小さい改善がV308、L309、Q311、G385、Q386、P387、およびN389のような末梢の残基の置換に広がる。ヒトFcRnに対する最高のアフィニティをもつ変異体はM252YS254TT256EおよびH433KN434FY436H突然変異を組み合わせることにより得られ、野生型IgG1と比較して57倍のアフィニティ増加を示した。かかる突然変異したヒトIgG1のinvivo挙動は、野生型IgG1と比較してカニクイザルにおける血清半減期のほぼ4倍増加を示した。本発明はそれ故に、FcRnと最適化結合をした抗原結合タンパク質の変異体を提供する。好ましい実施形態において、前記抗原結合タンパク質の変異体は、前記親ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を前記抗原結合タンパク質のFc域中に含み、ここで前記改変は、Fc域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446および447から成る群より選択されるここで、Fc域のアミノ酸の番号付けはKabatにおけるEU指数によるものである。本発明のさらなる態様において、改変はM252YS254TT256Eである。さらに様々な開示物が半減期の改変された生理活性分子を得る方法を記載しており、それらはFcRn結合ポリペプチドを分子中に導入することによるWO9743316;米国特許5869046;米国特許5747035;WO9632478;WO9114438、または分子をFcRn結合アフィニティは保存されるが他のFc受容体に対するアフィニティが非常に低い抗体と融合することによるWO9943713、または抗体のFcRn結合ドメインと融合することによるWO0009560;米国特許4703039ものである。さらに、生物学的半減期が減少した抗原結合タンパク質を産生する方法も提供される。His435をアラニンに突然変異させた変異体IgGはFcRn結合の選択的喪失をもたらし、血清半減期が有意に低下するFiranetal2001Internationalimmunology13:993。米国特許6165745は、抗原結合タンパク質をコードするDNAセグメント中にある突然変異を導入することによる生物学的半減期の減少した抗原結合タンパク質を産生する方法を開示している。その突然変異には、Fcヒンジドメインの位置253、310、311、433、または434におけるアミノ酸置換が含まれる。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ドメイン抗体dAbであるエピトープ結合ドメインを含み、例えば、エピトープ結合ドメインがヒトVHまたはヒトVLであっても、ラクダVHHナノボディまたはサメdAbNARVであってもよい。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、下記の群から選択されたスキャフォールド誘導体であるエピトープ結合ドメインを含む。CTLA-4Evibody;リポカリン;プロテインA由来分子例えばプロテインAのZドメインアフィボディ,SpA,Aドメインアビマー/マキシボディ;GroELやGroES等の熱ショックタンパク質;トランスフェリントランスボディ;アンキリンリピートタンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;C-タイプレクチンドメインテトラネクチン;ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチンaffilin;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチン;このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われたものである。本発明の抗原結合タンパク質は、アドネクチンであるエピトープ結合ドメインに結合したタンパク質スキャフォールド、例えば、重鎖のC末端に結合したアドネクチンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、またはアドネクチンに結合したタンパク質スキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したアドネクチンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または,アドネクチンに結合したタンパク質スキャフォールド、例えば、軽鎖のC末端に結合したアドネクチンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または,アドネクチンに結合したタンパク質スキャフォールド、例えば、軽鎖のN末端に結合したアドネクチンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばCTLA-4であるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したCTLA-4を有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したCTLA-4を有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したCTLA-4を有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したCTLA-4を有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばリポカリンであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したリポカリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したリポカリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したリポカリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したリポカリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばSpAであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したSpAを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したSpAを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したSpAを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したSpAを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばアフィボディであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したアフィボディを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したアフィボディを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したアフィボディを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したアフィボディを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばaffimerであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したaffimerを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したaffimerを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したaffimerを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したaffimerを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばGroELであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したGroELを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したGroELを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したGroELを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したGroELを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばトランスフェリンであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したトランスフェリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したトランスフェリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したトランスフェリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したトランスフェリンを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばGroESであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したGroESを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したGroESを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したGroESを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したGroESを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばDARPinであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したDARPinを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したDARPinを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したDARPinを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したDARPinを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、タンパク質スキャフォールド、例えばペプチドアプタマーであるエピトープ結合ドメインに結合したIgGスキャフォールド、例えば、重鎖のN末端に結合したペプチドアプタマーを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、重鎖のC末端に結合したペプチドアプタマーを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、例えば、軽鎖のN末端に結合したペプチドアプタマーを有するIgGスキャフォールドを含んでもよく、または、軽鎖のC末端に結合したペプチドアプタマーを有するIgGスキャフォールドを含んでもよい。本発明の一実施形態では、4つのエピトープ結合ドメイン、例えば4つのドメイン抗体があり、2つのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよく、抗原結合タンパク質中に存在する全てのエピトープ結合ドメインが同じ抗原に対し特異性を有してもよい。本発明のペアードVHVLドメイン、抗原及びタンパク質スキャフォールドは、リンカーを使ってエピトープ結合ドメインに連結してもよい。適切なリンカーの例は、長さで1アミノ酸~150アミノ酸,または1アミノ酸~140アミノ酸,例えば、1アミノ酸~130アミノ酸,または1~120アミノ酸,または1~80アミノ酸,または1~50アミノ酸,または1~20アミノ酸,または1~10アミノ酸,または5~18アミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。このような配列は、それ自身の三次構造を有してもよく、例えば、本発明のリンカーが単一可変ドメインを含んでもよい。一実施形態では、リンカーのサイズは、単一可変ドメインと同等である。適切なリンカーは、サイズが1~20オングストロームであってもよく、例えば、15オングストローム未満,または10オングストローム未満,または5オングストローム未満であってもよい。本発明の一実施形態では、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインはIgスキャフォールドに直接に結合し、このスキャフォールドは、1~150アミノ酸、例えば、1~20アミノ酸、例えば1~10アミノ酸からなるリンカーを有している。このようなリンカーは、リンカーGSであってもよいし、配列番号163170195または196で示されるもののいずれか1つから選択することができ、または、これらリンカーの複合であってもよい。本発明の抗原結合タンパク質で使用するリンカーは、単体でも他のリンカー、1つまたは複数のGS残基のセット、例えば、GSTVAAPSまたはTVAAPSGSまたはGSTVAAPSGSであってもよい。一実施形態ではリンカーは配列番号163を含む。一実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーPASnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーGGGGSnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーTVAAPSnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーGSmTVAAPSGSnによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーPAVPPPnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーTVSDVPnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインは、リンカーTGLDSPnGSmによりIgスキャフォールドに結合している。この全ての実施形態で、n=1~10,およびm=0~4である。このようなリンカーに例には、PASnGSmここでn=1およびm=1,PASnGSmここでn=2およびm=1,PASnGSmここでn=3およびm=1,PASnGSmここでn=4およびm=1,PASnGSmここでn=2およびm=0,PASnGSmここでn=3およびm=0,PASnGSmここでn=4およびm=0がある。このようなリンカーに例には、GGGGSnGSmここでn=1およびm=1,GGGGSnGSmここでn=2およびm=1,GGGGSnGSmここでn=3およびm=1、GGGGSnGSmここでn=4およびm=1,GGGGSnGSmここでn=2およびm=0,GGGGSnGSmここでn=3およびm=0,GGGGSnGSmここでn=4およびm=0がある。このようなリンカーに例には、TVAAPSnGSmここでn=1およびm=1配列番号:163,TVAAPSnGSmここでn=2およびm=1,TVAAPSnGSmここでn=3およびm=1,TVAAPSnGSmここでn=4およびm=1,TVAAPSnGSmここでn=1およびm=0配列番号:164,TVAAPSnGSmここでn=2およびm=0,TVAAPSnGSmここでn=3およびm=0配列番号:166,TVAAPSnGSmここでn=4およびm=0がある。このようなリンカーに例には、GSmTVAAPSGSnここでn=1およびm=1,GSmTVAAPSGSnここでn=2およびm=1,GSmTVAAPSGSnここでn=3およびm=1,またはGSmTVAAPSGSnここでn=4およびm=1,GSmTVAAPSGSnここでn=5およびm=1,GSmTVAAPSGSnここでn=6およびm=1,GSmTVAAPSGSnここでn=1およびm=0,GSmTVAAPSGSnここでn=2およびm=10,GSmTVAAPSGSnここでn=3およびm=0,GSmTVAAPSGSnここでn=3およびm=1配列番号:165,またはGSmTVAAPSGSnここでn=0がある。このようなリンカーに例には、PAVPPPnGSmここでn=1およびm=1,PAVPPPnGSmここでn=2およびm=1,PAVPPPnGSmここでn=3およびm=1,PAVPPPnGSmここでn=4およびm=1,PAVPPPnGSmここでn=2およびm=0,PAVPPPnGSmここでn=3およびm=0,PAVPPPnGSmここでn=4およびm=0がある。このようなリンカーに例には、TVSDVPnGSmここでn=1およびm=1,TVSDVPnGSmここでn=2およびm=1,TVSDVPnGSmここでn=3およびm=1,TVSDVPnGSmここでn=4およびm=1,TVSDVPnGSmここでn=2およびm=0,TVSDVPnGSmここでn=3およびm=0,TVSDVPnGSmここでn=4およびm=0がある。このようなリンカーに例には、TGLDSPnGSmここでn=1およびm=1配列番号57,TGLDSPnGSmここでn=2およびm=1,TGLDSPnGSmここでn=3およびm=1,TGLDSPnGSmここでn=4およびm=1,TGLDSPnGSmここでn=2およびm=0,TGLDSPnGSmここでn=3およびm=0配列番号:195,TGLDSPnGSmここでn=4およびm=0配列番号:196がある。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインおよびIgスキャフォールドの間にはリンカーが存在しない。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカーTVAAPSによりIgスキャフォールドに結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカーTVAAPSGSによりIgスキャフォールドに結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカーGSによりIgスキャフォールドに結合する。別の実施形態では、エピトープ結合ドメインはリンカーASTKGPTによりIgスキャフォールドに結合する。リンカーはヒト血清アルブミンから、例えば、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号187、配列番号188、配列番号189または配列番号190に設定されたリンカーから誘導することができる。リンカーはさらにいくつかのさらなる残基を含んでもよく、例えば、さらなるグリシンおよびセリン残基を含んでもよい。これらのさらなる残基はアルブミン由来の配列の最初または最後にあってもよく、またはアルブミン由来の配列内に存在してもよい。かかるリンカーの例には、配列番号167および配列番号169に設定されたものが含まれる。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、少なくとも1つの抗原結合性部位、例えばヒト血清アルブミンに結合可能な少なくとも1つのエピトープ結合ドメイン、を含む。一実施形態では、少なくとも3つの抗原結合性部位があり、例えば4または5または6または8または10抗原結合性部位があり、この抗原結合タンパク質は少なくとも3または4または5または6または8または10抗原に結合可能であり、例えば、3または4または5または6または8または10抗原に同時に結合可能である。また、本発明は医薬に使用するための、例えば、血管新生を必要とする、またはHGFHGF/Metシグナリングおよび/またはVEGFの上昇したレベルと関連すると考えられる固形腫瘍の治療薬製造に使用するための抗原結合タンパク質を提供する。そのような腫瘍としては、結腸,乳房,卵巣,肺小細胞または非小細胞,前立腺,膵臓,腎臓,肝臓,胃,頭頸部,メラノーマ,肉腫が挙げられる。原発性および二次性転移性脳腫瘍もまた含まれ、グリオーマ上衣腫を含む,髄膜腫,オリゴデンドローマ,アストロサイトーマ低悪性度,未分化および多形神経膠芽腫,髄芽腫,神経節腫,シュワン腫および脊索腫が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の抗原結合タンパク質を用いた治療に好適な望ましくない血管新生と関連する他の疾患としては、加齢性黄斑変性病,糖尿病性網膜症,RAおよび乾癬が挙げられる。本発明は、固形腫瘍結腸,乳房,卵巣,肺小細胞または非小細胞,前立腺,膵臓,腎臓,肝臓,胃,頭頸部,メラノーマ,肉腫を含む,原発性および二次性転移性脳腫瘍、例えば限定はされないが、グリオーマ上衣腫を含む,髄膜腫,オリゴデンドローマ,アストロサイトーマ低悪性度,未分化および多形神経膠芽腫,髄芽腫,神経節腫,シュワン腫および脊索腫,加齢性黄斑変性病,糖尿病性網膜症,RAまたは乾癬の患者を治療する方法を提供し、これは、本発明の治療量の抗原結合タンパク質の投与を含む。本発明の抗原結合タンパクは、固形腫瘍結腸,乳房,卵巣,肺小細胞または非小細胞,前立腺,膵臓,腎臓,肝臓,胃,頭頸部,メラノーマ,肉腫を含む,原発性および二次性転移性脳腫瘍、例えば限定はされないが、グリオーマ上衣腫を含む,髄膜腫,オリゴデンドローマ,アストロサイトーマ低悪性度,未分化および多形神経膠芽腫,髄芽腫,神経節腫,シュワン腫および脊索腫,加齢性黄斑変性病,糖尿病性網膜症,RAまたは乾癬あるいはHGFおよび/またはVEGFの過剰産生に関わる他の任意の疾患の治療に使うことができる。本発明に使われるタンパク質スキャフォールドには、抗体の全てのドメインを含む全モノクローナル抗体スキャフォールドを含み、または、本発明のタンパク質スキャフォールドは、一価抗体のような従来にない構造を含んでもよい。このような一価抗体は、重鎖のヒンジ部がホモ二量体化しないように修飾されたペアード重鎖と軽鎖を含んでもよいこのような一価抗体は、WO2007059782に記述されている。他の一価抗体は、機能的可変領域とCH1領域が欠けた第2の重鎖と二量体化するペアード重鎖と軽鎖を含んでもよい。この場合、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成するように第1と第2の重鎖を修飾して、2つの重鎖と1つの軽鎖を有する一価抗体ができるこのような一価抗体は、WO2006015371に記載されている。このような一価抗体は、本発明のエピトープ結合ドメインが結合できるタンパク質スキャフォールドを提供可能である。本発明に使われるエピトープ結合ドメインは、別の可変領域またはドメインと独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインであり、これは、ドメイン抗体であっても、または下記の群から選択された非免疫グロブリンスキャフォールドの誘導体であるドメインであってもよい。CTLA-4Evibody;リポカイン;プロテインA誘導分子、例えばプロテインAのZドメインアフィボディ,SpA,Aドメインアビマー/マキシボディ;熱ショックタンパク質、例えばGroELおよびGroES;トランスフェリントランスボディ;アンキリンリピートタンパク質DARPin;ペプチドアプタマー;Cタイプレクチンドメインテトラネクチン;ヒトγクリスタリンおよびヒトユビキチンaffilin;PDZドメイン;ヒトプロテアーゼ阻害剤のスコーピオントキシンクニッツタイプドメイン;およびフィブロネクチンアドネクチン;このドメインは、その天然のリガンド以外のリガンドに結合させるためにタンパク質工学による操作が行われた。一実施形態では、これはドメイン抗体であってもよく、また他の適切なドメイン、例えば、CTLA-4,リポカリン,SpA,アフィボディ,アビマー,GroEL,トランスフェリン,GroESおよびフィブロネクチンからなる群から選択されたドメインであってもよい。一実施形態では、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、アフィボディ,アンキリンリピートタンパク質DARPinおよびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、アフィボディ,アンキリンリピートタンパク質DARPinおよびアドネクチンから選択されてもよい。別の実施形態では、これは、ドメイン抗体、例えば、ヒト,ラクダまたはサメNARVドメイン抗体から選択されたドメイン抗体であってもよい。エピトープ結合ドメインは、1つまたは複数の位置でタンパク質スキャフォールドに結合可能である。この位置には、タンパク質スキャフォールドのC末端およびN末端,例えば、IgGの重鎖のC末端重鎖および/または軽鎖のC末端,または例えばIgGの重鎖のN末端および/または軽鎖のN末端が挙げられる。一実施形態では、第1のエピトープ結合ドメインがペアードVHVLを含むタンパク質スキャフォールドに結合し、第2のエピトープ結合ドメインが第1のエピトープ結合ドメインに結合し、例えばタンパク質スキャフォールドがIgGスキャフォールドの場合は、第1のエピトープ結合ドメインIgGスキャフォールドの重鎖のC末端に結合してもよく、そのエピトープ結合ドメインがそのC末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインに結合でき、または例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、IgGスキャフォールドの軽鎖のC末端に結合してもよく,その第1のエピトープ結合ドメインは、そのC末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよく,または例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、IgGスキャフォールドの軽鎖のN末端に結合してもよく、その第1のエピトープ結合ドメインはそのN末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよく,または例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、IgGスキャフォールドの重鎖のN末端に結合してもよく、その第1のエピトープ結合ドメインは、そのN末端の位置で第2のエピトープ結合ドメインにさらに結合してもよい。エピトープ結合ドメインがドメイン抗体である場合は、一部のドメイン抗体がスキャフォールド内の特定の位置に適合することがある。本発明で使用するドメイン抗体は、通常のIgGの重鎖および/または軽鎖のC末端で結合可能である。さらに、一部の免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常の抗体の重鎖および軽鎖の両方のC末端に結合できる。免疫グロブリン単一可変ドメインのN末端が抗体定常ドメインCH3またはCLのいずれかに融合している構築物の場合は、ペプチドリンカーは、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合するのを支援することができる。事実、dAbのN末端は、抗原結合活性に関わる相補性決定領域CDRSの近傍に配置される。従って、短いペプチドリンカーは、エピトープ結合ドメインおよびタンパク質スキャフォールドに対する定常ドメインの間のスペーサーとして作用し、これによりdAbCDRをより容易に抗原に近づけることができ、従って高い親和性での結合が可能となる。免疫グロブリン単一可変ドメインがIgGに結合する環境は、融合しようとする抗体鎖によって異なる:IgGスキャフォールドの抗体軽鎖のC末端で融合する場合は、各免疫グロブリン単一可変ドメインが抗体ヒンジとFc部の近くに配置されることが期待される。このような免疫グロブリン単一可変ドメインは相互に大きく離れていると思われる。通常の抗体では、Fab断片間の角度、および各Fab断片とFc部間の角度は非常に大きく変動する。mAb、dAbの場合はFab断片間の角度は多くは異ならないが、一方、各FabとFc部間の角度には、一部の角度制約が観察されることがある。IgGスキャフォールドの抗体重鎖のC末端で融合した場合、各免疫グロブリン単一可変ドメインはFc部のCH3ドメインの近くに配置されることが期待される。これはFc受容体例えば、FcγRI,II,IIIおよびFcRnへのFc結合特性に影響することは期待できない。理由は、これらの受容体が、CH2ドメインFcγRI,IIおよびIIIクラスの受容体の場合またはCH2およびCH3ドメイン間のヒンジ例えば、FcRn受容体の場合と結合しているからである。このような抗原結合タンパク質の別の特徴は、両免疫グロブリン単一可変ドメインが相互に空間的に接近していることが期待され、適切なリンカーにより与えられた柔軟性があるという条件下、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインはホモ二量体でさえ形成でき、従って、Fc部のジップドzipped四次構造化を促進し、この構築物の安定性を高めることができる。このような構造の考察は、エピトープ結合ドメインに結合する最も適切な位置、例えば、dAbのタンパク質スキャフォールド例えば、抗体上の位置、の選択の助けとなり得る。抗原のサイズ、その局在化血液中または細胞表面上,その四次構造単量体または多量体は変動可能である。通常の抗体は、ヒンジ部が存在することによりアダプター構築物として機能するように元々設計されているが、Fab断片の先端での2つの抗原結合性部位の方向は大きく変動でき、従って抗原の分子特性とその環境を受け入れることが可能である。対照的に、抗体または他のタンパク質スキャフォールドに結合した免疫グロブリン単一可変ドメインは、直接的あるいは間接的に構造的柔軟性が少ない。免疫グロブリン単一可変ドメインの溶液中結合状態と方法の理解も有益である。インビトロでdAbは単量体での存在が多く、溶液中ではホモ二量体か多量体が多いという根拠が蓄積されてきたReiteretalJMolBiol290p685698EwertetalJMolBiol325p531553JespersetalJMolBiol337p893903JespersetalNatBiotechnol22p11611165MartinetalProteinEng10p607614SepulvadaetalJMolBiol333p355365。これはIgドメインと一緒のインビボで観察された多量体発生、例えば、ベンスジョーンズタンパク質免疫グロブリン軽鎖の二量体Biochemistry14p49434952HuanetalBiochemistry33p1484814857HuangetalMolimmunol34p12911301およびamyloidfibersJMolBiol3676038、を強く想起させる。例えば、溶液中では二量体化する傾向のdabを軽鎖のC末端よりもFc部のC末端に結合させることが望ましいという可能性もある。理由は、Fc部のC末端への結合により本発明の抗原結合タンパク質との関連で、これらのdAbを二量体化させると思われるためである。本発明の抗原結合タンパク質は、単一抗原に特異的な抗原結合性部位を含んでもよく、2つ以上の抗原または単一抗原上の2つ以上のエピトープに対し特異的な抗原結合性部位を有してもよく、また、抗原結合性部位のそれぞれが同じまたは異なる抗原上の別々のエピトープに対し特異的であってもよい。特に、本発明の抗原結合タンパク質は、HGFおよびVEGFに関連する疾患、例えば、血管新生を必要とする、またはHGFHGF/Metシグナリングおよび/またはVEGFの上昇したレベルと関連すると考えられる固形腫瘍を治療するのに有用であり得る。そのような腫瘍としては、結腸,乳房,卵巣,肺小細胞または非小細胞,前立腺,膵臓,腎臓,肝臓,胃,頭頸部,メラノーマ,肉腫が挙げられる。原発性および二次性転移性脳腫瘍もまた含まれ、グリオーマ上衣腫を含む,髄膜腫,オリゴデンドローマ,アストロサイトーマ低悪性度,未分化および多形神経膠芽腫,髄芽腫,神経節腫,シュワン腫および脊索腫が挙げられるが、それらに限定されない。本発明の抗原結合タンパク質を用いた治療に好適な望ましくない血管新生と関連する他の疾患としては、加齢性黄斑変性病,糖尿病性網膜症,RAおよび乾癬が挙げられる。本発明の抗原結合タンパク質は、本発明の抗原結合タンパク質のためのコード配列を含む発現ベクターを有する宿主細胞の形質移入により産生可能である。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞に対する複製および発現、および/または分泌を制御できる通常の制御配列の操作環境にこれらのコード配列を置くことにより産生可能である。調節配列には、プロモータ配列,例えば、CMVプロモータ,および他の既知抗体から得られたシグナル配列が含まれる。同様にして、相補的抗原結合タンパク質の軽鎖または重鎖をコードしたDNA塩基配列を有する第2の発現ベクターを産生できる。特定の実施形態では、この第2の発現ベクターは、コード配列と選択可能なマーカーに関することを除いて第1の発現ベクターに同じにして、各ポリペプチド鎖が機能的に発現していることを可能な限り確実にする。あるいは、抗原結合タンパク質のための重鎖と軽鎖コード配列を単一のベクター上に、例えば、同じベクター中に2つの発現カセットに入れて、置いてもよい。選択された宿主細胞は、第1と第2のベクターの両方を使って通常の技術により同時形質移入されまたは、単純に単一のベクターで形質移入され、組換えまたは合成軽鎖と重鎖の両方を含む本発明の形質移入した宿主細胞が作られる。この形質移入した細胞は、次に通常の技術により培養され本発明の操作された抗原結合タンパク質が産生される。組換え重鎖および/または軽鎖の会合を含む抗原結合タンパク質はアッセイ、例えば、ELISAやRIA、により培養物からスクリーニングされる。同様の通常の技術を採用して、他の抗原結合タンパク質を構築することが可能である。本方法で採用されたクローニングおよびサブクローニングステップのための適切なベクター、および、本発明の組成物の作成は当業者により選択されうる。例えば、通常のクローニングベクターのpUCシリーズを使用可能である。1つのベクター、pUC19、は市販品で、Amershamバッキンガムシャー州,英国またはPharmaciaウプサラ、スウェーデン、等のサプライハウスから入手可能である。さらに、容易に複製可能で、多くのクローニングサイトと選択可能な遺伝子例えば、抗生物質耐性を有し、容易に操作できる、いずれのベクターもクローニングの目的に使用可能である。従って、クローニングベクターの選択は本発明における制約因子ではない。また、発現ベクターを、異種のDNA塩基配列の発現、例えば哺乳動物のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子DHFR、を増幅するための適切な遺伝子により特徴づけることができる。他のベクター配列には、ポリAシグナル配列、例えば、ウシ成長ホルモンBGH由来の配列、およびβ‐グロビンプロモータ配列betagloproが含まれる。本明細書で使える発現ベクターは、当業者にはよく知られた技術により合成してもよい。このようなベクターの構成要素、例えば、レプリコン,選択遺伝子,エンハンサー,プロモータ,シグナル配列、等、は市販または天然の入手源から入手してもよく、また、選択宿主中の組換えDNAの生成物の発現および/または分泌の誘導に使用される既知手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母、および真菌の発現に関する技術分野で既知の多くのタイプがある他の適切な発現ベクターもこの目的に選択してもよい。また、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドを形質移入された細胞株を包含する。これらクローニングベクターのクローニングと他の操作に有用な宿主細胞もまた従来からあるものである。しかし、種々の大腸菌株由来の細胞は、本発明の抗原結合タンパク質作成におけるクローニングベクターや他のステップの複製に使うことができる。本発明の抗原結合タンパク質の発現のための適切な宿主細胞または細胞株には、哺乳動物細胞、例えば、NS0,Sp2/0,CHO例えば、DG44,COS,HEK,繊維芽細胞例えば、3T3,および骨髄細胞、例えば、これはCHOまたは骨髄細胞中で発現してもよい、が含まれる。ヒト細胞を使って、分子をグリコシレーションパターンで修飾させてもよい。あるいは、他の真核細胞株を採用してもよい。哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換,培養,増幅,スクリーニングと生成物産生および精製の方法は、当業者には既知である。例えば、前述のSambrooketalを参照。細菌細胞は、組換えFabの発現のため、または本発明の他の実施形態のために適切な宿主細胞として有用であり得る例えば、PluckthunAImmunolRev130151188参照。しかし、細菌細胞で発現したタンパク質は、折り畳まれていないまたは不適切に折り畳まれた形式または非グリコシル化形式になる傾向があるため,細菌細胞中で産生されたいずれの組換えFabも抗原結合能力の保持の観点でスクリーニングしなければならなくなる。細菌細胞で発現された分子が正しく折り畳まれた形式で産生された場合は、その細菌細胞は望ましい宿主となるだろう。あるいは、別の実施形態で、分子が細菌宿主中で発現され、引き続き再折り畳みされることが可能である。例えば、発現に使われる種々の大腸菌株は、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々の枯草菌、ストレプトマイセス,他の桿菌等の株もまたこの方法に採用できる。所望の場合は、当業者に既知の酵母細胞株もまた、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエと鱗翅類、およびウイルス発現システムと同様に、宿主細胞として入手可能である。例えば、MilleretalGeneticEngineering8277298PlenumPress、および本明細書に引用の文献を参照のこと。ベクターが作成される一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要な形質移入方法、およびこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するために必要な培養方法、は全て従来からの技術であってもよい。典型的には,本発明の培養方法は無血清培養方法で,通常細胞を無血清懸濁液中で培養する。同様に、本発明の抗原結合タンパク質を一度産生した後、細胞培養内容物を当分野の標準的手法、例えば、硫安塩析法,アフィニティーカラム,カラムクロマトグラフイー,ゲル電気泳動法、等、により精製してもよい。このような技術は、当該分野の技術の範囲内にあり本発明を制限するものではない。例えば、改変抗体の調製に関しては、WO9958679およびWO9616990に記載されている。抗原結合タンパク質のさらに別の発現法では、トランスジェニック動物中での発現を使用してもよい。この例は、USPatentNo4873316に記載されている。これは、動物カゼインプロモータを使った発現システムであり、このプロモータは、遺伝子導入で哺乳動物に取り込んだ場合、雌のミルク中に所望の組換えタンパク質を産生させる。本発明のさらなる態様では、本発明の抗体を産生する方法を提供し、この方法は本発明の抗体の軽鎖および/または重鎖をコードしたベクターで形質転換または形質移入した宿主細胞を培養し、これにより産生された抗体を回収するステップを含む。本発明に従って、本発明の抗原結合タンパク質を産生する方法が提供され、この方法は、a抗原結合タンパク質の重鎖をコードした第1のベクターを提供するステップと;b抗原結合タンパク質の軽鎖をコードした第2のベクターを提供するステップと;c哺乳動物宿主細胞例えば、CHOを前記第1と第2のベクターで形質転換するステップと;d抗原結合タンパク質を前記宿主細胞から前記培地へ分泌を促す条件下で、ステップcの宿主細胞を培養するステップと;e分泌されたステップdの抗原結合タンパク質を回収するステップと、を含む。所望の方法で発現された後、抗原結合タンパク質のインビトロ活性を適切なアッセイにより調査する。現在よく使われるELISAアッセイ方式を採用し、標的に対する抗原結合タンパク質の定性および定量評価を行う。さらに、他のインビトロアッセイを使って、通常のクリアランス機序にも関わらす体の中に残留している抗原結合タンパク質を評価するため実施されるヒトの臨床試験の前に中和性能を確認する。治療の用量と持続時間は、ヒトの循環系における本発明の分子の相対的持続時間に関係し、治療条件と患者の全体的健康状態に依存して当業者により調節可能である。最大の治療効果を得るためには、長期間にわたる例えば、4~6ヶ月間反復投薬例えば、週一回または2週間に一回が、必要となる可能性があることが想定される。本発明の治療薬の投与方法は、宿主に薬剤を送達する任意の適切なルートであってよい。本発明の抗原結合タンパク質,および医薬品組成物は、非経口投与、すなわち、皮下s.c.,髄腔内,腹腔内,筋肉内i.m.,静脈内i.v.,または鼻腔内の投与に特に有用である。本発明の治療薬は、有効量の本発明の抗原結合タンパク質を製薬上許容可能なキャリア中の有効成分として含む医薬品組成物として調製されてもよい。本発明の予防薬としては、抗原結合タンパク質を含む水性懸濁液または水溶液は、生理的pHに緩衝され注射の準備ができた形としてもよい。非経口投与用組成物は、通常、本発明の抗原結合タンパク質の溶液、または製薬上許容可能なキャリア、例えば水性キャリア、に溶解したそのカクテルを含む。種々の水性キャリアは、例えば、0.9食塩水,0.3グリシン,等を用いてもよい。これらの溶液は、無菌状態で、通常、粒子状物質の無い状態にされる。これらの溶液は、通常のよく知られた滅菌技術例えば、濾過により無菌にされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされる、例えば、pH調節剤および緩衝剤等のような製薬上許容可能な補助物質を含んでもよい。このような製剤処方での本発明の抗原結合タンパク質の濃度は、広く変動可能で、すなわち、重量で約0.5未満から,通常、約1または少なくとも約1、そして15~20までになり、また、選択された具体的な投与方法に従って流体容量,粘性、等に基づき一次的に選択される。従って、本発明の筋肉内注射用医薬品組成物は、1mLの無菌緩衝水、および約1ng~約200mg、例えば、約50ng~約30mg、または、約5mg~約25mgの本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。同様に、本発明の点滴静注用医薬品組成物は、約250mlの無菌リンゲル液,および約1~約30mg、または約5mg~約25mgの1ml当たりのリンゲル液中の本発明の抗原結合タンパク質を含むように調製され得る。非経口投与組成物を調製する実際の方法は既知で、当業者には明らかであり、さらに詳細は、例えば、RemingtonsPharmaceuticalScience15thedMackPublishingCompanyイーストン,ペンシルベニア州、に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗原結合タンパク質製剤の調製については、LasmarUandParkinsDTheformulationofBiopharmaceuticalproductsPharmaSciTechtodaypage129137Vol3WangWInstabilitystabilisationandformulationofliquidproteinpharmaceuticalsIntJPharm185129188StabilityofProteinPharmaceuticalsPartAandBedAhernTJManningMCNewYorkNYPlenumPressAkersMJExcipientDruginteractionsinParenteralFormulationsJPharmSci9122832300ImamuraKetalEffectsoftypesofsugaronstabilizationofProteininthedriedstateJPharmSci92266274IzutsuKkojimaSExcipientcrystalinityanditsproteinstructurestabilizingeffectduringfreezedryingJPharmPharmacol5410331039JohnsonRMannitolsucrosemixturesversatileformulationsforproteinlyophilizationJPharmSci91914922HaEWangWWangYjPeroxideformationinpolysorbate80andproteinstabilityJPharmSci9122522264、を参照のこと。この全内容は参照により本明細書に組み込まれ、具体的に参照される。一実施形態では、医薬品として用いる場合、本発明の治療薬はユニット剤形として存在する。適切な治療有効量は当業者には容易に決定可能である。適切な用量は患者の体重により計算され、例えば、0.01~20mg/kg,例えば0.1~20mg/kg,例えば1~20mg/kg,例えば10~20mg/kgまたは例えば1~15mg/kg,例えば10~15mg/kgの範囲であってもよい。本発明の有効ヒト治療条件の使用に関して、適切な用量は0.01~1000mg,例えば0.1~1000mg,例えば0.1~500mg,例えば500mg,例えば0.1~100mg,または0.1~80mg,または0.1~60mg,または0.1~40mg,または例えば1~100mg,または1~50mg,の範囲内の本発明の抗原結合タンパク質であってもよく、これらは非経口、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内投与できる。このような用量は、必要なら、医師により選択された適切な時間間隔で反復してもよい。本明細書記載の抗原結合タンパク質は、貯蔵のための冷凍乾燥が可能で、使用に先立ち適切なキャリア中で再構成できる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示され、既知技術の凍結乾燥と再構成技術を用いることができる。当技術分野で既知のいくつかの方法を使って本発明に使われるエピトープ結合ドメインを見つけることが可能である。用語ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の不均一混合物を指す。ライブラリは、それぞれ単一ポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーからなる。この点で、ライブラリはレパートリーと同義である。ライブラリメンバー間の配列の差異は、ライブラリ中に存在する多様性の原因である。ライブラリはポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形を取ってもよく、また、核酸のライブラリで形質転換された生命体または細胞の形、例えば、細菌、ウイルス、動物、または植物、等の形であってもよい。一実施例では、それぞれの生命体または細胞は1つのみまたは限られた数のライブラリメンバーを含む。都合のいいことに、核酸によってコードされたポリペプチドを発現させるために核酸が発現ベクターの中に組み込まれる。一態様では、従って、ライブラリは宿主生物の集合体の形を取ることができ、各生命体は、発現して対応するポリペプチドメンバーを産生することが可能な核酸型の単一ライブラリメンバーを含んだ1つまたは複数の発現ベクターのコピーを含む。従って、この宿主生物の集合体は多様なポリペプチドの大きなレパートリーをコードする可能性を有している。ユニバーサルフレームワークは、Kabatの定義SequencesofProteinsofImmunologicalInterest米国保健社会福祉省の配列中に保存された抗体領域に対応する単一抗体フレームワーク配列、またはChothiaとLeskの定義ChothiaandLeskJMolBiol196910917によるヒト生殖細胞系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列である。これは、単一フレームワークでも、これらのフレームワークの集合体であってもよく、たとえ高頻度可変領域にのみある変異だったにしても、実質的にいかなる結合特異性の誘導も許容することが認められてきた。本明細書で定義されたアミノ酸およびヌクレオチド配列の整合性と相同性,類似性または同一性は、一実施形態中で調製され、デフォルトのパラメーターを使ってBLAST2Sequenceアルゴリズムにより測定されている。ディスプレイシステム例えば、核酸のコード化機能、および、核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイシステムが、本明細書記載の方法中で、例えば、dAbまたは他のエピトープ結合ドメインの選択において、使われた場合、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことは、好都合なことが多い。これは、本明細書記載の方法や他の適切な方法を使って追加のラウンドのために、あるいは、追加のレパートリー例えば、親和性成熟レパートリーを調製するために、十分な量の核酸および/またはペプチドまたはポリペプチドを得る効率的な手段を提供する。従って、一部の実施形態では、エピトープ結合ドメイン選択方法は、ディスプレイシステム例えば、ファージディスプレイのような、核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたペプチドまたはポリペプチドの機能特性とリンクしたディスプレイの使用を含み、選択されたペプチドまたはポリペプチドをコードした核酸のコピー数を増幅するまたは増やすことをさらに含む。核酸は、任意の適切な方法、例えば、ファージ増幅,細胞増殖またはポリメラーゼ連鎖反応、を使って増幅可能である。一実施例では、この方法は核酸のコーディング機能および核酸によりコードされたポリペプチドの物理的、化学的、および/または機能的特性にリンクしたディスプレイシステムを用いる。このようなディスプレイシステムは、複数の複写可能な遺伝子パッケージgeneticpackage、例えば、バクテリオファージまたは細胞細菌、を含むことができる。ディスプレイシステムは、ライブラリ、例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリ、を含んでもよい。バクテリオファージディスプレイはディスプレイシステムの一例である。多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム例えば、一価のディスプレイおよび多価のディスプレイシステムが記載されてきた例えばGriffithsetalUSPatentNo6555313B1参照により本明細書に組み込まれる;JohnsonetalUSPatentNo5733743参照により本明細書に組み込まれる;McCaffertyetalUSPatentNo5969108参照により本明細書に組み込まれる;MulliganKehoeUSPatentNo5702892参照により本明細書に組み込まれる;WinterGetalAnnuRevImmunol12433455SoumillionPetalApplBiochemBiotechnol47175189CastagnoliLetalCombChemHighThroughputScreen4121133、参照。バクテリオファージディスプレイシステムで提示されたペプチドまたはポリペプチドは、いずれの適切なバクテリオファージ、例えば、線状ファージ例えば、fd,M13,F1,溶菌ファージ例えば、T4,T7,ラムダ,またはRNAファージ例えば、MS2、上にも提示可能である。通常、適切なファージコートタンパク質例えば、fdpIIIタンパク質との融合タンパク質としてペプチドまたはファージポリポリペプチドのレパートリーを提示するファージライブラリは、産生されるか提供される。融合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドファージコートタンパク質の先端、または所望なら内部の位置、にペプチドまたはポリペプチドを提示できる。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドは、pIIIのアミノ末端からドメイン1まで存在可能であるpIIIのドメイン1はN1とも呼ばれる。提示されたポリペプチドは、直接pIIIに例えば、pIIIのドメイン1のN末端またはリンカーを使ってpIIIに融合可能である。所望なら,融合体はタグ例えば、mycエピトープ,Hisタグをさらに含むこともできる。ファージコートタンパク質との融合タンパク質として提示されたペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むライブラリは、任意の適切な方法を用いて産生可能である。例えば、提示されたペプチドまたはポリペプチドをコードしたファージベクターライブラリやファージミドベクターを、適切な宿主細菌中に導入し、生成した細菌を培養してファージを産生する例えば、適切なヘルパーファージを使って、または必要ならプラスミドを補完して。ファージライブラリは、培養物から任意の適切な方法、例えば、沈降法および遠心分離法、により回収可能である。ディスプレイシステムは任意の所望量の多様性を含むペプチドまたはポリペプチドのレパートリーを含むこともできる。例えば、このレパートリーは生命体、生命体のグループ、所望組織または所望細胞型、により発現された天然のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むことも、または、無秩序のまたは無秩序化されたアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含むこともできる。希望するなら、このポリペプチドは、共通のコアまたはスキャフォールドを共有することができる。例えば、レパートリーまたはライブラリ中の全ポリペプチドが、プロテインA,プロテインL,プロテインG,フィブロネクチンドメイン,アンチカリンAnticalin,CTLA4,所望の酵素例えば、ポリメラーゼ,セルラーゼ,または免疫グロブリンスーパーファミリー由来のポリペプチド,例えば、抗体または抗体断片例えば、抗体可変ドメインから選択されたスキャフォールドをベースにすることも可能である。このようなレパートリーやライブラリ中のポリペプチドは、無秩序または無秩序化されたアミノ酸配列の規定領域および共通アミノ酸配列の領域を含むことができる。特定の実施形態では、レパートリー中の全てまたは実質的に全てのポリペプチドが所望のタイプ、例えば、所望の酵素例えば、ポリメラーゼまたは所望の抗体の抗原結合性断片例えば、ヒトVHまたはヒトVL、である。一部の実施形態では、ポリペプチドディスプレイシステムはポリペプチドのレパートリーを含み、その中の各ポリペプチドは抗体可変ドメインを含む。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドはVH,VLまたはFv例えば、単鎖Fvを含んでもよい。アミノ酸配列の多様性を、任意の適切な方法を使って、ペプチドまたはポリペプチドまたはスキャフォールドの任意の所望の領域に導入可能である。例えば、アミノ酸配列の多様性を、標的部位、例えば、任意の適切な変異誘発性例えば、低忠実性PCR,オリゴヌクレオチド媒介または部位特異的変異,NNKコドンを使った多様化または任意の他の適切な方法を使って、多様化ポリペプチドをコードした核酸ライブラリを調製することにより、抗体可変ドメインの相補性決定領域または疎水性ドメイン、に導入可能である。所望なら、多様化すべきポリペプチドの領域を無秩序化できる。レパートリーを構成するポリペプチドのサイズは、概して選択できる問題であり、均一なポリペプチドサイズは必要ではない。レパートリー中のポリペプチドは、少なくとも三次構造少なくとも1つのドメインを形成するを有することができる。選択/単離/回収エピトープ結合ドメインまたはドメインの集合体は、適切な方法を使って、レパートリーまたはライブラリ例えば、ディスプレイシステム中のから選択、単離、および/または回収可能である。例えば,ドメインは選択可能な特性例えば、物理的特性,化学的特性,機能特性に基づいて選択または単離される。適切な選択可能な特性には、レパートリー中のペプチドまたはポリペプチドの生物活性,例えば,一般的リガンド例えば、スーパー抗原に対する結合性,標的リガンド例えば、抗原,エピトープ,基質に対する結合性,抗体に対する結合性例えば、ペプチドまたはポリペプチド上に発現したエピトープ経由,および触媒能力が含まれる例えば、TomlinsonetalWO9920749WO0157065WO9958655参照。一部の実施形態では、実質的に全てのドメインが共通の選択可能特性を共有するペプチドまたはポリペプチドのライブラリまたはレパートリーからプロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドが選択および/または単離される。例えば、ドメインを、実質的に全てのドメインに共通の一般的リガンドに結合する,共通の標的リガンドに結合する,共通の抗体に結合するまたは結合される,または共通の触媒能力を有するライブラリまたはレパートリーから選択することができる。この選択のタイプは、所望の生物活性を有する親のペプチドまたはポリペプチドに基づいたレパートリーまたはドメインを調製する際、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインの親和性成熟を行う場合、に特に有用である。共通の一般的リガンドに対する結合性に基づいた選択では、元のライブラリまたはレパートリーの成分である全てまたは実質的に全てのドメイを含むドメインのコレクションまたは集合体が得られる。例えば,標的リガンドまたは一般的リガンドに結合しているドメイン、例えばプロテインA,プロテインLまたは抗体は、パニングまたは適切な親和性マトリックスを使って選択、単離、および/または回収ができる。パニングは、リガンド例えば、一般的リガンド,標的リガンドの溶液を適切な容器例えば、チューブ,ペトリ皿に加え、リガンドを容器の壁表面上に沈着または被覆させることにより成し遂げられる。過剰リガンドを洗い流し、ドメインを容器に加え、この容器をペプチドまたはポリペプチドが固定化したリガンドと結合するための適切な条件下で維持する。非結合ドメインは、洗い流され、結合ドメインは、任意の適切な方法、例えば、削り取りやpHを下げることによって回収できる。適切なリガンド親和性マトリックスは、通常、固体担体またはビーズ例えば、アガロースを含み、これに対しリガンドが共有結合的または非共有結合的に連結される。親和性マトリックスは、ドメインがマトリックス上のリガンドに結合するための適切な条件下、バッチプロセス,カラムプロセスまたは任意の他の適切なプロセスを使って、ペプチドまたはポリペプチド例えば、プロテアーゼとインキュベートされたレパートリーと結合させることができる。親和性マトリックスと結合しないドメインを洗い流すことができ、結合したドメインを、低pHバッファー,マイルドな変性剤例えば、尿素、またはリガンドとの結合で競合するペプチドまたはドメインで溶出、等の任意の適切な方法で溶出し、回収する。一実施例では、ビオチン化した標的リガンドは、レパートリー中のドメインが標的リガンドに結合するために適切な条件下、レパートリーと結合する。結合ドメインは、固定化したアビジンストレプトアビジン例えば、ビーズ上のを使って回収される。一部の実施形態では、一般的または標的リガンドは、抗体またはその抗体の抗原結合性断片である。ライブラリまたはレパートリーのペプチドまたはポリペプチド中で実質的に保存されたペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴と結合する抗体または抗原結合断片は、特に一般的リガンドとして有用である。プロテアーゼ耐性ペプチドまたはポリペプチドの単離,選択および/または回収のためのリガンドとしての使用に適切な抗体と抗原結合性断片は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、任意の適切な方法で調製できる。ライブラリ/レパートリープロテアーゼエピトープ結合ドメインをコードする、および/または、これを含むライブラリは、任意の適切な方法を使って調製または入手可能である。ライブラリは、目的のドメインまたはスキャフォールド例えば、ライブラリから選択されたドメインに基づくドメインをコードするように設計することも、または、本明細書記載の方法を使って別のライブラリから選択することも可能である。例えば,ドメインが豊富なライブラリは、適切なポリペプチドディスプレイシステムを使って調整可能である。所望のタイプのドメインのレパートリーをコードしたライブラリは、任意の適切な方法を使って容易に産生可能である。例えば,所望のタイプのポリペプチド例えば、免疫グロブリン可変ドメインをコードした核酸配列を得ることができ、それぞれが1つまたは複数の変異を含む核酸のコレクションが調製できる。例えば、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応PCRシステムを使って核酸を増幅することにより、化学的変異誘発により、または細菌突然変異誘発株を使って調整可能である。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にすることができる。選択位置を変異させる方法も当業者にはよく知られており、これには、例えば、PCRを使う場合または使わない場合の、不適正なオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば,合成抗体ライブラリは、抗原結合ループに対する変異を標的にして作られてきた。無秩序または半無秩序抗体H3およびL3領域を、生殖細胞系列免疫グロブリンV遺伝子セグメントに付加して、変異フレームワーク領域を有する大ライブラリが構築されているsupraNissimetalsupraGriffithsetalsupraDeKruifetalsupra。このような多様化は、拡張され、一部または全ての他の抗原結合ループを含むまでになっているNatureMed2100RiechmannetalBioTechnology13475MorphosysWO9708320supra。他の実施形態では、核酸の特定の領域を多様化の標的にでき、例えば,2段階PCR戦略では1回目のPCR生成物をメガプライマーmega-primerとして用いる参照。標的の多様化は、例えば、SOEPCRを使っても達成できる参照。選択位置での配列多様性は、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変え、多くのアミノ酸例えば20全部またはそのサブセットをその位置に組み込むことにより得ることができる。IUPAC命名法を使って説明するが、最も用途の広いコドンは、NNKであり、これはTAG停止コドンと同様に全アミノ酸をコードする。NNKコドンは、必要な多様性を導入するために使用可能である。同じ目的を有する他のコドンNNNも使用でき、これは追加の停止コドンTGAとTAAを作り出す。このような標的化手法は、標的領域中の全配列空間を調査対象にすることができる。一部のライブラリは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるドメイン例えば、抗体またはその一部を含む。例えば、ライブラリは既知の主鎖構造を有するドメインを含むことができる。例えば、TomlinsonetalWO9920749参照。ライブラリは適切なプラスミドまたはベクター中で調製できる。本明細書で使われるベクターは、異種のDNAを細胞の中に導入し、それの発現および/または複製をするために使われる離散した要素を指す。任意の適切なベクターを使うことができ、これにはプラスミド例えば、細菌性プラスミド,ウイルスまたはバクテリオファージベクター、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異生成のために使うことができ、または、発現ベクターライブラリの発現を促進するために使うことができる。ベクターおよびプラスミドは、通常1つまたは複数のクローニング部位例えば、ポリリンカー、複製開始点、および少なくとも1つの選択可能なマーカー遺伝子を含む。発現ベクターは、ポリペプチドの転写と翻訳促進エレメント、例えば、エンハンサー,プロモータ,転写終結信号,シグナル配列,等をさらに含むことができる。これらのエレメントは、このような発現ベクターが、発現に適切な条件下維持された場合例えば、適切な宿主細胞中で、ポリペプチドが発現し、産生されるようにポリペプチドをコードしたクローン化挿入断片に作動可能なようにリンクされた状態に配置することが可能である。クローニングおよび発現ベクターは、通常、1つまたは複数の選択宿主細胞中でベクターに複製させる核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクター中では,この配列は、ベクターに宿主染色体DNAとは独立に複製させ、複製開始点または自己複製配列を含む配列である。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製開始点は、大抵のグラム陰性細菌に対し適切で、2ミクロンプラスミド開始点は、酵母に適切であり、また種々のウイルス開始点例えば、SV40,アデノウイルスは、哺乳動物細胞中に入れるクローニングベクターに有用である。これらがコス細胞のような高レベル複製が可能な哺乳動物細胞で使われるのでなければ、通常、複製開始点は哺乳類の発現ベクターには必要でない。クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。このようなマーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードしている。従って、選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、その倍地中で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質と他の毒素、例えば、アンピシリン,ネオマイシン,メトトレキサートまたはテトラサイクリン,に耐性を付与し、栄養要求性欠如を補完し,または成長培地中で得られない重要な栄養素を補給する、タンパク質をコードしている。適切な発現ベクターは多くの要素を含むことができる。例えば、複製開始点,選択可能マーカー遺伝子,1つまたは複数の発現調節エレメント,例えば、転写調節エレメント例えば、プロモータ,エンハンサー,ターミネーターおよび/または1つまたは複数の翻訳信号,シグナル配列またはリーダー配列,等を含むことができる。発現調節エレメントおよび信号またはリーダー配列は、もしあれば、ベクターまたは他のソースから供給を受けることができる。例えば,抗体鎖をコードしたクローン化核酸の転写および/または翻訳調節配列は、直接発現に使用可能である。プロモータは、所望の宿主細胞中の発現のために組み込んでもよい。プロモータは、構成的であっても誘導可能であってもよい。例えば,プロモータは、核酸の転写を命令するように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードした核酸に作動可能なようにリンクされてもよい。種々の適切な原核生物用プロモータ例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモータシステム,アルカリフォスファターゼ,トリプトファンtrpプロモータシステム,大腸菌用のlac,T3,T7プロモータおよび真核生物例えば、シミアンウイルス40初期または後期プロモータ,ラウス肉腫ウイルス末端反復配列プロモータ,サイトメガロウイルスプロモータ,アデノウイルス後期プロモータ,EG-1aプロモータ宿主が入手可能である。さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保持している宿主細胞の選択に用いる選択可能マーカー,および,複製可能な発現ベクターの場合には、複製開始点を含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードした遺伝子は、共通の選択可能マーカーであり、原核生物例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子アンピシリン耐性,テトラサイクリン耐性用Tet遺伝子および真核細胞例えば、ネオマイシンG418またはジェネテシン,gptミコフェノール酸,アンピシリン,またはヒグロマイシン耐性遺伝子で使用可能である。ジヒドロ葉還元酵素標識遺伝子は、種々の宿主中でメトトレキサートにより選択を可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードした遺伝子例えば、LEU2,URA3,HIS3は、酵母中の選択マーカーとして使われることが多い。ウイルス例えば、バキュロウイルスまたはファージベクター,および宿主細胞のゲノムに統合可能なベクター,例えば、レトロウイルスベクター、の使用もまた意図されている。原核生物例えば、大腸菌等の細菌細胞または哺乳動物細胞中での発現に適切な発現ベクターには、例えば,pETベクター例えば、pET-12a,pET-36,pET-37,pET-39,pET-40,Novagen他,ファージベクトル例えば、pCANTAB5E,Pharmacia,pRIT2TプロテインA融合ベクター,Pharmacia,pCDM8,pCDNA1.1/amp,pcDNA3.1,pRc/RSV,pEF-1Invitrogen,Carlsbad,CA,pCMV-SCRIPT,pFB,pSG5,pXT1pCDEF3pSVSPORTGibcoBRL,Rockville,MD,pEF-Bos等、が挙げられる。種々の発現宿主,例えば、原核細胞大腸菌,昆虫細胞ショウジョウバエSchniederS2細胞,Sf9,酵母P.methanolica,P.pastoris,S.cerevisiaeおよび哺乳動物細胞例えば、コス細胞での使用に適切な発現ベクターが入手可能である。ベクターの一部の実施例は、ポリペプチドライブラリメンバーに相当するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、一般的および/または標的リガンドによる選択は、ポリペプチドライブラリメンバーを発現する単一クローンの別々の増殖と発現により行われる。上述のように、具体的な選択ディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイである。従って、ファージまたはファージミドベクターは使用可能である。例えば、ベクターは大腸菌複製開始点二本鎖複製用および、ファージ複製起点一本鎖DNAの産生用を有するファージミドベクターであってもよい。このようなベクターの操作および発現は、当業者にはよく知られているsupraNissimetalsupra。簡単に述べれば、ベクターは、ファージミドおよび発現カセット上流のラックプロモータに選択性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、適切なリーダー配列,多重クローニング部位,1つまたは複数のペプチドタグ,1つまたは複数のTAG停止コドンおよびファージタンパク質pIIIを含むことができる。従って、大腸菌の種々の抑制因子および非抑制因子株を使って、また、グルコース,イソ-プロピルチオ-β-Dガラクトシドiso-propylthio-β-D-galactosideIPTGまたはVCSM13等のヘルパーファージを添加して、ベクターは、発現のないプラスミドとして複製することができ、大量のポリペプチドライブラリメンバーのみ、または産物ファージこの内の一部はポリペプチド-pIII融合体で、その表面に少なくとも1つのコピーを含む、を産生することができる。抗体可変ドメインは、標的リガンド結合部位および/または一般的リガンド結合部位を含んでもよい。特定の実施形態では、一般的リガンド結合部位は、プロテインA,プロテインLまたはプロテインG等のスーパー抗原のための結合部位である。可変ドメインは、任意の所望の可変ドメイン,例えば、ヒトVH例えば、VH1a,VH1b,VH2,VH3,VH4,VH5,VH6,ヒトVL例えば、VLI,VLII,VLIII,VLIV,VLV,VLVIまたはVK1またはヒトVK例えば、VK2,VK3,VK4,VK5,VK6,VK7,VK8,VK9またはVK10に基づくものであってもよい。またさらなる技術カテゴリーには、レパートリーの人工区分への選別が含まれ、これは遺伝子とその遺伝子産物との結びつきを利用する。例えば,所望の遺伝子産物をコードした核酸が、油中水乳剤を使って形成されたマイクロカプセル中で選択可能となる選択システムが、WO9902671WO0040712およびTawfikGriffithsNatureBiotechnol166526に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードした遺伝因子がマイクロカプセル中に区分けされ、次に、転写、および/または翻訳されてそれぞれの遺伝子産物RNAまたはタンパク質をマイクロカプセル内に産生する。引き続き、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子因子が選別される。この手法によって、種々の方法で所望の活性を検出することにより目的の遺伝子産物を選択できる。エピトープ結合ドメインの解析ELISAを含む当業者に周知の方法によって、ドメインのその特異的抗原又はエピトープに対する結合を試験することができる。一例として、結合は、モノクローナル抗体を用いたELISAを用いて試験される。ファージELISAは、任意の適切な手順に従い実施することができ:例示的なプロトコルを下記に記載する。それぞれの回の選別で生産したファージの集団を、ポリクローナルファージ抗体を同定するために、選択した抗原又はエピトープに対する結合によりELISAによってスクリーニングすることができる。これら集団由来の、単一の感染させたバクテリアのコロニーからのファージをその後、モノクローナルファージ抗体を同定するためにELISAによってスクリーニングすることができる。抗原又はエピトープに結合する可溶性抗体断片のスクリーニングもまた所望され、これもまた、例えばC-又はN-末端タグに対する試薬を用いたELISAによって実施することができる例えばWinteretal.1994Ann.Rev.Immunology12,433~55及びそこで引用された文献を参照のこと。PCR産物のゲル電気泳動Marksetal.1991,上記;Nissimetal.1994,上記、プロービングTomlinsonetal.,1992J.Mol.Biol.227,776又はベクターDNAのシークエンスにより、選択したファージモノクローナル抗体の多様性を評価することができる。dAbの構造dAbが、本明細書に記載したファージディスプレイ技術に用いるために選択したV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは普遍的なフレームワーク領域を含み、そのため、本明細書で定義したような特定の一般的リガンドによって認識されるようになる可能性がある。普遍的なフレームワーク、一般的リガンドなどの使用については国際公開第99/20749に記載されている。V遺伝子レパートリーが使用される場合には、ポリペプチド配列における多様性が可変ドメインの構造的ループ内に局在する場合もある。それぞれの可変ドメインとその相補対との相互作用を高めるために、DNAシャッフリング又は変異生成によって、いずれの可変ドメインのポリペプチド配列をも変化させてもよい。DNAシャッフリングは当業者に周知であり、かつ、例えばStemmer,1994,Nature,370:389~391及び米国特許第6,297,053号に記載され、この両方は引用することにより本明細書に組み入れられる。突然変異生成のその他の方法もまた当業者に周知である。dAb構築物作成における使用のためのスキャフォールドi.主鎖構造の選択免疫グロブリンスーパーファミリーの全てのメンバーは、ポリペプチド鎖については類似した折り畳み部分を共有する。例えば、抗体はそれらの一次配列に関しては高度に多様化しているが、配列の比較及び結晶学的な構造は予想に反して、6つの抗体の抗原結合ループのうちの5つH1、H2、L1、L2、L3が限られた数の主鎖構造、又は標準的な構造をとることを明らかにしたChothiaandLesk1987J.Mol.Biol.,196:901;Chothiaetal.1989Nature,342:877。ループ長及び鍵となる残基の解析はさらに、大部分のヒト抗体に見られるH1、H2、L1、L2及びL3の主鎖構造の予測を可能にしたChothiaetal.1992J.Mol.Biol.,227:799;Tomlinsonetal.1995EMBOJ.,14:4628;Williamsetal.1996J.Mol.Biol.,264:220。H3領域は、Dセグメントの使用により配列、長さ及び構造においてはより多様であるが、ループ及び抗体フレームワークの鍵となる位置における特定の残基の長さ及び存在又は残基の型に依存して、短いループ長においてはH3領域もまた限られた数の主鎖構造を形成するMartinetal.1996J.Mol.Biol.,263:800;Shiraietal.1996FEBSLetters,399:1。dAbはVHドメインライブラリ及び/又はVLドメインライブラリなどのドメインライブラリから有利に構築される。1つの態様においては、特定のループ長及び鍵となる残基がメンバーの主鎖構造を保証するように選択されてドメインライブラリが設計されることが知られている。都合の良いことに、これらは天然に見られる、上記で議論されたような機能を果たさない可能性を最小限にするための、免疫グロブリンスーパーファミリーの実際の構造である。生殖細胞系V遺伝子セグメントは、抗体又はT細胞受容体ライブラリを構築するための、1つの好適な基礎となるフレームワークとして機能するが、その他の配列もまた役立つ。変異も低頻度で生じ得るが、機能性メンバーの少数が、その機能に影響を及ぼさない程度に変化した主鎖構造を有する可能性がある程度である。標準的な構造の理論もまた、リガンドによってコードされる異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づく主鎖構造の予測、及び標準的な構造に影響を及ぼさない多様化のための残基の選択のために役立つ。ヒトVκドメインにおいては、L1ループは4つの標準的な構造のうちの1つをとることができ、L2ループは単一の標準的な構造を有し、ヒトVκドメインの90がL3ループにおける5つの標準的な構造のうちの1つをとることができることが知られているTomlinsonetal.1995上記;従って、Vκドメインのみにおいては、異なる種類の主鎖構造を作り出すために、異なる標準的な構造が結合することが可能である。VλドメインがL1、L2及びL3ループの異なる種類の標準的な構造をコードするし、Vκ及びVλドメインがH1及びH2ループの複数の標準的な構造をコードする任意のVHドメインと対合することが可能な場合には、これら5つのループで見られる標準的な構造な組み合わせの数は非常に多くなる。このことは、様々な種類の結合特異性を生産するためには、主鎖構造の多様性の生成が必須である可能性を意味する。しかしながら、予想に反し、見いだされた単一の既知の主鎖構造に基づいて抗体ライブラリを構築することにより、実質的に全ての抗原を標的とするための十分な多様性の生成のためには主鎖構造における多様性は必要とされない。さらに驚くべきことに、単一の主鎖構造はコンセンサス構造である必要もなく、単一の天然に生じる構造を全ライブラリの基礎として用いることが可能である。従って、一つの特定の態様においては、dAbは単一の既知の主鎖構造を有する。選択された単一の主鎖構造が、問題となる免疫グロブリンスーパーファミリータイプの分子間ではありふれたものになってもよい。その構造をとる十分な数の天然に生じる分子が観察される場合、その構造はありふれたものとなる。従って、1つの態様においては、天然に生じる免疫グロブリンドメインのそれぞれの結合ループの異なる主鎖構造は個別に検討され、その後、異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせを有する、天然に生じる可変ドメインが選択される。何も得られかった場合には、最も近似した等価物を選択することができる。異なるループにおける所望の主鎖構造の組み合わせは、所望の主鎖構造をコードする生殖細胞系遺伝子セグメントを選択することにより作出することができる。一例として、選択した生殖細胞系遺伝子セグメントは、天然にしばしば発現し、特に、それらは全ての天然の生殖細胞系遺伝子セグメント中で最も頻繁に発現するものであってもよい。ライブラリの設計においては、6つの抗原結合ループそれぞれの異なる主鎖構造の頻度を個別に検討してもよい。H1、H2、L1、L2及びL3においては、20から100の範囲で天然に生じる分子の抗原結合ループを構成する、指定された構造が選択される。典型的には、その観察される頻度は35を超えすなわち35から100の間、そして理想的には、50を超える、又は65を超えさえもする。H3ループの大部分が標準的な構造を有さないため、標準的な構造を示す、それらのループ間でありふれた主鎖構造を選択することが好ましい。ループのそれぞれにおいては、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造がされに選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループにおける、最も一般的な標準的な構造CSは以下の通りである:H1-CS1発現レパートリーの79、H2-CS346、L1-VκのCS239、L2-CS1100、L3-VκのCS136計算はκ:λ率が70:30であるとみなす。Hoodetal.1967ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.,48:133。標準的な構造を有するH3ループについては、94番の残基から101番の残基である、塩橋を有する7つの残基のCDR3の長さKabatetal.1991Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,U.S.DepartmentofHealth及びヒトServicesが最も一般的であることが見いだされた。EMBLデータライブラリには、この構造を形成するために必要とされる長さのH3及び鍵となる残基を有するヒト抗体配列が少なくとも16あり、及びタンパク質データバンク中には、抗体モデリングの基礎として使用可能な少なくとも2つの結晶学的な構造が存在する2cgr及び1tet。最も頻繁に発現する生殖細胞系遺伝子セグメントの標準的な構造の組み合わせは、VHセグメント3-23DP-47、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12DPK9及びJκセグメントJκ1である。VHセグメントDP45及びDP38もまた適している。これらのセグメントをさらに、所望の単一の主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として、組み合わせることによって使用することができる。また別の方法としては、単離において、それぞれの結合ループの天然に生じる異なる主鎖構造に基づいて単一の主鎖構造を選択する代わりに、天然に生じる主鎖構造の組み合わせが単一の主鎖構造を選択するための基礎として使用される。抗体の場合には、例えば、任意の2つ、3つ、4つ、5つ、6つの抗原結合ループの天然に生じる標準的な構造の組み合わせを決定することができる。ここで、選択される構造は天然に生じる抗体においてありふれたものであってもよく、かつ、天然のレパートリーにおいて最も頻繁に見られるものであってもよい。従って、ヒト抗体においては、例えば、5つの抗原結合ループであるH1、H2、L1、L2及びL3の天然の組み合わせについて検討する場合には、最も頻繁にみられる標準的な構造の組み合わせを決定し、その後、単一の主鎖構造を選択するための基礎として、H3ループにおける最も一般的な構造と組み合わせる。標準的な配列の多様化選択された複数の既知の主鎖構造又は単一の既知の主鎖構造を有することから、構造的及び/又は機能的多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を多様にすることにより、dAbを構築することができる。このことは、それらがそれらの構造及び/又それらの機能において十分な多様性を有するように変異が生成され、幅のある活性を提供することができることを意味する。所望の多様性は、典型的には、1つ以上の位置において選択した分子を多様化することにより生成される。変化させる位置は、ランダムに選ぶこともでき、又は選択してもよい。多様化はその後、非常に膨大な数の変異を生成する、在住アミノ酸を任意のアミノ酸又は、天然若しくは合成のそのアナログにより置換すること、又は限定数の変異を生成する、在住のアミノ酸を1つ以上の定義されたアミノ酸サブセットにより置換する、ランダム化によって達成できる。それらの変異を導入する様々な方法が報告されている。分子をコードする遺伝子中にランダムな突然変異を導入するためには、変異性PCRHawkinsetal.1992J.Mol.Biol.,226:889、化学的突然変異生成Dengetal.1994J.Biol.Chem.,269:9533又はバクテリアの突然変異誘発遺伝子株Lowetal.1996J.Mol.Biol.,260:359を用いることができる。選択した位置に変異を導入するための方法も当該分野においては周知であり、これらにはPCRの使用を介した又は介さない、ミスマッチオリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドの使用が含まれる。例えば、複数の合成抗体ライブラリが抗原結合ループに対するターゲティング突然変異によって作出された。ヒト破傷風トキソイド結合FabのH3領域が、新しい種類の結合特性を作出するためにランダム化されたBarbasetal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457。変異のないフレームワーク領域を有する巨大ライブラリを生産するために、H3及びL3領域のランダム化又はセミランダム化が生殖細胞系V遺伝子セグメントに付加されたHoogenboomWinter1992J.Mol.Biol.,227:381;Barbasetal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457;Nissimetal.1994EMBOJ.,13:692;Griffithsetal.1994EMBOJ.,13:3245;DeKruifetal.1995J.Mol.Biol.,248:97。それらの変異は、いくつか又は全てのその他の抗原結合ループを含むように拡大されたCramerietal.1996NatureMed.,2:100;Riechmannetal.1995Bio/Technology,13:475;Morphosys,国際公開第97/08320号,上記。ループランダム化はH3のみに対しては約1015を超える構造を作出し、その他の5つのループについても類似した数の変異を生成する可能性があるため、全ての可能な組み合わせを発現するライブラリを構築するために現在の形質転換技術を用いること、又は無細胞系を用いることさえも適してはいない。例えば、これまでに構築された最も巨大なライブラリのうちの1つにおいては、この設計のライブラリにおいて可能な多様性のただ1つの画分である、6x1010の異なる抗体が生成されたGriffithsetal.1994上記。1つの実施形態においては、分子の所望の機能を作出する又は変化させることに直接含まれるそれらの残基のみが多様化される。多くの分子においては、その機能は標的に結合することであり、さらに、分子の全体のパッキング又は選択した主鎖構造の維持に重要な残基を変化させることを避けるために、多様性は標的結合部位に集中させる必要がある。1つの態様においては、抗原結合部位におけるそれらの残基のみが多様化されたdAbライブラリが使用される。これらの残基は特にヒト抗体レパートリーにおいて多様であり、かつ、高品質な抗体/抗原複合体と結合することが知られている。例えば、L2においては、天然に生じる抗体の50及び53番目の位置が変化すると抗原と結合することが観察されることが知られている。反対に、ライブラリにおいては2つが変化したのに対し、標準的な方法では、Kabatetal.1991、上記によって定義された複数の7残基である、相当する相補性決定領域CDR1における全ての残基を多様化させただろう。このことは、幅のある抗原結合特性を作出するためには、機能的な多様性に関する十分な改良が必要とされることを示す。天然においては、抗体の多様性は、ナイーブ初代レパートリーを作出するための生殖細胞系V、D及びJ遺伝子セグメントの体細胞組換えいわゆる生殖細胞系及び接合多様性、並びに生じた再構成V遺伝子の体細胞超変異の、2つの過程の結果である。ヒト抗体配列の解析により、初代レパートリーにおける多様性が抗原結合部位の中心に集中していること、一方で体細胞超変異は初代レパートリーにおいて高度に保存される抗原結合部位の末端の領域にまで多様性を広げることが示されたTomlinsonetal.1996J.Mol.Biol.,256:813を参照のこと。この相補性はおそらく配列間隔を検索するための効果的な方法として発展し、そして明かに抗体に特有ではあるが、その他のポリペプチドレパートリーに対しても容易に適用することができる。多様化した残基は、標的への結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における異なる重複を含む残基のサブセットは、必要に応じて選択の異なる段階において多様化される。抗体レパートリーの例においては、初代ナイーブレパートリーは抗原結合部位のいくつかの、しかし全てではない、残基が多様化された場合に作出される。この文脈で本明細書で使用される場合、ナイーブ又はダミーという用語は、予め決められた標的を有しない抗体分子を意味する。これらの分子は、多様な抗原刺激に曝されていない胎児及び新生児患者の場合と同様に、免疫多様化を受けていない患者の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子に類似する。このレパートリーはその後、抗原又はエピトープの種類によって選択される。必要に応じて、さらなる多様性をその後、最初のレパートリーにおいて多様化された領域の外側に導入することができる。この成熟したレパートリーを改変した機能、特異性又は親和性によって選択することができる。本明細書において記載された配列は、実質的に同一な配列、例えば少なくとも90同一な配列、本明細書で記載された配列と例えば少なくとも91、又は少なくとも92、又は少なくとも93、又は少なくとも94、又は少なくとも95、又は少なくとも96、又は少なくとも97、又は少なくとも98、又は少なくとも99同一な配列を含むことを理解されたい。核酸については、実質的な同一性という用語は、2つの核酸又はその示された配列を、最適にアライン又は比較した場合に、適切なヌクレオチドの挿入又は欠損を含めて、少なくとも約80のヌクレオチドが、通常は少なくとも約90から95、または少なくとも約98から99.5のヌクレオチドが同一であることを示す。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。ヌクレオチド及びアミノ酸配列については、同一という用語は、適切な挿入又は欠損を含めて最適にアライン及び比較した場合の2つの核酸又はアミノ酸配列の同一性の度合いを意味する。また、実質的な同一性は、選択的なハイブリダイゼーションの条件下でDNAセグメントが相補鎖にハイブリダイズする場合にも存在する。2つの配列間の同一性のパーセンテージは、その2つの配列を最適にアライメントするために導入することが必要とされるギャップ及びそれぞれのギャップの長さを考慮した、その配列が共有している同一の位置の数の関数であるすなわち、同一性=同一の位置の数/全位置の数x100。2つの配列間の配列の比較及び同一性のパーセンテージの決定は、以下の限定しない実施例に記載した数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセンテージは、NWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70、又は80のギャップウェート及び1、2、3、4、5、又は6の長さウェートを使用してGCGソフトウェア中のGAPプログラムを用いて決定することができる。2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージもまたALIGNprogramversion2.0に組み込まれたE.Meyers及びW.MillerComput.Appl.Biosci.、4:11~171988のアルゴリズムを用い、PAM120ウェート残基表、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使用して決定することができる。加えて、2つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージはGCGソフトウェア中のGAPプログラム中に組み込まれたNeedleman及びWunschJ.Mol.Biol.48:444~4531970のアルゴリズムを用い、Blossum62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか及び16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェートと1、2、3、4、5、又は6の長さウェートを使用して決定することができる。一例として、本発明のポリペプチド配列は、配列番号38によってコードされる参照配列と100同一であってもよく、又は同一性のパーセンテージが100未満になるような特定の整数までのアミノ酸変異を、参照配列と比較して、含んでいてもよい。それらの変異は、少なくとも1つのアミノ酸欠損、保存置換及び非保存置換を含む置換、又は挿入からなる群より選択される。ここで前記変異は、参照配列若しくは参照配列中の1つ以上の隣接したグループのアミノ酸中に個別に散在して、参照ポリペプチド配列のアミノ-又はカルボキシ-末端又はそれら末端位置の間の任意の位置に生じてもよい。指定された同一性のパーセンテージにおけるアミノ酸変異の数は、配列番号38によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数とそれぞれの同一性のパーセンテージの数字上のパーセンテージ100で割るとを掛け、その後、配列番号38によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の数から得られた数値を引くことによって決定する、又は:であり、式中naはアミノ酸変異の数、xaは配列番号38によってコードされるポリペプチド配列中のアミノ酸の総数、及びyは、例えば70の場合には0.70、80の場合には0.80、85の場合には0.85などであり、並びにここでxa及びyの数値がいずれの整数でもない場合には、xaから引く前に、最も近い整数まで切り捨てる。用語治療および本明細書で使用する文法上の変化は治療法を意味する。特別な症状に関して、治療は、1その症状の生物学的徴候の1つ以上の条件を回復または阻止すること、2その症状をもたらすかまたは関わる生物学的カスケードの1つ以上の点、またはその症状の生物学的徴候の1以上を妨げること、3その症状またはその治療に関連する症候群、効果または副作用の1以上を軽減すること、または4症状または症状の生物学的徴候の1つ以上の進行を遅らせることを意味する。その際、予防療法も熟考される。熟練した従事者は予防が絶対的用語でないことを理解するであろう。医学において、予防は症状もしくはその生物学的徴候の可能性または重症度を実質的に減少するためまたはかかる症状もしくはその生物学的徴候の発症を遅らせるための薬物の予防投与を意味すると解釈される。予防療法は、例えば、被験者が癌を発生する高いリスクにあると考えられる場合、例えば、被験者が癌の強い家族史を有する場合または被験者が発癌物質に曝された場合に適当である。当技術分野で解釈される用語完全な緩解、完全な応答および完全な後退は治療に応答した全ての検出可能な癌のサインおよび/または症候群の消滅を意味する。また、当技術分野で解釈される癌の検出可能な癌のサインまたは症候群は治療する癌の型および段階に基づいて規定することができる。例として、肝臓癌を患う被験者における完全な応答はX線またはCTスキャンで可視性肝臓腫瘍が観察されないこととして規定することができる。いくつかの事例において、臨床応答は下記のRECIST10の判定基準TherassePArbuckSGEisenhauerEAWandersJKaplanRSRubinsteinLetalNewguidelinestoevaluatetheresponsetotreatmentinsolidtumors固体腫瘍の治療に対する応答を評価するための新ガイドラインEuropeanOrganizationforResearchandTreatmentofCancerNationalCancerInstituteoftheUnitedStatesNationalCancerInstituteofCanadaJNatlCancerInst20009220516により規定することができる。好適には、本発明は癌の重症度を治療または軽減する方法であって、癌が脳神経膠腫、グリア芽細胞腫、バナヤン-ゾナナBannayanZonana症候群、コーデン病、レルミットデュクロLhermitteDuclos病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、上衣腫、髄芽腫、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝細胞癌を含む肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨巨細胞腫、甲状腺癌、リンパ芽球性T細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性T細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞型白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫、巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核芽球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性T細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫または濾胞性リンパ腫、神経芽細胞種、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽腔癌、頬側口腔癌、口腔癌、GIST消化管間質腫瘍または精巣癌から選択される前記方法である。好適には、本発明は脳神経膠腫、グリア芽細胞腫、バナヤン-ゾナナBannayanZonana症候群、コーデン病、レルミットデュクロLhermitteDuclos病、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫および甲状腺癌から選択される癌の重症度を治療または軽減する方法に関する。癌は細胞増殖性の病状を意味し、限定されるものでないが、次が含まれる:心臓:肉腫血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫および奇形腫;肺:気管支原性癌扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌、肺胞細気管支癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫;消化管:食道、胃、膵臓管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ、小腸腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫、大腸腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫;泌尿生殖路:腎臓腺癌、ウィルムス腫瘍腎芽腫、リンパ腫、白血病、膀胱および尿道扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、前立腺、精巣精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫;肝臓:肝細胞腫肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫;骨:骨原性肉腫骨肉腫、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫細網細胞肉腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、および巨細胞腫;神経系:頭骨骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎、髄膜髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症、脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、グリオーマ、脳室上衣腫、胚細胞腫松果体腫、多形膠芽細胞腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍、脊髄神経繊維腫、髄膜腫、グリオーマ、肉腫;婦人科:子宮子宮内膜癌、子宮頸部子宮頸癌、前癌子宮頸部異形成、卵巣卵巣癌、顆粒膜腱鞘細胞腫、セルトリーライデッグ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫、外陰部扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、メラノーマ、膣部明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫胎児型横紋筋肉腫、輸卵管;血液系:血液骨髄性白血病急性および慢性、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増多症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫;皮膚:悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬;および副腎:神経芽細胞腫。本明細書で使用する用語癌、新生物および腫瘍は互換的にかつ単数形または複数形で使用され、宿主細胞に病理をもたらす悪性トランスフォーメーションを受けた細胞を意味する。原発性癌細胞すなわち、悪性トランスフォーメーションの部位近くから採取した細胞はよく確立された技法、特に組織学的試験によって非癌細胞から容易に識別することができる。本明細書で使用する癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先由来のいずれの細胞も含まれる。これには転移した癌細胞、およびinvitro培養および癌細胞由来の細胞株が含まれる。通常固体腫瘍して現れる癌の型について言及する場合、臨床的に検出可能な腫瘍は腫瘍塊に基づいて;例えば、CATスキャン、MR撮像、X線、超音波または触診により検出可能なもの、および/または患者から採取可能なサンプル中の1つ以上の癌特異的抗原の発現により検出可能なものである。腫瘍は肝細胞癌HCC病変などの固体腫瘍であってもよい。腫瘍は液性腫瘍を意味する造血性腫瘍、例えば、血液細胞の腫瘍などであってもよい。本明細書で使用する、タンパク質またはポリペプチドの過剰発現したおよび過剰発現ならびにそれらの文法的変化は、所与の細胞が通常細胞と比較して増加した数の或る特定のタンパク質を産生することを意味する。例として挙げると、cMetタンパク質は非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞により過剰発現されうる。さらにcMetタンパク質の突然変異体は或る細胞において野生型cMetタンパク質と比較して過剰発現されうる。当技術分野では理解されるように、細胞におけるポリペプチドの発現レベルはアクチンなどのハウスキーピング遺伝子に対して正準化することができる。いくつかの例において、ある特定のポリペプチドは腫瘍細胞において非腫瘍細胞と比較して発現低下させることができる。本明細書で使用する用語増幅およびその文法的変化は染色体全セットchromosomecomplement中の1以上の余分な遺伝子コピーの存在を意味する。ある特定の実施形態においては、cMetタンパク質をコードする遺伝子が細胞において増幅されうる。HER2遺伝子の増幅は特定型の癌と関係付けられている。HER2遺伝子の増幅はヒト唾液腺および胃腫瘍由来の細胞株、胃および結腸腺癌、ならびに乳腺癌において見出されている。SembaetalProcNatlAcadSciUSA8264976501;YokotaetalOncogene2283287;ZhouetalCancerRes4761236125;KingetalScience229974976;KrausetalEMBOJ6605610;vandeVijveretalMolCellBiol720192023;YamamotoetalNature319230234を参照されたい。典型的には、治療する感受性腫瘍に対して活性を有するいずれかの抗新生物薬剤を本発明の癌の治療に共投与することができる。かかる薬剤の例は、CancerPrinciplesandPracticeofOncologybyVTDevitaandSHellman6theditionLippincottWilliamsWilkinsPublishersに見出すことができる。当業者は、有用であろう薬剤の組み合わせを薬物と関わる癌の特徴に基づいて識別することができよう。本発明に有用な典型的な抗新生物薬には、限定されるものでないが、抗微小管剤、例えば、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイド;白金配位錯体;アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホン酸塩、ニトロソウレア、およびトリアゼン類;抗生物質、例えば、アントラサイクリン系、アクチノマイシン系およびブレオマイシン系;トポイソメラーゼII阻害薬、例えば、エピポドフィロトキシン;代謝拮抗薬、例えば、プリンおよびピリミジン類似体ならびに抗葉酸化合物;トポイソメラーゼI阻害薬、例えば、カンプトテシン;ホルモンおよびホルモン類似体;シグナル伝達経路阻害薬;受容体チロシンキナーゼ阻害薬;セリントレオニンキナーゼ阻害薬;非受容体型チロシンキナーゼ血管形成阻害薬、血管新生阻害薬;免疫療法薬;前アポトーシス剤;および細胞周期シグナル伝達阻害薬が含まれる。本発明はまた、少なくとも1つの本発明の抗原結合タンパク質本明細書では化合物Aと呼ぶまたはその製薬上許容される塩を、他の抗新生物薬化合物Bと共にまたは単独で投与するステップを含むものである、癌を治療する方法を提供する。本明細書で使用する用語規定した期間およびその文法的変化は、化合物A2および化合物B2の1つの投与と化合物A2および化合物B2の他の投与との間の時間間隔を意味する。特に断らない限り、規定した期間は共投与を含みうる。特に断らない限り、規定した期間は1日の間の化合物A2と化合物B2の投与を意味する。本明細書で使用する用語期間およびその文法的変化は、本発明の化合物を指定した連続日数の間に投与することを意味する。特に断らない限り、連続日数は治療の開始と共に開始しなくてもよく、または治療の終了と共に終了しなくてもよく、連続日数が治療コースの間のある時点に存在することが要求されるだけである。化合物Aまたはその製薬上許容される塩と組み合わせて用いるまたは共に投与するさらなる活性成分または成分抗新生物薬の例は化学治療薬である。抗微小管薬または抗有糸分裂薬は、細胞周期のM期または有糸分裂期の間、腫瘍細胞の微小管に対して活性な期特異的なphasespecific薬剤である。抗微小管薬の例には、限定されるものでないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドが含まれる。ジテルペノイドは天然の供給源に由来し、このジテルペノイドは、細胞周期のG2M期で作動する期特異的抗癌剤である。このジテルペノイドは、微小管のβチューブリンサブユニットと結合することによりこのタンパク質を安定化すると考えられる。次いで、このタンパク質の分解は阻害され、有糸分裂が停止し、そして細胞死が続くようである。ジテルペノイドの例には、限定されるものでないが、パクリタキセルおよびその類似体ドセタキセルが含まれる。パクリタキセル、5β20エポキシ12α47β10β13αヘキサ-ヒドロキシタクス11エン9オン410ジアセテート2ベンゾエートの13位でのNベンゾイル3フェニルイソセリンとのエステルは、タイヘイヨウイチイの木Taxusbrevifoliaから単離される天然のジテルペン産物であり、注射液TAXOLとして市販されている。パクリタキセルはテルペンのタキサンファミリーのメンバーである。パクリタキセルは1971年にWaniらJAmChemSoc9323251971により初めて単離され、Waniらはその構造を化学およびX線結晶学的方法により特徴付けた。その活性のための一つの機構はチューブリンと結合し、それにより癌細胞増殖を阻害するパクリタキセルの能力に関するSchiffetalProcNatlAcadSciUSA7715611565SchiffetalNature277665667KumarJBiolChem2561043510441。いくつかのパクリタキセル誘導体の合成および抗癌活性の総括については、DGIKingstonetalStudiesinOrganicChemistryvol26entitledNewtrendsinNaturalProductsChemistry19861986年、天然産物の新傾向AttaurRahmanPWLeQuesneEdspp219235を参照されたい。パクリタキセルは、米国において難治性卵巣癌の治療MarkmanetalYaleJournalofBiologyandMedicine645831991McGuireetalAnnlntemMed1112731989および乳癌の治療HolmesetalJNatCancerInst8317971991における臨床使用について承認されている。パクリタキセルは、皮膚EinzigetalProcAmSocClinOncol2046および頭頸部癌ForastireetalSemOncol20561990の新生物の治療のための潜在的候補である。この化合物はまた、多発性嚢胞腎疾患WooetalNature3687501994、肺癌およびマラリアの治療についても可能性を示す。パクリタキセルを用いた患者の治療は、閾値濃度50nMを超える投薬の継続期間に関連する骨髄抑制多数の細胞系統、IgnoffRJetalCancerChemotherapyPocketGuide1998を生じるKearnsCMetalSeminarsinOncology3p16231995。ドセタキセル、Nカルボキシ3フェニルイソセリン、Ntertブチルエステル、13位で5β20エポキシ12α47β10β13αヘキサヒドロキシタクス11エン9オン4アセテート2ベンゾエートとのエステル、三水和物は、TAXOTEREとして、注射液として市販されている。ドセタキセルの適応症は乳癌の治療である。ドセタキセルは、セイヨウイチイの木の針状葉から抽出される天然の前駆体、10デアセチルバッカチンIIIを使用して調製されるパクリタキセル上記を参照の半合成誘導体である。ドセタキセルの用量制限毒性は好中球減少である。ビンカアルカロイドは、ツルニチニチソウ植物に由来する期特異的抗新生物薬である。ビンカアルカロイドは、チューブリンに特異的に結合することにより、細胞周期のM期有糸分裂で作用する。それ故に、結合したチューブリン分子は微小管へと重合できない。有糸分裂は、細胞分裂中期で停止され、続いて細胞死が起こると考えられる。ビンカアルカロイドの例には、限定されるものでないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。ビンブラスチン、硫酸ビンカロイコブラスチンは、VELBANとして、注射液として市販されている。ビンブラスチンは、種々の固形腫瘍の第二選択療法として適応の可能性を有するが、ビンブラスチンは、主に、精巣癌およびホジキン病を含めた種々のリンパ腫、ならびにリンパ球性リンパ腫および組織球性リンパ腫の治療における適応が示されている。骨髄抑制は、ビンブラスチンの用量制限副作用である。ビンクリスチン、ビンカロイコブラスチン、22オキソ、硫酸塩がONCOVINとして、注射液として市販されている。ビンクリスチンは、急性白血病の治療に適応があり、ホジキン悪性リンパ腫および非ホジキン悪性リンパ腫のための治療レジメンで使用されてきた。脱毛症および神経学的効果は、ビンクリスチンの最も一般的な副作用であり、より少ない程度ではあるが骨髄抑制および胃腸の粘膜炎効果が起こる。ビノレルビン、34ジデヒドロ4デオキシCノルビンカロイコブラスチン[R23ジヒドロキシブタンジオエート]は、酒石酸ビノレルビンの注射液NAVELBINEとして市販されており、これは半合成のビンカアルカロイドである。ビノレルビンは、単独の薬剤としてまたはシスプラチンなどの他の化学療法剤と組合せて、種々の固形腫瘍、特に非小細胞性肺癌、進行乳癌、およびホルモン不応性前立腺癌の治療に適応がある。骨髄抑制は、ビノレルビンの最も一般的な用量制限副作用である。白金配位錯体:白金配位錯体は、DNAと相互作用する、期特異的でない抗癌剤である。この白金錯体は、腫瘍細胞に進入し、アクア化を受けて、DNAと鎖内および鎖間の架橋を形成し、腫瘍に対して有害な生物学的効果を引き起こす。白金配位錯体の例には、限定されるものでないが、オキサリプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチンが含まれる。シスプラチン、シスジアミンジクロロ白金は、PLATINOLとして、注射液として市販されている。シスプラチンは、主に、転移性の精巣癌および卵巣癌ならびに進行膀胱癌の治療に適応がある。シスプラチンの主な用量制限副作用は腎毒性水和および利尿により制御可能であるおよび聴器毒性である。カルボプラチン、白金ジアミン11シクロブタンジカルボキシレートOO]は、PARAPLATINとして、注射液として市販されている。カルボプラチンは、主に、進行卵巣癌の第一選択および第二選択の治療に適応がある。骨髄抑制がカルボプラチンの用量制限毒性である。アルキル化剤:アルキル化剤は、期特異的でない抗癌剤でありかつ強い求電子剤である。典型的には、アルキル化剤は、リン酸、アミノ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、カルボキシル、およびイミダゾール基などの、DNA分子の求核的部分を介して、アルキル化によって、DNAと共有結合を形成する。かかるアルキル化は核酸機能を破壊し、細胞死へと導く。アルキル化剤の例には、限定されるものでないが、シクロホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード;ブスルファンなどのアルキルスルホネート、カルムスチンなどのニトロソウレア;ならびにダカルバジンなどのトリアゼンが含まれる。シクロホスファミド、2ビスアミノ]テトラヒドロ2H132オキサアザホスホリン2オキシド一水和物は、CYTOXANとして、注射液または錠剤として市販されている。シクロホスファミドは、単独の薬剤としてまたは他の化学治療薬と組合せて、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病の治療に適応がある。脱毛症、吐き気、嘔吐および白血球減少症がシクロホスファミドの最も普通の用量制限副作用である。メルファラン、4ビス2クロロエチルアミノLフェニルアラニンは、ALKERANとして、注射液または錠剤として市販されている。メルファランは、多発性骨髄腫および切除不可能な卵巣上皮癌の対症療法に適応がある。骨髄抑制は、メルファランの最も一般的な用量制限副作用である。クロランブシル、4ビスアミノベンゼンブタン酸は、LEUKERAN錠剤として市販されている。クロラムブシルは、慢性リンパ性白血病、ならびにリンパ肉腫、巨大濾胞性リンパ腫、およびホジキン病などの悪性リンパ腫の対症療法に適応がある。骨髄抑制は、クロランブシルの最も一般的な用量制限副作用である。ブスルファン、14ブタンジオールジメタンスルホネートは、MYLERAN錠剤として市販されている。ブスルファンは、慢性骨髄性白血病の対症療法に適応がある。骨髄抑制は、ブスルファンの最も一般的な用量制限副作用である。カルムスチン、13ビス1ニトロソウレアは、BiCNUとして、凍結乾燥された物質の単一バイアルとして市販されている。カルムスチンは、単独の薬剤としてまたは他の薬剤と組合せて、脳腫瘍、多発性骨髄腫、ホジキン病、および非ホジキンリンパ腫のための対症療法に適応がある。骨髄抑制の遅延は、カルムスチンの最も一般的な用量制限副作用である。ダカルバジン、5イミダゾール4カルボキシアミドは、DTICDomeとして、物質の単一バイアルとして市販されている。カルバジンは、転移性の悪性黒色腫の治療について、および他の薬剤と組合せてホジキン病の第二選択治療に適応がある。吐き気、嘔吐、および摂食障害はダカルバジンの最も一般的な用量制限副作用である。抗生物質抗新生物薬は、DNAに結合するかまたはインターカレートする、期特異的でない薬剤である。典型的には、かかる作用は安定なDNA複合体または鎖切断を生じ、これは核酸の通常の機能を破壊し細胞死を導く。抗生物質抗新生物薬の例には、限定されるものでないが、ダクチノマイシンなどのアクチノマイシン、ダウノルビシンおよびドキソルビシンなどのアントラサイクリン、ならびにブレオマイシンが含まれる。アクチノマイシンDとしても知られるダクチノマイシンは、COSMEGENとして、注射剤型で市販されている。ダクチノマイシンは、ウィルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療に適応がある。吐き気、嘔吐、および摂食障害はダクチノマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。ダウノルビシン、8アセチル10としてリポソーム注射剤型として、またはCERUBIDINEとして注射剤として市販されている。ダウノルビシンは、急性非リンパ球性白血病および進行したHIV関連カポジ肉腫の治療における寛解導入療法に適応がある。骨髄抑制がダウノルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。ドキソルビシン、10オキシ8グリコロイル、78910テトラヒドロ6811トリヒドロキシ1メトキシ512ナフタセンジオン塩酸塩はRUBEXまたはADRIAMYCINRDFとして、注射剤型として市販されている。ドキソルビシンは、主に、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病の治療に適応があるが、いくつかの固形腫瘍およびリンパ腫の治療においても有用な成分である。骨髄抑制がドキソルビシンの最も一般的な用量制限副作用である。ストレプトマイセスベルチシルスStreptomycesverticillusの株から単離される細胞毒性糖ペプチド抗生物質の混合物であるブレオマイシンは、BLENOXANEとして市販されている。ブレオマイシンは、単独の薬剤としてまたは他の薬剤と組合せて、扁平上皮癌、リンパ腫、および精巣癌の対症療法として適応がある。肺および皮膚毒性はブレオマイシンの最も一般的な用量制限副作用である。トポイソメラーゼIIインヒビターには、限定されるものでないが、エピポドフィロトキシンが含まれる。エピポドフィロトキシンは、マンドレイク植物に由来する期特異的抗新生物薬である。エピポドフィロトキシンは、典型的には、トポイソメラーゼIIおよびDNAと三元複合体を形成してDNA鎖切断を引き起こすことにより、細胞周期のSおよびG2期において細胞に影響を及ぼす。この鎖切断は蓄積し、続いて細胞死が起こる。エピポドフィロトキシンの例には、限定されるものでないが、エトポシドおよびテニポシドが含まれる。エトポシド、4デメチルエピポドフィロトキシン9460エチリデンβDグルコピラノシド]は、VePESIDとして、注射液またはカプセルとして市販されており、VP16として一般に知られる。エトポシドは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、精巣癌および非小細胞性肺癌の治療に適応がある。骨髄抑制はエトポシドの最も一般的な用量制限副作用である。白血球減少症の発生率は血小板減少症よりさらに重症の傾向がある。テニポシド、4デメチルエピポドフィロトキシン9460テニリデンβDグルコピラノシドは、VUMONとして、注射液として市販されており、VM26として一般に知られる。テニポシドは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、小児の急性白血病の治療に適応がある。骨髄抑制はテニポシドの最も一般的な用量制限副作用である。テニポシドは白血球減少症と血小板減少症の両方を誘導しうる。代謝拮抗剤新生物薬は、DNA合成を阻害するかまたはプリンもしくはピリミジン塩基合成を阻害してDNA合成を制限することにより、細胞周期のS期DNA合成で作用する、期特異的抗新生物薬である。それ故に、S期は進行せず、続いて細胞死が起こる。代謝拮抗剤新生物薬の例には、限定されるものでないが、フルオロウラシル、メトトレキセート、シタラビン、メカプトプリン、チオグアニン、およびゲムシタビンが含まれる。5フルオロウラシル、5フルオロ24ピリミジンジオンはフルオロウラシルとして市販されている。5フルオロウラシルの投与は、チミジル酸合成の阻害を導き、また、RNAおよびDNAの両方の中へと取り込まれる。その結果は、典型的には細胞死である。5フルオロウラシルは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、乳房、結腸、直腸、胃および膵臓の癌の治療に適応がある。骨髄抑制および粘膜炎は5フルオロウラシルの用量制限副作用である。他のフルオロピリミジン類似体には5フルオロデオキシウリジンフロクスウリジンおよび5フルオロデオキシウリジン一リン酸が含まれる。シタラビン、4アミノ1βDアラビノフラノシル2ピリミジノンは、CYTOSARUとして市販されており、AraCとして一般に知られる。シタラビンは、シタラビンの、成長するDNA鎖への末端組み込みによってDNA鎖の延長を阻害することにより、S期において細胞期特異性を示すと考えられる。シタラビンは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、急性白血病の治療に適応がある。他のシチジン類似体には、5アザシチジンおよび22ジフルオロデオキシシチジンゲムシタビンが含まれる。シタラビンは白血球減少症、血小板減少症、および粘膜炎を誘導する。メルカプトプリン、17ジヒドロ6Hプリン6チオン一水和物はPURINETHOLとして市販されている。メルカプトプリンは、いまだ特定されていない機構によってDNA合成を阻害することによりS期において細胞期特異性を示す。メルカプトプリンは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、急性白血病の治療に適応がある。骨髄抑制および胃腸の粘膜炎は高用量におけるメルカプトプリンの予想される副作用である。有用なメルカプトプリン類似体はアザチオプリンである。チオグアニン、2アミノ17ジヒドロ6Hプリン6チオンは、TABLOIDとして市販されている。チオグアニンは、いまだ特定されていない機構によってDNA合成を阻害することによりS期において細胞期特異性を示す。チオグアニンは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、急性白血病の治療に適応がある。白血球減少症、血小板減少症、および貧血を含む骨髄抑制はチオグアニン投与の最も一般的な用量制限副作用である。しかし、胃腸の副作用が起こって用量が制限されうる。他のプリン類似体には、ペントスタチン、エリスロヒドロキシノニルアデニン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビンが含まれる。ゲムシタビン、2デオキシ22ジフルオロシチジン一塩酸塩β異性体はGEMZARとして市販されている。ゲムシタビンは、G1S境界で細胞の進行を遮断することによりS期において細胞期特異性を示す。ゲムシタビンは、シスプラチンと組合せて局所進行非小細胞性肺癌の治療に、および単独で局所進行膵臓癌の治療に適応がある。白血球減少症、血小板減少症、および貧血を含む骨髄抑制はゲムシタビン投与の最も一般的な用量制限副作用である。メトトレキセートN4メチル]メチルアミノベンゾイルLグルタミン酸は、メトトレキセートナトリウムとして市販されている。メトトレキセートは、プリンヌクレオチドおよびチミジル酸の合成のために必要とされるジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害を通してDNA合成、修復および/または複製を阻害することにより、特異的にS期において細胞期効果を示す。メトトレキセートは、単独の薬剤としてまたは他の化学療法剤と組合せて、絨毛癌、髄膜白血病、非ホジキンリンパ腫、ならびに乳房、頭部、頸部、卵巣および膀胱の癌の治療に適応がある。骨髄抑制白血球減少症、血小板減少症、および貧血および粘膜炎はメトトレキセート投与の予想される副作用である。カンプトテシンおよびカンプトテシン誘導体を含むカンプトテシン類は、トポイソメラーゼI阻害剤として利用できるかまたは開発中である。カンプトテシン細胞傷害活性は、そのトポイソメラーゼI阻害活性と関連すると考えられる。カンプトテシン類の例には、限定されるものでないが、イリノテカン、トポテカン、および下記の71011エチレンジオキシ20カンプトテシンの種々の光学異性体が含まれる。イリノテカンHCl、411ジエチル4ヒドロキシ9ジオン塩酸塩は、注射液CAMPTOSARとして市販されている。イリノテカンは、その活性代謝産物SN38と共に、トポイソメラーゼIDNA複合体に結合するカンプトテシンの誘導体である。細胞毒性は、トポイソメラーゼIDNAイリノテカンまたはSN38の三元複合体の複製酵素との相互作用によって引き起こされる回復不能な二重鎖切断の結果として起こると考えられる。イリノテカンは、結腸または直腸の転移性癌の治療に適応がある。イリノテカンHClの用量制限副作用は好中球減少を含む骨髄抑制、および下痢を含むGI影響である。トポテカンHCl、10メチル4エチル49ジヒドロキシ1Hピラノ3467インドリジノ12bキノリン314ジオン一塩酸塩は、注射液HYCAMTINとして市販されている。トポテカンはトポイソメラーゼIDNA複合体に結合するカンプトテシンの誘導体であり、DNA分子のねじれ歪みに応答してトポイソメラーゼIによって引き起こされる一重鎖切断の再連結を防止する。トポテカンは、卵巣癌および小細胞性肺癌の転移性癌の第二選択治療に適応がある。トポテカンHClの用量制限副作用は骨髄抑制、主に好中球減少症である。VOTRIENTとして市販されているパゾパニブはチロシンキナーゼインヒビターTKIである。パゾパニブは化学名54メチルアミノ2ピリミジニルアミノ2メチルベンゼンスルホンアミド一塩酸塩をもつ塩酸塩として提示される。パゾパニブは進行性腎細胞癌を患う患者の治療用に認可されている。リツキシマブはリツキサンおよびMABTHERAとして市販されるキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブはB細胞上のCD20と結合して細胞アポトーシスを引き起こす。リツキシマブは静脈内に投与され、慢性関節リウマチおよびB細胞非ホジキンリンパ腫の治療用に認可されている。オファツムマブはARZERRAとして市販される、完全ヒトモノクローナル抗体である。オファツムマブはB細胞上のCD20と結合し、フルダラビンFludaraおよびアレムツズマブCampathによる治療に不応性の成人において慢性リンパ性白血病CLL;白血球の癌の1つの型を治療するために用いられる。mTORインヒビターには、限定されるものでないが、ラパマイシンFK506およびラパログ、RAD001またはエベロリムスAfinitor、CCI779またはテムシロリムス、AP23573、AZD8055、WYE354、WYE600、WYE687およびPp121が含まれる。ベキサロテンはTargretinとして市販され、レチノイドX受容体RXRを活性化するレチノイドのサブクラスのメンバーである。これらのレチノイド受容体はレチノイン酸受容体RARのそれとは異なった生物学的活性を有する。化学名は41エテニル安息香酸である。ベキサロテンは、少なくとも1つの他の医薬を用いて首尾よく治療できなかった疾患を患う人の皮膚T細胞リンパ腫皮膚癌の型であるCTCLを治療するために用いられる。Nexavarとして市販されるソラフェニブはマルチキナーゼインヒビターと呼ばれる処方の1つのクラスである。その化学名は444クロロ3トリフルオロメチルフェニルカルバモイルアミノフェノキシNメチルピリジン2カルボキサミドである。ソラフェニブは進行性腎細胞癌腎で始まる癌の一つの型を治療するために用いられる。ソラフェニブはまた、切除不能な肝細胞癌外科で治療できない肝臓癌の一つの型を治療するために用いられる。erbBインヒビターの例にはラパチニブ、エルロチニブ、およびゲフィチニブが含まれる。ラパチニブ、Nメチルオキシフェニル65エチルアミノメチル2フラニル4キナゾリンアミン図解した式IIにより表されるは強力な、経口、小分子、erbB1およびerbB2EGFRおよびHER2チロシンキナーゼの二重インヒビターであって、HER2陽性転移性乳癌の治療のためのカペシタビンとの併用が認可されている。II式の化合物のフリー塩基、HCl塩およびジトシレート塩はWO99351461999年7月15日公開;およびWO02025522002年1月10日公開に開示された手順により調製することができる。エルロチニブ、N67ビス2エチルオキシ4キナゾリンアミン登録商標Tarcevaとして市販されるは図解した式IIIにより表される。IIIエルロチニブのフリー塩基およびHCl塩は、例えば、米国特許5747498の実施例20によって調製することができる。ゲフィチニブ、4キナゾリンアミンN7メトキシ634モルホリンプロポキシは図解した式IVにより表される。IV登録商標イレッサAstraZenencaのもとで市販されるゲフィチニブはerbB1インヒビターであって、白金系とドセタキセル両方の化学療法の失敗後の局所進行性または転移性の非小細胞肺癌を患う患者を治療するための単独療法に適応である。ゲフィチニブのフリー塩基、HCl塩、および二塩酸塩は国際特許出願PCTGB96009611996年4月23日出願およびWO96339801996年10月31日公開に従って調製することができる。実施例ヒトHGFに対する中和化mAbの産生マウス骨髄腫NS0由来の細胞で産生された組換えヒトHGFタンパク質をRDSystemsカタログ番号294HGNCFから入手した。2匹のSJLOlaHsdマウスを第0、6および11日にRD組換えヒトHGFを用いて免疫化した。脾細胞およびリンパ節を第14日に単離し、P3X63Ag8653由来の融合パートナーを用いてマウス骨髄腫細胞と融合した。不死化した抗体を産生する細胞を作製した。HAT選択を用いて未融合骨髄腫細胞を取り除いた。活動期培養物から得られるハイブリドーマ上清をHGFcMetの特異的結合および中和についてスクリーニングした。ヒットしたものを特定し、確認し、そして半固体培地での制限希釈または増殖によりクローニングしてモノクローナル抗体を得た。所望の特徴をもつモノクローナル抗体を培養液中でスケールアップし、抗体を標準のクロマトグラフィ法により精製した。得られる精製抗体を次いでさらに結合アフィニティおよび機能的効力について特徴付けた。抗体ヒト化:ハイブリドーマ可変域のクローニングS260116C12、S260105B02、S260115C11およびS265109B10ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出した。重鎖および軽鎖可変ドメインcDNA配列を逆転写とポリメラーゼ連鎖反応RTPCRにより作製した。RTPCR用のフォワードプライマーはマウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、そしてリバースプライマーは抗体定常域に特異的であって、この場合、S260116C12、S260105B02、S265109B10に対するアイソタイプIgG1およびS260115C11に対するアイソタイプIgG2bであった。プライマーはJonesおよびBendigBioTechnology9:88、1991が記載した計画に基づいて設計した。RTPCRは両方のV領域配列に対して行い、正しいV領域配列のその後の検証ができるようにした。RTPCRにより作製したV領域産物に対するDNA配列データを得た。抗体ヒト化:キメラ抗体のクローニング哺乳動物発現ベクター中へのクローニング用の制限部位ならびにヒトシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドを構築することにより、キメラ抗体をコードするDNA発現構築物をdenovo調製した。HindIIIおよびSpeI制限部位を導入して、ヒトγ1定常域を含有する哺乳動物発現ベクター中へクローニングするシグナル配列配列番号1を含有するVHドメインの枠を作った。HindIIIおよびBsiWI制限部位を導入して、ヒトκ定常域を含有する哺乳動物発現ベクター中へクローニングするシグナル配列配列番号1を含有するVLドメインの枠を作った。抗体ヒト化:ヒト化変異体のクローニング哺乳動物発現ベクター中へのクローニング用の制限部位ならびにヒトシグナル配列を含む重複オリゴヌクレオチドを構築することにより、ヒト化抗体変異体をコードするDNA発現構築物をdenovo調製した。HindIIIおよびSpeI制限部位を導入して、ヒトγ1定常域を含有する哺乳動物発現ベクター中へクローニングするシグナル配列配列番号1を含有するVHドメインの枠を作った。HindIIIおよびBsiWI制限部位を導入して、ヒトκ定常域を含有する哺乳動物発現ベクター中へクローニングするシグナル配列配列番号1を含有するVLドメインの枠を作った。組換え抗体の発現関係重鎖および軽鎖下の表1に掲げたをコードする発現プラスミドをHEK2936E細胞中に一過的にトランスフェクトして小規模で発現して抗体を産生した。抗体を上清からプロテインA精製し、Nanodrop分光高度計を用いて測定した。表1:キメラおよびヒト化抗体変異体Biacore上での抗体のHGFとの結合抗ヒトIgGBiacoreBR100839をCM5チップ上に一級アミンカップリングにより固定し、この表面を用いて抗体分子を捕獲した。ヒトHGFv1およびヒトHGFδ5GRITS38813を分析質として256nM、64nM、16nM、4nM、および1nMにて用いた。再生は3M塩化マグネシウムを用いて行った。全ての結合曲線をバッファー注入すなわち0nMで二重参照し、データをA100評価ソフトウエアに11モデルを用いて適合させた。試験は37°Cにて試験バッファーとしてVEGF試験に対してはHBを用い、HGF試験に対しては01M塩化リチウム、01Mグアニジン、01トリトンX705、013プロパンスルホナートSigmaT7763を加えたHBSNを用いて実施した。データは、全ての分子がHGF全長および短縮バージョンと結合できることを示した。試験した構築物のほとんどに対するアフィニティ測定を、BiacoreによりHGF全長および短縮バージョンについて測定可能な範囲内で実施したが、BPC1880結合についてはBiacoreにより測定可能なアフィニティ値を得るのに失敗した。しかしながらこれはBPC1880のHGFとの結合が非常に強いことを示すものである。表2はヒト化mAbsBPC1873、1880、1881、1884、1885およびキメラmAbBPC1856のHGF結合を示す。表2:抗体のHGFとの結合HGFVEGF二重特異性抗体の、Biacore上のHGFおよびVEGFとの結合プロテインAをCM5チップ上に一級アミンカップリングにより固定し、この表面を用いて抗体分子を捕獲した。ヒトHGFv1GRITS35238およびヒトHGFδ5GRITS38813を64nM、16nM、4nM、1nMおよび025nMにて用い、そしてヒトVEGFを256nM、64nM、16nM、4nMおよび1nMにて用いた。再生は50mMNaOHを用いて行った。全ての結合曲線をバッファー注入すなわち0nMで二重参照し、データをHGF分析については11モデル、そしてVEGF分析については11モデルおよび二価の分析質モデルを用いてA100評価ソフトウエアに適合させた。試験は25°Cにて試験バッファーとしてVEGF試験に対してはHBを用い、HGF試験に対しては01M塩化リチウム、01Mグアニジン、01トリトンX705、013プロパンスルホナートSigmaT7763を加えたHBSNを用いて実施した。データは、二重特異性分子がHGF全長および短縮バージョンおよびVEGFと結合できることを示した。HGF全長および短縮バージョン結合に対するデータはBiacoreにより測定可能なアフィニティを得るのに失敗したが、これはオフ速度がこのアッセイの機器の感受性を越えることによるものであって、このことは試験した分子BPC1923、BPC1924、BPC1925およびBPC1926がHGFと強く結合することを示した。表3はBiacore試験の結果を示し、BPC1923、BPC1924、BPC1925およびBPC1926がVEGFと結合できることを確証する。表3:抗体のVEGFとの結合併せて考えると、データは16C12のヒト化誘導体、特に16C12Ha4La0BPC1880はHGFに対して非常に高いアフィニティを有する抗体であり、かつ潜在的治療抗体であることを示唆する。重要なこととして、このHFGとの高いアフィニティは、16C12Ha4La0の二重特異性mAbdAbフォーマットにおいて保持され、かつVEGFとの高いアフィニティが加えられるBPC1923、BPC1924、BPC1925およびBPC1926に例示されるように。HGFおよびVEGF架橋ELISA96ウエル高結合プレートを、5μgmlの組換えヒトhVEGF165を含むPBSTB090219、Domantis、PBS中に19mgmLでコーティングし、一晩4°Cにて貯蔵した。そのプレートを2回PBSで洗浄した。200μLのブロック溶液PBSバッファー中に5BSAを各ウエルに加え、プレートを少なくとも1時間室温にてインキュベートした。次いでさらに1回の洗浄ステップを実施した。BPC1923、BPC1924、BPC1925、BPC1926、BPC1880をプレート全体にわたってブロック溶液に514nMまたは60nMから始めて、連続して希釈した。HGFVEGFmAbdAbの詳細は別表に掲げている。アッセイに無関係なタンパク質に特異的なmAbによるフォーマット中に抗VEGFdAb部分を含有するmAbdAb対照名称DMS4000も含まれた。1時間インキュベーション後に、プレートを洗浄した。ビオチン化hHGFv1GRITS37567、162mgmL、N1318512をブロック溶液で5μgmLに希釈し、50μLを各ウエルに加えた。プレートを1時間インキュベートし、次いで洗浄した。ストレプトアビジンHRPGEHealthcare、RPN4401Vを4000分の1にブロック溶液で希釈し、50μLを各ウエルに加えた。さらに1回の洗浄ステップの後、50μlのOPDSigmaFast基質溶液を各ウエルに加え、15分間後、50μLの2M硫酸を加えて反応を停止した。VersaMaxチューナブルマイクロプレートリーダーMolecularDevicesを使い、基本的な終点プロトコルを用いて吸収を490nmにて読み取った。図1は、HGFVEGF架橋ELISAの結果であり、BPC1923、BPC1924、BPC1925およびBPC1926がHGFおよびVEGFの両方と同時に結合できることを確証する。BPC1880およびDMS4000は両方の標的との結合を示さなかった。Mv1Lu増殖アッセイMv1Lu細胞増殖アッセイを用いて推定HGFアンタゴニストの効力を評価することができる。TGFβはMv1Lu細胞増殖を阻害し、これはHGFを加えることにより克服されるJImmunolMethods1996Jan16Vol1895964。従って、HGF処理細胞とHGF無処理細胞の間の細胞増殖の差はHGF媒介性細胞増殖を反映する。推定HGFアンタゴニストのこの効果を阻害する能力を定量することができる。S260116C12およびそのヒト化変異体のHGF中和能力を試験するために、Mv1Lu細胞ATCCを、40ngmlヒトHGF、1ngmlTGFβRDSystemsおよび試験抗体を補充した無血清培地中でインキュベートした。HGFは対照ウエルから適宜省略した。全てのアッセイはTGFβの存在のもとで行った。全てのアッセイは、HGFと記したネガティブ対照条件を除いて、HGFの存在のもとで行った。抗体は、13x1008、67x1009、33x1009、17x1009、83x1010、42x1010、21x1010、10x1010Mの最終濃度で加えた。無関係アイソタイプ対照ハイブリッド対照抗体と記したを用いた場合、13x1008Mの最終濃度を適用した。生物発光シグナルが生存細胞数に比例する発光性ATP依存アッセイCellTiterGlo、Promegaを用いて全細胞数を48時間後に測定した。全ての条件を三重に試験した。示したデータは平均値SDとして表示し、少なくとも2回の独立した実験の代表値である。ヒト化抗HGFモノクローナル抗体のBPC1880、BPC1881、BPC1884およびBPC1885は、それぞれ用量に応じた方式でHGF媒介性Mv1Lu細胞増殖を抑止し、それらのプロファイルはマウス抗体S260116C12と識別できなかった。ハイブリッド対照抗体はHGF媒介性細胞増殖に影響を与えなかった図2a~d。このHGF中和能力がmAbdAbフォーマットで保持されたことを確証するために、マウス抗HGFmAbS260116C12と代表的なヒト化抗HGFmAbdAb構築物BPC1923およびBPC1924それぞれヒト化mAb変異体BPC1880およびBPC1881に対応するとの間で直接比較を行った。これらのmAbdAbは抗VEGFdAb部分と共に、フォーマット中に抗HGFモノクローナル抗体成分を含有する。抗体を33x1008、17x1008、83x1009、42x1009、21x1009、10x1009、52x1010Mの最終濃度で加えた。ハイブリッド対照抗体および無関係なmAbdAb対照DMS4000と記したを使用し、それぞれ33x1008Mの最終濃度を適用した。示したデータは平均値SDとして表示し、少なくとも2回の独立した実験の代表値である。mAbdAb構築物による処置はHGF媒介性Mv1Lu細胞増殖の用量依存型抑止をもたらし、これは対応するmAb応答プロファイルとは識別不能であった図2e~f。無関係なハイブリッド対照抗体またはアッセイに無関係なタンパク質を標的化するモノクローナル抗体部分を含むアイソタイプ対照および抗VEGFdAb部分DMS4000はHGF媒介性細胞増殖に影響を与えることがなく、観察された試験抗体の効果はHGFの特異的中和によることを確証した。併せ考えると、これらのデータは、マウス抗HGFmAbS260116C12およびそのヒト化変異体BPC1880、BPC1881、BPC1884およびBPC1885と記したはHGF依存細胞増殖を用量依存型方式で抑止することおよびこの活性はBPC1923およびBPC1924により例示したmAbdAbフォーマットにおいて保持されることを示す。ヒト臍帯内皮細胞HUVECcMETリン酸化アッセイ血清飢餓HUVEC単層の組換えHGFによる処理はHGF受容体cMETのリン酸化をもたらし、これは細胞溶菌液において検出可能である。従って、HGFの中和は、推定HGFアンタゴニストで前インキュベートしておいた、HGF処理した細胞からのリン酸化cMETの定量により評価することができる。プールしたドナーHUVECLonzaを、ゼラチンコーティングした96ウエルプレートBectonDickensonに5000細胞ウエルでBulletkit培地Lonza中にまき、一晩37°C5CO2にてインキュベートした。培地を、添加物を含まない基本培地例えば、EGM2、Lonzaで置き換え、細胞をおよそ4時間インキュベートした。試験抗体の濃度滴定液を組換えHGFと15分間、前インキュベートした後に、細胞に加えて、25ngmlHGFの最終濃度および20、10、05、025、0125、006μgml試験抗体の最終濃度とした。細胞を37°Cにて20~25分間インキュベートした後、洗浄し、全細胞溶液を、MSDELISA法によりメーカーの取扱説明書MesoscaleDiscoveryに従ってpcMET分析用に調製した。全ての条件を少なくとも三重で実施した。示したデータは平均値SDとして表示し、少なくとも2回の独立した実験の代表値である。マウス抗HGF抗体S260116C12によるHGFの中和はHGF媒介性cMETリン酸化の用量依存型中和をもたらした。類似のデータがBPC1873、BPC1880、BPC1881、BPC1884およびBPC1885と記したS260116C12のヒト化変異体のそれぞれによる前インキュベーションにより得られ、S260116C12のHGF中和能力およびヒト化後のその保持を確証した。ハイブリッド対照抗体による前インキュベーションはcMETリン酸化に影響を与えなかった。データを粗MSD値として示した図3a~c。このHGF中和能力がmAbdAbフォーマットに保持されたことを確証するために、ヒト化抗HGFmAb、BPC1880およびBPC1881および対応する抗HGF抗VEGFmAbdAb構築物BPC1923およびBPC1924の間で直接比較を行った。これらのmAbdAbは抗HGFモノクローナル抗体成分を抗VEGFdAb部分と共に含有する。抗体をある濃度範囲例えば、13x1008、67x1009、33x1009、17x1009、83x1010、42x1010Mにわたって加えた。無関係なハイブリッド対照抗体を用いて13x1008Mの最終濃度にて適用した。示したデータは三重サンプルを用いて平均値SDとして表示し、少なくとも2回の独立した実験の代表値である。mAbdAb構築物による処理は、HGF媒介性cMETリン酸化の用量依存抑止をもたらし、これは対応するmAb応答プロファイルに非常に類似した図3d~e。無関係なハイブリッド対照抗体による処理はHGF媒介性cMetリン酸化に影響を与えなかった。データは、マウス抗HGFmAbS260116C12およびそのヒト化変異体BPC1880、BPC1881と記したの、HUVECにおけるHGF媒介性cMetリン酸化を中和する能力が保持され、BPC1923およびBPC1924により例示されることを示す。HUVECにおけるdAbmAbによるHGF媒介性cMETリン酸化およびVEGF媒介性VEGFR2リン酸化血清飢餓HUVEC単層の組換え血管内皮増殖因子VEGFによる処理はVEGF受容体VEGFR2のリン酸化をもたらし、これは細胞溶菌液において検出可能である。従って、VEGFの中和は、推定VEGFアンタゴニストで前インキュベートしておいた、VEGFで処理した細胞からのリン酸化VEGFR2の定量により評価することができる。さらに、抗HGF、抗VEGFmAbdAbの、VEGF媒介性VEGFR2リン酸化およびHGF媒介性cMETリン酸化を同時に阻害する能力は、VEGF、HGFおよび推定二重特異性VEGFHGFアンタゴニスト、例えば、mAbdAbの組み合わせで前インキュベートした細胞の処理により、同様に評価することができる。プールしたドナーHUVECLonzaを、ゼラチンコーティングした96ウエルプレートBectonDickensonに5000細胞ウエルでBulletkit培地Lonza中にまき、一晩37°C5CO2にてインキュベートした。培地を、添加物を含まない基本培地例えば、EGM2、Lonzaで置き換え、細胞をおよそ4時間インキュベートした。試験抗体の濃度滴定液を組換えHGFと15分間前インキュベートした後に、細胞に加えて、25ngmlHGF10ngmlVEGF165の最終濃度および13x1008、67x1009、33x1009、17x1009、83x1010、42x1010M試験抗体の最終濃度とした。細胞を37°Cにて20~25分間インキュベートした後、洗浄し、全細胞溶液を、MSDELISA法によりメーカーの取扱説明書MesoscaleDiscoveryに従ってpcMETおよびpVEGFR2分析用に調製した。全ての条件を少なくとも三重で実施した。示したデータは平均値SDとして表示し、少なくとも2回の独立した実験の代表値である。HGFまたはHGFとVEGFの組み合わせによる細胞の処理は、無処理細胞またはVEGF単独で処理した細胞と比較してpcMETの検出可能な増加をもたらした。HGFとVEGFの組み合わせのヒト化抗HGF抗体BPC1884または対応するmAbdAbBPC1925による前インキュベーションは、HGF媒介性cMETリン酸化の用量依存型中和をもたらし、HGF中和能力がmAbdAbフォーマットで保持されることを示す実施例10の発見と一致した図4a。pVEGFR2のレベルを同じ細胞溶菌液サンプルで定量した。VEGFまたはVEGFおよびHGFの組み合わせによる細胞の処理は、無処理細胞またはHGF単独で処理した細胞と比較して検出可能なpVEGFR2の増加をもたらした。HGFとVEGFの組み合わせの抗HGF、抗VEGFmAbdAbBPC1925による前インキュベーションは、検出可能なVEGFR2の低下をもたらし、図4aに記載したVEGFの中和と同時にHGF中和を反映した。対照的に、対応するヒト化抗HGFmAbBPC1884はVEGFR2レベルに影響を与えず、VEGF中和がmAbdAbのVEGF標的化部分により特異的に達成されたことを確証する図4b。これらのデータは、VEGFおよびHGFがBPC1925に例示した抗HGF抗VEGFmAbdAbにより中和され得ること、および、HUVECにおけるHGF媒介性pcMETおよびVEGF媒介性pVEGFR2の測定により確認され得ることを示す。血管新生アッセイこの実施例は予言的なものである。本発明の抗原結合タンパク質を試験できる追加のアッセイを行うためのガイダンスを与える。このアッセイは、血管新生を阻害する抗HGF抗VEGFmAbdAbまたは他の抗原結合タンパク質の能力をinvitro細胞アッセイにおいて評価する。AngiokitTMは、市販される内皮細胞および繊維芽細胞の共培養アッセイであり、推定抗血管形成薬の内皮ネットワーク形成に関する1つ以上のパラメーターを阻害する能力をinvitroで試験するのに用いることができる。これらのパラメーターは画像解析を用いて定量され、それには、例えば、内皮細胞面積フィールド面積、血管分枝点の数、平均細管長などが含まれる。典型的なアッセイにおいては、血管新生の共培養アッセイAngiokitTMをメーカーTCSCellworksの指示通り実施する。概略を述べると、培地を24ウエルフォーマットAngiokitTM共培養プレートから吸引し、ヒトHGFおよび/またはVEGFを補充したまたは補充しない全成長培地で置き換える。試験化合物を適当な濃度で加えることができる。培地と試験化合物を典型的には第4、7および9日に置き換える。細胞を典型的には第11日に固定し、そして内皮細胞ネットワークをメーカーの指示のように抗CD31免疫組織化学により可視化する。画像を光顕微鏡により記録し、画像解析を適当なソフトウエア例えば、AngioSys、TCSCellworksを用いて行い、様々な血管形成パラメーターの数値化を達成する。それにより、様々な血管形成プロセスにおける試験抗原結合タンパク質によるHGFアンタゴニズム、VEGFアンタゴニズムまたは同時のHGFおよびVEGFアンタゴニズムの効果を評価しかつ適当なポジティブおよびネガティブ対照と比較することができる。動物モデルにおける腫瘍増殖の阻害この実施例は予言的なものである。この実施例は本発明の抗原結合タンパク質を試験できる追加のアッセイを行うためのガイダンスを提供する。このアッセイは、抗HGF抗VEGFmAbdAbまたは他の抗原結合タンパク質の、動物モデルにおける実験的腫瘍増殖を阻害する能力を評価する。典型的な実験においては、動物例えば、マウスに腫瘍細胞または切除した腫瘍断片の懸濁液を接種し、腫瘍増殖を開始する。かかる接種または移植は、例えば、皮下;筋肉内;特定組織中に実施して、同所性の腫瘍静脈内に腫瘍細胞型に応じて、例えば、脳内にまたは乳房[乳腺]脂肪体中に行うことができる。免疫無防備状態の動物を用いて、例えば、ヒト腫瘍細胞株からの腫瘍異種移植の増殖を可能にすることができる。適当な経路例えば、静脈内、腹膜内によるmAbdAbまたは他の抗原結合タンパク質の投与を開始した後、同時または続いての腫瘍細胞接種を行うことができる。さらなる試験化合物の投薬を、典型的には、実験期間中、定期的に行う。腫瘍増殖を阻害するmAbdAbsまたは他の抗原結合タンパク質の治療効果は、明白な腫瘍次元の物理的測定、腫瘍生存の生物発光イメージング適当なルシフェラーゼ発現腫瘍細胞株が使われる事例ではを含む様々な手法により、ならびに、免疫組織化学および組織学的検査を含む一次および二次腫瘍の死後検査により評価することができる。後者は推定治療薬の効果、抗原結合タンパク質の標的に特異的な様々な腫瘍の特徴、例えば、血管新生/微小血管密度、壊死、リン酸化VEGF受容体またはHGF受容体の検出を提供しうる。さらなるバイオマーカーの定量、例えば、腫瘍負荷または腫瘍増殖の特徴を反映しうるHGF、VEGFまたは他の腫瘍由来の因子の循環レベルの検出も行うことができ。mAbdAbで治療する動物のグループ中のかかる腫瘍増殖のパラメーターを、対照物質または抗原結合タンパク質の組み合わせで処理する動物のグループと比較することができる。BxPC3細胞cMETリン酸化アッセイ血清飢餓BxPC3細胞の組換えHGFによる処理はHGF受容体cMETのリン酸化をもたらし、これは細胞溶菌液において検出可能である。従って、HGFの中和は、推定HGFアンタゴニストによる前インキュベーションの後にHGF処理した細胞からのリン酸化cMETの定量により評価することができる。BxPC3細胞をCostar96ウエルプレートのグルタミンおよび10FCSを補充したRPMI中のウエルに10000細胞/ウエルにてまき、16時間、37°C5CO2にてインキュベートした。細胞を100μlPBSで洗浄し、100μlRPMI無血清培地を加え、さらに16時間、37°C5CO2にてインキュベーションした。試験抗体を細胞に、濃度範囲667x1007、167x1007、42x1008、10x1008、26x1009、65x1010、16x1010、41x1011、10x1011Mにわたって二重で加えた。15分間後に、組換えHGFを200ngmlの最終濃度にて加えた。37°C5CO2にてインキュベーションの後、培地を取り除き、細胞を100μl氷冷PBSで洗浄し、メーカーMesoscaleDiscoveryの取扱説明書に従いMSDELISA法によるcMETホスホcMET検出用の細胞溶菌液を調製した。データは細胞溶菌液中の全検出可能cMETのパーセントとしてのpcMETとして表し、二重値のSEは少なくとも2回の独立した実験の代表値である。マウス抗HGFmAbS260116C12の添加はHGF媒介性cMETリン酸化の用量依存型中和をもたらした。類似のデータがBPC1880、BPC1881、BPC1884およびBPC1885と記したS260116C12のヒト化変異体を用いた処理により得られ、HGF中和能力がヒト化後に保持されていることが確証された。ハイブリッド抗体対照による処理はcMETリン酸化に対する実質的な効果を与えなかった。このHGF中和能力がmAbdAbフォーマットで保持されることを確認するために、細胞を抗HGF抗VEGFmAbdAb構築物のBPC1923、BPC1924、BPC1925、BPC1926それぞれmAbBPC1880、BPC1881、BPC1884、BPC1885に対応するで処理した。これらのmAbdAbは、抗VEGFdAb部分と共にフォーマットに抗HGFモノクローナル抗体成分を含有する。mAbdAb構築物による処理は、HGF媒介性cMETリン酸化の用量依存型抑止をもたらし、これは対応するmAb応答プロファイルじから識別できなかった。無関係なmAbdAbアイソタイプ対照DMS4000による処理はHGF媒介性cMetリン酸化に影響を与えなかった図5。これらのデータはBxPC3細胞におけるHGF媒介性cMETリン酸化を阻害するマウス抗HGFmAbS260116C12の能力を示しかつヒト化後のこの活性および抗HGF抗VEGFmAbdAbとしてのコンフィギュレーションの保持を確証する。BxPC3細胞遊走アッセイOris細胞遊走アッセイAmsbioTMは各ウエル内にシリコーン播種ストッパーを予め挿入した無菌96ウエル組織培養プレートから成る。細胞を加え、そして、集密まで増殖する。ストッパーを取り除いて円形の無細胞領域を残す。遊走インヒビターまたはプロモーターの添加後、この領域中への細胞遊走を経時的にモニターする。従って、このアッセイは、細胞遊走をモジュレートすることができる、HGFを含む因子の推定インヒビターを評価する手段を提供する。BxPC3膵臓細胞をOris細胞遊走96ウエルプレート内に1ウエル当たり100000細胞にてRPMI完全培地中にまき、72時間集密までインキュベートした。細胞ストッパーを取出して無細胞領域を作った。細胞を24時間、RPMI無血清中で様々な濃度667x1007、167x1007、42x1008、10x1008、26x1009、65x1010、16x1010、41x1011、10x1011Mの試験抗体と共に25ngmlHGFの最終濃度の組換えHGFと組み合わせてインキュベートした。無細胞領域中への細胞遊走を、CellTrackerCellTrackerTMGreenCMFDA、InvitrogenC2925による蛍光標識細胞およびプレートリーダーEnvisionを用いる蛍光測定により定量した。元来の無細胞領域の外側の細胞に由来する蛍光の排除は、メーカーの取扱説明書Amsbioに従い、プレートマスクを応用して行った。データは最大遊走のパーセントとして表し、少なくとも2回の独立実験の代表値である。細胞のHGFによる処理は、HGF無処理対照と比較して、無細胞領域中への細胞遊走の実質的増加をもたらした。このHGF媒介性細胞遊走は、マウス抗HGFmAbS260116C12により用量依存型方式で阻害された。ヒト化S260116C12変異体BPC1873、BPC1880、BPC1881、BPC1884およびBPC1885による処理は、非常に類似した阻害プロファイルをもたらし、ヒト化後のHGF中和能力の保持を確証した図6。Vk抗VEGFdAbの作製VkdAbsをUSSN61512143に記載の通り作製した。概略を述べると、ヒトVEGFと結合する能力をもつドメイン抗体dAbを作製するために、VkdAbを提示するファージディスプレイライブラリーを用いて選択を行った。選択は、共にビオチン化したrhVEGF15可溶性選択でおよびプラスチック表面に固定したrhVEGF165受動的選択で実施した。通常のファージパニング技法および濃度低減する抗原に対する3ラウンドの選択を用いてVEGF結合dAbの一団を特定した。配列分析は76種類のユニークなVk配列を特定した。適当な構造のdAbを特定する目的で、dAbを、哺乳動物発現ベクター中のヒトIgG1アイソタイプパスコリズマブ;抗IL4のジェネリックmAbの重鎖のC末端上にクローニングした。dAbをmAbと、2つのリンカー配列GSTVAAPSTから成る短いリンカーおよび配列GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGSから成る長いリンカーのうちの1つで連結した。dAbを分析してrhVEGFと結合する能力および組換えVEGFR1flt1またはVEGFR2KDRと結合する能力を確認した。受容体結合アッセイRBAデータは、プレートに基づくアッセイにおいて、DT02K044dAb配列番号191がVEGFと強く結合できるだけでなく、その天然受容体とのVEGF結合を阻止できることを実証した。DT02K044のオフ速度を改善する目的で、アフィニティ成熟を行いかつ候補リードを、HEK細胞においてパスコリズマブ軽鎖と共発現したパスコリズマブ3TmAb重鎖発現ベクターの環境において評価した。形質移入上清中の発現されたmAbdAbをSPR技法Proteonを用いてVEGFとの結合について分析した。サンプルを定量しなかったが、並んで発現されていた親mAbdAbと比較した。Proteon解析において、突然変異したクローンを同じやり方で発現した親クローンと比較した。全ての改善を13の多様化したCDR残基のうちの3つS34、G51、H96番号は残基1としてのVkdAbAspの第1残基に基づくにおいてクラスタ化した。これらの3つの位置のうち、位置S34およびH96における置換が最も有意であった改善されたKDを用いて、Proteon解析によりおよびHUVEc増殖アッセイにおいて。以下の表4は、アフィニティがDT02K044親dAbを越えて有意に上昇した特定の位置に対するKDnMでののProteon評価を強調している表4。表4:DT02K044配列番号191のアフィニティ成熟した変異体単独で有利であったこれたの突然変異が相加性であるかどうかを確認するために、これらの変化を組み合わせた組み合わせ突然変異体を構築し、これにより、なかんずく、DT02K044251S34KH96E、配列番号192およびDT02K044255S34KH96K、配列番号193として特定された二重突然変異体の特定に至った。これらの2つのdAbを、好ましい単独突然変異体DT02K044085S34K、配列番号194と一緒に、様々なリンカーヒト血清アルブミン由来の21アミノ酸リンカーを含むを用いてパスコリズマブとの融合体として発現した。これらの3つの構築物を、受容体結合アッセイ、HUVEc増殖アッセイにおける効力についておよびBiacoreSPRによる動力学アフィニティについて試験した。全ての3つの分子は低pM範囲において親分子と比較して有意に増強されたアフィニティを示した。配列識別子表5:アミノ酸およびDNA配列の配列識別子番号配列表"