費用対効果が高く、アルコールおよびCTABを使用しないクロマトグラフィーに基づいた、抗原性多糖からC-多糖を除去するための方法であって、a細菌細胞を発酵培地中でデオキシコレートにより溶解させ、それによって多糖溶液および固体細胞片を含む溶解物を製造すること;b前記多糖溶液から固体を分離することにより、この水性細胞溶解物を清澄化すること;c100K分子量カットオフ膜を使用して低分子量汚染物質を除去する限外濾過により前記多糖溶液を濃縮して、濃縮多糖溶液を形成すること;d多糖を含む前記溶液のヌクレアーゼによる処理;e硫酸アンモニウムまたはデオキシコール酸ナトリウム処理を使用した不純物の沈殿;f100K分子量カットオフ膜を使用したダイアフィルトレーション;g多糖溶液を一段階または多段階クロマトグラフィーに供すること;h濃縮およびダイアフィルトレーション;ならびにi精製した多糖溶液の無菌濾過を含む方法。精製した莢膜多糖が、イオン交換クロマトグラフィー前またはHIC後のC-多糖に対して、1~5倍の型特異的C-多糖汚染の減少、1未満のタンパク質汚染、および1未満の核酸汚染を示す請求項1に記載の方法。CTAB/アルコールに基づく方法よりも少なくとも80少ない時間および少なくとも90少ない費用を要する請求項1に記載の方法。前記多糖抗原が、限定されないがS.ニューモニエおよびS.アガラクチアから選択される請求項1に記載の方法。前記S.ニューモニエ多糖抗原が、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33Fから選択される請求項4に記載の方法。前記一段階または多段階クロマトグラフィーが、i疎水性相互作用、その後のイオン交換、ii直接イオン交換、およびiiiイオン交換、その後のHICから構成され得る請求項1に記載の方法。前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの支持体が、ブチル-、フェニル-、オクチル-アガロース、ブチル-、フェニル-、エーテル-有機ポリマー樹脂、およびフェニルセファロースからなる群から選択される請求項6に記載の方法。前記疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムは、5~8、好ましくは6~7.6のpH範囲で運用される請求項6に記載の方法。前記疎水性相互作用クロマトグラフィーが、50飽和硫酸アンモニウム塩、2M~5M濃度の範囲の塩化ナトリウムおよび2M~3M濃度のナトリウムのみの硫酸塩を含んだリン酸ナトリウムまたはカリウムの緩衝液を使用する請求項6に記載の方法。前記イオン交換クロマトグラフィーが陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項6に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、DEAEセルロース、MonoQ、CaptoQ、EshminoQ、GigacapQ650M、Nuvia-Q、CellufineQ-h、MiniQ、Source15Qおよび30Q、Q、DEAESepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance、QAEHADEX商標およびFASTQHAROSE商標GEHealthcare、UNOsphereQ、Biorad製のMacro-PrepDEAEおよびMacro-PrepHighQ、CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、ToyopearlSuperQ-650S、650Mおよび650C、QAE-550Cおよび650S、DEAE-650Mからなる群から選択される陰イオン交換樹脂で行われる請求項10に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、1MNaClを血清型に応じて10~60含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項10に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、1MNaClを血清型に応じて10、15、20、25、30、45および60含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項12に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、1MNaClを血清型に応じて直線的なまたは段階的な変化度で含んだリン酸緩衝液で溶離される請求項13に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、a血清型1については、1MNaClを10、15、20、25および30含んだリン酸緩衝液で;b血清型5については、1MNaClを10、15、20および45含んだリン酸緩衝液で;c血清型6B、6A、19Aおよび19Fについては、1MNaClを20および35含んだリン酸緩衝液で;d血清型23Fについては、1MNaClを15、20および30含んだリン酸緩衝液で;e血清型9Vについては、1MNaClを10、15および30含んだリン酸緩衝液で;f血清型7F、14および33Fについては、フロースルー及び1MNaClを100含んだリン酸緩衝液でそれぞれで溶離される請求項13に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、10mM~300mMの範囲のリン酸緩衝液を使用して行われる請求項12に記載の方法。前記陰イオン交換カラムは、5~8、好ましくは6~7.6のpH範囲で運用される請求項10に記載の方法。[実施例]例1S.ニューモニエ莢膜多糖血清型19FHIC、その後のIEXS.ニューモニエ血清型19Fの発酵培養液からの清澄化ブロス5Lを、100kDaのMWCO膜を使用して500mlに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性pHの25mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水WFIによるダイアフィルトレーションを行った。ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度8U/mlの溶液を得た。酵素処理を、攪拌しながら37°Cで10±2時間行った。ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して50飽和にし、2~8°Cで12±2時間インキュベートした血清型5および4を除く。混合物を遠心分離に供した。ペレット沈殿を捨てた。溶液~500mlを、NaCl、引き続いて冷WFIを使用した100kDダイアフィルトレーションに供した。多糖を含むこのダイアフィルトレーション溶液を緩衝液と共に高塩濃度でHICカラムに充填した。疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム300mlを50飽和硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液500mlをpH範囲6~8、好ましくはpH6~7のpHでカラムに充填した。さらに、カラムを、50飽和硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した。これらの条件下、多糖をカラムからフロースルーおよび平衡化洗浄液で回収した。次いで、100kDaのMWCOフィルターを使用して多糖溶液を濃縮し、次いで、NaClおよび注射用蒸留水WFIを使用してダイアフィルトレーションした。イオン交換クロマトグラフィーカラム300ml強陰イオン交換体を20mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液500mlをpH範囲6~8、好ましくはpH6.5~7.5のpHでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を1.0MNaClを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した種々の多糖を異なるイオン強度のNaClで溶出した。次いで、多糖溶液を100kDaのMWCOフィルターを使用して濃縮し、次いで、注射用蒸留水WFIを使用してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、0.22μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を-20±5°Cで凍結した。上記方法を血清型4、6A、6B、7F、9V、10A、14、18C、19A、19F、23Fにも利用した。結果:-HIC後とイオン交換クロマトグラフィー後のC-多糖をH1/P31NMRスペクトルにより推定した表1参照。例2S.ニューモニエ莢膜多糖血清型19F直接IEXS.ニューモニエ血清型19Fの発酵培養液からの清澄化ブロス5Lを、100kDaのMWCO膜を使用して約500mlに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性pHの25mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水WFIによるダイアフィルトレーションを行った。ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度8U/mlの溶液を得た。酵素処理を、37°Cで10±2時間行った。ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して50飽和にし、2~8°Cで12±2時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット沈殿を捨てた。多糖を含む溶液~500mlを、100kDaMWCO膜を使用して、20mMTrisHCl、2mMMgCl2pH8.0±0.2に対してダイアフィルトレーションした。次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、100kDaMWCOフィルターを使用して注射用蒸留水WFIに対してさらにダイアフィルトレーションした。イオン交換クロマトグラフィーカラム300ml強陰イオン交換体を20mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液500mlをpH範囲6~8、好ましくはpH6.5~7.5のpHでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を1.0MNaClを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した種々の多糖を異なるイオン強度のNaClで溶出した。次いで、多糖溶液を100kDaのMWCOフィルターを使用して濃縮し、次いで、注射用蒸留水WFIを使用してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、0.22μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を-20±5°Cで冷凍保存した。上記方法を血清型6A、6B、7F、9V、10A、14、18C、19A、19F、23Fにも利用した。結果:-イオン交換クロマトグラフィー後のC-多糖のみをH1/P31NMRスペクトルにより推定した表2参照。例3S.ニューモニエ莢膜多糖血清型19FIEX、その後HICS.ニューモニエ血清型19Fの発酵培養液からの清澄化ブロス5Lを、100kDaのMWCO膜を使用して約500mlに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性pHの25mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水WFIによるダイアフィルトレーションを行った。ヌクレアーゼを多糖溶液に添加して、最終濃度8U/mlの溶液を得た。酵素処理を、37°Cで10±2時間行った。ヌクレアーゼ処理した多糖溶液に硫酸アンモニウムを添加して50飽和にし、2~8°Cで12±2時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット沈殿を捨てた。多糖を含む溶液500mlを、100kDaのMWCO膜を使用して、20mMTrisHCl、2mMMgCl2pH8.0±0.2に対してダイアフィルトレーションした。次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、100kDaのMWCOフィルターを使用して注射用蒸留水WFIに対してさらにダイアフィルトレーションした。イオン交換クロマトグラフィーカラム300ml強陰イオン交換体を20mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化し、次いで多糖溶液500mlをpH範囲6~8、好ましくはpH6.5~7.5のpHでカラムに充填した。さらに、カラムを緩衝液で洗浄した。吸着多糖を1.0MNaClを使用して段階的な変化度の溶出で溶出した種々の多糖を異なるイオン強度のNaClで溶出した。疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム300mlを50飽和硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化し、次いでイオン交換溶出液からの多糖溶液500mlをpH範囲6~8、好ましくはpH6~7のpHでカラムに充填した。さらに、カラムを、50飽和硫酸アンモニウムを含む緩衝液で洗浄した。これらの条件下、多糖をカラムからフロースルーおよび洗浄液で回収した。次いで、多糖溶液を濃縮し、100kDaのMWCOフィルターを使用して、NaCl、次いで注射用蒸留水WFIに対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、0.22μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を-20±5°Cで冷凍保存した。上記方法を血清型6A、6B、7F、9V、10A、14、18C、19A、23Fにも利用した。結果:-イオン交換クロマトグラフィー後と疎水性相互作用クロマトグラフィー後のC-多糖をH1/P31NMRスペクトルにより推定した表3参照。例4S.ニューモニエ莢膜多糖血清型4S.ニューモニエ血清型4の発酵培養液からの清澄化ブロス5Lを、100kDaのMWCO膜を使用して約500mlに濃縮およびダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションは、中性pHの25mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用して達成し、引き続いて注射用蒸留水WFIによるダイアフィルトレーションを行った。酵素を多糖溶液に添加して、最終濃度10U/mlの溶液を得た。酵素処理を、37°Cで10±2時間行った。デオキシコール酸ナトリウム0.5w/vおよびNaCl60mMを酵素処理した多糖溶液に添加し、2~6°Cで10±2時間インキュベートした。混合物を遠心分離に供した。ペレット沈殿を捨てた。多糖を含む溶液約400mlを、100kDaのMWCO膜を使用して、20mMTrisHCl、2mMMgCl2pH8.0±0.2に対してダイアフィルトレーションした。次いで、多糖溶液を、一定の伝導率が得られるまで、100kDaMWCOフィルターを使用して注射用蒸留水WFIに対してさらにダイアフィルトレーションした。多糖を、例1または2または3に示す技術によりクロマトグラフ上で精製した。ダイアフィルトレーションした多糖溶液を、0.22μ膜フィルターを通してポリプロピレンボトルに濾過した。精製多糖を-20±5°Cで冷凍保存した。上記方法を血清型4にも利用した。結果は、約60~70の多糖回収率が得られ、C-多糖汚染減少がHIC後またはイオン交換クロマトグラフィー前のC-Ps含量と比べて1~5倍であり、タンパク質汚染が1未満であり、核酸汚染が1未満であることを示しており、CTAB/アルコールに基づく従来技術の方法と比べると、消費される時間が80~90少なく、負担費用が90少ない。疎水性相互作用クロマトグラフィー、その後のイオン交換クロマトグラフィーは、C-多糖および他の汚染物質の相当な減少のために好ましい方法である。クロマトグラフィーの順序を逆にした方法すなわち、イオン交換、その後の疎水性相互作用も相当なC-多糖除去をもたらす。あるいは、一段階イオン交換クロマトグラフィーの使用により、基準規格に適合するC-多糖減少および他の汚染物質例えば、タンパク質、核酸の最終多糖が得られる。本発明は以上の例証的実施例の詳細に限定されないこと、および、本発明はその本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態に具体化され得ることは、当業者に明らかであり、そのため、本態様および実施例は、全ての点において、例証的なものであり制限的ではなく、以上の記載よりもむしろ添付の特許請求の範囲のための参照であると解釈することが望まれ、それゆえ特許請求の範囲と均等な意味および範囲の内に入る全ての変更は、その範囲に包含されることが意図される。