以下のa~dのいずれかのDNA及びラクダ科動物抗体の重鎖可変ドメインをコードするDNAを融合したDNA:a配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAb配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAc配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAd配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。請求項1に記載のDNAに更に精製用のアミノ酸配列をコードするDNAを融合したDNA。糸状菌体内で機能するプロモーター遺伝子及び請求項1又は2に記載のDNAを含む遺伝子発現カセットを有する糸状菌用発現ベクター。請求項3に記載の糸状菌用発現ベクターで形質転換されてなるアスペルギルスオリゼ。請求項4に記載のアスペルギルスオリゼを培地で培養し、当該培地からVHHを含むタンパク質を回収する工程を含む、VHHを含むタンパク質の生産方法。前記アスペルギルスオリゼを液体培地で培養して、前記VHHを含むタンパク質を菌体外に分泌させることにより生成蓄積させることを特徴とする、請求項5に記載の方法。請求項5又は6に記載の方法において、更に前記VHHを含むタンパク質からVHHに結合したペプチドを切断する工程を有する、VHHの生産方法。請求項5又は6に記載の方法により得られたVHHを含むタンパク質。しかしながら、非特許文献2及び3におけるVHHの生産量は最大でも培地中に30mglしかなく、工業的なレベルでVHHを大量生産するためには更に生産量を上げる必要がある。そこで、本発明は、生産性が向上したVHHの生産方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該生産方法に用いるための材料、すなわちDNA、糸状菌用発現ベクター及び形質転換体を提供することを目的とする。更に、本発明は、当該方法により得られたVHHを含むタンパク質を提供する。本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、VHHを特定のリーダータンパク質と融合させてアスペルギルスオリゼにより生産させることで、VHHの生産性を向上させることができるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のDNA、糸状菌用発現ベクター、形質転換体、VHHの生産方法及びタンパク質を提供するものである。DNA以下のa~dのいずれかのDNA及びVHHをコードするDNAを融合したDNA:a配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAb配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAc配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAd配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。に記載のDNAに更に精製用のアミノ酸配列をコードするDNAを融合したDNA。前記精製用のアミノ酸配列がHisタグである、に記載のDNA。糸状菌用発現ベクター糸状菌体内で機能するプロモーター遺伝子及び~のいずれかに記載のDNAを含む遺伝子発現カセットを有する糸状菌用発現ベクター。形質転換体に記載の糸状菌用発現ベクターで形質転換されてなるアスペルギルスオリゼ。VHHの生産方法に記載のアスペルギルスオリゼを培地で培養し、当該培地からVHHを含むタンパク質を回収する工程を含む、VHHを含むタンパク質の生産方法。前記アスペルギルスオリゼを液体培地で培養して、前記VHHを含むタンパク質を菌体外に分泌させることにより生成蓄積させることを特徴とする、に記載の方法。又はに記載の方法において、更に前記VHHを含むタンパク質からVHHに結合したペプチドを切断する工程を有する、VHHの生産方法。タンパク質又はに記載の方法により得られたVHHを含むタンパク質。本発明の生産方法によれば、アスペルギルスオリゼを宿主としてVHHの生産性を大幅に向上させることが出来る。そのため、本発明によれば、優れた特徴を有するVHHの量産化が可能となり、VHHの生産コストを低減することも可能となる。以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明が対象とする糸状菌としては、長年清酒、醤油、味噌、みりんなどの醸造食品に利用されてきた安全な微生物であり、わが国の産業において利用頻度の高い宿主である点で、麹菌アスペルギルスオリゼが好ましい。1DNA本発明のDNAは、以下のa~dのいずれかのDNA及びVHHをコードするDNAを融合したDNAであることを特徴とする:a配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAb配列番号1に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルコアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAc配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAd配列番号2に記載される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。本明細書において、上記b又はdのDNAによりコードされるタンパク質を改変体と呼ぶことがある。11リーダータンパク質本発明が対象とするVHHと融合させて発現させるためのリーダータンパク質は、配列番号3に記載されるアミノ酸配列を有するグルコアミラーゼ若しくはその改変体、又は配列番号4に記載されるアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ若しくはその改変体である。リーダータンパク質としては、配列番号4に記載されるアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ又はその改変体がより好ましい。なお、配列番号3で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号1に表され、配列番号4で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号2に表される。VHHにこれらのリーダータンパク質を融合させて糸状菌で発現させることで、VHHの生産性を大幅に向上させることが可能となる。上記のストリンジェントな条件とは、例えば、65°Cで5×SSC溶液中でハイブリダイズさせ、更に01のSDSを含有する05×SSC溶液で65°Cで洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、MolecularCloningに記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、通常、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の同一性を有し、その同一性は、例えば70以上、好ましくは80以上、更に好ましくは90以上、特に好ましくは95以上が挙げられる。塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。塩基配列の同一性は、当該分野で慣用のプログラムを初期設定で用いて決定することができる。グルコアミラーゼ活性は今井ら939719930325の報告に記載の方法により、エンドグルカナーゼ活性は特開2003164284号公報の段落0017に記載の方法により測定することができる。このようなリーダータンパク質の改変体の製造は常法に従って行うことができる。12ラクダ科動物抗体の重鎖可変ドメイン本発明で使用するのは、ラクダ科動物由来抗体のフラグメントである重鎖の可変ドメインである。ラクダ科動物としては、特に限定されないが、例えば、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、グアナコ等が挙げられる。抗体としては、軽鎖を有さず、CH1ドメインを有さない重鎖のみからなるラクダ科動物由来の抗体であれば特に限定されない。また、VHHの抗原の種類も特に限定されず、どのような抗原を対象とするかはVHHの使用用途に応じて適宜決定される。VHHとしては、例えば、配列番号5、配列番号6、配列番号7で表されるアミノ酸配列からなるVHHが挙げられる。本発明におけるVHHは、天然に存在するものに加えて、天然のVHHのアミノ酸配列に1個以上のアミン酸を置換、欠失及び/又は付加したものも含む。特定の抗原に対するVHHの取得方法としては、ラクダの免疫、ファージディスプレイによる選択、B細胞ディスプレイによる選択、酵母細胞表層ディスプレイによる選択など複数あるが、抗体ファージライブラリーからの特異的な抗体の単離法であるバイオパニングが有効である。バイオパニングは、ラムダgt11などの抗体を提示できるファージライブラリーを作成し、目的の抗原を固定化したものと複数回接触させ、特異的な抗体を有するファージを濃縮選択する方法である。13精製用タグ本発明のDNAには、リーダータンパク質をコードするDNA及びVHHをコードするDNAに更に精製用のアミノ酸配列をコードするDNAが融合されていても良い。精製用のアミノ酸配列としては、例えばHisタグ、GST、MBPなどが挙げられ、好ましくはHisタグである。このような精製用のアミノ酸配列がVHHと結合していることで、アフィニティークロマトグラフによるVHHの精製が可能になる。上記の各DNAの順序は、本発明の効果が得られるものであればどのような順序であってもよいが、好ましくは5末端からリーダータンパク質→VHH、又はリーダータンパク質→VHH→精製用アミノ酸配列の順である。また、発現後に目的とするVHHを容易に回収できるように、ペプチド結合が切断可能な認識部位を介在させて、上記の各DNAを融合させても良い。該認識部位としては、プロセッシング酵素、消化酵素などのプロテアーゼで切断可能なアミノ酸配列、システインやメチオニンなどの化学修飾剤、超音波、レーザー、熱などの物理的開裂により切断可能なアミノ酸などが挙げられる。認識部位を切断可能な消化酵素としては、好ましくは第Xa因子、トロンビン、レニン、トリプシン、V8プロテアーゼ、Pseudomonasエンドプロテアーゼ、Arthrobacterリシルエンドペプチダーゼ等が挙げられ、認識部位としては、例えば第Xa因子認識配列であるIleGluGlyArgが挙げられる。化学修飾剤としては、Metを認識するCNBr、Asn、Asp、Gluを認識する希塩酸、及びCysを認識するDMAPCNが挙げられる。2遺伝子発現カセット本発明における遺伝子発現カセットは、糸状菌体内で機能するプロモーター遺伝子と上記DNAを含むことを特徴とする。21プロモータープロモーターは、糸状菌体内、特にアスペルギルスオリゼの菌体内でプロモーターとして機能するものであればよい。かかるプロモーターとして具体的には、例えばα-アミラーゼ遺伝子プロモーターamyB、グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターglaA、α-グルコシダーゼ遺伝子プロモーターagdA、マンガンSOD遺伝子プロモーターsodM、グルコアミラーゼ遺伝子プロモーターglaB、hlyプロモーター等が挙げられる。中でも好ましいのは、hlyプロモーターである。遺伝子発現カセットにおけるプロモーターの位置は、糸状菌体内でプロモーターが機能し、所望のVHHが発現し産生できる位置であれば、特に限定されないが、通常、VHH遺伝子配列の上流域に配置される。22ターミネーターターミネーターは、糸状菌体内、特にアスペルギルスオリゼの菌体内でターミネーターとして機能するものであれば良い。ターミネーターとしては、例えばα-アミラーゼ遺伝子のターミネーター、又はグルコアミラーゼターミネーター等を挙げることができる。本発明の糸状菌用遺伝子発現カセットは、これらのプロモーター、リーダータンパク質をコードするDNA、VHHをコードするDNA、及びターミネーターが、直接連結されてなるものであってもよいが、それらの間に1~2000塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。例えば、目的とするVHHをコードするDNAのオープンリーディングフレームの上流に糸状菌、好ましくはアスペルギルスオリゼの既知分泌タンパク質の遺伝子を配置しても良く、そうすることにより、目的とするVHHは、上記分泌タンパク質との融合タンパク質として発現産生され、斯くして産生された融合タンパク質は菌体外に分泌される。また、その他のヌクレオチドとして、通常ベクターが備える制限酵素切断部位などを備えていてもよい。なお、そのような分泌タンパク質のアスペルギルス糸状菌由来のものとしては、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、キシラナーゼ、ガラクトシダーゼ、フラクトフラノシダーゼ、キシロシダーゼ、ペクチンリアーゼ、フィターゼなどが知られている。3糸状菌用発現ベクター本発明の糸状菌用発現ベクターは、上記遺伝子発現カセットを有することを特徴とする。本発明の糸状菌用発現ベクターには、選択マーカー遺伝子が含まれていても良く、コトランスフォーメーションを行う場合は、当該糸状菌用発現ベクターとは別のベクターに選択マーカー遺伝子が存在していれば良い。本発明の糸状菌用発現ベクターは、これらの選択マーカー遺伝子及び遺伝子発現カセットが、直接連結されてなるものであってもよいが、それらの間に1~2000塩基程度のヌクレオチドが挟まれていてもよい。また、本発明には、直鎖状の糸状菌用発現ベクター及び環状の糸状菌用発現ベクターの両者が含まれるが、構築したプラスミドから1ステップのPCRで取得できるなど、環状の発現ベクターと比べて少ないステップで調製することができること、宿主としてロイシン要求性変異株を使用する場合に、当該変異を直接相補することができること、及び形質転換効率が環状の発現ベクターと比べて高いという点から、好ましくは直鎖状の糸状菌用発現ベクターである。31選択マーカー遺伝子選択マーカー遺伝子は、糸状菌体内、特にアスペルギルスオリゼの菌体内で選択マーカーとして機能するもの、すなわち発現できるものであれば良い。かかる選択マーカー遺伝子として、例えば、niaD、argB、sC、ptrA、pyrG、amdS、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子から選ばれるマーカー遺伝子を挙げることができる。これらの選択マーカー遺伝子は、上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプライマーを用いて、アスペルギルス属糸状菌の染色体DNAを鋳型としてPCRを行う方法、上記文献に記載された配列に基づいて設計されたプローブを用いてアスペルギルス属糸状菌の染色体DNAライブラリーからハイブリダイゼーションにより取得する方法などにより容易に入手することができる。また、宿主の糸状菌として、例えばロイシン要求性などの栄養要求性変異株を用いる場合、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。例えば、宿主がロイシン要求性変異株である場合、そのロイシン要求性を相補できる選択マーカー遺伝子を用いることができ、かかる遺伝子としてはβ-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするアスペルギルスニジュランス由来の遺伝子ANleu2及びアスペルギルスオリゼ由来の遺伝子leu2を挙げることができる。なお、これらの場合、宿主として用いる糸状菌は、選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有していない株を用いる必要がある。4形質転換体本発明の形質転換体は、上記糸状菌用発現ベクターでアスペルギルスオリゼを形質転換したものである。アスペルギルスオリゼを宿主とすることは、高いタンパク質生産能及び醸造微生物としての安全性の点で好ましい。なお、宿主として用いるアスペルギルスオリゼは、野生株に限らず、変異株であってもよい。かかる変異株としては、前述する選択マーカーに関する機能的遺伝子を有さないように変異してなる株を挙げることができ、具体的には正常にロイシンの生合成ができないようにロイシン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているロイシン要求性変異株:正常にアルギニンの生合成ができないようにアルギニン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているアルギニン要求性変異株:正常にメチオニンの生合成ができないようにメチオニン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているメチオニン要求性変異株:正常にヒスチジンの生合成ができないようにヒスチジン生合成を担う遺伝子が変異又は欠失しているヒスチジン要求性変異株:正常に硝酸が資化できないように硝酸資化性遺伝子が変異又は欠失しているniaD変異株:正常に硝酸イオンが資化できないように硝酸イオン資化性遺伝子が欠失しているsC変異株などを挙げることができる。宿主の形質転換方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Cohenらの方法、プロトプラスト法、コンピテント法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。5VHHの生産方法本発明のVHHを含むタンパク質の生産方法は、上記のアスペルギルスオリゼを培地で培養し、当該培地からVHHを含むタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明の方法によれば、VHHを培地中に1000mgl以上、好ましくは1500mgl以上生産することが可能となる。本発明において、VHHを含むタンパク質とはVHHにリーダータンパク質、精製用アミノ酸配列等が融合したタンパク質のことを意味している。培養は、固体培地を用いる固体培養、又は液体培地を用いる液体培養のいずれでも行うことができるが、好ましくは液体培地を用いた液体培養である。固体培地としては、アスペルギルスオリゼの培養に使用される公知の固体培地を制限なく使用することができる。固体培地とはその固形の支持担体が栄養源を含むか、又は固形の支持担体に栄養源が添加されものであり、そこにアスペルギルスオリゼが生育できる固形培地を指し示す。このような固体培地として主に、フスマ小麦などの穀物の殻、デンプン粉末、米小麦大豆の生あるいは蒸したもの、更にはメンブレンや多孔質の人工物等に栄養源を添加したもの等が挙げられる。特にフスマ及び蒸した米が好ましい。また、液体培地は、アスペルギルスオリゼの培養に使用される公知の液体培地を制限なく使用できる。例えば、用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、マルトース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。また、無機もしくは有機窒素源を含有するものも挙げられる。これらの炭素源及び窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源[例えば、無機塩、ビタミン類、抗生物質など]を培地中に添加してもよい。具体的な液体培地としては、例えば、ポテトデキストロース培地、最少培地、03NaNO3、02KCl、01KH2PO4、005MgSO4、0002FeSO4、pH60、GPY培地等を挙げることができる。なお、これらは15程度の寒天を添加することで、固体培地として調製することもできる。本発明のアスペルギルスオリゼの培養は、通常pH55~85、好ましくはpH6~8のpH条件;通常25~42°C、好適には30~37°Cの温度条件で行うことができる。培養時間は、その他の条件によって異なるが、通常2~7日間程度、好ましくは3~5日間程度を挙げることができる。本発明の方法によれば、目的とするVHHを含むタンパク質を菌体外に生成することもできる。その場合、VHHを含むタンパク質の取得に際しては、培養上清を回収すればよい。また、寒天培地などのように固体培地を使用する場合も培養上清としての寒天培地を回収すれば良い。さらに、これらの上清を、公知のタンパク質精製方法、例えばイオン交換、疎水、ゲルろ過などの各種クロマトグラフィーに供することにより目的とするVHHを含むタンパク質を単離し回収することができる。VHHを含むタンパク質が精製用のアミノ酸配列と結合している場合は、アフィニティークロマトグラフにより精製を行うことができる。本発明の方法で得られたVHHを含むタンパク質は、リーダータンパク質を含む形であっても抗原結合活性を有している。しかしながら、本発明の方法では、前記の2工程に加えて、培地から回収したVHHを含むタンパク質からリーダータンパク質を切断する工程を行うことによって、VHHのみを取得しても良い。以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、一般的な実験方法は、実験書のMolecularCloning:ALaboratoryManual第3版に従った。試験例で使用した遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列選択マーカー硝酸還元酵素遺伝子niaD<配列番号8>プロモーターhlyプロモーター<配列番号9>ターミネーターglaBターミネーター<配列番号10>リーダータンパク質glaBssGOD<配列番号11、12>、amyB<配列番号13、14>、glaB<配列番号1、3>、celA<配列番号15、16>、celB<配列番号2、4>VHH試験例1~10で使用したVHH<配列番号17、5>、試験例11で使用した抗EGFRのVHH<配列番号18、6>、試験例12で使用した抗R66のVHH<配列番号19、7>糸状菌用発現ベクターの構築<niaD遺伝子の大腸菌ベクターへの組み込み>麹菌アスペルギルスオリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子niaDをPstIHindIII断片となるようにプライマーAとプライマーBを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型としてLATaqを用いて以下の条件のPCRにより増幅した。PCR条件96°Cを1サイクル96°C、60°C、72°Cを30サイクル72°Cを1サイクル得られたPCR増幅産物を制限酵素PstIHindIIIで37°Cで処理後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、QIAquickGelExtractionkitを用いた。大腸菌プラスミドpUC119にDNALigationkitver1を用いてライゲーションし、大腸菌JM109株に形質転換した。その結果、niaDマーカーがサブクローニングされたプラスミドpNIA2を得た。プラスミドpNIA2は、PstI、SalI部位の両方に遺伝子をuniquesiteとして導入できる。<glaBターミネーターの組み込み>麹菌由来Histag付きglaBターミネーターの遺伝子のpNIA2への挿入を試みた。プライマーCとプライマーDを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型としてLATaqを用いて以下の条件のPCRにより増幅した。PCR条件96°Cを1サイクル96°C、60°C、72°Cを30サイクル72°Cを1サイクル得られたPCR増幅産物を制限酵素SalIXhoIで37°Cで処理後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、QIAquickGelExtractionkitを用いた。大腸菌プラスミドpNIA2のSalI部位にDNALigationkitver1を用いてライゲーションし、大腸菌JM109株に形質転換した。その結果、Histag付きglaBターミネーターがサブクローニングされたプラスミドpNIATを得た。プラスミドpNIATは、PstI、SalI部位の両方に遺伝子をuniquesiteとして導入できる。<hlyプロモーターの組み込み>麹菌由来hlyプロモーターの遺伝子のpNIATへの挿入を試みた。プライマーEとプライマーFを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型としてLATaqを用いて以下の条件のPCRにより増幅した。PCR条件96°Cを1サイクル96°C、60°C、72°Cを30サイクル72°Cを1サイクル得られたPCR増幅産物を制限酵素SalIPstIで37°Cで処理後、アガロースゲル電気泳動で切り出した。切り出しは、QIAquickGelExtractionkitを用いた。大腸菌プラスミドpNIATのPstISalI部位にDNALigationkitver1を用いてライゲーションし、大腸菌JM109株に形質転換した。その結果、hlyプロモーターがサブクローニングされたプラスミドpNMBを得た。プラスミドpNMBは、SalI部位に麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子をuniquesiteとして導入できる。<目的遺伝子の組み込み>1ベクターの調製pNMBを制限酵素SalIで37°C処理後、dNTPを最終10mMとなるように添加してT4DNAポリメラーゼで37°C1時間処理した。さらに、バクテリア由来アルカリホスファターゼで50°C、30分反応させた。得られた反応物をPCRクリーンアップカラムで処理溶出させ、ベクターとした。2インサートの調製麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を目的遺伝子として、上記ベクターにサブクローニングするインサートとした。目的遺伝子の開始コドンから下流30bpのセンス鎖のプライマーと、目的遺伝子の終止コドンから上流30bpのアンチセンス鎖のプライマーを用いて、目的遺伝子の起源生物由来のゲノムDNAを鋳型として、pfuTaqポリメラーゼを用いて下記条件でPCRを行った。PCR条件96°Cを1サイクル96°C、60°C、72°Cを30サイクル72°Cを1サイクル得られたPCR断片をPCRクリーンアップカラムプロメガ社製で処理溶出させ、インサートとした。3ベクターとインサートのライゲーションモル数で、ベクター:インサート=14となるように添加して、DNALigationkitver1を用いてライゲーションし、大腸菌JM109株に形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、目的遺伝子の読み枠がhlyプロモーターに対して正方向にサブクローニングされ、なお且つ翻訳時の読み枠がフレームシフトしておらず、更にHistagの読み枠と合致しているプラスミドを目的遺伝子発現プラスミドとして調製した。目的遺伝子発現株の取得定法であるPEGカルシウム法により、上記目的遺伝子発現プラスミドを用いて、アスペルギルスオリゼのniaD変異株を形質転換した。硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス培地で生育できる株を選択することにより、目的遺伝子発現プラスミドを保持する形質転換体を複数得た。目的遺伝子産物の取得上記形質転換体をポテトデキストロース培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。500ml容三角フラスコに入った100mlGPY液体培地に最終胞子濃度1×106mlとなるように植菌した。30°C3日間の液体培養で目的遺伝子産物が培地中に分泌発現し、当該培養液をサンプルとした。サンプルの更なる精製は、HisGraviTrapカラムを用い、所定のマニュアル通りに515mLのサンプルをカラムにアプライし自然落下により吸着させ、カラムに吸着せずに出てきた画分を素通り画分とした。10mLで洗浄した後、イミダゾール溶液を同様にアプライし、出てきた画分を溶出画分とした。試験例1:アスペルギルスニガー由来グルコースオキシダーゼタンパク質とのVHHの融合タンパク質の培地中への分泌生産の結果目的:モデルとして麹菌には類縁体が存在しないアスペルギルスニガー由来グルコースオキシダーゼタンパク質をリーダータンパク質としてVHHを融合させて、麹菌でGODVHH融合タンパク質を培地中への分泌生産させることを試みる。方法:1.ベクターの構築方法ベクターはhlyプロモーターが組み込まれた発現プラスミドからベクターの調製に従って調製し、インサートはglaBssGOD遺伝子を合成遺伝子配列北海道システムサイエンス社製を鋳型として、インサートの調製に従って調製した。ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlyglaBssGODhis分泌発現ベクターを構築した。融合タンパク質の分泌発現ベクターPhlyglaBssGODVHHhisは、インサート1:glaBssGOD遺伝子を鋳型としたものと、インサート2:VHH遺伝子を合成遺伝子配列を鋳型としたものを、インサートの調製に従ってそれぞれ調製した。ベクターとインサート1及び2を同時に混和して、ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlyglaBssGODVHHhisを構築した。2.タンパク質の発現分泌回収目的遺伝子発現株の取得に従い、麹菌に1で作成した分泌発現ベクターを麹菌に形質転換し、目的遺伝子産物の取得によりサンプルを回収した。3.SDSPAGE解析2で得られたサンプルをVIVASPIN500により濃縮し、5μgタンパク質相当をSDSPAGEにて解析を行った。EndoH処理は、EndoglycosidaseHにより行った。各サンプルはSDS電気泳動用のサンプルバッファー、2SDS、20glycerol、02BPB、02MDTTと1対1で混和し、室温、50°C又は99°Cで5分間インキュベートした後にSDSPAGE解析に供した。結果を図1に示した。結果及び考察:インキュベートの温度は、高温になるほどバンドがシャープになり、99°Cが最適であると考えられた。また、EndoH処理を行ったサンプルは全て72kDa近傍にバンドが検出されたことから、おおよそglaBssGODhisをコードする部分は生産できたと考えられる。しかしならが、glaBssGODVHHhisもほぼ同じ位置にバンドが検出されたことから、VHHの部分だけ取り除かれている可能性がある。glaBssGODVHHhisを泳動したレーン全てにVHH単独の分子量に近い17kDa近傍にバンドが検出されていることからとのVHHの融合タンパク質の培地中への分泌生産の結果目的:アスペルギルスオリゼ由来αアミラーゼをリーダータンパク質としてVHHを融合させて、麹菌でamyBVHH融合タンパク質を培地中への分泌生産させることを試みる。方法:1.ベクターの構築方法ベクターはhlyプロモーターが組み込まれた発現プラスミドからベクターの調製に従って調製し、インサートはamyB遺伝子をアスペルギルスオリゼ由来amyB遺伝子を鋳型として、インサートの調製に従って調製した。ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlyamyBhis分泌発現ベクターを構築した。融合タンパク質の分泌発現ベクターPhlyamyBVHHhisは、インサート1:amyB遺伝子を鋳型としたものと、インサート2:VHH遺伝子を合成遺伝子配列を鋳型としたものを、インサートの調製に従ってそれぞれ調製した。ベクターとインサート1及び2を同時に混和して、ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlyamyBVHHhisを構築した。2.タンパク質の発現分泌回収目的遺伝子発現株の取得に従い、麹菌に1で作成した分泌発現ベクターを麹菌に形質転換し、目的遺伝子産物の取得によりサンプルを回収した。3.SDSPAGE解析2で得られたサンプル100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図2に示した。結果及び考察:amyBhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルは良好にamyBが生産されていることが観察された。amyBVHHhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルにはVHHの分子量増加に相当する72kDaの位置にバンドが観察され、融合タンパク質の形でVHHが生産できたことを示唆する結果を得た。しかし、amyBhisと比較してamyBVHHhisのバンドのシグナル強度は弱く、生産性は低かった。試験例3:アスペルギルスオリゼ由来グルコアミラーゼとのVHHの融合タンパク質の培地中への分泌生産の結果目的:アスペルギルスオリゼ由来グルコアミラーゼをリーダータンパク質としてVHHを融合させて、麹菌でglaBVHH融合タンパク質を培地中への分泌生産させることを試みる。方法:1.ベクターの構築方法ベクターはhlyプロモーターが組み込まれた発現プラスミドからベクターの調製に従って調製し、インサートはglaB遺伝子をアスペルギルスオリゼ由来glaB遺伝子を鋳型としたものと、インサート2:VHH遺伝子を合成遺伝子配列を鋳型としたものを、インサートの調製に従ってそれぞれ調製した。ベクターとインサート1及び2を同時に混和して、ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlyglaBVHHhisを構築した。2.タンパク質の発現分泌回収目的遺伝子発現株の取得に従い、麹菌に1で作成した分泌発現ベクターを麹菌に形質転換し、目的遺伝子産物の取得によりサンプルを回収した。3.SDSPAGE解析2で得られたサンプル100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図3に示した。結果及び考察:glaBhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルは良好にglaBが生産されていることが観察された。しかしながら、3と4レーンのバンドはスプリットしており、一部hisタグが切断された可能性が示唆された。glaBVHHhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルにはVHHの分子量増加に相当する80kDaの位置にバンドが観察され、融合タンパク質の形でVHHが生産できたことを示唆する結果を得た。5-8の全てのレーンもスプリットしており、一部hisタグが切断された可能性が示唆された。しかし、glaBhisと比較してglaBVHHhisのバンドのシグナル強度は弱かったが、全体としての生産量は高かった。試験例4:αアミラーゼ及びグルコアミラーゼと融合させたVHHタンパク質のHistagカラムでの精製結果目的:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質がhistagまで完全に作られているかをHistagカラム精製により検証する。方法:試験例2と3で用いたamyBhis、amyBVHHhis、glaBhis及びglaBVHHhisサンプルをHistagカラムであるHisGraviTrapにて精製を行い、各サンプル100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図4に示した。結果及び考察:amyBhis、amyBVHHhis、glaBhis及びglaBVHHhisサンプルをHistagカラムであるHisGraviTrapにて精製を行った。amyBhisはサンプルと比較して素通り画分のバンドの強度が若干弱くなっていること、及び溶出画分にはっきりとしたバンドが確認できることからamyBhisの一部はhistagまでが分解されずに培地に分泌されていることが確認できた。同様にamyBVHHhisのサンプル、素通り画分及び溶出画分のバンドパターンからamyBVHHhisの一部はhistagまでが分解されずに培地中に生産できることが明らかとなった。また、スプリットしたバンドは溶出画分には見られなかったことから、70kDaのバンドがhistagまでの完全長産物であり、50kDaのバンドはVHH及びHistag部分分解産物であることが考えられる。glaBhisについてもamyBhisと同様に精製ができ、傾向も同じであった。glaBVHHhisについてはamyBVHHhisと同様に60kDaのバンドはカラム生成できなかったことから、70kDaのバンドがhistagまでの完全長産物であることが明らかとなった。完全長のバンドのシグナル強度はamyBVHHhisよりもglaBVHHhisが強く、glaBをリーダータンパク質とすることで分解を受けていない完全長型のVHHをより高生産できることを明らかにした。試験例5:固体培養におけるαアミラーゼ及びグルコアミラーゼと融合させたVHHタンパク質の生産結果目的:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質がフスマ固体培養で液体培養より効率よくhistagまで完全に作られているかを検証する。方法:試験例2及び3で得られたamyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質生産麹菌を、フスマ固体培養で培養を行った。100mL容のガラス製三角フラスコに乾燥した小麦フスマ5gを入れ、オートクレーブで滅菌した後、各麹菌の胞子を滅菌水に懸濁した胞子懸濁液を加えて良く混和し、30°Cで3日間静置培養を行った。培養物に50mMリン酸ナトリウム緩衝液を100mL加えて、タンパク質の抽出を行い、045μmのフィルターでろ過後、HisGraviTrapにて精製を行い、各サンプルを100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図5に示した。結果及び考察:amyBhisはGPY液体培養同様に精製できたが、素通り画分のバンドの強度が原液画分とほぼ同じであり、かつ溶出画分の強度が弱かったことから大半がhistagを欠損していることが明らかとなった。amyBVHHhisに関してはVHHに相当するバンドの分子量増加が見られず、また溶出画分に何も存在しなかったことから、histagのみならずVHHの部分もプロテアーゼなどにより分解されている可能性が示唆された。glaBhisについてもamyBhis同様に素通り画分のバンドの強度が原液画分とほぼ同じであり、かつ溶出画分の強度が弱かったことから大半がhistagを欠損していることが明らかとなった。glaBVHHhisについてもamyBVHHhisと同様にVHHに相当するバンドの分子量増加が見られず、また溶出画分に何も存在しなかったことから、histagのみならずVHHの部分もプロテアーゼなどにより分解されている可能性が示唆された。フスマ固体培養においてはHistagのみならずVHHも分解されることからGPY液体培養と比較してVHH生産には不向きである事が明らかとなった。試験例6:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質のN型糖鎖除去目的:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質が目的分子量を保持しているかを確認する。方法:試験例4で得られたHistagカラム精製タンパク質amyBhis、amyBVHHhis、glaBhis、及びglaBVHHhisをVIVASPIN500により濃縮し、5μgタンパク質相当をSDSPAGEにて解析を行った。EndoH処理は、EndoglycosidaseHにより行った。各サンプルはSDS電気泳動用のサンプルバッファー、2SDS、20グリセロール、02BPB、02MDTTと1対1で混和し、室温、5分間インキュベートしたのちにSDSPAGE解析に供した。結果を図6に示した。結果及び考察:各サンプルともに、EndoH処理をすることにより、低分子化し糖鎖が付加していることが明らかとなった。しかしながらバンドの位置及びその大きさから、幾つかのサンプルについては試験例1と同様に高温でインキュベートする必要が考えられた。試験例7:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質のN型糖鎖除去高温処理目的:amyBVHHhis及びglaBVHHhisタンパク質が目的分子量を保持しているかを確認する。方法:試験例4で得られたHistagカラム精製タンパク質amyBhis、amyBVHHhis、glaBhis及びglaBVHHhisをVIVASPIN500により濃縮し、5μgタンパク質相当をSDSPAGEにて解析を行った。EndoH処理は、EndoglycosidaseHにより行った。各サンプルはSDS電気泳動用のサンプルバッファー、2SDS、20グリセロール、02BPB、02MDTTと1対1で混和し、99°C、5分間インキュベートしたのちにSDSPAGE解析に供した。結果を図7に示した。結果及び考察:各サンプルともに、EndoH処理をすることにより、低分子化し糖鎖が付加している事が明らかとなった。amyBをリーダーとしたときはN型糖鎖の付加か少なく、glaBをリーダーとしたときは糖鎖付加により10kDa近い分子量の増加がみられた。またそれぞれの分子量の位置が理論値と一致しており、99°CでインキュベートすることによりVHHの付加による分子量増大が明らかとなった。試験例8:他のリーダータンパク質の検討、エンドグルカナーゼcelA及びcelB目的:glaBを超えるVHH生産に最適なリーダータンパク質を見出す。方法:1.ベクターの構築方法ベクターはhlyプロモーターが組み込まれた発現プラスミドからベクターの調製に従って調製し、インサートはcelA遺伝子をアスペルギルスオリゼ由来celA及びcelB遺伝子を鋳型として、インサートの調製に従ってそれぞれ調製した。ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlycelAhis及びPhlycelAhis分泌発現ベクターをそれぞれ構築した。融合タンパク質の分泌発現ベクターPhlycelAVHHhisは、インサート1:celA、インサート2:celBを鋳型としたものを、インサートの調製に従ってそれぞれ調製した。ベクターとインサート1及び3及びベクターとインサート2及び3同時に混和して、ベクターとインサートのライゲーションに従い、PhlycelAVHHhis及びPhlycelBVHHhisを構築した。2.タンパク質の発現分泌回収目的遺伝子発現株の取得に従い、麹菌に1で作成した分泌発現ベクターを麹菌に形質転換し、目的遺伝子産物の取得によりサンプルを回収した。3.SDSPAGE解析2で得られたサンプル100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図8に示した。結果及び考察:celBVHHhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルは目的産物が良好に生産されている事が観察された。celAVHHhis遺伝子導入した独立の4株のサンプルには目的産物がほとんど生産されていなかった。celBはリーダータンパク質として有望な可能性がある。試験例9:エンドグルカナーゼcelA及びcelBと融合させたVHHタンパク質のHistagカラムでの精製結果目的:celAVHHhis及びcelBVHHhisタンパク質がhistagまで完全に作られているかをHistagカラム精製により検証する。方法:GPY液体培養及びフスマ固体培養から得られたcelAVHHhis及びcelBVHHhisサンプルをHistagカラムであるHisGraviTrapにて精製を行った。得られたサンプル100μLをVIVASPIN500により濃縮し、SDSPAGEにて解析を行った。結果を図9に示した。結果及び考察:フスマ固体培養では目的物タンパク質自体を検出することができなかった。他方GPY液体培養では、溶出画分にのみcelAVHHhis産物を検出することができた。また、celBVHHhisサンプルからはglaBVHHhisと同程度の溶出画分サンプル量を得ることができ、glaBと並んでcelBは有望なリーダータンパク質であることが明らかとなった。試験例10:glaBVHHhisと抗原hCGとの結合性試験目的:glaBVHHhisの抗原結合能を検証する。方法:glaBhis、glaBVHHhisを臭化シアン活性化セファロースアマシャムバイオサイエンス社に付属のプロトコールにより固相化した。glaBhis、glaBVHHhisを結合した20μLのセファロース樹脂と10μgのhCG、シグマアルドリッチ社をバッファー中、室温で90分間インキュベートした後、3回同じバッファーで樹脂を洗浄した。洗浄した樹脂に10μLのSDS電気泳動用のサンプルバッファーを加えて、95°Cで15分間インキュベートし、VHHに結合したhCGを溶出した。樹脂を遠心で沈澱させ、上清をSDS電気泳動にかけ、クーマジーブリリアントブルーで染色を行なった。結果を図10に示した。結果及び考察:素通り画分では、活性化セファロースのみ、glaBhisを結合させたもの、glaBVHHhisを結合させたものに大きな差異はなく、hCGは大過剰量添加されていると言える。溶出画分ではglaBVHHhisのみに明瞭なバンドが検出されたことから、glaBVHHhisはhCGに対して強い結合能をもつことが明らかとなった。試験例11.抗EGFR抗体の麹菌での生産上皮成長因子受容体は、細胞の増殖や成長を制御する上皮成長因子を認識し、シグナル伝達を行う受容体である。このEGFRに遺伝子増幅や遺伝子変異、構造変化が起きると、発癌、および癌の増殖、浸潤、転移などに関与するようになる。hlyプロモーター支配下で、Lamaglama由来の抗EGFRのVHH抗体のcDNAを麹菌で発現させた。N末端にリーダータンパク質としてamyBglaBcelAcelBからなる群の1つの遺伝子とLamaglama由来の抗EGFRのVHH抗体のcDNAとHisタグをコードする遺伝子の順からなる融合遺伝子をpNMBベクターにサブクローニングし、得られたベクターを、定法であるPEGカルシウム法により、アスペルギルスオリゼのniaD変異株を形質転換した。得られた形質転換体をポテトデキストロース培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。500ml容三角フラスコに入った100mlGPY液体培地に最終胞子濃度1×106mlとなるように植菌した。30°C3日間の液体培養で目的遺伝子産物が培地中に分泌発現させ、分泌タンパク質をSDSPAGEで解析した。分泌された目的融合遺伝子産物の培地あたりのタンパク質生産量を決定するために、菌体外のタンパク質総量をBradfordプロテインアッセイ試薬で測定し、菌体外のタンパク質に対する目的融合遺伝子産物の量比と純度をAgilentTechnologies社製の商品名2100Bioanalyzerで測定した。その結果の生産量と全分泌タンパク質に対する目的融合遺伝子産物の純度を下記表1に示す。対照は、ベクターpNMBのみを形質転換した麹菌形質転換体である。その結果、当該抗EGFRのVHH抗体についても、glaBとcelBをリーダータンパク質に選択することで、良好に分泌発現でき、1528mgLの著量の分泌発現に成功し、その純度は942となった。次に、celBLamaglama由来の抗EGFRのVHH抗体Hisタグ融合タンパク質をNiカラムにより公知の方法で精製し、表面プラズモン共鳴シグナルによる抗体活性を測定した。前記精製タンパク質を、金薄膜がコートされたセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予め金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合タンパク質中のアミノ基と結合させることにより行った。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置にセットし、リガンドサンプルとして10~100nMのEGFR溶液をフローセルに流してリガンド物質を結合させた後、pH25のグリシン溶液によって解離させた。この結合解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウウェアBIAevaluation91によって解離定数を算出したところ147nMであった。なお、コントロール実験として、celBHisタグ融合タンパク質のみをセンサーチップに固定化して同様の実験を行ったところ、EGFRとの結合は全く検出されなかった。よって、Lamaglama由来の抗EGFRのVHH抗体は、融合タンパク質の状態で抗原結合活性を有することが判明した。試験例12.抗RR6抗体の麹菌での生産RR6は、ReactiveRed6という色素である。Lamaglama由来の抗EGFRのVHH抗体に代えてLamaglama由来の抗RR6のVHH抗体を使用した以外は試験例11と同様の実験を行った。その結果の生産量と全分泌タンパク質に対する目的融合遺伝子産物の純度を表2に示す。対照は、ベクターpNMBのみを形質転換した麹菌形質転換体である。その結果、当該抗RR6のVHH抗体についても、glaBとcelBをリーダータンパク質に選択することで、良好に分泌発現でき、1624mgLの著量の分泌発現に成功し、その純度は926となった。次に、celBLamaglama由来の抗RR6のVHH抗体Hisタグ融合タンパク質をNiカラムにより公知の方法で精製し、表面プラズモン共鳴シグナルによる抗体活性を測定した。前記精製タンパク質を、金薄膜がコートされたセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予め金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合タンパク質中のアミノ基と結合させることにより行った。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置にセットし、リガンドサンプルとして10~100nMのRR6溶液をフローセルに流してリガンド物質を結合させた後、pH25のグリシン溶液によって解離させた。この結合解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウウェアBIAevaluation91によって解離定数を算出したところ147nMであった。なお、コントロール実験として、celBHisタグ融合タンパク質のみをセンサーチップに固定化して同様の実験を行ったところ、RR6との結合は全く検出されなかった。よって、Lamaglama由来の抗RR6のVHH抗体は、融合タンパク質の状態で抗原結合活性を有することが判明した。以上すべての実施例を総合すると、glaB又はcelBをリーダータンパク質に選択すれば、すべての抗原に対するVHH抗体を、融合タンパク質として活性型で、著量高純度で分泌発現させることが可能なことが明らかとなった。