"線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防するための、第XII因子及び/又は第XIIa因子FXII/FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤。第XIIa因子の触媒活性を阻害できる化合物である、請求項1に記載の阻害剤。細胞における第XII因子の発現を低減できるか又は消失させ得る化合物である、請求項1に記載の阻害剤。第XII因子の第XIIaへの変換を阻害できる化合物である、請求項1に記載の阻害剤。セリンプロテアーゼ阻害剤である、請求項1~4のいずれか1項に記載の阻害剤。i野生型インフェスチンInfestin-4ポリペプチド配列配列番号33、又はその変異体[ここで、変異体はa野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2~13、及び野生型インフェスチン-4配列との差を生じる、該N末端アミノ酸の外側での少なくとも1つでかつ最大で5つまでのアミノ酸変異;及び/又はb野生型インフェスチン-4配列からの6つの保存されたシステイン残基、及び野生型インフェスチン-4配列に対する少なくとも70の相同性を含む];ii野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2~13を含むように変異されたSPINK-1配列番号29、又は該変異されたSPINK-1の変異体[ここで、変異体はa野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2~13;及び野生型SPINK-1配列との差を生じ、かつ野生型インフェスチン-4配列に対する変異体の相同性を増加させる、該N末端アミノ酸の外側での少なくとも1つでかつ最大で5つまでのアミノ酸変異;及び/又はb野生型SPINK-1配列からの6つの保存されたシステイン残基、及び野生型SPINK-1配列に対する少なくとも70の相同性を含む];iiiSPINKK1、K2又はK3配列番号30、31、又は32;ivアプロチニン、トウモロコシトリプシンインヒビターCTI、ウシ膵臓トリプシンインヒビターの変異体、及びPro-Phe-Arg-クロロメチル-ケトンPCK;v前記FXII/FXIIaに結合することができる抗体;からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の阻害剤。半減期増大ポリペプチドに連結されている、請求項6に記載の阻害剤であって、ここで該半減期増大ペプチドは場合によりアルブミン、アファミン、アルファ-フェトプロテイン又はビタミンD結合タンパク質、ヒトアルブミン、又はその変異体、免疫グロブリン又はその変異体、IgGのFcである、阻害剤。半減期増大ポリペプチドがリンカーを介してFXII阻害剤に連結される、請求項7に記載の阻害剤。リンカーが、i切断可能である;ii内因系、外因系、又は共通の凝固経路の凝固プロテアーゼにより切断可能である;iiiFXllaにより切断可能である、請求項8に記載の阻害剤。前記線維増殖性間質性肺疾患が肺線維症である、請求項1~9のいずれか1項に記載の阻害剤。前記肺線維症が特発性肺線維症である、請求項10に記載の阻害剤。前記処置が、コルチコステロイド薬、ピルフェニドン、アザチオプリン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、抗繊維化薬の投与及び/又は酸素療法を含む第二の療法との組み合わせ処置を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の阻害剤。線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防する方法であって、個体に薬学的に有効な量のFXII/FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含む、上記方法。線維増殖性間質性肺疾患に罹患した患者の生存期間を延長する方法であって、該患者に薬学的に有効な量のFXII/FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含む、上記方法。線維増殖性間質性肺疾患が特発性肺線維症である、請求項13又は14に記載の阻害剤の使用方法。FXII/FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤、並びに線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防するためのさらなる薬物を含む、間質性肺疾患を処置するための医薬キット。線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防するためのさらなる薬物が、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び抗繊維化薬からなる群より選択される、請求項16に記載の医薬キット。発明の要旨本発明者らは驚くべきことに、第XII因子が実験的に誘導された肺損傷の線維化期の間に役割を果たすということを見出した。さらに、肺線維芽細胞増殖のFXII依存性誘導は、ERK1/2経路の薬理的遮断及びFXIIaの特異的阻害により減弱されるということが観察された。これらの結果は、肺線維症の病理においてFXII/FXIIaを中心的位置に据えた。それ故、FXII活性化又はFXIIa活性を妨害及び遮断することができる物質は、肺における繊維化プロセス及びその臨床的結果を遮断するように適合され得、すなわち、このような物質は、FXII/FXIIaの細胞活性を特異的に阻害することにより肺の線維形成性fibroplast増殖を制限するために適切であり得る。第一の局面において、本発明は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患の処置及び/又は予防のための、第XII因子及び/又は第XIIa因子の細胞活性の非内因系阻害剤に関する。本発明の第二の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防する方法であり、該方法は、個体に薬学的に有効な量の、FXII及び/又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を投与することを含む。本発明の特別な局面において、処置は、間質性肺疾患を処置するための第二の治療剤又は治療原理との組み合わせ処置を含む。上記第二の治療原理は、酸素療法療法であり得る。間質性肺疾患の処置のための上記第二の治療剤は、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び/又は抗繊維化薬anti-fibroticsであり得る。本発明のさらなる局面は、線維増殖性間質性肺疾患に罹患した患者の生存期間を延長する方法であって、該方法は、該患者に薬学的に有効な量のFXII/FXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を投与することを含む。本発明のさらに別の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患に関連する症状を低減させる方法であって、該方法は、薬学的に有効な量のFXII及び/又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤を患者に投与することを含む。本発明のさらに別の局面は、特発性肺線維症のような線維増殖性間質性肺疾患を処置及び/又は予防するための医薬キットであり、該キットは、FXII及び/又はFXIIaの細胞活性の非内因系阻害剤、並びに間質性肺疾患を処置するためのさらなる薬物を含む。上記さらなる薬物は、コルチコステロイド薬、アザチオプリン、ピルフェニドン、シクロホスファミド、アセチルシステイン、及び抗繊維化薬からなる群から選択され得る。発明の詳細な説明本発明は、間質性肺疾患を処置及び/又は予防するための方法に関し、該方法は、被験体に薬学的に有効な量の、FXII/FXIIaの細胞活性の非内在性阻害剤を投与することを含み、すなわち、このような阻害剤を投与することが肺線維芽細胞の増殖を防止及び/又は限定する。同様に、本発明は間質性肺疾患を処置及び/又は予防するための医薬の製造のための非内在性細胞性FXII阻害剤の使用に関する。第XII因子FXIIは、単鎖78kDチモーゲンとして肝臓で産生されるポリペプチドである。活性化されるとFXIIは重鎖及び軽鎖からなる二本鎖形態に変換される。重鎖は以下のドメインを含有する:リーダーペプチド、フィブロネクチンII型ドメイン、上皮増殖因子ドメイン、フィブロネクチンI型ドメイン、クリングルドメイン、及びプロリンリッチドメインこれはFXIIに特有である。軽鎖はセリンプロテアーゼに典型的な触媒ドメインを含有し、これによりFXIIは、セリンプロテアーゼファミリーの他のメンバー、例えば組織型プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子、又は第VII因子活性化プロテアーゼと類似したドメイン構成を有する。重鎖は、アミノ末端に局在し、フィブロネクチンI型領域に沿って、そして場合により第二EGF様ドメイン又はクリングルドメインに局在化した、負に荷電した表面に対する結合領域を含有する。軽鎖におけるFXIIの活性部位は、His40、Asp89及びSer191残基を含む標準的触媒三連構造canonicalcatalytictriadからなる。この部位は、主要な内因系凝固経路阻害剤であるC1阻害剤の標的でもある。カリクレイン又はその自己活性化によるFXIIの切断は、FXIIチモーゲンにおいて結合しているArg353-Val354の分裂を生じ、活性アルファXIIa形態の生成をもたらし、これはジスルフィド結合により連結された重鎖及び軽鎖を含有する。アルファXIIa形態における2つのさらなるペプチド結合の加水分解は、軽鎖及び重鎖の切断型フラグメントを含有する30kDのベータXIIaを生じる。アルファXIIaは負に荷電した表面に結合することができ、そしてFXI及びプレカリクレインを活性化する。ベータXIIaは表面結合能を有していないがPKを活性化することができる。本明細書で使用される用語第XII因子又はFXIIは、第XII因子の上記の形態のいずれかを指す。特に、この用語は活性化形態の第XIIa因子を含む。間質性肺疾患びまん性実質性肺疾患としても知られる間質性肺疾患は、間質を冒す肺疾患の群を指す。これは、肺胞上皮、肺毛細血管内皮、基底膜、血管周囲組織及びリンパ周囲組織に関係する。本出願という意味ではILDは特に肺線維芽細胞増殖に関連し、従って用語線維増殖性ILDが使用される。この肺線維芽細胞増殖は、本発明により処置及び/又は予防されるはずである。好ましくは、本発明に従って処置しようとするILDは肺線維症である。最も好ましくは、肺線維症は特発性肺線維症である。特発性肺線維症は、肺に限定された未知の原因の、そして通常型間質性肺炎の組織学的パターンを伴う、慢性繊維化間質性肺炎の独特の型として定義される。IPF肺は、構造的破壊、蜂巣状の密な瘢痕及び散在した線維芽細胞病巣を特徴とする。FXIIの細胞活性の非内因系阻害剤用語FXIIの細胞活性の非内因系阻害剤又は非内因系細胞性FXII阻害剤は、FXII及び/若しくはFXIIaの細胞活性又はその量を低減することができるいずれかの非内因系化合物を指す。本発明という意味でFXII阻害剤は、FXIIaの触媒活性を妨げる化合物を含む。インビボでFXII又はFXIIaの量を低減することができる化合物がさらに含まれる。このような阻害剤は、FXIIの発現を低減することができる化合物を含む。さらに、FXIIのFXIIaへの変換を妨げる阻害剤が含まれる。このような阻害剤は、FXII及び/又はFXIIaの生物学的機能を、少なくとも50、好ましくは少なくとも75、より好ましくは少なくとも90そしてさらにより好ましくは少なくとも95、例えば少なくとも98又は少なくとも99も低減する。生物学的機能は、FXII/FXIIaの公知の細胞作用を意味する。上記細胞機能の例は、細胞、特に肺線維芽細胞又は平滑筋細胞に対する増殖性及び/又はマイトジェン作用である。本発明という意味での非内因系阻害剤は、FXII/FXIIaが阻害されるべき種において天然で存在しないFXII/FXIIa阻害剤である。FXII/FXIIaの内因系阻害剤は、例えば抗トロンビン、C1阻害剤、アルファ-1プロテアーゼ阻害剤である。本発明の非内因系FXII/FXIIa阻害剤は、内因系FXII/FXIIa阻害剤よりもかなり特異的であり、すなわち、本発明に従う阻害剤はFXII/FXIIaに対して非常に特異的である。この特異性は、FXII/FXIIaの活性の50の低減を得るために必要とされるFXII/FXIIaに対する特定の阻害剤のモル比として表され得る。これは本発明という意味ではモル阻害比と呼ばれる。05のモル阻害比は、FXII/FXIIa1pmolに対して加えられた阻害剤05pmolがFXII/FXIIa活性の50の低減をもたらすということを意味する。本発明の特異的な、すなわち非内因系阻害剤は、10若しくはそれ以下、又は好ましくは5若しくはそれ以下、又はより好ましくは2若しくはそれ以下、又はさらにより好ましくは1若しくはそれ以下、例えば05若しくはそれ以下のモル阻害比を有する阻害剤である。FXIIaの触媒活性を決定するための試験は、KannemeierCShibamiyaANakazawaFTrusheimHRuppertCMarkartPSongYTzimaEKennerknechtENiepmannMBruehlMLSeddingDMassbergSGuntherAEngelmannBPreissnerKTExtracellularRNAconstitutesanaturalprocoagulantcofactorinbloodcoagulationProcNatlAcadSciUSA104:6388-63932007に記載されている。手短には、FXIIaサンプル及び発色性基質ペプチドを混合し、そしてp-ニトロアニリンの放出を光度計で405nmにて経時的に追跡する。化合物は、そのアッセイにおいて触媒活性を有意な様式で、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも25、最も好ましくは少なくとも50、例えば少なくとも75又は少なくとも90も低減することができる場合、FXIIaの触媒活性、特に酵素活性の阻害剤として適切である。FXIIのFXIIaへの変換の程度を決定するための試験は、上記と同様のやり方で、発色性ペプチドアッセイにおけるFXIIaの増加を追跡することにより説明される。化合物は、その化合物がこの変換をそのアッセイにしたがって有意な程度まで阻害することができる場合に、FXIIのFXIIaへの変換を妨害する阻害剤として適切である;好ましくは、阻害剤により影響を及ぼされる変換における減少は、少なくとも10、より好ましくは少なくとも25、最も好ましくは少なくとも50である。FXII及び/又はFXIIaの量を決定する方法が記載されており、その方法において、FXII/FXIIaの総量は、酵素結合イムノソルベントアッセイによりFXII特異的抗体を使用して定量され、そして活性化FXIIの部分は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサンプルを分析し、続いてウェスタンブロットによりタンパク質バンド形成パターンを定量することにより決定される。このような方法は、ELISA及び他の免疫学的技術のようなタンパク質検出の公知の方法を含む。抗FXII抗体FXII及び/又はFXIIaに特異的な抗体は、FXIIaの機能を阻害するために使用され得る。このような抗体としては、例えば抗FXII抗体ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むが挙げられる。抗体はまた、阻害活性を保持している、同じもののフラグメント又は模倣物、例えば米国特許第6613890号の特に第4~8欄に開示されるようなアミロイド前駆体タンパク質のKunitzプロテアーゼ阻害剤ドメインのアナログであってもよい。プロテアーゼ阻害剤FXIIa活性を阻害するための効率的な方法は、特異的非内因系プロテアーゼ阻害剤、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤の使用である。例としては、アプロチニン、Z-Pro-Pro-アルデヒド-ジメチルアセテート、DX88255-8において引用される、プロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、例えばFmoc-Ala-Pyr-CN、トウモロコシトリプシンインヒビター、ウシ膵臓トリプシンインヒビターの変異体及びPro-Phe-Arg-クロロメチル-ケトンが挙げられる。他の適切な阻害剤は、HIsawaらににより開示されるHamadarinであり得る。適切なトウモロコシトリプシンインヒビター及びその製造方法は、ZYChenらにおいて開示される。引用される全ての参考文献は、それらの内容全体を含めて参照のために本出願に加入される。最後に述べるが決して軽んずべきでなく、その選択が基づいているアッセイとしてそれぞれFXII、FXIIaの使用を介して例のために単離される小分子は、本発明の一部であり、上記又は下記のそれらのそれぞれの使用も同様である。これらの小分子FXIIa阻害剤は、FXIIの結晶構造に基づいて設計され得る。従って、いくつかのFXIIドメイン又は軽鎖は、Ecoli、酵母又は哺乳動物細胞のような発現系で組み換え的に発現され得る。次いでタンパク質を精製し、そしてFXII基質FXIについて記載されるように標準的な手順を使用して結晶化させる。エコチン変異体との複合体におけるFXIa触媒ドメインの結晶構造は、基質様相互作用を明らかにした。あるいは、小分子セリンプロテアーゼ阻害剤は、FXII構造を安定化するために含まれ得る。最近、FXII/FXIIaの新規な阻害剤が昆虫において発見された:吸血性昆虫であるブラジルサシガメTriatomainfestansの中腸由来のインフェスチンドメイン3-4及びインフェスチンドメイン4FEBSLett577512-516。これらのタンパク質は、Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤である強力なFXIIa阻害剤として知られており、活性化部分トロンボプラスチン時間を約3倍延長する。国際特許出願WO2008/098720において、インフェスチン3-4及びインフェスチン-4、さらにはインフェスチン4のアルブミン融合タンパク質のFXIIaの強力な阻害剤としての使用が記載されており、これらの分子自体も同様に記載される。さらに、インフェスチン-4と非常に高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓で発現されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤であるSPINK-1であると記載された。野生型SPINK-1配列に基づいて、3つの異なる変異体は、インフェスチン-4に対するSPINK-1の増加した相同性と共に記載されている。成熟SPINK-1野生型タンパク質、3つの変異体及びインフェスチン-4のアミノ酸配列は配列番号29~33として示される。一実施態様において、本発明のFXII阻害剤は、SPINK-1から誘導された変異Kazal阻害剤を含み、ここでこの阻害剤はインフェスチン-4に対する増加した相同性を有する。用語それぞれ増加した相同性の増加したwithincreasingrespectiveincreasedhomologySPINK-1変異体は、インフェスチン-4と同一のアミノ酸、又は同一性の代わりに保存的置換同一のアミノ酸の代わりの保存的置換を意味するを20より多く含有する変異体を指す。好ましくは、変異Kazal阻害剤と阻害されるFXIIaとの接触部位はKazal型阻害剤インフェスチンのドメイン4由来である。WO2008/098720の記載全体が本出願に参照により加入される。従って、インフェスチンinfestin若しくはそのフラグメント、又はインフェスチン3-4若しくはインフェスチン-4、又はSPINK-1由来の上記変異Kazal阻害剤ここでこの阻害剤はインフェスチン-4に対する増加した相同性を有する]、及び以下に記載されるような融合タンパク質rHA-Infestin-4は、本発明に従うFXII/FXIIaの細胞活性の適切な非内因系阻害剤である。言い換えれば、一実施態様において、本出願はインフェスチンドメイン4を含むFXII阻害剤、インフェスチン-4を提供する。一実施態様において、FXII阻害剤はインフェスチン-4の変異体を含む。別の実施態様において、FXII阻害剤はインフェスチンドメイン4、並びに場合によりインフェスチンドメイン1、2、及び/又は3を含む;これらのタンパク質はFXIIの強力な阻害剤であることが知られている。インフェスチン-4の野生型ポリペプチド配列が提供される。本明細書で使用される用語変異体variantはアミノ酸変異を有するポリペプチドを指し、ここで変異は、野生型インフェスチン-4配列に対する置換、欠失又は付加として定義され、ここでこのような変化はそのポリペプチドがFXIIを阻害する機能的能力を変更しない。用語変異体は、野生型又は変異インフェスチン-4配列のフラグメントを含む。このような変異体のさらなる例は以下に示される。一実施態様において、インフェスチン-4変異体は、野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2-13、及びN末端アミノ酸の外側に野生型インフェスチン-4配列との差を生じる少なくとも1つでかつ5つまでのアミノ酸変異、又は6つの保存されたシステイン残基、及び野生型インフェスチン-4配列に対する少なくとも70の相同性を含む。インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2-13は、トロンビンに結合する関連した阻害剤ベネズエラサシガメRhodniusprolixusについての構造データ分析、及びキモトリプシンに結合するSPINK-1の分析これらは両方ともN末端領域における接触部位の集積という共通の特徴を共有するに基づいて、FXIIに対する結合に重要であり得る。従って、一実施態様において、インフェスチン-4の変異体は、野生型インフェスチン-4配列のアミノ酸2-13の保存されたN末端領域、及び野生型インフェスチン-4配列との差を生じるこれらの保存されたN末端アミノ酸の外側に少なくとも1つでかつ5つまでのアミノ酸変異を含む。変異は置換でも欠失でも付加でもよい。本明細書で使用される上記N末端アミノ酸の外側は、配列VRNPCACFRNYV、すなわち野生型インフェスチン-4配列からのアミノ酸2-13を含むアミノ酸の連続した配列以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。別の実施態様において、インフェスチン-4変異体は6つの保存されたシステイン残基を含み、そして野生型インフェスチン-4配列に対して少なくとも70の相同性を有する。一実施態様において、6つの保存されたシステイン残基は、野生型インフェスチン-4配列の6位、8位、16位、27位、31位及び48位におけるアミノ酸である。一実施態様において、変異体は最終的な保存されたシステインを含む。他の実施態様において、システイン残基の正確な位置、及び互いの相対的な位置は、インフェスチン-4変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型インフェスチン-4配列の6位、8位、16位、27位、31位及び48位から変化し得る。それにもなお、これらの実施態様において、インフェスチン-4変異体は全ての6つのシステインを含み、そして野生型インフェスチン-4配列に対して70、75、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の相同性を共有し得る。実施態様において、インフェスチン-4の変異体は、それがFXIIを阻害するということを特徴とする。FXIIを阻害する機能的活性は、例えばインビトロ及び/又はインビボでの特徴付けにより評価され得、これらとしては、FXII酵素活性の阻害、延長された凝固時間、すなわち活性化部分トロンボプラスチン時間を試験するための直接的なアッセイ、又は凝固を評価するインビボでの方法が挙げられる。インフェスチン-4変異体のさらなる例はSPINK-1変異体であり、これは以下に記載される。一実施態様は、ヒトにおける治療的使用のためのFXII阻害剤を含む。インフェスチン-4に対する高い類似性を有するヒトタンパク質が使用され得る。例えば、インフェスチン-4に対して最も高い類似性を有するヒトタンパク質は、膵臓において発現されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤であるSPINK-1である。Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの1つである。様々な種からの多数のタンパク質が記載されている。インフェスチン-4とSPINK-1との間のアミノ酸配列類似性は図12において概要を示される。野生型SPINK-1配列に基づいて、インフェスチン-4に対するSPINK-1配列の相同性を増加させるために様々な変異体が生成され得る。句インフェスチン-4に対する増加した相同性は、それによりSPINK-1配列をインフェスチン-4配列に近づけるためにSPINK-1に対してアミノ酸変異が作製されるプロセスを指す。一実施態様において、SPINK-1を、野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2-13を含むように変異させる;ポリペプチド配列が示され、そしてこれはK1と称される。上記のように、Infesin-4配列のN末端部分は、FXII阻害機能に重要であると考えられる。従って、一実施態様において、変異SPINK-1の変異体はまた、野生型インフェスチン-4配列のN末端アミノ酸2-13、及び野生型SPINK-1配列との差を生じ、かつ野生型インフェスチン-4配列に対する変異体の相同性を増加させる、上記N末端アミノ酸の外側に少なくとも1つでかつ5つまでのアミノ酸変異を含む。別の実施態様において、変異SPINK-1の変異体は、6つの保存されたシステイン残基を含み、そして野生型SPINK-1配列に対して少なくとも70の相同性を有する。変異は置換でも、欠失でも、付加でもよい。上で定義されたように、用語上記N末端アミノ酸の外側は、配列VRNPCACFRNYV、すなわち野生型インフェスチン-4配列からのアミノ酸2-13からなるアミノ酸の連続した配列以外の、変異体のポリペプチド鎖に沿ったいずれかのアミノ酸を指す。用語変異体は、上記の変異SPINK-1配列のフラグメントを含む。一実施態様において、6つの保存されたシステイン残基は、野生型SPINK-1配列の9位、16位、24位、35位、38位及び56位のアミノ酸であり得る。一実施態様において、変異体は最終的な保存されたシステインを含む。別の実施態様において、システインの正確な位置、及び互いの相対的な位置は、SPINK-1変異体における挿入又は欠失に起因して、野生型SPINK-1配列の9位、16位、24位、35位、38位及び56位から変化し得る。それでもなお、これらの実施態様において、SPINK-1変異体は6つのシステイン全てを含む。実施態様において、SPINK-1変異体はまたそれがFXIIを阻害するということも特徴とする。このようなSPINK-1変異体の例が示され、これらはK2、及びK3と名付けられる。SPINK-1変異体K2及びK3において、N末端の外側のさらなるアミノ酸置換が、インフェスチン-4に対する相同性を増加させるために作製され、ここで変異体はまた、それらがFXII活性を阻害することを特徴とする。WO2008/098720を参照のこと。SPINK-1変異体K3の場合、5つのアミノ酸置換がインフェスチン-4に対する相同性を増加させるために作製された。従って実施態様において、SPINK-1変異体は野生型SPINK-1配列と70、75、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の相同性を共有し得る。延長された半減期を有する阻害剤本発明の好ましい実施態様は、延長された半減期を有する、FXII/FXIIa阻害剤、特にインフェスチン-4及びインフェスチンホモログに基づく改変された哺乳動物Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤又はそれらのフラグメントの使用である。Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤はかなり小さなタンパク質であり、他の小さいタンパク質について公開されているように速い腎クリアランスが期待され得る。ポリペプチド化合物の短い血漿半減期を克服するための1つの方法は、それを繰り返し、又は持続注入により注射することである。好ましくは、ポリペプチド自体の固有の血漿半減期が増加される。従って、半減期延長タンパク質に融合されたFXII阻害剤、特にセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが好ましい。本明細書で使用されるHLEPは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンGの定常領域及びそのフラグメント、並びに生理的条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域の部分に結合することができるポリペプチドからなる群より選択される。具体例として、アルブミン及び免疫グロブリン並びにそれらのフラグメント又は誘導体がHLEPとして記載される。Ballanceらは、ヒト血清アルブミンに融合された場合にインビボで増加した機能的半減期及び延長された貯蔵寿命を有すると予測される多数の異なる治療的ポリペプチドの融合ポリペプチドを記載した。治療的タンパク質は、直接的に、又はアルブミン部分へのペプチドリンカーを介して融合され得、そしてC末端及びN末端融合が記載される。用語ヒト血清アルブミン及びヒトアルブミンは本出願において交換可能に使用される。用語アルブミン及び血清アルブミンはより広範であり、ヒト血清アルブミン、さらには他の種からのアルブミンを包含する。本明細書で使用されるアルブミンは、集合的に、アルブミンポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの1つ若しくはそれ以上の機能的活性例えば生物学的活性を有するアルブミンフラグメント若しくは変異体を指す。特に、アルブミンはヒトアルブミン又はそのフラグメント、特に配列番号34に示されるようなヒトアルブミンの成熟形態若しくは他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはそれらのフラグメント、又はこれらの分子のアナログ若しくは変異体若しくはそれらのフラグメントを指す。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のようなHA配列の全長を含んでいてもよく、又は治療活性を安定化若しくは延長することができる1つ若しくはそれ以上のそのフラグメントを含んでいてもよい。このようなフラグメントは、10若しくはそれ以上のアミノ酸長のものであり得、又はHA配列からの約15、20、25、30、50、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸を含み得、又はHAの特定のドメインの一部若しくは全てを含み得る。本発明に従って使用され得るアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は通常のHAの変異体であり得る。本発明の融合タンパク質の治療的ポリペプチド部分はまた、本明細書に記載されるような対応する治療的ポリペプチドの変異体であってもよい。用語変異体は挿入、欠失および保存的又は非保存的のいずれかの置換を含み、この場合、このような変化は、治療的ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。特に、本発明にしたがって使用され得るアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型変異体及びヒトアルブミンのフラグメントを含み得る。アルブミンはいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来のものであり得る。非哺乳動物アルブミンとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケに由来するものが挙げられる。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、治療的ポリペプチド部分と異なる動物由来であってもよい。本発明に従って使用され得るアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、HAの少なくとも1つのサブドメイン若しくはドメイン又はその保存的修飾を含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも40アミノ酸長、最も好ましくは70アミノ酸長より長い。アルブミン変異体は、優先的に少なくとも1つのアルブミンのドメイン全体又はそのドメインのフラグメント、例えばドメイン1、2、3、12、23又は13からなるか、あるいはこれらを含む。各ドメインはそれ自体、残基Lys106~Glu119、Glu292~Val315及びGlu492~Ala511を含む可動性のサブドメイン間リンカー領域と共に、2つの相同なサブドメイン、すなわち1-105、120-194、195-291、316-387、388-491及び512-585から構成される。アルブミンに加えて、アルブミンファミリーの別のメンバーであるアルファ-フェトプロテインは、結合した治療的ポリペプチドのインビボでの半減期を延長させると主張された。進化的に関連する血清輸送タンパク質であるタンパク質のアルブミンファミリーは、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、アファミンafamin及びビタミンD結合タンパク質からなる。それらの遺伝子は、ヒト、マウス及びラットにおいて同じ染色体領域に位置し、構造的及び機能的類似性を有する多重遺伝子クラスターを示す。アルブミンファミリーメンバーの構造的類似性は、HLEPとしてのそれらの有用性を示唆する。従って、このようなアルブミンファミリーメンバー、それらのフラグメント及び変異体をHLEPとして使用することは本発明の別の実施態様である。用語変異体は、挿入、欠失および保存的又は非保存的のいずれかの置換を含み、この場合、このような変化は、治療的ポリペプチドの治療的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。アルブミンファミリーメンバーは、それぞれのタンパク質AFP、AFM及びDBPの全長を含み得、又は治療活性を安定化若しくは延長することができるそれらの1つ若しくはそれ以上のフラグメントを含み得る。このようなフラグメントは、10又はそれ以上のアミノ酸長であっても、それぞれのタンパク質配列の約15、20、25、30、50、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいても、それぞれのタンパク質の特定のドメインの一部又は全てを含んでいてもよい。本発明のアルブミンファミリーメンバー融合タンパク質は、AFP、AFM及びDBPの天然に存在する多型変異体を含み得る。これらのタンパク質はいずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物アルブミンファミリーメンバーとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケ由来の物が挙げられる。IgG及び抗原結合ドメインを有していないIgGフラグメントもまたHLEPとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくはなお切断可能であり得る抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してIgG又はIgGフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願が、治療的タンパク質のインビボでの半減期を延長させるための治療的タンパク質の免疫グロブリン定常領域に対する融合を記載する。US2004/0087778及びWO2005/001025は、免疫グロブリン定常領域のFcドメイン又は少なくとも一部と、ペプチドの半減期を増加させる増加させる生物的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これはそうでなければインビボで急速に分解するだろう。Fc-IFN-β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより高い溶解度を達成すると記載された。延長された血清半減期及び増加したインビボでの効力を有するFc-EPOタンパク質が開示され、さらにG-CSF、グルカゴン様ペプチド-1、凝固因子及びインターロイキン-10とのFc融合も開示され、全て半減期延長特性を有する。従って、このような免疫グロブリン配列、好ましくはFcフラグメント及びそれらの変異体はHLEPとして使用することができる。インフェスチン-4のようなKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤、及びSPINK-1変異体のようなFXIIaに対する増強された阻害特異性を有する改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、HLEPとしてのFcドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部に融合され得、そしてEcoli、酵母、昆虫、植物若しくは脊椎動物細胞、又はトランスジェニック動物において発現され得る。SPINK-K2-Fc融合タンパク質は例として配列番号53に示される。本発明に従って好ましいFXII阻害剤は、形成される融合タンパク質がHLEPに連結されていない対応するKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤と比較して増加したインビボ半減期を有するように、インフェスチン-4のようなKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤及びSPINK-1変異体のような改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤又はそれらのフラグメント若しくは変異体を、HLEP又はそのフラグメント若しくは変異体のN末端又はC末端に連結した融合タンパク質である。介在するペプチドリンカーは、治療的ポリペプチドとHLEPとの間に導入され得る。HLEPが例えば立体障害により治療的ポリペプチドの特定の活性を妨害する場合は、切断可能なリンカーが導入され得る。リンカー切断のために好ましい酵素は、内因性の凝固経路の凝固プロテアーゼ、FXIIa、FXIa、FIXa、FVIIIa又はFXaであり、ここで最も好ましい切断酵素はFXIIaである。Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ファミリーは、セリンプロテアーゼ阻害剤の多数のファミリーのうちの1つである。様々な種由来の多くのタンパク質が記載されている。上記の定義内のインフェスチン-4及び改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、天然のアミノ酸配列又は配列番号30~33若しくは49~52を有するポリペプチドを含む。しかし、上記定義は、それらのポリペプチドがそれぞれのKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤の活性を実質的に保持している限り、わずかに改変されたアミノ酸配列、例えば末端アミノ酸欠失又は付加を含む改変されたN末端又はC末端を有するポリペプチドも含む。上記定義内のKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、存在し得るか又はある個体から別の個体へと発生し得る天然の対立遺伝子変異も含む。上記定義内のKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤の変異体をさらに含む。このような変異体は、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基において野生型配列と異なる。このような差の例は、1つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基によるN末端及び/若しくはC末端の短縮、又はN末端及び/若しくはC末端における1つ若しくはそれ以上の追加の残基の付加、さらには保存的アミノ酸置換、すなわち類似した特徴を有するアミノ酸のグループ、例えば小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸内で行われる置換を含み得る。このような保存的置換の例を表1に示す。本発明のKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤及び改変されたKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤は、原核生物若しくはは真核生物の宿主細胞、例えば細菌、酵母、植物、動物若しくはヒトの細胞株において、又はWO2008/098720に従ってトランスジェニック動物において組み換え分子として産生され得る。場合により、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。投薬量、製剤、及び投与経路本発明のFXII阻害剤、特にセリンプロテアーゼ阻害剤を、80より高い純度まで、より好ましくは95より高い純度まで精製することが好ましく、そして混入している高分子、特に他のタンパク質及び核酸に関して999より高い純度で、かつ感染性及び発熱性の因子を含まない薬学的純粋状態が特に好ましい。好ましくは、本発明の単離されたか又は精製されたセリンプロテアーゼ阻害剤は、他のポリペプチドを実質的に含まない。本発明において記載される治療的FXII阻害剤は、治療用途のために医薬製剤へと製剤化され得る。精製されたタンパク質又は抗体は、医薬製剤を提供するために、従来の生理的に適合性の水性緩衝溶液に溶解され得、これには医薬添加剤及び担体が場合により添加され得る。広範な種々の薬学的に許容しうる添加剤及び担体が当該分野で公知である。このような医薬担体及び添加剤、さらには適切な製剤処方が、様々な刊行物に十分に記載されている又はHandbookofPharmaceuticalExcipients、3rdedition、Kibbeetal、PharmaceuticalPressAGennaroRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、20thedition、Lippincott、Williams、Wilkins;PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsHCAnseletal、eds7thed、Lippincott、Williams、Wilkins;及びHandbookofPharmaceuticalExcipientsAHKibbeetal、eds、3rdedAmerPharmaceuticalAssocを参照のこと。特に、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、凍結乾燥形態又は安定な可溶形態で製剤化され得る。ポリペプチドは当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩溶液のような1つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤を加えることにより、使用前に再構成される。本発明の方法において、阻害剤単数又は複数は、所望の治療効果を生じることができるいずれかの都合のよい手段を使用して個体に投与され得る。従って、薬剤は治療的投与のための様々な製剤中に組み込まれ得る。より詳細には、本発明の薬剤は、適切な薬学的に許容しうる担体又は希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物へと製剤化され得、そして固形、半固形、液状又は気体の形態の製剤、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾル剤へと製剤化され得る。このように、薬剤の投与は、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内intrachealなどの投与を含む様々なやり方で達成され得、すなわち組成物の製剤は、いずれかの薬学的に適切な投与手段により個体に送達される。様々な送達系が公知であり、そしていずれかの従来の経路により組成物を投与するために使用され得る。優先的に、本発明の組成物は全身投与される。全身性の使用のために、本発明の治療的タンパク質は、従来の方法にしたがって、非経口又は経腸の送達のために製剤化される。最も優先の投与経路は静脈内投与又は肺内投与である。製剤は注入により、又はボーラス注射により連続的に投与され得る。いくつかの製剤は徐放slowrelease系を包含する。経口投与のための錠剤及びカプセル剤は、結合剤、フィラー、滑沢剤及び湿潤剤などのような従来の添加剤を含有し得る。経口液状製剤は、水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などの形態であっても、水若しくは他の適切なビヒクルで使用のために再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液状製剤は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存料を含有し得る。一般に、経口製剤については、薬剤は単独で、又は錠剤、散剤、顆粒剤若しくはカプセル剤を作製するために適した添加剤と組み合わせて、例えば従来の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチ、若しくはジャガイモデンプンと;結合剤、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチンと;崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムと;滑沢剤、例えばタルク若しくはステアリン酸マグネシウムと;そして必要に応じて希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料及び矯味矯臭剤と組み合わせて使用され得る。局所適用に適した製剤は、水性又は油性の懸濁剤、液剤、乳剤、ゲル、又は好ましくは乳剤性軟膏の形態であり得る。スプレー適用に有用な製剤は、噴霧可能な液体又は乾燥粉末の形態であり得る。薬剤は、それらを水性又は非水性の溶媒、例えば植物油若しくは他の同様な油、合成脂肪族系酸グリセリド、高級脂肪族系酸のエステル又はプロピレングリコール中に;そして必要な場合は従来の添加剤、例えば可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び保存料と共に、溶解、懸濁又は乳化することにより、注射のための製剤へと製剤化され得る。さらに、薬剤は、様々な基剤、例えば乳化基剤又は水溶性基剤と混合することにより坐剤にされ得る。本発明の化合物は坐剤により直腸投与され得る。坐剤は、体温で溶融するが室温では凝固する、カカオ脂、カーボワックス及びポリエチレングリコールのようなビヒクルを含み得る。医薬投薬形態において、薬剤はそれらの薬学的に許容しうる塩の形態で投与され得、又はそれらは単独で、若しくは他の薬学的に活性な化合物との適切に会合して、さらには組み合わせても使用され得る。以下の方法及び添加剤は単に例となるものであり、決して限定ではない。本発明のFXII阻害剤は、治療的に有効な用量で患者に投与され、これは耐えられない有害な副作用を生じる用量に達することなく、処置される状態又は適応症の重症度又は拡散を予防するか又は減少させて、所望の効果を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、多くの因子、例えば適応症、処方及び投与形式に依存し、そしてそれぞれの適応症について前臨床及び臨床試験において決定されなければならない。経口又は直腸投与のための単位投薬形態、例えばシロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤が提供され得、ここで各投薬単位、例えば茶さじ一杯分のもの、テーブルスプーン一杯分のもの、錠剤又は坐剤は、1つ又はそれ以上の阻害剤を含む組成物を所定量含有する。同様に、注射又は静脈投与のための単位投薬形態は、滅菌水、生理食塩水又は別の薬学的に許容しうる担体中の溶液として組成物中に阻害剤を含み得る。本明細書で使用される用語単位投薬形態は、ヒト及び動物被験体のための単一の投薬形態として適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるために十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を、薬学的に許容しうる希釈剤、担体またはビヒクルと併せて含有する。本発明の新規な単位投薬形態の仕様は使用される特定の化合物及び達成しようとする効果、並びに宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。当業者は、用量レベルが特定の化合物の機能、症状の重症度及び副作用に対する被験体の感受性によって変わり得るということを容易に理解するだろう。所定の化合物について好ましい投薬量は、様々な手段により当業者により容易に決定可能である。好ましい手段は、所定の化合物の生理学的効力を測定することである。適用様式に依存して、静脈内iv注射による全身投与と比較してかなり低い用量が吸入又はスプレーには適しているだろう。医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と関連して投与され得る。これらの薬剤は同じ医薬の一部として組み込まれ得る。本発明の様々な製品は、線維増殖性間質性肺疾患の治療のための医薬として有用である。従って、本発明は、上記の治療、特に肺線維症、好ましくは特発性肺線維症のための、本明細書に記載するFXII阻害剤、特に本明細書に記載されるKazal型セリンプロテアーゼ阻害剤ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明の改変されたDNAはまた、ヒト遺伝子治療における使用のために導入ベクター中に一体化され得る。FXIIに対する特異的siRNAを、FXII発現の下方調節又はノックダウンのために使用することができる。上記の実施態様のいずれも、それらが本発明の阻害剤、本発明の方法、本発明の使用及び本発明のキットのカテゴリーのうちの1つとの組み合わせだけで記載されているかどうかにかかわらず本発明の阻害剤、本発明の方法、本発明の使用及び本発明のキットに適用可能である。方法マウスにおける気管内ブレオマイシン投与20~22gの間の体重の雄性マウスを全ての実験で使用した。動物をNIHガイドラインに従って飼育し、そして実験を地方自治体の許可を得て行った。動物をケタミン塩酸塩及びキシラジン塩酸塩の混合物の腹腔内注射により麻酔した。5U/体重kgの用量のブレオマイシンをエアロゾルとして投与した。ブレオマイシン送達のために、動物を経口気管内挿管し、そして機械的に換気した。マイクロ噴霧器microsprayerにブレオマイシンを含有する食塩水100μlを充填し、気管分岐部のわずかに上に位置づけられた気管カニューレに導入し、そしてエアロゾル生成を終末呼気end-expiratory呼吸停止下で急速にシリンジを空にすることにより達成した。コントロールマウスにはビヒクルのみを投与した。5mg/kgCTI及び8mg/kgPCK両方とも09食塩水で希釈をそれぞれ9、12、15及び18日目に用量で又はマウス体重のindosisorofmousebodyweight気管内投与した。マウスを文章中に示されていなければ適用の21日後に致死量のケタミン及びキシラジンを用いて屠殺した。肺コンプライアンス測定マウスを気管切開しtracheotomised、そして容積駆動volumedriven様式で呼気終末陽圧0kPaにて通気した。呼吸速度を20呼吸分1に設定し、そして通気圧を肺の膨張の間、一回換気量200μLで記録した。肺調製動物の屠殺後、開胸し、そして肺動脈中に配置したカテーテルを介して肺にPBS緩衝液を流した。流出液から血液が消えたら肺を取り出し、そしてさらなる検査のためにパラホルムアルデヒド又は窒素中に置いた。細胞単離のために肺をPBS緩衝液中に置いた。マウス及びヒトの肺線維芽細胞の単離及び細胞培養肺実質のヒト肺検体及びマウス肺を刻んで1mm3より小さい小片にした。刻んだ小片をPBSで2回洗浄し、次いで100mmの皿に置いた。検体を、10ウシ胎児血清、及び1ペニシリン/ストレプトマイシンを用いて5CO2の加湿雰囲気下で37°Cにて培養した。単離された線維芽細胞の純度をビメンチン、フィブロネクチン及びIV型コラーゲンに対するポジティブ染色により検証した。全ての実験を3~4の継代からの肺線維芽細胞を用いて行った。マウスNIH3T3線維芽細胞を、10FCS、及び1ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で5CO2の加湿雰囲気下で37°Cにて培養した。肺組織及び肺胞上皮II型細胞の顕微解剖肺の凍結検体をクリオスタットで10μmの薄片にし、非コーティング薄ガラススライド上に載せ、そしてヘマランhaemalaunで45秒間染色した。次いでこれらの切片を70及び96エタノールに使用するまで浸した。貯蔵期間を制限するために、一度に10より多くの切片は調製しなかった。肺検体の選択された領域を視覚制御下でレーザー顕微解剖した。組織をシリンジニードルで採取して、10μlフィストストランドfiststrand緩衝液を入れた反応チューブ中に移した。サンプルを液体窒素中で凍結させ、そしてさらなる調製のために貯蔵した。肺胞II型細胞顕微解剖のために、クリオスタット切片をポリ-L-リジン被覆スライド上に載せてアセトン中で5分間保存した。proSP-C染色のために、ポリクローナルウサギ抗bpro-SP-C抗体を塗布し、続いてFITC-標識ヤギ抗ウサギIgGと共にインキュベートした。貯蔵期間を制限するために、一度に2つより多くの切片を調製しなかった。肺胞II型細胞をそれらの染色パターンに従って選択し、そして視覚制御下でレーザー顕微解剖した。50の細胞輪郭を含むサンプルをそれぞれ液体窒素中で即座に凍結させ、そしてさらなる調製のために貯蔵した。RNA単離及び逆転写酵素反応全RNAをPeqGOLDTotalRNAキットを使用して製造者の指示書に従って抽出した。肺ホモジネート、顕微解剖した肺検体、単離された線維芽細胞又は顕微解剖したATII細胞からそれぞれ得られたRNA1gを4μl5xファーストストランド緩衝液、2μldNTP、1μlランダムヘキサマー、1μlDDT、1μlRnase阻害剤及び1μlMuLV逆転写酵素を含有する、Rnaseを含まない水中の反応において使用した。反応混合物を43°Cで1時間インキュベートし、次いで94°Cで2分間インキュベートした。リアルタイムPCRリアルタイムPCRをSequenceDetectionSystem7700により行った。PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDGを用いてcDNA2mlを使用して反応を行った。β-アクチン遺伝子を参照遺伝子として使用した。サイクリング条件は95°C6分間、続いて95°C20秒、55°C30秒、そして73°C30秒を45サイクルであった。融解曲線分析及びゲル電気泳動を行って期待されるPCR産物だけの増幅を確認した。既に記載されたように2-ΔΔCT法を使用して遺伝子発現を評価した。内因系コントロールβ-アクチンと比較して標的遺伝子が何倍変化したかfoldchangeを、等式何倍変化したか=2-ΔΔCT、ここで-ΔΔCT=処理された-コントロール]を使用することにより決定した。プライマー配列を表2に列挙する。タンパク質単離及び定量採取した細胞及び凍結肺検体を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するRIPA緩衝液中で溶解した。溶解産物を氷上で30分間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を新しいチューブに入れて-80°Cで保存した。BCATMタンパク質アッセイキットを使用して製造者の指示書にしたがってタンパク質の定量を行った。標準として様々なウシ血清アルブミン濃度を使用した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動タンパク質サンプルを5xSDS-ローディングバッファSDS、50グリセロール、10β-メルカプトエタノールと混合し、10分間煮沸し、SDSアクリルアミドゲルSDS、01APS、01:10アクリルアミド:ビスアクリルアミド、375mMTris-HClpH88、01SDS、01APS、01にロードし、そしてSDS-ランニングバッファSDSで100Vで実行した。免疫ブロットSDSポリアクリルアミドゲル上で分離されたタンパク質を、転写バッファ中で湿式転写技術を使用してPVDF膜に1時間100Vで転写した。01を含有するtris緩衝化食塩水中5脱脂粉乳を用いてブロッキングした後、膜を4°Cで終夜、TBS-T中1BSAで希釈した適切な一次抗体とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識二次抗体と共に1時間インキュベートした後、タンパク質をECLPlusキットを使用して検出した。ゲルにロードされたタンパク質の量を決定するために、ブロットを1時間にし、そして抗β-アクチン抗体又は適切な抗pan抗体を使用して再検出した。免疫細胞化学免疫細胞化学的分析のために、HLFを4パラホルムアルデヒドを用いて10分間固定し、リン酸緩衝化食塩水中02TritonX-100を用いて10分間透過処理し、PBS中3BSAで1時間室温にてブロッキングし、そして以下の抗体のうちの1つと共に終夜4°Cでインキュベートした:マウス抗FXII、ウサギ抗IV型コラーゲン、マウス抗フィブロネクチン、ヤギ抗ビメンチン、及びウサギ抗ホスホ-Smad3。スライドをローダミン結合二次抗体と共にインキュベートし、そしてVectashield封入剤を用いて封入した。核を4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール染色により可視化した。一次抗体を非特異的抗体で置き換えることによりコントロールとした。画像を40×/125-075油浸対物レンズoil-objectiveを備えたLeicaDMR顕微鏡により室温で捕捉し、そしてMetaMorph70を使用して撮影した。例示した全ての画像は、少なくとも3つの独立した切片で見られた、1切片につき少なくとも4つの他の領域の代表である。免疫組織化学パラフィン包埋ホルマリン固定肺組織を5ミクロンの切片にし、そして適切な一次抗体及びZytoChemPlusAP-FastRedキットを製造者の指示書にしたがって使用して免疫組織化学染色のために処理した。ネガティブコントロールを、全ての場合において一次抗体を含めないことによって得た。増殖アッセイ初代マウス肺線維芽細胞を48ウェルプレートに播種し、そしてFXIIa刺激の前に24時間、無血清DMEMで飢餓状態にした。いくつかの実験において、細胞を5μg/ml抗uPAR、抗β1-インテグリン又は抗α5-インテグリンブロッキング抗体と共に、FXIIaに曝露する前に1~2時間プレインキュベートした。さらにいくつかの実験において、100μMPD98059、5μMSP600125、07μMウォルトマニン、3μMSB203580を、FXIIaを加える1~2時間前に細胞培養培地に加えた。細胞を3~9μg/mlFXIIaのみで、又はその特異的阻害剤:トウモロコシトリプシンインヒビター、H-D-Pro-Phe-Arg-クロロメチルケトン又はuPAR合成ペプチドの存在下で処理した。24~36時間後に細胞を3Hチミジンに6~12時間曝露し、PBSで3回すすぎ、そして02ml05M水酸化ナトリウムを用いて可溶化した。可溶化した物質01mlを液体シンチレーション測定1500、ACanberaCompany、Meriden、CTにより定量した。3Hチミジン取り込みを絶対放射能として表した。免疫沈降初代マウス線維芽細胞を、刺激しないか、又は6μg/mlFXIIaで30分間刺激し、そして20mMHEPESpH=75、10mMEGTA、40mMβ-グリセロホスフェート、1TritonX-100、25mMMgCl2、1mMDTT、2mMPMSF、20μg/mlアプロチニン、20μg/mlロイペプチン、2mMバナジン酸ナトリウムを含有する緩衝液中で溶解した。37°Cで30分インキュベートした後、不溶性物質を10000rpmで4°Cにて10分間の遠心分離によりペレット化した。細胞溶解物100μlをさらに終夜4°Cでヤギ抗uPAR抗体5μgと共に、又はヤギIgGコントロール抗体と共にインキュベートした。次にG-セファロース100μlを加え、そして免疫複合体を1時間4°Cで結合させた。次に、ビーズを溶解緩衝液で4回洗浄し、そして吸着物質を2xSDSローディングバッファで溶出した。煮沸した後、uPAR結合タンパク質をウェスタンブロットによりマウス抗FXII抗体を使用して分析した。FXIIプロモーター構築物の生成及び部位特異的変異誘発ヒトFXIIプロモーターフラグメントをPCRによりヒト肺DNAからロングPCR酵素ミックスを使用して製造者の指示書にしたがって増幅した。サイクリング条件は:95°C5分間、続いて95°Cで30秒間、55°Cで30秒間、そして72°Cで3分間を35サイクルであった。以下のプライマーを使用した:PCRフラグメントをpGL3エンハンサーベクターにXhoI及びHindIII制限部位を使用してクローン化した。点変異をpGL3-299構築物中のCAGAboxにQuikChange部位特異的変異誘発キットを使用して製造者の指示書に従って導入した。以下のプライマーを使用した:成功したクローン化及び変異のCAGAboxへの挿入を配列決定により確認した。一過性形質転換及びルシフェラーゼアッセイNIH3T3細胞を示されたプラスミドを用いてFuGene6を使用して製造者の指示書に従ってトランスフェクトした。48時間後に、細胞を刺激しないか又は10ng/mlTGF-β1を用いてさらに24時間刺激した。その後、細胞を採取し、そしてルシフェラーゼレポーター活性についてPromegaルシフェラーゼアッセイキットを使用して製造者の指示書に従ってアッセイした。pEGF-N1コントロールベクターを用いた同時トランスフェクションを使用してトランスフェクション効率について正規化した。アンチセンスオリゴヌクレオチドヒトSmad3、ヒトJNK1に特異的な予め設計された市販のsiRNA配列、及び万能universalネガティブコントロールsiRNAを使用した。細胞をsiRNAでX-tremeGenesiRNAトランスフェクション試薬を使用して処理した。標的遺伝子のsiRNA媒介下方調節をトランスフェクションの72時間後にウェスタンブロットにより評価した。この時点で細胞を刺激しないか又は10ng/mlTGF-β1で24時間刺激し、そしてFXIIについてのウェスタンブロットを上記のように作製した。クロマチン免疫沈降Milliporeからのクロマチン免疫沈降アッセイキットを使用して製造者の指示書に従ってChIPを行った。簡単には、刺激されていないか又は10ng/mlTGF-β1で刺激されたNIH3T3細胞を1ホルムアミドで10分間処理した。次いで架橋したクロマチンを製造し、そして平均サイズ500~800bpまで超音波処理した。DNAフラグメントをウサギ抗Smad3抗体又はIgGアイソタイプコントロールを用いて終夜4°Cで免疫沈降させた。架橋から回復させた後、免疫沈降したクロマチンを以下のプライマーを使用するPCRにより増幅した:ヒトFXII-299bp順方向:5-CTTAACCTCCTGATCTCC-3配列番号25;ヒトFXII-299bp逆方向:5-CGTTGGTCCAGCTGCCTATC-3配列番号26。PCR産物を2アガロースゲルで分離し、そして臭化エチジウム染色により可視化した。ストレプトアビジンプルダウンアッセイ二本鎖ビオチン化DNAフラグメントSBE-283/-258:又はSBE-283/-258C/T:に及ぶSBEをタンパク質相互作用について核抽出物20μg、20pmol/μlのビオチン化テンプレート、及びポリ1μgを含有する結合反応系100mlにおいてアッセイした。1時間30°Cでインキュベートした後、結合緩衝液、80mMKCl、10mMMgCl2、10中で予め平衡化したストレプトアビジンMagneSphere常磁性粒子を反応系に加え、そしてさらに1時間30°Cでインキュベートした。DNA-タンパク質複合体を洗浄緩衝液、50mMKCl、625mMMgCl2、05mMEDTA、2mMDTT、及び85で磁気デバイス-E、磁気粒子濃縮装置を使用して3回洗浄した。煮沸後に、DNA結合タンパク質をウェスタンブロットによりウサギ抗ホスホSmad3抗体を使用して分析した。核抽出物を核及び細胞質抽出試薬を使用して製造者の指示書に従って調製した。統計そうではないと記載されていなければデータは平均値±SDとして示される。正規分布をシャピロ-ウィルク検定により分析した。2つの集団間の統計的比較を独立スチューデントt検定を使用して行った。複数のグループ間の差を一元配置分散分析法One-wayANOVA、続いてチューキー事後検定又はクラスカル-ワリス、続いてダンの事後検定Dunnsposttestにより比較した。p<005のレベルを統計的に有意であるとみなした。生存曲線間の統計的有意性をログランク検定により評価した。結果FXII、FXI及びHMWKの発現は、特発性肺線維症肺において変更される。特発性肺線維症の病理発生における内因系凝固経路構成要素の潜在的役割を明らかにするために、IPF患者及びドナー由来の肺組織におけるFXII、FXII及びHMWKの発現を定量的リアルタイムRT-PCRを使用して分析した。図1Aに示されるように、FXII及びHMWKmRNAレベルはIPF肺検体において顕著に上方調節された。内因系凝固経路構成要素の細胞特異的発現を、初代ヒト肺胞上皮細胞II型並びにIPF患者及びドナーの肺由来の線維芽細胞において定量した。IPF肺組織から単離された肺線維芽細胞は、FXIImRNAをドナー肺由来の細胞よりも高いレベルで発現した。FXIImRNAはATII細胞において検出されなかった。IPF患者の肺由来のATII細胞及び肺線維芽細胞におけるFXI及びHMWK発現は、ドナーサンプルと比較して変化しなかった。さらに、IPF組織の線維性領域及び健康な領域から顕微解剖されたmicrodesected肺胞間中隔alveolarseptaeにおけるFXII、FXI及びHMWKの発現を分析した。IPF肺由来の健康な領域におけるFXII、FXI及びHMWKのmRNAレベルはドナー組織と比較して変化しなかった。対照的に、IPF肺の線維性領域におけるFXII、FXI及びHMWK遺伝子の有意な上方調節があった。mRNA発現と一致して、FXII及びHMWKのタンパク質レベルはIPF肺において上方調節された。IPF肺におけるFXIタンパク質の発現は変化しなかった。FXII発色性基質を使用した活性アッセイは、IPF患者由来の気管支肺胞broncholaveolar洗浄液における増加した酵素活性FXIIを示した。行われたアッセイの特異性は、その阻害剤であるトウモロコシトリプシンインヒビターによるFXII活性の遮断により証明された。FXII、FXI及びHMWKの免疫組織化学染色を、ドナー及びIPF肺におけるこれらの因子の局在化を特徴付けるために行った。図3に示されるように、全ての内因系凝固因子の発現は、ドナー組織と比較してIPF切片において顕著に増加していた。FXIIの最も強い免疫反応性は、線維芽細胞において、及びATII細胞の表面上で観察された。FXIは主にATII細胞及び線維芽細胞において発現されたが、HMWKは単球に大部分存在していた。ブレオマイシン肺においてFXII、FXI及びHMWKの発現は高くなる。IPF肺における知見が肺線維症の動物モデルに変換可能であるか否かを決定するために、FXII、FXI及びHMWKの発現をブレオマイシンチャレンジマウスの肺において定量した。RT-PCRは、ブレオマイシン処理マウスからの肺ホモジネートにおいてブレオマイシン点滴注入後4日目及び20日目でのFXII、FXI及びHMWKの上方調節を明らかにした。興味深いことに、FXIImRNAは初代マウス肺線維芽細胞及びATII細胞において検出されなかった。ブレオマイシン肺由来のATII細胞におけるFXI発現は変化しなかったが、肺線維芽細胞におけるその発現はブレオマイシン投与後12日目に上方調節された。ブレオマイシン適用後20日目に肺線維芽細胞におけるHMWKmRNAの有意な上方調節があったが、HMWK発現の変化はATII細胞において観察されなかった。IPF組織検体からの知見と比較して、免疫ブロットは、ブレオマイシン適用後4日目及び20日目に肺ホモジネートにおけるFXII、FXI及びHMWKタンパク質レベルの同様な上方調節を示した図5。免疫学的局在決定研究により、食塩水で処理したマウスの肺において観察された弱いシグナルと比較して、ブレオマイシン損傷肺におけるFXII、FXI及びHMWKの強い発現を確認した。正常コントロール肺における弱いFXII、FXI及びHMWK染色は、主に肺胞マクロファージにおいて観察された。ブレオマイシン適用後、FXII、FXI及びHMWKの強い免疫反応性は、線維性領域及び肺胞マクロファージにおいて明白であった。FXIIノックアウト又は阻害は、ブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護する。肺線維症におけるFXIIの役割を決定するために、FXII欠損マウスをブレオマイシンでチャレンジした。ヘマトキシリン及びエオシン染色により明らかにされたように、21日目に、ブレオマイシンで処理された野生型動物は、正常な肺構造のゆがみ、増加した間質壁厚、及び線維芽細胞数の増加を特徴とする顕著な肺線維症を示した。対照的に、FXII欠損マウスは、肺における顕著に減少した線維性変化を有していた。マッソントリクローム染色を行って、ブレオマイシンチャレンジ後の肺コラーゲン沈着における異常性を評価した。コラーゲンの蓄積は、FXII--マウスと比較してWT動物においてより顕著であった。最終的に、FXII--マウスの死亡率はWTマウスと比較して有意に低かった。ブレオマイシンチャレンジ後21日目に、WTマウスの死亡率は40であったが、FXII--の死亡率は5であった。フィブリン沈着におけるいずれかの変化がブレオマイシン適用後にWTマウス及びFXII--マウスにおいて生じるかどうかを決定するために、肺切片を抗フィブリン抗体を用いて染色した。ブレオマイシンを投与されたWT動物は、線維性領域において極度のフィブリン沈着を示した。フィブリン染色が線維症の領域のすぐ近傍、及び線維症の領域における肺胞腔において観察された。同様のパターンがブレオマイシンでチャレンジされたFXII--マウスの肺において明白であった。ブレオマイシン誘導肺損傷に対するFXII阻害の可能な治療効果を評価するために、食塩水コントロールマウス及びブレオマイシンチャレンジマウスに特異的FXII活性阻害剤であるトウモロコシトリプシンインヒビターを投与した。食塩水又はCTIを用量5mg/体重で9、12、15及び18日目に気管内投与した。21日目にマウスを屠殺し、肺コンプライアンスを測定し、そして肺組織検体を集めた。食塩水を投与されたブレオマイシン処理マウスは、正常構造の損失及び広範なコラーゲン沈着を伴う重篤な線維性変化を示した。コンプライアンスの強い減少は、広範な線維症の発症を反映していた。対照的に、CTIを投与されたブレオマイシン処理マウスの肺における組織学的知見は、より少ない線維性病変を示した。マッソン-トリクローム染色により評価したコラーゲン蓄積は、FXII阻害剤で処理した動物において顕著に減少していた。さらに、CTI処理動物のコンプライアンスは有意に改善された。ブレオマイシンチャレンジの21日後に、食塩水処理マウスの死亡率は80であったが、一方CTIを投与された動物の死亡率は20であった。CTIを投与されたコントロール動物は肺において組織学的変化を有していなかったが、それらは気腔中への炎症細胞の軽度の浸潤を示した。CTIのこの副作用はその治療適用を制限するかもしれない。ブラジキニン受容体1/2ノックアウトマウスはブレオマイシン誘導肺線維症に対して保護されない。FXIIaは血漿プレカリクレインの強力な活性化因子である。活性化されたカリクレインはさらにHMWKをHKa及びブラジキニンに切断し、これが2つのGタンパク質共役受容体:B1及びB2を介して血管拡張剤及び炎症促進性ペプチドとして作用する。FXII誘導ブラジキニン送達が肺線維症の発症に寄与するかどうかを決定するために、ブラジキニン1及び2受容体欠損マウスをブレオマイシンでチャレンジした。ブレオマイシン適用の21日後に、WT及びB1B2--動物の両方が、HE染色及びマッソン-トリクローム染色によりそれぞれ証明されるように、肺における強い線維性変化及びコラーゲン蓄積を生じた。ブレオマイシン投与後のWTマウスと比較して、肺コンプライアンス及び生存の改善はB1B2-/-において見られなかった。FXIIは肺線維芽細胞の増殖を刺激する。FXIIは、ヒトヘパトーム細胞、平滑筋細胞、II型肺胞細胞及び内皮細胞に対してマイトジェンとして作用することが報告されている。集中的な線維芽細胞増殖が肺線維症の特徴であることを考慮して、FXIIが肺線維芽細胞増殖も制御し得るかどうかを確認することは興味が持たれる。この問いに答えるために、マウス肺線維芽細胞を増加する濃度のFXIIaで刺激し、そして3H-チミジン取り込みを測定した。DNA合成の用量依存性増加がFXIIa処理の後に観察された。FXII誘導増殖はFXIIa特異的阻害剤であるCTIにより遮断された。さらに、FXIIaへの曝露後の増加したサイクリンD発現により、マウス肺線維芽細胞に対するFXIIaマイトジェン活性が確認された。マウス肺線維芽細胞のFXIIa誘導増殖に対する様々なシグナル伝達経路の寄与を調べるために、FXIIa刺激に応じたMAPKs及びAktリン酸化動力学を分析した。p38、p44/42及びAkt活性における顕著な増加が15分後に見られたが、一方JNK及びc-junのリン酸化は観察されなかった。FXIIa曝露の30分後に、CTIはp44/42及びAktリン酸化を減弱させた。リン酸化動力学の決定の後、次にこれらの経路の妨害がマウス肺線維芽細胞のFXII誘導増殖に影響を及ぼすかどうかを分析した。この問題を評価するために、JNK、PI3K、MEK及びp38キナーゼの特異的阻害剤を使用し、そしてFXIIaマイトジェン活性に対するそれらの効果を評価した。図12A、Bに示されるように、PD98059によるMEK活性の阻害は、FXIIaに応じたマウス肺線維芽細胞増殖の減少をもたらした。DNA合成における変化は、細胞をPI3K、JNK、及びp38キナーゼの阻害剤で前処理した場合に見られなかった。FXIIは、gC1qR、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体及びサイトケラチン1との複合で内皮細胞表面に結合すると報告された。さらに、uPARがFXII融合内皮細胞増殖に関与しているということを示す研究がある。uPARがマウス肺線維芽細胞に対するFXIIaマイトジェン活性を媒介するかどうかを調べるために、FXIIa刺激の前に細胞を抗uPARブロッキング抗体で細胞を処理した。3H-チミジン取り込みにより測定された細胞増殖は、抗uPAR抗体により遮断された。さらに、uPARのドメイン2に対応するペプチドを使用した実験により、FXIIaマイトジェン活性に関するこの受容体の重要性が確認され、そしてuPAR上の潜在的なFXII結合部位が明らかとなった。uPARのドメイン2からのペプチドLRG20は、FXIIa刺激後のDNA合成の増加を遮断した。相対的に、ドメイン2由来のペプチドTCK及びランダムなペプチドはFXIIa誘導増殖に対して効果を有していなかった。前の知見を確認するために、本発明者らは、uPAR欠損マウスからマウス肺線維芽細胞を単離し、そしてそれらをFXIIaに曝露した。野生型細胞と対照的に、uPAR欠損肺線維芽細胞はFXIIaに応答しなかった。これらのデータは、uPARがFXIIaマイトジェン活性に必要であるということを示した。この観察から、uPARがFXIIaタンパク質と相互作用するかどうかという疑問が生じた。この問題を調べるために、免疫沈降アッセイを行った。免疫沈降のために、刺激されていないか又はFXIIaで30分間刺激された細胞から溶解物を調製した。抗uPAR抗体を使用して、FXIIをFXIIaに曝露した細胞の溶解物から免疫沈降させた。uPARはアイソタイプコントロール抗体と共に免疫沈降しなかった。これらを元に、これらの結果はuPAR依存性の様式でFXIIがマウス肺線維芽細胞増殖を誘導するということを実証した。uPARはキナーゼ活性を有しておらず、そして細胞内経路と直接的に相互作用しないという事実に基づいて、他のタンパク質がこの機構に関与しているか否かという疑問が生じた。膜貫通構造のないグリコシルホスファチジルイノシトール固定uPARがどのようにシグナル伝達を媒介するのかということが不明である。uPARは、結合したタンパク質としてのインテグリンとのcis-相互作用を形成し、そしてそれにより、そのリガンドであるウロキナーゼが結合すると細胞に増殖シグナル又は遊走シグナルを伝達すると提案されている。共鳴エネルギー移動顕微鏡観察法及び精製された組み換えタンパク質との同時免疫沈降co-immunoprecipitationを使用した研究は、uPARがβ1-インテグリン及びβ2-インテグリンのサブセットと複合体を形成し、そしてこれらの分子のシグナル伝達能を調節するということを示した。これらの報告、及びFXIIa刺激後にフィブロネクチンに対する線維芽細胞の増加した接着を示した本発明者ら自身の研究に基づいて、フィブロネクチン受容体α5β1インテグリンがFXIIマイトジェン活性に影響を及ぼすかどうかを調べた。α5又はβ1インテグリンブロッキング抗体を用いた肺線維芽細胞の前処理は、FXIIに対する曝露後の3H-チミジン取り込みを消失させたが、IgGコントロール抗体は効果を有していなかった。この観察は、α5β1インテグリンがFXIIa誘導マウス肺線維芽細胞増殖に関与しているということを示唆した。TGF-β1はヒト肺線維芽細胞においてFXII発現を調節する。TGF-β1はHLFにおいてFXIImRNA及びタンパク質レベルを上方調節する。HLFの10ng/mlTGF-β1への曝露は、時間依存性の様式でFXIIの合成を刺激した。リアルタイムRT-PCR分析は、処置の4時間後にFXIImRNA発現の最も強い誘導を実証した。最大FXIIタンパク質レベルは、48時間の刺激時間内に達成され、72時間を過ぎてわずかに減少した。免疫蛍光染色により、TGF-β1に応じたFXIIの顕著な発現が明らかとなった。FXIIを細胞表面、さらにはHLFの細胞質画分で検出した。単離されたHLFの純度を、フィブロネクチン、ビメンチン、及びIV型コラーゲンについてのポジティブ染色により確認した。TGF-β1はMAPK、Akt及びSmad3のリン酸化を誘導する。HLFにおけるTGF-β1誘導FXII産生への様々なシグナル伝達経路の寄与を細かく調べるために、TGF-β1刺激に応じたMAPKs、Akt、及びSmadのリン酸化動力学を分析した。p42/44及びp38キナーゼのリン酸化は60分にピークに達し、次いで徐々に減少した。JNK活性の顕著な増加が60分後に見られたが、一方でAktの増強されたリン酸化は120分後に確認された。期待されたように、TGF-β1は30~60分以内の最大応答を伴うSmad3の急速なリン酸化を誘導した。c-junの活性化は検出できなかった。免疫蛍光分析により、ホスホ-Smad3の核へのTGF-β1誘導移行が実証された。従って、増加したレベルのホスホ-Smad3がTGF-β1処理後の核抽出物において観察された。ラミンB及びチューブリンをローディングコントロールとして使用して核画分の純度を評価した。Smad3及びJNKキナーゼはHLFにおけるTGF-β1誘導FXII発現を調節する。リン酸化動力学を決定した後、次に本発明者らは、これらの経路への干渉がHLFにおけるTGF-β1誘導FXII発現に影響を与えるか否かを分析しようとした。これを特徴付けるために、TβRI、JNK、PI3K、MEK及びp38キナーゼの特異的阻害剤を使用し、そしてFXIIのTGF-β1刺激発現に対するそれらの効果を評価した。図18A、Bに示すように、それぞれSB431542及びSP600125によるTβRI及びJNK活性の阻害は、TGF-β1に応じたFXII発現の減少をもたらした。HLFをAkt、p44/42、及びp38キナーゼの阻害剤で前処理した場合はFXIIの発現の変化は見られなかった。これらの結果をさらに確認するために、HLFをJNK1特異的又はSmad3特異的siRNAでトランスフェクトし、これらはウェスタンブロットにより実証されたように、これらのタンパク質の有意なノックダウンを生じた。図18D及びEに示されるように、JNK1のノックダウンはTGF-β1刺激後のFXII発現の阻害を生じた。Smad3を枯渇させた場合に同様の結果が得られた。JNKキナーゼは、Smad3のリン酸化及び核への移行を調節しない。次の実験において、Smad3のリン酸化及び核への移行におけるJNKキナーゼの役割を調べた。HLFをJNK阻害剤と共にインキュベートしてもSmad3リン酸化は減少しなかったが、JNK活性は完全に消滅した。TβRI阻害剤はTGF-β1に応じたSmad3及びJNK1のリン酸化を減弱させ、このことはSmad3及びJNKのリン酸化がTGF-β1シグナル伝達経路における最も近位の分子であるTβRIから始まることを示唆している。さらに、HLFのSP600125への曝露は、TGF-β1誘導Smad3核移行に対して効果を有していなかったが、一方でSB431542はこのプロセスを完全に遮断する。同様の結果が免疫蛍光分析により得られた。SB431542及びSP600125は単独で核におけるSmad3の蓄積に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、JNKキナーゼが、Smad3のリン酸化及び核への移行に対するいずれの効果も存在しない場合にTGF-β1誘導FXII発現を調節することができるということを示す。TGF-β1は、-272位に位置するSBEを介してFXIIプロモーター活性を誘導する。TGF-β1誘導FXII産生に必要なDNAエレメントを同定するために、一連のヒトFXIIプロモーター欠失構築物を用いてNIH3T3細胞を一過性トランスフェクトし、次いで未処理の細胞及びTGF-β1処理細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。それらの高いトランスフェクション効率のためにNIH3T3細胞をこれらの研究で使用した。pGL3-1630;pGL3-907;及びpGL3-577構築物でトランスフェクトされた細胞は、TGF-β1に応じたルシフェラーゼ活性の増加を示さなかったが、一方でFXIIプロモーター活性の強い誘導がpGL3-299でトランスフェクトした細胞において観察された。これらの結果は、ヒトFXIIプロモーターにおける-299/1bp内のTGF-β1応答エレメントの存在を示した。さらに、データは、-299bpの上流の領域に位置する抑制エレメントがTGF-β1の刺激作用を弱め得るということを示唆した。-299/1bp間にあるFXIIプロモーターのTGF-β1応答エレメントを同定するために、このDNA領域をコンセンサスsmad結合エレメントに付いて調べた。この分析により、-272bpの位置での推定SBEが同定された。期待されたように、SBE-272の点変異は、TGF-β1に応じたFXIIプロモーター活性を完全に消滅させた。これらの結果を確認するために、SBE-272を欠いた構築物を生成した。-299と-183との間の配列の欠失は、FXIIプロモーターがTGF-β1に対する応答性をもたらす能力を抑制した。同様の結果が、初代HLFを使用した場合に観察された。次に、FXII発現の調節におけるJNK/Smad3シグナル伝達経路の役割を、遺伝子ルシフェラーゼ活性アッセイにより試験した。細胞をpGL3-299構築物でトランスフェクトし、示された阻害剤で前処理し、次いで刺激しないか、又は10ng/mlTGF-β1で刺激した。図21Cに示されるように、TGF-β1駆動ルシフェラーゼ活性は、SB431542及びSP600125阻害剤の存在下でのみ強く減少した。Smad3はFXIIプロモーター内のSBE-272と相互作用する。Smad3のSBE-272との相互作用を調べるために、ChIP及びストレプトアビジンプルダウンアッセイを行った。ChIPアッセイは、SBE-272に隣接するFXIIプロモーター領域とのSmad3のTGF-β1誘導相互作用を明らかに実証した。Smad3のSBE-272への結合をさらに分析するために、FXIIの-283及び-258bp領域にわたるビオチン化テンプレートを使用してストレプトアビジンプルダウンを行った。期待されたように、Smad3はこのテンプレートから溶出されたが、SBE-272を変異させた場合は相互作用が起こらなかった。これらの知見は、Smad3-SBE-272がTGF-β1を用いたHLFの刺激後に複合体を形成するということを示した。JNKキナーゼはSmad3のSBE-272への結合に影響を及ぼす。JNKキナーゼの阻害はリン酸化及びSmad3の核への移行に対して影響を有していなかったので、このキナーゼのSmad3-SBE-272複合体の形成への関与をChIP及びストレプトアビジンプルダウンアッセイにより調べた。TβRI阻害剤又はJNK1阻害剤で前処理したHLFを、刺激しないか又はTGF-β1で刺激し、溶解し、そして抗Smad3抗体及びIgGアイソタイプisotypコントロールを使用してChIPアッセイを行った。TGF-β1はSmad3-DNA複合体形成を誘導した。この相互作用はSB431542を使用した場合に完全に消滅し、そしてSP600125の存在下では劇的に減少した。SB431542及びSP600125は単独ではSmad3とDNAとの相互作用に影響を及ぼさなかった。ストレプトアビジンプルダウンアッセイを行った場合に同様の結果が得られた。"