"ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞の存在を測定する結合検定法であって、前記ヒト腫瘍由来の組織試料を生体外において提供するステップと、PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマにより産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、抗悪性腫瘍薬シスプラチンを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗悪性腫瘍薬シスプラチンの組合せを前記組織試料と接触させるステップと、ならびに、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を有し、それにより前記組織試料中での前記癌細胞の存在を示す、ことを特徴とする結合検定法。前記ヒト腫瘍組織試料が、前立腺に由来する腫瘍から得たものである、ことを特徴とする請求項1に記載の結合検定法。ヒト腫瘍から選択された組織試料中の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍由来のヒト試料を生体外で提供するステップと、PTA-4621としてATCCに寄託されたハイブリドーマにより産生される、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、抗悪性腫瘍薬シスプラチンを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗悪性腫瘍薬シスプラチンの組合せを前記組織試料と接触させるステップと、ならびに、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を有し、それにより前記癌細胞が前記結合によって単離され、前記組織中での前記癌細胞の存在が確認される、ことを特徴とする方法。前記ヒト腫瘍組織試料が、前立腺に由来する腫瘍から得たものである、ことを特徴とする請求項3に記載の方法。ハイブリドーマ細胞株H460-16-2は、ブダペスト条約に従って、寄託番号PTA-4621として2003年11月11日付で米国菌培養収集所AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209に寄託された。37CFR1.808に従って、この寄託者は、寄託された材料の公衆に対する利用可能性に課された全ての制限が特許付与によって変更不能に取り除かれることを保証する。抗体産生:H460-16-2モノクローナル抗体の産生を、週に2回回収および再播種しながらハイブリドーマをCL-1000フラスコBDBiosciences,Oakville,ONで培養することによって、おこなった。この抗体を、プロテインGセファローズ4ファストフローProteinGSepharose4FastFlowAmershamBiosciences,Baied’Urfe,QCによる標準的な抗体精製法に従って、精製した。ヒト、ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、この発明の範囲内である。正常ヒト組織染色IHC研究が既にヒトのH460-16-2抗原分布を特徴づけるためにおこなわれておりS.N.10/603,00、またL178と比較されているS.N.10/647,818。したがって、本研究は、このH460-16-2抗原は、生化学的方法で既に決定されたCD44の癌変異体であると考えられることから、H460-16-2を、CD44BU75に対して向けられた別の抗体と比較することである。ヒト正常器官組織アレイImgenex,SanDiego,CAを用いて、59個の正常ヒト組織に対する抗体の結合をおこなった。全ての一次抗体H460-16-2;BU75抗CD44BIOCANScientificInc.,Mississauga,ON;およびマウスIgG1陰性対照Dako,Toronto,ONを抗体希釈緩衝液Dako,Toronto,ONで5μg/mlの濃度以前の最適化ステップで最適濃度であることがわかったに希釈した。陰性対照抗体は、製造元によって全てのほ乳類組織に対して陰性であることがわかっている。IHCに関する方法は、以下の通りである。組織切片をオーブンで58°C、1時間加熱することで、脱パラフィン化し、コプリンCoplinジャー内でキシレンに5回各々4分浸すことで、脱ろうした。一連の段階エタノール洗浄100~75で処理した後、切片を水で再水和した。スライドを10mMクエン酸緩衝液pH6Dako,Toronto,Ontarioに浸し、続いて、電子レンジ高、中、および低電力レベルにそれぞれ5分間設定にかけ、最後に冷PBSに浸した。次に、スライドを3パーセントの過酸化水素水に6分間浸し、PBSで3回各々5分間洗い、乾燥させ、室温で5分間、ユニバーサルUniversalブロッキング溶液Dako,Toronto,Ontarioとともにインキュベートした。H460-16-2、BU75、またはイソタイプ対照抗体黒色アスペルギルスAspergillusnigerグルコースオキシダーゼほ乳類組織に存在せず、また該組織で誘導することはできない酵素に対する抗体を、その作用濃度各抗体に対して5μg/mlまで、抗体希釈緩衝液Dako,Toronto,Ontarioに希釈して、室温で1時間にわたってインキュベートした。スライドをPBSで5分間、それぞれ洗った。一次抗体の免疫活性を、供給元DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontarioの指示通りに30分間、室温でHRP結合二次抗体によって、検出/視覚化した。このステップの後、スライドをPBSで各々、5分間、3回にわたって洗浄し、室温で10分間、免疫ペルオキシダーゼ染色用のDAB3,3‘-ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Dako,Toronto,Ontario発色基質を添加することで、呈色反応を生じさせた。スライドを水道水で洗うことで、呈色反応を停止させた。マイヤーのヘマトキリシンMeyer’sHematoxlinSigmaDiagnostics,Oakville,ONを用いて対比染色した後、スライドを段階的なエタノール75~100によって脱水し、キシレンによって透徹させた。封入剤DakoFaramount,Toronto,Ontarioを用いて、スライドにカバースリップを載せた。スライドの顕微鏡検査をアキソバートAxisovert200ZeissCanada,Toronto,ONを用いておこない、このスライドをノーザンイクリプスイメージングソフトウェアNorthernEclipseImagingSoftwareMississauga,ONを用いて保存した。結果の読み取り、記録、および解析は、病理学者がおこなった。表1は、一連の正常ヒト組織をH460-16-2およびBU75抗CD44染色した結果をまとめたものである。H460-16-2による組織染色は、以前に記述したものS.N.10/603,000に類似している。ここで再び言及しておくべきことは、この抗原が通常は肝臓、腎臓、および肺等の重要器官の細胞に存在しないことである。H460-16-2抗体は、マクロファージおよびリンパ球に結合し、それらの存在は切片状のいくつかの器官で観察される。しかし、BU75抗CD44抗体によってリンパ球がより強く染色されていた図1。H460-16-2に対して陽性であった組織もまた、通常、BU75抗CD44に対して陽性であったしばしば、強度がより高い。H460-16-2に対して陰性であった組織もまた、BU75抗CD44に対し、食道およびリンパ節の一試料等のいくつかの例外はあるが、概して陰性であった。これらの結果は、H460-16-2が、BU75およびCD44抗体によって認識されるより小さな群の組織に結合し、組織内での染色強度もまた、しばしばより低くなる。これらの結果は、H460-16-2の抗原は、正常組織では広範に発現されるものではなく、その上、この抗体は限られた数のヒト組織に特異的である。また、H460-16-2はCD44のエピトープに特異的であり、これはこれらのIHC研究で使用されるBU75によって認識されるものとは異なる変異体である。ヒト乳癌腫瘍組織染色以前のIHC研究は、H460-16-2抗体がヒト癌を認識する可能性があったかどうかについてH460-16-2抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定するためにS.N.10/603,000、またそれがどのようにして抗CD44染色とL178とを比較するかS。N.10/647,818についておこなわれた。現在のところ、比較は、BU75抗CD44染色、c-erbB-2抗Her2、および黒色アスペルギルスAspergillusnigerグルコースオキシダーゼに特異的な抗体ほ乳類組織に存在も誘導もされない酵素負の対照についておこなった。50人の乳癌患者に由来する一群の乳癌組織と、乳癌患者の非新生乳房組織由来の試料10個とを用いたImgenexCorporation,SanDiego,CA。各々の患者について、年齢、性別、対癌米国合同委員会AmericanJointCommitteeonCancer、AJCC腫瘍病期、リンパ節、エストロゲン受容体ER、およびプロゲステロン受容体ER状態に関する情報が提供された。実施例5からのIHCの手順に従った。全ての抗体を作用濃度5μg/mlで使用し、例外として抗Her2の濃度を1.5μg/mlで使用した。表2および表3は、それぞれ乳癌組織群のH460-16-2およびBU75抗CD44抗体染色をまとめたものである。各々の群は、患者50人から得た腫瘍試料から構成されるものであった。概して、試験した患者50人の62パーセントが、BU75抗CD44に関しては73パーセントであるのに対して、H460-16-2抗原については陽性であった。H460-16-2およびBU75抗CD44が同一組織を染色した例では、該試料の45パーセントがH40-16-2と比較して、BU75抗CD44での染色強度が高かった。H460-16-2およびBU75抗原に関して、乳癌患者由来の正常乳房組織試料10個のうち、それぞれ4個および8個が陽性であった。エストロゲン受容体状態とプロゲステロン受容体状態とのあいだに、何ら明確な相互関係は認められなかった。それはまた、より高い腫瘍病期によってH460-16-2およびCD44抗原の陽性発現が大きくなる傾向にあるとは思われなかった。H460-16-2染色は、図2に示すように、正常細胞と比較して、癌細胞に対して特異的であり、間質細胞が明らかに陰性であり、かつ悪性細胞シートがかなり陽性であった。H460-16-2抗原により見られる細胞局在化のパターンは、大多数の例で細胞膜に限定された。BU75CD44抗体は、より多くの乳癌試料を染色し、H460-16-2と比較して細胞質局在化よりも膜の度合いが高かった表4。BU75抗CD44はまた、パジェット病の悪性細胞を染色したが、このことはH460-16-2の例では見られなかった図3。H460-16-2染色に対して陽性であった乳癌患者由来の正常組織試料もまた、BU75抗CD44染色に対して陽性であった。c-erbB-2と比較して、H460-16-2は、相対的に異なる染色の様相を示した。ここでは、H460-16-2抗原に対して陽性であった31個の乳癌腫瘍組織試料のうち16個がHer2発現に関して陰性であり、依然として満たされていない標的治療薬が乳癌患者にとって必要であることが示されている表5、図4。H460-16-2およびHer2の両方に対して陽性であった乳房腫瘍組織切片間に染色強度の違いもあった。すなわち、H460-16-2抗原に対して高度に陽性であったいくつかの乳房腫瘍組織は、Her2に対しては中程度に陽性であったのみであり、その逆もまたしかりであり、H460-16-2抗原が乳癌患者の異なる集団を治療的に標的化することを説明している。c-erbB-2抗体もまた、正常乳房組織切片の一つを陽性に染色した。これらの結果は、H460-16-2に対する抗原が乳癌患者のほぼ2/3で発現されることを示唆している。また、H460-16-2処置に適したこれらの大部分が抗Her2処置に適するものではなかったと思われる。染色パターンは、患者試料において、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、H460-16-2抗原が細胞膜に局在化することでそれが魅惑的な薬となり得る標的となることを示した。同様ではあるが、よりいっそう限定されたH460-16-2対BU75抗CD44抗体の染色は、CD44のより制限された変異体であるH460-16-2エピトープの可能性を再び示す。生体内PC-3確立化学療法組み合わせ腫瘍実験図5および6を参照すると、6ないし8週齢の雄SCIDマウスに、100万個のPC-3ヒト前立腺ガン細胞を含む100マイクロリットルの生理食塩水を首筋に皮下注射することで、移植した。腫瘍の増殖を、毎週、カリパスを用いて測定した。集団の大部分が移植後21日目で腫瘍容積80mm3範囲50~130mm3に達した時点で、4通りの処理群の各々に、マウス8匹を無作為に割り当てた。H460-16-2抗体、化学治療薬シスプラチン、H460-16-2とシスプラチンとの組み合わせ、あるいは緩衝液対照を、2.7mMKCl、1mMKH2PO4、137mMNaCl、20mMNa2HPO4を含む希釈剤によりストック濃度を希釈した後、300マイクロリットルの容量で、抗体またはシスプラチンをそれぞれ15または6mg/kgで、腹腔内投与した。次に、H460-16-2または緩衝液対照を第一週目は一週あたり4回投与し、その後一週あたり3回投与し、移植後41日目まで同様のやり方で、合計11回分投薬した。シスプラチン投与は、抗体処置期間の第0日目、5日目、10日目、および15日目におこなった。腫瘍増殖を、移植後48日目または個々の動物がCCACエンドポイントに達するまで、ほぼ7日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を研究期間中記録した。研究終了時、全ての動物をCCACガイドラインに沿って安楽死させた。対応のあるt検定を用いて、シスプラチンまたはH460-16-2とシスプラチンとの組み合わせによる後処理腫瘍全身腫瘍組織量の減少図5がみられた。48日目処理後7日目において、シスプラチンおよびH460-16-2を処置することで、バッファ対照p<0.0001、シスプラチン処理単独p=0004、またはH460-16-2処理単独p<0.0001よりも、処理期間終了間もない腫瘍の増殖を抑制するのに、よりいっそう有意な効果がえられた。PC-3は前立腺癌の悪液質モデルであり、体重の減少に伴って、異種移植モデルでの全身腫瘍組織量および疾患進行の増加が生ずる。図6に示す平均体重減少に示されるように、全ての群のマウスで、顕著な体重減少がみられた。この研究では、全ての群のマウスが処置期間終了までに約23ないし35パーセントの体重減少を示した。H460-16-2で処置した群は、体重減少の度合いが最も低かった21.7パーセント。処置終了の直後、対照群と比較して、H460-16-2にシスプラチンを加えての処置に関連した体重のさらなる顕著な減少はみられなかったp=0.5042。したがって、H460-16-2にシスプラチンを加えたものは、ヒト乳癌疾患の周知モデルで、緩衝液対照群と比較して、腫瘍全身腫瘍組織量を低下させた。これらの結果は、ヒトを含むほ乳類の癌治療に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。ヒアルロン酸HA結合アッセイMDA-MB-231細胞既に、FACS分析によってH460-16-2抗原CD44が発現されるのが示されたを、組織培養プレートから得た使用済み培地を吸引し、PBSで洗い、各プレートに解離緩衝液5mLを添加し、細胞が離れるまで37°Cで細胞をインキュベートした後に、解離させた。次に、細胞を計数し、50ml管に移した。細胞を1,200rpmで5分間遠心し、培地に懸濁することで1~500万細胞/mlが得られた。次に1mlを2mlの深いウェルの各々のウェルに添加した。このプレートを1200rpmで5分間遠心し、プレートをペーパータオル上で逆さまにすることで過剰な上清を取り除いた。次に、深いウェルプレートをゆっくりとボルテックスし、細胞ペレットを除去し、この細胞ペレットを破壊した。1mlのH460-16-2、BU75陽性対照、BIOCANScientificInc.,Missisauga,ONまたはイソタイプ陰性対照107.3、BDBioschiences,Oakville,ON抗体を各ウェルに添加し、次に穏やかにボルテックスをかけることで混合した。次に、プレートを37°Cで2時間インキュベートした。しばらくして、48ウェルプレートを、37°Cで1~2時間にわたり1ウェルあたり4mg/mlHAストック溶液300μlでインキュベーションすることによって、HAで被覆した。インキュベーション後、過剰のHAを吸引除去し、層流フード内でプレートを完全に空気乾燥させた。抗体細胞インキュベーションを完了させた後、1200rpm、5分間で再び細胞をペレット状にした。深いウェルをペーパータオル上で逆さまにすることで、上清を取り除いた。深いウェルを再びボルテックスすることで、細胞ペレットを解離させ、各々のウェルに対して、2μMカルセイン含有PBSMgCl2およびCaCl2を含む1.2mlを添加した。細胞を再懸濁させ、250μl/ウェルをHA被覆プレートに移した。次に、HA被覆プレートを37°Cで2時間インキュベートすることで、付着させた。インキュベーション後、付着していない細胞を吸引により取り除いた。次に、いっさいの付着していない細胞または細胞の塊を取り除くために、各ウェルをPBSMgCl2およびCaCl2を含むによって2~3回洗った。プレートの読み取りをパーキンエルマーPerkin-ElmerHTS7000蛍光プレートリーダーでおこない、データをマイクロソフトエクセルMicrosoftExcelで分析し、さらに結果の一覧を表6または図7に示した。実験を別々に6回おこなって得た平均値からなる結果によって、平均で1.87±1.01μg/mlのH460-16-2が、HAに対するMDA-MB-231細胞の結合を50減少させるのに必要であることが明らかになった図7。HAに結合しているMDA-MB-231細胞に対するH460-12の効果は、用量依存的であり、20μg/mlのH460-16-2によって、HAに対する細胞結合の減少が60を超えた図7。これらの結果は、H460-16-2が、少なくとも部分的に、HAへの結合に関与するCD44上の領域と相互関係し、その結果、血管形成の下流制御を介した抗癌効果またはECMを介した腫瘍侵襲性を解明することができた。細胞周期アッセイMDA-MB-231の細胞周期に対するH460-16-2の効果を、FACS分析を用いて評価した。H460-16-2で抗体0、0.2、2.0、20μg/mLまたはイソタイプ対照クローン107.3、BDBiosciences、Oakville、ONを、24、48、および72時間にわたって、MDA-MB-231乳癌細胞とインキュベートした。処置および未処置の細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、単一の細胞をフローサイトメトリで分析することで、相対的なDNA含有量を見積もった。取得したデータセットを、低二倍体染色を示している細胞と同様に単細胞母集団上でゲーティングすることで、BDセルクエストCellQuestを用いて分析した。この分析後、H460-16-2で24時間処理した細胞では、周期性を示す細胞の割合が全体的に減少することが示されるとともに、sub-G1集団の用量依存的増加とを示した。sub-G1集団に現れた細胞は、細胞膜の完全性が失われたことによるDNAの損失があり、アポトーシスを起こした細胞の集団を現す場合がある図8。このデータは、H460-16-2がMDA-MB-231細胞周期に対する効果を有し、またこの効果がアポトーシス細胞の数を用量依存的に増加させた。証拠の優越性によって示されることは、H460-16-2がCD44変異体上に存在する炭水化物依存性立体構造エピトープのライゲーションを介して抗癌効果を調節すること、またこのエピトープは少なくとも部分的にHAに対するCD44変異体の結合に関与することである。対応する細胞で、このエピトープに対してH460-16-2の結合がアポトーシスを誘導するという証拠もある。S.N.10/713,451では、MDA-MB-231細胞等の発現細胞から同種抗原を免疫沈降させる際に、H460-16-2抗体を用いることでことができることが示されている。さらに、限定されるものではないがFACS、細胞ELISA、またはIHCによって示される技術を用いて、460-16-2抗体に特異的に結合するCD44抗原性部位を発現する細胞および/または組織の検出でH460-16-2抗体を使用し得ることを示すことができるかもしれない。したがって、免疫沈降したH460-16-2抗原は、そのようなFACS、細胞ELISA、またはIHCアッセイを用いて、そのような細胞または組織に対するH460-16-2の結合を阻害することができる。さらに、H460-16-2抗体と同様に、他の抗CD44抗体を使用してCD44抗体の他の形態を免疫沈降および単離することが可能であり、またこの抗原を用いて同一タイプのアッセイを持ち手抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害させることもできる。また、示すことができたことは、CD44の全ての形態すなわち、pan-CD44抗体を認識する抗CD44抗体を使用してその同種抗原を単離するならば、その抗原はまた、H460-16-2抗原が該抗原を発現する細胞または組織に対して結合することを阻害することができ、それによって上記抗原を発現する細胞および組織上のCD44のエピトープに対するH460-16-2の結合も示される。あるいは、H460-16-2およびpan-CD44抗体の比較を、両抗体が存在する競合結合アッセイ、ELISA、細胞ELISA、FACS,あるいはその他のアッセイで比較することもまた、上記抗原を発現する細胞および組織上のCD44のエピトープに対するH460-16-2の結合を示すことができる。この明細書で指摘した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物を、あたかも個々の刊行物が具体的かつ個々に参照によって援用されるかのように、同一の程度に参照によって本明細書中に援用する。本発明の特定の形態を例示する一方で、本明細書中に記載または示した構成要素の特定の形態または配置に限定されないことが理解される。種々の変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、また本発明が明細書に示し、かつ記載したものに限定されるものではないと考えられることは、当業者にとって明らかである。当業者は、本発明に固有のものと同様に、目的を実施すること、また上記した結果および利点を得ることに、本発明が十分に適していることを容易に理解する。本明細書に記載したいっさいのオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、例示を意図したものであって範囲を限定することを意図したものではない。ここでの変更および他の用途は、当業者が想到するものであり、本発明の精神の範囲内に包含されるとともに添付した請求の範囲によって定義される。本発明の説明を特定の好ましい実施形態と関連させておこなったが、理解すべきことは、請求項に記載された通りの本発明はそのような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないということである。実際、当業者に明らかである本発明を実行するための上記した態様の種々の変更は、別紙の請求の範囲の範囲内にあることを意図している。"