"誘導性RNaseH活性を有する酵素を含むホットスタート酵素組成物。前記酵素は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列を有するRNaseH相同性領域を含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と70以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と80以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項2に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH相同性領域は、配列番号10,11,12または13のアミノ酸配列と90以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項2に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH活性は、ピューロコッカスフリオススPyrococcusfuriosus、ピューロコッカスホリコシPyrococcushorikoshi、サーモコッカスリトラリスThermococcuslitoralis、サーマスサーモフィルスThermusthermophilusまたは大腸菌E.coliから分離することを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。ポリメラーゼ活性をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記ポリメラーゼ活性は、DNAポリメラーゼ活性を含むことを特徴とする請求項7に記載のホットスタート酵素組成物。前記DNAポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項8に記載のホットスタート酵素組成物。逆転写酵素活性をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH活性は、熱誘導性であることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH活性は、酵素を含む溶液のpHを変形させることによって誘導されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記誘導性RNaseH活性を有する酵素は、可逆的に変形されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記酵素は、前記酵素のアミノ酸残基のアシル化によって可逆的に変形されることを特徴とする請求項13に記載のホットスタート酵素組成物。前記アミノ酸は、リシンであることを特徴とする請求項14に記載のホットスタート酵素組成物。誘導性RNaseH活性を有する前記酵素は、ホルムアルデヒドによって可逆的に変形されることを特徴とする請求項13に記載のホットスタート酵素組成物。前記ホルムアルデヒドは、約0.2ないし1w/vの濃度でホルムアルデヒドを含む溶液であることを特徴とする請求項16に記載のホットスタート酵素組成物。リガンドをさらに含み、前記誘導性RNaseH活性は、前記リガンドと酵素との結合によって阻害され、前記結合が干渉されることによって誘導されることを特徴とする請求項1に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、熱不安定性thermolabileであることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記酵素と前記リガンドとの結合は、非共有性であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、前記酵素に対して、10-1M以下のKD解離定数を有するペプチド、核酸または小分子であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、前記RNaseHドメインに結合することを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、前記RNaseHドメインで、立体構造変化を誘導することを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマーまたはキレート剤であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記抗体断片は、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単一鎖Fvまたは単一鎖scFv、二硫化結合されたFv、V-NARドメイン、IgNar、イントラボディーintrabody、IgGDCH2、ミニボディminibody、Fab’3、テトラボディtetrabody、トリアボディtriabody、ジアボディdiabody、scFv2、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2またはscFv-Fcであることを特徴とする請求項24に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH活性は、酵素を含む溶液を約90°C以上の温度まで加熱することによって誘導されることを特徴とする請求項11に記載のホットスタート酵素組成物。前記RNaseH活性は、酵素を含む溶液のpHを約7.0以下に下げることによって誘導されることを特徴とする請求項12に記載のホットスタート酵素組成物。前記溶液は、標的核酸配列を含むポリメラーゼ連鎖反応PCR試料であることを特徴とする請求項27に記載のホットスタート酵素組成物。前記酵素と前記リガンドとの結合は、共有結合であることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。前記リガンドは、交差結合剤crosslinkingagentであることを特徴とする請求項18に記載のホットスタート酵素組成物。標的配列を増幅する方法であって、標的DNA配列を含む試料と、DNAポリメラーゼと誘導性RNaseH活性とを含む請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、前記標的DNA配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、前記標的DNA配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、検出可能な標識と連結され、RNaseHによって切断され得る組成を有するプローブと、含む増幅反応混合物を提供する段階と、前記増幅反応組成物に、一つ以上の増幅反応を遂行し、一つ以上の増幅産物を生成する段階と、収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、を含み、前記増幅反応は、約90°Cの温度で、前記反応組成物を加熱する段階を含む方法。前記反応組成物を加熱する段階は、約95°Cで行われることを特徴とする請求項31に記載の方法。前記プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分が、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列間に配列されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項31に記載の方法。前記加熱段階は、前記RNaseH活性を有する酵素と前記リガンドとの結合を破壊することによって、RNaseH活性を誘導することを特徴とする請求項31に記載の方法。前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項31に記載の方法。試料で、標的RNA配列を検出する方法であって、標的RNA配列を含む試料と、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNaseH活性を含み、前記RNaseH活性は、前記リガンドによって抑制されるものである請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、RNaseHの切断配列を含むプローブ配列と、前記標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、前記標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、含む増幅反応組成物を提供する段階と、RNA:cDNA二本鎖を形成するために、標的RNAの逆転写を開始する段階と、約90°C以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それによってRNA:cDNAデュプレックスのRNA部分を分解するために、誘導性RNaseH活性を活性化させる段階と、一つ以上の増幅産物を形成するために、一つ以上の増幅反応を開始する段階と、収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、を含む方法。前記プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分が、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列間に配列されたものであるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項36に記載の方法。前記標的RNA配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項36に記載の方法。前記反応組成物を加熱する段階は、約95°Cで行われることを特徴とする請求項36に記載の方法。前記加熱段階は、前記誘導性RNaseH活性を活性化させることを特徴とする請求項36に記載の方法。前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項36に記載の方法。請求項1、13及び18のうちいずれか1項に記載のホットスタート酵素組成物を含むマイクロアレイ。複数の試料で、標的RNA配列を検出する方法であって、標的RNA配列を含む試料と、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNaseH活性を含み、前記RNaseH活性は、リガンドによって抑制される請求項18に記載のホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、RNaseHの切断配列を含むプローブ配列と、標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、それぞれ含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階と、前記マイクロアレイのうちそれぞれの増幅反応組成物に対して、RNA:cDNAデュプレックスを形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階と、約90°C以上の温度まで反応組成物を加熱し、それによってRNA:cDNA二本鎖のRNA部分を分解するために、誘導性RNaseH活性を活性化させる段階と、一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階と、収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階と、を含む方法。前記標的RNA配列は、レトロウイルスであることを特徴とする請求項43に記載の方法。前記反応組成物を加熱する段階は、約95°Cで行われることを特徴とする請求項43に記載の方法。前記加熱段階は、前記誘導性RNaseH活性を活性化させることを特徴とする請求項43に記載の方法。前記リガンドは、熱不安定性であることを特徴とする請求項43に記載の方法。請求項42に記載のマイクロアレイを含むキット。逆転写酵素活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項48に記載のキット。DNAポリメラーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項48に記載のキット。試験試料で、核酸配列の改善されたCATACLEAVEプローブ検出のための、可逆的に変形されたホットスタートhotstartRNaseH酵素組成物について記載する。前記酵素組成物の重要な特徴は、逆転写PCRサイクルの過程中、RNaseHの触媒活性を調節する能力である。従って、逆転写前に、RNA:DNAプライマーヘテロ二本鎖の分解を最小化するために、RNaseH活性は、最初は抑制される。cDNA合成が完了した後、逆転写酵素-PCR産物内の標的DNA配列にアニーリングするCATACLEAVEプローブの切断と蛍光検出とを促進するために、RNaseH活性が誘導される。誘導性RNaseH酵素は、単一反応混合物で、一段階逆転写酵素CATACLEAVEPCRを要求する高速大量適用highthroughapplicationに使われる。一実施態様において、本発明は、誘導性RNaseH活性を有する酵素を含むホットスタート酵素組成物を含む。前記酵素は、配列番号11,12,13または14のアミノ酸配列に、少なくとも70,80,90,95または99の配列相同性を有することができる熱安定性RNaseHドメインを有することができる。ホットスタート組成物は、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素活性のようなポリメラーゼ活性を有することができる。前記RNaseH活性は、熱誘導性またはpH誘導性であってもよい。一実施態様において、前記誘導性RNaseH活性を有する酵素は、ピューロコッカスフリオススPrococcusfuriosusRNaseHII、ピューロコッカスホリコシイPyrococcushorikoshiRNaseHII、サーモコッカスリトラリスThermococcuslitoralisRNaseHI、サーマスサーモフィルスThermusthermophilusRNaseHI、大腸菌E.coliRNaseHIまたは大腸菌RNaseHIIであってもよい。前記誘導性RNaseH活性を有する酵素は、化学的変形によって、可逆的に変形されもする。実施態様において、前記酵素は、リシンのような、酵素のアミノ酸のアシル化、または約0.2ないし約1w/vの濃度を有するホルムアルデヒドとの反応によって可逆的に変形されもする。一実施態様において、ホットスタート酵素組成物は、リガンドをさらに含み、誘導性RNaseH活性は、リガンドと酵素との結合によって抑制されたり、あるいはリガンドと酵素との結合の干渉によって誘導されもする。リガンドは、熱不安定性であってもよい。酵素とリガンドとの結合は、非共有性結合である。前記リガンドは、誘導性RNaseH活性を有した前記酵素に対して、10-1M以下のKD解離定数を有するペプチド、核酸または小分子であってもよい。いくつかの実施態様において、前記リガンドは、RNaseHドメインに結合したり、あるいはRNaseHドメインの立体構造変化conformationalchangeを誘導することができる。前記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマーまたはキレート剤であってもよい。前記抗体断片は、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単一鎖Fvまたは単一鎖scFv、二硫化結合されたFv、V-NARドメイン、IgNar、イントラボディーintrabody、IgGDCH2、ミニボディminibody、Fab’3、テトラボディtetrabody、トリアボディtriabody、ジアボディdiabody、scFv2、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2またはscFv-Fcであってもよい。前記RNaseH活性は、1酵素を含む溶液を約90°C以上の温度まで加熱したり、あるいは2酵素を含む溶液のpHを約7.0以下で下げることによって誘導される。前記溶液は、標的核酸配列を含むポリメラーゼ連鎖反応試料であってもよい。酵素とリガンドとの結合は、共有結合であってもよい。例えば、リガンドは、交差結合剤crosslinkingagentである。一実施態様において、本発明は、標的配列を増幅する方法であって、標的DNA配列を含む試料と、DNAポリメラーゼと誘導性RNaseH活性とを含むホットスタート酵素組成物と、標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、検出可能な標識と連結され、RNaseHによって切断される組成を有するプローブと、を有する増幅反応混合物を提供する段階;一つ以上の増幅産物を生成するために、増幅反応組成物に一つ以上の増幅反応を遂行する段階;及び収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階を含み、前記増幅反応は、約90°Cの温度に反応組成物を加熱する段階を含む方法である。前記反応組成物を加熱する段階は、約95°Cで遂行されもする。前記プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分は、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列の間に配列されるものであるオリゴヌクレオチドであってもよい。前記加熱段階は、RNaseH活性を有する酵素とリガンドとの結合を破壊することによって、RNaseH活性を誘導することができる。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。他の実施態様において、本発明は、試料中の標的RNA配列を検出する方法であり、標的DNA配列を含む試料と、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNaseH活性を含み、前記RNaseH活性は、リガンドによって抑制されるものであるホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、RNaseHの切断配列を含むプローブ配列と、標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、を含む増幅反応組成物を提供する段階;RNA:DNAcDNAは、産物が二重鎖DNAであり、逆転写酵素産物ではないものを意味する二本鎖を形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階;約90°C以上の温度に反応組成物を加熱し、それにより、RNA:DNAデュプレックスのRNA部分を分解する誘導性RNaseH活性を活性化させる段階;一つ以上の増幅産物を生成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階;及び収得された増幅産物の検出可能な標識を測定する段階;を有する方法である。プローブは、一つ以上のDNA配列部分と、1つのRNA配列部分とを含み、前記RNA部分は、RNA配列の3’末端と5’末端とが2つのDNA配列のそれぞれに連結される方式で、2つのDNA配列間に配列されたものであるオリゴヌクレオチドであってもよい。標的RNA配列は、レトロウイルスであってもよい。反応組成物を加熱する段階は、約95°Cで遂行されもする。前記加熱段階は、誘導性RNaseH活性を活性化させることができる。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。さらに他の実施態様において、本発明は、本明細書に記載されたホットスタート酵素組成物を有するマイクロアレイを記載する。さらに他の実施態様において、本発明は、複数の試料で標的RNA配列を検出する方法であって、標的RNA配列を含む試料と、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び誘導性RNaseH活性を含み、前記RNaseH活性は、前記リガンドによって抑制されるホットスタート酵素組成物と、検出可能な標識を含み、RNaseHの切断配列を含むプローブ配列と、標的核酸配列の5’末端に相補的な配列を含む第1プライマーと、標的核酸配列の3’末端に相補的な配列を含む第2プライマーと、を含む複数の増幅反応組成物を有するマイクロアレイを提供する段階;マイクロアレイの中でそれぞれの増幅反応組成物に対して、RNA:cDNA二本鎖を形成するために標的RNAの逆転写を開始する段階;約90°C以上の温度まで前記反応組成物を加熱し、それにより、RNA:cDNA二本鎖のRNA部分を分解する誘導性RNaseH活性を活性化させる段階;一つ以上の増幅産物を形成するために一つ以上の増幅反応を開始する段階;及び収得した増幅産物の検出可能な標識を測定する段階;を含む方法である。前記標的RNA配列は、レトロウイルスであってもよい。前記反応組成物を加熱する段階は、誘導性RNaseH活性を活性化させることができる約95°Cで遂行されもする。前記リガンドは、熱不安定性であってもよい。一実施態様において、本発明は、逆転写酵素活性またはDNAポリメラーゼ活性を有する酵素を含むことができるホットスタート組成物のマイクロアレイを有するキットを開示する。前述の具現例は、RNA配列のCATACLEAVE逆転写PCR検出の感度を向上させるために、変形されたRNaseH酵素を使用することを含む多くの長所を有する。向上した検出方法は、早くて正確であり、高速大量適用に適する。RNA配列の高速大量検出のための、便利であってユーザ親和的であり、信頼性ある診断キットをも記載する。本明細書に開示された実施態様の実施は、取り立てて表示されなければ、当業界で知られた一般的なな分子生物学的技法を利用する。このような技法は、当業者に周知されており、文献に十分に説明されている。例えば、すべての付録を含んだ、Ausubel,etal.,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,Inc.,NY,N.Y.1987-2008;Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.1989を参照されたい。本明細書で取り立てて、定義されていない限り、本明細書で使用されたすべての技術的、科学的な用語は、当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。また、本明細書は、詳細な説明及び請求項の解釈の一助とするために、用語の定義を提供する。本明細書の定義が、他の定義と一致しなければ、本明細書に説明された定義が適用されるのである。RNaseH酵素及びRNaseHドメイン本願は、CataCleave逆転写酵素PCR反応に使用するための変形された熱安定性RNaseH酵素組成物を開示する。RNaseHは、RNA-DNAハイブリッドのうちRNAを加水分解する。子牛胸腺で初めて発見されたRNaseHは、その後多くの生物で開示された。事実、RNaseH活性は、真核生物及びバクテリアに偏在しているように見える。RNaseHは、多様な分子量と核酸分解活性とを有するタンパク質のファミリーを形成するが、基質要求性は、多様な亜型に対して類似していると見られる。例えば、現在まで研究されたほとんどのRNaseHは、エンドヌクレアーゼとして機能し、5’ホスフェート末端及び3’ヒドロキシル末端を有する切断産物を生成するために、二価陽イオン例えば、Mg2、Mn2を要求する。RNaseHは、原核生物で、クローニングされ、広範囲に特徴づけられているCrooke,etal.,1995BiochemJ,312Pt2,599-608;Limaetal.,1997JBiolChem,272,27513-27516;Limaetal.,1997Biochemistry,36,390-398;Limaetal.,1997JBiolChem,272,18191-18199;Limaetal.,2007MolPharmacol,71,83-91;Limaetal.,2007MolPharmacol,71,73-82;Limaetal.,2003JBiolChem,278,14906-14912;Limaetal.,2003JBiolChem,278,49860-49867;ItayaM.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,8587-8591を参照。例えば、E.ColiRNaseHIは、長さが155個のアミノ酸からなるが、E.ColiRNaseHIIは、長さが213個のアミノ酸からなる。E.coliRNaseHIIは、E.coliRNaseHIとわずか17の相同性を示す。S.typhimuriumからクローニングされたRNaseHは、E.coliRNaseHIと科11個の位置でのみ異なり、長さが155個のアミノ酸からなるItayaM.andKondoK.,NucleicAcidsRes.,1991,19,4443-4449。RNaseH活性を示すタンパク質もまた、数多くのウイルス、他のバクテリア及び酵母からクローニングされて精製されたWintersberger,U.Pharmac.Ther.,1990,48,259-280。多くの場合、RNaseH活性を有するタンパク質は、RNaseHが他の酵素、しばしばDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合タンパク質であるようだ。RNaseHドメインは、E.coliRNaseHIに相同性が高いと一貫して確認されたが、他のドメインが相当に異なるため、その融合タンパク質の分子量及び他の特性が幅広く多様である。高等真核生物で、分子量、二価陽イオンの効果、スルフィドリル作用剤sulfhydrylagents及び免疫学的交差-反応性での差異に基づいて、2種のRNaseHが定義されたBusenetal.,Eur.J.BiolChem.,1977,74,203-208。RNaseHI酵素は、68ないし90kDa範囲の分子量を有し、Mn2またはMg2によって活性化され、スルフィドリル作用剤に敏感ではないと報告された。一方、RNaseHII酵素は、31ないし45kDa範囲の分子量を有し、Mg2を要求し、スルフィドリル作用剤に相当に敏感であり、Mn2によって抑制されると報告されたBusen,W.,andHausen,P.,Eur.J.Biochem.,1975,52,179-190;Kane,C.M.,Biochemistry,1988,27,3187-3196;Busen,W.,J.Biol.Chem.,1982,257,7106-7108。異種からのRNaseの詳細な比較は、OhtaniN,HarukiM,MorikawaM,KanayaS.JBiosciBioeng.1999;881:12-9に報告された。また、RNaseHII特性を有した酵素がヒト胎盤からほぼ純粋にhomogeneity分離されたFranketal.,NucleicAcidsRes.,1994,22,5247-5254。このタンパク質は、約33kDaの分子量を有し、pH6.5ないし10の範囲で活性があり、最適pHがpH8.5ないし9である。前記酵素は、Mg2を要求し、Mn2及びn-エチルマレイミドによって阻害される。切断反応の産物は、3’ヒドロキシル末端と5’ホスフェート末端を有する。実施態様で使用されるRNaseH酵素の例は、ピューロコッカスフリオススRNaseHII、ピューロコッカスホリコシイRNaseHII、サーモコッカスリトラリスRNaseHI、サーマスサーモフィルスRNaseHIのような好熱性生物から分離した熱安定性RNaseHをさらに含むが、これらに限定されるものではない。実施態様で使用される他のRNaseH酵素は、例えば、ウエモリの米国特許第7,422,888号明細書またはワルダー米国公開出願第2009/0325169号に記載されており、その内容は、本明細書に参照として含まれる。一実施態様において、RNaseH酵素は、下記で表示される、PfuRNaseHIIのアミノ酸配列配列番号1と、40,50,60,70,80,90,95または99の相同性を有する熱安定性RNaseHである。MKIGGIDEAGRGPAIGPLVVATVVVDEKNIEKLRNIGVKDSKQLTPHERKNLFSQITSIA60DDYKIVIVSPEEIDNRSGTMNELEVEKFALALNSLQIKPALIYADAADVDANRFASLIER120RLNYKAKIIAEHKADAKYPVVSAASILAKVVRDEEIEKLKKQYGDFGSGYPSDPKTKKWL180EEYYKKHNSFPPIVRRTWETVRKIEESIKAKKSQLTLDKFFKKP224相同性は、例えば、コンピュータプログラムDNASIS-MacTakaraShuzo、コンピュータアルゴリズムFASTAバージョン3.0;Pearson,W.R.etal.,Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988またはコンピュータアルゴリズムBLASTバージョン2.0、Altschuletal.,NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997を利用して決定される。他の実施態様において、RNaseH酵素は、配列番号1の5ないし20,33ないし44,132ないし150、及び158ないし173の位置に相応する相同性領域1ないし4のうち一つ以上を有する熱安定性RNaseHである図12参照。相同性領域1:GIDEAGRGPAIGPLVV配列番号10;配列番号1の5ないし20の位置に相当する相同性領域2:LRNIGVKDSKQL配列番号11;配列番号1の33ないし44の位置に相当する相同性領域3:HKADAKYPVVSAASILAKV配列番号12;配列番号1の132ないし150の位置に相当する相同性領域4:KLKKQYGDFGSGYPSD配列番号13;配列番号1の158ないし173の位置に相当する他の実施態様において、RNaseH酵素は、配列番号10,11,12または13のポリペプチド配列と、50,60,70,80,90の配列相同性を有する相同性領域のうち一つ以上を有する熱安定性RNaseHである。本明細書で使用される用語配列相同性sequenceidentityは、配列が比較のウィンドーで、アミノ酸対アミノ酸の基準において同一であるか、あるいは機能的にまたは構造的に類似した程度を意味する。従って、配列相同性の百分率percentageofsequenceidentityは、例えば、比較のウィンドーで、2つの最適に整列された配列を比較し、一致した位置の数を収得するために、2つの配列で同一のアミノ酸が示される位置の数を決定し、比較のウィンドーすなわち、ウィンドーの大きさで、位置の総数によって、前記一致した位置の数を分け、配列相同性の百分率を収得するために、その結果に100を乗じることによって計算されもする。RNaseHの変形本明細書で使用される用語変形されたRNaseHmodifiedRNaseHは、RNaseHのエンドヌクレアーゼ活性の喪失を誘発する抑制因子に可逆的に連結されたり、あるいは可逆的に結合したRNaseHであってもよい。RNaseHからの抑制因子の放出または分離decouplingは、RNaseHのエンドヌクレアーゼ活性の完全な、または少なくとも一部活性を回復させる。完全なintactRNaseHの活性の約30ないし100が十分である。抑制因子は、リガンドまたは化学的変形であってもよい。リガンドは、抗体、アプタマー、受容体、共同因子またはキレート剤であってもよい。リガンドは、RNaseH酵素の活性部位に結合し、これにより、酵素活性を阻害したり、あるいはRNaseの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部実施態様において、前記リガンドは、立体構造的変化を誘導することができる。前記化学的変形は、交差結合例えば、ホルムアルデヒドによる交差結合またはアシル化であってもよい。RNaseHIIからの抑制因子の放出または分離は、連結されたRNaseHII不活性を含む試料または混合物を、約65°Cないし約95°C、またはそれ以上の温度まで加熱し、かつ/または試料または混合物のpHを約7.0以下に下げることによって達成される。本明細書で使用される用語不活性化されたRNaseHまたは不活性RNaseHは、それ以外には、同一の実験条件下で、50°Cで決定された変形されていないRNaseH100と見なされると比較し、約75以上、約85以上または約95以上のエンドヌクレアーゼ活性を喪失したRNaseHを意味する。本明細書で使用される用語活性化されたRNaseHまたは活性RNaseHは、前述のように変形され、それ以外には、同一の実験条件下で、50°Cで決定された変形されていないRNaseH100と見なされると比較し、約5以上、約10以上、約15以上、約20以上、約25以上または約30以上のエンドヌクレアーゼ活性を回復したRNaseHIIを意味する。本明細書で使用された誘導性RNaseH活性は、リガンドとの結合によって調節されるエンドヌクレアーゼ触媒活性を有する本明細書に記載された変形されたRNaseHを意味する。許容的permissive条件で、RNaseHエンドヌクレアーゼ触媒活性は活性化されるが、非許容的nonpermissive条件下で、前記RNaseHエンドヌクレアーゼ触媒活性は抑制される。一部実施態様において、変形されたRNaseHの触媒活性は、逆転写に適する温度、すなわち、約42°Cで抑制され、PCR反応で発見されるさらに高い温度、すなわち、約65°Cないし95°Cで活性化されもする。このような特性を有した変形されたRNaseHは、熱誘導性と言及される。他の実施態様において、変形されたRNaseHの触媒活性は、前記酵素を含む溶液のpHを変化させることによって調節される。本明細書で使用されたホットスタートhotstart酵素組成物は、非許容的温度、すなわち、約25°Cないし約45°Cで阻害され、PCR反応に適する温度、例えば、約55°Cないし約95°Cで活性化される酵素活性を有する組成物をいう。一部実施態様において、ホットスタート酵素組成物は、当業界で知られたホットスタートRNaseH及び/またはホットスタート熱安定性であるDNAポリメラーゼを有することができる。RNaseH酵素の交差結合は、例えば、ホルムアルデヒドを使用して遂行されもする。一実施態様において、熱安定性RNaseHIIにホルムアルデヒド使用して調節されて制限された交差結合を遂行する。不活性化状態である変形されたRNaseHIIを含む増幅反応組成物を、約95°C以上の温度まで長期間、例えば、約15分間加熱することによって、交差結合が逆転され、前記RNaseHII活性は回復する。一般的に、交差結合の程度が低いほど、交差結合の逆転後、酵素のエンドヌクレアーゼ活性がさらに高い。交差結合の程度は、ホルムアルデヒドの濃度及び交差結合反応の持続時間を変化させることによって調節される。例えば、約0.2w/v、約0.4w/v、約0.6w/vまたは約0.8w/vのホルムアルデヒドが、RNaseH酵素を交差結合させることに使用される。約10分の0.6ホルムアルデヒドを使用した交差結合反応は、ピューロコッカスフリオスス由来のRNaseHIIを不活性化するのに十分である。交差結合されたRNaseHIIは、約37°Cで測定可能なエンドヌクレアーゼ活性を示さない。一部の場合、交差結合されたRNaseHIIの測定可能な部分的再活性化が、PCR変性温度よりさらに低い約50°Cの温度で起こる。前記酵素のこのような意図しない再活性化を避けるために、変形されたRNaseHIIを再活性化まで、50°Cより低い温度で保管したり、あるいは維持することが必要である。一般的に、PCRは、二重鎖標的配列を変性させるために、約95°Cに、各サイクルで増幅組成物を加熱することを必要とし、これはまた、RNaseHから不活性化因子を放出させ、前記酵素の活性を部分的に、または全部回復させる。RNaseHはまた、前記酵素にアシル化試薬、例えば、ジカルボン酸を使用して、リシン残基のアシル化を行うことによって変形されもする。RNaseHのアシル化は、アシル化バッファー中において、RNaseHの溶液にcis-アコニット酸無水物cisaconiteanhydrideを添加し、約1ないし20°Cで、5ないし30時間の間収得した混合物をインキュベーションさせることによって行われる。一実施態様において、前記アシル化は、約3ないし8°C近辺で、18ないし24時間の間遂行される。アシル化バッファーの種類は、特別に制限さるものではない。実施態様において、前記アシル化バッファーは、約7.5ないし約9.0の間のpHを有する。アシル化されたRNaseHの活性は、増幅組成物のpHを約7.0以下に下げることによって回復される。例えば、Trisバッファーが緩衝剤として使用される場合、前記組成物は、約95°Cまで加熱され、その結果、pHが約8.725°Cから6.595°Cに下げられる。増幅反応組成物で、前記加熱段階の持続時間は、変形されたRNaseH、PCRに使用されたバッファーなどによって変わることがある。しかし、一般的に、95°Cで約30秒ないし4分間、増幅組成物を加熱することは、RNaseH活性を回復するのに十分である。一実施態様において、インビトロジェンAgPathバッファーと共に、商業的に利用可能なバッファーを使用し、ピューロコッカスフリオススRNaseHIIの完全な活性は、約2分の加熱後に回復する。RNaseH活性は、当業界に周知の方法を使用して決定されもする。例えば、第1方法によって、単位活性は、定義された分析条件下で、同一モルのポリチミジル酸の存在で、放射性標識されたポリアデニル酸の特定モル数の酸可溶化acidsolubilizationの側面で定義されるEpicentreHybridasethermostableRNaseHI参照。第2方法で、単位活性は、定義された分析条件下で、プローブと相補的なテンプレートDNAの同量を含む反応の相対的蛍光強度で特異的な増加と定義される。この第2方法は、実施例でさらに詳細に説明する。本発明によって変形されたRNaseHを使用する方法は、CataCleave逆転写酵素PCR検出を使用した試験試料で、RNA配列を検出する代表的実施態様で開示される。核酸テンプレートの準備一部実施態様において、試料は、精製された核酸テンプレート例えば、mRNA、rRNA及びその混合物を含む。試料からのRNA抽出及び精製の方法は、当業界に周知である。例えば、RNAは、TRIzol試薬インビトロジェン抽出方法を使用して細胞から分離することができる。RNAの量と質は、その次に、例えば、Nanodrop分光光度計及びアジレント2100バイオアナライザを使用して決定される。他の実施態様において、試料は、約6ないし約9のpHを有する溶解バッファー、約0.125ないし約2濃度の両性イオン性デタージェント、約0.3ないし約2.5mg/ml濃度のアジド及びプロテアーゼKのようなプロテアーゼ約1mg/mlを使用して細胞を溶解させることによって得られた細胞溶解物である。55°Cで15分間インキュベーションした後、高効率PCRまたは逆転写PCR分析と調和する実質的にタンパク質不包含substantiallyproteinfree溶解物を生成するために、プロテアーゼKを95°Cで10分間不活性化させる。一実施態様において、1×溶解試薬は、12.5mMTrisアセテート、Tris-HClまたはHEPES4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸pH=7ないし8、0.25w/vCHAPS、0.3125mg/mlアジド化ナトリウム及び1mg/mlのプロテアーゼKを含む。本明細書で使用される用語溶解物は、溶解された細胞残骸物及び核酸を含む液状をいう。本明細書で使用される用語実質的にタンパク質を含まないは、ほとんどのタンパク質がプロテアーゼによるタンパク質分解切断によって不活性化されたものである溶解物を意味する。プロテアーゼは、プロテアーゼKを含んでもよい。細胞を溶解させる間、プロテアーゼKの添加は、標的核酸を分解することができるヌクレアーゼを早く不活性化させる。実質的にタンパク質を含まない溶解物は、不活性化されたタンパク質を除去する処理を経たり、あるいは経ないこともある。本明細書で使用される用語細胞は、原核細胞または真核細胞を意味することができる。一実施態様において、用語細胞は、グラム陽性バクテリア、グラム陰性バクテリア、抗酸性バクテリアなどを含むが、これらに限定されないバクテリアのような微生物を意味することができる。一部実施態様において、試験対象細胞は、表面の綿棒サンプリングswabsamplingを使用して収集されもする。他の実施態様において、細胞は、病原性個体を意味することができる。他の実施態様において、試料は、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む。一部実施態様において、試料は、HIV-1またはHIV-2のようなレンチバイロス核酸を含んでもよい。本明細書で使用された両性イオン性界面活性剤は、両性イオンの特性例えば、純電荷を有さず、伝導度及び電気泳動移動度がなく、イオン交換樹脂に結合せず、タンパク質間結合を崩すを示す界面活性剤を意味し、CHAPS、CHAPSO及びベタイン誘導体、例えば、望ましくは、ブランド名ZwittergentCalbiochem、SanDiego、CA及びAnzergentAnatrace、Inc.Maumee、OHとして販売されるスルホベタインを含むが、これらに限定されるものではない。一実施態様において、両性イオン性界面活性剤は、下記の構造を有する3-[3-コールアミドプロピルジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート米国特許第4,372,888号明細書にさらに詳細に記載されているの略語であるCHAPSCASNumber:75621-03-3;SIGMA-ALDRICH製品番号C3023-1Gとして購入できるである:追加的な実施態様において、CHAPSは、すべて組成物の約0.125ないし約2重量/体積w/vの濃度で存在する。追加的な実施態様において、CHAPSは、すべて組成物の約0.25ないし約1w/vの濃度で存在する。さらに他の実施態様において、CHAPSは、総組成物の約0.4ないし約0.7w/vの濃度で存在する。他の実施態様において、溶解バッファーは、ノニデットNonidet、トゥイーンTweenまたはトリトンTritonX-100のような他の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。本明細書で使用される用語バッファーbufferは、25°Cで、約6ないし約9のpKaを有し、pH値をpH6ないし9に効果的に維持することができる組成物をいう。本明細書で記載したバッファーは、一般的に、酵素活性の機能と調和可能であり、生物学的高分子が、それらの正常な生理的及び生化学的な機能を保有することができるようにする生理的に適するバッファーphysiologicallycompatiblebufferである。バッファーの例は、4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPES、3-N-モルホリノ--プロパンスルホン酸MOPS、N-トリスヒドロキシメチルメチルグリシン酸トリシン、トリスヒドロキシメチルメチルアミン酸トリス、ピペラジン-N,N’-ビス2-エタンスルホン酸PIPES、及びアセテートまたはホスフェートを含むバッファーK2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4などを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に使用される用語アジドは、化学式-N3で記載される。一実施態様において、アジドは、一般的な殺菌剤と作用するアジド化ナトリウムNaN3CASnumber26628-22-8;SIGMA-ALDRICH製品番号S2002-25Gとして購入可能である。本明細書で使用される用語プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有する酵素である。プロテアーゼはまた、例えば、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ペプチドヒドロラーゼまたはタンパク質分解酵素とも呼ばれる。本発明による使用のためのプロテアーゼは、ポリペプチド鎖において、内部に作用するエンドタイプエンドペプチダーゼであってもよい。一実施態様において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、プロテアーゼKEC3.4.21.64;RocheAppliedSciencesから購入可能である組み換えプロテアーゼK50U/mlPichiapastoris由来Cat.No.03115887001であってもよい。プロテアーゼKは、核酸製剤nucleicacidpreparationからタンパク質を分解して汚染を除去するために使用される。核酸製剤にプロテアーゼKを添加し、ヌクレアーゼを早く不活性化させるが、そうではなければ、ヌクレアーゼが精製過程の間、DNAまたはRNAを分解させることがある。プロテアーゼKは、タンパク質を変性させる化学物質の存在下で活性があり、約95°Cの温度で約10分間で不活性化されるので、本実験に相当に適する。一実施態様において、リステリア、サルモネラ及び大腸菌のような、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアの溶解はまた、溶解試薬がプロテアーゼK1mg/mlを含むことを要求する。細胞溶解物のうちタンパク質は、55°Cで15分間でプロテアーゼKによって分解され、その次に、95°Cで10分間でプロテアーゼKを不活性化させる。冷却させた後、実質的にタンパク質不包含溶解物は、高効率PCR増幅に適する。プロテアーゼKに加え、またはその代わりに、溶解試薬は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サブチリシン、ストレプトグリシン、サーミターゼ、アクアリシン、プラスミン、ククミシン、またはカルボキシペプチダーゼA,D,CまたはYのようなセリンプロテアーゼを含んでもよい。セリンプロテアーゼに加えて、溶解溶液は、パパイン、カルパインまたはクロストリパインのようなシステインプロテアーゼ;ペプシン、キモシンまたはカテプシンのような酸プロテアーゼ;またはプロナーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼA,、B,E/H,M,TまたはUのようなメタロプロテアーゼを含んでもよい。プロテアーゼKは、広いpH範囲pH4.0ないし10.0で安定しており、両性イオン性界面活性剤が含まれたバッファーで安定する。逆転写酵素-PCR増幅逆転写酵素-PCR過程は、終点endpointまたはリアルタイム分析のうち一つに設定されもする。cDNA増幅は、本質的に2つの段階に分離された分子的合成を要求する:iRNAテンプレートからcDNAの合成、及びiiPCR増幅を介した新たに合成されたcDNAの複製。逆転写酵素-PCRとたびたび関連する技術的問題を解決するために、多数のプロトコルが下記過程の3種の基本段階を考慮して開発された:aRNAの変性とリバースプライマーとのハイブリダイゼーション;bcDNAの合成、及びcPCR増幅。いわゆる分離されたuncoupled逆転写酵素-PCR過程例えば、2段階逆転写酵素-PCRで、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適バッファー条件を使用して、独立した段階として遂行される。cDNA合成に続き、収得された反応液をTaqDNAポリメラーゼ活性のための最適条件により、MgCl2及びジオキシリボヌクルレオシドトリホスフェートdNTPmp濃度を低下させるように希釈し、標準条件によってPCRを遂行する米国特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書参照。一方、連結されたcoupled逆転写酵素PCR方法は、逆転写酵素及びTaqDNAポリメラーゼのための共通したバッファーを使用する。1つのバージョンで、リバースプライマーのアニーリングは、酵素添加の前の別個の段階であり、その後、1つの反応容器に添加される。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性TthDNAポリメラーゼの成分である。アニーリング及びcDNA合成は、Mn2の存在下で行われ、その後PCRは、キレート剤によって、Mn2を除去した後、Mg2の存在下で行われる。最後に、持続的continuous方法例えば、1段階逆転写酵素-PCRは、3段階の逆転写酵素-PCR段階を、構成要素または酵素の添加のための反応チューブを開くことを避ける単一持続的反応に統合する。持続的逆転写酵素-PCRは、最初の65°CRNA変性段階が省略されたものである熱安定性TaqDNAポリメラーゼ及びTthポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する一酵素システムと、AMV逆転写酵素及びTaqDNAポリメラーゼを使用した2つの酵素システムとで記載される。最高の感度を維持するために、cDNA合成前に、RNAが分解されないことが重要である。前述のように、1段階逆転写PCRプロトコルでのRNaseHの存在は、逆転写酵素のための基質として作用することができる前に、RNA:DNAプライマーハイブリッドの所望しない分解の原因になることがある。本明細書に記載された変形されたRNaseHは、逆転写のために必要な温度、すなわち、約45ないし55°Cで。RNaseHエンドヌクレアーゼ触媒的活性を不活性化させることによって、このような問題を解決する。例えば、本明細書に使用されたホットスタートRNaseH活性は、塩基性条件下で、cis-アコニット酸無水物とRNaseHとの反応後に生成された可逆的化学的変形を有したRNaseHであってもよい。変形された酵素は、Tris基礎バッファーとの反応に使われ、温度が95°Cまで上昇されれば、溶液のpHが下がり、RNaseH活性が回復される。この方法は、逆転写の開始前に、反応混合物のうちRNaseHを含むことを許容する。リアルタイム逆転写PCRの第1段階は、テンプレート特異的なDNAプライマーのうち一つを使用して、相補的なDNA鎖を生成するのである。従来のPCR反応において、この産物は変性され、第2テンプレート特異的プライマーがcDNAに結合し、デュプレックスDNAを形成するために伸張される。この産物は、その後、PCR増幅の次の段階で増幅される。用語ポリメラーゼ連鎖反応PCRは、試料において、標的ポリヌクレオチドのセグメントの濃度を上昇させるために、当業界で周知の増幅のための方法を意味し、前記試料は、単一ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、PCR過程は、試料、緩衝剤、熱安定性DNAポリメラーゼ、標的核酸配列、dNTP4種のジオキシヌクレオチドdATP,dCTP,dGTP及びdTTPそれぞれ、及び試料の二重鎖標的配列の反対側鎖に相補的なプライマーを含む10ないし100ml反応混合物に、モル過糧molarexcessの2種以上の伸張可能なオリゴヌクレオチドプライマーを導入する段階で構成される。反応混合物を、DNAポリメラーゼの存在下で、熱サイクリングのプログラムに適用し、その結果、DNAプライマーによって取り囲まれたflank所望の標的配列が増幅される。1つのPCR反応は、ポリヌクレオチド分子の変性と合成との約5ないし約100サイクルで構成されてもよい。PCR技術は、InnisらによるPCR:APracticalApproach,M.J.McPherson,etal.,IRLPress1991,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress1990、及びPCRTechnology:PrincipalsandApplicationsforDNAAmplification,H.A.Erlich,StocktonPress1989を含む数多くの文献に開示されている。PCRはまた、米国特許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書、同第4,800,159号明細書、同第4,965,188号明細書、同第4,889,818号明細書、同第5,075,216号明細書、同第5,079,352号明細書、同第5,104,792号明細書、同第5,023,171号明細書、同第5,091,310号明細書及び同第5,066,584号明細書を含んだ多くの米国特許にも記載されており、これらそれぞれは、本明細書に参照として挿入される。本明細書で使用される用語ヌクレオチドnucleotideは、リボース、アラビノース、キシロース及びピラノースのような糖、及びこれらの糖類似体fのC-1’炭素に連結されたヌクレオチド塩基を含む化合物を意味する。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体を含む。糖は、置換または非置換である。代替されたリボース糖は、一つ以上の炭素原子、例えば、2’-炭素原子が同一であるか、あるいは異なるCl、F、-R、-OR、-NR2またはハロゲン基のうち一つ以上によって置換され、それぞれのRは独立して、H、C1-C6アルキル基またはC5-C14アリール基であるリボースを含むが、これらに限定されるものではない。例示的なリボースは、2’-C1-C6アルコキシリボース、2’-C5-C14アリールオキシリボース、2’,3’-ジデヒドロリボースdidehydroribose、2’-デオキシ-3’-ハロリボース、2’-デオキシ-3’-フルオロリボース、2’-デオキシ-3’-クロロリボース、2’-デオキシ-3’-アミノリボース、2’-デオキシ-3’-C1-C6アルキルリボース、2’-デオキシ-3’-C1-C6アルコキシリボース及び2’-デオキシ-3’-C5-C14アリールオキシリボース、リボース、2’-デオキシリボース、2’,3’-ジデオキシリボースdideoxyribose、2’-ハロリボース、2’-フルオロリボース、2’-クロロリボース、及び2’-アルキルリボース、例えば、2’-O-メチル,4’-α-アノマーヌクレオチド,1’-α-アノマーヌクレオチド,2’-4’-,3’-4’-連結された及び他のロックドlockedまたはLNA二重環糖変形を含むが、これらに限定されるものではない例えば、PCT公開第WO98/22489号パンフレット、同第WO98/39352号パンフレット及び同第WO99/14226号パンフレット、並びに米国特許第6,268,490号明細書及み同第6,794,499号明細書参照。本明細書で使用される用語核酸nucleicacidは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、変形されてよく、あるいは変形された塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、2ないし60個のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。ポリヌクレオチドは、2個以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは、第2鎖が第1オリゴヌクレオチドの逆相補的な配列であるオリゴヌクレオチドであるアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖DNA、ジオキシチミジンを含む単一鎖核酸重合体、単一鎖RNA、二重鎖RNAまたはRNA/DNAヘテロデュ二本鎖のうちいずれか一つであってもよい。核酸は、ゲノムDNA、RNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、miRNA、siRNA、断片化された核酸、ミトコンドリアや葉緑体のような細胞小器官から得た核酸、及び生物学的試料の内または上に存在する微生物やDNAまたはRNAのウイルスから得た核酸を含むが、これらに限定されるものではない。核酸は、例えば、RNA及びDNAの場合のように、単一型の糖部分や、RNA/DNAキメラの場合でのように、異なる糖部分の混合物から構成されもする。明細書で、ヌクレオチドA,C,及びGは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのうちいずれか一つであり、リボヌクレオチドA、リボヌクレオチドC及びリボヌクレオチドGは、オリゴヌクレオチドの配列で、それぞれrA、rC及びrGと表示される。標的DNA、標的RNA、標的核酸または標的核酸配列は、DNA増幅のために標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、PCR反応または逆転写酵素-PCR反応において、増幅のためのテンプレートとして作用する。標的核酸配列は、天然分子及び合成分子いずれも含んでもよい。例示的な標的核酸配列は、ゲノムDNAまたはゲノムRNAを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用される用語オリゴヌクレオチドは、時折プライマーまたはポリヌクレオチドpolynucleotideと互換的に使用される。用語プライマーは、PCR反応において、DNA合成の開始位置に作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、おおむね長さが約15個ないし約35個のヌクレオチドからなり、標的配列で、相補的な領域にハイブリダイゼーションされる。オリゴヌクレオチドは、当業界に公知の適切な方法例えば、化学的合成によって合成されて製造される。オリゴヌクレオチドはまた、商業的な出所を介して利便に利用することができる。用語アニーリング及びハイブリダイゼーションは、互換的に使われ、二本鎖、三本鎖または他の高次元構造の形成をもたらす1つの核酸と他の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。一部実施態様において、一次的な相互作用は、ワトソン/クリック及びフーグスティーン-類型水素結合によって、塩基特異的であり、例えば、A/T及びG/Cである。一部実施例で、塩基-スタッキング及び疎水性相互作用はまた、二本鎖安定性に寄与することができる。緩衝剤またはバッファーは、増幅反応のpHを調節することによって、増幅反応の一つ以上の構成要素の安定性、活性及び/または寿命を変形する、増幅反応に添加される化合物である。一部緩衝剤が当業界に周知されており、トリス、トリシン、3-N-モルホリノ--プロパンスルホン酸MOPS及び4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPESを含むが、これらに限定されるものではない。用語試料は、核酸分子を含む物質を意味する。添加剤は、組成物の一つ以上の構成要素の安定性、活性及び/または寿命を変形する、組成物に添加される化合物である。一部実施態様において、前記組成物は、増幅反応組成物である。一部実施態様において、添加剤は、汚染酵素を不活性化させてタンパク質ホールディングを安定化させ、かつ/または凝集を減少させる。増幅反応に含まれる例示的な添加剤は、ベタイン、ホルムアミド、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、NaCO32、LiCl、MnOAc、NMP、トレハロース、ジメチルエチルスルホキシドDMSO、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトールDTT、ピロホスファターゼテルモプラズマアキドピルム無機ピロホスファターゼTAPを含むが、これに限定されるものではない、牛胎児血清アルブミンBSA、プロピレングリコール、グリシンアミド、CHES、Percoll、アウリントリカルボン酸、トゥイーン20、トゥイーン21、トゥイーン40、トゥイーン60、トゥイーン85、Brij30、NP-40、トリトンX-100、CHAPS、CHAPSO、マッケルニウムMackernium、LDAON-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、Zwittergent3-10、Xwittergent3-14、XwittergentSB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、E.ColiSSB、RecA、切断するnickingエンドヌクレアーゼ、7-デアーザG、dUTP、UNG、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、ステロール、浸透調節物質、陽イオン、増幅の効率を変化させることができるその他化学物質、タンパク質、または補助因子cofactorを含むが、これらに限定されるものではない。一部実施態様において、2個以上の添加剤が増幅反応に含まれる。本明細書で使用されたDNAポリメラーゼ活性は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する酵素活性を意味する。一般的に、前記酵素は、核酸テンプレート配列にアニーリングされたプライマーの3’末端で合成を始め、テンプレート鎖5’末端に向かって進むのである。公知されたDNAポリメラーゼは、例えば、ピューロコッカスフリオススPyrococcusfuriosusPfuDNAポリメラーゼLundbergetal.,1991,Gene,108:1、E.coliDNAポリメラーゼILecomteandDoubleday,1983,NucleicAcidsRes.11:7505、T7DNAポリメラーゼNordstrometal.,1981,J.Biol.Chem.256:3112、サーマスサーモフィルスThermusthermophilusTthDNAポリメラーゼMyersandGelfand1991,Biochemistry30:7661、バシラスステアロサーモフィラスBacillusstearothermophilusDNAポリメラーゼSteneshandMcGowan,1977,BiochimBiophysActa475:32、サーモコッカスリトラリスThermococcuslitoralisTliDNAポリメラーゼVentDNAポリメラーゼともいう、Carielloetal.,1991,NucleicAcidsRes,19:4193、9°NmDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsから断種された製品、サーモトガマリティマThermotogamaritimaTmaDNAポリメラーゼDiazandSabino,1998BrazJ.Med.Res,31:1239、サーマスアクアティクスThermusaquaticusTaqDNAポリメラーゼChienetal.,1976,J.Bacteoriol,127:1550、ピューロコッカスコダカラエンシスPyrococcuskodakaraensisKODDNAポリメラーゼTakagietal.,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:4504、JDF-3DNAポリメラーゼPatentapplicationWO0132887、及びピューロコッカスPyrococcusGB-DPGB-DDNAポリメラーゼJuncosa-Ginestaetal.,1994,Biotechniques,16:820を含む。前述の酵素ポリメラーゼ活性は、当業界で周知の手段で決定されもする。本発明によれば、DNAポリメラーゼ1ユニットは、最適温度で例えば、PfuDNAポリメラーゼの場合、72°C30分間、10ナノモルの全dNTPの重合形態への結合を触媒する酵素の量と定義される。用語逆転写酵素活性及び逆転写は、テンプレートとしてRNA鎖を使用し、DNA鎖すなわち、相補的なDNA、cDNAを合成することができるRNA依存的DNAポリメラーゼとして特徴される1種のポリメラーゼの酵素活性を意味する。逆転写酵素-PCRは、DNA依存的DNAポリメラーゼプライマー延長の複数サイクル前に、単一鎖DNA分子をまず生成するために、RNAテンプレート及び逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を使用するPCR反応である。マルチプルレックスPCRは、一般的に、単一反応において2種以上のプライマーを添加することによって、単一反応において1種以上の増幅された産物を生成するPCR反応を意味する。例示的な逆転写酵素は、米国特許第4,943,531号明細書に記載されたM-MLVMoloneymurineleukemiavirusRT、米国特許第5,405,776号明細書に記載されたRNaseH活性が欠如したM-MLV-RTの突然変異形態、BLVbovineleukemiavirusRT、RSVRoussarcomavirusRT、AMVavianmyeloblastosisvirusRT、及び米国特許第7,883,871号明細書に開示された逆転写酵素を含むが、これらに限定されるものではない。PCR増幅のために、本発明において使用された酵素は、望ましくは熱安定性である。用語熱安定性は、熱に安定しており、熱抵抗的であり、例えば、50°Cないし90°Cの高温で機能する酵素を意味する。本発明による熱安定性酵素は、増幅反応に効果的であるという単一基準を満足しなければならず、すなわち、前記酵素は、二重鎖ポリヌクレオチドの変性を行うために必要な時間の間、上昇された温度に露出されるとき、非可逆的に変性されることがあってはならない。これと係わって使用された非可逆的変性によって、酵素活性の永久的で完全な消失をもたらす過程を意味する。変性のために必要な加熱条件は、例えば、バッファー塩濃度、変性されるポリヌクレオチドの長さ及びヌクレオチド組成によって決定されるが、一般的に温度は、短いポリヌクレオチドについて、約85°Cないし約105°Cの範囲であり、時間は、温度とポリヌクレオチド長とに主に依存する時間の間、一般的に、短いポリヌクレオチドについては、0.25分、さらに長いDNA断片については、約4.0分の範囲である。バッファー塩濃度及び/またはポリヌクレオチドのGC組成が増加すれば、さらに高い温度が容認されもする。望ましくは、酵素は、約90°Cないし約100°Cで、非可逆的に変性されないのである。本発明によれば、非可逆的に変性されない酵素は、増幅反応の間に、約10以上、約25以上、または約50以上の機能や活性を保有する。一実施態様において、一つ以上のプライマーが標識されてよい。本明細書で使用された標識、検出可能な標識、またはマーカーまたは検出可能なマーカーは、明細書で互換的に使われ、ヌクレオチド、ヌクレオチド重合体または核酸結合因子に付着した化学的部分を意味し、前記付着は、共有結合性または非共有結合性であってもよい。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド重合体が、本発明の実施者に検出される。検出可能な標識は、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、有色分子、放射性アイソトープまたはシンチラントを含む。検出可能な標識はまた、有用なリンカー分子例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、HRP、タンパク質A、タンパク質G、抗体またはその断片、Grb2、ポリヒスチジン、Ni2、FLAGタグ、mycタグ、重金属、酵素例えば、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ及びルシフェラーゼを含む、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステル、染料及び熱量測定基質を含む。また、表面プラズモン共鳴検出の場合のように、質量の変化が検出可能な標識と見なされもするということを考慮することができる。当業者は、前記で述べられていない有用な検出可能な標識を容易に認識することができ、それらは、本発明の実施に利用されるであろう。1段階逆転写酵素-PCRは、分離した逆転写酵素-PCRに比べて、多くの長所を提供する。1段階逆転写酵素-PCRは、分離した逆転写酵素-PCRより反応混合物試薬と核酸産物との操作がそれほど要求されず例えば、2つの反応段階間で、成分または酵素の添加のために、反応チューブを開くこと、従って、労動強度が少なく、要求される人手時間personhourを短縮させる。1段階逆転写酵素-PCRはまた、試料をさらに少なく要求し、汚染の危険を減らす。1段階逆転写酵素-PCRの感度と特異性は、特定試料において、多くの遺伝子のうち1つの発現レベルの研究、または病原性RNAの検出に非常に適すると証明された。一般的にこのような過程は、cDNA合成を始めるための遺伝子特異的なプライマーの使用に限定された。このような逆転写酵素-PCR技法と組み合わされたリアルタイム検出によるPCR反応の動力学を測定する能力により、高い感度で、RNAコピー数を正確で精密に決定することができるようにする。これは、下記で説明する、5’蛍光発生ヌクレアーゼ分析Taq-Manまたはエンドヌクレアーゼ分析CataCleaveのような、蛍光二重標識されたハイブリダイゼーションプローブ技術によって、増幅過程間、PCR産物の蛍光モニタリング及び測定を介して、逆転写酵素-PCR産物を検出することによって可能になる。CataCleaveプローブを利用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイムPCR増幅後のアンプリコン検出は、労動と時間とを必要とする。リアルタイム方法は、PCR過程間の増幅をモニタリングするために開発された。このような方法は、一般的に、新たに合成されたDNAに結合する蛍光標識プローブまたは二重鎖DNAの間に挿入されると、蛍光放出が増加する染料を利用する。前記プローブは、一般的に標的がなければ、供与体放出が2つの発色団間の蛍光共鳴エネルギー移動FRET:fluorescenceresonanceenergytransferによって消光されるようにデザインされる。供与体発色団は、励起状態で、その対が近い距離にあれば、受容体発色団にエネルギーを伝達することができる。このような伝達は、常に非放射能性であり、双極子-双極子結合を介して起こるのである。発色団間の距離を十分に増大させるあらゆる過程は、FRET効率を低下させ、供与体発色団放出が放射能的に検出されもする。一般的な受容体発色団は、FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5及びTexasRedを含む。受容体発色団は、その励起スペクトルが。供与体の放出スペクトル、と重なるように選択される。このような結合対の例は、FAM-TAMRAである。また広範囲な供与体を消光させる非蛍光受容体もある。適切な供与体-受容体FRET対の他の例は、当業者に周知されている。PCRのリアルタイム検出のために使用されるFRETプローブの一般的な例は、分子ビーコンmolecularbeacon例えば、米国特許第5,925,517号明細書、TaqManプローブ例えば、米国特許第5,210,015号明細書及び同第5,487,972号明細書、及びCataCleaveプローブ例えば、米国特許第5,763,181号明細書を含む。分子ビーコンは、結合していない状態では、供与体と受容体発色団とが近辺に位置して供与体放出が低減する二次構造をプローブが形成するようにデザインされた単一鎖オリゴヌクレオチドである。適切な反応温度でビーコンは、構造が解体され、アンプリコンに特異的に結合する。いったん解体されるようになれば、供与体と受容体発色団との間の距離が増大し、FRETが逆転され、供与体放出が特化された機器を使用してモニタリングされる。TaqMan及びCataCleaveの技術は、利用されるFRETプローブが切断され、供与体と受容体発色団とがFRETを逆転させるように、十分に距離をとらせるという点で分子ビーコンと異なる。TaqMan技術は、5’末端で供与体発色団で標識され、3’末端で受容体発色団で標識された単一鎖オリゴヌクレオチドプローブを利用する。増幅のために使用されるDNAポリメラーゼは、5’->3’エキソヌクルレアーゼ活性を含まなければならない。TaqManプローブは、プライマーが結合すると同時に、アンプリコンの1つの鎖に結合する。DNAポリメラーゼがプライマーを伸張させれば、ポリメラーゼは、結局、結合されたTaqManプローブと対向することになる。このとき、ポリメラーゼのエキソヌクルレアーゼ活性は、Taq-Manプローブを、5’末端から始めて順次に分解する。前記プローブが分解されれば、プローブを含むモノヌクレオチドは、反応バッファーに放出される。供与体が受容体から遠く拡散し、FRETは逆転される。供与体からの放出は、プローブ切断を確認するために、モニタリングされる。TaqManが作用する方式のために特異的なアンプリコンが、PCRのサイクルごとに、ただ一回ずつ検出される。TaqMan標的部位を介したプライマーの伸張は、アンプリコンが次のPCRサイクルで変性されるまで、TaqManプローブの追加結合を阻む二重鎖産物を生成する。その内容について、本明細書に参照として含まれた米国特許第5,763,181号で、他のリアルタイム検出方法本明細書で、CataCleaveと記載を記載している。CataCleave技術は、プローブの切断が、ポリメラーゼ活性を有さない第2酵素によって行われるという点で、TaqManと異なる。CataCleaveプローブは、例えば、制限酵素やRNaseのような、エンドヌクレアーゼの標的な分子内の配列を有する。一実施例で、CataCleaveプローブは、プローブの5’末端及び3’末端がDNAで構成され、切断部位がRNAを含むものであるキメラ構造を有する。プローブのDNA配列部分は、両末端や内部に、FRET対として標識される。PCR反応は、RNA-DNAデュプレックスのRNA配列部分を特異的に切断するRNaseH酵素を含む図2参照。切断後、プローブの2つの半分は、反応温度で標的アンプリコンから分離され、反応バッファーに拡散する。供与体及び収容体が分離すれば、FRETは、Taq-Manプローブのような方式で逆転され、供与体放出がモニタリングされる。切断と分離は、追加的なCataCleave結合のための部位を再生する。このような方式で、プライマーがCataCleaveプローブ結合部位を介して伸張されるまで、単一アンプリコンが、複数回のプローブ切断の標的として作用することが可能である。CataCleaveプローブの標識化用語プローブは、特異的な核酸配列、例えば、標的核酸配列の相補的な領域と、配列特異的な方式でハイブリダイゼーションされるようにデザインされた特異的な部分を有するポリヌクレオチドを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが、約15個ないし約60個のヌクレオチド範囲にある。他の実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約18個ないし約30個のヌクレオチド範囲にある。オリゴヌクレオチドプローブの正確な配列と長さは、前記プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの属性に部分的に依存する。結合位置と長さは、特定の実施態様で、適切なアニーリング及び融解特性をなすように多様である。このようなデザイン選択をするための指針は、米国特許第5,763,181号明細書、同第6,787,304号明細書及び同第7,112,422号明細書に記載された、Taq-man分析またはCataCleaveを記載する多数の参照文献に見られ、その内容が全体として本明細書に参照として含まれる。プローブは、前述のように標識または検出可能な標識で標識されてよい。実施態様において、標識は、共有結合または非共有結合によって、プローブに付着された蛍光色素化合物である。本明細書で使用される、蛍光色素は、放出される光よりさらに短い波長の光による励起によって光を放出する蛍光化合物を意味する。用語蛍光供与体は、本発明に記載された分析で測定される光を放出する蛍光色素を意味する。さらに具体的には、蛍光供与体は、蛍光受容体によって吸収されるエネルギー伝達は、非放射能性を提供する。用語蛍光受容体は、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収する第2蛍光色素または消光分子を意味する。第2蛍光色素は、蛍光供与体から放出されたエネルギーを吸収し、蛍光供与体によって放出される光よりさらに長い波長の光を放出する。消光分子は、蛍光供与体によって放出されたエネルギーを吸収する。発光分子、望ましくは蛍光色素及び/または蛍光消光剤が、本発明の実施に使用され、前記発光分子は、例えば、AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、フルオレセイン、OregonGreen488、OregonGreen514、テトラメチルロダミン、ロダミンX、テキサスレッド染料、QSY7、QSY33、Dabcyl、BODIPYFL、BODIPY630/650、BODIPY6501665、BODIPYTMR-X、BODIPYTR-X、ジアルキルアミノクマリン、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPAEu3-AMCA及びTTHAEu3AMCAを含む。一実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブの3’末端ヌクレオチドは、ブロッキングされていたり、あるいは核酸ポリメラーゼによって、伸張することがないようになっている。このようなブロッキングは、プローブの末端3’位置に、レポーターまたは消光剤分子を付着させることによって利便に行われる。他の実施態様において、レポーター分子は、連結部分を介して、プローブの3’末端または5’末端への付着のために誘導体化された蛍光有機染料である。望ましくは、消光剤分子はまた、本発明の実施態様によっては蛍光であってもなくともよい有機染料である。例えば、本発明の望ましい実施態様において、前記消光剤分子は、非蛍光である。一般的に、消光剤分子が蛍光や非放射能性分解によって、レポーターから伝達されたエネルギーを単純に放出するか否かにかかわらず、前記消光剤の吸収バンドは、前記レポーター分子の蛍光放出バンドと実質的に重畳されなければならない。励起レポーター分子からエネルギーを吸収するが、放射性にエネルギーを放出しない非蛍光消光剤分子は、本発明で、発色性分子と呼ぶ。例示的なレポーター消光剤対は、フルオレセインを含んだキサンテン染料及びロダミン染料から選択されもする。このような化合物の多数の適切な形態が、オリゴヌクレオチドの付着のために、結合部位として、または結合官能基として利用されるフェニル部分に置換基を有し、幅広く商業的に入手可能である。蛍光化合物の他のグループは、アルファ位置またはベータ位置にアミノ基を有するナフチルアミンである。そのようなナフチルアミノ化合物に含まれるのは、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホネート、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート及び2-p-トウイジニル-6-ナフタレンスルホネートである。他の染料は、3-フェニル-7-イソシアナトクマリン、9-イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン;N-p-2-ベンゾオキサゾリルフェニルマレイミド;ベンゾオキサゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。一実施態様において、レポーター及び消光剤分子は、フルオレセイン及び非蛍光消光剤染料から選択される。下記参照文献によって例示されたように、オリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端に、レポーターまたは消光剤分子を付着させるための多くの連結部分及び方法論が存在する:Eckstein,editor,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproachIRLPress,Oxford,1991;Zuckermanetal.,NucleicAcidsResearch,15:5305-53211987オリゴヌクレオチドの3’チオール基;Sharmaetal.,NucleicAcidsResearch,19:301919913’スルフヒドリル;Giustietal.,PCRMethodsandApplications,2:223-2271993;Fungetal.,U.S.Pat.No.4,757,141AppliedBiosystems,FosterCity,Calif.から利用可能なAminolink..IIを介した5’ホスホアミノ基;Stabinsky、米国特許第4,739,044号明細書3’アミノアルキルホスホリル基;Agrawaletal.,TetrahedronLetters,31:1543-15461990ホスホロアミノ酸連結を介した付着;Sproatetal.,NucleicAcidsResearch,15:483719875’メルカプト基;Nelsonetal.,NucleicAcidsResearch,17:7187-719419893’アミノ基;など。ローダミン及び非蛍光消光剤染料はまた、例えば、Wooetal.,米国特許第5,231,191号明細書、及びHobbs,Jr.,米国特許第4,997,928号明細書で、固体相合成の開始時、オリゴヌクレオチドの3’末端に利便に付着する。固体支持体へのCataCleaveプローブの付着本発明の一部実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に付着することができる。互いに異なるプローブが固体支持体に付着し、試料で互いに異なる標的配列を同時に検出するために使用される。互いに異なる蛍光波長を有するレポーター分子は、互いに異なるプローブに使用され、従って、互いに異なるプローブに対するハイブリダイゼーションが別個に検出されもする。オリゴヌクレオチドプローブの固定化のための固体支持体の望ましい形態の例は、ポリスチレン、アビジンコーティングされたポリスチレンのビーズセルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル及び活性化されたデキストラン、調節された空隙ガラスCPG:controlledporeglass、ガラスプレート及びその交差結合されたhighlycrosslinkedポリスチレンを含む。このような固体支持体は、それらの化学的安定性、官能化functionalizationの容易さ及び望ましく定義された表面積のために、ハイブリダイゼーション及び診断研究に望ましい。CPG500,1000及び非膨脹、高い交差結合ポリスチレン1000のような固体支持体がそれらのオリゴヌクレオチド合成との適合性の観点で特に望ましい。オリゴヌクレオチドプローブは、反応溶液で、ガラス状に存在することができる。代案としては、オリゴヌクレオチドプローブは、多様な方式で固体支持体に付着することができる。例えば、該プローブは、固体支持体へのプローブの3’末端ヌクレオチドまたは5’末端ヌクレオチドの付着によって、固体支持体に付着することができる。しかし、該プローブは、前記固体支持体からプローブを分離させるリンカーによって固体支持体に付着することができる。該リンカーは、非常に望ましくは、長さが30個以上の原子であり、さらに望ましくは、長さが50個以上の原子である。固体支持体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般的に、プローブが30個以上の原子、さらに望ましくは、50個以上の原子によって、固体支持体から分離することを要求する。このような分離をなすために、リンカーは、一般的に、リンカーと3’ヌクルレオシドとの間に位置したスペーサを含む。オリゴヌクレオチド合成のために、リンカームarmは、ほぼ固体支持体からオリゴヌクレオチドを遊離させるために、塩基性試薬によって切断されるエステル結合によって、3’ヌクルレオシドの3’-OHに付着する。オリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に付着させるのに使用される多種のリンカーが当業界に知られている。該リンカーは、標的配列が固体支持体に付着したプローブにハイブリダイゼーションされることを有意的に妨害しない化合物で形成されもする。該リンカーは、自動化された合成によって、リンカーに容易に添加される単一重合体性homopolymericオリゴヌクレオチドで形成されもする。代案としては、官能化されたポリエチレングリコールのようなポリマーが、前記リンカーとして使用される。該ポリマーが、標的オリゴヌクレオチドにプローブがハイブリダイゼーションされることを有意的に妨害しないために、このようなポリマーは、単一重合体性オリゴヌクレオチドより望ましい。ポリエチレングリコールは、商業的に利用可能であり、有機及び水溶性の媒質いずれにも溶解可能であり、官能化しやすく、オリゴヌクレオチド合成及び合成後の条件下で、完全に安定しているので、特に望ましい。固体支持体、リンカー及びプローブ間の結合は、望ましくは、高温で塩基性条件下で、塩基性保護基を除去する間に切断しない。望ましい結合の例は、カルバメート及びアミド結合を含む。プローブの固定化は、当業界に周知されており、当業界で当業者であるならば、固定化条件を決定することができるであろう。本方法の一実施態様によれば、ハイブリダイゼーションプローブは、固体支持体に固定化される。オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに有利な条件下で、核酸の試料と接触される。ハイブリダイゼーションされていない状態では、蛍光標識は、消光剤によって消光される。標的にハイブリダイゼーションされれば、蛍光標識は、消光剤から分離して蛍光を出す。固体支持体へのハイブリダイゼーションプローブの固定化はまた、プローブにハイブリダイゼーションされた標的配列を試料から容易に分離可能にする。その後の段階で、分離された標的配列は、研究者の特別な必要性に合うように、当業界に周知の方法によって、固体支持体から分離されて加工例えば、精製、増幅される。CataCleaveプローブを使用した標的核酸配列のリアルタイム検出標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使用される図1及び図2参照。CataCleaveオリゴヌクレオチドプローブは、まず、選別された標的配列を含むPCRアンプリコン内で発見される配列に相補的なDNA及びRNA配列に合成される。一実施態様において、前記プローブは、FRET対で標識され、例えば、プローブの一末端は、フルオレセイン分子であり、他の末端は、非蛍光消光剤分子として標識される。その次に、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、熱安定性変形されたRNaseH活性、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションされるPCR増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチドプローブの存在の下で、標的ポリヌクレオチドで行われる。標的RNA配列の検出のために、反応混合物は、本明細書で記載された最初のcDNA合成段階のための逆転写酵素活性を含む。リアルタイムPCR反応の間、PCRアンプリコンとプローブとのハイブリダイゼーションは、RNaseH活性によって切断されるRNA:DNAヘテロ二本鎖を形成する。RNaseHによるプローブの切断は、蛍光消光剤から蛍光供与体を分離させ、試料での標的DNA配列のリアルタイム検出に相応するプローブの蛍光のリアルタイム増加をもたらす。一部実施態様において、リアルタイム核酸増幅は、約40PCR増幅サイクル以下で、単一標的DNA分子のリアルタイム検出が可能である。キット本発明はまた、試料での標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。該キットはまた、下記の品目を一つ以上含んでもよい:バッファー、使用説明書、及び陽性または陰性の対照群。該キットは、本明細書に記載された方法を遂行するために、適切な比率で共に混合した試薬の容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、本方法を遂行するとき、測定する段階を不要にさせる単位量の試薬を含む。該キットはまた、熱安定性ポリメラーゼ、熱安定性変形されたRNaseH、核酸標的配列を増幅させるために選別されたプライマー、及びリアルタイムPCR産物にアニーリングされ、本明細書に記載された方法論によって標的核酸配列の検出を可能にする標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチドプローブを含むが、これらに限定されない、リアルタイムPCRのための反応試薬を含む。キットは、2以上の標的核酸配列の検出のための試薬を含んでもよい。他の実施態様において、キット試薬は、生物学的試料からゲノムDNAまたはゲノムRNAの抽出のための試薬をさらに含んでもよい。キット試薬はまた、適用することができる場合、逆転写酵素-PCR分析のための試薬を含んでもよい。下記の実施例は、本発明による変形されたRNaseH酵素組成物を使用する方法を提示している。本実施例に記載された方法の段階は、限定することを意図するものではないと理解される。前述のところ以外に、本発明の追加的な目的及び長所は、本発明の範囲を制限することを意図しない実施例から明白になるであろう。実施例1.PfuRNaseHII切断分析プローブ:テンプレートの比率を変化させ、反応中のPfuの量を一定に維持し、PfuRNaseHIIの定量的切断活性を調査した。また、反応中のPfuの量を変化させ、プローブ:テンプレートの比率を一定に維持して活性を調査した。PfuRNaseHIIのアミノ酸配列は、配列番号1であり、下記に記載する。PfuRNaseHII活性は、下記のように測定した。それぞれ10X反応バッファー30ml、プローブ20pmol、多様なpmolのテンプレート、及びH2Oで300mlにした反応混合物を、64°Cで10分間インキュベーションし、その後、1mlのPfuRNaseHIIを添加した。反応バッファー、プローブ及びテンプレート組成物は、下記実施例2に記載する。フルオレセイン標識されたプローブのPfuRNaseHIIによる切断は、520nm490nmで励起の蛍光放出でモニタリングした。該結果を図11Aに示した。図11Aの結果は、プローブ:テンプレートの比率が上昇するほど、反応速度が速くなるということを示す。20:20pmolの比率では、反応が瞬間的であるが、それは、PfuRNaseHIIが基質より過剰量であるということを意味する。この比率が適切に設定されているか否かを決定するために、多様な濃度のPfuで実験を行った。その結果を、図11Bに示す。PfuRNaseHIIを1X反応バッファーで希釈した。PfuRNaseHIIが希釈されることにより、反応活性が低下した。1:200の希釈で、速度が時間と比例した。実施例2.PfuRNaseHIIの可逆的ホルムアルデヒド交差結合crosslinkingPfuRNaseHIIを、多様な濃度のホルムアルデヒドを使用したホルムアルデヒド交差結合に供した。下記の緩衝剤を使用した。交差結合バッファー:20mMHEPES、pH7.9、200mMKCl及び1mMEDTA2xRNaseHII保存バッファー:100mMTris-HCl、pH8.0、200mMNaCl及び0.2mMEDTA25mlの25mg/ml約50ODPfuRNaseHIIを、475mlの交差結合バッファー1.25mg/ml、約2.5ODに希釈した。PfuRNaseHIIを、下記表1のような条件の下で、氷上で交差結合に適用させた:その次に、反応混合物を37°C水槽で30分間インキュベーションした。混合物を氷上に配置し、各反応混合物に2mlの2MTris-HCI、pH8.0を添加した。反応が完了した後、2xRNaseHII保存バッファーであらかじめ平衡化させたG50マイクロスピンカロムを使用して反応混合物を精製し、その次に、-20°Cで保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。下記に記載された条件を利用し、前記表の各交差結合条件をテストするために、一連の等温切断反応を行った。タイプAの反応は、プローブに相補的な標的を含んでいない。タイプCの反応は、PfuRNaseHIIを含んでいない。RNaseHII活性は、活性化せずに50°C、及び15分間95°Cで活性化させた後で50°Cで測定した。PfuRNaseHIIによるフルオレセイン標識されたプローブの切断は、0ないし30分の時間で表示された分析温度で、510nm465nmで励起の蛍光放出でモニタリングした。実験の結果は図示され、Pfu交差結合条件番号4は、切断活性の抑制程度が最も大きく、95°Cで活性化された後、活性回復が最も大きいということが分かった。。図4Aは、0.75μlの13.8ホルムアルデヒドとPfuとの反応が、酵素の非存在下で観察されたところと類似しており、Pfu切断活性の抑制をもたらしたということを示す。模擬処理されたPfu試料の活性は、切断活性のベースラインを示す。95°Cで活性化した後、ホルムアルデヒド処理されたPfuの切断活性は、図4Bで表示された模擬処理されたレベルのほぼ50に回復した。図4B及び図4Cは、分析条件下で、テンプレートがなければ、プローブ切断が起きていないということを示している。実施例3:ホルムアルデヒド交差結合されたRNaseHIIを使用したサルモネラinvA増幅の検出ホルムアルデヒド交差結合されたPfuRNaseHIIの性能を、サルモネラinvACataCleavePCR実験を使用して測定した。処理されていないPfuRNaseHIIと、ホルムアルデヒド交差結合されたPfuRNaseHII実施例2の試料4とを、5ないし5x106コピーのサルモネラinvA遺伝子標的を検出するためのCataCleavePCR分析で機能する能力についてテストした。図5A及び図Bから分かるように、処理されていないPfuRNaseHII実施例2で試料1、図5の模擬処理されたPfuとホルムアルデヒド交差結合されたPfuRNaseHII実施例2で試料4、図5のホルムアルデヒド交差結合されたPfuとのPCR効率間に有意性のある差がない。Cp値は、処理されていないRNaseHIIと比較し、ホルムアルデヒド交差結合されたRNaseHIIに対して、約2.5ないし3個のサイクルほどさらに高かった。終点蛍光はまた、ホルムアルデヒド交差結合されたRNaseHIIを使用した増幅に対してさらに低かった。実施例4:PfuRNaseHIIの可逆的cis-アコニチン化PfuRNaseHIIを50:1ないし200:1モル比のcis-アコニット酸無水物対酵素の多様な濃度のcis-アコニット酸無水物を使用して、cis-アコニチン化させた図3参照アシル化のために、下記のバッファーを使用した。25mlの25mg/ml約50ODPfuRNaseHIIを、475mlのアシル化バッファー1.25mg/ml、約2.5ODに希釈し、アシル化反応物を氷上に配置した。反応混合物を、4°Cで約18時間インキュベーションさせた。反応混合物を、2xRNaseHII保存バッファーで事前に平衡化させたG50マイクロスピンカラムを使用して精製させた。各反応混合物を-20°Cで保管するために、同じ体積のグリセロールで希釈した。cis-アコニット酸無水物とRNaseHIIとのモル比、及び他のアシル化条件を下記表2に表示する。その次に、cis-アコニチン化されたPfuRNaseHIIのエンドヌクレアーゼ活性を、95°Cで15分間の熱処理再活性化下及び非処理の下、50°Cで決定した。下記RNaseHII分析混合物を、RNaseHII活性を測定するために使用した。結果は、図6A再活性化していない及び図6B再活性化したに表示する。該結果は、約200:1モル比のcis-アコニット酸無水物:酵素が、50°CでRNaseHIIの活性を完全に不活性化させるために必要であるということを示している。Tris-アセテート、pH8.4バッファーを使用して再活性化すなわち、95°Cで加熱を行った場合、使用されたあらゆる濃度のcis-アコニット酸無水物が、95°Cで15分後にRNaseHII活性をほぼ完全に再活性化させた。緩衝剤が再活性化に影響を及ぼすか否かを評価するために、1X反応バッファー実施例2に記載された組成物を使用するRNaseHII実験マスター混合物2を使用して、同一の再活性過程を行った。RNaseHII活性は、各サイクルごとに30秒の維持時間50°C60サイクルで測定した。結果記載せずは、HEPES-KOHpH7.8Tris-HClの代わりを含む反応バッファーがまた再活性化を行うことができるということを示している。実施例5:アシル化されたRNaseHIIを使用したサルモネラinvAの検出ホルムアルデヒド交差結合されたPfuRNaseHIIの性能実施例2の試料4を、サルモネラinvA及びCataCleavePCR分析を使用して測定した。増幅のためのマスター混合物は、以下である。分析は、pH8.4またはpH8.7で行った。図7ApH8.4及び図7BpH8.7の結果は、Tris-アセテートバッファーpH8.4または8.7を使用は、サルモネラinvACATACLEAVEqPCR分析で95°Cで15分熱処理含む、cis-アコニチン化されたPfuRNaseHIIのほぼ完全な再活性化を行うのに適するということを示している。また、約200:1モル比のcis-アコニット酸無水物:酵素が増幅で好ましく機能し、熱活性化なしに、最小のRNaseH活性を有するホットスタートPfuRNaseHIIを作るのに必要であって十分であるということが分かる。実施例6:HIV-1の一段階RTPCR増幅前記で準備したような可逆的に変形されたRNaseHIIは、特にウイルスRNA標的の一段階RTPCR増幅に使用するのに適する。変形された不活性RNaseHIIは、試料内の標的RNA分子を切断せずに、逆転写酵素がRNA核酸からウイルスcDNA分子を生成することができる。例示的な実施態様において、変形されたRNaseHIIが、HIV-1標的RNAを検出するのに使用される。実施例2の試料4組成物2及び実施例3の試料4組成物3を検出するために、変形されたRNaseHIIに使用した。比較のために、変形されていないPfuRNaseHIIを使用した組成物1。RT-PCR条件は下記の通りである:50°Cで30分95°Cで15分95°Cで30秒、60°Cで30秒及び72°Cで60秒のサイクル50回RNaseHIIのエンドヌクレアーゼ活性は、実施例2で記載した過程に沿って測定した。結果を図8に図示し、組成物1、組成物2、組成物3それぞれを使用し、RT-PCR産物で決定された蛍光を示している。図8に図示されたように、ホルムアルデヒド交差結合されたRNaseHIIより、アシル化されたRNaseHIIがより急激なカーブを示すが、これは、多分にアシル化されたRNaseHIIが、実施例で使用された条件下で、さらに十分に再活性されるからであろう。高温のインキュベーションによるホルムアルデヒド処理されたRNaseHII活性が十分であるか、あるいは完全な回復は、均等な試料でpHを変化させることによって、アシル化処理された酵素で観察されたところよりさらに低い。実施例7:可逆的にアシル化されたRNaseHIIの感度変形されたRNaseHIIの感度を決定するために、アシル化されたRNaseHII実施例3の試料4を使用し、HIV-1標的RNAの濃度が増幅組成物で異なるという点以外において、実施例6に記載されたところと同一の過程を遂行した。結果を図9に表示する。図9から分かるように、アシル化されたPfuRNaseHを含む一段階RTPCRは、HIV-1ゲノムRNAのわずか10個の注入コピーも検出することができた。陰性対照群では、いかなる増幅も観察されなかった。また反応は、濃度依存性を示した記載せず。実施例8:可逆的にアシル化されたRNaseHIIと変形されていないRNaseHIIとの比較RT-PCR条件は、下記の通りである:50°Cで30分95°Cで15分95°Cで30秒、60°Cで30秒、及び72°Cで60秒のサイクル50回約1,500個のヌクレオチドのサルモネラinvARNAを、T7/ポリメラーゼシステムを使用して合成した。RNAを定量し、106,105,104,103,102及び10コピー/μlの、既分注prealiquoted希釈でのコピー数によって標準化した。このような希釈は、使用するまで、およそ-80°Cで保管された。106,105,104,103,102及び10コピーinvARNA/μlをそれぞれ含む一段階RT-PCR増幅組成物前記一段階逆転写酵素-PCRCATACLEAVEバッファー6に表示された通りを、下記条件下でRT-PCRに供し、結果として得られる増幅産物の蛍光465ないし510nmを測定した。アシル化されたPfuRNaseHIIとして、実施例3の試料4を使用した。比較のために、実施例3試料4のアシル化されたPfuRNaseHIIではなく、変形されていないPfuRNaseHIIを含む同一の増幅組成物を使用した。結果は、図10に表示する。図10から分かるように、アシル化されたRNaseHIIを含む組成物は、約1,500個のヌクレオチドを有するサルモネラRNA標的核酸配列わずか10コピーを測定することができた。処理されていないPfuRNaseHIIを使用すると、大きなCpシフト約10回のサイクルと感度の低下10ないし100倍1ないし2ordersofmagnitudeが観察された。この実験は、RT反応が、活性RNaseHIIの存在下で行われると、その感度は、RNAテンプレートの分解のため大きく低下するということを示す。これは、リアルタイム反応のためのCp値の著しい増大と示される。本明細書で開示されたあらゆる特許、特許出願、公開またはその他開示資料は、その全体で本明細書に参照として含まれる。本明細書で参照として含まれるが、本明細書の定義、陳述またはその他開示資料と矛盾する資料またはその一部は、含まれた資料と本明細書の開示資料とが矛盾しない程度のみに含まれる。"