"ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの結晶性シュウ酸塩であって;該結晶性シュウ酸塩は:a11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20、および23.45±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物;ならびにb15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20、および23.73±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられる水和物から選択される、結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20、および23.45±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である、請求項1に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、ピーク位置が図1に示されるパターンのピーク位置に実質的に一致する粉末X線回折パターンによって特徴付けられる、請求項2に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、約162°C~約164°Cの範囲に及ぶ融点によって特徴付けられる、請求項2に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、図2に示されるものに実質的に一致する示差走査熱分析トレースによって特徴付けられる、請求項2に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20、および23.73±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられる水和物である、請求項1に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、ピーク位置が図3に示されるパターンのピーク位置に実質的に一致する粉末X線回折パターンによって特徴付けられる、請求項6に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、約162°C~約164°Cの範囲に及ぶ融点によって特徴付けられる、請求項6に記載の結晶性シュウ酸塩。前記結晶性シュウ酸塩は、図4に示されるものに実質的に一致する示差走査熱分析トレースによって特徴付けられる、請求項6に記載の結晶性シュウ酸塩。薬学的組成物であって、該薬学的組成物は:a請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩;およびb薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。薬学的組成物であって、該薬学的組成物は:a請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩;bステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物;およびb薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。肺の障害を処置する方法であって、該方法は、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩を患者に投与する工程を含む、方法。肺の障害を処置する方法であって、該方法は、a請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩;およびbステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を含む、方法。前記肺の障害は、慢性閉塞性肺疾患または喘息である、請求項12または13に記載の方法。哺乳動物において気管支拡張をもたらす方法であって、該方法は、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩を吸入によって該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。治療において使用するための、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩。肺の障害の処置において使用するための、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩。慢性閉塞性肺疾患または喘息の処置において使用するための、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩。医薬の製造のための、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の結晶性シュウ酸塩の使用。発明の概要本発明は、結晶性固体状態の形態であるビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルのシュウ酸付加塩に関する。そのような結晶性シュウ酸塩としては、結晶性シュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物、および結晶性シュウ酸塩水和物が挙げられる。本発明の特定の結晶性シュウ酸塩は、大気の水分にさらされる場合に、非潮解性であること、および受容可能な吸湿性特性を有することが見出されている。さらに、本発明の結晶性シュウ酸塩は、少なくとも約160°Cの比較的高い融点を有する。従って、1つの局面において、本発明は、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}-エチルピペリジン-4-イルエステルの結晶性シュウ酸塩を提供する。1つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、11.66±0.20、15.75±0.20、19.55±0.20、23.00±0.20、および23.45±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である。この結晶性の形態または多形は、Form1と指定されている。別の実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、15.32±0.20、16.90±0.20、19.25±0.20、および23.73±0.20の2θ値における回折ピークを含む粉末X線回折パターンによって特徴付けられる水和物である。この結晶性の形態または多形は、Form2と指定されている。1つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの結晶性シュウ酸塩を約1日~約5日の期間の間、約80相対湿度~約100相対湿度に曝すことによって調製される水和物である。別の局面において、本発明は、本発明の結晶性シュウ酸塩を含む組成物を提供する。1つの実施形態において、上記組成物は、a本発明の結晶性シュウ酸塩、およびb薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。別の実施形態において、上記組成物は、a本発明の結晶性シュウ酸塩;bステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物;およびc薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。別の局面において、本発明は、治療における使用のための本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。1つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害の処置において使用される。特定の実施形態において、上記肺の障害は、慢性閉塞性肺疾患である。別の特定の実施形態において、上記肺の障害は、喘息である。1つの実施形態において、本発明は、肺の障害を処置する方法を提供し、上記方法は、本発明の結晶性シュウ酸塩を患者に投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明は、肺の障害を処置する方法を提供し、上記方法は、a本発明の結晶性シュウ酸塩;およびbステロイド性抗炎症剤、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳動物において気管支拡張をもたらす方法を提供し、上記方法は、本発明の結晶性シュウ酸塩を吸入によって哺乳動物に投与する工程を含む。別の実施形態において、本発明は、医薬の製造における使用のための本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。本発明の他の局面および実施形態は、本明細書中に開示される。発明の詳細な説明本発明は、結晶性固体状態の形態であるビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルのシュウ酸付加塩そのイソプロパノール溶媒和物および水和物を含むに関する。本発明の結晶性シュウ酸塩は、1つまたはそれより多くのまったく異なったdistinct結晶性固体状態の形態として存在し得、本発明は、別段示されない限り、すべてのそのような形態形態の混合物を含むを包含する。1つの実施形態において、本発明は、本明細書中でForm1と称される、式Iの化合物のシュウ酸付加塩の結晶性シュウ酸塩の固体状態の第一の形態を提供する。Form1は、イソプロパノール溶媒和物の形態である。別の実施形態において、本発明は、本明細書中でForm2と称される、式Iの化合物のシュウ酸付加塩の結晶性シュウ酸塩の固体状態の第二の形態を提供する。Form2は、水和物である。式Iの化合物は、R配置を有する1つのキラル中心を含む。しかし、別段示されない限り、重大ではない量のS立体異性体が、本発明の組成物中に存在し得、ただし、上記組成物の任意の有用性は、全体として、そのような異性体の存在によって排除されないことが当業者によって理解される。式Iの化合物およびその中間体は、市販のMDL登録商標ISIS/DrawソフトウェアSymyx,SantaClara,CaliforniaのAutoNom機能を用いて名付けられている。定義本発明の化合物、組成物、方法、およびプロセスを記載する場合、以下の項目は、別段示されない限り、以下の意味を有する。用語融点は、最大吸熱熱流が示差走査熱分析によって観測される温度を意味する。用語微粉化または微粉化された形態では、粒子の少なくとも約90が約10μm未満の直径を有する粒子を意味する。用語溶媒和物は、溶質の1つまたはそれより多くの分子すなわち、式Iの化合物のシュウ酸塩と、溶媒の1つまたはそれより多くの分子との会合例えば、複合体または凝集体を意味する。代表的な溶媒としては、例として、水およびイソプロパノールが挙げられる。上記溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。用語治療上有効な量は、処置を必要とする患者に投与する場合に、処置を達成するために十分な量を意味する。用語処置することまたは処置は:a疾患または医学的状態が起こらないようにすること、すなわち、患者または被験体の予防的処置;b疾患または医学的状態を改善すること、すなわち、患者における疾患または医学的状態を排除するか、または患者における疾患または医学的状態の回帰を生じさせること;c疾患または医学的状態を抑制すること、すなわち、患者における疾患または医学的状態を遅くすること、または患者における疾患または医学的状態の発症を阻止すること;あるいは、d患者における疾患または医学的状態の症状を緩和することを意味する。用語単位剤形は、患者に投薬するために適した物理的に別々の単位、すなわち、単独または1つもしくはそれより多くのさらなる単位と組み合わせて治療効果を生み出すように計算された所定の量の治療剤を含む各単位を意味する。例えば、そのような単位剤形は、乾燥粉末吸入器のカプセル剤、定量吸入器からの定量、カプセル剤、錠剤、丸剤などであり得る。本発明の代表的な結晶性シュウ酸塩ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの結晶性シュウ酸塩は、少なくとも2つの異なる結晶性の形態で存在することが見出されている。本発明の目的のために、これらの形態は、本明細書中でForm1およびForm2と識別される。Form1は、約11.66±0.20、約15.75±0.20、約19.55±0.20、約23.00±0.20、および約23.45±0.20の2θ値において、他のピークの中でも顕著な回折ピークを有する粉末X線回折PXRDパターンによって特徴付けられるイソプロパノール溶媒和物である。Form1は、約162°C~約164°Cにおける例えば、約163.3°Cにおける吸熱熱流においてピークを示す示差走査熱分析DSCトレースを有する。Form1は、式Iの化合物のシュウ酸塩1モル当量当たり、約1モル当量~約2モル当量のイソプロパノールを含み、それには、約1.25モル当量~約1.75モル当量例えば、1.5モル当量が挙げられる。Form2は、約15.32±0.20、約16.90±0.20、約19.25±0.20、および約23.73±0.20の2θ値において、他のピークの中でも顕著な回折ピークを有する粉末X線回折PXRDパターンによって特徴付けられる水和物である。Form2は、約162°C~約164°Cにおける例えば、約162.6°Cにおける吸熱熱流においてピークを示す示差走査熱分析DSCトレースを有する。Form2は、式Iの化合物のシュウ酸塩1モル当量当たり、約1モル当量~約3モル当量の水を含み、それには、約1.5モル当量~約2モル当量が挙げられる。本発明の結晶性シュウ酸塩は、1モル当量の式Iの化合物当たり、約0.90モル当量と約1.10モル当量との間のシュウ酸を代表的に含み;1モル当量の式Iの化合物当たり、約0.95モル当量と約1.05モル当量との間のシュウ酸が挙げられる。特定の実施形態において、本発明のシュウ酸塩は、1モル当量の式Iの化合物当たり、約1モル当量のシュウ酸を含む。モル比は、従来の方法例えば、13CNMR、元素分析、イオン分析、またはHPLCを用いて決定される。本発明の結晶性シュウ酸塩は、代表的に、シュウ酸またはシュウ酸二水和物、およびビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルを用いて調製される。シュウ酸およびシュウ酸二水和物は、例えば、Sigma-Aldrich,St.Louis,MOから市販されている。本発明において用いられるビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}-エチルピペリジン-4-イルエステルは、下の実施例に記載される手順を用いて、または本願の背景のセクションに記載された同一人に譲渡された米国出願に記載される手順を用いることによって、市販の出発物質および試薬から容易に調製され得る。本発明の結晶性シュウ酸塩を調製するための方法またはプロセスは、実施例において提供される。代表的に、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルは、希釈剤中、約0.90モル当量~約1.1モル当量例えば、1.0モル当量のシュウ酸またはシュウ酸二水和物と接触させられる。一般に、この反応は、約0°C~約60°Cの範囲に及ぶ温度において行われ;約20°C~約35°C例えば、約25°C~約30が挙げられる。この反応に適切な不活性希釈剤としては、必要に応じて水を含む、メタノール、イソプロパノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、反応混合物は、結晶化を容易にするために従来の装置を用いて音波処理され得る。本発明の結晶性シュウ酸塩を調製するプロセスは、主に特定の結晶性の形態を生成するために、必要に応じて種晶の使用を含み得る。例えば、Form2の種晶を用いることによって、結晶性シュウ酸塩水和物は、種晶と実質的に同じ形態すなわち、Form2を有して調製され得る。そのような種晶は、本発明の結晶性シュウ酸塩を初めに形成する場合に使用され得る、またはそれらは、結晶性の形態もしくは部分的に結晶性の形態を再結晶化するために使用され得る。代表的に、種晶は、撹拌せずに、そして冷却せずに、ゆっくりとした結晶化によって調製される。例示として、種晶を得るために、式Iの化合物は代表的に、溶解をもたらすのに十分な温度で希釈剤中に溶解される。例えば、式Iの化合物は、熱い、メタノール中10v/vの水中に溶解され、次に周囲温度に冷却される。この溶液は、ゆっくりと蒸発させられて、本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。得られた結晶は、濾過または他の従来の手段によって単離される。あるいは、種晶は、結晶性物質の以前の調製物から得られ得る。Form2の結晶性は、結晶性物質が、高い湿度の下で周囲温度にて保存される場合に向上することが見出されている。例えば、Form2のサンプルが84相対湿度で周囲温度にて保存される場合、結晶性はサンプルのPXRDパターンによって測定される際に、約5日の期間にわたって向上した。組成物、組み合わせ物、および製剤本発明の結晶性シュウ酸塩は、他の物質例えば、治療剤、キャリア、賦形剤、希釈剤、および溶媒などと組み合わせられて、組成物を形成し得る。1つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、キャリアまたは賦形剤とともに製剤化されて、薬学的組成物または製剤を形成し得る。そのような薬学的組成物は、代表的に、治療上有効な量の本発明の結晶性シュウ酸塩を含む。しかし、いくつかの場合において、上記薬学的組成物は、治療上有効な量より多い量例えば、濃縮されたバルク組成物;または治療上有効な量より少ない量例えば、複数単位投与を意図した単位剤形を含み得る。上記薬学的組成物は、代表的に、約0.01重量~約95重量の本発明の結晶性シュウ酸塩を含み、それには、例えば、約0.05重量~約30重量;または約0.1重量~約10重量が挙げられる。そのような薬学的組成物は、従来のキャリアまたは賦形剤を用いて調製され得る。特定のキャリアもしくは賦形剤、またはキャリアもしくは賦形剤の組み合わせの選択は、種々の要因例えば、投与の様式、または処置される疾患もしくは医学的状態に依存する。薬学的組成物を調製するための多くの適切なキャリアおよび賦形剤は市販されている。例えば、物質は、SigmaSt.Louis,MOから購入され得る。投与の特定の様式に適した薬学的組成物を調製するための手順および物質は、薬学的な技術分野例えば、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEdition,LippincottWilliamsWhite,Baltimore,Maryland2000;およびH.C.Anseletal.,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,7thEdition,LippincottWilliamsWhite,Baltimore,Maryland1999が挙げられるにおいて記載される。薬学的に受容可能なキャリアの代表的な例としては:1糖例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;2デンプン例えば、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプン;3セルロース、およびその誘導体例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース;4粉末トラガカント;5麦芽;6ゼラチン;7タルク;8凝脂、およびワックス例えば、ココアバター、および坐剤用ワックス;9液体油室温で例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油;10グリコール例えば、プロピレングリコール;11ポリオール例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール;12エステル例えば、オレイン酸エチル、およびラウリン酸エチル;13寒天;14緩衝剤例えば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム;15アルギン酸;16パイロジェン除去水;17等張食塩水;18リンガー溶液;19エチルアルコール;20リン酸緩衝溶液;21圧縮プロペラントガス例えば、クロロフルオロカーボン、およびヒドロフルオロカーボン;ならびに22薬学的組成物に用いられる非毒性の他の適合可能な物質が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物は、代表的に、本発明の結晶性シュウ酸塩を、薬学的に受容可能なキャリアおよび任意の他の任意選択の成分と完全におよび密に、混合すること、またはブレンドすることによって調製される。必要であれば、または所望される場合、得られた均一にブレンドされた混合物は次に、従来の手順および装置を用いて、錠剤、カプセル剤、丸剤、キャニスター、カートリッジ、ディスペンサーなどに成形され得るか、または充填され得る。1つの実施形態において、上記薬学的組成物は、吸入投与に適している。吸入投与のための薬学的組成物は、代表的に、エアゾールまたは粉末の形態である。そのような組成物は、一般に、吸入器送達デバイス例えば、定量吸入器MDI、乾燥粉末吸入器DPI、ネブライザー吸入器、または同様の送達デバイスを用いて投与される。特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、乾燥粉末吸入器を用いて吸入によって投与される。そのような乾燥粉末吸入器は、代表的に、上記薬学的組成物を、吸息中に患者の空気の流れair-streamに分散される流動性free-flowing粉末として投与する。流動性粉末組成物を達成するために、上記治療剤は、代表的に、適切な賦形剤例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸PLA、ポリラクチド-コ-グリコリドPLGA、またはそれらの組み合わせとともに製剤化される。代表的に、上記治療剤は、微粉化され、適切なキャリアと組み合わせられて、吸入に適した組成物を形成する。従って、1つの実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、微粉化された形態である。乾燥粉末吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、微粉化された形態での、ラクトースおよび本発明の結晶性シュウ酸塩を含む。そのような乾燥粉末組成物は、例えば、乾式粉砕されたラクトースを上記治療剤と組み合わせ、次に構成要素を乾式ブレンドすることによって作製され得る。上記組成物は次に、代表的に、乾燥粉末ディスペンサー、または乾燥粉末送達デバイスで使用するための吸入カートリッジもしくはカプセルへ充填される。吸入によって治療剤を投与することに適した乾燥粉末吸入器送達デバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的な乾燥粉末吸入器送達デバイスまたは製品としては、AeolizerNovartis;AirmaxIVAX;ClickHalerInnovataBiomed;DiskhalerGlaxoSmithKline;Diskus/AccuhalerGlaxoSmithKline;EasyhalerOrionPharma;EclipseAventis;FlowCapsHovione;HandihalerBoehringerIngelheim;PulvinalChiesi;RotahalerGlaxoSmithKline;SkyeHaler/CertihalerSkyePharma;TwisthalerSchering-Plough;TurbuhalerAstraZeneca;UltrahalerAventis;などが挙げられる。別の特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、定量吸入器を用いて吸入によって投与される。そのような定量吸入器は、代表的に、圧縮プロペラントガスを用いて、測定量の治療剤を放出する。従って、定量吸入器を用いて投与される薬学的組成物は、代表的に、液化プロペラント中に上記治療剤の溶液または懸濁物を含む。任意の適切な液化プロペラントは、ヒドロフルオロアルカンHFA例えば、1,1,1,2-テトラフルオロエタンHFA134a、および1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロ-n-プロパンHFA227;およびクロロフルオロカーボン例えば、CCl3Fを含んで用いられる。特定の実施形態において、上記プロペラントは、ヒドロフルオロアルカンである。いくつかの実施形態において、上記ヒドロフルオロアルカン製剤は、共溶媒例えば、エタノールまたはペンタン、および/または界面活性剤例えば、ソルビタントリオレエート、オレイン酸、レシチン、およびグリセリンを含む。定量吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、約0.01重量~約5重量の本発明の結晶性シュウ酸塩;約0重量~約20重量のエタノール;および約0重量~約5重量の界面活性剤を含み;残りはHFAプロペラントである。そのような組成物は、代表的に、上記治療剤、エタノール存在する場合、および上記界面活性剤存在する場合を含む適切な容器に、冷却または加圧されたヒドロフルオロアルカンを加えることによって調製される。懸濁物を調製するために、上記治療剤は、微粉化され、次に上記プロペラントと組み合わせられる。上記組成物は次に、定量吸入器デバイスの一部分を代表的に形成するエアゾールキャニスターに充填される。吸入によって治療剤を投与するのに適した定量吸入器デバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的な定量吸入器デバイスまたは製品としては、AeroBidInhalerSystemForestPharmaceuticals;AtroventInhalationAerosolBoehringerIngelheim;FloventGlaxoSmithKline;MaxairInhaler3M;ProventilInhalerSchering;SereventInhalationAerosolGlaxoSmithKline;などが挙げられる。別の特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、ネブライザー吸入器を用いて、吸入によって投与される。そのようなネブライザーデバイスは、代表的に、上記薬学的組成物をミストとしてスプレーさせ、そのミストを患者の気道に運ぶ高速の空気の流れを生み出す。従って、ネブライザー吸入器において使用するために製剤化される場合、上記治療剤は、適切なキャリアに溶解されて、溶液を形成し得る。あるいは、上記治療剤は、微粉化され、適切なキャリアと組み合わされて、微粉化された粒子の懸濁物を形成し得る。ネブライザー吸入器において使用するための代表的な薬学的組成物は、微粉化された形態での約0.05μg/mL~約10mg/mLの本発明の結晶性シュウ酸塩を含む等張水性懸濁物を含む。1つの実施形態において、上記溶液は、約4~約6のpHを有する。吸入によって治療剤を投与するのに適したネブライザーデバイスは、当該分野において記載され、そのようなデバイスの例は、市販されているものである。例えば、代表的なネブライザーデバイスまたは製品としては、RespimatSoftmistInhalalerBoehringerIngelheim;theAERxPulmonaryDeliverySystemAradigmCorp.;thePARILCPlusReusableNebulizerPariGmbH;などが挙げられる。所望される場合、本発明の結晶性シュウ酸塩は、1つまたはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与され得る。本発明のこの局面において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、他の治療剤と物理的に混合されて両方の剤を含む組成物を形成するか;または各剤は、同時もしくは逐次のいずれかで、患者に別個に投与されるかのいずれかである。例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、従来の手順および装置を用いて第二の治療剤と組み合わせられて、本発明の結晶性シュウ酸塩および上記第二の治療剤を含む組成物を形成し得る。さらに、上記治療剤は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられて、本発明の結晶性シュウ酸塩、第二の治療剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を形成し得る。この実施形態において、上記組成物の構成要素は、代表的に、混合されるか、またはブレンドされて、物理的混合物を作り出す。上記物理的混合物は次に、本明細書中に記載される経路のうちの任意のものを用いて患者に投与される。あるいは、上記治療剤は、患者への投与前に、別個およびまったく異なったままであり得る。この実施形態において、上記治療剤は、投与前には物理的に一緒に混合されていないが、別個の剤または組成物として、同時投与または逐次投与される。例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、各治療剤について別個の区画例えば、ブリスターパックを用いる吸入送達デバイスを用いて、別の治療剤とともに吸入によって同時投与または逐次投与され得る。あるいは、組み合わせ物は、別個の送達デバイス、すなわち、各治療剤について1つの送達デバイスを用いて投与され得る。さらに、上記治療剤は、異なる投与経路すなわち、1つは吸入によるものであり、もう1つは、経口投与によるものであるによって送達され得る。本発明の結晶性シュウ酸塩と適合可能な任意の治療剤は、そのような塩と組み合わせて使用され得る。特定の実施形態において、上記第二の治療剤は、吸入によって有効に投与されるものである。例示として、使用され得る治療剤の代表的なタイプとしては、抗炎症剤例えば、ステロイド性抗炎症剤コルチコステロイドおよびグルココルチコイドが挙げられる、非ステロイド性抗炎症剤NSAID、およびPDE4インヒビター;気管支拡張剤例えば、PDE3インヒビター、アデノシン2b調節因子、およびβ2アドレナリン作動性受容体アゴニスト;抗感染剤例えば、グラム陽性抗生物質、グラム陰性抗生物質、および抗ウイルス剤;抗ヒスタミン;プロテアーゼインヒビター;求心性遮断剤例えば、D2アゴニスト、およびノイロイキン調節因子;ならびにムスカリン性受容体アンタゴニスト抗コリン薬が挙げられるが、これらに限定されない。そのような治療剤の数多くの例は、当該分野において公知である。これらの他の治療剤についての適切な用量も当該分野において公知であり、代表的に、約0.05μg/日~約500mg/日の範囲に及ぶ。1つの実施形態において、上記第二の治療剤は、肺の障害を処置するために有用である。特定の実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。代表的なステロイド性抗炎症剤としては、ジプロピオン酸ベクロメタゾン;ブデソニド;ブチキソコルトプロピオネート;20R-16α,17α-[ブチリデンビスオキシ]-6α,9α-ジフルオロ-11β-ヒドロキシ-17β-メチルチオアンドロスタ-4-エン-3-オンRPR-106541;シクレソニド;デキサメタゾン;6α,9α-ジフルオロ-17α-[2-フラニルカルボニルオキシ]-11β-ヒドロキシ-16α-メチル-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17β-チオカルボン酸S-フルオロメチルエステル;6α,9α-ジフルオロ-11β-ヒドロキシ-16α-メチル-17α-[4-メチル-1,3-チアゾール-5-カルボニルオキシ]-3-オキソアンドロスタ-1,4-ジエン-17β-チオカルボン酸S-フルオロメチルエステル;6α,9α-ジフルオロ-11β-ヒドロキシ-16α-メチル-3-オキソ-17α-プロピオニルオキシアンドロスタ-1,4-ジエン-17β-チオカルボン酸S-2-オキソテトラヒドロフラン-3S-イルエステル;フルニソリド;フロ酸フルチカゾン;プロピオン酸フルチカゾン;メチルプレドニゾロン;フロ酸モメタゾン;プレドニゾロン;プレドニゾン;ロフレポニド;ST-126;トリアムシノロンアセトニド;など、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩および溶媒和物が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなステロイド性抗炎症剤は、市販されているか、または従来の手順および試薬を用いて調製され得る。例えば、ステロイド性抗炎症剤の調製および使用は、2003年3月25日に発行された米国特許第6,537,983号;2004年6月15日に発行された米国特許第6,750,210B2号;2004年7月6日に発行された米国特許第6,759,398B2号;2005年2月22日に発行された米国特許第6,858,596B2号;2006年9月5日に発行された米国特許第7,101,866B2号;およびそれらにおいて引用された参考文献に記載されている。上記ステロイド性抗炎症剤は、用いられる場合、代表的に、本発明の結晶性シュウ酸塩と共投与される場合に治療上有益な効果を生み出す量で投与される。代表的に、上記ステロイド性抗炎症剤は、1用量当たり約0.05μg~約500μgの上記剤を提供するために十分な量で投与される。代表的な薬学的組成物としては、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない:A.乾燥粉末組成物本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩100mgは、乾式粉砕されたラクトース25gとブレンドされる。このブレンドされた混合物は次に、はがすことができるブリスターパックの個々のブリスターへ、1用量当たり約10μg~約500μgの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で充填される。ブリスターの中身は、乾燥粉末吸入器を用いて投与される。B.乾燥粉末組成物本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩1gは、乾式粉砕されたラクトース200gとブレンドされて、1:200の結晶性シュウ酸塩:ラクトースの重量比を有するバルク組成物を形成する。ブレンドされた組成物は、1用量当たり約10μgと約500μgとの間の本発明の結晶性シュウ酸塩を送達することが可能な乾燥粉末吸入デバイスへパックされる。C.乾燥粉末組成物本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩100mgおよび微粉化されステロイド性抗炎症剤500mgは、乾式粉砕されたラクトース30gとブレンドされる。このブレンドされた混合物は次に、はがすことができるブリスターパックの個々のブリスターへ、1用量当たり約10μg~約500μgの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で充填される。ブリスターの中身は、乾燥粉末吸入器を用いて投与される。D.定量吸入器組成物本発明の微粉化された結晶性シュウ酸塩10gは、脱塩水200mL中にレシチン0.2gを溶解させることによって調製された溶液中に分散される。得られた懸濁物は、スプレー乾燥され、次に微粉化されて、約1.5μmよりも小さい平均直径を有する粒子を含む微粉化された組成物を形成する。上記微粉化された組成物は次に、定量吸入器によって投与される場合に、1用量当たり約10μg~約500μgの本発明の結晶性シュウ酸塩を提供するために十分な量で、加圧された1,1,1,2-テトラフルオロエタンを含む定量吸入器カートリッジに充填される。有用性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}-エチルピペリジン-4-イルエステルは、β2アドレナリン作動性受容体アゴニストおよびムスカリン性受容体アンタゴニストの両方の活性を有し、従って、本化合物のシュウ酸塩は、β2アドレナリン作動性受容体またはムスカリン性受容体によって媒介される医学的状態、すなわち、β2アドレナリン作動性受容体アゴニストまたはムスカリン性受容体アンタゴニストでの処置によって改善される医学的状態を処置するための治療剤として有用であることが予期される。そのような医学的状態は、例えば、Eglenetal.,MuscarinicReceptorSubtypes:PharmacologyandTherapueticPotential,DNP108,462-4691997;Emilienetal.,CurrentTherapeuticUsesandPotentialofbeta-AdrenoceptorAgonistsandAntagonists,EuropeanJ.ClinicalPharm.,536,389-4041998;およびそこに引用される参考文献の教示によって例示されるように当該分野において公知である。例えば、そのような医学的状態としては、例示として、可逆的な気道閉塞に関連する肺の障害または疾患例えば、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支炎、気腫、肺の線維症などが挙げられる。慢性閉塞性肺疾患、すなわちCOPDは、Barnes,ChronicObstructivePulmonaryDisease,N.Engl.J.Med.,2000:343:269-78、およびそこに引用される参考文献の教示によって例示されるように、多様な呼吸状態慢性閉塞性気管支炎および気腫が挙げられるを含むことが、当該分野において公知である。他の状態としては、早産、うつ病、うっ血性心不全、皮膚疾患例えば、炎症性、アレルギー性、乾癬性、および増殖性の皮膚疾患、消化の酸性度を下げることが望ましい状態例えば、消化性潰瘍化および胃潰瘍化、および筋肉消耗性疾患musclewastingdiseaseが挙げられる。1つの局面において、本発明は、治療において使用するための、本発明の結晶性シュウ酸塩を提供する。例えば、本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害例えば、慢性閉塞性肺疾患、または喘息を処置するために使用され得る。本発明の結晶性シュウ酸塩は、肺の障害を処置するために使用される場合、処置を必要とする患者に投与される。1つの実施形態において、上記結晶性シュウ酸塩は、吸入によって投与される。本発明の結晶性シュウ酸塩は、1日当たり複数用量例えば、1日2回または1日3回、1日当たり1用量例えば、毎日、1週間当たり単一用量、または必要とされる通りに投与され得る。一般に、肺の障害を処置するための用量は、約10μg/日~約1,000μg/日の範囲に及ぶ。本発明の結晶性シュウ酸塩は、吸入によって哺乳動物に投与される場合、代表的に、気管支拡張をもたらし、従って、本発明の結晶性シュウ酸塩は、哺乳動物例えば、ヒト、イヌ、モルモット、ラットなどにおいて気管支拡張をもたらすための剤として有用である。この実施形態において、本発明の結晶性シュウ酸塩は、代表的に、気管支拡張をもたらす量で、吸入によって哺乳動物に投与される。一般に、気管支拡張をもたらすための用量は、約0.25μg/kg~約20μg/kgの範囲に及ぶ。本発明の結晶性シュウ酸塩は、治療剤として用いられる場合、必要に応じて、1つまたはそれより多くの他の治療剤と組み合わせて投与される。特に、本発明の結晶性シュウ酸塩をステロイド性抗炎症剤とともに投与することによって、三重の肺の治療、すなわち、β2アドレナリン作動性受容体アゴニスト活性、ムスカリン性受容体アンタゴニスト活性、および抗炎症性活性が、たった2つの治療剤を用いて達成され得る。2つの治療剤を含む薬学的組成物および組み合わせ物は、代表的に、3つの治療剤を含む組成物と比較して、製剤化することおよび/または投与することがより容易であるので、そのような2つの構成要素の組成物は、3つの治療剤を含む組成物よりも著しい利点を提供する。従って、特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物、組み合わせ物、および方法は、ステロイド性抗炎症剤またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物をさらに含む。本発明の結晶性シュウ酸塩の特性および有用性は、当業者に公知である種々のインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて実証され得る。例えば、代表的なアッセイは、以下の実施例において記載される。実施例以下の実施例を本発明の種々の代表的な実施形態および局面を例示するために提供し、具体的に示されない限り、あらゆる様式において本発明の範囲を限定することは意図されない。以下の実施例において使用される全ての試薬、出発物質、および溶媒を商業的供給業者例えば、Sigma-AldrichChemicalCompany,St.Louis,MOから購入し、別段示されない限り、さらなる精製なしで使用した。以下の略語を希釈剤に使用する。:DCM=ジクロロメタン;DMF=N,N-ジメチルホルムアミド;DMSO=ジメチルスルホキシド;EtOAc=酢酸エチル;MeOH=メタノール;およびTHF=テトラヒドロフラン。1HNMRスペクトルを、別段示されない限り、400MHzVarianAS400スペクトロメーターにおいて記録した。化学シフトを、内部標準としてのテトラメチルシランTMSに対して、ppmでのδ値として報告する。結合定数J値をヘルツHzで示し、多重度を以下の略語を用いて報告する:s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線、br=ブロード、nd=決定されない。液体クロマトグラフィー質量分光法LC-MS条件Agilent1100LiquidChromatographySystem-G1312ABinaryPumpAgilentTechnologies、ZORBAXRapidResolution3.5μmRx、Bonus-RPカラム3.5μmの粒径;2.1mm×50mmAgilentTechnologies、およびAPI150EXSingleQuadrupoleLC/MSMassSpectrometerPerkin-ElmerSciexInstrumentsを用いて、LC-MSデータを得た。使用した溶媒系は:溶媒A:98の水および2のアセトニトリルv/v1mL/LのTFA溶媒B:90のアセトニトリルおよび10の水v/v1mL/LのTFA流速:500μL/分勾配:方法10-90:3分間にわたって10のBから90のB方法2-90:3分間にわたって2のBから90のB方法10-70:3分間にわたって10のBから70のBであった。HPLC条件HP1100SeriesHPLCSystemAgilentTechnologies、およびZORBAXRapidResolution3.5μmRx、Bonus-RPカラム3.5μmの粒径;2.1mm×50mmAgilentTechnologies、またはAscentisExpressC18HPLCカラム2.7μmの粒径、3.0mm×3cmを用いて、HPLCを行った。使用した溶媒系は:溶媒A:98の水および2のアセトニトリルv/v1mL/LのTFA溶媒B:90アセトニトリルおよび10の水v/v1mL/LのTFA流速:500μL/分勾配:方法10-50:6分間にわたって10のBから50のB方法10-70:6分間にわたって10のBから70のB方法2-90:6分間にわたって2のBから90のBであった。実施例13-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]プロピオン酸の調製DCM500mL中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸ピペリジン-4-イルエステル50.0g、168.7mmol例えば、2006年2月16日に公開された米国特許公開第2006/0035931A1号を参照のことおよびアクリル酸15.1mL、219.3mmolの撹拌溶液を50°Cで一晩加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をMeOH600mL中に溶解させた。得られた溶液を75°Cで2時間加熱し、その後、室温で約48時間静置させた。得られた固体を濾過によって収集し、MeOHで洗浄し、乾燥させて表題化合物61.5g、99の収率を得た。実施例2メチル5-メチルアミノペンタノエート塩酸塩の調製水酸化ナトリウム水溶液4M、11.0mL、44.0mmol中の1-メチル-2-ピペリジノン4.40mL、40.0mmolの撹拌溶液を100°Cで15時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、その後、濃塩酸でpH2に酸性化した。上記混合物を次に、減圧下で濃縮して、桃色がかった白色固体として粗製5-メチルアミノペンタン酸を得た。粗製5-メチルアミノペンタン酸にMeOH40.0mL、987mmolおよび濃塩酸0.33mL、4.0mmolを加えた。得られた濁った溶液を60°Cで39時間加熱し、その時点でLC-MSは、残りの出発物質を示した。さらなる濃塩酸0.33mL、4.0mmolを加え、得られた混合物を60°Cで33時間加熱し、その後、65°Cでさらに24時間加熱した。LC-MSは、残りの出発物質を示した。反応混合物を減圧下で濃縮し、MeOH中の塩化水素の溶液1.25Mを残留物に加えた。得られた混合物を60°Cで72時間加熱し、その時点で残りの出発物質は、LC-MSによって観測されなかった。反応混合物を減圧下で部分的に濃縮し、形成された固体物質を濾過によって除去し、MeOHで洗浄した。濾液を次に、減圧下で濃縮して、メチル5-メチルアミノペンタノエート塩酸塩7.57g、100の収率を薄黄色固体として提供した。LC-MS方法2-90:保持時間1.10分;m/z146.4[MH].1HNMRCD3ODδ4.86s,3.66s,3.30t,3.00t,2.69s,2.41t,1.71m。実施例35-{3-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]プロピオニル}メチルアミノペンタン酸メチルエステルの調製DCM160mL中、メチル5-メチルアミノペンタノエート塩酸塩7.27g、40.0mmol、3-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]プロピオン酸13.3g、36.0mmolおよび1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール5.14g、37.8mmolと、2,6-ルチジン12.5mL、108mmolとの混合物を室温で3時間撹拌した。N-3-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩10.4g、54.0mmolを加え、得られた混合物を室温で2時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液約100mLを加え、層を分離した。水層をDCM50mLで抽出し、有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーヘキサン中30~100のEtOAc;次にDCM中2~10のMeOHによって精製して、表題化合物12.38g、69の収率を薄黄色の粘稠な油状物/白色固体として得た。LC-MS方法2-90:保持時間2.43分;m/z496.6[MH].1HNMRCDCl3δ8.10d,1H,7.40m,6H,7.20m,2H,6.58s,1H,4.74m,1H,3.66d,3H,3.37t,1H,3.29m,1H,2.97s,2H,2.91s,1H,2.70m,4H,2.49m,2H,2.34m,4H,1.92m,2H,1.60m,5H。実施例45-{3-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]プロピオニル}メチルアミノペンタン酸の調製5-{3-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]プロピオニル}-メチルアミノペンタン酸メチルエステル10.21g、20.60mmol、tert-ブチルアルコール20mL、および水20mLの混合物に、LiOH:水が1:1の混合物1.97g、41.2mmolを加えた。得られた混合物を室温で4時間撹拌し、次に上記混合物のpHを、塩酸水溶液1Nを用いて約pH2に調整した。水層をDCM2×約80mLで抽出し、有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物12.23g、定量的をオフホワイトの泡状固体残留tert-ブチルアルコールを含むとして得た。LC-MS方法2~90:保持時間2.32分;m/z482.4[MH]。実施例52-4-ニトロフェニル-1,3-ジオキソランの調製トルエン800mL中、p-ニトロベンズアルデヒド101.5g、672mmol、エチレングリコール112mLおよびp-トルエンスルホン酸12.8g、67.2mmolの撹拌溶液を、Dean-Starkトラップを備えたフラスコにおいて、120°Cで4時間加熱した。室温に冷却後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液800mLを加え、この混合物を室温で15分間撹拌した。得られた固体を濾過によって単離し、減圧下で乾燥させて表題化合物121.8g、92の収率を黄色固体として得た。1HNMRDMSO-d6:δ=8.12d,2H,7.59d,2H,5.78s,1H,3.8-4.0m,4H。実施例64-1,3-ジオキソラン-2-イルフェニルアミンの調製乾燥窒素下で、二酸化白金227mg、1.00mmolと炭酸水素ナトリウム420mg、5.00mmolとの混合物に、EtOH30.0mL中の2-4-ニトロフェニル-1,3-ジオキソラン976mg、5.00mmolの溶液を加えた。反応混合物を水素で15分間バブリングし、次に水素雰囲気バルーン下で2時間撹拌した。反応混合物を次に、MeOHで洗浄しながらCeliteのパッドを通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、表題化合物0.80g、96の収率を得た。実施例7ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-1,3-ジオキソラン-2-イル-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの調製DCM48.4mL中、5-{3-[4-ビフェニル-2-イルカルバモイルオキシピペリジン-1-イル]-プロピオニル}メチルアミノペンタン酸2.33g、4.84mmol、4-1,3-ジオキソラン-2-イルフェニルアミン800mg、5mmol、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン1.26mL、7.26mmolの撹拌溶液に、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール692mg、5.08mmol、およびN-3-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩1.39g、7.26mmolを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を次に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物3.04g、100の収率を黄色固体として得た。LC-MS方法10~70:保持時間2.67分;m/z629.6[MH]。実施例8ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-ホルミルフェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの調製塩酸水溶液1M、10mLおよびアセトニトリル10mL中のビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-1,3-ジオキソラン-2-イルフェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル3.04g、4.84mmolの撹拌混合物を50°Cで2時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液およびDCMを残留物に加えた。層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物2.83g、100の収率を得た。LC-MS方法10~70:保持時間2.67分;m/z585.4[MH]。実施例9ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-tert-ブチルジメチル-シラニルオキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの調製MeOH:DCMが1:1の混合物40.0mL、312mmol中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-ホルミル-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル2.83g、4.84mmol、および5-[R-2-アミノ-1-tert-ブチルジメチルシラニルオキシエチル]-8-ヒドロキシ-1H-キノリン-2-オン酢酸塩1.91g、4.84mmolの撹拌溶液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム3.08g、14.5mmolを加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、次に層を分離した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して黄色固体を得た。上記固体をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーDCM中0~30のMeOH0.5のNH4OHによって精製して、表題化合物3.60g、82の収率を黄色固体として得た。LC-MS方法10~70:保持時間2.72分;m/z903.8[MH]。実施例10ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルジトリフルオロ酢酸塩の調製DCM:DMFが9:1の混合物32.9mL中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-tert-ブチルジメチルシラニルオキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]-メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル3.60g、3.98mmolの撹拌溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩1.95mL、12.0mmolを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次に減圧下で濃縮した。残留物をHPLC方法10~70によって精製して、表題化合物1.90g、46の収率を白色固体として得た。LC-MS方法10~70:保持時間2.12時間;m/z789.6[MH]。実施例11ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル二フッ化水素酸塩の調製DCM20mLとDMF2.5mLとの混合物中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-tert-ブチルジメチルシラニルオキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]-メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル3.87g、4.28mmolの撹拌溶液に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩2.1mL、13mmolを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。DCM68mLを反応混合物に加え、次に、撹拌しながら、EtOAc68mLを滴下して加えた。薄い色の沈殿物が形成され、スラリーをもたらした。スラリー混合物を中程度の多孔度のフリット付きfrittedガラスフィルターを通して濾過し、濾過ケークをEtOAc2×10mLですすぎ、次に、窒素プレスでプレス乾燥pressdryonanitrogenpressさせて、表題化合物3.73g、99の収率を得た。実施例12ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルの調製MeOH中10の0.5Mの水酸化アンモニウムを含むDCM溶液150mLの合計溶液中のビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル二フッ化水素酸塩15.2g、16.7mmolの溶液を、MeOH中10の0.5Mの水酸化アンモニウムを含むDCM溶液200mLで前もって濡らされた粗いフリット付きガラス漏斗中のシリカゲル80g上に充填した。上記シリカゲルを、MeOH中20の0.5Mの水酸化アンモニウムを含むDCM溶液1×1000mLですすぎ;次にMeOH中25の0.5Mの水酸化アンモニウムを含むDCM溶液1×1000mLですすいだ。濾液を減圧下で濃縮して黄色のガラス状固体13.6gを得た。この物質をDCM600mL中に溶解させ、得られた溶液をフリット付きガラスフィルターを通して濾過し、フィルターをDCM3×150mLで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、油浴を用いて残留物を50°Cに温め、高い減圧下に一晩保持して表題化合物12.7g約6重量のDCMを含んだを提供した。実施例13結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物Form2の調製THF5mL、60mmol中のビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル0.50g、0.63mmolの撹拌溶液に、MeOH2mL、50mmol中のシュウ酸二水和物80mg、0.63mmolの溶液を滴下して加えた。オフホワイトの沈殿物は、すぐに、および5分の期間にわたって形成され、固体が凝集して粘着性のボールを形成した。反応混合物を次に、60°Cで2時間加熱し、その時点において、上記混合物は、非常に細かい粒子のオフホワイトの粘稠なスラリーを形成していた。この混合物をゆっくりと室温に冷却し、次に約72時間撹拌した。混合物を濾過する試みがなされたが、沈殿物のほとんどはフィルターを通り抜けた。濾液を次に、減圧下で濃縮して残留物を形成した。約1/4の残留物を除去し、MeOH中10v/vの水の、熱い溶液中に溶解させた。この溶液を室温に冷却したが、沈殿物は形成されなかった。上記溶液を次に静置させ、4日の期間にわたってゆっくりと室温で蒸発させ、そのことにより、ある複屈折を示す粒子を生じた。時折、音波処理をしながら、撹拌を5日の期間にわたって続けて、より良好な複屈折を示す物質の白色スラリーを形成した。この物質を濾過によって収集し、高い減圧下で室温にて2時間乾燥させて、表題化合物を得た。PXRDパターンは、この物質が結晶性または半結晶性であることを示した。実施例14結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物Form2の調製MeOH12.4mL中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]-メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル0.65g、0.824mmolの撹拌溶液に、水0.6mL中のシュウ酸二水和物104mg、0.824mmolの溶液を滴下して加えた。わずかに粘着性の沈殿物がすぐに形成され、実施例13からの種晶を加えた。得られたスラリーを室温で約72時間撹拌し、次に5分間音波処理した。上記スラリーを次に、30°Cで一晩撹拌した。上記スラリーを次に、0°Cに冷却し、30分間撹拌し、濾過して沈殿物を収集した。濾過ケークを1時間空気乾燥させ、次に、高い減圧下で室温にて2時間乾燥させて、表題化合物705mg、96の収率、>99の純度を得た。実施例15高い相対湿度へのForm2の曝露ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}-エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物約100mg;実施例14からを、ペトリ皿に置かれたフィルターペーパー上に広げた。上記ペトリ皿を、デシケーター内の、飽和塩化カリウム水溶液100mLより上の有孔プレートの上に置き、デシケーターをしっかりと密閉した。チャンバー内の相対湿度は、湿度計によって測定する場合に約84RHのままであった。3日後、固体をデシケーターから取り出した。この物質についてのPXRD、DSC、TGA、DMSのプロットを、それぞれ図4、5、6、および7に示す。実施例16結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物Form2の調製MeOH19mL中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル1.0g、1.27mmolの撹拌溶液に、水1.0mL中のシュウ酸二水和物160mg、1.269mmolの溶液を滴下して加えた。粘着性の黄色がかった沈殿物がすぐに形成された。反応混合物を40°Cで一晩加熱し、次に5分間音波処理した。反応混合物を次に、40°Cで18時間加熱し、0°Cに冷却し、沈殿物を濾過によって収集した。沈殿物を乾燥させて表題化合物1.05g、93の収率、>99の純度を得た。実施例17高い相対湿度へのForm2の曝露塩化カリウムの過飽和水溶液をデシケーターの底部で調製した固体のKClは、長くはげしい撹拌後に残った。秤量紙において、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物500mg、0.569mmol;実施例16からを広げ、上記秤量紙を、デシケーター内の、KCl溶液の上にある有孔プラスチックプレート上に置き、デシケーターを閉めた。KCl溶液の平衡蒸気圧に起因して、デシケーター内の相対湿度を84RHに維持した。3日後、5日後、および10日後にシュウ酸塩の一部におけるPXRDパターンを得た。PXRDパターンは、5日に至るまでシュウ酸塩の結晶性が向上することを示した。結晶性における変化は、5日間と10日間との間でわずかだった。実施例18結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物Form2の調製MeOH400mL中、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-キノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステル11.0g、13.9mmolの撹拌溶液に、水22mL中のシュウ酸二水和物1.758g、13.9mmolの溶液を滴下して加えた。粘着性の沈殿物がすぐに形成された。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に5分間音波処理した。反応混合物を次に、室温で48時間撹拌し、次に40°Cで8時間加熱した。反応混合物をゆっくり周囲温度に冷却し、次に30°Cで約72時間加熱した。沈殿物を濾過によって収集し、MeOH1×50mLで洗浄し、高い減圧下で一晩乾燥させて表題化合物11.6g、94の収率、>99の純度を得た。実施例19結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}-フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩イソプロパノール溶媒和物Form1の調製結晶性ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]メチル}フェニルカルバモイルブチル]-メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルシュウ酸塩水和物約40mgを、イソプロパノール中5v/vの水の溶液4mL中に懸濁し、得られたスラリーを200rpmで室温にて撹拌した。3日後、上記スラリーを吸引濾過によって濾過し、固体を空気中で乾燥させて表題化合物36mgを得た。この物質についてのPXRD、DSC、およびTGAスペクトルを、それぞれ図1、2、および3に示す。実施例20粉末X線回折RigakuMiniFlexX線回折計を用いて、粉末X線回折分析を実施した。X線源は、20kVの出力電圧および15mAの電流を有するCu-Kα放射線λ=1.54051Åであった。サンプルにおける強度を最大にするように設定された入射スリット、発散スリット、および散乱スリットを有するBragg-Brentano幾何学配置において、機器を作動した。測定について、少量の粉末5mg~25mgを単結晶シリコンサンプルホルダー上で穏やかにプレスして、滑らかな表面を形成し、X線曝露に供した。上記サンプルを2θ-2θモードで、1分間当たり0.03°のステップサイズおよび2.0°の走査スピードで、2θにおいて2°~40°で走査した。データ収集をRigakuStandard測定ソフトウェアVersion1.2.0.0によって制御し、Jadeソフトウェアversion7.5.1によって分析した。Form1およびForm2についての代表的な生の未処理PXRDパターンを、それぞれ図1および図4に示す。Form1およびForm2について、観測されたPXRD2-θピーク位置およびd-間隔を、それぞれ表1および2に示す約20以上の相対ピーク高Hを有するピークのみを列挙する。実施例21示差走査熱分析ThermalAnalystコントローラーを備えたTAInstrumentsModelQ-100モジュールを用いて、示差走査熱分析DSCを実施した。データを収集し、TAInstrumentsThermalSolutionsソフトウェアを用いて分析した。約2mgのサンプルを正確に計量し、ふた付きのアルミニウムパンに入れた。周囲温度から約300°Cまで10°C/分の線形加熱傾斜linearheatingrampを用いて、上記サンプルを評価した。使用中、DSCセルを乾燥窒素でパージした。Form1およびForm2についての代表的なDSCトレースを、それぞれ図2および図5に示す。上記DSCトレースにより、Form1およびForm2が約162°C~164°Cの範囲での融点を有して、優れた熱安定性を有することが実証される。実施例22熱重量分析高分解能を備えたTAInstrumentsModelQ-500モジュールを用いて熱重量分析TGAを実施した。データを収集し、TAInstrumentsThermalSolutionsソフトウェアを用いて分析した。約10mgの重さのサンプルを白金パンの上に置き、周囲温度から300°Cまで高分解な加熱速度で走査した。使用中、てんびんチャンバーおよび炉チャンバーを窒素流でパージした。Form1およびForm2についての代表的なTGAトレースを、それぞれ図3および図6に示す。実施例23動的水分収着判定Form2のサンプルについて、動的水分収着DMS判定水分収着-脱着プロフィールとしても公知であるを、VTI大気下微量てんびんatmosphericmicrobalance、SGA-100システムVTICorp.,Hialeah,FL33016を用いて実施した。約10mgのサンプルサイズを使用し、分析の開始時に湿度を周囲の値に設定した。代表的なDMS分析は、3つの走査からなった:5相対湿度RH/ステップの走査速度で、周囲から5RH、5RHから90RH、90RHから5RH。質量を、2分毎に測定し、サンプルの質量が5つの連続した点について0.01以内に安定している場合、RHを次の値/-5RHに変更した。Form2についての代表的なDMSトレースを図7に示す。図7のDMSトレースにより、Form2が5RH~90RHの湿度範囲において約1.6重量というほんのわずかな重量増を有したことが実証される。可逆的水分収着/脱着プロフィールにより、Form2が受容可能な吸湿性を有し、潮解性でないことが実証される。上記塩のPXRDプロフィールは、DMSの実験前および実験後で同様であり、このことは、水分収着および水分脱着のプロセスの間に物理的形態の変化が起こらなかったことを示唆した。生物学的アッセイおよび調製実施例AヒトM1、M2、M3、およびM4ムスカリン性受容体を発現する細胞からの細胞培養および膜調製それぞれクローン化ヒトhM1、hM2、hM3、およびhM4ムスカリン性受容体サブタイプを安定に発現するCHO細胞系を、10のFBSおよび250μg/mLのGeneticinを補ったHamsF-12培地において、コンフルエントに近い状態nearconfluencyまで増殖させた。上記細胞を、5のCO2、37°Cのインキュベーターにおいて増殖させ、dPBS中2mMのEDTAで取り上げたlifted。細胞を650×gでの5分間の遠心分離によって収集し、細胞ペレットを-80°Cで冷凍保存するか、または膜を、使用のためにすぐに調製した。膜調製物について、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁し、PolytronPT-2100組織破壊機disrupterKinematicaAG;20秒×2バーストburstで均質化した。粗製膜を、4°Cにて40,000×gで15分間遠心分離した。膜ペレットを次に、再懸濁バッファーで再懸濁し、Polytron組織破壊機で再度均質化した。膜懸濁物のタンパク質濃度を、Lowryら、1951,JournalofBiochemistry,193,265に記載される方法によって決定した。全ての膜を、アリコートで-80°Cにて凍結保存するか、またはすぐに使用した。調製されたhM5受容体膜のアリコートをPerkinElmer,Inc.Wellesley,MAから購入し、使用まで-80°Cで保存した。実施例Bムスカリン性受容体についての放射リガンド結合アッセイクローン化ムスカリン性受容体についての放射リガンド結合アッセイを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、100μLの合計アッセイ体積で実施した。hM1、hM2、hM3、hM4、またはhM5ムスカリン性サブタイプのいずれかを安定に発現するCHO細胞膜を、以下の特定の標的タンパク質濃度μg/ウェルhM1については10μg、hM2については10μg~15μg、hM3については10μg~20μg、hM4については10μg~20μg、およびhM5については10μg~12μgに、アッセイバッファー中に希釈して同様のシグナルcpmを得た。アッセイプレートの添加前に、Polytron組織破壊機を用いて上記膜を短時間均質化した10秒間。L-[N-メチル-3H]スコポラミンメチルクロリド[3H]-NMSTRK666,84.0Ci/mmol,AmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,Englandを0.001nM~20nMの範囲に及ぶ濃度で用いて、放射リガンドのKD値を決定するための飽和結合研究を実施した。試験化合物のKi値の決定のための置換アッセイを、1nMでの[3H]-NMSおよび11個の異なる試験化合物の濃度を用いて実施した。上記試験化合物を最初に、希釈バッファー中400μMの濃度へ溶解させて、次に希釈バッファーを用いて10pM~100μMの範囲に及ぶ最終濃度まで5倍連続希釈にした。添加の順序およびアッセイプレートに添加された体積は、以下の通りであった:25μLの放射リガンド、25μLの希釈した試験化合物、および50μLの膜。アッセイプレートを37°Cで6時間インキュベートした。結合反応を、1のBSAにおいて前もって処理されたGF/Bガラス繊維フィルタープレートPerkinElmer,Inc.を通して急速濾過によって終結させた。フィルタープレートを洗浄バッファー10mMのHEPESで3回すすいで、未結合の放射能を除去した。上記プレートを次に、空気乾燥させ、50μLのMicroscint-20液体シンチレーション流体PerkinElmer,Inc.を各ウェルに加えた。上記プレートを次に、PerkinElmerTopcount液体シンチレーションカウンターPerkinElmer,Inc.においてカウントした。結合データを、1部位競合モデルを用い、GraphPadPrismSoftwareパッケージGraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CAを用いて非線形回帰分析によって分析した。試験化合物についてのKi値を、Cheng-Prusoff式ChengY;PrusoffWH.1973BiochemicalPharmacology,2223:3099-108を用いて、放射リガンドの、観測されたIC50値およびKD値から計算した。Ki値をpKi値に変換して、相乗平均および95信頼区間を決定した。これらの概要的な統計を次に、データ報告のためにKi値に変換し直した。このアッセイにおいて、より低いKi値は、受容体について試験化合物がより高い結合親和性を有することを意味する。このアッセイにおいて、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]-メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、0.1nMデータを最も近い0.1nMに丸めたのhM3においてKi値を有した。実施例Cヒトβ1、β2、またはβ3アドレナリン作動性受容体を発現する細胞からの細胞培養および膜調製クローン化ヒトβ1およびβ2アドレナリン作動性受容体を安定に発現するヒト胚性腎HEK-293細胞系またはクローン化ヒトβ3アドレナリン作動性受容体を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞系を、500μg/mLのGeneticinの存在下で、10のFBSを補った、DMEMまたはHamsF-12培地において、コンフルエントに近い状態まで増殖させた。細胞単層をPBS中2mMのEDTAで取り上げた。細胞を1,000rpmでの遠心分離によってペレットにし、細胞ペレットを-80°Cで冷凍保存するか、または膜を、使用のためにすぐに調製した。β1およびβ2受容体を発現する膜の調製について、細胞ペレットを溶解バッファー4°Cにて、10mMのHEPES/HCl、10mMのEDTA、pH7.4に再懸濁し、氷上で、ぴったり合うtight-fittingDounce型ガラスホモジェナイザー30ストロークを用いて均質化した。よりプロテアーゼ感受性のβ3受容体を発現する膜について、50mLのバッファー当たり2mMのEDTAを有するCompleteProteaseInhibitorCocktailTabletRocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN1錠を補った溶解バッファー10mMのTris/HCl、pH7.4において、細胞ペレットを均質化した。ホモジェネートを20,000×gで遠心分離し、得られたペレットを、本明細書中に記載される通りに再懸濁および遠心分離することによって、溶解バッファーで1回洗浄した。最終ペレットを次に、氷冷結合アッセイバッファー75mMのTris/HClpH7.4、12.5mMのMgCl2、1mMのEDTA中に再懸濁した。膜懸濁物のタンパク質濃度を、Lowryetal.,1951,JournalofBiologicalChemistry,193,265;およびBradford,AnalyticalBiochemistry,1976,72,248-54に記載される方法によって決定した。全ての膜をアリコートで-80°Cにて凍結保存するか、またはすぐに使用した。実施例Dアドレナリン作動性受容体アゴニストの効力を決定するためのアッセイ製造者の指示に従って、[125I]-cAMPNENSMP004,PerkinElmerLifeSciencesInc.,Boston,MAを用い、FlashplateAdenylylCyclaseActivationAssaySystemを用いて、放射線免疫アッセイフォーマットでcAMPアッセイを実施した。このアッセイについて、クローン化ヒトβ1またはβ2受容体を安定に発現するHEK-293細胞系を、10のFBSおよびGeneticin500μg/mLを補ったDMEMにおいて、コンフルエントに近い状態まで増殖させるか;またはクローン化ヒトβ3アドレナリン作動性受容体を安定に発現するCHO-K1細胞系を、10のFBSおよびGeneticin250μg/mLを補ったHamsF-12培地において、コンフルエントに近い状態まで増殖させた。細胞をPBSですすぎ、2mMのEDTAまたはTrypsin-EDTA溶液0.05のトリプシン/0.53mMのEDTAを含むdPBSCaCl2およびMgCl2なしのDulbecco’sPhosphateBufferedSaline中で取り外した。Coulter細胞カウンターにおいて細胞をカウントした後、細胞を1,000rpmでの遠心分離によってペレットにし、前もって室温に温められたIBMXを含む刺激バッファーPerkinElmerKit中に再懸濁して1.6×106細胞/mL~2.8×106細胞/mLの濃度にした。1ウェル当たり、約40,000細胞~約80,000細胞をこのアッセイに使用した。試験化合物DMSO中10mMを、BeckmanBiomek-2000において、0.1のBSAを含むPBSに希釈し、100μM~1pMの範囲に及ぶ11個の異なる濃度において試験した。反応物を、37°Cで10分間インキュベートし、[125I]-cAMPNENSMP004,PerkinElmerLifeSciences,Boston,MAを含む冷検出バッファー100μLを加えることによって止めた。生成されたcAMPの量pmol/ウェルを、製造者の使用者マニュアルに記載される通りに、サンプルについて観測されたカウントおよびcAMP標準に基づいて計算した。シグモイド式sigmoidalequationを用い、GraphPadPrismSoftwareパッケージGraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CAを用いて、非線形回帰分析によってデータを分析した。Cheng-Prusoff式ChengY,andPrusoffWH.,BiochemicalPharmacology,1973,22,23,3099-108を使用してEC50値を計算した。このアッセイにおいて、より低いEC50値は、試験した受容体において試験化合物がより高い機能的活性を有することを意味する。このアッセイにおいて、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]-メチル}フェニルカルバモイル-ブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、1nMデータを最も近い1nMに丸めたのhβ2においてEC50値を有した。実施例Eアイントホーフェンアッセイこのアッセイは、ラットにおいて、メタコリンMChにより誘導された気管支収縮に対して気管支保護を提供する試験化合物の能力を測定する。200gと350gとの間の体重のオスのSprague-DawleyラットHarlan,Indianapolis,INを、全ての研究に使用した。試験化合物またはビヒクル滅菌脱イオン水を、5mLの投薬溶液を用いて、パイ型pieshaped吸入チャンバーRSMolds,SanCarlos,CAにおいて、吸入IHによって10分の期間にわたって投薬した。ラットを、22psiの圧力下でBioblend5のCO2/95の大気によって駆動されたLCStarNebulizerSetModel22F51PARIRespiratoryEquipment,Inc.Midlothian,VAから生じたエアゾールに曝した。別段示されない限り、100μgの試験化合物をラットに投薬した。所定の時点において、120mg/kgのイナクチンチオブタバルビタールの腹腔内IP注射でラットに麻酔をかけた。動物が身体的刺激例えば、趾をつまむtoepinchに反応する場合、補充用量40mg/kg、IPを投与した。手術部位を剃り、首の腹面側の、1cm~2cmの正中切開を行った。頸静脈を分離し、食塩水が充填されたポリエチレンカテーテルPE-50を挿入してcannulatedMChのIV注入を可能にした。気管を切開して自由にしdissectedfree、14G針NE-014,SmallParts,MiamiLakes,FLを挿入した。気管のカニューレの配置後、1mL/100gの体重の一回拍出量しかし、2.5mLの体積を超えない、および1分間に90回の脈拍の速度に設定したレスピレータModel683,HarvardApparatus,Inc.,MAを用いて各ラットに換気を行わせた。T-コネクターを、レスピレータ呼気チューブに沿って置いて、BiopacTSD137C前置増幅器に接続されたBiopac変換器を用いて換気圧VPの変化の測定を可能にした。体温を、加熱パッドを用いて37°Cに維持した。AcknowledgeDataCollectionSoftwareSantaBarbara,CAを用いて、VPの変化を記録した。ベースラインの値を少なくとも2.5分間収集した。次にラットを40μg/kgおよび80μg/kgのMChの非累積静脈内IV注入により調べた。MChを、シリンジポンプsp210iw,WorldPrecisionInstruments,Inc.,Sarasota,FLから2mL/kg/分の速度で、2用量のMChの間で2分の間隔をあけて、2.5分間静脈内に注入した。対照動物と比較して、処置動物における通気圧cmH2Oの変化をMCh応答の阻害として表した。このアッセイにおいて、他の気管支収縮剤例えば、ヒスタミンおよびアセチルコリンを、MChの代わりに使用し得る。さらに、ラットの代わりにモルモットを使用し得る。このアッセイにおいて、MCh応答のより高い阻害は、試験化合物がより大きな気管支保護効果を提供したことを示す。24時間において、30よりも大きい阻害または30と等しい阻害は、作用の長い持続を示すものである。このアッセイにおいて、ビフェニル-2-イルカルバミン酸1-2-{[4-4-{[R-2-ヒドロキシ-2-8-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-5-イルエチルアミノ]-メチル}フェニルカルバモイルブチル]メチルカルバモイル}エチルピペリジン-4-イルエステルジトリフルオロ酢酸塩は、24時間において少なくとも約40の阻害を提供した。"