"哺乳動物のタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープを認識し特異的に結合する抗体、又はその機能性部分であって、該抗体又は抗体断片が可溶性及び不溶性タウタンパク質に対して高い結合親和性を有し、可溶性及び不溶性タウのレベルを調節する抗体又はその機能性部分。前記抗体又は抗体断片が、哺乳動物の脳内で可溶性及び不溶性タウのレベルを調節する、請求項1に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が、大脳皮質及び/又は海馬内で可溶性及び不溶性タウのレベルを調節する、請求項2に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が全可溶性タウタンパク質のレベルを減少させる、請求項1から3の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が可溶性リン酸化タウタンパク質のレベルを減少させる、請求項1から4の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が高リン酸化タウタンパク質を含む対らせん状細線維のレベルを減少させる、請求項1から5の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が全可溶性タウタンパク質、可溶性リン酸化タウタンパク質、及びpTau対らせん状細線維のレベルを減少させる、請求項1から6の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記哺乳動物がヒトである、請求項1から7の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも10nMの解離定数を有する、請求項1から8の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも5nM、少なくとも2nM、少なくとも1nM、少なくとも500pM、少なくとも300pM、少なくとも200pM、少なくとも100pMの解離定数を有する、請求項1から9の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が104M-1s-1以上、105M-1s-1以上、106M-1s-1以上の会合定数を有する、請求項1から10の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも4nMの解離定数と105M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から11の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも3nMの解離定数と106M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から12の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも2nMの解離定数と104M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から13の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも1nMの解離定数と105M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から14の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも200pMの解離定数と105M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から15の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が少なくとも100pMの解離定数と106M-1s-1以上の会合定数を持つ高結合親和性を有する、請求項1から16の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が、位置18にリン酸化TyrY18を含むタウaa15-20、位置409にリン酸化SerpS409を含むタウaa405-412、位置409にリン酸化SerpS409を含むタウaa405-411;位置212にリン酸化ThrpT212及び位置にリン酸化SerpS214を含むタウaa208-218;位置396にリン酸化SerpS396を含むタウaa393-401、位置396にリン酸化SerpS396を含むタウaa396-401、位置396にリン酸化SerpS396を含むタウaa394-400、位置404にリン酸化SerpS404を含むタウaa402-406、及び位置396にリン酸化SerpS396を含むタウaa393-400からなる群から選択されるエピトープに結合する、請求項1から17の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が位置18にリン酸化TyrY18を持つタウaa15-20を含むエピトープに結合する、請求項12又は13に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が位置409にリン酸化SerpS409を持つタウaa405-412を含むエピトープに結合する、請求項14又は15に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が位置409にリン酸化SerpS409を持つタウaa405-411を含むエピトープに結合する、請求項16又は17に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が位置396にリン酸化SerpS396を含むタウaa396-401を含むエピトープに結合する、請求項12に記載の抗体又はその機能性断片。前記抗体又は抗体断片が位置404にリン酸化SerpS404を含むタウaa402-406を含むエピトープに結合する、請求項12に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32、73、81、93、101、106に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも70、特に少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33、74、82、94、102、107に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR2;及び配列番号23、26、31、34、75、83、95、103、108に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも60、特に少なくとも70、特に少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン;及び/又は配列番号12、15、18、70、78、89、98に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19、71、79、90、99、115に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つ配列CDR2;及び配列番号14、17、20、72、80、91、100に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つ配列CDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から23の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも70同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR2及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも80同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から24の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも85同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも80同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも85同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも85同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を含む抗体ドメインを含む請求項1から25の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から26の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン抗体ドメイン、及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から27の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から28の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から29の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21、24、27、28、29、32に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22、25、30、33に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23、26、31、34に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号12、15、18に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13、16、19に示されるアミノ酸配列持つCDR2、及び配列番号14、17、20に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から30の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号21に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも76同一であるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号22に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号23に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号13に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも88同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から31の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号24に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも88同一であるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号25に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号12に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号13に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも88同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号14に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも66同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から32の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。CDR1が配列番号27に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも88同一であるアミノ酸配列を有する第一結合ドメインを含む、請求項33に記載の抗体又はその機能性断片。CDR1が配列番号28に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも88同一であるアミノ酸配列を有する第一結合ドメインを含む、請求項33に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号29に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号30に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号31に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号15に示されるアミノ酸配列を持つCDR1;配列番号16に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも94同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号17に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも36同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む請求項1から35の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号32に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号33に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号34に示されるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号18に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号19に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号20に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも63同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から36の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号73に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号74に示されるアミノ酸配列を持つCDR2,及び配列番号75に示されるアミノ酸配又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は配列番号70に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95、特に98、特に99同一であるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号71に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも94、95、96、97、98、又は99同一であるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号72に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から37の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号81に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号82に示されるアミノ酸配列を持つCDR2,及び配列番号83に示されるアミノ酸配又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号78に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号79に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号80に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から38の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号93に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号94に示されるアミノ酸配列を持つCDR2,及び配列番号95に示されるアミノ酸配又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号89に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号90に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号91に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から39の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号101に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号102に示されるアミノ酸配列を持つCDR2,及び配列番号103に示されるアミノ酸配又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号98に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号99に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号100に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から40の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号106に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号107に示されるアミノ酸配列を持つCDR2,及び配列番号108に示されるアミノ酸配又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号89に示されるアミノ酸配列を持つCDR1、配列番号115に示されるアミノ酸配列を持つCDR2、及び配列番号91に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100上記のCDRの何れか一に同一であるアミノ酸配列を持つCDR3を配列に含む第二結合ドメインを含む、請求項1から41の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号6、7、8、9、10、11に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号1、2、3、4、5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも85同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から42の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号6、7、8、9、10、11に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号1、2、3、4、5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも91同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から43の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号6、7、8、9、10、11に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン抗体ドメイン;及び/又は、配列番号1、2、3、4、5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも91同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から44の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号69、77、116/92、97、105に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン、及び/又は、配列番号68、76、88、96、104に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、特に少なくとも85、特に少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、特に少なくとも95、特に少なくとも96、特に少なくとも97、特に少なくとも98、特に少なくとも99又は100同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から45の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号6又は配列番号7に示されるアミノ酸配列又はそれに対してそれぞれ少なくとも90及び94同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号1に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも91同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から46の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号8に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号2に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から47の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号9に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号3に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から48の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号10に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも99同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号4に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも89同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から49の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。配列番号11に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも98同一であるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン;及び/又は、配列番号5に示されるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも87同一であるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む、請求項1から50の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。a.配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はb.配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はc.配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はd.配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はe.配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はf.配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はg.配列番号69に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号68に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はh.配列番号77に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号76に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はi.配列番号116に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号88に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はj.配列番号92に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号88に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はk.配列番号97に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメイン;又はl.配列番号105に示されるアミノ酸配列を含む第一結合ドメイン及び/又は配列番号104に示されるアミノ酸配列を含む第二結合ドメインを含む請求項1から51の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体又はその機能性断片である、請求項1から52の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。IgG2b、IgG2a又はIgG3アイソタイプのものである、請求項1から53の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片。請求項1から54の何れか一項に記載の抗体の結合ペプチド又はタンパク質。前記結合ペプチド、タンパク質抗体又は抗体断片が、哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に凝集したタウタンパク質のリン酸化エピトープを認識し特異的に結合するが、対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合しない、請求項1から55の何れか一項に記載の結合ペプチド又はタンパク質又は抗体又はその機能性断片。請求項1から56の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド。a.配列番号35-45に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子;b.配列番号35-45、配列番号84-87、配列番号109-112及び117-119に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも85の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;c.配列番号35-45、配列番号84-87、配列番号109-112及び117に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;d.配列番号35-45、配列番号84-87、配列番号109-112及び117-119に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;e.配列番号35-45、配列番号84-87、配列番号109-112及び117-119に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも98の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;f.a-fの何れかに記載の核酸分子にハイブリダイズする相補鎖の核酸配列を含む核酸分子;g.遺伝コードの縮重によって、a-gの何れかに定められた核酸配列から逸脱するヌクレオチド配列を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含み、a-gの何れかに定められた前記核酸配列が、哺乳動物、特にヒトタウタンパク質又はその断片のリン酸化エピトープ、特に病的タンパク質タウのコンフォーマーを認識し、特異的に結合するが、しかし対応する非リン酸化エピトープ及び/又は関連しないエピトープに結合せず、前記抗体が凝集タウタンパク質に対して高親和性を有し、可溶性及び不溶性のタウレベルを調節する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。請求項1から58の何れか一項に記載の結合ペプチド又はタンパク質、抗体又はその断片、又はポリヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを、薬学的に許容される担体と一緒に治療的有効量含有する薬学的組成物。哺乳動物のタウタンパク質の2つの異なるリン酸化エピトープを認識し結合する、請求項1から59の何れか一項に記載の少なくとも2つの結合ペプチド又はタンパク質、抗体又はその機能性断片、又はポリヌクレオチドを含む、請求項59に記載の薬学的組成物。異なるアミロイド形成タンパク質を認識し結合する更なる抗体又はその機能性断片を含む、請求項59又は60に記載の薬学的組成物。哺乳動物、特に治療を必要としているヒトにおいて治療に使用するための、特に、タウオパチーなどの神経変性疾患の治療に使用するための、請求項1から61の何れか一項に記載の抗体又はその機能性断片、結合ペプチド又はタンパク質、ポリヌクレオチド又は薬学的組成物、又はそれらの組み合わせ。実施例1:ハイブリドーマと抗体の産生及びスクリーニング本研究の目的は、抗タウモノクローナル抗体抗Tau-mAbモノクローナル抗体を産生させてスクリーニングすることであった。ハイブリドーマは骨髄腫細胞株とタウワクチン免疫マウス脾臓の融合により産生した。ハイブリドーマは、リン酸化及び非リン酸化全長タウ蛋白質並びにワクチン製剤に使用されるリン酸化及び非リン酸化タウの抗原性ペプチドの両方に対する反応性について評価した。ハイブリドーマのスクリーニングはまた、タウトランスジェニックマウスの脳切片上の免疫化学を用いて、タウ濃縮体についてハイブリドーマ上清の反応性について行った。1.1方法1.1.1融合ACI-33タウ5-20[pY18]でワクチン接種された野生型C57BL/6マウスをハイブリドーマの生産に用いた。マウスは第0日目と次いで第4日目に再びACI-33ワクチンで追加免疫され、融合は第7日目に行った。173x106ACI-33、免疫化マウス由来の脾細胞;を、5脾細胞/1骨髄腫細胞の割合でSP2-O-Ag14骨髄腫細胞と融合させた。ACI-35タウ393-408[pS396、pS404]でワクチン接種された野生型C57BL/6マウスをハイブリドーマの生産に用いた。マウスは第0日目と次いで第4日目にACI-35ワクチンで追加免疫し、融合が第6日目に行われた。x107ACI-35、免疫化マウス由来の脾細胞を3脾細胞/1骨髄腫細胞の割合で2x107SP2-O-Ag143骨髄腫細胞と融合した。ACI-36タウ401-418[pS404/S409]でワクチン接種された野生型C57BL/6マウスをハイブリドーマの生産に用いた。マウスは第0日目と次いで第4日目に再びACI-36ワクチンで追加免疫され、融合は第7日目に行った。免疫化マウス由来の84x106脾細胞;を、5脾細胞/1骨髄腫細胞の割合でSP2-O-Ag14骨髄腫細胞と融合させた。ACI-41タウ206-221[pT212/pS214]とタウ196-211[pS202/pT205]の混合でワクチン接種された野生型C57BL/6マウスをハイブリドーマの産生に用いた。マウスは第0日目と次いで第4日目に再びACI-41ワクチンで追加免疫され、融合は第8日目に行った。免疫化マウス由来の162x106脾細胞;を、5脾細胞/1骨髄腫細胞の割合でSP2-O-Ag14骨髄腫細胞と融合させた。8x96ウェルプレートに結果として得られた4つの融合物及びクローンはプレート1-8、次いで行A-G、そして最後に列1-12に従って命名された。1.1.2クローンを選択するためのスクリーニング法8x96ウェルプレートを、IgG発現について二回最初にスクリーニングした。陽性発現するクローンを24ウェルプレートに移し、増殖細胞の細胞上清=クローンをタウELISAスクリーニング及び免疫組織化学TAUPIRスクリーニングで検査した。ELISA及び/又はTAUPIRの陽性上清をT25フラスコに移し、クローンをタウELISAスクリーニングとTAUPIRスクリーニングにおいてIgG発現について再びスクリーニングした。1.1.3IgGスクリーニングElisaプレートをコーティング緩衝液中4°Cで16時間、50μl/ウェルの抗マウスIgG抗体CERGroupe、Marloie、Belgiumでコーティングした。PBS/Tweenでプレート洗浄後、100ul/ウェルのブロッキング溶液を室温で1時間塗布した。希釈していないハイブリドーマ上清の50μlを室温で1時間インキュベートした。洗浄工程後に、西洋ワサビペルオキシダーゼHRP結合抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3の混合物AbSerotec、Raleigh、NC、USAを室温で1時間プレートに塗布した。最終洗浄後に、検出が、TMB3-3’、5,5’-テトラメチルベンジジン、HRP用ホスファターゼ基質を用いて実施され、プレートをELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取った。結果はO.D.として表される。光学濃度。1.1.4ハイブリドーマのTauELISAスクリーニングハイブリドーマのELISAスクリーニングを、pTauペプチドACI-33、T1.5:タウ5-20[pY18];ACI-35、T3.5:タウ393-408[pS396/pS404];ACI-36、T4.5:タウ401-418[pS404/S409];ACI-41、T8.5:タウ206-221[pT212/pS214]及びT9.5:タウ196-211[pS202/pT205]PolyPeptideLaboratories、Hillerod、Denmark、対応するタウペプチドACI-33、T1.6:タウ5-20;ACI-36、T4.6:タウ401-4、ACI-41、T8.6:タウ206-221とT9.6:タウ196-211、PolyPeptideLaboratories、Hillerod、Denmark、リン酸化された完全長441aaタウタンパク質pTauタンパク質、Vandebroekら、2005及び完全長441aaタウ蛋白タウタンパク質、SignalChem、Richmond、Canadaで行った。最後に、ウシ血清アルブミンBSAを陰性コントロールとして用いた。プレートを10μg/mlの対応タウペプチド及び1μg/mlの対応するタウタンパク質で4°Cで一晩コーティングした。PBS-0.05Tween20で各ウェルを洗浄し、PBS-0.05のTween20中の1BSAでブロッキングした後、希釈していないハイブリドーマ上清又は培地陰性コントロールをプレートに添加し、2時間37°Cでインキュベートした。洗浄後に、プレートを、アルカリホスファターゼAP結合抗マウスIgG全抗体JacksonLaboratories、Baltimore、PA、USAと共に2時間37°Cでインキュベートした。プレートを、アルカリホスファターゼAP結合抗マウスIgG抗体合計ジャクソン研究所、ボルチモア、PA、USAを2時間37°Cでインキュベートした。洗浄後、プレートをpNPPパラ-ニトロフェニル-ホスフェート、AP用ホスファターゼ基質と共にインキュベートし、ELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取った。結果はO.D.として表される。光学濃度。1.1.5ハイブリドーマのIHCスクリーニング:トランスジェニックマウスからの脳切片における濃縮体の対する抗タウ抗体の結合TAUPIRTAUPIR実験は実施例3.1.2からのプロトコルに従って行った。1.1.6T25フラスコのIgGスクリーニングELISAプレートを炭酸塩-重炭酸塩コーティング緩衝液pH9.6Sigma、Buchs、Switzerlandに溶解した5ug/mlの抗マウスIgGFab’2断片特異的抗体JacksonLaboratories、Baltimore、PA、USAで一晩4°Cでコーティングした。プレートを洗浄した後、希釈していないハイブリドーマ上清、陽性コントロールIgG1抗体1ug/mlの6E10:Covance、Emeryville、CA、USA又は陰性コントロール培地のみを室温で1時間インキュベートした。洗浄工程後、二次AP結合ヤギ抗マウスIgGサブクラス12a2b3のFcγ断片特異的抗体JacksonLaboratories、Baltimore、PA、USAを37°Cで2時間プレート上でインキュベートした。最終洗浄後、pNPPパラ-ニトロフェニル-ホスフェート、AP用ホスファターゼ基質を行いて検出が行われ、プレートをELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取った。結果はO.D.として表される。光学濃度。1.2結果1.2.1ACI-33ハイブリドーマ融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル8x96ウェルにおいて、277ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、79クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした表2。クローン6C10は3つのスクリーニングで唯一陽性であり、サブクローニング用に選択した。1.2.2ACI-36ハイブリドーマ融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル8x96ウェルにおいて、333ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、75クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした表3。次の工程のためのクローンを選択するため、IgG/ELISA/TAUPIRスクリーニングに対して陽性の全ての上清のランキングがELISAとTAUPIRの結果に基づいて行われた。ELISA及びTAUPIRの結果のランキングは方法の項で説明したように行った。TAUPIR染色は、最初の5つのクローンについてほとんど同じであり、これはELISAの結果に対応する。4C12はそれが4C1と同じプレートで見いだされたため廃棄され、2つのクローンが同一である同じエピトープを認識する可能性が増大した。最良の4つのクローンは3A8、2B6、4C1及び6H1であった。他の6クローン4C12、2G1、2F9、7D6、3B9、4E12はバックアップとして保存された。ELISAスクリーニング及びTAUPIRスクリーニングで陽性を示した10クローンのランキングが最高のものを選択するために行われた表4。グレーで強調表示されたのは、最高の5クローンである。1.2.3ACI-41ハイブリドーマ融合物から生じる8x96ウェルプレートからの細胞上清を、IgGの産生についてスクリーニングした。検査した768ウェル8x96ウェルにおいて、215ウェルが、IgG発現について陽性であり、24ウェルプレートに移した。24ウェルプレートで、81クローンが生育しており、これらの細胞からの上清を分析した。陽性クローンを更にT25フラスコに移し、上清をIgGの産生、ELISAおよびTAUPIRについてスクリーニングした表5。クローン5D10及び7C2は3つのスクリーニングで陽性であり、サブクローニング用に選択した。クローン5D10はペプチドT8.5にのみ結合し、一方クローン7C2は、ACI-41ワクチンT8.5とT9.5の2つのペプチドに結合するPCT出願PCT/EP2010/054418の図10を参照。5D10から派生するサブクローン5D10A4はpTauペプチドに特異的であった。1.3.結果生成された抗体は、非リン酸化ペプチドに対してごくわずかに結合し、pTauペプチドに高い特異性を示している。4つの融合物ACI-33、ACI-36、ACI-35及びACI-41から、全16クローンがDSMZに寄託され表1、更なるサブクローニング用に選択された。上記の陽性母クローンはさらに96ウェルプレートで、その後24ウェルプレートで、最終的にT25フラスコで培養した。各段階で、ハイブリドーマクローンの上清をELISA、Taupir及びウェスタンブロットによりスクリーニングした。実施例2:抗体軽鎖及び重鎖可変領域のクローニングハイブリドーマ細胞からの抗体重鎖と軽鎖の可変領域がクローニングされ、相補性決定領域CDRのDNA配列とその位置並びに抗体結合の特徴が決定された。全RNAが、QiagenRNeasyミニキットカタログ番号74104を用いて3x106ハイブリドーマ細胞から調製された。RNAを50mLの水で溶出し、1.2アガロースゲル上で確認した。VH及びVKcDNAは、IgGとカッパ定常領域プライマーにより逆転写酵素を用いて調製された。第一鎖cDNAは、シグナル配列プライマーの大きいセットを用いてPCRにより増幅した。増幅されたDNAはゲル精製され、ベクターpGem登録商標TEasyPromegaへクローニングした。得られたVH及びVKクローンは、予想された大きさの挿入のためスクリーニングされた。選択されたクローンのDNA配列は自動化DNAシーケンシングにより両方向で決定された。その配列の相補性決定領域CDRの位置は他の抗体配列を参照して決定されたKabatEAetal1991。実施例3:結合研究I目的は、タウリポソームワクチンで免疫したマウス由来のサブクローニングしたハイブリドーマから産生された抗体のリン酸化タウpTau結合を測定することであった。これをテストするため、酵素結合免疫吸着測定法ELISAは、リン酸化及び非リン酸化完全長タウタンパク質ならびにリポソームワクチン製剤に使用されるリン酸化及び非リン酸化タウ抗原性ペプチドの両方に対する精製された抗体の結合を測定するために用いられた。スクリーニングは、他の二つの方法で完了した。一次抗体として抗タウ抗体を用いたタウトランスジェニック動物TAUPIRからの脳切片上の免疫組織化学IHCが行われた。更に、タウトランスジェニックマウスからの脳タンパク質ホモジネートのウェスタンブロットWBは、ブロッティング抗体として抗タウ抗体を用いて実施された。3.1方法3.1.1リン酸化タウ結合アッセイ抗リン酸化タウ抗体マウスIgG3アイソタイプはリポソームタウワクチン接種マウスから産生された。リポソームワクチンはリン酸化タウpTauペプチドのリン酸化製剤である。抗タウ抗体を産生するハイブリドーマのサブクローンは母クローンから限界希釈によって選択した。アイソタイピングを、単一のアイソタイプクローンの存在を示すために行った。抗体は、ローラーボトル中で産生され、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、滅菌0.22μmろ過を行い、定量した。タウ及びpTauへの抗体の結合を試験するためにELISAアッセイを使用した。簡潔には、NuncMaxiSorp96ウェルプレートNuncRoskildeDenmarkが、1μg/mLの完全長441aaタウ蛋白質SignalChemRichmondCanada又はリン酸化完全長441aaタウ蛋白質Vandebroeketal、2005でコーティングした。加えて、プレートを10μg/mLのタウ由来ペプチドでコーティングした。ワクチン製剤で使用されていなかったタウ配列及びpTau配列に対する交差反応性を試験するために、プレートは以下のペプチドを10μg/mLでコーティングした:Tau5-20Y18はリン酸化されるか又はされない、Tau393-408S396及びS404はリン酸化されるか又はされない、Tau401-418S404及びS409はリン酸化されるか又はされない、Tau206-221T212及びS214はリン酸化されるか又はされない及びTau196-211S202及びS205はリン酸化されるか又はされない。コーティングは、リン酸緩衝生理食塩水PBS中で4°Cで一晩行われた。プレートを0.05Tween20/PBSで十分に洗浄し、次いで37°Cで1時間、0.05Tween20/PBS中、1ウシ血清アルブミンBSAでブロックした。試験される抗体を8回又は16回の20~0μg/mLの間の2倍希釈系列に添加し、37°Cで2時間インキュベートさせた。プレートは、その後、前述のように洗浄し、AP-結合抗マウスIgG二次抗体JacksonImmunoResearchLaboratories、Suffolk、Englandを37°Cで2時間、0.05Tween20/PBSの6000分の1希釈で加えた。洗浄後、プレートを、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物pNPP;Sigma-AldrichBuchsSwitzerlandホスファターゼ基質溶液と共にインキュベートし、ELISAプレートリーダーを用いて2又は16時間のインキュベーション後に405nmで読み取った。結果は光学濃度O.D.として表される。3.1.2タウトランスジェニック動物からの脳切片におけるタウ濃縮体に対する抗タウ抗体の結合TAUPIR使用した脳スライスは、TPLHマウスと交配した老齢>18ヶ月のダブルトランスジェニックbiGTP301L変異を有するヒトタウの最長のアイソフォーム441aaを含有する、GSK-3βトランスジェニックマウスからのものであった。さらにタウノックアウトマウスTKO、6ヶ月由来の切片も使用した。脳の切片はPBSで5分間洗浄し、次に、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、室温で15分間、PBS:MeOH1:1中で1.5のH2O2でインキュベートした。切片をPBSTPBS/0.1TritonX100で3回洗浄後、それらはPBST10FCSウシ胎児血清ブロッキング溶液中で室温で30分間インキュベートした。試験された抗タウ抗体とのインキュベーションは、PBST/10FCSでの示された希釈で4°Cで一晩行われた。次に、切片を室温で1時間PBST/10FCSでHRP結合ヤギ抗マウスダコ、グロストラップ、デンマークから購入した二次抗体とのインキュベーションの前にPBSTで3回洗浄した。検出前に、切片をPBSTで3回洗浄し、5分間、50mMのトリス/HClpH7.6中でインキュベートした。検出は、ジアミノベンジジンDAB:150mMのトリスHCl3ulのH2O230を10ml中に一錠;MPBiomedicalsSolonOHUSAで3分間切片をインキュベートすることにより行われた。反応はPBSTで切片を3回洗浄することにより停止させた。次いで、切片をシラン化ガラスプレート上に移し、温プレート上で2時間50°Cで空気乾燥した。対比染色は、1分間、メイヤーヘマトキシリンFlukaChemieBuchsSwitzerlandとのインキュベーションを用いて行われ、その後流れる水道水による4分間の洗浄工程が続いた。切片は50、70、90、及び2回の100エタノール槽を通過させ、次いでキシロール中を2回1分間通過させることにより脱水した。最終的に、切片をDePexBDHChemicalsLtdPooleEnglandでガラスカバー下にマウントした。更に、1/10希釈でのハイブリドーマ上清が、タウトランスジェニックマウス、野生型マウス又はノックアウトマウスからSDS-PAGEで分離された脳ホモジネートタンパク質を含有する膜をブロットするために使用された。3.1.3.AD及びタウオパチー患者からの脳切片におけるタウ濃縮体に対する抗タウ抗体の結合TAUPIRヒトの脳内におけるpTauに対する抗pTau抗体ACI-36-3A8-AB1の免疫反応のアッセイはTAUPIRによって行われた。脳のパラフィン切片をキシロール中に5分間に2回、及び100EtOH中に1分間に2回通すことにより脱パラフィンし、その後90、70、50EtOH、及び蒸留水中で1分間洗浄し、その後PBS中で5分間に2回洗浄した。抗原回復のため、切片は0.01Mのクエン酸溶液水溶液pH6.0で10分間加熱することにより処置し、20分間冷却した。切片は、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で15分間PBS:MeOH1:1中の1.5H2O2でインキュベートした。切片をPBSTPBS/0.05Tween-20で3回洗浄後、それらはブロッキング溶液としてPBST10のウシ胎仔血清FCS中で室温で30分間インキュベートした。一次抗pTau抗体ACI-36-3A8-AB1ブロッキングバッファー中に410ng/mLによるインキュベーションを4°Cで一晩行った。次いで切片をPBSTで3回洗浄し、PBST/10FCSで1/500希釈したHRP結合ヤギ抗マウス二次抗体Dako、Glostrup、Denmarkで室温で1時間インキュベートした。検出前に、切片をPBSTで3回洗浄し、5分間、50mMのトリス/HClpH7.6中でインキュベートした。検出は、ジアミノベンジジンDAB:150mMのトリスHCl3ulのH2O230を10mL中に一錠;MPBiomedicalsSolonOHUSAで3分間切片をインキュベートすることにより行われた。反応はPBSで切片を3回洗浄することにより停止させた。対比染色はマイヤーのヘマトキシリンFlukaChemieBuchsSwitzerlandで1分間インキュベートすることにより行い、次いで水道水中で4分間洗浄した。切片は、50、70、90のエタノール槽を通し、100のエタノール槽に2回通し、その後キシロールに1分間に2回通して脱水した。最終的に、切片をDePexBDHChemicalsLtd.PooleEnglandでガラスカバー下にマウントした。染色した切片は白色光顕微鏡と3CCDカメラLeicaWetzlarGermanyで撮影したデジタル画像で調べた。画像が捕捉され、専用のソフトウェアIM500Leicaを用いて分析した画像は20×1.6の倍率で示される。3.1.4.ウエスタンブロットWBトランスジェニック動物からの脳抽出物における試験抗体のpTauに対する結合はWBによって行われた。野生型FVB、TPLH、biGT及びTKOマウスから脳のホモジナイズは、次のバッファで行われた:25mMTris/HClpH7.6、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、30mMNaF、0.2mMNa3VO4、1nMオカダ酸、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルPMSF、5mMNa4P2O7、総12ミリリットルあたり1錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテルCPIC。全脳ホモジネートを得るために、脳は1容量/重量の半球ml/gが氷上でモーター駆動ポッター様ガラスチューブ/テフロン乳棒により700rpmでホモジナイズされた。全脳ホモジネートは半分がサンプルバッファー25mMのトリス/HClpH6.8、4w/vドデシル硫酸ナトリウムSDS、20グリセロール、0.01ブロモフェノールブルーおよび5β-メルカプトエタノールで希釈し、次いで95°Cまで急速に加熱した。サンプルは5分間保持され、サンプルバッファーで1/4希釈され、再び95°Cに加熱し、次いで冷却し、可溶化されていなかった破片を除去するために5分間14.000rpmで回転させた。上清を回収し、SDS-PAGEゲル上にロードした。ニトロセルロース膜Hybond-ECLへの転写はトランスファーバッファー25mMトリスpHが8.6、190mMのグリシン、20メタノール中で行った。膜を、ブロッキング溶液TBS中0.1Tween50mMのトリスHCl、pH7.6、150mMのNaCl、及び5乾燥ミルクパウダーに移し、ブロッキング溶液で希釈した試験抗体と4°Cで一晩インキュベートした。ブロッキング溶液で1/10’000に希釈した二次抗体HRP結合ヤギ抗マウスDakoGlostrupDenmarkとのとのインキュベーションを室温で1時間行った。検出は、GEヘルスケアからのECLウェスタンブロッティング検出試薬を用いて行った。3.2結果3.2.1濃縮体陽性タウトランスジェニックマウスからの脳切片を用いたELISAアッセイおよびTAUPIR抗体の結合を、免疫原として使用されるリン酸化タウペプチドに対して、及びリン酸化全長ヒトタウタンパク質に対して測定した。これは、441個のアミノ酸からなるヒトタウタンパク質の最も長いアイソフォームである。対応する非リン酸化ペプチド及び全長ヒトタウタンパク質も含まれていた。表6に示すように、6つの抗体がリン酸化タウペプチドに対して高い結合を示し、リン酸化全長ヒトタウタンパク質に対してはごく限定された結合ないしは全く結合を示さなかった。結合は、対応する非リン酸化タウペプチドまたは非リン酸化全長ヒトタウタンパク質に対しては観察されなかった。これは、リン酸化ヒトタウペプチドに対する抗タウ抗体の高い結合を示している。他のリン酸化および非リン酸化タウ配列に対する非特異的結合を試験するため、抗体は、5つのリン酸化タウペプチド及び非リン酸化タウペプチドへの結合について試験され、その一つが抗原ペプチド配列として用いられた。ワクチンに使用されるペプチド以外で、リン酸化または非リン酸化タウペプチドに対する交差反応は、ペプチドが高濃度であっても観察されなかった。タウトランスジェニックマウスの脳におけるpTauに対する抗タウ抗体の結合は、TAUPIR染色図1及びWB図1によって評価した。抗体は、タウトランスジェニックbiGTマウスの脳における皮質と海馬に存在する神経網スレッドとタウ濃縮体への結合を実証した。TAUPIRに使用される抗体の希釈は、0.05から0.0033ug/mLの範囲であった。抗タウ抗体は、野生型FVB、TPLH、biGT及びTKOマウスからの全脳ホモジネートを用いるWBにおいて一次抗体として使用し、SDS-PAGEで分離された。2種の市販の抗pTau抗体をコントロールのMC1とTau5として使用した。全ての抗タウ抗体はタウトランスジェニックマウスの脳内に存在するpTauに結合した。ブロッティングタウトランスジェニックマウス、野生型マウスおよびタウノックアウトマウスからSDS-PAGE分離したタンパク質ホモジネートを含有する膜上で、全ACI-35抗体表1に開示が、タウ及びpTauと同じ46kDaの移動様式を持つタンパク質のバンドに結合したデータ非公開。3.2.2ADとタウオパチー患者からの脳切片におけるTAUPIR研究AD、FAD、AGD、FTDP-17、CBDとPSP含む診断タウオパチーに罹患した被験体からのヒト脳切片に宿ったタウ凝集体に結合する抗体ACI-36-3A8-AB1の能力を、TAUPIR免疫組織化学により調べた図2。抗pTau抗体ACI-36-3A8-AB1は、ヒトの脳切片における糸屑状構造物、神経原線維変化NFTはを含むpTau、及びニューロン及びグリア細胞型に存在するpTauの蓄積物の他の形態に結合した。より具体的には、ACI-36-3A8-AB1は、AD脳におけるNFT、糸屑状構造物、及びアミロイド斑を取り巻く変性神経突起を顕著に染色し、それはAD及びFADと診断された被験体で容易に明らかであった。AGDからの脳切片において、ACI-36-3A8-AB1は、複数の好銀性粒子/顆粒が明らかに見え、NFTと糸屑状構造物の両方を染色した図2。PSPからの脳切片のACI-36-3A8-Ab1による染色はNFT,糸屑状構造物、及び変性神経突起を示した。更に、ピック体様封入及び房状pTau陽性星状細胞が明らかに示され、PSPでの豊富な特徴であり、そこではpTau染色が、遠位の突起を含む細胞全体に広がっている。FTDP-17において、染色パターンはまた、NFTだけでなく検出された無色の膨らんだニューロンを持ち、疾患の既知の不均一性を示した。ACI-36-3A8-AB1抗体はまた、CBDの主な特徴であるかすかにタウ陽性である腫れた無彩色のニューロンを染色した。CBDのその他の顕著な病理学的特徴、すなわち、コイル体と呼ばれるオリゴデンドログリア封入もまた、ACI-36-3A8-AB1抗体によって良好に検出された。染色はAT8陰性コントロール被験体において検出されなかったが、弱い染色がAT8陽性のコントロール被験体で同定された。以前にタウオパチーの異なる形態に罹患と診断された被験体からのヒト脳切片上でTAUPIRを使用して、抗pTauの抗体ACI-36-3A8-AB1は、これらのの被験体の脳に存在する様々な既知のpTauに豊んだ病理学的特徴に対する良好な結合を実証した。実施例4:結合研究II本研究の目的は、表面プラズモン共鳴SPRを用いて抗タウ抗体とリン酸化タウペプチドとの間の結合親和性を決定することであった。リン酸化タウペプチドは、抗タウ抗体を産生するためのワクチン製剤に使用されるペプチド配列に相当する。この相互作用を研究するために、リン酸化ペプチドをセンサチップの表面に固定化し、その結合は、チップ上に抗体を通過させる際にSPRを使用してリアルタイムでモニターした。4.1方法4.1.1SPR結合アッセイ全ての実験は、SPRビアコアX機器GEHealthcareで行った。固定化の試薬EDC、NHSおよびエタノールアミン、センサーチップCM5カルボキシメチルデキストラン、並びにバッファHBS-EPは、GEHealthcareから購入した。リン酸化タウペプチドは1:1v/vの比でPBS/酢酸ナトリウム緩衝液10mMの、pH値5.0に可溶化し、250μgの/mlの最終ペプチド濃度を得た。このペプチド溶液を、次いで、EDC/NHSを用いて予備活性化したCM5センサーチップのフローセルfc2を介して結合させた。結合後、エタノールアミンをその表面に通し、218RUの最終的な固定化レベルを与えていた。抗タウ抗体の5つの濃度は、泳動バッファーを用いた段階希釈によってアッセイした。注入は、最も低い濃度から出発して行われ、180秒間、30μL/分の流速でfc1と2の両方に通した。フローセル1を非誘導体化し、機器ノイズとバルク屈折率の変化を補正するために反応をfc2から差し引いた。注入が終了した後、表面を300秒間ランニングバッファーで直ちに洗浄した。残った結合抗体をチップから除去するために、表面の再生を、1MNaClを含む8mMのNaOHの水溶液のパルス典型的には3μlを注入することによって実施した。動態解析は、BIAevaluation3.0を使用して数値積分およびグローバル解析のためのアルゴリズムを用いて行った。異なる濃度の抗体の注射について得られたセンソグラムを重ね、ベースラインをゼロに調整した。カーブフィッティングのために、全てのデータを1:1均質ラングミュアモデルに対して同時に適合させた。あるいは、固定化ビオチン化T3ペプチドT3.30を、ビアコアX機器を用いてストレプトアビジンビアコアSAチップGEヘルスケアに固定化した。抗体は、HBS-EPランニングバッファGEヘルスケアで希釈し、50ul/分で120秒間注入し、続いて100秒間解離させた。表面再生を16mMのNaOHのパルス1-3ulを用いて行った。フィッティングはBIAevaluationを用いて、1:1のラングミュア結合相互作用を想定して行った。4.2結果リン酸化タウペプチドに対する抗タウ抗体の結合を、SPRを用いてリアルタイムで監視した。抗体結合の会合相及び解離相の分析は、会合速度定数ka、解離速度定数Kd並びに解離定数KDを決定するために使用することができる。抗体ACI-33-6C10-AB1は、抗体の3.7→367nMの範囲で、非誘導体化カルボキシメチルデキストラン表面でペプチドT1.5に特異的に結合する。センソグラムの速度論的分析は、9.46x105M-1s-1の速い会合速度定数と3.27x10-3s-1の解離速度定数を示した表7。従って、解離定数KDは3.46nMであることが決定され、抗体が非常に高い親和性でリン酸化ペプチドT1.5を認識していることを示している。全ての試験抗体は、免疫化とハイブリドーマ生成のために使用されたそれぞれのリン酸化ペプチドに高い親和性を示したが、それらは非リン酸化ペプチドにはほとんど親和性を示さなかった。実施例5:抗pTau抗体のエピトープマッピング5.1方法抗リン酸化タウのマウスモノクローナル抗体のエピトープマッピングは、異なるリン酸化および非リン酸化ペプチドライブラリーを用いてELISAによって行った。使用されるペプチドライブラリーのアミノ酸配列を表8に示す。各ライブラリは、ペプチドワクチンに存在するリン酸化及び非リン酸化配列にまたがる短いビオチン化ペプチドから成っていた。ペプチドライブラリはANAWA取引SAから購入した。エピトープマッピングは、製造業者Mimotopesの指示に従って行った。簡潔には、ストレプトアビジンコーティングプレートNUNCは、リン酸緩衝生理食塩水PBS中の0.1BSAで、4°Cで一晩ブロックされた。.PBS-0.05Tween20による洗浄後、プレートは各ライブラリからの異なるペプチドにより室温で1時間コーティングされ、0.1BSA、0.1アジ化ナトリウムのPBS溶液で最終濃度10μMに希釈された。洗浄後、プレートは、2のBSAと0.1のアジ化ナトリウムのPBS溶液で40ng/mlに希釈された試験抗体とともに室温で1時間インキュベートした。プレートは、再び洗浄され、1/6000希釈でAP結合抗マウスIgG二次抗体JacksonImmunoResearchLaboratoriesSuffolkEnglandとともに室温で1時間インキュベートした。最終洗浄後、プレートは、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物pNPP;Sigma-AldrichBuchsSwitzerlandホスファターゼ基質溶液とともにインキュベートし、2時間のインキュベーション後にELISAプレートリーダーを用いて405nmで読み取られた。結合は、光学濃度O.D.がバックグランドのO.D.の少なくとも2倍である場合、陽性と考えられた。5.2結果エピトープマッピング実験の結果として、エピトープは、本明細書に開示されている抗体が特異的に結合する必要なリン酸化アミノ酸残基表9参照を含め識別され得る。タウaa15-20,pY18を要件とする6C10F9C12A11;6C10E5E9C12タウaa405-412,pS409を要件とする6H1A11C11;6H1G6E6タウaa405-411,pS409を要件とする2B6A10C11;2B6G7A12;3A8A12G7;3A8E12H8タウaa208-218,pT212とpS214を要件とする7C21F10C10D3タウaa393-401,pS396を要件とするA4-2A1-18;A4-2A1-40タウaa396-401,pS396を要件とするA4-4A6-18タウaa394-400,pS396を要件とするA6-1D2-12タウaa402-406,pS404を要件とするA6-2G5-08タウaa393-400,pS396を要件とするA6-2G5-30;A6-2G5-41実施例6:タウトランスジェニックマウスの1週間受動免疫化6.1.方法全てのインビボ試験について、タウトランスジェニックマウスが用いられ、下記の表に示すように、治療抗体を投与した。6.1.1.マウス及び処置全長ヒトTAUアイソフォームTAU441を過剰発現し、マウスThy-1プロモーターの制御下でミスセンス変異V337MとR406Wを担持する雌と雄の6.3月齢±3日のTgマウスTMHTマウスが研究番号1で用いられた上の表参照マウスは、脳内のTAU病理を決定するために、最後の投与後1日に安楽死させた。6.1.2動物の同定と住居遺伝子型のテールティッピングの過程で、動物は古典的な耳標装着により、連続的に番号付けられた。全ての動物は、試験開始前に再度遺伝子型を決定した。マウスは、国際基準に基づいくJSW標準操作手順に従って維持した。動物はRettenmaier登録商標によって提供される標準化されたげっ歯類の寝具の個々の換気ケージに収容した。温度を約24°Cに維持し、相対湿度を40から70に維持した。動物は、一定の光サイクル12時間の明るい/暗い下で飼育した。乾燥され、ペレット化した標準的なげっ歯類の餌Altromin登録商標と、通常の水道水は動物に対して自由に利用可能であった。個々の動物を、個々の動物のデータシートに記載された任意の臨床徴候について定期的にチェックした。6.1.3.インビボでの出血最初の免疫化の前七日は、インビボでの出血は顔の静脈/動脈からの下顎のサンプリングにより行った。血液サンプルは、静脈および動脈の血液の混合物である。血漿を得るために、血液をヘパリンチューブに回収し、遠心分離した1,000×gで、10分間、室温。血漿は使用するまで2つのアリコートに凍結された。6.1.4.免疫組織化学的IHC定量全てのクライオ凍結脳の半球を分析した。レベル全部で5つのレベルあたり15クライオ切片、それぞれ10μmの厚LeicaCM3050Sを矢状に切断した。脳レベルは形態学アトラスTheMouseBrainfromPaxinosandFranklin第2版に従って選択された。5つのレベルの切断はランダムスライスで開始し、次いでサンプリングが均一かつ体系的に継続し、常に連続してレベルごとに15スライスを保持し、レベル間では150μmを廃棄した。脳領域あたり海馬と扁桃体の5つのスライス各レベルから1のTAU病理を決定するために、動物はAT180MN1040、ThermoScientific抗体とHT7MN1000、ThermoScientific抗体を用いて染色された。一次抗体はCy-3-結合2次抗体により可視化され、続いて、免疫反応性領域がイメージプロプラスv6.2のソフトウェアを用いて評価した。免疫反応性の対象物はサイズ制限扁桃体で30μm2、海馬で7μm2以上と動的強度閾値以上で測定された。対象物の全領域と強度及び個々の閾値は自動的に提出された。使用される場合、動的な閾値はAOI内の平均強度プラスAOI内のピクセル強度の標準偏差の因子倍と定義した。いずれの場合においても、値は、最低限の設定閾値を超えなければならなかった。正確な閾値レベルを以下の表に示す。領域サイズは、海馬と扁桃体の手動での線引きにより測定した。HT7及びAT180IR領域データは、領域サイズに正規化した。n>4の全てのIHC関連データは、コルモゴロフスミルノフ正規試験に従ってガウス分布に従い、平均±SEMとして表される。従って4匹の動物からのみからなるビヒクル群に対しては、正規性試験には少なすぎるので、ガウス分布を仮定した。群の違いは、パラメトリックな一方向性ANOVAを用いて計算し、続いてGraphPadPrismソフトウェアで計算されるニューマンクールズ事後試験を行った。α-エラーレベルを0.05に設定した。脳のTAU病理は、AT180抗pTAU抗体及びHT7抗TAU抗体を用いて免疫組織化学的IHC定量によって海馬と扁桃体で決定された。更に、メソスケールディスカバリーMSDデュプレックス技術を使用して、可溶性ホモジネート画分で皮質と海馬の可溶性pTAUとTAUの治療効果を測定し、pTAUと総TAUを探索した。IHCアッセイ又はMSDアッセイの何れかで使用される抗体は、この研究で使用される2つの治療抗体と重複するエピトープを持っていない。6.1.5.Tgマウスの可溶性脳画分中の可溶性タウタンパク質のレベルの定量化のための画分の生成方法6.1.1に従って処置されたマウスは、脳内のタウ病理を決定するために、2回目の投与後1日に安楽死させた。簡潔には、一つの脳半球からの可溶性皮質サンプルを100から200μLの冷たい抽出緩衝液25mMのトリス-HClpH=7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10mMのβ-グリセロリン酸、30mMのNaF、2mMのNa3VO4、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルでホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し4°Cで15分間、74,200×g、上清を可溶性タウの分析に用いた。皮質サンプルの可溶性画分中の総タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量アッセイThermoFisherScientificRockfordILUSAによって決定した。6.1.6.ウェスタンブロットによるpTauの存在の分析ACI-36-2B6-AB2とACI-36-3A8-AB2を投与したマウスの脳における免疫反応を探るために、pTauPHFエピトープに結合することが報告された2つの抗体Greenbergetal1992Reigetal1995Hoffmannetal1997を、ウェスタンブロットWBアッセイで用いた。皮質からの可溶性画分を等容量のサンプルバッファーA125mMのトリス-HClpH6.8、4[w/vの]ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、20グリセロール、0.01ブロモフェノールブルー、5β-メルカプトエタノールを添加することによって希釈し、そしてサンプルを、10分間95°Cに加熱した。30μgのサンプルを4-12のBisーTrisゲルInvitrogenBaselSwitzerland上にロードし、MOPSSDSバッファーInvitrogenで泳動した。タンパク質はトランスファーバッファー25mMトリスpH8.6、190mMのグリシン、20メタノール中で0.45μmPVDFに転写した。タンパク質の転写を確認するため、膜をPonceauSで5分間染色し、ブロッキングバッファーTBS50mMトリス-HCl、pHが7.6、150mMのNaCl]中に5のBSAで1時間ブロックした。ブロッキングバッファーおよび0.1Tween中で、膜を一次抗体で4°Cで一晩ブロットした。WBで使用された2つのpTauPHF特異的一次抗体は以下である:抗pS396PHF-13エピトープ;AbCamCambridgeUK;3μg/mLで使用、ヒト又はマウスpTauのリン酸化Ser396に特異的Hoffmannetal1997、及びAD2PHF-1エピトープ;BioRad、ReinachSwitzerland;0.4μg/mLで使用、ヒト及びマウスのpS396及びリン酸化Ser404に特異的pS404;Reigetal1995。全タウWBのために、タウ50.5μg/mL、ヒト及びマウスのタウの両方に結合する抗体BDBiosciencesAllschwilSwitzerlandを用いた。一次抗体とのインキュベーション後に、膜をTBS中0.1のTweenで洗浄し、二次抗体:ヤギ抗マウスIRDye800またはヤギ抗ウサギIRDye680両方ともLi-CorBiosciencesNEUSAからとインキュベートし、両方ともBBと0.1のTweenで1:15000希釈した。次いで、膜を、室温で1時間光から保護してインキュベートし、TBS中の0.1のTweenで15分間3回洗浄し、TBSで5分間2回洗浄し、バンドをLi-Corオデッセイ近赤外イメージングシステムLi-Corを使用して定量化した。バンドはβ-アクチンの発現に対して正規化したAbCam;0.4μg/mLで使用。ヒトトランスジェニックタウのバンド対マウス内在性のタウのバンドの同定を確認するために、ブロットをヒト完全タウに特異的抗体Tau13、AbCam;表示せずで探索した。加えて、治療抗体ACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2が、抗pS396又はAD2の結合に干渉するのに十分な量で変性した試験サンプルに存在していないことを確認するために、膜を抗マウス一次抗体で探索した。この研究で使用したサンプルではインタクト又は変性した治療抗体は検出されなかた結果は非表示。6.1.7.統計的分析データは、ノンパラメトリックなクラスカル-ワリス順位和統計を用いて分析し、P<0.05レベルで有意であれば、ダンの事後テストを全群の比較に用いたGraphPadPrismGraphPadソフトウエアCAUSA。結果は平均±平均値の標準誤差SEMを示す個別のデータ点として示される。P<0.05を持つ差は統計的に有意とみなした。6.2結果6.2.1.免疫組織化学的IHC定量による脳のTAU病理本研究期間中、ACI-36-2B6-Ab2とACI-36-3A8-Ab2の2回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。IHCによるAT180を使用するpT231とpS235の染色は、ACI-36-3A8-Ab2の処置後に、扁桃体で免疫反応領域IRの増大を示した。3mg/kgACI-36-2B6-Ab2で処置されたマウスは、海馬において著しく小さいAT180IR領域を持っていた。扁桃体において、ACI-36-3A8-AB2処置は、PBS群に比べて、AT180IRpTAUを増加させた。海馬において、ACI-36-2B6-AB2処置はpTAUを減少させた。AT180は特異的にpTAUを標識する。AT180IR細胞の発生頻度は、ACI-36-2B6-AB2処置マウスで減少した。この作用は、低用量3mg/kg群ACI-36-2B6-AB2LDでより強かった。細胞体の染色パターンは、群間で違いはない。ACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2の両方について、より高い10mg/kgの容量において、海馬において小さなAT180IRの有意でない傾向が見られた。定性的には、ACI-36-2B6-AB2で処置した動物は、非常に強いAT180標識を持った海馬ニューロン数の減少を示した。6.2.2.受動免疫後の脳画分中の総タウ濃度の低下可溶性タンパク質を含む脳画分中のpTAUとTAUに関する治療の効果は、MSDデュプレックスアッセイを用いて測定した。皮質の全可溶性TAUのレベルは、ACI-36-2B6-Ab2とACI-36-3A8-Ab2で処置されたマウスで著しく減少したP<0.01、図3の上の段。ACI-36-2B6-Ab2の3mg/kgの用量により、可溶性pTAUのレベルもまた著しく減少しP<0.01、図3の下の段、最大の減少を実証しているp<0.01。全TAUに対するpTAUの比率は変わらなかった。可溶性のTAUとpTAUのレベルは海馬からのサンプルでは変化しなかったここでは非表示。6.2.3.対らせん状細線維PHFに存在するリン酸化タウエピトープの存在におけるACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2の投与の影響構造的には、神経原線維変化NFTは、高リン酸化された状態で主に見られる、微小管結合タンパク質タウからなる対らせん状細線維PHFからなるAlonsoetal1997。この研究の目的は、ACI-36-2B6-Ab2とACI-36-3A8-Ab2の投与後に、タウトランスジェニックマウスの脳内でpTauPHFを探索し定量化するためにpTauPHFを認識する抗体を使用することであった。文書で十分に立証されたタウPHFリン酸化エピトープの量に関して、2つのACI-36-2B6-Ab2又はACI-36-3A8-Ab2の投与の効果を測定するために、処置されたタウTgマウスからの大脳皮質可溶性画分が、WBを用いた抗pS396抗体PHF-13エピトープ、pS396及びAD2PHF-1エピトープ、pS396/pS404で探索された。免疫反応性は、赤外線イメージングシステムを用いて定量した。タウTgマウスにおけるAD2PHF免疫反応性におけるACI-36-3A8-AB2とACI-36-2B6-AB2の作用をAD2を用いて決定し、pS396とpS404、タウの2つの以前に文書化されたPHFリン酸化残基を探索するGreenbergetal1992Reigetal1995。AD2PHF-1抗体を用いたS396とS404がリン酸化されたヒト及びマウスpTauを示すバンドがLi-Cor赤外線イメージングシステムを用いて定量化された。個別のマウスに対する値ならびに平均±平均値の標準誤差が決定された。トランスジェニックヒトpTauのバンドについて観察された、ADー2陽性pTau免疫反応性の減少について、有意ではない傾向が観察された。しかしながら、3mg/kgのACI-36-2B6-Ab2で処置されたマウスAD2陽性pTauの量の有意な減少が、マウスに観察され、10mg/kgのACI-36-2B6-Ab2又はACI-36-3A8-Ab2の何れかで処置された場合には有意でない傾向が観察された。pTaupS396を特異的に認識する異なる抗体が染色に用いられた場合Hoffmannetal1997、更に大きな効果が観察された。10mg/kgのACI-36-2B6-Ab2又はACI-36-3A8-Ab2で処置されるときに、減少する傾向を持ち、3mg/kgのACI-36-2B6-Ab2で処置されたマウスは、pS396陽性ヒトトランスジェニック及びマウス内因性pTauが著しく少なかった。非リン酸化及び全pTauの両方を含む全ヒト及びマウスのタウにおける作用を評価するために、ブロットをTau5抗体で探索した。ビヒクルコントロールに比較して、10mg/kgで投与されたACI-36-2B6-Ab2又はACI-36-3A8-Ab2によって、全タウは調節されなかったが、しかし、全タウについて減少する傾向がACI-36-2B6-Ab2を3mg/kgで投与されたマウスで観察された。6.2.4要約抗pTAU抗体ACI-36-3A8-Ab2によるタウTgマウスの2回の末梢性投与は、大脳皮質において可溶性のTAUと可溶性のpTAUを著しく減少させた。抗pTAU抗体ACI-36-2B6-Ab2によるタウTgマウスの2回の末梢性投与は、大脳皮質において可溶性のTAUと可溶性のpTAUを著しく減少させた。更に、ACI-36-2B6-Ab2は大幅に海馬のpTAU免疫反応性を減少させた。これらの結果は、タウオパチーの低減における、ACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2抗体を用いた受動抗pTAU免疫化の能力を実証している。タウTgマウスに対するACI-36-2B6-Ab2の3mg/kgでの2回の末梢性投与は、ウェスタンブロット法により測定される皮質におけるpTauPHFエピトープの存在を減少させた。より高用量の10mg/kgでは、ACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2の両方ともpTauPHFエピトープ免疫反応性の減少傾向を示した。これらの結果はACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2抗体は、アルツハイマー病などのタウオパチーに対する受動免疫治療に適切に用いられ得る。実施例7:ヒトタウ過剰発現マウスの1ヶ月の処置7.1方法7.1.1マウス及び処置タウトランスジェニックマウスが用いられ、方法6.1の表に示すように、治療抗体を投与した。研究番号27.1.2.行動実験-モリス水迷路MWMタスク最後の投与後に、6.1.1に従って処置されたマウスの空間記憶能力について試験するために水迷路MWMタスクが実行された。MWM実験は開始後第4週に全ての囲い込まれた動物で実施された。MWMは21°C±2°Cの温度での水道水で満たされた100センチメートルの直径を持つ白い円形プールで構成されている。プールはは実質的に4つのセクターに分割される。透明なプラットフォーム直径8cmが水面下約0.5cmに配置される。全ての試験セッションの最中にて、プラットフォームは、プールの南西の四分円に位置している。各マウスは、連続4日間の各々で3つの試験を実行しなければならなかった。1回の試験は、最大で1分間続いた。この期間、マウスは隠された半透明の標的を見つける機会があった。各試行後に、マウスは環境に適用させるためにプラットフォーム上で10~15秒間休ませた。第4日の最後の試行後に少なくとも1時間、マウスはいわゆるプローブ試験PTを履行する必要があった。PTの最中、プラットフォームはプールから除去され、旧標的位置上の交差の数が、この四分円における滞在とともに、実験者によって記録された。PTにおいて、逃避潜時マウスが隠されたプラットフォームを見つけて水から脱出するのに必要な時間[秒]、経路標的に到達する軌跡の長さ[メートル]、標的ゾーンの交差、及び標的四分円における滞在の定量化のために、コンピュータ化されたトラッキングシステムBiobserveソフトウェアを用いた。全ての動物は、行動の結果における不十分な視覚能力の影響を排除するために、最後の日のPT後に視覚検査を行う必要があった。7.1.3.免疫組織化学的IHC定量による脳のタウ病理マウスは、脳内のタウ病理を決定するためにMWMの後1日で最後の投与後1週間で安楽死させた。脳のタウ病理は、AT180抗pTau、pT231/pS235抗体及びHT7ヒト特異的抗タウ抗体を用いて免疫組織化学的IHC定量によって海馬と扁桃体で決定された。更に、メソスケールディスカバリーMSDデュプレックス技術を使用して、ホモジネート画分で皮質と海馬の可溶性pTauと可溶性Tauの治療効果を測定し、pTaupT231と総TAUを探索した。IHCアッセイ又はMSDアッセイの何れかで使用される抗体は、この研究で使用される治療抗体と重複するエピトープを持っていない。7.1.4.皮質と海馬における可溶性タウの分析のためのサンプル調製マウスは、最後の治療投与後一週間で、組織の収集のために安楽死させた。皮質と海馬を100から200μLの冷たい抽出緩衝液25mMのトリス-HClpH=7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、10mMのβ-グリセロリン酸、30mMのNaF、2mMのNa3VO4、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルでホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し4°Cで15分間、74,200×g、皮質と海馬における可溶性タウの分析のために上清を用いた図4。ペレットを100-200μLの抽出バッファー210mMトリスHClpH=7.4、800mMのNaCl、300mMのスクロース、1mMのEGTA、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルに再懸濁する。溶液は遠心分離され4°Cで20分間、4000g、上清を超遠心チューブに移した。次にサルコシル30水溶液を1の最終濃度まで添加し、室温で1.5時間インキュベートした。遠心分離後4°Cで30分間、74200g、上清をを廃棄し、ペレットを100μLの緩衝液350mMのトリス-HCl、pH=7.4に再懸濁した。再懸濁したペレットは皮質と海馬でサルコシル不溶性SinTタウとして使用された。可溶性画分及びSinT画分のサンプル中の総タンパク質濃度は、BCAタンパク質定量アッセイThermoFisherScientificRockfordILUSAによって決定した。7.1.5.pTauPHF及びタウのウェスタンブロット大脳皮質と海馬におけるpTauPHFの存在下でのACI-36-2B6-Ab1の作用を評価するために、pTauPHFエピトープに結合すると報告された2つの抗体がGreenbergetal1992Reigetal1995Hoffmannetal1997ウェスタンブロットWBアッセイに用いられた。皮質と海馬からの可溶性画分とSinT画分を等容量のサンプルバッファーA125mMのトリス-HClpH6.8、4[w/v]ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、20グリセロール、0.01ブロモフェノールブルー、5β-メルカプトエタノールを添加することによって希釈し、そしてサンプルを、10分間95°Cに加熱した。30μgのサンプルを4-12のBisーTrisゲルInvitrogenBaselSwitzerland上にロードし、MOPSSDSバッファーInvitrogenで泳動した。タンパク質はトランスファーバッファー25mMトリスpH8.6、190mMのグリシン、20メタノール中で0.45μmPVDFに転写した。タンパク質の転写を確認するため、膜をPonceauSで5分間染色した。膜は次いで洗浄し、ブロッキングバッファーTBS50mMトリス-HCl、pHが7.6、150mMのNaCl]中に5のBSAで1時間ブロックした。ブロッキングバッファーおよび0.1Tween中で、膜を一次抗体で4°Cで一晩ブロットした。WBで使用された2つのpTauPHF特異的一次抗体は以下である:抗pS396PHF-13エピトープ;AbCamCambridgeUK;3μg/mLで使用、ヒト又はマウスpTauのリン酸化Ser396に特異的Hoffmannetal1997、及びAD2PHF-1エピトープ;BioRadReinachSwitzerland;0.4μg/mLで使用、ヒト及びマウスのpS396及びリン酸化Ser404に特異的pS404;Reigetal1995。ターゲット効果を検出するため、ACI-36-2B6-Ab1を、1.6μgの/mLでブロッティングのために使用した。全タウWBのために、タウ5、ヒト及びマウスのタウの両方に結合する抗体BDBiosciencesAllschwilSwitzerlandを0.5μg/mLで用いた。タンパク質負荷のために正規化するため、全ての膜がβ-アクチンAbCam:0.4μg/mLで使用について更にブロットされた。一次抗体とのインキュベーション後に、膜をTBS中0.1のTweenで洗浄し、二次抗体:ヤギ抗マウスIRDye800またはヤギ抗ウサギIRDye680両方ともLi-CorBiosciences、NE、USAからとインキュベートし、両方ともBBと0.1のTweenで1:15000希釈した。次いで、膜を、室温で1時間光から保護してインキュベートし、TBS中の0.1のTweenで15分間3回洗浄し、TBSで5分間2回洗浄し、バンドをLi-Corオデッセイ近赤外イメージングシステムLi-Corを使用して定量化した。目的のバンドはβ-アクチンの発現に対して正規化した。ヒトトランスジェニックタウのバンド対マウス内在性のタウのバンドの同定を確認するために、ブロットをヒト完全タウに特異的でマウスタウと交差反応しない抗体Tau13、AbCam;表示せずで探索した。加えて、治療抗体が、一次ブロッティング抗体の結合に干渉するのに十分な量で変性した試験サンプルに存在していないことを確認するために、膜を抗マウス一次抗体で探索した。この研究で使用したサンプルではインタクト又は変性した治療抗体は検出されなかた結果は非表示。値は、任意のβ-アクチン補正免疫反応性IRとして表される。7.1.6.統計的分析データは一方向性ANOVAを用いて解析され、続いて、ダネットの多重比較事後試験GraphPadPrismGraphPadSoftwareCAUSAを行、各処置をTgコントロール処置マウスと比較した。結果は平均±平均値の標準誤差SEMを示す個別のデータ点として示される。P<0.05を持つ差は統計的に有意とみなした。グラブの極端なスチューデント逸脱試験により有意なp<0.05異常値として同定された単一の値は除外された。7.2結果7.2.1.行動実験-受動免疫後のモリス水迷路MWMタスク毎週3mg/kgで又は4週間の期間に1mg/kgで投与されたACI-36-2B6-Ab1の4回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。処置の最終週の期間、動物の空間ナビゲーションの学習及び記憶を評価した。動物は1日あたり3回試行で4日間のトレーニングを行う必要があり、その後1回のプローブ試験と視覚検査を行った。逃避潜時マウスが隠されたプラットフォームを見つけて水から脱出するのに必要な時間[秒]、経路標的に到達する軌跡の長さ[メートル]、泳ぐ速度経路と逃避潜時の計算商、標的交差の数及び標的四分円における滞在が評価された。4日間の試験にわたって、プラットフォームへ到達するために水泳経路の長さ及び逃避潜時が評価されると、Tg群A並びにヒヒクルで処置されたnTgFコントロールの動物は期待された学習曲線を示した。TgコントロールAの動物は、nTgコントロールの動物Fに比較して、逃避潜時と水泳経路において、平坦な学習曲線で示されるように、著しい学習障害を持っていた。逃避潜時と水泳経路は、トレーニングの3日及び4日で著しく双方向ANOVA長かったP<0.001;ボンフェローニの事後試験。ACI-36-2B6-Ab1とACI-36-3A8-Ab1による処置は、低又は高投与量それぞれ群B及びC及びD及びEで、Tgコントロールの動物に比較して空間学習能の著しい改善には至らず、似たような学習曲線を示した。各群の第一日の成績を100に適合し、かつ全ての以後の日を第一日の割合とすると、ACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスに改善を見ることができる両方の用量。効果は、第3日p<0.01群D及びp<0.05群Eと第4日p<0.05群Dの水泳経路長に関して統計的有意性に達した。ACI-36-2B6-Ab1で処置されたマウス両方の用量について、統計的有意性は無いもの、水泳経路長にわずかな改善を見ることができる。処置群間での違いは、全4日間のトレーニングで水泳速度の観点では検出されなかった。MWM試験の結果は、ACI-36-2B6-Ab1とACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される傾向を実証した。7.2.2.免疫組織化学的IHC定量による脳のTAU病理AT180抗体は内因性及びヒトpTAUThr231及びSer235で2重リン酸化を染色する。ACI-36-2B6-AB1及びACI-36-3A8-AB1での免疫化後の扁桃体と海馬におけるAT180IRを測定した。扁桃体と海馬のAT180IR面積百分率を測定した。nTgコントロールにおける細胞体内のpTAUの量は、Tg群と比較して有意に低かったp<0.001。扁桃体において、細胞体pTAUを増加させる傾向が、3mg/kgのACI-36-2B6-Ab1処置で観察された。これに対し、ACI-36-2B6-Ab1の両方の投薬量は、海馬におけるビヒクル処置動物と比較してpTAUを低下させる傾向があった。平均染色強度は、全てのトランスジェニック群で同等であった。ACI-36-3A8-Ab1の処置は海馬と扁桃体における細胞体pTAUを変化させず、扁桃体と海馬の神経細胞のpTAUレベルは扱われたトランスジェニック群間で有意な違いは無かった。染色強度の平均及び総計は、全てのトランスジェニック群で同等であった。HT7抗体は、ヒトTAUに特異的であるので、サイズが7ピクセル以上のリポフスチンドットの自家蛍光に由来する、僅かな信号のみが、nTGコントロールで測定された。ビヒクルコントロールPBSに比べて、ACI-36-2B6-Ab1処置は海馬の細胞体HT7陽性IR面積を変えなかった。IR領域の観点において、扁桃体では、ACI-36-2B6-Ab1の低用量を投与したマウスは、全ヒトTAUの高いレベルT検定:P=0.0954を有する傾向にあった。この増加はまた、染色の領域の増大及び個々の神経細胞の細胞体における染色強度の増大として定性的に可視的であった。統計的に有意な処置誘導型の相違点は、海馬ニューロンで観察されなかった。ビヒクルコントロールPBSに比べて、ACI-36-3A8-Ab1処置は扁桃体の細胞体HT7陽性IR面積を有意には変えなかった。染色強度の平均及び総計は、全てのトランスジェニック群で同等であったデータ非表示。脳のタウ病理は脳の可溶性画分で全タウ又はpTauのレベルに変化を示さなかったが、脳切片の免疫染色は、ACI-36-2B6-Ab1で処置したマウスにおける海馬のpTauの減少を示した。7.2.3.対らせん状細線維PHFに存在するリン酸化タウエピトープにおける抗タウ抗体の投与の影響アルツハイマー病ADは、神経原線維変化によって神経病理学的に特徴付けられるNFTs;BraakBraakBohl1993。構造的には、NFTは、高リン酸化された状態で主に見られる、微小管結合タンパク質タウからなる対らせん状細線維PHFからなるAlonsoetal1997。本研究の目的は、抗pTau抗体ACI-36-2B6-Ab1とACI-36-3A8-Ab1の4回の投与によって、タウトランスジェニックマウスの脳におけるこれらのpTauPHFエピトープを減らすことだった。文書で十分に立証されたタウPHFリン酸化エピトープの量に関して、4回のACI-36-2B6-Ab1の投与の効果を測定するために、処置されたタウTgマウスからの大脳皮質及び海馬の可溶性画分及びSinT画分が、WBを用いた抗pS396抗体PHF-13エピトープ、pS396及びAD2PHF-1エピトープ、pS396/pS404で探索された。タウPHFのマーカーとして、pS396/pS404の存在Greenbergetal1992Reigetal1995、より具体的にはpS396位置Hoffmannetal1997が以前に文書化されている。タウTgマウスにおいて、タウは内因性マウスタウとして及びヒトタウ導入遺伝子として、両方の種由来のタウと2つの異なる転写産物由来のタウに結合するブロッティング抗体が十分な量で発現されるときに、明らかにWBで識別することができる分子量の違いを有して、発現される。従って、可能な場合、内因性マウスのバンド及びヒトトランスジェニックタウのバンドは各ブロッティング抗体に対して識別され別々に定量した。我々のWBアッセイでこれらのタウバンドの移行パターンを検証するために、ヒト特異的タウ13であってタウTg脳でヒトの導入遺伝子を示すのみであるが、全タウに結合する抗タウ抗体が、タウトランスジェニックマウスにおいてヒト及びマウスのタウの移行パターンを検証するためにタウTgコントロールサンプルに用いられた。さらに、全ての定量化されたバンドはβアクチンに規格化された。大脳皮質からの可溶性画分で探索されるPHFエピトープの存在は、ACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスで減少した。これは、WBでpS396PHF-13抗体を用いて、マウスとヒトのバンドの両方で有意であった図5A及びB。AD2PHF-1、pS396/pS404抗体が、ACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1処置マウスからの抽出物のWBで用いられるとき、有意な減少が観察された図5C。これらのWBで使用された2つのPHF-特異的抗体は類似のエピトープ及びリン酸化ターゲットに対する良好な特異性を持っているにもかかわらず、pS396PHF-13抗体はより良いシグナル対ノイズ比を有するように見え、かつこれらのWBについてより良好な全体的抗体であったことは記録されるべきである。治療抗体の直接的な標的効果は、ブロッティング抗体としてACI-36-2B6-Ab1とACI-36-2B6-Ab1をそれぞれ使用して大脳皮質において探索された。この抗pTau抗体は、本研究で用いた治療抗体と同じリン酸化タウのエピトープに結合する。ブロットは、以前は二次抗マウスIgG抗体で探索された。バンドは、赤外線イメージングシステムを用いて定量した。個別のマウスに対する値ならびに平均±平均値の標準誤差が決定された。バックグランド以上のシグナルは検出されず、これらのサンプルおいて治療抗体によって遮断効果又は干渉がないことを実証しているデータ非表示。ACI-36-2B6-Ab1で処置したマウスでは、コントロールで処置されたnTGマウスのレベルまで下がってシグナルが低減する傾向が観察され、直接的な標的効果を示している図5G。ACI-36-3A8-Ab1で処置したマウスでは、処置の有意な影響は観察されなかった図5G。タウTgマウスの可溶性皮質における総タウにおいて、内因性マウスタウ及びトランスジェニックヒトタウの両方に結合するブロッティング用Tau5抗体を用いて、ACI-36-2B6-Ab1処置の有意な効果が観察された。全タウの有意な減少は、大脳皮質の可溶性画分における内因性マウスのタウおよびトランスジェニックヒトタウの両方について観察された。マウスA及びヒトBの全タウタウ5を示すバンドは、赤外線イメージングシステムを用いて定量した。個別のマウスに対する値ならびに平均±平均値の標準誤差が決定された。界面活性剤不溶性タウ画分中のPHFエピトープの存在は、サルコシル不溶性SinT脳画分を調製することによって行われた。バンドは、赤外線イメージングシステムを用いて定量した。個別のマウスに対する値ならびに平均±平均値の標準誤差が決定された。皮質と海馬の両方で、可溶性タウ画分と比較したとき、この画分でタウはほとんど存在していなかった。これは、4ヶ月で海馬及び皮質に不溶性で凝集したタウの有意な量を蓄積していない可能性がある本研究で用いたタウTgマウスの年齢に起因する可能性がある。従って、SinT画分でPHFエピトープを探索するとき、AD2PHF-1、pS396/pS404抗体のみが、バンドの信頼性のある量子化のために十分であったシグナルを提供した。1mg/kgのACI-36-2B6-Ab1及び1mg/kgのACI-36-3A8-Ab1でそれぞれ処置されたマウスは、内因性マウスタウを表すバンドでPHF-1エピトープの有意な減少があった図5Cトランスジェニックヒトバンドで観測されたシグナルは確実に定量するのに十分な強さではなかった。海馬はまた、皮質に対するものと同じ抗体および画分を用いて探索された。全ブロッティングの抗体についてより低シグナルが、皮質のそれと比べて海馬由来画分において検出された。タウTgマウスの可溶性海馬におけるpS396PHF-13免疫反応において、ACI-36-2B6-AB1及びACI-36-3A8-AB1処置の効果を決定した。マウスA及びヒトBのpTaupS396PHF-13エピトープを示すバンドは、赤外線イメージングシステムを用いて定量した。個別のマウスに対する値ならびに平均±平均値の標準誤差が決定された。ACI-36-2B6-Ab1処置は、ヒトの導入遺伝子バンドにおいて減少するわずかな傾向を伴っており、マウスタウ溶性海馬画分中でpS396PHF-13エピトープの存在を有意には変えなかった。ACI-36-3A8-Ab1処置は、pS396PHF-13エピトープの存在下で、マウスタウ可溶性海馬画分及びヒト導入遺伝子のバンドで、減少傾向を示した。pS396PHF-13WBで観察されたものと類似して、ACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスの抽出物の両方で、ヒトタウ可溶性海馬画分における全タウについて、シグナルの減少する傾向が検出された。皮質SinTサンプルに似て、海馬からのSinT画分はpTauのレベルが非常に低かった。ACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1のそれぞれで処置されたマウスは、内因性マウスタウを表すバンドにおいて、PHF-1pS396/pS404エピトープに変化は無かった。トランスジェニックヒトバンドで観測されたシグナルは確実に定量するのに十分に強くはなかった。7.2.4要約本研究は、リン酸化部位特異的抗pTau抗体ACI-36-2B6-Ab1抗体及びACI-36-3A8-Ab1抗体の4回の投与を用いる受免疫化は、空間学習を改善し、脳のpTau病理を減少させることを示している。タウTgマウスに対する抗pTau抗体ACI-36-2B6-Ab1の1及び3mg/kgでの4回の末梢性投与は、ウェスタンブロット法により測定される皮質におけるpTauPHFエピトープの存在を減少させた。減少の傾向は海馬で観察された。同様に、全タウの低下も観察された。pTauPHF-1免疫反応性の有意な減少が、不溶性皮質画分で観察され、抗体治療の直接的な標的効果を示す傾向もまた観察された。これらの結果は、ACI-36-2B6-Ab2及びACI-36-3A8-Ab2抗体は、アルツハイマー病などのタウオパチーに対する受動免疫治療における、抗pTau抗体ACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1についての更なる支持を与えている。実施例8:ヒトタウ過剰発現マウスの3ヶ月の処置8.1方法8.1.1マウス及び処置タウトランスジェニックマウスが用いられ、方法6.1の表に示すように、治療抗体を投与し研究番号3、下記の表に記載のようにマウスは4つの異なる処置群に割り当てられた。全45匹のTgマウスプラス3匹の予備は、処置群AからCに割り当てられ、15匹のnTgマウスプラス1匹の予備群Gは、PBSビヒクルコントロール又は抗pTAU抗体のACI-36-2B6-Ab1又はACI-36-3A8-Ab1の何れかを腹腔内注射により、第0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、35日目、42日目、49日目、56日目、63日目、70日目、77日目、および84日目に処置された。動物を全ての処置群の動物を含む5つの異なる出発群階級に無作為に囲い込んだ。一階級における動物の数は同じ年齢で均一な取扱いを確保するように限定された。第12回目の投与後に、水迷路MWMタスクを、空間記憶の成績を試験するために行った。MWMの後で、マウスに被験物質を更に1回追加投与し第13回目の注射、24時間後安楽死させてタウ病理を決定した。脳のタウ病理は、AT180抗pTau、pT231/pS235抗体を用いて免疫組織化学的IHC定量によって海馬と扁桃体で決定された。更に、皮質と海馬において、可溶性及びサルコシル不溶性タウ及びpTauに関する処置の効果を、メソスケールディスカバリーMSD技術を用いて測定し、pTaupT231とpS396及び全タウを探索した。8.1.2.行動実験-モリス水迷路MWMタスクこの実験は、実施例7.1.2に記載のプロトコルに従って行った。第12週に、学習および記憶を評価するために、空間的ナビゲーションをモリス水迷路MWMで試験した。8.1.3.分子生物学全TAU及びThr231及びpS396をリン酸化したタウは、メソスケールディスカバリーMSDから免疫測定法を用いて、Tg動物の脳ホモジネートで定量した。8.1.4.免疫組織化学的IHC定量による脳のタウ病理この実験は、実施例7.1.3に記載のプロトコルに従って行った。TAU病理は、群あたり8匹の海馬及び扁桃体におけるAT180免疫反応によって決定された。8.1.5.対らせん状細線維PHFに存在するリン酸化タウエピトープにおける3ヶ月抗タウ抗体の投与の影響この実験は、実施例7.1.4、7.1.5と7.1.6に記載のプロトコルに従って行った。文書で十分に立証されたタウPHFリン酸化エピトープの量に関して、4回のACI-36-2B6-Ab1及びACI-36-3A8-Ab1の投与の効果を測定するために、処置されたタウTgマウスからの大脳皮質及び海馬の可溶性画分及びSinT画分が、WBを用いて、AD2PHF-1エピトープ、pS396/pS404、抗pS396抗体PHF-13エピトープ、pS396及びAT180pT231/pS235で探索された。8.1.6.biGTタウバイジェニックマウスを用いた、リン酸化タウエピトープに対する3ヶ月抗タウ抗体投与の影響研究番号4は方法6.1に示したようにバイジェニックタウマウスを用いて行った。ウェスタンブロッティングの総ホモジネートTHまたは可溶性画分S1を使用して、下図に示すように、大脳皮質サンプルを調製した。膜はpTauまたは全タウに対して次のブロッティング抗体を用いて探索した:HT-726ng/ml、全ヒトタウに対して特異的PHF-13pS3961/7500希釈AT180pT2312.47ug/mlAT8pS2023ug/mlpS4041:5000希釈pS4001:5000希釈すべての定量化は、β-アクチンに対して規格化した。8.2ACI-36-2B6-Ab1抗体の結果12週間の研究期間中毎週1又は3mg/kgで投与されたACI-36-2B6-Ab1の13回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。8.2.1行動結果-モリス水迷路MWM試験の結果は、ACI-36-2B6-Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される強い傾向を実証した図9。処置の最終週の期間、動物の空間ナビゲーションの学習及び記憶を評価した。動物は1日あたり3回試行で4日間のトレーニングを行う必要があり、その後1回のプローブ試験と視覚検査を行った。逃避潜時マウスが隠されたプラットフォームを見つけて水から脱出するのに必要な時間[秒]、経路標的に到達する軌跡の長さ[メートル]、泳ぐ速度経路と逃避潜時の計算商、標的交差の数及び標的四分円における滞在が評価された。4日間の試験にわたるプラットフォームへ到達するために水泳経路の長さ及び逃避潜時の観点から、ビヒクルで処置されたTg群A及びnTgFコントロールの動物は期待された学習曲線を示した。TgコントロールAの動物は、nTgコントロールの動物群Fに比較して、逃避潜時と水泳経路の平坦な学習曲線で示される、著しい学習能力の障害を示した。逃避潜時と水泳経路は、トレーニングの3日P<0.01、潜時;p<0.001、長さ;ボンフェローニの事後試験及び4日P<0.01;ボンフェローニの事後試験で著しく双方向ANOVA異なっていた。ACI-36-2B6-Ab1による処置は、Tgコントロールの動物Aと比較して、低又は高用量BとCで、空間学習能を著しくは改善しなかった。各群の成績をトレーニング第1日における100に適合させ、以後の全ての日を第一日の割合とすると、ACI-36-2B6-Ab1で処置されたマウスにおいて低及び高用量、統計的有意性は無いが、遊泳経路長にわずかな改善を見ることができる。処置群間での違いは、全4日間のトレーニングで水泳速度を計算すると検出されなかった。プローブ試験PTにおいて、標的四分円西南象限における滞在並びに標的ゾーンの交差が記録された。nTgコントロール群Fは、統計的有意性は無いが、標的四分円でより長時間を過ごし、Tgコントロール群Aに比べて非常にしばしば標的ゾーンを交差した。低容量又は高用量の何れの処置も、PTにより評価されるように、Tgコントロールに比較して、空間学習能の改善には至らなかった。8.2.2分子生物学8.2.2.1皮質ホモジネートの可溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS、群BTg、ACI-36-2B6-Ab11mg/kg,及び群CTg、ACI-36-2B6-Ab13mg/kgに由来するn=16匹の動物の皮質ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI-36-2B6-Ab1による処置は可溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI-36-2B6-Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に有意性は無いがわずかな増加が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は影響を受けなかった。8.2.2.2皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS、群BTg、ACI-36-2B6-Ab11mg/kg,及び群CTg、ACI-36-2B6-Ab13mg/kgに由来するn=16匹の動物の皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI-36-2B6-Ab1による処置はサルコシル不溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI-36-2B6-Ab1の処置の際、全TAU及びp231TAUの平均に有意性は無いがわずかな増加が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は影響を受けなかった。8.2.2.3海馬ホモジネートの可溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS、群BTg、ACI-36-2B6-Ab11mg/kg,及び群CTg、ACI-36-2B6-Ab13mg/kgに由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI-36-2B6-Ab1による処置は可溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI-36-2B6-Ab1の処置の際、全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUのリン酸化のわずかな増加が有意性は無いが観察された。8.2.2.4海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS、群BTg、ACI-36-2B6-Ab11mg/kg,及び群CTg、ACI-36-2B6-Ab13mg/kgに由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI-36-2B6-Ab1による処置はサルコシル不溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。3mg/kgによる処置は全TAU、p231TAU並びにp396TAUの平均を、有意性に到達することは無いものの増加させたが、1mg/kgで処置すると、全TAU、p231TAU並びにp396TAUの平均のわずかな減少が観察された。全TAUに対するpTAUの比率として評価されるTAUリン酸化は、3mg/kgのACI-36-2B6-Ab1処置によりわずかに増加した。8.2.2.5.水溶性の皮質のウェスタンブロットACI-36-2B6-Ab1の用量依存性による処置は、大脳皮質の可溶性画分において、pS396/pS404図5D及びpT181図F5E及び5FpTauエピトープの両方の存在を減少させ、3mg/kg用量で有意な作用を示した。8.2.2.6biGTタウバイジェニックマウスのTAU3ヶ月間ACI-36-2B6-Ab1で処置したbiGTマウスは、大脳皮質可溶性画分で総タウを有意に減少させた図6Aおよび6B。pTauエピトープのpT231/AT180図6C及び6D、pS202/AT8図6E、及びpS396図6F及び6Gで有意な減少が観察された。有意な減少もまたpTauエピトープpS400図6H及び6I及びpS404図6L及び6Mの両方の総ホモジネートTHの両方で観察された。更に、pTauエピトープpS400の可溶性画分で有意な減少も観察され図6J及び6K、pTauエピトープpS404について減少傾向がみられた図6N及び6O。8.2.3組織学8.2.3.1形態計測-領域面積の決定解剖及びIHC又は染色の最中で組織に対する負の影響例えば明確な収縮、異なる切片と、ある程度、処置が誘発した萎縮を除外し、海馬及び扁桃体の測定されたの領域面積は、調査された脳の全てを通して有意差は認められなかった。個々の切片は、例えば、標識化プロトコルの実行の最中での切片部分の喪失又は組織の折れたたみのために、個体及び群の平均から逸脱する場合がある。従って、任意の標識の全免疫反応性面積[μm2単位]は、領域面積内の標識面積の割合[標識面積/領域面積10.000]を計算することにより、切片の個々の領域面積[mm2単位]に対して規格化した。8.2.3.2AT180IHの結果AT180抗体は内因性及びヒトpTAUThr231及びSer235で2重リン酸化を検出する。nTgコントロールにおける細胞体内のpTAUの量は、Tg群と比較して有意に低かったp<0.01並びにp<0.001。扁桃体では、ACI-36-2B6-Ab1の高用量3mg/kg群Cは、ビヒクル処置動物に比べて細胞体pTAUを有意に減少させた図7、左。低用量1mg/kg群Cは同様の傾向を示したが有意性には至らなかった。同じ効果は、海馬で検出可能であった。ACI-36-2B6-Ab1は用量依存的にpTAUを減少させ、高用量で有意であり低用量でその傾向がみられた図7、右。この減少はまた、染色の領域の減少及び個々の神経細胞の細胞体における染色強度の減少として定性的に可視的であった。ニューロンの細胞体で測定されたAT180IRのAOIのサイズに規格化された染色強度の総和の結果は、扁桃体における高用量の大きな効果の有意な用量依存性を含み、測定されたAT180IR面積割合が同程度であった。海馬では、事後の比較は有意な水準には達しなかった。8.2.4要約MSDで測定した脳のタウ病理には、有意な変化を示さなかったが、脳切片の免疫染色は、神経細胞体でAT180pT231/pS235免疫染色の最大60の減少を伴う用量依存性を示した。本研究は、リン酸化部位特異的抗pTau抗体ACI-36-2B6-Ab1抗体の13回の投与を用いる受免疫化は、空間学習を改善し、脳のpTau病理を著しく減少させることを示している。8.3ACI-36-3A8-Ab1抗体の結果12週間の研究期間中毎週1又は3mg/kgで投与されたACI-36-3A8-Ab1の13回の腹腔内注射は、いかなる著しい悪影響をも示さなかった。8.3.1行動結果-モリス水迷路MWM試験の結果は、3mg/kgのACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスに関して空間学習が改善される有意な効果を実証した図10。4日間の試験にわたるプラットフォームへ到達するために水泳経路の長さ及び逃避潜時の観点から、ビヒクルで処置されたTg群A及びnTgFコントロールの動物は期待された学習曲線を示した。TgコントロールAの動物は、nTgコントロールの動物群Fに比較して、逃避潜時と水泳経路の平坦な学習曲線で示される、著しい学習能力の障害を示した。逃避潜時と水泳経路は、トレーニングの3日P<0.01、潜時;p<0.001、長さ;ボンフェローニの事後試験及び4日P<0.01;ボンフェローニの事後試験で著しく双方向ANOVA異なっていた。ACI-36-3A8-Ab1による処置は、Tgコントロールの動物Aと比較して、低又は高用量DとEで、絶対値が解析されるとき、空間学習能を著しくは改善しなかった。各群の成績をトレーニング第1日における100に適合させ、以後の全ての日を第一日の割合とすると、ACI-36-3A8-Ab1処置低及び高用量の際に学習及び記憶能力の改善の可能性がある。ACI-36-3A8-Ab1群Dの低用量で処置された動物は、Tgコントロール群Aに比べて、MWMでごくわずかに良好に機能した。3mg/kgのACI-36-3A8-Ab1による毎週の処置の効果は群Eはるかに顕著であり、nTg動物のパフォーマンスをほとんど回復した。TgコントロールAに比べて、3mg/kgのACI-36-3A8-Ab1の作用は第3日と第4日で遊泳経路長について統計的に有意であった。処置群間での違いは、全4日間のトレーニングで水泳速度を計算すると検出されなかった。プローブ試験PTにおいて、標的四分円西南象限における滞在並びに標的ゾーンの交差が記録された。nTgコントロール群Fは、統計的有意性は無いが、標的四分円でより長時間を過ごし、Tgコントロール群Aに比べて非常にしばしば標的ゾーンを交差した。低容量又は高用量の何れの処置も、PTにより評価されるように、Tgコントロールに比較して、統計的に有意な改善には至らなかった。しかし、ACI-36-3A8-Ab1処置動物は-統計的には有意でないものの-、Tgコントロールに比較して、標的ゾーンをより交差し、それは4日間にわたるトレーニングの遊泳距離の結果と一致する。8.3.2分子生物学8.3.2.1皮質ホモジネートの可溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS及び群DTg、ACI-36-3A8-Ab1、1mg/kgに由来するn=16匹の動物、及び群ETg、ACI-36-3A8-Ab1、3mg/kgに由来するn=15匹の動物の皮質ホモジネートの可溶性画分で評価された。ACI-36-3A8-Ab1による処置は可溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。しかし、ACI-36-3A8-Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に有意性は無いがわずかな増加が観察された。全TAUに対するp231TAUの比率として評価される231でのTAUリン酸化は、3mg/kgのACI-36-3A8-AB1による処置後にわずかに減少した。8.2.2.2皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS及び群DTg、ACI-36-3A8-Ab1、1mg/kgに由来するn=16匹の動物、及び群ETg、ACI-36-3A8-Ab1、3mg/kgに由来するn=15匹の動物の皮質ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI-36-3A8-AB1による処置はサルコシル不溶性皮質ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。1mg/ACI-36-3A8-Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU,及びp396TAUの平均に有意性は無いがわずかな減少が観察された。更に、1mg/kgのACI-36-3A8-Ab1で処置された動物の全TAUに対するp231TAUは、ヒヒクルで処置された動物に比べて、2つの群の全TAUに対するp231TAUの平均を変化させることなく、わずかに低いばらつきをFテスト:p=0.184において有意性を欠いてはいるが示した。1mg/kg及び3mg/kgでのACI-36-3A8-Ab1処置群において、p396TAUリン酸化のわずかな増加が観察された。8.3.2.3海馬ホモジネートの可溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は、群ATgビヒクル群;PBS及び群DTg、ACI-36-3A8-Ab1、1mg/kgに由来するn=16匹の動物、及び群ETg、ACI-36-3A8-Ab1、3mg/kgに由来するn=15匹の動物の海馬ホモジネートの可溶性画分で評価された。IRN6301群Dの可溶性海馬画分におけるTAU及びpTAUのレベルは異常値であり除外された。ACI-36-3A8-Ab1による処置は可溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI-36-3A8-Ab1の処置の際、全TAUに対するpTAUの比率として評価される、231でのTAUのリン酸化のわずかな増加が有意性は無いが観察された。8.2.2.4海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分におけるTAU全TAU、p231TAU、p396TAU、及びpTAUの全TAUに対する比率は群ATgビヒクル群;PBS、群BTg、ACI-36-3A8-Ab1、1mg/kg,及び群CTg、ACI-36-3A8-Ab1、3mg/kgに由来するn=16匹の動物の海馬ホモジネートのサルコシル不溶性画分で評価された。ACI-36-3A8-Ab1による処置はサルコシル不溶性海馬ホモジネートにおいて全TAU及びpTAUに有意には影響を与えなかった。ACI-36-3A8-Ab1の処置の際、全TAU、p231TAU、並びにp396TAUの平均に有意性は無いがわずかな増加が観察された。全TAUに対するp231TAUの比率として評価されるTAUのリン酸化は影響されず、1mg/kgのACI-36-3A8-Ab1による処置は、全TAUに対するp396TAUの比率をわずかに減少させた。8.3.2.5水溶性の皮質のウェスタンブロット1又は3mg/kgのACI-36-3A8-Ab1で処置されたマウスの可溶性大脳皮質において、pS396/pS404pTauエピトープの有意な減少図5D。ヒト/トランスジェニックpT181pTauエピトープの存在は、可溶性皮質画分で減少し、1mg/kgで処置されたマウスで有意な作用と3mg/kgで処置されたマウスで傾向を示した。減少傾向は内因性pT181pTauの量で観察された図5F。8.3.2.6biGTタウバイジェニックマウスのTAU3ヶ月間ACI-36-3A8-Ab1で処置したbiGTマウスは、大脳皮質可溶性画分で総タウを有意に減少させた図6Aおよび6B。pTauエピトープのpT231/AT180図6C及び6D、pS202/AT8図6E、及びpS396図6F及び6Gで有意な減少が観察された。有意な減少もまたpTauエピトープpS400図6H及び6I及びpS404図6L及び6Mの両方の総ホモジネートTHの両方で観察された。更に、pTauエピトープpS400の可溶性画分で有意な減少も観察され図6J及び6K、pTauエピトープpS404について減少傾向がみられた図6N及び6O。8.3.3組織学8.3.3.1形態計測-領域面積の決定実施例8.2.3.1を参照。8.3.3.2AT180IHの結果AT180抗体は内因性及びヒトpTAUThr231及びSer235で2重リン酸化を検出する。nTgコントロールにおける細胞体内のpTAUの量は、Tg群と比較して有意に低かったp<0.001。扁桃体では、ACI-36-3A8-Ab1[1mg/kg群D及び3mg/kg群E]の両方の用量が、ビヒクル処置動物に比べて細胞体pTAUを有意に減少させた図8、左。類似の効果が海馬で観察可能であり、低用量のACI-36-3A8-Ab1はpTAUを減少させたが、しかしこの場合、高用量では有効性は少なく、減少傾向へと導くのみであった。この減少はまた、染色の領域の減少及び個々の神経細胞の細胞体における染色強度の減少として定性的に可視的であった。ニューロンの細胞体で測定されたAT180IR強度の規格化された合計の結果は、扁桃体において、AT180IR面積の割合に匹敵したが、高用量においてのみ有意性に到達した。海馬では結果は、IR面積百分率に全く同等であった。8.3.4要約MSDで測定した脳のタウ病理には、有意な変化を示さなかったが、脳切片の免疫染色は、神経細胞体でAT180pT231/pS235免疫染色の最大40の減少を伴う用量依存性を示した。本研究は、リン酸化部位特異的抗pTau抗体ACI-36-3A8-Ab1の13回の投与を用いる受免疫化は、空間学習を改善し、脳のpTau病理を著しく減少させることを示している。寄託以下のハイブリドーマ細胞株がブダペスト条約の規定により、ブラウンシュワイクの微生物及び細胞培養のドイツコレクション有限責任会社DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHinBraunschweig、Inhoffenstrasse7B、38124BraunschweigとともにエーシーイミューンACImmuneSA、PSEEPFLBuildingB、1015Lausanne、Switzerland及びルーヴェンカトリック大学KatholiekeUniversiteitLeuven、Minderbroedersstraat8aBox5105、B3000Leuvenの名目で寄託された参考文献リストAlonsoADetalProcNatlAcadSciUSA94298303AlvingetalInfectImmun6024382444AsunietalJNeurosc27911529BraakHetalEurNeurol33403408GilletalNatureMed9589595GreenbergSGetalJBiolChem267564569HarlowandLaneAntibodiesALaboratoryManualBioTechnoloy9421HoffmannRetalBiochemistry3681148124KabatEAWuTTPerryHMGottesmanKSFoellerCSequencesofproteinsofImmunologicalInterestUSDepartmentofHealthandHumanServices1991KennedyJHetal1976KhawBAetalJNuclMed2310111019LewisetalNatureGenetics25402405MasliahetalNeuron4685768MasliahetalPLoSONEVolume6e19338pp117MuhsetalProcNatlAcadSciUSA10498105MuyllaertetalRevNeurol162903907MuyllaertetalGenesBrainBehavSuppl15766NeuweltEAImplicationoftheBloodBrainBarrieranditsManipulationVoIs12PlenumPressNYNicolauetalProcNatlAcadSciUSA9923322337NicolletalNatureMed9448452OddoetalNeuron43321332QueenetalProcNatlAcadSciUSA861002910032PapanastassiouetalGeneTherapy9398406ReigSetalActaNeuropathol90441447RibeetalNeurobiolDis2081422RobersonetalScience3167504RosenmannetalArchNeurol63145967RousseauxetalMethodsEnzymologyAcademicPre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