"明細書中に記載の発明。要旨本発明の化合物は、親抗体の一つ以上のアミノ酸が遊離システインアミノ酸と置き換えられたシステイン操作抗体を含む。システイン操作抗体は、0.6~1.0の範囲のチオール反応性値を有する一つ以上の遊離システインアミノ酸を含む。遊離システインアミノ酸は、親抗体において操作されていて、ジスルフィド架橋の一部ではない、システイン残基である。一つの局面では、このシステイン操作抗体は、以下を含むプロセスによって調製される:a親抗体の一つ以上のアミノ酸残基をシステインによって置換する工程、およびbシステイン操作抗体をチオール反応性試薬と反応させることにより、システイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程。このシステイン操作抗体は、チオール反応性試薬との反応性が親抗体よりも上であり得る。遊離システインアミノ酸残基は、重鎖もしくは軽鎖に、または定常ドメインもしくは可変ドメインに位置し得る。抗体フラグメント例えば、Fabはまた、抗体フラグメントのアミノ酸を置換する一つ以上のシステインアミノ酸を用いて操作されて、システイン操作抗体断片が形成され得る。本発明の別の局面は、システイン操作抗体を調製作製する方法を提供し、この方法は、以下を包含する:a一つ以上のシステインアミノ酸を親抗体に導入して、システイン操作抗体を生成する工程;およびbチオール反応性試薬とのシステイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程;ここで、このシステイン操作抗体は、チオール反応性試薬との反応性が親抗体よりも高い。システイン操作抗体を調製する方法の工程aは、以下を包含し得る:iシステイン操作抗体をコードする核酸配列に変異誘発する工程、iiこのシステイン操作抗体を発現させる工程;およびiiiこのシステイン操作抗体を単離および精製する工程。システイン操作抗体を調製する方法の工程bは、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上でシステイン操作抗体を発現させる工程を包含し得る。システイン操作抗体を調製する方法の工程bはまた、以下を包含し得る:iシステイン操作抗体とチオール反応性親和性試薬とを反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成する工程;およびiiこの親和性標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程。本発明の別の局面は、チオール反応性について、非常に反応性の不対システインアミノ酸を有するシステイン操作抗体をスクリーニングする方法であり、この方法は、以下を包含する:a一つ以上のシステインアミノ酸を親抗体に導入してシステイン操作抗体を生成する工程;bこのシステイン操作抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成する工程;およびcこの親和性標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程;およびdチオール反応性試薬を用いてシステイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程。システイン操作抗体のスクリーニング方法の工程aは、以下を包含し得る:iシステイン操作抗体をコードする核酸配列に変異誘発する工程、iiこのシステイン操作抗体を発現させる工程;およびiiiこのシステイン操作抗体を単離および精製する工程。システイン操作抗体のスクリーニング方法の工程bは、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上にシステイン操作抗体を発現させる工程を包含し得る。システイン操作抗体のスクリーニング方法の工程bはまた、以下を包含し得る:iシステイン操作抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成させる工程;およびiiこの親和性標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程。システイン操作抗体は、癌の処置に有用であり得、そして細胞表面および膜貫通レセプターに特異的な抗体および腫瘍関連抗原TAAに特異的な抗体を包含する。このような抗体は、裸の抗体薬物にも標識部分にも結合していないとして、または、式Iの抗体-薬物結合体ADCとして、用いられ得る。システイン操作抗体を調製して、スクリーニングするための方法の実施形態は、親抗体が抗体フラグメント例えば、hu4D5Fabv8である実施形態を包含する。親抗体はまた、アルブミン結合性ペプチド配列ABPを含む融合タンパク質でもよい。親抗体はまた、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7およびhuMAb4D5-8トラスツズマブtrastuzumabから選択されるヒト化抗体でもよい。本発明のシステイン操作抗体は、チオール反応性試薬と部位特異的にかつ効率的に結合され得る。チオール反応性試薬は、多官能性リンカー試薬、捕捉標識試薬、発蛍光団試薬または薬物-リンカー中間体であり得る。システイン操作抗体は、検出可能な標識で標識されてもよく、固相支持体に固定されてもよく、そして/または薬物部分と結合されてもよい。本発明の別の局面は、システイン操作抗体Abおよび薬物部分Dを含む、抗体-薬物結合体化合物である。ここで、このシステイン操作抗体は、リンカー部分Lによって一つ以上の遊離システインアミノ酸を通してDへと結合している;この化合物は、以下の式Iを有する:Ab-L-DpIここで、pは1、2、3、または4であり;このシステイン操作抗体は、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基を一つ以上の遊離システインアミノ酸によって置換する工程を包含するプロセスにより調製される。薬物部分としては、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセンtrichothecene、CC1065、カリケアマイシンおよび他のエンジインenediyne抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な薬物部分としては、DM1、MMAEおよびMMAFが挙げられる。式Iの抗体-薬物結合体は、アルブミン結合性ペプチドABP配列をさらに含み得る;この化合物は、以下の式Iaを有する:ABP-Ab-L-DpIa。本発明の別の局面は、システイン操作抗体またはシステイン操作抗体-薬物結合体、および生理的または薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む組成物である。治療用途のためのこの組成物は、無菌であり、そして凍結乾燥され得る。本発明の別の局面は、本明細書において開示される化合物および組成物の、診断用途および治療用途を包含する。薬学的組成物は、式Iの化合物と一つ以上の化学療法剤との組合せを含む。本発明の別の局面は、腫瘍細胞または癌細胞を殺傷するかまたは腫瘍細胞または癌細胞の増殖を阻害するための方法であり、この方法は、腫瘍細胞または癌細胞を殺傷するかまたは腫瘍細胞または癌細胞の増殖を阻害するために有効な量の本発明の抗体-薬物結合体または薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物でこの細胞を処理する工程を包含する。本発明の他の局面は、以下を処置するための方法を包含する:癌;自己免疫疾患;または感染性疾患。この方法は、その必要がある患者に、有効量の本発明の抗体-薬物結合体化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物を投与する工程を包含する。本発明の別の局面は、哺乳類における癌の処置のための方法であり、ここで、この癌は、ErbBレセプターの過剰発現によって特徴付けられる。この哺乳類は、必要に応じて、結合していない抗ErbB抗体を用いた処置に応答しないかまたは不十分にしか応答しない。この方法は、治療上有効量の本発明の抗体-薬物結合体化合物をこの哺乳類に投与する工程を包含する。本発明の別の局面は、HER2レセプターおよびEGFレセプターからなる群から選択される増殖因子レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、この方法は、この増殖因子レセプターに特異的に結合する抗体-薬物結合体化合物および化学療法剤を患者に投与する工程を包含し、ここで、この抗体-薬物結合体および化学療法剤は、患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量において各々投与される。本発明の別の局面は、ErbB2レセプターの過剰発現によって特徴付けられる障害に感受性であるかまたはその障害であると診断されたヒト患者の処置のための方法であり、この方法は、有効量の組合せの抗体-薬物結合体化合物および化学療法剤を投与する工程を包含する。本発明の別の局面は、癌細胞の検出のためのアッセイ方法であり、この方法は、細胞を抗体-薬物結合体化合物に曝露する工程、およびこの細胞に対する抗体-薬物結合体化合物の結合の程度を決定する工程を包含する。本発明の別の局面は、抗体-薬物結合体化合物;容器;およびこの化合物を使用して癌を処置し得ることを示している添付文書またはラベルを備える製品である。本発明は、例えば、以下の項目を提供する:項目10.6~1.0の範囲のチオール反応性値を有する、一つ以上の遊離システインアミノ酸を含むシステイン操作抗体であって、該システイン操作抗体は、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基をシステインによって置換する工程を包含するプロセスにより調製される、システイン操作抗体。項目2前記システイン操作抗体は、チオール反応性試薬との反応性が前記親抗体よりも高い、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目3前記プロセスが、前記システイン操作抗体をチオール反応性試薬と反応させることによって該システイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程をさらに包含し;該システイン操作抗体は、該チオール反応性試薬との反応性が親抗体よりも高い、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目4前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が軽鎖に位置する、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目5前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、L-10~L-20、L-38~L-48、L-105~L-115、L-139~L-149およびL-163~L-173から選択される範囲において前記軽鎖に位置する、項目4に記載のシステイン操作抗体。項目6前記一つ以上の配列が、以下:iSLSASCGDRVT配列番号17iiQKPGKCPKLLI配列番号18iiiEIKRTCAAPSV配列番号19ivTCAAPCVFIFPP配列番号20vFIFPPCDEQLK配列番号21viDEQLKCGTASV配列番号22viiFYPRECKVQWK配列番号23viiiWKVDNCLQSGN配列番号24ixALQSGCSQESV配列番号25xVTEQDCKDSTY配列番号26およびxiGLSSPCTKSFN配列番号27から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目7前記一つ以上の配列が、以下:iNWIRQCPGNK配列番号40iiLNSCTTEDTAT配列番号41iiiGQGTLVTVSACSTKGPSVFPL配列番号42ivHTFPCVLQSSGLYS配列番号43およびvHTFPACLQSSGLYS配列番号44から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目8前記一つ以上の配列が、以下:iFLSVSCGGRVT配列番号45iiQKPGNCPRLLI配列番号46iiiEIKRTCAAPSV配列番号47ivFYPRECKVQWK配列番号48およびvVTEQDCKDSTY配列番号49から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目9前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が重鎖に位置する、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目10前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、H-35~H-45、H-83~H-93、H-114~H-127、およびH-170~H-184から選択される範囲において重鎖に位置する、項目9に記載のシステイン操作抗体。項目11前記一つ以上の配列が、以下:iWVRQCPGKGL配列番号9iiNSLRCEDTAV配列番号10iiiLVTVCSASTKGPS配列番号11ivLVTVSCASTKGPS配列番号12vLVTVSSCSTKGPS配列番号13viLVTVSSACTKGPS配列番号14viiHTFPCVLQSSGLYS配列番号15およびviiiHTFPAVLQCSGLYS配列番号16から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目12前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、H-268~H-291、H-319~H-344、H-370~H-380、およびH-395~H-405から選択される範囲において前記重鎖のFc領域にある、項目9に記載のシステイン操作抗体。項目13前記一つ以上の配列が、以下:iHEDPECKFNWYVDGVEVHNAKTKPR配列番号29iiHEDPEVKFNWYCDGVEVHNAKTKPR配列番号30iiiHEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR配列番号31ivHEDPEVKFNWYVDGVECHNAKTKPR配列番号32vHEDPEVKFNWYVDGVEVHNCKTKPR配列番号33viYKCKVCNKALP配列番号34viiIEKTICKAKGQPR配列番号35viiiIEKTISKCKGQPR配列番号36ixKGFYPCDIAVE配列番号37およびxPPVLDCDGSFF配列番号38から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目14前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、重鎖または軽鎖の可変領域の位置から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目15前記一つ以上の遊離システインアミノ酸残基が、定常領域の位置から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目16前記チオール反応性値が0.7~1.0の範囲にある、項目1に記載の抗体。項目17前記チオール反応性値が0.8~1.0の範囲にある、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目18以下:i前記システイン操作抗体をコードする核酸配列に変異誘発する工程;ii該システイン操作抗体を発現させる工程;およびiii該システイン操作抗体を単離および精製する工程を包含するプロセスにより調製される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目19前記変異誘発する工程が、部位特異的変異誘発を含む、項目18に記載のシステイン操作抗体。項目20前記システイン操作抗体が、ファージまたはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上に発現される、項目18に記載のシステイン操作抗体。項目21以下:i前記システイン操作抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成する工程;およびii該親和性標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程をさらに包含する、項目18に記載のシステイン操作抗体。項目22前記チオール反応性親和性試薬がビオチン部分を含む、項目21に記載のシステイン操作抗体。項目23前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、項目22に記載のシステイン操作抗体。項目24前記捕捉媒体がストレプトアビジンを含む、項目21に記載のシステイン操作抗体。項目25前記親抗体が、アルブミン結合性ペプチドABPを含む融合タンパク質である、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目26前記ABPが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5から選択される配列を含む、項目25に記載のシステイン操作抗体。項目27前記親抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から選択される、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目28前記親抗体が、huMAb4D5-8トラスツズマブである、項目27に記載のシステイン操作抗体。項目29前記親抗体が、抗EphB2R抗体である、項目27に記載のシステイン操作抗体。項目30前記親抗体が、抗MUC16抗体である、項目27に記載のシステイン操作抗体。項目31配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号28および配列番号39から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目32前記親抗体が、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMから選択されるインタクトな抗体である、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目33前記IgGが、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2から選択される、項目32に記載のシステイン操作抗体。項目34親抗体が抗体フラグメントである、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目35前記抗体フラグメントがFabフラグメントである、項目34に記載のシステイン操作抗体。項目36前記Fabフラグメントがhu4D5Fabv8である、項目35に記載のシステイン操作抗体。項目37システインによって置換されるhu4D5Fabv8のアミノ酸残基のうちの一つ以上が、L-V15、L-A43、L-V110、L-A144、L-S168、H-A40、H-A88、H-S119、H-S120、H-A121、H-S122、H-A175およびH-S179から選択される、項目36に記載のシステイン操作抗体。項目38前記システイン操作抗体または前記親抗体が、以下のレセプター1~36:1BMPR1B骨形態形成タンパク質レセプター-IB型、Genbank登録番号NM_001203;2E16LAT1、SLC7A5、Genbank登録番号NM_003486;3STEAP1前立腺の6回膜貫通上皮抗原、Genbank登録番号NM_012449;40772PCA125、MUC16、Genbank登録番号AF361486;5MPFMPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリン、Genbank登録番号NM_005823;6Napi3bNAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34リン酸ナトリウム、メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸輸送体3b、Genbank登録番号NM_006424;7Sema5bFLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin5bHlog、semaドメイン、7回トロンボスポンジン繰り返し1型および1型様、膜貫通ドメインTmおよび短い細胞質ドメイン、セマフォリン5B、Genbank登録番号AB040878;8PSCAhlg2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA2700050C12、RIKENcDNA2700050C12遺伝子、Genbank登録番号AY358628;9ETBRエンドセリンB型レセプター、Genbank登録番号AY275463;10MSG783RNF124、仮想タンパク質FLJ20315、Genbank登録番号NM_017763;11STEAP2HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原2、6回膜貫通前立腺タンパク質、Genbank登録番号AF455138;12TrpM4BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性レセプター電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4、Genbank登録番号NM_017636;13CRIPTOCR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫由来増殖因子、Genbank登録番号NP_003203またはNM_003212;14CD21CR2補体レセプター2またはC3DRC3d/エプスタインバーウイルスレセプターまたはHs.73792Genbank登録番号M26004;15CD79bCD79B、CD79β、IGb免疫グロブリン関連β、B29、Genbank登録番号NM_000626;16FcRH2IFGP4、IRTA4、SPAP1ASH2ドメインを含むホスファターゼアンカータンパク質1a、SPAP1B、SPAP1C、Genbank登録番号NM_030764;17HER2Genbank登録番号M11730;18NCAGenbank登録番号M18728;19MDPGenbank登録番号BC017023;20IL20RαGenbank登録番号AF184971;21BrevicanGenbank登録番号AF229053;22EphB2RGenbank登録番号NM_004442;23ASLG659Genbank登録番号AX092328;24PSCAGenbank登録番号AJ297436;25GEDAGenbank登録番号AY260763;26BAFF-RB細胞活性化因子レセプター、BLySレセプター3、BR3、NP_443177.1;27CD22B細胞レセプターCD22-Bイソ型、Np-001762.1;28CD79aCD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、Igβ、CD79Bと共有結合的に相互作用して、IgM分子を有する複合体を表面に形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達する、B細胞特異的タンパク質、Genbank登録番号NP_001774.1;29CXCR5バーキットリンパ腫レセプター1、CXCL13ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走および体液性防御において機能し、HIV-2感染症およびおそらくエイズ、リンパ腫、ミエローマおよび白血病の発症において役割を果たす、Gタンパク質共役レセプター、Genbank登録番号NP_001707.1;30HLA-DOBペプチドを結合してそれらをCD4Tリンパ球に提示するMHCクラスII分子Ia抗原のβサブユニット、Genbank登録番号NP_002111.1;31P2X5プリン作動性レセプターP2Xリガンド型イオンチャネル5細胞外のATPによって作動するイオンチャネルは、シナプス伝達および神経発生において関与し得、欠乏は、特発性不安定膀胱の病態生理に寄与し得る、Genbank登録番号NP_002552.2;32CD72B細胞分化抗原CD72、Lyb-2、Genbank登録番号NP_001773.1;33LY64リンパ球抗原64RP105ロイシンリッチリピートLRRファミリーのI型膜貫通タンパク質は、B細胞活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は、全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の上昇と関連している、Genbank登録番号NP_005573.1;34FcRH1Fcレセプター様タンパク質1C2型Ig様ドメインおよびITAMドメインを含む免疫グロブリンFcドメインについての推定上のレセプターは、Bリンパ球分化において役割を有し得る、Genbank登録番号NP_443170.1;35IRTA2免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連2B細胞の発達およびリンパ腫生成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター;トランスロケーションによるこの遺伝子の調節解除は、いくつかのB細胞悪性疾患において生じる、Genbank登録番号NP_112571.1;および36TENB2推定上の膜貫通プロテオグリカン、増殖因子およびフォリスタチンのEGF/ヒレグリンファミリーに関連する、Genbank登録番号AF179274のうちの一つ以上と結合する、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目39前記抗体が、薬物部分に共有結合している、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目40前記抗体が、捕捉標識、検出標識または固体支持体に共有結合している、項目1に記載のシステイン操作抗体。項目41前記抗体が、ビオチン捕捉標識に共有結合している、項目40に記載のシステイン操作抗体。項目42前記抗体が、蛍光色素検出標識に共有結合している、項目40に記載のシステイン操作抗体。項目43前記蛍光色素が、フルオレセインタイプ、ローダミンタイプ、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッドおよびそれらのアナログから選択される、項目42に記載のシステイン操作抗体。項目44前記抗体が、3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atおよび213Biから選択される放射性核種検出標識に共有結合している、項目40に記載のシステイン操作抗体。項目45前記抗体が、キレートリガンドによって検出標識に共有結合している、項目40に記載のシステイン操作抗体。項目46前記キレートリガンドが、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPAおよびTETAから選択される、項目45に記載のシステイン操作抗体。項目47チオール反応性についてシステイン操作抗体をスクリーニングする方法であって、以下:a一つ以上のシステインアミノ酸を親抗体に導入してシステイン操作抗体を生成する工程;b該システイン操作抗体をチオール反応性親和性試薬と反応させて、親和性標識されたシステイン操作抗体を生成する工程;およびc該親和性標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体に対する結合を測定する工程を包含する、方法。項目48前記チオール反応性試薬を用いて前記システイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程をさらに包含する、項目47に記載のスクリーニング方法。項目49方法の工程aが:i二本鎖dsプラスミドにおいて前記システイン操作抗体をコードする遺伝子の部位特異的変異誘発をする工程、およびii該システイン操作抗体を発現させる工程を包含する、項目47に記載のスクリーニング方法。項目50前記発現されたシステイン操作抗体を分離および精製する工程をさらに包含する、項目49に記載のスクリーニング方法。項目51前記チオール反応性親和性試薬がビオチン部分を含む、項目47に記載のスクリーニング方法。項目52前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、項目47に記載のスクリーニング方法。項目53前記捕捉媒体がストレプトアビジンを含む、項目47に記載のスクリーニング方法。項目54前記親抗体が、アルブミン結合性ペプチドABPを含む融合タンパク質である、項目47に記載のスクリーニング方法。項目55前記ABPが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5から選択される配列を含む、項目54に記載のスクリーニング方法。項目56前記親抗体が抗体フラグメントFabである、項目47に記載のスクリーニング方法。項目57システイン操作抗体Abおよび薬物部分Dを含む抗体-薬物結合体化合物であって、該システイン操作抗体は、リンカー部分Lによって一つ以上の遊離システインアミノ酸を通してDへと結合しており;該化合物は、式I:Ab-L-DpIを有し、ここで、pは1、2、3、または4であり;該システイン操作抗体は、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基を一つ以上の遊離システインアミノ酸によって置換する工程を包含するプロセスにより調製される、抗体-薬物結合体化合物。項目58前記システイン操作抗体は、チオール反応性試薬との反応性が親抗体よりも高い、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目59前記システイン操作抗体が、以下:a親抗体の一つ以上のアミノ酸残基をシステインによって置換する工程;およびb前記システイン操作抗体をチオール反応性試薬と反応させることによって該システイン操作抗体のチオール反応性を決定する工程を包含するプロセスにより調製され、該システイン操作抗体は、該チオール反応性試薬との反応性が親抗体よりも高い、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目60アルブミン結合性ペプチドABP配列をさらに含む、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目61前記ABPが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5から選択される配列を含む、項目60に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目62前記システイン操作抗体が、EGFR、HER2、HER3およびHER4から選択されるErbBレセプターと結合する、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目63前記システイン操作抗体または前記親抗体が、以下のレセプター1~36:1BMPR1B骨形態形成タンパク質レセプター-IB型、Genbank登録番号NM_001203;2E16LAT1、SLC7A5、Genbank登録番号NM_003486;3STEAP1前立腺の6回膜貫通上皮抗原、Genbank登録番号NM_012449;40772PCA125、MUC16、Genbank登録番号AF361486;5MPFMPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリン、Genbank登録番号NM_005823;6Napi3bNAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34リン酸ナトリウム、メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸輸送体3b、Genbank登録番号NM_006424;7Sema5bFLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin5bHlog、semaドメイン、7回トロンボスポンジン繰り返し1型および1型様、膜貫通ドメインTmおよび短い細胞質ドメインセマフォリン5B、Genbank登録番号AB040878;8PSCAhlg2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA2700050C12、RIKENcDNA2700050C12遺伝子、Genbank登録番号AY358628;9ETBRエンドセリンB型レセプター、Genbank登録番号AY275463;10MSG783RNF124、仮想タンパク質FLJ20315、Genbank登録番号NM_017763;11STEAP2HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原2、6回膜貫通前立腺タンパク質、Genbank登録番号AF455138;12TrpM4BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性レセプター電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4、Genbank登録番号NM_017636;13CRIPTOCR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫由来増殖因子、Genbank登録番号NP_003203またはNM_003212;14CD21CR2補体レセプター2またはC3DRC3d/エプスタインバーウイルスレセプターまたはHs.73792Genbank登録番号M26004;15CD79bCD79B、CD79β、IGb免疫グロブリン関連β、B29、Genbank登録番号NM_000626;16FcRH2IFGP4、IRTA4、SPAP1ASH2ドメインを含むホスファターゼアンカータンパク質1a、SPAP1B、SPAP1C、Genbank登録番号NM_030764;17HER2Genbank登録番号M11730;18NCAGenbank登録番号M18728;19MDPGenbank登録番号BC017023;20IL20RαGenbank登録番号AF184971;21BrevicanGenbank登録番号AF229053;22EphB2RGenbank登録番号NM_004442;23ASLG659Genbank登録番号AX092328;24PSCAGenbank登録番号AJ297436;25GEDAGenbank登録番号AY260763;26BAFF-RB細胞活性化因子レセプター、BLySレセプター3、BR3、NP_443177.1;27CD22B細胞レセプターCD22-Bイソ型、Np-001762.1;28CD79aCD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、Igβ、CD79Bと共有結合的に相互作用して、IgM分子を有する複合体を表面に形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達する、B細胞特異的タンパク質、Genbank登録番号NP_001774.1;29CXCR5バーキットリンパ腫レセプター1、CXCL13ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走および体液性防御において機能し、HIV-2感染症およびおそらくエイズ、リンパ腫、ミエローマおよび白血病の発症において役割を果たす、Gタンパク質共役レセプター、Genbank登録番号NP_001707.1;30HLA-DOBペプチドを結合してそれらをCD4Tリンパ球に提示するMHCクラスII分子Ia抗原のβサブユニット、Genbank登録番号NP_002111.1;31P2X5プリン作動性レセプターP2Xリガンド型イオンチャネル5細胞外のATPによって作動するイオンチャネルは、シナプス伝達および神経発生において関与し得、欠乏は、特発性不安定膀胱の病態生理に寄与し得る、Genbank登録番号NP_002552.2;32CD72B細胞分化抗原CD72、Lyb-2、Genbank登録番号NP_001773.1;33LY64リンパ球抗原64RP105ロイシンリッチリピートLRRファミリーのI型膜貫通タンパク質は、B細胞活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は、全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の上昇と関連している、Genbank登録番号NP_005573.1;34FcRH1Fcレセプター様タンパク質1C2型Ig様ドメインおよびITAMドメインを含む免疫グロブリンFcドメインについての推定上のレセプターは、Bリンパ球分化において役割を有し得る、Genbank登録番号NP_443170.1;35IRTA2免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連2B細胞の発達およびリンパ腫生成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター;トランスロケーションによるこの遺伝子の調節解除は、いくつかのB細胞悪性疾患において生じる、Genbank登録番号NP_112571.1;および36TENB2推定上の膜貫通プロテオグリカン、増殖因子およびフォリスタチンのEGF/ヒレグリンファミリーに関連する、Genbank登録番号AF179274のうちの一つ以上と結合する、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目64pが1である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目65pが2である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目66Lが、式:-Aa-Ww-Yy-を有し、ここで:Aは、前記システイン操作抗体Abのシステインチオールに共有結合したストレッチャー単位であり;aは0または1であり;各Wは、独立して、アミノ酸単位であり;wは、0~12の範囲の整数であり;Yは、前記薬物部分に共有結合したスペーサー単位であり、そしてyは、0、1または2である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目67以下の式:を有し、ここで、PABがパラ-アミノベンジルカルバモイルであり、そして、R17が、CH2r、C3-C8カルボシクリル、O-CH2r、アリーレン、CH2r-アリーレン、-アリーレン-CH2r-、CH2r-C3-C8カルボシクリル、C3-C8カルボシクリル-CH2r、C3-C8ヘテロシクリル、CH2r-C3-C8ヘテロシクリル、-C3-C8ヘテロシクリル-CH2r-、-CH2rCONRbCH2r-、-CH2CH2Or-、-CH2CH2Or-CH2-、-CH2rCONRbCH2CH2Or-、-CH2rCONRbCH2CH2Or-CH2-、-CH2CH2OrCONRbCH2CH2Or-、-CH2CH2OrCONRbCH2CH2Or-CH2-、および-CH2CH2OrCONRbCH2r-から選択される二価のラジカルであり;ここで、RbがH、C1-C6アルキル、フェニルまたはベンジルであり;そして、rは、独立して、1~10の範囲の整数である、項目66に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目68Wwがバリン-シトルリンである、項目67に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目69R17がCH25またはCH22である、項目67に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目70式:を有する、項目66に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目71R17がCH25またはCH22である、項目70に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目72式:を有する、項目66に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目73LがSMCCである、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目74LがBMPEOである、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目75前記薬物部分Dが、マイクロチューブリンインヒビター、有糸分裂インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターおよびDNAインターカレーターから選択される、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目76前記薬物部分Dが、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチンおよびカリケアマイシンから選択される、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目77Dが、構造:を有するMMAEであり、ここで波形の線が前記リンカーLへの結合部位を示す、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目78Dが、構造:を有するMMAFであり、ここで波形の線が前記リンカーLへの結合部位を示す、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目79Dが、構造:を有するDM1であり、ここで波形の線が前記リンカーLへの結合部位を示す、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目80前記親抗体が、アルブミン結合性ペプチドABPを含む融合タンパク質である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目81前記親抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体から選択される、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目82前記親抗体が、huMAb4D5-8トラスツズマブである、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目83前記親抗体が、抗ErbB2抗体である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目84前記親抗体が、抗EphB2R抗体である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目85前記親抗体が、抗CD22抗体である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目86前記親抗体が、抗MUC16抗体である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目87前記親抗体が、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMから選択されるインタクトな抗体である、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目88前記IgGが、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2から選択される、項目87に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目89前記親抗体が、抗体フラグメントである、項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目90前記抗体フラグメントが、Fabフラグメントである、項目89に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目91前記Fabフラグメントが、hu4D5Fabv8である、項目90に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目92システインによって置換されるhu4D5Fabv8のアミノ酸残基の一つ以上が、L-V15、L-A43、L-V110、L-A144、L-S168、H-A40、H-A88、H-S119、H-A121、H-S122、H-A175およびH-S179から選択される、項目91に記載の抗体-薬物結合体化合物。項目93構造:から選択される抗体-薬物結合体化合物であって、ここで、Valは、バリンであり;Citは、シトルリンであり;pは、1、2、3、または4であり;そして、Abは、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基を一つ以上の遊離システインアミノ酸によって置換する工程を包含するプロセスにより調製されるシステイン操作抗体である、抗体-薬物結合体化合物。項目94構造:を有する抗体-薬物結合体化合物であって、ここで、pは、1、2、3、または4であり;nは、0、1または2であり;そして、Abは、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基を一つ以上の遊離システインアミノ酸によって置換する工程を包含するプロセスにより調製されるシステイン操作抗体である、抗体-薬物結合体化合物。項目95項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物またはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能な希釈液、キャリアまたは賦形剤を含む、薬学的組成物。項目96治療上有効量のさらなる化学療法剤をさらに含む、項目95に記載の薬学的組成物。項目97腫瘍細胞もしくは癌細胞を殺傷するかまたは腫瘍細胞もしくは癌細胞の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、腫瘍細胞もしくは癌細胞を殺傷するかまたは腫瘍細胞もしくは癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物で腫瘍細胞または癌細胞を処理する工程を包含する、方法。項目98細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、以下:a細胞培養培地中の哺乳動物細胞を項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物に曝露する工程、およびb該抗体-薬物結合体化合物の細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性を測定する工程を包含し、それによって該細胞の増殖が阻害される、方法。項目99HER2レセプターおよびEGFレセプターから選択される増殖因子レセプターを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該増殖因子レセプター特異的に結合する項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物および化学療法剤を患者に投与する工程を包含し、ここで、該抗体-薬物結合体および化学療法剤は各々、該患者における腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量で投与される、方法。項目100前記抗体-薬物結合体化合物が、前記腫瘍細胞を前記化学療法剤に対して感作する、項目99に記載の方法。項目101項目57に記載の抗体-薬物結合体化合物、容器、および該化合物を使用して癌を処置し得ることを示している、添付文書またはラベルを備える、製品。項目102抗体-薬物結合体化合物の製造方法であって、該抗体-薬物結合体化合物は、システイン操作抗体Abおよび薬物部分Dを含み、ここで、該システイン操作抗体は、リンカー部分Lによって一つ以上の遊離システインアミノ酸を通してDへと結合しており;該化合物は、式I:Ab-L-DpIを有し、ここで、pは1、2、3、または4であり;該方法は、親抗体の一つ以上のアミノ酸残基をシステインによって置換して該システイン操作抗体を調製する工程を包含する、方法。項目103以下の工程:a前記システイン操作抗体の操作されたシステイン基をリンカー試薬と反応させて抗体-リンカー中間体Ab-Lを形成させる工程;およびbAb-Lを活性化薬物部分Dと反応させ、それによって、該抗体-薬物結合体が形成される工程をさらに包含する、項目102に記載の方法。項目104以下の工程:a薬物部分の求核基とリンカー試薬とを反応させて薬物-リンカー中間体D-Lを形成させる工程;およびbD-Lと前記システイン操作抗体の操作されたシステイン基とを反応させ、それによって、該抗体-薬物結合体が形成される工程をさらに包含する、項目102に記載の方法。項目105チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞において前記システイン操作抗体を発現させる工程をさらに包含する、項目102に記載の方法。項目106前記発現されたシステイン操作抗体がIgG抗体である、項目102に記載の方法。項目107前記発現されたシステイン操作抗体を還元剤で処理する工程をさらに包含する、項目102に記載の方法。項目108前記還元剤がTCEPおよびDTTから選択される、項目107に記載の方法。項目109前記還元剤を用いた処理の後に、前記発現されたシステイン操作抗体を酸化剤で処理する工程をさらに包含する、項目107に記載の方法。項目110前記酸化剤が硫酸銅である、項目109に記載の方法。例示的な実施形態の詳細な説明ここで、本発明の特定の実施形態に対し、詳細な言及がなされる。特定の実施形態の例は、添付の構造および式において説明される。本発明は、列挙される実施形態に関連して記載されるが、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図しないことが、理解される。反対に、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含まれ得る、全ての代替物、改変および均等物を、網羅することが意図される。当業者は、本明細書中に記載の方法および材料と類似するかもしくは均等である多くの方法および材料を認識し、これらの方法および材料は、本発明の実施において使用され得る。本発明は、いかなる場合でも、記載される方法および材料に限定されない。そうでないことが規定されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有し、以下と一致する:Singletonら1994DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第2版,J.WileySons,NewYork,NY;およびJaneway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik2001Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,NewYork。定義他に言及されない限り、以下の用語および語句は、本明細書中で使用される場合、以下の意味を有することが意図される:本明細書中で商品名が使用される場合、本出願人は、商品名の製品の処方物、ジェネリック医薬品およびこの商品名の製品の活性な薬学的成分を個々に包含することを意図する。用語抗体は、本明細書中で、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多重特異的抗体たとえば、二重特異的抗体および抗体フラグメントを網羅するMillerら2003Jour.ofImmunology170:4854-4861。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であり得、または他の種から由来し得る。抗体は、免疫系によって産生されるタンパク質であり、特定の抗原を認識し、かつこの抗原に結合することが可能であるJaneway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik2001ImmunoBiology,第5版,GarlandPublishing,NewYork。標的抗原は、一般に、多くの結合部位エピトープとも呼ばれるを有し、多数の抗体におけるCDRによって認識される。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なった構造を有する。したがって、1つの抗原は、1つより多くの対応する抗体を有し得る。抗体は、全長免疫グロブリン分子もしくは全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位を含み、すなわち、目的の標的の抗原に免疫学特異的に結合する抗原結合部位を含む分子またはその一部であり、このような標的としては、癌細胞もしくは自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の型例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA、クラス例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2、またはサブクラスの免疫グロブリンであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかし、1つの局面において、免疫グロブリンは、ヒト起源、マウス起源、もしくはウサギ起源である。抗体フラグメントは、全長抗体の一部分一般に、その抗原結合領域もしくは可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、Fab’2フラグメント、およびFvフラグメント;ディアボディーdiabody;線状抗体;ミニボディーminibodyOlafsenら2004ProteinEng.DesignSel.174:315-323、Fab発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ抗Id抗体、CDR相補性決定領域、および癌抗原、ウイルス抗原もしくは微生物抗原に免疫特異的に結合する、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント、単鎖抗体分子;ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。用語モノクローナル抗体は、本明細書中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量で存在し得る天然に起こる突然変異を除いては同一である集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、1つの抗原部位に対して指向される。さらに、異なる決定基エピトープに対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の抗体よって夾雑されずに合成され得る点で、有利である。修飾語モノクローナルは、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら1975Nature256:495によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、または組換えDNA方法例えば、US4816567;US5807715を参照によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えばClacksonら1991Nature,352:624-628;Marksら1991J.Mol.Biol.,222:581-597において記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。本明細書中のモノクローナル抗体は、特にキメラ抗体を含み、ここで、重鎖および/もしくは軽鎖の一部分は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかもしくはこれと相同であり、一方、鎖の残りは、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくは抗体サブクラスに属する抗体ならびに所望の生物学的活性を示す限りこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるかもしくはこれと相同であるUS4816567;およびMorrisonら1984Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855。目的のキメラ抗体は、本明細書中で、非ヒト霊長類例えば、旧世界ザル、類人猿などに由来する可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む霊長類化primatized抗体を含む。インタクトな抗体は、本明細書中で、VLおよびVHドメイン、ならびに軽鎖定常ドメインCLおよび重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン例えば、ヒト天然配列定常ドメインであってもよく、またはそのアミノ酸配列改変体であってもよい。インタクトな抗体は、1つもしくはそれより多くのエフェクタ機能を有し得、これは、抗体のFc定常領域天然配列Fc領域もしくはアミノ酸配列改変体Fc領域に起因し得る生物学的活性をいう。抗体エフェクタ機能の例としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害;Fcレセプター結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害ADCC;食作用;および細胞表面レセプター例えば、B細胞レセプターおよびBCRのダウンレギュレーションが挙げられる。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は、異なるクラスに割り当てられ得る。インタクトな免疫グロブリン抗体の5つの主要なクラスが存在する:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM。そして、これらのいくつかは、さらにサブクラスアイソタイプ例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2に分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。Ig形態としては、ヒンジ改変形態hinge-modificationもしくはヒンジなし形態hingelessformが挙げられるRouxら1998J.Immunol.161:4083-4090;Lundら2000Eur.J.Biochem.267:7246-7256;US2005/0048572;US2004/0229310。ErbBレセプターは、ErbBレセプターファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、このErbBレセプターファミリーのメンバーは、細胞増殖、細胞分化および細胞生存の重要なメディエータである。ErbBレセプターファミリーは、上皮細胞増殖因子レセプターEGFR、ErbB1、HER1、HER2ErbB2またはp185neu、HER3ErbB3およびHER4ErbB4またはtyro2を含む、4つの異なったメンバーを含む。抗ErbB2抗体のパネルは、ヒト乳房腫瘍細胞株SKBR3を用いて性質決定されているHudziakら1989Mol.Cell.Biol.93:1165-1172。最大阻害は、4D5と呼ばれる抗体によって得られ、これは、細胞増殖を56阻害した。パネルにおける他の抗体は、このアッセイにおいて、細胞増殖を、より小さな程度で低減された。さらに、抗体4D5は、ErbB2過剰発現性乳房腫瘍細胞株を、TNF-αの細胞傷害性作用に対して感作することが見出されたUS5677171。Hudziakらにおいて考察された抗ErbB2抗体は、Fendlyら1990CancerResearch50:1550-1558;Kottsら1990InVitro263:59A;Sarupら1991GrowthRegulation1:72-82;Shepardら,J.1991Clin.Immunol.113:117-127;Kumarら1991Mol.Cell.Biol.112:979-986;Lewisら1993CancerImmunol.Immunother.37:255-263;Pietrasら1994Oncogene9:1829-1838;Vitettaら1994CancerResearch54:5301-5309;Sliwkowskiら1994J.Biol.Chem.26920:14661-14665;Scottら1991J.Biol.Chem.266:14300-5;D’souzaら,Proc.Natl.Acad.Sci.199491:7202-7206;Lewisら1996CancerResearch56:1457-1465;およびSchaeferら1997Oncogene15:1385-1394においてさらに性質決定されている。ErbBレセプターは、一般に、ErbBリガンドに結合し得る細胞外ドメイン;脂肪親和性膜貫通ドメイン;保存的細胞内チロシンキナーゼドメイン;および幾つかのリン酸化され得るチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。ErbBレセプターは、天然配列ErbBレセプターであっても、またはそのアミノ酸配列改変体であってもよい。好ましくは、ErbBレセプターは、天然配列ヒトErbBレセプターである。したがって、ErbBレセプターファミリーのメンバーは、EGFRErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4または現在既知であるかもしくは将来同定される任意の他のErbBレセプターである。用語ErbB1、上皮細胞増殖因子レセプター、EGFRおよびHER1は、本明細書中で相互交換可能に使用され、例えばCarpenterら1987Ann.Rev.Biochem.,56:881-914に記載されるようにEGFRと呼ばれ、その天然に存在する変異体形態を含む例えば、Humphreyら1990Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:4207-4211におけるような欠失変異体EGFR。用語erbB1は、EGFRタンパク質産物をコードする遺伝子を意味する。HER1に対する抗体は、例えば、Murthyら1987Arch.Biochem.Biophys.,252:549-560およびWO95/25167において記載される。用語ERRP、EGF-レセプター関連タンパク質、EGFR関連タンパク質および上皮細胞増殖因子レセプター関連タンパク質は、本明細書中で相互交換可能に使用され、そして例えばUS6399743および米国公開第2003/0096373号に開示されるように、ERRPと呼ばれる。表現ErbB2およびHER2は、本明細書中で相互交換可能に使用され、例えばSembaら1985Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:6497-6501およびYamamotoら1986Nature,319:230-234Genebank登録番号X03363に記載されるヒトHER2タンパク質をいう。用語erbB2は、ヒトErbB2をコードする遺伝子を意味し、そしてneuは、ラットp185neuをコードする遺伝子を意味する。好ましいErbB2は、天然配列ヒトErbB2である。ErbB3およびHER3は、例えば米国特許第5183884号および同第5480968号ならびにKrausら1989Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:9193-9197において開示されるようなレセプターポリペプチドを意味する。ErbB3に対する抗体は、例えば、米国特許第5183884号、同第5480968号およびWO97/35885におけるように、当該分野で公知である。用語ErbB4およびHER4は、本明細書中で、例えば、欧州特許出願第599,274号;Plowmanら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1746-1750;およびPlowmanら1993Nature366:473-475において開示されるようなレセプターポリペプチドを意味し、例えば、WO99/19488において開示されるように、そのイソ型を含む。HER4に対する抗体は、例えば、WO02/18444において開示される。ErbBレセプターに対する抗体は、多くの供給源例えばSantaCruzBiotechnology,Inc.,California,USAが挙げられるから購入可能である。用語アミノ酸配列改変体とは、天然配列ポリペプチドからある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アミノ酸配列改変体は、天然ErbBリガンドの少なくとも1つのレセプター結合ドメインもしくは天然ErbBレセプターの少なくとも1つのリガンド結合ドメインと少なくとも約70の配列同一性を有し、そしてこれらは、このようなレセプター結合ドメインもしくはリガンド結合ドメインと、好ましくは、少なくとも約80、より好ましくは、少なくとも約90、配列で相同である。アミノ酸配列改変体は、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置において、置換、欠失および/または挿入を有する。アミノ酸は、慣用的名称、1文字コードもしくは3文字コードによって表される。配列同一性は、配列を並列させそして必要な場合に最大配列同一性百分率を達成するためにギャップを挿入した後に、アミノ酸配列改変体における同一である残基の百分率によって規定される。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。1つのこのようなコンピュータープログラムは、Genentech,Inc.によって作成されたAlign2であり、これは、1991年12月10日に、UnitedStatesCopyrightOffice、Washington、DC20559に使用者向け文書と共に提出されている。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害およびADCCは、FcレセプターFcRを発現する非特異的細胞傷害性細胞例えば、ナチュラルキラーNK細胞、好中球およびマクロファージが、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を意味する。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、一方、単球は、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、RavetchおよびKinet,1991Annu.Rev.Immunol.9:457-92の464頁の表3においてまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、例えば、US5500362およびUS5821337において記載されるインビトロアッセイが、実施され得る。このようなアッセイのために有用なエフェクタ細胞としては、末梢血単核細胞PBMCおよびナチュラルキラーNK細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のADCC活性は、インビボで例えば、Clynesら1998PROC.NAT.ACAD.SCI.USAUSA95:652-656において開示されるような動物モデルにおいて評価され得る。ヒトエフェクタ細胞は、1つ以上の定常領域レセプターFcRを発現し、エフェクタ機能を果たす白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、そしてADCCエフェクタ機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞PBMC、ナチュラルキラーNK細胞、単球、細胞傷害性T細胞および好中球が挙げられ、PBMCおよびNK細胞が、好ましい。このエフェクタ細胞は、その天然の供給源から例えば、本明細書中で開示されるように、血液もしくはPBMCから単離され得る。用語FcレセプターもしくはFcRは、抗体のFc定常領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好ましいFcRは、天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体に結合するFcRγレセプターであり、そして、FcγRIサブクラス、FcγRIIサブクラス、およびFcγRIIIサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子改変体および選択的スプライシング形態を含む。FcγRIIレセプターは、FcγRIIA活性化レセプターおよびFcγRIIB阻害性レセプターを含み、その細胞質ドメインにおいて主に異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターFcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフITAMを含む。阻害性レセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフITIMを含む概説M.inDaёron,Annu.Rev.Immunol.15:203-2341997を参照。FcRは、RavetchおよびKinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-921991;Capelら1994Immunomethods4:25-34;ならびにdeHaasら1995J.Lab.Clin.Med.126:330-41において概説される。他のFcR将来同定されるFcRを含むは、本明細書中で用語FcRによって包含される。この用語はまた、新生児レセプターであるFcRnをも含み、これは、胎児への母性IgGの輸送を担うGuyerら1976J.Immunol.,117:587およびKimら1994J.Immunol.24:249。補体依存性細胞傷害もしくはCDCは、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力をいう。補体活性化経路は、同系抗原と複合体化した分子例えば、抗体への補体系の第1成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、CDCアッセイ例えば、Gazzano-Santoroら,J.Immunol.Methods,202:1631996において記載されるが実施され得る。天然抗体は、通常、約150,000ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、2つの同一な軽L鎖および2つの同一な重H鎖からなる。各軽鎖は、1つの共有結合性ジスルフィド結合によって重鎖に結合され、ここで、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖の間で異なる。また、各重鎖および軽鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端において可変ドメインVHを有し、その後に多くの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端において可変ドメインVLを有し、そして他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1定常ドメインと並列し、そして軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられる。用語可変とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体の間で大規模に異なるという事実をいい、そして各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方における超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域FRと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々4つのFRを含み、おおむねβ-シート立体配置をとり、3つの超可変領域によって連結される。これらの超可変領域はループ連結を形成し、そしていくつかの場合においてはこのβ-シート構造の一部分を形成する。各鎖における超可変領域は、FRと非常に近接して、他の鎖由来の超可変領域と一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与しているKabatら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的に関与しないが、種々のエフェクタ機能例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害ADCCにおける抗体の関与を示す。用語超可変領域は、本明細書中で使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、相補性決定領域すなわちCDR由来のアミノ酸残基例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基24~34L1、50~56L2および89~97L3ならびに重鎖可変ドメインにおける31~35H1、50~65H2および95~102H3;Kabatら,前出および/または超可変ループ由来の残基例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基26~32L1、50~52L2および91~96L3ならびに重鎖可変ドメインにおける26~32H1、53~55H2および96~101H3;ChothiaおよびLesk1987J.Mol.Biol.,196:901-917を含む。フレームワーク領域残基すなわちFR残基は、本明細書中で規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を有するFabフラグメントと呼ばれる2つの同一な抗原結合フラグメント、および残りのFcフラグメントこの名前は、容易に結晶化するその能力を反映しているを産生する。ペプシン処理は、Fab’2フラグメントを生じ、これらは、2つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原と架橋可能である。Fvは、完全な抗原認識抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有結合する1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。これは、各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用し、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定する立体配置である。集合的に、6つの超可変領域が、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、1つの可変ドメインもしくは、抗原に特異的な3つの超可変領域しか含まないFvの半分でさえも、抗原を認識しそして結合する能力を、完全な結合部位よりは低い親和性であるが、有する。また、Fabフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメインCH1を含む。Fab’フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における、抗体ヒンジ領域由来の1つもしくはそれより多くのシステインを含む、数残基の付加によって、Fabと異なる。Fab’-SHは、本明細書中で、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも1つの遊離のチオール基を保有するFab’についての表示である。Fab’2抗体フラグメントは、通常、一対のFab’フラグメントとして産生され、このフラグメントの間にヒンジシステインを有する。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた、公知である。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、2つの明らかに異なった型のうちの1つに割り当てられる。これらの型は、カッパκおよびラムダλと呼ばれ、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づく。単鎖FvフラグメントすなわちscFv抗体フラグメントは、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーは、scFvが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にする。scFvの概説については、Plueckthun,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻,RosenburgおよびMoore編,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-3151994を参照。抗ErbB2抗体scFvフラグメントは、WO93/16185;米国特許第5571894号;および同第5587458号に記載される。用語ディアボディーdiabodyは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖内に、可変軽鎖ドメインVLに連結する可変軽鎖ドメインVHを含むVH-VL。同じ鎖上の2つのドメインの間で対形成させるには短すぎるリンカーの使用によって、このドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成させられて、2つの抗原結合部位を生じる。ディアボディーは、例えば、EP404,097;WO93/11161;およびHollingerら1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448においてより完全に記載される。非ヒト例えば、げっ歯類抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を有するキメラ抗体である。ヒト化は、マウス抗原結合情報を、非免疫原性ヒト抗体アクセプタacceptorへ移し、多くの治療的に有用な薬物を生じる方法である。ヒト化の方法は、一般に、全ての6つのマウス相補的決定領域CDRを、ヒト抗体フレームワーク上に移すことによって開始するJonesら,1986Nature321:522-525。これらのCDRグラフトCDR-grafted抗体は、一般に、抗原結合についてのその元の親和性を保持せず、実際、親和性は、多くの場合深刻に損なわれる。CDRに加えて、非ヒト抗体フレームワーク残基もまた、正しいCDR立体配置を維持するために組み込まれなければならないChothiaら1989Nature342:877。グラフトしたCDRの構造的立体配置を支持するための、主要なマウスフレームワーク残基のヒトアクセプタへの移行は、抗原結合および親和性を回復することが示されているRiechmannら1992J.Mol.Biol.224,487-499;FooteおよびWinter,1992J.Mol.Biol.224:487-499;Prestaら1993J.Immunol.151,2623-2632;Wertherら1996J.Immunol.Methods157:4986-4995;およびPrestaら2001Thromb.Haemost.85:379-389。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンレシピエント抗体であり、ここで、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギもしくは非ヒト霊長類のような非ヒト種ドナー抗体の超可変領域と置き換えられる。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域FR残基は、対応する非ヒト残基と置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体もしくはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの改変は、さらに抗体性能を精錬するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも1つの、代表的には2つの可変ドメインを含み、ここで、全てのもしくは実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、そして全てのもしくは実質的に全てのFRは、ヒト免疫グロブリン配列のFRである。ヒト化抗体は、必要に応じて、また、免疫グロブリン定常領域Fc、代表的にはヒト免疫グロブリン定常領域Fcの少なくとも一部分を含み得る。さらなる詳細については、US6407213;Jonesら1986Nature,321:522-525;Riechmannら1988Nature332:323-329;およびPresta,1992Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596を参照のこと。遊離のシステインアミノ酸は、親抗体内に操作されているチオール官能基を有し、かつ分子内ジスルフィド架橋もしくは分子間ジスルフィド架橋として対形成しない、システインアミノ酸残基をいう。用語チオール反応性値は、遊離のシステインアミノ酸の反応性の定量的性質決定をいう。チオール反応性値は、システイン操作された抗体における遊離のシステインアミノ酸の百分率であり、この抗体はチオール反応性試薬と反応し、そして最大値1に変換される。例えば、100の収率でチオール反応性試薬例えば、ビオチン-マレイミド試薬と反応してビオチン標識化抗体を形成する、システイン操作された抗体上の遊離のシステインアミノ酸は、1.0のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と80の収率で反応する、同じかもしくは異なる親抗体内に操作された別のシステインアミノ酸は、0.8のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬とまったく反応しない、同じかもしくは異なる親抗体内に操作された別のシステインアミノ酸は、0のチオール反応性値を有する。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ELISAアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、または他の定量的分析試験によって実施される。親抗体は、1つもしくはそれより多くのアミノ酸残基が1つもしくはそれより多くのシステイン残基によって置換されているアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、天然の配列もしくは野生型配列を含み得る。親抗体は、抗体の他の天然形態、野生型形態、もしくは改変形態に対し、事前に存在するアミノ酸配列改変例えば、付加、欠失および/もしくは置換を有し得る。親抗体は、目的の標的抗原例えば、生物学的に重要なポリペプチドに対して指向され得る。非ポリペプチド抗原例えば、腫瘍関連糖脂質抗原;US5091178参照に対して指向される抗体もまた、企図される。例示的な親抗体としては、細胞表面レセプターおよび膜貫通レセプターならびに腫瘍関連抗原TAAに対する親和性および選択性を有する抗体が挙げられる。他の例示的な親抗体としては、限定されないが、以下から選択される抗体が挙げられる:抗エストロゲンレセプター抗体、抗プロゲステロンレセプター抗体、抗p53抗体、抗HER-2/neu抗体、抗EGFR抗体、抗カテプシンD抗体、抗Bcl-2抗体、抗E-カドヘリン抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖タンパク質抗体、抗CEA抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ras腫瘍性タンパク質抗体、抗LewisX抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD10抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD39抗体、抗CD100抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD106抗体、抗ユビキチン抗体、抗CD71抗体、抗c-myc抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗HPVタンパク質s抗体、抗κ軽鎖抗体、抗λ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異的抗原抗体、抗S-100抗体、抗τ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体および抗Tn-抗原抗体。単離された抗体は、同定されており、かつ、その天然の環境の成分から、分離されそして/または回収されている抗体である。その天然の環境の夾雑成分は、この抗体についての診断的使用もしくは治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性溶質もしくは非タンパク性溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、抗体は、1ローリー法によって決定される抗体の重量の95重量より多く、そして最も好ましくは99重量より多くなるまで、2スピニングカップシークエネーターspinningcupsequenatorの使用によってN末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度、または3クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた還元条件もしくは非還元条件下のSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。何故なら、この抗体の天然環境の少なくとも1種の成分が存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも1回の精製工程によって調製される。分子標的もしくは目的の抗原例えば、ErbB2抗原に結合する抗体は、抗体のこの抗原を発現する細胞の標的化において有用である。この抗体がErbB2に結合する抗体である場合、通常、この抗体は、他のErbBレセプターに対して優先的にErbB2に結合し、そしてEGFR、ErbB3もしくはErbB4のような他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体であり得る。このような実施形態において、これらの非ErbB2タンパク質に対するこの抗体の結合例えば、内因性レセプターに対する細胞表面結合の程度は、蛍光活性化細胞選別FACS分析もしくは放射性免疫沈降法RIAによって決定した場合に、10未満である。時々、抗ErbB2抗体は、ラットneuタンパク質と有意に交差反応しない例えば、Schecterら1984Nature312:513およびDrebinら1984Nature312:545-548において記載される。本発明によって包含される抗体についての分子標的としては、CDタンパク質およびそのリガンドが挙げられ、例えば以下であるが、これらに限定されない:iCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79αCD79a、およびCD79βCD79b;iiErbBレセプターファミリーのメンバー例えば、EGFレセプター、HER2レセプター、HER3レセプターもしくはHER4レセプター;iiiLFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAMおよびαv/βインテグリンのような細胞接着分子であって、これらのαサブユニットもしくはβサブユニットのいずれかを含む例えば、抗CD11a抗体、抗CD18抗体もしくは抗CD11b抗体;ivVEGFのような増殖因子;IgE;血液型抗原;flk2/flt3レセプター;肥満OBレセプター;mplレセプター;CTLA-4;タンパク質C、BR3、c-met、組織因子、β7など;ならびにv細胞表面腫瘍関連抗原および膜貫通腫瘍関連抗原TAA。そうでないことが示されない限り、用語モノクローナル抗体4D5は、マウス4D5抗体ATCCCRL10463の抗原結合残基もしくはこの抗体に由来する抗原結合残基を有する抗体をいう。例えば、モノクローナル抗体4D5は、マウスモノクローナル抗体4D5もしくはその改変体例えば、ヒト化4D5であり得る。例示的なヒト化4D5抗体としては、米国特許第5821337号のように、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7およびhuMAb4D5-8トラスツズマブ、HERCEPTIN登録商標が挙げられる。用語処置するもしくは処置は、被験体が、所望されない生理学的変化または疾患例えば、癌の発症もしくは拡散を予防されるかもしくは緩徐にされる軽減される、治療的処置および予防的prophylacticもしくは防衛的preventative手段の両方をいう。本発明の目的のために、有益であるかもしくは所望される臨床結果としては、症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の安定化すなわち、悪化しない状態、疾患の進行を遅延させるかもしくは緩徐にすること、疾患状態の改善もしくは緩和、および部分的もしくは完全な寛解が挙げられるが、これらに限定されない検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらない。処置はまた、処置を受けなかった場合の予測される生存と比較した場合の、生存の延長を意味し得る。処置を必要とする者としては、既にこの状態もしくは障害を有する者、ならびにこの状態もしくは障害が予防されるべきである場合この状態もしくは障害に罹りやすい者が挙げられる。用語治療的に有効な量は、哺乳動物において疾患もしくは障害を処置するために有効な薬物の量をいう。癌の場合、薬物の治療的に有効な量は、癌細胞の数を減少させ得;腫瘍サイズを縮小させ得;末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し得すなわち、ある程度遅らせ、そして好ましくは停止させる;腫瘍転移を阻害し得すなわち、ある程度遅らせ、そして好ましくは停止させる;ある程度腫瘍増殖を阻害し得;そして/または癌に関連する1つもしくはそれより多くの症状をある程度軽減し得る。薬物が存在する癌細胞の増殖を予防し得る程度および/または存在する癌細胞を殺傷する程度は、細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性であり得る。癌治療について、効力は、例えば、疾患進行の時間TTPを評価することおよび/または反応速度RRを決定することによって測定され得る。用語バイオアベイラビリティーは、患者に投与される所定の量の薬物の全身的すなわち、血液/血漿レベル利用能をいう。バイオアベイラビリティーは、投与された投薬形態から全身循環に到達する薬物の時間速度および総量程度の両方の測定値を示す、定数項である。用語癌および癌性は、代表的に、調節されていない細胞増殖によって性質決定される哺乳動物における生理学的条件を意味するか、またはこれを説明する。腫瘍は、1つ以上の癌性細胞を含む。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病もしくはリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより詳細な例としては、扁平上皮癌例えば、上皮epithelial扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌肺癌NSCLC、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌gastriccancerすなわち胃癌stomachcancer、膵臓癌、多形性グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌kidneycancerもしくは腎臓癌renalcancer、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭部の癌もしくは頚部の癌が挙げられる。ErbBを発現する癌は、その細胞表面に存在するErbBタンパク質を有する細胞を含む癌である。ErbB2を発現する癌は、抗ErbB2抗体がErbB2に結合し得、そしてこの癌に対する治療的効果を有し得るような、その細胞の表面において十分なレベルのErbB2を産生する癌である。抗原性レセプターを過剰発現する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面において有意により高いレベルの抗原性レセプター例えば、ErbB2を有する癌である。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって引き起こされ得るか、または転写もしくは翻訳の増大によって引き起こされ得る。レセプター過剰発現は、細胞の表面上に存在するレセプタータンパク質の増大したレベルを評価することによる、診断アッセイまたは予後診断アッセイにおいて例えば、免疫組織化学アッセイ;IHCを介して決定され得る。あるいは、またはさらに、細胞におけるレセプターをコードする核酸のレベルを、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション技術FISH;WO98/45479を参照、サザンブロッティング技術もしくは実時間定量的PCRRT-PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応PCR技術を介して測定し得る。ErbB2HER2を過剰発現する腫瘍は、細胞あたりに発現されるHER2分子の数に対応し、生物化学的に決定され得る免疫組織化学スコアによってランク付けされる:0=0~10,000コピー/細胞、1=少なくとも約200,000コピー/細胞、2=少なくとも約500,000コピー/細胞、3=約1~2×106コピー/細胞。チロシンキナーゼのリガンド依存的活性化をもたらす3レベルでのHER2の過剰発現Hudziakら1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:7159-7163は、乳癌の約30で生じ、そしてこれらの患者において、無再発性の生存および生存全体が減少するSlamonら1989Science,244:707-712;Slamonら1987Science,235:177-182。細胞傷害性薬剤は、本明細書中で使用される場合、細胞の機能を阻害するかもしくは妨げる物質および/または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60C、およびLuの放射性同位体、化学療法剤および毒素を含むことが意図され、この毒素は、例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の低分子毒素または酵素学的に活性な毒素であり、その合成アナログもしくは誘導体を含む。本明細書中で自己免疫疾患は、個々の自己の組織もしくは器官から生じ、そして組織もしくは器官に対して生じる疾患もしくは障害であるか、あるいはそのコ-セグリゲートco-segregateもしくは発現、またはそれから生じる状態である。多くのこれらの自己免疫障害および炎症性障害において、多くの臨床マーカーおよび研究室マーカーが存在し得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中に堆積する抗原-抗体複合体、コルチコステロイドもしくは免疫抑制性処置からの利益、および罹患した組織におけるリンパ球凝集。B細胞媒介型自己免疫疾患に関するいかなる1つの理論にも限定されることなく、B細胞は、ヒト自己免疫疾患において、多数の機構的経路自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状細胞活性化およびT細胞活性化、サイトカイン合成、直接的ケモカイン放出ならびに異所性新リンパ球生成neo-lymphogenesisのための病巣の提供を介して病原性作用を示すと考えられている。これらの経路の各々は、自己免疫疾患の病理学において、異なった程度で関与し得る。自己免疫疾患は、器官特異的疾患すなわち、この免疫応答は、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸系および肝臓系、腎臓系、甲状腺系、耳系、神経筋計、中枢神経系などの1つの器官系に特異的に向けられているであり得るか、または多数の器官系に影響し得る全身性疾患例えば、全身性紅斑性狼瘡SLE、慢性関節リウマチ、多発性筋炎などであり得る。用語細胞増殖抑制性は、細胞の機能を限定する作用をいい、たとえば、細胞成長もしくは細胞の増殖を限定する作用をいう。化学療法剤は、癌の処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、エルロチニブErlotinibTARCEVA登録商標、Genentech/OSIPharm.、ボルデゾミブBortezomibVELCADE登録商標、MilleniumPharm.、フルベストラントFulvestrantFASLODEX登録商標、Astrazeneca、ステントSutentSU11248、Pfizer、レトロゾールLetrozoleFEMARA登録商標、Novartis、イマチニブメシレートImatinibmesylateGLEEVEC登録商標、Novartis、PTK787/ZK222584Novartis、オキサリプラチンEloxatin登録商標、Sanofi、5-FU5-フルオロウラシル、ロイコボリン、ラパマイシンSirolimus、RAPAMUNE登録商標、Wyeth、ラパチニブLapatinibGSK572016、GlaxoSmithKline、ロナファルニブLonafarnibSCH66336、ソラフェニブSorafenibBAY43-9006、BayerLabs.、およびゲフィチニブIRESSA登録商標、Astrazeneca、AG1478、AG1571SU5271;Sugen、チオテパおよびCYTOXAN登録商標シクロホスファミドのようなアルキル化剤;ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホン酸塩;ベンゾドパbenzodopa、カルボコン、メツレドパmeturedopa、およびウレドパuredopaのようなアジリジン;エチレンイミンおよびアルトレタミンを含むメチラメラミンmethylamelamine、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミン;アセトゲニンacetogenin特にブラタシンbullatacinおよびブラタシノンbullatacinone;カンプトテシン合成アナログであるトポテカンを含む;ブリオスタチンbryostatin;カリスタチンcallystatin;CC-1065そのアドゼレシンadozelesin、カルゼレシンcarzelesinおよびビゼレシンbizelesinの合成アナログを含む;クリプトフィシンcryptophycin特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8;ドラスタチンdolastatin;デュオカルマイシンduocarmycin合成アナログであるKW-2189およびCB1-TM1を含む;エレウテロビンeleutherobin;パンクラチスタチンpancratistatin;サルコジクチンsarcodictyin;スポンジグラスタチンspongistatin;クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムチン、イホスファミド、メクロレクタミン、酸化メクロレクタミン塩酸塩mechlorethamineoxidehydrochloride、メルファラン、ノベンビシンnovembichin、フェネステリンphenesterine、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンのようなニトロソ尿素nitrosurea;エネジインenediyne抗生物質例えば、カリケアマイシンcalicheamicin、特にカリケアマイシンγ1IおよびカリケアマイシンωI1AngewChemIntl.Ed.Engl.199433:183-186のような抗生物質;ダイネマイシンAdynemicinAを含むダイネマイシン;クロドネートのようなビスホスホネート;エスペラミシンesperamicin;ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連の色素タンパク質エネジイン抗生発色団、アクラシノマイシンaclacinomysin、アクチノマイシン、アントラマイシンanthramycin、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシンcarabicin、カルミノマイシンcarminomycin、カルチノフィリン、クロモミシニスchromomycinis、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシンdetorubicin、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN登録商標ドキソルビシンモルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシンmarcellomycin、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシンpotfiromycin、プロマイシン、ケラマイシンquelamycin、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジンtubercidin、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル5-FUのような代謝拮抗物質;デノプテリンdenopterin、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸アナログ;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリンアナログ;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジンアナログ;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタンのような抗副腎薬anti-adrenal;フロリン酸frolinicacidのような葉酸補充薬;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシドaldophosphamideglycoside;アミノレブリン酸;エニルウラシルeniluracil;アムサクリン;ベストラブシルbestrabucil;ビサントレンbisantrene;エダトラキサートedatraxate;デフォファミドdefofamine;デメコルシン;ジアジコンdiaziquone;エルホルニチンelfornithine;酢酸エリプチニウムelliptiniumacetate;エポチロンepothilone;エトグルシドetoglucid;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダイニンlonidainine;マイタンシンmaytansineおよびアンサマイトシンansamitocinsのようなメイタンシノイドmaytansinoid;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモールmopidanmol;ニトラエリンnitraerine;ペントスタチン;フェナメットphenamet;ピラルビシン;ロソキサントロンlosoxantrone;ポドフィリン酸podophyllinicacid;2-エチルヒドラジン;プロカルバジン;PSK登録商標多糖類複合体JHSNaturalProducts,Eugene,OR;ラゾキサン;リゾキシンrhizoxin;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセンtrichothecene特にT-2毒素である、ベラクリンAverracurinA、ロリジンroridinAおよびアングイジンanguidine;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブリニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシンgacytosine;アラビノシドAra-C;シクロホスファミド;チオテパ;タキソイドtaxoid、例えば、TAXOL登録商標パクリタキセルBristol-MyersSquibbOncology、Princeton、N.J.、ABRAXANETMCremophor非含有、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方物AmericanPharmaceuticalPartners、Schaumberg、Illinois、およびTAXOTERE登録商標ドセタキセルRhone-PoulencRorer、Antony、France;クロラムブシルchloranbucil;GEMZAR登録商標ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ;ビンブラスチン;白金;エトポシドVP-16;イホスファミド;ミトザントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE登録商標ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネートibandronate;CPT-11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチルオルニチンdifluorometlhylornithineDMFO;レチノイン酸のようなレチノイド;カペシタビン;および上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸もしくは誘導体。この化学療法剤の定義にはまた、以下も含まれる:i抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプター調節因子SERMのような、腫瘍におけるホルモン作用を調節するかもしくは阻害する抗ホルモン剤例えば、タモキシフェンNOLVADEX登録商標タモキシフェンを含む、ラロキシフェン、ドロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェンkeoxifene、LY117018、オナプリストン、およびFARESTONトレミフェンが挙げられる;ii副腎においてエストロゲン産生を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば、45-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE登録商標酢酸メゲストロール、AROMASIN登録商標エキセメスタン、ホルメスタニーformestanie、ファドロゾール、RIVISOR登録商標ボロゾールvorozole、FEMARA登録商標レトロゾールletrozole、andARIMIDEX登録商標アナストロゾール;iiiフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンのような抗アンドロゲン;ならびにトロキサシタビンtroxacitabine1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ;ivアロマターゼインヒビター;vプロテインキナーゼインヒビター;vi脂質キナーゼインヒビター;viiアンチセンスオリゴヌクレオチド、非接着性abherant細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、PKC-α、RalfおよびH-Ras;viiiリボザイム、例えばVEGF発現インヒビター例えば、ANGIOZYME登録商標リボザイムおよびHER2発現インヒビター;ixワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ALLOVECTIN登録商標ワクチン、LEUVECTIN登録商標ワクチン、およびVAXID登録商標ワクチン;PROLEUKIN登録商標rIL-2;LURTOTECAN登録商標トポイソメラーゼ1インヒビター;ABARELIX登録商標rmRH;x抗脈管形成剤、例えばベバシズマブbevacizumabAVASTIN登録商標、Genentech;ならびにxi上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩もしくは誘導体。本明細書中で使用される場合、用語EGFR標的化薬物は、EGFRに結合し、必要に応じて、EGFR活性化を阻害する治療剤をいう。このような薬剤の例としては、EGFRに結合する抗体および低分子が挙げられる。EGFRに結合する抗体の例としては、MAb579ATCCCRLHB8506、MAb455ATCCCRLHB8507、MAb225ATCCCRL8508、MAb528ATCCCRL8509US4943533、Mendelsohnらを参照およびそれらの改変体、例えばキメラ化225C225もしくはCetuximab;ERBITUX登録商標および再成形reshapedヒト225H225WO96/40210、ImcloneSystemsInc.を参照;II型変異体EGFRに結合する抗体米国特許第5,212,290号;US5891996に記載のEGFRに結合するヒト化抗体およびキメラ抗体;ならびにABX-EGFWO98/50433、Abgenixを参照のようなEGFRに結合するヒト抗体が挙げられる。抗EGFR抗体は、細胞傷害性薬剤と結合体化され得、それによって免疫結合体を産生し得る例えば、EP659,439A2、MerckPatentGmbHを参照。EGFRに結合する低分子の例としては、ZD1839もしくはゲフィチニブIRESSATM;AstraZeneca、エルロチニブHClErlotinibHClCP-358774、TARCEVATM;Genentech/OSIおよびAG1478、AG1571SU5271;Sugenが挙げられる。プロテインキナーゼインヒビターとしては、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害するチロシンキナーゼインヒビター例えばErbBレセプターが挙げられる。このようなインヒビターの例としては、上の段落に記載したEGFR標的化薬物、ならびにPD153035、4-3-クロロアニリノキナゾリンのようなキナゾリン、ピリドピリミジン、ピリミドピリミジン、ピロロピリミジン例えばCGP59326、CGP60261およびCGP62706、およびピラゾロピリミジン、4-フェニルアミノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン、クルクミンジフェルロイルメタンdiferuloylmethane、4,5-ビス4-フルオロアニリノフタルイミド、ニトロチオフェン部分を含むチルホスフィンtyrphostine;PD-0183805Warner-Lambert;アンチセンス分子例えば、ErbBをコードする核酸に結合するアンチセンス分子;キノキサリンUS5804396;tryphostinsUS5804396;ZD6474AstraZeneca;PTK-787Novartis/ScheringAG;CI-1033Pfizerのようなpan-ErbBインヒビター;アフィニタックAffinitacISIS3521;Isis/Lilly;イマチニブメシレートImatinibmesylateGleevec;Novartis;PKI166Novartis;GW2016GlaxoSmithKline;CI-1033Pfizer;EKB-569Wyeth;セマキサニブSemaxanibSugen;ZD6474AstraZeneca;PTK-787Novartis/ScheringAG;INC-1C11Imclone;もしくは以下の特許公開のいずれかに記載されるものが挙げられる:WO99/09016AmericanCyanamid;WO98/43960AmericanCyanamid;WO97/38983WarnerLambert;WO99/06378WarnerLambert;WO99/06396WarnerLambert;WO96/30347Pfizer,Inc;WO96/33978Zeneca;WO96/3397Zeneca;およびWO96/33980Zeneca。抗脈管形成剤とは、血管の発達をある程度遮断するかもしくは妨害する化合物である。抗脈管形成因子は、例えば、脈管形成の促進に関与する増殖因子もしくは増殖因子レセプターに結合する低分子もしくは抗体であり得る。本明細書中で好ましい抗脈管形成因子は、脈管内皮増殖因子VEGFに結合する抗体である。用語サイトカインは、1つの細胞集団によって放出されるタンパク質であって、別の細胞上で細胞間メディエータとして作用するタンパク質についての総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、以下が含まれる:ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;レラキシン;プロレラキシン;卵胞刺激ホルモンFSH、甲状腺刺激ホルモンTSHおよび黄体化ホルモンLHのような糖タンパク質ホルモン;肝性増殖因子;線維芽細胞増殖因子;プロラクチン;胎盤ラクトゲン腫瘍壊死因子-αおよび腫瘍壊死因子-β;ミュラー阻害物質;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;脈管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチンTPO;NGF-βのような神経増殖因子;血小板増殖因子;TGF-αおよびTGF-βのようなトランスホーミング増殖因子TGF;インスリン様増殖因子-Iおよびインスリン様増殖因子-II;エリトロポイエチンEPO;骨誘導性因子;インターフェロン-α、インターフェロン-β、およびインターフェロン-γのようなインターフェロン;マクロファージ-CSFM-CSF、顆粒球マクロファージCSFGM-CSFおよび顆粒球-CSFG-CSFのようなコロニー刺激因子CSF;IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12のようなインターロイキンIL;TNF-αもしくはTNF-βのような腫瘍壊死因子;およびLIFおよびkitリガンドKLを含む他のポリペプチド因子。本明細書中で使用される場合、用語サイトカインは、天然供給源由来もしくは組換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。用語プロドラッグは、本出願中で使用される場合、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してより細胞傷害性が低く、そして酵素的にもしくは加水分解的に活性化されるかまたはより活性な親形態に変換される、薬学的に活性な物質の前駆体もしくは誘導体の形態をいう。例えば、Wilman,ProdrugsinCancerChemotherapyBiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,第615回MeetingBelfast1986およびStellaらProdrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery,DirectedDrugDelivery,Borchardtら編,pp.247-267,HumanaPress1985を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸改変プロドラッグ、糖化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5-フルオロシトシンおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグであり、これらは、より活性な細胞傷害性の遊離の薬物に変換され得る。本発明における使用のためにプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例としては、上記の化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームは、種々の型の脂質、リン脂質および/または界面活性剤から構成される小さな小胞であり、哺乳動物への薬物例えば、本明細書中で開示される抗ErbB2抗体、および必要に応じて化学療法剤の送達のために有用である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と類似した二層構造に配置される。用語パッケージ挿入物は、通例、このような治療用製品の使用に関する効能、用法、用量、投与、禁忌および/または警告についての情報を含む、市販の治療用製品のパッケージに含まれる指示書をいうように使用される。ファージディスプレイは、改変体ポリペプチドがファージ例えば、繊維状ファージ、粒子表面上の融合タンパク質として提示される技術である。ファージディスプレイの1つの有用性は、無作為化したタンパク質改変体の大きなライブラリーが、標的分子に高親和性で結合する配列について、迅速かつ効率的に選別され得るという事実に基づく。ファージ上におけるペプチドおよびタンパク質のライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有するポリペプチドについて何百ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ方法は、代表的には繊維状ファージのpIIIもしくはpVIIIのいずれかに対する融合を介して、小さな無作為のペプチドおよび小さなタンパク質を提示するために使用されているWellsおよびLowman,1992Curr.Opin.Struct.Biol.,3:355-362、ならびにその中に引用されている参考文献。一価のファージディスプレイにおいて、タンパク質もしくはペプチドのライブラリーは、ファージコートタンパク質もしくはその一部分に融合され、そして野生型タンパク質の存在下で、低レベルで発現される。アビディティ作用は、多価ファージに対して低下し、したがって、選別は内因性のリガンド親和性に基づき、そしてDNA操作を単純化するファージミドベクターが、使用される。LowmanおよびWells,Methods:AcompaniontoMethodsinEnzymology,3:205-02161991。ファージディスプレイは、抗体様分子を産生するための技術を含むJaneway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik2001Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,NewYork,p627-628;Leeら。ファージミドは、細菌の複製起点例えば、Co1E1およびバクテリオファージの遺伝子間領域の1つのコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、任意の公知のバクテリオファージにおいて使用され得、これらのファージとしては、繊維性バクテリオファージおよびλバクテリオファージが挙げられる。プラスミドはまた、一般に、抗生物質抵抗性についての選択可能マーカーを含む。これらのベクター内にクローン化されるDNAのセグメントは、プラスミドとして増殖され得る。これらのベクターを有する細胞が、ファージ粒子の産生のために必要な全ての遺伝子と共に提供される場合、プラスミドの複製の様式がローリングサークル複製へと変化し、一本鎖のプラスミドDNAのコピーとパッケージファージ粒子とを産生する。このファージミドは、感染性もしくは非感染性のファージ粒子を形成する。この用語は、遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子に連結したファージコートタンパク質遺伝子もしくはそのフラグメントを含み、それによってこの異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上に提示されるファージミドを含む。リンカー、リンカー単位もしくはリンクlinkは、共有結合を含む化学部分もしくは薬物部分の抗体に共有結合する原子の鎖を意味する。種々の実施形態において、リンカーは、Lとして特定される。リンカーとしては、アルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、-CR2nOCR2n-のような部分、アルコキシ例えば、ポリエチレンオキシ、PEG、ポリメチレンオキシおよびアルキルアミノ例えば、ポリエチレンアミノ、JeffamineTMの反復単位;ならびにコハク酸塩、コハク酸アミド、ジグリコレート、マロネートおよびカプロアミドを含む二価酸エステルおよび二価酸アミドのような二価ラジカルが挙げられる。用語標識は、抗体に共有結合し得る任意の部分を意味し、これは、i検出可能シグナルを提供する;ii第2の標識と相互作用し、第1もしくは第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する例えば、FRET蛍光共鳴エネルギー移動;iii抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化するか、もしくは結合の親和性を増大する;iv電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度例えば、電気泳動度もしくは細胞透過性に影響する、あるいはv捕捉部分を提供し、リガンド親和性、抗体/抗原結合もしくはイオン複合体化ioniccomplexを調節するように作用する。本明細書中で使用される立体化学的な規定および規約は、一般に、S.P.Parker,編,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms1984McGraw-HillBookCompany,NewYork;ならびにEliel,E.およびWilen,S.,StereochemistryofOrganicCompounds1994JohnWileySons,Inc.,NewYorkに従う。多くの有機化合物が、光学活性形態で存在し、すなわち、これらは、平面偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物の記載において、接頭語DおよびL、またはRおよびSは、そのキラル中心に関する分子の絶対配置を表示するために使用される。接頭語dおよびlまたはおよび-は、化合物による平面偏光の回転の符号を表し、-もしくはlは、この化合物が左旋性であることを意味する。もしくはdの接頭語を有する化合物は、右旋性である。所定の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像対称であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーと呼ばれ得、そしてこのような異性体の混合物は、しばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの50:50混合物は、ラセミ混合物もしくはラセミ体と呼ばれ、これは、化学反応もしくはプロセスにおいて立体選択性もしくは立体特異性が存在しない場合に生じ得る。用語ラセミ混合物およびラセミ体は、光学活性を有さない、2つのエナンチオマー種の等モル濃度の混合物をいう。語句薬学的に受容可能な塩は、本明細書中で使用される場合、ADCの薬学的に受容可能な有機もしくは無機の塩をいう。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩pamoateすなわち、1,1’-メチレン-ビス-2-ヒドロキシ-3-ナフトエートが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンもしくは他の対イオンのような別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分もしくは無機部分であり得る。さらに、薬学的に受容可能な塩は、1つより多くの荷電した原子をその構造内に有し得る。多数の荷電した原子がこの薬学的に受容可能な塩の一部分である場合、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に受容可能な塩は、1つもしくはそれより多くの荷電した原子および/または1つもしくはそれより多くの対イオンを有し得る。薬学的に受容可能な溶媒和物は、1つもしくはそれより多くの分子とADCとの会合物をいう。薬学的に受容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、DMSO、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。以下の略称が、本明細書中で使用され、そして示される定義を有する:BMEはβ-メルカプトエタノール、BocはN-t-ブトキシカルボニル、citはシトルリン2-アミノ-5-ウレイドペンタン酸、dapはドラプロインdolaproine、DCCは1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド、DCMはジクロロメタン、DEAはジエチルアミン、DEADはジエチルアゾジカルボキシレート、DEPCはジエチルホスホリルシアニデート、DIADはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、DIEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミン、dilはドライソロイシンdolaisoleucine、DMAはジメチルアセトアミド、DMAPは4-ジメチルアミノピリジン、DMEはエチレングリコールジメチルエーテルもしくは1,2-ジメトキシエタン、DMFはN,N-ジメチルホルムアミド、DMSOはジメチルスルホキシド、doeはドラフェニンdolaphenine、dovはN,N-ジメチルバリン、DTNBは5,5’-ジチオビス2-ニトロ安息香酸、DTPAはジエチレントリアミンペンタ酢酸、DTTはジチオトレイトール、EDCIは1-3-ジメチルアミノプロピル-3-エチルカルボジイミド塩酸塩、EEDQは2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン、ES-MSはエレクトロスプレー質量分析、EtOAcは酢酸エチル、FmocはN-9-フルオレニルメトキシカルボニル、glyはグリシン、HATUはO-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-N、N、N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、HOBtは1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、HPLCは高速液体クロマトグラフィー、ileはイソロイシン、lysはリジン、MeCNCH3CNはアセトニトリル、MeOHはメタノール、Mtrは4-アニシルジフェニルメチルもしくは4-メトキシトリチル、norは1S、2R--ノルエフェドリン、PABはp-アミノベンジルカルバモイル、PBSはリン酸緩衝化生理食塩水pH7、PEGはポリエチレングリコール、Phはフェニル、Pnpはp-ニトロフェニル、MCは6-マレイミドカプロイル、pheはL-フェニルアラニン、PyBropはブロモトリ-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、SECはサイズ排除クロマトグラフィー、Suはスクシンイミド、TFAはトリフルオロ酢酸、TLCは薄層クロマトグラフィー、UVは紫外線、およびvalはバリン。システイン操作抗体本発明の化合物は、野生型抗体もしくは親抗体の1つもしくはそれより多くのアミノ酸が、システインアミノ酸と置き換えられている、システイン操作抗体を含む。抗体の任意の形態は、このように操作され得るすなわち、変異され得る。例えば、親Fab抗体フラグメントは、システイン操作Fabを形成するように操作され得、本明細書中でチオFabと呼ばれる。同様に、親モノクローナル抗体は、チオMabを形成するように操作され得る。一部位変異は、チオFabにおいて1つの操作システイン残基を生じ、一方、IgG抗体のダイマーの性質に起因して、一部位変異は、チオMabにおいて2つの操作システイン残基を生じる。置き換えられた操作されたシステインCys残基を有する変異体は、新規に導入された操作チオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は、0から1.0の範囲の相対的な数値の項であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、0.6~1.0;0.7~1.0;もしくは0.8~1.0の範囲内である。本発明の設計方法、選択方法および調製方法は、求電子性官能基と反応性であるシステイン操作抗体を可能にする。これらの方法は、さらに、指定された、設計された、選択的部位に薬物分子を有する抗体結合体化号物例えば、抗体-薬物結合体ADC化合物を可能にする。抗体表面上の反応性システイン残基は、チオール反応性基例えば、マレイミドもしくはハロアセチルを介した薬物部分の得意的な結合体化を可能にする。Cys残基のチオール官能基のマレイミド基に対する求核反応性は、タンパク質中の任意の他のアミノ酸官能基例えば、リジン残基のアミノ基もしくはN末端アミノ基と比較して約1000倍高い。ヨードアセチル試薬およびマレイミド試薬におけるチオール特異的官能基は、アミン基と反応し得るが、より高いpH>9.0およびより長い反応時間が必要とされるGarman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London。本発明のシステイン操作抗体は、その対応する野生型親抗体の抗原結合能力を保持する。したがって、システイン操作抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合可能である。このような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原TAA、細胞表面レセプタータンパク質および他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発生もしくは組織分化に関連する例えば、機能的に寄与することが公知であるかもしくは疑われる分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子および脈管形成に関連する例えば、機能的に寄与することが公知であるかもしくは疑われる分子が挙げられる。腫瘍関連抗原は、分化因子の集団すなわち、CDタンパク質であり得る。システイン操作抗体が結合可能である抗原は、上記のカテゴリーの1つの下位集団のメンバーであり得、ここで、このカテゴリーの他の下位集団は、異なる特性目的の抗原に関連してを有する他の分子/抗原を含む。親抗体はまた、US5821337本明細書中に明白に参考として援用されるの表3において記載されるように、huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7およびhuMAb4D5-8トラスツズマブ、HERCEPTIN登録商標から選択されるヒト化抗体であり得る;本明細書中に記載される、ヒト化520C9WO93/21319抗体およびヒト化2C4抗体。本発明のシステイン操作抗体は、部位特異的にかつ効率的にチオール反応性試薬とカップリングされ得る。このチオール反応性試薬は、多官能性リンカー試薬、捕獲すなわち親和性試薬、標識試薬例えば、ビオチン-リンカー試薬、検出標識例えば、フルオロフォア試薬、固相固定化試薬例えば、HAROSETM、ポリスチレン、もしくはガラスまたは薬物-リンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の1つの例は、N-エチルマレイミドNEMである。例示的な実施形態において、チオFabのビオチン-試薬との反応は、ビオチン化チオFabを提供し、これにより、操作されたシステイン残基の反応性の存在が、検出され得そして測定され得る。チオFabと多官能性リンカー試薬との反応性は、感応性付与されたリンカーをチオFabに提供し、このリンカーは、薬物部分試薬もしくは他の標識とさらに反応させられ得る。チオFabと薬物リンカー中間体との反応は、チオFab薬物結合体を提供する。本明細書中で記載される例示的な方法は、一般に、抗体の同定および産生に適用され得、そしてより一般には、本明細書中に記載される設計およびスクリーニング工程の適用を介して、他のタンパク質に適用され得る。このようなアプローチは、他のチオール反応性剤の結合体化に適用され得、ここで、この反応性基は、たとえばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィドもしくは他のチオール反応性結合体パートナーであるHaugland,2003,MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes,Inc.;Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2;Garman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London;Means1990BioconjugateChem.1:2;Hermanson,G.,BioconjugateTechniques1996AcademicPress,SanDiego,pp.40-55,643-671。このパートナーは、細胞傷害性薬剤例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素のような毒素、フルオロセインもしくはローダミンなどの蛍光色素のようなフルオロフォア、画像化のためのキレート剤もしくは放射線治療用の金属、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識または検出タグ、またはポリエチレングリコールの種々の異性体のようなクリアランス改変剤、第3成分に結合するペプチド、あるいは別の炭水化物もしくは脂肪親和性薬剤であり得る。本明細書中の例示的な抗体フラグメントであるhu4D5Fabv8上に同定される部位は、主に抗体の定常ドメインにあり、これは、抗体の全ての種にわたって保存されている。これらの部位は、他の抗体に対し、構造的設計もしくは特異的抗体構造の知識をさらに必要とせずに、そして抗体の可変ドメインに固有の抗原結合特性を妨害することなしに、広範に適用可能である。癌の処置において有用であり得るシステイン操作抗体としては、細胞表面レセプターに対する抗体および腫瘍関連抗原TAAに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、裸の抗体薬物もしくは標的部分に結合体化されていない抗体として使用されてもよく、または式Iの抗体-薬物結合体ADCとして使用されてもよい。腫瘍関連抗原は、当該分野で公知であり、そして当該分野で周知の方法および情報を用いた抗体の産生における使用のために調製され得る。癌診断および癌治療のための有効な細胞性標的を発見する試みにおいて、研究者らは、1種以上の特定の型の癌細胞の表面上で、1種以上の正常な非癌性細胞と比較して特異的に発現される、膜貫通ポリペプチドもしくは他の腫瘍関連ポリペプチドを同定している。多くの場合、このような腫瘍関連ポリペプチドは、癌細胞の表面上で、非癌性細胞の表面上と比較して、より豊富に発現される。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体ベースの治療を介した破壊のために癌細胞を特異的に標的化する能力をもたらしている。TAAの例としては、以下に列挙するTAA1~36が挙げられるが、これらに限定されない。便宜上、名称、別名、Genbank登録番号および主な文献を含めて、これらの抗原に関連する情報これらは全て、当該分野で公知であるを以下に列挙し、NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIの核酸配列およびタンパク質配列同定規約に従った。TAA1~36に対応する核酸配列およびタンパク質配列は、GenBankのような公開データベースにおいて利用可能である。抗体によって標的化された腫瘍関連抗原は、引用した参考文献において同定される配列に対して少なくとも約70、80、85、90、もしくは95の配列同一性を有するか、または引用した参考文献において見出される配列を有するTAAと実質的に同一の生物学的な特性もしくは特徴を示す、アミノ酸配列改変体およびイソ型を含む。例えば、改変体配列を有するTAAは、一般に、列挙した対応する配列を有するTAAに特異的に結合する抗体に特異的に結合し得る。本明細書中に具体的に引用される参考文献中の配列および開示は、明白に参考として援用される。腫瘍関連抗原1~36:1BMPR1B骨形態形成タンパク質レセプター-IB型、Genbank登録番号NM_001203tenDijke,P.らScience2645155:101-1041994、Oncogene1411:1377-13821997;WO2004063362請求項2;WO2003042661請求項12;US2003134790-A138-39ページ;WO2002102235請求項13、296ページ;WO200305544391-92ページ;WO200299122実施例2、528-530ページ;WO2003029421請求項6;WO2003024392請求項2、図112;WO200298358請求項1、183ページ;WO200254940100-101ページ;WO200259377349-350ページ;WO200230268請求項27、376ページ;WO200148204実施例、図4NP_001194骨形態形成タンパク質レセプター、IB型/pid=NP_001194.1-相互参照:MIM:603248、NP_001194.1;AY0659942E16LAT1、SLC7A5、Genbank登録番号NM_003486Biochem.Biophys.Res.Commun.2552,283-2881999,Nature3956699:288-2911998,Gaugitsch、H.W.ら1992J.Biol.Chem.26716:11267-11273;WO2004048938実施例2;WO2004032842実施例IV;WO2003042661請求項12;WO2003016475請求項1;WO200278524実施例2;WO200299074請求項19;127-129ページ;WO200286443請求項27、222ページ、393ページ;WO2003003906請求項10、293ページ;WO200264798請求項33;93-95ページ;WO200014228請求項5;133-136ページ;US2003224454図3;WO2003025138請求項12;150ページ;NP_003477溶質キャリアファミリー7カチオン性アミノ酸輸送体、yシステム、メンバー5/pid=NP_003477.3-Homosapiens相互参照:MIM:600182;NP_003477.3;NM_015923;NM_003486_13STEAP1前立腺の6回膜貫通上皮抗原、Genbank登録番号NM_012449CancerRes.61155857-58602001,Hubert,R.S.ら1999Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9625:14523-14528;WO2004065577請求項6;WO2004027049図1L;EP1394274実施例11;WO2004016225請求項2;WO2003042661請求項12;US2003157089実施例5;US2003185830実施例5;US2003064397図2;WO200289747実施例5、618-619ページ;WO2003022995実施例9;図13A;実施例53;173ページ、実施例2;図2A;NP_036581前立腺の6回膜貫通上皮抗原相互参照:MIM:604415;NP_036581.1;NM_012449_140772PCA125、MUC16、Genbank登録番号AF361486J.Biol.Chem.27629:27371-273752001;WO2004045553請求項14;WO200292836請求項6、図12;WO200283866請求項15;116-121ページ;US2003124140実施例16;相互参照:GI:34501467;AAK74120.3;AF361486_15MPFMPF、MSLN、SMR、巨核球増強因子、メソテリンmesothelin、Genbank登録番号NM_005823Yamaguchi,N.ら,Biol.Chem.2692805-8081994、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9620:11531-115361999、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.931:136-1401996、J.Biol.Chem.27037:21984-219901995;WO2003101283請求項14;WO2002102235請求項13、287-288ページ;WO2002101075請求項4、308-309ページ;WO200271928320-321ページ;WO941031252-57ページ;相互参照:MIM:601051、NP_005814.2、NM_005823_16Napi3bNAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34リン酸ナトリウム、メンバー2、II型ナトリウム依存性リン酸輸送体3b,Genbank登録番号NM_006424J.Biol.Chem.27722:19665-196722002,Genomics622:281-2841999,Feild、J.A.ra1999Biochem.Biophys.Res.Commun.2583:578-582;WO2004022778請求項2;EP1394274実施例11;WO2002102235請求項13、326ページ;EP875569請求項1、17-19ページ;WO200157188請求項20;329ページ;WO2004032842実施例IV;WO200175177請求項24、139-140ページ;相互参照:MIM:604217、NP_006415.1、NM_006424_17Sema5bFLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin5bHlog、semaドメイン、7回トロンボスポンジン繰り返し1型および1型様、膜貫通ドメインTMおよび短い細胞質ドメインセマフォリンsemaphorin5B,Genbank登録番号AB040878NagaseT.ら2000DNARes.72:143-150;WO2004000997請求項1;WO2003003984請求項1;WO200206339請求項1、50ページ;WO200188133請求項1、41-43ページ、48-58ページ;WO2003054152請求項20;WO2003101400請求項11;登録:Q9P283;EMBL;AB040878;BAA95969.1.Genew;HGNC:10737;8PSCAhlg2700050C12Rik;C530008O16Rik;RIKENcDNA2700050C12;RIKENcDNA2700050C12遺伝子;Genbank登録番号AY358628;Rossら2002CancerRes.62:2546-2553;US2003129192請求項2;US2004044180請求項12;US2004044179請求項11;US2003096961請求項11;US2003232056実施例5;WO2003105758請求項12;US2003206918実施例5;EP1347046請求項1;WO2003025148請求項20;相互参照:GI:37182378;AAQ88991.1;AY358628_19ETBRエンドセリンB型レセプター、Genbank登録番号AY275463;NakamutaM.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991;OgawaY.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991;AraiH.ら,Jpn.Circ.J.56、1303-1307、1992;AraiH.ら,J.Biol.Chem.268、3463-3470、1993;SakamotoA.,YanagisawaM.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991;ElshourbagyN.A.ら,J.Biol.Chem.268、3873-3879、1993;HaendlerB.ら,J.Cardiovasc.Pharmacol.20、s1-S4、1992;TsutsumiM.ら,Gene228、43-49、1999;StrausbergR.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99、16899-16903、2002;BourgeoisC.ら,J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997;OkamotoY.ら,Biol.Chem.272、21589-21596、1997;VerheijJ.B.ら,Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002;HofstraR.M.W.ら,Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997;PuffenbergerE.G.ら,Cell79、1257-1266、1994;AttieT.ら,、Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995;AuricchioA.ら,Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996;AmielJ.ら,Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996;HofstraR.M.W.ら,Nat.Genet.12,445-447,1996;SvenssonP.J.ら,Hum.Genet.103,145-148,1998;FuchsS.ら,Mol.Med.7、115-124、2001;PingaultV.ら2002Hum.Genet.111,198-206;WO2004045516請求項1、WO2004048938実施例2;WO2004040000請求項151;WO2003087768請求項1;WO2003016475請求項1;WO2003016475請求項1;WO200261087図1;WO2003016494図6;WO2003025138請求項12、144ページ;WO200198351請求項1、124-125ページ;EP522868請求項8、図2;WO200177172請求項1、297-299ページ;US2003109676;US6518404図3;US5773223請求項1a、Col31-34;WO2004001004;10MSG783RNF124、仮想タンパク質FLJ20315、Genbank登録番号NM_017763;WO2003104275請求項1;WO2004046342実施例2;WO2003042661請求項12;WO2003083074請求項14、61ページ;WO2003018621請求項1;WO2003024392請求項2;図93;WO200166689実施例6;相互参照:LocusID:54894、NP_060233.2、NM_017763_111STEAP2HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、前立腺の6回膜貫通上皮抗原2、6回膜貫通前立腺タンパク質、Genbank登録番号AF455138Lab.Invest.8211:1573-15822002;WO2003087306;US2003064397請求項1、図1;WO200272596請求項13;54-55ページ;WO200172962請求項1;図4B;WO2003104270請求項11;WO2003104270請求項16;US2004005598請求項22;WO2003042661請求項12;US2003060612請求項12;図10;WO200226822請求項23;図2;WO200216429請求項12;図10;相互参照:GI:22655488;AAN04080.1;AF455138_112TrpM4BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性レセプター電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4、Genbank登録番号NM_017636Xu,X.Z.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9819:10692-106972001,Cell1093:397-4072002,J.Biol.Chem.27833:30813-308202003;US2003143557請求項4;WO200040614請求項14;100-103ページ;WO200210382請求項1;図9A;WO2003042661請求項12;WO200230268請求項27;391ページ;US2003219806請求項4;WO200162794請求項14;図1A-D;相互参照:MIM:606936;NP_060106.2;NM_017636_113CRIPTOCR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、奇形癌腫由来増殖因子、Genbank登録番号NP_003203またはNM_003212Ciccodicola,A.ら,EMBOJ.87:1987-19911989,Am.J.Hum.Genet.493:555-5651991;US2003224411請求項1;WO2003083041実施例1;WO2003034984請求項12;WO200288170請求項2;52-53ページ;WO2003024392請求項2;図58;WO200216413請求項1;94-95ページ、105ページ;WO200222808請求項2;図1;US5854399実施例2、Col17-18;US5792616図2;相互参照:MIM:187395;NP_003203.1;NM_003212_114CD21CR2補体レセプター2またはC3DRC3d/エプスタインバーウイルスレセプターまたはHs.73792Genbank登録番号M26004Fujisakuら1989J.Biol.Chem.2644:2118-2125;WeisJ.J.ら,J.Exp.Med.167、1047-1066、1988;MooreM.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84、9194-9198、1987;BarelM.ら,Mol.Immunol.35,1025-1031,1998;WeisJ.J.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83、5639-5643、1986;SinhaS.K.ら1993J.Immunol.150,5311-5320;WO2004045520実施例4;US2004005538実施例1;WO2003062401請求項9;WO2004045520実施例4;WO9102536図9.1-9.9;WO2004020595請求項1;登録:P20023;Q13866;Q14212;EMBL;M26004;AAA35786.1.15CD79bCD79B、CD79β、IGb免疫グロブリン関連β、B29、Genbank登録番号NM_000626または11038674Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.20031007:4126-4131、Blood20021009:3068-3076;Mullerら1992Eur.J.Immunol.226:1621-1625;WO2004016225請求項2、図140;WO2003087768;US2004101874請求項1、102ページ;WO2003062401請求項9;WO200278524実施例2;US2002150573請求項5、15ページ;US5644033;WO2003048202請求項1、306ページおよび309ページ;WO99/558658;US6534482請求項13、図17A/B;WO200055351請求項11、1145-1146ページ;相互参照:MIM:147245;NP_000617.1;NM_000626_116FcRH2IFGP4、IRTA4、SPAP1ASH2ドメインを含むホスファターゼアンカータンパク質1a、SPAP1B、SPAP1C、Genbank登録番号NM_030764、AY358130GenomeRes.1310:2265-22702003、Immunogenetics542:87-952002、Blood998:2662-26692002、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9817:9772-97772001、Xu,M.J.ら2001Biochem.Biophys.Res.Commun.2803:768-775;WO2004016225請求項2;WO2003077836;WO200138490請求項5、図18D-1-18D-2;WO2003097803請求項12;WO2003089624請求項25;相互参照:MIM:606509、NP_110391.2、NM_030764_117HER2ErbB2、Genbank登録番号M11730CoussensL.ら,Science19852304730:1132-1139、YamamotoT.ら,Nature319、230-234、1986;SembaK.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82、6497-6501、1985;SwierczJ.M.ら,J.CellBiol.165、869-880、2004;KuhnsJ.J.ら,J.Biol.Chem.274、36422-36427、1999;ChoH.-S.ら,Nature421、756-760、2003;EhsaniA.ら1993Genomics15,426-429;WO2004048938実施例2;WO2004027049図1I;WO2004009622;WO2003081210;WO2003089904請求項9;WO2003016475請求項1;US2003118592;WO2003008537請求項1;WO2003055439請求項29、図1A-B;WO2003025228請求項37、図5C;WO200222636実施例13、95-107ページ;WO200212341請求項68;図7;WO20021384771-74ページ;WO200214503114-117ページ;WO200153463請求項2;41-46ページ;WO20014178715ページ;WO200044899請求項52;図7;WO200020579請求項3;図2;US5869445請求項3;Col31-38;WO9630514請求項2;56-61ページ;EP1439393請求項7;WO2004043361請求項7;WO2004022709;WO200100244実施例3;図4;登録:P04626;EMBL;M11767;AAA35808.1.EMBL;M11761;AAA35808.1。18NCACEACAM6、Genbank登録番号M18728;BarnettT.ら,Genomics3、59-66、1988;TawaragiY.ら,Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988;StrausbergR.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903、2002;WO2004063709;EP1439393請求項7;WO2004044178実施例4;WO2004031238;WO2003042661請求項12;WO200278524実施例2;WO200286443請求項27;427ページ;WO200260317請求項2;登録:P40199;Q14920;EMBL;M29541;AAA59915.1.EMBL;M18728;19MDPDPEP1、Genbank登録番号BC017023Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9926:16899-169032002;WO2003016475請求項1;WO200264798請求項33;85-87ページ;JP05003790図6-8;WO9946284図9;相互参照:MIM:179780;AAH17023.1;BC017023_120IL20RαIL20Ra、ZCYTOR7、Genbank登録番号AF184971;ClarkH.F.ら,GenomeRes.13、2265-2270、2003;MungallA.J.ら,Nature425、805-811、2003;BlumbergH.ら,Cell104、9-19、2001;DumoutierL.ら,J.Immunol.167,3545-3549,2001;Parrish-NovakJ.ら,J.Biol.Chem.277、47517-47523、2002;PletnevS.ら2003Biochemistry42:12617-12624;SheikhF.ら2004J.Immunol.172,2006-2010;EP1394274実施例11;US2004005320実施例5;WO200302926274-75ページ;WO2003002717請求項2;63ページ;WO20022215345-47ページ;US200204236620-21ページ;WO20014626157-59ページ;WO20014623263-65ページ;WO9837193請求項1;55-59ページ;登録:Q9UHF4;Q6UWA9;Q96SH8;EMBL;AF184971;AAF01320.1。21BrevicanBCAN、BEHAB、Genbank登録番号AF229053GaryS.C.ら,Gene256、139-147、2000;ClarkH.F.ら,GenomeRes.13、2265-2270、2003;StrausbergR.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99、16899-16903、2002;US2003186372請求項11;US2003186373請求項11;US2003119131請求項1;図52;US2003119122請求項1;図52;US2003119126請求項1;US2003119121請求項1;図52;US2003119129請求項1;US2003119130請求項1;US2003119128請求項1;図52;US2003119125請求項1;WO2003016475請求項1;WO200202634請求項1;22EphB2RDRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、Genbank登録番号NM_004442Chan,J.およびWatt,V.M.,Oncogene661057-10611991Oncogene105:897-9051995,Annu.Rev.Neurosci.21:309-3451998、Int.Rev.Cytol.196:177-2442000;WO2003042661請求項12;WO200053216請求項1;41ページ;WO2004065576請求項1;WO2004020583請求項9;WO2003004529128-132ページ;WO200053216請求項1;42ページ;相互参照:MIM:600997;NP_004433.2;NM_004442_123ASLG659B7h、Genbank登録番号AX092328US20040101899請求項2;WO2003104399請求項11;WO2004000221図3;US2003165504請求項1;US2003124140実施例2;US2003065143図60;WO2002102235請求項13;299ページ;US2003091580実施例2;WO200210187請求項6;図10;WO200194641請求項12;図7b;WO200202624請求項13;図1A-1B;US2002034749請求項54;45-46ページ;WO200206317実施例2;320-321ページ、請求項34;321-322ページ;WO200271928468-469ページ;WO200202587実施例1;図1;WO200140269実施例3;ページ190-192;WO200036107実施例2;205-207ページ;WO2004053079請求項12;WO2003004989請求項1;WO200271928233-234ページ、452-453;WO0116318;24PSCA前立腺の幹細胞抗原前駆体、Genbank登録番号AJ297436ReiterR.E.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95、1735-1740、1998;GuZ.ら,Oncogene19、1288-1296、2000;Biochem.Biophys.Res.Commun.20002753:783-788;WO2004022709;EP1394274実施例11;US2004018553請求項17;WO2003008537請求項1;WO200281646請求項1;164ページ;WO2003003906請求項10;288ページ;WO200140309実施例1;図17;US2001055751実施例1;図1b;WO200032752請求項18;図1;WO9851805請求項17;97ページ;WO9851824請求項10;94ページ;WO9840403請求項2;図1B;登録:O43653;EMBL;AF043498;AAC39607.1。25GEDAGenbank登録番号AY260763;AAP14954脂肪腫HMGIC融合パートナー様タンパク質/pid=AAP14954.1-Homosapiens種:HomoSapiensヒトWO2003054152請求項20;WO2003000842請求項1;WO2003023013実施例3、請求項20;US2003194704請求項45;相互参照:GI:30102449;AAP14954.1;AY260763_126BAFF-RB細胞活性化因子レセプター、BLySレセプター3、BR3、Genbank登録番号AF116456;BAFFレセプター/pid=NP_443177.1-HomosapiensThompson,J.S.ら,Science2935537、2108-21112001;WO2004058309;WO2004011611;WO2003045422実施例;32-33ページ;WO2003014294請求項35;図6B;WO2003035846請求項70;615-616ページ;WO200294852Col136-137;WO200238766請求項3;133ページ;WO200224909実施例3;図3;相互参照:MIM:606269;NP_443177.1;NM_052945_1;AF13260027CD22B細胞レセプターCD22-Bイソ型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814、Genbank登録番号AK026467;Wilsonら1991J.Exp.Med.173:137-146;WO2003072036請求項1;図1;相互参照:MIM:107266;NP_001762.1;NM_001771_128CD79aCD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、IgβCD79Bと共有結合的に相互作用して、IgM分子を有する結合体を表面に形成し、B細胞分化に関与するシグナルを伝達する、B細胞特異的タンパク質pI:4.84、MW:25028TM:2[P]GeneChromosome:19q13.2、Genbank登録番号NP_001774.10WO2003088808;US20030228319;WO2003062401請求項9;US2002150573請求項4、ページ13-14;WO9958658請求項13、図16;WO9207574図1;US5644033;Haら1992J.Immunol.1485:1526-1531;Muellerら1992Eur.J.Biochem.22:1621-1625;Hashimotoら1994Immunogenetics404:287-295;Preud’hommeら1992Clin.Exp.Immunol.901:141-146;Yuら1992J.Immunol.1482633-637;Sakaguchiら1988EMBOJ.711:3457-3464;29CXCR5バーキットリンパ腫レセプター1、CXCL13ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走および体液性防御において機能し、HIV-2感染症およびおそらくエイズ、リンパ腫、ミエローマおよび白血病の発現で役割を果たす、Gタンパク質共役レセプター;372aa、pI:8.54MW:41959TM:7[P]GeneChromosome:11q23.3、Genbank登録番号NP_001707.1WO2004040000;WO2004015426;US2003105292実施例2;US6555339実施例2;WO200261087図1;WO200157188請求項20、269ページ;WO20017283012-13ページ;WO200022129実施例1、152-153ページ、実施例2、254-256ページ;WO9928468請求項1、38ページ;US5440021実施例2、Col49-52;WO942893156-58ページ;WO9217497請求項7、図5;Dobnerら1992Eur.J.Immunol.22:2795-2799;Barellaら1995Biochem.J.309:773-779;30HLA-DOBペプチドを結合して、それらをCD4Tリンパ球に提示する、MHCクラスII分子Ia抗原のβサブユニット;273aa、pI:6.56MW:30820TM:1[P]GeneChromosome:6p21.3、Genbank登録番号NP_002111.1Tonnelleら1985EMBOJ.411:2839-2847;Jonssonら1989Immunogenetics296:411-413;Beckら1992J.Mol.Biol.228:433-441;Strausbergら2002Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903;Serveniusら1987J.Biol.Chem.262:8759-8766;Beckら1996J.Mol.Biol.255:1-13;Naruseら2002TissueAntigens59:512-519;WO9958658請求項13、図15;US6153408Col35-38;US5976551Col168-170;US6011146Col145-146;Kasaharaら1989Immunogenetics301:66-68;Larhammarら1985J.Biol.Chem.26026:14111-14119;31P2X5プリン作動性レセプターP2Xリガンド型イオンチャネル5細胞外のATPによって作動するイオンチャネルは、シナプス伝達および神経形成において関与し得、欠乏は、特発性不安定性膀胱の病態生理学に寄与し得る;422aa、pI:7.63、MW:47206TM:1[P]GeneChromosome:17p13.3、Genbank登録番号NP_002552.2Leら1997FEBSLett.4181-2:195-199;WO2004047749;WO2003072035請求項10;Touchmanら2000GenomeRes.10:165-173;WO200222660請求項20;WO2003093444請求項1;WO2003087768請求項1;WO200302927782ページ;32CD72B細胞分化抗原CD72、Lyb-2、PROTEINSEQUENCEFullmaeaity...tafrfpd1..359;359aa,pI:8.66、MW:40225TM:1[P]GeneChromosome:9p13.3,Genbank登録番号NP_001773.1WO2004042346請求項65;WO200302649351-52、57-58ページ;WO200075655105-106ページ;VonHoegenら1990J.Immunol.14412:4870-4877;Strausbergら2002Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903;33LY64リンパ球抗原64RP105、ロイシンリッチリピートLRRファミリーのI型膜貫通タンパク質は、B細胞活性化およびアポトーシスを調節し、機能の喪失は、全身性エリテマトーデス患者における疾患活性の上昇と関連している;661aa、pI:6.20、MW:74147TM:1[P]GeneChromosome:5q12、Genbank登録番号NP_005573.1US2002193567;WO9707198請求項11、39-42ページ;Miuraら1996Genomics383:299-304;Miuraら1998Blood92:2815-2822;WO2003083047;WO9744452請求項8、57-61ページ;WO20001213024-26ページ;34FcRH1Fcレセプター様タンパク質1C2型Ig様ドメインおよびITAMドメインを含む免疫グロブリンFcドメインについての推定上のレセプターは、Bリンパ球分化において役割を有し得る、429aa、pI:5.28、MW:46925TM:1[P]GeneChromosome:1q21-1q22、Genbank登録番号NP_443170.1WO2003077836;WO200138490請求項6、図18E-1-18-E-2;Davisら2001Proc.Natl.Acad.SciUSA9817:9772-9777;WO2003089624請求項8;EP1347046請求項1;WO2003089624請求項7;35IRTA2免疫グロブリンスーパーファミリーレセプタートランスロケーション関連2B細胞の発達およびリンパ腫生成において役割を有し得る推定上の免疫レセプター;トランスロケーションによるこの遺伝子の調節解除は、いくつかのB細胞悪性疾患において生じる;977aa、pI:6.88MW:106468TM:1[P]GeneChromosome:1q21、Genbank登録番号Human:AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085;マウス:AK089756、AY158090、AY506558、NP_112571.1WO2003024392請求項2、図97;Nakayamaら2000Biochem.Biophys.Res.Commun.2771:124-127、WO2003077836、WO200138490請求項3、図18B-1-18B-2;36TENB2TMEFF2、tomoregulin、TPEF、HPP1、TR、推定上の膜貫通プロテオグリカン、増殖因子およびフォリスタチンのEGF/ヒレグリンファミリーに関連する;374aa、NCBI登録:AAD55776、AAF91397、AAG49451、NCBIRefSeq:NP_057276;NCBIGene:23671;OMIM:605734;SwissProtQ9UIK5;Genbank登録番号AF179274;AY358907、CAF85723、CQ782436WO2004074320配列番号810;JP2004113151配列番号2、4、8;WO2003042661配列番号580;WO2003009814配列番号411;EP129594469-70ページ;WO200230268329ページ;WO200190304配列番号2706;US2004249130;US2004022727;WO2004063355;US2004197325;US2003232350;US2004005563;US2003124579;Horieら2000Genomics67:146-152;Uchidaら1999Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602;Liangら2000CancerRes.60:4907-12;Glynne-Jonesら2001IntJCancer.10月15日、942:178-84。親抗体はまた、アルブミン結合性ペプチドABP配列Dennisら2002AlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteinsJBiolChem.277:35035-35043;WO01/45746を含む融合タンパク質であり得る。本発明の抗体としては、以下によって教示されるABP配列を含む融合タンパク質が挙げられる:iDennisら2002JBiolChem.277:35035-35043、表IIIおよび表IV、35038ページ;iiUS20040001827の[0076]、配列番号9~22;ならびにiiiWO01/45746の12-13ページ、配列番号z1-z14。これらの全ては、本明細書中に参考として援用される。変異誘発出発ポリペチドのアミノ酸配列改変体をコードするDNAは、当該分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法としては、ポリペチドをコードする予め調製したDNAの、部位特異的またはオリゴヌクレオチド媒介変異誘発、PCR変異誘発およびカセット変異誘発による調製が挙げられるがこれらに限定されない。組換え抗体の改変体は、制限フラグメントの操作によって、または、合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸張PCRによっても構築され得る。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術は、このような変異体システイン操作抗体をコードするDNAを生成するために使用され得る。一般的なガイダンスは、Sambrookら,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;およびAusubelら,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork,N.Y.,1993に見出され得る。部位特異的変異誘発は、置換改変体すなわち、変異タンパク質を調製するための1つの方法である。この技術は、当該分野で周知である例えば、Carterら1985NucleicAcidsRes.13:4431-4443;Hoら1989GeneAmst.77:51-59;およびKunkelら1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488を参照のこと。手短に述べると、DNAの部位特異的変異誘発を実施する際には、出発DNAは、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、このような出発DNAの一本鎖に最初にハイブリダイズさせることによって変更される。ハイブリダイゼーションの後、DNAポリメラーゼは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、そして出発DNAの一本鎖をテンプレートとして用いて、第2鎖全体を合成するために用いられる。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは、得られる二本鎖DNAに組み込まれる。部位特異的変異誘発は、発現プラスミドにおいて、変異誘発させるべきタンパク質を発現する遺伝子内で実施され得、そして得られるプラスミドは、所望のシステイン置換変異の導入を確認するために配列決定され得るLiuら1998J.Biol.Chem.273:20252-20260。市販のものを含めたプロトコールおよび形式の部位特異的なもの。例えば、QuikChange登録商標MultiSite-DirectedMutagenesisキットStratagene,LaJolla,CA。PCR変異誘発はまた、出発ポリペチドのアミノ酸配列改変体を作製することにも適している。Higuchi1990PCRProtocols,pp.177-183,AcademicPress;Itoら1991Gene102:67-70;Bernhardら1994BioconjugateChem.5:126-132;およびValletteら1989Nuc.AcidsRes.17:723-733を参照のこと。手短に述べると、少量のテンプレートDNAをPCRにおいて出発材料として用いる場合、テンプレートDNA中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみがテンプレート配列と異なる比較的大量の特異的DNAフラグメントを生成するために用いられ得る。改変体を調製するための別の方法カセット変異誘発は、Wellsら1985Gene34:315-323によって記載されている技術に基づく。出発材料は、変異させるべき出発ポリペチドDNAを含むプラスミドまたは他のベクターである。出発DNA中の変異させるべきコドンが同定される。同定された変異部位の両側には、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。このような制限部位が存在しない場合、それらは、出発ポリペチドDNA中の適切な位置にこれらを導入するために上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。プラスミドDNAは、これらの部位で切断されて、DNAを直鎖状にする。制限部位間にこのDNAの配列をコードするが、所望の変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準手順を使用して合成される。ここで、オリゴヌクレオチドの2本の鎖は、別々に合成され、次いで標準技術を使用して一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、直鎖状にしたプラスミドの末端と適合する5’末端および3’末端を有するように設計され、その結果、これは、このプラスミドに直接連結され得る。このプラスミドはいまや、変異したDNA配列を含む。コードされたシステイン置換を含んでいる変異体DNAは、DNA配列決定により確認され得る。単一変異はまた、PCRベースの変異誘発による、テンプレートとして二本鎖プラスミドDNAを使用したオリゴヌクレオチド指向性変異誘発によっても生成されるSambrookおよびRussel2001MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版;Zollerら1983MethodsEnzymol.100:468-500;Zoller,M.J.およびSmith,M.1982Nucl.AcidsRes.10:6487-6500。本発明において、M13ファージ上に提示されるhu4D5Fabv8Gerstnerら2002SequencePlasticityInTheAntigen-BindingSiteOfATherapeuticAnti-HER2AntibodyJMolBiol.321:851-62を、モデル系として実験に用いた。システイン変異を、hu4D5Fabv8-ファージ、hu4D5Fabv8構築物およびABP-hu4D5Fabv8構築物中に導入した。hu4D5-チオFab-Phage調製を、以前Lowman,HenryB.1998MethodsinMolecularBiologyTotowa,NewJersey87CombinatorialPeptideLibraryProtocols249-264に記載されたとおりのポリエチレングリコールPEG沈殿法を使用して実施した。オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト合成法US4415732;US4458066;Beaucage,S.およびIyer,R.1992Advancesinthesynthesisofoligonucleotidesbythephosphoramiditeapproach,Tetrahedron48:2223-2311により調製される。ホスホルアミダイト法は、制御された細孔ガラスまたは高度に架橋されたポリスチレンから構成される固体支持体上で最も一般的には、3’→5’方向に;ここで、3’末端ヌクレオシドは、合成開始時に固体支持体上に結合している成長しているオリゴヌクレオチド鎖への、反応性3’ホスホルアミダイト部分を用いたヌクレオチドモノマー単位の周期的な添加を伴うUS5047524;US5262530。この方法は、通常、自動化された市販の合成機AppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して実施される。オリゴヌクレオチドは、検出、捕捉、安定化または他の目的のための非アイソトープ部分で化学的に標識され得るAndrus,A.Chemicalmethodsfor5’non-isotopiclabellingofPCRprobesandprimers1995PCR2:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,Oxford,pp.39-54;Hermanson,G.,BioconjugateTechniques1996AcademicPress,SanDiego,pp.40-55,643-671;Keller,G.およびManak,M.,DNAProbesSecondEdition1993,StocktonPress,NewYork,pp.121-23。PHESELECTORアッセイPHESELECTORPhageELISAforSelectionofReactiveThiolsアッセイは、ELISAファージ形式での抗体中の反応性システイン基の検出を可能にする。ウェル表面上で目的のタンパク質例えば、抗体をコーティングし、続いてファージ粒子とともにインキュベートし、次いでHRPで標識された二次抗体の吸光度を検出するプロセスは、実施例2において詳述される。ファージ上に提示される変異タンパク質は、迅速で頑強なハイ高いスループット様式でスクリーニングされ得る。システイン操作抗体のライブラリーが作製され得、そして抗体または他のタンパク質のランダムなタンパク質-ファージライブラリーから遊離Cys取り込みの適切に反応性の部位を同定するために同じアプローチを使用した結合選択を受け得る。この技術は、ファージ上に提示されたシステイン変異タンパク質を、親和性試薬またはチオール反応性でもあるレポーター基と反応させることを含む。図8は、HER2へのFabまたはチオFabの結合上の図およびビオチン化チオFabのストレプトアビジンへの結合下の図を示す概略図によって、PHESELECTORAssayを図示する。タンパク質の発現および精製システイン操作抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて例えば、マウス抗体の重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより容易に分離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源として役立つ。一旦単離されると、このDNAは、発現ベクター内に配置され得、次いで、この発現ベクターは、トランスフェクションしなければ抗体タンパク質を生成しない宿主細胞例えば、E.coli細胞、サルのCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または他の哺乳動物宿主細胞例えば、骨髄腫細胞US5807715;US2005/0048572;US2004/0229310へとトランスフェクションされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。hu4D5Fabv8システイン操作抗体の収率は、野生型hu4D5Fabv8と類似していた。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する総説としては、Skerraら1993Curr.OpinioninImmunol.5:256-262およびPlueckthun1992Immunol.Rev.130:151-188が挙げられる。設計および選択の後、非常に反応性の高い不対Cys残基を有するシステイン操作抗体例えば、チオFabは、以下によって生成され得る:i細菌例えば、E.coli系または哺乳類細胞培養系WO01/00245例えば、チャイニーズハムスター卵巣CHOにおける発現;ならびにii一般的なタンパク質精製技術を使用した精製Lowmanら1991J.Biol.Chem.26617:10982-10988。チオFabは、34B8非サプレッサーE.coli系Bacaら1997JournalBiologicalChemistry27216:10678-84において、誘導によって発現された。実施例3aを参照のこと。収集した細胞ペレットをPBSリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁し、マイクロフルイダイザーを通過させることにより総細胞溶解を実施し、そしてチオFabを、プロテインGHAROSETMを用いたアフィニティークロマトグラフィーAmershamによって精製した。チオFabを上記の通りにビオチン-PEO-マレイミドと結合させ、そしてビオチン化されたチオFabをSuperdex-200TMAmershamゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。これにより、遊離ビオチン-PEO-マレイミドおよびチオFabのオリゴマー画分が除去された。質量分析法による分析液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー電離質量分析LC-ESI-MSによる分析を、ビオチン結合体化Fabの正確な分子量決定のために用いたCole,R.B.ElectroSprayIonizationMassSpectrometry:Fundamentals,InstrumentationAndApplications.1997Wiley,NewYork。ビオチン化されたhu4D5Fabv8A121Cペプチドのアミノ酸配列を、トリプシン性消化、続いてLC-ESI-TandemMS分析表4、実施例3bによって決定した。抗体Fabフラグメントhu4D5Fabv8は、10個のCys残基5個は軽鎖上に、5個は重鎖上にを含め、約445アミノ酸残基を含む。ヒト化4D5可変フラグメントFv4D5の高分解度構造を確立した。Eigenbrotら,X-RayStructuresOfTheAntigen-BindingDomainsFromThreeVariantsOfHumanizedAnti-P185her2Antibody4D5AndComparisonWithMolecularModeling1993JMolBiol.229:969-995を参照のこと。全てのCys残基は、ジスルフィド結合の形態で存在し、従って、これらの残基は、還元剤で処理されない限りは薬物-マレイミドと結合するいかなる反応性チオール基も有しない。それゆえ、新しく操作されたCys残基は、不対のままであり得、そして、求電子性リンカー試薬または薬物-リンカー中間体例えば、薬物-マレイミドと反応し得る、すなわち、結合し得る。図1Aは、X線結晶座標によって導かれたhu4D5Fabv8抗体フラグメントの三次元図を示す。重鎖および軽鎖の操作されたCys残基の構造位置は、連続番号付けシステムsequentialnumberingsystemに従って番号付けされる。この連続番号付けシステムは、図1Bによって、トラスツズマブtrastuzumabの4d5v7fabH改変体についてのKabat番号付けシステムと関連付けられているKabatら1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD。図1Bは、N末端から始まって、a、b、cにより注記される挿入によってKabat番号付けスキーム下の列と異なる、連続番号付けスキーム上の列を示す。Kabat番号付けシステムを用いると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはCDRの短縮または挿入に対応して、より少ないかまたはより多いアミノ酸を含み得る。システイン操作された重鎖改変体部位は、以下のチャートの連続番号付けスキームおよびKabat番号付けスキームにより同定される:M13ファージミド-Cys変異体Fab図3Aおよび3Bは、Fabタンパク質と比較して迅速にスクリーニングされ得る。抗原に、およびストレプトアビジンに結合しているファージミド-チオFabは、実施例2にて説明し、そして図8において図示したように、ELISAプレート上へHER2およびストレプトアビジンをコーティングし、続いて抗Fab-HRP西洋ワサビペルオキシダーゼでプロービングすることによって、それぞれ、試験され得る。この方法は、操作されたCys残基/結合したビオチン分子による、抗原結合に対する影響およびチオール基の反応性の同時モニタリングを可能にした。また、この方法は、M13ファージに提示される任意のタンパク質について反応性チオール基をスクリーニングするために適用され得る。結合体化したかまたは結合体化していないファージミド-チオFabは、簡便なPEG沈澱により精製される。ヒト化4D5の抗原結合性フラグメントhu4D5Fabは、E.Coliにおいてよく発現され、そしてファージ上に提示されたGarrardら1993Gene128:103-109。抗体Fabフラグメントhu4D5Fabv8は、チオール反応性をプローブするために、ELISAベースのアッセイのモデル系として、M13ファージ上に提示された。図8は、PHESELECTORアッセイの図示であり、HER2上図およびストレプトアビジン下図に対する、ビオチン化されたチオFabファージおよび抗ファージHRP抗体の結合を表す。5つのアミノ酸残基L-Ala43、H-Ala40、H-Ser119、H-Ala121およびH-Ser122は最初に、抗原結合表面から離れて、結晶構造情報から選択されたEigenbrotら1993JMolBiol.229:969-995。このタンパク質データベースX線結晶構造は、1FVCと命名された。Cys残基は、部位特異的変異誘発によってこれらの位置で操作された。チオFab-ファージ調製物を単離し、そしてビオチン化試薬と反応させた。ビオチン結合体化改変体および非結合体化改変体を、HRP西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ファージ抗体を用いたELISAベースのPHESELECTORアッセイ図8、実施例2を使用して、HER2およびストレプトアビジンの結合について試験した。非ビオチン化ファージ-hu4D5Fabv8図2Aおよびビオチン化されたファージ-hu4D5Fabv8図2Bと、BSA白四角、HER2灰色四角またはストレプトアビジン黒四角との相互作用を、標準的なHRP反応を発色させ、そして450nmでの吸光度を測定することにより、抗M13-西洋ワサビペルオキシダーゼHRP抗体によってモニタリングした。比色基質の回転によって生成される吸光度を、450nmで測定した。HER2とのチオFabの反応性は、抗原結合を測定する。ストレプトアビジンとのチオFabの反応性は、ビオチン化の程度を測定する。BSAとのチオFabの反応性は、非特異的相互作用についてのネガティブコントロールである。図2Aからわかるように、全てのチオFab-ファージ改変体は、野生型hu4D5Fabv8-ファージの結合と比較して、HER2に対して類似の結合を有する。さらに、ビオチンとの結合体化は、HER2に対するチオFabの結合を妨害しなかった図2B。驚いたことに、そして、予想外に、チオFab-ファージサンプルは、種々のレベルのストレプトアビジン結合活性を示した。全ての試験されたファージ-チオFabのうち、A121Cシステイン操作抗体は、最大のチオール反応性を示した。野生型hu4D5Fabv8-ファージを同量のビオチン-マレイミドとともにインキュベートした場合であっても、これらのファージは、ストレプトアビジン結合をほとんど有さなかった。このことは、hu4D5Fabv8およびM13ファージコートタンパク質からのジスルフィド結合形成に関与する既存のシステイン残基が、ビオチン-マレイミドの部位特異的結合体化を妨げなかったことを示す。これらの結果は、ファージELISAアッセイを成功裏に用いて、Fab面上の反応性チオール基をスクリーニングし得ることを実証する。PHESELECTORアッセイは、抗体における反応性チオール基のスクリーニングを可能にする。この方法によるA121C改変体の同定は、例示である。Fab分子全体は、反応性チオール基を有するより多くのチオFab改変体を同定するために、効果的に検索され得る。表面アクセシビリティー率fractionalsurfaceaccessibilityというパラメータを用いて、ポリペチド中のアミノ酸残基への溶媒のアクセシビリティーを同定および定量した。表面アクセシビリティーは、溶媒分子例えば、水によって接触され得る表面積Å2として表現され得る。水の占有空間は、1.4Åの半径の球体として近似される。ソフトウェアは、公知のX線結晶学から誘導された座標を用いてあるタンパク質の各アミノ酸の表面アクセシビリティーを算出するためにアルゴリズムを使用する結晶学プログラムCCP4Suiteとして、入手自由であるか、または許諾され得るSecretarytoCCP4,DaresburyLaboratory,Warrington,WA44AD,UnitedKingdom,Fax:441925603825,またはインターネット:www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.htmlによるTheCCP4Suite:ProgramsforProteinCrystallography1994Acta.Cryst.D50:760-763。表面アクセシビリティーの算出を実行する2つの例示的なソフトウェアモジュールは、B.LeeおよびF.M.Richards1971J.Mol.Biol55:379-400のアルゴリズムに基づく、AREAIMOLおよびSURFACEである。AREAIMOLは、溶媒がタンパク質のファンデルワールス表面を転がるので、タンパク質のうちの溶媒がアクセス可能な表面を、プローブ球体溶媒分子を表すの中心位置と規定する。AREAIMOLは、原子の中心から、原子の半径とプローブの半径との合計の距離を置いて各原子を中心として拡張した球体上の表面の点を作製し、そしてことは隣接原子と会合した等しい球体内に存在するものを除去することによって溶媒アクセス可能な表面積を算出する。AREAIMOLは、原子のうちの溶媒がアクセス可能な面積を、PDB座標ファイルにおいて見い出し、そして残基毎に、鎖毎に、そして分子全体について、アクセス可能な面積をまとめる。個々の原子についてのアクセス可能な面積または面積の差は、偽PDB出力ファイルに書き込まれ得る。AREAIMOLは、各要素について単一の半径を仮定し、そして限定された数の異なる要素のみを認識する。未知の原子タイプすなわち、AREAIMOLの内部データベースにないものは、1.8Åのデフォルト半径を割り当てられる。認識された原子のリストは、以下の通りである:AREAIMOLおよびSURFACEは、絶対的なアクセシビリティーすなわち、平方オングストロームÅの数字を報告する。表面アクセシビリティー率は、ポリペチド内のアミノ酸に関連した標準状態を参照することで算出される。参照状態は、トリペプチドGly-X-Glyであり、ここで、Xは、目的のアミノ酸であり、そして、参照状態は、拡張コンフォメーションすなわち、β鎖にあるようなものであるべきである。拡張コンフォメーションは、Xのアクセシビリティーを最大にする。算出されたアクセス可能な面積は、Gly-X-Glyトリペプチド参照状態におけるアクセス可能な面積によって除算され、そして商が報告される。これがアクセシビリティー率である。アクセシビリティーパーセントは、アクセシビリティー率に100を乗算したものである。表面アクセシビリティーの算出のための別の例示的なアルゴリズムは、ポリペチドのX線座標に基づいて水球体に対するアミノ酸残基のアクセシビリティー率を算出するプログラムxsaeBroger,C.,F.Hoffman-LaRoche,BaselのSOLVモジュールに基づく。hu4D5Fabv7中のあらゆるアミノ酸についての表面アクセシビリティー率は、結晶構造情報Eigenbrotら1993JMolBiol.229:969-995を使用して算出された。hu4D5Fabv7の軽鎖および重鎖のアミノ酸についての表面アクセシビリティー率値を、表1に降順で示す。以下の2つの基準を適用して、操作してCys残基で置換され得るhu4D5Fabv8の残基を同定した:1.完全に埋め込まれるすなわち、10未満の表面アクセシビリティー率のアミノ酸残基は除去される。表1は、10よりも高くアクセス可能である表面アクセシビリティー率の、hu4D5Fabv8の134残基軽鎖および151残基重鎖が存在することを示す。上位10個の最もアクセス可能なSer残基、Ala残基およびVal残基を、新しく操作されたCysによって抗体に最小の構造制約しか導入しない、他のアミノ酸よりもCysへのそれらの構造的類似性の近さに起因して選択した。他のシステイン置換部位もまたスクリーニングされ得、そして結合体化に有用であり得る。2.残基は、Fabの機能的相互作用および構造的相互作用におけるそれらの役割に基づいて選別される。抗原相互作用に関与しておらず、かつ既存のジスルフィド結合から離れた残基をさらに選択した。新しく操作されたCys残基は、抗原結合とは別であるべきであり、かつ抗原結合を妨害しないべきであり、しかも、ジスルフィド結合形成に関与するシステインと誤った対を形成しないべきである。hu4D5Fabv8の以下の残基は、上記の基準を有しており、そしてCysで置換されるように選択された:L-V15、L-A43、L-V110、L-A144、L-S168、H-A88、H-A121、H-S122、H-A175およびH-S179図1に示される。チオール反応性は、反応性システインアミノ酸でのアミノ酸の置換が以下でなされ得る任意の抗体に一般化され得る:L-10~L-20;L-38~L-48;L-105~L-115;L-139~L-149;L-163~L-173から選択される軽鎖の範囲内;H-35~H-45;H-83~H-93;H-114~H-127;およびH-170~H-184から選択される重鎖の範囲内:H-268~H-291;H-319~H-344;H-370~H-380;およびH-395~H-405から選択される範囲内のFc領域。チオール反応性はまた、抗体の特定のドメイン例えば、軽鎖定常ドメインCLおよび重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3に一般化され得る。0.6以上のチオール反応性値をもたらすシステイン置換は、以下のそれぞれのインタクトな抗体の重鎖定常ドメインα、δ、ε、γおよびμにおいてなされ得る:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMIgGサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2を含む。選択された10個のCys変異体が抗原結合部位例えば、この場合、HER2との界面からはるかに離れていることは、結晶構造データから明白である。これらの変異体は、機能的な相互作用に対する間接効果について実験的に試験され得る。全てのCysFab改変体のチオール反応性を測定し、そして実施例1および2にて記載したように算出し、そして表2に提示した。残基L-V15C、L-V110C、H-A88CおよびH-A121Cは、反応性チオール基および安定チオール基図3Aおよび3Bを有する。変異体V15C、V110C、A144C、S168Cは、軽鎖Cys改変体である。変異体A88C、A121C、A175C、S179Cは、重鎖Cys改変体である。PHESELECTORアッセイにより算出したところ、高い表面アクセシビリティー率を有する部位が最も高いチオール反応性を有したのではないことは、驚くべきことであり、かつ予想外であった表2。換言すれば、表面アクセシビリティー率表1、2は、チオール反応性表2と相関しなかった。事実、20~80という中程度の表面アクセシビリティーを有する部位図4A、表1またはAla残基またはVal残基のような部分的に露出した部位で操作されたCys残基は、Ser残基に導入されたCysよりも良好なチオール反応性すなわち>0.6図3B、表2を示した。このように、結晶構造情報は単独では、これらの部位を選択するのに十分ではないので、チオール反応部位のスクリーニングにおけるPHESELECTORアッセイの使用を必要とした図3Bおよび4A。チオール反応性データを、4D5チオFabCys変異体のアミノ酸残基について図3Aおよび図3Bに示す:3A非ビオチン化ファージ-チオFabコントロールおよび3Bビオチン化ファージ-チオFab。抗体/Fab表面上の反応性チオール基は、非ビオチン化ファージ-hu4D5Fabv83Aおよびビオチン化ファージ-hu4D5Fabv83BとBSA白四角、HER2灰色四角またはストレプトアビジン黒四角との相互作用についてのPHESELECTORアッセイ分析により同定された。このアッセイを、実施例2にて記載したように実施した。軽鎖改変体は左側にあり、そして重鎖改変体は右側にある。非ビオチン化4D5チオFabCys変異体の結合は予想通り低いが、HER2に対する強い結合は保持される。ビオチン化された4D5チオFabシステイン変異体の、ストレプトアビジンに対する結合とHER2に対する結合との比率は、表2のチオール反応性値を与える。450nmでのバックグラウンド吸光度またはBSAに対するビオチン化4D5チオFabCys変異体の少量の非特異的タンパク質結合は、図3Bにも明らかである。Cys残基で置換された選択されたアミノ酸残基の表面アクセシビリティー率値を図4Aに示す。表面アクセシビリティー率を、利用できるhu4D5Fabv7構造から算出し、表1に示したEigenbrotら1993JMolBiol.229:969-995。hu4D5Fabv7およびhu4D5Fabv8の構造のコンホメーションパラメータは非常に一貫しており、そしてhu4D5Fabv7の表面アクセシビリティー率算出とhu4D5Fabv8システイン変異体のチオール反応性との間でのいかなる相関の決定をも可能にする。部分的に露出した残基AlaまたはValにおいて導入されたファージチオFabCys残基の測定されたチオール反応性は、Ser残基において導入されたものと比較して、より良好なチオール反応性を有する表2。表2のチオFabCys変異体から、チオ反応性値と表面アクセシビリティー率との間にはほとんどまたは全く相関がないということがわかり得る。抗体のL-15位、L-43位、L-110位、L-144位、L-168位、H-40位、H-88位、H-119位、H-121位、H-122位、H-175位、およびH-179位にあるアミノ酸は、一般に、遊離システインアミノ酸によって変異され得る置換され得る。これらの位置の両側の約5つのアミノ酸残基内の範囲すなわち、L-10~L-20;L-38~L-48;L-105~L-115;L-139~L-149;L-163~L-173;H-35~H-45;H-83~H-93;H-114~H-127;およびH-170~H-184ならびにH-268~H-291;H-319~H-344;H-370~H-380;およびH-395~H-405から選択されるFc領域内の範囲もまた、遊離システイン酸によって置換されて、本発明のシステイン操作抗体が産生され得る。軽鎖からの2つのCys改変体L-V15CおよびL-V110Cおよび重鎖からの2つのCys改変体H-A88CおよびH-A121Cを、さらなる分析のために選択した。なぜなら、これらの改変体が最も高いチオール反応性を示した表2からである。ファージ精製とは異なり、Fab調製は、生産規模に依存して、2~3日を必要とし得る。この間に、チオール基は、酸化に起因して反応性を失い得る。hu4D5Fabv8-ファージに対するチオール基の安定性をプローブするために、ファージ-チオFabのチオール反応性の安定性を測定した図4B。チオFab-ファージ精製の後、1日目、2日目および4日目に、全てのサンプルをビオチン-PEO-マレイミドと結合体化させ、そしてファージELISAアッセイPHESELECTORによりプローブして、HER2およびストレプトアビジンの結合を試験した。L-V15C、L-V110C、H-A88CおよびH-A121Cは、他のチオFab改変体と比較して有意な量のチオール反応性を保持する図4B。標識したシステイン操作抗体本発明のシステイン操作抗体は、反応性システインチオール基によって抗体に結合した共有結合であり得る任意の標識部分と結合体化され得るSinghら2002Anal.Biochem.304:147-15;HarlowE.およびLane,D.1999UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;LundbladR.L.1991ChemicalReagentsforProteinModification,第2版,CRCPress,BocaRaton,FL。結合した標識は、以下のために機能し得る:i検出可能なシグナルを提供する;ii第2の標識と相互作用して、第1の標識または第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変して、例えば、FRET蛍光共鳴エネルギー転移を与える;iii抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するかまたは結合親和性を増加させる;iv電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメータによる移動性例えば、電気泳動易動度または細胞浸透性に影響を及ぼす;またはv捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体/抗原結合またはイオン性錯体形成を改変する。標識されたシステイン操作抗体は、例えば、特定の細胞、組織または血清における目的の抗原の発現を検出するための診断アッセイに有用であり得る。診断適用に関しては、この抗体は、概して、検出可能な部分によって標識される。一般に以下のカテゴリーに分類され得る多数の標識が利用できる:aラジオアイソトープ放射性核種例えば、3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは213Bi。ラジオアイソトープ標識抗体は、レセプターを標的とした画像化実験に有用である。抗体は、CurrentProtocolsinImmunology、1巻および2巻、Coligenら編,Wiley-Interscience、NewYork、NY、Pubs.1991に記載されている技術を用いて、結合するか、キレート化するか、またはさもなければラジオアイソトープ金属を錯体化するリガンド試薬によって標識され得、ここで、この試薬は、抗体の操作されたシステインチオールと反応性である。金属イオンを錯体化し得るキレート化リガンドとしては、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPAおよびTETAMacrocyclics,Dallas,TXが挙げられる。放射性核種は、本発明の抗体-薬物結合体との錯体形成を介して標的化され得るWuら2005NatureBiotechnology239:1137-1146。画像化実験のための抗体標識として適切な金属-キレート錯体は、以下に開示される:US5342606;US5428155;US5316757;US5480990;US5462725;US5428139;US5385893;US5739294;US5750660;US5834456;Hnatowichら1983J.Immunol.Methods65:147-157;Mearesら1984Anal.Biochem.142:68-78;Mirzadehら1990BioconjugateChem.1:59-65;Mearesら1990J.Cancer1990,Suppl.10:21-26;Izardら1992BioconjugateChem.3:346-350;Nikulaら1995Nucl.Med.Biol.22:387-90;Cameraら1993Nucl.Med.Biol.20:955-62;Kukisら1998J.Nucl.Med.39:2105-2110;Verelら2003J.Nucl.Med.44:1663-1670;Cameraら1994J.Nucl.Med.21:640-646;Rueggら1990CancerRes.50:4221-4226;Verelら2003J.Nucl.Med.44:1663-1670;Leeら2001CancerRes.61:4474-4482;Mitchellら2003J.Nucl.Med.44:1105-1112;Kobayashiら1999BioconjugateChem.10:103-111;Miedererら2004J.Nucl.Med.45:129-137;DeNardoら1998ClinicalCancerResearch4:2483-90;Blendら2003CancerBiotherapyRadiopharmaceuticals18:355-363;Nikulaら1999J.Nucl.Med.40:166-76;Kobayashiら1998J.Nucl.Med.39:829-36;Mardirossianら1993Nucl.Med.Biol.20:65-74;Roselliら1999CancerBiotherapyRadiopharmaceuticals,14:209-20。b蛍光標識例えば、希土類キレートユウロピウムキレート、フルオレセイン型FITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインが挙げられる;ローダミン型TAMRAが挙げられる;ダンシル;リサミン;シアニン;フィコエリトリン;テキサスレッド;およびそれらのアナログ。蛍光標識は、例えば、CurrentProtocolsinImmunology前出において開示される技術を使用して抗体に結合され得る。蛍光色素および蛍光標識試薬としては、Invitrogen/MolecularProbesEugene,ORおよびPierceBiotechnology,Inc.Rockford,ILから市販されているものが挙げられる。cさまざまな酵素-基質標識が入手可能であるかまたは開示されているUS4275149。これらの酵素は、一般に、さまざまな技術を使用して測定され得る、色素形成性基質の化学変化を触媒する。例えば、これらの酵素は、基質の色変化を触媒し得、これは分光測光法により測定され得る。あるいは、これらの酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。蛍光の変化を定量する技術は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後、例えば、化学ルミノメーターを使用して測定され得る光を発し得るかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを与える。酵素標識の例としては、以下が挙げられる:ルシフェラーゼ例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ;US4737456、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼHRP、アルカリホスファターゼAP、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなど。抗体に酵素を結合させる技術は、O’Sullivanら1981MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,MethodsinEnzym.J.LangoneおよびH.VanVunakis編,AcademicPress,NewYork,73:147-166に記載されている。例えば、酵素-基質の組合せの例としては、以下が挙げられる:i西洋ワサビペルオキシダーゼHRPと、基質としての水素ペルオキシダーゼここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体例えば、オルトフェニレンジアミンOPDまたは3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン塩酸塩TMBを酸化する;iiアルカリホスファターゼAPと、色素形成性基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート;およびiiiβ-D-ガラクトシダーゼβ-D-Galと、色素形成性基質例えば、p-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼまたは蛍光発生性基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼ。多数の他の酵素-基質の組合せは、当業者に利用可能である。一般的な概説に関しては、US4275149およびUS4318980を参照のこと。標識は、システイン操作抗体と間接的に結合され得る。例えば、抗体は、ビオチンと結合し得、そして、前述の3つの幅広いカテゴリーの標識のうちのいずれかが、アビジンまたはストレプトアビジンと結合してもよく、またはその逆であってもよい。ビオチンは、ストレプトアビジンと選択的に結合し、従って、この標識は、この間接的な様式で抗体と結合し得る。あるいは、ポリペチド改変体と標識との間接的な結合を達成するために、ポリペチド改変体は、小さいハプテン例えば、ジゴキシンと結合され、そして前述の異なるタイプの標識のうちの1つが抗ハプテンポリペチド改変体例えば、抗ジゴキシン抗体と結合される。従って、ポリペチド改変体と標識との間接的な結合が達成され得るHermanson,G.1996BioconjugateTechniquesAcademicPress,SanDiego。本発明のポリペチド改変体は、任意の公知のアッセイ方法例えば、ELISA、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイで使用され得るZola,1987MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158,CRCPress,Inc.。検出標識は、結合事象または認識事象を局所決定し、視覚化し、そして定量するために有用であり得る。本発明の標識抗体は、細胞表面レセプターを検出し得る。検出可能に標識された抗体の別の用途は、蛍光標識抗体とビーズとを結合することおよびリガンドの結合の際の蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズベースの免疫捕捉方法である。類似の結合検出方法論は、抗体-抗原相互作用を測定および検出するために、表面プラズモン共鳴SPR効果を利用する。検出標識例えば、蛍光色素および化学発光色素Briggsら1997SynthesisofFunctionalisedFluorescentDyesandTheirCouplingtoAminesandAminoAcids,J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1:1051-1058は、検出可能なシグナルを提供し、そして一般的に標識抗体に適用し得、好ましくは以下の特性を有する:iこの標識抗体は、低バックグラウンドを有する非常に高いシグナルを生じるはずであり、その結果、少量の抗体が、無細胞アッセイおよび細胞ベースアッセイの両方において高感度で検出され得る;ならびにiiこの標識抗体は、光に安定なはずであり、その結果、重大な光退色なしで、蛍光シグナルが観察され得、モニタリングされ得、そして記録され得る。膜または細胞表面特に生きた細胞への標識抗体の細胞表面結合に関する適用については、この標識は、好ましくは、iii有効な結合体濃度および検出感度を達成する良好な水溶性を有する、ならびにiv生きた細胞に対して無毒性であり、その結果、細胞の正常な代謝プロセスを破壊せず、早すぎる細胞死も引き起こさない。細胞蛍光強度の直接定量および蛍光標識事象例えば、ペプチド-色素結合体の細胞表面結合の計数は、混合および読み取り、生きた細胞またはビーズを用いた非放射性アッセイを自動化したシステムFMAT登録商標8100HTSSystem,AppliedBiosystems,FosterCity,Calif.において行われ得るMiraglia,Homogeneouscell-andbead-basedassaysforhighthroughputscreeningusingfluorometricmicrovolumeassaytechnology,1999J.ofBiomolecularScreening4:193-204。標識抗体の使用としてはまた、以下が挙げられる:細胞表面レセプター結合アッセイ、免疫捕捉アッセイ、蛍光連結免疫吸着材アッセイFLISA、カスパーゼ切断Zheng,Caspase-3controlsbothcytoplasmicandnucleareventsassociatedwithFas-mediatedapoptosisinvivo,1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:618-23;US6372907、アポトーシスVermes,Anovelassayforapoptosis.FlowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononearlyapoptoticcellsusingfluoresceinlabelledAnnexinV1995J.Immunol.Methods184:39-51および細胞傷害性アッセイ。蛍光定量的マイクロボリュームアッセイ技術は、細胞表面に標的化される分子によるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを確認するために用いられ得るSwartzman,Ahomogeneousandmultiplexedimmunoassayforhigh-throughputscreeningusingfluorometricmicrovolumeassaytechnology,1999Anal.Biochem.271:143-51。本発明の標識されたシステイン操作抗体は、例えば以下の生物医学画像化および分子画像化のさまざまな方法および技術による画像化生体マーカーおよびプローブとして有用である:iMRI磁気共鳴画像化;iiMicroCTコンピューター連動断層撮影法;iiiSPECTシングルフォトンエミッションコンピューター連動断層撮影法;ivPETポジトロン断層撮影法Chenら2004BioconjugateChem.15:41-49;v生物発光;vi蛍光;およびvii超音波。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体が動物患者またはヒト患者に投与され、そして抗体が局在した身体内部位の画像が撮影される、画像化手順であるUS6528624。画像化生体マーカーは、客観的に測定され得、そして正常な生物学的プロセス、病的なプロセスまたは治療介入への薬理学的応答の指標として評価され得る。生体マーカーは、いくつかのタイプのものであり得る:0型は、疾患の天然の歴史的なマーカーであり、既知の臨床指数例えば、関節リウマチにおける滑膜炎症のMRI評価と長期的に相関する;I型のマーカーは、作用機構に従って介入の効果を捕捉するが、この機構は、臨床結果と関連しないかもしれない;II型マーカーは、生体マーカーの変化または生体マーカーからのシグナルが臨床利益を予測する代理終点として作用して、標的とされた応答例えば、CTによって関節リウマチにおいて測定される骨腐食が確認される。画像化生体マーカーは、このように、以下のような薬力学的PD治療情報を提供し得る:i標的タンパク質の発現、ii標的タンパク質への治療剤の結合すなわち、選択性、ならびにiiiクリアランスおよび半減期薬物動態データ。研究室ベースの生体マーカーと比較したインビボでの画像化生体マーカーの利点としては、以下が挙げられる:非侵襲的処理、定量可能な全身評価、反復投薬および評価すなわち、複数の時点、ならびに前臨床小動物から臨床ヒトまでの結果からの潜在的に移動可能な効果。いくつかの適用に関しては、生体画像化は、前臨床試験における動物実験にとって代わるかまたは動物実験数を最小にする。放射性核種画像化標識としては、放射性核種例えば、3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは213Biが挙げられる。放射性核種の金属イオンは、キレートリンカー例えば、DOTAと錯体形成し得る。DOTA-マレイミド4-マレイミドブチルアミドベンジル-DOTAのようなリンカー試薬は、Axworthyら2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA974:1802-1807の手順に従って、イソプロピルクロロホルメートAldrichによって活性化された4-マレイミド酪酸Flukaとのアミノベンジル-DOTAの反応により調製され得る。DOTA-マレイミド試薬は、システイン操作抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、そして抗体上に金属錯体形成リガンドを提供するLewisら1998Bioconj.Chem.9:72-86。キレート化リンカー標識試薬例えば、DOTA-NHS1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸モノN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、市販されているMacrocyclics,Dallas,TX。放射性核種で標識された抗体を用いたレセプター標的画像化は、腫瘍組織への抗体の進行性の蓄積の検出および定量によって、経路活性化のマーカーを提供し得るAlbertら1998Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210。結合体化放射性金属は、リソソーム分解後、細胞内に維持され得る。ペプチド標識方法は、周知である。Haugland,2003,MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes,Inc.;Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2;Garman,1997Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London;Means1990BioconjugateChem.1:2;Glazerら1975ChemicalModificationofProteins.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyT.S.WorkおよびE.Work編AmericanElsevierPublishingCo.,NewYork;Lundblad,R.L.およびNoyes,C.M.1984ChemicalReagentsforProteinModification,Vols.IandII,CRCPress,NewYork;Pfleiderer,G.1985ChemicalModificationofProteins,ModernMethodsinProteinChemistry,H.Tschesche編,WalterDeGryter,BerlinandNewYork;ならびにWong1991ChemistryofProteinConjugationandCross-linking,CRCPress,BocaRaton,Fla.;DeLeon-Rodriguezら2004Chem.Eur.J.10:1149-1155;Lewisら2001BioconjugateChem.12:320-324;Liら2002BioconjugateChem.13:110-115;Mierら2005BioconjugateChem.16:240-237を参照のこと。充分な近位にある2つの部分蛍光リポーターおよびクエンチャーで標識したペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動FRETを受ける。レポーター基は、代表的に、特定の波長の光で励起されて、最大の明るさでの放出のための適切なストークスシフトを伴ってエネルギーをレセプター基またはクエンチャー基へ移動させる蛍光色素である。蛍光色素としては、拡張した芳香族性を有する分子例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。蛍光リポーターは、完全なペプチド中のクエンチャー部分によって、部分的にまたは著しくクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによってペプチドが切断されると、蛍光の検出可能な増加が測定され得るKnight,C.1995FluorimetricAssaysofProteolyticEnzymes,MethodsinEnzymology,AcademicPress,248:18-34。本発明の標識された抗体は、親和性精製剤としても使用され得る。このプロセスでは、標識された抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、固相例えば、Sephadex樹脂または濾紙に固定される。固定された抗体は、精製されるべき抗原を含んでいるサンプルと接触され、その後、支持体が、精製されるべき抗原以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒によって洗浄される。精製されるべき抗原は、固定されたポリペチド改変体に結合される。最後に、この支持体は、抗原をポリペチド改変体から遊離させる別の適切な溶媒例えば、グリシン緩衝液pH5.0によって洗浄される。標識化試薬は、代表的に、反応性官能基を保有し、この反応性官能基は、iシステイン操作抗体のシステインチオールと直接反応して、標識された抗体を形成し得る、iiリンカー試薬と反応して、リンカー-標識中間体を形成し得る、またはiiiリンカー抗体と反応して、標識された抗体を形成し得る。標識化試薬の反応性官能基としては以下が挙げられる:マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル例えば、NHS、N-ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、塩化スルホニル、2,6-ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホルアミダイト、しかし、他の官能基もまた使用され得る。例示的な反応性官能基は、検出可能な標識例えば、ビオチンまたは蛍光色素のカルボキシル基置換基のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルNHSである。標識のNHSエステルは、予め成形され得、単離され得、精製され得、そして/もしくは特徴付けられ得るか、またはそれは、インサイチュで形成されて抗体の求核基と反応し得る。代表的に、カルボキシル形態の標識は、カルボジイミド試薬例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたはウロニウムuronium試薬例えば、TSTUO-N-スクシンイミジル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、HBTUO-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートまたはHATUO-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、アクチベーター例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールHOBtおよびN-ヒドロキシスクシンイミドのいくつかの組合せと反応させて、標識のNHSエステルを得ることにより活性化される。いくつかの場合には、標識および抗体は、一工程で、標識のインサイチュ活性化および抗体との反応により結合されて、標識-抗体結合体を形成し得る。他の活性化試薬および結合試薬としては、以下が挙げられる:TBTU2-1H-ベンゾトリアゾ-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、TFFHN,N’,N,N’-テトラメチルウロニウム2-フルオロ-ヘキサフルオロホスフェート、PyBOPベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、EEDQ2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロ-キノリン、DCCジシクロヘキシルカルボジイミド、DIPCDIジイソプロピルカルボジイミド、MSNT1-メシチレン-2-スルホニル-3-ニトロ-1H-1,2,4-トリアゾールおよびアリールスルホニルハロゲン化物例えば、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル。チオFabに対するビオチン-マレイミドの結合ファージコートタンパク質に対するFabの融合がCysチオールアクセシビリティまたは反応性を潜在的に変更し得るので、上記のチオFab特性を、ファージの存在下で確立した。従って、チオFab構築物を、アルカリホスファターゼプロモーターChangら1987Gene55:189-196下で発現ベクターにクローン化し、そしてチオFab発現を、ホスフェートを含まない培地中でE.coli細胞を増殖させることにより誘導した。チオFabを、ProteinGHAROSETMカラムにおいて精製し、そして還元型SDS-PAGEゲルおよび非還元型SDS-PAGEゲルにおいて分析した。これらの分析は、チオFabがそれらの反応性チオール基を保持したかまたは分子内ジスルフィド結合もしくは分子間ジスルフィド結合を形成することによって不活性になったかの評価を可能にする。チオFabL-V15C、チオFabL-V110C、チオFabH-A88CおよびチオFabH-A121Cを発現させ、そしてProtein-GHAROSETMカラムクロマトグラフィーにより精製した詳細については、方法のセクションを参照のこと。精製されたタンパク質を、還元条件下DTTありおよび非還元条件DTTなしにおいてSDS-PAGEゲルで分析した。BMEβ-メルカプトエタノールのような他の還元剤をゲルにおいて用いて、鎖間ジスルフィド基を切断し得た。主な約90部分のチオFabがモノマー形態であり、その一方で、野生型hu4D5Fabv8は本質的にモノマー形態47kDaであることは、SDS-PAGEゲル分析から明白である。チオFabA121Cおよび野生型hu4D5Fabv8を、100倍過剰のビオチン-マレイミドとともに室温にて3時間インキュベートし、そしてビオチン化されたFabをSuperdex-200TMゲル濾過カラムにローディングした。この精製工程は、モノマーFabをオリゴマーFabから分離することに、そしてまた過剰な遊離ビオチン-マレイミドまたは遊離の細胞傷害性薬物から分離することに役立った。図5は、ファージの情況の非存在下でのチオFab改変体の特性の確認を示す。ファージ融合のないタンパク質hu4D5Fabv8およびhu4D5Fabv8-A121CチオFab-A121Cを発現させ、そしてプロテインGアガロースビーズを使用して精製し、その後、100倍モル過剰のビオチン-マレイミドとともにインキュベートした。ビオチン化されたcys操作チオFabと非ビオチン化野生型FabとのストレプトアビジンおよびHER2結合を比較した。ビオチン結合体化ストレプトアビジンとの相互作用の程度およびHER2に対するそれらの結合能力を、ELISA分析によってモニタリングした。各Fabを2ngおよび20ngで試験した。ビオチン化されたA121CチオFabは、野生型hu4D5Fabv8の結合と匹敵するHER2結合を保持した図5。野生型FabおよびA121C-チオFabを、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製した。これらの2つのサンプルを、二次抗体としてヤギ抗Fab-HRPを使用したELISAによって、HER2結合およびストレプトアビジン結合について試験した。野生型白四角およびチオFab点四角は両方とも、HER2に対して類似の結合を有するが、しかし、チオFabのみはストレプトアビジン結合を保持した。ほんのバックグラウンドレベルのストレプトアビジンとの相互作用が、非ビオチン化野生型hu4D5Fabv8について観察された図5。ビオチン化されたチオFabA121Cの質量分析LC-ESI-MSは、野生型hu4D5Fabv847737ダルトンと比較して、48294.5ダルトンの主なピークをもたらした。2つの分子の間の537.5ダルトンの違いは、チオFabに結合した単一のビオチン-マレイミドに正確に対応する。質量分析タンパク質配列決定LC-ESI-Tandem質量分析の結果は、結合体化ビオチン分子が新たに操作されたCys残基であることをさらに確認した表4、実施例3。アルブミン結合性ペプチドABP-チオFabに対するビオチン-マレイミドの部位特異的結合体化血漿タンパク質結合は、短命の分子の薬物動態特性を改善する有効な手段であり得る。アルブミンは、血漿において最も豊富なタンパク質である。血清アルブミン結合性ペプチドABPは、組織取り込み、浸透および拡散の変更を含め、融合した活性ドメインタンパク質の薬力学を変更し得る。これらの薬力学的パラメータは、適切な血清アルブミン結合性ペプチド配列の特異的選択により調節され得るUS20040001827。一連のアルブミン結合性ペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングにより確認されたDennisら2002AlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteins,JBiolChem.277:35035-35043;WO01/45746。本発明の化合物は、以下によって教示されるABP配列を含む:iDennisら2002JBiolChem.277:35035-35043,TablesIIIおよびIV,35038頁;iiUS20040001827,[0076],配列番号9~22;およびiiiWO01/45746,12-13頁,配列番号z1~z14。これらの全ては、本明細書中に参考として援用される。アルブミン結合性ABP-Fabを、化学量論比1:11ABP/1Fabで、アルブミン結合性ペプチドをFab重鎖のC末端に融合させることにより操作した。アルブミンとのこれらのABP-Fabの会合により、ウサギおよびマウスにおいて25倍より高くそれらの半減期が増加することが示された。従って、上記した反応性Cys残基は、これらのABP-Fabに導入され得、そして細胞傷害性薬物との部位特異的結合体化に、続いてインビボでの動物研究のために使用され得る。図9は、グラフィックで、アルブミン結合性ペプチド-Fab融合体ABP-Fabリンカー薬物結合体を示す。例示的なアルブミン結合性ペプチド配列としては、配列番号1~5に列挙されるアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない:CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF配列番号1QRLMEDICLPRWGCLWEDDF配列番号2QRLIEDICLPRWGCLWEDDF配列番号3RLIEDICLPRWGCLWEDD配列番号4DICLPRWGCLW配列番号5。アルブミン結合性ペプチドABP配列は、Kdウサギ=0.3μMを有する複数の種マウス、ラット、ウサギ、ウシ、アカゲザル、ヒヒおよびヒトからアルブミンを結合する。アルブミン結合性ペプチドは、アルブミンと結合することが公知のリガンドと競合せず、かつウサギにおいて2.3時間の半減期T1/2を有する。ABP-チオFabタンパク質を、そして上記のセクションで記載したとおりに、BSA-HAROSETMで精製し、続いてビオチン-マレイミド結合体化を行い、Superdex-S200カラムクロマトグラフィで精製した。精製されたビオチン化タンパク質は、均一であり、そしていかなるオリゴマー形態も含まなかった実施例4。図6は、アルブミン結合性ペプチドABP-チオFab改変体の特性を示す。ELISA分析を実施して、ウサギアルブミン、ストレプトアビジンおよびHER2とのABP-hu4D5Fabv8-wt、ABP-hu4D5Fabv8-V110CおよびABP-hu4D5Fabv8-A121Cの結合能力を試験した。ELISA図6およびBIAcore結合速度分析表3によって確認されたとおり、ビオチン化ABP-チオFabsは、野生型ABP-hu4D5Fabv8の親和性と類似の親和性でアルブミンおよびHER2と結合し得る。ELISAプレートを、記載される通りにアルブミン、HER2およびSAでコーティングした。アルブミン、HER2およびSAに対するビオチン化ABP-チオFabの結合を、抗FabHRPでプローブした。ビオチン化ABP-チオFabは、コントロールの非ビオチン化ABP-hu4D5Fabv8-wtと比較して、ストレプトアビジンに結合し得た。このことは、同じCys変異体が両方の改変体のために使われたので、ABP-チオFabが、部位特異的様式でチオFabのようなビオチンマレイミドと結合体化したことを示している図6。あるいは、アルブミン結合性ペプチドは、リンカー部分による共有結合によって、抗体に連結され得る。Fabあたり2個の遊離チオール基を有するABP-チオFabの操作上記の結果は、4つ全てL-V15C、L-V110C、H-A88CおよびH-A121CのチオFabシステイン操作Fab抗体改変体が、標識試薬、リンカー試薬または薬物-リンカー中間体との部位特異的結合体化のために使用され得る反応性チオール基を有することを示す。L-V15Cは、比較的低い収率で、発現および精製され得る。しかしながら、L-V110C、H-A88CおよびH-A121C異型の発現収率および精製収率は、hu4D5Fabv8のものと類似していた。従って、これらの変異体は、さらなる分析のために使用され得、そして組換えられてFabあたり1個より多くのチオール基が得られ得る。この目的に向けて、軽鎖上の1つのチオール基および重鎖上の1つのチオール基を構築して、Fab分子あたり2個のチオール基を得たL-V110C/H-A88CおよびL-V110C/H-A121C。これらの2つの二重Cys改変体をE.coli発現系において発現させ、そして精製した。精製されたビオチン化ABP-チオFabの均質性は、単一Cys改変体の均一性と類似していることがわかった。Fabあたり2個の反応性Cys残基を操作することの影響を調査した図7。第2のビオチンの存在を、ストレプトアビジン-HRPを使用してSAに対するビオチン化ABP-チオFabの結合をプローブすることによって試験した図7。HER2/Fab分析のために、ELISAプレートをHER2でコーティングし、そして抗FabHRPでプローブした。SA/Fab分析のために、ELISAプレートをSAでコーティングし、そして抗FabHRPでプローブした。SA/SA分析のために、ELISAプレートをSAでコーティングし、そしてSA-HRPでプローブした。図7。ビオチン化ABP-hu4D5Fabv8Cys改変体とHER2、ストレプトアビジンSAとの相互作用についてのELISA分析。HER2/Fab、SA/FabおよびSA/SAは、それらの相互作用がそれぞれ抗Fab-HRP、SA-HRPによってモニタリングされたことを示す。SA/FabはFabあたり1個のビオチンの存在をモニタリングし、そしてFabあたり1個より多くのビオチンはSA/SA分析によってモニターされる。HER2と二重Cys変異体との結合は、単一のシステイン改変体の結合と類似している図7。しかしながら、二重Cys変異体でのビオチン化の程度は、Fab分子あたり1個より多くの遊離チオール基に起因して、単一のCys改変体と比較して、より高かった図7。トラスツズマブのチオIgG改変体の操作システインを、全長モノクローナル抗体であるトラスツズマブHERCEPTINR登録商標、GenentechInc.に、特定の残基において導入した。トラスツズマブの単一Cys変異体H-A88C、H-A121CおよびL-V110C、ならびにトラスツズマブの二重Cys変異体V110C-A121CおよびV110C-A121Cを、1mMのシステインを含んでいる培地中での一過性発酵によって、CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。A88C変異体重鎖配列450aaは、配列番号6である。A121C変異体の重鎖配列450aaは、配列番号7である。V110C変異体の軽鎖配列214aaは、配列番号8である。EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRCEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号6EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号7DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC配列番号8。一実施形態によれば、システイン操作されたチオトラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域重鎖配列配列番号9~16のうちの一つ以上を含む。別の実施形態によれば、システイン操作されたチオトラスツズマブ抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域軽鎖配列配列番号17~27のうちの一つ以上を含む。得られる全長チオトラスツズマブIgG改変体を、は、チオール反応性およびHER2結合活性についてアッセイした。図13Aは、吸光度検出のための固定されたHER2およびHRP標識二次抗体と結合しているビオチン化抗体の漫画による図を示す。図13Bは、左から右に以下のものの、450nmでの吸光度の検出を有する固定されたHER2への結合測定値を示す:非ビオチン化野生型トラスツズマブWt、ビオチン-マレイミド結合体化チオトラスツズマブ改変体V110C単一のcys、A121C単一のcysおよびV110C-A121C二重cys。各チオIgG改変体およびトラスツズマブを、1、10および100ngで試験した。これらの測定値は、ビオチン化抗HER2チオMabがHER2結合活性を保持することを示す。図14Aは、吸光度検出のための抗IgG-HRPへのビオチンの結合を有する固定されたHER2と結合しているビオチン化抗体の漫画による図を示す。図14Bは、ストレプトアビジンと結合する際の、ビオチン-マレイミド結合体化チオトラスツズマブ改変体および非ビオチン化野生型トラスツズマブの450nmでの吸光度の検出での結合測定値を示す。左から右に:V110C単一のcys、A121C単一のcys、V110C/A121C二重cysおよびトラスツズマブ。各チオIgGトラスツズマブ改変体および親トラスツズマブを、1、10および100ngで試験した。これらの測定値は、HER2チオMabが高いチオール反応性を有することを示す。システインを、全長2H9抗EphB2R抗体に特定の残基において導入した。2H9の単一cys変異体H-A121Cを、1mMのシステインを含んでいる培地中での一過性発酵によってCHOチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。A121C2H9変異体の重鎖配列450aaは、配列番号28である。EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFINPSTGYTDYNQKFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRPKIPRHANVFWGQGTLVTVSSCSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号28。システイン操作チオ2H9抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下のFc定常領域重鎖配列配列番号29~38を含む。図16は、固定されたプロテインAでの精製後の、2H9チオMabFc改変体左から右に、レーン1~9A339C;S337C;S324C;A287C;V284C;V282C;V279C;およびV273Cおよび2H9野生型の非還元型上図および還元型下図の変性SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。右のレーンはサイズマーカーラダーであり、これは、インタクトなタンパク質が約150kDaであり、重鎖フラグメントが約50kDaであり、そして軽鎖フラグメントが約25kDaであることを示す。図17Aは、固定されたプロテインAでの精製後の、2H9チオMab改変体左から右に、レーン1~4L-V15C;S179C;S375C;S400Cの非還元型左および還元型右の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。図17Bは、固定されたプロテインAでの精製後の、さらなる2H9チオMab改変体および3A5チオMab改変体の非還元型左および還元型DTT右の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。Fab領域およびFc領域における2H9チオMab改変体を、記載される通りに発現させ、そして精製した。図16、図17Aおよび図17Bからわかるように、全てのタンパク質はSDS-PAGEにおいて均質であり、その後、実施例11の還元手順および酸化手順が行われて、結合体化実施例12のための反応性チオMabが調製される。システインを、全長3A5抗MUC16抗体に特定の残基において導入した。3A5の単一cys変異体H-A121Cを、1mMのシステインを含んでいる培地中での一過性発酵によって、CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。A121C3A5変異体の重鎖配列446aaは、配列番号39を含む。DVQLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSITNDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGYTTYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTLVTVSACSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK配列番号39。システイン操作されたチオ3A5抗MUC16抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域重鎖配列配列番号40~44を含む。システイン操作されたチオ3A5抗MUC16抗体は、遊離システインアミノ酸を有する以下の可変領域軽鎖配列配列番号45~49を含む。チオMabのチオール反応性全長のIgGシステイン操作抗体チオMabのチオール反応性を、ビオチン化およびストレプトアビジン結合によって測定した。ウェスタンブロットアッセイを設定して、ビオチン-マレイミドと特異的に結合されたチオMabをスクリーニングした。このアッセイにおいて、抗体は還元型SDS-PAGEによって分析され、そして、ビオチンの存在は、ストレプトアビジン-HRPとともにインキュベートすることによって特異的にプローブされる。図18からわかるように、ストレプトアビジン-HRP相互作用は、どの操作されたcys改変体異型が使われたかに依存して重鎖または軽鎖のいずれかにおいて観察され、そして野生型については相互作用は見られない。このことは、チオMab改変体が、操作されたCys残基においてビオチンを特異的に結合したことを示す。図18は、固定された抗IgG-HRP上のゲルおよびストレプトアビジン-HRP下のゲルへの捕捉後の、還元したビオチン化チオ-IgG改変体の変性ゲル分析を示す。レーン1:3A5H-A121C。レーン2:3A5L-V110C。レーン3:2H9H-A121C。レーン4:2H9L-V110C。レーン5:抗EphB2R2H9親、野生型。各変異体レーン1~4を、選択性および親和性が保持されたことを示しているHRP検出を用いて抗IgGによって捕捉した上図。HRP検出を用いた固定されたストレプトアビジンによる捕捉下図は、重鎖および軽鎖上でのビオチンの位置を確認した。レーン1およびレーン3におけるシステイン操作抗体でのシステイン変異の位置は、重鎖である。レーン2およびレーン4におけるシステイン操作抗体でのシステイン変異の位置は、軽鎖である。システイン変異部位は、ビオチン-マレイミド試薬での結合体化を受ける。LC/MSによる図18のチオMabシステイン操作抗体および2H9V15C改変体の分析は、チオール反応性の定量的指標を与えた表5。システイン操作を、IgG抗体の定常ドメインすなわち、Fc領域において実施した。様々なアミノ酸部位をシステイン部位に変え、そして発現された変異体すなわち、システイン操作抗体を、それらのチオール反応性について評価した。ビオチン化2H9チオMabFc改変体を、ELISAアッセイにおける固定されたストレプトアビジンへの捕捉によるHRP定量によってチオール反応性について評価した図19。ELISAアッセイは、反応チオール基を有するCys残基を迅速にスクリーニングするために確立された。図19の概略図にて図示するように、ストレプトアビジン-ビオチン相互作用は、抗IgG-HRPでプローブし、続いて450nmで吸光度を測定することによってモニタリングされる。これらの結果は、2H9-チオFc改変体V282C、A287C、A339C、S375CおよびS400Cが、中程度から最も高いチオール反応性を有することを確認した。2H9チオMabFc改変体のビオチン結合体化の程度を、表6において報告されるようにLS/MS分析によって定量した。LS/MS分析は、A282C改変体、S375C改変体およびS400C改変体が100のビオチン結合体化を有し、そしてV284CおよびA339Cが50の結合体化を有することを確認した。このことは、反応性システインチオール基の存在を示す。他のチオFc改変体および親の野生型2H9は、ごくわずかなビオチン化を有したかまたは有さないかのいずれかであった。チオ4D5Fab軽鎖改変体のチオール反応性抗ErbB2抗体4D5の様々なシステイン操作された軽鎖改変体Fabのスクリーニングは、図8のPHESELECTORアッセイによって測定したところ、0.6以上のチオール反応性値を有する多くの改変体を与えた表7。表7のチオール反応性値は、HC-A121C改変体の完全なビオチン化を仮定して100と設定される重鎖4D5チオFab異型HC-A121Cに対して正規化され、パーセント値として表される。抗体-薬物結合体本発明のシステイン操作抗体は、任意の治療剤すなわち、薬物部分と結合され得る。この薬物部分は、反応性システインチオール基を通して抗体に共有結合され得る。抗体-薬物結合体ADC化合物の例示的実施形態は、システイン操作抗体Abおよび薬物部分Dを含み、ここで、この抗体は、0.6~1.0の範囲のチオール反応性値を有する一つ以上の遊離システインアミノ酸を有し、そしてこの抗体は、リンカー部分Lによる一つ以上の遊離システインアミノ酸を通してDへと結合している;この構成物は、式Iを有する:Ab-L-DpIここで、pは1、2、3、または4である。チオール反応性リンカー部分を介して抗体分子へと結合し得る薬物部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入されるシステイン残基の数により制限される。従って、式Iの例示的なADCは、1、2、3、または4個の操作されたシステインアミノ酸を有する抗体を含む。抗体-薬物結合体化合物ADCの別の例示的実施形態は、システイン操作抗体Ab、アルブミン結合性ペプチドABPおよび薬物部分Dを含み、ここで、この抗体は、リンカー部分Lによって薬物部分と結合しており、そしてこの抗体は、アミド結合または第2のリンカー部分によって、アルブミン結合性ペプチドと結合している;この構成物は、式Iaを有する:ABP-Ab-L-DpIaここで、pは、1、2、3、または4である。本発明のADC化合物は、抗癌活性についての有用性を有するものを含む。特に、この化合物は、薬物部分すなわち、毒素に結合したすなわち、リンカーによって共有結合したシステイン操作抗体を含む。薬物が抗体に結合していない場合、この薬物は、細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を有する。このように、薬物部分の生物学的活性は、抗体への結合によって調節される。本発明の抗体-薬物結合体ADCは、有効量の細胞傷害剤を腫瘍組織へと選択的に送達し、それにより、より大きな選択性すなわち、より低い有効用量が達成され得る。1つの実施形態では、ADCの薬物部分を含む薬物化合物と比較した場合、本発明のADCまたはADCの細胞内代謝産物のバイオアベイラビリティーは、哺乳類において改善される。また、薬物部分を有しないADCアナログと比較した場合、ADCまたはADCの細胞内代謝産物のバイオアベイラビリティーは哺乳類において改善される。薬物部分抗体-薬物結合体ADCの薬物部分Dは、細胞傷害効果または細胞増殖抑制果を有する、任意の化合物、部分または基を含む。薬物部分としては、以下が挙げられる:i化学療法剤これは、マイクロチューブリンインヒビター、有糸分裂インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターまたはDNAインターカレーターとして機能し得る、iiタンパク質毒素これは、酵素的に機能し得る、およびiiiラジオアイソトープ。例示的な薬物部分としては、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、CC1065、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにそれらの立体異性体、同配体、アナログまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。マイタンシノイド薬物部分としての使用に適しているマイタンシン化合物は、当該分野で周知であり、そして公知の方法に従って、天然の供給源から分離され得るか、遺伝子工学技術Yuら2002PROC.NAT.ACAD.SCI.USA99:7968-7973を参照のことを使用して生成され得るか、またはマイタンシノールおよびマイタンシノールアナログは、公知の方法に従って合成により調製され得る。例示的なマイタンシノイド薬物部分としては、例えば以下の、改変芳香環を有するものが挙げられる:C-19-デクロロUS4256746アンサミトシンansamytocinP2の水素化アルミニウムリチウム還元により調製される;C-20-ヒドロキシまたはC-20-デメチル/-C-19-デクロロ米国特許第4361650号および同第4307016号StreptomycesもしくはActinomycesを用いた脱メチル化により、またはLAHを使用した脱塩素作用により、調製される;ならびにC-20-デメトキシ、C-20-アシルオキシ-OCOR/-デクロロ米国特許第4,294,757号アシルクロリドを使用したアシル化により調製される、ならびに他の位置に改変を有するもの。例示的なマイタンシノイド薬物部分としてはまた、例えば以下の改変を有するものが挙げられる:C-9-SHUS4424219H2SまたはP2S5を用いたマイタンシノールの反応により調製される;C-14-アルコキシメチルデメトキシ/CH2ORUS4331598;C-14-ヒドロキシメチルもしくはアシルオキシメチルCH2OHまたはCH2OAcUS4450254Nocardiaから調製される;C-15-ヒドロキシ/アシルオキシUS4364866Streptomycesによるマイタンシノールの変換により調製される;C-15-メトキシ米国特許第4313946号および同第4315929号Trewianudlfloraから単離される;C-18-N-デメチル米国特許第4362663号および同第4322348号Streptomycesによるマイタンシノールの脱メチル化により調製される;および4,5-デオキシUS4371533マイタンシノールの三塩化チタン/LAH還元により調製される。マイタンシン化合物上の多くの位置は、連結のタイプに依存して、結合位置として有用であることが公知である。例えば、エステル結合を形成するために、ヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルにより修飾されるC-14位、ヒドロキシル基により修飾されるC-15位およびヒドロキシル基を有するC-20位は、全て適切である。式Iの抗体-薬物結合体ADCの薬物部分Dは、以下の構造を有するマイタンシノイドを含む:ここで、波形の線は、抗体-薬物結合体ADCのリンカーLへのDの硫黄原子の共有結合を示す。Rは、独立して、HまたはC1-C6アルキルであり得、C1-C6アルキルは、メチル、エチル、1-プロピル、2-プロピル、1-ブチル、2-メチル-1-プロピル、2-ブチル、2-メチル-2-プロピル、1-ペンチル、2-ペンチル、3-ペンチル、2-メチル-2-ブチル、3-メチル-2-ブチル、3-メチル-1-ブチル、2-メチル-1-ブチル、1-ヘキシル、2-ヘキシル、3-ヘキシル、2-メチル-2-ペンチル、3-メチル-2-ペンチル、4-メチル-2-ペンチル、3-メチル-3-ペンチル、2-メチル-3-ペンチル、2,3-ジメチル-2-ブチルおよび3,3-ジメチル-2-ブチルから選択される。アミド基を硫黄原子に結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニルまたはプロピルであり得る。すなわち、mは、1、2または3である。マイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質であるチュービュリンの重合阻害によって有糸分裂中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害するRemillardら1975Science189:1002-1005。マイタンシンおよびマイタンシノイドは非常に細胞傷害性であるが、癌治療におけるそれらの臨床用途は、それらの乏しい腫瘍選択性に主に起因しているそれらの重篤な全身副作用によって大いに制限されている。マイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系および胃腸系に対する深刻な副作用に起因して中断されたIsselら1978Can.Treatment.Rev.5:199-207。マイタンシノイド薬物部分は、抗体-薬物結合体において魅力的な薬物部分である。なぜなら、これらは以下であるからである:i発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的アクセス可能である、ii非ジスルフィドリンカーを通した抗体に対する結合体化に適している官能基を用いた誘導体化が可能である、iii血漿中で安定である、およびiv様々な腫瘍細胞株に対して有効であるUS2005/0169933;WO2005/037992;US5208020。他の薬物部分と同様に、マイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体すなわち、Dのキラル炭素におけるR配置およびS配置の任意の組合せは、本発明の化合物について意図される。一つの実施形態では、マイタンシノイド薬物部分Dは、以下の立体化学を有する:マイタンシノイド薬物部分の例示的実施形態としては、以下の構造を有する、以下が挙げられる:DM1、CR2m=CH2CH2;DM3、CR2m=CH2CH2CHCH3;およびDM4、CR2m=CH2CH2CCH32:リンカーは、連結のタイプに依存して、さまざまな位置においてマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル結合は、従来の結合技術を使用したヒドロキシル基との反応により形成され得る。この反応は、ヒドロキシル基を有しているC-3位、ヒドロキシメチルにより修飾されるC-14位、ヒドロキシル基により修飾されるC-15位およびヒドロキシル基を有しているC-20位で生じ得る。好ましい実施形態では、この結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノールアナログのC-3位で形成される。式Iの抗体-薬物結合体ADCの薬物部分Dはまた、ドラスタチンおよびそれらのペプチドアナログおよび誘導体オーリスタチンを含む米国特許第5635483号;同第5780588号。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管力学、GTP加水分解、ならびに核および細胞の分裂を妨げることが示されたWoykeら2001Antimicrob.AgentsandChemother.4512:3580-3584。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、抗癌活性US5663149および抗真菌性活性を有するPettitら1998Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965。さまざまな形態のドラスタチン薬物部分またはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のNアミノ末端またはCカルボキシル末端を通して抗体に共有結合され得るWO02/088172;Doroninaら2003NatureBiotechnology217:778-784;Franciscoら2003Blood1024:1458-1465。薬物部分としては、ドラスタチン、オーリスタチンUS5635483;US5780588;US5767237;US6124431、ならびにそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管力学、GTP加水分解、ならびに核および細胞の分裂を妨げることが示されているWoykeら2001Antimicrob.AgentsandChemother.4512:3580-3584。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、抗癌活性US5663149および抗真菌性活性を有するPettitら1998Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965。ドラスタチン薬物部分またはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のNアミノ末端またはCカルボキシル末端を通して抗体に結合され得るWO02/088172。代表的なオーリスタチンの実施形態としては、以下で開示される、N末端に連結されたモノメチルオーリスタチン薬物部分DEおよびDFが挙げられる:WO2005/081711;Senterら,ProceedingsoftheAmericanAssociationforCancerResearch,Volume45,AbstractNumber623,presentedMarch28,2004年3月28日に公開これらの各々の開示は、明らかに、その全体が本明細書中に参考として援用される。式Iの抗体-薬物結合体ADCの薬物部分Dとしては、N末端を通して抗体へと連結される、以下の構造を有するモノメチルオーリスタチン薬物部分MMAEおよびMMAFが挙げられる:代表的には、ペプチドベースの薬物部分は、二個以上のアミノ酸および/またはペプチドフラグメントの間でペプチド結合を形成することにより調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野では周知である液相合成法E.SchroederandK.Luebke,ThePeptides,volume1,76-136頁,1965,AcademicPressを参照のことに従って調製され得る。薬物部分としては、カリケアマイシン、ならびにそのアナログおよび誘導体が挙げられる。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満の濃度で二本鎖DNA切断を生じ得る。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製に関しては、US5712374;US5714586;US5739116;US5767285;US5770701、US5770710;US5773001;US5877296を参照のこと。用いられ得る、カリケアマイシンの構造アナログとしては、γ1I、α2I、α3I、N-アセチル-γ1I、PSAGおよびθI1が挙げられるが、これらに限定されないHinmanら,CancerResearch53:3336-33421993,Lodeら,CancerResearch58:2925-29281998。タンパク質毒素としては、以下が挙げられる:ジフテリアA鎖、ジフテリアトキシンの非結合性活性フラグメント、エキソトキシンA鎖Pseudomonasaeruginosa菌由来、リシンA鎖Vitettaら1987Science、238:1098、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、α-サルシンsarcin、Aleuritesfordiiタンパク質、ダイアンシンdianthinタンパク質、Phytolacaamericanaタンパク質PAPI、PAPIIおよびPAP-S、momordicacharantiaインヒビター、クルシンcurcin、クロチンcrotin、sapaonariaofficinalisインヒビター、ゲロニン、マイトゲリンmitogellin、レストリクトシンrestrictocin、フェノマイシンphenomycin、エノマイシンenomycinおよびトリコテセンtricotheceneWO93/21232。治療用ラジオアイソトープとしては、以下が挙げられる:32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212Bi、212PbおよびLuの放射性同位元素。ラジオアイソトープまたは他の標識は、公知の方法で結合体中に組み込まれ得るFrakerら1978Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57;MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy,Chatal,CRCPress1989。炭素14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸MX-DTPAは、抗体に対する放射性核種の結合体化のための例示的なキレート剤であるWO94/11026。リンカーリンカーLは、1以上の薬物部分Dおよび抗体単位Abを連結して、式Iの抗体-薬物結合体ADCを形成するために使用され得る、二官能性または多官能性の部分である。抗体-薬物結合体ADCは、薬物および抗体に結合させるための反応性官能基を有するリンカーを用いて、簡便に調製され得る。システイン操作された抗体Abのシステインチオールは、リンカー試薬、薬物部分、または、薬物-リンカー中間体の官能基と結合を形成し得る。1つの局面において、リンカーは、抗体に存在する求核性システインに対して反応性の求電子性基を有する反応性の部位である。抗体のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応性であり、リンカーに対して共有結合を形成する。有用な求電子性基としては、マレイミド基およびハロアセタミド基が挙げられるがこれらに限定されない。Klussmanら2004、BioconjugateChemistry154:765-773の766ページに記載される結合体化法、および実施例4のプロトコールによれば、システイン操作された抗体は、マレイミドまたはα-ハロカルボニルのような求電子性の官能基で、リンカー試薬または薬物-リンカー中間体と反応する。1つの実施形態において、ADCのリンカーLは、以下の式:-Aa-Ww-Yy-を有し、上記式において:-A-は、抗体Abのシステインチオールに共有結合したストレッチャー単位であり;aは、0または1であり;各-W-は、独立して、アミノ酸単位であり;wは、独立して、0~12の範囲の整数であり;-Y-は、薬物部分に共有結合するスペーサー単位であり;そしてyは、0、1または2である。ストレッチャー単位ストレッチャー単位-A-は、存在する場合、1つの抗体単位を1つのアミノ酸単位-W-に連結し得る。この点に関して、抗体Abは、ストレッチャー単位の求電子性の官能基と結合を形成し得る、遊離のシステインチオール基を有する。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は、式IIIaおよびIIIbの括弧内に示され、ここで、Ab-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは、上に定義されたとおりであり、そして、R17は、CH2r、C3-C8炭素環式、O-CH2r-アリーレン、CH2r-アリーレン、-アリーレン-CH2r-、CH2r-C3-C8炭素環式、C3-C8炭素環式-CH2r、C3-C8複素環式、CH2r-C3-C8複素環式、-C3-C8複素環式-CH2r-、-CH2rCONRbCH2r-、-CH2CH2Or-、-CH2CH2Or-CH2-、-CH2rCONRbCH2CH2Or-、-CH2rCONRbCH2CH2Or-CH2-、-CH2CH2OrCONRbCH2CH2Or-、-CH2CH2OrCONRbCH2CH2Or-CH2-、および-CH2CH2OrCONRbCH2r-から選択される二価のラジカルである;ここでRbは、H、C1-C6アルキル、フェニル、またはベンジルである;そして、rは、独立して、1~10の範囲の整数である。アリーレンは、親の芳香族環系から2つの水素原子を除去することによって誘導された、6~20個の炭素原子の二価の芳香族炭化水素ラジカルを含む。代表的なアリーレン基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されたラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。複素環式基は、1以上の環原子がヘテロ原子例えば、窒素、酸素および硫黄である、環系を含む。複素環ラジカルは、1~20個の炭素原子と、N、O、PおよびSから選択される1~3個のヘテロ原子とを含む。複素環は、3~7個の環員2~6個の炭素原子と、N、O、PおよびSから選択される1~3個のヘテロ原子を有する単環、または7~10個の環員4~9個の炭素原子と、N、O、PおよびSから選択される1~3個のヘテロ原子を有する二環例えば、ビシクロ[4,5]系、ビシクロ[5,5]系、ビシクロ[5,6]系またはビシクロ[6,6]系であり得る。複素環は、Paquette,LeoA.;PrinciplesofModernHeterocyclicChemistryW.A.Benjamin,NewYork,1968、特に、第1章、第3章、第4章、第6章、第7章、および第9章;TheChemistryofHeterocyclicCompounds,AseriesofMonographsJohnWileySons,NewYork,1950~現在、特に、第13巻、第14巻、第16巻、第19巻、および第28巻;ならびにJ.Am.Chem.Soc.196082:5566に記載される。複素環の例としては、一例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ピリジル、ジヒドロdihydroyピリジル、テトラヒドロピリジルピペリジル、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル酸化硫黄、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ピペリジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、2-ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス-テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス-テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、6H-1,2,5-チアジアジニル、2H,6H-1,5,2-ジチアジニル、チエニル、チアスレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、2H-ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、3H-インドリル、1H-インダゾリル、プリニル、4H-キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル、4Ah-カルバゾリル、カルバゾリル、β-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、およびイサチノイル。炭素環式基は、単環として3~7個の炭素原子を、または、二環として7~12個の炭素原子を有する、飽和または不飽和の環を含む。単環式炭素環は、3~6個の環原子、なおより代表的には、5または6個の環原子を有する。二環式炭素環は、7~12個の環原子例えば、ビシクロ[4,5]系、ビシクロ[5,5]系、ビシクロ[5,6]系またはビシクロ[6,6]系として並べられるか、または、9もしくは10個の環原子ビシクロ[5,6]系またはビシクロ[6,6]系として並べられるを有する。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、1-シクロペンタ-1-エニル、1-シクロペンタ-2-エニル、1-シクロペンタ-3-エニル、シクロヘキシル、1-シクロヘキサ-1-エニル、1-シクロヘキサ-2-エニル、1-シクロヘキサ-3-エニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。全ての式IADCの例示的な実施形態例えば、III~VIから、特別に表示されていない場合でさえも、操作されたシステイン残基の数に依存して、1~4個の薬物部分が、1つの抗体に連結されるp=1~4ことが理解される。例示的なストレッチャー単位は、式IIIaのものであり、そしてこれは、マレイミド-カプロイルMCから誘導されたものであり、ここで、R17は、-CH25-である:。例示的なストレッチャー単位は、式IIIaのものであり、そしてこれは、マレイミド-プロパノイルMPから誘導されたものであり、ここで、R17は、-CH22-である:。別の例示的なストレッチャー単位は、式IIIaのものであり、ここで、R17は、-CH2CH2Or-CH2-であり、そして、rは2である:。別の例示的なストレッチャー単位は、式IIIaのものであり、ここで、R17は、-CH2rCONRbCH2CH2Or-CH2-であって、ここでRbはHであり、各rは2である:。別の例示的なストレッチャー単位は、式IIIbのものであり、ここで、R17は、-CH25-である:。別の実施形態において、ストレッチャー単位は、抗体単位の硫黄原子とストレッチャー単位の硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して、抗体単位へと連結される。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は、式IVの括弧内に示され、ここで、R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは、上に定義されるとおりである。。なお別の実施形態において、ストレッチャーの反応性の基は、抗体の遊離システインチオールと結合を形成し得る、チオール反応性の官能基を含む。チオール反応性の官能基の例としては、マレイミド、α-ハロアセチル、活性化エステル例えば、スクシニミドエステル、4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルホニル塩化物、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態の代表的なストレッチャー単位は、式VaおよびVbの括弧内に示され、ここで、-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、wおよびyは上に定義されるとおりである;。別の実施形態において、リンカーは、分枝の多官能性リンカー部分を通して、2以上の薬物部分を1つの抗体へと共有結合させるための、樹状型リンカーであり得るSunら2002BioorganicMedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sunら2003BioorganicMedicinalChemistry11:1761-1768;King2002TetrahedronLetters43:1987-1990。樹状リンカーは、薬物対抗体の分子比、すなわち、ADCの効力に関連する負荷を高め得る。こうして、システイン操作された抗体が、1つのみの反応性のシステインチオール基を有する場合、多数の薬物部分が、樹状リンカーを介して結合され得る。アミノ酸単位リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸単位-Ww-は、存在する場合、抗体Abを、本発明のシステイン操作された抗体-薬物結合体ADCの薬物部分Dに連結する。-Ww-は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドの単位である。アミノ酸単位を含むアミノ酸残基としては、天然に存在するもの、ならびに、少数のアミノ酸、および、シトルリンのような天然に存在しないアミノ酸アナログが挙げられる。各-W-単位は、独立して、括弧内に示される以下の式を有し、そして、wは、0~12の範囲の整数である:ここで、R19は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、ベンジル、p-ヒドロキシベンジル、-CH2OH、-CHOHCH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-CH23NHC=NHNH2、-CH23NH2、-CH23NHCOCH3、-CH23NHCHO、-CH24NHC=NHNH2、-CH24NH2、-CH24NHCOCH3、-CH24NHCHO、-CH23NHCONH2、-CH24NHCONH2、-CH2CH2CHOHCH2NH2、2-ピリジルメチル-、3-ピリジルメチル-、4-ピリジルメチル-、フェニル、シクロヘキシル、である。アミノ酸単位は、腫瘍関連プロテアーゼを含む、1種以上の酵素によって酵素的に切断されて、薬物部分-Dを解放し得、この薬物部分-Dは、1つの実施形態においては、解放の際にインビボにおいてプロトン化され、薬物Dを提供する。有用な-Ww-単位は、特定の酵素例えば、腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断について、設計され、そして、その選択性が最適化され得る。1つの実施形態において、-Ww-単位は、その切断がカテプシンB、CおよびD、または、プラスミンプロテアーゼによって触媒される単位である。例示的な-Ww-アミノ酸単位としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン-シトルリンvcまたはval-cit、アラニン-フェニルアラニンafまたはala-pheが挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン-バリン-シトルリンgly-val-citおよびグリシン-グリシン-グリシンgly-gly-glyが挙げられる。R19が水素以外である場合、R19が結合する炭素原子は、キラルである。R19が結合する炭素原子の各々は、独立して、SもしくはRの立体配置であるか、または、ラセミ混合物である。したがって、アミノ酸単位は、鏡像異性的に純粋であっても、ラセミであっても、ジアステレオマーであってもよい。スペーサー単位スペーサー単位-Yy-は、存在する場合y=1または2、アミノ酸単位が存在する場合w=1~12に、アミノ酸単位-Ww-を薬物部分Dに連結する。あるいは、スペーサー単位は、アミノ酸単位が存在しない場合、ストレッチャー単位を薬物部分に連結する。スペーサー単位はまた、アミノ酸単位もストレッチャー単位も存在しない場合w、y=0に、薬物部分を抗体単位に連結する。スペーサー単位は、2つの一般的な型のものである:自己犠牲型および非自己犠牲型。非自己犠牲型のスペーサー単位は、抗体-薬物結合体、または、薬物部分-リンカーの切断、特に、酵素的な切断の後に、スペーサー単位の一部または全体が薬物部分に結合したままであるものである。グリシン-グリシンスペーサー単位、または、グリシンスペーサー単位を含むADCが、腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼ、または、リンパ球関連プロテアーゼによって酵素的な切断を受けるとき、グリシン-グリシン-薬物部分、または、グリシン-薬物部分が、Ab-Aa-Ww-から切断される。1つの実施形態において、独立した加水分解反応が標的細胞内で生じて、グリシン-薬物部分の結合を切断し、そして、薬物を解放する。別の実施形態において、-Yy-は、p-アミノベンジルカルバモイルPAB単位スキーム2および3を参照のことであり、このフェニレン部分は、Qmによって置換され、ここで、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;そして、mは、0~4の範囲の整数である。非自己犠牲型のスペーサー単位-Y-の例示的な実施形態は、-Gly-Gly-;-Gly-;-Ala-Phe-;-Val-Cit-である。1つの実施形態において、スペーサー単位が存在しないy=0、薬物部分-リンカー、もしくは、ADC、または、その薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物が、提供される。あるいは、自己犠牲型のスペーサー単位を含むADCは、-Dを解放し得る。1つの実施形態において、-Y-は、PAB基のアミノ窒素原子を介して-Ww-に結合し、そして、カルボネート基、カルバメート基、またはエーテル基を介して-Dに直接結合した、PAB基である。ここで、ADCは、以下の例示的な構造:を有し、ここで、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;mは、0~4の範囲の整数であり;そして、pは、1~4の範囲である。自己犠牲型のスペーサーの他の例としては、2-アミノイミダゾール-5-メタノール誘導体Hayら1999Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237、および、オルトまたはパラ-アミノベンジルアセタールのようなPAB基に電子的に類似する芳香族化合物が挙げられるがこれらに限定されない。置換および非置換の4-アミノ酪酸アミドRodriguesら1995ChemistryBiology2:223、適切に置換されたビシクロ[2.2.1]環系およびビシクロ[2.2.2]環系Stormら1972J.Amer.Chem.Soc.94:5815、ならびに、2-アミノフェニルプロピオン酸アミドAmsberry,ら1990J.Org.Chem.55:5867のような、アミド結合の加水分解の際に環化を受けるスペーサーが使用され得る。グリシンが置換されたアミン含有薬物の脱離Kingsburyら1984J.Med.Chem.27:1447もまた、ADCにおいて有用な自己犠牲型のスペーサーの例である。1つの実施形態において、スペーサー単位は、複数の薬物を組み込んだり解放したりするために使用され得る、分枝のビスヒドロキシメチルスチレンBHMSであり、以下の構造:を有し2-4-アミノベンジリデンプロパン-1,3-ジオールデンドリマー単位WO2004/043493;deGrootら2003Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494を含む、そしてここで、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;mは、0~4の範囲の整数であり;nは、0または1であり;そして、pは、1~4の範囲である。樹状リンカー別の実施形態において、リンカーLは、分枝の多官能性リンカー部分を通して、2以上の薬物部分を1つの抗体へと共有結合させるための、樹状型リンカーであり得るSunら2002BioorganicMedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sunら2003BioorganicMedicinalChemistry11:1761-1768;King2002TetrahedronLetters43:1987-1990。樹状リンカーは、薬物対抗体の分子比、すなわち、ADCの効力に関連する負荷を高め得る。こうして、システイン操作された抗体が、1つのみの反応性のシステインチオール基を有する場合、多数の薬物部分が、樹状リンカーを介して結合され得る。樹状リンカー試薬の以下の例示的な実施形態は、9つまでの求核性薬物部分をクロロエチル窒素マスタード官能基との反応によって結合体化させる:。スペーサー単位の別の実施形態において、自己犠牲型の2,6-ビスヒドロキシメチル-p-クレゾールデンドリマー単位および2,4,6-トリスヒドロキシメチル-フェノールデンドリマー単位WO2004/01993;Szalaiら2003J.Amer.Chem.Soc.125:15688-15689;Shamisら2004J.Amer.Chem.Soc.126:1726-1731;Amirら2003Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499を有する分枝の樹状リンカーは、本発明の化合物におけるリンカーとして使用され得る。別の実施形態において、D部分は同じである。なお別の実施形態において、D部分は異なる。1つの局面において、スペーサー単位-Yy-は、式X~XIIによって表れる:ここで、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;そしてmは、0~4の範囲の整数である;。式Iの抗体-薬物結合体化合物の実施形態としては、XIIIaval-cit、XIIIbMC-val-cit、XIIIcMC-val-cit-PAB:が挙げられる。式Iaの抗体-薬物結合体化合物の他の例示的な実施形態としては、XIVa-e:が挙げられ、ここで、Xは、であり;Yは、であり;そして、Rは、独立して、HまたはC1-C6アルキルであり;そして、nは、1~12である。別の実施形態において、リンカーは、抗体に存在する求電子性基に対して反応性の求核性基を有する反応性の官能基を有する。抗体上の有用な求電子性基としては、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子は、抗体上の求電子性基と反応して、抗体単位への共有結合を形成し得る。リンカー上の有用な求核性基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるがこれらに限定されない。抗体上の求電子性基は、リンカーへの結合のための便利な部位を提供する。代表的には、ペプチド型のリンカーは、2以上のアミノ酸および/またはペプチドフラグメント間のペプチド結合を形成することによって調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の、液相合成法E.SchroederおよびK.Luebke1965ThePeptides,第1巻,pp76-136,AcademicPressに従って調製され得る。リンカー中間体は、スペーサー単位、ストレッチャー単位およびアミノ酸単位を含む、反応のあらゆる組み合わせまたは順序で組み立てられ得る。スペーサー単位、ストレッチャー単位およびアミノ酸単位は、自然状態では求電子性、求核性またはフリーラジカルである、反応性の官能基を使用し得る。反応性の官能基としては、以下:が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Xは、脱離基例えば、O-メシル、O-トシル、-Cl、-Br、-I;またはマレイミドである。別の実施形態において、リンカーは、可溶性または反応性を調節する基で置換され得る。例えば、帯電した置換基例えば、スルホネート-SO3-またはアンモニウムは、ADCを調製するために使用される合成経路に依存して、試薬の水溶性を高め、そして、リンカー試薬の、抗体または薬物部分とのカップリング反応を促進するか、または、Ab-L抗体-リンカー中間体のDとのカップリング反応、またはD-L薬物-リンカー中間体のAbとのカップリング反応を促進し得る。本発明の化合物は、明らかに、リンカー試薬を用いて調製されたADC:BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、およびSVSBスクシニミジル-4-ビニルスルホンベンゾエート;ならびにビス-マレイミド試薬を用いて調製されたADC:DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BMPEO3、およびBMPEO4これらは、PierceBiotechnology,Inc.,CustomerServiceDepartment,P.O.Box117,Rockford,IL.61105U.S.A,U.S.A1-800-874-3723,International815-968-0747から市販されているを意図するが、これらに限定されない。2003-2004ApplicationsHandbookandCatalogの467~498ページを参照のこと。ビス-マレイミド試薬は、連続的または同時の様式で、システイン操作された抗体のチオール基の、チオール含有薬物部分、標識、またはリンカー中間体への結合を可能にする。システイン操作された抗体、薬物部分、標識またはリンカー中間体のチオール基と反応性である、マレイミド以外の多の官能基としては、ヨードアセタミド、ブロモアセタミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。。有用なリンカー試薬はまた、MolecularBiosciencesInc.Boulder,COのような他の市販の供給源から入手され得るか、または、Tokiら2002J.Org.Chem.67:1866-1872;Walker,M.A.1995J.Org.Chem.60:5352-5355;Frischら1996BioconjugateChem.7:180-186;US6214345;WO02/088172;US2003130189;US2003096743;WO03/026577;WO03/043583;およびWO04/032828に記載される手順に従って合成され得る。式IIIaのストレッチャーは、以下のリンカー試薬:を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。ストレッチャー単位は、以下の二官能性試薬:を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得、上記式において、XはBrまたはIである。この式のストレッチャー単位はまた、以下の二官能性試薬:を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。式Vaのストレッチャー単位は、以下の中間体:を、アミノ酸単位のN末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。以下に示される式:のイソチオシアネートストレッチャーは、Angew.Chem.,19758714,517に記載されるようにして、イソチオシアナトカルボン酸クロリドから調製され得、上記式において、-R17-は、本明細書中に記載されるとおりである。マレイミドストレッチャーと、パラ-アミノベンジルカルバモイルPAB自己犠牲型スペーサーとを有する、例示的なバリン-シトルリンval-citまたはvcジペプチドリンカー試薬は、以下の構造:を有し、上記構造において、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;そして、mは、0~4の範囲の整数である。マレイミドストレッチャー単位と、p-アミノベンジル自己犠牲型スペーサー単位とを有する、例示的なphe-lysMtrジペプチドリンカー試薬は、Dubowchikら1997TetrahedronLetters,38:5257-60に従って調製され得、そして、以下の構造:を有し、上記構造において、Mtrは、モノ-4-メトキシトリチルであり、Qは、-C1-C8アルキル、-O-C1-C8アルキル、-ハロゲン、-ニトロまたは-シアノであり;そして、mは、0~4の範囲の整数である。本発明の例示的な抗体-薬物結合体化合物としては、以下:が挙げられ、ここで、Valはバリンであり;Citはシトルリンであり;pは、1、2、3または4であり;そして、Abは、システイン操作された抗体である。メイタンシノイド薬物部分DM1が、BMPEOリンカーを介して、トラスツズマブのチオール基に連結された他の例示的な抗体薬物結合体は、以下の構造:を有し、上記構造において、Abは、システイン操作された抗体であり;nは、0、1または2であり;そして、pは、1、2、3または4である。抗体-薬物結合体の調製式IのADCは、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製され得る:1共有結合を介して、抗体-リンカー中間体Ab-Lを形成するための、システイン操作された抗体のシステイン基のリンカー試薬との反応、その後の、活性化された薬物部分Dとの反応;および2共有結合を介して、薬物-リンカー中間体D-Lを形成するための、薬物部分の求核性基のリンカー試薬との反応、その後の、システイン操作された抗体のシステイン基との反応。結合体化方法1および2は、種々のシステイン操作された抗体、薬物部分およびリンカーを用いて行われ、式Iの抗体-薬物結合体を調製し得る。抗体のシステインチオール基は、求核性であり、そして、リンカー試薬および薬物-リンカー中間体上の求電子性基と反応して共有結合を形成し得る。この求電子性基としては、以下が挙げられる:iNHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物のような活性なエステル;iiアルキル、およびハロアセタミドのようなベンジルハライド;iiiアルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、およびマレイミド基;ならびにivスルフィド交換による、ピリジルジスルフィドを含む、ジスルフィド。薬物部分上の求核性基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成し得る、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド。マイタンシンは、例えば、May-SSCH3へと変換され得、これは、遊離チオールであるMay-SHへと還元され、そして、修飾された抗体と反応してChariら1992CancerResearch52:127-131ジスルフィドリンカーと、メイタンシノイド-抗体免疫結合体を生成し得る。ジスルフィドリンカーを用いた抗体-メイタンシノイド結合体が報告されているWO04/016801;US6884874;US2004/039176A1;WO03/068144;US2004/001838A1;米国特許第6441163号、同第5208020号、同第5416064号;WO01/024763。ジスルフィドリンカーSPPは、リンカー試薬N-スクシニミジル4-2-ピリジルチオペンタノエートを用いて構築される。特定の条件下では、システイン操作された抗体は、DTTクリーランド試薬、ジチオスレイトールまたはTCEPトリス2-カルボキシエチルホスフィンヒドロクロリド;Getzら1999Anal.Biochem.Vol273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MAを用いた処理によって、リンカー試薬との結合体化のために反応性にされ得る。CHO細胞において発現させた、全長のシステイン操作されたモノクローナル抗体チオMabを、約50倍過剰のTCEPを用いて37°Cにて3時間還元し、新しく導入されたシステイン残基と、培養培地中に存在するシステインとの間に形成し得る、ジスルフィド結合を還元した。この還元されたチオMabを、希釈して、10mM酢酸ナトリウム、pH5中でHiTrapSカラムにロードし、そして、0.3M塩化ナトリウムを含むPBSで溶出した。ジスルフィド結合を、室温にて、一晩、希200nM硫酸銅CuSO4水溶液を用いて、親のMab中に存在するシステイン残基間に再度確立させた。当該分野で公知の他の酸化物質、すなわち、酸化剤および酸化条件が使用され得る。周囲の空気の酸化もまた有効である。この、穏やかで、部分的な再酸化段階は、高い忠実度で、効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。約10倍過剰の薬物-リンカー中間体、例えば、BMPEO4-DM1を加え、混合し、そして、室温にて約1時間静置させて、結合体化を行い、TioMab抗体-薬物結合体を形成する。この結合体混合物を、ゲル濾過して、HiTrapSカラムにロードし、このカラムを通して溶出して、過剰の薬物-リンカー中間体と他の不純物とを除去した。図15は、結合体化のための細胞培養から発現させる、システイン操作された抗体を調製するための一般的なプロセスを示す。システイン付加物は、おそらくは、種々の鎖内ジスルフィド結合を伴って、還元的に切断され、抗体の還元形態を与える。対になったシステイン残基間の鎖内ジスルフィド結合は、周囲の酸素への暴露のような部分的な酸化条件下で再生される。新しく導入され、操作され、そして、対になっていないシステイン残基は、本発明の抗体結合体を形成するための、リンカー試薬または薬物-リンカー中間体との反応に利用可能なままである。哺乳動物細胞株において発現させたチオMabは、-S-S-結合の形成によって、操作されたCysへと、外部から結合体化されたCysの付加をもたらす。したがって、精製したチオMabは、実施例11に記載されるような還元および酸化の手順を用いて処理され、反応性のチオMabを生成する。これらのチオMabは、細胞傷害性薬物、フルオロフォアおよび他の標識を含むマレイミドとの結合体化のために使用される。種々のチオFabおよびチオMab抗体-薬物結合体が調製された実施例4~8。システイン変異体hu4D5Fabv8V110Cを、ビス-マレイミドリンカー試薬であるBMPEOを用いて、メイタンシノイド薬物部分DM1と結合体化させて、hu4D5Fabv8V110C-BMPEO-DM1実施例8を形成した。インビトロ細胞増殖アッセイ一般に、抗体-薬物結合体ADCの細胞毒性または細胞増殖抑制活性は、レセプタータンパク質例えば、HER2を有する哺乳動物細胞を、細胞培養培地中のADCの抗体に暴露し;約6時間~約5日間のある期間にわたって細胞を培養し;そして、細胞の生存度を測定することによって測定される。細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、本発明のADCの生存度増殖、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導カスパーゼの活性化を測定した。抗体-薬物結合体のインビトロ能力を、細胞増殖アッセイによって測定した図10および11、実施例9。CellTiter-Glo登録商標LuminescentCellViabilityAssayは、Coleopteraルシフェラーゼの組換え発現に基づいた市販のPromegaCorp.,Madison,WI、均質なアッセイである米国特許第5583024号;同第5674713号および同第5700670号。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するATPの定量化に基づいて、培養物中の生細胞の数を決定するCrouchら1993J.Immunol.Meth.160:81-88;US6602677。CellTiter-Glo登録商標Assayを、96ウェル形式で行い、自動化ハイスループットスクリーニングHTSに適応させたCreeら1995AntiCancerDrugs6:398-404。均質なアッセイ手順は、単一の試薬CellTiter-Glo登録商標Reagentを直接、血清補充培地中で培養した細胞に加える工程を必要とする。細胞の洗浄、培地の除去、および複数回のピペッティングの工程は必要とされない。この系は、試薬を加え、混合してから10分以内に、384ウェルの形式で15細胞/ウェル程度の数を検出する。これらの細胞は、ADCで継続的に処理され得るか、または、ADCで処理され、そして、ADCから分離され得る。一般に、簡単に、すなわち、3時間処理した細胞は、継続的に処理した細胞と同様の効力の作用を示した。均質な添加-混合-測定の形式は、細胞の溶解と、存在するATPの量に比例する発光シグナルの生成とをもたらす。ATPの量は、培養物中に存在する細胞の数に直接比例する。CellTiter-Glo登録商標Assayは、使用される細胞の型および培地に依存して、一般には5時間よりも長い半減期を有する、ルシフェラーゼ反応により生成されるグロー型の発光シグナルを生成する。生細胞は、相対発光単位RLUに反映される。基質カブトムシルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱炭酸され、同時に、ATPのAMPへの変換を伴う。延長された半減期は、試薬注入器を使用する必要性を排除し、そして、複数のプレートの連続した処理、または、バッチモードの処理のための柔軟性を提供する。この細胞増殖アッセイは、種々のマルチウェル形式例えば、96ウェル形式または384ウェル形式で使用され得る。データは、ルミノメーターまたはCCDカメラ撮像装置によって記録され得る。発光の出力は、経時的に測定される相対光単位RLUとして表される。あるいは、発光からの光子が、シンチラントscintillantの存在下で、シンチレーションカウンターにおいて計数され得る。光単位は、次いで、1秒あたりのCPSカウントとして表され得る。抗体-薬物結合体の抗増殖性作用を、SK-BR-3乳癌細胞株に対して、上記の細胞増殖の、インビトロ細胞殺傷アッセイによって測定した図10および11。ADCのIC50値を、SK-BR-3細胞HER2レセプタータンパク質を過剰発現することが公知に対して確立した。図10は、トラスツズマブSMCC-DM1IC50=0.008~0.015μg/mlが、重鎖システイン変異結合体hu4D5Fabv8-A121C-BMPEO-DM1IC50=0.04μg/mlよりも強力であったことを示す。両方の結合体は、細胞の殺傷において、裸のトラスツズマブIC50=0.1μg/mlよりも有意に強力であった。トラスツズマブSMCC-DM1に対する薬物の負荷は、2.8DM1/Abであり、そして、hu4D5Fabv8A121C-BMPEO-DM1については、0.6DM1/Abであった。図11は、トラスツズマブSMCC-DM1IC50=0.008~0.015μg/mlが、軽鎖システイン変異体hu4D5Fabv8V110C-BMPEO-DM1IC50=0.07μg/mlよりも強力であったことを示す。両方の結合体は、細胞の殺傷において、裸のトラスツズマブIC50=0.1μg/mlよりも強力であった。トラスツズマブSMCC-DM1に対する薬物の負荷は、2.8DM1/Abであり、そして、hu4D5Fabv8V110C-BMPEO-DM1については、0.9DM1/Abであった。全長IgGチオMab結合体を、インビトロでの細胞増殖作用について試験し、そして、親抗体と比較した。図20は、親抗体トラスツズマブHERCEPTIN登録商標,Genentech,Inc.;薬物負荷が約3.4DM1/AbのトラスツズマブSMCC-DM1;および薬物負荷が約1.6DM1/Abのチオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1で処理した、SK-BR-3細胞のアッセイ結果を示す。トラスツズマブSMCC-DM1結合体は、アミノ反応性のNHSエステルSMCCリンカー試薬を介して抗体に連結させるのに対し、チオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1結合体は、チオール反応性のマレイミドBMPEOリンカー試薬を介して連結させる。両方の結合体は、SK-BR-3細胞に対して強力であり、そして、匹敵する活性を示したが、トラスツズマブは、細胞傷害性作用を示さなかった。図21Aは、親2H9抗-EphB2R;およびチオ2H9A121CBMPEO-DM1結合体で処理したHT1080EphB2細胞のアッセイ結果を示す。図21Bは、親2H9抗-EphB2R;およびチオ2H9A121CBMPEO-DM1結合体で処理したBT474細胞のアッセイ結果を示す。HT1080EphB2細胞およびBT474細胞の両方に対して、2H9チオMab結合体は、親2H9抗体結合体よりも強力であった。結合体チオ-2H9-BMPEO-DM1は、非EphB2細胞株であるBT474においてわずかな活性のみが観察されるのと比べ、EphB2特異的な細胞株HT1080EphB2において、機能的な細胞殺傷活性を示した。抗体-薬物結合体を、抗体が親抗体である場合と、抗体がシステイン操作した抗体である場合で比較した。図22は、3A5抗MUC16-SMCC-DM1;およびチオ3A5A121CBMPEO-DM1で処理した、PC3/neo細胞のアッセイ結果を示す。図23は、3A5抗MUC16-SMCC-DM1;およびチオ3A5A121CBMPEO-DM1で処理した、PC3/MUC16細胞のアッセイ結果を示す。図24は、3A5抗MUC16-SMCC-DM1;およびチオ3A5A121CBMPEO-DM1で処理した、OVCAR-3細胞のアッセイ結果を示す。チオ-3A5-BMPEO-DM1は、コントロールのPC3/neo細胞株においては有意な細胞殺傷活性を示さなかったが、PC3/MUC16細胞株においては、3A5-SMCC-DM1に対して匹敵する活性を示した。チオ-3A5-DM1結合体もまた、内因性のMUC16抗原を発現するOVCAR-3において、活性を示した。インビボの有効性本発明の2つのアルブミン結合ペプチド-DM1メイタンシノイド-抗体-薬物結合体ADCのインビボでの有効性を、HER2を高度に発現するトランスジェニック外植マウスモデルによって測定した図12、実施例10。同種移植片を、Fo5mmtvトランスジェニックマウスから増殖させた。このFo5mmtvトランスジェニックマウスは、HERCEPTIN登録商標治療に対して、応答しないか、または、不完全に応答する。被験体を、ABP-rhuFab4D5-cys軽鎖-DM1;ABP-rhuFab4D5-cys重鎖-DM1;およびプラセボのPBS緩衝液コントロールビヒクルで一回処置し、そして、3週間にわたってモニターして、腫瘍倍化時間、対数細胞殺傷、および腫瘍の縮小を測定した。用語Tiは、T=0のときの、腫瘍を有する研究群における動物の数を群における動物の総数で割ったものである。用語PRは、T=0のときの、群における、部分的な腫瘍の寛解を達成した動物の数を、腫瘍を有する動物の数で割ったものである。用語CRは、T=0のときの、群における、腫瘍の完全な寛解を達成した動物の数を、腫瘍を有する動物の数で割ったものである。用語TDVは、腫瘍倍化時間、すなわち、コントロールの腫瘍容積が、二倍になるのにかかる日数である。25mg/kgのABP-rhuFab4D5-cys軽鎖-DM11012μg/m2のDM1で処置した7匹のマウスは全て、腫瘍陽性であり、そして、20日後には、1匹の動物が部分的な寛解を有した。37.5mg/kgのABP-rhuFab4D5-cys重鎖-DM11012μg/m2のDM1で処置した7匹のマウスは全て、腫瘍陽性であり、そして、20日後には、4匹の動物が部分的な寛解を有した。A121Cシステイン変異を有し、そして、BMPEOリンカーおよびDM1薬物部分に結合体化させた全長IgGチオMab抗体改変体を、MMTV-HER2Fo5腫瘍を有するマウスにおいて、親トラスツズマブSMCC-DM1結合体に対して試験した。0日目の注射時点での腫瘍の大きさは、約100~200mmであった。図25は、0日目にビヒクル緩衝液;トラスツズマブSMCC-DM110mg/kg;チオトラスツズマブA121C-SMCC-DM121mg/kgおよびチオトラスツズマブA121C-SMCC-DM110mg/kgを単回投薬した後の、MMTV-HER2Fo5乳腺腫瘍同種移植片を有する無胸腺ヌードマウスにおける、21日間にわたる平均腫瘍容積の変化を示す。図25から、各結合体が、プラセボビヒクルに対して、腫瘍増殖を遅らせる有意な効果を発揮することが見られ得る。上記4つの群における10匹のマウスの各々に、1日目に、単回の注射を与えた。親トラスツズマブSMCC-DM1結合体は、システイン操作したチオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1結合体1.6DM1/Abの、2倍以上の薬物部分の数3.4DM1/Abで負荷した。従って、DM1の有効量は、親トラスツズマブSMCC-DM1とより高い用量21mgAbチオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1との間でほぼ等しかった。これらの2つのサンプルは、ほとんどの効力を示した。注射から14日後に、これらの結合体を与えた動物の多くは、部分的または完全な寛解を達成した。より低い用量のチオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1サンプルのより低い有効性は、DM1用量関連性の応答を確認した。チオ-トラスツズマブDM1を、コントロールトラスツズマブSMCC-DM1結合体の量と等価な抗体10mg/kgまたはDM1薬物21mg/kgのいずれかで投薬した。図25から見られるように、チオ-BMPEO-DM121mg/kgは、トラスツズマブSMCC-DM1群の応答よりもわずかに良い応答を示した。なぜならば、いくらかの動物が、チオmab-DM1と完全な応答を示したのに対し、トラスツズマブSMCC-DM1とは、部分的な応答のみであったからである。抗体-薬物結合体の投与本発明の抗体-薬物結合体ADCは、処置される状態に適した適切な任意の経路で投与され得る。ADCは、代表的に、非経口的にすなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔内および硬膜外投与され得る。薬学的処方物本発明の治療用抗体-薬物結合体ADCの薬学的処方物は、代表的に、非経口投与すなわちボーラス注射、静脈内注射、腫瘍内注射のために、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと共に、単位投薬注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する抗体-薬物結合体ADCは、必要に応じて、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤もしくは安定化剤Remington’sPharmaceuticalSciences1980第16版,Osol,A.編と、凍結乾燥処方物形態もしくは水溶液形態で混合される。受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤および安定化剤は、レシピエントに対して、使用される投薬量および濃度において非毒性であり、そして緩衝液例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液および他の有機酸の緩衝液;抗酸化剤アスコルビン酸およびメチオニンを含む;保存剤例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノールアルコール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール;低分子量約10残基未満ポリペプチド;アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質;ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンのようなアミノ酸;単糖類、二糖類、および他の炭水化物グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む;EDTAのようなキレート剤;ショ糖、マンにトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖類;ナトリウムのような塩形成性対イオン;金属複合体たとえばZn-タンパク質複合体;ならびに/または非イオン性界面活性剤例えばTWEENTM、PLURONICSTMもしくはポリエチレングリコールPEGを含む。例えば、凍結乾燥化抗ErbB2抗体処方物は、WO97/04801明白に本明細書中に参考として援用されるに記載される。活性な薬学的成分もまた、例えばコアセルベーション技術によってもしくは界面重合体化によって調製されるマイクロカプセル例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース-マイクロカプセルもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-メチルメタクリレートマイクロカプセル中、コロイド薬物送達系例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル中、またはマクロエマルジョン中に含まれ得る。このような技術は、Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編1980において開示される。徐放性調製物もまた、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、ADCを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物質の形態例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、またはポリビニルアルコール、ポリラクチドUS3773919、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー例えば、LUPRONDEPOTTM乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能ミクロスフェア、およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならず、このことは、濾過滅菌膜を通した濾過によって容易に達成される。この処方物は、上記の投与経路に適した処方物を含む。この処方物は、単位投薬形態で簡便に提供され得、そして、製薬の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。技術および処方物は、一般に、Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPublishingCo.,Easton,PAにおいて見出される。このような方法は、活性成分を1種以上の補助的成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、活性成分を液体キャリアもしくは微細に分割した個体キャリアまたはその両方と均一にかつしっかりとintimately会合させ、必要な場合、製品を成形することによって、調製される。本発明の水性懸濁液は、活性物質を、水性懸濁液の製造のために適した賦形剤と混合して含有する。このような賦形剤としては、懸濁化剤例えば、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース、ポピドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントおよびアラビアゴム、ならびに分散化剤もしくは湿潤剤例えば、天然に存在するホスファチド例えば、レシチン、アルキレンオキシドと脂肪酸との濃縮産物例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの濃縮産物例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの濃縮産物例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。水性懸濁液はまた、エチルp-ヒドロキシ-ベンゾアートもしくはn-プロピルp-ヒドロキシ-ベンゾアートのような1種以上の保存剤、1種以上の着色剤、1種以上の香味添加剤、および1種以上の甘味剤例えば、ショ糖もしくはサッカリンを含み得る。ADCの薬学的組成物は、無菌注射可能水性懸濁液もしくは無菌注射可能油性懸濁液のような、無菌注射可能調製物の形態であり得る。この懸濁液は、上述した適切な分散化剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知技術にしたがって処方され得る。無菌注射可能調製物はまた、例えば、1,3-ブタン-ジオール中の溶液のような非毒性非経口受容可能希釈剤もしくは非毒性非経口受容可能溶媒中の無菌注射可能溶液もしくは無菌注射可能懸濁液であってもよく、または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。受容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が使用され得る。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒もしくは懸濁媒体として、従来使用され得る。この目的のために、任意の混合の不揮発性油が使用され得、これらとしては、合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドが挙げられる。さらに、脂肪酸例えばオレイン酸が、注射可能薬の調製において同様に使用され得る。キャリア物質と合わせられて単回投薬形態を形成する活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変動する。例えば、静脈内注入を意図される水溶液は、約30mL/時間の速度での適切な容量の注入が生じ得るために、溶液1mlあたり約3~500μgの活性成分を含有し得る。非経口投与のために適した処方物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る無菌注射可能水溶液および非水性無菌注射可能溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含有し得る水性無菌懸濁液および非水性無菌懸濁液が挙げられる。タンパク質治療薬の経口投与は、胃における加水分解もしくは変性に起因して好ましくないが、経口投与に適するADCの処方物は、各々所定量のADCを含有するカプセル、カシェ剤もしくは錠剤として、別個の単位で調製され得る。この処方物は、単位用量容器もしくは多回用量容器例えば、密閉されたアンプルおよびバイアルに梱包され得、そして、注射のために、使用直前の無菌液体キャリア例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥freeze-dried凍結乾燥lyophilized状態で保存され得る。即席注射溶液および即席注射懸濁液は、上述した類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投薬処方物は、活性成分の、本明細書中上で挙げたような日用量もしくは単位日下位用量を含むか、または、その適切な一部分を含む。本発明は、上で規定したように、獣医学用組成物をさらに提供し、この組成物は、少なくとも1種の活性成分を、従って獣医学用キャリアと共に含有する。獣医学用キャリアは、組成物の投与の目的のために有用な物質であり、固体、液体もしくは気体の物質であり得、これらは、獣医学分野で受容可能であるかさもなければ不活性であり、そして活性成分と適合性である。これらの獣医学的組成物は、非経口投与されても、経口投与されても、または任意の他の所望の経路によって投与されてもよい。抗体-薬物結合体処置本発明の抗体-薬物結合体ADCは、種々の疾患もしくは障害例えば、腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられる疾患もしくは障害を処置するために使用され得る。例示的な状態もしくは過剰増殖性障害としては、良性もしくは悪性の腫瘍;白血病およびリンパ性悪性疾患が挙げられる。他の障害としては、神経系障害、神経膠障害、星状細胞障害、視床下部障害、上皮障害、間質障害、胞胚腔障害、炎症性障害、脈管形成性障害および免疫障害自己免疫障害を含むが挙げられる。動物モデルおよび細胞ベースのアッセイにおいて同定されたADC化合物は、腫瘍を有する高等霊長類およびヒトの臨床試験さらに試験され得る。ヒト臨床試験は、抗HER2モノクローナル抗体HERCEPTIN登録商標の効力を試験する臨床試験Baselgaら1996J.Clin.Oncol.14:737-744において報告されると同様に、以前に大規模な抗癌治療を受けているHER2過剰発現性転移性乳癌を有する患者において設計され得る。臨床試験は、コウチの治療レジメン例えば、放射線照射および/または公知の化学療法剤および/または細胞傷害性薬剤に関する化学療法と組み合わせたADCの効力を評価するために設計され得る。一般に、処置される疾患もしくは障害は、癌のような過剰増殖性疾患である。本明細書中で処置される癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病もしくはリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌例えば、上皮epithelial扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃癌gastriccancerすなわち胃癌stomachcancer、膵臓癌、多形性グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌kidneycancerもしくは腎臓癌renalcancer、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、ならびに頭部の癌もしくは頚部の癌が挙げられる。癌は、HER2発現性細胞を含み得、したがって、本発明のADCが、癌細胞に結合し得る。癌におけるErbB2発現を決定するために、種々の診断/予後診断アッセイが利用可能である。1つの実施形態において、ErbB2過剰発現は、IHCによって例えばHERCEPTESTDakoを用いて分析され得る。腫瘍生検からのパラフィン包埋した組織切片が、IHCアッセイに供され得、そして以下のErbB2タンパク質染色強度基準に当てはめられ得る:スコア0、染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の10未満で観察される;スコア1、淡い/辛うじて見える膜染色が、腫瘍細胞の10を超えて検出され、細胞は、その膜の一部分でしか染色されていない;スコア2、弱い~中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の10を超えて観察される;スコア3、中程度~強い完全な膜染色が、腫瘍細胞の10を超えて観察される。ErbB2過剰発現評価について、0スコアもしくは1スコアを有する腫瘍はErbB2を過剰発現していないと特徴付けられ、一方、2スコアもしくは3スコアを有する腫瘍は、ErbB2を過剰発現していると特徴付けられる。あるいは、またはさらに、FISHアッセイ例えば、INFORMTMVentanaCo.,Ariz.もしくはPATHVISIONTMVysis,Ill.が、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された腫瘍組織において、腫瘍における存在する場合はErbB2の程度を決定するために実施され得る。ADC化合物が処置において使用され得る自己免疫疾患としては、リウマチ性障害例えば、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、SLEおよびループス腎炎のような狼瘡、多発性筋炎/皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リンパ抗体症候群、および乾癬性関節炎、骨関節炎、自己免疫性胃腸障害および自己免疫性肝臓障害例えば、炎症性張疾患例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、およびセリアック病、脈管炎例えば、チャーグ-ストラウス症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、および多発性動脈炎polyarteriitisを含むANCA-関連性脈管炎、自己免疫性神経障害例えば、多発性硬化症、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病および自己免疫性多発性ニューロパシー、腎臓障害例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バージャー病、自己免疫性皮膚障害例えば、乾癬、じんま疹urticaria、じんま疹hive、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および皮膚エリテマトーデス、血液障害例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸液後紫斑および自己免疫性溶血性貧血、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患例えば、内耳疾患および難聴、ベーチェット病、レーノー症候群、器官移植ならびに自己免疫性内分泌障害例えば、インスリン依存性真性糖尿病IDDM、アディソン病および自己免疫性甲状腺疾患例えば、グレーヴズ病および甲状腺炎のような糖尿病関連自己免疫性疾患が挙げられる。疾患の予防もしくは処置のために、ADCの適切な投薬量は、上で規定されるような処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、この分子が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴および抗体の応答、ならびに主治医の判断に依存する。この分子は、1回に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の型および重症度に依存して、約1μg/kg~15mg/kg例えば、0.1~20mg/kgの分子が、例えば1回以上の別個の投与でまたは連続的な注入でのいずれかによる、患者への投与のための初回候補投薬量である。代表的な日投薬量は、上述の要因に基づき、約1μg/kg~100mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。患者に投与されるADCの例示的な投薬量は、患者の体重1kgあたり約0.1~約10mgの範囲である。何日もまたはそれより長くにわたる反復される投与について、状態に依存して、処置は、疾患徴候の所望の抑制が生じるまで、持続される。例示的な投薬レジメンは、抗ErbB2抗体の、約4mg/kgの初回負荷用量の投与、およびその後の約2mg/kgの毎週の維持用量の投与を包含する。他の投薬レジメンが、有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって、容易にモニタリングされる。組み合わせ治療本発明の抗体-薬物結合体ADCは、薬学的な組み合わせ処方物、もしくは組み合わせ治療としての投薬レジメンにおいて、抗癌特性を有する第2の化合物と組み合わされ得る。薬学的組み合わせ処方物もしくは投薬レジメンの第2の化合物は、組み合わせのADCに対して好ましくは補完的な活性を有し、それによって、互いに有害に作用しない。第2の化合物は、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害性薬剤、抗ホルモン剤、および/または心保護剤cardioprotectantであり得る。このような分子は、意図される目的のために有効な量での組み合わせにおいて、好適に存在する。本発明のADCを含有する薬学的組成物はまた、有効量の、チューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターもしくはDNA結合剤のような化学療法剤をも有し得る。他の治療レジメンが、本発明に従って同定される抗癌剤の投与と組み合わされ得る。組み合わせ治療は、同時のレジメンもしくは連続的なレジメンとして投与され得る。投与が連続的である場合、組み合わせは、2回以上の投与で投与され得る。組み合わせ投与は、別個の処方物もしくは単一の薬学的処方物を用いる同時投与、およびどちらかの順番での連続的投与を含み、この連続的投与において、好ましくは、両方のもしくは全ての活性剤が同時にその生物学的活性を発揮する時間の期間が存在する。1つの実施形態において、ADCによる処置は、本明細書中で同定される抗癌剤と1種以上の化学療法剤もしくは増殖阻害剤との組み合わせ投与を包含し、これらの投与には、異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。化学療法剤としては、タキサン類例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルおよび/またはアントラサイクリン抗生物質が挙げられる。このような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得るか、または熟達した医師によって実験的に決定され得る。このような化学療法のための調製および投薬スケジュールはまた、ChemotherapyService,1992M.C.Perry編,WilliamsWilkins,Baltimore,Mdに記載される。ADCは、抗ホルモン化合物例えば、タモキシフェンのような抗エストロゲン化合物;オナプリストンEP616812のような抗プロゲステロン;またはフルタミドのような抗アンドロゲンの、このような分子について公知の投薬量と組み合わせられ得る。処置される癌が、ホルモン非依存性の癌である場合、患者は、以前に抗ホルモン治療を受けている場合があり、癌がホルモン非依存性になった後、ADCおよび必要に応じて本明細書中で記載される他の薬剤が、患者に投与され得る。心保護剤治療に伴う心筋不全を予防するかもしくは低下させるためまたは1種以上のサイトカインを患者に同時投与することもまた、有用であり得る。上記の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および/または放射線治療を受け得る。上記の同時投与される薬剤のいずれかの適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、そして、新規に同定された薬剤と他の化学療法剤もしくは処置との総合作用相乗作用に起因して、より低くあり得る。組み合わせ治療は、相乗作用を提供し得、そして相乗的であるずなわち、活性成分が一緒に使用される場合、別個の化合物の使用からもたらされる効果の合計よりもより大きく達成されることが証明され得る。相乗効果は、活性成分が以下である場合に、達成され得る:1合わせた単位投薬処方物中で、同時に処方され、そして同時に投与されるかもしくは送達される場合;2別個の処方物として、交互もしくは平行に送達される場合;または3なんらかの他のレジメンによる場合。交互の治療において送達される場合、相乗効果は、この化合物が、例えば別個のシリンジ内の異なる注射によって、連続的に投与されるかもしくは送達される場合に、達成され得る。一般に、交互の治療の間、各活性成分の有効な投薬量は、連続的にsequentiallyしたがって、連続的にserially投与され、一方、組み合わせ治療において、2種以上の活性成分の有効投薬量は、一緒に投与される。抗体-薬物結合体の代謝物本明細書中で記載されるADC化合物のインビボ代謝産物もまた、このような産物が新規かつ先行技術から自明でない範囲で、本発明の範囲内である。このような産物は、例えば、投与された化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素切断などから生じ得る。したがって、本発明は、本発明の化合物を、その代謝産物を生じるために十分な時間、哺乳動物に接触させる工程を包含するプロセスによって産生される、新規かつ非自明な化合物を含む。代謝産物は、代表的に、放射性標識された例えば、14Cもしくは3HADCを調製し、これを非経口的に検出可能な用量例えば、約0.5mg/kgよりも多い用量で、ラット、マウス、モルモット、サルもしくはヒトのような動物に投与し、代謝が起こるために十分な時間代表的に、約30秒間~約30時間を与え、そしてその変換産物を尿、血液もしくは他の生物学的サンプルから単離することによって同定される。これらの産物は、これらが標識されているので、用意に単離される他は、代謝物において残留するエピトープを結合可能な抗体の使用によって単離される。代謝物構造は、従来の様式で例えば、MS、LC/MSもしくはNMR分析によって決定される。一般に、代謝物の分析は、当業者に周知の従来の薬物代謝研究と同じ様式で行われる。変換産物は、これらがインビボで見出されない限り、本発明のADC化合物の治療用投薬量についての診断アッセイにおいて有用である。標識化抗体画像化方法本発明の別の実施形態において、システイン操作抗体は、放射性核種、蛍光色素、生物発光を引き起こす基質部分、化学発光を引き起こす部分、酵素および診断用途、薬力学用途および治療用途を有する画像化実験のための他の検出標識を有するシステインチオールを介して標識され得る。一般に、標識化システイン操作抗体すなわち、バイオマーカーもしくはプローブは、生体例えば、ヒト、げっ歯類もしくは他の小動物、灌流された器官もしくは組織サンプルへの注射、輸液もしくは経口摂取によって投与される。プローブの分布は、時間経過にわたって検出され、そして画像によって表される。製品本発明の別の実施形態において、上記の障害の処置のために有用な物質を含む製品もしくはキットが、提供される。製品は、容器およびこの容器上もしくはこの容器に伴うラベルもしくはパッケージ挿入物を含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、パックなどが挙げられる。容器は、ガラスもしくはプラスチックのような、種々の材料から形成され得る。容器は、状態を処置するために有効な抗体-薬物結合体ADC組成物を維持し、そして、無菌アクセスポートを有し得る例えば、この容器は、静脈内溶液バッグもしくは皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを備えたバイアルであり得る。この組み合わせ中の少なくとも1種の活性成分は、ADCである。ラベルもしくはパッケージ挿入物は、この組成物が、最適な状態例えば癌を処置するために使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製品は、薬学的に受容可能な緩衝液例えば注射のための静菌水BWFI、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む第2もしくは第3の容器をさらに含み得る。これはさらに、商業的視点および使用者の視点から所望される他の物質を含み得、これらとしては、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが挙げられる。実施例1ビオチン化チオFabファージの調製チオFab-ファージ5×1012ファージ粒子を、150倍過剰のビオチン-PEO-マレイミド-ビオチニル-3-マレイミドプロピオンアミジル-3,6-ジオキサオクタインジアミン、Odaら2001NatureBiotechnology19:379-382,PierceBiotechnology,Inc.と、3時間室温で反応させた。過剰なビオチン-PEO-マレイミドを、ビオチン-結合体化ファージから、PEG沈殿の繰り返し3~4回によって除去した。システインチオール基と反応性である求電子性の基を有する他の市販のビオチン化試薬が、使用され得、これらとしては、ビオチン-BMCC、PEO-ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル-LC-ビオチン、およびビオチン-HPDPPierceBiotechnology,Inc.、ならびにNα-3-マレイミジルプロピオニルビオチシンMPB,MolecularProbes,Eugene,ORが挙げられる。ビオチン化二重官能性リンカー試薬およびビオチン化多重官能性リンカー試薬の他の商業的供給源としては、MolecularProbes,Eugene,ORおよびSigma,St.Louis,MOが挙げられる。実施例2PHESELECTORアッセイウシ血清アルブミンBSA、erbB2細胞外ドメインHER2およびストレプトアビジン2μg/mlの100μlを、Maxisorp96ウェルプレート上に別個にコーティングした。0.5Tween-20PBS中によるブロッキング後、ビオチン化hu4D5Fabv8-チオFab-ファージおよび非ビオチン化hu4D5Fabv8-チオFab-ファージ2×1010ファージ粒子を、1時間室温でインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼHRP標識化二次抗体抗M13ファージコートタンパク質、pVIIIタンパク質と共にインキュベートした。図8は、FabもしくはチオFabのHER2に対する結合上およびビオチン化チオFabのストレプトアビジンに対する結合下を示す略図によって、PHESELECTORアッセイを示す。標準的HRP反応を実施し、そして吸光度を450nmで測定した。チオール反応性を、ストレプトアビジンについてのOD450/HER2についてのOD450の間の比を計算することによって、測定した。1のチオール反応性値は、システインチオールの完全なビオチン化を示す。Fabタンパク質結合測定の場合において、hu4D5Fabv82~20ngを使用し、その後、HRP標識化ヤギポリクローナル抗Fab抗体と一緒のインキュベーションを行った。実施例3aチオFabの発現および精製チオFabを、34B8、非サプレッサーnon-suppressorE.coli株Bacaら1997JournalBiologicalChemistry27216:10678-84における誘導において発現させた。回収した細胞ペレットを、PBSリン酸緩衝化生理食塩水中に再浮遊させ、細胞溶解全体を、マイクロフルイタイザーmicrofluidizerを通過させることによって行い、そしてチオFabを、タンパク質GHAROSETMAmershamを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製した。チオFabL-V15C、チオFabL-V110C、チオFabH-A88C、およびチオFabH-A121Cを、発現させ、そしてProtein-GHAROSETMカラムクロマトグラフィーによって精製した。オリゴマー-Fabは、画分26~30に存在し、そしてほとんどのモノマー形態は、画分31~34に存在した。モノマー形態を含む画分を、プールし、そして野生型hu4D5Fabv8と共にSDS-PAGEによって分析し、そして還元条件下DTTもしくはBMEを含むおよび非還元条件下DTTもしくはBMEを含まないでSDS-PAGEゲル上で分析した。A121C-チオFabのゲル濾過画分を、非還元SDS-PAGE上で分析した。チオFabを、上記のようにビオチン-PEO-マレイミドと結合体化させ、そしてこのビオチン化-チオFabを、Superdex-200TMAmershamゲル濾過クロマトグラフィー遊離のビオチン-PEO-マレイミドおよびチオFabのオリゴマー画分を除去するによってさらに精製した。野生型hu4D5Fabv8およびhu4D5Fabv8A121C-チオFab0.5mgの量を、各々そして別個に、100倍モル濃度過剰なビオチン-PEO-マレイミドと共に、室温で3時間インキュベートし、そしてSuperdex-200ゲル濾過カラム上にローディングして、遊離のビオチンおよびオリゴマーFabsを、モノマー形態から分離した。実施例3bチオFabの分析ビオチン化hu4D5Fabv8A121CチオFabおよび野生型hu4D5Fabv8の酵素的フラグメント消化物を、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析LS-ESI-MSによって分析した。ビオチン化hu4D5Fabv8A121Cの第1質量である48294.5と、野生型hu4D5Fabv8の第1質量である47737.0との間は、557.5質量単位であった。このフラグメントは、1つのビオチン-PEO-マレイミド部分C23H36N5O7S2の存在を示す。表4は、配列を確認する、フラグメント化値の割り当てを示す。表4.トリプシン消化後のビオチン化hu4D5Fabv8チオFabA121CのLC-ESI-質量分析Superdex-200ゲル濾過の前後に、ビオチン化ABP-hu4D5Fabv8-A121C、ビオチン化ABP-hu4D5Fabv8-V110C、ビオチン化二重CysABP-hu4D5Fabv8-V110C-A88C、およびビオチン化二重CysABP-hu4D5Fabv8-V110C-A121Cの、還元DTTもしくはBMEによるおよび非還元のSDS-PAGEゲル分析を、行った。hu4D5Fabv8-V110C-BMPEO-DM1の質量分析MS/MSSuperdex-200ゲル濾過精製後:Fab151607.5、Fab50515.5。このデータは、91.2結合体化を示す。hu4D5Fabv8-V110C-BMPEO-DM1還元のMS/MS分析:LC23447.2、LC124537.3、HCFab27072.5。このデータは、全てのDM1結合体は、Fabの軽鎖であることを示す。実施例4ABP-hu4D5Fabv8-V110CとMC-MMAEとの結合体化による、ABP-hu4D5Fabv8-V110C-MC-MMAEの調製DMSO中に溶解した、薬物リンカー試薬であるマレイミドカプロイル-モノメチルアウリスタチンauristatinEすなわち、MC-MMAEを、アセトニトリルおよび水中に公知の濃度で希釈し、そして氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水PBS中のABP-hu4D5Fabv8-V110CチオFabに添加する。約1時間後、過剰なマレイミドを添加して反応を止め、そして全ての未反応抗体チオール基をキャップする。反応混合物を、遠心限界濾過によって濃縮し、そしてABP-hu4D5Fabv8-V110C-MC-MMAEを、PBS中のG25樹脂を通した溶出によって精製しそして脱塩し、無菌条件下で0.2μmフィルターを通して濾過し、そして保存のために凍結する。実施例5ABP-hu4D5Fabv8-V110CとMC-MMAFとの結合体化によるABP-hu4D5Fabv8-V110C-MC-MMAFの調製ABP-hu4D5Fabv8-V110C-MC-MMAFを、ABP-hu4D5Fabv8-V110CチオFabとMC-MMAFとの結合体化により、実施例4の手順に従って調製する。実施例6ABP-A121C-チオFabとMC-val-cit-PAB-MMAEとの結合体化による、ABP-A121C-チオFab-MC-val-cit-PAB-MMAEの調製ABP-hu4D5Fabv8-A121C-MC-val-cit-PAB-MMAEを、ABP-hu4D5Fabv8-A121CとMC-val-cit-PAB-MMAEとの結合体化により、実施例4の手順に従って調製する。実施例7ABP-A121C-チオFabとMC-val-cit-PAB-MMAFとの結合体化による、ABP-A121C-チオFab-MC-val-cit-PAB-MMAFの調製ABP-hu4D5Fabv8-A121C-MC-val-cit-PAB-MMAFは、ABP-hu4D5Fabv8-A121CとMC-val-cit-PAB-MMAFとの結合体化により、実施例4の手順に従って調製する。実施例8hu4D5Fabv8-V110CチオFab-BMPEO-DM1の調製hu4D5Fabv8-V110CチオFab上の遊離のシステインを、ビス-マレイミド試薬BMPEO4PierceChemicalによって改変し、未反応のマレイミド基を抗体の表面上に残した。このことを、BMPEO4を50エタノール/水混合物中に、10mMの濃度まで溶解し、そして10倍モル濃度過剰のBMPEO4を、リン酸緩衝化生理食塩水中約1.6mg/ml10μMの濃度のhu4D5Fabv8-V110CチオFabに添加し、そしてこれを1時間反応させることによって達成した。過剰なBMPEO4を、150mMNaCl緩衝液含有30mMクエン酸pH6中のゲル濾過HiTrapカラム、Pharmaciaによって除去した。ジメチルアセトアミドDMA中に溶解した約10倍モル濃度過剰のDM1を、このhu4D5Fabv8-V110CチオFab-BMPEO中間体に添加した。また、ジメチルホルムアミドDMFを、薬物部分試薬を溶解するために使用し得る。この反応混合物を、一晩反応させ、その後、PBS中でゲル濾過もしくは透析を行って、未反応の薬物を除去した。PBS中、S200カラム上のゲル濾過を、高分子量凝集体を除去するために使用し、精製hu4D5Fabv8-V110CチオFab-BMPEO-DM1を提供した。同じプロトコールにより、hu4D5Fabv8A121CチオFab-BMPEO-DM1を精製した。実施例9インビトロ細胞増殖アッセイADCの効力を、以下のプロトコールCellTiterGlo発光細胞生存度アッセイ,PromegaCorp.TechnicalBulletinTB288;Mendozaら2002CancerRes.62:5485-5488を用いる細胞増殖アッセイによって測定した。1.約104個の細胞SKBR-3、BT474、MCF7もしくはMDA-MB-468を培地中に含む100μlの細胞培養物のアリコートを、96ウェルの不透明ウェルプレートの各ウェルに入れた。2.培地を含みそして細胞を含まないコントロールウェルを、調製した。3.ADCを、実験ウェルに添加し、そして3~5日間インキュベートした。4.プレートを、30分間、室温に対して平衡化した。5.各ウェル中に存在する細胞培養培地の容量と同容量のCellTiter-Glo試薬を、添加した。6.内容物を、オービタルシェーカーorbitalshaker上で2分間混合し、細胞溶解を誘導した。7.このプレートを、室温で10分間インキュベートし、発光シグナルを安定化させた。8.発光を、RLU=相対発光単位のグラフに記録し、そして報告した。特定の細胞を、96ウェルプレート、50μL/ウェル中に、1000~2000/ウェルPC3株もしくは2000~3000/ウェルOVCAR-3で播種する。1日後PC3もしくは2日後OVCAR-3、ADCを、50μLの容量で、9000ng/mL、3000ng/mL、1000ng/mL、333ng/mL、111ng/mL、37ng/mL、12.4ng/mL、4.1ng/mL、もしくは1.4ng/mLの最終濃度まで添加し、ADCなしコントロールウェルには培地のみを添加する。条件を、二連もしくは三連で行う。3日後PC3もしくは4~5日後OVCAR-3、100μL/ウェルのCellTiterGloIIを、添加しルシフェラーゼベースのアッセイ;増殖を、ATPレベルによって測定する、そして細胞数を、ルミノメーターluminometerを用いて決定する。データを、繰り返しの各組についての発光の平均として、標準偏差のエラーバーと共にプロットする。プロトコールは、CellTiterGlo発光細胞生存度アッセイPromegaの変法である:1.プレートは、PC3/Muc16、PC3/neoの1000細胞/ウェル50μL/ウェルの培地中である。Ovcar3細胞を、2000細胞/ウェルその培地の50μL中でプレート培養するべきである処方箋は以下。細胞を、一晩接着させる。2.ADCは、18μg/mlの作用濃度で開始して、培地中で1:3で連続希釈するこれにより、9μg/mlの最終濃度を生じる。50μLの希釈したADCを、既にウェル中に存在する50μLの細胞および培地に添加する。3.72~96時間インキュベートする標準は72時間であるが、0μg/mL濃度を観察し、細胞が85~95コンフルーエントである時にアッセイを停止する。4.100μL/ウェルのPromegaCellTiterGlo試薬を添加し、3分間振とうし、そしてルミノメーター上で読み取る。培地:PC3/neoおよびPC3/MUC16は、50/50/10FBS/グルタミン/250μg/mL中で増殖する。G-418OVCAR-3は、RPMI/20FBS/グルタミン中で増殖する。実施例10腫瘍増殖阻害、高発現HER2トランスジェニック体外移植マウスにおけるインビボ効力トランスジェニック実験に適した動物は、TaconicGermantown,N.Y.のような標準的な商業的供給源から得られ得る。多くの系統が好適であるが、FVB雌性マウスが、腫瘍形成に対するその高い感受性ゆえに、好ましい。FVB雄を、交配のために使用し、そして精管切除したCD.1studsを、偽妊娠を刺激するために使用した。精管切除したマウスは、任意の業者から得られ得る。創始マウスfounderを、FVBマウスのいずれか、もしくは29/BL6×FVBp53異種接合マウスと交配した。p53対立遺伝子において異種接合性を有するマウスを、潜在的な腫瘍形成の増大のために使用した。しかし、これは、不必要であることが証明されている。しかし、いくつかのF1腫瘍は、混合した系統の腫瘍であった。創始腫瘍founder腫瘍は、FVBのみである。いくらかの発達中の腫瘍を有する6匹の創始マウスを、同腹子なしで得た。腫瘍Fo5mmtvトランスジェニックマウスから増殖させた同種移植片を有する動物を、ADCの単回用量もしくは多回用量で、IV注射によって処置した。腫瘍体積を、注射後の種々の時点で評価した。neuHER2のラットホモログの変異的活性化形態を発現するトランスジェニックマウス中で、腫瘍は容易に生じるが、ヒト乳癌において過剰発現されるHER2は変異されていない。そして腫瘍形成は、変異されていないHER2を過剰発現するトランスジェニックマウス中ではずっと弱いWebsterら1994Semin.CancerBiol.5:69-76。変異されないHER2によって腫瘍形成を改善するために、トランスジェニックマウスを、上流ATGが欠失しているこのような上流ATGコドンによる翻訳の開始を防ぐため、さもなければ下流の正しいHER2の開始コドンからの翻訳開始の頻度が低下するHER2cDNAプラスミドを用いて産生した例えば、Childら1999J.Biol.Chem.274:24335-24341を参照。さらに、キメライントロンを、5’末端に付加した。このイントロンもまた、以前に報告されていた発現レベルよりも発現レベルを増強するNeubergerおよびWilliams1988NucleicAcidsRes.16:6713;BuchmanおよびBerg1988Mol.Cell.Biol.8:4395;Brinsterら1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:836。このキメライントロンは、Promegaベクターである、Pci-neo哺乳動物発現ベクターから誘導されたbp890~1022。cDNA3’末端は、ヒト成長ホルモンエキソン4および5ならびにポリアデニル化シグナルに隣接している。さらに、FVBマウスを、使用した。何故なら、この系統は、腫瘍の発達に対してより感受性であるからである。MMTV-LTRからのプロモーターを使用し、乳腺における組織特異的HER2発現を確実にした。動物に、腫瘍形成に対する感受性を上昇させるために、AIN76A食餌を与えたRaoら1997BreastCancerRes.andTreatment45:149-158。実施例11結合体化のためのチオMabの還元/酸化全長の、CHO細胞中で発現されるシステイン操作モノクローナル抗体チオMabsを、約50倍過剰のTCEPトリ2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩;Getzら1999Anal.Biochem.第273巻:73-80;SoltecVentures,Beverly,MAによって、3時間、37°Cで還元した。還元型チオMab図15を、希釈し、そして10mM酢酸ナトリウムpH5中でHiTrapSカラム上にローディングし、そして0.3M塩化ナトリウムを含有するPBSによって溶出した。溶出した還元型チオMabを、200nM硫酸銅CuSO4水溶液で、室温で一晩処理した。周囲の空気の酸化もまた、有効であった。実施例12チオMabの結合体化実施例11からの再酸化型reoxidizedチオMabチオ-トラスツズマブA121C、チオ-2H9A121C、およびチオ-3A5A121Cを含むを、10倍過剰な薬物-リンカー中間体BMPEO4-DM1と合わせ、混合し、そして約1時間室温に静置して結合体化を起こさせ、そしてチオMab抗体-薬物結合体チオ-トラスツズマブA121C-BMPEO-DM1、チオ-2H9A121C-BMPEO-DM1、およびチオ-3A5A121C-BMPEO-DM1を含むを形成した。結合体混合物を、ゲル濾過するか、またはHiTrapSカラム上にローディングしそして溶出して、過剰な薬物-リンカー中間体および他の不純物を除去した。本発明は、本発明のいくつかの局面の例示として意図される実施例に開示された特定の実施形態によって限定されず、そして機能的に均等な任意の実施形態は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に記載の改変に加えて、本発明の種々の改変が、当業者に明らかであり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。"