所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法であって、その発現により該遺伝子エレメントの光学特性が直接または間接的に改変されるものであり、遺伝子エレメントをマイクロカプセル内に区画化するステップマイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ遺伝子エレメントの光学特性の変化により、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ;を含む上記方法。ステップにおいて、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントが修飾され、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項1に記載の方法。マイクロカプセル内の遺伝子エレメントの修飾が該遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する、請求項2に記載の方法。遺伝子エレメントの修飾により、マイクロカプセルの外部で該遺伝子エレメントがさらに修飾され、その光学特性の変化を誘導することが可能となる、請求項2に記載の方法。遺伝子エレメントの一部がリガンドであり、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物が直接または間接的に該リガンドに結合することにより、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項2に記載の方法。リガンドもまた遺伝子エレメントによりコードされる、請求項5に記載の方法。遺伝子エレメントの一部が基質であり、マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により該基質が、遺伝子エレメントの一部として保持されることにより該遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物に、直接または間接的に変換される、請求項2に記載の方法。マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性による生成物が、遺伝子エレメントと複合体を形成することにより遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物の産生を直接または間接的にもたらす、請求項2に記載の方法。マイクロカプセル内の所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に区画内で第2の遺伝子の発現の変化をもたらし、該第2の遺伝子の産物の活性により、遺伝子エレメントの光学特性の変化を用いる遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。ステップが;マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、そのそれぞれの遺伝子産物を産生させ、該遺伝子産物をそれらをコードする遺伝子エレメントに連結させ、その結果形成される複合体を単離することを含む、請求項1に記載の方法。ステップにおいて、前記複合体の変化した光学特性に基づいて該複合体を直接分取し、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離する、請求項10に記載の方法。ステップにおいて、前記複合体がさらに反応して、遺伝子エレメントの光学特性の、複合体中の所望の活性を有する遺伝子産物の存在に依存する条件的変化を誘導する、請求項10に記載の方法。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離するために前記複合体をさらなる区画化ステップに供する、請求項10に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化が特有の光学特性を有する遺伝子産物が遺伝子エレメントに結合することに起因する、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化が特有の光学特性を有するリガンドが遺伝子産物と結合することに起因する、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化がリガンドに結合した際の遺伝子産物の光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化が、遺伝子産物が結合した際のリガンドの光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化が、結合した際のリガンドおよび遺伝子産物の双方の光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの光学特性の変化が、選択された反応の基質および生成物の異なる光学特性に起因する、請求項1に記載の方法。基質および生成物の双方が同様の光学特性を有するが、選択された反応の生成物だけが遺伝子エレメントと結合または反応するが、基質はそれと結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性が変化する、請求項1に記載の方法。さらに別の試薬が、遺伝子エレメントに結合した生成物と特異的に結合または特異的に反応するが、基質とは結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性を変化する、請求項1に記載の方法。遺伝子産物の所望ではない活性により遺伝子エレメントの所望の活性により生じるものとは異なる光学特性の変化が起こる、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。所望ではない活性により起こる光学的変化を、遺伝子エレメントのネガティブな選択に用いる、請求項22に記載の方法。ネガティブな選択をポジティブな選択と組合せて反応特異性を改善する、請求項22に記載の方法。改善される反応特異性が結合特異性の改善である、請求項24に記載の方法。改善される反応特異性が、基質ならびにまたは生成物に対する部位およびもしくは立体選択性の改善である、請求項24に記載の方法。遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーから遺伝子エレメントが単離される、請求項1~26のいずれか1項に記載の方法。各遺伝子エレメントが2以上の遺伝子をコードし、各遺伝子産物が、遺伝子エレメントの光学特性が改変されることにより遺伝子エレメントの分取を可能とするような所望の活性を有している、請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。各遺伝子エレメントが2以上の遺伝子をコードし、該遺伝子産物がマイクロカプセル内で互いに結合し、遺伝子エレメントの光学特性を改変することにより遺伝子エレメントの分取が可能となる、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。付加的ステップステップにおいて単離された遺伝子エレメント中に1つ以上の変異を導入すること、をさらに含む、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。ステップ~の1つ以上を反復することをさらに含む、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。遺伝子エレメントを増幅することをさらに含む、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。油をベースとする媒体中で水性溶液の油中水型エマルジョンを形成することによりマイクロカプセル化が達成される、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントがマイクロビーズに結合する遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。マイクロビーズが非磁性、磁性、または常磁性である、請求項1に記載の方法。遺伝子エレメントの蛍光の変化を検出することにより遺伝子エレメントを分取する、請求項1に記載の方法。蛍光活性化セルソーター、またはこれに類似した装置を用いて、遺伝子エレメントを分取する、請求項36に記載の方法。基質および生成物の異なる蛍光特性が、蛍光共鳴エネルギー移動によるものである、請求項36に記載の方法。1種以上の試薬を油相に添加することによりマイクロカプセル内の環境を調整する、請求項1~38のいずれか1項に記載の方法。所望の遺伝子産物の活性により直接または間接的に修飾された遺伝子エレメントを、チラミドシグナル増幅;NENによりさらに修飾して該遺伝子エレメントの光学特性を直接または間接的に変化させることにより、遺伝子エレメントの分離が可能となる、請求項1~39のいずれか1項に記載の方法。請求項1~40のいずれか1項に記載の方法により単離される産物。遺伝子産物を調製する方法であって、遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップ遺伝子エレメントをマイクロカプセル中へ区画化するステップマイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ;光学特性の変化を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップおよび該所望の活性を有する遺伝子産物を発現させるステップ;を含む、上記方法。遺伝子産物の活性を調節することができる1つ以上の化合物をスクリーニングする方法であって、遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製するステップ該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中へ区画化するステップマイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ;光学特性の変化を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップおよび所望の活性を有する遺伝子産物を化合物と接触させ、化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップ;を含む、上記方法。化合物を調製する方法であって、少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成方法を提供するステップ;該ステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製するステップ;マイクロカプセル内に該遺伝子エレメントを区画化するステップ;マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させ、それぞれの遺伝子産物を産生させるステップ;光学特性の変化を用いて、所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ;およびステップで関連する合成ステップを促進すると同定されたポリペプチド遺伝子産物を用いて化合物を調製するステップ;を含む、上記方法。上記の方法のうち突然変異および選択の反復工程を可能とするものは、通常、進化の過程に基づく機序、すなわち変異の繰り返し、所望の活性についての累積的な選択、および複製を、invitroで模倣するものである。しかし、これまでに開発された方法には、天然に見られるものに匹敵する多様性および機能的効能を有する分子を提供するものはない。さらに、生化学的および生物学的活性の全ての範囲に作用するために核酸およびタンパク質の両方を進化させることができ、所望の産物または活性を導く複数のプロセスを組み合わせることができる人工の進化システムはない。従って、上記の制限を克服するinvitroの系に対する大きな需要がある。TawfikおよびGriffiths、および国際特許出願PCTGB9801889において、我々は、遺伝子型と表現型を分子レベルで連結するためのマイクロカプセル中の区画化を用いて上記の制限の多くを克服するinvitroの進化のためのシステムを記載する。TawfikおよびGriffiths、および国際特許出願PCTGB9801889のいくつかの実施形態においては、遺伝子産物の所望の活性によりそれをコードする遺伝子エレメントを修飾する。その後、修飾された遺伝子エレメントを以後のステップで選択できる。本明細書においては、遺伝子エレメントの修飾がエレメントそれ自体の光学特性の変化を引き起こし、これまでに記載された方法に対して多くの利点を有する別の発明を記載する。本発明の第1の態様によれば、その発現により直接または間接的に前記遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの光学特性の修飾を生じる所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法であって、遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化しマイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれらのそれぞれの遺伝子産物を産生させ遺伝子エレメントの変化した光学特性に従って所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取する;ステップを含む前記方法を提供する。本発明のマイクロカプセルは、遺伝子エレメントおよび遺伝子産物を、それらが物理的に連結したまま保持されるように区画化する。本明細書にいう遺伝子エレメントとは、核酸を含む分子または分子構築物である。本発明の遺伝子エレメントは任意の核酸を含み得る。遺伝子エレメントの核酸成分はさらに、タンパク質、化学物質および化学基を含む1個以上の分子もしくは構造物、ビーズなどの固相支持体などに、共有結合または非共有結合により結合されていてもよい。本発明の方法においては、これらの構造物もしくは分子は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの分取および/または単離に役立つように設計することができる。本明細書にいう発現とは、最も広義の意味において使用され、遺伝子エレメントに含まる核酸がその遺伝子産物に変換されることを示す。従って、核酸がDNAである場合、発現とはDNAのRNAへの転写をいい、このRNAがタンパク質をコードする場合、発現はRNAのタンパク質への翻訳も意味し得る。核酸がRNAである場合、発現とは、このRNAのさらに別のRNAコピーへの複製、RNAのDNAへの逆転写、そして場合によってはこのDNAのさらに別のRNA分子への転写、並びに場合によってはこれらの生成したRNA種のいずれかのタンパク質への翻訳を意味し得る。従って、好ましくは、発現は、転写、逆転写、複製および翻訳からなる群から選択される1つ以上の工程によって行われる。遺伝子エレメントの発現は、本発明のマイクロカプセル内で、DNA、RNAもしくはタンパク質、非天然の塩基もしくはアミノ酸を含む核酸またはタンパク質について行われ、その結果遺伝子産物は遺伝子エレメントと同一のマイクロカプセル内に閉じ込められる。遺伝子エレメントとそれによりコードされる遺伝子産物は、それぞれの遺伝子エレメント、および遺伝子エレメントによってコードされる各遺伝子産物が同一のマイクロカプセル内に閉じ込められることにより連結する。従って、1つのマイクロカプセル内の遺伝子産物は、他のいずれのマイクロカプセル内においても変化しえない。さらに、以下に記載するように、さらに別の連結手段を利用して遺伝子産物を、それらをコードする遺伝子エレメントに連結してもよい。用語マイクロカプセルは、当技術分野において通常それが有する意味に従って本明細書において使用されるものであり、さらなる説明は後述する。しかし本質的には、マイクロカプセルは、その境界が本明細書に記載する分子的機構を有する成分の交換を制限し、それにより、遺伝子エレメントをそれらがコードする遺伝子産物の機能に従って分取することを可能にする人工的な区画である。好ましくは、本発明の方法において使用されるマイクロカプセルは、非常に多数産生することができ、それにより遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーを区画化することができるものである。本明細書にいう遺伝子エレメントの光学特性の変化とは、吸収、発光、燐光もしくは蛍光の変化を含む電磁放射の吸収または放出のあらゆる変化をいう。そのような特性はいずれも光学の用語に含まれる。遺伝子エレメントは、例えば発光、蛍光または燐光活性化ソーティングにより分取することができる。好ましい実施形態においては、遺伝子エレメントを分取するためにフローサイトメトリーが使用され、例えば光散乱および蛍光分極を使用してフローソーティングを実施することができる。非常に好ましい実施形態においては、遺伝子エレメントを、蛍光活性化セルソーターを使用して分取する。光学特性の変化は直接的または間接的であってよい。従って、かかる変化は、遺伝子エレメントそれ自体の光学特性の変化をもたらすこともあり、または間接的にそのような変化をもたらすこともある。例えば、遺伝子エレメントの修飾により、遺伝子エレメントの光学活性のあるリガンドに結合する能力を変化させることができ、これにより間接的にその光学特性が変化する。または、イメージング技術を使用して遺伝子エレメントの薄片をスクリーニングし、例えば、所望の特性を有する遺伝子エレメントが位置する領域を物理的に単離し、または所望ではない遺伝子エレメントの削除により所望の特性を有する遺伝子エレメントを濃縮することができる。遺伝子エレメントは発光、燐光または蛍光により検出することができる。本発明の第1の態様の好ましい実施形態によれば、遺伝子エレメントの分取は本質的に2つの技術のうちの1つにより行うことができる。最初の実施形態においては、遺伝子エレメントは、1つ以上の共通の区画へマイクロカプセルをプールした後に分取される。この実施形態においては、所望の活性を有する遺伝子産物がそれをコードする遺伝子エレメントを修飾し、その修飾された光学特性により後のステップにおける該遺伝子エレメントの選択を可能とする。反応を停止し、その後マイクロカプセルを破壊して個々のマイクロカプセルの内容物をすべてプールする。マイクロカプセル内の遺伝子エレメントの修飾は、遺伝子エレメントの光学特性の改変を直接的にもたらし得る。または、この修飾により、遺伝子エレメントがマイクロカプセルの外部でさらに修飾されてその光学特性の変化をもたらすことができる。改変された光学特性を有する遺伝子エレメントの選択により、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを濃縮することができる。従って、本発明は、ステップで、所望の活性を有する遺伝子産物がそれをコードする遺伝子エレメントを修飾し、該遺伝子エレメントの光学特性の変化の結果として遺伝子エレメントの単離を可能とする、本発明の第1の態様による方法を提供する。いうまでもなく修飾は直接的なものでもよく、その場合、それは遺伝子産物の遺伝子エレメントに対する直接の作用によって生起され、また一連の反応による間接的なものでもよく、その場合は、一連の反応の中の所望の活性を有する遺伝子産物が関与する1つ以上の反応により、遺伝子エレメントが修飾されるものと理解される。第2の実施形態においては、遺伝子エレメントを多段階的工程により分取でき、その操作は、少なくとも2つのステップを含み、例えば、遺伝子エレメントを少なくとも2つの別々の反応が起こりうるような条件に暴露することを可能とする。当業者には明らかなように、本発明の第1のマイクロカプセル化ステップは、遺伝子エレメントの発現、すなわち転写、転写および/または翻訳、複製等を可能とする条件にすることが有利である。これらの条件下では、例えば遺伝子産物がこれらの条件の下では活性を示さないかもしれないこと、または発現システムが妨害活性を含んでいることにより、特定の遺伝子産物活性について選択できないことがあり得る。従って本発明は、ステップが、マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現してそれらのそれぞれの遺伝子産物を生成し、各遺伝子産物をそれらをコードする遺伝子エレメントに連結させ、それにより形成された複合体を単離することを含む、本発明の第1の態様による方法を提供する。これにより、遺伝子産物活性によって分取する前に、遺伝子エレメントおよびそれらに結合した遺伝子産物をカプセルから単離することが可能となる。好ましい実施形態においては、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離する前に、複合体を別の区画化ステップに供する。このさらなる別の区画化ステップは、マイクロカプセル内で行うことが有利であり、遺伝子エレメントおよびそれらのそれぞれの遺伝子産物が物理的に連結している環境内で、異なる条件の下で、さらなる反応を起こすことができる。遺伝子エレメントの最終的な分取は上記の実施形態に従って行うことができる。第2のカプセル化は、ファージ展示法、ポリソーム展示法、RNAペプチド融合法またはlacリプレッサーペプチド融合法などのその他の手段により遺伝子産物と連結された遺伝子エレメントを用いて行うこともできる。選択された遺伝子エレメントを、場合によっては、その後反復するステップにおいてより厳密な分取工程に供してもよく、本発明の方法を全体として再適用するか、または選択したステップのみを再適用してもよい。条件を適当に調整することにより、より最適化された活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを各選択工程後に単離できる。さらに、分取の最初の工程の後に単離された遺伝子エレメントを、上記の本発明の方法のステップを反復して分取を繰り返す前に突然変異誘発に供してもよい。各突然変異誘発後、いくつかの遺伝子エレメントは、遺伝子産物の活性が増強されるように改変される。さらに、選択された遺伝子エレメントを発現ベクターにクローン化し、遺伝子エレメントおよびそれらの産物のさらなる特性解析をすることができる。第2の態様においては、本発明の第1の態様によって選択された産物を提供する。この文意において使用する産物とは、本発明による選択が可能な遺伝子産物または遺伝子エレメントを示し得るものをいう。第3の態様においては、本発明は遺伝子産物の調製方法を提供し、該遺伝子産物の発現は直接または間接的にそれをコードする遺伝子エレメントの光学特性の変化をもたらすものであり、前記方法は、遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製し遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化しマイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれらのそれぞれの遺伝子産物を産生させ、遺伝子エレメントの変化した光学特性を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取し所望の活性を有する遺伝子産物を発現させる;ステップを含む。第3の態様によれば、ステップは、好ましくは、遺伝子エレメントのレパートリーを調製することを含み、各遺伝子エレメントが潜在的に異なる遺伝子産物をコードするものとする。レパートリーは、ファージ展示法などの方法による選択を意図するライブラリーの生成に使用されるものなどの、従来の技術によって生成することができる。所望の活性を有する遺伝子産物を、他の遺伝子産物とは異なる方法で遺伝子エレメントの光学特性を修飾する能力により、本発明に従い、レパートリーから選択できる。例えば、所望の遺伝子産物は、他の遺伝子産物より高度に、または全く修飾しないことを含めてより低い程度で光学特性を修飾できる。第4の態様においては、本発明は、遺伝子産物の活性を調節することができる化合物をスクリーニングする方法を提供し、該遺伝子産物の発現が直接または間接的にそれをコードする遺伝子エレメントの光学特性の修飾をもたらすものであって、該方法は、遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製し遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化しマイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれぞれの遺伝子産物を産生させ、遺伝子エレメントの変化した光学特性を使用して、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取しそして、所望の活性を有する遺伝子産物を化合物と接触させ、化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターする;ステップを含む。上記方法は、さらに遺伝子産物の活性を調節することができる化合物を同定し、その化合物を合成する;ステップを含むことが有利である。この選択システムは、触媒、調節もしくは結合活性を有するRNA、DNAまたはタンパク質分子を選択するために構成することができる。一般的説明本発明のマイクロカプセルは、本発明の実施を可能とするのに適切な物理的性質を必要とする。第1に、遺伝子エレメントと遺伝子産物がマイクロカプセルの間で拡散しないことを確実にするために、各マイクロカプセルの内容物は好ましくは周囲のマイクロカプセルの内容物から隔離されており、実験期間中マイクロカプセルの間での遺伝子エレメントおよび遺伝子産物の交換が全くまたはほとんどないようにする。第2に、本発明の方法は、マイクロカプセル1個当たり限定された数のみの遺伝子エレメントが存在することを必要とする。これにより、個々の遺伝子エレメントの遺伝子産物が他の遺伝子エレメントから隔離される。従って、遺伝子エレメントおよび遺伝子産物の間の結合は高度に特異的なものとなる。濃縮倍率は、平均で1のマイクロカプセル当たり1個またはそれより少数の遺伝子エレメントで最大となり、個々の遺伝子エレメントの遺伝子産物はその他のすべての遺伝子エレメントの生成物から単離されるので、核酸とコードする遺伝子産物の活性との間の連結は可能な限り強固なものとなる。しかし、平均で、1個のマイクロカプセル当たりに1個の遺伝子エレメントまたはそれより少ない遺伝子エレメントという理論的に最適な状況を使用しなくても、1のマイクロカプセル当たり5、10、50、100のもしくは1000個、またはそれ以上の遺伝子エレメントの比率も、大きなライブラリーの分取において有益である。後に、異なる遺伝子エレメント分布により新たなカプセル化を含む分取を反復することにより遺伝子エレメントのより厳密な分取が可能となる。1個のマイクロカプセル当たり、単一またはより少数の遺伝子エレメントであることが好ましい。第3に、マイクロカプセルの形成および組成は、遺伝子エレメントの発現機構および遺伝子産物の活性の機能を破壊しないことが有利である。当業者には明らかなように、適切なシステムは本発明の各用途における必要条件の詳細な性質に依存する。広範な種類のマイクロカプセル化法が利用可能であり、本発明により使用されるマイクロカプセルを作成するために使用することができる。実際に、200を越えるマイクロカプセル化方法が文献に見られる。そのようなものとしては膜に封入された水性小胞、例えば脂質小胞および非イオン性界面活性剤小胞が挙げられる。これらは非共有結合により構築された分子の単一または複数の二重層の閉鎖膜カプセルであり、各二重層は水性区画により隣接するものから分離されている。リポソームの場合、膜は脂質分子で構成され、該分子は通常リン脂質からなるが、コレステロール等のステロールも膜に組込まれている。RNAおよびDNAの重合を含む様々な酵素触媒性生化学反応をリポソーム中で行うことができる。膜に封入された小胞系においては、殆どの水相は小胞の外部にあり、従って区画化されていない。この間を埋めている水相を除去するか、あるいはその中の生物学的な系が阻害または破壊し、反応がマイクロカプセルに限定されるようにする。その他の種々の方法により生成されたマイクロカプセル中での酵素により触媒される生化学的反応も示されている。多くの酵素は逆性ミセル溶液中で活性があり、例えばAOTイソオクタン水系において活性がある。マイクロカプセルは界面重合および界面複合化によっても生成することができる。この種のマイクロカプセルは強固な非浸透性の膜または半透膜を有してよい。硝酸セルロース膜、ポリアミド膜および脂質ポリアミド膜で仕切られた半透性のマイクロカプセルは、いずれも複数の酵素系を含む生化学的反応を支持できる。アルギネートポリリシンマイクロカプセルは、非常に穏やかな条件下で形成することができ、非常に生物学的適合性が高く、例えば生細胞または生組織をカプセル化するのに有効な方法を提供することが判明している。例えばエマルジョンのようなコロイド系内の水性環境の相分離に基づく、膜質ではないマイクロカプセル化システムも使用することができる。好ましくは、本発明のマイクロカプセルはエマルジョンから形成され、これは2種の非混和性液相の不均質系であり、1つの相が他方に顕微鏡サイズまたはコロイドサイズの小滴として分散しているものである。エマルジョンは非混和性液体の任意の適当な組合せから調製できる。好ましくは、本発明のエマルジョンは、微細に分割された小滴の形で存在する相として水を含み、該小滴が懸濁されるマトリックスとして疎水性の非混和性液体を含む。このようなエマルジョンは油中水型と称される。これは別々の小滴中に生化学的成分を含む水相全体が区画されているという利点を有する。疎水性油である外部相は、一般には生化学的成分を全く含んでおらず、従って不活性である。エマルジョンは1つ以上の界面活性剤を添加することによって安定化することができる。そのような界面活性剤は乳化剤と呼ばれ、水油界面で相の分離を防止するように作用する。多数の油および多数の乳化剤を油中水型エマルジョンの生成のために使用することができ、最近の文献においては16000の界面活性剤が挙げられており、それらの多くを乳化剤として使用することができる。適当な油としては、軽質流動パラフィン、およびソルビタンモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。アニオン性界面活性剤を使用することも有益である。適当な界面活性剤としては、コール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムが挙げられる。特に好ましいのはデオキシコール酸ナトリウムであり、好ましくは05wv以下の濃度で使用する。そのような界面活性剤を含有させると、遺伝子エレメントの発現および/または遺伝子産物の活性を増加させることができる場合がある。ある種のアニオン性界面活性剤を非エマルジョン化反応混合物に添加すると翻訳が完全に阻害されてしまう。しかし、エマルジョン化の際に界面活性剤は水相から界面に移動し、活性が復活する。エマルジョン化する混合物にアニオン性界面活性剤を添加することにより、区画化された後にのみ反応が進行するようにすることができる。エマルジョンの生成には、相を強制的に混合するために一般に機械力を加えることが必要である。これを行うためには、種々の機械装置を使用する種々の方法があり、そのような装置としては、攪拌機、ホモジナイザー、コロイドミル、超音波および膜乳化装置等が挙げられる。油中水型エマルジョン中に形成された水性マイクロカプセルは一般に安定であり、マイクロカプセル間での遺伝子エレメントまたは遺伝子産物の交換はあるとしてもわずかである。さらに本発明者は、いくつかの生化学的反応がエマルジョンマイクロカプセル内で進行することを示した。さらに、複雑な生化学的プロセス、特に遺伝子転写および翻訳もエマルジョンマイクロカプセル内で活性を有する。何千リットルという工業的規模までの容量でエマルジョンを作成する技術がある。好ましいマイクロカプセルのサイズは、本発明により行われる任意の個々の選択的プロセスの詳細な必要条件により変化する。すべての場合において、遺伝子産物の効率的な発現および遺伝子産物の反応性を達成するための、遺伝子ライブラリーサイズ、要求される濃縮および個々のマイクロカプセル中の成分の必要な濃度の間の最適なバランスが存在する。発現の過程は本発明により提供される個々のマイクロカプセル内で起こる。invitroでの転写および転写翻訳の組み合わせは、いずれもナノモル濃度未満のDNA濃度では効率が低下する。各マイクロカプセル中に存在するDNA分子が限定された数だけが必要であるため、これにより可能なマイクロカプセルのサイズの実際的な上限が設定される。好ましくは、マイクロカプセルの平均容量は52x1016m3未満、より好ましくは65x1017m3未満、より好ましくは約42x1018m3、理想的には約9x1018m3である。マイクロカプセル中の有効なDNAまたはRNA濃度は、当技術分野で周知の種々の方法により人為的に増加させることができる。このような方法としては、例えば、ポリエチレングリコールの容量排除化学物質volumeexcludingchemicalsの添加、および種々の遺伝子増幅法、例えば、大腸菌、真核生物、およびT7、T7、およびSP6のようなバクテリオファージからのRNAポリメラーゼを使用した転写、ポリメラーゼ連鎖反応、Qbレプリカーゼ増幅、リガーゼ連鎖反応、および自己維持配列複製系および鎖置換増幅等が挙げられる。PCRおよびLCRのような熱サイクルを必要とする遺伝子増幅技術は、エマルジョンおよびinvitro転写または転写翻訳を組み合わせた系は熱に対して安定である場合に使用できる。局所的有効核酸濃度を増加させることによって、より大きなマイクロカプセルを有効に使用することができる。これによりマイクロカプセル容量が約52x1016m3に好ましい実際的な上限が与えられる。マイクロカプセルのサイズは、マイクロカプセル内で起こることが必要な生化学的反応の必要な成分をすべて収容することができるように十分に大きいことが好ましい。例えば、invitroでは、転写反応および組み合わせた転写翻訳反応のいずれも約2mMの全ヌクレオチド三リン酸濃度を必要とする。例えば、単一の500塩基の短いRNA分子に遺伝子を転写するためには、1個のマイクロカプセルあたり最低500分子のヌクレオチド三リン酸を必要とする。2mM溶液を構成するためには、この数の分子が容量417x1019リットルのマイクロカプセルに含まれることになる。さらに、特に翻訳を含む反応の場合には、翻訳が生じるのに必要なリボソームは、それ自体約20nmの直径を有することに留意しなければならない。従って、マイクロカプセルの直径の好ましい下限は、約01μmである。従って、マイクロカプセル容量は好ましく52x1022m3~52x1016m3の間にあり、これは直径01μm~10μmの球体に相当し、より好ましくは、約52x1019m3~65x1017m3の間である。直径26μmの球状物が最も有利である。区画の好ましい大きさが、細菌の大きさ例えばエスケリッチアEscherichia菌は11~15x20~60μmの桿菌であり、アゾトバクターAzotobacter菌は直径15~20μmの卵形の細胞であるに非常に近いものであることは偶然のことではない。その最も単純な形では、ダーウィン学派による進化論は1遺伝子型1表現型機構に基づくものである。単一の区画化された遺伝子またはゲノムの濃度については、直径2μmの区画中では04nMであるが、5μmの直径の区画中では25pMに低下する。原核生物の転写翻訳機構は直径約1~2μmの区画の中で機能的に進化し、この場合単一遺伝子はおよそナノモル濃度である。直径26μmの区画中の単一の遺伝子は02nMの濃度にある。この遺伝子濃度は、効率的な翻訳には十分に高い。そのような容量に区画化することにより、遺伝子産物の単一の分子だけが形成された場合でも、該分子が約02nMで確実に存在することが可能であり、これは遺伝子産物が遺伝子エレメントそれ自体の修飾活性を有することが必要である場合に重要である。従ってマイクロカプセルの容量は、遺伝子エレメントの転写および翻訳のための必要条件のみならず、本発明の方法における遺伝子産物に必要とされる修飾活性をも考慮して選択される。エマルジョンマイクロカプセルのサイズは、単に、選択系の必要条件によりエマルジョンを形成するために使用するエマルジョン化の条件を調整することにより変更できる。マイクロカプセルサイズがより大きくなると、所定の遺伝子エレメントライブラリーをカプセル化するために必要とされる容量が大きくなるので、最終的な制限要因がマイクロカプセルのサイズであり、すなわち単位容量あたりに存在し得るマイクロカプセルの数であることによる。マイクロカプセルのサイズを、転写翻訳系の必要条件に注意を払うだけでなく、遺伝子エレメントのために使用する選択系の必要条件も考慮して選択する。すなわち、化学修飾系のような選択系の成分は、転写翻訳には最適でない反応容量および/または試薬濃度を必要とし得る。本明細書に記載するように、そのような必要条件は第2の再カプセル化ステップによって適用させることができ、さらにそれらは全体として転写翻訳および選択を最大化するためにマイクロカプセルのサイズを選択することにより適用させることができる。例えば本明細書に記載するように、最適のマイクロカプセル容量および試薬濃度は経験的に決定することが好ましい。本発明の遺伝子エレメントは上記した通りである。好ましくは、遺伝子エレメントは、DNA分子、RNA分子、合成塩基のみからなる、または天然および合成の塩基の混合物からなる部分的にまたは完全に人工的な核酸分子からなる群から選択される分子または構築物であり、これらはポリペプチドに結合していてもよく、またはその他の分子基または構築物に結合していてもよい。有利には、他の分子基または構築物は、核酸、ポリマー物質、特にビーズ例えばポリスチレンビーズ、および磁性または常磁性のビーズのような磁性または常磁性の物質からなる群から選択することができる。遺伝子エレメントの核酸部分は、遺伝子産物の効率的な発現に必要とされる適切な調節配列例えばプロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライシング部位等を含んでよい。以下の記載から明らかなように、多くの場合、ポリペプチドもしくその他の分子基または構築物は、遺伝子エレメントの光学特性を変化させるために直接もしくは間接的に遺伝子産物に結合するか、またはそれと反応するリガンドもしくは基質である。これにより、遺伝子産物の活性に基づいて遺伝子エレメントの分取が可能となる。リガンドまたは基質は、当業者には明らかな種々の手段により、核酸に結合させることができる。核酸分子をリガンドまたは基質に結合し得る1つの方法は、ビオチン化によるものである。これは、5’ビオチン化プライマーを使用するPCR増幅を行い、ビオチンと核酸を共有結合により結合させて行うことができる。リガンドまたは基質は当業者には明らかな種々の手段により修飾された核酸に結合することができる。ビオチン化された核酸を、アビジンまたはストレプトアビジンでコートされているために非常に高いアフィニティで該核酸に結合するポリスチレンまたは常磁性のマイクロビーズに結合させることができる。このビーズは、任意の適切な方法、例えばビオチン化基質の添加または共有結合させることにより、基質またはリガンドで誘導化できる。または、ビオチン化核酸は、チログロブリンまたはフェリチンのような大きなタンパク質分子と複合体化したアビジンまたはストレプトアビジンに結合できる。この複合体は、例えばリシンのεアミノ基に共有結合することにより、または、ビオチンアビジンのような共有結合ではない相互作用により、基質もしくリガンドで誘導化できる。基質は、遺伝子エレメントには結合していないが、光活性化などのそれを活性化する別のステップを必要とする不活性なタグを含む形態で存在してもよい。選択される触媒はその後基質を産物に変換する。その後タグは活性化され、タグ結合分子が結合したタグを付された基質および/または産物は核酸と複合体を形成する。従ってタグを介して核酸に結合した産物に対する基質の比率は、溶液中の基質および産物の比率を反映する。これに替わる方法としては、核酸を産物特異的抗体に結合させることである。この方法では、基質が、遺伝子エレメントに連結していない各マイクロカプセル中に存在するが、分子タグを有する。選択される触媒が基質を産物に変換されるとき、産物はタグを保持しており、その後産物に特異的な抗体によってマイクロカプセル中で捕獲される。この方法では、基質を産物に変換することができる酵素をコードするか産生する場合にのみ、遺伝子エレメントがタグに結合することになる。用語単離する、分取するおよび選択する並びにそれらの変化形を本明細書で使用する。単離とは、本発明においては、ある物質を不均質な集団、例えば混合物から分離し、単離工程の前に共に存在した少なくとも1の物質を含まなくなるようにする工程をいう。好ましい実施形態においては、単離は、実質的に均質になるまで物質を精製することをいう。物質を分取するとは、所望の物質を所望ではない物質に対して優先的に単離する工程をいう。これが所望の物質の単離に関する限り、用語分離するおよび分取するは同義である。本発明の方法によれば、所望の遺伝子エレメントを含む遺伝子エレメントのプールからの所望の遺伝子エレメントを分取することが可能となる。選択とは、物質の特定の特性によりその物質を単離する工程を示すために使用する。非常に好ましい用途においては、本発明の方法は、遺伝子エレメントのライブラリーを分取するのに有用である。従って本発明は、前記の本発明の態様による方法を提供し、該方法においては、遺伝子エレメントは、遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーから分離される。ここで用語ライブラリー、レパートリーおよびプールは当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用するものである。例えば、遺伝子エレメントのライブラリーは、遺伝子産物のレパートリーをコードする。一般に、ライブラリーは遺伝子エレメントのプールから構築され、分取を促進する特性を有する。本発明を使用する遺伝子エレメントライブラリーからの遺伝子エレメントの最初の選択は、多くの場合、多数の変異体遺伝子エレメントのスクリーニングを必要とする。遺伝子エレメントのライブラリーは種々の方法により製造することができ、以下のものが含まれる。天然の遺伝子エレメントのプールは、ゲノムDNAまたはcDNAからクローン化することができ、例えば、ファージ抗体ライブラリーは、免疫化されたまたは免疫化されていない供与体から得た抗体遺伝子のPCR増幅したレパートリーによって作製され、機能的な抗体断片の非常に有効な供給源であることが判っている。遺伝子のライブラリーは、コード遺伝子の全体もしくは一部からなるものとしてもよく、またはランダム化もしくはドープ化doped合成オリゴヌクレオチドからなる遺伝子のプールからなるものとしてもよい。ライブラリーはまた、invivoにおける種々の技法により遺伝子エレメントまたは遺伝子エレメントのプールに、変異をランダムに導入することによっても作製することができ、そのような方法としては、大腸菌mutD5のような細菌のミューテーター株を使用する技法、Bリンパ細胞の抗体超突然変異系を使用する方法などがある。ランダム変異は、化学的突然変異原、およびイオン化またはUV照射、または突然変異原塩基類似体の導入によりinvivoおよびinvitroのいずれにおいても導入することもできる。ランダムな突然変異はまた、例えば誤読の多いポリメラーゼを使用することによりポリマー化の間にinvitroで導入することもできる。多様性はさらに、invivoまたはinvitroでの相同組換えを使用して導入することができる。従って、本発明の別の態様によれば、本発明の遺伝子エレメントライブラリーから遺伝子の1つ以上のエレメントを選択し、遺伝子産物へのレパートリーをコードする遺伝子エレメントの別のライブラリーを生成するために選択された遺伝子エレメントに変異を起こさせ、増強された活性を有する遺伝子産物を得るためにステップおよびを繰り返す、ステップを含む、invitroでの進化の方法が提供される。変異は、上記のような遺伝子エレメントに導入することができる。本発明の遺伝子エレメントは、酵素、好ましくは薬学的または工業的利益を有するもの、活性化剤または阻害剤、特には、細胞シグナル伝達機構、抗体およびその断片、ならびに診断および治療への適用に適したその他の結合物等の生物学的系のものであることが有利である。従って、好ましい形態においては、本発明は、臨床的にまたは産業上において有用な産物の同定および単離を可能とする。本発明の別の態様では、本発明の方法によって単離された産物が提供される。適切なカプセル化条件を選択することが望ましい。スクリーニングするライブラリーの複雑さおよびサイズによって、カプセル化方法を設定し、マイクロカプセル当たり1または1未満の遺伝子エレメントがカプセル化されるようにすることが有利であり得る。これにより最大の解析能が得られる。しかし、ライブラリーがより大きくおよび/またはより複雑な場合、これは実行不可能である場合があり、複数の遺伝子エレメントを一緒にカプセル化し、本発明の方法を繰り返して適用することにより所望の活性の分取を達成することが好ましい場合がある。カプセル化方法を組合せて使用すると所望の濃縮が得られる場合がある。理論的な研究により、より多数の遺伝子エレメント変異体を調製することにより、所望の特性を有する分子が作製される可能性がより高くなることが示されている。近年、より大きなファージ抗体レパートリーがより小さいレパートリーより優れた結合アフィニティを有するより多くの抗体を与えることも実際に確認されている。頻度の低い変異体が生成され、それを選択されることが可能であるようにするため、大きなライブラリーサイズが望ましい。従って、最適な小さいマイクロカプセルを使用することが有益である。invivoでのステップを必要とする方法を使用して現在までに作成された最大のレパートリーは、16x1011個のクローンのファージペプチドライブラリーであり、これは15リットルの細菌培養を必要とした。SELEX実験は、非常に多数の変異体について行われることが多い。本発明を使用する場合、直径26μmの好ましいマイクロカプセルにおいて、20mlのエマルジョン中で1mlの水相を使用して少なくとも1011個のレパートリーサイズの選択が可能である。上記の遺伝子エレメントに加えて、本発明のマイクロカプセルは、実施する分取プロセスに必要な別の成分を含む。該系のその他の成分は、例えば、遺伝子エレメントの転写および/または翻訳に必要なものを含む。これらは、特定の系の必要条件について、修飾された遺伝子産物の選択を可能とするために、適切なバッファー、invitro転写複製系、および/または必要な成分を全て含むinvitro翻訳系、酵素、補因子、RNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、核酸、トランスファーRNA、リボソームおよびアミノ酸、および対象となる反応の基質から選択される。適切なバッファーは、その中では生物学的系の所望の成分がすべて活性であるものであり、従ってそれぞれの特定の反応系の必要条件に依存するものである。生物学的および/または化学反応に適するバッファーは当技術分野で公知であり、その内容は種々の実験書、例えばSambrookら、1989に記載されている。invitroでの翻訳系は通常細胞抽出物を含むものであり、細菌、ウサギ網状赤血球、または小麦麦芽からのものが典型的なものである。多くの適切な系が市販品として利用可能であり、転写翻訳の組み合わせを可能とするものが含まれる。使用されるアミノ酸の混合物は、所望ならば、合成アミノ酸を含んでよく、そのことにより、ライブラリー内で生成可能なタンパク質の数または種類を増加させることができる。これは人工アミノ酸にtRNAを割り当てて、選択されるタンパク質のinvitro翻訳にこれらのtRNAを使用することにより行うことができる。各選択の実施後に、対象の分子をコードするものについての遺伝子エレメントのプールの濃縮度を、区画化されていないinvitro転写複製または転写翻訳を組み合わせた反応によって分析することができる。選択されたプールは、適切なプラスミドベクターにクローン化され、RNAまたは組換え体タンパク質を個々のクローンから製造しさらに精製して分析する。好ましい形態では、マイクロカプセルの内部環境は、エマルジョンの油相に試薬を添加することによって変化させることができる。かかる試薬は、油相を通ってマイクロカプセルの水性環境に拡散する。好ましくは、該試薬は少なくとも部分的には水溶性であり、その一部が油相からマイクロカプセルの水性環境に供給されるものである。試薬は油相に実質的に不溶性であることが有利である。該試薬は、好ましくは機械的混合、例えば攪拌によって油相に混合される。油相を介して添加することができる試薬としては、基質、バッファー成分、因子等がある。特に、マイクロカプセル内部のpHは、油相に酸性または塩基性成分を添加することによりinsituで変化させることができる。さらに本発明は遺伝子産物を製造する方法に関し、ここで該遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは本発明の方法によってすでに分取されたものである。明らかに、遺伝子エレメントはそれ自体、慣用の手段によって直接発現させて遺伝子産物を製造することができる。しかし、当業者には明らかなように、別の方法も採用することができる。例えば、遺伝子産物に導入された遺伝子情報は、適切な発現ベクターに導入し、そこから発現させることができる。本発明はさらに、慣用のスクリーニング法を使用して、本発明の第1の態様によって同定された遺伝子産物と相互作用することができる化合物を同定することについて記載する。好ましい実施形態においては、遺伝子産物をコードする核酸をベクターに導入し、適切な宿主細胞に導入して該遺伝子産物を発現する形質転換細胞系を製造する。その後、得られた細胞系を、遺伝子産物の機能に影響を及ぼす潜在的薬剤の効果の定性的および/または定量的で再現可能な分析のために作製することができる。すなわち、遺伝子産物を発現する細胞は、遺伝子産物の機能を調節する化合物、特に定分子量化合物の同定のために使用することができる。従って、遺伝子産物を発現する宿主細胞は薬剤をスクリーニングするのに有用であり、本発明の別の目的は、遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定法を提供することであり、該方法は、遺伝子産物をコードする不均質なDNAを含み、機能的な遺伝子産物を生成する細胞を少なくとも1の化合物もしくは化合物の混合物または前記遺伝子産物の活性を調節する能力を判定することが求められているシグナルに暴露し、その後、その調節により起こる変化について細胞をモニターすることを含む。このようなアッセイにより、遺伝子産物のアゴニスト、アンタゴニスト、および/またはアロステリック調整剤のような調製剤を同定することが可能となる。本明細書で使用する、遺伝子産物の活性を調整する化合物またはシグナルとは、その化合物またはシグナルの存在下で、遺伝子産物の活性が異なっているような、遺伝子産物の活性を変化させる化合物をいう。細胞に基づくスクリーニングアッセイは、リポータータンパク質、すなわちβガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質またはルシフェラーゼのような容易にアッセイできるタンパク質の発現が遺伝子産物に依存する細胞系を、構築することにより設計することができる。このようなアッセイにより、直接遺伝子産物の機能を調整する化合物、例えば遺伝子産物に拮抗する化合物、または遺伝子産物の活性のために必要なその他の細胞の機能を阻害または強化する化合物を検出することが可能となる。本発明はまた、細胞内で起こる遺伝子産物に依存的な過程に外因的な影響を及ぼす方法を提供する。組換え遺伝子産物を産生する宿主細胞、例えば哺乳動物細胞を被験化合物に接触させ、そして被験化合物の存在下および非存在下で遺伝子産物に媒介される応答を比較するか、または被験細胞または対照細胞の、遺伝子産物が媒介する応答を化合物の存在に関連付けることによりその調節効果を評価することができる。さらなる態様では、本発明は、ポリペプチドによって促進される少なくとも1つのステップを含む製造工程を最適化する方法に関する。例えば、このステップは触媒ステップを含むものであってよく、これは酵素によって促進される。すなわち本発明は、少なくとも1つのステップがポリペプチドによって促進される合成プロトコルを提供し、その発現により直接または間接的に遺伝子エレメントの光学特性の改変を生じる、前記ステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製し、マイクロカプセル中に該遺伝子エレメントを区画化し、マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、各遺伝子産物を産生させ、遺伝子エレメントの変化した光学特性を使用して、所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取し、そして、で合成の当該ステップを促進すると同定されたポリペプチド遺伝子産物を使用して1つ以上の化合物を調製する、ステップを含む化合物の調製方法を提供する。本発明により、化合物の調製に関与する酵素を、最適な活性について選択することにより最適化することができる。この方法は、スクリーニングされるポリペプチドの変異体の調製を含み、これは本明細書でいうポリペプチドのライブラリーに相当する。変異体は、本明細書の別項に記載したようなライブラリーと同様の方法で調製することができる。選択方法系は、触媒、調節または結合活性を有するRNA、DNAあるいはタンパク質遺伝子産物分子を選択するために構成することができる。結合についての選択特定のリガンドに対するアフィニティを有する遺伝子産物についての選択の場合、マイクロカプセル中で遺伝子エレメントはリガンドを介して遺伝子産物と連結させることができる。すなわち、リガンドに対してアフィニティを有する遺伝子産物だけが遺伝子エレメントに結合し、リガンドを介して結合した遺伝子産物を有する遺伝子エレメントだけが変化した光学特性を獲得し、これにより選択ステップでそれらが保持されるようにされる。従ってこの態様においては、遺伝子エレメントは遺伝子産物に対するリガンドと連結した遺伝子産物をコードする核酸を含む。リガンドに遺伝子産物が結合した後の遺伝子エレメントの光学特性の変化は種々の方法で誘導することができ、以下のものが挙げられる。遺伝子産物それ自体が特殊な光学特性を有し得、例えばそれは蛍光性である。遺伝子産物の光学特性が、リガンドに結合する際に改変され得、例えば遺伝子産物の蛍光が結合時に消光または増強される。リガンドの光学特性が、遺伝子産物に結合する際に改変され得、例えばリガンドの蛍光は結合時に消光または増強される。リガンド及び遺伝子産物両方の光学特性が、結合する際に改変され得、例えばリガンドから遺伝子産物に蛍光共鳴エネルギー移動が起こり得、その結果、供与体吸収波長で励起された場合、受容体発光波長における発光が起こる。この態様においては、リガンドを介した遺伝子産物の遺伝子エレメントへの結に直接光学特性の変化を誘導する必要はない。選択される遺伝子産物はいずれも選択されることになる推定上の結合ドメイン、及び共通の特徴、すなわちタグを含み得る。各マイクロカプセル中の遺伝子エレメントは物理的にリガンドと連結する。遺伝子エレメントから産生された遺伝子産物は、リガンドに対してアフィニティを有する場合にリガンドに結合し、遺伝子産物をコードしていた同一遺伝子エレメントに物理的に連結することになり、その結果、遺伝子エレメントにタグが付されることになる。反応の終了時点で、すべてのマイクロカプセルを合わせ、すべての遺伝子エレメント及び遺伝子産物を1つの環境中にプールする。所望の結合を示す遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは、特異的にタグに結合又は反応する試薬を加えることにより選択することができ、それにより遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導し、そこで分取することが可能となる。例えば、蛍光標識された抗タグ抗体を使用することができる。あるいは抗タグ抗体の後に、その第1の抗体に結合する第2の蛍光標識された抗体を使用することができる。別の態様においては、リガンドに結合する遺伝子産物が、リガンドを、例えば、遺伝子エレメントの光学特性を別に改変するようなさらなる結合相手から単に隠すことに基づいて、遺伝子エレメントを分取することができる。この場合、未改変の光学特性を有する遺伝子エレメントが選択されることになる。別の態様においては、本発明は本発明の第1の形態による方法であって、ステップにおいて、遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子エレメントに結合する方法を提供する。遺伝子産物は結合された遺伝子エレメントとともに、所望の結合活性を有する遺伝子産物にリガンドが結合する結果、分取される。例えば、遺伝子産物はいずれも、共有結合または非共有結合により遺伝子エレメントに結合する不変領域、及び所望の結合活性を生成するように変化させられる第2の領域を含むことができる。別の態様においては、遺伝子産物に対するリガンドはそれ自体遺伝子エレメントによりコードされ、遺伝子エレメントに結合する。言い換えると、遺伝子エレメントは2つの遺伝子産物をコードし、少なくともその1つが遺伝子エレメントに結合し、そしてそれらは互いに結合する能力を有するものである。遺伝子産物がマイクロカプセル中で相互作用した場合にのみ、その分取を可能とする光学特性の変化を最終的に生じるような形で遺伝子エレメントが修飾される。この態様は、例えば、互いに結合するタンパク質の対をコードする遺伝子の対について遺伝子ライブラリーを探索するのに使用される。蛍光は、TyramideSignalAmplification増幅を使用して遺伝子エレメントを蛍光性にすることにより増強することができる。これは、遺伝子エレメントに結合し、フルオレセインチラミンの、その後遺伝子エレメントと反応するフリーラジカル形態への変換を触媒するペルオキシダーゼを使用する。TSAを実施するための方法は当分野で知られており、キットはNENから市販されている。TSAは、遺伝子エレメントの蛍光の直接の増加を生じるように構成することができ、あるいは第2の蛍光分子あるいは分子の配列により結合される遺伝子エレメントにリガンドが結合され、それらのうちの1つ以上が蛍光性であるように構成することができる。触媒作用についての選択選択が触媒作用についてのものである場合、各マイクロカプセル中の遺伝子エレメントは反応の基質を含み得る。遺伝子エレメントが触媒として作用し得る遺伝子産物をコードする場合、遺伝子産物が、基質の生成物への変換を触媒することになる。従って、反応の終了時には、遺伝子エレメントは、触媒された反応の生成物と物理的に連結している。ある場合においては、基質が遺伝子エレメントの成分でないことが望ましい場合がある。この場合、基質は、光活性化のもののようなさらにそれを活性化するステップを必要とする不活性なタグを含む。選択される触媒はその後基質を生成物に変換する。その後、タグは活性化され、タグを付された基質及び/またはタグ結合分子が結合した生成物は核酸と複合化する。従って、タグを介して核酸に結合された生成物の基質に対する比率は溶液中の基質及び生成物の比率を反映する。結合した生成物を有し、所望の触媒活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの光学特性は、例えば、異なる光学特性を有する基質及び生成物、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ及びプロテアーゼ等がある、または同様の光学特性を有する基質及び生成物であるが、生成物のみが遺伝子エレメントに結合しあるいはそれと反応し、基質はしない、基質及び生成物のために、基質遺伝子エレメント複合体には見られない光学特性を有する生成物遺伝子エレメント複合体、生成物に特異的に結合するかそれと反応し、それによりその分取を可能とする遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する試薬を添加すること、のいずれかにより修飾することができる。試薬は、基質及び生成物の両方が遺伝子エレメントに結合している場合は、生成物に特異的に結合するかそれと反応し、基質とはせず、生成物のみが遺伝子エレメントに結合し、またはそれと反応し、基質はしない場合は、任意に基質及び生成物の両方に結合する。触媒分子をコードする、プールされた遺伝子エレメントは、改変された光学特性を有する遺伝子エレメントについて選択することによりその後濃縮することができる。代替的方法としては、核酸を生成物特異的抗体に結合することがある。この方法では、基質が、遺伝子エレメントに連結されていない各マイクロカプセル中に存在するが、分子タグを有する。選択される触媒が基質を生成物に変換すると、生成物はタグを保持し、その後生成物特異的抗体によってマイクロカプセル中で捕獲される。このようにして、遺伝子エレメントはタグに結合するようになるだけの状態において基質を生成物に変換することができる酵素をコードするか生産する。全ての反応を停止し、マイクロカプセルを合わせると、活性な酵素をコードする遺伝子エレメントにはタグが付されており、例えばダグが蛍光性基である場合は、変更された光学特性を既に有し得る。あるいは、タグが付された遺伝子の光学特性の変化は、タグに結合する蛍光で標識されたリガンドを加えることにより誘導することができる。あるいは、選択は、最初の反応を、同じマイクロカプセル中で起こる後続の反応につなぐことにより間接的に行うことができる。これを行う一般的な2つの方法がある。最初の態様においては、第1の反応の生成物を、第1の反応の基質とは反応しない分子と反応させ、あるいはそれにより結合させる。第2には、結合された反応が、第1の反応の生成物の存在下のみで進行するものとする。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは、その後、第2の反応の生成物の特性を使用して上記のように遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導することにより精製することができる。あるいは、選択される反応の生成物は、第2の酵素触媒反応の基質あるいは共因子とすることができる。第2の反応を触媒する酵素は、マイクロカプセル中でその場で翻訳するか、あるいはマイクロカプセル化に先立って反応混合物中に導入することができる。第1の反応が進行する場合にのみ、結合された酵素が、上記のように遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導するために使用することができる生成物を生成する。この結合の概念は、基質として、前の反応の生成物をそれぞれ使用する複数の酵素を導入するように具体化することができる。これにより、固定された基質とは反応しない酵素の選択を可能となる。また、1の反応の生成物が、選択可能な生成物を生じる第2の反応または一連の反応の触媒あるいは共因子である場合には、シグナル増幅により感度を増加するように設計することができる。さらに、酵素カスケード系は、酵素の活性化剤の製造あるいは酵素阻害剤の破壊に基づくものとすることができる。結合は、同じ生成物を生成する酵素の群全体に共通の選択系を使用することができ、単一のステップで実行することができない複雑な化学的変換の選択を可能とするという利点を有する。従ってそのような結合の方法は、最初の1つのステップ、次いで次のステップと選択して改良する、段階型のinvitroにおける新規な代謝経路の開発を可能とする。選択の戦略は経路の最終生成物に基づくものであり、それまでの全てのステップは、反応の各ステップについて新たな選択系を設定することなく独立にあるいは連続的に開発することができる。言い換えれば、所望の触媒活性を有する遺伝子産物をコードする1以上の遺伝子エレメントを単離する方法が提供され、該方法は、遺伝子エレメントを発現してそれらのそれぞれの遺伝子産物を与え、遺伝子産物に、基質から生成物への変換を触媒させ、これは所望の活性に従って直接選択可能なものであってもなくてもよく、任意に第1の反応を後続の1以上の反応に結合し、各反応は先の反応の生成物により調節され、最終的な選択可能な生成物を生じるものとし、触媒作用の選択可能な生成物を遺伝子エレメントに、a生成物が遺伝子エレメントに結合したままとなるように基質を遺伝子エレメントに結合すること、b生成物上に保持される基質に結合された適当な分子タグにより選択可能な生成物を遺伝子エレメントと反応させるかそれに結合すること、あるいは、c生成物特異的反応または生成物との相互作用によって選択可能な生成物を遺伝子エレメントに結合することのいずれかにより連結し、その特有の光学特性、あるいは生成物に特異的に結合するかそれと特異的に反応し、それにより遺伝子エレメントの光学特性の変化を生起する試薬を加えることのいずれかによって、それが結合する遺伝子エレメントとともに触媒作用の生成物を選択するステップを含み、ステップ~において各遺伝子エレメント及び各遺伝子産物はマイクロカプセル中に含まれているものとする。酵素基質特異性選択性についての選択基質特異性あるいは選択性を有する酵素をコードする遺伝子エレメントは、1の基質との反応についてのポジティブ選択、及び別の基質との反応についてのネガティブ選択を行うことにより特異的に濃縮することができる。そのような組み合わされたポジティブ及びネガティブ選択プレッシャーは、部位選択的及び立体選択的酵素の単離において非常に重要である。例えば、2種の基質を異なるタグでそれぞれ標識し、酵素触媒反応によりタグが遺伝子エレメントに結合されるようにする。2種のタグが遺伝子エレメントに異なる光学特性を与える場合、酵素の基質特異性は遺伝子エレメントの光学特性から決定することができ、好ましくない特異性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは拒絶される。異なる光学特性を有するタグ特異的リガンドを加える場合は、光学活性の変化を与えないタグも使用できる。調節についての選択同様の系を酵素の調節特性についての選択に使用することができる。生化学的プロセスの活性化剤あるいは抑制剤として作用する調節分子についての選択の場合は、生化学的プロセスの成分は各マイクロカプセル中でinsituで翻訳することができ、あるいはマイクロカプセル化の前の反応混合物中に導入することができる。選択される遺伝子エレメントが活性化剤をコードする場合、触媒作用に関して上記したように、調節された反応の生成物について選択を行うことができる。阻害剤が望まれる場合は、選択は、制御された反応の基質に特異的な化学的特性についてのものとすることができる。従って、所望の調節活性を示す遺伝子産物をコードする1以上の遺伝子エレメントを分取する方法が提供され、該方法は、遺伝子エレメントを発現してそれらのそれぞれの遺伝子産物を与え、遺伝子産物に、所望の活性に従って、選択可能な分子が生成あるいは生存するように、生化学的反応あるいは一連のつながった反応を活性化あるいは阻害させ、選択可能な分子を遺伝子エレメントに、a遺伝子エレメントに結合した、選択可能な分子、またはそれから誘導された基質を有すること、b生成物上に保持された基質に結合された適当な分子タグにより、選択可能な生成物を遺伝子エレメントと反応させるかそれに結合すること、あるいは、c生成物特異的反応または生成物との相互作用によって、触媒作用の生成物を遺伝子エレメントに結合することのいずれかにより連結し、その特有の光学特性、あるいは生成物に特異的に結合するかそれと特異的に反応し、それにより遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する試薬を加えることのいずれかによって、それが結合する遺伝子エレメントとともに選択可能な生成物を選択するステップを含み、ステップ~において各遺伝子エレメント及び各遺伝子産物はマイクロカプセル中に含まれているものとする。遺伝子産物の光学特性についての選択マイクロカプセル中において、例えば遺伝子エレメントの一部であるリガンドに結合する遺伝子産物の共通のエレメントを介して、遺伝子産物が再び遺伝子エレメントに結合される場合は、遺伝子産物の固有の光学特性について選択することが可能である。遺伝子エレメントをプールした後、結合した遺伝子産物の光学特性を使用して分取することができる。この態様は例えば、改善された蛍光及び/または新規な吸収及び発光スペクトルを有する、グリーン蛍光タンパク質の変異体を選択するために使用することができる。遺伝子エレメントのフローソーティング本発明の好ましい態様においては、遺伝子エレメントはフローサイトメトリーにより分取される。種々の光学特性を分取を開始するために使用することができ、光散乱及び蛍光分極等が挙げられる。非常に好ましい態様においては、遺伝子エレメントの光学特性の差が蛍光の差となり、遺伝子エレメントは、蛍光活性化セルソーターあるいは同様の装置を使用して分取される。非常に好ましい態様においては、遺伝子エレメントは非蛍光性の非磁性あるいは常磁性マイクロビーズに含まれ、それらは最適には06~10μmの直径を有し、遺伝子及び蛍光シグナルを発生するのに関与する基の両方が結合される。古くからのメーカーから市販されている蛍光活性化セルソーター装置は、毎時108までの遺伝子エレメントを分取することが可能である。各ビーズからの蛍光信号は、ビーズに結合した蛍光分子の数に厳密に対応する。現在、1の粒子当たり数百という少数の蛍光性分子を定量的に検出することができる。蛍光検出器の広範な動力学的範囲により分取工程の厳密さを容易に設定することができ、これにより最初のプールから最適な数の遺伝子エレメントを回収することが可能となる。市販されている蛍光活性化セルソーター装置は、異なる2つまでの波長で同時に励起し、異なる4つまでの波長で蛍光を検出することができ、2異なる蛍光性マーカーを有する遺伝子エレメントの標識化をモニターすることによりポジティブ及びネガティブ選択を同時に行うことができ、例えば、2種の代替的な酵素基質を異なる蛍光タグで標識すると、遺伝子エレメントは使用した基質により異なる蛍光団で標識することができ、対掌体選択性を有する酵素をコードする遺伝子のみが選択される。非常に均一な誘導化あるいは非誘導化非磁性及び常磁性微粒子は多数の供給元から市販されている。多段階法本発明によれば、1つのマイクロカプセル内で起こるすべての反応による、転写複製及び/または翻訳、及び選択のすべてのプロセスを単一のステップにおいて行う必要はないことは理解されるであろう。選択方法は2ステップ以上を含んでもよい。まず、遺伝子エレメントライブラリーの各遺伝子エレメントの転写複製、及び/または翻訳は、最初のマイクロカプセルにおいて起こるものとすることができる。その後、各遺伝子産物は、例えば、抗体のような遺伝子産物特異的リガンドを介して、それをコードする遺伝子エレメントと連結する。その後、マイクロカプセルを破壊し、それらのそれぞれの遺伝子産物に結合された遺伝子エレメントを任意に精製する。あるいは、遺伝子エレメントは、カプセル化に依存しない方法を使用してそれらのそれぞれの遺伝子産物に結合することができる。例えばファージディスプレイ、ポリソームディスプレイ、RNAペプチド融合物あるいはlacリプレッサーペプチド融合物等である。前記方法の第2のステップでは、その遺伝子産物に結合された、精製された各遺伝子エレメントは、選択される反応の成分を含む第2のマイクロカプセル中に入れる。その後この反応を開始する。反応終了後に、マイクロカプセルを再び破壊し、修飾された遺伝子エレメントを選択する。多くの個々の成分及び反応ステップが使用される複雑な多段階反応の場合には、1以上の介在ステップを、遺伝子産物の生成と遺伝子エレメントへの連結の最初のステップと、遺伝子エレメントの選択可能な変化を生じる最終ステップとの間に行ってもよい。必要ならば、第2マイクロカプセル内の遺伝子エレメントからの遺伝子産物の放出を種々の方法で達成することができ、例えば、結合部位に対する低分子量産物による特異的競合、あるいは、触媒ドメインから遺伝子産物の結合ドメインに連結するリンカー領域の酵素的あるいは自己触媒的開裂が挙げられる。レポーター遺伝子のinsitu発現の活性化による選択遺伝子エレメントによりコードされる所望の結合、触媒または調節活性が、直接または間接的に、すべてのマイクロカプセル中にあるリポーター遺伝子の発現の活性化を生じるように系を構成することができる。所望の活性を有する遺伝子産物だけがリポーター遺伝子の発現を活性化する。本明細書に記載した方法のいずれかで、リポーター遺伝子発現から得られた活性により、遺伝子エレメントの選択が可能となる。例えば、リポーター遺伝子の活性化は、2ハイブリッド系に類似した方法での遺伝子産物の結合活性の結果とすることができる。活性化は、所望の遺伝子産物によって触媒される反応の生成物からも得られる。例えば、反応生成物は、リポーター遺伝子の転写誘導物質とすることができる。例えば、アラビノースをaraBADプロモーターからの転写を誘導するために使用することができる。所望の遺伝子産物の活性が、リポーター遺伝子の発現を生じる転写因子の修飾を生じるものとすることもできる。例えば、所望の遺伝子産物がキナーゼあるいはホスファターゼである場合、転写因子のリン酸化あるいは脱リン酸化によりリポーター遺伝子発現の活性化が起こる。増幅本発明のさらに別の態様によれば、前記方法は遺伝子エレメントを増幅するステップをさらに含む。選択的な増幅を、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの濃縮のための手段として使用することができる。上記の全ての構成において、遺伝子エレメントに含まれる遺伝子情報を増幅することができ、その工程は反復するステップで繰り返すことができる。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応によるもの、あるいはQbレプリカーゼ増幅、リガーゼ連鎖反応、自己維持配列複製系及び鎖置換増幅等の種々のその他の遺伝子増幅法のいずれかによるものとすることができる。本発明の種々の形態及び態様を以下の実施例において例示する。本発明の範囲から逸脱することなく詳細部分についての改変を行うことができることは理解されるであろう。本文中に挙げた文献は全て引用により本明細書の一部とする。実施例1酵素は、溶液中の遺伝子および常磁性ミクロビーズに結合した遺伝子から同じ効率で発現されうる光学特性の変化を利用することによる遺伝的エレメントの選択のための1つの方法は、該遺伝子が結合するミクロビーズを該遺伝的エレメントが含むというものである。本実施例においては、酵素大腸菌Ecoliジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子がいかに常磁性ビーズに連結し、溶液中の場合と全く同じ効率でinvitroで翻訳されうるのかを示す。ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFRをコードする大腸菌EcolifolA遺伝子を、オリゴヌクレオチドEDHFRFoおよびEDHFRBaを使用してPCR増幅する。ついでこのDNAを、lacプロモーターおよびT7RNAポリメラーゼプロモーターの下流の、HindIIIおよびKpnIで消化されたpGEM4ZベクターPromega中にクローニングする。オリゴヌクレオチドEDHFRBaは、DHFR開始コドンの上流に効率的ファージT7遺伝子10翻訳開始部位を付加する。DNA配列決定は、正確なヌクレオチド配列を有するクローンを同定する。このクローンpGEMfolAで形質転換された細菌は、IPTGで誘導されると活性DHFRlacプロモーターから駆動されるを過剰発現することが判明している。ついでpGEMfolAプラスミド中のfolA遺伝子を、プライマーfolAFWおよびfolABWを使用してPCR増幅し、HindIIIおよびXhoI内で得られたそのDNA断片の消化を行ない、それを、HindIIIXhoIで消化されたpET23a発現ベクターNovagen中にサブクローニングして、構築物pET23afolAを得る。PCR増幅されたfolA遺伝子の配列を配列決定により確認した。pET23afolAを、5ビオチン化プライマーpETforbおよびpETrevbで更に増幅し、該PCR混合物中への10μCiα35dATPAmershamPharmaciaBiotechUKの添加により放射能標識した。得られた1765bpの二重ビオチン化断片T7folAを、Qiagenキットを使用してゲル精製し、分光光度的に定量した。該産物の比活性は、BeckmanLS6000SCシンチレーションカウンター上での測定では210000CPMpmolT7folADNAであった。該プラスチックへの非特異的結合を除去するために、このDNAの10nMおよび1nM希釈液を、1mgmlのHindIIIで消化されたラムダDNA中で調製した。ついでこのPCR断片を使用して、直鎖状鋳型用に設計された原核性invitro共役転写/翻訳系を設計したLesleyBrowおよびBurgess1991。この系の市販の調製物は、T7RNAポリメラーゼ103単位を添加して使用するEcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromega。該DNA断片を、ビオチン化プロテインASigmaで予め部分的にコートされたストレプトアビジン常磁性ビーズ074μm径のSeraMagビーズビオチン結合能46nmolmgSeradynUSAに結合させる。2μlの80μMビオチン化プロテインAを、100μl1mgのビーズに加えて室温で1時間結合させ、1回洗浄し、ウサギIgGビーズ1mg当たり10μlの1mgml抗体TBS01Tween20中で室温で1時間コートする。ついでビーズをTBSTで2回洗浄した後、放射能標識ビオチン化T7folADNAを加えて室温で1時間結合させた。結合したT7folADNAの量を、ビーズのアリコートに結合した放射能を計数することにより算出した。該全DNAの~50が結合した。ビーズ上に結合したDNA断片または未結合DNA断片を、S30ExtractSystemに直接加える。反応を37°Cで2時間インキュベートする。既に記載されているとおりにWilliamsら1979Maら1993、NADPHからNADPへの酸化を340nmで10分間の時間経過にわたり分光光度的にモニターすることにより、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性をアッセイする。クエンチされた各invitro翻訳反応液2μlを150μlのバッファーA100mMイミダゾールpH7010mMβメルカプトエタノールおよび20μlの1mMNADPHに加える。1分後に20μlのジヒドロ葉酸1mMH2Fを加え、ThermoMaxマイクロプレートリーダーMolecularDevicesを使用して該反応を340nmでモニターする。SoKMの条件下の初期速度vmaxにより、活性を算出する。該DNAが遊離している場合、または該DNAが末端ビオチンを介してストレプトアビジンコート化ビーズに結合している場合に産生された活性DHFRの量における有意な相違は存在しない図1を参照されたい。実施例2蛍光タンパク質GFPは、油中水型エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子からinvitroで翻訳され、その翻訳された遺伝子産物は該ミクロビーズに再結合してそれを蛍光性にしうる遺伝的要素の選択のための1つの方法は、ミクロビーズに連結した遺伝子を該遺伝的要素が含み、該産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合して、その分取を可能にするミクロビーズの光学特性の変化を直接的または間接的にもたらすというものである。本実施例においては、油中水型エマルションの水性画分内に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子から蛍光タンパク質グリーン蛍光タンパク質、すなわちGFPがinvitroで転写および翻訳され、その翻訳された遺伝子産物が該ミクロビーズに再結合してそれを蛍光性にしうることを示す。pBSGFP6プラスミドSiemeringら1996中のGFPを、プライマーGFPFWおよびGFPBWを使用してPCR増幅し、HindIIIおよびXhoI内で得られたそのDNA断片の消化を行ない、それを、HindIIIXhoIで消化されたpET23a発現ベクターNovagen中にサブクローニングして、構築物pET23aGFPを得た。PCR増幅されたGFP遺伝子の配列を配列決定により確認した。pET23aGFPを、5ビオチン化プライマーpETforbおよびpETrevbで更に増幅した。得られた2038bpの二重ビオチン化断片T7GFPを、Qiagenキットを使用してゲル精製し、分光光度的に定量した。該プラスチックへの非特異的結合を除去するために、このDNAの10nMおよび1nM希釈液を、1mgmlのHindIIIで消化されたラムダDNA中で調製した。ついでこのPCR断片を使用して、直鎖状鋳型用に設計された原核性invitro共役転写/翻訳系を設計したLesleyBrowおよびBurgess1991。この系の市販の調製物は、T7RNAポリメラーゼ103単位を添加して使用するEcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromega。対照として、ビオチン化された1765bpのDNA断片T7folA実施例1と同様にしてPCRにより合成したを使用して、非蛍光タンパク質DHFRの合成を設計した。150μlのProActiveストレプトアビジンコート化常磁性ビーズBangsLaboratoriesビーズ2×107個μlを5mMTris741MNaCl01Tween20に懸濁させ、50μlの3つのアリコートに分割した。05μlの02μMDNAT7folAまたはT7GFPを各ビーズアリコートに加え、43°Cで15分間インキュベートし、25mMNaH2PO4、125mMNaCl、01Tween20pH70PBS01Tween20中で3回洗浄し、40μlのTBSTに再懸濁させ、10μlの80μMビオチン化プロテインASigmaを加えた15μMの最終濃度とした。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS01Tween20中で3回洗浄し、20μlの110希釈ウサギ抗GFPポリクローナル抗体Clontechまたは1mgml非免疫化ウサギIgGSigmaに再懸濁させた。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS01Tween20中で3回洗浄し、EcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaからの15μlのS30予混体に再懸濁させ、超音波浴中で1分間超音波処理し、ついで該S30invitro翻訳混合物の残りを加え氷上、T7RNAポリメラーゼ103単位で添加した。その50μlの氷冷invitro翻訳反応液を10μlの5つのアリコート中で~2分間かけて、マグネティックバー8×3mm、ピボットリング付きScientificIndustriesInternationalLoughboroughUKで攪拌しながら、095mlの氷冷油相5mlのCostarBiofreezeVial中、鉱油SigmaM5904に45Span80Flukaを、次いで05Tween80SigmaUltraP8074を溶解することにより新たに調製したものに徐々に加えた。攪拌1150rpmを氷上で更に3分間継続した。ついで反応を32°Cで3時間インキュベートした。2μlのエマルションを、13mm円形カバーグラス下の顕微鏡スライド上に広げ、RTEACCD1300YCCDカメラPrincetonInstrumentsを備えたAxioplan顕微鏡Zeiss上で20×Neofluar対物レンズを使用して可視化した。フルオレセイン用の標準的な励起発光フィルターを使用し、像をIPLabソフトウェアで処理した。図2から理解されうるとおり、ミクロビーズを抗GFP抗体でコートした場合には、該エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子から翻訳されたGFPが該ミクロビーズにinsituで結合する。この結合は、該ビーズ上で蛍光が濃縮されるにつれて、表面蛍光epifluorescence顕微鏡検査により観察される。GFP遺伝子または抗GFP抗体のいずれかが存在しない場合には、ビーズの蛍光は全く観察されない。実施例3蛍光タンパク質GFPは、油中水型エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子からinvitroで翻訳され、その翻訳された遺伝子産物は該ミクロビーズに再結合し、該ミクロビーズの蛍光の増加はフローサイトメトリーにより検出されうる150μlのストレプトアビジンコート化ポリスチレンビーズ直径1μMBangsLaboratoriesビーズ2×107個μlを5mMTris741MNaCl01Tween20に懸濁させ、50μlの3つのアリコートに分割した。05μlの02μMDNAT7folAまたはT7GFPを各ビーズアリコートに加え、43°Cで15分間インキュベートし、25mMNaH2PO4、125mMNaCl、01Tween20pH70PBS01Tween20中で3回洗浄し、40μlのTBSTに再懸濁させ、10μlの80μMビオチン化プロテインASigmaを加えた15μMの最終濃度とした。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS01Tween20中で3回洗浄し、20μlの110希釈ウサギ抗GFPポリクローナル抗体Clontechまたは1mgml非免疫化ウサギIgGSigmaに再懸濁させた。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS01Tween20中で3回洗浄し、EcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaからの15μlのS30予混体に再懸濁させ、超音波浴中で1分間超音波処理し、ついで該S30invitro翻訳混合物の残りを加え氷上、T7RNAポリメラーゼ103単位を添加した。その50μlの氷冷invitro翻訳反応液を10μlの5つのアリコート中で~2分間かけて、マグネティックバー8×3mm、ピボットリング付きScientificIndustriesInternationalLoughboroughUKで攪拌しながら、095mlの氷冷油相5mlのCostarBiofreezeVial中、鉱油SigmaM5904に45Span80Flukaを、次いで05Tween80SigmaUltraP8074を溶解することにより新たに調製したものに徐々に加えた。攪拌1150rpmを氷上で更に3分間継続した。ついで反応を32°Cで3時間インキュベートした。該反応混合物を回収するために、該エマルションを3000gで5分間遠心し、該油相を除去すると、濃縮されているが無傷のままであるエマルションが該バイアルの底に残った。PBSおよび2mlの水飽和エーテルを加え、該混合物をボルテックスし、短時間の遠心分離を行い、該エーテル相を除去した。ビーズをPBSで2回洗浄し、最後にPBSにビーズ108個mlで再懸濁させた。488nmでの励起およびフルオレセイン発光フィルターを用いるFACScaliburフローサイトメーターBectonDickinsonを使用して、104個のビーズを分析した。該エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子から翻訳されたGFPは、該ミクロビーズを抗GFP抗体でコートした場合には該ミクロビーズにinsituで結合する。該ミクロビーズへのGFPの結合はそれを蛍光性にし図2、GFPが結合しているビーズは、そうでないビーズからフローサイトメトリーにより明らかに区別されうる図3。実施例4酵素触媒反応の生成物は常磁性ビーズ上に捕捉され、生成物で誘導体化されたビーズはフローサイトメトリーにより同定されうる酵素ヒトグルタチオンSトランスフェラーゼM22GSTM22により触媒される反応を行なって、ビオチン化生成物を生じさせた図4。使用した2つの基質は、1クロロ24ジニトロベンゼンCDNBSigmaおよび還元型ビオチン化グルタチオンビオチンGSHであった。得られた生成物ビオチンGSDNPは、ストレプトアビジンコート化常磁性微粒子への結合を可能にするビオチンを一方の末端に有し、そして抗DNP抗体が結合しうる24ジニトロフェノールDNP基を有する。1mlのDMF中の100mgのビオチンアミドカプロアートNヒドロキシスクシンイミドエステルビオチンNHSSigmaを1mlの水、30μlの125NNaOHおよび1mlのDMF中の酸化型グルタチオンFlukaの溶液に加えることにより、ビオチンGSHを合成した。該ビオチンNHSは、100μlのアリコート中、氷上で20分間かけて加えた。ついで該pHを1NNaOHで70に調節した。該反応中に生成したシロップ様沈殿物を、室温に加温しボルテックスし300μlの水を加えることにより溶解した。攪拌を室温で2時間継続し、該pHを1NNaOHの添加により70に戻し、室温で一晩攪拌した。ついでNaOHを使用して該pHを75に戻し、該反応液を室温で更に30分間攪拌し、ついで500μlの1MDTTの添加後に更に30分間インキュベートした。該溶媒を真空下で蒸発させ、該生成物を、C8カラムおよび10~40アセトニトリル、01TFAの勾配を用いる逆相HPLCにより精製した。01MKH2PO41mMEDTApH65中に1μgの精製組換えGSTM22、500μMCDNBおよび200μMビオチンGSHを含有する100μlの反応液中、ビオチンGSDNPを酵素的に合成した。インキュベーションは25°Cで1時間であった。340nmにおける吸光度の増加を追跡することによる判定によれば、該反応は実質的に完了していた。また、対照反応を、1GSTの不存在下、2CDNBの不存在下、および3ビオチンGSHの不存在下で行なった。反応液を5mMTrisHCl、05mMEDTA、10MNaClpH74BWバッファー中に200倍希釈した1μMビオチンの最終濃度を得た。50μlの該希釈化反応液を、293μg108微粒子の0737μm径SeraMag商標ストレプトアビジンコート化磁性微粒子MGSASeradynを含有する50μlのBWバッファーと混合し、室温で1時間インキュベートした。微粒子を、磁石DynalMPC96を使用してマイクロタイタープレートFalcon3911中で分離し、10mMTrisHCl、1mMEDTA、20MNaClpH742×BWバッファーで3回、ついでPBS、01Tween20で2回洗浄した。該微粒子を、PBS01Tween20中のマウス抗ジニトロフェノールモノクローナル抗体SPE2111ZeligEshhar教授からの贈呈物の12500希釈液に再懸濁させ、室温で45分間インキュベートした。該微粒子をPBS01Tween20中で3回洗浄し、15μgmlフルオレセインFITC結合F2フラグメントヤギ抗マウスIgGF2フラグメントJackson115096006を含有するPBS01Tween20に再懸濁させ、室温で30分間インキュベートした。該微粒子をPBS01Tween20中で4回洗浄し、1mlのPBS01Tween20に再懸濁させ、2×105個の微粒子を、FACScanフローサイトメーターBectonDickinsonを使用して分析した。図5から理解されうるとおり、全3個の対照反応GSTの不存在下、GDNBの不存在下およびビオチンGSHの不存在下からのビーズの蛍光強度の分布における相違は存在せず、この場合の平均蛍光は約3である。これとは対照的に、該酵素触媒反応からのビーズは、10倍以上高い34の平均蛍光を有する。実際のところ、示されているゲートgateを使用した場合図5、該酵素触媒反応からのかつ該ビオチン化生成物でコートされたビーズの811が該ゲート中に存在し、一方、該対照反応においては、ビーズのせいぜい006が該ゲート中に存在するにすぎない。したがって、該GST触媒反応の生成物でコートされたビーズは、そうでないビーズから容易に分取されうる。実施例5グルタチオンSトランスフェラーゼM22GSTM22は基質としてケージドビオチン化グルタチオンを利用し、ついでケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、アビジンコート化ビーズ上に捕捉され、フローサイトメトリーにより検出されうるケージドビオチン5およびその誘導体7の合成は、公開されているプロトコールPirrungおよびHuang1996Sundbergらに基づくものであった。しかしながら、後記のとおり、これらのプロトコールの有意な改変を、該合成のいくつかの工程において行なった。ビオチンメチルエステル3ビオチンOMeは、Sundbergらに記載されているのと実質的に同じ方法で調製した図6を参照されたい。メチルニトロピペロニルアルコール1MeNPOH346ニトロアセトフェノンLancaster62g296mmolを、THF100mlとエタノール100mlとの混合物に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム112g296mmolを加え、該溶液を室温で3時間攪拌した。TLCシリカコート化プレート上溶媒DCM中の3メタノールは、出発物質Rf08から該アルコールRf06への完全な変換を示した。水素の発生が止まるまで、塩酸1Nをゆっくり加え、該溶媒を真空下で蒸発させた。残留固体をDCM500mlに溶解し、ブライン40mlで洗浄した。該有機相を乾燥MgSO4させ、該溶媒を真空下で除去した。熱DCMおよびへキサンからの再結晶により、61gの1黄色結晶性固体を得た。Oメチルニトロピペロニルカルボニルイミダゾール2MeNPOCOImメチルニトロピペロニルアルコール169g8mmolをいくつかに分けて20分間かけて、カルボニルジイミダゾールCDI26g16mmolのDCM50ml溶液に加えた。該溶液を3時間攪拌し、その後、TLCは、該アルコールDCM中の3メタノールにおいてRf06から生成物Rf045への完全な変換を示した。DCM100mlおよび水30mlを加え、該反応混合物を分液漏斗に移した。該混合物を混合し、該水相のpHが6未満になるまで1NHClを1mlのアリコートで加えた。該水相を除去し、更に水30mlを加え、混合しながらpH6まで酸性化した。最後に、該DCM相をブラインで洗浄し、乾燥MgSO4し、該溶媒を真空下で除去した。該残留固体を熱DCMおよびへキサンから再結晶して、22gの2黄色結晶性固体を得た。Nビオチンメチルエステル4MeNPOCOビオチンOMe水素化ナトリウム油中の60懸濁液100mg25mmolを、氷上の無水DCM10ml中のビオチンOMe517mg2mmolおよびMeNPOCOIm305mg1mmolの攪拌懸濁液に加えた。該溶液を氷上で30分間および室温で30分間攪拌した。TLCは、MeNPOCOImDCM中の5メタノールにおいてRf06の完全な消失および該生成物Rf045の出現を示した。痕跡量のアルコール1Rf07およびRf095の副生成物おそらくジMeNPOカーボネートも観察された生成物と前記副生成物との比率は調製物によって様々であった。該出発物質を注意深く乾燥させ該反応を氷上で行なうと、一般に、該生成物の収率は、より高くなった。該反応が完了したら、DCMを加え100ml、該溶液を1MNaH2PO4で3回抽出した。該有機相を乾燥MgSO4させ、該溶媒を真空下で除去した。残留シロップを熱DCM約5mlに溶解し、ヘキサン約5mlを曇り点まで加え、該溶液を4°Cで一晩放置した。これにより、白色結晶性固体としての過剰の該ビオチンOMeの沈殿が生じたこれをエーテルで洗浄し、乾燥させ、後続の反応に使用した。該濾液を真空中で濃縮し、シリカ上のクロマトグラフィーDCM中の15~3メタノールにより精製して、4を黄色泡状物として得た385mgまでの収量、すなわち出発物質としての2のモル等量に基づけば80。Nビオチン5MeNPOCOビオチンOHMeNPOCOビオチンOMe940mg173mmolを25mlの05NHClおよびジオキサン46アルゴンでフラッシュされたものに溶解した。該溶液を、アルゴン下、44°Cで24時間攪拌した。該溶媒を真空下で約1mlまで減少させ、水を加え10ml、得られた混合物を凍結乾燥させた。得られた固体を、2メタノール20mlを含有するDCMに溶解し、木炭を加えた。該混合物を数分間煮沸し、濾過した。TLCDCM中の10メタノールは、該加水分解生成物Rf02の出現および約5の出発物質MeNPOCOビオチンOMeRf09を示した。該溶媒を真空下で除去して黄色固体を得、それを真空下で乾燥させた約95の5および5の4の860mg。より高濃度のHCl例えば、1Nおよびより高温例えば、共溶媒としてのTHFとの還流は、該メチルエステルの完全な加水分解を引き起こした。しかし、有意な量のアルコール1およびビオチンも認められ、これは、これらの条件下での該カルバマートの加水分解を示している。メチルエステル4および特にその加水分解生成物5が酸化に感受性であることが判明したことに注目すべきである。5の溶液の加温または更には保存空気の存在下は褐色化を引き起こした。同様に、シリカ上でのクロマトグラフィーによる5例えば7の誘導体の精製を試みたところ、酸化による非常に高い損失が生じた。Nビオチン3アミノプロピオン酸tertブチルエステル6MeNPOCOビオチンβAlaOButMeNPOCOビオチンOH約5のMeNPOCOビオチンOmeを含有する860mg約16mmolを20mlの無水DCMに溶解した。βアラニンtertブチルエステルHβAlaOBut塩酸塩Bachem362mg2mmol、Nヒドロキシスクシンイミド172mg15mmolおよびトリエチルアミン280μl2mmolを加えた。該攪拌溶液を氷上で冷却し、EDCIを加えた420mg22mmol。該反応を4°Cで24時間および室温で2時間攪拌した。TLCDCM中の5メタノールは、該生成物Rf03の出現および残存未反応物MeNPOCOビオチンOMeRf45を示した。該反応液をDCM30mlで希釈し、1MNaH2PO4で3回および飽和NaHCO3で1回抽出した。該有機相を乾燥Na2SO4し、該溶媒を真空下で除去した。残留シロップをシリカ上のクロマトグラフィーDCM中の30~45メタノールにより精製して、640mgの6黄色泡状物を得た。Nビオチン3アミノプロピオン酸7MeNPOCOビオチンβAlaOHtertブチルエステル6510mg084mmolを15mlの05NHClおよびジオキサン46アルゴンでフラッシュされたものに溶解した。該溶液を、アルゴン下、52°Cで24時間攪拌した。水を加え10ml、得られた溶液を凍結乾燥させて、加水分解生成物7と出発物質6約10とを含有TLCによる判定する固体を得た。この混合物を、シリカ上のカラムクロマトグラフィーアセトン中の10メタノールおよび01酢酸により精製して、60mgの7を得た低収率は、主に、シリカ上での7の酸化の結果であった。Nビオチン3アミノプロピオニルグルタチオン8MeNPOCOビオチンβAlaGSHカルボニルジイミダゾール20mg120μmolを、MeNPOCOビオチンβAlaOH749mg89μmolのDMF15ml溶液に加えた。該溶液を室温で30分間攪拌し、ついで数個のアリコートとして、氷上で攪拌されたDMF2ml水015ml中の酸化型グルタチオン62mg100μmolおよびトリエチルアミン55μl04mmolの溶液に加えた。該溶液を氷上で30分間、ついで室温で攪拌した。該溶液が透明になるまでトリエチルアミンを加え25μl、ついで該反応液を室温で更に2時間攪拌した。ついでDTTを加え025mlの1M溶液025mmol、該溶液を室温で10分間攪拌した。前記反応の生成物を、01トリフルオロ酢酸の存在下の水アセトニトリル勾配を使用するRP8分取カラム上の逆相HPLCにより精製した。8に対応するピーク保持時間286分を集めた。ついで該生成物を凍結乾燥により単離し、逆相HPLC同じカラムおよび溶媒系を用いるもの上で再び精製した。分析用逆相HPLCを使用する2回目のHPLC精製の後の該生成物の分析は、8に対応するUVスペクトルを有する生成物95示した特に、355nmのλmaxはケージドビオチンのOメチルニトロピペロニルカルボニル基の存在を示した。8の濃度を、該グルタチオンに由来する遊離チオール基の滴定Hermanson1996に記載のとおりにDTNB55ジチオビスを使用するものにより、そしてまた、355nmの吸光度該ケージドビオチンに対応により測定した。これらの互いに独立した測定は共に、実験誤差範囲内の同じ結果を与えた。また、精製された8は、同一条件下でグルタチオンの場合に認められるものより約10倍遅い速度のCDNBの求電子置換におけるヒトM22GSTの基質であることが判明した340nmの吸光度の変化によりモニターしたHabigおよびJakoby1981。還元型MeNPOCOビオチンβAlaGSHケージドビオチンβalaGSHを、1クロロ24ジニトロベンゼンCDNBSigmaまたは4クロロ3ニトロ安息香酸CNBAcrosのいずれかと反応させた。得られたケージド生成物は、アビジンにもストレプトアビジンにも結合しない。しかし、紫外線による光化学的脱ケージ後は、該生成物は、アビジンまたはストレプトアビジンコート化微粒子に結合するビオチンを一方の末端に、そして適当な抗DNPまたは抗3ニトロ安息香酸抗体が結合しうる24ジニトロフェノールDNPまたは3ニトロ安息香酸基のいずれかを有する図7および8を参照されたい。5μl108個のビーズの10μm径非蛍光性ニュートラビジンneutravidin標識ミクロスフェアMolecularProbesF8777を、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心し、該上清を除去した。該ビーズを5μlの01MKH2PO4pH65、1mMEDTA、2mMジチオトレイトール、10μMケージドビオチンβalaGSHおよび500μMCDNBと500μMCNBとのいずれかに再懸濁させた。その5μlの反応混合物は、075μgの精製組換えヒトGSTM22を含有するか、またはいずれの酵素も含有しなかった。反応液を25°Cで30分間CDNB反応液または4時間CNB反応液インキュベートし、ついでそれらを35μlの01M酢酸ナトリウムpH50の添加により停止させ、氷に移した。ついで各反応液をそれぞれ20μlの2つのアリコートに分割し、そのうちの1つを氷冷アルミニウムブロック表面上のパラフィルム層上にスポットとして配置した。ついでこのスポットに、約6cmの距離に維持されたB100APUVランプUVPで2分間照射した。もう一方のアリコートは未照射のままとした。ついですべてのサンプルを室温で30分間インキュベートし、ついで045μmMultiScreenHVフィルタープレートMilliporeMAHVN4510中、200μlのPBS、01Tween20中で3回洗浄した各洗浄の合間に十分に再懸濁させた。ついでビーズを、20ngμlAlexa488標識ウサギ抗DNP抗体DakoV0401、20ngμlAlexa488標識抗CNB抗血清を含有する200μlのPBS、01Tween20に再懸濁させ、室温で1時間インキュベートした。該抗CNB抗血清は、DMF中の43ニトロ安息香酸CNBCH2Brの200mM溶液のアリコートを50mMホウ酸塩pH88中のウシ血清アルブミンBSAまたはキーホールリンペットヘモシアニンKLHの5mgml溶液に加えることによりタンパク質1mg当たり15~6μmolのCNBCH2Brを得る調製したCNBCH2KLHコンジュゲートで免疫することによりウサギにおいて惹起させた。該反応混合物を室温で6時間攪拌し、得られたタンパク質コンジュゲートをリン酸緩衝食塩水PBSに対して4°Cで十分に透析した。コンジュゲート化のレベルハプテン密度、すなわちHdを、該コンジュゲートの光学密度を355nmで測定することにより求めた。該タンパク質サンプルに加えたCNBCH2Brの量に応じて、これらは、BSA1分子当たり7~11個のCNBCH2基、およびKLH1分子当たり94~243個のCNBCH2基となることが判明した。142のHdを有するCNBCH2KLHコンジュゲートを使用して、公開されているプロトコールTawfikら1993Tawfikら1997を用いてウサギを免疫したWeizmannInstituteofScienceRehovotのZEshhar教授による。血清を、コンジュゲートCNBCH2BSAHd11およびBSAへの結合に関してELISAにより試験した。両方の免疫ウサギからの最初の採血は50倍以上希釈した場合、CNBCH2BSAコンジュゲートと共にインキュベートした場合には高いシグナルを及びBSAでは非常に低いバックグラウンド80を示した。特に、355nmにおけるλmaxは、該ケージドビオチンのOメチルニトロピペロニルカルボニル基の存在を示しPirrungおよびHuang1996、ケージドビオチンには存在しない277nmにおける肩は、17のpニトロフェニルホスフェートエステルの存在を示す。01M水酸化カリウム中で該pニトロフェニルホスフェートエステルを加水分解し遊離pニトロフェノールの量を測定することにより405nmにおける光学密度、17の濃度を確認する。精製された17はまた、パラオキソンの場合に認められるものより僅か約6倍遅い速度でpニトロフェノールの遊離を引き起こすPTEの基質であることが判明している図13405nmにおける光学密度の変化によりモニター。注目すべきことに、反応完了まで進行する17の塩基触媒加水分解およびパラオキソンのPTE触媒加水分解とは異なり、17のPTE触媒加水分解は、該基質の半分が加水分解されるまで有意な速度で進行するにすぎない。該基質の残り半分も加水分解されうるが、それは、はるかに大量のPTEの存在下および長時間数時間から一晩のインキュベーションの後で生じるにすぎない。これは、おそらく、17が2つのジアステレオマーそのキラルなホスホトリエステルに関する2つのエナンチオマーに対応を含み、そのうちの一方だけが該酵素の有効な基質であることによるものであろう。実際のところ、PTEおよび他のキラルなホスホトリエステルに関して立体選択性が既に認められているHongおよびRaushel1999。対応するpニトロフェニルホスホトリエステルの加水分解生成物であるエチルホスホジエステルを認識する抗体を産生させる。この目的には、後記のとおり、適当なエチルホスホジエステル誘導体を合成し、担体タンパク質にコンジュゲートさせる図14。EtNPBG18無水グルタル酸180mg16mmolおよびトリエチルアミン022ml16mmolを、DCM15ml中の12前記のとおり16mmolの11の脱保護により調製したものに加える。該溶液を20分間攪拌し、トリエチルアミン012ml085mmolを加え、該溶液を更に1時間攪拌する。DCMを加え20ml、該溶液を1MNa2HPO4pH4で2回抽出し、ついでMgSO4で乾燥させる。該溶媒を真空下で除去してシロップを得、それをシリカ上のカラムクロマトグラフィー溶媒DCM中の125メタノール01酢酸で精製して445mgの18シロップを得る。基質コンジュゲートEtNPBGKLHおよびEtNPBGKLHカルボニルジイミダゾールCDI32mg200μmolを、1860mg134μmolのDMF1ml溶液に加える。該溶液を室温で60分間攪拌する。ついで、活性化された18のアリコートを、01Mリン酸塩pH80中のウシ血清アルブミンBSAまたはキーホールリンペットヘモシアニンKLHの5mgml溶液にタンパク質1mg当たり05~4μmolの18となるように加える。該反応液を室温で1時間攪拌し、得られたタンパク質コンジュゲートを4°Cでリン酸緩衝食塩水PBSに対して十分に透析する。コンジュゲーションのレベルハプテン密度、すなわちHdを、01M水酸化カリウム中で該透析コンジュゲートのサンプルを加水分解し遊離pニトロフェノールの量をモニター405nmすることにより測定する。これらは、該タンパク質サンプルに加えられた活性化された18の量に応じて、BSA1分子当たり85~24個のEtNPBG分子、およびKLH1分子当たり14~63個のEtNPBG分子であることが判明している。生成物コンジュゲートEtBGKLHおよびEtBGKLH前記のEtNPBGKLHおよびEtNPBGKLHコンジュゲートを01MカーボネートpH118に対して室温で44時間透析し、ついでPBSに対して十分に透析4°Cする。公開されているプロトコールTawfikら1993Tawfikら1997を用いてEtBGKLHHd14での免疫により、抗EtBG抗体をウサギにおいて惹起させたWeizmannInstituteofScienceRehovotのZEshhar教授からの贈呈物。血清を、基質コンジュゲートEtNPBGBSAHd85および対応生成物コンジュゲートEtBGBSAHd85の両方への結合に関してELISAにより試験する。該免疫ウサギの一方からの最初の採血は50倍以上希釈した場合、該生成物コンジュゲートと共にインキュベートした場合には高いシグナルを及び該基質コンジュゲートでは低いバックグラウンド20を与える所望の選択性を示す。COVApバッファー2MNaCl、10g、1MgSO47H2O、004Tween20、10mMリン酸塩、01mMpニトロフェノールpH65中で該血清を希釈すると、選択性が更に増加し、バックグラウンドレベルは5未満に減少する。HiTrapProteinAカラムPharmaciaを使用して、抗EtBG血清を精製する。その精製されたウサギ抗体を、AlexaFluor488タンパク質標識キットMolecularProbesで、該製造業者の説明書に従い標識する。10μl約2×108個のビーズの095μmストレプトアビジンコート化ミクロビーズBangs、懸濁液1μl当たり約2×107個のビーズを、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心し、該上清を取り出す。該ビーズを、EtNPBzGluケージドビオチン17を含有する10μlの50mMTrispH83に再懸濁させて、10μM、20μMまたは30μMの最終濃度とする。PTEを、OPDLMB32ビオチンDNA断片5nMの転写/翻訳によりinvitroで発現させる。T7RNAポリメラーゼ2000単位で補足されたこの系の市販の調製物EcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaを使用し、該反応液を25°Cで15時間インキュベートする。ついで、Trisバッファー10mMpH80中の炭酸カリウム10mMおよび塩化コバルト1mMを加え、4°Cで一晩インキュベートすることにより、該PTEを集合させる。また、ホスホトリエステラーゼ活性を示さないもう1つの酵素メチルトランスフェラーゼHaeIIIも、MHaeIIILMB32ビオチン断片5nMからの転写/翻訳によりinvitroで発現させ、ついでPTEの場合と同様にして炭酸塩およびコバルトで処理する。前記反応混合物の5μlアリコートを該ビーズ懸濁液に加え、該反応液を暗所中25°Cで1時間インキュベートする。該反応を、15μlの01M酢酸ナトリウムpH50の添加により停止させ、氷に移す。ついで各反応液をそれぞれ15μlの2つのアリコートに分割し、そのうちの1つを氷冷アルミニウムブロック表面上のパラフィルム層上にスポットとして配置する。ついでこのアリコートを、約6cmの距離に維持されたB100APUVランプUVPで2分間照射する。もう一方のアリコートは暗所中に放置する。ついですべてのビーズサンプルを室温で30分間インキュベートし、045μmMultiScreenHVフィルタープレートMilliporeMAHVN4510中、200μlのPBS、01Tween20で3回洗浄する各洗浄の合間に十分に再懸濁させる。ついでビーズ約2×107を、100ngμlAlexa488標識ウサギ抗EtBG抗体を含有する200μlのCOVApに再懸濁させ、室温で1時間、ついで4°Cで1時間インキュベートする。該ビーズを前記のとおりに200μlのPBS、01Tween20で3回洗浄し、ついで1mlのPBS、01Tween20に再懸濁させ、FACScanフローサイトメーターBectonDickinsonを使用して10000事象を分析する。図15から理解されうるとおり、ストレプトアビジンコート化ビーズの存在下のEtNPBzGluケージドビオチンのPTE触媒加水分解後およびUV照射後に平均ビーズ蛍光において20倍までの増加が認められる。これは、ホスホトリエステラーゼ活性を有しない別の酵素MHaeIIIの存在下であること以外は実質的に同様に処理したビーズと比較した場合に認められた増加である。注目すべきことに、蛍光シグナルの相違は、PTEおよびMHaeIIIの両方を対応遺伝子からinvitroで発現させinvitro転写/翻訳反応混合物の全内容物と共に加えた場合に認められる。認められる平均蛍光は、高い基質濃度においては、20μMにおいて認められるものより低い。また、20μMを超える基質濃度においては、暗所で維持された反応とUV照射された反応との間で蛍光シグナルにおける相違は実質的に全く存在しないデータは示していない。前記の反応条件下、該ビーズは、10μMを超える濃度で結合シグナルの飽和を示し始めるためついで蛍光標識抗EtBG抗体を加えることにより検出される生成物のもの、これらの結果は、EtNPBzGluケージドビオチンの調製物におけるETNPBzGluビオチン混入物の存在により説明されうる。また、これらの結果は、照射後に認められるシグナルの15程度の、暗所中すなわち、UV照射の不存在下でのアビジンへのケージドビオチンの既に認められているバックグラウンド固定化Sundbergら1995と符合する。既に認められている暗所darkシグナルは、ケージドビオチン調製物中の痕跡量のビオチンの混入、または該リンカーを含む該ケージドビオチンの成分とアビジンとの間の弱い相互作用のいずれかによるものであったSundbergら1995。どちらのメカニズムも、高濃度のケージドビオチン化基質および該ビーズの結合能以上において該暗所シグナルが有意になる理由を説明しうる。それにもかかわらず、20μM以下の基質濃度においては、該暗所シグナルは、該照射シグナルの25または更には10未満例えば、10μMEtNPBzGluケージドビオチンを構成するにすぎない。このことは、EtNPBzGluケージドビオチンのPTE触媒加水分解のほとんどが、該基質が溶液中に存在し該ビーズに結合していない時に生じること、および得られた生成物EtBzGluケージドビオチンが、UV光での照射後に脱ケージされ、該ミクロビーズ上に固定化されることを示している。実施例10ビーズに結合した遺伝子はinvitroで発現され、得られた遺伝子産物酵素は、触媒活性を保有したまま該ミクロビーズ上に固定化される。固定化された酵素は、ケージドビオチン化基質との反応を触媒し、ついで、得られたケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、その形成を引き起こした酵素をコードする遺伝子と共にこれらのビーズに結合する。ついでこれらのビーズはフローサイトメトリーにより検出される。遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるミクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含み、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物例えば、タンパク質または酵素をコードする遺伝子に結合した該遺伝子産物の複合体の形成につながる。ついでこれらの複合体を、リガンドへの結合に関して実施例12を参照されたい、または第2区画化反応を介した酵素活性に関して選択することが可能であろう。そのような複合体が触媒活性に関して選択されるためには、可溶性基質が該固定化酵素により利用可能であるべきであり、該触媒反応が完了したら、選択されるべき酵素活性を有する生成物は、この酵素をコードする遺伝子に結合すべきである。ついで、得られた複合体は、それに結合している生成物に基づき、例えば、該生成物を認識する蛍光標識抗体を使用することにより、分取または選択されうるであろう。所望の酵素活性を示さない遺伝子産物と遺伝子との複合体を含有する他の区画においては、該未反応基質は該遺伝子に結合するであろう。これらの複合体は、該生成物で標識されず、したがって除かれるであろう。酵素ホスホトリエステラーゼまたはPTEが、ミクロビーズに結合した遺伝子からinvitroで転写および翻訳されることが可能であり、その翻訳された酵素が該ミクロビーズに再結合することを、本実施例において示す。ついで、その翻訳された酵素は、活性部位コバルトを取込むように修飾されることが可能であり、それが該酵素コード遺伝子と共に該ミクロビーズに結合したままで、その触媒活性は維持される。ついで該固定化PTEはケージドビオチン化基質と反応し、生成したケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、PTEをコードする遺伝子が結合した同じアビジンコート化ビーズ上に捕捉される。ついでこれらのビーズは、フローサイトメトリーにより検出され、ホスホトリエステラーゼ活性を示さないタンパク質をコードする遺伝子を保持するビーズから明らかに区別される。095μmのストレプトアビジンコート化ミクロスフェアBangs、懸濁液1μl当たり約2×107ビーズの懸濁液のアリコートを、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心する。該上清を除去し、該ビーズをTNTバッファー01MTris75、015MNaCl、005Tween20に再懸濁させる。ビオチン化BioM5ビオチン標識抗Flag抗体Sigmaされており該Flagペプチドに結合しうる抗体を、平均104抗体ビーズまで該ビーズ懸濁液に加え、該混合物を数時間インキュベートする。該ビーズを、それを遠心し元の容積にまでTNTバッファーに再懸濁させることによりリンスする。ビオチン化DNA断片NFlagOPDLMB32ビオチン、またはT7RNAポリメラーゼプロモーターと、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位と、異なる酵素NFlagペプチドでもタグ付けされているものをコードする遺伝子とを保持する断片、例えばメチルトランスフェラーゼHaeIIINFlagMHaeIIILMB32ビオチンを抗体コート化ビーズの懸濁液に16nMの濃度で加え、該混合物を4°Cで一晩インキュベートする。該ビーズを、それをTNTバッファー中で遠心沈殿させ、再懸濁させることにより3回リンスする。前記のビーズ懸濁液約109個のビーズの50μlアリコートを、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心させる。該上清を除去し、該ビーズを、直鎖状鋳型用に設計された原核性invitro共役転写/翻訳系Lesleyら199150μlに、氷上で穏やかに再懸濁させる。T7RNAポリメラーゼ2000単位で補足されたこの系の市販の調製物EcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaを使用する。該反応液を25°Cで15時間インキュベートし、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心する。該上清を取り出し、該ビーズを100μlの50mMTris、10mM炭酸カリウムpH80に再懸濁させる。塩化コバルトの水溶液を1mMの濃度まで加え、該反応を室温で2時間インキュベートする。該ビーズを、それをTNTバッファー中で遠心沈殿させ、再懸濁させることにより4回リンスする。最後に、ビーズを元の容積にまでTNTバッファーに再懸濁させる。前記ビーズのアリコートを、50mMTrispH83中の025mMパラオキソンの溶液に加える。該ビーズを、種々の時間にわたり時々攪拌しながら25°Cでインキュベートする。該ビーズを、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心し、該上清を除去し、その光学密度を405nmで測定する。ビオチン化DNA断片NFlagOPDLMB32ビオチンを結合させついで前記のとおりに反応させたビーズの場合には、ビーズもしくはホスホトリエステラーゼの不存在下、またはNFlagMHaeIIILMB32ビオチンDNA断片が結合しており前記のとおりに反応させたビーズの存在下であること以外は同一である条件下で行なった反応と比較して、405nmにおける光学密度の有意な変化は認められない。つぎに、10μl約2×108個のビーズの前記ビーズを、マイクロフュージ中、10000gで3分間遠心し、該上清を除去する。該ビーズを、50mMTrispH83中の125または25μMEtNPBzGluケージドビオチン溶液10μlに再懸濁させる。該ビーズ懸濁液を、暗所中、25°Cで15時間インキュベートする。該反応を、10μlの01M酢酸ナトリウムpH50の添加により停止させ、氷に移し、それを、約6cmの距離に維持されたB100APUVランプUVPで2分間照射する。ついですべてのビーズサンプルを室温で30分間インキュベートし、045μmMultiScreenHVフィルタープレートMilliporeMAHVN4510中、200μlのPBS、01Tween20で3回洗浄する各洗浄の合間に十分に再懸濁させた。ついでビーズ約7×107個を、COVAp中で1125希釈されたウサギ抗EtBG血清125μlに再懸濁させ、4°Cで一晩インキュベートする。該ビーズを200μlのCOVApで1回、ついで200μlのPBS、01Tween20前記のとおりで3回洗浄し、ついで200μlのPBS、01Tween20に再懸濁させる。70μlの前記ビーズ懸濁液約2×107個を、PBS、01Tween20中の40ngμlFITC標識ヤギ抗ウサギFabJackson115095006溶液50μlに加え、室温で1時間インキュベートする。該ビーズを200μlのPBS、01Tween20前記のとおりで3回洗浄し、ついで1mlのPBS、01Tween20に再懸濁させ、FACScanフローサイトメーターBectonDickinsonを使用して10000事象を分析する。その結果、図16において理解されるとおり、Flagペプチドでタグ付けされたホスホトリエステラーゼをコードする遺伝子がFlagペプチドに結合する抗体と共に結合したビーズは、ホスホトリエステラーゼ活性を有さない酵素例えば、NFlagMHaeIIIをコードする他の遺伝子が結合した遺伝子から明らかに区別されうるであろう。実施例11invitroで転写および翻訳された大腸菌EcoliBirAは、油中水型エマルジョンの水性区画中の基質標識ミクロスフェアの蛍光特性に変化をもたらす反応を触媒する。大腸菌Ecoliにおいてinvivoでビオチン化されたプロピオニバクテリウムシャーマニイPropionibacteriumshermanii由来のペプチドをコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドBCCP5およびBCCP3を使用してベクターPinpointXa1Promegaから増幅する。該PCR断片を、BamIIIおよびHindIIIで消化されたベクターpET23dFLAG中、T7RNAポリメラーゼプロモーターおよびファージT7遺伝子10翻訳開始部位の下流に、N末端のFLAGペプチドコード領域と読み枠を合わせて、クローニングする。このベクターをpET23dFLAGBCCPと称する。ベクターpET23dFLAGは、後記スキーム2に示すとおり、N末端FLAGペプチドコード領域を含むように改変されたユニークなNcoI部位とBamHI部位との間の領域以外は、ベクターpET23dNovagenと同一である。該タンパク質のC末端にヘキサヒスチジンタグを付加するために、2つのオリゴヌクレオチドBCCPHisおよびBCCPHisをアニールさせ、ついで、SacIおよびNotIで消化されたベクターpET23dFLAGBCCP中に連結して、ベクターpETを得た。タンパク質FLAGBCCPHisFBHと称されるを、株C41DE3MirouxおよびWalker1996中で過剰発現させ、回収し、NiNTAアガロースQiagenを用いて該製造業者のプロトコールに従い天然条件下で精製する。洗浄バッファー50mMNaH2PO4pH80300mMNaCl20mMイミダゾールで4°Cで1時間かけて予め平衡化した等容量のアビジンアガロースSigmaと共にインキュベートすることにより、ビオチン化タンパク質を枯渇させる。ついでその懸濁液を10000gで2分間遠心分離し、該上清を貯留し、アリコートに分け、液体窒素中長期または4°Cで保存する。大腸菌EcoliBirAをコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドBirA5およびBirA3を使用するPCRにより、大腸菌EcoliBirA遺伝子を含有するpBluescript2SKベクターPWangからの贈呈物、未発表から増幅した。該PCR断片を、KpnIおよびXhoIで消化されたベクターpGEM4Z中、lacプロモーター、T7RNAポリメラーゼプロモーターおよび効率的ファージT7遺伝子10翻訳開始部位の下流に、クローニングする。ベクターpGEM4Zは、NcoI部位の下流に唯一のXhoI部位を含有するように以下のスキーム3に従い改変されたユニークなNcoI部位とKpnI部位との間の領域以外は、ベクターpGEM4ZNcolと同一である実施例8、スキーム1を参照されたい。DNA配列決定により、pGEMBirAと称されるその正確なヌクレオチド配列を有するクローンを同定する。前記のpGEMBirAプラスミドを、前記のプライマーLMB2およびLMB3を使用するPCRにより増幅して、T7RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位およびBirA遺伝子を担持する1139塩基対のPCR断片BirALMB23を得る。WizardPCRPrepsPromegaを使用して、該PCR断片を直接精製する。直径10μmの非蛍光性ヤギ抗マウスIgG標識ミクロスフェアBangsLaboratoriesCP03Nの60μLアリコート12×109個のビーズを、マイクロフュージ中で、約2600g6000rpmで3分間スピンをかける。上清を除去し、ビーズを60μLの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSAに再懸濁した。そのビーズを再びスピンし、60μLのM5抗FLAG抗体SigmaF4042に再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートした。そのビーズを再び3分間スピン2600gし、上清を除去し、ビーズを、30μLの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSAと前記のとおりに得られた30μLのFBHタンパク質との混合物最終タンパク質濃度は約4mgmlに再懸濁し、室温で1時間インキュベートした。一方、直鎖状鋳型用に設計された原核性invitro共役転写/翻訳系Lesleyら1991の60μLアリコートを、市販のキットEcoliS30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaに加えてT7RNAポリメラーゼ2000単位、10nMBirALMB23DNAまたは全くDNAを加えないを使用して調製した。これらのアリコートを25°Cで1時間インキュベートして翻訳させた。ビーズの60μLアリコートを、マイクロフュージ中にて、2600g6000rpmで3分間スピンし、上清を除去した。それを、60μLの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSAに再懸濁し、再度スピンし、上清を除去した。最後に、それを、3μLの2mMdビオチンと3μLの02MATPとを添加した前記原核性invitro共役転写/翻訳反応の54μLアリコートに氷上で再懸濁した。5μlアリコートを各反応混合物から取り出し、未エマルジョン化のままとした。残りの反応混合物の50μlを、TawfikおよびGriffithsに記載されているのと実質的に同じ方法でエマルジョン化した。油相は、鉱油SigmaM5904に45Span80Flukaを、次いで05Tween80SigmaUltraP8074を溶解することにより、新たに調製した。磁性バー8×3mm、ピボットリング付きScientificIndustriesInternationalLoughboroughUKで攪拌しながら、5mlBiofreezeVialCostar2051中の10mlの氷冷油相に氷冷反応混合物を徐々に10μlの5アリコートとして約2分かけて加えた。攪拌1150rpmを氷上で更に1分間継続した。すべての反応物を37°Cで4時間インキュベートして、ビオチン化反応を進行させた。該エマルジョンを15mlマイクロチューブに移し、マイクロフュージ中、135krpmで1分間スピンし、該油相を除去すると、濃縮されたしかし無傷のままのエマルジョンが該チューブの底に残った。200μlの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSAを加え、1mlへキサンで4回抽出し各ヘキサン添加の合間にボルテックスすることにより該エマルジョンを破壊した。SpeedvacFarmingdaleNY中の減圧下、周囲温度で10分間スピンすることにより、残留へキサンを除去した。ついで該破壊エマルジョンおよび該未エマルジョン化反応物由来の約1×108個のビーズを、045μmMultiScreenHVフィルタープレートMilliporeMAHVN4510中、100μlのTNTBSAで2回洗浄した各洗浄の合間に十分に再懸濁した。ついでビーズを、1μlのストレプトアビジンHRP溶液NENTSADirectキットを含有する50μlの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSAに再懸濁し、周囲温度で30分間インキュベートした。該ビーズを、前記のとおりに100μlの02MTris、10mMイミダゾールpH88で2回洗浄し、ついで50μLの02MTris、10mMイミダゾールpH88、001H2O2に再懸濁した。1μLのフルオレセインチラミドストック溶液製造業者の説明NENTSADirectキットに従い調製したものを加え、該反応を10分間進行させた。該ビーズを、前記のとおりにPBSで2回洗浄し、合計500μLのPBSに最終的に再懸濁し、それを5mlポリスチレン丸底チューブFalconに移し、FACScanフローサイトメーターBectonDickinsonを使用して10000事象を分析した。図17から理解されうるとおり、エマルジョン化反応および未エマルジョン化反応のどちらにおいても、invitroで翻訳されたBirAにより触媒される反応は、酵素が存在しない場合より強い蛍光を有するビーズをもたらす。invitroで翻訳されたBirAと共にエマルジョン中でインキュベートされたビーズは、エマルジョン中でインキュベートされていないビーズと比べてより蛍光性であることが分かる。実施例12遺伝子エレメントの蛍光の変化を用いて、結合活性を有するペプチドをコードする遺伝子エレメントを選択的に富化させることができる。蛍光標識された遺伝子エレメントはフローサイトメトリー分取により単離される。遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるマイクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含んでおり、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のマイクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物をコードする遺伝子に該遺伝子産物が結合した複合体の形成につながる。ついで、該結合相互作用がマイクロビーズの蛍光に変化を引き起こせば、これらの複合体を、フローサイトメトリー分取によりリガンドへの結合に関して選択することができる。pET23dベクターは、pET23dのポリリンカー領域に融合させたN末端FLAGペプチドをコードしている。pET23dをNcoIBamHIで消化し、ゲル精製し、水に再溶解する。2種の合成リン酸化オリゴヌクレオチドVhBioLtdNewcastleuponTyneUKFLAGおよびFLAGasを、各1μM濃度で水中で混合し、94°Cで3分間加熱し、室温まで冷ました後、該ライゲーション混合物中の消化されたベクターに付加させた。該ライゲーション反応物を未精製のまま使用して、大腸菌EcoliTG1を形質転換した。該インサートを含有するクローンを、KpnI消化により同定し、配列決定OswelResearchProductLtdSouthamptonUKにより確認した。pET23dのポリリンカー領域は以下のとおりである。ビオチン化FLAGHA発現構築物を、PCRによりpET23dベクターから準備した。プライマーFLAGHAおよび5ビオチン化プライマーpETrevbを使用して、インフルエンザ赤血球凝集素由来のペプチド配列YPYDVPDYAをpET23d中のFLAGタグに付加した。その増幅産物は903塩基長であり、該構築物のコード領域は以下のとおりである。該選択方法における競合構築物は、プライマーpETforおよびpETrevbを使用してpET23afolAから増幅されたジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする大腸菌EcolifolA遺伝子である。QIAquickGelExtractionキットQiagenを使用して、PCR断片をゲル精製した。DNA濃度をUV分光測光により測定した。PCRにより調製される発現構築物の希釈液は、HindIIIで消化されたラムダファージDNAから調製された05mgmlのキャリアDNA80°Cで40分間、ついでエタノール沈殿および水への溶解を用いて作製した。2×109個のストレプトアビジンコート化095μmポリスチレンビーズを含む100μlアリコートの1懸濁液BangsLaboratoriesIncCP01Nを、マイクロフュージ中で、約2600g6000rpmで3分間スピンした。上清を除去し、ビーズを100μLの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20、05BSATNTBに再懸濁した。7μlの2mgmlビオチン化抗FLAGモノクローナル抗体M5Sigmaを該再懸濁化ビーズに加え、該混合物を室温で2時間インキュベートした。抗体でコートした後、該ビーズを200μlのTNTBで3回洗浄し、100μlのTNTBに再懸濁し、10μlアリコート1および2ならびに40μlアリコート3および4に分割した。1純粋FLAGHADNAの07nMストック溶液、2純粋folADNAの07nMストック溶液、または3および41000倍過剰のfolADNAで希釈された純粋FLAGHADNAの07nMストック溶液のそれぞれを、HindIIIで消化されたラムダDNA中へと調製し、該ビーズアリコートにアプライした。結合反応を4°Cで一晩進行させた。ビーズ1個当たりの遺伝子の最大数は、アリコート1~3においては2、アリコート4においては02であった。FLAGHA構築物でコートされたビーズを陽性対照として、folAでコートされたビーズを陰性対照として用いた。4°Cで一晩インキュベートした後、該ビーズをTNTB中で2回洗浄し、T7RNAポリメラーゼ20単位μlを添加したS30invitro翻訳混合液S30ExtractSystemforLinearTemplatesPromegaに再懸濁した。氷冷invitro翻訳反応液を、磁性バー8×3mm、ピボットリング付きScientificIndustriesInternationalLoughboroughUKで攪拌しながら、05mlの氷冷油相5ml用CostarBiofreezeVial中で、鉱油SigmaM5904に45Span80Flukaを、次いで05Tween80SigmaUltraP8074を溶解することにより新たに調製したものに徐々に10μlの5アリコートに分けて約2分間かけて加えた。攪拌1150rpmを氷上で更に3分間継続した。ついで反応液を30°Cで90分間インキュベートした。該エマルジョンを15mlマイクロチューブに移し、マイクロフュージ中、65krpmで8分間スピンし、該油相を除去すると、濃縮されたしかし無傷のままのエマルジョンが該チューブの底に残った。200μlの01MTrisHClpH75、015MNaCl、005Tween20TNTを加え、1mlへキサンで4回抽出し各ヘキサン添加の合間にボルテックスすることにより該エマルジョンを破壊した。該ビーズ懸濁液に周囲温度で1~2分間通気することにより、残留へキサンを除去した。ついで該破壊エマルジョン由来のビーズを、045μmMultiScreenHVフィルタープレートMilliporeMAHVN4510中、100μlのTNTで2回洗浄した各洗浄の合間に十分に再懸濁した。ついでビーズを、100mUmlラット抗HAペルオキシダーゼ高親和性コンジュゲートBoehringerMannheimを含有するTNTBに106ビーズμlで再懸濁した。該ビーズを該抗体と共に周囲温度で30分間インキュベートし、200μlのTNTで3回洗浄した後、2mlの02MTris、10mMイミダゾールpH88に再懸濁した。HeatSystemsソニケーターを出力195サイクル、34mmチップで使用して、その懸濁されたビーズを氷上で1分間超音波処理した。該超音波処理ビーズを02MTris、10mMイミダゾールpH88に108ビーズmlで再懸濁させた。このビーズ懸濁液に、等容量のチラミンシグナル増幅TSAバッファー02MTris、10mMイミダゾールpH88、0004H2O2、5μgmlフルオレセインチラミンを加えた。フルオレセインチラミンは、HopmanらAnthonHNHopmanFransCSRamaekersErnstJMSpeelTheJounalofHistochemistryandCytochemistryvol467717771998により記載されているとおりに合成した。該反応を、室温で5分間進行させた後、110量のPBS中10ウシ血清アルブミンBSASigmaの添加により停止させる。標識反応液の2mlアリコート中のビーズをスピンダウンさせ、TNTB中で2回、およびPBS中で1回洗浄した。最後に該ビーズを2mlのPBSに再懸濁し、前記のとおりに超音波処理した。folA、FLAGHA、またはFLAGHAのfolA中1000倍希釈物をコードする遺伝子でコートされたビーズを、BectonDickinsonFACScanフローサイトメーター上で分析した。図18において、低解像度ヒストグラムAは、FLAGHADNAサンプル1を保持するビーズが陰性対照folAサンプル2より有意に強く蛍光標識されていることを示している。スパイクspiked混合物3および4は、少数の強度の蛍光性のビーズ以外は、陰性対照サンプルと大部分同様な結果であるパネルB。サンプル3中のビーズの004およびサンプル4中のビーズの002は、陽性事象の95をカバーする領域M1中に収まった。領域M1中に収まったサンプル3および4中のビーズを、MoFlo蛍光活性化セルソーターを使用して分取した。サンプル3および4の両方に関して、2組の分取ビーズを得た。第1組においては、500個のビーズを1個のチューブ中に集めた。第2組においては、96個のビーズを個々に96ウェルプレートのウェル中に集めた。どちらのビーズの組も、プライマーpETrevbおよびFLAGrev1を使用する35サイクルのPCRに付した。該増幅産物をゲル電気泳動により分析した図19。産物のサイズは、FLAGHAでは903塩基、folAでは1390bpである。該増幅反応産物のゲル電気泳動分析は、分取経過中の顕著な富化を示している。パネルAにおいて、未分取反応物3および4から増幅された産物のレーン上にはFLAHHAバンドは全く認められないが、分取ビーズ由来のサンプル中のFLAGHAバンドは強く認められる。増幅されたDNAの性質に関する信頼性のあるデータを、単一のビーズから増幅されたDNAの分析から得た。反応3では、96個中合計22個のビーズがDNA産物を生じ、これらの50は純粋なFLAGHAであった。反応4については、9個のビーズが産物を生じ、8個がFLAGHAであった。反応3に関する単一ビーズのデータは、適用した濃度名目上、DNA2分子ビーズにおいては、該ビーズのほとんどが、実際上、唯一つの遺伝子を結合して有し、該遺伝子はその産物との間に明白な結合を有することを示唆している。しかしながら、陽性標識ビーズ数の相対的な多さは、回収されたビーズの約50が偽陽性であったことを意味している。約01遺伝子ビーズだけしか存在しなかったサンプル4においては、回収されたDNAの純度は90に近かったが、このことは、1工程でのほぼ1000倍の富化を示している。オリゴヌクレオチド参照文献1AndersonCWStrausJWおよびDudockBSMethodsEnzymol101635442AndersonJECurrOpStructBiol32430AshMおよびAshI工業用界面活性剤のハンドブックHandbookofindustrialsurfactantsGowerAldershot3AtwellSWellsJAProcNatlAcadSciUSA96949795024BaccanariDPAverettDBriggsCおよびBurchallJBiochemistry16356672BaranyFPCRMethodsApplicl5165BaezSSeguraAguilarJWiderstenMJohanssonASおよびMannervikBBiochemJ32425286BassSGreeneRおよびWellsJAProteins8309147BecherPエマルジョン:理論および実践EmulsionstheoryandpracticeReinholdNewYorkBenitaS編マイクロカプセル化:方法および工業的応用Microencapsulationmethodsandindustrialapplications薬剤および薬学DrugsandpharmaceuticalsciencesSwarbrickにより編集JNewYorkMarcelDekker8BennerSATrendsBiotechnol12158639BermanJEisenbergSおよびTyeBKMethodsEnzymol1555283710BetlachLHershfieldVChowLBrownWGoodmanHMBoyerHWDNAのEcoRI制限切断および修飾を制御する細菌プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ解析ArestrictionendonucleaseanalysisofthebacterialplasmidcontrollingtheEcoRIrestrictionandmodificationofDNAFederationProceedings352037204311BlattnerFRおよびDahlbergJENatureNewBiol2372273212BougueleretLSchwarzsteinMTsugitaAZabeauM大腸菌のEcoRV制限切断および修飾系をコードする遺伝子の特性付けCharacterizationofthegenescodingfortheEcoRVrestrictionandmodificationsystemofEscherichiacoliNucleicAcidsRes1236597613BruRWaldeP逆転ミセルにおけるαキモトリプシンの生成物阻害ProductinhibitionofalphachymotrypsininreversemicellesEurJBiochem19995l03BruRWaldeP逆転ミセルにおけるエラスターゼの触媒活性CatalyticactivityofelastaseinreversemicellesBiochemMolBiolInt316859214BrynesPJAndradePGordonDトリプシン様プロテアーゼおよび膵臓エラスターゼ検出用の感受性蛍光基質SensitivefluorogenicsubstratesforthedetectionoftrypsinlikeproteasesandpancreaticelastaseAnalBiochem12644715CahillPFosterKおよびMahanDEClinChem371482516ChakrabartiACBreakerRRJoyceGFDeamerDWリン脂質小胞内に封入されたポリメラーゼタンパク質によるRNAの産生ProductionofRNAbyapolymeraseproteinencapsulatedwithinphospholipidvesiclesJMolEvol39555917ChamberlinMおよびRingJJBiolChem2482235224418ChangTM人工細胞中へのマイクロカプセル化により固定された複合酵素系によるNADの再生RecyclingofNADbymultienzymesystemsimmobilizedbymicroencapsulationinartificialcellsMethodsEnzymol136678219ChangTMSマイクロカプセル化に基づく人工細胞の最近の進歩Recentadvancesinartificialcellsbasedonmicroencapsulation医学および薬学におけるマイクロカプセルおよびナノ粒子Microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacypp323339CRCPressBocaRatonFlorida20ChapmanKBおよびSzostakJWCurropStructBiol461862221ChetverinABおよびSpirinASProgNucleicAcidResMolBiol512257022ClacksonTおよびWellsJATrendsBiotechnol121738423CormackBPValdiviaRHFalkowS緑色蛍光タンパク質GFPのFACS最適化突然変異体FACSoptimizedmutantsofthegreenfluorescentproteinGene24CraigDら2、3個のβガラクトシダ-ゼ分子測定用の、毛細管電気泳動レーザー誘導蛍光検出による蛍光に基づく酵素的アッセイFluorescencebasedenzymaticassaybycapillaryelectrophoresislaserinducedfluorescencedetectionforthedeterminationofafewβgalactosidasemoleculesAnalBiochem22614725CreaghALPrausnitzJMBlanchHW逆転ミセルにおける酵素の構造的および触媒的特性StructuralandcatalyticpropertiesofenzymesinreversemicellesEnzymeMicrobTechnol153839226CullMGMillerJFおよびSchatzPJProcNatlAcadSciUSA891865927DelagraveSHawtinRESilvaCMYangMMYouvanDC緑色蛍光タンパク質の赤方移動励起突然変異体RedshiftedexcitationmutantsofthegreenfluorescentproteinBiotechnologyNY13151428DemartisSHuberAVitiFLozziLGiovannoniLNeriPWinterGNeriDJMolBiol28661763329DickinsonEInWedlockDJエマルジョンおよび液滴の大きさ制御EmulsionsanddropletsizecontrolButterworthHeinemannOxfordVolpp19125730EhrigTOKaneDJPrendergastFG改変蛍光励起スペクトルを有する緑色蛍光タンパク質突然変異体GreenfluorescentproteinmutantswithalteredfluorescenceexcitationspectraFebsLett367163631EllingtonADおよびSzostakJWNature3468182232EllmanJMendelDAnthonyCSNorenCJおよびSchultzPGMethodsEnzymol2023013633FahyEKwohDYおよびGingerasTRPCRMethodsAppl1253334FieldsSSongOタンパク質タンパク質相互作用を検出するための新規遺伝学的システムAnovelgeneticsystemtodetectproteinproteininteractionsNature340245635FinchCAカプセル化および制御放出EncapsulationandcontrolledreleaseSpecPublRSocChem1383536FischIKontermannREFinnernRHartleyOSolerGAGriffithsADおよびWinterGProcNatlAcadSciUSA937761637FornusekLおよびVetvickaV細胞表面マーカー追跡用の診断用ツールとしての重合マイクロスフェアPolymericmicrospheresasdiagnostictoolsforcellsurfacemarkertracingCritRevTherDrugCarrierSyst21377438FreeseEJMolBioll8739FriedbergECWalkerGCおよびSiedeWDNA修復および突然変異誘発DNArepairandmutagenesisASMPressWashingtonDC40GoldLPoliskyBUhlenbeckOおよびYarusMAnnuRevBiochem647639741GreenRおよびSzostakJWScience2581910542GregoriadisGMethodsEnzymol442182743GriffithsADWilliamsSCHartleyOTomlinsonIMWaterhousePCrosbyWLKontermannREJonesPTLowNMAllisonTJらEmboJ1332456044GuixeVRodriguezPHBabulJ大腸菌ホスホフラクトキナーゼ2におけるリガンド誘導配座転移LigandinducedconformationaltransitionsinEscherichiacoliphosphofructokinase2Biochemistry37132697545HaberJMaslakiewiczPRodakiewiczNJWaldePナトリウムビススルホスクシネートイソオクタン逆転ミセルにおける、ウシ肝臓カタラーゼの活性および分光特性ActivityandspectroscopicpropertiesofbovinelivercatalaseinsodiumbissulfosuccinateisooctanereversemicellesEurJBiochem2175677346HabigWHJakobyWBMethodsinEnzymology7739840547HanesJPluckthunAリボソームディスプレイを用いた機能的タンパク質のinvitro選択および進化InvitroselectionandevolutionoffunctionalproteinsbyusingribosomedisplayProcNatlAcadSciUSA944937494248HauglandRH蛍光プローブおよび研究用化学薬品のハンドブックHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals第6版MolecularProbespp20125049HeimRTsienRY改良された輝度、より長い波長および蛍光共鳴エネルギー転移を目指した緑色蛍光タンパク質の遺伝子工学的作製EngineeringgreenfluorescentproteinforimprovedbrightnesslongerwavelengthsandfluorescenceresonanceenergytransferCurrBiol61788250HermansonGT生物結合技術BioconjugatetechniquesAcademicPressSanDiego51HochuliEDobeliHおよびSchacherAJChromatogr41l1778452HongSBRaushelFMBiochemistry381159116553HoogenboomHR高親和性抗体を生成するためのライブラリー選択戦略の設計および最適化DesigningandoptimizinglibraryselectionstrategiesforgeneratinghighaffinityantibodiesTrendsBiotechnol15627054HoogenboomHRらNuclAcidsRes914133413755HuangZら蛍光発生基質として36フルオレセインジホスフェートを用いた24ジニトロフェノールに対する高感度競合ELISAAsensitivecompetitiveELISAfor24dinitrophenolusing36fluoresceindiphosphateasafluorogenicsubstrateJImmunolMeth14926156JandaKDLoLCLoCHLSimMMWangRWongCHおよびLernerRAScience27594594857JestinJLKristensenPWinterGAngewChemIntEdEngl381124112758JohannssonAInPriceCPおよびNewmanDJ異種酵素免疫アッセイHeterogeneousenzymeimmunoassaysStocktonPressNewYorkVolpp29532559JohannssonAおよびBatesDLInKemenyDMおよびChallacombeSi第2酵素による増幅AmplificationbysecondenzymesJohnWileyChichesterVolpp8510660JonesLJら直接蛍光測定によるプロテアーゼ活性のアッセイ用の、消光されたBODIPY色素標識カゼイン基質QuenchedBODIPYdyelabeledcaseinsubstratesfortheassayofproteaseactivitybydirectfluorescencemeasurementAnalBiochem25114461JoyceGFCurropStructuralBiol433133662KadirFHおよびMooreGRFebsLett27681463KallenRGJencksWPホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸との縮合の機構ThemechanismofthecondensationofformaldehydewithtetrahydrofolicacidJBiolChem2415851586364KatanaevVLKurnasovOVおよびSpirinASFebsLett359899265KeijJFGroenewegenACVisserJWM高速光損傷細胞分取:ザッパー原型の評価HighspeedphotodamagecellsortingAnevaluationoftheZAPPERprototypeMethodsincellbiology4237135866KerkerMフローサイトメトリーにおける弾力性の光散乱および弾力性のない光散乱ElasticandinelasticlightscatteringinflowcytometryCytometry411067KlugAAnnNYAcadSci7581436068KlugAおよびSchwabeJWFasebT959760469KolbVAMakeyevEVKommerAおよびSpirinASBiochemCellBiol7312172070KowalczykowskiSCDixonDAEgglestonAKLauderSDおよびRehrauerWMMicrobiolRev584016571KrumdiekCLBaughCMプテロイルポリグルタメートの固相合成SolidphasesynthesisofpteroylpolyglutamatesMethodsEnzymolpp52452972KumarAKumarAKatiyarSS逆転ミセル水プールにおけるinvitroグルタチオンレダクターゼの活性および動的特徴ActivityandkineticcharacteristicsofglutathionereductaseinvitroinreversemicellarwaterpoolBiochimBiophysActa9961673LandegrenUKaiserRSandersJおよびHoodLScience24110778074LesleySABrowMABurgessRR大腸菌転写因子とコアRNAポリメラーゼとの相互作用を研究するために、およびモノクローナル抗体のエピトープマッピング用にポリメラーゼ連鎖反応で生成した鋳型からのinvitroタンパク質合成の使用UseofinvitroproteinsynthesisfrompolymerasechainreactiongeneratedtemplatestostudyinteractionofEscherichiacolitranscriptionfactorswithcoreRNApolymeraseandforepitopemappingofmonoclonalantibodiesJBiolChem2662632875LesleySAMethodsMolBiol372657876LeungDWChenEおよびGoeddelDVTechnique1111577LiaoHMcKenzieTおよびHagemanRProcNatlAcadSciUSA835768078LimFSunAMバイオ人工膵臓内分泌腺であるマイクロカプセル化された島組織MicroencapsulatedisletsasbioartificialendocrinepancreasScience2109081079LimF編マイクロカプセル化の生医学的応用BiomedicalapplicationsofmicroencapsulationBocaRatonFloridaCRCPress80LissantKJ編エマルジョンおよびエマルジョン技術EmulsionsandemulsiontechnologySurfactantScienceNewYorkMarcelDekker197481LissantKJ編エマルジョンおよびエマルジョン技術EmulsionsandemulsiontechnologySurfactantScienceNewYorkMarcelDekker198482LorenzWWMcCannROLongiaruMCormierMJウミシイタケルシフェラーゼをコードするcDNAの単離および発現IsolationandexpressionofacDNAencodingRenillareniformisluciferaseProcNatlAcadSciUSA8844384283LowNMHolligerPHおよびWinterGJMolBiol2603596884LowmanHBBassSHSimpsonNおよびWellsJABiochemistry3010832885LuisiPLBSH逆転ミセル溶液における酵素の活性および立体構造ActivityandconformationofenzymesinreversemicellarsolutionsMethodsEnzymol13618821686MaCKudlickiWOdomOWKramerGおよびHardestyBBiochemistry3279394587MackenzieNMPinderAC生医学的研究および診断へのフローマイクロ蛍光定量法の適用:概説TheapplicationofflowmicrofluorimetrytobiomedicalresearchanddiagnosisareviewDevBiolStand6418119388MagdassiSFrenkelMCartiNおよびCazanR9737737989MahajanNPLinderKBerryGGordonGWHeimRHermanB緑色蛍光タンパク質でプローブしたミトコンドリアにおけるBcl2およびBax相互作用、ならびに蛍光共鳴エネルギー転移Bcl2andBaxinteractionsinmitochondriaprobedwithgreenfluorescentproteinandfluorescenceresonanceenergytransferNatBiotechnol165475290ManleyJLFireASamuelsMおよびSharpPAMethodsEnzymol1015688291MaoQWaldeP逆転ミセルにおけるαキモトリプシンの酵素活性に対する基質効果SubstrateeffectsontheenzymaticactivityofalphachymotrypsininreversemicellesBiochemBiophysResCommun17811051292MaoQWaldePLuisiPL逆転ミセルにおけるαキモトリプシンの動的挙動。ストップドフロー研究KineticbehaviourofalphachymotrypsininreversemicellesAstoppedflowstudyEurJBiochem2081657093MasuiRKuramitsuS1アニリノナフタレン8スルホン酸を利用した大腸菌RecAタンパク質のDNA結合部位のプロービングProbingofDNAbindingsitesofEscherichiacoliRecAproteinutilizing1anilinonaphthalene8sulfonicacidBiochemistry3712l331214394MatayoshiEDら共鳴エネルギー転移によりレトロウイルスプロテアーゼをアッセイするための新規蛍光発生基質NovelfluorogenicsubstratesforassayingretroviralproteasesbyresonanceenergytransferScience24795495MattheakisLCBhattRRおよびDowerWJProcNatlAcadSciUSA919022696McCaffertyJGriffithsADWinterGおよびChiswellDJNature348552497MeltonDAKriegPARebagliatiMRManiatisTZinnKおよびGreenMRNucleicAcidsRes1270355698MendelDCornishVWおよびSchultzPGAnnuRevBiophysBiomolStruct244356299MengerFMYamadaKJAmChemSoc10167316734100MieleEAMillsDRおよびKramerFRJMolBiol17128195101MirouxBWalkerJEJournalofMolecularBiology260289298102MiyawakiALlopisJHeimRMcCafferyJMAdamsJAIkuraMTsienRY緑色蛍光タンパク質およびカルモジュリンに基づくCa2に対する蛍光指示薬FluorescentindicatorsforCa2basedongreenfluorescentproteinsandcalmodulinNature3888827103MizePDHokeRALinnCPReardonJEおよびSchulteTHAnalBiochem17922935104MockDMLangfordGDuBoisDCriscimagnaNHorowitzPAnalBiochem151178181105MontigianiSNeriGNeriPおよびNeriDJMolBiol258613106MooreMJNature3747667107MulbryWWKarnsJSJournalofBacteriology17167406746108NemotoNMiyamotoSatoEHusimiYおよびYanagawaHinvitroウイルス:3末端にピューロマイシンを有するmRNAの、それにコードされるタンパク質のC末端への、invitroでのリボソーム上での結合InvitrovirusBondingofmRNAbearingpuromycinatthe3terminalendtotheCterminalendofitsencodedproteinontheribosomeinvitroFEBSLetters414405408109NewRRC編リポソーム:実際的研究法。実際的研究法シリーズLiposomesapracticalapproachThepracticalapproachseriesRickwoodDHamesBDOxfordにより編集OxfordUniversityPress110NissimAHoogenboomHRITomlinsonIMFlynnGMidgleyCLaneDおよびWinterGEmboJ136928111NormanSOフローサイトメトリーFlowcytometryMedPhys7609615112OberholzerTAlbrizioMLuisiPLリポソームにおけるポリメラーゼ連鎖反応PolymerasechainreactioninliposomesChemistryandBiology2677682113OberholzerTWickRLuisiPLBiebricherCK自己再生中の小胞における酵素的RNA複製:最小細胞へのアプローチEnzymaticRNAreplicationinselfreproducingvesiclesanapproachtoaminimalcellBiochemBiophysResCommun2072507114OmburoGAKuoJMMullinsLSおよびRaushelFMJournalofBiologicalChemistry2671327813283115ParmleySFおよびSmithGPGene7330518116PedersonHHolderSSutherlinDPSchwitterUKingDSSchultzPGProcNatlAcadSciUSA9510523l0528117PelhamHRおよびJacksonRJEurJBiochem6724756118PerelsonASおよびOsterGFJTheorBiol8164570119PerezGMSanchezFAGarciaCF逆性ミセルにおけるリポキシゲナーゼの動的分析への活性段階プロットの適用ApplicationofactivephaseplottothekineticanalysisoflipoxygenaseinreversemicellesBiochemJ120PirrungHuangBioconjugateChemistry7317321121PosnerBALiLBethellRTsujiTおよびBenkovicSJBiochemistry35165363122QiXGrabowskiGA酸性βグルコシダ-ゼ:内在性蛍光ならびにリン脂質およびサポシンCにより誘導される立体構造変化AcidbetaglucosidaseintrinsicfluorescenceandconformationalchangesinducedbyphospholipidsandsaposinCBiochemistry37l1544115554123RobertsBEGoreckiMMulliganRCDannaKJRozenblattSおよびRichAProcNatlAcadSciUSA7219226124RobertsJWNature224116874125RobertsRWSzostakJWペプチドおよびタンパク質のinvitro選択のためのRNAペプチド融合体RNApeptidefusionsfortheinvitroselectionofpeptidesandproteinsProcNatlAcadSciUSA941229712302126RollandJMDimitropoulosKBishopAHockingGRおよびNairnRC1985フローサイトメトリーによる蛍光偏光アッセイFluorescencepolarizationassaybyflowcytometryJImmunolMethods761lO127RosenbergMWeissmanSおよびdecrombruggheBJBiolChem250475564128SaikiRKGelfandDHStoffelSScharfSJHiguchiRHornGTMullisKBおよびErlichHAScience23948791129SambrookJFritschEFおよびManiatisT分子クローニング:実験室マニュアルMolecularcloningalaboratorymanualColdSpringHarborLaboratoryPressNewYork130SavageMDMattsonGDesaiSNielanderGWMorgensenSおよびConklinEJアビジンビオチン化学:ハンドブックAvidinbiotinchemistryahandbookPierceChemicalCompanyRockford131SchickMJ非イオン性界面活性剤NonionicsurfactantsMarcelDekkerNewYork132ShapiroHMマルチステーションマルチパラメーターフローサイトメトリー:批判的批評および正当性MultistationmultiparameterflowcytometryacriticalreviewandrationaleCytometry3227243133ShermanPエマルジョン科学EmulsionscienceAcademicPressLondon134SiemeringKRGolbikRseverRおよびHaselhofJ緑色蛍光タンパク質の熱感受性を抑制する突然変異MutationsthatsuppressthethermosensitivityofgreenfluorescentproteinCurrentBiology616531663135SmithGPScience22813157136SoumillionPJaspersLBouchetMMarchandBJWinterGおよびFastrezJJMolBiol23741522137StemmerWPNature37038991138StemmerWPProcNatlAcadSciUSA911074751139StofkoHRCarrDWおよびScottJDFebsLett3022748140SunAMVasekITaiI生細胞および組織のマイクロカプセル化Microencapsulationoflivingcellsandtissues医学および薬学におけるマイクロカプセル化およびナノ粒子Microencapsulationandnanoparticlesinmedicineandpharmacypp315322CRCPressBocaRatonFlorida141SundbergらJAmChemSoc1171205012057142TawfikDSGreenBSChapRSelaMEshharZcatELISA:触媒抗体への容易な一般的経路catELISAafacilegeneralroutetocatalyticantibodiesProcNatlAcadSciUSA903737143TawfikDSLindnerABChapRKimSHGreenBSEshharZ免疫学方法マニュアルInImmunologyMethodsManualpp553559編ILefkovitsAcademicPressLondon144TawfikDSGriffithsAD分子進化のための人工の細胞様画分ManmadecelllikecompartmentsformolecularevolutionNatureBiotechnology16652656145TokatlidisKFriguetBDevilleBDBaleuxFFedorovANNavonADjavadiOLおよびGoldbergMEPhilosTransRSocLondBBiolSci3488995146TripetBYuLBautistaDLWongWYIrvinRTおよびHodgesRSProteinEngng910291042147TuerkCおよびGoldLScience24950510148vanHalDABouwstraJAJungingerHE局所適用のためのエストラジオールを含有する非イオン性界面活性剤小胞Nonionicsurfactantvesiclescontainingestradiolfortopicalapplicationマイクロカプセル化:方法および工業的応用Microencapsulationmethodsandindustrialapplicationspp329347MarcelDekkerNewYork149VossEW1993分光蛍光学法による分子相互作用の動的測定KineticmeasurementsofmolecularinteractionsbyspectrofluorometryJMolRecognit65158150WaldePGotoAMonnardPAWessickenMLuisiPLオパリン反応再考:ミセルおよび自己再生小胞におけるポリアデニル酸の酵素的合成OparinsreactionsrevisitedenzymaticsynthesisofpolyinmicellesandselfreproducingvesiclesJAmChemSoc11675417547151WaldePHanDLuisiPL逆転ミセルにおいて可溶化されたリパーゼの分光研究および動的研究SpectroscopicandkineticstudiesoflipasessolubilizedinreversemicellesBiochemistry32402934152WaldePPengQFadnavisNWBattistelELuisiPL逆転ミセルにおけるトリプシンの構造および活性StructureandactivityoftrypsininreversemicellesEurJBiochem1734019153WalkerGTFraiserMSSchramJLLittleMCNadeauJGおよびMalinowskiDPNucleicAcidsRes2016916154WangGTら共鳴エネルギー転移に基づいた新規の蛍光発生HIVプロテアーゼ基質の設計および合成DesignandsynthesisofnewfluorogenicHIVproteasesubstratesbasedonresonanceenergytransferTetrahedronLett316493155WeilPALuseDSSegallJおよびRoederRGCell1846984156WhateleyTLマイクロカプセル:界面重合および界面錯体形成による調製およびその適用法Microcapsulespreparationbyinterfacialpolymerisationandinterfacialcomplexationandtheirapplicationsマイクロカプセル化:方法および工業的応用InMicroencapsulationmethodsandindustrialapplicationspp349375MarcelDekkerNewYork157WickRLuisiPL酵素含有リポソームは、膜構成脂質を内生的に産生することができるEnzymecontainingliposomescanendogenouslyproducemembraneconstitutinglipidsChemBiol327785158WiderstenMおよびMannervikBJMolBiol25011522159WilliamsJWMorrisonJFおよびDugglebyRGBiochemistry18256773160WinterGGriffithsADHawkinsREおよびHoogenboomHRAnnuRevImmunol1243355161WyattJR1ChastainMおよびPuglisiJDBiotechniques117649162YamagishiJKawashimaHMatsuoNOhueMYamayoshiMFukuiTKotaniHFurutaRNakanoKおよびYamadaMProteinEng37139163YelamosJKlixNGoyenecheaBLozanoFChuiYLGonzalezFAPannellRNeubergerMSおよびMilsteinCNature3762259164ZaccoloMWilliamsDMBrownDMおよびGherardiEJMolBiol255589603165ZakrzewskiSF高特異的活性のトリチウム化されたジヒドロ葉酸の調製PreparationoftritiateddihydrofolicacidofhighspecificactivityMethodsEnzymolpp539166ZaugAJおよびCechTRBiochemistry25447882167ZaugAJおよびCechTRScience2314705168ZaugAJBeenMDおよびCechTRNature32442933169ZubayGAnnuRevGenet726787170ZubayGMethodsEnzymol6585677