"ヒト多能性幹細胞hPSまたは肝細胞前駆細胞precursorcellsを、肝細胞前駆体progenitors、肝細胞様細胞または成熟肝細胞に分化する方法であって:ihPSまたは肝細胞前駆細胞precursorcellsを二次元の表面に播種、生育して分化を開始する工程、iiさらなる分化および成熟化のために、工程iの初期分化した細胞を三次元の3Dスキャホールドに移す工程を含む方法。前記細胞が二次元と比べて3倍高い、5倍高いまたは10倍高いなど、より高い密度で三次元に播種される、請求項1に記載の方法。前記細胞が、ROCKRhoキナーゼの阻害剤などの細胞生存因子の存在下で播種される、請求項1に記載の方法。工程iまたはiiの少なくとも1つが、フィーダーフリーfeeder‐free条件下で行われる、請求項1~3のいずれかに記載の方法。工程iまたはiiの少なくとも1つが、ゼノフリーxeno‐free条件下で行われる、請求項1~4のいずれかに記載の方法。前記hPS細胞または肝細胞前駆体precursorsが、例えばゼノフリーhPS細胞系に由来するゼノフリー細胞である、請求項1~5のいずれかに記載の方法。前記hPS細胞が、ヒト胚性幹hES細胞である、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記hPS細胞が、人工多能性幹iPS細胞である、請求項1~7のいずれかに記載の方法。前記肝細胞前駆細胞precursorcellsが、体内胚葉DE細胞である、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記肝細胞前駆細胞precursorcellsが、胚体内胚葉DE細胞ではない、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記肝細胞前駆細胞precursorcellsが、胎児内胚葉の特徴を有する、請求項1~6のいずれかに記載の方法。前記肝細胞前駆細胞precursorcellsが、肝内胚葉の特徴を有する、請求項1~6のいずれかに記載の方法。工程iで得られた前記細胞が、4~15日などの2~25日後に3Dスキャホールドに移される工程ii、請求項1~12のいずれかに記載の方法。請求項1~13のいずれかに記載の方法であって、前記3Dスキャホールドが以下:i多孔性アルギン酸塩スポンジii生物分解性ポリウレタン尿素PUURポリマーiiiエマルジョンテンプレート型ポリスチレンiv合成ナノ繊維性複合材v少なくとも1つの非垂直側壁non‐verticalside‐wallをもつマイクロウェル装置viポリL‐乳酸PLLAから作られた多孔性スポンジの1つから選択される方法。前記3Dスキャホールドが、50~200μMの細孔径を有する多孔性アルギン酸塩スポンジである、請求項14に記載の方法。前記3Dスキャホールドが、15~45μMなどの0.1~1000μMの範囲の細孔径を有するエマルジョンテンプレート型emulsiontemplatedポリスチレンスキャホールドである、請求項14に記載の方法。前記3Dスキャホールドがコーティングされていない、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記3Dスキャホールドが、1つ以上の細胞外マトリックス成分で予めコーティングされる、請求項1~16のいずれかに記載の方法。前記1つ以上の細胞外マトリックス成分が、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサンまたは前述のいずれかの複合材を含むリストから選択される、請求項18に記載の方法。限定されないが、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、384ウェルプレート、1536ウェルプレートを含むマルチウェルプレートなどの好適な培養容器、または他の好適な細胞培養容器内に、前記スキャホールドが入れられる、請求項1~19のいずれかに記載の方法。前記肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsが、CYP2C9またはCYP3Aなどの1つ以上のCYPマーカーの発現の増加によって示されるように、代謝活性の上昇を示す、請求項1~20のいずれかに記載の方法。前記肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsが、B、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1などの1つ以上のトランスポータータンパク質の発現の増加を示す、請求項1~21のいずれかに記載の方法。非肝細胞と比較した肝細胞のまたは肝細胞前駆体progenitorsの割合が、10などの、20などの、30などの、40などの、50などの、60などの、70などの、80などの、90などの、100などの、5より大きい、請求項1~22のいずれかに記載の方法。前記肝細胞または肝細胞前駆体precursorsが、前記3Dスキャホールドで、限定されないが肝星細胞、肝免疫クッパーKuppfer細胞、肝内皮細胞、胆管上皮細胞または線維芽細胞から選ばれる少なくとも1つの他の細胞型と共培養される、請求項1~23のいずれかに記載の方法。CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、アルブミン、UGT2B7、AAT、TATを含むリストから選択される肝細胞関連の遺伝子マーカーのレベルの上昇を示すhPS由来肝細胞、肝細胞様細胞または肝細胞前駆体progenitor。3Dスキャホールドで培養されるかまたはされてきており、2D表面で生育した対応する細胞と比較して、前記マーカーCYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、アルブミン、UGT2B7、AAT、TATの1つ以上のレベルの上昇を示す、請求項25に記載のhPS由来肝細胞、肝細胞様細胞または肝細胞前駆体progenitor。請求項1~24のいずれかに記載の方法によって得られる、hPS由来の肝細胞または肝細胞前駆細胞progenitorcell。治療、再生医療における、薬物スクリーニング、毒性テストまたは薬物送達のための、請求項27に記載のhPS由来の肝細胞または肝細胞前駆細胞progenitorcellの使用。請求項1~28のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な、hPS由来の肝細胞または肝細胞前駆細胞progenitorcellを含む組成物。限定されないが、多孔性アルギン酸塩スポンジ、生物分解性ポリウレタン尿素PUURポリマー、エマルジョンテンプレート型ポリスチレンまたは合成ナノ繊維性複合材などの3Dスキャホールドをさらに含む、請求項29に記載の組成物。治療、再生医療における、薬物スクリーニング、毒性テストまたは薬物送達のための請求項29~30のいずれかに記載の組成物の使用。本発明の1つの態様は、ヒト多能性幹細胞hPSまたは肝細胞前駆細胞precursorcellsを、成熟肝細胞または肝細胞様細胞に分化する方法であって:ihPSまたは肝細胞前駆細胞precursorcellsを二次元の表面に播種して分化を開始する工程、iiさらなる分化および成熟化のために、工程iの初期分化した細胞を三次元の3Dスキャホールドに移す工程を含む方法に関する。細胞は、2D培養と比べて3倍高い、5倍高いまたは10倍高いなど、より高い密度で3Dスキャホールドに播種されうる。さらに、Rhoキナーゼrock阻害剤が加えられることがあり、および/または該方法は、フィーダーフリーfeeder‐freeまたはゼノフリー条件下で行われることができる。本発明に記載の方法に使用される細胞は、ゼノフリーhPS細胞系もしくはゼノフリーhPS細胞系由来の細胞などのゼノフリー細胞であってよく、または該細胞は、ヒト胚性幹hES細胞もしくは人工多能性幹細胞iPS細胞であってよい。本発明に記載の肝細胞前駆細胞precursorcellsは、胚体内胚葉DE細胞であってもなくともよく、胎児内胚葉または肝内胚葉の特徴を有してよい。工程iからiiの移行、すなわち、工程iで得られた細胞の移行が3Dスキャホールドに移される工程iiは、4~15日などの2~25日後に実施されうる。三次元スキャホールドは以下のタイプから選択されうる:i多孔性アルギン酸塩スポンジ、ii生物分解性ポリウレタン尿素PUURポリマー、iiiエマルジョンテンプレート型ポリスチレン、iv合成ナノ繊維性複合材v少なくとも1つの非垂直側壁non‐verticalside‐wallをもつマイクロウェル装置、viポリL‐乳酸PLLAから作られた多孔性スポンジ、または三次元スキャホールドは別の好適なタイプでありうる。多孔性アルギン酸塩スポンジは、50~200μMの細孔径を有しうる一方で、エマルジョンテンプレート型ポリスチレンスキャホールドの細孔径は、15~45μMなどの0.1~1000μMの範囲にある。さらに、本発明は、上記のように3Dスキャホールドがコーティングされてない方法に関する。別の態様では、3Dスキャホールドは、例えば1つ以上の細胞外マトリックス成分で予め被覆される。細胞外マトリックス成分の例は、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリシン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ヒアルロナンヒドロゲル、絹フィブロイン、キトサン、または前述にいずれかの複合材を含む。本発明の3Dスキャホールドは、限定されないが、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、384ウェルプレート、1536ウェルプレートを含むマルチウェルプレートなどの好適な培養容器、または他の好適な細胞培養容器内に入れられうる。したがって、本明細書において詳しく述べられる発明は、より肝臓の表現型を有する細胞または部分的もしくは完全に成熟した肝臓の表現型を最終的に有する細胞へのhPS細胞の分化を向上するのに使用される方法を含み、この方法は、細胞が最初に二次元培養表面で培養された後に6つの可能性のある三次元のスキャホールドの1つに移されることを必要とする。この肝臓表現型の向上は、いかなる特定の培養培地組成に依存しない用いた細胞培養プロトコールについては図9を参照されたい。遺伝子発現および代謝研究に基づいて、本発明の発明者らは、従来の2D基質基と比較して、3DスキャホールドがhPS由来肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsの成熟およびさらなる分化に、より良好な環境を提供することを見出した。さらに、該発明者らは、細胞を3D環境に播種する前に2D表面で細胞を培養した際に、さらなる効果を見出した。このことは、細胞系、マトリックスコーティング、培養日数または選択されたスキャホールドにかかわらず、そのすべてが2D表面より3Dスキャホールドで培養された細胞においてより高度に発現されるCyp2C9、アルブミン、Cyp3A4、およびUGT2B7などの幾つかの肝臓マーカー遺伝子の発現を比較することによって見られることができる。具体的には、3Dで培養されたとき、多くの肝臓トランスポーターB、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1がより一層高いレベルで発現され、より成熟した、機能的な肝細胞を示している。これは、Ultraweb図3およびAggrewell図5などの局所的なスキャホールド、AlgiMatrix図2およびポリ‐L‐リジン図6などの多孔性スポンジタイプを含むさまざまな異なるスキャホールドタイプ、ならびにArtelon図1およびAlvatex図4などの合成ポリマーに基づくスキャホールドで見られることができる。3Dスキャホールドは、肝細胞が通常遭遇する生体内微環境に、より類似するようにマトリックス成分で予め被覆されうる。具体的には、マトリックス成分であるゼラチンおよびマトリゲルがスキャホールドと併せて使用されたとき、幾つかの肝臓マーカーの発現レベルを向上することが示されている。数個のマーカーTAT、CYP2C9、OATP2の発現は、マトリゲルでコーティングしたArtelonArtimplantでは、コーティングしてないものと比較してより高い図1CE;図1AD。多くのマーカーTATおよびUGT2B7が、マトリゲルでコーティングされたAlvatexで、コーティングしてないものと比較して著しく高度に発現されており図4FG、18日目に分析、またこのことは、他の幾つかのマーカーTAT、UGT2B7などのにも当てはまり、それらはゼラチンでコーティングされたAlvatexでコーティングしてないものと比較してより高い程度に発現されている図4EG。本発明のこの特定の実施形態は、どのマーカーが高い程度に発現されるが見られるのが望ましいかに応じて随意に適用されることができる。特定のセットのマーカーの発現は、肝臓系統のある特定の表現型または段階を示唆すると思われるので、本発明のこの態様の適用により、生成された肝細胞の機能性のより細かい制御が可能になりうる。この態様の拡張は、3Dスキャホールドに播種されたhPS細胞またはhPS由来肝臓前駆体progenitorsへの1つ以上の異なる細胞型の追加でありえ、3Dスキャホールドでの細胞系の共培養を可能にする。とりわけ、細胞は、異なる相対的な密度で3Dスキャホールドに播種されうる。相対的な密度は、標準×1密度すなわち2D対照表面に播種された細胞と同じ密度もしくは3倍高い初期密度×3と表わすもしくは10倍高い密度またはその間の任意の密度でありうる。図1HおよびIは、コーティングしてないArtelonArtimplantを使用したとき、マーカーOATP2、OCT1およびTATの発現が、×1より低い初期密度で播種された細胞においてより高いことを示す。また、ある特定のマーカー例えばCYP7AIの発現は、×1で播種された細胞と比較して、×3でコーティングしてないAlvatexに播種された細胞でより低い図4NおよびOが、他のマーカーOCT1などは、×3でコーティングしてないAlvatexに播種された細胞においてより高い発現を有する図4IおよびK。したがって、この特定の実施形態の適用は、この場合もやはり使用者によって求められる肝細胞の所望の表現型に依存する。分化の制御を可能にするには、細胞が3Dスキャホールドに播種される分化の段階が関連し、すなわち3Dスキャホールドに播種される前により長期間培養されるとより成熟した表現型になる。hPS細胞は、分化の異なる数段階において、例えば、未分化細胞0日目として、もしくはアクチビンAで処理して胚体内胚葉に誘導後4~7日目、または3Dスキャホールドでの成熟のための肝臓の前駆体precursors9、11、13、14および15日目としてスキャホールドに播種できる。そのような前駆細胞precursorcellsの特徴付けが実施され、両段階に特徴的な定義されたマーカーの発現に基づいて、それら細胞が、スキャホールド図11に播種する前に胚体内胚葉系統、またはより進んだ肝細胞前駆体precursor図12であることを決定することができる。違いはArtelonArtimplantで培養された細胞で容易に観察され、例えば14日目に播種した細胞におけるOCT1の発現レベルは、11日目に播種したものと比較してほぼ2倍である図1FH。これとは対照的に、OATP2のレベルは、14日目に播種した細胞において、11日目に播種したものと比較して減少している図1JM。また、この傾向は、Alvatexで培養された細胞にも見ることができ、この場合もやはり、14日目に播種した細胞は、11日目の細胞より低い発現レベルのOATP2を有し、OATP2が、より未成熟肝細胞表現型のマーカーである可能性を示している図4IJ。同様の方法では、OCT1のレベルもまた、より成熟した14日目よりも、より若い11日目ときに播種された細胞のほうが高い図4NP。よって、細胞培養および分化期間の長さは、生成される細胞の最終的な表現型を制御するという点で本発明の重要な因子であり、適宜に変えることができる。図9および下表に概説したように、培養の期間および培地組成は調整され、本明細書において開示される方法によって得られる細胞の成熟度および発達段階を最適化しうる。関連する態様は、細胞がスキャホールドに播種される前に供される分化管理体制regime、実施例2で詳しく述べられるように、特に細胞がRhoキナーゼROCKの阻害剤を含有する培地に曝されるか否かに関係し、そのような阻害剤は、2Dおよび3D段階の両方において継代および播種後に細胞の生存および再付着を向上するのに使用される。従来の2D表面で培養されたものと比較して、3Dスキャホールドに播種された肝細胞では、機能および代謝活性における向上が観察されている。実施例6に従って3Dスキャホールドで成熟したhESC由来の肝細胞は、薬物フェナセチンAPAP、ミダゾラムまたはジクロフェナクに曝されたとき、2D対照培養と比較して、より大きいCYP活性の誘導を示し図7および8、10、AlvatexスキャホールドはUltrawebより大きい誘導を示した。AlvatexReinnervateで培養された細胞のさらなる試験により、それらの細胞は、分化開始後23日目および29日目の両日においてCYP2C9活性によって測定した際、2D表面で培養された細胞と比較して、より一層大きな代謝活性を有することが示された。CYP2C9活性は、3D表面で培養された細胞では既に高かったが、細胞がジクロフェナクで処理されたとき上昇することも観察された図8。このことは、3Dスキャホールドで分化された肝細胞がやはり、2D培養された細胞と比較して優れた代謝幹細胞機能を有することを示す。これらの結果は、重要な肝臓のマーカーCYP3Aのレベルもまた、薬物ミダゾラムの代謝分解産物について細胞がアッセイされたとき2D対照と比較してマトリゲルでコーティングされたAlvatexReinnervateで培養された細胞ではより高く、Ultrawebで培養された細胞ではわずかに高いという結果をよって裏付けられている図8。よって、本発明は、3Dスキャホールドで培養された細胞における肝臓の代謝活性の向上の幾つかの例を示している。したがって、上記のように、本発明の態様は、CYP2C9もしくはCYP3Aなどの1つ以上のCYPマーカーの発現の増加、および/またはCYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、アルブミン、UGT2B7、AAT、TATを含むリストから選択される肝細胞関連遺伝子マーカーレベルの上昇で示されるように、肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsが代謝活性の上昇を見せる方法に関する。さらに、本発明の態様は、肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsが、B、FABP1、MRP2、NTCP、OATP2、OCT1などの1つ以上のトランスポータータンパク質の発現の増加を見せる方法に関する。本方法は、上記のように、非肝細胞と比較した肝細胞のまたは肝細胞前駆体progenitorsの割合が、10などの、20などの、30などの、40などの、50などの、60などの、70などの、80などの、90などの、100などの、5より大きいことを促しうる。前記肝細胞または肝細胞前駆体progenitorsが、前記3Dスキャホールドで、限定されないが肝星細胞、肝免疫クッパーKuppfer細胞、肝内皮細胞、胆管上皮細胞または線維芽細胞から選ばれる少なくとも1つの他の細胞型と共培養される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。したがって、上記のように、本発明の態様は、本明細書において記載されている方法によって得ることが可能なhPS由来肝細胞もしくは肝細胞前駆細胞progenitorcells、またはhPS由来細胞もしくは肝細胞前駆細胞progenitorcellsを含む組成物に関する。さらに、本発明の態様は、治療、再生医療における、薬物スクリーニング、毒性テストまたは薬物送達のための、本明細書において記載されている方法によって得らことが可能なhPS由来肝細胞もしくは肝細胞前駆細胞progenitorcellsまたはhPS由来細胞もしくは肝細胞前駆細胞progenitorcellsを含む組成物の使用に関する。さらに、組成物は、限定されないが、多孔性アルギン酸塩スポンジ、生物分解性ポリウレタン尿素PUURポリマー、エマルジョンテンプレート型ポリスチレンまたは合成ナノ繊維性複合材などの3Dスキャホールドを含みうる。実施例1ヒト多能性幹細胞由来の肝細胞の出発材料hPS細胞上記で定義されたすべてを、本発明の出発材料として使用することができる。下の例では、肝細胞様細胞を、mEF細胞上で培養した未分化ヒト胚性幹細胞hESCからインビトロで生成したHeins,N.etal.2004,StemCells。この実験に使用する細胞系は、限定されないがhES細胞系SA002、SA121、SA181、SA461CellartisAB、Goteborg、スウェーデン、http://www.cellartis.comであり、Heins,Nらによる2004年の記載のように増殖させることができる。これらの細胞系は、NIH幹細胞レジストリーtheNIHstemcellregistry、英国幹細胞バンクtheUKStemCellbankおよび欧州hESCレジストリーtheEuropeanhESCregistryに載っており、依頼に応じて入手可能である。hESCから得られるhPSと並んで、hiPS人工多能性幹細胞から得られるhPSを本発明の実施例のための肝細胞の誘導に使用している。この場合、hiPS‐HEPとは、アルブミン、CYP3A4、UGT2B7、OATP‐2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19およびCYP2D6などの成熟した肝臓のマーカーを発現している人工多能性幹細胞に由来する細胞型を意味することを意図する定義も参照されたい。ゼノフリーiPS細胞またはSA611CellartisAB、Goteborg、スウェーデン、http://www.cellartis.comなどのゼノフリー由来hES細胞系を使用することにより、随意に発明全体をゼノフリー状態下で使用してゼノフリー細胞生成物を作製することが可能になりうる。実施例23Dスキャホールドを使用したヒト多能性幹細胞からの肝細胞の誘導以下に詳しく述べるように、肝細胞をプロトコールa~eに従ってhES細胞およびヒトhiPS細胞の両方から生成した。分化の開始前に、培養物をPBSで2回洗浄した。異なる培地表1を、0日目からそれ以降、プロトコール概説に従って新たに調製して加えた。培地を、初期分化ID段階の間は毎日または1日おきに交換し、それ以降は1日おきまたは2日おきに交換した。各実験に対して1つ細胞系のみを使用したが、細胞の共培養が可能な3Dスキャホールド上に第一の細胞系を播種する場合、随意に第二またはより多くの細胞系を追加することもできた。2D培養をゼラチンをコーティングした培養容器に播種した実験114および116以外は、2D培養をマトリゲルでコーティングした培養容器に播種した。2D培養では、150,000~200,000細胞/cm2で播種した。下表は、種々の実験の概要、どの細胞系を出発材料として使用したか、図9で概説される分化プロトコールの変形、細胞を3Dスキャホールドに播種した分化プロトコールの日time、細胞を分析した分化の日timeofdifferentiation、およびスキャホールドに播種した時点で10mMのROCK阻害剤を培地に加えたか否か用いたプロトコールの詳細な図解については図9も参照されたいを示す。実施例3スキャホールド試験に使用したスキャホールドおよびマトリックスコーティングArtelonArtimplant;細孔径<150pm、48ウェルプレート用にフォーマットArtelonArtimplantVastraFrolunda、スウェーデンの厚意により提供国際公開第0035507号、またBlumenthal,B.etal.2010を参照されたい。Alvatex;48ウェル用サイズ、StefanPrzyborskiRelnnervateDurham、英国の厚意により提供国際公開第07125288号、国際公開第10038013号を参照されたい。AlgiMatrix;Invritogen/ギブコGibco、カタログ番号12684、ロット番号731950、96ウェル実験088089国際公開第08112904号、またShapiro,LCohen,S.1997を参照されたい。UltraWeb;コーニングCorning、カタログ番号3873xx、ロット番号09207043、96ウェル実験088089国際公開第09032117号、国際公開第10060066号、またPiryaei,A.etal.2010を参照されたい。Aggrewell;StemCellTechnologies、カタログ番号27865、およそ300マイクロウェル国際公開第20081067711号を参照されたい。HAC/Porocell;HacBiomed;CellTransplant.1997Sep-Oct;65:463-8幹細胞用三次元培養系としての高度に多孔質のポリマーマトックスHighlypolymermatricesasathree-dimensionalculturesystemforhepatocytes.KaufmannPM,HeimrathS,KimBS,MooneyDJ.3Dスキャホールドおよび2D培養皿の使用前調製:ArtelonArtimplantおよびAlvatexスキャホールドを、70EtOHに浸し、EtOHを取り除き、スキャホールドをDPBSで2回洗浄した。マトリゲル:BDからの低増殖因子マトリゲル、ロット番号0934を、DPBS中で0.016mg/mLに希釈し、スキャホールドおよび2D培養皿に加え、室温で少なくとも1時間インキュベーションした後、マトリゲルを使用直前に取り除いた。ゼラチン:製造用ゼラチンgelatinfromproductionを、スキャホールドおよび/または2D培養皿にを加え、室温で少なくとも30分間インキュベーションし、次にそのゼラチンを使用直前に取り除いた。実施例4hES細胞培養の継代および維持培養細胞から培地を取り除き、培養物をDPBS-/-37°C、0.5mL/cm2で2回洗浄した。TrypLESelectを加え室温、0.1mL/cm2、37°Cにて未分化細胞またはアクチビンA処理後の細胞については4~5分間、前記細胞progenitor段階にある細胞については10~45分間インキュベーションした。次に、p1000で細胞を流して細胞を剥がした。VitroHESを加え37°C、0.1mL/cm2、細胞懸濁液を遠心分離チューブに移し、330×gで5分間室温にて遠心分離した。細胞ペレットを、培養培地で懸濁して細胞を数え、適切な播種懸濁液に希釈した。幾つかの実験実験113、114、116、118、119、120では、播種する日に10mMのRock阻害剤を培養培地に加えた。実施例53Dスキャホールドで培養したhESC由来肝細胞の遺伝子発現分析図の説明に示したように、mEF層上でDEF培養系またはSA002培養から培養した細胞系SA002、SA121、SA181、SA46からhESC-HEPを生成した。18、22、24、25および30日目に、キアゲンのRNA単離キットを使用することによってhES‐HEP培養物から全RNAを回収し、単離した。Taqmanプローブを使用することによって、定量逆転写酵素PCR、QrtPCRを以下の肝臓マーカー遺伝子について行った:第1相薬物代謝酵素:CYPシトクロムP4501A2、2C9、3A4、7A1、第2相薬物代謝酵素GSTA1グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼglutation-S-transferasA1、UGT2B7UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ2B7、第3相、トランスポーター、MRP2多剤耐性タンパク質multi-drugresidenceprotein2、ABCC2とも称される、B胆汁酸塩排出ポンプ、NTCP溶質輸送体、ナトリウム/胆汁酸共トランスポーター、OCTI溶質輸送体、有機カチオントランスポーター、OATP2溶質輸送体、有機アニオントランスポーター、FABP1脂肪酸の取り込み、輸送、および代謝に関与する脂肪酸結合タンパク質、および一般的な肝臓マーカー:AATアルファ‐1抗トリプシン、ADHIAアルコールデヒドロゲナーゼ1AALBアルブミンおよびTATチロシンアミノトランスフェラーゼ。他に指示がある場合を除いて、データすべてを、ハウスキーピング遺伝子であるCREBBPに対して正規化した。他に指示がある場合を除いて、2D対照に対する倍率変化foldchangeとしてデータを提示する。データは図1~4に示され、2Dと比較して3D培養したとき、hESC‐HEPにおいて肝臓の遺伝子が、より高いレベルで発現されることを示している。3D培養における他の肝臓マーカーの発現レベルの上昇は、3D培養がhESCの肝臓への分化に重要であるという発見を支持する。実施例6CYPアッセイ16、18、20、21および25日目に、基質であるフェナセチン、ジクロフェナクおよびミダゾラムを、それぞれ最終濃度、26pM、9pMおよび3pMで、0.1ペニシリンストレプトマイシン、2mML‐グルタミンおよび25mMHepesを補充したフェノールレッドを含まないWilliams培地E中でインキュベーションすることによって、hESC由来肝細胞培養をシトクロムP4501A、2Cおよび3A活性について分析した。ウェル表面1cm2当たり100μLの容積例えば48ウェルでは75μLの希釈した基質を加えた。基質とともに、hESC由来肝細胞培養を一晩インキュベーションした。16時間後、培地を回収し、それに続いて10000gで4°Cにて20分間遠心分離した。シトクロムp450酵素CyplA2、1A1フェナセチンCyp2C9、2C8ジクロフェナクおよびCyp3A4、3A5ミダゾラムによって生物学的に変換されたbiotransformed代謝産物であるパラセタモール、4‐OH‐ジクロフェナクおよび1‐OHミダゾラムの存在について、液体クロマトグラフィー‐質量分析LC‐MSLCMSにより試料を分析した。実施例7Reinnervateスキャホールドで培養した細胞におけるCyp2C9活性の向上およびCYP2C9活性の誘導の向上実施例1および2、実験083の条件、次いで以下のスキームに従って、細胞系SA461CellartisABを培養して分化させた。上で適用した成長培地組成物。分化は15日目まで実施され、15日目にスキャホールドを24ウェルプレートに合うように小さい円に切った。AlvatexRelnnervateスキャホールドを、70EtOHで洗浄し、EtOHを取り除き、ウェルをPBS/で2回洗浄した。マトリゲル:GFRマトリゲルロット番号6741を、DPBSで0.016mg/mLに希釈し、1ウェル当たり、スキャホールド当たり500uLをスキャホールドに加えた。スキャホールドを、~1時間室温にてマトリゲルとインキュベーションした。マトリゲルを使用の直前に取り除いた。目的は、2Dウェルに1.5:1の分割比で播種することであった。AlvatexRelnnervateでは、5倍多くの細胞を播種し、7.5:1の分割比であった。9.6cm2の27ウェル、つまり260cm2で開始。AlvatexRelnnervateスキャホールドでは、1cm2当たり100uLを播種するために、細胞を260/7.5×0.1=34.63.46mLに懸濁した。27ウェルの細胞を、DBPS/で1回洗浄し、1ウェル当たり2mLのTrypleSelectを加え、23分間37°Cでインキュベーションした。遠沈した培地を加え、細胞を流して剥離した。細胞を回収し、5分間400×gで遠心した。3.46mLの播種培地に再懸濁した。AlvatexRelnnervateスキャホールド当たりこの懸濁液を200μL播種した。600μLの懸濁液を5倍に希釈し、2Dウェル当たりこの200μlを播種した。次に、全ウェルに培地を加えて、1ウェルにつき総量800μlとした。細胞カウント:27.9×106細胞/mL生存率87、総量3.46mL、合計96x106個の細胞誘導:細胞を、1mMフェノバルビタール、10μMデキサメタゾンおよび5μMβ‐ナフトフラボンで誘導した。これらの溶液を得るために、100μLの64mMデキサメタゾン溶液を、540μLのDMSOに希釈し、10mMデキサメタゾン溶液を得た。11.4mgのβ‐ナフトフラボンを8.446mLのDMSOに溶かし、5mM溶液を得た。1Mフェノバルビタールを、PBSで1:1で希釈した。35mLM6Dex含まずに、35μLの10mMdex、35μLの5mMβ‐ナフトフラボンおよび70μLの0.5Mフェノバルビタール。酵素活性をベースライン酵素活性と比較できるように、対照培地非誘導培地はDMSOを含有しなかった。各ウェルに、誘導または対照培地のいずれか2D培養では400μL/ウェル、Relnnevateスキャホールドでは2000μL/ウェルを加え、プレートを24時間インキュベーションした。活性アッセイ:誘導の24時間後、全ウェルをDPBS/で2回洗浄し、活性アッセイ培地を加えた:2D対照では200uL/ウェルおよびRelnnervateスキャホールドでは1000uL/ウェル。活性アッセイ培地:0.1PEST、2mML‐グルタミン、25mmHEPESならびに26uMフェナセチン、3uMミダゾラムおよび9uMジクロフェナク含有WEからなるフェノールレッドを含まない無タンパク質培地。37°Cで16時間インキュベーションした後、培地をエッペンドルフチューブに移し、20分間4°Cにて10000gで遠心した。ジクロフェナクの代謝産物であるOH‐ジクロフェナクの存在について、上澄みをHPLCによって分析した。実施例8スキャホールドに播種したときに、細胞が胚体内胚葉または肝臓前駆体precursorsに分化していることの検証肝細胞への分化に使用したプロトコールを、内胚葉誘導工程後の胚体内胚葉細胞、プロトコールaに従って培養した細胞の形成について分析した図11。分化プロトコール中の7日目に、細胞をRNA用に採取し、リアルタイムPCRで分析し、実験の開始0日目からの未分化細胞と比較した。分化プロトコールにより、胚体内胚葉マーカーFOXA2、SOX17、HHEX、CXCR4、CER1を発現する細胞が生成されることが示された。さらに、未分化細胞のマーカーNanogおよびOCT4が、未分化出発材料に比べて下方制御されていることが確かめられた。くわえて、胚体外内胚葉マーカーSox7およびCDX2は内胚葉誘導の間に増加しないので、細胞がこれらの遺伝子を発現していることを確認した。同様の方法を採用して、スキャホールド肝前駆体precursorsとして播種された細胞が実際にこの表現型を保有することを検証した図12。"