"土壌DNAを抽出し、ダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子βtubulinのみを特異的にPCR増幅させ、土壌中におけるダイズ黒根腐病菌を迅速検出する方法。請求項1に記載のダイズ黒根腐病菌のマーカー遺伝子βtubulinのみを増幅する、配列表に示す配列番号1と配列番号2からなるプライマーセット。土壌試料からのダイズ黒根腐病菌の検出は難しく、定量的な解析は不可能であった。ダイズ黒根腐病菌の検出には、その土壌に生えている病徴を示すダイズ植物体試料から検出するしかなく、土壌試料を用いて迅速にダイズ黒根腐病菌を検出する必要があった。土壌試料から全DNAを抽出し、ダイズ黒根腐病菌に特異的なマーカー遺伝子をターゲットとするプライマーを用いてPCR増幅し、増幅産物をアガロースゲルで電気泳動して、ダイズ黒根腐病菌マーカー遺伝子を検出する。土壌DNAの抽出方法土壌試料を60°Cで乾燥し、約05g秤量する。土壌試料をDNA抽出キットSoilDNAIsolationKit,MOBioを用いて、土壌中の全DNAを抽出する。土壌試料の採取方法一つの圃場から数点ずつ土壌試料を採取する。採取点数は、面積が一反10アールにつき最低4地点から採取する。深さは表面から5cmの間とし、約500g採取する。採取した土壌試料は、解析に供するまで冷蔵保存する。土壌試料の前処理方法土壌試料生土を、60°Cで24時間通風乾燥する。乾燥土壌試料を、乳鉢を用いて微粉砕する。土壌DNAの抽出方法乾燥土壌試料を、約05g秤量する。土壌試料を土壌DNA抽出キットSoilDNAIsolationKit,MOBioを用いて、土壌中の全DNAを抽出する。マーカー遺伝子を増幅するプライマーの作成土壌中のダイズ黒根腐病菌を検出するためには、ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のみをPCR増幅する必要がある。ダイズ黒根腐病菌が持つ遺伝子のうち、配列表に示すようにHistoneH3、およびβtubulin遺伝子領域を増幅するプライマーセットを設計した。なお、プライマーセット1は配列番号1および配列番号2の組合せ、プライマーセット2は配列番号2および配列番号3の組合せである。PCR増幅と検出方法ダイズ黒根腐病菌2菌株に対して、HistoneH3、およびβtubulin遺伝子領域に設計した合計3種のプライマーセットを用いてPCR増幅を行った。その後、PCR増幅産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。染色した泳動ゲルを、トランスイルミネーターで紫外線照射し、バンドを検出した。従来のダイズ黒根腐病菌検出方法では、時間や手間もかかり、ダイズ栽培前の検出は不可能であった。本方法を用いることにより土壌中のダイズ黒根腐病菌を短時間で検出できるだけでなく、腐病菌の半定量も可能になるため、ダイズ栽培前にダイズ黒根腐病が発生する可能性を判断できる。ダイズを作付けする予定の土壌を、あらかじめ採取する。本検出法を用いて土壌中のダイズ黒根腐病菌の存在菌密度を調査し、ダイズ黒根腐病発生の危険性の情報を得ることで、土壌消毒や作目変更などの対策をとる。プライマーの検証いずれの菌株においても、安定して遺伝子の増幅が認められたプライマーセットは、βtubulin領域に設計した2種のプライマーセット1とプライマーセット2のみであった。そこで図1に示す3種のうち、これらのプライマーセットについての検出限界を検討した結果、図2に示すようにプライマーセット1βtubulinでは、DNA濃度が反応液あたり5pgμlまで検出可能であった。加えて、本プライマーセット1は、茎疫病菌、白絹病菌、菌核病菌では遺伝子の増幅が認められなかったことから、本プライマーセット1の特異性が実証された。"