以下の段階を含む、多数の標的ヌクレオチド配列において一つ又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる多数の配列の、一つ又は複数を同定する方法:多数の配列差異を伴う一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のある試料を提供する段階;各セットが標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のセットのオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合には相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;リガーゼを提供する段階;混合物を形成するために、試料、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合する段階;ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれもが標的ヌクレオチド配列から分離される変性処理、および、オリゴヌクレオチドプローブセットが、その各々の標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合は隣接した位置で塩基特異的に当該標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いにライゲーションして、位置特定可能なアレイ特異的部分、互いに結合した標的特異的部分、及び検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物配列を形成し、また、オリゴヌクレオチドプローブセットがその各々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズしうるものの、一つまたは複数のミスマッチが存在するために相互にライゲーションせず変性処理中に個別に分離される、ハイブリダイゼーション処理を含む、一つ又は複数のリガーゼ検出反応サイクルに混合物を供する段階;多孔質表面および、特定部位に固定された種々の、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供する段階;前述の供する段階後、塩基特異的方法で位置特定可能なアレイ特異的部分が捕獲用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに効果的な条件下で、混合物を固体支持体と接触させ、これにより位置特定可能なアレイ特異的部分を相補的な捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う部位で固体支持体上に捕獲する段階;並びに固体支持体に特定部位で捕獲されたライゲーション産物配列のレポーター標識を検出し、これにより試料中に一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列が存在することを示す段階。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項1記載の方法。ミスマッチがライゲーション接合部の3側塩基にある、請求項2記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項1記載の方法。ミスマッチがライゲーション接合部の3側塩基に隣接した塩基にある、請求項4記載の方法。試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:前述の検出後に、試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の量を、既知量の標的ヌクレオチド配列を伴う試料から作製された捕獲されたライゲーション産物配列の検量線と比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の一つ又は複数を未知量含有する可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;前記混合が、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを、混合物を生成するために混合することを含み、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在し、マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び固体支持体上の捕獲用オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びにマーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより各セットが特徴付けられる、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;固体支持体上の特定部位に捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、捕獲された他のライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列が、試料中の標的ヌクレオチド配列と、一つ又は複数の単ヌクレオチド部位で異なる、請求項7記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブセット及びマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位で複数の対立遺伝子の差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有する、請求項8記載の方法。試料が、多数の配列差異を伴う多数の標的ヌクレオチド配列の2つ以上を未知量含む可能性があり、以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:検出後に、試料中の各々の多数の標的配列により作製された捕獲されたライゲーション産物配列の相対量を比較することにより、試料中の各々の多数の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量し、これにより試料中の2つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量的尺度を提供する段階。重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブセットにより、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項1記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブセットの標的特異的部分が、実質的に同じ融解温度を有し、その結果これらが同様のハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に異なる部位で捕獲された、各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の試料中の存在を示す、請求項1記載の方法。所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項14記載の方法。重複する標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを有するオリゴヌクレオチドプローブ群により、単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異、または複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子の差異が識別される、請求項14記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチが存在する、請求項16記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つもしくは複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、もしくは他のDNA再編成からなる複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子と塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上の異なる位置で捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより試料中の、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における挿入、欠失、マイクロサテライト反復、転座、及び他のDNA再編成からなる群より選択される一つ又は複数の対立遺伝子差異の存在を示す、請求項1記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブセットが、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする一つ又は複数のヌクレオチド部位での挿入、欠失、及びマイクロサテライト反復からなる群より選択される複数の対立遺伝子差異を識別するために設計され、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブが共通の標的特異的部分を有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが所定の対立遺伝子に塩基特異的方法でハイブリダイズする異なる長さの反復配列を含む異なる標的特異的部分を有する、請求項18記載の方法。過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列中の、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列中の、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での少量の複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブセットは多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群は、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットは、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、検出において、異なる位置で固体支持体上に捕獲された各群のライゲーション産物配列の標識が検出され、これにより、試料中における、一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の少量の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部での完全な相補性により、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項20記載の方法。過剰量の正常配列の存在下での、単独の標的ヌクレオチド配列における、複数の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異、又は、過剰量の正常配列の存在下での、複数の標的ヌクレオチド配列における、重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とする複数のヌクレオチド部位での、少量の複数の対立遺伝子差異が、試料中で定量される、以下の段階を更に含む、請求項20記載の方法:既知量の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を提供する段階;各セットが、マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びにマーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブにより特徴付けられ、特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列又は追加されたマーカー配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階;各群が、マーカーヌクレオチド配列を含む、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された、一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセット又はマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを含み、群内の一つ又は複数のセットが、共通の第二のオリゴヌクレオチドプローブを共有し、かつ第一のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的方法で正常な対立遺伝子を除く所定の対立遺伝子又はマーカーヌクレオチド配列とハイブリダイズする異なる標的特異的プローブ部分を有し、混合は、試料、マーカー標的ヌクレオチド配列、多数のオリゴヌクレオチドプローブセット、多数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセット、及びリガーゼを混合物を生成するために混合することを含む、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を提供する段階;固体支持体上に特定の部位で捕獲されたライゲーションされたマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのレポーター標識を検出し、これにより試料中の一つ又は複数のマーカー標的ヌクレオチド配列の存在を示す段階;並びに既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列より作製された捕獲されたライゲーション産物の量と、少量の未知の試料より作製された他の捕獲されたライゲーション産物の量とを比較することにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を定量する段階。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により、選択された条件下で対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合はライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列とハイブリダイズされる場合には第一のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項22記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、かつ第二のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基特異的方法で所定の対立遺伝子にハイブリダイズする異なる標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群のライゲーション産物配列の異なるレポーター標識が検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列における一つ又は複数のヌクレオチド部位での一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項24記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項24記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接するようにハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部位で相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第二のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項26記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の位置での複数の対立遺伝子差異が識別され、これらのオリゴヌクレオチドセットが多数のプローブ群を形成し、各群が、単独のヌクレオチド部位での複数の対立遺伝子差異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、異なる群のオリゴヌクレオチドプローブ中で、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有するか、もしくは第一のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の標的特異的部分を有し、上記検出において、固体支持体上に特定の部位で捕獲された各群の多数の標識されたライゲーション産物配列のひとつが検出され、これにより試料中の一つ又は複数の標的ヌクレオチド配列中の一つ又は複数のヌクレオチド部位の一つ又は複数の対立遺伝子の存在を示す、請求項1記載の方法。所定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項28記載の方法。ひとつの標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異、又は、複数の標的ヌクレオチド配列中の、2個以上の隣接するヌクレオチド部位での、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、複数の対立遺伝子差異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が重複する標的特異的部分を伴うプローブを含む、請求項28記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項30記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、単独の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、及び複数の標的ヌクレオチド配列中の複数のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドセットが、多数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が、単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異を識別するために設計された一つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含み、各群のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、第二のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの5側塩基のみが異なり、かつ異なるレポーター標識を含み、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、それらのライゲーション接合部でのそれらの3側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含むか、又は第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の塩基に隣接するそれらの3側塩基のみが異なり、かつ異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含む、請求項29記載の方法。セット中のオリゴヌクレオチドプローブが、ライゲーション接合部の完全な相補性により対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は、ライゲーション接合部での相互ライゲーションに適しているが、セット中のオリゴヌクレオチドが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合には、第一のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の3側塩基もしくはライゲーション接合部のこの塩基に隣接する塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有するか、又は第二のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部の5側塩基にこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、請求項29記載の方法。単独の標的ヌクレオチド配列中の単独のコドンについての全ての可能な単塩基突然変異、又は複数の標的ヌクレオチド配列中の2個以上の隣接するコドンについての、もしくは重複するオリゴヌクレオチドプローブセットを必要とするヌクレオチド部位での、全ての可能な単塩基突然変異が識別され、オリゴヌクレオチドプローブ群が、重複している標的特異的部分を伴うオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項33記載の方法。変性処理が約80°C~105°Cで行われる、請求項1記載の方法。変性処理及びハイブリダイゼーション処理を含む各サイクルが、約30秒から約5分間の長さである、請求項1記載の方法。前記供する段階が2サイクルから50サイクル繰り返される、請求項1記載の方法。前記供する段階の総時間が1分から250分間である、請求項1記載の方法。リガーゼが、サーマスアクアティカスThermusaquaticusリガーゼ、サーマスサーモフィラスThermusthermophilusリガーゼ、大腸菌Ecoliリガーゼ、T4リガーゼ、サーマスThermus種AK16リガーゼ、アキフェクスエオリクスAquifexaeolicusリガーゼ、サーモトガマリチマThermotogamaritimaリガーゼ、及びピロコッカスPyrococcusリガーゼからなる群より選択される、請求項1記載の方法。検出可能なレポーター標識が、発色団、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、りん光基、放射性物質、化学発光部分、及び電気化学的検出部分からなる群より選択される、請求項1記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が各々、40°C~85°Cのハイブリダイゼーション温度を有する、請求項1記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、20ヌクレオチド長から28ヌクレオチド長を有する、請求項1記載の方法。混合物が更に担体DNAを含む、請求項1記載の方法。前記供する段階が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットについて、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブがライゲーションする部位でミスマッチを生じたライゲーション産物の生成速度が、特定のオリゴヌクレオチドプローブセットのマッチしたライゲーション産物配列の生成速度の0005未満であるような生成速度を実現する、請求項1記載の方法。以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:混合前に、試料中の標的ヌクレオチド配列を増幅する段階。前記増幅が、試料をポリメラーゼに基づく増幅法へ供することにより実施される、請求項45記載の方法。前記ポリメラーゼに基づく増幅法が、DNAポリメラーゼにより実施される、請求項45記載の方法。固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造されている、請求項1記載の方法。前記検出が、以下の段階を含む、請求項1記載の方法:特定の部位で固体支持体をスキャニングし、オリゴヌクレオチドプローブセットのライゲーションが生じたかどうかを確定する段階;及び確定されたライゲーションを、標的ヌクレオチド配列の有無と関連付ける段階。多数の捕獲用オリゴヌクレオチドが各々、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項1記載の方法。各捕獲用オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドを内部挿入又は欠失を伴わずに1端で互いに並置したときに、ヌクレオチド総数の4個毎に少なくとも1個につき、アレイ上のその隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドと異なる、請求項50記載の方法。各捕獲用オリゴヌクレオチドが、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドから、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプローブセットが前記接触中にそれにハイブリダイズしないような障壁オリゴヌクレオチドにより隔てられた、隣接する捕獲用オリゴヌクレオチドを有する、請求項50記載の方法。オリゴヌクレオチドプローブセットが、捕獲用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプローブセットの位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項1記載の方法。以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:混合物を一連のリガーゼ検出反応サイクルに供した後、混合物を化学的又は酵素的に処理し、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドプローブを破壊する段階。前記処理がエキソヌクレアーゼにより実施される、請求項54記載の方法。以下の段階を更に含む、請求項1記載の方法:捕獲用オリゴヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドを除去し、固定された捕獲用オリゴヌクレオチドを伴う固体支持体の再使用を可能にする段階。固体支持体が、異なる位置で固定化された異なる捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該異なる捕獲用オリゴヌクレオチドは異なる位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが、固体支持体上の異なる部位で捕獲されかつ検出される、請求項1記載の方法。固体支持体が、固体支持体上に固定された同一の捕獲用オリゴヌクレオチドを含み、該捕獲用オリゴヌクレオチドは全ての位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的であり、またオリゴヌクレオチドプローブセットに結合した標識は異なっており、これにより異なるオリゴヌクレオチドプローブセットが異なる標識により検出されかつ識別される、請求項1記載の方法。多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項1記載の方法。機能性モノマーがアクリル酸である、請求項59記載の方法。機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項59記載の方法。親水性ポリマーが、501未満のレベルで架橋される、請求項59記載の方法。親水性ポリマーが、5001未満のレベルで架橋される、請求項62記載の方法。以下を含む、固体支持体上のオリゴヌクレオチドアレイ:多孔質表面及び各々オリゴヌクレオチド結合に適した位置のアレイを有する、固体支持体;各アレイ位置で固体支持体に結合した、固体支持体へのオリゴヌクレオチドのカップリングに適したリンカー又は支持体;及びアレイ位置の少なくとも一部が16個のヌクレオチドより大きいオリゴヌクレオチドで占有される、固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ。異なるオリゴヌクレオチドが、固体支持体上の異なるアレイ位置に結合し、異なる核酸を検出する、請求項64記載のアレイ。固体支持体が、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲル、ガラス、シリコン、及びそれらの複合材からなる群より選択される材料で製造された、請求項64記載のアレイ。固体支持体が、アレイ位置に結合したオリゴヌクレオチドを伴うアレイ位置を有する、請求項64記載のアレイ。多孔質表面が、アクリルアミドと、カルボン酸エステル、アルデヒド又はアミノ基を含む機能性モノマーの組合せで構成された親水性ポリマーである、請求項64記載のアレイ。機能性モノマーがアクリル酸である、請求項68記載のアレイ。機能性モノマーがモノメタクリル酸グリセロールである、請求項68記載のアレイ。親水性ポリマーが、501未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。親水性ポリマーが、5001未満のレベルで架橋される、請求項68記載のアレイ。以下を含む、多数の標的ヌクレオチド配列中の単塩基の変化、挿入、欠失、又は転座により異なる、多数の配列の一つ又は複数を同定するキット:リガーゼ;各セットが標的配列特異的部分及び位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第一のオリゴヌクレオチドプローブ、並びに標的配列特異的部分及び検出可能なレポーター標識を有する第二のオリゴヌクレオチドプローブで特徴付けられ、ここで特定のセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、各々の標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズされる場合は相互ライゲーションに適しているが、試料中に存在する任意の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合にはこのようなライゲーションを妨害するミスマッチを有する、多数のオリゴヌクレオチドプ発明及び図面の詳細な説明本発明は、複数の標的ヌクレオチド配列中の一つもしくは複数の単一塩基の変化、挿入、欠失、もしくは転移によって異なる一つもしくは複数の配列の多重性を同定する方法に関する。方法は、ライゲーション期、捕獲期、および検出期を含む。ライゲーション期には、複数の配列の差異を伴う潜在的に一つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む試料の提供が必要である。複数のオリゴヌクレオチドセットをこの段階で用いる。各々のセットは、標的特異的部分および位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定のセットにおける第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で相互に隣接してハイブリダイズする場合に、ともにライゲーションすることに関して好適である。しかしながら、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブは、試料中の別のヌクレオチド配列にハイブリダイズする際には、このようなライゲーションを阻害するミスマッチを有する。リガーゼも利用する。混合物の調製には、試料、複数のオリゴヌクレオチドプローブのセット、およびリガーゼを混合して混合物を調製する。この混合物を、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む一つもしくは複数の、リガーゼによる検出反応サイクルにかける。変性処理は、標的ヌクレオチド配列由来のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれをも分離させることを含む。ハイブリダイゼーション処理は、隣接した位置のオリゴヌクレオチドプローブのセットを塩基特異的な方法で、試料中にそれぞれの標的ヌクレオチド配列が存在する場合には、それにハイブリダイゼーションさせること、およびそれらを互いにライゲーションして、a位置特定可能なアレイ特異的部分b互いに結合した標的特異的部分、およびc検出可能なレポーター標識を含むライゲーション産物の配列を生成させることを含む。該オリゴヌクレオチドプローブのセットは、それぞれの標的ヌクレオチド配列以外の試料中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることもあるが、この場合一つ以上のミスマッチの存在によって互いにライゲーションせずに変性処理中に個々に分離する。この方法の次の段階は捕獲期である。この段階は、特定部位に固定化した捕獲オリゴヌクレオチドを有する固体支持体を提供することを含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、位置特定可能なアレイ特異的部分に相補的である。混合物は、ライゲーション期を経た後、位置特定可能なアレイ特異的部分にハイブリダイズさせることに関して有効な条件下で、塩基特異的な方法で捕獲オリゴヌクレオチド固体支持体に接触させる。その結果、位置特定可能なアレイ特異的部分は、相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有する部位において固体支持体上に捕獲される。本発明の1つの局面は、多孔性表面を有する固体支持体を提供することを含む。本発明の別の局面は、陰性電荷のマスクに有効な条件下で前記混合物を固体支持体と接触させることを含む。捕獲期の次は検出期である。該方法のこの段階では、ライゲーション産物の配列のレポーター標識を、固体支持体上の特定部位に捕獲する。固体支持体に結合したレポーター標識の存在が検出された場合には、試料中に一つ以上のヌクレオチド配列がそれぞれ存在することが示される。しばしば、複数の異なる単一塩基の変異、挿入、もしくは欠失が、目的配列の同一ヌクレオチド位置で起こることがある。この方法は、第2のオリゴヌクレオチドプローブが共通でありかつ検出可能な標識を含み、かつ第1のオリゴヌクレオチドプローブが異なる位置特定可能なアレイ特異的部分および標的特異的部分を有するオリゴヌクレオチドセットを有する。第1のオリゴヌクレオチドプローブは、ミスマッチなしに被検配列にハイブリダイズする場合には、第1のライゲーション接合部で第2の隣接したオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションさせるために好ましい。隣接する異なる第1のオリゴヌクレオチドプローブは、接合部位に別の識別塩基を含み、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーションのみが接合部位置でライゲーション可能となる。各々の第1の隣接したオリゴヌクレオチドは、異なる位置特定可能なアレイ特異的部分を含み、従って、特定の塩基の変化が異なるアドレスでの捕獲によって識別される。このスキームでは、少なくとも1つの塩基により、他の核酸と異なる別の核酸配列の多重検出を行うために、複数の異なる捕獲オリゴヌクレオチドを、固体支持体上の異なる位置に結合させてある。または、第1のオリゴヌクレオチドプローブは、共通の位置特定可能なアレイ特異的部分を含み、第2のオリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能な標識および標的特異的部分を有する。このような配置により、少なくとも1つの塩基が他の核酸と異なる別の核酸配列の多重検出が可能となる。このような多重検出を実施する際には、該核酸配列が同一もしくは異なる対立遺伝子上に存在する。本発明はまた、リガーゼを含む本発明の方法を実施するためのキット、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブのセット、および捕獲オリゴヌクレオチドを固定化した固体支持体に関する。標的ヌクレオチド配列の予備的増幅に用いるプライマーもキットに含まれる。増幅をポリメラーゼ連鎖反応で実施する場合には、ポリメラーゼもキットに含まれる。図1および2には、キャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動蛍光の定量化を利用した先行技術のリガーゼによる検出反応と比較した本発明の方法の流れ図を示す。図1は生殖系列の変異検出に関し、図2は癌の検出を示す。図1は、リフラウメニ症候群LiFraumenisyndromeの原因となるp53変異等の生殖系列における点突然変異の検出を示す。段階1において、DNA試料の調製後、Taqすなわち、Thermusaquaticusポリメラーゼを用いホットスタートの条件下でエキソン5~8をPCR増幅した。反応の最後に、100°Cで10分間加熱しTaqポリメラーゼを失活させる。段階2では、該産物を対立遺伝子特異的および共通のLDRプローブを含む新しいLDR緩衝液で20倍に希釈する。チューブは、通常、各プライマーを約100~200フェムトモル含む。段階3では、リガーゼによる検出反応は、Taqリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始する。LDRプローブは、接合部部位における完全な相補性を示す標的配列の存在下でのみ隣接したプローブとライゲーションする。産物は2つの異なる形態で検出される。第1の形態4aでは、当先行技術分野において用いられる、蛍光標識されたLDRプローブは、異なる長さのポリAもしくは酸化ヘキサエチレンテールを含む。従って、僅かに異なる易動度を有する正常DNAに対するライゲーションで生じる各々のLDR産物はピークのラダーを与える。生殖系列の突然変異によって、電気泳動像に新たなピークが生成する。新しいピークのサイズは、概ねもとの試料に存在する変異の量に相当する。ホモ接合体の正常で0、ヘテロ接合体のキャリアーで50、ホモ接合体の変異体では100である。第2の形態4bにおいては、本発明に従って、各々の対立遺伝子特異的プローブは、例えば、付加的な24ヌクレオチド塩基をその5末端に含む。これらの配列は、位置特定可能なアレイ上で相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする単一の位置特定可能な配列である。LDR反応では、各々の対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在下で隣接する蛍光標識した共通プローブに対してライゲーションを行うことができる。野生型および変異体の対立遺伝子は、アレイ上の隣接したアドレスに捕獲される。未反応のプローブを洗い流す。黒いドットは、野性型対立遺伝子に関して100のシグナルを示す。白いドットは、変異体の対立遺伝子に関して0のシグナルを示す。斜線で示されたドットは、生殖系列の突然変異における1つの位置での各々の対立遺伝子に関して50のシグナルを示す。図2は、p53腫瘍抑制性遺伝子における体細胞変異の検出を表すが、いずれも通常、低感度の変異検出に関するものである。段階1では、DNA試料を調製し、蛍光PCRプライマーを用いてエキソン5~9を3つの断片としてPCRで増幅する。これにより、段階2でのキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動を用いたPCR産物の蛍光の定量化が可能となる。段階3では、マーカーDNAの1100希釈3つの断片の各々に対しで産物が急増する。癌細胞では観察されない変異を含むが、適当なLDRプローブで容易に検出されること以外は、このDNAは、野性型DNAに相同である。段階4の混合したDNA産物を変異体もしくはマーカー対立遺伝子に対してのみ特異的な全LDRプローブを含む緩衝液で20倍に希釈する。段階5では、リガーゼ反応を、Taqリガーゼの添加によりホットスタート条件下で開始した。接合部部位における完全な相補性を与える標的配列の存在下でのみ、隣接したプローブに対してLDRプローブのライゲーションが起こる。図1に記載される同一の2つの形態で、産物が検出される。段階6aの当先行技術分野において用いられる形態では、産物はキャピラリー電気泳動もしくはゲル電気泳動で分離し、蛍光シグナルを定量する。変異体ピークのマーカーピークに対する比は、100分割したもとの試料に存在する癌の突然変異量の概算を与える。段階6bの形態では、本発明に基づいて、位置特定可能なアレイ上の相補的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションで産物を検出する。マーカードットに対する変異体ドットの蛍光シグナル比は、100分割したもとの試料に存在する癌の突然変異量の概算を与える。本発明のリガーゼによる検出反応の方法は、図3~10を参照することによって最もよく理解される。一般的には、これは、Baranyらの国際公開公報第9017239号;FBaranyらの耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaThermostableDNALigaseencodingGeneGene1091111991、およびFBaranyらのクローン化耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびDNA増幅GeneticDiseaseDetectionandDNAAmplificationUsingClonedThermostableLigaseProcNatlAcadSciUSA881891931991等に記載されており、これらの開示は参照として本明細書に組み入れられる。本発明のリガーゼによる検出反応には、2セットの相補的オリゴヌクレオチドを用いることができる。これは、直ぐ上に示した3つの参考文献に記載のリガーゼ連鎖反応として知られるものであり、参照として本明細書に組み入れられる。または、リガーゼによる検出反応は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイとして知られる単一サイクルを含む。Landegrenらのリガーゼによる遺伝子検出技術ALigaseMediatedGeneDetectionTechniqueScience2411077801988LandegrenらのDNA診断薬分子技術と自動化DNADiagnosticsMolecularTechniquesandAutomation、Science242229371988およびLandegrenらの米国特許第4988617号を参照のこと。方法のリガーゼによる検出反応期の際、ハイブリダイゼーションは50~85°Cで起こるが、変性処理は80~105°Cで実施する。各々のサイクルは、変性処理および全体として約1~5分の加熱ハイブリダイゼーション処理を含む。通常、ライゲーションによる検出反応は、2~50サイクルの繰り返し変性とハイブリダイゼーションを行うことを含む。該方法のリガーゼによる検出反応段階にかかる全体の時間は1~250分である。オリゴヌクレオチドプローブのセットは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩糖鎖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であってもよい。一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブのセットのオリゴヌクレオチドは、各々が66~70°Cのハイブリダイゼーションもしくは融解温度すなわち、Tmを有する。これらのオリゴヌクレオチドは20~28ヌクレオチドの長さである。DNAアレイ上にライゲーション産物を捕獲する前に位置特定可能なヌクレオチドアレイ特異的な部分を含む未変換のLDRオリゴヌクレオチドプローブを化学的もしくは酵素的に破壊することが望ましい。これを行わない場合、このような未変換のプローブは、相補的配列を含む固体支持体のアレイ上のアドレスで、結合に関してライゲーション産物と競合する。破壊はエキソヌクレアーゼIII等LHGuoandRWu、MethodsinEnzymology10060961985、これは参照として本明細書に組み入れられるのエキソヌクレアーゼを利用し、端でブロックされ、互いにプローブのライゲーションには含まれないLDRプローブと組み合わせることによって達成できる。ブロッキング部分は、レポーター基もしくはホスホロチオエート基を含むことができるTTNikiforowらの単一鎖PCR産物の調製のためのホスホロチオエートプライマーおよびエキソヌクレアーゼ加水分解の利用と固相ハイブリダイゼーションによる検出TheUseofPhosphorothioatePrimersandExonucleaseHydrolysisforthePreparationofSinglestrandedPCRProductsandtheirDetectionbySolidphaseHybridization、PCRMethodsandApplications3p2852911994、これは参照として本明細書に組み入れられる。LDR法の後に、ライゲーションの起こらなかったプローブは、反応混合物をエキソヌクレアーゼと反応させて選択的に破壊する。ライゲーションの起こったプローブは、エキソヌクレアーゼ反応の開始に必要なフリーの3末端の除去により保護される。このアプローチにより、特にLDR反応が少量の産物のみを形成する場合にシグナル対雑音比の増加が起こる。ライゲーションの起こらなかったオリゴヌクレオチドは、捕獲に関して捕獲オリゴヌクレオチドと競合するので、このようなライゲーションの起こったオリゴヌクレオチドとの競合はシグナルを低下させる。このアプローチの別の利点は、ハイブリダイズしていない標識を含む配列が分解し、したがって、標的に依存しないバックグラウンドシグナルを生じづらくなることである。何故ならば、洗浄によってDNAアレイからより容易に除去され得るからである。上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、検出に好ましいレポーター標識を有する。有用な標識は、発色基、蛍光部分、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光基、放射線物質、化学発光部位、および電気化学的検出部位を含む。捕獲オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾ペプチドヌクレオチド類縁体、修飾リン酸塩糖骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、およびその混合物の形態であり得る。本発明の方法が複数のオリゴヌクレオチドセットの使用を含む場合、第2のオリゴヌクレオチドプローブは同一でもよいが、第1のオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイ特異的部分は異なっている。または、第1のオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイ特異的部分は同一でもよいが、第2のオリゴヌクレオチドプローブのレポーター標識は異なる。本発明のライゲーションによる検出反応期前に、好ましくは、最初の標的核酸の増幅法で試料を増幅する。これにより、試料中の標的ヌクレオチド配列の量が増加する。例えば、最初の標的核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、配列の自己複製、もしくはQβレプリカーゼによって媒介されるRNA増幅を用いて達成される。ポリメラーゼ連鎖反応法は、好ましい増幅法であり、HErlichらのポリメラーゼ連鎖反応における最近の進歩RecentAdvancesinthePolymeraseChainReactionScience2521643501991MInnisらのPCRプロトコール方法と応用の指針AGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressNewYork1990およびRSaikiらの耐熱性DNAポリメラーゼによるDNAのプライマー特異的な酵素的増幅PrimerdirectedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymeraseScience239487911988等に詳細に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。参照として本明細書に組み入れられるJGuatelliらのレトロウイルスの複製をモデルにしたマルチ酵素反応による核酸の等熱インビトロ増幅Isothermal、invitroAmplificationofNucleicAcidsbyaMultienzymeReactionModeledAfterRetroviralReplicationProcNatlAcadSciUSA871874781990には、配列の自己複製法に関して記載がある。Qβレプリカーゼによって媒介されるRNA増幅は、FKramerらの複製可能なRNAレポーターReplicatableRNAReportersNature339401021989に開示されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。本発明のポリメラーゼ連鎖反応法の使用およびその後のリガーゼによる検出法の使用を図3に示す。ここで二つの多型におけるホモもしくはヘテロ接合性すなわち、対立遺伝子としての差異は、同一遺伝子上にある。または、このような対立遺伝子の差異は異なる遺伝子上にあってもよい。図3に示されるように、標的核酸が二本鎖DNA分子の形態である場合、変性して鎖を分離させる。これは、80~105°C程度の温度に加熱することによって達成する。次に、ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーを加え、通常、20~85°C程度の温度で鎖にハイブリダイズさせる。また、耐熱性ポリメラーゼ例えば、Thermusaquaticusポリメラーゼを添加し、温度を50~85°Cに調整して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長させる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長の段階後に、得られた二本鎖分子を80~105°Cの温度に加熱し、分子を変性させ鎖を分離させる。これらのハイブリダイゼーション、伸長、および変性の段階を、何回も繰り返して標的を適当なレベルに増幅する。方法のポリメラーゼ連鎖反応期が完了すると、図3に示すライゲーションによる検出反応期が開始される。二本鎖DNA分子の状態であれば、80~105°Cの温度、好ましくは94°Cで標的核酸を変性させた後、標的ヌクレオチド配列の一方の鎖に対するライゲーションによる検出反用のオリゴヌクレオチドプローブをリガーゼ例えば、図3に示す耐熱性リガーゼ様のThermusaquaticusリガーゼとともに加える。次に、オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸分子にハイブリダイズさせ、通常、4585°C、好ましくは65°Cの温度でライゲーションを行う。ライゲーション接合部に完全な相補性があれば、オリゴヌクレオチドはともにライゲーションすることができる。置換可能なヌクレオチドがTまたはAであるとき、標的ヌクレオチド配列にTが存在すれは、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションし、また標的ヌクレオチド配列にAが存在すれば、位置特定可能なアレイ特異的部分Z2を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションする。同様に、変化可能なヌクレオチドがAまたはGであるときには、標的ヌクレオチド配列にTが存在すれば、位置特定可能なアレイ特異的部分Z4を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブにライゲーションし、また標的ヌクレオチド配列にCが存在すれば、位置特定可能なアレイ特異的部分Z3を有するオリゴヌクレオチドプローブがレポーター標識Fを有するオリゴヌクレオチドプローブとライゲーションする。ライゲーション後に、材料を再び変性させてハイブリダイズしている鎖を分離する。ハイブリダイゼーションライゲーションおよび変性の段階は、一つもしくは複数のサイクル例えば、1~50サイクルを経て標的シグナルを増幅する。蛍光ライゲーション産物同様に、位置特定可能なアレイ特異的部分を有する、ライゲーションされなかったオリゴヌクレオチドプローブは、位置特定可能なアレイ上の特定のアドレスにおけるZ1、Z2、Z3、およびZ4部位に相補的な捕獲プローブへのハイブリダイゼーションにより捕獲される。次に、オリゴヌクレオチドの一方に前もって存在する標識Fで、ライゲーションの起こったオリゴヌクレオチドの存在を検出する。図3において、ライゲーション産物の配列は、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1およびZ3に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドでアレイのアドレスにハイブリダイズするが、ライゲーションの起こらなかった位置特定可能なアレイ特異的部分Z2およびZ4を有するオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的捕獲オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。しかしながら、ライゲーション産物の配列のみが標識Fを有するので、それらのみの存在が検出される。図4は、本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図であり、与えらた部位がいずれの塩基あっても識別できる。位置特定可能なアレイ特異的部分Z1、Z2、Z3、およびZ4に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、標的ヌクレオチド配列における、それぞれ、A、G、C、およびT対立遺伝子の存在を示す。ここで、標的ヌクレオチド配列A、およびC対立遺伝子の存在は、部位Z1およびZ3にそれぞれ相補的な捕獲オリゴヌクレオチドプローブで固体支持体上のアドレスの蛍光で示される。図4では、位置特定可能なアレイ特異的部分が識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあり、識別塩基がこれらのプローブの3末端にあることに注目されたい。図5は、本発明の2カ所の近接部位における可能な塩基の存在の検出に関するPCRLDRの段階の流れ図である。ここで、LDRプライマーは重複していてもよいが、接合部に完全な相補性がある場合にライゲーションが可能である。このことが、重複プライマーが互いに阻害を起こす対立遺伝子特異的PCR等のほかのアプローチと、LDRが異なる点である。図5においては、第1のヌクレオチドの位置は、AおよびCの対立遺伝子でヘテロ接合体であるが、第2のヌクレオチドの位置はG、CおよびTの対立遺伝子でヘテロ接合体である。図4に示すように、位置特定可能なアレイ特異的部分は識別オリゴヌクレオチドプローブ上にあり、識別塩基はこれらのプローブの3末端にある。レポーター基例えば、蛍光標識は、共通オリゴヌクレオチドプローブの3末端にある。例えば、各々の個体が、2つの正常遺伝子および2つの偽遺伝子を有し、2カ所のスプライス部位ヌクレオチド656に3つの可能な単一塩基G、A、およびCが存在する場合の21ヒドロキシラーゼ遺伝子に関して、これが可能である。また、これを用いて薬剤耐性例えば、AZTに対する株の出現を示すHIV感染における低レベルの変異を検出できる。図5に戻って、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、およびZ8に相補的なアドレスの蛍光シグナルの出現は、ヘテロ接合体の部位のAおよびC対立遺伝子における、それぞれ、A、G、C、およびTの存在、およびヘテロ接合体部位のG、C、およびT対立遺伝子における、それぞれA、G、C、およびTの存在を示す。図6は、本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図であり、挿入左上部のプローブセットおよび欠失右下部のプローブセットを識別する。左では、正常配列がポリAテールに5つのAを含む。変異体の配列は、さらに2つのAがテール内に挿入されている。したがって、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1正常の配列を表すおよびZ32塩基対の挿入を表すを有するLDR産物は、共通プライマーにライゲーションすることによって蛍光標識されている。LDR法例えば、耐熱性リガーゼ酵素を用いるは、単一ヌクレオチド反複における単一塩基の挿入もしくは欠失を簡単に識別できるが、対立遺伝子特異的PCRでは、このような差異を識別できない。なぜならば、3塩基が両方の対立遺伝子に存在するためである。右では、正常配列は5つのCA反復すなわち、CACACACACAである。変異体では、正常配列と比較して2つ少ないCA塩基を含むすなわち、CACACA。これらは、特定位置特定可能なアレイ特異的部分Z8正常の配列を表すおよびZ62つのCA欠失を表すアドレスにおける、蛍光LDR産物として検出される。また、さまざまな感染因子の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べることができる。図6では、Z1およびZ3に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスにおける蛍光標識Fで示されるライゲーション産物の配列の存在は、正常および変異体のポリA配列の両方の存在を示す。同様に、Z6およびZ8に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスの蛍光標識Fで示されるライゲーション産物の配列の存在は、正常なCAの繰り返し配列および繰り返しユニットが1つ欠失した配列の両方の存在を示す。図7は、過剰の正常配列の存在における低レベルの変異を検出する位置特定可能なアレイ特異的部分を用いた本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図である。図7は、Kras遺伝子のグリシンGlyをコードするコドン12の配列GGTを示す。ごく一部の細胞が、アスパラギン酸AspをコードするGATにおけるGからAへの変異を含む。野生型のLDRプローブすなわち、正常配列は、反応から除外される。正常LDRプローブ識別塩基Gを有するを含む場合、これらを共通プローブに対してライゲーションさることによって、変異体の標的に由来するシグナルより強めることができる。代わりに、図7に示されるように、蛍光標識Fを有するライゲーション産物の配列の存在は、位置特定可能なアレイ特異的部分Z4に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドを有するアドレスにおけるアスパラギン酸をコードする変異体の存在を示す。図8は、本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図であり、位置特定可能なアレイ特異的部分が、共通のオリゴヌクレオチドプローブに配置されおり、識別オリゴヌクレオチドプローブはレポーター標識を有する。対立遺伝子の差異は、異なる蛍光シグナルF1、F2、F3、およびF4で識別される。この方法により、より高密度なアレイの使用が可能となる。なぜならば、各々の位置は、特定の基で発光すると予測されるからである。エミッションスペクトルにおいて最小重複を有し、多重走査が必要な蛍光基を必要とするという不利な点を有する。これは低レベルの対立遺伝子例えば、癌に関連した変異の検出に理想的といえるほど好適ではない。図9は、本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図であり、隣接および近傍の対立遺伝子の両方が検出される。隣接した変異は、互いの右隣にあり、1セットのオリゴヌクレオチドプローブが接合部の3末端の塩基を識別する異なる位置特定可能なアレイ特異的部分Z1、Z2、Z3、およびZ4の使用によってが、もう一方のオリゴヌクレオチドプローブのセットは、接合部の5末端の塩基を識別する異なる蛍光レポーター標識F1、F2、F3、およびF4の使用。図9では、疾患遺伝子例えば、嚢胞性線維症CFTRのGlyおよびアルギニンArgをコードするコドンが、それぞれ、生殖系列の突然変異の候補である。図9の検出結果は、GlyGGAライゲーション産物の配列を有する部位Z2および標識F2で示されるがグルタミン酸GluGAA部位Z2および標識F1を有するライゲーション産物の配列で示されるに突然変異を起こしており、ArgCGG部位Z7および標識F2を有するライゲーション産物の配列で示されるがトリプトファンTrpTGG部位Z8および標識F2を有するライゲーション産物の配列で示されるに突然変異を起こしていることを示している。したがって、患者は、複合ヘテロ接合型の個体であるすなわち、両方の遺伝子に変異体対立遺伝子を有する。図10は、本発明のPCRLDRの段階に関する流れ図であり、単一コドンに関して可能な単一塩基の変異すべてが検出される。通常アミノ酸のコドンは3番目の塩基が縮重しているのでこれら可能な変異すべてについて、蛋白質レベルで最初の2つの位置を決定できる。これらのアミノ酸には、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、プロリン、アラニン、グリシン、およびバリンを含む。しかしながら、幾つかのアミノ酸については、コドンの3つの塩基すべてを調べるので、3箇所の隣接した位置の変異を識別するオリゴヌクレオチドプローブが必要となる。図10に示すように、3末端に対する最後から2番目の位置に4種の可能な塩基を含む4つのオリゴヌクレオチドプローブを設計し、また3末端に4種の考え得る塩基を含む別の4つの捕獲オリゴヌクレオチドを設計し、この問題を解決する。レポーター標識のみを有する共通オリゴヌクレオチドプローブはコドンの縮重に対応し、同一のアレイアドレスで捕獲され異なるライゲーション産物の配列間の識別ができる2つの蛍光基を有している。例えば、図10に示されるように、グルタミンGlnをコードするコドンすなわち、CAAおよびCAGの存在が、部位Z1および標識F2を含むライゲーション産物の配列の存在によって示される。同様に、ヒスチジンHisをコードする変異コドンCACでコードされるに対するGlnの存在は、部位Z1および標識F2を有するライゲーション産物の配列の存在ならびに部位Z7および標識F2を有するライゲーション産物の配列の存在によって示される。プライマーZ1およびZ7が同一の配列を有するという事実に起因し、このアッセイに冗長性が内在する。本発明の特に重要な局面は、試料中の標的ヌクレオチド配列の量が定量可能であることである。内部すなわち、該試料を用いた増幅検出により得られる標準材料もしくは外部すなわち、得られる標準物質は増幅されないが該試料を用いて検出される標準を得ることによって、これを様々な方法で達成することができる。ある定量法に従って、レポーター標識により生成したシグナルは、分析試料より生産されたライゲーション産物の配列の捕獲によって生じ検出されるものである。このシグナル強度は、生成した既知の量の標的ヌクレオチド配列を有する試料中に存在するライゲーション産物の配列の捕獲によって生じるシグナルによって得られる検量線と比較する。その結果、分析試料中の標的ヌクレオチド配列の量を調べることができる。本技術は、外部標準の使用を含む。本発明の別の定量法は、内部標準に関する。ここでは、既知の量の一つもしくは複数のマーカー標的ヌクレオチド配列を試料に添加する。さらに、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットをリガーゼ、上記のオリゴヌクレオチドプローブのセットおよび試料とともに混合物に添加する。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブのセットは、1マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分ならびに支持体上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な位置特定可能なアレイ特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、2マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分ならびに検出可能なレポーター標識を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む。特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列上で相互に隣接してハイブリダイズし、互いにライゲーションすることにおいて適切である。しかしながら、試料中の他のヌクレオチド配列または添加したマーカー配列にハイブリダイズする場合には、このようなライゲーションを阻害するミスマッチが存在する。固体支持体上に捕獲されたライゲーション産物の配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。次に、既知の量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成し捕獲されたライゲーション産物の量を捕獲された他のライゲーション産物の配列の量と比較することによって、試料中の標的ヌクレオチド配列の量を決定する。本発明の別の定量法は、複数の配列上の差異を有する2つもしくはそれ以上の複数の標的ヌクレオチド配列を含む試料の解析を含む。ここでは、標的ヌクレオチド配列に対応するライゲーション産物の配列が、上記のいずれかの技術によって検出識別される。次に、生成し捕獲されたライゲーション産物の配列の相対量を比較して、試料中の標的ヌクレオチド配列の相対量を定量する。これは、試料における標的ヌクレオチド配列の相対的レベルの定量的尺度を提供する。本発明のリガーゼによる検出反応法の段階の前に、リガーゼ連鎖反応法を行い、オリゴヌクレオチド産物を増幅することもできる。本方法は、FBaranyらの耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaThermostableDNALigaseencodingGeneGene1091111991、およびFBaranyらのクローン化耐熱のリガーゼを用いた遺伝病の検出およびDNA増幅GeneticDiseaseDetectionandDNAAmplificationUsingClonedThermostableLigaseProcNatlAcadSciUSA88189931991に完全な記載があり、これらは参照として本明細書に組み入れられる。増幅にリガーゼ連鎖反応を用いる代わりに、転写に基づく増幅法を利用することもできる。好ましい耐熱性リガーゼはThermusaquaticus由来のものである。本酵素はこの生物から単離できるMTakahashiら好熱性DNAリガーゼThermophillicDNAligaseJBiolChem25910041471984;これは参照として本明細書に組み入れられる。または、リコンビナントで調製することもできる。このような単離法は、リコンビナントThermusaquaticusリガーゼの産生およびThermusthemophilusリガーゼとともに、Baranyらの国際公開公報第9017239号、およびFBaranyらの耐熱性DNAリガーゼをコードする遺伝子のクローニング、過剰発現および塩基配列Cloning、OverexpressionandNucleotideSequenceofaThermostableDNALigaseencodingGeneGene1091111991等に開示されており、参照として本明細書に組み入れられる。これらの文献は、このリガーゼおよびこれをコードするDNAの完全な配列情報を含む。他の好ましいリガーゼとしては、Ecoliリガーゼ、T4リガーゼ、ThermusspAK16リガーゼ、Aquifexaeolicusリガーゼ、Thermotogamaritimaリガーゼおよび、Pyrococcusリガーゼを含む。ライゲーション増幅混合物は、サケ精子DNA等の担体DNAを含んでいてもよい。好ましくは加熱ハイブリダイゼーション処理であるハイブリダイゼーションの段階では、ライゲーション接合部における識別ヌクレオチドに基づくヌクレオチド配列間での識別を行う。標的ヌクレオチド配列間の差異は、例えば、単一核酸塩基の差、核酸の欠失、再構成である。1塩基以上を含むこのような配列の差異も検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブのセットは実質的に同一の長さを有し、それらを実質的に同様なハイブリダイゼーション条件で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。その結果、本発明の方法は、感染性疾患、遺伝病、および癌を検出できる。また、環境モニタリング、法医科学、および食品科学においても有用である。広く多様な感染性疾患は、本発明の方法で検出できる。通常、これらは細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌性の感染因子によっておこる。また、さまざまな感染因子の薬剤に対する耐性は、本発明を用いて調べることができる。本発明で検出する細菌性感染因子は、大腸菌、サルモネラ菌Salmonella、赤痢菌Shigella、クレブシエラKlebsiella、シュードモナスPseudomonas、リステリア菌Listeriamonocytogenes、結核菌Mycobacteriumtuberculosis、ミコバクテリアアビウムイントラセルラMycobacteriumaviumintracellulare、エルシニアYersinia、フランシセラFrancisella、パスツレラPasteurella、ブルセラBrucella、クロストリジウムClostridia、百日咳菌Bordetellapertussis、バクテロイドBacteroides、黄色ブドウ球菌Staphylococcusaureus、スタフィロコッカスニューモニアStreptococcuspneumonia、B溶連菌BHemolyticstrep、コリネバクテリアCorynebacteria、レジオネラLegionella、ミコプラズマMycoplasma、ウレアプラズマUreaplasma、クラミジアChlamydia、淋菌Neisseriagonorrhea、髄膜炎菌Neisserimeningitides、ヘモフィルスインフルエンザHemophilusinfluenza、エンテロコッカスファエカリスEnterococcusfaecalis、プロテウスブルガリスProteusvulgaris、プロテウスミラビリスProteusmirabilis、ヘリコバクターピロリHelicobacterpylori、梅毒トレポネーマTreponemapalladium、ボレリアバーグドーフェリBorreliaburgdorferi、ボレリアレクレンティスBorreliarecurrentis、リケッチアRickettsialの病原、ノカルジアNocardia、およびアシトノマイセスAcitnomycetesを含む。本発明で検出される真菌性感染因子は、クリプトコッカスネオフォルマンスCryptococcusneoformans、ブラストミセスデルマティティディスBlastomycesdermatitidis、ヒストプラズマカプスラタムHistoplasmacapsulatum、コクシジウムイミティスCoccidioidesimmitis、パラコクシシオイデスブラシリアンシスParacoccicioidesbrasiliensis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペルギルスフミガーツスAspergillusfumigautus、フィコマイセテスPhycomycetesリゾプス、スポロスリックスシェンキーSporothrixschenckii、クロモミコシスChromomycosis、およびマズロミコシスMaduromycosisを含む。本発明で検出されるウイルス性感染因子は、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトT細胞リンパ球親和性ウイルス、肝炎ウイルス例えば、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、バンヤウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルス、およびレオウイルスを含む。本発明で検出される寄生性作用因子は、プラスモジウムファルシパラムPlasmodiumfalciparum、プラスモジウムマラリアPlasmodiummalaria、プラスモジウムビバックスPlasmodiumvivax、プラスモジウムオーバルPlasmodiumovale、オンコバルバボルブラスOnchovervavolvulus、レーシュマニアLeishmania、トリパノソーマTrypanosoma種、住血吸虫Schistosoma種、エンタモエバヒストリチカEntamoebahistolytica、クリプトスポリジウムCryptosporidum、ギアルディアGiardia種、トリチモナスTrichimonas、バラチジウムコーライBalatidiumcoli、ウチェレリアバンクロフティWuchereriabancrofti、トキソプラズマToxoplasma種、エンテロビウスバーミキュラシスEnterobiusvermicularis、アスカリスラムブリコイデスAscarislumbricoides、トリチュリストリチウラTrichuristrichiura、ドラカムクルスメディネシスDracunculusmedinesis、吸虫trematodes、ジフィロボツリウムラタンDiphyllobothriumlatum、条虫Taenia種、ニューモシスティスカリニーPneumocystiscarinii、及びネカターアメリカニスNecatoramericanisを含む。本発明はまた、感染性因子による薬剤耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカスファエシウムEnterococcusfaecium、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌Streptococcuspneumoniae、多剤耐性結核菌Mycobacteriumtuberculosis、およびAZT耐性ヒト免疫不全ウイルスはいずれも本発明で同定できる。遺伝性疾患は、本発明の方法で検出できる。これは染色体および遺伝的異常の出生前スクリーニングもしくは遺伝病の出生後スクリーニングで実施可能である。検出可能な遺伝病の例としては、21ヒドロキシラーゼ欠損、嚢胞性線維症、脆弱X症候群、ターナー症候群、デュシェーヌ筋ジストロフィー、ダウン症候群もしくはその他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、HLAタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状細胞貧血、テイサックス病、タラセミア、クラインフェルトラー症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、脂肪代謝異常症、肥満症、血友病、先天性代謝異常、および糖尿病があげられる。本発明の方法で検出される癌は、通常、癌遺伝子、腫瘍抑制性遺伝子、もしくはDNA増幅に関与する遺伝子、複製、組換え、もしくは修復を含む。これらの例は、BRCA1遺伝子、p53遺伝子、家族性大腸ポリポーシス、Her2Neu増幅、BcrAbI、Kras遺伝子、ヒトパピローマウイルスのタイプ16および18、白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱腫瘍、メラノーマ、肝癌、骨肉腫およびその他の骨癌、睾丸癌および卵巣癌、耳鼻咽喉科の腫瘍、およびヘテロ接合性の消失を含む。環境モニタリングの分野においては、本発明は、都市廃水浄化システムおよび貯水器等の天然の、および工学的な生態系ならびに微小生態系もしくは生物的環境浄化を行っている汚染域における病原性および常在微生物の検出、同定、およびモニタリングに用いられる。集団動態研究における特異的標的微生物のモニタリング、または環境および工業用植物における改変微生物における遺伝学的検出、同定、もしくはモニタリングのいずれかのために、非生体物質を代謝する遺伝子を含むプラスミドの検出をおこなうことも可能である。本発明は、軍人、および犯罪捜査におけるヒトの識別、父性検査および家族関係解析、HLA適合性タイピング、および血液、精子、もしくは移植臓器の汚染スクリーニングを含む多様な法医学的分野においても用いることができる。食品および飼料工業においては、本発明は広く多様な応用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン、その他の産生に関わる酵母等の産生用微生物の同定および特徴付けに用いることができる。利用に関する別の分野は、産物の品質管理および検定ならびに工法例えば、家畜、殺菌、および食肉加工における汚染に関する。その他の利用としては、育種目的の植物、球根、および種子の特徴付け、植物特異的病原体の存在同定、ならびに家畜感染の検出および同定があげられる。望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション接合部において完全な相補性に基づき、対応する標的ヌクレオチド配列上で相互に隣接してハイブリダイズする場合の、ライゲーション接合部におけるライゲーションに好ましいものである。しかしながら、該セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブは、試料中の他のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合には、ライゲーションを阻害するライゲーション接合部位置の塩基にミスマッチが存在する。最も好ましくは、ミスマッチはライゲーション接合部の3塩基に隣接した位置の塩基に存在する。または、ミスマッチは、ライゲーション接合部の塩基に隣接した塩基にあってもよい。本発明の方法は、第1および第2のヌクレオチド配列を100アトモルから250フェムトモルの量で試料中に検出することができる。LDR段階を第1のポリメラーゼ特異的増幅段階とカップルさせ、本発明の完全な方法では、単一分子程度を含む試料において標的ヌクレオチド配列を検出することができる。さらに、ピコモル量であることの多いPCR増幅産物は上記範囲で容易に希釈できる。このリガーゼによる検出反応では、ミスマッチライゲーション産物の配列の形成速度は、マッチしたライゲーション産物の配列の形成速度の0005より低い。ライゲーション期が完了すると、捕獲期が開始される。本方法の捕獲期では、混合物は25~90°C、好ましくは60°C~80°Cの温度で、かつ10~180分間、好ましくは60分までので時間、固体支持体と接触させる。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション中にライゲーション混合物を混合すること、または容積排除、カオトロピック薬剤、テトラメチルアンモニウム塩、もしくはNNNトリメチルグリシンベタイン一水和物を添加することによって加速もしくは改善される。アレイが数十から数百のアドレスからなる場合、正しいライゲーション産物が適当なアドレスでハイブリダイズする機会を有することが重要である。これは、用いる高い温度におけるオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面と接触する液体の機械的運動、もしくは電界によるアレイ全域にわたるオリゴヌクレオチドの運動によって達成することができる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを除去し、捕獲されたプローブの検出の最適化を図るために、アレイを緩衝液で洗浄する。または、アレイを順次洗浄する。好ましくは、固体支持体は、アクリルアミドとカルボン酸塩、アルデヒド、もしくはアミノ基を含む機能性のモノマーとの組み合わせで構成される親水性ポリマーの多孔性表面を有する。この表面は、支持体を、ポリアクリルアミドをベースとしたゲルでコーティングするによって形成する。好ましい配合は、アクリルアミドアクリル酸およびNNジメチルアクリルアミドモノメタクリル酸グリセロールの混合物を含む。クロスリンカーNNメチレンビスアクリルアミドは、501以下のレベル、好ましくは5001以下のレベルで存在する。固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する一態様は、二価カチオンの利用によって達成される。二価カチオンは、Mg2、Ca2、MN2、もしくはCo2でよい。通常、二価カチオンによるマスキングは、カチオンを含むハイブリダイゼーション緩衝液により10mMの最小濃度で室温で15分間、固体支持体のプレハイブリダイゼーションを行うことによって実施する。固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する別の態様は、pH60もしくはそれ以下のpHで接触させることによって実施する。これは、固体支持体に接触させる前もしくは接触中にライゲーション混合物に緩衝液を添加することにより達成される。好ましい緩衝液は、2Nモルフォリノエタンスルフォン酸MES、リン酸ナトリウム、およびリン酸カリウムを含む。固体支持体をライゲーション混合物に接触させている間の陰性電荷のマスキングに関する別の態様は、ポリマーの親水性を維持しながら遊離のカルボン酸基を中和剤でキャッピングすることによって実施する。好ましい中和剤は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、イソプロパノールアミン、およびジイソプロパノールアミンを含む。通常、中和剤によるマスキングは、1プロピル3エチルカルボジイミド塩酸塩およびNヒドロキシこはく酸イミドを用い固体支持体内でカルボン酸基を活性化した後、クロロフォルム、ジクロロメタン、もしくはテトラヒドロフラン等の極性非プロトン性溶媒中で中和剤溶液による処理を行うことによって実施する。本発明による陰性電荷のマスキングによって、ライゲーションの起こらなかったオリゴヌクレオチドプローブの存在下におけるライゲーションされた産物の存在を検出する能力が向上する。特に、ライゲーションの起こらなかったオリゴヌクレオチドプローブに対する比が1300未満、好ましくは1900未満、さらに好ましくは13000未満、最も好ましくは19000未満である場合のライゲーション産物の存在の検出に、本発明は効果的である。さらに、本発明による陰性電荷のマスキングによって、非標的ヌクレオチド配列とは異なる標的ヌクレオチド配列の存在を非標的ヌクレオチド配列から単一塩基の差によって検出する能力が向上する。特に、標的ヌクレオチド配列の非標的ヌクレオチド配列に対する比が120未満、好ましくは150未満、より好ましくは1100未満、最も好ましくは1200未満である場合の標的ヌクレオチド配列の検出に、本発明は有効である。安定にハイブリダイズする捕獲オリゴヌクレオチドおよび位置特定可能なヌクレオチド配列の選択が重要である。このために、オリゴヌクレオチドセットおよび捕獲オリゴヌクレオチドを、位置特定可能なアレイ特異的部分に捕獲オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする温度以下の温度で標的ヌクレオチド配列にオリゴヌクレオチドセットがハイブリダイズするように設計する必要がある。オリゴヌクレオチドをこのように設計しなかった場合、標的にハイブリダイズする同一のオリゴヌクレオチドセットから隣接した未反応のオリゴヌクレオチドを捕獲してしまうことで偽陽性シグナルが生じる。特定のオリゴヌクレオチドセットのライゲーションが起こり、ライゲーションが被検試料中の標的ヌクレオチド配列の有無と相関する場合には、本方法の検出期は走査と同定を含む。走査は、走査電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、電荷結合素子、走査トンネル電子顕微鏡法、赤外線顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、電導度、および蛍光もしくは燐光撮像技術によって実施可能である。相関付けはコンピュータで行う。本発明の別の局面は、固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイ形成法に関する。この方法は、各々がオリゴヌクレオチドの付加に適切である部位のアレイを有する支持体を提供することを含む。各々のアレイ位置において支持体へのオリゴヌクレオチドの結合に好ましいリンカー、もしくは支持体好ましくは非加水分解性は固体支持体に結合している。固体支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイは、多量体ヌクレオチドの付加のための選択されたアレイ位置の活性化および活性アレイ位置における多量体ヌクレオチドの付加の一連のサイクルによって形成される。本発明のさらに別の局面は、支持体上のオリゴヌクレオチドのアレイそのものに関する。固体支持体は、オリゴヌクレオチドの付加に各々好適である部位のアレイを有する。オリゴヌクレオチドの固体支持体への結合に好ましいリンカー、もしくは支持体好ましくは非加水分解性は、アレイの各々の位置において固体支持体に結合している。オリゴヌクレオチドのアレイは、固体支持体上の16ヌクレオチド以上を有するオリゴヌクレオチドで占められる少なくとも一部のアレイの位置に配置される。アレイ形成法においては、異なる多量体オリゴヌクレオチドセットに由来する多量体オリゴヌクレオチドは、固体支持体上の異なるアレイ位置で結合する。その結果、支持体は異なる位置に結合した多量体オリゴヌクレオチドの異なる基を有する位置のアレイを含む。異なる1000のアドレスは、LDRオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的配列例えば、約20~25merと共有結合でライゲーションしたユニークな捕獲オリゴヌクレオチド例えば、24merであってもよい。捕獲オリゴヌクレオチドプローブの配列は、試料中に存在するゲノム上の標的配列もしくは他の配列のいずれかに対して如何なる相同性をも示さないものである。次に、このオリゴヌクレオチドプローブを、位置特定可能なアレイ特異的部分、位置特定可能な固体支持体アレイ上の捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な配列に捕獲させる。この概念を、可能な2つの形態で示し、例えば、p53R248変異図13ACの検出があげられる。図13A~Cには、p53腫瘍抑制性遺伝子のコドン248における生殖系列変異の存在を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブの設計に関するほかの2つの形態を示す。野性型配列はアルギニンR248をコードするが、癌の変異では、トリプトファンR248Wをコードする。下部の図は捕獲オリゴヌクレオチドの模式図である。太い水平の線は位置特定可能なアレイを含むメンブレンもしくは表面を表す。細い曲線は、柔軟なリンカーアームを示す。比較的太い線は、CからN方向で固体表面に結合した捕獲オリゴヌクレオチド配列を示す。例示の目的において、セクションBにおけるリンカーアームが引き延ばされたように捕獲オリゴヌクレオチドを垂直に描いている。アームは柔軟なため、塩基対相補性により捕獲オリゴヌクレオチドは各々において5をCにおよび3をNにハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドがN末端においてメンブレンに結合する場合、同一方向のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが可能となる。この場合、DNAPNAハイブリダイゼーションは、5から3、および3から5への標準的な逆平行にある。他の修飾された糖リン酸骨格も同様に用いられる。図13Bは、3末端における塩基CもしくはTの識別を含むことにより野生型および変異体p53を識別するように設計された2つのLDRプローブを示す。正しい標的DNAおよびTthリガーゼの存在においては、識別プローブは共有結合で下流の共通オリゴヌクレオチドに結合する。下流のオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されている。識別オリゴヌクレオチドは、各々の5末端における単一の位置特定可能なアレイ特異的部分Z1およびZ2の存在によって識別される。黒いドットは、標的依存性のライゲーションが起こっていることを示す。ライゲーション後に、オリゴヌクレオチドプローブを、アレイ上での単一アドレスにおける相補的な位置特定可能アレイ特異的部分によって捕獲してもよい。ライゲーションしたオリゴヌクレオチドプローブおよび未反応のオリゴヌクレオチドプローブのいずれもが、オリゴヌクレオチドアレイによって捕獲される。未反応の蛍光標識した共通プライマーおよび標的DNAを、高温約65°C~80°Cおよび低塩濃度で洗い流す。変異シグナルは、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドにおける蛍光シグナルの検出によって識別するが、野性型シグナルは、位置特定可能なアレイ特異的部分Z2に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドに出現する。ヘテロ接合性は、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1およびZ2に相補的な捕獲オリゴヌクレオチドにおける同程度のシグナルによって示される。シグナルは蛍光撮影装置を用いて定量される。この形態では各々の対立遺伝子に関して単一アドレスを用い、低レベルのシグナル30~100アトモルのLDR産物の非常に正確な検出の達成に好適である。図13Cは、識別シグナルが蛍光撮影装置を用いて定量できることを示す。この形態では、異なる蛍光基をF1およびF2を5末端に有することによってオリゴヌクレオチドプローブを識別する単一アドレスを用いる。オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが、位置特定可能なアレイ特異的部分Z1を3末端に含む共通の下流オリゴヌクレオチドプローブにライゲーションすることができる。この形態においては、野性型および変異体LDR産物の両方がアレイ上の同一のアドレスに捕獲され、それらの異なる蛍光で識別される。この形態では、アレイのより効率的な利用が可能であり、数百もの潜在する生殖系列の突然変異を検出する場合には好適である。固体支持体は、広く多様な材料から作製することが可能である。基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機、もしくはこれらのいずれの組み合わせでもよく、粒子、鎖、沈殿、ゲル、シート、管状材料、球状、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、メンブレン、その他として存在するものである。基質は、盤、四角形、円形、その他等の通常の形状を有する。基質は、好ましくは平坦なものであるが、様々な異なる表面配置をとってもよい。例えば、基質は合成の起こる隆起もしくは陥没した領域を有していてもよい。基質およびその表面は、好ましくはその上で本明細書に記載の反応を起こさせる固い支持体を形成する。また、基質およびその表面は、適当な光吸収特性を提供するように選択したものである。例えば、基質は、重合LangmuirBlodgettフィルム、機能化ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、修飾シリコン、または広く多様なゲルのいずれか、もしくはポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ポリビニル、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート、もしくはその組み合わせ等のポリマーでもよい。当業者であれば、他の基質材料についても、本開示の記載により容易に理解できる。好ましい態様においては、基質は平坦なガラスもしくは単一結晶シリコンである。幾つかの態様においては、所望の表面特性を与えるように、基質表面を既知の技術を用いてエッチングする。例えば、トレンチ、V字溝、丘段構造、切り上がりプラットフォーム等の方法で形成し、合成領域は蛍光源等からの集光を最大限にするための反射鏡構造で得られる照射光の焦点内により近接して配置する。固体基質上の表面は、常にではないが通常は、基質と同一材料で構成する。従って、表面は、広汎な材料、例えば、ポリマー、プラスチック、セラミック、多糖、シリカもしくはシリカをベースにした材料、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、もしくはそれらの組み合わせのいずれかで構成される。基質表面にしっかりと結合した結合部材で表面を官能基化する。好ましくは、表面の官能基は、シラノール、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、ハロ、ハロゲン化アシルもしくはカルボキシル基等の反応基である。ある場合においては、このような官能基は予め基質に内在する。例えば、シリカをベースとした材料はシラノール基を有し、多糖はヒドロキシル基を有し、また合成ポリマーは、それを生じるモノマーに依存して多様な官能基を含む。または、基質が所望の官能基を含まない場合には、このような基は、1段階もしくは複数の段階において基質に結合させることができる。好適に修飾されたガラス、プラスチック、または炭水化物による表面もしくは多様なメンブレンを含む多様な市販材料を用いることができる。材料に依存して、表面の官能基例えば、シラノール、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノはおそらく、コーティングポリマーの一部として最初から存在する、もしくは、官能基の導入のために別の方法例えば、プラズマアニメーション、クロム酸酸化、官能基化側鎖のアルキルトリクロロシランによる処理を必要とする。複数の方法でヒドロキシル基を安定なカルバミン酸ウレタン結合に組み込む。アミノ官能基は直接アセチル化することができるが、カルボキシル基は活性化例えば、NNカルボジイミダゾールもしくは水溶性カルボジイミドし、アミノで官能基化した化合物と反応させる。図11に示すように、固体支持体は出発官能基Xを有するメンブレンもしくは表面であってもよい。官能基の変換は、基Yとの共有結合における1つのパートナーを表す基Xを提供する必要に応じて多様な方法で行うことができる。図11は、PEGすなわち、ポリエチレングリコールのグラフトを具体的に示すが、同一レパートリーの反応を、炭水化物ヒドロキシルを有する、リンカーカルボキシルを有する、およびもしくは好ましい官能基アミノもしくはカルボキシルによって伸長したオリゴヌクレオチドを付加させるために用いることができるただし、必要であれば。ある場合においては、基XもしくはYは予め活性化される別の反応で単離可能な種。または、活性化はインサイチューで起こる。図11に記載のPEGを参照すると、YおよびYは同一同一二元官能基でも異なって異質二元官能基いてもよい。後者の場合、Yはさらに化学的コントロールを行うために保護することができる。未反応のアミノ基をアセチル化、スクシニル化でブロックし、過剰のハイブリダイズしていないDNAを排除する中性もしくは陰性に荷電した環境を保つ。負荷レベルは、標準的な分析法で調べることができる。Fieldsらの固相ペプチド合成の原理および実施PrinciplesandPracticeofSolidPhasePeptideSynthesis合成ペプチドユーザー指針SyntheticPeptidesAUsersGuideGGrant、Editor、WHFreemanandCoNewYorkp771831992、これは参照として本明細書に組み入れられる。シリカをベースとした支持体表面に官能基を付加する一つのアプローチとしては、所望の官能基例えば、オレフィン、アミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ケト、ハロ、ハロゲン化アシルもしくはカルボキシルを有する分子、もしくは所望の官能基を含む別の分子Bに結合することのできる分子Aのいずれかでシラン化することがあげられる。前者の場合、ガラスもしくはシリカをベースとした支持体の、例えば、アミノ基による官能基化は、3アミノプロピルトリエトキシシラン、3アミノプロピルメチルジエトキシシラン、3アミノプロピルジメチルエトキシシラン、3アミノプロピルトリメトキシシラン、N2アミノエチル3アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N2アミノエチル3アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノフェニルトリメトキシシラン、4アミノブチルジメチルメトキシシラン、4アミノブチルトリエトキシシラン、アミノエチルアミノメチルフェネチルトリメトキシシラン、もしくはその混合物等のアミン化合物で実施する。後者の場合には、分子Aは、好ましくはビニル、アクリレート、メタクリレート、もしくはアリル等のオレフィン基を含むが、分子Bはオレフィン基および所望の官能基を含む。この場合、分子AおよびBは、互いに重合する。ある場合においては、その性質を修飾するために例えば、生体適合性を付与するおよび機械的安定性を向上させるために。シラン化した表面を修飾することが好ましい。これは、分子A、B、およびCを含むポリマーネットワークを得るために、分子Bとともにオレフィン分子Cを添加することによって達成できる。分子Aは、以下の化学式で定義される:式中、R1はHもしくはCH3である。R2はCOOR6で、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族芳香族基の混合したものである。R3はOアルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。R4は、Oアルキル、アルキルもしくはハロゲン基である。R5はOアルキル、アルキルもしくはハロゲン基であり、またR6は、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族芳香族基の混合したものである。分子Aの例は、3トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、N3トリメトキシシリルプロピルN4ビニルベンジルエチレンジアミン、トリエトキシビニルシシラン、トリエチルビニルシシラン、ビニルトリクロロシシラン、ビニルトリメトキシシラン、およびビニルトリメチルシシランを含む。分子Bは、上記の一つもしくは複数の官能基を含むモノマーである。分子Bは、以下の化学式で定義される:式中、iR1はHもしくはCH3であり、R2はCO、およびR3はOHもしくはClである;またはiiR1はHもしくはCH3、およびR2はCOOR4、官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族芳香族基の混合したものである。また、R3はOH、COOH、NH2、ハロゲン、SH、COC1、もしくは活性エステル等の官能基、およびR4は官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族基、官能置換基を有するもしくは有さない芳香族基、または官能置換基を有するもしくは有さない脂肪族芳香族基の混合したものである。分子Bの例は、アクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸、ビニル酢酸、4ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン、アリルエチルアミン、4アミノスチレン、2アミノエチルメタクリレート、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、4ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、アリルアルコール、2ヒドロキシエチルメタクリラート、もしくはポリエチレングリコールメタクリレートを含む。分子Cは、分子A、分子B、もしくは両方に重合可能な分子であり、選択的に上記の一つもしくは複数の官能基を含む。分子Cは、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル酢酸、4ビニル安息香酸、イタコン酸、アリルアミン、アリルエチルアミン、4アミノスチレン、2アミノエチルメタクリレート、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、クロロスチレン、ジクロロスチレン、4ヒドロキシスチレン、ヒドロキシメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、アリルアルコール、2ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリエチレングリコールメタクリレート、アクリル酸メチル、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、スチレン、1ビニルイミダゾール、2ビニルピリジン、4ビニルピリジン、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリルアクリレート、NNメチレンジアクリルアミド、NNフェニレンジアクリルアミド、35ビスアクリロイルアミド安息香酸、ペンタエリスリトールトリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート143EOOHトリアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート73EOOHトリアクリレート、トリエチロールプロパンプロポキシレート1POOHトリアクリレート、もしくはトリメチロールプロパンプロポキシレート2POPHトリアクリレート等のモノマーもしくはクロスリンカーであってもよい。通常、官能基は最終的には支持体に結合するオリゴヌクレオチドのための出発点として働く。これらの官能基は、固体支持体に結合する有機基に反応性であるか、またはリンカーもしくはハンドルの利用によってこのような基に反応性となるように修飾することができる。官能基は、支持体にさまざまな所望の性質を付与することができる。支持体を必要に応じて官能基化した後、相補的オリゴヌクレオチド捕獲プローブの担体部位として働く活性化された官能基を含むテーラーメイドのポリマーネットワークを支持体に植え込む。従って、このアプローチの利点としては、捕獲プローブの負荷容量を有意に増加させることができ、中間体としての固相対液相の物理的性質が制御しやすくなる。最適化を受けるパラメータは、官能基を含むモノマーの種類と濃度、および用いるクロスリンカーの種類と相対的濃度を含む。リンカー分子は本発明に必要な要素ではないものと理解されるが、官能基化した基質表面は、好ましくはリンカー分子層とともに提供される。作製した基質においてポリマーが基質に暴露された分子と自由に相互作用できるように、リンカー分子は、好ましくは充分な長さのものである。充分に暴露されるように、リンカー分子は、6~50原子の長さであることが必要である。リンカー分子、例えば、アリールアセチレン、2~10モノマーユニットを含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン類、2価酸、アミノ酸類、もしくはその組み合わせである。別の態様においては、リンカー分子をその親水性疎水性の性質に基づいて選択し、特定の受容体に対する合成ポリマーの提示について改善する。例えば、親水性受容体の場合には、親水性リンカー分子は、受容体が合成ポリマーにより近接して近づくことが可能であることが好ましい。もう一つの別の態様においては、リンカー分子は中間位置に光開裂性の基を有するものとして提供される。光開裂性の基は、保護基とは異なる波長で開裂することが好ましい。これにより、異なる光波長に暴露する方法で合成完了後に、さまざまなポリマーの除去を可能にする。リンカー分子は、炭素と炭素の間の結合で、例えば、ポリトリフルオロクロロエチレン表面を用いて、もしくは、好ましくは、シロキサン結合例えば、ガラスもしくは酸化シリコン表面を用いてで基質に結合できる。基質表面とのシロキサン結合は、一態様においては、トリクロロシリル基を有するリンカー分子の反応によって形成する。リンカー分子は、選択的に整列アレイすなわち、重合化単層にその頭部が平らに並んだものとしてに結合していてもよい。別の態様においては、リンカー分子は基質表面に吸着している。しばしば、DNAもしくはPNA合成の出発リンカーの付加前に、相補的官能基化をPEGスペーサーに導入することが望ましいGBaranyらの固相ペプチド合成のための新規ポリエチレングリコールポリスチレンPEGPSグラフト支持体NovelPolyethyleneGlycolpolystyreneGraftSupportsforSolidphasePeptideSynthesisedCHSchneiderandANEberle、Leiden、TheNetherlandsEscomSciencePublishers2672681993Zaiipskyらの固相ペプチド合成のためのポリエチレングリコールポリスチレングラフト樹脂支持体の調製および応用PreparationandApplicationsofPolyethyleneGlycolpolystyreneGraftResinSupportsforSolidphasePeptideSynthesisReactivePolymers22243581994JMHarris、edポリエチレングリコールの化学生物技術および生物医学的応用PolyChemistryBiotechnicalandBiomedicalApplications1992、PlenumPressNewYork;これらは参照として本明細書に組み入れられる。必要に応じて、同様にデキストラン層を導入するCassらのパイロット、新規ペプチドリード最適化技術とその応用一般的ライブラリー法として、ペプチド化学、構造および生物学、第13回米国ペプチドシンポジュウムPilotANewPeptideLeadOptimizationTechniqueandItsApplicationasaGeneralLibraryMethod、inPeptidesChemistryStructureandBiologyProceeaingsoftheThirteenthAmericanPeptideSymposiumRSHodgesandJASmith、Editor1994、EscomLeiden、TheNetherlandsLofasらのリガンドの迅速かつ高効率の共有結合による固定化のための金表面プラズマ共鳴センサー上の新規ハイドロゲルマトリックスANovelHydrogelMatrixonGoldSurfacePlasmaResonanceSensorsforFastandEfficientCovalentImmobilizationofLigandsJChemSoc、ChemCommunpp152615281990、これらは参照として本明細書に組み入れられる。インドール部分で効率的かつ特異的捕獲ができるので、特に好ましいリンカーは、酸が希釈されたwithdiluteacidトリスアルコキシベンジルカルボニウムイオンである。DNAオリゴヌクレオチドは、アミノ酸のトリプトファン残基で合成しこれを停止することができ、また、トリスアルコキシベンジルエステル超感受性酸不安定HALもしくはトリスアルコキシベンジルアミドPALリンカーによる修飾を受けた支持体に効率的に結合することができるFAlbericioetalJOrgChem55373037431990FAlbericioandGBarany、TetrahedronLett、32101510181991、これらは参照として本明細書に組み入れられる。他の潜在的に迅速な化学は、チオールとブロモアセチルもしくはマレイミド官能基との反応を含む。一つの変法として、アミノ官能基化DNAの末端を無水臭化酢酸で修飾し、ブロモアセチル官能基を、支持体上に容易に導入したチオール基で捕獲する。または、プローブの末端にライゲーションしたNアセチル、Sトリチルシステイン残基は、開裂および脱保護の後に、支持体上のマレイミド基で捕獲できる遊離のチオールを与える。図12に示されるように、化学的に合成したプローブをそのいずれかの末端に伸長させる。さらに提案される化学のバリエーションは容易に理解できる。図12Aは、プローブ上のアミノ基は、無水臭化酢酸で修飾され、ブロモアセチル官能基は支持体上のチオール基で捕獲されることを示す。図12Bは、プローブの末端にライゲーションしたNアセチル、Sトリチルシステイン残基は、開裂および脱保護の後に、支持体上のマレイミド基で捕獲される遊離のチオールを与えることを示す。図12Cは、プローブは希酸によるHAL修飾固体支持体の処理後に捕獲されるオリゴトリプトファニルのテールn1~3を含むことを示す。本発明のアレイを調製するためにDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーを固体支持体に付加させることが必要である。これは、前もって合成されたプローブを付加する、もしくは直接組立ててから支持体に側鎖の脱保護オリゴマーが遊離しないようにを行うことのいずれかのよって達成する。さらに、支持体の環境としては効率的なハイブリダイゼーションが可能であること等が必要である。このために、2つの要因が存在する。1支持体材料が充分に親水性である性質例えば、PEGもしくは炭水化物部分および2支持体骨格からプローブを隔てる柔軟なリンカーアーム例えば、酸化ヘキサエチレンもしくはより長いPEG鎖。多くの表面上平坦な表面は分子レベルでは非常に厚いものであることに注意する。最後に、支持体材料が非特異的結合もしくは固有蛍光による有意なバックグランドシグナルを与えないことが重要である。本明細書において用いられるリンカー分子およびモノマーは、保護基を結合した官能基として提供される。好ましくは、保護基は基質と逆側のリンカー分子の遠位もしくは末端にある。保護基は、陰性保護基すなわち、保護基は、リンカー分子が暴露されたときのモノマーに対する反応性を弱めるもしくは陽性保護基すなわち、保護基は、リンカー分子が暴露されたときのモノマーに対する反応性を強めるのいずれかである。陰性保護基の場合、別の再活性化段階が必要である。幾つかの態様においては、これは加熱によって行う。リンカー分子の保護基は、好ましくはoニトロベンジル誘導体もしくはベンジルスルフォニル等のニトロ芳香族化合物を含む広く多様な光反応性の陽性基から選択される。好ましい態様においては、6ニトロベラチルオキシカルボニルNVOC、2ニトロベンジルオキシカルボニルNBOC、ベンジルオキシカルボニルBOC、フルオレニルメトキシカルボニルFMOC、もしくはααジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニルDDZが用いられる。ある態様においては、ニトロ基に対してオルソのベンジル水素を含むニトロ芳香族化合物が用いられる。すなわち、次の式で表される化学物質である式中、R1はアルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、アルケニル、もしくは水素R2はアルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、ニトロ、もしくは水素R3はアルコキシ、アルキル、ハロ、ニトロ、アリール、もしくは水素R4はアルコキシ、アルキル、水素、アリール、ハロ、もしくはニトロおよびR5はアルキル、アルキニル、シアノ、アルコキシ、水素、ハロ、アリール、もしくはアルケニルである。用いられる他の物質としては、oヒドロキシαメチルシナモイル誘導体があげられる。光除去性の保護基は、例えば、Patchomik、JAmChemSoc9263331970およびAmitらJOrgChem391921974に記載されており、両方とも参照として本明細書に組み入れられる。別の態様においては、陽性の反応基は溶液中の試薬との反応において活性化される。例えば、カルボニルに結合した場合には、5ブロモ7ニトロインドリン基は420nmの光に暴露することによって反応が起こる。第2の別の態様においては、リンカー分子の反応基はシナメート基を含む広く多様な陰性の光反応基から選択される。または、反応基は電子線リソグラフィー、X線リソグラフィー、もしくはその他の照射法によって活性化もしくは不活性化される。電子線リソグラフィーに好ましい反応基はスルフォニル基である。用いられる他の方法は、例えば、電流源への暴露を含む。その他の反応基および活性化法が、本開示の図に示されている。結合分子は、好ましくは、例えば、半導体工業で既知であり、例えば、SzeのVLSITechnology、McGrawHill1983、およびMeadらのIntroductiontoVLSISystems、AddisonWesley1980、これらは、すべての目的において参照として本明細書に組み入れられるに記載のタイプの光リソグラフィー技術を用いた好ましいマスク法で光に暴露する。保護基の除去に必要な光の波長に対し透過性である基質であれば、保護基を含む表面もしくは基質の背面のいずれかに光を当てる。マスクは、ある態様においては、不透明材料の層で選択的にでコートされた透明な支持体材料である。不透明材料部分は、基質表面上の所望の精密パターンにおける不透明材料を残し、除去される。マスクを基質表面と直接接触させる。マスクの開口部は、基質から光除去性の保護基を除去することが好ましい基質上の位置に対応する。並列マークを用い、その前のパターン化段階の順次マスクを正確に重層する通常の並列化技術を用いて、もしくはより洗練された技術を用いて並列化を行う。例えば、Flandersら新規干渉並列化技術ANewInterferometricAlignmentTechniqueAppPhysLett314264281977これは参照として本明細書に組み入れられるに記載のもの等の干渉技術が用いられる。基質に当てた光のコントラストを向上させるためには、幾つかの態様に従ってコントラストを亢進する材料をマスクおよび基質の間に入れることが好ましい。このようなコントラストを亢進する層は、キノンジアザイドもしくは目的波長で一過的に漂白される材料等の光で分解される分子を含み得る。材料の一過的漂白によって、光を当てる場所での浸透がより大きくなり、従ってコントラストが亢進する。または、コントラストの亢進は被覆ファイバーオプティックス束によっても得られる。光は、通常の白熱光源、レーザー、レーザーダイオード等に由来するものであってもよい。非平行光源を用いる場合には、基質上に光が広がるのを防ぐ厚い、もしくは多重層のマスクを用いることが好ましい。さらに、幾つかの態様においては、合成を制御するために異なる波長に感応する基を利用することが好ましい。例えば、異なる波長に感応する基を用いて、ポリマー合成もしくは特定のマスキング段階を省くように分枝位置を選択することも可能である。または、基質は変調レーザーもしくはダイオード光源下で変換される。このような技術は、例えば、Feyrerらの米国特許第4719615号に記載され、参照として本明細書に組み入れられる。別の態様においては、レーザーガルバノメトリックスキャナーを利用する。別の態様においては、通常の液晶本明細書において光バルブと称するまたはファイバーオプティックによる光源上もしくは接触して合成がおこる。適当に調整した液晶によって、光を選択的に制御し、光が選択された基質領域に接触できるようにする。または、光が選択的にあたる一連の光ファイバーの端で合成が起こる。光に当てる位置をコントロールする他の手段については、当業者であれば、理解できる。ペプチド合成のリンカーおよびハンドルの開発は、Fieldsらの固相ペプチド合成の原理および実際PrinciplesandPracticeofSolidPhasePeptideSynthesisSyntheticPeptidesAUsersGuideGGrant、EditorWHFreemanandCoNewYorkp771831992GBaranyらの固相ペプチド合成のためのハンドルおよび支持体における最近の進歩、ペプチド化学構造および生物学、第13回米国ペプチドシンポジュウム、RSHodgesandJASmith、EditorEscomSciencePublishersLeiden、TheNetherlandspp1078801994に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。この技術は容易にDNAおよびPNAに利用可能である。PALの開発Albericioら穏和な条件におけるC末端ペプチドアミドの固相合成のための549フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノメチル35ジメトキシフェノキシ吉草酸PALハンドルの調製および応用PreparationandApplicationofthe5Aminomethyl35DimethoxyphenoxyValericAcidHandlefortheSolidphaseSynthesisofCterminalPeptideAmidesunderMildConditionsJOrgChem55373037431990;これは参照として本明細書に組み入れられる;およびエステルHALAlbericioら、保護ペプチドセグメントの固相合成のための超感受性酸不安定HALトリスアルコキシベンジルエステルのアンカーリングHypersensitiveAcidlabileTrisBenzylEsterAnchoringforSolidphaseSynthesisofProtectedPeptideSegmentsTetrahedronLett32101510181991;これは参照として本明細書に組み入れられる;C末端のペプチドアミド、および所謂セグメント濃縮法の構築単位として用いることのできる保護されたペプチド酸をそれぞれ与える酸による開裂で生じる結合は、特に興味深い。PALもしくはHAL結合の開裂から酸において生じた安定化カルボニウムイオンは、トリプトファニルペプチドによって停止することができる。この反応はペプチド合成には好ましくはなく、適当なスカンベンジャーの使用によってこれを部分的には防ぐことができるが、HAL修飾表面でオリゴTrp末端標識DNAおよびPNA分子を化学的に捕獲する有益な応用法がある。オリゴヌクレオチドアレイを作製する複数のアプローチが当技術分野で知られている。Southernらオリゴヌクレオチド配列のアレイに対するハイブリダイゼーションによる核酸配列の分析比較実験モデルを用いた評価AnalyzingandComparingNucleicAcidSequencesbyHybridizationtoArraysofOligonucleotidesEvaluationusingExperimentalModelsGenomics13100810171992Fodorら生物学的チップを用いた多重バイオケミカルアッセイMultiplexedBiochemicaAssayswithBiologicalChips、Nature3645555561993KhrapkoらオリゴヌクレオチドマトリックスでのハイブリダイゼーションによるDNAシーケンシングの方法AMethodforDNASequencingbyHybridizationwithOligonucleotideMatrix、JDNASeqMap13753881991VanNessらオリゴデオキシヌクレオチドプローブをベースにしたハイブリダイゼーションアッセイのための多目的固体支持体システムAVersatileSolidSupportSystemforOligodeoxynucleosideProbebasedHybridizationAssays、NucleicAcidsRes、19334533501991Zhangら膜結合性修飾オリゴヌクレオチドを用いる癌および遺伝病の単一塩基変異分析SinglebaseMutationalAnalysisofCancerandGeneticDiseasesUsingMembraneBoundModifiedOligonucleotides、NucleicAcidsRes19392939331991KBeattie、ゲノセンサー研究における進歩AdvancesinGenosensorResearch、ClinChem415700061995は参照として本明細書に組み入れられる。これらのアプローチは3つのカテゴリーに分類される。1標準的方法によるオリゴヌクレオチド合成および空間的アレイにおける、ある時間でのそれらの結合、2短いオリゴヌクレオチド合成を可能とするシリコンチップの光リソグラフィーのよるマスキングおよび光化学的脱保護、Fodorら生物学的チップを用いた多重バイオケミカルアッセイMultiplexedBiochemicaAssayswithBiologicalChips、Nature3645555561993およびRJLipshutzら遺伝的多様性に対するオリゴヌクレオチドプローブアッセイの利用UsingOligonucleotideProbeArraysToAssessGeneticDiversity、Biotechniques、194424471995、これは参照として本明細書に組み入れられるおよび3未マスク部位における単一塩基の添加による短いオリゴヌクレオチド合成を可能とする物理的マスキングSouthernらオリゴヌクレオチド配列のアレイに対するハイブリダイゼーションによる核酸配列の分析比較実験モデルを用いた評価AnalyzingandComparingNucleicAcidSequencesbyHybridizationtoArraysofOligonucleotidesEvaluationusingExperimentalModelsGenomics13100810171992Maskosらガラス支持体上で合成した大型アレイを用いたオリゴヌクレオチド再会合の研究AStudyofOligonucleotideReassociationUsingLargeArraysofOligonucleotidesSynthesisedonaGlassSupport、NucleicAcidsRes、21466346691993、は参照として本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチドアレイの構築に関してはかなりの進歩が見られ、あるものは独立の256のアドレスを含むが、ハイブリダイゼーションで特異的DNA配列を検出することにおいてはこれらの方法はあまり好適ではない。特に、より長いオリゴヌクレオチドを含むアレイは、現在のところ、一度に一箇所のアドレスに付加することによってしか合成されないので、潜在的サイズにおいて制限を受ける。現行法では、オリゴヌクレオチドを順次付加するには約1時間かかる。従って、1000アドレスのアレイでは、調製に24時間通しで行ったとしても40日以上を要する。8merから10merの短いオリゴヌクレオチドを含むアレイは、産業上の応用には適さない。なぜならば、単一塩基の違いを効果的に検出するためにより長い分子が必要となるからである。これら従来の方法も、本発明の検出法のオリゴヌクレオチドアレイを有する該支持体を調製するために依然として有用である。しかしながら、より好ましいアプローチがある。相対的に小さいが、明確に区別される部位のオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマー負荷に好ましい支持体を調製することが望ましい。現在の市販の蛍光撮影装置では、50平方μmのピクセル当たり3アトモル程度の低いシグナルを検出することができる。従って、合理的サイズのアドレスもしくはアレイ上のスポットは、約4×4ピクセル、もしくは200平方μmである。より小さいアドレスはCCDで検出することができる。このようなアドレスの検出限界はスポット当たり約48アトモルであり、これは蛍光DNAシークエンシング装置を用いたときの100アトモルの検出限界に匹敵する。200平方μm当たり負荷することのできるオリゴヌクレオチドの容量は、潜在的なシグナル対雑音比の指標を与える。20フェムトモルは約4001のシグナル対雑音比を与えるが、200フェムトモルは約40001の良好なシグナル対雑音比を可能とする。オリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーは、ハイブリダイゼーションを容易にするために、柔軟なリンカーアームおよび固体支持体の外側もしくは表面上に存在する必要がある。支持体は、非蛍光性であり、ハイブリダイゼーションを阻害することなく、また非特異的結合による高バックグランドシグナルを与えることがないものであることが必要である。固体支持体上の相補的捕獲オリゴヌクレオチドアドレスは、DNAもしくはPNAのいずれかである。PNAによる捕獲は、DNAによる捕獲より好適である。何故ならば、PNADNAデュプレックスはDNADNAデュプレックスよりも約l°C塩基対強いからである。MEgholmらワトソンクリックの水素結合の規則に従って相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするPNAPNAHybridizestoComplementaryOligonucleotidesObeyingtheWatsonCrickHydrogenbondingRules、Nature3655665681993は参照として本明細書に組み入れられる。従って、Tm72°Cである24merのDNADNA二重鎖は、予測されるTm=96°Cを有する一方がPNAである二重鎖に対応する実際の融解点は、上記の経験則より僅かに低く、融解点が80°Cを越えるとより不正確になる。さらに、DNADNAとPNADNAとの融解の差は、低塩でさらに低くなる。DNADNAデュプレックスの融解温度は、4nGC2mAT°Cで見積もることができる。オリゴヌクレオチド捕獲は、形成したデュプレックスと互いにハイブリダイズする相補的位置特定可能なアレイ特異的部分との間のGCAT含量の差より生じるTm差を狭めることによって、捕獲オリゴヌクレオチドを最適化できる。チミンの代わりに5プロピニルdUを用いることでDNAデュプレックスのTmを、平均置換当たり17°C増加させることができる。Froehlerら2デオキシウリジンおよび2デオキシシチジンのC5プロピン類縁体を含むオリゴヌクレオチドOligonucleotidesContainingC5PropyneAnalogsof2deoxyuridineand2deoxycytidine、TetrahedronLett33530753101992およびJSagiらのTetrahedronLetters3421911993は参照として本明細書に組み入れられる。捕獲スキームにおける同一置換は、デュプレックス等の成分間のTm差を低め、全デュプレックスのTmを上げることが必要である。以下の構造を有するSプロピニルdUのホスホアミダイト誘導体は、直ぐ上のFroehlerおよびSagiの文献に従って調製できる。これらは、参照として本明細書に組み入れられる。Fmocアミノ保護基を有する5プロピニルウラシルPNAモノマーは、以下の合成で得られるここで、DMFはNNジメチルホルムアミド、DCCはNNジクロロヘキシルカルボジイミド、HOBtは1ヒドロキシベンゾトリアゾール、およびTHFはテトラヒドロフランであるEgholmらペプチド核酸PNAアキラル性のペプチド骨格を有するオリゴヌクレオチド類縁体PeptideNucleicAcidsOligonucleotideAnalogueswithanAchiralPeptideBackbone、JAmChemSoc、114189518971992及びEgholmらシトシンとチミンを含むペプチド核酸PNAによるDNA中のグアニンとアデニンの認識RecognitionofGuanineandAdenineinDNAbyCytosineandThymineContainingPeptideNucleicAcids、JAmChemSoc114967796781992に記載の方法を用いて、これらは参照として本明細書に組み入れられる。上記の合成スキームには、5プロピニルウラシル塩基の成分を有するPNAモノマーの調製を示している。5ヨードウラシルは、まずヨード酢酸でアルキル化し、次にプロピニル基をPdCu触媒で塩基部分にライゲーションする。スキームの残余の段階は上記の参考文献による方法に従う。これらモノマーを合成DNAおよびPNA鎖に組み込むことができる。アレイ合成の一般的な好ましいアプローチには2つある。第1のアプローチにおいては、完全長のDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーを調製し、次に共有結合で、固体支持体もしくはメンブレンと結合する。第2のアプローチでは、支持体に多量体を順に付加し、特異的に設計したPNAオリゴマーもしくはDNAオリゴヌクレオチドを構築する。これらの多量体を、固体支持体もしくはメンブレン表面に列もしくは行に特異的付加する。得られたチェッカーボードパターンが完全長のPNAもしくはDNAの単一の位置特定可能なアレイを生成する。図14~図16に完全長のDNAオリゴヌクレオチドもしくはPNAオリゴマーの調製、次に、結鎖固体支持体への完全長の分子への結合に関する異なる方法を示す。図14A~Eには、個々の完全長オリゴヌクレオチドをグリッドの適当な位置にカップリングさせることによるDNAもしくはPNAオリゴヌクレオチドアレイ構築法を示す。図14Aのアレイは、アレイ表面の200μm×200μmの16の領域にオリゴヌクレオチドが結合して生成したオリゴヌクレオチドのパターンを示す。各々個々の200μm×200μmの領域は、表面に結合した単一の配列を含むDNAもしくはPNAを含む。個々の四角形の領域は、隣接した四角形から200μm離れている。従って、図14Aのアレイは、3mm×3mmの領域に648×8の異なるオリゴヌクレオチドを支持する。アレイの構築を多重化するために、800μmの距離離れている16の四角形に、同時に特異的オリゴヌクレオチドを結合させた。したがって、図14B14Eに示されるように、8×8グリッドをたった4段階で構築できる。これらの図において、黒い四角形は、本合成段階における異なる位置を表すが、斜線の四角は、それ以前の段階で合成した領域を表す。最初の段階図14Bでは、同時にAl、El、I1、Ml、A5、E5、I5、M5、A9、E9、I9、M9、A13、E13、I13、およびM13の位置でオリゴヌクレオチドを固定化する。次の段階図14Cでは、装置を再並列させ列Cを開始する。行1が完了した後、次の段階図14Dでは行3を開始する。最後に、8×8グリッドを完成させるために最後の16オリゴヌクレオチドを固定化する図14E。従って、8×8アレイの構築を、64個の個々のスポッティング反応段階で行う代わりに4合成段階に減らすことができる。この方法は、容易に拡張でき、同時に96オリゴマーのスポッティングが可能である装置を用いて、迅速により大きなアレイを構築できる。図15A~Eは、図14に記載のアレイの構築法の透視図を表す。図15A~Eにおいては、4つの異なる24merをスポッティング可能である装置を用いた4×416アレイの構築が同時に描かれている。第1に、図15Aに示されるように、装置で、Al、El、A5、およびE5の位置で4つのオリゴマーを結合させる。次に、図15Bで示すように、装置を水平に移動させて、4つのオリゴマーをC1、G1、C5、およびG5の位置で結合させる、次に、図15Cで示すように、装置の位置調整をし、A3、E3、A7、およびE7の位置で4つのオリゴマーを結合させる。最後に、図15Dに示されるように、装置で残余の4オリゴマーをC3、G3、C7、およびG7の位置で結合させる。図15Eの透視図に示されるように、完成したアレイは、16の24merを含む。図16A~Cには、図14に示されるアレイグリッドGの異なる位置に同時に16の異なるオリゴヌクレオチドのカップリングが可能である添加装置2の図を示す。上面図の黒い四角形図16Aは、互いに空間的に600μm離れた16個の200μm×200μmの領域を表す。該装置には、異なるオリゴヌクレオチドを含むチューブでアレイ上の上記の異なる位置の漏斗形のチェンバーを満たすことが可能な16個の入力ポートがある。装置の側面図それぞれ図16Aのライン16B16Bおよび16C16Cを含む図16B~Cは漏斗形のチェンバー4が装置下のアレイ上の適当な領域に並列していることを示す。さらに、2つのバルブ6および8図16A~Cの斜線の四角形は、独立した16個の反応チェンバーにおいて液体の流れを制御する。一つのバルブ6は入力ポート10からの流体の流入を制御し、反応チェンバー4への添加と除去を行うために、もう一方のバルブ8は減圧ライン12にライゲーションする。装置はまずアレイの適当な200μm×200μm領域にわたって並列する。次に、全装置がアレイに確実な加圧を行い、上記各々の位置で密閉反応チェンバーを形成する。アレイ上の各々の位置の周りに存在する10μmの隆起堤Rによって、オリゴマーがアレイ上の隣接領域に漏れることを防ぐ密着シールの形成を確保する。次に、減圧ライン12へのバルブ8を開け、溶液流入ポート10のバルブ10を閉める。これによって反応チェンバー4から空気を除去し、チェンバー内を陰圧にする。次に、減圧ライン12へのバルブ8を閉め、溶液流入ポート10のバルブ10を開ける。陰圧により、溶液が反応チェンバーに流れ込む。この段階では、反応チェンバー4内の気泡形成の可能性を確実に除き、200μm×200μmの領域におけるオリゴヌクレオチドの分布を確実にする。オリゴヌクレオチドを活性化アレイ表面に結合させた後、入力バルブ6を閉め、減圧ライン12へのバルブ8を開ける。過剰な溶液を反応チェンバーから完全に除去するために装置をアレイ表面から持ち上げる。今度は第2の装置を再並列させ、次にアレイ上の16個の位置の合成をおこなう。図15~図26には、順に支持体にPNAもしくはDNA多量体を添加することにより、固体支持体上にPNAオリゴマーもしくはDNAオリゴヌクレオチドを構築するための異なる方法を示す。多量体によるアレイ構築の例として、このような構築を四量体で達成することができる。4塩基を四量体として配置する可能な26544通りの方法のうち、単一の配列を有する36通りのものが選択される。選択された四量体の各々が、他のすべてのものと少なくとも2塩基異なり、2つの二量体で互いに相補的なものはない。さらに、自己対合もしくはアドレス間のヘアピン形成を起こす四量体は除かれている。最終的な四量体は、表1のリストに示してあり、任意に1~36までの番号付けを行った。必要となることもある24mer捕獲オリゴヌクレオチドアドレスの配列の設計モジュールとして、この四量体の単一セットを用いる。段階的に1度に1塩基、もしくは同時四量体構築単位合成法で、この構造を組み立てる。四量体の多くの他のセットは、上記の規則に従って設計される。このセグメントアプローチは四量体のみに限定されるものではなく、他のユニット、すなわち、二量体、三量体、五量体、もしくは六量体でも用いることができる。表1互いに少なくとも2塩基異なる四量体PNA配列および相補的DNA配列のリスト四量体の番号付けスキームでは、各々のアドレスが6つの数字で略称されることに注目すること例えば、下記の表2第2列。36の四量体単一セットで設計された24merアドレスの概念表1から、可能な構造は膨大な数となる3662176782336。図17には、少なくとも2塩基互いに異なる36の四量体で多数の可能な設計のうちの1つを示す。チェッカーボードパターンは、256の可能な全四量体を示す。四角形は、チェッカーボードにおける左の最初の2塩基とそれに続く上部の2塩基を表す。各々の四量体は少なくとも互いに2塩基異なる必要があり、非相補的である必要がある。四量体を白いボックスで示し、その相補鎖を番号としてリストに載せた。従って、このスキームにおいて、相補的配列GACC20およびGGTC20はお互いに排除的である。さらに、四量体は、非回文構造的でなくてはならない、例えば、TCGA黒い対角線のボックス、および非繰り返しでなくてはならない、例えば、CACA黒い対角線のボックス、上部の左から下部右。36の四量体とは、僅か1塩基しか異ならないその他の配列はいずれも、明るい灰色で斜線付けされている。4つの潜在的四量体白いボックスは、すべてがATもしくはすべてがGCである塩基のいずれかであるために選択されなかった。しかしながら、下記に示されるように、AT塩基のTm値をほぼGC塩基のレベルに上げることは可能である。従って、すべてがATもしくはすべてがGC塩基である四量体白ボックス中のものを含むは、潜在的に四量体設計用いることができる。さらに、捕獲オリゴヌクレオチドアドレスの配列内で、およびオリゴヌクレオチドプローブの位置特定可能なアレイ特異的部分であれば、チミンは5プロピニルウリジンで置換できる。これにより、AT塩基対のTmは約17°C増加する。従って、個々の四量体のTm値は、約151°Cから157°Cとなるはずである。完全長24merのTm値は95°C以上となるはずである。この概念を例示する目的で、36の四量体配列のうちで6つからなるサブセットを用いて、アレイ1TGCG2ATCG3CAGC4GGTA5GACCおよび6ACCTを構築した。所望の24merの位置特定可能なアレイ特異的部分および24merの相補的捕獲オリゴヌクレオチドのアドレス配列設計モジュールとして、この単一の四量体セットを用いることができる。この態様は、5つの位置特定可能なアレイ特異的部分表2のリストに載せた配列の合成を含む。四量体の番号付けスキームで、各々の部位の略称Zipと称するが6つの数字で示されているzipコードと称することに注目すること。表25つのDNAPNAオリゴヌクレオチドアドレス配列の全リストこれらのオリゴマーは各々、5末端に酸化ヘキサエチレンリンカーアームPGrossmanらNuclAcidsRes、22452745341994は参照として本明細書に組み入れられる、およびスライドグラス表面への結合に好適である最終的なアミノ官能基、もしくは別の物質を含む。結合方法は、フリーの表面官能基に依存するYZhangら、NucleicAcidsRes、19392939331991およびZGuoら、NucleicAcidsRes、34545654651994は参照として本明細書に組み入れられる。合成オリゴヌクレオチド正常および相補的方向、捕獲ハイブリダイゼーションもしくはハイブリダイゼーションライゲーションのいずれかは、天然の塩基もしくはヌクレオチド類似体のいずれかを有するDNAもしくはPNAのいずれかとして調製する。このような類似体は完全な相補性で天然の塩基と対をなすが、Tm値は増加する例えば、5プロピニルウラシル。捕獲オリゴヌクレオチドは各々、配列が大きく差なり、交叉反応性の機会を最小にする。図17および表1を参照のこと。段階的に合成を行い、塩基を1つ1つ導入するのではなく、保護されたPNA四量体を構築単位として用いることができる。これらは簡単に調製できる。対応する保護されたオリゴヌクレオチド中間体は、ヌクレオチド間のリン酸結合を付加的に保護する必要がある。所与の任意のアドレスにおいて、24merの構築は、6つの合成段階のみを必要とし、段階的合成と比較して全体的な収率の改善を伴う。このアプローチは、全体として配列表面にモノマーを1つ1つ付加する際におこる支持体上の誤った配列の存在を排除する。従って、従来技術との違いは、擬似シグナルの可能性の減少である。さらに、各々のアドレスにおける誤った配列は、より短いものであり、少なくとも4塩基少ないので、これらが正しいハイブリダイゼーションの阻害を起こすリスクはない。このことはキャッピング段階は必要ではないことをも意味する。下記の説明のように、マスキング技術によって、同時に複数のアドレスを構築することが可能となる。アレイ製造段階の直接の結果として、さらに複数の利点に気づく。各々の24merのアドレスは直ぐ近傍の24merとは3つの四量体もしくは少なくとも6塩基分異なる。低塩では、PNADNAハイブリッドにおける各々の塩基のミスマッチによって、融解温度が8°C低下する。従って、正しいPNADNAハイブリダイゼーションのTmは、不正確なハイブリダイゼーションよりも少なくとも48°C高くなる。また、隣接した24merは、12mer離れており、これはいずれともハイブリダイズせず、検出プロフィールのデッドゾーンを表している。PNAアドレスは、丈夫で再利用可能なアレイを与える。以下の記載では、36の単一PNA四量体の調製について開示し、アレイの機械的化学的調製方法を示す。この技術を用い、PNA24merの25アドレスを有する5×5アレイを作製することができる。または、36の四量体すべてを組み込んで、1296アドレスからなる完全サイズのアレイを作製することができる。図18AGは、PNA四量体を付加して単一24merアドレスの5×5アレイの作製を示す模式図である。製造装置では、マルチチェンバー装置もしくは表面を90°回転させて、列もしくは行のいずれかにPNA四量体を付加することができる。円形のマニホルドによって四量体付加の円形状による交換が可能となる。従って、複雑な単一アドレスを、単純なアルゴリズムを用いて組み立てることができる。最初の四量体付加においては、PNA四量体1、2、3、4、および5は、それぞれ図18Aに示されるように、5列の各々の表面に結合する。図18Bに示されるように、チェンバーを90°回転させた後、PNA四量体6、5、4、3、および2を隣接した行に添加する。図18Cに示されるように、第3の段階では、四量体3、4、5、6、および1円形状交換であることに注意を列に添加する。第4の段階では、図18Dに示されるように、四量体2、1、6、5、および4を隣接した行に添加する、等々。この段階を、下記の図23E~Gに示す方法で継続する。図の下部は、各々位置における単一24merを生成する四量体配列を表す。真ん中の行の配列は、14366124461134562144663および541641は完全長で表2に示す。円形状交換による四量体の付加を用いて、より大きなアレイを生成する。四量体付加は、円形状パターンに制限されるものではなく、他の多数の組み合わせで付加し、少なくとも3つの四量体が互いに異なり、少なくとも6塩基に変換される単一アドレスを形成することができる。本発明は、対立遺伝子特異的PCR、ディファレンシャルハイブリダイゼーションもしくはシークエンシングバイハイブリダイゼーションを利用する既存の変異検出法より特異性が高い。これらの方法は、ハイブリダイゼーションのみに頼って、他は同一の2つのオリゴヌクレオチドにおける単一塩基の違いを識別する。このようなハイブリダイゼーションのシグナル対雑音比は、アレイにおける最も密接に関連した2つの捕獲オリゴヌクレオチドで達成可能のものよりも顕著に低い。3つの行および3つの列に別の四量体を付加することによって各々のアドレスを設計するので、与えらたアドレスは隣接したものから少なくとも3つの四量体が異なる。各々の四量体は少なくとも2塩基他の四量体のいずれもと異なるので、与えらたアドレスは少なくとも6塩基別のアドレスと異なる。しかしながら、実際には、ほとんどのアドレスが、かなり多くの塩基について他のほとんどのアドレスと異なる。この概念を2つのアドレスZip12およびZip14を用いて下記に例示する。これら2つのアドレスは、図18および図20下記に模式図的に表した25アドレスの中で最も関連している。これらの2つのアドレスは、それぞれ異なる位置下線で示すで共通の四量体を有する。さらに、それらは共通に1つながりの12ヌクレオチド、および共通の最後4ヌクレオチドを含む下線で示す。それぞれは、オリゴヌクレオチド間で少なくとも8つの差異を含む。下線付けされたヌクレオチドにおいてZip12もしくはZip14に相補的なオリゴヌクレオチドを、より低い温度で例えば、37°Cこれらのアドレスの両方にハイブリダイズさせことができるが、完全に相補的なオリゴヌクレオチドのみが高い温度で例えば、70°Cハイブリダイズする。さらに、Zip3等の他の捕獲オリゴヌクレオチドについては、共通ヌクレオチド数はさらに低い下線で示す。したがって、ハイブリダイゼーション中にZip3からZip12を識別する能力は、既存の方法を用いて達成可能なものよりも有意に高い。列もしくは行のいずれかにPNA四量体を送る前に、異なるチェンバーと壁各々200μm厚を有するマルチチェンバー装置を、図19Aの修飾ガラスもしくはシリコン表面に押しつける。表面は10μmの隆起を生ずる黒い線ようにエッチングされ、チェンバー間の漏れを防止する。最初、アレイ表面に柔軟なスペーサーリンカーを結合させる。第1の段階では、図19Bに示されるように、PNA四量体、1、2、3、4、および5はそれぞれ、各々5つの列の表面に結合する。次に、マルチチェンバー装置を90°回転する。図19Cに示されるように、四量体6、5、4、3、および2を隣接した行に付加する。24merのPNAオリゴマーを合成するために、該段階を合計3回繰り返す。与えらた行もしくは列内で各々の完成した24merは単一のPNA配列を表し、従って所望の位置特定可能なアレイを得ることができる。より小さいオリゴヌクレオチド配列は、同一方向に3回の合成を行って得られるハーフサイズの12merを表す。各々の24merは隣接したものとは3つの四量体が異なり、各々の四量体は、他のものとは少なくとも2塩基異なるので、各々の24merは隣とは少なくとも6塩基異なるすなわち、25のヌクレオチドの違い。従って、間違ったアドレスではその24塩基において6ミスマッチを有し、したがって、特に75~80°Cのハイブリダイゼーション条件下では間違ったアドレスには捕獲されないのである。さらに、特定のより小さな12mer配列は、グリッド上のいずれかの位置の24mer配列内に見出されるが、位置特定可能なアレイ特異的部分は50°C以上の温度では12mer配列にハイブリダイズしないのである。出発表面は遊離アミノ基を含み、非開裂性アミド結合を支持体のPNAのC末端にライゲーションし、PNA鎖がそのアドレスに保持されるようにセグメント濃縮アセンブリーを完了し直交側鎖脱保護する必要がある。200μmの空間と200μmバリヤーを含む単純マスキング装置は、異なった列図20Aにおいて、5つの四量体の各々が固体支持体に結合できるように設計される。第1の四量体セットの付加後に、マスキング装置を90°回転し、第2の5つの四量体のセットを付加する図20B。これは行に付加した後に列に付加することと比較することができる。行および列の交点は、さらに付加を含み、同様に、各々の交点は、単一配列の8merを含む。この手順で合計6サイクル繰り返すことによって、単一の24merを含む25の四角形、および共通12merを含む残余の四角形が生成する図20Cおよび21A~F。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μmの隆起を含み、真空下でチェンバーを満たす。円形のマニホルド図26により、5つの行もしくは列に送達する前に6つの四量体の円形状交換が可能となる。この設計によって、幾つかの配列が隣接した配列の同一の3つの四量体を含む場合であっても、常に少なくとも3つの四量体が互いに異なる単一の24merが生成する。このマスキング装置は、アレイがモノマーに対し四量体で作られることを除けば、概念的にはSouthernら、Genomics13100810171992およびMaskosら、NucleicAcidsRes21226722681993参照として本明細書に組み入れられるに開示されるマスキング技術と同様である。または、各々の位置を分離するマスクを用いて、不完全な12mer配列の産生を防止する。第1段階図19Dに記載のでは、PNA四量体1、2、3、4、および5は、それぞれ、5つの列の各々において表面に結合させる。次に、マルチチェンバー装置を90°回転させる。図19Eに示すように、四量体6、5、4、3、および2を隣接した行に付加する。24merのPNAオリゴマーを合成するために、この段階を合計3回繰り返えす。与えらた行および列内の各々の完成した24merは、単一のPNA配列を表し、従って位置特定可能なアレイを得ることができる。さらに、各々の24merは、PNAオリゴマーを結合していない200μm領域で隣接したオリゴマーから分離されている。シリコンもしくはガラス表面は光化学的にチェッカーボードパターンにおいて10μmの隆起の直交グリッドを生ずるようにエッチングする図20を参照のこと。四角形200μm×200μmを一つおきに活性化し、C18アルキルスペーサーおよびPEG親水性リンカーMW400~4000の付加を可能にすると、側面において少なくとも1つの空の四角形および2つの隆起で隔てられようになる。PNA四量体を用いた通常のアレイの例が得られる。1回につき36の列もしくは行のいずれかに36の異なる四量体を付加する。いずれかの四量体をいずれかの行に付加するもっとも単純な方法は、小型バルブにチューブをつないで、36の全四量体溶液を唯一の開口部を有する円形のマニホルドへ結合させることである。円形のマニホルドの反対側は、個々の行もしくは列に通じる36の小型バルブのいずれかに結合する。従って、マニホルドおよび小型バルブをチェンバー行の方へ回転させて、1度につきいずれかの四量体をポンプでいずれかの行に送ることができる。これは、物理的回転を必要とする機械装置でもよく、もしくは一連の流入四量体および流出行チャネルと電子マイクロバルブを用いて達成することもできる。この段階は非常に迅速で次の使用のためのマニホルドのすすぎを含め5秒あり、36行すべてに付加するのに約36×5180秒かかる。行もしくは列を充填する潜在的にさらに迅速な方法は、同時にすべてを充填することである。これを、5×5アレイに関し図20に例示する。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μmの隆起を含み、上記の真空技術を用いてチェンバーを満たす。円形のマニホルドにより、5つの行もしくは列に送達する前に6つの四量体の円形状交換が可能となる。図20においては、第1の段階は5、4、3、2、1である。マルチチェンバー装置を回転させて、順方向で、もしくは逆方向のいずれかで添加を継続することができる。この例においては、2、3、4、5、6の順方向で第2の段階を行う。第3の段階では、円形状交換リバース1、6、5、4、3で行う。第4の段階では、フォワード4、5、6、1、2である。第5の段階ではリバース4、3、2、1、6である。第6の段階ではフォワード5、6、1、2、3である。これは、36の四量体を36の行もしくは列に拡張することができる。このアプローチでは、アドレスの作製に関して、あらゆる位置で3662176782336から単一位置で3662176782336であるアレイの潜在的なバリエーションを第1のアドレスで定められる1295位置に制限する。これは必要な異なるアドレス数を大幅に上回る。さらに、各々のアドレスはあらゆる他アドレスと少なくとも6ヌクレオチド異なる。複数のシリコンチップは同一ウェーハー上に作製できるので、これらのアレイいずれもが群として生産されることに注目されたい。与えらた行もしくは列に同一四量体を添加する必要があるので、このことは四量体の概念では特によく当てはまる。従って、1つの行で10のアレイラインをカバーし、ゆえに1回に10×10グリッド100アレイが作製される。または、図20を参照として記載される段階を実施し、1サイクル減らして20merオリゴヌクレオチドを作製することができる。捕獲オリゴヌクレオチドは、選択されたハイブリダイゼーション条件下で相補的位置特定可能なアレイ特異的部分を捕獲するのに充分長くなくてはならない。図21A~Fは、位置特定可能なアレイの合成説明文模式的断面図を示す。図21Aは、柔軟なスペーサーリンカーのアレイ表面への付加を示す。図21Bは、第1行のオリゴヌクレオチド四量体の合成を示す。第1の行のみが、四量体1を含み、可視的である。マルチチェンバー装置を配置し、各々が異なる四量体を含む付加的な行は、第1の行の後ろに位置する。図21Cは、第1列のオリゴヌクレオチド四量体の合成を示す。マルチチェンバー装置もしくは表面は90°回転されている。四量体9、18、7、および12を隣接チェンバーに添加する。図21Dは、オリゴヌクレオチド行の第2ラウンドの合成を示す。第1行は、四量体2を含む。図21Eはオリゴヌクレオチド合成の第2ラウンドの合成を示す。四量体34、11、14、および23を第2ラウンドで隣接したチェンバーに添加する。図21Fは、PNA行の第3ラウンドの合成を示す。第1行は四量体16、7、20、および29を付加する四量体3を含む。与えらた行もしくは列内の24merの全オリゴヌクレオチドは単一で、従って位置特定可能なアレイを得ることができることに注目されたい。各々の24merは隣接したものとは3つの四量体分異なるので、四量体は少なくとも2塩基互いに異なるので、各々の24merは少なくとも6塩基分異なる。各々のミスマッチは有意にTmを下げ、24塩基における6ミスマッチの存在によって35°Cでのクロスハイブリダイゼーションが起こらないようにする。より小さい12merの配列は互いに同一であるが、24mer配列とは共通では全くないことに注目されたい。特定の12mer配列がグリッド上のいずれかの位置の24mer内に見出される場合でも、例えば17123285、オリゴヌクレオチドは、50°C以上の温度で12merにハイブリダイズしない。図22A~Cには、図19~21に記載のアレイグリッドGの構築が可能であるマスキング装置2の設計を示す。図22Aは、装置2およびアレイグリッドGの配置の上面図であり、側面図22B~22Cは、それぞれ、図22Aのライン22B22Bおよびライン22C22Cを含む。マスキング装置は200μmの空間および200μmのバリアーを含み、5つの四量体の各々を異なった行の固体支持体に結合させることが可能となる。第1の四量体セットの添加後、マスキング装置を90°回転し、第2の5つの四量体セットを添加する。これは行に付加した後に列に付加することと比較することができる。行および列の交点は、さらに付加を含み、同様に、各々の交点は、単一配列の8merを含む。この手順で合計6サイクル繰り返すことによって、単一24merを含む空間的に分離した25の四角形、および共通の12merを含む残りの四角形を生成する。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μmの隆起Rを含み、チェンバー内を陰圧にするためにチェンバー4を減圧ライン12への開口バルブ8を用いて満たす。緊密シールを形成するためにマルチチェンバー装置をメンブレンもしくは活性化した固体表面に押しつける。1つのチェンバーが隣のチェンバーと相互汚染することを避けるために、バリヤーをゴムもしくはその他の材料でに被覆した。メンブレンもしくは支持体表面が溶解剤によって適切に濡らされていることを確かめることも必要である。減圧ライン12へのバルブ8を閉じ、次に表面の活性化を行い、脱保護し、開口バルブ6でライン10を通じて四量体をチェンバー4に加える。チェンバーを乾かし、メンブレンを90°回転し、再び固定する。四量体の第2ラウンドでは、上記の真空および四量体添加段階で、添加を行う。バルブのブロック組立物図25A~Cにより、適当な行に各々の四量体を送達する。または、円筒形のマニホルド図26A~Dでは、5つの行または、列への送達の前に、6つの四量体の円形状交換を可能にする。幾つかの配列が隣接した配列に同一の3つの四量体を含む場合であっても、この設計で常に少なくとも3つの四量体分互いに異なっている単一の24merが生成する。図23A~Cは、図19図19D~19Eに記載されるアレイ構築法の透視図を表す。第1の段階では、図23Aに示されるように、PNA四量体1、2、3、4、および5は、それぞれ、5つの列各々の表面に結合している。列の5つの位置各々は隔てられており、オリゴヌクレオチドが結合していないものの間で200μmのギャプがある。次に、図23Bに示されるように、マルチチェンバー装置を90°回転する。四量体6、5、4、3および2は、隣接した列で添加する。行の5つの位置の各々は隔てられており、オリゴヌクレオチドが結合していないものの間で200μmのギャプがある。図23Cに示されるように、完成した各々の24merは、与えらた行および列内で単一のPNA配列を表す。図19~22に示される設計とは異なり、分離した位置のマスクを用いるため、このアレイの設計では各々完全な24mer間にハーフサイズの12merを含まない。図24A~Cは、図23に記載のアレイグリッドGの構築が可能であるマスキング装置2の設計を示す。図24Aは装置2およびアレイグリッドGの配置の上面図であり、側面図24Bおよび24Cは、それぞれ、図24Aのライン24B24Bおよびライン24C24Cを含む。マスキング装置は200μmの空間及び200μmのバリアーを含み、5つの四量体の各々をアレイグリッドG上の異なった位置の固体支持体に結合させることが可能となる。第1の四量体セットの添加後、マスキング装置もしくは表面を90°回転し、第2の5つの四量体セットを添加する。この手順で合計6サイクル繰り返すことによって、単一24merを含む空間的に分離した25の四角形、および共通の12merを含む残りの四角形を生成する。シリコンもしくはガラス表面は、緊密なシールを確実にするために、10μmの隆起Rを含み、チェンバー2内を陰圧にするためにチェンバー4を真空を用いて開始する方法によって満たす。この真空は、減圧ライン12へのバルブ8を開口することによって得られる。緊密シールを形成するためにマルチチェンバー装置をメンブレンもしくは活性化した固体表面に押しつける。1つのチェンバーが隣のチェンバーと相互汚染することを避けるために、バリアーをゴムもしくはその他の材料に被覆する。メンブレンもしくは支持体表面が溶解剤によって適切に濡らされていることを確かめることも必要である。減圧ライン12へのバルブ8を閉じ、次に表面の活性化を行い、脱保護し、開口バルブ6でライン10を通じて四量体をチェンバー4に加える。チェンバーを乾かし、メンブレンを90°回転し、再び固定する。四量体の第2ラウンドでは、上記の真空および四量体添加段階で、添加を行う。バルブのブロック組立物図25A~Cにより、適当な行に各々の四量体を送達する。または、円筒形のマニホルド図26A~Dでは、5つの行または、列への送達の前に、6つの四量体の円形状交換を可能にする。この設計で常に少なくとも如何なるオリゴヌクレオチドも存在しない領域で互いに隔てられた単一の24merが生成する。図25A~Cには、共通のチェンバー18によって6つの入力ポート10が5つの出力ポート16とライゲーションしているバルブブロック組立物14を示す。6つの入力ポート10および5つの出力ポート16の各々は、それぞれ、液体の流れを制御するバルブ6およびバルブ20を含む。6つの入力チューブ10は異なる溶液を含み、バルブのブロック組立物14は、一回につき5つの出力ポート16の一つへの入力液体のいずれか1つの送液が可能である。入力ポート10の1つのバルブ6および出力ポート16のバルブ20の1つを同時に開口し、チェンバー18を液体で満たし、開口バルブ20にライゲーションした出力ポート16に排出させることのよって、これを達成することができる。バルブブロック組立物14は、バルブ24および8によって、それぞれ、溶媒22のソースおよび真空12のソースにライゲーションし、送液間において中心チェンバー18のクリーニングを行う。溶媒をチェンバー18に満たし、真空を用いて、全液体をチェンバーから除去する。これによって、次の送液段階で液体の相互汚染を防ぐようにチェンバー18を準備する。図26A~Dには、入力液体の異なる6本のチューブを異なる5本の出力チューブに送る円筒形のマニホルド組立物114を示す。マニホルドそれ自体は、それぞれの半分がそれを軸に独立に回転する共通の中心スポーク134でつながった分離した2つの半分114Aと114Bを含む。下部の114Bは、それを穿孔する6つのチャネル130を有する円筒形ブロックである図26Bのライン26C26Cを含む図26Bの下面図である図26Cを参照のこと。6つのチャネル130の各々は、6つの異なる入力チューブ110に結合している。入力チューブ110は、バルブ124を有するバルブ108および溶媒ライン122を有する減圧ライン112に至るバルブ136を有するライン138を通じて試薬、溶媒、もしくは真空のいずれかに至る入力チャネル130にライゲーションしたバルブ106を含む。これにより、異なる液体がマニホルドのチャネル130および132に入り、送液間で過剰液体を含むチャネル130および132を洗浄することが可能となる。マニホルド上部図26Bのライン26A26Aを含む図26Bの上面図である図26Aを参照のことも、それを穿孔する5つのチャネル132を有する円筒形のブロックである。5つのチャネル132は、各々異なる出力チューブ116にライゲーションする。マニホルドの2つの半分114Aと114Bは独立に回転することができ、異なる入力チャネル130は、異なる出力チャネル132へとライゲーションする。これにより、入力液体の6つのチューブが同時に、5つの出力チューブへと移送することを可能にする。各々の入力ポート110を出力ポート116と並列させるために、マニホルドの下部半分の114Bは、60°回転する。このようにして、各々入力ポート110を出力ポート116のいずれかと並列させることができる。図26A~Dの円形のマニホルドは、入力ポートを出力ポートに接続する5つのチャネルを有しているので、前者が同時に6つの入力液体のうちの5つを5つの出力ポートへ送液可能であることにおいて、図26A~Cのバルブブロック組立物とは異なる。この概念は、36の四量体を同時に36の位置へ送達することに、容易に拡張できる。本発明は、先行技術のシステムに比べ数々の利点を含む。本発明のDNAアレイを含む固体支持体によって、ライゲーション産物の配列をアレイ上の特異的位置にハイブリダイゼーションさせて、捕獲された標識が発するシグナルの位置が配列の存在を示すようにすることによって、配列を検出する。特異的多重LDR産物のハイスループット検出のために、位置特定可能なアレイ特異的部分は、固体支持体上の設計したアドレスに各々のLDR産物を導く。他のDNAチップアプローチでは、溶液対表面のハイブリダイゼーションにおける、融解温度の微妙な差で密接に関連した配列の識別を試みるが、本発明では、溶液をベースとしたLDR反応において、ハイブリダイゼーション前に、所望の特異性を達成する。従って、本発明では、互いに非常に異なる配列を有する捕獲オリゴヌクレオチドのアレイの設計を可能にする。各々のLDR産物は単一の位置特定可能なアレイ特異的部分を有し、これは固体支持体上の特異的アドレスで捕獲オリゴヌクレオチドにより選択的に捕獲される。固体支持体上の相補的捕獲オリゴヌクレオチドが修飾DNAもしくはPNAのいずれかであれば、LDR産物はより高い温度でも捕獲することができる。このことはハイブリダイゼーション時間の短縮および非特異的結合の減少等の付加的な利点をもたらす。その結果、シグナル対雑音比が改善される。本発明の別の利点は、緊密なクラスターを成す変異、単一塩基の変化、および短い反複ならびに欠失の検出がPCRLDRによって可能なことである。これらは、対立遺伝子特異的PCRもしくはハイブリダイゼーションによる検出法では不可能である。本発明に従えば、DNA合成の誤りによる偽ハイブリダイゼーションシグナルを避けることができる。不正確なアドレスに対するハイブリダイゼーションTm値と大きく異なるように、アドレスを設計することができる。対照的に、直接ハイブリダイゼーションのアプローチは微妙な差に依存する。本発明では、DNA合成の誤り、バンドの広がり、もしくはバンドの偽の移動のいずれかにより生じるゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動の誤ったデータ読み取りの問題をも排除する。ライゲーション産物の存在を検出するための捕獲オリゴヌクレオチドの使用により、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いてオリゴヌクレオチドにおける単一塩基の違いを検出する必要性を排除する。対立遺伝子特異的PCR、ディファレンシャルハイブリダイゼーションもしくはシークエンシングバイハイブリダイゼーション法等に基づく当先行技術分野における他の既存の方法では、新しく解析する配列の各々に対し個々に最適化されたハイブリダイゼーション条件が必要となる。複数の変異を同時に検出しようとするときには、ハイブリダイゼーション条件の最適化は困難もしくは不可能となる。対照的に、本発明は、標的配列に非依存性でかつ均一なハイブリダイゼーション条件下で、特異性の高い正しいシグナルを検出する一般的な方法である。本発明は、当先行技術分野の範囲内で現在利用可能な方法によるよりも有意に高い忠実度で、異なるオリゴヌクレオチド配列間における差を識別する、柔軟な方法をもたらす。本発明のアレイは汎用性であり、癌の変異、遺伝性の生殖系列変異、およびおよび感染性疾患の検出に有用である。さらなる利点としては、アレイの再使用が可能であり、試料当たりのコストが削減される。本発明は、また、オリゴヌクレオチドの合成および支持体への結合において柔軟性が高い。オリゴヌクレオチドは、支持体とは別に合成し、次に支持体上の特有の表面に結合できる。中間体の骨格保護例えば、PNAを必要としないオリゴヌクレオチドの多量体セグメントを合成し、固体支持体上に結合させることができる。他の利点は、これらの合成アプローチを捕獲オリゴヌクレオチドのアドレスの設計に組みこめることである。このような固体支持体の生産は、自動生産が可能であり、人間の関与の必要性およびその結果おこる汚染の懸念を回避するこができる。本発明のアレイの重要な利点は、以前に結合した捕獲オリゴヌクレオチドと共に再使用可能なことである。このように再使用できるように固体支持体を調製するためには、捕獲されたオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合する結合成分を除去することなしに、捕獲されたオリゴヌクレオチドを除去する必要がある。この課題を達成するために、多様な方法を用いることができる。例えば、固体支持体を95~100°Cで蒸留水中で処理する、室温で001NNaOHに曝す、90~95°Cで50ジメチルホルムアミドと接触させる、もしくは90~95°Cで50ホルムアミドにより処理することができる。通常、この方法を用い、約5分以内に捕獲されたオリゴヌクレオチド除去できる。これらの条件は、DNADNAハイブリダイゼーションを破壊するのに適切なものである。DNAPNAハイブリダイゼーションでは他の破壊条件が必要となる。以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例にのみ限定されるものではない。実施例1捕獲オリゴヌクレオチドの固体支持体への固定化固定化のための固体支持体は、ガラス、特に顕微鏡スライドであった。空間的位置特定可能なアレイにおける、ガラス例えば、顕微鏡スライド、又はシリコン例えば、チップ、メンブレン例えば、ナイロンメンブレン、ビーズ例えば、常磁性ビーズもしくはアガロースビーズ、もしくはプラスチック支持体例えば、ポリエチレンシートのようなその他の支持体への捕獲オリゴヌクレオチドの固定化は、5つの段階からなる。A支持体のシラン化シラン化試薬は、3アミノプロピルトリエトキシシランAPTSであった。又は、3グリシドキシプロピルトリメトキシシランKLBeattieらゲノセンサー研究の進歩AdvancesinGenosensorResearchClinChem41700706UMaskosらガラス支持体におけるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション:オリゴヌクレオチド合成のための新規なリンカー及びインサイチューで合成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性OligonucleotideHybridizaionsonGlassSupportsaNovelLinkerforOligonucleotideSynthesisandHybridizationPropertiesofOligonucleotidesSynthesizedinsituNucleicAcidsRes2016791684CFMandeniusら偏光解析法及びその他の関連技術において使用するための生物学的分子のシリコン表面へのカップリングCouplingofBiomoleculestoSiliconSurfacesforUseinEllipsometryandOtherRelatedTechniquesMethodsEnzymol388394頁参照として本明細書に組み込まれる又は3トリメトキシシリルプロピルメタクリレートMGladらポリシロキサンでコーティングされた多孔性シリカにおける分子インプリンティング及び酵素捕獲のためのシランモノマーの使用UseofSilaneMonomersforMolecularImprintingandEnzymeEntrapmentinPolysiloxanecoatedPorousSilicaJChromatogr3471123EHedborgら電解効果装置と組み合わされた分子プリンティングされたポリマーメンブレンの研究SomeStudiesofMolecularlyimprintedPolymerMembranesinCombinationwithFieldeffectDevicesSensorsandActuatorsA3738796799及びMKempeら酵素リボヌクレアーゼAを使用した表面インプリンティング法AnApproachTowardsSurfaceImprintingUsingtheEnzymeRibonucleaseAJMolRecogn83539参照として本明細書に組み込まれるも、初期シラン化試薬として使用されうる。シラン化の前に、支持体を清浄化し、支持体の表面を疎水性にした。ガラススライドFisherScientificExtrathickmicroslidesfrostedcat1255011を、濃NH4OH水H2O2H2O1:1:5、vvv中で80°Cで5分間インキュベートし、蒸留水で濯いだ。次いで、文献に記載されたようにしてCFMandeniusら偏光解析法及びその他の関連技術において使用するための生物学的分子のシリコン表面へのカップリングCouplingofBiomoleculestoSiliconSurfacesforUseinEllipsometryandOtherRelatedTechniquesMethodsEnzymol388394頁Grahamらファイバーオプティックエバネッセント波バイオセンサーにおける遺伝子プローブアッセイGeneProbeAssayonaFibreOpticEvanescentWaveBiosensorBiosensorsBioelectronics7487493Jonssonらよく特徴決定されたシリカ表面におけるフィブロネクチンの吸収挙動AdsorptionBehaviorofFibronectinonWellCharacterizedSilicaSurfacesJColloidInterfaceSci90148163参照として本明細書に組み込まれる、支持体を蒸留水、エタノール、及びアセトンで洗浄した。2vv3アミノプロピルトリエトキシシランSigmaStLouisMOを含む無水アセトン997溶液中で、室温で、一夜、支持体をシラン化したZGuoらガラス支持体上のオリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションによる遺伝子多型の直接蛍光分析DirectFluorescenceAnalysisofGeneticPolymorphismsbyHybridizationwithOligonucleotideArraysonGlassSupportsNuclAcidsRes22545665参照として本明細書に組み込まれる。次いで、支持体を無水アセトンで十分に洗浄し、真空デシケーターで80°Cで乾燥させた。B官能基例えば、カルボキシル基又はアミノ基によるシラン化固体支持体の誘導体化シラン化試薬がAPTSである場合には、所望のアミノ官能性が直接導入された。官能基例えば、重合可能アクリレートで表面を官能化するための3トリメトキシシリルプロピルメタクリレートMGladらポリシロキサンでコーティングされた多孔性シリカにおける分子インプリンティング及び酵素捕獲のためのシランモノマーの使用UseofSilaneMonomersImprintingandEnzymeEntrapmentinPolysiloxanecoatedPorousSilicaJChromatogr3471123EHedborgら電解効果装置と組み合わされた分子プリンティングされたポリマーメンブレンの研究SomeStudiesofMolecularlyimprintedPolymerMembranesinCombinationwithFieldeffectDevicesSensorsandActuatorsA3738796799及びMKempeら酵素リボヌクレアーゼAを使用した表面インプリンティング法AnApproachTowardsSurfaceImprintingUsingtheEnzymeRibonucleaseAJMolRecogn83539参照として本明細書に組み込まれるを既に含有している適当なシラン化試薬プライマーを選択することにより、又はアミノ官能表面を所望の官能基を含有している試薬と反応させることにより例えば、写真石版術において使用される保護されたアミノ基の局所的な光による光脱保護Fodorら光による空間的位置特定可能なパラレル化学合成LightDirectedSpatiallyAddressableParallelChemicalSynthesisScience251767773Fodorら生物学的チップを用いた複合生化学的アッセイMultiplexedBiochemicalAssayswithBiologicalChipsNature364555556参照として本明細書に組み込まれるの後、その他の官能基を導入することもできる。C官能基の活性化固体支持体上の官能基はアミノ基であった。直径1mm、325mm間隔のドットの5×5アレイを有する組立て式マスクを使用して、1~2トリエチルアミン生成する酸を除去するためを補足された、70mgmlアジピン酸ジスクシニミジルエステルHillらタンパク質の二官能クロスリンキング試薬としてのジスクシニミジルエステルDisuccinimidylEstersasBifunctionalCrosslinkingReagentsforProteinsFEBSLett102282286HortonらCovalentImmobilizationofProteinsbyTechniqueswhichPermitSubsequentReleaseMethodsEnzymol130141頁参照として本明細書に組み込まれるを含有する無水ジメチルホルムアミドDMF溶液を、少量典型的には02~10μl、ギルソンGilsonP10ピペットを使用して手動で固体支持体に適用した。適用後、フード内で、室温で、30分間、反応を進行させ、その後、再びアジピン酸ジスクシニミジルエステルを適用した。計1時間の反応時間の後、支持体を無水DMFで洗浄し、真空デシケーター内で室温で乾燥させた。官能基がカルボキシル基である場合には、固体支持体を1エチル33ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸EDCと反応させることができるFrankら分節固体支持体としてのセルロースペーパーディスク上での連続流動条件下での同時複合ペプチド合成SimultaneousMultiplePeptideSynthesisUnderContinuousFlowConditionsonCellulosePaperDiscsasSegmentalSolidSupportTetrahedron4460316040参照として本明細書に組み込まれる。この反応の前に、01NHClで簡単に処理することにより、固体支持体の表面をプロトン化した。前記の組立て式マスクを使用して、1MEDCSigmaStLouisMO、1mM5アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及び20mMKH2PO4pH=83を含有する新鮮な溶液を、少量典型的には02~10μl、手動で固体支持体に適用した。反応を1時間進行させ、その後、支持体を蒸留水で洗浄し、真空デシケーター内で室温で乾燥させた。D予め活性化された固体支持体へのアミノ官能化捕獲オリゴヌクレオチドのカップリングEDCで活性化された固体支持体以外の支持体の場合には、やはり前記の組立て式マスクを使用して、1nmolμlの5アミノ修飾オリゴヌクレオチド即ち、表2の配列を含む20mMKH2PO4pH83を、少量02~10μl、活性化された支持体へ適用した。反応を室温で1時間進行させた。E固体支持体上の残存反応基の不活性化反応生成物が、非捕獲プローブ依存的に固体支持体上に非特異的に捕獲されるのを防止するため、相補的オリゴヌクレオチドプローブの捕獲後、固体支持体の表面上の残存反応基を不活性化させることが必要である場合がある。この点に関して、支持体を、01N水酸化ナトリウム中で、室温で、5分間インキュベートした。又は、02MリジンpH=90中で不活性化を実施することもできる。不活性化後、支持体表面を中和するため、01Nリン酸ナトリウム緩衝液pH72で支持体を洗浄した。蒸留水での最後の洗浄後、支持体を乾燥させ、真空デシケーター内で室温で保存した。実施例2アッセイシステムの設計GeneAmpInSituPCRSystem1000登録商標PerkinElmerAppliedBiosystemsDivisionFosterCityCAGJNuovoPCRinsituHybridizaitonNewYorkRavenPress参照として本明細書に組み込まれるを使用して、ハイスループット式に、ハイブリダイゼーションを試験し、続いて捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ捕獲オリゴヌクレオチドハイブリッドを洗浄するための、半自動カスタム設計アッセイシステムを作成した。システムの概略フローチャートが、図27に示されている。システムは、試料担荷装置及び多重ポートシステムを介して、一連の液体槽、そして廃液槽と接続されたフロースルーハイブリダイゼーションチャンバーからなっている。液体輸送は、ポンプにより調節される。ポンプを、組立てラインの末端に設置し、システムの漏出及び汚染を防止するための軽度の真空を維持する条件下で作動させた。ハイブリダイゼーションチャンバー及び液体槽は、GeneAmpInSituPCRSystem1000登録商標内で正確に調和するよう設計されていたため、アッセイのハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階の間、温度は正確に調節され維持され得た。システムの個々の部分を、以下のセクションにおいて詳細に説明する。Aハイブリダイゼーションチャンバーハイブリダイゼーションチャンバーは、フロースルーの特徴に順応するよう修飾されたインサイチューPCR試薬収納システムである。収納システムは、ガラス顕微鏡スライド76×25×12±002mmと、薄いステンレススチールクリップによりスライドに取り付けられたシリコンゴム隔壁とから構成されている。金属クリップの内側の卵形の縁は、ハイブリダイゼーションプローブ及び洗浄液の収納を保証する、水及び気体が通過しない封を作出するために十分な力で、シリコンディスクの端を、スライドに押し付ける。包含量は、およそ50μlである。固定化された捕獲オリゴヌクレオチドのアッセイは、シリコンディスクにより覆われたスライドの中央部分およそ13mm×15mmに含まれる。異なる部材の組立ては、InSituPCRSystemの製造業者より提供される組立てツールにより容易となる。組立て後、12のチューブ及び多重試料ルアーアダプターmultiplesamplelueradapterを有する2つの25G34注射針BectonDickinsonRutherfordNJの挿入により、ハイブリダイゼーションチャンバーの入口及び出口を作出する。プローブ標的ハイブリッドの洗浄中の上方側方upandacross流動パターンを保証するため、斜めに注射針を挿入する。B液体槽異なる洗浄溶液を収納する槽は、GeneAmpInSituPCRSystem1000登録商標のサーマルブロックthermalblockの垂直溝と調和するよう、カスタム設計された。各槽は、シリコンシーラントDowCorningMidlandMIを使用して相互に接着させた、組立て式シリコンガスケットNuncIncNapiervilleILを収納する2つのガラス顕微鏡チャンバースライド25×75×1mmからなっている。12長のチューブ及び多重試料ルアーアダプターを有する21G34注射針BectonDickinsonRutherfordNJのシリコンガスケットへの挿入により、出口を作出した。空気入口を作出するため、チューブを有しない第2の21G34注射針BectonDickinsonFranklinLakesNJを、シリコンガスケットへ挿入した。液体槽は、漏出不可であり、サーマルブロックの溝内に正確に調和しており、含まれた液体への良好な熱伝達を保証するため金属フィンに取り付けられている。各槽の容量は、およそ2mlである。Cマルチポートシステム及び試料担荷装置液体槽、試料担荷装置、及びハイブリダイゼーションチャンバーは、手動で調節される一方向の液体の流動を可能にするマルチポートシステムを通って接続されている。システムは、雄雌接続により相互に接続された、ルアーアダプターを有する一連の3方向ナイロンストップコックKontesScientificGlasswareInstrumentsVinelandNJからなっている。液体槽からの雌ルアーアダプターは、雄雄ルアーアダプターカップラーBioradRichmondCAを介してマルチポート雌ルアーアダプターと接続されている。試料担荷装置は、液体槽と接続されたポートと、ハイブリダイゼーションチャンバーと接続されたポートとの間に設置されている。それは、ルアーアダプターを介してマルチポートシステムと直接接続された1mlシリンジBectonDickinsonFranklinLakesNJからなる。液体の流動は、所望の方向にストップコック上のハンドルを回すことにより手動で調節されうる。D廃液槽ハイブリダイゼーションチャンバーからの出口チューブは、プランジャーが固定された位置に取り付けられている、ルアーアダプターを有する20mlシリンジBectonDickinsonFranklinLakesNJからなる廃液槽と接続されている。ポンプとの接続は、12長のチューブ及び多重試料ルアーアダプターを有する21G34注射針の、プランジャーのシリコンガスケットへの挿入により、確立されている。ポンプを作動させると、シリンジ内にわずかな真空が生じ、それが、液体槽から、ハイブリダイゼーションチャンバーを経由して、廃液槽へと液体を流動させる。Eポンプシステムにおける液体の流動を調節するため、蠕動ポンプP1PharmaciaPiscatawayNJを使用した。それは、システム内のわずかな真空を維持するため、組立てラインの末端に設置された。ポンプの入口チューブは、3方向ナイロンストップコックを介して、廃液槽の出口チューブと接続されていた。この構造により、重力による排液を可能とする、廃液槽内の真空の放出が確立される。実施例3ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件異なる捕獲オリゴヌクレオチドの捕獲特異性を調査するため、6テトラマーのうちの3個即ち、24ヌクレオチドのうちの12個を共有する2つの捕獲オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ハイブリダイゼーション実験を実施した。この実験は、異なる捕獲オリゴヌクレオチドを区別することが最も困難な例を表している。一般的に、位置特定可能なアレイ上の異なる増幅産物を分離するためには、より少ないテトラマーを共有する他の捕獲オリゴヌクレオチドが選択されるであろう。典型的には、文献記載の常法をわずかに修飾した方法に従い、それぞれ10pmolのオリゴヌクレオチドcomp12及びcomp14表3参照を、T4ポリヌクレオチドキナーゼNewEnglandBiolabsBeverlyMA10単位、[γ32P]ATP222MBq、50mMトリスHClpH8、10mMMgCl2、1mMEDTA、及び10mMジチオトレイトールを収納する20μlの容量で、5末端標識した。超微細DNA等級セファデックスSephadexG25PharmaciaPiscatawayNJを収納するカラムでの濾過により、取り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。セファデックスは、10mM酢酸アンモニウム中で4°Cで一夜、予め膨張させた。標識されたオリゴヌクレオチドプローブを真空で乾燥させ、ハイブリダイゼーション溶液05MNa2HPO4pH72、1結晶等級BSA、1mMEDTA、7SDSに溶解させた。標識されたオリゴヌクレオチドプローブcomp12及びcomp14の比活性は、それぞれ、286×106cpmpmol及び243×106cpmpmolであった。表3使用されたオリゴヌクレオチド5から3前セクションに記載されたようにして、アミノリンク捕獲オリゴヌクレオチド12及び14表3参照400ピコモルを、カルボキシル官能化ガラス顕微鏡スライド及びアミノ官能化ガラス顕微鏡スライドの両方に沈積させ、反応させた。相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp12とのハイブリダイゼーションにより、左上及び右下の斜めの位置について陽性のシグナルが生じ、相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp14とのハイブリダイゼーションにより、左下及び右上の斜めの位置について陽性のシグナルが生じるよう、2×2マトリックスアレイで捕獲オリゴヌクレオチドを固定化した。放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp12及びcomp14表3参照を、それぞれ25pmol100μl及び41pmol100μlの濃度でハイブリダイゼーション溶液に溶解させた。ハイブリダイゼーション溶液は、アッセイシステム内輸送中のプローブの視覚的モニタリングを容易とする、2ブロモフェノールブルーマーカー5μlを補足されていた。次いで、放射標識プローブ100マイクロリットルを注入し、ハイブリダイゼーションチャンバーへとポンプで送った。ハイブリダイゼーションを70°Cで15分間実施した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液2×SSC緩衝液は300mM塩化ナトリウム及び30mMクエン酸ナトリウムを収納する、01ドデシル硫酸ナトリウムSDS2mlで2回、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液02×SSC、01SDS1×SSC緩衝液は150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含有する2mlで2回、70°Cで連続的に洗浄した。実施例4捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブの検出洗浄後、捕獲オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドプローブハイブリッド、シリコンディスク、注射針、及び金属カバークリップを、ガラス顕微鏡スライドから除去し、残存している液体をキムワイプKimberlyClarkRoswellGAを使用して吸収した。ホスフォールイメージャーphosphorimagerMolecularDynamicsSunnyvaleCAを使用して、捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブを可視化し定量した。ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャースクリーンに21時間曝露した後、試験された異なる固体支持体についてのデータを収集した。得られた画像を図28に示す。定量データは、表4A及び4Bに示す。使用された条件下においては、NH2官能化スライドについて得られたシグナル及び交差反応性データの方が、COOH官能化スライドについて得られたものよりも優れていた。表4A捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ12の定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント表4B捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブ14の定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント実施例5捕獲オリゴヌクレオチドの固定化パラメータの最適化文献記載の方法に従い、ポリマーをスライド上に沈積させたBarnardら不連続の感知部位を有するファイバーオプティックセンサーAFibreOpticSensorWithDiscreteSensingSitesNature35333840Bonkらポリマーでコーティングされたイメージングオプティカルファイバーバンドル上のアリルアジドによるパターン化センサーアレイの組立てFabricationofPatternedSensorArraysWithArylAzidesonaPolymercoatedImagingOpticalFiberBundleAnalChem66331920SmithらポリNアクリルピロリドンペプチド化学における新規な樹脂PolyNacrylpyrrolidoneANewResininPeptideChemistryIntJPeptideProteinRes1310912参照として本明細書に組み込まれる。アミノリンク捕獲オリゴヌクレオチド12及び14表3参照400ピコモルを、4つの同一の光沈積ポリマースポットを収納するガラス顕微鏡スライドに2×2パターンで沈積させ、反応させた。相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp12とのハイブリダイゼーションにより、上及び下の位置について陽性のシグナルが生じ、相補的オリゴヌクレオチドプローブcomp14とのハイブリダイゼーションにより、左及び右の位置について陽性のシグナルが生じるよう、オリゴヌクレオチドをスポットした。放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp12表3参照を、24pmol100μlの濃度でハイブリダイゼーション溶液に溶解させた。アッセイシステム内輸送中のプローブのモニタリングを容易にするため、ブロモフェノールブルーマーカー2溶液5μlをハイブリダイゼーション溶液に添加した。放射標識プローブcomp12100マイクロリットルを、ハイブリダイゼーションチャンバーへとポンプで送った。ハイブリダイゼーションを70°Cで15分間実施した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液2×SSC、01SDS1mlで3回、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液02×SSC、01SDS1mlで3回、70°Cで連続的に洗浄した。ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャースクリーンに24時間曝露した後、試験された全ての異なる固体支持体についてのデータを収集した。得られた画像を図29に示す。定量データを、表5に示す。表5捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブの定量EFDMA=エチレングリコールジメタクリレートHDDMA=ヘキサンジオールジメタクリレートpic=相対ホスフォールイメージャーカウント固定化化学は、効率的な核酸増幅産物の捕獲にとって必要な適当な物理的特性を提供する、テーラーメイドの特別ポリマーマトリックスの使用を可能にする。固定化された捕獲オリゴヌクレオチドの特異性は、ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより単一のミスマッチ、欠失、及び挿入を区別する現行の方法KLBeattieらゲノセンサー研究の進歩AdvancesinGenosensorResearchClinChem4170006参照として本明細書に組み込まれると比較して良好であった。最後に、本発明のアッセイシステムが、核酸オリゴマーの普遍的な同定を可能にすることが証明された。実施例6位置特定可能なオリゴヌクレオチドプローブの固体支持体への捕獲異なる捕獲オリゴヌクレオチド固定化法の後、ポリマーでコーティングされたスライドを、位置特定可能なオリゴヌクレオチドプローブの捕獲能について試験した。次いで、3トリメチルオキシシリルプロピルメタクリレートによるシラン化の後、モノマーをスライド上で重合させた。1つの例においては、ポリエチレングリコール含有クロスリンカーを用いて、COOH官能基を有するポリマー層を形成させた。もう一つの例においては、OH官能基を形成させるため、ポリエチレングリコールメタクリレートモノマーを、スライド上に重合させた。COOH官能基を有するスライドを、実施例1のEDC活性化法を使用して活性化した。OH官能基を有するスライドは、02M11カルボニルジイミダゾールCDISigmaChemicalCoStLouisMoを含む水の含有量の低いlowwaterアセトンJTBakerPhillipsburgNJを含有する密閉された50mlプラスチックディスポーザブルチューブCorningIncCorningNY内でのインキュベーションにより、室温で一夜活性化した。次いで、水の含有量の低いアセトンでスライドを洗浄し、室温で真空で乾燥させた。アミノ結合捕獲オリゴヌクレオチド14を、両スライド上の予め印を付けた位置に手動でスポットした1スライド当たり4ドット。反応はフード内で実施され、スポットされたオリゴヌクレオチドの量は2×02μl08nmolμlであった。全反応時間は1時間であった。次いで、予め印を付けた各ドットにプロピルアミンを数滴適用することにより、15分間、スライドをクエンチした。クエンチした後、スライドを01Nリン酸ナトリウム緩衝液pH72中で5分間インキュベートし、二重蒸留H2Oで洗浄し、真空で乾燥させた。スライド上の相補的捕獲オリゴヌクレオチドを、放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp14表3とハイブリダイズさせた。放射標識オリゴヌクレオチドプローブcomp14100マイクロリットル28pmol;6440000cpmpmolを、ハイブリダイゼーションチャンバーにポンプで送った。ハイブリダイゼーションを、05MNa2HPO4pH72、1結晶等級BSA、1mMEDTA、7SDS中で、70°Cで15分間実施した。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションチャンバーを、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液2×SSC、01SDS2mlで2回、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液02×SSC、01SDS2mlで2回、70°Cで連続的に洗浄した1×SSC緩衝液は150mM塩化ナトリウム及び15mMクエン酸ナトリウムを含有する。ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャースクリーンに30分間曝露した後、両スライドについてのデータを収集した。ガラス顕微鏡スライドをホスフォールイメージャースクリーンに30分間曝露した後、データを収集した。表6及び図30を参照のこと。表6OH官能化スライドにおける捕獲オリゴヌクレオチドプローブ14の定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウントこの試験において、OH官能基を含有するポリマーでコーティングされたスライドの方が、COOH官能基を含有するポリマーでコーティングされたスライドよりも良好な結果が得られた。20アミン含有モノマーで重合され、4EGDMA又はHDDMAでクロスリンクされた予め調製されたポリHEMA含有ポリマーでは、放射標識ライゲーション産物配列ホスフォールイメージャースクリーンに23時間曝露した後にのみ可視化された表5約275amolを捕獲することが可能であった。ポリエチレンメタクリレートポリマー製剤を使用すると、ライゲーション産物配列約106fmolを捕獲することが可能であった。シグナルは、30分間の曝露の後に検出され得た。実施例7メンブレン支持体を使用して捕獲されたオリゴヌクレオチドの検出メンブレン支持体を使用した異なる捕獲オリゴヌクレオチドの捕獲特異性を調査するため、捕獲オリゴヌクレオチドプローブ12及び14表3参照を使用してハイブリダイゼーション実験を実施した。OH官能化ナイロンメンブレンの細片MilliporeBedfordMassachusettsを、02Mカルボニルジイミダゾールを含む水の含有量の低いアセトン溶液に一夜浸した。細片をアセトンで洗浄し、真空で乾燥させた。2つの容量の02μl1mMの捕獲オリゴヌクレオチド12及び14を含む20mMK2HPO4pH83表3を、特別なブロッティング装置ImmuneticsCambridgeMassachusettsを使用してメンブレンに負荷した。相補的オリゴヌクレオチドプローブを、実施例3の記載のようにして放射性標識した。オリゴヌクレオチドプローブを真空で乾燥させ、ハイブリダイゼーション緩衝液05MNa2HPO4pH72、1結晶等級BSA、1mMEDTA、7SDS200μlに入れた。Hybaidハイブリダイゼーションオーブン内の15mlエッペンドルフチューブ内で、ハイブリダイゼーション緩衝液800μl中で、60°Cで、15分間、メンブレンをプレハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションコンパートメントの総容量を減少させるため、不活性カルナウバロウStrahlPitschIncNewYorkNewYork500μlをチューブに充填した。プレハイブリダイゼーション後、放射標識プローブ200μlを添加した。60°Cで15分間、メンブレンをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液2×SSC、01SDS1mlで15分間を2回、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液02×SSC、01SDS1mlで15分間を2回、60°Cで洗浄した。ホスフォールイメージャーMolecularDynamicsSunnyvaleCAを使用して、捕獲されたオリゴヌクレオチドプローブを定量した。ホスフォールイメージャースクリーンに45分間曝露した後、データを収集した。結果を表7に示す。捕獲オリゴヌクレオチド12及び14の活性は、それぞれ、112picamol及び210picamolである。表7メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント一連の同様の実験において、ハイブリダイゼーション温度及びハイブリダイゼーション時間をさらに探索した。表8に示されたデータ捕獲オリゴヌクレオチド12及び14の活性は、それぞれ、251picamol及び268picamolであるは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリダイゼーション緩衝液800μl中で65°Cで15分間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液1ml中で65°Cで15分間のハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液1mlでの65°Cで5分間の2回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液1mlでの65°Cで5分間の2回の洗浄。表8メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント表9に示されたデータ捕獲オリゴヌクレオチド12及び14の活性は、それぞれ、487picamol及び506picamolであるは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリダイゼーション緩衝液150μl中で70°Cで15分間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70°Cで15分間のハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで5分間の2回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで5分間の2回の洗浄。表9メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント表10に示されたデータは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリダイゼーション緩衝液150μl中で70°Cで15分間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70°Cで5分間のハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで5分間の2回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで5分間の2回の洗浄。表10メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウント表11に示されたデータは、以下の条件で得られた結果を表している。ハイブリダイゼーション緩衝液150μl中で70°Cで5分間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション緩衝液200μl中で70°Cで1分間のハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで2分間の2回の洗浄、及び高ストリンジェンシー洗浄緩衝液800μlでの70°Cで5分間の2回の洗浄。表11メンブレン上の捕獲されたオリゴヌクレオチドの定量pic=相対ホスフォールイメージャーカウントこれらのデータは、捕獲オリゴヌクレオチドプローブのその相補的配列とのハイブリダイゼーションが特異的であったことを証明している。ガラススライドで実施された前実験と比較して、有意に多い量即ち、amol量と比較してfmol量のオリゴヌクレオチドプローブが、メンブレン支持体に再現可能に捕獲された。これらの2つの極めて密接に関連した捕獲オリゴヌクレオチドプローブについて、約1という平均交差反応性値が得られた。しかし、アレイ内の他の捕獲オリゴヌクレオチド対については、これらの値は有意に優れていたと考えられる。一般的に、そのような値は、当分野において既知の既存の方法の使用、即ち対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションASO又はシークエンシングバイハイブリダイゼーションSBHのようなディファレンシャルハイブリダイゼーション法によっては達成され得ない。実施例8ガラス表面の洗浄濃縮NH4OHH2O2H2O155vvv水溶液中80°Cで5分間グラススライドFisherScientificExtrathickmicroslidesfrostedcat1255011をインキュベートし滅菌水ですすいだ。濃縮HClH2O2H2O115vvv水溶液中80°Cで5分間2回目のインキュベーションを行った。参照として本明細書に組み入られる、UジョーンソンUJonssonらのよく特徴づけられたシリカ表面上でのフィブロネクチンの吸収挙動コロイド界面科学雑誌JColloidInterfaceSci、第90巻:第148163頁1982年を参照せよ。スライドを滅菌水、メタノール、ならびにアセトンでよくすすぎ、室温で風乾させた。実施例9メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシランMethacryloyloxypropyltrimethoxysilaneによるシラン化実施例8に基づき調製した、洗浄済みスライドを26mlのメタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシランAldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat235792、026mlのトリエチルアミンおよび130mlのトルエンから構成される溶液中室温で24~48時間インキュベートした。参照として本明細書に組み入られる、EヘッドボーグEHedborgらのセンサーズアクチュエーターズASensorsActuatorsA第3738巻:第796799頁1993年を参照せよ。スライドをアセトン、メタノール、滅菌水、再度メタノールならびに再度アセトンでよくすすぎ、室温で風乾させた。図31を参照せよ。実施例10ジクロロジメチルシランによるシラン化実施例8に基づき調製した洗浄済みスライドを12mlのジクロロジメチルシランおよび120mlのトルエンを含む溶液中室温で15分間インキュベートした。スライドをアセトン、メタノール、滅菌水、再度メタノール、ならびに再度アセトンでよくすすぎ風乾させた。実施例11メタクリル酸誘導体ガラスを用いたポリエチレングリコールメタクリレートの重合35mlのアセトニトリル中22gのポリエチレングリコールメタクリル酸AldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat409537および50mgの22アゾビス2メチルプロピオニトリルを氷上で冷却し3分間アルゴン気流でパージさせた。次の段階をアルゴン大気下、グローブボックス中で行った。実施例8および9に基づき調製したメタクリル酸誘導体グラススライド上に5~15滴の重合混合液を載せた。メタクリル酸誘導体グラススライドならびに重合混合液の上に実施例10に基づきシラン化させておいた2枚目のスライドグラスをかぶせ、この2枚のグラススライドを強く加圧してクリップで固定した。次にスライドを減圧乾燥機に移した。重合反応を熱分解的に55°Cで、または光分解的に366nmで開始させた。図32を参照せよ。実施例12メタクリル酸誘導体ガラスを用いたアクリル酸およびトリメチロールプロパンエトキシレート143EOOHトリアクリレートの重合35mlのアセトニトリル中05gのアクリル酸AldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat147230、183gのトリメチロールプロパンエトキシル酸143EOOHトリアクリル酸AldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat235792、および50mgの22アゾビス2メチルプロピオニトリルを氷上で冷却し3分間アルゴン気流でパージさせた。次の段階を実施例11で記載されるように、グローブボックス中で行った。次にスライドを減圧乾燥機に移し実施例11に記載されるように重合させた。図33を参照せよ。実施例13メタクリレート誘導体グラスを用いたポリエチレングリコールメタクリル酸およびトリメチロールプロパンエトキシル酸143EOOHトリアクリル酸の重合35mlのアセトニトリル中055gのポリエチレングリコールメタクリル酸AldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat409537、164gのトリメチロールプロパンエトキシル酸143EOOHトリアクリレートAldrichChemicalCompanyIncMilwaukeeWiscat235792、および50mgの22アゾビス2メチルプロピオニトリルを氷上で冷却し3分間アルゴン気流でパージさせた。次の段階を実施例11で記載されるように、グローブボックス中で行った。次にスライドを減圧乾燥機に移し実施例11に記載されるように重合させた。図34を参照せよ。実施例14材料および方法オリゴヌクレオチド合成および精製。オリゴヌクレオチドを注文合成品としてIDT社CoralvilleIAから入手するか、標準的なホスホラミダイト化学を用いてABI394DNAシンセサイザーPEBiosystemsIncFosterCityCAを用いて内部で合成した。スペーサーホスホラミダイト18、3アミノモディファーC3CPG、および3フルオレセインCPGをグレンリサーチGlenResearchSterlingVAより購入した。その他の試薬は全てPEバイオシステムズBiosystemsより購入した。3アミノ修飾化および/または蛍光標識化オリゴヌクレオチドを25°Cにて2時間濃縮NH4OH水溶液で処理し支持体から切断した。無水DMF28μlのテキサスレッドXサクシニミジルエステル500μgMolecularProbesEugeneOR溶液を含むチューブに02MNaHCO3150μlおよびオリゴヌクレオチド200μgを添加することによりテキサスレッド標識を行った。続いて終夜25°Cで撹拌し、3MNaCl20μlおよび氷冷エタノール500μlを添加し、30分間ドライアイスエタノール槽にて冷却および12000gで30分間遠心してほとんどの未反応標識を除去した。上清を除去し、沈澱したオリゴヌクレオチドを70エタノール100μlで洗浄し、乾燥させた。Zip13に対する相補配列を含んだ完全長LDR産物を刺激するフルオレセイン標識された70merであるFAMcZip13Prdを、1000Å細孔径CPG上に合成した。配列は:であった位置特定可能なアレイ特異的部分を太字で示す。標識化および未標識化オリゴヌクレオチドを12変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって精製した。バンドを紫外線陰影によって可視化し、ゲルから切断して、05MNaCl、5mMEDTA、pH80中37°Cで終夜溶出させた。説明書に従いC18セップパックスSepPaksWatersCorporationMilfordMAにてオリゴヌクレオチド溶液を脱塩し、続いてオリゴヌクレオチドを乾燥濃縮させSpeedVac20°Cで保存した。ポリマー被覆スライド顕微鏡用スライドFisherScientificプレクリーン、3インチ×1インチ×12mmを2メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン02トリエチルアミンのCHCl3溶液に25°Cで30分間浸し、次にCHCl3で洗浄した15分間を2回。モノマー溶液[20L8アクリルアミド2アクリル酸002NNメチレンビスアクリルアミドモノマー:架橋剤の比率が500:108過硫酸ラジカル重合開始剤]をスライドの一端に滴下し予めシラン化52SiCl2クロロホルム溶液しておいたカバーガラス24×50mmを用いて押し広げた。ホットプレートにて70°Cで45分間スライドを加熱することにより重合を行った。ホットプレートからスライドを取り除き、単端カミソリ刃ですぐにカバーガラスを剥離させた。被覆スライドを脱イオン化水ですすぎ、大気中で乾燥させ、周囲条件下で保存した。位置特定可能アレイポリマー被覆スライドを20mMNヒドロキシサクシニミドを含む01M1[3ジメチルアミノプロピル]3エチルカルボジイミド塩酸の01MK2HPO4KH2PO4pH60溶液に25°Cで30分間浸すことにより予め活性化させておいた。活性化スライドを水ですすぎ、65°Cのオーブンで乾燥させた;これらはドライエライト入り乾燥器中25°Cで6ヶ月またはそれ以上の期間の保存に対し安定であった。手動によるスポッティングは、02MK2HPO4KH2PO4、pH83の捕獲オリゴヌクレオチドストック液500μMからレイニンピペットマンRaininPipetmanを用いて02μlのアリコートを採取し、前活性化重合体表面上に3×3アレイで置くことにより行った。結果として得られるアレイを水ホルムアミド1:1を含む加湿容器中65°Cで1時間インキュベートした。自動装置によるスポッティングは、大気調整容器中で針型スポッターを装備した自動装置を用いて10~50nlの捕獲オリゴヌクレオチド同緩衝液中15mMのアリコートを25°Cであらかじめ活性化しておいた表面に置くことで行った。4スポット群からなるアドレスを持つ、2組の3×3アレイを各スライドに置いた。いずれかの方法を用いてスポットした後、300mMバイシンbicine、pH80300mMNaCl01SDSにスライドを65°Cで30分間浸し、水ですすいで乾燥させることにより未結合オリゴヌクレオチドを重合表面から除去した。このアレイを必要となるまでスライドボックスに25°Cで保存した。KrasDNA試料のPCR増幅パラフィン油下10mMトリスHClpH8315mMMgCl250mMKCl800μMdNTPs25μMフォワードプライマーならびにリバースプライマー各プライマー125pmol;表12を参照せよおよびパラフィン包埋腫瘍または細胞株から抽出した1~50ngの染色体DNAを含む20Lの反応混合液中でPCR増幅を行った。94°Cで2分間の変性段階に続き、02ユニットのTaqDNAポリメラーゼPEBiosystemsを添加した。表12PCRLDRアレイハイブリダイゼーションによるKras変異検出のために設計されたプライマーおよびプローブこれらのPCRプライマーはNrasおよびHrasの共増幅を伴うことなくKrasのエクソン1を増幅するために特異的に設計された。対立遺伝子特異的LDRプローブはそれらの5末端太字に24merの位置特定可能アレイ部分および3末端下線に識別塩基を含めた。共通LDRプローブは5リン酸基および3末端にフルオレセインまたはテキサスレッド標識のどちらかを含めた。94°C15秒および60°C2分の40ラウンドによる熱サイクルに続き、65°C5分の最終伸長段階によって増幅を行った。PCR後、1μlのプロテナーゼK18mgmlを添加し、反応溶液を70°Cで10分間加熱および95°Cで5分間加熱することにより反応停止させた。予想される大きさの増幅産物の存在を確認するために各PCR産物1μlを3アガロースゲルで解析した。KrasDNA試料のLDRパラフィン油下20mMトリスHClpH855mMMgCl2100mMKCl10mMDTT1mMNAD8pmol全LDRプローブ500fmolの各識別プローブ4pmolの蛍光標識共通プローブ、および細胞株または腫瘍試料からのPCR産物1pmolを含む20μl体積量でLDR反応を行った。7つの変異特異的プローブ、3つの共通プローブ、およびコドン12またはコドン13のいずれかに対する野生型判別プローブを含む、各2つのプローブ混合液を調製した図35Cおよび表12。反応混合液を94°Cで2分間予め加熱処理し、続いて25fmolの野生型TthDNAリガーゼを添加した。LDR反応を94°C15秒および65°C4分の20ラウンドサイクルで行った。各反応溶液の2μlずつを2Lのゲルローディング緩衝液[8ブルーデキストラン、50mMEDTApH80ホルムアミド1:5]と混合し、94°Cで2分間変性して、氷上で冷却した。各混合液の1μlを10変性ポリアクリルアミドゲルに添加しABI377DNAシーケンサーにより1500ボルトで電気泳動した。KrasLDR産物とDNAアレイのハイブリダイゼーション最終緩衝液濃度が300mMMESpH6010mMMgCl201SDSである緩衝液を作成するために40μlの14×ハイブリダイゼーション緩衝液でLDR反応液17μlを希釈した。1×ハイブリダイゼーション緩衝液中でアレイを25°Cで15分間プレインキュベーションを行った。カバーウェルズCoverwellsGraceIncSunriverORに希釈LDR反応液を充填しアレイに装着した。このアレイを加湿培養チューブに設置し回転ハイブリダイゼーションオーブン中65°Cおよび20rpmで1時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、アレイを25°Cで10分間300mMバイシン、pH8010mMMgCl201SDSで洗浄した。蛍光シグナルを顕微鏡/CCDを用いて測定した画像解析を参照せよ。合成LDR産物とDNAアレイのハイブリダイゼーション4500fmolの全フルオレセイン標識共通LDRプローブおよび9×500fmolの各未標識識別LDRプローブを含む位置特定可能なアレイ特異的部分を組み合わせた100amol1fmol3fmol10fmolまたは30fmolのFAMcZip13Prdアドレス13に相補的な合成70merLDR産物を含む4通りのハイブリダイゼーション混合液を、55μlの300mMMES、pH6010mMMgCl201SDSに調製した。前節に記載される手順に従いハイブリダイゼーションを行い、フルオロイメージャーFluorImagerおよび落射蛍光顕微鏡のデータを取得し解析を行った画像解析を参照せよ。LDRおよび連続希釈G12VG12とDNAアレイのハイブリダイゼーションこれらの実験は20μl体積量で行った。G12V変異を含むPCR増幅SW620細胞株DNAを100nM2000fmolの野生型G12DNAおよび100nM2000fmolのG12V識別プローブならびにテキサスレッド標識共通プローブの両方を含むLDR混合液に5nM100fmol120から0050nM1fmol12000で希釈した。LDRおよびハイブリダイゼーションは上述のように行い、顕微鏡/CCDによるイメージ化は画像解析に詳述されるように行った。画像解析モレキュラーダイナミクスフルオロイメージャー595MolecularDynamicsFluorImager595SunnyvaleCAまたはプリンストンインストルメントTECCD512TKBMIカメラPrincetonInstrumentsTECCD512TKBMIcameraTrentonNJを装備したオリンパスAX70落射蛍光顕微鏡MelvilleNYを用いてアレイを画像化した。フルオロイメージャーによるフルオレセイン標識プローブの解析については、530/30発光フィルターを用いて488nm励起を使用した。走査空間解像度はピクセルあたり100μmとした。結果として得られる画像を機器に備え付けられているImageQuaNTソフトウェアを用いて解析した。落射蛍光顕微鏡に100W水銀ランプ、FITCフィルターキューブ励起48040、二色性ビームスプリッター595、発光64575、および100mmマクロ対物レンズを装着した。マクロ対物レンズにより直径15mmの対象領域の照射および123×123mmマトリックスのCCDへの7×7mmアレイ領域の投射が可能となる。カメラを供給したウィンビュー32Winview32ソフトウェアを用いて画像を16ビットモードで収集した。サイオンイメージScionImageScionCorporationFrederickMDを用いて解析を行った。実施例15捕獲アドレスの設計本発明のアプローチはアドレスとよばれる24塩基で設計された捕獲配列に依存しており、これらはお互いに非常に異なっておりまた標的配列または染色体上のその他の配列に対するいかなる相同性も欠損している表13。表13原型アレイに用いられるアドレス配列対応するアドレス配列中のテトラマーオリゴヌクレオチドセグメントの順番。36セット全てから無作為に選別した6テトラマーは以下の通りである;1TGCG2ATCG3CAGC4GGTA5GACC6ACCT。緊密な配列であるZip135Zip111315およびZip212325は1、3、5番目テトラマー配置が異なっているが、2、4、6番目テトラマー配置は同一である。†スペーサーNH2PO46PO33NH2各アドレス配列は完全長24merが70°C~82°COligo60MolecularBiologyInsightsIncPlymouthMNandCascadeCOを用いて算出の範囲で同様のTm値を持つような6セットのテトラマーの組合せである。各テトラマーがその他全てのものと少なくとも2塩基異なり、自己相補でなくまた他のいかなるテトラマーに対しても相補ではない、36テトラマーの開始群を作製した表1および13を参照せよ。各アドレス配列が少なくとも3つの交互テトラマー単位までその他全てのものから異なるようにテトラマーを組み合わせた表13。これにより各アドレスがその他全てのものとは少なくとも6塩基まで異なり、しかるにオリゴヌクレオチドプローブの最も緊密な位置特定可能アレイ特異的部分ですら交差ハイブリダイゼーションするのを防ぐことが保証される正確なハイブリダイゼーションのTm値はどの不正確なハイブリダイゼーションのものより少なくとも24°C高い。シグナルが検出されるそれらのアドレスの位置から各変異の存在および型を決定した。異なる変異特異的LDRプローブを同セットアドレス相補配列に付加させることができるので、このアレイは普遍的であり、任意の遺伝子中の変異を検出するためにプログラムすることができる。実施例16アレイ調製様々な型の2次元および3次元マトリックスを以下に関して調べた:i表面調製の容易度;iiヌクレオチド負荷容量;iiiオリゴヌクレオチドの結合に加えハイブリダイゼーションならびに洗浄に求められる条件に対する安定性;およびiv蛍光検出の適合性。位置特定可能アレイを構築する好ましい方法論はガラス固相支持体に容易に架橋されたアクリルアミド/アクリル酸共重合のフィルムをまず作成し、次に重合体表面全体に無作為に拡散した遊離カルボキシル基を活性化して、共有アミド結合を形成するためにアミン末端化捕獲オリゴヌクレオチドを添加することを含む図34ABおよび36A。記載されるカップリング化学は迅速で直接的、効率的であり、手動および自動スポット操作に適応しやすい。活性表面およびオリゴヌクレオチド結合表面は共に長期保存に対して安定である。実施例17ハイブリダイゼーション条件の至適化モデル位置特定可能アレイにおける蛍光標識70merプローブハイブリダイゼーションを緩衝液、金属補因子、体積、pH、時間、および混合の力学の機能として測定した表14。緊密なアドレスについてさえ、シグナルノイズ比率が少なくとも50:1であり交差ハイブリダイゼーションは無視できるかまたは不在であった。これらの実験から異なるアドレスはおよそ同比率でハイブリッドを形成する、つまり、1アドレスあたりに結合するオリゴヌクレオチド量で標準化した場合に蛍光シグナルレベルは比較的均一であることが示唆される。マグネシウムはハイブリッドを形成させるには必須であり、この二価陽イオン存在下で1fmol以下のプローブを検出することができた表14;図37。pHが80から60に低下することによりハイブリダイゼーションシグナルが倍加されるが、大量のポリマーマトリックス中の未結合アクリル酸基から生じる負電荷それ故オリゴヌクレオチドとの反発的相互作用が減少するが遮蔽されることによる可能性が高い。この仮説を確証するために、標準的なカップリング条件の下、捕獲オリゴヌクレオチドが既に結合しているアレイ上の遊離カルボキシル基をエタノールアミンで保護した。pH80での保護したアレイのハイブリダイゼーションはpH60における保護なしでの同アレイと一致する結果が得られた。確実なハイブリダイゼーションを得るためには連続して混合することが重要であることが判明し、時間経過検証から標準として選択された65°Cで1時間が導き出された。ハイブリダイゼーション体積を減少させることによりハイブリダイゼーションシグナルが改善されたが、これは相対的にプローブ濃度が増加したためである。連続して混合することのできる特殊化した小体積ハイブリダイゼーション容器を用いることによりさらなる改善が達成されうる。表14ハイブリダイゼーションシグナルにおけるハイブリダイゼーション条件の効果ハイブリダイゼーションは1pmolのFAMcZip13Prdおよび手動でスポットしたアレイで行った。緩衝液は、緩衝液A:300mMバイシン、pH8010mMMgCl201SDS;†緩衝液B:300mMMES、pH6010mMMgCl201SDS。混合は、断続性Inter:10分毎に1回試料を手動で混合;連続性Cont;ハイブリダイゼーションオーブン内20rpmで試料を撹拌。実施例18KrasLDR産物のアレイハイブリダイゼーション位置特定可能アレイの検出に共役するPCRLDR増幅を、モデルシステムとしてKras遺伝子を用いて検証した。KrasDNA隣接コドン12および13を選択的に増幅させるためにエクソン特異的なPCRプライマーを用いた。結腸直腸癌のKras遺伝子に最もよく見いだされる7つの変異を検出するためにLDRプローブを設計した図35C、表14。例えば、コドン12の2番目であるGGTはアスパラギン酸をコードするGATに変異しうるが、これは5末端に位置特定可能アレイ特異的部分の相補鎖をもつcZip13および蛍光標識した共通プローブの3末端に識別塩基、Aを連結することにより検出される図35C。既知Kras変異を含む細胞株またはパラフィン包埋腫瘍に由来する9つの各DNA試料についてPCRLDR反応を行った。LDRが成功したことを確認するために各反応液からアリコート2μlを搾取しシーケンス機器で電気泳動を行った。次に3×3位置特定可能アレイによるLDR産物混合液のハイブリダイゼーションを行い各アドレスを4つ組にスポットした、蛍光スポットの位置を検出することによって異なる変異を判別した図36Bおよび図39。野生型試料のWtおよびWtは予想通りそれぞれZip1ならびにZip25における4つの同じハイブリダイゼーションシグナルを示した。変異試料は細胞株または腫瘍に存在する野生型DNAと同様に、変異に一致するハイブリダイゼーションシグナルを示した。この唯一の例外はG12V試料で、G12VKras対立遺伝子に対しホモ接合性の細胞株SW620に由来する細胞株であった。実験は手動ならびに自動でスポットしたアレイおよびフルオレセインまたはテキサスレッドいずれかで標識したLDRプローブを用いて数回繰返した。これらいずれの実験においても偽陽性または偽陰性シグナルは出現しなかった。アレイ上に見られる最少量のノイズは埃、掻き傷、および/または重合体中の小泡に帰することができる。これらの不備は4つ組のスポットパターンで再現されるものよりも弱く散発的であるため容易に判別される;このようなノイズは製造条件をより厳密にすることにより最小化される。実施例19アレイ捕獲感受性LDR反応後、過剰の未ライゲーション識別プローブは、正しくライゲーションした蛍光標識LDR産物と、アレイ上の正確なアドレスとのハイブリダイゼーションに関して競合する。捕獲感受性を測定するために、標準的な条件で、全セットのKrasLDRプローブ全9000fmolの識別および共通プローブを組み合わせた存在下100amol190000から301300fmolの標識化合成70merのFAMcZip13Prdこれは完全長LDR産物を刺激する;配列に関して材料と方法を参照せよを用い4つ組でDNAアレイをハイブリダイゼーションさせた。フルオロイメージャーFluorImagerを用いたアレイ解析は4500fmolのFAM標識LDRプローブおよびハイブリダイゼーション溶液中に位置特定可能アレイ特異的部分を含む4500fmolのプローブ存在下最少3fmol13000のFAMcZip13Prd標識プローブから開始した場合に、3:1以上のシグナル対ノイズ比率が得られることを示している。蛍光を定量する顕微鏡/CCD計測手段を用いた結果はより著しいものであった:1fmol19000の標識化プローブ図37、右側で開始することで3:1のシグナル対ノイズ比率を維持することができ、その限界はさらに至適化した後100amolまで伸展することができると予測される。所定のアレイの、いずれかの機器により定量した蛍光に関して、捕獲数値は添加される標識化FAMcZip13Prd量に伴い直線的に変化した。同アレイに対し、同濃度で同プローブを再度ハイブリダイゼーションする再現性は±5以内であった。アレイ間の蛍光シグナルにおける差異は結合した捕獲オリゴヌクレオチド量の差異を反映しており、これは手動によるスポット操作特有の不正確さおよび/または重合体の均一性における差異によるものである。実施例20PCRLDRアレイハイブリダイゼーションによる低存在量変異の検出PCR/LDRアレイハイブリダイゼーションを用いて野生型DNAの低レベル変異検出の限界値を測定するために、連続希釈系を調製し解析した。1:20から1:500の範囲の比率でPCR増幅した純G12VDNAを野生型KrasDNA中に希釈した。2000fmolのG12V変異に対する各識別および共通プローブをそれぞれ含む2プローブのセットを用いて、2000fmolの全DNAに対し2つ組LDR反応を行った。1:200の希釈度で陽性ハイブリダイゼーションシグナルを定量することが可能であることが明らかとなった図38;シグナルは1:500の希釈度においても判別可能であるが、後者の場合重合体の埃または気泡によるノイズレベルによって結果の正確な定量性は妨げられた。純野生型DNA対照はハイブリダイゼーションシグナルを示さなかった。これらの結果は明らかにPCDLDRと組み合わせた場合、位置特定可能アレイハイブリダイゼーションは全DNAの1しか存在しない遺伝子多型を検出しうることを示している。これらの結果は、26プローブセットおよび産物のゲル電気泳動に基づく解析を用いたPCRLDRはシグナル対ノイズが少なくとも3:1の比率で、野生型が500倍まで過剰に存在する中で任意のKras変異をも検出することができることを示す早期の研究と一致している。実施例21γメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランγmethacryloxypropyltrimethoxysilaneで被覆したグラススライド表面上でのアクリルアミドアクリル酸重合体の重合反応1vv濃度のアクリル酸を作成するために10mlの19アクリルアミド1ビスアクリルアミドwv溶液に100mgのビスアクリロイルシスタミンSigmaを添加した。33μlの2wv過硫酸アンモニウムBiorad、および100μlアリコートあたり1μlのTEMEDを添加した後混合液を重合させた。実施例9に記載されるように、25μlのTEMED活性化溶液をγメタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン被覆グラススライドにアプライし、実施例10に記載されるようにジクロロジメチルシランで被覆したグラススライド下で重合させた。実施例22アクリルアミドビスアクリルアミドアクリル酸共重合体への色素および色素標識オリゴヌクレオチドの付着実施例9に記載されるようにγメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランでシラン化した固相支持体にアクリルアミドビスアクリルアミドアクリル酸共重合体から構成される楔形ゲルを調製した。1mlのアクリルアミドビスアクリルアミドアクリル酸95:05:1wv溶液に33μlの2過硫酸アンモニウムを添加した。100μlアリコートに1μlのTEMEDを添加し20μlのこの混合液をシラン化した固相支持体にアプライした。01MフルオレセインアミンResearchOrganics、01Mプトレセインputrescein含有01MボディピーBodipyFLNHSMolecularProbes、およびアミノ誘導体化フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドを含む1Mリン酸緩衝液pH7および50mMEDCPierceを楔形ゲルにアプライした。加湿容器で室温にて30分間カップリング反応を進めた。相対蛍光単位をモレキュラーダイナミクス595フルオロイメジャーによる光電子増倍管で、488nm励起、513nm発光および700V電位にて測定した。表15は表面に結合する色素についての相対蛍光度を示している。ゲルの類比深度領域において、ボディピーBodipyFLはプトレセインを介してマトリックスに結合しているにも関わらずRFUが最も高かったが、一方でフルオレセインアミンはマトリックスと直接結合しているにも関わらずシグナルはより低かった。ボディピーFLはフルオレセインに比べpH感受性が低いことが分かっていおり、これがほぼ5倍のRFUの違いを説明している。表面に結合したフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドはフルオレセインより5倍以上RFUが低下した。フルオレセイン標識アミノオリゴヌクレオチドで最も低いシグナルが観察された。色素はオリゴヌクレオチドより効率的にマトリックスに結合するように思われるが、これはより容易にマトリックスに浸透するためである可能性がある。図40のように楔形ゲルの最大深度勾配に沿った相対蛍光単位RFUを測定し色素のマトリックス浸透能力を示した。ゲルの厚さが増加するにつれフルオレセインアミンのRFUが増加する。表15アクリルアミド/アクリル酸共重合体に結合する色素およびオリゴヌクレオチド相対蛍光の定量RFU相対蛍光単位実施例23野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子のPCRLDR検出のためのBRCA1およびBRCA2のエクソン増幅50ngのDNA、25mMの各dNTP、1×TCK緩衝液20mMトリシン、200μgmlウシ血清アルブミン、および50mM酢酸カリウム、および25UTaqポリメラーゼを含む20μlの反応混合液から開始して染色体DNAからの増幅を行った。BRCA1エクソン20およびBRCA2エクソン11を増幅するために、8pmolの各BRCA1エクソン2プライマーと共に4pmolの各フォワードプライマーならびにリバースプライマープライマーを用いた。チューブにミネラルオイルを充填し94°Cで15分間前保温した。必要単位のポリメラーゼを導入するために1×緩衝液で希釈したポリメラーゼ1μlを添加してホットスタートを行った。40サイクルで各セグメントを増幅した。各サイクルは94°C15秒の融解段階、および55°C2分の混合アニール伸長段階からなる。最終サイクル後、55°Cでさらに5分間反応を継続した。PCR後、プロテナーゼKで70°C10分間および90°C15分間処理した。変異対立遺伝子と野生型を判別するために、変異対立遺伝子から野生型を、各対立遺伝子について異なる蛍光色素をもつ異なる大きさのバンドとしてゲル上で検出可能に設計された競合LDRに対する鋳型としてPCR産物を用いた。共通プローブを5リン酸化しC3スペーサーにてその3末端を遮断したBk。連結反応には500fmolの各識別プローブおよび750fmolの各共通プローブを用い、10サイクルで94°Cにて15秒間の変性および65°Cで2分間のライゲーション反応を行った。10アクリルアミドゲルを用いた電気泳動によりLDR産物を分離しABI373蛍光シーケンサーで検出した。ABITAMRA350サイズ基準をLDR試料に添加した。アレイ上の特異的な相補物のアドレスに捕獲できるように、位置特定可能なアレイ特異的部分を含めるようLDRプローブを再設計した。2種類の方法を開発した。一つ目は、各対立遺伝子を同定するための異なる色素を持つLDR標的に対して、一つのアドレスをアレイ上に設置する方法である表16。表16BRCA1およびBRCA2の3つの特異的変異を検出するためのプローブ。LDR標的あたりのアレイ上のあるアドレスとのハイブリダイゼーションによる捕獲、および各対立遺伝子間を識別するための異なる蛍光色素からのシグナル。これらのプローブは野生型PCR産物および変異PCR産物とハイブリダイゼーションするが、両プローブが間隙または重複なく完全に一致する場合にのみライゲーションする図41。識別プローブの各位置特定可能アレイ特異的部分はLDR産物をアレイ上の特異的アドレスへと配向させる。2つめの方法は、変異の存在および不在を判別する全てのLDRプローブに、各LDR産物を個々のアドレスに配向させる特有の位置特定可能アレイ特異的部分を持たせることである表17。表17BRCA1およびBRCA2の3つの特異的変異を検出するためのプローブ。単一の蛍光色素に由来する対立遺伝子シグナルあたりのある特有のアレイアドレスとのハイブリダイゼーションによるアレイ上での捕獲。一つの色素のみが必要とされる図43。ゲルで大きさによってこれらの産物を分離し、変異の存在または不在を確認することができる図44。PCR産物を、単一および二重の色素プローブを用いたアプローチの両方を用いて、並行して変異についてLDRによってスクリーニングした。同一の試料から得られたLDR産物を両ゲルにロードし、両方とも一致した量の各LDR産物を示す。産物がゲル上で完全には分離しない可能性があるため、二重色素アプローチは、ゲル上での変異産物対野性型産物を視覚的に判別することをより容易にする。しかし、位置特定可能なアレイ特異的部分のアレイ上へのハイブリダイゼーションがアレイ上での完全な物理的な分離を許せば、この場合単一の色素で十分である。アレイは、再現性を確認するため、それぞれ4つを一群としてスポットした、複数のアドレス表18を伴うよう作成された図44。表18アレイに結合する捕獲プローブ100W水銀バーナー、フルオレセインならびにローダミンフィルターキューブおよびプリンストンインストルメントTEK512CCDカメラPrincetonInstrumentsTEK512CCDcameraを用いてオリンパスプロビスAX70OlympusProvisAX70顕微鏡でアレイを画像化した。TET標識LDR産物から独立してFAM標識LDR産物を画像化した。8ビットグレースケールへ変換する前にLDRシグナルをより狭域に絞るため、16ビットグレースケールを再調整した。フォトショップPhotoshopを用いて、FAM野性型を緑色に、およびTET変異を赤色にして8ビット画像に色付けをした図45。最後にこれらの画像を重ね合わせ、アドレスに野性型対立遺伝子および変異対立遺伝子の両方が存在すると黄色になるような併用画像を作成した。野性型対立遺伝子が各試料に存在し、LDR産物の位置特定可能特異的部分に相補的なアドレスのみが検出可能なシグナルを有していた。従って、位置特定可能アレイのハイブリダイゼーションは極めて特異的である。アレイにハイブリダイゼーションする各試料のゲルレーンを示す。各試料の変異の存在は、対応するアレイアドレスおよびゲルバンドの記載に下線を引くことで指し示す。それぞれの場合において、アレイはゲルの結果を再現した。二重標識法は同アレイアドレス上で野性型および変異対立遺伝子の存在を同定することができ、この方法はホモ接合体個体またはヘテロ接合体個体を同定することができる。実施例24アレイの調製およびハイブリダイゼーション反応における使用単層被覆支持体と比較した場合、ガラス顕微鏡スライド上を重合体コーティングすることにより捕獲プローブの結合容量が増加した。この結果のために、20μmまでの厚さの中性重合体層で支持体を調製した。この重合体はモノメタクリル酸グリセロールを混入した、アクリルアミドに基づく材料であった。酸化させると、モノメタクリル酸グリセロールのビシノールジオールがアルデヒドに転換し、これはアミン末端オリゴヌクレオチド捕獲プローブの固定点としてはたらく。表面に重合体を固定するために、参照として本明細書に組み込まれるSサバードSSavardらの手順、水溶液中のシラン加水分解および濃縮HydrolysisandCondensationofSilanesinAqueousSolution、ポリムコンポスPolymCompos第5巻:第242249ページ1984年に従い、まずガラスを3トリメトキシシリルプロピルメタクリレートでシラン化した。3トリメトキシシリルプロピルメタクリレート004Mの希HCl水溶液、pH2~4を25°Cにて30分間激しく撹拌する。清浄な3×1顕微鏡スライド実施例8に従い調製を25°Cで30分間、時々撹拌しながらこの溶液中でインキュベートし、脱イオン水ですすぎ、窒素で風乾し、24時間以内に使用する。1インチおよび1000インチのステンレススチール製楔をメタクリレート処理したスライドおよび疎水性にした10vvジクロロジメチルシランのトルエン溶液2枚目の顕微鏡スライドの間3箇所の端に設置する。ENチモフENTimofeevら、アクリル共重合体ゲルへの短いオリゴヌクレオチドの位置選択的固定化RegioselectiveImmobilizationofShortOligonucleotidestoAcrylicCopolymerGels核酸リサーチNucleicAcidsRes第24巻:第31423148頁1996年、これは参照として本明細書に組み入れられる。楔で固定された3端を顕微鏡スライドの1カ所1インチを空けたクランプの位置に保持する。次に、このように形成された孔をNNジメチルアクリルアミド09M、モノメタクリル酸グリセロール01MPolysciencesIncWarringtonPA、NNメチレンビスアクリルアミド架橋剤00027Mを含む重合可能な溶液、NNNNテトラメチルエチレンジアミン02vvおよび要時調製した10過硫酸アンモニウム2vvで充填し重合反応を開始する。25°Cにて30分間重合反応を行い、サンドイッチを解離させる。重合体フィルムを脱イオン水ですすぎ、乾燥させてさらに使用するまで4°Cで保存する。前記参照で実行されているように、NNジメチルアクリルアミドと共重合した特別に設計した前駆体である、ゲル形態のアルデヒドを作成するためにNaIO4による酸化反応を利用して、従来の手法を用いる。本発明におけるアルデヒドを、メタクリル酸グリセロールのビシノールジオールをNaIO401M、25°C、1時間で処理することにより作製する。マトリックスを含むアルデヒドを脱イオン水中に浸水させる25°C、1時間。スライドを浴槽から取り出し、水和させた表面から過剰の水を窒素気流にて噴き落とす。重合体を乾燥させる25°C、30分間。05μl容量の注射器を用いて、01μlの末端1級アミンを含む蛍光標識24mer捕獲オリゴヌクレオチドプローブpH約5の02M酢酸ナトリウム緩衝液中に500μMをアルデヒド化表面に付着させる。アドレスを含む液体の上に01μlのシアノ水素化ホウ酸ナトリウム01Mを直接付着させる。加湿容器中で24時間還元アミノ化反応を行う25°C。カップリング反応後、マトリックスを65°Cで30分間、300mMNaClおよび01ドデシル硫酸ナトリウムを含むビシン緩衝液300mMpH8に浸す。このスライドを脱イオン水にてすすぎ、窒素で風乾して乾燥器にて保存する。実施例14に従いハイブリダイゼーションを行う。4×倍率で水銀蒸気ランプを用いて、ユニバーサルイメージングUniversalImagingのスポットカメラSpotCameraにより蛍光画像を取得する。ローダミン標識相補的配列に対する露光時間は10秒とする。メタモルフMetamorphを用いてバックグラウンドを上回る光シグナル量を定量する。オリジナル画像を50まで縮小し、400ピクセル径の円を組み込む。表19は上述の方法で調製したスライドの捕獲性能を示している。表19捕獲プローブの蛍光定量変異を検出する本アプローチは3つの直交する要素をもつ:i一次PCR増幅ii溶液相LDRの検出:およびiii固相ハイブリダイゼーションでの捕獲。従って、各段階でのバックグラウンドシグナルを最小化することができ、結果として本発明方法の全体的な感度および精度は他のストラテジーによって供給されるものより有意に向上する。例えば、シークエンシングバイハイブリダイゼーションSequencingbyhybridazation法はi複数ラウンドのPCRまたはPCRT7転写反応;iiPCR増幅産物の断片化処理またはこれらの一本鎖化;およびiii長時間のハイブリダイゼーション時間10時間またはそれ以上を必要とし、これらの処理量が限定されるGuoら、NucleicAcidsRes、第22巻:第54565465頁1994年;Haciaら、NatGenet、第14441447頁1996年;Cheeら、Science、第274巻:第610614頁1996年;Croninら、HumanMutation、第7巻:第244255頁1996年;Wangら、Science、第280巻:第107710821998年;Schenaら、ProcNatlAcadSciUSA、第93巻:第1061410619頁1996年;およびShalonら、GenomeRes、第6巻:第639645頁1996年、これらは参照として本明細書に組み入れられる。加えて、これらのアレイに固定されたプローブは広範囲なTm値を有するので、0°Cから44°Cの温度でハイブリダイゼーションを行う必要がある。結果として、例えば反復配列中の小規模な挿入および欠失によるハイブリダイゼーションのミスマッチおよび非特異的結合のために、バックグラウンドノイズおよび偽シグナルが増加するHaciaら、NatGenet、第14441447頁1996年;Croninら、HumanMutation、第7巻:第244255頁1996年;Wangら、Science、第280巻:第10771082頁1998年;およびSouthernEM、TrendsinGenet、第12巻:第110115頁1996年、これは参照として本明細書に組み入れられる。一方、本発明の方法により、単一の反応で多重PCRが可能となりBelgraderら、GenomeSciTechnol、第1巻:第7787頁1996年、これらは参照として本明細書に組み入れられる、産物を一本鎖型に変換するための付加的な段階が必要とされず、反復配列中の滑りslippageを含む全ての点変異を容易に判別することができるDayら、Genomics、第29巻:第152162頁1995年、これは参照として本明細書に組み入れられる。選択的DNAアレイは、配列の多様性または試料中に存在する標的の量が原因でハイブリダイゼーション効率のばらつきを被る。類似の熱力学的性質をもつ多岐にわたるアドレス配列を設計する本手法を用いることによって、ハイブリダイゼーションを65°Cで行うことができ、結果としてより厳密および迅速なハイブリダイゼーションが得られる。変異検出段階からハイブリダイゼーション段階を切り離すことで、ゲルに基づくLDR検出を用いて既に達成されているように、LDR産物の定量化の見通しを与える。ガラス表面に直接スポットした、またはインサイチュで合成したアレイと比較して、重合体表面にスポットしたアレイは単一捕獲の有意な改善をもたらすDrobyshevら、Gene、第188巻:第4552頁1997年;Yershovら、ProcNatlAcadSciUSA、第93巻:第49134918頁1996年;およびParinovら、NucleicAcidsRes、第24巻:第29983004頁1996年、これらは参照として本明細書に組み入れられる。しかし、その他に記載される重合体は、用いるアドレスが8merから10merに限定されるが、本発明の重合体表面によって容易に24mer捕獲オリゴヌクレオチドを浸透させ共有結合させることが可能となる。さらに、60から75ヌクレオチド塩基長のLDR産物が浸透し、続いて正しいアドレスにハイブリダイゼーションすることも見出される。付加的な長所として、この重合体はほとんどあるいは全くバックグラウンド蛍光を生じず、蛍光標識オリゴヌクレオチドの非特異的な結合を示さない。最後に、個々のアドレスにスポットし共有結合させた捕獲オリゴヌクレオチドは近隣のスポットに漏洩しないため、例えばゲルパッドを切除することにより物理的に位置を分離する必要性が排除される。本発明は文献中に前出する、アレイに基づく他の検出システムから実質的に異なる、高処理量の変異検出に関するストラテジーに関連する。溶液中で行われるポリメラーゼ連鎖反応/リガーゼ検出反応PCRLDRアッセイと一致して、本発明のアレイにより、遺伝性でその遺伝子について配列の50として存在するか、散発性で野生型配列の1またはそれ以下で存在するかどうかに関わらず、単一塩基変異の正確な検出が可能となる。熱安定性DNAリガーゼが変異判別の特異性を供給する一方で、LDRプローブの多岐にわたる位置特定可能アレイ特異的部分が各LDR産物をDNAアレイ上の指定されたアドレスへと導くため、この感度が得られる。アドレス配列は一定でありこれらの相補的配列を任意の組み合わせのLDRプローブに付加することができるため、本発明の位置特定可能なアレイは汎用性がある。従って、広範囲な遺伝性変異を検出するために単一のアレイ設計をプログラムすることができる。多種多様な遺伝子にある多くの潜在的部位における変異の迅速な検出のための確実な方法は、癌患者の診断および治療の改善において非常に有望である。唾液、痰、尿、および糞便中に排出される細胞の変異解析に関する非侵襲性試験は高危険率群の監視を有意に単純化および改善し、内視鏡試験の費用および不快さを減少させ、癌の、早期かつ治療可能な段階でのより効果的な診断へと結び付けることができる。現れる変異の検出の実行可能性が、既知のおよび遺伝学的に特徴付けられている腫瘍を持つ患者において明確に示されているがSidranskyら、Science、第256巻:第102105頁1992年、Nollauら、IntJCancer、第66巻:第332336頁1996年;Calasら、CancerRes、第54巻:第356873頁1994年;Hasegawaら、Oncogene、第10巻:第141316頁1995年;およびWuら、癌の分子マーカの早期検出EarlyDetectionofCancerMolecularMarkersLippmanら、編集1994年、これらは参照として本明細書に組み入れられる、効果的な前駆症状診断は無数の潜在的低頻度変異を最小の偽陽性および偽陰性で同定する必要があると思われる。さらに、治療に対する反応の可能性についての臨床的情報を有する腫瘍内の遺伝学的変化を決定するための技術の統合によって、治療のために、より進行性の腫瘍をもつ患者をどのように選択するかを根本的に改変させることができた。大規模な臨床試験で多くの候補遺伝子を試験することが、信頼性のある遺伝子マーカーの同定および確証に必要である。100000を超えるアドレスをもつ高価な微細加工チップを作製することはできるが、これらの内、このような臨床試験で正確に変異プロファイルを記録することが必要とされるような、低頻度の変異を検出する能力を示すものはないHaciaら、NatGenet、第14441447頁1996年;Cheeら、Science、第274頁:6106141996年;Kozalら、NatMed、第2巻:第753759頁1996年;およびWangら、Science、第280頁:第10771082頁1998年、これらは参照として本明細書に組み入れられる。本発明の汎用性の位置特定可能アレイによるアプローチは、多種多様な遺伝子の様々なコドンにおける低頻度の変異を迅速かつ確実に同定すること、また同様に、腫瘍の成長に付随する様々な遺伝子の欠失および増幅を定量することのできる可能性を有している。加えて、mRNA発現プロファイリングに関して、LDR汎用性アレイはKras、Nras、およびHrasのような高度に類似する遺伝子を判別することができる。さらに、特定遺伝子または特定の変異タンパク質を標的とする新規治療法が開発されるにつれ、迅速および正確な高処理量の遺伝子試験の重要性は疑い無く増加するであろう。本発明は例証を目的として詳細に記載されているが、そのような詳細は単に例証の目的のためにあるものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者により変法が作製できることが理解される。