"血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記酸素分圧が上昇する環境が、低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む環境である、請求項1に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記低酸素分圧が0.1~10である請求項2に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記低酸素分圧が、該分圧下で培養を行った場合、他の分圧下での培養と比較して低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧であることを特徴とする、請求項2又は3に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記低酸素分圧において細胞培養開始から一定期間細胞培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに細胞培養を行う請求項2乃至4のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記一定期間が、4~10日間である請求項5に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前期一定期間が、KDR陽性、CD34陽性、CD43陽性を示す細胞が出現するまでである請求項5又は6に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記より高い酸素分圧下に変える時期が、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期であることを特徴とする請求項5乃至7のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記より高い酸素分圧が、酸素分圧11~30である請求項5乃至8のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である請求項1乃至9のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする請求項1乃至10のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。前記細胞培養を行う培地中にVEGFを添加しないことを特徴とする請求項1乃至11のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。請求項1乃至12のいずれかに記載の方法で製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞。請求項13に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養して製造される血液細胞。請求項14に記載の血液細胞を含む医薬製剤。請求項1に記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。本発明者らは、すでに、多能性幹細胞から血液前駆細胞を取得し、さらに、各種血液細胞にまで分化させる方法を確立しているが、この方法によって調製される血液細胞の量は少なく、治療等に使用する量として十分であるとまではいえない状況にある。そこで、本発明は、上記事情に鑑み、より大量かつ安定的なインビトロにおける血液細胞の調製法の確立を目指し、血液前駆細胞への新規な分化誘導方法の提供、並びに、該方法で製造される血液前駆細胞及び該血液前駆細胞から分化誘導される各種血液細胞の提供を目的とする。発明者らは、多能性幹細胞から血液前駆細胞を誘導する工程において、細胞培養を、一定期間、低酸素分圧下で行ったところ、誘導された血液前駆細胞の数が大気酸素分圧下のみで培養を行った場合と比較して増大することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の1~16に関する。1血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。2前記酸素分圧が上昇する環境が、低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む環境である、上記1に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。3前記低酸素分圧が0.1~10である上記2に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。4前記低酸素分圧が、該分圧下で培養を行った場合、他の分圧下での培養と比較して低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧であることを特徴とする、上記2又は3に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。5前記低酸素分圧において細胞培養開始から一定期間細胞培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに細胞培養を行う上記2乃至4のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。6前記一定期間が、4~10日間である上記5に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。7前期一定期間が、KDR陽性、CD34陽性、CD43陽性を示す細胞が出現するまでである上記5又は6に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。8前記より高い酸素分圧下に変える時期が、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期であることを特徴とする上記5乃至7のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。9前記より高い酸素分圧が、酸素分圧11~30である上記5乃至8のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。10前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である上記1乃至9のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。11前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする上記1乃至10のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。12前記細胞培養を行う培地中にVEGFを添加しないことを特徴とする上記1乃至11のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。13上記1乃至12のいずれかに記載の方法で製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞。14上記13に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養して製造される血液細胞。15上記14に記載の血液細胞を含む医薬製剤。16上記1に記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。本発明によれば、従来法と比較して、分化誘導される血液前駆細胞、赤血球前駆細胞並びに血液細胞の数を増大させることが可能となる。本発明によれば、所望の数の血液前駆細胞、赤血球前駆細胞又は血液細胞を取得するための培養期間を短縮することが可能となる。本発明によれば、従来、効率的な血液前駆細胞の誘導のために必要であったVEGFを使用することなく、血液前駆細胞を調製することができる。本発明によれば、血液分化能力の高い血液前駆細胞、赤血球前駆細胞を得ることができる。本発明の実施形態の1つは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。また、本発明の他の実施形態は、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。ここで、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞とは、特に限定するものではなく、例えば、多能性幹細胞ES細胞、iPS細胞など、あるいは、多能性幹細胞と血液前駆細胞の間の分化段階にある細胞であればいずれの細胞であってもよく、好ましくは、ES細胞又はiPS細胞である。本発明で使用されるES細胞は、特に限定されるものではなく、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と共に一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的にES細胞株として樹立することができる。このように、ES細胞は受精卵から取得するものである。その他、例えば、脂肪組織、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤、精巣細胞など、受精卵以外の細胞、組織から取得され、ES細胞類似の特徴を持ち、分化多能性を有するES細胞様の細胞であってもよい。また、本発明で使用されるiPS細胞は、体細胞例えば、線維芽細胞や血液細胞などへ分化多能性を付与する数種類の転写因子以下、ここでは分化多能性因子と称する遺伝子を導入することにより、ES細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞であれば、如何なる由来の細胞であってもよい。分化多能性因子としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Octファミリー例えば、Oct3/4、SOXファミリー例えば、SOX2、SOX1、SOX3、SOX15及びSOX17など、Klfファミリー例えば、Klf4、Klf2など、MYCファミリー例えば、c-MYC、N-MYC、L-MYCなど、NANOG、LIN28などを挙げることができる。iPS細胞の樹立方法については、多くの文献が発行されているので、それらを参考にすることができる例えば、Takahashiら,Cell2006,126:663-676;Okitaら,Nature2007,448:313-317;Wernigら,Nature2007,448:318-324;Maheraliら,CellStemCell2007,1:55-70;Parkら,Nature2007,451:141-146;Nakagawaら,NatBiotechnol2008,26:101-106;Wernigら,CellStemCell2008,10:10-12;Yuら,Science2007,318:1917-1920;Takahashiら,Cell2007,131:861-872;Stadtfeldら,Science2008322:945-949などを参照のこと。本発明により分化又は製造される血液前駆細胞とは、CD34-CD34陰性、CD34CD34陽性、Lin-CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD41、CD45、CD56、CD66b、または、CD235a陰性、CD38-CD38陰性、CD90CD90陽性、CD49fCD49f陽性、VEGFR2VEGFR2陽性、CD31CD31陽性、CD43CD43陽性、CD34/CD45CD34陽性、かつ、CD45陽性、Rhodamine弱陽性、あるいは、Hoechst陰性/弱陽性ののうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴付けられる造血系の細胞の事である。また、本発明により分化又は製造される赤血球前駆細胞とは、CD71CD71陽性、GPAGlycophorinAGPA陽性、GPA/CD41GPA陽性/CD41陽性あるいは、GPAGlycophorinA/CD45GPA陽性/CD45陽性として、特徴付けられる造血系の細胞のことである。また、本発明により分化又は製造される巨核球、血小板とは、CD41CD41陽性、CD42bGPA陽性、CD41/CD42bCD41陽性/CD42b陽性、あるいは、GPA-/CD41GPA陰性/CD41陽性として特徴付けられる造血系の細胞の事である。本発明で使用される細胞が由来する動物は、ヒト及び非ヒト動物例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなどであり特に限定はされないが、特に好ましくは、ヒトである。本発明において、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導するために行う細胞培養の条件のうち酸素分圧条件以外の条件については、当業者により選択可能な如何なる条件を使用してもよく、例えば、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞としてES細胞又はiPS細胞を使用する場合、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導する過程において、ネット様構造物又は胚様体が形成されるような条件などを培養条件の例として使用することができる。ここで、ES細胞又はiPS細胞から調製されるネット様構造物とは、ES細胞又はiPS細胞由来の立体的な嚢状内部に空間を伴うもの構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、TAKAYAMAら,BLOOD2008,111:5298-5306、を参照のこと。ES細胞又はiPS細胞からネット様構造物が形成される培養条件とは、用いるES細胞又はiPS細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度15のFBSを添加したIMDMを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。なお、従来法では、ネット様構造物を効率的に形成させるために、VEGF0~100ng/ml、より好ましくは、20ng/ml程度を加えて培養を行っているが、本発明で開示されるように低酸素環境下での培養を行う場合には、VEGFを添加しなくても、VEGFを添加した場合と同等の効果を得ることができる。酸素分圧以外の培養の環境としては、用いるES細胞又はiPS細胞の種類によって異なるが、例えば、5CO2、36~38°C、好ましくは37°Cの条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ES細胞又はiPS細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、14~16日間程度である。形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具例えば、セルストレイナーなどに通すことにより、分離することができる。このようにして得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞は、さらに培養して、各種血液細胞へ分化させることができる。また、ES細胞又はiPS細胞から血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を培養する条件酸素分圧以外の条件として、胚様体と呼ばれる内胚葉、中胚葉、外胚葉の分化細胞を含む細胞塊が形成されるような条件を使用することも可能である。その条件としては、用いるES細胞又はiPS細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度15のFBS、トランスフェリンなどを添加したIMDMを用い、その他適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。また、酸素分圧以外の培養環境としては、用いるES細胞又はiPS細胞の種類によって異なるが、例えば、5CO2、36~38°C、好ましくは37°Cの条件を用いることができる。本発明において、酸素分圧が上昇する環境とは培養中に酸素分圧が上昇する条件を備えた環境を意味する。この環境は人工的に作り出された環境であってよい。酸素分圧が上昇するとは低酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよいし、より高い酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよい。また低酸素分圧からより高い酸素分圧へ移行するような範囲において酸素分圧が上昇してもよい。培養中に酸素分圧が上下に変動するような環境であっても、一時的に酸素分圧が上昇するような環境は、本発明の酸素分圧が上昇する環境である。本発明における低酸素分圧とは、例えば、酸素分圧0.1~10、好ましくは、1~5、より好ましくは5程度のことである。あるいは、低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧を低酸素分圧として選択してもよい。ここで、低酸素応答性遺伝子とは、例えば、HIF2α、HIF1α、HIF3α、HIF1β、GLUT-1、p21、p57、FoxO、Notch1、VEGF、ABCG2/Bcrp-1、CXCR4、PDK-1、c-Kitなどが挙げられる。本発明における発現とは、例えば、遺伝子が転写されてmRNAが合成されること、遺伝子のmRNAが翻訳されてタンパク質となること、あるいは遺伝子のタンパク質が機能を発揮することである。また、血液前駆細胞へ分化し得る細胞から血液前駆細胞を分化誘導又は製造するために行う細胞培養において、全工程を低酸素分圧下にしてもよいが、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始から、例えば、KDR、CD34、CD43を示す細胞が出現するまでの期間を低酸素分圧下で培養し、その後、より高い酸素分圧、例えば大気酸素分圧21の酸素分圧下で培養することが好ましい。例えば、ヒトES細胞又はヒトiPS細胞からネット様構造物を形成させる条件で培養を行う場合、ES細胞又はiPS細胞の培養開始から、1~10日間、好ましくは、4~8日間、より好ましくは、7日間程度、低酸素分圧下例えば、酸素分圧5程度で培養を行い、その後、より高い酸素分圧下で培養することが好ましい。あるいは、低酸素分圧からより高い酸素分圧に切り替えるタイミングは、特定の遺伝子の発現変化を指標にして決定してもよい。特定の遺伝子としては、限定はしないが、例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子を挙げることができる。例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現するタイミングの前後で酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替える事が望ましい。また、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子は、その発現が始まる前後までに酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替えることが望ましい。前述の中内胚葉誘導の指標となる遺伝子とは、T、SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、Mixl1、FGF4CD48、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、c-Kit、CD99、OTX2、Nodalなどが挙げられる。前述の血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子とは、TAL-1、KDR、CD34、CXCR4、c-Kit、RUNX-1、GATA-1、GATA-2、CD43、ETV-2、Tie-2、CD31、CLOUDIN5、Sca-1などが挙げられる。前述の分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子とは、VEGF、EPOR、EPO、TPO、BMP4、FGF-2、FLT-1、Ang-1、SDF-1、SCFなどが挙げられる。前述の血液細胞誘導の指標となる遺伝子とは、CD41、Glycophorin-A、c-MPL、Rh抗原、α4インテグリン、KLF-1、BCL-11A、CD45、β-Globin、α-Globin、ε-Globin、γ-Globinなどが挙げられる。ここで、より高い酸素分圧とは、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始時の酸素分圧低酸素分圧よりも高い酸素分圧であり、例えば、11~30程度の酸素分圧、より好ましくは、15~25程度の酸素分圧である。特に、より高い酸素分圧とは、大気酸素分圧21程度が好ましい。本発明の他の実施形態は、本発明の方法により製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養し、各種血液細胞を分化誘導又は製造する方法である。血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞から様々な血液細胞を分化誘導する方法は、当該技術分野において、多くの方法が公知になっており例えば、Miharadaら,NatBiotechnol2006,24:1255-1256;Qiuら,Blood2008,111:2400-2408;Maら,PNAS2008,105:13087-13092;Luら,Blood2008,112:4475-4484;Baekら,Transfusion2009,11:2285―2295;Lapillonneら,haematologica2010,doi:10.3324、当業者であれば容易に選択し、実施することができる。例えば、本発明の方法により製造された血液前駆細胞から、成熟巨核球細胞、さらに、血小板を製造する場合、その培養条件として、TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3リガンド、Heparinなどのいずれか又はこれらのうちの2つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、成熟巨核球細胞及び血小板を分化誘導する条件として、例えば、TPO10~200ng/mL、好ましくは100ng/mL程度の存在下で、あるいは、TPO10~200ng/mL、好ましくは100ng/mL程度、SCF10~200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度及びHeparin10~100U/mL、好ましくは25U/ml程度の存在下で、7~15日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、5CO2、36~38°C、好ましくは37°Cの条件下で培養を実施してもよい。また、本発明の方法により製造された赤血球前駆細胞から、成熟赤血球細胞を分化誘導するために適した条件とは、例えば、TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11,EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3リガンド、IGF-I、IGF-II、Dexamethasone、Hydrocortisone、Mifepristone、Heparinなどのいずれか又はこれらのうちの2つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、赤血球細胞を分化誘導する条件として、EPO2~100U/mL、好ましくは10U/mL程度の存在下で、あるいは、EPO2~100U/mL、好ましくは10U/mL程度、SCF10~200ng/mL、好ましくは50ng/mL程度、TPO5~200ng/mL、好ましくは20ng/mL程度の存在下で、7~25日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、5CO2、36~38°C、好ましくは37°Cの条件下で培養を実施してもよい。また、本発明によって製造される各種血液細胞は、製剤の形態で安定に供給することも可能である。本発明の方法によって、例えば、血小板を製造し、これを製剤化する場合、血小板が豊富に存在する培養液の画分を回収し、白血球除去フィルターなどを使用して、巨核球細胞、その他、血小板以外の血球系細胞成分を除去して、調製することができる。血液製剤を調製するにあたっては、血小板又は赤血球細胞の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。このような安定化に資する成分は、当該技術分野の専門家において周知のものを選択することが可能である。より具体的には、取得した血小板は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。ACD-A液:FFPfreshfrozenplasma;献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含むを1:10の比率で調整し、15-50Gyの放射線照射後に20-24°Cにて振とうしながら保存する。ACD-A液;クエン酸ナトリウム22g/クエン酸8g/ブドウ糖22gを注射用水で全体を1Lとするように調整する。以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、1×109血小板/mL程度が望ましい。また、GM6001abroad-rangehydroxamicacid-basedmetalloproteaseinhibitorCalbiochem社、LaJolla,CA,USAを添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子GPIb-V-IXやGPVIの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスES細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Bergmeier,Wetal.,CirRes95:677-683,2004及びGardiner,EEetal.,JThrombosisandHaemostasis,5:1530-1537,2007を参照のこと。なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。また、本発明により、例えば、赤血球細胞を製造し、これを製剤化する場合、以下のように行うことができる。培養上清を遠心後濃縮した濃厚赤血球液にMAP液組成は以下参照を加えて調製し、15-50Gyの放射線照射後に2~6°Cで保存する。以上の方法を使用する場合、赤血球の濃度としては、例えば、1×1010赤血球/mL程度が望ましい。取得した赤血球は、赤血球保存用添加液MAP液として、例えば、D-マンニトール14.57g、アデニン0.14g、結晶リン酸二水素ナトリウム0.94g、クエン酸ナトリム1.50g、クエン酸0.20g、ブドウ糖7.21g、塩化ナトリム4.97gを、注射用水を加えて溶かし、全量を1000mlとしたものを使用することができる。その他、赤血球の製剤化に適当と思われる公知の方法を適宜選択することは、当業者において容易なことである。さらに、本発明の実施形態には、本発明の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の分化方法又は製造方法を使用することを特徴とした、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法が含まれる。具体的には、本発明の方法として実施される細胞の培養工程において、適当な時期に、適当な期間、培地中に候補となる分化促進物質又は分化阻害物質を添加し、得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数を測定し、対照として行われる実験候補物質を加えず同じ培養工程を行うとの比較により、該促進物質又は阻害物質の効果を評価することができる。対照の実験から得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数よりも多ければ、促進物質であり、少なければ阻害物質として評価することができる。以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、実施例は、あくまでも本発明の一部の態様を示すものであって、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。<材料及び方法>1.細胞と試薬ヒトiPS細胞は、山中4因子OCT3/4、KLF4、SOX2、c-MYCの導入によって樹立したTkCB7-2、TkCB7-4、TkCB8-3を用いた。iPS細胞の維持培養は、DulbeccomodifiedEaglemediumandHamF-12mediumSIGMAに、0.1mM非必須アミノ酸Invitrogen、2mML-グルタミンInvitrogen、20knockoutserumreplacementInvitrogen、0.1mM2-メルカプトエタノールSIGMA、及び5ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF;Upstateを加えた培地を使用した。iPS細胞は、放射線照射50Gyしたマウス胎児線維芽細胞MEF上にて培養し、3日おきに継代して未分化状態を維持した。また、フィーダー細胞として使用したマウスC3H10T1/2細胞は、EaglebasalmediumInvitrogenに、10ウシ胎児血清FBS、2mML-グルタミンを加えて培養した。分化培地は、IscovemodifiedDulbeccomediumSIGMAに、10μg/mLヒトインスリン、5.5μg/mLヒトトランスフェリン、5ng/mL亜セレン酸ナトリウムSIGMA、2mML-グルタミン、0.45mMα-モノチオグリセロールSIGMA、50μg/mLアスコルビン酸SIGMA、及び15highlyfilteredFBSCellectGold;ICNBiomedicalsを加えて使用し、これに、ヒト血管内皮細胞増殖因子RDSystemsを添加、又は、未添加で行った。以上の培養はCO2インキュベーターHERACELL150iThermoSCIENTIFICを用いて37°C、5CO2下で実施した。また、ES細胞については、KhES3株を用い、iPS細胞と同じ条件で、維持培養及び分化等を行った。2.iPS細胞又はES細胞由来のネット様構造物以下、iPS-Sac又はES-Sacの作製本実施例において行ったネット様構造物を調製するための培養工程について以下に説明する詳細は、TAKAYAMAら,BLOOD2008,111:5298-5306を参照のこと。事前に、50Gyの放射線照射を行ったC3H10T1/2を100-mmディッシュに用意し、ヒトiPS細胞又はES細胞を1×105ずつ分化培地にて播種した。窒素ガスを注入して酸素濃度を大気酸素21O2と低酸素5又は1O2としたCO2インキュベーター内で、1~14日の間で適宜期間を設定し培養を行った。低酸素で培養した細胞は、その後大気酸素条件へ移すか、そのまま培養を続け、計14日間の培養を行い、iPS-Sac又はES-Sacを作製した。3.iPS-Sac又はES-Sacからの血液細胞の回収iPS-Sac又はES-Sacをディッシュから剥がして破砕し、3FBSを含むPBSに懸濁した後、40μmセルストレイナーBDを通過させた。通過した溶液を440×g、10分間遠心分離して血液細胞を回収し、細胞数をカウントした。4.フローサイトメトリー解析細胞表面抗原の発現は、フローサイトメトリーMoFlo,BeckmanCoulterで解析した。細胞は、phycoerythrinPE結合-抗CD34抗体、phycoerythrinPE結合-抗CD42b抗体、Alexa405結合-抗CD45抗体、allophycocyaninAPC結合-抗glycophorinグリコフォリンA抗体、allophycocyaninAPC結合-抗CD41a抗体BDBiosciencesを用いて染色した。5.血液前駆細胞HPC;hematopoieticprogenitorcellのコロニーアッセイiPS-Sac又はES-Sacから回収したHPC、5-10×103を50ng/mlトロンボポイエチンRDsystemsを添加したMethoCultGFH4434StemCellTechnologiesに懸濁した後、35mmディッシュへ播種した。CO2インキュベーター内で13-14日間培養し、生じたコロニーをピックアップした。コロニーは、シャンドンサイトスピン4ThermoSCIENTIFICにて800rpm、1分間遠心し、HemacolorRapidstainingofbloodsmearMERCKによって染色して観察した。6.成熟赤血球の免疫染色iPS-Sac又はES-Sacから回収したHPCを成熟赤血球へと分化させ、シャンドンサイトスピン4にて遠心してスライドグラスへ貼り付けた。これを4パラホルムアルデヒドで固定後、0.1TritonX-100で透過処理してから、スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体として、抗ヒトヘモグロビン抗体BethylLaboratories、抗ヒトβグロビン抗体SantaCruzBiotechnologyと赤血球を反応させ、二次抗体として、Alexa488結合-抗ヤギ抗体及びAlexa546結合-抗マウス抗体Invitrogenで染色した。VECTASHIELDMountingMediumwithDAPIVectorLaboratoriesで封入して、共焦点顕微鏡FV1000オリンパスで観察した。βグロビン鎖陽性細胞率は、βグロビン鎖陽性細胞数/ヘモグロビン陽性細胞数×100で算出した。7.リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析iPS-Sac又はES-SacをRNeasyMiniKitQIAGENを用いて処理し、TotalRNAを精製した。RNAを逆転写してcDNAを合成し、RocheUniversalProbeRocheAppliedScienceを用いて7900HTFastReal-TimePCRSystemAppliedBiosystemsで解析した。内部標準遺伝子として、glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseGAPDHを使用した。T、TAL-1、KDR、CD34、VEGF、EPOR、CD41a、Glycophorin-A、HIF2α、GAPDHの各遺伝子のプライマー配列は、下記の通りである。Tforwardgctgtgacaggtacccaacc配列番号1Treversecatgcaggtgagttgtcagaa配列番号2TAL1forwardctatgagatggagattactgatggtc配列番号3TAL1reversegtgtggggatcagcttgc配列番号4KDRforwardgaacatttgggaaatctcttgc配列番号5KDRreversecggaagaacaatgtagtctttgc配列番号6CD34forwardgtgaaattgactcagggcatc配列番号7CD34reversecccctgtccttcttaaactcc配列番号8VEGFforwardccttgctgctctacctccac配列番号9VEGFreverseccacttcgtgatgattctgc配列番号10EPORforwardttggaggacttggtgtgtttc配列番号11EPORreverseagcttccatggctcatcct配列番号12CD41aforwardgagacacccatgtgcagga配列番号13CD41areverseagctggggcacacatacg配列番号14GlycophorinAforwardgacacatatgcagccactcct配列番号15GlycophorinAreverseatgatgggcaagttgtaccc配列番号16HIF2αforwardgacatgaagttcacctactgtgatg配列番号17HIF2αreversegcgcatggtagaattcatagg配列番号18GAPDHforwardaacagcctcaagatcatcagc配列番号19GAPDHreversettggcaggtttttctagacgg配列番号20<結果>1.血液細胞への分化に対する低酸素培養の効果iPS細胞TkCB7-4を分化培地に播種した後、14日間大気酸素分圧下21で培養した場合図11、7日間低酸素分圧下5で培養後、7日間大気酸素分圧下21で培養した場合図12、14日間低酸素分圧下5で培養した場合図13の各々について、iPS-Sac内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、7日間の低酸素分圧下での培養を行った後、7日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、生じた血液細胞の数が最も多かった図12。この結果から、iPS細胞を低酸素分圧下で培養を開始し、一定期間低酸素分圧下で培養することで、形成される血球数を増加できることが分かった。2.血液前駆細胞HPC;hematopoieticprogenitorcellへの分化に対する低酸素培養の効果HPCへの分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトiPS細胞を、大気酸素分圧下21で14日間図21、低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間図22、低酸素分圧下5で14日間培養図23し、各々、iPS-Sac内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるCD34及びCD45が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、血液前駆細胞の比率は、一定期間低酸素分圧下での培養することで、向上することが分かった図22図23。次に、血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、HPCのコロニーアッセイにより検討を行った。iPS細胞TkCB7-2により形成されたiPS-Sacより回収した血液細胞を、1×104播種し、培養後に生じたコロニー数をカウントし、各コロニー中に存在する血液細胞の種類n好中球、mマクロファージ、E赤芽球、M巨核球、blast幼若血球を観察した。その結果、低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間図32培養した場合、大気酸素分圧下21で14日間図21培養した場合に比べて、形成されるコロニー数が増加していた。さらに、4種類の血液細胞の全てが含まれるミックスコロニーmixは、造血幹細胞/血液前駆細胞を含むことの指標となるものであるが、このミックスコロニーも低酸素分圧下での培養を行った場合の方が多く形成された図3;大気酸素分圧下での培養では18個であったのに対し、低酸素分圧下での培養を行うと34個であった。。ES細胞KhES3からHPCへの分化に対する低酸素培養の効果についても検討を行った。ES細胞を、低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間図41VEGF、大気酸素分圧下21で14日間VEGF図42、大気酸素分圧下21で14日間-VEGF図43培養を行った後、ES-Sac内に生じたCD34陽性の細胞数を、カウントした。その結果、ES細胞を用いた場合において、低酸素分圧下での培養を行うことで血液前駆細胞の数が増加することが分かった図4の1と2を比較。縦軸は、大気酸素分圧下21で14日間-VEGF培養した場合の血液前駆細胞数を1とした場合の相対数。以上のことから、iPS細胞又はES細胞などの多能性幹細胞から血液前駆細胞を分化させる場合、低酸素分圧下における培養過程を含めることで、生じる血液前駆細胞の数を増加できることが明かとなった。3.赤血球系細胞への分化に対する低酸素培養の効果赤血球前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトiPS細胞を、大気酸素分圧下21で14日間図51、低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間図52、低酸素分圧下5で14日間培養図53し、各々、iPS-Sac内に生じた細胞について、赤血球前駆細胞のマーカーであるGPA陽性かつCD45陰性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、赤血球前駆細胞の比率は、7日間の低酸素分圧下での培養を行った後、7日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、最も大きくなることが分かった図52。このように、多能性幹細胞から赤血球系細胞の分化させる場合においても、低酸素分圧下における培養が効果的であることが示された。4.低酸素培養による各種血液細胞の増幅効果酸素分圧を57日間培養から217日間培養へ切り替えて作製したHPCを成熟赤血球、巨核球、血小板へと分化させ、培養酸素分圧の最適化による末梢血液細胞の増幅効果を確認した。その結果、1×105ES細胞KhES-3あたり得られる成熟赤血球数は、21酸素分圧を用いて作製した場合と比べて約2.2倍となり図6A、iPS細胞TkCB7-2では約5倍となった図6B。さらに巨核球/血小板分化では、1×105iPS細胞あたり得られる巨核球数は約4.4倍であり図6C、血小板数は2.8倍に増加した図6D。以上のことから、本技術は、各種血液細胞を多能性幹細胞から作製する際に有効であることが示された。5.赤血球細胞のβグロビン鎖陽性率に対する低酸素培養の効果酸素分圧を57日間培養から217日間培養へ切り替えて作製したHPCを成熟赤血球へと分化させ、赤血球成熟度の指標となるβグロビン鎖陽性細胞率を測定した。その結果、ES細胞KhES-3では、21酸素分圧を用いて作製したHPCを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は19.5であるが図7A1、5酸素分圧から21酸素分圧への切り替えを用いて作製したHPCを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は37.3であり図7A2、赤血球成熟度が向上していた。同様にiPS細胞TkCB7-2では、21酸素分圧を用いて作製したHPCを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は31.3であるが図7B1、5酸素分圧から21酸素分圧への切り替えを用いて作製したHPCを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は51.2であった図7B2。以上のことから、本技術を用いることで、成熟度の高い末梢血液細胞を作製することが可能であると分かった。6.低酸素培養によるVEGF代替性に関する検討多能性幹細胞からネット様構造体を経て、血液細胞を効率よく分化させるには、VEGFを添加することが望ましい。そこで、血液細胞を効率よく分化させVEGFの効果を、低酸素培養により代替することができるか検討を行った。iPS細胞TkCB7-4を、VEGF存在下で14日間大気酸素分圧下21にて培養した場合図8A1、VEGF非存在下で、7日間低酸素分圧下5で培養後、7日間大気酸素分圧下21で培養した場合図8A2について、iPS-Sac内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、VEGFを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方が、若干多く血液細胞が生じていた。次に、iPS-Sac内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるCD34及びCD45が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した結果、血液前駆細胞の比率は、VEGFを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方がやや大きかった図8B。さらに、低酸素培養のVEGF代替性について、コロニーアッセイにより検討を行った。iPS細胞TkCB7-4図9A及びTkCB8-3図9Bより回収した血液細胞を、5×103TkCB7-4図9A又は1×104TkCB8-3図9B播種し、コロニーアッセイを行った。その結果、VEGF非存在下にて低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間培養した場合図9A2及びB2の方が、VEGF存在下において大気酸素分圧下21で培養した場合図9A1及びB1よりも、形成されるコロニー数が増加し、また、ミックスコロニーの数も増加していた。さらに、VEGF存在下において、ES細胞を酸素分圧を5から21へ切り替えて得られた血液細胞は、VEGF非存在下の場合と比べて、形成されるコロニー数が多くなる傾向が認められた図9C。以上のことから、低酸素培養は、VEGFの効果を代替するとともに、さらにVEGFとの組み合わせによっても血液前駆細胞数を増加させ、血液分化能力の高い血液前駆細胞を生み出す事が示された。7.1酸素分圧下での培養の効果VEGF非存在下において、低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間培養した場合図101と、より低い低酸素分圧下1で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間培養した場合図102において、同数のES細胞から形成される血球コロニー数を比較した。その結果、5酸素分圧下で培養した場合の方が、血球コロニー数は多く形成され、血液前駆細胞が多数得ることができた。そこで、次に、1低酸素分圧下において生じる血液前駆細胞の血液細胞への分化能力について、生じるミックスコロニーの数を指標に検討した。VEGF存在下において大気酸素分圧下21で14日間培養した場合図111、VEGF非存在下において低酸素分圧下5で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間培養した場合図112、さらに、VEGF非存在下において低酸素分圧下1で7日間培養後、大気酸素分圧下21で7日間培養した場合図113において、CD34細胞を各々から同数回収し、コロニーアッセイを行った。その結果、1酸素分圧下で培養を開始した場合に、コロニー数が最も多く得られ、ミックスコロニーの数も一番多く出現していた全期間の大気酸素分圧下で培養した場合の約5倍、5酸素分圧下で培養を開始した場合の約2.6倍。この結果から、より低い酸素分圧下例えば、1程度で細胞培養を開始すると、血液細胞への分化能のより高い血液前駆細胞を作製することができる。8.低酸素環境から大気酸素環境への切り替えのタイミングに関する検討ES細胞KhES3株を、低酸素分圧下5図12A又は1図12Bで4日間、7日間、10日間培養後、残りの期間を大気酸素分圧下で培養したもの、全期間14日間を低酸素分圧下で培養したもの、全期間14日間を大気酸素分圧下で培養したもの、各々について培養後に生じた血球数をカウントした。その結果、低酸素分圧下における培養期間が7日間の場合に生じる血球数は最も多く、さらに低酸素分圧下における培養期間を長くすると、血球の形成効率は低下することが分かった図12A及びBのL7。従って、低酸素分圧下での培養7日目頃に大気酸素分圧下での培養に切り替えると最も効率よく血液細胞を分化させることができ、長くても、低酸素分圧下の培養10日間程度で、大気酸素分圧下での培養に切り替えることが望ましいといえる。9.低酸素分圧下での培養条件における遺伝子発現変化の検討ES細胞KhES-3を14日間低酸素分圧下5で培養した場合5L14と、7日間低酸素分圧下5で培養後、大気酸素分圧下21で培養した場合5L7の遺伝子発現変化をリアルタイムPCRにて分析した。5L14と比べて、5L7は、培養8日目に中内胚葉誘導の指標となる遺伝子例えば、T図13の発現が増加していた。その後T遺伝子の発現は、酸素分圧にかかわらず培養8日目以降徐々に低下していた。また、培養8日目以降には血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子例えば、TAL-1図14A、KDR図14B、CD34図14C、サイトカインの指標となる遺伝子例えば、VEGF図15A、EPOR図15B、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子例えば、CD41a図16A、Glycophorin-A図16Bの発現が増加していた。これら遺伝子の発現は、その後培養14日目まで増加を続け、一貫して5L7が高い発現傾向を示していた。また、酸素分圧を変化させる前の培養7日目において、大気酸素21Nと低酸素5L7を比較した結果、低酸素応答性の遺伝子例えば、HIF2αの発現が上昇していた図17。以上の結果より、これらの遺伝子の発現は酸素分圧に伴って変化し、酸素分圧の切り替え時期や、使用する酸素分圧を決める際の指標とすることができると分かった。"