"多重コンパートメント送達システムにより組織を画像化および処理する方法であって、a効果的な量の多重コンパートメント送達システムを被験体に投与する工程であって、該送達システムが外側のコンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側のコンパートメントを含み、前記1種以上の内側のコンパートメントが約10nm~約300nmであり、前記外側のコンパートメントが約0.5ミクロン~約20ミクロンであり、前記1種以上の内側のコンパートメントが第1の物理的特性を有する第1の材料をさらに含み、前記外側のコンパートメントが第1の物理的特性とは異なる第2の物理的特性を有する第2の材料を含み、前記1種以上の内側のコンパートメントが第1の薬剤をカプセル化するものである、前記工程と;b前記多重コンパートメント送達システムが標的の組織または細胞へ選択的に結合することを可能にする工程と;c治療剤を送達する工程と;d前記被験体中の画像化剤を検出する工程とを含む方法。前記1種以上の内側のコンパートメントが、約10nm~約30nmのサイズ範囲である、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が画像化剤である、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が、コロイド金、酸化鉄結晶および量子ドットからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。前記第1の薬剤が、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。前記第1の薬剤が蛍光団である、請求項3に記載の方法。前記第1の薬剤が治療剤である、請求項1に記載の方法。前記第1の薬剤が、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。前記外側のコンパートメントが第2の薬剤をカプセル化する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記第2の薬剤が画像化剤である、請求項9に記載の方法。前記第2の薬剤が、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。前記第2の薬剤が治療剤である、請求項9に記載の方法。前記第2の薬剤が、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、抗炎症剤、siRNAおよびDNAからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。前記第1の材料がポリε-カプロラクトンである、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。前記第1の材料が親水性である、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。前記第1の材料が水溶性である、請求項15に記載の方法。前記第2の材料が疎水性である、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。前記第2の材料がサフラワー油である、請求項17に記載の方法。前記外側のコンパートメントが外部のコンパートメント内にカプセル化される、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。前記外部のコンパートメントが水溶性材料を含む、請求項19に記載の方法。標的特異的結合剤が前記外側のコンパートメントの表面に付加される、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。前記標的特異的結合剤が、抗体およびその結合断片、ペプチド配列ならびにリガンドおよびその結合断片からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。前記標的特異的結合剤がEGFR特異的抗体である、請求項22に記載の方法。前記標的特異的結合剤がα-V-βIIIインテグリン受容体へ結合する、請求項23に記載の方法。多重コンパートメント送達システムにより疾患を治療する方法であって、a効果的な量の多重コンパートメント送達システムを被験体に投与する工程であって、該送達システムが外側のコンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側のコンパートメントを含み、前記1種以上の内側のコンパートメントが第1の物理的特性を有する第1の材料を含み、前記外側のコンパートメントが第1の物理的特性とは異なる第2の物理的特性を有する第2の材料を含み、前記1種以上の内側のコンパートメントが約10nm~約300nmであり、前記外側のコンパートメントが約0.5ミクロン~約20ミクロンであり、前記1種以上の内側のコンパートメントが第1の治療剤をさらに含むものである、前記工程と;b前記多重コンパートメント送達システムが標的組織または細胞へ選択的に結合することを可能にする工程と;c治療剤を放出する工程とを含む方法。前記疾患が、アテローム性動脈硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび癌からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。前記1種以上の内側のコンパートメントが約10nm~約30nmのサイズ範囲である、請求項25に記載の方法。前記1種以上の内側のコンパートメントまたは前記外側のコンパートメントが画像化剤をカプセル化する、請求項25に記載の方法。前記画像化剤が、コロイド金、酸化鉄結晶および量子ドットからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。前記画像化剤が、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。前記画像化剤が蛍光団である、請求項28に記載の方法。前記治療剤が、化学療法剤、抗炎症剤、脂肪酸、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。第2の治療剤をさらに含み、該第2の治療剤が、化学療法剤、抗炎症剤、脂肪酸、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される、請求項25の方法。前記外側のコンパートメントが前記第2の治療剤をカプセル化する、請求項33に記載の方法。前記1種以上の内側のコンパートメントが前記第2の治療剤をカプセル化する、請求項33に記載の方法。前記第1の材料がポリε-カプロラクトンである、請求項25~35のいずれか1項に記載の方法。前記第1の材料が親水性である、請求項25~35のいずれか1項に記載の方法。前記第1の材料が水溶性である、請求項37に記載の方法。前記第2の材料が疎水性である、請求項25~38のいずれか1項に記載の方法。前記第2の材料がサフラワー油である、請求項39に記載の方法。前記外側のコンパートメントが外部のコンパートメント内にカプセル化される、請求項25~40のいずれか1項に記載の方法。前記外部のコンパートメントが水溶性材料を含む、請求項41に記載の方法。標的特異的結合剤が前記外側のコンパートメントの表面に付加される、請求項25~42のいずれか1項に記載の方法。前記標的特異的結合剤が抗体およびその結合断片ならびにペプチド配列からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。前記標的特異的結合剤がEGFR特異的抗体である、請求項44に記載の方法。前記標的特異的結合剤がα-V-βIIIインテグリン受容体へ結合する、請求項48に記載の方法。前記第1の薬剤が遺伝子コンストラクトである、請求項25に記載の方法。前記遺伝子コンストラクトを前記標的の組織または細胞中で発現させることをさらに含む、請求項47に記載の方法。前記遺伝子コンストラクトがIL-10をコードする、請求項48に記載の方法。前記遺伝子コンストラクトが前記標的の組織または細胞中でアポトーシスを引き起こす、請求項48に記載の方法。前記遺伝子コンストラクトがsiRNAである、請求項48に記載の方法。前記標的細胞がマクロファージである、請求項1~51のいずれか1項に記載の方法。外側の疎水性のコンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側の水溶性コンパートメントを含み、前記外側の疎水性のコンパートメントが外部の水溶性コンパートメントによって囲まれる、多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の内側の水溶性コンパートメント内にカプセル化された第1の薬剤をさらに含む、請求項53に記載の多重コンパートメント送達システム。前記第1の薬剤が、画像化剤、診断剤、治療剤、ワクチン、タンパク質または遺伝子コンストラクトからなる群から選択される、請求項54に記載の多重コンパートメント送達システム。前記外側の疎水性のコンパートメント内にカプセル化された第2の薬剤をさらに含む、請求項50~55のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記第2の薬剤が、画像化剤、診断剤、治療剤、ワクチン、タンパク質または遺伝子コンストラクトからなる群から選択される、請求項53に記載の多重コンパートメント送達システム。前記外側のコンパートメントがマイクロスフェアを形成する、請求項53~57のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記マイクロスフェアが約0.5~500ミクロンである、請求項58に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の内側の水溶性コンパートメントがナノ粒子を含む、請求項53~59のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の内側の水溶性コンパートメントが約50nm~約300nmである、請求項60に記載の多重コンパートメント送達システム。前記ナノ粒子がゼラチンまたはアルギン酸塩を含む、請求項53~61のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記外側の疎水性のコンパートメントがサフラワー油を含む、請求項53~62のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記外部の水溶性コンパートメントが水を含む、請求項53~63のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の内側の水溶性コンパートメントまたは前記外側の疎水性のコンパートメントの表面へ付加された、1種以上の標的特異的結合剤をさらに含む、請求項53~64のいずれか1項に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の標的特異的結合剤が、前記外側の疎水性のコンパートメントの表面へ付加される、請求項65に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の標的特異的結合剤が、前記1種以上の内側の水溶性コンパートメントおよび前記外側の疎水性のコンパートメントへ付加される、請求項66に記載の多重コンパートメント送達システム。前記1種以上の内側の水溶性コンパートメントへ付加された前記1種以上の標的特異的結合剤が、前記1種以上の内側のコンパートメントを細胞内局在へ方向付け、前記外側の疎水性のコンパートメントへ付加された前記1種以上の標的特異的結合剤が、マイクロスフェアを細胞へ方向付ける、請求項67に記載の多重コンパートメント送達システム。前記外側の疎水性のコンパートメントの表面へ付加された前記1種以上の標的特異的結合剤がタフトシンである、請求項66~68のいずれか一項に記載の多重コンパートメント送達システム。詳細な説明本開示は、経口経路、鼻腔経路、吸入経路、注入経路または当業者に公知の他の経路による身体中の投与に際して、造影剤、薬物、遺伝子、低分子干渉RNAsiRNA、およびワクチン接種用分子のマクロファージへの安全で効果的な送達のための組成物に部分的に関する。1.多重コンパートメント送達システム本開示は、外側の疎水性コンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側の水溶性コンパートメントを含み、外側の疎水性コンパートメントが外部の水溶性コンパートメントによって囲まれる、多重コンパートメント送達システムに関する。システムのいくつかの実施形態において、第1の薬剤は1種以上の内側の水溶性コンパートメント内にカプセル化される。他の実施形態において、第1の薬剤は、画像化剤、診断剤、治療剤、ワクチン、タンパク質、または遺伝子コンストラクトからなる群から選択される。さらに他の実施形態において、第2の薬剤は外側の疎水性コンパートメント内にカプセル化される。カプセル化とは、材料中に溶解されること、材料と結び付くこと薬剤またはナノ粒子が表面上に存在し得ることを意味する、材料内にあること、またはコンパートメントを構成する材料によって囲まれることを含むように本明細書において定義される。第2の薬剤は、画像化剤、診断剤、治療剤、ワクチン、タンパク質、または遺伝子コンストラクトからなる群から選択することができる。本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムは、マイクロスフェアを形成する外側のコンパートメントも含むことができる。マイクロスフェアを産生する方法は、当該技術分野において公知であり、単一エマルジョン法および溶媒置換法を含む例えば、FurtadoMosqueiraetal.JournalofPharmaceuticalSciencesSpecialIssue:1999MacromolecularDrugDeliveryConference2000895:614-626からの論文;Roscaetal.JournalofControlledRelease2004992:271-280を参照されたい。マイクロスフェアは約0.5~500ミクロンのサイズであり得る。いくつかの実施形態において、内側の水溶性コンパートメントは約50nm~約300nmである。さらに他の実施形態において、内側の水溶性コンパートメントはナノ粒子を含む。別の実施形態において、ナノ粒子はゼラチンまたはアルギン酸塩を含む。多重コンパートメント送達システムのさらに他の実施形態において、外側の疎水性コンパートメントはサフラワー油を含む。いくつかの実施形態において、1種以上の標的特異的結合剤は外側の疎水性コンパートメントの表面に付加される。いくつかの実施形態において、外側の疎水性コンパートメントの表面に付加される1種以上の標的特異的結合剤は、タフトシンである。粒子または担体に結合剤を付加する方法は、当該技術分野において公知である例えば、Magadalaetal.AAPSJ.2008104:565-576を参照されたい。いくつかの実施形態において、外部の水溶性コンパートメントは水を含む。他の実施形態において、多重コンパートメント送達システムは、内側の水溶性コンパートメントまたは外側の疎水性のコンパートメントの表面に付加された1種以上の標的特異的結合剤をさらに含む。さらに他の実施形態において、1種以上の標的特異的結合剤は、内側の水溶性コンパートメントおよび外側の疎水性コンパートメントに付加される。さらなる実施形態は、内側の水溶性コンパートメントに付加されて内側のコンパートメントを細胞内局在へ方向付ける1種以上の標的特異的結合剤、および外側の疎水性コンパートメントに付加されてマイクロスフェアを細胞へ方向付ける1種以上の標的特異的結合剤をさらに含む。本明細書において開示される送達ベヒクルは、以下の2つの利点の与える複数のコンパートメント多重コンパートメントを有するようにデザインされる。1非混合性例えば難溶性、不安定性、または時間的に制御された放出および送達の要望に起因する、コンパートメントの各々中のペイロードを隔離する能力;および2所望の生物学的標的部位へペイロードの効果的な送達を与えるために、異なる組織、細胞および細胞内のバリアを乗り越える能力。これは、遺伝子、オリゴヌクレオチドおよびsiRNA等の核酸ベースの治療剤については特に重要である。図1中に図示されるように、多重コンパートメント送達システムは、ペイロード例えば疎水性vs親水性、身体における送達部位、意図される適用例えば薬物vsワクチン、および対象となる疾患の要求を満たすようにデザインされる。本明細書において開示される多重コンパートメント送達ベヒクルはマイクロスフェア中ナノ粒子型であり得る図3。マイクロスフェア中ナノ粒子型は外側のコンパートメントすなわちマイクロスフェアを有することができる。特定の実施形態において、マイクロスフェアは固体である。本明細書において使用される時、固体という用語は、構造的に硬く、変形に対して耐性のある物質を意味する。かかるマイクロスフェアは、ポリε-カプロラクトンPCL、ポリD,L-ラクチド-コ-グリコリドPLGA、およびポリメチルメタクリレート等の材料からなる。マイクロスフェアは約500ナノメートル~約1.5ミクロンであり得る。特定の実施形態において、マイクロスフェアは、内側のコンパートメントを形成する固体ナノ粒子をカプセル化する。ナノ粒子はマイクロスフェアとは異なる材料からなり得る。例えば、親水性材料からなるナノ粒子は疎水性材料からなるマイクロスフェア内にカプセル化される。特定の実施形態において、疎水性ナノ粒子は親水性マイクロスフェア内にカプセル化される。疎水性マイクロスフェアは、サフラワー油もしくは他の生物学的適合性のある油等の油、ワックスまたはポリε-カプロラクトン、ポリD,L-ラクチド-コ-グリコリドPLGA、およびポリメチルメタクリレートPCL等の疎水性分子からなり得る。かかるナノ材料はPhosphorexInc.FallRiver、MAから得ることができる。さらに、ナノ粒子を作製する方法は当該技術分野において公知である例えば、Yangetal.,Int.J.Pharmaceutics20063242:185-190;Gouetal.,Int.J.Pharmaceutics20093751-2:170-176を参照されたい。本明細書において開示されるすべての実施形態において、ナノ粒子は、約20ナノメートルnm~約300ナノメートル;約20nm~約30nm;約30nm~約40nm;約40nm~約50nm;50nm~約100nm;約100nm~約150nm;約150nm~約200nm;約200nm~約250nm;および約250~約300nmであり得る。本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムは2つを超える別のコンパートメントを有することができる図2bおよび2c。例えば、多重コンパートメント送達システムは3つのコンパートメントを含むことができる。特定の実施形態において、ナノ粒子は固体で親水性である。ナノ粒子は、外側の疎水性コンパートメントを形成する疎水性マイクロスフェア中にカプセル化することができる。疎水性マイクロスフェアは、サフラワー油もしくは他の生物学的適合性のある油等の油、ワックスまたはポリε-カプロラクトン、ポリD,L-ラクチド-コ-グリコリドPLGA、およびポリメチルメタクリレートPCL等の疎水性分子からなることができる。かかるマイクロスフェアはSpherotech,Inc.LakeForest、ILから商業的に得ることができる。マイクロスフェアを作製する方法も当該技術分野において公知である例えばBarbatoetal.Biomaterials20012211:1371-8;Lucianietal.Biomaterials20082936:4800-7を参照されたい。この構造は、マイクロスフェアをカプセル化する第3のコンパートメントを有することができる。このコンパートメントは1つのコンパートメントである。図2bおよび2c。例えばマイクロスフェアはゼラチン等のゲルによって囲むことができる。マイクロスフェアは水によって囲むことができる。送達システムを細胞または組織へ標的化する標的特異的結合剤によって、本開示の多重コンパートメント送達システムを修飾することもできる。標的特異的結合剤の例は、抗体、Fab断片および他の抗体結合断片、リガンド、ペプチド、低分子ならびにペプチド模倣物化合物である。具体的な実施形態において、標的特異的結合剤はタフトシンである。他の実施形態において、標的特異的結合剤はアルギニン-グリシン-アスパラギン酸塩RGDトリペプチドである。特定の実施形態において、多重コンパートメント送達システムは、外側のコンパートメントの表面上に官能基化された特異的ペプチドを使用して、マクロファージへ標的化される。例えば、多重コンパートメント送達システムの外側のコンパートメントは、標的特異的結合剤をその表面に付加させることができる。加えて、多重コンパートメント送達システムは治療剤または画像化剤をカプセル化する。かかる薬剤は、内側のコンパートメント、外側のコンパートメントまたは両方の内にカプセル化することができる。特定の実施形態において、薬剤は炎症誘発特性または抗炎症特性を増進して例えば炎症誘発および免疫アジュバント応答のための卵アルブミンまたは抗炎症応答のためのオメガ-3脂肪酸含有する油、システムの治療効果をさらに促進することができる。薬剤は、化学療法剤、放射性同位体、抗生物質、ペプチド、ワクチン、低分子、タンパク質および抗体療法剤等の治療剤であり得る。加えて、治療剤は遺伝子療法のために使用される核酸であり得る。特定の実施形態において、治療剤はDNA分子である。薬剤は特異的組織における遺伝子のサイレンシングのために送達されるsiRNA分子であり得る。本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムの多くの利点の1つは、コンパートメント化送達システムを利用するということであり、これを使用してペイロードが対象となる標的に到達するまで、分解されやすいペイロードをシールドすることができる。マクロファージ好ましい標的細胞はリゾソーム内に多量のヌクレアーゼを含み、これらの開示されたシステムの保護なしでは、細胞に送達されたDNAペイロードが分解される可能性が高いので、このことは遺伝子療法の成功にとって重要である。2.多重コンパートメント送達システムを使用する方法いくつかの実施形態において、本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムにより組織を画像化および処理する方法は、a効果的な量の多重コンパートメント送達システムを被験体に対して投与する工程であって、送達システムが外側のコンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側のコンパートメントを含み、1種以上の内側のコンパートメントが約10nm~約300nmであり、外側のコンパートメントが約0.5ミクロン~約20ミクロンであり、1種以上の内側のコンパートメントが第1の物理的特性を有する第1の材料をさらに含み、外側のコンパートメントが第1の物理的特性とは異なる第2の物理的特性を有する第2の材料を含み、1種以上の内側のコンパートメントが第1の薬剤をカプセル化するものである、前記工程と;b多重コンパートメント送達システムが標的の組織または細胞へ選択的に結合することを可能にする工程と;c治療剤を送達する工程と、d被験体中の画像化剤を検出する工程とを含む。本方法のいくつかの実施形態において、内側のコンパートメントは約10nm~約30nmのサイズ範囲である。他の実施形態において、第1の薬剤は画像化剤である。さらに他の実施形態において、第1の薬剤は、コロイド金、酸化鉄結晶、量子ドット、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤である。さらに他の実施形態において、第1の薬剤は治療剤である。本開示のいくつかの態様において、第1の薬剤は、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、外側のコンパートメントは第2の薬剤をカプセル化する。いくつかの態様において、第2の薬剤は画像化剤である。この画像化剤は、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択することができる。他の態様において、第2の薬剤は治療剤である。送達ベヒクルの外側のコンパートメントまたは内側のコンパートメントは1種以上の画像化剤をカプセル化することができる。本明細書において使用される時、カプセル化するという用語は、ポリマー担体内に封入するかまたはポリマー担体と結び付くことを意味する。カプセル化は、ポリマー担体の表面でのまたはポリマー担体内での分子または化合物の結び付きを含むことができる。かかる画像化剤は、蛍光団、放射標識、X線造影剤、ラマン分光法用薬剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤を含む。蛍光団の例は、ローダミン、フルオレセイン、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、フルオレサミンおよび金属キレートを含む。放射標識の例は,3H、123I、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、55Fe、59Fe、90Y、99mTcテクネチウム99の準安定な異性体および75Seを含む。さらに、X線造影剤は、ディアトリゾエートHypaque50、メトリゾアートIsopaque370、イオキサグラートHexabrix、イオパミドールIsovue370、イオヘキソールOmnipaque350、イオキシランOxilan350、イオプロミドUltravist370およびイオジキサノールVisipaque320を含む。他の薬剤は、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシルTEMPO基、DID蛍光色素アナログ、および全重水素化したアルキルホスホニウム基またはアリールホスホニウム基を含む。粒子内の画像化剤をカプセル化する方法は当該技術分野において公知である。例えば、溶媒置換法は核酸および低分子およびペプチドのカプセル化へ使用されている。例えばOsteretal.JournalofControlledRelease20061113:371-381;Ribeiroetal.FoodHydrocolloids221:12-17を参照されたい。さらに他の態様において、第2の薬剤は、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、抗炎症剤、siRNAおよびDNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第1の材料はポリε-カプロラクトンである。他の実施形態において、第1の材料は親水性である。さらに他の実施形態において、第1の材料は水溶性である。さらに他のものにおいて、第2の材料は疎水性である。いくつかの態様において、第2の材料はサフラワー油である。さらに他の実施形態において、外側のコンパートメントは外部のコンパートメント内にカプセル化される。開示のいくつかの態様において、外部のコンパートメントは水溶性材料を含む。いくつかの実施形態において、標的特異的結合剤は外側のコンパートメントの表面に付加される。いくつかの態様において、標的特異的結合剤は、抗体およびその結合断片、ペプチド配列ならびにリガンドおよびその結合断片からなる群から選択される。さらに他の態様において、標的特異的結合剤はEGFR特異的抗体である。他の態様において、標的特異的結合剤はα-V-βIIIインテグリン受容体へ結合する。有機ポリマーの誘導体化を実行してそれらの表面で選択された反応基を曝露することができる例えばTownsend,S.A,etal.Biomaterials20072834:5176-5184;Weiss,B.,etal.BioconjugateChemistry2007184:1087-1094;andGindy,M.E.,etal.PMreprints200695:989-990を参照されたい。さらに、ポリマーへ標的特異的結合剤タンパク質、ペプチド、抗体および低分子等を付加することは当該技術分野において公知である例えば米国特許第7022,336号;Bumgarneretal.JControlRelease20091372:90-7;Syetal.Biomaterials20103118:4987-94;Balmayoretal.J.R.Soc.Interface201110.1098/rsif.2010.0531を参照されたい。標的特異的結合剤は、標的を結合する低分子、リガンド、ペプチド例えばアルギニン-グリシン-アスパラギン酸塩RGDトリペプチド、タンパク質、抗体、Fab断片、Fab’2断片およびペプチド模倣物化合物であり得る。例示的な標的は、受容体例えばα-V-βIIIインテグリン受容体およびEGFR受容体、リン脂質、糖タンパク質およびタンパク質を含む。本開示は、多重コンパートメント送達システムにより疾患を治療する方法であって、a効果的な量の多重コンパートメント送達システムを被験体に対して投与する工程であって、送達システムが外側のコンパートメント内にカプセル化された1種以上の内側のコンパートメントを含み、1種以上の内側のコンパートメントが第1の物理的特性を有する第1の材料を含み、外側のコンパートメントが第1の物理的特性とは異なる第2の物理的特性を有する第2の材料を含み、1種以上の内側のコンパートメントが約10nm~約300nmであり、外側のコンパートメントが約0.5ミクロン~約20ミクロンであり、1種以上の内側のコンパートメントが第1の治療剤をさらに含むものである、前記工程と;b多重コンパートメント送達システムが標的組織または細胞へ選択的に結合することを可能にする工程と;c治療剤を放出する工程とを含む方法も教示する。いくつかの実施形態において、疾患は、アテローム性動脈硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、1種以上の内側のコンパートメントは、約10nm~約30nmのサイズ範囲である。さらに他の実施形態において、1種以上の内側のコンパートメントまたは外側のコンパートメントは画像化剤をカプセル化する。いくつかの態様において、画像化剤は、コロイド金、酸化鉄結晶、量子ドット、蛍光団、放射標識、X線造影剤およびポジトロン放出断層撮影法用薬剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、抗炎症剤、脂肪酸、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される。さらに他の実施形態において、方法は第2の治療剤を含み、第2の治療剤は、化学療法剤、抗炎症剤、脂肪酸、抗生物質、抗ウイルス剤、低分子、siRNAおよびDNAからなる群から選択される。いくつかの態様において、第2の治療剤は外側のコンパートメントによってカプセル化される。さらに他の態様において、第2の治療剤は内側のコンパートメントによってカプセル化される。本開示の他の実施形態において、第1の材料はポリε-カプロラクトンである。さらに他の実施形態において、第1の材料は親水性である。いくつかの態様において、第1の材料は水溶性である。さらに他の実施形態において、第2の材料は疎水性である。いくつかの態様において、第2の材料はサフラワー油である。特定の実施形態において、外側のコンパートメントは外部のコンパートメント内にカプセル化される。外部のコンパートメントは水溶性材料を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的特異的結合剤は外側のコンパートメントの表面に付加される。いくつかの態様において、標的特異的結合剤は、抗体およびその結合断片ならびにペプチド配列からなる群から選択される。さらに他の態様において、標的特異的結合剤はEGFR特異的抗体である。さらに他の態様において、標的特異的結合剤はα-V-βIIIインテグリン受容体へ結合する。いくつかの実施形態において、第1の薬剤は遺伝子コンストラクトである。いくつかの実施形態において、方法は標的の組織または細胞中で遺伝子コンストラクトを発現することをさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトはIL-10をコードする。他の態様において、遺伝子コンストラクトは、標的の組織または細胞におけるアポトーシスを引き起こす。さらに他の態様において、遺伝子コンストラクトはsiRNAである。本開示の好ましい実施形態において、標的細胞はマクロファージである。インターロイキン10IL-10発現プラスミドDNAは、PCLマイクロスフェア中にカプセル化されたゼラチンナノ粒子により処方された。同じ送達ベヒクルを使用して本明細書において開示されるシステムを経口的に投与し、炎症性腸疾患の治療において腫瘍壊死因子-αTNF-αの発現のサイレンシングを行う。NiMOSのイラストならびにsiRNAカプセル化ゼラチンナノ粒子およびマイクロスフェアの走査型電子顕微鏡写真を、図3A中に示す。溶媒置換法を使用して、279.2±3.2nmの平均径を持つsiRNAをカプセル化した球形ゼラチンナノ粒子を産生した例えばOsteretal.JournalofControlledRelease20061113:371-381;Ribeiroetal.FoodHydrocolloids221:12-17を参照されたい。胃腸通過の間のpHおよび酵素による分解からの追加の保護のために、ナノ粒子をPCLマイクロスフェア中でさらにカプセル化してNiMOSを生成した。これらはかなり一様な形状およびサイズであり、比較的平滑な表面形態を持ち、ブランクのマイクロ粒子およびsiRNAをカプセル化するマイクロ粒子についてそれぞれ2.4μm~3.2μmの範囲の直径であった図3C。siRNAが製造プロセスの間に影響を受けないこと、および分解酵素の存在下において粒子がこのペイロードを効率的に保護できることを保証するために、抽出したsiRNAの安定性をアガロースゲル電気泳動によって評価した。カプセル化はsiRNAの構造またはサイズに影響を与えない図3B。例えば、ゼラチンナノ粒子レーン5およびNiMOSレーン7および8からのsiRNAは、対照siRNAレーン2と同じサイズを有していた。さらに、プロテアーゼ添加はsiRNAに対する有害作用を有していなかったレーン3。加えて、NiMOSはペイロードに対する保護的効果を有するようであった。これはレーン7におけるバンドによって実証された。NiMOSをRNAseAに曝露し、続いて酵素を不活性化しsiRNAを抽出したところ、対照相当物と同じサイズを持つ断片が示された。しかしながら、ゼラチンナノ粒子から放出されたsiRNAは、プロテアーゼおよびRNAseに曝露された場合完全に分解されたレーン6、9。NiMOSのプロテアーゼ単独への曝露はsiRNAを遊離しなかったバンドなし;レーン11。カプセル化されたsiRNAの定量化により、ゼラチンナノ粒子において90.2±5.4のローディング効率であることが明らかになった。NiMOS中の最終的なsiRNAローディング効率は添加されたsiRNAの55.2±2.8であると測定された。3.医薬処方かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えばLD50集団の50への致死用量およびED50集団の50における治療法上効果的な用量の決定のための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手技によって決定することができる。毒性と治療法上の効果との間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表現できる。大きな治療的誘導を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞に対する可能性のある損傷を最小限にし、そしてそれによって副作用を低下させるために、かかる化合物を影響を受けた組織部位へ標的化する送達システムをデザインするように注意するべきである。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される投薬量の範囲の処方において使用することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないED50を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。本明細書において記載された方法において使用される任意の化合物について、治療法上効果的な用量は最初に細胞培養アッセイから推定できる。細胞培養において決定されるようなIC50すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を処方することができる。かかる情報を使用してより正確にヒトにおいて有用な用量を決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。開示されたシステムおよび方法に従う使用のための医薬組成物は、1種以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用する従来の様式で処方することができる。したがって、化合物およびそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、例えば注入、吸入または隔離口または鼻のいずれかを介してによる投与、または経口投与、頬腔投与、非経口投与もしくは直腸投与のために処方することができる。かかる治療法にのために、化合物は、全身投与および局所投与または局在投与を含む投与の様々なロードのために処方することができる。技法および処方は、概してRemington’sPharmaceuticalSciences、MeadePublishingCo.、Easton、Pa中に見出すことができる。全身投与のためには、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注入が好ましい。注入のために、化合物は液体溶液中で、好ましくはハンクス液またはリンゲル液等の生理的に適合性のある緩衝液中で処方することができる。加えて、化合物は固体形態で処方され、使用の直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。経口投与のために、医薬組成物は、例えば結合剤例えばあらかじめゼラチン状にしたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース;充填剤例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム;潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ;崩壊剤例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム;または湿潤剤例えばラウリル硫酸ナトリウム等の薬学的に許容される賦形剤により従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は当該技術分野において周知の方法によってコートすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁物の形態をとることができるか、または使用前に構成のための乾燥製品として水または他の好適なベヒクルと共に提供することができる。かかる液体調製物は、懸濁化剤例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂;エマルジョン化剤例えばレシチンまたはアラビアゴム;非水溶性ベヒクル例えばアチオンドオイルationdoil、油状エステル、エチルアルコールまたは分留植物油;および防腐剤例えばメチル-p-オキシ安息香酸エステルもしくはプロピル-p-オキシ安息香酸エステルまたはソルビン酸等の薬学的に許容される添加物により従来の手段によって調製することができる。調製物は、緩衝塩、着香剤、着色剤および甘味剤も必要に応じて含むことができる。本明細書において開示される多重コンパートメントシステムの実施形態は、被験体に対する経口送達のためにデザインすることができる。例えば、多重コンパートメント送達システムは固体アルギン酸塩および/またはゼラチンナノ粒子を含むことができる。親水性ナノ粒子は、ポリε-カプロラクトンPCLまたはポリD,L-ラクチド-コ-グリコリドPLGA等の疎水性材料を含むマイクロスフェア中にカプセル化することができる。図3は、これらの多重コンパートメント送達システムの走査電子顕微鏡画像を示す。経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出を生ずるように好適に処方することができる。頬腔投与のために、組成物は従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。吸入による投与のために、本開示に記載の使用のための化合物は、好適な噴射剤例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスの使用により、加圧パックまたは噴霧器からエアゾルスプレー体裁の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合において、投薬単位は、測定された量を送達する弁を提供することによって決定できる。吸入器または通気器における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤の粉末混合物を含んで処方することができる。化合物は、注入による例えばボーラス注入または継続的な点滴による非経口投与のために処方することができる。注入のための処方は、単位投薬量形態で例えばアンプルまたは多重用量容器中で添加された防腐剤と共に提供することができる。組成物は、油性または水溶性ベヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンとしてかかる形態をとり、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤等の処方剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、好適なベヒクル例えば滅菌されたパイロジェン不含有水による使用前構成のための粉末形態であり得る。化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸剤等の直腸用組成物中にも処方することができる。先に記載された処方に加えて、化合物もデポー調製物として処方することができる。かかる長時間作用性処方は、移植例えば皮下または筋肉内または筋肉内注入によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料例えば許容可能な油中のエマルジョンとしてまたはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体として例えば難溶性塩として処方することができる。他の好適な送達システムは、延長された期間にわたって薬物の局所的非侵襲性送達の可能性を提供するマイクロスフェアを含む。この技術は、炎症または虚血を引き起こさずに、冠動脈カテーテルを介して、例えば心臓または他の臓器の任意の選択された部分の中へ注入できる前毛細血管サイズのマイクロスフェアを利用する。投与された治療剤は、これらのマイクロスフェアから徐々に放出され、囲まれた組織細胞例えば内皮細胞によって取り込まれる。全身投与は経粘膜手段または経皮手段によることもできる。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透すべきバリアに適切な浸透剤を処方中に使用することができる。かかる浸透剤は、当該技術分野において一般的に公知であり、例えば胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体の経粘膜投与のためのものを含む。加えて、透過を促進するために界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与は鼻内スプレーを介するかまたは坐剤を使用することができる。局所投与のために、オリゴマーは当該技術分野において一般的に公知であるような軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームの中に処方することができる。洗浄溶液は局所的に使用して傷害または炎症を治療し、治癒を加速することができる。臨床設定において、本開示における多重コンパートメント送達システムは、複数の方法その各々は当該技術分野においてよく知られているのいずれかによって患者へと導入することができる。例えば、多重コンパートメント送達システムは、例えば静脈注入によって全身的に導入することができる。細胞外バリアおよび細胞内バリアからの核酸の保護の促進は問題である。この問題に取り組むために、核酸がカプセル化された固体ナノ粒子水中油中水型W/O/W多重エマルジョンの最も内側の水相中にさらに包まれるをデザインし、エマルジョン中ナノ粒子型NiE多重コンパートメント送達システムを開発した。4.マクロファージに標的化された送達マクロファージがトロイの木馬ベクターとして挙動するというアイディアは、微生物細菌およびウイルス等が単球およびマクロファージを使用して、増殖し免疫監視システムから隠れるという知識から生ずる。特にHIV-1の進行の場合において、疾患進行、病理発生および潜伏貯蔵所形成におけるマクロファージの役割を示す証拠が増加している。他のレトロウイルスおよびレンチウイルスのように、HIV-1は単球/マクロファージ系列の細胞等の非分裂細胞に感染し複製する能力を有するが、CD4Tリンパ球がHIVウイルスの一次標的であると思われる。ウイルスはサイトカイン産生プロファイルに影響することによってマクロファージに影響を与え、これは慢性炎症および広範囲な組織損傷をもたらし得る。興味深いことには、感染マクロファージはウイルスの毒性効果に対して耐性があると考えられ、したがってHIVウイルスへトロイの木馬として働く。本開示で記載される方法およびシステムは、病態および疾患の画像化、診断、および治療を含む様々な目的のために使用することができる。さらに、多重コンパートメント送達システムは、遺伝子療法、遺伝子サイレンシング、癌治療およびワクチン接種のために利用することができる。本明細書において記載されるシステムおよび方法は、任意の組織または細胞のタイプへ標的化され得る。1つのかかるタイプの細胞はマクロファージである。マクロファージに標的化された送達のためのナノ粒子システム過去20年間にわたる医学的診断および治療法のためのナノテクノロジーの適用の進歩により、特定の細胞/組織/臓器のための送達システムの特異性を促進するためにナノ粒子の表面を修飾する能力は、本明細書において開示される方法の実施に活用できる程度まで開発されている。マクロファージの過剰活性または低活性は、悪性腫瘍の増殖および播種、敗血症、関節リウマチ中の慢性炎症、リソソーム蓄積症、アテローム性動脈硬化症、ならびにHIV/AIDSおよび結核を含む主要な感染を含むが、これらに限定されない病理学的病態の開始および/または進行をもたらし得る。標的化には、受動的標的化または能動的標的化の2つのアプローチがある。受動的標的化は、病理生理学的条件ならびに解剖学的経路の活用による薬物の蓄積または薬物担体ナノシステムを指す。例えば、100nm未満のナノ粒子システムは容易にオプソニン化され、網状内皮系RESによって循環から除去され、肝臓および脾臓中のマクロファージによって分解される。したがって、RES中に局在する非修飾ナノ粒子の傾向は、ペイロードをマクロファージへ受動的に送達する方法として活用されてきた。ナノ粒子は、促透過および保持の促進EPR効果に起因して、炎症を起こした部位で受動的に蓄積することが観察されている。これらの部位でのマクロファージの存在は、これらの細胞を受動的に標的化する機会を示す。これらの部位でのマクロファージの存在は、薬物/遺伝子送達目的のために成功して活用されている例えばGriffithsetal.GeneTherapy20007:255-262;Burkeetal.JournalofLeukocyteBiology200272:417-428を参照されたい。加えて、粒子の疎水性、サイズ、表面電荷および形状特徴も、マクロファージの特異的送達の促進に活用される。例えば、ポリスチレンにより作製されたもの等の高度に疎水性のナノ粒子は、親水性ナノ粒子と比較して、マクロファージにおいて効率的に内部移行される。能動的標的化アプローチは、身体中の特定の細胞タイプ、組織または臓器の認識および相互作用のための選択的親和性を有する薬剤例えばリガンド、抗体、ペプチドによるシステムの表面修飾に基づく。能動的標的化の現象は細胞の原形質膜上の様々な受容体および脂質成分の存在の利用による達成することができる。マクロファージは本明細書において開示されるシステムのための好ましい細胞タイプである。これらの受容体は、特異的細胞上で独特に発現されてもよいか、または正常細胞と比較して異常細胞上で差異的により高い発現を示してもよい。以下の表1は、マクロファージの表面上に存在し、これらの細胞を能動的に標的化するために利用できる、異なる受容体の基本性質のいくつかを簡潔に記載する。これらの異なる受容体は公知の遺伝子療法技法を使用して、ダウンレギュレートまたはアップレギュレートすることができる。加えて、かかる受容体は、多重コンパートメント送達システムのための標的として使用することができる。かかるシステムは、内側のコンパートメントまたは外側のコンパートメントの表面へ付加された標的特異的結合剤を有することができる。標的特異的結合剤は、受容体のためのリガンド、受容体へ結合するペプチド模倣物化合物、または受容体へ結合可能な低分子であり得る。多重コンパートメント送達システムは特定の実施形態において疎水性である。多重エマルジョン小球は疎水性であるので、経口投与に際してパイエル板を介して腸のマクロファージによって容易に内部移行される。さらに、これらの多重コンパートメント送達システムを作製する場合、それらは、マクロファージによって優先的に取り込まれるサイズで生成することができる。一旦マクロファージによってこれらの細胞が内部移行されたならば、移動し、全身循環を通して身体の異なる部分中にトランスフェクションされたタンパク質を送達することができる。あるいは、この方法は、活性化マクロファージにおける重要な遺伝子のサイレンシングを行って、疾患の効果的な疾患治療のために炎症誘発状態または抗炎症状態を所望に応じて促進することができる。さらに、マクロファージおよび効果的な細胞内輸送による取り込みは、ペプチド、タンパク質、抗原として弱毒化された微生物を使用するワクチン接種に加えて、トランスフェクションならびに適切なヒトおよび細胞の免疫反応の産生を必要とする、DNAおよびRNAベースのワクチンのための機会も提供する。低分子および生物学的療法剤の送達のための標的化システムHIV/AIDS、炎症関連疾患、癌および感染性疾患等の様々な疾患におけるマクロファージ細胞の役割から、マクロファージは好ましい医薬用標的となる。例えば、マクロファージは様々な微生物をファゴサイトーシスし死滅させることが公知であるが、分子生物学の分野における進歩により、これらの病原体の多くが主としてファゴサイトーシスの回避またはリソソーム耐性の発達によってマクロファージ中に定着するための巧妙な手段を発達させたことが、立証されている。かかる疾患のために入手可能な薬物は、副作用および可溶性の問題に悩まされる。それゆえ、ナノ粒子ベースの薬物送達システムは、毒性の低下およびマクロファージへの標的化能力の促進によって、かかる薬物の治療指数を改善することができる。マクロファージの標的化のための低分子薬物を含むナノプラットフォームシステムの例については、表2を参照されたい。本明細書において開示されるいくつかの実施形態において、本明細書において開示される多重コンパートメント送達ベヒクルを取り込んだマクロファージを使用して、腫瘍または炎症の部位等の身体内の標的部位へ該ベヒクルによって送達されるペイロードを運ぶことができる。ペイロードは、ステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症治療剤、低分子薬物すなわちビスホスホネート、脂肪酸および抗酸化剤に加えて、化学療法剤、抗生物質、ペプチド、ワクチン、低分子、タンパク質および抗体療法剤等であるが、これらに限定されない治療的処理であり得る。本方法論はさらに広範囲にわたる抗炎症性の疾患または病態を治療することができる。本明細書において使用される時、炎症性疾患または炎症性病態は、当該技術分野において公知であるような炎症性またはアレルギー性のプロセスによって特徴づけられる、任意の疾患、病態、特色、遺伝子型または表現型を意味し、それらは炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性大腸疾患、骨盤内炎症性疾患、疼痛、眼炎症性疾患、腹腔疾患、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症FE、常染色体劣性痙性失調症、喉頭炎症性疾患;結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および他の塵肺症、ならびに細胞または組織における疾患関連遺伝子発現の修飾に対して、単独でまたは他の療法と組み合わせて応答できる、他の炎症性の疾患、病態、特色、遺伝子型または表現型等である。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムを使用して、標的細胞に治療的処理のペイロードを送達し、そこで低分子薬物は標的細胞においてアポトーシスを誘導する。治療用遺伝子送達または遺伝子サイレンシング等の生物学的療法は、マクロファージを標的化し活用するようにデザインすることができる。いくつかの実施形態において、治療用遺伝子は細胞へと移行させることができ、次いで、それは誘導ミサイルとして使用できる。マクロファージは様々な生物学的産物を分泌することができる下記の表3を参照されたい。分泌されている産物に依存して、このプロセスが抑えられないままならば、慢性炎症の特徴である組織損傷および線維化をもたらし得る。マクロファージは様々な生体分子の分泌に加えて複数のプロセスを行うことが可能なので、炎症、癌、クローン病、炎症性大腸疾患およびアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない様々な疾患および病態の治療のための遺伝子療法のための理想的な標的である。表3活性化マクロファージから選択した機能および分泌性生体分子表3に列挙された標的は、所望の結果に依存して、アップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。例えば、抗炎症性サイトカインの発現の増加は、本出願において開示される多重コンパートメント送達システムを使用して、遺伝子コンストラクトの細胞への送達によって達成することができる。これはマクロファージの炎症性応答の減少をもたらすだろう。本開示の特定の実施形態において、アップレギュレートされる抗炎症性サイトカインはIL-10である。分泌性生体分子の発現を減少させるために、siRNAは、本出願において開示された多重コンパートメント送達システムを使用して、細胞に投与することができる。別の実施形態において、本開示の、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングが行われる炎症性サイトカインはTNF-αである。画像化のためにマクロファージに標的化されたナノシステムナノメートルスケールでの原子の配置および間隔は、ユニークな物理的および化学的特性を材料に与える。コロイド金、酸化鉄結晶および量子ドット等の粒子は、1~30nmのサイズ範囲である無機ナノ粒子のいくつかの例のである。かかるナノ粒子を作製する方法は当該技術分野において公知である例えばLunaMartinezetal.Mater.Sci.Forum:Adv.Elec.Microscop.Nanomat.2010644:51-55;Gardea-Torresdeyetal.JournalofNanoparticleResearch199913:397-404;Zhouetal.Chem.Mater.1999119:2310-2312を参照されたい。これらの粒子は、核磁気共鳴映像法MRI、ポジトロン放出断層撮影法PETおよびコンピューター断層撮影法CT等の多重形式非侵襲的画像化技法のための画像化/造影促進剤として働く能力について調査されてきた。さらに粒子サイズが小さいことに加えて、血液循環半減期が長く、表面修飾の機会があるので、シグナルの強度および特異性の改良が可能であり、そのことからこれらの粒子を非常に好ましい診断促進剤または造影促進剤になる。マクロファージは、炎症、アテローム性動脈硬化症および関節リウマチ等の疾患における好適な画像化標的である。これは、これらの細胞が豊富に存在し、炎症および血管新生をもたらす複数の機能に関与するからである。それゆえ、かかる病態におけるマクロファージの役割のモニターは、疾患の進行に対する価値ある洞察を提供できる。マクロファージ細胞に標的化するようにデザインしたナノ粒子は、ヒト大動脈粥状硬化症の検出および特徴評価を改善する可能性を有する。ナノ粒子の有効性が造影剤およびマクロファージの標的化としてインビボの動物モデルにおいて実証される具体的な実施例は、本開示の実施例において論じられるだろう。以下の表4は、マクロファージの標的化に使用した好適な画像化剤を含むナノプラットフォームシステムの選択例を検討し、アテローム性動脈硬化症および関節リウマチの疾患モデルの治療におけるかかるシステムの利点を実証した。生物学的療法剤の送達古典的活性化状態は細胞内病原体の殺傷および癌抵抗性によって特徴づけられ、インターフェロン-γIFN-γによって単独でまたはリポポリサッカライドLPS等の微生物産物または腫瘍壊死因子αTNF-α等のサイトカインと併用して誘導することができる。古典的経路経由のマクロファージの活性化は、高い抗原提示能力、IL-12、IL-23一酸化窒素NOおよび活性酸素種の高産生によって特徴づけられる。代替の状態は、IL-4およびIL-13等のサイトカインによって誘導することができ、抗炎症性応答および傷害消散を主としてもたらす。さらに、代替の活性化ステージは、IL-10、IL-1raサイトカイン、マンノースおよびスカベンジャー受容体の増加、アルギナーゼ産生、ならびに誘導型一酸化窒素合成酵素の産生の減少によって特徴づけられる。以下の図4は、先天性免疫応答に加えて適応的免疫応答の媒介におけるマクロファージの中心的な役割にハイライトを当てたものである。腫瘍壊死因子TNF-αを含むがこれらに限定されない炎症性サイトカインの発現は、siRNA低分子干渉RNAアプローチを使用して、ダウンレギュレーション/サイレンシングすることができる。本明細書において開示されるシステムおよび方法の他の実施形態は、IL-10等の抗炎症性サイトカインタンパク質をコードするプラスミド遺伝子をマクロファージに送達することによって炎症を治療すること、およびそれをTNF-αのサイレンシング効果と比較することを含む。表5は、マクロファージによって分泌される炎症性メディエーターのいくつかを記載する。所望の効果に依存して、本明細書において記載される方法を使用して、疾患状態を制御するためにこれらのメディエーターの任意の1つの発現を修飾することができる。表5.マクロファージによって分泌される炎症性メディエーターGM-CSF=顆粒球マクロファージコロニー刺激因子;IL=インターロイキン;LTB4=ロイコトリエンB4;LTC4=ロイコトリエンC4;LTD4=ロイコトリエンD4;MCP=単球走化性タンパク質;MIP=マクロファージ炎症性タンパク質;PGD2=プロスタグランジンD2;PGE2=プロスタグランジンE2;PGF2=プロスタグランジンF2;RANTES=regulatedonactivationnormalTcellexpressedandsecreted;TNF-α=腫瘍壊死因子α。IL-10は、T細胞、B細胞、抗原提示細胞、肥満細胞および顆粒球によって産生され、その中でマクロファージはIL-10の主要産生細胞である。IL-10は異なる細胞タイプに対する作用によって免疫調節において重要な役割を果たす表6を参照されたい。IL-10に曝露された場合、単球およびマクロファージは可溶性免疫メディエーターを合成および放出し、炎症の消散を引き起こし、組織修復を支援する。これらのメディエーターはIL-1RAおよび可溶性TNF-α受容体を含む。加えて、IL-10は、IL-1β、IL-6、G-CSF、GM-CSFおよびTNFαを含む抗炎症性サイトカインの放出を阻害する。炎症によりマクロファージが動員され、それは炎症を増加させて、最終的には組織破壊を引き起こし得る。本開示は、炎症性カスケードを停止し、炎症の制御および消散を可能にするために、炎症を修飾する方法を記載する。例えば、特定の実施形態において、抗炎症性サイトカインIL-10は開示された多重コンパートメント送達ベヒクルを使用して、マクロファージへ送達される。一旦マクロファージ内に入ったならば、IL-10は細胞によって発現され、それによってマクロファージによって引き起こされた炎症性応答を減少させる。他の実施形態において、siRNAはマクロファージによって分泌される炎症性タンパク質の発現を停止するためにマクロファージへ送達される。異なる免疫細胞タイプに対するIL-10の効果の要約は表6に示される。表6.異なる免疫細胞タイプに対するIL-10の効果。別の実施形態において、IL-10遺伝子コンストラクトは本明細書において開示される多重コンパートメント送達システムを利用して投与される。一旦多重コンパートメント送達システムが投与されたならば、標的の組織または細胞に選択的に結合し、細胞の中へそのペイロードを送達することを可能にする。特定の実施形態は、ナノ粒子中にIL-10遺伝子コンストラクトをカプセル化することをさらに含む。いくつかの態様において、ナノ粒子は、細胞内の細胞内小器官を標的化するようにデザインされる。特定の態様において、細胞内小器官は核である。他の実施形態において、多重コンパートメント送達システムは、診断剤、画像化剤、または治療剤からなる群から選択される第2の薬剤を含む。遺伝子療法戦略タンパク質をコードする遺伝子が発現される場合、遺伝子療法は、身体の特異的細胞への遺伝子の送達を含む。結果として生じる所望のタンパク質の高濃度は治療または疾病予防をもたらすに違いない。最初は、遺伝子療法は遺伝性疾患のみに限定され、その場合異常遺伝子または欠損遺伝子の送達が行われ、欠損遺伝子の機能を補充する。しかしながら、遺伝子療法は、細胞機能を修飾できるタンパク質をコードする遺伝子の補足によって非遺伝性疾患の治療のためにも使用することができる。細胞の中への遺伝子の送達と続いて行われる治療用タンパク質の発現のための異なるアプローチは、標的組織の中への直接的注入を介する遺伝子の送達、ウイルスベクターを介する遺伝子送達、および非ウイルスベクターを介する遺伝子送達である。本明細書において開示される組成物および方法を使用して病変組織および細胞に対して遺伝子療法を実行することができる。遺伝子、または標的遺伝子によって、RNAをコードする核酸例えばポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むが、これらに限定されない核酸配列が意味される。遺伝子または標的遺伝子は、機能的RNAfRNA,または低分子一時的RNAstRNA,マイクロRNAmiRNA、低分子核内RNAsnRNA、小型干渉RNAsiRNA、低分子仁RNAsnRNA、リボソームRNArRNA、転移RNAtRNAおよびその前駆体RNA等の非コードRNAncRNAもコードすることができる。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌から得ることができるか、またはそれらの中に含まれ得る。植物の非限定例は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物を含む。動物の非限定例は脊椎動物または無脊椎動物を含む。真菌の非限定例はカビまたは酵母を含む。総説については例えばSnyderandGerstein,2003,Science,300,258-260を参照されたい。自動化法を使用して100ヌクレオチドを超える長さ核酸の合成は困難であり、かかる分子の治療コストは法外に高い。本発明において、低分子核酸モチーフ低分子は、100ヌクレオチド以下の長さ、80ヌクレオチド以下の長さおよび50ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフを指す;例えば個別のsiNAオリゴヌクレオチド配列またはタンデムで合成されたsiNA配列は、外来性送達のために好ましくは使用される。これらの分子の単純構造は、核酸がタンパク質および/またはRNA構造の標的化領域に侵入する能力を増加させる。本発明の例示的な分子は化学的に合成され、他のものは同様に合成することができる。オリゴヌクレオチド例えば特定の修飾されたオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠損するオリゴヌクレオチドの部分は、例えばCaruthersetal.,1992,MethodsinEnzymology211,3-19、Thompsonetal.、国際出願PCT公開第WO99/54459号、Wincottetal.,1995,NucleicAcidsRes.23,2677-2684、Wincottetal.,1997,MethodsMol.Bio.,74,59、Brennanetal.,1998,BiotechnolBioeng.,61,33-45、およびBrennan、米国特許第6001,311号中に記載されるように、当該技術分野において公知のプロトコルを使用して合成される。これらの参照文献はすべて参照として本明細書に援用される。オリゴヌクレオチドの合成は、5’末端でのジメトキシトリチルおよび3’末端でのホスホアミダイト等の一般的な核酸の保護基およびカップリング基を利用する。非限定実施例において、小規模合成は394AppliedBiosystems,Inc.合成装置上で、0.2μmolスケールプロトコルを使用して、2’-O-メチル化ヌクレオチドのための2.5分のカップリング工程および2’-デオキシヌクレオチドまたは2’-デオキシ-2’-フルオロヌクレオチドのための45秒のカップリング工程で行なわれる。あるいは、0.2μmolスケールでの合成は、ProtogenePaloAlto、Calif.によって製造された装置等の96ウェルプレート合成装置上でサイクルを最小限に修飾して実行することができる。33倍の過剰量の2’-O-メチルホスホアミダイト60μLの0.11M=6.6μmolおよび105倍の過剰量のS-エチルテトラゾール60μLの0.25M=15μmolは、ポリマーに結合した5’ヒドロキシルに対する2’-O-メチル残基の各カップリングサイクルにおいて使用することができる。22倍の過剰量のデオキシホスホアミダイト40μLの0.11M=4.4μmolおよび70倍の過剰量のS-エチルテトラゾール40μLの0.25M=10μmolは、ポリマーに結合した5’ヒドロキシルに対するデオキシ残基の各カップリングサイクルにおいて使用することができる。394AppliedBiosystems,Inc.合成装置上での平均カップリング収率トリチル画分の比色定量化によって決定されたは、典型的には97.5~99である。394AppliedBiosystems,Inc.合成装置のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬は、以下を含む。脱トリチル化溶液は塩化メチレン中の3のTCAABIであり;キャップ付加はTHFABI中の16のN-メチルイミダゾールおよびTHFABI中の10の無水酢酸/102,6-ルチジンにより実行され;酸化溶液は16.9mMI.sub.2、49mMピリジン、THFPerSeptiveBiosystems,Inc.中の9の水である。BurdickJackson合成グレードのアセトニトリルを試薬ビンから直接使用する。S-エチルテトラゾール溶液アセトニトリル中で0.25MはAmericanInternationalChemical,Inc.から得られた固体から作製される。あるいは、ホスホロチオエート結合の導入のために、Beaucage試薬3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド、アセトニトリル中で0.05Mを使用する。本発明の特定のsiNA分子を含むRNAのために使用する合成の方法は、Usmanetal.,1987,J.Am.Chem.Soc.,109,7845;Scaringeetal.,1990,NucleicAcidsRes.,18,5433;andWincottetal.,1995,NucleicAcidsRes.23,2677-2684Wincottetal.,1997,MethodsMol.Bio.,74,59中で記載されるような手技に従い、5’末端でのジメトキシトリチルおよび3’末端でのホスホアミダイト等の一般的な核酸の保護基およびカップリング基を利用する。非限定実施例において、小規模合成は394AppliedBiosystems,Inc.合成装置上で、0.2μmolスケールプロトコルを使用して、アルキルシリルで保護したヌクレオチドのための7.5分のカップリング工程および2’-Oメチル化したヌクレオチドのための2.5分カップリング工程で行われる。あるいは、0.2μmolスケールでの合成は、ProtogenePaloAlto、Calif.によって製造された装置等の96ウェルプレート合成装置上でサイクルを最小限に修飾して行うことができる。33倍の過剰量の2’-O-メチルホスホアミダイト60μLの0.11M=6.6μmolおよび75倍の過剰量のS-エチルテトラゾール60μLの0.25M=15μmolは、ポリマーに結合した5’ヒドロキシルに対する2’-O-メチル残基の各カップリングサイクルにおいて使用することができる。66倍の過剰量のアルキルシリルリボで保護したホスホアミダイト120μLの0.11M=13.2μmolおよび150倍の過剰量のS-エチルテトラゾール120μLの0.25M=30μmolは、ポリマーに結合した5’ヒドロキシルに対するリボ残基の各カップリングサイクルにおいて使用することができる。394AppliedBiosystems,Inc.合成装置上での平均カップリング収率トリチル画分の比色定量化によって決定されたは、典型的には97.5~99である。394AppliedBiosystems,Inc.合成装置のための他のオリゴヌクレオチド合成試薬は、以下を含む。脱トリチル化溶液は塩化メチレン中で3のTCAABIであり;キャップ付加はTHFABI中の16のN-メチルイミダゾールおよびTHFABI中の10の無水酢酸/102,6-ルチジンにより実行され;酸化溶液は16.9mMI.sub.2、49mMピリジン、THFPerSeptiveBiosystems,Inc.中の9の水である。BurdickJackson合成グレードのアセトニトリルを試薬ビンから直接使用する。S-エチルテトラゾール溶液アセトニトリル中で0.25Mは、AmericanInternationalChemical,Inc.から得られた固体から作製される。あるいは、ホスホロチオエート結合の導入のために、Beaucage試薬3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド、アセトニトリル中で0.05Mを使用する。様々なサイトカインに標的化されたタンパク質および遺伝子による治療法は、最近探究されている。可溶性TNF受容体分子、IFN-γR-IgG融合物分子およびIL-12受容体アンタゴニスト等の炎症誘発性サイトカインのアンタゴニストは炎症性応答の正常化において有用であることが見出されている。可溶性TNF受容体エタネルセプト、抗TNF抗体インフリキシマブ、IL-1受容体アンタゴニストIL-1Ra等のタンパク質療法は効果的であること見出されたが、これらは、非常に短いタンパク質半減期のために繰り返し高用量の注入/点滴を必要とした。タンパク質療法の他の制限は注入後の治療用タンパク質の高い全身的な濃度に起因する。これは身体中の標的部位以外の部位で治療用タンパク質分子の所望されない副作用をもたらし得る。全身循環におけるタンパク質のレベルと比較した場合に、治療用タンパク質をコードする遺伝子が標的細胞中で発現されて高いタンパク質のレベルをもたらすならば、これらの制限は克服することができる。本開示の多重コンパートメント送達システムは遺伝子療法アプローチの特異性を改善する。標的化遺伝子療法のより高い特異性に起因して、本明細書において開示される方法は全身性副作用の低下をもたらす。さらに、細胞の内側に送達されたプラスミドDNAの単一コピーが延長された期間にわたって複数の発現サイクルを行うことができるので、遺伝子療法が使用される場合、治療用タンパク質の反復投与は必要ではない。これは投薬頻度の減少を可能にする。効果的な遺伝子送達システムは分解からDNAを保護し、網状内皮系によるそれらのクリアランスを阻害するだろう。さらに、遺伝子送達システムはエンドソームエスケープによってサイトゾルの中へそのペイロードを放出し、DNAの核への侵入を促進し、延長された期間の間で高レベル遺伝子トランスフェクションを引き起こす。本明細書において開示される多重コンパートメントシステムはポリマーを含むことができる。特定の実施形態において、ポリマーは化学的に修飾することができる。例えば、陽イオン性ポリマーの化学的修飾を実行することができる。ポリL-リジンの場合において、正に荷電した粒子の凝集はポリL-リジンの水溶解度の増加によって減少させることができる。これは、ポリL-リジンのεアミノ基へのデキストランの付着によって達成することができる。PEIの場合において、水溶解度は、PEIのアミノ基とPEGの共有結合のカップリングによって増加させることができる。さらに、PEGによるポリL-リジンの修飾が培養における細胞に対するその細胞毒性効果を減少できることが見出された。特定の実施形態において、非縮合ポリマーは非静電的相互作用によってDNAをカプセル化することができる。これらのポリマーは中性電荷またはわずかな負電荷のいずれかを保持し、これは外来性ヌクレアーゼからのDNAの保護を支援する。正電荷の非存在は、ポリマーと負に荷電したDNAとの間の静電的相互作用を阻害し、DNAのカプセル化をさらに実行可能にする。さらに、DNAがポリマーマトリックス内にカプセル化されるので、エンドサイトーシスを阻害し得るDNAペイロードと細胞膜との間の反発作用は制限される。さらに、正電荷の非存在は、単核食細胞系による非縮合ポリマー送達ベヒクルの認識を制限し、したがって送達ベヒクルの早期のクリアランスを制限する。加えて、ポリマー上の非陽イオン性電荷は、急性炎症性応答を引き起こす単核食細胞系による先天性免疫系の活性化の可能性も回避する。PEG、ポリエチレンオキシドPEO、ポリD,L-ラクチド-コ-グリコリドPLGA、ポロキサマーブロックコポリマー、ゼラチンおよびセルロース誘導体のようなDNAをカプセル化するポリマーは、今までに研究され、様々な研究において顕著な遺伝子トランスフェクション効率を示している。PEGおよびPEOは、DNAのヌクレオチド塩基およびリン酸基とポリマーマトリックスの分子との間の水素結合を用いてDNAカプセル化を引き起こす。PEOベースのコポリマーであるポロキサマーPluronics登録商標もDNAカプセル化のために使用されている。遺伝子トランスフェクションのためのタイプのBのゼラチンベースのナノ粒子ベクターは、効果的な全身的送達および局所的送達、細胞内トラフィッキング、ならびに様々な局所的および全身的研究において発現を示した例えばMagadalaetal.AAPSJ.2008104:565-576を参照されたい。タイプBゼラチンから処方されたナノ粒子は、生体適合性、生物分解性、高DNAローディング能力、高遺伝子トランスフェクション効率、非特異的エンドサイトーシスまたは受容体媒介性エンドサイトーシスによる高い細胞による取り込みのような複数の長所を有する。タイプBゼラチンアルカリ加水分解による得られるは4.8~5の間の等電点を有する。中性のpHで、タイプBゼラチンはその表面上に正味の負電荷を有しており、したがってタイプBゼラチンおよびDNAは電荷非依存性様式で相互作用し、DNAは、ゼラチンバイオポリマーのマトリックスのようなヒドロゲル中で物理的にトラップされる。ゼラチンのこれらの特性のために、ゼラチンは、効果的で安全な非ウイルス性遺伝子トランスフェクションベクターとして使用するために選択されるポリマーとなる。エマルジョン中ナノ粒子型NiE処方昨今の薬物送達産業が直面する最大の課題の1つは、ペプチド、タンパク質および核酸ベースの生物学的分子等の生物学的分子の経口投与を介する送達である。薬物の経口投与は、投与の容易性、投薬量調節および頻度の容易性、ならびに治療法の全費用の減少等の長所を有する。核酸のような生体分子の経口送達を成功させるために、送達ベヒクルは、生体分子の細胞取り込みのための胃腸管の吸収粘膜でペイロードを放出してその治療効果を示すまで、胃腸管の生理的環境からのカプセル化ペイロードへの保護を提供できるようにデザインされるべきである。局所性疾患および全身性疾患の遺伝子療法について、胃腸管における遺伝子トランスフェクションの成功は、コードされたタンパク質の産生をトランスフェクションの局所的部位で引き起こすことができるだけではなく、合成タンパク質の放出を全身循環においても引き起こすことができる。胃腸管は、DNAワクチンの送達の標的として利用することもでき、そこでは、コードされたタンパク質抗原は、局所的および全身的な免疫応答の発生を引き起こすことができる。腸における水中油中水型多重エマルジョンを介する治療用タンパク質およびペプチド抗原のような低分子の制御放出の成功は、複数の研究グループによって報告されているが、遺伝子送達ベヒクルとしての多重エマルジョンシステムの利用による、効果的な遺伝子の送達およびトランスフェクションを確認している研究はわずかしかない。タンパク質送達については成功することが証明されているが、遺伝子送達の場合において、DNAは腸のヌクレアーゼから保護されるだけでなく、効果的な遺伝子トランスフェクションを引き起こすために標的細胞の核に到達することも必要であるので、DNA保護の促進が必須である。この問題に取り組むために、DNAにナノ粒子内のカプセル化によって追加の保護を提供することができ、次いでそれは多重エマルジョンの最も内側の水相中にカプセル化することができる。この様式で、カプセル化された遺伝子への保護促進および制御放出特性を提供することができる、多重コンパートメントDNA送達ベヒクルを処方することができる。プラスミドをカプセル化したナノ粒子を含む多重エマルジョン小球は、小腸におけるパイエル板のM細胞による取り込み前に、またはパイエル板内に存在する食細胞による貪食後にそれらのペイロードを放出することができる。多重エマルジョン小球が疎水性であるので、それらは他の細胞タイプに加えて腸のマクロファージによっても容易に内部移行される。一旦マクロファージによって内部移行されたならば、これらの細胞は移動し、全身循環を通して身体の異なる部分においてタンパク質を送達することができる。本明細書において記載された送達システムは、エマルジョンシステムにおいてより大きなDNAペイロードのローディングを可能にするナノ粒子内のDNAのカプセル化を含む。これは、DNAがナノ粒子内に保護され、したがって多重エマルジョンの調製プロセスの間に起こる高剪断性の均質化工程に耐えることができるからである。ゼラチンナノ粒子を使用する遺伝子トランスフェクション研究から得られた結果に基づいて、水中油中水型W/O/W多重エマルジョンシステムの最も内側の相中でのナノ粒子のカプセル化によるさらなる保護と共にこれらのナノ粒子を提供することができるならば、制御され促進された遺伝子の送達およびトランスフェクションをインビトロおよびインビボの両方で達成できると考えられた。本開示は以下の実施例によってさらに説明される。実施例は説明の目的のためにのみ提供される。それらは開示の範囲または内容を限定するものとして決して解釈されるべきではない。多重コンパートメント送達システムの使用の他の方法癌治療法癌は細胞増殖の迅速で制御されない進行として定義される。腫瘍細胞は、血管新生、転移および免疫抑制等の一連のプロセスを行うことによって、この増殖を達成する。腫瘍関連マクロファージTAMは、腫瘍が上述のプロセスを行うことを支援することによって腫瘍生存において顕著な役割を果たすと考えられる。乳癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌における多量のTAMと予後不良との間の密接な関連性の証拠は、既に確立されている。典型的なシナリオにおいて、腫瘍は、コロニー刺激因子-1CSF-1、ケモカインCCL2、3、4、5および8、血管内皮細胞増殖因子VEGF等の様々な化学誘引物質を分泌する。結果として、血流中の単球は腫瘍組織へ誘引され、そこで単球は分化し、常在性マクロファージの役割を努める。加えて、健康な組織から得たマクロファージと比較すると、これらの細胞は別の表現型を有するようである。TAMは、分化関連マクロファージ抗原、カルボキシペプチダーゼMおよびCD51の低発現、インターロイキンIL-1およびIL-6の高い構成的発現、ならびにTNF-αの低発現によって特徴づけられる。マクロファージが極性化したタイプIIまたはM2マクロファージへと発生するように、IL-4、6、10、TGF-β1およびPGE2等の腫瘍由来のサイトカイン、ケモカインならびにプロテアーゼはマクロファージに作用すると考えられている。結果として、健康な組織とは違って、マクロファージの抗腫瘍活性は腫瘍微小環境において損なわれる。加えて、腫瘍微小環境中の低酸素が、PGE2およびIL-10の分泌の促進による腫瘍細胞へのTAMの細胞毒性活性を減少させることに寄与できることも報告されている。したがって、分化に際して、常在性マクロファージが特異的機能を実行するように、腫瘍細胞によって訓練または形作られるようである。上述のプロセスにおけるTAMの役割は図5中に要約される。TAMが死滅させられるならば、転移性腫瘍の増殖が阻害されることは当該技術分野において公知である。侵襲性癌および/または転移癌においてでさえ、腫瘍増殖および疾患進行を劇的に減速させることが示された。本明細書において記載されたシステムおよび方法は、これらのマクロファージの特異的標的化を可能にし、これらの細胞へのアポトーシス剤の効果的な送達のために使用することができる。さらに、腫瘍の同時画像化を可能にする他の薬剤を多重システム送達ベヒクル中に含むことができ、それによって疾患を治療しながら、疾患を同時にモニタリングすることを可能にする。本開示において先に記載されるように、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、マクロファージの標的化のために提供される。これは、化学療法剤または局所放射線療法のための放射性分子等の治療剤の投与を可能にする。さらに、当業者は本明細書において記載された多重コンパートメント送達システムを使用して、本開示によって遺伝子療法を施すことができる。遺伝子コンストラクトを使用して、腫瘍細胞を攻撃するようにTAMを再教育すること、マクロファージの一部上の様々な生体分子分泌をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることに加えて、ペイロードを腫瘍部位へ送達することができる。これらの態様はこの開示の全体にわたって記載された。身体内のナノ粒子分布は、より長い循環時間をもたらすそれらの比較的小さなサイズおよび腫瘍の特徴を利用するそれらの能力等の様々なパラメータに基づく。実施例1W/O/Wシステムの処方および使用W/O/W多重エマルジョンは、三相外側の水相によって包まれた油小球中に含まれる内側の水溶性液滴からなる三相性のシステムである。W/O/W多重エマルジョンは2工程のエマルジョン化によって処方された。オメガ-3多価不飽和脂肪酸およびオメガ-6多価不飽和脂肪酸に富むサフラワー油Jedwards,Inc.、Quincy、MAを、エマルジョンの油相のために使用した。サフラワー油は高レベルのトコフェロールを含み、炎症誘発性サイトカインの腫瘍壊死因子アルファおよびインターロイキン1-ベータのレベルに対して負の効果があることは報告されている。トコフェロールは酸化防止活性を発揮することが示されており、活性酸素種によって媒介される急性炎症に対する保護を提供し得る10。第1の工程は、油溶性界面活性剤Span登録商標80を使用するW/O一次エマルジョンの処方からなっていた。ネイキッドプラスミドMEまたはゼラチンナノ粒子中にカプセル化されたプラスミドNiEを、一次エマルジョンの水相中に取り込んで50μg/mlの最終濃度の多重エマルジョンを生じた。カプセル化されたネイキッドプラスミドDNAによる安定した一次W/Oエマルジョン、またはDNAがカプセル化されたナノ粒子による分散として安定した一次W/Oエマルジョンを、SilversonホモジナイザーL4RTを9000rpmの速度で15分間使用して形成した。一次エマルジョン分散物を、水溶性界面活性剤Tween登録商標80からなる追加の水相と混合し、処方を4000rpmで4分間のホモジナイゼーションによって調製した。この工程の間に4000rpmを越えるまで速度を増加させることは、多重エマルジョン小球の破壊をもたらした。約200000の細胞をアルコール滅菌したガラスカバースリップを含む6ウェルプレートの各ウェル中にプレーティングし、対照および試験の処方による処理前に12時間接着させた。内側の水相中に可溶化された0.0025w/vのローダミン-デキストランを含む多重エマルジョン、またはゼラチン粒子中でカプセル化された0.0025w/vのローダミンデキストランを含み、その粒子を次いでW/O/Wエマルジョンの内部水相へ添加した多重エマルジョンのいずれかを細胞に与えた。ブランクの水相またはブランクのゼラチンナノ粒子により調製された多重エマルジョンを、対照として使用した。対照および試験の処方によるインキュベーションの60分、90分および120分後に、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水PBS、pH7.4で洗浄し、カバーグラスをウェルから除去し、清浄なスライドグラス上にマウントした。図1上部中の顕微鏡画像は、ローダミン-デキストランを含有するW/O/WエマルジョンおよびNiE処方が、マウス肺胞マクロファージJ774A.1細胞中に迅速に内部移行したことを示す。時刻が進むにつれて、蛍光強度の増加が観察され、120分の曝露後に最大になった。加えて、図1下部中の顕微鏡画像は、NiE処方で処理した細胞において最高の遺伝子トランスフェクションが観察され、ME処方およびGNP処方が続くことを示す。最大の緑色蛍光はNiE処方で処理した細胞において観察され、それは処理後24時間で開始し、2、3および4日目でレベルは維持され、続いて5および6日目で衰退した。これらの結果は、NiE処方が遺伝子トランスフェクションにおいては、ME処方またはGNP処方と比較してより良好だったことを示し、これはNiE処方が、処方の間処方1mlあたりのプラスミドDNAのより高いローディング効率をもたらすに加えて、エンドソーム/リソソームのコンパートメントにおけるプラスミドDNAの細胞内輸送の間に、プラスミドDNAのより良い保護を提供するためである。実施例2マクロファージに標的化された非縮合のタフトシンで修飾したアルギン酸塩ナノ粒子要約マクロファージに標的化されたタフトシンで修飾した架橋アルギン酸塩ナノ粒子が、局所的および全身的な抗炎症性遺伝子療法のために開発された。強化緑色蛍光タンパク質GFPおよびインターロイキン10IL-10の両方を発現するプラスミドDNAを、非縮合アルギン酸塩マトリックス中に物理的にカプセル化した。アルギン酸塩ナノ粒子は、効率的にプラスミドをカプセル化し、DNAse分解に対して保護することができた。さらに、タフトシンで修飾したナノ粒子はJ774A.1マクロファージ細胞中に効率的に内部移行され、インキュベーションの1時間以内に飽和した。GFP発現プラスミドDNAおよびIL-10発現プラスミドDNAによる導入遺伝子発現の定量的および定性的な分析の両方から、タフトシンで修飾したナノ粒子は他のシステムスクランブル化ペプチドで修飾したナノ粒子およびLipofectin登録商標陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を含むのいずれかよりも有意に高い効率を有することが示された。序論導入遺伝子発現を使用する治療用タンパク質の局所的産生は、抗体のようなタンパク質の反復全身投与よりも副作用が少なく、治療法にわたってより高い制御を与える。ウイルス性遺伝子および非ウイルス性遺伝子の送達システムは抗炎症性遺伝子療法のために調べられているが、この実験的戦略を臨床的に実行可能な治療的アプローチへと移すことができるように、安全で効果的なシステムを開発するチャレンジがなされてきた。本明細書において、IL-10発現プラスミドDNAのための新規の安全で効果的な非ウイルス性遺伝子送達システム、ならびに局所的および全身的な抗炎症性療法のためのトランスフェクションの開発が記載される。IL-10の臨床的有意性は、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および関節リウマチを含むが、これらに限定されない炎症関連疾患に適用されている。マクロファージにおけるIL-10の発現は、かかる疾患モデルに関連する炎症性応答の終了または少なくとも有意な低下をもたらすだろう。負に荷電したDNAと静電複合体を形成する陽イオン性の脂質およびポリマーとは異なり、アルギン酸塩担体はナノ粒子の調製のための生体適合性非縮合ポリマーとして選択され、表面はマクロファージ選択的な取り込みのためにタフトシンにより修飾された。抗炎症治療法のための遺伝子送達システムGFP発現プラスミドDNAまたはIL-10発現プラスミドDNA400μgを、中間粘度のアルギン酸塩ポリマー0.1w/vの水溶液と混合して、1時間撹拌した。次いで、プラスミドDNAを含有するアルギン酸塩溶液を、塩化カルシウム9mMの滴下添加によって架橋した。次いで、粒子を1mg/mlのタフトシンペプチド溶液で表面修飾して、マクロファージ上の特異的受容体を標的化した図6。対照およびペプチドで修飾したナノ粒子処方は、粒子サイズ、表面電荷、表面形態およびDNAローディング効率について特徴づけられた。カプセル化されたDNAの安定性をアガロースゲル電気泳動によって査定した。粒子の毒性をJ774A.1マクロファージ細胞株においてMTSアッセイによって評価した。時間依存性細胞取り込み研究を、ローダミンで標識したデキストラン色素をナノ粒子中にカプセル化することによって実行し、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡検によって査定した。GFPの定量的および定性的な導入遺伝子発現を、投与後12、24、48、72および96時間で蛍光顕微鏡およびELISAによってそれぞれ査定した。IL-10トランスフェクションは、RT-PCRおよびRDSystemsからのQuantikine登録商標ELISAキットによって測定した。粒子特徴評価の研究から、形成されたDNAをロードした架橋アルギン酸塩ナノ粒子は球形の形状であり、約300nm~400nmの平均径を備えていることが示された。平均では、非修飾処方およびペプチドで修飾した処方の表面電荷は、それぞれ-47.7mVおよび19.7mVであり、それはナノ粒子の表面上のペプチドコンジュゲーションの成功も示した。両方のGFP発現プラスミドDNAおよびIL-10発現プラスミドDNAは約58の効率で至適にカプセル化され、安定性研究により処方プロセスの間にDNAは完全な形のままであることが確認された。非修飾ナノ粒子またはスクランブル化ペプチド配列で修飾したものと比較して、タフトシンで修飾した処方がより高い取り込みをもたらすはずであるという仮説を証明するために、J774A.1マクロファージ細胞株において時間依存性ナノ粒子取り込みを実行した。粒子取り込みの結果は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡によって、それぞれ定量的および定性的に評価された図7。これらの研究は実際、他のすべての対照と比較して、J774A.1マクロファージにおける粒子取り込みがタフトシンで修飾した処方でより高かいことを示した。さらに、標的化された処方による高い粒子取り込みは、早期の時間ポイントですなわち15分、30分および60分で観察された。GFP発現プラスミドDNAおよびIL-10発現プラスミドDNAを使用する導入遺伝子発現の定量的および定性的な研究を実行した。GFP特異的ELISAの結果図8は、タンパク質発現が、Lipofectin登録商標等の陽性対照およびスクランブル化ペプチド配列を含む他の対照と比較して、タフトシンで修飾したナノ粒子で処理した細胞において有意により高かいことを示したp<0.01;n=3。蛍光顕微鏡による定性的なGFP発現解析により、タフトシンで修飾したナノ粒子がより高いトランスフェクション効率を示すことも確認された。さらに、投薬後4日を超える期間にわたり、タンパク質発現を観察することができた。J774A.1マクロファージ細胞株におけるIL-10導入遺伝子発現を検討したところ、結果はGFP発現について観察されたものに非常に類似していた図9。実施例3マクロファージにおける遺伝子送達およびトランスフェクションのためのエマルジョン中ナノ粒子型処方のインビトロ評価要約治療上活性のあるタンパク質の持続的産生をもたらす、特異的細胞の中へトランスフェクション可能な遺伝子送達ベヒクルは、疾患治療のために非常に効果的な戦略として働くことができる。この研究において、固体エマルジョン中ナノ粒子型NiE処方を開発し、接着肺胞マクロファージにおける遺伝子送達およびトランスフェクションについてインビトロで評価した。強化緑色蛍光タンパク質を発現するレポータープラスミドEGFP-N1をゼラチンナノ粒子GNP中にカプセル化し、それをサフラワー油含有W/O/W多重エマルジョンの内側の水相中にさらにカプセル化した。この研究の結果は、W/O/W多重エマルジョンMEの水相中に溶解したDNA、GNP中にカプセル化されたDNA、またはDNAがLipofectin登録商標陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬と複合体化された場合等の対照処方と比較して、NiE処方が、肺胞マクロファージにおけるEGFP-N1のトランスフェクションにおいてより効果的であることを示す。序論遺伝子療法は、異なる急性疾患状態および慢性疾患状態の治療のための特異的細胞の中への治療法の遺伝子の送達、続いて転写および生物学的に活性のあるタンパク質への翻訳を含む。ヒトゲノムの解読および生物学的操作における最近の発展で、非常に多数の治療用遺伝子配列が公知である。これらの遺伝子配列は、身体中の特異的細胞内で所望のタンパク質の産生のために使用することができる1。この目的を達成するために、特異的細胞の中への遺伝子を効率的に送達できる送達ベヒクルの開発は有用である。ウイルスベクターは高い遺伝子トランスフェクション効率を有するが、それらの臨床用途は、細胞毒性、免疫原性および送達された遺伝子の染色体組込みのために限定されている。マクロファージに向けて標的化された非ウイルス性遺伝子送達システムは、急性および慢性的な炎症性疾患を制御するユニークな方法を提供する。この研究において、NiEは、特に粘膜投与後の、遺伝子送達およびトランスフェクションのための新規のマクロファージに標的化されたシステムとして開発された。かかる多重コンパートメント送達システムは、より高い安定性または時間制御された送達のために、内側のコンパートメントおよび外側のコンパートメント中に異なるタイプの治療用ペイロードまたは画像化ペイロードをカプセル化する方法も提供する。本開示は、マウス接着肺胞マクロファージJ774.A1細胞におけるEGFP-N1プラスミドDNAを使用するインビトロ遺伝子トランスフェクション実験から得られた結果を提供する。実験方法タイプBGNPは先に記載されるようにエタノール水溶媒置換方法によって調製した3。粒子サイズおよび電荷はMalvernZetasizer登録商標を使用して決定した。W/O/W多重エマルジョンはSilversonhomogenizer登録商標L4RTを使用して、2工程のエマルジョン化プロセスによって処方された5。細胞の取り込み研究のために、ローダミン標識したデキストラン水溶性蛍光団を、MEの内部水相中に取り込むか、またはGNP中にカプセル化して次いでそれらを内側の水相中に取り込んだ。細胞の取り込み研究は対照および処理されたJ77A.1細胞の蛍光顕微鏡による画像化によって実行した。遺伝子トランスフェクション研究のために、EGFP-N1をGNP中にカプセル化し、次いでそれらをMEの内側の水相中に取り込んだ。異なる処方におけるEGFP-N1ローディングはPicoGreen登録商標dsDNA試薬を使用して評価した。異なる処方におけるEGFP-N1安定性はアガロースゲル電気泳動の使用によって特徴づけられた。EGFP-N1の異なるカプセル化処方で処理した細胞およびLipofectin登録商標と複合体化されたEGFP-N1で処理した細胞を、蛍光顕微鏡により定性的に、および緑色蛍光タンパク質GFP特異的酵素結合抗体免疫吸着アッセイELISAにより定量的に導入遺伝子発現について検査した。結果および考察ブランクのGNPおよびEGFP-N1をロードしたGNPは、それぞれ164.3nmおよび166.0nmの平均粒子サイズを有していた。ブランクのゼラチンナノ粒子およびEGFP-N1をロードしたゼラチンナノ粒子の表面電荷は、それぞれ-10.7mVおよび-11.2mVであることが見出された。MEおよびNiEは5μm以下の小球サイズを有し、内側の水相からの内容物の漏洩の兆候なかった図10。GNP、MEおよびNiEにおけるEGFP-N1のローディング効率は、それぞれ99、54および70であることが見出された。すべての3つの処方からのアガロースゲル電気泳動の結果は4.7kbのサイズで単一バンドを示し、それは純粋なEGFP-N1のサイズに類似していた。これらの結果は、プラスミドが処方の加工条件によって負の影響を受けないことを示した。細胞の取り込み研究から、ME処方およびNiE処方の迅速な取り込みと処理後2時間内の飽和が示された図10。定性的な緑色蛍光タンパク質GFP発現を蛍光顕微鏡によって評価した。EGFP-N1をロードしたGNP、ME、NiE、およびLipofectin登録商標と複合体化されたEGFP-N1で処理した細胞について、画像を得た。最大の緑色蛍光はNiEで処理したJ774A.1マクロファージ細胞で観察され、他の処方で処理したものが続いた図11。J774A.1マクロファージにおける定量的GFP発現解析は特異的ELISAを使用して決定された。トランスフェクション効率は、全細胞タンパク質の1ミリグラムあたり産生されたGFPのナノグラムとして報告された。ELISA結果は、図12中に図示されるように、J774A.1細胞によるこのインビトロシステムにおける他の処方と比較して、NiE処方が最も高いトランスフェクション効率を有することを示す。記述この研究の結果は、サフラワー油含有W/O/W多重エマルジョン中に固体ゼラチンナノ粒子を効果的にカプセル化できることを示す。このNiEシステムはマクロファージにおいて遺伝子トランスフェクションのために使用することができ、経口投与後の粘膜トランスフェクションに有益であると証明することができる。実施例4NiMOSによる経口TNF-α遺伝子サイレンシング要約この実施例は、経口RNA干渉療法によるTNF-αのダウンレギュレーションを評価した。対照スクランブル化配列またはTNF-α特異的低分子干渉RNAsiRNAをタイプBゼラチンナノ粒子中にカプセル化し、ポリε-カプロラクトンPCLマイクロスフェア中にさらにトラップして、マイクロスフェア中ナノ粒子型経口システムNiMOSを形成した。デキストラン硫酸ナトリウムDSS誘導性急性結腸炎モデルの確認に際して、マウスを、複数の処理群処理なし、ブランクのNiMOS、スクランブルsiRNAを持つNiMOS、またはTNF-αサイレンシングsiRNAを持つNiMOSを経口投与によって投与されるへと分けた。成功した遺伝子サイレンシングは、TNF-αの結腸レベルの低下、他の炎症誘発性サイトカインIL-1α、IL-1β、IFN-γおよびケモカインMCP-1の発現の抑制、体重の増加、ならびに組織ミエロペルオキシダーゼ活性の減少をもたらした。この研究の結果は、急性結腸炎モデルにおいて実証されるような炎症性大腸疾患の治療のためのNiMOSベースの経口TNF-α遺伝子サイレンシングシステムの臨床的有用性を確立する。序論炎症性腸疾患IBDは2つの主要な表現型クローン病および潰瘍性大腸炎により表わされる慢性の再発病態であり、胃腸管の炎症を含む。その病因は今もなお未知であるが、遺伝的素因、環境条件、生活様式、微生物因子および免疫学的因子の複雑な相互作用が、IBDをもたらす主要な態様のいくつかとして同定されている1、2。従来の治療は、疾患の範囲および重症度を含む患者の臨床状態に依存して、抗炎症薬および免疫抑制性薬からなる3。いくつかの医薬物は急性事態の炎症に対抗する効果的な方策であるが、毒性、依存性および高再発率のために寛解の維持には効果がない。他の治療選択肢は炎症を起こした腸組織の外科切除であるが、患者は多くの精神的ストレスおよび肉体的苦悩を経験しなければならない。現在の治療選択肢に関連した有効性および安全性には制限があるために、粘膜炎症性経路の選択的な遮断を含む新規の生物学的療法の開発は、IBDにおけるより効果的な治療選択肢の可能性を提供する。腫瘍壊死因子アルファTNF-αはIBDの炎症の媒介において中心的な役割を果たす5。全身的な抗TNF-αは伝統的療法に対して抵抗性のある患者においてうまく機能しているが、日和見感染、治療法の有効性の低下と共に起こる抗TNF-αに対する抗体産生、および点滴反応の出現の増加を含む深刻な禁忌および副作用が報告されている6、8、9。胃腸管は、経口および直腸の投与経路を介して大きな表面積があり、炎症の管腔部位へ接近できるので、遺伝子療法の理想的な標的を提供する。RNA干渉療法は通常20~25ヌクレオチドからなる小型干渉RNAsiRNAを利用し、RNA干渉を介する遺伝子サイレンシング機構に関与し、そこでsiRNAは特異的遺伝子例えば疾患において発現されたものの発現を最終的に遮断することができる。したがって、siRNAの適用は疾患を克服するために代替の治療方針を提供する。現在、遺伝子サイレンシングにおいて最も大きなハードルは、依然として細胞質および血漿中でのsiRNAの迅速な分解に起因する送達および安定性である。この目的のために、ウイルスベクター、ナノ粒子18、ポリマーベースのベヒクルまたはリポソーム小胞を含む様々なシステムを含む、カプセル化および送達の機構が使用されている。本明細書において開示されるのは、PCLシェル中に包まれるレポーターおよび治療用タンパク質を発現するプラスミドDNAをカプセル化するゼラチンナノ粒子を使用する、多重コンパートメントのマイクロスフェア中ナノ粒子型システムNiMOSの開発であり、げっ歯類モデルにおいてトランスフェクションの成功が示される。本明細書において、対照スクランブル化TNF-αはゼラチンナノ粒子中にカプセル化されたNiMOSの形成。TNF-α特異的siRNAもゼラチンナノ粒子中にカプセル化された。これはDSS誘導性急性結腸炎マウスモデルにおける投与によって、IBDにおけるTNF-α遺伝子サイレンシングの経口送達の可能性を評価するために行った。材料225ブルーム強度のタイプBゼラチン分子量40000~50000、100gのタンパク質あたり100~115mMの遊離カルボン酸、4.7~5.2のpIおよびポリビニルアルコールPVA加水分解度86.7~88.7、分子量~67000は、SigmaChemicalCompanySt.Louis、MOから得た。ポリε-カプロラクトンPCLゲル透過クロマトグラフィーによって分子量10000~20000と検証されるはPolysciences,Inc.Warrington、PAから購入した。試薬グレードのジクロロメタン、ヘマトキシリンエオジンはFisherScientificピッツバーグ、PAから購入した。試薬グレードの無水アルコールはAcrosOrganicsParsipanny、NJから得た。カプセル化有効性研究およびゲル電気泳動のために、6.9単位/mgの活性のウシ膵臓のプロテアーゼはSigmaChemicalCompanySt.Louis、MOから得た。脱塩しアニーリングしたsiRNAsはDharmaconLafayette、COから得た。配列は以下のとおりであった。TNF-αsiRNA、5’GACAACCAACUAGUGGUGCdTdT3’;スクランブル化siRNA、5’GACAACCAGGGCGUGGUGCdTdT3’14。センス配列のみを示す。動物研究のために、デキストランナトリウム硫酸塩DSS分子量36000~50000はMPBiomedicalsUnitedStatesSolon、OHから購入した。他のすべての試薬および化学物質は分析グレードであった。水溶液は全て脱イオン化された蒸留水NanopureII、Barnstead/Thermolyne、Dubuque、IA中で調製した。Balb/cマウスはCharlesRiverlaboratoriesWilmington、MAから購入した。RNAseAおよびSuperscriptIIIはInvitrogenCarlsbad、CAから得た。方法siRNAをカプセル化するゼラチンナノ粒子およびNiMOSの処方先に記載したように、ゼラチンナノ粒子を調製した。簡潔には、siRNAsをpH7.00のゼラチン水溶液と混合し、室温で10分間プレインキュベーションし、続いて非溶剤としてのエタノールの補助によりsiRNA含有ゼラチン溶液またはブランクのゼラチン溶液の制御された沈殿を行った。最終的なブレンドにおいて、エタノール対水の体積比は65:35で一定に保たれた。もたらされたナノ粒子を32000rpmで45分間遠心分離し、脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥した。本明細書において記載されるように、マイクロスフェア中ナノ粒子型経口送達システムNiMOSは、ダブルエマルジョン様技法の利用によって製造された。siRNAをカプセル化するゼラチンナノ粒子およびNiMOSの特徴づけ粒子サイズ分析新たに調製したナノ粒子処方は、90°散乱角でMalvernZetasizerNanoZS90装置Westborough、MAを使用して、液滴の平均粒径について特徴づけられた。NiMOSは、BeckmanCoulterFullerton、CAからのMultisizer商標3を使用して、粒子サイズおよびサイズ分布について特徴づけられた。粒子サイズの測定はすべて室温で実行した。走査電子顕微鏡SEM凍結乾燥したブランクのゼラチンナノ粒子またはロードしたゼラチンナノ粒子およびNiMOSを、アルミニウムスタブ上にマウントし、金-パラジウムでスパッタコートして、表面のチャージを最小限にした。このように調製したサンプルを、HitachiS-4800Pleasanton、CA電界放射型走査電子顕微鏡によるそれらの表面形態に従って、評価した。ゼラチンナノ粒子およびNiMOS中のsiRNAローディングの決定上で論じたように、siRNAをロードしたゼラチンナノ粒子およびNiMOSを調製した。これらの処方におけるsiRNAのカプセル化効率は、透明な溶液が得られるまで、0.2mg/mlのプロテアーゼを含むリン酸緩衝生理食塩水PBS、pH7.4中で既知の量のサンプルを37°Cで溶解することによって決定された。放出されたsiRNAは、メーカーのプロトコルに従ってPicoGreen登録商標アッセイInvitrogen、Carlsbad、CAを使用して定量した。PerkinElmerLS50B分光光度計Norwalk、CTを使用して、485nmの励起波長および520nmの放射波長で、PicoGreen登録商標結合siRNAに比例する蛍光強度を測定した。FLWINLAB登録商標ソフトウェアを結果のデータの処理および分析のために使用した。先に記載されたようにNiMOS中のsiRNAローディングの評価を実行した23。簡潔には、既知の量の先に記載されたサンプルを既知の量のジクロロメタンへ添加してPCLマトリックスを溶解し、ゼラチンナノ粒子を放出させた。この有機PCL-ジクロロメタン混合物へ等量の蒸留脱イオン水を添加して、有機溶液からナノ粒子を分離した。有機相から水相を注意深く分離した後に、ゼラチンナノ粒子に上記と同じ手技を行い、PicoGreen登録商標定量分析を使用してNiMOS中の最終的なsiRNAローディング効率を測定した。siRNA安定性NiMOSのゼラチンナノ粒子の製造プロセスがsiRNAの完全性に影響を与えなかったことを確認するために、カプセル化されたsiRNAの安定性をアガロースゲル電気泳動によって査定した。加えて、RNAseAの存在下におけるペイロードの完全性を決定した。NiMOSを含むsiRNAのサンプルを37°Cで20分間RNAseAで処理し、続いて酵素を不活性化し、上で論じられるものと同じ様式で抽出したゼラチンマトリックスのプロテアーゼ消化によって、ロードしたナノ粒子からsiRNAを抽出した。マイクロスフェアおよびナノ粒子からのsiRNA放出後に、サンプルを4w/vの前染色されたE-gel商標システムのウェルへ添加し、対照としての10bpラダー、ネイキッドsiRNA、プロテアーゼで処理したネイキッドsiRNA、ならびにプロテアーゼおよびRNAseAで処理したネイキッドsiRNAに対して泳動した。70Vで45分の泳動後に、画像を紫外線下で記録および加工した。実験動物含まれる動物研究はすべて、InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeatNortheasternUniversityBoston、MAによって承認された実験的プロトコルに従って実行された。メスBalb/cマウス6~8週間、約18~20gを、CharlesRiverLaboratoriesWilmington、MAから購入した。1ケージあたり4匹のマウスの群へ動物を無作為に割り当て、研究の開始前に10日間順応させた。マウスをそれぞれ22°Cの温度および26の湿度と12時間の明暗サイクルで制御された室の中に収容し、経口強制投与の準備をするために一晩絶食させる場合以外は、水および標準的なペレットを自由に与えた。デキストランナトリウム硫酸塩DSを使用する急性結腸炎の誘導動物を10群n=4へ無作為に割り当てた。研究期間の間の飲料水中への3.5w/wデキストランナトリウム硫酸塩DSSの添加によって、急性結腸炎をマウスにおいて誘導し、一方1つの対照群n=8は研究の経過を通じて一般的な水道水を与えた。DSS溶液を毎日のベースで新たに調製し、マウスの健康状態については毎日モニターした。急性疾患モデルは、体重減少、便の硬さ、直腸出血、組織学の評価によって確認した。研究の10および14日目で、CO2吸入、続いて頸椎脱臼によって動物を屠殺し、以下に記載されるように組織を加工した。DSS大腸炎を誘導したBalb/cマウスにおける経口siRNA投与研究の2、4および6日目で、すべての対照を含む各群のマウスを一晩絶食させ、続いてブランクのNiMOSsiRNAを含まない粒子または1匹の動物あたり750pmolのsiRNATNFα配列またはTNFαスクランブル化配列を含むマイクロ粒子を、食道の中へ挿入した先端を丸めた供給針を使用する経口強制投与によって、1群あたりNiMOS処方を最大3用量添加する処理を行った。追加の対照群は、DSS曝露の経過の全体にわたって経口処理を受けない動物DSS対照からなった。投与後3および7日目それぞれ10および14日目の所定の時間ポイントで、時間ポイントおよび群あたり4匹の動物をCO2吸入、続いて頸椎脱臼を使用して屠殺した。安楽死後に、大腸を外科的に摘出して組織切片の組織学的分析のためにPBSで慎重に洗浄し、MultiplexELISAおよびリアルタイムPCRによってそれぞれサイトカインおよびマウスTNFα-mRNAレベルを決定した。結腸組織からのRNAの単離および定量的ポリメラーゼ連鎖反応大腸から得た組織サンプルを、RNAlater登録商標AppliedBiosystemsInc.、FosterCity、CA中で4°Cで2日間保存して十分な時間で組織に浸透させ、続いて過剰な液体を除去し、加工まで組織を-70°Cで保存した。RNAは、RNAqueous登録商標-4PCRキットAppliedBiosystemsInc.、FosterCity、CA中に供給されるグアニジンイソチオシアネート法を使用して、メーカーのプロトコルに従って、組織サンプルから単離した。上記の組織サンプルから単離したRNAは、NanoDrop1000ThermoFisherScientificInc.、Wilmington、DEUV-可視光線分光光度計の使用によって定量した。単離したmRNAからの逆転写によるcDNAの合成全RNA濃度の決定後に、サンプルはさらなる使用まで-70°Cで保存した。メーカーによって推奨されるように、定量的PCRのためのSuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSuperMixInvitrogen、Carlsbad、CAを使用して、cDNAをRNAから合成した。RNAサンプルの逆転写の調製は氷上でおよびメーカーの推奨に従って実行された。UV分光光度法によって決定された1μgのRNAに対応する体積を合成プロセスのために使用した。cDNAを含むサンプルを100μlの最終的な体積へ希釈し、さらなる使用まで-20°Cで保存した。ポリメラーゼ連鎖反応PCRによるcDNAの定量的分析定量的リアルタイムPCRを大腸組織から得たcDNAサンプル上で実行して、mRNA転写物のレベルを決定した。L32リボソームタンパク質を発現するL32遺伝子を対照として使用した。前希釈したcDNAを、マウスTNF-αまたはL32コンストラクトを検出する0.2μMのプライマーペアおよびSYBR登録商標GreenPCRマスターミックスと混合し、バーコードを備えたABIPrism商標96ウェル光学反応プレートAppliedBiosystems、FosterCity、CAの中へピペットで移した。使用したプライマーの配列は以下のとおりであった。1マウスL325’AGCAACAAGAAAACCAAGCACAT3’および5’TTGACATTGTGGACCAGGAACT3’、2マウスTNF-α5’CATGAGCACAGAAAGCATGATC3’および5’CCTTCTCCAGCTGGAAGACT3’。定量的PCR反応をAppliedBiosystemsからの7300Real-TimePCRSystemにおいて実行し、40サイクルの95°C15秒間;1分間60°Cのサイクルプログラムを使用した。PCR反応から得られた結果を比較Ct分析によって分析して、サンプル中のマウスTNF-αcDNAの相対的量を決定した。ELISAによる組織マウスサイトカイン発現レベルの決定続いて行なわれるELISAおよびミエロペルオキシダーゼ活性の測定のために、全大腸のサンプルを、プロティナーゼ阻害剤を補足した溶解緩衝液1Mトリス、pH7.4;0.5MEDTA、pH8.0;5MNaCl、10w/vBrij、10v/vTween20中で氷上でホモジナイズして、組織サンプルからタンパク質を抽出した。タンパク質を含む上清を13000gの遠心分離によって4°Cで30分間分離し、分析まで-70°Cで保存した。QuansysBiosciencesLogan、UTから得たQ-Plex商標MouseCytokineScreenELISAを使用して、大腸炎を誘導したBalb/cマウスの大腸において、一連の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインTNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-12p70、IL-17、MIP-1α、MCP-1およびGMCSFの濃度の変化を、メーカーのプロトコルに従って測定した。各サンプルの発光強度を測定し各サイトカインの濃度をQ-View商標ソフトウェアQuansysBiosciencesを使用して、5パラメータ曲線のフィッティングで分析した。マルチプレックスELISAから得られたサイトカイン濃度を、ビシンコニン酸アッセイPierce、Rockford、ILによって決定される個々のサンプルの全タンパク質含有量に対して正規化した。値は、各サンプルの全タンパク質含有量の1mgあたりの発現されたマウスサイトカインのピコグラムpgまたはフェムトグラムfgとして表現し、4匹のマウスの平均±S.D.を表わす。ヘマトキシリンエオシン染色による組織切片の組織学的分析組織サンプルは、ヘマトキシリンエオジン調査染色の光学顕微鏡法の使用によって、粘膜構造の変化、細胞浸潤、炎症、表在筋肥厚、腺窩膿瘍の存在、杯細胞枯渇、水腫の兆候、表面の上皮細胞過形成および上皮再生の兆候について評価された25、35。これらの値を使用して、処理群および対照群における粘膜損傷および修復の程度を査定する。非炎症/炎症の結腸の末端領域から採取された組織サンプルを10のホルマリン溶液中で少なくとも2日間4°Cで保存して組織を固定した。その後に、サンプルをPBSで洗浄して過剰なホルマリン溶液を取り除き、次いで凍結による損傷からの保護を目的として30w/wスクロース溶液へ2日間移して、続いて行なわれる組織の凍結切片の作成のために調製した。7μm厚の組織切片をメーカーによって供給されたプロトコルに従ってヘマトキシリンエオジンで染色し、続いて明視野顕微鏡OlympusBX51TRF、OlympusAmerica、CenterValley、PAを使用して画像化した。組織ミエロペルオキシダーゼ活性の決定組織ミエロペルオキシダーゼ活性はCellTechnology,Inc.MountainView、CAから購入したFluoroMPOキットで検出した。この調製において、組織サンプルを、氷上のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド緩衝液50mMリン酸緩衝液中で0.5中でミンスおよびホモジナイズした。ホモジネートを超音波で処理し、凍結融解サイクルを行い、10000rpmで3分間遠心分離した。特定の既知の量の組織溶解物上清を、H2O2、非蛍光検出試薬および1×アッセイ緩衝液を含む検出混合物と合わせた。検出試薬は過酸化水素およびMPOの存在下において酸化されて蛍光アナログを産生し、それを530nmの励起波長および590nmの放射波長で測定した。報告された値をサンプルの全タンパク質含有量のmgに対して正規化した。統計解析示されたデータはすべて、平均±標準偏差S.D.として表わされる。対照群と処理群との間の統計的な差はスチューデントのt検定を使用して決定した。結果経口TNF-cc遺伝子サイレンシングのためのNiMOSNiMOSのイラストおよびsiRNAカプセル化ゼラチンナノ粒子およびマイクロスフェアの走査型電子顕微鏡写真を図13A中で示す。溶媒置換方法を使用して、279.2nm±3.2nmの平均径を備えたsiRNAをカプセル化する球形ゼラチンナノ粒子が産生された。胃腸通過の間のpHおよび酵素による分解からの追加の保護のために、ナノ粒子をPCLマイクロスフェア中でさらにカプセル化してNiMOSを生成した。これらは、比較的平滑な表面形態を備えたかなり一様な形状およびサイズであり、ブランクのカプセル化マイクロ粒子およびsiRNAカプセル化マイクロ粒子についてそれぞれ2.4μmから3.2μmの範囲の直径であった図13C。siRNAが製造プロセスの間の影響を受けないこと、および粒子が分解酵素の存在下においてこのペイロードを効率的に保護できることを確認するために、抽出したsiRNAの安定性をアガロースゲル電気泳動によって評価した。これらの研究に基づいて、カプセル化はsiRNAの構造またはサイズに影響を与えるとは考えられない図13B。例えば、ゼラチンナノ粒子レーン5およびNiMOSレーン7および8からのsiRNAは、対照siRNAレーン2と同じサイズを有していた。さらにプロテアーゼ添加はsiRNAに対する有害作用を有していなかったレーン3。加えて、NiMOSはペイロードに対する保護的効果を有すると考えられる。これはレーン7中のバンドによって実証された。NiMOSをRNAseAへ曝露し、続いて酵素の不活性化およびsiRNAの抽出を行うと、対照相当物と同じサイズの断片が示された。しかしながら、プロテアーゼおよびRNAseへ曝露された場合、ゼラチンナノ粒子から放出されたsiRNAは完全に分解されたレーン6、9。プロテアーゼへのNiMOSの曝露は単独でsiRNAを遊離しなかったバンドなし;レーン11。カプセル化されたsiRNAの定量化により、ゼラチンナノ粒子におけるローディング効率が90.2±5.4であることが明らかになった。NiMOSにおける最終的なsiRNAローディング効率は、添加されたsiRNAの55.2±2.8であると測定された。急性DSS誘導性大腸炎モデル飲料水におけるDSS投与5日後に、マウスは、体重減少図14A、下痢、直腸出血、およびミエロペルオキシダーゼ値の上昇によって証明されるような炎症の兆候図14B、有意な程度の白血球浸潤、および杯細胞枯渇を含む異常な粘膜構造図14Cを含む、IBDの典型的な病徴を示した。TNF-α遺伝子サイレンシング定量的リアルタイムPCRqPCR分析を実行して、研究10日目および14日目でmRNAのレベルでマウスTNF-αの発現を査定する図15A。10日目に、TNF-αmRNA転写物はTNF-αsiRNAカプセル化NiMOSを投与した処理群において最低だった。この時間ポイントで、最高値はブランクのNiMOSを投与された対照群において観察された。14日目で、ブランクのNiMOS、スクランブル化NiMOS、またはTNF-αNiMOSを投与した動物のTNF-αmRNAのレベルにおいて、有意な差は観察されなかった。さらに、マウスTNF-αタンパク質レベルを商業的に入手可能なELISAを使用して決定した図15B。全体として、TNF-αNiMOSを投与した群は、両方の時間ポイントで最低の発現レベルであり、14日目でおよその3倍の減少であった。10および14日目でタンパク質濃度はDSS対照群において最も高かった。ここで、TNF-αNiMOSで処理した動物において測定されたレベルと比較して、およそ5倍の増加が観察された。炎症誘発性サイトカインおよびケモカインのプロファイルNiMOSの3用量の経口投与に際して、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの発現プロファイルを、ELISAによって測定した図16。全体として、炎症誘発性サイトカインはDSSへ曝露されなかった健康な群対照において最低であった。それゆえ、大腸炎は誘導されず、炎症の特徴は示されなかった。インターロイキンIL-1αおよびIL-1βの発現はDSS対照群において10日目でアップレギュレートされ、それぞれ135および57pg/mg全タンパク質の値に到達した図16A、16B。濃度の有意な減少は14日目で観察されなかった。他のすべてのNiMOS群において、10日目でIL-1αについてブランクのNiMOS処理群と比較した場合、2分の1未満の発現レベルが検出された。しかしながら、14日目で、IL-1αおよびIL-1βの濃度は他のすべての大腸炎群とは対照的に、TNF-αNiMOS群において最低であり、残りの群とは重要な差はなかったが、DSS対照と比較して、5および3倍を超えるダウンレギュレーションを示した。研究において試験されたすべての大腸炎を有する動物のうちで、10日目で、IL-1、IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-12p70およびIL-17図16C~16Hの最低の濃度は、スクランブルNiMOS群において測定され、一方IL-12p70レベルはTNF-αNiMOS群において最も高かった。DSS対照は残りのサイトカインについて最も高い発現レベルであった。IL-1αおよびβにおいて観察されるように、上で言及された炎症誘発性サイトカインのレベルは、14日目で、大腸炎対照群および処理群よりもTNF-αNiMOSマウスにおいて有意に低かった。研究10日目で、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSFおよび単球炎症性タンパク質MIP-1αのレベルは、3つのNiMOS群すべてにおいて有意な変動を示さなかった。レベルはそれぞれ約1.8pg/mgおよび13pg/mg全タンパク質であり、一方残りの大腸炎群はこれらの値の約2.5倍の濃度に達した図16I。GMCSFの正常な濃度は0.65pg/mg全タンパク質と測定されたが、MIP-1α値はアッセイの検出限界以下であったことに注目すべきである。図16Kは、14日目で両方のケモカインがすべての大腸炎群に対してTNF-αNiMOS群において有意に減少し、1mg全タンパク質あたり0.45pgGMCSFおよび4.5pgMIP-1αの値に到達したことを示す。これは、それぞれ、大腸炎群と比較して、ケモカインの10倍および6倍以上の減少と同等であり、ブランクのNiMOSおよびスクランブル化NiMOSと比較して、6倍および3倍の減少である。ブランクのNiMOSおよびスクランブル化NiMOSは、これらの2つのケモカインについて同レベルを示し、mg全タンパク質あたり約2.7pgGMCSFおよび13pgMIP-1αの値であった。類似した結果は14日目で単球走化性タンパク質MCP-1について観察された。結腸組織の組織病理学ヘマトキシリンエオシン染色した大腸からの凍結切片を、急性結腸炎の誘導およびTNF-αNiMOSによる炎症の治療に際して組織学的レベルで起こる変化について評価した図17。対照群からの組織は炎症または健康な組織形態の破壊の兆候を持たない正常な結腸組織学を有しており、残りのサンプルに対する比較のためのベースラインとして供給された。これとは対照的に、DSS対照、ブランクのNiMOSを投与した群およびスクランブル化NiMOSを投与した群からの腸組織は、細胞浸潤、杯細胞枯渇および先に記載されるような不規則な粘膜構造を含む、炎症の明らかな兆候を示し、それは研究が進んでも実質的に軽減されなかった。一方、TNF-αNiMOS群からの組織は炎症のレベルのかなりの減少を示し、上皮再生の兆候を示し、健康なベースライン組織と類似する形態的組織構造を示した。治療有効性大腸炎を誘導したマウスの体重の変化を、様々な処理の投与後に対照と比較して評価した図18。2、4および6日目で、胃および胃腸管の他の部分中の食品が処方の投与に際して投薬および分析を妨害することが公知であるので、すべての群からのマウスは一貫性のために一晩絶食させた。翌朝マウスに、ブランクのNiMOS、TNF-αNiMOSまたはスクランブル化NiMOSを経口投与した。絶食はすべての群において約10の体重喪失を引き起こしたので図18A、体重の正常化が起こるようにするために一日おきにマウスに投与した。対照群における体重は最終投与後に安定化し、研究の開始時の体重よりも約5高いところで横ばいになった。DSS対照、ブランクのNiMOSおよびスクランブル化NiMOSの動物についての体重減少は、最終経口投与後に速やかに起こり、それぞれの値は14日目で、もとの体重の19、26、および18の減少であった。すべての大腸炎群のうち、約8の最も少ない体重喪失がTNF-αNiMOS群において観察された。さらに、この群において全般的な外観は健康なマウスに非常に近く、先に記述された残りの大腸炎マウス多数の動物における急性結腸炎と関連する古典的特徴を示すとは対照的に、大腸炎の重症の病徴はなかった。結腸長を査定し、図14B中に報告した。対照マウスは約8.8cmの結腸長を有していた。結腸長の有意な低下はDSS大腸炎の誘導に際して観察され、約6cmの値であった。ブランクのNiMOSおよびスクランブル化配列siRNANiMOSで処理したマウスも大腸炎対照と同等の結腸の短縮を示した。TNF-αNiMOS群については、約8cmへの結腸長の増加が観察され、それは残りの大腸炎群と比較してベースラインに近かった。加えて、ミエロペルオキシダーゼの活性を、活性化された好中球の浸潤に基づく炎症の指標マーカーとして測定した図18C、14C。約4mUおよび3mU/mg全タンパク質が、10日目および14でDSS大腸炎の誘導に際してマウスにおいてそれぞれ検出され、それはブランクのNiMOSおよびスクランブル化NiMOSで処理した動物の組織において観察された活性と同等であった。TNF-αNiMOS群におけるMPO活性は両方の時間ポイントでより低く、それぞれ3.4および3.1mU/mg全タンパク質の値に達していた。14日目では、この値は他の大腸炎マウスにおいて検出された活性と比較して有意に減少していなかったが、それは健康な対照群のベースライン値よりもわずかに低かった。14日目で、より高い程度の炎症が、わずかに低い浸潤と共に、DSS対照、ブランクのNiMOS群およびスクランブル化NiMOS群において観察されることが見出された。結果要約本開示は、siRNAの経口投与を介する局所治療を可能にする生体分解性ポリマーのナノ微粒子およびマイクロ微粒子システムの安全性とRNA干渉のプラスの面を組み合わせる局所的IBD治療を使用する。このオプションは、局所療法に起因してより低用量/より少数の用量であること、および全身投与と関連する薬剤の相対的希釈がないこと、より少ない副作用、ならびにより高い有効性を含む複数の長所を提供することができる。本明細書において開示されるのは、他の疾患タイプおよびモデルへ適用可能な、新規の生体分解性および生体適合性ポリマーベースのシステムである。TNF-αをコードするsiRNAは成功してカプセル化され、続いてDSS誘導性大腸炎マウスへの経口投与を行い、炎症に関与するRNAサイレンシングの効率および実行可能性を評価した。この疾患モデルは最も高頻度で使用されるげっ歯類IBDモデルの1つであるので選択された。動物の飲料水中のDSSを自由に供給することは、疾患の予測可能な開始および経過、ならびに死亡率のより低いリスクを提供する。経口siRNA送達の課題の中には、胃および腸内酵素によるペイロードの最小分解と腸における粒子の最大の滞留時間を保証することがある。これは、標的細胞との十分な相互作用を可能にし、サイトゾル中での効果的なサイレンシングのための細胞の取り込みおよびエンドソーム放出を支援する。この目的に対して、最も内側のナノ粒子相中で親水性に対して不安定なペイロードを運ぶNiMOSを開発した。かかるシステムは、外側層の制御された分解によってペイロードの経時的な放出が可能である。このプラットフォームはプラスミドDNAの効率的なカプセル化を示し、細胞内取り込みおよび核輸送を可能にするが、遺伝子トランスフェクションのために安全で効果的であり、siRNAのカプセル化に容易に適合させることができる。さらに、タイプBゼラチンは物理的にpDNAおよびsiRNAをトラップし細胞内輸送の間にペイロードを保護することができるので、タイプBゼラチンをナノ粒子処方のために選択したが;他のより一般的なシステムは表面吸着または静電複合体形成に依存してsiRNAを運ぶ。結果は、NiMOSが、PCLマイクロスフェアの内部のナノ粒子内にカプセル化されたsiRNAを、胃腸バリアおよびタンパク質分解酵素による分解から効果的に保護できることを示し;放出は腸の炎症の部位で起こると予想される。さらに、5μm未満のサイズを備えたマイクロスフェアは、一旦PCLマトリックス、エンドサイトーシスを可能にする胃管において豊富に存在するリパーゼによって分解されれば、腸細胞およびこれらの部位の他の細胞へのゼラチンナノ粒子の送達によって、腸における局在を促進する。それゆえ、これはsiRNAカプセル化および送達のための効果的なシステムである。TNF-αNiMOS群において、両方の時間ポイントのリアルタイムPCRの分析は非常に低いレベルのマウスTNF-αを示し、それは10日目で健康な対照マウスにおいて観察されたレベルに類似していた。これはNiMOSのサイレンシング効果に帰着され、残りの大腸炎を有する群では観察されなかった。14日目ですべてのNiMOS群においてTNF-αmRNAの発現が相対的に減少しているのは、大腸炎の誘導に起因する代償性反応をもたらす炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの複雑な相互作用におそらく帰着させることができる。ELISA結果はリアルタイムPCR分析と良好な相関性があった。残りの大腸炎を有する群と比較して、TNF-αNiMOS動物において、両方の時間ポイントでのTNF-αおよび14日目での大部分のサイトカインでより低いレベルが観察され、経口投与およびRNAサイレンシングのためのTNF-αsiRNANiMOSの高い能力を明瞭に示すが、炎症誘発性サイトカインレベルの上昇はブランクのNiMOS群およびスクランブル化において検出された。TNF-αのダウンレギュレーションに起因する多くのサイトカインのより低い発現は、疾患部位で炎症の軽減をもたらすことができた。これは、体重減少度の軽減、および非常に少数の異常しかない再生の兆候を示す結腸組織形態においても反映されていた。しかしながら、3回のNiMOS用量すべての投与の直後では、サイトカインのダウンレギュレーションは、TNF-α群において同じほどには顕著ではなく、残りのNiMOSで処理した対照マウスと比較して、発現レベルはわずかに高かった。この効果はTNF-αsiRNAの特異性に帰着させることができ、それはTNF-αのサイレンシングをもたらし、短時間後に他のマーカーに対して即時効果はなかった。さらに、この群においてサイレンシングに起因するTNF-αのより低発現は、他の炎症誘発性サイトカインのダウンレギュレーションに先行した。さらに、14日目で、疾患部位で細胞浸潤を調節し、したがって直接炎症反応に寄与するマーカーであるGMCSFおよびMIP-1αおよびMCP-1等の特定のケモカインにおける発現減少が見られた。例えば、MIP-1αの全身投与はマウスモデルにおいて大腸炎をかなり悪化させることが示されている。したがって、TNF-αNiMOS群において観察されるようなMIP-1αの発現レベルの低下は、疾患の重症度の減少を示し、TNF-αサイレンシング処理の治療有効性を示唆する。実施例5非ウイルス性遺伝子送達システム多重エマルジョンの最も内側の相中にカプセル化された場合、ゼラチン非縮合ポリマーは効果的な遺伝子トランスフェクションを引き起こすことができる。緑色蛍光タンパク質発現プラスミドDNAEGFP-N1トランスフェクション効率の評価を、マウス接着肺胞マクロファージJ77A.1で行った。1.ゼラチンエマルジョン中ナノ粒子型NiE処方の調製および特徴づけゼラチンナノ粒子の調製および特徴づけ:ゼラチンナノ粒子GNPを溶媒置換法によって調製した。簡潔には、100mgのタイプBゼラチンブルーム強度225SigmaAldrichを、10mlの水中に37°Cで溶解した。この工程後に、0.2MのNaOH溶液を使用して、pHを7に調節した。逆溶媒としてエタノールを使用して、水溶液からゼラチン粒子を沈殿させた。エタノール水の最終的な比を4:1へ最適化した。ゼラチン溶液への添加前に、逆溶媒効果を促進するためにエタノール溶液の温度を-40°Cに下げた。強化緑色蛍光タンパク質EGFP発現プラスミドDNAEGFP-N1を、可溶化したゼラチンのうちの1w/wの濃度で添加した。あるいは、細胞取り込み研究のために、ローダミンコンジュゲートデキストラン分子量70kDaを、物理的カプセル化のためのpH調整後に、ゼラチンのうちの0.5w/wの最終濃度でゼラチン溶液へ添加した。沈殿させた粒子は、Beckman超遠心分離機を使用して、35000rpmで45分間遠心分離した。ナノ粒子ペレットを回収し、液体窒素中に急速凍結し、脱イオン水で洗浄し、24時間凍結乾燥して、乾燥粉末を得た。エマルジョン中ナノ粒子型NiE処方の処方:水中油中水型W/O/W多重エマルジョンは、三相外側の水相によって包まれた油小球中に含まれる内側の水溶性液滴からなる三相性のシステムである。W/O/W多重エマルジョンは2工程のエマルジョン化方法によって処方された。オメガ-3多価不飽和脂肪酸およびオメガ-6多価不飽和脂肪酸中に富む超純粋サフラワー油Jedwards,Inc.、Quincy、MAを、エマルジョンの油相のために使用した。サフラワー油は高レベルのトコフェロールを含み、炎症誘発性サイトカインの腫瘍壊死因子アルファおよびインターロイキン1ベータのレベルに対して負の効果があることは報告されている。さらに、トコフェロールは酸化防止活性を発揮することが示されており、活性酸素種によって媒介される急性炎症に対する保護を提供し得る。第1の工程は、油溶性界面活性剤Span登録商標80を使用するW/O一次エマルジョンの処方からなっていた。ネイキッドプラスミドMEまたはゼラチンナノ粒子NiE中にカプセル化されたプラスミドを、一次エマルジョンの水相中に取り込み、50μg/mlの最終濃度のW/O/W多重エマルジョンとした。最適化した処方における適切な量の各成分は表7中にリストされる。カプセル化されたネイキッドプラスミドDNAによる安定した一次W/Oエマルジョン、またはDNAがカプセル化されたナノ粒子による分散として安定した一次W/Oエマルジョンを、SilversonホモジナイザーL4RTを9000rpmの速度で15分間使用して形成した。一次エマルジョンの分散物を、水溶性界面活性剤Tween登録商標80からなる追加の水相と混合した。処方を4000rpmで4分間ホモジナイゼーションによって調製した。この工程において4000rpmを越えるまで速度を増加させることは、多重エマルジョン小球の破壊をもたらした。表7:最適化した一次エマルジョンおよび多重エマルジョンまたは分散処方の組成物対照およびプラスミドDNAがカプセル化されたナノ粒子のサイズおよび表面電荷ζ電位値は、超遠心前または超遠心後にMalvernのZetasizer登録商標を使用して測定した。表8中に示される結果は、粒子サイズが直径160nm~170nmの範囲であり、ζ電位値が負であったことを示す。タイプBゼラチンの等電点が4.5~5.5の範囲であるので、形成されたナノ粒子はpH7.4で正味の負電荷を有するだろう。プラスミドDNAは、正に荷電した脂質およびポリマーによる静電的縮合とは対照的に、タイプBゼラチンバイオポリマーのヒドロゲルタイプマトリックス中に物理的にカプセル化される。表8.ブランクのタイプBゼラチンナノ粒子およびプラスミドDNAがカプセル化されたタイプBゼラチンナノ粒子の粒子サイズおよび表面電荷値平均±標準偏差n=3エマルジョン中ナノ粒子型NiEの三相性システムの安定性を、加速遠心分離および異なる条件下での相分離の評価を使用して評価した。多重エマルジョンまたはNiEを4000rpmで1時間遠心分離した場合、顕微鏡による評価で観察される相分離はなかった。加えて、溶脱および放出に対する水性溶媒中での1000倍までの希釈の効果を、W/O一次エマルジョンの中への直接投与またはナノ粒子カプセル化に際しての投与のいずれか場合について、ローダミン標識デキストランの蛍光顕微鏡検査法によって検査した。予備的な安定性研究の結果は、W/O/W処方およびNiE処方の両方は、保存に際しておよび加速遠心分離サイクル後でさえ相分離しないことを示した。加えて、図19中に示されるように、内側の水相中の内面化したローダミン-デキストラン、またはゼラチンナノ粒子中にカプセル化された場合は、4°Cで7日間のインキュベーション後でさえ外部水相中のそれらの内容物を放出しなかった。2.プラスミドDNAカプセル化および安定性研究プラスミドDNAローディング研究:NiE、MEおよびGNP処方におけるpEGFP-N1のローディング効率を、Quant-iT商標PicoGreen登録商標dsDNA試薬InvitrogenおよびCarlsbad、CAの使用によって評価した。PicoGreen登録商標dsDNA試薬は、二本鎖DNAの定量化のために非常に感受性の高い蛍光染色法である。この目的のために、NiEおよびMEに、多重エマルジョンの内部相中に50μg/mlの最終的な濃度でpEGFP-N1をロードした。GNPにpEGFP-N1の1w/wをロードし、そのうちの40mgは多重エマルジョンの内部相中に取り込まれた。凍結乾燥したGNPからのカプセル化されたpEGFP-N1の抽出は、1mlのPBS0.2mg/mlのプロテアーゼを含むにより1mgのゼラチン粒子を37°Cで30分間インキュベーションすることによって行なわれた。ME処方については、pEGFP-N1を、最初に体積の1/10の5MNaClの添加によりエマルジョンを不安定にすること、続いて20000rpmで30分間遠心分離することによって抽出した。このプロセス後に、油および水の層は、2つの別の層へ分離されるようになった。油性層の廃棄後に、水層をPBSで2μg/mlの濃度へ200倍希釈した。この希釈溶液の10μlをDNAローディングの評価のために使用した。NiEの場合において、1mlのエマルジョンを5MNaClの100μlにより脱安定化し、20000rpmで30分間遠心分離した。得られたGNPペレットを、粒子からのEGFP-N1プラスミドDNAの放出のために5mlのプロテアーゼ緩衝液により37°Cで30分間処理した。ブランクのゼラチン粒子およびブランクの内側の水相とのエマルジョンまたは内側の水相中のブランクのゼラチン粒子は、プラスミドをロードした処方と同じ抽出処理を実行した後、対照として使用された。検量曲線を得るために、PBS中の異なる既知の基準濃度のEGFP-N1プラスミドDNAを調製した。100μlのPicoGreen登録商標アッセイ試薬を96ウェルプレートのウェルへ添加し、続いて、規準溶液、サンプル溶液または対照溶液のいずれかを100μl添加した。96ウェルプレートを遮光して室温で5分間インキュベーションし、次いで、蛍光強度を、KC4ソフトウェアと共にBio-TekWinooski、VTSynergy登録商標HTマイクロプレートリーダーを使用して、480nmの励起波長および520の放射波長で測定した。EGFP-N1プラスミドDNAの安定性:ゲルリタデーションアッセイを実行してNiE、MEおよびGNP中にカプセル化されたプラスミドDNAの安定性を評価し、処方のプロセスの間のプラスミドDNAの物理的および化学的な安定性を確認した。この目的のために、E-Gel登録商標1.2をSYBRSafe商標Invitrogen、Carlsbad、CAと共に使用した。SYBRSafeによるDNA染色は、変異および染色体変化を引き起こし得るエチジウムブロマイドと比較して、より安全であるという長所を有する。アガロースゲル電気泳動は、負に荷電したDNAがゲルを介して正極に移動する、電場の影響下でのアガロースゲルを介するDNAの移動を意味する。このプロセスにおいて、より大きなサイズのDNA断片は、より小さなサイズのDNA断片と比較して、アガロースゲルを介してより遅く移動する。DNAがゲルを介して移動するにつれて、DNAのサイズ依存性の分離を時間と共にもたらす。電気泳動のプロセス後に形成されたバンドは、青色光UVトランスルミネセンス下で可視化することができる。エマルジョン化のプロセスの間に、プラスミドDNAが断片へと破壊されていれば、複数のバンドがアガロースゲル上で観察されるだろう。あるいは、プラスミドDNAが処方プロセスの間にスーパーコイル化形態で安定していれば、プラスミドDNAの単一バンドが観察されるだろう。プラスミドDNAのサイズを決定するために、スーパーコイルDNAラダーInvitrogen、Carlsbad、CAを使用した。この研究下では、pEGFP-N1を含む3つの処方NiE、MEおよびGNPを、プラスミドEGFP-N1安定性について試験した。上で言及されるように、EGFP-N1プラスミドDNAをNiE、MEおよびGNP処方から抽出し、1.2のE-Gelカセット登録商標Invitrogen、Carlsbad、CAの1ウェルあたり20μlのローディング緩衝液中に100ngの濃度でロードした。EGFP-N1プラスミドDNAローディング効率は、最初に添加したプラスミドと比較して、ロードしたプラスミドのパーセンテージとして計算された。表9中に示す結果は、保護のないネイキッドプラスミドがMEの内部相中に存在するME処方と比較して、プラスミドがNiE処方においてGNP中のカプセル化による保護される場合、プラスミドローディング効率が増加したことを示す。後に、ブランクのエマルジョン処方の個別の群に、エマルジョン化プロセスの両方の工程の完了後にEGFP-N1プラスミドDNAを最終的に添加した。次いで、類似のプラスミド抽出手技を実行した。これらの実験から、アッセイされたプラスミドの量は最終的に添加されたものの99.16±0.35であることが見出された。この結果から、プラスミドローディング効率の減少は高剪断ホモジナイゼーションプロセスのためであり得ることを示された。表9:タイプBゼラチン粒子中およびエマルジョン中ナノ粒子型処方中のプラスミドDNAカプセル化効率平均±S.En=3プラスミドDNA安定性についての分析のためにアガロースゲル電気泳動を使用した。図20中に図示されるように、4.7kbサイズのpEGFP-N1の単一バンドが3処方すべてについて観察され、EGFP-N1プラスミドDNAは処方プロセスの全体にわたってその安定性を保持することを示す。対照処方をロードしたウェルはバンドを示さなかった。3.細胞の取り込みおよび細胞内トラフィッキング研究細胞培養条件:ウシ胎仔血清およびペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を補足したダルベッコ変法イーグル培地DMEMを使用して、接着マウス肺胞マクロファージJ774A.1細胞ATTC、Rockville、MDをT75培養フラスコ中で培養した。細胞は所望の密度に到達するまで分裂させた。細胞カウントは、血球計数スライド上に20μlの細胞懸濁物混合物を置くことによって推定した。細胞生存率研究はトリパンブルー色素排除アッセイを使用して実行した。細胞の取り込みおよび局在研究:マクロファージ中のNiEおよびMEの取り込みならびに細胞内局在を評価するために、ローダミン-デキストラン分子量70kDaを、多重エマルジョンへと処方する前に、一次W/Oエマルジョンの内部水相中またはゼラチンナノ粒子中にカプセル化した。両方の処方において取り込まれたローダミン-デキストランの最終的な濃度は、0.0025w/vであった。NiEの場合において、0.5w/wのローダミン-デキストランがカプセル化されたゼラチン粒子の40mgを、多重エマルジョンの内部相へ添加し、一方ME処方の場合においてローダミンデキストランの25mg/mlの溶液の8μlを多重エマルジョンの内部相へ取り込ませた。約200000の細胞をアルコール滅菌したガラスカバースリップを含む6ウェルプレートの各ウェル中にプレーティングし、対照および試験の処方による処理前に12時間接着させた。内側の水相中に可溶化された0.0025w/vのローダミン-デキストランを含む多重エマルジョン、またはゼラチン粒子中にカプセル化された0.0025w/vのローダミン-デキストランを含み、その粒子を次いでW/O/Wエマルジョンの内部水相へ添加した多重エマルジョンのいずれかを細胞にを与えた。ブランクの水相またはブランクのゼラチンナノ粒子により調製された多重エマルジョンを、対照として使用した。対照および試験の処方によるインキュベーションの60分、90分および120分後に、細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水PBS、pH7.4で洗浄し、カバーグラスをウェルから除去し、清浄なスライドグラス上にマウントした。サンプルは、BioQuant画像解析システムを装備したOlympus蛍光顕微鏡により観察した。細胞内DNAトラフィッキング研究:プラスミドEGFP-N1を含有するNiE処方の細胞の取り込みならびに細胞内輸送を理解するために、DNAトラフィッキング研究を実行した。この目的に向けて、0.5w/wの濃度でGNPへ共有結合された蛍光色素ローダミンBイソチオシアネートSt.Louis、MOを使用してNiEを標識し、その結果NiEにおいて0.0025w/vの最終的な色素濃度をもたらされた。DNAはPicoGreen登録商標試薬Invitrogen、Carlsbad、CAを使用して標識した。細胞の核はHoechst登録商標33245色素Invitrogen、Carlsbad、CAを使用して染色した。約200000のJ774A.1マクロファージ細胞を6ウェルプレート中にプレーティングし、蛍光標識したNiE処方で処理した。1、2、4および6時間のNiE処方による細胞のインキュベーション後に、青色、赤色および緑色の蛍光の可視化のために460/50nm、515/30nmおよび560/55nmの励起/放射波長の水銀アークランプを有するNikonEclipse登録商標TE200顕微鏡を使用して、画像を得た。NiE、プラスミドEGFP-N1および細胞の核によって発光される異なる蛍光シグナルに基づいて、細胞の核に対するNiEおよびプラスミドEGFP-N1の局在を可視化した。類似の研究を、ローダミンをコンジュゲートしたGNP単独、および多重エマルジョンの最も内側の水相中に溶解されたローダミン標識デキストラン分子量70000を含むMEを使用して実行した。図21中の顕微鏡画像は、ローダミン-デキストランを含有するW/O/WエマルジョンおよびNiE処方がマウス肺胞マクロファージJ774A.1細胞中に迅速に内部移行されたことを示す。時間が進むにつれて、蛍光強度の増加は観察され、それは曝露の120分後に最大になった。異なる処方の細胞核内へのDNAの送達能力を査定するために、DNAトラフィッキング研究も実行した。これらの研究の結果を図22中に示す。GNP、MEおよびNiEの細胞内部移行は、処方処理後30分の時間ポイントで開始することが観察された。最初の30分の時間ポイントでは、粒子は細胞核からさらに離れていた。異なる処方による処理後2および4時間の時間ポイントから開始して、粒子と核との間の距離が減少し、緑色および青色の共局在も観察された。これは、GNP、MEまたはNiE処方を介して送達されたDNAが、処方のインキュベーションの2~4時間以内に細胞の核コンパートメントに到達できることを示した。時間にともなう処方の細胞内取り込みの増加と共に、時間にともなうDNAの核共局在の増加も観察され、細胞核に向けて周囲から粒子が移動することを示す。6時間のタイムポイントで、赤色は核膜腔の付近に局在し、一方大部分の緑色は青色と共局在した。これらの結果はGNP、MEおよびNiEが細胞の核コンパートメント内にDNAを送達できたことを示す。4.レポーターGFP遺伝子導入研究定性的な遺伝子導入研究:上記の処方がマウス肺胞マクロファージ細胞株において遺伝子トランスフェクションを引き起こすことができたかを決定するために、遺伝子トランスフェクション研究を実行した。この目的のために、プラスミドEGFP-N1強化緑色蛍光タンパク質EGFPを発現するレポータープラスミドを使用した。NiE、MEおよびGNP処方について遺伝子導入研究を実行した。EGFP-N1プラスミドDNAがNiEおよびMEの中へ50μg/mlの最終的な濃度で取り込まれた。NiEの場合において、1w/wのEGFP-N1プラスミドをロードした40mgのゼラチン粒子を、W/O/W多重エマルジョンの内側の水相へ添加し、一方MEの場合において、400μlの1mg/mlのEGFP-N1の溶液が多重エマルジョンの最も内側の水相中に取り込まれた。Lipofectin登録商標商業的に入手可能な正に荷電した脂質トランスフェクション試薬によるEGFP-N1プラスミドDNAのトランスフェクションを、陽性対照として使用した。ブランクの処方で処理した細胞を陰性対照として使用した。アルコール滅菌したカバーグラスを6ウェルプレートの各ウェル中に置いた。約200000の接着肺胞マクロファージ細胞を、10FBSおよび5ペニシリン-ストレプトマイシンにより修飾したDMEMを使用して、6ウェルプレートの各ウェル中に接種し、12時間にわたりカバーグラスに接着させた。この期間後に、細胞による処方の十分な取り込みを可能にするために、血清含有培地を、無血清培地を含む処方で置換し、続いて37°Cで6時間インキュベーションした。6時間後に、処方を含有する培地を、10FBSおよび5ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質により修飾したDMEMで置換した。サンプルを、処理後1日目日~6日目でBioQuant画像解析システムを装備したOlympus蛍光顕微鏡により観察した。定量的遺伝子導入研究:上述の実験によって得られた結果をさらに確認するために、定量的遺伝子トランスフェクション研究を実行した。この目的のために、300000の接着肺胞マクロファージ細胞をT25フラスコ中に接種した。接種12時間後、NiE、ME、またはGNPのいずれかで上で言及したEGFP-N1プラスミドDNAを含有する処方により、細胞を処理した。1つの細胞の群を、EGFP-N1と複合体化された正に荷電した脂質Lipofectin登録商標で処理し、陽性対照とした。加えて、ブランクの処方で処理した細胞を陰性対照とした。無血清DMEM中で6時間異なる処方により細胞を処理した後に、24、48、72、96、120および144時間にわたって37°Cで細胞をインキュベーションした。各時間ポイントの完了後に、全細胞質タンパク質を400μlの細胞溶解緩衝液を使用する細胞溶解によって4°Cで抽出した。タンパク質レベルの定量化のために使用するまで、サンプルを-80°Cで保存した。ThermoFisherScientificによるBCA登録商標ビスシンコニン酸タンパク質分析を、全タンパク質濃度の評価のために使用した。BCAアッセイは、Cu2イオンとのアミノ酸残基の反応を含み、そしてそれはビウレット反応によるCu1イオンの形成をもたらす。上述の反応において形成されたCu1イオンはビスシンコニン酸と反応し、562nmで直線状の吸光度を示す可溶性の紫色の複合体の形成をもたらす。異なる濃度のアルブミンの規準を使用して検量曲線をプロットし、各サンプルから全タンパク質濃度の評価のために使用した。全タンパク質濃度の評価後に、緑色蛍光タンパク質特異的ELISAを実行した。サンドイッチELISAのためのELISAプレートを調製した。この目的に向けて、一次抗EGFPモノクローナル抗体NovusBiologics、Littleton、COを、1:4000希釈で、各ウェルの底面への抗体の付着のために各ウェルへ添加した。室温での2時間のインキュベーション後に、ウェルをPBS-Tween80で4~5回洗浄して未結合の抗体を取り除いた。次いで非特異的結合部位をstarlingsuperblockFisherScientific、Milwaukee、WIの使用によってブロッキングした。ウェルをPBS-Tween登録商標80で4~5回洗浄した。次いで、100μlのGFPタンパク質の既知の基準濃度または細胞溶解後に得られた100μlの細胞上清を各ウェルへ添加し、続いて4°Cで一晩インキュベーションした。次いで、任意の未結合のタンパク質を取り除くために、すべてのウェルをPBS-Tween80で4~5回洗浄し、次いでアルカリフォスファターゼ酵素NovusBiologics、Littleton、COを付加したウサギポリクローナル抗EGFP二次抗体を、各ウェル中に添加した。室温での2時間のインキュベーション後に、未結合の二次抗体分子を取り除くために、ウェルをPBS-Tween80で再び4~5回洗浄した。この最終的な洗浄工程後に、すべてのウェルをアルカリ性リン酸塩基質により30分間インキュベーションした。0.5NのNaOHの添加によって反応を停止し、次いでKC4ソフトウェアと共にBio-Tek登録商標SynergyHTプレートリーダーを使用して408nmで吸光度を読み取った。サンプル中のEGFPの濃度を基準検量曲線から計算した。トランスフェクション効率は、全タンパク質の1ミリグラムあたりに存在するEGFPのナノグラムとして計算した。定性的導入遺伝子発現解析:蛍光顕微鏡をEGFP-N1遺伝子トランスフェクションの定性的な決定のために使用した。図23f中の顕微鏡画像は、NiE処方で処理した細胞において最高の遺伝子トランスフェクションが観察され、ME処方およびGNPの処方が続くことを示す。最大の緑色蛍光はNiE処方で処理した細胞において観察され、それは処理後24時間で開始し、2、3および4日目でレベルは維持され、続いて5および6日目で衰退した。これらの結果は、NiE処方が遺伝子トランスフェクションにおいては、ME処方またはGNP処方と比較してより良好だったことを示し、これはNiE処方が、処方の間処方1mlあたりのプラスミドDNAのより高いローディング効率をもたらすに加えて、エンドソーム/リソソームのコンパートメントにおけるプラスミドDNAの細胞内輸送の間に、プラスミドDNAのより良い保護を提供するためである。5.治療用IL-10遺伝子導入研究形質転換した大腸菌E.coliからのmIL-10プラスミドDNAの増幅、精製および単離:mIL-10プラスミドを形質転換した大腸菌をInvivogenSanDiego、CAから得た。液体寒天ブロスは、SigmaAldrichSt.Louis、MOから得られた35gのLB寒天粉末を1Lの脱イオン水中に溶解することによって調製され、121°Cで15分間オートクレーブ滅菌することによって滅菌された。凍結乾燥大腸菌細菌ディスクを液体ブロス寒天培地中に懸濁した。次いで細菌懸濁液を固形寒天プレート上にストリークし、細菌コロニーの増殖のために37°Cで12時間インキュベーションした。12時間後に、滅菌接種ループを使用して単一コロニーを取り、形質転換大腸菌の選択のために10μg/mlアンピシリン含有液体寒天ブロス培養培地へ移した。大腸菌を含有する培養フラスコは、温度調節インキュベーターシェーカー上で37°Cで16時間インキュベーションした。この工程の後に、プラスミドDNAの抽出、精製および単離をQiagenプラスミドメガキットを使用して実行した。プラスミドDNA抽出物の純度はA260/A280値の測定によって分析した。DNA濃度の定量化はPicoGreen登録商標アッセイInvitrogen、Carlsbad、CAを使用して行った。抽出したプラスミドmIL-10のサイズの決定のために、アガロースゲル電気泳動は、未消化のプラスミドまたはNewEnglandBiolabsIpswich、MAから得られたNheIおよびNcoI制限酵素で消化したプラスミドのいずれかにより実行した。mIL-10mRNA発現についてのRT-PCR分析:逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応はmRNAのレベルで遺伝子発現を同定するための技法である。mRNAのレベルでIL-10発現を定性的に分析するために、200000のJ774A.1細胞を、NiE、ME、GNP、Lipofectin登録商標またはネイキッドIL-10プラスミドにより6、12および24時間インキュベーションした。各時間ポイントの完了後に、全細胞のRNAをHighPureRNAIsolationKitRoche、Indianapolis、INを使用してキットプロトコルに従って細胞から抽出した。単離したRNAの定量化はNanoDrop登録商標2000c装置Thermo-FisherScientific、Wilmington、DEを使用して実行した。単離したRNA画分を、OneStepRT-PCRキットQiagen、Valencia、CAを使用し、IL-10およびβ-アクチンについての選択的なプライマーを使用して、キットのメーカープロトコルに従って、最終的なPCR産物に転換した。IL-10mRNAのcDNAへの転換のために使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ5’-CCAGCCTTATCGGAAATGA-3’および5’-TCTCACCCAGGGAATTCAAA-3’であった。β-アクチンmRNAのcDNAへの転換のために使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ5’-GTTACCAACTGGGACGACA-3’および5’-TGGCCATCTCCTGCTCGAA-3’であった。各反応のために添加した鋳型RNAの量は1μgであった。cDNA増幅のためのPCRサイクラー設定を表10中に示す。最終的なPCR産物を1.2アガロースE-gelsInvitrogen、CAで泳動し、cDNAバンドの可視化のためにKodakUV/NIR画像ステーションを使用した。表10:RT-PCR実験のためのPCRサイクラー設定ELISAによる定量的mIL-10トランスフェクション研究:ネイキッドプラスミドmIL-10、NiE、MEまたはGNPによって引き起こされたmIL-10遺伝子発現の定量的分析のために、mIL-10特異的ELISAを実行した。この目的に向けて、200000のJ774A.1細胞を6ウェルプレートの異なるウェル中にプレーティングした。細胞接着後、細胞を無血清DMEM培地中でmIL-10含有処方で6時間処理した。6時間後、細胞培養培地を、10FBSを含有する新鮮なDMEM培地で完全に置換した。細胞培養上清を、12時間、24時間、48時間、72時間および96時間の時間ポイントで回収し、-80°Cで保存した。mIL-10タンパク質ための呈色サンドイッチELISAプレートをRDSystemsMinneapolis、MNから購入した。ELISAアッセイをキットプロトコルに従って実行した。簡潔には、50μlのアッセイ希釈液および50μlの基準、サンプルまたは対照を、異なるウェルへ添加した。緩やかな混合後に、プレートをプレートシーラーにより覆い、2時間インキュベーションした。2時間後に、溶液を各ウェルから吸引し、ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄した。この工程後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした100μlの二次抗体を各ウェルへ添加し、2時間インキュベーションした。2時間後に、再び各ウェルから内容物を吸引し、ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄した。この工程後に、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンを含有する100μlの基質溶液を各ウェルの中へ添加し、遮光して30分間インキュベーションした。30分の終わりで、希塩酸を含有する停止溶液を添加し、KC4ソフトウェアを使用し、BioTekSynergyHTWinooski、VTプレートリーダーを使用して、540nmの補正波長と共に450nmの吸光度を読み取った。定量的導入遺伝子発現研究:EGFP-N1遺伝子トランスフェクションの定量的評価はEGFP-N1ELISAを使用して実行した。図24中に示される結果は、NiE処方が遺伝子トランスフェクションにおいて最も効果的であり、ME処方およびGNP処方が続くことを示す。NiEはトランスフェクション後24時間で遺伝子トランスフェクションの最高レベルを示し、4日目までレベルを維持し、続いて5および6日目で衰退した。6.IL-10遺伝子トランスフェクション媒介性の炎症誘発性サイトカインの抑制IL-10遺伝子トランスフェクション媒介性のTNFαおよびIL1β等の炎症誘発性サイトカインの抑制を評価するために、LPS刺激研究を実行した。この目的に向けて、200000のJ774A.1細胞を6ウェルプレートの異なるウェル中にプレーティングした。細胞接着後、細胞を無血清DMEM培地中でmIL-10含有処方で6時間処理した。6時間後、細胞培養培地を、10FBSを含有する新鮮なDMEM培地で完全に置換した。細胞培養上清を、12時間、24時間および48時間の時間ポイントで回収した。各時間ポイントの6時間前に、リポポリサッカライドLPSを、各ウェル中で100ng/mlの最終的な濃度で各ウェルへ添加した。各時間ポイントでのTNFαおよびIL1βmRNAのレベルの検出のためにRTPCR分析を使用した。RDsystemsMinneapolis、MNから得られたTNFαおよびIL1β特異的ELISAアッセイプレートを、各時間ポイントでの細胞培養上清中のTNFαおよびIL1βタンパク質レベルの検出のために使用した。各時間ポイントの完了後に、全細胞のRNAをHighPureRNAIsolationKitRoche、ドイツを使用して、キットプロトコルに従って細胞から抽出した。単離したRNAの定量化はNanoDrop登録商標2000c装置Thermo-Scientific、Delawareを使用して実行した。単離したRNA画分は、OneStepRT-PCRキットQiagen、Valencia、CAを使用し、TNFαおよびIL1βについての選択的なプライマーおよびβ-アクチンを使用して、キットのメーカープロトコルに従って、最終的なPCR産物に転換した。TNFαのcDNAへのmRNAの転換のために使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマー配列は、それぞれ5’-CATGAGCACAGAAAGCATGATC-3’および5’-CCTTCTCCAGCTGGAAGACT-3’であった。IL-1βのcDNAへのmRNAの転換のために使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマー配列は、それぞれ5’-GGCTGCTTCCAAACCTTTGA-3’および5’-GCTCATATGGGTCCGACAGC-3’であった。各反応のために添加した鋳型RNAの量は1μgであった。cDNA増幅のためのPCRサイクラー設定を表10中に示す。最終的なPCR産物を1.2アガロースE-gels登録商標Invitrogen、Carlsbad、CAで泳動し、cDNAバンドの可視化のためにKodakUV/NIR画像ステーションを使用した。TNFαおよびIL1βのELISA分析:ELISAアッセイをキットプロトコルに従って実行した。簡潔には、50μlのアッセイ希釈液および50μlの基準、サンプルまたは対照を、両方のプレート中の異なるウェルへ添加した。緩やかな混合後に、プレートをプレートシーラーにより覆い、2時間インキュベーションした。2時間後に、溶液を各ウェルから吸引し、ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄した。この工程後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートした100μlの二次抗体を各ウェルへ添加し、2時間インキュベーションした。2時間後に、再び各ウェルから内容物を吸引し、ウェルを1×洗浄緩衝液で5回洗浄した。この工程後に、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンを含有する100μlの基質溶液を各ウェルの中へ添加し、遮光して30分間インキュベーションした。30分の終わりで、希塩酸を含有する100μlの停止溶液を両方のプレートへ添加し、KC4ソフトウェアを使用し、BioTekSynergyHTプレートリーダーを使用して、540nmの補正波長と共に450nmの吸光度を読み取った。形質転換された大腸菌からのmIL-10プラスミドDNAの単離:プラスミド抽出物の純度の決定のために、A260/A280比を決定した。すべての抽出物についてのA260/280値は1.9~2.0のウィンドウ内にあり、プラスミド抽出物が少しもまたはごくわずかしかタンパク質混入物を含有しないことを示した。さらに、プラスミド抽出物を1.2アガロースE-gels登録商標で泳動した場合、約3.7キロ塩基対のサイズの完全な形のDNAバンドが観察された。抽出したプラスミド中のIL-10導入遺伝子の存在を決定するために、プラスミド抽出物を2つの制限酵素NheIおよびNcoIで消化した。消化したプラスミドを1.2アガロースE-gelで泳動した場合、IL-10形質転換大腸菌の供給業者によって記載されるように図25、IL-10導入遺伝子のサイズと相関した約500bpsのバンドが観察された。これらの結果は、mIL-10プラスミドが、安定した形態のタンパク質またはゲノム核酸不純物がないように単離および精製されたことを示す。mIL-10mRNA発現のためのRT-PCR分析:IL-10RT-PCRから得られた結果は、異なる時間ポイントで、IL-10mRNAはNiE処方で処理した細胞において最高の発現であり、ME処方およびGNP処方が続くことを示す。Lipofectamine標準的なトランスフェクション試薬と比較して、NiEはより高いIL-10mRNA発現を示した。結果を図26中に示す。ELISAによる定量的mIL-10遺伝子導入研究:mIL-10ELISAから得られた結果は、IL-10RT-PCR実験NiE処方が最高の遺伝子トランスフェクション効率を示し、MEおよびGNPが続くと相関していた。ELISA結果を図27中に図示する。TNFαおよびIL1βのRT-PCR分析:LPS誘導性の炎症誘発性サイトカインの発現および放出は、RT-PCR分析を使用して評価した。12時間および48時間の時間ポイントの終わりで、IL-10の遺伝子含有処方で前処理した細胞におけるTNFαおよびIL1βのレベルは、無処理細胞と比較してより低かった。試験された異なる処方の中で、mIL-10遺伝子トランスフェクションにおいて最も効果的なNiE処方はTNFαおよびIL1βの遺伝子転写を最高に抑制し、ME処方およびGNP処方が続くことを示した。この研究の結果を図28中に示す。ELISAによるTNFαおよびIL1βの発現解析:TNFαおよびIL1βについてのELISAを、IL-10をトランスフェクションしたJ774A.1細胞に対するLPS刺激後の異なる時間ポイントでの細胞培養上清中のこれらのサイトカインのレベルを定量するために実行した。結果図29および30は、NiEで処理した細胞においてTNFαおよびIL1βの両方を最高に抑制し、ME処方およびGNP処方が続くことを示した。これらの結果は、TNFαおよびIL1β等の炎症誘発性サイトカインの発現を抑制できる場合には、NiEを介して送達されたIL-10プラスミドが治療活性を有することを示す。この研究の結果は、W/O/W多重エマルジョンの最も内側の水相中にDNA含有固体ゼラチンナノ粒子をカプセル化してNiE処方を形成できることを示す。EGFP-N1プラスミドDNAまたはmIL-10プラスミドDNAをロードしたNiE処方は、J774A.1のマウス接着肺胞マクロファージ細胞株において持続的遺伝子トランスフェクションを生ずることができた。さらに、EGFP-N1またはmIL-10がMEまたはGNP中にカプセル化されたプラスミド、またはLipofectin登録商標陽イオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬と複合体化されたプラスミドと比較して、EGFP-N1またはmIL-10がNiE中にカプセル化されたたプラスミドは、優れた遺伝子トランスフェクション効率を有することが見出された。さらに、NiEを介して送達されたmIL-10は、LPSで刺激されたJ774A.1細胞において、炎症誘発性サイトカインTNFαおよびIL1βのレベルをダウンレギュレートできたことが確認された。同等物当業者は、単なるルーチンの実験作業を使用するだけで、本明細書において特に記載された特定の実施形態に対する多数の同等物を認識または確認することができよう。かかる同等物は、以下の請求項の範囲内に包含されることが意図される。参考文献以下の参考文献は、ここに参考により全体として取り込まれる。KKNagatoshiFujiwaraMacrophagesinInflammationCurrentDrugtargetsInflammationAllergy5281286MFLopesCGFreiredeLimaandGADosReisThemacrophagehauntedbycellghostsapathogengrowsImmunologytoday21489494COElsonMTomasiMTDertzbaughGThaggardRHunterandCWeaverOralantigendeliverybywayofamultipleemulsionsystemenhancesoraltoleranceAnnNYAcadSci778156162ASuzukiMMorishitaMKajitaKTakayamaKIsowaYChibaSTokiwaandTNagaiEnhancedcolonicandrectalabsorptionofinsulinusingamultipleemulsioncontainingeicosapentaenoicacidanddocosahexaenoicacidJPharmSci8711961202AShahiwalaandMMAmijiEnhancedmucosalandsystemicimmuneresponsewithsqualaneoilcontainingmultipleemulsionsuponintranasalandoraladministrationinmiceJDrugTarget16302310BBozanandFTemelliChemicalcompositionandoxidativestabilityofflaxsafflowerandpoppyseedandseedoilsBioresourTechnol9963546359CMasterjohnTheantiinflammatorypropertiesofsaffloweroilandcoconutoilmaybemediatedbytheirrespectiveconcentrationsofvitaminEJAmCollCardiol4918251826SDevarajandIJialalAlphatocopheroldecreasestumornecrosisfactoralphamRNAandproteinfromactivatedhumanmonocytesbyinhibitionof5lipoxygenaseFreeRadicBiolMed3812121220SDevarajandIJialalAlphatocopheroldecreasesinterleukin1betareleasefromactivatedhumanmonocytesbyinhibitionof5lipoxygenaseArteriosclerThrombVascBiol1911251133MDeBandtMGrossinFDrissJPincemailCBabinChevayeandCPasquierVitaminEuncouplesjointdestructionandclinicalinflammationinatransgenicmousemodelofrheumatoidarthritisArthritisRheum46522532AlexisetalDNAvaccinationasantiinflammatorystrategyInPDRCHEvansGeneTherapyinInflammatoryDiseasesProgressinInflammationResearchBirhauserVerlagBaselSwitzerland2000pp205230RJMrsnyTissueandCellSpecificTargetingfortheDeliveryofGeneticInformationInMMAmijiPolymericGeneDeliveryPrinciplesandApplicationsCRCPressBocaRatonFL2005pp527PackDWetalDesignanddevelopmentofpolymersforgenedeliveryNatRevDrugDiscov2005458193GloverDJHJLippsandDAJansTowardssafenonviraltherapeuticgeneexpressioninhumansNatRevGenet20056299310KaulGandMAmijiTumortargetedgenedeliveryusingpolymodifiedgelatinnanoparticlesinvitroandinvivostudiesPharmRes20052295161BhavsarMDandMMAmijiOralIL10genedeliveryinamicrospherebasedformulationforlocaltransfectionandtherapeuticefficacyininflammatoryboweldiseaseGeneTher200815p12009ShahiwalaAandMMAmijiEnhancedmucosalandsystemicimmuneresponsewithsqualaneoilcontainingmultipleemulsionsuponintranasalandoraladministrationinmiceJDrugTarget200816p30210BoumaGStroberWTheimmunologicalandgeneticbasisofinflammatoryboweldiseaseNatureReviewsImmunology3521533StroberWFussIMannonPThefundamentalbasisofinflammatoryboweldiseaseJournalofClinicalInvestigation117514521ArdizzoneSPorroGBBiologictherapyforinflammatoryboweldiseaseDrugs6522532286OldenburgBHommesDBiologicaltherapiesininflammatoryboweldiseasetopdownorbottomupCurrentOpinioninGastroenterology23395399MuellerCTumournecrosisfactorinmousemodelsofchronicintestinalinflammationImmunology10518SandbornWJStrategiesfortargetingtumournecrosisfactorinIBDBestPracticeResearchinClinicalGastroenterology17105117vanDeventerSJHNewbiologicaltherapiesininflammatoryboweldiseaseBestPracticeResearchinClinicalGastroenterology17119130PapaAetalBiologicaltherapiesforinflammatoryboweldiseasecontroversiesandfutureoptionsExpertReviewofClinicalPharmacology2391403HoentjenFVanBodegravenAASafetyofantitumornecrosisfactortherapyininflammatoryboweldiseaseWorldJournalofGastroenterology1520672073MannonPJetalAntiInterleukin12AntibodyforActiveCrohn’sDiseaseTheNewEnglandJournalofMedicine35120692079ItoHetalApilotrandomizedtrialofahumanantiInterleukin6receptormonoclonalantibodyinactiveCrohn’sdiseaseGastroenterology126989996SandbornWJetalNatalizumabinductionandmaintenancetherapyforCrohn’sdiseaseNewEnglandJournalofMedicine35319121925FeaganBGetalTreatmentofulcerativecolitiswithahumanizedantibodytothealpha4beta7integrinNewEnglandJournalofMedicine35224992507SorensenDRLeirdalMSioudMGenesilencingbysystemicdeliveryofsyntheticsiRNAsinadultmiceJournalofMolecularBiology327761766MacDiarmidJAetalSequentialtreatmentofdrugresistanttumorswithtargetedminicellscontainingsiRNAoracytotoxicdrugNatureBiotechnology27643U697KortylewskiMetalInvivodeliveryofsiRNAtoimmunecellsbyconjugationtoaTLR9agonistenhancesantitumorimmuneresponsesNatureBiotechnology27925932ChoiBetalTumornecrosisfactoralphasmallinterferingRNAdecreasesherpessimplexvirusinducedinflammationinamousemodelJournalofDermatologicalScience528797PeerDParkEJMorishitaYCarmanCVShimaokaMSystemicleukocytedirectedsiRNAdeliveryrevealingcyclinD1asanantiinflammatorytargetScience319627630AouadiMetalOrallydeliveredsiRNAtargetingmacrophageMap4k4suppressessystemicinflammationNature4581180U1116SioudMOnthedeliveryofsmallinterferingRNAsintomammaliancellsExpertOpiniononDrugDelivery2639651XuDetalDeliveryofMDR1smallinterferingRNAbyselfcomplementaryrecombinantadenoassociatedvirusvectorMolecularTherapy11523530FattalEBochotAStateoftheartandperspectivesforthedeliveryofantisenseoligonucleotidesandsiRNAbypolymericnanocarriersInternationalJournalofPharmaceutics364237248BhavsarMDAmijiMMGastrointestinaldistributionandinvivogenetransfectionstudieswithnanoparticlesinmicrosphereoralsystemJournalofControlledRelease119339348BhavsarMDAmijiMMOralIL10genedeliveryinamicrospherebasedformulationforlocaltransfectionandtherapeuticefficacyininflammatoryboweldiseaseGeneTherapy1512001209MelgarSKarlssonAMichaelssonEMAcutecolitisinducedbydextransulfatesodiumprogressestochronicityinC57BL6butnotinBALBcmicecorrelationbetweensymptomsandinflammationAmericanJournalofPhysiologyGastrointestinalandLiverPhysiology288G1328G1338OkayasuIetalANOVELMETHODINTHEINDUCTIONOFRELIABLEEXPERIMENTALACUTEANDCHRONICULCERATIVECOLITISINMICEGastroenterology98694702GrishamMBBenoitJNGrangerDNASSESSMENTOFLEUKOCYTEINVOLVEMENTDURINGISCHEMIAANDREPERFUSIONOFINTESTINEMethodsinEnzymology186729742BhavsarMDAmijiMMDevelopmentofnovelbiodegradablepolymericnanoparticlesinmicrosphereformulationforlocalplasmidDNAdeliveryinthegastrointestinaltractAapsPharmscitech9288294BhavsarMDAmijiMMPolymericnanoandmicroparticletechnologiesfororalgenedeliveryExpertOpiniononDrugDelivery4197213KaulGAmijiMTumortargetedgenedeliveryusingpolymodifiedgelatinnanoparticlesinvitroandinvivostudiesPharmaceuticalResearch22951961PenderSLFetalSystemicadministrationofthechemokinemacrophageinflammatoryprotein1aexacerbatesinflammatoryboweldiseaseinamousemodelGut5411141120BhavsarMDTiwariSBAmijiMMFormulationoptimizationforthenanoparticlesinmicrospherehybridoraldeliverysystemusingfactorialdesignJournalofControlledRelease110422430DiezSdeIlarduyaCTVersatilityofbiodegradablepolymicrospheresforplasmidDNAdeliveryEuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics63188197TracyMDevelopmentandscaleupofamicrosphereproteindeliverysystemBiotechnologicalProgress14108115BarbaraGXingZHogaboamCMGauldieJCollinsSMInterleukin10genetransferpreventsexperimentalcolitisinratsGut46344349"