"ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定する方法であって、以下のaおよびbを特徴とする方法。a以下の1~3の工程を同一反応槽中で行う。b1および2の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで3の工程を開始させる。1被検液中のヘモグロビンを定量する工程、2被検液に、HLB12以上の下記式Iで表される化合物の存在下、pH5.0~9.5の範囲内で0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。3上記2の反応液に、pH5.0~9.5の範囲内で500~500000U/mLのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。請求項1に記載の方法において、3の工程でプロテアーゼをHLB12以上の上記式Iで表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめる方法請求項1または2に記載の方法において、3の工程でプロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩の存在下作用せしめる方法同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定するための試薬であって、以下のaおよびbを特徴とする試薬。a第一試薬および第二試薬の2つの部分から構成される。b第一試薬に、HLB12以上の下記式Iで表される化合物、及びpH5.0~9.5の範囲で緩衝能を有する緩衝液、0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、500~500000U/mLのプロテアーゼを含む。R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。請求項4に記載の試薬において、第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれる試薬。請求項4または5に記載の試薬において、第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩を含有する試薬。上記の特許文献1~7、非特許文献1に記載の方法では、テトラゾリウム塩は還元性を有する化合物、例えば糖化タンパク質やアスコルビン酸等と強く反応し呈色することから糖化タンパク質濃度の高い試料やアスコルビン酸を含む試料で異常値を示す原因になる。特許文献8、9に記載の方法では、スルホン化合物は酵素の阻害剤になるものが多く、特によく使用されるラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の反応停止剤となるほど強力な阻害剤である。さらにニトロ化合物は着色しており、試薬ブランクが上昇し測定精度が低下する原因となる。特許文献10に記載の方法では、本特許の反応促進剤に比べ、ショ糖エステルを用いた場合は、共存する酵素の安定性が低い。工業用のショ糖エステルは安価であるが、純度が低く、ロイコ色素が自己発色する恐れがある。純度の高いショ糖エステルは一般的な界面活性剤と比較し高価である。特許文献11に記載の方法では、用いる添加剤が一般的に高価である。特許文献11に開示されている酢酸基を含む化合物又はその塩、N-アシルタウリン又はその塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩は、いずれもアニオン界面活性剤である。これらの中で、実施例1に記載されているように、N-アシルアミノ酸であるサルコシネートCN-30、サルコシネートMN、サルコシネートPN、アラニネートLN-30、アルキルエーテルカルボン酸であるECTD-3NEX、ECTD-6NEX、AKYPO-RLM100、N-アシルタウリン酸であるLMT、SMT、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩であるSBL-2T-36、SBL-4T、SBL-203-27については、現実にプロテアーゼ反応促進効果を有していることが実証されている。しかし、一般に、アニオン界面活性剤は、タンパク質分子酵素に吸着してその活性を抑えてしまうと言われており、測定酵素と共存する形態で加速試験ではなく実際に長期間保存された場合は、さらに酵素活性そのものが低下し測定に悪影響を及ぼす可能性がある。本発明は上記の先行技術における問題点を解決することを課題とする。本発明者らは、HLB12以上の下記式Iで表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、プロテアーゼの反応が大幅に促進されることを見出し本発明に到達した。R-O-XIここで、Rは、炭素数が9~18のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。Rのアルキル基の炭素数は9以上、好ましくは9~18、より好ましくは12~16である。もっとも好ましくは、Rのアルキル基の炭素数は12である。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。[項1]ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定する方法であって、以下のaおよびbを特徴とする方法。a以下の1~3の工程を同一反応槽中で行う。b1および2の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで3の工程を開始させる。1被検液中のヘモグロビンを定量する工程、2被検液に、HLB12以上好ましくはHLB14以上、さらに好ましくはHLB16以上の下記式Iで表される化合物の存在下、pH5.0~9.5の範囲内で0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。3上記2の反応液に、pH5.0~9.5の範囲内で500~500000U/mLのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。[項2]項1に記載の方法において、3の工程でプロテアーゼをHLB12以上好ましくはHLB14以上、さらに好ましくはHLB16以上の上記式Iで表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめる方法[項3]項1または2に記載の方法において、3の工程でプロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩の存在下作用せしめる方法[項4]同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定するための試薬であって、以下のaおよびbを特徴とする試薬。a第一試薬および第二試薬の2つの部分から構成される。b第一試薬に、HLB12以上好ましくはHLB14以上、さらに好ましくはHLB16以上の下記式Iで表される化合物、及びpH5.0~9.5の範囲で緩衝能を有する緩衝液、0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、500~500000U/mLのプロテアーゼを含む。R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。[項5]項4に記載の試薬において、第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれる試薬。[項6]項4または5に記載の試薬において、第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩を含有する試薬。本発明により、プロテアーゼの反応が促進たとえば、第二反応の5分のみで全反応が完了するされ、その結果、消去系を組むことができるようになるため、輸液中に存在する測定対象成分以外の糖化アミノ酸または糖化ペプチドの影響による偽高値が解消される。選定したプロテアーゼ促進剤は反応主要酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼFAOD、ペルオキシダーゼPEO、プロテアーゼその他消去用酵素カタラーゼCAOの安定性の阻害にならない。選定した反応促進剤は界面活性作用を持ち自動分析機に対応した診断薬において添加が必須である界面活性剤を新たに添加する必要がない、などの効果を有する。本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の~は以上、以下を意味し、例えば明細書中で★~☆と記載されていれば★以上、☆以下を示す。また本明細書中のおよび/またはは、いずれか一方または両方を意味する。本発明の測定方法の特徴的な構成本発明の特徴的な構成は、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定する方法であって、以下のaおよびbを特徴とする方法である。a以下の1~3の工程を同一反応槽中で行う。b1および2の工程を同一のステップ内で行い、その次のステップで3の工程を開始させる。1被検液中のヘモグロビンを定量する工程、2被検液に、HLB12以上好ましくはHLB14以上、さらに好ましくはHLB16以上の下記式Iで表される化合物の存在下、pH5.0~9.5の範囲内で0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加し、内因性の糖化アミノ酸および糖化ペプチドを予め消去する工程、R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。3上記2の反応液に、pH5.0~9.5の範囲内で500~500000U/mLのプロテアーゼを作用させて糖化ヘモグロビンを定量する工程。[被検液]被検液は、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料すなわち生体から採取された試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。糖化ヘモグロビンとしてはHbA1cヘモグロビンのβ鎖が糖化された糖化タンパク質が例示できる。本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。また、自動溶血機能付きの自動分析機例えば、日本電子BM9130形自動分析機では、自動溶血時の攪拌力が強いため、界面活性剤では、気泡を発生しサンプリングに支障をきたすことから、浸透圧の差を利用する方法がより好ましい。前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン-p-t-オクチルフェニルエーテルTriton系界面活性剤等、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルTween系界面活性剤等、ポリオキシエチレンアルキルエーテルBrij系界面活性剤等等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が1~10体積の場合、前記処理溶液中の濃度が0.1~1重量になるように前記界面活性剤を添加し、室温で5秒~1分程度攪拌すればよい。また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し2~100倍体積量の精製水を添加して溶血させる。なお、溶血処理は、前処理として行うのではなく、第一ステップで反応と同時に行うこともできる。[糖化ヘモグロビンの測定]まず、本発明における糖化ヘモグロビンの測定に関して説明する。以下の説明は、糖化へモグロビンとしてHbA1cを測定する方法を例示するものを含むが、糖化ヘモグロビンの測定はこれに限定されるものではない。また、ヘモグロビンの測定および糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合の測定については、後述する。本発明における糖化ヘモグロビンの測定には、例えば、以下の1および2の反応工程を含む方法により、測定試料たとえば全血または血液中のHbA1cを測定する方法が例示される。1糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖N末端からFVHフルクトシルバリルヒスチジンを切り出す能力を有するプロテアーゼにより、糖化タンパク質を糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドに断片化する反応2断片化されたFVHに反応し、かつ、以下のaおよびbに示す特性を満たすFAODフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、該FVHと酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素または酸素を定量する反応本発明に適用されるプロテアーゼ本発明の方法に用いるプロテアーゼは特に限定されない。これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。例えば、サーモリシン、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが例示できる。本発明に用いるプロテアーゼは、安定性、反応速度比活性、入手の容易性などから、以下のものが好ましい。メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼK、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Bacillussubtilis由来プロテアーゼ、Aspegillusoryzae由来プロテアーゼ、Aspegillussaitoi由来プロテアーゼ、Streptomycesgriseus由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、プロテアーゼAアマノG天野エンザイム、プロテアーゼMアマノG天野エンザイム、プロテアーゼSアマノG天野エンザイム、ペプチダーゼR天野エンザイム、パパインM40天野エンザイム、サーモリシン大和化成、サモアーゼPC10大和化成、商品名プロテアーゼNフルカ、商品名プロテアーゼNアマノ天野製薬、Bacillus属由来メタロプロテイナーゼ東洋紡績:商品名トヨチーム、エンドプロテイナーゼGlu-Cロシュ等があげられる。なかでも、Bacillus属由来メタロプロテイナーゼ東洋紡績:商品名トヨチーム、サーモリシン天野エンザイム、サモアーゼPC10天野エンザイム、プロテアーゼStreptomycesgriseus由来、フルカ、プロテアーゼAspegillussaitoi由来、シグマがより好ましい。本発明に用いるプロテアーゼは、上記以外のものであっても、製造方法が知られているプロテアーゼについて精製し構造を解明したもの、あるいは、精製した酵素の部分アミノ酸配列等を明らかにし、その情報を利用して新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。また、データベースに公開されている情報などから推定される遺伝子やタンパク質の配列を利用して、新規にスクリーニングして得られたものであっても良い。さらには、遺伝子やタンパク質の配列が現実に知られているプロテアーゼ、あるいは、上記の方法により新規に得られたプロテアーゼに、さらに遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加えたものであっても良い。本発明に適用されるFAOD本発明の方法に用いるFAODは特に限定されない。例えば、公知のものとして、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属由来酵素およびその改変体、あるいは、カーブラリアクラベータYH923またはネオコスモスポラヴァシンフェクタ474由来酵素およびその改変体などが使用できる。また、特開2010-35469に記載の、Cryptococcusneoformans由来酵素およびその改変体、あるいは、特開2010-57474に記載の、Aspergillusnidulans由来酵素およびその改変体などが使用できる。また、市販のものでは、FPO-301商標東洋紡績、FPOX-CE商標キッコーマン、FPOX-EE商標キッコーマンなどを使用することができる。あるいは、本発明の方法に用いるFAODとしては、例えば、PCT/JP2009/005173に開示されているPhaeosphaerianodorum由来酵素およびその改変体から選ばれるFAODが挙げられる。具体的には、以下のIからIIIのいずれかに記載の、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質が例示できる。I配列番号1に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。II配列番号1に記載されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。III配列番号1に記載されるアミノ酸配列と86.0以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。このようなFAODとしては、中でも、上記IIまたはIIIに記載のタンパク質であって、アミノ末端から58番目のイソロイシン、アミノ末端から110番目のグリシンおよびアミノ末端から282番目のフェニルアラニンのうち少なくとも1箇所以上が他のアミノ酸に置換されているタンパク質が好ましい。このようなFAODとしては、上記アミノ末端から58番目のイソロイシンが、メチオニン、トレオニン、アラニン、アスパラギン、セリン、バリン、または、ロイシンに置換されているタンパク質が好ましい。このようなFAODとしては、上記アミノ末端から110番目のグリシンが、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、システイン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、アルギニン、セリン、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシンまたはフェニルアラニンに置換されているタンパク質が好ましい。このようなFAODとしては、上記アミノ末端から282番目のフェニルアラニンが、チロシンに置換されているタンパク質が好ましい。あるいは、これらの変異が組み合わさったものでも良い。上記のFAODの入手方法については、例えば、以下のIVからVIIのいずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを作製し、該組換えベクターで宿主を形質転換した形質転換体を培養してフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を生成させ、当該タンパク質を採取すればよい。IV配列番号2に記載される塩基配列からなるポリヌクレオチド。V配列番号2に記載される塩基配列において、1つ以上30以下の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加された塩基配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。VI本発明のタンパク質のうちの何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。VII上記IVからVIのいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。また、本発明に用いることができるFAODは、上記で説示したタンパク質のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加される部位は、置換、欠失、挿入および/または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで1または数個のアミノ酸残基とは、具体的には10個以内の範囲のアミノ酸残基数であり、好ましくは6個以内の範囲のアミノ酸残基である。また、本発明に用いることができるFAODは、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列配列番号1に示すにおいて、当該アミノ酸配列と86.0以上、より好ましくは90.0以上、より好ましくは95.0以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を包含する。なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、GENETYX-WIN株式会社ゼネティックスの商品名を当該商品のマニュアルに従って使用し、配列番号1に示すアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチhomologysearchにより一致するアミノ酸配列の割合として、相同性を計算することができる。相同性は、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定され得る。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失例えば、ギャップ等を許容してもよい。また本発明に用いることができるFAODタンパク質等は、例えば、分子間架橋および/または分子内架橋例えば、ジスルフィド結合などが施されたもの、化学修飾例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基などされたもの、標識例えば、ヒスチジンタグ、Mycタグ、またはFlagタグなどが付与されたもの、または融合タンパク質例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、GSTまたはGFPなどを付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明に用いることができるFAODタンパク質は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。なお、現時点では本願発明に使用することはできないFAODであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。あるいは、今後新規に得られたFAODであって、上記の特性を有するFAODは、本願発明に使用できる。そして、そのようなFAODを用いて構築したHbA1cの測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。糖化ヘモグロビンの測定方法以下、糖化ヘモグロビンとしてHbA1cを測定する方法を例に挙げて説明する。上記HbA1c測定方法の具体的な態様は、[0023]に記載の1および2の反応工程を含むように設計されていれば特に限定されず、市販の器具や機器を適宜選択して使用して良いが、汎用の自動分析機たとえば、日立7180形自動分析機を用いるのが便利である。これらの自動分析機に酵素法を適用するためには、典型的には、測定前に、酵素法を実施するための試薬を、液状の2剤第一試薬以下R1とも記載、第二試薬以下R2とも記載に分けて調製する。典型的な測定パターンは、測定セルに試料を分注したあと、第一試薬を投入し数分間たとえば、前出の日立7180形自動分析機では約5分間一定温度で保持この工程を以下第一反応とも記載した後、第二試薬を投入してさらに数分間たとえば、前出の日立7180形自動分析機では約5分間一定温度で保持この工程を以下第二反応とも記載する。この間に、使用する機器の仕様などに基づいて適宜設定したほぼ一定の時間間隔で吸光度が継続して測定される。測定波長や、サンプルと各試薬の添加液量液量比、各ステップに要する時間等は、使用する機器の仕様などに基づいて適宜調節することが出来る。例えば、典型的な態様として、R1にFAOD、R2にプロテアーゼを配した試薬を作製し、自動分析機を用いて測定を行えばよい。この試薬を自動分析機に適用した場合、第一反応では、R1投入により、FAODが測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離のいわゆる内因性の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドに作用して過酸化水素が生成する消去反応。しかし、この、測定対象物中に何らかの理由で存在している遊離の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドは、本来FAODが作用すべき対象であるプロテアーゼによってHbA1cから切り出されたものではなく、非測定対象であり、測定値に正誤差を与える。そこで、上記の反応によって生成した過酸化水素は、例えば過酸化水素の定量系としてキノン色素を生成させる系を用いる場合には、例えばR1にカタラーゼ等を配することにより、第一ステップにおいて、このような非測定対象に由来する過酸化水素を、生成に引続いてすぐにほぼ同時に酸素と水に分解させることにより、後の反応すなわち、第二ステップにおける過酸化水素の定量反応に影響を与えないようにすることができる除去反応。なおこの場合は、ペルオキシダーゼはR2に配することが好ましい。ここで、R1には、HLB12以上の下記式Iで表される化合物を存在させる。好ましくはHLB14以上、更に好ましくはHLB16以上である。式Iで表される化合物ここで、Rは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。Rのアルキル基の炭素数は好ましくは12である。上記式Iで表される化合物として具体的な化合物名およびその製品名は、表1に例示されている。具体的には、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノヤシ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルエーテル、ポリオキシエチレンオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン20ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン18ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン15ノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン30オクチルフェニルエーテル、ポリグリセリンラウリン酸エステル、などが例示される。中でも、ポリオキシエチレンラウリルエーテルには、HLB12以上で顕著な反応促進効果があり好ましい。HLB14以上ではさらに好ましく、HLB16以上ではさらに好ましい。[HLB値の測定方法]所定のHLB値または、HLB価とも記載する。を有する化合物が存在するか否かは、添加されている化合物が明確である場合は、当該化合物が市販品であれば該製品の製造者がカタログ等に記載している値を採用する。製造者が情報を開示していない場合は、学術論文や特許文献等に記載されている値を採用する。化学式が明確である場合や、臨界ミセル濃度cmcが明らかな場合は、以下の式で計算する。HLB価=7Σ親水基の基数-nCH2基の基数またはHLB価=74.02log/cmc添加されている化合物の構造、cmcが不明の場合などは、HLB価のわかっている油相とHLBがすでにわかっている活性剤1種を使って、HLB価未知の活性剤と既知の活性剤を種々の割合に混合し、この混合活性剤を用いて一定条件のもとに乳化実験を行い、そのエマルジョンの状態と比較検討することでもとめることができる。たとえば、油相AHLB=7.5と界面活性剤BHLB=2.1を用いて界面活性剤CのHLBHLBをxとする。を決定する場合、Bを32とCを68混合時、もっとも良いエマルジョンができたとすると、2.1×32x×68=7.5よりx=10と求めることができる。また、既知のHLB価をもつ2種以上の界面活性剤を混合する場合は、混合液のHLB価は、それぞれ単独のHLB価の加重平均で表す。本発明において、上記式Iで表される化合物を存在させる濃度は、特に限定されるものではないが、プロテアーゼ反応が行われる場において、下限は0.14W/W重量以上が好ましい。さらに好ましい下限は0.3以上、さらに好ましい下限は0.75以上である。上限は溶解性などの観点から、10以下が好ましい。さらに好ましくは上限5以下、さらに好ましくは上限3以下である。本発明の方法では、プロテアーゼはR2にのみ配されているので、R1における上記式Iで表される化合物の濃度は、使用する機器の仕様などに基づいて適宜設定されたサンプルと各試薬の添加液量液量比によって規定される。また、第一反応におけるpHは5.0~9.5の範囲であれば特に限定されない。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、EPPS緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液等があげられる。また、第一反応におけるFAODの濃度は、0.1~100U/mLであれば特に限定されない。好ましくは0.5~50U/mLの範囲であり、さらに好ましくは0.5~20U/mLであり、さらに好ましくは1~10U/mLである。本発明において、第一反応または第二反応における各試薬の濃度やpHは、サンプルと試薬との液量比によって変動する可能性があるが、通常の測定では、サンプル液量と比べて、R1液量、あるいはR1とR2とを合計した液量を十数倍~数十倍に設定することがほとんどであり、そのような場合、サンプルの影響を無視して実質的に試薬中の濃度やpHによって規定することが出来る。次に、第二反応では、R2投入により、プロテアーゼによるHbA1cからFVHを切り出す工程断片化反応が開始され、それに引続いてすぐにほぼ同時に、切り出されたFVHにFAODが作用して酸化還元反応により過酸化水素を生成する工程が開始される。第二反応においては、FAODを新たに添加する必要はなくR2にFAODを配する必要はなく、R1に配されたものをそのまま用いることができるが、必要であればR2にもFAODを配し、第二反応で追添しても差し支えない。予め第一反応で、測定対象物中にもともと存在する遊離の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを消去しているため、第二反応において、HbA1cをプロテアーゼで分解しても、もはやFAODと非測定対象物とが反応することはなく、プロテアーゼによってHbA1cから切り出されたもののみをFAODと反応させることができる。第二反応におけるpHは5.0~9.5の範囲であれば特に限定されない。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、EPPS緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液等があげられる。また、第二反応におけるプロテアーゼの濃度は、500~500000U/mLであれば特に限定されない。好ましくは500~50000U/mLの範囲であり、さらに好ましくは800~20000U/mLであり、さらに好ましくは1000~10000U/mLである。第二反応においては、R1で添加したカタラーゼの影響を排除するため、R2にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を配してもよい。あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの添加比率を適切に設定することにより、R2にカタラーゼ阻害剤を配さない設定も可能である。例えば、第二反応において、過剰量のペルオキシダーゼおよび発色性基質を添加すればよい。この場合、ペルオキシダーゼは、前記カタラーゼの添加量Uに対し、例えば、5~100倍の活性U量を添加することが好ましい。上記の定量系発色系に用いるペルオキシダーゼは特に限定されるものではなく、例えば市販のものが使用できる。好適なものとしては、西洋ワサビ、微生物などに由来するものが挙げられる。中でも、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。本発明におけるペルオキシダーゼの濃度は、例えば、0.01KU/L~4MU/Lの範囲であり、好ましくは0.1KU/L~200KU/L、より好ましくは5KU/L~100KU/Lである。KUはキロユニット、MUはメガユニットを示す。本発明に用いる発色性基質としては、特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。水素供与体はカップラーと組み合せて用いることができる。例えば、水素供与体としてのトリンダー試薬とカップラーとしての4-アミノアンチピリンとの組み合せがあげられる。上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。これらは、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、カップラー4-アミノアンチピリン4-AAなどに対して酸化縮合反応し色素を生成する。水素供与体としては、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-スルホプロピルアニリン、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン、N-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メチルアニリン、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピルアニリン、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン、N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-3-メトキシアニリン、N-スルホプロピルアニリン、N-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル-2,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-3-メチルフェニル-N’-サクシニルエチレンジアミン、N-エチル-N-3-メチルフェニル-N’-アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。カップラーとしては、前記4-アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンMBTH更に具体的には、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンSMBTH更に具体的には、スルホン化3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等も使用できる。ロイコ体としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。これらは、ペルオキシダーゼの存在下で直接酸化呈色する。例えば、4,4’-ベンジリデンビスN,N-ジメチルアニリン、4,4’-ビス[N-エチル-N-3-スルホプロピルアミノ-2,6-ジメチルフェニル]メタン、1-エチルアミノチオカルボニル-2-3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシフェニル-4,5-ビス4-ジエチルアミノフェニルイミダゾール、4,4’-ビスジメチルアミノジフェニルアミン、N-カルボキシメチルアミノカルボニル-4,4’-ビスジメチルアミノジフェニルアミン塩例えばナトリウム塩、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジン塩等が挙げられる。特に好ましくは、10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジン塩である。テトラゾリウム塩としては、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩、2,5-ジフェニル-3-1-ナフチル-2H-テトラゾリウム塩、3,3’-[3,3’-ジメトキシ-1,1’-ビフェニル-4,4’-ジイル]-ビス[2-4-ニトロフェニル-5-フェニル-2H-テトラゾリウム]塩、3,3’-[3,3’-ジメトキシ-1,1’-ビフェニル-4,4’-ジイル]-ビス2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム塩、2-4-ヨードフェニル-3-4-ニトロフェニル-5-2,4-ジスルホフェニル-2H-テトラゾリウム塩、3,3’-1,1’-ビフェニル-4,4’-ジイル-ビス2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム塩、3-4,5-ジメチル-2-チアゾリル-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム塩等が挙げられる。上記発色系基質の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として0.001~10mmol/Lが好ましい。より好ましくは0.005~0.5mmol/Lである。測定対象に血球が含まれる場合、非測定対象の消去には、血球中に本来存在しているカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ等の作用を利用しても良い。また、非測定対象の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドから発生する過酸化水素を除去する方法としては、この他に以下の方法も採用できる。例えば、プロテアーゼを添加する前に、FAODとペルオキシダーゼならびに電子供与体を共存させる方法がある。これによれば、プロテアーゼを添加する前に、非測定対象の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドより発生した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ反応によって脱水素を起こし、電子は電子供与体に供与され、その結果、過酸化水素は除去される。また、プロテアーゼを添加する前に、FAODとペルオキシダーゼならびに酸化により発色する発色剤を添加し、この発色量を予め測定しておき、この発色量で補正を行うことも可能である。HbA1cとプロテアーゼとを、それぞれR1、R2のどちらに配するかは、測定目的や測定対象試料などに応じて、適宜決定されうる。また、HbA1cとプロテアーゼとを反応させる際の濃度設定などの具体的な条件は、特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度などに応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。また、FAODを、非測定対象の糖化アミノ酸および/または糖化ペプチドを消去するためにも用いる場合は、R1とR2の液量比などを考慮して、両方の反応を行いうる条件に適宜設定すればよい。例えば、プロテアーゼは、0.1~30MU/Lの範囲であり、好ましくは2~15MU/Lであり、より好ましくは3~10MU/Lである。また、例えば、FAODは、0.1~45U/Lの範囲であり、好ましくは2~15U/Lであり、より好ましくは3~10U/Lである。反応温度は、例えば、2~60°C、好ましくは4~40°Cである。反応時間は、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、0.5~30分間、好ましくは10分以下であり、さらに好ましくは5分以下、さらに好ましくは3分以下、さらに好ましくは2分以下、さらに好ましくは1分以下である。第一反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、0.25~15分間が例示でき、好ましくは5分以下であり、さらに好ましくは2.5分以下、さらに好ましくは1.5分以下、さらに好ましくは1分以下、さらに好ましくは0.5分以下である。第二反応では、特に限定されるわけではないが、例えば、全工程であれば、0.25~15分間が例示でき、好ましくは5分以下であり、さらに好ましくは2.5分以下、さらに好ましくは1.5分以下、さらに好ましくは1分以下、さらに好ましくは0.5分以下である。好ましい第一反応時間-第二反応時間の組合せは10分-10分、さらに好ましくは5分-5分、さらに好ましくは2.5分-2.5分、さらに好ましくは1.5分―1.5分、さらに好ましくは1分-1分、さらに好ましくは0.5分-0.5分である。酵素法を用いたHbA1cの測定ではプロテアーゼ反応が測定時間の律速になる。本発明者らは、HLB12以上の下記式Iで表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、プロテアーゼの反応が大幅に促進されることを見出し本発明に到達した。R-O-XIここで、Rは、炭素数が9~18のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。Rのアルキル基の炭素数は9以上、好ましくは9~18、より好ましくは12~16である。もっとも好ましくは、Rのアルキル基の炭素数は12である。すなわち本方法を用いることによりプロテアーゼの反応が促進され、それに伴い測定全工程の時間を短縮することが可能である。pHは、例えば、5~9の範囲である。また、この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、EPPS緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液等があげられる。なお、本発明において、酵素の活性については、明細書に記載がないものについては、原則として、市販品については容器や添付の説明書パンフレット等に測定法や単位の記載があればそれに従う。また、文献に記載されたものであれば、その文献に記載されている活性測定方法に従う。活性の定義測定方法がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。[ヘモグロビンの測定]上記の態様においては、ヘモグロビン以下Hbとも記載を測定することも可能である。また、糖化ヘモグロビンとヘモグロビン以下Hbとも記載を同時測定することも可能であるし、それらの測定結果に基づいて、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合を求めることも可能である。ヘモグロビン以下Hbとも記載の測定は、本発明の測定方法における第一ステップが実行されている間のいずれかの時点で、Hbが本来有している赤色550nm付近の吸光度を測定することにより、測定をすることができる。例えば、HbA1cの測定が行われている間のいずれかの時点、好ましくは本発明の測定方法における第一ステップが実行されている間のいずれかの時点で、Hbが本来有している赤色550nm付近の吸光度を測定することにより、HbとHbA1cの同時測定をすることができる。ここで、HbA1cの測定における発色反応において、酸化により発色する基質を適宜選択することにより、Hb測定とHbA1c測定とで測定波長が一致しないよう設定することが好ましい。これにより、互いの測定に与える影響を小さくすることができる。また、Hbは反応液中で酸化されメトヘモグロビンに変化し、徐々に吸光度が変化するので、HbおよびHbA1cの測定値に影響を与える場合がある。これを防止するためには、試料に、前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を加えることにより予めHbをメトヘモグロビンに変えておく以下メト化とも記載ことが好ましい。あるいは、R1に同様に前処理として、フェロシアン化物、亜硝酸塩、硝酸カリウム、アジ化物などの酸化剤を配しておき第一反応でメト化を行わせることもできる。本発明においては、上記態様に示したように、第一試薬にFAODを処方し、第二試薬にプロテアーゼを処方する。本構成により、第二試薬にプロテアーゼを配することにより、第一試薬中で内因性の糖化アミノ酸またはペプチドの消去が可能となり、内因性の糖化アミノ酸またはペプチドを測りこんでしまうことによる、偽高値が解消されうる。本発明においては、[0015]に記載の3の工程で、プロテアーゼをHLB12以上の上記式Iで表される化合物および金属イオンの存在下作用せしめることが好ましい。金属イオンとしては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが例示できる。本発明においては、[0015]に記載の3の工程で、プロテアーゼをフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩の存在下作用せしめることが好ましい。本発明において、上記構成の他、緩衝剤例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびGOOD緩衝液などが含まれていてもよい。さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬例えば、EDTAおよびO-ジアニシジンなど、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤例えば、トリトンX-100およびNP-40など、ならびに各種抗菌剤および防腐剤例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなどなどが含まれていてもよい。さらには、塩類、酵素安定化剤、色源体安定化剤などを、必要に応じて添加することができる。これらの試薬は、単一試薬でも2種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。防腐剤としては、プロクリン登録商標、スペルコ社各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム、塩化カルシウム等が挙げられる。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。また、酵素安定化剤として、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。色素安定化剤としては、硫酸カリクスアレン6、硫酸カリクスアレン8等が挙げられる。また還元物質の影響を回避することを目的として、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加しても良い。これら添加剤は還元物質の影響回避のみならず、Hbのメト化やプロテアーゼの反応促進においても効果を発揮する。上記の各成分試薬中に存在するプロテアーゼ、FAODなどの酵素、および、他の成分の濃度条件等は、使用する試薬酵素等の種類により、反応性および/または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。その際には、試薬中に存在するそれぞれの成分が互いに干渉しあうことにより、HbA1cの測定や試薬の安定性等に影響が及ぶ可能性についても、考慮することが好ましい。例えば、第二反応で、プロテアーゼとFAODが共存する場合は、できるだけ両酵素の特性を活かせるよう適宜条件決定することができる。上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、HbA1cの測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。本発明の、別の特徴的な構成は、同一反応槽中で、ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン、および、糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合のうち少なくとも1つ以上を測定するための試薬であって、以下のaおよびbを特徴とする試薬である。a第一試薬および第二試薬の2つの部分から構成される。b第一試薬に、HLB12以上の下記式Iで表される化合物、及びpH5.0~9.5の範囲で緩衝能を有する緩衝液、0.1~100U/mLのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬に、500~500000U/mLのプロテアーゼを含む。R-O-XIRは、炭素数が12~16のアルキル基または置換アルキル基であり、Xは、ポリオキシエチレン残基である。Rのアルキル基の炭素数は好ましくは12である。本発明の試薬においては、第一試薬に糖化ヘモグロビン定量用色素が含まれることが好ましい。本発明の試薬においては、第一試薬および第二試薬のいずれかにフェロシアン化カリウムおよび/または亜硝酸塩を含有することが好ましい。上記糖化ヘモグロビン測定試薬は、さらに、いずれかの部分に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含んでもよい。また、上記糖化ヘモグロビン測定試薬は、2つの部分から構成され、第一試薬に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試薬にプロテアーゼを含む試薬であることが好ましい。このような形態の試薬には、第一試薬にさらにカタラーゼ、パーオキシダーゼおよび色素のうちいずれか1つ以上を含ませることができる。本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬には、例えば、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、POD、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のキットは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法の項における緩衝剤等の説明を援用することができる。なお、本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬には、測定に必要な全ての構成をセットにしたものだけでなく、分割されている各構成それぞれも、実質的に包含される。例えば、液状のR1とR2のセットであれば、R2と組合せて使用することを前提としたR1、または、R2と組合せて使用することを前提としたR2についても、実質的に本発明のキットに包含される。本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。[実施例1]プロテアーゼ反応促進剤のスクリーニング<試薬>R1PIPES50mmol/LpH6.5NaCl50mmol/LNaNO27mmol/LFPOX-CEキッコーマン2KU/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績6KU/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績化合物各種0.2重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L10-カルボキシメチルアミノカルボニル-3,7-ビスジメチルアミノフェノチアジン塩DA-67和光純薬50μmol/L<操作方法>37°CにインキュベートされたR1;120μlにEDTA-2Na採血管にて採取したHbA1c検体を精製水で1/20倍希釈したものから10μlを添加し、37°Cで反応を開始し、5分後にR2;40μlを添加した。R2添加前及び添加1.5分後の660nmの吸光度を測定し、R2添加前の吸光度から添加1.5分後の吸光度を差し引く計算を行った。検体1糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合HbA1cが10.6から得られた吸光度を吸光度AH、検体2HbA1cが5.1から得られた吸光度を吸光度ALとした。表1~表3に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評価結果を示した。表1~表3中に示したAH-ALは、吸光度AHから吸光度ALを差し引いた差である。なお、検体1、2のHbA1cはHA-8180HPLC法、アークレイにて通法に従い測定を実施した。ここでAH-ALが大きければプロテアーゼ反応促進効果があると判定できる。特に、AH-ALが40以上の場合には優れた促進効果がある。表1~表3の結果よりHLB12以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルに効果が見られた。特にHLB16以上でより良好な反応促進効果が得られた。[実施例2]各酵素の安定性に与える影響<試薬>R1PIPES50mmol/LpH6.5NaCl50mmol/LNaNO27mmol/LFAODFPOX-CEキッコーマン2KU/LDA-67和光純薬25μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績化合物各種0.5重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/L化合物各種0.5重量<操作方法>反応促進効果の見られた化合物について、上記組成中のFAOD、カタラーゼ、ペルオキシダーゼの安定性について、35°C、2週間保存した試薬を用いて、それぞれ下記の方法にて安定性を検討した。なお、安定性は保存前に同様に測定した活性値に対する、35°C、2週間保存後の活性値で評価した。1FAOD酵素活性は、1.0mMのフルクトシルバリルヒスチジンを基質とし、FAODの酵素反応によって生成される過酸化水素を、ペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加を測定することによって求めた。まず、活性測定試薬3mLを37°Cにて5分間加温した後、当該活性測定試薬に、予め酵素希釈液0.1トリトンX100を含む50mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5にて希釈した酵素溶液0.1mLを加え、反応を開始した。37°Cにて5分間反応させた後、単位時間あたりの500nmの吸光度変化を測定したΔODtest/min。盲検としては、酵素溶液の代わりに酵素希釈液0.1mLを用い、同様の操作を行って吸光度変化を測定したΔODblank/min。下記計算式に基づいて、得られた吸光度変化から酵素活性を算出した。なお、上記条件下で1分間に1マイクロモルの基質を酸化する酵素量を1単位Uと規定した。計算式活性値U/mL={ΔODtest/min-ΔODblank/min×3.1mL×希釈倍率}/13×1.0cm×0.1mLなお、上記計算式において、3.1mLは全液量を示し、13はミリモル吸光係数を示し、1.0cmはセルの光路長を示し、0.1mLは酵素サンプル液量を示す。2ペルオキシダーゼ1.原理2Pyrogallol3H2O2Purpurogallin5H2OCO2生成するPurpurogallinをエーテル抽出し,420nmの吸光度の変化で測定する。2.定義下記条件下で20秒間に1.0mgのPurpurogallinを生成する酵素量を1Purpurogallin単位Uとする。3.試薬A.5W/Vピロガロール水溶液用時調製B.0.147MH2O2水溶液30W/VH2O2溶液1.67mLを蒸留水で希釈して100mLとする用時調製C.0.1Mリン酸緩衝液,pH6.0反応混液及び酵素希釈用D.2.0NH2SO4溶液酵素溶液:酵素標品を予め氷冷した0.1Mリン酸緩衝液,pH6.0で溶解し,同緩衝液で3.0~6.0PurpurogallinU/mLに希釈して氷冷保存する。4.手順1試験管32φ×200mmに下記反応混液を調製し,20°Cで約5分間予備加温する。14.0mL蒸留水2.0mLピロガロール水溶液A1.0mLH2O2水溶液B2.0mLリン酸緩衝液C2酵素溶液1.0mLを加え,反応を開始する。320°Cで正確に20秒間反応させた後,H2SO4溶液D1.0mLを加えて反応を停止させる。反応停止後の混液から生成したPurpurogallinをエーテル15mLで抽出する。この操作を5回繰り返し,抽出液を合わせ,更にエーテルを加えて全量を100mLにする。この液につき420nmにおける吸光度を測定するODtest。4盲検は反応混液1を20°Cで20秒間放置後,H2SO4溶液D1.0mLを加えて混和し,次いで酵素溶液1.0mLを加えて調製する。この液につき上記同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定するODblank。5.計算式U/mL={ΔODODtest-ODblank×希釈倍率}/{0.117×1mL}=ΔOD×8.547×希釈倍率U/mg=U/mL×1/C0.117:1mgPurpurogallinエーテル溶液の420nmにおける吸光度C:溶解時の酵素濃度cmg/mL注1Purpurogallin単位は13.5国際単位o-dianisidineを基質とし,25°Cの反応条件下に相当する。3カタラーゼ1.原理過酸化水素の減少量をチタン呈色法で測定する。2.定義下記条件下で1分間に1マイクロモルの過酸化水素を分解する酵素量を1単位Uとする。3.試薬A.10mMリン酸緩衝液、pH7.025°CB.H2O2溶液:16mM0.182mLの30W/VH2O2を100mLのbufferAに溶解する用時調製C.チタン試薬ナカライテスク製酵素溶液:酵素備品を予め氷冷した緩衝液Aで0.35~1.35U/mLに希釈する。4.手順1試験管32φ×200mmに0.25mLの基質溶液Bを採り,25°Cで約5分間予備加温する。2酵素溶液0.25mLを添加し,ゆるやかに混和する。325°Cで正確に5分間反応させた後,チタン試薬C2.5mLを加えて反応を停止させ、水を対照にして410nmの吸光度を測定するODtest。4盲検は5分間の加温の後、最初に基質溶液B0.25mLをチタン試薬C2.5mL加えて混和し、次いで酵素溶液を添加するODblank。5.計算式U/mL={ΔODODblank-ODtest×3.0mL×希釈倍率}/{F×5分×1.0×0.25mL}=ΔOD×3.43×1/F×希釈倍率U/mg=U/mL×1/CF:0.1mM過酸化水素によるチタン呈色生成物の吸光度係数Fは濃度の分かっている過酸化水素を用いて各ロット毎に決定する。通常は0.7前後である1.0:光路長cmC:溶解時の酵素濃度cmg/mL表4に結果を示す。一般的に酵素の活性値低下に伴って反応速度も低下することから、反応促進効果を保つためには、反応促進剤が酵素の安定性に影響を与えないものが好ましい。HLB12以上のポリオキシエチレンラウリルエーテルに、FAOD、カタラーゼ、ペルオキシダーゼに対する安定化効果が見られた。比較例として、N-アシルアミノ酸、糖エステルおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩について同様の試験を行ったところ、ある程度の反応促進効果が見られたが、FAOD、カタラーゼおよびPODの安定性は、実施例に比べて劣る結果となった。[実施例3]反応促進剤の添加量検討<試薬>R1MES50mmol/LpH6.5NaNO27mmol/LFAODFPOX-CEキッコーマン2KU/LDA-67和光純薬25μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績化合物各種各濃度重量R2MES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/L<操作方法>37°CにインキュベートされたR1;120μlにEDTA-2Na採血管にて採取したHbA1c検体を精製水で1/20倍希釈したものから10μlを添加し、37°Cで反応を開始し、5分後にR2;40μlを添加した。R2添加前及び添加1.5分後の660nmの吸光度を測定し、R2添加前の吸光度から添加1.5分後の吸光度を差し引く計算を行った。検体3糖化ヘモグロビンのヘモグロビンに対する割合HbA1cが9.3から得られた吸光度を吸光度AH、検体4HbA1cが4.5から得られた吸光度を吸光度ALとした。表5に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評価結果を示した。表5中に示したAH-ALは、吸光度AHから吸光度ALを差し引いた差である。なお、検体3、4のHbA1cはHA-8180HPLC法、アークレイにて通法に従い測定を実施した。ここでAH-ALが大きければプロテアーゼ反応促進効果があると判定できる。特に、AH-ALが35以上の場合には優れた促進効果がある。表5に結果を示す。表5より0.2反応液中、0.14以上で特に良好な反応を示すことを確認した。[実施例4]内因性糖化アミノ酸、糖化ペプチドの消去能の確認<試薬>実施例R1PIPES50mmol/LpH7.0NaCl50mmol/LNaNO27mmol/LFAODFPOX-CEキッコーマン2KU/LDA-67和光純薬100μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH7.0CaCl210mmol/Lサーモリシン天野エンザイム5000kU/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/L<操作方法>日立7180形自動分析機を用いた。Hb濃度の測定37°CにインキュベートされたR1;120μlに下記の検体を精製水で1/20倍希釈したものからHbA1c検体10μlを添加し、37°Cで反応を開始し、5分後に505nmの吸光度を測定した。結果を、キャリブレーター1Hb101.0μmol/l、HbA1c3.54μmol/l、HbA1cが5.0とキャリブレーター2Hb153.8μmol/l、HbA1c13.70μmol/l、HbA1cが10.2とを用いて作成した検量線と対比してHb濃度を求めた。HbA1c濃度の測定また、R1添加、5分後にR2;40μlを添加した。R2添加前及び添加5分後の660nmの吸光度を測定した。結果を、上記と同じキャリブレーター1とキャリブレーター2とを用いて作成した検量線と対比してHbA1c濃度を求めた。HbA1cの測定上記で得られた各検体のHb濃度μmol/lとHbA1c濃度μmol/lから、下記式によりHbA1cを算出した。HbA1c={96.3×HbA1c濃度μmol/l/Hb濃度μmol/l}1.62検体には、EDTA-Na採血管で採取した5.79のHbA1c全血検体にユニカリックNテルモ;アミノ酸、糖、電解質を含む滋養強壮用の輸液製剤を各濃度で添加したものを使用した。なお、検体のHbA1cはHA-8180HPLC法、アークレイにて通法に従い測定を実施した。アミノ酸、糖を含む輸液製剤中には保存中にアミノ酸と糖が結合した糖化アミノ酸が生成し、この糖化アミノ酸にFAODが反応するため、偽高値の原因となることが問題となっているが、表6、図1に結果を示すとおり、本発明においては、内因性の糖化アミノ酸を消去できることを確認した。[実施例5]標準品の測定<試薬>実施例5R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPOX-CEキッコーマン5KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/L<操作方法>実施例4と同じ。検体には、JCCRM411IFCC法HbA1c測定用常用参照標準物質、一般社団法人検査医学標準物質機構ReCCS品5水準LEBEL1からLEBEL5までを用い、それぞれ800g×5分で遠心して、血球成分を下記の前処理液で1/40希釈したものを使用した。前処理液;MES10mMpH6.5とNaNO20.5g/lを含む水溶液表7に結果を示す。結果より標準物質の測定値が表示値と一致することを確認した。さらに、実施例5-1~5-15、比較例1として、pH、FAODの添加量、プロテアーゼの添加量を種々変更して、実施例5と同様の試験を行った。実施例5-1~5-6はpHを、実施例5-7~5-10はFAODの添加量を、実施例5-11~5-15はプロテアーゼの添加量をそれぞれ変えて、試験を行った。また、比較例として、ポリオキシエチレンオレイルエーテルを用いて、試験を行った。以下に、各実施例および比較例の詳細な試薬組成を示す。<試薬>実施例5-1R1R1MES50mmol/LpH6.0FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2MES50mmol/LpH6.0CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-2R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-3R1R1PIPES50mmol/LpH7.0FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH7.0CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-4R1R1TES50mmol/LpH7.5FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2TES50mmol/LpH7.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-5R1R1HEPPSO50mmol/LpH8.0FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2HEPPSO50mmol/LpH8.0CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-6R1R1TAPS50mmol/LpH8.5FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2TAPS50mmol/LpH8.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-7R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績0.2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-8R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績1.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-9R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績4.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-10R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績10.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<試薬>実施例5-11R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム500KU/L<試薬>実施例5-12R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム2000KU/L<試薬>実施例5-13R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム8000KU/L<試薬>実施例5-14R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム12000KU/L<試薬>実施例5-15R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム20000KU/L<試薬>比較例1R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2.0KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンオレイルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L表8に結果を示す。結果より実施例において標準物質の測定値が表示値と一致することを確認した。[実施例6]実検体測定における相関性確認<試薬>実施例下記、3種のプロテアーゼを用いて、3種の試薬を作製した。R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPOX-CEキッコーマン5KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lプロテアーゼ下記Lot.A;メタロプロテアーゼ東洋紡績5000KU/LLot.B;プロテアーゼStreptomycesgriseus由来、フルカ5000KU/LLot.C;サーモリシン天野エンザイム5000KU/L<操作方法>検体n=60には、EDTA-Na採血管で採取した検体を下記の前処理液で1/20希釈したものを使用した。検体の希釈以外の操作については、実施例4と同様。前処理液;PIPES10mMpH6.5とNaNO20.5g/lを含む水溶液対照法はHPLC法とし、HA-8180アークレイを用いて、通法に従い測定を実施した。図2~4に結果を示す。結果より既存法と良好な相関性を示すことを確認した。[実施例7]短時間60秒-60秒での測定[酵素法]1.試薬R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPOX-CEキッコーマン5KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lサーモリシン天野エンザイム5000KU/L<操作方法>Hb濃度の測定37°CにインキュベートされたR1;120μlに下記の方法で希釈した検体を10μl添加し、37°Cで反応を開始し、1分後に505nmの吸光度を測定した。結果を、キャリブレーター1Hb101.0μmol/l、HbA1c3.54μmol/l、HbA1cが5.0とキャリブレーター2Hb153.8μmol/l、HbA1c13.70μmol/l、HbA1cが10.2とを用いて作成した検量線と対比してHb濃度を求めた。HbA1c濃度の測定また、R1添加、1分後にR2;40μlを添加した。R2添加前及び添加1分後の660nmの吸光度を測定した。結果を、上記と同じキャリブレーター1とキャリブレーター2とを用いて作成した検量線と対比してHbA1c濃度を求めた。HbA1cの測定上記で得られた各検体のHb濃度μmol/lとHbA1c濃度μmol/lから、下記式によりHbA1cを算出した。HbA1c={96.3×HbA1c濃度μmol/l/Hb濃度μmol/l}1.6<検体希釈方法>EDTA-Na採血管で採取した検体n=100を下記の前処理液で1/20希釈した。前処理液;PIPES10mMpH6.5とNaNO20.5g/lを含む水溶液対照法はHPLC法とし、HA-8180アークレイを用いて、通法に従い測定を実施した。相関データを図5に示す。これらの結果より、本発明を用いることにより短時間測定が可能となり、測定結果の迅速なレポートが可能になる。[実施例8]短時間60秒-60秒での測定[酵素法]1.試薬R1R1PIPES50mmol/LpH6.5FAODFPO-301東洋紡績2KU/LDA-67和光純薬50μmol/Lカタラーゼ100KU/L東洋紡績ポリオキシエチレンラウリルエーテル花王1.0重量R2PIPES50mmol/LpH6.5CaCl210mmol/Lフェロシアン化カリウム0.01g/LペルオキシダーゼPEO-302東洋紡績20KU/Lメタロプロテアーゼ東洋紡績4000KU/L<操作方法>Hb濃度の測定実施例7と同じ。HbA1c濃度の測定実施例7と同じ。HbA1cの測定実施例7と同じ。<検体希釈方法>実施例7と同じ。対照法はHPLC法とし、HA-8180アークレイを用いて、通法に従い測定を実施した。相関データを図6に示す。また、64検体中3検体分について、タイムコースを図7に示す。本結果においてもタイムコース、相関性とも良好であり、本発明を用いることにより短時間測定が可能であった。本結果より測定時間を短縮化することにより、迅速、短時間での測定が可能となる。"