"配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンがグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも80以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列ただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンのグリシンまたはセリンへの置換は維持されているからなり、かつGal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有する、タンパク質。Gal-Glcまたはその誘導体が、下記式1aまたは1b:式中、R1、R2およびR3は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子を示し、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは1以上の糖残基を示す。で表される糖化合物である、請求項1記載のタンパク質。R1、R2およびR3が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基を示し、R4、R5、R6およびR7が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基、または1以上の糖残基を示す、請求項1または2記載のタンパク質。R4、R5、R6およびR7から選ばれる3つの基が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、またはC1~C6アルキルオキシ基を示し、R4、R5、R6およびR7から選ばれる残りの1つの基が、1以上の糖残基を示す、請求項3記載のタンパク質。前記活性が、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式2aまたは2b:式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、前記と同じである。Fucは、フコシル基を示す。で表される糖化合物を生成する活性である、請求項2~4のいずれか一項記載のタンパク質。前記活性が、ラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、請求項1記載のタンパク質。前記活性が、N-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、請求項1記載のタンパク質。前記糖鎖が、二糖、三糖または四糖である、請求項1~7のいずれか一項記載のタンパク質。請求項1~8のいずれか一項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。請求項9記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。請求項10記載の発現ベクターが導入された形質転換体。請求項11記載の形質転換体を培地中で培養して、請求項1~8のいずれか一項記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。請求項1~8のいずれか一項記載のタンパク質の存在下において、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体を得ることを含む、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体の製造方法。ラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、請求項13記載の方法。N-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、請求項13記載の方法。本発明は、LeaおよびLex抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造可能な方法を開発することを目的とする。本発明者らは、オリゴ糖精密合成を目的としたグリコシンターゼ技術の可能性を広げるために、BbAfcBを1,3-1,4-α-L-フコシンターゼ化し、次に、その位置特異性および受容体特異性について検討した。その結果、本酵素が、I型糖鎖Galβ1-3GlcNAc,lacto-N-bioseI,LNBにLea抗原決定基を、またII型糖鎖Galβ1-4GlcNAc,N-acetyllactosamine,LacNAcにLex抗原決定基を導入するのに有効な手段となることなどを見出し、本願発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。1配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンがグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも80以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列ただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンのグリシンまたはセリンへの置換は維持されているからなり、かつGal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有する、タンパク質。2Gal-Glcまたはその誘導体が、下記式1aまたは1b:式中、R1、R2およびR3は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子を示し、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは1以上の糖残基を示す。で表される糖化合物である、1のタンパク質。3R1、R2およびR3が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基を示し、R4、R5、R6およびR7が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基、または1以上の糖残基を示す、1または2のタンパク質。4R4、R5、R6およびR7から選ばれる3つの基が、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、またはC1~C6アルキルオキシ基を示し、R4、R5、R6およびR7から選ばれる残りの1つの基が、1以上の糖残基を示す、3のタンパク質。5前記活性が、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式2aまたは2b:式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、前記と同じである。Fucは、フコシル基を示す。で表される糖化合物を生成する活性である、2~4のいずれかのタンパク質。6前記活性が、ラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、1のタンパク質。7前記活性が、N-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、1のタンパク質。8前記糖鎖が、二糖、三糖または四糖である、1~7のいずれかのタンパク質。91~8のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。109のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。1110の発現ベクターが導入された形質転換体。1211の形質転換体を培地中で培養して、1~8のいずれかのタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。131~8のいずれかのタンパク質の存在下において、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体を得ることを含む、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体の製造方法。14ラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、13の方法。15N-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、13の方法。本発明によれば、LeaおよびLex抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造することができる。本発明は、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有するタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンがグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも80以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなるただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンのグリシンまたはセリンへの置換は維持されている。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、さらにより好ましくは95以上、最も好ましくは96以上、97以上、98以上または99以上であってもよい。一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンがグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の変異例、欠失、置換、付加および挿入を含むアミノ酸配列からなるものであってもよいただし、配列番号2で表されるアミノ酸配列における703位のアスパラギンのグリシンまたはセリンへの置換は維持されている。1または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の1つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。アミノ酸残基の変異に関する用語1または数個が示す数は、例えば、1~290個、好ましくは1~250個、より好ましくは1~200個、1~150個または1~100個、さらにより好ましくは1~50個、1~30個、1~20個または1~10個、特に好ましくは1、2、3、4または5個である。アミノ酸配列において変異を導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントを参考にして、変異体を作製してもよい。具体的には、当業者は、1複数のホモログのアミノ酸配列例、配列番号2で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列を比較し、2相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、3相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造機能の相関性を認識できる図1。アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語保存的置換とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸例、リジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖を有するアミノ酸例、アスパラギン酸、グルタミン酸、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、非極性側鎖を有するアミノ酸例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、β位分岐側鎖を有するアミノ酸例、スレオニン、バリン、イソロイシン、芳香族側鎖を有するアミノ酸例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、ヒドロキシル基例、アルコール性、フェノール性含有側鎖を有するアミノ酸例、セリン、スレオニン、チロシン、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸例、システイン、メチオニンが挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号1で表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよいただし、配列番号1で表されるヌクレオチド配列における2107~2109位のヌクレオチド残基は、グリシンまたはセリンをコードするように置換されている。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、同一性が高いポリヌクレオチド同士、例えば80以上、好ましくは85以上、より好ましくは90以上、さらにより好ましくは95以上、最も好ましくは96以上、97以上、98以上または99以上の同一性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い同一性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、6×SSC塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム中、約45°Cでのハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1SDS中、50~65°Cでの1または2回以上の洗浄が挙げられる。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性例、同一性または類似性は、例えばKarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLASTPro.Natl.Acad.Sci.USA,90,58731993、PearsonによるFASTAMethodsEnzymol.,183,631990を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTP、BLASTNとよばれるプログラムが開発されているのでhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov参照、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Lipman-Pearson法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアGENETYXVer7.0.9を使用し、ORFにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、UnitSizetoCompare=2の設定でSimilarityをpercentage計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が由来し得る微生物としては、特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウムビフィダムBifidobacteriumbifidum等のビフィドバクテリウムBifidobacterium属に属する細菌が挙げられる。本発明のタンパク質は、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有し、それにより、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体を生成する。Galは、ガラクトースを示し、Glcはグルコースを示し、Gal-Glcは、ガラクトースおよびグルコースからなる二糖を示す。Gal-Glcまたはその誘導体の糖間の結合としては、Gal-Glcまたはその誘導体に対してフコシル基を導入する活性を保持し得るものである限り特に限定されないが、例えば、β-1,3-結合、およびβ-1,4-結合が挙げられる。好ましくは、上記活性は、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、Gal-GlcにおけるGlc部分またはGal-Glcの誘導体におけるGlc対応部分と、α-1,3-フコシル結合またはα-1,4-フコシル結合を生成する活性である。Gal-Glcの誘導体としては、Gal-Glc中のGal部分および/またはGlc部分が修飾された誘導体、ならびにGal-Glcまたはその誘導体を、糖鎖の非還元末端に有する糖化合物が挙げられる。糖化合物を構成する糖残基の個数は、Gal-Glcに起因する糖残基の個数2個を、後述する糖残基の個数に加算した数である。より具体的には、Gal-Glcの誘導体としては、以下が挙げられる:1Gal-GlcにおけるGlc部分の1以上のヒドロキシ基が、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基-NH3、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基-OH、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子で置換された化合物;2Gal-GlcにおけるGal部分のヒドロキシ基が、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは1以上の糖残基で置換された化合物;ならびに3上記1および2で示された置換が組み合わされた化合物。好ましい実施形態では、Gal-Glcまたはその誘導体は、下記式1aまたは1b:式中、R1、R2およびR3は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子を示し、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基、置換されていてもよいC3~C11芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、置換されていてもよいモノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいC1~C6炭化水素オキシ基、置換されていてもよいC3~C11芳香族オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは1以上の糖残基を示す。で表される糖化合物であってもよい。したがって、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性は、上記のGal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式2aまたは2b:式中、R1、R2、R3、R4、R5、R6およびR7は、前記と同じである。Fucは、フコシル基を示す。で表される糖化合物を生成する活性であってもよい。C1~C6炭化水素基は、直鎖または分岐鎖、あるいは環状の炭素原子数1~6個の炭化水素基を示す。C1-6炭化水素基としては、例えば、C1~C6アルキル基例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、C2~C6アルケニル基例、ビニル、アリル、C2~C6アルキニル基例、エチニル、プロパルギル、C3~C6シクロアルキル基例、シクロプロピル、シクロブチルが挙げられる。C1~C6炭化水素基は、好ましくは、C1~C6アルキル基である。また、C1~C6炭化水素基は、上述したように置換されていてもよいが、置換されていてもよいC1~C6炭化水素基としては、ヒドロキシ基で置換されたC1~C6炭化水素基が好ましく、ヒドロキシ基で置換されたC1~C6アルキル基であるヒドロキシC1~C6アルキル基がより好ましい。C3~C11芳香族基は、炭素原子数3~11個の芳香族基を示す。C3~C11芳香族基としては、例えば、C6~C10アリール基例、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチルまたはC3~C11芳香族複素環基が挙げられる。C3~C11芳香族基は、好ましくは、C6~C10アリール基である。C3~C11芳香族複素環基は、3~11個の炭素原子および少なくとも1個のヘテロ原子を含む単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基であり得る。このような単環式芳香族複素環基は、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子好ましくは、窒素原子から選ばれるヘテロ原子を1ないし4個含有する4ないし7員好ましくは、5または6員の基であり得る。このような縮合芳香族複素環基は、上記の単環式芳香族複素環基好ましくは、環構成原子として窒素原子を含有する基に対応する環と、1または2個の窒素原子を含む5または6員の芳香族複素環例、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリジン、ピリミジン、1個の硫黄原子を含む5員の芳香族複素環例、チオフェンおよびベンゼン環から選ばれる1または2個の環とが縮合した環から誘導される基であり得る。上記の単環式芳香族複素環基としては、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルが挙げられる。上記の縮合芳香族複素環基としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、キノキサリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル例、インドール-1-イル、インドール-2-イル、インドール-3-イル、インドール-5-イル、インダゾリル、ピロロピラジニル、イミダゾピリジニル、イミダゾピラジニル、ピラゾロピリジニル、ピラゾロチエニル、ピラゾロトリアジニルが挙げられる。モノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基は、上記のC1~C6炭化水素基でモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基は、好ましくは、モノまたはジC1~C6アルキルアミノ基であり、より好ましくは、C1~C6アルキルアミノ基である。モノまたはジC3~C11芳香族アミノ基は、上記のC3~C11芳香族基でモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジC3~C11芳香族アミノ基は、好ましくは、モノまたはジC3~C11芳香族アミノ基であり、より好ましくは、C6~C10アリールアミノ基である。C1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基は、上記のC1~C6炭化水素基および上記のC3~C11芳香族基で置換されたアミノ基を示す。モノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基は、C1~C6炭化水素-カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。C1~C6炭化水素-カルボニルにおけるC1~C6炭化水素部分は、上記のC1~C6炭化水素基と同様である。モノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基は、好ましくは、モノまたはジC1~C6アルキル-カルボニルアミノ基であり、より好ましくは、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基である。C1~C6アルキル-カルボニルにおけるC1~C6アルキル部分は、上記のC1~C6アルキル基と同様である。モノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基は、C3~C11芳香族-カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。C3~C11芳香族-カルボニルにおけるC3~C11芳香族部分は、上記のC3~C11芳香族基と同様である。モノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基は、好ましくは、モノまたはジC6~C10アリール-カルボニルアミノ基であり、より好ましくは、C6~C10アリール-カルボニルアミノ基である。C6~C10アリール-カルボニルにおけるC6~C10アリール部分は、上記のC6~C10アリール基と同様である。C1~C6炭化水素オキシ基は、上記のC1~C6炭化水素基で置換されたヒドロキシ基-O-Rを示す。C1~C6炭化水素オキシ基は、好ましくは、C1~C6アルキルオキシ基である。C1~C6アルキルオキシ基におけるC1~C6アルキル部分は、上記のC1~C6アルキル基と同様である。C3~C11芳香族オキシ基は、上記のC3~C11芳香族で置換されたヒドロキシ基-O-R’を示す。C3~C11芳香族オキシ基は、好ましくは、C6~C10アリールオキシ基である。C6~C10アリールオキシ基におけるC6~C10アリール部分は、上記のC6~C10アリール基と同様である。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。置換されていてもよい上記の基における置換基としては、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、ホルミル基、アミノ基およびカルボキシル基、ならびに上述したようなC1~C6炭化水素基、C3~C11芳香族基、C3~C11芳香族複素環基、モノまたはジC1~C6炭化水素アミノ基、モノまたはジC3~C11芳香族アミノ基、C1~C6炭化水素C3~C11芳香族アミノ基、モノまたはジC1~C6炭化水素-カルボニルアミノ基、モノまたはジC3~C11芳香族-カルボニルアミノ基、C1~C6炭化水素オキシ基、およびC3~C11芳香族オキシ基が挙げられる。置換基の個数は、1~3個であり、好ましくは、1個または2個である。置換基が2個または3個である場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。R3、R4、R5およびR6についての糖残基としては、ペントース、ヘキソース、ヘプトースが挙げられる。糖残基は、アルドースまたはケトースであり得る。具体的には、糖残基としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、N-アセチル-グルコサミン、N-アセチル-ガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸が挙げられる。糖残基は、α体またはβ体であり得る。糖残基はまた、D体またはL体であり得る。糖残基の個数が2個以上である場合、糖残基の種類は同じでも異なっていてもよい。R3、R4、R5およびR6についての糖残基の個数は、1以上であれば特に限定されないが、例えば、1~15個、好ましくは、1~10個、より好ましくは、1~5個、さらにより好ましくは1~3個、特に好ましくは、1個または2個である。例えば、糖残基の個数が1個である場合、式1で表される糖鎖は三糖であり、糖残基の個数が2個である場合、式1で表される糖鎖は四糖である。R3、R4、R5およびR6についての糖残基は、通常の糖間結合を介して、Gal-GlcにおけるGalに結合し得る。また、R3、R4、R5およびR6についての糖残基の個数が2個以上である場合、2個以上の糖残基は、通常の糖間結合を介して、隣接する糖残基に各々結合し得る。このような糖間結合としては、Gal-Glcまたはその誘導体糖鎖の非還元末端に存在し得るに対してフコシル基を導入する活性を保持し得るものである限り特に限定されないが、例えば、α-1,2-結合、α-1,3-結合、α-1,4-結合、β-1,2-結合、β-1,3-結合、およびβ-1,4-結合が挙げられる。好ましくは、R1、R2およびR3は、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基を示してもよい。好ましくは、R4、R5、R6およびR7は、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、C1~C6アルキルオキシ基、または1以上の糖残基を示してもよい。より好ましくは、R4、R5、R6およびR7から選ばれる3つの基は、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、またはC1~C6アルキルオキシ基を示してもよく、R4、R5、R6およびR7から選ばれる残りの1つの基が、1以上の糖残基を示してもよい。さらにより好ましくは、R1およびR2は、各々独立して、C1~C6アルキル基、ヒドロキシC1~C6アルキル基、アミノ基、C1~C6アルキルアミノ基、C1~C6アルキル-カルボニルアミノ基、ヒドロキシ基、またはC1~C6アルキルオキシ基を示してもよい。R3、R4、R5およびR6は、ヒドロキシ基、またはC1~C6アルキルオキシ基を示してもよい。R7は、ヒドロキシメチル基等のヒドロキシC1~C6アルキル基を示してもよい。フコシル基の導入のために用いられるフコシル基供給化合物は、フコース中のヒドロキシ基例、1位のヒドロキシル基が脱離基で置換されているフコース誘導体であり得る。フコシル基供給化合物におけるフコシル基は、α体またはβ体であり得る。フコシル基はまた、L体であり得る。脱離基としては、例えば、フッ素原子、リン酸基が挙げられる。好ましくは、フコシル基供給化合物は、フッ化フコースである。より好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、以下の活性を有し得る:iラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性GlcNAcは、グルコサミンを示す。以下、同様。;iiN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;iiiラクトースGalβ1-4Glc、またはラクトースGalβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、3-フコシルラクトース[Galβ1-4Fucα1-3Glc]、または3-フコシルラクトース[Galβ1-4Fucα1-3Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;iv2’-フコシルラクトースFucα1-2Galβ1-4Glc、または2’-フコシルラクトースFucα1-2Galβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]、またはジフコシルラクトース[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性;ならびにvラクト-N-テトラオースGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、またはラクト-N-テトラオースGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト-N-フコペンタオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]、またはラクト-N-フコペンタオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性。上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、Gal-Glcに起因する糖残基の個数2個を、上述した糖残基の個数に加算した数である。したがって、糖鎖を構成する糖残基の総数は、例えば、1~17個、好ましくは、1~12個、より好ましくは、1~7個、さらにより好ましくは3、4または5個である。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を発現する形質転換体から得ることができる。この形質転換体は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本発明のタンパク質の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製することができる。本発明のタンパク質を発現させるための宿主としては、例えば、エスケリシアコリEscherichiacoli等のエスケリシア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルスズブチリスBacillussubtilisをはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、ピヒアスティピティスPichiastipitis、アスペルギルスオリゼAspergillusoryzaeをはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。形質転換される宿主としてE.coliについて詳述すると、E.coliとしては、例えば、E.coliK12株亜種のE.coliJM109株、DH5α株、HB101株、BL21DE3株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換体を選別する方法は、MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,ColdSpringHarborpress2001/01/15などにも記載されている。以下、形質転換されたE.coliを作製し、これを用いて本発明のタンパク質を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。本発明のタンパク質をコードするDNAを発現させるプロモータとしては、通常E.coliにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、T7プロモータ、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPRプロモータ、PLプロモータ、T5プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。ベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、pACYC184、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE30およびその誘導体が挙げられる。また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、T7ターミネータ、fdファージターミネータ、T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌trpA遺伝子のターミネータが挙げられる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子をE.coliに導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、誘導体とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および/または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やUV照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。ベクターは、形質転換体の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている例、pUC系タカラバイオ社製、pPROK系クローンテック製、pKK233-2クローンテック製。得られた発現ベクターを用いてE.coliを形質転換し、得られたE.coliを培養すると、本発明のタンパク質が発現される。培地としては、例えば、M9-カザミノ酸培地、LB培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を産生する形質転換体を回収した後、形質転換体を破砕例、ソニケーション、ホモジナイゼーションあるいは溶解例、リゾチーム処理することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製タンパク質、粗タンパク質、または本発明のタンパク質含有画分を得ることができる。本発明はまた、本発明のタンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む形質転換体を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするので、本発明のタンパク質に関する上述した説明に基づいて、種々の観点から特定することができる。本発明はまた、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体の製造方法を提供する。本方法は、本発明のタンパク質の存在下において、Gal-Glcまたはその誘導体にフコシル基を導入して、フコシル化されたGal-Glcまたはその誘導体を生成することを含む。本発明のタンパク質、Gal-Glcまたはその誘導体、フコシル基を導入するためのフコシル基供給化合物等の詳細は、上述したとおりである。好ましい実施形態では、Gal-Glcまたはその誘導体は、上記式1で表される多糖であってもよい。より好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、以下のとおりである:i’ラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAc、またはラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc、またはルイスa抗原Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する方法ii’N-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAc、またはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc、またはルイスx抗原Galβ1-4Fucα1-3GlcNAcを非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法;iii’ラクトースGalβ1-4Glc、またはラクトースGalβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、3-フコシルラクトース[Galβ1-4Fucα1-3Glc]、または3-フコシルラクトース[Galβ1-4Fucα1-3Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法;iv’2’-フコシルラクトースFucα1-2Galβ1-4Glc、または2’-フコシルラクトースFucα1-2Galβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]、またはジフコシルラクトース[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法;ならびにv’ラクト-N-テトラオースGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、またはラクト-N-テトラオースGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト-N-フコペンタオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]、またはラクト-N-フコペンタオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法。上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、上述したとおりである。本発明のタンパク質の存在下におけるGal-Glcまたはその誘導体へのフコシル基の導入は、反応系中に、本発明のタンパク質、ならびにGal-Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物が共存する条件下で行なわれる。このような条件は、例えば、I本発明のタンパク質例、精製タンパク質、粗タンパク質、ならびにGal-Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する反応液、またはII本発明のタンパク質を発現する本発明の形質転換体、ならびにGal-Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する培養液を用いることにより達成することができる。反応系中の基質Gal-Glcまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物の濃度は、特に制限されず、適宜設定できる。基質はまた、反応中に適宜補充されてもよい。さらに、基質は、遊離の塩基および塩のいずれの形態でも用いることができる。反応系中には、フッ化フコース等の基質の自発分解を抑制し得る成分を補充してもよい。このような成分としては、例えば、DMSOが挙げられる。本発明の製造方法におけるpHは、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発明の製造方法は、目的化合物の収率の観点から、例えば、pH約4.0~約7.5、好ましくは、pH約4.0~約6.5、より好ましくはpH約4.5~約5.5で行なわれてもよい。本発明の製造方法における温度は、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発明の製造方法は、例えば、約20~45°C、好ましくは、約25~40°Cで行なわれてもよい。本発明の製造方法において、反応時間は、製造されるべき目的化合物の量に応じて適宜設定できる。反応は、静置または攪拌状態で行われ得る。本発明の製造方法において得られる目的化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製することができる。本発明の製造方法において原料として用いられる化合物、および本発明の製造方法において得られる目的化合物は、特に断らない限り、塩の形態であってもよい。このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、原料または目的化合物に無機酸または有機酸を加えることによって製造することができる。また、原料または目的化合物の塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含されるものである。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の各種塩が挙げられる。略語CAD:荷電エアロゾル検出器chargedaerosoldetectorDC-SIGN:樹状細胞特異的細胞間接着分子-3-グラビング非インテグリンdendriticcell-specificintercellularadhesionmolecule-3-grabbingnon-integrinDFL:ジフコシルラクトースdifucosyllactoseESI-MS:電気スプレーイオン化-質量分析electrosprayionization-massspectrometry2’-FL:2’-フコシルラクトース2’-fucosyllactose3-FL:3-フコシルラクトース3-fucosyllactoseFucF:β-L-フコピラノシルフルオリドβ-L-fucopyranosylfluorideFucN3:β-L-フコピラノシルアジドβ-L-fucopyranosylazideGH:グリコシドヒドロラーゼglycosidehydrolaseHEPES:4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonicacidHPLC:高速液体クロマトグラフィーhigh-performanceliquidchromatographyLac:ラクトースlactoseLacNAc:N-アセチルラクトサミンN-acetyllactosamineLNB:ラクト-N-ビオースIlacto-N-bioseILNDFH:ラクト-N-ジフコヘキサオースlacto-N-difucohexaoseLNFP:ラクト-N-フコメンタオースlacto-N-fucopentaoseLNT:ラクト-N-テトラオースlacto-N-tetraoseLPS:リポ多糖lipopolysaccharidesMES:2-N-モルホリノエタンスルホン酸2-N-morpholinoethanesulfonicacidMOPS:3-N-モルホリノプロパンスルホン酸3-N-morpholinopropanesulfonicacidNMR:核磁気共鳴nuclearmagneticresonancepNP-α-Fuc:4-ニトロフェニル-α-L-フコピラノシド4-nirtophenyl-α-L-fucopyranosideTLC:薄層クロマトグラフィーthin-layerchromatography以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。材料および方法材料LacNAc、Lea、Lex、および、LNFPIIは、DextraLaboratoriesReading,UKより購入した。N,N’-ジアセチルキトビオースは生化学工業Tokyo,Japanから、DFLはIsosepTullinge,Swedenから購入した。LNBNishimotoetal.2007、Glcβ1-4GlcNAcHondaetal.2004、および、FucFWadaetal.2008は既報通りに合成した。3-FLはDextraLaboratoriesで購入し、Bio-GelP2カラムBio-Rad,CA,USAで更に精製した。他の試薬は、分析グレードの市販品である。変異体の構築BbAfcBのD703変異体D703A,D703C,D703G,D703Sは、鋳型にプラスミドpET23b-afcBAshidaetal.2009を使って、QuikChangesite-directedmutagenesismethodStratageneにより構築した。使用したプライマーは、以下の表1に記載した。設計した部分以外に余分な変異が入っていないことはシークエンスにより確認した。作製したプラスミドは、EscherichiacoliBL21ΔlacZDE3に導入したAshidaetal.2009。タンパク質発現と精製組換え体は、100μg/mLアンピシリンを含むLuria-Bertani培地にて、吸光度600nmが0.5に達するまで18°Cで培養し、その後、isopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを終濃度0.1mMになるように加えた。さらに15時間培養した後に集菌し、超音波処理により破砕した。超音波破砕することで、BugBusterProteinExtractionreagentMerck,Darmstadt,Germanyを使用した以前の方法Ashidaetal.2009よりも高収率で活性酵素を得ることが出来た。遠心後、上清をNi-NTAアガロースカラムQiagenにアプライし、マニュアルに従って蛋白質を溶出させた。活性フラクションを収集し、AmiconUltra50KMillipore,MA,USAにて濃縮した後、Superdex20010/300GLゲルろ過カラムGEHealthcareBio-Sciences,Uppsala,Swedenに供した。溶出は150mMNaClを含む20mMtrishydroxymethylaminomethane-HClbufferpH8.0にて行った。精製した酵素は50mM4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonicacidHEPESbufferpH7.0に透析した。タンパク質濃度は、bovineserumalbuminを標準に用い、BCAproteinassaykitPierce,ThermoFisherScientific,IL,USAにて測定した。酵素測定BbAfcB変異体の加水分解活性は、基質に3-FLを用いて決定した。反応液の組成は、100mM3-N-morpholinopropanesulfonicacidMOPSbufferpH6.5、1mM基質、および、酵素野生型14nM、および、D703変異体12μMとした。反応は30°Cで行い、熱処理で反応を止めた後、遊離したL-fucoseFucの量をフコースデヒドロゲナーゼカップリング法で決定したCohenfordetal.1989;Katayamaetal.2004。1Uは、1分間に1μmolのFucを生じさせるのに必要な酵素量とした。D703変異体のグリコシンターゼ活性は、100mMMOPSbufferpH7.0、20mMFucF供与体、100mMLNB/LacNAc受容体、および、酵素17μMの存在下で測定した。反応は50μlで行い、30°Cにて10分保温後に、30トリクロロ酢酸5μlを加えて反応を止めた。反応産物はSugar-Dカラム4.6×250mm、NacalaiTesqueを用いた高速クロマトグラフィーHPLCによって分析した。溶出には75もしくは78アセトニトリルを用い、40°Cおよび流速1.0mL/minとした。検出は214nmもしくはコロナ荷電化粒子検出器CoronaCAD,Esa,USAにて行った。反応産物の濃度は、LeaおよびLexトリサッカライド標品を使用して作成した検量線を用いて決定した。グリコシンターゼ反応の至適pHは、D703S変異体を用いて決定した。緩衝液100mMは、クエン酸-NaOHpH4.0-5.0、MESpH5.0-6.5、およびMOPSpH6.5-8.0を使用した。反応初速度は、100mMMESbufferpH5.0、FucF20および60mM、LNB/LacNAc0-300mM、および、酵素17μMD703Sの存在下、反応産物が直線的に増加する条件下30°C,5分で決定した。D703S変異体の受容体特異性は、13種類の基質を用いて検討した。40mMFucFおよび100mM各受容体を含む100mMMESbufferpH5.0を、17μMD703S存在下もしくは非存在下で30°C40分間保温し、その後、反応産物をHPLC-CADにて分析した。D703S変異体を使用した最適条件下でのLeaおよびLexトリサッカライドの合成Leaトリサッカライド合成は、100mMMESbufferpH5.0、40mMFucF供与体、200mMLNB受容体、および、D703変異体17μMの存在下で行った。反応液は300μlとし30°Cで行った。Lexトリサッカライド合成では、受容体に100mMLacNAcを用い、同様の条件で行った。反応産物の精製と構造解析反応産物はAmberliteMB-3にて脱塩し、凍結乾燥させた後に、Sugar-Dカラムを使ってHPLCにより精製した。溶出条件は上記の通りである。得られた画分は、凍結乾燥後、さらにTSKgelODS-80TSカラム4.6×250mm,Tosoh,Japanを用いて精製し、残存するLNB/LacNAcを完全に取り除いた。溶出には水を用い、流速は0.5ml/minとした。また、検出には示差屈折率検出器RID-10A,Shimazu,Kyoto,Japanを用いた。1H-および13CNMR解析には、BrukerAvance500spectrometerを用いた。ESI-MS測定にはBrukerAPEXII70eフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を用い、ポジティブモードで行った。求核残基としてのAsp-703B.bifidum由来1,3-1,4-α-L-フコシダーゼBbAfcBは、糖質加水分解酵素GHファミリー29に属しているhttp://www.cazy.orgCantareletal,2009。このファミリーに属する酵素は、立体保持型の反応機構でα-L-フコシル結合を加水分解するMcCarterandWithers1994;Sulzenbacheretal.2004。BbAfcBのα-L-フコシンターゼ化の第一段階として、まず求核残基の同定を試みた立体保持型グリコシダーゼをグリコシンターゼ化するためには、求核残基に変異を導入して加水分解活性を消失させることが必須である。既知の数種類のGH29酵素の立体構造やアミノ酸配列を比較した結果、Asp-703が求核残基である可能性が示唆された後に詳しく考察する。Asp-703をアラニン、システイン、グリシン、および、セリンに置換し、これら変異体の加水分解活性を調べた[これらのアミノ酸残基はグリコシンターゼ化に適していると言われているJakemanandWithers2002]。なお、活性は比活性のみで表している。というのも、反応初速度が20mMの基質濃度まで直線的に増加し、速度論的パラメータを算出できなかったためである。野生型酵素の比活性と比較して、D703A、D703C、D703G、およびD703Sの比活性はそれぞれ160,000倍、46,000倍、17,000倍、および76,000倍低下した表2。これらの結果から、Asp-703がBbAfcBの求核残基であることが強く示唆された考察および図1。1,3-1,4-α-L-フコシンターゼへの変換上記で得られたBbAfcBD703変異体のグリコシンターゼ活性を調べた。20mMFucFβ-L-フコピラノシルフルオリドを供与体、100mMLNBGalβ1-3GlcNAcを受容体として反応させたところ、D703GとD703S変異体において、保持時間15.4分にLeaトリサッカライドに相当するピークが検出された図2。しかしながら、野生型およびD703A/C変異体においては検出されなかった。D703GとD703S変異体では、受容体にLacNAcGalβ1-4GlcNAcを用いた際にも、保持時間14.9分にLexトリサッカライドに相当するピークが観察された図3。どちらの受容体を用いた場合でも、D703Sのピークの方がD703Gのピークよりわずかに大きかった。以上の結果、および、D703Sの加水分解活性の方がD703Gより低いことから表2、以降の実験にはD703Sを使用することとした。合成反応の至適pHは5.02-N-morpholinoethanesulfonicacidMESbufferであり、その時の収量はpH7.0のときより2倍高かった図4。反応液をコロナ荷電化粒子検出器を用いた高速液体クロマトグラフィーHPLC-CADによって分析した結果、FucF、LNB/LacNAc、および、酵素が存在した時にのみ合成活性が検出され、どれか1つでも反応系から除くと、基質以外のピークは検出されないことが明らかとなった図5、6[120分以降の保持時間においてもピークは検出されなかったデータ示さず]。反応産物の薄層クロマトグラフィー分析においても、LeaおよびLexトリサッカライドの特異的合成が示唆されたデータ示さず。反応産物の同定については後述する。次に、FucF濃度を20mMおよび60mMに固定し、LNB/LacNAc濃度を変化させる0-300mMことによって、速度論的パラメータを決定しようと試みた図7、8。その結果、LNB/LacNAcに対する見かけのKm値はFucF依存的に増加し、また、これらの値は2基質反応の式Cleland1963に回帰することが出来なかった。以上の結果から、本酵素のFucFに対する親和性が低いことが示唆された。最適化した条件下[40mMFucF供与体,200mMLNBもしくは100mMLacNAc受容体,17μM酵素]において反応の時間依存性を検討したところ、Leaトリサッカライドの濃度は約40分、Lexトリサッカライドの濃度は約60分で最大に達した。両者とも、その反応効率は添加したFucFに対して56であった図9、10。受容体特異性様々な単糖およびオリゴ糖100mMを使用して、BbAfcBD703Sの受容体特異性を調べた表3。本酵素は、LNBおよびLacNAcに加えてラクトースLacGalβ1-4Glc、2’-フコシルラクトース2’-FLFucα1-2Galβ1-4Glc、およびラクト-N-テトラオースLNTGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを認識し、それぞれ3-FL[Galβ1-4Fucα1-3Glc]、ジフコシルラクトースDFL[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]、ラクト-N-フコペンタオースIILNFPII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]を生成した。収率は、添加したFucFに対して13、5.5、および、41であった。しかしながら本酵素は、単糖Gal,GalNAc,Glc,GlcNAc、セロビオースGlcβ1-4Glc、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-β-グルコシル-グルコースGlcβ1-4GlcNAc、N,N’-ジアセチルキトビオースGlcNAcβ1-4GlcNAc、および、ガラクト-N-ビオースGalβ1-3GalNAcには全く作用しなかった。以上の結果から、本酵素は、非還元末端のLNB、LacNAc、Lac二糖構造[Galβ1-3/4GlcNAc]を認識して、GlcNAc/Glc残基にα-1→3/4-フコシル結合を導入することが明らかになった図11。反応産物の分析1,3-1,4-α-L-フコシンターゼの位置特異性および立体特異性を証明するため、反応産物を精製してエレクトロスプレーイオン化質量分析ESI-MS、および、1H-,13C-核磁気共鳴分光法NMRを用いて分析した。MSスペクトルの結果は、LNBおよびLacNAcにフコシル基が一カ所導入されたことを示していたナトリウム付加物[MNa]の計算値は552.19、実測値は552.18。1Hおよび13CNMRスペクトルは、LeaおよびLexトリサッカライド標準品のスペクトルと一致したデータ示さず。受容体にLNTを用いた場合では、LNFPII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]のみが合成され、ラクト-N-フコペンタオースV[Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Fucα1-3Glc]やラクト-N-ジフコヘキサオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Fucα1-3Glc、LNDFHII]は合成されなかったデータ示さず。以上の結果により、本シンターゼの特異性が証明された。考察BbAfcBの求核残基D703GH29は、そのアミノ酸配列の系統樹解析により2つのサブファミリーに分類されており、この分類は明らかに両グループの基質特異性の差異と相関しているAshidaetal.2009。一つ目のサブファミリーGH29-Aは、ヒトやThermotogamaritima由来の酵素によって代表されるように、比較的広い基質特異性を示し、4-ニトロフェニル-α-L-フコピラノシドpNP-α-Fucにも作用する酵素群から構成されるLiuetal.2009a;Sulzenbacheretal.2004。これとは対照的に、もう一つのサブファミリーGH29-Bに属する酵素は、非還元末端に存在するα-1→3-およびα-1→4-フコシル結合のみを特異的に切断し、pNP-α-Fucには作用しない。BbAfcBはGH29-Bサブファミリーに分類されるAshidaetal.2009。最近、B.longumsubsp.infantisATCC15697由来の1,3-1,4-α-L-フコシダーゼホモログBiAfcB,GH29-Bの結晶構造が決定されたPDBcode:3MO4。その立体構造はT.maritimaTmFucGH29-Aのα-L-フコシダーゼPDBcode:1ODUと類似性を示し[therootmeansquaredeviation=3.5オングストローム289Cα原子に対して;Zスコア=28.5;配列一致性=24]HolmandPark2000、特に、-1サブサイトの構造が極似していた。TmFucの求核残基Asp-224Sulzenbacheretal.2004は、立体構造上でBiAfcBのAsp-172とよく重なり、BiAfcBのAsp-172は、アミノ酸配列のアライメントにおいてBbAfcBのAsp-703に対応していた図1。これらの知見、および、変異体解析の結果から、BbAfcBの求核残基はAsp-703であると結論づけた。1,3-1,4-α-L-フコシンターゼD703GおよびD703SはLeaとLexトリサッカライド合成活性を示したのに対し、D703AおよびD703Cは示さなかった。この結果は、BbAfcBのグリコシンターゼ化には、変異体の残存加水分解活性や置換残基の側鎖の大きさが関係しないことを示唆している表2。それゆえ、グリコシンターゼ化を行う上で求核残基をどのアミノ酸残基に置換するのが適当であるかという疑問に対する答えは、Cobucci-Ponzanoetal.2009が示唆しているように、目的の酵素に依存しているのであろう。合成反応において、2基質反応の式に適合する速度論的パラメータは、今回の実験条件下では得られなかった。このことは、本シンターゼの基質に対する親和性の低さを示唆している。変異体は、添加したFucF量に対して約60の収率でLeaおよびLexトリサッカライドを合成した。この反応効率は典型的なグリコシンターゼ80以上よりわずかに低いと思われるが、これは、反応中にFucFが自然分解したためと考えられるWadaetal.2008。近年、Cobucci-Ponzanoら2009はSulfolobussolfataricus由来SsFucD242SおよびT.maritima由来TmFucD224Gの2種のα-L-フコシンターゼを作製した両酵素ともGH29-Aサブファミリーに属している。これら2種のフコシンターゼは、β-L-フコピラノシルアザイドFucN3水溶液中ではFucFに比べてかなり安定を糖供与体に利用することが可能であり、その反応効率は、受容体の種類により変動するものの30-90、最大でFucN3に対して90まで到達した。BbAfcBD703変異体は、検討した条件下においてはFucN3を供与体として利用できず、また、アザイドによってその活性はレスキューされなかったデータ示さず。基質特異性位置特異性および受容体特異性の高さは、オリゴ糖を精密合成する際に、特に重要な決定因子であり、その点で、酵素合成法は化学合成法よりも有効である場合が多い。これまでに、Alcaligenessp.、Aspergillusniger、Penicilliummulticolor、および、T.maritima由来の立体保持型α-L-フコシダーゼにおいて、糖供与体にpNP-Fucを利用した糖転移反応によるフコシルオリゴ糖の合成が行われてきたAjisakaetal.1998;Murataetal.1999;Farkasetal.2000;Osanjoetal.2007。また、上述したように、近年、TmFuとSsFucがグリコシンターゼ化されたCobucci-Ponzanoetal.2009。これらの酵素もしくは変異体は、様々な受容体に効率的にα-L-フコシル結合を導入することが出来るが、GH29-Aに属しているためいくつかの酵素についての遺伝子情報は得られていないが、pNP-Fucに対して活性があることから推察できる、本質的に、位置および受容体の選択的制御が出来ない。例えば、TmFucをpNP-α-Fuc供与体およびpNP-β-Gal受容体と反応さて糖転移反応を行うと、Fucα1-3Fucα-pNPおよびFucα1-2Galβ-pNPの混合物が得られることが知られているOsanjoetal.2007。また、SsFucのグリコシンターゼ変異体は、供与体にFucN3、および、受容体にGalβ-pNPを用いると、Fucα1-6Galβ-pNP、Fucα1-3Galβ-pNP、Fucα1-4Galβ-pNP、および、Fucα1-2Fucα1-3Galβ-pNPを生じることが報告されているCobucci-Ponzanoetal.2009。本研究では、BbAfcBのグリコシンターゼ化により、特異的かつ効率的にLeaおよびLexトリサッカライドを合成することに成功した。特筆すべきはその厳密な受容体特異性である。本酵素は、非還元末端に存在するLNB、LacNAc、Lacの二糖構造[Galβ1-3/4GlcNAcGlc]のみを受容体として認識し、単糖はGlcNAcでさえ認識しない。現在、BbAfcBの立体構造情報がないので類縁酵素BiAfcBにおいても、サブサイトを形成するループ構造が決定できていない、本酵素の受容体特異性について説明することが出来ないが、以前の報告にあるようにSugimuraetal.2006、様々な基質を利用して受容体特異性を調べることで、サブサイトの特性についての有用な情報を得ることが出来た。つまり、BbAfcBはGlc/GlcNAc残基のサブサイトGalNAc残基は認識しないの隣に、枝分かれしたGal残基を収容できるサブサイトGlcNAc/Glc残基は認識しないがあると推察された表3、図11。ここで、LNBとLacNAcLacでは、GlcNAc環の面が反転しており、そのためにそれぞれのGlcNAc残基のO4およびO3の水酸基の立体位置が同一となることに注目すべきである図11。非還元末端Galβ1-3/4GlcNAcGlc二糖を認識することによって、本酵素は特異的にGlcNAcGlcのO3/O4位にα-L-フコシル基を導入する。GlcNAc/Glc残基のフコシル化部位の隣の位置する環外官能基の大きさ-NHCOCH3,-CH2OH,-OHが反応効率に影響すると考えられた表3、図11。このような位置特異性および受容体特異性は、本酵素BbAfcBD703Sのユニークの特性であり、GH29-Aサブファミリーに属する他のα-L-フコシダーゼを利用することでは確立できなかったであろうと思われる。本酵素は受容体に2’-FLFucα1-2Galβ1-4Glcを利用し、効率は良くないがDFL[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]を特異的に合成した。また、本酵素はLNTGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを受容体とした場合に、LNFPII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]を合成した。LNTにはフコシル化可能な部位が2つ存在するが、単離した産物を分析したところ、LNFPIIしか検出されなかった。このことは、野生型のBbAfcBをLNDFHII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Fucα1-3Glc]に作用させた場合、Fucα1-3Glc結合よりもFucα1-4GlcNAc結合を約100倍早く切断するという事実と良く一致していたデータ示さず。BbAfcBD703S変異体を利用すれば、様々な複合糖質糖鎖の非還元末端のI型およびII型構造に、極めて特異的に、意図しないフコシル基を導入することなく、LeaおよびLex抗原を形成することが可能となる。また、1,3-1,4-α-L-フコシンターゼ、および、我々がすでに開発している1,2-α-L-フコシンターゼWadaetal.2008を組み合わせることで、すべてのタイプのルイス糖を合成することが可能となるかも知れない。まとめルイスaLea[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAc]およびルイスxLex[Galβ1-4Fucα1-3GlcNAc]血液型抗原決定基は、複合糖質糖鎖の非還元末端に存在し、様々な生命現象に関わっている.それゆえ、これら抗原の効率的な合成方法を確立することは、糖鎖の機能研究において極めて重要である。我々は、Bifidobacteriumbifidum由来1,3-1,4-α-L-フコシダーゼの求核残基変異体D703Sが、供与体にβ-L-フッ化フコースFucFおよび受容体にラクト-N-ビオースIGalβ1-3GlcNAcあるいはN-アセチルラクトサミンGalβ1-4GlcNAcを用いた場合に、添加したFucF濃度に対して56の効率でLeaとLexトリサッカライドを合成することを見出した。また、本酵素は受容体としてラクトースGalβ1-4Glc、2’-フコシルラクトースFucα1-2Galβ1-4Glc、ラクト-N-テトラオースGalβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcを認識し、それぞれ3-フコシルラクトース[Galβ1-4Fucα1-3Glc]、ジフコシルラクトース[Fucα1-2GalβFucα1-31-4Glc]、ラクト-N-フコペンタオースII[Galβ1-3Fucα1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc]を特異的に合成した。しかしながら、単糖、セロビオースGlcβ1-4Glc、Glcβ1-4GlcNAc、N,N’-ジアセチルキトビオースGlcNAcβ1-4GlcNAc、ガラクト-N-ビオースGalβ1-3GalNAcは受容体にはならなかった。すなわち、本酵素は、非還元末端に存在する二糖構造[Galβ1-3/4GlcNAcGlc]を特異的に認識し、GlcNAc/Glc残基の3位もしくは4位にフコシル基を特異的に導入することを明らかとした。本酵素1,3-1,4-α-L-フコシンターゼの高い位置特異性および受容体特異性は極めてユニークであり、I型およびII型糖鎖構造にそれぞれLeaおよびLex抗原決定基を導入するための極めて有用なツールとなることが示唆された。参考文献AjisakaK,FujimotoH,MiyasatoM.1998.Anα-L-fucosidasefromPenicilliummulticolorasacandidateenzymeforthesynthesisofα1→3-linkedfucosyloligosaccharidesbytransglycosylation.CarbohydrRes.309:125-129.AndersonK,LiSC,LiYT.2000.Diphenylamine-aniline-phosphoricacidreagent,aversatilesprayreagentforrevealingglycoconjugatesonthin-layerchromatographyplates.AnalBiochem.287:337-339.AshidaH,MiyakeA,KiyoharaM,WadaJ,YoshidaE,KumagaiH,KatayamaT,YamamotoK.2009.Twodistinctα-L-fucosidasesfromBifidobacteriumbifidumareessentialfortheutilizationoffucosylatedmilkoligosaccharidesandglycoconjugates.Glycobiology.19:1010-1017.CantarelBL,CoutinhoPM,RancurelC,BernardT,LombardV,HenrissatB.2009.TheCarbohydrate-ActiveEnZymesdatabaseCAZy:anexpertresourceforGlycogenomics.NucleicAcidsRes.37:D233-D238.ClelandWW.1963.Thekineticsofenzyme-catalyzedreactionswithtwoormoresubstratesorproducts.I.Nomenclatureandrateequations.BiochimBiophysActa.67:104-137.Cobucci-PonzanoB,ConteF,BediniE,CorsaroMM,ParrilliM,SulzenbacherG,LipskiA,DalPiazF,LeporeL,RossiM,MoracciM.2009.β-Glycosylazidesassubstratesforα-glycosynthases:preparationofefficientα-L-fucosynthases.ChemBiol.16:1097-1108.CohenfordMA,AbrahamA,AbrahamJ,DainJA.1989.ColorimetricassayforfreeandboundL-fucose.AnalBiochem.177:172-177.FarkasE,ThiemJ,AjisakaK.2000.Enzymaticsynthesisoffucose-containingdisaccharidesemployingthepartiallypurifiedα-L-fucosidasefromPenicilliummulticolor.CarbohydrRes.328:293-299.HancockSM,VaughanMD,WithersSG.2006.Engineeringofglycosidasesandglycosyltransferases.CurrOpinChemBiol.10:509-519.HolmL,ParkJ.2000.DaliLiteworkbenchforproteinstructurecomparison.Bioinformatics16:566-567.HondaY,KitaokaM,HayashiK.2004.ReactionmechanismofchitobiosephosphorylasefromVibrioproteolyticus:identificationoffamily36glycosyltransferaseinVibrio.BiochemJ.377:225-232.HondaY,KitaokaM.2006.Thefirstglycosynthasederivedfromaninvertingglycosidehydrolase.JBiolChem.281:1426-1431.JakemanDL,WithersSG.2002.Glycosynthases:Newtoolsforoligosaccharidesynthesis.TrendsGlycosciGlycotechnol.14:13-25.KatayamaT,SakumaA,KimuraT,MakimuraY,HiratakeJ,SakataK,YamanoiT,KumagaiH,YamamotoK.2004.MolecularcloningandcharacterizationofBifidobacteriumbifidum1,2-α-L-fucosidaseAfcA,anovelinvertingglycosidaseglycosidehydrolasefamily95.JBacteriol.186:4885-4893.KatayamaT,FujitaK,YamamotoK.2005.Novelbifidobacterialglycosidasesactingonsugarchainsofmucinglycoproteins.JBiosciBioeng.99:457-465.KitaokaM,HondaY,FushinobuS,HidakaM,KatayamaT,YamamotoK.2009.COnversionofinvertingglycosidehydrolasesintocatalystsforsynthesizingglycosidesemployingaglycosynthasestrategy.TrendsGlycosciGlycotechnol.21:23-39.LiuSW,ChenCS,ChangSS,MongKK,LinCH,ChangCW,TangCY,LiYK.2009.Identificationofessentialresiduesofhumanα-L-fucosidaseandtestsofitsmechanism.Biochemistry.48:110-120.MackenzieLF,WangQ,WarrenRAJ,WithersSG.1998.Glycosynthases:mutantglycosidasesforoligosaccharidesynthesis.JAmChemSoc.120:5583-5584.MaletC,PlanasA.1998.Fromβ-glucanasetoβ-glucansynthase:glycosyltransfertoα-glycosylfluoridescatalyzedbyamutantendoglucanaselackingitscatalyticnucleophile.FEBSLett.440:208-212.McCarterJD,WithersSG.1994.Mechanismsofenzymaticglycosidehydrolysis.CurrOpinStructBiol.4:885-892.MurataT,MorimotoS,ZengX,WatanabeS,UsuiT.1999.Enzymaticsynthesisofα-L-fucosyl-N-acetyllactosaminesand3’-O-α-L-fucosyllactoseutilizingα-L-fucosidases.CarbohydrRes.320:192-199.NagaeM,TsuchiyaA,KatayamaT,YamamotoK,WakatsukiS,KatoR.2007.Structuralbasisofthecatalyticreactionmechanismofnovel1,2-α-L-fucosidasefromBifidobacteriumbifidum.JBiolChem.282:18497-18509.NishimotoM,KitaokaM.2007.Practicalpreparationoflacto-N-bioseI,acandidateforthebifidusfactorinhumanmilk.BiosciBiotechnolBiochem.71:2101-2104.OsanjoG,DionM,DroneJ,SolleuxC,TranV,RabillerC,TellierC.2007.Directedevolutionoftheα-L-fucosidasefromThermotogamaritimaintoanα-L-transfucosidas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