"創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムBGranzymeB阻害剤を対象に投与し、それにより前記対象における創傷治癒を促進することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法。創傷治癒を促進するのに十分な時間および十分な量でグランザイムBGranzymeB阻害剤を創傷に適用し、それにより対象における創傷治癒を促進することを含む、対象における創傷治癒を促進する方法。前記創傷が慢性創傷である、請求項1または2に記載の方法。前記慢性創傷が慢性皮膚創傷である、請求項3に記載の方法。前記慢性皮膚創傷が褥創である、請求項4に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項1または2に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項7に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質に結合したTGFβの放出が阻害される、請求項1または2に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項9に記載の方法。皮膚裂傷を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムB阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより前記対象における皮膚裂傷を予防することを含む、対象の皮膚裂傷を予防する方法。前記皮膚裂傷が慢性創傷に付随する、請求項11に記載の方法。前記皮膚裂傷が老化に付随する、請求項11に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項11に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項14に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質に結合したTGFβの放出が阻害される、請求項11に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項17に記載の方法。創傷の皮膚肥厚性瘢痕化を予防するのに十分な時間および十分な量でグランザイムB阻害剤を対象の皮膚に適用し、それにより創傷の肥厚性瘢痕化を阻害することを含む、創傷の肥厚性瘢痕化を阻害するための方法。細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項19に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項20に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質に結合したTGFβの放出が阻害される、請求項19に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項23に記載の方法。対象におけるコラーゲン組織を増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムB阻害剤を前記対象の皮膚に適用し、それにより前記対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させることを含む、対象の皮膚中のコラーゲン組織を増大させるための方法。細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項25に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項26に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質に結合したTGFβの放出が阻害される、請求項25に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項29に記載の方法。対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるのに十分な量および十分な時間でグランザイムB阻害剤を前記対象の皮膚に適用し、それにより対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させることを含む、対象の治癒しつつあるまたは治癒した皮膚創傷の引張強さを増大させるための方法。細胞外マトリックスタンパク質の切断が阻害される、請求項31に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項32に記載の方法。細胞外マトリックスタンパク質に結合したTGFβの放出が阻害される、請求項31に記載の方法。前記細胞外マトリックスタンパク質がデコリンである、請求項35に記載の方法。細胞外プロテオグリカンとグランザイムB阻害剤とを接触させ、それにより細胞外タンパク質に結合したTGFβの放出を阻害することを含む、細胞外タンパク質に結合したTGFβの放出を阻害するための方法。前記タンパク質が、デコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、ブレビカン、フィブロモジュリン、フィブリリン-1、フィブリリン-2、およびフィビュリン-2からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。前記タンパク質がデコリンである、請求項38に記載の方法。デコリンとグランザイムB阻害剤とを接触させ、それにより細胞外デコリン切断を阻害することを含む、細胞外デコリン切断の阻害方法。前記グランザイムB阻害剤が、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項41に記載の方法。前記グランザイムB阻害剤が、以下のもの:2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-R-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-フェニルアセトアミドペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-ピラゾール-3-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-ピラゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-イミダゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-5-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イソオキサゾール-3-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-2-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イソオキサゾール-5-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリミジン-5-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリダジン-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-2-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-3-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イミダゾ[1,2-a]ピリミジン-2-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-3a,7a-ジヒドロベンゾ[d]チアゾール-2-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-R-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-S-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-フェニルアセトアミドペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-2,3-ジフルオロフェニルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ジメチルアミノアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ジメチルアミノアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;R-N-2S,5S-2-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチルカルバモイル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-5-イル-3-アセチル-5,5-ジメチルチアゾリジン-4-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-オキソピロリジン-1-イルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2-シクロペンチルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-S-2-アセトアミド-2-シクロプロピルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-S-2-アセトアミド-2-シクロペンチルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;Bio-x-IEPDP-OPh2;アゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3S-3-ヒドロキシ-1-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]アミノ]-1-オキソブタン-2-イル]アミノ]-5-オキソペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-3-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;ZINC05723764;ZINC05723787;ZINC05316154;ZINC05723499;ZINC05723646;ZINC05398428;ZINC05723503;ZINC05723446;ZINC05317216;ZINC05315460;ZINC05316859;ZINC05605947;イソクマリン;ペプチドクロロメチルケトン;ホスホン酸ペプチド;グランザイムB阻害性核酸分子;抗グランザイムB抗体;阻害性グランザイムBペプチド;SerpB9ポリペプチド、またはその断片;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;Ac-IEPD-CHO;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;Ac-IETD-CHO;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3S-3-ヒドロキシ-1-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]アミノ]-1-オキソブタン-2-イル]アミノ]-5-オキソペンタン酸;2S,5S-4-オキソ-5-{[N-フェニルアセチル-L-イソロイシル]アミノ}-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;5-クロロ-4-オキソ-3-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3S-3-ヒドロキシ-1-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]アミノ]-1-オキソブタン-2-イル]アミノ]-5-オキソペンタン酸、Serp2ポリペプチド、またはその断片;CrmAポリペプチドまたはその断片;およびSerpinA3ポリペプチドまたはその断片の1種以上から選択される、請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。前記グランザイムB阻害剤が局所投与用に製剤化される、請求項1~43のいずれか一項に記載の方法。前記グランザイムB阻害剤が他の創傷治療と共に投与するために製剤化される、請求項1~44のいずれか一項に記載の方法。他の創傷治療が、局所抗菌剤;清浄剤;創傷ゲル;コラーゲン;エラスチン;組織成長促進剤;酵素的壊死組織除去用調製物;抗真菌剤;抗炎症剤;バリア;保湿剤;およびシーラントの1種以上から選択される、請求項45に記載の方法。前記他の創傷治療が、創傷被覆剤、創傷フィラー、およびインプラントの1種以上から選択される、請求項45に記載の方法。他の創傷治療が、吸収性ドレッシング;アルギン酸塩ドレッシング;フォームドレッシング;ハイドロコロイドドレッシング;ハイドロファイバードレッシング;圧迫ドレッシングおよびラップ;複合ドレッシング;接触層;創傷ゲル含浸ガーゼ;創傷ゲルシート;透明フィルム;創傷フィラー;皮膚マトリックス生成物または組織スキャフォールド;ならびに閉鎖デバイスの1種以上から選択される、請求項45に記載の方法。前記対象が哺乳動物である、請求項1~48のいずれか一項に記載の方法。前記対象がヒトである、請求項1~49のいずれか一項に記載の方法。対象における創傷治癒を促進するためのグランザイムB阻害剤の使用。対象における創傷治癒を促進するための薬剤の調製におけるグランザイムB阻害剤の使用。前記創傷が皮膚創傷である、請求項51または52に記載の使用。前記皮膚創傷が慢性皮膚創傷である、請求項53に記載の使用。前記グランザイムB阻害剤が、核酸分子、ペプチド、抗体、および小分子からなる群から選択される、請求項51~54のいずれか一項に記載の使用。前記グランザイムB阻害剤が、以下のもの、2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-R-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-フェニルアセトアミドペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,4-トリアゾール-3-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-ピラゾール-3-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-ピラゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-イミダゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-5-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イソオキサゾール-3-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-2-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イソオキサゾール-5-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-チアゾール-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリミジン-5-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリダジン-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-2-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-3-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-N-ピリジン-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-イミダゾ[1,2-a]ピリミジン-2-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-5-2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタンアミド-N-3a,7a-ジヒドロベンゾ[d]チアゾール-2-イルメチル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-R-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-S-3-メチル-2-ピリジン-2-イルブタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-フェニルアセトアミドペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-2,3-ジフルオロフェニルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ジメチルアミノアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-2H-テトラゾール-5-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ジメチルアミノアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-2-2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルアセトアミド-3-メチルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;R-N-2S,5S-2-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチルカルバモイル-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-5-イル-3-アセチル-5,5-ジメチルチアゾリジン-4-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2S,3S-3-メチル-2-2-オキソピロリジン-1-イルペンタンアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-2-シクロペンチルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-S-2-アセトアミド-2-シクロプロピルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;2S,5S-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-5-S-2-アセトアミド-2-シクロペンチルアセトアミド-4-オキソ-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;Bio-x-IEPDP-OPh2;アゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3S-3-ヒドロキシ-1-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]アミノ]-1-オキソブタン-2-イル]アミノ]-5-オキソペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-3-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;ZINC05723764;ZINC05723787;ZINC05316154;ZINC05723499;ZINC05723646;ZINC05398428;ZINC05723503;ZINC05723446;ZINC05317216;ZINC05315460;ZINC05316859;ZINC05605947;イソクマリン;ペプチドクロロメチルケトン;ホスホン酸ペプチド;グランザイムB阻害性核酸分子;抗グランザイムB抗体;阻害性グランザイムBペプチド;SerpB9ポリペプチド、またはその断片;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;Ac-IEPD-CHO;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;Ac-IETD-CHO;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3S-3-ヒドロキシ-1-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]アミノ]-1-オキソブタン-2-イル]アミノ]-5-オキソペンタン酸;2S,5S-4-オキソ-5-{[N-フェニルアセチル-L-イソロイシル]アミノ}-N-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イルメチル-1,2,4,5,6,7-ヘキサヒドロアゼピノ[3,2,1-hi]インドール-2-カルボキサミド;5-クロロ-4-オキソ-3-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;5-クロロ-4-オキソ-2-[2-[2-フェニルメトキシカルボニルアミノプロパノイルアミノ]プロパノイルアミノ]ペンタン酸;4S-4-[[2S-2-アセトアミド-4-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[2-[[2S-4-ヒドロキシ-1,4-ジオキソブタン-2-イル]カルバモイル]ピロリジン-1-イル]-5-オキソペンタン酸;4S-4-[[2S,3S-2-アセトアミド-3-メチルペンタノイル]アミノ]-5-[[2S,3ここで使用する略語:CTL、細胞傷害性リンパ球;DCI、3,4-ジクロロイソクマリン;DMSO、ジメチルスルホキシド;ECM、細胞外マトリックス;Erk、細胞外信号調節キナーゼ;GAG、グリコサミノグリカン;グランザイムB、グランザイムB;HCASMC、ヒト冠動脈平滑筋細胞;NK、ナチュラルキラー細胞;LAP、潜伏関連ペプチド;LLC、大型の潜在型TGF-β複合体;LTBP、潜在型TGF-β結合タンパク質;MMP、マトリックスメタロプロテイナーゼ;MT-MMP1、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ1;SLC、小型の潜在型TGF-β複合体;TGF-β、トランスフォーミング成長因子ベータ。例1グランザイムBは、細胞外マトリックスタンパク質を切断する。方法。インビトロ細胞外マトリックス切断アッセイのために、細胞をコンフルエンシーまで成長させ、溶解させ、無傷のECMをプレートに残した。次いで、ECMをビオチン化した。次いで、プレートをPBSで洗浄し、37°Cで、グランザイムBと共に、および/またはグランザイムB阻害剤、3,4-ジクロロイソクマリンDCIと共に、4および24時間、室温でインキュベートした。次いで、上清を収集し、切断断片について評価した。断片は、ウェスタンブロットまたはN末端配列決定により決定した。切断の確認は、その後、精製した基質を用いて実施した。結果:細胞外グランザイムB基質を同定するために、組換えデコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、およびブレビカンを、精製したグランザイムBと共に24時間インキュベートした。反応は、SDS-PAGE負荷緩衝液を用いて停止させ、SDS-PAGEゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜のポンソー染色により画像化した。図1Aに示す通り、グランザイムBは、組換えデコリン、ビグリカン、ベータグリカン、シンデカン、およびブレビカンを切断する。グランザイムBが平滑筋細胞SMC由来のECMも切断するかどうかを決定するために、ECM合成のための5~7日間の血清飢餓の後、水酸化アンモニウムを使用してヒト冠動脈平滑筋細胞HCASMCを6ウェルプレートから除去した。グランザイムBをECM上で24時間インキュベートし、上清をフィブリリン-1、フィブリリン-2またはフィビュリン-2についてウェスタンブロットした図1B。図2は、グランザイムBが平滑筋細胞由来のデコリンおよびビグリカンも切断することを示す。十分なECM合成のために、HCASMCをコンフルエンシーにおいてインキュベートした。細胞を除去し、グランザイムBをECMと共にインキュベートし、デコリンおよびビグリカン切断断片をウェスタン免疫ブロットにより検出した。例2グランザイムBは、プロテオグリカンを切断し、細胞外マトリックスから封鎖されたTGF-βを放出する。方法:ECM切断アッセイのために、グランザイムBおよび/または阻害剤3,4-ジクロロイソクマリンDCIを、デコリン、ビグリカンまたは可溶性ベータグリカンと共に4および24時間、室温でインキュベートし、ポンソー染色により可視化した。切断部位同定のために、切断断片にエドマン分解を施した。TGF-βは、前述のプロテオグリカンにより封鎖されるので、グランザイムBをTGF-β結合プロテオグリカンと共にインキュベートして、グランザイムB切断により、封鎖されたTGF-βの放出が生じたのかどうかを決定した。サイトカイン放出を、上清においてウェスタンブロットを使用して評価した。グランザイムBにより放出されたTGF-βが活性であるかどうかを決定するために、上記放出アッセイからの上清をヒト冠動脈平滑筋細胞HCASMC上でインキュベートし、SMAD/Erk活性化をウェスタンブロットにより検査した。結果:グランザイムBは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンを切断し、25nMもの低さのグランザイムB濃度でのタンパク質分解が明白であった。タンパク質分解は、DCIにより阻害されたが、溶媒対照DMSOによっては阻害されなかった。エドマン分解分析により、アスパラギン酸のP1残基を用いてPGにおけるグランザイムB切断部位を決定し、これは、グランザイムB切断特異性と調和していた。サイトカイン放出アッセイにおいて、TGF-βは、24hのインキュベーション後、デコリン、ビグリカン、およびベータグリカンからグランザイムB依存的に遊離した。TGF-βは、グランザイムBの非存在下またはグランザイムBがDCIにより阻害された場合、放出されず、このことは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンからの放出が特異的であることを示していた。さらに、グランザイムBにより遊離されたTGF-βは、16hのインキュベーション後、活性なままであり、HCASMCにおけるSMAD-3およびErk-2リン酸化を誘発した以下を参照されたい。例3グランザイムBは、デコリン、ビグリカンおよび可溶性ベータグリカンを切断し、活性トランスフォーミング成長因子-βを放出する方法:プロテオグリカン切断アッセイ。組換えヒトPG、デコリン0.5μg、Abnova、Walnut、CA、ビグリカンおよびベータグリカン1.5~5ug、RDSystems、Minneapolis、MNを、室温で24h、25~500nMの精製したヒトグランザイムBAxxora、SanDiego、CAと共に、50mMのトリス緩衝剤、pH7.4においてインキュベートした。阻害剤研究のために、グランザイムBを、200μMのセリンプロテアーゼ阻害剤3,4-ジクロロイソクマリンDCI;SantaCruzBiotechnologyInc、SantaCruz、CAまたは阻害剤溶媒対照、ジメチルスルホキシドDMSO;Sigma-Aldrich、StLouis、MOの存在または非存在下で4hまたは24hインキュベートした。インキュベーション後、タンパク質は変性し、10のSDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写された。ポンソー染色FisherScientific、Waltham、MAを使用して、切断断片を検出した。N末端配列決定。エドマン分解のために、2~5μg/レーンのビグリカンおよびベータグリカンを100~500nMのグランザイムBと共に24hインキュベートした。ゲル上で泳動させ、PVDF膜に転写させた時点で、切断断片がポンソー染色により同定された。蒸留水を用いた洗浄により染色を除去し、該膜を乾燥させ、HospitalforSickKidsのAdvancedProteinTechnologyCenterToronto、ONで分析した。TGF-β放出アッセイ。MMPについて先に記載したのと同様の方法Imaiら、1997を使用して、TGF-β放出アッセイを行った。つまり、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカン15μg/mLを48ウェル組織培養物プラスチックプレート上にコーティングし、PBS、pH7.4において一晩4°Cでインキュベートさせた。1のウシ血清アルブミンを用いてブロックした後、1ウェル当たり20ngの活性TGF-β1PeprotechInc、RockyHill、NJを、カルシウムおよびマグネシウムを含有するDPBS14040、Invitrogen、Carlsbad、CAにRTで5h添加した。次いで、グランザイムBを、DCIと共にまたはなしで、該ウェルに添加した。24h後、上清を除去し、変性させ、15のSDS-PAGEゲル上で泳動させた。ニトロセルロース膜に転写し、10のスキムミルクを用いてブロックすると、ラット抗ヒトTGF-β1抗体1:200、BDBiosciences、FranklinLakes、NJおよびIRDye登録商標800共役親和性精製抗ラットIgG1:3000、RocklandInc、Gilbertsville、PAを使用して該膜を調べた。Odyssey赤外線イメージングシステムLI-CORBiotechnology、Lincoln、NEを使用してバンドを画像化した。ヒト冠動脈平滑筋細胞TGF-βバイオアベイラビリティーアッセイ。バイオアベイラビリティーアッセイのために、継代3~5代目のHCASMCClonetics/Lonza、Walkersville、MDを、平滑筋細胞成長媒体SmGM、Clonetics5のウシ胎仔血清FBS、Invitrogenにおける6ウェルプレートに播種し、コンフルエンスまで成長させた。このとき、細胞を血清除去により24h静止させ、その後、150μlの放出アッセイ上清上記の通りまたは10ngのTGF-β陽性対照を細胞に16h添加した。細胞溶解物を、SDS-PAGE/ウェスタンブロットにより、リン酸化Erk1/2p-Erk1/2;1:1000、CellSignalingTechnology、Danvers、MA、総Erk1/2t-Erk1/2;1:1000、CellSignalingTechnology、リン酸化SMAD3p-SMAD3;1:2000、Epitomics、Burlingame、CA、総SMAD3t-SMAD3;1:500、BDBiosciencesおよび負荷対照β-アクチン1:5000、Sigma-Aldrichまたはβ-チューブリン1:3000、Millipore、Billerica、MAについて評価した。二次IRDye登録商標800共役抗体1:3000、RocklandIncを利用し、Odyssey赤外線イメージングシステムLI-CORBiotechnologyを用いて画像化した。濃度測定分析をOdyssey赤外線イメージングシステムで実行し、p-SMAD-3/β-チューブリンおよびp-Erk/β-アクチン比により図式的に表示した。結果:グランザイムBは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンを切断する。デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムBとのインキュベーションにより、複数の切断断片が濃度依存的に発生した図3a~c。全長デコリン約65kDaならびに約50kDaおよび約30kDaでの4つのデコリン切断断片がグランザイムBインキュベーション後に認められた。ビグリカンは、約40kDaで同定され、約25kDaおよび15kDaで切断断片が認められたが、組換え可溶性ベータグリカン約100kDaのグランザイムBとのインキュベーションにより、複数の切断断片が約60kDaおよび40kDaで生じた。これらの基質の全てがPGであり、グリコサミノグリカンGAG鎖を含有するので、全長タンパク質および断片の見掛けMWは、グリコシル化によりゲルを通る動きが変わる恐れがあるので、正確ではない可能性がある。そのため、タンパク質およびタンパク質断片のうちのいくつかは、濃縮されたバンドとは対照的にスメアとして観察される。図3を参照すると、用量依存的なグランザイムB媒介のデコリン、ビグリカンおよびベータグリカンの切断がそこに示されている。増大する濃度のグランザイムB25、50、100および200nMをデコリンa、ビグリカンb、およびベータグリカンcと共にRTで24hインキュベートした。図3において使用する場合、マークは全長タンパク質を示し、矢印は切断断片を示し、^は、グランザイムBを示す。デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンタンパク質分解がグランザイムBにより媒介されることを確認するために、DCIを反応に4hまたは24h含めた図4a~c。より高い濃度のPG基質およびグランザイムBを、切断断片の最適検出のためのこのアッセイにおいて利用した。DCIは、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカン切断を両方の時点で効果的に阻害したが、ビヒクル対照DMSOは、効果がなかった図4a~c。グランザイムB切断部位同定。グランザイムB切断部位をエドマン分解によりビグリカンおよびベータグリカンにおいて特徴付けた図4b~c。デコリンのN末端配列の結果は、何回も試したにもかかわらず、低い断片収率が原因で得ることができなかった。ビグリカンにおいて、切断部位は、AspのP1残基を用いてAsp91Thr-Thr-Leu-Leu-Aspで同定された図4b。興味深いことに、ベータグリカンについて6つの独特なバンドの配列決定をしたにもかかわらず、1つの独特な切断部位、該タンパク質のc末端近くのAsp558Ala-Ser-Leu-Phe-Thrしか特徴付けられなかった図2c。1により標識されたベータグリカン断片のN末端配列は、該タンパク質のN末端に対応しており、2で標識された断片のN末端配列は、切断部位に対応していた図4c。SDS-PAGEゲルにおける見掛けサイズの違いは、グリコシル化の違いが原因である可能性が最も高い。グリコシル化におけるこの不均一性は、全長タンパク質がスメアとしてゲルの最上部を泳動するので、全長タンパク質において明白である図4cにおいてにより示す。図4を参照すると、PGのグランザイムB媒介切断が4hおよび24hでDCIにより阻害され、グランザイムB切断部位がアスパラギン酸をP1残基で含有することがそこに示されている。より具体的には、グランザイムBを、デコリンa、ビグリカンbおよびベータグリカンc、/-DCIおよび溶媒対照DMSOと共に4hおよび24hインキュベートした。ビグリカンおよびベータグリカンにおける切断部位は、N末端エドマン分解により同定された。図4で利用する場合、マークは全長タンパク質を示し、矢印は切断断片を示し、切断部位は右側に表示する。ビグリカン、デコリンおよびベータグリカンのグランザイムB依存的切断により、活性TGF-β1の放出が生じる。デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンは活性TGF-β1を封鎖するので、TGF-β放出アッセイを利用して、これらのタンパク質のグランザイムB媒介切断により活性TGF-β放出が生じたかどうかを決定した図5。インキュベーションの24h後、最小限のTGF-βがグランザイムBの非存在下でプレートから解離しており、このことは、PG/TGF-β複合体がインキュベーション時間中ずっと安定であったことを示唆している。グランザイムB処理の24h後、3つ全てのPGからTGF-βが上清に放出された。この放出は、DCIにより阻害され、このことは、該プロセスが活性グランザイムBに依存していたことを示唆している。ベータグリカンは、一貫してデコリンおよびビグリカンより多くのTGF-βを放出した。図5を参照すると、デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムB切断が活性TGF-βの放出につながることを示している。より具体的には、TGF-β1結合デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンでコーティングした48ウェルプレートをグランザイムB、DCI、および/または阻害剤溶媒対照で24h処理した。上清放出されたTGF-βを含有を収集し、放出されたTGF-βをウェスタンブロットにより検出した。これは、各PGについて2~3回繰り返したうちの代表的なウェスタンブロットである。グランザイムBにより放出されたTGF-βは活性なままであり、平滑筋細胞におけるSMADおよびErkシグナル伝達を誘発する。グランザイムBにより放出されたTGF-βが活性なままであり、阻害断片に結合していなかったことを決定するために、ベータグリカン放出アッセイからの上清をヒト冠動脈平滑筋細胞上で16hインキュベートした図6。SMAD-3およびErk1/2のリン酸化phoshoporylationおよび活性化を通してTGF-βシグナル伝達を検査した。HCASMCは、10ngのTGF-β陽性対照群に良好に応答し、16hでSMAD-3およびErk1/2リン酸化が増大した。グランザイムBによりベータグリカンから放出されたTGF-βは、SMADおよびErkシグナル伝達を誘発し、このことにより、グランザイムBにより放出されたTGF-βが活性なままであったことが確認される。予想どおり、グランザイムBの非存在下またはDCIの存在下では、TGF-βシグナル伝達は限定的であった。総Erkおよび総SMADレベルは、TGF-β処理により変化しなかった。図6を参照すると、グランザイムBにより放出されたTGF-βは、活性であり、HCASMCにおいてSMAD-3およびErk-2リン酸化を誘発する。より具体的には、グランザイムB/-DCIをベータグリカン/TGF-β複合体上で24hインキュベートした。上清放出されたTGF-βを含有をHCSMCに16h添加し、リン酸化Erkならびにリン酸化SMAD-3レベルを検査した。グランザイムB依存的リン酸化における同様の傾向が2つのさらなる実験において観察された図7。前述の例において、グランザイムBの3つの新規の細胞外基質:デコリン、ビグリカンおよびベータグリカンが同定された。さらに、グランザイムBによるこれらのPGの切断時に、活性TGF-βが放出されることが示された。報告書は、グランザイムBのおおよそ3分の1を免疫細胞会合/脱顆粒の間に非特異的に放出することができ、細胞傷害性リンパ球が標的細胞会合の非存在下でグランザイムBを恒常的に放出することを示していた例えば、Prakashら、2008を参照されたい。ある程度、ここで得られた結果に基づいて、グランザイムBは、病変形成において細胞外での役割を果たす。この研究において、ビグリカンおよびベータグリカンのグランザイムB切断部位が同定された。この研究において、グランザイムBがこれらのPG基質をAspのP1残基ビグリカン:D91、ベータグリカン:D558で切断したことが示された。さらに、ここに記載の研究において、TGF-β1は、3つ全ての基質から放出された。プロテアーゼを欠いた陰性対照において、またはグランザイムBを不可逆的阻害剤DCIと共にコインキュベートした場合、放出は認められなかった。さらに、グランザイムBにより放出されたTGF-βは、SMAD-3およびErk-2リン酸化を誘発し、それにより、グランザイムBが活性TGF-βを放出し、TGF-β活性を変えないことが確認される。ベータグリカン切断により、一貫してビグリカンおよびデコリンより多くのTGF-βが放出され、これは、ベータグリカンが複数のTGF-βの結合部位を有すること、およびグランザイムBが2つ以上の結合部位からサイトカインを潜在的に放出することが原因の可能性がある。要約すると、この例は、グランザイムBの3つの新規の因子の同定を示し、細胞外環境におけるグランザイムBの蓄積が、ECMによる成長因子抑制にどのように負の影響を及ぼすのかを示す。例4アポリポタンパク質Eノックアウトマウスにおける皮膚のマトリックス再構築および老化におけるグランザイムBの役割。ここで使用する略語:アポリポタンパク質EapoE;ノックアウトKO;二重ノックアウトDKO;細胞外マトリックスECM;グランザイムBグランザイムB;紫外線UV;高脂肪食餌HFD;第2高調波発生SHG。材料および方法:マウス。全ての動物手順は、UniversityofBritishColumbiaのAnimalCareCommitteeにより承認された動物実験用のガイドラインに従って実施した。雄のC57BL/6およびapoE-KOマウスをTheJacksonLaboratoryBarHarbor、MEから購入し、TheGeneticEngineeredModelsGEM施設JamesHoggResearchCentre、UBC/St.Paul’sHospital、Vancouver、BCに収容した。ApoE/グランザイムB二重ノックアウトマウスを現場で生成し、同様にGEM施設に収容した。全てのマウスに、高脂肪21.2脂肪、TD.88137、HarlanTeklad;Madison、WIまたは通常の固形飼料等量のPicoLabMouseDiet20:5058およびPicoLabRodentDiet20:5053、LabDiet;Richmond、INの食餌のいずれかを、6~8週齢で開始し、0、5、15または30週間のいずれかにわたって不断給餌した。それぞれの時点で、マウスを秤量し、二酸化炭素吸入により安楽死させた。寿命は、30週の時点まで飼育することを意図したマウス、ならびに開放性皮膚病変および黄色腫症の病変の形態の重症の病気が原因で必要とされる安楽死の結果としての死亡率のみを使用して測定した。安楽死を必要とする疾患重症度の程度は、GEM施設内で、独立した動物ケア技術者により盲検下で判定した。つまり、動物は、軽減することができない窮迫または疼痛状態にあるように見える場合に安楽死を検討された。動物は、鎮痛薬を服用することができないので、マウスは、安楽死が必要とされる開いた皮膚病変または重症の黄色腫が原因で苦しんでいると考えられる。組織の収集および処理。安楽死の後、マウスの背中の毛を剃り、背側の皮膚を中背部から下背部にかけて除去した。皮膚試料の半分を10のリン酸緩衝ホルマリン中で固定した。組織学的検査および免疫組織化学的検査のために、固定した皮膚切片を処理し、パラフィンに包埋し、断面が5μmとなるように切断した。背側の皮膚試料の残りの半分は、脱毛クリームで処理して、全ての毛を皮膚の表面から完全に除去した。次いで、これらの皮膚試料は、液体N2において瞬間凍結し、多光子顕微鏡検査でさらに使用するまで-80°Cで貯蔵した。組織学的検査および免疫組織化学的検査。パラフィン包埋した皮膚断面を、形態の評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンHEで、ならびにコラーゲン含量を検査するためにピクロシリウスレッドで染色した。Lunaのエラスチンを使用して、弾性線維を検査した。皮膚厚さの測定は、40X対物レンズおよび較正された接眼マイクロメータースケールを使用して完了した。測定は、皮膚の断面全体にわたって複数の部位で行い、各マウスについて平均化した。コラーゲンは、100の偏光を使用してピクロシリウスレッド染色切片において観察し、固定露光で写真を撮影した。グランザイムB免疫組織化学的検査は、脱パラフィンしたスライドをクエン酸緩衝液pH6.0中で15min沸騰させることにより実施した。背景染色は、スライドを10のヤギ血清と共にインキュベートすることによりブロックした。使用した一次抗体は、1:100希釈のウサギ抗マウスグランザイムB抗体Abcam、Cambridge、MAであり、4°Cで一晩インキュベートした。次いで、スライドを、1:350希釈のビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体VectorLaboratories、Burlingame、CAと共に、その後、ABC試薬VectorLaboratoriesと共にインキュベートした。染色は、DABペルオキシダーゼ基質peroxidisesubstrateVectorLaboratoriesを用いて可視化した。デコリン免疫組織化学的検査は、脱パラフィンしたスライドをクエン酸緩衝液pH6.0に80°Cで10min浸漬することにより実施した。スライドは、10のウサギ血清を用いてブロックし、スライドを4°Cで一晩インキュベートしている間、ヤギ抗マウスデコリン抗体1μg/mlRDSystems、Minneapolis、MNを使用した。ビオチン化ウサギ抗ヤギ二次抗体1:350VectorLaboratoriesを、上記のABC試薬VectorLaboratoriesおよびDAB基質VectorLaboratoriesと共に使用した。多光子顕微鏡検査。毛を完全に除去した凍結皮膚試料を室温で解凍し、小型皿の内部の平坦な表面に固定化した。皮膚試料を複数回洗浄し、リン酸緩衝buffed生理食塩水に浸漬した。第2高調波発生SHG信号が皮膚試料中のコラーゲンにより放射され、これをコラーゲン密度の尺度として定量化した。使用した方法は、先に記載したものと同様であったAbrahamら、2009年。つまり、使用したレーザーは、モード同期フェムト秒Ti:SapphireTsunamiSpectra-Physics、MountainView、CAであり、20X/0.5NAHCXAPOL水浸対物レンズを通して試験片に焦点を合わせた。880nmの励起波長を使用し、対物レンズを通して試料からの後方散乱したSHG放射を収集した。LeicaConfocalSoftwareTCSSP2を画像取得に使用した。取得した画像8ビットを10回フレーム平均処理して、ランダムノイズを最小化した。各試料について、組織深さが減少していく状況で、約200~250枚の厚さ約0.63μmのZ断面画像を取得し、試料当たりの厚さ測定は合計でおおよそ130~160μmであった。これらの測定は、観察した最も薄い真皮層が250μmであったので、完全に各試料の真皮内で行い、したがって、信号の低下は、真皮コラーゲン材料の欠如ではなく密度の低下が原因である。Z断面画像を編集し、最終的にVolocityソフトウェアImprovisions、Inc.、Waltham、MAを使用して3D画像復元を実施した。カーネルサイズが3×3のノイズ除去フィルターをこれらの3D画像に適用し、VelocityソフトウェアImprovisionsInc.を使用して設定閾値内のSHG信号を3D画像全体について定量化した。統計分析。生存率データを、Mantel-Cox試験を使用し、P<0.05を有意と見なして、有意性について分析した。群比較分析のために、必要に応じてボンフェローニ事後試験を伴う一または二元配置ANOVAを使用し、P<0.05を有意と見なした。結果:罹患率および皮膚病態。30週の前に安楽死を必要とした事例は全て、重症の開放性皮膚病変または黄色腫症の皮膚病変に起因していた。先の報告と矛盾なく、この研究におけるapoE-KOマウスは、野生型の対照と比較して顕著な健康の低下を示し、その結果、30週の期間にわたる罹患率および安楽死が必要となる頻度の増大が生じた図8A。野生型のマウスをHFDで飼育しても生存率は30週の期間にわたって変わらなかったが、apoE-KOマウスにHFDを供給した場合、安楽死の必要性は有意に増大し、たった約69しか30週の時点まで生存していなかった図8A。図8Bに示す通り、apoE-KOマウスは、脆弱化、脱毛、白毛化の兆候ならびにそれらの背中および肩での皮下病変または黄色腫の形成を30週で示した。これらの表現型は、apoE-KOマウスにHFDを供給した場合、より苛酷であり、早く発生した図8B。30週の群において通常の固形食餌で飼育した全てのapoE-KOマウスのうち、9/3129が黄色腫/皮膚病態の証拠を示し、最も早い事例では18週で示し、ほとんどの事例7/9は、30週で検査したときに明らかとなった。HFDを供給した場合、13/3241のapoE-KOマウスが黄色腫/皮膚病態の証拠を示し、10/13は、30週の時点より前に発生した。これらのデータは、HFDがこれらの病変の頻度および発症を加速させることを示す。興味深いことに、重症の黄色腫の出現は、安楽死を必要とする最初の事例が19.9週で現れ、観察された皮膚病態の総発生率はたった3/1421であったので、HFDを供給したDKOマウスにおいて遅延された図8A。比較すると、19.9週で、HFDを供給したapoE-KO群からの8匹のマウス25が既に安楽死を必要とし、最初の発生は、7週という早さであった表1。通常の固形食餌を供給したDKOマウスは、黄色腫を発生していると見られる場合もあった2/11または18が、30週の前に安楽死を必要とするほど苛酷ではなかった図8A。これらの結果は、グランザイムBが病変重症度に寄与すること、およびグランザイムBの低減によりこれらの皮膚病態の発症が遅延されることを示す。表1は、全ての群における皮膚病変の発生率および重症度の概要を示す。体重増加。HFDにより、C57BL/6対照マウスにおいて30週の時点で有意な体重増加が生じたが、HFDで飼育したapoE-KOマウスは、固形飼料を供給したapoE-KOマウスと比較して有意な体重の増大を示さず、30週でHFDを供給したC57BL/6マウスより有意に体重が少なかった図8F。体重増加を0、5、15および30週の時点で検査すると、HFDで飼育したC57BL/6マウスは、その食餌で飼育して5週間という早さで、固形飼料を供給した対照と比較して体重の有意な増大を示し、研究の間ずっと高いままであった図8C。ApoE欠損だけでは、固形飼料を供給した対照と比較して、体重増加における違いは30週まで生じず、30週では、固形飼料を供給したapoE-KO群の体重増加が止まり図8D、脆弱な表現型をとった図8B。apoE-KOマウスにHFDを供給した場合、それらは、対照群と同様の速度で体重が増加しているように見え、おそらく、15週ではより大幅に体重が増加した。しかし、30週までには、それらは、実際には体重が減少したように見え図8E、脆弱で病的な皮膚を示した場合が多かった図8B。このプロセスにおけるグランザイムBの役割を検査するために、通常の固形飼料またはHFDのいずれかで飼育したDKOマウスを30週まで維持した。いずれの群のDKOマウスも、C57BL/6固形飼料を供給した対照群またはapoE-KO群のいずれかと比較して、30週で体重における有意な違いを示さなかった図8F。図8を参照すると、C57BL/6固形飼料CC、C57BL/6高脂肪CH、apoE-KO固形飼料AC、apoE-KO高脂肪AH、DKO固形飼料GDCおよびDKO高脂肪GDHである。A高脂肪n=18または通常の固形飼料n=19食餌のいずれかで飼育したC57BL/6野生型のマウスの全てが30週の時点まで生存していたが、固形飼料を供給したapoE-KOマウスn=31の94が30週間生き続けていた。HFDは、対照CC群と比較して、apoE-KOマウスn=32における生存率を有意にP<0.01低減し、30週の期間生存するのに十分健康なままなのはわずか69であった。固形飼料を供給したDKOマウスn=11の100が30週の時点まで生存していたが、HFDを供給したDKOマウスn=14における罹患は、AH群と比較して遅延したように見えた。B30週の時点でのマウスの代表的画像。C~ECCと比較したCH、ACおよびAH群の0、5、15および30週にわたる体重増加。F30週の時点での全ての群のマウスの平均体重エラーバーは、平均±SEMを表す。D~F。P<0.05、P<0.001。より具体的には、図8Bに関して、そこの写真は、以下のものを示す:C57BL/6固形飼料-対照マウス、一般的な健康なサイズおよび体重。正常な外観の黒色の毛。C57BL/6高脂肪-対照マウスと比較して太っているように見え、毛および皮膚は、その他の点では通常である。ApoE-KO固形飼料-このマウスは、対照マウスと比較して脆弱であるように見え、白毛化の証拠および一部の領域の毛の菲薄化/脱毛を示す。ApoE-KO高脂肪-このマウスも対照マウスと比較してより脆弱であるように見え、C57BL/6マウスのように高脂肪食餌により体重を増加することができない。このマウスも、それらの背中に出現する白毛化、脱毛および炎症性皮膚病変黄色腫の証拠を示す。DKO固形飼料-これらのマウスは、対照マウスと比較して体重増加の観点から相対的に正常であるように見え、apoE-KO固形飼料群と比較して脱毛、白毛化および皮膚病変形成の発生率および重症度が低減した。DKO高脂肪-この群も、一般に、apoE-KO高脂肪群より健康であるように見え、脱毛、白毛化および皮膚病変の発生率および重症度が低減した。皮膚病理組織検査。図9に示す通り、apoE-KOマウスの皮膚は不均一であり;正常な普通の外観の皮膚図9Aおよび黄色腫症の病変を特徴とする他の領域図9Bを示している。これらの病変は、マウスの背中に発生することが多く、年齢と共に、およびHFDを供給すると、重症度および頻度の増大と共に生じる。C57BL/6野生型のマウスでは、食餌を問わず、30週の期間にわたるいずれの時点でも黄色腫症を示したものはなかった。apoE-KOマウスにおける黄色腫症の病変の組織学的検査により、皮膚肥厚が示され、これには、表皮の肥厚、相当な免疫浸潤、正常な脂肪組織の損失、ECM変性およびコレステロール結晶の存在が含まれていた図9B。黄色腫発生は、apoE-KOマウスにおいてよく見られたが、全てのマウスがこの表現型を示したわけではなく、場合によっては、マウスは、相対的に正常に見える皮膚を有していた図9A。図9を参照すると、ApoE-KOマウス皮膚は、不均一であり、皮膚の特定の領域は普通に見えるが、他の領域は黄色腫症の病変を含有するHE染色。AC57BL/6固形飼料CC、C57BL/6高脂肪CH、apoE-KO固形飼料ACR、apoE-KO高脂肪AHR、DKO固形飼料GDCRおよびDKO高脂肪GDHRからの30週の時点での普通な外観の皮膚。Bコレステロール結晶矢印を示している、30週の時点まで生存していたHFDを供給したapoE-KOマウスAHXからの黄色腫、ならびにC該病変の重症度が原因で14.9週で安楽死を必要としたHFDを供給したapoE-KOマウスからの黄色腫。E:表皮;D:真皮;A:脂肪組織。Aスケールバー=200μm、BおよびCスケールバー=100μm。皮膚厚さ。皮膚菲薄化および萎縮症は、ヒトとマウスの両方において年齢と共に発生する特徴的な特色である例えば、BhattacharyyaおよびThomas、2004を参照されたい。apoE-KOマウスがこの体質を示すかどうかを決定するために、本発明者らは、固形飼料またはHFDを供給したC57BL/6およびapoE-KOマウスのホルマリン固定した中背部から下背部からの皮膚切片を、HE染色を使用して0、5、15および30週で分析し、表皮、真皮、脂肪および骨格筋層を含めた総皮膚厚さを測定した図10A。apoE-KOマウスの皮膚の不均一な性質および黄色腫発生が皮膚厚さに対して劇的な効果を有するという事実図9に起因して、apoE-KOマウスからの皮膚試料を、黄色腫組織の存在に応じて2つの群:普通の皮膚および黄色腫の皮膚に分離した。HFDを供給した場合、野生型のC57BL/6マウスは、5、15および30週の時点で対照群より有意に厚い皮膚を有していた図10A。ApoE欠損単独では、図10Bに示す通り、対照と比較して経時的に有意な違いは生じなかった。興味深いことに、HFDを供給したapoE-KO群からの皮膚は、厚さを経時的に測定すると、30週では対照群より有意に薄いが、15週では対照群よりわずかに厚いように見えた図10C。このことは、これらの変化が、野生型の対照と比較して、単純に発育上の違いの結果ではなく、むしろ、時間とともに加速的に発生する変化であることを示す。グランザイムBの欠損により皮膚菲薄化および脆弱化が防がれるかどうかを決定するために、通常の固形飼料またはHFDで飼育したDKOマウスからの皮膚を30週で検査し、他の群と比較した。上述の通り、HFDは、C57BL/6群において有意な皮膚厚さの増大を引き起こしたが、apoE-KO群においては有意な厚さの低下を引き起こした図10G。HFDを供給したDKOマウスは、30週でHFDを供給したapoE-KO群と比較して総皮膚厚さの有意な増大を示し図10G、グランザイムBがapoE-KOマウスにおける老化関連の皮膚菲薄化および脆弱化に寄与することを示している。皮膚の個々の層のより厳密な分析により、普通の皮膚試料における総皮膚厚さの変化が、主に真皮および/または脂肪組織層の変化に起因していたことが示された。30週の時点ではいずれの群についても表皮厚さの有意な違いは観察されなかった図10Dが、真皮の厚さは、固形飼料を供給したDKO群において固形飼料を供給した対照群と比較して有意に厚かった図10E。興味深いことに、HFDを供給した場合、DKO群は、HFDを供給したapoE-KO群より有意に厚い真皮を有していた図10E。脂肪組織層の厚さの変化が最も多様であり、HFDを供給したC57BL/6群が有意な増大を示し、apoE-KO群および固形飼料を供給したDKO群のいずれも、固形飼料を供給した対照より有意に薄い脂肪組織層を有していた図10F。HFDを供給したDKOマウスは、固形飼料を供給した対照またはapoE-KO群のいずれかと比較して、脂肪組織厚さの有意な違いを示さなかった図10F。これらの結果は、apoE欠損により総皮膚厚さの低下が生じること、およびこのことが、脂肪組織の低下にある程度起因しており、一方、グランザイムBの欠損により、真皮厚さの増大にある程度起因して皮膚菲薄化が防がれることを示している。図10を参照すると、A~Cは、C57BL/6固形飼料CC、C57BL/6高脂肪CH、apoE-KO固形飼料ACRおよびapoE-KO高脂肪AHRの皮膚厚さを、非病的な普通の皮膚切片を使用して0、5、15および30週で測定した。個々の皮膚層をCC、CH、ACR、AHR、DKO固形飼料GDCRおよびDKO高脂肪GDHRについて30週で測定し、これには、D表皮、E真皮、F脂肪およびG骨格筋を含めた総皮膚厚さが含まれていた。エラーバーは、平均±SEMを表す。P<0.05対CC;P<0.01対CC;P<0.001対CC;†P<0.05対AHR;††P<0.01対AHR;†††P<0.001対AHR。apoE-KOマウスの皮膚におけるコラーゲンおよびエラスチン異常。apoE-KOマウスの病的な黄色腫皮膚病変において発生するコラーゲン変化を調査するために、皮膚切片をピクロシリウスレッドで染色し、偏光を使用して可視化した。図11Cおよび12Kに示す通り、皮膚病変は、対照マウスからの普通の皮膚と比較して、コラーゲン組織および構造の明らかな変性を示している図11A。コラーゲン線維は、病的な皮膚において、より平行な配向で配置され、コラーゲン束がより薄いことが多く図11C、これにより、これらの病変において観察された増大した剛性および皮膚脆弱化が説明される。真皮の一部の領域は、正常なコラーゲンのほぼ完全な損失/分解および真皮表皮バリアへの損傷の証拠を示していた図12I。病的な皮膚におけるエラスチン含量を検査するために、Lunaのエラスチン染色を使用した。野生型の対照マウスは、拡散したエラスチン分布ならびに細い弾性線維および最低限の大型のエラスチン束を示した図11E。病的な皮膚において、本発明者らは、真皮乳頭層におけるエラスチン沈着の増大ならびに真皮における異常なエラスチン束沈着を観察した図11FおよびG。図11を参照すると、固形飼料を供給したC57BL/6マウスからの皮膚切片は、厚い高密度コラーゲン線維を示すが、HFDで飼育したapoE-KOマウスは、しばしば、対照と比較して低減した密度と共にコラーゲン形態が変化した領域を示す。A固形飼料食餌で30週間飼育したC57BL/6マウスからの皮膚コラーゲンの画像E:表皮;D:真皮;A:脂肪組織。BHFDで30週間飼育したapoE-KOマウスからの普通の皮膚試料からの皮膚コラーゲン。C黄色腫を含有する病的な領域からのHFDを供給したapoE-KOマウスの皮膚コラーゲン。DHFDを供給したDKOマウスの30週での普通の皮膚からの皮膚コラーゲンの例。E固形飼料食餌で30週間飼育したC57BL/6マウスからのエラスチンエラスチンは濃い紫色に染まる-矢印。FおよびG病的な皮膚を有する30週間HFDを供給したapoE-KOマウスからの異常なエラスチン沈着矢印の例。偏光の下で見たピクロシリウスレッド染色A~DおよびLunaのエラスチン染色E~G。A~DおよびF~Gスケールバー=100μm、Eスケールバー=10μm。図11において、コラーゲンをモニターしている。図11Aにおいて、コラーゲンを正常な非ノックアウトマウスからのこのスライドに高密度に充填している。図11Bは、apoE-KOマウスからのスライドである。コラーゲンは、それほど高密度に充填されていないように見える。図11Cにおいて、このスライドは、apoE-KOマウスからの病的な皮膚を示している。コラーゲンは、直線的であるように見え、それほど弾性ではない。図11Dにおいて、このスライドは、グランザイムB-/-ApoE-KOマウスにおけるコラーゲンを示している。コラーゲンは、単一ノックアウトapoE-KOマウス組織と比較してより高密度に充填されているように見える。図11Eおよび11Fにおいて、エラスチンをモニターしている。図11Eは、正常なマウスからのデータである。右側のパネルは、エラスチン線維を示している矢印を参照されたい。皮膚apoE-KOマウスにおけるデコリン再構築およびグランザイムB発現。コラーゲン組織崩壊は、病的なapoE-KOマウスの皮膚において容易に観察された図12I。皮膚の一部の領域において最低限の違いが観察された図12Bが、病的な皮膚切片を抗デコリン抗体で染色することにより、apoE-KOマウスの病的な皮膚の他の領域においてデコリンの明確な損失が示された図12CおよびD。デコリン分解の領域は、コラーゲン損失および再構築の領域と一致した図12IおよびJ。DKOマウスは、特に真皮表皮接合の近くの非病的な皮膚切片において増大したデコリン含量を示した図12EおよびF。さらに、デコリン損失の領域は、DKOマウスからの病的な皮膚切片において、apoE-KOマウスほど観察されなかった図12GおよびH。apoE-KOマウスからの黄色腫皮膚切片を抗グランザイムB抗体で染色した場合、グランザイムBは、特定の領域の病変において観察され、真皮表皮接合近くの真皮乳頭層に局在していることが多かった図12K。興味深いことに、該病変における局在型グランザイムB発現のこれらの領域は、染色連続切片から明らかなように、コラーゲン/デコリンの損失および再構築の領域と直接一致した図12I~K。これらの結果は、デコリンの切断を通して皮膚のコラーゲン再構築にグランザイムBが関与していることを示す。図12を参照すると、Aは、固形飼料を供給したC57BL/6B~DHFDを供給したapoE-KOからの皮膚におけるデコリン染色であり、E~Fは、真皮表皮接合近くの真皮乳頭層でより濃いデコリン染色矢印を示すHFDを供給したDKOの普通の皮膚であり、G~Hは、DKOの病的な皮膚である。Iコラーゲン、Jデコリンおよび、KおよびLグランザイムBを染色したHFDを供給したapoE-KO皮膚の連続切片。A~HおよびLスケールバー=50μm、I~Kスケールバー=200μm図12Aにおいて、正常なマウスにおけるデコリン染色を示す。染色は、表皮真皮接合部に向かって強くなっている。図12Bは、apoE-KOマウスにおけるデコリン染色を示す。染色は、より拡散している。図12Cおよび12Dは、apoE-KOマウス組織からの皮膚の病的な部分にデコリン染色がほぼ存在していないことを示す。図12Eおよび12Fは、グランザイムB-/-apoE-/-マウス組織からの普通の皮膚を示す。強いデコリン染色が存在している。図12Gおよび12Hは、グランザイムB-/-apoE-/-マウス組織からの病的な皮膚を示す。図12Hにおいて、デコリンは表皮に存在している。図12I、12J、および12Kは、コラーゲン、デコリン、およびグランザイムBをそれぞれモニタリングしている連続切片であり、全て、apoE-KOマウス組織からのものである。図12Lは、図12Kからのズームイン写真である。図12Kにおいて、グランザイムB染色が増大している。コラーゲン密度および組織。apoE-KOマウスが普通の非黄色腫皮膚においてコラーゲン含量の違いを示すかどうかを決定するために、ホルマリン固定した皮膚切片にピクロシリウスレッド染色を使用し、コラーゲン含量および構造の変化について分析した。固形飼料を供給した対照群からの真皮コラーゲンは、30週の時点で厚い高密度コラーゲン線維の一般的な赤色/オレンジ色の染色を示した図11A。対照的に、HFDを供給したapoE-KOマウスは、緩く充填され、対照群ほど構造化されていない真皮コラーゲンを示すことが多かった図11B。これは、HFDを供給したDKO群を含めた他の群においては容易に観察されず図11D、このことは、HFDとapoE欠損を組み合わせると、apoE-KOマウス皮膚におけるコラーゲン構造および密度に影響が及ぶこと、ならびにグランザイムB欠損により厚い線維の形成およびコラーゲン密度の損失が予防されることを示唆している。固定した薄くスライスした切片の分析により、コラーゲン含量および構造に関して有用な情報を得ることができるが、重要な三次元および組織に関する性質は、処理の間に損なわれるまたは変性する可能性がある。本発明者らは、コラーゲンの複屈折bifringent性質を利用して、三次元空間において多光子顕微鏡検査を使用して、固定していない非染色の厚い皮膚試料におけるコラーゲン構造および組織を視覚化した。高秩序の原線維形成コラーゲンタイプI、II、III等は、第2高調波発生SHG信号を生成し、外因性の標識を必要としない例えば、Zipfelら、2003を参照されたい。これらのSHG信号は、総コラーゲン含量ではなくコラーゲンマトリックスの密度および組織と相関する。コラーゲンマトリックス灰色に由来する代表的な平面化したflattened三次元SHG画像を、30週の時点での全ての群について図13Aに示す。非病的な皮膚のみをこれらの実験に使用して、観察されたECM変化が、確実に、黄色腫形成の結果ではなく、むしろ、より内因性の老化プロセスの結果であるようにする。コラーゲン密度を経時的にモニターした場合、0週の時点では、C57BL/6およびapoE-KO群が同様であるように見えた図13B~D。固形飼料を供給した対照群は、経時的にコラーゲン密度のわずかな低下を示すように見えたが、HFDを供給したapoE-KOマウスは、年齢の関数としてSHG信号の低減を示し、これは、5週で、野生型の対照より早い速度で開始し、これは、コラーゲン修飾および組織崩壊の速度増大を示しており、30週間でコラーゲン密度の有意な損失が生じた図13D。これらの実験において使用した皮膚が普通の非黄色腫皮膚であったことを確認するために、これらの実験に続いて皮膚試料を10の緩衝ホルマリンに固定し、HE染色を使用して組織学的に検査した。組織学的検査をすると、これらの実験のために選択したHFDを供給したapoE-KO皮膚は、黄色腫症の証拠を示さず、観察されたコラーゲン密度の変化が黄色腫形成によりもたらされたのではなく内因性の性質であることを確認したデータ図示せず。これらの結果は、HFDを供給したapoE-KOマウスの皮膚において、老化関連ECM変化が、黄色腫が形成されていない皮膚切片においてさえも、野生型のマウスと比較して増大した速度で発生しており、早すぎる皮膚の老化につながることを示す。図13を参照すると、Aは、固形飼料を供給したC57BL/6CC、apoE-KOマウスACRおよびDKOマウスGDCR、ならびにHFDを供給したC57BL/6CH、apoE-KOマウスAHRおよびDKOマウスGDHRから30週で得た新たなex-vivoの固定していない非染色のマウスの普通の皮膚組織の代表的3Dマージ平面画像である。灰色は、コラーゲンマトリックスを表す。B~Dは、それらのそれぞれの食餌で0、5、15および30週間飼育したCC、CH、ACRおよびAHR群についての、SHG信号の強度として表される時間の関数としてのコラーゲン密度である。Cは、6つ全ての群についての30週の時点でのコラーゲン密度である。ノックアウトグランザイムBは、HFDを供給したapoE-KOマウスにおいて失われたSHG信号強度を回復させる。エラーバーは、平均±SEMを表す。P<0.05対CC;P<0.01対CC;†P<0.05対AHR;††P<0.01対AHR。スケールバー=80μm。観察されたコラーゲン密度の損失におけるグランザイムBの役割をさらに検査するために、固形飼料またはHFDをこの時点で大部分の極端な違いが観察されたので30週間供給した後でDKOマウスの皮膚もSHGを使用して検査した。言及した通り、30週の時点で、HFDを供給したapoE-KOマウスのみが、SHG信号の減少により示される通り、固形飼料を供給した対照群と比較して有意に減少した皮膚のコラーゲン密度を示し図13E、このことは、apoE欠損とHFDを組み合わせると、皮膚コラーゲン密度の損失が生じることを示唆している。いずれかの食餌で飼育したDKOマウスのいずれの群も、HFDを供給したapoE-KO群と比較した場合、皮膚コラーゲン密度の有意な増大を示し、このことは、皮膚における内因性の老化プロセスにおいて、真皮コラーゲンの年齢依存的な組織崩壊を促進することによりグランザイムBが関与していることを示していた図13E。グランザイムBは、デコリンを切断し、デコリン分解の領域に存在している。図14を参照すると、グランザイムBの添加により、全長グリコシル化デコリンの分解および損失が24hで生じる。このことは、強力なグランザイムB阻害剤、化合物20が含まれる場合に防止される。図14A;アステリスク=全長タンパク質。野生型の固形飼料WT、apoE-KO高脂肪ApoE-脂肪およびDKO高脂肪DKO-脂肪群からの非病的な皮膚におけるデコリン免疫染色濃い灰色。矢印は、真皮表皮接合の近くの増大したデコリンを指し示すスケールバー=50μm図14B。ApoE-脂肪およびDKO-脂肪群からの病的な皮膚におけるデコリン免疫染色濃い灰色スケールバー=50μm図14C。ApoE-脂肪マウスからの病的な皮膚におけるグランザイムB免疫染色濃い灰色。Eは、表皮を示し、Dは、真皮を示す。矢印は、真皮表皮接合の領域を指し示すスケールバー=100μm図14D。肥満細胞およびグランザイムBを二重染色したApoE-脂肪マウスからの病的な皮膚切片。矢印は、肥満細胞濃い灰色内のグランザイムB薄い灰色を指し示すスケールバー=25μm図14E。前述の例における結果の検討:本研究において、HFDがapoE-KOマウスにおける皮膚の老化に対して相当な効果を有することが示された。HFDは、マウスの老化に伴う炎症性皮膚疾患の頻度に影響を及ぼすだけではなく、ECMの構造的組織における有意な老化に関連した変性と共に、脆弱で薄くなった皮膚の状態ももたらす。本発明者らは、セリンプロテアーゼ、グランザイムBが、皮膚の老化および疾患において、鍵となるECMタンパク質およびプロテオグリカンの再構築を通して重要な役割を果たすことも示す。apoE-KOマウスにHFDを30週間供給した場合、それらは、脆弱化および野生型の対照と比較して増大した罹患率を示した図8。このことは、皮下脂肪組織の損失と共に、皮膚病変の増大および皮膚菲薄化の形態で組織学的にも観察された図9および10。黄色腫の発生は、食餌を問わずapoE-KOマウスにおいて発生したが、特定の内因性老化表現型、例えば、皮膚菲薄化およびコラーゲン密度の損失などを観察するのにHFDが必要であった図10および13。apoE-KOマウスにおける皮膚病変の発症および重症度と同様に、HFDは、これらの老化特徴を加速し、固形飼料を供給したapoE-KOマウスも、30週を超えたより遅い時点での検査でこれらの表現型を示す。この研究において、通常の固形飼料またはHFDを供給したapoE-KOマウスは、30週で脂肪層厚さの低下を示したが、HFDを供給したapoE-KOマウス皮膚における皮膚厚さ全体は、15~30週の時点で減少した図10。このことは、グランザイムB欠損により、真皮厚さを保存することによりこの皮膚菲薄化表現型の救助がある程度促進されることを示す図10。黄色腫皮膚試料におけるコラーゲンおよびエラスチンの分析により、光老化した皮膚において見られることが多い日光弾力線維症と類似の異常なエラスチン沈着と共にコラーゲンの相当な再構築が示された。普通のapoE-KOマウスの皮膚における老化に関連した変化の存在は、黄色腫皮膚の肥厚し再構築した炎症促進性状態と共に、apoE-KOマウスが内因性/経時的皮膚の老化と光老化と同様の外因性老化の両方の特色を示し、いずれの場合も、ヒトにおけるこれらの形態の皮膚の老化を模倣するECM変化が生じることを示す。この研究において、セリンプロテアーゼグランザイムBが、apoE-KOマウスの皮膚のコラーゲンおよびデコリンの分解および再構築の領域において発現する証拠が得られた図12。本発明者らの結果は、グランザイムBが、老齢のapoE-KOマウスにおいて観察された脆弱な/薄い皮膚および高密度コラーゲンの欠如に寄与することも示す。さらに、病的な皮膚試料において観察されたグランザイムBの苔癬様の発現により、病変形成およびECM分解の新規の機序が提示される。苔癬様の炎症は、複数の炎症性皮膚疾患の特徴的な特色である。この領域におけるグランザイムBの存在により、グランザイムBが真皮表皮接合またはその付近のECMを破壊することも示される。実際に、DKOマウスは、真皮表皮接合近くの皮膚においてデコリン染色の明らかな増大を示した例えば、図12EおよびFを参照されたい。病的な皮膚に加えて、HFDを供給したが通常の固形食餌は供給していないapoE-KOマウスが、普通の皮膚試料における30週の期間にわたるSHGおよび多光子顕微鏡検査により示される、真皮におけるコラーゲン密度の有意な損失を示した図13。これらの実験は、新たな厚い組織切片に対して行い、それにより、任意の固定または処理法の前に3Dの皮膚のコラーゲン含量に独特な展望がもたらされる。これらの皮膚組織のその後の固定および組織学的分析により、HFDを供給したapoE-KOマウスにおけるコラーゲン密度の低下が普通の非黄色腫皮膚において発生したこと、およびSHG信号の減少は、単純に黄色腫の存在が原因ではないことが確認されたデータ図示せず。固定した皮膚切片をピクロシリウスレッドで染色することにより、apoE-KOマウスの皮膚において、対照と比較してより拡散したコラーゲンパターンも示した図11B。興味深いことに、本発明者らは、DKOマウスを使用して、このコラーゲン密度および組織信号の低下を、グランザイムB活性をブロックすることにより救助できることを示す例えば、図11および13を参照されたい。要約すると、これらの発見は、apoE-欠損により、皮膚における炎症促進性状態の増大が生じ、これが、ECM再構築および観察された他の老化に関連した変化に寄与すること、およびHFDが、グランザイムB媒介機序を通してこれらの変化を悪化させることを示す。これらの発見は、デコリンの切断および真皮コラーゲンの再構築を伴う、皮膚におけるグランザイムBの新規の役割も示し、これは、ECM構造、老化および疾患における皮膚の脆弱性、ならびに創傷修復において重要な意味を有するプロセスである。例5特定の小分子阻害剤Willoughby20を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりベータグリカン切断が阻害される。この例において、特定の小分子阻害剤Willoughby20を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害により、ベータグリカン切断が阻害される。図15に示す通り、インキュベーションを室温で24時間実施し、総反応体積は30μlであった。試料を10のゲル上で泳動させ、ポンソー染色を用いて画像化し、走査した。図15に示す通り、アステリスクは全長タンパク質を示し;矢印は切断断片を示す。例6特定の小分子阻害剤Willoughby20を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりプロテオグリカン封鎖TGF-βの放出が阻害される。この例において、20ug/mlのベータグリカンを48ウェルプレート上にコーティングし、10ngのTGF-βと共にインキュベートした。過剰なTGF-βを洗浄してプレートから取り除き、ベータグリカン/TGF-β複合体をグランザイムB/-阻害剤と共にRTで24hインキュベートした。上清放出されたTGF-βを含有を収集し、TGF-βについてウェスタンブロットした。グランザイムBの非存在下では、TGF-βの上清への非特異的解離はほとんどなかった2;図16を参照されたい。TGF-βは、24hのインキュベーション後、グランザイムBにより放出される4;図16を参照されたい。放出は、Willoughby20特定のグランザイムB阻害剤により阻害され5;図16を参照されたい、DCIにより部分的に阻害される非特異的セリンプロテアーゼ阻害剤6;図16を参照されたい。例7特定の小分子阻害剤Willoughby20を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりデコリン切断が阻害される。この例において、インキュベーションをRTで24h実施し、総反応体積は30ulであった。試料を10のゲル上で泳動させ、クーマシーブルー染色により画像化した。図17を参照すると、アステリスク=全長タンパク質である。例8グランザイムBグランザイムBの小分子阻害剤の同定。小分子ライブラリーZINC-IrwinJJおよびShoichetBK、2005。J.ChemInfModel4591:177~182;NCI-Voigt、J.H.ら。J.Chem.Inf.Comput.Sci.2001、41、702~712を、グランザイムB阻害性化合物候補についてinsilicoでスクリーニングした。複数の小分子阻害剤候補が同定され、インビトログランザイムB阻害アッセイを施した。より具体的には、基質Ac-IEPD-pNAを用いてグランザイムB活性の連続比色colormetricアッセイを実施した。つまり、8ug/mlのグランザイムB、20μMの基質、および増大する濃度の目的の阻害剤をインキュベートし、最終反応体積は50ulであった。反応緩衝剤は、50mMのHEPESpH7.5、10のスクロース、0.1のCHAPSおよび5mMのDTTからなっており、反応は、37°Cで行った。pNA放出およびグランザイムB阻害を、TecanSafireマイクロプレートリーダーで405nmでモニターした。アッセイにおいて、グランザイムBは、4μg/ml0.145μMの濃度で使用し、これは、対象において観察されるものより約80000倍高いと推定され、本発明者らの発見は、GrBの病態的レベルが、50pg/ml超~約150pg/mであることを示していた。結果は、表Bに示す。ここで詳述する通り、およびこの例の表AおよびBにおいて詳述する通り、阻害剤候補、および阻害アッセイから得られたIC50濃度は、以下に示す。化合物NCI644752、NCI644777、ZINC05317216、NCI630295は、約100μM以下のIC50を示し高い阻害;化合物NCI641248、NCI641235、NCI642017、NCI641230、NCI641236、NCI640985、NCI618802、NCI623744は、約320μM以下のIC50を示した低い阻害。例9小分子阻害剤は、デコリンのグランザイムB切断を阻害する。この例の詳細は、代表的に図18に示す。より具体的には、図18は、小分子阻害剤を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりECM切断が阻害されることを示す。そこで詳述する通り、アステリスクは、全長タンパク質をマークする。矢印は切断断片を示し、星印は、全長タンパク質を示す。より具体的には、図18との関係において、内因性ECMを合成するために、ヒト冠動脈平滑筋細胞を6ウェルプレートに播種し、血清飢餓媒体SMGM0.2のFBS中でコンフルエンシーにおいて7日間インキュベートした。0.25Mの水酸化アンモニウムを用いた20minのインキュベーションにより、細胞をプレートから除去した。この処理により、細胞は除去されるが、周囲の細胞外マトリックスは無傷のまま残る。その後、100nMのグランザイムBおよび目的の阻害剤を内因性ECM上で24hインキュベートした。プレートからの上清切断断片を含有をSDS-PAGEゲル上で泳動させ、フィブロネクチンまたはデコリンについてウェスタンブロットした。DMSO溶媒対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク=全長タンパク質;矢印=切断断片、星印は、全長を示す。例10小分子阻害剤を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりECM切断が阻害される。本明細書の図19に示す通り、内因性ECMを合成するために、ヒト冠動脈平滑筋細胞を6ウェルプレートに播種し、血清飢餓媒体SMGM0.2のFBS中でコンフルエンシーにおいて7日間インキュベートした。0.25Mの水酸化アンモニウムを用いた20minのインキュベーションにより、細胞をプレートから除去した。この処理により、細胞は除去されるが、周囲の細胞外マトリックスは無傷のまま残る。その後、100nMのグランザイムBおよび目的の阻害剤を内因性ECM上で24hインキュベートした。プレートからの上清切断断片を含有をSDS-PAGEゲル上で泳動させ、フィブロネクチンまたはデコリンについてウェスタンブロットした。DMSO溶媒対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク=全長タンパク質;矢印=切断断片、星印は、全長を示す。例11NCI644777を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりベータグリカン切断が阻害される。本明細書の図20に示す通り、インキュベーションをRTで4h実施し、総反応体積は30μlであった。試料を10のゲル上で泳動させ、ポンソー染色を用いて画像化し、走査した。化合物NCI644752は、100μMでベータグリカンのグランザイムB切断を阻害しないしかし、150μMでデコリン切断に対して有効であることが先に示された。化合物NCI644777は、グランザイムBを50μMで部分的に、および100μMで完全に阻害する。DMSOビヒクル対照は、冗長になるので含まなかった。アステリスク=全長タンパク質;矢印=切断断片。グランザイムB/ベータグリカンレーンの妨害物は、最初の2つの切断断片に影響を及ぼしている。例12Willoughby20を使用したグランザイムBグランザイムBの阻害によりフィブロネクチン切断が阻害される。本明細書の図21AおよびBに示す通り、フィブロネクチンFNおよびグランザイムBを用いて、阻害剤Willoughby20の非存在下および阻害剤Willoughby20の存在下の両方で、本明細書に記載のインキュベーションを実施した。化合物Willoughby20は、3.12nMでFNのグランザイムB切断を阻害する。さらに、図21Aは、HMVEC添加ヒト微小血管内皮細胞の結果およびその後の細胞数を示し、フィブロネクチンFNのグランザイムB切断により、FNへのEC癒着が用量依存的に低減することを示す。図21Bは、グランザイムBが特異的および用量依存的にフィブロネクチンを切断し、その結果、フィブロネクチン断片の放出が生じることを示す。例13グランザイムBの阻害によりインビボで慢性創傷におけるデコリン分解が予防される。図23において示す通り、デコリン分布は、閉じた創傷組織においてserpina3nの影響を受ける。7週齢の野生型のC57BL/6マウスに、直径1cmの全層創傷を背中に与えた。次いで、マウスに、生理食塩水上部パネルまたはグランザイムB阻害剤、serpina3n下部パネルのいずれかを、創傷手順の直後に60μlの適切な溶液を直接創傷に適用することにより与えた。創傷を16日間治癒させ、その時点でマウスを屠殺し、閉じた創傷組織を収集した。デコリンの免疫組織化学的検査により、新たに形成された真皮におけるデコリン分布のパターンの2つの群の間の違いが示された。生理食塩水で処理されたマウスは、真皮表皮接合の近くでデコリンの漸進的な増大を示した。Serpina3nで処理されたマウスは、真皮表皮接合の近くで強いデコリン染色を示したが、より深い真皮への強いデコリン染色も示し、グランザイムB阻害により、急性または慢性創傷における過剰なデコリン分解が予防されることを示した。したがって、新たに形成された真皮の全体にわたるデコリンの増大により、より組織化したコラーゲン、より少ない瘢痕化および増大した引張強さがもたらされる。特定の本発明の態様について説明および例示してきたが、そのような態様は、単に本発明を例示するものと見なすべきであり、本発明を限定するものと見なすべきではなく、添付の特許請求の範囲に従って解釈されると見なすべきである。本発明の他の特色および利点は、以下の図面および発明の説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。"