"BRAF活性を有する突然変異型BRAFポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチド配列番号2またはBRAFV600Eポリペプチド配列番号4と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、上記核酸分子。前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される位置において起こる、請求項1に記載の核酸分子。前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される、請求項1に記載の核酸分子。前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドと比較して、1~5個のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の核酸分子。前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドと比較して、1個のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の核酸分子。前記突然変異型BRAFポリペプチドは、1またはそれより多くのアミノ酸位置T521K、V528F、または、P686Qに置換を含むBRAFポリペプチドである、請求項1に記載の核酸分子。前記BRAF阻害剤は、RAF-265またはPLX4720である、請求項1~6のいずれか一項に記載の核酸分子。請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。請求項8に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。請求項9に記載の宿主細胞によって突然変異型BRAFポリペプチドが生産されるように、該細胞を培養することを含む、突然変異型BRAFポリペプチドの製造方法。BRAF活性を有する単離された突然変異型BRAFポリペプチドであって、ここで前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチド配列番号2またはBRAFV600Eポリペプチド配列番号4と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、上記ポリペプチド。前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される位置において起こる、請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。前記少なくとも1つのアミノ酸置換は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される、請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドと比較して、1~5個のアミノ酸置換を有する、請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドと比較して、1個のアミノ酸置換を有する、請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。前記BRAF阻害剤がRAF-265である、請求項11~15のいずれか一項に記載の突然変異型BRAFポリペプチド。癌治療において有用な化合物の同定方法であって、該方法は:a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドおよびBRAF基質を含む分析組成物を提供すること;b試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること;およびcBRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること;を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は癌治療において有用な化合物として同定される、上記方法。第二世代のBRAF阻害剤としての化合物の同定方法であって、該方法は:a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドおよびBRAF基質を含む分析組成物を提供すること;b試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること;および、cBRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること;を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される、上記方法。前記BRAF基質がMEK1またはMEK2である、請求項17または18に記載の方法。前記MEK1またはMEK2のリン酸化は、リン酸特異的MEK抗体を用いて決定される、請求項19に記載の方法。前記MEK1またはMEK2のリン酸化は、ミエリン塩基性タンパク質MBPのリン酸化を測定することによって決定される、請求項19に記載の方法。前記分析組成物は、細胞抽出物である、請求項17または18に記載の方法。癌治療において有用な化合物の同定方法であって、該方法は:a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること;b該細胞を試験化合物と接触させること;および、cBRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること;を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は癌治療において有用な化合物として同定される、上記方法。癌治療において有用な化合物の同定方法であって、該方法は:を含み、a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること;b該細胞を試験化合物と接触させること;および、c細胞増殖に対する試験化合物の作用を決定すること;ここで適切なコントロールと比較して細胞増殖が減少していれば、その化合物は癌治療において有用な化合物として同定される、上記方法。第二世代のBRAF阻害剤である化合物の同定方法であって、該方法は:を含み、a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること;b該細胞を試験化合物と接触させること;および、cBRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること;ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされていれば、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される、上記方法。第二世代のBRAF阻害剤である化合物の同定方法であって、該方法は:を含み、a請求項11に記載の突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること;b該細胞を試験化合物と接触させること;および、c細胞増殖に対する試験化合物の作用を決定すること;ここで適切なコントロールと比較して細胞増殖が減少していれば、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される、上記方法。前記BRAF基質は、MEK1またはMEK2である、請求項23または25に記載の方法。試験化合物を第二世代のBRAF阻害剤として同定するための細胞ベースのスクリーニング方法であって、該方法は、請求項9に記載の宿主細胞を試験化合物と接触させることを含み、ここで試験化合物に対する宿主細胞の感受性が、第二世代のBRAF阻害剤としての化合物を同定する、上記方法。前記試験化合物に対する宿主細胞の感受性は、細胞増殖分析、細胞の生存の分析およびMEKリン酸化分析からなる群より選択される分析を用いて測定され、ここで試験化合物の存在下において細胞増殖、細胞の生存、またはMEKリン酸化における減少がみられた場合、その化合物は第二世代のBRAF阻害剤として同定される、請求項28に記載の方法。第二世代のBRAF阻害剤の同定方法であって、該方法は:a突然変異型BRAFポリペプチドの三次元結晶または溶液構造を用いたコンピューター支援モデリングによって候補薬を選択すること、ここで前記突然変異型BRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここで上記少なくとも1つのアミノ酸置換は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する;b前記候補薬を突然変異型BRAFポリペプチドと接触させること;および、c前記候補薬と突然変異型BRAFポリペプチドとの相互作用を検出すること;を含み、ここで突然変異型BRAFポリペプチドと相互作用することができる化合物が、第二世代のBRAF阻害剤として同定される、上記方法。前記試験化合物は、化合物ライブラリーに含まれる化合物である、請求項17~30のいずれか一項に記載の方法。請求項17~31のいずれか一項に記載の方法によって同定された単離された化合物。突然変異型BRAFポリペプチドを、請求項17~31のいずれか一項に記載の方法に従って同定された化合物と接触させることを含む、突然変異型BRAFポリペプチドの活性を阻害する方法。前記化合物はさらに、野生型BRAFポリペプチドの活性を阻害する、請求項33に記載の方法。前記接触は、インビトロで起こる、請求項33に記載の方法。前記接触は、インビボで起こる、請求項33に記載の方法。前記接触は、被験者中で起こる、請求項33に記載の方法。前記接触は、癌を有する被験者中で起こる、請求項33に記載の方法。前記被験者は、RAF-265での治療後に再発を起こしている、請求項38に記載の方法。前記癌は、黒色腫である、請求項38または39に記載の方法。被験者に、請求項17~31のいずれか一項に記載の方法に従って同定された化合物を投与することを含む、癌を有する被験者の治療方法。前記化合物はさらに、野生型BRAFポリペプチドの活性を阻害する、請求項41に記載の方法。前記被験者は、RAF-265での治療後に再発を起こしている、請求項41または42に記載の方法。前記癌において、BRAFポリペプチド中の1種またはそれより多くの突然変異、または、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異が同定され、ここで前記1種またはそれより多くの突然変異は、突然変異型BRAFポリペプチドに、1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、請求項41~43のいずれか一項に記載の方法。前記癌は、黒色腫である、請求項41~44のいずれか一項に記載の方法。癌を有する被験者を、RAF阻害剤での治療に耐性を付与するBRAF突然変異に関してスクリーニングする方法であって、該方法は、a被験者から癌細胞を含むサンプルを得ること;および、bサンプル中で野生型BRAFポリペプチド配列番号1またはBRAFV600Eポリペプチドをコードする核酸分子配列番号3と比べて1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を同定すること、ここで該突然変異は、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択されるBRAFポリペプチド中の1またはそれより多くのアミノ酸をコードする位置で起こる、を含み、ここで癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有すると同定される、上記方法。前記核酸分子は、野生型BRAFポリペプチド配列番号2またはBRAFV600Eポリペプチド配列番号4と比べて、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fからなる群より選択される1またはそれより多くのアミノ酸置換を有するBRAFポリペプチドをコードする、請求項46に記載の方法。癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療中に、再発を起こす比較的高い危険を有すると同定される、請求項46に記載の方法。癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないと同定される、請求項46に記載の方法。前記第一世代のBRAF阻害剤は、RAF-265である、請求項48または49に記載の方法。癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在する場合、その被験者は、第二世代のBRAF阻害剤での治療に層別化される、請求項46に記載の方法。前記癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子の配列を決定することを含む方法によって決定される、請求項46~51のいずれか一項に記載の方法。前記癌細胞を含むサンプル中にこのような核酸分子が存在するかどうかは、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される位置に突然変異を含むBRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記核酸分子によってコードされたポリペプチドを検出することによって決定される、請求項46~51のいずれか一項に記載の方法。BRAFポリペプチド中の1種またはそれより多くの前記突然変異の存在が検出された被験者に、請求項32に記載の化合物を投与することをさらに含む、請求項46~53のいずれか一項に記載の方法。癌を有する被験者の治療を最適化する方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;および、bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること;を含み、ここで配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、それは、その被験者をMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤で治療する必要があることを示す、上記方法。癌を有する被験者の治療を最適化する方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;および、bサンプルをPCRで処理し、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を同定すること;を含み、ここで配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、それは、その被験者をMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤で治療する必要があることを示す、上記方法。癌を有する被験者の治療方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること;および、c配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが上記核酸分子に含まれる場合、被験者にMEK阻害剤または第二世代のBRAF阻害剤を投与すること、を含む、上記方法。癌を有する被験者の治療方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;bサンプルをPCRで処理し、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を同定すること;c配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが上記核酸分子に含まれる場合、被験者にMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤を投与すること、を含む、上記方法。MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者の同定方法であって、該方法は:a癌から得られた核酸サンプルを、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸残基の同一性を変更する1種またはそれより多くの突然変異が存在するかどうかについて分析すること;および、bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異の存在を、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と関連付けること、を含む、上記方法。MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者の同定方法であって、該方法は:a癌から得られた核酸サンプルを、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸残基の同一性を変更する1種またはそれより多くの突然変異が存在するかどうかについて分析すること;および、bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異の存在を、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と関連付けること、を含む、上記方法。癌を有する被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療中に高い再発の危険を有することを同定する方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;および、bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること;を含み、ここで配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、その被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療の間高い再発の危険を有することを同定する、上記方法。癌を有する被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを同定する方法であって、該方法は:a癌細胞から核酸を抽出すること;および、bBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること;を含み、ここで配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合は、その被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを同定する、上記方法。前記MEK阻害剤は、CI-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリル、および4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリルからなる群より選択される、請求項55~60のいずれか一項に記載の方法。前記RAF阻害剤は、RAF265、または、PLX4720である、請求項61~62のいずれか一項に記載の方法。前記癌は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌からなる群より選択される、請求項55~64のいずれか一項に記載の方法。前記癌は、黒色腫である、請求項55~64のいずれか一項に記載の方法。I.BRAFの生物活性RAFタンパク質ファミリーには3つの種が含まれる:BRAF、ARAF、および、CRAFまた、RAF-1としても知られている。これらのRAFタンパク質はそれぞれ、アミノ末端の調節ドメイン、活性化ループ、および、C末端キナーゼドメインを含む。RAFの調節は、調節ドメインおよび触媒ドメインのリン酸化を含む。活性化されたら、RAF分子は、リン酸化によって下流のシグナル伝達分子を活性化することができるセリン/スレオニンキナーゼとして機能する。RAFは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼMAPKシグナル伝達経路と連結することによって細胞増殖を促進することに関与する。具体的に言えば、RAFタンパク質は、Ras介在シグナル伝達の発端となるエフェクターである。活性化されたRasはRAFと直接相互作用し、細胞質から細胞膜にRAFを補充する。細胞膜へのトランスロケーションの際に、Ras結合型RAFは、RAFセリン/スレオニンキナーゼ活性を活性化するのに役立つ一連のリン酸化現象およびコンフォメーション変化を受けない。またRAFは、インターフェロンベータ、プロテインキナーゼCPKCアルファ、Bcl-2のような抗アポトーシスタンパク質、様々な足場タンパク質、紫外光、電離放射線、レチノイド、エリスロポイエチン、および、RAFアイソフォーム間の二量体化などが関与する、Rasとは独立した経路を介して活性化される場合もある。RAFは、一度活性化されたら、RAFによる認識を可能にするプロリンリッチな配列を含むキナーゼMEK1およびMEK2をリン酸化することによって下流のシグナル伝達を仲介する。BRAFは、ARAFまたはRAF-1のどちらよりも相当有効なMEK1およびMEK2のアクチベーターである。MEK1およびMEK2は順にERK1およびERK2をリン酸化して活性化し、続いてそれらを細胞核に転移させる。核のERK1およびERK2はElk-1、Fos、Jun、AP-1およびMycなどの転写因子を活性化し、最終的に例えばサイクリンD1、サイクリンE、および、cdcアクチベーター25ホスファターゼなどの細胞増殖、脱分化および生存に関与する遺伝子の転写を誘導する。RAF中の活性化突然変異の存在またはRasを介する異常なシグナル伝達のどちら原因でも、RAFシグナル伝達のアップレギュレーションは、前述のシグナルカスケードの活性化、その結果としての細胞増殖および生存の増加によって腫瘍形成を促進する。RAFポリペプチド、特にBRAF中の活性化突然変異は、高頻度でヒト癌に関連している。このようなBRAF突然変異の1つは単一のチミジンからアデノシンへの転換であり、それによりアミノ酸600位においてバリンがグルタミン酸に変換される。黒色腫のケースのおよそ3分の2がこの腫瘍形成性のBRAFV600E突然変異を有しており、この突然変異は、MAPKシグナル伝達の活性化を介してメラニン細胞の形質転換に関与している。その他様々なタイプの癌、例えば、これらに限定されないが、結腸、卵巣および甲状腺癌なども同様に、BRAFV600E突然変異を含む。従って、RAFを標的化すること、具体的にはBRAFV600Eを標的化することが癌治療に有望なアプローチとなる。BRAFは、そのMEK1およびMEK2基質に関して示される高度な特異性のために治療にとって魅力的な標的である。現在のところ様々なBRAF阻害剤が臨床開発中である。このような阻害剤の1つは化合物RAF-265であり、これは、3種全てのRAFアイソフォームに加えて、BRAFV600Eに対しても効果的である。RAF-265は臨床的に有望であることから、RAFの標的化は将来見込みのある癌治療法である。本明細書において同じ意味で用いられる用語RAF活性、RAF生物活性およびRAFの機能的な活性は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで決定されるような、RAF反応性の細胞または組織例えば癌細胞または癌に対して、または、RAFの標的分子に対して、RAFタンパク質例えばBRAFによって発揮される活性を含む。RAF活性は、直接的な活性であってもよく、例えばRAF標的分子例えばMEK1またはMEK2との結合、または、RAF基質例えばMEK1またはMEK2のリン酸化であってもよい。あるいはRAF活性は、間接的な活性であってもよく、例えばRAFタンパク質とRAF標的分子例えばMEK1またはMEK2との相互作用が介在する下流の生物学的な事象であってもよい。RAFはMEK1およびMEK2が関与するシグナル伝達経路中に存在することから、このような下流の生物学的な現象としては、これらに限定されないが、例えばMBPのリン酸化、ERK1またはERK2のリン酸化、ERK1またはERK2標的遺伝子の調節の変化、および、細胞増殖または生存の変化が挙げられる。II.BRAF耐性突然変異resistancemutationRAF阻害剤、例えばBRAF阻害剤での癌治療は有望な治療アプローチであるが、このような治療を受ける患者のなかには再発したりまたは治療に反応を示さない場合もあり、その結果として患者の病気は進行する。本明細書において説明されているように、本発明は、現在のところ臨床開発中のRAF阻害剤に耐性を付与するBRAFにおける突然変異の発見に関する。このような突然変異が癌細胞に取り込まれていれば、その患者は所定のRAF阻害剤での治療に対して耐性を示す。代表的な実施態様において、本発明は、RAF阻害剤のRAF-265に対する耐性の発達に関する。ARAF阻害剤に対する耐性を付与するBRAF突然変異の同定様々な実施態様において、本発明は、RAF活性を阻害する薬物に対するBRAFポリペプチドの耐性を付与する、BRAFポリペプチドにおける突然変異、または、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子における突然変異を同定する方法に関する。突然変異型BRAFポリペプチドは、本明細書において述べられるように、1またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドを含む。BRAF阻害剤に対する耐性を付与する上記1種またはそれより多くの突然変異に加えて、突然変異型BRAFポリペプチドは、V600E置換を含んでいてもよい。野生型BRAFポリペプチド配列と比べてV600E置換のみを含み、それ以外の突然変異をまったく含まないBRAFポリペプチドは、本明細書において定義される突然変異型BRAFポリペプチドとはみなされない。突然変異型BRAF核酸分子は、本明細書において述べられるように、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を含む。1またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子は、当業界でよく知られている様々な適切な方法を用いて作製することができ、このような方法としては、例えば、野生型BRAF核酸配列またはBRAFV600E核酸配列のランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発が挙げられ、これらの方法は、大腸菌Ecoliで行うことができる。代表的な実施態様において、野生型BRAF核酸配列は、ヒト野生型BRAF核酸配列配列番号1であり、BRAFV600E核酸配列は、ヒトBRAFV600E核酸配列配列番号3である。続いて、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有する突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸を同定するために、BRAF阻害剤での治療に対して別の方法で感受性を有する細胞中で突然変異型BRAF核酸分子をスクリーニングしてもよい。突然変異型BRAF核酸および突然変異型BRAFポリペプチドを、RAF阻害剤例えばRAF-265での治療に対する耐性に関してスクリーニングするために、様々な適切な方法を使用することができる。いずれの場合においても、RAF阻害剤での治療に対して耐性を有する突然変異型BRAFポリペプチドは、RAF阻害剤の存在下で野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドが示すよりも、RAF阻害剤の存在下でより大きいBRAF活性を示す。1つの典型的な方法において、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子は、RAF阻害剤での治療に対して別の方法で感受性を有する細胞中で発現させることができる。この目的において有用な典型的な細胞系は、黒色腫細胞系A375である。突然変異型BRAFポリペプチドを発現させた後、細胞をRAF阻害剤で処理することができる。続いて突然変異型BRAFポリペプチドの活性を測定して、同様に発現させてRAF阻害剤で治療した野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドの活性と比較してもよい。BRAFポリペプチドの活性は、例えばBRAF阻害剤での治療した後に細胞の増殖または生存を測定することによって決定することができ、ここで増殖または生存は、BRAF活性と決定的な相関を有する。細胞増殖、増殖または生存は、当業界でよく知られているあらゆる適切な方法を用いて決定することができる。一実施態様において、細胞増殖は、MTSまたはセルタイターGLoCellTiterGLoのようなウェルベースの細胞増殖/生存分析を用いて決定することができ、ここでRAF阻害剤の存在下における細胞増殖は、RAF阻害剤の非存在下で培養した未処理細胞で観察された細胞増殖に対するパーセンテージとして示される。所定の実施態様において、耐性とは、GI50値における、適切なコントロールと比較して少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、最も好ましくは少なくとも4~5倍のシフトと定義される。その他の実施態様において、耐性は、約1μMのGI50値と定義される。またBRAFポリペプチド活性は、例えばBRAF阻害剤での治療した後に細胞中に存在するリン酸化されたMEK1/2またはERK1/2の相対量を決定することによっても測定することができる。また野生型または突然変異型BRAFポリペプチドの活性は、インビトロでのリン酸化分析を用いて決定することもでき、ここでBRAF活性は、BRAF阻害剤での治療した後の分析物中のリン酸化されたMEK1/2またはERK1/2の比率を測定することによって決定される。上述したように、MEK1/2はBRAFの基質であるが、ERK1/2はMEK1/2の基質であり、これはBRAF活性の下流の指標として役立つ。RAF阻害剤での治療後に野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドよりも大きい活性を有する突然変異型BRAFポリペプチドは、RAF阻害剤に対する耐性を付与する突然変異を含むと同定される。続いてこのようなRAF阻害剤に対する耐性を付与する突然変異は、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸を配列解析すること、または、突然変異型BRAFポリペプチドを直接配列解析することによって同定することができる。BRAF-265に対する耐性を付与するBRAF突然変異前述の方式で、ヒトBRAFポリペプチド中の、突然変異したするとRAF阻害剤RAF-265に対する耐性を付与するアミノ酸残基をいくつか同定した。このようなアミノ酸残基としては、以下に示すアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748が挙げられる。本発明の所定の実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、これらのアミノ酸残基のうち1種またはそれより多くにおいて、野生型ヒトBRAFポリペプチド配列またはBRAFV600Eポリペプチド配列と比べて突然変異を含む。関連する実施態様において、突然変異型BRAF核酸分子は、これらのアミノ酸残基の1種またはそれより多くをコードする1種またはそれより多くのヌクレオチドにおいて、野生型ヒトBRAF核酸配列またはBRAFV600Eポリペプチド配列と比べて突然変異を含む。代表的な実施態様において、本明細書において具体的に述べられた突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。その他の代表的な実施態様において、本明細書において具体的に述べられた突然変異型BRAFポリペプチドをコードする突然変異型BRAF核酸分子は、以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。本発明の突然変異型BRAF核酸分子および突然変異型BRAFポリペプチドは、本明細書において説明されたものに加えてその他の突然変異を含んでいてもよい。例えば本発明の突然変異型BRAFポリペプチドは、アミノ酸残基A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748における1またはそれより多くの突然変異に加えて、その他のアミノ酸残基に突然変異を含んでいてもよい。いずれのケースにおいても、本発明の突然変異型BRAFポリペプチドはBRAF活性を有し、さらに本発明の突然変異型BRAF核酸分子は、BRAF活性を有するポリペプチドをコードする。代表的な実施態様において、本発明の突然変異型BRAF分子は、アミノ酸残基A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748における1またはそれより多くの突然変異に加えて、アミノ酸残基V600に突然変異を有する。一実施態様において、V600における突然変異は、活性化突然変異であり、例えばV600E突然変異である。RAF阻害剤のRAF-265は、V600E活性化突然変異を含むBRAFの活性を効果的に阻害した。この突然変異は高いパーセンテージで腫瘍中に存在しており、例えば黒色腫の場合はそのうちおよそ3分の2に存在する。本明細書において説明されるBRAF耐性突然変異は、RAF-265のようなRAF阻害剤に対する耐性をBRAF-V600E対立遺伝子に付与する。従って、BRAF-V600Eを含む腫瘍を有する患者は、RAF-265のような第一世代のBRAF阻害剤での治療中に、以下の部位のいずれか:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に第二のBRAF突然変異が生じることにより、再発する危険性がある。本明細書において説明されているように、BRAF阻害剤に対する耐性を付与するBRAF中の突然変異を同定することによって、1またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFタンパク質を阻害するのに効果的な第二世代のRAF阻害剤の設計およびスクリーニングが可能になる。このような第二世代のRAF阻害剤は、多くの臨床および治療用途において有用であり、例えば癌治療において有用である。またBRAFポリペプチドにおける耐性突然変異を同定することによっても、癌に1種またはそれより多くのBRAF耐性突然変異が存在するかまたは存在しないかを決定するための癌患者のスクリーニングが可能になる。癌に1種またはそれより多くのBRAF耐性突然変異が存在するかまたは存在しないかを決定することによって、癌患者の治療計画の変更も可能になる。例えば、癌患者から得られた癌細胞を含むサンプル中の本明細書において説明される1種またはそれより多くのBRAF耐性突然変異の同定は、患者を第二世代のRAF阻害剤での治療に層別化するのに用いることができる。同様に、癌を有する患者から得られた癌細胞を含むサンプル中の本明細書において説明される1種またはそれより多くのBRAF耐性突然変異の同定は、患者をMEK阻害剤での治療に層別化するのに用いることができる。またBRAF耐性突然変異の同定は、高い再発の危険がある患者、または、所定のRAF阻害剤での治療に反応しない患者のスクリーニングおよび同定も可能にする。III.第二世代のBRAF阻害剤を同定する方法BRAF耐性突然変異の同定により、第二世代のRAF阻害剤の開発および/または同定が可能になる。本明細書で用いられるように、第二世代のRAF阻害剤は、本明細書において説明される1またはそれより多くの突然変異を含む、RAFポリペプチド、例えばBRAFポリペプチドの活性を効果的に阻害する物質である。第二世代のRAF阻害剤は、突然変異型RAFポリペプチドに加えて、野生型RAFポリペプチドの活性を阻害する場合もあるし、阻害しない場合もある。好ましい実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、BRAFV600Eポリペプチド配列番号4の活性を阻害し、同様に、追加で本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFV600Eポリペプチドの活性も阻害する。代表的な実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、以下に示すアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を含むBRAFポリペプチドの活性を阻害する。従って、本発明は、試験化合物を第二世代のRAF阻害剤として同定するための方法を提供する。一実施態様において、非突然変異型BRAFポリペプチド例えば野生型BRAFポリペプチド、または、BRAFV600Eポリペプチドと比較して、化合物の存在または非存在下におけるRAF突然変異型BRAFポリペプチドの相対的な活性を決定することによって、その化合物を第二世代のRAF阻害剤として同定することができる。第二世代のRAF阻害剤である化合物が存在する場合、突然変異型BRAFポリペプチドは、化合物が存在しない場合よりも低いレベルのRAF活性を有する。第二世代のRAF阻害剤ではない化合物が存在する場合、突然変異型BRAFポリペプチドは、化合物が存在しない場合と等価体かまたはそれよりも高いレベルのRAF活性を有する。所定の実施態様において、RAF活性は、インビトロの組換えBRAFポリペプチドを用いた分析で測定することができる。その他の実施態様において、RAF活性は、インビボのBRAFポリペプチドを発現する培養細胞または実験動物を用いた分析で測定することができる。BRAF活性の指標は、化合物が第二世代のRAF阻害剤であるかどうかを決定するのに適していればどのようなものでもよい。代表的な実施態様において、BRAF活性は、RAF基質のMEK1/2のリン酸化を測定することによって決定され、ここでMEK1/2のリン酸化の減少は、RAF活性の減少を示す。一実施態様において、MEK1/2のリン酸化は、細胞または細胞抽出物中で測定される。代替の実施態様において、MEK1/2のリン酸化は、インビトロの精製または組換えタンパク質を用いたリン酸化分析で測定される。当業界でよく知られているMEK1/2のリン酸化を検出する方法は、BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドの活性の指標としてMEK1/2のリン酸化を測定するのに適している。このような方法としては、これらに限定されないが、ウェスタンブロットおよびマススペクトロスコピーが挙げられる。所定の実施態様において、MEK1/2のリン酸化分析は、インビトロで組換えタンパク質を用いて行うことができる。その他の実施態様において、MEK1/2のリン酸化分析は、インビボで培養細胞または実験動物を用いて行うことができる。その他の代表的な実施態様において、BRAF活性は、MEK基質のERK1/2のリン酸化を測定することによって決定され、ここでERK1/2のリン酸化の減少は、BRAF活性の減少を示す。一実施態様において、ERK1/2のリン酸化は、細胞または細胞抽出物中で測定される。代替の実施態様において、ERK1/2のリン酸化は、インビトロの精製または組換えタンパク質を用いたリン酸化分析で測定される。当業界でよく知られているERK1/2のリン酸化を検出する方法は、BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドの活性の指標としてERK1/2のリン酸化を測定するのに適している。このような方法としては、これらに限定されないが、ウェスタンブロットおよびマススペクトロスコピーが挙げられる。所定の実施態様において、ERK1/2のリン酸化分析は、インビトロで組換えタンパク質を用いて行うことができる。その他の実施態様において、ERK1/2のリン酸化分析は、インビボで培養細胞または実験動物を用いて行うことができる。一実施態様において、第二世代のRAF阻害剤の同定に突然変異型BRAFポリペプチドを発現する宿主細胞が用いられ、ここでこのような宿主細胞が試験化合物に対して感受性を有する場合、その試験化合物は、第二世代のRAF阻害剤として同定される。本明細書で用いられる用語宿主細胞の試験化合物に対する感受性は、試験化合物が、例えば細胞増殖、細胞増殖、細胞の生存および/または細胞内シグナル伝達例えばMEK1/2などの1種またはそれより多くのBRAF基質、または、例えばERK1/2などの1種またはそれより多くの下流シグナル伝達分子のリン酸化によって証明されるような、BRAFが介在するシグナル伝達などの1種またはそれより多くのパラメーターで測定可能な作用を有することを意味するものとする。化合物の存在または非存在下における突然変異型BRAFポリペプチドを発現する細胞の生存または増殖率を決定することによって、その化合物が第二世代のRAF阻害剤として同定することが可能である。このような分析で用いられる細胞系が野生型BRAFポリペプチドを発現する場合、これらの細胞系は、RAF阻害剤に感受性を有すると予想され、さらに、上記細胞系が突然変異型BRAFポリペプチドを発現する場合、RAF阻害剤すなわち第一世代のRAF阻害剤に対して耐性を有すると予想される。第二世代のRAF阻害剤の同定に有用な典型的な細胞系は、黒色腫細胞系A375である。A375細胞は、野生型BRAFポリペプチドを発現する場合、RAF阻害剤のRAF-265に感受性を有するが、A375細胞は、突然変異型BRAFポリペプチド、例えば以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含むBRAFポリペプチドを発現する場合、RAF-265に対して耐性を有する。第二世代のRAF阻害剤である化合物の存在下において、突然変異型BRAFポリペプチドを発現する細胞系は、このような化合物が存在しない場合よりも低い生存または増殖率を有する。第二世代のRAF阻害剤ではない化合物の存在下において、突然変異型BRAFポリペプチドを発現する細胞系は、化合物が存在しない場合と等価体かまたはそれよりも高い生存または増殖率を有する。BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドを発現する細胞系の試験化合物に対する感受性を決定するために、当業界でよく知られている細胞の生存および/または増殖率の測定方法が適している。このような方法としては、これらに限定されないが、トリパンブルー色素排除、テトラゾリウム化合物の代謝、トリチウム化チミジンの取り込み、BrdU取り込み、グルコース摂取、ATP濃度、および、アポトーシスレベルの測定が挙げられる。一実施態様において、細胞増殖は、例えばMTSまたはセルタイターGLoなどのウェルベースの細胞増殖/生存分析を用いて決定することができる。所定の実施態様において、感受性は、GI50値における、適切なコントロールと比較して少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、最も好ましくは少なくとも4~5倍のシフトと定義される。従って、一実施態様において、本発明は、第二世代のRAF阻害剤である化合物の同定方法を提供し、本方法は、BRAF基質と、野生型BRAFポリペプチドに比べてまたはBRAFV600Eポリペプチドに比べて1またはそれより多くの突然変異を有するBRAFポリペプチドとを含む分析組成物を提供すること、試験化合物の非存在下でBRAF基質のリン酸化を可能にする条件下で、分析組成物を試験化合物と接触させること、および、BRAF基質のリン酸化に対する試験化合物の作用を決定すること、を含み、ここで適切なコントロールと比較してBRAF基質のリン酸化がダウンレギュレーションされている場合、その化合物は第二世代のRAF阻害剤として同定される。この方法で同定された化合物は、例えば突然変異型RAFポリペプチドが検出された癌のような癌を治療するのに有用な化合物である。前述の方法において有用なBRAFポリペプチドは、RAF阻害剤のRAF-265に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドであり、例えば、1種またはそれより多くの本明細書において説明された突然変異を含むBRAFポリペプチドである。前述の方法において有用なBRAF基質は、例えばMEK1/2である。MEK1/2のリン酸化の低下、減少またはダウンレギュレーションは、その化合物がRAF阻害剤であることを示す指標である。同様に、前述の方法において有用な下流のRAFシグナル伝達分子は、例えばERK1/2である。ERK1/2リン酸化の低下、減少またはダウンレギュレーションは、その化合物がRAF阻害剤であることを示す指標である。前述の方法はインビトロで行うこともでき、ここでBRAFポリペプチドおよびBRAF基質は、単離タンパク質または精製タンパク質である。また前述の方法は、インビトロで行ってもよく、ここでBRAFポリペプチドおよびBRAF基質は、細胞抽出物の構成要素である。この実施態様において、分析組成物は、細胞抽出物である。適切なコントロールは、当業者にとって上記方法を行う際によく用いられると予想されるあらゆるコントロールであり、このようなコントロールとしては、例えば、試験化合物で処理していない、または、コントロール化合物で処理した類似または同一の分析組成物、または、野生型BRAFポリペプチドまたはBRAFV600Eポリペプチドを含む類似の分析組成物または細胞抽出物が挙げられる。その他の実施態様において、本発明は、第二世代のRAF阻害剤である化合物の同定方法を提供し、本方法は、突然変異型BRAFポリペプチドを含む細胞を提供すること、該細胞を試験化合物と接触させること、および、MEK1/2のリン酸化、ERK1/2リン酸化または細胞増殖に対する試験化合物の作用を決定すること、を含み、ここで適切なコントロールと比べて、MEK1/2のリン酸化、ERK1/2リン酸化または細胞増殖が低下、減少またはダウンレギュレーションされた場合、その化合物は第二世代のRAF阻害剤として同定される。この方法で同定された化合物は、例えば突然変異型BRAFポリペプチドが検出された癌のような癌を治療するのに有用な化合物である。適切なコントロールは、当業者にとって本方法を行う際によく用いられると予想されるあらゆるコントロールであり、このようなコントロールとしては、例えば、試験化合物で処理していない、または、コントロール化合物で処理した類似または同一な細胞、または、組換え、野生型BRAFまたはBRAFV600Eを発現させた類似の細胞または細胞抽出物が挙げられる。一実施態様において、前述の方法で用いられる試験化合物は、野生型RAFポリペプチド、例えばBRAFポリペプチドの生物活性を阻害するRAF阻害剤である。それに加えて、または、その代わりに、前述の方法で用いられる試験化合物は、BRAFV600Eポリペプチドの活性を阻害するRAF阻害剤である。一実施態様において、第二世代のRAF阻害剤であるかどうかを決定するための試験化合物として用いられる可能性があるRAF阻害剤としては、PLX4032、PLX5568、XL281、および、US2008/0108615この内容は参照により本明細書に組み入れられるで説明されているイミダゾール-2-カルボキサミド誘導体が挙げられる。その他の実施態様において、試験化合物は、試験化合物ライブラリーの一種である。試験化合物ライブラリーは、多種多様な試験化合物を含むパネルを意味する。有機小分子の分子ライブラリーを合成するアプローチは、説明されているAngewChemIntEdEngl332059CarelletalAngewChemIntEdEngl332061。本発明の化合物は、当業界でよく知られているコンビナトリアルライブラリー法における様々なアプローチのいずれかを用いて得ることができ、このようなアプローチとしては、生物学的ライブラリー;三次元的に処理可能なパラレルな固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、1ビーズに対して1化合物のライブラリー法、および、アフィニティークロマトグラフィーによる選択を利用した合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、それ以外の4種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子物質の化合物ライブラリーに適用することができるAnticancerDrugDes12145。その他の典型的な分子ライブラリーの合成方法は当業界でよく知られており、例えば:ErbetalProcNatlAcadSciUSA9111422HorwelletalImmunopharmacology3368および、GallopetalJMedChem371233で見出すことができる。化合物ライブラリーは、溶液で例えば、HoughtenBiotechniques13412421、または、ビーズ上LamNature3548284、チップ上FodorNature364555556、細菌Ladnerの米国特許第5,223,409号、胞子Ladnerの米国特許第5,223,409号、プラスミドCulletalProcNatlAcadSciUSA8918651869、または、ファージScottandSmithScience249386390Science249404406ProcNatlAcadSci8763786382JMolBiol222301310に提供されてもよい。さらにその他の実施態様において、コンビナトリアルポリペプチドは、cDNAライブラリーから生産される。活性でスクリーニングすることができる典型的な化合物としては、これらに限定されないが、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子および天然産物抽出物ライブラリーが挙げられる。第二世代のRAF阻害剤は、本明細書において説明される1またはそれより多くの耐性突然変異を含むBRAF対立遺伝子の構造に基づいて合理的に設計することもできる。本明細書において説明されているように、RAF阻害剤に対する耐性を付与するBRAFの残基は、第一世代のRAF阻害剤のRAF-265と結合するBRAFの同じ領域に位置する。RAF阻害剤に対する耐性を付与するBRAF突然変異体の対立遺伝子を同定することによって、突然変異体の対立遺伝子の構造と野生型BRAFまたはBRAFV600Eとの比較が可能になる。第一世代のRAF阻害剤に対する耐性を付与する変更された構造的特徴を知ることにより、突然変異体の対立遺伝子と結合しそれを阻害する阻害剤などのリガンドの合理的な設計および構築が可能になる。このような阻害剤は、本明細書において説明される第二の突然変異を含まないBRAF突然変異体の対立遺伝子、BRAFV600Eと野生型BRAFとの両方に結合するように設計することができる。本明細書において説明される1またはそれより多くの突然変異を含むBRAF対立遺伝子と結合するように設計された阻害剤は、第二世代のRAF阻害剤である。このような合理的に設計された阻害剤の突然変異型BRAFポリペプチドの生物活性を阻害する能力は、本明細書において説明されるインビトロおよび/またはインビボの分析を用いて確認することができる。本明細書において説明される1またはそれより多くの耐性突然変異を含むBRAFポリペプチドの構造は、コンピューター支援のモデリングによって、または、突然変異型BRAFポリペプチドの結晶または溶液構造を決定することによって決定することができる。突然変異型BRAFポリペプチドの構造を決定するために、当業界でよく知られている適切なあらゆる方法を使用することができる。典型的なコンピューター支援のモデリング方法としては、例えばPYMOL、CAVITY4337354で説明されている参照により本明細書に組み入れられる、および、DiscoveryStudioRアクセルリスカリフォルニア州サンディエゴなどのソフトウェアプログラムの使用が挙げられる。コンピューター支援の分子モデリングに有用な追加の技術は、JBUON12Suppl1S10118参照により本明細書に組み入れられるで説明されている。また上記タンパク質に結合すると予想される分子を同定するのに、既知の構造を有するタンパク質のコンピューターに基づく解析も使用することができる。このような方法は、分子の受容体部位に相補的な形状に基づいて分子を分類する。例えばDOCKのようなプログラムは、三次元データベースを用いて、XBP-1、IRE-1アルファおよび/またはEDEMに結合すると予想される分子を同定するのに利用することができる。DesJarliasetalJMedChem31722MengetalJComputerChem13505MengetalProteins17266ShoichetetalScience2591445を参照。加えて、標的タンパク質に対する分子の電子的な相補性を解析して、標的に結合する分子を同定することもできる。これは、例えば、MengetalJComputerChem13505、および、MengetalProteins17266で説明されているような分子力学力場を用いて決定することができる。使用できるその他のプログラムとしては、推定上のリガンドとのドッキングでGRID力場を利用するCLIX例えば、LawrenceetalProteins1231GoodfordetalJMedChem28849および、BoobbyeretalJMedChem321083を参照、これら全体が開示に組み入れられるが挙げられる。結晶化は、あらゆる結晶化方法によって行うことができ、このような方法としては、これらに限定されないが、バッチ法、透析法および蒸気拡散法例えば、シッティングドロップおよびハンギングドロップ法が挙げられる。また結晶化を容易にするために、結晶のマイクロ、マクロおよび/またはストリークシーディングを行うこともある。BRAF突然変異体の対立遺伝子を含む結晶は、当業界でよく知られている様々な方法によって形成することができる。例えば結晶化は、バッチ法、透析法および蒸気拡散法シッティングドロップおよびハンギングドロップ法によって行うことができる。基本的なタンパク質結晶化のセットアップの詳細な説明は、McReeDPracticalProteinCrystallography第2版アカデミックプレス社を参照してもよい。結晶化実験を行うことに関するさらなる説明は、StevensetalCurrOpinStructBiol1055863ならびに米国特許第6,296,673号;5,419,278号;および、5,096,676号これらの内容は参照により本明細書に組み入れられるで示されている。このような結晶は、BRAF突然変異体の対立遺伝子の三次元構造を決定するために、X線または中性子回折解析を行うのに利用することができる。BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドの溶液構造は、当業界でよく知られている技術を利用した核磁気共鳴分光分析を用いて同定することができる。X線結晶学またはNMR分光分析によるポリペプチド構造決定に適した方法は、BrungeretalCrystallographyNMRsystemAnewsoftwaresystemformacromolecularstructuredeterminationActaCrystallogrD54905921BrungeretalSolutionofaProteinCrystalStructureWithaModelObtainedFromNMRInterprotonDistanceRestraintsScience23510491053DrenthPrinciplesofProteinXrayCrystallographySpringerVerlagpp119andNarulaetalSolutionstructureoftheCterminalSH2domainofthehumantyrosinekinaseSykcomplexedwithaphosphotyrosinepentapeptideStructure310611073で説明されており、これらの全体は参照により本明細書に組み入れられる。突然変異型RAFポリペプチドの結晶または溶液構造が同定されたら、上述のコンピューター支援のモデリングアプローチを利用して突然変異型BRAFポリペプチドの阻害剤を同定することができる。前述の方法によって同定された第二世代のRAF阻害剤は、野生型および/または突然変異型RAFポリペプチドの発現に伴う病気または状態を治療するのに有用である。例えば、第二世代のRAF阻害剤は、被験者における癌を治療するのに有用であり、具体的には、突然変異型BRAFポリペプチドが同定されている癌を治療するのに有用である。代表的な実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、以下のアミノ酸残基の1種またはそれより多く:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を有するBRAFポリペプチドを含む癌を治療するのに有用である。関連する実施態様において、第二世代のRAF阻害剤は、以下に示す突然変異の1種またはそれより多く:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを有するBRAFポリペプチドを含む癌を治療するのに有用である。IV.単離された核酸分子本発明は、BRAF遺伝子関連のポリヌクレオチドまたは核酸分子およびそれぞれの遺伝子産物に関する。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は哺乳動物細胞から単離して精製することができる。本発明の具体的な形態において、本明細書において説明される単離したBRAF核酸分子は、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含む。突然変異型BRAF核酸分子は、本明細書において述べられるように、突然変異型BRAFポリペプチドをコードする、すなわち1またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドをコードするBRAF核酸分子を含む。単離して精製したBRAF核酸分子、例えば突然変異型BRAF核酸分子が、RNAまたはDNAのどちらの形態でもあり得ることも考えられる。本明細書で用いられる用語RNA転写物は、DNA核酸分子からの転写産物であるRNA分子を意味する。このような転写物は、1種またはそれより多くのポリペプチドをコードしていてもよい。本願において用いられるように、用語ポリヌクレオチドは、単離された核酸分子、RNAまたはDNAを意味し、例えば全体のゲノム核酸を含まない状態の核酸分子、RNAまたはDNAである。それゆえにBRAFをコードするポリヌクレオチドは、BRAFのコード配列を含むが、全体のゲノムDNAおよびタンパク質から単離されているか、または、精製してそれらを含まない状態である核酸セグメントを意味する。本願においてBRAFをコードするポリヌクレオチドまたは核酸の機能または活性について述べられる場合、それは、そのようなポリヌクレオチドは、野生型BRAFポリペプチドの活性例えばMEK1またはMEK2基質のリン酸化を達成することができる分子をコードすることを意味する。用語cDNAは、テンプレートとしてRNAを用いて製造されたDNAを意味することとする。cDNAを用いる利点は、ゲノムDNAまたはRNA転写物とは対照的に、安定性があることと、組換えDNA技術を用いて配列を操作する能力であるSambrook1989Ausubel1996を参照。完全なゲノム配列が好ましい場合もあるし、または部分的なゲノム配列が好ましい場合もある。あるいは、cDNAはポリペプチドのコード領域を示し、イントロンなどの調節領域が除去されているため、cDNAが有利である可能性がある。また、所定の細胞由来の所定のBRAFをコードする核酸またはBRAF遺伝子が、わずかに異なる核酸配列を有するが、それでも活性なBRAFポリペプチドをコードする天然の変異体または変異株によって示され得ることも考えられる。好ましい実施態様において、活性なBRAFポリペプチドは、活性なヒトBRAFポリペプチドである。特に好ましい実施態様において、活性なBRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチドの活性を有するが、1種またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対して耐性を有する突然変異型BRAFポリペプチドである。その結果として、本発明の所定の形態は、アミノ酸変化が最小であるが、同じ生物学的機能を有するBRAF誘導体を包含する。用語遺伝子は、機能性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位を意味するものとして簡略的に用いられる。当業者であれば理解しているものと思われるが、この機能的な用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、融合タンパク質および突然変異タンパク質を発現する、または、それらが発現されるように適応させることができるゲノム配列、cDNA配列、および、比較的小さい加工された遺伝子セグメントを含む。BRAFをコードする核酸分子は:少なくとも約6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000個またはそれより多くの長さのヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対を有する連続した核酸配列を含んでいてもよい。このような配列は、例えば配列番号1またはそれらのフラグメントと同一であってもよいし、またはそれらに相補的であってもよい。様々な本発明の実施態様は、BRAFにおける遺伝学的な突然変異に関する。本明細書で用いられるように、突然変異は、BRAF核酸分子の部位における単一のヌクレオチドの付加、欠失または置換を意味する。代表的な実施態様において、突然変異型BRAF核酸分子は、特定の治療に対する耐性、例えばRAF-265のようなBRAF阻害剤に対する耐性を付与する1またはそれより多くの突然変異を含む。関連する実施態様において、突然変異型BRAFの核酸分子は、突然変異型BRAF核酸分子が突然変異型BRAFポリペプチドをコードするような1またはそれより多くの突然変異を含み、ここで突然変異型BRAFポリペプチドは、特定の治療に対する耐性、例えばRAF-265のようなBRAF阻害剤に対する耐性を付与する1またはそれより多くの突然変異を含む。従って、本発明の具体的な形態において、配列を変更させることによって、その配列によってコードされたポリペプチドの特性に、結果的に治療に対する少なくともある程度の耐性、例えばBRAF阻害剤での治療に対する耐性が起るような影響を与える変化が生じる。実質的にその他のコード配列から単離されたとは、対象の遺伝子が核酸セグメントのコード領域の一部を形成しており、そのセグメントは、天然に存在するコード核酸の大部分、例えば大きい染色体フラグメント、または、その他の機能的な遺伝子またはcDNAコード領域を含まないことを意味する。当然ながら、これは、もともと単離されており、人為的操作によってセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を後で排除しない核酸セグメントを意味する。具体的な実施態様において、本発明は、そのアミノ酸配列内に、突然変異型BRAFポリペプチドに従って、または、実質的に突然変異型BRAFポリペプチドに対応する連続したアミノ酸配列を含む、突然変異型BRAFポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列が組み込まれた、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。代表的な実施態様において、本発明は、そのアミノ酸配列内に、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドの連続したアミノ酸配列を含む、BRAFタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列が組み込まれた単離したDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。所定の実施態様において、上記1またはそれより多くの突然変異は、A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748の位置で起こる。その他の実施態様において、上記1またはそれより多くの突然変異は、A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。本発明で用いられる核酸セグメントは、コード配列それ自身の長さに関係なく、その他のDNAまたはRNA配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、その他のコーディングセグメントなどと組み合わせることができ、その結果、それら全体の長さが著しく変化してもよい。従って、ほぼあらゆる長さの核酸フラグメントを使用することも考えられるが、全体の長さは、目的とする組換えDNAプロトコールにおける調製および使用が容易になるように制限することが好ましい。本発明の核酸コンストラクトが、BRAFポリペプチドまたは突然変異型BRAFポリペプチドをコードすることが考えられる。異種配列は、その他の配列にとって外来または外因性である配列を意味する。異種遺伝子は、その遺伝子がその時点で一緒に配置されている配列の近辺で天然状態では見出されない遺伝子を意味する。非限定的な実施例において、BRAF遺伝子の全部または一部と同一な、または、それらに相補的な連続したヌクレオチドのストレッチを含む1種またはそれより多くの核酸コンストラクトを製造することができる。核酸コンストラクトは、長さが少なくとも50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、20,000、30,000、50,000、100,000、250,000、約500,000、750,000~約1,000,000個のヌクレオチドを含んでいてもよいし、加えて、酵母人工染色体のような核酸コンストラクトの出現が当業者によく知られていることを考慮すると、それよりも大きいサイズのコンストラクト、例えば最大染色体サイズのヌクレオチドを含んでいてもよいその間のあらゆる中間の長さおよび中間の範囲を含む。当然のことながら、本明細書で用いられる中間の長さおよび中間の範囲は、引用された値を含む、または、それらの値の間のあらゆる長さまたは範囲を意味するすなわち、このような値を含む、および、それらの間の全ての整数。中間の長さの非限定的な例としては、約11、約12、約13、約16、約17、約18、約19など;約21、約22、約23など;約31、約32など;約51、約52、約53など;約101、約102、約103など;約151、約152、約153、約97001、約1,001、約1002、約50,001、約50,002、約750,001、約750,002、約1,000,001、約1,000,002などが挙げられる。中間の範囲の非限定的な例としては、約3~約32、約150~約500,001、約3,032~約7,145、約5,000~約15,000、約20,007~約1,000,003などが挙げられる。本発明の所定の実施態様は、ベクター、プロモーター、治療的な核酸、および、細胞中の形質転換および発現に関与するその他の核酸要素などの様々な核酸に関する。所定の形態において、核酸は、野生型核酸、または、突然変異体核酸を含む。具体的な形態において、核酸は、転写された核酸をコードするか、または、転写された核酸を含む。用語核酸は当業界でよく知られている。核酸は、本明細書で用いられるように、一般的に、DNA、RNAまたはそれらの核酸塩基を含む誘導体もしくは類似体の分子すなわち鎖を意味することとする。核酸塩基としては、例えば、DNA中に見出される天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基例えばアデニンA、グアニンG、チミンTまたはシトシンC、または、RNA中に見出される天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基例えば、A、G、ウラシルUまたはCが挙げられる。用語核酸は用語オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを包含し、これらはそれぞれ用語核酸の下位分類である。用語オリゴヌクレオチドは、核酸塩基の長さが約3~約100の分子を意味する。用語ポリヌクレオチドは、核酸塩基の長さが約100よりも大きい少なくとも1つの分子を意味する。遺伝子は、遺伝子産物のコード配列を意味し、加えてイントロンおよび遺伝子産物のプロモーターのコード配列も意味する。特許請求された発明の組成物および方法とともに使用するための核酸として、BRAF遺伝子に加えてその他の調節領域、例えばBRAFのエンハンサーも考慮される。これらの定義は、一般的には一本鎖分子を意味するが、具体的な実施態様においては、一本鎖分子に部分的に、実質的に、または完全に相補的な追加の鎖も含まれることもある。従って、核酸は、1またはそれより多くの相補鎖または特定の配列を含む分子の相補物を含む、二本鎖分子または三本鎖分子を包含する可能性もある。本明細書で用いられるように、一本鎖核酸は接頭辞ssで、二本鎖核酸は接頭辞dsで、および、三本鎖核酸は接頭辞tsで表示することができる。核酸は、当業者によく知られているあらゆる技術によって作製することができる、例えば、化学合成、または、酵素的な生産、または、生物学的な生産によって作製することができる。合成核酸例えば、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する突然変異の同定を容易にする合成BRAFプライマーの非限定的な例としては、インビトロでのホスホトリエステルを用いた化学合成、亜リン酸またはホスホアミダイト化学および固相技術、例えば、EP266,032参照により本明細書に組み入れられるで説明されているような技術、または、Froehleretal1986および米国特許第5,705,629号それぞれ参照により本明細書に組み入れられるで説明されているようなデオキシヌクレオシドH-ホスホン酸中間体を介した技術によって製造された核酸が挙げられる。本発明の方法において、1種またはそれより多くのオリゴヌクレオチドを用いてもよい。オリゴヌクレオチド合成の多種多様なメカニズムが、例えば米国特許第4,659,774号、4,816,571号、5,141,813号、5,264,566号、4,959,463号、5,428,148号、5,554,744号、5,574,146号、5,602,244号で開示されているこれらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。酵素的に生産された核酸の非限定的な例としては、PCRのような増幅反応で酵素によって生産された核酸例えば、米国特許第4,683,202号および4,682,195号を参照、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、または、米国特許第5,645,897号参照により本明細書に組み入れられるで説明されているようにしてオリゴヌクレオチドの合成によって生産された核酸が挙げられる。生物学的に生産された核酸の非限定的な例としては、生きた細胞中で生産されたすなわち複製された組換え核酸、例えば細菌中で複製された組換えDNAベクター例えば、Sambrooketal1989を参照、参照により本明細書に組み入れられるが挙げられる。核酸は、BRAFに対する耐性を付与する突然変異の評価の一環として、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム勾配遠心法、または、当業者によく知られているその他のあらゆる手段によって精製することができる例えばSambrooketal1989を参照、参照により本明細書に組み入れられる。好ましい形態において、核酸は、薬理学的に許容できる核酸である。薬理学的に許容できる組成物は当業者によく知られており、本明細書において説明されているものである。所定の形態において、本発明は、単離された核酸としての核酸に関する。本明細書で用いられる用語単離された核酸は、1またはそれより多くの細胞のゲノムの核酸全体および転写された核酸のほとんどが含まれないように単離された、または、それ以外の方法でそれらのほとんどが含まれていない状態の核酸分子例えばRNAまたはDNA分子を意味する。所定の実施態様において、単離された核酸は、細胞成分またはインビトロでの反応構成要素例えば脂質またはタンパク質などの高分子、低分子量の生体分子などのほとんどが含まれないように単離された、または、それ以外の方法でそれらのほとんどが含まれていない状態の核酸を意味する。V.発現ベクターおよび宿主細胞本発明は、発現ベクター組成物、および、BRAFポリペプチド、例えば突然変異型BRAFポリペプチドをコードさせるためのこのようなベクターの使用を包含し、加えてこのような発現ベクターが導入された宿主細胞組成物を包含する。用語ベクターは、核酸配列を複製することができる細胞に導入するために、核酸配列を挿入することができるキャリアー核酸分子を意味するものとして用いられる。核酸配列は外因性であってもよく、ここで外因性とは、その配列が、ベクターを導入しようとする細胞にとって外来のものであること、または、その配列が、細胞中の配列に相同であるが、その配列が通常見出されない宿主細胞内の核酸の位置に存在することを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスバクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス、ならびに人工染色体例えばYACが挙げられる。当業者であれば標準的な組換え技術によってベクターを構築することについて十分に認識しているものと思われ、このような技術は、Sambrooketal1989andAusubeletal1996いずれも参照により本明細書に組み入れられるで説明される。用語発現ベクターまたは発現コンストラクトは、転写させることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。場合によっては、それに続いてRNA分子はタンパク質、ポリペプチド、または、ペプチドに翻訳される。その他のケースにおいて、これらの配列は、例えばアンチセンス分子またはリボザイム生産において翻訳されない。発現ベクターは様々な制御配列を含んでいてもよく、ここで制御配列とは、特定の宿主生物中で作動可能なように連結したコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様にその他の機能を果たす核酸配列を含んでいてもよいこのような核酸配列については以下で説明する。1.プロモーターおよびエンハンサープロモーターは、コントロール配列であって、これは、転写開始および速度を制御する核酸配列の領域である。これらは、調節タンパク質および分子が例えばRNAポリメラーゼやその他の転写因子と結合することができる遺伝学的要素を含んでいてもよい。作動可能なように位置する、作動可能に結合した、制御下でおよび転写制御下でという成句は、プロモーターが、転写開始および/またはその配列の発現を制御するための核酸配列に関して適切な機能的な位置および/または方向にあることを意味する。プロモーターは、エンハンサーと共に用いられる場合もあるし、そうでない場合もあり、ここでエンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関するシス作用性の調節配列を意味する。プロモーターは、コーディングセグメントおよび/またはエキソンの上流に位置する5’非コード配列を単離することにより得ることができる遺伝子または配列に通常伴って存在し得るものである。このようなプロモーターは、内因性と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、上記配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列に通常伴って存在し得るものである。あるいは、組換えまたは異種プロモーターこれは、その自然の環境において通常核酸配列に結合していないプロモーターを意味するの制御下で、コーディング核酸セグメントの位置決めをすることによってもある種の利点が得られると予想される。また組換えまたは異種エンハンサーも、その自然の環境において通常核酸配列に結合していないエンハンサーのことである。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、その他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および、その他のあらゆる原核、ウイルスまたは真核細胞から単離したプロモーターまたはエンハンサー、および、天然に存在しないプロモーターまたはエンハンサー、すなわち、異なる転写調節因子領域の異なる要素、および/または、発現を変化させる突然変異を含むプロモーターまたはエンハンサーが挙げられる。当然に、発現のために選択された細胞型、細胞器官および生物中で効果的に核酸セグメントの発現を指示するプロモーターおよび/またはエンハンサーを用いることが重要であると予想される。分子生物学の当業者であれば一般的に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用について熟知している例えばSambrooketalを参照、参照により本明細書に組み入れられる。導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導性および/または有用なプロモーターを用いることができる。このようなプロモーターは異種プロモーターであってもよいし、または外因性プロモーターであってもよく、例えばBRAFをコードする配列にとって非BRAFプロモーターであってもよい。いくつかの例において、インビトロでの望ましい配列の転写で利用するための原核性のプロモーターが用いられる。多くの市販の系で利用できる原核性のプロモーターとしては、T7、T3、および、Sp6が挙げられる。2.開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位特異的な開始シグナルも、コード配列の効率的な翻訳に必要な場合がある。これらのシグナルは、ATG開始コドンまたは隣接する配列を含む。ATG開始コドンなどの外因性の翻訳制御シグナルを提供する必要性がある場合がある。当業者であれば容易にこのことを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。挿入物全体が確実に翻訳されるように、望ましいコード配列のリーディングフレームと共に開始コドンはフレーム内に存在させなければならないことはよく知られている。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものであってもよいし、または合成であってもよい。適切な転写エンハンサー要素を包含させることによって発現効率が強化される場合がある。本発明の所定の実施態様において、内部リボソーム侵入部位IRES要素の使用は、多重遺伝子または多シストロン性のメッセージを創り出すのに利用することができる。3.マルチクローニングサイトベクターは、マルチクローニングサイトMCSを含んでいてもよく、ここでマルチクローニングサイトとは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、そのうちのいずれかが、ベクターを消化するための標準的な組換え技術と共に用いることができる例えば、Carbonellietal1999Levensonetal1998andCocea1997を参照、参照により本明細書に組み入れられる。制限酵素による消化は、核酸分子中の特異的な位置でのみ機能する酵素を用いた核酸分子の触媒作用による切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。MCS内で切断を行う制限酵素を用いてベクターを直線状にするかまたは断片化することにより、外来配列をベクターにライゲーションさせるようにすることがよく行われる。ライゲーションは、2つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味し、これらのフラグメントは、互いに連結していてもよいし、そうでなくてもよい。制限酵素およびライゲーション反応を含む技術は、組換え技術分野の当業者にはよく知られている。4.スプライシング部位ほとんどの転写された真核RNA分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにRNAスプライシングを受けると予想される。真核性のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のために転写物を適切にプロセシングするために、ドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とする場合がある例えば、Chandleretal1997を参照、参照により本明細書に組み入れられる。5.終結シグナル本発明のベクターまたはコンストラクトは、一般的に少なくとも1つの終結シグナルを含むと予想される。終結シグナルまたはターミネーターは、RNAポリメラーゼによるRNA転写を特定のところで終結させることに関するDNA配列で構成される。従って、所定の実施態様において、RNA転写物の生産を終わらせる終結シグナルが考慮される。ターミネーターは、インビボにおいて、望ましいメッセージレベルを達成するのに必要なことがある。6.ポリアデニル化シグナル発現のために、特に真核性の発現のために、典型的には、転写物の適切なポリアデニル化を実行するためのポリアデニル化シグナルを含むと予想される。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとって重要なものではないと考えられており、および/または、このような配列ならばどれでも使用できる。好ましい実施態様としては、便利であり、および/または、様々な標的細胞で十分に機能することがわかっている、SV40ポリアデニル化シグナル、および/または、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化は転写の安定性を高めることができるか、または、細胞質内輸送を容易にする可能性がある。7.複製起点宿主細胞中のベクターを増やすために、1種またはそれより多くの複製起点部位oriと称されることが多いを含んでいてもよく、この複製起点は、複製を開始させる特異的な核酸配列である。あるいは宿主細胞が酵母である場合、自律複製型配列ARSを用いてもよい。8.選択可能な、および、スクリーニング可能なマーカー本発明の所定の実施態様において、本発明の核酸コンストラクトを含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含ませることによってインビトロでもインビボでも同定することが可能になる。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与すると思われ、このような変化によって発現ベクターを含む細胞を容易に同定できるようになる。一般的に、選択マーカーとは、選択を可能にする特性を付与するマーカーのことである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在によって選択が可能になるようなマーカーであり、一方で陰性選択マーカーは、マーカーの存在が選択を妨害するようなマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。通常、薬剤選択マーカーを包含することは形質転換株のクローニングおよび同定に役立ち、有用な選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。条件を満たすことによって形質転換株の識別が可能になる表現型を付与するマーカーに加えてその他のタイプのマーカーも考慮され、例えば熱量解析を原理とするGFPなどのスクリーニング可能なマーカーが挙げられる。あるいは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼtkまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATのようなスクリーニング可能な酵素を利用することもできる。当業者であれば免疫学的なマーカーをどのようにして使用するかを理解しているものと思われが、場合によってはFACS解析と共に使用することもある。使用されたマーカーが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されるのであれば、マーカーは重要ではないと考えられる。選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者によく知られている。9.宿主細胞本明細書で用いられるように、用語細胞、細胞系および細胞培養は、同義的に用いることができる。本発明において、BRAFポリヌクレオチドを含む細胞は、BRAFポリヌクレオチドが突然変異型でも野生型でも用いられる可能性がある。またこれらの用語はいずれもそれらの後代も含み、ここで後代とは、その後に続くすべての世代を意味する。当然のことながら、いずれの後代も、計画的な突然変異または偶発的な突然変異のために同一でない場合もある。異種核酸配列を発現することに関して、宿主細胞は原核または真核細胞を意味し、このような細胞としては、ベクターを複製することができる、および/または、ベクターによってコードされた異種遺伝子を発現することができるあらゆる形質転換可能な生物が挙げられる。宿主細胞はベクターの受容者として用いることができでき、さらにそのように用いられてきた。宿主細胞は、トランスフェクションまたは形質転換されていてもよく、これらは、外来核酸を宿主細胞に移入または導入させるプロセスを意味する。形質転換した細胞は、初代の対象の細胞とその後代を含む。組換え宿主細胞は、組換え核酸、すなわちインビトロで操作された核酸、または、そのように操作された核酸の複製コピーである核酸を有する宿主細胞を意味する。宿主細胞は、望ましい結果が、ベクターの複製なのか、ベクターによってコードされた核酸配列の一部または全部の発現なのか、または、感染性のウイルス粒子の生産なのかに応じて原核生物から誘導してもよいし、または真核生物から誘導してもよい。宿主細胞として使用するのに様々な細胞系および培養物が利用可能であり、これらはアメリカンタイプカルチャーコレクションATCCから得ることができ、ATCCとは、生きた培養物や遺伝物質のアーカイブとして役立つ組織である。適切な宿主は、当業者によってベクターの主鎖と要求される結果に基づき決定することができる。多くのベクターを複製するために、例えばプラスミドまたはコスミドを原核生物の宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および/または発現のための宿主細胞として用いられる細菌細胞としては、DH5α、JM109およびKC8が挙げられ、加えて様々な市販の細菌宿主、例えばシュアーSURETM.コンピテント細胞、および、ソロパックSolopackTMゴールド細胞ストラタジーンStrategeneRTMラホヤも挙げられる。あるいは、ファージウイルス用の宿主細胞として、大腸菌EcoliLE392のような細菌細胞を用いてもよい。本発明の好ましい真核宿主細胞は、黒色腫細胞系A375であり、この細胞は、BRAFポリペプチド、例えば本発明の突然変異型BRAFポリペプチドをコードする発現ベクターで形質転換されている。10.発現系上記で考察された組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現系が存在する。BRAF核酸配列またはそれらの同源のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを生産するために、原核および/または真核細胞ベースの系が本発明と共に用いることができる。このような系の多くは通常市販されている。昆虫細胞/バキュロウイルス系は、例えば米国特許第5,871,986号、4,879,236号いずれも参照により本明細書に組み入れられるで説明されているように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を起こすことができ、このような系は、例えばインビトロジェンInvitrogenTMからMaxBacTM20、および、クロンテックClontechTMからBacPackTMバキュロウイルス発現系という名称で購入することができる。発現系のその他の例としては、合成エクジソン誘導性受容体に関与するストラタジーンのコンプリートコントロールCompleteControlTM誘導性哺乳動物発現系、または、そのpET発現系、大腸菌発現系が挙げられる。誘導性発現系のその他の例は、インビトロジェンより入手可能なものがあり、これは、TRexTMテトラサイクリンで調節される発現系、全長CMVプロモーターを利用した誘導性哺乳動物発現系を含む。クロンテックClontechTM製のTetOnTMおよびTetOffTM系は、哺乳動物宿主中での発現をテトラサイクリンまたはその誘導体を用いて調節するのに用いることができる。これらの系の実際の使用は、Gossenetal1992およびGossenetal1995、ならびに米国特許第5,650,298号で説明されているこれらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。インビトロジェンはまた、ピチアメタノリカPichiamethanolica発現系と呼ばれる酵母発現系も提供しており、これは、メチロトローフ酵母のピチアメタノリカにおいて組換えタンパク質が高レベルで生産されるように設計されている。当業者であれば、核酸配列またはその同源のポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドを生産するために、ベクター、例えば発現コンストラクトをどのようにして発現させるかについてよく知っているものと思われる。VI.単離したポリペプチド分子本発明のその他の形態は、単離および/または精製したBRAFタンパク質、および、それらの生物学的に活性な部分に関する。本発明の具体的な形態において、本明細書において説明されるBRAFポリペプチドは、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異を含む。突然変異型BRAFポリペプチドは、本明細書において述べられるように、1種またはそれより多くの既知のBRAF阻害剤に対する耐性を付与する、1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAFポリペプチドを含む。単離したまたは精製したタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、実質的に、組換えDNA技術によって生産された場合ならば細胞の成分、または、化学合成された場合ならば前駆体化学物質もしくはその他の化学物質を含まない。実質的に細胞成分を含まないという文言は、BRAFタンパク質を自然にまたは組換えによって生産する細胞の細胞成分から、BRAFタンパク質が分離されている状態のBRAFタンパク質調製物を含む。一実施態様において、実質的に細胞成分を含まないという文言は、乾燥重量で約30未満の非BRAFタンパク質また、本明細書においては不純物タンパク質とも称される、より好ましくは約20未満の非BRAFタンパク質、さらにより好ましくは約10未満の非BRAFタンパク質、最も好ましくは約5未満の非BRAFタンパク質を含むBRAFタンパク質調製物を含む。BRAFタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分が組換え生産される場合、これらも実質的に培地を含まないことが好ましく、すなわち培地は、タンパク質調製物の体積の約20未満、より好ましくは約10未満、最も好ましくは約5未満で存在する。実質的に前駆体化合物またはその他の化学物質を含まないという文言は、BRAFタンパク質が、タンパク質合成に関与する前駆体化合物またはその他の化学物質から分離されている状態のBRAFタンパク質調製物を含む。一実施態様において、実質的に前駆体化合物またはその他の化学物質を含まないという文言は、乾燥重量で約30未満の前駆体化合物または非BRAF化学物質、より好ましくは約20未満の前駆体化合物または非BRAF化学物質、さらにより好ましくは約10未満の前駆体化合物または非BRAF化学物質、最も好ましくは約5未満の前駆体化合物または非BRAF化学物質を含むBRAFタンパク質調製物を含む。BRAFタンパク質の生物学的に活性な部分は、BRAFタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列、または、BRAFタンパク質に相同なタンパク質のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、ここでこのようなペプチドは、全長BRAFタンパク質またはBRAFタンパク質に相同な全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、さらに、BRAFタンパク質の活性のうち少なくとも1種を示す。典型的には、生物学的に活性な部分ペプチド、例えば5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100、200、300、400、500、600、700個またはそれより多いアミノ酸長さを有するペプチドは、BRAFタンパク質の活性のうち少なくとも1種を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、タンパク質のその他の領域が欠失したその他の生物学的に活性な部分は組換え技術によって製造して、それらを本明細書において説明される活性のうち1種またはそれより多くについて評価することができる。好ましくは、BRAFタンパク質の生物学的に活性な部分は、1またはそれより多くの選択された生物活性を有するドメイン/モチーフまたはそれらの部分を含む。好ましい実施態様において、BRAFタンパク質の生物学的に活性な部分は、野生型BRAF配列と比べて1またはそれより多くの突然変異を含み、ここで前記1またはそれより多くの突然変異は、全長突然変異型BRAFポリペプチド中に存在する場合、既知のBRAF阻害剤に対する耐性を突然変異型BRAFポリペプチドに付与する。代表的な実施態様において、このような突然変異は、以下に示す野生型BRAFタンパク質中の1またはそれより多くの位置:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に相当するアミノ酸において起こる。関連する実施態様において、このような突然変異としては、以下に示す1またはそれより多くのBRAF残基:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fが挙げられる。BRAFタンパク質は、好ましくは組換えDNA技術によって生産される。例えばBRAFタンパク質をコードする核酸分子は、上述したように発現ベクターにクローニングされ、発現ベクターは、上述したように宿主細胞に導入され、宿主細胞中でBRAFタンパク質が発現される。続いて標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによってこれらの細胞から4BRAFタンパク質を単離することができる。組換え発現の代わりに、BRAFタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成してもよい。さらに、天然型BRAFタンパク質および/または突然変異型BRAFタンパク質は、例えば抗BRAF抗体を用いて細胞例えば癌細胞から単離することもでき、このような抗体は、標準的な技術によって本発明のBRAFタンパク質またはそれらのフラグメントを利用して生産することができる。本発明はまた、BRAFキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で用いられるように、BRAFキメラタンパク質または融合タンパク質は、非BRAFポリペプチドに作動可能に結合したBRAFポリペプチドを含む。BRAFポリペプチドは、BRAFタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、それに対して非BRAFポリペプチドは、実質的にBRAFタンパク質に相同ではないタンパク質、例えばBRAF活性を示さず、同じまたは異なる生物から誘導された実質的にBRAFタンパク質と異なるタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質において、用語作動可能に結合したは、BRAFポリペプチドおよび非BRAFポリペプチドが、フレーム内で互いに融合していることを示すこととする。非BRAFポリペプチドは、BRAFポリペプチドのN末端またはC末端に融合していてもよい。例えば、一実施態様において、このような融合タンパク質は、BRAF配列がGST配列のC末端に融合したGST-BRAF融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えBRAFタンパク質の精製を容易にすることができる。その他の実施態様において、このような融合タンパク質は、N末端に異種シグナル配列を含むBRAFタンパク質である。所定の宿主細胞例えば哺乳動物宿主細胞において、異種シグナル配列の使用によってBRAFタンパク質の発現および/または分泌を高めることができる。好ましくは、本発明のBRAFキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えDNA技術によって生産される。例えば異なるポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントは、従来の技術によって、例えばライゲーションのための平滑末端またはジグザグ状の末端、適切な末端にするための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の穴埋めfillingin、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および、酵素によるライゲーションを用いることによって、フレーム内にまとめてライゲーションされる。その他の実施態様において、このような融合遺伝子は、自動DNA合成装置などの従来の技術によって合成することができる。あるいは、2つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングを形成するアンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのPCR増幅を行うことができ、続いてこのオーバーハングをアニールし再度増幅させて、キメラ遺伝子配列を生成することができる例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubeletal編集ジョンワイリーサンズ1992を参照。さらに、予め融合部分例えばGSTポリペプチドがコードされた発現ベクターが多数市販されている。このような発現ベクターに、BRAFをコードする核酸を、融合部分がフレーム内でBRAFタンパク質に連結されるようにしてクローニングすることができる。好ましい実施態様において、本発明の単離したBRAFポリペプチドは、野生型BRAFポリペプチド配列に比べて1種またはそれより多くの突然変異例えば置換または欠失を含む。一実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、ヒト野生型BRAFポリペプチド配列配列番号2に比べて1種またはそれより多くの突然変異を含む。特に好ましい実施態様において、このような1種またはそれより多くの突然変異は、BRAF阻害剤に対する耐性を付与する。代表的な実施態様において、BRAF阻害剤は、RAF-265である。本発明の突然変異型BRAFタンパク質は、野生型BRAFタンパク質に特徴的な生物活性を示す。このような生物活性としては、例えばMEK1またはMEK2のリン酸化が挙げられる。典型的な本発明の突然変異型BRAFポリペプチドとしては、野生型ヒトBRAFポリペプチドと比べて、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、または、C748に突然変異を含むBRAFポリペプチドが挙げられる。また典型的な本発明の突然変異型BRAFポリペプチドとしては、野生型ヒトBRAFタンパク質と比べて、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸置換:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含むBRAFポリペプチドも挙げられる。突然変異型BRAFタンパク質は、野生型BRAFタンパク質、または、野生型BRAFタンパク質をコードする核酸分子の変異誘発によって生成することができる。また突然変異型BRAFタンパク質は、例えばBRAF阻害剤に対する耐性などの望ましい活性を有する突然変異型BRAFタンパク質に関してBRAF突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。当業界において、点突然変異またはトランケーションによって製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする技術や、選択された特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングする技術など様々な技術がよく知られている。このような技術は、コンビナトリアル変異誘発によって生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用することができる。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット解析で処理することができる汎用の技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、細胞を結果得られたベクターライブラリーを適切で形質転換すること、および、望ましい活性を検出することによって生成物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になるような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現すること、を含む。VIII.突然変異の検出その他の形態において、本発明は、サンプル例えば癌患者からの生体サンプル中の突然変異型BRAFタンパク質の存在を検出する方法に関する。サンプル中の、例えば核酸および/またはポリペプチドサンプル中の本発明の突然変異型BRAFタンパク質の存在を検出するのに、様々なスクリーニング方法を用いることができる。具体的な実施態様において、このようなサンプルは、細胞または細胞抽出物を含む。代表的な実施態様において、このようなサンプルは、被験者、例えば癌を有する被験者から得られたものである。BRAFタンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分をコードする配列を含むゲノムDNA、cDNAおよびRNAすなわちmRNA中の耐性突然変異の存在を検出する方法を本発明の範囲内で用いることができる。同様に、BRAFポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分中の耐性突然変異の存在を検出する方法も本発明の範囲内で用いることができる。具体的な実施態様において、これらに限定されないが、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、または、C748に突然変異を有する、BRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法を用いることができる。代表的な実施態様において、これらに限定されないが、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを有するBRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法を用いることができる。点突然変異は、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動DGGE、制限酵素断片長多型解析RFLP、化学的または酵素的な切断方法、PCRによって増幅した標的領域の直接的な配列解析上記を参照、一本鎖高次構造多型分析SSCP、ポリメラーゼ連鎖反応、配列解析、ハイブリダイゼーション、パイロシーケンシングまたは単一の分子配列解析後のハイブリッドキャプチャー、およびその他の当業界でよく知られている方法などの方法を用いて検出することができる。点突然変異に関してスクリーニングする方法の一つは、RNA/DNAまたはRNA/RNAヘテロ二重鎖における塩基対ミスマッチのRNアーゼ切断に基づく方法である。本明細書で用いられる用語ミスマッチは、二本鎖RNA/RNA、RNA/DNAまたはDNA/DNA分子中の1またはそれより多くの対になっていない、または誤って対になったヌクレオチドの領域と定義される。従ってこの定義は、挿入/欠失による突然変異、加えて単一または複数の塩基の点突然変異によるミスマッチも含む。米国特許第4,946,773号は、一本鎖DNAまたはRNA試験サンプルをRNAプローブにアニーリングし、続いてこの核酸二重鎖をRNアーゼAで処理することを含む、RNアーゼAのミスマッチ切断分析を説明している。ミスマッチを検出するために、電気泳動を用いてサイズで分離したRNアーゼA処理の一本鎖産物は、同様に処理したコントロール二重鎖と比較される。コントロール二重鎖では観察されなかった比較的小さいフラグメント切断産物を含むサンプルを陽性としてスコア付けする。その他の研究者は、ミスマッチ分析におけるRNアーゼIの使用を説明している。例えば、プロメガPromegaはRNアーゼIを含むキットを販売しており、このRNアーゼIは、4種の既知のミスマッチのうち3種を切断することが報告されている。またその他の研究者が、MutSタンパク質または単一の塩基のミスマッチ検出のためのその他のDNA修復酵素を用いたものも説明している。本発明の実施で用いることができる欠失、挿入または置換による突然変異を検出する代わりの方法が、米国特許第5,849,483号、5,851,770号、5,866,337号、5,925,525号および5,928,870号に開示されているこれらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み入れられる。スクリーニング方法は、上記で同定された突然変異の出現について個体をスクリーニングするために行うことができる。例えば、一実施態様において、サンプル例えば血液もしくはその他の体液、または、細胞もしくは組織サンプルを遺伝子型解析のために患者から採取する。代表的な実施態様において、患者は癌患者である。本明細書において説明される1種またはそれより多くの突然変異の存在または非存在によって、スクリーニングされた個体が第一世代のBRAF阻害剤を用いた治療に対して耐性を有する能力があるかどうかが決定される。このような結果は、本発明によって提供される方法に従って、第一世代のBRAF阻害剤の用量を調節および/または変更したり、または、第二世代のBRAF阻害剤を用いた治療方針を選択したりするのに用いられると予想される。癌を有する被験者の有効な治療は、癌細胞の根絶、癌例えば固形腫瘍の増殖の停止または増殖速度の低減、または、癌の症状の少なくとも1つの改善を含んでいてもよい。BRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子における耐性突然変異は、当業界でよく知られているあらゆる適切な方法またはそれらの改変法を用いて検出することができ、このような方法としては以下で説明される方法がある。このような方法としては、対立形質特異的なポリメラーゼ連鎖反応の使用、直接または間接的な部位の配列解析、制限酵素の使用それぞれの部位の対立遺伝子が制限部位を形成しているかまたは破壊している、対立形質特異的なハイブリダイゼーションプローブの使用、突然変異型BRAFポリペプチドに特異的な抗体の使用、または、その他のあらゆる生化学的な分析法が挙げられる。1.DNAの配列解析突然変異を特徴付けるための最も一般的に使用される方法は、両側に多型を有する遺伝子座の直接のDNA配列解析directDNAsequencingofthegeneticlocusthatflanksandincludesthepolymorphismである。このような解析は、サンガー法としても知られているジデオキシ鎖終結方法SangerFetal1975、または、マクサムギルバート法としても知られている化学分解法MaxamAMetal1977のいずれかを用いて達成することができる。望ましい遺伝子の回収を容易にするために、配列解析と、ポリメラーゼ連鎖反応のようなゲノム配列特異的な増幅技術とを併用してもよいMullisKetal1986;欧州特許出願第50,424号;欧州特許出願第84,796号、欧州特許出願第258,017号、欧州特許出願第237,362号;欧州特許出願第201,184号;米国特許第4,683,202号;4,582,788号;および、4,683,194号、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。またプールしたサンプルの配列解析は、ソレクサSolexa/イルミナIlluminaの配列解析イルミナIllumina,カリフォルニア州サンディエゴ、パイロシーケンシング、または、その他の単一の分子を配列解析するアプローチを用いて達成することもできる。2.エキソヌクレアーゼ耐性突然変異した部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するのに用いることができるその他の方法としては、特殊化したエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を利用する方法がある米国特許第4,656,127号。3’直後から多型の部位の対立遺伝子の配列に相補的なプライマーを調査対象のDNAにハイブリダイズさせる。DNA上の多型の部位が、存在する特定のエキソヌクレオチド耐性のヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、その誘導体は、ポリメラーゼによってハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれると予想される。このような取り込みによって、プライマーはエキソヌクレアーゼの切断に対して耐性になり、その検出が可能になる。エキソヌクレオチド耐性の誘導体の同一性は既にわかっているため、DNAの多型の部位に存在する特定のヌクレオチドを決定することができる。3.マイクロシークエンス方法DNA中の突然変異部位を分析するための様々なその他のプライマー誘導ヌクレオチド取り込み法が説明されているKomherJSetal1989SokolovBP1990Syvanen1990Kuppuswamyetal1991Prezantetal1992UgozzollLetal1992Nyrenetal1993。これらの方法は、突然変異部位における塩基を区別するための標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みによるものである。シグナルは取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチド鎖に起った突然変異によって、鎖の長さに比例するシグナルが生じるSyvanenetal1993。4.溶液中での伸長フランス国特許第2,650,840号およびPCT出願番号WO91/02087は、溶液ベースの突然変異部位のヌクレオチドの同一性の決定方法を論じている。これらの方法によれば、対立遺伝子の配列の3’の直後から多型の部位に相補的なプライマーが用いられる。その部位が多型の部位のヌクレオチドに相補的な場合、プライマーの末端に取り込まれた標識されたジデオキシヌクレオチド誘導体を用いてその部位のヌクレオチドの同一性が決定される。5.遺伝学的なビットBitTM解析または固相での伸長PCT出願第92/15712号は、標識されたターミネーターと3’から多型の部位の配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する方法を説明している。取り込まれた標識されたターミネーターが評価対象の標的分子の多型の部位に存在するヌクレオチドに相補的なので、同定される。ここでこのようなプライマーまたは標的分子は固相に固定される。6.オリゴヌクレオチドライゲーション分析OLAオリゴヌクレオチドのライゲーション分析は、上述したものとは異なる方法論を利用する固相方法であるLandegrenetal1988。標的DNAの一本鎖の隣接する配列にハイブリダイゼーション可能な2種のオリゴヌクレオチドを利用する。これらのオリゴヌクレオチドのうち一方はビオチン化されており、他方は、検出可能に標識されている。標的分子に正確な相補配列が見出される場合、オリゴヌクレオチドは、それらの末端を隣り合わせてライゲーションの基質が形成されるようにハイブリダイズすると予想される。ライゲーションにより、アビジンを用いた標識されたオリゴヌクレオチドの回収が可能になる。また、この方法に基づくその他のPCR併用の核酸検出分析も説明されているNickersonetal1990。ここでPCRは、標的DNAを指数関数的な増幅を達成するのに用いられており、続いて標的DNAはOLAを用いて検出される。7.リガーゼ/ポリメラーゼが仲介する遺伝学的ビットBit解析米国特許第5,952,174号は、同様に標的分子の隣接する配列にハイブリダイゼーションすることができる2種のプライマーを用いる方法を説明している。標的が固定された固体支持体上にハイブリダイズした生成物が形成される。ここで、プライマーが、ヌクレオチド1つのスペースをあけて互いに分離されるようにハイブリダイゼーションが起こる。このハイブリダイズした生成物を、ポリメラーゼ、リガーゼ、および、少なくとも1種のデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下でインキュベートすることにより、あらゆる隣接するハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド対のライゲーションが可能になる。リガーゼ添加により、シグナル、伸長およびライゲーションの発生に必要な2つの現象が起こる。それにより、伸長またはライゲーションのいずれか単独を用いた方法よりも特異性が高く、かつノイズも低くなり、さらに、ポリメラーゼベースの分析とは異なり、この方法と第二のハイブリダイゼーションおよび固相に結合するシグナルのライゲーション工程とを組み合わせることによって、この方法はポリメラーゼ工程の特異性を強化する。8.核酸の転移方法本発明の方法のうちいくつかにおいて、核酸の転移方法を用いることができる。本発明の組成物を発現させるための核酸の送達に適した方法は、本明細書で説明されているように、または、当業者が熟知していると思われるように、核酸例えばDNA、例えばウイルスおよび非ウイルスベクターなどを細胞器官、細胞、組織または生物に導入することができる実質的にはほとんどすべての方法を含むと考えられる。このような方法としては、これらに限定されないが、例えば注射による直接のDNA送達米国特許第5,994,624号、5,981,274号、5,945,100号、5,780,448号、5,736,524号、5,702,932号、5,656,610号、5,589,466号および5,580,859号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、例えばマイクロインジェクションなどHarlanandWeintraub1985;米国特許第5,789,215号、参照により本明細書に組み入れられる;エレクトロポレーションによる方法米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に組み入れられる;リン酸カルシウム沈殿による方法GrahamandVanDerEb1973ChenandOkayama1987Rippeetal1990DEAE-デキストラン、続いてポリエチレングリコールを用いることによるGopal1985;直接の超音波処理しながらのローディングによる方法Fechheimeretal1987;リポソームが媒介するトランスフェクションによる方法NicolauandSene1982Fraleyetal1979Nicolauetal1987Wongetal1980Kanedaetal1989Katoetal1991;微粒子銃による方法PCT出願番号WO94/09699および95/06128;米国特許第5,610,042号;5,322,783号、5,563,055号、5,550,318号、5,538,877号および5,538,880号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる;炭化ケイ素繊維での撹拌による方法Kaeppleretal1990米国特許第5,302,523号および5,464,765号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる;アグロバクテリウム属が媒介する形質転換による方法米国特許第5,591,616号および5,563,055号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる;プロトプラストのPEGが媒介する形質転換による方法Omirullehetal1993米国特許第4,684,611号および4,952,500号、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる;または、枯渇/阻害が媒介するDNAの取り込みによる方法Potrykusetal1985が挙げられる。このような技術の適用により、細胞器官、細胞、組織または生物を、安定して、または一時的に形質転換させることができる。9.対立形質特異的な抗体本明細書において説明される1またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドは、突然変異型BRAFポリペプチドを特異的に認識するが野生型BRAFポリペプチドを認識しない抗体を用いて検出が可能である。1またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドの1種またはそれより多くの対立形質に対して抗体を発生させることができる。ペプチドまたはタンパク質上のエピトープを特異的に認識する抗体を惹起する抗原として特異的なタンパク質またはオリゴペプチドを用いるための技術は、よく知られている。一実施態様において、標的遺伝子の望ましい対立形質のDNA配列は、適切な発現ベクターに挿入することによりクローニングし、続いて原核または真核宿主細胞中でタンパク質に翻訳することができる。このようなタンパク質を回収して、特異的な抗体の生産を惹起する抗原として使用することができる。その他の実施態様において、標的遺伝子の望ましい対立形質のDNAをPCR技術で増幅させ、その後インビトロでタンパク質に翻訳して、特異的な抗体の生産を惹起するための抗原として使用することができる。第三の実施態様は、特異的な抗体の生産を惹起する抗原として使用するために、対立遺伝子のアミノ酸配列を示す合成ペプチドを生成する基礎として、代替の対立遺伝子のDNA配列を使用することである。抗体は、標準的なモノクローナル抗体技術による生成、または、組換えベースの発現系による生成のいずれかによって行うことができる。一般論として、AbbasLichtmanandPoberCellularandMolecularImmunologyWBSaundersCoを参照。用語抗体は、抗原に特異的に結合することができる無傷の抗体分子、加えて抗体フラグメントまたは誘導体、例えばFabおよびFab’2などを意味する。このようにして生産された抗体は、抗体を形成するために抗原として用いられた対立形質で生産された突然変異体タンパク質のみに選択的に結合すると予想される。また、対立形質特異的な抗体を生成する方法は、米国特許第6,200,754号、および、米国特許第6,054,273号これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられるでも説明されている。このような突然変異型BRAFポリペプチドに特異的な抗体は、当業界でよく知られている技術を用いて、サンプル中で、例えば分析サンプル、細胞サンプル、細胞抽出物、生体サンプルまたは患者サンプル中で、1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドの存在を検出するのに用いることができる。このような技術としては、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、間接免疫蛍光法、および、抗体マイクロアレイが挙げられる。また突然変異型BRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体は、第二世代のBRAF阻害剤である可能性もある。突然変異型BRAFポリペプチドの生物活性を阻害する突然変異型BRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体の能力は、本明細書において説明される第二世代のBRAF阻害剤を同定する方法を用いて決定することができる。IX.診断剤およびスクリーニングの適用前述の技術は、患者から得られたサンプル中で、BRAF核酸またはポリペプチド分子中の予め同定された耐性突然変異の存在または非存在を決定するのに用いることができる。患者サンプル中の突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子の同定は、患者の病気または状態を特徴付けるのに有用な可能性がある。例えば、BRAFの異常な発現または活性化に関連する病気例えば癌を有する患者の場合、患者から得られたサンプル例えば癌細胞を含むサンプルに突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、BRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを示す。一実施態様において、患者から得られた癌細胞を含むサンプルに本明細書において説明される1種またはそれより多くの突然変異を含むBRAF核酸またはポリペプチド分子が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、第一世代のBRAF阻害剤、例えばRAF-265での治療に対して反応しないことを示す。本明細書において説明されるBRAF耐性突然変異を有する患者は、第一世代のBRAF阻害剤での治療後、BRAF耐性突然変異を検出できない患者よりも高い再発の危険を有する。従って、本明細書で用いられる用語比較的高い再発の危険は、突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子を検出することができない患者と比較した場合である。すなわち、比較的高い再発の危険を有する患者は、突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子を検出することができない患者と比較して比較的高い再発の危険を有する患者である。所定の実施態様において、以下に示す1種またはそれより多くの残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748において突然変異を有するBRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、第一世代のBRAF阻害剤、例えばRAF-265での治療に対して反応しないことを示す。代表的な実施態様において、以下に示す1種またはそれより多くの耐性突然変異:RAF-265:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、または、C748Fを有するBRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸が同定された場合、それは、その患者が、比較的高い再発の危険を有するか、または、例えばBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを示す。また、患者サンプル中の突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子の存在または非存在を決定することによっても、患者にとって最適化された治療計画を選択すること、または、患者を所定の治療群に層別化することが可能である。一実施態様において、患者からの癌細胞を含むサンプルが突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子を含まない場合、その患者には第一世代のBRAF阻害剤での治療を含む治療計画が選択される。このような患者は、第一世代のBRAF阻害剤を含む治療計画に層別化することができる。このような患者には、BRAF阻害剤を標準的な用量および標準的な投与インターバルで投与することができる。その他の実施態様において、患者からの癌細胞を含むサンプルが、突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子、例えば本明細書において説明される1種またはそれより多くの上記突然変異を含むBRAF核酸またはポリペプチド分子を含む場合、その患者にはBRAF阻害剤を使用しない治療を含む治療計画が選択される。このような患者は、BRAF阻害剤を含まない治療計画に層別化することができる。その他の実施態様において、患者からの癌細胞を含むサンプルが、突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子を含む場合、その患者には高い用量の第一世代のBRAF阻害剤での治療を含む治療計画が選択される。このような患者は、高い用量の第一世代のBRAF阻害剤を含む治療計画に層別化することができる。前述の実施態様の典型的な形態において、第一世代のBRAF阻害剤は、RAF-265である。その代わりの実施態様において、患者から得られた癌細胞を含むサンプルで突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子が同定された場合、それは、その患者が、第二世代のBRAF阻害剤での治療に反応する可能性が高いことを示す。従って、一実施態様において、患者からの癌細胞を含むサンプルが、突然変異型BRAF核酸またはポリペプチド分子を含む場合、その患者には第二世代のBRAF阻害剤での治療を含む治療計画が選択される。このような患者は、第二世代のBRAF阻害剤を含む治療計画に層別化することができる。前述の実施態様の具体的な形態において、突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を有する。代表的な実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを有する。好ましい実施態様において、突然変異型BRAF核酸分子は、1またはそれより多くの前述のアミノ酸残基に突然変異を含む突然変異型BRAFポリペプチドをコードする。従って、一実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療を最適化する方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること、を含み;ここで、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、それは、その被験者をMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤で治療する必要があることを示す。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療を最適化する方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;および、サンプルをPCRで処理し、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を同定すること、を含み;ここで、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、それは、その被験者をMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤で治療する必要があることを示す。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること;および、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが上記核酸分子に含まれる場合、被験者にMEK阻害剤または第二世代のBRAF阻害剤を投与すること、を含む。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;サンプルをPCRで処理し、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を同定すること;および、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドをが上記核酸分子に含まれる場合、被験者にMEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤を投与すること、を含む。その他の実施態様において、本発明は、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者の同定方法を提供し、本方法は、癌から得られた核酸サンプルを、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中に、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸残基の同一性を変更する1またはそれより多くの突然変異が存在するかどうかについて分析すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異の存在を、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と関連付けること、を含む。その他の実施態様において、本発明は、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い癌を有する被験者の同定方法を提供し、本方法は、癌から得られた核酸サンプルを、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸残基の同一性を変更する1またはそれより多くの突然変異の存在について分析すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の1種またはそれより多くの突然変異の存在を、MEK阻害剤または第二世代のRAF阻害剤での治療によって利益を得る可能性が高い被験者と関連付けること、を含む。前述の形態の様々な実施態様において、MEK阻害剤は、CI-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリル、または、4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリル、または、それらの組み合わせである。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療の間高い再発の危険を有することを同定する方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること、を含み;ここで、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合、その被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療の間高い再発の危険を有することを同定する。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを同定する方法を提供し、本方法は、癌細胞から核酸を抽出すること;および、BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を配列解析すること、を含み;ここで、配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748からなる群より選択される1またはそれより多くの位置におけるアミノ酸に関して、コードされたBRAFポリペプチドの1またはそれより多くのアミノ酸におけるアミノ酸残基の同一性を変更するヌクレオチドが存在する場合は、その被験者が第一世代のBRAF阻害剤での治療に対して反応しないことを同定する。前述の形態の様々な実施態様において、RAF阻害剤は、RAF265、または、PLX4720である。前述の形態のいくつかの実施態様において、癌は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌からなる群より選択される。その他の実施態様において、癌は黒色腫である。X.治療方法様々な実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供する。代表的な実施態様において、被験者は、1種またはそれより多くの突然変異、例えば本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドを含む癌を有する。関連する実施態様において、被験者は、1種またはそれより多くの突然変異、例えば本明細書において説明される1種またはそれより多くの耐性突然変異を有するBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を含む癌を有する。用語治療した、を治療することまたは治療は、治療しようとする状態に伴う症状の少なくとも1つを低減または緩和することを含む。例えば、治療によって、例えば癌のような疾患の1種または数種の症状を減少させるか、または、完全に根絶することができる。同様に、化合物の治療有効量とは、治療しようとする状態に伴う症状の少なくとも1つを減少または緩和するのに十分な量である。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供し、本方法は、被験者に第二世代のRAF阻害剤を投与することを含む。その他の実施態様において、本発明は、癌を有する被験者の治療方法を提供し、本方法は、被験者にMEK阻害剤を投与することを含む。前述の形態の代表的な実施態様において、癌中に、BRAFポリペプチドまたはBRAFポリペプチドをコードする核酸分子中の、本明細書において説明されているような1種またはそれより多くのBRAF阻害剤に対する耐性を付与する1種またはそれより多くの突然変異が同定される。例えば、本発明は、任意にV600EにBRAF突然変異を有することに加えて、以下に示す1種またはそれより多くのBRAF中の位置:配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748にアミノ酸置換を含む癌の治療方法を提供し、前記方法は、被験者に治療有効量の第二世代のBRAF阻害剤を投与することを含む。本発明はさらに、任意にV600EにBRAF突然変異を有することに加えて、以下に示す1種またはそれより多くのBRAF中の位置:配列番号2または配列番号4のA29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748にアミノ酸置換を含む癌の治療方法を提供し、前記方法は、被験者に治療有効量のMEK阻害剤を投与することを含む。RAF下流でMEKが活性化されると、MEK阻害剤は、本明細書において説明される1種またはそれより多くのRAF耐性突然変異を有する細胞中のRAFシグナル伝達をうまく阻害することができる。本発明を実施するのに適したMEK阻害剤としては、これらに限定されないが、I-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-4-4-フェノキシ-フェニルアミノ-キノリン-3-カルボニトリル、4-[3-クロロ-4-1-メチル-1H-イミダゾール-2-イルスルファニル-フェニルアミノ]-6-メトキシ-7-3-モルホリン-4-イル-プロポキシ-キノリン-3-カルボニトリル、および、ロシュRoche製の化合物RG7420が挙げられる。本発明を実施するのに適したさらなるMEK阻害剤としては、これらに限定されないが、WO2008076415、US20080166359、WO2008067481、WO2008055236、US20080188453、US20080058340、WO2007014011、WO2008024724、US20080081821、WO2008024725、US20080085886、WO2008021389、WO2007123939、US20070287709、WO2007123936、US20070287737、US20070244164、WO2007121481、US20070238710、WO2007121269、WO2007096259、US20070197617、WO2007071951、EP1966155、IN2008MN01163、WO2007044084、AU2006299902、CA2608201、EP1922307、EP1967516、MX200714540、IN2007DN09015、NO2007006412、KR2008019236、WO2007044515、AU2006302415、CA2622755、EP1934174、IN2008DN02771、KR2008050601、WO2007025090、US20070049591、WO2007014011、AU2006272837、CA2618218、EP1912636、US20080058340、MX200802114、KR2008068637、US20060194802、WO2006133417、WO2006058752、AU2005311451、CA2586796、EP1828184、JP2008521858、US20070299103、NO2007003393、WO2006056427、AU2005308956、CA2587178、EP1838675、JP2008520615、NO2007003259、US20070293544、WO2006045514、AU2005298932、CA2582247、EP1802579、CN101065358、JP2008517024、IN2007DN02762、MX200704781、KR2007067727、NO2007002595、JP2006083133、WO2006029862、US20060063814、US7371869、AU2005284293、CA2579130、EP1791837、CN101023079、JP2008513397、BR2005015371、KR2007043895、MX200703166、IN2007CN01145、WO2006024034、AU2005276974、CA2578283、US20060079526、EP1799656、CN101044125、JP2008510839、MX200702208、IN2007DN02041、WO2006018188、AU2005274390、CA2576599、EP1781649、CN101006085、JP2008509950、BR2005014515、AT404556、US20060041146、MX200701846、IN2007CN00695、KR2007034635、WO2006011466、AU2005265769、CA2575232、EP1780197、BR2005013750、JP4090070、MX200700736、CN101124199、KR2007041752、IN2007DN01319、WO2005121142、AU2005252110、CA2569850、US20060014768、US7378423、EP1761528、CN101006086、AT383360、BR2005011967、JP2008501631、EP1894932、ES2297723、MX2006PA14478、NO2007000155、IN2007CN00102、KR2007034581、HK1107084、JP2008201788、US20050256123、US20050250782、US20070112038、US20050187247、WO2005082891、WO2005051302、AU2004293019、CA2546353、US20050130943、US20050130976、US20050153942、EP1689233、JP2007511615、WO2005051301AU2004293018、CA2545660、US20050130943、US20050130976、US20050153942、EP1682138、BR2004016692、CN1905873、JP2007511614、MX2006PA05657、IN2006DN03183、NO2006002692、KR2007026343、WO2005028426、EP1674452、US20070105859、US20050054701、US7230099、US20050049419、US7144907、AU2004270699、CA2537321、WO2005023759、EP1673339、BR2004014111、CN1874769、JP2007504241、JP4131741、US20060030610、MX2006PA02466、NO2006001506、US20050049419、US7144907、US20050054701、US7230099、AU2004270699、CA2537321、WO2005023759、EP1673339、BR2004014111、CN1874769、JP2007504241、JP4131741US20060030610、MX2006PA02466、IN2006DN01661、NO2006001506、US20060189808、US20060189649、US7271178、US20060189668、US20050049276、WO2005009975、CA2532067、EP1651214、BR2004012851、JP2006528621、US20050026970、US7160915、MX2006PA00921、WO2005007616、US20050059710、WO2005000818、US20050026964、US7273877、WO2004056789、US20050004186、CA2509405、AU2003286306、EP1578736、BR2003017254、JP2006516967、MX2005PA06803、WO2004044219、AU2003291268、WO2004041811、AU2003278369、EP1575943、JP2006508944、US20050282856、US7173136、US20070191346、WO2004041185、AU2003287366、US20060270643、WO2004030620、AU2003275282、US20040092514、US7232826、EP1545529、US20040039037、US6989451、WO2003077855、CA2478534、AU2003220202、US20030216460、EP1482944、CN1652792、JP2005526076、RU2300528、BR2003006016、MX2004PA08894、US20060106225、WO2003062191、CA2473545、EP1467968、BR2003007060、JP2005515253、TW592692、US20040006245、US6891066、MX2004PA05527、US20050137263、US7078438、WO2003062189、CA2472367、EP1467965、BR2003007071、JP2005515251、US20030232889、US6770778、MX2004PA05528、WO2003047585、AU2002347360、WO2003047583、AU2002365665、WO2003047523、CA2466762、AU2002365899、US20030125359、US7307071、JP2005526008、EP1578346、WO2003035626、CA2463101、AU2002359291、EP1438295、JP2005508972、US20050054706、US7253199、US20070293555、AU2008202731、US6506798、WO9901421、WO2000041994、US6310060、WO2002006213、CA2416685、AU2001073498、BR2001012584、HU2003002781、JP2004504294、JP3811775、EE200300030、NZ524120、AU2001273498、IN2003MN00028、NO2003000249、KR773621、MX2003PA00591、HR2003000083、BG107564、ZA2003000348、US20040054172、US6960614、HK1055943、US20050176820、US7411001、WO2000042029、JP2000204077、CA2355374、EP1144394、BR9916896、TR200102029、HU2001005092、JP2002534515、EE200100374、NZ513432、AT302761、ES2249060、ZA2001005219、MX2001PA06659、IN2001MN00785、NO2001003451、HR2001000525、BG105801、US6545030、HK1042488、US20030004193、WO2000042022、JP2000204079、CA2355470、EP1144385、BR9916904、TR200102030、HU2001005113、EE200100373、JP2002534510、NZ513433、AT302193、ES2247859、MX2001PA06568、ZA2001005224、IN2001MN00786、US6469004、NO2001003452、HR2001000524、BG105800、WO2000042003、JP2000212157、CA2349832、EP1144371、BR9916885、AT309205、ES2252996、MX2001PA04332、US6440966、US20030092748、US6750217、WO2000042002、JP2000204075、CA2349467、EP1144372、BR9916894、JP2002534497、AT311363、ES2251851、MX2001PA04331、US6455582、US20030045521、US6835749、WO2000037141、CA2352326、BR9916839、EP1140291、TR200101871、HU2001004844、JP2002532570、EE200100339、NZ512859、AT310567、ES2253928、ZA2001004277、MX2001PA05476、IN2001MN00673、NO2001003099、HR2001000473、BG105715、US20040171632、GB2323845、WO9901426、CA2290506、AU9882627、AU757046、EP993439、BR9810366、NZ501276、HU2000003731、JP2002511092、AT277895、IL132840、PT993439、ES2229515、TW396149、ZA9805728、MX9910649、NO9906491、NO315271、US20030078428、US6821963、US20050049429、US20060052608、US7169816、WO9901421、CA2290509、AU9882626、AU756586、EP993437、BR9810385、JP2002509536、NZ501277、AT344791、ES2274572、TW221831、ZA9805726、MX9910556、US6310060、US6506798、US20020022647、US6492363、US20030149015、および、US7019033で説明されている化合物が挙げられるこれらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。前述の化合物の投与量、製剤および投与様式は当業界でよく知られている。典型的な投与様式としては、これらに限定されないが、経口、皮下、静脈内、または、非経口が挙げられる。経口投与のための液状の投薬形態としては、これらに限定されないが、医薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および、エリキシルが挙げられる。液状の投薬形態は、活性化合物に加えて、当業界において一般的に使用されている不活性希釈剤を含んでいてもよく、このような不活性希釈剤としては、例えば水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油具体的には、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、および、ゴマ油、クレモフォールcremaphor、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタン脂肪酸エステル、および、それらの混合物が挙げられる。経口用組成物は、不活性希釈剤の他にも、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、および、着香料を含んでいてもよい。経口投与のための固形の投薬形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、および、顆粒が挙げられる。このような固形の投薬形態において、活性化合物は、少なくとも1種の不活性な医薬的に許容される賦形剤またはキャリアーと混合され、このような賦形剤またはキャリアーとしては、例えばクエン酸ナトリウム、または、リン酸二カルシウム、および/または、a充填剤もしくは増量剤、例えばスターチ、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および、ケイ酸、b結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、および、アカシア、c湿潤剤、例えばグリセロール、d崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ポテトまたはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および、炭酸ナトリウム、e溶解遅延剤、例えばパラフィン、f吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、g湿潤剤、例えばセチルアルコール、および、モノステアリン酸グリセロール、h吸収剤、例えばカオリン、および、ベントナイト粘土、および、i潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および、それらの混合物が挙げられ、さらにj物理的な混合物中または固体分散体の形態の場合、溶解速度促進剤、例えば高分子量ポリエチレングリコール、または、ポリビニルピロリドンも挙げられる。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その投薬形態は緩衝剤も含んでいてもよい。BRAF中の突然変異は概して多種多様の癌において耐性を強化することから、本明細書において説明される方法および第二世代のBRAF阻害剤は、固形腫瘍や血液の悪性疾患などの広範囲の癌の治療において有用である。このような腫瘍の例としては、これらに限定されないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌、肉腫、腺腫、神経系癌、および、尿生殖器癌が挙げられる。代表的な実施態様において、前述の方法は、成人および小児の急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、AIDS関連の癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、線維性組織球腫、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、脳室上皮腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視床下部膠腫、乳癌、男性乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸直腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜癌、脳室上皮腫、食道癌、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視覚路の神経膠腫、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、腎細胞癌、喉頭癌、口唇および口腔癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、中枢神経系原発リンパ腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体癌、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部組織肉腫、子宮肉腫、セザール症候群、非黒色腫皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、睾丸癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、および、ウィルムス腫瘍を治療することにおいて有用である。XI.キット本発明の一部として、様々なキットを組み立てることができる。キットは、特定の患者をBRAF阻害剤を用いた治療に対する耐性を生じさせる危険について評価するために、BRAF中の突然変異を分析する構成要素を含んでいてもよく、それにより、臨床医は、患者にとって代替の治療法が必要か否かを決定することができる。このようなキットは、突然変異を評価することができる試薬を含んでいてもよく、このような試薬としては、例えばBRAF阻害剤例えばRAF-265に対する耐性に関する表現型の出現と相関する突然変異を評価するためのプライマーセットが挙げられる。例えば、配列番号1の全部または一部に相補的な、または、それと同一のプライマーまたはプライマー対が、キットの一部であることも考えられる。好ましい実施態様において、このようなプライマーは、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を含む突然変異型BRAFポリペプチドをコードする核酸分子を特異的に検出または増幅するのに用いることができる。代表的な実施態様において、このようなプライマーは、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含むBRAFポリペプチドをコードする核酸分子を、特異的に検出または増幅する。その他の実施態様において、本キットは、BRAFポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を増幅するために、配列番号1の全部または一部に相補的または同一なプライマーを使用するための説明書を含む。その他の実施態様において、本キットは、突然変異を含むBRAFポリペプチドを検出するための組成物、例えば1種またはそれより多くの耐性突然変異を含む突然変異型BRAFポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む。典型的なポリペプチドとしては、以下に示す1種またはそれより多くのアミノ酸残基:A29、H72、S113、S124、P162、C194、L227、P231、C251、V291、Q329、V483、L485、T521、V528、D587、P655、S657、S683、P686、C696、L697、P722、F738、および、C748に突然変異を含む突然変異型BRAFポリペプチドが挙げられる。その他の実施態様において、突然変異型BRAFポリペプチドは、以下に示す1種またはそれより多くの突然変異:A29V、H72N、S113I、S124F、P162H、C194、L227F、P231T、C251F、V291F、Q329K、V483E、L485F、T521K、V528F、D587E、P655T、S657、S683R、P686Q、P686T、C696、L697I、P722T、F738L、および、C748Fを含む。上記で考察された特定の方法でBRAF突然変異を分析するために必要な必須の材料および試薬の全てが、キット中で一緒に組み立てられていてもよい。本キットの構成要素が1またはそれより多くの液状の溶液中に提供される場合、その液状の溶液は、好ましくは水溶液であり、特に好ましくは滅菌水溶液である。また本キットの構成要素は、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供することもできる。試薬または構成要素が乾燥形態として提供される場合、一般的には、再溶解は、適切な溶媒を添加することによってなされる。また、このような溶媒がその他の容器手段に提供されることも想定される。また本発明のキットは、典型的には、例えば望ましいバイアルを保持する射出または吹込成形されたプラスチック容器のような、市販するために厳重な管理下でバイアルを収容するための手段を含むと予想される。容器の数またはタイプに関わりなく、本発明のキットはさらに、サンプル回収および評価を補助する装置を含むか、または、それらがパッケージ化されていてもよい。このような装置は、例えば、吸入器、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、またはそのような医学的に承認されたあらゆる運搬手段であり得る。本発明のキットはまた、患者において特定の突然変異が同定された場合、選択できる治療法のうち推奨されるものの概略を示す説明書のシートを含んでいてもよい。例えば、本発明のキットに同梱される説明書のシートは、疾患例えば癌を有する患者において突然変異型BRAFポリペプチドが同定された場合、第一世代のBRAF阻害剤での治療を中止すること、第一世代のBRAF阻害剤での治療中に再発についてモニターすること、第一世代のBRAF阻害剤での治療を高用量で継続すること、または、第二世代のBRAF阻害剤での治療を開始させることを推奨することができる。同様に本発明のキットに同梱される説明書のシートは、障害を有する患者において突然変異型BRAFポリペプチドが検出できなかった場合、第一世代のBRAF阻害剤での治療を標準的な用量で継続することを推奨することができる。代表的な実施態様において、第一世代のBRAF阻害剤は、RAF-265である。以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらは、限定と解釈されるべきではない。本願全体にわたり引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。実施例1:BRAF-V600Eランダム変異誘発のスクリーニングRAF265およびPLX4720公開された方法の改変法によって突然変異させたライブラリーを作製した。簡単に言えば、MutS、MutD5-およびMutT-DNA修復遺伝子が欠失したE.coliXL1-レッド;ストラタジーンStratagene中でBRAFV600E発現プラスミドpWZL-Blast-BRAFV600Eを増殖させることにより変異誘発を行った。これらの細菌からプラスミドDNAを抽出し、XL1-ブルーE.coliストラタジーン中で増幅した。突然変異BRAFV600Eプラスミドまたは非突然変異コントロールを用いて、A375黒色腫細胞に感染させた。ブラスチシジンで選択した後、細胞を15cmの培養皿で平板培養し、耐性クローンが出現するまで、RAF阻害剤RAF265またはPLX4720;それぞれ2μMまたは1.5μMの存在下で5週間培養した。耐性クローンを配列解析して、高い頻度で出現した突然変異を同定した。図5と図6に結果を示す図5:RAF265のスクリーニング、および、図6:PLX4720のスクリーニング。図7は、両方のスクリーニングにおいて高い頻度で発生した3種のBRAF突然変異の位置を示す。実施例2:BRAF突然変異体を含む細胞におけるpMEK1/2およびpERK1/2活性化のウェスタンブロット解析293T細胞をそれぞれ推定上の耐性対立遺伝子に関するBRAFを含むpWZLBLAST6μgでトランスフェクションし、その後様々な濃度のBRAFV600E阻害剤PLX47200、0.08、0.4、2、5および10μMで16時間処理した。標準的手法を用いて免疫ブロット実験を行った。簡単に言えば、処理された細胞をプロテアーゼ阻害剤ロシュRoche、NaFおよびNaVO3それぞれ1mMを含むTNN緩衝液で溶解させた。溶解産物を定量しブラッドフォード分析、変性させ95oC、および、SDSゲル電気泳動で分解した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、BRAFを認識する一次抗体サンタクルーズSantaCruz;1:10,000の希釈液、p-ERK1/2、p-MEK1/2Ser-217/221、および、α-チューブリンセルシグナリングテクノロジーCellSignalingTechnology;1:1,000の希釈液で検査した。適切な二次抗体抗ウサギまたは抗マウスIgG、HRP結合型;1:1,000の希釈液、セルシグナリングテクノロジーとインキュベートした後、タンパク質を化学発光ピアースPierceを用いて検出した。図8に結果を示す。そこで示したように、BRAF-V600E、BRAF-V600E-T521K、および、BRAFV600E-P686Qを含む細胞において、リン酸化MEK1/2およびERK1/2のレベルは増加した。リン酸化MEK1/2およびERK1/2の増加は、PLX4720の濃度を増加させるにつれて、BRAF-V600E-T521KおよびBRAFV600E-P686Q細胞において持続した。実施例3:BRAFキナーゼ分析293T細胞70のコンフルエントを推定上の耐性対立遺伝子であるBRAFV600Eを含むpc-DNA-DEST40、キナーゼ欠損BRAFまたは野生型15μgでトランスフェクションした。トランスフェクション後48時間で、標準的な方法によって溶解産物を作製した。1mgの全細胞抽出物を、コバルトビーズを用いて4°Cで30分間沈殿させた。タンパク質が結合したコバルトビーズを、20μLのATP/マグネシウム混合物20mMのMopspH7.2、25mMのβ-グリセロリン酸塩、5mMのEGTA、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、75mMのMgCl2、および、0.5mMATP、20μLの希釈緩衝液20mMのMops、pH7.2、25mMのβ-グリセロールリン酸塩、5mMのEGTA、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのDTT、および、1μgの不活性なMEK1ミリポアMilliporeから入手と共に30°Cで30分間インキュベートした。p-MEK1/2抗体セルシグナリングテクノロジーを用いた免疫染色によってリン酸化MEK1生成物を検出した。均等物本明細書において特定の実施例および実施態様のみを参照しながら本発明を説明した。しかしながら可能な全ての本発明の実施例および実施態様を徹底的に説明する努力がなされた訳ではない。実際に、当業者であれば、以下の請求項で述べられる本発明の目的とする本質および範囲から逸脱することなく上述の実施例および実施態様に様々な付け足し、省略、改変などの変化を施すことができると予想される。このような全ての付け足し、省略、改変などの変化は、以下の請求項の範囲内に含まれるものとする。"