"ヒト卵胞刺激ホルモン及び免疫グロブリンFc領域が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性重合体を介して連結されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したヒト卵胞刺激ホルモンの持続性製剤。前記ヒト卵胞刺激ホルモンは、FSHfolliclestimulatinghormone又はそのアゴニストagonist、誘導体derivative、断片fragment、変異体variant及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項1に記載の持続性製剤。反応基末端が2つである非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンFc領域及び卵胞刺激ホルモンのアミノ基又はチオール基Thiolgroupに結合されたものである請求項1に記載の持続性製剤。反応基末端が3つである非ペプチド性重合体の二末端が、免疫グロブリンFc領域及びヒト卵胞刺激ホルモンのアミノ基又はチオール基Thiolgroupに結合されたものである請求項1に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域が非グリコシル化されたことを特徴とする請求項1に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3及びCH4ドメインからなる群から選択される1つ~4つのドメインからなるものである請求項1に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含むものである請求項6に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来するFc領域である請求項1に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域の各ドメインが、IgG、IgA、IgD、IgE及びIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである請求項8に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域が、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である請求項9に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域がIgG4Fc領域である請求項8に記載の持続性製剤。免疫グロブリンFc領域がヒト非グリコシル化IgG4Fc領域である請求項9に記載の持続性製剤。非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである請求項1に記載の持続性製剤。スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル及びスクシンイミジルカーボネートからなる群から選択されるものである請求項13に記載の持続性製剤。非ペプチド性重合体が、両末端又は三末端に反応アルデヒド基の反応基を有する請求項13に記載の持続性製剤。不妊治療用補助生殖技術である体外受精IVFET、配偶子卵管内移植GIFT、接合子卵管内移植ZIFT、卵細胞質内精子注入法ICSI又は試験管ベビー技術に用いるためのものである請求項1に記載の持続性製剤。低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症又は多嚢胞性卵巣症候群Polycysticovarysyndromeの治療用である請求項1に記載の持続性製剤。1両末端にアルデヒド、マレイミド及びスクシンイミド誘導体から選択される反応基を有する非ペプチド性重合体をヒト卵胞刺激ホルモンのアミノ基又はチオール基に共有結合させる段階と、2前記1の反応混合物からN末端以外のアミノ酸残基に非ペプチド性重合体が共有結合されたヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び卵胞刺激ホルモンに結合されたペプチド結合体を生成する段階とを含む、請求項1のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法。1両末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体をヒト卵胞刺激ホルモンのリシン残基にpH7.5以上で共有結合する段階と、2前記1の反応混合物からリシン残基に非ペプチド性重合体が共有結合されたヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及び卵胞刺激ホルモンに結合されたタンパク質結合体を生成する段階とを含む、請求項1のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法。1三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体の三末端反応基のうち二末端反応基を免疫グロブリンFcのN末端アミノ基に共有結合により連結する段階と、21で製造された反応混合物から非ペプチド性重合体に連結された免疫グロブリンFcを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にヒト卵胞刺激ホルモンを共有結合により連結する段階とを含む、請求項1のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法。有効量の請求項1の持続性製剤を個体に投与する段階を含む、生殖障害を有する個体を治療する方法前記生殖障害は不妊である請求項21に記載の方法。有効量の請求項1の持続性製剤を投与する段階を含む、個体の生殖能力を向上させる方法。そこで、本発明者らは、ヒト卵胞刺激ホルモンの血中半減期の増加及び生体内活性の維持を同時に最大化する方法として、免疫グロブリンFc領域、二末端又は三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体、及び卵胞刺激ホルモンを共有結合によりN末端以外のアミノ酸残基に部位選択的に又はN末端に互いに連結させる製造方法を用いると、結合体の生体内の効力持続効果が画期的に増加することを確認して本発明を完成するに至った。本発明の目的は、ヒト卵胞刺激ホルモンの生体内活性を維持しながらも血中半減期を延長させて一層優れたヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤及びその製造方法を提供することにある。本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体は、糖タンパク質の生体内活性が比較的高く維持され、血中半減期が大幅に増加する効果がある。上記目的を達成するための一態様として、本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモン及び免疫グロブリンFc領域が二末端又は三末端に反応基を有する非ペプチド性重合体を介して互いに共有結合により連結されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加したヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤を提供する。本発明において用いられるヒト卵胞刺激ホルモンは、脳下垂体で産生されて内分泌系から分泌される糖タンパク質ホルモンであり、卵巣で卵胞の生産、発達及び成熟を刺激する機能を有する。アルファサブユニットとベータサブユニットのアミノ酸配列は次の通りである。アルファサブユニットAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS配列番号1ベータサブユニットNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE配列番号2具体的な一態様によれば、本発明において用いたヒト卵胞刺激ホルモンは、動物細胞を用いた組換えタンパク質生産方法で生産することができる。また、本発明において、ヒト卵胞刺激ホルモンは、様々な部位で非ペプチド性重合体に結合される。例えば、アルデヒド反応基は、低いpHではN末端に選択的に反応し、高いpH、例えばpH9.0の条件ではリシン残基とも共有結合を形成することができる。反応pHを変えてペグ化PEGylation反応を進めると、イオン交換カラムを用いて反応混合物から位置異性体を分離することができる。N末端以外の位置にカップリングする場合、天然アミノ酸配列において修飾しようとするアミノ酸残基の位置に反応性チオール基を導入すると、非ペプチド性重合体のマレイミドリンカーを用いて共有結合を形成することができる。非ペプチド性重合体にアルデヒドリンカーを用いると、N末端とリシン残基にあるアミノ基と反応し、選択的に反応収率を向上させるために変形した形態のヒト卵胞刺激ホルモンを使用できる。例えば、N末端をブロックする方法、リシン残基を置換する方法、C末端にアミノ基を導入する方法などを用いると、1つの反応するアミノ基を希望の位置に維持することができ、ペグ化及びカップリング収率を向上させることができる。N末端の保護方法としては、ジメチル化dimethylation以外にも、メチル化methylation、脱アミノ化deamination、アセチル化acetylation方法などが可能であり、こららのアルキル化alkylation方法に限定されるものではない。本発明の好ましい態様において、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体は、卵胞刺激ホルモンのN末端に特異的に免疫グロブリンFc領域が結合されたヒト卵胞刺激ホルモン結合体である。ヒト卵胞刺激ホルモンのアルファサブユニットとベータサブユニットのN末端は受容体との結合に関与しないので、本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモンのN末端に特異的にFc領域を結合させることにより、ヒト卵胞刺激ホルモンの活性を維持しながらも生体内の半減期が増加する優れた効果を有することを確認した。本発明において、活性という用語は、ヒト卵胞刺激ホルモンがヒト卵胞刺激ホルモン受容体に結合してヒト卵胞刺激ホルモンとして作用することを意味する。このようなN末端特異的結合体の製造はpH調整により行われ、好ましいpH範囲は4.5~7.0である。本発明において、N末端という用語は、N末端領域という用語と混用される。具体的な一実施例として、本発明者は、ヒト卵胞刺激ホルモンのN末端に選択的にカップリングする方法として、二末端の反応基を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンにPEGを結合させる際にpH6.0で反応させてN末端のペグ化反応を誘導した。他の方法として、三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、ヒト卵胞刺激ホルモンにPEGを結合させる際にモル比を変えてpH6.0で反応を誘導した。三末端を有する非ペプチド性重合体を用いる場合は、両末端を有する非ペプチド性重合体を用いる場合より、PEGの使用量が減少するので、収率を増加させることができる。免疫グロブリンFc領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンFc領域は、全免疫グロブリン分子に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の製造、精製及び収率の面で有利である。アミノ酸配列が抗体毎に異なるので、高い非均質性を示すFab部分を除去することにより、物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性が低くなるという効果も期待することができる。本発明において、免疫グロブリンFc領域とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖不変領域1CH1及び軽鎖不変領域CL1を除いたものであり、重鎖不変領域2CH2及び重鎖不変領域3CH3部分を含むタンパク質を意味する。ここで、重鎖不変領域にヒンジhinge部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンFc領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖不変領域1CH1及び/又は軽鎖不変領域1CL1を含む拡張されたFc領域であってもよい。また、CH2及び/又はCH3に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンFc領域は、1CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、2CH1ドメイン及びCH2ドメイン、3CH1ドメイン及びCH3ドメイン、4CH2ドメイン及びCH3ドメイン、51つ又は2つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域又はヒンジ領域の一部との組み合わせ、6重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。また、本発明の免疫グロブリンFc領域は、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体mutantをも含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、IgGFcの場合、結合に重要であることが知られている214~238、297~299、318~322又は327~331番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられる。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、天然型FcからN末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、又は天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばC1q結合部位が除去されてもよく、ADCC部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンFc領域の配列誘導体を製造する技術は、国際公開第97/34631号、国際公開第96/32478号などに開示されている。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知であるHNeurathRLHillTheProteinsAcademicPressNewYork1979。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly間の交換である。場合によっては、Fc領域はリン酸化phosphorylation、硫酸化sulfation、アクリル化acrylation、グリコシル化glycosylation、メチル化methylation、ファルネシル化farnesylation、アセチル化acetylation、アミド化amidationなどにより修飾modificationされてもよい。前述したFc誘導体は、本発明のFc領域と同じ生物学的活性を示すが、Fc領域の熱、pHなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体である。また、このようなFc領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの他の動物の生体内から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換え型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理するとFab及びFcに切断され、ペプシンを処理するとpFc及びFab2に切断される。これらの断片は、サイズ排除クロマトグラフィーsizeexclusionchromatographyなどを用いてFc又はpFcを分離することができる。ヒト由来のFc領域は、微生物から得られた組換え型免疫グロブリンFc領域であることが好ましい。また、免疫グロブリンFc領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンFc糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Fcから糖鎖が除去された免疫グロブリンFc領域は、補体c1qの結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低下又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンFc領域は、薬物のキャリアとして本来の目的に適する。本発明において、糖鎖の除去Deglycosylationとは、酵素で糖を除去したFc領域を意味し、非グリコシル化Aglycosylationとは、原核生物、好ましくは大腸菌から産生されてグリコシル化されていないFc領域を意味する。また、免疫グロブリンFc領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM由来、又はそれらの組み合わせcombinationもしくはそれらのハイブリッドhybridによるFc領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なIgG又はIgM由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているIgG由来であることが最も好ましい。本発明において、組み合わせcombinationとは、同一起源の単鎖免疫グロブリンFc領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合して二量体又は多量体を形成することを意味する。すなわち、IgGFc、IgAFc、IgMFc、IgDFc及びIgEFc断片からなる群から選択される2つ以上の断片から二量体又は多量体を製造することができる。本発明において、ハイブリッドhybridとは、2つ以上の異なる起源の免疫グロブリンFc断片に該当する配列が単鎖免疫グロブリンFc領域内に存在することを意味する用語である。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、IgGFc、IgMFc、IgAFc、IgEFc及びIgDFcのCH1、CH2、CH3及びCH4からなる群から選択される1つ~4つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。一方、IgGもIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。IgG2及びIgG4サブクラスであることが好ましく、補体依存性細胞毒性CDCComplementdependentcytotoxicityなどのエフェクター機能effectorfunctionのほとんどないIgG4のFc領域であることが最も好ましい。すなわち、本発明の薬物のキャリアとして最も好ましい免疫グロブリンFc領域は、ヒトIgG4由来の非グリコシル化されたFc領域である。ヒト由来のFc領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のFc領域に比べて好ましい。本発明において、非ペプチド性重合体とは、繰り返し単位が2つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLAポリ乳酸polylacticacid及びPLGAポリ乳酸-グリコール酸polylacticglycolicacidなどの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。当該分野に知られたこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も本発明に含まれる。従来のインフレームフュージョンinframefusion方法で製造された融合タンパク質に用いられていたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待したほど得られないということである。しかし、本発明においては、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いるので、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば限定されることなく用いられる。非ペプチド性重合体の分子量は、1~100kDaの範囲、好ましくは1~20kDaの範囲である。また、前記免疫グロブリンFc領域に結合される本発明の非ペプチド性重合体は、1種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンFc領域及びタンパク質薬物に結合される反応基を有する。前記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミドmaleimide基及びスクシンイミドsuccinimide誘導体からなる群から選択されることが好ましい。ここで、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられる。特に、前記非ペプチド性重合体が2つの両末端又は三末端に反応アルデヒド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド反応基は、低いpHではN末端に選択的に反応し、高いpH、例えばpH9.0の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。前記非ペプチド性重合体の二末端反応基又は三末端反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシル基を前述した様々な反応基として活性化してもよく、商業的に入手可能な変形した反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明のヒト卵胞刺激ホルモン結合体を製造してもよい。このような本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は、女性においては卵胞の生成、発達及び成熟を促進し、男性においては精子形成を誘導するというヒト卵胞刺激ホルモンの生体内活性が維持されるだけでなく、ヒト卵胞刺激ホルモンの血中半減期及びそれによるヒト卵胞刺激ホルモンの生体内の効力持続効果を画期的に増加させる。よって、不妊治療のための補助生殖技術である体外受精IVFET、配偶子卵管内移植GIFT、接合子卵管内移植ZIFT、及び卵細胞質内精子注入法ICSI又は試験管ベビー技術と、無排卵症、低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症及び多嚢胞性卵巣症候群の治療とに有用である。本発明の持続性製剤は、生体内持続性及び安定性を維持する上で優れた効果がある。本発明の具体的な実施例によれば、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて半減期が約10倍近く増加した表2。本発明の持続性製剤は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、経口投与の場合は結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、注射剤の場合は緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、局所投与用の場合は基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いてもよい。本発明の持続性製剤は、前述した薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造してもよい。例えば、持続性製剤は、経口投与の場合は錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造してもよい。持続性製剤は、注射剤の場合は使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造してもよい。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放型製剤などに剤形化してもよい。製剤化に適する担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを用いてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。本発明による持続性製剤は、不妊治療のための補助生殖技術である体外受精IVFET、配偶子卵管内移植GIFT、接合子卵管内移植ZIFT、卵細胞質内精子注入法ICSI又は試験管ベビー技術と、無排卵症、低性腺刺激ホルモン性性腺機能低下症及び多嚢胞性卵巣症候群Polycysticovarysyndromeの治療とに有用であるため、本発明による持続性製剤を投与することにより、前記疾患の治療を図ることができる。本発明において、投与とは、所定の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する。本発明の持続性製剤は、製剤が標的組織に送達されるものであれば、いかなる一般的な経路を介して投与してもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などであるが、これらに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。注射剤の形態で投与されることが好ましい。また、持続性製剤は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。また、本発明の持続性製剤は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、並びに疾患の重篤度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を著しく減少させることができる。他の態様として、本発明は、1両末端にアルデヒド、マレイミド又はスクシンイミド誘導体反応基を有する非ペプチド性重合体を用いてヒト卵胞刺激ホルモンのアミノ基又はチオール基に共有結合により連結する段階と、2前記1の反応混合物からN末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合したヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及びヒト卵胞刺激ホルモンに結合された結合体を生成する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。本発明において、用語連結体とは、非ペプチド性重合体とヒト卵胞刺激ホルモンのみが共有結合により連結された中間体であり、後に連結体中の非ペプチド性重合体のヒト卵胞刺激ホルモンが連結されていない他方の末端に免疫グロブリンFc領域を結合させる。好ましい一態様として、本発明は、1両末端にアルデヒド反応基を有する非ペプチド性重合体をヒト卵胞刺激ホルモンのリシン残基に共有結合により連結する段階と、21の反応混合物からリシン残基に非ペプチド性重合体が共有結合したヒト卵胞刺激ホルモンを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に免疫グロブリンFc領域を共有結合により連結し、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンFc領域及びヒト卵胞刺激ホルモンに結合されたタンパク質結合体を生成する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。1の非ペプチド性重合体及びヒト卵胞刺激ホルモンのリシン残基は、pH7.5以上で連結されることがより好ましい。好ましい他の態様として、本発明は、1三末端の反応基を有する非ペプチド性重合体の二末端反応基を免疫グロブリンFcのN末端アミノ基に共有結合により連結する段階と、21で製造された反応混合物から非ペプチド性重合体に連結した免疫グロブリンFcを含む連結体を分離する段階と、3分離した連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端にヒト卵胞刺激ホルモンを共有結合により連結する段階とを含むヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造方法を提供する。好ましいさらに他の態様として、本発明は、前記持続性製剤を個体に投与する段階を含む、生殖障害を有する個体を治療する方法を提供する。前記生殖障害は不妊であることが好ましい。また、好ましいさらに他の態様として、本発明は、薬学的に有効な量の前記持続性製剤を投与する段階を含む、個体の生殖能力を向上させる方法を提供する。ここで、個体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタなどの哺乳類であってもよい。以下、下記実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。[実施例1]ヒト卵胞刺激ホルモンの産生ヒト卵胞刺激ホルモンを産生するために、産生細胞株であるHMFS126寄託番号KCTC11529BP細胞株を、無血清培地を用いて総体積7.5L、実産生体積5Lの動物細胞用生物反応器で培養してヒト卵胞刺激ホルモンを産生した。産生方法を簡単に説明すると次の通りである。まず、生物反応器で培養を始めるために必要な細胞数を確保するために、冷凍保管されている細胞株を解凍し、総体積250mlのErlenmeyerフラスコで30mlの無血清培地EXCELLCHOmediumSAFCCat63225Cを用いて培養を始め、2日毎に継代培養した。10×105cells/mlの濃度になるように生物反応器に接種し、細胞数を拡張した。連続培養方法により、生物反応器で無血清培地EXCELLCHOmediumSAFCCat63289Cを用いて細胞数が100×105cells/ml以上になるように37°Cで培養した。その後、温度を30.5°Cに降下させ、1mM酪酸ナトリウムSodiumbutyrateSigmaCatB5887を添加して約20日間培養し、ヒト卵胞刺激ホルモンを産生した。産生期間中は継続して無血清培地を一定速度で添加し、添加した分だけ反応器から流出する培養上澄液を24時間毎に回収して遠心分離した。その後、限外濾過膜SARTOCONSliceCassettePESUSartorius社MWCO10Kを1Lの1NNaOHで1時間以上洗浄し、5Lの滅菌水を用いて最終洗浄した。ヒト卵胞刺激ホルモンの発現培養液を注入して20倍に濃縮した。ここで、卵胞刺激ホルモンの損失はほとんどなく、濃縮された卵胞刺激ホルモンの最終濃度は0.1mg/mlに維持された。1バッチが終了するまで濃縮された発現培養液を-20°Cの冷凍状態で保管し、バッチが終了すると回収して精製した。[実施例2]染料親和性クロマトグラフィー段階染料親和性クロマトグラフィー段階のために、濃縮されたヒト卵胞刺激ホルモン培養液に、最終濃度が50mMになるように1Mグリシン-水酸化ナトリウムpH90バッファを添加し、その後最終濃度が0.2Mになるように3.5M塩化カリウム溶液を順次添加した。各溶液が添加された培養液を0.45μmSartopore2300SterileCapsule08045μmの濾過フィルタで最終濾過して染料親和性クロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、染料親和性クロマトグラフィーとしてブルーセファロースBlueSepharoseFastFlowGEhealthcareレジンが充填されたカラムを用い、負荷された試料は平衡及び洗浄バッファA50mMグリシン-水酸化ナトリウム02M塩化カリウムと溶出バッファB50mMグリシン-水酸化ナトリウム25M塩化カリウム溶液を用いて定組成溶離isocraticelutionによりタンパク質を溶出した。図1[実施例3]疎水性クロマトグラフィー段階染料親和性クロマトグラフィー段階で溶出した試料に、最終的に100mMになるように1MトリスpH70バッファを添加して試料のpHを約8.0に補正し、その後疎水性クロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、疎水性クロマトグラフィーとしてソース15PHESource15PHEGEhealthcareレジンが充填されたカラムを用い、負荷された試料は溶媒A10mMトリス1M硫酸アンモニウムから溶媒B10mMトリス20イソプロパノールになるように6カラム容量で線形濃度勾配によりタンパク質を溶出した。図2[実施例4]限外濾過を用いたヒト卵胞刺激ホルモンの濃縮及び定溶濾過段階限外濾過膜SARTOCONSliceCassettePESUSartorius社MWCO10Kを1Lの1NNaOHと5Lの滅菌水を用いて洗浄し、その後疎水性クロマトグラフィー溶出液を希釈バッファ10mMリン酸ナトリウムで3倍に希釈して濃縮及び定溶濾過した。最終の定溶濾過希釈倍数は1000倍となり、濃縮されたヒト卵胞刺激ホルモンの最終濃度は約1mg/mlとなり、限外濾過膜の分離能MWCOは10Kのサイズが用いられた。[実施例5]ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー段階10mMリン酸ナトリウムpH80溶液で定溶濾過されて1mg/mlの濃度まで濃縮された試料をセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに負荷した。本発明においては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしてマクロプレップセラミックヒドロキシアパタイトタイプ1CeramichydroxyapatiteType180μmBioRadレジンが充填されたカラムを用い、濃縮された試料は溶媒A10mMリン酸ナトリウムで平衡化された状態のカラムに負荷された。その後、カラムに吸着せずに溶出するフロースルー分画にヒト卵胞刺激ホルモンが含まれる溶出液を回収し、溶媒B500mMリン酸ナトリウムでカラムに吸着したヒト卵胞刺激ホルモン以外のタンパク質を溶出、除去した。図3[実施例6]限外濾過及びエタノール処理段階限外濾過膜Pellicon2PLCCCMillipore社MWCO5Kを0.5Lの0.1NNaOHと2Lの滅菌水を用いて洗浄し、その後ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから得られたヒト卵胞刺激ホルモンを2mg/mlの濃度まで濃縮した。濃縮したヒト卵胞刺激ホルモンは、濃縮した試料と同じ体積の100エタノール溶液と混ぜて常温で恒温処理した。恒温処理において、卵胞刺激ホルモンの濃度は1mg/ml、エタノールの濃度は50となるようにし、常温で3時間ゆっくり攪拌しながら恒温処理した。[実施例7]陰イオン交換クロマトグラフィー段階エタノール処理段階を経たヒト卵胞刺激ホルモンは、サイズ排除クロマトグラフィーにより10mMトリスpH75バッファでバッファ交換し、溶媒A10mMトリスで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーに負荷された。陰イオン交換クロマトグラフィーとしてはソース15QSource15QGEhealthcareレジンが充填されたカラムが用いられ、負荷された試料は溶媒Aと溶媒B10mMトリス1M塩化ナトリウムを用いて溶媒Bの濃度が40となるように10カラム容量で線形濃度勾配によりタンパク質を溶出した。図4[実施例8]精製されたヒト卵胞刺激ホルモンの分析4段階のカラムクロマトグラフィーを経て精製されたヒト卵胞刺激ホルモンは、EPに記載された卵胞刺激ホルモンの試験法に従って確認及び純度確認試験を行った。ヒト卵胞刺激ホルモンの純度はサイズ排除クロマトグラフィーSECsizeexclusionchromatography、ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDSPAGEにより分析し、逆相クロマトグラフィー、免疫ブロッティング、質量分析試験などにより卵胞刺激ホルモンの物質確認試験を行い、等電点電気泳動IEFIsoelectricfocusingによりグリコシル化の程度を測定した。宿主由来DNA及びタンパク質定量を行った。[図5a~c][実施例9]ヒト卵胞刺激ホルモンのペグ化Pegylationと精製3.4KPropionALD2PEGプロピオンアルデヒド基を2つ有するPEGIDBInc韓国を、実施例7で得て実施例8で確認されたヒト卵胞刺激ホルモンのベータチェーンに80以上ペグ化するために、ヒト卵胞刺激ホルモンとPEGのモル比を1:15、タンパク質の濃度を1.5mg/mlとし、4°Cで6時30分間反応させた。ここで、反応はpH6.0、100mMの濃度のPotassiumphosphate緩衝液内で行われ、還元剤である20mMSCBNaCNBH3を添加して反応させた。反応液からSOURCEPHERESOURCEPHE1mlアマシャムバイオサイエンスによりモノペグ化されたMonopegylatedタンパク質を精製した。SOURCEPHERESOURCEPHE1mlアマシャムバイオサイエンスに20mMTrispH750.7M硫酸アンモニウムを用いて試料を結合させ、徐々に硫酸アンモニウムの濃度を低くし、有機溶媒を添加して試料を溶出させた。HICカラムに結合力の弱いヒト卵胞刺激ホルモンが先に溶出し、結合力の強いヒト卵胞刺激ホルモン-3.4KPEG試料が後で溶出した。溶出したピークのモノペグ化はSDS-PAGEgelを用いて確認した。ヒト卵胞刺激ホルモンのベータチェーンに80以上ペグ化された結果を確認するために、逆相カラムを用いて分析した結果を図13aおよびbに示す。Column:SOURCEPHERESOURCEPHE1mlアマシャムバイオサイエンス流速:1.0ml/分勾配:B100→0100分BA20mMトリスpH8007M硫酸アンモニウムB20mMトリスpH8020isopropanol[実施例10]ヒト卵胞刺激ホルモン-3.4KPEG-免疫グロブリンFc結合体HM12160Aの製造実施例9の方法を用いて3.4KPropionALD2PEGを濾胞刺激ホルモンと反応させ、モノペグ化濾胞刺激ホルモンのみ精製して免疫グロブリンFcハンミ,韓国とカップリングさせた。濾胞刺激ホルモン-3.4KPEGと免疫グロブリンFcのモル比を1:8.5、全タンパク質濃度を40mg/mlとし、4°Cで16時間反応させた。反応液は100mMK-PpH6.0であり、還元剤である20mMSCBを添加した。カップリング反応液は2つの精製カラムにより精製した。まず、カップリング反応に関与しない多量の免疫グロブリンFcを除去するために、BlueHPHiTrap5mlアマシャムバイオサイエンスを用いた。BlueFFに結合力の低い免疫グロブリンFcは20mMTrispH75を用いると溶出し、低い濃度のsaltと高いpH02MKCl50mMGlyNaOHpH90を用いて残った免疫グロブリンFcを完全に除去した。その後、高い濃度のsaltと高いpH25MKCl50mMGlyNaOHpH90を用いて反応しない濾胞刺激ホルモン-3.4KPEGと濾胞刺激ホルモン-PEG-免疫グロブリンFcを溶出させた。一次精製により免疫グロブリンFcが除去されるが、親和性カラムにおいては濾胞刺激ホルモン-3.4KPEGと濾胞刺激ホルモン-免疫グロブリンFcは結合力の差が大きくないので分離しない。よって、二物質の疎水性Hydrophobicityを用いて二次精製した。SOURCEISORESOURCEISO1mlアマシャムバイオサイエンスに20mMTrispH751.3M硫酸アンモニウムを用いた。HICカラムに結合力の弱い濾胞刺激ホルモン-3.4KPEGは20mMTrispH751.3M硫酸アンモニウムにおいてSOURCEISOに結合せずに溶出し、結合力の強い濾胞刺激ホルモン-免疫グロブリンFc試料は硫酸アンモニウムの濃度を低くすることにより後で溶出した。これらの疎水性の差が大きいので、イオン交換カラムよりはるかに分離が容易であった図6。HPLCサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、純度97.66を示した図7。Column:BlueHPHiTrap5mlアマシャムバイオサイエンス流速:3.0ml/分勾配:A0→1000分B→1000分CA20mMトリスpH75B50mMグリシン-水酸化ナトリウムpH9002M塩化カリウムC50mMグリシン-水酸化ナトリウムpH9025M塩化カリウムColumn:SOURCEISORESOURCEISO1mlアマシャムバイオサイエンス流速:1.0ml/分勾配:B100→0100分BA20mMトリスpH75BA13M硫酸アンモニウム[実施例11]ヒト卵胞刺激ホルモンと免疫グロブリンFcのペグ化Pegylationと精製5KPropionALD3PEGプロピオンアルデヒド基を3つ有するPEGNOF日本を免疫グロブリンFcハンミ,韓国の2つのN末端にペグ化させるために、タンパク質とPEGのモル比を1:2、タンパク質の濃度を6mg/mlとし、4°Cで4時間30分反応させた。ここで、反応はpH6.0、100mMの濃度のPotassiumphosphate緩衝液内で行われ、還元剤である20mMSCBNaCNBH3を添加して反応させた。反応液からSOURCEQFineLINE1000mlアマシャムバイオサイエンスによりモノペグ化されたMonopegylatedタンパク質を精製した。溶出したピークのモノペグ化はSDS-PAGEgelを用いて確認した。Column:SOURCEQFineLINE1000mlアマシャムバイオサイエンス流速:40.0ml/分勾配:A0→41分B→2480分BA20mMトリスpH75BA1MNaCl[実施例12]ヒト卵胞刺激ホルモン-5KPEG-免疫グロブリンFc結合体HM12160Bの製造実施例11の方法を用いて5KPropionALD3PEGを免疫グロブリンFcの2つのN-termと反応させ、モノペグ化免疫グロブリンFcのみ精製し、実施例7で得て実施例8で確認されたヒト卵胞刺激ホルモンとカップリングさせた。ヒト卵胞刺激ホルモンと免疫グロブリンFc-5KPEGのモル比を1:4.5、全タンパク質濃度を40mg/mlとし、4°Cで16時間反応させた。反応液は100mMK-PpH6.0であり、還元剤である20mMSCBを添加した。カップリング反応液は2つの精製カラムにより精製した。まず、カップリング反応に関与しない多量の免疫グロブリンFc-5KPEGを除去するために、BlueFFVantageLLaboratoryColumn38mlミリポアを用いた。BlueFFに結合力の低い免疫グロブリンFc-5KPEGは20mMTrispH75を用いると溶出し、低い濃度のsaltと高いpH02MKCl50mMGlyNaOHpH90を用いて残った免疫グロブリンFc-5KPEGを完全に除去した。その後、高い濃度のsaltと高いpH25MKCl50mMGlyNaOHpH90を用いて反応しないヒト卵胞刺激ホルモンとヒト卵胞刺激ホルモン-PEG-免疫グロブリンFcを溶出させた。一次精製により免疫グロブリンFc-5KPEGが除去されるが、親和性カラムにおいてはFSHとFSH-免疫グロブリンFcは結合力の差が大きくないので分離しない。よって、二物質の疎水性Hydrophobicityを用いて二次精製した。SOURCEPHEXK19mlアマシャムバイオサイエンスに20mMTrispH751M硫酸アンモニウムを用いて一次精製した試料を結合させ、徐々に硫酸アンモニウム濃度を低くして試料を溶出させた。HICカラムに結合力の弱い濾胞刺激ホルモンが先に溶出し、結合力の強い濾胞刺激ホルモン-免疫グロブリンFc試料が後で溶出した。これらの疎水性の差が大きいので、イオン交換カラムよりはるかに分離が容易である。HPLCサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、純度98.07を示した図8。Column:BlueFFVantageLLaboratoryColumn38mlミリポア流速:5.0ml/分勾配:A0→1000分B→1000分CA20mMトリスpH75B50mMグリシン-水酸化ナトリウムpH9002M塩化カリウムC50mMグリシン-水酸化ナトリウムpH9025M塩化カリウムColumn:SOURCEPHEXK19mlアマシャムバイオサイエンス流速:2.0ml/分勾配:B100→0150分BA20mMトリスpH75BA1M硫酸アンモニウム[実施例13]持続型及び天然型ヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力を測定するために、未成熟雌ラットを用いて卵巣重量の増加を確認した。21日齢の未成熟雌ラットに3日間持続性製剤を0.5又は1.5mcg/headFSH濃度基準で単回投与し、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンを0.5mcg/headの用量で毎日、又は1.5mcg/headの用量で単回投与した。3日間の試験期間中、ヒト卵胞刺激ホルモン製剤の投与と同時に、ヒト性腺刺激ホルモンhumanchorionicgonadotropinを13.3IU/headの用量で毎日並行投与した。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、両末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。最初に試験物質を投与し、72時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。単回投与されたヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤は同量投与された天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて卵巣重量が26増加し、1/3の用量で同等の卵巣重量の増加効果を示した[図9aおよびb]。[実施例14]持続型ヒト卵胞刺激ホルモンとCTP-フュージョンヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力について、Organon社で開発中のCTP-フュージョンヒト卵胞刺激ホルモン持続型製剤との比較試験を行うために、Organon社で行った次の効能試験法に従い、ヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験を行った。21日齢の未成熟雌ラットに3日間、持続性製剤を1.4又は2.8mcg/headヒト卵胞刺激ホルモン濃度基準で単回投与し、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンを2.8mcg/headの用量で単回投与した。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、両末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。ヒト性腺刺激ホルモンの併用投与は行わなかった。最初に試験物質を投与し、72時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。持続性製剤投与群は、ヒト卵胞刺激ホルモン投与群に比べて1/2用量投与群では38、同量投与群では68の卵巣重量の増加が確認された。本試験と同じ試験法を用いたCTP-フュージョンヒト卵胞刺激ホルモンのヒト卵胞刺激ホルモンの効力試験において、CTP-フュージョンヒト卵胞刺激ホルモン投与群は天然型ヒト卵胞刺激ホルモン投与群に比べて、同量投与では29の卵巣重量の増加を示す結果から表1、本発明のヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力がより優れるものと予測される図10。[実施例15]両反応基末端を有する重合体と三反応基末端を有する重合体を用いて作成されたヒト卵胞刺激ホルモンのインビボ効力試験の比較末端が2つ又は3つである異なる非ペプチド性重合体を用いて製造された各ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤のインビボ効力を比較するために、未成熟雌ラットを用いて卵巣重量の増加を確認した。21日齢の未成熟雌ラットに3日間、両末端を有する重合体で製造された、又は三末端を有する非ペプチド性重合体を用いて製造されたヒト卵胞刺激ホルモンを0.3、0.075又は0.018mcg/headヒト卵胞刺激ホルモン濃度基準で単回投与した。3日間の試験期間中、ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の投与と同時に、ヒト性腺刺激ホルモンを13.3IU/headの用量で毎日並行投与した。最初に試験物質を投与し、72時間経過後に試験動物を安楽死させ、卵巣を摘出して重量を測定した。単回投与された2種類の持続性製剤はどちらも濃度依存的な卵巣重量の増加効果を示し、投与物質間、投与濃度群間の卵巣重量の増加に差は認められなかった。上記結果からヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の製造における両末端又は三末端を有する非ペプチド性重合体の差異に伴う効力差はないことが確認された図11。[実施例16]持続型ヒト卵胞刺激ホルモン製剤のインビボ薬物動態確認試験ヒト卵胞刺激ホルモン持続性製剤の生体内持続性を確認するために、未成熟雌ラットを用いて薬物動態を確認した。21日齢の未成熟雌ラットに天然型又は持続型ヒト卵胞刺激ホルモンを80g/kgヒト卵胞刺激ホルモン基準を単回皮下投与し、その後酵素免疫測定キットを用いて時間による血中濃度の変化を測定し、測定された濃度値からWinnolin5.2ソフトウェアを用いて薬物動態パラメータを算出した表2。ここで、用いられたヒト卵胞刺激ホルモンは、三末端を有する非ペプチド性重合体で連結された持続性製剤であった。ヒト卵胞刺激ホルモンの半減期は85.6時間であり、天然型ヒト卵胞刺激ホルモンに比べて約10倍長い持続性を示すことが確認された図12。[実施例17]卵胞刺激ホルモン-3.4KPEG-免疫グロブリンFc結合体の結合部位の確認卵胞刺激ホルモンと3.4KPEG-免疫グロブリンFcの結合部位を確認するために、HPLC逆相クロマトグラフィーを用いた。濃度1mg/mlの卵胞刺激ホルモン20μgを低いpHで逆相クロマトグラフィーにかけ、その結果アルファサブユニットとベータサブユニットが分離したことを確認した。同一条件で卵胞刺激ホルモン-3.4KPEG-免疫グロブリンFc結合体を逆相クロマトグラフィーにかけた結果、3.4KPEG-免疫グロブリンFcが結合していないアルファサブユニット、ベータサブユニットと3.4KPEG-免疫グロブリンFcが結合したサブユニットが分離した。その結果、卵胞刺激ホルモン-3.4KPEG-免疫グロブリンFc結合体の場合、濾胞刺激ホルモンに比べてベータサブユニットのピークが著しく減少したことが確認された図14。215nmの波長のインテグレーションを基準にベータサブユニットの80、アルファサブユニットの20が3.4KPEG-免疫グロブリンFcに結合したことが確認された。"