"対象における循環器病を診断する方法であって、a前記対象から生体試料を得ることおよびb前記対象から得られた前記生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含み、シトルリン化タンパク質のレベルが循環器病を示している方法。前記シトルリン化タンパク質が、前記シトルリン化タンパク質の対照量と比べて上昇している、請求項1に記載の方法。前記生体試料が、血液、血漿、血清および組織生検からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記組織生検が心筋組織である、請求項2に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、アルギニン残基からシトルリンへの翻訳後変換を含む、請求項1に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、ミオシン重鎖、ミオシン結合タンパク質C、トロポミオシンα1、トロポミオシンα3、アクチン、タイチン、リポタンパク質リパーゼ、L-乳酸デヒドロゲナーゼB鎖、アルファ-1-抗キモトリプシン、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質10、ジンクフィンガーZZ型およびEF-ハンドドメイン含有タンパク質1からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33および配列番号34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質の存在が、質量分析、高分解能質量分析、タンデム質量分析、結合アッセイ、免疫アッセイ、抗体結合または免疫組織化学を使用して検出される、請求項1に記載の方法。対象におけるシトルリン化タンパク質に対する自己免疫に対する感受性を診断する方法であって、a前記対象から生体試料を得ることおよびb前記対象から得られた前記生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含み、シトルリン化タンパク質のレベルが循環器病を示している方法。前記シトルリン化タンパク質が、前記シトルリン化タンパク質の対照量と比べて上昇している、請求項10に記載の方法。前記生体試料が、血液、血漿、血清および組織生検からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。前記組織生検が心筋組織である、請求項12に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、アルギニン残基からシトルリンへの変換を含む、請求項10に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、ミオシン重鎖、ミオシン結合タンパク質C、トロポミオシンα1、トロポミオシンα3、アクチン、タイチン、リポタンパク質リパーゼ、L-乳酸デヒドロゲナーゼB鎖、アルファ-1-抗キモトリプシン、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質10、ジンクフィンガーZZ型およびEF-ハンドドメイン含有タンパク質1からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質が、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33および配列番号34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の方法。前記シトルリン化タンパク質の存在が、質量分析、高分解能質量分析、タンデム質量分析、結合アッセイ、免疫アッセイ、抗体結合または免疫組織化学を使用して検出される、請求項10に記載の方法。PAD活性の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することにより、ペプチジルアルギニンデイミナーゼアイソフォーム1PAD1、アイソフォーム2PAD2および/またはアイソフォーム4PAD4の活性を調節する方法。前記阻害剤が、F-アミジン[N-α-ベンゾイル-N5-2-フルオロ-1-イミノエチル-1-オルニチンアミド]、2-クロロアセトアミジンおよびCl-アミジン[N-α-ベンゾイル-N5-2-クロロ-1-イミノエチル-1-オルニチンアミド]からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。[実施例]組織試料:ヒト左心室LV経壁組織試料は、末期ISHD、IDCMおよび非不全ドナー心臓を有する患者から得られた。これらの非特定化組織保存試料由来の組織は心停止液中に収集され、液体窒素中で保存された。試料は、Dr.CrisDosRemoidois、UniversityofSidney、Australiaにより我々に提供された。本研究ではサブセットが解析される表2。心臓組織の細分画:その方法により、異なるpHでの可溶性に基づいて3つの分画:1細胞質濃縮された抽出物中性pH、2筋フィラメント濃縮された抽出物酸性pHおよび3膜タンパク質濃縮されたペレットが生じる。このような方法での心臓組織の分画は徹底的なプロテオーム解析の基礎を提供するKaneetal.、CardiovascularProteomics2007年、357:87~90頁。質量分析によるタンパク質シトルリン化の標的解析:MSは、タンパク質およびペプチドに対するPTMの解析のための最適の方法になっている。しかし、PTMは典型的には、異種の複雑なタンパク質混合物中に比較的少量で存在する。具体的には、シトルリン化の場合、その同定は、アルギニンからシトルリンへの変換に起因する質量シフトがわずかである1Daという事実のために複雑であり、低分解能MS計測手段を使用してシトルリン化を同定するのは困難になっている。この難問を克服するために、我々はLTQOrbitrap高分解能MSを使用したStenslandetal.、RapidCommunMassSpectrom2009年、23:2754~2762頁。その上、この誘導体化戦略はシトルリン残基に±239Daの特定の質量タグ図1Aを付加するので、修飾部位を確信的に同定することができる。我々の最近の調査によれば、この戦略を使用することにより、異種混合物、たとえば、ウシ血清アルブミンBSAのトリプシン消化物からシトルリン化ペプチドを同定することができることが明らかになっている図1B。二次元ゲル電気泳動:二次元ゲル電気泳動2DEは、一次元における固定化pH勾配18cmストライプGEHealthcare、Buckinghamshire、UK、pH範囲4~7で実施された。試料は、4w/vCHAPS、7M尿素、2Mチオ尿素、10mMTris-HCl、pH8.3および1mMEDTAを含有する2-DE溶解バッファー中に再懸濁された。2D-DIGEを実施する前に、タンパク質試料はシアニン色素Cy2、Cy3およびCy5のN-ヒドロキシサクシニミジルエステル誘導体で標識された。手短に言えば、150μgのタンパク質試料は、同一2-DE上での比較のために375pmolのCy3またはCy5のいずれかで最小限に標識された。画像マッチングおよびクロスゲル統計比較を促進するために、すべての試料のプールも調製され、すべてのゲルについての内部標準として1μgのタンパク質あたり2.5pmolCy2のモル比のCy2で標識された。このようにして、3通りの試料および内部標準を流し複数の2-DE上で定量化することができた。標識化反応は暗所において氷上で30分間実施され、次に20倍モル比過剰なフリーL-リジンで10分間クエンチされた。次に、差次的にCy3-およびCy5標識された試料はCy2-標識内部標準と混合され、ジチオスレイトールで30分間還元された。IPGバッファー、pH4~7非線形2v/v、GEHealthcareが添加され、最終容積は再水和のために2D-溶解バッファーで350μlに調整された。固定化pH勾配IPGストライプ18cmpH4~7直線勾配は50Vで12時間、試料350μLのIEFバッファー中150μgのタンパク質と活発に再水和され、続いて250、500および1000Vでそれぞれ1時間、次に20°C、45kVhで10000Vからなる急速電圧ランピングが行われた。等電点電気泳動は20°Cで合計62.5kV-hで実施された。ストライプは、6M尿素、30v/vグリセリン、4SDSw/v、100mMTris-HClpH8.8、65mMジチオスレイトール中で20分間、次に240mMヨードアセトアミドを含有する同一バッファー中でさらに20分間平衡化された。平衡化されたIPGストライプは20×20cm10ポリアクリルアミドゲル上に移された。ゲルは、2n-モルフォリノエタンスルホン酸MESランニングバッファーを用いてProtean登録商標IIXLシステムBio-Rad上、90Vで一晩流された。続いて、ゲルはTyphoon可変モード撮像装置9210GEHealthcareを使用してスキャンされた。CyDye染色により可視になる大部分のスポットは通常、Shevchenkoetal.AnalChem1996年、68:850~858頁のプロトコールに従えば、銀染色により可視になる。ゲル内消化およびペプチド抽出:ゲル染色が完了すると、個々のバンドはゲルから切り取られた。ゲル内消化およびペプチド抽出は、以前の改良プロトコールを使用して達成されたZhangetal.、JProteomeRes2007年、6:2295~2303頁。手短に言えば、cTnIバンドは切り取られ、1mm3片に切断され、50アセトニトリル/25mM炭酸水素アンモニウムを用いて15分間振盪しながら3回洗浄された。ゲル片は25mM炭酸水素アンモニウム10mMジチオスレイトールと一緒に55°Cで60分間インキュベートされ、アセトニトリルACNで洗浄され、次に20mM炭酸水素アンモニウム55mMヨードアセトアミド作り立てと一緒に暗所で30分間インキュベートされた。ゲル片はアセトニトリルで洗浄され、風乾され、25mM炭酸水素アンモニウム中で12.5ng/μLトリプシンPromega、シークエンシング等級、Madison、WIを用いて再水和され、次に37°Cで18時間または一晩インキュベートされた。その液体は清潔なチューブに移された。ペプチドは、25°Cで20分間50ACN0.1TFAを使用し、続いて20分間の振盪、1分間の遠心分離および前段階由来の液体を用いた2度の抽出を組み合わせて、二度抽出された。免疫ブロッティング解析:タンパク質試料はLaemmliバッファー50mMTrisHCl、pH6.8、2SDS、10グリセリン、ブロモフェノールブルーに、5β-メルカプトエタノールと一緒に溶解され95°Cで5分間インキュベートされた。試料は10TrisHClポリアクリルアミドゲルBiorad、Hercules、CA、USA上に充填され、電気泳動は150Vを70分間印加することにより実施された。SDS-PAGE後、マウス由来の分離されたタンパク質はニトロセルロース膜Millipore、USAにブロットされた。転写は、電気泳動転写用のセルにおいて60分間、100Vの定電圧設定で、25mMTris、192mMグリシンおよび10容積分率のメタノール、pH=8.3を含有するバッファー中で実施された。ニトロセルロースブロット上のシトルリン化タンパク質の存在は、製造業者のプロトコールに従って、抗修飾シトルリンAMC検出キットUpstate、Charlottesville、VA、USAを使用して検出された。insituでのシトルリン化タンパク質の検出:シトルリン化タンパク質の免疫染色は、抗修飾シトルリンIgGポリクローナル抗体を使用することにより実施された。手短に言えば、シトルリン化染色のためのスライドは、37°Cで3時間、アンチピリンおよび2,3-ブタンジオンを含有する強酸液中で改変された。内在性ペルオキシダーゼ活性は、メタノール中0.3H2O2中での18分間のインキュベーションにより遮断された。非特異的タンパク質活性は、非血清タンパク質溶液DAKOCorporation、Carpinteria、CAと一緒のインキュベーションにより遮断された。シトルリン染色についての点数化も、最小、中程度および顕著なシトルリン化染色に従って5ポイントスケール0.5増加で1~3を使用して盲検で実施された。結果:我々のデータは、シトルリン化が心筋で起こることを示している。我々は健康様疾患試料においてシトルリン化タンパク質を検出した。同様に、それぞれの不活性なexanimate画分において修飾されたタンパク質を見出した。興味深いことに、アクチンとの周期的歯止め様相互作用を通じて筋節短縮を推進する分子モーターであるミオシンおよびトロポミオシンにおいて少数のシトルリン化残基を見出した。したがって、心筋タンパク質がシトルリン化されると心不全において心機能に影響を及ぼすことができると思われる。タンデム質量分析によるタンパク質シトルリン化のinvivo標的解析:我々は、タンデムMS/MSによるシトルリン含有ペプチドの特定の検出および同定のために2,3-ブタンジオンおよびアンチピリン修飾を調べた。適用された条件下では、2,3-ブタンジオン/アンチピリンによる修飾はシトルリンに絶対的に特異的である。この条件下では、ヒト心筋の未処理細胞成分画分においていくつかのタンパク質を同定することができた表1Aおよび1B。興味深いことに、いくつかの修飾された部位は対照と比べてHFにより特異的であると思われる図1。シトルリン化はヒト心臓組織において起こる:我々の仮説を支持するために、シトルリン化タンパク質の存在についてヒト心臓組織を調査した。シトルリン化タンパク質に対する市販の抗体抗シトルリン修飾検出キット、Milliporeを使用して、シトルリン化タンパク質がヒト心臓組織に存在することを確証した図2a。さらに、我々は免疫組織化学を使用して心臓組織においてシトルリン化の位置を突き止める図2b。図2aに示されるように、2個の主要タンパク質、ミオシンおよびアクチンは比較された群内では異なる作用をする。HF組織では、対照と比べてミオシン重鎖シトルリン化の有意な増加が見られた。一方、アクチンはミオシンとは反対のパターンを示した。さらに、対照心臓組織のIHC染色により、ヒト心臓組織におけるシトルリン化タンパク質の存在が証明された。DIGEおよび質量分析:9個のゲルのDIGE画像により変動スポットの位置確認が可能になった。CyDyes染色により検出されるスポットは切り取られ、同定に供された。全体で、9個のゲル上で最大25個の異なるスポットが検出された。OrbitrapLTQを使用して、それぞれのスポットのゲル内消化後にペプチドを解析した。全体で25個のタンパク質スポットのうち、7個のスポットのみが同定に成功した。表4は同定されたタンパク質を示している。"