"iガストリン17G17のN末端の、アミノ酸配列pEGPWLE配列番号5内のエピトープ、iiガストリン17G17及びガストリン34G34のC末端の、アミノ酸配列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2配列番号6内のエピトープ、iiiヒトガストリン34G34のN末端の、アミノ酸配列pELGPQG配列番号7内のエピトープ、又は、ivグリシン伸長ガストリン17G17-Gly及びグリシン伸長ガストリン34G34-GlyのC末端の、アミノ酸配列YGWMDFG配列番号8内のエピトープ、において、ガストリンホルモン型に選択的に結合するモノクローナル抗体。400-1ATCCアクセッション番号PTA-5889、ハイブリドーマ400-2ATCCアクセッション番号PTA-5890、ハイブリドーマ400-3ATCCアクセッション番号PTA-5891、及びハイブリドーマ400-4ATCCアクセッション番号PTA-5892、からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマ458-1ATCCアクセッション番号PTA-5896によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマ401-2ATCCアクセッション番号PTA-5893によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。ハイブリドーマ445-1ATCCアクセッション番号PTA-5894及び445-2ATCCアクセッション番号PTA-5895のいずれかによって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。ヒト化されている、請求項1~5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。iアミノ酸配列pEGPWLE配列番号5内のエピトープで、ガストリン17G17のN末端に選択的に結合する抗体、iiアミノ酸配列KKEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2配列番号6内のエピトープで、ガストリン17G17又はガストリン34G34のC末端に選択的に結合する抗体、iiiアミノ酸配列pELGPQG配列番号7内のエピトープで、ヒトガストリン34のN末端G34に選択的に結合する抗体、及び/又は、ivアミノ酸配列YGWMDFG配列番号8内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン17G17-Gly及びグリシン伸長ガストリン34G34-GlyのC末端に選択的に結合する抗体、のいずれか2つ以上の抗体を含むモノクローナル抗体パネル。ハイブリドーマ400-1ATCCアクセッション番号PTA-5889、ハイブリドーマ400-2ATCCアクセッション番号PTA-5890、ハイブリドーマ400-3ATCCアクセッション番号PTA-5891、又はハイブリドーマ400-4ATCCアクセッション番号PTA-5892の特性を有する、請求項2に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。401-2ATCCアクセッション番号PTA-5893の特性を有する、請求項3に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。445-1ATCCアクセッション番号PTA-5894又はハイブリドーマ445-2ATCCアクセッション番号PTA-5895の特性を有する、請求項4に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。458-1ATCCアクセッション番号PTA-5896の特性を有する、請求項2に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。請求項1~6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。ガストリン介在性の疾患又は状態の予防又は治療に適した薬剤を調製するための、請求項1~6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の使用。患者におけるガストリン介在性の疾患又は状態を診断する方法であって、患者から得た生体液の試料中のガストリンホルモン型のレベルを測定するステップと、前記試料中のガストリンホルモン型のレベルを、健常個体グループから得た生体液の試料中の前記ガストリンホルモン型の正常レベルと比較するステップと、を含む方法。患者におけるガストリン介在性の疾患又は状態の経過をモニターする方法であって、ガストリン介在性の疾患又は状態に罹患しているか、又はその危険がある患者から得た生体液の試料中のガストリンホルモン型のレベルを、第1の時点で測定するステップと、患者から得た生体液の1つ又は複数の試料中の前記ガストリンホルモン型のレベルを、異なる時点で測定するステップと、それによって、ガストリン介在性の疾患又は状態の経過をモニターするステップと、を含む方法。イムノアッセイを実施するためのキットであって、400-1、400-2、400-3、400-4、401-2、445-1、445-2、及び458-1、からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の特性を有するモノクローナル抗体と、適当な容器と、を含むキット。ガストリンホルモン介在性の疾患又は状態に罹患している患者のガストリンホルモン遮断治療を評価する方法であって、a治療の前又は初期に、患者から生体液の第1の試料を得るステップと、b第1の試料中のガストリンホルモンのレベルを、イムノアッセイ法によって測定するステップと、c治療対象の疾患又は状態、及び第1の試料中のガストリンホルモンのレベルに基づいて診断を行うステップと、dガストリンホルモンに結合して、invivoでガストリンホルモンの標的受容体との結合を調節する第1の薬剤、又は第1の薬剤を生成する物質、を含む治療を患者に実施するステップと、e治療の効果が生じると考えられる適当な時間の後、患者から生体液の第2の試料を得るステップと、f第2の試料の第1のアリコート中の結合及び遊離ガストリンホルモンを含む全ガストリンホルモンのレベルをイムノアッセイによって測定するステップであって、第2の試料の第1のアリコートを、i第1の薬剤が結合したいかなるガストリンホルモンとも置換する第2の薬剤、及びii第2の薬剤に結合しない固定化抗ガストリンホルモン抗体、と共にインキュベートし、第2の薬剤を洗浄除去し、ガストリンホルモンには結合するが、前記固定化抗体とは競合しない検出可能抗体を添加し、ガストリンホルモンに結合した固定化抗体を含み、当該ガストリンホルモンが検出可能抗体と結合している免疫複合体を形成させるステップと、g免疫複合体中の検出可能抗体の量を検出し、それによって、第2の試料中の全ガストリンホルモンの量を測定するステップと、h第2の試料の第2のアリコートを用いて、ステップf及びgを反復することによって、遊離ガストリンホルモンのレベルを測定するステップであって、ステップfにおけるインキュベーションを第2の薬剤なしで行うステップと、j第1の試料中の遊離ガストリンホルモンの測定量を、第2の試料中の遊離ガストリンホルモン及び全ガストリンホルモンの量と比較して、患者のガストリンホルモン遮断治療の有効性を判定するステップと、を含む方法。生体液が血清である、請求項17に記載の方法。第1の薬剤が、G17のN末端に対する抗体、又はG17受容体模倣体であり、第2の薬剤がG17N末端ペプチドである、請求項17に記載の方法。固定化抗ガストリンホルモン抗体若しくは検出可能抗体、又はそれらの両方がモノクローナル抗体である、請求項17に記載の方法。i固定化抗ガストリンホルモン抗体がG17のC末端に結合し、検出可能抗体がG17のN末端に結合すること、ii第1の薬剤がG34のN末端に対する抗体であり、第2の薬剤がG34N末端ペプチドであること、iii固定化抗体がG17又はG34のC末端に結合すること、iv検出可能抗体がG34のN末端に結合すること、v第1の薬剤が、G17-GlyのN末端に対する抗体、又はG17-Gly受容体模倣体であり、第2の薬剤がG17N末端ペプチドであること、vi検出可能抗体がG17-GlyのN末端に結合すること、vii第1の薬剤がG34-GlyのC末端に対する抗体であり、第2の薬剤がG34N末端ペプチドであること、及び、viii検出可能抗体がG34-GlyのN末端に結合すること、のいずれか1つ又は複数の特徴を有する、請求項17に記載の方法。[0067]実施例1:ヒトG17のC末端に対するモノクローナル抗体の産生[0068]CSSEEAYGWMDF-NH2配列番号10と、リンカースペーサである-Cys-Ser-Ser-配列と、それに続く、ヒトG17及びG34のC末端エピトープを含有するアミノ酸配列-EEAYGWMDF-NH2、配列番号6と、を含有するペプチドは、標準的な固相ペプチド合成法によって合成されたものを購入した。[0069]このペプチドを免疫原に組み込み、G17/G34のC末端に対する抗体を、以下の通りにして誘導した。最初に、このペプチドを、ジフテリアトキソイドDTに、共有結合によって連結させ、ペプチド-担体結合を産生させた。各DT担体上に置換されたペプチド単位の数を測定し、最後に、この結合体を免疫原として処方した。使用した方法は、米国特許第5622702号明細書に記載の通りであった。[0070]簡潔には、担体へのペプチドの化学結合は、ヘテロ二官能性架橋物質であるε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシサクシニミドε-MCSを用いて行った。この結合体を、0.1Mナトリウムリン酸緩衝生理食塩水、pH7.3PBSに対する透析によって精製し、ローリー法のアッセイによってタンパク質濃度を測定した。DT上でのペプチドの置換レベルは、結合体のアミノ酸分析によってモル量で測定した。その後、溶解させた結合体は、結合体溶液をMontanideISA703PIC社製、仏国オイルと30/70の比率結合体/アジュバントのwt/wt比で混合することによって、MontanideISA703をアジュバントとした免疫原として処方した。混合は、適当な容積の各々の液体を注射器に引き込み、次に、連結ハブを通して、第2の注射器との間で溶液を前後に迅速に通過させることによって行った。[0071]マウスの免疫は、最初に、容積0.1mL中の0.1mgのペプチドDT結合体免疫原/MoxtanideISA703をi.p.注射して行った。最初の注射の3週間後に、同一の用量で第2の注射を投与した。[0072]G17/G34のC末端に選択的なMAbを産生するハイブリドーマを作製するために、当業者に周知の標準的な方法によって、免疫化されたマウスから得た脾細胞を、標準的なマウス骨髄腫融合パートナー細胞株に融合させた。これらの方法は、多数の総説及び実験ハンドブックに記載されている。例えば、Kaprowskiらに交付された米国特許第4196265号明細書Methodofproducingantibodies;SelectedMethodsinCellularImmunologyChapter17:ImmunoglobulinProducingHybridCellLinesB.Mishell及びS.Shiigi、W.H.FreemanandCo.社、SanFrancisco、1980年;Harlowe及びLane、Antibodies;ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress社、1988年;Zola、MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques、CRCPress,Inc.社、BocaRaton,FL、1987年を参照されたい。免疫化されたマウスの追加免疫を、それらの脾細胞を細胞融合用に採集する4日前に、上述したペプチド-DT結合体0.1mgのPBS溶液をi.p.注射することによって行った。ハイブリッド細胞の初期選択は、Mishell及びShiigiの文献に記載の通り、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン補充培地を用いて行った。この融合体をF458と名付けた。[0073]G17のC末端に対するMAbを産生するハイブリドーマを単離するための最初の選択ステップは、標的ペプチドに対する抗体産生と、ハイブリッド細胞株の安定性とに関する細胞の選択を含むものであった。抗体を産生する細胞の選択は、G17/34のC末端に対する抗体のための単一クローンを含有する組織培養ウェルから得られた細胞培地をスクリーニングすることによって実施した。スクリーニングは、リシン-16でシステインを介して、免疫担体であるウシ血清アルブミンBSAに連結された、アミド化された合成ペプチドG34のアミノ酸16~34-NH2を含む結合体を標的抗原として用いたELISAによって実施した。適当なELISA法は当業者に知られており、そのうちのいくつかの例は、下記に詳細に説明する。安定した細胞株は、ELISA試験で、hG3416~34NH2-BSA結合体に結合する抗体を産生した各ハイブリッドを2回クローニングすることによって取得した。これらの方法によって、G17及びG34に共通のC末端に対するMAbを産生する15株のハイブリッド細胞株を取得した。[0074]実施例2:全結合プラス遊離G17の免疫酵素アッセイで優れた性能を示すモノクローナル抗体の選択[0075]抗ガストリン抗体を含有する可能性のある、ヒト血漿等の生体液試料中のG17の総量を測定する方法が開発されており、2004年3月29日出願の米国特許出願第10/813336号明細書に記載されている。簡潔には、この方法は、生体液試験試料中に存在して、同様に試験試料中に存在する可能性のあるG17N末端エピトープ特異的抗体に、N末端エピトープを介して結合している可能性のあるいかなるガストリンホルモンとも置換するように、ヒトG17のアミノ酸1~8を含有するペプチドヒトG171~8置換ペプチドの過剰量を、この生体液試験試料中に添加するステップを含む。一定の時間インキュベーションした後で、置換用のペプチドを含有する試料混合物を、G17のC末端に対して産生された捕獲抗体でコーティングされた96ウェルのELISAプレートに添加する。インキュベーションの後で、プレートを洗浄して、置換用のペプチドを除去し、それに続いて、G17のN末端エピトープに結合する酵素結合抗体を添加することによって、結合しているG17を検出及び定量化する。結合しなかった酵素結合抗体を除去するのに、別の一連の洗浄ステップが必要であり、抗体に連結された酵素の作用によって検出可能な産物を産生する発色基質又は他の基質を添加することによって、検出可能なシグナルを発生させる。例えば、酵素が西洋わさびペルオキシダーゼHRPである場合には、基質はテトラメチルベンジジンスルホナートTMBSである。アルカリホスファターゼが、検出に使用された酵素である場合には、有色化合物p-ニトロフェノールを産生する発色基質として、p-ニトロフェノールリン酸を使用することができる。発色の程度は、吸光度単位AU、p-ニトロフェノールの場合は405nm、また、TNBSの場合には450nmで測定するで測定し、これは、試験試料中に存在するG17の量を示し、実際の濃度は、試験試料の吸光度を測定して、既知の濃度のG17を用いて作成された検量線と対照させることによって決定する。[0076]ヒト患者からの血漿試料を用いて、このアッセイで予備試験を行った。この血漿試料に所定の濃度のG17を添加し、G17のC末端エピトープに対するポリクローナルウサギ抗体を、試験プレートのウェルにコーティングされた捕獲抗体として用いてイムノアッセイを行った。これらのアッセイから得られた結果及びデータは、一貫性が乏しく、許容されるレベルの感度を与えなかった。従って、試験プレートをコーティングするのに、C末端に選択的なMAbを使用し、このアッセイにおける捕獲抗体として試験した。[0077]融合体458から得たC末端G17選択的なMAbの各々を全G17アッセイで試験するために、G17のC末端に対する15株の個々のMAbを、最初にプロテインG親和性クロマトグラフィーで精製した。これは、市販キットHiTrapProteinGHP、1mL、AmershamBiosciences社を、製造業者の指示に従って使用することによって行った。その後、各MAbの濃度を、波長280nmの吸光度A280から決定した。濃度を得るために、A280を濃度係数1.4mL/mgで割った。濃度が0.1~1.0mg/mLの範囲になるように調整した。その後、G17のC末端へのMAbの結合を質的に確認するために、各溶液をELISAで再試験した無希釈。[0078]次に、15株のMab、1株の陰性対照MAb、及び精製されたMabの3種類の混合物を、上述の通りヒトG171~8置換ペプチドを用いて、全G17の免疫酵素アッセイでの性能を求めるために試験した。各MAbを、アッセイコーティング緩衝液1バイアルのConvolpH8.0濃縮緩衝溶液BDH社、製品番号180521Uを2.5Lの水に添加し、アジ化ナトリウム2.5gを添加して溶解させるで最終濃度10μg/mLに希釈し、その後、全G17を測定する方法で上述した通り、96ウェルのELISAプレートのウェルをコーティングするのに用いたウェルあたり0.1mLを添加した。[0079]終夜、室温でインキュベートして、存在するG17を内因性の血清プロテアーゼで完全に消化させることによって天然のG17が枯渇している血清試料に、既知濃度のG17のアリコートを添加した。G17の既知濃度の標準溶液を調製するために、このG17添加された血清の希釈液を調製した。標準溶液中のG17濃度は、0、4.1、64、及び800pMであった。その後、G17のN末端を含むヒトG171~8置換ペプチドを添加して、これらの試料をアッセイでの試験試料として取り扱った。その後、G17のC末端に選択的な個々のMAbの調製物でコーティングされたプレートウェルに、各G17溶液を添加し、上述した操作法に従って全G17アッセイを行った。[0080]これらのアッセイの結果を表1に示す。結果は、試験プレートのウェルに捕捉MAbとしてコーティングされた15株のモノクローナル抗体の各々を用いたアッセイにおける、各濃度のG17によって得られたA280吸光度度単位で示されている。[0082]アッセイにおける各MAbの性能を試験した結果に基づいて、最適なMAbを選択した。単離されたMAbを比較するのに使用された規準には、以下のものが含まれていた。すなわち、10.0pMのG17が添加された際の吸光度の値が低いことベースライン値、好ましくは≦0.1AU、24.1pMのG17を添加した際の吸光度がベースラインの倍あること、3アッセイの主要な動作範囲である、4.1pMのG17と、64pMのG17との間で、AUの増大勾配が最も急であること、そして4G17濃度800pMでAUの値が最も高いことである。[0083]これらの規準に基づいて、最も性能の良かったMAbは、F458-3-8G1H3Cであった。この抗体の名称をMAb458-1に改め、G17のC末端に選択的に結合する最適なMAbとして、これ以降のアッセイで使用した。これらの規準及び同様のアッセイは、下記に例示する、ガストリンホルモン型G17、G34、G17-Gly、及びG34-Glyの末端のエピトープに対して産生されたMAbの選択にも適用した。[0084]結合しているホルモンと置換する、適切なアミノ酸配列の置換ペプチドの使用を、他のガストリンホルモンペプチド型のアッセイに組み入れることによって、試料中の遊離ホルモンの量と、全ホルモン結合ホルモン遊離ホルモンの量との両方の測定を行うことができる。置換ペプチドの使用は、当該ペプチドが結合する領域のアミノ酸配列が利用可能ないかなるペプチドホルモンの総量のアッセイにも適用することができる。[0085]実施例3:ヒトG34のN末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定[0086]G34のアミノ末端に対するMAbを産生するハイブリドーマを、G17及びG34のC末端に対するMAbの産生に関する実施例1に記載の通りに作製した。但し、G34のN末端に存在するエピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、G34のN末端エピトープに特異的なMabを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。G34のN末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、pELGPQGRPPPPC配列番号12というペプチドをDTに結合して、免疫原を形成させた。G34のN末端エピトープに対するMabを同定するためのELISAで使用する標的抗原を形成させるために、このペプチドをBSAに同様に連結させた。この融合体にF401という番号を付けた。[0087]F401は、MAb401-2を産生した。G34への特異性は、抑制ELISAによって立証した。この抑制ELISAで、G34N末端のペプチド性免疫摸倣体immunomimic配列番号12へのMAb401-2の結合が、表2に示す通り、G34ペプチドのみによって抑制されることが示された。[0089]G17、G17-Gly、及びウマG17を含む他の型のガストリン、並びにCCK8非硫酸化及び陰性対照であるGnRHは、401-2Mabの結合を抑制しなかった表2に示した通り。[0090]実施例4:G17のN末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定[0091]G17のアミノ末端に対するMAbを産生するハイブリドーマを、G17及びG34のC末端に対するMAbの産生に関する実施例1に記載の通りに作製した。但し、G17のN末端に存在するエピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、G17のN末端エピトープに特異的なMabを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。G17のN末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、pEGPWLERPPPPC配列番号5というペプチドをDTに結合して、免疫原を形成させた。G17のN末端エピトープに対するMabを同定するためのELISAで使用する標的抗原を形成させるために、このペプチドをBSAに同様に連結させた。加えて、pEGPWLEEEEAAPPC配列番号16というペプチドをBSAに連結させて、G17のN末端エピトープに関するELISA標的抗原を作製した。この融合体にF400という番号を付けた。F400は、G17のN末端エピトープに対する4株のMAbを産生した。これらは、MAb番号を400-1から-4まで通して付けた。[0092]MAbは、標準的な方法によって、マウスの腹水液として産生した。試験での使用には、F400MAbの各々の腹水液を等容積で混合して、前記抗体のプールを形成させた。このプールの抗G17MAb力価を、ELISAによって測定した。それらを表3に示す。[0093]4株のF400MAbの各々の親和性を、抑制ラジオイムノアッセイのスキャッチャード解析によって測定した。この抑制ラジオイムノアッセイでは、当業者に知られている標準的なラジオイムノアッセイ法を用い、放射性ヨウ素化されたG17への各MAbの結合を、標識されていないG17で、その濃度を上昇させながら抑制した。MAb400-1~-4の各々の親和性Kaを表4に示す。G17のN末端エピトープへの特異性は、抑制ELISAによって立証した。この抑制ELISAでは、G17配列番号11のN末端のペプチド性免疫摸倣体への、MAb400-1から-4までの結合が、G17、G17-Gly、及びウマG17ペプチドによってのみに抑制され、一方、G34、並びにCCK8非硫酸化及び陰性対照であるGnRHは、400-1から-4までのMAbの結合を抑制しないことが示された表5に示す通り。[0094]抗G17MAbの特性決定[0098]実施例5:グリシン伸長G17/G34のC末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定[0099]G17-Glyのカルボキシ末端エピトープに対するMAbを産生するハイブリドーマを、G17及びG34のC末端に対するMAbの産生に関する実施例1に記載の通りに作製した。但し、G17-Glyのカルボキシ末端エピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、G17-Glyのカルボキシ末端エピトープに特異的なMAbを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。G17-Glyのカルボキシ末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、CPPPPSSYGWMDFG配列番号14というペプチドをDTに結合して、免疫原を形成させた。[0100]CGGSKKEGPWLEEEEEAYGWMDFG配列番号15というペプチドをBSAに連結させ、G17-Glyのカルボキシ末端エピトープに対するMabを同定するためのELISAで使用する標的抗原を形成させた。G17-Glyには結合するが、G17又はG34には結合しないMAbを選択するために、この融合体には、G17-Gly配列番号2ではMAbが抑制されるが、G17配列番号1では抑制されないことを実証する追加の選択ステップを用いた。この融合体にF445という番号を付けた。[0101]F445は、グリシン伸長G17に特異的な2株のMAbを産生した。これらには、MAb番号445-1及び445-2を付けた。これらのMAbを作製するのは特に困難であった。発明者らがそれに成功するまでに、約14回の融合を行う必要があった。通常、本明細書に記載の他のガストリンホルモン等、ペプチドホルモンに対するMAbを得るのには、1回の融合で十分である。[0102]G17-Glyへの特異性は、抑制ELISAによって立証した。この抑制ELISAでは、G17-GlyC末端エピトープ標的ペプチド配列番号14BSA結合体へのMAb445-1及び445-2の結合を、G17-Glyペプチド配列番号2及びCPPPPSSYGWMDFG配列番号14という免疫原ペプチドのみが抑制し、一方、G17、G34、及びウマG17を含む他の型のガストリン、並びにCCK8非硫酸化及び陰性対照であるGnRHは、445-1及び445-2MAbの結合を抑制しなかったことが示された表6に示す通り。[0105]実施例6:G34のC末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定[0106]ヒトG34及びG17は同一のC末端エピトープを有する。実施例1に記載の融合体番号F458で産生されたMAbは、G34及びG17両方のC末端エピトープに結合するMAbを産生した。この融合体で産生されたMAbに、458-1から-5までの通し番号を付けた。[0107]G17とG34とによって共有されているC末端エピトープへの、MAb458-1から-5までの特異性は、抑制ELISAによって立証した。この抑制ELISAでは、G17/34C末端エピトープ標的ペプチド配列番号11BSA結合体への、MAb458-1から-5の結合を、G17ペプチド配列番号1、G34ペプチド配列番号3、及びCCK8ペプチド配列番号13これもC末端エピトープを提示するのみが抑制し、一方、G17-Gly及びG171~9N末端を含む他の型のガストリン、並びに陰性対照であるGnRHは、458-1から-5までのMAbの結合を抑制しなかったことが示された表7に示す通り。[0109]実施例7:膵癌、胃癌、及び大腸癌の細胞に対するF400MAbのinvitroでの抗腫瘍細胞有効性の実証[0110]実施例4の図3に示した、G17のN末端に対するMAbのプールを、ヒト膵癌、胃癌、及び大腸癌から得られた腫瘍細胞株の増殖抑制能について試験した。これらのinvitro研究では、各臓器源から2株の細胞株を試験した。試験された6株の個々の腫瘍細胞株は、それ自身のG17ホルモンを産生することが知られていた。これは、オートクリン効果をもたらす可能性があり、G17に対する中和MAbが、それを抑制するかもしれない。[0111]細胞に対するinvitro試験用のF400MAb混合物を調製するために、セファロースSulfo-Link、Pierce社に、Sulfo-Linkキットと共に提供された方法によって連結された、G17配列番号12のN末端エピトープを提示するペプチドに対するクロマトグラフィーによって、抗体の親和性精製を行った。これらのMAbをPBSに対して透析し、それらの濃度を、A280測定によって決定した。[0112]細胞は、標準条件37°C、5CO2、加湿インキュベーター下で培養した。培地は、10v/v熱不活性化されたウシ胎仔血清FBS、Sigma社を含有する完全RPMI1640培地Gibco社からなるものであった。[0113]実験用の細胞を採取するために、準集密的な単層培養中の細胞を、0.025のエチレンジアミン四酢酸EDTA、Sigma社を用いて採取した。細胞を培地で洗浄し、1x105生存細胞/mLの密度で培地に再懸濁し、96ウェル培養プレート中に、0.1mL/ウェルでプレーティングした。終夜のインキュベーションの後、吸引によって培地を除去し、F400MAbの混合物又は正常なマウス免疫グロブリンNMIgのいずれか500μg/mLを含有する新たな培地で置換した。その後、更に48時間、細胞をインキュベートし、それに続いて、哺乳類細胞のinvitro培養における細胞増殖を評価するのに一般的に使用されているテトラゾリウムベースのMTTアッセイによって細胞増殖を評価した。各試験グループn=5について、MTTアッセイで得られた各ウェルの吸光度を平均した。その後、NMIgの存在下における増殖と比較して、F400MAbが細胞増殖を抑制したパーセントを計算した。[0114]これらの試験の結果を表8に示す。表8は、抗G17MAb混合物が、試験された各腫瘍細胞株の増殖を抑制したことを示す。抑制は、膵臓腫瘍細胞株の19.5から、胃細胞株の52.0にまで及んだ。[0115]従って、3種類の一般的な消化管の悪性腫瘍に由来する腫瘍に対して、本発明のMAbがinvitroで抗増殖性治療活性を有することが示された。[0117]実施例8:胃癌細胞に対するF400Mabのinvivoでの抗腫瘍有効性の実証[0118]G17のN末端に対するMAbのプールは、MAb400-1~-4の各々を含有する腹水液の等容積混合物を含有するものであるが、MGLVA1という、ヒト胃癌から得られた腫瘍細胞株の増殖を抑制するそれらの能力を試験した。MGLVA1細胞はそれら自身のG17ホルモンを産生することが知られており、これは、オートクリン効果をもたらす可能性があり、G17に対する中和MAbが、それを抑制するかもしれない。[0119]invivo試験用のF400MAb腹水液混合物を調製するために、それらの腹水液を56°Cで30分間加熱することによって、腹水液中の補体を枯渇させた。Sigma社から購入した、陰性対照の腹水液も同様に処理した。[0120]MGLVA1胃腫瘍細胞は、メスのヌードマウスで皮下腫瘍として増殖させた。腫瘍を試験マウスに移植するためには、腫瘍保持マウスから外科的に腫瘍を切除し、約1mm3の小片に切断した。その後、これらの断片を、研究で使用されるヌードマウスの側腹部に皮下移植し、腫瘍を生着させる。腫瘍部位を観察し、腫瘍成長をノギスで測定した。腫瘍の生着が観測されたときに、マウスを、試験MAbF400混合物で処置されるグループ、又は陰性対照の腹水で処置されるグループに無作為に振り分けた。この研究ではマウス12匹/グループであった。[0121]第1週には、0.2mLの腹水液F400混合物又は陰性対照を、週に2回、マウスの腹腔内に注入した。第1週の後には、注射容積を週2回0.1mLにまで減少させた。週に3回、腫瘍の測定を行った。この研究は27日間継続した。研究の最後に、マウスを屠殺し、腫瘍を切除して、重量を測定した。[0122]F400試験MAb混合物で処置されたマウスのMGLVA1胃癌腫瘍の平均重量は0.75gであった。一方、MGLVA1胃癌腫瘍を保有し、陰性対照の腹水液で処置されたマウスの腫瘍の平均重量は1.5gであった。従って、F400試験混合物の抗G17MAbは、胃癌細胞に対して強力な増殖阻害作用を示し、腫瘍の重量を50減少させた。[0123]実施例9:G17及びG34のC末端に対する抗体の力価を測定するためのELISA[0124]この解析法の目的は、試験血清中の抗hG17抗体の力価をELISAによって測定することである。簡潔には、本発明の抗hG17抗体ELISAは、hG171~9-AAPPC-BSA結合体配列番号16のリンカーを介してしてBSAに連結されたヒトガストリンホルモンペプチドのアミノ酸1~9によって提示されたhG17エピトープに対する抗体Ab、ポリクローナル又はモノクローナルのいずれかの特異的な結合に基づいている。[0125]最初のステップで、96ウェルELISAプレートのウェルに結合体を結合させた。遊離している結合体は、96ウェルプレート洗浄機を用いた洗浄ステップで除去した。その後、試験又は対照抗血清を添加した。試験血清中に存在する抗hG17Abは、抗原表面に存在するhG17ペプチドエピトープの存在によって結合体に結合した。その後、検出される抗hG17抗体に種特異的な抗IgGアルカリホスファターゼ試薬の添加によって、抗体を検出した。例えば、ウサギ抗hGH17抗体は、Ab検出試薬としてヤギ抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ結合体GAR-APを用いて検出する。GAR-APは、ウサギ抗hG17Abに結合する。続いて、抗Ig-AP結合体のAP部分が、基質から有色産物p-ニトロフェノールへの変換を触媒する。発色は、ELISAプレートリーダーでの405nmの吸光度として測定した。[0126]試験試料と同じ動物種から得た、プールされた抗hG17血清を含有する標準血清又は、指定された参照力価を有する抗hGI7MAbを含有する腹水液を陽性対照として用いた。試験試料と同じ動物種から得た血清、例えば、正常な血清、免疫前の血清等を陰性対照として用いた。[0127]直線領域における発色の程度は、標的抗原に結合した抗hG17Abの量に正比例していた。標準曲線を作成するために、陽性標準抗hG17血清の連続希釈に対する吸光度のプロットを用いた。その後、陽性標準物質の参照力価例えば、ウサギ抗hG17陽性標準物質の1:200000希釈と同じ吸光度を生じる希釈率から試験試料の抗hG17Ab力価を決定した。[0128]試薬溶液:この解析法で調製するように特定された試薬及び溶液の量は、便宜のためのみのものである。実際の量は、必要に応じて調節できる。1.0.02のNaN3を含有する炭酸緩衝液炭酸緩衝液:1.59gのNa2CO3と、2.93gのNaHCO3を約750mlの蒸留水中にマグネチックスターラで溶解させることによって作製する。4mlの5NaN3溶液を添加して、撹拌する。水を加えて1.0リットルに調整する。pHを測定する。pHは、9.6±0.2とすべきである必要に応じて、1.0MのNaOH又は1.0MのHClでpHを調整する。必要になるまで冷蔵庫で保存する。2.0.05のTween-20及び0.02のNaN3を含有するFTAPBSFTA/Tween:9.23gのFTAを約750mlの精製水中に溶解させる。0.5mlのTween-20と4mlの5NaN3を添加する。水を加えて1.000リットルに調整する。3.1BSAを含有するFTA/TweenBSA/FTA/Tween:10gのBSAを1000mlのFTA/Tweenに溶解させる。4.基質緩衝液:50mgのMgCl26H20を448mlの精製水に溶解させる。50mlのDEAと、2mlの5のNaN3と、を添加する。濃塩酸でpHを9.8に調整する。光から保護して室温で保存する。5.PBS、pH7.2:固体のFTAFTA赤血球凝集緩衝液FTABectonDickensonMicrobiologySystems社、Cockeysville,MDから調製することができる。[0129]ELISAの手順:抗原でのコーティング:炭酸緩衝液中に1μg/mlhG171~9-AAPPC-BSA結合体の溶液配列番号16のリンカーを介してBSAに連結されたヒトガストリンホルモンペプチドのアミノ酸1~9を調製する。各プレートのコーティングには、最小限5.2mlの抗原溶液が必要である。炭酸緩衝液で、1mg/ml結合体保存溶液の1:1000希釈を行うことによって、抗原溶液を調製する。プレートは、例えば、Microtiter登録商標イムノアッセイプレート、硬質スチレン例えば、Immulon登録商標2丸底96ウェルプレート、DynatechLaboratories,Inc.社、VA;平底96ウェルプレート、ポリスチレン:例えば、MicrowellPlates、Nunc社、VWR社販売等、ELISAアッセイに適したいかなるプレートでもよい。50μl/ウェルの抗原溶液を添加することによって、Immulon登録商標2丸底プレートを抗原でコーティングする。水分の消失を防止するために、プレートを湿室例えば、水分を含んだペーパータオルの入っている密閉容器に保存し、冷蔵庫2°~8°Cで終夜インキュベートする。[0130]血清希釈液の調製:陽性標準及び陰性対照、並びに試験血清の1/100.5系列希釈シリーズを、表9に示す通りに調製した。血清は、平底96ウェルプレート内のBSA/FTA/Tween溶液中に希釈した12チャンネルのマルチピペッターによって、最大12点の血清の同時希釈が可能となる。[0132]各血清の希釈液を、最小作業容積を200μlとするのに十分な容積調製した。血清力価に応じて、各血清の1/100希釈低力価血清用又は1/1000希釈高力価血清用に始まる希釈液を行Aに作製し、その後、系列希釈を各列の下側へ行Hまで進め表9を参照、合計8つの各試料の希釈液を産生させる。陰性対照の連続希釈は、1/100から始めて調製した。陽性標準血清及び事前採血/陰性対照血清の連続希釈試料は、各プレートで2つ組みで行った。[0133]プレートの洗浄:プレート洗浄機例えば、UltrawashPlus;又はDynaWasherIIDynatechLaboratories,Inc社,VA又は同等のものを用いて、コーティングされたプレートを、各々4回、FTA/トゥイーンで洗浄し、その後、残留溶液を除去するために、ペーパータオルの上にプレートを勢いよく押し付けた。[0134]抗体結合:下記の表10に示す通りに、試料プレート連続希釈を行った後、50μl/ウェルの希釈された血清を、抗原でコーティングされた丸底プレートにおける対応するウェルに移した。プレートを湿室内、室温で1時間インキュベートした。[0136]抗体検出試薬:抗Ig-アルカリホスファターゼ結合体の適当な希釈液をFTA/Tweenで調製した。アッセイではプレートあたり最小限5.2mlが必要であった。プレートは上述の通りに洗浄した。50μl/ウェルのGAR-AP溶液抗Ig-アルカリホスファターゼ結合体、例えば、ウサギ抗hG17抗体を試験するには、ヤギ抗ウサギIgGHL-アルカリホスファターゼAntibodiesInc.社、Davis,CAを、丸底プレートのすべてのウェルに添加し、湿室内、室温で、1時間インキュベートした。[0137]ウサギ以外の種から得られた血清中の抗hG17抗体を検出するには、試験用血清を産生した種に特異的な抗Ig-AP結合体を用いなければならない例えばヒト抗hG17抗体は、試薬の各ロットに関して確立した希釈で使用される抗ヒトIgG-AP試薬で検出されるであろう。陽性標準及び陰性対照血清は、試験血清と同じ種から得るべきである。[0138]基質溶液:p-NPP錠剤p-ニトロフェニルリン酸、PhosphataseSubstrateTablets,Sigma104p-NPPSigmaChemicalCo.社、St.Louis,MOとして販売を冷凍庫から取り出して、室温に暖まるまでおいた。使用する直前に、1錠のp-NPP錠剤を、5mlのDEA基質緩衝液室温に添加することによって、1mg/mlのp-NPP溶液を調製した。1枚のアッセイプレートには、基質溶液の各5ml分量で十分であった。基質溶液は、使用するまで暗所に保存した。[0139]基質の添加:プレートは上述の通りに洗浄した。列1に始まるすべてのウェルに、50μl/ウェルのp-NPP溶液を、8又は12チャンネルマルチピペッターを用いて同時に、行Aから始めて添加した。[0140]反応のモニタリング:参照力価に最も近い陽性標準物質希釈液の吸光度が、ELISAプレートリーダーの最大線形測定値の10~30に達したときに、基質溶液の発色は停止させた。参照力価に対応する希釈液が、リーダーの読み取り範囲の10~30に達したとき通常10~30分間の発色時間の後を判定するために、陽性標準物質の吸光度をモニターするのに、MRX自動プレートリーダー;若しくはMR580MicroELISA自動リーダーDynatechLaboratories,Inc.社、VA;又はこれらの等価物等のELISAプレートリーダーを用いた。ELISAリーダーは、p-ニトロフェノール用にA405nmで測定するように設定した。[0141]反応の停止:陽性標準物質における上述の通りに選択された希釈液の吸光度が、リーダーの線形範囲の10~30に達したときに、8又は12チャンネルのピペッターで、50μlの1.0MNaOHを各ウェルに添加することによって、反応を停止させた。NaOH溶液は、基質溶液を添加したのと同じ順序、かつ同じタイミングでウェルに添加した。試薬は、台上でプレートを慎重に振盪することによって、穏やかに混合した。[0142]吸光度の測定:プレート全体をELISAリーダーで測定した。[0143]データの分析:各血清の力価は、次の通りに決定した。陰性対照血清で得られた吸光度を、陽性標準物質及び試験血清における、対応する希釈液の吸光度から引いた。陽性標準物質及び陰性対照の各希釈液の平均を用いた。陽性標準物質を含む各血清について、片対数グラフ目盛における、横座標対数目盛の1/希釈に対して、吸光度を縦座標線形目盛にプロットした。希釈の逆数をプロットすることによって、力価をX軸上で直接的に読み取ることができた。時として、吸光度が、特定の血清の結合曲線から明確に離れている異常値ことがあったが、そのような値はその曲線から排除した。各血清の力価は、陽性標準物質の参照力価例えば、ウサギ抗hG17陽性標準物質の1:200000希釈によって生じるものと同じ吸光度を生じる希釈の逆数として決定される。データ分析の例を図1に示す。[0144]実施例10:抑制ELISAによる抗体特異性の測定[0145]ペプチド阻害ELISAにも、上記の実施例と同じ方法が行われたが、以下に記載の点が相違していた。[0146]抑制物質の調製:通常、適当な標的ホルモンペプチド、この場合はhG17を、1μmol/ml1000μMの作業用保存液として調製する。抑制連続希釈は、1:2から1:10までの希釈率で作業用保存液から調製し、プレートのレイアウトに応じて合計8つから12の希釈液を産生する。[0147]試料希釈の調製:50最大結合における抗体試料の希釈率を確定するために、抑制分析の前に、試料の力価測定シリーズを行う。次に、等容積のペプチド性抑制物質と、そして、抑制分析の対照として緩衝液と混合させるために、50結合濃度の2Xに試料を調製した。試料混合物を湿室内で約30分間インキュベートし、その後、コーティングされ、かつ洗浄されたELISAプレートに添加し、湿室内で、約1時間インキュベートした。[0148]パーセント結合は、抑制物質存在下の試料から得られた吸光度を、抑制物質非存在下で試料対照から得られた吸光度で割って、この値に100を掛けることによって、吸光度の測定値バックグランドの値が引かれているから決定した。最後に、パーセント抑制は、100から結合パーセントを引くことによって決定した。[0149]試験試料は、血清、細胞培養上清中のMAb、腹水液、又はアフィニティー精製抗体Abであってもよい。G17のアミノ末端以外の標的抗原に対するAbには、適切な標的ホルモン抗原及び抑制物質が使用される。陰性対照として、関連性のないペプチドが含まれているべきである。[0150]ELISA:データ分析[0151]上述のELISAで得られたデータの例を図1に示す。各希釈における正味の吸光度を得るために、平均の陽性標準物質及び試験血清の値から、平均の陰性対照血清の吸光度を引いた。正味の吸光度の値を力価に対してプロットしたこの例では、典型的な値を明らかにするために、陰性対照もプロットした。[0152]ガストリン17の安定性[0153]室温約22°Cにおけるガストリンの安定性を、上述の全ガストリンアッセイによって評価した。これは、15、100、及び600pMを既知のG17濃度とするように試料を調製した直後と、室温で机上に2時間置いた後とに全G17を測定することによって行った。結果を下記の表11に示す。それらは、各試料のG17濃度が実質的に減少していることを実証するものである。[0155]実施例11:HG17に対する抗血清の抑制ラジオイムノアッセイRIA-抗ヒトガストリン17hG17抗血清の抗原結合能ABCを測定するための血清力価測定及び抗原抑制RIA[0156]希釈緩衝液:1.リン酸緩衝食塩水、pH7.2PBS0.02アジ化ナトリウムNaN3。可溶性固形物の市販製剤であるFTA赤血球凝集緩衝液を蒸留水で溶解させて、PBSを産生することができる9.23g/lによってpH7.2±0.1の溶液が得られる。2.1ウシ血清アルブミンBSA及び0.02NaN3を含有するFTA。3.補充用子ウシ血清SCS;GIBCO社、50ml以下の分量で凍結保存。4.PEG、MW8000、25溶液に調製1リットルあたり250g、ゆっくりと溶解させる。4°Cで保存する。5.ヒトガストリン1715-LeuResearchPlus社、07-027-002;単回使用分量には、FTA/1BSA/アジ化物中に5~10μg/ml。-70°Cで保存。6.ヒトガストリン17-125INEN社。[0157]方法[0158]抑制RIAで試験する各抗血清の容積を確立するために、最初に、試験血清を量の異なる1組のhG17-125Iに対して力価測定を行った。その後、血清を抑制RIAによって試験し、スキャッチャード解析によって抗原結合能ABCを計算した。[0159]力価測定RIAプロトコル:1.陽性対照抗血清及びすべての試験抗血清について、アッセイされる各抗血清希釈液用に2つ組みのチューブを用意した。好ましくは、アッセイチューブにおける最終希釈が1:40~1:400000となるように、血清の5回の10倍希釈を行った。これは、1チューブあたり、10μlから0.001μlの範囲の抗血清が添加されたのと同等である。2.300μlの希釈緩衝液を2本のチューブに分注した。これらは試薬ブランクとして機能した。残りのチューブすべてに200μlの希釈緩衝液を添加した。3.希釈された抗血清100μlを2つ組みの血清チューブの各々に移した各希釈につき2X100μlが必要である。連続希釈には、移動の際の減失を考慮しても、30μlの抗血清から始めることで十分であった1:10希釈液300μlを産生する。4.非特異的な結合に関する対照として、少なくとも1希釈1:40、試験血清の最も低い希釈の陰性血清を含有させた。5.RIA緩衝液で約10000cpm/0.1mlに希釈された125I標識された抗原Ag。下記の希釈手順を参照のこと。6.すべてのチューブに標識されたガストリン100μlを添加した。添加された総カウント数を確認するために、標識されたhG17100μlを10本のシンチレーションバイアル又はγ線計数器チューブに添加した。7.チューブの内容物を振盪又はボルテックスによって混合し、パラフィルムで覆った。8.チューブを終夜、約18時間、4°Cでインキュベートした。これは最小のインキュベーション時間であって、力価測定RIAには更に長いインキュベーションを用いることもできるが、通常、その必要はない。9.100μlのSCSをすべてのチューブに添加し、チューブを震動させた。10.500μlの25PEG4°C又はRTをすべてのチューブに添加して、ボルテックスによって混合した。11.2000Xg、4~12°Cで30分間、チューブを遠心した。12.すべてのチューブから上清を吸引して、廃棄した。13.γ線計数器でアッセイチューブ内の沈殿を計測するか、下記に記載の通り、シンチレーション計測用に調製を行った。[0160]計算[0161]2つ組み試料の毎分カウント数cpmを平均した。非特異的なバックグランド結合の減算は行わなかった。添加された血清の容積に対する、hG17-125I結合として、データをプロットした。試料あたりに添加された総cpmの35に結合した各血清の量を抑制RIA用に選択した。[0162]抑制RIA1.各抑制シリーズに、力価測定RIAで決定された1通りの希釈の抗血清を用いた。用意する2つ組みチューブの数は、無抑制の対照を含む、試験される抑制物質の希釈の数によって決定される。通常は、抗血清1つあたり、抑制物質の希釈8通り16チューブと、2本の無抑制チューブと、を用いた。2.ゼロ計数ブランクとして、2本のチューブに希釈緩衝液300μlを分注した自然バックグラウンド計数を確定するため。3.陰性対照血清を受容するもの非特異的な結合のバックグランドを得るためとして、6本のチューブに緩衝液200μlを分注し、これらのうち2本はアッセイの終わりに試験した。各抗血清あたり2本のチューブに緩衝液200μlを分注した結合した総カウント数計測用。これらのチューブには、いかなるhG17抑制物質も添加されなかった。4.残りすべてチューブに希釈緩衝液100μlを添加した。5.適当な最終濃度下記参照が得られるように希釈された無標識のhG17抑制物質100μlを、試験抗血清及び対照抗血清の各々の2つ組みチューブに分注した。これらのシリーズによって、各抗血清に関するhG17抑制曲線が確立された。hG17抑制物質は、5120pg/0.1mlに始まる、FTA/アジ化物中での1:1連続希釈によって調製した。8.チューブの内容物を混合した。9.RIA緩衝液中の125I標識された抗原を約10000cpm/0.1mlに希釈した。10.添加された合計カウント数を確定するために、アッセイ全体にわたって配置されている12本以上のチューブを含むすべてのチューブにhG17-125I100μlを添加した。11.最後に、適切に希釈された抗hG17対照血清、陰性対照血清、又は試験血清100μlを、適切なチューブセットの各チューブに添加した。12.チューブの内容物を混合し、カバーした例えばパラフィルムを用いて。13.チューブを約42時間2日間4°Cでインキュベートした。14.すべてのチューブにSCS100μlを添加して混合した。15.すべてのチューブに25PEG500μlを添加して混合した。16.チューブを2000Xg、4°Cで30分間、遠心した。17.すべてのチューブから上清を吸引して廃棄した。18.γ線計数器でアッセイチューブ内の沈殿を計測するか、シンチレーション計測用に調製を行った。シンチレーション計測用に、すべてのアッセイチューブにdH2O250μlを添加した。水を90~100°Cに加熱することによって、ペレットの溶解が加速される。ペレットの溶解には、2~3時間を必要とした。その後、シンチレーションバイアルの各々に3mlのシンチレーション液を添加した。溶解したペレットのすべてを、1本のチューブから1本のシンチレーションバイアルに移し、計測用にラック内に配置した。[0164]計算1.2つ組み試料のcpmを平均し、非特異的なバックグランド結合陰性血清対照の平均によって決定とするを引いた。2.無抑制の抗HG17抗体に結合した総カウント数が予測された範囲内にあったことを確認するために、総カウント数を加算し、ベースラインバックグランド対照を用いた。3.抑制物質の各々の量に関して、添加された総カウント数と、結合したカウント数と、を用いて、抗血清のABC及び親和定数を、スキャッチャード解析結合した抗原に対する結合/遊離のプロットによって決定した。個々の抗血清に関して、最良の線形回帰線を与えた点を選択し、残りを除去した。これは、プロットを見て、回帰係数に注意することによって行った。一般的には、プロットにおける値の低い部分は用いなかった。ABC及び親和定数は、この目的のために設定したスプレッドを用いて自動的に計算した。[0165]HG17-125Iの希釈[0166]hG17-125IはNEN社から購入した。この放射標識されたホルモン15μCiには、出荷時に、2200μCi/mmoleの比活性があった。添付されていた商品説明書に従い、崩壊日数に基づいて、凍結乾燥物をdH2Oで50μCi/mlに希釈した。溶解の後、50μl分量を作製し、鉛の容器に入れて-70°Cで保存した。[0167]10000CPMへの希釈[0168]約10000cpmの標識化合物を各アッセイチューブ0.1mlに入れた通常10000~10400cpm/チューブ。必要とする希釈hG17-125Iの容積を決定する際には、総カウント数測定と、移動及び泡立ちによる減失を考慮して、3~4mlの余分を与えた。[0169]注意:このアッセイで検査される試験試料は、血清でも、細胞培養上清中のMAbでも、腹水液でも、アフィニティー精製Abでもよい。G17のアミノ末端以外の標的抗原に対する抗体には、適当な125I標識標的ホルモン抗原及び抑制物質を使用する。関連のないペプチドも含めて、陰性対照として試験するべきである。[0170]実施例12:ウサギα-GRE11抗体を用いたパラフィン包埋組織上のCCK2受容体の検出[0171]3回の別々のキシレン槽各槽につき5~6回上下させるでの浸漬によって、組織切片のパラフィン除去を行った。その後、100工業用加メチルエタノールIMS中でのインキュベーション各槽につき5~6回上下させるによって、それを再水和させた。スライドを蒸留水中で5分間すすいだ。スライドを15酢酸中で20分間インキュベートすることによって、内因性のアルカリホスファターゼ活性を遮断した。その後、スライドを蒸留水中で5分間すすいだ。スライドを、相互に2スペース離れるようにプラスチックスライドラック中に配置し、pH6のクエン酸緩衝液1Lあたり2.1gクエン酸一水和物、12.5mL2MNaOHの中に入れ、最高出力の電子レンジ600Wで10分間加熱した。その際、全過程の時間、スライドを覆うのに十分な量の緩衝液が確実に存在するように注意した。その後、スライドを直ちに、冷たい蒸留水の水流中に移し、スライドが乾燥してしまわないように注意しながら3~4分間おいた。[0172]疎水性のペンを用いて切片に印を付け、湿室に入れ、pH7.6のトリス緩衝食塩水TBS0.66gトリス-ヒドロキシメチルメチルアミン、8.75gNaCl、約4.15mLHCL中に、室温RTで5分間、浸漬させた。スライドを、TBS中の10正常ヤギ血清と共にRTで20分間、インキュベートすることによって、2次抗体Abの非特異的結合を遮断した。スライドから液体を除き、各スライドに、一次抗体200μl/スライドを添加し、湿室中、RTに1時間置いた。スライドの洗浄は、最初にTBS洗浄ビンsquirtbottle中;組織切片に直接水流を向けないように注意するで穏やかにすすぎ、次に、5分間、緩衝液中に浸漬させることによって行った。[0173]アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ2次抗体又は、試験抗体の産生源を標的とした適当な抗体を、200μl/スライドのTBS中、1/50希釈でスライドに添加した。次に、スライドをRTで1時間インキュベートし、その後、TBS中で5分間洗浄した。[0174]FastRed基質VectorRed、VectorLabs社/FastRed、Sigma社を、使用の直前に調製し、各切片に添加して、最長の時間を20分Vector又は30分Sigma社としてインキュベートした。スライドをTBS、次いで蒸留水ですすぎ、その後、マイヤーヘマトキシリン時間は変動的で対比染色を行った。染色の後に、スライドを蒸留水中に移した。[0175]その後、過剰の対比染色を除去するために、スライドを1酸アルコール1リットルあたり10mL濃塩酸、700mLIMS、290mL蒸留水中に浸漬した。但し、FastRed基質Sigma社を用いた場合には、代わりに蒸留水中に移した。スライドを0.5テトラホウ酸ナトリウム溶液水で希釈したもの中で何度か上下させた。この時点で、核が、紫色ではなく、青いかどうかを確認するために、切片の1つを顕微鏡下で検査するのが賢明である。その後、染色されたスライドを蒸留水に移し、それに続いて、IMSに、そして最後にキシレンに移し、その後、DPXキシレン包埋剤で包埋した。[0176]試験及び対照血清/精製抗体の適切な希釈率は、連続希釈を用いて確定した。GI切片は、アルカリホスファターゼ試薬システムを用いて染色するのが最良である。ABCは、更に特異的であるが、高感度であることによる多くの非特異的染色をもたらす。腸管アルカリホスファターゼは、レバミソールVectorlabs社で遮断することができ、切片を発色させるときには、これを基質溶液に添加する。Vectorred基質は、Sigma社の基質製品より問題が少ない。しかし、調製された基質溶液に、レバミソールを1滴、添加する必要がある。[0177]この免疫組織化学法に使用される一次抗体Abは、血清でも、MAbでも、細胞培養上清中のAbでも、腹水液でも、親和性精製されたAbでもよい。[0178]本明細書で上述した手順は、他のペプチド、特に、他のガストリンホルモン型を含む他のホルモンペプチドの免疫検出アッセイ及び免疫酵素アッセイ用に最適なMAbの単離に適用可能なことを、当業者ならば直ちに認識するであろう。本発明では、本明細書に記載の非限定な実施例によって教示及び例示される全範囲のMAbが企図されている。本明細書で引用したすべての特許及び出版物はそのまま、参照されることにより本明細書に組み込まれる。[0179]ハイブリドーマ細胞株の寄託[0180]本発明の特定のMAbを産生する下記のハイブリドーマを、2004年3月25日にATCCAmericanTypeCultureCollection、Manassas,VAに寄託した。1.MAb400-1を産生するハイブリドーマ400-1には、アクセッション番号PTA-5889が指定された。2.MAb400-2を産生するハイブリドーマ400-2には、アクセッション番号PTA-5890が指定された。3.MAb400-3を産生するハイブリドーマ400-3には、アクセッション番号PTA-5891が指定された。4.MAb400-4を産生するハイブリドーマ400-4には、アクセッション番号PTA-5892が指定された。5.MAb401-2を産生するハイブリドーマ401-2には、アクセッション番号PTA-5893が指定された。6.MAb445-1を産生するハイブリドーマ445-1には、アクセッション番号PTA-5894が指定された。7.MAb445-2を産生するハイブリドーマ445-2には、アクセッション番号PTA-5895が指定された。8.MAb458-1を産生するハイブリドーマ458-1には、アクセッション番号PTA-5896が指定された。"