細胞状膜を有する少なくとも2種の融合相手の選択的電気融合インビトロ方法において、A電極の使用により、融合相手を互いに接触させ;B融合を得るのに充分な強度であると共に融合相手に高度に集中した電場を加え、前記少なくとも1種の微小電極を顕微鏡、少なくとも1つのマイクロポジショナーおよび/または定位用具の使用により位置決めし、C2種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい2個の微小電極を用いて、工程Bにて電場を与えることを特徴とする選択的電気融合インビトロ方法。2種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい1個のみの微小電極を用いて、工程Bにて電場を与える請求項1に記載のインビトロ方法。マイクロチップに移動自在に装着された1個の電極を用いて、工程Bにて電場を与える請求項1または2に記載のインビトロ方法。マイクロチップに移動自在に装着された数個の電極を用いて、工程Bにて電場を与える請求項1または2に記載のインビトロ方法。電極を、融合生成物の組合せ合成に適する設計のマイクロチップに移動自在に装着する請求項3または4に記載のインビトロ方法。少なくとも1個の微小電極が中空であると共に、2種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい請求項2~5のいずれか一項に記載のインビトロ方法。中空であり、電解質充填され、2種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい少なくとも1個の微小電極を用いて工程Bにて電場を与え、さらに前記微小電極を用いて電気浸透、電気泳動またはポアスール流動により融合相手または化学薬剤を供給する請求項2~6のいずれか一項に記載のインビトロ方法。前記電極の外径が、たとえば細胞、リポソームおよび蛋白リポソームのような近似構造に悪影響することなく前記少なくとも2種の融合相手の選択的融合を可能にするよう充分小さい請求項2~7のいずれか一項に記載のインビトロ方法。前記電極の外径が1~100μmである請求項8に記載のインビトロ方法。少なくとも1個の電極を融合部位への少なくとも一種の融合相手を供給すべく使用する請求項2~9のいずれか一項に記載のインビトロ方法。工程Aを光学トラッピングの使用により行う請求項1~10のいずれか一項に記載のインビトロ方法。工程Aをマイクロピペットの使用により行う請求項1~10のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一方が細胞であると共に、他方の融合相手が独立して単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞および卵細胞、除核卵細胞、任意の発育段階における精子細胞および植物プロトプラストよりなる群から選択される請求項1~12のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一種が単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞、卵細胞、除核卵細胞、任意の発育段階における精子細胞および植物プロトプラストよりなる群から選択される複数の構造体により構成される請求項1~12のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手を、工程Bに先立ち緩衝液にて供給する請求項1~14のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一種が工程Aに先立ち固定化されている請求項1~15のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の一種が細胞ネットワークの部分である請求項1~16のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一種が、工程Aに先立ち緩衝液にてエレクトロポレートされている請求項1~17のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一種が、工程Aに先立ち緩衝液にて誘電泳動フィールドに露呈されている請求項1~18のいずれか一項に記載のインビトロ方法。融合相手の少なくとも一種が、近接細胞-細胞接触を促進する融合剤もしくは他の薬剤により処理されている請求項1~19のいずれか一項に記載のインビトロ方法。インビトロ受精における請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。ヒトクローン化を除きクローン化における請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。ハイブリドーマを形成するための請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。細胞膜の組成を処理するための請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。充分規定された容積の物質を細胞に供給するための請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。医薬活性物質を細胞に供給するための請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。腫瘍の処置のための薬剤の調合における請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。たとえばパーキンソン氏病およびアルツハイマー氏病のような慢性神経変成病の処置のための薬剤の調合における請求項1~20のいずれか一項に記載のインビトロ方法。単一細胞の生化学的および遺伝的性質を選択的かつ調節自在に変化させることがしばしば望ましい。この挑戦に挑むと共にバルク電気融合の欠点を克服するため、本発明者等は単一対の細胞を一度に互いに融合させる技術を開発した。単一細胞を互いに調節自在に融合させる能力は長期の遺伝的同一性および選択細胞の性質を正確に処理しうる技術を示し、ハイブリッドおよびクローン化細胞の組合せ保存物を形成する新たな可能性を開く。強力な測定および影像化技術との組合せにて、単一細胞の遺伝的および生化学的性質を詳細に検討することができる。細胞特性の変化をも、所望の小胞含有量および膜組成物を有する合成燐脂質小胞を標的細胞まで互いに融合させて達成することができる。この技術を使用して単一細胞の内容物および膜特性を変化させることができる。たとえば、リポソームにて再構成された膜蛋白質を細胞プラズマ膜に導入することができる。単一細胞の膜組成を選択的に形質転換させるこの能力は、たとえば有力なリガンドおよび関連薬理化合物をスクリーニングするための表面リセプタの導入のような有用な生物学的用途を有すると予想される。すなわち本発明は、たとえば細胞およびリポソームのような細胞構造物の選択的電気融合につき新規な方法を提供する。この方法は細胞選択の高空間解像力を有する付着性細胞構造物の融合の利点を与え、複雑な細胞ネットワークを形成する可能性を与える。電気融合は緩和な方法であるため、この小型化した方法をたとえば単一細胞レベルにてクローン化につきおよびインビトロ受精につき使用することができる。特にクローン化実験につき、バルク電気融合の欠点が本発明により解消される。何故なら、これは融合プロセスに対し完全制御を与えると共に、体細胞の確認に対する疑いを提起する必要がないからである。さらに、この方法は好ましくは微小機械加工チップ技術と組合わせてクローン化細胞もしくはハイブリッド細胞のスクリーニング用保存物を形成することもできる。本発明の特徴は、以下の説明および請求の範囲から明らかとなるであろう。図1は実験設備を示す略図である。細胞1、2はポリカーボネート製ホルダーに装着された顕微鏡カバースリップ3に懸濁物から添加される。各細胞を光学トラッピングMOPAレーザー4により或いは単にこれらを高目盛マイクロマニキュレータ7により制御される微小電極5、6にて互いに押圧することにより予備整列される。蛍光画像化および光学トラッピングのため、2つのコリニアレーザー光線を顕微鏡対物レンズ9に送り、アルゴンイオンレーザー10黒色の細い矢印を用いてフルオレスセインを励起させると共に、MOPAダイオードレーザー4黒色の太い矢印を光学トラッピングにつき使用する。得られた蛍光および鮮明フィールド画像をCCDカメラ11に指向させる。図2A~Cは微小電極を用いる選択細胞とのリポソームの整列を示し、図2D~Eは細胞と接触させた6つのフルオレスセイン含有10μMリポソームを示す。図2Gに示したように、背景の蛍光は検出されず、これは表面へのリポソームの電気浸透化または内部細胞とリポソームとの間の電気融合への薬物の選択的供給が可能であることを示す。図3A~Dは細胞-細胞融合配列を示す。図3Aは電気泳動0.3~3kV/cm、2MHzの際のPC12細胞を示す。図3Bは、最後の融合パルスそれぞれ1msの持続時間の6パルス、3kV/cmによる融合の開始を示し、これは各細胞間における幅広かつ扁平な接触帯域により見ることができる。図3C融合パルス後の1分間までおよび図3D融合パルス後の2分間まではその後の各細胞間の融合領域の拡大を示し、完全融合を示す。図4A~Cは、ホスファシジルコリンPCリポソーム左側とCOS7細胞右側との電気融合8kV/cm、4msの前図4A、その間図Bおよびその後図4Cに撮った鮮明フィールド画像を示す。図4D~EはNG-108細胞30分間にわたりプロテアーゼ処理および組込みγ-グルタミルトランスフェラーゼγ-GTを有するPCリポソームとの間の融合を示す。図4Eにおいて、どのように微小電極が細胞から緩和に引き離されると共にリポソーム微小電極に付着は延伸するが細胞から脱着しないかが見られる。図5は本発明による方法の臨床用途の1例を示し、ここで脳における単一もしくは複数の細胞を電気融合させて他の融合相手の内容物を組込む。融合相手は中空電極を介して供給される。電極を定位装置により位置決めし、カルテシヤン座標系および定位マイクロポジショナーにより図面に示す。本発明は細胞状膜を有する少なくとも2種の融合相手の選択的電気融合方法に関するものであり、次の工程:A融合相手を互いに接触させ、B融合を得るのに充分な強度を有すると共に融合相手に高度に集中した電場を加えることを特徴とする。細胞状膜を有する前記少なくとも2種の融合相手は好ましくは細胞もしくはサブ細胞寸法の構造体である。細胞もしくはサブ細胞寸法の構造体という用語は特に生物学的構造体たとえば独立細胞およびより小さい構造体に関するものであるが、さらに同様な人工的構造体にも関するものである。すなわち、融合相手は互いに独立して単一細胞、リポソーム、蛋白リポソーム、合成小胞、植物プロトプラスト、卵細胞、精子もしくは精細胞および除核卵細胞とすることができる。上記したように、融合相手を互いに接触させる。このことは、融合相手の外側表面が接触するようこれらを位置せしめ或いは融合相手を互いに極めて小間隔にて設置することを意味する。大抵の場合、本発明による方法を用いて2種の融合相手すなわち示した融合相手Iおよび融合相手IIの融合につき使用するが、2種以上の融合相手を融合させるために使用することもできる。或る種の場合、3種以上の相手を融合させ、たとえば3個以上の核を有する多核細胞を形成させ、或いは相手の一方が他方よりもずっと大きい寸法を有する場合も特に興味がある。この例は、小胞に含有された物質を細胞中へ導入することが望ましい場合である。この場合、融合相手Iは細胞であると共に、融合相手IIはより小さい小胞の数種である。さらに本発明による方法を1回もしくは数回反復して、新たな融合相手を2種の既に融合された融合相手に融合させることもできる。これは、クローン化細胞およびハイブリッド細胞の組合せ保存物を形成させる際に特に重要である。融合相手Iが細胞であると共に融合相手IIが単一リポソームである場合、これらの融合は細胞内部へのリポソーム含有物の導入とリポソーム膜から細胞表面への脂質および膜蛋白質の付加との両者を可能にする。この細胞-リポソーム融合は膜内容物および単一細胞の表面特性の処理に新たな手法を与える。たとえば細胞、リポソームまたは他の同様な構造体など融合相手Iを、たとえば細胞、リポソームまたは同様な構造体など融合相手IIに融合させるには2種の融合相手を互いに隣接させ、すなわち互いに接触させて位置せしめる必要がある。2種の融合相手を融合前に互いに隣接位置せしめるという事実は、各細胞間の緊密接触の発生につき従来使用されている誘電泳動を回避することを可能にする。しかしながら、誘電泳動を本発明と組合わせて好適に使用することにより、dc-フィールド融合パルスを加える前に近接細胞-細胞接触を形成すると共に確立することができる。機械的に、核融合相手間の緊密接触は任意適するように行うことができる。整列につき2種の融合相手の個々の操作はこの整列を容易化させる。たとえば高度に集中されたレーザー光線で光学トラッピングするため、個々の細胞および小寸法のオルガネラを含め他の生物学的構造体を任意に処理および移動させることができる[これは従来記載されている:たとえばM.J.ジャロスデスキー等1994、機械促進細胞-細胞電気融合、バイオフィジックスジャーナル、第67巻、第1574-1581頁;M.ウチダ等1995、光学トラッピングによる全細胞処理、カレントバイオロジー、第5巻、第380-382頁;D.T.チュ等1998、毛細管電気泳動による単一分泌小胞の検査、サイエンス、第279巻、第1190-1193頁参照]。融合相手の位置決めにつき電極を使用する場合、下記するように電極の先端で移動させてその位置を調整することにより2種の融合相手を整列させることができる。電極を移動させるには顕微鏡、少なくとも1種のマイクロポジショナーおよび/または定位用具を使用するのが有利である。2種の融合相手の位置決めをさらに容易化させるには、工程Aを行う前に融合相手の一方を固定化するのが有利である。電極を使用する場合、これはたとえば融合相手の少なくとも1種を微小電極の少なくとも1つに可逆的に付着させて行うことができる。或る種の場合、融合の前に2種の整列細胞の予備処理として誘電泳動を使用することが有利である。これはac-フィールド掃引機能発生器を電極に接続して行うことができる。電場は用いる電極および他の実験パラメータに応じて低電圧もしくは高電圧パルスゼネレータの使用により得ることができる。電圧ゼネレータを使用して、2種の融合相手の間に融合を生ぜしめるのに充分な電場強度約0.1~10kV/cmを10μs~数秒の持続時間にわたり発生させる。融合相手の膜にて測定される電圧は数百ミリボルト~数ボルト、好ましくは約1.5Vとすべきである。複数電圧パルスプロトコールの場合、約1Hzのパルス反復割合も適しているが、他の反復割合でも充分作動しうることが判明した。より長いバルス適用時間に応じ、より低い周波数の反復割合を使用すべきである。いずれの場合も、各パルスの長さおよび強度は融合させるべき相手の寸法に依存する。好ましくは、融合パルスは矩形波形を有するが、他の波形たとえば各種のac-フィールドパルスプロトコールも作動することができる。誘電泳動につき掃引機能ゼネレータは好ましくは100V/cm~5kV/cm、100Hz~2MHzのフィールド強度の交流フィールド正弦波形を発生する。融合を得るため工程Bにて使用される電場は、周囲の構造体への悪影響を回避すると共に本発明の利点を得るため高度に集中させるべきである。電場を集中させるには、細胞膜から2種の融合相手に近接位置するすなわち0~10μm、好ましくは0~5μm1個もしくは2個の微小電極を使用して電場を発生させるのが好ましい。単一電極を使用する場合、この電極は好ましくは陽電位陽極にてバイヤスさせると共に磨砕細胞調製物に対し作動させる。本発明によれば、微小電極は好ましくは細胞~サブ細胞寸法の電極である。好ましくは融合相手に最も近接位置する電極の端部の外径は数nm~100μm、より好ましくは5~30μm、特に好ましくは約20μmである。各電極は密実導電性材料で作成することができ、或いは選択する融合相手もしくは化学薬剤を供給すべく中空とすることもできる。各電極は種々異なる材料から作成することができる。特殊タイプの電極は中空であると共に、しばしば毛細管電気泳動およびガスクロマトグラフィー分離につき使用されるタイプの融合シリカ毛細管から作成される。これら毛細管は、典型的には内径1~100μmかつ外径5~400μmであると共に、長さは数mm~1mである。細胞融合用途につき、これら電極には電解質好ましくは生理学的緩衝溶液を満たす。細胞融合を生ぜしめるのに充分な電位を毛細管に加える場合、毛細管には電気エンドオスモシスバルク流が誘発され、これをポアセル流動毛細管における重力流動と組合わせて用いることにより、各材料を融合相手に効率的に移行させることができる。この種の中空細孔融合シリカ毛細管は、入口端部に添加される各成分をその電荷と摩擦とのドラッグ比に基づき分画しうるという更なる利点を有する。このシステムの特徴は、たとえば細胞融合に対する各種分画成分の作用を検討すべく使用することができる。さらに工程Bに先立ち、2種の融合相手を電気融合緩衝剤にて供給することが好ましい。融合を容易化させるには、工程Aを実施する前に融合相手の少なくとも1種を予備エレクトロポレートするのが有利である。融合相手の一方または両者が細胞である場合は、これを細胞ネットワークもしくは組織の部分として、たとえば選択細胞の生化学的性質の変化が全ネットワークの挙動に対し顕著な作用を及ぼしうる細胞ネットワークを検討することができる。本発明による方法を実施するのに適する設備を図1に示す。この図面において、2種の融合相手1、2は両者とも細胞である。融合させるべき細胞を懸濁物からポリカーボネート製ホルダーに装着された顕微鏡カバースリップ3に添加する。各細胞を、光学トラッピングMOPAレーザー4を用いて或いは単にこれらを高目盛マイクロマニビュレータ7により制御される微小電極5、6と一緒に押圧することにより予備整列させる。好ましくは微小電極は炭素繊維電極、特に好ましくは酸素繊維超微小電極直径5μmまたは中空ガラス繊維電極である。電圧ゼネレータ8を使用して所要の電場を与える。蛍光画像化および光学トラッピングについては、2種のコリニアレーザー光線を顕微鏡対物レンズ9に送る。アルゴンイオンレザー10からの488nm光線アルゴンイオンレーザーからの光線を黒色の細線矢印で示すを用いてフルオレスセインを励起させると共に、MOPAダイオードレーザー4からの992nm光線アルゴンイオンレーザーからの光線を黒色の太線矢印で示すを光学トラッピングにつき使用した。得られた蛍光かつ鮮明フィールド画像をCCDカメラ11に指向させる。さらに設備は鏡12と二色性ビームスプリッタ13と多色性ビームスプリッタ14とレンズ15と回転盤16とフィルタ17とを備える。本発明による方法は、たとえばオルガネラのような個々の細胞もしくはサブ細胞構造体の遺伝的性質および生化学的表面特性を取り扱うのに適する。これはインビトロ受精につき特に適すると共に興味がある。さらに、たとえばクローン化、ハイブリドーマの形成、細胞膜の組成の取り扱い、および細胞への充分規定された容積の物質の供給特に細胞への医薬活性物質の供給のような幾つかの他の用途にも使用することができる。本発明による方法はさらに、個々の細胞群における生化学的障害を持った患者もしくは動物のインビボ電気融合にも適している。遺伝的に獲得されても或いはされなくても、多くの病気は代謝障害をもたらす。たとえば黒質線状体経路におけるニューロンの変成によって生ずるパーキンソン氏病は、細胞の分離集団におけるドーパミンの生成につき生化学機作における機能不全をもたらす。次いで、これは運動挙動欠陥をもたらす。パーキンソン氏病の標準的処置はL-DOPAすなわちドーパミンの先駆体の経口投与である。代案として、ドーパミンを形成するニューロン細胞を持ったグラフト細胞を患者の脳に移植する。適する脳構造体へのインビボにおける細胞内薬物もしくは遺伝子投与は、上記例に記載されると共に治療方策として使用されるものと同様な電気融合過程を用いて行うことができる。小集団の細胞が機能不全である他の病気は内部器官における多くの障害を包含するが腫瘍をも含む。遺伝子供給のための遺伝子工学処理されたウィルスを用いる脳腫瘍の実験処置が成功報告例を以て使用されている。しかしながら、供給系としてのウィルスの使用は、これがウィルス突然変異種を与えるので強力な害を提起するという限界を有する。下記実施例に記載したものと同様な遺伝子供給のための電気融合過程たとえば自殺遺伝子サイトキンデアミナーゼもしくはチミジンキナーゼは、癌療法におけるウィルス供給システムの使用の必要性を排除する。薬物もしくは遺伝子の局部投与機能不全群の細胞に対する直接投与遺伝子療法は腹腔内、経口、静脈内または他の任意の種類の一般に用いられる薬物投与技術よりもずっと優れていると思われる。インビボにおける細胞内薬物-遺伝子-投与は、下記実施例に記載したと同様な電気融合手順を用いて達成することができる。電極の極めて小さい寸法のため、印加する低電圧と組合せて極めて小さい組織外傷しか予想されない。さらに、電極の位置決めおよびその後の遺伝子もしくは薬物供給は極めて正確である。これは脳において特に重要である。エレクトロポレーションにつきここで用いられる電極よりも数100倍大きい程度であるマイクロ透析プローブは移植の24時間後にわたり極めて小さい組織外傷および局部的代謝の障害しか生ぜしめない。エレクトロポレーションを用いるインビボにおける細胞およびオルガネラへの溶解質移行には、中空である電極を使用するのが好ましい。次いで細胞中へ電気融合させる融合相手を単に電極の中心における細いチャンネルを介して投与し、これには注射器ポンプもしくは蠕電動ポンプまたは電気泳動を含む他の任意の種類の溶液ポンプ輸送システムによる流動を加える。特に興味ある可能性は、細胞もしくは組織への電気融合のため融合相手と共に溶解質を連続投与するための生物許容性材料にてバッテリー作動式灌流/エレクトロポレーション移植体を使用することである。この種の低電位が必要とされるので、数ボルト~20ボルトの範囲におけるemfを有するバッテリーを使用することができる。これらバッテリー作動式エレクトロポレーション装置は小さく作成することができ、実質的にこれらは僅か数mm2の寸法のチップに含ませることができる。インビボ施設の例を図5に示す。中空電極20を脳における細胞21に近い定位式用具の使用により位置決めする。この細胞21は融合相手の1種を構成する。他の融合相手はたとえばDNA、蛋白質、RNAもしくは薬物のような医薬活性物質を含有するリポソームにより構成される。細胞には電極21への第2融合相手の注入によりリポソームを灌流させ、これには図面に示した注射器22を使用し、または或る種の他の適する手段を使用する。以下、本発明を実施例により更に説明する。この実施例は単に本発明を例示する目的に過ぎず、決して本発明の範囲を限定するものでない。これら実施例にて、以下の方法および材料を使用した。顕微鏡操作および融合高度集中レーザー光線での光学トラッピングを用いて各融合相手を整列させた。この手順を用い溶液における各融合相手の1種細胞もしくはリポソームをIRレーザー光線によりトラップすると共に他の融合相手と接触させ、前記他の融合相手はサブストレータムにて成長した付着性細胞またはサブストレータムに設置された細胞のいずれかとし、これには図1に図示すると共に上記した施設で光学トラッピングを用いた。融合のための細胞標的に近接して細胞もしくはリポソームを位置決めするため、本発明者等はさらに炭素繊維微小電極先端への可逆的吸着を使用する。細胞-リポソーム融合に関するこの特定方式を用いる際、ポリ-L-リジン被覆ガラス表面にて細胞と共に同時固定化されたリポソームを表面から脱着させ、これには電極先端をリポソームに対し目的平面に対しほぼ平行に押し付けた。かくしてリポソームは電極先端に軽く付着し、三次元にて0.2μmの増分で移動しうる顕微操作器により細胞構造体に近接して再位置せしめることができる。これを図2A~Cに示し、直径約5μmのリポソームを標的細胞に対し約90μm移動させるのに対し、図2D-Gはこの簡単な手法を用いてどのように複合細胞-リポソームパターンを形成しうるかを示す。図2A~Cにおけるリポソームを先ず最初にポリ-L-リジン被覆ボロシリケートカバースリップに固定化すると共に、細胞を懸濁物にて添加した。リポソームは90μmにわたり細胞まで容易に移動することができた。光学トラッピングに比べこの技術の1つの利点は、小胞に加えうるずっと大きい力である。2種の細胞の整列につき同じ方法を用いたが、ただしポリ-L-リジン被覆カバーガラスを使用する必要はない。何故なら、懸濁物における細胞は単に重力により表面に付着するからである。電気融合につき、外径5μmの炭素繊維微小電極の同じ対を用いる。図1は、融合につき予備整列された1対の細胞に関する電極の幾何学的配置を示す。細胞-細胞および細胞-リポソームの融合につき、高集中電場を低電圧パルスゼネレータを用いて加える。この施設の利点は、電極が細胞~サブ細胞寸法であって複雑細胞ネットワークにおける単一細胞の融合をサブストレータムにて成長させうる点である。同時に高集中電場は、周囲細胞の望ましくない融合もしくはエレクトロポレーションの危険性を最少化させる。実験プロトコール光学トラッピング、顕微鏡および蛍光画像化光学トラッピングおよび蛍光画像化システムをハウス内構築した。光学トラップは単一モードMOPAレーザーダイオードモデルSDL-5762-A6、SDLインコーポレーションからの出力を空間フィルタモデル900、ニューポート社を介し送信することにより形成し、次いで出力を近赤外ミラーで反射させた。反射したレーザー光を二色性ミラーに通過させ、多色性ミラークロマテクノロジーコーポレーションから反射させ、この多色性ミラーは顕微鏡ニコンダイヤフォト社もしくはライカDMIRB社に戴置し、次いで多数孔対物それぞれ100x、NA1.4ニコンおよび100x、NA1.3ライカを有する屈折制限焦点にした。アルゴンイオンレーザースペクトロフィジックス2025-05の488-nm出力を望遠鏡に通過させた後に回転盤に送って蛍光励起を達成した。回転盤の目的は、レーザー光を分散させて蛍光画像化につき均一照明を達成することである。円盤からの分散レーザー光をレンズにより集めると共に、二色性ミラークロマテクノロジーコーポレーションから反射させた。この反射光を顕微鏡に送ると共に、多色性ミラーにより反射させた。蛍光および鮮明画像化を3-チップカラーCCD-カメラハママツ社またはシリコン-強化標的カメラハママツ社により行い、スーパーVHSレコーダーパナソニック社により記録し或いはフレームグラバーを介し硬質円盤に直接ダンプした。電気融合装備電気融合実験につき、細胞皿を減圧グリースを用いて円形ポリカーボネートホルダーに装着し、転倒顕微鏡のステージに移した。外径5μmを有する2個の炭素繊維微小電極アクソンインスツールメンツインコーポレーションProCFEを各融合相手の各側に高目盛顕微操作器ナリシゲMWH-3により近接位置せしめた。2つの炭素繊維電極先端部陽極および陰極を目的平面に対し0~20°および160~180°の角度にて位置せしめた。各細胞をパルスゼネレータデジタイマースチミュレータDS9Aまたは手作り品を用いて複数1-msパルスで融合させた。パルスゼネレータからの電圧出力を、高インピーダンス電極およびパッチ-クランプ増幅器を用いて検定した。電気融合緩衝剤は0.3モル/kgハンクスヘペスHepes溶液1.37mMNaCl、5.4mMKCl、0.41mMMgSO4、0.4mMMgCl2、1.26mMCaCl2、0.64mMKH2PO4、3.0mMNaHCO3、5.5mMD-グルコース、20mMヘペス、NaOHでpHを7.4に調整または0.2モル/kgヘペス塩水緩衝液135mMNaCl、5mMKCl、10mMグルコース、2mMMgCl2、2mMCaCl2、および10mMヘペスとし、30~50のMilliQ-水で希釈した。PC12細胞については標準的イソ-オスモラおよびハイポ-オスモラ融合媒体をそれぞれ300L3および75L3として用いた[S.ファング等、ジャーナルオブイミュノロジカルメソッズ、第134巻、第35-42頁]。NG-108およびCos7の細胞-細胞融合実験につき、5PEG4000融合媒体に添加し、細胞-リポソーム融合においては1.25DMSOを添加した。細胞培養ジュルカットMG108、COS7およびPC12細胞を標準的手順に従い培養した。NG-108およびCOS7細胞を2mg/mlのプロテアーゼアステルペルギルスオリゼーからで5~30分間にわたり培養器内37°C、湿度90および5CO2雰囲気で処理した。蛍光カプ細胞化ユニラメラ小胞および蛍光標識蛋白リポソームの作成クロロホルムにおけるL-α-ホスファチジルコリンからのリポソーム新鮮卵黄からの粉末、シグマ社、セントルイス、MO州を、回転蒸発法を用いて高収率で得た[たとえばA.モスコ等1996、巨大ユニラメラ小胞の迅速作成、プロシーディングナショナルアカデミーサイエンス、USA、第93巻、第11443-11445頁参照]。蛍光標識されたγ-GTを2.3mMのフルオレスセインイソチオシアネートFITCとの反応により作成した。γ-GT-FITC溶液をエコノパック10DGカラムビオラドラボラトリース社、CAに6000Dカットオフで通過させることにより、未反応FITCを除去した。次いで、標識されたγ-GTを小胞形成プロセスに際し小胞中に組込んだ。ポリ-L-リジン被覆カバースリップの作成カバースリップボロシリケート、直径28mm、厚さ0.13~0.17mm、ケボ社、スェーデンを70エタノール/水の溶液v/vで洗浄した後、MilliQ-水で洗浄した。ガラスをポリ-L-リジンシグマ-アルドリッチ社、ヨーロッパ/MQ-水の溶液0.1、w/vに入れた。これらカバースリップを、減圧グリースを用いて円形ポリカーボネートホルダーに取り付けた。1mlのリポソーム溶液を添加した。30分間の後、充分な個数のリポソームを固定化させ、外側溶液を交換すると共に細胞を添加した。微小電極を用いるリポソームおよび細胞の顕微操作リポソームをポリ-L-リジン被覆ボロシリケート表面における種々異なる箇所に移行させるため、高目盛顕微操作器により制御された炭素繊維微小電極ナリシゲ、日本国、0.2μm解像力を、単に組合わせ押圧、剥取移動を使用して表面から小胞を緩めることにより使用した。小胞を表面から脱着させた後、これらを電極先端に付着させると共に長距離にわたり移動させて、細胞標的に近接位置せしめた。リポソーム含有量の顕著な損失がこの処理の結果であるかどうかを判定するため、リポソームをフルオレスセイン10μMで処理し、カバースリップに取り付け、充分に洗浄して蛍光背景を顕著に減少させた。小胞を移動させる前後の小胞内蛍光強度の間の比較は、内容物の実質的な損失の徴候を示さなかったデータ示さず。薬品および材料ヘペス>99、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび水酸化ナトリウム全てスプラプール社、二塩化カルシウム、二塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、燐酸二水素カリウム、PEG4000および炭酸水素ナトリウムはメルク社から購入した。D-グルコースアラナRはBDHリミテッドプール社から購入し、フルオレスセインGC-級、γ-GT、プロテアーゼタイプXXIII、アスペルギリスオリゼーから、フルオレスセインナトリウム塩、およびDMSOはシグマ-アルドリッチ社、スェーデンから入手した。フルオレスセインイソチオシアネートはモレキュラプローブ社、ヨーロッパから入手した。Milli-Qシステムミリポア社からの脱イオン水を使用した。例1:細胞-細胞融合この例においては、光学トラッピングにより接触させると共にカバースリップに固定化された2個のPC12細胞直径8μmおよび10μmを図3A~Dに示したように融合させた。図3Aは誘電泳動0.3~3kV/cm、2MHzの際のPC12細胞を示す。図3Bは最終融合パルスそれぞれ1ms持続期間の6パルス、3kV/cmによる融合の開始を示し、これは各細胞間の一層幅広かつ扁平な接触帯域により見ることができる。図3C融合パルスの~1分間後および図3D融合パルス後の~2分間は各細胞間の融合領域の拡大を示し、完全融合を示す。この技術により達成される高空間解像力を示すため、ネットワークにおける個々のMG108細胞を融合させたデータ示さず。PC12細胞およびNG108細胞の他に、ユルカット細胞およびCos7細胞をも融合させることに成功したデータ示さず。PC12細胞とNG108細胞との間のハイブリッド細胞を同様な融合方式により形成することに成功したデータ示さず。細胞骨格が存在するので、融合細胞はその膜を再構成すると共にリポソームに比べ球形となるにはずっと長い時間を要する。たとえば、同一の実験施設を用いる典型的リポソーム-リポソーム融合はミリ秒の範囲であるデータ示さず。強度の細胞骨格スカフォールドを有する或る種の細胞につき、膜再構成は数分間を要することがある。しかしながら、初期細胞質連続性を特徴とする融合はまだ1秒以内に生ずる。一般に0.2モル/kgの緩衝液にて予備エレクトロポレートされた細胞の融合は、等張性0.3モル/kg緩衝液に保持された細胞の融合よりもずっと迅速であることが観察された。等張性培地における全融合細胞への初期細胞質連続性からの融合プロセスは数時間を要した。これは、エキソサイトシスのような膜融合イベントに対する融合培地作用[たとえばG.ウエーバー等1992、レーザーマイクロビームおよび光学トラッピングによる細胞、オルガネラおよびゲノムの操作、Int.Rev.Cyt、第133巻、第1-41頁に記載]および細胞-細胞融合[たとえばJ.チンマーベルク等1980、カルシウム結合性蛋白質を含有する平面二層を有する脂質小胞の融合をマイクロモレキュラCa2は刺激する、サイエンス、第210巻、第906-908頁;J.J.シュミット等1989、強ハイポオスモラ溶液における電気融合による向上ハイブリドーマ生産、バイオヒミカバイオフィジカアクタ、第983巻、第42-50頁;J.J.シュミット等1989、浸透圧処理細胞の電気融合、ナチュールビッセンシャフト、第76巻、第122-123頁に記載]に関する初期の見積もりと一致する。その後、ハイポ-オスモチック融合媒体により到達する電気融合の向上はスペクトリン変性に基づくと論じられている[たとえばU.チンマーマン等1990、ハイポオスモラ電気泳動によるマウス-ヒト細胞ラインの効率的ハイブリッド化、ジャーナルオブイミュノロジカルメソッズ、第134巻、第43-50頁;L.V.チェルノモルジク等1991、スペクトリンネットワークおよび非浸透力は電気融合血小板ゴーストにて融合生成物形態を調節するという証明、バイオフィジックスジャーナル、第60巻、第1026-1037頁に記載]。全NG-108およびCos7融合実験において各細胞をプロテアーゼで処理し5~30分間、さらにNG-108細胞につき細胞融合媒体は5w/vのPEG4000を含有した[たとえばA.E.ソワース1995、血小板膜の融合に際する表面形状変化の膜骨格拘束:浸透圧および誘電泳動性の微小力としての使用からの証明、バイオフィジックスジャーナル、第69巻、第2507-2516頁に記載]。各細胞ラインに関する種々異なる予備処理条件および融合条件の必要性は細胞融合に関する事前の観察と一致する。電気融合細胞は生物学的に完全であって、成長し続けることが充分確認された。さらに本発明の融合プロトコールにおいて、各細胞は表面に付着すると共に融合後の5~24時間にわたる点検に際し成長し続けた。例2:細胞-リポソーム融合細胞融合の事前のカウントは他のフェノタイプの哺乳動物細胞に加え合成小胞および植物プロトプラストも哺乳動物細胞に融合させうることを示した。合成小胞は或る種の化学処理またはたとえばPEGなどを用いて融合されている[たとえばN.G.ストイキバ等1994、ポリエチレングリコールの存在下における哺乳動物細胞の電気誘発融合、ジャーナルメンブランバイオロジー、第140巻、第177-182頁]またはHVJ-グルコ蛋白再構成リポソームを用いて融合されている[S.セイビッケ等1988、腹水腫瘍細胞およびその脂質欠如体との脂質小胞の融合、放射能-および蛍光-標識小胞での研究、バイオヒミカバイオフィジカアクタ、第944巻、第487-496頁記載]。合成脂質フィルムは細胞におけるプラスマ膜に組み込まれると共に、脂質被覆ガラスマイクロピペットと細胞膜との間の緩和な接触により微小注入が容易化されている[たとえばI.ラファフィアン等1998、脂質促進微小注入:小細胞のサイトストールおよび膜への物質の導入、バイオフィジックスジャーナル、第75巻、第255-2563頁に記載]。合成小胞に関する融合方式は、細胞不透過性分子を内容物の混合を介し標的細胞に移行させると共にたとえば蛋白質のような膜脂質および膜関連構造体を標的細胞膜中へ移行させる目的で使用することができる。図4A~Eは本発明による単一小胞-細胞融合を例示する画像の2つの配列である。第1配列図4A~Cにおいては、直径~5μmのホスファチジルコリン小胞を直径~12μmのCos-7細胞と融合させ、第2配列図4D~Eにおいては直径~3μmのホスファチジルコリン小胞を再構成γ-GTと共に直径~20μmのNG-108細胞30分間にわたりプロテアーゼ処理と融合させる。これは、リポソーム組込み蛋白質を細胞構造体に導入する能力を示す。小胞と細胞との融合は同じ種類の2他の細胞間の融合よりも達成するのがずっと困難であることに注目される。0.3モル/kg融合媒体へのDMSO~2の添加および0.2モル/kg融合媒体の使用の両者は融合を容易化させることが判明した。DMSOはエレクトロポレーションを用いるDNAの吸収を容易化させると共に融合の収率を増大させ、ハイポ-オスモラ媒体の使用は細胞の融合収率を増大させることが周知されている[上記]。図面に示した実験においては、融合をヘペス-緩衝塩水溶液にて行い、1.25のジメチルスルホキシドおよび20のMQ-水を外部緩衝溶液に添加して小胞-細胞電気融合を促進させた。例3:単一開孔融合シリカ毛細管を用いる細胞融合融合実験をNG108細胞で行い、標準的手順に従って培養すると共に円形ポリカーボネートホルダーに装着されたNo.1円形カバースリップに塗沫し、転倒顕微鏡ステージに移した。全実験の間、細胞バッチを白金ワイヤにより磨砕した。各細胞を光学トラッピングにより融合のため整列させた。1~30kVの陽電位にて操作される高電圧出力供給部ベルタンド社、ヒックスビル、NY、USAを電解質充填融合シリカ毛細管長さ30cm、内径30mm、外径375mmと一緒に電極として使用した。その他は実験施設は図1に示したものと同一にした。融合シリカ電極を、回転サンドペーパー皿での先端部の磨砕により外径約50mmまで尖らせた。毛細管および緩衝剤容積これは毛細管の入口端部を白金ワイヤにより高出力電圧供給部に接続するにはハンクス緩衝塩水を充填した。尖らせた毛細管先端部出口端部を、高目盛り顕微操作器を用いて各融合相手の一方に近接典型的には10μm未満にて位置せしめた。2つの整列NG108-15細胞の融合は、5~15kVのパルスを0.1~5秒間にわたり加えて行った。本発明によるこの方法は、複合システムにて2種の細胞の融合につき極めて効率的であることが示された。これは、細胞および他の融合相手のインビボ融合にて使用するのに特に重要である。