"ブラシノステロイド化合物を含む、治療的有効量の組成物を被検体に投与するステップを含む、前記被検体における全身同化作用を増加させるための方法。前記ブラシノステロイド化合物は、式Iの化合物またはその誘導体であり、式中、R1およびR2はそれぞれ、HおよびOHから成る群より独立して選択され、R3は、CHOH、CHF、C=O、およびCHOR9から成る群より選択され、またはR2およびR3は、それらが結合される炭素原子とともに、3員エポキシド環を形成し、R4は、CH2、C=O、CHOH、およびNHから成る群より選択され、R5は、結合、O、NH、およびC=Oから成る群より選択され、R6は、Hおよびから成る群より選択され、R7は、CH2、CHCH3、CHCH2CH3、C=CH2、およびC=CHCH3から成る群より選択され、R8は、HおよびCH3から成る群より選択され、R9は、C=OCH2nCH3およびから成る群より選択され、nは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、および18から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記ブラシノステロイド化合物は、22S,23S-ホモブラシノリドHB、22S,23S-ホモカスタステロン、22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリド、22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロン、22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリド、22S,23S-7-アザ-ホモブラシノリド、22R,23R-ホモブラシノリド、22S,23S-エピブラシノリド、および22R,23R-エピブラシノリドから成る群より選択される、請求項1または2に記載の方法。前記全身同化作用は、アンドロゲン副作用を最小限含む、または全く含まない、請求項1~3のうちのいずれか1項に記載の方法。前記全身同化作用は、筋肉または皮膚の同化作用的に有利な状態である、請求項1~4のうちのいずれか1項に記載の方法。筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、筋細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、または減少したタンパク質分解によって測定される、請求項1~5のうちのいずれか1項に記載の方法。筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した骨格筋量によって測定される、請求項1~6のうちのいずれか1項に記載の方法。前記増加した骨格筋量は、筋線維の増加した総数によって、または筋線維の増加した断面積によって測定される、請求項1~7のうちのいずれか1項に記載の方法。前記筋繊維の増加した数は、増加したI型および/またはII型筋線維によって測定される、請求項1~8のうちのいずれか1項に記載の方法。筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した除脂肪体重、増加した体重増加、および/または減少した脂肪塊によって測定される、請求項1~9のうちのいずれか1項に記載の方法。筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、増加した身体能力、増加した体力、および/または増加した身体の健康によって測定される、請求項1~10のうちのいずれか1項に記載の方法。前記増加した体力は、増加した握力によって測定される、請求項1~11のうちのいずれか1項に記載の方法。筋肉の前記同化作用的に有利な状態は、アルファセリン/トレオニンタンパク質キナーゼAKTの増加したリン酸化によって測定される、請求項1~11のうちのいずれか1項に記載の方法。皮膚の前記同化作用的に有利な状態は、皮膚細胞内における、増加したタンパク質合成、増加したタンパク質蓄積、減少したタンパク質分解、または短縮した創傷治癒時間によって測定される、請求項1~5のうちのいずれか1項に記載の方法。前記増加したタンパク質合成は、増加したコラーゲン産生によって測定される、請求項14に記載の方法。前記増加したタンパク質蓄積または前記減少したタンパク質分解は、増加したコラーゲンによって測定される、請求項14に記載の方法。前記増加したタンパク質合成は、増加したエラスチン産生によって測定される、請求項14に記載の方法。前記増加したタンパク質蓄積または前記減少したタンパク質分解は、増加したエラスチンによって測定される、請求項14に記載の方法。前記短縮した創傷治癒時間は、皮膚創傷の50が塞がれる時間によって測定される、請求項14に記載の方法。前記短縮した創傷治癒時間は、元の創傷サイズの割合によって測定される、請求項14に記載の方法。前記短縮した創傷治癒時間は、減少した炎症に起因する、請求項14に記載の方法。前記減少した炎症は、TGF-βメッセンジャーRNAの減少した発現、TNF-αメッセンジャーRNAの減少した発現、またはICAM-1メッセンジャーRNAの減少した発現によって測定される、請求項21に記載の方法。皮膚の前記同化作用的に有利な状態は、増加した弾性、増加した平滑性、低減したしわ、および/または健康な輸血に起因する向上した色を有する皮膚によって実証される、請求項1~5のうちのいずれか1項に記載の方法。前記ブラシノステロイド化合物は、約0.1mg/kgから約1000mg/kgの投与量で前記被検体に少なくとも毎週投与される、請求項1~23のうちのいずれか1項に記載の方法。前記ブラシノステロイド化合物は、約0.1mg/kgから約1000mg/kgの投与量で前記被検体に毎日投与される、請求項1~24のうちのいずれか1項に記載の方法。前記ブラシノステロイド化合物は、約0.1mg/kgから約1000mg/kgの投与量で毎日2回投与される、請求項1~25のうちのいずれか1項に記載の方法。前記ブラシノステロイド化合物は、数日から数週間または数日から数ヶ月の期間にわたって投与される、請求項1~26のうちのいずれか1項に記載の方法。前記化合物は、局所的に、非経口的に、または経腸的に投与される、請求項1~27のうちのいずれか1項に記載の方法。前記局所性投与は、化粧用途のための皮膚に対するものである、請求項1~28のうちのいずれか1項に記載の方法。前記被検体は、ほ乳類である、請求項1~29のうちのいずれか1項に記載の方法。前記ほ乳類は、ヒトである、請求項1~30のうちのいずれか1項に記載の方法。本開示は、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持のために同化作用的に有利な状態を誘発するための、式Iで定義される化合物を含む、ブラシノステロイド化合物を使用する方法を提供する。しかしながら、本開示の主題の実施形態が詳細に説明される前に、本開示は、その用途において、以下の説明で記載される、または図および実施例で例証される構成要素の構造および配列の詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される節の見出しは、組織的な目的によるものにすぎず、説明される主題を限定するものとして解釈されない。本願で引用される全ての参考文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。本開示は、他の実施形態を包含し、種々の方法で実践または実行される。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的によるものであり、限定的と見なされるべきではないことを理解されたい。含む、備える、有するといった用語、およびそれらの変化例は、以降に記載される項目およびそれらの同等物、ならびに付加的な主題を包含するように意図されている。定義特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示で使用される用語の多くの一般定義を当業者に提供する:Singleton,etal.,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY2ded.1994;THECAMBRIDGEDICTIONARYOFSCIENCEANDTECHNOLOGYWalkered.,1988;THEGLOSSARYOFGENETICS,5THED.,R.Rieger,etal.eds.,SpringerVerlag1991;およびHaleandMarham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY1991.以下の略称が全体を通して使用される。本明細書では、本明細書および添付の請求項で使用されるように、1つのおよびそのといった単数形は、文脈が特に明確に決定しない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。範囲は、種々の態様では、約あるいはおよその1つの特定の値から、および/または約あるいはおよその別の特定の値までとして、本明細書で表される。先行詞約の使用によって、値が近似として表される時に、ある量の変動が範囲に含まれることが理解されるであろう。本明細書で使用されるように、以下の用語は、特に指定されない限り、それらに帰属する意味を有する。同化という用語は、例えば、アミノ酸からの筋タンパク質または皮膚タンパク質の合成等の、複合分子がより単純な分子から合成される、代謝過程を表すと理解される。同化状態は、体内のどの場所でもタンパク質合成の刺激および/またはタンパク質の減少した分解のいずれか一方を通して、窒素が除脂肪体重で特異的に保持される、状態として定義されるKuhn,RecentProg.Horm.Res.57:411-434,2002。同化過程は、臓器および組織を蓄積する傾向がある。これらの過程は、細胞の成長および分化、概して、複合分子の合成を伴う過程である、身体サイズの増加を生じる。同化過程および作用の実施例は、筋肉量、骨量、赤血球産生の増加、ならびに皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンの合成の増加を含む。加えて、同化という用語は、抗異化過程である作用機序を含む。異化という用語は、破壊的である代謝過程を表すと理解される。そのような破壊過程は、タンパク質の分解またはタンパク質分解等の、より大きい分子のより小さい分子への分解を伴う。本開示の種々の態様では、ブラシノステロイドは、タンパク質分解に抗異化作用を及ぼす、すなわち、タンパク質分解を阻害する。全身同化作用という用語は、被検体の全身への全体的なプラス作用を表すと理解される。そのような同化作用は、特に筋肉および皮膚の組織および組織内で、細胞組織の蓄積同化をもたらす、細胞内のタンパク質合成の増加、ならびに体力、耐久力、および除脂肪体重の増加等の一般作用によって示される。同化作用的に有利な状態という用語は、タンパク質合成が増加させられ、および/またはタンパク質蓄積の増加とともにタンパク質分解が減少させられる、蓄積のプラスの状態を指す。いくつかの態様では、筋肉の同化作用的に有利な状態は、筋肉タンパク質合成が刺激され、筋タンパク質が蓄積し、体力および/またはサイズが増加し、より短い回復期間を経る筋肉をもたらすことを意味すると理解される。他の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、皮膚タンパク質合成が刺激され、皮膚タンパク質が蓄積し、より堅い、あるいは増加した弾性および/または若々しい外見増加した平滑性、低減したしわ、および健康な輸血に起因する色を有する皮膚をもたらすことを意味すると理解される。特定の態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、皮膚がより若く見え、より少ないしわを有することを意味すると理解される。より具体的な態様では、皮膚の同化作用的に有利な状態は、創傷治癒時間が縮小されることを意味すると理解される。その結果として、皮膚がより速く治癒する。結果として、式Iの化合物および本明細書で説明されるブラシノステロイド化合物を用いた処置が同化作用的に有利な状態を誘発するため、化合物は、骨格筋および皮膚の成長、修復、および維持において有用である。最小限のアンドロゲン副作用を伴う、またはアンドロゲン副作用を全くないという用語は、男性生殖器および典型的な男性の体毛パターンの発達、ならびに男性型はげ頭症、前立腺肥大、およびにきび等の望ましくない作用を含む、固有の男性特質に起因する因子等の男性ステロイドに起因し得る副次的作用がほとんどない、または全くないことを示すと理解される。有効量および治療的有効量という用語はそれぞれ、本明細書で説明されるような被検体における筋肉および皮膚の全身同化作用または同化作用的に有利な状態を支援するために使用される、ブラシノステロイド化合物の量を指す。例えば、治療的有効量は、本開示のいくつかの態様では、被検体において、筋肉量を増加させる、除脂肪体重を増加させる、脂肪塊を減少させる、身体能力を増加させる、体力を増加させる、タンパク質産生を増加させる、タンパク質蓄積を増加させる、タンパク質分解を減少させる、またはそれらの組み合わせを行うために必要な量となる。本明細書で使用されるような対照は、活性、陽性、陰性、または媒介物対照を指すことができる。当業者によって理解されるように、対照は、実験結果の関連性を確立するために使用され、試験されている状態の比較を提供する。AKTは、グルコース代謝、細胞増殖、アポトーシス、転写、および細胞移動等の複数の細胞過程で主要な役割を果たす、セリン/トレオニンタンパク質キナーゼである。AKTは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている下流標的を変調する、IGF-1信号伝達経路内の主要な仲介物である。骨格筋の中の構成的に活性なAKTの活性化は、向上した代謝を伴う急速な筋肉肥大につながるIzumiyaetal.,Cell.Metab.7:159-172,2008。AKTが、タンパク質合成および分解を調節することが知られている細胞内標的を変調するため、AKT活性化へのブラシノステロイド作用を判定するようにAKTリン酸化が測定される。ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質という用語は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基のポリマーを指すために、本明細書で交換可能に使用される。タンパク質という用語は、典型的には、大型ポリペプチドを指す。ペプチドという用語は、典型的には、短ポリペプチドを指す。化粧用途という用語は、身体またはそのある部分、例えば、皮膚の外見を増進させる際の使用を意味すると理解される。化粧品は、スキンケアクリーム、ローション、パウダー、香水、リップスティック、マニキュア液、アイおよびフェイシャルメイク、ウェットティッシュ、パーマネントウェーブ、カラーコンタクトレンズ、ヘアカラー、ヘアスプレーおよびジェル、デオドラント、手の殺菌剤、ベビー用品、バスオイル、バブルバス、バスソルト、バター、および身体または身体部分の外見を向上させるように設計されている多くの他の種類の製品を含む。一態様では、本明細書で説明されるブラシノステロイド化合物は、皮膚の外見を向上させるように、スキンケアクリーム、ローション、または化粧品の中に処方される。ある期間にわたってという用語は、少なくとも数日を意味すると理解される。いくつかの態様では、期間は、医師によって必要と判定されるような、数週間、数ヶ月間、または数年間の処置を含むことができる。本明細書で使用されるように、ブラシノステロイドまたはBRという用語は、その類似体、変異体、および誘導体を含む、当技術分野で公知の全ての天然および合成BRを含む、第6部類の植物ホルモンとして認識されているポリヒドロステロイドの類を表すと理解される。類似体、変異体、または誘導体は、ある場合においては程度が異なるが、自然発生分子と構造が実質的に同様であり、同一または同様の生物学的活性を有する、化合物である。ブラシノステロイドの構造、生物活性、および用途の論評が、ZulloらBraz.J.PlantPhysiol.14:143-81,2002によって提供され、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。彼らの発見以来、70個以上のBR化合物が植物から単離されておりBajguz,PlantPhysiol.Biochem.45:95-107,2007、の全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。本開示のいくつかの態様では、ブラシノステロイドは、式Iの化合物およびその誘導体を含む、組成物を含むと理解される。式中、R1およびR2はそれぞれ、HおよびOHから成る群より独立して選択され、R3は、CHOH、CHF、C=O、およびCHOR9から成る群より選択され、またはR2およびR3は、それらが結合される炭素原子とともに、3員エポキシド環を形成し、R4は、CH2、C=O、CHOH、およびNHから成る群より選択され、R5は、結合、O、NH、およびC=Oから成る群より選択され、R6は、Hおよびから成る群より選択され、R7は、CH2、CHCH3、CHCH2CH3、C=CH2、およびC=CHCH3から成る群より選択され、R8は、HおよびCH3から成る群より選択され、R9は、C=OCH2nCH3およびから成る群より選択され、nは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、および18から成る群より選択される。ブラシノステロイドの合成種々の態様では、BRは、カンペステロールから生合成される。生合成経路は、日本人研究者らによって解明され、後にシロイヌナズナ、トマト、およびエンドウマメにおけるBR生合成突然変異体の分析を通して正しいことが示された。最も豊富で広く発生しているブラシノステロイドは、C28ステロイドであり、それらの中でも、ブラシノリドが最も生物学的に活性である。ブラシノリドは、セイヨウアブラナからの花粉が茎伸長および細胞分割を推進でき、生物学的に活性な分子が単離されることが示された、1979年に、最初の単離されたブラシノステロイドであった。植物は、全てステロイド生合成経路に由来する、ブラシノリドの生合成のための複数の経路を有する。カンペスタノールからカスタステロンCSへの2つの経路である、C6酸化および後期C6酸化経路は、多くの植物で作動する。別の分岐経路である、初期C22酸化経路は、シロイヌナズナのブラシノステロイド欠損突然変異体を使用して実証された。カンペステロールから6-デオキソチファステロールからのショートカット経路は、ブラシノステロイド生合成に関与するシトクロムP450モノオキシゲナーゼの機能分析によって実証された。したがって、少なくとも4つの経路が、CSの生合成に関与し、CSは、B環のラクトン化によってブラシノリドBLにさらに代謝される。付加的な説明が、FujiokaらAnnu.Rev.PlantBiol.54:137-64,2003によって提供され、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。種々の態様では、以下のブラシノステロイドが使用される:[22S,23S-ホモブラシノリドHBまたは28-ホモブラシノリドまたはHBとしても知られている、22S,23S,24S-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-β-ホモ-7-オキソ-5α-コレスタン-6-オン]、22S,23S,24R-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-メチルB-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン、22R,23R,24R-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-メチル-B-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン、22S,23S-ホモカスタステロン、22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリド、22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロン、22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリド、22S,23S-7-アザ-ホモブラシノリド、22R,23R-ホモブラシノリド、22S,23S-エピブラシノリド、オヨビ22R,23R-エピブラシノリド。アエグレマルメロスコレアミカン科から単離されたブラシノステロイドである、24-エピブラシノリドEBLが、種々の態様では、本開示の方法で使用するために含まれる。HB図1が、WaterstoneTechnologyCarmel,INまたはSciTechPraha,CzechRepublicから購入され、その構造が、ESI-LCMSおよびNMRによって確認された。22S,23S,24R-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-メチル-B-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オンおよび22R,23R,24R-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-メチル-B-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オンが、SciTechPraha,CzechRepublicから購入され、それらの構造が、ESI-LCMSおよびNMRによって確認された。図12は、本明細書で使用されるブラシノステロイドのうちのいくつかの合成を説明する。いくつかの態様では、ブラシノステロイドが、細胞へのそれらの作用を調べるために投与される。態様では、ブラシノステロイドは、約0.01μMから約100μMの濃度で投与される。いくつかの態様では、ブラシノステロイドは、約0.1μMから約50μMの濃度で投与される。種々の態様では、ブラシノステロイドは、約0.2μM、約0.3μM、約0.4μM、約0.5μM、約0.6μM、約0.7μM、約0.8μM、約0.9μM、約1.0μM、約2.0μM、約3.0μM、約4.0μM、約5.0μM、約6.0μM、約7.0μM、約8.0μM、約9.0μM、約10μM、約11μM、約12μM、約13μM、約14μM、約15μM、約16μM、約17μM、約18μM、約19μM、約20μM、約21μM、約22μM、約23μM、約24μM、約25μM、約26μM、約27μM、約28μM、約29μM、約30μM、約35μM、約40μM、または約45μMの濃度で投与される。化学物質種々の態様では、本開示で説明される、より多くの方法のうちの1つに関する種々の実験を実行するために、化学物質が購入された。L-[2,3,4,5,6-3H]-フェニルアラニンが、GEHealthcarePiscataway,NJから入手された。Phospho-AKTおよびAKTmAbsが、CellSignalingTechnologyDanvers,MAから購入された。qPCRに使用された試薬および酵素が、StratageneLaJolla,CAおよびAppliedBiosystemsFosterCity,CAから入手された。全ての他の化学物質および細胞培地は、特に指定されない限り、InvitrogenCarlsbad,CAおよびSigmaSaintLouis,MOから入手された。細胞培養いくつかの態様では、細胞培養実験が実行された。ラットL6骨格筋細胞株CRL-1458がATCCManassas,VAから入手された。筋芽細胞が、37°Cおよび5CO2にて、10FBSおよび0.1ペニシリンストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地DMEMの中で定期的に維持された。細胞が、タンパク質合成、分解、および細胞生存研究のために24ウェルプレートの中へ、ならびにウェスタンブロット分析のために6ウェルプレートの中へ培養されたGreinerBioOne,Monroe,NC。いったん細胞が90集合に達すると、血清濃度を2まで下げることによって分化が誘発され、培地が2日ごとに交換された。培養の7~9日後に、筋芽細胞は多核筋管に融合していたMandeletal.,Nature251:618-620,1974。NIH3T3マウス胚線維芽細胞株ATCCCCL-92が、37°Cおよび5CO2にてDMEMおよび10FBSの中で維持され、3~4日ごとに継代培養された。他の態様では、皮膚細胞へのブラシノステロイドの作用を調べるように、細胞培養実験が実行される。ヒトケラチン生成細胞の培養は、皮膚の細胞生物学の研究のための便利で有用なモデルである。しかしながら、種々の態様では、当技術分野で皮膚タンパク質の研究に使用される任意の細胞が、本開示で使用される。いくつかの態様では、コラーゲンおよびエラスチンへのブラシノステロイドの作用が研究される。コラーゲンおよびエラスチンは、人体内で作製されて使用される、構造タンパク質である。コラーゲンは、主に腱、靱帯、ならびに皮膚、血管、および肺の結合組織で見出される。エラスチンは、主に動脈壁、肺、腸、および皮膚で見出される。これらのタンパク質は、結合組織内で連携して機能する。コラーゲンは、結合組織および臓器が機能することができるように、それらに剛性を与え、エラスチンは、それらを伸張させ、元の状態に戻らせる。コラーゲンは、エラスチンが破壊点まで伸張することを可能にしない。皮膚では、コラーゲンおよびエラスチンは、表皮の直下の層であり、真皮の主要構成要素である。コラーゲンおよびエラスチンは、皮膚の支持構造を提供する。ブラシノステロイドは、いくつかの態様では、そのような皮膚タンパク質に同化作用を及ぼす、すなわち、コラーゲンおよびエラスチンの産生を増加させ、コラーゲンおよびエラスチンの蓄積を増加させ、コラーゲンおよびエラスチンの分解を減少させる。細胞生存試験および用量範囲判定種々の態様では、細胞生存が測定され、化合物および試薬の用量の作用が細胞株で試験される。いくつかの態様では、細胞生存が、MTT3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド分析によって3通りに測定されMosmannetal.,J.Immunol.Methods65:55-63,1983、マイクロプレートリーダMolecularDevices,Sunnyvale,CAを使用して、550nmにて分光光度法で定量化された。媒介物0.1エタノールと比較して細胞生存の変化を示さなかった試薬の濃度が、さらなる研究のために選択された。タンパク質合成の測定種々の態様では、タンパク質合成が、特定のタンパク質へのブラシノステロイドの作用を判定するように測定された。タンパク質合成を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。ブラシノステロイド用量反応研究では、完全に分化した筋管が、無血清DMEMで洗浄され、媒介物0.1エタノール、増加する濃度のHB、または陽性対照として6.5nMのインスリン様成長因子1IGF-1で3通りに処置された。化合物が、0.5μCi/mL[3H]-フェニルアラニンを含有する無血清培地に追加され、4時間培養された。HB経時変化研究のために、完全に分化した筋管が、同じ培養条件を使用して、3μMHBで1~24時間処置された。氷上に細胞を置き、培地を破棄し、組み込まれていない放射標識を除去するように冷たいPBSで細胞を広く洗浄することによって、培養が停止された。タンパク質が、5トリクロロ酢酸で沈殿させられ、0.5NNaOH中で溶解させられたMontgomeryetal.,MethodsCell.Sci.24:123-129,2002。タンパク質結合フェニルアラニンの比放射能が、液体シンチレーションカウンタLS6500BeckmanCoulter,Fullerton,CAを使用して定量化され、BCAタンパク質分析PierceBiotechnology,Rockford,ILによって判定された総タンパク量のmgに正規化された。タンパク質分解の測定種々の態様では、タンパク質分解が、特定のタンパク質へのブラシノステロイドの作用を判定するように測定される。タンパク質分解を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。タンパク質分解へのブラシノステロイドの作用が、わずかな修正を伴って、FawcettらArch.Biochem.Biophys.385:357-363,2001によって説明されるように、完全に分化した筋管で調査された。完全に分化した筋管が、1.5μCi/mL[3H]-フェニルアラニンを用いた細胞タンパク質の標識化を可能にするように16時間培養された。細胞が、組み込まれていない放射標識を除去するようにPBSで2回洗浄され、媒介物0.1エタノール、増加する濃度のブラシノステロイド、または無血清培地中の10nMのインスリンで4時間処置された。氷上に細胞を置くことによって、培養が停止され、培地中のタンパク質が、5トリクロロ酢酸で沈殿させられた。無タンパク質フェニルアラニン比放射能が、液体シンチレーションカウンタLS6500BeckmanCoulter,Fullerton,CAを使用して定量化され、BCAタンパク質分析PierceBiotechnology,Rockford,ILによって判定された総細胞タンパク量のmgに正規化された。タンパク質濃度およびタンパク質検出種々の態様では、タンパク質検出の方法およびタンパク質濃度を測定する方法が実行される。タンパク質を検出し、タンパク質濃度を測定するための全ての既知の方法が、本開示の方法に含まれる。いくつかの態様では、ウェスタンブロット分析が実行された。完全に分化したL6筋管が、上記で説明されるように培養され、全細胞抽出物が、10mMフッ化ナトリウム、2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMPMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルSigmaが補充された冷たいRIPA緩衝液の中で沈殿させられ、4°Cにて12,000gで20分間遠心分離された。上清からの等量のタンパク質50μgが、10SDSポリアクリルアミドゲル上で分離され、ニトロセルロース膜上にブロットされた。ウェスタンブロット検出が、製造業者の指示CellSignalingTechnology,Danvers,MAに従って、モノクローナルphospho-AKTSer473抗体を用いて実行された。洗浄された後、ブロットは、抗ウサギペルオキシダーゼ標識二次抗体用いて培養され、ECLウェスタンブロッティング検出試薬GEHealthcare,Piscataway,NJを使用して可視化された。揮散された後、同じブロットは、ローディング対照としての機能を果たすように、全AKT抗体を用いて精査された。アンドロゲン受容体結合ラットアンドロゲン受容体結合分析が、参照することにより本明細書に組み込まれる、他の場所で説明されるようにChangetal.,J.SteroidBiochem.27:123-131,1987、MDSPharmaServicesTaiwanによって行われた。媒介物1DMSO、増加する濃度のHB、またはメタンドロステノロンが、特異的結合リガンド[3H]-ミボレロンの存在下で4°Cにて4時間培養され、培養緩衝液のDPMが、リガンドの変位を定量化するように測定された。各処置が2~3回繰り返され、結果が平均化された。動物実験および遺伝子発現研究6週齢オスウィスター系ラット180~220g、CharlesRiverLaboratories,MAが、12時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。動物は、食物および水に自由にアクセスできた。動物は、7日間新しい条件に適応させられ、動物の取扱は、物理的操作のストレスを低減するように、この時間の間に毎日実行された。動物は、投薬の1日前に体重によってグループに無作為化された。プロトコル1:23.9タンパク質、10.7脂肪、5.1繊維、および58.7炭水化物を含有する通常食を与えられ、4.61kcal/gエネルギー値5001RodentChow食、Purina,St.Louis,MOをもたらした、ウィスター系ラットの3つのグループn=6が、1mlの媒介物トウモロコシ油中の5DMSO、20mg/kgまたは60mg/kg体重のHBを、24日間毎日強制経口投与された。各動物の体重および消費された食物の総量こぼれたものを計上したが、実験の持続時間にわたって2日ごとに記録された。実験の終了時に、血液がCO2吸入後の心臓穿刺によって収集され、動物の身体組成が、LunarProdigyDensitometerGEHealthcare,Waukesha,WIを使用したDEXA二重エネルギーX線吸収分析によって評価された。解剖時に、組織重量が記録された。組織サンプルが、液体窒素中でスナップ凍結することによって収集され、さらなる研究のために-80°Cで保管された。総RNAがTrizolを使用して単離され、その数量および純度が、NanoDropNanodropTechnologies,Wilmington,DEを使用して判定された。プールRNAサンプルが、ラットインスリン信号伝達PCRアレイQiagen,Valencia,CAに使用され、製造業者のプロトコルに従って分析された。cDNA合成および定量的PCR分析が、本質的にKomarnytskyらによって説明されるように行われたInt.J.Obes.Lond、2010Sep7,Potatoproteaseinhibitorsinhibitfoodintakeandincreasecirculatingcholecystokinlevelsbyatrypsin-dependentmechanism,[印刷前Epub;PMID:20820171[PubMed-出版者によって供給]]。プロトコル2:39.4タンパク質、10.0脂肪、4.3繊維、および37.0炭水化物を含有する高タンパク質食を与えられ、3.93kcal/gエネルギー値5779食、Testdiet/Purina,Richmond,INをもたらした、ウィスター系ラットの3つのグループn=8が、1mlの媒介物トウモロコシ油中の5DMSO、20または60mg/kgのHBを、24日間毎日強制経口投与された。全ての手順および測定はプロトコル1に従った。プロトコル3:4週齢の擬似手術を受けた擬似、n=6または精巣摘出されたORX、n=24ウィスター系ラットCharlesRiverLaboratories,MAが、擬似、ORX媒介物、ORX経口的に20mg/kgHB、ORX経口的に60mg/kgHB、およびORX皮下に分析のための陽性対照としての機能を果たす0.4mg/kgプロピオン酸テストステロンといった実験条件下で、10日間のハーシュバーガー分析外科的に去勢された思春期前後の成体モデルを受けた。身体組成測定が行われなかったことを除いて、全ての手順および測定はプロトコル1に従った。ProductSafetyLaboratoriesDayton,NJによるデジタルフォースゲージWagnerInstrumentsモデルFDV5を使用して、肢の握力が、対照動物および60mg/kgHBを受容した動物について測定された。ラットは、足でスクリーンを握らされた後、足がスクリーンから解放されるまで迅速に引っ張られ、必要な解放力が記録された。各動物での3回の試験が3通りに行われ、スチューデントのt検定を使用して有意性が判定されたp<0.05。腓腹筋に加えて、アンドロゲン感受性組織腹側前立腺、精嚢、球海綿体筋/肛門挙筋複合体、陰茎亀頭、およびカウパー腺が解離され、重量を量られた。プロトコル4:4週齢の擬似手術を受けた擬似、n=6または精巣摘出されたORX、n=24ウィスター系ラットCharlesRiverLaboratories,MAが、擬似、ORX媒介物、ORX皮下に0.4mg/kgHB、ORX皮下に4mg/kgHB、およびORX皮下に分析のための陽性対照としての機能を果たす0.4mg/kgプロピオン酸テストステロンといった実験条件下で、10日間のハーシュバーガー分析外科的に去勢された思春期前後の成体モデルを受けた。全ての手順および測定はプロトコル1に従った。骨格筋骨格筋は、体性神経系の制御下にある横紋筋組織の形態である。それは、3つの主要な筋肉型のうちの1つであり、その他は心筋および平滑筋である。その名前が示唆するように、ほとんどの骨格筋は、腱として知られているコラーゲン繊維の束によって骨に取り付けられている。骨格筋は、筋線維として知られている個々の構成要素で構成されている。これらの線維は、発達性筋芽細胞筋細胞を生じる一種の胚前駆細胞の融合から形成される。筋原線維筋線維は、骨格筋の横紋のある外見に関与し、筋肉収縮に必要な基本機構を形成する基本機能単位である、サルコメアとして反復されるアクチンおよびミオシン筋原線維から成る、長い円筒形の多核細胞である。筋肉という用語は、結合組織によってともに保持される、筋線維の複数の束を指す。筋線維個々の筋線維は、発達中に、筋芽細胞として知られているいくつかの未分化未熟細胞の長い円筒形の多核細胞への融合から形成される。この状態への分化は主に、その後にサイズが増大し続ける細胞とともに、出生前に完了する。骨格筋は、筋線維の細胞質内の細胞骨格要素の配列により、顕微鏡下で視認した時に独特の横縞模様を示す。主要な細胞質タンパク質は、サルコメアと呼ばれる反復単位で配列される、ミオシンおよびアクチンそれぞれ、厚いおよび薄いフィラメントを形成するである。ミオシンおよびアクチンの相互作用は、筋肉収縮に関与する。存在するミオシンの種類高速または低速、および線維が受ける酸化的リン酸化の程度といった、筋線維を分類する2つの主要な方法がある。したがって、骨格筋は、I型およびII型といった2つの広いカテゴリに分けることができる。I型線維は、酸素結合タンパク質ミオグロビンの存在により、赤く見える。I型線維は、耐久力に適しており、ATPを生成するために酸化的代謝を使用するため、ゆっくり疲労する。II型線維は、ミオグロビンの欠如および糖分解酵素への依存により、白く見える。II型線維は、短い爆発的な速さおよび力に効率的であり、特定の亜型に応じて、酸化的代謝および嫌気的代謝の両方を使用し、より早く疲労する。個々の筋肉は、3つの種類の筋線維I型、IIa型、およびIIb型の混合物であるが、それらの割合は、その筋肉の動作に応じて異なる。弱い収縮が必要とされる場合、I型運動単位のみが活性化される。より強い収縮が必要とされる場合、I型線維を支援するように、IIa型線維が活性化または使用される。最大限の収縮は、常に最後に活性化されるIIb型線維の使用を促進する。これらの線維は、弾道的活動中に使用されるが、容易に疲れる。筋肉組織学組織学的分析用の筋肉サンプルが、ORXおよびHB処置と関連付けられる線維型分布および断面積の差異の観察を可能にするように、プロトコル4本明細書の上記で説明されるに従って処置された去勢動物の混合線維腓腹筋の中央部から採取された。連続横断低温切開片10μmが、各筋肉から調製され、アルカリ性pH=9.5前保温後に筋原線維アデノシン三リン酸mATPase組織化学について分析された。線維断面積および酵素活性レベルが、ImageJソフトウェアNationalInstitutesofHealth,Bethesda,MDを使用してグレーレベル写真として保管された、筋肉断面のデジタル化画像から判定された。血漿サンプルの分析血液サンプルが、心臓穿刺によって一晩絶食した動物から採取され、EDTA被覆管の中に収集され、1,500gで20分間遠心分離され、分離された血漿が分析まで-80°Cで保管された。LifescanグルコメータJohnsonandJohnson,NewBrunswick,NJを使用して、グルコースが血液サンプル中で測定された。インスリンの血漿中濃度が、ラット/マウスインスリンELISAキットMillipore,Billerica,MAによって判定された。血漿トリグリセリドおよび総コレステロールが、酵素比色分析WakoDiagnostics,Richmond,VAによって測定された。血漿サンプル中の総テストステロンが、ELISA分析DRGDiagnostics,Marburg,Germanyによって定量化された。統計Prism4.0GraphPadSoftware,SanDiego,CAを使用して、統計分析が実行された。特に記述がない限り、データは、処置を因子として用いた一元配置ANOVAによって分析された。ダネットの多重比較試験を使用して、個々の実験グループ間の差異のポストホック分析が行われた。体重増加が、時間および処置を独立変数として用いた2因子反復測定ANOVAによって分析された。有意性がp<0.05に設定された。値が平均±SEMとして報告された。50阻害濃度IC50が、非線形回帰曲線分析によって計算された。投与経路および投与量本開示は、局所、腸内、または非経口投与に利用可能である、生物学的に活性な化合物、すなわち、ブラシノステロイド化合物またはブラシノステロイド化合物単独を含む、組成物を検討する。局所投与については、化合物は、種々の態様では、経真皮的に、経粘膜的に、経皮的に、点眼薬を介して、点耳薬を介して、または吸入によって送達される。特定の態様では、化合物は、化粧目的で皮膚に経皮的に塗布される。腸内/非経口投与については、化合物は、種々の態様では、経口的に、経直腸的に、舌下で、唇下で、頬側に、注射によって、または注入によって送達される。特定の態様では、化合物は、注射される時に、静脈内に、動脈内に、皮下に、皮内に、筋肉内に、心臓内に、心膜に、髄腔内に、腹腔内に、膀胱内に、硝子体内に、膣内に、硬膜外に、または鼻腔内に注射される。いくつかの態様では、生物学的に活性な化合物は、経口投与のために錠剤化され、カプセル化され、または別様に処方される。いくつかの態様では、組成物は、医薬組成物、栄養補助組成物例えば、栄養補助食品として、あるいは米国食品医薬品局によって定義されるような食品および飲料添加物として提供される。上記の組成物の投与形態は、特に制限されない。例えば、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、粉末、坐薬、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、滅菌等張水性緩衝溶液、および同等物が全て、好適な投与形態として検討される。いくつかの態様では、組成物は、1つ以上の希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、湿潤剤、放出制御基質、着色剤、香味料、担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、市販のアジュバント、および/または当技術分野で公知の他の添加剤を含む。種々の態様では、医薬媒介物、賦形剤、または媒体としての機能を果たす、薬学的に容認可能なすなわち、当技術分野で公知であるように無菌で容認可能に非毒性の液体、半固体、または固体希釈剤が使用される。具体的な態様では、希釈剤は、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、鉱油、ココアバター、およびカカオ脂、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、アルギン酸塩、炭水化物、特に、マンニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース、蔗糖、ブドウ糖、ソルビトール、変性デキストラン、アラビアガム、およびデンプンを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様では、そのような組成物は、化合物の物理的状態、安定性、生体内放出速度、および生体内クリアランス率に影響を及ぼす。薬学的に容認可能な充填剤は、ある態様では、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、ブドウ糖、マンニトール、および/または蔗糖を含む。他の態様では、リン酸三カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含む塩が、医薬組成物で充填剤として使用される。いくつかの態様では、結合剤が、組成物をともに保持して硬いタブレットを形成するために使用される。特定の態様では、結合剤は、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチン等の有機生成物からの材料を含む。他の好適な結合剤は、メチルセルロースMC、エチルセルロースEC、およびカルボキシメチルセルロースCMCを含む。いくつかの態様では、化合物は、食品の中に投与される。化合物を含む食品はさらに、身体による化合物の吸収を増加させるように作用する、生体利用性増進剤を含む。生体利用性増進剤は、天然または合成化合物である。一態様では、化合物を含む食品はさらに、化合物の生体利用性を増進させるために、1つ以上の生体利用性増進剤を含む。天然生体利用性増進剤は、ショウガ、キャラウェイ抽出物、コショウ抽出物、およびキトサンを含む。ショウガの中の活性化合物は、6-ジンゲロールおよび6-ショウガオールを含む。キャラウェイ油もまた、生体利用性増進剤として使用することができる米国特許出願2003/022838。ピペリンは、生体利用性増進剤として作用する、コショウコショウまたはヒハツ由来の化合物である米国特許第5,744,161号参照。ピペリンは、Bioperine登録商標SabinsaCorp.,Piscataway,N.J.という商標の下で市販されている。いくつかの態様では、天然生体利用性増進剤は、食品の総重量に基づいて、約0.02重量から約0.6重量の量で存在する。好適な合成生体利用性増進剤の実施例は、Gelucire登録商標、Labrafil登録商標およびLabrasol登録商標、Lauroglycol登録商標、PleurolOleique登録商標GattefosseCorp.,Paramus,N.J.、ならびにCapmul登録商標AbitecCorp.,Columbus,Ohioを含むが、それらに限定されない。化合物の量および投与レジメンは、投与の目的に関連する種々の因子、例えば、被検体の年齢、性別、体重、ホルモンレベル、または被検体の他の栄養必要量に基づく。いくつかの態様では、化合物は、約0.001mg/kg体重から約10g/kg体重の投与量、すなわち量で、被検体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、約0.005mg/kg体重の量で被検体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、約0.01mg/kg体重、約0.02mg/kg体重、約0.03mg/kg体重、約0.04mg/kg体重、約0.05mg/kg体重、約0.06mg/kg体重、約0.07mg/kg体重、約0.08mg/kg体重、約0.09mg/kg体重、約0.1mg/kg体重、約0.2mg/kg体重、約0.3mg/kg体重、約0.4mg/kg体重、約0.5mg/kg体重、約0.6mg/kg体重、約0.7mg/kg体重、約0.8mg/kg体重、約0.9mg/kg体重、約1mg/kg体重、約2mg/kg体重、約3mg/kg体重、約4mg/kg体重、約5mg/kg体重、約6mg/kg体重、約7mg/kg体重、約8mg/kg体重、約9mg/kg体重、約10mg/kg体重、約20mg/kg体重、約30mg/kg体重、約40mg/kg体重、約50mg/kg体重、約60mg/kg体重、約70mg/kg体重、約80mg/kg体重、約90mg/kg体重、約100mg/kg体重、約150mg/kg体重、約200mg/kg体重、約250mg/kg体重、約300mg/kg体重、約350mg/kg体重、約400mg/kg体重、約450mg/kg体重、約500mg/kg体重、約550mg/kg体重、約600mg/kg体重、約650mg/kg体重、約700mg/kg体重、約750mg/kg体重、約800mg/kg体重、約850mg/kg体重、約900mg/kg体重、約950mg/kg体重、約1g/kg、約2.5g/kg体重、約5g/kg体重、約7.5g/kg体重、または10g/kg体重の量で被検体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、1日につき約1μg/kg体重から1日につき約10g/kg体重の投与量で動物被検体に投与される。特定の態様では、化合物は、1日につき約1mg/kg体重から1日につき約1g/kg体重の投与量で動物被検体に投与される。より具体的な態様では、化合物は、1日につき約10mg/kg体重から1日につき約100mg/kg体重の投与量で動物被検体に投与される。特定の態様では、レジメンは、化合物の複数用量を含む。一態様では、上記で立案されるような化合物レジメンは、1日につき1回投与される。いくつかの態様では、化合物は、数日、数週間、数ヶ月、または数年の期間にわたって毎日投与される。種々の態様では、化合物は、任意の時に個体に投与される。いくつかの態様では、化合物は、同時に、あるいは食事の摂取の前または後に投与される。本明細書で説明される化合物は、ブラシノステロイド化合物を必要としている被検体にそれを提供するために、人間医学および獣医学の分野で有用であることが理解されるであろう。いくつかの態様では、処置される被検体または個体は、ほ乳類である。特定の態様では、ほ乳類は、ヒトである。獣医学的目的で、被検体は、ほ乳類および非ほ乳類を含む。ある態様では、ほ乳類は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヤギ等の家畜である。種々の態様では、ほ乳類は、イヌおよびネコ等のペットを含む。他の態様では、被検体は、ほ乳類および非ほ乳類となり得る、珍しいおよび/または動物園の動物を含む。他の態様では、被検体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびハムスター等の実験動物を含む。ある態様では、非ほ乳類は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウ等の家禽を含む。一態様では、化合物は、ヒトに投与するために処方され、したがって、果物ベースの風味等のヒトの興味を引く風味を含有する。菓子のような質および風味で処方される化合物もまた、不快な味および質感により、薬剤または栄養補助食品を服用することにしばしば抵抗がある子供にとって魅力的である。別の態様では、化合物は、ヒト以外の動物に投与するために処方される。錠剤およびカプセル等の従来の固体投与形態での動物への化合物の投与は、動物がしばしばそれらを吐き出すという点で問題となり得て、動物が投薬手順に抵抗することを習得するため、連続投与はしばしば困難である。この目的で処方された時に、化合物は、種々の態様では、より典型的にはヒト以外の動物の興味を引く風味、例えば、魚および肉の風味を含有する。本明細書で引用される各出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それが本開示と矛盾しない程度に、その全体で参照することにより組み込まれる。本明細書で説明される実施例および実施形態は、例証目的によるものにすぎず、それを踏まえた種々の修正または変更が当業者に提案され、本願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的で、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。本開示の付加的な態様および詳細が、限定的よりもむしろ例証的となることを目的としている、以下の実施例から明白となるであろう。実施例1:タンパク質合成へのHBの作用HBがタンパク質合成を誘発するかどうかを判定するために、細胞がいくつかの濃度のHB0.3~20μMで4時間処置され、筋管への放射性標識[3H]-フェニルアラニンの取り込みが評価された。より低い濃度1μMで、HBが、対照レベルを上回ってタンパク質合成を12.4±2.3増加させたp<0.05。反応は、それぞれ、34.9±3.1および36.9±2.9の増加を伴って、10から20μMのHBの間で飽和に近づいた図2A。6.5nMでのIGF-1が、この分析で陽性対照としての機能を果たした。IGF-1陽性対照は、タンパク質合成を42.5±4.5増加させた。高濃度のHBは、あまり効果的ではなかった。HBは、MTT分析および細胞学的観察によって確立されるように、最大25μMまで、完全に分化したL6ラット骨格筋管への毒性を示さなかった。タンパク質合成へのHBの速度作用を調査するために、筋管を処置するために50有効用量として選択された3μMHBを用いて、1~24時間研究が実行された。HBに応答したタンパク質合成の時間依存性増加が観察された図2B。HB刺激タンパク質合成は、3時間でピークに達し、処置の4時間後に減少し始めた。タンパク質合成へのIGF-1の同様の速度作用が観察されたが、IGF-1の作用は、より規模が大きかった。この研究は、HBが筋管内のタンパク質合成を用量および時間依存的に刺激したことを示す。実施例2:タンパク質分解への28HBの作用HBがタンパク質分解に影響を及ぼすかどうかを評価するために、[3H]-フェニルアラニンで標識されたタンパク質の分解が、培地の中への酸可溶性放射能の放出について観察された。0.3~20μMの濃度でのHBは、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、HBの作用は、3から10μMの間の濃度で停滞期に達した図2C。より低い濃度で、1μMHBが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を8.2±0.6減少させたp<0.05。より高い濃度で、10μMHBが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を9.5±0.9減少させたp<0.05。10nMでのインスリンが、この分析で陽性対照としての機能を果たし、タンパク質分解を13.0±1.6低減した。HBに応答したタンパク質分解の速度を調査するために、3μMHBを用いて、1~4時間研究が行われた。タンパク質分解の抑制は、時間依存的に発生し、HBおよびインスリンの両方について3時間で停滞期に達した図2D。IGF-1は、インスリンと同様に、タンパク質合成への同化作用および骨格筋内のタンパク質分解への抗異化作用の両方を及ぼすHarperetal.,J.Endocrinol.112:87-96,1987。タンパク質合成は、インスリン注入よりもIGF-1注入に感受性が高く、インスリン受容体によって仲介されないDouglasetal.,J.Clin.Invest.88:614-622,1991。それとは反対に、インスリンは、タンパク質分解を阻害することによって、タンパク質の代謝回転に影響を及ぼすRooyackersetal.,Annu.Rev.Nutr.17:457-485,1997。この研究は、HBがL6ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解を阻害したことを示す。実施例3:HBがAKTのリン酸化を刺激するIGF-1は、PI3K/AKT/GSK-3βおよびPI3K/AKT/mTOR依存性機序を通して筋管内のタンパク質分解を阻害することが、以前に示されているLietal.,Int.J.Biochem.Cell.Biol.37:2207-2216,2005。AKTは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている下流標的を変調する、IGF-1信号伝達経路内の主要な仲介物であることが実証されているHajduchetal.,Diabetes47:1006-1013,1998。プラスの正味タンパク質平衡を誘発するように、それを通してHBが信号伝達する変換経路を特徴付けるために、L6筋管内のAKTのリン酸化レベルが調査された。[3H]-フェニルアラニン取り込み分析で得られた結果と一致して、HBが、用量および時間依存的にAKTのリン酸化を刺激した図3。増加する濃度のHBが、処置の1時間後に3μMHBを用いて最大3倍までAKTのSer473リン酸化を刺激した図3A。AKT刺激がHBの追加後30分で検出され、リン酸化が最大1時間まで維持された一方で、総AKTタンパク質レベルは不変であった図3B。AKTリン酸化へのHBの作用は、IGF-1について説明されるものほど堅調ではないがRommeletal.,NatCellBiol3:1009-1013,2001、これらのデータは、L6筋管内の同化信号伝達のHB刺激におけるPI3K/AKT経路の役割を支持する。したがって、この研究は、部分的にAKTリン酸化を誘発することによって、HBがL6ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解を阻害したことを示す。AKT活性化を生じた有効HB濃度は、タンパク質合成を変調するために必要とされる濃度と同程度であり、HBがタンパク質合成の刺激およびタンパク質分解の抑制を伴うことを意味する。実施例4:同化作用身体組成へのHBの同化作用動物の身体組成への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、20および60mg/kg体重のHBそれぞれ、HB20およびHB60が、通常食を24日間与えられた健康なラットに経口で毎日投与された。処置の終了時に、HB20またはHB60で処置されたラットの最初の体重に対する全体重増加は、媒介物で処置された対照と比較して、それぞれ18.3および26.8増加した図4A。毎日の食物摂取量合計のわずかであるが統計的に有意な増加対照については20.8±0.4g、HB20については22.2±0.8g、HB60群については23.6±0.5gが、HB投与と関連付けられたが、体重で調整された時に、食物摂取量は全てのグループの間で異ならなかった図4B。したがって、HB処置群内の体重増加の増加は、動物の食性の変化に起因し得ない。DEXA分析によって判定された身体組成は、除脂肪体重がHB207.0およびHB60動物14.2で有意に多かったことを示した。脂肪塊は、それらの対照物と対比して、HB20-3.9およびHB60群-4.9でわずかに少なかった。したがって、HB処置ラットでのより大きい体重増加は、主に増加した除脂肪体重によるものであった表1。表1.HBで処置されたラットの身体組成および血液生化学ラットは、通常23.9タンパク質含量食または高タンパク質39.4タンパク質含量食のいずれか一方を与えられ、20または60mg/kg体重HBを、24日間毎日強制経口投与された。身体組成がDEXAによって測定された。結果は平均±SEMとして表される一元配置ANOVAおよびダネット事後検定によって適切な対照と比較した時にP<0.05、P<0.01、P<0.001。HBの投与は、それぞれ、HB20およびHB60動物で腓腹筋量を15.6および19.0増加させた。全身骨塩量BMCは、HB処置動物でわずかに多かったが、差異は有意性に到達しなかった。HBの補給は基礎血漿コレステロールまたはトリグリセリドに影響を及ぼさなかった。HBのより多くの用量は、対照5.0±0.3mMと対比した、わずかに低い血漿グルコースレベル4.5±0.3mMと関連付けられたが、差異は統計的有意性に到達しなかった。インスリンレベルがわずかに上昇させられた表1。実施例5:高タンパク質食を与えられたラットにおけるHBの同化作用食事タンパク質の短期増加は、おそらく、時間とともに徐々に正常に戻る食事摂取量の最初の減少により、ラットにおいて除脂肪体重に有利に働き、体脂肪を低減できることが示されているJeanetal.,J.Nutr.131:91-98,2001。高タンパク質食が、除脂肪体重および筋肉量へのHB関連作用をさらに増進させることができるかどうかを調査するために、高タンパク質食39.4タンパク質を与えられたラットが、経口で20および60mg/kg体重HBを24時間毎日投与された。高タンパク質食を与えられた対照動物は、通常食を食べた対照動物よりも少ない食物を摂取し、体重増加が少なかった表1。体重および食物摂取へのHBの促進作用が、通常および高タンパク質食の両方の背景で明白であった。高タンパク質食はおそらく、体重増加への低用量のHB20mg/kgの促進作用を増進した図4C。食物摂取量のHB関連増加は、これらの動物で観察されなかった図4D。高タンパク質食に起因し得る、身体組成または血液生化学の付加的な差異がなかった表1。健康なラットへのHBの24日間経口投与は、媒介物で処置された対照と比較して、体重増加、除脂肪体重、および腓腹筋量を選択的に増加させた図4および表1。HB処置動物の高タンパク質食の補給は、低用量のHBの作用を増進した表1。予想通りにJeanetal.、上記、2001、高タンパク質食を与えられた対照動物図4CおよびDは、通常食を与えられた対照動物図4AおよびBと比較して、増加した体重増加、食物摂取量、および他の身体組成パラメータを示した。それらの血漿トリグリセリドも減少させられた表1。HBを用いた処置は、高用量のHBを受容するコホート内でわずかに低かった空腹時グルコースを除いて、通常食または高タンパク質食のいずれか一方を与えられた動物において血液生化学を改変しない。実施例6:HBがアンドロゲン受容体を結合しないHBがアンドロゲンと同様の同化作用を生じたため、HBがアンドロゲン受容体を活性化する可能性を除外するように研究が実行された。HBを、同化剤として治療的に使用されるアンドロゲン類似体である、メタンドロステノロンと比較するために、ラット核アンドロゲン受容体からの標識[3H]-ミボレロンの変位を測定する結合分析が使用されたFeldkorenetal.,J.SteroidBiochem.Mol.Biol.94:481-487,2005。メタンドロステノロンは、24nMのIC50でアンドロゲン受容体への特異的結合、および内因性リガンドであるテストステロンと同様の結合曲線を生じた。しかしながら、HBは、0.01μMから最大10μMの濃度からでは有意な結合を示さなかった図5A。この研究は、血漿中テストステロンレベルがHB処置に応答して異ならなかったため、身体組成および骨へのHBの生体内作用が内因性テストステロン作用に起因し得ないことを示した図5B。実施例7:ORXラットにおけるHBの選択的作用同化作用がある全てのステロイドは、テストステロンの誘導体であり、男性生殖器系の成長および機能を刺激するため、アンドロゲン性であるとともに同化作用がある。個々の薬剤は、同化/アンドロゲン活性の平衡が異なるが、現在入手可能な薬剤のうちのいずれも純粋には同化作用がないKuhn,RecentProg.Horm.Res.57:411-434,2002。したがって、アンドロゲン欠乏後にアンドロゲン依存性組織を回復させる、注入されたプロピオン酸テストステロン陽性対照と対比したHBの能力が、外科的に去勢された思春期前後のラットモデルで調査されたHershbergeretal.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.83:175-180,1953。適切な用量範囲での経口および皮下処置が、精巣摘出術ORX後2週間で開始され、10日間継続された。予想通り、アンドロゲン欠乏が、前立腺、精嚢、球海綿体筋/肛門挙筋複合体、陰茎亀頭、およびカウパー腺のサイズの有意な縮小を引き起こし、これらの臓器はそれぞれ、擬似手術を受けた動物で観察されたものの8.6、6.5、23.9、54.6、および40.5まで縮小した。0.4mg/kgでのプロピオン酸テストステロンの注射が、アンドロゲン感受性臓器の重量を3倍から8倍に増加させたが、テストステロン注射は、擬似対照と比較して、腹側立腺、精嚢、および球海綿体筋/肛門挙筋複合体を元のサイズに回復させることができなかった。10日間の処置後、20および60mg/kgでのHBの経口投与は、ORXと関連付けられるアンドロゲン感受性組織の減量を防止できなかったが、陰茎亀頭のわずかであるが有意な用量依存性増加が、HB処置と関連付けられた対照動物について45.7±1.5mgと対比して、H20について55.3±1.7mgおよびH60について59.6±1.6mg。対照的に、HBは球海綿体筋/肛門挙筋複合体の重量同化活性の骨格筋バイオマーカーを増加させたが、変化は統計的に有意ではなかった。HBが、ハーシュバーガー分析での陽性対照0.4mg/kgでのプロピオン酸テストステロンに対して1倍および10倍用量で皮下注射された時に、アンドロゲン感受性組織重量は、有意な増加が4mg/kgHBで観察された陰茎亀頭および球海綿体筋/肛門挙筋複合体を除いて、ORX対照の重量と異ならなかった表2。表2.HBで処置された擬似およびORXラットからのアンドロゲン感受性組織の重量ラットは、通常食23.9タンパク質含量を与えられ、20または60mg/kg体重HBを10日間毎日強制経口投与された、または0.4および4mg/kg体重HBを皮下注射された。結果は平均±SEMとして表される一元配置ANOVAおよびダネット事後検定によってORXと比較した時にP<0.05、P<0.01、P<0.0011。プロピオン酸テストステロンTPが、0.4mg/kgで皮下注射として投与され、陽性対照としての機能を果たした。擬似動物では、20または60mg/kgHBの経口投与が血漿中テストステロンレベルを改変しなかった。予想通り、精巣摘出術により、事実上検出不可能なレベルのテストステロンを有する、ORX動物へのHBの経口または皮下投与後に、血漿中テストステロンが検出されなかった一方で、プロピオン酸テストステロンの0.4mg/kg注射は、ORXラットにおける血漿中テストステロンレベルを元のレベルの20.5まで部分的に回復させた図5B。HBは、ハーシュバーガー分析で試験された時に非常に低いアンドロゲン活性を示した表2。HBは、アンドロゲンと同様の同化作用を動物で生じたが、同化作用は、薬学的異なると考えられた。HB投与経口または皮下は、同化ステロイドの強力なアンドロゲン作用とは際立って対照的に、最小限のアンドロゲン副作用しか生じなかった。HBがアンドロゲン受容体への低い結合を有し、または有意な結合を持たず、血漿中テストステロンレベルを変調しなかった図5Aという付加的な観察は、HBが、アンドロゲン依存性機序を通して、その同化作用を及ぼし得ることを示す。たとえHBおよびアンドロゲンの両方が同じステロイド骨格を含有しても、C6/C7におけるラクトン機能、C2およびC3における2つのヒドロキシル基、ならびにC24におけるメチル置換基を含む、2つの部類の化合物を区別する、主要な構造差がある。理論に縛られることを希望することなく、これらの化学的差異は、HBが核内アンドロゲン受容体を活性化することを制限し、薬理反応の差異を説明してもよい。実施例8:ORXラットにおける身体能力および筋線維分布HBがどのようにして身体能力および筋肉の構造変化に影響を及ぼしたかを判定するために、動物は、前および後肢の握力について、ならびに筋肉量および機能の基礎的改変によって検出することができる筋肉の構造変化について試験された。下肢の握力の変化が、1日につき60mg/kgHBの経口投与を10日間受容したORX動物において、有意に大きかった対照の-0.0143±0.0392kgと対比して0.0851±0.0197kg。前肢の握力の変化も、HB処置動物でより大きかった図6Aが、有意性に達しなかった対照の0.1631±0.0405kgと対比して0.2711±0.0660kg。予想通り、アンドロゲン欠乏が、擬似手術を受けた動物で観察されたものの85.8までの腓腹筋量の有意な減少を引き起こした図6B。ORXラットへのHBの経口投与は、それぞれ、HB20およびHB60動物で腓腹筋量を13.8および10.3増加させ、したがって、筋肉を元のサイズにほぼ回復させた。同時に、陽性対照の1倍および10倍の用量でのHBの皮下投与は、それぞれ、腓腹筋量を2.8および9.1増加させた。構造変化を判定するために、筋肉量および機能の基礎的改変、線維分布の変化図6C、および断面積図6Dが分析された。去勢マウスにおけるHB処置は、腓腹筋線維萎縮を防止し、去勢対照のレベルを上回って、I型およびIIa型線維の平均線維面積を増加させたP<0.001。対照動物と比較して、線維型分布は、HB処置動物10日間にわたって1日につき20または60mg/kgで有意な影響を受けた。IIa型およびIIb型線維の総数が、HB用量から独立して約60増加した一方で、I型線維の数の有意な増加は、高用量のHBのみで観察された。HBは、訓練されていないORXラットの向上した身体の健康を示した図6。しかしながら、訓練されていないラットの前および後肢の身体の健康へのHBの差動作用は図6、豊富なアンドロゲン受容体がオスでは典型的には低い、後肢領域で、より強い薬理反応が観察されたことを示すと考えられる。去勢動物へのHBの10日間経口投与は、増加した身体能力および耐久力のために重要である、筋原線維の総数ならびに酸化的I型およびIIa型筋線維の断面積の大幅な増加につながった。したがって、HBの経口投与は、最小限のアンドロゲン副作用を伴って、または全く伴わずに、強い同化反応をトリガした。実施例9:タンパク質合成への官能基の位置または立体化学の作用同化活性へのHB官能基の官能基位置または立体化学間の構造活性関係を調査するために、一連のHB類似体[22S,23S-ホモカスタステロン、22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリド、22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロン、22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリド、および22S,23S-7-アザ-ホモブラシノリド表3の化合物ID2-6]が合成され、L6ラット骨格筋細胞内のタンパク質合成を刺激する、またはタンパク質分解を阻害する能力実施例10参照について、他の合成および自然発生ブラシノステロイド[22R,23R-ホモブラシノリド、22S,23S-エピブラシノリド、および22R,23R-エピブラシノリド表3の化合物ID7-9]と比較された。22S,23S-ホモカスタステロン表3の化合物ID2が、ブラシノステロイドの同化活性へのC-6ラクトンの影響を評価するように合成された。C-2における機能的ヒドロキシ官能基が欠けており、C-3においてフッ素化される化合物を合成することによって[22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリドおよび22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロン表3の化合物ID3および4]、筋細胞内のタンパク質蓄積を推進するブラシノステロイドの能力における2α,3α-隣接ジオール部分の要求が試験された。22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリドおよび22S,23S-7-アザ-ホモブラシノリド表3の化合物ID5および6が、ブラシノステロイド分子のB環に-アザおよび7-アザ置換基を含有するように合成され、生物活性のための6-ケト基の要求の評価を可能にした。22R,23R-隣接ジオール部分の立体化学が異なる表3の化合物ID7、または5α-エルゴスタン構造の側鎖内のC-24にメチル基を持つ表3の化合物ID8および9、他の自然発生ブラシノステロイドへのHBの同化活性も比較された。HBおよびその類似体の構造が図7に示される。表3.L6ラット骨格筋細胞内のタンパク質蓄積へのHB1およびその類似体2-9の作用化合物は10μMで試験され、結果は3通りで行われた判定の平均±SEMとして表される一元配置ANOVAおよびダネット事後検定によって対照と比較した時にP<0.05、P<0.01、P<0.001HBおよびその類似体の生物活性が、生体外でL6ラット骨格筋細胞内のタンパク質合成の増加を測定することによって評価された。細胞が、[3H]-フェニルアラニンで4時間培養され、媒介物0.1エタノールまたは試験化合物10μMで3通りに処置され、タンパク質合成が、総タンパク量によって正規化されたタンパク質への[3H]-フェニルアラニンの取り込みとして測定された表3。これらの条件下で、HBおよび22S,23S-ホモカスタステロンの両方が、それぞれ、タンパク質合成を37.2±5.9p<0.001および41.0±2.7p<0.001増加させた。このタンパク質合成は、この分析で陽性対照としての機能を果たした、6.5nMでのIGF-1の生物活性42.5±4.5、p<0.001と有利に比較して増加した。A環内のC-3における2α-ヒドロキシル基およびフッ素化の除去表3の化合物ID3-4は、陽性対照と比較して、生物活性の約50減少につながったそれぞれ、24.6±5.3、p<0.01および22.5±2.7、p<0.01。しかしながら、依然としてタンパク質合成の増加があった。7-オキサラクトン基のB環内のアミンとの置換表3の化合物ID6が、生物学的活性を半分に低減した一方で、6-カルボニル基のアミンとの同様の置換表3の化合物ID5は、タンパク質合成の活性の完全損失をもたらした。側鎖内の修飾表3の化合物ID7-9が、活性を無効にした。タンパク質合成への最も活性なブラシノステロイドの用量依存性作用を調査するために、表3からの0.3~30μMの化合物1-2を用いて研究が実行された。両方の反応が、それぞれ、36.9±2.9および40.7±4.9p<0.01のタンパク質合成または発現の最大増加とともに、10から20μMの間で飽和に近づいた図8A。HBに関係する一連のブラシノステロイド類似体表3の化合物ID2-6が合成され図7、これらの化合物の構造活性関係が、L6ラット骨格筋細胞においてタンパク質合成および分解分析を実行することによって探索された。結果は、22S,23S-ホモカスタステロンが、HBと同様に、筋細胞内でタンパク質蓄積を有意に増加させることができると示した図8。これらの化合物間の唯一の差異が、HBのB環内の付加的な7-オキサラクトン基であるため、これらの結果は、7-オキサラクトン部分がブラシノステロイドの同化部分に必要ではないことを示す。それとは反対に、ラクトンから植物中の6-ケトンに移行すると、ブラシノリド活性がブラシノリドとカスタステロンとの間で50減少することが観察されたTakatsutoetal.,J.Chem.Soc.Perkin.Trans.1:439-447,1984。この部分の6-アザ-7-オキサラクトン化合物ID5、表3または6-オキソ-7-アザ化合物ID6、表3基のいずれか一方への変換が、タンパク質合成を刺激する能力を劇的に低減した表3。これらの結果は、6-アザ-7-オキソ-ホモブラシノリドが不活性であったAnastasiaetal.,GazzetaChimicaItaliana114:159-161,1984一方で、7-アザ-ホモブラシノリドで劇的に低減された植物ブラシノリド活性を示したTakatsutoetal.,Chem.Pharmaceutic.Bulletin35:211-216,1987、以前の研究と同様である。ブラシノステロイドの同化活性へのA環置換基の作用は、あまり劇的ではなかった。α-フルオロ基による2つの2α,3α-隣接ヒドロキシル基の置換は、生物活性を減少させたが、無効にはしなかった。また、データは、C-24における側鎖メチル対エチルが、ほ乳類系における生物活性のために非常に重要であることを示した。エピブラシノリド表3の化合物ID8および9は、ホモブラシノリド表3の化合物1および7と比較して、骨格筋細胞内で非常時低い同化活性を保有することが分かった。実施例10:タンパク質分解への官能基の位置および立体化学の作用表3に示されるようなHBおよびその類似体の生物活性もまた、生体外でL6ラット骨格筋細胞内のタンパク質分解の減少を測定することによって評価された。細胞が、[3H]-フェニルアラニンで一晩標識され、後に媒介物0.1エタノールまたは試験化合物10μMで3通りに4時間処置され、タンパク質分解が、総タンパク量によって正規化された培地への酸可溶性[3H]-フェニルアラニンの放出として評価された表3。HB、22S,23S-ホモカスタステロン、22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリド、22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロン、22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリド、および22R,23R-ホモブラシノリドが、生体外でタンパク質分解を低減したが、それらの活性の効力は、それらの構造によって異なった。化合物ID1-3は、この分析で陽性対照としての機能を果たした10nMインスリン処置と有利に比較して、20以上のタンパク質分解の最も強い防止を示した20.2±1.6、p<0.05。分解の防止は、化合物1および7を化合物8および9と比較して側鎖内のC-24位置におけるエチル基の存在に依存し、化合物1および7を比較して22R,23R-隣接ジオール部分の立体化学に部分的に依存した。興味深いことに、7-オキサラクトン基の22S,23S-7-アザ-ホモブラシノリドのB環内のアミンとの置換が、タンパク質分解へのその作用を完全に無効にした一方で、6-カルボニル基の22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリド内のアミンとの同様の置換は、その生物学的活性に軽微な作用しか及ぼさなかった。この分析での最も活性な化合物の中でも、0.3~20μMの濃度でのHBが、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、HB活性は3から10μMの間で停滞期に達した図8B。より低い濃度で、1μMHBが、対照レベルを上回ってタンパク質分解を8.2±0.6減少させたp<0.05。0.3~30μMの濃度での化合物2が、タンパク質分解を用量依存的に阻害し、化合物2の活性は10μMで停滞期に達した。より低い濃度で、1μMでの化合物2が、対照レベルを上回ってタンパク質分解を8.7±1.7抑制したp<0.05。これらの研究は、6-ケト基および22α,23α-ヒドロキシルが、ラット骨格筋細胞内のブラシノステロイドの同化活性のために重要であるという証拠を提供する。そのような情報は、高い同化選択性を保有する新規の治療用分子の設計に有用である。加えて、分析された分子の中でも、22S,23S-ホモブラシノリドおよび22S,23S-ホモカスタステロンは、最大の同化活性を保有することが確認された。実施例11:L6筋細胞および3T3線維芽細胞内の細胞毒性全てのブラシノステロイドおよびそれらの類似体は、MTT分析および細胞学的観察によって確立されるように、最大30μMの濃度まで、生体外で細胞に投与された時に完全に分化したL6ラット骨格筋管への毒性を示さなかった。したがって、全ての化合物が、3T3/NIHマウス線維芽細胞培養を使用して、基礎細胞毒性について標準試験で試験された。22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリドが、12.5μMの半最大阻害濃度IC50で用量依存的に細胞増殖を阻害した、唯一のブラシノステロイド類似体であった。A環内のC-3におけるフッ素化22S,23S-3α-フルオロ-ホモブラシノリドおよび22S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロンは、元のブラシノステロイド22S,23S-ホモブラシノリドおよび22S,23S-ホモカスタステロンと比較して、増加した細胞毒性につながった図9。実施例12:AKTリン酸化AKTは、タンパク質合成および分解を調節することが知られている細胞内標的を変調するため、AKTリン酸化へのブラシノステロイドの作用を判定するように実験が実行された。[3H]-フェニルアラニン取り込み分析で得られた結果と一致して、生物活性ブラシノステロイドが、ラット骨格筋細胞培養の中でAKTのリン酸化を刺激した図8。HBおよび22S,23S-ホモカスタステロン処置は、1時間後にAKTの有意な活性をもたらし、10分以内にAKTをリン酸化する、IGF-1によって生じた反応よりもはるかに遅い反応であった。同様の遅延したAKT反応が、エクジステロイドについて以前に報告されているGorelick-Feldmanetal.,J.Agric.FoodChem.56:3532-3537,2008。実施例13:生体内のHBの薬理ゲノム学的作用本明細書の上記で立案されるように、HB処置通常食を24日間与えられた健康なラットに毎日60mg/kg体重は、訓練されていないラットにおける除脂肪体重の14.2増加および向上した身体の健康と関連付けられた。どのようにしてHBがこのような作用を引き起こしていたかを判定するために、HBの経口投与24日間の60mg/kg後の遺伝子発現の変化を調べることによって、HBの薬理ゲノム学的性質が、健康なラットにおいて研究された。凍結骨格筋媒介物CtrおよびHB処置動物の腓腹筋生検から得られたプールRNAサンプルが、HBへのmRNA反応を測定するために、ラットインスリン信号伝達PCRアレイで使用された。インスリン信号伝達、ホスホイノシチド3-キナーゼPI3Kおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼMAPK経路、炭水化物代謝、および細胞周期調節に関与する84個の遺伝子のうち、遺伝子の2つの小集団が、Ctr群よりもHB処置群で多く発現された。しかしながら、差異の規模は異なった図11A。上方調節された遺伝子の第1の小集団は、アルファ-1Dアドレナリン受容体ADRA1D6.5倍、インスリン様成長因子結合タンパク質1IGFBP12.5倍、およびステロール調節要素結合タンパク質1SREBP-12.5倍といった、PI3K/AKT信号伝達経路を通して上方調節された一式の標的遺伝子を含んだ。第2の小集団は、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ2FBP24.5倍およびIGF-21.4倍といった、筋細胞成長および炭水化物代謝を調節する、上方調節された遺伝子を含有した。アルファ-1Dアドレナリン受容体は、Gタンパク質への結合を伴い、その後にホスホリパーゼCβおよびタンパク質キナーゼCの活性化が続く、カテコールアミンの内因性機能を仲介するStrosberg,Obes.Res.3Suppl4:501S-505S,1995。IGF-2およびIGFBP1のメッセンジャーRNAレベルもまた、HBが投与されたラットの骨格筋内で上方調節された。骨格筋分化中のインスリン様成長因子2IGF-2発現は、転写レベルで調節されKouetal.,Mol.Endocrinol.7:291-302,1993、局所的に産生されたIGF-2によるインスリン様成長因子1IGF-1受容体を通した信号伝達は、正常な筋肉成長および再生に重要である経路を定義する。これらの結果は、CtrおよびHB処置動物からの個々の筋肉サンプルでRT-PCRを使用することによって、IGF-2遺伝子発現についてさらに検証された図11B。真核翻訳開始因子2B1EIF2B1の発現の変化は見られなかった。たとえAKTの誘発性活性化が、衛星細胞の活性化を伴わずに、骨格筋量および力を増加させるのに十分であってもBlaauwetal.,FASEBJ23:3896-3905,2009、筋肉成長および分化を変調する、種々の筋原性転写因子の発現へのHB処置の作用も評価された。HB処置は、筋肉分化1MYOD12.1倍、筋原性因子5MYF51.3倍、筋原性因子6MYF61.3倍、およびミオゲニン筋原性因子4またはMYOGとしても知られている1.7倍の上方調節を誘発した図11C。MYOD1は、HB処置後の2倍以上の上方調節と関連付けられた唯一の転写因子であった図11C。MYOD1は、筋肉特異的遺伝子を活性化することによって細胞分化を誘発し、細胞増殖から分化への切替において重要であるSolomonetal.J.Endocrinol.191:349-360,2006。結果は、HBが筋細胞成長および炭水化物代謝に関与する2組の遺伝子を強く刺激したことを示す。上方調節される遺伝子の中でも、ADRA1Dは、最も顕著な6.5倍誘発を示した図11A。α1アドレナリン受容体は、Gタンパク質への結合を伴い、その後にホスホリパーゼCβおよびタンパク質キナーゼCの活性化が続く、カテコールアミンの内因性機能を仲介する。理論に縛られることを希望することなく、ADRA1Dは、筋肉生存および分化を調節してもよいSainietal.,Cell.Physiol.Biochem.25:253-262,2010。IGF-2およびIGFBP1のメッセンジャーRNAレベルまた、HBが投与されたラットの骨格筋内で上方調節された。骨格筋分化中のIGF-2発現は、転写レベルで調節されKouetal.,Mol.Endocrinol.7:291-302,1993、局所的に産生されたIGF-2によるインスリン様成長因子1IGF-1受容体を通した信号伝達は、正常な筋肉成長および再生に重要である経路を定義する。実施例14:ブラシノステロイド処置が創傷閉塞時間を短縮した動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、生体外擦過創傷閉塞実験が実行された。3T3スイスアルビノマウス線維芽細胞がATCCManassas,VAから入手された。細胞株が、3~4日ごとに継代培養され、37°Cおよび5CO2にて10FBSおよび0.1ペニシリンストレプトマイシンを含有するDMEMの中で維持された。細胞は、細胞増殖および擦過創傷閉塞分析のために24ウェル皿の中で、ならびに細胞生存および酸化窒素産生研究のために96ウェル皿の中で副次培養された。3T3線維芽細胞が、3×105細胞/mlの濃度で24ウェル皿の中へ播種され、ほぼ密集した細胞単層まで培養された。実験の日に、線形創傷が、滅菌100μlプラスチックピペット先端を用いて単層に生成され、滅菌PBSで細胞を1回洗浄することによって、細胞残骸が除去された。媒介物0.1エタノール、陽性対照0.5FBS、あるいは種々の濃度の化合物の分画、副分画、または純粋化合物を含有する、新鮮DMEM培地が、1用量につき一式の3つのウェルに追加され、5CO2で37°Cにて12時間培養された。次いで、細胞が、PBS中の20μlの10メチレンブルーを用いて5分間可視化された。各ウェルからの擦過領域の3つの代表的な画像が、擦過創傷閉塞を推定するように0および12時間で写真撮影された。画像は、ImageJプログラムNIH,Bethesda,MDを使用して分析され、創傷閉塞率が、媒介物対照に対して計算され、対照と比べた創傷閉塞率として報告された表4。HBおよびその類似体を用いた処置は、生体外で創傷閉塞を向上させた。表4を参照されたい。表4.3T3細胞での擦過創傷閉塞へのHB1およびその類似体2-9の作用化合物は10μMで試験され、結果は3通りで行われた判定の平均±SEMとして表される一元配置ANOVAおよびダネット事後検定によって対照と比較した時にP<0.0512匹のC57BL/6Jオスマウス20±4g;CharlesRiverLaboratories,MAが、12時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。動物は、食物および水に自由にアクセスできた。動物は、7日間新しい条件に適応させられた。動物は、物理的操作のストレスを低減するように毎日取り扱われた。動物は、投薬の1日前に体重によってグループに無作為化された。揮発性麻酔効果を生じるために5イソフルラン下で、各動物の肩および背部が剃毛された。皮筋および付着組織を含む皮膚を除去するように、それらの腰椎上に鋭い穴開け器内径6mmが適用された。試験物質が、皮膚損傷の直後に連続10日間毎日1回、局所的にTOP投与された。使用された物質は、1ホモブラシノリド10μg/マウス、2陽性対照CGS-21680、特異的アデノシンA2A亜型受容体作用薬、10μg/マウス、または3媒介物1.5カルボキシメチルセルロースCMCであった。創傷治癒の速度を調査するために、創傷サイズが、処置後1、3、5、7、および9日に測定された。創傷は、透明なプラスチックシート上に透写され、米国国立衛生研究所NIHよりオンライン上にある、ImageJプロブラムrsbweb.nih.gov/ij/を使用することによって測定された。ImageJは、NIHで開発された、一般公開されているJavaベースの画像処理プログラムである。処置を受けた創傷の面積を、対照処置を受けた創傷の面積と比較することによって、創傷閉塞までの時間が推定された。創傷の閉塞率が計算され、創傷半閉塞時間皮膚創傷の50が塞がれる時間、CT50が、Graph-PrismGraphSoftwareUSAを使用した線形回帰によって分析された。実験の終了時に創傷の誘発後10日、CO2ガス吸入によって動物が安楽死させられた。血液が、心臓穿刺によって収集された。創傷組織および筋肉が、免疫組織化学分析および創傷治癒因子分析のために収集された。HBは、創傷閉塞のマウスモデルにおいて、生体内の創傷閉塞の割合を増加させた図13。したがって、BR処置は、創傷治癒に必要な時間を縮め、すなわち、短縮し、したがって、創傷の処置において皮膚に有益な作用を及ぼした。実施例15:ブラシノステロイドが皮膚細胞内のエラスチン産生を増加させた動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、ヒト皮膚線維芽細胞内のエラスチン遺伝子発現が、ホモカスタステロンを用いた処置に応答して測定された。ヒト新生児皮膚線維芽細胞HNDFが、DMEM10FBSの中で維持され、5CO2を伴う加湿37°Cインキュベータの中で保持された。細胞が、24ウェルプレートの中に1つのウェルにつき1×104個の細胞の密度で置かれ、24時間、または100密集度に達するまで培養された。後に、培地が除去され、着脱細胞または細胞残骸を除去するように、細胞が500μLPBSで2回洗浄された。次いで、HNDFが、以下の通りに16時間処置された:DMEMのみ、レチノイン酸5μM、レチノイン酸10μM、ホモカスタステロン5μM、およびホモカスタステロン10μM。製造業者の指示に従ってTrizol試薬Invitrogenを使用して、RNAがHNDFから抽出された。NanoDropsystemNanoDropTechnologies,Wilmington,DEを使用して、260nmおよび280nmにおける吸光測定によって、RNAが分光光度法で定量化された。RNAの質が、ゲル電気泳動での分離によって評価された。微量のDNA汚染を除去するために、次いで、RNAが、製造業者のガイドラインに従ってDnaseIInvitrogenで処置された。製造業者のプロトコルに従ってAppliedBiosystemsHighCapacitycDNAReverseTranscriptionKitを使用して、相補DNAcDNAが、各サンプルに3.0μgのRNAを使用して合成された。定量的RT-PCRqPCR増幅が、12.5μlBrilliantSYBR登録商標GreenPCRマスタ混合AppliedBiosystems、5μlの1:25希釈cDNA、0.5μlの6μM遺伝子特異的プライマーIDT,Coralville,IA、および7μlPCR-等級純水を含有する、25μlの全容量内で、ABI7300Real-TimeDetectionSystem上で3通りに実行された。プライマーは、IntegratedDNATechnologies,Inc.Coralville,IA,USAによって、以下の通りに合成された:β-アクチン、順方向プライマー5’-ACGTTGCTATCCAGGCTGTGCTAT-3’SEQIDNO:1、逆方向プライマー5’-CTCGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-3’SEQIDNO:2、エラスチン、逆方向プライマー5’-AAGCAGCAGCAAAGTTCGGT-3’SEQIDNO:3、および逆方向プライマー5’-ACTAAGCCTGCAGCAGCTCCATA-3’SEQIDNO:4。qPCR増幅が、50°Cで2分間の1サイクル、95°Cで10分間の1サイクル、その後に続いて95°Cで15秒および60°Cで1分の40サイクルを使用して、7300RealTimePCRSystemABAppliedBiosystems上で行われた。解離曲線が、95°Cで15秒、60°Cで1分、および95°Cで15秒の1サイクルで完成された。RTなしNRTおよびテンプレート対照なしNTCは、品質管理ステップとして各実験に含まれなかった。標的mRNA発現が、ΔΔCt方法を使用して分析され、β-アクチンハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化された。DMEMのみで処置された細胞陰性対照が、この研究で較正サンプルとしての機能を果たし、1.0という値が、較正サンプルの標的遺伝子発現に割り当てられた。全てのサンプルは3通りに実行された。0.001というp値が有意であると見なされた。表5.ホモカスタステロンがヒト皮膚線維芽細胞内のエラスチン遺伝子発現を増加させるp<0.001、一元配置ANOVA、ボンフェローニ多重比較検定、n=3ホモカスタステロンは、HNDF内のエラスチンのmRNAレベルを有意に増加させた。実際、エラスチンmRNAレベルを増加させるホモカスタステロンの作用は、レチノイン酸陽性対照の作用に匹敵し、処置されていない細胞よりも最大3.23±0.4倍高かった表5。したがって、ホモカスタステロンは、皮膚内のエラスチン産生にプラスの作用を及ぼす。この実験は、BRが、ホモカスタステロンのように、皮膚の処置における実用性を実証し、局所的な老化防止スキンケア製品として有用であることを示す。実施例16:皮膚へのHBの同化作用動物の皮膚への植物ブラシノステロイドの潜在的な同化作用を評価するために、20および60mg/kg体重のHBそれぞれ、HB20およびHB60が、通常食を24日間与えられた健康なラットに毎日経口投与された。コラーゲンおよびエラスチン産生が、それらの対照物と対比して、HBで処置された動物の皮膚内で測定される。コラーゲンおよびエラスチンのタンパク質分解が、例えば、コラーゲンまたはエラスチンELISAによって、それらの対照物と対比して、HBで処置された動物の皮膚内で測定される。HBで処置された動物の皮膚に存在するコラーゲンおよびエラスチンタンパク質の量が、それらの対照物と対比して測定される。HBを用いた処置は、皮膚内のコラーゲンおよびエラスチン産生を増加させ、皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンのタンパク質分解を減少させ、および/または皮膚内のコラーゲンおよびエラスチンの量を増加させる。実施例17:創傷治癒の動物モデル創傷治癒への植物ブラシノステロイドの作用を評価するために、動物モデルが、本明細書の以下で説明されるように種々の態様で使用された。JacksonLaboratoryBarHarbor,MEから入手された27匹の6週齢オスC57BL/6Jマウスが、12時間明暗サイクルとともに一定の室温で維持された室内で、個々のチャンバの中に収容された。マウスは、食物および水に自由にアクセスできた。マウスは、7日間新しい条件に適応させられ、マウスの取扱は、理的操作のストレスを低減するように、この時間の間に毎日行われた。マウスは、投薬の1日前に体重によってグループn=9に無作為化された。揮発性麻酔効果を生じるために5イソフルラン下で、各動物の肩および背部が剃毛された。皮筋および付着組織を含む皮膚を除去するように、それらの腰椎上に鋭い穴開け器内径6mmが適用された。試験物質対照媒介物1.5カルボキシメチルセルロース、あるいは10μg/マウスのHBまたは陽性対照としてアデノシン受容体作用薬CGS-21680Vallsetal.,Biochem.Pharmacol.77:1117-1124,2009が、皮膚損傷の直後に、次いで、10日間毎日、局所的に投与された。創傷治癒の速度を調査するために、創傷サイズが、ImageJソフトウェアrsbweb.nih.gov/ij/を用いて、2日ごとに写真撮影および測定された。処置創傷の面積を対照創傷の面積と比較することによって、創傷閉塞までの時間が推定された。創傷の閉塞率が計算され、皮膚創傷の50が閉塞された時間CT50が、線形回帰によって分析された。実験の終了時に、CO2ガス吸入によって動物が安楽死させられた。創傷組織サンプルが、液体窒素中でスナップ凍結することによって収集され、創傷治癒因子分析のために-80°Cで保管され、またはMayerのヘマトキシリンおよびエオシンを使用した定期的な組織切片および染色法のために4パラホルムアルデヒドで固定された。実施例18:創傷治癒の動物モデルにおける体重および食物摂取量へのブラシノステロイド処置の作用体重および食物摂取量への創傷の作用を評価するために、実施例17で説明されるプロトコルに従って、動物が創傷され、HB、CGS-21680陽性対照、または媒介物陰性対照で10日間処置された。基本的に、皮膚を除去するように、腰椎上に鋭い穴開け器が適用され、次いで、処置10μg/マウスのHB、CGS-21680、または媒介物が、10日間局所的に投与された。体重および食物摂取量が、創傷後の10日間、1日おきに動物で測定された。データが平均±SEMとして報告された。多重比較ダネット検定によって完成した一元配置ANOVAを使用したGraphPadPrism4.0SanDiego,CAを用いて、統計分析が行われた。創傷閉塞関連の体重変化が、時間および処置を独立変数として用いた2因子反復測定ANOVAによって分析された。0.05未満のP値が有意と見なされた。創傷後の10日間の期間に、体重に対する有意な全体的作用はなかったが、全てのマウスが創傷後の2日に減量し、体重増加が4日に再開した図14。マウスは、2日までに1.5gの体重を減らし、処置間に有意差はなかったが、HBが創傷と関連付けられる減量を低減する傾向があった。また、創傷後48時間続いた食物摂取の過渡的な低減もあり、処置間に有意差は見られなかった。実施例19:HB処置が創傷治癒を向上させる皮膚創傷治癒への植物ブラシノステロイドの作用を評価するために、HB10μg/マウス/日、陽性対照CGS-2168010μg/マウス/日、または陰性対照媒介物単独が、実施例17で詳述されるように、創傷後の10日間毎日、局所的に投与された。創傷サイズが、10日間、2日ごとに写真撮影および測定された。1日に対する創傷閉塞が2日ごとに判定され、CT50が線形回帰によって計算された。2因子反復測定ANOVAが行われた。0.05未満のP値n=9が有意と見なされた。皮膚創傷治癒は、媒介物単独で処置された対照と比較して、HBを受容した動物で有意に向上させられた図15A。ブラシノステロイド作用は、創傷治癒の初期段階創傷後最大6日に発生すると考えられた図15B。CT50は、媒介物対照7.2±0.2日と比較して、HB5.4±0.3日および陽性対照CGS-216806.2±0.4日の両方によって有意に低減された。HB処置と関連付けられる最も強い作用が、炎症および組織修復段階が重複する、4日に観察された。理論に縛られることを希望することなく、細胞増殖の刺激または創傷領域の中への移動によって、HBが創傷治癒を促進すること可能性がある。データが元の創傷サイズの割合に関して表された時に、対照マウスに対して創傷閉塞の速度の2倍の増加があった。HB処置と関連付けられる別の興味深い形態学的観察は、4日に顕著になり、6~8日にゆっくり治まって創傷後10日に完全に消滅した、創傷縁の増加した体積であった。この作用は、陰性および陽性対照の両方では欠けていた。実施例20:HBが創傷治癒における炎症性マーカーを低減する皮膚創傷治癒は、初期炎症反応によって特徴付けられる。創傷治癒における炎症へのブラシノステロイドの作用を評価するために、創傷およびHB、陽性対照CGS-21680、または陰性対照媒介物を用いた処置後10日に、炎症性サイトカインTNF-αおよびTGF-βならびに付着ケモカインICAM-1のmRNAレベルが、対照および処置マウスの創傷組織で測定された。リアルタイム定量的PCR総RNAが、TrizolInvitrogen,Carlsbad,CAを使用して線維芽細胞から抽出された。RNAは、NanoDropリーダNanoDropTechnologies,Wilmington,DEを使用して、260nmおよび280nmにおける吸光測定によって、RNAが分光光度法で定量化された。RNAの質が、ゲル電気泳動によって評価された。次いで、微量のDNA汚染を除去するように、RNAがDnaseIInvitrogen,Carlsbad,CAで処置され、製造業者のプロトコルに従ってStratascript逆転写酵素Stratagene,SantaClara,CAを使用して、cDNAが、2.5μgのRNAで合成された。PrimerExpress2.0ソフトウェアAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して選択された、β-アクチン、順方向プライマー5’-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3’SEQIDNO:5、および逆方向プライマー5’-GCGGCAGTGGCCATCTC-3’SEQIDNO:6といった、遺伝子特異的プライマーIDT,Coralville,IAを使用して、定量的PCRが、本質的に前述のように2通りに行われたKomarnytskyetal.,Int.J.Obes.35:236-43,2011。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンの標的遺伝子発現は、1という値が割り当てられた。サンプルは、増幅特異性を確認するように融解曲線分析を受けた。内因性対照遺伝子に対する標的遺伝子β-アクチンの相対的変化が、2ΔΔCT方法を使用して判定されたWineretal.,Anal.Biochem.270:41-9,1999。HB処置は、TGF-βmRNAの下方調節、ICAM-1mRNAの有意な抑制、およびTNF-αmRNAのほぼ完全な下方調整への弱い作用と関連付けられた図16。アデノシン受容体作用薬CGS-21680陽性対照で処置された動物からの創傷組織は、TNF-αmRNAの顕著な抑制を示したが、TGF-βまたはICAM-1mRNAレベルのいずれか一方への作用を示さなかった。実施例21:細胞生存および増殖へのブラシノステロイドの作用細胞増殖へのブラシノステロイドの作用をさらに解明し、ブラシノステロイドの生物学的活性のための構造活性要件を判定するために、HB図1およびその天然または合成類自体図7、表6、およびEspositoetal.,J.Med.Chem.54:4057-66,2011の細胞傷害および細胞増殖作用が、3T3マウス線維芽細胞培養で分析された。細胞培養NIH3T3マウス胚線維芽細胞株CCL-923T3線維芽細胞が、ATCCManassas,VAから入手された。細胞は、37°Cおよび5CO2にて、10FBSおよび0.1ペニシリンストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地DMEMの中で定期的に維持され、3~4日ごとに継代培養された。細胞は、増殖および細胞生存分析のために96ウェルプレート、ならびに擦過創傷閉塞研究のために24プレートの中に副次培養されたGreinerBioOne,Monroe,NC。細胞生存および増殖分析3T3線維芽細胞が、1×104細胞/mlの濃度で、96ウェル平底皿の中へ播種された。細胞生存が、本質的にMosmannJ.Immunol.Methods65,55-63,1983によって説明されるように、MTT3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド分析によって3通りに4時間にわたって0.3~30μMの試験物質測定され、マイクロプレートリーダMolecularDevices,Sunnyvale,CAを使用して、550nmで分光光度法で定量化された。媒介物0.1エタノールと比較して細胞生存の変化を示さなかった試薬の濃度が、さらなる研究のために選択された。細胞増殖研究のために、細胞が0.1~10μMの試験物質で3通りに24時間処置され、AmershamUppsala,SwedenからのBrdU5-ブロモ-2’-デオキシウリジンキットを使用して分析された。HB[22S,23S,24S-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-β-ホモ-7-オキソ-5α-コレスタン-6-オン]がWaterstoneTechnologyCarmel,INから購入され、その構造がESI-LCMSおよびNMRによって確認された。ホモカスタステロン22S,23S,24S-2α,3α,22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-5α-コレスタン-6-オン2、22S,23S,24S-3α-フルオロ-22,23-ジヒドロキシ-24-エチル-B-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン3、22S,23S,24S-3α-フルオロ-22,23-ジヒドロキシ-24-エチル-5α-コレスタン-6-オン4、22S,23S,24S-2α,3α-22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-B-ホモ-6-アザ-5α-コレスタン-7-オン5、22S,23S,24S-2α,3α-22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-B-ホモ-7-アザ-5α-コレスタン-6-オン6、22R,23R,24S-2α,3α-22,23-テトラヒドロキシ-24-エチル-B-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン7、22S,23S,24R-2α,3α-22,23-テトラヒドロキシ-24-メチルB-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン8、および22R,23R,24R-2α,3α-22,23-テトラヒドロキシ-24-メチルB-ホモ-7-オキサ-5α-コレスタン-6-オン9を含む、ブラシノステロイド類似体2~9図7が、以前に合成または購入されEsposito、上記参照、図7に示されている。全ての他の化学物質および細胞培地は、特に指定がない限りSigmaSaintLouis,MOまたはInvitrogenCarlsbad,CAから入手された。表6の化合物5、22S,23S-6-アザ-ホモブラシノリドは、12.5mMのIC50とともに最高細胞毒性を示した。分子のA環内にフッ素化置換基を伴う2つの他の合成ブラシノステロイドは、試験された最高濃度である、30mMで弱い毒性を示した。細胞増殖および細胞移動の刺激を誘発する化合物の能力の間には明白な相関がなかった表6。実施例22:擦過創傷閉塞へのブラシノステロイドの作用擦過創傷閉塞へのブラシノステロイド処置の作用をさらに調べるために、創傷およびブラシノステロイドを用いた処置後に、3T3線維芽細胞が調べられた。生体外の擦過創傷閉塞3T3スイス線維芽細胞が、3×105細胞/mlの濃度で24ウェル組織培養の中へ播種され、ほぼ密集した細胞単層まで培養された。次いで、線形創傷が、滅菌100μlプラスチックピペット先端を用いて単層に生成された。PBSで洗浄することによって、細胞残骸が除去された。媒介物0.1エタノール、FBS1、陽性対照、または種々の濃度のブラシノステロイドを伴うDMEM培地が、1用量につき一式の3つのウェルに追加され、5CO2で37°Cにて12時間培養された。細胞は、10メチレンブルーの中で5分間可視化された。各条件下の擦過領域の各ウェルからの3つの代表的な画像が、処置後0および12時間で相対的細胞移動を推定するように写真撮影された。データは、各用量時点での擦過閉塞の割合を対照に対して計算することによって、米国国立衛生研究所rsbweb.nih.gov/ij/からオンラインで入手可能なImageJソフトウェアを使用して分析された。3T3線維芽細胞の顕微鏡観察は、12時間の培養後に、5μMにて30±4.2の最大有効性で、HBが擦過創傷域の中への細胞移動を促進することを実証した。HBを用いたそのような処置は、陽性対照として使用される1FBS41.5±6.5、ならびに以前に報告されたPDGF処置の参照活性Schmidtetal.,J.Ethnopharmacol.122:523-532,2009に有利に匹敵する。いくつかのHB類似体は、この分析では、構造的修飾に特に関連することなく、同様のまたは減少した擦過創傷閉塞活性を示した表6。細胞傷害性化合物522S,23S-6-アザ-ホモブラシノリドは、予想通り、線維芽細胞への作用を示さなかった。用量依存性移動活性が、0.1~10μMの濃度で創傷閉塞を有意に加速した全ての活性化合物について評価された。化合物422S,23S-3α-フルオロ-ホモカスタステロンは、HBと同様に、高い活性を保有することが判明した一方で、化合物622S,23S-7-アザ-ホモブラシノリドは、おそらく、この処置のより高い用量と関連付けられる弱い細胞毒性により、3μMで最も高い活性を示した図17A-C。表6.3T3マウス線維芽細胞内の細胞生存、増殖、および擦過創傷閉塞へのHB1およびその類似体2-9の作用結果は3通りで行われた判定の平均±SEMとして表される一元配置ANOVAおよびダネット事後検定によって対照と比較した時にP<0.05。FBSおよび血小板由来成長因子PDGFが参照処置として示されている。Nt=試験されていない。HBが、最大30μMの濃度で試験された時に、生体外で細胞毒性を示さなかった一方で、分子のB環内に6-アザ基またはA環内にフッ素化置換基を含有する、いくつかのブラシノステロイド類似体は、試験された最高濃度で弱い毒性を示した表6。5μMで細胞増殖を誘発する能力について、この研究で試験された4つ全てのブラシノステロイドは、分子のAまたはB環のいずれか一方の構造変化との相関がない、適度な生物学的活性を示した表6。R,R-およびS,S-24-エピブラシノリドの両方は、細胞増殖を促進したが、移動を促進しなかった一方で、HB処置が両方のパラメータの有意な増加をもたらしたため、細胞増殖を誘発する化合物の能力と、細胞移動を刺激するその能力との間にも相関がなかった。しかしながら、細胞移動を促進する化合物の能力図17と、細胞生存、細胞周期進行、および移動に関与する信号変換経路内の主要な酵素である、Aktのリン酸化を誘発するその能力Esposito、上記参照との間に、直接相関があった。本開示は、本開示の実践のための特定の様態を備えることが分かっている、または提案されている、特定の実施形態に関して説明されている。本開示の種々の修正および変動は、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明白となるであろう。本開示は、具体的実施形態に関連して説明されているが、請求されるような本開示の主題は、そのような具体的実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明白となる、本開示を実行するための説明された様態の種々の修正は、以下の請求項の範囲内であることを目的としている。"