"選択された細胞集団を標的としてメイタンシノイドを向かわせるための方法であって、当該方法は選択された細胞集団を含有すると推測される細胞集団または組織を、細胞結合物質メイタンシノイド複合体と接触させることを包含し、ここで1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が選択された細胞集団の細胞に結合する、前記方法。非開裂リンカーが、酸に誘発される開裂、光に誘発される開裂、ペプチダーゼに誘発される開裂、エステラーゼに誘発される開裂、またはジスルフィド結合の開裂に対して実質的に耐性がある、請求項1に記載の方法。非開裂リンカーがイオウ原子を有していない、請求項1に記載の方法。リンカーがジカルボン酸を基本とする部分から誘導される、請求項3に記載の方法。リンカーがα、ω-ジカルボン酸を基本とする部分から誘導され、ここで当該α、ω-ジカルボン酸は一般式HOOC-Xl-Yn-Zm-COOHを有しており、式中Xは、2から20の炭素原子を持つ直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Yは3から10の炭素原子を持つシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Zは6から10の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族の基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSより選択される置換されたもしくは置換されていない複素環式の基であり、そしてl、mおよびnは各々0または1であるが、ただしそれらすべてが同時に0ではない、請求項4に記載の方法。α、ω-ジカルボン酸が、アジピン酸、グルタル酸、ピメリン酸、ヘキセン-1,6-二酸、ペンテン-1,5-二酸、シクロヘキサン-二酸、またはシクロヘキセン-二酸である、請求項5に記載の方法。非開裂リンカーがイオウ原子を有する、請求項1に記載の方法。非開裂リンカーがマレイミドを基本とする部分から誘導される、請求項7に記載の方法。非開裂リンカーが、N-スクシンイミジル4-シクロヘキサンカルボキシレートSMCC、N-スクシンイミジル-4--シクロヘキサン-1-カルボキシ-LC-SMCC、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N--スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-ヘキサノエートSMPH、N-スクシンイミジル4--ブチレートSMPB、およびN-イソシアネートPMPIから成る群より選択される、マレイミドを基本とする部分から誘導される、請求項8に記載の方法。非開裂リンカーがSMCCから誘導される、請求項9に記載の方法。非開裂リンカーがハロアセチルを基本とする部分から誘導される、請求項7に記載の方法。非開裂リンカーが、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセテートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセテートSBA、およびN-スクシンイミジル3-プロピオネートSBAPから成る群より選択される、ハロアセチルを基本とする部分から誘導される、請求項11に記載の方法。非開裂リンカーがSIABから誘導される、請求項12に記載の方法。リンカーが、少なくとも1つのメイタンシノイドのC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの基のいずれか1つにある、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、メイタンシノールのN-メチル-アラニンを含有するエステルである、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、メイタンシノールのN-メチル-システインを含有するエステルである、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、式II’-L、II’-DまたはII’-D,L:[式中:Y1’はを表し、式中:R1からR12は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR12はHであることができる;A、B、およびDは各々独立して、3から10の炭素原子を有する環式アルキルもしくは環式アルケニル、シンプルなアリールもしくは置換されたアリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルである;l、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuは各々独立して、0または1から5の整数である、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuの少なくとも2つが双方ともゼロではない;そしてMayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す]により表される、請求項1に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項17に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項17に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、式II-L、II-D、またはII-D,L:[式中:Y1はを表し、式中:R1からR8は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR8はHであることができる;l、m、およびnは各々独立して、1から5の整数であり、そして加えてnはゼロであることができる;そしてMayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す]により表される、請求項1に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項20に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項20に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが式41’:[式中:Y1’はを表し、式中:R1からR12は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR12はHであることができる;A、B、およびDは各々独立して、3から10の炭素原子を有する環式アルキルもしくは環式アルケニル、シンプルなアリールもしくは置換されたアリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルである;そしてl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuは各々独立して、0または1から5の整数である、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuの少なくとも2つが双方ともゼロではない]により表わされる請求項1に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項23に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項23に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが式41:[式中:Y1はを表し、式中:R1からR8は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルまたはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR8はHであることができる;そしてl、m、およびnは各々独立して、1から5の整数であり、そして加えてnはゼロであることができる]により表される、請求項1に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項26に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項26に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM1である、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM3である、請求項1に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM4である、請求項1に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式5の化合物:[式中Xは、2から20の炭素原子を持つ直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Yは3から10の炭素原子を持つシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Zは6から10の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族の基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSより選択される置換されたもしくは置換されていない複素環式の基であり、そしてl、mおよびnは各々0または1であるが、ただしそれらすべてが同時に0ではない、そしてEはカルボニル基と共に活性なエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよびスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ならびにスルホニルテトラフルオロフェニルエステルを形成する]を与える、請求項1に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式6の化合物:[式中、nは3から24の整数を表し、そしてEはカルボニル基と共に活性なエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよびスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ならびにスルホニルテトラフルオロフェニルエステルを形成する]を与える、請求項1に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式7の化合物:[式中、RはHまたはSO3Naである]を与える、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞;ウイルスに感染した細胞、微生物に感染した細胞、寄生体に感染した細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化T細胞、B細胞、もしくはメラノサイト;CD33、CD19、CanAg、CALLA、もしくはHer-2抗原を発現する細胞;またはインスリン増殖因子受容体、表皮増殖因子受容体、もしくは葉酸受容体を発現する細胞に結合する、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞肺癌細胞、精巣癌細胞、および神経芽腫細胞から成る群より選択される細胞に結合する、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するドメイン抗体、ドメイン抗体フラグメント、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養素を輸送する分子である、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、インターフェロン、IL2、IL3、IL4、IL6、インスリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、ステロイドホルモン、ソマトスタチン、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、葉酸、トランスフェリン、エストロゲン、エストロゲン類似体、アンドロゲン、またはアンドロゲン類似体である、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する抗体、単鎖抗体、または抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する表面再修飾したresurfaced抗体、表面再修飾した単鎖抗体、または表面再修飾した抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するヒト化抗体、ヒト化単鎖抗体、またはヒト化抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する表面再修飾したモノクローナル抗体、表面再修飾した単鎖モノクローナル抗体、または表面再修飾したモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体、またはドメイン抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞に特異的に結合する表面再修飾したモノクローナル抗体、表面再修飾した単鎖モノクローナル抗体、または表面再修飾したモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞に特異的に結合するキメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、ドメイン抗体、またはドメイン抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合する表面再修飾したモノクローナル抗体、表面再修飾した単鎖モノクローナル抗体、または表面再修飾したモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、結腸直腸癌細胞または乳癌細胞に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、乳癌細胞に特異的に結合する表面再修飾したモノクローナル抗体、表面再修飾した単鎖モノクローナル抗体、または表面再修飾したモノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、乳癌細胞に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。細胞結合物質が、抗CanAg抗体、抗CD19抗体、抗CD33抗体、抗CALLA抗体、抗EGFR抗体、抗CD56抗体、抗IGF-IR抗体、または抗Her2抗体である、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。細胞結合物質が、表面再修飾した抗体であるMy9-6、KS77、またはN901である、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。細胞結合物質が、トラスツツマブ抗体、B4抗体、huC242抗体である、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。細胞結合物質がhuC242抗体である、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。細胞結合物質がトラスツツマブ抗体である、請求項1から34のいずれか1項に記載の方法。非開裂リンカーを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体が、開裂可能なリンカーを介して細胞結合物質に連結した少なくとも1つのメイタンシノイドを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体より毒性が低い、請求項1に記載の方法。細胞結合物質メイタンシノイド複合体が、抗体単独の血漿クリアランスとほぼ等しい値を有する、請求項1に記載の方法。非開裂リンカーを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の最大耐薬用量が、開裂可能なリンカーを介して細胞結合物質に連結した少なくとも1つのメイタンシノイドを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の値より大きい、請求項1に記載の方法。非開裂リンカーを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の生物学的活性の持続性が、開裂可能なリンカーを介して細胞結合物質に連結した少なくとも1つのメイタンシノイドを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の値より大きい、請求項1に記載の方法。非開裂リンカーを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の抗原陰性細胞に対する活性が、開裂可能なリンカーを介して細胞結合物質に連結した少なくとも1つのメイタンシノイドを包含する細胞結合物質メイタンシノイド複合体の値より低い、請求項1に記載の方法。細胞結合物質メイタンシノイド複合体が最小のバイスタンダー活性を示す、請求項1に記載の方法。細胞を排除する方法であって、当該方法は細胞を、細胞結合物質メイタンシノイド複合体と接触させることを包含し、ここで、1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が細胞に結合する、前記方法。非開裂リンカーが、酸に誘発される開裂、光に誘発される開裂、ペプチダーゼに誘発される開裂、エステラーゼに誘発される開裂、またはジスルフィド結合の開裂に対して実質的に耐性がある、請求項66に記載の方法。非開裂リンカーがイオウ原子を有していない、請求項66に記載の方法。リンカーがジカルボン酸を基本とする部分から誘導される、請求項68に記載の方法。リンカーがα、ω-ジカルボン酸を基本とする部分から誘導され、ここで当該α、ω-ジカルボン酸は一般式HOOC-Xl-Yn-Zm-COOHを有しており、式中Xは、2から20の炭素原子を持つ直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Yは3から10の炭素原子を持つシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Zは6から10の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族の基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSより選択される置換されたもしくは置換されていない複素環式の基であり、そしてl、mおよびnは各々0または1であるが、ただしそれらすべてが同時に0ではない、請求項69に記載の方法。α、ω-ジカルボン酸が、アジピン酸、グルタル酸、ピメリン酸、ヘキセン-1,6-二酸、ペンテン-1,5-二酸、シクロヘキサン-二酸、またはシクロヘキセン-二酸である、請求項70に記載の方法。非開裂リンカーがイオウ原子を有する、請求項66に記載の方法。非開裂リンカーがマレイミドを基本とする部分から誘導される、請求項72に記載の方法。非開裂リンカーが、N-スクシンイミジル4-シクロヘキサンカルボキシレートSMCC、N-スクシンイミジル-4--シクロヘキサン-1-カルボキシ-LC-SMCC、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N--スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-ヘキサノエートSMPH、N-スクシンイミジル4--ブチレートSMPB、およびN-イソシアネートPMPIから成る群より選択される、マレイミドを基本とする部分から誘導される、請求項73に記載の方法。非開裂リンカーがSMCCから誘導される、請求項74に記載の方法。非開裂リンカーがハロアセチルを基本とする部分から誘導される、請求項72に記載の方法。非開裂リンカーが、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセテートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセテートSBA、およびN-スクシンイミジル3-プロピオネートSBAPから成る群より選択される、ハロアセチルを基本とする部分から誘導される、請求項76に記載の方法。非開裂リンカーがSIABから誘導される、請求項77に記載の方法。リンカーが、少なくとも1つのメイタンシノイドのC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルの基のいずれか1つにある、請求項66に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、メイタンシノールのN-メチル-アラニンを含有するエステルである、請求項66に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、メイタンシノールのN-メチル-システインを含有するエステルである、請求項66に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、式II’-L、II’-DまたはII’-D,L:[式中:Y1’はを表し、式中:R1からR12は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR12はHであることができる;A、B、およびDは各々独立して、3から10の炭素原子を有する環式アルキルもしくは環式アルケニル、シンプルなアリールもしくは置換されたアリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルである;l、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuは各々独立して、0または1から5の整数である、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuの少なくとも2つが双方ともゼロではない;そしてMayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す]により表される、請求項66に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項82に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項82に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが、式II-L、II-D、またはII-D,L:[式中:Y1はを表し、式中:R1からR8は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR8はHであることができる;l、m、およびnは各々独立して、1から5の整数であり、そして加えてnはゼロであることができる;そしてMayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す]により表される、請求項66に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項85に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項85に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが式41’:[式中:Y1’はを表し、式中:R1からR12は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR12はHであることができる;A、B、およびDは各々独立して、3から10の炭素原子を有する環式アルキルもしくは環式アルケニル、シンプルなアリールもしくは置換されたアリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルである;そしてl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuは各々独立して、0または1から5の整数である、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuの少なくとも2つが双方ともゼロではない]により表される、請求項66に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項88に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項89に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドが式41:[式中:Y1はを表し、式中:R1からR8は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルまたはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR8はHであることができる;そしてl、m、およびnは各々独立して、1から5の整数であり、そして加えてnはゼロであることができる]により表される、請求項66に記載の方法。R1がメチルでありR2がHである、またはR1およびR2がメチルである、請求項91に記載の方法。R1がメチルであり、R2がHであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;またはR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、請求項91に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM1である、請求項66に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM3である、請求項66に記載の方法。少なくとも1つのメイタンシノイドがDM4である、請求項66に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式5の化合物:[式中Xは、2から20の炭素原子を持つ直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Yは3から10の炭素原子を持つシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Zは6から10の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族の基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSより選択される置換されたもしくは置換されていない複素環式の基であり、そしてl、mおよびnは各々0または1であるが、ただしそれらすべてが同時に0ではない、そしてEはカルボニル基と共に活性なエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよびスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ならびにスルホニルテトラフルオロフェニルエステルを形成する]を与える、請求項66に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式6の化合物:[式中、nは3から24の整数を表し、そしてEはカルボニル基と共に活性なエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよびスルホスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ならびにスルホニルテトラフルオロフェニルエステルを形成する]を与える、請求項66に記載の方法。メイタンシノイドが、イオウを含有しない架橋物質で修飾され、式7の化合物:[式中、RはHまたはSO3Naである]を与える、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、腫瘍細胞;ウイルスに感染した細胞、微生物に感染した細胞、寄生体に感染した細胞、自己免疫細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化T細胞、B細胞、もしくはメラノサイト;CD33、CD19、CanAg、CALLA、もしくはHer-2抗原を発現する細胞;またはインスリン増殖因子受容体、表皮増殖因子受容体、もしくは葉酸受容体を発現する細胞に結合する、請求項63に記載の方法。細胞結合物質が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、扁平上皮癌細胞、小細胞肺癌細胞、精巣癌細胞、および神経芽腫細胞から成る群より選択される細胞に結合する、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体、キメラ抗体フラグメント、標的細胞に特異的に結合するドメイン抗体、もしくはドメイン抗体フラグメント、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養素を輸送する分子である、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、インターフェロン、IL2、IL3、IL4、IL6、インスリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、ステロイドホルモン、ソマトスタチン、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、葉酸、トランスフェリン、エストロゲン、エストロゲン類似体、アンドロゲン、またはアンドロゲン類似体である、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する抗体、単鎖抗体、または抗体フラグメントである、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する表面再修飾した抗体、表面再修飾した単鎖抗体、または表面再修飾した抗体フラグメントである、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するヒト化抗体、ヒト化単鎖抗体、またはヒト化抗体フラグメントである、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体フラグメントである、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合する表面再修飾したモノクローナル抗体、表面再修飾した単鎖モノクローナル抗体、または表面再修飾したモノクローナル抗体フラグメントである、請求項66に記載の方法。細胞結合物質が、標的細胞に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体、ヒト化単鎖モノクローナル抗体、またはヒト化モノクローナル抗体フラグメントである発明の概要17以下に記載する本発明の説明のための非限定的な態様は、上の不都合な点および上に記載していないその他の不都合な点を克服するものである。その上本発明は上に記載した不都合な点を克服する必要がなく、以下に記載する本発明の説明のための非限定的な態様は、上に記載したいずれの問題点も克服していなくてよい。18本発明の1つの側面は、選択された細胞集団由来の細胞を含有すると推測される細胞集団または組織を、細胞結合物質メイタンシノイド複合体と接触させることを包含する、前記の選択された細胞集団を標的としてメイタンシノイドを向かわせるための方法であり、その場合1つまたはそれより多くのメイタンシノイドが非開裂リンカーを介して細胞結合物質に連結されている。19本発明のもう1つの側面は、標的に向かう物質が細胞結合物質である標的療法により治療することのできる、腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、ウイルス感染、寄生体感染、およびその他の疾患の治療のための方法であって、当該方法は1つまたはそれより多くのメイタンシノイドが細胞結合物質に連結されている細胞結合物質メイタンシノイド複合体、または医薬的に受容可能な前記複合体の製剤もしくは溶媒和物の有効量を、治療を必要とする被験者に投与することを包含する、前記方法である。20本発明のもう1つの側面は、1つまたはそれより多くのメイタンシノイドが非開裂リンカーを介して細胞結合物質に連結されている、細胞結合物質メイタンシノイド複合体である。21本発明のもう1つの側面は、上記記載の複合体を包含する組成物である。22本発明のもう1つの側面は、上記記載の複合体を製造する方法である。23本発明のもう1つの側面は、新規メイタンシノイドエステルである。発明の例としての態様の詳細な説明54当該技術分野は、現存する薬剤をそれらの細胞毒性の効能を低下させずに修飾することが極めて困難であることを露呈している。しかし米国特許第6,441,163B1号、6,333,410B1号、5,416,064号および5,208,020号は、開裂可能なリンカー、特にジスルフィド基を含有する開裂可能なリンカーを介して、メイタンシノイドを適当な細胞結合物質に連結することにより、効能ある細胞毒性物質を生成することができることを立証している。細胞結合物質メイタンシノイド複合体は、望ましくない細胞のみ標的とする形で適用して、それにより標的ではない健康な細胞に損傷を与えることによる副作用を避けるための、メイタンシノイドの十分な細胞毒性の作用を可能にする。55本発明者らは非開裂リンカーを介して細胞結合物質に連結したメイタンシノイドが、いくつかの重要な点において開裂可能なリンカーを介して連結したメイタンシノイドより優れていることを、意外にも発見した。特に開裂可能なリンカーを含有する複合体と比較した場合、非開裂リンカーを用いた複合体は、invitroおよびinvivoの双方において等しい抗腫瘍活性を示すが、血漿クリアランスの速度および毒性においては著明な低減が立証されている。56このように本発明は、副作用を最小限に抑えながら、標的とする細胞、特に破壊すべき細胞、例えば腫瘍細胞特に固形腫瘍細胞、ウイルスに感染した細胞、微生物に感染した細胞、寄生体に感染した細胞、自己免疫細胞自己抗体を産生する細胞、活性化細胞移植片拒絶または移植片対宿主病に伴うもの、または他のあらゆるタイプの罹患した細胞または異常な細胞に関する、改善された方法を提供する。57本発明の方法において使用する複合体は、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に連結した1つまたはそれより多くのメイタンシノイドを有する。複合体を製造する1つの方法において、細胞結合物質例えば抗体を、細胞結合物質例えばSMCCで初めに修飾する。第2のステップでチオール基を有する反応性のメイタンシノイド例えばDM1を、修飾した抗体と反応させて、抗体-メイタンシノイド複合体を生成する。あるいはメイタンシノイドを架橋試薬で修飾した後、細胞結合物質と反応させることもできる。例えば米国特許第6,441,163B1号を参照のこと。適切なメイタンシノイド58本発明における使用に適するメイタンシノイドは当該技術分野で周知であり、公知の方法に従って天然素材から単離する、遺伝子工学技術を用いて産生するYuetal99PNAS79687973を参照のこと、または公知の方法に従って合成により調製することができる。59適切なメイタンシノイドの例は、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を含む。適切なメイタンシノール類似体の例は、修飾された芳香環を有するもの、および他の位置に修飾を有するものを含む。60修飾された芳香環を有する適切なメイタンシノール類似体の具体的な例は以下を含む:1C-19-デクロロ米国特許第4,256,746号アンサマイトシンP2のLAH還元により調製;2C-20-ヒドロキシまたはC-20-デメチル-C-19-デクロロ米国特許第4,361,650号および4,307,016号ストレプトマイセスもしくはアクチノマイセスを用いての脱メチル化またはLAHを用いての脱クロロ化により調製;ならびに3C-20-デメトキシ、C-20-アシルオキシ-OCOR、-デクロロ米国特許第4,294,757号塩化アシルを用いてのアシル化により調製。61他の位置の修飾を有する適切なメイタンシノール類似体の具体的な例は以下を含む:1C-9-SH米国特許第4,424,219号メイタンシノールのH2SまたはP2S5との反応により調製;2C-14-アルコキシメチルデメトキシCH2OR米国特許第4,331,598号;3C-14-ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチルCH2OHまたはCH2OAc米国特許第4,450,254号ノカディアより調製;4C-15-ヒドロキシアシルオキシ米国特許第4,364,866号ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換により調製;5C-15-メトキシ米国特許第4,313,946号および4,315,929号トレウィアヌドルフローラより単離;6C-18-N-デメチル米国特許第4,362,663号および4,322,348号ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化により調製;ならびに74,5-デオキシ米国特許第4,371,533号メイタンシノールの三塩化チタンLAH還元により調製。62連結のタイプに依存して、メイタンシノールの多くの位置が結合位置として有用であることが知られている。例えばエステル結合を形成するためには、ヒドロキシル基を有するC-3の位置、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14の位置、ヒドロキシル基で修飾されたC-15の位置、およびヒドロキシル基を有するC-20の位置が、すべて適する。しかしC-3の位置が好ましく、メイタンシノールのC-3の位置が特に好ましい。63本発明に従って、好ましいメイタンシノイドはフリーのチオール基を有する。フリーのチオール基を包含する特に好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノールのC-3エステルおよびその類似体である、メイタンシノールのN-メチル-アラニンを含有するエステル、N-メチル-システインを含有するエステルを含む。好ましいエステルは、メイタンシノールのN-メチル-アラニン-を含有するエステル、およびN-メチル-システイン-を含有するエステルを含む。フリーのチオール基を有するメイタンシノールのエステルの合成は、以前に、例えば米国特許第5,208,020号、Charietal52CancerRes127131、およびLiuetal93ProcNatlAcadSci86188623に記載されている。さらに米国特許第6,333,410、B1号その全開示を本明細書により参照として援用するは、細胞結合物質への連結に適するチオールを含有するメイタンシノイドの調製および精製に関する改善された方法を提供している。64以下に例示する本発明の複合体の多くは、化学式ではN2’-デアセチル-N2’--メイタンシンと表す、チオールを含有するメイタンシノイドDM1を利用する。DM1は以下の構造式:で表される。65チオールを含有するメイタンシノイドDM1の合成は以前に記載されている米国特許第5,208,020号。66米国特許出願10849,136その全開示を本明細書により参照として援用するは、チオール官能基を持つα-炭素上に1つまたは2つのアルキル置換基を持つ、立体障害のチオールを含有するメイタンシノイドについて記載している。加えてスルフヒドリル基を持つメイタンシノイドのアシル化されたアミノ酸側鎖のアシル基は、アミドのカルボニル基とイオウ原子との間に少なくとも3つの炭素原子の直鎖を保有する。これらの新規メイタンシノイドは、本発明における使用に適する。67立体障害のチオール基を有するメイタンシノイドの合成は、米国特許出願10849,136号、特に同文献の図3を参照として記載することができる。68本発明の1つの側面において、メイタンシノイドは立体障害のチオール基を含有し、式II’-L、II’-D、またはII’-D,L:により表される。式II’において、Y1’はを表す。A、B、およびDは各々独立して、3から10の炭素原子を有する環式アルキルもしくは環式アルケニル、シンプルなアリールもしくは置換されたアリール、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルである。R1からR12は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルもしくはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環式のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環式芳香族もしくはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR12はHであることができる。l、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuは各々独立して、0または1から5の整数である、ただしl、m、n、o、p、q、r、s、t、およびuの少なくとも2つが双方ともゼロではない。MayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノイドを表す。69本発明に有用なもう1つのメイタンシノイドは、式II-L、II-D、またはII-D,L:により表される。式IIにおいて、Y1はを表す。R1からR8は各々独立して、1から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルまたはアルケニル、3から10の炭素原子を有する分枝鎖または環式のアルキルまたはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、複素環式芳香族またはヘテロシクロアルキルのラジカルであり、そして加えてR2からR8はHであることができる。l、m、およびnは各々独立して、1から5の整数であり、そして加えてnは0であることができる。MayはC-3ヒドロキシル、C-14ヒドロキシメチル、C-15ヒドロキシルまたはC-20デスメチルに側鎖を持つメイタンシノールを表す。70もう1つの有用なメイタンシノイドを式41’:により表す。式中、置換基は上の式II’について定義したとおりである。71もう1つの有用なメイタンシノイドを式41:により表す。式中、置換基は上の式IIについて定義したとおりである。72好ましくは、式中R1がHでありR2がメチルである、またはR1およびR2がメチルである、上に記載した化合物のいずれかである。73特に好ましくは、式中R1がHであり、R2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが各々1であり、そしてnが0である;ならびにR1およびR2がメチルであり、R5、R6、R7およびR8が各々Hであり、lおよびmが1であり、そしてnが0である、上に記載した化合物のいずれかである。74さらにL-アミノアシル立体異性体が好ましい。751から10の炭素原子を有する直鎖のアルキルまたはアルケニルの例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、プロペニル、ブテニルおよびヘキセニルを含むがこれに限定されない。763から10の炭素原子を有する分枝鎖のアルキルまたはアルケニルの例は、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、イソペンチル、1-エチル-プロピル、イソブテニルおよびイソペンテニルを含むがこれに限定されない。773から10の炭素原子を有する環式のアルキルまたはアルケニルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、およびシクロヘキセニルを含むがこれに限定されない。78シンプルなアリールは6から10の炭素原子を有するアリールを含み、置換されたアリールは、1から4の炭素原子を含有する少なくとも1つのアルキル置換基、またはアルコキシ置換基例えばメトキシ、エトキシ、またはハロゲン置換基またはニトロ置換基を有する6から10の炭素原子を有するアリールを含む。796から10の炭素原子を含有するシンプルなアリールの例は、フェニルおよびナフチルを含むがこれに限定されない。80置換されたアリールの例はニトロフェニル、ジニトロフェニルを含むがこれに限定されない。81複素環式芳香族ラジカルは、N、OまたはSより選択される1つまたは2つのヘテロ原子を含有する3から10員環を有する基を含む。82複素環式芳香族ラジカルの例は、ピリジル、ニトロ-ピリジル、ピロリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、およびフリルを含むがこれに限定されない。83ヘテロシクロアルキルラジカルは、N、OまたはSより選択される1つまたは2つのヘテロ原子を含有する3から10員環系を包含する環式化合物を含む。84ヘテロシクロアルキルラジカルの例は、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリノを含むがこれに限定されない。85立体障害のチオール結合を含有する側鎖を包含する特に好ましいメイタンシノイドは、以下のメイタンシノイド、すなわちN2’-デアセチル-N2’--メイタンシンDM3と呼ぶおよびN2’-デアセチル-N2’--メイタンシンDM4と呼ぶである。DM3およびDM4は以下の構造式:により表される。細胞結合物質86治療薬としての本発明の化合物の有効性は、適当な細胞結合物質の注意深い選択に依存する。細胞結合物質は、現在知られている、または知られるようになるあらゆる種類の物質でよく、ペプチドおよび非ペプチドを含む。一般にこれらは抗体特にモノクローナル抗体、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養素を輸送する分子例えばトランスフェリン、または標的に特異的に結合するあらゆるそれ以外の細胞に結合する分子もしくは物質であることができる。87使用することのできる細胞結合物質のより具体的な例は以下を含むことができる:完全なヒトの抗体を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体;単鎖の抗体ポリクローナルおよびモノクローナル;抗体のフラグメントポリクローナルおよびモノクローナル、例えばFab、Fab’、Fab’2、およびFvParham131JImmunol28952902Springetal113JImmunol470478Nisonoffetal89ArchBiochemBiophys230244キメラ抗体および抗原に結合するそのフラグメント;ラクダの抗体を含む、ドメイン抗体dAbsおよび抗原に結合するそのフラグメントDesmyteretal3NatureStructBiol7521996;新たな抗原受容体と言われるサメの抗体IgNARGreenbergetal374Nature1681995Stanfieldetal305Science177017732004;インターフェロン例えばアルファ、ベータ、ガンマ;リンホカイン例えばIL-2、IL-3、IL-4、IL-6;ホルモン例えばインスリン、TRH甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、MSHメラノサイト刺激ホルモン、ステロイドホルモン例えばアンドロゲンおよびエストロゲン;増殖因子およびコロニー刺激因子例えばEGF、TGF-アルファ、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSFおよびGM-CSFBurgess5ImmunologyToday155158;トランスフェリンO’Keefeetal260JBiolChem932937;およびビタミン、例えばフォレート。88モノクローナル抗体の技術により、特異的なモノクローナル抗体の形で極めて特異的な細胞結合物質を産生することができる。当該技術分野において特に周知なのは、対象の抗原例えば標的細胞そのもの、標的細胞から単離した抗原、ウイルス全体、弱毒化ウイルス全体、およびウイルスのタンパク質例えばウイルスのコートタンパク質を用いて、マウス、ラット、ハムスターまたはその他のあらゆる哺乳動物を免疫することにより産生されるモノクローナル抗体を作成するための技術である。感作されたヒトの細胞もまた使用することができる。モノクローナル抗体を作成するもう1つの方法は、scFv一本鎖可変部断片、具体的にはヒトscFvのファージライブラリ例えばGriffithsetal米国特許第5,885,793号および5,969,108号;McCaffertyetalWO9201047;LimingetalWO9906587を参照のことを使用することである。加えて、米国特許第5,639,641号に開示された表面再修飾したresurfaced抗体もまた、ヒト化抗体として使用してよい。89適当な細胞結合物質の選択は、標的とすべき特定の細胞集団に依存する選択の問題であるが、一般的なヒトのモノクローナル抗体で、適当な1つが利用できれば好ましい。90例えばモノクローナル抗体J5は、共通急性リンパ芽球性白血病抗原CommonAcuteLymphoblasticLeukemiaAntigenCALLAに対して特異的であるネズミIgG2a抗体Ritzetal283Nature583585であるが、標的細胞がCALLAを発現する場合、例えば急性リンパ芽球性白血病の疾患において使用することができる。91モノクローナル抗体MY9は、CD33抗原に特異的に結合するネズミIgG1抗体JDGriffinetal8LeukemiaRes521であるが、急性骨髄性白血病AMLの疾患におけるように標的細胞がCD33を発現する場合に使用することができる。92同様に、互換性をもってB4とも言われるモノクローナル抗体抗B4は、B細胞上のCD19抗原に結合するネズミIgG1Nadleretal131JImmunol244250であるが、標的細胞がB細胞、またはこの抗原を発現する罹患した細胞である場合、例えば非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病において使用することができる。93加えてCanAg抗原に結合するモノクローナル抗体C242米国特許第5,552,293号を使用して、CanAgを発現する腫瘍、例えば結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、および胃癌を治療することができる。huC242は、米国特許第5,552,293号に記載されているヒト化モノクローナル抗体C242であり、これに関してはハイブリドーマがECACC同定番号90012601にて保管されている。ヒト化は、CDRグラフティング法米国特許第5,585,089号;5,693,761号;および5,693,762号、または表面再修飾するresurfacing方法米国特許第5,639,641号のいずれかを適用することにより調製することができる。huC242を使用してもまた、CanAgを発現する腫瘍、例えば結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、および胃癌を治療することができる。94さらに抗体のトラスツツマブを使用して、乳癌ならびにHer2抗原を発現する前立腺癌および卵巣癌のようなその他の癌、を治療することができる。95インスリン増殖因子受容体に結合する抗IGF-IR抗体もまた有用である。96卵巣癌および前立腺癌を、例えば各々抗MUC1抗体、例えば抗HMFG-2TaylorPapadimitriouetal28IntJCancer17211981またはhCTM0156CancerRes517951851996、および抗PSMA前立腺に特異的な膜抗原、例えばJ591Liuetal57CancerRes362936341997を用いて、それぞれうまく標的とすることができる。97抗体でない分子を使用してもまた特異的な細胞集団を標的とすることができる。例えば骨髄細胞に結合するGM-CSFを細胞結合物質として使用して、急性骨髄性白血病由来の罹患した細胞を標的とすることができる。加えて活性化T細胞に結合するIL-2を、移植片拒絶の予防、移植片対宿主病の治療および予防、および急性T細胞白血病の治療用に使用することができる。メラノサイトに結合するMSHは、黒色腫の治療用に使用することができる。葉酸を使用して、卵巣腫瘍およびその他の腫瘍上に発現される葉酸受容体を標的とすることができる。表皮増殖因子EGFを使用して、扁平上皮細胞癌、例えば肺癌ならびに頭部および頸部の癌を標的とすることができる。ソマトスタチンを使用して、神経芽腫およびその他の腫瘍のタイプを標的とすることができる。乳癌および精巣癌は、各々細胞結合物質としてエストロゲンもしくはエストロゲン類似体またはアンドロゲンもしくはアンドロゲン類似体を用いて、うまく標的とすることができる。架橋試薬98メイタンシノイドは、反応させた時にメイタンシノイドおよび細胞結合物質の間に非開裂リンカーを形成する架橋試薬を使って、細胞結合物質に連結される。99本明細書において使用する場合リンカーは、細胞結合物質を共役結合によりメイタンシノイドに連結するあらゆる化学的部分である。一部の場合には、リンカー部分はメイタンシノイドにより提供される。例えばチオールを含有するメイタンシノイドであるDM1図2は、天然のメイタンシノイドであるメイタンシンの誘導体であるが、リンカー部分を提供する。メイタンシンのC-3ヒドロキシル基での側鎖は末端が-CO-CH3であり、DM1の側鎖は末端が-CO-CH2-CH2-SHである。したがって最終的なリンカーは2つの部分、すなわち細胞結合物質に導入された架橋試薬およびDM1由来の側鎖から組み立てられる。100開裂可能なリンカーはマイルドな条件下、すなわちメイタンシノイド薬剤の活性に影響を及ぼさない条件下、で開裂することのできるリンカーである。多くの公知のリンカーがこのカテゴリーに含まれ、そしてこれらを以下に記載する。101ジスルフィドを含有するリンカーは、生理学的条件下で起こり得るジスルフィド交換を通して開裂可能なリンカーである。102酸に不安定なリンカーは、酸性のpHで開裂可能なリンカーである。例えばある種の細胞内の一区画、例えばエンドソームおよびリソソームは、酸性のpHpH4-5を有しており、酸に不安定なリンカーを開裂するのに適する条件を提供する。103光に不安定なリンカーは、体表面でおよび光の届き得る多くの体腔において有用である。さらに赤外光は組織を透過することができる。104いくつかのリンカーはペプチダーゼにより開裂することができる。ある種のペプチドのみしか細胞内部または外部で容易に開裂されない。例えばTrouetetal79ProcNatlAcadSciUSA626629およびUmemotoetal43IntJCancer677684を参照のこと。さらにペプチドはα-アミノ酸およびペプチド結合から成り、ペプチド結合は化学的には1つのアミノ酸のカルボキシレートおよび第2のアミノ酸のα-アミノ基間のアミド結合である。その他のアミド結合、例えばカルボキシレートおよびリジンのε-アミノ基間の結合は、ペプチド結合ではないと理解されており、開裂可能でないと考えられている。105いくつかのリンカーはエステラーゼにより開裂することができる。やはりある種のエステルのみしか、細胞内部または外部に存在するエステラーゼにより開裂することはできない。エステルはカルボン酸およびアルコールの縮合により形成される。シンプルなエステルは、シンプルなアルコール、例えば脂肪族アルコール、ならびに小さな環式アルコールおよび小さな芳香族アルコールにより生成されるエステルである。例えば本発明では、エステルのアルコール成分であるメイタンシノールが非常に大きく複雑であるため、メイタンシンのC-3のエステルを開裂するエステラーゼを発見することはできなかった。106非開裂リンカーは、安定な共有結合の様式でメイタンシノイドを細胞結合物質に連結することができ、開裂可能なリンカーとして上に列記したカテゴリーに含まれないあらゆる化学的な部分である。したがって非開裂リンカーは、酸に誘発される開裂、光に誘発される開裂、ペプチダーゼに誘発される開裂、エステラーゼに誘発される開裂、およびジスルフィド結合の開裂に対して実質的に耐性がある。107開裂に対して実質的に耐性があることは、細胞結合物質メイタンシノイド複合体母集団の少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、なおより好ましくは少なくとも95、そして最も好ましくは少なくとも99のリンカーの化学的結合またはリンカーに隣接する化学的結合が、酸、光感受性開裂物質、ペプチダーゼ、エステラーゼ、または開裂可能なリンカーの化学的結合例えばジスルフィド結合を開裂する化学的化合物もしくは生理学的化合物によって、上に記載した物質のいずれかによる処理の数時間から数日間の範囲内で、非開裂を維持することを意味する。108さらに非開裂は、メイタンシノイドまたは細胞結合物質がその活性を失わない条件で、酸、光感受性開裂物質、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を開裂する化学的化合物もしくは生理学的化合物により誘発される開裂に耐える、リンカーの化学的結合またはリンカーに隣接する化学的結合の能力を言う。109当業者は、開裂可能なリンカーから非開裂リンカーを容易に識別することだろう。110リンカーが開裂に対して実質的に耐性があるかどうかを検査するための適当なコントロールの一例は、上に記載した物質のいずれかにより開裂されやすい化学的結合、例えばジスルフィド結合を含むリンカーである。リンカーが開裂に対して実質的に耐性があるかどうかは、ELISA、HPLC、またはその他の適切な手段により、数時間から数日間、典型的には4時間から5日間に及ぶ時間にわたり複合体の安定性を測定することにより、検査することができる。ELISAアッセイを使用して、血漿濃度における安定な複合体のレベルを測定することができる。111非開裂リンカーはまた、非開裂リンカーを包含する複合体のinvivoの半減期が開裂可能なリンカーを包含する複合体の値より、一般に約20高いという特徴がある。マウスにおいて、非開裂リンカーを介して連結したIgG-メイタンシノイド複合体のinvivoの半減期は、少なくとも4日である。112メイタンシノイドおよび細胞結合物質の間に、非開裂リンカーを形成する適切な架橋試薬は当業界において周知であり、イオウ原子を包含する例えばSMCCまたはイオウ原子を含まない非開裂リンカーを形成することができる。113メイタンシノイドおよび細胞結合物質の間に非開裂リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドまたはハロアセチルを基本とする部分を包含する。本発明に従って、そのような非開裂リンカーはマレイミドまたはハロアセチルを基本とする部分から誘導されると言う。マレイミドを基本とする部分を包含する架橋試薬は、N-スクシンイミジル4-シクロヘキサンカルボキシレートSMCC、SMCCの長鎖類似体であるN-スクシンイミジル-4--シクロヘキサン-1-カルボキシ-LC-SMCC、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、N--スクシンイミドエステルAMAS、スクシンイミジル-6-ヘキサノエートSMPH、N-スクシンイミジル4--ブチレートSMPB、およびN-イソシアネートPMPIを含むマレイミドを基本とする架橋試薬の代表的な構造については図15を参照のこと。これらの架橋試薬はマレイミドを基本とする部分から誘導される非開裂リンカーを形成する。114ハロアセチルを基本とする部分を包含する架橋試薬は、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセテートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセテートSBAおよびN-スクシンイミジル3-プロピオネートSBAPを含むハロアセチルを基本とする架橋物質の代表的な構造については図16を参照のこと。これらの架橋試薬はハロアセチルを基本とする部分から誘導される非開裂リンカーを形成する。115図15および図16に記載した活性なエステルは、N-ヒドロキシスクシンイミジルおよびスルホスクシンイミジルのエステルから成るが、他の活性なエステル、例えばN-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびスルホニルテトラフルオロフェニルエステルもまた使用することができる。116特に好ましい架橋試薬は、イオウ原子を含有しない非開裂リンカーを形成する。図21は、α、ω-ジカルボン酸アルカンまたはアルケンが3-24の炭素原子を有するアルカン二酸またはアルケン二酸から誘導される、架橋物質を用いて誘導体化したメイタンシノイド分子を示す。細胞結合物質と反応させると、架橋試薬はイオウを含まない非開裂リンカーSを含有しない非開裂リンカーを形成することになる。117図21のメイタンシノイド分子は、以下のように製造する。最初にアジピン酸ヘキサン二酸または1,6-ヘキサンジカルボン酸としても知られるのモノエステルを、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、1当量の2-トリメチルシリルエタノールを用いて処理することにより調製する。イソブチルクロロホルメートを用いて残っているカルボン酸基を活性化し、続いてN-メチル-L-アラニンと反応させ、アシル化したN-メチル-L-アラニンを提供する。ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび塩化亜鉛の存在下でメイタンシノールと反応させ、続いてテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いてトリメチルシリル保護基を除去し、フリーのカルボキシ基を持つメイタンシノイドエステルを提供する。ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でのスルホN-ヒドロキシスクシンイミドとの反応による、カルボキシル基のエステル化により、細胞結合物質と反応することのできるメイタンシノールの活性なエステルを提供し、イオウ原子を含有しない非開裂複合体を得る。118イオウ原子を含有しない非開裂リンカーはまた、上に記載した方法を用いて他のジカルボン酸を基本とする部分から誘導することもできる。他の適切なジカルボン酸を基本とする部分として、一般式IVのα、ω-ジカルボン酸:を含むがこれに限定されない。119式IVにおいてXは、2から20の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、Yは3から10の炭素原子を持つシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Zは6から10の炭素原子を持つ置換されたもしくは置換されていない芳香族の基、またはヘテロ原子がN、OもしくはSより選択される置換されたもしくは置換されていない複素環式の基であり、そして式中l、mおよびnは各々0または1であるが、ただしそれらすべてが同時に0ではない。120Sを含有しない非開裂リンカーを有する複合体を形成するために、細胞結合物質と直接反応させることのできる活性なエステルを含有する誘導体化したメイタンシノイドは、式5:により表すことができ、式中X、Y、Z、l、mおよびnはすべて上の式IVについて定義したとおりであり、さらに式中Eはカルボニル基と共に活性なエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミジルおよびスルホスクシンイミジルのエステル、N-ヒドロキシフタルイミジルエステル、N-ヒドロキシスルホフタルイミジルエステル、オルト-ニトロフェニルエステル、パラ-ニトロフェニルエステル、2,4-ジニトロフェニルエステル、3-スルホニル-4-ニトロフェニルエステル、3-カルボキシ-4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびスルホニルテトラフルオロフェニルエステルを形成する。121好ましくは式6により表される誘導体化したメイタンシノイド:であり、式中nは3から24の整数を表し、Eは式5のメイタンシノイドについてと同様の定義を有する。122より好ましい態様は、式7により表される誘導体化したメイタンシノイド:であり、式中RはHまたはSO3-Naである。123式5、6、および7の化合物は、新規メイタンシノイドである。1242から20の炭素原子を有する直鎖のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基の例は、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、プロペニル、ブテニルおよびヘキセニルを含むがこれに限定されない。1252から20の炭素原子を有する分枝鎖のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基の例は、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、イソペンチル、1-エチル-プロピル、イソブテニル、イソペンテニル、エチニル、プロピニルプロパルギル、1-ブチニル、2-ブチニル、および1-ヘキシニルを含むがこれに限定されない。1263から10の炭素原子を有するシクロアルキル基またはシクロアルケニル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、およびシクロヘプタジエニルを含むがこれに限定されない。1276から10の炭素原子を含有する芳香族の基の例は、フェニルおよびナフチルを含むがこれに限定されない。128置換された芳香族の基の例は、ニトロフェニルおよびジニトロフェニルを含むがこれに限定されない。129複素環式芳香族の基は、N、OまたはSより選択される1つまたは2つのヘテロ原子を含有する、3から10員環を有する基を含むがこれに限定されない。130置換されたおよび置換されていない複素環式芳香族の基の例は、ピリジル、ニトロ-ピリジル、ピロリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、およびフリルを含むがこれに限定されない。131ヘテロシクロアルキルラジカルは、N、OまたはSより選択される1つまたは2つのヘテロ原子を含有する、3から10員環系を包含する環式化合物を含むがこれに限定されない。132ヘテロシクロアルキルラジカルの例は、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピロリル、ピペリジニル、ピペラジニル、およびモルホリノを含むがこれに限定されない。133一般式HOOC-Xl-Yn-Zm-COOHのα、ω-ジカルボン酸の例は、アジピン酸、グルタル酸、ピメリン酸、ヘキセン-1,6-二酸、ペンテン-1,5-二酸、シクロヘキサン-二酸、およびシクロヘキセン-二酸を含むがこれに限定されない。細胞毒性の複合体の合成134細胞結合物質およびメイタンシノイドの複合体は、現在公知のまたは今後開発されるあらゆる技術を用いて形成することができる。135細胞結合物質をメイタンシノイドと複合体化する方法は、一般に2段階の反応ステップを伴う。米国特許第5,208,020号に記載されている1つの方法において、細胞結合物質、例えば抗体を、架橋試薬を用いて修飾して、1つまたはそれより多く、通常1-10の反応基を導入することができる。次に修飾された細胞結合物質を1つまたはそれより多くのチオールを含有するメイタンシノイドと反応させて、複合体を生成する。136あるいは米国特許第6,441,163B1号に開示されているように、チオールを含有するメイタンシノイドを初めに架橋試薬で修飾し、続いて修飾されたメイタンシノイドを細胞結合物質と反応させることができる。例えばチオールを含有するメイタンシノイドを、図15に記載したマレイミド化合物と、または図16に記載したハロアセチル化合物と反応させ、活性なスクシンイミジルエステルまたはスルホスクシンイミジルエステルを持つメイタンシノイドチオエーテルを得ることができる。活性化されたリンカー部分を含有するこれらのメイタンシノイドを、細胞結合物質と反応させることにより、非開裂の細胞結合物質メイタンシノイド複合体を生成するもう1つの方法を提供する。137本発明のもう1つの側面において、上に開示したように、イオウ原子を含有しないメイタンシノイドを、ジカルボン酸を基本とする架橋試薬により初めに誘導体とし、続いて細胞結合物質と反応させて、Sを含有しない非開裂リンカーを介してメイタンシノイドが細胞結合物質に連結されている複合体を形成することができる。138典型的には1抗体当たり平均して1-10のメイタンシノイドが連結される。複合体はSephadexG25カラムを通して精製することができる。139米国特許第5,208,020号および6,441,163B1号の全開示を特に本明細書において参照として援用する。140本発明の代表的な複合体は、抗体-メイタンシノイド誘導体、抗体フラグメント-メイタンシノイド誘導体、増殖因子-メイタンシノイド複合体例えば表皮増殖因子EGE-メイタンシノイド誘導体、ホルモン-メイタンシノイド複合体例えばメラノサイト刺激ホルモンMSH-メイタンシノイド誘導体、甲状腺刺激ホルモンTSH-メイタンシノイド誘導体、エストロゲン-メイタンシノイド誘導体、エストロゲン類似体-メイタンシノイド誘導体、アンドロゲン-メイタンシノイド誘導体、アンドロゲン類似体メイタンシノイド誘導体、およびビタミン-メイタンシノイド複合体例えば葉酸エステルfolateメイタンシノイドである。141抗体、抗体フラグメント、タンパク質のホルモン、タンパク質の増殖因子およびその他のタンパク質のメイタンシノイド複合体も、同様の方法で作成する。例えばペプチドおよび抗体は、上述の非開裂架橋試薬で修飾することができる。文献に記載されているように、バッファー水溶液中の抗体の溶液を過剰モルの抗体を修飾する架橋試薬、例えばスクシンイミジル-4--シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、スルホ-MBS、スクシンイミジル-ヨードアセテート、またはN-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、SMCCの長鎖類似体であるN-スクシンイミジル-4--シクロヘキサン-1-カルボキシ-LC-SMCC、スルホ-LC-SMCC、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステルKMUA、スルホ-KMUA、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステルGMBS、スルホ-GMBS、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルEMCS、スルホ-EMCS、N--スクシンイミドエステルAMAS、スルホ-AMAS、スクシンイミジル-6-ヘキサノエートSMPH、スルホ-SMPH、N-スクシンイミジル4--ブチレートSMPB、スルホ-SMPH、N-イソシアネートPMPI、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、N-スクシンイミジルヨードアセテートSIA、N-スクシンイミジルブロモアセテートSBA、およびN-スクシンイミジル3-プロピオネートSBAPと共にインキュベーションしてよい。Yoshitakeetal101EurJBiochem395399HashidaetalJAppliedBiochem5663およびLiuetal18690697Utoetal138JImmunolMeth8794Richetal18JMedChem10041010KitagawaandAikawa79JBiochem233236Tanimorietal62JImmunolMeth123128Higashidaetal6JApplBiochem5663Thorpeetal140EurJBiochem6371Chriseyetal24NuclAcidRes30313039Annunziatoetal4BioconjugateChem212218Rectoretal24JImmunolMeth321336、およびInmanetal2BioconjugateChem458463を参照のこと。142次に修飾された抗体を、チオールを含有するメイタンシノイド1.25モル等量マレイミド基またはヨードアセチル基で処理して、複合体を生成する。混合液を一晩、約4°Cでインキュベーションする。抗体-メイタンシノイド複合体を、SephadexG25カラムを通してのゲル濾過により精製する。1抗体分子当たりに結合したメイタンシノイド分子の数は、分光光度計で252nmおよび280nmの吸光度の比率を測定することにより決定することができる。典型的には1抗体当たり平均して1-10のメイタンシノイドが連結される。143好ましい方法は、スクシンイミジル4--シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCCで抗体を修飾してマレイミド基を導入し、続いて修飾された抗体の、チオールを含有するメイタンシノイドとの反応により、チオエーテルで連結した複合体を得ることである。やはり1抗体分子当たり1から10の薬剤分子を伴う複合体が得られる。抗体-メイタンシノイド複合体の例を図17-20に示す。144同様に例えば、エストロゲンおよびアンドロゲンの細胞結合物質例えばエストラジオールおよびアンドロステンジオールは、適当に保護されたチオール基を含有するカルボン酸クロリド例えば3-S-アセチルプロパノイルクロリドと反応させることにより、C-17ヒドロキシ基でエステル化することができる。エステル化のその他の方法についても、文献Haslam36Tetrahedron24002433に記載されている様に利用することができる。次に保護されたまたはフリーのチオールを含有するアンドロゲンまたはエストロゲンを、チオールを含有するメイタンシノイドと反応させて、複合体を生成することができる。複合体はシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーまたはHPLCにより精製することができる。145特定の好ましい方法は、いかなるイオウ原子も含有しない結合を結果的に得られる架橋試薬でメイタンシノールを修飾し、続いて修飾されたメイタンシノイドを抗体と反応させることにより複合体を生成するものである。本発明の細胞毒性複合体の治療効能146本発明の細胞結合物質メイタンシノイド複合体を、invitroで多様な細胞株の増殖を抑制するそれらの能力について評価することができる。例えば、細胞株例えばヒト結腸癌株COLO205、ヒト黒色腫細胞株A375、ヒト骨髄性白血病細胞株HL60、ヒト乳癌株SKBR3、またはヒト表皮癌細胞株KBを、これらの複合体の細胞毒性の評定のために使用することができる。評価する細胞を、24時間化合物に暴露させ、生存している細胞の分画を公知の方法による直接的なアッセイで測定することができる。例えば、Goldmacheretal135JImmunol36483651、およびGoldmacheretal102JCellBiol13121319を参照のこと。次にIC50値をアッセイの結果から算出することができる。147高い細胞毒性は、invitroでSKBR3細胞を用いて薬剤への24時間暴露で測定したときに、約10-8Mまたはそれ未満のIC500.5の生存している分画が残る毒性物質の阻害濃度を有する毒性を示すものとして定義することができる。148本発明の抗体-メイタンシノイド複合体のinvitroの効能および標的特異性を図4に示す。架橋試薬SMCCを用いてのhuC242のDM1との複合体は、3.5×10-12MのIC50値を有する、抗原陽性のSKBR3細胞を破壊する高い効能がある。反対に抗原陰性のA375細胞には800分の1未満の感受性であり、本発明のメイタンシノイド複合体が高い効能および特異性があることを立証している。149huC242-SMCC-DM1複合体は、クローン原性アッセイ図6A-Cおよび間接的な細胞毒性アッセイ図7において、ジスルフィドを含有するリンカーを用いて調製した複合体と比較した場合、等しいかまたはそれより高い効能があった。SMCCを介してメイタンシノイドに複合体化した抗Her2抗体が特異的な活性を示さなかったことを立証する以前に公開されたデータCharietal52CancerRes127133に基づけば、これらの結果は予想外であった。150SMCCという非開裂リンカーを用いて調製された複合体の活性は、huC242の複合体に限定されない。invitroの特異的な活性はまた、抗Her2抗体のトラスツツマブ;抗CD33抗体のMy9-6;抗EGFR抗体のKS77;および抗CD56抗体のN901の、SMCC-DM1複合体でも観察された図8A-Dおよび25。151加えてinvitroで特異的な活性を示す非開裂リンカーを用いた複合体は、SMCCリンカーに限定されない。非開裂リンカーSIABを用いて合成したDM1のhuC242複合体は、invitroのクローン原性アッセイにおいて効能および抗原特異的な細胞毒性を示した図9。さらにSIABを用いて合成したDM1のトラスツツマブ複合体もまた、クローン原性アッセイにおいて細胞毒性があった図28。さらにhuC242-Sを含有しない非開裂リンカー-DM1複合体もまた、invitroのクローン原性アッセイにおいて効能および抗原特異的細胞毒性が立証された図22。152SMCCリンカーを用いてのDM1との抗体の複合体は、マウスにおいて、ヒト腫瘍の異種移植片に対する抗腫瘍効能を示す図10A-C。SNU16胃腫瘍の異種移植片の、huC242-SMCC-DM1による治療での、腫瘍の成長の顕著な阻害が観察された図10A。この抗腫瘍活性は、薬剤の毒性の基準であるマウスの体重に影響を及ぼさない複合体の用量で観察されている。COLO205結腸癌腫瘍の異種移植片を有するマウスの、huC242-SMCC-DM1複合体による治療は、腫瘍の完全な緩解をもたらし、何頭かのマウスは治療後2ヶ月にわたり検出可能な腫瘍が認められないままであった図10B。やはりこの活性も、マウスの体重に影響を示さない複合体の濃度で観察された。トラスツツマブ-SMCC-DM1複合体もまた、MCF-7乳癌細胞株を用いたマウスの腫瘍異種移植片モデルにおいて、有意な腫瘍の緩解を示した図10C。153非開裂リンカーSMCCを用いて合成した抗体-メイタンシノイド複合体の血漿クリアランスは非常に遅く、抗体単独のクリアランスに匹敵する。このことは、相対的に変化しやすいジスルフィド結合を用いて調製した複合体、例えばhuC242-SPP-DM1の血漿クリアランスと明確な対比をなす。例えばSMCC複合体のクリアランスの半減期はおよそ320時間であり、一方SPP複合体の半減期は40-50時間の範囲内である図11。しかし各タイプの複合体に関する抗体成分のクリアランスは一致しており、測定された複合体のクリアランス速度の差異が、SPP-DM1複合体の場合、抗体複合体からのメイタンシノイドの喪失によるものであることを示唆する。したがって非開裂SMCCの結合はSPP-DM1複合体に比して、invivoに存在するメイタンシノイド-リンカー開裂活性に対して、はるかに大きな耐性がある。さらにSPP-DM1複合体に比してSMCCで連結した複合体の低下したクリアランス速度は、薬物濃度曲線下面積AUCにより測定した場合、動物のメイタンシノイドへの暴露全体においてほぼ5倍の増加をもたらすことになる。この増加された暴露が、一部の場合には薬剤の効能への実質的なインパクトを有することができるだろう。154非開裂リンカー例えばSMCCを用いて調製したメイタンシノイド複合体は、開裂可能なジスルフィドリンカーを用いて調製した複合体と比較して、マウスにおいて予想外の増加した許容性を示す。1回の静脈内投与による急性毒性検査を、メスCD-1マウスにて行った。huC242-SMCC-DM1複合体非開裂の、開裂可能なジスルフィド結合を含有するリンカーを用いて調製したhuC242複合体との許容性の比較を、各複合体の一連の4段階の用量増加にわたる、マウスの死亡図12AおよびBおよび毒性の兆候図12CおよびDをモニターすることにより行った。SMCC-DM1複合体に関する最大耐用量MTDは、検査した最大用量150mgkgより高かったが、ジスルフィドで連結した複合体であるSPP-DM1に関するMTDは、45-90mgkgの範囲内であった。150mgkgでSMCC-DM1治療群のすべてのマウスは生存していたが、SPP-DM1治療群のすべてのマウスに関しては治療後96時間までに致死的毒性であることが観察された。155メイタンシノイド複合体は、微小管の重合の阻害を通してそれらの細胞を破壊する活性を及ぼすと考えられている。この微小管の重合の阻害は、細胞周期を主としてG2Mで停止させることになる。抗体-メイタンシノイド複合体による細胞の抗原依存性のG2M2での停止は、フローサイトメトリーの分析によりモニターすることができる図13。huC242-SPP-DM1複合体またはhuC242-SMCC-DM1複合体によるCOLO205細胞の処理は、6-10時間までにG2Mでの完全な停止をもたらす。しかし処理後30時間までに、ジスルフィドで連結したhuC242-SPP-DM1複合体での処理により停止された細胞の一部は、細胞周期の停止から脱して細胞分裂を再開している。驚くことに非開裂複合体で処理した細胞は、この後者のタイムポイントで細胞周期の阻止から脱していない。これら2つの複合体の活性の持続性の差異はまた、トリパンブルーを用いての色素排除アッセイにより判定した場合の、30時間のタイムポイントで死滅した細胞の比率にも反映されている。これらの結果は、非開裂SMCCリンカー複合体での処理により導入される分子レベルの事象の予想外の持続性を立証している。156開裂可能なジスルフィドリンカーを有する複合体と比較しての、非開裂リンカーを用いて調製した複合体の付加的な側面は、本明細書でバイスタンダー効果と言う、抗原陽性細胞に近接している場合に抗原陰性細胞に対する活性、を示さないことである。すなわち非開裂リンカーを用いて調製した複合体は、最小のバイスタンダー活性を有する。huC242-SPP-DM1開裂可能複合体およびhuC242-SMCC-DM1非開裂複合体の双方とも、別々に培養した場合には、抗原陽性COLO205細胞株に対して効能のある細胞破壊活性を示し、抗原陰性細胞株であるNamalwaに対しては活性を有していない。しかしCOLO205細胞およびNamalwa細胞の共培養での、huC242-SPP-DM1による処置は、抗原陰性Namalwa細胞に対してさえも複合体の劇的な細胞破壊活性を現した。反対にhuC242-SMCC-DM1複合体は、これらの条件下でそのようないかなるバイスタンダー活性も示されていない。Namalwa細胞に対して細胞破壊活性を示さないことが、抗原陽性COLO205細胞と共溶媒した場合でさえも、huC242-SMCC-DM1複合体で観察されている。このinvitroアッセイで測定した際の、非開裂複合体のこの最小のバイスタンダー活性が、急性毒性試験で観察された非開裂リンカーを用いた複合体の増加した許容性に寄与しているのかもしれない。157上の実験の結果は、本発明の非開裂リンカーを用いたメイタンシノイド複合体が、以前に記載された細胞結合物質メイタンシノイド複合体と比較して、大幅に改善された抗腫瘍活性を保有することを立証している。使用方法158上に記載した複合体は、選択された細胞集団を標的としてメイタンシノイドを向かわせるための方法であって、当該方法は選択された細胞集団を含有すると推測される細胞集団または組織を、細胞結合物質メイタンシノイド複合体と接触させることを包含し、その場合1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が選択された細胞集団の細胞に結合する、前記方法において使用することができる。159上に記載した複合体はまた、細胞を破壊する方法であって、当該方法は細胞を、細胞結合物質メイタンシノイド複合体と接触させることを包含し、その場合1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が細胞に結合する、前記方法において使用することができる。160上に記載した複合体はまた、悪性腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、ウイルス感染、微生物感染、および寄生体感染を含むがこれに限定されない病気の治療法であって、当該方法は治療を必要とする被験者に、細胞結合物質メイタンシノイド複合体の有効量を投与することを包含し、その場合1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が病気の罹患した細胞または感染した細胞に結合する、前記方法において使用することができる。161本発明の方法に従って治療することのできる医学的な状態の例は、例えば肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、およびリンパ系器官の癌;自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症;移植片拒絶、例えば腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心移植拒絶、および骨髄移植拒絶;移植片対宿主病;ウイルス感染、例えばCMV感染、HIV感染、AIDS等;ならびに寄生体感染、例えばランブル鞭毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症、および当業者により決定されるようなその他の疾患を含むあらゆるタイプの悪性疾患を含むがこれに限定されない。162本方法は、invitroまたはinvivoで行うことができる。163上に記載した複合体は、例えば自己由来骨髄細胞を同一患者への移植前に、罹患した細胞もしくは悪性細胞を破壊する目的で処理する;骨髄細胞もしくはその他の組織を移植前に、T細胞およびその他のリンパ細胞を破壊し、移植片対宿主病GVHDを予防する目的で処理する;標的抗原を発現しない、所望のバリアント以外のすべての細胞を破壊する目的で細胞培養物を処理する;または所望でない抗原を発現するバリアントの細胞を破壊する目的で細胞培養物を処理する;ためのinvitroで使用する方法であって、当該方法は細胞結合物質メイタンシノイド複合体の有効量で細胞を処置することを包含し、その場合1つまたはそれより多くのメイタンシノイドは、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に共有結合で連結され、そして当該細胞結合物質が破壊すべき細胞に結合する、前記方法において使用することができる。164invitroで臨床的および非臨床的に使用する状態は、当業者により容易に決定される。165例えば処置は以下のように実行することができる。骨髄を患者または他の個体から採取した後、本発明の細胞毒性物質を約10pMから1nMの濃度範囲で添加した血清を含有する培地中で、約30分から約48時間の間、約37°Cでインキュベーションする。インキュベーションの濃度および時間の正確な条件、すなわち用量は、当業者により容易に決定することができる。インキュベーション後、骨髄細胞を血清を含有する培地で洗浄し、公知の方法に従って静脈より患者に戻すことができる。骨髄採取時および処置した細胞の再注入時の間に、患者が他の治療、例えば破壊的化学療法ablativechemotherapyまたは全身照射のコースを受ける状況では、処置した骨髄細胞を、標準的な医学装置を用いて液体窒素中に凍結保存することができる。166臨床的なinvivoの使用のため、細胞毒性物質は、無菌性およびエンドドキシンレベルについて検査された溶液または凍結乾燥粉末として提供することができる。複合体の投与の適切なプロトコルの例は以下の通りである。複合体は、毎週の静脈内への一括投与として1週1回、4週の間与えることができる。一括投与の用量は、5から10mlのヒト血清アルブミンを添加することのできる50から500mlの通常の生理生理食塩水中にて与えることができる。投与量は、静脈内への1回の投与当たり10mgから2000mg1日当たり100ngから20mgkgとする。4週の治療後、患者は1週に1回を基本として治療を継続して受けることができる。167投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量、時間などに関する具体的なinvivoの臨床プロトコルは、臨床的状況が許す範囲で当業者により決定することができる。168所望であれば、他の活性物質、例えば他の抗腫瘍薬を複合体と共に併用してもよい。新規複合体、組成物および複合体の製造法169非開裂リンカーにより連結された抗体およびメイタンシノイドのいくつかの複合体は公知であるが、それ以外は新規である。したがって、非開裂リンカーを介して細胞結合物質に連結した少なくとも1つのメイタンシノイドを有する細胞結合物質メイタンシノイド複合体を提供する、ただし細胞結合物質が抗体である場合、リンカーは以下から成る群:スクシンイミジル4--シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、スルホ-MBS、およびスクシンイミジル-ヨードアセテート、より選択される架橋物質から誘導される基を包含しない。170新規複合体は上に記載したように製造、使用することができる。171組成物は、細胞結合物質メイタンシノイド複合体および担体を包含する。172担体は、医薬的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤であってよい。173適切な医薬的に受容可能な担体、希釈剤、および賦形剤は周知であり、臨床的状況が許す範囲で当業者により決定することができる。174適切な担体、希釈剤およびまたは賦形剤の例は以下を含む:1約1mgmlから25mgmlヒト血清アルブミンを含有するまたは含有しない、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水、pH約7.4、20.9生理食塩水0.9wvNaCl、および35wvデキストロース;そしてまた抗酸化剤例えばトリプタミン、および安定剤例えばTween20を含有してもよい。175これらの新規複合体について、合成法もまた提供する。176細胞結合物質メイタンシノイド複合体を製造する方法の1つは、以下を包含する:a細胞結合物質を提供する、b細胞結合物質を架橋物質で修飾する、そしてc修飾された細胞結合物質を、メイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドと複合体化させ、それにより細胞結合物質、およびメイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドの間に非開裂リンカーを提供して、複合体を生成する。177細胞結合物質メイタンシノイド複合体を製造するもう1つの方法は、以下を包含する:aメイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドを提供する、bメイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドを架橋物質で修飾し、それにより非開裂リンカーを形成する、そしてc修飾されたメイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドを、細胞結合物質と複合体化させ、それにより細胞結合物質、およびメイタンシノイドまたはチオールを含有するメイタンシノイドの間に非開裂リンカーを提供して、複合体を生成する。178細胞結合物質メイタンシノイド複合体を製造する付加的な方法は、以下を包含する:aメイタンシノイドを提供する、bメイタンシノイドを修飾して、活性なエステルを有する、イオウを含有しないメイタンシノールを提供する、そして179c修飾されたメイタンシノイドを細胞結合物質と複合体化させ、それにより細胞結合物質およびメイタンシノールの間に、Sを含有しない非開裂リンカーを提供して、複合体を生成する。これらの方法は詳細に上にそして、本明細書に引用した米国特許に記載されており、同文献を特に本明細書において参照として援用する。実施例180本発明を今度は非限定的な実施例を参照として説明することにする。他に記述がなければ、すべてのパーセント、比率、部、等は重量による。181以下の実施例で使用するバッファーは以下の通りである:50mMリン酸カリウムKPi50mM塩化ナトリウムNaCl2mMエチレンジアミン四酢酸EDTA、pH6.5バッファーA;1×リン酸緩衝化生理食塩水PBS、pH6.5バッファーB;および0.1MKPiバッファー2mMEDTApH7.5アッセイバッファー。182SMCC製品番号22360、M.W.334.33gモルおよびSIAB製品番号22329、M.W.402.15gモルをPierceより購入した。huC242抗体は、米国特許第5,552,293号に記載されているヒト化モノクローナル抗体C242であるが、これに関してはハイブリドーマがECACC同定番号90012601にて保管されている。トラスツツマブ抗体はGenentechより入手した。DM1フリーのチオールの形;M.W.737.5gモルは、米国特許第5,208,020号および6,333,410B1号に以前に記載されたように調製した。183クロマトグラフィーはAmershamBiosciencesより購入したクロマトグラフィーカラムSephadexG25NAP25プレパックカラムAmersham17085202;HiPrep2610脱塩カラム、SephadexG25微細樹脂、3本連結したものAmersham117508701を用いて行った。TSKGELG3000SWXLクロマトグラフィーカラムTOSOHBioscience08541もまた、TSKColumeGuardSWx1とともに使用した。184以下の実施例に使用した溶媒は、ジメチルスルホキシドDMSO、ジメチルアセトアミドDMA、エタノールEtOH、およびDMSO中の100mMエルマン試薬DTNB、CaymanChemicalより入手可能であった。実施例1AhuC242-SMCC-DM1複合体の調製a.huC242抗体の調製および測定185抗体の濃度は、280nmの吸光係数1.48mgmL-1および分子量147,000gモルを用いて測定した。b.SMCCストック溶液の調製および測定186SMCCの20mM溶液6.69mgmLをジメチルスルホキシドDMSO中に調製した。この溶液をアッセイバッファー中に140希釈し、サンプルの吸光度を302nmで測定した。ストック溶液の濃度は、吸光係数602M-1cm-1を用いて算出した。c.DM1ストック溶液の調製および測定187DM1フリーのチオールの形の10mM溶液をジメチルアセトアミドDMA中に調製した7.37mgmL図2。エタノールEtOH中でのストック溶液の希釈溶液の吸光度を280nmで測定した。ストックDM1の濃度を、280nmの吸光係数5700M-1を用いて算出した。ストックDM1調製液中のフリーのスルフヒドリル基またはチオール基-SHの濃度は、エルマン試薬DTNBを用いて測定した。ストック溶液の希釈液を、3vvDMAとしたアッセイバッファー中に調製した後、DMSO中の100mMDTNB1100倍の容積を加えた。412nmの吸光度の増加を試薬のブランクに対して測定し、吸光係数14150M-1cm-1を用いて算出した。エルマンアッセイから得られる-SHの濃度を使用して、複合状態に関する計算上のDM1ストック濃度を表した。d.SMCC架橋リンカーを用いてのhuC242の修飾188抗体を2つのサンプルに分けた;一方は7.5倍モルの過剰のSMCC架橋リンカーを用いて、他方は8.5倍モルの過剰のSMCC架橋リンカーを用いて修飾した。サンプルを8mgmLの抗体濃度で反応させた。反応はDMSO5vvを含むバッファーA95vv中で、2時間室温で撹拌しながら行った。e.過剰のSMCCを除去するためのG25クロマトグラフィー189huC242-SMCC反応混合液を、バッファーA中に平衡化したSephadexG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲル濾過した。カラムにかける容量および溶出容量は、製品の説明書に従った。修飾された抗体の溶出液をアッセイして、上に記載した吸光係数を用いて抗体の濃度を決定した。修飾された抗体の収率は、7.5倍モルの過剰のSMCCの反応では74.6、そして8.5倍モルの過剰のSMCCの反応では81.6であった。f.huC242-SMCCのDM1との複合体化190修飾された抗体サンプルを、リンカーに対して1.7倍の過剰のDM1と反応させた1抗体当たり5リンカーと仮定する。反応は、DMA3vvを含むバッファーA97vv中の2.5mgmLの抗体濃度で行った。DM1の添加後、反応液を室温で約20時間撹拌しながらインキュベーションした。g.G25クロマトグラフィーによる複合体の精製191複合反応混合液を、バッファーB中に平衡化したSephadexG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲル濾過した。カラムにかける容量および溶出容量は、製品の説明書に従った。huC2421モル当たりに連結したDM1分子の数を、溶出された材料の吸光度を252nmおよび280nmの双方で測定することにより決定した。7.5倍モルの過剰のSMCCサンプルのDM1/抗体の比率は3.54であることが見出され、8.5倍モルの過剰のSMCCサンプルの比率は3.65であることが見出された。複合体化ステップの収率は、各々83.7および75.4であった。双方の複合体を合わせてプールし、滅菌濾過し、薬剤および抗体の濃度について再度アッセイした。プールしたサンプルは、Lot1713-146Cと指定し、結合、細胞毒性、特異性、凝集の程度およびフリーの薬剤の含有量について分析した。実施例1BhuC242-SMCC-DM1のinvitroの検査a.結合192huC242抗体およびhuC242-SMCC-DM1の結合のアフィニティーをCOLO205細胞における間接的な方法を用いて比較した。結果を図3に示す。裸の抗体はKD5.1×10-10Mで結合し、複合体化したバージョンはKD5.52×10-10Mで結合した。したがってDM1との複合が、huC242の結合アフィニティーを変化させることはないようである。b.細胞毒性および特異性193huC242-SMCC-DM1複合体のinvitroの細胞毒性および特異性を、継続的暴露でのクローン原性アッセイを用いて評価した。結果を図4に示す。huC242-SMCC-DM1は、抗原陽性のSKBR3細胞を破壊する上で有効であったIC50=3.5×10-12M。特異性は、標的のSKBR3細胞のIC50値を、抗原陰性細胞株であるA375の値A375において複合体のIC50値は3.0×10-9Mより高かったと比較することにより示した。c.サイズ排除カラムクロマトグラフィーの分析194複合体をTSK300サイズ排除カラムを用いて分析し、96.0がモノマーであることを見出した図5。d.フリーの薬剤195フリーの薬剤の比率をELISAにより測定し、4.4であることを見出した。実施例2Aトラスツツマブ-SMCC-DM1複合体の調製196トラスツツマブ抗体は、非開裂のヘテロの2官能基の架橋試薬SMCCを用いてDM1と複合体化させるため、Genentechより入手した。この抗体は、50mMリン酸カリウム2mMEDTA,pH6.0から、50mMリン酸カリウム50mM塩化ナトリウム2mMEDTA,pH6.5バッファーAにバッファーを交換した。次に抗体を7.5倍モルの過剰のSMCCリンカーと反応させ、SephadexG25樹脂により精製し、DM1と複合体化させた。最終的な複合体をSephadexG25樹脂により再度精製した。得られる複合体は、抗体1モル当たり3.1モルのDM1を含有していた。a.トラスツツマブ抗体の調製および測定19750mMリン酸カリウム2mMEDTA,pH6.0バッファー中のトラスツツマブ抗体を、バッファーAで平衡化したSephadexG25カラムに通し、バッファーA中に溶出した。この実施例で使用するすべてのバッファーは、色素生産性リムルス変形細胞溶解物LAL試験法を用いて、エンドトキシンを含まないことを検査した。抗体の濃度は、280nmの吸光係数1.45mLmg-1cm-1および分子量145.423gを用いて測定した。b.SMCCストック溶液の調製および測定198SMCC20mM溶液6.69mgmLをDMSO中に調製した。この溶液をアッセイバッファー中で140に希釈し、サンプルの吸光度を302nmで測定した。ストック溶液の濃度は、モル吸光係数602M-1cm-1を用いて算出した。c.DM1ストック溶液の調製および測定199DM1フリーのチオールの形の10mM溶液をDMA中に調製した7.37mgmL図2。EtOH中でのストック溶液の希釈液の吸光度を280nmで測定した。ストックDM1の濃度を、280nmのモル吸光係数5700M-1cm-1を用いて算出した。ストックDM1調製液中のフリーの-SHの濃度を、エルマン試薬DTNBを用いて測定した。ストック溶液の希釈液は、3vvDMAとしたアッセイバッファー中に調製した後、DMSO中の100mMDTNB1100倍の容積を加えた。412nmの吸光度の増加を試薬のブランクに対して測定し、吸光係数14150M-1cm-1を用いて濃度を算出した。エルマンアッセイから得られる-SHの濃度を使用して、複合状態に関する計算上のDM1ストック濃度を表した。d.SMCC架橋リンカーを用いてのトラスツツマブの修飾200抗体を、20mgmLの抗体濃度で7.5倍モルの過剰のSMCCを用いて修飾した。反応はDMSO5vvを含むバッファーA95vv中で、2時間室温で撹拌しながら行った。e.過剰のSMCCを除去するためのG25クロマトグラフィー201トラスツツマブ-SMCCの反応混合液を、バッファーA中に平衡化したSephadexG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲル濾過した。カラムにかける容量および溶出容量は、製品の説明書AmershamBiosciencesに従った。修飾された抗体溶液の濃度を、分光光度計の測定により上に記載した吸光係数を用いてアッセイした。修飾された抗体の収率は、タンパク質濃度に基づき88であった。f.トラスツツマブ-SMCCのDM1との複合体化202修飾された抗体は、リンカーに対して1.7倍の過剰のDM1と反応させた1抗体当たり5リンカーと仮定する。反応は、DMA6vvを含むバッファーA94vv中の10mgmLの抗体濃度で行った。DM1の添加後、反応液を室温で約16.5時間撹拌しながらインキュベーションした。g.G25カラムクロマトグラフィーによる複合体の精製203複合反応混合液を、バッファーB中に平衡化したSephadexG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲル濾過した。カラムにかける容量および溶出容量は、製品の説明書AmershamBiosciencesに従った。トラスツツマブ1モル当たりに連結したDM1分子の数を、溶出された材料の252nmおよび280nmの双方での吸光度測定することにより決定した。DM1/抗体の比率は3.13であることが見出され、複合ステップの収率は、95.7であった。複合体化したトラスツツマブの全体の収率は出発時の抗体に基づき84であった。得られる複合体を、結合、細胞毒性、特異性、凝集の程度およびフリーの薬剤の含有量について分析した。実施例2Bトラスツツマブ-SMCC-DM1のinvitroの検査204結合の試験は、DM1への抗体の複合が見かけのKDに影響を与えないことを示した;裸のトラスツツマブ抗体およびトラスツツマブ-SMCC-DM1複合体の双方ともECDプレートへの同じ結合アフィニティー5.5×10-11Mを有していた。サンプルのinvitroの細胞毒性の評価は、トラスツツマブ-SMCC-DM1複合体が、毒性抗原陽性細胞株においてIC503.6×10-12Mおよび特異性抗原陰性細胞株においてIC50は3.0×10-9Mより高いの双方とも高いことを示した。a.結合205トラスツツマブ抗体およびトラスツツマブ-SMCC-DM1の結合アフィニティーを、Genentechにより提供されたHER2ECDプレート結合アッセイを用いて比較した。結果を図24に示す。裸の抗体および複合体化したバージョンの双方とも、5.5×10-11Mの見かけのKDで結合する。したがってDM1との複合体化は、トラスツツマブの結合アフィニティーを変化させない。b.細胞毒性および特異性206トラスツツマブ-SMCC-DM1複合体のinvitroの細胞毒性および特異性を、継続的暴露でのクローン原性アッセイを用いて評価した。結果を図25に示す。トラスツツマブ-SMCC-DM1は、抗原陽性のSKBR3細胞を破壊する上で有効であったIC50=3.6×10-12M。特異性は、標的のSKBR3細胞のIC50値を、抗原陰性細胞株であるA375の値この複合体においてIC50値は3.0×10-9Mより高かったと比較することで示された。c.サイズ排除カラムクロマトグラフィーの分析207複合体をTSKサイズ排除カラムを用いて分析し、95.3がモノマーであることを見出した図26。d.フリーの薬剤の分析208フリーの薬剤の比率をELISAにより測定し、3.4であることを見出した。e.エンドトキシンレベル209複合体をクロマトグラフィーによるLAL検査を用いて検査し、0.03EUmgを含有することを見出した。実施例3Aトラスツツマブ-SIAB-DM1複合体の調製210トラスツツマブ抗体は、非開裂のヘテロの2官能基の架橋リンカーであるSIABを用いてDM1と複合体化させるため、Genentechより入手した。この抗体を、7.0倍モルの過剰のSIABリンカーとpH6.5で反応させ、SephadexG25樹脂により精製した。抗体を含有する分画をプールし、DM1と一晩、pH6.5の標準的な複合条件で室温で、ただし暗所で反応させた。反応容器からアリコートを取り出し、DM1の組み込みを決定するため分析した。NAP5濾過後にアリコートを測定したところ、わずか1.4薬剤抗体しか有していなかった。さらなる8倍の過剰のSIABを反応液に加えて2時間の後、pHを8に上げ、直ちにさらなる1.5倍の過剰なDM1SIABを添加した。反応液を放置して反応を進行させ、SephadexG25F樹脂を用いて精製した。得られる複合体は、抗体1モル当たり3.42モルのDM1を含有していた。a.トラスツツマブ抗体の測定211抗体の濃度は、280nmの吸光係数1.45mLmg-1cm-1、および分子量145.423gを用いて測定した。b.SMCCストック溶液の調製および測定212SIAB18mM溶液をDMSO中に調製した7.2mgmL。pH4バッファー中に希釈したこの溶液の波長スキャンを情報目的用にのみ記録した。c.DM1ストック溶液の調製および測定213DM1フリーのチオールの形の約30mM溶液をDMA中に調製した。ストックDM1調製液中のフリーの-SHの濃度を、エルマン試薬DTNBを用いて測定した。ストック溶液の希釈液は、3vvDMAとしたアッセイバッファー中に調製した後、DMSO中の100mMDTNB1100倍の容積を加えた。412nmの吸光度の増加を試薬のブランクに対して測定し、モル吸光係数14150M-1cm-1を用いて濃度を算出した。エルマンアッセイから得られる-SHの濃度を使用して、複合状態に関する計算上のDM1ストック濃度を表した。d.SIAB架橋リンカーを用いてのトラスツツマブの修飾214抗体を、20mgmLの抗体濃度で7.0倍モルの過剰のSIABを用いて修飾した。反応はDMSO5vvを含むバッファーA95vv中で、2時間室温で暗所で撹拌しながら行った。e.過剰のSIABを除去するためのG25クロマトグラフィー215トラスツツマブ-SIAB反応混合液を、バッファーA中に平衡化したHiPrep2610脱塩カラムを通してゲル濾過した。280nmにSIAB試薬からの干渉があるようなので、修飾された抗体の収率を100であると仮定し、複合反応におけるDM1の量の決定に関しては5リンカー抗体の修飾と仮定した。f.トラスツツマブ-SIABのDM1との複合体化216修飾された抗体を、上記のように100収率および5架橋リンカー抗体と仮定するリンカーに対して1.7倍の過剰のDM1と反応させた。反応における抗体の濃度を12.5mgmLであると推定し、反応を、DMA3vvを含むバッファーA97vv中で行った。DM1を添加後、反応液を室温、暗所で、約16.5時間撹拌しながらインキュベーションした。g.複合反応の分析217反応混合液の0.25mLアリコートを取り出し、バッファーB中に平衡化したG25Sephadexのプレパックカラムでゲル濾過した。トラスツツマブ1モル当たりに連結したDM1分子の数は、溶出された材料の252nmおよび280nmの双方の吸光度を測定することにより決定した。DM1/抗体の比率はわずか1.4であった。h.付加的な修飾複合反応218さらなる8倍モルの過剰のSIABを加え、2時間室温で放置してインキュベーションした。SIABに対して1.5倍モルの過剰のDM1を加え、1NNaOHを加えて反応液のpHを8に上げた。反応液を室温、暗所でインキュベーションし、バッファーB中に平衡化したG25F樹脂カラムでゲル濾過した。i.複合体のプールおよび特徴づけ219タンパク質を含有する分画をプールし、濾過し、252および280nmの吸光度により測定した。複合体のサンプルを、エンドトキシンレベル、結合、特異的および非特異的な細胞毒性、モノマーの、およびフリーの薬剤のレベルについて検査した。実施例3Bトラスツツマブ-SIAB-DM1のinvitroの検査220結合の試験は、DM1への抗体の複合が見かけのKDに影響を与えないことを示した;裸のトラスツツマブ抗体およびトラスツツマブ-SMCC-DM1複合体の双方とも類似する結合アフィニティー見かけのKD抗体1.2×10-10M、および複合体1.9×10-10Mを有していた。サンプルのinvitroの細胞毒性の評価は、トラスツツマブ-SIAB-DM1複合体が、毒性抗原陽性細胞株のSKBR3においてIC505×10-12Mおよび特異性抗原陰性細胞株のA375においてIC50は3.0×10-9Mより高いの双方とも高いことを示した。a.結合221トラスツツマブ抗体およびトラスツツマブ-SIAB-DM1の結合のアフィニティーを、Genentechにより提供されたHER2ECDプレート結合アッセイを用いて比較した。結果を図27に示す。裸のトラスツツマブおよびトラスツツマブ-SIAB-DM1は、類似する結合アフィニティー見かけのKD抗体は1.2×10-10M、および複合体は1.9×10-10Mを有していた。b.細胞毒性および特異性222サンプルのinvitroの細胞毒性の評価は、トラスツツマブ-SIAB-DM1複合体が、毒性抗原陽性細胞株のSKBR3においてIC50=5×10-12Mおよび特異性抗原陰性細胞株のA375においてIC50は3.0×10-9Mより高いの双方とも高いことを示した。図28を参照のこと。c.サイズ排除カラムクロマトグラフィーの分析223複合体をTSKサイズ排除カラムを用いて分析し、96.4がモノマーであることを見出した図29。d.フリーの薬剤224フリーの薬剤の比率をELISAにより測定し、0.35であることを見出した。e.エンドトキシンレベル225複合体をクロマトグラフィーによるLAL検査を用いて検査し、<0.04EUmgを含有することを見出した。実施例4Sを含有しない非開裂リンカーを形成する架橋試薬によるhuC242の複合体化a.合成226架橋試薬構造に関しては図21を参照のことのストック溶液をDMA中に作成し、不溶性沈殿物を遠心して除き、残っている溶液の濃度を、280nmの波長でのDM1の吸光である吸光係数ε280=5700M-1cm-1を用いて決定した。この材料に関する真の吸光係数は測定されていないため、この値は濃度の推定値に過ぎない。DM1に関するε252ε280比が4.7EtOH中であるのに対して、この架橋試薬溶液pH7.5バッファー中に関するε252ε280は1.42と測定され、異なる吸光または不純物のいずれかであることを示唆するたことに注目しなければならない。227複合体化反応は、バッファーE、pH7.5バッファーE=50mMリン酸ナトリウム、150mMNaCl、10mMEDTA中の16DMAにおける2.8mgmlのhuC242抗体を用いて、2mgのスケールで行った。ストック溶液の推定される架橋試薬濃度に基づいて、30等量の架橋リンカー抗体を使用した10等量の架橋リンカー抗体を使用した初期の実験では、わずか0.9DM1抗体のみを含む複合体しか生成できなかった。反応液を放置して3時間反応を進行させた後、複合体をNap10G25カラムに通すことにより精製した。濾過MillexGVフィルター、0.2umポアサイズ後、複合体は2.56DM1抗体を有していたLot1749-119A、抗体回収率=78。複合体のアリコートをHPLCHiPrepカラムによりフリーのDM1について調べ、かなり大きなDM1のピークが12.09’に観察された。そのためサンプルをバッファーB中に透析してこのピークを除去した後、再度アッセイした。最終的な複合体サンプルLot1749-124AはHPLCにより、フリーのDM1を含んでおらず、1.84DM1抗体を有していた。SECHPLCをこの複合体について行い、97がモノマーの抗体であることを示した。b.細胞毒性および結合228本発明では、huC242-Sを含有しない非開裂リンカー-DM1複合体における細胞毒性および結合の試験を行った。この複合体は、フリーの抗体より約2倍高い見かけの解離定数図23を参照のこと、およびhuC242-SMCC-DM1に匹敵するinvitroの細胞毒性Sを含有しない非開裂リンカーの複合体のIC50=7.0×10-12M図22を参照のことを有していた。229本発明を、詳細にそしてその具体的な態様を参照として記載してきたが、多様な変更および修飾を、本発明の精神および領域から離れずにそれらにおいて行うことができることは、当業者には明らかであろう。230本明細書に引用したすべての特許、公開、およびその他の参考文献を、特にそれらの全内容において参照として援用する。"