"肺炎球菌性急性中耳炎の再発罹患のリスクのある患者における肺炎球菌感染を原因とする急性中耳炎の再発を予防又は治療するための方法であって、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも1種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物の治療上有効量を前記患者に少なくとも1回投与することを含む、方法。前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも1回経験している、請求項1に記載の方法。前記患者は急性中耳炎のエピソードを、6ヶ月間に3回以上か、12ヶ月間に4回以上か経験した、請求項2に記載の方法。前記患者は、急性中耳炎を罹患しているか、あるいは、発症のリスクがある、請求項1に記載の方法。前記患者は急性中耳炎を罹患している、請求項4に記載の方法。前記組成物の投与は抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起又は増強する、請求項1に記載の方法。組成物の投与は、IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aを産生する抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起又は増強する、請求項6に記載の方法。IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aを産生する抗原特異的CD4T細胞の百分率は、前記組成物の投与直前に存在した抗原特異的CD4T細胞の百分率と相関して増大する、請求項7に記載の方法。投与はIFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aサイトカインの産生を刺激する、請求項1に記載の方法。前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項1に記載の方法。患者における肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎の再発を予防又は治療に使用するための、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンからなるグループから選択される少なくとも1種類の、単離され実質的に精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物。前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも1回過去に経験している、請求項11に記載の組成物。前記患者は急性中耳炎のエピソードを、6ヶ月間に3回以上か、12ヶ月間に4回以上か経験している、請求項11に記載の組成物。前記患者は、急性中耳炎を罹患しているか、あるいは、発症のリスクがある、請求項11に記載の組成物。前記患者は急性中耳炎を罹患している、請求項14に記載の組成物。組成物の投与は抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起する、請求項11に記載の組成物。組成物の投与は、IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aを産生する抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起する、請求項16に記載の組成物。組成物の投与は、前記少なくとも1種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを欠く組成物の投与に対して、IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aを産生する抗原特異的CD4T細胞の百分率が増大する、請求項16に記載の組成物。投与は、IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aサイトカインの産生を刺激する、請求項11に記載の組成物。組成物はさらにアジュバントを含む、請求項11に記載の組成物。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも2種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも3種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも4種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも5種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。前記無毒化ニューモリシンは、野生型配列の第65番目、第293番目及び第428番目の位置にアミノ酸置換を含む突然変異型ニューモリシンタンパク質である、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23及び24のいずれか1つに記載の方法。前記3箇所のアミノ酸置換は、T65→C、G293→C及びC428→Aを含む、請求項25に記載の方法。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも2種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項11に記載の組成物。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも3種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項11に記載の組成物。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも4種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項11に記載の組成物。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも5種類の、単離され精製された免疫原性ポリペプチドを含む、請求項11に記載の組成物。前記無毒化ニューモリシンは、野生型配列の第65番目、第293番目及び第428番目の位置にアミノ酸置換を含む突然変異型ニューモリシンタンパク質である、請求項11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、27、28、29及び30のいずれか1つに記載の組成物。前記3箇所のアミノ酸置換は、T65→C、G293→C及びC428→Aを含む、請求項31に記載の組成物。前記組成物はワクチンである、請求項11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、27、28、29、30、31及び32のいずれか1つに記載の組成物。前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、適切な抗生物質療法の少なくとも48時間後に細菌の除去及び/又は徴候の消失を達成できなかった、請求項1に記載の方法。前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、該急性中耳炎のための抗生物質治療コースを完了して14日以内に急性中耳炎の徴候が再発した、請求項1に記載の方法。前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、適切な抗生物質療法の少なくとも48時間後に細菌の除去及び/又は徴候の消失を達成できなかった、請求項10に記載の組成物。前記患者は、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎のエピソードを経験し、該急性中耳炎のための抗生物質治療コースを完了して14日以内に急性中耳炎の徴候が再発した、請求項10に記載の組成物。肺炎球菌急性中耳炎再発症のリスクがある患者における肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎の再発のリスクを低減する方法であって、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンと、その免疫原性断片とからなるグループから選択される少なくとも1種類の、単離され実質的に精製された免疫原性ポリペプチドを含む免疫原性組成物の治療上有効量を前記患者に投与することを含む、方法。罹患リスクのある患者における肺炎球菌感染を原因とする再発性急性中耳炎の予防又は治療方法が説明される。罹患リスクのある患者は、例えば、急性中耳炎の再発エピソードのある例えば、中耳炎好発性の乳幼児及び小児と、急性中耳炎治療に失敗したことのある者とを含む。例えば、肺炎球菌急性中耳炎発症のリスクがある患者における肺炎球菌感染を原因とする急性中耳炎再発を予防又は治療する方法であって、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンかこれらの免疫原性断片かからなるグループから選択される、少なくとも1種類の単離精製された免疫原性ポリペプチドを含む組成物の治療上有効量を前記患者に少なくとも1回投与することを含む、方法が提供される。一部の実施態様では、前記患者は急性中耳炎のエピソードを少なくとも1回経験している場合がある。一部の実施態様では、前記患者は、急性中耳炎のエピソードを6ヶ月以内に3回以上か、12ヶ月以内に4回以上か経験している場合がある。一部の実施態様では、前記患者は急性中耳炎を罹患中の場合がある。これらの方法における、急性中耳炎の再発の予防又は治療に使用するための組成物も説明される。前記組成物は、肺炎球菌PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシンか、これらの免疫原性断片かからなるグループから選択される、少なくとも1種類の免疫原性ポリペプチドを含む。本明細書に開示される主題は複数の利点を提供する。例えば本明細書に説明される方法は、抗原特異的CD4T細胞産生を惹起又は増強するのに用いられる場合がある。その他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明かであろう。罹患リスクのある患者例えば小児における肺炎球菌感染による急性中耳炎の再発を予防及び/又は治療するための方法が説明される。急性中耳炎の再発を予防及び/又は治療するために本方法で使用される組成物も説明される。前記組成物は、PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化されたニューモリシンか、これらの免疫原性断片かからなるグループから選択される肺炎球菌の少なくとも1種類の免疫原性ポリペプチドを含む。これらの方法及び組成物は以下にさらに説明される。提供される予防及び治療方法は、PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化されたニューモリシンか、これらの免疫原性断片かからなるグループから選択される肺炎球菌の少なくとも1種類の単離精製免疫原性ポリペプチドを含む組成物例えば、医薬組成物の治療上有効量を少なくとも1回肺炎球菌急性中耳炎再発すなわち、急性中耳炎再発をもたらす症候性肺炎球菌感染を発症するリスクのある患者に投与することを含む。罹患リスクのある患者集団は、例えば、生まれてから少なくとも1回、2回、3回、4回又は5回以上の急性中耳炎エピソードを有する乳児及び小児と、耳炎好発性のすなわち、6ヶ月以内に3回以上の急性中耳炎エピソードを有するか、1年以内に4回以上のエピソードを有する乳児及び小児と、急性中耳炎治療に失敗した乳児及び小児すなわち、適切な抗生物質療法の少なくとも48時間後に除菌及び/又は症状の解消を達成できない急性中耳炎を罹患している乳児及び小児か、抗生物質治療コースの完了から14日以内に急性中耳炎の徴候及び症状が再発した乳児及び小児かとを含む。罹患リスクのある患者集団は、例えば、再発性急性中耳炎の遺伝的傾向を有する乳児及び小児CasselbrantMLetalJAMA199928221252130と、自宅以外の託児所に通う乳児及び小児と、個人保育所に通う乳児及び小児と、親/介護者の1人以上が喫煙者である乳児及び小児と、おしゃぶりを使う乳児及び小児と、母乳よりも粉ミルクで哺育される乳児及び小児と、生後6ヶ月以内に急性中耳炎感染を経験した乳児及び小児BentdaletalIntJPedOtorhinolaryngol20077112511259とを含む。小児が成長するにつれて、耳管の解剖学的な変化のために急性中耳炎を発症しにくくなる。通常は、耳炎好発性の小児は3才ないし5才頃にその傾向性を卒業する本件文献40及び48-51。一部の実施態様では、患者は肺炎球菌急性中耳炎を発症しているか、あるいは、発症するリスクを有する。本明細書の実施例に説明されるとおり、耳炎好発性の小児すなわち、罹患リスクのある患者の集団は、耳炎非好発性の小児と比べると、肺炎球菌抗原例えば、PhtD、PhtE、PcpA、LytB、Plyに対して免疫応答が弱い。例えば、耳炎好発性の小児は肺炎球菌抗原特異的な機能するメモリーCD4T細胞例えば、PhtD、PhtE、PcpA、LytB又はPlyに特異的な機能するメモリーCD4T細胞が耳炎非好発性の小児と比べて欠如又は低減しており、肺炎球菌抗原例えば、PhtD、PhtE、PcpA、LytB、Plyに対する血清IgGレベルが低下している。しかし、これらの小児は、機能するメモリーT細胞全体か、ワクチン抗原に対するB細胞介在抗体応答の惹起かが欠損しているのではない。急性中耳炎治療失敗AOMTFの小児は、耳炎好発性の小児と免疫学的に類似した挙動をしめす。罹患リスクのある患者は、例えばPhtD、PhtE、PcpA、LytB及び/又はPlyのような肺炎球菌抗体に対してかかる免疫学的低応答を示す者である。本明細書に用いられるところの、患者における急性中耳炎の再発予防とは、肺炎球菌急性中耳炎の再発罹患から患者を保護するために、該患者に本明細書に説明される組成物の治療上有効量を投与することを意味する意図である。本明細書で用いられるところの、急性中耳炎の再発か、耳炎好発性患者又は再発性急性中耳炎患者かの治療とは、病状例えば急性中耳炎又は疾患例えば急性中耳炎の徴候を治癒、平癒、軽減、緩和、変化、救済、向上、改善又は影響を与えることを目的として、肺炎球菌を原因とする急性中耳炎を現に罹患している患者か、肺炎球菌に曝露されてきて、過去に急性中耳炎を罹患した患者かに、本明細書に説明される組成物の治療上有効量を投与することを意味する意図である。治療上有効量とは、ある病状及び投与方法のために治療効果を与える量をさす。治療上有効量は、患者の特徴年齢、体重、性別、病状、合併症、他の疾患等に基づいて通常の技量を有する医療従事者によって決定できる。さらに治療上有効量は、当該組成物の投与経路によって影響されるであろう。一部の実施例では、前記組成物の投与は抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起又は増強する。産生が惹起又は増強される抗原特異的CD4T細胞は、例えば、IFN-γ、IL-4、IL-2及び/又はIL-17aのサイトカイン産生細胞の場合がある。例えば、1つの実施態様では、前記組成物の投与は、IFN-γを産生する抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起又は増強する。本明細書で用いられるところの抗原特異的CD4T細胞の産生を惹起又は増強するとは、抗原特異的CD4T細胞の量又は百分率が増大することを意味する意図である。細胞の数は、前記組成物の投与直前に存在した細胞の数と比較して、例えば、25、30、35、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、300、400又はそれ以上増加する場合がある。1つの実施態様では前記組成物の投与は、抗原特異的抗体例えばIgG産生を惹起又は増強する。抗体産生を惹起又は増強することにより、抗原特異的IgGの総量の全濃度力価は、投与直前に存在した濃度力価と比較して、増大する。終点力価は、前記組成物の投与直前に存在した力価と比較して、例えば、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200又はそれ以上増大する場合がある。1つの実施態様では抗原特異的IgG力価は、前記組成物の投与直前に存在した力価と比較して、例えば、2倍、3倍又は4倍増大する。罹患リスクのある患者例えば小児における急性中耳炎再発のリスクを低減する方法であって、開示される免疫原性ポリペプチドの1種類以上を含む組成物を前記患者に投与することを含む、方法も開示される。かかる再発のリスクは、本明細書に説明される方法によって低減される場合がある。特定の実施態様では、罹患リスクのある患者すなわち、少なくとも1回以上の急性中耳炎の再発エピソードのある患者における耳炎好発症状を予防又は治療する方法が提供される。本件明細書の開示内容は、本明細書に説明される組成物を投与することによって、罹患リスクのある患者における免疫応答を惹起する方法も提供する。これは、前記患者の免疫システムに少なくとも1種類の免疫原性ポリペプチドを曝露する効果のある組成物の薬学的に許容可能な製剤を投与することによって達成される場合がある。本件明細書の開示内容は、例えばワクチン組成物のような組成物中に1種類以上の免疫原性肺炎球菌ポリペプチドを使用することも提供する。患者例えばほ乳類に投与されると、かかる組成物は、前記組成物に含まれる前記免疫原性ポリペプチドすなわち抗原に対して向けられる免疫応答を誘導又は増強する。この応答は、例えばB細胞の刺激を介して抗体の生成か、T細胞系応答例えば細胞傷害性応答かを含む場合がある。これらの応答は、保護又は中和する場合もそうでない場合もある。保護的又は中和的な免疫応答は、前記抗原に対応する例えば、該抗原が由来した感染生物にとっては有害で、患者にとっては感染を低減又は予防することにより有益なものである。本明細書に用いられるところの保護的又は中和的な抗体は、野生型肺炎球菌ポリペプチドに反応して、患者例えば、ほ乳類でテストされるとき、対応する肺炎球菌菌体又は対応する野生型肺炎球菌ポリペプチドの致死性を低減又は阻害する場合がある。患者に投与されると保護的又は中和的な免疫応答をもたらす免疫学的な組成物は、ワクチンと考えられる場合がある。本明細書に説明される組成物は、罹患リスクのある患者における急性中耳炎再発を予防又は治療する方法に用途が見出されるが、上記のとおり定義されるところの前記患者は、肺炎球菌に感染し、急性中耳炎再発を発症するリスクがある。前記組成物は、再発性急性中耳炎の予防又は治療方法にも用途が見出される。本明細書に説明される組成物は、例えば、経皮的percutaneous、例えば筋注、静注、腹腔内又は皮下、経皮的transdermal、粘膜例えば経鼻又は局所的のような適切な経路により、当業者により適切に定められる量及び用法で投与される場合がある。例えば、100ng-500μg、1-240μg、10-100μg、5-50μg又は10-25μgの免疫原性ポリペプチドが1回投与量あたりに投与される場合がある。予防又は治療の目的のためには、ワクチンは1回又は複数回投与される場合がある。例えばワクチンは、1回、2回、3回又は4回投与される場合がある。1つの実施例では、1回以上の投与が、いわゆるプライムブーストプロトコールの一部として行われる場合がある。複数回投与のときには、各回の投与は、例えば、1週間、1ヶ月又は数ヶ月離して行われる場合がある。本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドは免疫原活性がある。免疫原活性という用語は、患者例えば哺乳類において免疫学的応答を惹起するポリペプチドの能力をさす。ポリペプチドに対する免疫学的応答は、該ポリペプチドに対する細胞免疫応答及び/又は抗体を介する免疫応答が動物体内で発生することである。通常は、免疫応答は、前記ポリペプチドの1つ以上のエピトープに向けられた抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞及び/又は細胞傷害性T細胞の産生という効果の1つ以上を含むが、これらに限られない。エピトープという用語は、抗体が産生されるように特異的B細胞及び/又はT細胞が応答する抗原上の部位をさす。免疫原活性は保護的な場合がある。保護的免疫原活性という用語は、肺炎球菌による感染を予防又は阻害する例えば、急性中耳炎の再発を起こす肺炎球菌による感染を阻害する患者の体内での免疫学的応答を惹起するポリペプチドの能力をさす。一部の実施態様では、2種類、3種類、4種類又はそれ以上の免疫原性ポリペプチドを含む多成分組成物が、肺炎球菌感染が原因の急性中耳炎再発に対して保護するために処方される場合がある。かかる組成物の好ましい実施態様は、免疫原性ポリペプチドのPhtD及びPcpAを含む。さらに好ましい組成物は、免疫原性ポリペプチドのPhtD、PcpA及び無毒化ニューモリシンを含む。本明細書に説明されるように用いられる一部の好ましい多成分組成物は、国際公開第2011/075823号パンフレット2010年12月20日出願、発明の名称:免疫原性組成物に説明される。多成分組成物の成分は、抗原干渉を回避して、いずれかの起こりうる相乗効果を最適化するために、混合可能で、かつ、適切な量比で併用されることが好ましい。例えば、各成分の量は、1回投与量あたり約5μgないし約500μgか、1回投与量あたり5μgないし約10μgか、1回投与量あたり25μgないし約50μgか、1回投与量あたり50μgないし約100μgかの範囲内の場合がある。前記範囲は、1回投与量あたり抗原成分ごとに約10μgないし50μgの場合が最も好ましい。免疫原性ポリペプチド前記免疫原性ポリペプチドをコード化する核酸は、限定されないが、例えば、野生型又は突然変異型の肺炎球菌菌体から単離される場合があるが、代替的には、ポリメラーゼ連鎖反応PCR法を用いることによるか、当業者に認識される代替的な標準的技術を用いることによって、適用可能なDNA遺伝子配列例えばpcpA又はphtDを有する肺炎球菌株のDNAから直接入手される場合もある。使用することが可能な菌株は、例えば、肺炎球菌TIGR4株及び14453株を含む。好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは肺炎球菌14453株から組換え技術により得られる。本明細書に説明されるポリペプチドは、標準的な分子生物学的技術及び発現システムを用いて製造できる例えば、MolecularCloningALaboratoryManualThirdEditionbySambrooketalColdSpringHarborPress2001を参照せよ。例えば、免疫原性ポリペプチドをコード化する遺伝子断片が単離され、該免疫原性ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドが例えば、pBR322及びpUC系ベクターNewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,マサチューセッツ州のようないずれかの商業的に入手可能な発現ベクターか、例えば、GST系融合ベクターPfizer,Inc.,Piscataway,ニュージャージー州のような発現/精製ベクターかにクローン化され、適切な原核生物、ウイルス又は真核生物の宿主中で発現される場合がある。その後精製は、従来技術の手法によって実行されるか、商業的な発現/精製システムの場合には、製造者の指示書に従って実行される。代替的には、本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドは、変異体を含めて、例えば、完全固相合成exclusivesolidphasesynthesis、部分固相法partialsolidphasemethods、断片縮合又は液相合成のような商業的に自動化された手順を用いる化学合成を通じて得られる場合がある。免疫原性PcpAポリペプチドは、シグナル配列を含む場合又は含まない場合の完全長PcpAアミノ酸配列と、その断片と、これらの変異体とを含む。本明細書に説明される組成物に使用するのに適切なPcpAポリペプチドは、数ある中でも例えば、GenBankアクセッション番号CAB04758、YP817353、AAK76194、NP359536、ZP01835022及びZP01833419のものと、本明細書に説明されるものと、以下の実施例中のものとを含む。1つの実施態様では、PcpAは配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列を有する。肺炎球菌14453株ゲノム中の完全長PcpAのアミノ酸配列が配列番号1である。好ましいPcpAポリペプチドは、配列番号1、2又は3との同一性が50以上例えば、60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5又はこれ以上のアミノ酸配列を含む場合がある。好ましいポリペプチドは、例えば、配列番号1、2又は3の連続するアミノ酸の少なくとも8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号1、2又は3由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号1又は2の少なくとも1個のエピトープを保持するが、配列番号1又は2のN末端から1個以上のアミノ酸例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個又はこれ以上、及び/又は、配列番号1又は2のC末端から1個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号1又は2のN末端からシグナル配列を欠失する。好ましいPcpAポリペプチドは配列番号3である。PcpAの免疫原性ポリペプチドは、天然の成熟PcpAタンパク質に存在するのが典型的な塩素結合ドメインアンカー配列を任意的に欠失する。成熟PcpAタンパク質の塩素結合ドメインアンカーの天然配列は、国際公開第2008/022302号パンフレットに配列番号52として開示される。より具体的には免疫原性ポリペプチドは、天然PcpAに対して、1個以上のアミノ酸置換と、約60ないし約99の配列同一性又は80、85、90又は95の同一性の間のいずれかの同一性とを有する、天然PcpAのN末端領域を含む。N末端領域は、1個以上の保存的アミノ酸置換を含む場合又は含まない場合と、シグナル配列を含む場合又は含まない場合とがある、配列番号1又は2又は国際公開第2008/022302号パンフレットの配列番号1、2、3、41又は45のアミノ酸配列を含む場合がある。N末端領域は、本出願の配列表に掲載される配列番号1、2又は3か、国際公開第2008/022302号パンフレットの配列番号1、2、3又は41かに対して、約60ないし約99の配列同一性80ないし99の間のいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む場合がある。配列番号1、2又は3の免疫原性断片は、例えば、配列番号1、2又は3の5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190及び191個のアミノ酸残基か、5個と191個との間のいずれかの個数のアミノ酸残基かを含む場合がある。PcpAの免疫原性断片の例は国際公開第2008/022302号パンフレットに開示される。本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドの変異体は、1個以上の保存的アミノ酸置換を含む場合がある。免疫原性PcpAポリペプチドの変異体は、配列番号1、2又は3か、これらのいずれかの断片かに対して、約50ないし約99の配列同一性又は50と99との間のいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含む。変異体は、当業者に周知の方法を用いて、免疫原としての能力について選択される。本明細書に説明される組成物に相応しい免疫原性PhtXポリペプチドは、例えば、シグナル配列を含む場合又は含まない場合の完全長PhtD又はPhtEアミノ酸配列と、これらの免疫原性断片と、これらの変異体と、これらの融合タンパク質とを含む。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいPhtDポリペプチドは、数あるなかでも例えば、GenBankアクセッション番号AAK06760、YP816370及びNP35851を含む。肺炎球菌14453株ゲノム中の完全長PhtDアミノ酸配列は配列番号4で、TIGR4株由来のアミノ酸配列は配列番号5である。肺炎球菌14453株ゲノム由来のPhtDの好ましいポリペプチドは配列番号6である。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいPhtEポリペプチドは、数あるなかでも例えば、GenBankアクセッション番号AAK06761、YP816371及びNP358502を含む。肺炎球菌14453株ゲノム中の完全長PhtEアミノ酸配列は配列番号7である。肺炎球菌14453株ゲノム由来の好ましいPhtEポリペプチドは配列番号8である。免疫原性PhtX例えば、PhtD又はPhtEポリペプチドは、シグナル配列が連結した完全長タンパク質と、シグナルペプチド例えばN末端の約20個のアミノ酸が除去された成熟完全長タンパク質と、天然又はそれ以外、例えば合成のPhtXの変異体と、PhtXの免疫原性断片例えば、天然成熟PhtXタンパク質に存在する少なくとも15個又は20個の連続するアミノ酸を含む断片とを含む場合がある。PhtXポリペプチドの免疫原性断片及び変異体は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的な免疫応答を惹起できる。PhtDの免疫原性断片の例は国際公開第2009/012588号パンフレットに開示される。使用するのに好ましいPhtDポリペプチドは、配列番号4、5又は6との同一性が50以上例えば、60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5又はこれ以上有するアミノ酸配列を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号4、5又は6の連続するアミノ酸が少なくとも8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号4、5又は6由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号4、5又は6のN末端から1個以上例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個又はこれ以上のアミノ酸、及び/又は、配列番号4、5又は6のC末端から1個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号4、5又は6のN末端からシグナル配列を欠失する。好ましいPhtDポリペプチドは配列番号6である。使用するのに好ましいPhtEポリペプチドは、配列番号7又は配列番号8との同一性が50以上例えば、60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5又はこれ以上有するアミノ酸配列を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号7又は8の連続するアミノ酸が8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は、配列番号7又は配列番号8由来のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号7又は8の少なくとも1個のエピトープを保持するが、配列番号7又は8のN末端から1個以上例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個又はこれ以上のアミノ酸、及び/又は、配列番号7又は8のC末端から1個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号7のN末端からシグナル配列を欠失する。好ましいPhtEポリペプチドは配列番号8である。免疫原性LytBポリペプチドは、シグナル配列が連結する完全長タンパク質と、前記シグナル配列が除去された成熟完全長タンパク質と、天然か、その他、例えば合成由来かのLytBの変異体と、LytBの免疫原性断片例えば、天然成熟LytBタンパク質に存在する少なくとも15又は20個の連続するアミノ酸を含む断片とを含む。本明細書で説明される免疫原性LytBポリペプチドの免疫原性変異体及び断片は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的な免疫応答を惹起することができる場合がある。本明細書に説明される組成物に使用するのに相応しいLytBポリペプチドは、数ある中でも例えば、GenBankアクセッション番号CAA09078、YP816335、ABJ55408、AAK19156、NP358461及びAAK75086のものを含む。使用するのに好ましいLytBポリペプチドは、配列番号9、10又は11との同一性が50以上例えば、60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5又はこれ以上を含む場合がある。使用するのに好ましいポリペプチドは、配列番号9、10又は11の少なくとも、例えば、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はこれ以上の連続するアミノ酸の断片を含む場合がある。好ましい断片は配列番号9、10又は11のエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号9又は10の少なくとも1個のエピトープを保持するが、配列番号9、10又は11のN末端から1個以上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個又はこれ以上のアミノ酸、及び/又は、配列番号9又は10のC末端から1個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は配列番号10のN末端からシグナル配列を欠失する。好ましいLytBポリペプチドは配列番号11である。ニューモリシンPlyは、繊毛運動ciliarybeatingの阻害と、上皮細胞間のタイトジャンクションの破壊とを含む、肺炎球菌の発病機序の複数のステップに関与するとされる細胞傷害活性毒素であるHirstetalClinicalandExperimentalImmunology。数あるなかでも例えばGenBankアクセッション番号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5及びABO21381を含む複数のニューモリシンが知られており、無毒化の後本明細書に説明される組成物に使うのに相応しいであろう。1つの実施態様では、Plyは配列番号12のアミノ酸配列を有する。免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、シグナル配列が連結する完全長タンパク質と、前記シグナル配列が除去された成熟完全長タンパク質と、天然か、その他、例えば合成由来かのニューモリシンの変異体と、ニューモリシンの免疫原性断片天然成熟ニューモリシンタンパク質に存在する少なくとも15又は20個の連続するアミノ酸を含む断片を含む場合がある。免疫原性ニューモリシンポリペプチドの免疫原性変異体及び断片は、対応する完全長成熟アミノ酸配列に特異的免疫応答を惹起できる場合がある。免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、典型的には無毒化される、すなわち、肺炎球菌によって産生され放出される成熟野生型ニューモリシンタンパク質と比較して毒性が欠失するか、減少する。免疫原性ニューモリシンポリペプチドは、例えば、例えばホルムアルデヒド処理を用いて化学的にか、例えば突然変異型で組換え技術で製造されて遺伝学的にかのやり方で無毒化される場合がある。免疫原性無毒化ニューモリシンの好ましい例は国際公開第2010/071986号パンフレットに開示される。1つの実施態様では、免疫原性無毒化ニューモリシンは配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する。好ましいニューモリシンポリペプチドは、配列番号12又は配列番号13との同一性が50以上例えば、60、65、70、75、80、85、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5又はこれ以上有するアミノ酸配列を含む場合がある。好ましいニューモリシンポリペプチドは、配列番号12又は13の連続するアミノ酸の少なくとも8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250個又はこれ以上の断片を含む場合がある。好ましい断片は、配列番号12又は配列番号13由来のエピトープを含む場合がある。その他の好ましい断片は、配列番号12又は13の少なくとも1個のエピトープを保持するが、配列番号12又は13のN末端から1個以上例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25個又はこれ以上のアミノ酸、及び/又は、配列番号12又は13のC末端から1個以上のアミノ酸を欠失する。さらに好ましい断片は、配列番号12のN末端からシグナル配列を欠失する。好ましい免疫原性無毒化ニューモリシンポリペプチドは配列番号13である。本明細書に説明される免疫原性ポリペプチドの変異体は、当業者に周知の方法を用いて免疫原としての能力について選択される。かかる変異体はアミノ酸修飾を含む場合がある。例えばアミノ酸配列修正は、置換、挿入又は欠失の変化を含む。置換、欠失、挿入又はこれらのいずれかの組合せが単一の変異体で併存することは、当該変異体が免疫原性ポリペプチドであるかぎりにおいて起こってもよい。挿入は、1個以上のアミノ酸残基が、アミノ末端及び/又はカルボキシル末端に融合することと、配列内部へ挿入されることとを含む。挿入は、例えば1個ないし4個の残基のオーダーで、アミノ末端又はカルボキシル末端の融合よりも短い挿入が通常であろう。欠失はタンパク質配列からの1個以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。約2個から6個を超えない残基が前記タンパク質分子内のいずれか1箇所の部位で欠失されることが典型的である。これらの変異体は前記タンパク質をコード化するDNAにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異生成によって前記変異体をコード化するDNAを作出し、その後、該DNAを組換え細胞の培養中で発現させることによって調製されるのが通常である。既知配列を有するDNAの予め定められた部位に置換突然変異を作成する技術は周知で、M13プライマー突然変異生成法及びPCR突然変異生成法を含むが、これらに限られない。アミノ酸置換は1個の残基が典型的であるが、複数の異なる部位に同時に起こる場合もある。置換変異体は、少なくとも1個の残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される変異体である。かかる置換は、以下の表に従って実行されるのが一般的で、保存的置換という。その他は当業者に周知である。本明細書で用いられるところのアミノ酸置換は、保存的な場合と非保存的な場合とがある。保存的アミノ酸置換は、その位置のアミノ酸残基の大きさ、極性、電荷、疎水性又は親水性に影響がほとんど又は全くなく、特に免疫原性を低下させることがないような別のアミノ酸残基でもとのアミノ酸残基を置換することを伴う場合がある。適切な保存的アミノ酸置換は以下の表1に示される。当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に提供されるポリペプチド及び/又は断片の適切な変異体を決定することができるであろう。類似体は、アミノ酸配列及び/又は配列以外の修飾で天然の肺炎球菌ポリペプチドと異なる場合がある。配列以外の修飾は、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化又は糖鎖付加での変化を含む。ポリペプチドの修飾は、構成するアミノ酸の1個以上で化学的又は酵素的に誘導体化されるポリペプチド又は、例えばこれらの断片のようなこれらの類似体を含む場合がある。かかる修飾は、例えば、アセチル化と、水酸化と、メチル化と、アミド化と、糖鎖又は脂質原子団、補因子等の付加と、これらの組合せとのような、例えば、側鎖修飾、骨格修飾及びN末端及びC末端修飾を含む場合がある。本明細書に説明される修飾ポリペプチドは、未修飾ポリペプチドの生物活性を保持する場合か、生物活性が増減する場合かがある。2本のポリペプチドの構造的類似性は、各配列のアミノ酸はそれでも適正な順番のままでなければならないが、各配列の長さに沿って同一アミノ酸の数を最適化し、一方又は両方の配列のギャップは同一アミノ酸の数を最適化するために該アライメントをとるうえで許容されるように、例えば候補ポリペプチドと、例えば配列番号2のポリペプチドとの2本のポリペプチドの残基のアライメントをとることによって決定できる。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えば微生物から単離されるか、組換え技術を用いて産生されるか、化学的又は酵素的に合成される場合がある。アミノ酸配列のペアワイズ比較解析は、例えば、Needleman-Wunsch法のようなグローバルなアルゴリズムを用いて実行される場合がある。代替的には、TatianaらFEMSMicrobiol.Lett,174247-2501999により説明され、国立バイオテクノロジー情報センターNCBIウェッブサイトで入手可能なBLAST2検索アルゴリズムBlastpプログラムのような局所的アライメントアルゴリズムを用いて比較される場合がある。matrix=BLOSUM62、opengappenalty=11、extensiongappenalty=1、gapxdropoff=50、expect10、wordsize=3及びfilteronを含むデフォルト値が、全てのBLAST2検索パラメーターについて使用される場合がある。Smith及びWatermanのアルゴリズムは、使用可能な別の局所アライメントのツールである1988。2本のアミノ酸配列の比較では、構造的類似性は、百分率の同一性という場合があり、あるいは、百分率の類似性という場合がある。同一性は同一アミノ酸の存在をさす。類似性は同一アミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在もさす。本明細書に説明されるポリペプチド内のアミノ酸についての保存的置換は、該アミノ酸が属する表1に示されるクラスの他のメンバーから選択される場合がある。組成物組成物例えばワクチン組成物は、アジュバントとともに、あるいは、アジュバントなしに投与される場合がある。一般にアジュバントは抗原の免疫原性を増強できる物質である。アジュバントは獲得免疫及び自然免疫例えばtoll様受容体の両方で役割を果たし、その全てが理解されているわけではないさまざまなやり方で機能する場合がある。天然及び合成の多くの物質がアジュバントとして機能することが示されてきた。例えば、アジュバントは、鉱物塩、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁標品、ある種の乳剤、モノホスホリルリピドA、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、QuilA、コレラ毒素Bサブユニット、ポリホスファゼン及び誘導体、免疫刺激複合体ISCOMs、サイトカインアジュバント、MF59アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、一部の細菌外毒素その他の構成要素、一部のオリゴヌクレオチド、PLG等を含むがこれらに限られない。これらのアジュバントは本明細書に説明される組成物及び方法に用いられる場合がある。一部の実施態様では、前記組成物は、少なくともスクアレン、水溶性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル疎水性非イオン性界面活性剤、疎水性非イオン性界面活性剤、を含む水中油乳剤を含むアジュバントの存在下で投与され、前記水中油乳剤は転相温度過程により得ることができ、油滴の体積組成populationbyvolumeの90は200nm未満の大きさで、任意的には150nm未満の大きさである。かかるアジュバントは、本明細書にその全体が取り込まれる、国際公開第2007/006939号パンフレット熱逆転可能な乳剤を含むワクチン組成物に説明される。前記組成物は、前記スクアレン水中油乳剤に加えて、あるいは、の代わりに製品E6020CAS番号287180-63-6も含む。製品E6020は引用によりその全体が本明細書に取り込まれる米国特許出願公開第2007/0082875号明細書に説明される。一部の実施態様では、前記組成物は、TLRアゴニスト例えばTLR4アゴニストを単独で、あるいは、アジュバントとの組合せで含む。例えば前記アジュバントは、TLR4アゴニスト例えばTLA4と、スクアレンと、水溶性溶媒と、ポリオキシエチレンアルキルエーテルに属する非イオン性親水性界面活性剤と、熱可逆性である非イオン性疎水性界面活性剤とを含む場合がある。かかるアジュバントの例は、本明細書にその全体が取り込まれる国際公開第2007/080308号パンフレット熱可逆性水中油乳剤に説明される。1つの実施態様では、前記組成物は、CpG及びアルミニウム塩アジュバント例えばミョウバンとの組合せでアジュバント化される。アルミニウム塩アジュバント又は化合物は、本明細書に説明される実務に使用されるアジュバントに含まれる。有用なアルミニウム塩アジュバントの例は、水酸化アルミニウム例えば、結晶オキシ水酸化アルミニウムAlOOH及び水酸化アルミニウムAlOH3を含む。水酸化アルミニウムは、Al3イオン及び水酸基-OHを含むアルミニウム化合物である。水酸化アルミニウムと他のアルミニウム化合物例えば、ヒドロキシリン酸又はヒドロキシ硫酸との混合物で、得られる混合物が水酸基を含むアルミニウム化合物であるときは有用な場合もある。特定の実施態様では、アルミニウムアジュバントはオキシ水酸化アルミニウム例えばAlhydrogel登録商標である。アルミニウム塩アジュバントを含む組成物は極端な温度、すなわち、氷点0°C以下又は高温例えば70°C以上に曝露されるべきではないことは当業者に周知であるが、かかる曝露は、安定性と、吸着した抗原及びアジュバントの両方の免疫原性とに悪影響を与える場合があるからである。特定の実施態様では、前記アルミニウム化合物水酸化アルミニウムアジュバントはリン酸で処理される。好ましい実施態様では、リン酸は塩の形状で水酸化アルミニウムアジュバントに添加される。リン酸イオンは、リン酸二ナトリウム一ナトリウムdisodiummonosodiumphosphateを含むバッファー溶液により提供されることが好ましい。本明細書に実例が示されるとおり、好ましい実務では、前記アルミニウム化合物例えばオキシ水酸化アルミニウムは例えば、国際公開第2011/075822号パンフレット2010年12月20日出願、発明の名称:免疫原性組成物及び関連方法に説明されるプロセスによりリン酸で処理される。このプロセスでは、オキシ水酸化アルミニウムの水性懸濁液約20mg/mLがリン酸バッファー溶液例えば約400モル/Lと混合される。リン酸の好ましい最終濃度は約2mMから20mMまでである。前記混合液はバッファー例えばTris-HCl、生理食塩水を含むTris-HCl、HEPESで希釈されて、オキシ水酸化アルミニウム及びリン酸PO4の懸濁液を調製する。前記バッファーは10mMTris-HCl及び150mMNaCl、pH約7.4であることが好ましい。前記懸濁液は室温で約24時間混合される。最終懸濁液中の元素アルミニウムの濃度は、約0.28mg/mLから1.68mg/mLまでの範囲内が好ましい。元素アルミニウムの濃度は約0.56mg/mLがより好ましい。免疫原性ペプチド例えばPcpA、PhtDは、単剤又は合剤で、前記処理済みの水酸化アルミニウムに吸着される場合がある。前記組成物は、液状が好ましい場合があるが、常法に基づく凍結乾燥か、国際公開第2009/012601号パンフレット、抗原アジュバント組成物及び方法に説明されるとおり泡沫乾燥かの場合がある。1つの実施態様による組成物は液状である。免疫投与量は0.5ないし1.0mLの体積で処方される場合がある。液体製剤は、例えば溶液又は懸濁液を含む、投与に適するいずれかの形状の場合がある。したがって前記組成物は、液体培地例えば生理食塩水又は水を含む場合があり、緩衝剤が添加される場合がある。製剤及び組成物のpHは、約6.4ないし約8.4が好ましい場合がある。pHが約7.4であることがより好ましい。前記組成物の代表的なpH範囲は、5-10、例えば、5-9、5-8、5.5-9、6-7.5又は6.5-7である。前記pHは緩衝剤の利用により維持される場合がある。免疫原性組成物の医薬製剤は、当業者に周知の1種類以上の添加剤例えば、希釈剤、粘稠剤、緩衝剤、保存料、界面活性剤、アジュバント剤、洗剤及び/又は免疫賦活剤を任意的に含む場合もある。適当な添加剤は、当業者に知られるとおり、抗原及びアジュバントと適合性であろう。希釈剤の例は、デンプン、セルロース、誘導体、フェノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンのような、結合剤、崩壊剤又は分散剤を含む。医薬製剤は、抗菌剤、抗炎症剤及び麻酔剤のような1種類以上の活性成分を含む場合もある。洗剤の例は、Tween80のようなTweenポリソルベートを含む。前記組成物に含まれるのに好ましい添加剤は当業者に知られている。アジュバントを用いる免疫の1つの実施態様では、例えば、免疫原性のポリペプチド及び/又はそれらの断片は、多糖類コンジュゲートを形成するために細菌多糖類に共有結合により結合される場合がある。かかるコンジュゲートは、前記ポリペプチド及び/又はこれらの断片にコンジュゲートされる細菌多糖類に対して向けられるT細胞依存性免疫原性応答を惹起するための免疫原として有用な場合がある。免疫原性組成物は、該免疫原性組成物と、アジュバントか、従来技術又はその他の器具を用いて、ほ乳類に前記組成物を投与のための再構成を容易にする1種類以上の薬学的に許容できる希釈剤を含む、再構成溶液かとを含むキット形状で提供される場合がある。かかるキットは、前記組成物の液状を投与するための器具例えば、皮下用シリンジ、マイクロニードルアレイと、使用説明書とを任意的に含むかもしれない。以上の開示内容は本主題の一部の実施態様を一般的に説明する。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得られる。これらの実施例は、例示の目的だけのために説明されるのであって、本開示内容の範囲の限定を意図するものではない。状況が示唆するか都合がよいかの場合には、形態の変更及び均等物の置換が意図される。具体的な用語が本明細書では用いられてきたが、かかる用語は説明の意味で意図されるのであって、限定の目的ではない。本開示内容及び実施例において利用されるが、明示的に説明されない、分子遺伝学、タンパク質生化学及び免疫学の方法は、科学文献に十分報告され、当業者の能力範囲内に含まれる。免疫応答CD4T細胞は、例えば肺炎球菌のような細胞外病原体に対しては最も重要であると考えられる。MHCクラスII分子のコンテキストで抗原提示細胞APCsに装荷された抗原で刺激されると、未熟なCD4T細胞は、機能的に異なるTヘルパーThのサブセットに分化する場合がある。異なるThサブセットへのコミットメントは、抗原タイプ及び装荷、共刺激分子及びサイトカインシグナル伝達を含む、許容的環境でのAPCsとの複雑な相互作用に依存する本件文献7-9。例えば、インターロイキンIL-2、インターフェロン-ガンマIFN-γ及び腫瘍壊死因子-ベータTNF-β産生を特徴とするTh1細胞は、細胞内病原体を除去するために最重要である。細胞外病原体を除去するのに必須のTh2細胞は、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13及びIL-25を発現する。最近発見されたTh17細胞はIL-17、IL-21及びIL-22を分泌する本件文献10。メモリーT細胞応答は、エフェクター応答線形モデル又は非対称分裂の際に発生するか、病原体の消失後に縮小残存するエフェクタークロノタイプの大集団の生き残りかである本件文献11。迅速なリコール反応及びサイトカイン大量産生を伴う免疫記憶は、流行性感染に対する迅速な保護を確保するための非常に効果的なメカニズムであり、呼吸器粘膜のような侵入部位での病原体の再遭遇に対する主要な防御として機能する本件文献12、13。強固なメモリーT及びB細胞応答は、自然な感染の過程と、ワクチン接種時との両方で発生し、メモリーリンパ球がリンパ系及び非リンパ系の部位に分布する本件文献14-16。いったん発生すると、メモリーT細胞は一定期間循環血中で検出できる。本件文献15、17、18。肺炎球菌に対する免疫発生の現行の説は、CD4Thヘルパー-メモリーサブセットTh-1、Th-2及びTh-17の主要な役割を画定するマウスでの研究から発展してきた本件文献19-21。動物モデルでは、CD4T細胞免疫は耳の病原体に対する保護で顕著な役割を果たしており、抗体非依存免疫も付与できる本件文献20、22、23。しかし、急性中耳炎を罹患中のヒトでT-ヘルパーメモリーサブセットの保護的役割を支持するデータはない。獲得免疫応答における抗原特異的CD4T細胞の中心的役割は、一方で抗体産生においてB細胞に援助を提供し、他方で免疫機能の自分自身のエフェクターとしてはたらくことである本件文献7、9、23、27。さらに、Th細胞によって提供される定常的なサイトカイン環境中で抗原刺激に応答して、特異的B細胞は、クローン増殖、クラススイッチ及び体細胞超突然変異を行い、より親和性の高い抗体の選択につながる本件文献28、29。増幅されたB細胞は、一部はメモリーB細胞に分化する一方、抗体を大量に分泌する形質細胞に分化して、骨髄のようなニッチで生き続ける本件文献29、30。メモリーB細胞は抗原再刺激に迅速に応答でき、長期間CD4T細胞からの定常的な援助で形質細胞のプール及び血清抗体レベルの維持に寄与するかもしれない本件文献31。実施例1肺炎球菌タンパク質抗原を用いて、小児での耳炎好発状態を評価するために、耳炎非好発及び耳炎好発小児のコホートの末梢血中の肺炎球菌特異的機能メモリーCD4Th細胞サブセットが定量された。これらのコホートの小児の血清中での同一抗原に対するB細胞IgG応答も計測された。患者は、米国国立衛生研究所により資金援助された5年間の急性中耳炎長期予後研究の参加者であった本件文献26。急性中耳炎エピソードを6ヶ月間に3回か、1年間に4回か経験した小児は耳炎好発性と考えられ、エピソードの回数がそれ以下の者は耳炎非好発群に入れられた。参加した小児はニューヨーク州ロチェスターの中流郊外居住階層出身であった。急性中耳炎の既往歴のない生後6ヶ月の健康な小児が登録され、月齢6、9、12、15、18、24及び30ヶ月の7回、血清と、鼻咽喉NP及び耳咽喉OP培養とが採取され、両方のコホートとも2才未満のさまざまな年齢の小児であった。中耳液は急性中耳炎エピソードの際に鼓室穿刺により採取された。肺炎球菌及びインフルエンザ菌鼻咽喉/耳咽喉定着の評価は鼻咽喉及び耳咽喉表面及び中耳液の培養の微生物学的テストにより定期的に得られた。採取された血液由来の末梢血単核細胞は単離され、使用時まで液体窒素中で凍結された。本研究に用いられたサンプルは、耳炎好発小児からは急性中耳炎診察時に採取され、耳炎非好発小児からはコロニー形成時colonization又は急性中耳炎診察時に採取された。小児は、適用可能なスケジュールに従って、利用可能な結合型ワクチンの年齢に適する投与量で肺炎球菌に対して免疫済みであった。抗原使用される肺炎球菌タンパク質抗原は、PhtD配列番号6、PhtE配列番号8、LytB配列番号11、PcpA配列番号3及びニューモリシンの無毒化誘導体PlyD1配列番号13である。対照実験として、PspAも使用される。各タンパク質は肺炎球菌血清型6B株式会社からクローン化され、大腸菌で可溶性タンパク質として組換え技術で発現され、イオン交換クロマトグラフィーの組合せで精製された。SDS-PAGE法及びRP-HLPC法によりアッセイしたところ、各タンパク質は精製後90以上の純度であった。刺激に最適な投与量は、トリパンブルー染色及び/又はヨウ化プロピジウム染色後のフローサイトメトリー解析の使用によって決定された。T細胞刺激肺炎球菌が鼻咽喉に定着しているか、肺炎球菌で急性中耳炎感染している耳炎好発性及び耳炎非好発性小児由来の末梢血単核細胞は前記6種類の肺炎球菌抗原で刺激され、無莢膜型インフルエンザ菌が鼻咽喉に定着しているか、無莢膜型インフルエンザ菌で急性中耳炎感染している小児は3種類の無莢膜型インフルエンザ菌抗原で刺激された。刺激前に、凍結末梢血単核細胞は37°Cのウオーターバスで急速解凍され、ゆっくりと完全培地10のFBSと、2mMのL-グルタミンと、0.1mMのピルビン酸ナトリウムと、非必須アミノ酸と、100U/mlのペニシリンと、100μg/mLのストレプトマイシンとが添加されたRPMI1640が添加された。それから、細胞は洗浄され、完全培地の入った24穴プレート中で終夜静置された。末梢血単核細胞は過去の報告本件文献35、36から適応された標準的なプロトコールを用いて刺激された。簡潔には、細胞数が計測され、96穴平底培養プレートに入れられ、1μg/mLのさまざまなタンパク質抗原か、1μg/mLのブドウ球菌エンテロトキシンBSEBかのいずれかで刺激された。共刺激を提供し、抗原特異的応答を増強するために1μg/mL濃度の抗CD28及び抗CD49d抗体それぞれクローンL293及びL25、BDBiosciencesが前記細胞培養に添加された。抗CD28及び抗CD49d抗体はバックグランドレベルに影響のない共刺激のために広く用いられている本件文献18、37。その後細胞は抗原プロセシングのために、2時間、37°C、5CO2存在下でインキュベーションされた。2時間後、ゴルジ輸送阻害剤BDBiosciencesがサイトカインを細胞内に保持するために添加され、インキュベーションがさらに4時間継続された。サイトカインのプロファイリングマルチパラメーターフローサイトメトリー法が、本研究のコホートにおける急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の循環血中肺炎球菌タンパク質に対する特異的CD4T細胞応答を検出するために用いられた。細胞内サイトカイン染色アッセイICCSが抗原特異的CD4T細胞サブセットTh-1、Th-2及びTh-17を評価するために用いられた。刺激後、細胞は96穴V字底プレートに移され、FACSバッファー5FBSが添加されたPBSで1回洗浄され、さまざまな細胞表面マーカーに対する抗体で染色された。使用された抗体は、抗CD4APCAlexafluor750クローンRPAT4、eBiosciences、PE-テキサスレッド抗CD45RAクローンMEM56、Invitrogen及び抗CCR7PerCP/Cy5.5コンジュゲートクローンTG8/CCR7、Biolegendであった。細胞は固定及び透過化溶液BDBiosciencesで20分間透過化され、その後1×透過化バッファーBDBiosciencesで3回洗浄された。さまざまなサイトカイン特異的抗体のカクテルが刺激の結果細胞内に捕捉されたサイトカインを染色するのに用いられた。使用された抗体は、PE-Cy7結合抗IFN-γクローンB27、BDBiosciencesと、パシフィックブルー結合抗IL17AクローンBL168、Biolegend、Alecafluor700抗IL-2クローンMQ1-17H12、Biolegend、PE結合抗IL-4クローン8D4-8、BDBiosciences、AF488結合TNF-α、抗CD3Qdot605クローンUCHT1、Invitrogen及びPE-Cy5抗CD69クローンFN50、BDBiosciencesであった。細胞内染色後、細胞はさらに3回1×透過化バッファーで洗浄され、FACS用試験管に再懸濁する前にFACSバッファーで1回最終洗浄された。12種類の蛍光パラメーター検出用に装備された注文生産のBDLSRIIフローサイトメーターが、各サンプルについて2-5×105回のイベントを収集するために使用され、データはFLOJOTreeStarソフトウェアを用いて解析された。細胞の破片及びクランプを排除するために、細胞は最初に前方及び側方散乱特性に基づいてゲーティングされ、その後、CD4T細胞、CD45RA弱陽性、そしてCD69サイトカイン陽性細胞と順番にゲーティングされた。代替的には、細胞は確認のためにTNF-α対他のサイトカインTNF-αVsothercytokinesでもゲーティングされた。低頻度の応答細胞は過剰な戻しゲーティングによって確認された。過去に報告されたとおり、抗原特異的細胞の検出を補助するために、マルチパラメーター染色とともに抗CD28/CD49d抗体が使われて無関係なバックグランドを避けるのを手助けする本件文献37。全アッセイは標準化され、サイトカインのプロフィール検出についてマルチプレックスビーズアレイCBA、BDBiosciencesと比較された。液性応答サンプル中のIgG抗体レベルを計測するために、以前説明されたとおりELISA法が実行された本件文献26、38。簡潔には、96穴プレートNunc-Immulonが、コーティングバッファー重炭酸pH9.4中の0.25μg/mLの個々の抗原ウェルあたり100μLでコーティングされ、終夜4°Cでインキュベーションされた。洗浄後、前記プレートは3の脱脂粉乳ウェルあたり200μLで37°C1時間ブロッキングされた。5回洗浄後、血清が初回希釈1:1003脱脂粉乳入りのPBSで前記ウェルに100μL添加され、2倍ずつ連続希釈された。前記混合液は室温で1時間インキュベーションされ、その後、2次抗体として、ホースラディッシュペロキシダーゼBethylLaboratories,Inc,Montgomery、テキサス州に結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG抗体が添加された。反応産物は、TMBMicrowellペロキシダーゼ基質システムKPL、Gaithersburg、メリーランド州を用いて発色され、1.0モルリン酸の添加により反応が停止され、450nmフィルターを用いる自動ELISAリーダーによって読み取られた。抗体濃度に関する定量的結果を提供するために、未知サンプル中に存在する特異抗体レベルが内部参照血清抗原特異的抗体レベルが高いヒト血清のプールとの比較により決定された。4種類のパラメーターのロジスティク-対数関数が、参照及びサンプルの曲線を作成するのに用いられた。このELISA法はICHガイダンスに従って完全に認証された。全てのデータはGraphPadPrismソフトウェアを用いて統計学的に解析された。前記データについての両側検定P値がMannWhitney検定を用いて算出された。結果耳炎好発性グループの小児は耳炎非好発性の小児と年齢は類似していた。性別、託児所利用歴、家庭内受動喫煙曝露、8才未満の兄弟姉妹の数及び母乳哺育歴の分布は2つの研究グループ間で類似していた。耳炎非好発性及び耳炎好発性の小児の間でさまざまな肺炎球菌抗原特異的メモリーTh細胞のサブセットの循環頻度が、これらの末梢血単核細胞を特異的抗原で刺激することにより比較された。そのために、IFN-γ、IL-4、IL-2又はIL-17を産生するCD45RA弱陽性メモリーCD4T細胞の百分率が、最近活性化されたCD69T細胞でゲーティングすることによって算出された。抗原特異的応答は、未刺激のまま放置されるか、非特異的抗原キーホールリンペットヘモシアニンで刺激されるかの対照実験の末梢血単核細胞で正規化された。結果の要約を示す図1は、急性中耳炎後n=6又は肺炎球菌の鼻咽喉定着後n=9の耳炎非好発性小児n=15における刺激に用いられた全ての肺炎球菌抗原に対するCD45RA弱陽性メモリーCD4T細胞のさまざまなサブセットの検出可能な頻度を示す。これとは著しく対照的に、急性中耳炎後n=10又は鼻咽喉定着後n=3の耳炎好発性小児n=13は、循環する肺炎球菌特異的メモリーCD4T細胞が際だって欠乏した。特に、LytB、PhtE及びPlyに対してIFN-γを産生するメモリーCD4T細胞は完全に欠落し、著しく低レベルのIFN-γP<0.02がPHtD、PcpA及びPspAに応答して産生された図1A。耳炎好発性小児ではPhtD及びLytBに対してIL-4を産生するメモリーCD4T細胞の著しい減少P<0.02が観察された図1B。PhtDP<0.05、PcpAP<0.005、PhtEP<0.05PlyP<0.005及びPspA0.02に対するIL-2応答は耳炎好発性小児では著しく低く図1C、PhtD、PcpA及びPhtE<0.05に応答する耳炎好発性小児ではIL-17a産生細胞の有意な減少がみられた図1D。抗原特異的メモリーTh細胞の不在が抗原特異的B細胞応答不全の原因かもしれないため本件文献9、耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児での抗原特異的IgG力価が評価された。それぞれの群での肺炎球菌抗原に対する血清IgGレベルが図2に示される。予想どおり、メモリーT細胞頻度の増大に伴って、PhtDP<0.05、LytBP<0.0005、PhtEp<0.0005、Plyp<0.005に対するIgG力価は、耳炎好発性群と比較して耳炎非好発性群で有意に高かった図2。PcpA抗原に対するIgG力価も増大したが、差は有意ではなかった図3。乳幼児の免疫システムはT及びB細胞応答のコンテキストで完全に成熟しているわけではないので本件文献39、40、耳炎好発性小児ではメモリーT細胞応答不全が内在的なT又はB細胞不全の原因かどうかを評価するために、B細胞及びT細胞を介する応答が調べられた。抗原提示細胞の関与とは独立にT細胞応答を刺激するブドウ球菌エンテロトキシンB本件文献41で末梢血単核細胞が刺激された。図3はIFN-γ、IL-4、IL-2又はIL-17aを産生するCD4T細胞の百分率を示し、耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児で同じである。小児は全てDTaPワクチンを接種されていたことから、耳炎好発性小児は一般的な免疫不全があるかどうか評価するために、ワクチン抗原のジフテリア、破傷風及び百日咳に対するIgG力価が測定された。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳毒素、繊維状赤血球凝集素又はパータクチンに対するIgG抗体濃度は群間で有意な差は見られなかったデータは示されない。要約すると、これらのデータは、耳炎非好発性小児と比較して耳炎好発性小児では、肺炎球菌抗原特異的なメモリーCD4T細胞の機能が欠失又は低下していることを示す。この効果は研究された抗原に対するIgG応答の低下と関連した。前記データに示されるとおり、耳炎好発性小児は、抗原特異的CD45RA弱陽性Thメモリーの機能による肺炎球菌に対する応答を生じさせることができず、肺炎球菌タンパク質抗原に対して弱い抗体応答しか惹起できなかった。しかしこれらの小児は、メモリーT細胞機能全体や、ワクチン接種された抗原に対するB細胞を介する抗体応答例えばIgGの惹起に不全があるわけではない。CD4Th細胞が肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌を原因とする感染と戦うのを補助するという事実にもかかわらず、小児における肺炎球菌又は無莢膜型インフルエンザ菌を介する急性中耳炎と関連する特異的CD4Th細胞の直接的な役割を証明する報告が過去に全くなかった。明らかに、小児におけるCD4T細胞メモリーの発生が悪いことがその後のB細胞を介する抗体応答の低下の原因かもしれない。したがって免疫学的な記憶の欠落は、繰り返し耳が感染しやすくなる結果をもたらすのかもしれない。ここで発明者たちは、耳炎好発性小児は急性中耳炎及び/又は鼻咽喉定着後の循環血中のTh細胞での耳の病原体例えば肺炎球菌特異的なメモリーが欠落/低減していることを証明する。これに対し耳炎非好発性小児では、急性中耳炎及び/又は耳の病原体の鼻咽喉定着後にメモリー抗原特異的CD4T細胞が発生する。急性中耳炎及び肺炎球菌の鼻咽喉定着後に耳炎好発性小児で一部の抗体が検出可能であるため、該耳炎好発性小児は短期的なB細胞応答は行うようである。しかし、T細胞記憶がない状態では、抗体レベルが下がった後にさらなる急性中耳炎に感染しやすくなる。したがって、根本的な免疫学的欠点は、耳炎好発性小児でのT細胞記憶形成にあると考えられる。耳炎好発性小児は抗原提示細胞のプロセッシングを必要としない抗原ブドウ球菌エンテロトキシンBには同様に反応し、DTaPワクチンの形態で抗原の非経口注射に対しても同様に反応したため、耳炎好発性小児の問題は、免疫学的には鼻粘膜に存在する抗原提示細胞による肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌の実際のプロセッシング及び提示のさらに上流にあるかもしれない。過去の研究は、小児及び成人における5-7日間のCD4T細胞の増殖応答における肺炎球菌又は無莢膜型インフルエンザ菌抗原の役割を証明してきた本件文献42、43。先行研究は、耳炎好発性小児のアデノイド及び扁桃腺から採取された細胞由来のCD4T細胞増殖を評価したところ、無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質P6に応答する増殖が認められなかった本件文献44。このような性格の研究は抗原特異的T細胞増殖を評価するが、抗原特異的メモリーCD4T細胞の存在について情報を与えることはできない。CD4Th-2細胞は宿主から細菌病原体の除去に有用な抗体応答の大半を促進するが、マウスモデルにおける最近の研究は、肺炎球菌鼻咽喉定着に対するIL-17aを介する抗体非依存免疫がCD4T細胞Th-17細胞を産生することを示した本件文献20。ここではヒトではじめて、耳炎非好発性小児の循環血中の肺炎球菌特異的IL-17a産生メモリーTh細胞は耳炎好発性小児より頻度が高いことが検出された。したがって、肺炎球菌特異的IL-17a産生メモリーTh細胞は耳炎好発状態から保護しているかもしれない。急性中耳炎の際の感染部位中耳粘膜及び中耳液での細胞表現型タイピングは、CD45RO強陽性/CD45RA弱陽性メモリーCD4T細胞の大量の遊走と、ホーミングレセプターL-セレクチンの消失とを示唆する本件文献45。他の研究は、急性中耳炎の際の中耳液における主としてメモリーCD4T細胞の集積を明かにする本件文献45-47。アデノイドのような局所的2次リンパ器官は、細菌定着のような上部気道感染の際のT細胞プライミングの主要部位である。ひとたび抗原を装荷した抗原提示細胞が局所的2次リンパ器官アデノイドに移動すると、リンパ球の分化例えば、CD4T細胞が起こる。血液循環に入った後、前記CD4T細胞は急性中耳炎の場合は中耳粘膜及び/又は鼻咽喉定着の際は上部気道に最終的に移動する。理論に拘泥するわけではないが、免疫学的な成熟の遅延は、耳炎好発性小児で機能するT細胞の欠落の原因の可能性がある本件文献48。小児は、成長するにつれて、耳管の解剖学的変化のために急性中耳炎に罹患しにくくなるが、成長とともに免疫システムの成熟も起こる。強固なT細胞記憶応答は3才ないし5才ごろに発生するのが典型的で本件文献40、48-51、耳炎好発性小児はこの年齢の時間フレームの間に罹患傾向を卒業するのが通常である。ヒトでは、メモリーCD4T細胞は急性中耳炎との戦いで要の役割を果たすかもしれない。そこで、肺炎球菌特異的CD4T細胞のメモリーは、もし発生するならば、再発性急性中耳炎の発症予防に役立つかもしれない。実施例2本研究では、1AOMエピソードが6ヶ月間に3回以上又は12ヶ月間に4回以上の小児を含む耳炎好発性群と、2適切な抗生物質療法の少なくとも48時間後に細菌除去及び/又は徴候の消失を達成できなかった小児本件文献70、71と、1回の抗生物質治療コースを完了して14日以内に急性中耳炎の徴候がぶり返した小児とを含む急性中耳炎治療失敗AOMTF群と、3急性中耳炎のエピソードが1回か2回しかなかった小児を含む耳炎非好発性群という、3群の急性中耳炎を罹患している生後6ヶ月ないし36ヶ月の小児でのPhtD、PhtE、LytB、PcpA及びPlyに対する血清IgG抗体の発生が比較された。採取分析されたサンプルは実施例に記載の予後研究の際に得られた。急性中耳炎の既往歴のない生後6ヶ月の健康な小児が登録され、生後30ヶ月まで予後が追跡された。血清、鼻咽喉及び耳咽喉OP培養が、研究期間中生後6、9、12、15、18、24及び30ヶ月の7回採取された。しかし、非常に少数の患者しか30ヶ月の診察を受けに来なかったため、生後30ヶ月のサンプルは本分析から除外された。本研究期間中、小児が急性中耳炎を罹患したら、血清、鼻咽喉及び耳咽喉培養が鼓室穿刺による中耳液MEFとともに採取された。回復期サンプルは3週間後に採取された。これらの小児の過半数は急性中耳炎を発症しなかったので約70、第3群耳炎非好発性小児に含められた。一部の小児はその後耳炎好発性の定義に該当したので約5、第1群に含められるか、急性中耳炎治療失敗となり約5分析のための第2群に含められた。耳炎好発性及び急性中耳炎治療失敗のコホートのサイズを大きくするために、生後6ないし36ヶ月の年齢範囲内にこれらの定義に該当するときはいつでも追加の小児が登録された。急性中耳炎罹患時に、鼻咽喉、耳咽喉及び中耳液の急性期サンプルが採取され、3週間後に回復期サンプルが採取された。急性中耳炎の診断を確認するために、米国小児科アカデミー急性中耳炎診断ガイドラインを用いて認定された耳鏡専門家の小児科医師validatedotoscopistpediatriciansにより診察された。鼓室穿刺術は中耳液に耳の病原体が存在することを確認するために実施された。中耳液、鼻咽喉及び耳咽喉サンプルはトリプチケースソイ培地と、5ヒツジ血液が添加されたトリプチケースソイ寒天プレートと、チョコレート寒天プレートとに接種された。細菌は、CLSI標準培養手順に従って単離された。ELISAアッセイ:実施例1に用いられた肺炎球菌タンパク質PhtD、LytB、PcpA、PhtE及びPlyD1が本研究でも用いられた。タンパク質特異的抗体力価は、精製組換えタンパク質を使うELISA法により測定された。96穴Nunc-Immulon4プレートが、重炭酸コーティングバッファーpH9.4中の各タンパク質0.5μg/mLウェルあたり100μLでコーティングされ、4°Cで終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記プレートは3脱脂粉乳で37°C1時間ウェルあたり200μLブロッキングされた。5回の洗浄後、100μLの血清が初回希釈1:1003脱脂粉乳入りのPBSで前記ウェルに添加され、2倍ずつ連続希釈された。前記混合液は室温で1時間インキュベーションされ、その後、2次抗体として、ホースラディッシュペロキシダーゼBethylLaboratories,Inc,Montgomery、テキサス州に結合されたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトIgG抗体が添加された。反応産物は、TMBMicrowellペロキシダーゼ基質システムKPL、Gaithersburg、メリーランド州を用いて発色され、1.0モルリン酸の添加により反応が停止され、Softmax終点希釈プロトコールを用いて、SpectramaxプレートリーダーMolecularDevices、Sunnyvale、カリフォルニア州により450nmで解析された。統計解析は、GraphPadPrism5で実施された。対応のないunpairedt検定が、IgG抗体解析のために3つの群の間の差を比較するために適用された。対応のあるpairedt検定は急性期対回復期の血清サンプルを比較するために適用された。一元配置分散分析onewayANOVAは経時的な抗体上昇を評価するのに用いられた。0.05未満のP値が有意とされた。急性中耳炎罹患時の小児3群におけるPhtD,LytB、PcpA、PhtE及びPlyに対する特異的IgG抗体力価肺炎球菌のPhtD,LytB、PcpA、PhtE及びPlyタンパク質に対するIgG抗体力価が、耳炎好発性小児35名、急性中耳炎治療失敗小児25名及び耳炎非好発性群の1回目又は2回目の急性中耳炎罹患時の小児34名の急性中耳炎急性期に測定された図4。耳炎好発性小児でのPhtDタンパク質に対するIgG力価は、耳炎非好発性小児より有意に低かったp<0.05。急性中耳炎治療失敗小児でのPhtDに対するIgG抗体レベルも耳炎非好発性小児より低かったが、差は有意には至らなかった。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児でのLytBに対するIgG力価は耳炎非好発性小児より有意に低かった両方の比較ともp<0.001。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児におけるPcpAタンパク質に対するIgGの幾何学的平均力価GMTsは、耳炎非好発性小児よりほぼ3倍低かったが、抗体レベルのばらつきが大きかったため、小児の3つの群の間での差は統計学的に有意ではなかった。耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児におけるPhtEタンパク質に対するIgG力価は、耳炎非好発性小児より有意に低かったp<0.001。PlyD1タンパク質に対するIgG力価は、耳炎非好発性小児と比較して、耳炎好発性小児p=0.006及び急性中耳炎治療失敗小児p=0.02では有意に低かった。小児3群における急性期及び回復期急性中耳炎の肺炎球菌PhtD、LytB、PcpA、PhtEおよびPlyに対する抗体レベル耳炎好発性小児22名、急性中耳炎治療失敗AOMTF小児13名及び耳炎非好発性小児20名から急性期急性中耳炎罹患時及び回復期3週間後に1対の血清サンプルが得られた。小児の3群全てで、5種類のタンパク質に対するIgG抗体レベルのうち4種類は急性期対回復期で有意な上昇は認められなかった例外は急性中耳炎治療失敗小児でのPhtEタンパク質で、p=0.04と有意差が認められた。表1。しかし急性期及び回復期の血清中の抗体レベルに大きな個別のばらつきが認められ、3群全ての小児の一部では1種類以上の抗原に対する抗体で2倍の上昇がみられた表2。耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児の抗体レベルと年齢図5は、生後6-24ヶ月の予後追跡中の耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児が急性中耳炎を罹患していない定期診察を受けたときのPhtD、LytB、PcpA、PhtE及びPlyに対するIgG抗体レベルを示す。示されたデータは、耳炎非好発性小児150名及び耳炎好発性小児10名からのものである。耳炎非好発性小児では、LytBp=0.075を除く全てのタンパク質でIgG抗体レベルは経時的に有意に上昇したp<0.001。これに対し、耳炎好発性小児は、5種類のタンパク質のいずれについてもIgG抗体レベルの有意な経時的変化は認められなかったPhtDタンパク質につきp=0.40、KytBについてp=0.39、PcpAについてp=0.11、PhtEについてp=0.09、Plyについてp=0.42。これらのデータは、耳炎非好発性小児と比較して、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児では、急性中耳炎罹患時の肺炎球菌タンパク質に対する抗体レベルが有意に低いことを示し、肺炎球菌への事前の曝露が血清抗体レベルに反映する獲得免疫応答を全く惹起しないか、あまり強固でない応答しか惹起しないかであることを示唆する。この知見は、免疫学的に、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児は類似するが、耳炎非好発性小児と比較すると異なることを示唆する。また、研究された5種類の肺炎球菌抗原に対する血清抗体量は、耳炎非好発性小児より耳炎好発性小児では増加が有意に遅かった。耳炎好発性小児では鼻咽喉定着による自然な曝露の後の抗体獲得が遅いことは、耳の病原菌の曝露後の耳炎好発性小児での免疫応答不全の観察と矛盾しない。これらのデータは、急性中耳炎に対する血清抗体応答について、耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児は耳炎非好発性小児と違いがないことも示す。本研究のとおり少なくとも3才までの年齢範囲では、3群のいずれの小児の多数についても、急性中耳炎は免疫感作イベントではないようである。肺炎球菌に対して観察された抗原特異的免疫応答は、耳炎好発性小児についての他人の観察を確認及び敷衍し、一部の先行報告とは矛盾し、もっと新しいデータを提供する。Freijdら本件文献72は、生後30ヶ月の耳炎好発性小児15名での血清型3、6A及び23に対する抗肺炎球菌多糖類抗体を同年代の対照小児及び成人と比較して記載した。彼らは、耳炎好発性小児では血清型6A及び23に対する抗体が有意に低いことを見つけた。Prellnerら本件文献73は、耳炎好発性小児15名で血清型6A、19及び23に対する抗肺炎球菌多糖類抗体を測定し、前記小児の60は検出可能な抗体がないことを見つけた。6才でも、耳炎好発性小児では6A多糖類に対する抗体レベルは耳炎非好発性小児より低かった。Hotomiら本件文献74は、耳炎好発性小児36名平均生後18ヶ月と、耳炎非好発性小児20名を無莢膜型インフルエンザ菌OMPP6と、前記23価肺炎球菌ワクチンを抗原として用いて肺炎球菌多糖類とに対する血清抗体応答について評価した。耳炎好発小児の55はP6に対する抗体応答が低く、48は肺炎球菌多糖類に対する応答が低かった。Yamanaka及びFadenの1993年の研究本件文献75、76と、Bernsteinら本件文献77とは、別の耳の病原体である無莢膜型インフルエンザ菌に対する血清及び/又は粘膜抗体レベルが耳炎好発性小児で同様に低下していることを見つけた。発明者の知る限り、これは耳炎好発性小児及び急性中耳炎治療失敗小児における肺炎球菌タンパク質に対する血清抗体応答の最初の報告である。急性中耳炎を発症する耳炎好発性小児における抗PhtD、LytB、PcpA、PhtE及びPly抗体応答に関するこれらの観察は、これらの小児は、曝露が自然の鼻咽喉経路を通じて起こるときの肺炎球菌その他の耳の病原体に対する抗体応答に特異的な免疫学的欠陥があるという、耳炎好発状態に関する一般的になされる説明を支持する。実施例1で認められたとおり、耳炎好発性小児は、Tヘルパー細胞の機能と、肺炎球菌及び無莢膜型インフルエンザ菌抗原に対するTメモリー細胞応答とに欠陥がある未発表結果、本件文献82。ジフテリア、破傷風及び百日咳非経口ワクチンに対するこれらの小児の抗体応答は低下しないので、これらの知見は、オタフク風邪その他の小児ワクチン接種への血清抗体応答が耳炎好発性小児も正常であることを見つけたPellnerら本件文献83及びWiertsmaら84の観察と矛盾しない。したがって、耳炎好発性小児での免疫機能不全は、耳の病原体への自然な曝露では起こるが、非経口ワクチン接種では起こらない。耳炎好発性小児で肺炎球菌結合型ワクチンへの適切な免疫応答が起こるとの観察はこの結論を支持する本件文献85、86。本研究の肺炎球菌タンパク質への急性期及び回復期の抗体レベルを比較すると、全体的な幾何学的平均力価は、耳炎好発性小児、急性中耳炎治療失敗小児又は耳炎非好発性小児で有意な上昇を示さなかった。これは、個々の小児の免疫応答のばらつきが大きいことが主な原因である。実際、小児の一部は回復期力価のほうがより高いが、他の小児はより低かったり、変わらなかったりした。これらの結果の原因は、急性中耳炎感染が起こる前の肺炎球菌の鼻咽喉での定着期間の長さの違いである可能性が一番高い。定着期間がより長い小児は急性中耳炎発症前に抗体応答のピークに達するであろうし、急性期ないし回復期の血清中の抗体レベルは一定か下降を示すであろう。他の小児は急性中耳炎発症前の鼻咽喉定着期間が短く、急性期ないし回復期の抗体レベルの上昇を示す。これらの結果は、無症状定着による自然なやり方で小児宿主にタンパク質が提示されるか、急性中耳炎感染かで、乳幼児での抗原性が異なることをたぶん反映して、抗原が違うと異なる抗体応答プロフィールを惹起することを示す。無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質に対する抗体応答が評価されるときにも同様な観察がなされ、他のグループも急性中耳炎イベントの前後での急性期ないし回復期の抗体レベルのこのばらつきを観察していた本件文献87-89。Soininenらは、生後2年間追跡調査した小児329名のコホートにおける鼻咽喉定着及び急性中耳炎に関連する肺炎球菌多糖類型1、6B、11A、14、19F及び23Fに対する抗体の自然発生を研究した本件文献90。抗体は少しだが有意な経時的増大が起こり、血清型11A及び14はより低い年齢で免疫原性が高かった。彼らは、鼻咽喉定着又は急性中耳炎の後は抗体レベルは等しいことを見つけた。しかし、同じ小児を含む後の研究では、Soininenらは2倍を超える抗体上昇は急性中耳炎後では比較的頻度が低く、ばらつきは小児の年齢と肺炎球菌の血清型とに帰因できることを示す知見を記載した本件文献89。対応する研究では、本研究と同じ5種類の肺炎球菌タンパク質と、3種類の無莢膜型インフルエンザ菌タンパク質タンパク質D、P6及びOMP26とに対する抗体が健康な小児におけて経時的にゆっくりと獲得されることが記録された本件文献69、87。本研究における耳炎好発性小児では、5種類の肺炎球菌タンパク質全てに対する抗体の年齢と相関する上昇が認められなかったか、有意に遅かった。結論として、これらの結果は耳炎好発性小児の免疫応答についてさらなる情報を提供する。耳炎好発性小児における肺炎球菌抗原に対する免疫低応答が観察された。急性中耳炎治療失敗小児が耳炎好発性小児と免疫学的に同様に挙動することも示された。PhtD、PhtE、PcpA、LytB及び無毒化ニューモリシン例えばPlyD1のうち少なくとも1種類以上を含むワクチン組成物を任意的にアジュバントを用いる非経口的経路により投与することは、肺炎球菌への自然な曝露の後に記録される免疫低応答を軽減するために用いられる場合がある。実施例3実施例1で言及された研究由来の耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児多数から得られた血清サンプル中の肺炎球菌抗原特異的メモリーB細胞の循環頻度が評価及び比較された。研究対象小児総数約387名中22名の小児がここでは研究された。十分な量の末梢血単核細胞サンプルの利用可能性にもとづいて耳炎好発性小児10名が本実施例の研究のために同定され、前記耳炎好発性小児と類似の年齢で急性中耳炎罹患回数1回又は2回の耳炎非好発性小児12名が対照の役割を果たすためにランダムに選択された。前記小児の臨床的な特徴は表3に示される。抗原特異的PhtD、PhtE、LytB、PcpA、PlyIgG分泌細胞と、全IgG分泌細胞とが、メモリーB細胞が試験管内で刺激されて抗体分泌細胞ASCに分化される自家で標準化されたELISPOTアッセイにより定量化された。簡潔には、完全培地単独か、1μg/mLのヤマゴボウマイトゲンを含む完全培地かを1mL含む24穴プレートの各ウェルに、解凍末梢血単核細胞100万個が入れられた。細胞は分化のために3日間37°Cに保たれ、完全培地で洗浄され、細胞数が計測され、抗原10μg/mLで終夜コーティングされた96穴ELISPOTプレートMillipore上に分配された。形質細胞への分化はフローサイトメトリー法による分化細胞の評価で最適化されたデータは示されない。全IgG分泌細胞の検出のために、ウェルはPBS中に10μg/mLのモノクローナル抗ヒトIgGMT91/145、Mabtechでプレコーティングされた。陰性対照のウェルは未処理のままか、同じ濃度のウシ血清アルブミンBSAでコーティングされた。プレートは10FBSが添加されたRPMIを用いて30分間37°Cでブロッキングされた。刺激された末梢血単核細胞は細胞数が計測され、対照ウェル及び抗原でコーティングされたウェルに分配される前に、5×105個の細胞が新鮮な完全RPMI培地200μLに再懸濁された。その後プレートは37°C、5CO2インキュベータ中で終夜インキュベーションされ、少なくとも5回PBSで洗浄された。次に、1μg/mLのビオチン化抗ヒトIgG抗体MT78/145、Mabtech100μLが前記ウェルに添加され、1時間インキュベーションされた。洗浄後、ストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼコンジュゲート1:1000が前記ウェルに添加され、1時間37°Cでインキュベーションされた。基質BCIP/NBT、Mabtechで発色される前に、プレートはPBSで5回洗浄された。抗原特異的抗体産生細胞の頻度が低いため、発色したスポットは解剖顕微鏡を用いて手作業でカウントされた。抗原特異的なデータは、抗原特異的メモリーB細胞の百分率として表現され、以下の式にしたがって、末梢血単核細胞100万個あたりで計算された。抗原特異的メモリーB細胞の百分率=特異的スポットの数/全Igスポットの数×100これら2群の小児の血清中の抗原特異的IgG力価は、プレートは0.5μg/mLの抗原でコーティングされ、アフィニティー精製されたホースラディッシュペロキシダーゼBethylLaboratories,Inc.、Montgomery、テキサス州に結合されたヤギ抗ヒトIgG、IgM又はIgA抗体が2次抗体として用いられた。全てのデータはGraphPadPrismソフトウェアを用いて統計学的に解析された。データについての両側検定P値はMannWhitney検定を用いて計算された。結果の要約は図6A、B、Cに示される。耳炎好発性小児及び耳炎非好発性小児由来サンプル中に存在する5種類の肺炎球菌抗原PhtD、PhtE、LytB、PcpA、Plyに特異的なメモリーB細胞の百分率は図6Aに示される。耳炎非好発群とは際だって対照的に、急性中耳炎又は鼻咽喉定着の後の耳炎好発性小児は、循環肺炎球菌特異的メモリーB細胞が顕著に減少した図6A。特に、抗原PhtD、PhtE及びPlyD1に対する抗原特異的IgGを産生するメモリーB細胞の百分率の顕著な低減が観察されたP<0.02。耳炎好発性小児はLytBに特異的なメモリーB細胞の百分率も全体的な低減を示したが、差は統計学的に有意ではなかったp=0.1。耳炎好発性及び耳炎非好発性群由来のサンプル中のPxpA特異的メモリーB細胞の百分率には統計学的に有意な差は見つからなかった図6A。同様に、前記2つの群に存在するIgG分泌細胞の総数も差がなかったデータは示されない。それぞれの群における肺炎球菌抗原に対する血清IgGレベルは図6Bに示される。耳炎好発性群の小児由来の血清と比較すると、PhtD、PcpA及びPhtEに対するIgG力価は耳炎非好発性群の小児由来の血清のほうが有意に高かったP<0.05。Plyレベルは低かったが、群間で統計学的に有意な差はなかった図6B。LytB抗体力価は両方のコホートでテストされた全ての抗原のなかで最も低かった図6B。本研究では、急性中耳炎及び/又は鼻咽喉定着後の耳炎好発性小児の循環血中のメモリーB細胞の百分率の低下が認められた図6A。抗原のナイーブなB細胞との遭遇の後、抗原特異的メモリーB細胞及び抗体分泌細胞は2次リンパ構造で発生し、血流を通じて骨髄、脾臓又は気道のような標的組織に移動する本件文献16。血清抗体レベルはメモリーB細胞により維持されるので本件文献31、発生した抗原特異的メモリーB細胞の百分率を分析することにより、耳炎好発性小児における抗体レベルが低いことのより正確な免疫学的な説明が提供される。メモリーB細胞の頻度が低いことと血清抗体レベルとの関連を確認するために、急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の耳炎非好発性小児n=15及び耳炎好発性小児n=13の異なるコホート由来のサンプルを用いて肺炎球菌特異的抗体力価が測定され、実施例1に示された研究で得られた結果と同様に、耳炎好発性小児では有意に低いことがわかった図6B。全体として、耳炎非好発性小児で肺炎球菌抗原特異的力価の結果が高い傾向は、実施例1で評価されたコホートで認められた傾向と矛盾しないが、抗原特異的応答についての群間の統計学的有意差の関する正確な結果は一部の事例で異なる。例えば、本研究で評価される小児の小さな群はPly特異的な抗体力価では差を示さなかった。細菌の定着及び/又は急性中耳炎後の特定のタンパク質抗原に対する抗体応答及びB細胞発生は、個々の小児の間でばらつきがあるかもしれないが、ワクチン接種でばらつきの程度が小さくなることが期待される。実施例1に示されるとおり、耳炎好発性小児は肺炎球菌抗原特異的メモリーCD4T細胞応答が不十分である本件文献96。抗体及びメモリーB細胞は、急性中耳炎と、耳の病原体での鼻咽喉定着との後の耳炎好発性小児で検出可能であったため図6A-B、本研究からの知見は上記実施例からの知見すなわち、耳炎好発性小児は一部の抗体応答を発生する場合があることを確認する。しかし、抗原特異的メモリーB細胞発生及び/又はメモリーCD4T細胞発生が起こらない以上、抗体レベルは減衰し、耳炎好発性小児は適切な血清抗体レベルを維持できないで急性中耳炎感染を繰り返しやすくなる。肺炎球菌多糖類結合型ワクチンは、抗多糖類抗体の保護レベルを増強するのに役立つが本件文献86、血清型の多様性が菌株特異的な抗多糖類抗体の保護薬効の限界となる95。しかし、耳炎好発性小児は結合型ワクチンに対する血清型特異的抗体を誘発できるという事実にもかかわらず、再発性感染がこの感染しやすい群では普通であり本件文献86、血清型中和免疫は短期的で不完全であることを示す。興味深いことに、循環中のPhtD特異的メモリーB細胞の百分率は血清PhtDレベルと相関した図6C。PcpA及びPlyD1に対する抗原特異的B細胞の百分率と血清抗体レベルとは差があることが観察された図6A-B。結論として、本研究で評価される抗原に関して、耳炎好発性小児では抗体分泌細胞に分化できるメモリーB細胞の発生が有意に低い。この知見の臨床的関連性は明かである。抗原特異的メモリーB細胞は血清抗体維持用貯蔵庫として働き、抗原再遭遇に際して、前記メモリーB細胞は抗体分泌細胞に増殖して血清抗体レベルの上昇をもたらす。発明者らは、耳炎好発性小児はIgG分泌細胞全部が欠落しているのではないことを見いだした。さらに、発明者らのフローサイトメトリー結果は、ポリクローナル刺激に応答して、耳炎好発性小児はメモリーB細胞CD19IgD-の抗体分泌形質細胞CD27CD38CD138への転換メカニズムに機能不全があるわけではないことを示したデータは示されない。これらのデータは、肺炎球菌抗原特異的応答は急性中耳炎又は鼻咽喉定着後の耳炎非好発性小児及び耳炎好発性小児の両方に見られることを示す。耳炎好発性小児では応答の低減が見られるが、それでも、自然な感染又は定着後のこれらの小児で応答が見られ、肺炎球菌への自然な曝露の後に認められる免疫低応答を軽減するため、上記のとおり例えば実施例2、PhtD、PhtE、PxpA、LytB及び無毒化ニューモリシン例えばPlyD1の少なくとも1種類以上を含むワクチン組成物を投与することを支持する。実施例の方法、タンパク質、組成物その他の特徴が説明されたが、本発明、開示内容又は出願の範囲を制限すること、あるいは、いかなる方法でも限定することは出願人の意図ではない。修正、改変及び変更は、当業者には容易に明かであろう。したがって、本開示内容は、本明細書に示され、説明される、具体的な詳細、代表的な装置及び実施例に限定されない。配列表が本明細書とともに提出され、本開示の一部とされる。以上に引用された全ての文献の内容は、引用により本明細書に取り込まれる。a及びtheのような単数形の本明細書での使用は、文脈がその反対であると示さないかぎり、対応する複数形の表示を排除しない。したがって例えば、ある請求項がaXorYの使用を記載する場合、特記がなければ、2個以上のX又はYの使用もカバーするものと解釈できる。用語又はが明細書の説明又は特許請求の範囲に用いられる範囲例えば、A又はBで、Aか、Bか、両方かを意味することを意図する。意図がAか、Bかだけで、両方ではないの状況では、AかBかだけで、両方ではないという用語が用いられるであろう。したがって、本明細書における用語又はは、両立的に用いられ、排他的な意味ではない。他の実施態様は以下の特許請求の範囲に含まれる。本件文献のリスト1PichicheroMERecurrentandpersistentotitismediaPediatrInfectDisJ20001991162PichicheroMECaseyJROtitismediaExpertOpinPharmacother200231073903VergisonADaganRArguedasABonhoefferJCohenRDhoogeIetalOtitismediaanditsconsequencesbeyondtheearacheLancetInfectDis2010101952034TeeleDWKleinJORosnerBEpidemiologyofotitismediaduringthefirstsevenyearsoflifeinchildreningreaterBostonaprospectivecohortstudyJInfectDis198916083945PoehlingKASzilagyiPGGrijalvaCGMartinSWLaFleurBMitchelEetalReductionoffrequentotitismediaandpressureequalizingtubeinsertionsinchildrenafterintroductionofpneumococcalconjugatevaccinePediatrics2007119707156DelBeccaroMAMendelmanPMInglisAFRichardsonMADuncanNOClausenCRetalBacteriologyofacuteotitismediaanewperspectiveJPediatr19921208147FiettaPDelsanteGTheeffectorThelpercelltriadeRivBiol200910261748MosmannTRSadSTheexpandinguniverseofTcellsubsetsTh1Th2andmoreImmunolToday199617138469MosmannTRCoffmanRLTH1andTH2cellsdifferentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalpropertiesAnnuRevImmunol198971457310KornTBettelliEOukkaMKuchrooVKIL17andTh17CellsAnnuRevImmunol20092748551711vanLeeuwenEMSprentJSurhCDGenerationandmaintenanceofmemoryCD4TCellsCurrOpinImmunol2009211677212McKinstryKKStruttTMSwainSLThepotentialofCD4TcellmemoryImmunology20101301913CombadiereBSiberilSDuffyDKeepingthememoryofinfluenzavirusesPatholBiol201058e79e8614LanzavecchiaASallustoFHumanBcellmemoryCurrOpinImmunol20092129830415deBreeGJDanielsHSchilfgaardeMJansenHMOutTAvanLierRAetalCharacterizationofCD4memoryTcellresponsesdirectedagainstcommonrespiratorypathogensinperipheralbloodandlungJInfectDis200719517182516KellyDFPollardAJMoxonERImmunologicalmemorytheroleofBcellsinlongtermprotectionagainstinvasivebacterialpathogensJAMA200529430192317PickerLJSinghMKZdraveskiZTreerJRWaldropSLBergstresserPRetalDirectdemonstrationofcytokinesynthesisheterogeneityamonghumanmemoryeffectorTcellsbyflowcytometryBlood19958614081918PitcherCJQuittnerCPetersonDMConnorsMKoupRAMainoVCetalHIV1specificCD4TcellsaredetectableinmostindividualswithactiveHIV1infectionbutdeclinewithprolongedviralsuppressionNatMed199955182519KodamaSSuenagaSHiranoTSuzukiMMogiGInductionofspecificimmunoglobulinAandTh2immuneresponsestoP6outermembraneproteinofnontypeableHaemophilusinfluenzaeinmiddleearmucosabyintranasalimmunizationInfectImmun200068229430020MalleyRSrivastavaALipsitchMThompsonCMWatkinsCTzianabosAetalAntibodyindependentinterleukin17AmediatedcrossserotypeimmunitytopneumococciinmiceimmunizedintranasallywiththecellwallpolysaccharideInfectImmun20067421879521vandenBiggelaarAHRichmondPCPomatWSPhuanukoonnonSNadalSimsMADevittCJetalNeonatalpneumococcalconjugatevaccineimmunizationprimesTcellsforpreferentialTh2cytokineexpressionarandomizedcontrolledtrialinPapuaNewGuineaVaccine2009271340722ChenSJChuMLWangCJLiaoCLHsiehSLSytwuHKetalKineticTh1Th2responsesoftransgenicmicewithbacterialmeningitisinducedbyHaemophilusinfluenzaeClinSci20061112536323SnapperCMShenYKhanAQColinoJZelazowskiPMondJJetalDistincttypesofTcellhelpfortheinductionofahumoralimmuneresponsetoStreptococcuspneumoniaeTrendsImmunol2001223081124FadenHThemicrobiologicandimmunologicbasisforrecurrentotitismediainchildrenEurJPediatr20011604071325MurphyTFYiKMechanismsofrecurrentotitismediaimportanceoftheimmuneresponsetobacterialsurfaceantigensAnnNYAcadSci19978303536026KaurRCaseyJRPichicheroMESerumAntibodyResponsetoThreeNontypeableHaemophilusinfluenzaeOuterMembraneProteinsDuringAcuteOtitisMediaandNasopharyngealColonizationinOtitisProneandNonOtitisProneChildrenVaccine2011291023827MosmannTRSchumacherJHStreetNFBuddROGarraAFongTAetalDiversityofcytokinesynthesisandfunctionofmouseCD4TcellsImmunolRev19911232092928RajewskyKClonalselectionandlearningintheantibodysystemNature1996381751829ManzRAHauserAEHiepeFRadbruchAMaintenanceofserumantibodylevelsAnnuRevImmunol2005233678630SlifkaMKAntiaRWhitmireJKAhmedRHumoralimmunityduetolonglivedplasmacellsImmunity199883637231BernasconiNLTraggiaiELanzavecchiaAMaintenanceofserologicalmemorybypolyclonalactivationofhumanmemoryBcellsScience2002298219920232DeLasRBGarciaJLLopezRGarciaPPurificationandpolarlocalizationofpneumococcalLytBaputativeendobetaNacetylglucosaminidasethechaindispersingmureinhydrolaseJBacteriol20021844988500033KirkhamLAJefferiesJMKerrARJingYClarkeSCSmithAetalIdentificationofinvasiveserotype1pneumococcalisolatesthatexpressnonhemolyticpneumolysinJClinMicrobiol200644151934KirkhamLAKerrARDouceGRPatersonGKDiltsDALiuDFetalConstructionandimmunologicalcharacterizationofanovelnontoxicprotectivepneumolysinmutantforuseinfuturepneumococcalvaccinesInfectImmun2006745869335PerfettoSPChattopadhyayPKLamoreauxLNguyenRAmbrozakDKoupRAetalAminereactivedyesaneffectivetooltodiscriminateliveanddeadcellsinpolychromaticflowcytometryJImmunolMethods200631319920836WaldropSLPitcherCJPetersonDMMainoVCPickerLJDeterminationofantigenspecificmemoryeffectorCD4TcellfrequenciesbyflowcytometryevidenceforanovelantigenspecifichomeostaticmechanisminHIVassociatedimmunodeficiencyJClinInvest19979917395037WaldropSLDavisKAMainoVCPickerLJNormalhumanCD4memoryTcellsdisplaybroadheterogeneityintheiractivationthresholdforcytokinesynthesisJImmunol199816152849538PichicheroMEDeloriaMARennelsMBAndersonELEdwardsKMDeckerMDetalAsafetyandimmunogenicitycomparisonof12acellularpertussisvaccinesandonewholecellpertussisvaccinegivenasafourthdosein15to20montholdchildrenPediatrics19971007728839AdkinsBBuYGuevaraPThegenerationofThmemoryinneonatesversusadultsprolongedprimaryTh2effectorfunctionandimpaireddevelopmentofTh1memoryeffectorfunctioninmurineneonatesJImmunol20011669182540HoltPGFunctionallymaturevirusspecificCD8TmemorycellsincongenitallyinfectednewbornsproofofprincipleforneonatalvaccinationJClinInvest20031111645741FleischerBSuperantigensAPMIS199410231242MureithiMWFinnAOtaMOZhangQDavenportVMitchellTJetalTcellmemoryresponsetopneumococcalproteinantigensinanareaofhighpneumococcalcarriageanddiseaseJInfectDis20092007839343ZhangQBagradeLBernatonieneJClarkeEPatonJCMitchellTJetalLowCD4TcellimmunitytopneumolysinisassociatedwithnasopharyngealcarriageofpneumococciinchildrenJInfectDis2007195119420244KodamaHFadenHHarabuchiYKatauraABernsteinJMBrodskyLCellularimmuneresponseofadenoidalandtonsillarlymphocytestotheP6outermembraneproteinofnontypeableHaemophilusinfluenzaeanditsrelationtootitismediaActaOtolaryngol19991193778345MattilaPSNykanenAElorantaMTarkkanenJAdenoidsprovideamicroenvironmentforthegenerationofCD4CD45ROLselectinCXCR4CCR5TlymphocytesalymphocytephenotypefoundinthemiddleeareffusionIntImmunol20001212354346ForseniMHanssonGKBaggerSjobackDHultcrantzMInfiltrationofimmunocompetentcellsinthemiddleearduringacuteotitismediaatemporalstudyAmJOtol199920152747SkotnickaBStasiakBarmutaAHassmannPoznanskaEKasprzyckaELymphocytesubpopulationsinmiddleeareffusionsflowcytometryanalysisOtolNeurotol2005265677148ZaghouaniHHoemanCMAdkinsBNeonatalimmunityfaultyThelpersandtheshortcomingsofdendriticcellsTrendsImmunol2009305859149AdkinsBLeclercCMarshallClarkeSNeonataladaptiveimmunitycomesofageNatRevImmunol200445536450SiegristCANeonatalandearlylifevaccinologyVaccine20011933314651TuWChenSSharpMDekkerCManganelloAMTongsonECetalPersistentandselectivedeficiencyofCD4TcellimmunitytocytomegalovirusinimmunocompetentyoungchildrenJImmunol20041723260752KleinNPGansHASungPYasukawaLLJohnsonJSarafanovAetalPreterminfantsTcellresponsestoinactivatedpoliovirusvaccineJInfectDis20102012142253GeigerRDuhenTLanzavecchiaASallustoFHumannaiveandmemoryCD4TcellrepertoiresspecificfornaturallyprocessedantigensanalyzedusinglibrariesofamplifiedTcellsJExpMed200920615253454UphamJWRateARoweJKuselMSlyPDHoltPGDendriticcellimmaturityduringinfancyrestrictsthecapacitytoexpressvaccinespecificTcellmemoryInfectImmun20067411061255BluestoneCDStephensonJSMartinLMTenyearreviewofotitismediapathogensPediatrInfectDisJ199211S71156LuotonenJHervaEKarmaPTimonenMLeinonenMMakelaPHThebacteriologyofacuteotitismediainchildrenwithspecialreferencetoStreptococcuspneumoniaeasstudiedbybacteriologicalandantigendetectionmethodsScandJInfectDis1981131778357BerkleyJALoweBSMwangiIetalBacteremiaamongchildrenadmittedtoaruralhospitalinKenyaNEnglJMed2005352394758DennyFWLodaFAAcuterespiratoryinfectionsaretheleadingcauseofdeathinchildrenindevelopingcountriesAmJTropMedHyg1986351259HuangSSPlattRRifasShimanSLPeltonSIGoldmannDFinkelsteinJAPostPCV7changesincolonizingpneumococcalserotypesin16Massachusettscommunities2001and2004Pediatrics2005116e408e41360KadiogluAWeiserJNPatonJCAndrewPWTheroleofStreptococcuspneumoniaevirulencefactorsinhostrespiratorycolonizationanddiseaseNatRevMicrobiol2008628830161PatonJCAndrewPWBoulnoisGJMitchellTJMolecularanalysisofthepathogenicityofStreptococcuspneumoniaetheroleofpneumococcalproteinsAnnuRevMicrobiol1993478911562OgunniyiADGrabowiczMMahdiLKetalPneumococcalhistidinetriadproteinsareregulatedbytheZn2dependentrepressorAdcRandinhibitcomplementdepositionthroughtherecruitmentofcomplementfactorHFASEBJ200923731863AdamouJEHeinrichsJHErwinALetalIdentificationandcharacterizationofanovelfamilyofpneumococcalproteinsthatareprotectiveagainstsepsisInfectImmun2001699495864GarciaPGonzalezMPGarciaELopezRGarciaJLLytBanovelpneumococcalmureinhydrolaseessentialforcellseparationMolMicrobiol19993112758165RosenowCRyanPWeiserJNetalContributionofnovelcholinebindingproteinstoadherencecolonizationandimmunogenicityofStreptococcuspneumoniaeMolMicrobiol1997258192966GloverDTHollingsheadSKBrilesDEStreptococcuspneumoniaesurfaceproteinPcpAelicitsprotectionagainstlunginfectionandfatalsepsisInfectImmun20087627677667WalkerJAAllenRLFalmagnePJohnsonMKBoulnoisGJMolecularcloningcharacterizationandcompletenucleotidesequenceofthegeneforpneumolysinthesulfhydrylactivatedtoxinofStreptococcuspneumoniaeInfectImmun1987551184968MusherDMPhanHMBaughnREProtectionagainstbacteremicpneumococcalinfectionbyantibodytopneumolysinJInfectDis20011838273069PichicheroMEKaurRCaseyJRXuQAlmudevarAOchsMAntibodyResponsetoStreptococcuspneumoniaeVaccineTargetsPhtDLytBPcpAPhtEandPlyD1AfterNasopharyngealColonizationandAcuteOtitisMediainChildren10thInternationalSymposiumonRecentAdvancesinOtitisMediaNewOrleansLAUSAAbstractJ03page105June59201170PeltonSILeibovitzERecentadvancesinotitismediaPediatrInfectDisJ200928S133S13771PichicheroMECaseyJRHobermanASchwartzRPathogenscausingrecurrentanddifficulttotreatacuteotitismedia20032006ClinPediatr200847901672FreijdAHammarstromLPerssonMASmithCIPlasmaantipneumococcalantibodyactivityoftheIgGclassandsubclassesinotitispronechildrenClinExpImmunol198456233873PrellnerKKalmOPedersenFKPneumococcalantibodiesandcomplementduringandafterperiodsofrecurrentotitisIntJPediatrOtorhinolaryngol19847394974HotomiMYamanakaNSaitoTetalAntibodyresponsestotheoutermembraneproteinP6ofnontypeableHaemophilusinfluenzaeandpneumococcalcapsularpolysaccharidesinotitispronechildrenActaOtolaryngol1999119703775YamanakaNFadenHAntibodyresponsetooutermembraneproteinofnontypeableHaemophilusinfluenzaeinotitispronechildrenJPediatr1993122212876YamanakaNFadenHLocalantibodyresponsetoP6ofnontypableHaemophilusinfluenzaeinotitisproneandnormalchildrenActaOtolaryngol1993113524977BernsteinJMBronsonPMWilsonMEImmunoglobulinGsubclassresponsetomajoroutermembraneproteinsofnontypableHaemophilusinfluenzaeinchildrenwithacuteotitismediaOtolaryngolHeadNeckSurg19971163637178GiebinkGSMillsELHuffJSCatesKLJuhnSKQuiePGPolymorphonuclearleukocytedysfunctioninchildrenwithrecurrentotitismediaJPediatr19799413879FreijdAOxeliusVARynnelDagooBAprospectivestudydemonstratinganassociationbetweenplasmaIgG2concentrationsandsusceptibilitytootitismediainchildrenScandJInfectDis1985171152080VeenhovenRRijkersGSchilderAetalImmunoglobulinsinotitispronechildrenPediatrRes2004551596281BermanSLeeBNussRRoarkRGiclasPCImmunoglobulinGtotalandsubclassinchildrenwithorwithoutrecurrentotitismediaJPediatr19921212495182SharmaSKaurRCaseyJRPichicheroMELackofGenerationofTCellMemorytoPneumococcalandHaemophilusinfluenzaeProteinsinEarlyChildhoodExplainsImmunologicSusceptibilitytotheOtitisProneCondition83PrellnerKHarstenGLofgrenBChristensonBHeldrupJResponsestorubellatetanusanddiphtheriavaccinesinotitisproneandnonotitispronechildrenAnnOtolRhinolLaryngol1990996283284WiertsemaSPSandersEAVeenhovenRHetalAntibodylevelsafterregularchildhoodvaccinationsintheimmunologicalscreeningofchildrenwithrecurrentotitismediaJClinImmunol2004243546085BreukelsMARijkersGTVoorhorstOginkMMZegersBJSandersLAPneumococcalconjugatevaccineprimesforpolysaccharideinducibleIgG2antibodyresponseinchildrenwithrecurrentotitismediaacutaJInfectDis19991791152686BarnettEDPeltonSICabralHJetalImmuneresponsetopneumococcalconjugateandpolysaccharidevaccinesinotitisproneandotitisfreechildrenClinInfectDis199929191287PichicheroMEKaurRCaseyJRSabirovAKhanMNAlmudevarAAntibodyResponsetoHaemophilusinfluenzaeOuterMembraneProteinDP6andOMP26AfterNasopharyngealColonizationandAcuteOtitisMediainChildrenVaccine20102871849288RapolaSKilpiTLahdenkariMMakelaPHKayhtyHAntibodyresponsetothepneumococcalproteinspneumococcalsurfaceadhesinAandpneumolysininchildrenwithacuteotitismediaPediatrInfectDisJ200120482789SoininenALahdenkariMKilpiTMakelaPHKayhtyHAntibodyresponsetopneumococcalcapsularpolysaccharidesinchildrenwithacuteotitismediaPediatrInfectDisJ2002211869290SoininenAPursiainenHKilpiTKayhtyHNaturaldevelopmentofantibodiestopneumococcalcapsularpolysaccharidesdependsontheserotypeassociationwithpneumococcalcarriageandacuteotitismediainyoungchildrenJInfectDis20011845697691ZhangQBernatonieneJBagradeLetalSerumandmucosalantibodyresponsestopneumococcalproteinantigensinchildrenrelationshipswithcarriagestatusEurJImmunol200636465792ObaroSKAdegbolaRATharpeJAetalPneumococcalsurfaceadhesinAantibodyconcentrationinserumandnasopharyngealcarriageofStreptococcuspneumoniaeinyoungAfricaninfantsVaccine200019411293HolmlundESimellBJaakkolaTetalSerumantibodiestothepneumococcalsurfaceproteinsPhtBandPhtEinFinnishinfantsandadultsPediatrInfectDisJ200726447994HolmlundEQuiambaoBOllgrenJetalAntibodiestopneumococcalproteinsPhtDCbpAandLytCinFilipinopregnantwomenandtheirinfantsinrelationtopneumococcalcarriageClinVaccineImmunol2009169162395CaseyJRAdlowitzDGPichicheroMENewpatternsintheotopathogenscausingacuteotitismediasixtoeightyearsafterintroductionofpneumococcalconjugatevaccinePediatrInfectDisJ201029304996SharmaSKCaseyJRPichicheroMEReducedmemoryCD4TCellgenerationinthecirculationofyoungchildrenmaycontributetotheOtitisProneConditionJInfectDis2011"