"試料中のハプトグロビン濃度の定量アッセイ法において、iヘモグロビンをアッセイ対象の前記試料と混合して、前記試料中に存在するハプトグロビンでハプトグロビン-ヘモグロビン複合体を形成させるステップと、ii過酸化水素が試薬から生成され、存在する前記ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性の基質を形成し、緩衝液のpHが、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシジス活性が実質的に抑制されるには十分に低いが過酸化水素の生成が起こるには十分に高い範囲内であるという条件下で、前記緩衝液の存在下で、ステップiの生成物を、過酸化水素を生成する前記試薬と、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする1種又は複数種の色原体とに接触させるステップと、iii前記反応混合物の光学的性質における変化を測定することによって、前記ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性を定量するステップと、iv前記ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシジス活性のレベルを前記試料中のハプトグロビンの量と関連づけるステップとを含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1に記載のアッセイ法において、ステップi及びステップiiが同時に実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項1又は2に記載のアッセイ法において、前記アッセイがpH3.9~pH4.5の範囲のpHで実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項3に記載のアッセイ法において、前記アッセイがpH4~pH4.5の範囲のpHで実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項4に記載のアッセイ法において、前記アッセイがpH4.1で実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至5の何れか1項に記載のアッセイ法において、過酸化水素を生成する前記試薬が、反応生成物として過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を、前記酵素の基質とともに含むことを特徴とするアッセイ法。請求項6に記載のアッセイ法において、過酸化水素を生成する前記試薬が酵素グルコースオキシダーゼ及び基質グルコースを含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至7の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記色原体が、ペルオキシジス活性が存在する場合に分光学的に検出することができる色変化をすることを特徴とするアッセイ法。請求項8に記載のアッセイ法において、前記色原体が、フェノール、4-ヨードフェノール、3-アミノフェノゾン、8-アニリノナフタレンスルホン酸ANS、4-アミノアンチピリンAAP、2-アミノ-4-ヒドロキシベンゼンスルホン酸AHBS、テトラメチルベンジジンTMB、O‐フェニレンジアミン二塩酸塩、O-ジアニシジン、ナトリウム-2-ヒドロキシ-3,5-ジクロロベンゼンスルホナート及び2,2’-アジノ-ジ3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸ABTS又はこれらの混合物を含むことを特徴とするアッセイ法。請求項9に記載のアッセイ法において、前記色原体が、フェノールと8-アニリノナフタレンスルホン酸ANSと4-アミノアンチピリンとの組合せを含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至10の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記アッセイが、前記試料中のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための1種又は複数種の追加の試薬の存在下で実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項11に記載のアッセイ法において、前記1種又は複数種の追加の試薬が、タンパク質結合阻害剤、ジスルフィド結合を抑える効果のある還元剤及びカオトロピック剤又はこれらの混合物から選択されることを特徴とするアッセイ法。請求項12に記載のアッセイ法において、前記タンパク質結合阻害剤が8-アニリノナフタレンスルホン酸ANS、プロトポリリン、ビリルビン、タウロデオキシコール酸胆汁塩、ジクマロール又は2-メルカプトベンゾチアゾールを含むことを特徴とするアッセイ法。請求項12又は13に記載のアッセイ法において、前記還元剤が、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、4,4’-ジチオピリジン又は5,5’-ジチオ2-ニトロ安息香酸を含むことを特徴とするアッセイ法。請求項12乃至14の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記カオトロピック剤が、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム又は塩化ナトリウムを含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至15の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記アッセイ混合物が界面活性剤をさらに含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至16の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記アッセイ混合物が抗菌剤をさらに含むことを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至17の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記アッセイがアッセイ対象の前記試料と第1の反応混合物及び第2の反応混合物との混合物を形成することによって実施されることを特徴とするアッセイ法。請求項18に記載のアッセイ法において、前記第1の試薬混合物が、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素を含み、前記第2の試薬混合物が、1種又は複数種の色原体及び前記第1の混合物の前記酵素の基質を含むことを特徴とするアッセイ法。請求項19に記載のアッセイ法において、前記1種又は複数種の色原体が前記第1の反応混合物中に含まれることを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至20の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記アッセイを実施するために、構成成分としての前記アッセイ試薬の一部又は全部を乾燥形態で組み合わせ、次いで前記水性試料に添加することを特徴とするアッセイ法。請求項21に記載のアッセイ法において、前記アッセイ試薬の組合せが、溶液で調製され、固体表面上に凍結乾燥されることを特徴とするアッセイ法。請求項22に記載のアッセイ法において、前記固体表面が紙又はアッセイスティックであることを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至23の何れか1項に記載のアッセイ法において、前記ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性レベルが、既知のハプトグロビン濃度を使用して作成した標準曲線を参照して、前記試料中のハプトグロビン量と関連づけられることを特徴とするアッセイ法。請求項1乃至24の何れか1項に記載のハプトグロビンアッセイで使用するためのキットにおいて、ヘモグロビン、過酸化水素を生成する試薬、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に光学的に検出可能な変化をする1種又は複数種の色原体及び緩衝液を含むことを特徴とするキット。実質的に本明細書に記載されている通りのアッセイ法。実質的に本明細書に記載されている通りのキット。本発明によるアッセイ法は、任意の動物の、血漿又は血清などの血液試料で好適に実施することができる。或いは、アッセイで使用する試料は、腹腔液、滑液、脳脊髄液乳汁などの他の生体液を含んでもよい。一実施形態では、試料はヒトを含む哺乳動物から得ることができる。一実施形態では、試料中のハプトグロビン濃度は0.02mg/ml~1.4mg/mlの範囲である。本発明によるアッセイ法で使用するヘモグロビンは、アッセイ用の試料を得るのと同じ動物から得てもよいし、異なる種から得てもよい。一実施形態では、ヘモグロビンはメト-ヘモグロビンである。本発明によるアッセイ法において、試料中のハプトグロビン及び添加されたヘモグロビンは一緒に反応してハプトグロビン-ヘモグロビン複合体を形成する。一実施形態では、アッセイ反応混合物は、20分まで、例えば5~20分間インキュベートされる。本発明の方法によるハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の形成は、反応混合物の光学的性質の変化を測定することで、複合体のペルオキシダーゼ活性を定量することによって検出される。その後、ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性のレベルは、試料中のハプトグロビンの量と関連づけることができる。本発明によるアッセイ法では、ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性は、アッセイ中にinsituで過酸化水素を生成して複合体のペルオキシダーゼ活性の基質を形成し、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする色原体を使用してペルオキシダーゼ活性を検出することによって定量される。本発明に従って使用するための過酸化水素を生成する試薬は、反応生成物として過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を、その酵素の基質とともに、好適には含む。本発明の一実施形態では、過酸化水素を生成する試薬は、酵素グルコースオキシダーゼ及び基質グルコースを含む。当然ながら、アッセイ中にinsituで過酸化水素を生成するために、他の好適な酵素/基質の組合せを使用することができる。当該技術分野において慣用の、過酸化水素を生成する任意の酵素/基質の組合せ、例えばコレステロール/コレステロールオキシダーゼ又は尿素/尿素オキシダーゼなどを使用することができる。ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光学的に検出可能な変化をする色原体は当該技術分野において周知であり、例えば、上記の欧州特許第1031035B1号明細書に記載されている。ヘモグロビン濃度の検査用として当該技術分野において公知の任意の発色基質を、本発明によるアッセイで好都合には使用することができる。一実施形態では、本発明によるアッセイのヘモグロビン-ハプトグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性は、ペルオキシダーゼ活性が存在する場合に分光光度的に検出できる色変化をする、以下の色原体を使用して定量される。例えばフェノール、4-ヨードフェノール、3-アミノフェノゾンaminophenozone、8-アニリノナフタレンスルホン酸ANS、4-アミノアンチピリンAAP、2-アミノ-4-ヒドロキシベンゼンスルホン酸AHBS、テトラメチルベンジジンTMB、O‐フェニレンジアミン二塩酸塩、O-ジアニシジン、ナトリウム-2-ヒドロキシ-3,5-ジクロロベンゼンスルホナート、2,2’-アジノ-ジ3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸ABTS又はこれらの混合物などである。一実施形態では、本発明によるアッセイで使用する発色基質は、フェノールと8-アニリノナフタレンスルホン酸ANSと4-アミノアンチピリンとの組合せを含む。検出可能な色変化は、当該技術分野において慣用の種々の濃度範囲で存在する色原体によって検出することができる。ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性とinsituで過酸化水素を生成する試薬の活性の双方ともpH依存的であり、したがって、本発明が取り組む課題は、双方の活性が有効であるpH範囲を見出すことである。複合体を形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が低pHで不活化できることは、当該技術から既知である。Jpn.JVet.Sci,44,p15~211982で報告されているように、この活性は、pH4.1で不活化することができる。しかし、遊離ヘモグロビンから発生するペルオキシダーゼ活性はかかるpHで残存することがあると示唆されており、上記の欧州特許第1031035B1号明細書に記載されているアッセイは、好ましくはpH4.1未満、特にpH3.8で実施される。しかし、本発明者らは、pH3.9~4.5の範囲の緩衝液の存在下で本発明のアッセイ法を実施することによって、アッセイ混合物中に残存する、複合体を形成していない任意のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が、insituでの過酸化水素の生成を阻害することなく、実質的に抑制されうることを発見した。一実施形態では、本発明によるアッセイ法はpH4~4.5の範囲の緩衝液の存在下で実施される。特定の実施形態では、本発明のアッセイ法はpH4.1で実施される。当該技術分野において慣用の、任意の緩衝液を使用して、アッセイ用に所望するpHを維持することができる。好都合には、混合したクエン酸-リン酸緩衝液を使用することができる。これはリン酸緩衝液pH7.4とクエン酸緩衝液pH3.8とが所望のpHに滴定されているものである。欧州特許第1031035B1号明細書から、血液試料中に存在するアルブミン及び他のタンパク質が、ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の本来のペルオキシダーゼ活性に依拠するハプトグロビンアッセイに対して望ましくないペルオキシダーゼ効果を及ぼすことが知られている。したがって、一実施形態では、本発明のアッセイ法は、試料中の任意のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための1種又は複数種の追加の試薬の存在下で実施される。当然ながら、かかる追加の1種又は複数種の試薬は、ハプトグロビン-ヘモグロビン複合体の形成を実質的に阻害するには不十分な量で添加されることになろう。試料中の任意のアルブミン又は他のタンパク質によるペルオキシダーゼ効果を低減するための好適な追加の試薬は、欧州特許第1031035B1号明細書に記載されている通りであり、例えば、タンパク質結合阻害剤、ジスルフィド結合を抑える効果のある還元剤及びカオトロピック剤を含む。一実施形態では、追加の1種又は複数種の試薬は濃度0.1~0.5mMで存在することができる。一実施形態では、本発明によるアッセイ法は、8-アニリノナフタレンスルホン酸ANS、プロトポリリンprotoporhyrin、ビリルビン、タウロデオキシコール酸胆汁塩、ジクマロール又は2-メルカプトベンゾチアゾールなどのタンパク質結合阻害剤の存在下で実施される。別の実施形態では、ジスルフィド結合を抑える効果のある追加の還元剤は、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、4,4’-ジチオピリジン又は5,5’-ジチオ2-ニトロ安息香酸から選択される。別の実施形態では、本発明によるアッセイ法は、塩酸グアニジン、チオシアン酸カリウム又は塩化ナトリウムなどの好適なカオトロピック剤の存在下で実施される。本発明によるアッセイは、好適には、溶液中の他の構成成分を維持するのを助けるために界面活性剤をさらに含む。一実施形態では、界面活性剤は、アッセイ混合物に、低濃度で、好適には0.3v/vまでの量で添加される。使用することができる好適な界面活性剤には、当該技術分野において慣用の非イオン界面活性剤及びイオン界面活性剤が含まれる。一実施形態では、アッセイ混合物に添加するための界面活性剤には、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシレンソルビトールエステル例えばTween商標20、40、60、80、ポリオキシエチレンアルコール例えばBrij商標35,36又はこれらの混合物などが含まれる。別の実施形態では、界面活性剤は、1種又は複数種のイオン界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム又はセトリミドなどを含む。当然ながら、色原体における分光学的に検出可能な変化がアッセイの開始前に発生しないという条件で、アッセイ試薬は任意の順序で一緒に添加することができる。例えば、試薬を種々の安定した組合せで予め混合し、試料と一緒にしてアッセイを実施することができる。抗菌剤を、試薬又は試薬混合物のうち1種又は複数種とともに含めて、防腐剤として作用させることができる。好適な成分には、例えば、トリクロサン又はチオメルサラートが含まれる。一実施形態では、第1の試薬混合物及び第2の試薬混合物が用意され、アッセイは、アッセイ対象試料と第1の試薬混合物及び第2の試薬混合物との混合物を形成することによって実施される。一実施形態では、第1の試薬混合物は、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素を含み、第2の試薬混合物は、1種又は複数種の色原体及び第1の混合物の酵素の基質を含む。好適には、酵素はグルコースオキシダーゼを含み、酵素の基質はグルコースを含む。別の実施形態では、1種又は複数種の色原体は、第1の試薬混合物中に、ヘモグロビン、及び過酸化水素を反応生成物として生成する反応を触媒する酵素とともに含まれる。一実施形態では、アッセイを実施するために、構成成分としてのアッセイ試薬の一部又は全部を乾燥形態で組み合わせ、次いで水性試料に添加することができる。好適には、アッセイ試薬の組合せは、溶液で調製され、紙又はアッセイスティックなどの固体表面上に凍結乾燥させることができる。このような乾燥形式は、保管及び携帯に特に便利であり、これは試薬の1つとして過酸化水素が必要である場合には実現することができないため、従来技術の方法と比較すると本発明の方法にとって顕著な利点である。本発明によるアッセイ法において定量した、形成したハプトグロビン-ヘモグロビン複合体のペルオキシダーゼ活性レベルは、既知のハプトグロビン濃度を使用して作成した標準曲線を参照して、試料中のハプトグロビン濃度と関連づけることができる。本発明による方法で使用するキットは、好適には、既知のハプトグロビン濃度を伴う血清の標準物などのさらなる構成成分を含むことができる。一実施形態では、本発明によるアッセイ法は、試験管又はマイクロタイタープレートなどの器具を使用して好適に実施することができる。別法として、アッセイは生化学自動分析装置を使用して実施することができる。本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、単語含むcomprise及び含有するcontain並びにこれらの単語の変化形、例えば含むcomprising及び含むcomprisesは、含むがそれらに限定されないを意味し、他の部分、添加物、構成成分、整数又はステップを排除するものではない。本明細書の記載及び特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味が要求されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、文脈上他の意味が要求されない限り、本明細書は単数形のみならず複数形も企図しているものと理解されるべきである。本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して説明される通りとする場合がある。本発明の他の特徴は以下の実施例から明らかになるであろう。概して、本発明は、本明細書添付の特許請求の範囲及び図面のいずれも含むに開示する特徴の、任意の新規な1つ、又は任意の新規な組合せにも適用される。したがって、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と関連して記載する特徴、整数、特性、化合物、化学的部分又は化学基は、本明細書に記載する任意の他の態様、実施形態又は実施例と矛盾するものではない限り、これらに適用可能であると理解されるべきである。さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示するいずれの特徴も、同一の又は同様の目的にかなう代替の特徴で置き換えることができる。以下に、本発明を、以下の非限定的実施例を参照しながらさらに例示することにする。以下の溶液及び一般的な手順を使用した。ストック溶液:試薬A:ヘモグロビン及びグルコースオキシダーゼリン酸緩衝液0.05MpH7.4マキムラMakimura及びススキSusuki、1982.JapJVetSci44:15~21に従って調製した、ウマヘモグロビン30mg/mlの超純水溶液グルコースオキシダーゼSigma10mg/mlのリン酸緩衝溶液試薬B:色原体/グルコースストック溶液:クエン酸緩衝液0.5M、pH3.8リン酸緩衝液0.05M、pH7.4塩化ナトリウム0.15M、1v/vtween20生理食塩水/tween4-アミノアンチピリンAAP158mMの生理食塩水/tween溶液8-アニリノ-1-ナフタリンnaphthalineスルホン酸ANS33mMの生理食塩水/tween溶液フェノール1.1Mの生理食塩水/tween溶液ジチオトレイトールDTT65mMの生理食塩水/tween溶液システインCys129.65mMの生理食塩水/tween溶液グルコースGlu0.5Mのリン酸緩衝溶液試料ブランクとしての水陰性対照血清としてのウシ胎仔血清FCSSigma陰性対照としてのウシ血清アルブミン2w/vBSASigmaハプトグロビンを1.4mg/mlで含むウシ血清ウシ及びイヌの血清試料。手順開発中、原理実証及びアッセイ試薬の最適化のために、手順をマイクロタイタープレートのウェルにて室温で行い、10分後又は20分後に吸光度をELISAプレートリーダーUltrastar、BMGLabtechにて600nmで測定した。その後、生化学自動分析装置MIRA、Roche又はPrestige分析装置TriodiagnosticLtdにて37°Cで開発を実施した。実施例1:マイクロタイタープレートにて試薬Aウマヘモグロビンストック溶液のアリコート50μlをリン酸緩衝液25mlに添加した。グルコースオキシダーゼストック溶液1.25mlを、希釈したヘモグロビン溶液10mlに添加した。試薬Bi1Tween20含有クエン酸緩衝液pH3.8、1.0mlに、AAP0.01ml、フェノール0.02ml、ANS0.03ml、DTT0.006mlを添加した。試薬Biiリン酸緩衝液pH7.4、1.0mlに、AAP0.01ml、フェノール0.02ml、ANS0.03ml、DTT0.006mlを添加した。作業用試薬B試薬Bi1mlを試薬Bii1mlと混合し、0.5Mグルコースのリン酸緩衝溶液0.56mlを添加した。試料6μlをウェルに入れ、次いでヘモグロビン/グルコースオキシダーゼ試薬A100μl及び色原体試薬B100μlを入れ、10分間室温でインキュベートし、吸光度をELISAリーダーにて595nmで測定した。得られた結果を下の表1に示す。血清中のハプトグロビンは反応して暗青色を呈し、FCS及び水の反応は最小限であった。実施例2還元剤としてのDTTとCysとの比較DTTは試薬混合物中で最も不安定であるとして知られる。SS二重結合を還元することができる代替の試薬がハプトグロビンアッセイの安定性を高めることになろう。バックグラウンドのペルオキシジス活性の阻害におけるシステイン及びDTTの効力を比較する実験において、試料4μlをウェルに入れ、次いでヘモグロビン/グルコースオキシダーゼ試薬A75μl及び色原体BiDTT又はBiiCys75μlを入れ、30分間室温でインキュベートし、吸光度をELISAリーダーにて600nmで測定した。作業用溶液作業用試薬Aリン酸緩衝液2.5mlに、ヘモグロビン5μl及びグルコースオキシダーゼ溶液30μlを添加した。作業用試薬BiDTTクエン酸緩衝液10mlリン酸緩衝液10mlpH4.1次いで、混合緩衝液1mlにつき、以下を添加:0.01mlAAP0.03mlANS0.02mlフェノール0.006mlDTT0.25mlGlu作業用試薬BiiCysクエン酸緩衝液10mlリン酸緩衝液10mlpH4.1次いで、混合緩衝液1mlにつき、以下を添加:0.01mlAAP0.03mlANS0.02mlフェノール0.012mlCys0.25mlGlu得られた結果を以下の表2に示す。この結果は、バックグラウンドのペルオキシダーゼ活性を阻害するためにシステインを還元剤として使用することは、DTTと同様に効果があることを示している。実施例3:pH最適化apH3.9~4.5pHを変化させることによる、ハプトグロビン反応に対する効果をマイクロタイタープレートアッセイで定量した。試薬Bの緩衝液を、クエン酸緩衝液とリン酸緩衝液とを下記表3の通り混合し、還元剤としてDTTを伴う実施例2におけるBiDTTのような他の化学物質を添加することによって調製した。緩衝液混合物B2~B5のpHを、全ての化学物質を添加した後で定量した。試料5μlをウェルに入れ、次いでヘモグロビン/グルコースオキシダーゼ試薬Aを90μl、及び色原体B3~B6を90μl入れ、20分間室温でインキュベートし、吸光度をELISAリーダーにて600nmで測定した。得られた結果を下の表4に示す。この結果から、pH4.1及び4.4でハプトグロビンの反応性が最も高く、pH4.44でブランク及び陰性血清試料の反応性が最小限であることがわかる。bpH4.1~6.0表5に列挙した種々のpHの緩衝液B6~B10を、リン酸緩衝液pH7.4をクエン酸緩衝液pH3.8で滴定し、実施例2における試薬BiDTTと同様の試薬を添加することによって調製した。試料4μlをウェルに入れ、次いでヘモグロビン/グルコースオキシダーゼ試薬Aを75μl、及び色原体B2~B5を75μl入れ、30分間室温でインキュベートし、吸光度をELISAリーダーにて600nmで測定した。pH4.5を超えると反応が進行しないことがわかった。pH4.14及び4.5では反応があり、この試薬セットではpH4.14での反応の方が優位であった。実施例4自動分析マイクロタイタープレートにて最適化した試薬を、以下の方法に従い、生化学自動分析装置MIRA、Rocheにて使用した。試薬Aリン酸緩衝液0.05M、pH4.519mlに、ヘモグロビン溶液18μl及びグルコースオキシダーゼ溶液108μlを添加した。試薬B0.05Mリン酸緩衝液pH7.4、15mlを0.5Mクエン酸緩衝液pH3.8約5.3mlでpH4.14に滴定した。混合緩衝液1mlにつき以下の試薬を添加した。0.01mlAAP0.03mlANS0.02mlフェノール0.006mlCys0.25mlGluMIRA分析装置に、試薬Aを第1の試薬として入れ、試薬B12を添加すべき第2の試薬として入れた。アッセイパラメーターを次のように設定した。試料体積=0.0052ml第1の試薬A=0.09ml第2の試薬B12=0.09ml添加は第1の試薬、試料添加、試薬B12添加とすべきであり、サイクル1~1525秒おきにて600nmで測定すべきである。サイクル2とサイクル15の間350秒の600nmでの吸光度の変化を測定値ΔA600とする。試料:標準曲線の血清中Hp、1.4、0.7、0.35及び0g/L対照の生理食塩水、FCS、4w/vウシ血清アルブミンBSA試料:Hp濃度が上昇している血清得られた結果を表6に示す。アッセイ系に過酸化物を生成するためにグルコースオキシダーゼ及びグルコースを使用する試薬によってハプトグロビン標準値との線形曲線が得られ、結果が自動出力される。4アルブミン及びFCSで観察された明らかなハプトグロビンの低濃度はs残存するバックグラウンド活性及び分析において、ここで使用しているアッセイ法におけるように、これら4BSA又はFCSのいずれかをゼロ標準として使用することによって克服することができる。実施例5ハプトグロビンのドライケミストリー試験反応のために過酸化物を用意する必要がないため、試薬はドライケミストリー方式で使用可能である。乾燥前の試薬の相互作用を最小限にするために、試薬を順番に添加し、最後の試薬の添加後、直ちに凍結してから真空で乾燥した凍結乾燥。実施例1におけるものと同様の試薬A実施例1におけるものと同様の試薬B試薬A0.025mlを濾紙Biorad上に点状に配分し、風乾し、ポリ袋に入れてドライアイス上で60分間放置した。氷冷した試薬B0.025mlを、予め配分した試薬Aの上に点状に配分し、再びポリ袋に入れてドライアイス上で30分間放置した。濾紙を凍結乾燥器中に一晩放置した。ハプトグロビンを0.74及び0.35g/l実施例4で使用した標準1.4g/lの1:2及び1:4希釈物で含むウシ血清0.01ml並びに5g/l及び2.5g/lのBSAを、乾燥した点の上につけ、約5分間インキュベートして顕色をスキャニングによって記録した。この新たな試薬は、濾紙上に乾燥した場合、ハプトグロビンを含有する試料をつけると5分で濃青/紫に反応したが、BSAでは陰性反応を示した。実施例6最適化した湿式化学アッセイウシ試料試薬濃度の調節を必要とするさらなる最適化試験を、試薬A中にアミノアンチピリンを加えて実施した。PrestigeTriodiagnosticLtd生化学分析装置を使用してウシ血清試料中のハプトグロビンを定量した。試薬A:ヘモグロビン/グルコースオキシダーゼ/アミノアンチピリン脱イオン水中に以下を溶解:塩化ナトリウムSigma0.154MグルコースオキシダーゼSigma0.6mg/ml105U/mlウマヘモグロビン0.26mg/ml4-アミノアンチピリンSigma3.1mMトリクロサンFluka0.0001v/v試薬B脱イオン水中に以下を溶解、pH4.1クエン酸Sigma0.06Mリン酸水素二ナトリウムFluka0.08MグルコースSigma0.5MTween20Sigma1v/vフェノールSigma0.02M8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸Fluka1.5mML-システインSigma0.82mMトリクロサンFluka0.0001v/vPrestige分析装置プロトコル:試料:4μl希釈用水:10μl試薬1=A2:200μl試薬2=B13:90μlブランク:正常なウシ血清キャリブレーター:正常なウシ血清中1.48g/L、0.74g/L、0.37g/L、0.19g/L、0.048g/Lのハプトグロビン計算方法:Logit2得られた結果を表7に示す。試料1~5は急性期反応中の仔ウシ由来のものである。実施例7最適化した湿式化学アッセイイヌ試料実施例6におけるものと同様の試薬をPentra400HoribaAbxLtd分析装置で使用し、イヌ血清試料中のハプトグロビンを定量した。試料を1:10に希釈してから0.9w/vNaCl中で二重反復試験にて分析した。得られた結果は、希釈に対して調整する計算をした後のものであり、二重反復試験の平均値である。Pentra分析装置プロトコル:試料:7.5ul希釈用水:5ul試薬1=A2:150ul試薬2=B13:60ulブランク及びキャリブレーター希釈液CalibratorDiluent:2w/vウシ血清アルブミンBSA塩化ナトリウムSigma0.154MBSAFracVSigma20.0g/LトリクロサンFluka0.0001v/vキャリブレーター:キャリブレーター希釈液中1.48g/L、0.74g/L、0.37g/L、0.19g/Lに希釈したハプトグロビン計算方法:Logit/Log4得られた結果を表8に示す。試料6~7は健常なイヌにおいて見られる範囲のハプトグロビンを有するイヌ由来のものであり、試料8~9は炎症状態又は感染症状態のイヌ由来のものである。"