アセチル化および非アセチル化タンパク質を含む未精製物をマルチモードクロマトグラフィー支持体に適用するステップ、およびpHを変化させて溶出を行うステップを含み、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法。前記マルチモードクロマトグラフィー支持体が、疎水性基および陰イオン交換基を含む、請求項1に記載の方法。前記マルチモードクロマトグラフィー支持体の疎水性基が、芳香族基、複素芳香族基または非芳香族疎水性基を含む、請求項2に記載の方法。前記疎水性基が、ヘキシル基、ブチル基、フェニル基またはエーテル基である、請求項2に記載の方法。前記マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基が、強力な陰イオン交換体である、請求項2に記載の方法。前記マルチモードクロマトグラフィー支持体が、Captoadhereである、請求項1に記載の方法。前記未精製物が、pH6~7の間で適用される、請求項1に記載の方法。前記未精製物が、細胞由来である、請求項1に記載の方法。前記未精製物が、原核細胞由来である、請求項1に記載の方法。前記溶出のためのpH変化が、段階的であるまたは勾配を有する、請求項1に記載の方法。pH変化が、3~7の間で実施される、請求項1に記載の方法。前記溶出のpH変化が、30~55の間で実施される、請求項1に記載の方法。前記溶出が、酢酸およびアンモニウムを含む溶液で行われる、請求項1に記載の方法。インスリン、ソマトトロピン、インターロイキン、インターフェロンまたはソマトメジンの精製において使用される、請求項1に記載の方法。発現系から生産され、可溶化されおよびリフォールディングされたインターフェロンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、当該インターフェロンがアセチル化形態および非アセチル化形態を含むステップ、およびステップで得られたインターフェロンを、本明細書で言及した非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に供して、非アセチル化形態のインターフェロンを得ることができるステップ、を含む、発現系で生産された組み換えインターフェロンを精製してその非アセチル化形態を得る方法。前記インターフェロンがインターフェロンαである、請求項15に記載の方法。前記インターフェロンが、IFNα2aおよびIFNα2bである、請求項15に記載の方法。ステップにおいて可溶化されリフォールディングされた前記インターフェロンが、発現系における組み換えタンパク質生産によって得られた組み換えインターフェロンの不溶性体の可溶化と、その後得られたインターフェロンを酸化剤の存在下でリフォールディングすることによって得られる、請求項15に記載の方法。前記可溶化が、カオトロピック剤または洗浄剤などの可溶化剤で行われる、請求項18に記載の方法。前記カオトロピック剤が、尿素またはグアニジン塩酸塩である、請求項19に記載の方法。前記洗浄剤が、SDS、NアセチルトリメチルアンモニウムクロリドまたはNラウロイルサルコシンナトリウムである、請求項19に記載の方法。前記可溶化剤が、グアニジン塩酸塩である、請求項19に記載の方法。前記酸化剤が、ヨウ素またはヨードソベンゾエートである、請求項18に記載の方法。酸化剤が、oヨードソベンゾエートである、請求項18に記載の方法。本発明は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質の分離例えば、所望のアセチル化タンパク質の分離または微生物による組み換えタンパク質生産の間に生じたアセチル化バリアントの除去を、マルチモードクロマトグラフィーを用いる単純で時間を節約する方法を成功裏に開発する。本明細書において言及するすべての刊行物および特許文献は、例えば、記載された本発明に関連して使用され得る刊行物に記載された構成及び方法論を記載するおよび開示する目的で、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書で議論された刊行物は、単に本明細書の出願日前の開示を提供するにすぎない。本明細書のいかなる記載も、このような先行発明またはその他のいかなる理由により、発明者が特許を与えられないことを認めるものではない。本発明書において他に定義がない場合は、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるが、万一潜在的に不明瞭性がある場合には、本明細書で提供された定義が、辞書または付帯的ないかなる定義にも優先する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される際、単数形は、文脈上明らかに示されていない限りは、複数形を含む。用語組み換えタンパク質は、本明細書において使用される場合、比較的純粋な形態で回収することが望ましいタンパク質であると定義され、天然タンパク質およびそれらのアナログならびに置換、欠失、転換または修飾された配列を有する変異体のアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。用語組み換え発現ベクターは、DNA配列からタンパク質を発現するためのプラスミドもしくはファージもしくはウイルスまたはベクターのことをいう。発現ビヒクルは、遺伝子エレメントまたは遺伝子発現を制御する役割を有するエレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサー、mRNAへ転写およびタンパク質へ翻訳される構造領域またはコード領域、および、適切な転写開始配列および停止配列のアセンブリを含む転写ユニットを含む。用語翻訳後修飾は、翻訳後のタンパク質の化学的修飾を意味する。用語同時翻訳は、組み換えDNAにおいて生じるハイブリッドmRNA分子の翻訳を通じて、使用された臓器から分泌される正常タンパク質に共有結合する所望のタンパク質産物からなるハイブリッド分子の合成を意味する。用語形質転換は、DNAを生物に導入して、染色体外エレメントとしてまたは染色体に統合することによってDNAを複製可能とすることを意味する。用語形質移入は、コード配列が実際に発現しているかどうかに関わらず、適する宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。用語生物学的活性は、本明細書において使用される場合、例えば天然または非天然に発生する分子と類似または同一の、生命体における構造的、制御的、生化学的またはその他の生物学的機能を意味する。用語マルチモードクロマトグラフィー支持体は、結合する化合物と相互作用する、少なくとも二種の、異なるが同時に作用する部位を提供することができるものをいう。例えば、これらの部位のうちの一つが、リガンドと対象物質の電荷電荷相互作用の引力を有する型を提供し得る。他方の部位は、電子供与性受容性相互作用ならびにまたは疎水性およびもしくは親水性相互作用を提供し得る。電子供与性受容性相互作用には、水素結合、パイパイ、陽イオンパイ、電荷輸送、双極子双極子、誘起双極子などの相互作用が含まれる。マルチモードクロマトグラフィー支持体はまた、ミックスモード分離マトリクスとしても知られている。米国特許第7714112号は、液体サンプル中のその他の化合物から抗体を分離する方法に関している。当該方法においては、抗体が液体中で遊離したまま、前記サンプルを含む移動相はマルチモード分離マトリクスに接触して望ましくない化合物を吸着しており、マルチモード分離マトリクスは、標的化合物の負の電荷を有する部位と相互作用することができる第一の基、および、標的化合物と電荷電荷相互作用以外の少なくとも一種の相互作用をすることができる第二の基を含む。この先行技術文献は、参照として本明細書に組み込まれる。用語クロマトグラフィーは、分離方法に密接に関連する系統を包含する。クロマトグラフィーを他の大部分の物理的および化学的な分離方法と区別する特徴は、相互に混和しない二つの相が接触し、一方の層が固定され他方の層が移動するという点である。用語官能基は、本明細書において、標的分子または標的化合物と相互作用することができるという意味で官能性のある基または分子に対して使用される。用語溶出液は、当分野における通常の意味で使用される。用語インターフェロンは、ウイルス感染またはマイトジェンの曝露を含む様々な環境刺激に曝露された種々の真核細胞によって生産される分泌タンパク質の系統をいう。抗ウイルス特性を有することに加え、インターフェロンは広汎な細胞機能に影響を与えることが示されている。すべてのインターフェロンユニットは、本明細書において、WHO国際基準、94786および95650を参照として表される。本発明によると、インターフェロンにはコンセンサスインターフェロンおよびインターフェロン様産物が含まれる。。一態様において、本発明は、アセチル化タンパク質および非アセチル化タンパク質を含む未精製物をマルチモードクロマトグラフィー支持体に適用し、pHを変化させて溶出を行う工程を含む、アセチル化タンパク質を非アセチル化タンパク質から分離する方法を提供する。本発明によると、未精製物はアセチル化タンパク質および非アセチル化タンパク質を含む任意のものである。好ましくは、未精製物は、pH6と7の間で適用される。好ましくは、未精製物は細胞に由来する。さらに好ましくは、未精製物は原核細胞に由来する。本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離するために使用される。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、疎水性基および陰イオン交換基を含む。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、好ましくはクロマトグラフィーカラムで提供される。好ましくは、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、Captoadhereである。マルチモードクロマトグラフィーは、参照として全体が本明細書に組み込まれるKjellErikssonらJieChenetal2010JournalofChromatographyA1217pp216224、および米国特許第7714112号に開示されている。これらの先行技術文献においては、マルチモードクロマトグラフィーを使用して、モノクローナル抗体を分離している。これらの文献のいずれも、アセチル化タンパク質の分離においてマルチモードクロマトグラフィーを使用していない。一実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、液体クロマトグラフィーすなわち、マルチモードクロマトグラフィー支持体を含むクロマトグラフィーカラムを移動相が通過することによってにおいて使用される。支持体は、本質的に球状の粒子などの多孔質または非多孔質の粒子の形態、モノリス、フィルター、膜、表面、キャピラリーまたはその他の一般的に使用される任意の形式であり得る。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、拡張床クロマトグラフィーにおいて使用される。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体は、分離マトリクスを液体サンプルを含む管に加える、バッチ法において使用される。本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体の疎水性基は、芳香族基、複素芳香族基または非芳香族疎水性基を含む。好ましくは、疎水性基はヘキシル基、ブチル基、フェニル基またはエーテル基である。本発明によると、マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基は、強力な陰イオン交換体であり得る。この文脈において、用語強力な陰イオン交換体は、広汎なpH範囲内で電荷を有するままである基として理解される。より有利な実施形態において、強力な陰イオン交換基は、第四級アミンである。別の実施形態において、マルチモードクロマトグラフィー支持体の陰イオン交換基は弱いイオン交換体であり得る。この文脈において、用語弱い陰イオン交換体とは、あるpH値で電荷を有し、pHが変わることによって電荷を失い得る基を意味するものとして理解される。一実施形態において、アセチル化タンパク質を分離するために、サンプルがマルチモードクロマトグラフィー支持体に接触してアセチル化タンパク質が吸着され、次に、pH変化と共に溶出を行って、アセチル化タンパク質を支持体に保持する一方で非アセチル化タンパク質を溶出する。一実施形態において、第一ステップにおいて、アセチル化タンパク質を含むサンプルを、アセチル化タンパク質の支持体への吸着を可能にする条件下で、マルチモードクロマトグラフィー支持体を通過させる。支持体の容量を超えないよう注意を要する。次のステップにおいては、pH勾配下および非アセチル化タンパク質を溶出するその他の条件下で、マルチモードクロマトグラフィー支持体を使用して溶出を行う。本発明によると、溶出のためのpH変化は段階的または勾配を有する。好ましくは、pH変化は7~3の間で実施する。より好ましくは、投入されるタンパク質混合物は60~70のpH範囲であり、pH変化は55~30の間で行う。好ましい実施形態においては、溶出液は酢酸およびアンモニウムを含む。本発明によると、非アセチル化タンパク質を溶出するその他の条件は、一般的には塩濃度により提供される。クロマトグラフィーの一般的原理は、当分野においてよく知られており、この分野の当業者は、本発明の方法を使用するために必要なパラメーターを容易に選定することができる。好ましい実施形態において、必要であれば、一つまたは複数の洗浄ステップを、本発明の方法の任意のステップの前または間に適用し得る。本発明の方法によると、前記方法は、翻訳後アセチル化タンパク質、および発現系における組み換えタンパク質生産の同時翻訳の間に生じたアセチル化不純物の分離において使用され得る。好ましくは、本発明の方法は、インスリン、ソマトトロピン、インターロイキン、インターフェロンまたはソマトメジンの精製において使用され得る。一実施形態において、本発明の方法は、組み換えタンパク質の精製において使用され、それらからアセチル化形態を除去することができる。従って、本発明は、発現系から得られた組み換えタンパク質産物を精製する方法であって、iマルチモードクロマトグラフィー支持体に、発現系から得られ、リフォールディングされた組み換えタンパク質混合物を適用するステップ、および、iipH変化を伴う溶出を行い、本質的にアセチル化タンパク質を含まない組み換えタンパク質産物を得るステップを含む方法を提供する。好ましくは、発現系は、微生物、酵母または哺乳類の発現系である。さらなる実施形態において、本発明の方法は、組み換えインターフェロンを精製するために使用される。よって、本発明は、発現系から得られた組み換えインターフェロン産物を精製してそれらの非アセチル化形態を得る方法を提供し、当該方法は、発現系から生産され、可溶化およびリフォールディングされたインターフェロンを、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供するステップであって、インターフェロンがアセチル化形態および非アセチル化形態を含むステップ、およびステップで得られたインターフェロンを、本明細書で言及した非アセチル化タンパク質からアセチル化タンパク質を分離する方法に供して、非アセチル化形態のインターフェロンを得ることができるステップ、を含む。本発明によると、発現系においては、精製されるインターフェロンは、先行技術で開示された、アセチル化タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌または出芽酵母などの宿主細胞から得ることができる。さらに好ましくは、インターフェロンはインターフェロンαである。さらに好ましくは、インターフェロンはIFNα2aおよびIFNα2bである。不溶性部分を分離するために、組み換え宿主細胞を、遠心分離またはフィルター濾過とその後の従来技術を適用する破砕により、培養液から回収する。不溶性部分を、緩衝液で、好ましくはTris緩衝液で好ましくは洗浄する。一実施形態において、封入体を、Trisグアニジン塩酸緩衝液で洗浄する。本発明の方法によると、ステップにおいては、発現系で生産され、可溶化されリフォールディングされたインターフェロンを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供する。HICは、生体分子の分析分離および調製分離の両方において、強力な技術である。当該技術は、タンパク質表面に位置する疎水性領域に対して有利である。HICは困難な分離、特に不純物の等電点または分子量が類似している場合に適している。当該目的に適するクロマトグラフィーカラムは、種々の区分及び長さでよく、HIC樹脂は商業的に入手可能なものから選択される。タンパク質と吸着材料が接触する段階中のpHは、供給される溶液のpHである。本発明の方法によると、本発明の目的に適するHIC樹脂材料は、インターフェロンに疎水的に結合することができ、様々な商標下で商標的に入手可能であるものから選択される。好ましくは、HICカラムは、Toyopearlシリーズである。より好ましくは、HICカラムはToyopearlButy650Mである。本発明の方法によると、ステップにおいて、ステップに由来するインターフェロンをさらに、マルチモードクロマトグラフィーを用いる本発明の方法に供する。マルチモードクロマトグラフィーは、好ましくは、高流速で使用する事が可能である固いアガロースマトリクスに基づく。高架橋アガロースベース支持体は、高い化学的及び物理的安定性を媒体に付与する。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、標的化合物の負の電荷を有する部位と相互作用することができる第一の基、および、当該標的化合物と電荷電荷相互作用以外の少なくとも一つの相互作用をすることができる第二の基を含む。マルチモードクロマトグラフィー支持体は、クロマトグラフィーカラムにおいて提供される。好ましくは、マルチモードクロマトグラフィーはCaptoadhereを使用する。本発明によると、HICおよびマルチモードクロマトグラフィーは、配列バリアントを分離することができる。HICの第一のカラムのステップは、共有結合性の凝集体を除去することを目的としており、第二のマルチモードクロマトグラフィーカラムは、アセチル化バリアントを分離することを意図している。本発明によると、ステップにおいて、発現系における組み換えタンパク質産物から得られた組み換えインターフェロンの不溶性体を可溶化し、その後得られたインターフェロンを酸化剤の存在下でリフォールディングすることにより、可溶化しリフォールディングしたインターフェロンが得られる。本発明によると、不溶性体を可溶化することが出来る任意の適した可溶化剤を、本発明において使用することが出来る。本発明の一実施形態において、カオトロピック剤または洗浄剤を、封入体の可溶化に使用することが出来る。好ましくは、カオトロピック剤は尿素、グアニジン塩酸塩であり、洗浄剤はSDS、Nアセチルトリメチルアンモニウムクロリド、またはNラウロイルサルコシンナトリウムである。より好ましくは、可溶化剤はグアニジン塩酸塩である。不溶性体を分離し可溶化する技術は、本明細書にその全体が参照として組み込まれているJournalofBioscienceandBioengineeringなどに開示されている通り、当分野において知られている。一実施形態において、封入体をTrisGdHClTweenに溶解し、1~5mgmLのインターフェロンを得る。本発明によると、可溶化させたインターフェロンのリフォールディングは、酸化剤の存在下で実施する。酸化剤はシステインを選択的に酸化することができる。好ましくは、酸化剤はヨウ素またはヨードソベンゾエートであり;好ましくは、酸化剤はoヨードソベンゾエートである。酸化剤は、システイン残基を選択的及び化学量論的に酸化するために使用される。この点において、用語選択的とは、酸化剤が、システインを、ジスルフィドレベルに酸化し、より高いレベルにまで酸化しないまたはわずかに酸化するに留まり、還元されたタンパク質中に近接して位置する活性なシステインを優先的に酸化することを意味する。合成タンパク質に対する酸化剤のモル比は、使用される酸化剤によって幅広く変わり得る。当該モル比は、少なくとも化学量論的であり、典型的には11から100:1の範囲である。oヨードソベンゾエートの場合は、当該モル比は通常約1:1から約5:1の範囲である。すべての例において、酸化剤は、反応の最終部分の間、還元されたタンパク質の完全な酸化を確実にする量を超える。これらの条件は、反応期間全体にわたって酸化剤過剰で反応が進行することによって、または、反応期間の大部分にわたって凡そ等モル量の反応物質で反応が進行し、反応期間の終わり近くに過剰量の酸化剤を添加することによって、達成され得る。oヨードソベンゾエートの使用などによるチオール基の酸化は、本明細書に参照としてその全体が組み込まれている米国特許第4530787号で参照することが出来る。高い回収率を維持する一方で、宿主の不純物を除去することは、本発明の主要な課題である。本発明は、当分野におけるクロマトグラフィーで4つのカラムのステップを用いる方法に代わって、2つのカラムのステップを用いる方法を実証する。本明細書で得られた生産物は、純度および収率が高く;例えば、全体の回収率は最大3040であり、95よりも高い純度の収率を達成することが出来る実施例1本発明の方法を使用するIFNα2aの精製IFNα遺伝子クローニング、プラスミド設計およびコドン最適化を、組み換えDNA技術によって実施した。組み換えIFNα2aは、IFNα2aの遺伝子を含有するプラスミドPET30aを有するBL21菌において、不溶性封入体として発現させた。培養は、5L流加培養において、溶存酸素レベル30で実施した。1mMIPTGで3時間誘導後、遠心分離によって細胞を培養液から回収した。細胞ペーストを20mMTrispH7405mMEDTA緩衝液で洗浄し、その後、超音波処理によって細胞を破砕するために、同じ緩衝液で再懸濁した。IBを遠心分離によって収集した。IBを適切な体積の50mMTrispH7470GdHCl2tween80に溶解し、4mgmLのIFNα2aを得た。室温で1時間穏やかに撹拌し、完全に溶解した。タンパク質溶液を50mMTrispH74緩衝液で11倍に希釈した。不溶性のデブリスを、30分間の冷却遠心で除去した。ジスルフィド酸化に先立ち、50mMTrispH74緩衝液中の1mMヨードソベンゾエートを調製した。10μΜヨードソベンゾエートを、1時間ごとに5回タンパク質溶液に導入した。タンパク質溶液を穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。1mMEDTAおよび10mMメチオニンをタンパク質溶液に加え、続いて固体硫酸アンモニウムを加えて1Mとした。pHを酢酸でpH65に調節した。粒子を遠心分離および濾過で除去した後、クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。ToyopearlButyl650M5x5cm流速25ml分、緩衝液A20mMNaPipH6510MAmS04lmMEDTA10mMメチオニン、緩衝液B20mMNaPipH651mMEDTA10mMメチオニン。タンパク質溶液を、緩衝液Aで平衡化したカラムに投入した。投入後、カラムを、OD280がほぼ0になるまで、少なくとも5CVの100の緩衝液Aで洗浄した。タンパク質を、2CVより多い20の緩衝液B、2CVより多い40の緩衝液B、2CVより多い60の緩衝液B、2CVより多い80の緩衝液B、および2CVより多い100の緩衝液Bで、一連の手順で溶出した。カラムを水、05NのNaOHおよび01NのHClで浄化した後、緩衝液Aで再生した。各画分18mLを収集し、サンプルをRPHPLCで分析した。本質的に凝集したIFNα2aを含まない画分をプールした。5mM酢酸アンモニウム緩衝液を導入し、硫酸アンモニウムを最終伝導率15mScm未満になるまで希釈した。クロマトグラフィー精製を以下の通り実施した。CaptoAdhere26x6cm、流速67ml分、緩衝液C50酢酸を加えることによる、25mM酢酸アンモニウム緩衝液、緩衝液D5mM酢酸希釈タンパク質溶液を、予め緩衝液Cで平衡化したカラムに投入した。完了後、カラムを3CVの60の緩衝液Dで洗浄した。標的タンパク質を80の緩衝液Dで溶出した。IFNα2aのクロマトグラムを図1に示す。カラムを、100の緩衝液C、続いて2MNaCl、1NNaOH、2MNaClおよび01M酢酸で浄化した。各画分17mLを収集し、サンプルをRPHPLCによって分析した。本質的にアセチル化アイソフォームを含まない画分をプールした。得られた産物を、それぞれの純度を比較することによって評価した。SDSPAGE分析の結果を図2に示す。純度において仕様が適合するCaptoAdhereカラムに由来する画分をプールし、3KD遠心式フィルターを使用して3mgmLより高い濃度に濃縮した。精製された大部分をさらに、02μmのメンブレンで濾過した。各段階におけるIFNα2aの収率を表1に示す。アセチル化IFNの量は、封入体で約20~30であった。前記クロマトグラフィーのステップを実施した後、アセチル化IFNは検出されない。実施例2本発明の方法を使用するIFNα2bの精製IFNα2b生産を実施例1と同じやり方で実施した。IFNα2bの全体の収率を表2に示す。本質的にアセチル化アイソフォームを含まない、得られた画分をプールした。IFNα2bのクロマトグラムを図3に示す。得られた産物を、それぞれの純度を比較することによって評価した。SDSPAGE分析の結果を図4に示す。アセチル化IFNの量は、封入体で約20~30であった。前記クロマトグラフィーのステップを実施した後、アセチル化IFNは検出されない。実施例3実施例1のIFNα2aおよび実施例2のIFNα2bの分析試験実施例1のIFNα2aおよび実施例2のIFNα2bを分析した。RPHPLCにて決定されたIFNα2aおよびIFNα2bならびに関連タンパク質の不純物を、図5に示す。