"細胞中の少なくとも1つの内因性染色体配列を編集する方法であって、a前記細胞内に、i少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびii前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む少なくとも1つの一本鎖核酸を導入すること;ならびにb前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸の配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持することを含む、方法。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の他方の側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含む、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、前記染色体配列と比べて少なくとも1つのヌクレオチドの変化をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項2に記載の方法。前記一本鎖核酸が、前記第1の領域および前記第2の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列を含む、請求項2に記載の方法。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の上流または下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含み、その結果、前記編集された染色体配列が欠失を含む、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、前記第1の領域および前記第2の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列をさらに含む、請求項5に記載の方法。前記一本鎖核酸が、直鎖状または環状である、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、約20ヌクレオチド~約100,000ヌクレオチドの長さを有する、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド模倣体、修飾ヌクレオチド、2’-O-メチルヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、センスまたはアンチセンス鎖である、請求項1に記載の方法。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の少なくとも1つの側の少なくとも10ヌクレオチドに対する少なくとも約90の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターTALEヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、または人工標的DNA二本鎖切断誘導剤である、請求項1に記載の方法。前記細胞内に少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項1に記載の方法。1つの標的化エンドヌクレアーゼ、前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第1の一本鎖核酸、前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第2の一本鎖核酸、および1つのドナーポリヌクレオチドが前記細胞内に導入され、前記ドナーポリヌクレオチドは、前記第1の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第1の配列、および前記第2の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第2の配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第1の配列および第2の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項14に記載の方法。第1の標的化エンドヌクレアーゼ、前記第1の標的化エンドヌクレアーゼの前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第1の一本鎖核酸、第2の標的化エンドヌクレアーゼ、前記第2の標的化エンドヌクレアーゼの前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第2の一本鎖核酸、および1つのドナーポリヌクレオチドが前記細胞内に導入され、前記ドナーポリヌクレオチドは、前記第1の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第1の配列、および前記第2の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第2の配列を含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第1の配列および第2の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項14に記載の方法。前記細胞が、培養細胞、初代細胞、不死細胞、幹細胞、誘導多能性幹細胞iPS、または1細胞胚である、請求項1に記載の方法。前記細胞が、ヒト細胞、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、または単細胞真核生物である、請求項1に記載の方法。前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記一本鎖核酸が、少なくとも30ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸である、請求項1に記載の方法。細胞中の内因性染色体配列を編集するためのキットであって、a少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸;およびb前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む少なくとも1つの一本鎖核酸を含む、キット。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の他方の側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含む、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、前記染色体配列に対する少なくとも1つのヌクレオチドの変化をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含む、請求項21に記載のキット。前記一本鎖核酸が、前記第1の領域および前記第2の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列を含む、請求項21に記載のキット。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の上流または下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含み、その結果、前記編集された染色体配列が欠失を含む、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、前記第1の領域および前記第2の領域と隣接する外因性配列をさらに含み、その結果、前記編集された染色体配列が、組込まれた外因性配列をさらに含む、請求項24に記載のキット。前記一本鎖核酸が、直鎖状または環状である、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、約20ヌクレオチド~約100,000ヌクレオチドの長さを有する、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド模倣体、修飾ヌクレオチド、2’-O-メチルヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせを含む、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、センスまたはアンチセンス鎖である、請求項20に記載のキット。前記一本鎖核酸が、前記標的切断部位の少なくとも1つの側の少なくとも10ヌクレオチドに対する少なくとも約90の配列同一性を有する、請求項20に記載のキット。前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターTALEヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、または人工標的DNA二本鎖切断誘導剤である、請求項20に記載のキット。前記キットが、前記標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第1の一本鎖核酸、および前記標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む第2の一本鎖核酸を含み、ドナーポリヌクレオチドであって、前記第1の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第1の配列、および前記第2の一本鎖核酸の第2の部分に対する実質的な配列同一性を有する第2の配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、前記ドナーポリヌクレオチドの前記第1の配列および第2の配列は、前記染色体配列内への挿入のための配列に隣接する、請求項20に記載のキット。少なくとも1つのPCRのためのプライマーをさらに含む、請求項20に記載のキット。緩衝剤、希釈剤、および培養培地から選択される少なくとも1つの試薬をさらに含む、請求項20に記載のキット。前記標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり、前記一本鎖核酸が、少なくとも30ヌクレオチドを含むデオキシリボ核酸である、請求項20に記載のキット。本開示の種々の態様には、細胞中の少なくとも1つの内因性染色体配列を編集するための方法の提供が含まれる。本方法は、細胞内に、i少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびii前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む少なくとも1つの一本鎖核酸を導入することを含む。本方法は、前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸の配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持することをさらに含む。さらなる態様は、細胞中の染色体配列を編集するためのキットを提供する。このキットは、a少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびb前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む少なくとも1つの一本鎖核酸、を含む。本開示の他の態様および特長は、下記でより詳しく説明する。カラー図面の参照本願は、カラーで制作された少なくとも1つの写真を含む。カラー写真を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要手数料の支払い時に、特許庁により提供される。発明の詳細な説明本開示は、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いて、内因性染色体配列を編集するための方法を提供する。具体的には、標的化エンドヌクレアーゼは、染色体配列中の標的部位に二本鎖切断を導入することができ、一本鎖核酸は、標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する領域を含む。標的化エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断は、染色体配列が一本鎖核酸の配列と交換され、それによって染色体配列を編集する、一本鎖核酸を用いた相同性指向修復プロセスによって修復される。編集された染色体配列は、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。また、本明細書で開示される方法を用いて染色体配列を編集するための適切な試薬を含むキットも本明細書において提供される。I染色体配列を編集するための方法本開示の一態様は、細胞中の少なくとも1つの内因性染色体配列を編集するための方法を提供する。本方法は、細胞内に、a少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびb前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する配列を含む少なくとも1つの一本鎖核酸を導入することを含む。本方法は、前記標的化エンドヌクレアーゼによって導入される前記二本鎖切断が、前記染色体配列が前記一本鎖核酸のうちの少なくとも1つの配列と交換され、それによって前記染色体配列を編集する相同性指向修復プロセスによって修復される条件下に、前記細胞を維持することをさらに含む。本方法の要素は以下に詳述する。a標的化エンドヌクレアーゼ本方法は、細胞内に、少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼまたは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を導入することを含む。標的化エンドヌクレアーゼは、特定の二本鎖染色体DNA配列を認識して結合し、染色体配列の標的切断部位に二本鎖切断を導入する実体である。標的化エンドヌクレアーゼは、天然タンパク質または人工タンパク質であってもよい。あるいは、標的化エンドヌクレアーゼは、タンパク質を含まなくてもよい例えば、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤。標的化エンドヌクレアーゼのタイプは異なり得、また異なるであろう。一部の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼであってもよい。他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。さらに他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターTALE-ヌクレアーゼであってもよい。さらなる実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼであってもよい。さらに他の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤であってもよい。iジンクフィンガーヌクレアーゼ一実施形態において、細胞内に導入される標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼZFNであってもよい。通常は、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、DNA結合ドメインすなわち、ジンクフィンガーおよび切断ドメインすなわち、ヌクレアーゼを含むが、これらについては下記で説明する。ジンクフィンガー結合ドメイン。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択される任意の核酸配列を認識し、それに結合するように操作されてもよい。例として、Beerlietal.2002Nat.Biotechnol.20:135-141、Paboetal.2001Ann.Rev.Biochem.70:313-340、Isalanetal.2001Nat.Biotechnol.19:656-660、Segaletal.2001Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637、Chooetal.2000Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416、Zhangetal.2000J.Biol.Chem.27543:33850-33860、Doyonetal.2008Nat.Biotechnol.26:702-708、およびSantiagoetal.2008Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:5809-5814を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法は、合理的設計および種々のタイプの選択を含むが、それらに限定されない。合理的設計は、例えば、ダブレット、トリプレット、および/またはカドラプレットヌクレオチド配列、ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、ここでダブレット、トリプレット、またはカドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはカドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つ以上のアミノ酸配列に関連する。例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,453,242号および第6,534,261号を参照されたい。例として、米国特許第6,453,242号に記載されるアルゴリズムを使用して、事前選択された配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計してもよい。また、非縮重認識コード表を用いる合理的設計等の代替的方法を使用して、特定の配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計してもよいSeraetal.2002Biochemistry41:7074-7081。DNA配列内の潜在的標的部位を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための公的に入手可能なウェブベースのツールは、それぞれhttp://www.zincfingertools.orgおよびhttp://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/に見出すことができるMandelletal.2006Nuc.AcidRes.34:W516-W523、Sanderetal.2007Nuc.AcidRes.35:W599-W605。ジンクフィンガー結合ドメインは、約3ヌクレオチド~約21ヌクレオチド長、または好ましくは約9~約18ヌクレオチド長の範囲のDNA配列を認識して結合するように設計されてもよい。概して、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも3つのジンクフィンガー認識領域すなわち、ジンクフィンガーを含む。一実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、4つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、5つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。さらに別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、6つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の好適な標的DNA配列に結合するように設計されてもよい。例として、米国特許第6,607,882号、第6,534,261号、および第6,453,242号を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的方法は、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含んでもよく、それらは米国特許第5,789,538号、第5,925,523号、第6,007,988号、第6,013,453号、第6,410,248号、第6,140,466号、第6,200,759号、および第6,242,568号、ならびに国際公開第WO98/37186号、国際公開第WO98/53057号、国際公開第WO00/27878号、国際公開第WO01/88197号、および英国特許第2,338,237号に開示され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、国際公開第WO02/077227号に記載されている。ジンクフィンガー結合ドメイン、ならびに融合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドの設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、米国特許出願公開第20050064474号および第20060188987号に詳述され、これら各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域および/またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、5つ以上のアミノ酸長のリンカーを含む、好適なリンカー配列を用いてともに結合されてもよい。6つ以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的例については、米国特許第6,479,626号、第6,903,185号、および第7,153,949号を参照されたく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の好適なリンカーの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在シグナルまたは配列NLSをさらに含んでもよい。NLSは、染色体の標的配列における二本鎖切断を導入するために、核内へのジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の標的化を促進するアミノ酸配列である。核局在シグナルは、当技術分野で既知である。例えば、Makkerhetal.1996CurrentBiology6:1025-1027を参照されたい。切断ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼはまた、切断ドメインも含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、それらに限定されない。例えば、2002-2003Catalog,NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.、およびBelfortetal.1997NucleicAcidsRes.25:3379-3388またはwww.neb.comを参照されたい。DNAを切断するさらなる酵素は既知である例えば、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNaseI、ミクロコッカルヌクレアーゼ、酵母HOエンドヌクレアーゼ。また、Linnetal.eds.Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993も参照されたい。これらの酵素のうちの1つ以上またはそれらの機能的断片は、切断ドメインの源として使用されてもよい。また、切断ドメインは、上述の通り、切断活性のための二量体化を必要とする酵素またはその部分に由来してもよい。各ヌクレアーゼは、活性酵素二量体の単量体を含むため、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素二量体を作り出すために両方の単量体を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、活性酵素二量体は、核酸分子を切断することができる酵素二量体である。2つの切断単量体は、同じエンドヌクレアーゼまたはそれらの機能的断片に由来してもよく、または各単量体は、異なるエンドヌクレアーゼまたはそれらの機能的断片に由来してもよい。2つの切断単量体を使用して活性酵素二量体が形成される場合、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、好ましくは、それぞれの認識部位への2つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば、二量体化によって、切断単量体が活性酵素二量体を形成することを可能にする相互の空間的配向で切断単量体を配置するように、配置される。結果として、認識部位の近端は、約5~約18ヌクレオチド分、隔てられてもよい。例えば、近端は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18ヌクレオチド分、隔てられてもよい。しかしながら、ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の任意の整数が、2つの認識部位例えば、約2~約50ヌクレオチド対以上の間に介入してもよいことは理解されよう。例えば、本明細書に詳述される近端等の、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、6ヌクレオチド分、隔てられてもよい。概して、切断の部位は、認識部位の間にある。制限エンドヌクレアーゼ制限酵素は、多くの種において存在し、DNA認識部位におけるに配列特異的に結合し、結合の部位における、またはその近くのDNAを切断することができる。ある種の制限酵素例えば、IIS型は、認識部位から移動した部位におけるDNAを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、IIS型酵素FokIは、一方の鎖上のその認識部位から9ヌクレオチド、および他方の鎖上のその認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号、第5,436,150号、および第5,487,994号、ならびにLietal.1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279、Lietal.1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768、Kimetal.1994aProc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887、Kimetal.1994bJ.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも1つのIIS型制限酵素からの切断ドメインおよび1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含んでもよく、それらは操作されても、されなくてもよい。例示的IIS型制限酵素は、例えば、国際公開第WO07/014,275号に記載され、この公開の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる制限酵素もまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらもまた、本開示によって企図される。例えば、Robertsetal.2003NucleicAcidsRes.31:418-420を参照されたい。その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な、例示的IIS型制限酵素には、FokIがある。この特定の酵素は、二量体として活性であるBitinaiteetal.1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。したがって、本開示の目的で、ジンクフィンガーヌクレアーゼに使用されるFokI酵素の部分は、切断単量体と見なされる。したがって、FokI切断ドメインを用いる標的二本鎖切断のために、各々がFokI切断単量体を含む、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび2つのFokI切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許公開第20050064474号、第20060188987号、および第20080131962号に記載される通り、ホモ二量体化を最小化または防止する、1つまたは複数の操作された切断単量体を含んでもよく、これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、FokIの446位、447位、479位、483位、484位、486位、487位、490位、491位、496位、498位、499位、500位、531位、534位、537位、および538位のアミノ酸残基は全て、FokI切断ハーフ-ドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。絶対的ヘテロ二量体を形成するFokIの、例示的な操作された切断単量体としては、第1の切断単量体がFokIのアミノ酸残基490位および538位における変異を含み、第2の切断単量体がアミノ酸残基486位および499位における変異を含む対が挙げられる。したがって、一実施形態では、アミノ酸490位における変異は、GluEをLysKで置換し、アミノ酸538位における変異は、IsoIをLysKで置換し、アミノ酸486位における変異は、GlnQをGluEで置換し、499位における変異は、IsoIをLysKで置換する。具体的には、操作された切断単量体は、1つの切断単量体におけるE~Kの490位およびI~Kの538位を変異させて、E490K:I538Kと命名される操作された切断単量体を産生することによって、ならびに別の切断単量体におけるQ~Eの486位およびI~Lの499位を変異させて、Q486E:I499Lと命名される操作された切断単量体を産生することによって、調製されてもよい。上述の操作された切断単量体は、異常な切断が最小化されるか、または無効にされる、絶対的ヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第20050064474号に記載される野生型切断単量体FokIの部位特異的突然変異誘発によって調製することができる。ii他の標的化エンドヌクレアーゼ別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであってもよい。メガヌクレアーゼは、大きい認識部位を特徴とする、すなわち、認識部位が、一般に約12塩基対~約40塩基対の範囲である、エンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要件により、認識部位は、一般に、任意の所定のゲノム中に1度のみ生じる。メガヌクレアーゼの中で、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADGファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム操作のための重要な手段となっている。メガヌクレアーゼは、当業者に公知の技法を用いて特定の染色体配列の認識配列を修飾することにより、それらの特定の染色体配列を標的とすることができる。さらなる実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターTALEヌクレアーゼであってもよい。TALEは、新しいDNA標的に結合するように容易に操作できる植物病原菌キサントモナス由来の転写因子である。TALEまたはそのトランケート型をFokIなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに結合して、TALEヌクレアーゼまたはTALENと称される標的化エンドヌクレアーゼを作製してもよい。さらに別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼであってもよい。具体的には、部位特異的ヌクレアーゼは、その認識部位がゲノム中にまれに生じる、レアカッターエンドヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中に1度のみ生じる。また別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤人工制限DNAカッターとも称されるであってもよい。例えば、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤は、DNAを切断する金属/キレート剤錯体と、標的切断部位に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドとを含んでもよい。したがって、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤は、いかなるタンパク質も含有しない。金属/キレート剤錯体の金属は、セリウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛等であってもよい。金属/キレート剤錯体のキレート剤は、EDTA、EGTA、BAPTA等であってもよい。好ましい実施形態において、金属/キレート剤錯体は、CeIV/EGTAであってもよい。別の好ましい実施形態において、人工標的DNA二本鎖切断誘導剤は、CeIV/EGTAの錯体と、疑似相補性ペプチド核酸PNAの二本鎖とを含んでもよいKatadaetal.,CurrentGeneTherapy,2011,111:38-45。iii標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸一部の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼは、核酸として細胞内に導入してもよく、この細胞は次いで標的化エンドヌクレアーゼを発現および産生する。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。RNAは、メッセンジャーRNAであってもよく、mRNAは、5’キャップされていても、ポリアデニル化されていても、またはその両方であってもよい。概して、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、プロモーター調節領域に操作可能に結合されることになる。調節領域は、構成的または誘導的であってもよい。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸およびその結合調節領域は、プラスミドなどのベクター等として細胞内に導入してもよい。あるいは、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸およびその結合調節領域は、直鎖状分子として細胞内に導入してもよい。b一本鎖核酸i一般的特性本方法は、細胞内に、標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する領域を含む少なくとも1つの一本鎖核酸を導入することをさらに含む。一部の実施形態において、1つの一本鎖核酸が細胞内に導入される。他の実施形態において、2つの一本鎖核酸が細胞内に導入される。さらなる実施形態において、3つ以上の一本鎖核酸が細胞内に導入される。実質的な配列同一性という表現は、オリゴヌクレオチドが、標的染色体配列に対する少なくとも約75の配列同一性有することを意味する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的染色体配列に対する約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99の配列同一性を有してもよい。さらに、一本鎖核酸は、一般に、標的切断部位の少なくとも1つの側の少なくとも約10ヌクレオチドに対して実質的な配列同一性を有する。一部の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の少なくとも1つの側の約15ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約40ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約100ヌクレオチド、または100を超えるヌクレオチドに対して、実質的な配列同一性を有してもよい。細胞内に導入される一本鎖核酸の長さは異なり得、また異なるであろう。例えば、一本鎖核酸は、約20ヌクレオチド長から約200,000ヌクレオチド長までの範囲であってもよい。種々の実施形態において、一本鎖核酸は、約20ヌクレオチド長~約100ヌクレオチド長、約100ヌクレオチド長~約1000ヌクレオチド長、約1000ヌクレオチド長~約10,000ヌクレオチド長、約10,000ヌクレオチド長~約100,000ヌクレオチド長、または約100,000ヌクレオチド長~約200,000ヌクレオチド長の範囲であってもよい。一部の実施形態において、一本鎖核酸は直鎖状であってもよい。他の実施形態において、一本鎖核酸は、環状であってもよい例えば、当業者に既知のファージ法によって調製される。一本鎖核酸は、対象染色体配列に対してセンスまたはアンチセンス鎖であってもよい。一本鎖核酸の組成は異なり得、また異なるであろう。核酸のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってもよい。ヌクレオチドは、標準ヌクレオチドすなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン、またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体とは、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基、または修飾リボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド例えば、イノシン、または非天然ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加または除去、ならびに塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子との置換例えば、7-デアザプリンがある。またヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、2’-O-メチルヌクレオチド、ロックド核酸LNA、ペプチド核酸PNA、およびモルホリノも含まれる。一本鎖核酸のヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホラミダイト結合、ホスホロジアミデート結合、またはそれらの組み合わせによって結合されていてもよい。好ましい実施形態において、一本鎖核酸は、デオキシリボヌクレオチドを含む。ii好ましい一本鎖核酸一実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域、および標的切断部位の下流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含んでもよい例えば、図1および図4を参照。本実施形態の種々の反復法において、一本鎖核酸は、染色体配列と比べて少なくとも1つのヌクレオチドの変化をさらに含んでもよい。例えば、一本鎖核酸は、一般に、少なくとも1つのヌクレオチドの置換、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、またはそれらの組み合わせを含むであろう。種々の反復法において、一本鎖核酸は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のヌクレオチド変化を含んでもよい。これらのヌクレオチド変化の結果として、編集された染色体配列が改変配列または小変異を含み、修飾された遺伝子産物が産生される、遺伝子産物が産生されない等であってもよい。代替的実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位のいずれかの側に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域および第2の領域と隣接する、外因性配列を含んでもよい上述の通り。その結果、編集された染色体配列は、組込まれた外因性核酸配列を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、用語外因性のとは、通常はその染色体位置に位置しない任意の配列を指す。例えば、外因性配列は、別の生物由来の遺伝子、同じ生物由来の遺伝子のさらなるコピー、人工配列、レポーター分子をコードする配列等であってもよい。別の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の一つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域、および標的切断部位の遠位の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含んでもよい図12を参照。遠位染色体配列は、標的切断部位の上流または下流であってよく、遠位染色体配列は、標的切断部位から約20塩基対~約1,000,000塩基対離れて位置していてもよい。例えば、遠位染色体配列は、標的切断部位の約0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、または1,000キロ塩基対上流または下流であってもよい。結果として、編集された染色体配列は、最大約1,000,000塩基対の欠失を含んでもよい。本実施形態の1つの反復法において、一本鎖核酸は、標的切断部位の下流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域、および標的切断部位の上流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含んでもよく、編集された染色体配列は、標的切断部位に対して上流または5’の欠失を含んでもよい。本実施形態の別の反復法において、一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域、および標的切断部位の下流に位置する遠位染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域を含んでもよく、編集された染色体配列は、標的切断部位に対して下流または3’の欠失を含んでもよい。また別の実施形態において、一本鎖核酸は、標的切断部位の一つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の領域および標的切断部位の遠位の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の領域と隣接する、外因性配列を含んでもよい上記に詳述した通り。本実施形態において、編集された染色体配列は、欠失、および標的切断部位における外因性配列の組込みを含んでもよい図16を参照。外因性配列の同一性は異なり得、また異なるであろう。例えば、外因性配列は、別の生物由来の遺伝子、同じ生物由来の遺伝子のさらなるコピー、レポーター分子等であってもよい。c任意のドナーポリヌクレオチド特定の実施形態において、方法は、細胞内に、少なくとも1つのドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、標的切断部位の染色体配列内への組込みのための配列を含み、この組込みのための配列は第1の配列および第2の配列と隣接し、第1の配列および第2の配列は、それぞれ一本鎖核酸の部分に対する実質的な配列同一性を有する。したがって、ドナーポリヌクレオチドは、第1の一本鎖核酸および第2の一本鎖核酸ならびに少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼとともに導入される。第1の一本鎖核酸は、標的切断部位の上流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分、およびドナーポリヌクレオチド中の第1の配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の部分を含む。第2の一本鎖核酸は、標的切断部位の下流側に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分、およびドナーポリヌクレオチド中の第2の配列に対する実質的な配列同一性を有する第2の部分を含む。ドナーポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体等を含んでもよい。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、環状または直鎖状であってもよい。通常は、ドナーポリヌクレオチドは、DNAであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、DNAプラスミド、細菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YAC、ウイルスベクター等であってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、複製起点、選択マーカー、マルチクローニングサイト等をさらに含んでもよい。ドナーポリヌクレオチドのサイズは異なり得、また異なるであろう。例えば、ドナーヌクレオチドは、約1キロ塩基kb~約200kbの範囲であってもよい。一実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、対象タンパク質をコードするヒトDNA配列の約100kbのエキソン配列およびイントロン配列を含んでもよい。d細胞本方法は、上記に記載の標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可および核酸複数可を細胞内に導入することを含む。様々な細胞が、本方法における使用に適している。概して、細胞は、真核細胞または単細胞真核生物であろう。一部の例において、細胞は、培養細胞、初代細胞、または不死細胞であってもよい。好適な細胞には、菌類または酵母、例えば、ピキアPichia、サッカロミセスSaccharomyces、またはシゾサッカロミセスSchizosaccharomyces、昆虫細胞、例えば、スポドプテラフルギペルダSpodopterafrugiperda由来のSF9細胞またはキイロショウジョウバエDrosophilamelanogaster由来のS2細胞、および動物細胞、例えば、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞がある。例示的細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、初代細胞であってもよい。概して、二本鎖切断に感受性であるいかなる初代細胞も使用することができる。細胞は、様々な細胞型を有してもよく、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、T細胞またはB細胞、マクロファージ、上皮細胞等である。哺乳動物細胞株を使用する場合、その細胞株は、まだ記載されていないいかなる樹立細胞株または初代細胞株であってもよい。細胞株は、接着性または非接着性であってよく、あるいは細胞株は、当業者に既知の標準技術を用いて、接着性、非接着性、または器官型の成長を促進する条件下で成長させてもよい。好適な哺乳動物細胞株の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、SV40で形質転換したサル腎臓CVI株COS7、ヒト胚性腎臓株293、ベビーハムスター腎臓細胞BHK、マウスセルトリ細胞TM4、サル腎臓細胞CVI-76、アフリカミドリザル腎臓細胞VERO、ヒト子宮頸癌細胞HeLa、イヌ腎臓細胞MDCK、バッファローラット肝臓細胞BRL3A、ヒト肺細胞W138、ヒト肝臓細胞HepG2、マウス乳腺腫瘍細胞MMT、ラットヘパトーマ細胞HTC、HIH/3T3細胞、ヒトU2-OS骨肉腫細胞、ヒトA549細胞、ヒトK562細胞、ヒトHEK293細胞、ヒトHEK293T細胞、ヒトHCT116細胞、ヒトMCF-7細胞、およびTRI細胞がある。哺乳動物細胞株の広範な一覧について、当業者は、AmericanTypeCultureCollectioncatalogATCC登録商標,Mamassas,VAを参照することができる。さらに他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。好適な幹細胞には、胚性幹細胞、ES様幹細胞、胎生幹細胞、成人幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、多能性multipotent幹細胞、少能性oligopotent幹細胞、および単能性unipotent幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、細胞は1細胞胚であってもよい。胚は、脊椎動物の胚または非脊椎動物の胚であってもよい。好適な脊椎動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類が含まれる。好適な哺乳動物の例には、齧歯動物、伴侶動物、家畜動物、および非霊長類が含まれるが、これらに限定されない。齧歯動物の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットがある。好適な伴侶動物には、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが含まれるが、これらに限定されない。家畜の非限定的な例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカが含まれる。好適な非霊長類には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびサバンナモンキーが含まれるが、これらに限定されない。鳥類の非限定的な例には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウが含まれる。あるいは、動物は、無脊椎動物、例えば昆虫、線虫等であってもよい。昆虫の非限定的な例には、ショウジョウバエDrosophilaおよび蚊が含まれる。e細胞への送達上記に記載の標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可および核酸複数可は、様々な手段で細胞内に導入することができる。好適な送達手段には、微量注入、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクション、陽イオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光学トランスフェクション、専有の薬剤増強型の核酸取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介する送達が含まれる。一実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可および核酸複数可は、ヌクレオフェクションによって細胞内に導入することができる。別の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可および核酸複数可は、微量注入によって細胞例えば、1細胞胚中に導入することができる。標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可および核酸複数可は、細胞核または細胞質中に微量注入してもよい。1つより多くの標的化エンドヌクレアーゼ分子および1つより多くの一本鎖核酸が細胞内に導入される実施形態において、それらの分子は、同時または順次に導入することができる。例えば、それぞれ標的切断部位に対して特異的な標的化エンドヌクレアーゼ分子、および対応する一本鎖核酸複数可は、同時に導入してもよい。あるいは、各標的化エンドヌクレアーゼ分子、および対応する一本鎖核酸複数可は、順次導入してもよい。任意のドナーポリヌクレオチドも同様に導入してよい。標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可の一本鎖核酸複数可に対する比率は、異なり得、また異なるであろう。概して、標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可の核酸複数可に対する比率は、約1:10~約10:1の範囲であってもよい。種々の実施形態において、標的化エンドヌクレアーゼ分子複数可の核酸複数可に対する比率は、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、または10:1であってもよい。一実施形態において、この比率は約1:1であってもよい。f細胞の培養本方法は、標的化エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断が、一本鎖核酸複数可を用いた相同性指向プロセスによって修復されて、染色体配列が編集され得る適切な条件下に、細胞を維持することをさらに含む。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸複数可が細胞内に導入される実施形態において、本方法は、細胞が標的化エンドヌクレアーゼを発現する適切な条件下に、細胞を維持することを含む。概して、細胞は、細胞にとって適切な条件下で維持されるであろう。好適な細胞培養条件は、当技術分野において周知であり、例えば、Santiagoetal.2008PNAS105:5809-5814、Moehleetal.2007PNAS104:3055-3060、Urnovetal.2005Nature435:646-651、およびLombardoetal2007Nat.Biotechnology25:1298-1306に記載されている。当業者は、細胞を培養するための方法が、当技術分野において既知であり、細胞型に応じて異なり得、また異なるであろうことを理解する。あらゆる場合において、日常的な最適化を使用して、個々の細胞型にとって最良の技術を決定することができる。細胞が1細胞胚である実施形態では、胚は、インビトロ例えば、細胞培養物中で培養してもよい。通常は、胚は、適切な温度および適切な培地で、二本鎖切断の修復を可能にし、胚の発達を可能にするために必要なO2/CO2比で培養する。好適な培地の非限定な例には、M2培地、M16培地、KSOM培地、BMOC培地、およびHTF培地が含まれる。当業者は、培養条件が胚の種に応じて異なり得、また異なるであろうことを理解するであろう。あらゆる場合において、日常的な最適化を使用して、個々の胚の種にとって最良の培養条件を決定することができる。一部の例において、胚は、胚をメス宿主の子宮中に移すことによって、インビボで培養してもよい。概して言えば、メス宿主は、その胚と同じ種または類似した種に由来する。好ましくは、メス宿主は、偽妊娠している。偽妊娠したメス宿主を準備する方法は、当技術分野で既知である。さらに、胚をメス宿主中に移す方法も既知である。胚をインビボで培養することは、胚の発達を可能にし、その胚に由来する動物の出生をもたらし得る。本プロセスのこのステップにおいて、標的化エンドヌクレアーゼ一部の例では、導入された標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸から発現されるは、染色体配列中の標的切断部位を認識し、結合し、そこで二本鎖切断を作製する。染色体配列中の二本鎖切断は、核酸配列が染色体配列と交換される、一本鎖核酸を用いた相同的組み換えによって修復される。核酸配列は、物理的に組込んでもよく、あるいは核酸配列を切断の修復のためのテンプレートとして使用して、染色体配列の編集をもたらしてもよい。染色体配列の標的編集の頻度は、様々な要因に応じて異なり得、また異なるであろう。一部の実施形態において、編集の頻度は、約0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、または30を超えてもよい。編集された染色体配列を含む単細胞クローンは、当技術分野において周知の技術を用いて単離することができる。当業者は、編集された染色体配列のホモ接合型の細胞を生成するための方法に精通している。つまり、細胞は、編集された染色体配列のヘテロ接合型またはホモ接合型であってもよい。編集された染色体配列は、1つまたは複数の点変異すなわち、1つのヌクレオチドが、別のヌクレオチドに置換される、1つまたは複数の欠失、および/または1つまたは複数の挿入を含んでもよい。点変異は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、またはサイレント突然変異であってもよい。欠失は、約1塩基対~約500キロ塩基対の範囲であってよく、挿入は、約1塩基対~約200キロ塩基対の範囲であってもよい。したがって、編集された染色体配列は、修飾遺伝子産物すなわち、タンパク質または非コードRNAを生じてもよい。例えば、編集された染色体配列がタンパク質コード領域内に位置する実施形態では、得られるタンパク質は、少なくとも1つのアミノ酸変化を含んでもよい。他の実施形態において、修飾染色体配列は、修飾非コードRNAを生じてもよく、または修飾染色体配列は、変更された制御機能を有してもよい。あるいは、編集された染色体配列は、機能性遺伝子産物が産生されないまたは制御領域の機能が排除されるように不活性化してもよい。例えば、編集された染色体配列がタンパク質コード領域内に位置する実施形態において、点変異複数可、欠失複数可、および/または挿入複数可が、未成熟終止コドン、スプライス部位突然変異、および/またはフレームシフト突然変異を導入して、機能性タンパク質が産生されないようにしてもよい。編集された染色体配列が挿入を含む実施形態において、挿入される配列は、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質断片、タンパク質サブユニット、タンパク質タグ等をコードしてもよい。あるいは、挿入される配列は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでも、非コードRNAをコードしても、マイクロRNA結合部位を含んでも、または転写調節因子として機能してもよい。II少なくとも1つの編集された染色体配列を含む細胞本開示の別の態様は、少なくとも1つの編集された染色体配列であって、上記の第I章に記載した方法で編集された染色体配列を含む細胞を提供する。好適な細胞は、上記の第Id章に詳述される。IIIキットさらなる態様は、細胞中の染色体配列を編集するためのキットを包含する。本キットは、a少なくとも1つの標的化エンドヌクレアーゼであって、前記染色体配列中の標的切断部位に二本鎖切断を導入することができる、標的化エンドヌクレアーゼ、または前記標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、およびb前記標的切断部位の少なくとも1つの側の染色体配列に対する実質的な配列同一性を有する第1の部分を含む少なくとも1つの一本鎖核酸、を含む。したがって、本キットは、上記の第I章に詳述した方法を用いて染色体配列を編集するための手段を提供する。本キットは、標的化エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いたゲノム編集のための開示される方法を実施するのに有用な、1つまたは複数のさらなる試薬をさらに含んでもよい。キットは、一般に、1つまたは複数の別個の組成物として、または試薬の適合性が許容する場合には任意により混合物として試薬を保持する1つまたは複数の容器を有するパッケージを含む。本キットは、使用者の立場から望ましいであろう他の材料複数可、例えば緩衝剤複数可、希釈剤複数可、培養培地複数可、標準物質複数可、および/または加工時、またはゲノム編集方法の任意のステップを実施する際に有用な任意の他の材料も含んでよい。本明細書において提供されるキットは、好ましくは、上記の第I章に詳述したように染色体配列を編集するための使用説明を含む。本キットに含まれる使用説明は、パッケージ材料に書き添えられていても、添付文書として含まれていてもよい。使用説明は、通常は記載物または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明を保存し、それらを最終使用者に伝達することができるいかなる媒体も本開示により想定されている。そのような媒体には、電子記憶媒体例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ、光媒体例えば、CDROM等を含むが、それらに限定されない。本明細書で使用されるとき、用語使用説明は、その使用説明を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。IV用途本明細書に開示される染色体配列を編集するための方法は、様々な用途を有しうる。一部の実施形態において、本方法を研究目的で使用して、修飾タンパク質の機能を検査することができるように、対象タンパク質中に標的突然変異を導入することができる。また、本方法を使用して、タンパク質が産生されないようにタンパク質コード配列を不活性化してもよく、このとき細胞または細胞を含む生物の表現型を検査することができる。さらに、本方法を使用して、RNAコード領域または転写調節領域を研究目的で修飾または不活性化することができる。さらに他の実施形態において、本方法を使用して、染色体配列および/または組込み外因性核酸配列の大きい領域を欠失させることができる。他の実施形態において、本明細書に開示される方法は、臨床目的または治療目的で使用することができる。つまり、本方法を用いて、病原遺伝子または染色体配列を修復または修正することができる。一例として、鎌状赤血球病は、単一ヌクレオチド変化によって生じ得るすなわち、β-グロビン遺伝子におけるAからTへの変化は、β-グロビンタンパク質におけるグルタミン酸のバリンへの変化をもたらす。したがって、本開示の方法を使用して、鎌状赤血球形質または鎌状赤血球病を有する個人の細胞内のβ-グロビン遺伝子において、SNPを修正することができる。同様に、本方法を使用して、特定の疾患または疾患状態に関与する他の遺伝子または染色体配列における、スプライス部位の突然変異、欠失、挿入等を修正することができる。定義別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明において使用される用語の多くの一般的定義を提供する:Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.1994、TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnologyWalkered.,1988、TheGlossaryofGenetics,5thEd.,R.Riegeretal.eds.,SpringerVerlag1991、およびHaleMarham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology1991。本明細書で使用されるとき、以下の用語は、別途指示されない限り、それらに帰された意味を有する。本開示の要素またはそれら好ましい実施形態複数可を紹介するとき、冠詞a、an、the、およびsaidは、1つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。含む/備えるcomprising、含むincluding、および有するhavingという用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の付加的な要素が存在し得ることを意味する。編集またはゲノム編集とは、特定の染色体配列を変化させるプロセスを指す。編集された染色体配列は、少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、および/または少なくとも1つのヌクレオチドの置換を含んでもよい。編集された修飾染色体配列は、修飾遺伝子産物例えば、変更されたアミノ酸配列を有するタンパク質、変更されたヌクレオチド配列を有する非コードRNA等をコードしても、修飾された機能例えば、変更されたプロモーター機能、変更されたエンハンサー機能等を提供しても、遺伝子産物をもたらさなくてもすなわち、配列が転写されない、および/または機能性産物が生成されない、制御機能を提供しなくても、外因性配列をコードしなくても、または新しい機能すなわち、制御可能なプロモーター、誘導可能なプロモーター、マイクロRNA結合部位等としてを提供しなくてもよい。本明細書で使用されるとき、用語内因性のとは、その細胞の天然の染色体配列を指す。本明細書で使用されるとき、用語外因性のとは、通常は特定の染色体位置に位置しない核酸配列を指す。外因性配列は、別の生物に由来してもよく、人工的であってもよく、または別の染色体位置に存在する核酸配列の重複コピーであってもよい。本明細書で使用されるとき、遺伝子は、遺伝子産物をコードするDNA領域エクソンおよびイントロンを含む、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのDNA領域を指し、かかる制御配列がコード配列および/または転写配列に隣接するか否かを問わない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等の転写制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座調節領域を含むが、必ずしもそれらに限定されない。核酸およびポリヌクレオチドという用語は、直鎖状または環状立体配座のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的で、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であるものとして解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および/またはリン酸部分例えば、ホスホロチオエート骨格において修飾されたヌクレオチドを包含し得る。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対形成する。ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用されるとき、標的部位または標的配列という用語は、編集対象の染色体配列の一部分を規定し、結合に十分な条件が存在することを条件として、ジンクフィンガーヌクレアーゼが認識し、結合するように操作される核酸配列を指す。上流および下流という用語は、定位置に対する核酸配列中の位置を指す。上流は、その位置の5’側すなわち、鎖の5’末端近傍の領域を指し、下流は、その位置の3’側すなわち、鎖の3’末端近傍の領域を指す。核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は、当技術分野において既知である。通常は、そのような技術には、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列を決定すること、および/またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。ゲノム配列もこれと同様に決定し、比較することができる。概して、同一性は、2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドとヌクレオチド、またはアミノ酸とアミノ酸の正確な一致を指す。2つ以上の配列ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、それらの同一性百分率を決定することによって比較することができる。2つの配列の同一性百分率は、核酸であるかアミノ酸配列であるかを問わず、2つのアラインメントされた配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで除し、100を乗じたものである。核酸配列の近似アラインメントは、SmithandWaterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482-4891981の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff,AtlasofProteinSequencesandStructure,M.O.Dayhoffed.,5suppl.3:353-358,NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.,USAによって開発され、Gribskov,Nucl.AcidsRes.146:6745-67631986によって正規化されたスコアリング行列を用いることによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性百分率を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実現形態は、GeneticsComputerGroupMadison,Wis.により、BestFitユーテリティアプリケーションにおいて提供される。配列間の同一性百分率または類似性を算出するために好適な他のプログラムは、概して当該技術分野で既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる:遺伝コードgeneticcode=標準standard;フィルターfilter=なしnone;鎖strand=両方both;カットオフcutoff=60;期待数expect=10;行列Matrix=BLOSUM62;表示Descriptions=50配列;分類方法sortby=高スコアHIGHSCORE;データベースDatabases=非重複non-redundant、GenBankEMBLDDBJPDBGenBankCDStranslationsSwissproteinSpupdatePIR。これらのプログラムの詳細は、GenBankウェブサイト上に見出すことができる。本明細書に記載される配列に関して、望ましい配列同一性の程度の範囲は、約80~100およびその間の任意の整数値である。通常は、配列間の同一性百分率は、少なくとも70~75、好ましくは80~82、より好ましくは85~90、さらにより好ましくは92、より一層好ましくは95、最も好ましくは98の配列同一性である。あるいは、安定な二重鎖の形成が、ある程度の配列同一性を共有する領域間で起こり得るような条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ複数可により消化し、消化された断片のサイズ決定を行うことによって、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度を決定することができる。2つの核酸配列、または2つのポリペプチド配列は、それらの配列が、上記の方法を用いて決定したときに、その分子の規定の長さにわたって、少なくとも約70~75、好ましくは80~82、より好ましくは85~90、さらにより好ましくは92、より一層好ましくは95、最も好ましくは98の配列同一性を示す場合、互いに実質的に類似している。本明細書で使用されるとき、実質的に類似はまた、指定したDNA配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。実質的に類似したDNA配列は、例えば、その特定の系に対して定義されるストリンジェントな条件下で行われる、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Sambrooketal.,上記を参照;NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,editorsB.D.HamesandS.J.Higgins,1985Oxford;Washington,D.C.;IRLPressを参照されたい。2つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下の通りに決定することができる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、かかる分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響を及ぼす。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる例えばサザンDNAブロット、ノーザンRNAブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Sambooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,1989ColdSpringHarbor,N.Y.を参照されたい。かかるアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでの様々な条件を用いて行うことができる。低ストリンジェンシー条件を用いる場合、非特異的結合の不在は、ある程度でも配列同一性を欠いた二次プローブ例えば、標的分子との約30未満の配列同一性を有するプローブを用いて、非特異的結合事象の不在下ではその二次プローブが標的にハイブリダイズしないようにすることにより、評価することができる。ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合は、参照核酸配列に相補的な核酸プローブを選択し、次いで適切な条件を選択することによって、プローブと参照配列とが互いに選択的にハイブリダイズ、または結合して、二重鎖分子を形成する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、通常は、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約70の配列同一性を有する、少なくとも約10~14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にするような条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常は、選択された核酸プローブの配列と約90~95を超える配列同一性を有する、少なくとも約10~14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよび参照配列が特定の配列同一性の程度を有する場合、プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当分野で既知である通りに決定することができる例えば、NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,editorsB.D.HamesandS.J.Higgins,1985Oxford;Washington,D.C.;IRLPressを参照されたい。ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を疎外する程度を指し、ストリンジェンシーの高さはミスマッチハイブリッドに対する許容度の低さと相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、これには温度、pH、イオン強度、および有機溶媒、例えばホルムアミドおよびジメチルスルホキシドの濃度が含まれるが、これらに限定されない。当業者には既知の通り、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、高温、低イオン強度、および低溶媒濃度によって増大する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコールの存否、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータなどの因子を変更することによって、ならびに洗浄条件を変更することによって、数多くの相当条件を用いて特定のストリンジェンシーを確立できることは、当技術分野で周知である。特定の一連のハイブリダイゼーション条件は、当技術分野における次の標準方法に従って選択することができる例えば、Sambrook,etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,1989ColdSpringHarbor,N.Y.を参照されたい。本発明を説明するために以下の実施例が含まれる。RSK2キナーゼの修飾以下の実施例は、RSK2キナーゼ遺伝子座の修飾について詳述する。RSK2キナーゼ染色体配列内に3つの異なる変異を組込むように、オリゴヌクレオチド125ntを設計した。このオリゴヌクレオチドは、1後続する非相同末端結合NHEJを防止するためのZFN結合部位中の2つの点変異、2CysをValに変換するためのTGCからGTTへの変化、および3クローンスクリーニングのための固有BamHI部位を作製するためのCからAへのサイレント変化を含んだ図1。オリゴヌクレオチドは、標準合成手順例えば、化学修飾なしを用いて作製し、PAGE精製した。RSK2キナーゼ遺伝子座を標的とするように、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼZFNを設計した。一方のZFNは、配列5’-GTATACATAAAGCTA-3’配列番号6、図1に示される左結合部位に結合するように設計し、他方のZFNは、5’-GGAGTTTGCAGTGAAGGTA-3’配列番号7、図1に示される右結合部位に結合するように設計した。ヒトK562細胞に、ZFNをコードするmRNA8μgと、オリゴヌクレオチド0.3nmolをヌクレオフェクトした。2日間のインキュベーション後、BamH1部位の存在について細胞のプールを解析した。図2に示すように、オリゴヌクレオチドおよびZFNの双方に暴露した細胞はBamH1部位を包含したが、オリゴヌクレオチドのみの導入は効果を示さなかった。組込み率は、約20~30の範囲であった。単細胞クローンを単離し、qPCRアッセイを用いてスクリーニングして、BamH1部位を包含するものを同定した図3を参照。およそ750個のクローンをスクリーニングし、約40個の陽性クローンを同定した。続いて陽性クローンを標的染色体位置周囲でPCR増幅し、BamHIで消化して、RSK2キナーゼ染色体遺伝子座の編集を確認した。配列決定データは、BamHI陽性クローンが、望ましいCysからValへのコドン変化に対しても陽性であることを明らかにした。AAVS1遺伝子座の修飾以下の実施例は、HindIII部位をAAVS1遺伝子座に導入するためのオリゴヌクレオチドの使用について詳述している。図4は、AAVS1遺伝子座の野生型配列、ならびにHindIII部位を含むセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列108ntを示している。これらのオリゴヌクレオチドは、標準手順例えば、化学修飾なしでを用いて作製し、PAGE精製した。AAVS1遺伝子座を標的とするように、一対のZFNを設計した。一方のZFNは、配列5’-ACCCCACAGTGG-3’配列番号8、図4に示される左結合部位に結合するように設計し、他方のZFNは、5’-TAGGGACAGGAT-3’配列番号9、図4に示される右結合部位に結合するように設計した。キャップされ、ポリアデニル化されたZFNをコードするmRNAを、標準手順を用いて調製した。HindIII部位を含むZFNmRNAおよびオリゴヌクレオチドをK562細胞、HCT116細胞、U2OS細胞、A549細胞、HEK293細胞、HepG2細胞、またはMSF7細胞内にヌクレオフェクトした。インキュベーション期間後、HindIII部位の存在について細胞のプールを解析した。オリゴヌクレオチドおよびZFNの双方に暴露した細胞はHindIII断片を含んだが、オリゴヌクレオチドのみで処理したものは、HindIII断片を有さなかった図5。単細胞A549クローンを単離し、qPCRアッセイを用いてスクリーニングして、HindIII部位を包含するものを同定した図6。およそ933個のクローンをスクリーニングし、308個を陽性と同定した。したがって、HindIII部位の送達率は、約33であった。続いて陽性クローンを標的染色体位置周囲でPCR増幅し、HindIIIで消化して、オリゴヌクレオチド配列の挿入を確認した。親PCR産物の位置に薄いバンドを示すクローンの配列を決定し、HindIII部位を含むことを確認した図6を参照。親PCR産物の周囲に複数の強いバンドを示すクローンは、小さいNHEJ由来の挿入を含むと仮定される。AAVSI遺伝子座の修飾-オリゴヌクレオチドの長さより短いオリゴヌクレオチドを用いてHindIII部位をAAVS1遺伝子座に送達することができるかどうかを判断するために、36~106ntの範囲の長さのオリゴヌクレオチドを調製した。例えば、106ntのオリゴヌクレオチドは、ZFN切断部位のいずれかの側の50ntに対する配列同一性を有しすなわち、50ntの相同アームを有し、相同アーム間にHindIII部位6ntを有する。オリゴヌクレオチドの配列を下記の表1に示す。K562細胞に、それぞれのAAVS1指向型ZFNをコードするプラスミドDNA2.5μg合計5μgと、100μΜオリゴヌクレオチド原料センスまたはアンチセンスのいずれか3μLとをヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション2日後に細胞を採取した。ゲノムDNAをPCR増幅し、HindIIIで消化した。図7は、様々な長さのセンス鎖AAVS1-HindIIIオリゴヌクレオチドの組込みを示す。ZFNおよびこれらのオリゴヌクレオチドのいずれの送達も組込みをもたらした。しかしながら、40nt以上を含むオリゴヌクレオチドが、より良好な組込みをもたらしたと思われる。様々な長さのアンチセンス鎖AAVS1-HindIIIオリゴヌクレオチドの組込みを図8に示す。上記の通り、これらのオリゴヌクレオチドおよびZFNのいずれへの暴露も組込みをもたらした。これらのデータは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを使用してもよいこと、また30ntの短いオリゴヌクレオチドでも組込まれることを明らかにした。ZFNをコードする核酸の種類が、挿入速度に影響を与えるかどうかを判断するために、K562細胞に、ZFNをコードする2.5μgのDNAまたは2.0μgのmRNAそれぞれ合計5μgまたは4μgと、100μΜのAAVS1-ΗindIIIオリゴヌクレオチドすなわち、50nt、60nt、または100ntの3μlとをヌクレオフェクトした。細胞をヌクレオフェクション2日後に採取した。ゲノムDNAをPCR増幅し、HindIIIで消化した。図9に示すように、RNAとしてのZFNの送達は、異なる長さを有するオリゴヌクレオチドのより良好な組込みをもたらした。推定NHEJ断片を検出するために、ZFN/オリゴヌクレオチド処理細胞にCel-1アッセイを実施した。Cel-1アッセイは、ZFN誘導性DNA二本鎖切断のNHEJ媒介性不完全修復および/または付加ヌクレオチドの挿入の結果として、野生型から逸脱した標的遺伝子座の対立遺伝子を検出する。ZFN処理細胞のプールからの標的領域のPCR増幅は、WTおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の溶融および再アニーリングは、WTのヘテロ二重鎖と変異対立遺伝子との間ミスマッチの形成をもたらす。ミスマッチの部位で形成されるDNAバブルを、サーベイヤーヌクレアーゼCel-1で切断し、切断産物をゲル電気泳動により分離することができる。親のバンドと比較した切断産物の相対強度は、ヘテロ二重鎖のCel-1切断のレベルの尺度である。この目的で、ZFN/オリゴヌクレオチド処理細胞のプールをPCR増幅し、2つの試料に分割した。一方の試料は未処理のままとし、他方の試料はCel-1酵素1μLおよびエンハンサー1μLにより、42°Cで30分間処理した。この結果は図10に示す。Cel-1断片および推定NHEJ誘導性ミスマッチ断片が、Cel-1処理細胞中に検出された。相同性がオリゴヌクレオチド媒介性組込みに要求されるA549細胞に、4μgのAAVS1標的ZFNをコードするmRNA、およびAAVS1-HindIIIオリゴヌクレオチドまたはCNR1-HindIIIオリゴヌクレオチドのいずれかをヌクレオフェクトした。オリゴヌクレオチドの各種類について、以下の形態を試験した:aセンス一本鎖、bアンチセンス一本鎖、cセンスアンチセンス、dセンス一本鎖2X、e二本鎖事前アニール。インキュベーション2日後、細胞を採取し、ゲノムDNAをPCR増幅し、その後HindIIIで消化した。図11に示すように、相同AAVS1-HindIIIオリゴヌクレオチドに暴露した細胞のみが、AAVS1遺伝子座にHindIII部位を有した。ssDNAオリゴおよびZFNによる細胞における標的ゲノム欠失一本鎖DNAオリゴヌクレオチドssODN、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを使用して、K562細胞におけるAAVS1遺伝子座で0.1kb~100kbの標的ゲノム配列を欠失させることができるかどうかを判断するために、多数のssODNを調製した。5kb、10kb、および100kbの標的AAVS1ゲノム配列を欠失させるように設計したssODNsを表2に示す。各オリゴヌクレオチドは、ZFN切断部位から特定の距離に位置するゲノム領域すなわち、遠位欠失境界または欠失終点領域に対する配列同一性を有する領域図12においてI’と指定と、ZFN切断部位近傍の適切なZFN結合部位に対応する領域図12においてIIと指定とを含んだ。標準合成手順例えば、化学修飾なしを用いてオリゴヌクレオチドを作製し、PAGE精製した。上記の表2に示す例示的ssODN配列において、下線が付いたものはZFN結合部位図12AにおいてIIと指定される領域を含む遺伝子座の核酸である。下線付きかつ太字の核酸は、AAVS1ZFNの右結合部位の認識ヌクレオチドである。太字斜体であるが下線が付いていない核酸は、遠位欠失終点図12AにおいてIと指定される領域に相補的である。図12Aは、ZFN切断部位の5’側の欠失を示す。図12Bは、ZFN切断部位の3’側の欠失を示す。一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNによる、K562におけるAAVS1遺伝子座での異なるサイズの標的ゲノムDNA欠失。K562細胞に、4μgのAAVS1指向型ZFNをコードするmRNA合計8μgと、3μLの100μΜssODNドナー:AAVS1-0.1kb、AAVS1-0.5kb、AAVS1-1kb、AAVS1-1.5kb、AAVS1-2kb、AAVS1-2.5kb、AAVS1-3kb、AAVS1-3.5kb、AAVS1-4kb、AAVS1-4.5kb、AAVS1-5kb、AAVS1-10kb、AAVS1-10.2kb、AAVS1-19.9kb、AAVS1-20kb、AAVS1-50kb、AAVS1-100kbをヌクレオフェクトした。ssODNのみまたはZFNのみをヌクレオフェクトしたK562細胞を対照として使用した。K562細胞をヌクレオフェクション2日後に採取した。遠位欠失終点の5’末端上流のフォワードプライマー、およびZFNの右結合部位の3’末端下流のリバースプライマーにより、図12Aに示すように、ゲノムDNAをPCR増幅した。同様に、図12BのZFN切断部位からの3’欠失の概略図の参照点としてZFN切断部位を使用すると、フォワードプライマーは、ZFNの結合部位の5’末端上流にあり、リバースプライマーは、遠位欠失終点の3’末端下流にある。図13において、2と表示したレーンは、オリゴヌクレオチドのみに暴露し、PCR増幅のテンプレートとしてZFNを用いないK562細胞を使用した。したがって、PCR断片は、野生型対立遺伝子欠失を含まないに由来することを示すサイズを有すると予想された。3と表示したレーンは、ZFNのみに暴露したK562細胞を使用し、したがってPCR産物は、同様に野生型対立遺伝子に由来することを示す長さを有すると予想されたまたはNHEJ産物。1と表示したレーンは、オリゴヌクレオチドおよびZFNの双方に暴露したK562細胞を使用し、したがってPCR断片は、欠失対立遺伝子から増幅され、したがって欠失されるように設計された塩基対の数だけ野生型対立遺伝子よりサイズが小さいと予想された。細胞中の意図された欠失の長さに応じて、レーン1は、野生型対立遺伝子から増幅されたPCR断片も含み得る。野生型対立遺伝子のPCR断片および欠失対立遺伝子のPCR断片の予想サイズは、図13において、各レーン群の上部に示す。PCR断片は全て予想サイズを有し、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNを用いて、約0.1kb、0.5kb、1.0kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、5.0kb、10.0kb、10.2kb、19.9kb、20kb、50kb、および100kbの標的ゲノムDNA欠失が良好に実施されたこと示した。参照点としてZFN切断部位を使用して、標的ゲノム欠失領域に対する上流3’欠失および/または下流5’欠失のZFN切断部位複数可の選択に従って、アンチセンスおよび/またはセンス一本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、特に上流ZFN切断部位の標的ゲノム欠失を媒介した。図13において、レーン群には、ZFN切断部位から3’側の欠失を示す星印付きの群、ZFN切断部位から5’側の欠失を示す星印が付いていない群、ZFN切断部位から3’側および5’側の両欠失を示す2個の星印付きの1群が含まれる。図13に示されるように、各タイプの群は、予想サイズのPCR産物を有することを示した。一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNによる、異なる細胞型におけるAAVS1遺伝子座での標的5kbゲノムDNA欠失。異なる細胞におけるAAVS1遺伝子座での標的ゲノムDNA欠失を試験するために、K562、HCT116、U2OS、A549、HEK293、HepG2、およびMCF7の各細胞プールに、4μgのAAVS1指向型ZFNをコードするmRNA合計8μgと、3μLの100μΜssODNドナー:AAVS1-5kbとをヌクレオフェクトした。ssODNのみまたはZFNのみをヌクレオフェクトした各細胞プールを対照として使用した。細胞をヌクレオフェクション2日後に採取した。標的欠失の5’末端上流のフォワードプライマー、および標的欠失の3’末端下流のリバースプライマーにより、ゲノムDNAをPCR増幅した。1と表示したレーンは、PCRテンプレートとしてのオリゴヌクレオチドおよびZFNの双方に暴露した細胞に由来するDNAであり、PCR断片は欠失対立遺伝子から増幅されたと予想され、野生型対立遺伝子PCR断片5303bpよりも5kb小さいサイズを有した。図14に示されるように、全ての細胞試料における欠失対立遺伝子のPCR断片は、予想サイズ303bpを有した。一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNによる、K562における異なる遺伝子座での標的ゲノムDNA欠失。K562細胞における異なる遺伝子座での標的ゲノムDNA欠失を試験するために、K562細胞に、16kb欠失に対して、IRAK4指向型ZFNをコードするmRNA合計8μgと、ssODNドナー3μLの100μΜ、25.2kb欠失に対して、RSK2指向型ZFNをコードするmRNA合計8μgと、ssODNドナー3μLの100μΜ、および35.0kb欠失に対して、RSK4指向型ZFNをコードするmRNA合計8μgと、ssODNドナー3μLの100μΜとをヌクレオフェクトした。ssODNのみまたはZFNのみをヌクレオフェクトした各細胞プールを対照として使用した。細胞をヌクレオフェクション2日後に採取し、ゲノムDNAを単離した。標的欠失の5’末端上流のフォワードプライマー、および標的欠失の3’末端下流のリバースプライマーにより、ゲノムDNAをPCR増幅した。1と表示したレーンは、PCRテンプレートとしてのオリゴヌクレオチドおよびZFNの双方に暴露した細胞に由来するDNAを使用し、PCR断片は欠失対立遺伝子から増幅されたと予想された。図15に示されるように、全ての細胞試料における欠失対立遺伝子PCR断片は、それぞれ、IRAK4遺伝子座に対して予想サイズ334bp、RSK2遺伝子座に対して281bp、およびRSK4遺伝子座に対して190bpを有した。一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNによる、K562におけるAAVS1遺伝子座での標的ゲノムDNA欠失の精度評価。ゲノムDNAプールのクローンのDNA配列解析を行って、一本鎖オリゴヌクレオチドおよびZFNによって媒介される標的欠失の精度のレベルを評価した。ゲノムDNAプールは、AAVS1遺伝子座におけるZFN切断部位の5’側の標的100bpを欠失するように設計される、ZFNおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露されるK562細胞から単離した。40をわずかに上回るクローンが、標的100bpの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、55をわずかに上回るクローンが、野生型対立遺伝子欠失、切断、もしくは修復を含まない、または非相同末端結合NHEJの結果としての対立遺伝子を含み、不正確な欠失すなわち、意図された5’欠失境界の追加の81bp欠失を有する対立遺伝子を有するクローンは、5未満であったデータは示さず。別の事象において、K562細胞がAAVS1遺伝子座におけるZFN切断部位の3’側の標的100bpを欠失するように設計されたZFNおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露された後に単離されたゲノムDNAプールのクローンを、DNA配列解析に供した。50をわずかに上回るクローンが、標的100bpの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、50をわずかに下回るクローンが、野生型対立遺伝子欠失、切断、もしくは修復を含まない、または非相同末端結合NHEJの結果としての対立遺伝子を含み、不正確な欠失を有する対立遺伝子を有するクローンは無かったデータは示さず。なお別の事象において、K562細胞がAAVS1遺伝子座におけるZFN切断部位の5’および3’の双方の標的100bpを欠失するように設計される、欠失に対する標的領域にわたる一対のZFN、および2組の一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露された後に単離されたゲノムDNAプールのクローンを、DNA配列解析に供した。20を上回るクローンが、ZFN切断部位の5’側の標的100bpの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、30をわずかに下回るクローンが、ZFN切断部位の3’側の標的100bpの正確な欠失を有する対立遺伝子を有し、50をわずかに下回るクローンが、野生型対立遺伝子欠失、切断、もしくは修復を含まない、または非相同末端結合NHEJの結果としての対立遺伝子を含み、ZFN切断部位の5’もしくは3’欠失のいずれに対しても不正確な欠失を有する対立遺伝子を有するクローンは無かったデータは示さず。標的ゲノムDNA欠失の単一細胞クローニング、およびK562におけるAAVS1遺伝子座でのその解析。単離された単一細胞クローンを、ゲル分析を通じて遺伝子型決定して、標的ゲノムDNA欠失が行われた遺伝子座における対立遺伝子組成を決定した。単一細胞クローンは、K562細胞が、それぞれ5kb、10kb、および100kbゲノム配列を欠失するように設計されるZFNおよび一本鎖オリゴヌクレオチドに暴露される前に、単離した。ホモ接合型欠失クローンは、クローンにおいて、2つの欠失対立遺伝子に由来する1つのサイズのPCR断片を有することが予想された。ヘテロ接合型欠失クローンは、欠失対立遺伝子、および野生型非欠失対立遺伝子を有することが予想された。野生型非欠失対立遺伝子は、2つの欠失境界の各々に隣接するプライマー対によるジャンクションPCRによって検出された。表3は、単一クローン遺伝子型決定の結果を要約する。一本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびZFNによる、細胞における同時標的ゲノム欠失および挿入図16は、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドssODNおよびZFNにより、細胞における同時標的ゲノム欠失および挿入を達成するための例示的な概略図を示す。標的欠失および挿入に対するssODN配列は、3つの領域:遠位欠失終点に相補的なヌクレオチド配列を含む領域I’図16でIと表される領域;ZFN結合部位ヌクレオチド配列を含む領域II図16でIIと表される領域;および挿入されるべきヌクレオチド配列を含む領域IIIを有する。具体的に、オリゴヌクレオチドSM271が、5kbの同時標的欠失およびloxP部位の挿入のために設計された:、loxP部位は小文字のヌクレオチド配列によって表され、ZFN結合部位は下線が付され、ZFNの右結合部位に対する認識ヌクレオチドは下線が付され、太字であり、遠位欠失終点に相補的な配列は太字斜体であるが、下線が付いていない。図16に示されるように、領域IおよびIIに隣接するPCRフォワードプライマーAおよびリバースプライマーBを使用して、標的欠失を検証し、PCRフォワードプライマーAおよびリバースプライマーCを使用して、標的挿入を検証し、プライマーCは、ZFNの右結合アームの接合部位のヌクレオチドおよび周辺ゲノムDNAを含む。図17は、プライマーAおよびBを使用して、欠失対立遺伝子レーン6:AAVS1-ZFNおよびAAVS1-5kbssODNから予想される303bpPCR断片を生じた5kb配列の標的欠失のPCR検証を示す。loxP部位の標的挿入は、プライマーAおよびCを使用したPCR断片によって検証された図17、レーン10を参照されたい。一本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびZFNによる、普遍的プラスミド挿入方法。以下の実施例は、ドナープラスミドからの対象配列をAAVS1遺伝子座に導入するためのオリゴヌクレオチドおよびZFNの使用を詳述する。概して、1つまたは2つのZFN、2つのオリゴヌクレオチドドナー、およびプラスミドドナーが、このプロセスに関与する。ZFNが、二本鎖切断DSBを作製する。2つのオリゴヌクレオチドドナーは、次いでZFN切断部位に相補的な部分を用いてDSB端に結合する。2つのオリゴヌクレオチドドナーの各5’端は、ドナープラスミド普遍的またはそうでないにおける領域に相同的である。オリゴヌクレオチドドナーの5’端における相同性は、プラスミドドナー内への侵入をもたらす。ドナープラスミドを用いてDSBが分解されると、ドナープラスミドからの所望の配列が、ZFN切断部位に導入および挿入される図22。スキームを確認するために、細胞を2つのAAVS1ZFNZ、2つのオリゴヌクレオチドドナーO、およびマウスRosa26プラスミドドナーDZODでトランスフェクトした。ZFNのみZ、オリゴヌクレオチドドナーのみO、プラスミドドナーのみD、ZFNおよびオリゴヌクレオチドドナーのみZO、ZFNおよびプラスミドドナーのみZD、オリゴヌクレオチドドナーおよびプラスミドドナーのみODでトランスフェクトした細胞を、対照として使用した。次いで、トランスフェクトした細胞を培養し、採取し、個々の細胞クローンを解析した。ジャンクションPCRを実施して、プラスミドドナーからのドナーDNAがAAVS1遺伝子座に組込まれたことを確認した。5’接合部に隣接するプライマーAAVS1Cel-F25’TTCGGGTCACCTCTCACTCC3’;配列番号25およびSM373.Junc.R15’ACCTCGAGACCGGTGGATCCGA3’;配列番号26を5’接合確認のために使用し、3’接合部に隣接するプライマーSM373.Junc.F25’GCGGTCTGAATTCGGATCCACCG3’;配列番号27およびAAVS1Cel-R25’GGCTCCATCGTAAGCAAACC3’;配列番号28を3’接合確認のために使用した。5’接合部および3’接合部における配列解析は、プラスミドドナーからのドナー配列が、細胞においてAAVS1遺伝子座へ組込まれたことを確認した。5’接合部における確認された組込みは、図18に提示される配列配列番号29によって示される。3’接合部における確認された組込みは、図19に提示される配列配列番号30によって示される。図20は、2つのZFN、2つのオリゴヌクレオチドドナー、およびプラスミドドナーZODに暴露されたクローンが、ドナー配列組込みを示す、サイズ390bpの5’接合部位PCR断片図20Aおよびサイズ309bpの3’接合部位PCR断片図20Bを含んだことを示す。標的10kbゲノムDNA欠失のオリゴ媒介ゲノム修飾における、オリゴヌクレオチド配列同一性の効果ゲノム配列上の相同的部位に対するオリゴヌクレオチドDNAの配列同一性が、標的ゲノム配列欠失の効率に影響するかどうかを調査するために、オリゴヌクレオチド配列を、AAVS1ZFN切断部位から遠位欠失境界10kbに対応するセグメント上で改変し、100の同一性、98の配列同一性、90の配列同一性、50の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、10kb欠失の効率をSYBRGreenリアルタイムPCRによって測定した図21。100の同一性と98の同一性との間のΔCtは0.4であり、100の同一性と90の同一性との間のΔCtは5であり、100の同一性と50の同一性との間のΔCtは7であった。欠失効率は、100の同一性を有するオリゴヌクレオチドと98の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドとの間で同等であった。欠失の効率は、配列同一性が90まで低下した時に減少し、効率は、配列同一性が50以下の時にわずかに低下した。"