"胚、デンプン、および1、2または3個のSBEIIaタンパク質を含んでなるコムギ穀粒Triticumaestivumにおいて、前記胚が、SBEIIa-A遺伝子の2個の同一対立遺伝子、SBEIIa-B遺伝子の2個の同一対立遺伝子、およびSBEIIa-D遺伝子の2個の同一対立遺伝子を含んでなり、前記デンプンが、穀粒の抽出可能デンプンの比率として、少なくとも50w/wのアミロース含有量を有し、前記SBEIIaタンパク質の少なくとも1つが発生中のコムギ内胚乳で生成されてデンプン分枝酵素活性を有することを特徴とするコムギ穀粒。請求項1に記載の穀粒において、前記穀粒が、ウエスタンブロット分析による判定で1種のSBEIIaタンパク質のみを有し、前記タンパク質が、発生中のコムギ内胚乳で生成されると、SBEIIa-A、SBEIIa-B、およびSBEIIa-D遺伝子の1つによってコードされてデンプン分枝酵素活性を有することを特徴とする穀粒。請求項1または2に記載の穀粒において、前記胚が、SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B、およびSBEIIb-Dからなる群から選択される、SBEIIa遺伝子の5~12個の対立遺伝子のそれぞれに機能喪失変異を含んでなり、前記5~12個の対立遺伝子が、それぞれ機能喪失変異を含んでなる4個または6個のSBEIIa対立遺伝子を含んでなり、その中で機能喪失変異を含んでなるSBEIIa対立遺伝子数が4個のみであれば、機能喪失変異を含んでなるSBEIIb対立遺伝子数は6個であり、機能喪失変異を含んでなるSBEIIa対立遺伝子数が6個であれば、少なくとも2個のこのような対立遺伝子は、発生中の内胚乳で生成されると、デンプン分枝酵素活性を有するSBEIIaタンパク質をコードすることを特徴とする穀粒。請求項1~3のいずれか一項に記載の穀粒において、前記胚が、SBEIIa遺伝子のnull対立遺伝子を2個のみまたは4個のみ有することを特徴とする穀粒。請求項1~4のいずれか一項に記載の穀粒において、前記胚が、SBEIIb遺伝子のnull対立遺伝子を有さず、またはSBEIIb遺伝子のnull対立遺伝子を2個のみ、4個または6個のみ有することを特徴とする穀粒。請求項1~5のいずれか一項に記載の穀粒において、Aゲノム、Bゲノム、Dゲノム、AおよびBゲノム、AおよびDゲノム、BおよびDゲノム上の前記SBEIIa遺伝子のnull対立遺伝子、および/またはAゲノム、Bゲノム、Dゲノム、AおよびBゲノム、AおよびDゲノム、BおよびDゲノム、またはA、B、およびDゲノムの3つ全ての上の前記SBEIIb遺伝子のnull対立遺伝子を含んでなることを特徴とする穀粒。請求項1~6のいずれか一項に記載の穀粒において、発生中の内胚乳で生成されるとデンプン分枝酵素活性を有する、SBEIIbタンパク質を1種のみまたは2種のみ含んでなる、またはウエスタンブロット分析によって検出可能なSBEIIbタンパク質を1種のみまたは2種のみ含んでなることを特徴とする穀粒。請求項7に記載の穀粒において、前記1種のSBEIIbタンパク質が、前記Aゲノム、BゲノムまたはDゲノムによってコードされ、または前記2種のSBEIIbタンパク質が、前記AおよびBゲノム、AおよびDゲノムまたはBおよびDゲノムによってコードされることを特徴とする穀粒。請求項1~8のいずれか一項に記載の穀粒において、SBEIIa遺伝子の少なくとも一部とSBEIIb遺伝子の少なくとも一部を欠失させ、好ましくはSBEIIa遺伝子および/またはSBEIIb遺伝子の全てを欠失させる、前記A、BまたはDゲノム中の欠失変異である、null変異を含んでなることを特徴とする穀粒。請求項1または2に記載の穀粒において、アミノ酸置換変異である、null変異を含んでなることを特徴とする穀粒。請求項1または2に記載の穀粒において、少なくとも1個のnull変異を含有し、各null変異が、欠失変異、挿入変異、スプライス部位変異、翻訳早期終止変異、およびフレームシフト変異からなる群から独立して選択されることを特徴とする穀粒。請求項1~11のいずれか一項に記載の穀粒において、発生中の内胚乳で発現されるとデンプン分枝活性を有するSBEIIaタンパク質の少なくとも1つが、対応する野生型遺伝子によって発現される前記タンパク質のデンプン分枝酵素の量または活性の2~60、または10~50の量および/または活性を有することを特徴とする穀粒。請求項1~12のいずれか一項に記載の穀粒において、前記穀粒中の全SBEIIタンパク質の量または活性が、野生型コムギ穀粒中の全SBEIIタンパク質の量または活性の2~30、または2~15、または3~10、または2~20、または2~25であることを特徴とする穀粒。請求項1~13のいずれか一項に記載の穀粒において、前記穀粒中のSBEIIaタンパク質の量または活性が、野生型コムギ穀粒中のSBEIIaタンパク質の量または活性の2~30、または2~15、または3~10、または2~20、または2~25であることを特徴とする穀粒。請求項1~14のいずれか一項に記載のコムギ穀粒において、穀粒の抽出可能デンプンの比率として、少なくとも60w/wまたは少なくとも67w/wのアミロース含有量を有することを特徴とするコムギ穀粒。請求項1~15のいずれか一項に記載の穀粒において、非遺伝子組換えであり、またはSBEIIa遺伝子の発現を低下させるRNAをコードするいかなる外来性核酸も含まないことを特徴とする穀粒。請求項1~16のいずれか一項に記載の穀粒において、少なくとも1個、2個以上、または全ての変異が、i導入変異であり、ii化学薬剤、生物剤または照射などの変異誘発物質による変異誘発によって親コムギ植物または種子に導入され、またはiii前記植物ゲノムを修飾するために導入されることを特徴とする穀粒。請求項1~17のいずれか一項に記載の穀粒において、前記穀粒が、標準条件下の対照または野生型穀粒の発芽率と比較して、約70~約90、または約90~約100の発芽率を有することを特徴とする穀粒。請求項1~18のいずれか一項に記載の穀粒において、前記SBEII活性またはSBEIIa活性が、免疫学的手段または別の手段によって、コムギ植物中で発生中の穀粒中の前記酵素活性をアッセイすることにより、または収穫穀粒中のSBEIIタンパク質またはSBEIIaタンパク質の量をアッセイすることにより判定されることを特徴とする穀粒。請求項1~19のいずれか一項に記載の穀粒において、前記穀粒のデンプンが、i少なくとも2の難消化性デンプンを含んでなる;ii低い相対血糖指数GIを含んでなる;iii低い相対アミロペクチンレベルを含んでなる;iv歪んだデンプン顆粒;v顆粒複屈折の低下;vi膨潤体積の低下;vii鎖長分布および/または分枝発生頻度の修正;viii糊化温度の終了遅延およびより高いピーク温度;ix粘度低下ピーク粘度、糊化開始温度など;xアミロペクチンの分子量増大;およびxi野生型コムギデンプン顆粒またはデンプンと比較して修正された、結晶化度、A型またはB型デンプンからなる群から選択される、1つまたは複数の特性によって特徴付けられることを特徴とする穀粒。請求項1~20のいずれか一項に記載の穀粒において、コムギ植物に含まれることを特徴とする穀粒。請求項1~21のいずれか一項に記載の穀粒において、発生中の穀粒であることを特徴とする穀粒。請求項1~20のいずれか一項に記載の穀粒において、成熟した収穫穀粒であることを特徴とする穀粒。請求項1~20のいずれか一項に記載の穀粒において、粗挽き、挽き割り、湯通し、圧延、パール加工、製粉または粉砕穀粒などのように、それがもはや発芽できないように処理されることを特徴とする穀粒。請求項1~20のいずれか一項に記載の穀粒を産生することを特徴とするコムギ植物。請求項25に記載のコムギ植物において、雄性および雌性稔性であることを特徴とするコムギ植物。請求項1~20または請求項23のいずれか一項に記載の穀粒から製造されることを特徴とする、全粒小麦または小麦粉。請求項1~24のいずれか一項に記載の穀粒から製造されることを特徴とする、コムギデンプン顆粒またはコムギデンプン。請求項28に記載のデンプン顆粒またはデンプンにおいて、前記デンプンの比率として、少なくとも50w/w、または少なくとも60w/w、または少なくとも67w/wのアミロースを含んでなり、i野生型コムギデンプン顆粒またはデンプンと比較して2~30の量の全SBEIIまたはSBEIIaを含んでなる;ii少なくとも2の難消化性デンプンを含んでなる;iii低い相対血糖指数GIを含んでなる;iv低い相対アミロペクチンレベルを含んでなる;v歪んだデンプン顆粒;vi顆粒複屈折の低下;vii膨潤体積の低下;viii鎖長分布および/または分枝発生頻度の修正;ix糊化温度の終了遅延およびより高いピーク温度;x粘度低下ピーク粘度、糊化開始温度など;xiアミロペクチンの分子量増大;および/またはxii野生型コムギデンプン顆粒またはデンプンと比較して修正された、結晶化度、A型またはB型デンプンの1つまたは複数によって特徴付けられることを特徴とするデンプン顆粒またはデンプン。請求項1~24のいずれか一項に記載の穀粒、請求項27に記載の全粒小麦または小麦粉、請求項28または請求項29に記載のデンプン顆粒またはデンプンを含んでなることを特徴とする、食品成分。請求項30に記載の食品成分において、前記穀粒が、粗挽き、挽き割り、湯通し、圧延、パール加工、製粉または粉砕穀粒である、またはこれらの任意の組み合わせであることを特徴とする食品成分。乾燥重量基準で少なくとも10のレベルの食品または飲料成分を含んでなり、前記成分が請求項1~24のいずれか一項に記載のコムギ穀粒、請求項27に記載の全粒小麦または小麦粉、または請求項28または請求項29に記載のデンプン顆粒またはデンプンであることを特徴とする、食品または飲料製品。少なくとも10重量のレベルの請求項1~24のいずれか一項に記載の穀粒、または請求項27に記載の全粒小麦または小麦粉と、または請求項28または請求項29に記載のコムギデンプン顆粒またはコムギデンプンと、約50w/wよりも低いアミロースレベルを有するコムギ穀粒と、またはそれから得られる小麦粉、全粒小麦、デンプン顆粒またはデンプンとを含んでなることを特徴とする、組成物または混合物。iSBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B、およびSBEIIb-Dからなる群から選択される、1、2または3個のSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子のそれぞれにnull変異をそれぞれ含んでなる2つの親コムギ植物を交雑し、または前記null変異を含んでなる親植物を変異誘発するステップと;ii前記植物または穀粒からのDNA、RNA、タンパク質、デンプン顆粒またはデンプンを分析することによって、交雑または変異誘発から得られた植物または穀粒、またはそれから得られた子孫植物または穀粒をスクリーニングするステップと;iiiその穀粒中で、野生型穀粒中のそれぞれのタンパク質量または活性の2~30の全SBEIIまたはSBEIIa量または活性を呈示する稔性植物を選択するステップとを含んでなる、前記穀粒中の全デンプンの比率として、少なくとも50w/w、または少なくとも60w/w、または少なくとも67w/wのアミロース含有量を含んでなる、穀粒を産生する、コムギ植物を産生することを特徴とする方法。請求項34に記載の方法において、前記選択された稔性コムギ植物の穀粒が、請求項の1~24のいずれか一項に記載の特性によって特徴付けられることを特徴とする方法。i野生型または対照植物または穀粒の量または活性と比較して、SBEIIaおよび/またはSBEIIbの量または活性を判定するステップと、野生型植物または穀粒中の全SBEIIまたはSBEIIaタンパク質の2~30の量または活性を有する植物または穀粒を選択するステップとを含んでなることを特徴とする、コムギ植物または穀粒をスクリーニングする方法。i請求項1~24のいずれか一項に記載の穀粒を得るステップと、ii前記穀粒を加工して食品または飲料成分を製造するステップと、iiiiiからの食品または飲料成分を別の食品または飲料成分に添加して、それによって食品または飲料を製造するステップとを含んでなることを特徴とする、食品または飲料を製造する方法。請求項1~24のいずれか1つに記載の穀粒、または請求項32に記載の食品または飲料製品を対象に提供するステップを含んでなることを特徴とする、それを必要とする対象において、代謝健康、腸健康または心臓血管健康の1つまたは複数のパラメータを改善し、または糖尿病、腸疾患または心血管疾患などの代謝障害の重症度または発生を予防しまたは低下させる方法。請求項32に記載の食品または飲料製品において、対象において、代謝健康、腸健康または心臓血管健康の1つまたは複数のパラメータを改善し、または代謝、腸または心血管疾患の重症度または発生を予防しまたは低下させるのに使用されることを特徴とする食品または飲料製品。i請求項25または26に記載のコムギ植物を得るステップと、ii前記植物からコムギ穀粒を収穫するステップと、iii任意選択的に、前記穀粒を加工するステップを含んでなることを特徴とする、穀粒を生産する方法。i請求項1~25のいずれか一項に記載のコムギ穀粒を得るステップと、ii前記穀粒からデンプンを抽出して、それによってデンプンを製造するステップとを含んでなることを特徴とする、デンプンを製造する方法。請求項1~23のいずれか一項に記載のコムギ穀粒を得るステップと、得られたコムギ穀粒を金銭上の利益のために取引するステップとを含んでなることを特徴とする、コムギ穀粒を取引する方法。請求項44に記載の方法において、前記コムギ穀粒を得る方法が、前記コムギ穀粒を栽培または収穫するステップを含んでなることを特徴とする方法。請求項45に記載の方法において、前記コムギ穀粒を得る方法が、前記コムギ穀粒を保存するステップをさらに含んでなることを特徴とする方法。請求項45または46に記載の方法において、前記コムギ穀粒を得る方法が、前記コムギ穀粒を異なる場所に輸送するステップをさらに含んでなることを特徴とする方法。本発明は、植物全体にわたりSBEIIa活性を完全に欠くコムギ植物は、それらを生成するようにデザインされた交雑種中で回収され得ず、実際に、完全なSBEIIaの欠如は、種子発生および/または稔性にとって致命的であると結論付けられた、本明細書に記載される実験における観察に一部基づいている。以前の研究は、SBEIIa中の単一null変異株が、コムギ中で容易に得られ得て、稔性であることを示していたので、これは驚くべきことであった。さらに、正常な生育し得る種子を産生するために、コムギ植物中で保持される必要がある最小レベルのSBEIIa活性が、野生型レベルの約2であることが観察された。特に、野生型穀粒と同様の率で発芽する、表現型的に正常な雄性および雌性稔性植物および穀粒を得るために、変異SBEIIa遺伝子を組み合わせる上で、SBEIIa遺伝子中に少なくとも1個の点変異を含んでなる変異植物および穀粒が、各SBEIIa遺伝子に欠失を有する植物および穀粒より有利であることもまた観察された。この観察の1つの可能な説明は、欠失が、SBEIIa遺伝子に隣接する重要な遺伝要素を除去しがちなことである。難消化性デンプン量および関連した健康上の利点が実質的に増大するレベルである、少なくとも50w/wのアミロース含有量を穀粒デンプン中で得るためには、穀粒中の全SBEII活性、具体的にはSBEIIa活性を野生型レベルの30未満に低下させることが必要であることもまた観察された。さらに六倍体コムギ中では、3個の各同祖SBEIIa遺伝子からの、または少なくとも2個の同祖SBEIIa遺伝子からの、および2または3個の同祖SBEIIb遺伝子からの、SBEIIタンパク質のレベルおよび/または活性の低下が、2個の同祖SBEIIa遺伝子中にnull変異を有する植物と比較して、コムギ内胚乳のデンプン中のアミロース比の実質的非線形増大をもたらすと判定された。六倍体コムギの穀粒中のアミロース含有量とSBEIIレベル間のこの非直線関係は、図5および6に図示される。A、B、およびDゲノムからのSBEIIaおよび/またはSBEIIb対立遺伝子の組み合わせ中の部分的および完全機能喪失変異を研究することで、デンプン特性の調節における複数SBEII遺伝子の役割が確立された。具体的には、非常に高レベルのアミロースを有する稔性コムギ植物を得るのに必要な、変異対立遺伝子数および変異対立遺伝子の組み合わせが調査され、判定された。コムギをはじめとする高等植物の内胚乳中のデンプン合成は、4つの重要な段階を触媒する一連の酵素によって行われる。第1に、ADP-グルコースピロホスホリラーゼEC2.7.7.27が、G-1-PおよびATPからのADP-グルコースの合成を通じて、デンプンのモノマー前駆体を活性化する。第2に、活性化グルコシル供与体であるADP-グルコースが、デンプンシンターゼEC2.4.1.24によって、既存のα1-4結合の非還元末端に移転される。第3に、デンプン分枝酵素が、α1-4結合グルカン領域の切断を通じて分岐点を導入し、受容鎖への切断鎖の移動がそれに続いて、新しいα1-6結合が形成する。デンプン分枝酵素は、α-ポリグルカンにα1-6結合を導入し得る唯一の酵素であり、そのためアミロペクチンの形成において重要な役割を果たす。第4に、デンプン脱分枝酵素EC2.4.4.18が、分枝結合のいくつかを除去する。デンプンは、コムギをはじめとする穀類などの植物における主要貯蔵炭水化物である。デンプンはアミロプラスト中で合成されて顆粒に成形され、穀粒などの発生中貯蔵器官中で貯蔵される。これは本明細書において、貯蔵デンプンまたは穀粒デンプンと称される。穀類の穀粒中では、貯蔵デンプンの大部分は内胚乳に蓄積する。デンプンは、本明細書において、α1-4およびα1-6結合の双方の組み合わせを通じて重合した、グルコピラノース単位から構成される多糖類と定義される。デンプンの多分散分子は、それらの重合度DPおよびα1-6とα1-4結合の比率に基づいて、アミロースおよびアミロペクチンとして知られる、2つの構成要素画分に属すると分類される。コムギをはじめとする、野生型穀類植物からの穀粒デンプンは、約20~30のアミロースおよび約70~80のアミロペクチンを含んでなる。本明細書においてアミロースは、時に真のアミロースと称される、α1,4結合したグルコシドグルコピラノース単位の本質的に直鎖の分子と、時に中間体物質またはアミロース様アミロペクチンと称され、ヨウ素滴定アッセイにおいて真のアミロースと共にヨウ素結合物質として出現する、アミロース様長鎖デンプンとを含むと定義されるTakedaetal.,1993b;Fergason,1994。典型的に、真のアミロース中の直鎖分子は500~5000のDPを有し、1未満のα1-6結合を含有する。最近の研究は、アミロース中に約0.1のα1-6-グリコシド分枝部位が現れることもあることを示し、そのため本質的に直鎖と記述される。対照的に、アミロペクチンはDPが5000~50,000の範囲にわたり、4~5のα1-6結合を含有する、はるかにより大きい分子である。したがってアミロペクチン分子は、より高度に分枝している。アミロースが、分子量約104~約106ダルトンの螺旋立体構造を有するのに対し、アミロペクチンは、約107~約108ダルトンの分子量を有する。これらの2種類のデンプンは、当該技術分野で周知の方法によって容易に区別され得て、または分離され得る。本明細書で定義されるデンプン中のアミロース比は、重量/重量w/w基準であり、すなわちアミロースおよびアミロペクチン画分への分画前のデンプンと比較した、穀粒から抽出可能な全デンプン重量の百分率としてのアミロース重量である。デンプン中のアミロース比およびアミロース含有量という用語は、本明細書において本発明の穀粒、小麦粉またはその他の製品の文脈で使用される場合、本質的に同義である。アミロース含有量は、例えば90w/vDMSO中のサイズ排除高速液体クロマトグラフィーHPLC、コンカナバリンA法MegazymeInt,Irelandをはじめとする、当該技術分野で公知の方法のいずれかによって、または好ましくは例えば実施例1に記載されるヨウ素滴定法によって、測定されてもよい。HPLC法は、デンプンの脱分枝を伴ってもよくBateyandCurtin,1996、または伴わなくてもよい。真のアミロースのみをアッセイするBateyandCurtin,1996のHPLC法などの方法は、本明細書で定義されるアミロース含有量を過小評価することもあることが理解されるであろう。HPLCまたはゲル透過クロマトグラフィーなどの方法が、デンプンのアミロースおよびアミロペクチン画分への分画に依存するのに対し、ヨウ素滴定法は差次的ヨウ素結合に依存するので、分画は必要ない。穀粒重量およびアミロース含有量から、穀粒あたりの蓄積アミロース量を計算して、試験および対照系統を比較し得る。デンプンは最初に、植物の葉およびその他の緑色組織中で、光合成産物として合成され蓄積される。このデンプンは、種子または塊茎デンプンとは対照的に、日中に光合成組織の色素体中に蓄積し、少なくとも夜間に分解するために、本明細書において移動デンプンなどと称される。夜間、移動デンプンは糖類に加水分解され、それは植物成長で使用されるために、代謝のためのエネルギー源として、または貯蔵デンプンとしての組織内貯蔵のために、主にスクロースとして供給組織からシンク組織に輸送される。本明細書の用法では、デンプンシンターゼとは、ADP-グルコースを既存のα1-4結合の非還元末端に移動させる酵素を意味する。穀類の内胚乳中には、デンプン顆粒内だけに局在するイソ型である顆粒結合デンプンシンターゼGBSS、顆粒と可溶性画分との間で分配される2つの形態SSI,Lietal.,1999a;SSII,Lietal.,1999b、および可溶性画分SSIII中に全てが位置する第4の形態Caoetal.,2000;Lietal.,1999b;Lietal.,2000の4クラスのデンプンシンターゼが見られる。GBSSは、アミロース合成に必須であることが示されておりShureetal.,1983、SSIIおよびSSIII中の変異はアミロペクチン構造を変化させることが示されているGaoetal.,1998;Craigetal,1998。穀類中のGBSSを欠く変異株は、真のアミロースもまた欠いており、したがってアミロペクチンのみを蓄積する。これらは、一般にワキシー変異株と称される。SSI活性の役割を定義する変異については、記載されていない。アミロペクチン合成はアミロース合成よりも複雑であり、GBSS以外のデンプンシンターゼ、複数のデンプン分枝酵素、および脱分枝酵素の組み合わせを必要とする。本明細書の用法では、脱分枝酵素とは、デンプン分枝酵素によって形成された、アミロペクチン枝のいくつかを除去する酵素を意味する。高等植物中には、イソアミラーゼ型脱分枝酵素とプルラナーゼ型脱分枝酵素の2種類の脱分枝酵素が存在し、それらの基質特異性に基づいて定義されるMyersetal.,2000。トウモロコシおよびイネのSugary-1変異は、双方の脱分枝酵素の欠損と関連付けられているがJamesetal.,1995;Kuboetal.,1999、原因変異は、イソアミラーゼ型脱分枝酵素遺伝子と同一位置にマッピングされる。コムギをはじめとする穀類からのデンプン分枝酵素をコードする遺伝子の例を表1に示す。本明細書の用法では、デンプン分枝酵素とは、グルコース残基鎖の間にα-1,6グリコシド結合を導入する酵素を意味するEC2.4.1.18。発生中の穀類内胚乳をはじめとする、イネ、トウモロコシ、オオムギ、およびコムギなどの穀類中で、3形態のデンプン分枝酵素、すなわちデンプン分枝酵素ISBEI、デンプン分枝酵素IIaSBEIIa、およびデンプン分枝酵素IIbSBEIIbHedmanandBoyer,1982;BoyerandPreiss,1978;Mizunoetal.,1992,Sunetal.,1997が発現される。これらの酵素をコードする遺伝子のゲノム配列およびcDNA配列は、イネ、オオムギ、およびコムギで特性解析されている表1。配列アラインメントは、ヌクレオチドおよびアミノ酸の双方のレベルにおける高度な配列類似性だけでなく、配列の相違を明らかにし、SBEI、SBEIIa、およびSBEIIbクラスに分類できるようにする。あらゆる1つの種からのSBEIIaおよびSBEIIbは、特に遺伝子の中心領域において、概して互いに約80のアミノ酸配列同一性を呈示する。SBEIIaおよびSBEIIbはまた、それらの発現パターンによって区別されてもよいが、これは異なる種において異なる。トウモロコシでは、SBEIIbが内胚乳で最も高度に発現される一方で、SBEIIaは植物の全ての組織に存在する。オオムギでは、SBEIIaおよびSBEIIbの双方が、内胚乳にほぼ等量で存在するのに対し、コムギ内胚乳では、SBEIIaがSBEIIbよりも約4倍より高度に発現される。したがって穀類種は、SBEIIaおよびSBEIIb発現においてかなり大きい相違を示し、1つの種から引き出された結論は、別種には容易に適用され得ない。コムギでは、SBEIIaおよびSBEIIbタンパク質はサイズが異なり下記参照、これはそれらを区別する都合良い方法である。また特異的抗体を使用して、それらを区別してもよい。トウモロコシでは、高アミロース表現型は、amyloseextenderae遺伝子としてもまた知られている、SBEIIb遺伝子の損傷から得られることが示されているBoyerandPreiss,1981,Mizunoetal.,1993;Nishietal.,2001。これらのSBEIIb変異体では、内胚乳デンプン穀粒が異常な形態を示し、アミロース含有量が顕著に上昇して、残留アミロペクチンの分枝発生頻度が低下し、短鎖<DP17、特にDP8-12の比率がより低かった。さらにデンプンの糊化温度が増大した。これに加えて、アミロースとアミロペクチンの中間体と定義される物質のかなり大きいプールがあった。Boyeretal.,1980;Takeda,etal.,1993b。対照的に、SBEIIa遺伝子が変異しているトウモロコシ植物では、葉のデンプンは変化したが、mutatorMu挿入因子と、その結果SBEIIaタンパク質発現を欠くために、内胚乳デンプンの分枝において野生型植物から識別不能であったBlauthetal.,2001。同様に、SBEIIa活性を欠くイネ植物が、内胚乳中のアミロペクチン鎖プロファイルの有意な変化を示さなかったNakamura,2002のに対し、SBEIIbの変異体は、インディカ種背景で最高およそ35、ジャポニカ種背景で最高25~30のアミロースレベルの中程度の増大を示したMizunoetal.,1993;Nishietal.,2001。トウモロコシとイネの双方で、SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子は、ゲノム中で連鎖しない。オオムギでは、内胚乳中のSBEIIaおよびSBEIIb発現の双方を低下させる遺伝子サイレンシングコンストラクトを使用して、高アミロースオオムギ穀粒が作成されたReginaetal.,2010。発生中のコムギ内胚乳中では、SBEIMorelletal,1997が可溶性画分アミロプラストストロマのみに見られる一方、SBEIIaおよびSBEIIbは、内胚乳中の可溶性画分およびデンプン顆粒結合画分の双方に見られるRahmanetal.,1995。コムギでは、明白な遺伝子複製事象が、各ゲノム中のSBEI遺伝子数を増大させたRahmanetal.,1999。A、B、およびDゲノムからのSBEI遺伝子の最高発現形態における変異の組み合わせによる、97を超えるSBEI活性の除去は、デンプン構造または機能性に測定可能な影響を及ぼさなかったReginaetal.,2004。対照的に、コムギ中の遺伝子サイレンシングコンストラクトによるSBEIIa発現の低下が、高アミロースレベル>70をもたらした一方、SBEIIb発現を低下させるがSBEIIaを低下させない対応するコンストラクトの影響は、最小であったReginaetal.,2006。デンプン分枝酵素SBE活性は、例えばホスホリラーゼ刺激アッセイなどの酵素アッセイによって測定されてもよいBoyerandPreiss,1978。このアッセイは、ホスホリラーゼAによるメタノール不溶性ポリマーα-D-グルカンへのグルコース-1-リン酸組み込みの、SBEによる刺激を測定する。SBE活性は、ポリマー分枝から生じるグルカン-ポリヨード複合体の吸光度の低下を測定する、ヨウ素染色アッセイによって測定され得る。SBE活性はまた、イソアミラーゼisoamylose消化に続いて、基質としての還元アミロースからの還元末端の生成を測定する、分枝連鎖アッセイによってアッセイし得たTakedaetal.,1993a。好ましくは、活性はSBEI活性の不在下で測定される。SBEのイソ型は異なる基質特異性を示し、例えばSBEIがアミロースの分枝においてより高い活性を示すのに対し、SBEIIaおよびSBEIIbはアミロペクチン基質に対してより高い分枝率を示す。イソ型はまた、それが移入されるグルカン鎖の長さに基づいて区別されてもよい。SBEタンパク質はまた、本明細書に記載されるものなどの特異的抗体を使用して測定されてもよい。SBEII活性は、穀粒の成長中に、発生中の内胚乳で測定されてもよい。代案としては、SBEIIレベルは、タンパク質がなおも存在し、免疫学的方法によってアッセイされ得る成熟穀粒中で測定される。いくつかの実施形態では、SBEIIまたはSBEIIaのレベルまたは活性は、ノーザンブロットまたはRT-PCR分析などにより転写物レベルを評価することで、評価されてもよい。好ましい方法では、穀粒中または発生中の内胚乳中のSBEIIaタンパク質の量は、電気泳動によってゲル上で穀粒/内胚乳の抽出物中のタンパク質を分離して、次にウエスタンブロット法によってタンパク質を膜に移し、それに続いて特異的抗体を使用して膜上でタンパク質を定量的検出するウエスタンブロット分析ことで測定される。これは実施例11に例示される。本明細書で示されるように、発生中の六倍体コムギ内胚乳は、A、B、およびDゲノムのそれぞれから、SBEIIaおよびSBEIIbを発現する。四倍体コムギは、AおよびBゲノムのそれぞれから、SBEIIaおよびSBEIIbを発現する。本明細書の用法では、Aゲノムから発現されるSBEIIaまたはSBEIIa-Aとは、そのアミノ酸配列が配列番号1で記載される、または配列番号1で記載されるアミノ酸配列と少なくとも99同一である、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。配列番号1のアミノ酸配列GenBank受入番号CAA72154は、野生型SBEIIa-Aの参照配列として、本明細書で使用されるコムギのAゲノムから発現されるSBEIIaに対応する。配列番号1のタンパク質は、823アミノ酸長である。この酵素の活性変種は、例えば栽培品種Cheyenneであるコムギ中に存在する。配列番号1と99.88822/823同一である受入番号AF286319を参照されたい。このような変種は、配列番号1に関して本質的に野生型デンプン分枝酵素活性を有するという条件で、SBEIIa-Aに含まれる。本明細書の用法では、Bゲノムから発現されるSBEIIaまたはSBEIIa-Bとは、そのアミノ酸配列が配列番号2で記載される、または配列番号2で記載されるアミノ酸配列と少なくとも99同一である、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。配列番号2のアミノ酸配列GenBank受入番号CAR95900は、野生型SBEIIa-Bの参照配列として、本明細書で使用される変種ChineseSpringのBゲノムから発現されるSBEIIaに対応する。配列番号2のタンパク質は、823アミノ酸長である。この酵素の活性変種はコムギ中に存在してもよく、配列番号2に関して本質的に野生型デンプン分枝酵素活性を有するという条件、でSBEIIa-Bに含まれる。配列番号2は、配列番号1と98.42811/824同一である。図1のアミノ酸配列の配列比較は、タンパク質を区別するのに、またはSBEIIa-AまたはSBEIIa-Bとして変種を分類するのに使用されてもよい、アミノ酸の差異を示す。本明細書の用法では、Dゲノムから発現されるSBEIIaまたはSBEIIa-Dとは、そのアミノ酸配列が配列番号3で記載される、または配列番号3で記載されるアミノ酸配列と少なくとも98同一である、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。配列番号3のアミノ酸配列GenBank受入番号AAK26821は、野生型SBEIIa-Dの参照配列として本明細書で使用される、六倍体コムギのDゲノムの祖先であると思われるタルホコムギA.tauschiiのDゲノムから発現されるSBEIIaに対応する。配列番号3のタンパク質は、819アミノ酸長である。この酵素の活性変種はコムギ中に存在してもよく、それらが配列番号3に関して本質的に野生型のデンプン分枝酵素活性を有するという条件で、SBEIIa-Dに含まれる。配列番号3は配列番号1と97.57803/823同一であり、配列番号2と97.81805/823同一である。図1のアミノ酸配列の配列比較は、タンパク質を区別するのに、またはSBEIIa-A、SBEIIa-BまたはSBEIIa-Dとして変種を分類するのに使用されてもよい、アミノ酸の差異を示す。この文脈で、例えばBlastnによって、同一性百分率を判定するためにアミノ酸配列を比較する場合は、完全長配列を比較すべきであり、配列中のギャップは、アミノ酸の相違として数えられる。本明細書の用法では、SBEIIaタンパク質は、デンプン分枝酵素活性が低下しまたは皆無であるタンパク質変種、ならびに本質的に野生型の酵素活性を有するタンパク質を含む。SBEIIaタンパク質が、穀粒中に、具体的には一般に商業的に収穫されているが、穀粒の生理学的条件のために非活性状態にある休眠穀粒中に、存在してもよいこともまた理解される。このようなタンパク質は、本明細書の用法ではSBEIIaタンパク質に含まれる。SBEIIaタンパク質は、穀粒発生中の一時期のみにおいて、特に貯蔵デンプンが典型的に蓄積されるが、その他の点では非活性状態にある発生中の内胚乳において、酵素的に活性であってもよい。このようなSBEIIaタンパク質は、ウエスタンブロット分析などの免疫学的方法を使用して、容易に検出され定量化されてもよい。SBEIIbタンパク質は、本明細書の用法では類似した意味を有する。本明細書の用法では、Aゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-Aとは、配列番号4で記載される、または配列番号4で記載されるアミノ酸配列と少なくとも98同一であるアミノ酸配列を含んでなる、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。配列番号4のアミノ酸配列は、野生型SBEIIb-Aの参照配列として本明細書で使用される、コムギゲノムから発現されるSBEIIbのアミノ末端配列に対応する。本明細書の用法では、Bゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-Bとは、配列番号5で記載される、または配列番号5で記載されるアミノ酸配列と少なくとも98同一であるアミノ酸配列を含んでなる、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。野生型SBEIIb-Bの参照配列として本明細書で使用されるアミノ酸配列番号5は、コムギのSBEIIb-B遺伝子のエクソン2~3によってコードされる、部分的アミノ酸配列である。変種SBEIIb-B配列は、栽培変種ChineseSpringから単離された、受入番号AK335378のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列である。本明細書の用法では、Dゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-Dとは、そのアミノ酸配列が配列番号6で記載される、または配列番号6で記載されるアミノ酸配列と少なくとも98同一である、またはこのような配列を含んでなる、デンプン分枝酵素を意味する。配列番号6のアミノ酸配列GenBank受入番号AAW80631は、六倍体コムギのDゲノムの祖先であると思われ、野生型SBEIIb-Dの参照配列として本明細書で使用されるタルホコムギA.tauschiiのDゲノムから発現されるSBEIIbに対応する。この酵素の活性変種はコムギ中に存在してもよく、それらが配列番号6に関して本質的に野生型のデンプン分枝酵素活性を有するという条件で、SBEIIb-Dに含まれる。例えば米国特許出願公開第20050074891号明細書の配列番号4は、第1のメチオニンに始まって、本出願の配列番号6と99.5同一である、SBEIIb-Dタンパク質のアミノ酸配列を示す。図2のアミノ酸配列の配列比較は、SBEIIbタンパク質を区別するのに、またはSBEIIb-A、SBEIIb-BまたはSBEIIb-Dとして変種を分類するのに使用されてもよい、アミノ酸の差異を示す。したがってSBEIIa-Aに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号1で記載されるデンプン分枝酵素を意味し;SBEIIa-Bに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号2で記載されるデンプン分枝酵素を意味し;SBEIIa-Dに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号3で記載されるデンプン分枝酵素を意味し;SBEIIb-Aに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号4で記載されるデンプン分枝酵素を意味し;SBEIIb-Bに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号5で記載されるデンプン分枝酵素を意味し;およびSBEIIb-Dに言及する場合の野生型とは、本明細書の用法では、そのアミノ酸配列が配列番号6で記載されるデンプン分枝酵素を意味する。本明細書の用法では、コムギSBEIIa遺伝子およびコムギSBEIIb遺伝子という用語は、その他のコムギ変種中に存在する相同遺伝子をはじめとする、コムギ中でそれぞれ機能的SBEIIaまたはSBEIIb酵素をコードする遺伝子を指し、低下した活性または検出不能な活性がある酵素をコードする遺伝子の変異型もまた指す。これらとしては、表1に列挙されるゲノム配列とcDNA配列をはじめとする、クローンされたコムギSBEII遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、遺伝子は、いかなるタンパク質も全くコードしない変異型を包含し、その場合は変異型は、遺伝子のnull対立遺伝子に相当する。内在性SBEII遺伝子は、野生型および変異型をはじめとする、コムギゲノム中の天然の位置にあるSBEII遺伝子を指す。対照的に、単離SBEII遺伝子および外来性SBEII遺伝子という用語は、例えばクローンされ、合成され、ベクターに含まれ、または好ましくは遺伝子組換えコムギ植物中の導入遺伝子として、細胞中の導入遺伝子の形態である、天然の位置にないSBEII遺伝子を指す。この文脈でSBEII遺伝子は、以下のように記述される特定形態のいずれかであってもよい。本明細書の用法では、コムギのAゲノム上のSBEIIa遺伝子またはSBEIIa-A遺伝子とは、本明細書で定義されるSBEIIa-Aをコードするあらゆるポリヌクレオチド、または天然ポリヌクレオチド、配列変種または合成ポリヌクレオチドをはじめとする、SBEIIa-Aをコードするポリヌクレオチドに由来するあらゆるポリヌクレオチドを意味し、本質的に野生型活性があるSBEIIa-Aをコードする野生型SBEIIa-A遺伝子、および本質的に野生型活性があるSBEIIa-Aをコードしないが、すぐ分かるほどに野生型SBEIIa-A遺伝子に由来する変異SBEIIa-A遺伝子を含む。SBEII遺伝子の突然変異型と、一連の野生型SBEII遺伝子とのヌクレオチド配列の比較を使用して、それがいずれのSBEII遺伝子に由来するかを判定し、分類する。例えばそのヌクレオチド配列がより近い関係にあれば、すなわちあらゆるその他のSBEII遺伝子よりも野生型SBEIIa-A遺伝子に対してより高い配列同一性を有すれば、変異SBEII遺伝子は、変異SBEIIa-A遺伝子であると見なされる。変異SBEIIa-A遺伝子は、デンプン分枝酵素活性が低下したSBE部分的変異体をコードし、またはSBE活性を欠くタンパク質をコードし、またはタンパク質を全くコードしないnull変異遺伝子。SBEIIa-A遺伝子に対応するcDNAの例示的なヌクレオチド配列は、GenBank受入番号Y11282に記載される。SBEIIa-A遺伝子の一部の配列はまた、図7、8、9、および10と、配列番号13、14、および15とを参照して、本明細書でも提示される。本明細書の用法では、Bゲノムから発現されるSBEIIaまたはSBEIIa-B、Dゲノムから発現されるSBEIIaまたはSBEIIa-D、Aゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-A、Bゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-B、およびDゲノムから発現されるSBEIIbまたはSBEIIb-Dという用語は、前段落のSBEIIa-Aに対応する意味を有する。例示的な部分的SBEIIb-A、SBEIIb-B、およびSBEIIb-Dタンパク質の配列が、図2に提供される。例示的SBEIIb-Aアミノ酸配列は、配列番号1および配列番号4に記載されるエクソン1~3によってコードされるアミノ末端配列。例示的SBEIIb-Bアミノ酸配列は、配列番号2および配列番号5に記載される。例示的SBEIIb-Dアミノ酸配列は、配列番号3および配列番号6および配列番号9に記載される。上で定義されるSBEII遺伝子としては、転写領域内の関連転写領域およびイントロンの発現を調節するプロモーター領域をはじめとする、転写領域の5’または3’であるあらゆる制御配列が挙げられる。異なるコムギ変種からのSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の配列には、自然変動があるものと理解される。相同的な遺伝子は、配列同一性に基づいて当業者によって容易に認識される。相同SBEIIa遺伝子またはタンパク質間の配列同一性の程度は、少なくとも90と考えられ、SBEIIb遺伝子またはタンパク質についても同様である。コムギSBEIIa遺伝子は、コムギSBEIIb遺伝子と配列が約80同一である。コードされたタンパク質もまた、配列が約80同一である。対立遺伝子は、単一遺伝子座における遺伝子の変種である。二倍体生物は、2組の染色体を有する。各染色体は、各遺伝子1個の対立遺伝子の1コピーを有する。双方の対立遺伝子が同一であれば、生物はその遺伝子に関して同型接合しており、対立遺伝子が異なれば、生物はその遺伝子に関して異型接合している。遺伝子座における対立遺伝子間の相互作用は、一般的に優勢または劣性と記述される。機能喪失変異は、穀粒中のSBEII、SBEIIaまたはSBEIIb酵素の皆無のまたは低下した、検出可能なレベルまたは活性をもたらす対立遺伝子中の変異である。変異は、例えば変異を含んでなる遺伝子から転写されるRNAが皆無でありまたはより少なく、または生成タンパク質の活性が皆無でありまたは低下することを意味してもよい。いかなる活性酵素の生成もコードしない、またはもたらすことができない対立遺伝子は、null対立遺伝子である。対立遺伝子中の部分的機能喪失変異をはじめとする機能喪失変異は、穀粒中のSBEII、SBEIIaまたはSBEIIb酵素の低下したレベルまたは活性をもたらす、対立遺伝子中の変異を意味する。対立遺伝子中の変異は、例えば野生型のまたは低下した活性を有するより少ないタンパク質が翻訳される、または野生型のまたは低下したレベルの転写に、酵素活性が低下した酵素の翻訳が続くことを意味してもよい。低下したタンパク質量またはレベルとは、対応する野生型対立遺伝子によって産生される量またはレベルと比較しての低下を意味する。低下した活性とは、対応する野生型SBEII、SBEIIaまたはSBEIIb酵素と比較しての低下を意味する。胚中の異なる対立遺伝子は、同一または異なる変異を有してもよく、異なる対立遺伝子は、当該技術分野で公知の方法を使用して組み合わされてもよい。いくつかの実施形態では、SBEIIa遺伝子またはSBEIIb遺伝子それぞれの転写または翻訳が低下するために、SBEIIaタンパク質またはSBEIIbタンパク質の量が低下する。いくつかの実施形態では、穀粒中に野生型の数のSBEIIaタンパク質分子またはSBEIIbタンパク質分子があるにもかかわらず、SBEIIaタンパク質またはSBEIIbタンパク質の重量は低下するが、これは例えば変異SBEIIaタンパク質またはSBEIIbタンパク質が、翻訳早期終止シグナルのためにトランケートされるなど、生成するタンパク質のいくつかが、野生型SBEIIaタンパク質またはSBEIIbタンパク質よりも短いためである。穀類からクローンされた、代表的なデンプン生合成遺伝子を表1に列挙する。本明細書の用法では、SBEIIa-A遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIa-A遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味し;SBEIIa-B遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIa-B遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味し;SBEIIa-D遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIa-D遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味し;SBEIIb-A遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIb-A遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味し;SBEIIb-B遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIb-B遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味し;SBEIIb-D遺伝子の2個の同一対立遺伝子は、SBEIIb-D遺伝子の2個の対立遺伝子が互いに同一であることを意味する。本発明のコムギ植物は、変異誘発後に産生して識別することができる。これは非遺伝子組換えコムギ植物を提供してもよく、それは市場によっては望ましく、またはSBEIIa遺伝子の発現を低下させるいかなる外来性核酸分子も含まない。単一SBEII遺伝子中に変異を有し、その他のSBEII変異との交雑および選択によって組み合わせて本発明のコムギ植物を産生し得る変異コムギ植物は、例えば核酸に部位特異的変異誘発を実施することで、または変異原性処理によって誘発される合成であり得て、または天然でありすなわち天然原料から単離されてもよい。概して、先祖植物細胞、組織、種子または植物を変異誘発して、ヌクレオチド置換、欠失、付加および/またはコドン修飾などの単一または複数変異を生成してもよい。本発明の好ましいコムギ植物および穀粒は、少なくとも1個の導入SBEII変異、より好ましくは2個以上の導入SBEII変異を含んでなり、天然原料からの変異を含まなくてもよく、すなわち植物中の全ての変異SBEIIaおよびSBEIIb対立遺伝子は、合成手段によって、または変異原性処理によって得られる。変異誘発は、例えば種子のEMSまたはアジ化ナトリウムZwarandChandler,1995処理などの化学的または照射手段によって、または当該技術分野で周知のγ線照射によって、獲得され得る。化学変異誘発は、ヌクレオチドの置換でなく欠失を誘発する傾向がある重イオンビームHIB照射は、新しい植物栽培品種を産生する突然変異育種のための効果的技術として知られており、例えばHayashietal.,2007およびKazamaetal,2008を参照されたい。イオンビーム照射は、DNA損傷量およびDNA欠失サイズを決定する生物学的効果に対して、投与gyおよびLET線エネルギー付与、keV/umの2つの物理的要因を有し、これらは所望の変異誘発の程度次第で調節し得る。実施例で示されるように、HIBは変異株のコレクションを生成し、その多くは欠失を含んでなり、特定のSBEII遺伝子の変異についてスクリーニングされてもよい。同定される変異株は、変異誘発ゲノム中の非連鎖変異の影響を除去し、したがってそれを低下させるために、反復親としての非変異コムギ植物と戻し交配してもよく、実施例9を参照されたい。部位特異的変異体の生成において有用な生物学的作用物質としては、DNA中に二本鎖切断を含み、内在性修復機構を刺激する、酵素が挙げられる。これらとしては、エンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、および部位特異的リコンビナーゼが挙げられる。亜鉛フィンガーヌクレアーゼZFNは、例えばゲノム中の部位特異的切断を促進し、内在性またはその他の末端連結修復機構が、欠失または挿入を導入してギャップを修復できるようにする。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ技術については、LeProvostetal.,2009でレビューされる。Duraietal.,2005およびLiuetal.,2010もまた参照されたい。変異株の単離は、変異誘発植物または種子をスクリーニングすることで達成されてもよい。例えばSBEIIaおよび/またはSBEIIb遺伝子型について、変異誘発コムギ集団を直接スクリーニングしてもよく、またはSBEII遺伝子中の変異に起因する表現型について、間接的にスクリーニングしてもよい。遺伝子型について直接スクリーニングすることは、好ましくはSBEII遺伝子中の変異の存在についてアッセイすることを含み、それは遺伝子のいくつかを欠失させた場合に予期されるように、特定のSBEIIaまたはSBEIIbマーカーの不在によってPCRアッセイ中で、またはTillingのようなヘテロ二本鎖ベースのアッセイ中で観察されてもよい。表現型のスクリーニングは、1つまたは複数のSBEIIaまたはSBEIIbタンパク質量の損失または低下について、ELISAまたは親和性クロマトグラフィーによって、または穀粒デンプ中の増大するアミロース含有量について、スクリーニングすることを含んでなってもよい。六倍体コムギ中では、スクリーニングは、好ましくは機能活性をさらに欠く変異株を探し求めるように、例えば3個のゲノムの内2個の上でSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子が既に変異体であるコムギ植物中などの、SBEII活性の1つまたは2つを既に欠く遺伝子型中で行われる。四倍体コムギ中では、スクリーニングは好ましくは、AまたはBゲノムのいずれかの上で1つのSBEII活性を既に欠く遺伝子型中で行われ、第2のゲノムからのSBEIIが低下した変異株が同定される。親和性クロマトグラフィーは、実施例11で実証されるように実施してもよい。変異誘発種子の大集団数千または数万の種子は、実施例10で実証されるように、近赤外線分光法NIRを使用して、高アミロース表現型についてスクリーニングしてもよい。NIRを使用して、高アミロース候補について濃縮された亜集団が得られた。これらの手段によって、ハイスループットスクリーニングが容易に達成でき、数百個の種子あたりおよそ1個の頻度で変異株を単離できる。本発明の植物および種子は、TILLINGゲノム中の標的部位に局所的損傷を誘発する手法として知られる工程を使用して生じさせ得て、コムギ植物または穀粒中の変異の1つまたは複数が、この方法によって生じてもよい。第1のステップでは、化学または照射変異原で種子または花粉を処理することによって、新規単一塩基対の修正などの導入変異を植物集団内で誘導し、次に典型的に、同型接合体が同定されることもあるM2世代である、変異が安定して遺伝する世代に進む。集団の全構成員からDNAが抽出され、種子が保存されて、経時的に繰り返しアクセスし得る資源が作成される。TILLINGアッセイでは、関心の対象である単一遺伝子を特異的に増幅するPCRプライマーがデザインされる。次に染料標識プライマーを使用して、複数個体のプールされたDNAからPCR産物を増幅し得る。これらのPCR産物を変性させ、再アニーリングして、ミスマッチ塩基対を形成させる。ミスマッチ、またはヘテロ二本鎖は、天然単一ヌクレオチド多形性SNPすなわち集団からのいくつかの植物は、同一多形性を有することが期待できると、誘導SNPすなわち稀な個々の植物のみが変異を呈示することが期待できるの双方に相当する。ヘテロ二本鎖形成後、ミスマッチDNAを認識して切断するCelIなどのエンドヌクレアーゼの使用が、TILLING集団内で新規SNPを発見する上で重要である。このアプローチを使用して、数千の植物をスクリーニングして、あらゆる遺伝子またはゲノムの特定領域中で、単一塩基置換ならびに小さな挿入または欠失1~30bpがある、あらゆる個体を同定し得る。アッセイされるゲノムの断片は、0.3~1.6kb程度のサイズに及び得る。8倍のプールで、1.4kb断片をアッセイあたり96レーンで増幅し、この組み合わせは、単一アッセイあたり、最高の100万個のゲノムDNAの塩基対がスクリーニングできるようにして、TILLINGをハイスループット技術にする。TILLINGについては、SladeandKnauf,2005、およびHenikoffetal.,2004でさらに記載される。変異の効率的な検出を可能にするのに加えて、ハイスループットTILLING技術は、天然多形性の検出に理想的である。したがって既知の配列とのヘテロ二本鎖形成によって未知の相同DNAを照合することで、多型性部位の数および位置が明らかになる。少なくともいくつかの反復数多形性をはじめとするヌクレオチド変化と、小さな挿入および欠失の双方が同定される。これは、Ecotillingと称されているComaietal.,2004。変異誘発植物からのDNAプールでなく、配列生態型DNAarrayedecotypicDNAを含有するプレートがスクリーニングされ得る。検出は、ほぼ塩基対の分解能のゲル上であり、背景パターンはレーンの全域で一様であるため、同一サイズのバンドを整合させ得て、したがって変異が単一ステップで発見されて遺伝子型が同定される。このようにして、変異遺伝子の配列決定は単純で効率的である。次に所望の遺伝的背景がある植物と変異株とを交雑して、同定された変異を望ましい遺伝的背景に導入し、適切な回数の戻し交雑を実施して、本来望まれない親背景を交雑除去crossoutしてもよい。本出願の文脈で、誘導変異または導入変異は、例えばトランスポゾンまたはT-DNA挿入などの化学、照射または生物学ベースの変異誘発の結果であってもよい、人工的に誘導された遺伝的変動である。好ましい変異は、遺伝子を完全に不活性化する、ナンセンス変異、フレームシフト変異、欠失、挿入変異またはスプライス部位変種などのnull変異である。その他の好ましい変異は、いくらかのSBEII活性を保つが、野生型酵素のレベルを下回る部分的変異である。ヌクレオチド挿入誘導体としては、5’および3’末端融合ならびに単一または複数ヌクレオチドの配列内挿入が挙げられる。挿入ヌクレオチド配列変種は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼZFNまたはその他の相同的組換え法により可能であるような所定部位に、またはランダム挿入と得られた生成物の適切なスクリーニングによって、ヌクレオチド配列部位に1つまたは複数のヌクレオチドが導入されたものである。欠失変種は、配列からの1つまたは複数のヌクレオチドの除去によって特徴付けられる。好ましくは、変異遺伝子は、野生型遺伝子と比較して、ヌクレオチド配列の単一挿入または欠失のみを有する。欠失は、十分大規模であって、1つまたは複数のエクソンまたはイントロン、エクソンおよびイントロンの双方、イントロン-エクソン境界、プロモーターの一部、翻訳開始部位を含み、または遺伝子全体さえも含んでもよい。欠失は十分広がり、2個の遺伝子の密接な遺伝的連鎖に基づいて、A、BまたはDゲノム上のSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の双方の少なくとも一部、または全体を含んでもよい。3の正確な倍数でないいくつかのヌクレオチドを挿入または欠失させる、遺伝子のタンパク質コード領域のエクソン内の挿入または欠失は、翻訳中に読み枠の変化を引き起こし、このような挿入または欠失を含んでなる変異遺伝子の活性をほぼ必ず消滅させる。置換ヌクレオチド変種は、配列中の少なくとも1個のヌクレオチドが除去され、異なるヌクレオチドがその場所に挿入されたものである。野生型遺伝子と比較した変異遺伝子中の置換によって影響される、好ましいヌクレオチド数は、最大10ヌクレオチド、より好ましくは最大9、8、7、6、5、4、3、または2、または最も好ましくは1ヌクレオチドのみである。置換は、置換が、コドンによって規定されるアミノ酸を変化させないサイレントであってもよい。ヌクレオチド置換は翻訳効率を低下させ、それによって例えばmRNA安定性を低下させることで、またはエクソン-イントロンスプライス境界近くの場合はスプライシング効率を変化させることで、SBEII発現レベルを低下させてもよい。SBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の翻訳効率を変化させないサイレント置換は、遺伝子活性を変化させることが予測されず、そのため本明細書では非変異体と見なされ、すなわちこのような遺伝子は活性変種であり、変異対立遺伝子に包含されない。代案としては、特に保存アミノ酸がかなり異なる別のアミノ酸によって置換され、すなわち非保存的置換であれば、ヌクレオチド置換はコードされたアミノ酸配列を変化させ、それによってコードされた酵素の活性が変化してもよい。典型的な保存的置換は、表3に従って作成されたものである。変異という用語は、本明細書の用法では、遺伝子の活性に影響を及ぼさないサイレントヌクレオチド置換を含まず、したがって遺伝子活性に影響を及ぼす遺伝子配列の変化のみを含む。多形性という用語は、このようなサイレントヌクレオチド置換をはじめとする、ヌクレオチド配列中のあらゆる変化を指す。スクリーニング法は、1番目に多形性のスクリーニング、2番目に多形変種群内の変異のスクリーニングを伴ってもよい。当該技術分野で理解されるように、パンコムギなどの六倍体コムギは、一般にA、B、およびDゲノムと称される3個のゲノムを含んでなる一方、デュラムコムギなどの四倍体コムギは、一般にAおよびBゲノムと称される2個のゲノムを含んでなる。各ゲノムは7対の染色体を含んでなり、それは当該技術分野で周知のように、減数分裂間に細胞学的方法によって観察され、したがって同定されてもよい。植物およびコムギ植物という用語は、名詞としての本明細書の用法では、概して植物全体を指すが、植物またはコムギが形容詞として使用される場合、用語は、例えば植物器官例えば葉、茎、根、花卉、単一細胞例えば花粉、種子、例えば組織培養細胞をはじめとする植物細胞、小麦粉、コムギ穀粒、コムギデンプン、コムギデンプン顆粒などの植物から製造される製品など、植物またはコムギ植物中に存在し、それから得られ、それに由来し、またはそれに関連するあらゆる物質を指す。それから根および苗条が出現した小植物および発芽種子もまた、植物の意味に含まれる。植物部位という用語は、本明細書の用法では、好ましくはコムギ植物である植物全体から得られる、1つまたは複数の植物組織または器官を指す。植物部位としては、栄養構造体例えば葉、茎、根、花器官/構造体、種子胚、内胚乳、および種皮をはじめとする、植物組織例えば維管束組織、粉砕組織など、細胞およびその子孫が挙げられる。植物細胞という用語は、本明細書の用法では、好ましくはコムギ植物である、植物から得られる、または植物中の細胞を指し、プロトプラストまたは植物に由来するその他の細胞、配偶子生成細胞、および植物全体に再生する細胞が挙げられる。植物細胞は、培養中の細胞であってもよい。植物組織とは、植物中のまたは植物外植片から得られる分化組織、または未熟または成熟胚、種子、根、苗条、果実、花粉、およびカルスなどの培養中の植物細胞の様々な集合形態に由来する、未分化組織を意味する。コムギ種子などの種子中のまたは種子からの植物組織は、種皮、内胚乳、胚盤、アリューロン層、および胚である。本明細書の用法では穀類は、それらの種子の可食成分のために栽培される、単子葉植物科の禾本科PoaceaeまたはGraminaeの植物または穀粒を意味し、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、イネ、ソルガム、ライコムギ、キビ、ソバが挙げられる。好ましくは、穀物植物または穀類は、コムギまたはオオムギ植物または穀類、より好ましくはコムギ植物または穀類である。さらに好ましい実施形態では、穀物植物は、イネまたはトウモロコシでなく、またはこれらのいずれでもない。本明細書の用法では、コムギという用語は、その祖先、ならびにその他の種との交雑によって生じるその子孫をはじめとする、コムギ属Triticumのあらゆる種を指す。コムギには、42本の染色体からなるAABBDDのゲノム構成を有する六倍体コムギ、および28本の染色体からなるAABBのゲノム構成を有する四倍体コムギが含まれる。六倍体コムギとしては、コムギT.aestivum、スペルトコムギT.spelta、マカコムギT.macha、密穂コムギT.compactum、インド矮性コムギT.sphaerococcum、バビロビコムギT.vavilovii、およびそれらの種間交雑が挙げられる。四倍体コムギとしては、デュラムコムギT.durumデュラムコムギdurumwheatまたはリベットコムギデュラム亜種Triticumturgidumssp.durumとも称される、T.ジコッコイデスT.dicoccoides、エンマーコムギT.dicoccum、ポーランドコムギT.polonicum、およびそれらの種間交雑が挙げられる。これに加えて、コムギという用語は、AゲノムではウラルツコムギT.urartuT.uartu、ヒトツブコムギT.monococcumまたは野生型ヒトツブコムギT.boeoticum、BゲノムではクサビコムギAegilopsspeltoides、DゲノムではタルホコムギT.tauschiiAegilopssquarrosaまたはAegilopstauschiiとしてもまた知られているなどの六倍体または四倍体コムギTriticum種の予測される祖先を含む。本発明で使用するためのコムギ栽培品種は、上に列挙した種のいずれかに属してもよいが、これに限定されるものではない。ライムギSecalecerealeなどのライコムギTriticaleをはじめとするが、これに限定されるものではない非コムギTriticum種との有性交雑中で、親としてコムギTriticum種を使用して、従来技術によって生成される植物もまた包含される。好ましくはコムギ植物は、六倍体コムギまたはデュラムコムギの商業的変種などのように、当業者に知られている適切な農業特性を有して、穀物の商業生産に適する。より好ましくは、コムギは、コムギエスチバム亜種Triticumaestivumssp.aestivumまたはリベットコムギデュラム亜種Triticumturgidumssp.durumであり、最も好ましくは、コムギは、本明細書でパンコムギとも称されるコムギエスチバム亜種Triticumaestivumssp.aestivumである。本明細書の用法では、オオムギという用語は、その祖先、ならびにその他の種との交雑によって生じるその子孫をはじめとする、オオムギ属Hordeumのあらゆる種を指す。植物は、例えばオオムギHordeumvulgareの株または栽培品種または変種などの商業的に栽培されるオオムギHordeum種であり、または穀物の商業生産に適することが好ましい。本発明のコムギ植物は、例えば調査または育種における用途など、食品または動物飼料用途以外の多くの用途を有してもよい。コムギなどの種子繁殖作物中では、植物が自己交雑して所望の遺伝子について同型接合である植物を生じ得て、または例えば発生中の胚芽細胞などの半数組織が染色体組を倍加するように誘導して、同型接合植物を産生し得る。本発明の同系交配コムギ植物は、それによって同型接合であってもよい、変異SBEII対立遺伝子の組み合わせを含有する種子を産生する。これらの種子を栽培して、例えばそのデンプン中の高アミロース含有量などの選択された表現型を有する植物を産生し得る。本発明のコムギ植物は、より望ましい遺伝的背景を含有する植物と交雑してもよく、したがって本発明は、その他の遺伝的背景への低SBEII形質の移入を含む。最初の交雑後、適切な回数の戻し交雑を実施して、望ましさに劣る背景を除去してもよい。本明細書に記載されるものなどのSBEII対立遺伝子特異的PCRベースのマーカーを使用して、対立遺伝子の所望の組み合わせがある子孫植物または穀粒をスクリーニングまたは同定し、それによって育種プログラムにおける対立遺伝子の存在を追跡してもよい。所望の遺伝的背景は、遺伝子の適切な組み合わせを含んで、商業的産生量、および農業生産力または非生物的ストレス耐性などのその他の特性を提供してもよい。遺伝的背景はまた、例えばその他のコムギ系統からの遺伝子など、その他の改変デンプン生合成または修飾遺伝子を含み得る。遺伝的背景は、例えばグリホサートなどの除草剤耐性をもたらす遺伝子などの1つまたは複数の導入遺伝子を含んでなってもよい。コムギ植物の所望の遺伝的背景は、農業収量およびその他の特性の考察を含む。このような特性は、冬型または春型、農業生産力、疾病耐性および非生物的ストレス耐性を有することが所望されるかどうかを含み得る。オーストラリアにおける使用では、本発明のコムギ植物の改変デンプン形質をBaxter、Kennedy、Janz、Frame、Rosella、Cadoux、Diamondbirdまたはその他の一般的栽培変種などのコムギ栽培品種に交雑することが所望されるかもしれない。その他の栽培地域では、その他の変種が適切であろう。本発明のコムギ植物は、少なくともいくつかの栽培地域における対応する野生型変種の収量と比較して、少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、または少なくとも90の穀粒収量を提供することが好ましく、なおもより好ましくは同じ条件下で栽培されたほぼ同じ遺伝的背景を有する野生型変種と比較して、少なくとも95の穀粒収量を提供する。最も好ましくは、本発明のコムギ植物の穀粒収量は、少なくとも、ほぼ同じ遺伝的背景を有して同じ条件下で栽培された野生型コムギ植物の収量と同程度に大きい。収量は、対照野外実験で、または温室内の疑似野外実験で、好ましくは野外で容易に測定し得る。マーカー利用選択は、古典的育種プログラムにおいて、反復親と戻し交雑する際に、得られた異型接合体植物を選択するための周知の方法である。各戻し交雑世代中の植物集団は、対象遺伝子について異型接合体であり、常態では戻し交雑集団中に1:1の比率で存在し、分子マーカーを使用して、遺伝子の2個の対立遺伝子を区別し得る。例えば若芽からDNAを抽出し、遺伝子移入された望ましい形質のための特異的マーカーで試験することで、さらなる戻し交雑のための植物の初期選択が行われ、同時により少数の植物にエネルギーと資源が集中される。コムギ植物交雑、自家受粉コムギ植物またはマーカー利用選択などの手順は標準手順であり、当該技術分野で周知である。デュラムコムギなどの四倍体コムギの対立遺伝子の六倍体への移入、またはその他の形態のハイブリダイゼーションはより困難であるが、これもまた当該技術分野で公知である。所望の表現型特性を同定するためには、変異SBEIIaおよびSBEIIb対立遺伝子またはその他の所望の遺伝子の組み合わせを含有するコムギ植物を、典型的に対照植物と比較する。穀粒デンプン中のアミロース含有量などの酵素活性に付随する表現型特性を評価する場合、試験される植物および対照植物は、グロースチャンバー、温室、無蓋チャンバーおよび/または野外条件下で栽培される。特定の表現型形質の同定および対照との比較は、日常統計学的分析とスコア付けに基づく。植物系統間の統計学的差異は、酵素を発現する各組織型内において、植物系統間で酵素活性を比較することで評価し得る。発現および活性は、植物部位形態学、色、数、サイズ、寸法、乾燥および湿重量、熟成、地上-地下バイオマス比;および栄養成長、結実、開花をはじめとする老化を通じた成長の様々な段階のタイミング、速度および持続期間;およびスクロース、グルコース、果糖、およびデンプンレベルならびに内在性デンプンレベルをはじめとする可溶性炭水化物含有量をはじめとする、成長、発生および収量パラメータと比較される。好ましくは、本発明のコムギ植物は、同じ条件下で栽培した場合、これらのパラメータの1つまたは複数において、野生型植物と、50未満、より好ましくは40未満、30未満、20未満、15未満、10未満、5未満、2未満のまたは1未満異なる。本明細書の用法では、連鎖するという用語は、染色体上で、マーカー遺伝子座および第2の遺伝子座が十分近いため、例えば無作為でなく、50を超える減数分裂で、一緒に遺伝することを指す。この定義は、マーカー遺伝子座と第2の遺伝子座が、同一遺伝子の一部を形成する状況を含む。さらにこの定義は、マーカー遺伝子座が、対象形質に関与する多形性を含んでなる状況を含む換言すればマーカー遺伝子座が表現型と直接連鎖する。遺伝的に連鎖するという用語は、本明細書の用法では、より狭く、マーカー遺伝子座と第2の遺伝子座が、染色体上で十分に近いため、50を超える減数分裂で、一緒に遺伝する場合についてのみ使用される。したがって世代あたりの遺伝子座間で観察された組換え百分率センチモルガンcMは、50未満であろう。本発明の特定の実施形態では、遺伝的に連鎖した遺伝子座は、染色体上で、45、35、25、15、10、5、4、3、2、または1cM以下離れていてもよい。好ましくは、マーカーは、5cMまたは2cM未満離れており、最も好ましくは約0cMは離れている。本明細書の実施例5に記載されるように、SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子は、各コムギゲノムの染色体2の長腕上で遺伝的に連鎖して約0.5cM離れており、それは約100~200kbの物理的距離に相当する。本明細書の用法では、その他の遺伝子マーカーは、本発明のコムギ植物中の所望の形質と結びついた、あらゆる分子であってもよい。このようなマーカーは当業者に良く知られており、疾病耐性、歩留まり、植物形態学、穀粒品質、穀粒色などのその他の休眠形質、種子中のジベレリン酸含有量、草高、小麦粉色などの形質を定める遺伝子と結びついた、分子マーカーが挙げられる。このような遺伝子の例は、黒さび病耐性遺伝子Sr2またはSr38、黄さび病耐性遺伝子Yr10またはYr17、Cre1およびCre3などの線虫耐性遺伝子、Ax、Bx、Dx、Ay、By、およびDy対立遺伝子などの生地強度を決定するグルテニン遺伝子座の対立遺伝子、半矮性の成長傾向ひいては耐倒伏性を決定するRht遺伝子であるEaglesetal.,2001;Langridgeetal.,2001;Sharpetal.,2001。本発明のコムギ植物、コムギ植物部位、およびそれからの製品は、好ましくは、SBEIIa発現を阻害する遺伝子について非遺伝子組換えであり、すなわちそれらは、内在性SBEIIa遺伝子の発現を低下させるRNA分子をコードする導入遺伝子を含まないが、この実施形態では、それらは例えば除草剤耐性遺伝子などのその他の導入遺伝子を含んでなってもよい。より好ましくは、コムギ植物、穀粒、およびそれからの製品は、非遺伝子組換えであり、すなわちそれらはいかなる導入遺伝子も含有せず、それはいくつかの市場で好ましい。このような製品はまた、本明細書で非形質転換製品として記載される。このような非遺伝子組換え植物および穀粒は、変異誘発後に生じるものなどの本明細書に記載される複数の変異SBEII対立遺伝子を含んでなる。遺伝子組換え植物および遺伝子組換えコムギ植物という用語は、本明細書の用法では、同一の種、変種または栽培品種の野生型植物中には見られない遺伝子コンストラクト導入遺伝子を含有する植物を指す。すなわち、遺伝子組換え植物形質転換植物は、形質転換前には含有しなかった遺伝物質を含有する。本明細書で言及される導入遺伝子は、生物工学技術分野における標準的意味を有し、組換えDNAまたはRNA技術によって生成または改変され、植物細胞に導入された遺伝子配列を指す。導入遺伝子は、植物細胞、または別の植物細胞、または非植物原料、または合成配列から得られ、またはそれに由来する、遺伝子配列を含んでもよい。典型的に、導入遺伝子は、例えば形質転換などによって、人為的操作によって植物に導入されるが、当業者は認識するようにあらゆる方法を使用し得る。遺伝物質は、典型的に安定して植物のゲノムに組み込まれる。導入遺伝物質は、同種の天然配列を含んでなってもよいが、それは例えばアンチセンス配列などの再配置された順序、または異なる配置である。このような配列を含有する植物は、本明細書において遺伝子組換え植物に含まれる。本明細書で定義される遺伝子組換え植物は、組換え技術を使用して遺伝子操作された最初の形質転換および再生植物T0植物の全ての子孫を含み、子孫は導入遺伝子を含んでなる。このような子孫は、初代遺伝子組換え植物の自家受粉によって、またはこのような植物と同一種の別の植物との交雑によって得られてもよい。一実施形態では、遺伝子組換え植物は、それらの子孫が所望の表現型から分離しないよう、導入されるありとあらゆる遺伝子導入遺伝子について同型接合である。遺伝子組換え植物部位としては、例えば種子、培養組織、カルス、およびプロトプラストなど、導入遺伝子を含んでなる前記植物の全ての部分および細胞が挙げられる。非遺伝子組換え植物、好ましくは非遺伝子組換えコムギ植物とは、組換えDNA技術による遺伝物質導入によって遺伝子操作されていないものである。本明細書の用法では、対応する非遺伝子組換え植物という用語は、ほとんどの特性において同一または同様であって、好ましくは遺伝子組換え植物に対して同質遺伝子型または準同質遺伝子型であるが、対象導入遺伝子がない植物を指す。好ましくは、対応する非遺伝子組換え植物は、対象遺伝子組換え植物の祖先と同一栽培品種または変種であり、またはコンストラクトを欠いて分離個体と称されることが多い同胞植物系統であり、または空ベクターコンストラクトで形質転換された非遺伝子組換え植物であってもよい、同一栽培品種または変種の植物である。野生型は、本明細書の用法では、本発明に従って改質されていない細胞、組織または植物を指す。当該技術分野で公知の野生型細胞、組織または植物を対照として使用して、本明細書に記載されるように改質された細胞、組織または植物について、外来性核酸の発現レベルまたは形質修飾の程度と性質を比較してもよい。本明細書の用法では、野生型コムギ穀粒は、対応する非変異誘発非遺伝子組換えコムギ穀粒を意味する。本明細書の用法では、特定の野生型コムギ穀粒としてはSunstateおよびCadouxが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの方法のいずれかを用いて、形質転換植物中の導入遺伝子の存在を判定してもよい。例えばポリメラーゼ連鎖反応PCRを使用して、形質転換植物に特有の配列を増幅し、ゲル電気泳動またはその他の方法によって、増幅産物を検出してもよい。従来法を使用して植物からDNAを抽出し、形質転換および非形質転換植物を区別するプライマーを使用して、PCR反応を実施してもよい。陽性形質転換体を同定する代替え方法は、当該技術分野で周知のサザンブロット法ハイブリダイゼーションによる。形質転換されたコムギ植物は、例えば選択可能なマーカー遺伝子の存在によってもたらされるそれらの表現型によって、または導入遺伝子によってコードされる酵素の発現、または導入遺伝子によってもたらされるあらゆるその他の表現型を検出または定量化する免疫測定法によって、同定されてもよく、すなわち非形質転換または野生型コムギ植物と区別されてもよい。本発明のコムギ植物は、主に食用に供するため、または動物飼料としての穀粒、または特にエタノール製造などの発酵または工業原料生産用の穀粒のために、栽培または収穫されてもよい。代案としては、コムギ植物は飼料として直接使用されてもよい。本発明の植物は、好ましくは食品製造、特に商業的食品生産のために有用である。食品製造としては、商業的食品製造の成分であり得る、穀粒からの小麦粉、生地、セモリナまたはその他の製品の製造が挙げられる。本明細書の用法では、穀粒という用語は、概して植物の成熟し収穫された種子を指すが、文脈次第で吸水または発芽後の穀粒もまた指し得る。成熟穀類などのコムギは、一般に約18~20未満の水分含有量を有する。本明細書の用法では、種子という用語は、収穫種子を含むが、開花後に植物中で発生中の種子および収穫前に植物に含まれる成熟種子もまた含む。本明細書の用法では、発芽は、吸水後の種皮からの根端の出現を指す。発芽率は、吸水後、例えば7または10日の期間内に発芽した集団中の種子の百分率を指す。発芽率は、当該技術分野で公知の技術を使用して計算し得る。例えば種子集団を数日間にわたって毎日評価して、経時的に発芽百分率を判定し得る。本発明の穀粒に関して、本明細書の用法では実質的に同一の発芽率という用語は、穀粒の発芽率が、対応する野生型穀粒の少なくとも90であることを意味する。デンプンは、例えばSchulmanandKammiovirta,1991の方法などの標準法を使用して、容易にコムギ穀粒から単離される。工業規模では、湿式粉砕または乾式製粉を使用し得る。デンプン顆粒サイズは、より小さなB顆粒からより大きなA顆粒が分離されるデンプン加工産業で重要である。栽培される栽培品種に多少依存して、商業的に栽培される野生型コムギは、穀粒中に通常55~65の範囲のデンプン含有量を有する。相対的に、植物が同じ条件下で栽培された場合、本発明の種子または穀粒は、野生型穀粒のデンプン含有量と比較して少なくとも90、好ましくは少なくとも93、少なくとも95、または少なくとも98のデンプン含有量を有する。さらなる実施形態では、穀粒のデンプン含有量は、穀粒重量の百分率w/wとして、少なくとも約25、少なくとも約35、少なくとも約45、または少なくとも約55~約65である。その他の望ましい特性としては、穀粒の製粉能力、特に穀粒硬度が挙げられる。コムギ植物の価値をより高める別の側面は、穀粒からのデンプン抽出の程度であり、より高い抽出率がより有用である。粒形もまた、植物の商業的有用性に影響を及ぼし得る別の特徴であり、したがって粒形は、穀粒を製粉し得る容易さまたはその他の点に影響を及ぼし得る。別の態様では、本発明は、アミロース比が増大してアミロペクチン比が低下した、上述のデンプン顆粒、または植物穀粒から得られるデンプンを提供する。精製デンプンは、例えばタンパク質、油、および繊維からのデンプンの分離を伴う、湿式磨砕工程などの製粉工程によって穀粒から得られてもよい。製粉工程の初期生成物は、デンプン顆粒の混合物または組成物であり、したがって本発明は、このような顆粒を包含する。コムギからのデンプン顆粒は、数あるタンパク質中で特にGBSS、SBEIIa、およびSBEIIbをはじめとするデンプン顆粒結合タンパク質を含んでなり、したがってこれらのタンパク質の存在は、その他の穀類のデンプン顆粒からコムギデンプン顆粒を区別する。デンプン顆粒からのデンプンは、加熱および/または化学的処理によるデンプン顆粒の破壊と分散後に、タンパク質を除去することで精製してもよい。本発明のコムギ穀粒からのデンプン顆粒では、特に穀粒の全デンプンの百分率として少なくとも50のアミロース含有量を有するコムギ穀粒では、本明細書で例示されるように光学顕微鏡下で観察すると、典型的に形状および表面形態が歪んでいる。一実施形態では、穀粒から得られるデンプン顆粒の少なくとも50、好ましくは少なくとも60または少なくとも70は、歪んだ形状または表面形態を示す。デンプン顆粒はまた、偏光下で観察した際に複屈折喪失も示す。本発明の穀粒デンプン、デンプン顆粒デンプン、および精製デンプンは、以下の特性の1つまたは複数によってさらに特徴付けられてもよい。i全デンプンの比率として、少なくとも50w/w、または少なくとも60w/w、または少なくとも67w/wのアミロース;ii膨潤体積の修正;iii鎖長分布および/または分枝発生頻度の修正;iv糊化温度の修正;v粘度ピーク粘度、糊化開始温度などの修正;viアミロペクチンおよび/またはアミロースの分子量の修正;vii結晶化度の修正viii少なくとも2の難消化性デンプンを含んでなる;および/またはix低い相対血糖指数GIを含んでなる。デンプンはまた、野生型デンプンと比較した、過剰な加熱水中の膨潤体積によって特徴付けられてもよい。膨潤体積は、典型的に、デンプンまたは小麦粉のいずれかと過剰な水を混合して加熱し、典型的に90°Cを上回る高温にして測定される。次にサンプルを遠心分離によって収集し、サンプル乾燥重量で除した沈降物質の質量として膨潤体積が表される。低膨潤特性は、特に水和食品の調製において、食品調製品のデンプン含有量を増大することが所望される場合に有用である。改変アミロペクチン構造の1つの尺度は、デンプンの鎖長分布または重合度である。鎖長分布は、イソアミラーゼisoamylose脱分枝に続いて、フルオロフォア支援炭水化物電気泳動FACEを使用して判定しもよい。本発明のデンプンのアミロペクチンは、脱分枝に際して、野生型植物からのデンプンの分布を上回る、5~60の範囲の鎖長分布を有してもよい。鎖長のより長いデンプンは、分枝頻度もまた比例して低下する。したがってデンプンはまた、なおも存在するアミロペクチン中に、より長いアミロペクチン鎖長の分布を有してもよい。穀粒のアミロペクチンは、アミロペクチンのイソアミラーゼ脱分枝後の測定で、野生型穀粒のアミロペクチンと比較して、4~12dp鎖長画分の比率低下を含んでなることで特徴付けられてもよい。本発明の別の態様では、コムギデンプンは、示差走査熱量測定DSCによって容易に測定されてもよい、糊化温度の変化を有してもよい。糊化は、顆粒膨潤、微結晶融解、複屈折喪失、粘度発生、およびデンプン可溶化などの特性の同時不可逆的変化を伴う、過剰な水中におけるデンプン顆粒内の分子秩序の熱駆動崩壊破壊である。糊化温度は、残留アミロペクチンの鎖長次第で、野生型植物からのデンプンと比較して、上昇または低下してもよい。アミロース増量aeトウモロコシ変異株からの高アミロースデンプンは、標準的トウモロコシよりも高い糊化温度を示したFuwaetal.,1999;Kruegeretal.,1987。他方、デンプンシンターゼIIa活性を欠くオオムギsex6変異株からのデンプンは、対照植物と比べて糊化温度が低下し、糊化ピークのエンタルピーが低下したMorelletal.,2003。糊化温度、特に最初のピークの開始温度および最初のピークの頂点温度は、DSCによる測定で、類似しているが非改変の穀粒から抽出されるデンプンと比較して、少なくとも3°C、好ましくは少なくとも5°C以上、好ましくは少なくとも7°C上昇してもよい。デンプンは、デンプン顆粒形態の変化が理由であり得る消化酵素の物理的到達し難さ、顕著なデンプン結合脂質の存在、結晶化度の変化、およびアミロペクチン鎖長分布の変化からなる群の1つまたは複数をはじめとする、特定の物理的特性によって示される構造変化と共に、難消化性デンプンレベルの上昇を含んでなってもよい。アミロースの高比率もまた、難消化性デンプンレベルに寄与する。本発明のコムギデンプンの構造は、小麦から単離された標準的デンプンに比べて、結晶化度が低下しているという点で異なっていてもよい。デンプンの結晶化度の低下はまた、官能特性の向上と関係して、より滑らかな口当たりに寄与すると考えられる。したがってデンプンは、1つまたは複数のアミロペクチン合成酵素の活性レベル低下に起因する、結晶化度の低下をさらに示してもよい。結晶化度は、X線結晶構造解析によって典型的に調査される。いくつかの実施形態では、検討中のデンプンは、1~20、2~18、3~18または5~15の難消化性デンプンをはじめとする、難消化性デンプンの増大、および血糖指数GI低下などの消化特性の修正を提供する。本発明はまた、穀粒から製造される、小麦粉、全粒小麦粉、またはその他の製品も提供する。これらは未加工であっても、または例えば分画または漂白によって加工されていてもよい。本発明はまた、好ましくは難消化性デンプンレベルの上昇と組み合わさった、増大した食物繊維量を含んでなる、例示されるコムギ植物の穀粒からのデンプンも提供する。この増大はまた、少なくとも部分的に、高い相対的アミロースレベルの結果である。食物繊維という用語は、本明細書の用法では、健康なヒトの小腸で吸収されずに、大腸に入る炭水化物と炭水化物消化産物を含む。これは難消化性デンプンと、その他の可溶性および不溶性炭水化物ポリマーとを含む。これは、大腸内で常在性細菌叢によって発酵される炭水化物部分の少なくとも一部を構成することが、意図される。本発明のデンプンは、比較的高レベルの食物繊維、より具体的にはアミロースを含有する。本発明の穀粒の食物繊維含有量は、少なくとも部分的に、穀粒のデンプン中のアミロース含有量増大に起因し、また全デンプンの百分率としての難消化性デンプン含有量の増大にも起因し、またはそれらの組み合わせに起因する。難消化性デンプンは、本明細書において、健康なヒトの小腸で吸収されないが大腸に入る、デンプンおよびデンプン消化産物の合計と定義される。これは文脈次第で、穀粒の全デンプンの百分率、または食物の全デンプン含有量の百分率の観点から定義される。したがって難消化性デンプンからは、消化され小腸で吸収される産物は除外される。難消化性デンプンとしては、物理的にアクセス不能なデンプンRS1形態、難消化性天然デンプン顆粒RS2、老化デンプンRS3、および化学修飾デンプンRS4が挙げられる。デンプン構造の変化、特に本発明のデンプンの高アミロースレベルは、食物中で摂取された際に、難消化性デンプンの増大を引き起こす。デンプンは、消化にとっていくぶんアクセス不能なRS1形態であってもよい。V-複合結晶化度によって測定されるデンプン-脂質結合もまた、恐らく難消化性デンプンのレベルに寄与する。本発明は、ヒトの治療または予防法において特に有用であってもよい一方で、本発明はまた、ウシ、ヒツジ、ブタなどの農業動物、イヌまたはネコなどの飼育動物、ウサギや、マウス、ラット、ハムスターなどの齧歯類などの実験動物、またはウマなどのスポーツで使用されることもあり得る動物などをはじめとするが、これに限定されるものではない、非ヒト対象にも適用できるものと理解される。方法は、特に、非反芻動物哺乳類に、または単胃哺乳類などの動物に適用可能であってもよい。本発明はまた、例えばニワトリ、ガチョウ、カモ、シチメンチョウ、またはウズラをはじめとする家禽などのその他の農業動物、または魚に適用可能であってもよい。特にヒトである対象の処置方法は、本明細書で定義される改変コムギ穀粒、小麦粉、デンプンまたは食品または飲料製品を、それによって腸健康または代謝指標の1つまたは複数のレベルが改善される量と期間で、対象に1回または複数回投与することを含んでなってもよい。指標は、pH、SCFAレベル上昇、食後グルコース変動などのいくつかの指標については、非改変コムギデンプンまたはコムギまたはその製品の摂取と比較して、数時間以内に変化してもよく、または糞量増大または便通改善については数日間を要してもよく、または酪酸により改善される正常結腸細胞の増殖の測定については、恐らくは数週間または数ヶ月程度の長さを要してもよい。改変デンプンまたはコムギまたはコムギ製品の投与が、生涯にわたることが望ましいこともある。しかし改変デンプンを投与し得る相対的な容易さを考慮すれば、治療される個人による服薬遵守の良好な見通しがある。投与量は、治療されるまたは予防される病状次第で変動してもよいが、ヒトでは、1日あたり少なくとも1gの本発明のコムギ穀粒またはデンプン、より好ましくは1日あたり少なくとも2g、好ましくは1日あたり少なくとも10gまたは少なくとも20gが想定される。1日あたり約100グラムを超える投与は、かなりの送達体積を要して、服薬遵守を低下をさせることもある。最も好ましくは、ヒトへの投与量は1日あたり5~60gのコムギ穀粒またはデンプンであり、または成人では1日あたり5~100gである。血糖指数GIは、デンプンを含んでなる食品の消化速度に関係があり、血糖濃度変動幅に対する試験食品の影響と、精白パンまたはグルコースの影響との比較である。血糖指数は、食後血清グルコース濃度と、血糖恒常性のためのインシュリン要求に対する、食品の影響可能性の尺度である。本発明の食品によって提供される1つの重要な特性は、血糖指数の低下である。血清グルコースレベルは、ヒトボランティアによる高アミロースコムギ製品摂取の30分後に、低アミロースコムギと比較して低下するGoddardetal.,1984。さらに食品は最終消化レベルが低く、その結果比較的低カロリーであってもよい。低カロリー製品は、製粉されたコムギ穀粒から製造された小麦粉の包含に基づき得る。このような食品は、満腹させ、腸健康を高め、食後血清グルコースおよび脂質濃度を低下させる効果を有し、ならびに低カロリー食品を提供してもよい。腸健康改善の指標は、i腸内容物のpH低下、ii腸内容物の全SCFA濃度または全SCFA量の増大、iii腸内容物の1つまたは複数のSCFAの濃度または量の増大、iv糞量増大、v下痢なしでの腸または糞便の全水分量の増大、vi便通改善、vii1種または複数種のプロバイオティクス細菌の数または活性の増大、viii糞便中胆汁酸排泄量の増大、ix腐敗産物の尿中レベル低下、x腐敗産物の糞便中レベル低下、xi正常結腸細胞の増殖増大、xii腸が炎症性である個体における腸内の炎症低下、xiii尿毒症患者における、尿素、クレアチニン、およびリン酸塩のいずれか1つの糞便または大腸レベルの低下、およびxiv上記の任意の組み合わせを含んでなってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。代謝健康改善の指標は、i食後グルコース変動の安定化、ii血糖応答の改善低下、iii食前pro-prandial血漿インシュリン濃度の低下、iv血液脂質プロフィールの改善、v血漿LDLコレステロールの低下、vi尿毒症患者における、尿素、クレアチニン、およびリン酸塩の1つまたは複数の血漿レベルの低下、vii血糖調節異常dysglucaemic応答の改善、またはviii上記の任意の組み合わせを含んでなってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。本発明の1つの利点は、特定の栄養面での恩恵があるパンなどの製品を提供することであり、さらにそうするために、コムギ穀粒のデンプンまたはその他の構成物を収穫後に改質する必要がないものと理解される。しかし穀粒のデンプンまたはその他の構成物の改質が所望されることもあり、本発明はこのような改質構成物を包含する。改質方法は、周知であり、従来法によるデンプンまたはその他の構成物の抽出、および難消化性形態を増大させるデンプンの改質が挙げられる。デンプンは、熱および/または水分による処理、物理的処理例えばボールミル粉砕、例えばα-またはβ-アミラーゼ、プルラナーゼpullalanaseなどを使用した酵素的処理、液体または気体の試薬を使用した湿式または乾式化学的加水分解、酸化、二官能性試薬例えばナトリウムトリメタリン酸、オキシ塩化リンとの交差結合、またはカルボキシメチル化によって改質されてもよい。本発明のコムギデンプンは、エタノール生物燃料またはエタノール含有飲料のための発酵に適した基質であり、コムギ穀粒またはコムギデンプンは、食品、栄養補助食品不溶性または可溶性繊維、酵素および工業原料などのその他の発酵製品のための発酵に適した基質であろう。植物由来デンプンを使用した発酵法は、当業者に良く知られており、様々な発酵産物のための確立されたプロセスがある例えばVogeletal.,1996およびその中の参考文献を参照されたい。一実施形態では、デンプン炭水化物は、穀粒などの本発明のコムギ植物の部分の破砕によって、または植物組織から水または別の適切な溶媒中への拡散によって抽出されてもよい。本発明のコムギ組織またはデンプンは、バッチ式、連続式、または固定化細胞工程において、発酵または生物変換のための基質として直接使用されてもよい。ポリペプチドおよびタンパク質という用語は、本明細書において概して同義的に使用される。タンパク質およびポリペプチドという用語は、本明細書の用法では、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの変種、変異体、改質および/または誘導体もまた含む。本明細書の用法では、実質的に精製されたポリペプチドとは、それが天然状態で結合する、脂質、核酸、その他のペプチドおよびその他の分子から分離されたポリペプチドを指す。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、それが天然に結合するその他の成分を少なくとも60、より好ましくは少なくとも75、より好ましくは少なくとも90含まない。組換えポリペプチドとは、組換え技術を使用して、すなわち細胞、好ましくは植物細胞、より好ましくはコムギ細胞中の組換えポリヌクレオチド発現を通じて、作成されたポリペプチドを意味する。一実施形態では、ポリペプチドは、デンプン分枝酵素活性、具体的にはSBEII活性を有し、本明細書に記載されるSBEIIと少なくとも90同一である。本明細書の用法では、生物学的活性断片は、完全長ポリペプチドの規定の活性を保つ、本発明のポリペプチドの一部である。特に好ましい実施形態では、生物学的活性断片は、デンプン分枝酵素活性を有する。生物学的活性断片は、規定の活性を保ちさえすればあらゆるサイズであり得るが、好ましくは少なくとも700または800アミノ酸残基の長さである。別のポリペプチドと比較したポリペプチドの同一性は、GAPNeedlemanandWunsch,1970分析GCGプログラムによって、gapcreationpenalty=5、およびgapextensionpenalty=0.3で判定し得る。クエリー配列は少なくとも50アミノ酸長であり、GAP分析は、2つの配列を少なくとも50個のアミノ酸の領域にわたって整合させる。より好ましくは、クエリー配列は少なくとも100アミノ酸長であり、GAP分析は、2つの配列を少なくとも100個のアミノ酸の領域にわたって整合させる。なおもより好ましくは、クエリー配列は少なくとも250アミノ酸長であり、GAP分析は、2つの配列を少なくとも250個のアミノ酸の領域にわたって配列比較する。最も好ましくは、2つのSBEIIポリペプチドは、それらの完全長アミノ酸配列にわたって配列比較される。定義されたポリペプチドに関しては、上で提供されるものよりも高い同一性値が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。したがって当てはまる場合、最小同一性の観点から、ポリペプチドが、該当する指定配列番号と、少なくとも75、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも91、より好ましくは少なくとも92、より好ましくは少なくとも93、より好ましくは少なくとも94、より好ましくは少なくとも95、より好ましくは少なくとも96、より好ましくは少なくとも97、より好ましくは少なくとも98、より好ましくは少なくとも99、より好ましくは少なくとも99.1、より好ましくは少なくとも99.2、より好ましくは少なくとも99.3、より好ましくは少なくとも99.4、より好ましくは少なくとも99.5、より好ましくは少なくとも99.6、より好ましくは少なくとも99.7、より好ましくは少なくとも99.8、さらにより好ましくは少なくとも99.9同一のアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を本発明の核酸に導入することによって、または化学的または放射線処理などによる生体内変異誘発によって調製し得る。このような変異体としては、例えばアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドに、Harayama,1998に記載されるDNAシャフリング技術、またはその他の生体外法を実施して、ポリペプチド変種をコードする改変ポリヌクレオチドを生成してもよい。これらのDNAシャフリング技術には、コムギ以外の植物種からのSBE遺伝子などの本発明に関連した遺伝子配列を使用してもよい。変異/改変DNAに由来する生成物は、本明細書に記載される技術を使用して容易にスクリーニングして、それらが例えばSBE活性を有するかどうかを判定し得る。アミノ酸配列欠失は、概して約1~15残基、より好ましくは約1~10残基、典型的には約1~5連続残基の範囲である。置換変異体は、ポリペプチド分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入される。置換変異誘発の最大関心部位としては、活性部位として同定された部位が挙げられる。その他の関心部位は、その中で様々な株または種から得られた特定の残基が同一である、すなわち保存的アミノ酸である部位である。これらの位置は、生物学的活性にとって重要であってもよい。これらのアミノ酸、特に少なくとも3個のその他の同様に保存されたアミノ酸の連続配列内に入るものは、SBEII活性などの機能を保持するために、好ましくは比較的保存的様式で置換される。このような保存的置換は、表1の例示的な置換の見出しの下に示される。非保存的アミノ酸置換は、本明細書では、表3に列挙されるもの例示的な保存的置換以外の置換として定義される。SBEII中の非保存的置換は酵素活性を低下させることが予測され、多くは、部分的機能喪失変異SBEII遺伝子によってコードされるSBEIIに対応する。コムギのアミロプラスト中でSBEI、SBEIIa、およびSBEIIbについて示されたように、本発明の範囲内には、例えばリン酸化によって、合成の最中または後に、差次的に修飾された本発明のポリペプチドもまた含まれるTetlowetal.,2004。これらの修飾は、例えばデンプン合成中のアミロプラスト内のタンパク質複合体形成の調節によって、酵素活性を調節する役割を果たしてもよくTetlowetal.,2008、または本発明のポリペプチドの安定性および/または生物活性を増大させ、または別の分子を結合させるリガンドとしての役割を果たす。いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝子活性、具体的にはSBEII遺伝子活性の修飾、変異遺伝子の組み合わせ、およびキメラ遺伝子の構築および使用を伴う。本明細書の用法では、遺伝子という用語は、タンパク質コード領域を含む、または結合非コードおよび調節領域と共に細胞中で転写されるが翻訳されない、あらゆるデオキシリボヌクレオチド配列を含む。このような結合領域は、典型的に、どちらの側も約2kbの距離で、5’および3’末端の双方で、コード領域に隣接して位置する。この点において、遺伝子は、所与の遺伝子に天然に結合するプロモーター、エンハンサーなどの調節シグナル、転写終結および/またはポリアデニル化シグナル、または異種調節シグナルを含み、その場合、遺伝子はキメラ遺伝子と称される。タンパク質コード領域の5’に位置して、mRNA上に存在する配列は、5’非翻訳配列と称される。タンパク質コード領域の3’または下流に位置して、mRNA上に存在する配列は、3’非翻訳配列と称される。遺伝子という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム形態の双方を包含する。遺伝子という用語は、本明細書に記載される本発明のタンパク質をコードする合成または融合分子を含む。遺伝子は、通常、二本鎖DNAとしてコムギゲノム中に存在する。キメラ遺伝子は、細胞中の染色体外維持のために、または宿主ゲノムへの組み込みのために、適切なベクターに導入されてもよい。遺伝子または遺伝子型は、本明細書において斜体で言及される例えばSBEIIa一方、タンパク質、酵素または表現型は非斜体SBEIIaで言及される。コード領域を含有するゲノム形態または遺伝子クローンは、イントロンまたは介在領域または介在配列と称される非コード配列によって、中断されてもよい。イントロンとは、本明細書の用法では、一次RNA転写物の一部として転写されるが、成熟mRNA分子中に存在しない遺伝子断片である。イントロンは、核または一次転写産物から除去され、または切り出され;したがってメッセンジャーRNAmRNA中にイントロンは不在である。イントロンは、エンハンサーなどの調節要素を含有してもよい。エクソンとは、本明細書の用法では、成熟mRNA中に、またはRNA分子が翻訳されない場合は成熟RNA分子中に存在するRNA配列に対応する、DNA領域を指す。翻訳におけるmRNAの機能は、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定することである。本発明は、様々なポリヌクレオチドに言及する。本明細書の用法では、ポリヌクレオチドまたは核酸または核酸分子は、例えばmRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、および単鎖または二本鎖DNAをはじめとする、例えばDNAおよびRNAのヘテロ二本鎖などのDNAまたはRNAまたはその組み合わせであってもよい、ヌクレオチドのポリマーを意味する。それは、細胞起源、ゲノム起源、または例えば自動合成装置上で作成された合成起源のDNAまたはRNAであってもよく、炭水化物、脂質、タンパク質またはその他の材料と組み合わされてもよく、蛍光性のまたはその他の基で標識されてもよく、または固体担体に付着されて本明細書で定義される特定の活性を発揮してもよい。好ましくはポリヌクレオチドは、細胞中で生じる場合、DNAのみまたはRNAのみであり、コムギ細胞中で生じる場合、いくつかの塩基は、メチル化されまたは別の方法で修飾されてもよい。ポリマーは、単鎖、本質的二本鎖または部分的二本鎖であってもよい。部分的二本鎖RNA分子の一例は、ヌクレオチド配列とその補体間の塩基対形成によって形成される二本鎖ステムと、ヌクレオチド配列とその補体を共有結合的に連結するループ配列とを含む、ヘアピン型RNAhpRNA、低分子ヘアピン型RNAshRNAまたは自己相補的RNAである。塩基対形成とは、本明細書の用法では、RNA分子中のG:U塩基対をはじめとする、ヌクレオチド間の標準塩基対形成を指す。相補的とは、2つのポリヌクレオチドが、それらの長さの一部に沿って、または片方または双方の完全長に沿って、塩基対形成できることを意味する。単離という用語は、常態ではその天然状態に付随する構成要素を実質的にまたは本質的に含まない、材料を意味する。本明細書の用法では、単離ポリヌクレオチドまたは単離核酸分子は、それがその天然状態では付随または連結する、同一タイプのポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離され、好ましくはそれを実質的にまたは本質的に含まない、ポリヌクレオチドを意味する。例えば単離ポリヌクレオチドとしては、例えば常態では断片に隣接する配列から取り出されたDNA断片などのように、天然状態では側面に位置する配列から精製または分離されたポリヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、単離ポリヌクレオチドはまた、タンパク質、炭水化物、脂質などのその他の成分を少なくとも90含まない。組換えポリヌクレオチドという用語は、本明細書の用法では常態では天然に見られない形態に核酸を操作することで、生体外で形成されるポリヌクレオチドを指す。例えば組換えポリヌクレオチドは、発現ベクターの形態であってもよい。概してこのような発現ベクターとしては、細胞中で転写されるヌクレオチド配列と作動可能に結合する、転写および翻訳調節核酸が挙げられる。本発明は、プローブまたはプライマーとして使用されてもよい、オリゴヌクレオチドの使用に言及する。本明細書の用法では、オリゴヌクレオチドは、最高50ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。それらは、RNA、DNA、またはいずれかの組み合わせ、または誘導体であってもよい。オリゴヌクレオチドは、SBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の一部と、またはSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子に対応するcDNAと同一である、またはそれに相補的な、10~30ヌクレオチド、一般に15~25ヌクレオチド長の、典型的に10~30または15~25ヌクレオチドを含んでなる、典型的に比較的短い単鎖分子である。増幅反応中でプローブまたはプライマーとして使用される場合、このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、標的核酸分子上でオリゴヌクレオチドと相補配列間に安定ハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。好ましくはオリゴヌクレオチドは少なくとも15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも18ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも19ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、なおもより好ましくは少なくとも25ヌクレオチド長である。プローブとして使用されるポリヌクレオチドは、典型的に、放射性同位体、酵素、ビオチン、蛍光分子または化学発光分子などの検出可能な標識にコンジュゲートされる。本発明のオリゴヌクレオチドおよびプローブは、SBEIIa、SBEIIbの対立遺伝子、または例えば改質デンプンなどの対象形質と関連付けられている、その他の遺伝子を検出する方法において有用である。このような方法は核酸ハイブリダイゼーションを用いて、多くの場合、例えば野生型または変異対立遺伝子の検出または同定のためにPCRで使用されるような適切なポリメラーゼによる、オリゴヌクレオチドプライマー延長を含む。好ましいオリゴヌクレオチドおよびプローブは、例えば配列番号36~149などの本明細書で開示される配列のいずれかをはじめとする、コムギからのSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子配列とハイブリダイズする。好ましいオリゴヌクレオチド対は、1つまたは複数のイントロン、またはイントロンの一部にまたがるものであり、したがってイントロン配列を増幅するためにPCR反応中で使用してもよい。本明細書の実施例において、多数の例が提供される。ポリヌクレオチド変種および変種などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的に配列同一性を呈し、参照配列と類似様式で、または同一活性で機能できるポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも1個のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別され、または天然分子と比べて、1つまたは複数の変異を有するポリヌクレオチドも包含する。したがってポリヌクレオチド変種および変種という用語は、その中で1つまたは複数のヌクレオチドが付加されまたは欠失し、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドを含む。この点においては、改変ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保つように、参照ポリヌクレオチドに、変異、付加、欠失、および置換を包含する特定の改変を加え得ることが、当該技術分野で良く知られている。したがってこれらの用語は、酵素的またはその他の調節活性を呈示するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含し、またはポリヌクレオチドは、選択的プローブまたはその他のハイブリッド形成剤としての役割を果たすことができる。ポリヌクレオチド変種および変種という用語はまた、天然対立遺伝子の変種も含む。変異体は、天然すなわち天然原料から単離されるまたは合成例えば核酸上での部位特異的変異誘発の実施によるのいずれかであり得る。好ましくは、酵素活性があるポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド変種は、長さが400を超え、より好ましくは500を超え、より好ましくは600を超え、より好ましくは700を超え、より好ましくは800を超え、より好ましくは900を超え、なおもより好ましくは1,000ヌクレオチドを超えて、最大で遺伝子の完全長である。本発明のオリゴヌクレオチドの変種は、例えば本明細書で定義される特定のオリゴヌクレオチド分子に近い位置で、コムギゲノムとハイブリダイズできる様々なサイズの分子を含む。例えば変種は、標的領域となおもハイブリダイズさえすれば、追加的なヌクレオチド1、2、3、4個以上など、またはより少ないヌクレオチドを含んでなってもよい。さらにいくつかのヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的領域とハイブリダイズする能力に影響することなしに、置換されてもよい。これに加えて、本明細書で定義される特定のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする、植物ゲノムの領域近く例えば50ヌクレオチド以内であるが、これに限定されるものではないでハイブリダイズする変種を容易にデザインしてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈における対応するまたはに対応するは、a参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と実質的に同一でありまたはそれに相補的なヌクレオチド配列を有する、またはbペプチドまたはタンパク質中のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この語句は、その範囲内に、参照ペプチドまたはタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドを有する、ペプチドまたはアミノ酸配列もまた含む。2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係性を記述するのに使用される用語としては、参照配列、比較ウィンドウ、配列同一性、配列同一性百分率、実質的同一性および同一が挙げられ、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の規定最小数について、または好ましくは完全長にわたり定義される。配列同一性および同一性という用語は、本明細書において同義的に使用され、比較ウインドウ全体にわたって、ヌクレオチド単位で、またはアミノ酸単位で、配列が同一である程度を指す。したがって配列同一性百分率は、比較ウインドウ全体にわたって最適に整列させた2つの配列を比較して、同一核酸塩基例えばA、T、C、G、Iまたは同一アミノ酸残基例えばAla、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMetが、双方の配列内に存在する位置の数を求めて一致位置数とし、一致位置数を比較ウインドウ内の総位置数すなわちウインドウサイズで除して、結果に100を乗じて配列同一性百分率を得ることで計算される。ポリヌクレオチドの同一性は、GAPNeedlemanandWunsch,1970分析GCGプログラムによって、gapcreationpenalty=5、およびgapextensionpenalty=0.3で判定し得る。特に断りのない限り、クエリー配列は少なくとも45ヌクレオチド長であり、GAP分析は少なくとも45ヌクレオチドの領域にわたり、2つの配列を配列比較する。好ましくは、クエリー配列は少なくとも150ヌクレオチド長であり、GAP分析は少なくとも150ヌクレオチドの領域にわたり、2つの配列を配列比較する。より好ましくは、クエリー配列は少なくとも300ヌクレオチド長であり、GAP分析はいずれの場合にも少なくとも300ヌクレオチド、または少なくとも400、500または600ヌクレオチドの領域にわたり、2つの配列を配列比較する。例えばAltschuletal.,1997によって開示されたBLASTファミリーのプログラムもまた、参照し得る。配列分析の詳細な論考は、Ausubeletal.,1994-1998,Chapter15のUnit19.3にある。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、少なくとも約95の、特に少なくとも約98の、より特には少なくとも約98.5の、かなり特には約99の、特に約99.5の、より特には約100の、ななり特には同一である、配列同一性を有する場合、本質的に同様と示される。RNA配列が、DNA配列と本質的に同様であり、またはある程度の配列同一性を有すると記述される場合、DNA配列中のチミンTは、RNA配列中のウラシルUに等しいと見なされることが明らかである。定義されたポリヌクレオチドに関しては、上で提供されるものよりも高い同一性値が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。したがって当てはまる場合、最小同一性値の観点から、ポリヌクレオチドは、該当する指定配列番号と、少なくとも75、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも91、より好ましくは少なくとも92、より好ましくは少なくとも93、より好ましくは少なくとも94、より好ましくは少なくとも95、より好ましくは少なくとも96、より好ましくは少なくとも97、より好ましくは少なくとも98、より好ましくは少なくとも99、より好ましくは少なくとも99.1、より好ましくは少なくとも99.2、より好ましくは少なくとも99.3、より好ましくは少なくとも99.4、より好ましくは少なくとも99.5、より好ましくは少なくとも99.6、より好ましくは少なくとも99.7、より好ましくは少なくとも99.8、なおもより好ましくは少なくとも99.9同一のポリヌクレオチド配列を含んでなることが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明は、2つのポリヌクレオチドの相補性の程度を定義するハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに言及する。ストリンジェンシーは、本明細書の用法では、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、および特定の有機溶媒の存在または不在を指す。ストリンジェンシーが高いほど、標的ヌクレオチド配列と標識ポリヌクレオチド配列間の相補性の程度が高くなる。ストリンジェントな条件とは、相補的塩基を高頻度に有するヌクレオチド配列のみがその下でハイブリダイズする、温度およびイオン条件を指す。本明細書の用法では、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするという用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述する。ハイブリダイゼーション反応を実施するためのガイダンスは、参照によって本明細書に援用する、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,N.Y.1989,6.3.1~6.3.6.にある。本明細書で参照される特定のハイブリダイゼーション条件は、次のようである。1約45°Cの6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCと、それに続く50~55°Cの0.2×SSC、0.1SDSでの2回の洗浄の低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件;2約45°Cの6×SSCと、それに続く60°Cで0.2×SSC、0.1SDSでの1回または複数回の洗浄の中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件;3約45°Cの6×SSCと、それに続く65°Cで0.2×SSC、0.1SDSでの1回または複数回の洗浄の高度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件;および4非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、0.5Mのリン酸ナトリウム、65°Cで7のSDSと、それに続く65°Cで0.2×SSC、1SDSでの1回または複数回の洗浄である。本明細書の用法では、キメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトは、その天然位置の天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指し、すなわちそれは人為的に操作されて、コムギゲノムに組み込まれた、キメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトを含む。典型的にキメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトは、自然界では一緒に見られない、調節および転写またはタンパク質コード配列を含んでなる。したがってキメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなってもよい。内在性という用語は、常態では、好ましくはコムギ植物である研究中の植物と同一発達段階において、未改質植物中で産生される、デンプンまたはSBEIIaまたはSBEIIbなどの物質に言及するために、本明細書で使用される。内在性遺伝子とは、好ましくはコムギ植物中のSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子である、生物のゲノム中のその自然な位置にある天然遺伝子を指す。本明細書の用法では、組換え核酸分子とは、組換えDNA技術によって構築され、または修飾された核酸分子を指す。異質ポリヌクレオチドまたは外来性ポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドなどという用語は、実験的操作によって、好ましくはコムギゲノムである細胞のゲノムに導入されるが、細胞中で天然に発生しないあらゆる核酸を指す。導入遺伝子が、例えば天然遺伝子との比較で、導入変異または選択可能なマーカー遺伝子の存在などのいくらかの改変を含有する限り、これらには、その細胞中に見られる改質形態の遺伝子配列が含まれる。異質性または外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然に見られる遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトであってもよい。導入遺伝子は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。遺伝子操作されたという用語は、細胞中に遺伝子を導入し、細胞中の遺伝子を変異させ、これらが実行される細胞または生物またはそれらの子孫中の遺伝子の調節を改変または修飾することを含む。本発明は、作動可能に結合または連結した要素に言及する。作動可能に結合するまたは作動可能に連結するなどは、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。典型的に、作動可能に結合する核酸配列は隣接して連結し、必要な場合、2つのタンパク質コード領域を、隣接して読み枠内につなぎ合わせる。RNAポリメラーゼが2つのコード配列を単一RNAに転写して、それが翻訳されると、双方のコード配列から抽出されるアミノ酸を有する単一ポリペプチドに翻訳される場合に、コード配列は別のコード配列と作動可能に結合する。発現される配列が、究極的にプロセシングされて所望のタンパク質が生成しさえすれば、コード配列は互いに隣接しなくてもよい。本明細書の用法では、シス作用配列、シス作用エレメントまたはシス調節領域または調節領域という用語または類似用語は、遺伝子配列の発現を調節する、あらゆる任意のヌクレオチド配列を意味するものとする。これは、例えばコムギSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子を調節するなどのその天然状況における天然シス作用配列であってもよく、または遺伝子配列に対して適切に配置されるとその発現を調節する遺伝子コンストラクト中の配列であってもよい。このようなシス調節領域は、転写レベルまたは転写後レベルにおいて、遺伝子配列の発現レベルおよび/または細胞型特異性および/または成長特異性を活性化、サイレンシング、促進、抑制し、または別の方法で修正できてもよい。本発明の好ましい実施形態では、シス作用配列は、プロモーターなどの発現可能な遺伝子配列の発現を高め、または刺激する、活性化配列である。遺伝子の5’-leaderUTR中のイントロンの存在は、コムギなどの単子葉植物中の遺伝子発現を高めることが示されているTanakaetal.,1990。別のタイプのシス作用配列は、活性クロマチンドメインを核マトリックスに固着させることで、遺伝子発現に影響を及ぼしてもよい、マトリックス付着領域MARである。プロモーターまたはエンハンサー要素を転写可能ポリヌクレオチドに作動可能に結合するとは、転写可能ポリヌクレオチド例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその他の転写物をプロモーターの調節制御下に置き、次にそれが、そのポリヌクレオチドの転写を制御することを意味する。異種プロモーター/構造遺伝子の組み合わせの構築では、概して、転写可能ポリヌクレオチドの転写開始部位から少し離して、プロモーターまたはその変種を配置させることが好ましく、その距離は、そのプロモーターとそれがその自然環境で制御する遺伝子、すなわちプロモーターがそれに由来する遺伝子の間とほぼ同一距離である。当該技術分野で公知のように、この距離のいくらかの変動は、機能喪失なしに対応可能である。本発明は、キメラ遺伝子または遺伝子コンストラクトの生成、操作または移入のために、ベクターを利用する。ベクターとは、好ましくは、その中に核酸配列が挿入されてもよい、例えばプラスミド、バクテリオファージまたは植物ウイルスに由来するDNA分子である、核酸分子を意味する。ベクターは、好ましくは1つまたは複数の独特の制限酵素認識部位を含有し、標的細胞または組織、またはその前駆細胞または組織をはじめとする、定義された宿主細胞中で自律複製できてもよく、またはクローンされた配列が再現可能であるように、定義された宿主のゲノムに組み込み可能integrableであってもよい。したがってベクターは自律複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に非依存性であるベクター、例えば直鎖もしくは閉環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含有してもよい。代案としては、ベクターは、細胞に導入されると、受容体細胞のゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターシステムは、単一ベクターまたはプラスミド、2つ以上のベクターまたはプラスミドを含んでなってもよく、それは一緒になって宿主細胞のゲノムまたはトランスポゾンに導入される全DNAを含有する。ベクターの選択は、典型的に、ベクターがその中に導入される細胞とベクターとの適合性に左右される。ベクターはまた、適切な形質転換体の選択のために使用し得る抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー、またはT-DNAまたはP-DNA配列などの原核生物または真核生物特にコムギ細胞の形質転換を高める配列を含んでもよい。このような耐性遺伝子と配列の例は、当業者に周知である。マーカー遺伝子とは、マーカー遺伝子を発現する細胞に特徴的な表現型を与え、したがってこのような形質転換細胞が、マーカーを持たない細胞と区別されるようにする遺伝子を意味する。選択可能なマーカー遺伝子は、選択作用物質例えば除草剤、抗生物質、照射、熱、または非形質転換細胞を損傷するその他の処理に対する耐性に基づいて、または代謝可能基質存在下における成長上の利点に基づいて、選択し得る形質を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子は、観察または試験を通じて、すなわちスクリーニング例えば非形質転換細胞には存在しない、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、GFPまたはその他の酵素活性によって同定し得る形質を与える。マーカー遺伝子と対象ヌクレオチド配列が連鎖する必要はない。細菌選択可能マーカーの例は、アンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。植物形質転換体を選択するための例示的な選択可能なマーカーとしては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイグロマイシンB耐性を与えるhyg遺伝子;例えばPotrykusetal.,1985によって記載される、カナマイシン、パロモマイシン、G418などに対する耐性を与える、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼnpt遺伝子;例えば欧州特許第A-256223号明細書に記載される、グルタチオン由来除草剤に対する耐性を与える、ラット肝臓からのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子;例えば国際公開第87/05327号パンフレットに記載される、過剰発現時に、ホスフィノトリシンなどのグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する耐性を与える、グルタミンシンセターゼ遺伝子;例えば欧州特許第号明細書-A-275957に記載される、選択作用物質ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ストレプトマイセスビリドクロモゲネスStreptomycesviridochromogenesからのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子;例えばHincheeetal.,1988によって記載される、N-ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える5-エノールシキミ酸-3-リン酸シンターゼEPSPSをコードする遺伝子;例えば国際公開第91/02071号パンフレットに記載される、ビアラホスに対する耐性を与えるbar遺伝子;ブロモキシニルに対する耐性を与える、クレブシエラニューモニアエ亜種オザエナエKlebsiellaozaenaeからのbxnなどのニトリラーゼ遺伝子Stalkeretal.,1988;メトトレキサートに対する耐性を与える、ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFR遺伝子Thilletetal,1988;イミダゾリノン、スルホニル尿素またはその他のALS-阻害化学薬品に対する耐性を与える、変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子ALS欧州特許第A-154204号明細書;5-メチルトリプトファンに対する耐性を与える、変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子;または除草剤に対する耐性を与えるダラポン脱ハロゲン酵素遺伝子。好ましいスクリーニング可能なマーカーとしては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。そのための様々な色素産生基質が知られている、β-グルクロニダーゼGUS酵素をコードするuidA遺伝子;そのための色素産生基質が知られている酵素をコードする、β-ガラクトシダーゼ遺伝子;カルシウム感受性生物発光検出中で用いられてもよいエクオリン遺伝子Prasheretal.,1985;緑色蛍光タンパク質遺伝子GFP、Niedzetal.,1995またはその変種の1つ;生物発光を検出できるようにするルシフェラーゼluc遺伝子Owetal.,1986、および当該技術分野で公知のその他のもの。いくつかの実施形態では、内在性デンプン分枝活性またはその他の酵素活性のレベルは、コムギ植物中のこれらの機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを低下させることによって、またはコムギ植物中の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現レベルを増大させることによって、調節される。発現増大は、コード配列から発現される転写物レベルを制御できる、異なる強度のプロモーター、または誘導性プロモーターを使用して、転写レベルで獲得され得る。その生成物が、デンプン分枝を下方制御する遺伝子の発現を調節しまたは高める、転写因子をコードする異種配列が導入されてもよい。遺伝子の発現レベルは、コード配列とそれに作動可能に結合して細胞中で機能性である転写制御要素を含んでなる、コンストラクトの細胞あたりのコピー数を修正することで、調節してもよい。代案としては、複数の形質転換体を選択し、導入遺伝子組み込み部位近傍の内在性配列の影響に起因する、好ましいレベルおよび/または特異性の導入遺伝子発現があるものについて、スクリーニングしてもよい。導入遺伝子発現の好ましいレベルおよびパターンは、コムギ植物のデンプン合成またはアミロース含有量の実質的増大をもたらすレベルである。これは単純な形質転換体試験によって検出されてもよい。遺伝子発現の低下は、コムギ植物に導入された遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子の導入と転写を通じて得られてもよい。遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子は、好ましくはコムギゲノムに、好ましくはコムギ核ゲノムに、安定して導入される。本明細書の用法では遺伝子サイレンシング効果とは、サイレンシングRNAの導入によって獲得され得る、コムギ細胞、好ましくは内胚乳細胞中の標的核酸の発現低下を指す。好ましい実施形態では、1つまたは複数の内在性遺伝子、好ましくはSBEIIaおよび/またはSBEIIb遺伝子の発現を低下させるRNA分子をコードする、遺伝子サイレンシングキメラ遺伝子が導入される。コムギ中の標的遺伝子はまた、表1に列挙される遺伝子を含む。このような低下は、メチル化によるクロマチン再構築を介した転写低下、またはRNA分解をはじめとするRNA分子の転写後修飾、またはその双方の結果であってもよい。遺伝子サイレンシングは、必ずしも標的核酸または遺伝子発現の消滅とは解釈されない。サイレンシングRNAの存在下での標的核酸レベルでの発現が、その非存在下よりも低ければ、それで十分である。標的遺伝子の発現レベルは、少なくとも約40、または少なくとも約45、または少なくとも約50、または少なくとも約55、または少なくとも約60、または少なくとも約65、または少なくとも約70、または少なくとも約75、または少なくとも約80、または少なくとも約85、または少なくとも約90、または少なくとも約95低下してもよく、または事実上検出不能なレベルに消滅してもよい。アンチセンス技術を使用して、コムギ細胞中の遺伝子発現を低下させてもよい。アンチセンスRNAという用語は、特異的mRNA分子の少なくとも一部に相補的であり、好ましくはSBEIIaおよび/またはSBEIIb遺伝子である、mRNAをコードする遺伝子の発現を低下させられるRNA分子を意味するものとする。このような低下は、典型的に配列依存様式に起きて、核から細胞質へのmRNA輸送、mRNA安定性、または翻訳阻害などの転写後事象に干渉することで生じると考えられる。アンチセンス法の使用については、当該技術分野で周知である例えばHartmannandEndres,1999を参照されたい。アンチセンス法は、今や植物中の遺伝子発現を操作するための確立された技術である。アンチセンス分子は、典型的に、標的遺伝子の転写領域の一部に対応する配列、または遺伝子発現またはスプライシング事象の制御をもたらす配列を含む。例えばアンチセンス配列は、本発明の遺伝子の標的タンパク質コード領域、または5’-非翻訳領域UTRまたは3’-UTRまたはこれらの組み合わせに対応してもよく、好ましくは標的遺伝子のエクソン配列のみに対応する。UTRの関連遺伝子間の概してより大きい多様性を考えると、これらの領域の標的化は、遺伝子阻害により大きな特異性を提供する。アンチセンス配列の長さは、少なくとも19個の隣接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチドであり、最大で阻害される遺伝子の完全長である。遺伝子転写物全体に相補的な完全長配列を使用してもよい。長さは、最も好ましくは100~2000ヌクレオチドである。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも90、より好ましくは95~100であるべきである。アンチセンスRNA分子は、もちろん、分子を安定化するよう機能してもよい無関係の配列を含んでなってもよい。アンチセンスRNAを発現する遺伝子コンストラクトは、本明細書の用法では、植物細胞中の標的遺伝子中の配列の転写およびそれが起きる場合は翻訳配向に対する逆転配向を指す、アンチセンス配向の標的遺伝子領域に、プロモーター配列を連結することで、容易に作成されてもよい。好ましくは、アンチセンスRNAは、内胚乳特異的プロモーターの使用によって、コムギ植物の内胚乳で優先的に発現される。リボザイムという用語は、特徴的な基質RNAを特異的に認識して、その切断を触媒するRNA分子を指す。典型的に、リボザイムは、標的核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列と、本明細書で触媒ドメインと称される酵素領域とを含有する。特に本発明で有用なリボザイムの種類は、ハンマーヘッド型リボザイムHaseloffandGerlach,1988;Perrimanetal.,1992、およびヘアピン型リボザイムShippyetal.,1999である。本明細書の用法では、人工的に導入されたdsRNA分子とは、好ましくは、このようなdsRNA分子をコードするキメラ遺伝子からの転写によって、コムギ細胞中で合成された、二本鎖RNAdsRNA分子の導入を指す。RNA干渉RNAiは、遺伝子発現を特異的に低下させ、または特定タンパク質の生成を阻害する上で、コムギ中でもまた特に有用であるReginaetal.,2006。この技術は、対象遺伝子のmRNAまたはその一部、およびその補体と本質的に同一である配列を含有し、それによってdsRNAが形成する、dsRNA分子の存在に依存する。好都合には、dsRNAは、宿主細胞中の単一プロモーターから生成され得て、センスおよびアンチセンス配列が転写されてヘアピン型RNAを生じ、その中ではセンスおよびアンチセンス配列がハイブリダイズして、SBEII遺伝子関連配列または無関連配列があるdsRNA領域を形成し、ヘアピン型RNAがステムループ構造を含んでなるようにループ構造を形成する。本発明の適切なdsRNA分子のデザインおよび生成は、特に、Waterhouseetal.,1998;Smithetal.,2000;国際公開第99/32619号パンフレット;国際公開第99/53050号パンフレット;国際公開第99/49029号パンフレット;および国際公開第01/34815号パンフレットを考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。dsRNAをコードするDNAは、典型的に、逆方向反復として配置された、センスおよびアンチセンス配列の双方を含んでなる。好ましい実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、RNAへの転写時に切り出されるイントロンを含んでなる、スペーサー領域によって区切られる。この配置は、より高い効率の遺伝子サイレンシングをもたらすことが示されているSmithetal.,2000。二本鎖領域は、1つまたは2つのDNA領域のいずれかから転写された、1または2個のRNA分子を含んでなってもよい。dsRNAは大部分が相補的であり得るが、完全に相補的でなくてもよい、長いセンスおよびアンチセンス領域典型的に約200bpよりも大きく、200~1000bpの範囲に及ぶを有する、長鎖hpRNAに分類されてもよい。hpRNAはまた、かなり小型であり得て、二本鎖部分は、約30~約42bpのサイズ範囲に及ぶが、94bpよりも長くない国際公開第04/073390号パンフレットを参照されたい。二本鎖RNA領域の存在は、内在性植物系からの応答を引き起こし、それは二本鎖RNAと、標的植物遺伝子からの相同的なRNA転写物の双方を破壊して、標的遺伝子の活性を効率的に低下させまたは排除すると考えられる。ハイブリダイズするセンスおよびアンチセンス配列の長さは、それぞれ少なくとも19個の隣接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30または50ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写物全体に対応する、完全長配列を使用してもよい。長さは最も好ましくは、100~2000ヌクレオチドである。センスおよびアンチセンス配列と標的転写物との同一性の程度は、少なくとも85、好ましくは少なくとも90、より好ましくは95~100であるべきである。配列が長いほど、全体的な配列同一性に対する要求は、厳しさが低下する。RNA分子は、もちろん、分子を安定化するよう機能してもよい無関係の配列を含んでなってもよい。dsRNA形成コンストラクトを発現するように使用されるプロモーターは、標的遺伝子を発現する細胞中で発現される、あらゆるタイプのプロモーターであってもよい。標的遺伝子が、SBEIIaまたはSBEIIbまたは内胚乳で選択的に発現されるその他の遺伝子である場合、その他の組織中の標的遺伝子発現に影響を及ぼさないように、内胚乳プロモーターが好ましい。下方制御SBEII遺伝子で使用されてもよいdsRNA分子の例は、実施例4に提供される。その他のサイレンシングRNAは、国際公開第01/12824号パンフレットまたは米国特許第6423885号明細書に記載される、標的遺伝子のRNA転写物のヌクレオチド配列補体と少なくとも95の配列同一性を有する、少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含んでなる非ポリアデニル化RNAであってもよい。さらに別のタイプのサイレンシングRNAは、標的核酸配列またはその補体と少なくとも95の配列同一性を有する少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含んでなり、国際公開第03/076619号パンフレットに記載される大部分が二本鎖の領域をさらに含んでなる、参照によって本明細書に援用する国際公開第03/076619号パンフレットに記載されるRNA分子である。本明細書の用法では、サイレンシングRNAは、好ましくはSBEIIaまたはSBEIIbである標的遺伝子から転写されたmRNA領域に相補的な、21~24個の隣接ヌクレオチドを有するRNA分子である。21~24個のヌクレオチドの配列は、好ましくは、mRNAの21~24個の隣接ヌクレオチド配列と完全に相補的であり、すなわち21~24個のヌクレオチドのmRNA領域の補体と同一である。しかしmRNA領域内に最高5個のミスマッチを有するmiRNA配列もまた使用してもよくPalatniketal.,2003、塩基対形成は1または2個のG-U塩基対を含んでもよい。サイレンシングRNAの21~24ヌクレオチドの全てが、mRNAと塩基対形成できない場合、サイレンシングRNAの21~24ヌクレオチドとmRNA領域との間のミスマッチは、1または2個のみであることが好ましい。miRNAに関しては、最大5個までであるあらゆるミスマッチは、miRNAの3’末端近くにあることが好ましい。好ましい実施形態では、サイレンシングRNAおよびその標的mRNAの配列間に、1または2個以下のミスマッチがある。サイレンシングRNAは、本発明のキメラDNAによってコードされるより長いRNA分子に由来する。よ本明細書でRNA前躯体とも称される、より長いRNA分子は、コムギ細胞中におけるキメラDNAからの転写によって生じる最初の生成物であり、相補領域間の分子内塩基対形成によって形成される、部分的二本鎖の特徴を有する。RNA前駆体は、一般にダイサーと称される専門クラスのRNAsesによって、典型的に21~24ヌクレオチド長である、サイレンシングRNAにプロセッシングされる。サイレンシングRNAは、本明細書の用法では、短い干渉RNAsiRNAおよびマイクロRNAmiRNAを含み、それらは生合成の点で異なる。SiRNAは、可能なG-U塩基対を含み、二本鎖領域から突出するミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチドのない、少なくとも21個の隣接塩基対を有する、完全または部分的二本鎖RNAに由来する。これらの二本鎖RNAは、それ自身への折り返しによって形成されて本明細書でヘアピン型RNAと称されるステムループ構造を形成する単一自己相補的転写物から、または少なくとも部分的に相補的でハイブリダイズして二本鎖RNA領域を形成する2つの別個のRNAから形成される。miRNAは、不完全塩基対構造を形成する、完全に相補的でない相補領域を含む、より長い単鎖転写物のプロセッシングによって生成され、したがって部分的二本鎖構造内に、ミスマッチまたは非塩基対形成ヌクレオチドを有する。塩基対形成構造はまた、G-U塩基対を含んでもよい。miRNAを形成するRNA前躯体のプロセッシングは、特定配列を有する1つの特徴的な小型RNAであるmiRNAの優先的な蓄積をもたらす。これは、典型的にRNA前駆体のアンチセンス鎖であるRNA前駆体の単鎖から誘導される一方で、siRNAを形成する長い相補的RNA前駆体のプロセッシングは、配列は一様でないが、前駆体の双方の鎖からの多数の部分に対応するsiRNA集団を生成する。miRNAは、最初にC.エレガンスC.elegans中でlin-4遺伝子を制御する小型調節RNAとして発見されたLeeetal.,1993。それ以来、多数のその他の天然miRNAが、動物および植物中で機能する遺伝子の調節に関与することが報告されている。本明細書で人工miRNA前駆体とも称される本発明のRNAのmiRNA前駆体は、それが標的mRNAの21~24個のヌクレオチド領域と相補的であり、好ましくは完全に相補的であるように、天然前駆体のmiRNA部分のヌクレオチド配列を修正することにより、そしてmiRNA配列と塩基対形成して塩基対を維持する、miRNA前駆体の相補領域のヌクレオチド配列を修正することにより、典型的に天然miRNA前駆体から誘導される。RNAのmiRNA前駆体の残部は未改変であり、したがって天然miRNA前駆体と同一配列を有してもよく、またはヌクレオチド置換、ヌクレオチド挿入、または好ましくはヌクレオチド欠失、またはあらゆるその組み合わせによって、配列が改変されてもよい。RNAのmiRNA前駆体の残部は、ダイサー様1DCL1と称されるダイサー酵素による構造の認識に関与すると考えられ、そのため構造の残部に対する修正は、あったとしてもわずかであることが好ましい。例えば塩基対形成ヌクレオチドは、全体的構造に対する主要な修正なしに、その他の塩基対形成ヌクレオチドによって置換されてもよい。それから本発明の人工miRNA前駆体が誘導される天然miRNA前駆体は、コムギ、別の穀物植物などの別の植物、または非植物源に由来してもよい。このようなRNA前駆体の例は、イネmi395前駆体、アラビドプシス属Arabidopsismi159b前駆体、またはmi172前駆体である。人工miRNAは、例えばAlvarezetal.,2006;Parizottoetal.,2004;Schwabetal.,2006などのように、植物中で実証されている。使用してもよい別の分子生物学的アプローチはコサプレッションである。コサプレッションの機序は良く分かっていないが、転写後遺伝子サイレンシングPTGSを伴うと考えられ、その点でアンチセンス抑制の多数の例と非常に良く相似してもよい。それはその発現のためのプロモーターに対してセンス方向で、遺伝子またはその断片の追加コピーを植物に導入することを伴い、それは本明細書の用法では、標的遺伝子中の配列に対して、配列の転写およびそれが起きる場合は翻訳と同一方向を指す。センス断片のサイズ、その標的遺伝子領域との対応関係、および標的遺伝子に対するその相同性の程度は、アンチセンス配列について上述したとおりである。場合によっては、遺伝子配列の追加的なコピーは、標的植物遺伝子の発現に干渉する。コサプレッションアプローチを具現する方法については、国際公開第97/20936号パンフレットおよび欧州特許第0465572号明細書を参照されたい。アンチセンス、コサプレッションまたは二本鎖RNA分子はまた、大部分二本鎖のRNA領域を含んでなってもよく、好ましくは国際公開第03/076619号パンフレットに記載されるように、核局在化シグナルを含んでなる。遺伝子発現を低下させるこれらの技術のいずれかを使用して、複数遺伝子の活性を協調的に低下させ得る。例えば共通する遺伝子領域を標的化することで、関連遺伝子ファミリーに対して、1個のRNA分子を標的化し得る。代案としては、各領域が異なる遺伝子を標的化する複数領域を1個のRNA分子中に含めることで、無関係の遺伝子を標的化してもよい。これは単一プロモーターの制御下にある複数領域を融合させることで、容易に実行し得る。核酸分子のコムギ細胞への導入には、いくつかの技術が利用でき、当該技術分野の当業者には周知である。形質転換という用語は、本明細書の用法では、異質または外来性核酸導入による、例えば細菌または植物などの細胞、特にコムギ植物である細胞の遺伝子型の修正を意味する。形質転換体とは、このように改変された生物を意味する。親植物の交雑による、または変異誘発それ自体による、コムギ植物へのDNAの導入は、形質転換に含まれない。本明細書の用法では遺伝子組換えという用語は、その中で内在性ゲノムが、導入された異質または外来性遺伝子のランダムまたは部位特異的組み込みによって、または配列の複製可能な非組み込み形態での安定維持によって、補足または修飾されている、遺伝子改変植物を指す。導入遺伝子は、植物に導入された、異質または外来性遺伝子または配列を意味する。核酸分子は、染色体外要素として複製されてもよく、または好ましくは安定して植物ゲノムに組み込まれる。ゲノムとは、細胞、植物または植物部位の全ての遺伝する遺伝的補体を意味し、染色体DNA、色素体DNA、ミトコンドリアDNA、および染色体外DNA分子が含まれる。一実施形態では、導入遺伝子は、コムギ核ゲノムに組み込まれるが、これは六倍体コムギの場合、本明細書でA、B、およびDゲノムと称される、A、B、およびDサブゲノムを含む。稔性の遺伝子組換えコムギ植物を生成する最も一般的に使用される方法は、再生可能なコムギ細胞へのDNA送達と、生体外組織培養を通じた植物再生との二段階を含んでなる。DNA送達には、通常、アグロバクテリウムツメフアシェンスAgrobacteriumtumefaciensまたは関連細菌を使用したT-DNA転移と、粒子衝突によるDNAの直接導入の2つの方法が使用されるが、その他の方法も使用されてコムギまたはその他の穀類にDNA配列が組み込まれている。それが許容可能レベルの核酸移入を達成するという条件で、植物細胞に核酸コンストラクトを導入する形質転換システムの特定の選択が本発明に必須でなく、またはそれを制限しないことは、当業者には明らかである。コムギのためのこのような技術については、当該技術分野で周知である。形質転換コムギ植物は、本発明に従った核酸コンストラクトを受容体細胞に導入し、本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでそれを発現する新しい植物を栽培することで、産生し得る。細胞培養中における、形質転換細胞からの新しい植物の栽培過程は、本明細書で再生と称される。再生可能なコムギ細胞としては、成熟胚細胞、葉脚の葉肉細胞などの成長点組織、または好ましくは、開花後12~20日に得られる未熟胚の胚盤、またはこれらのいずれかに由来するカルスが挙げられる。再生されたコムギ植物を回収する最も一般的に使用される手段は、2,4-Dなどのオーキシンおよび低レベルサイトカイニン添加MS寒天などの培地を使用した体細胞胚形成であり、SparksandJones,2004を参照されたい。コムギのアグロバクテリウムAgrobacterium媒介形質転換は、Chengetal.,1997;Weiretal.,2001;KannaandDaggard,2003またはWuetal.,2003の方法によって実施してもよい。好ましくはLBA4404、AGL0またはAGL1Lazoetal.,1991またはC58変種などの追加的な感染性遺伝子機能を有する株である、十分な感染性を持つあらゆるアグロバクテリウムAgrobacterium株を使用してもよい。アグロバクテリウムAgrobacteriumに関連した細菌もまた、使用してもよい。アグロバクテリウムAgrobacteriumから受容体コムギ細胞に移入されるDNAT-DNAは、遺伝子コンストラクトキメラプラスミドに含まれ、それは、移入される核酸の側面に位置する、野生型TiプラスミドのT-DNA領域の1つまたは2つの境界領域を含有する。遺伝子コンストラクトは、例えば対象遺伝子を含有する1個のT-DNAと、選択可能なマーカー遺伝子を含有する第2のT-DNAとの2個以上のT-DNAを含有して、2個のT-DNAの非依存性挿入と、対象導入遺伝子から離れた選択可能なマーカー遺伝子の可能な隔離とを提供してもよい。再生可能なあらゆるコムギタイプを使用してもよく、BobWhite、Fielder、Veery-5、Cadenza、およびFlorida変種について成功が報告されている。これらのより容易に再生可能な変種の1つの形質転換事象は、標準戻し交雑によるエリート変種をはじめとする、あらゆるその他のコムギ栽培品種に移転されてもよい。生体内接種法と、それに続く組織培養を使用した形質転換植物の再生および選択を利用する、アグロバクテリウムAgrobacteriumを使用した代替え法が効率的であることが判明しており、国際公開第00/63398号パンフレットを参照されたい。アグロバクテリウムAgrobacteriumの使用を伴うその他の方法としては、アグロバクテリウムAgrobacteriumと培養単離プロトプラストとの共培養;アグロバクテリウムAgrobacteriumによる種子、頂点または分裂組織の形質転換;またはBechtoldetal.,1993によって記載される、アラビドプシス属Arabidopsisのための花浸漬法などの植物体中接種が挙げられる。この後者のアプローチは、アグロバクテリウムAgrobacterium細胞懸濁液の真空浸潤に基づいている。代案としては、ベクターとしてアグロバクテリウムAgrobacteriumの発根Riプラスミドを使用して、キメラコンストラクトを導入してもよい。核酸コンストラクトを植物細胞に導入するために通常使用される別の方法は、例えばKleinetal.,1987によって記載される、小型ビーズまたは粒子マトリックス内、またはその表面のいずれかに含有される導入される核酸を用いた、小型粒子による高速弾道貫通粒子衝突または微粒子銃としてもまた知られているである。この方法は、コムギに応用されているVasil,1990。傷を誘発し、アグロバクテリウムAgrobacteriumとの共培養がそれに続く、微粒子銃を使用してもよい欧州A-486233特許第号明細書。遺伝子コンストラクトはまた、例えばFrommetal.,1985およびShimamotoetal.,1989に記載される、電気穿孔によって植物細胞に導入し得る。代案としては、核酸コンストラクトは、機械的または化学的手段を使用して細胞を核酸に接触させることで、花粉細胞などのコムギ細胞に導入し得る。コムギの形質転換で使用される好ましい選択可能なマーカー遺伝子としては、除草剤グルホシネートアンモニウムを使用した選択と併せた、ストレプトマイセスハイグロスコピカスStreptomyceshygroscopicusbar遺伝子またはpat遺伝子、抗生物質ハイグロマイシンと併せたhpt遺伝子、またはカナマイシンまたはG418と併せたnptII遺伝子が挙げられる。代案としては、唯一のC源としての糖マンノース-6-リン酸と併せて、ホスホマンノースイソメラーゼPMIをコードするmanA遺伝子などの陽性選択可能なマーカーを使用してもよい。以下の非限定的例によって、本発明をさらに説明する。実施例1:方法と材料炭水化物の測定と分析Reginaetal.,2006の方法を使用して、発生中および成熟コムギ穀粒の双方からデンプンを小規模に単離した。大規模デンプン抽出は、Reginaetal.,2004の方法に従って実施した。MegazymeBray,CoWicklow,RepublicofIrelandによって提供される全デンプン分析キットを使用して、デンプン含有量を測定し、成熟、未製粉穀粒重量の百分率として、重量を基準にして計算した。次にデンプン含有量を対照植物と比較した。全穀粒重量からデンプン重量を差し引いて穀粒の全非デンプン含有量を得て、総重量の低下がデンプン含有量の低下に起因するかどうかを判定した。デンプンサンプルのアミロース含有量は、軽微な修正を加えたMorrisonandLaignelet1983の比色分析ヨウ素滴定法によって、次のように測定した。およそ2mgのデンプンを正確に秤量して精度0.1mg、蓋にゴム座金を装着した2mlのネジ蓋管に入れた。脂質を除去するために、デンプンに1mlの85v/vメタノールを混合し、時々ボルテックスしながら、管を65°C水浴中で1時間加熱した。13,000gで5分間の遠心分離後、上清を注意深く除去して、抽出ステップを繰り返した。次にデンプンを65°Cで1時間乾燥し、2mgのデンプン上記のように秤量あたり1mlのUDMSOを使用して、尿素ジメチルスルホキシド溶液UDMSO;1体積の6M尿素に対して9体積のジメチルスルホキシドに溶解した。混合物を即座に激しくボルテックスして、95°Cの水浴内で1時間、断続的にボルテックスしてインキュベートし、デンプンを完全に溶解させた。デンプン-UDMSO溶液50μlのアリコートを、1mlの水あたり2mgのヨウ素および20mgのヨウ化カリウムを含有する、20lのI2-KI試薬で処理した。混合物を水で1mlにした。200lをマイクロプレートに移し、EmaxPrecisionMicroplateReaderMolecularDevices,USAを使用して吸光度を読み取り、620nmにおける混合物の吸光度を測定した。0~100のアミロースと100~0のアミロペクチンとを含有する標準サンプルをジャガイモアミロースおよびトウモロコシまたはジャガイモアミロペクチンSigmaから作成し、試験サンプルと同様に処理した。標準サンプルの吸光度から得られた回帰方程式を使用して、吸光度値からアミロース含有量アミロース百分率を判定した。非脱分枝デンプンのアミロース/アミロペクチン比の解析はまた、Caseetal1998に従って実施してもよく、またはBateyandCurtin,1996によって記載される脱分枝デンプン分離のための90DMSOを使用したHPLC法によって実施してもよい。アミロースデータの統計学的分析は、8theditionofGenstatforWindowsVSNInternationalLtd,Herts,UKを使用して実施した。デンプン中の鎖長分布は、デンプンサンプルの脱分枝後に、Morelletal.,1998に従って、キャピラリー電気泳動ユニットを使用して、フルオロフォア支援炭水化物電気泳動FACEによって分析した。デンプンサンプルの糊化温度プロファイルは、Pyris1示差走査熱量計PerkinElmer,Norwalk,CT,USA内で測定した。デンプン溶液の粘度は、例えばBateyetal.,1997で報告される条件を使用して、Rapid-Visco-AnalyserRVA,NewportScientificPtyLtd,Warriewood,Sydney上で測定した。パラメータ測定には、ピーク粘度最大加熱糊化粘度、保持強度、最終粘度、および糊化開始温度が含まれた。小麦粉またはデンプンの膨潤体積は、Konik-Roseetal.,2001の方法に従って測定した。水の取り込みは、規定温度の水に小麦粉またはデンプンサンプルを混合し、続く糊化物質の回収の前後にサンプルを秤量して判定した。デンプン顆粒形態は、顕微鏡検査で分析した。Leica-DMR複合顕微鏡を使用して、普通光および偏光の双方の下で水中の精製デンプン顆粒懸濁液を検査して、デンプン顆粒の形態を判定した。JoelJSM35C装置を使用して、走査型電子顕微鏡を実施した。精製デンプンを金でスパッタ被覆して、15kVおよび室温で走査した。MegazymeBray,Co.Wicklow,RepublicofIrelandから提供されるキットを使用して、β-グルカンレベルを判定した。内胚乳中のタンパク質発現の解析内胚乳中のSBEI、SBEIIa、およびSBEIIbタンパク質の特異的発現、特にこれらのタンパク質の発現レベルまたは蓄積レベルをウエスタンブロット法によって分析した。内胚乳を全ての母体組織から切り離し、5mMのEDTA、20グリセロール、5mMのDTTおよび1mMのPefablocを含有する、600μlの50mMリン酸カリウム緩衝液42mMK2HPO4および8mMKH2PO4、pH7.5中で、およそ0.2mgのサンプルを均質化した。粉砕サンプルを13,000gで10分間遠心分離し、上清をアリコートにして使用時まで-80°Cで凍結した。総タンパク質量推定のために、0.25mg/mlのBSA標準の0、20、40、60、80、および100μlのアリコートを使用して、BSA標準曲線を作成した。サンプル3μlを蒸留水で100μlにして、1mlのCoomassiePlusProtein試薬を各サンプルに添加した。標準曲線からの0BSAサンプルを空試験として使用して、5分後に595nmで吸光度を読み取り、サンプル中のタンパク質レベルを判定した。0.34MトリスHClpH8.8、アクリルアミド8.0、過硫酸アンモニウム0.06、およびTEMED0.1を含有する8非変性ポリアクリルアミドゲル上で、各内胚乳からの20μgの総タンパク質量を含有するサンプルを分離した。電気泳動に続いて、Morelletal.,1997に従って、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、SBEIIa、SBEIIbまたはSBEI特異的抗体と免疫反応させた。成熟コムギSBEIIaのN末端のアミノ酸配列AASPGKVLVPDGESDDL配列番号16を有する合成ペプチドを使用して、コムギSBEIIaタンパク質抗wBEIIaに対する抗血清を作成したRahmanetal.,2001。AGGPSGEVMI配列番号17を使用して、N末端合成ペプチドと類似様式で、コムギSBEIIb抗wBEIIbに対する抗血清を作成したReginaetal.,2005。このペプチドは成熟SBEIIbペプチドのN末端配列に相当し、さらにオオムギSBEIIbタンパク質のN末端と同一であると考えられるSunetal.,1998。N末端合成ペプチドVSAPRDYTMATAEDGV配列番号18を使用して、類似様式でコムギSBEIに対するポリクローナル抗体を合成したMorelletal.,1997。このような抗血清は、合成ペプチドで免疫化したウサギから標準法に従って得られた。SBEのための酵素アッセイ。全ての3つのイソ型、SBEI、SBEIIa、およびSBEIIbの活性を検出する分枝酵素の酵素活性アッセイは、軽微な修正を加えたNishietal.,2001の方法に基づいた。電気泳動後、10グリセロールを含有する50mMのHEPES、pH7.0でゲルを2回洗浄し、50mMのHEPES、pH7.4、50mMのグルコース-1-リン酸、2.5mMのAMP、10グリセロール、50Uのホスホリラーゼ、1mMのDTT、および0.08マルトトリオースからなる反応混合物中で室温で16時間インキュベートした。0.2W/VI2および2KI溶液で、バンドを視覚化した。SBEI、SBEIIa、およびSBEIIbイソ型の比活性は、これらの電気泳動条件下で分離された。これは、抗SBEI、抗SBEIIa、および抗SBEIIb抗体を使用した、免疫ブロット法で確認された。各バンドの強度を測定するTotalLabソフトウェアパッケージNonlinearDynamicsLtd,Newcastle,UKを使用した免疫ブロットの濃度測定分析を実施して、各イソ型の酵素活性レベルを判定した。デンプン分枝酵素SBE活性は、例えばホスホリラーゼ刺激アッセイなどの酵素アッセイによって測定されてもよいBoyerandPreiss,1978。このアッセイは、ホスホリラーゼAによるメタノール不溶性ポリマーα-D-グルカンへのグルコース-1-リン酸組み込みの、SBEによる刺激を測定する。SBEの特定イソ型の活性は、Reginaetal.,2004に記載されるようにして、個々のイソ型の精製に続いてこのアッセイで測定し得る。全可溶性タンパク質抽出物は、上述の抽出緩衝液で予備平衡化された3mlのβ-シクロデキストリンβ-CDアフィニティカラムに適用された。カラムは、製造会社の使用説明に従ってβ-CDをエポキシ活性化セファロース6BAmershamBiosciences,Uppsala,Swedenにカップリングして調製された。リン酸緩衝液中の1β-CDを使用して結合タンパク質SBE含有を溶出し、次に緩衝液A20mMのリン酸緩衝液、pH8.0、1mMのEDTA、および1mMのDTTに対して透析した。緩衝液Aで予備平衡化された1mlのMonoQカラムAmershamPharmaciaを使用して、透析サンプルをアニオン交換クロマトグラフィーで分離した。非結合タンパク質の溶出後、緩衝液Aに緩衝液B500mMのリン酸緩衝液、pH8.0、1mMのEDTA、1mMのDTTを添加して、30分間の直線濃度勾配を適用して、結合タンパク質を溶出した。SBE活性は、グルカンポリマー分枝から生じるグルカン-ポリヨード複合体の吸光度の低下を測定する、ヨウ素染色アッセイによっても測定し得る。SBE活性はまた、イソアミラーゼ消化に続いて、基質としての還元アミロースからの還元末端の生成を測定する、アッセイ分枝結合によってアッセイし得たTakedaetal.,1993a。好ましくは、活性はSBEI活性の不在下で測定される。SBEのイソ型は異なる基質特異性を示し、例えばSBEIがアミロースの分枝においてより高い活性を示すのに対し、SBEIIaおよびSBEIIbはアミロペクチン基質に対してより高い分枝率を示す。イソ型はまた、それが移入されるグルカン鎖の長さに基づいて区別されてもよい。SBEタンパク質はまた、本明細書に記載されるものなどの特異的抗体を使用して測定されてもよい。好ましくは、SBEII活性は、穀粒の成長中に発生中の内胚乳で測定される。SBEIIタンパク質レベルは、好ましくは、ウエスタンブロット分析などの免疫学的方法で、タンパク質がなおも存在する成熟穀粒中で測定される。コムギ植物のDNA分析形質転換コムギ植物または導入遺伝子の存在について試験される植物のPCR分析は、StaceyandIsaac,1994によって記載されるミニプレップ法を使用して、1~2cm2の新鮮な葉材料から抽出されたゲノムDNA上で実施した。ヘアピン型RNAコンストラクトの存在を判定するPCRアッセイでは、SBEIIa遺伝子からの断片462bpを増幅するようにデザインされた、プライマーSBEIIa-For:5’-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3’配列番号19およびSBEIIa-Rev:5’-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3’配列番号20を使用した。反応条件は、次のとおりであった:ホットスタート94°C、3分間と、それに続く30サイクルの変性95°C、30秒間、アニーリング55°C、30秒間、延長73°C、2分間と、それに続く1サイクルの73°C5分間。反応生成物は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。凍結乾燥粉砕組織からの大規模9ml抽出からのDNA上で、サザンブロット法ハイブリダイゼーション分析を実施したStaceyandIsaac,1994。DNAサンプルを0.2mg/mlに調節し、HindIII、EcoRI、およびKpnIなどの制限酵素で消化した。StaceyandIsaac1994により記載されるようにして、制限酵素消化、ゲル電気泳動、および真空ブロッティングを実施した。ds-SBEIIコンストラクトのイントロン3領域を含むジゴキシゲニンDigoxygenin標識プローブは、McCreeryandHelentjaris,1994の方法に従って、PCRにより作成された。プローブのサザンブロットへのハイブリダイゼーションおよび化学発光による検出は、McCreeryandHelentjaris,1994の方法に従って実施した。アグロバクテリウムAgrobacteriumAgrobactaeriumによるコムギの形質転換virプラスミドpAL4404およびpSB1を保有する、武装解除disarmedアグロバクテリウムツメフアシェンスAgrobacteriumtumefaciensLBA4404株に、コムギの形質転換のための遺伝子コンストラクトを電気穿孔によって導入し、スペクチノマイシン添加培地上での選択がそれに続いた。形質転換アグロバクテリウムAgrobacterium株を固化YEP培地上で27°Cで2日間インキュベートした。次に細菌を収集し、コムギ接種のために、400mMのアセトシリンゴンを含有するTSIM1100mg/lのミオイノシトール、10g/lのグルコース、50mg/lのMES緩衝液を添加したMS培地、pH5.5中に650nmで2.4の光学濃度で再懸濁した。コムギ植物変種NB1、NickersonSeedsLtd,Rothwell,Lincs.から得られる春コムギ変種を22/15°Cの日中/夜間温度で、1日に16時間の光を与えるよう補い、温室内で栽培した。開花後およそ14日間およそ1mmの胚長で、50cmの分蘖柄を含めて分蘖を収穫した。次に分蘖から止め葉以外の全ての葉を除去し、止め葉を清浄にして汚染真菌胞子を除去した。次に各小穂の苞穎、および最初の2個の小花からの外穎を注意深く除去して、未熟種子を露出した。通常、各小穂中のこれらの2個の種子のみを露出した。花序の全長に沿ってこの手順を実施した。次に簡潔な表面滅菌として、穂に70IMSを噴霧した。10μlのHamiltonシリンジを使用して、全ての露出種子が接種されるように、ほぼ胚盤と内胚乳の境界面の位置で、未熟種子にアグロバクテリウムAgrobacterium懸濁液1μlを接種した。次に分蘖を水に入れ、半透明なポリ袋で覆って種子の脱水を防ぎ、1日に16時間の光を与えて、23°C、45μEm-2s-1PARの照明インキュベーターに3日間入れた。3日間の共培養後、接種未熟種子を取り出して、70エタノール30秒間、次に20漂白剤Domestos、20分間で表面滅菌し、無菌蒸留水中での徹底的洗浄がそれに続いた。未熟胚を無菌的に単離し、追加の150mg/lのTimentinW3T培地および胚盤最上部と共に、W3培地20g/lのスクロースおよび2mg/lの2,4-Dを添加したMS;Sigmaからの6g/lのタイプIアガロースで固化にのせたプレートあたり20個の胚。培養物を25°Cで明るい場所に置いた1日に16時間の光、80μEm-2s-1PAR。単離の約5日後に、胚上の胚軸の成長を評価して、カルス生成の改善のために必要な場合は軸を除去した。単離後2週間で新鮮な培地に移して、胚をW3T中に4週間保ち、胚形成能力を評価した。4週間の成長後、接種胚から誘導されたカルスは、W3T培地に播種された未接種胚から得られた対照カルスと、非常に良く似ていた。細菌の存在は、接種胚から誘導されたカルスの胚形成能力を実質的に低下させなかったようであった。胚形成カルスを2mg/lのAsulamまたは25mg/lのgeneticinおよび150mg/lのTimentin添加W3培地W32AT培地に移した。カルスをこの培地上でさらに2週間維持し、次に各カルスを2mmサイズの断片に分割し、W32AT上に再播種した。バイナリーベクターコンストラクトなしのLBA4404の接種から誘導された対照胚は、選択培地上で形質転換カルスを生じなかった。さらに2週間の培養後、胚形成カルスの成長について全ての組織を評価した。選択上で4週間後、継続成長の徴候を示すあらゆるカルスを再生培地RMT;40g/lのマルトースおよび150mg/lのTimentin添加MS、pH5.8;Sigmatype1の6g/lのアガロースで固化に移した。苗条はこの培地上で4週間以内に再生されて、次に苗条伸長および発根のために、150mg/lのTimentin添加MS30に移された。次に幼若植物を土壌混合物に移し、ミスティングベンチ上に2週間保ち、最後に温室に移した。AGL1株などの代案のアグロバクテリウムAgrobacterium株またはハイグロマイシン耐性をコードする遺伝子などの選択可能なマーカーもまた、方法で使用し得る。実施例2:ヘアピン型RNAコンストラクトを使用したコムギ中のSBEIIa遺伝子の阻害4つのヘアピン型RNAdsRNAコンストラクトを作成して、コムギのiSBEIIa、またはiiSBEIIa、SBEIIb、およびSBEI遺伝子の発現を低下させた。各コンストラクト中で、ヘアピン型RNAをコードするDNAを、ヘアピン型RNAの内胚乳特異的発現を提供するコムギDx5遺伝子から得られる高分子量グルテニンHMWGプロモーター配列、およびアグロバクテリウムAgrobacteriumからのノパリンシンターゼ遺伝子からの転写ターミネーター配列nos3’と連結させた。このプロモーターは、ヘアピン型RNAをコードする合成遺伝子の内胚乳特異的発現を提供する。hp5’-SBEIIahp5’-SBEIIaと称される第1のコンストラクトの構築および使用については、Reginaetal.,2006に記載される。hp5’-SBEIIaコンストラクトは、コムギSBEIIa遺伝子からのPCRによって増幅された1536bpのヌクレオチド配列を含有するGenBank受入番号AF338431。これは、以下を含んだ。エクソン1および2の全てとエクソン3の一部ヌクレオチド配列部位1058~1336、1664~1761、および2038~2219SBEIIaをコードするタルホコムギAegilopstauschiicDNAのヌクレオチド配列部位1~578、GenBank受入番号AF338431.1を含むを含んでなり、各側にEcoRIおよびKpnI制限酵素認識部位を有する、468bpの配列断片1、SBEIIaヌクレオチド配列部位2220~2731のエクソン3および4の一部およびイントロン3の全てからなり、各側にKpnIおよびSacI部位を有する、512bpの配列断片2、およびSBEIIaタルホコムギAegilopstauschiiSBEIIacDNAヌクレオチド配列部位1~638、GenBank受入番号AF338431.1を含む、AF338431中のヌクレオチド配列部位1058~1336、1664~1761、および2038~2279の完全エクソン1、2、および3からなり、各側にBamHIおよびSacI部位を有する、528bpの断片断片3。次に断片3の配列が、断片1に対してアンチセンス方向で断片2とライゲートするように、断片1、2、および3をライゲートした。ヘアピン型RNAコンストラクトは、最初に、HMWGプロモーター配列とnos3’ターミネーターを含有するベクターpDVO3000中で生成された。hpc-SBEIIahpc-SBEIIaと称されるSBEIIaコンストラクトは、SBEIIacDNAGenBank受入番号AF338432.1のヌクレオチド1255~1547に対応する293塩基対のDNA断片を含んでなり、それはSBEIIa遺伝子のエクソン12の一部、エクソン13および14、およびエクソン15の一部に対応する。SBEIIaのこの領域は、SBEIIbcDNAの対応する領域のヌクレオチド配列と約81のみの同一性を有し、したがってSBEIIbでなく、SBEIIaのサイレンシングの特異性の可能性を増大させることから選択された。hp3’-SBEIIahp3’-SBEIIaと称されるSBEIIaコンストラクトは、SBEIIacDNAのヌクレオチド2305~2434に対応する130塩基対のDNA断片を含んでなり、SBEIIa遺伝子のエクソン21の一部、エクソン22、および3’非翻訳領域3’UTRの一部に対応した。hp-combohp-comboと称されるヘアピン型RNAコンストラクトは、SBEIIa遺伝子の一部に加えて、コムギSBEI遺伝子の領域を含んでなり、iSBEIIacDNAからのヌクレオチド1756~2172に対応し、エクソン16の一部、エクソン17~19、およびエクソン20の一部に対応する417塩基対の配列、およびiiSBEIcDNAGenBank受入番号AF076679のヌクレオチド267~623に対応し、SBEI遺伝子のエクソン3の一部、エクソン4、およびエクソン5の一部に対応する357塩基対の配列を含有した。SBEIIa遺伝子断片は、SBEIIb遺伝子の対応する領域と約86の同一性を有し、SBEIIbのそれらの対応する領域と100同一性がある23個の連続したヌクレオチドのいくつかの領域を含み、そのためコムギ中のSBEIIbをコードする遺伝子ならびにSBEIIaおよびSBEIをコードする遺伝子の発現を低下させるという期待を持って、組み合わせコンストラクトがデザインされた。上述の各断片の2つのコピーは、イネチューブリン遺伝子イントロンが2つのコピーの間に存在するように、片方はセンス方向、他方はアンチセンス方向で適切なベクターに挿入された。合成遺伝子は、バイナリーベクター中に挿入され、コムギを形質転換するのに使用された。これらのコンストラクトは、実施例1に記載されるコムギを形質転換するのに使用された。それぞれのコンストラクトについてPCR陽性の独立コムギ遺伝子組換え系の数は、次のとおりであった。hp5’-SBEIIa、27;hpc-SBEIIa、10;hp3’-SBEIIa、10;およびhp-combo、63。遺伝子組換え植物の分析:DNA分析PCR分析を実施して、StaceyandIsaac1994によって記載されるミニプレップ法を使用して、1-2cm2の新鮮葉料から抽出されたゲノムDNAを使用して、再生植物中の導入遺伝子の1つまたは複数を検出した。例えばプライマーSBEIIa-For:5’-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3’配列番号19およびSBEIIa-Rev:5’-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3’配列番号20を使用して、hp5’-SBEIIa導入遺伝子で形質転換された植物に対して、PCR反応を実施した。これらのPCR反応は、SBEIIa遺伝子からの約462bpの断片を増幅するようにデザインされた。反応条件は、次のとおりであった:ホットスタート94°C、3分間と、それに続く30サイクルの変性95°C、30秒間、アニーリング55°C、30秒間、および延長73°C、2分間と、それに続く1サイクルの73°C5分間。デンプン顆粒形態T0形質転換コムギ植物から得られる、成熟T1種子からのデンプン顆粒の形態を光学顕微鏡によって観察した。25のT0hp5’-SBEIIa植物のそれぞれからの10個の個々の穀粒を分析した。各内胚乳を穏やかに粉砕してデンプン顆粒を放出し、それを水中に分散して光学顕微鏡下で視覚化した。分析した25系統の内、12系統が歪んだ顆粒がある穀粒を有したが、目視観測からは、異なる種子中の様々なレベルの歪みが明らかになった。デンプン顆粒の形態学的変化について、hpc-SBEIIa、hp3’-SBEIIa、およびhp-combo導入遺伝子で形質転換された各植物からの9個の種子を同様に分析した。この場合、残りの各半切種子をT1植物に栽培することで各系統を保存できるように、半切種子を分析した。63のhp-combo系統の内55系統は、様々なレベルの歪みがある、顆粒形態が変化した種子を有した。10のhp5’-SBEIIa系統は全て、様々なレベルの歪みがある、デンプン顆粒形態が変化した種子を有した。SBEIIa3’系統のいずれにおいても、有意なデンプン顆粒形態の変化は観察されなかった。歪んだデンプン顆粒は、内胚乳中のデンプン中のアミロースレベル上昇の指標であり、典型的に約50のアミロースであり、または高度に歪んだデンプン顆粒では約70のアミロースである。これは、表現型の程度の範囲が、有効なサイレンシングコンストラクトのそれぞれについて観察されたことを示した。発生中内胚乳中における、ウエスタンブロット法によるタンパク質発現抗SBEIIaおよび抗SBEIIb抗体をそれぞれ使用して、ウエスタンブロット法により、SBEIIaおよびSBEIIbタンパク質のレベルについて、T1遺伝子組換え系からの4~7個のT2発生中内胚乳を分析した。hp-combo系統の場合、抗SBEI抗体を使用して、SBEI発現もまた分析した。選択された遺伝子組換え系からの全SBEIIタンパク質レベルSBEIIaおよびSBEIIbは、野生型変種NB1中のレベルの百分率として計算され、表11に示される。実施例1に記載されるヨウ素滴定法を使用して、穀粒中の全デンプンの百分率として計算された、遺伝子組換え系からの成熟穀粒中のアミロースレベルもまた判定された表11。これは図5に図示される。SBEIIaおよびSBEIIbの発現レベル範囲が、独立系統の統遺伝子組換え植物の穀粒中で得られた。このような範囲は、異なる遺伝子組換え事象における導入遺伝子組み込み部位の多様性のために、常態では、あらゆる1個のコンストラクトによって得られた遺伝子組換え系内で予測されて、一般に位置効果と称される4個のコンストラクトは、SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の発現低下において等しく効率的でないことが観察されたため、これらの実験で見られた発現レベル範囲は広がった。特に、いくつかの形質転換された系統でhp-comboコンストラクトによって引き起こされるSBEIIbの発現低下の程度は、例えば系統679.5.3および672.2.3.などのSBEIIaの発現低下の程度と相関しなかった。しかし全てのコンストラクトは、大部分の形質転換系統中で対応する遺伝子の発現を低下させた。全SBEIIタンパク質レベルに対してアミロースの百分率をプロットし、データ点から最良適合曲線を作成すると図5を参照されたい、野生型と比較して少なくとも75の全SBEIIの低下は、内胚乳デンプン中で50w/w以上のアミロース含有量をもたらすことが観察された。野生型と比較して少なくとも40の全SBEII活性の低下は、少なくとも40w/wのアミロース含有量をもたらした。残留SBEIIaタンパク質レベルに対してアミロース百分率をプロットすると、非常に良く似た曲線が得られ図6を参照されたい、コムギ内胚乳中のSBEIIaのレベルが、デンプン中のアミロースレベルの一次決定要因であり、SBEIIbおよびSBEIのレベルが二次決定要因であるという結論がもたらされた。アミロースモデルは、3組の入力図6に基づいてさらに発展させた。1SBEIIaおよびSBEIIbの相対的発現レベルに基づく理論的データ、および遺伝子導入からのアミロースデータ、2単一および二重nullのアミロースデータ、およびSBEIIaおよびSBEIIbの相対的発現レベルに基づく理論的データ、3測定されたアミロースデータ、および追加的なコンストラクト遺伝子導入から測定されたSBEIIaおよびSBEIIbレベル。図6では、検出力曲線がこのデータに適合されている。まとめるとこれらの3つのデータセットは、入力タイプ間で高度に一貫したモデルを生じ、予測ルーツとしてのモデルを強化する。モデルは、パンコムギまたは四倍体コムギ中で高アミロース生成するために、SBEII遺伝子中に複数の変異を作り出すことの重要性を予測した。実施例3:コムギからのSBEII遺伝子配列のクローニングおよび比較タルホコムギAegilopstauschiiゲノムライブラリからのSBEII遺伝子の単離およびPCRによる、それらの特性評価については、国際公開第99/14314号パンフレットおよび国際公開第200162934-A号パンフレットに記載される。A、B、およびDゲノムのSBEIIa遺伝子のイントロン5領域からのDNA配列は、国際公開第200162934-A号パンフレットに記載される。さらなる研究からは、異なるコムギ遺伝子型からのコムギSBEIIa遺伝子のその他の領域から配列を得て、例えば次のようにして同祖遺伝子をさらに特性評価することが導かれた。プライマーAR2aE12F075’-CATTCGTCAAATAATACCCTTGACGG-3’配列番号21およびAR2aE14R075’-CTTCACCAATGGATACAGCATCAG-3’配列番号22を使用して、六倍体コムギ変種CharaからSBEIIaのエクソン12~14領域を増幅した。これから約656bpのPCR産物が生じ、それは3つの同祖遺伝子のそれぞれからの増幅断片の混合物であると推定された。TOPOベクターへのクローニングに続いて、この産物を配列決定した。エクソン12~14間の領域をカバーする、3つの多型配列が得られた図7。実施例4で詳述されるように、切断後増幅多型CAPマーカーを使用した、ChineseSpring染色体操作系のPCR分析に基づいて、配列F1-1はDゲノムに割り当てられ、配列F1-13はBゲノムにゲノム割り当てられ、配列F1-15はAゲノムに割り当てられた。プライマー対AR2akpnIF5’-GGTACCGGCAAATATACGAGATTGACCCG-3’配列番号23およびAR2aSacIR5’-GAGCTCCCACCTTCATGTTGGTCAATAGC-3’配列番号24を使用して、2個の六倍体コムギ変種、SuncoおよびTasmanから、SBEIIaのイントロン3領域を増幅した。3つの多型配列が、SuncoおよびTasmanのそれぞれから得られた図8。コムギSBEIIaDゲノム配列GenBank受入番号AF338431.1と比較して、配列Tasman0257およびSunco0242はDゲノムに割り当てられた。Tasman0272およびSunco0241配列は、分離集団における一塩基多型に基づく多型マーカーのマッピングに基づいて、Bゲノムに割り当てられた。Tasman0264およびSunco0243の配列は、BおよびDゲノム配列と異なるようであり、それらはAゲノムに由来するはずであると結論付けられた。遺伝子型特異的多形性はまた、3個の各ゲノムにおいて、SuncoおよびTasman間でSBEIIaのこの領域についても観察された。プライマーAR2aexon3F5’-GATACCTGAAGATATCGAGGAGC-3’配列番号25およびAR2aexon3R5’-CGGTAGTCAAGATGGCTCCG-3’配列番号26を使用して、ChineseSpringCSからのSBEIIaのエクソン3領域を増幅した。3つの多型配列が得られた図9。コムギSBEIIa遺伝子GenBank受入番号AF338431.1の比較からは、配列CSエクソン3aがDゲノムに由来することが明らかにされた。配列CSエクソン3bは、パンコムギ2B染色体に由来すると報告されているGenBank受入番号FM865435との100同一性に基づいて、Bゲノムに由来することが分かった。第3の配列CSエクソン3dは、GenBank受入番号Y11282.1と99同一性を示し、それは次にChineseSpringのAゲノムGenBank受入番号EU670724に由来すると報告されている、部分的コード配列との高度な同一性99を有した。これは配列CSエクソン3dが、Aゲノムに由来するという予測を導いた。プライマーAR2aexon1F5’-CACACGTTGCTCCCCCTTCTC-3’配列番号29およびAR2aexon1R5’-GAGAGGAGTCCTTCTTCCTGAGG-3’配列番号28を使用して、CSからのSBEIIaのエクソン1領域を増幅した。配列が得られた図10。SBEIIGenBank受入番号との配列比較からは、配列CSエクソン1aのBゲノムFM865435と100相同性への、CSエクソン1bのAゲノムY11282.1と99相同性への、CSエクソン1cのDゲノムAF338431.1と100相同性への割り当てが導かれた。SBEIIa遺伝子配列はまた、パンコムギの二倍体祖先または類縁、パンコムギのAゲノム祖先と考えられるウラルツコムギTriticumurartu、Bゲノム祖先と考えられるクサビコムギAegilopsspeltoidesTriticumspeltoidesとしてもまた知られている、およびDゲノム祖先と密接な関係があると考えられるタルホコムギAegilopstauschiiからも得られる。遺伝子断片は、次のようにしてこれらの種から得られる。Dゲノム受入番号AF338432のSBEIIa遺伝子のヌクレオチド配列またはその補体に基づいて、10個のプライマーをデザインし、その配列全体をカバーしたPCRによって、これらのプライマーセットを使用して、二倍体種SBEIIa遺伝子の断片を増幅した。10個のプライマーを使用して、二倍体種ウラルツコムギT.urartuAAゲノム、クサビコムギA.speltoides、BB、タルホコムギA.tauschiiDD、および四倍体種デュラムコムギT.durumAABBゲノムからのDNAと共に、16の組み合わせがPCRで使用された。これらの増幅から、それらのヌクレオチド配列決定をする配列決定のために十分な品質であった、全部で35の断片が選択された。ContigExpressを使用して、配列を比較し編集し、二倍体からの祖先SBEIIa遺伝子について決定された配列を組み合わせる。A、B、およびDゲノム上の遺伝子を区別するのに使用し得るSNPまたは挿入/欠失などの多形性が同定され、Amplifierを使用して変異体同定のための特異的プライマーがデザインされる。ウラルツコムギT.urartuからのSBEIIa遺伝子のエクソン11~22領域のヌクレオチド配列は、配列番号13で示され、エクソン3~8は配列番号15、およびエクソン1~3は配列番号14で示される。タルホコムギA.tauschiiのSBEIIa遺伝子全体のヌクレオチド配列は、参照によって本明細書に援用する国際公開第2005001098号パンフレットで提供される。SBEIIaおよびSBEIIbのマッピング-コムギ中のSBEIIaおよびSBEIIbの遺伝的連鎖SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子は、どちらもコムギ2番染色体の長腕上に位置しReginaetal.,2005;Rahmanetal.,2001、これらの報告に基づいて連結すると考えられたが、連鎖がどの程度近いのか正確に分かっていなかった。親栽培品種Baxter、Yitpi、Chara、およびWestoniaが関与する、四元交雑から得られる分離集団を使用して、SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の遺伝子マッピングを実施した。遺伝子間の組換えに関する集団分析は、およそ900の子孫から1個の組換えのみを明らかにした。このデータから、SBEIIaとSBEIIb間の遺伝距離はわずか0.5cMと計算された、これは2個の遺伝子間の非常に密な連鎖であった。2個の遺伝子間の物理的距離を判定するために、Moulletetal.,1999によって構築されたタルホコムギAegilopstauschiiのBACライブラリーをスクリーニングして、SBEII含有クローンを同定した。SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子のそれぞれの5’および3’領域から、32Pで標識されたハイブリダイゼーションプローブを作成して使用し、BACライブラリーをスクリーニングした。4つのプローブの混合物でスクリーニングすると、陽性ハイブリダイゼーションシグナルのある9個のクローンが同定された。次に各プローブで9個のクローンを別々にスクリーニングして、3個のクローンを選択した。それらの1つBAC2は完全に配列決定され、完全長SBEIIb遺伝子を含有することが示された。その他のクローンでは、BAC1は部分的直接配列決定によってSBEIIa遺伝子を含有することが示され、BAC3はPCRによって示されるように、SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の双方の部分を含有するようであった。これは2個の遺伝子が、どの程度密に物理的に連結するのかを示唆した。BAC1およびBAC3は、完全に配列決定されるであろう。この物理的データから、密接した遺伝的連鎖が確認された。したがって遺伝子の1つに影響を与える放射線などの作用物質によって生じる欠失変異は、恐らく遺伝子の双方に及びまたは全体にわたり、すなわち双方の遺伝子にとってnullであることが予測された。さらにこれは、このような欠失変異株に生存能力があり、野生型の適応度を有し得る可能性を示唆した。少なくとも、観察された密な連鎖は、生存度または適応度に必要とされるその他の連鎖遺伝子に及ばない、比較的小さな欠失がある変異株を得る可能性を高めた。したがってこのような変異株を実施例5~7で下述するようにして探し求めた。実施例4:コムギ中のSBEIIaおよびSBEIIb同祖遺伝子の識別実施例2で得られた配列多形性に基づいて、PCRアッセイをデザインし作成して、パンコムギ中の同祖SBEIIa遺伝子を区別した。コムギSBEIIaのエクソン12~14領域からの207bp産物を増幅するように、ネステッドプライマー対、AR2aI13ゲノムF25’-GTACAATTTTACCTGATGAGATCATGG-3’配列番号29およびAR2aI13ゲノムR25’-CTTCAGGAATGGATACAGCATCAG-3’配列番号30をデザインした。2種の制限酵素Ssp1およびMse1で消化すると、ChineseSpringCSからのプライマーを使用して増幅された生成物は、サイズ207bp、147bp、99bp、および108bpの4本の明確なバンドを生じた。CS染色体操作系におけるこのPCRマーカーアッセイの使用からは、207bpの生成物がAゲノムに由来し、147bpの生成物がBゲノムに由来し、99bpおよび108bpの生成物がDゲノムに由来することが明らかになった図11。コムギの二倍体祖先、すなわちゲノムAではウラルツコムギTriticumurartu、ゲノムBではクサビコムギAegilopsspeltoides、ゲノムDではタルホコムギAegilopstauschiiからのSBEIIa配列に基づいて、異なるゲノムからのSBEIIa遺伝子の異なる領域からの断片を特異的に増幅してそれらを区別し得るプライマー対をデザインした表4~8。表6~8は、ヌクレオチド多形性のいくつかSNPと標識された列と、指定されたプライマー対を使用した際に得られる増幅断片のサイズとを列挙する。これらの同一プライマーの組み合わせを使用して、デュラムコムギからのAおよびBゲノム同祖SBEIIa遺伝子を区別し得る。パンコムギのA、B、およびDゲノムからの同祖SBEIIb遺伝子を識別するいくつかのPCRプライマーセットの開発、および六倍体コムギ中のこれらの各ゲノム中のSBEIIbの同定については、国際公開第200162934-A号パンフレットに記載される。コムギの二倍体祖先、すなわちゲノムAではウラルツコムギTriticumurartu、ゲノムBではクサビコムギAegilopsspeltoides、ゲノムDではタルホコムギAegilopstauschiiからのSBEIIb配列に基づいて、SBEIIbの異なる領域からの3個のゲノムのそれぞれを特異的に増幅し得るプライマー対をデザインした表9~10。これらの同一プライマーの組み合わせを使用して、デュラムコムギからのAおよびBゲノム同祖SBEIIb遺伝子を区別し得る。実施例5:SBEII変異株の作成および同定重イオン衝撃によるコムギの変異誘発コムギ種子の重イオン衝撃HIB一般に使用される市販品種であるコムギ品種Charaにおいて、変異誘発コムギ集団を作成した。日本国埼玉県和光市の理化学研究所で行われた変異誘発では、2種類の重イオン、すなわち炭素およびネオンの供給源が使用された。変異誘発された種子を温室内に播種して、M1植物を得た。これらを自家受粉させて、M2世代を作成した。SBEIIaARIIaF2/ARIIaR2およびSBEIIbのゲノム特異的PCRプライマーARA19F/ARA23R診断PCRを使用して、およそ15,000のM2植物のそれぞれから単離されたDNAサンプルをSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子のそれぞれの変異について個々にスクリーニングした。野生型DNAサンプルに対する各PCR反応が、A、B、およびDゲノム上のSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の増幅領域に対応する、3個の異なる増幅産物を生じた一方で、変異誘発M2サンプルからのPCR中の1個の断片の不在は、1個のゲノム中の対応領域の不在を示唆し、すなわちその中で遺伝子の少なくとも一部が欠失した変異対立遺伝子の存在を示唆した。このような変異対立遺伝子は、ほぼ確実にnull対立遺伝子である。ゲノム特異的プライマー対を使用したM2系統のスクリーニングによって、SBEIIaおよび/またはSBEIIb遺伝子の変異体である合計34の変異株が同定された。SBEIIaの変異株をSBEIIb遺伝子の存在および不在についてスクリーニングした。その結果、同定された変異株は3群に分類された。SBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の双方が変異体である、すなわち1個のゲノム中で双方の野生型遺伝子を欠くタイプ1、SBEIIa遺伝子のみが変異体である一方、SBEIIb遺伝子は野生型であるタイプ2、および特定ゲノム中でSBEIIb遺伝子のみが変異体でありSBEIIa遺伝子が野生型であるタイプ3。A、B、およびDゲノム上のSBEIIa遺伝子は、診断PCR反応によって区別されたので、同様に、いずれの増幅産物が不在であるのかによって、SBEIIb遺伝子、変異対立遺伝子が、ゲノムの1つに割り当てられ得た。本明細書の用法では、名称A1は、ゲノム上のSBEIIaおよびSBEIIb遺伝子の双方が変異体である遺伝子型を指し、A2は、Aゲノム上のSBEIIa遺伝子が変異体でありSBEIIb遺伝子が野生型である遺伝子型を指し、A3は、Aゲノム上のSBEIIa遺伝子が野生型であり、SBEIIb遺伝子が変異体である遺伝子型を指す。名称B1、B2、B3、D1、D2、およびD3は、BおよびDゲノムと類似した意味を有する。これらの可能な9タイプの各変異株は、収集された34の変異株内で同定された。34の各変異株の中の染色体欠失の程度は、マイクロサテライトマッピングによって判定された。以前、染色体2A、2B、および2Dの長腕に位置づけられたマイクロサテライトマーカー表12をこれらの変異株上で試験して、各変異体中の各マーカーの存在または不在を判定した。反応における適切な増幅産物の生成に基づいて、その中で特定染色体マイクロサテライトマーカーの全てまたは大部分のいずれかが保持されている変異植物は、比較的小さな欠失変異株であると推測された。変異がその他の重要な遺伝子に影響する可能性があまりないことを考慮すると、このような変異株が好ましい。同定された変異株、およびマイクロサテライトマッピングからの結果を表13に要約する。変異株の交雑複数ゲノム上に変異SBEII対立遺伝子を有する子孫植物および穀粒を作成する交雑のために、マイクロサテライトマーカー分析による判定で、より小さな欠失について同型接合である変異植物を選択した。交雑種からのF1子孫植物を自家受粉させ、得られたF2種子をそれらのSBEII遺伝子型について分析した。このような12のF2集団のスクリーニングは、11種類の異なる変異対立遺伝子組み合わせ二重nullの同定をもたらした表14。その特定の交雑の1200を超えるF2子孫をスクリーニングしたにもかかわらず、12回目の交雑において、B1D1遺伝子型の二重null組み合わせは得られなかった。この1つの可能な説明は、SBEII遺伝子座近傍の重要遺伝子がBおよびDゲノムには存在するがAゲノムにはないことであり、したがってB1およびD1二重null変異の組み合わせが、種子を生育不能にしたかもしれない。27種類の二重null変異株の組み合わせが理論的には可能であり、より多くのF2集団をスクリーニングして、その他の組み合わせが同定されるであろう。実施例6:コムギの単一および二重NULLSBEII変異株のアミロース含有量実施例1に記載されるヨウ素滴定法を使用して、実施例5に記載される単一および二重null植物の穀粒デンプンのアミロース百分率を測定した。変異系統数X軸に対してアミロース含有量Y軸をプロットする散布図を図4に示す。変異株穀粒中のアミロース含有量は、27.3~38.7の範囲であった。野生型未変異Charaサンプルのアミロース含有量は、27.4~29.5の範囲であった。26系統が、34を上回るアミロース含有量を記録した。これらの26系統の内、20系統は二重nullであり、そのいくつかは、タイプ1またはタイプ2の組み合わせのいずれかの同一交雑からの複製であることが観察された。換言すれば、単一null穀粒のアミロース含有量と比較して、タイプ1およびタイプ2二重null組み合わせにおいて、アミロース含有量が顕著に増大する傾向があった。重要なことには、そして意外にもこの研究以前には、アミロースが40を超えるデンプンを有する二重null変異株穀粒はなかった。これには、それぞれ4個のSBEIIaおよび4個のSBEIIbnull対立遺伝子を含有し、2個の野生型SBEIIaおよび2個の野生型SBEIIb対立遺伝子を保持する、A1B1、A1D1、およびB1D1遺伝子型が含まれた。しかしこの観察は、実施例2のデータから立てられた予測と一貫していた。そのため変異を組み合わせることで、アミロースが40を超えるコムギ穀粒を獲得するには、穀粒が、4個を超えるSBEIIaの変異対立遺伝子を有する必要があり、または代案としては、4個のSBEIIaの変異対立遺伝子のみが存在する場合は、4個のSBEIIa対立遺伝子と組み合わせて4個を超える変異SBEIIb対立遺伝子が必要であり、好ましくは6個のSBEIIb遺伝子が全て変異体であると結論付けられた。データから、A、BおよびDゲノムのそれぞれの上のSBEIIa遺伝子は、相互比較で同様のレベルで発現され、すなわちパンコムギ中では、いずれの1個のゲノムもSBEIIaを優勢に発現しないこともまた示唆された。A3およびA3D3遺伝子型が、実施例2のデータと一致する低アミロース含有量を有したことは興味深く、コムギ中のアミロース含有量を定める上で、SBEIIbの役割がSBEIIaと比較してより小さいことが確認された。実施例7:三重null変異株を作り出す試みにおける交雑種4個を超えるSBEIIa変異対立遺伝子がある変異株系統を作成するために、単一nullおよび二重null系統のいくつかを交雑し、診断PCRアッセイを使用して、これらの交雑種のF2子孫を分析した。アッセイは、3個のSBEIIaおよび3個のSBEIIb遺伝子の存在を試験し、したがってA、B、およびDゲノムのそれぞれの中のSBEIIaおよび/またはSBEIIb遺伝子にnull変異を有した植物SBEIIaおよび/またはSBEIIbに関して三重null系統を同定する試みにおいて使用された。第1の実験で実施された交雑、および親系統と可能な三重nullF2子孫の遺伝子型を表15に列挙する。これらの交雑から選択された見かけが正常なF2種子および皺が寄った/萎縮F2種子を顕微鏡検査して、デンプン顆粒形態を分析した。D2単一null親植物とA1B2二重null親植物の間の交雑からそれぞれ得られた、08/dd交雑から5個の、および08/bb交雑から1個の、6個の皺が寄った/萎縮種子を選択した。6個の各種子は、デンプン顆粒の重度の歪みを示し、種子中の顆粒の大部分で異常な歪んだ形状を示し、それはアミロースレベルが増大した遺伝子組換え種子で観察された顆粒と類似していた実施例2。その他の交雑種からの皺が寄った/萎縮種子および選択された外見が奇妙ないくつかの種子の検査は、デンプ顆粒形態が無変化であったことを明らかにし、08/ddおよび08/bb種子中で観察された表現型が、遺伝子型に特異的であって、種子発生中の発育障害のためではないことが示唆された。歪んだデンプン顆粒を有する6個の種子から単離されたデンプンをプールして、実施例1に記載されるヨウ素滴定法を使用して、アミロース含有量を試験した。プールされたサンプルのアミロース含有量は、67と測定された表16。栽培品種CadouxおよびCharaの野生型種子対照中のアミロースレベルは、およそ35であった。デンプン顆粒形態が変化した種子の遺伝子型分析。08/ddおよび08/bb交雑からのデンプン顆粒形態が変化した種子を播種して、結果として生じた植物を温室栽培した。実施例3に記載されるSBEIIaおよびSBEIIbのゲノム特異的プライマーを使用して、植物から抽出されたDNAを分析した。PCRアッセイからの結果は、これらの各種子が、遺伝子型A1B2、B2D2またはA1D2のホモ接合二重null変異株である一方、第3の野生型遺伝子は、同型接合または異型接合状態のいずれかで存在することを示唆した。植物中の3個のSBEIIa遺伝子の存在または不在、および同型接合性または異型接合性をアッセイする、ゲノム特異的個別プライマー対を使用した、定量的PCRリアルタイムPCR、Rotorgene6000を使用して、これらの植物からのDNAをさらに試験した。SBEIIaのために使用されたプライマー対は、Snp6for/Arev5配列番号51/配列番号61Aゲノム、205bpの増幅産物、Bsnp4/Arev5配列番号55/配列番号61Bゲノム、494bpの増幅産物、およびDSnp7for/Drev1配列番号58/配列番号62Dゲノム、278bpの増幅産物であった。SBEIIa増幅反応を正規化するために、全ての植物で等しく発現されると予測される細胞壁生合成遺伝子でありコムギの7番染色体に位置するCslF6遺伝子から、190bpの産物を増幅するプライマー対SJ156/SJ242を使用して、増幅を制御した。野生型植物からのDNA、2B2と称される変異誘発集団からのDNA、および野生型栽培変種ChineseSpringCSからのDNAを対照テンプレートとして使用した。SBEIIaプライマーとの反応で生成された相対濃度の値は、各テンプレートDNA調製品のためのCslf6プライマーの値で正規化した。可能な三重null植物およびCSの値を2B2系統と比較して計算した。これらの3個のプライマー対の内、Dゲノムプライマーが、S14と称される1つの植物について明白な単一バンドを生じ、定量化を可能にした。S14のAおよびBゲノム上のSBEIIa遺伝子ではバンドが得られず、これらのゲノム上の変異対立遺伝子について、それが同型接合であったことが示唆された。定量化は、S14が、2B2と比較しておよそ30~50のD対立遺伝子補体を有した一方、CSはDゲノムSBEIIa遺伝子について、2B2のおよそ95の値を与えたことを示唆した。これは、約67のアミロースレベルの種子を与えたS14が、Aゲノム中のSBEIIbnull変異について同型接合であったことに加えて、2個のゲノムAおよびBのSBEIIanull変異について同型接合であり、第3のゲノムDについて異型接合体であったことを示した。すなわち、S14は、A1同型接合、B2同型接合、D2/異型接合体遺伝子型を有した。同様に、定量的PCRは、S24と称される植物がB2同型接合、D2同型接合およびA1異型接合体遺伝子型を有したことを示した。PCR分析は、残りの5植物が以下の遺伝子型を有したことを示した。08dd9-B4はA1B2遺伝子型について同型接合であり、すなわちAゲノム上のSBEIIaおよびSBEIIbについて同型接合変異体であり、Bゲノム上のSBEIIaおよび野生型SBEIIbについて同型接合変異体であり、Dゲノム上の双方の遺伝子について同型接合野生型である一方、08bb11-D9はB2D2遺伝子型について同型接合であり、S28およびS22はA1D2遺伝子型について同型接合であった。F3種子の分析S28、S22、S14、およびS24系統の種子を温室内に播種して、結果として生じた植物を自家受粉させ、各植物から種子F3世代を得た。植物の稔性が影響を被り、ヘッドあたりの種子数および稔性の花穂の百分率は、同時に同一条件下で栽培された、野性型、単一null、およびその他の二重null変異株と比較して顕著に低下したが、消滅しなかったことが観察された表17。デンプン顆粒形態は、S28、S14、およびS22の各系統からの100~200個の種子上で、光学顕微鏡によって判定された。S22系統からの試験された200個の種子の内、102個のF3種子に歪んだデンプン顆粒があると同定された。データは、予想よりも正常な表現型の数が多い、予想される1:2:1同型接合変異体:異型接合体:野生型からの分離比の歪みを明らかにした。高アミロース表現型を持つ同型接合植物が同定されるかどうかを見るために、歪んだ顆粒がある102個の種子を発芽に適する条件においた。102個の種子の内、61個が発芽した。これらの61個の植物からのDNAはSBEIIaゲノム特異的PCRによって分析され、全ての61個の植物はA1D2遺伝子型の二重nullのようであり、同型接合三重nullは同定されなかった。Bゲノム上の野生型SBEIIa遺伝子は異型接合体であることが示され、すなわちBゲノムに対して野生型および変異対立遺伝子の双方が存在した。歪んだデンプン顆粒を有したが発芽しなかった41個の種子は、それらのSBEIIa遺伝子型について分析された。これらの多くは三重nullであることが観察され、すなわちSBEIIa遺伝子のあらゆる増幅産物の不在を示し、したがってSBEIIaに対して6個のnull対立遺伝子を有した。これから、三重null種子が生じ得るが、これらの種子は発芽に影響を及ぼす欠陥を有したことが確認された。これらの種子いくつかから胚を摘出し、胚の発芽を促進する条件下で、組織培養液を使用して培養した。いくつかの胚は成功裏に発芽して、緑色小植物がもたらされた。しかしこれらの小植物を土壌に移すと、それらは発育不良であり、稔性コムギ植物を生じなかった。これらのデータから、HIB生成欠失変異に基づく同型接合三重null変異体種子、およびこれらの種子から誘導され、6個のnullSBEIIa対立遺伝子を有して完全にSBEIIaを欠く小植物は、これらの交雑種から回収可能であったが、発芽および成長が影響を被ったと結論付けられ、これらの過程におけるいくつかのSBEIIaの重要な役割が示唆された。対照的に、第3のnull対立遺伝子について異型接合体であり、したがって5個のnullSBEIIa対立遺伝子を有するSBEIIaの二重null変異株は、回収されて正常に成長し、稔性は低下したものの稔性であった。S28系統のタンパク質発現解析SBEIIa特異的抗体を使用して、ウエスタンブロット法により、S28植物からの1本の花穂全体から得られる発生中の内胚乳中のBEIIaタンパク質表現を分析した。花穂中の15個の内胚乳の全ては、SBEIIaのAおよびDゲノムイソ型の双方を欠くパターンAD二重nullを示し、Bゲノムから発現される1つのSBEIIaバンドのみが存在した。15個の内胚乳の内7個は、他よりも、そして対照系統NB1よりも大幅に低い、BゲノムSBEIIa発現レベルを有した。バンド強度に基づいて、各内胚乳中のSBEIIa発現を定量化した。内胚乳からの残りのデンプン顆粒を、90Percollを使用して精製した。200μlの水中の再懸濁に続いて、顆粒を顕微鏡的に検査した。野生型の約36未満のSBEIIa発現レベルを有する全ての内胚乳は、高アミロース表現型に典型的な、歪んだ形態のデンプン顆粒を有したことが観察された。S24植物からの1本の花穂からの発生中の穀粒中で観察された一連のSBEIIaタンパク質発現レベルは、野生型の5未満に低下した。SBEIIaのレベルがより低い内胚乳はまた、デンプン顆粒形態の変化も示し;したがってこの実験において表現型は、完全に相関性がある。これらの全ての内胚乳中のSBEIIb発現レベルはまた、SBEIIb特異的抗体を使用して分析された。結果は、SBEIIa発現の低下に対応して、SBEIIbの発現に同時の低下があったことを明らかに示した。考察4個の変異SBEIIa対立遺伝子を有するA1B2変異遺伝子型がある植物表18に要約されるからの種子の分析は、その遺伝子型について、アミロース含有量がわずかにのみ上昇し、40未満のアミロースレベルがもたらされたことを示した。比較すると、S14、S22、S24、およびS28種子からのデータは、第5のSBEIIa変異対立遺伝子の追加が、アミロースレベルを約67に上昇させることを実証した。したがって4個のSBEIIanull対立遺伝子から最低限の5個の変異SBEIIa対立遺伝子への増加は、アミロースレベルを50w/wを超えて、実際に60w/wを超えて増大させる上で重要であった。この結論は、実施例2のデータから立てられた予測と一致した。対立遺伝子組成とアミロース含有量との観察された関係性は、植物中のSBEIIa変異対立遺伝子の総数が、アミロース含有量を定める上で重要であったことを示唆した表18。SBEIIb変異対立遺伝子の数が役割を果たすこともまた結論付けられたが、SBEIIa変異対立遺伝子の数よりも重要性に劣った。同型接合三重null変異体種子、および6個のnullSBEIIa対立遺伝子を有してSBEIIaを完全に欠く小植物が、HIB生成欠失を含有する単一null変異株から作成され得るが、これらは発芽および成長に影響を被ると結論付けられ、いくつかのSBEIIaのこれらの過程における重要な役割が示唆された。対照的に、第3のnull対立遺伝子について異型接合体であり、したがって5個のnullSBEIIa対立遺伝子を有するSBEIIaの二重null変異株は、回収されて正常に成長し、稔性であった。実施例8:完全にSBEIIaまたはSBEIIbを欠く三重null変異株を生成するさらなる試み完全にSBEIIaを欠く三重null変異株が作成できないという、上の実施例の観察は、交雑の親として使用される特定の変異体植物に依存したかもしれない。これを試験するために、これもまたHIB変異誘発から得られた追加的な親変異株を使用して交雑の第2の組を実施し、表19に要約する。38の交雑種からのF2種子を収穫してDNA抽出した。その内の12はA1B2D2遺伝子型三重null変異体の生成を目的する交雑種からであるが、実施例7に記載されるのとは異なる親系統を使用している、25の交雑種からの少なくとも96個のDNAをPCRによってスクリーニングし、分離傾向を判定した。これらの交雑種のいずれからも、生存能力がある三重nullは同定されなかった。二重nullの回収もまた交雑に応じて変動したが、ほとんどの場合、予測された遺伝子型が得られた。6個のA1B2D2交雑種からのF2種子もまた顕微鏡的にスクリーニングして、高アミロース表現型有する種子を同定した。このような種子は、中程度の頻度で同定された。A2B2D2交雑からの種子のスクリーニング、08/mm-1。表19に列挙される交雑種の内、12はA2遺伝子型親とB2D2遺伝子型親の間の交雑種であり、すなわちA2B2D2遺伝子型を有する三重nullSBEIIa変異株を作り出す目的で、双方の親は3つ全てのSBEIIb遺伝子について野生型であった。08/mm-1交雑から得られるおよそ672個のF2種子からのDNA調製品をPCRによってスクリーニングした。分離比は、予測されるメンデル比から歪んで、予測されたよりも顕著により少ない二重nullが同定された表20。それでもなお、生育し得る種子中で、二重null変異の全ての可能な組み合わせが同定された。メンデル型分離では、約10個が予測されたにもかかわらず、672個の種子中にA2B2D2遺伝子型の三重nullは同定されなかった。並行して、08/mm-1交雑のF2種子を顕微鏡検査でスクリーニングして、高アミロース/歪んだデンプン顆粒HA表現型を持つあらゆる種子を同定した。スクリーニングされた576個のF2種子の内、HA表現型を持つと同定された種子はなかった。この種子集団は、2個のゲノムにおいて同型接合変異体であり、第3のゲノムにおいてSBEIIaの異型接合変異体/野生型を有する、5個の変異SBEIIa対立遺伝子を有する、低頻度の種子を含むべきであった。A2B2D2交雑における、HA表現型がある種子の観察された欠如は、あらゆるSBEIIb変異対立遺伝子の不在下では、5個の変異SBEIIa対立遺伝子が、高アミロース>50アミロース表現型を提供するには不十分なようであったことを示唆した。すなわち50を超えるアミロースを提供するには、5個の変異SBEIIa対立遺伝子と1個の野生型SBEIIa対立遺伝子の文脈で、SBEIIaレベルの大幅低下に加えて、野生型と比較したBEIIbレベルの低下が必要であり、または1つまたは複数のSBEIIa遺伝子に部分的機能喪失変異を有する内胚乳で、同等のSBEIIa活性レベルが必要であった。その他の2個のゲノム上の単一SBEIIa変異体親野生型SBEIIbと二重SBEIIa変異体親の間の11の追加的な交雑種からのF2種子のスクリーニングもまた、いかなる生存能力のあるA2B2D2遺伝子型の三重null変異体種子も同定しなかった。タイプ3変異を伴う交雑4個の変異SBEIIa対立遺伝子と組み合わされた、2、4または6個の変異SBEIIb対立遺伝子の同型接合を有する変異株を発見する目的でタイプ3変異を伴う交雑を実施し、結果として生じる植物およびその穀粒の表現型を測定した。表21は、タイプ3変異を伴う交雑種のスクリーニング結果を要約する。そのどちらも野性型デンプン顆粒形態を示した、A3B3D3およびA3B2D2交雑種からの三重nullが同定された。実施例9:高アミロース変異株のさらなるスクリーニング同定された単一変異株からの三重nullSBEIIa変異株を生成するさらなる試みにおいて、改変ストラテジーを採用した。このストラテジーでは、単一変異株の同定後に、単一SBEIIa変異を有するM2植物から未連鎖で無関係の変異を除去するために、単一変異株のいくつかの初期戻し交雑ステップを追加した。これは、変異が組み合わさると有害効果を及ぼし得る、所望のSBEIIa変異と無関係の追加的な変異を植物中に生じ得る、使用された高レベル変異誘発処理に起因する変異背景の影響を低下させるために含めた。これらの初期戻し交雑は、M2変異株と、冬コムギ栽培品種Apacheまたは春コムギ栽培品種Charaコムギのいずれかの植物との交雑によって実施された。最初に、13回の交雑を実施して、全ての3ゲノム上の変異を組み合わせ、21,400F2の半切種子からのDNAについて分子解析を実施して、各半切種子の残りは系統維持のために保持した。変異を検出する予備スクリーニングでは、SBEIIaまたはSBEIIbに対する特異的ゲノムである、優勢SSRマーカーを使用した。これから、ゲノム特異的増幅産物の不在によって、21個の種子が推定上の三重null変異株として、793個の種子が推定上の二重変異株として同定された表22。コムギ種子遺伝子型のQ-PCRTaqManベースのアッセイ上述の優勢マーカーを使用した1回目のスクリーニングは、あらゆる1個のSBEIIa遺伝子について、異型接合または同型接合野生型の種子を区別できなかった。そのためTaqManベースのPCRアッセイを開発して、第3のゲノム上のSBEIIa遺伝子について、異型接合体および同型接合体を区別して、最初のスクリーニングからの遺伝子型を同定した。TaqMan分析は、半切種子に対して実施され、コムギ内胚乳は各ゲノムについて三倍体3nであるので、第3のゲノム上の野生型SBEIIa対立遺伝子に関する異型接合体内胚乳について、以下の2種類のプロファイルのいずれかが可能であった。野生型対立遺伝子が母親によって提供される2n、または野生型対立遺伝子が花粉を通じて父親によって提供される1n。Q-PCRTaqManベースのアッセイは、AppliedBiosystems7900HTFastRealTimePCRSystemABI,FosterCity,CAを使用して、推定上の二重変異体コムギ種子の第3のゲノム上のSBEIIa遺伝子のコピー数を検出した。アッセイは、磁気ビーズ法Nucleomag、カタログ番号744400.24によって、半切種子から抽出されるゲノムDNAを使用した。DNAを384ウェルプレートに装入し、二本鎖Q-PCR反応を各プレートについて二連で実施した。PCR反応は、プライマーSBE2aQPCRABDF4順方向プライマー:5’-ACGATGCACTCTTTGGTGGAT-3’配列番号31およびSBE2aQPCRABDR4逆方向プライマー:5’-ACTTACGGTTGTGAAGTAGTCGACAT配列番号32を使用して、SBEIIa遺伝子のエクソン21からの65bp断片を増幅するようにデザインされた。Q-PCR反応中に蛍光シグナルを送達するのに使用されたプローブは、SBE2aQPCRABDS4TaqMan登録商標プローブMGB、FAM5’-CAGCAGGCTTGATCAT-3’配列番号33であった。プライマーGamyB1F順方向プライマー:5’-GATCCGAATAGCTGGCTCAAGTAT-3’配列番号34およびGamyB2R逆方向プライマー:5’-GGAGACTGCAGGTAGGGATCAAC-3’配列番号35を使用して、内在性遺伝子からの配列GamyBを内部対照として使用して各サンプルのシグナル値を正規化した。反応条件は、次のとおりであった:ホットスタート95°C、10分間とそれに続く40サイクルの変性95°C、15秒間、アニーリング58°C、60秒間。7900HTFastRealTimePCRSystemに組み込まれたRelativeQuantificationマネジャーソフトウェアを使用して、反応生成物を分析した。このTaqManアッセイを使用して、全ての21の推定上の三重null変異株は二重nullであって、三重nullではないことが確認された。最初のスクリーニングにおける不正確な同定は、恐らくテンプレートDNAの低品質によって引き起こされた偽陰性に起因すると考えられた。光学顕微鏡によってデンプン顆粒形態について14個の種子を検査すると、観察された14個は全て野生型顆粒表現型を有し、これは二重null変異株であって三重null変異株でない種子と一致した。アッセイはまた、交雑種M76、M77、M82、M83、およびM86から、第3のゲノム上の2n異型接合体である、数個の推定上の二重変異体種子を同定した。しかし二重nullSBEIIa背景の存在下であってさえも、2n異型接合遺伝子型を3n同型接合遺伝子型から区別することは困難であったため、これらの結果は確認されなくてはならない。これは、次世代子孫で確認されるであろう。アッセイはまた、交雑種M79、M81、M74、M75、M78、およびM80から得られる第3のゲノム上の異型接合変異SBEIIa/野生型である、SBEIIa二重null変異株がなかったことも示した。交雑種M84およびM85は、第3のゲノム上の1n異型接合体変異SBEIIa/野生型の有望な候補である、明確に同定された同型接合二重nullSBEIIa変異株の最大数を与えた。いくつかの2n異型接合体もまた同定されが、確認されなくてはならない。これらの交雑種では、単一および二重nullSBEIIa変異株の数が、メンデル型分離から予測される頻度よりも低かった。分離のこの歪みは、さらに研究された。同型接合単一変異株の予測される頻度が25であるべき場合、交雑種によっては頻度がはるかにより低く、1~25の範囲であった。三重null変異株を生じる、交雑種の子孫中の二重同型接合変異株の数は、理論的には組み合わせ6AB、6AD、および6ABあたり約61/41/4になるべきである。同定された二重変異株の実際の数ははるかにより低く、0~5.2の範囲であった。これはいくつかの変異組み合わせが、植物に対して、例えば種子発生に対して有害であり、予測されるよりも低い変異組み合わせの回収をもたらしたことを示唆した。2つの交雑種、M74およびM75は、予測と比較して最低頻度を与えた。これらの交雑で使用された親は、交雑実施前に、ApacheまたはCharaと戻し交配されていなかったことに気付かれ、変異誘発処理から生じた親中の追加的な無関係の変異が、分離比の歪みにおいて役割を果たした可能性が示唆された。より高い数の単一変異株を与えた交雑種M76およびM86でさえも、二重null変異株の頻度は、特にいくつかの組み合わせで低かった。例えば交雑M76では、DゲノムおよびAゲノム中の単一nullの頻度がそれぞれ23および17であったのに対し、AおよびDゲノムの双方における二重null変異株の頻度は、0.8のみであった。これはSBEIIa変異のいくつかの組み合わせが、他よりも植物にとって好ましさに劣り、その結果逆選択されたことが示唆された。5個の変異SBEIIa対立遺伝子第3のゲノム上の異型接合変異体である二重nullを含有する変異株の比率もまた、非常に低かった。予測される頻度が91/41/41/23であったのに対し、最大観察百分率はM84およびM85交雑種で1.1であった。M74およびM75交雑種における同型接合単一および二重変異株の頻度の相関は、AおよびDゲノム上のSBEIIa変異でかなり優れていたそれぞれ0.789および0.558が、Bゲノムでははるかにより低かった0.386。可能な説明は、M74およびM75交雑種で使用された親の1つ19.832D1/20.257A2[08/b12]が、最初の段階で二重同型接合変異体でなく異型接合体であったことである。これらの条件下で、三重null変異体6個のnull変異SBEIIa対立遺伝子を得る確率は非常に低く、予測される頻度の1/64を大幅に下回る。しかし特にM84およびM85交雑種からの、これもまた第3のゲノム上の異型接合体である二重変異株の自家受粉は、三重null変異株がこれらの親変異株から回収可能かどうかを確認することが予測される。自家受粉植物の子孫を分析して、あらゆる三重変異体種子が同定されるであろう。実施例10:NIRによる変異株コムギ種子のスクリーニング迅速非破壊的ハイスループット方法を開発して、高アミロース含有量と関連付けられている表現型について、単一種子をスクリーニングした。実施例4~6に記載されるPCRベースのスクリーニング法は、15,000個の種子集団中の変異株を検出するのに成功したが、手動で各種子を切断した後に、各半切種子からのDNA調製が必要であるため時間と手間がかかった。近赤外線分光法NIRSを使用して、高アミロースと標準的アミロース表現型を区別し得ると判断した。近赤外線分光法NIRSは、コムギ種子の特性を判定するのに使用されている非破壊技術であるMcClure,2003。ワキシーデンプン表現型低アミロースコムギ単一種子NIRS分析は、Delwicheetal.2006によってデュラムコムギ上で開発された。Dowelletal2009は、ワキシー、部分的ワキシー、および標準的デュラムおよび六倍体コムギを分離する自動単一種子NIR仕分け装置を開発した。我々の知る限りでは、この方法は、これまで六倍体コムギ中の高アミロース種子を区別するために、使用されていない。粉砕種子材料中の見かけのアミロース含有量を測定する小規模生化学的参照法の開発および検証個々の種子中の見かけのアミロース含有量に従ってNIRS測定を較正するために、この場合は単一種子である同一サンプル上で、NIRSスペクトルデータと見かけのアミロース含有量を測定する生化学的方法とを相関させるための、数理モデルを確立してなくてはならなかった。例えば実施例1に記載される方法などの標準ヨウ素滴定法では、一定量の種子が慣例的に使用され、それはデンプン可溶化前に合わせられて、バルク合わせたデンプンを提供し、それは常態では、ヨウ素結合に基づいたアミロース含有量の比色分析測定に先だって脱脂される。NIRS較正目的での使用に適切にするために、この方法を修正、簡易化、縮小して、単一種子中の見かけのアミロース含有量を測定できるようにし、それによって種子間のアミロース含有量の変動を考慮に入れた。修正法は、粉砕穀粒からのデンプンを精製せず、デンプン中のアミロースと相互作用する脂質を除去せず、結果は種子からの単離デンプンの百分率でなく新鮮種子重量の百分率として表されるので、見かけのアミロース含有量という用語がこの文脈で使用される。これらの理由から、見かけのアミロース含有量について得られる値は、実施例1に記載される標準法を使用して得られる値よりもはるかに低い。第1段階として、この方法はデンプン精製なしに粉砕コムギ穀粒を使用して、比色分析応答とアミロース含有量の間の直線性を評価することで開発された。このために使用した高アミロース材料は、hp5’-SBEIIaコンストラクトで形質転換されてSBEIIaが低下しているコムギ穀粒WM、系統85.2c、実施例2を参照されたい、および同時に同一条件下で栽培された野生型コムギWMCである標準的アミロースレベルのコムギであった。粉砕WM穀粒が、実施例1の標準法による測定で約80のアミロースを含有したのに対し、粉砕WMC穀粒は約25のアミロース含有量を有した。異なる比率のWMとWMCのサンプルを粉砕種子材料から調製したが、さらなる精製はしなかった。およそ17mgのサンプルをアッセイで使用した。WMおよびWMC混合物を正確に秤量して、1.5ml微量遠心管に入れた。サンプル中のデンプンを可溶化するために、17mgのサンプルあたり1mlのDMSOを添加して、次に時々ボルテックスして、混合物を95°Cの水浴内で90分間加熱した。各混合物からの10μlのアリコートを1.98mlの水に添加して、10μlの0.01NNaOH溶液中の0.3I23KIで処理した。各混合物の吸光度を605nmで測定し、標準曲線を使用して吸光度値をアミロース百分率に変換した。アミロース比0~100のトウモロコシアミロペクチンSigma、カタログ番号A7780およびジャガイモアミロースSigma、A0512を使用し、粉砕コムギサンプルと同様に処理して標準曲線を作成した。結果は、WM組み込みレベルと見かけのアミロース含有量の間の直線関係を示し、NIRS較正のために簡易化ヨウ素滴定法を使用し得て、この目的でデンプン精製が必要でなかったことが示された。半切種子中の見かけのアミロース含有量を測定するための生化学的参照法の試験この試験では、ArizonaおよびWashingtonで行われた野外実験から得られたWMおよびWMC対照系統からの種子を使用した。全部で47個の胚除去半切種子を1.5ml微量遠心管に個々に入れて、それぞれに0.6mlのDMSOを添加する前に正確に秤量した。管を95°Cの水浴内で20分間インキュベートし、その後、ガラス棒を使用して、サンプルを管の中で粉砕した。各混合物の体積を17mgのサンプルあたり1mlにDMSOで正確に調節し、その後、時々ボルテックスして、管を水浴内で95°Cでさらに70分間インキュベートした。前述同様に、各混合物の10μlのアリコートを取り出して、それらを10μlの0.01NNaOH溶液中の0.3I23KIで処理し、H2Oで2mlに希釈して、見かけのアミロースを測定した。上述したように、各サンプルの吸光度を605nmで測定し、標準曲線を使用して、吸光度値を見かけのアミロース百分率に変換した。この方法を使用して、WM種子の見かけのアミロース含有量が20~41平均27の範囲であったのに対し、WMC種子の見かけのアミロース含有量は、7.5~17平均11.4の範囲であった。これらの値が、実施例1の方法によって測定されたアミロース含有量よりもはるかに低い理由については上述した。したがってこの簡易法は、高アミロースがある種子を野生型アミロース含有量の種子から区別できるようにした。NIRS較正WMおよびWMC種子上の単一種子NIRSスキャンは、MultiPurposeAnalyserMPANIRS分光計BrukerOptics,F-77420ChampsSurMarnes,Franceを使用して得られた。各種子をアルミニウムホイルで覆ったガラス管の底に入れ、2回スキャンした。ファイバープローブを装着したBrukerMPAMulti-Purpose-AnalyserspectrometerBrukerOpticsを使用して、スペクトルを記録した。16cm-1の分解能で4000~12,500cm-1の範囲にわたる、32個の参照スキャンおよび16個のサンプルスキャンを使用してスペクトルを記録し、1100個のデータ点がもたらされた。使用された光ファイバープローブは、固体用IN261プローブであった。見かけのアミロースレベルとNIR読み取り間の相関を判定するために、6~44の範囲にわたる見かけのアミロース含有量がある、226の個々のWMまたはWMC種子を分析した。最初に各種子について二連でNIRSスペクトルを得て、その後上述の方法に従って、各種子について、見かけのアミロース含有量を生物化学的に測定した。全データセットのスペクトルと比較して、スペクトル外れ値6サンプルを異常なスペクトルとして同定し、除外した残りのスペクトルをNormalisationMin-maxpre-treatmentで分析した。完全ワンアウト交雑検証があるPartialLeastSquareソフトウェアを使用して、モデルを作成した。モデル開発のために使用されたスペクトルウインドウは、9827~7150cm-1および6271~4481cm-1であった。較正を開発するのに使用されたPLS要素数は、14であった。較正モデルの正確度は、交雑検証SECVの標準誤差および決定係数R2で表された。キャリブレーションの効率は、セットの参照データの標準偏差に対する予測の標準誤差の比率rationRMSECVであるRPDによって示された。生化学的データとNIRスペクトルデータの間に正相関R2=0.702が得られた図15。モデルは、高アミロースコムギ種子を標準的アミロースコムギ種子から区別するのに十分頑強でありながら、なおもあらゆる1個の種子中でアミロース含有量を正確に測定するのに十分正確であると結論付けられた。したがって方法は、高アミロース表現型がある穀粒を濃縮するために、非常に多数の種子集団をスクリーニングできる。これは次のように検証された。NIRS検証高アミロース穀粒と対照穀粒の識別におけるNIR法を検証するために、さらに60個のWM種子と34個のWMC種子をNIRで2回スキャンして、計算される見かけのアミロース含有量を予測した。このように測定された見かけのアミロース値がWMおよびWMC集団の分布形状を獲得するようにプロットされると、2つの群がわずかな重なりを持ってほとんどは分離されることが分かる図16。これらの結果によれば、NIRSによる判定で30以上の予測された見かけのアミロース表現型を有する種子は、高アミロース種子の良好な候補と見なし得た。コムギ交雑からのF2種子のNIRSスクリーニングNIRSスクリーニングを実施して、高アミロース含有量を有する変異体種子を検出した。スクリーニングでは、21.142B2/TypeI-20257A1[08/h-111]//TypeI-19.832D1/CHARAおよび5.706D2/21.668B2//20.257A1/CHARAである、M80およびM85の2つの異なる交雑種からの2,700個のF2種子を使用した。したがってスクリーニングは、それぞれA1B2D1またはA1B2D2遺伝子型がある種子を同定することを目的とした。上述したように、種子あたり2回のNIRSスペクトルを記録した。二連のスクリーニングの少なくとも1つにおいて、34を超える予測された見かけのアミロース値を与えた種子をさらなる分析のために最初に選択した。2,700個の種子から27個の種子が選択され、次に光学顕微鏡によって評価されて、デンプン顆粒形態が判定された。各種子を注意深く掻き取って胚を保存しながら、なおも十分な内胚乳検査材料を獲得した。27個の内4個の種子が、歪んだデンプン顆粒形態を有することが観察された。これらの4個の種子は、NIRスクリーニングから、期せずして最大の予測された見かけのアミロース含有量を有し、これらの種子だけにおいて、予測されたアミロース値と見かけのアミロース値の双方が30を超えた。他の23個の種子は、標準的野生型顆粒形態を示した。NIRSスクリーニングによって選択された種子上の分子データ4個の種子上でPCR分析を実施して、それぞれのSBEIIa遺伝子型を判定した。最初のアッセイは、3個のゲノム上で各SBEIIa遺伝子の存在または不在を示す、優勢PCRマーカーを使用した。種子の3個は二重null変異株であることが示された一方で、4個目の種子は推定上の三重null変異株であった。しかし共優勢PCRマーカー下記参照でさらに試験すると、4個の種子は全て、SBEIIaの二重null変異株すなわち2個のゲノム中にSBEIIaを欠くであり、第3のゲノム上の変異SBEIIa遺伝子について異型接合体であることが示された。したがってこれらの種子は、5個の変異SBEIIa対立遺伝子、および少なくとも2個の変異SBEIIb対立遺伝子を含有した。各種子からの胚を発芽条件下に置くと、恐らくそれらは非常に損傷を受けており、または変異の組み合わせが非常に有害であったために、それらの中で成功裏に発芽したものはなかった。より多くの候補の同定を試みるために、あまり厳しくない候補種子選択により、M80およびM85交雑種からのさらに多数のF2子孫種子上で、さらなるNIRSスクリーニングを実施した。第2のスクリーニングのための選択基準は、予測された見かけのアミロース値の1つが30を超えて、第2の値が少なくとも23でなくてはならないことであった。光学顕微鏡によるデンプン顆粒評価のために、22個の種子の新しいセットを選択した。これらの22の候補の内、1個の種子BD85;9F08P279-F08-834は、歪んだデンプン顆粒表現型を示した。この変異株はPCRによってさらに分析され、AおよびBゲノム上の二重nullSBEIIa変異体であり、Dゲノム上の変異SBEIIa遺伝子について異型接合であることが示された。これは増殖のために成功裏に発芽した。実施例11:デンプン結合親和力が変化したデンプン分枝酵素の対立遺伝子の検出化学的変異原アジ化ナトリウムまたはEMSを用いた処理によって生成された、変異誘発コムギ穀粒の集団をスクリーニングして、野生型コムギと比較して、SBEIIa遺伝子に点変異を有し、したがってSBEIIa-A、-Bまたは-D活性、またはSBEIIb-A、-Bまたは-D活性部分的変異株を潜在的に低下させるが消滅させない変異株を同定した。変株異のスクリーニング法は、SBEIIaまたはSBEIIbに対して特異的な抗体と共にウエスタンブロット法を使用して実施例2を参照されたい、または次のような親和性ベースの技術によって、SBEIIaまたはSBEIIbタンパク質量を測定することに基づいた。このスクリーニングはまた、SBEIIa-A、-B、または-D活性を完全に欠く点変異のある変異株、ならびに部分的に活性の変異株を検出することが予測された。グリコーゲン、アミロペクチン、アミロースまたはβ-限界デキストリンを含有するポリアクリルアミドマトリックス親和性ゲル電気泳動を通過する、デンプン分枝酵素を含む穀粒からのタンパク質抽出物の天然ゲル電気泳動は、デンプン結合能力が変化したSBEIIaまたはSBEIIbをコードするSBEIIaまたはSBEIIbの対立遺伝子を同定する方法を提供する。デンプン分枝酵素の活性部位がデンプン結合部位を含有することを考えると、結合効率が変化したSBEIIポリペプチドは、触媒の速度および/または親和性が恐らく変化している。特に、結合効率が低下したポリペプチドは、SBEII活性が低下すると予測される。いくらかの修正を加えて、Morelletal.,1997;およびKosar-Hashemietal.,2006に基づいて、以下の方法を使用した。タンパク質の調製5mMのEDTA、5mMのDTT、0.4プロテアーゼ阻害剤カクテル、および20グリセロールを含有する、50mMのリン酸緩衝液、pH7.5中で、発生中の種子開花後約15日からの単離内胚乳を均質化し、可溶性タンパク質を抽出した。14,000gで10分間の遠心分離後、上清をゲル電気泳動のために使用した。抽出物中のタンパク質濃度をCoomassiePlusProteinAssayReagentを使用して推定した。親和性電気泳動SBEIIaタンパク質イソ型分離のための二次元2D親和性電気泳動技術において、HoeferSE600垂直16cmスラブゲルユニット中に流し込まれた非変性ポリアクリルアミドゲルである第1次元のゲルに、タンパク質抽出物のアリコート40または100μgを装入した。第2次元ゲルの分離用成分は、ゲル構造内に固定化された、適量の多糖類標的アミロペクチン、β-限界デキストリンまたはグリコーゲンが添加された10グリセロールを含有する、6非変性ゲル14×16cmまたは16×16cm、1.5mm厚さであった。濃縮用ゲル多糖類を含まないをガラスプレートフォーミングの上部から1cmに注ぎ込んで、コームを使用してウェルを形成した。ゲルを一晩4°C、定常電圧グリコーゲンおよびβ-限界デキストリンでは100V、アミロペクチン含有ゲルでは135Vで泳動した。代案としては、一次元形を使用して、タンパク質抽出物20μgを非変性ポリアクリルアミドゲルに装入して、SBEIIaタンパク質を分離した。ゲルの分離用成分が、ゲル構造内に固定化された、0.15のβ限界デキストリンを添加した10グリセロールを含有する、6非変性ゲルであった一方、濃縮用ゲルは多糖類を含まなかった。ゲルを4°Cで、ゲルあたり20mAの定電流、および最大電圧200Vで泳動した。SBEIIbタンパク質は、ビス-トリス4~12勾配ゲルInvitrogen上でもまた分離し得る。ゲルを4°Cで、ゲルあたり20mAの定電流、および最大電圧200Vで泳動する。免疫学的検出電気泳動に続くSBEIIタンパク質の免疫化学的検出のために、TE70PWR半乾燥移動ユニットAmershamBiosciencesを使用して、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移した。転写バッファーは、39mMグリシン、48mMトリス、0.0375SDS、および20メタノールを含有した。移動は、0.8mA/cm2の定電流で1~1.5時間実施した。コムギSBEIIaに対して特異的な一次ウサギポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロット法に先だって、膜を5脱脂乳でブロックした。一次元親和性ゲル電気泳動方法によって分析すると、コムギA、B、およびDゲノムからの同祖対立遺伝子によってコードされるSBEIIイソ型の移動パターンは、異なるコムギ変種間で相違を示した。いくつかの変種では、A、B、およびD同祖形態の明確な分離が可能であり、これらの変種からの変異誘発集団における多形性の単純なスコア付けを可能にした。例えば野生型コムギ変種SunstateおよびNB1の内胚乳からのタンパク質抽出物の親和性ゲル電気泳動は、SBEIIa-A、-Bおよび-Dイソ型の明確な分離を示した。デンプン親和性が低下している分枝酵素対立遺伝子は、それぞれの固有の同祖対立遺伝子よりも、多糖類含有ポリアクリルアミドゲル内でより長距離移動した。同型接合状態にあるバンドの存在/不在によって、および異型接合体系統中のバンド強度を測定する濃度測定を通じて、特定の同祖対立遺伝子の発現が低下し、または発現が不在の対立遺伝子を含有する系統を同定した。この方法を検証するために、親和性ゲル電気泳動によって、遺伝子型分析によって同定されたSBEIIa-およびSBEIIb-変異体植物実施例6が、それらの遺伝子型に一致して、特異的SBEIIaまたはSBEIIbタンパク質を欠くことを確認した。これらの実験は、SBEIIイソ型の量または活性が低下した変異株の検出について、このタンパク質分析法を検証した。ZwarandChandler1995に記載されるようにアジ化ナトリウムで処理された、コムギSunstate変種の2100の変異誘発系統の集団が、β-限界デキストリン親和性ゲル電気泳動を使用してスクリーニングされ、親和性ゲル上におけるSBEIIaタンパク質の1つの運動性の変化親和性変異株、またはその遺伝子によってコードされる検出可能なタンパク質の欠如に基づくSBEIIa遺伝子の1個のnull変異株のいずれかを有する、18の変異株が同定された。親和性変異株の1つにおける各SBEIIaイソ型のデンプン-酵素相互作用の解離定数Kdは、Kosar-Hashemietal.,2006で記載されるように、1-D親和性ゲル内のβ-限界デキストリン濃度の関数として、酵素運動性の変化を測定して計算された。この親和性変異株は、SBEIIa-A、SBEIIa-B、およびSBEIIa-Dイソ型のそれぞれに対して、Kd値が0.53g/l、0.52g/l、および1.69g/lであるSBEIIaタンパク質を有した図13。Dイソ型で観察された、AおよびBイソ型と比較してより高いKd値は、デンプン結合に対するこのイソ型のより低い親和性を示し、この系統がSBEIIa-D遺伝子の親和性変異体であることを示唆した。この系統のDゲノムイソ型SBEIIa-Dは、その他の2つのイソ型と比較して酵素活性がより低いが、活性は完全には喪失しないことが予測される。この予測は、SBEIIa-AおよびSBEIIa-Bのnull対立遺伝子存在下のSBEII活性アッセイによって確認される。次に2個のゲノムからSBEIIa活性を欠いて、第3のゲノムから活性が完全にまたは部分的に喪失した三重変異株を単離するために、アジ化ナトリウム変異誘発Sunstate集団から同定されたSBEIIa単一変異株を先に同定されたHIB二重null変異株と交雑した。遺伝子型A1B2D2を単離する4回の交雑、A2B2D2およびA2B2D1を単離するそれぞれ2回の交雑、およびA1B2D1を単離する1回の交雑を実施した。A1B2D2交雑種の1つからのF2種子のデンプン顆粒形態の顕微鏡検査は、高アミロースデンプン少なくとも70のアミロースに見られるのに類似した、デンプン顆粒が極度に歪んだ種子を同定した。これらの種子の遺伝子型およびアミロース表現型は、種子および子孫中のSBEIIa対立遺伝子を分析することで、そして子孫穀粒からデンプンを抽出および分析することで、同定された。また親和性単一変異株間で8回の交雑を実施して、SBEIIaの親和性二重変異株を生成した。これはA2B2、A2D2、およびB2D2二重親和性変異株を単離する目的で生成された交雑種を含んだ。F2子孫を上述の方法によって分析し、二重同型接合親和性変異株を同定した。実施例12:高アミロースコムギ穀粒からのデンプン顆粒およびデンプンの特性デンプン顆粒の形態および複屈折の変化実施例2に記載される遺伝子組換え高アミロースコムギ中で、デンプンおよびデンプン顆粒の特性を調べた。走査型電子顕微鏡を使用して、デンプン顆粒サイズおよび構造の全体的変化を同定した。SBEIIa発現が低下している内胚乳からのデンプン顆粒は、非形質転対照と比較して著しい形態学的変化を示した。それらは形が高度に不規則であり、A顆粒>10μm径の多くは鎌形のようであった。対照的に、SBEIIb発現が低下しSBEIIa発現が無変化の内胚乳からのAおよびB<10μm径デンプン顆粒は、どちらも表面が滑らかで形状が球状または楕円体であり、野生型コムギデンプン顆粒と識別不能であった。偏光下で顕微鏡的に観察すると、野生型デンプン顆粒は、典型的に強力な複屈折パターンを示す。しかし、高アミロースデンプン含有顆粒では、複屈折は大幅に低下した。SBEIIa発現が低下してアミロース含有量が70~80の系統からのデンプン顆粒を偏光下で視覚化すると、10未満が複屈折性であった。SBEIIb発現が本質的にないが野生型SBEIIa発現のある系統では、非形質転換対照と比較して、複屈折の変化は観察されなかった。野生型およびSBEIIb抑制系統のどちらも、デンプン顆粒のおよそ94が完全な複屈折を示した。データを表23に記載する。したがって複屈折喪失は、高アミロース含有量と密な相関性がある。遺伝子組換えコムギ穀粒のアミロース含有量2つの独立した方法、すなわちヨウ素滴定法およびサイズ排除クロマトグラフィーSEC法によって、遺伝子組換えコムギ穀粒のアミロース含有量をアッセイした。アミロース含有量のヨウ素滴定測定は、実施例1記載されるように、既知の濃度精製ジャガイモアミロースおよびアミロペクチンを使用して作成される標準曲線に関連して、ヨウ素がα-1,4グルカンの直鎖領域に結合する際に誘発される色変化の測定に基づいていた。サイズ排除クロマトグラフィー法は、脱分枝されていないアミロースおよびアミロペクチンのカラムクロマトグラフィーによる分離と、それに続くカラムから溶出した画分中のデンプン濃度の測定に基づいていた。穀粒の3つの遺伝子型を分析した。1つ目は、hp-SBEIIaコンストラクトで形質転換されて、SBEIIa発現レベルが非常に低い植物;2つ目は、hp-SBEIIbコンストラクトを含有して、検出可能なSBEIIb発現がないがSBEIIaについて野生型である植物;3つ目は、非形質転換野生型対照NB1。SBEIIb発現を欠く植物008からの穀粒は、アミロース含有量が、ヨウ素滴定法による測定で27.3であり、SEC法では32であった。これは非形質転換対照系統NB1穀粒のアミロース含有量ヨウ素滴定で31.8、SECで25.5と顕著に異ならない。しかしSBEIIa発現が低下している穀粒087系統では、アミロース含有量は顕著に上昇したヨウ素滴定で88.5、SECで74.4。087系統に関するこれらの2つの数値の差は、アミロースと良く似てヨウ素に結合し、ヨウ素滴定アッセイ中でアミロースとして測定されるが、カラムクロマトグラフィーではより大きいアミロペクチンと共に分離される、いくつかの中間体物質の存在であると考えられた。FACEによるデンプンの鎖長分布イソアミラーゼ脱分枝デンプンの鎖長分布は、フルオロフォア支援炭水化物電気泳動FACEによって判定した。この技術は、DP1~50の範囲内で、鎖長分布の高分解能分析を提供する。非形質転換対照の正規化鎖長分布が遺伝子組換え系の正規化分布から差し引かれるモル差プロットmolardifferenceplotから、SBEIIa発現が低下した穀粒からのデンプンにおいて、DP6-12の鎖長の比率の著しい低下と、DP12を上回る対応する鎖長増大があったことが観察された。野生型と比較して、hp-SBEIIb系統からのデンプンの鎖長分布に、統計的に有意な変化は観察されなかった。アミロペクチンおよびアミロースの分子量デンプンの分子量分布をサイズ排除-HPLCSE-HPLCによって測定した。HPLCシステムは、AutoSamplerGBC、LC1610および蒸発光散乱検出器ELSDALLTech、Deerfield,USAを装着した、GBCポンプLC1150、GBCInstruments,Vic,Australiaから構成された。Ultrahydrogel1000カラム、Ultrahydrogel250カラム、およびガードカラム7.8mm×300mm、Waters,Japanを使用して、HPLC操作中35°Cを保った。 ́酢酸アンモニウム緩衝液0.05M;pH5.2を流速0.8mLmin-1で移動相として使用した。SBEIIa低減穀粒デンプン中のアミロペクチンの分子量は、NB1野生型、非遺伝子組換えおよびSBEIIb低下穀粒デンプン中のアミロペクチンよりも、はるかにより低いようであったピーク位置が45523、43646kDaと対比して7166kDa。対照的に、SBEIIb低下穀粒からのアミロースの分子量は、非形質転換変種NB1からの野生型穀粒と比較して、顕著に異ならなかった。データは表24にある。SBEIIa発現が低下したコムギ内胚乳中の全デンプン含有量穀粒重量の百分率としての穀粒中の全デンプン含有量の解析は、対照の52およびhp-SBEIIb系統の50.3と比較して、hp-SBEIIa系統43.4中の内胚乳デンプン含有量のわずかな低下を明らかにした表23。これは阻害性コンストラクトによってSBEIIa発現が低下すると、全デンプン合成にいくらかの低下があったことを示唆した。デンプン膨潤力SSPデンプンの糊化中の水取り込みを測定するKonik-Roseetal.,2001の小規模検査に従って、糊化デンプンのデンプン膨潤力を測定した。SSP推定値は、対照9.31およびSBEIIb低下穀粒10.74からのデンプンと比較して、SBEIIa低下系統からのデンプンで数値3.51と顕著により低かった表23。デンプン糊化特性本質的にReginaetal.,2004に記載されるRapidViscoAnalyzerRVAを使用して、デンプン糊化粘度パラメータを測定した。RVAの温度プロファイルは、以下の段階を含んでなる。60°Cで2分間保持、6分間で95°Cに加熱、95°Cで4分間保持、4分間で50°Cに冷却、および50°Cで4分間保持。結果表25は、対照コムギデンプンと比較して、SBEIIa低下穀粒からのデンプン中で、ピークおよび最終粘度が顕著により低かったことを示した。デンプンゼラチン化特性Reginaetal.,2004に記載される示差走査熱量測定DSCを使用して、デンプンゼラチン化特性を研究した。PerkinElmerPyris1示差走査熱量計上でDSCを実施した。1:2の比率でデンプンおよび水を予備混合し、およそ50mgをDSCパン内に量り入れて密封し、一晩平衡化させた。1分あたり10°Cの加熱速度を使用して、試験および参照サンプルを30~130°Cに加熱した。装置付属のソフトウェアを使用して、データを分析した。結果表26は、対照66.6°Cと比較して、SBEIIa低下穀粒からのデンプンのゼラチン化温度終了遅延72.6°Cを明らかに示した。対照デンプン61.16°Cと比較して、SBEIIa低下デンプン63.51°Cは、ピークゼラチン化温度もまたより高かった。実施例13:加工中の高アミロースコムギ小麦粉の分析加圧加工に関するCSIROFoodandNutritionalSciences,Werribeeとの共同研究小角X線散乱SAXSを使用して、天然デンプンと比較した高アミロースコムギデンプンの構造特性評価を実施した。研究は、a生小麦粉の特性評価、およびb100°Cを超える温度における小麦粉またはデンプンサンプルの加圧料理中の糊化処理のリアルタイム分析、およびc0~10日間にわたる冷却時の構造変化と老化を含めるようにデザインされた。研究では、約25野生型~約75の範囲にわたる、約10刻みで増大する様々なアミロース含有量の小麦粉サンプルを使用した。3組の小麦粉サンプルを実験に含めた。1つ目は、SBEIIa低下系統からの高アミロースコムギのプールなしの純粋系統であり、hp-comboコンストラクトで形質転換された約50のアミロースを有する中程度のレベルのアミロースコムギ系統AC45.1実施例2および対照コムギNB1。2つ目は、実施例2に記載される形質転換系統からのプールされたコムギ材料、プールサンプルは、アミロース含有量が約10刻みで増大される。3つ目は、コムギ高アミロース、野生型、およびSSIIaを欠くコムギ、オオムギ野生型、SBEIIaおよびSBEIIb低下による高アミロース、およびSSII低下による高アミロース、およびアミローストウモロコシをはじめとする、異なる種からの比較穀粉。一連のアミロース含有量のプールされたコムギ物質に対する難消化性デンプン分析の結果は、難消化性デンプンのアミロース含有量880540からの直線的増大を明らかにした。実施例14:パンおよびその他食品生産高アミロースコムギなどの穀粒を食餌中に送達する最も効果的な様式の1つは、パンを経由する。高アミロースコムギが、パンに容易に組み込み得ることを示し、製パン品質の維持を可能にする要素を調べるために、小麦粉サンプルを製造し、分析して、ベーキングで使用した。以下の方法を用いた。方法コムギ穀粒を16.5の水分含量に一晩調湿して、BRILtd,AustraliaのBuhler実験室規模製粉機で、またはQuadromatJunior製粉機を使用して製粉し、それに続いて篩掛けして、最終粒度150μmを得た。AACC法39-111999に従った赤外線反射率NIRによって、またはDumas法およびAACC法44-15AAACC51999に従った空気乾燥器によって、サンプルのタンパク質および水分含有量を測定した。マイクロZ-arm混合マイクロZ-armミキサーによって、混合あたり4gの試験小麦粉を使用して小麦粉の最適吸水値を判定したGrasetal.,2001;Bekesetal.,2002。全ての混合において、それぞれ96および64rpmの迅速および緩慢ブレードの軸速度で、一定の角速度を使用した。混合は、三連で各20分間実施した。水を小麦粉に添加する前に、固形成分の混合のみによって、ベースラインを自動的に記録した30秒間。自動送水ポンプを使用して、水を一度に添加した。以下のパラメータは、個々の混合実験から平均を取って判定された。WA:吸水量は500ブラベンダー単位BU生地粘稠度で判定された;生地形成時間DDT:ピーク抵抗までの期間秒。ミキソグラム改変小麦粉に関する最適生地混合パラメータを判定するために、全生地質量を一定に保ちながら、10gのCSIROプロトタイプミキソグラフ中で、マイクロZ-armミキサーで測定される吸水量に相当する変動する吸水量のサンプルを混合した。各小麦粉サンプルで、以下のパラメータを記録した。MT-混合時間秒;PR-ミキソグラフピーク抵抗任意の単位、AU;BWPR-ピーク抵抗での帯域幅任意の単位、AU;RBD-抵抗崩壊;BWBD-帯域幅崩壊;TMBW-最大帯域幅までの期間秒;およびMBW-最大帯域幅任意の単位、A.U.。マイクロ伸張試験生地伸展性パラメータは、次のように測定した:生地を10gのプロトタイプミキソグラフ中のピーク生地形成まで混合した。修正ジオメトリKieffer生地およびグルテン伸展性装置を用いて、TA.XT2iテクスチャー分析器上で、1cm/sでの伸張試験を実施したMannetal.,2003。伸張試験のための生地サンプル約1.0g/試験をKieffer成型機で成型して、伸張試験前に30°Cおよび90RHで45分間休ませた。ExceedExpertソフトウェアを用いて、データからR_MaxおよびExt_Rmaxを判定したSmewing,ThemeasurementofdoughandglutenextensibilityusingtheSMS/KiefferrigandtheTA.TX2textureanalyzerhandbook,SMSLtd:Surrey,UK,1995;Mann,2002。14gの小麦粉を100とした例証的レシピは、次のとおりであった。小麦粉100、塩2、乾燥酵母1.5、植物油2、および改良剤アスコルビン酸100ppm、真菌アミロース15ppm、キシラナーゼ40ppm、大豆粉0.3;GoodmanFielderPtyLtd,Australiaから得られる1.5。加水レベルは、完全配合のために調節されたマイクロZ-arm吸水値に基づいた。小麦粉14gおよびその他の成分を35gのミキソグラフ中のピーク生地形成時間まで混合した。成型および型詰めを40°Cで85RHの二段階プルーフィングで実施した。ベーキングはRotelオーブン内で、190°Cで15分間実施した。ローフ体積カノーラ種子置換法によって測定されるおよび重量は、ラック上で2時間の冷却後に測定した。ローフを経時的に秤量して、正味水損失を測定した。小麦粉または全粒小麦は、非改変コムギからの小麦粉または全粒小麦、またはオオムギなどのその他の穀類と混合して、所望の生地および製パンまたは栄養価を提供してもよい。例えば栽培品種CharaまたはGlenleaからの小麦粉は、生地強度が高いのに対し、栽培品種Janzの生地強度は中程度である。特に小麦粉中の高および低分子量グルテニンサブユニットのレベルは、生地強度と正の相関があり、さらに存在する対立遺伝子の性質によって影響を受ける。SBEIIaが低下した遺伝子組換えコムギ系統からの小麦粉が、100、60、および30の添加レベルで使用された。例えば全ての小麦粉が様々なコムギ系統に由来するか、またはベーキング対照B.追加小麦粉に60または30が添加された。百分率は、パン配合中の全小麦粉である。4つの遺伝子組換えコムギ系統が、次のように使用された:072SBEIIa低下、212SBEIIa低下×SBEI三重nullコムギの交雑に由来するコムギ系統、H7SBEIIa低下×SSIIa三重nullコムギの交雑に由来するコムギ系統、および008SBEIIb低下が、非形質転換対照コムギNB1と共に試験された。全てのコムギは、BrabenderQuadramatJuniorミル内で製粉した。全ての混合物は、上述したように、4gのZ-armミキサーで測定された吸水量と、10gのミキソグラフで測定された最適混合時間を有した。これらの条件を使用して、10gの試験ベーキングローフを調製した。混合特性対照系統ベーキング対照、NB1および008を除いて、全てのその他のコムギ系統は大幅に上昇した吸水値を与えた図17a。系統212および072は、添加レベルの増大と共に、100の212小麦粉の添加で最高95の吸水値をはじめとする、吸水値の増大を与えた。これらの系統からの小麦粉の組み込みレベルの増大はまた、最適ミキソグラフ混合時間の短縮をもたらした図17b。吸水データと同様に、非対照系統は、添加レベルの増大と共に、比膨化体積ローフ体積/ローフ重量に大幅な低下を示した。影響は212系統で特に強力であった。これらの研究は、許容されるクラム構造、歯触り、および外観をはじめとする、商業的可能性のあるパンが、対照小麦粉サンプルと会合された高アミロースコムギ小麦粉を使用して得られ得ることを示す。さらに、高アミロースコムギは、好ましい遺伝的背景特性例えば好ましい高および低分子量グルテニン、グルテン、アスコルビン酸塩または乳化剤などの改良剤の添加、または異なる製パン様式の使用例えば中種製パン、サワードウ、マルチグレイン、または全粒小麦と組み合わせて使用されて、腸および代謝健康の改善に対して特定の効用および栄養効能がある一連の製品を提供する。その他の食品:標準BRIResearchNoodleManufacturingMethodAFL029を使用して、Hobartミキサー内で、黄色アルカリ麺YAN100小麦粉、32水、1Na2CO3を調製した。Otake製麺機のステンレス鋼ローラー内で麺シートを形成した。休止30分間後、麺シートを切り分けて細断した。麺の寸法は1.5×1.5mmであった。標準BRIResearchNoodleManufacturingmethodAFL028に従って、Hobartミキサー内で、即席麺100小麦粉、32水、1NaCl、および0.2Na2CO3を調製した。Otake製麺機のステンレス鋼ローラー内で麺シートを形成した。休止5分間後、麺シートを切り分けて細断した。麺の寸法は1.0×1.5×25mmであった。麺を3.5分間蒸煮して、次に150°C、45秒間で油で揚げた。中種SDパンBRIResearch中種ベーキングは、二段法を伴った。最初の段階では、全小麦粉の一部を水、酵母、およびイーストフードと混合してスポンジを作成した。スポンジを4時間発酵させた。第2の段階では、スポンジに残りの小麦粉、水、およびその他の成分を合わせて、生地を作成した。工程のスポンジ段階は200gの小麦粉で作成し、4時間発酵させた。発酵したスポンジに残りの100gの小麦粉およびその他の成分を混合して、生地を調製した。パスタ-スパゲティパスタ製造に使用した方法は、Sissonsetal.,2007に記載される。高アミロースコムギSBEIIa低下および対照コムギNB1からの試験サンプル小麦粉をManildraセモリナと様々な百分率で混合し試験サンプル:0、20、40、60、80、100、小規模パスタ調製用の小麦粉ミックスを得た。サンプルを30水分に調節した。所望量の水をサンプルに添加して短時間混合し、50gファリノグラフボールに移し入れてさらに2分間混合した。コーヒー豆サイズの小片に似た得られた生地をステンレス鋼チャンバーに移し入れて、7000kPaの圧力下で9分間、50°Cで休ませた。次にパスタを定速で押出し、およそ48cmの長さに切断した。各サンプルで2バッチのパスタを製造した。ThermolineTemperatureandHumidityCabinetTEC2604ThermolineScientificEquipment,Smithfield,Australiaを使用してパスタを乾燥した。乾燥サイクルは、25°Cの保持温度とそれに続く65°Cへの増大を45分間、次に50°Cで約13時間とそれに続く25°Cへの冷却からなった。サイクル中、湿度を制御した。引き続く試験のために乾燥パスタを7cmの長さに切断した。実施例15:食物サンプルの血糖指数GIおよび難消化性デンプンRSの生体外測定本明細書に記載されるように製造されたパンをはじめとする食物サンプルの血糖指数GIを生体外で次のように測定した:食物サンプルを家庭用フードプロセッサ内で均質化した。およそ50mgの炭水化物に相当するサンプル量を120mlのプラスチックサンプル容器内に量り入れ、α-アミラーゼなしで100μlの炭酸塩緩衝液を添加した。炭酸塩緩衝液添加のおよそ15~20秒後に、5mlのペプシン溶液65mlのHCl0.02Mに溶解した65mgのペプシンSigma、pH2.0、使用日に作成を添加し、混合物を70rpmの往復流水浴内で37°Cで30分間インキュベートした。培養に続いてサンプルを5mlのNaOH0.02Mで中和して、25mlの酢酸緩衝液0.2M、pH6を添加した。次にNa酢酸緩衝液酢酸ナトリウム緩衝液、0.2M、pH6.0、0.20M塩化カルシウムおよび0.49mM塩化マグネシウム含有に溶解した、2mg/mLパンクレアチンα-アミラーゼ、SigmaとアスペルギルスニガーAspergillusnigerからの28U/mLアミログルコシダーゼAMG、Sigmaを含有する5ml酵素混合物を添加して、混合物を2~5分間インキュベートした。1mlの溶液を各フラスコから1.5ml管に移し入れ、3000rpmで10分間遠心分離した。上清を新しい管に移し、冷凍庫内で保存した。残りの各サンプルをアルミニウムホイルで覆い、容器を水浴内で37°Cで5時間インキュベートした。次にさらに1mlの溶液を各フラスコから収集し、先に実施したように、遠心分離して上清を移した。これもまた、吸光度の読み取りまで、冷凍庫内に保存した。全てのサンプルは室温で解凍し、3000rpmで10分間遠心分離した。サンプルを必要に応じて希釈し通常1:10希釈で十分である、各サンプルから10μlの上清を96ウェルマイクロタイタープレートに二連または三連で移し入れた。グルコース0mg、0.0625mg、0.125mg、0.25mg、0.5mg、および1.0mgを使用して、各マイクロタイタープレートの標準曲線を作成した。各ウェルに200ulのGlucoseTrinder試薬MicrogeneticsDiagnosticsPtyLtd,Lidcombe,NSWを添加して、プレートを室温でおよそ20分間インキュベートした。プレートリーダーを使用して、各サンプルの吸光度を505nmで測定し、標準曲線を参照してグルコースの量を計算した。本明細書に記載されるように製造されたパンをはじめとする食物サンプル中の難消化性デンプンRSのレベルは、生体外で次のように測定した。この方法は、試料調製と、普通に摂食されたものとしての食物中のデンプンの生体外消化について記述する。方法は2つの部分を含む:第1に、食物中のデンプンを疑似生理学的条件下で加水分解した;第2に、洗浄を通じて副産物を除去し、サンプルの均質化および乾燥後に残留デンプンを測定した。消化処理の終わりに定量化されたデンプンは、食物の難消化性デンプン含有量に相当する。1日目に、例えば家庭用フードプロセッサで噛みくだきによって達成される粘稠度に均質化することで、摂取を模倣する様式で食物サンプルを処理した。均質化後、最高500mgの炭水化物に相当する量の食物を125mLエルレンマイアーフラスコ内に量り入れた。121mgのNaHCO3および157mgのKClをおよそ90mLの精製水に溶解し、159μLの1MCaCl26H2O溶液および41μLの0.49MMgCl26H2Oを添加して、0.32MのHClでpH7~7.1に調節し、体積を100mLに調節して炭酸塩緩衝液を調製した。この緩衝液を4°Cで最高5日間まで保存した。1mLの炭酸塩緩衝液あたり250単位ofα-アミラーゼSigmaA-3176;ブタ膵臓からのタイプVI-Bを含有する人工唾液溶液を調製した。およそ食物重量に等しい人工唾液溶液の量をフラスコに添加した。唾液添加の約15~20秒後、5mLのHCl中のペプシン溶液0.02MのHCl、pH2.0中の1mg/mLペプシンSigma、使用日に作成を各フラスコに添加した。アミラーゼ、次にペプシンの混合は、ヒトが食物を飲む混む前の噛みくだきを模倣した。混合物を85rpmで振盪しながら、37°Cで30分間インキュベートした。次に混合物を5mLの0.02MNaOHで中和した。フラスコあたり、25mLの酢酸緩衝液0.2M、pH6と、酢酸緩衝液、pH6中に2mg/mLのパンクレアチンSigma、ブタ膵臓4×USP活性およびアスペルギルスニガーAspergillusnigerからの28UのアミログルコシダーゼAMG、Sigmaを含有する5mLのパンクレアチン酵素混合物とを添加した。各フラスコにアルミニウムホイルで蓋をして、85rpmに設定した往復流水浴内で、37°Cで16時間インキュベートした。2日目に、各フラスコの内容物を50mLポリプロピレン管に定量的に移し、室温で2000×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄して、各ペレットを20mLの水で3回洗浄し、各洗浄毎に管を穏やかにボルテックスしてペレットを砕き、続いて遠心分離した。最後の50μlの洗浄水をGlucoseTrinder試薬で、遊離グルコースの不在について試験した。次に各ペレットをおよそ6mLの精製水に再懸濁し、S25N-8G分散ツール付きUltraTurraxTP18/10を使用して、10秒間にわたり3回均質した。内容物を25mLメスフラスコに定量的に移して、一定体積にした。内容物を完全に混合して、ポリプロピレン管に戻した。各懸濁液の5mLのサンプルを25mLの培養管に移して、即座に液体窒素内でシェル凍結して凍結乾燥した。3日目に、MegazymeTotalStarchProcedureキットで提供される試薬を使用して、各サンプル中の全デンプンを測定した。デンプン標準物質RegularMaizeStarch、SigmaS-5296およびアッセイ試薬空試験を調製した。サンプル、対照、および試薬空試験を0.4mLの80エタノールで湿らせて分散を助け、ボルテックスがそれに続いた。即座に2mLのDMSOを添加して、ボルテックスにより溶液を混合した。管を沸騰する水浴5分間に入れて、MOPS緩衝液pH7、5mMのCaCl2および0.02アジ化ナトリウム含有中の3mLの熱安定性アミラーゼ100U/mlを即座に添加した。a溶液を3分間隔でボルテックス混合しながら、沸騰水浴内でさらに12分間インキュベートした。次に管を50°C水浴に入れて、4mLの酢酸ナトリウム緩衝液200mM、pH4.5、0.02アジ化ナトリウム含有と0.1mLの300U/mlアミログルコシダーゼを添加した。混合物を10分間隔で穏やかに混合しながら、50°Cで30分間インキュベートした。体積をメスフラスコ内で25mLにして良く混合した。アリコートを2000×gで10分間遠心分離した。50μLの上清中のグルコースの量を1.0mLのGlucoseTrinder試薬によって測定し、管を最低18分間最大45分間暗所で室温インキュベーションした後に、吸光度を505nmで測定した。4種の遺伝子組換えコムギ系統、すなわち072低下SBEIIa、212SBEIIa低下×SBEI三重nullコムギの交雑に由来するコムギ系統、H7SBEIIa低下×SSIIa三重nullコムギの交雑に由来するコムギ系統、および008SBEIIb低下からの小麦粉から焼かれた食パンを非形質転換対照コムギNB1と共に、100、60および30の小麦粉、残りの40または70の小麦粉が野生型穀粒由来である組み込みレベルで、RSおよびGIについて試験した。212、072、およびH7小麦粉の組み込みの増大は、RSの有意な増大図18aと、予測GIの低下図18bをもたらした。変化の規模は、系統212からの小麦粉を使用した場合に最大であった。例えばこの高アミロース小麦粉の100添加から作られたパンはRS含有量が約10であり、これは30レベルの含有の150増大に相当し、NB1対照と比較して9倍の増大に相当した。008系統からの小麦粉の組み込み程度の増大は、結果として生じるローフのRSおよびGIに影響を及ぼし、結果はベーキング対照小麦粉と同等であった。実施例16:高アミロースコムギの加工および結果として生じるRSレベル小規模研究を行って、圧延または圧扁された高アミロースコムギからの加工穀粒の難消化性デンプンRS含有量を判定した。技術は、水分レベル25への1時間の穀粒の馴化を伴い、穀粒の蒸煮がそれに続いた。蒸煮に続いて、小規模ローラーを使用して、穀粒を圧扁した。次にフレークをオーブン内で120°Cで35分間ローストした。SBEIIa低下高アミロースコムギHAW、系統85.2cおよび野生型対照コムギ栽培変種Hartogからのおよそ200gのサンプル上で、2種類のローラー幅と3種類の蒸煮時間を使用した。試験されたローラー幅は、0.05mmおよび0.15mmであった。試験された蒸煮時間は60’、45’、および35’であった。この研究は、対照と比較して、加工高アミロースコムギ中のRS量の明白なかなりの増大を示した表27、図18。またRSレベルに対して、加工条件のいくらかの効果もあった。例えば高アミロース穀粒では、より長い蒸煮時間は、RSレベルにわずかな低下をもたらしたが、これは蒸煮中のデンプン糊化の増大に起因する見込みが高い表27。より幅広いローラー間隙は、最長蒸煮時間以外では、より高いRSレベルを生じた。これは、より狭い間隙で穀粒を圧延した際に、デンプン顆粒の剪断損傷が増大して、RSレベルをわずかに低下させたことに起因し得た。より狭いローラー間隙はまた、Hartog対照でより高いRSレベルをもたらしたが、全体的RSレベルははるかにより低かった。高アミロースの結果とは対照的に、蒸煮時間の増大はより高いRSレベルをもたらしたが、これは恐らくより長い蒸煮時間でのデンプン糊化の増大が、引き続く加工および冷却中のデンプン老化増大に寄与したためである。様々な製品からのRSに関する統合データ。実施例10に記載されるようにして調製された麺、中種パンおよびスパゲティなどの様々な製品から得られたRSデータを表28に提示する。全ての製品について全ての組み込みレベルが試験されたわけではないが、分析した製品の大部分で、20、40、および60の組み込みレベルを使用した。結果は、RS含有量と高アミロース小麦粉組み込みレベルとの間の直線関係を示した。実施例17:SBEIIAに点変異を有する植物の単離標準EMS処理条件を使用して、コムギ栽培品種ArcheまたはApache種子をEMS変異誘発した後に、変異植物系統集団を開発した。変異誘発種子から、約5000のApacheおよび900のArcheの個々のM1植物を栽培して自家受粉させ、各植物からの種子と引き続く子孫をそれぞれ個々のM1植物に由来する潜在的変異系統として維持した。次世代Solexa配列決定Illuminaにより、系統を3つの同祖SBEIIa遺伝子中の変異についてスクリーニングした。これを行うためには、Arche集団からの約130のM1ファミリーおよびApache集団からの96のM1ファミリーからDNAをそれぞれプールして、7個のDNAプールを調製した。プールされたDNA上で、遺伝子のスプライス部位をはじめとするエクソン領域を標的にして、同祖遺伝子あたり3または4領域についてPCRを実施した。ゲノム特異的プライマーを表29に記載する。PCR産物の正規化後に、同一DNAプールからの10個の単位複製配列増幅産物をマージさせ、1個のDNAプールあたり1個のフローセルで配列決定を行った。配列データを分析し、全ての多形性から、観察された多形性頻度に基づいて、配列決定の誤りでなく変異に起因する見込みが高いものを選択した。Arche集団からの64の推定上の変異体およびApache集団からの48の推定上の変異体が、エクソン領域およびスプライス部位をカバーする第1の配列分析から観察された。kaspar技術に基づいて、各多形性毎にSNPアッセイをデザインし、特定の多形性について陽性の各プール中の130ファミリー上で遺伝子型同定を実施した。したがって各変異遺伝子を含有する個々の変異体系統が同定されて、変異SBEIIa配列が確認された。この方法により、それぞれSBEIIa変異を有し、それぞれM2kernelを保持する、Apache集団からの31の変異体系統と、Arche集団からの9の変異体系統が同定された。入手可能性に応じて、各変異体系統からの約10個のM2種子を半切し、胚がない半分をDNA抽出と分析で使用して、胚がある残りの半分を播種のために保存した。Arche集団からの半切種子上で合計5の変異株が確認され、Apache集団からは28が確認された。対応する種子を播種して子孫植物を産生し、M2植物葉材料上で分析を繰り返し、変異がメンデル様式で遺伝することを確認し、より良いDNA品質を提供した。これらの分析は、Arche集団からの4株とApache集団からの15株である19の変異株を確認し、それらのDNAと変異株によってコードされる推定タンパク質の配列に応じて、それらの格付けを可能にした。得られた変異株は、BまたはDゲノム上のSBEIIa遺伝子のタンパク質コード領域中に停止コドンがあってSBEIIaタンパク質翻訳の早期終結を引き起こす変異SBEIIa遺伝子を有するもの、およびSBEIIa-Bまたは-D遺伝子にスプライス部位変異がある系統を含んだ。このような変異は、null変異であることが予測された。アミノ酸置換変異などのSBEIIa-A,SBEIIa-BおよびSBEIIa-D遺伝子中の点変異もまた得られて、Blosum62およびPam250マトリックスを使用して、コードされたタンパク質構造に対するそれらの影響が予測された。三重変異体植物とF2世代種子を生成するために、最も有望な8変異体系統からの植物をA1D2、A2D2、A1B2、B2D2遺伝子型をはじめとする適切な遺伝子型の二重nullSBEIIa変異株と交雑した。デンプン含有量中に少なくとも50のアミロースがある種子を産生する稔性植物を選択した。変異株植物はまた、デュラムコムギ栽培品種Soldurとも交雑して四倍体コムギに変異を導入した。"