"単離した、組換え型のBドメイン完全欠失第VIII因子またはBドメイン部分欠失第VIII因子FVIII変異体であって、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を欠くFVIII変異体。配列番号1と少なくとも90同一である配列を含み、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を欠く、請求項1に記載のFVIII変異体。前記変異体が、配列番号1と少なくとも95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8または99.9の同一性を共有する、請求項2に記載のFVIII変異体。前記変異体が、配列番号1と99.5、99.6、99.7、99.8または99.9の同一性を共有する、請求項3に記載のFVIII変異体。前記変異体が配列番号1である、請求項4に記載のFVIII変異体。単離した、組換え型のBドメイン完全欠失第VIII因子FVIII変異体またはBドメイン部分欠失第VIII因子FVIII変異体であって、図2に示すヒト第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号8のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を欠くFVIII変異体。配列番号1と少なくとも90同一である配列を含み、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号8のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を欠く、請求項6に記載のFVIII変異体。前記変異体が、配列番号2と少なくとも95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8または99.9の同一性を共有する、請求項7に記載のFVIII変異体。前記変異体が、配列番号2と99.5、99.6、99.7、99.8または99.9の同一性を共有する、請求項8に記載のFVIII変異体。前記変異体が配列番号2である、請求項9に記載のFVIII変異体。前記FVIII変異体が部分的にBドメインを欠失し、前記Bドメインの残りの部分が、配列番号4または配列番号5からなる配列から選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のFVIII変異体。請求項1~11のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。請求項13に記載の発現ベクターを含む哺乳類細胞。以下のステップを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のFVIII変異体を産生する方法:a.請求項14に記載の哺乳類細胞を培養するステップ;およびb.前記哺乳類細胞から前記FVIII変異体を単離するステップ。以下のステップをさらに含む、請求項15に記載の方法:c.適切な賦形剤と共に前記第VIII因子変異体を医薬組成物に製剤化するステップ。請求項1~10のいずれか一項に記載の第VIII因子変異体を含む医薬組成物。血友病を患う患者を治療する方法であって、請求項1~10のいずれか一項に記載の治療有効量のFVIII変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、前記患者の血友病を治療することを含む方法。血友病を治療するのに使用する、請求項1~10のいずれか一項に記載のFVIII変異体。前記血友病が血友病Aである、請求項18または請求項19に記載の方法または使用。前記血友病が後天性血友病である、請求項18または請求項19に記載の方法または使用。前記血友病が、ヒトFVIII抗体を発生している患者において治療される、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法または使用。前記第VIII因子が、200μg/用量、150μg/用量または140μg/用量以下の量で投与される、請求項18~22のいずれか一項に記載の方法または使用。第一の態様において、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失第VIII因子FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失第VIII因子FVIII変異体であって、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応する最高で27個のアミノ酸配列を欠くFVIII変異体に関する。この27個のアミノ酸配列NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR配列番号10は、部分的に、または完全に欠失させることができる。一実施形態において、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失FVIII変異体であって、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応する最高で27個のアミノ酸配列を欠き、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸が欠失してもよいFVIII変異体に関する。別の実施形態において、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個または20個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、27個、26個または25個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR配列番号10に対応する27個のアミノ酸が欠失する。一実施形態において、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失FVIII変異体であって、図2に示すヒト第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号8のアミノ酸714~740に対応する最高で27個のアミノ酸配列を欠き、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸が欠失してもよいFVIII変異体に関する。別の実施形態において、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個または20個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、27個、26個または25個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR配列番号11に対応する27個のアミノ酸が欠失する。別の実施形態において、本発明は、DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR配列番号10に対応する27個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のBドメイン完全欠失ブタFVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失ブタFVIII変異体に関する。別の実施形態において、本発明は、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR配列番号11に対応する27個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のBドメイン完全欠失ヒトFVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失ヒトFVIII変異体に関する。別の実施形態において、本発明は、NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR配列番号12に対応する27個のアミノ酸を完全に欠く、単離された組換え型のBドメイン完全欠失イヌFVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失イヌFVIII変異体に関する。本発明の第二の態様は、記載した第一の態様および実施形態で定義したとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。第三の態様において、本発明は、第二の態様で定義したとおりのポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。本発明の第四の態様は、第三の態様で定義したとおりの発現ベクターを含む哺乳類細胞に関する。第五の態様において、本発明は、以下のステップを含む、第一の態様で定義したとおりのFVIIIを産生する方法に関する:a.第四の態様に係る哺乳類細胞を培養するステップ;およびb.この哺乳類細胞からこのFVIII変異体を単離するステップ。本発明の第六の態様は、第一の態様で定義したとおりのFVIII変異体を含む医薬組成物に関する。第七の態様において、本発明は、血友病を患う患者を治療する方法であって、本発明の第一の態様に係る治療有効量のFVIII変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、前記患者の血友病を治療することを含む方法に関する。第八の態様において、本発明は、血友病の治療に使用するための、第一の態様に係るFVIII変異体に関する。配列の簡単な説明配列番号1は、ブタBドメイン部分欠失FVIIIv3の配列を示し、配列番号2は、ヒトBドメイン欠失FVIIIv3の配列を示し、配列番号3は、イヌBドメイン欠失FVIIIv3の配列を示し、配列番号4は、本発明のBドメイン部分欠失FVIII分子内に存在し得るブタFVIIIBドメイン由来の配列いわゆるBドメインリンカーを示し、配列番号5は、本発明のBドメイン部分欠失FVIII分子内に存在し得るヒトFVIIIBドメイン由来のBドメインリンカー配列を示し、配列番号6は、本発明のBドメイン部分欠失FVIII分子内に存在し得るイヌFVIIIBドメイン由来のBドメインリンカー配列を示し、配列番号7は、全長のブタFVIIIのアミノ酸配列を示し、配列番号8は、全長のヒトFVIIIのアミノ酸配列を示し、配列番号9は、全長のイヌFVIIIのアミノ酸配列を示し、配列番号10は、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応する27個のペプチド配列を示し、配列番号11は、図2に示すヒト第VIII因子のアミノ酸714~740または配列番号8のアミノ酸714~740に対応する27個のペプチド配列を示し、配列番号12は、図2に示すイヌ第VIII因子のアミノ酸714~740または配列番号9のアミノ酸708~734に対応する27個のペプチド配列を示す。本発明は、特定の27個のアミノ酸欠失を含む組換え型のBドメイン部分欠失ブタ第VIII因子タンパク質の変異体の発見に基づいている。本明細書でrpFVIIIv3と命名されるこの変異体は、この27個のアミノ酸ストレッチを含む類似タンパク質、すなわち、OBI-1と呼ばれる組換え型のBドメイン部分欠失ブタFVIIIと比較した時に、増加した比活性を有することが示されている。OBI-1、そのアミノ酸配列およびOBI-1をコードするポリヌクレオチドは、例えば、米国特許第6,458,563号から知られている。本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失第VIII因子FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失第VIII因子FVIII変異体であって、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を欠くFVIII変異体に関する。さらに、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失FVIII変異体であって、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742または配列番号7のアミノ酸714~740に対応する27個のアミノ酸配列を欠き、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸が欠失してもよいFVIII変異体に関する。一方の変異体においては、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個または20個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、27個、26個または25個のアミノ酸が欠失する。rpFVIIIv3変異体において、DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR配列番号10に対応する27個のアミノ酸が欠失する。さらに、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失FVIII変異体であって、図2に示すヒト第VIII因子のアミノ酸714~740または配列番号8のアミノ酸714~740に対応する27個のアミノ酸配列を欠き、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸が欠失してもよいFVIII変異体に関する。一方の変異体においては、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個または20個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、27個、26個または25個のアミノ酸が欠失する。ヒトFVIIIv3変異体rhFVIIIv3において、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR配列番号11に対応する27個のアミノ酸が欠失する。さらに、本発明は、単離された組換え型のBドメイン完全欠失FVIII変異体もしくは単離された組換え型のBドメイン部分欠失FVIII変異体であって、図2に示すイヌ第VIII因子のアミノ酸714~740または配列番号9のアミノ酸708~734に対応する27個のアミノ酸配列を欠き、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸が欠失してもよいFVIII変異体に関する。一方の変異体においては、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個または20個のアミノ酸が欠失する。もう一方の変異体においては、27個、26個または25個のアミノ酸が欠失する。イヌFVIIIv3変異体rcFVIIIv3において、NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR配列番号12に対応する27個のアミノ酸が欠失する。かかる変異体は、インタクトな27個のアミノ酸配列を含む類似の変異体と比較した時に、上昇した比活性を有する。好ましくは、この比活性は、25、30、35、40、45、50、55または60超増加する。本明細書で使用される比活性という用語は、ヒト第VIII因子欠乏血漿の凝固欠陥を補正する活性を表す。比活性は、ヒト第VIII因子欠乏血漿の凝固時間を正常ヒト血漿の凝固時間と比較する標準アッセイにおいて、総第VIII因子変異体1ミリグラムあたりの凝固活性の単位で測定される。高純度のFVIII濃縮物についてFDAが承認するFVIII製品の力価を測定するのに適切な標準アッセイは、一段階凝固アッセイone-stageclottingassayと呼ばれるOSCA;実施例5;LangdellRD,WagnerRH,BrinkhousKM.,Effectofantihemophilicfactoronone-stageclottingtests:apresumptivetestforhemophiliaandasimpleone-stageantihemophilicassayprocedure,JLabClinMed,1953;41:637-47;BrandJT,MeasurementoffactorVIII:apotentialriskfactorforvasculardisease,ArchPatholLabMed,1993;117:48-51;PrestonFE,KitchenS,QualitycontrolandfactorVIIIassays,Haemophilia,1998;4:651-3;米国臨床研究所規格委員会NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandardsNCCLSUSA,Determinationoffactorcoagulantactivities;認可されたガイドライン,NCCLSDocumentH-48-A1997;17:1-36を参照されたい。試料中に存在するFVIIIタンパク質の量は、例えば、SECHPLCサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。第VIII因子活性の1ユニットは、正常ヒト血漿1ミリリットル中に存在する活性である。このアッセイにおいて、血餅形成時間が短いほど、アッセイされる第VIII因子の活性は高い。ブタ第VIII因子は、ヒト第VIII因子アッセイにおいて凝固活性を有する。本発明に沿って、タンパク質およびポリペプチドという用語は、互換的に使用されている。図2に示すアミノ酸716~742に対応するアミノ酸配列を欠くとは、本発明のFVIII変異体中のアミノ酸716および742、ならびにこれらの位置の間のアミノ酸が欠失している、すなわち、含まれないことを意味する。したがって、このアミノ酸ストレッチは、本発明のFVIII変異体が欠いている27個のアミノ酸からなる。本発明の第VIII因子変異体は、本明細書全体でFVIII変異体複数可もしくはFVIIIv3またはrFVIIIv3と命名される。これらは、ブタ、ヒト、イヌ、マウス、またはヒトもしくは動物の治療に適している任意の他の起源のものであり得る。図2は、ヒト、ブタ、マウスおよびイヌ起源のFVIII配列の配列アラインメントを示す。本発明のFVIII変異体において欠失している配列は、太字かつ二重下線で強調されている。このアミノ酸ストレッチは、例えば、ブタまたはヒトの配列と、さらなる種のFVIII配列を整列させ、本特許出願の図2のようなアミノ酸716~742に対応するアミノ酸を取得することによって、他の種のFVIII変異体について当業者が同定することができる。本発明の実施形態は、ブタ、ヒトまたはイヌ起源のFVIII変異体に関する。一実施形態において、本発明に係るFVIII変異体は配列番号1の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号1と少なくとも90同一である配列を含む。10の変異性は、この欠失しているアミノ酸ストレッチの外側の配列に影響する、すなわち、この変異体は、DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR配列番号10、図2に示すブタ第VIII因子のアミノ酸716~742もしくは配列番号7のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列を完全に欠いていると理解される。さらなる実施形態において、本発明のFVIII変異体は配列番号2の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号2と少なくとも90同一である配列を含む。かさねて、この変異体は、図2に示すヒト第VIII因子のアミノ酸714~740もしくは配列番号8のアミノ酸714~740に対応するアミノ酸配列NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR配列番号11を完全に欠いていると理解される。さらなる実施形態において、本発明のFVIII変異体は配列番号3の配列を含むか、またはその変異体は、配列番号3と少なくとも90同一である配列を含む。かさねて、この変異体は、図2に示すイヌ第VIII因子のアミノ酸714~740もしくは配列番号9のアミノ酸708~734に対応するアミノ酸配列NIDDYYEDTYEDIPTPLLNENNVIKPR配列番号12を完全に欠いていると理解される。本発明のFVIII変異体は、配列番号7、配列番号8または配列番号9の配列と少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8または99.9同一である配列も含み得る。2つのポリペプチド/タンパク質の同一性パーセントを決定するために、これらのアミノ酸配列を最適な比較目的のために整列させる例えば、ギャップを、第2のアミノ酸配列との最適なアラインメントのために、第1のアミノ酸配列の配列内に導入することができる。その後、対応するアミノ酸の位置におけるアミノ酸残基を比較する。第1の配列内の位置を、第2の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基が占める場合、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列が共有する同一の位置の数の関数すなわち、同一性=同一の位置の数/位置の総数例えば、重なる位置×100である。2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例として、KarlinandAltschul1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268のアルゴリズムが挙げられ、これは、KarlinandAltschul1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877で変更された。かかるアルゴリズムは、Altschul,etal.1990J.Mol.Biol.215:403-410のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実行し、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を取得することができる。BLAST変異体検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて実行し、本発明の変異体分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較目的のためのギャップアラインメントを取得するために、ギャップBLASTが、Altschuletal.1997NucleicAcidsRes.25:3389-3402に記載のとおりに利用できる。あるいは、PSI-Blastを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。BLASTプログラム、ギャップBLASTプログラム、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム例えば、XBLASTおよびNBLASTのデフォルトパラメーターを用いることができる。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的な例として、MyersandMiller1988CABIOS4:11-17のアルゴリズムが挙げられる。かかるアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム2.0版に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティー4を用いることができる。局所配列の類似性およびアラインメントの領域を同定するのに有用な、さらなる別のアルゴリズムは、PearsonandLipman1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448に記載されているFASTAアルゴリズムである。ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するためにFASTAアルゴリズムを用いる場合、PAM120重量残基表を、例えば、k-tuple値2と共に用いることができる。2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容しようとしまいと、上記に記載のものと同様の手法を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際に、完全一致のみが数えられる。本発明のFVIII変異体は、部分的にまたは完全にBドメインを欠失し得る。これは、Bドメイン全体が欠失するか、またはBドメインの一部がこのFVIII変異体に保持されるかのいずれかを意味する。Bドメインの残りの保持される部分は、例えば、Bドメインの20個、15個、12個、10個または5個のN末端アミノ酸および20個、15個、12個、10個または5個のC末端アミノ酸から選択され、互いにインフレームで融合される。したがって、好ましくは、本発明のBドメイン部分欠失FVIII変異体において、約900個のアミノ酸のBドメインのかなりの部分が除去される。本発明の実施形態において、これらのFVIII変異体中に存在するBドメインの5未満、4未満、3未満、2未満または1未満がとどまる。本発明の実施形態において、このBドメインの残りの部分は、配列番号4、配列番号5または配列番号6からなる配列から選択される。さらなる態様において、本発明は、上記に記載のポリペプチド/タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドはRNA分子またはDNA分子であり得、そのヌクレオチド配列が、遺伝暗号の既知の関係に従って、本発明の変異体のアミノ酸配列について宿主細胞に暗号情報を例示する。さらなる態様において、本発明は、上記に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。発現ベクターは、多くの場合、環状構造であり、所望の宿主細胞において自己複製する能力または宿主細胞ゲノムに組み込まれる能力を有し、適切な部位かつ適切な向きでベクター配列に挿入されるコードDNAの発現を可能にする特定の周知の特徴も有するDNAエレメントである。かかる特徴には、コードDNAの転写開始を指示する1つまたは複数のプロモーター配列、ならびにエンハンサーおよびポリアデニル化部位などの他のDNAエレメント全て当技術分野で周知であるが含まれ得るが、これらに限定されない。発現ベクターという用語は、発現ベクターの配列内に挿入される、発現させられるDNAコード配列を有するベクター、および挿入部位に対して配置されるため、その部位に挿入される任意のコードDNAを発現するように機能することができる必須発現制御エレメントを有するベクター全て当技術分野で周知であるの両方を示すために用いられる。したがって、例えば、プロモーターを欠くベクターは、コードDNAに結合させたプロモーターの挿入によって発現ベクターになることができる。本明細書で使用される発現ベクターは、ウイルスベクターでもあり得る。本発明の組換えFVIII変異体の発現は、好ましくは、哺乳類細胞培養において行われる。したがって、さらなる態様において、本発明は、上記に記載の発現ベクターを含む哺乳類細胞に関する。例えば、CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞およびBHK細胞ベビーハムスター腎臓細胞は、本発明の文脈において、適切な宿主細胞である哺乳類細胞である。本発明の別の態様にしたがって、本発明のFVIII変異体を産生する方法は、以下のステップを含む:a.上記に記載の哺乳類細胞を培養するステップ;およびb.この哺乳類細胞からこのFVIII変異体を単離するステップ。一実施形態において、この方法は、さらに、以下のステップを含む;c.適切な賦形剤と共に、第VIII因子変異体を医薬組成物に製剤化するステップ。ヒトまたは動物の投与に適する賦形剤は、例えば、医薬的に安定な化合物、防腐剤、送達ビヒクル、および/または担体ビヒクルである。第VIII因子製品に適切な1つの製剤は、例えば、WO03/080108に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。さらなる態様において、本発明は、本発明のFVIII変異体を含む医薬組成物に関する。本発明のさらなる態様は、第VIII因子欠乏症を患う患者を治療する方法であって、治療有効量の本発明のFVIII変異体を、それを必要としている患者に投与することによって、前記患者の第VIII因子欠乏症を治療することを含む方法に関する。本明細書で使用される治療有効量という用語は、FVIII欠乏症を有し、FVIII変異体の医薬組成物を受け入れている患者の血漿中のFVIIIレベルを意味し、これは、この患者において測定可能な改善または保護効果を示す例えば、出血を止めるのに十分である。FVIII欠乏症を有する患者は、一般的に、先天性血友病A患者であるが、後天性血友病と診断されるそれらの対象も含み、その症状において、先天性血友病ではない患者は、かれらのFVIIIに対する阻害抗体を自発的に発生させ、深刻なFVIII欠乏症を引き起こす。本発明は、第VIII因子欠乏症を治療するのに使用する本発明のFVIII変異体にも関する。必要に応じて、治療は、この組成物の単回静脈内投与または長期間にわたる定期的投与もしくは連続投与の形態をとり得る。好ましくは、このFVIII変異体の投与は、静脈内経路によるものである。本明細書で使用される第VIII因子欠乏症には、欠陥のある第VIII因子の産生によるか、第VIII因子の不十分な産生もしくは全く産生されないことによるか、または阻害物質による第VIII因子の部分阻害もしくは完全阻害によって引き起こされる凝固活性の欠乏が含まれる。血友病Aは、X連鎖遺伝子における欠陥、およびX連鎖遺伝子がコードする第VIII因子変異体の欠如または欠乏に起因する第VIII因子欠乏症のタイプである。本発明のFVIII変異体を用いて、血友病患者の第VIII因子欠乏症による制御不能の出血例えば、関節内出血、頭蓋内出血、または消化管出血を治療する。本発明の一実施形態において、この第VIII因子欠乏症は血友病Aである。別の実施形態において、この第VIII因子欠乏症は後天性血友病である。一実施形態において、この第VIII因子欠乏症は、ヒトFVIII抗体を発生している患者において治療される。上述したとおり、本発明のFVIII変異体は、増加した比活性を有する。したがって、本発明に従ってVIII欠乏症を治療するために、FVIII変異体の量を減少させて投与することができる。FVIII変異体の量は、本発明の最高で27個のアミノ酸欠失を含まないFVIII製品による治療と比較して、少なくとも30、35、40、45、50、55、60減少させることができる。FVIII変異体療法の量を減少させることは、期待される免疫原性の低下という利点を有し、すなわち、患者においてFVIII補充療法に対する阻害抗体の生成の可能性が著しく低下することが期待される。一実施形態において、本発明の第VIII因子変異体は、200μg/用量、150μg/用量、145μg/用量、140μg/用量、136μg/用量、または130μg/用量以下の量で投与される。ここで本発明を十分に記載しているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、かつ過度の実験をせずに、同じことが、同等のパラメーター、濃度および条件の広い範囲内で行われ得ることを当業者は理解するであろう。本発明は、その特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる変更が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般的に、本発明の原則に従い、本発明が属する技術の範囲内の公知のまたは習慣的な実施の範囲内にあり、本明細書中に前述された本質的な特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含む本発明の全てのバリエーション、使用または適応を包含することが意図される。学術論文、抄録、公開もしくは非公開の米国特許出願、公開もしくは非公開の外国特許出願、発行された米国特許もしくは外国特許、または任意の他の参考文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、これらの引用される参考文献中に提示される全てのデータ、表、図およびテキストを含めて、参照により本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本明細書に引用される参考文献中に引用される参考文献の内容全体も、参照により完全に組み込まれる。公知の方法のステップ、従来の方法のステップ、公知の方法または従来の方法への言及は、本発明の全ての態様、発明を実施するための形態または実施形態が、従来の技術の中で開示、教示、または示唆されることを認めるものではない。特定の実施形態の上記の説明は、他の人が、本明細書に引用される参考文献の内容を含む当業者の技術内の知識を適用することによって、過度の実験をせず、本発明の一般概念を逸脱することなく容易に変更し、かつ/またはかかる特定の実施形態の様々な適用に適合させることができるほど十分に本発明の一般的な性質を明らかにするであろう。したがって、かかる適合および変更は、本明細書に提示される教示および指針に基づいて、開示される実施形態の同等物の範囲内にあると意図される。本明細書の専門用語または用語は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示および指針を考慮して当業者によって解釈されるべきであるように、本明細書の用語または専門用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことが理解されるべきである。実施例実施例1:組換え型のブタBドメイン部分欠失FVIIIOBI-1の発現および3つの変異体タンパク質rpVIIIv1、rpVIIIv2およびrpVIIIv3の単離BHK細胞内でのOBI-1の発現を、基本的には、米国特許第6,458,563号に記載されるとおりに行った。3つの変異体rpVIIIv1、rpVIIIv2およびrpVIIIv3を、産生された物質内で検出した。これらの変異体を単離し、イオン交換クロマトグラフィーにより95を上回る純度まで精製した。精製には、MonoQHR10/10半分取陰イオン交換カラム現在は、MonoQ10/100GL、GEヘルスケアライフサイエンス社、カタログ番号17-5167-01を用いるAKTAエクスプローラーシステムAKTAExplorersystemAKTAExplorer10、GEヘルスケアライフサイエンス社、カタログ番号17-5167-01を用いた。溶出を、2つの以下の緩衝液を用いる勾配で行った:緩衝液A:10mMトリス、pH7.0、0.01ポリソルベート80緩衝液B:緩衝液Aおよび1M塩化ナトリウム精製法の特徴を表1にまとめる。実施例2:変異体3rpVIIIv3は、変異体1および変異体2よりも非常に高い比活性を有する各変異体の比活性を、方法ごとにSECHPLCによって測定する場合、一段階凝固アッセイOSCAによって評価した力価をタンパク質濃度で割ることにより評価した。OSCA法およびSECHPLC法を、実施例5の材料および方法に記載したとおりに行った。結果これらの比活性についての結果を表2に示す。OSCAアッセイにおける変異体3の、有意により高い比活性の観察結果は、特徴的であり、一慣性がある。OSCA法は、ヒトにおける凝固プロセスに対して予測的であり、かつ代表的であるので、変異体3は有意な値の産物であることが期待される。力価が1.5~2.0倍増加すると、患者に投与されるFVIIIの量が減少するため、免疫学的副作用の発生を間接的に減少させる可能性があることが期待される。実施例3:rpFVIIIv3の配列決定精製したv3の配列を、MassLynx4.0ウォーターズ社WatersCorporation、ミルフォード、マサチューセッツ州を実行し、Q-TOFUltima質量分析計でのLCMS液体クロマトグラフィー質量分析法およびLCMS/MS液体クロマトグラフィー質量分析法/質量分析法が続くペプチドマップにより決定した。約250μgの変異体3を、アミコン社の、10,000MWCOフィルターを備えるセントリコンCentriconYM-10濃縮器ミリポア社、ビレリカ、マサチューセッツ州を用いて、100μl未満の量まで濃縮した。これらの試料を、6MグアニジンHCl/0.002MEDTAエチレンジアミン四酢酸/0.02Mトリス緩衝液pH8450μlと混合し、2.0mLのポリプロピレンチューブに移した。1MDTTジチオスレイトールを、10mMの最終濃度になるまで各試料に加え、37°Cで1時間インキュベートした。還元後、2Mのヨードアセトアミドを、20mMの最終濃度になるまで各チューブに加え、室温でさらに1時間インキュベートした。還元し、アルキル化した試料を透析カセットに移し、1.0Mの尿素を含む50mMの重炭酸アンモニウム透析緩衝液pH81Lに対して1時間透析した。次いで、これらの試料を、一定の攪拌を維持しながら、室温で一晩、透析緩衝液1Lに対して透析した。透析後、最終的な体積は、それぞれ約0.5mLであった。試料を、2つのアリコート125μgに分けた。透析後、このタンパク質試料は、トリプシンによるタンパク質消化に最適なマトリックスに含まれていた。トリプシンを、酵素対基質の比を1:20w:wにして各試料に加え、37°Cで8時間インキュベートした。全ての試料をHPLCバイアルに移し、HPLC-MSによって分析した。還元し、アルキル化したタンパク質を、VydacC18逆相カラムグレース社、ディアフィールド、イリノイ州に注入した。この試料注入の前に、ブランク試料移動相A;0.2v:vギ酸を含む脱イオン水を分析し、カラムを平衡化して、干渉ピークが存在しないことを実証した。質量分析データを、陽イオンモードでエレクトロスプレーイオン化ESIを用いてQ-TOFAPI-US質量分析計またはQ-TOFUltima質量分析計ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州で収集した。試料分析前に、この質量分析計を、175~1285m/Zの範囲をカバーするGlu-フィブリノゲンペプチドのフラグメントイオンに5次フィット5thorderfitを用いて較正した。仕様にパスするための較正では、5ppm未満のこれらのペプチドフラグメントの質量のRMS二乗平均平方根誤差が必要とされた。ソフトウェアパッケージMasslynx4.0商標のSP2およびSP4ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州を、データの取得および解析のために用いた。MSおよびMS/MSの両方のデータを、単独の液体クロマトグラフィーLCランを用いて収集した。完全な質量分析計MSサーベイスキャンを200~1950m/zで収集した。rpFVIIIの配列を決定すると、配列番号1に一致した。この配列は、OBI-1配列と比較すると、27個のアミノ酸欠失を含む。実施例4:rpFVIIIv3は、他の既知のFVIII製品よりも高い比活性を有する。rpFVIIIv3の比活性を、3種類の市販のFVIII製品、すなわち、Xynthia登録商標ワイスファーマシューティカルズWyethPharmaceuticals社フィラデルフィア、ペンシルバニア州の組換え型のBドメイン欠失ヒトFVIII、KogenateFS登録商標BayerHealthcare社タリータウン、ニューヨーク州の全長ヒトFVIIIおよびAdvate登録商標バクスター社ウェストレイクビレッジ、カリフォルニア州の全長ヒトFVIII、ならびに現在臨床開発中のOBI-1組換え型のBドメイン部分欠失ブタFVIII、およびBドメイン欠失イヌ第VIII因子DeniseE.Sabatinoet.al.,RecombinantcanineB-Domain-deletedFVIIIexhibitshighspecificactivityandissafeinthecaninehemophiliaAmodel,Blood,12November2009,Vol.114,No.20,pp.4562-4565と比較した。OBI-1およびrpFVIIIv3の比活性を、実施例5に記載の方法により測定した。これらの結果を表3および図1に示す。その比活性の増大により、1用量あたりより低量のprVIIIv3を、患者に投与することができる。一用量あたりのこの減少は、免疫原性の低下につながること、すなわち、患者が阻害抗体を発生する可能性がより低くなることが期待される。結論として、これらの結果は、FVIII補充療法について、rpVIIIv3が、現在市販されているかまたは臨床開発中の試験製品よりも有意により高い比活性を有することを示す。特に、OBI-1中ではなくrpVIIIv3中に存在する27個のアミノ酸の欠失が、OSCAアッセイにより測定した場合比活性を50増加させることは非常に驚くべきことである。実施例5:材料および方法一段階凝固アッセイ-OSCA-方法1.1.0ユニット/mLの力価を目標とするために、標準品をアッセイ緩衝液1Lあたり10の第VIII因子欠乏血漿Owren’sVeronal緩衝液、28ミリモルのバルビタールナトリウムおよび125ミリモルのNaCl、pH7.35で希釈する。2.目標となる力価まで試験標準物質、活性対照および試料をアッセイ緩衝液で希釈する。3.Symex装置SysmexCA-1500、凝固分析器、デイドベーリング社のカタログ番号B4260-1500シーメンス社、ディアフィールド、イリノイ州内の適切なウェルに校正標準基準および試薬を添加する。4.Sysmex装置の外側のラックに試験標準物質、対照および試料を添加する。5.分析の順序は、以下のとおりに、この装置内で自動的に行われる。a.試料5μlを、反応試験管内でアッセイ緩衝液45μlに希釈する。b.第VIII因子欠乏血漿50μlをこの反応試験管に加える。c.DadeActinFS1.0×10-4Mのエラグ酸活性化因子中の精製大豆ホスファチド、デイドベーリング社、リーデルバッハ、ドイツで活性化した部分的トロンボプラスチン時間試薬50μlを、この反応試験管に加え、60秒間インキュベートした。d.塩化カルシウム0.025M、デイドベーリング社、リーデルバッハ、ドイツ50μlをこの反応試験管に加え、240秒間インキュベートした。e.凝固時間は、300秒の最大時間まで測定する。6.その後、この凝固時間は、標準品の検量線によって生成される力価と相関させる。サイズ排除SECHPLC法アジレント1100アジレントテクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州またはWatersBioallianceHPLCシステムウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州を、タンパク質濃度を決定するためのサイズ排除法のために使用し、これは一般的に使用されている。用いた代表的なサイズ排除カラムは、GE社のSuperdex200Superdex20010.300GL、10×300mm、カタログ番号17-5175-01GEヘルスケアライフサイエンス社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州であった。全体的なアッセイプロトコールは以下のとおりである:1.20mMトリス、pH7.4および0.01ポリソルベート80と共に400mMのNaClを含む代表的な移動相を調製した。2.ベースラインの平衡が観察されるまで、この移動相をHPLCシステムおよびカラムに通した。3.システム適合性を確立するために標準物質を流し、各試料の一般的な実行時間は30分であった。4.例によって、試料を、制御チャンバー温度が4°Cであるオートサンプラーに添加した。5.例によって、タンパク質1、3、5、10および25μgの様々な量の標準試料を含む既知濃度の較正標準を、10μlと50μlとの間の体積のカラムに添加した。6.未知濃度の試料も、例によって、30μlと50μlとの間の体積のカラムに添加した。7.HPLCシステムを、配列セットアップに従って、自動的に試料を流すようにプログラムした。8.較正基準および未知試料のピーク面積を、励起および発光が、それぞれ280nmおよび340nmである蛍光検出に基づいて測定した。9.較正標準の線形回帰を作成し、未知試料の濃度をこの検量線に対して決定した。較正標準のSECプロファイルおよび検量線の線形回帰の代表的な例を図3に示す。実施例6:フォンヴィルブランド因子への結合フォンヴィルブランド因子vWFは、第VIII因子と複合体を形成した多量体形態FVIII/vWF複合体として血漿中で循環する多機能性糖タンパク質である。このFVIII/vWF複合体は、この結合したFVIIIを生体内の血液循環の初期のタンパク質分解から保護するのに役立つ。サイズ排除クロマトグラフィーSECを用いて、FIII/vWF複合体中のこの結合を特徴づける。Superose6カラムSuperose610/300GL,GEヘルスケア社、カタログ番号17-5172-01、流速=0.5mL/分を、その既知の生体適合性および4000万ダルトンの高い排除限界のために選択した移動相製剤緩衝液:2mMCaCl2、10mMのトリスpH7.0、300mMのNaCl、0.01PSB-80、11mMのショ糖、10mMのクエン酸三ナトリウム。フォンヴィルブランド因子約500kDの位置で二量体、Fitzgerald社のカタログ番号30C-CP4003U、Lot番号A09121050、単量体の分子量=約260kD、濃度=77μg/mlとrpFVIII約160kDとの間の分子量の違いは、これらの2種類を分離するのに十分である。結合の化学量論を、rpFVIIIの量を増加させて、一定量のvWFの滴定により決定した。rpFVIIIとvWFとの間の複合体形成のプロファイルを、SECクロマトグラムおよび適切なピークの積分から決定した。上清中の得られた混合物の可溶性形態を用いて、rpFVIIIの量を増加させて、滴定からこの複合体形成の終点を決定した。rpFVIIIとvWFとの間に形成されるより大きい、安定した複合体は、通常の保持時間からカラムの排除限界まで移動する。飽和が発生する場合、非結合のrpFVIII量の増加が、SECクロマトグラムにおいて観察される。この方法は、変異体の性質の違いや類似性を区別するために使用される。実施例7:トロンビン消化の動態SDS-PAGE組換え型のブタ第VIII因子rpFVIII分子は、78.5kD分子量の軽鎖A3-C1-C2、765-1448および分子量範囲が86.7kDA1-A2の重鎖から構成される約160kDのヘテロ二量体である。rpFVIIIの重鎖は異種性であり、細胞からの分泌の際に形成される3つの主な変異体から構成され、PACE対塩基性アミノ酸切断酵素PairedBasicAminoAcidCleavageEnzymeと命名されたスブチリシンファミリーの膜結合型プロテアーゼによって切断され得る。ヒト第VIII因子と同様に、rpFVIIIは、トロンビンの限定分解により活性型に変換される。rpFVIIIのトロンビン活性化は、Arg372-Ser373における重鎖の切断部位に特異的である。Arg805-Ser806における軽鎖の切断領域は、765~804に及ぶ小さな40個のアミノ酸ペプチド部分約4.4kDを遊離する。トロンビンによるこれらの最初の切断の組み合わせは、A1約50kD、A2約40kD、およびA3-C1-C2約70kDと命名されるサブユニットのヘテロ三量体として、活性化された組換えブタ第VIII因子を形成する。切断されたrpFVIIIのA1サブユニットおよびA3-C1-C2サブユニットは、二価金属イオン依存的な結合を保持するが、A2サブユニットは、主として静電相互作用によりA1-A3-C1-C2ダイマーと弱く結合する。SDS-PAGEでは、これらのサブユニットは、3つの異なるバンドとして示される。このrpFVIII2ペプチドユニットの3ペプチドユニットへの変換効率は、この産物のトロンビン活性化に特有である。この方法は、個々の変異体間の類似点および相違点を区別する。2つの他の直交法は、FVIIIのトロンビン消化の動態を明らかにするために用いることができ、それを用いた。変性逆相HPLCを用いてもよく、ピークプロファイルはSDS-PAGEのそれと同様であると予想される。ペプチドの天然型を保持する陰イオン交換クロマトグラフィーも用いてもよい。逆相HPLC機器:1.HPLC1100シリーズ:アジレントテクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;モデル番号61312A、シリアル番号DE109077532.Poroshell5um2.1×75mmカラム:アジレントテクノロジー社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国;品番660750-909、シリアル番号USVV001988試薬:1.緩衝液A:水中0.1TFAJTBBaker、フィリップスバーグ、ニュージャージー州;カタログ番号94700-00、ロット番号J23J002.緩衝液B:アセトニトリル中0.1TFAJTBBaker、フィリップスバーグ、ニュージャージー州;カタログ番号9017-03、ロット番号J38807手順:1.1ml/分で、99Aおよび1Bを用いて60分間カラムを平衡化する。2.試料注入体積は50μlであり、標準品25μlを対照として用いた。3.これらの試料を流すのに用いた方法の一例を表4に示す。陰イオン交換クロマトグラフィー機器:1.AllianceBioHPLC、ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国;モデル番号2796;シリアル番号M08BA1199M2.ProteinPakHiResQ5um4.6×100mmカラム:ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州、米国;品番186004931;シリアル番号502N112561VE04試薬:緩衝液A10mMトリス塩基1.211g/L2mM塩化カルシウム0.588g/L0.01ポリソルベート801mlの10PS-80/L1Lまでろ水でメスアップ、pH7.0緩衝液B:10mMトリス塩基1.211g/L2mM塩化カルシウム0.588g/L0.01ポリソルベート801mlの10PS-80/L1M塩化ナトリウム58.44g/L1Lまでろ水でメスアップ、pH7.0手順:1.0.5ml/分で、70Aおよび30Bを用いて60分間カラムを平衡化する。2.試料注入体積は50μlであり、標準品10μlを対照として用いた。3.これらの試料を流すのに用いた方法の一例を表5に示す。当業者は、これらのおよび他の方法を用いて、本明細書に記載の組換え第VIII因子タンパク質の理解に達することができることを知っており、認識するであろう。"