"野生型wtと比較して、F遺伝子内に少なくとも第1の遺伝子組み換えを含み、P遺伝子内に少なくとも第2の遺伝子組み換えを含むことを特徴とする、遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第1の遺伝子組み換えの結果として親和性が拡張されることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えの結果として親和性が制限されることを特徴とする、請求項1または2に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。遺伝子組み換えセンダイウイルスSeVであることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第1の遺伝子組み換えによってSeVwtプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列が遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列と置き換えられることを特徴とする、請求項4に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記遍在性プロテアーゼ切断部位がニューカッスル病ウイルスNDVのF遺伝子に由来することを特徴とする、請求項5に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記SeVwtプロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列VPQSR配列番号5を含み、かつ/または前記遍在性プロテアーゼ切断部位がアミノ酸配列RRQKR配列番号6を含むことを特徴とする、請求項5または6に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、P遺伝子のヌクレオチド配列にコードされる非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つが修飾されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つが転写不可能となっていることを特徴とする、請求項8に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、前記非構造アクセサリータンパク質の少なくとも1つにおいて開始コドンが機能破壊されていることを特徴とする、請求項9に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記非構造アクセサリータンパク質が、C’、C、Y1、Y2、VおよびWから成る群より選択されることを特徴とする、請求項8~10のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともCCおよび/またはC’タンパク質ならびにYY1および/またはY2タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともCCおよび/またはC’タンパク質、Vタンパク質ならびにWタンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記第2の遺伝子組み換えによって、少なくともCCおよび/またはC’タンパク質、Vタンパク質、Wタンパク質ならびにYY1および/またはY2タンパク質が修飾され、好ましくは機能破壊されていることを特徴とする、請求項11に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。野生型wtと比較して少なくとも1つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。前記導入遺伝子が自殺遺伝子、もしくはそれ以外の細胞死誘導遺伝子または免疫刺激遺伝子であることを特徴とする、請求項15に記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルス。請求項1~16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスと薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする、医薬品組成物。腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行を治療および/または予防的に治療するための、請求項1~16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用。1請求項1~16のいずれかに記載の遺伝子組み換えパラミクソウイルスを提供すること、および2前記遺伝子組み換えパラミクソウイルスを薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含むことを特徴とする、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行の治療および/または予防的治療のための医薬組成物を製造する方法。このような背景下、本発明の基をなす目的は、これまでに使用されてきた腫瘍崩壊ウイルスの短所の大部分を回避することができる、改善された腫瘍崩壊ウイルスを提供することである。特に、腫瘍細胞内で複製して細胞を破壊することができるが、非腫瘍細胞内での複製は強く抑制され、その結果、疫学的安全性が十分に満たされるような腫瘍崩壊ウイルスを提供する必要がある。上記の目的は、遺伝子組み換えパラミクソウイルス、好ましくは、野生型wtと比較してF遺伝子内に少なくとも第1の遺伝子組み換えを含み、P遺伝子内に少なくとも第2の遺伝子組み換えを含む遺伝子組み換えセンダイウイルスSeVを提供することによって達成される。本発明によれば、パラミクソウイルスはパラミクソウイルス科のウイルスおよびそれらの増殖によって生じたウイルスを指す。パラミクソウイルスは、レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、アビュラウイルス属およびモルビリウイルス属を含むパラミクソウイルス亜科ならびにニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含むニューモウイルス亜科を包含する。パラミクソウイルスの分類についての詳細は、たとえばKneipeらによるFieldsVirology第5版,LippincotWilliamsWilkins2007に記載されている。本発明者らの見出した限り、本発明の好ましい実施形態によれば、基本的にはセンダイウイルスのすべてのウイルス株が本発明による組み換えに適したウイルス株であると言える。センダイウイルスのうち特に適した株は、FushimiHarrisZ株OhitaHamamatsuCantellおよび52である。本発明者らは、F遺伝子またはFタンパク質の遺伝子を組み換えて特定のプロテアーゼによる制限をなくすることにより、腫瘍組織内でウイルスが効率的に拡大し、幅広い種類の腫瘍の感染が可能となることを初めて突き止めた。センダイウイルスのF遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号1で示され、その遺伝子番号は1489775である。センダイウイルスのFタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号2で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA24390.1またはNP_056877である。本発明者らはまた、P遺伝子またはPタンパク質における第2の遺伝子組み換えによりウイルスが弱毒化することを突き止めた。P遺伝子内の遺伝子組み換えまたは突然変異によって、C’、C、Y1およびY2遺伝子またはタンパク質の読み枠がシフトする。しかしながら、Pタンパク質は完全に元のままの状態で残る。センダイウイルスのP遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号3で示される。Pタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号4で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA24386.1およびAAB06279である。P遺伝子は、C’、C、Y1、Y2、VおよびWと呼ばれるいくつかの非構造アクセサリータンパク質をコードする。これらのタンパク質は、オーバーラップした読み枠のRNAの編集によって作製される。非構造アクセサリータンパク質の正確な機能については、その詳細が完全に解明されているわけではないが、インターフェロンシステム等の、感染細胞の持つ非特異的防御システムと相互作用できることが推測されている。本発明に従って組み換えられたパラミクソウイルスは、野生型ウイルスとは対照的に、腫瘍組織内で非依存的に複製して組織を破壊し、特定の腫瘍細胞型への特異性は見られない。驚くべきことに、本発明のウイルスは、ヒト初代肝細胞や線維芽細胞等の非腫瘍細胞においては、非常に限定的な複製しかできない。その結果、本発明のウイルスは非腫瘍細胞と比較すると非常に高い選択性で腫瘍細胞に感染する。そのため正常組織の損傷は顕著に減少し、ウイルスによる治療の範囲は広くなる。本発明によれば、遺伝子組み換えとは、本発明のパラミクソウイルスにおけるゲノム、遺伝子情報またはコードされたタンパク質の、好ましくは標的を定めて行われる野生型からの変更を言い、これはたとえば標的突然変異誘発により導入できる。好ましいさらなる発展形態によれば、第1の遺伝子組み換えは、ウイルスの親和性が拡張されるように設計される。この方策には、本発明のウイルスが、たとえば少数の組織または腫瘍細胞においてのみ発現されるような特定のプロテアーゼに依存しなくなるという利点がある。これに関連して、たとえば野生型センダイウイルスは、気管支上皮細胞においてのみ発現されるトリプターゼに依存しており、そのため気管支上皮細胞以外には感染できない。Kinohら2009;上記引用文献により記載されたウイルスはマトリクスメタロプロテアーゼMMPに依存し、そのためMMPを発現する腫瘍細胞以外には感染できない。対照的に、本発明によるさらに発展したウイルスは、F遺伝子内の第1の遺伝子組み換えにより、あらゆる腫瘍細胞に感染して溶解させることができる。さらに好ましい実施形態によれば、第2の遺伝子組み換えは、親和性が制限されるように設計される。この方策には、ウイルスの安全性が向上しかつ副作用は顕著に低減するという利点がある。本発明のウイルスは腫瘍細胞を選択的に溶解させるが、正常細胞に対してはまったく溶解させないか、あるいはごくわずかしか溶解させない。本発明者らは、P遺伝子すなわち非構造タンパク質において標的を定めた遺伝子組み換えを行うことによって、ウイルスが腫瘍細胞に狙いを定めて複製するような効果を溶解対象である細胞における反応に対して及ぼすことができることを突き止めた。このアプローチは、Kinohら2009;上記引用文献が記載したような、構造タンパク質をコードするM遺伝子の欠失によって不完全ウイルス粒子を合成させるというアプローチとは異なるものである。このようなアプローチは、溶解活性の低減にもつながる。驚くべきことに、腫瘍細胞のみを溶解対象とする本発明のウイルスの溶解活性は非常に高い。F遺伝子内の第1の遺伝子組み換えによってSeVWTプロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列アミノ酸配列VPQSR配列番号5を含むが遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列と置き換えられることが好ましく、該遍在性プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列は、ニューカッスル病ウイルスNDVのF遺伝子アミノ酸配列RRQKR配列番号6を含むに由来することが好ましい。本発明による、Fタンパク質内のタンパク質分解性SeV-WTプロテアーゼ切断部位の修飾は、野生型から特定のプロテアーゼによる制限をなくするものである。このFタンパク質は、結果として遍在性プロテアーゼによって切断できるようになり、マウスの呼吸器にのみ存在するような特定のプロテアーゼや、さらには腫瘍産生性プロテアーゼへの依存から解放される。その結果、この遺伝子組み換えウイルスは、より幅広い種類の腫瘍に使用することができる一方、耐性発現のリスクは顕著に低減されている。本発明のさらなる好ましい発展形態によれば、P遺伝子内の第2の遺伝子組み換えによってP遺伝子にコードされる非構造アクセサリータンパク質の修飾が起き、好ましくは該アクセサリータンパク質のうち少なくとも1つが転写不能となり、さらに好ましくは開始コドンの機能破壊により転写不能となる。これらの方策には、本発明によって組み換えられたウイルスが、非悪性細胞および正常な組織における複製が顕著に抑制されることによって弱毒化されるという利点がある。その結果、本発明のウイルスは、腫瘍細胞により的確に狙いを定めて感染し、それらを溶解させることができる。非構造アクセサリータンパク質は、C’、C、Y1、Y2、VおよびWから成る群から選択されることが好ましく、P遺伝子内の第2の遺伝子組み換えによって、好ましくは少なくともC’/CおよびY1/Y2タンパク質、さらに好ましくは少なくともC’/C、VおよびWタンパク質、さらに好ましくは少なくともC’/C、V、WおよびY1/Y2タンパク質が修飾され、それぞれ機能破壊されていることが好ましい。本発明者らがモデルシステムで見出した限り、上記のように組み換えられたウイルスは、腫瘍細胞選択性が非常に高く、非腫瘍細胞における複製能は非常に低い。センダイウイルスのC’遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号7で示され、その遺伝子番号はAB005796.1である。センダイウイルスのC’タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号8で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA24394である。センダイウイルスのC遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号9で示される。センダイウイルスのCタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号10で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA24396である。センダイウイルスのV遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号11で示される。センダイウイルスのVタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号12で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA20021である。センダイウイルスのW遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号13で示される。センダイウイルスのWタンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号14で示され、そのデータベースアクセス番号はAAX07444である。センダイウイルスのY1遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号15で示される。センダイウイルスのY1タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号16で示され、そのデータベースアクセス番号はBAA24388である。センダイウイルスのY2遺伝子のヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号17で示される。センダイウイルスのY1タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号18で示され、そのデータベースアクセス番号はAAX07449である。好ましいさらなる一実施形態によれば、本発明のウイルスは、野生型wtのウイルスと比較して少なくとも1つの導入遺伝子を含み、この導入遺伝子は、好ましくは自殺遺伝子、またはそれ以外の細胞死誘導遺伝子もしくは免疫刺激遺伝子である。この方策には、感染した腫瘍細胞の破壊の激化に寄与する導入遺伝子の産物として、本発明のウイルスの細胞毒性が増強されるという利点がある。抗腫瘍効果のある導入遺伝子もまた、包含される。このような背景下、本発明のさらなる主題は、本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、従来技術、たとえばBauerらによるLehrbuchderPharmazeutischenTechnologie,WissenschaftlicheVerlagsgesellschaftmbHStuttgart1999、KibbeらによるHandbookofPharmaceuticalExcipients,AmericanPharmaceuticalAssociationandPharmaceuticalPress2000等に包括的に記載されている。前記刊行物の内容は、本発明の開示に含まれる。上記の医薬品組成物が細胞増殖抑止剤等のさらなる補助的薬剤や活性薬剤を含んでもよいことは言うまでもない。本発明のさらにまた別の主題は、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行を治療および/または予防的に治療するための、本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスの使用に関する。肝細胞癌は年間100万人の割合で発生しており、世界的に最も多く見られる悪性腫瘍の1つである。切除および肝移植による根治治療が可能な症例はごくわずかである。これまでのところ、試験したどの化学療法に対しても明らかな耐性が見られたため、信頼できる代替治療概念は存在しない。このようなニーズは、本発明によって効果的に満たされる。本発明のさらにまた別の主題は、腫瘍性疾患、好ましくは固形腫瘍の増殖、より好ましくは肝細胞癌の進行の治療および/または予防的治療のための医薬組成物を製造する方法に関し、該方法は1本発明の遺伝子組み換えパラミクソウイルスを提供すること、および2前記遺伝子組み換えパラミクソウイルスを薬学的に許容される担体を用いて製剤化することを含む。上述した特徴および以下で説明する特徴が、具体的に示す組合せに限定されず、本発明の範囲から逸脱しない他の組合せまたは単独で使用できることは理解されるであろう。以下、本発明を実施例により説明し、本発明のさらなる特徴、利点、および特性を明らかにする。添付の図面を参照されたい。1.センダイウイルスのゲノムの構成センダイウイルスは、約15kbのゲノムを有するマイナス鎖RNAウイルスである。そのゲノムの構成を図1に示す。6つの構造タンパク質の遺伝子は、3’-N-P-M-F-HN-L-5’の順序でウイルスゲノムRNA上に配置されている。最初の遺伝子の前には54のヌクレオチドを含むリーダー領域ldがあり、最後の遺伝子の後には57ヌクレオチド長のトレーラー領域trが続く。各遺伝子の下の数字は、bpで表した各遺伝子の長さに相当する。各遺伝子の転写において、該ウイルスのポリメラーゼは、遺伝子開始モチーフGSと呼ばれる、3’末端に位置する保存配列からmRNAの合成を開始し、次いで非翻訳領域UTR、ウイルス遺伝子の読み枠ORFと進み、最後に遺伝子終止モチーフGEでmRNAの合成を停止する。2つの発現ユニット間には、mRNAには組み込まれない3bpの保存された遺伝子間モチーフIが見られる。本発明の基礎は、いわゆるpSVV10プラスミド、より正確にはセンダイウイルスFushimi株、ATCCVR-105のcDNAをコードする19.774bpのpSVV10IdGFPMFHNプラスミドの形態で提供される。このプラスミドを図2に示す。2.P遺伝子によってコードされるアクセサリータンパク質の詳細な説明センダイウイルスのアクセサリータンパク質C’、C、Y1、Y2、VおよびWは、P遺伝子によってコードされる。Cタンパク質およびYタンパク質のORFは1塩基分ずつシフトしている。Vタンパク質およびWタンパク質は、いわゆる編集部位ESに挿入されているGタンパク質の数に応じて作製される。アクセサリー遺伝子を有するP-ORF配列領域を図3に示す。数字は、PSVV10ベクター内の位置である。3.突然変異誘発プラスミド内でのサブクローン化アクセサリータンパク質の遺伝子に点変異を挿入するために、突然変異誘発PCRを行った。しかしながら、この方法に使用できるのはサイズが8kbまでのプラスミドに限られる。センダイウイルスのゲノムのP/V/C領域は、制限酵素EcoRIおよびSphIによってセンダイウイルスベクターpSVV1019774bpからクローニングベクターpSL11803422bp中にサブクローン化した。これを実施するため、pSVV10図2とpSL1180の両ベクターを酵素EcoRIおよびSphIで消化し、pSVV102254bp内の突然変異の対象となる上記領域をsPL11803303bpのベクターバックボーンにライゲートした。生じたクローニングプラスミドpSL1180SphI-EcopSVV10のサイズは5557bpであった図4参照。4.突然変異誘発標的を定めた変異によってアクセサリー遺伝子C’、C、Y1およびY2の転写を防止することが必要である。編集部位の変異には、それ以上の編集を起こさせなくする効果もある。以下の概略図に、pSL1180のクローニング関連領域を、すべての遺伝子開始部位、編集部位とともに示す配列番号19。アクセサリータンパク質の遺伝子の開始配列を機能的に破壊する一方、P読み枠のアミノ酸には変化をもたらさない3種のプライマーを設計した。突然変異誘発PCRにおいて、これらのプライマーを用いて以下の変異が生成した。Stratagene登録商標社のQuickChange部位特異的突然変異誘発キットを使用することにより、サイズが8kbまでのプラスミドに対し、3ステップで標的を定めた点変異を挿入することが可能となる。第1のステップでは、それぞれ異なる点変異を含むミスマッチプライマーが反応に付され、変性したテンプレートの1本鎖にアニールする。このとき、すべてのプライマーが同一のテンプレート鎖に結合するよう注意しなければならない。PfuTurboポリメラーゼは、プライマーから相補的配列の伸長を開始するが、プライマー自体を置き換えることはない。新たに生成したDNA鎖には、変異と1本鎖の突出末端いわゆるニックとが組み込まれる。このニックは、ブレンド酵素の構成要素によって適切に置き換えられる。第2のステップでは、DpnIを用いた消化を行い、メチル化またはヘミメチル化されたDNAを特異的に消化する。大腸菌内で増幅されたプラスミドはdam-メチル化されている。そのため親テンプレートは消化されるが、PCRで生成した変異を含むコピーは消化されない。最後のステップにおいて、ssDNAはXL10-Goldウルトラコンピテントセル内に形質転換され、生体内でdsDNAに変換される。ここで、プラスミドを該細菌から単離し、シークエンシングにより挿入された変異の分析を行うことができる。突然変異誘発PCRの原理を図5に示す。突然変異誘発分析は、以下のように構成される表1。突然変異誘発PCRは、従来のPCRと似ているが、伸長時間だけが非常に長い。これは、ベクター全体の相補鎖を形成する必要があることによる。したがって、伸長時間はベクターによって異なる。1kb当たり2分間であり、ここでpSVV10から得る5.5kb以下のpSL1180Eco-SphI断片は伸長時間11分間に相当する表2参照。増幅直後にDpnI制限酵素10U/μl1μlをPCR分析に加えてピペットで再懸濁し、短時間の遠心分離を行った後、37°Cで消化させた。生じたssDNAをXL10-Goldウルトラコンピテントセルに形質転換し、Miniprepを用いてdsDNAに変異したプラスミドとして該細菌から単離した表3参照。5.シークエンシング生じた変異プラスミドに変異が正確に挿入されているかどうかを確認した。変異領域全体を含むプライマースキームを図6に示す。上部の数字はオリジナルのベクターpsVV10~19kbにおける位置情報を表し、下部の数字はpSL1180pSVV10クローニングベクター~5.5kbにおける位置情報を表す。6.センダイウイルス全体をコードするベクターへの変異配列の再クローニング変異させた配列領域は、再クローニングすることによってセンダイウイルスの完全なcDNA配列を有するベクターに戻す必要があった。げっ歯動物の呼吸器においてトリプターゼクララによってのみ活性化される切断部位の代わりに遍在性F切断部位を有するウイルスを作製するため、ベクターpRSId-EGFPFmut19958bp,SaschaBossow,MPIミュンヘンのeco-eco領域を使用した。これは、ヌクレオチド配列GTTCCACAGTCGAGA;配列番号33を有する、センダイウイルスのFタンパク質中の切断部位の代わりに、配列CGTCGTCAGAAGAGA;配列番号34を有する、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質の遍在性切断部位を含むものである。まず、pSL1180Sph1-EcopSVV10クローニングベクターから異なる変異SphI-EcoRIフラグメントを切り出し、センダイウイルスベクターpSVV13へと移植した。このベクターは、pSVV10と類似しているが、F遺伝子およびHN遺伝子領域を欠いている。次いで、EcoRIを用いて、このベクターに、欠失しているF遺伝子およびHN遺伝子領域としてpRSId-EGFPFutのF遺伝子における修飾された切断部位を移植した。生じたベクターをpSeVmutと呼ぶ。レスキュー法を用いたBSR-T7細胞へのトランスフェクションによって、機能性センダイウイルスを作製した。再クローニングのステップ1を図7に、またステップ2を図8に示す。7.組み換えセンダイウイルスの作製パラミクソウイルス科のためのレスキュー法によって、遺伝子組み換えウイルスを作製することができる。BSR-T7は構成的にT7RNAポリメラーゼを発現する細胞であるが、ヘルパープラスミドおよびセンダイウイルスのcDNAをコードするプラスミドを、リポフェクションによってこの細胞に共導入した。T7プロモーターによって制御されるこれらのプラスミドは細胞内で転写され、いくつかのステップを経てウイルスタンパク質およびウイルスのマイナス鎖RNAゲノムを生じ、機能性ウイルスを生成する。BSR-T7細胞6ウェルプレートの各ウェルにつき3×105個を播種し、37°Cで一晩培養した。トランスフェクションのために、FuGENE6Fugene6の量はDNA1μg当たり2μlに相当を含むDMEM200μlをバイアルに入れ、5分間インキュベートした。表4に記載のDNA成分を加えた後、さらなるインキュベーションステップを室温で25分間実施する。前記BSR-T7細胞をDMEMで2回洗浄し、次いで1.8mlのDMEM培地2FCSを加える。インキュベートしたトランスフェクション混合物を撹拌下で滴下し、細胞を33°Cで3日間培養した。次いで、トランスフェクトしたBSR-T7細胞を1回につき1mlのDMEMで3回洗浄し、残存するプラスミドを除去した。ここへ1mlの新鮮DMEM培地2FCSを加え、新たに生成したウイルスを1日後に回収した。ベロ細胞にトランスフェクトして増幅させる前に、ウイルスを含む上清を室温、300rpmで4分間遠心分離した。4日前に調製播種:3.5cmのディッシュ1枚当たり細胞2×105個;目標:感染日に3.5cmのディッシュ1枚当たり細胞約106個したベロ細胞をDMEMで2回洗浄し、撹拌下15分毎、33°Cで1時間かけて100~500μlのBSR-T7上清培地を含む吸着量~500μlを用いて感染させた。接種材料を除去し、細胞をDMEMで2回洗浄した後、培地を毎日交換しながら1mlの培地中、33°Cで2~5日間インキュベートした。ウイルスにコードされたマーカータンパク質としてのeGPFが蛍光顕微鏡によって検出された時点で、培養上清を除去した。この最初の継代ウイルスを用いて、さらに規模を拡大して継代第2、第3継代を作製した。ウイルスの子孫の力価をTCID50法によって定量した。本発明に従って、以下の遺伝子修飾または組み換えを受けたセンダイウイルスを作製した。aSeVFmut:NDV切断部位を有するセンダイウイルスFushimi株bSeVFmutdV:さらにV遺伝子およびW遺伝子に変異を有するa株cSeVFmutdC:さらにC遺伝子およびC’遺伝子に変異を有するa株dSeVFmutdCdY:さらにC遺伝子およびC’遺伝子ならびにY1遺伝子およびY2遺伝子に変異を有するa株eSeVFmutdCdV:さらにC遺伝子およびC’遺伝子ならびにV遺伝子およびW遺伝子に変異を有するa株fSeVFmutdCdYdV:さらにC遺伝子およびC’遺伝子、V遺伝子およびW遺伝子、ならびにY1遺伝子およびY2遺伝子に変異を有するa株8.組み換えセンダイウイルスの特性決定作製した組み換えセンダイウイルスについて、いくつかのレベルで広く特性決定を行った。ウイルスの複製は、形質転換されていないベロ細胞由来産生細胞、および腫瘍細胞、具体的には肝癌細胞Hep3B、HuH7、PLC/PRF/5、および数種類の非腫瘍細胞、具体的にはヒト線維芽細胞株MRC5や様々な提供者から得た初代ヒト肝細胞PHH等を用いて分析した。増殖曲線1.12のウェルに1×105個の細胞500μl中ベロ細胞、肝癌細胞、MRC5、PHHを使用し、いずれも1×105個から開始を用意2.増殖3.培地を除去、PBSで1回洗浄4.250μlのOptiMEMを添加5.ウイルスをOptiMEMMOI0.05で希釈6.細胞に希釈したウイルスを添加7.6種のSeV変異体すべてを用いて感染残った希釈物は凍結させ、開始値としての滴定を行う8.37°Cで1時間かけて感染9.細胞をPBSで2回洗浄10.1mlの新鮮培地DMEM5FCSを添加11.24、48、72、96時間後感染開始からの時間に上清中のウイルスを除去し、-80°Cで保存各200μla.培地で注意深く2回洗浄b.1000mlの培地DMEM5FCSを添加し、細胞をこすり取る12.溶解物を-80°Cで凍結13.滴定のため融解a.37°Cの水浴に2分間b.10~15秒間のボルテックスc.小型遠心分離機で3000×gを2分間14.遠心分離15.ベロ細胞における滴定TCID50d.ウイルス希釈物を調製1本目は常に希釈しないe.96ウェルプレートに添加プレートに常に新鮮培地を用意し4°Cに調整f.細胞をトリプシン処理g.2×104個/96ウェルとなるよう細胞を数えて添加h.3日後に力価を評価図9に、ベロ細胞由来産生細胞および肝癌細胞における本発明のウイルスの複製を示す。生成した組み換えウイルスがいずれもベロ細胞由来産生細胞において非常によい複製能を示し、いずれも同等の力価を備え、TCID50/mlが107~108であることがわかる。ウイルス粒子の滴定は、独立した3回の分析を繰り返して行った。その平均値および標準偏差を示すIO=接種材料。肝細胞癌の3種のヒト標準細胞株、HuH7、PLC/PRF/5、およびHep3Bにおいて、組み換えウイルスはいずれも腫瘍細胞内で非常によい複製能を示すことがわかった。したがって、本発明の組み換えウイルスの腫瘍崩壊作用に不可欠な要件の1つは満たされる。ヒト線維芽細胞株MRC-5および数人の異なる提供者から得た初代ヒト肝細胞PHHを、代表的な非腫瘍細胞として分析した。結果を図10に示す。分析した変異体の腫瘍崩壊の強度は、アクセサリータンパク質における欠失に依存する。欠失が1つのみのウイルスSeVVFmutdC,SeVVFmutdVは、正常細胞における複製能を中程度に失ったに過ぎなかったが、2つ以上の欠失を有するウイルスSeVFmutdCdY,SeVFmutdCdV,SeVFmutdCdYdVは、肝癌細胞すなわち腫瘍細胞において効率的に複製し、該細胞を破壊するものの、正常細胞への感染はほとんど観察されない。ウイルス粒子の滴定は、独立した3回の分析を繰り返して行ったPHHは、異なる3人の提供者から得た。その平均値および標準偏差を示すIO=接種材料。さらに実験を行いinvivoでのウイルスの拡大を分析した。1.5×106個のHuH7腫瘍細胞を、Balbcnu/nuマウスの右脇腹に皮下注入した。2.腫瘍の容積が少なくとも100mm3に達した後、PBS100μl中のセンダイウイルスを腫瘍内へ投与した。3.ウイルスの注射から2日後に、マウスを犠死させ、腫瘍を摘出した。4.腫瘍の一部をTissueTackに包埋し、凍結させ、クリオトームを用いて薄切した。ウイルスによって発現されたGFPを、蛍光顕微鏡で直接検出した。5.腫瘍の別の部分をパラフィン包埋し、GFPを特異的抗GFP抗体によって検出した。結果を図11に示す。腫瘍細胞が組み換えウイルスSeVFmutに感染し、ウイルスがそこから拡大できることが、生体内で実証された。この結果から、所望の通り、生体内の肺以外にある腫瘍組織において複製可能であることが確認できる。SeVFmutウイルスは、ヒト肝細胞癌異種移植組織HuH7において増殖可能であるが、D52ウイルスFushimi野生型変異体は、腫瘍内へのウイルス投与後、高度に制限されて局所に留まる。9.結論本発明者らは、野生型と比較してF遺伝子およびP遺伝子内に組み換えを有する様々な組み換えセンダイウイルスを用いて、抗腫瘍療法においてそれらを腫瘍崩壊ウイルスとして使用できることを実証できた。以下の配列を一覧として記載する。配列番号1:SeVOhita株F遺伝子のヌクレオチド配列配列番号2:SeVOhita株Fタンパク質のアミノ酸配列配列番号3:SeVOhita株P遺伝子のヌクレオチド配列配列番号4:SeVOhita株Pタンパク質のアミノ酸配列配列番号5:SeV-WTプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列配列番号6:NDVFタンパク質のプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列配列番号7:SeVOhita株C’遺伝子のヌクレオチド配列配列番号8:SeVOhita株C’タンパク質のアミノ酸配列配列番号9:SeVOhita株C遺伝子のヌクレオチド配列配列番号10:SeVOhita株Cタンパク質のアミノ酸配列配列番号11:SeVHamamatsu株V遺伝子のヌクレオチド配列配列番号12:SeVHamamatsu株Vタンパク質のアミノ酸配列配列番号13:SeVCantell株W遺伝子のヌクレオチド配列配列番号14:SeVCantell株Wタンパク質のアミノ酸配列配列番号15:SeVOhita株Y1遺伝子のヌクレオチド配列配列番号16:SeVOhita株Y1タンパク質のアミノ酸配列配列番号17:SeV52株Y2遺伝子のヌクレオチド配列配列番号18:SeV52株Y2タンパク質のアミノ酸配列配列番号19:pSL1180のクローニング領域のヌクレオチド配列配列番号20:PCRプライマー1のヌクレオチド配列配列番号21:P遺伝子のヌクレオチド配列配列番号22:変異したP遺伝子のヌクレオチド配列配列番号23:変異したC遺伝子のヌクレオチド配列配列番号24:PCRプライマー2のヌクレオチド配列配列番号25:P遺伝子のヌクレオチド配列配列番号26:Y1遺伝子のヌクレオチド配列配列番号27:変異したY1遺伝子のヌクレオチド配列配列番号28:PCRプライマー3のヌクレオチド配列配列番号29:P遺伝子のヌクレオチド配列配列番号30:変異したP遺伝子のヌクレオチド配列配列番号31:変異したV遺伝子のヌクレオチド配列配列番号32:変異したW遺伝子のヌクレオチド配列配列番号33:SeVF遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列配列番号34:NDVF遺伝子の切断部位のヌクレオチド配列"