水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYATを生産する方法であって、適切な発現宿主を用意するステップと、前記発現宿主においてGLYATを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現プラスミドを形成するステップと、前記宿主を前記発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、前記発現系において前記GLYAT遺伝子を発現させるステップと、前記発現されたGLYATを前記発現系から分離するステップとを含む方法。前記発現されたGLYATを前記発現系から分離する前記ステップが、前記発現系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび前記分離されたGLYATを濃縮または凍結乾燥するステップを含む、請求項1に記載の方法。前記発現宿主が、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系および哺乳動物細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌および枯草菌を含む原核生物系、ならびに古細菌系からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記分離した発現GLYATをグリシンと組み合わせるさらなるステップを含む請求項1~3のいずれかに記載の方法。請求項1~4のいずれかに記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYAT。請求項1~4のいずれかに記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATを含む医薬。哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、解毒を増強する方法、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を治療および/または予防する方法における、製薬学的に有効な量の、請求項1~4のいずれかに記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATの使用。体重1キログラム当たり0.1mg~160mgの間の生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATを、必要とする哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、解毒を増強する方法、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性中毒または慢性中毒を治療および/または予防する方法において使用するための水溶性の酵素的に活性な組換えGLYAT。哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させること、解毒を増強すること、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性中毒または慢性中毒を治療および/または予防することに使用するための医薬を製造する方法における、製薬学的に有効な量の、請求項1~4のいずれかに記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATの使用。前記代謝障害が、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか1つまたは複数である、請求項7~9のいずれかに記載の使用。請求項1~4に記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATが、グリシン抱合能力をさらに刺激するためにグリシンと組み合わせて投与される、請求項7~10のいずれかに記載の使用。請求項1~4のいずれかに記載の方法に従って調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATとグリシンとの組み合わせ、および少なくとも1つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形剤を含み、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、TAT転写のトランス活性化因子ペプチド、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質に基づく構造体を含有するコロイド系、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、および皮下注射剤を含む群から選択される剤形の医薬。添付の図面を参照して本明細書に記載および例示されているとおりの、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYATを生産する方法。したがって、本発明の目的は、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYAT酵素を生産する新規な方法を提供することおよびそのような方法を用いて生産されたGLYATを提供することである。本発明のさらなる目的は、哺乳動物において、解毒を増強する方法、および代謝障害を治療および/または予防するための方法における、製薬学的に有効な量のGLYATの使用を提供することである。本発明のさらに別の目的は、前述の不都合を克服する、または少なくとも最小にすることができる、哺乳動物において、解毒を増強する方法、および代謝障害を治療および/または予防するための方法を提供することである。本発明の第1の態様によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYATを生産する方法であって、適切な発現宿主を用意するステップと、発現宿主においてGLYATを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現プラスミドを形成するステップと、宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、発現系においてGLYAT遺伝子を発現させるステップと、発現されたGLYATを発現系から分離するステップとを含む方法が提供される。さらに本発明によれば、発現されたGLYATを発現系から分離するステップは、発現系の水溶性画分を不溶性物質から分離するステップおよび分離されたGLYATを濃縮または凍結乾燥するステップを含んでもよい。さらに本発明によれば、発現宿主は、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系および哺乳動物細胞発現系を含む真核生物系、大腸菌Escherichiacoliおよび枯草菌Bacillussubtilisならびに古細菌系を含む原核生物系からなる群から選択することができる。さらに本発明によれば、この方法は、分離した発現されたGLYATをグリシンと組み合わせるさらなるステップを含む。本発明の第2の態様によれば、本発明の第1の態様によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATが提供される。本発明の第3の態様によれば、本発明の第1の態様によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATを含む医薬が提供される。本発明の第4の態様によれば、哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、解毒を増強する方法、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を治療および/または予防する方法における、製薬学的に有効な量の、本発明の第1の態様によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATの使用が提供される。本発明の第5の態様によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATは、それを必要とする哺乳動物に、増加したグリシン抱合の要求に応じて、体重1キログラム当たり0.1mgから160mgの間の生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATを投与することによって、哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させる方法、解毒を増強する方法、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を治療および/または予防する方法において使用されてもよい。本発明の第6の態様によれば、哺乳動物において、グリシン抱合解毒系の能力を向上させること、解毒を増強すること、または代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性または慢性中毒を治療および/または予防することに使用するための医薬を製造する方法における、製薬学的に有効な量の、本発明の第1の態様の方法によって調製される水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATの使用が提供される。さらに本発明によれば、代謝障害は、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか1つまたは複数であり得る。本発明の第7の態様によれば、本発明の第1の態様による水溶性の酵素的に活性な組換えGLYAT、ならびに少なくとも1つの不活性な製薬学的に許容される担体または賦形剤から調製される、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、および皮下注射剤からなる群から選択される剤形の医薬が提供される。水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATは、所望の細胞内区画を標的とする形態の酵素の製剤を用いて、静脈内注入IVによって投与されてもよい。代替として、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATは、膜透過TAT転写のトランス活性化因子ペプチドと融合したGLYAT酵素を使用することによって投与されて、組換え酵素が細胞膜を効率的に通過して、所望のミトコンドリアマトリックスに到達することを可能にしてもよい。さらに代替として、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATは、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含有するコロイド系を使用することによって投与されてもよい。さらに本発明によれば、生物学的に有効な量の水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATを投与するステップは、グリシン抱合能力をさらに刺激するために、水溶性の酵素的に活性な組換えGLYATをグリシンと組み合わせて投与するさらなるステップを含んでもよい。添付の図面を参照して、本発明を以下にほんの一例としてさらに記載する。本発明の好ましい一実施形態によれば、水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYATを生産するための方法が提供される。この方法は、GLYAT発現遺伝子をもたらす適切な発現宿主を用意するステップと、発現宿主においてGLYATを発現させるための遺伝子を含むベクターを調製して、発現プラスミドを形成するステップと、宿主を発現プラスミドで形質転換して、発現系を形成するステップと、GLYATを発現系において発現させるステップと、発現GLYATを発現系から分離するステップと、分離した発現GLYATをグリシンと組み合わせるステップとを含む。発現宿主は、酵母細胞発現、昆虫細胞発現および哺乳動物細胞発現を含む真核生物系、大腸菌および枯草菌を含む原核生物系ならびに古細菌系からなる群から選択される。大腸菌E.coliは、特に適切な宿主を提供することが見出された。ウシGLYATをコードしている遺伝子は、ウシ肝臓RNAから単離され、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅によって、pColdIII発現ベクター中にクローニングされた図1において示されているとおり。pColdIII発現ベクターは、摂氏15度での大腸菌におけるタンパク質の発現を可能にし、これは、可溶性の酵素的に活性な組換えタンパク質の発現を増強する。様々な他のベクターもまた、真核生物、原核生物および古細菌の発現宿主における、組換えヒトGLYATおよび組換えウシGLYATまたは他のGLYAT変異体の発現のために使用され得る。適切なベクターを得るために、ヒスチジンタグHis-タグが、遺伝子のC末端に接続される。C末端ヒスチジンタグの代替として、タグは、N末端ヘキサヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質MBP、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、GSTタグおよびStrep-TagIIからなる群から選択される。GLYATは、代替として、精製タグなしで発現され、公知のタンパク質精製戦略を利用することによって発現宿主のタンパク質から分離される。GLYATはヌクレオチド-補因子結合酵素であるという事実のために、GLYATはさらに代替として、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。[実施例1:組換えウシGLYAT]組換えウシGLYATを、C末端ヒスチジンタグをコードしている3つの改変されたpColdIIIpColdIII-E、pColdIII-AおよびpColdIII-EH発現ベクターのセットにクローニングした。コード配列を発現ベクター中にクローニングするために、定方向クローニングを容易にするためのNdeIおよびXhoI制限酵素部位を含むプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応PCRによって配列を増幅する。PCR反応混合物は、1×TakaraExTaqバッファー、10nmolの各dNTP、25pmolの各プライマー、約50ngの鋳型DNAおよび2ユニットのTakaraExTaqポリメラーゼを最終体積50μl中に含有していた。サーマルサイクリング条件は、摂氏94度で1分間、次いで摂氏94度で30秒間を30サイクル、摂氏70度で30秒間および摂氏72度で1分間、続いて摂氏72度で10分間の最終伸長であった。大腸菌を組換えGLYATコード配列を含む発現プラスミドで形質転換した後、制限分析またはPCR増幅のいずれかを使用して、コロニーを所望の組換えプラスミドについてスクリーニングした。図2において示されているように、アガロースゲルにおいて約900bpの切り取られた断片が見られれば、コロニーを陽性であるとみなした。組換えタンパク質を、ニッケルアフィニティー精製プロセスを使用して精製した。組換えGLYATと融合したヒスチジンタグは、ニッケルイオンが固定された樹脂を通過すると、その表面に固定されたニッケルイオンと配位結合を形成することによってカラムマトリックスに強固に結合する。このことにより、ヒスチジンタグ付きGLYATは結合したままでありながら、大部分の他のタンパク質をカラムから洗浄することが可能となる。タグ付きタンパク質を高濃度のイミダゾールを含有するバッファーで溶出し、イミダゾールがヒスチジン残基とニッケルイオンとの間の配位結合と置き換わり、部分的に精製された組換えタンパク質をもたらした。図3に関して、ドデシル硫酸ナトリウムSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動図PAGEを使用して、pColdIIIベクターからのウシGLYATの発現を分析した。タンパク質を、クマシーブリリアントブルーで染色することによって可視化した。レーン2は発現されたタンパク質の全画分を示し、レーン3は細菌溶解物の可溶性画分を示しており、発現された可溶性組換えGLYATは、細菌タンパク質のバックグラウンドにおいてはっきりと見られない。図4に関して、組換えウシGLYATを、C末端ヒスチジンタグとともにpColdIIIから発現した。可溶性画分を、ニッケルアフィニティー精製カラムに通過させて、タグ付き組換えGLYAT酵素を精製した。発現された可溶性組換えウシGLYATのレベルは低く、よって、精製の最後の溶出液をかなり濃縮した。SDS-PAGE分析は、レーン2において発現されたタンパク質の全画分を明らかにした。レーン3は、組換えGLYATの可溶性画分を表し、細菌タンパク質のバックグラウンドに対して顕著な量の可溶性組換えGLYATは見られない。レーン4は、ニッケルアフィニティー精製の結果として部分的に精製された酵素を示す。下のバンドは、GLYAT酵素の活性な形態を示す。図5に関して、20mMのイミダゾールを、精製キットのカラム洗浄バッファーに添加した。バッファーにおいてイミダゾールを使用することにより、以前に同時精製したタンパク質の大部分が失われる結果となった。図5における下のバンドは、酵素的に活性なウシGLYATおよび未知のタンパク質を表す。本発明によって調製された組換えウシGLYAT酵素は、ウシ肝臓から精製されたGLYAT酵素と同様の生化学的特性を有することが見出された。[実施例2:組換えヒトGLYAT]ヒトGLYAT配列をコードしているヌクレオチド配列を合成し、pET32発現ベクター中にクローニングした。pET32発現ベクターは、酵素の精製および正しいフォールディングをそれぞれ容易にするN末端ヘキサヒスチジンタグおよびN末端Trxタグを有するヒトGLYATの発現を可能にする。ヒトGLYATをコードしている発現ベクターで、Origami発現細胞を形質転換した。細胞はまた、TakaraのpGro7ベクターでも形質転換し、これにより、GroESおよびGroELシャペロンタンパク質の共発現をもたらした。シャペロンタンパク質は、タンパク質の正しいフォールディングを助け、可溶性組換え酵素の収率を増加させる。組換えヒトGLYATおよびシャペロンタンパク質の発現のためのプラスミドを含むOrigami細胞を、液体培地中で増殖させた。可溶性GLYATの最適な発現は、IPTGイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドの非存在下で起こり、したがって、IPTGを用いて融合タンパク質の発現を誘導する公知の方法とは対照的に、遅い基本速度でGLYATの発現を可能にすることが見出された。発現の後、細胞を遠心分離によって回収し、300mMのNaCl、50mMリン酸塩バッファー、pH8.0、10グリセロール、1Triton-X、リゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する最適化されたネイティブ溶解バッファーを使用して溶解した。細胞溶解物を、10000gで30分間遠心分離を使用して清澄化して不溶性物質を除去し、Protinoニッケルアフィニティー精製カラムを通してヘキサヒスチジンタグ付き酵素を選択的に結合させた。カラムを洗浄し、精製されたタンパク質を最終体積3ml中に溶出した。図6に関して、可溶性組換えヒトGLYATを、N末端ヘキサヒスチジン-Trx融合タグを付けて発現させた。レーン1は、分子サイズマーカーを含有する。レーン2およびレーン3は、BugBusterタンパク質抽出試薬を使用して溶解した細胞の培養物の、それぞれ不溶性画分および可溶性画分を含有する。可溶性組換えヒトGLYATは見られなかったため、この溶解試薬は組換えヒトGLYATの抽出に適していないことが見出された。代替として、最適化されたネイティブ溶解バッファーを使用して、0時間から4時間まで発現しているタンパク質を培養物から単離し、可溶性画分をレーン5~9にロードした。ヘキサヒスチジン-Trx-GLYAT融合タンパク質を、55kDa範囲にある矢印によって示す。図7に関して、可溶性組換えヒトGLYAT融合タンパク質は、ProtinoNi-TEDカラムを使用したニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。レーン1は、分子量マーカーを含有し、レーン2には何も入っていない。レーン3は、精製後の野生型組換えヒトGLYAT融合タンパク質を含有する。レーン4~9は、GLYAT遺伝子の一塩基多型SNPの既知異変に関する、本発明に従って調製された精製済み組換えヒトGLYAT融合タンパク質を含有する。図8に関して、得られた酵素調製物を、分光光度アッセイを使用してGLYATの酵素活性についてアッセイした。アッセイにおいて、ウシGLYATを陽性対照として使用する。観察される酵素活性がグリシン依存的であることを示す陰性対照として、グリシンを用いない反応を行った。組換えヒトGLYATは、412nmでの吸光度ODの増加を示し、本発明に従って調製した組換えヒトGLYATのグリシン存在下での酵素活性を裏付けた。上述のように治療用組換えGLYAT酵素を使用することに加えて、GLYAT酵素の新規な形態が、合理的なおよび半合理的な酵素工学戦略によって得られ得ること、およびこれらが代替的にそれらの特殊化した機能のために使用され得ることが考えられる。酵素工学戦略による改変を受け得るGLYAT酵素の特質には、触媒反応速度、基質特異性、安定性、免疫学的側面および最適基質濃度が含まれる。ヒトGLYATの既知の天然SNP一塩基多型変異体が6種存在しており、部位特異的突然変異誘発を使用して、野生型配列からこれらの変異体コード配列を生成した。6種のSNP変異体のうち、2種は野生型GLYATより高い酵素活性を有し、残りは野生型GLYATよりはるかに低い活性を有することが見出された。例えば触媒反応速度が増加した変異体を使用すれば明らかな利益が伴うと予想することができる。[さらなる発見および分析]使用において、代謝障害の性質および程度に応じて、体重1キログラム当たり0.1mg~160mgの製薬学的に有効な量の組換えGLYAT酵素が、それを必要とする患者に、所望の細胞内区画を標的とする形態の酵素の製剤を用いて、静脈内注入IVによって投与される。代替として、調製された組換えGLYAT酵素は、膜透過剤として作用するTAT転写のトランス活性化因子ペプチドを使用することによって投与され、これにより、組換え酵素が、細胞膜を効果的に通過して、所望のミトコンドリアマトリックスに到達することが可能になろう。さらに代替として、調製された組換えGLYAT酵素は、サブミクロンサイズおよびミクロンサイズの独特で安定な脂質系構造体を含むコロイド系を使用して投与することにより、哺乳動物において解毒を増強し、代謝障害、およびキシレンまたはアスピリンなどの化合物による急性中毒または慢性中毒を治療および/または予防する。代謝障害は、プロピオン酸血症、イソ吉草酸血症およびグルタル酸尿症から選択される有機酸血症、メープルシロップ尿症および高グリシン血症から選択されるアミノ酸尿症、ならびに尿素回路異常症からなる群から選択される疾患のいずれか1つまたは複数でもよい。組換えGLYATは、さらに代替として、以下の、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤、皮内注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、および皮下注射剤を含む剤形のいずれかに製剤化される。グリシンと組み合わせて組換えGLYATから調製される医薬を使用して、化学物質および工業溶媒に曝露された患者の治療、および急性アスピリン中毒の救急治療において、グリシン抱合解毒系の能力が直接向上する。いくつかの有機酸のグリシン抱合は、治療用組換えGLYAT酵素の使用によって増強される。本発明に関して、組換え酵素を生産する新規な方法、より詳細には水溶性の酵素的に活性な組換えグリシンN-アシルトランスフェラーゼGLYAT酵素を生産する新規な方法を提供する際の詳細の変更が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく可能であることは理解されよう。