"本明細書に記載される発明。本発明は、免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地を提供し、ここでこの培地は、乾燥重量で少なくとも20の動物由来でないタンパク質性物質を含有し、そして動物由来のタンパク質性物質を含有しない。細菌を培養するための任意の標準培地が、動物由来のタンパク質性物質を含まないという条件で、本発明の培地の基礎として使用され得る。好ましくは、本発明の培地は、炭素およびエネルギー源、窒素源、必須塩類、ならびに必要に応じて培養されるべき微生物を選択するための選択剤例えば、抗生物質を含有する。本発明の培地は、固体または液体培地であり得る。本発明の培地の基礎を形成し得る標準液体培地の例には、Brucellaブロストリプトンおよびペプタミンなし、Watson培地カザミノ酸なし、MuellerMiller培地心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし、CL培地カザミノ酸なし、およびFranzA培地が挙げられる。標準固体培地は、寒天のような凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。本明細書中で使用される用語培養するは、細菌の維持、好ましくは増殖を意味する。細菌増殖は、本明細書中では、細菌生物量の増加として定義される。本明細書中で使用される用語病原性細菌は、疾患の病原性に関与する任意の細菌を意味する。好ましい病原性細菌には、Helicobacterpylori、Haemophilusinfluenzae、CorynebacteriumdiphtheriaeおよびNeisseriameningitidis、BordetellapertussisおよびClostridiumtetaniが挙げられる。本明細書中で使用される用語免疫原性因子は、ヒトまたは動物の免疫系を刺激し得る任意の因子を意味する。このような免疫原性因子には、抗原性タンパク質、特に毒性因子およびそのフラグメントが挙げられる。毒性因子は、細菌の毒性に関連するものとして定義され、Helicobacterpyloriにより産生される液胞vaculating細胞毒素VacAのような因子を含む。他の毒性因子は、Rappuoli,R.ら、EuropeanJournalofGastroenterologyandHepatologyofHelicobacterpyloriinfection.ProceedingsofaninterdisciplinarymeetingGenova,1993年6月18日~19日J.J.Misiewicz編CSCurrentScience,S76~S78頁本明細書中で参考として援用されるにより記載されている。免疫原性因子は、毒素化toxoidingプロセスにより遺伝的に解毒されるかまたは処理され得る。免疫原性因子を遺伝的に解毒および毒素化の方法は、当業者に周知であり、Rappuoli,R.、Vaccine,12,579-581,1994本明細書中で参考として援用されるにより記載される方法を含む。本明細書中で使用される用語タンパク質性物質は、タンパク質、および遊離のアミノ酸を含むタンパク質分解産物を意味する。好ましくはタンパク質性物質は、タンパク質加水分解物である。本明細書中で使用される動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源例えば、植物、鳥、魚、酵母、真菌、藻類、および微生物由来のタンパク質性物質を意味する。より好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、植物、酵母、藻類および微生物由来のタンパク質性物質を意味する。最も好ましくは、動物由来でないタンパク質性物質は、大豆、綿実、ジャガイモ等由来のタンパク質組成物のような、植物由来のタンパク質性物質を意味する。好ましい動物由来でないタンパク質性物質には、HYYESTQuestのような酵母抽出物、ならびにHysoyQuest、AmisoyQuest、N-ZsoyQuestおよびSoytoneDifcoのような大豆由来のタンパク質組成物が挙げられる。酵母抽出物は、当業者に周知の標準的手順により調製され得る。さらに、酵母抽出物は、SigmaおよびQuestを含む多数の供給源から市販されている。大豆由来のタンパク質組成物は、パパインのような標準的酵素を用いて、大豆粉または大豆単離物の酵素的消化によって調製され得る。例えば、N-Zsoyは、大豆単離物の酵素的消化により生成される可溶性タンパク質組成物であり、そしてHysoyは、大豆粉のパパイン消化物である。大豆由来のタンパク質組成物はまた、大豆単離物の酸加水分解により得られ得る。例えば、Amisoyは、大豆単離物の酸加水分解により生成されるアミノ酸およびペプチド供給源である。他の動物由来でないタンパク質性物質は、非哺乳動物源の物質を含むタンパク質の酵素的消化または酸加水分解のいずれかにより得られ得る。本発明の培地における動物由来でないタンパク質性物質は、2つ以上の異なる動物由来でないタンパク質性物質例えば、Hysoy、Amisoy、N-ZsoyおよびSoytoneのような大豆由来のタンパク質性組成物の混合物を含み得る。動物由来のタンパク質性物質には、ウシ胎仔血清FCS、ウシ血清アルブミンBSA、プロテオースペプトン、カザミノ酸、トリプトン、ペプタミン、およびカゼイン加水分解物などのタンパク質組成物が挙げられる。好ましくは、本発明の培地は、乾燥重量で少なくとも20の動物由来でないタンパク質性物質、より好ましくは乾燥重量で少なくとも30の動物由来でないタンパク質性物質、最も好ましくは乾燥重量で少なくとも50の動物由来でないタンパク質性物質を含む。本発明の培地を使用した病原性細菌の培養が、動物由来のタンパク質性物質を含む培地における病原性細菌の培養と比較して、細菌増殖の増加および免疫原性因子の収量の増加をもたらすことが、驚くべきことに見出された。本発明はさらに、免疫原性因子を産生するための病原性細菌の培養のための培地の作製プロセスを提供し、このプロセスは、細菌培養のための標準培地に十分な量の動物由来でないタンパク質性物質を添加する工程を包含し、これは動物由来のタンパク質性物質を含まず、故に、病原性細菌の培養のためのこの培地は、乾燥重量で少なくとも20の動物由来でないタンパク質性物質を含みかつ動物由来のタンパク質性物質を含まない。標準的液体培地の例には、Brucellaブロストリプトンおよびペプタミンなし、Watson培地カザミノ酸なし、MuellerMiller培地心臓注入物およびカゼイン加水分解物なし、CL培地カザミノ酸なし、およびFranzA培地が挙げられる。標準的固体培地は、寒天などの凝固剤の添加により、任意の液体培地から調製され得る。本発明はさらに、任意の前記したおよび病原性細菌の培地を包含する培養を提供する。好ましい病原性細菌には、Helicobacterpylori、Haemophilusinfluenzae、CorynebacteriumdiphtheriaeおよびNeisseriameningitidis、BordetellapertussisおよびClostridiumtetaniが挙げられる。最も好ましくは、病原性細菌はHelicobacterpyloriである。本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、および必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程を包含する。好ましくは、病原性細菌は、本発明の培地において、少なくとも6時間、より好ましくは少なくとも36時間、最も好ましくは少なくとも72時間、免疫原性因子の産生に適した条件下で、培養される。免疫原性因子の産生に適した培養条件培養期間を含むは、培養する細菌に依存して変化する。しかし、当業者は、免疫原性因子の産生に必要な培養条件を、標準的プロトコール例えば、MethodsinMicrobiology,AcademicPressInc.のシリーズ本明細書中で参考として援用されるに記載のプロトコールに従うことによって、そして必要ならば、適切な培養条件を決定するための多くの標準的実験を行うことによって、容易に決定し得る。免疫原性因子は、多数の標準的技術Manetti,R.ら、Infect.Immun.,63,4476-4480,1995本明細書中で参考として援用されるに記載されている技術を含むを用いて、細菌培養物より単離され得る。本発明はまた、病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程を包含するワクチン生成のプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の培地において細菌を培養する工程、必要に応じて培地から免疫原性因子を精製する工程、および必要に応じて毒素化された上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと会合させる工程を包含する。ワクチンを産生するのに適した方法は、Rappuoli,R.,NewandimprovedvaccinesagainstDiphtheriaandTetanus.1990,251-268,NewGenerationofVaccines,G.C.Woodrow,M.MLevine編,MarcelDekkerInc.NewYork本明細書中で参考として援用されるに記載されている。本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、それらを使用するとき、アジュバントの添加を必要とする。適切なアジュバントは、Gupta,R.K.ら、Vaccine,13,1263-1276,1995に記載されている。本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、細菌感染に対して個体をワクチン接種するために使用され得る。ワクチン接種され得る好ましい細菌感染には、B型胃炎、細菌性髄膜炎、ジフテリア、破傷風、および百日咳が挙げられる。本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、上記したように薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバントと混合した本発明のワクチンを含有する薬学的組成物として提供され得る。本発明のプロセスにより調製されるワクチンは、経口または非経口経路静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道エアゾール、直腸および局所的投与を含むにより、投与され得る。経口投与の場合、本発明の化合物は一般的に、錠剤もしくはカプセル剤の形状で、または水性溶液もしくは懸濁液として、提供される。経口使用のための錠剤は、薬学的に受容可能な賦形剤例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤、および保存剤と混合された有効成分ワクチン成分を含み得る。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびに乳酸が挙げられるが、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよび他の周知の試薬を含み得るが、もし存在する場合、滑沢剤は一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望であるならば、錠剤は、消化管における吸収を遅延するために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の物質でコーティングされ得る。経口使用のためのカプセルとしては、有効成分が固体希釈剤と混合される硬質カプセル、および有効成分が水または油例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟質カプセルが挙げられる。筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内の使用について、本発明の化合物は、一般に、適切なpHおよび等張性に緩衝化された、滅菌で水性の溶液または懸濁液中に提供される。適切な水性ビヒクルとしては、リンゲル液および等張性の塩化ナトリウムが挙げられる。本発明に従う水性懸濁液としては、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、およびトラガカントゴムのような懸濁剤、ならびにレシチンのような湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液に適切な保存剤としては、エチルおよびn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。本発明のプロセスによって調製されるワクチンはまた、リポソーム処方物として提供され得る。本発明はまた、以下を提供し得る:項目1免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地であって、上記培地は、少なくとも20乾燥重量の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まない、培地。項目2項目1に記載の培地であって、上記動物由来でないタンパク質性物質は、酵母抽出物および/またはダイズ由来タンパク質組成物である、培地。項目3項目1または項目2に記載の培地であって、上記病原性細菌は、Helicobacterpylori、Haemophilusinfluenzae、Corynebacteriumdiphtheriae、Neisseriameningitidis、Bordetellapertussis、またはClostridiumtetaniである、培地。項目4項目1~3のうちのいずれか1項に記載の培地と、病原性細菌とを含む、培養物。項目5病原性細菌の免疫原性因子を調製するためのプロセスであって、上記細菌を、項目1~3のうちのいずれか1項に記載の培地中で培養する工程、および必要に応じて、上記培地から上記免疫原性因子を精製する工程を包含する、プロセス。項目6ワクチン生成のためのプロセスであって、項目5に記載のプロセスによって病原性細菌の免疫原性因子を調製する工程、および上記因子を薬学的に受容可能なキャリアと結合させる工程を包含し、ここで、上記因子は必要に応じてトキソイド化される、プロセス。項目7免疫原性因子を生成するために病原性細菌を培養するための培地の作製プロセスであって、病原性細菌を培養するための上記培地が、少なくとも20乾燥重量の動物由来でないタンパク質性物質を含み、かつ動物由来のタンパク質性物質を含まないように、充分な動物由来でないタンパク質性物質を、細菌を培養するための動物由来タンパク質性物質を含まない標準培地に添加する工程を包含する、プロセス。本発明は、ここに、以下の実施例および図面を参照して記載される。実施例全ての引用文献は、本明細書中に参考として援用される。実施例IHelicobacterpyloriは、約10年前に単離された湾曲したグラム陰性の微好気性細菌であり、ヒトにおいてB型胃炎と関連する。この細菌は、ヒト胃粘膜にコロニーを形成し、そして胃潰瘍および十二指腸潰瘍を生じ得Blaser、M.J.、1990、J.Infect.Dis.、161、629-633、および胃ガン腫の発症についての危険因子であり得るParsonnet、J.ら1991、NewEngl.J.Med.、325、1127-1131慢性の感染を確立する。長期的には、感染および疾患はワクチン接種によって予防および処置され得る。現在、細菌接着、コロニー形成、および発病力に関与するいくつかの因子が同定されている。疾患に関与する最も興味深い因子のうちの1つは、液胞形成細胞毒VacAであり、これはいくつかの哺乳動物細胞株において大量の液胞形成を引き起こすLeunk、R.D.、1991、Rev.Infect.Dis.、13増刊8、S683-689。液胞はまた、慢性胃炎を伴う患者の胃上皮において観察されているTricottet、V.ら1986、Ultrastruct.Pathol.、10、113-117。このタンパク質は、マウスにおいて潰瘍形成を引き起こすことが示されておりTelford,J.L.ら1994、J.Exp.Med.、179、1653-1658、そしてワクチンの候補である。精製された細胞毒は、細菌培養上清から非常に小量で精製され得る87~94kDのタンパク質である。材料および方法細菌株HelicobacterpyloriCCUG17874株型、CultureCollection、UniversityofGoteborgを使用した。培地および補充物2g/lの2,6-ジ-0-メチル-b-シクロデキストリンCDTeijinLim.Tokyo、Japanおよび20mg/Lのストレプトマイシンを補充した、BrucellaBrothトリプトン10g/l、ペプタミン10g/l、デキストロース1g/l、酵母抽出物2g/l、塩化ナトリウム5g/l、および亜硫酸水素ナトリウム0.1g/lBBDifcoを、比較目的のための液体培地として使用した。BBに存在するトリプトンおよびペプタミンの代わりに、HysoyまたはSoytoneを、10g/Lの濃度で使用した。保存接種物の凍結アリコートを、グリセロール40、胎児ウシ血清FCSHyClone、Logan、Utah20、および0.4CDから構成される溶液で1:2希釈した、2×108CFU/mlのフラスコ培養物から調製した。得られた懸濁液を、3mlバイアル中に分注し、そして-80°Cで保存し、そしてSoytone20でFCSを置換して調製した新規の凍結バイアルとの比較のために、開始凍結バイアルとして使用した。液体培地中での増殖最初の培養を、100mlの液体培地を含有する500mlErlenmeyerフラスコ中で行った。培養物に、3mlの凍結ストックを接種し、そして微好気性環境において、36°Cで36時間、振とうしながら100rpm、2.5cmの偏心距離インキュベートした。フラスコを、嫌気性のジャーの内側におき、ここではBBLCampyPakエンベロープBectonDickinsonを使用して、正確な条件を発生させた。次いで、これらの培養物を使用して、250mlの培地を含有する1000mlのフラスコに接種し、そして上記と同じ条件下でインキュベートし、そしてこれを使用して、バイオリアクターに接種した。培養容器および増殖条件バッチ発酵を、5lの培地を含有する7リットルのバイオリアクターMBRBioreactorsAG、8620Wetzikon、CH中で行った。全ての培養物を、36°Cで増殖した。pH値は制御しなかった。溶存酸素圧力DOTを、2工程手順によって、予め設定したレベル3にて自動的に維持した。先ず、空気流量速度を、0.1から0.5l/l/分まで増加して、培養物の増加するO2要求性を満たした。さらなる増加が必要である場合、純粋なO2を最大0.4l/l/分まで供給することによって得た。最初の12時間の増殖の間、N2およびCO2の一定の流量を、それぞれ、0.2l/l/分および0.02l/l/分に等しく維持した。攪拌速度を、130rpmに維持した。攪拌器シャフトは、直径7cmの2つのRhustonタービンを備え、そしてバイオリアクターの直径は、17cmであった。グルコース供給50グルコース溶液を、時間0で添加して、5g/Lの最終濃度を与えた。5g/Lの別の添加を、ODが2~3の範囲にある場合に行った。バイオマス測定増殖を、水ブランクPerkinElmer35分光光度計、光路1cmに対して、590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度のチェックを、グラム染色によって行った。VacAタンパク質の分析発酵の間の決められた時点で、培養サンプルを、10分間当たり8,300×gで、遠心分離したBiofugeA、Heareus。上清を、トリクロロ酢酸で沈殿し、そしてBioRadMiniProteanII装置を使用して9SDS-Pageに供した。タンパク質を、ニトロセルロースフィルターSchleicherSchuellに移し、次いでVacAタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗血清Telford,J.L.ら1994J.Exp.Med.、179、1653-1658とともに、一晩、インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体Sigmaとの2時間のインキュベーション後、免疫反応性のバンドを、4-クロロ-ナフトール染色によって可視化した。結果BrucellaBrothは、トリプトン10g/l、ペプタミン10g/l、デキストロース1g/l、酵母抽出物2g/l、塩化ナトリウム5g/l、および亜硫酸水素ナトリウム0.1g/lから構成される複合培地である。この培地は、血液誘導体が補充された場合にのみ、H.Pyloriの増殖を支持し得るとして多くの文献において記載されているCover,T.L.およびBlaser,M.J.1992、J.Biol.Chem.、267、10570-10575;Shahamat,M.ら1991、J.Clin.Microbiol.、29、2835-2837;Buck、G.E.およびSmith,J.S.1987、J.Clin.Microbiol.、25、597-599;ならびにMorgan、D.R.ら1987、J.Clin.Microbiol.、25、2123-2125。H.pylori増殖培地の実質的な単純化は、シクロデキストリンが、血液誘導体の代わりに使用され得ることが発見された近年、得られたOlivieri,R.ら、1993、J.Clin.Microbiol.、31、160-162。この単純化培地およびグルコース供給を使用する、H.pyloriの増殖は、図1において報告される。グルコース供給は、炭素およびエネルギー供給源が、常に培地に存在することを確実にするために使用された。H.pyloriを、これらの条件下で培養した場合、培地中のVacAの生成を、上記のように測定した。結果を、図5および図6において示す。増殖培地におけるSoytoneおよびHysoyの使用は、それぞれ、図2および3において報告される結果を与えた。VacA産生は、Soytoneが使用された場合、図5において報告され、そしてHysoyを使用した場合、図6において報告される。結果は、Helicobacterpylori増殖の増殖培地および発酵条件に対する改善、ならびに液胞形成細胞毒VacAの生成における改善を示す。実施例IIHaemophilusinfluenzaeは、子供における細菌性髄膜炎の主要な原因である、小さな非運動性のグラム陰性菌である。これらの微生物は主に、毒素産生性ではなく、侵襲性である。これらは、呼吸管の居住者であり共生性および病原性、そしてこれらは、抗食作用性の多糖カプセルを有する。材料および方法細菌株HaemophilusinfluenzaeBATCC10211。培地および補充物培地の調製は、以下のように異なる溶液の使用を含む:FranzA培地調製成分1リットル当たりの量精製水800mLグルタミン酸1.6g/-0.01gNa2HPO412H2O5.03g/-0.05gKCl0.892/-0.008gNaCl6.005g/-0.06gNH4Cl1.25g/-0.01g精製水1.0リットルに十分な量3NNaOHpH=8.2に必要なだけ上述の成分を、混合しながら溶解する。3NNaOHを、溶液のpHをpH=8.2にするために使用する。限外濾過されたSoytone調製成分1リットル当たりの量Soytone33.3g/-0.03g精製水1.0リットルに十分な量この溶液を、30kDTFF装置を介して限外濾過した。限外濾過されたプロテオースペプトン成分1リットル当たりの量プロテオースペプトン33.3/-0.03g精製水1.0リットルに十分な量この溶液を、30kDTFF装置を介して限外濾過した。限外濾過されたYE調製成分1リットル当たりの量酵母抽出物100g/-0.02g精製水1.0リットルに十分な量使用した酵母抽出物は、Questから入手可能なHYEASTであった。この溶液を、10kDTFF装置を介して限外濾過した。50グルコース溶液成分1リットル当たりの量グルコース無水500g/-5g精製水1.0リットルに十分な量。NAD0.1溶液成分1リットル当たりの量NAD1.0g/-0.005gTRIS1.21g/-0.01g精製水1.0リットルに十分な量HCl37pH7.4±0.2に必要なだけ。ヘミン0.4溶液成分1リットル当たりの量ヘミン4g/-0.02g0.2NNaOH1.0リットルに十分な量使用するヘミンは、好ましくは、化学的に合成される。化学的に合成されたヘミンは、Flukaから市販されている。550mlのFranzAを、450mlの限外濾過したSoytoneまたはプロテオースペプトンと混合して、1リットルのHib基本培地を得、これを、121°Cで30分間、オートクレーブすることによって、滅菌した。冷却後、濾過によって滅菌した、10ml/Lグルコース溶液、20ml/LのYE、2ml/LのNAD溶液を、添加し上記の付加を伴って、そしてこの培地をHib完全培地と呼んだ。液体培地中での増殖暖める前の、非整流unbaffeled振とうフラスコ500/150に、1.0mLのそれぞれの有効なworkingストックバイアルを接種した。振とうフラスコを、35/-1°Cで、150RPMにて6時間、1インチの偏心距離インキュベーター-振とう器に置いた。6時間後、振とうフラスコの適切な量を、0.5Lの暖める前のHib完全培地を含有する1つの2リットルの非整流振とうフラスコに移した。振とうフラスコを、35/-1°Cで、200rpmにて、9時間、1インチの偏心距離インキュベーター-振とう器に置き、次いで、内容物を滅菌接種に移し、次いで、接種物を発酵器に移した。培養容器および増殖条件バッチ発酵を、20lの培地を含有する30リットルバイオリアクターMBRBioreactorsAG、8620Wetzikon、CHにおいて行った。培養物は、35°Cおよび2psiの背圧で増殖した。pHを、3NNaOHで7.3に制御した。最初の攪拌速度を、最小の150rpmに設定し、そして最低通気を10L/分に設定した。DOTを、150~400の範囲にrpmを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって35に維持した。。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約2g/Lであった場合、0.2リットルのグルコース溶液を添加した。バイオマス測定。増殖を、水ブランクPerkinElmer35分光光度計、1cmの光路に対する590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。HibPSの分析。この分析を、Weeke,B.,Scand.J.Immunol.2、37-46、1973本明細書中に参考として援用されるによって記載されるように、Rocket免疫電気泳動によって行った。結果Soytoneを用いて得られた増殖曲線、およびプロテオースペプトンを用いて得られた増殖曲線を、図7において比較する。HibPSの収量は、Soytoneおよびプロテオースペプトンを含有する培地において、それぞれ、600mg/Lおよび150mg/Lであった。増殖曲線は、2つの培地を使用してかなり類似するが、Soytoneを使用するHibPSの収量は4倍増加する。植物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用は、動物由来のタンパク質性物質を含有する培養培地の使用に比較して、HibPSのような多糖の収量増加を導く。実施例IIIC.diphtheriaeは、グラム陽性の、桿体様の微生物であり、柵をまとっている。バクテリオファージによるC.diphtheriae溶原化は、強力な毒素の合成を引き起こし、この発現は、鉄濃度によって調節される。材料および方法細菌株C.diphtheriaeCN2000。培地および補充物培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む:A.限外濾過された酵母抽出物YEおよびカザミノ酸CAA成分量g/L精製水800ml酵母抽出物20g/Lカザミノ酸10g/L精製水1.0リットルに十分な量この溶液を、10kDTFF装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化deferration容器に添加した。A.A限外濾過された酵母抽出物YEおよびSoytone成分量g/L精製水800ml酵母抽出物20g/LSoytone10g/L精製水1.0リットルに十分な量この溶液を、10kDTFF装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱酸素塩容器に添加した。A.B限外濾過された酵母抽出物成分量g/L精製水800ml酵母抽出物30g/L精製水1.0リットルに十分な量この溶液を、10kDTFF装置を介して限外濾過し、そして透過物を、脱鉄酸塩化容器に添加した。A.1脱鉄酸塩化以下の成分を、攪拌容器に導入した成分量UFYECAA溶液1LKH2PO45g/LCaCl2-2H2O、50w/v2mL/LL-トリプトファン、1w/v5mL/L0.05g/L3NNaOHpH7.4に補正するために十分な量UFは、溶液が限外濾過されることを示す。攪拌しながら、溶液を100°Cに加熱する。100°Cで1分間保持し、次いで、37°Cに培地を冷却する。濾過は、一旦37°Cを下回ると開始し得る。濾過後、培地を、CAAを含有するCYベース培地として記載する。A.1.A脱鉄酸塩化以下の成分を、攪拌容器に導入する成分量UFYESoytone溶液1LKH2PO45g/LCaCl2-2H2O、50w/v2mL/LL-トリプトファン、1w/v5mL/L0.05g/L3NNaOHpH7.4に補正するために十分な量。攪拌しながら、溶液を100°Cに加熱する。100°Cで1分間保持し、次いで、37°Cに培地を冷却する。濾過は、一旦37°Cを下回ると開始し得る。濾過後、培地を、Soytoneを含有するCYベース培地として記載する。A.1.B脱鉄酸塩化以下の成分を、攪拌容器に導入する成分量UFYE溶液1LKH2PO45g/LCaCl2-2H2O、50w/v2mL/LL-トリプトファン、1w/v5mL/L0.05g/L3NNaOHpH7.4に補正するために十分な量。攪拌しながら、溶液を100°Cに加熱する。100°Cで1分間保持し、次いで、37°Cに培地を冷却する。濾過は、一旦37°Cを下回ると開始し得る。濾過後、培地を、YEのみを含有するCYベース培地として記載する。B.補充物溶液B1溶液A成分1リットル当たりの量MgSO4-7H2O225gβ-アラニン1.15gニコチン酸1.15gピメリン酸0.075gCuSO40.50gZnSO4-7H2O0.40gMnCl2-4H2O0.15gHCl、3730mL精製水1.0リットルに十分な量。B2溶液B成分1リットル当たりの量精製水800mLL-シスチン200gHCl、37200mL。溶液を、個々に10分間、混合する。溶解後、20mLの溶液Aおよび10mLの溶液Bを混合し、そして0.2ミクロンのフィルターを介して濾過する。溶液を、光から覆って、4°Cで保存する。フラスコ滅菌化一旦脱鉄酸塩化したら、濾過した培地A.1またはA.1.AまたはA.1.Bを、フラスコにロードする。フラスコを、25分間、121°Cで滅菌する。滅菌後の調整1.50マルトースを添加する30ml/L2.補充物を添加する3.0ml/L上述の12を含有する培地:CAAまたはSoytoneまたは酵母のみを含有する完全CY培地。液体培地中での増殖各100mlの培地を含有する500mlの非整流振とうフラスコに、1.0mLの有効なストックバイアルを接種する。振とうフラスコを、1インチの偏心距離インキュベーター-振とう器に、35/-1°Cで、100rpmにて、5時間、置く。5時間後、攪拌を、250rpm、43時間に増加する。プロセスは、2つの異なる相を有する:1指数関数的な増殖、および2産生相。2つの相からの移行は、徐々におこり、そして細胞増殖速度および酸素要求性の減少によって記される。バイオマス測定増殖を、水ブランクPerkinElmer35分光光度計、1cmの光路に対する590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。結果48時間のインキュベーション後、フラスコ中のODおよびLf/mlは以下のとおりであった:CAAを含有する培地OD=7.5Lf/ml=50Soytoneを含有する培地OD=7.87Lf/ml=60YEのみを含有する培地OD=8.07Lf/ml=60。実施例IVNeisseriameningitidisは、非運動性のグラム陰性球菌であり、最もしばしば、対で増殖するが、必要に応じて、四分子およびクラスターで増殖する。これらは、血清群についての基準である抗食作用性の多糖カプセルを有する。材料および方法細菌株Neisseriameningitidis.C11。培地および補充物培地の調製は、以下のような異なる溶液の使用を含む:Franz培地調製。接種振とうフラスコ培地調製成分1リットル当たりの量精製水800mLグルタミン酸1.6gNa2HPO42H2O15.5gKCl0.09gNH4Cl1.25g精製水1リットルに十分な量3NNaOHpH=7.6について必要とされるように。上述の成分を混合しながら溶解する。121°Cで、30分間、オートクレーブすることによって、滅菌する。冷却後、50グルコースおよびMenC補充物を、以下のように添加する。50グルコース10mL/L/-0.3mLMenC発酵補充物20mL/L/-0.3mLグルコースおよび補充物溶液の添加を伴って、培地はFranz完全培地と呼ばれ得る。20L発酵器の調製A.CAAを含有する20LのWatsonベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。成分1リットル当たりの量精製水800mLグルタミン酸1g/-0.01gNa2HPO42H2O3.25g/-0.03gKCl0.09g/-0.001gカザミノ酸10g/-0.1g精製水1リットルに十分な量3NNaOHpH=7.6に必要なだけ。A.AAmisoyを含有する20LのWatsonベース培地を作製するために、以下の成分が、混合容器に導入され、そして溶解されなければならない。成分1リットル当たりの量精製水800mLグルタミン酸1g/-0.01gNa2HPO42H2O3.25g/-0.03gKCl0.09g/-0.001gAmisoy10g/-0.1g精製水1リットルに十分な量3NNaOHpH=7.6に必要なだけ。B.発酵器滅菌25分間、121°Cで発酵器を滅菌する。滅菌後、以下の条件を設定する:温度、35°C;10L/分での通気;150rpmでの攪拌、および0.2バールでの背圧。発酵器を35°Cに冷却した後、pHを測定するためのサンプルを採取し、発酵器のpHプローブ校正を調整し、次いで、培地のpHを7.6に調整する。C.滅菌後の調整1.50グルコースを添加する10ml/L2.MenC補充物を添加する20ml/L上述の12を含有する培地:Watson完全培地。A.50グルコース溶液成分1リットル当たりの量グルコース無水物500g/-5g精製水1リットルに十分な量この溶液を、121°Cで30分間、オートクレーブすることによって滅菌する。B.MenC補充物溶液B.1限外濾過されたYE成分量精製水1Lに十分な量酵母抽出物125g/Lこの溶液を、10kDTFF装置を介して限外濾過する。保持物を、必要な透過物が回収された後に廃棄し、そして透過物を補充物を含有する容器に添加する。B.2成分UFYEの1リットル当たりの量MgSO4-7H2O30g/-0.5gL-システイン-HCl1.5g/-0.2g1LのUFYEに化学物質を添加し、10分間混合し、0.2ミクロンフィルターを介して濾過滅菌し、そして発酵器に移す。C.3NNaOH3NNaOH=12w/vNaOH=120g/LNaOH。D.泡止め剤使用する泡止め剤は、DowCorning1510である。これを、121°Cで30分間、オートクレーブすることによって滅菌する。液体培地中での増殖500ミリリットルフラスコに、1.0mLの有効なストックバイアルを接種する。振とうフラスコは、150mLの完全Franz培地を含む。接種した振とうフラスコを、35/-1°Cで150rpmの1インチの偏心距離インキュベーター-振とう器に置く。10時間後、フラスコを、無菌にサンプリングする。光学密度は、590nmで1.3~3.3の間にあるべきであり、その場合、4つの2L振とうフラスコに、それぞれ、150mL振とうフラスコからの適切な容量を接種する。各2L振とうフラスコは、0.2Lの暖める前のFranz完全培地を含む。振とうフラスコを、35/-1°Cで、200rpmの1インチの偏心距離インキュベーター-振とう器に置く。10時間後、各振とうフラスコの内容物を、滅菌接種に移し、そして発酵器に接種する。培養容器および増殖条件バッチ発酵を、20Lの培地を含有する30リットルのバイオリアクターMBRBioreactorsAG、8620Wetzikon、CH中で行った。培養物は、35°Cおよび14×103N/m22psi背圧で増殖していた。pHを、3NNaOHで7.3に制御した。最初の攪拌速度を、最小の150rpmに設定し、そして最低通気を、10L/分に設定した。DOTを、150~400の範囲にrpmを制御し、次いで、必要であれば、酸素を補充することによって35に維持した。泡止め剤を、泡立ちを制御するために手動で添加した。グルコースの残余の濃度を検出し、そしてこれが約2g/Lであった場合、0.2リットルのグルコース溶液を添加した。バイオマス測定増殖を、水ブランクPerkinElmer35分光光度計、1cmの光路に対する590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。MenCPSの分析多糖の定量的評価を、LarsSvennerholmによって、BiochimicaandBiophysicaActa1957、21、610において報告された方法に従って、シアル酸含量を分析することによって行った。結果Amisoyを用いて得られた増殖曲線、およびカザミノ酸を用いて得られた増殖曲線を、図8において比較する。MenCPSの収量は、Amisoyおよびカザミノ酸を含有する培地において、それぞれ、307mg/Lおよび345mg/Lであった。増殖曲線およびPS産生は、2つの培地を使用してかなり類似する。本発明が、例示の手段としてのみ上記され、そしてび改変が、添付の請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内でなされる得ることが理解される。実施例VClostridiumtetaniは、2μm長、および0.3~0.5μm幅である細長い桿菌である。これはしばしば、より長い微細線維様の細胞の形態で存在する。胞子が形成される場合、この桿菌は、特徴的なドラムスティックの外見をとる。これは、運動性の生物体であり、グラム陽性であるが、そのグラム染色は、変化し得るか、または老化した培養物においては陰性でさえある。Clostridiumtetaniは、厳密に嫌気性であり、そして2つの外毒素を生成する。これらのうちの1つの、テタノスパスミンtetanospasminは、疾患の臨床像全体を担う神経毒である。材料および方法細菌株ClostridiumtetaniHarvaryY-VI-3。培地種培養物を、g/Lで表わされる、以下に報告される培地を使用して調製した。成分量g/LN-ZSoy15.0グルコース5.5酵母抽出物5.0NaCl2.5L-システイン0.5ナトリウムチオグリコール酸0.5寒天0.75PH=7.1。産生培地を、WHO/VSQ/GEN/941990において記載されるMueller-Miller培地の改変として調製した。この培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液が使用されているが、g/Lで表わされる、以下に報告される改変培地においては、ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液の代わりにHysoyおよびSoytoneを使用した:成分量g/Lグルコース-H2O12.1NaCl2.5Na2HPO4-12H2O2.5KH2PO40.15MgSO4-7H2O0.15アミノ酸溶液17.5mlビタミン溶液4.2mlNaOH5M4.0mlFeSO4-7H2O1溶液4.0mlSoy誘導体20.0PH=7.3120°Cで20分間、オートクレーブすることによって滅菌する。アミノ酸溶液成分L-チロシン28.51g/Lウラシル0.142g/LL-システイン14.25g/LHCl37131.6ml/L。ビタミン溶液:成分パントテン酸CaCapantithenate238.1mg/Lチアミン59.7mg/Lピリドキシン59.7mg/Lリボフラビン59.7mg/Lビオチン0.73mg/Lエタノール256.4ml/L。液体培地中での増殖15mlの種培地を含有する、2つの25mlチューブに、0.5mlの有効な種バイアルのそれぞれを接種し、そして35°Cで、29時間、嫌気性ジャーにおいてインキュベートし、ここでは、Gas生成キットOXOIDを使用した。第2の一連のチューブに、1.5mlの第1のチューブを接種し、そして上記の同じ条件で、24時間、インキュベートした。これらの培養物の7mlを使用して、75mlの同じ培地を含有する100mlチューブに接種した。これらのチューブを、上記と同じ条件で、24時間、インキュベートした。これらのチューブの全内容物を使用して、2500mlの産生培地を含有する5000mlビーカーに接種した。バイオマス測定増殖を、水ブランクPharmacia分光光度計、1cmの光路に対する590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。結果186時間のインキュベーション後、ビーカー中のODおよびLf/mlは以下のとおりであった:Hysoyを含有する培地OD=1.08Lf/ml=60Soytoneを含有する培地OD=0.74Lf/ml=60ウシ心臓注入液およびカゼイン溶液を含有する培地OD=1.236Lf/ml=60。実施例VIBordetellapertussisは、約0.5μmの直径および0.5~2μmの長さのグラム陰性球状桿菌である。その栄養要求性は、単純であり、そしてこれは、糖を必要としない。これは、脂肪酸に極めて感受性であり、防御因子がないと生存は不十分である。材料および方法細菌株Bordetellapertussis9K/129GPizza,M.ら1989Science、246、497-500。培地種培養物および産生培養物を、g/Lで表わされる、以下に報告されるCL培地Imaizumi,A.ら1983InfectionandImmunity、413、1138-1143を使用して調製した:成分量g/LL-グルタミン酸ナトリウム10.7L-プロリン0.24NaCl2.5KH2PO40.5KCl0.2MgCl2-6H2O0.1CaCl20.02Tris6.1L-システイン0.04FeSO4-7H2O0.01ナイアシン0.004還元型グルタチオン0.15アスコルビン酸0.4カザミノ酸10.0ジメチル-B-シクロデキストリン1.0PHを、HClで7.6に調整する濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブした培地に無菌的に添加する。改変培地は、カザミノ酸の代わりに10g/lのN-ZSoyを含んだ。液体培地中での増殖各100mlのCL培地または改変培地を含有する500mlの非整流振とうフラスコに、3.0mLの有効なストックバイアルを接種した。振とうフラスコを、35/-1°Cで、100RPMにて、12時間、1の偏心距離インキュベーター-振とう器に置いた。12時間後、攪拌を、さらに16時間、250RPMに増加した。バイオマス測定増殖を、水ブランクPharmacia分光光度計、1cmの光路に対する590nmでの光学密度によってモニターした。サンプルの純度チェックを、グラム染色によって行った。PTの分析この分析を、ELISANencioni,L.ら1990Infect.Immun.、58、1306-1315によって行った。結果28時間のインキュベーション後、フラスコ中のODおよびPTmg/Lは、以下のとおりであった:CAAを含有する培地OD=2.31PT=2.4mg/LNZ-Soyを含有する培地OD=1.99PT=2.25mg/L。"