a第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチド、b第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびにc第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているssLDNAリンカーを含む複合体。a標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、b結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているssLDNAリンカー、ならびにcssLDNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を含む複合体。ssLDNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。ssLDNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含むことを特徴とする、請求項1記載の複合体。ポリペプチドが一価抗体または一価抗体断片であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。第1および第2のポリペプチドが、同じ標的に結合し、かつ同じ標的上の重複しないエピトープに結合することを特徴とする、請求項5記載の複合体。結合対のメンバーが、ロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイジング核酸配列からなる群より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。非共有結合複合体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。エフェクター成分が、結合成分、標識成分、および生物学的に活性な成分からなる群より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。第1のポリペプチドが抗HER2抗体2C4のFAB断片であり、第2のポリペプチドが抗HER2抗体4D5のFAB断片であり、結合対のメンバーがハイブリダイジング核酸であり、かつssLDNAリンカーが60~100個のLDNAヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。第1の結合対の第1および第2のメンバーが、SEQIDNO05およびSEQIDNO08の核酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。第2の結合対の第1および第2のメンバーが、SEQIDNO06およびSEQIDNO07の核酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。以下の構成成分a標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、b結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、ならびにcポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階a標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドと、ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分とをそれぞれ合成する段階、b第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびにc合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチドポリヌクレオチド複合体を形成させる段階を含む前記方法。以下の構成成分a第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチド、b第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびにc第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを含む複合体を生成する方法であって、以下の段階a第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチドと、第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチドとをそれぞれ合成する段階、ならびにb第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびにc合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチドポリヌクレオチド複合体を形成させる段階を含む前記方法。請求項1~12のいずれか一項記載の複合体と、任意で薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。医薬として用いるための、請求項1~12のいずれか一項記載の複合体。請求項1~12のいずれか一項記載の複合体の、医薬の製造における使用。発明の詳細な説明一般式XまたはXの複合体が本明細書において報告され、式中、AおよびBは各々、標的に特異的に結合するポリペプチドを表し、ここでAはBの結合に干渉せず、式中、aaおよびbbは各々、第1のメンバーおよび第2のメンバーからなる結合対を表し、ここでaおよびaは、bとbの結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、式中、Sは長さが少なくとも1nmのポリヌクレオチドリンカーであり、式中、Xは、a、a、b、b、またはSのうちの少なくとも1つに結合しているエフェクター成分を示し、式中、nは、複合体中のエフェクター成分の数を示す整数であり、式中、は共有結合を表し、式中、は非共有結合を表し、かつ式中、aSbは6nm~100nmの長さを有する。本明細書において用いられる用語および表現1つのおよび1つのという冠詞は、該冠詞の文法的対象の1つをまたは2つ以上をいうように本明細書において用いられる。例として、1つの抗体は1種の抗体または2種以上の抗体を意味する。アクセプタヒトフレームワークは、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメインフレームワークまたは重鎖可変ドメインフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプタヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変化の数は10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、4個もしくはそれ未満、3個もしくはそれ未満、または2個もしくはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプタヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。親和性という用語は、分子の単一の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合性相互作用の合計の強度を意味する。別段の指示がない限り、本明細書において用いられる場合、結合親和性は、結合対のメンバー間の11の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。分子XのそのパートナーYに対する親和性は一般に、解離定数によって表すことができる。親和性は、表面プラズモン共鳴のような、および同様に本明細書において報告されるものを含めた、当技術分野において公知の共通の方法によって測定することができる。親和性成熟抗体は、1つまたは複数の超可変領域における1つまたは複数の改変であって、そのような改変を保有していない親抗体と比べて、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすそのような改変を有する抗体をいう。ケージ化という用語は、血清および体液中で制御された半減期を有する保護基によってエフェクターが保護されることを意味する。保護基は内因性酵素によって酵素的に切断することができる。保護基は、アスコルビン酸のような、注入によって外部から投与されまたは経口的に与えられる第2のエフェクターによって除去され、切断され、分解され、酵素的に消化されまたは代謝されうる。ケージ化エフェクター分子は、体液中で天然に存在している酵素によって活性化されうる。ケージ化エフェクター分子は、アスコルビン酸のような、体液中に同様に存在している還元剤によって活性化されうる。エフェクター成分という用語は、活性が細胞に送達されおよびまたは細胞に局在することが望まれる任意の分子または分子の組み合わせを意味する。エフェクター成分は、標識、細胞毒素、酵素、成長因子、転写因子、薬物、放射性核種、リガンド、抗体、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどを含むが、これらに限定されることはない。HER2という用語は、別段の指示がない限り、霊長類およびげっ歯類のような哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然HER2をいう。この用語は、全長の、プロセッシングされていないHER2、および細胞中でのプロセッシングから生じる任意のHER2形態を包含する。この用語はまた、天然に存在するHER2バリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントを包含する。ヒトHER2タンパク質は、例えば、SembaKetalProcNatlAcadSciUSA8264976501およびYamamotoTetalNature319230234ならびにGenBankアクセッション番号X03363に報告されている。例示的なHER2のアミノ酸配列は、SEQIDNO20に示されている。抗HER2抗体およびHER2に結合する抗体という用語は、HER2を標的とするうえでの診断剤およびまたは治療剤として有用であるような十分な親和性でHER2と結合することができる抗体をいう。1つの態様において、関係のない非HER2タンパク質との抗HER2抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ法によって測定した場合にHER2と抗体との結合の約10未満である。特定の態様において、HER2に結合する抗体は、108Mまたはそれ未満の解離定数を有する。HudziakRMら11651172は、ヒト乳房腫瘍細胞株SKBR3を用いて特徴付けられた抗HER2抗体のパネルの作製について記述している。この抗体への曝露後のSKBR3細胞の相対的な細胞増殖が、72時間後の単層のクリスタルバイオレット染色によって判定された。このアッセイ法を用いて、細胞増殖を56阻害した4D5と呼ばれる抗体により最大阻害が得られた。パネルにおける他の抗体は、このアッセイ法においてそれほどではないにせよ細胞増殖を低減した。抗体4D5は、TNFαの細胞傷害効果に対する、HER2を過剰発現している乳房腫瘍細胞株の感受性を増加させることがさらに分かった。HudziakRMらに論じられている抗HER2抗体は、FendlyBMら15501558、KottsCEら59A、SarupJCら7282、ShepardHMら117127、KumarRら979986、LewisGDら255263、PietrasRJら18291838、VitettaESら53015309、SliwkowskiMXら1466114665、ScottGKら1430014305、DsouzaBら72027206、LewisGDら14571465、およびSchaeferGら13851394においてさらに特徴付けられている。マウス抗HER2抗体4D5の組換えヒト化型、US5821337参照は、広範な事前の抗がん療法を受けたHER2過剰発現性の転移性乳がんを有する患者において臨床的に有効である737744。ヒト化抗HER2抗体には、参照により本明細書に明示的に組み入れられるUS5821337の表3に記述のhuMAb4D51、huMAb4D52、huMAb4D53、huMAb4D54、huMAb4D55、huMAb4D56、huMAb4D57およびhuMAb4D58参照により本明細書に明示的に組み入れられる、WO9321319に記述のヒト化520C9およびWO01000245に記述のヒト化2C4抗体が含まれる。抗HER2抗体4D5は、SEQIDNO26のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVHCDR1はSEQIDNO27のアミノ酸配列を有し、VHCDR2はSEQIDNO28のアミノ酸配列を有し、かつVHCDR3はSEQIDNO29のアミノ酸配列を有する。抗HER2抗体4D5は、SEQIDNO30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVLCDR1はSEQIDNO31のアミノ酸配列を有し、VLCDR2はSEQIDNO32のアミノ酸配列を有し、かつVLCDR3はSEQIDNO33のアミノ酸配列を有する。さまざまな特性を有する他の抗HER2抗体がTagliabueEら933937、McKenzieSJら543548、MaierLAら53615369、BacusSSら350362、Stancovskiら86918695、BacusSSら25802589、XuFら401408、WO9400136、KasprzykPGら27712776、HandcockMCら45754580、ShawverLKら13671373、ArteagaCLら37583765、HarwerthIMら1516015167、US5783186、およびKlapperLNら20992109に記述されている。相同性スクリーニングの結果、2つの他のHERファミリーのメンバーであるHER391939197およびHER417461750、PlowmanGDetalNature366473475が特定された。これらの受容体の両方が、少なくとも一部の乳がん細胞株において発現の増大を見せる。HER受容体は一般に、細胞においてさまざまな組み合わせで見出され、ヘテロ二量体化が種々のHERリガンドに対する細胞反応の多様性を高めるものと考えられる115132。上皮成長因子受容体は、6種の異なるリガンドである、上皮成長因子、形質転換成長因子α、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子、βセルリン、およびエピレグリンによって結合される235257。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーは、HER3およびHER4に対するリガンドである。ヘレグリンファミリーには、α、βおよびγヘレグリン12051210、US5641869、SchaeferGetalOncogene1513851394、neu分化因子、グリア成長因子、アセチルコリン受容体誘導因子、ならびに感覚運動神経由来因子が含まれる235257、LemkeGMolCellNeurosci7247262、LeeDCetalPharmRev475185を参照のこと。最近になって、3種のさらなるHERリガンドである、HER3またはHER4のいずれかと結合するとされているニューレグリン2509512、CarrawayKLetalNature387512516、HER4と結合するニューレグリン395629567、およびHER4と結合するニューレグリン426812689が特定された。HBEGF、βセルリン、およびエピレグリンもHER4に結合する。EGFおよびTGFαはHER2と結合しないが、EGFはEGFRを刺激して、HER2とヘテロ二量体を形成し、これによってヘテロ二量体においてEGFRによるHER2のトランスリン酸化およびその逆も引き起こされる。同様に、HER3がHER2と共発現される場合、活性なシグナル伝達複合体が形成されるが、HER2に対する抗体は、この複合体を破壊することができる1466114665。さらに、ヘレグリンに対するHER3の親和性は、HER2と共発現される場合に、いっそう高い親和性状態に増大される13291340、MorrisseyTKetalProcNatlAcadSciUSA9214311435、LewisGDetalCancerRes5614571465を参照のこと。HER4は、HER3のように、HER2と活性なシグナル伝達複合体を形成する58。HER抗体に関連する特許公報は、を含む。1つの態様において、本明細書において報告される複合体は、HER二量体化阻害剤であり、EGFR、またはHER3、またはHER4とHER2とのヘテロ二量体化を阻害する。1つの態様において、複合体は、HER二量体化阻害剤であり、抗HER2抗体4D5およびまたは抗HER2抗体2C4の断片を含む。本明細書において抗体2C4および特にそのヒト化変種ManassassVAUSAに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるは、HER2の細胞外ドメイン中の領域の領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基に結合する、抗体である。ヒト化2C4抗体の例は、WO0100245の実施例3に提供されている。ヒト化抗HER2抗体2C4はペルツズマブとも呼ばれる。ペルツズマブは、HER二量体化阻害剤として公知の新しいクラスの薬剤の最初のものである。ペルツズマブはその二量体化ドメインでHER2に結合し、それによって、活性な二量体受容体複合体を形成するその能力を阻害し、かくして細胞増殖および分裂を最終的には引き起こす下流のシグナルカスケードをブロックする317328を参照のこと。ペルツズマブは、HER2の細胞外ドメインに対する完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ヒト上皮細胞上のHER2へのペルツズマブの結合によって、HER2がHERファミリーの他のメンバーと複合体を形成することが、おそらくはHER2ホモ二量体化も、阻止される。複合体形成をブロックすることにより、ペルツズマブはHER1、HER3およびHER4のリガンドにより活性化された増殖刺激作用および細胞生存シグナルを阻止する。ペルツズマブはヒトIgG1フレームワーク配列に基づいた完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブの構造は2本の重鎖および2本の軽鎖からなる。トラスツズマブと比べて、ペルツズマブは軽鎖において12アミノ酸の相違、およびIgG1重鎖において29アミノ酸の相違を有する。抗HER2抗体2C4は、SEQIDNO34のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVHCDR1はSEQIDNO35のアミノ酸配列を有し、VHCDR2はSEQIDNO36のアミノ酸配列を有し、かつVHCDR3はSEQIDNO37のアミノ酸配列を有する。抗HER2抗体2C4は、SEQIDNO38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVLCDR1はSEQIDNO39のアミノ酸配列を有し、VLCDR2はSEQIDNO40のアミノ酸配列を有し、かつVLCDR3はSEQIDNO41のアミノ酸配列を有する。トラスツズマブは、腫瘍がHER2を過剰発現する、またはHER2遺伝子増幅を有する転移性乳がんを有する患者の処置のためにその転移性疾患に対する少なくとも2つの化学療法レジメンを受けた患者の処置のための単剤療法として以前の化学療法は、少なくともアントラサイクリンおよびタキサンを含んでいたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くがホルモン受容体陽性の患者はまた、ホルモン療法を受けたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くが、その転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けて、およびアントラサイクリンが適していない者に向けてパクリタキセルとの組み合わせで、ならびにその転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けてドセタキセルとの組み合わせで適応される。当技術分野において、Herceptinトラスツズマブによる乳がん患者の処置は、例えば、HER2陽性疾患を有する患者に対して推奨され慣用されている。HER2陽性疾患は、免疫組織化学法によって検出される高いHER2発現レベルもしくはHER2遺伝子増幅またはその両方が、乳房組織生検もしくは乳房組織の切除などの、患者から得られるサンプルにおいて、または転移部位に由来する組織において見出されるなら、存在する。エピトープ2C4は、抗HER2抗体2C4が結合するErbB2の細胞外ドメイン中の領域である。2C4エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、AntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryEdHarlowandDavidLaneに記述されているものなどの、慣用的な交差ブロッキングアッセイ法を行うことができる。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がErbB2の2C4エピトープの領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基に結合するかどうかを評価することもできる。エピトープ4D5は、抗HER2抗体4D5が結合するErbB2の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはErbB2の膜貫通ドメインに近接している。4D5エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、AntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryEdHarlowandDavidLaneに記述されているものなどの、慣用的な交差ブロッキングアッセイ法を行うことができる。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がErbB2の4D5エピトープの領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基に結合するかどうかを評価することもできる。ErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体は、そのような活性化を低減または阻止するものであり、ここで該抗体はモノクローナル抗体4D5よりもかなり効果的に、例えば、モノクローナル抗体7F3もしくは2C4またはそのFAB断片とほぼ同じくらい効果的に、およびとりわけ、モノクローナル抗体2C4またはそのFAB断片とほぼ同じくらい効果的にErbB受容体のリガンド活性化をブロックすることができる。例えば、ErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体は、ErbBヘテロオリゴマーの形成のブロッキングで4D5よりも約50~100効果的であるものでありうる。ErbB受容体のリガンド活性化のブロッキングは任意の手段によって、例えば、ErbB受容体へのリガンドの結合に干渉する、ErbB複合体形成に干渉する、ErbB複合体におけるErbB受容体のチロシンキナーゼ活性に干渉する、およびまたはErbB受容体におけるもしくはErbB受容体によるチロシンキナーゼ残基のリン酸化に干渉することによって、行うことができる。ErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体の例としては、モノクローナル抗体2C4および7F3、ならびにL26、L96およびL288抗体20992109が挙げられる。ErbBヘテロオリゴマーは、少なくとも2種の異なるErbB受容体を含む非共有結合したオリゴマーを意味する。そのような複合体は、2種またはそれ以上のErbB受容体を発現している細胞がErbBリガンドに曝露される場合に生じ得、例えば、SliwkowskiMXetalJBiolChem2691466114665に記述されているように免疫沈降により単離され、SDSPAGEにより分析されうる。そのようなErbBヘテロオリゴマーの例としては、EGFRErbB2、ErbB2ErbB3およびErbB3ErbB4複合体が挙げられる。さらに、ErbBヘテロオリゴマーはErbB3、ErbB4またはEGFRのような、異なるErbB受容体と組み合わせた、2つまたはそれ以上のErbB2受容体を含みうる。サイトカイン受容体サブユニットのような、他のタンパク質がヘテロオリゴマーに含まれることもある。ErbB受容体のリガンド活性化とは、関心対象のErbB受容体を含むErbBヘテロオリゴマーへのErbBリガンドの結合によって媒介されるシグナル伝達を意味する。一般的に、これにはErbBヘテロオリゴマーへのErbBリガンドの結合が含まれ、これによってヘテロオリゴマーにおけるErbB受容体の1つまたは複数のキナーゼドメインが活性化され、その結果、ErbB受容体の1つもしくは複数におけるチロシン残基のリン酸化、およびまたはさらなる基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化が引き起こされる。ErbB受容体活性化は、さまざまなチロシンリン酸化アッセイ法を用いて定量することができる。本明細書において抗体という用語は、その最も広い意味で用いられ、所望とされる抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体および抗体断片を含むがこれらに限定されない、さまざまな抗体構造を包含する。抗体断片という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する完全抗体または全長抗体の断片を意味する。抗体断片の例としてはFv、FAB、FAB、FABSH、F2ダイアボディ直鎖状抗体一本鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されることはない。特定の抗体断片の概説については、HudsonPJetalNatMed9129134を参照されたい。さらに詳細には、抗体断片という用語のなかに包含されるのは、FAB断片、すなわち、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価抗体断片2断片の考察については、US5869046を参照のこと、F2断片、すなわち、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された2つのFAB断片を含む二価断片、VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片pp269315、WO9316185、US5571894、US5587458を参照のこと、VHドメインからなるdAb断片544546を参照のこと、ならびに単離された相補性決定領域である。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用い、VLおよびVH領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、つなぎ合わせることができるとして公知、例えば、BirdREetalScience242423426HustonJSetalProcNatlAcadSciUSA8558795883を参照のこと。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を用いて得ることができ、インタクトな抗体と同じようにその結合特性についてスクリーニングすることができる。参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、競合アッセイ法において、50またはそれ以上で、参照抗体とその抗原との結合をブロックする抗体をいい、逆に、参照抗体は、競合アッセイ法において、50またはそれ以上で、上記抗体とその抗原との結合をブロックする。キメラ抗体という用語は、重鎖およびまたは軽鎖の一部分が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖およびまたは軽鎖の残部が、異なる供給源または種に由来する抗体をいう。抗体のクラスは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプをいう。5つの主要なクラスの抗体である、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在しており、これらのいくつかはサブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。化学療法剤は、がんの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミドスルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンアジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアミルアミンナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードニトロ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6ジアゾ5オキソLノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび5フルオロウラシル葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートプリン類似体、例えばフルダラビン、6メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5FUアンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン葉酸補充薬、例えばフロリン酸アセグラトンアルドホスファミドグリコシドアミノレブリン酸アムサクリンベストラブシルビサントレンエダトラキサートデフォファミンデメコルシンジアジコンエルフォルニチンエリプチニウムアセテートエトグルシド硝酸ガリウムヒドロキシウレアレンチナンロニダミンミトグアゾンミトキサントロンモピダモールニトラクリンペントスタチンフェナメットピラルビシンポドフィリン酸2エチルヒドラジドプロカルバジンPSKラゾキサンシゾフィランスピロゲルマニウムテヌアゾン酸トリアジコン222トリクロロトリエチルアミンウレタンビンデシンダカルバジンマンノムスチンミトブロニトールミトラクトールピポブロマンガシトシンアラビノシドシクロホスファミドチオテパタキサン、例えばパクリタキセル、BristolMyersSquibbOncologyPrincetonNJおよびドセタキセル、Rh6nePoulencRorerAntonyFranceクロラムブシルゲムシタビン6チオグアニンメルカプトプリンメトトレキサート白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンビンブラスチン白金エトポシドイホスファミドマイトマイシンCミトキサントロンビンクリスチンビノレルビンナベルビンノバントロンテニポシドダウノマイシンアミノプテリンゼローダイバンドロネートCPTII35トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000ジフルオロメチルオルニチンレチノイン酸エスペラマイシンカペシタビンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるのは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4イミダゾール、4ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストンおよびトレミフェンを含む抗エストロゲンならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの、腫瘍に及ぼすホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤である。抗血管新生剤は、血管の発生をある程度までブロックする、または妨害する化合物をいう。抗血管新生剤は、例えば、血管新生の促進に関わる成長因子または成長因子受容体に結合する小分子または抗体でありうる。抗血管新生因子は1つの態様において、血管内皮成長因子に結合する抗体である。サイトカインという用語は、ある細胞集団によって放出され、細胞間メディエータとして別の細胞に作用するタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカインおよび従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインのなかに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Nメチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン副甲状腺ホルモンチロキシンインスリンプロインスリンリラキシンプロリラキシン糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモン肝成長因子線維芽細胞成長因子プロラクチン胎盤ラクトゲン腫瘍壊死因子aおよび腫瘍壊死因子Pミュラー阻害物質マウスゴナドトロピン関連ペプチドインヒビンアクチビン血管内皮成長因子インテグリントロンボポエチン神経成長因子、例えばNGFp血小板成長因子形質転換成長因子、例えばTGFaおよびTGFpインスリン様成長因子Iおよびインスリン様成長因子IIエリスロポエチン骨誘導因子インターフェロン、例えばインターフェロンa、インターフェロンPおよびインターフェロンyコロニー刺激因子、例えばマクロファージCSF顆粒球マクロファージCSFおよび顆粒球CSFインターロイキン、例えばILI、ILla、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILII、IL12腫瘍壊死因子、例えばTNFαまたはTNFPならびにLIFおよびkitリガンドを含む他のポリペプチド因子である。本明細書において用いられる場合、サイトカインという用語は、天然供給源由来のタンパク質または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物を含む。fMLPという用語は、Nホルミルメチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンからなるトリペプチドを意味する。1つの態様において、エフェクター成分はfMLPまたはその誘導体である。プロドラッグという用語は、親薬物と比べて腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、かつ酵素的に活性化されうるかまたはさらに活性な親形態へと変換されうる、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体の形態をいう。例えば、WilmanProdrugsinCancerChemotherapyBiochemicalSocietyTransactionsVol14615thMeetingBelfastpp375382およびStellaetalProdrugsAChemicalApproachtoTargetedDrugDeliveryDirectedDrugDeliveryBorchardtetalpp247267HumanaPressを参照されたい。エフェクター成分として使用されうるプロドラッグは、さらに活性な、細胞毒性のない薬物へ変換されうる、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Dアミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、bラクタム含有プロドラッグ、置換されてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換されてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5フルオロシトシンおよび他の5フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されることはない。本発明において用いるためのプロドラッグ形態へ誘導体化されうる細胞毒性薬物の例としては、本明細書において記述される化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。細胞毒性成分という用語は、細胞の機能を阻害もしくは阻止する、およびまたは細胞の死もしくは破壊を引き起こす物質をいう。細胞毒性剤は、放射性同位体化学療法剤または化学療法薬、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤成長阻害剤酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素抗生物質細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素的に活性な毒素のような、その断片およびまたは変種を含めた、毒素ならびに本明細書において開示されるさまざまな抗腫瘍剤または抗がん剤を含むが、これらに限定されることはない。薬剤、例えば、薬学的製剤の有効量は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間単位での、有効な量をいう。Fc領域という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含んだ免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために本明細書において用いられる。この用語は天然配列Fc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジンは存在してもまたは存在していなくてもよい。本明細書において特別の定めのない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の付番は、KabatetalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest5thEdPublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMDに記述されているように、EU指数とも呼ばれる、EU付番システムにしたがう。フレームワークまたはFRという用語は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基をいう。可変ドメインのFRは一般に、4つのFRドメインである、FR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFR配列は一般に、VH中に以下の配列で見られるFR1H1FR2H2FR3H3FR4。全長抗体、インタクトな抗体、および完全抗体という用語は、天然抗体の構造に実質的に類似の構造を有する、または本明細書において定義されるFc領域を含んだ重鎖を有する抗体をいうように本明細書において互換的に用いられる。そのような抗体は一般に、2本の重鎖および2本の軽鎖を含む。ヒト抗体は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用した、非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義では、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト化抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVRの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、かつFRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも1つ、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を任意で含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体のヒト化形態は、ヒト化を受けた抗体をいう。本明細書において用いられる超可変領域またはHVRという用語は、配列が超可変である、およびまたは構造的に規定されたループを形成する抗体可変ドメインの領域の各々をいう。一般に、天然の4本鎖抗体は6つのHVRVH中の3つおよびVL中の3つを含む。HVRは一般に、超可変ループ由来のアミノ酸残基およびまたは相補性決定領域由来のアミノ酸残基を含み、後者は配列多様性が最も高く、およびまたは抗原認識に関与する。例示的な超可変ループはアミノ酸残基番号26~32、50~52、91~96、26~32、53~55および96~101の位置に存在する901917を参照のこと。例示的なCDRは、L1のアミノ酸残基番号24~34、L2のアミノ酸残基番号50~56、L3のアミノ酸残基番号89~97、H1のアミノ酸残基番号31~35B、H2のアミノ酸残基番号50~65およびH3のアミノ酸残基番号95~102の位置に存在するを参照のこと。VH中のCDR1を除いて、CDRは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原に接触する残基である特異性決定残基またはSDRを含む。SDRは、短縮型CDRまたはaCDRと呼ばれるCDRの領域の中に含まれる。例示的なaCDRは、L1のアミノ酸残基番号31~34、L2のアミノ酸残基番号50~55、L3のアミノ酸残基番号89~96、H1のアミノ酸残基番号31~35B、H2のアミノ酸残基番号50~58およびH3のアミノ酸残基番号95~102の位置に存在する16191633を参照のこと。別段の指示がない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基は、本明細書においてKabatら、前記にしたがい付番される。イムノコンジュゲートは、結合対のメンバー、核酸またはエフェクター分子を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の非抗体由来分子とコンジュゲートされた抗体または抗体断片である。個体または対象は哺乳類である。哺乳類は、家畜化した動物、霊長類、ウサギ、ならびにげっ歯類を含むが、これらに限定されることはない。特定の態様において、個体または対象はヒトである。モノクローナル抗体という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、一般的には少量存在している、生じ得る変種抗体を除いて、同一であり、およびまたは同じエピトープに結合する。異なる決定基に対する異なる抗体を通例含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、モノクローナルという修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られている抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本明細書において報告される複合体において用いられるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだ形質転換動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、種々の技法によって作製されてもよく、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法が本明細書に記述されている。一価結合ポリペプチドまたは一価結合抗体断片という用語は、その標的または抗原への結合のための部位または領域を1つしか持たない分子を意味する。一価結合ポリペプチドの例は、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、有機小分子、ダルピン、アンキリン反復タンパク質、Kunitz型ドメイン、単一ドメイン抗体514522を参照のこと、細胞表面受容体のリガンド、全長抗体の一価断片などである。例えば、全長抗体はその標的に対する結合部位を2つ持ち、したがって、二価である一方で、scFvまたはFAB抗体断片はその標的に対する結合部位を1つしか持たず、したがって、一価である。一価抗体または抗体断片がポリペプチドとして用いられる場合、この部位はパラトープと呼ばれる。裸の抗体または裸の抗体断片は、非抗体成分とコンジュゲートされていない抗体または抗体断片をいう。天然の抗体は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子をいう。例えば、天然のIgG抗体は、ジスルフィド結合している2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖から構成された、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へと、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる、可変領域と、それに続く3つの定常ドメインを有する。同様に、N末端からC末端へと、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる、可変領域と、それに続く定常軽鎖ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる、2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。薬学的製剤という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態にある調製物であって、その製剤が投与されるであろう対象に許容されず有毒である追加の構成成分を含有しない調製物をいう。薬学的に許容される担体は、対象にとって毒性のない、活性成分以外の、薬学的製剤中の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤または保存剤を含むが、これらに限定されることはない。ポリヌクレオチドまたは核酸配列という用語は、少なくとも8ヌクレオチドおよび多くても約1000ヌクレオチドを含む短い、一般的には一本鎖の、ポリヌクレオチドを意味する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも15、または少なくとも18、または少なくとも21、または少なくとも24、または少なくとも27、または少なくとも30ヌクレオチドの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは200ヌクレオチド以下、または150ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下、または90ヌクレオチド以下、または80ヌクレオチド以下、または70ヌクレオチド以下、または60ヌクレオチド以下、または50ヌクレオチド以下、または45ヌクレオチド以下、または40ヌクレオチド以下、または35ヌクレオチド以下、または30ヌクレオチド以下の長さを有する。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも15、または少なくとも18、または少なくとも21、または少なくとも24、または少なくとも27、または少なくとも30ヌクレオチドの長さで、かつ200ヌクレオチド以下、または150ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下、または90ヌクレオチド以下、または80ヌクレオチド以下、または70ヌクレオチド以下、または60ヌクレオチド以下、または50ヌクレオチド以下、または45ヌクレオチド以下、または40ヌクレオチド以下、または35ヌクレオチド以下、または30ヌクレオチド以下の長さを有する。Lポリヌクレオチドという用語は、LDNAのような、単量体構成要素として50超のLヌクレオチドを含む核酸を意味する。1つの態様において、LポリヌクレオチドはLヌクレオチドだけを含む。そのようなLポリヌクレオチドのヌクレオチドの数は、1つのLヌクレオチドから任意の数にまで及ぶことが理解されるべきである。しかしながら、1つの態様において、Lヌクレオチドの数は少なくとも10、または少なくとも15、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも45、または少なくとも50、または少なくとも55、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100ヌクレオチドである。LポリヌクレオチドはLA、LG、LC、LU、LTおよびその組み合わせから作製され、ここでLAはLリボースアデニンを意味する、などである。LポリデオキシヌクレオチドはLdA、LdG、LdC、LdU、LdTおよびその組み合わせから作製され、ここでLdAはLデオキシリボースアデニンを意味する、などである。ポリヌクレオチドリンカーという用語は、2つのヌクレオチド配列をともに連結している成分を意味する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーはポリヌクレオチドである。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび少なくとも1つの非ポリヌクレオチドを含む。非ポリヌクレオチドは、ポリペプチド、重合体、または多糖でありうる。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、長さが10~30ヌクレオチドのポリヌクレオチドおよび直鎖状ポリを含む。ポリペプチドは、天然に産生されたか合成的に産生されたかを問わず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなる重合体である。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドはペプチドといわれてもよいが、2つもしくはそれ以上のポリペプチドからなる、または100アミノ酸残基超の1つのポリペプチドを含む分子は、タンパク質といわれてもよい。ポリペプチドは、炭水化物群、金属イオンまたはカルボン酸エステルのような、非アミノ酸構成成分を含んでもよい。非アミノ酸構成成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって付加されてもよく、細胞のタイプによって変化してもよい。ポリペプチドは、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸という点で本明細書において定義される。炭水化物群などの付加は一般的に特定されていないが、それでもなお存在することがある。ポリペプチドエピトープは、対応する一価結合ポリペプチドによって結合されるポリペプチド標的上の結合部位を意味する。これは一般的にはアミノ酸から構成される。結合ポリペプチドは直鎖状エピトープ、すなわち、5~12個の連続アミノ酸のストレッチからなるエピトープに結合するか、または結合ポリペプチドは、ポリペプチド標的のいくつかの短いストレッチの空間的配置によって形成される三次元構造に結合するかのどちらかである。結合ポリペプチドにより、例えば、抗体または抗体断片の抗原認識部位またはパラトープにより認識される三次元エピトープは、抗原分子の三次元表面の特徴と考えることができる。これらの特徴は、結合ポリペプチドの、対応する結合部位にぴったり適合し、その結果、結合ポリペプチドとその標的との間の結合が促進される。特異的に結合するという用語は、ポリペプチドまたは抗体もしくは抗体断片が108Mまたはそれ未満の、1つの態様において108M~1013Mの、1つの態様において109M~1013Mの解離定数でその標的に結合することを意味する。この用語は、ポリペプチドが、存在する他の生体分子に特異的に結合しない、すなわち、ポリペプチドが106M以上の、1つの態様において106M~1Mの解離定数で他の生体分子に結合することを示すためにさらに用いられる。本明細書において用いられる場合、処置は、処置されている個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入をいい、予防のためにまたは臨床病理の過程中に行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、病状の改善または緩和、および寛解または改善された予後予測を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、本明細書において報告される複合体は、疾患の発生を遅延させるため、または疾患の進行を遅らせるために用いられる。可変領域または可変ドメインという用語は、抗体をその抗原に結合させる際に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインをいう。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインは一般に、類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域および3つの超可変領域を含むを参照のこと。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用い、それぞれ、相補性VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして単離されうる880887、ClarcksonTetalNature352624628を参照のこと。本明細書において用いられるベクターという用語は、連結している別の核酸を増やすことができる核酸分子をいう。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクターの他に、導入を受けた宿主細胞のゲノムに組み入れられているベクターも含む。特定のベクターは、機能的に連結している核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において発現ベクターといわれる。ポリペプチドポリヌクレオチド複合体標的への1つまたは複数のエフェクター成分の送達のための複合体が本明細書において報告され、これにより、複合体は、非共有結合性相互作用によって接続されている少なくとも2つの構成成分を含み、構成成分は、単離されたRNAまたはDNAよりも、とりわけDDNAよりもインビボでのタンパク質分解および酵素分解に対して耐性である。複合体はその標的に対して高い親和性を有し、良好な溶解性を有する。ポリペプチド部分およびポリヌクレオチド部分、とりわけLポリヌクレオチド部分の混合物を含む複合体は、これらの要件を満たし、インビボでのエフェクター成分の送達にとりわけ適していることが分かった。本明細書において報告される複合体は、例えば、免疫アッセイ法においてアナライトとの結合に用いることができる。例えば、アナライトが少なくとも2つの重複しないエピトープを有する場合、本明細書において報告される複合体は、リンカーポリヌクレオチドと、重複しないエピトープに特異的に結合する2つのポリペプチドとを含み、リンカーポリヌクレオチドは、これらのエピトープに特異的に結合するポリペプチドの相乗的結合に最適な長さを有するように構築される。これは、例えば、そのような複合体を利用するアナライトの検出のための方法において大変有用でありうる。したがって、本明細書において報告される1つの局面は、サンプル中の関心対象のアナライトの検出における本明細書において報告される複合体の使用である。特定の態様において、用いられる検出方法は、酵素免疫アッセイ法、任意の適切なシグナル検出の方法、例えば、電気化学発光、または免疫組織化学において用いられる複合体を利用する直接的、間接的、競合的またはサンドイッチ免疫アッセイ法である。本明細書において報告される1つの局面は、式XまたはXのポリペプチドポリヌクレオチド複合体であり、式中、AおよびBは、標的に特異的に結合するポリペプチドであり、式中、aaおよびbbは結合対であり、ここでaおよびaは、bとbの結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、式中、Sはリンカーポリヌクレオチドであり、式中、は、共有結合的にまたは結合対によってa、a、b、b、またはSのうちの少なくとも1つに結合されたエフェクター成分を意味し、式中、は整数であり、式中、は共有結合を表し、かつ式中、は非共有結合を表す。同様に、1つの局面として本明細書において報告されるのは、上で概説した式XまたはXのポリペプチドポリヌクレオチド複合体を生成するための、以下の段階を含む方法であるaAaおよびbBをそれぞれ合成する段階、bリンカーaSbを合成する段階、ならびにc前記式の複合体を形成させる段階、ここで、エフェクター成分Xは、段階a、bまたはcにおいてa、a、b、b、またはSのうちの少なくとも1つに結合している。本明細書において報告される複合体は、その個々の構成成分に基づき、複合体の個々の構成成分とコンジュゲートされた結合対のメンバー間のハイブリダイゼーションによる標準的な手順によって得ることができる。111の化学量論を有する複合体を得るために、複合体を他のコンジュゲーション副生成物からクロマトグラフィーによって分離することができる。この手順は、色素標識された結合対のメンバーおよびまたは荷電リンカーを用いることによって容易にすることができる。この種の標識されたおよび強く負に荷電された結合対のメンバーを用いることにより、モノコンジュゲートポリペプチドは、電荷および分子量の差異を分離のために用いることができるので、2つ以上のリンカーを保有するポリペプチドおよび非標識ポリペプチドから容易に分離される。蛍光色素は、標識された一価結合剤と同様、非結合構成成分から複合体を精製するのに有用でありうる。本明細書において報告される1つの局面では、以下の構成成分a標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、b第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、cポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を含むポリペプチドポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階ai標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドと、iiポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分とをそれぞれ合成する段階、b第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびにc合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチドポリヌクレオチド複合体を形成させる段階を含む前記方法が報告される。本明細書において報告される別の局面は、以下の構成成分a第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチド、b第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチド、ならびにc第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを含むポリペプチドポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階a第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチドと、第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチドとをそれぞれ合成する段階、ならびにb第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびにc合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチドポリヌクレオチド複合体を形成させる段階を含む前記方法である。複合体は、電荷を均等化するために1つまたはいくつかの対イオンYをさらに含むことができる。適当な、負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、OH、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、スルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基がとりわけ適している。他の適した、正に荷電した対イオンは、アルカリ金属イオンおよびまたはアンモニウムイオンのような一価陽イオンである。本明細書において報告される複合体の完全ライブラリーを容易に提供することができ、分析することができ、そのようなライブラリーのなかから適当な結合剤を必要に応じて、大規模で生成することができる。ライブラリーは、本明細書において報告される複合体のセットをいい、ここで各々のポリペプチドおよび結合対のメンバーは同一であり、かつここでポリヌクレオチドリンカーの長さは、結合剤について提示された要件に最も適合するように調整される。1nm~100nmの全範囲に及ぶ、かつ約10nm間隔のステップを有するポリヌクレオチドリンカーラダーを最初に用いることが容易に可能である。その後、第1ラウンドにおいて特定された最も適切な長さの前後で、リンカーの長さは再度、容易に、さらに精緻化される。本明細書において、異なるポリヌクレオチドリンカー長を有する多数の複合体を含んだライブラリーからのポリペプチドポリヌクレオチド複合体の選択のための方法も報告される。この方法の1つの態様において、さまざまな長さのポリヌクレオチドリンカーを有するいくつかのリンカー分子を合成し、これを、さまざまな長さのポリヌクレオチドリンカーを含んだ本明細書において報告される複合体の形成において用い、2つの一価ポリペプチド結合剤のより良い方と比べて少なくとも5倍のKdissの改善を有する複合体を選択する。1つの態様において所望のKdissを有する二価結合剤の選択は、実施例において開示のBIAcore分析によって行われる。本明細書において報告される1つの局面は、a第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、b第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびにc第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分を第1の末端に含む、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を第2の末端に含むリンカーを含む複合体である。本明細書において報告される1つの局面は、a第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、b第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、ならびにc第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分を第1の末端に含む、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を第2の末端に含むリンカーを含む複合体である。第1の一本鎖LDNA成分は、第2の一本鎖LDNA成分とハイブリダイズせず、かつ第2の一本鎖LDNAリンカー成分とハイブリダイズしない。一方、第2の一本鎖LDNA成分は、第1の一本鎖LDNA成分とハイブリダイズせず、かつ第1の一本鎖LDNAリンカー成分とハイブリダイズしない。本明細書において提示される全ての局面の以下の態様においては、以下が与えられる。1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、抗体または抗体断片である。1つの態様において、抗体断片はFABである。1つの態様において、第1およびまたは第2の一本鎖LDNA成分は、10~50ヌクレオチドの長さを有する。1つの態様において、長さは15~35ヌクレオチドのものである。1つの態様において、長さは20~30ヌクレオチドのものである。1つの態様において、リンカーは第1の一本鎖LDNAリンカー成分、第2の一本鎖LDNAリンカー成分、および一本鎖ドッキング成分を含む。1つの態様において、リンカーは直鎖状の非ヌクレオチド成分をさらに含む。1つの態様において、直鎖状の非ヌクレオチド成分はポリペプチドまたは非イオン性重合体である。1つの態様において、非イオン性重合体は直鎖状ポリである。1つの態様において、直鎖状ポリは1~100個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリは1~50個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリは1~25個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、複合体は、a第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、b第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖LDNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、ならびにc第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分を第1の末端に含む、第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を第2の末端に含む、および第1の一本鎖LDNA成分と第2の一本鎖LDNA成分との間に第3の一本鎖LDNAリンカー成分を含むリンカーを含む。1つの態様において、リンカーは3から5の方向に第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分、ドッキング一本鎖LDNA成分、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を含む。ドッキング一本鎖LDNA成分は第1の一本鎖LDNA成分またはその相補的な第1の一本鎖リンカー成分とハイブリダイズせず、かつ第2の一本鎖LDNA成分またはその相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分とハイブリダイズしない。1つの態様において、リンカーは3から5の方向に第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分、直鎖状の非ヌクレオチド成分、ドッキング一本鎖LDNA成分、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を含む。1つの態様において、リンカーは3から5の方向に第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分、ドッキング一本鎖LDNA成分、非ヌクレオチド成分、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を含む。1つの態様において、リンカーは3から5の方向に第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分、非ヌクレオチド成分、ドッキング一本鎖LDNA成分、および第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を含む。1つの態様において、リンカーは3から5の方向に第1の一本鎖LDNA成分と相補的な第1の一本鎖LDNAリンカー成分、第1の非ヌクレオチド成分、ドッキング一本鎖LDNA成分、第2の非ヌクレオチド成分、第2の一本鎖LDNA成分と相補的な第2の一本鎖LDNAリンカー成分を含む。1つの態様において、第1の非ヌクレオチド成分および第2の非ヌクレオチド成分は同じものまたは異なるものである。1つの態様において、直鎖状の非ヌクレオチド成分はポリペプチドまたは非イオン性重合体である。1つの態様において、非イオン性重合体は直鎖状ポリである。1つの態様において、直鎖状ポリは1~100個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリは1~50個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリは1~25個のエチレングリコール単位を含む。ポリペプチド構成成分モノクローナル抗体法は、特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片の形態で特異的に結合する作用物質の産生を可能にする。モノクローナル抗体またはその断片を作製するために、マウス、ウサギ、ハムスターまたは任意の他の哺乳類をポリペプチド、すなわち抗体の標的、またはおよびポリペプチドをコードする核酸で免疫するような技法を用いることができる。あるいは、モノクローナル抗体またはその断片をscFv、具体的にはヒトscFvのファージライブラリーの使用によって得ることができる。1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、一価抗体断片である。1つの態様において、一価抗体断片はモノクローナル抗体に由来する。一価抗体断片はFAB、FABSH、単一ドメイン抗体、F2、FvおよびscFv断片を含むが、これらに限定されることはない。したがって、1つの態様において、一価抗体断片は、FAB、FABSH、単一ドメイン抗体、F2、FvおよびscFv断片を含む群より選択される。1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの少なくとも1つが、モノクローナル抗体のFAB断片または、FAB断片または、単一ドメイン抗体である。1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの両方が、お互いに独立してモノクローナル抗体のFAB断片または、FAB断片または、単一ドメイン抗体である。1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの両方が、単一ドメイン抗体、またはFAB断片、またはFAB断片である。1つの態様において、ポリペプチドまたは一価結合ポリペプチドによって特異的に結合される標的またはエピトープは、重複しない。ダイアボディは、二価または二重特異性でありうる2つの抗原結合部位を有する抗体断片である129134、およびHolligerPetalProcNatlAcadSciUSA9064446448を参照のこと。トリアボディおよびテトラボディもHudsonPJetalNatMed9129134に記述されている。単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。Fvは最小の抗体断片であり、これは完全な抗原結合部位を含み、かつ定常領域を欠く。scFvの概説については、例えば、PlueckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodiesvol113RosenburgandMoorepp269315、WO9316185、US5571894、US5587458を参照されたい。一般に、6つの超可変領域が、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメインでさえ、その抗原を認識して結合する能力を有する。1つの態様において、一価抗体断片は、強力な非共有結合状態にある1本の重鎖および1本の軽鎖の可変ドメインの二量体からなる2本鎖Fv種である。1つの態様において、一価抗体断片は、柔軟性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結された1本の重鎖および1本の軽鎖の可変ドメインからなる一本鎖Fv種である。抗体のFAB断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン、ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメインを含む。FAB断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含めて重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりFAB断片とは異なる。FABSHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持ったFABを意味する。抗体断片の産生のために、さまざまな技法が開発されている。伝統的には、全長抗体のタンパク質消化によって抗体断片を得ることができる107117、BrennanMetalScience2298183を参照のこと。例えば、全長抗体のパパイン消化は、FAB断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力をその名が反映している、残りのFc断片とを生ずる。特定の抗体断片の概説については、HudsonPJetalNatMed9129134を参照されたい。抗体断片は組換え手段によって直接産生することもできる。FAB、FvおよびscFv抗体断片は全て、例えば大腸菌中で発現させ、大腸菌から分泌させ、かくして、これらの断片の大量の簡易産生を可能にすることができる。抗体断片は標準的な手順にしたがって抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、FABSH断片は大腸菌から直接回収することもできる163167。哺乳類細胞システムを用いて、抗体断片を発現させ、必要なら、分泌させることもできる。1つの態様において、抗原に特異的に結合するポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。1つの態様において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の態様において、ポリペプチドは、≦10nM、≦1nM、≦01nM、≦001nM、または≦0001nMの解離定数でその標的に結合する。ポリペプチドが抗体または抗体断片である1つの態様において、解離定数は、以下のアッセイ法によって記述されるように、抗体のFAB断片およびその抗原で行われる放射性標識抗原結合アッセイ法によって決定される。抗原に対するFABの溶液中結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下において最小濃度の標識抗原でFABを平衡化し、その後、結合した抗原を、抗FAB抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定される865881を参照のこと。アッセイの条件を確立するために、MICROTITERマルチウェルプレートを50mM炭酸ナトリウム中5μgmlの捕捉用抗FAB抗体で終夜コーティングし、その後、PBS中2のウシ血清アルブミンにより室温によって2~5時間ブロッキングする。非吸着プレートでは、100pMまたは26pMの125I抗原を、関心対象のFABの連続希釈液と混合する45934599における抗VEGF抗体FAB12の評価と一致している。その後、関心対象のFABを終夜インキュベートするしかしながら、平衡に達することを確実とするために、さらに長い時間、インキュベーションを続けてもよい。その後、混合物を室温でのインキュベーションのために捕捉プレートに移す。その後、溶液を除去し、プレートをPBS中01のポリソルベート20で8回洗浄する。プレートが乾いた時点で、150μlウェルのシンチレーション剤Packardを加え、プレートをTOPCOUNTガンマカウンタにて10分間カウントする。最大結合の20以下を与える各FABの濃度を、競合的結合アッセイ法で用いるために選択する。別の態様によれば、およそ10反応単位の固定化抗原CM5チップを備えた25°CのBIACORE2000またはBIACORE3000またはBIACOREA100により表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて解離定数を決定する。手短に言えば、カルボキシメチル化したデキストランバイオセンサチップを、供給元の使用説明書にしたがってNエチルNカルボジイミド塩酸塩およびNヒドロキシスクシンイミドで活性化する。抗原を、5μl分の流速での注入の前に10mM酢酸ナトリウムpH48で5μgmlまで希釈して、およそ10反応単位の、カップリングされたタンパク質を達成する。抗原の注入後、1Mのエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。動力学の測定のために、FABの2倍連続希釈液を、25°Cの、005ポリソルベート20界面活性剤を含むPBS中にておよそ25μl分の流速で注入する。単純な1対1ラングミュアー結合モデル評価ソフトウェアバージョン32を用いて会合および解離のセンサグラムを同時に当てはめることによって、会合速度および解離速度を計算する。平衡解離定数をkoffkonの比として計算する865881を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイ法による会合速度が106M1s1を超えるなら、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計または撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLMAMINCO分光光度計にて測定される、漸増濃度の抗原の存在下、PBSpH72中20nMの抗抗原抗体の25°Cでの蛍光放出強度の増加または減少を測定する蛍光消光技法を用いることによって会合速度を決定することができる。2つの結合分子が2つの独立した結合部位を認識する場合、協調的結合事象が生み出されうるが、これはポリヌクレオチドリンカーの長さとは無関係でありうる。協調的結合効果は、自由ギブズ結合エネルギーΔG°1およびΔG°2がΔG°coopΔG°1ΔG°2ΔG°coopにまとめられるという点で物理学的に特徴付けられる。ギブズ方程式ΔG°coopRTlnKDcoopによれば、ΔG°coopは親和性KD1およびKD2から生成物を形成する。自由ギブズ結合エネルギーの増強は、結合親和性および結合特異性を協調的、劇的に増大する。結合特異性は、応じる結合部位が、例えば腫瘍細胞の表面上に共局在化されうる2つの異なる標的分子上に独立して位置している場合に、さらに増大する。標的に特異的に結合するポリペプチドは、特定のカップリング試薬と潜在的に反応しうる、1つまたは複数の遊離OH、COOH、NH2およびまたはSH基を保有する可能性が高い。コンジュゲーション反応の間の反応を回避するために、以下の表1に与えたカップリング化学反応の1つを選択することができる。表1は、ポリペプチドを結合対の各メンバーに共有結合させるための、ならびにリンカーを結合対の各メンバーに共有結合させるための反応基の概要を示す。表1上記の双直交カップリング化学反応は、一価結合ポリペプチドのコンジュゲーションにとりわけ適している。2つの結合パートナーが特定の反応性官能基を保有していないなら、例えば2つのアプタマーの組み合わせの場合なら、反応部位の選択の自由度はさらに高い。それゆえ、上記表に与えた対応する反応部位の対に加えてまたはそれと組み合わせて、アミノ活性エステルおよびSHSHまたはSHマレインイミドを直交カップリングのために用いることができる。一価結合ポリペプチドは合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交化学反応性を有するアミノ酸を、そのような合成中に組み入れることができる12811295を参照のこと。多種多様の直交官能基にかかわる問題であり、これらの官能基は合成ペプチドに導入することができるため、リンカーへのそのようなペプチドのコンジュゲーションは標準的な化学反応である。ポリヌクレオチド構成成分本明細書において報告される複合体は、リンカーを含む。リンカーがポリペプチドと共有結合していてもよく、またはリンカーおよびポリペプチドが特異的な結合対によって互いに結合していてもよい。異なる長さのリンカーが用いられる場合には、その結果として、標的に特異的に結合する第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の距離の異なる複合体の構築体を得ることができる。これによって最適な距離およびまたは柔軟性が可能になる。ポリヌクレオチドという用語は、広義に理解されるべきであり、DNAおよびRNAならびにその類似体および修飾を含む。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、20超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、30超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、40超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、50超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。例えば、リンカーはヌクレオシドから排他的に構成されてもよく、またはリンカーはヌクレオシドおよびアミノ酸、およびもしくは糖残基、およびもしくはジオール、およびもしくはホスホ糖単位、およびもしくは非イオン性重合体構成要素の混合物であってもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、標準塩基デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシトシン、デオキシチミジン、デオキシウラシルの位置に置換基を保有する置換ヌクレオチドを含んでもよい。そのような置換核酸塩基の例は、5置換ピリミジンdU、5プロピニルdUまたはdCのような、5ハロゲン化dUまたはdC、N置換ピリミジン、N置換プリン、8置換プリンヘキサ1イル8アミノdGまたはdAのような、8ハロゲン化dAまたはdG、8アルキルdGまたはdA、および2置換dAである。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含んでもよい。すなわち、天然に存在する核酸塩基は、5ニトロインドールDリボシド、3ニトロピロールDリボシド、デオキシイノシン、デオキシアントシン、7デアザdG、dA、dIもしくはdX、7デアザ8アザdG、dA、dIもしくはdX、8アザdA、dG、dIもしくはdX、Dホルマイシン、プソイドdU、プソイドイソdC、4チオdT、6チオdG、2チオdT、イソdG、5メチルイソdC、N8連結8アザ7デアザdA、56ジヒドロ5アザdC、エテノdA、またはピロロdCのような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる。当業者には明らかなように、相補鎖中の核酸塩基は、二重鎖形成が特異的であるように選択されなければならない。例えば、5メチルイソdCが片鎖において用いられるなら、イソdGが相補鎖中になければならない。1つの態様において、リンカーのオリゴヌクレオチド骨格は、置換糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間リン酸成分の修飾を含むように修飾され、およびまたはPNAである。オリゴヌクレオチドは、例えば、2メトキシ、2フルオロ、2メチルセレノ、2アリルオキシ、4メチルdNのような置換デオキシリボースを有するヌクレオチドを含みうる。糖類似体は、例えば、キシロース、またはのような24架橋リボース、Lリボース、LDリボース、ヘキシトール、シクロヘキセニル、アルトリトール、C3およびC5原子が、シクロプロパン環に縮合しているエチレン架橋によって接続されている三環式リボース類似体、グリセリン、グルコピラノース、カルバリボース、ヒドロキシメチルモルホリンである。ヌクレオシド間リン酸成分の多くの修飾は、ハイブリダイゼーション特性に干渉しないことも知られており、このような骨格修飾を置換ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。上記の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびポリヌクレオチド骨格修飾を、本明細書において報告される複合体中に含まれるポリヌクレオチドにおいて必要に応じて組み合わせることができる。リンカーは1nm~100nmの長さを有する。1つの態様において、リンカーは4nm~80nmの長さを有する。1つの態様において、リンカーは5nm~50nmの、または6nm~40nmの長さを有する。1つの態様において、リンカーは10nmもしくはそれを上回る、または15nmもしくはそれを上回る長さを有する。1つの態様において、リンカーは10nm~50nmの長さを有する。1つの態様において、リンカーとコンジュゲートされた結合対のメンバーは、少なくとも各25nmの長さを有する。リンカーの長さは、実体と化学的に類似している構成成分の既知の結合距離および結合角度を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的なテキストブック中に一部の分子についてまとめられている。スペーサーまたはリンカーの長さの計算では、以下の近似を当てはめるa非ヌクレオシドの実体の長さを計算するために、連結される原子の性質とは関係なく、結合角度180°とともに平均の結合の長さ130pmを用いる、b一本鎖における1つのヌクレオチドは500pmで計算する、およびc二本鎖における1つのヌクレオチドは330pmで計算する。130pmの値は、125pmの2つのC間の結合距離および推定結合角度180°で換算した、およそ250pmである2つのC間の距離153pmおよび結合角度109°28でのCCC鎖の2つの末端炭素原子の距離の計算に基づく。PおよびSのようなヘテロ原子ならびにsp2およびsp1C原子もリンカーの一部でありうることを考慮すると、130pmの値がとられる。リンカーがシクロアルキルまたはアリールのような環状構造を含むなら、その距離は、距離を規定している原子の鎖全体の一部である環状構造の結合の数をカウントすることによって同じように計算される。本明細書において報告される複合体中のリンカーの長さは、必要に応じて変化させることができる。可変長のリンカー、すなわち、ライブラリーを容易に利用可能とするために、そのようなライブラリーの異なるリンカーへ合成によって簡単に到達できることが適当である。リンカーのコンビナトリアル固相合成が適している。リンカーは最大およそ100nmの長さで合成されなければならないので、合成戦略は、単量体の合成構成要素が高い効率で固相合成中にアセンブルされるように選択される。単量体の合成構成要素としてのホスホラミダイトのアセンブリに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成がこの要件を満たす。そのようなリンカーにおいて、リンカー内の単量体単位はいずれの場合にも、ホスフェートまたはホスフェート類似体成分を介して連結される。リンカーは1つの態様などで、多官能性アミノカルボン酸の遊離正電荷基またはおよび負電荷基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含むことができる。例えば、電荷担体は、aアミノ基および2つのカルボキシレート基、またはb2つのアミノ基および1つのカルボキシレート基を含む三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、αβジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEP0618192またはUS5519142に記述されているものなどの対称三官能性カルボン酸である。あるいは、aの三官能性アミノカルボン酸におけるカルボキシレート基の1つは、ホスフェート、スルホネートまたはスルフェート基によって置換されうる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。リンカーはまた、1つの態様などで、非荷電親水性基を含むことができる。非荷電親水性基の適した例は、エチレンオキシド基、またはとりわけ、エチレンオキシド基などの、少なくとも3つの構成要素を含むポリ基、スルホキシド基、スルホン基、カルボン酸アミド基、カルボン酸エステル基、ホスホン酸アミド基、ホスホン酸エステル基、リン酸アミド基、リン酸エステル基、スルホン酸アミド基、スルホン酸エステル基、硫酸アミド基および硫酸エステル基である。アミド基は1つの態様において、第一級アミド基であり、とりわけ、例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの、アミノ酸側鎖基のカルボン酸アミド残基である。エステルは、とりわけ、親水性アルコール、具体的にはC1~C3アルコールまたはジオールまたはトリオールに由来する。鏡像異性LDNAは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性で知られており、可変長のポリヌクレオチドの合成の容易さで知られている。1つの態様において、複合体中の全てのポリヌクレオチドは鏡像異性LDNAまたはLRNAである。1つの態様において、複合体中の全てのポリヌクレオチドは鏡像異性LDNAである。鏡像異性の一本鎖LDNAは、高い分子柔軟性および体液中での安定性を兼ね備える。一本鎖LDNAが2つまたはそれ以上の独立した結合分子間のリンカーとして用いられる場合、これらの結合分子は、ssLDNAリンカーの長さに依るにすぎない、実質的にあらゆる結合角度および結合距離に適応しうる。1つの態様において、リンカーは、互いにハイブリダイズしうるセグメントとして合成される。この場合、リンカーは、セグメント相互のハイブリダイゼーションによって形成されうる。結果として生じるリンカー構築体は、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分を含む。リンカーがそのように構築される場合、二重鎖を形成するハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの実体の配列は、結合対の核酸とのハイブリダイゼーションまたは干渉が起こりえないように選択される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、互いにハイブリダイズしうるssLDNAセグメント、例えばAおよびBとして合成される。この場合、ポリヌクレオチドリンカーは、セグメント相互のハイブリダイゼーションによって構築されうる。それゆえ、リンカーの長さは、鎖状体を形成する構成要素、すなわち例証される通りのAおよびBの順次適用によって単純に、2つの結合部位の間の距離に自己調整されうる。リンカーは、樹立されたリンカーの核酸末端が、鎖状体間の融点温度よりも低い融点温度で、ssLDNA標識結合分子とハイブリダイズするという点で特徴付けられる。全長リンカーの最終の長さを分析するために、得られた複合体を、第1の融点温度を上回るが、しかし第2の融点温度を下回る第3の温度でインキュベートする。その温度により溶出されたリンカーを標準的な方法により、例えば、エチジウムブロミド染色アガロースゲルを用いて分析することができる。リンカーの長さは、各鎖状体の長さが分かっているので、計算することもできる。個々の鎖状体を1つの態様において標識することができる。二重鎖部分はオリゴヌクレオチドリンカーを強固にしうる。これを用いて、リンカーの可動性および柔軟性を低減することができる。1つの態様において、1つまたは複数のLDNAオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドLDNAリンカーとハイブリダイズされる。この態様において、オリゴヌクレオチドリンカーがLDNA二重鎖形成によって強固にされる。1つの態様において、LDNAポリハイブリッドがリンカーとして用いられる。1つの態様において、LDNADDNAポリハイブリッドがリンカーとして用いられる。1つの態様において、LDNADDNAポリポリペプチドハイブリッドがリンカーとして用いられる。1つの態様において、1つまたは複数のLDNAオリゴヌクレオチドがLDNAポリハイブリッドリンカーとハイブリダイズされる。1つの態様において、さまざまな長さのポリ分子に共有結合的にカップリングされている1つまたは複数のLDNAオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドLDNAポリハイブリッドリンカーとハイブリダイズされる。1つの態様において、LDNADDNAハイブリッドがリンカーとして用いられる。1つの態様において、LDNADDNAハイブリッドがリンカーとして用いられ、ここで1つまたは複数のDDNAオリゴヌクレオチドがリンカーのオリゴヌクレオチドDDNA部分とハイブリダイズされて、二本鎖DDNAを形成する。1つの態様において、LDNADDNAハイブリッドがリンカーとして用いられ、ここで1つまたは複数のLDNAオリゴヌクレオチドがリンカーのオリゴヌクレオチドLDNA部分とハイブリダイズされて、二本鎖LDNAを形成する。二本鎖の、すなわちらせん状の、DNA二重鎖の形成を用いて、複合体のインビボでの半減期を改変または調整し、ヌクレアーゼの酵素作用に応じうるようにすることができる。リンカーを構築する簡単な方法は、標準的なDまたはLヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を用いることである。1つの態様において、dTの一本鎖ストレッチが用いられる。これは有利である。というのは、dTが、塩基保護基を保有する必要がないからである。二本鎖の長さは一本鎖と比べて低減され、かつ二本鎖は一本鎖よりも強固であるので、リンカーの長さおよびスペーサーの柔軟性を変化させるために、ハイブリダイゼーションを用いることができる。ハイブリダイゼーションのために、1つの態様において、官能成分で修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、リンカーとハイブリダイズしない1つもしくは2つの末端延長部を有することができ、およびまたは内向きに分岐される。リンカーとハイブリダイズしていないそのような末端延長部は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。1つの態様において、末端延長部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、エフェクター成分を含むオリゴヌクレオチドである。この標識されたオリゴヌクレオチドは、かさねて、さらなるハイブリダイゼーションを可能とするために末端延長部を含んでもよく、または分岐されていてもよく、それによりポリヌクレオチド凝集体またはデンドリマーを得ることができる。ポリ標識を作製するために、またはエフェクター成分の高い局所濃度を得るために、とりわけ、ポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾ヌクレオチドを、それらのポリヌクレオチドに組み入れることができる。適した修飾ヌクレオチドは、C5置換ピリミジンまたはC7置換7デアザプリンである。ポリヌクレオチドを、エフェクター成分の導入のために用いられる非ヌクレオチド実体を用いて内側でまたは5もしくは3末端で修飾することができる。1つの態様において、そのような非ヌクレオチド実体は、2つの結合対のメンバー間のリンカー内に位置する。ポリヌクレオチドの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド構成要素は、文献において公知であり、多種多様のものが市販されている。エフェクター成分の導入のために、非ヌクレオシド二官能性構成要素または非ヌクレオシド三官能性構成要素のどちらかを、末端標識のためのCPGとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとして用いることができる16671678を参照のこと。二官能性スペーサー構成要素は1つの態様において、非ヌクレオシド構成成分である。例えば、そのようなリンカーはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖である一方で、アルキル、アルケニル、アルキニル鎖は、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよびもしくはアミド成分または四級化陽イオン性アミン成分によって中断されてもよい。1つまたは2つのC1~C6アルキル基で置換されてもよい、C5~C6シクロアルキル、C4N、C5N、C4O、C5Oヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状成分を非ヌクレオシド二官能性リンカーとして用いることもできる。適した二官能性構成要素はC3~C6アルキル成分およびトリ~ヘキサエチレングリコール鎖を含む。表2aおよび2bは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド二官能性スペーサー構成要素のいくつかの例を示す。一方の酸素原子は、酸に不安定な保護基、好ましくはジメトキシトリチルに接続され、他方のものはホスホラミダイトの一部である。表2a表2bそれゆえ、三官能性構成要素はポリヌクレオチド内の任意の位置への官能成分の位置付けを可能にする。三官能性構成要素はまた、ポリヌクレオチドの3末端標識のために用いられる、固体支持体、例えば制御多孔質ガラスを用いた合成のための必要条件である。この場合、三官能性リンカーはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖を介して官能成分または、必要なら、保護官能成分に接続されるが、アルキル、アルケニル、アルキニル鎖は、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよびまたはアミド成分によって中断されてもよく、固相に切断可能なスペーサーを介して付着しているヒドロキシル基および酸に不安定な保護基で保護されているヒドロキシル基を含む。この保護基の除去後、ヒドロキシル基は遊離され、これがその後、ホスホラミダイトと反応しうる。三官能性構成要素は非ヌクレオシドまたはヌクレオシドであってもよい。非ヌクレオシド三官能性構成要素はC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖である一方で、アルキル、アルケニル、アルキニルは、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよびまたはアミド成分によって任意で中断されてもよい。他の三官能性構成要素は、1つまたは2つのC1~C6アルキル基で置換されてもよい、C5~C6シクロアルキル、C4N、C5N、C4O、C5Oヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状基である。環状基および非環状基は1つのアルキルOPG基で置換されうる一方で、C1~C18アルキルはn、m成分を含み、nおよびmは互いに独立して0~6であり、PGは酸に不安定な保護基である。好ましい三官能性構成要素は、任意で1つのアミド結合を含んでよい、かつC1~C6アルキルOPG基で置換されてもよいC3~C6アルキル、シクロアルキル、C5Oヘテロシクロアルキル成分であり、ここでPGは酸に不安定な保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。非ヌクレオシド三官能性構成要素の非限定的な、しかし適した例は、例えば、表3にまとめられている。表3非修飾ポリヌクレオチドと比べてポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を与えないことが必要である場合は常に、内部標識のためにヌクレオシド三官能性構成要素が用いられる。それゆえ、ヌクレオシド構成要素は、相補的塩基とそれでもなおハイブリダイズできる塩基または塩基類似体を含む。本明細書において報告される複合体中に含まれるa、a、b、b、またはSの1つまたは複数の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式を式IIに示す。式II式中、PGは酸に不安定な保護基、とりわけモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、とりわけジメトキシトリチルであり、式中、YはC2~C18アルキル、アルケニル、アルキニルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルはエチレンオキシおよびまたはアミド成分を含んでよく、式中、Yは好ましくは、C4~C18アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、かつ1つのアミド成分を含み、ならびに式中、Xは官能成分である。そのような置換がハイブリダイゼーション特性に及ぼす影響を最小限に抑えるために、塩基の特定の位置が選択されてもよい。それゆえ、以下の位置は置換にとりわけ適しているa天然塩基による置換C5位でのウラシル置換、C5位またはN4位でのシトシン置換、C8位またはN6位でのアデニン置換、およびC8位またはN2位でのグアニン置換、ならびにb塩基類似体による置換C7位での7デアザA置換および7デアザG置換、C7位での7デアザ8アザA置換および7デアザ8アザG置換、C7位での7デアザアザ2アミノA置換、N1位でのプソイドウリジン置換およびN2位でのホルマイシン置換。表4表4において、二官能性成分の末端酸素原子または三官能性成分の末端酸素原子の1つは、詳細には示されていないが、しかし当業者には明らかなホスホラミダイトの一部である。三官能性構成要素のもう1つの末端酸素原子は、上記式IIについて定義のように、酸に不安定な保護基PGで保護される。合成後修飾は、共有結合している官能成分をリンカーに導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構成要素を用いることにより、アミノ基が導入される。支持体からの切断およびアミノ修飾リンカーの精製後、リンカーを官能成分の活性化エステルと反応させるか、または二官能性試薬と反応させる。ここで1つの官能基は活性エステルである。とりわけ適した活性エステルはNHSエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルである。合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定ではない官能成分を導入するためにとりわけ有用である。例としては、Staudingerライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる置換697701、市販のスルホSMCCを用いてマレイニミド基を導入するためのジゴキシゲニンによる修飾である。結合対の構成成分1つの態様において、結合対の各メンバーは、10kDaまたはそれ未満の分子量である/分子量を有する。1つの態様において、結合対の各メンバーの分子量は8kDa、もしくは7kDa、もしくは6kDa、もしくは5kDa、もしくは4kDaまたはそれ未満である。結合対に対する解離定数、すなわち結合親和性は、少なくとも108Mである。本明細書において報告される複合体中の両結合対のメンバーは、異なる。結合対aaとbbとの間の差異は、例えば、相反性結合、例えば、bまたはbへのaおよびaの結合の解離定数が対aaの解離定数の10倍またはそれ以上であるなら、認められる。1つの態様において、相反性結合、すなわちbまたはbそれぞれへの、aおよびaの結合の解離定数は、対aaの解離定数の20倍またはそれ以上である。1つの態様において、解離定数は対aa内での解離定数の50倍またはそれ以上である。1つの態様において、相反性結合の解離定数は結合対内での解離定数の100倍またはそれ以上である。1つの態様において、結合対のメンバーは、ロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイジング核酸配列からなる群より選択される。1つの態様において、両方の結合対がロイシンジッパードメイン二量体である。1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジング核酸配列である。1つの態様において、全ての結合対のメンバーがLDNA配列である。1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジングLDNAである。1つの態様において、結合対の両メンバーがロイシンジッパードメインに相当する。ロイシンジッパードメインという用語は、およそ35残基のストレッチにおける7残基ごとのロイシン残基の存在によって特徴付けられる二量体化ドメインを意味する。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは当初、いくつかのDNA結合タンパク質において特定された17591764。既知のロイシンジッパーのなかには、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、WO9410308に報告されているもの、およびHoppeHJetalFEBSLett344191195に報告されている肺サーファクタントタンパク質Dに由来するロイシンジッパーである。ロイシンジッパードメインは、αヘリックスコイルドコイルによって結び付けられた二量体を形成する。コイルドコイルは1回転あたり35残基を有し、これは、7残基ごとにヘリックス軸に対して等価な位置を占めることを意味する。コイルドコイル内部のロイシンの規則的配列構造が、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用により構造を安定化する。ロイシンジッパードメインが第1の結合対および第2の結合対を形成するなら、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち第1の結合対のメンバーは第2の結合対のメンバーに結合しない。ロイシンジッパードメインは、転写因子などの、そのようなドメインを含むことが知られている天然タンパク質から単離されうる。1つのロイシンジッパードメインは、例えば、転写因子fosに由来し、2つ目のものは転写因子junに由来しうる。ロイシンジッパードメインは、当技術分野において公知の合成および設計のための標準的な技法を用いて、設計され、人工的に合成されてもよい。1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジング核酸配列である。したがって、各結合対のメンバー、すなわちaとaならびにbとbは、それぞれ、互いにハイブリダイズする。一方の第1の結合対に含まれる核酸配列と、他方の第2の結合対に含まれる核酸配列とは異なり、すなわち互いにハイブリダイズしない。1つの態様において、結合対は両方ともにハイブリダイジング核酸対であり、ここで異なる結合対のハイブリダイジング核酸配列は互いにハイブリダイズしない。他の言い方をすると、第1の結合対の核酸同士は互いにハイブリダイズするが、しかし第2の結合対の核酸のいずれにも結合せず、または第2の結合対の核酸同士のハイブリダイゼーションに干渉せず、逆の場合も同じである。ハイブリダイゼーション動態およびハイブリダイゼーション特異性は融点分析によって容易にモニタリングすることができる。当該結合対に対する融解温度が、任意の可能な他の結合対との組み合わせまたは他の結合対メンバー同士の組み合わせと比べて少なくとも20°C高ければ、当該結合対の特異的ハイブリダイゼーションおよび干渉のないことが認められる。結合対を形成する核酸配列は、原理上は、任意の天然に存在する核酸塩基またはそれに対する類似体を含んでよく、原理上は、上記のように修飾骨格または非修飾骨格を有してよいが、ただし複数の塩基対合によって安定な二重鎖を形成できることを条件とする。安定なとは、二重鎖の融解温度が30°Cよりも高い、とりわけ37°Cよりも高いことを意味する。二本鎖は1つの態様において、2つの完全に相補的な一本鎖ポリヌクレオチドからなる。しかしながら、37°Cでの安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。核酸二重鎖は鎖間架橋結合によってさらに安定化することができる。いくつかの適切な架橋結合法、例えばソラレンによるまたはチオヌクレオシドに基づく方法が知られている。結合対のメンバーに相当する核酸配列は1つの態様において、12~50ヌクレオチドからなる。1つの態様において、そのような核酸配列は15~35ヌクレオチドからなる。RNAseは遍在しているので、RNAに基づく結合対およびまたはリンカー配列の望ましくない消化を回避するためには、特別な注意を払わなければならない。RNAに基づく結合対およびまたはリンカーを使用できるが、DNAに基づく結合対およびまたはリンカーがとりわけ適している。適切なハイブリダイジング核酸配列は、3対以上の相反性の相補ポリヌクレオチドを提供するように容易に設計することができ、3つ以上の結合対の簡易な作製および使用を可能にすることができる。本明細書において報告される複合体においてハイブリダイジング核酸配列を用いることの別の利点は、修飾を容易に導入できるということである。例えば官能成分を含むポリヌクレオチドの簡易合成を可能にする、修飾された構成要素が市販されている。そのような官能成分は任意の所望の位置に、かつ第1およびもしくは第2の結合対のメンバーならびにまたはポリヌクレオチドリンカーのいずれかに容易に導入することができるが、ただしそれらは全て、ポリヌクレオチドに相当するということを条件とする。末端に結合対のメンバーを含むリンカーを、提供することができ、単一のポリヌクレオチドとして合成することができる。標的に特異的に結合するポリペプチドを、ハイブリダイジング核酸配列、すなわち結合対のメンバーと、各々、カップリングさせることができる。リンカーの長さは、任意の所望の方法で容易に変化させることができる。標的に特異的に結合するポリペプチドの生化学的性質に依り、結合対のメンバーへのコンジュゲーションのための異なる戦略がいつでも使える。ポリペプチドが天然に存在し、または組換えにより産生され、50~500アミノ酸残基長である場合、当業者は、テキストブックに報告されている標準的な手順に容易にしたがうことができる1003010074を参照のこと。コンジュゲーションのための1つの態様において、ポリペプチド内のシステイン残基とのマレイニミド成分の反応が用いられる。これは、例えば抗体のFABまたはFAB断片が一価結合ポリペプチドとして用いられる場合には、とりわけ適したカップリング化学反応である。1つの態様において、ポリペプチドのC末端と結合対のメンバーとのカップリングが行われる。タンパク質の、例えばFAB断片のC末端修飾を、例えば、記述33613371のように行うことができる。一般に、部位特異的な反応および一価結合ポリペプチドと結合対のメンバーとの共有結合的なカップリングは、ポリペプチドに存在する他の官能基の反応性と直交性である反応性を有するアミノ酸へと天然アミノ酸を変換することに基づく。例えば、稀有な配列コンテクスト内の特定のシステインを、アルデヒドにて酵素的に変換することができる425427を参照のこと。所与の配列コンテクストにおける天然アミノ酸を用いた特定の酵素の特異的な酵素反応性を利用することにより、所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である119126、GautierAetalChemBiol15128136BordusaFinHighlightsinBioorganicChemistrySchmuckCandWennemersHWileyVCHWeinheimpp389403を参照のこと。部位特異的な反応および一価結合ポリペプチドと結合対のメンバーとの共有結合的なカップリングは、適切な修飾試薬との末端アミノ酸の選択的反応によって達成することもできる。ベンゾニトリルとN末端システインとの反応性96589662を参照のことを用いて、部位特異的な共有結合的カップリングを達成することができる。天然型化学的ライゲーション法もC末端システイン残基に依存しうる6596。EP1074563は、正電荷アミノ酸のストレッチに位置するシステインとの負電荷アミノ酸のストレッチ内のシステインの高速反応に基づくコンジュゲーション法について報告している。エフェクター構成成分エフェクター成分は、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、および反応性成分からなる群より選択することができる。2つ以上のエフェクター成分が複合体に存在するなら、各々のそのようなエフェクター成分はいずれの場合にも、独立して、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、または反応性成分でありうる。結合成分は、各結合対との干渉がないように選択される。1つの態様において、エフェクター成分は、結合成分、標識成分、および生物学的に活性な成分からなる群より選択される。1つの態様において、エフェクター成分は結合成分である。結合成分の例は、互いに特異的に相互作用しうるバイオアフィン結合対のメンバーである。適当なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原と抗体アミノビオチン、イミノビオチン、またはデスチオビオチンなどのビオチンまたはビオチン類似体とアビジンまたはストレプトアビジン糖とレクチン、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、受容体とリガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体とステロイドホルモンおよびウシリボヌクレアーゼAの104個のアミノ酸の断片とウシリボヌクレアーゼAの15個のアミノ酸の断片の対である。1つの態様において、エフェクター成分は結合成分であり、複合体の構成成分の少なくとも1つに共有結合されている。1つの態様において、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはポリヌクレオチドは、本明細書において報告される複合体に含まれるポリヌクレオチドの少なくとも1つに共有結合されている。1つの態様において、エフェクター成分は、ハプテン、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチンまたはビオチン類似体ポリヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合成分である。1つの態様において、エフェクター成分は標識基である。標識基は任意の公知の検出可能な基から選択することができる。1つの態様において、標識基は、化学発光基などの発光標識基のような色素、例えばアクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体、ルテニウム錯体もしくはユーロピウム錯体などの発光金属錯体、CEDIA、例えばEP0061888に用いられるような酵素、ミクロ粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。1つの態様において、標識基は発光金属錯体であり、該化合物は一般式の構造を有するMnYXmA式中、Mは、希土類金属イオンまたは遷移金属イオンから選択される二価または三価の金属陽イオンであり、L1、L2およびL3は、同じまたは異なるものであり、かつ窒素原子を介してL1、L2およびL3が金属陽イオンと結合している少なくとも2つの窒素含有複素環を有する配位子を意味し、Xは、リンカーYを介して配位子L1、L2およびL3の少なくとも1つに共有結合された反応性官能基であり、nは1~10、とりわけ1~4の整数であり、mは1または2、とりわけ1であり、Aは電荷を一様にするために必要とされうる対イオンを意味する。金属錯体は1つの態様において、発光金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を起こす金属錯体である。発光反応は、例えば、蛍光測定により、または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体における金属陽イオンは、例えば、遷移金属または希土類金属である。金属は1つの態様において、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムがとりわけ適している。ルテニウムが最も適している。本明細書において報告される複合体中の標識成分として金ナノロッドを用いることもできる。ナノロッドは、10nm~100nmの、10nmと100nmを含めた、およびその間の全ての整数を含めた長さを有することができる。1つの態様において、GNRは70~75nmの平均長を有する。GNRは、5nm~45nmの、5nmと45nmを含めた、およびその間の全ての整数を含めた直径を有することができる。1つの態様において、GNRは25~30nmの平均直径を有する。GNRは純金であり得、または90~99の、90と99を含み、その間の全ての整数を含めた、純金でありうる。さまざまな態様において、GNRはその表面に最大で1の銀を含んでよく、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含んでよい。この関連で、GNRは任意の適当な方法によって作製することができる。例えば、溶液中での電気化学合成、膜テンプレート法、光化学的合成、マイクロ波合成、および種結晶媒介成長は全て、GNRを作製する方法の適当かつ非限定的な例である。1つの態様において、金ナノロッドは、臭化セチルトリメチルアンモニウム中での種結晶媒介成長法を用いて作製される。金ナノロッドおよびRNAポリヌクレオチドの複合体を形成するために、GNRをDNAまたはRNAポリヌクレオチドと静電的に複合体形成させるのに適した正のゼータ電位を与えるよう金ナノロッドの表面を官能化することができる。金ナノロッドに対して正のゼータ電位を生み出す任意の適当な方法が用いられてもよい。例えば、金ナノロッドの表面をチオール化PEGNH2またはチオール化PEGCOOHのような、二官能性分子で官能化することができる。1つの態様において、表面官能化は、CTABによりコーティングされた金ナノロッドを、最初に陰イオン性ポリ電解質のポリポリでコーティングし、その次に陽イオン性ポリ電解質のポリでコーティングすることにより達成される。この結果、陽イオン性の表面電荷を有する金ナノロッドを生じ、また、CTAB層をマスクする1255212557を参照のこと。正電荷を持つ金ナノロッドは、静電相互作用を用いてDNAポリヌクレオチドと静電的に複合体形成される。ナノ粒子複合体の形成は、金ナノロッドの、局在化した縦プラズモン共鳴ピークの赤方偏移の観測から、およびゲル電気泳動を用いたナノ粒子複合体の、制限された電気泳動移動度から確認することができる。1つの態様において、エフェクター成分Xは治療的に活性な物質である。治療的に活性な物質は、例えばがんの阻害、アルキル化による、架橋結合による、またはDNAの二本鎖切断によるDNA鋳型の損傷において有効な、様々な方法を有する。他の治療的に活性な物質はインターカレーションによりRNA合成をブロックすることができる。作用物質のなかには、ビンカアルカロイドのような、紡錘体毒、または酵素活性を阻害する代謝拮抗物質、またはホルモン剤および抗ホルモン剤がある。エフェクター成分は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、ニトロソ尿素、ホルモン剤および抗ホルモン剤、ならびに毒素から選択されうる。適したアルキル化剤はシクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、またはナイトロジェンマスタードである。適した代謝拮抗物質はメトトレキサート、5フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、6チオグアニン、6メルカプトプリンである。適した抗腫瘍抗生物質はドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシン、ニミトキサントロン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンである。適した紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイドであり、ビンカアルカロイドおよびエピポドフィロトキシンはビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチン、エトポシド、テニポシドによって例示されうる。さらに、適したタキサン剤はパクリタキセル、ドセタキセル、SBT1214によって例示されうる。適したニトロソ尿素はカルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンである。適したホルモン剤および抗ホルモン剤は、アドレノコルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン、抗アンドロゲンである。適したランダム合成薬剤はデカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ミトタン、プロカルバジド、シスプラチン、カルボプラチンである。適した単球走化因子はfMetLeuPhe、fMetLeuPheoメチルエステル、ホルミルノルロイシルフェニルアラニン、ホルミルメチオニルフェニルアラニンである。適したNK細胞誘引因子はIL12、IL15、IL18、IL2、およびCCL5、抗体のFC部分である。エフェクター成分は、複合体の構成成分の少なくとも1つに共有結合的にまたはさらなる結合対を介して結合されうる。エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体中に1倍から数倍含まれ得、ここでは整数であり、0または1もしくは2以上である。1つの態様において、は1~1000000である。1つの態様において、は1000~300000である。1つの態様において、は1~50である。1つの態様において、は1~10、または1~5である。1つの態様において、は1または2である。複合体中の構成成分の少なくとも1つへのエフェクター成分の共有結合のために、任意の適切なカップリング化学反応を用いることができる。第1およびもしくは第2の結合対のメンバーならびにまたはリンカーを合成するときに、とりわけポリペプチドまたはリンカーとコンジュゲートされる結合対のメンバーに、適切な構成要素の使用によって官能成分を組み入れることも可能である。実質的に非免疫原性である連結をもたらすコンジュゲーション方法が、とりわけ適している。それゆえ、ペプチド、スルフィド、、ジスルフィド、ヒドラゾン、または他の連結がとりわけ適している。これらの連結は、ほとんど非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す235244WO2009059278WO9517886を参照のこと。1つの態様において、エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体のリンカーに結合される。1つの態様において、エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体のポリペプチドまたはリンカーとコンジュゲートされた結合対のメンバーに共有結合される。エフェクター成分が、ハイブリダイジングポリヌクレオチド内に位置するなら、それを修飾ヌクレオチドに結合させることがとりわけ適しており、またはヌクレオシド間P原子に付着される。二官能性構成要素を用いて、伸長中のポリヌクレオチド鎖の末端ヒドロキシル基へと構成要素を5末端でまたは3末端で付着させるためのホスホラミダイト基に、エフェクター成分または、必要なら、保護されたエフェクター成分を接続することができる。三官能性構成要素を用いて、エフェクター成分または、必要なら、保護されたエフェクター成分、伸長中のポリヌクレオチド鎖の末端ヒドロキシル基へとポリヌクレオチド合成中にレポーターまたはエフェクター成分もしくは、必要なら、保護されたエフェクター成分をカップリングさせるためのホスホラミダイト基、および酸に不安定な保護基で、とりわけジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基を接続することができる。この酸に不安定な保護基の除去後、ヒドロキシル基が遊離し、これはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。エフェクター成分は1つの態様において、第1およびもしくは第2の結合対のメンバーの少なくとも1つに、またはポリヌクレオチドリンカーに、さらなる第3の結合対を介して結合される。1つの態様において、第3の結合対は、ハイブリダイジング核酸配列の対である。第3の結合対のメンバーは、他の結合対のメンバーが互いに行う結合に干渉しない。エフェクター成分が結合されうるさらなる結合対は、とりわけロイシンジッパードメインまたはハイブリダイジング核酸である。エフェクター成分が、第1およびもしくは第2の結合対のメンバーの少なくとも1つに、またはリンカーに、さらなる結合対メンバーを介して結合される場合には、エフェクター成分が結合している結合対メンバー、ならびに第1および第2の結合対のメンバーは、それぞれ、全てが異なる特異性を有するように選択される。第1および第2の結合対ならびにエフェクター成分が結合している結合対のメンバーは各々、他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、その各パートナーに結合する。1つの態様において、結合対およびまたはリンカーの相補的核酸は、少なくとも部分的に、LDNA、もしくはLRNA、もしくはLNA、もしくはイソC核酸、もしくはイソG核酸、またはその任意の組み合わせで作製される。1つの態様において、リンカーは少なくとも50のLDNA、もしくはLRNA、もしくはLNA、もしくはイソC核酸、もしくはイソG核酸、またはその任意の組み合わせで作製される。1つの態様において、リンカーはLポリヌクレオチドである。1つの態様において、LポリヌクレオチドはLDNAである。1つの態様において、リンカーはDNAである。1つの態様において、リンカーはβLDNAもしくはLDNAとしても公知のDNAのL立体異性体または鏡像DNAである。この立体異性DNAは、LDNAの2つの相補的一本鎖の間でのみ二重鎖が形成されるが、しかしLDNAの一本鎖と相補的DDNA鎖との間では二重鎖が形成されないことを意味する、直交ハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性および長いリンカーの合成さえも容易なことなどの利点を特徴とする。合成の容易さおよびスペーサーの長さの可変性は、リンカーライブラリーを提供するために重要である。可変長のリンカーは、最適な長さのポリヌクレオチドリンカーを有した本明細書において報告される複合体を特定するうえで有用であり、したがって、標的に特異的に結合する2つのポリペプチド間の最適な距離を提供する。1つの態様において、複合体は非共有結合複合体である。1つの態様において、非共有結合複合体は結合対によって形成される。いくつかの態様において、エフェクター成分は治療薬である。例えば、エフェクター成分は治療用放射性核種、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、抗体もしくは抗体断片、核酸アプタマー、酵素、ポリペプチド、毒素、細胞毒素、化学療法剤、または放射線増感剤でありうる。本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される複合体を用いる方法である。例えば、本明細書において報告される複合体が、細胞を殺処理するのに十分な量で細胞に投与される、細胞を殺処理する方法が本明細書において報告される。1つの態様において、細胞はがん細胞である。本明細書において報告される複合体が、がん細胞の成長を遅延または停止させるのに十分な量で哺乳類に投与される、哺乳類においてがん細胞の成長を遅延または停止させる方法も本明細書において報告される。1つの態様において、本方法は、がん細胞の成長または増殖を阻害するための方法である。1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、細胞の細胞表面分子に特異的に結合する。1つの態様において、細胞表面分子はがん細胞上に特異的に存在する。1つの態様において、標的に特異的に結合する第1および第2のポリペプチドは互いに独立して、抗体、抗体断片、一本鎖可変領域抗体、小ペプチド分子、環状ポリペプチド、ペプチド模倣体、およびアプタマーからなる群より選択される。1つの態様において、標的に特異的に結合する第1および第2のポリペプチドは、一価結合ポリペプチドである。1つの態様において、ポリペプチドが特異的に結合する細胞表面分子は、plgR、plgRstalk、アポリポタンパク質、サイトカイン受容体、Toll受容体またはToll様受容体、受容体チロシンキナーゼ、スカベンジャー受容体、GPI連結タンパク質、糖脂質、スフィンゴ糖脂質、セラミド、セレブロシド、トランスフェリン受容体、トランスフェリン受容体に結合したトランスフェリン、トランスフェリン受容体に結合したアポトランスフェリン、ビタミンB12受容体、FcRn、PGDFおよびVEGF受容体ファミリーのメンバー、アクアポリン、高密度リポタンパク質結合タンパク質、カドヘリン、ならびに低密度リポタンパク質受容体からなる群より選択される。1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの標的は、白血球マーカーCD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD44、CD45およびアイソフォーム、CDw52、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA4、LFA1、TCR、her2neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリンCMV糖タンパク質B、H、およびgCIII、HIV1外被糖タンパク質、RSV外被糖タンパク質、HSV外被糖タンパク質、HPV外被糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原を含む群より選択される。細胞へのエフェクター成分の効率的な、標的化された送達を達成するために、直接、細胞の表面上の標的に特異的に結合するポリペプチドを用いることができる。1つの態様において、ポリペプチドは抗体断片である。1つの態様において、抗体断片は、細胞表面分子に特異的に結合する内在化抗体に由来する。本明細書において報告される複合体とエフェクター成分とのコンジュゲーションは、細胞上の所望の部位でのエフェクター成分の特異的な局在化を可能にする。局在化は標的細胞上のエフェクター成分の有効濃度を増大し、それによってエフェクター成分の効果を最適化する。さらに、複合体は非標的化エフェクター成分と比べて低い用量で投与することができる。これは、エフェクター成分が付随した毒性を有する場合、または慢性疾患の処置において用いられる場合、特に関連しうる。LDNAは、本明細書において報告される複合体の形成において有用なヌクレオチドである。LDNAは、それ自体、天然に存在する形態のDNAまたはRNAとハイブリダイズしない。LDNAは多くの酵素の天然基質ではないため、インビボでのLDNAの安定性はDDNA安定性よりも高くなりうる。LDNA二重鎖はDDNAと溶解性、二重鎖安定性および選択性という点で同じ物理的特性を有するが、しかし左らせん状の二重らせんを形成する。本明細書において用いられるLポリヌクレオチドは、若干のDポリヌクレオチドを含んでもよいものと理解されるべきである。Lポリヌクレオチドの化学的性質のために、Lポリヌクレオチドの使用の根底にある薬物動態が、DNA特異的な分解過程の影響を受ける程度にまではならず、または少なくともその影響を受ける程度にまではならず、その程度にまでLポリヌクレオチドが代謝されることはない。Lポリヌクレオチドの安定性の増大を考えると、哺乳類での本明細書において報告される複合体のインビボ半減期は、かくして、事実上、無制限である。特に重要なのは、Lポリヌクレオチドが腎毒性ではないという事実である。1つの態様において、哺乳類はヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、またはマウスから選択される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーはDDNAおよびLDNAヌクレオチドを含み、すなわちポリヌクレオチドリンカーはDDNAおよびLDNAの混合物である。このリンカーを用いて、ポリヌクレオチドリンカーの半減期を操作することが可能であり、すなわち、オリゴヌクレオチドリンカーのインビボ半減期を複合体の対象用途に対して個別化かつ調整することができる。本明細書において報告される複合体に存在するポリヌクレオチドの各々が、1つまたは複数のエフェクター成分を含むことができる。エフェクター成分は疾患の処置での本明細書において報告される複合体の使用を可能にする。エフェクター成分は、例えば担体の目的のために、すなわちエフェクター機能の送達のために、およびまたは薬物動態的挙動の調節のために、およびまたは物理化学的特性の調節のために用いることができる。1つの態様において、エフェクター成分は親油性成分、ペプチド、タンパク質、炭水化物およびリポソームから選択される。1つの態様において、ポリヌクレオチドはLポリヌクレオチドである。Lポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドとしてまたは二本鎖ポリヌクレオチドとして存在することができる。典型的には、Lポリヌクレオチドは、二次構造、およびまた、三次構造を形成しうる一本鎖核酸として存在する。そのような二次構造には、また、二本鎖ストレッチが存在することもある。しかしながら、Lポリヌクレオチドは、互いに相補的である2つの鎖がハイブリダイズされるという意味で少なくとも部分的に二本鎖分子として存在することもできる。Lポリヌクレオチドは修飾されてもよい。修飾はポリヌクレオチドの個々のヌクレオチドに関連しうる。二次構造の形成を回避するために、1つの態様において核酸塩基として24ジヒドロキシ5メチルピリミジンを用いることができる。本明細書において報告される複合体中のLポリヌクレオチドは1つの態様において、自己ハイブリダイゼーションを起こしやすい。したがって、Lポリヌクレオチドは相補的Lポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることがさらに容易に可能であるが、しかし天然DNAまたはRNAとは安定な二重鎖を形成しない。1つの態様において、LDNAセグメントにおけるヌクレオチドは1S、3R、および4Sの高次構造を有する。1つの態様において、LDNAポリヌクレオチドリンカーは、その末端の結合対のメンバーと複合体のポリペプチドとのハイブリダイゼーションによって、コンジュゲートされる。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも1nmの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、6nm~100nmの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも70ヌクレオチドの長さを有する。ポリヌクレオチドリンカーはタグ配列を含んでもよい。タグ配列はのような一般的に用いられるタンパク質認識タグから選択されうる。かくして、本明細書において報告される方法の1つの態様において、エフェクター成分を含まない本明細書において報告される複合体を最初に投与し、その標的に結合させ、その後、リンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートされたエフェクター成分を投与する。それによって、エフェクター成分はインサイチューで、本明細書において報告される複合体とハイブリダイズすることによりその標的に結合された複合体と共に位置付けられる。本明細書において報告される複合体が、いずれかの特定の核酸配列に、もしくは標的に特異的に結合するいずれかのポリペプチドに、または特定の細胞種に、もしくは特定の条件に、もしくは特定の方法などに限定されず、したがって変わることもあり、その中の多数の修飾および変形が当業者には明らかなことが理解されるべきである。本明細書において報告される方法の1つの態様において、複合体は腫瘍細胞の細胞表面に結合し、高い密度または高い局所濃度のエフェクター成分にまで局所的に濃縮する。1つの態様において、エフェクター成分は標識されたssLDNAであり、これは複合体の初期標的会合と同時にまたは複合体の初期標的結合に続いて投与される。標識されたssLDNAエフェクター成分は、複合体のssLDNAリンカーとハイブリダイズする。標的結合複合体を用いて、先天性免疫反応を活性化する、すなわち、ナチュラルキラー細胞とも呼ばれる、細胞傷害性リンパ球を誘引する。NK細胞は腫瘍およびウイルスに感染した細胞の拒絶において主要な役割を果たす。それらは、アポトーシスによって標的細胞を死滅させるグランザイムおよびパーフォリンと呼ばれるタンパク質の細胞質小顆粒を放出させることにより細胞を殺処理する。1つの態様において、本明細書において報告される複合体を用いて、結合した複合体のすぐ近くにNK細胞を誘引する。1つの態様において、サイトカインとコンジュゲートされたssLDNAをエフェクター成分として用いる。このサイトカイン標識エフェクター成分を用いて、NK細胞を誘引することができる。NK活性化に関わるサイトカインには、IL12、IL15、IL18、IL2、およびCCL5が含まれる。1つの態様において、抗体のFc部分とコンジュゲートされたssLDNAをエフェクター成分として用いる。NK細胞は、マクロファージおよびいくつかの他の細胞種とともに、Fc受容体分子、つまり抗体のFc部分に結合する活性化生化学的受容体を発現する。これは、NK細胞を、液性反応が動員された細胞に標的指向させ、NK細胞に、抗体依存性細胞傷害を通じて細胞を溶解させる。1つの態様において、1つもしくは複数のFc部分とコンジュゲートされたssLDNAの1つもしくは複数または組み合わせをエフェクター成分として用いる。この態様において、複合体を用いて、ADCCおよびまたは補体活性化を調節することができる。1つの態様において、遺伝子操作されたFc区画を、ADCCおよびCDCに関与するその効力についてスクリーニングする方法において、この複合体を用いる。1つの態様において、複合体を用いて、精液ホスファターゼを阻害する。この態様において、複合体を用いて、NK細胞不活化を回避することができる。1つの態様において、細胞表面分子に特異的に結合する抗体または抗体断片のような、標的に特異的に結合するポリペプチドは、標的受容体のリガンドまたは標的を提示している細胞への複合体の取り込みを増大するために細胞のエンドサイトーシス機構によっていっそう容易に取り込まれる大分子とコンジュゲートされる。標的に結合した複合体はその後、エンドサイトーシスにより内在化され、エフェクター成分が細胞の内部で放出されうる。標的に特異的に結合するポリペプチドは1つの態様において、抗体断片である。一本鎖可変領域断片またはscFvという用語は、軽鎖および重鎖の部分が抗原結合部位を形成することを可能とするのに十分な長さを有する共有結合によってともに連結された単一の抗体軽鎖および単一の抗体重鎖の可変の、抗原結合領域を意味する。そのようなリンカーは共有結合と同じくらい短くてもよい。とりわけ適したリンカーは、2~50アミノ酸残基、およびとりわけ5~25アミノ酸残基を含む。他の抗体断片はHolligerPら9064446448によって最初に記述されたダイアボディである。これらは、抗体の重鎖および軽鎖を用いて、ならびに抗体の個々のCDR領域を用いることによって構築されうる。典型的には、ダイアボディは、短すぎて同じ鎖上の2つのドメイン間での対合を可能としえないリンカーによって軽鎖可変ドメインに接続された重鎖可変ドメインを含む。したがって、1つの断片のVHおよびVLドメインを別の断片の相補的VHおよびVLドメインと対合させ、それにより2つの抗原結合部位を形成させる。トリアボディを3つの抗原結合部位で同様に構築することができる。Fv抗体断片は、非共有結合性相互作用によって結び付けられたVLドメインおよびVHドメインを含んだ完全な抗原結合部位を含む。Fv断片はまた、VHおよびVLドメインがグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド結合、または他のリンカーを通じて架橋されている構築体を含む。重鎖および軽鎖の可変ドメインをともに融合させて、親抗体のもともとの特異性を保持している一本鎖可変断片を形成させることができる。GruberMetalJImmunol15253685374によって最初に記述された一本鎖Fv二量体は、抗体の重鎖および軽鎖を用いて、ならびに抗体の個々のCDR領域を用いることによって構築されうる。当技術分野において公知の多くの技法を用いて、本明細書において報告される複合体において適した特異的な結合性構築体を調製することができる。二重特異性抗体は、化学的架橋結合によりまたはハイブリッドハイブリドーマ技術により作製することができる。あるいは、二重特異性抗体分子は、組換え技法によって産生することもできる。二量体化は、VHおよびVLドメインをつなぎ合わせるリンカーの長さを、scFv断片の産生のために日常的に用いられる約15アミノ酸から、約5アミノ酸にまで減らすことによって促進されうる。これらのリンカーはVHおよびVLドメインの鎖内アセンブリに有利に働く。適当な短いリンカーはSGGGSであるが、しかし他のリンカーを用いることができる。かくして、2つの断片が二量体分子へアセンブルする。リンカーの長さを0~2アミノ酸残基にまでさらに減らすことにより、三量体または四量体分子を作製することができる。1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチド、例えば細胞表面受容体に特異的に結合する抗体を、標的受容体のリガンドまたは細胞のエンドサイトーシス機構によっていっそう容易に取り込まれる大分子に連結させることができる。この態様において、複合体を用いて、標的を提示している細胞への複合体の取り込みを増大させることができる。標的に結合した複合体はその後、エンドサイトーシスにより内在化され、エンドサイトーシス小胞がリソソームと融合する際に、エフェクター成分が酸加水分解または酵素活性により放出されうる。本明細書において報告される複合体を用いて、エフェクター成分を細胞内におよび細胞外に送達することができる。複合体を用いて、がん細胞をインサイチューで認識し、それらを、標的化治療用物質の開発に向けた魅力的な候補にすることができる。構成成分と別の構成成分との非共有結合が望ましい場合、利用されうる適切な結合性相互作用は、抗体抗原、受容体ホルモン、アビジンビオチン対、ストレプトアビジンビオチン、金属キレート、小分子ポリヌクレオチド22152235ZahnZYandDervanPBBioorgMedChem824672474を参照のことポリヌクレオチド相補的ポリヌクレオチド、アプタマー小分子、アプタマーポリペプチド、コイルドコイル、ならびにポリヌクレオチドポリペプチドヘリックス、ロイシンジッパーおよびヘリックスループヘリックスモチーフを含むが、これらに限定されることはない。本明細書において報告される複合体を用いて、治療薬、放射線を放出する構成成分、植物、真菌または細菌由来の分子、生体タンパク質、およびその混合物を含む細胞毒性薬のような種々のエフェクター成分を細胞に送達することができる。例えば、細胞毒性薬は、例えば、短距離、高エネルギーのα放射体を含め、短距離の放射線放射体のような、細胞内で作用する細胞毒性薬でありうる。1つの態様において、エフェクター成分は、薬物を封入しているリポソーム、免疫系の構成成分による結合細胞の認識を刺激する抗原、免疫系の構成成分に特異的に結合し、かつそれらを細胞へ向かわせる抗体などである。1つの態様において、エフェクター成分は、細胞に及ぼす電離放射線の細胞傷害効果を増強する放射線増感剤を含むことができる。1つの態様において、エフェクター成分は単球走化因子、もしくはfMetLeuPhe、もしくはfMetLeuPheoメチルエステル、もしくはホルミルノルロイシルフェニルアラニン、もしくはホルミルメチオニルフェニルアラニン、またはその誘導体から選択される。1つの態様において、エフェクター成分は反応基である。反応基はアミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニルまたはアルケニルのような、任意の公知の反応基から選択することができる。1つの態様において、反応基はマレイニミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。作用機序がエフェクター成分としてのfMLPの場合のようなエフェクターの高い局所濃度を標的に対して作ることに依るなら、リンカー実体のLDNAの性質は、同じまたは異なるエフェクター成分で修飾された第2のLDNAオリゴヌクレオチドとの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。第2のLDNAに結合されるエフェクター成分の数は、単一のエフェクター修飾LDNAによって誘導される反応がないため、限定される必要がある。望ましいなら、第2のLDNAは、同じまたは異なるエフェクター成分で修飾された第3のLDNAオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズできるさらなる部位を含む。ある二重鎖を他の二重鎖の存在下において特異的に形成する多くの異なる配列を選択することは容易であるので、多量体複合体は容易に構築されうる。多量体複合体は、重複配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて直鎖状の多量体複合体を形成させることにより、または分岐したオリゴヌクレオチドを用いることにより構築することができ、ここで分岐は、樹枝状の多量体複合体の形成をもたらす第3のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。1つの態様において、エフェクター成分はα放射体、すなわち、α粒子を放射する放射性同位体である。適当なα放射体はBi、213Bi、211Atなどを含むが、これらに限定されることはない。エフェクター成分はリガンド、エピトープタグ、または抗体を含むこともできる。酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A由来、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサクリン、特定のシナアブラギリタンパク質、特定のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ならびにエノマイシンから選択することができる。1つの態様において、高密度のケージ化エフェクター成分で修飾された1つまたは複数のLDNAオリゴヌクレオチドが、LDNAリンカーとハイブリダイズされる。がん細胞はさまざまな形で正常細胞とは異なり、そのうちの1つが細胞表面の分子組成である。表面の化学的性質の変化により、がん細胞は、成長および生存の外部シグナルに効率的に反応することが可能になり、種々の宿主組織要素と直接相互作用して、移動し、血液循環に侵入し、浸出し、遠隔部位に定着することが可能になる。悪性細胞のマーカーとして働くことに加えて、腫瘍細胞表面分子は、血流または細胞外空間に投与された標的指向分子に対するその相対的に容易な接近可能性のため、治療に有益な標的である569578。企図される腫瘍特異抗原は、CEA、CD20、HER1、HER2neu、HER3、HER4、PSCA、PSMA、CA125、CA199、cMet、MUC1、RCAS1、EpCAM、MelanAMART1、RHAMM、VEGF、EGFR、インテグリン、フィブロネクチンのEDB、ChL6、Lym1、CD1b、CD3、CD5、CD14、CD20、CD22、CD33、CD52、CD56、TAO72、インターロイキン2受容体、フェリチン、神経細胞接着分子、黒色腫関連抗原、ガングリオシドGm、EOF受容体、テネイシン、cMetを含むが、これらに限定されることはない。1つの態様において、抗体は、細胞表面受容体上の翻訳後修飾された標的に特異的に結合する。1つの態様において、翻訳後の標的はリン酸化またはグリコシル化により修飾される。1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、同じまたは重複するエピトープに結合する。ポリヌクレオチドリンカーにより互いに連結されている、標的に特異的に結合する2つの一価ポリペプチドからなる複合体であって、第1のポリペプチドが標的のポリペプチドエピトープに結合し、第2のポリペプチドが翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、各一価結合剤が102秒~103秒の範囲のKdissを有する、104秒以下のKdissを有する該複合体によって、翻訳後修飾された標的ポリペプチドが検出できることが分かった。異なるタイプの共有結合性のアミノ酸修飾が知られている。例えば、MannandJensenによりおよびSeoandLeeにより報告された翻訳後修飾は、参照255261SeoJandLeeKJBiochemistryandMolecularBiology3713544により本明細書に含まれる。1つの態様において、翻訳後修飾は、アセチル化、リン酸化、アシル化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、硫酸化およびニトロ化からなる群より選択される。アセチル化は、かなり安定な二次修飾である。例としては、多くのタンパク質のN末端に見出されるアセチル化またはリジンもしくはセリン残基上のアセチル化がある。通常、リジン残基のアセチル化はポリペプチド鎖内の1つまたは複数の明確に規定された位置に見出されるが、他のリジン残基はそれほど頻繁にはまたは全くアセチル化されない。タンパク質のリン酸化および脱リン酸化は、タンパク質の生物活性の調節において重要な要素の1つであることが知られている。低い割合のリン酸化アミノ酸残基が、特定の生物活性を誘発するのに既に十分なこともある。リン酸化は80Daの質量増加をもたらす。アミノ酸のチロシン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸がリン酸化されうる。ポリペプチドの生物学的機能が複雑であるほど、それに対応する、リン酸化の可能性がある部位のパターンも複雑になる。これは膜結合受容体、とりわけ、いわゆる受容体チロシンキナーゼについてとりわけ知られ、当てはまる。その命名から既に示唆されるように、RTKの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部は、そのようなRTKの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態によって媒介される。ポリペプチドはファルネシル基、ミリストイル基またはパルミトイル基によってアシル化されてもよい。アシル化は、通常、システイン残基の側鎖上で起こる。二次修飾としてのメチル化は、リジン残基の側鎖を介して起こる。核酸に結合できる調節タンパク質の結合特性は、例えば、メチル化を介して調節されうることが示されている。グリコシル化は一般的な二次修飾である。これはタンパク質タンパク質相互作用に、タンパク質の可溶化に、その安定性にも大きな影響を及ぼす。2つの異なるタイプのグリコシル化が知られているN結合型を介した側鎖およびO結合型側鎖またはトレオニンを介した。OGlcNAcのような糖誘導体を含むものもある、多くの異なる多糖が特定されている。ユビキチン化およびSUMO化は、それぞれ、血液循環中でのタンパク質の半減期に影響を及ぼすことが知られている。ユビキチン化は破壊シグナルとして働き、ユビキチン化ポリペプチドの切断およびまたは除去をもたらしうる。チロシン残基を介した硫黄化は、タンパク質タンパク質相互作用の調節において、ならびにリガンド相互作用において重要であるものと考えられる。チロシン残基のニトロ化は、例えば炎症過程などでの、酸化的損傷の特徴であるものと考えられる。Lデオキシヌクレオシドホスホラミダイト単位LdT、LdC、LdAおよびLdGは、文献にしたがって調製することができる33253332ShiZDetalTetrahed5832873296を参照のこと。Lデオキシリボース誘導体は、8段階を通じてLアラビノースから合成することができる。LデオキシヌクレオシドはLデオキシリボース誘導体での適切な核酸塩基誘導体のグリコシル化によって得ることができる。ヌクレオシドホスホラミダイトへの誘導体化の後、それらを固相DNA合成法によってオリゴデオキシヌクレオシドに組み入れることができる。逆相HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動によってオリゴマーを精製することができる。LDNAは、標準的な合成プロトコルを用いることによってDNAのように大規模合成することができる。scFv抗体断片の発現および精製の場合、scFvをコードする核酸を、scFvのC末端の位置にcmycエピトープタグおよびヘキサヒスチジンタグの付加をもたらしうる、pUC119mycHisのような、発現およびまたは分泌ベクターにクローニングすることができる。免疫組織化学用の2二量体40264034を作製するため、cmycエピトープタグをpUC119mycHisから遺伝学的に除去することができ、遊離システインをヘキサヒスチジンタグに先行するscFvのC末端の位置に導入することができる。scFvまたは2二量体タンパク質を細菌ペリプラズムから収集し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製することができる109118。あるいは、scFvは、scFvをコードする構造遺伝子を、C末端の位置にcmycおよびヘキサヒスチジンタグを付与する発現ベクターに導入することによって産生することもできる704710。可溶性2を産生するため、第2のベクターを用いて、C末端の位置にシステインおよびヘキサヒスチジンタグを付与することができる。IPTG誘導の後、抗体断片を細菌細胞膜周辺腔からニトリロ三酢酸ニッケルビーズ上に精製することができる。FACSおよび免疫組織化学研究の場合、EZLinkSulfoNHSLCBiotinを製造元の使用説明書にしたがって用い、scFvをビオチン化することができる。解離定数の決定の場合、10FCSを補充したRPMI1640などの適当な培地中で、各標的表面分子を発現している細胞株を90の集密度まで増殖させることができる。細胞を2mmollEDTAPBS中のトリプシンでの短時間の消化によって収集することができる。ビオチン化scFvをPBS025ウシ血清アルブミン中にて4°Cで4時間105個の細胞とともにインキュベートすることができる。結合したscFvをストレプトアビジンフィコエリトリンによって検出することができ、FACSによって分析することができる。データを曲線適合させることができ、GraphPadPrismを用いてKD値を計算することができる。免疫組織化学の場合、凍結およびまたはパラフィン包埋ブロック由来の組織切片を用いることができる。免疫組織化学分析の場合、組織切片を4時間4°Cで精製二量体scFvとともにインキュベートし、PBSで洗浄し、400分の1に希釈した抗6抗体、引き続き400分の1に希釈したビオチン化抗抗6抗体および400分の1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンとともにインキュベートすることができる。基質としてジアミノベンジジンを用いて、結合を検出することができる。あるいは、試験組織および対照組織の凍結切片を1時間室温でビオチン化scFvで染色することができる。FACSによって試験細胞株に結合しないscFvを、全ての実験の対照として用いることができる。結合したscFvは、33ジアミノベンジジン基質を用いてストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼにより検出することができる。染色された組織をヘマトキシリンで対比染料し、70、95および100エタノール中で乾燥し、マウントし、分析することができる。HER2過剰発現および増幅を検出するための免疫組織化学および蛍光インサイチューハイブリダイゼーションに関しては、特にUS20030152987を参照されたい。内在化の判定の場合、以下の手順を用いることができる。蛍光顕微鏡検査実験の場合、細胞を24ウェルプレート中で約80の集密度まで増殖させ、37°Cで4時間11ジオクタデシル3333テトラメチルインドカルボシアニン55ジスルホン酸で標識された非標的化または標的化複合体とともに同時にインキュベートすることができる。細胞をPBSで洗浄し、NikonEclipseTE300蛍光顕微鏡で調べることができる。FACS分析の場合、細胞を2時間37°Cで11ジオクタデシル3333テトラメチルインドカルボシアニン55ジスルホン酸標識複合体とともにインキュベートし、表面に結合したリポソームを除去するために5分間室温でグリシン緩衝液に曝露し、FACSによって分析することができる。平均蛍光強度値を用い、全細胞会合リポソームと比べて内在化リポソームの割合を計算することができる。増殖阻害および内在化アッセイの場合、約30~80の集密度のがん細胞を、1FCSを含有する培地中にて72時間37°Cで、さまざまな濃度のアフィニティー精製複合体とともにインキュベートすることができる。テトラゾリウム塩32イル25ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイを用いて増殖状態を評価することができ、KaleidaGraph35を用いてIC50を計算することができる。内在化アッセイの場合、複合体をスルホNHSLCビオチンでビオチン化し、さまざまな時間37°Cで標的細胞とともにインキュベートすることができる。細胞を100mMグリシン緩衝液で洗浄し、2ホルムアルデヒドで固定し、氷冷100メタノールで透過処理し、ストレプトアビジンFITCとともにインキュベートすることができる。染色された細胞を最初に、Axiophot蛍光顕微鏡で調べ、LeicaTCSNT共焦点レーザー蛍光顕微鏡でさらに観察することができる。毒性の判定の場合、細胞を96ウェルプレート中に1ウェルあたり6000個でプレーティングし、37°Cで2時間さまざまな濃度の本明細書において報告される複合体とともにインキュベートすることができる。複合体の除去後、細胞を、10FCSを補充したRPMI1640で1回洗浄し、37°Cでさらに70時間インキュベートすることができる。CellCountingKit8を製造元の使用説明書にしたがって用い、細胞生存をアッセイすることができる。データは、非処理対照細胞のものと比べた生存細胞の割合として表すことができる。インビトロでの細胞毒性の判定の場合、がん細胞を96ウェルプレート中に播種し、37°Cで4時間、本明細書において報告される複合体とともにインキュベートすることができる。細胞を、補充RPMI1640で2回洗浄して薬物を除去し、37°Cでさらに72時間、新鮮培地とともにインキュベートすることができる。325ジフェニルテトラゾリウムブロミド染色を用いて細胞生存をアッセイすることができ936942、マイクロタイタープレートリーダーを用いて570nmで結果を読み取ることができる。Cellcountingkit8を製造元の使用説明書にしたがって用い、細胞生存を判定することができる。細胞内送達のアッセイの場合、以下の方法を用いることができる。細胞内複合体送達を評価するために、複合体を1μgmlの精製6タグ付scFvとともに細胞に加え、30分間37°Cでインキュベートし、1mMEDTAを含有する生理食塩水で3回洗浄して、内在化することができなかった細胞表面結合複合体を除去することができる。複合体の取り込みを、Gemini顕微蛍光光度計を用いた顕微蛍光測光により、および倒立蛍光顕微鏡により判定することができる。組換え方法および組成物一般に、抗体断片または結合対のメンバーのようなポリペプチドは、例えば、US4816567に記述されているように、組換え方法および組成物を用いて産生されうる。1つの態様において、本明細書において報告される複合体の各ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列およびもしくはVHを含むアミノ酸配列ならびにまたは結合対のメンバーのアミノ酸配列をコードしうる。1つの態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つの態様において、以下を含む宿主細胞が提供される抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだベクター、または抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだ第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだ第2のベクター。1つの態様において、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはリンパ系細胞である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現の場合、例えば、US5648237、US5789199、およびUS5840523、CharltonMethodsinMolecularBiologyVol248BKCLoHumanaPressTotowaNJpp245254を参照されたい。発現後、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような有用真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である14091414、およびLiHetalNatBiotech24210215を参照のこと。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。脊椎動物細胞が宿主細胞として用いられてもよい。例えば、浮遊状態で増殖するように適合された哺乳類細胞株が有用でありうる。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株、ヒト胚腎臓株、ベビーハムスター腎細胞、マウスセルトリ細胞243252に記述されているTM4細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頸がん細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳腺腫瘍細胞、例えば、MatherJPetalAnnalsNYAcadSci3834468に記述されているTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、DHFRCHO細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣細胞42164220、ならびにY0、NSOおよびSp20のような骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、YazakiandWuMethodsinMolecularBiologyVol248pp255268を参照されたい。本明細書において報告される複合体のポリペプチドを産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。ハムF10、最小必須培地、RPMII640、およびダルベッコ改変イーグル培地Sigmaのような、市販されている培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、HamRGetalMethEnzymol584493、BarnesDetalAnalBiochem102255270、US4767704、US4657866、US4927762、US4560655、US5122469、WO9003430、WO8700195、およびUSRe30985に記述されている培地のいずれかが宿主細胞に対する培地として用いられてもよい。これらの培地のいずれにも必要に応じて、ホルモンおよびまたは他の成長因子、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質薬など、微量元素、ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源が補充されてもよい。任意の他の必要な補充物質が、当業者に知られている適切な濃度で含まれてもよい。温度、pHなどのような、培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。組換え技法を用いる場合、ポリペプチドは細胞内で、細胞膜周辺腔中で産生され、または培地中に直接分泌されうる。ポリペプチドが細胞内で産生されるなら、最初の段階として、宿主細胞または溶解断片のどちらかの、微粒子状残屑を、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去する。例えば、CarterPetalBioTechnology10163167は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順について記述している。手短に言えば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウムEDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下で約30分間かけて融解する。細胞残屑を遠心分離によって除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現系由来の上清を一般に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばAmiconまたはMilliporePellicon限外ろ過ユニットを用いて最初に濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにPMSFのようなプロテアーゼ阻害剤を前記の段階のいずれかに含めてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するために抗生物質を含めてもよい。細胞から調製されたポリペプチド組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい抗体精製技法である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインAを用いて、ヒトγ1、γ2またはγ4重鎖に基づく抗体を精製することができる113。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプの場合におよびヒトγ3の場合に推奨される15671575。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、ほとんどの場合はアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、BakerbondABX樹脂が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンHAROSE上のクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマト分画、SDSPAGE、および硫安沈殿のような、他のタンパク質精製技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。任意の予備的な精製段階の後、関心対象のポリペプチドおよび夾雑物を含む混合物は、約25~45のpHの溶出緩衝液を用いた、とりわけ、低い塩濃度で行われる低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されうる。本明細書において報告される複合体およびその個々の構成成分は、所望のように単離および精製されうる。複合体が形成される反応混合物の不要な構成成分は、例えば、所望とされる複合体に行き着かなかったものの、その構成要素を構成するポリペプチドおよびポリヌクレオチドである。1つの態様において、複合体は分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって判定した場合に80超の純度まで精製される。いくつかの態様において、複合体は分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって判定した場合に、それぞれ、90重量、95重量、98重量、または99重量超の純度まで精製される。純度は、あるいは、例えば、還元または非還元条件下のSDSPAGEにより、例えば、タンパク質検出時にクマシーブルー染色または銀染色を用いて容易に判定されうる。純度が複合体レベルで評価される場合、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して、複合体を副生成物から分離することができ、260nmのODをモニターして、その純度を評価する。イムノコンジュゲート本明細書において、標的に特異的に結合するポリペプチドまたはリンカーの少なくとも1つが1つまたは複数のエフェクター成分、例えば化学療法剤もしくは化学療法薬のような、細胞毒性剤、増殖阻害剤、毒素、あるいは放射性同位体とコンジュゲートしている複合体も提供される。1つの態様において、エフェクター成分は、メイタンシノイド、モノメチルアウリスタチン薬成分DEおよびDFのようなアウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはその誘導体33363342、LodeHNetalCancerRes5829252928を参照のこと、ダウノマイシンまたはドキソルビシンのようなアントラサイクリン477523、JeffreySCetalBioorgMedChemLetters16358362、TorgovMYetalBioconjugChem16717721、NagyAetalProcNatlAcadSciUSA97829834、DubowchikGMetalBioorgMedChemLett1215291532、KingHDetalJMedChem4543364343、およびUS6630579を参照のこと、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル、トリコテセン、ならびにCC1065を含むが、これらに限定されない、薬物である。1つの態様において、エフェクター成分は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素またはその断片である。1つの態様において、エフェクター成分は、放射性原子である。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲートの産生のために利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出のために用いられる場合、それは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばTc99mもしくはI123、または核磁気共鳴画像法のためのスピン標識、例えば、ここでもI123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含んでもよい。エフェクター成分は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばNスクシンイミジル3プロピオネート、スクシンイミジル4シクロヘキサン1カルボキシレート、イミノチオラン、イミドエステルの二官能性誘導体、活性エステル、アルデヒド、ビスアジド構成成分ヘキサンジアミン、ビスジアゾニウム誘導体エチレンジアミン、ジイソシアネート、および二活性フッ素構成成分を用い本明細書において報告される複合体の任意の構成成分とコンジュゲートさせることができる。例えば、リシン免疫毒素は、VitettaESetalScience23810981104に記述されているように調製することができる。炭素14標識1イソチオシアナトベンジル3メチルジエチレントリアミン五酢酸は、複合体との放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。本明細書において報告される複合体と毒性成分をコンジュゲートさせるためのリンカーは、細胞中での細胞毒性薬の放出を容易にする切断可能なリンカーでありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー127131、US5208020を用いることができる。エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体の化合物とコンジュゲートされてもよいが、しかし市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LCSMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホEMCS、スルホGMBS、スルホKMUS、スルホMBS、スルホSIAB、スルホSMCCおよびスルホSMPB、ならびにSVSBベンゾエートを含むが、これらに限定されない、架橋試薬で調製されたそのようなコンジュゲートに限定されない。複合体依存性酵素媒介プロドラッグ療法本明細書において報告される複合体は、プロドラッグを活性な抗がん薬に変換するプロドラッグ活性化酵素であるエフェクター成分を用いることによりCDEPTにおいて用いられてもよい。CDEPTに有用な複合体の酵素構成成分は、プロドラッグをそのさらに活性な細胞毒性形態に変換するようにプロドラッグに作用できる任意の酵素を含む。本発明の方法において有用である酵素は、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、無毒性の5フルオロシトシンを抗がん薬の5フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシンのような、プロテアーゼ、Dアミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なDアラニルカルボキシペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素、βラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβラクタマーゼ、ならびにアミン窒素の位置で、それぞれ、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼなどの、ペニシリンアミダーゼを含むが、これらに限定されることはない。あるいは、当技術分野においてアブザイムとしても公知の、酵素活性を有する抗体を用いて、本明細書において報告されるプロドラッグを遊離活性薬に変換することもできる457458を参照のこと。複合体アブザイムコンジュゲートは、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために本明細書において記述されるように調製することができる。酵素は、上記のヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような、当技術分野において周知の技法によって複合体に非共有結合的にまたは共有結合的に結合されうる。あるいは、酵素の少なくとも機能的に活性な部分と連結している抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質が、当技術分野において周知の組換えDNA技法を用いて構築されてもよい604608を参照のこと。診断および検出のための方法および組成物特定の態様において、本明細書において提供される複合体のいずれも、生物学的サンプル内での、複合体中のポリペプチドによって特異的に結合される標的の存在を検出するのに有用である。本明細書において用いられる検出するという用語は、定量的または定性的検出を包含する。1つの態様において、複合体は、診断または検出の方法で用いるために提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル内での、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの標的の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、本方法は、ポリペプチドのその標的への結合に許容的な条件の下で本明細書において報告される複合体と生物学的サンプルとを接触させる段階、および複合体と標的との間で複合体が形成されるかどうかを検出する段階を含む。そのような方法はインビトロまたはインビボの方法でありうる。1つの態様において、本明細書において報告される複合体は、複合体に含まれる単離されたポリペプチドによる治療に適した対象を選択するために、例えば、標的が、患者の選択のためのバイオマーカーである場合に用いられる。特定の態様において、標識された複合体、すなわちエフェクター成分が標識である複合体が提供される。標識は、直接的に検出される標識、ならびに例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて、間接的に検出される、酵素またはリガンドのような、標識を含むが、これらに限定されることはない。例示的な標識は、放射性同位体P32、C14、I125、H3、およびI131、フルオロフォア、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、23ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングさせたもの、ビオチンアビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離基などを含むが、これらに限定されることはない。薬学的製剤本明細書において報告される複合体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような複合体と、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体RemingtonsPharmaceuticalSciences16theditionMackPublishingCompanyとを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は一般に、利用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤保存剤、低分子量のポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン、親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤、例えばEDTA、糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属錯体、ならびにまたは非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されることはない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ヒト可溶性PH20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20BaxterInternationalIncをさらに含む。rHuPH20を含めて、特定の例示的なsHASEGPおよび使用の方法は、US20050260186およびUS20060104968に記述されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US6267958に記述されている。水性の抗体製剤は、US6171586およびWO2006044908に記述されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン酢酸緩衝液を含む。本明細書における製剤は、処置されている特定の適応症のために必要な2つ以上の活性成分、とりわけ互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。そのような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。活性成分は、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム中に、またはマクロエマルジョン中に、封入されてもよい。そのような技法は、RemingtonsPharmaceuticalSciences16theditionOsolAに開示されている。持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適当な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。インビボ投与に用いられる製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、容易に達成されうる。治療方法および組成物本明細書において報告される複合体のいずれも治療方法において使用されうる。1つの局面において、医薬として用いるための本明細書において報告される複合体が提供される。さらなる局面において、がんの処置で用いるための複合体が提供される。特定の態様において、処置の方法で用いるための複合体が提供される。特定の態様において、本発明は、複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法で用いるための複合体を提供する。1つのそのような態様において、本方法は、少なくとも1つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、血管新生の阻害もしくは細胞増殖の阻害またはB細胞の枯渇で用いるための本明細書において報告される複合体を提供する。特定の態様において、本発明は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させる方法で用いるための複合体を提供する。上記の態様のいずれかによる個体は、とりわけヒトである。さらなる局面において、本明細書において報告される複合体の、医薬の製造または調製における使用が本明細書において提供される。1つの態様において、医薬はがんの処置のためである。さらなる態様において、医薬は、がんを有する個体に医薬の有効量を投与する段階を含む、がんを処置する方法で用いるためである。さらなる態様において、医薬は血管新生の阻害もしくは細胞増殖の阻害またはB細胞の枯渇のためである。さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために医薬の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させる方法で用いるためである。上記の態様のいずれかによる個体は、ヒトでありうる。本明細書において報告されるさらなる局面において、がんを処置するための方法が提供される。1つの態様において、本方法は、本明細書において報告される複合体の有効量を、そのようながんを有する個体に投与する段階を含む。上記の態様のいずれかによる個体は、ヒトでありうる。本明細書において報告されるさらなる局面において、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させるための方法が提供される。1つの態様において、本方法は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために、本明細書において報告される複合体の有効量を個体に投与する段階を含む。1つの態様において、個体はヒトである。本明細書において報告されるさらなる局面において、例えば、上記の治療方法のいずれかで用いるための、本明細書において提供される複合体のいずれかを含む薬学的製剤が提供される。1つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において提供される複合体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告される複合体のいずれかと、少なくとも1つのさらなる治療剤とを含む。本明細書において報告される複合体は、治療法において単独でまたは他の薬剤との組み合わせで用いることができる。例えば、本明細書において報告される複合体は、少なくとも1つのさらなる治療剤と同時投与されうる。上記のそのような併用療法は併用投与、および個別投与を包含し、その場合、本発明の抗体の投与は、さらなる治療剤およびまたは補助剤の投与の前に、同時に、およびまたは後に行うことができる。本明細書において報告される複合体は、放射線療法との組み合わせで用いることもできる。本明細書において報告される複合体は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与、必要に応じて局所の処置のために、病巣内投与を含む、任意の適当な手段によって投与することができる。非経口注入は筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与を含む。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の適当な経路により、例えば、静脈内注射または皮下注射のような、注射により投薬することができる。単回投与またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない、さまざまな投薬スケジュールが本明細書において企図される。本明細書において報告される複合体は、適正な医療行為と一致する形で製剤化され、投薬され、および投与される。これに関連して考慮される要因には、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医師に知られる他の要因が含まれる。複合体は、問題になっている障害を予防または処置するために現在用いられている1つまたは複数の薬剤とともに製剤化される必要はないが、しかし任意で製剤化されてもよい。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する複合体の量、障害または処置のタイプ、および上記の他の要因に依存する。これらは一般的に、本明細書において記述されるのと同じ投与量および投与経路で、または本明細書において記述される投与量の約1~99で、または適切であるものと経験的に臨床的に決定されている任意の投与量および任意の経路で用いられる。疾患の予防または処置のため、本明細書において報告される複合体の適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、複合体のタイプ、疾患の重症度および経過、複合体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、過去の治療、患者の病歴および複合体に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存する。複合体は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依り、約1μgkg~15mgkgの複合体は、例えば、1回もしくは複数回の個別投与によるか、または持続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期の候補投与量でありうる。1つの典型的な1日投与量は、上記の要因に依り、約1μgkg~100mgkgまたはそれ以上に及びうる。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依り、疾患症状の所望の抑制が起きるまで、処置は一般的に持続される。複合体の1つの例示的な投与量は、約005mgkg~約10mgkgの範囲内であると考えられる。したがって、約05mgkg、20mgkg、40mgkgまたは10mgkgの1回または複数回の用量が患者に投与されうる。そのような用量は断続的に、例えば毎週または3週ごとに投与されうる。初期の高負荷用量、その後、1回または複数回の低用量が投与されうる。この治療の進捗は従来の技法およびアッセイ法によって容易にモニターすることができる。製造品本明細書において報告される1つの局面において、上記の障害の処置、予防およびまたは診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は容器、および容器の表面のまたは容器に付随のラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV液バッグなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成されうる。容器は、状態を処置、予防およびまたは診断するのに有効な、単独でのまたは別の組成物との組み合わせでの、組成物を収容し、無菌アクセスポートを持ちうる。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本明細書において報告される複合体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択の状態を処置するために用いられることを示す。さらに、製造品は、本明細書において報告される複合体を含む組成物を含有した第1の容器およびさらなる細胞毒性剤またはそれ以外の治療剤を含む組成物を含有した第2の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物を用いて特定の状態を処置できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。あるいは、またはさらに、製造品は、注射用の静菌水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような、薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含めて、商業上および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。アッセイ法上記のように、任意の細胞表面標的の発現レベルを免疫組織化学法によって検出することができる。例えば、HER2の検出のための方法が当技術分野において周知であり、対応する市販のキットが容易に入手可能である。使用されうる例示的なキットは、とりわけ、Dako社によって製造かつ流通されているHercepTestまたはVentanaPathwayと呼ばれる試験である。適当には、HER2タンパク質発現のレベルは、HercepTestに提供されている試薬を用いることにより、およびHercepTestのプロトコルにしたがうことにより評価される。当業者は、免疫組織化学法によってHER2の発現レベルを判定するためのさらなる手段および方法を承知している。それゆえ、HER2の発現レベルは、過度の負担なく当業者によって容易にかつ再現性よく判定されうる。しかしながら、正確なかつ再現性のある結果を確実とするには、試験は専門研究所で行われなければならず、これによって試験手順の検証を確実とすることができる。あるいは、HER2のタンパク質発現レベルの評価のためのさらなる方法、例えばウエスタンブロット、ELISAに基づく検出システムなどが用いられてもよい。HER2タンパク質の正常発現レベルは、これらの技法により、およびcMyc遺伝子増幅についてさらに分析されたHER2タンパク質発現の正常レベルを有するものと分類された患者の組織サンプルにより判定されうる。HER2の発現レベルはノザンブロット、リアルタイムPCR、RTPCTなどのような、対応する技法によるmRNA発現の評価によって判定されてもよい。これらの検出システムの全てが当技術分野において周知であり、LottspeichFandZorbasHまたはSambrookandRussellなどの、標準的なテキストブックから推測されうる。HER2mRNAの正常発現レベルは、これらの技法により、およびcMyc遺伝子増幅についてさらに分析されたHER2mRNA発現の正常レベルを有するものと分類された患者の組織サンプルにより判定されうる。一般的に、すなわち標的特異的にではなく、本明細書において報告される複合体の増殖阻害特性は、乳房腫瘍細胞株SKBR3を用いて評価することができる11651172を参照のこと。手短に言えば、SKBR3細胞を、025のトリプシンの使用によってはがし、1mlあたり細胞4×105個の密度で完全培地中に懸濁することができる。100μlのアリコットを96ウェル微量希釈プレートにプレーティングすることができ、細胞を接着させることができ、培地のみまたは複合体を含有する培地100μlをその後、加えることができる。72時間後、SugamanBJetalScience230943945に記述されているようにプレートをPBSで2回洗浄し、クリスタルバイオレットで染色し、相対的な細胞増殖について分析することができる。モノクローナル抗体2C4および4D5は、SKBR3の相対的な細胞増殖を、それぞれ、約20および約56阻害した。一般的に、すなわち標的特異的にではなく、本明細書において報告される複合体は、MCF7細胞の全細胞溶解物由来のMW180000の範囲にあるタンパク質のHRO刺激性のチロシンリン酸化を阻害するその能力について評価することができる14571465。MCF7細胞は、全ての既知ErbB受容体を発現するものの、比較的低いレベルで発現することが報告されている。ErbB2、ErbB3およびErbB4はほぼ同一の分子サイズを有するので、全細胞溶解物をウエスタンブロット分析によって評価する場合にどのタンパク質が、リン酸化されたチロシンになっているかを区別することは可能ではない。しかしながら、これらの細胞は、用いられるアッセイ条件の下で、外因的に加えられたHRGがない場合に、MW180000の範囲にあるチロシンリン酸化タンパク質を低いレベル~検出不能なレベルで示すので、HRGチロシンリン酸化アッセイ法に理想的である。アッセイのため、MCF7細胞を24ウェルプレートにプレーティングすることができ、本明細書において報告される複合体を各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートすることができるその後、rHRGβ1177244を各ウェルに02nMの終濃度まで加えることができ、インキュベーションを8分間続けることができる。培地を各ウェルから注意深く吸引することができ、SDSサンプル緩衝液100μlの添加によって反応を停止させることができる。各サンプルを4~12の勾配ゲル上で電気泳動することができ、その後、ポリビニリデンジフルオリド膜へ電気泳動的に転写することができる。抗ホスホチロシン免疫ブロットを発色させることができ、Mr180000の位置の主たる反応性バンドの強度を既述12051210、SliwkowskiMXetalJBiolChem2691466114665のように、反射率デンシトメトリによって定量することができる。モノクローナル抗体2C4および4D5は、MW180000の位置でのHRG誘導性のチロシンリン酸化シグナルの生成を顕著に阻害した。HRGがない場合、これらの抗体のどちらもMW180000の範囲にあるタンパク質のチロシンリン酸化を刺激することができなかった。また、これらの抗体はEGFR15501558、ErbB3またはErbB4と交差反応しない。抗体2C4は対照の抗体FABssDNAaコンジュゲートAの調製の場合には、SEQIDNO05の誘導体、すなわちを用い、配列中、XホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトを介して導入されたプロピレンホスフェートであり、配列中、Y3アミノ修飾剤TFAアミノC6lcaaCPGを介して導入された3アミノ修飾剤C6であり、かつ配列中、Zスルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートを介して導入された4Nマレイニミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。b抗トロポニンT抗体FABssDNAコンジュゲートB抗トロポニンT抗体FABssDNAbコンジュゲートBの調製の場合には、SEQIDNO06の誘導体、すなわちを用い、配列中、XホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトを介して導入されたプロピレンホスフェートであり、配列中、Yヘキシルホスホラミダイトを介して導入された5アミノ修飾剤C6であり、かつ配列中、Zスルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートを介して導入された4Nマレイニミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。それぞれ、SEQIDNO05または06のオリゴヌクレオチドは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。マレイニミド基の導入は、固相オリゴヌクレオチド合成過程の間に組み入れられたZのスクシンイミジル基とのYのアミノ基の反応によって行われた。上に示した一本鎖DNA構築体は、システアミン処理によって作製されたFABヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB断片を得るために、FAB断片に対するssDNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB断片の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって行う。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲルろ過クロマトグラフィーおよびSDSPAGEによって達成する。実施例2ビオチン化リンカー分子の形成それぞれ、ssDNAリンカーL1、L2およびL3において用いられるオリゴヌクレオチドは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法により、およびビオチン化のためのビオチン化ホスホラミダイト試薬の利用により合成された。リンカー1、つまりスペーサーを持たないビオチン化ssDNAリンカー1は、以下の組成を有する。これは、それぞれ、SEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチドを含み、ビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイトを用いることによりビオチン化された。リンカー2、つまり10merのスペーサーを持つビオチン化ssDNAリンカー2は、以下の組成を有する。これは、それぞれ、SEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチド、2度の、各チミジン5個のオリゴヌクレオチドストレッチを含み、ビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイトを用いることによりビオチン化された。リンカー3、つまり30merのスペーサーを持つビオチン化ssDNAリンカー3は、以下の組成を有する。これは、それぞれ、SEQIDNO7および8のssDNAオリゴヌクレオチド、2度の、各チミジン15個のオリゴヌクレオチドストレッチを含み、ビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイトを用いることによりビオチン化された。実施例3一価トロポニンT結合剤aおよびbに対する各エピトープ個々に、それぞれ、抗トロポニンT抗体aおよびbに由来する対応のFAB断片に対する中等度の親和性しか持たない合成ペプチドを構築した。a抗体aに対するエピトープAはに含まれ、配列中、Uはβアラニンを表す。b抗体bに対するエピトープBはに含まれ、配列中、Oはアミノトリオキサオクタン酸を表す。当業者には理解されるように、これらの2つのエピトープ含有ペプチドを2通りの方法で組み合わせることが可能であり、エピトープAおよびBを直線的に組み合わせることによって両方の変種を設計し、調製した。両方の変種の配列、つまりエピトープABおよびBAの直鎖状配列は、それぞれ、最先端のペプチド合成法により調製した。それぞれ、エピトープAおよびBに対する配列は、それに対するFABの各々の結合親和性を減らすためにヒト心臓トロポニンT配列のオリジナルのエピトープと比べて改変された。このような状況の下、ヘテロ二価結合の効果の動態は、例えばBIAcore技術で結合親和性を分析することにより、いっそう良好に視認できる。実施例4生体分子の相互作用分析この実験のため、BIAcore3000機器をT25°Cで、システムに取り付けられたBIAcoreSAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100μl分で、50mMのNaOH中1MのNaClの注入3×1分および10mMのHCl1分により行った。HBSET20をシステム緩衝液として用いた。サンプル緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。BIAcore3000システムは制御ソフトウェアV111の下で駆動された。フローセル1は7RUのDビオチンで飽和させた。フローセル2には、1063RUのビオチン化ssDNAリンカーL1を固定化した。フローセル3には、879RUのビオチン化ssDNAリンカーL2を固定化した。フローセル4には、674RUのビオチン化ssDNAリンカーL3を捕捉した。その後、FAB断片DNAコンジュゲートAを600nMで注入した。FAB断片DNAコンジュゲートBはシステムへ900nMで注入した。これらのコンジュゲートを2μl分の流速で3分間注入した。これらのコンジュゲートを継続的に注入して、各FAB断片DNAコンジュゲートの、その各リンカーに対しての各飽和シグナルをモニターした。FABの組み合わせは、各リンカーに存在する単一のFAB断片DNAコンジュゲートA、単一のFAB断片DNAコンジュゲートBならびにFAB断片DNAコンジュゲートAおよびBの両方で推進された。安定なベースラインは、リンカーがFAB断片DNAコンジュゲートによって飽和された後に作製されたが、これはさらなる動態測定のための必須条件であった。ペプチドアナライトTnT1およびTnT2は、表面提示されたFAB断片と相互作用させるためにシステムへ溶液中のアナライトとして注入した。TnT1は500nMのアナライト濃度で注入し、TnT2は900nMのアナライト濃度で注入した。両方のペプチドを4分の会合時間、50μl分で注入した。解離を5分間モニターした。再生は全てのフローセルで50μl分の50mMNaOHでの1分の注入により行った。動態データはBIAevaluationソフトウェアを用いて決定した。表面提示された各FAB断片の組み合わせからのTnT1およびTnT2ペプチドの解離速度KDは、線形Langmuir11適合モデルにしたがって決定した。一次動態方程式lnの解にしたがい分単位の複合体半減時間を計算した。結果それぞれ、表5および6に示した実験データは、それぞれ、一価dsDNAFABAまたはBコンジュゲートと比べて、それぞれ、アナライトと、さまざまなヘテロ二価FABFABコンジュゲートABとの間の複合体安定性の増大を実証する。この効果は各表中、列2および列3と比べて列1において認められる。表5さまざまな長さのリンカーとともにTnT1を用いた分析データ表6さまざまな長さのリンカーとともにTnT2を用いた分析データ結合力の効果はさらに、リンカーの長さに依存する。表1下に示した副表において、30merのリンカーL3が最も低い解離速度または最も高い複合体安定性を示し、表2下に示した副表において、10merのL2リンカーが最も低い解離速度または最も高い複合体安定性を示す。これらのデータは総合すれば、本発明において示したアプローチに固有のリンカー長の柔軟性が大変有用であり、有利であることを実証している。実施例5FABssDNAコンジュゲートの形成重複しない異なるエピトープAおよびBの位置でヒトHER2に結合する2種のモノクローナル抗体を用いた。第1の抗体は抗HER2抗体4D5全体が参照により本明細書に組み入れられるUS5821337を参照のことである。第2の抗体は抗HER2抗体2C4である。培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、タンパク質化学の最先端の方法を用いて行うことができる。精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化されたパパインまたはペプシンでプロテアーゼ消化して、F2断片をもたらす。これらをその後、37°Cで低濃度のシステアミンによりFAB断片に還元する。ポリペプチドを含有するサンプル部分からSephadexG25カラム上にシステアミンを分離することによって、反応を停止させる。得られたFAB断片を活性化ssDNAポリヌクレオチドとコンジュゲートさせる。a抗HER2抗体4D5FABssDNAコンジュゲート抗HER2抗体4D5FABssDNAコンジュゲートの調製の場合には、SEQIDNO05の誘導体、すなわちを用い、配列中、XホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトを介して導入されたプロピレンホスフェートであり、配列中、Yヘキシルホスホラミダイトを介して導入された5アミノ修飾剤C6であり、かつ配列中、Zスルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートを介して導入された4Nマレイニミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。b抗HER2抗体2C4FABssDNAコンジュゲート抗HER2抗体2C4FABssDNAコンジュゲートBの調製の場合には、SEQIDNO06の誘導体、すなわちを用い、配列中、XホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイトを介して導入されたプロピレンホスフェートであり、配列中、Yヘキシルホスホラミダイトを介して導入された5アミノ修飾剤C6であり、かつ配列中、Zスルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートを介して導入された4Nマレイニミドメチルシクロヘキサン1カルボキシである。それぞれ、SEQIDNO05またはSEQIDNO06のポリヌクレオチドは、最先端のポリヌクレオチド合成法によって合成された。マレイニミド基の導入は、固相ポリヌクレオチド合成過程の間に組み入れられたYのアミノ基とスルホスクシンイミジル4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートとの反応によって行われた。一本鎖DNA構築体は、システアミン処理によって作製されたFABヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB断片を得るために、FAB断片に対するssDNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB断片の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって行う。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲルろ過クロマトグラフィーおよびSDSPAGEによって達成する。実施例6生体分子の相互作用分析この実験のため、BIAcoreT100機器をT25°Cで、システムに取り付けられたBIAcoreSAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100μl分で、50mMの50mMNaOHpH80中1MのNaClの注入3×1分、引き続いて10mMのHClの注入1分により行った。システム緩衝液はHBであった。サンプル緩衝液は、1mgmlのCMDを補充したシステム緩衝液であった。ビオチン化ssLDNAリンカーを各フローセル中のSA表面に捕捉させた。フローセル1はアミノPEOビオチンで飽和させた。40RUのビオチン化35merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル2に捕捉させた。55RUのビオチン化75merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル3に捕捉させた。60RUのビオチン化95merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル4に捕捉させた。250nMの抗HER2抗体4D5FABssLDNAをシステムへ3分間注入した。300nMの抗HER2抗体2C4FABssLDNAをシステムへ5分間2μl分で注入した。DNA標識FAB断片を単独でまたは組み合わせで注入した。対照として、250nMの抗HER2抗体4D5FABssDDNAおよび300nMの抗HER2抗体2C4FABssDDNAしかシステムへ注入しなかった。さらなる対照として、DNA標識FAB断片の代わりに緩衝液を注入した。各ssLDNA二官能性リンカーに対してのssLDNA標識FAB断片のハイブリダイゼーションの後、溶液中のアナライトhHER2ECDを35分の会合相の間、100μl分でシステムへ24nM、8nM、3nM、1nM、03nM、0nMの異なる濃度系列で注入した。解離相を15分間100μl分でモニターした。システムは20μl分の100mMのグリシン緩衝液での30秒の注入、その後、30μl分での水の1分の二次注入によって再生させた。シグナルをアナライトの濃度依存的な時間分解センサグラムとして測定した。BIAcoreBIAevaluationソフトウェア41を用いてデータを評価した。適合モデルとして、標準的なLangmuirバイナリ結合モデルを用いた。結果ssDDNA標識FAB断片は、センサ表面に提示されたシュピーゲルマーのssLDNAリンカーとハイブリダイズしなかったので、ssDDNA標識FAB断片をシステムに注入した場合にはHER2ECDの相互作用を観測することができなかった。表7複合体形成実験の動態の結果。リンカー表面提示されたビオチン化ssLDNAポリヌクレオチドリンカー、リンカーの長さが異なるオリゴ35merBi、オリゴ75merBiおよびオリゴ95merBi。ssLDNAFAB2C4ssLDNA19merフルオレセインで標識された抗HER2抗体2C4FABssLDNA。4D5ssLDNA17merフルオレセインで標識された抗HER2抗体4D5FABssLDNA。4D52C4ssLDNA表面提示された両断片組み合わせ。LRUセンサ表面にハイブリダイズされる、反応単位質量。抗原溶液中のアナライトとして87kDaのHER2ECDを用いた。ka単位の会合速度。kD単位の解離速度。t12解離一次動態方程式の解lnkD3600にしたがい時間単位で計算された抗原複合体の半減時間。kDモル単位の親和性。kDピコモル単位で計算された親和性。Rmax反応単位での飽和時の最大のアナライト反応シグナル。MR相互作用の化学量論を示す、モル比。Chi2U値測定の品質指標。表7BIAcoreセンサグラムは35mer複合体HER2ECDの相互作用の濃度依存測定を示す。このリンカーは、もっぱらDNA標識のハイブリダイゼーションの原動力となる配列からなる。動態データから、完全に樹立された複合体が動態性能の改善のないことを示すものと示唆される。これは、35merの不十分なリンカー長および柔軟性の欠如によるものである。BIAcoreセンサグラムは75mer複合体HER2ECDの相互作用の濃度依存測定を示す。75merのリンカーは35merのリンカーと比べて、リンカーの長さを増すためにポリTを保有する。動態データから、完全に樹立された複合体がその動態性能の劇的な改善を示すものと示唆される。これは、75merの最適なリンカー長および柔軟性によるものである。BIAcoreセンサグラムは95mer複合体HER2ECDの相互作用の濃度依存測定を示す。95merのリンカーは35merのリンカーと比べて、リンカーの長さを増すためにポリTを保有する。動態データから、完全に樹立された複合体がその動態性能の劇的な改善を示すものと示唆される。これは、95merのリンカー長および柔軟性の増大によるものである。BIAcoreアッセイのセットアップには以下が含まれたssLDNA二官能性リンカーをBIAcoreSAセンサ上に提示した。フローセル1は対照としての役割を果たした。溶液中のアナライトHer2ECDを用いた。抗HER2抗体2C4FABssLDNAおよび抗HER2抗体2C4FABssLDNAを、表面提示されたリンカーとハイブリダイズさせた。初めて、高度に柔軟なssLDNAリンカーによってともに連結されたHerceptinFABとペルツズマブFABとの間の十分に機能的で協調的な結合事象をここに示す。表3中のデータは、協調的な結合事象の存在の証拠を提供する。完全に樹立された複合体のRmax値が一つずつのFAB腕の構築体のシグナルの高さのほぼ2倍であるにもかかわらず、モル比の値はちょうど1である。これは両FAB断片の同時に行われる、協調的な結合事象の存在の明らかな証拠である。複合体は11のLangmuir結合化学量論で単一分子と見なす。2つの個別結合性のHER2接触面を有するにもかかわらず、1つの複合体と2つのHER2ドメインとの間の分子間結合を検出することはできない。モノクローナル抗体の相乗作用対の、または化学的に架橋された二重特異性F2の結合力定数は一般に、個々のモノクローナル抗体の親和性定数よりも最大で15倍高いだけであり、これは、反応物間の理想の組み合わせで予想される理論的な結合力よりも著しく低い795800。この理論によって束縛されるわけではないが、この理由の1つは、相乗的結合に関与する個々のエピトープパラトープの相互作用が、最適な相乗作用を得るように互いに対して特定の方法で配向されなければならないということである可能性がある。さらに、表7に提示されたデータは、ssLDNAハイブリダイゼーションの原動力だけからなる短い35merのリンカーが、協調的な結合効果を生み出すのに十分な柔軟性またはおよびリンカー長を示さないという証拠を提供する。35merのリンカーは固い、二重らせんLDNA構築体である。ハイブリダイゼーションが二重LDNAらせんを生じ、これはssLDNA配列よりも短く、柔軟性が低い。らせんは自由度の低減を示し、固いリンカー構築体と見なすことができる。表7は、35merのリンカーが協調的な結合事象を生み出しえないことを示す。リンカーの長さを高度に柔軟なポリTssLDNAにより延長して、それぞれ、75merおよび95merを形成させることで、親和性の増大およびとりわけ抗原複合体安定性kDの増大をもたらす。chi2値は良質の測定結果を示す。全ての測定結果は極小の誤差を示す。データはLangmuir11適合モデルの残差逸脱度に適合させることができ、データを得るためにわずか1のRU、小さいchi2値およびわずか10回の反復計算が必要であった。協調的な結合効果は、自由結合エネルギーΔG1およびΔG2が集約するという点で、物理法則にしたがって作用する。親和性は倍加するKDcoopKD1×KD2。さらに、解離速度も倍加するKDcoopkd1×KD2。これは、75merおよび95merのリンカーの実験においてまさしく観測可能である。これは、それぞれ、4146時間および3942時間の非常に長い複合体半減時間をもたらす。親和性は100fmollの範囲内である。協調的な結合事象が起こることが明らかである。全ての完全に樹立された複合体の会合速度は、一つずつハイブリダイズされた構築体と比べて、いっそう速い。より高い分子量を示すにもかかわらず、会合速度は増大する。ここで、本発明者らは、本明細書において報告される複合体においてともに連結されたトラスツズマブおよびペルツズマブがHER2細胞外ドメインに同時に結合することを示すことができた。両方のFAB断片は、HER2ECDの真のエピトープに結合する。さらに、両方のFAB断片は、その結合角度がかなり異なる。最適な75merssLDNAのリンカー長ならびにその有益な柔軟性および長さ特性を用いることにより、協調的な結合事象を示すことができた。シグナルをアナライトの濃度依存的な時間分解センサグラムとして測定した。BIAcoreBIAevaluationソフトウェア41を用いてデータを評価した。適合モデルとして、標準的なLangmuirバイナリ結合モデルを用いた。実施例7さらなる生体分子の相互作用分析BIAcore3000機器にCM5センサチップを取り付けた。センサは製造元から推奨されているようにプレコンディショニングされた。システム緩衝液は20であった。システム緩衝液はサンプル緩衝液としても使われた。システムは制御ソフトウェア41の下、25°Cで操作された。10mM酢酸緩衝液pH45中30μgmlのポリクローナルヤギ抗ヒトIgGFcγ抗体をフローセル1に13952RUでおよびフローセル2に15047RUで標準的なNHSEDC化学により固定化した。10mMグリシンpH15緩衝液の20秒のパルス、10mMグリシンpH17緩衝液の1分のパルス、および10mMグリシンpH15緩衝液の30秒のパルスを用い20μl分でシステムを再生した。フローセル1に、5nMhuIgGを参照として10μl分で1分間注入した。フローセル2に、10nMのヒトHER2細胞外受容体FCキメラを10μl分で1分間注入した。典型的には、100反応単位の予構築ホモ二量体hHER2ECDpresSFcをヤギ抗ヒトIgGFcγ抗体によってフローセル2に、ヒトFC部分を介して捕捉した。典型的には、130反応単位のhuIgGをフローセル1に、ヒトFC部分を介して捕捉した。フローセル2のシグナルをフローセル1に対して参照とした。ssLDNA標識FAB断片の抗HER2抗体4D5FABssLDNAおよび抗HER2抗体2C4FABssLDNAを75merのssLDNAリンカーと、111のモル化学量論によりハイブリダイズさせた。完全に樹立された複合体2C475mer4D5をシステムへ50nMで3分間注入した。対照として、単一のFAB断片をシステムへ50nMで注入した。注入終了の直後に、250nMのストレプトアビジンまたはシステム緩衝液を10μl分で3分間システムへ注入した。75merのリンカーはその配列の中央に単一のビオチン成分を含むので、SAはFAB断片の存在ではなく、リンカー内のビオチンを認識するためのプローブとして働くはずである。別の実験では、完全に樹立された4D575mer2C4複合体を異なる濃度段階0nM、06nM、19nM、2×56nM、167nM、50nMにて3分間10μl分でシステムへ注入した。hHER2ECDpresSFcアナライトの濃度依存的な反応レベルをモニターした。反応レベルをhHER2ECDpresSFcの濃度段階に対してプロットした。ソフトウェアOrigin7を用いてデータを視覚化した。Origin7ソフトウェアによって提供されているHill方程式yVmaxxnを用いてデータを適合した。BIAcoreアッセイのセットアップには以下が含まれたポリクローナルヤギ抗ヒトIgGFcγ抗体をBIAcoreCM5センサに固定化し、huFcキメラHER2ECDの捕捉システムとして役立てた。抗HER2抗体2C4FABssLDNA、抗HER2抗体4D5FABssLDNAおよび完全に樹立された複合体を注入し、引き続いてストレプトアビジンの注入を行った。実験の目的は、75merのssLDNAリンカー内のビオチン成分の存在および接近可能性を実証することである。実験の結果を図7に描く。BIAcoreセンサグラムは、抗HER2抗体2C4FABssLDNA、抗HER2抗体4D5FABssLDNA、および75merのssLDNAリンカーにより接続され完全に樹立された複合体の50nMの注入による相互作用シグナルの重ね合わせプロットを示す。重ね合わせプロットから、完全に樹立された複合体結合剤は、137kDaというさらに高いその質量によって、FAB断片の注入と比べた場合に、さらに高いシグナル反応レベルを生ずることが示される。FAB断片は、それぞれ、57kDaの計算上の分子量を有する。420秒での注入終了の直後に、250nMのストレプトアビジンまたはシステム緩衝液を注入した。両矢印は、緩衝液の注入と比べて250nMのストレプトアビジンの注入により誘導された14RUのシグナルシフトに印を付けている。FAB断片はSA注入によるシグナルシフトがないことを示し、緩衝液のシグナルレベルにとどまっている、、、。ストレプトアビジンはエフェクター成分である。ストレプトアビジンはssLDNAリンカーの接近可能性を示す。表面提示されたhuFcキメラHER2ECDと相互作用する、溶液中のアナライトとしての完全に樹立された75mer複合体の濃度依存的な測定結果の重ね合わせプロットを示すBIAcoreセンサグラムを図8に示す。黒線はデータに関する11Langmuir適合を表す。動態データ、会合速度ka125105Ms1、解離速度KD339105s1、親和性定数03nM。図8の反応レベルは、完全に樹立された複合体のアナライト濃度に対してプロットされた。データをhill方程式にしたがって適合させ、hill因子を決定した。方程式yVmaxxn、Chi2DoF06653、R2099973n100201006143。表8には、図6に描いたBIAcoreアッセイ形式からの動態データを示す。協調的な結合効果は溶液中の複合体によって生み出すことができる。モル比は、正確に単一の複合体が単一のHER2ECDキメラを認識することを示す。動態データ、会合速度kaMs1、解離速度kDs1、親和性定数KDおよび単位、最大結合反応シグナル、捕捉されたhuFcキメラHer2ECDリガンドの量、Langmuirt12解離にしたがう複合体半減時間。結合事象の化学量論を示す、モル比MR。誤差chi2。4D52C475merは、完全に樹立された複合体である。4D575merおよび2C475merはFAB断片であるが、ssLDNA75merリンカーとハイブリダイズする。表8表8に提示したデータから、75merssLDNAリンカーによって接続され、完全に樹立された複合体は協調的な結合を示すことが実証される。単一のFAB断片は、完全に樹立された複合体と比べて、より低い親和性を示す。Rmaxでのシグナルレベルは、単一のFAB断片と比べて複合体の分子量の増大を示す。より高いシグナルレベルにもかかわらず、モル比はちょうど11である。これは、統計的に各複合体が単一のhuFcキメラHER2ECD分子に結合することを示す。協調性による増幅率は、複合体がセンサ表面にアセンブルされた先のアッセイ形式と比べた場合にそれほど高くない。KDcoopは最大6倍まで誘因される。理論によって束縛されるわけではないが、これは、ホモ二量体huFcキメラHER2ECDの性質によるものでありえた。潜在的に、二重結合剤は、huFcHER2キメラにおける2つの分離したHER2ECDを認識するが、協調性を完全には樹立することができない。生細胞に対するフィコエリトリン標識ストレプトアビジンプローブを用いたFACS分析により、色素形態のエフェクター成分の効率的な送達を示すことができた。ストレプトアビジン標識プローブは、75merssLDNAリンカー構築体におけるビオチン成分に容易に接近することができた。上記の測定からのデータをHillプロットの作成に用いた。複合体のHill分析から、FAB断片の結合事象は相互に独立しており、相互に干渉しないことが示される。HER2分子の構造障害という点から協調的結合を検出できなかったが、Hill係数はちょうど1である。それゆえ、リンカーの化学的構造、ssLDNAリンカーの性質およびオリゴ標識FAB断片は、標的分子の認識にマイナスに干渉していない。実施例8さらなる複合体合成および特徴付けハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成それぞれ、SEQIDNO05および06に示した配列を含む以下のアミノ修飾前駆体は、標準的な方法にしたがって合成された。下記のオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく、蛍光色素も含む。当業者なら容易に理解するように、この蛍光色素は、したがってオリゴヌクレオチドの、およびそれらを含む構成成分の精製を容易にするのに非常に好都合である。合成は市販のCPGを固体支持体として、ならびに標準的なdA、dT、dGおよびdCホスホラミダイトを用いトリチルオンモードまたはトリチルオフモードにて10μmolのスケールでABI394合成機にて行った。以下のアミダイト、アミノ修飾剤およびCPG支持体を用いて、オリゴヌクレオチド合成の間に、それぞれ、C3スペーサー、色素およびアミノ成分を導入したスペーサーホスホラミダイトC3プロピル1ホスホラミダイト5アミノ修飾剤は5アミノ修飾剤C6ヘキシルホスホラミダイトの使用によって導入される5フルオレセインホスホラミダイト6ヘキシル1OホスホラミダイトCy5ホスホラミダイト13プロピル13LightCyclerFluoresceinCPG500Aおよび3アミノ修飾剤TFAアミノC6lcaaCPG500A。Cy5標識オリゴヌクレオチドの場合、dA、dT、dG、dCホスホラミダイトを用い、33アンモニアでの脱保護を室温で2時間行った。LDNAオリゴヌクレオチドはβLdA、dT、dGおよびdCホスホラミダイトの使用によって合成された。フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、2段階の手順によって行われた最初に、オリゴヌクレオチドを逆相HPLCOAcMeCN955BMeCN10ml分の流速で3分、A中20のB、12分、A中20~50のBおよび25分、A中20のB、260nmで検出にて精製した。所望の産物を含有する画分を混ぜ合わせ、蒸発乾固させた。。標識としてフルオレセインを含んだオリゴマーは、HPLCでのIEXクロマトグラフィーMonoQカラム緩衝液A水酸化ナトリウム緩衝液B水酸化ナトリウムに溶解された1Mの塩化ナトリウム勾配1ml分の流速で100緩衝液Aから100緩衝液Bへ30分にて260nmで検出によって再度精製された。産物を透析によって脱塩した。Cy5標識オリゴマーを逆相HPLCOAcMeCN955BMeCN10ml分の流速で3分、A中20のB、12分、A中20~50のBおよび25分、A中20のB、260nmで検出での最初の精製の後に用いた。オリゴマーを透析によって脱塩し、SpeedVacエバポレータにて凍結乾燥し、固形物を得、これを24°Cで凍結させた。ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化実施例2からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを01Mのホウ酸ナトリウム緩衝液pH85の緩衝液に溶解し、ThermoScientificからの、DMFに溶解された18倍モル過剰のスルホSMCCと反応させた。スルホSMCC4Nマレイミドメチルシクロヘキサン1カルボキシレートの加水分解産物を除去するために、反応産物を水に対して十分に透析した。透析物を蒸発によって濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションに直接用いた。ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを両端に含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは、市販のdTCPGを固体支持体として用い、ならびに標準的なdA、dT、dGおよびdCホスホラミダイトを用いトリチルオンモードにて10μmolのスケールでABI394合成機にて標準的な方法により合成された。LDNAオリゴヌクレオチドは市販のβLdTCPGを固体支持体として、ならびにβLdA、dT、dGおよびdCホスホラミダイトを用いることによって合成された。オリゴヌクレオチドの精製は、実施例3の下で記述したように逆相HPLCにて行われた。所望の産物を含有する画分を混ぜ合わせ、蒸発乾固させた。脱トリチル化は15分間80酢酸とともにインキュベートすることによって行われた。酢酸は蒸発により除去した。残りを水に溶解し、凍結乾燥した。以下のアミダイトおよびCPG支持体を用いて、オリゴヌクレオチド合成の間にC18スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入したスペーサーホスホラミダイト18ホスホラミダイトビオチンdTビオチニルアミノヘキシル3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイトビオチンホスホラミダイト1ジメトキシトリチルオキシ2プロピル3Oホスホラミダイトならびにアミノ修飾およびジゴキシゲニンNヒドロキシルスクシンイミジルエステルでの後標識のための5ジメトキシトリチル5N3アクリルイミド2デオキシウリジン3ホスホラミダイト。以下の架橋構築体またはリンカーを合成した。上記の架橋構築体の例は少なくとも第1のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第2のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー3~18はハイブリダイズ可能な核酸ストレッチに加えて、それぞれ、中央のビオチン化チミジンもしくはジゴキシゲニン化チミジン、または上記の長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。それぞれ、5ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQIDNO07に対応し、3ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQIDNO08に対応する。SEQIDNO07のオリゴヌクレオチドはSEDIDNO06のオリゴヌクレオチドと容易にハイブリダイズする。SEQIDNO08のオリゴヌクレオチドはSEDIDNO05のオリゴヌクレオチドと容易にハイブリダイズする。上記の架橋構築体の例において、BLは、LDNAオリゴヌクレオチド配列が与えられていることを示しスペーサーC18、ビオチンおよびビオチンdTはそれぞれ、上記の構成要素に由来のC18スペーサー、ビオチンおよびビオチンdTをいいかつ数字の付いたTは、示した位置でリンカーに組み入れられたチミジン残基の数を示す。複合体のアセンブリAIgGの切断およびssDNAでのFAB断片の標識化精製されたモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けを借りて切断し、F2断片を得たが、これをその後、37°Cで低濃度のシステアミンでの処理によりFAB断片に還元する。PD10カラムでのシステアミンの分離によって反応を停止させる。FAB断片を、実施例3にしたがって生成された活性化オリゴヌクレオチドで標識する。この一本鎖DNAは、FABヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB断片を得るために、FAB断片に対するssDNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB断片の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって行う。効率的な精製の検証は、分析的ゲルろ過およびSDSPAGEによって達成する。B標的に特異的に結合する2つのポリペプチドを含む複合体のアセンブリ抗pIGF1R複合体は、IGF1Rの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする2つのFAB断片に基づくFAB812は標的タンパク質のリン酸化部位を検出し、FAB14168は非リン酸化部位を検出する。これらのFAB断片が一本鎖DNAに共有結合的に連結されたFAB14168は、SEQIDNO05を含むかつ蛍光マーカーとしてフルオレセインを含有する17merのssDNAに連結され、FAB812は、SEQIDNO06を含むかつ蛍光マーカーとしてCy5を含有する19merのssDNAに連結された。以下において、共有結合された17merまたは19merのssDNAを有するこれらのFABを、それぞれ、ssFAB14168およびssFAB812と名付ける。複合体のアセンブリは、ssFAB断片の対応するssDNAとハイブリダイズするリンカーを含む架橋構築体によって媒介される。複合体の2つのssFAB断片の距離は、それぞれ、スペーサー、例えばC18スペーサーまたは異なる長さのDNAを用いることによって変化させることができる。アセンブリの評価のため、複合体の構成成分ssFAB812、ssFAB14168およびリンカー構築体およびを室温にて等モル量で混合した。1分のインキュベーション段階の後、反応混合物を分析的ゲルろ過カラム20010300GLGEHealthcareにて分析した。単一の複合体構成成分の溶出体積と反応混合物のVEとの比較から、複合体が成功裏に形成されたことが実証される。固定化されたIGF1RおよびIRペプチドへの抗pIGF1R複合体の結合を評価するBIAcore実験この実験のため、BIAcore2000機器をT25°Cで、システムに取り付けられたBIAcoreSAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100μl分で、50mMのNaOH中1MのNaClの注入3×1分および10mMのHCl1分により行った。HBSET20をシステム緩衝液として用いた。サンプル緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。BIAcore2000システムは制御ソフトウェアV111の下で駆動された。その後、ビオチン化ペプチドを各フローセル中のSA表面に捕捉させた。16RUのIGF1R1346pTyrGluをフローセル2に捕捉させた。18RUのIGF1RGluをフローセル3に捕捉させた。20RUのhInsR1361pTyrGluをフローセル4に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをdビオチンで飽和させた。複合体形成のため、上記のアセンブリプロトコルを用いた。2つのssFABのうちの1つだけでの個別操作を行った場合、リンカーDNAの有無は会合または解離曲線に影響を与えなかった。溶液中100nMのアナライトを240秒の会合時間にわたって50μl分で注入し、解離を500秒間にわたってモニターした。効率的な再生は80mMNaOHによる50μl分での1分の注入段階を用いることにより達成された。フローセル1は参照としての役割を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルの減算によりデータの二重参照とした。各測定サイクルにおいて、溶液中の以下のアナライトのうちの1つを4つ全てのフローセルに注入したそれぞれ、100nMssFAB812、100nMssFAB14168、100nMssFAB812および100nMssFABの混合物、リンカー上にハイブリダイズされたssFAB812およびssFAB14168からなる100nMの二価結合剤、ならびにリンカー上にハイブリダイズされたssFAB812およびssFAB14168からなる100nMの二価結合剤。シグナルを時間依存性BIAcoreセンサグラムとしてモニターした。報告点をアナライトの会合相の終わりBLに、およびアナライトの解離相の終わりSLに設定して、各相互作用の反応単位のシグナルの高さをモニターした。BIAcore評価ソフトウェア41を用い線形11Langmuirの適合にしたがって解離速度kDを計算した。式lnによって分単位の複合体半減時間を計算した。センサグラムは、ssFAB14168およびssFAB14168が複合体の形態で用いられる場合、おそらく、根底にある協調的な結合効果により、pIGF1R結合の特異性と複合体安定性の両方の増加を示す。FAB14168単独では、pIRペプチドに対する交差反応性のないことは示されるものの、IGF1Rのリン酸化型と非リン酸化型とが識別されない。FAB812は、しかしながら、IGF1Rペプチドのリン酸化型にのみ結合するが、リン酸化インスリン受容体といくらかの望ましくない交差反応性を示す。複合体はpIGF1Rペプチドと他の両ペプチドとを十分に識別し、したがって、非特異的結合の問題を克服するのに役立つ。両方のFABがリンカーDNAなしで適用される場合には、特異性の増加が失われることに留意されたい。pIGF1Rペプチドに対する複合体の親和性の増加は、個別のFAB、およびリンカーDNAを除いたFABの混合物と比べて解離半減時間の増大で明らかである。2つの異なるDNAリンカーを有する試験された複合体は、標的結合特異性および親和性に対し全体としてプラスの効果を共有するが、より長いリンカーは両基準に関して有利であるように見える。M14168IgGおよびM812のBIAcoreアッセイサンドイッチBIAcoreT100機器をシステムに取り付けられたBIAcoreCM5センサとともに用いた。センサは100μl分の01SDS、50mMNaOH、10mMHClおよび100mMH3PO4での1分の注入によりプレコンディショニングされた。システム緩衝液はHBSET20であった。サンプル緩衝液がシステム緩衝液であった。BIAcoreT100システムは制御ソフトウェアV111の下で駆動された。10mMの酢酸ナトリウムpH45中30μgmlでポリクローナルウサギIgG抗体Rを製造元の使用説明書にしたがってEDCNHS化学により、それぞれ、フローセル1、2、3および4に10000RUで固定化した。最後に、センサ表面を1Mエタノールアミンでブロックした。完全な実験は13°Cで駆動された。500nMの一次mAbM1004168IgGをR表面に10μl分で1分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する3μMのIgG断片混合物を、5分間30μl分で注入した。ペプチドIGF1R1346pTyrGluをT25°Cで、システムに取り付けられたBIAcoreSAセンサとともに用いた。システムは100μl分で、50mMのNaOH中1MのNaClの注入3×1分および10mMのHCl1分によりプレコンディショニングされた。システム緩衝液はHBSET20であった。サンプル緩衝液がシステム緩衝液であった。BIAcore3000システムは制御ソフトウェアV41の下で駆動された。124RUのアミノPEOビオチンを参照フローセル1に捕捉させた。1595RUのビオチン化された146kDaT0Bi37merssDNAリンカーおよび1042RUのビオチン化された237kDaT40Bi77merssDNAリンカーを異なるフローセルに捕捉させた。300nMのssFAB812および300nMのssFAB1004168を3分間50μl分でシステムに注入した。対照として、300nMのssFAB812または300nMのssFAB1004168のみを注入して、各ssFABの動態寄与を調べた。対照として、ssFabの代わりに緩衝液を注入した。ペプチドIGF1R1346pTyrアミド、INR1361pTyrアミド、IGF1Rアミドを溶液に遊離させ0nM、4nM、11nM、33nM、100nMおよび300nMの濃度段階で4分間50μl分でシステムに注入した。ペプチドIGF1R1346pTyrアミドに対する親和性を測定するための別の態様では、0nM、04nM、11nM、33nM、10nMおよび30nMの濃度段階であった。解離を53分間50μl分でモニターした。システムを各濃度段階の後、250mMNaOHの12秒のパルスによって再生し、システムにssFABリガンドを再負荷した。図17は、BIAcore機器に関してのアッセイのセットアップを図式的に記述している。図18に示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図19、図20および図21は、このアッセイのセットアップからの例示的なBIAcoreの結果について描いている。図18の表は、複合体構想の利益を実証している。T40二重結合剤は、抗原複合体の半減時間の2倍の改善および親和性の3倍の改善を、それぞれが192分および30pMのT0二重結合剤と比べて、もたらす。これは、協調的な至適結合効果を生ずるようにリンカーの長さを最適化する必要性を強調している。T40二重結合剤を含む二重結合剤は、リン酸化IGF1Rペプチドに対して10pMの親和性を示す。これは、リン酸化インスリン受容体ペプチドに対する2400倍の親和性の改善および非リン酸化IGF1Rペプチドに対する100倍の改善である。それゆえ、2つの異なったかつ分離した結合事象の組み合わせによって特異性および親和性を増大するという目標が達成される。協調的な結合効果はとりわけ、リン酸化IGF1Rペプチドに対する解離速度から明らかとなり、ここで複合体は、それぞれ、一価結合剤812単独での05分に対して、および一価結合剤14168単独での3分に比べて、414分の抗原複合体の半減時間を示す。さらに、完全にアセンブルされた構築体はその解離速度kDを、一つずつFABがハイブリダイズされた構築体と比べた場合、ほぼ倍加する。興味深いことに、また会合速度kaは単一FABの相互作用事象と比べた場合にわずかに増大し、これは構築体の分子柔軟性の増大によるものでありうる。実施例9結合アッセイ法インビトロおよびエクスビボ検出オリゴヌクレオチドプローブCy5ssLDNA検出オリゴヌクレオチドプローブCy5は、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。Cy5色素の導入はアミノ基とCy5モノ反応性NHSエステルとの反応により行われた。。ヌクレオチドには、LDNAアミダイトを用いた。固相オリゴヌクレオチド合成過程の間に5および3アミノ基を導入し、配列中、Yヘキシルホスホラミダイトを介して導入された5アミノ修飾剤C6であり、かつZ3アミノ修飾剤TFAアミノC6長鎖アミノアルキルControlledPoreGlass1000Aを介して導入された3アミノ修飾剤C6である。二重結合剤リンカーオリゴヌクレオチドssLDNAオリゴヌクレオチドリンカーは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。複合体のアセンブリ複合体は、SEQIDNO73のssLDNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4FABssLDNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5FABssLDNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。インビトロ結合アッセイ法ヒト乳がんKPL4細胞をμスライドVIへ30μlの体積中にて細胞2×106個mlの濃度で播種した。それから3時間後に、培地70μlを加えて、細胞を接着させた。水飽和雰囲気中5CO2および37°Cで24時間のインキュベーションの後、上清を除去し、細胞をPBS100μlで1回洗浄して、残存培地を除去した。連続適用のため、FITC溶液で標識された上記で調製の複合体4D52C450μlを加え、45分間インキュベートし、引き続いてPBS100μlでの1回の洗浄段階および等モル量のDNAプローブ50μlとのさらなるインキュベーションを行った。予混合手順は、複合体および検出プローブを最初に混合することによって行われた。その後、それを細胞に加え、引き続き45分間のインキュベーションを行った。Xolair、つまりヒトIgE免疫グロブリンを標的とするヒト化IgG1モノクローナル抗体を陰性対照として用い、ヒトHER2受容体を標的とする、Cy5で標識されたHerceptinを陽性対照として用いた。両方の抗体を同じ濃度で適用した。その後、上清を除去し、細胞をPBS100μlで1回洗浄した。細胞核をその後、HOECHST33342溶液50μlの添加によりDAPIで染色し、15分間インキュベートした。細胞染色色素を除去するために、細胞を上清の除去後、PBS100μlで2回洗浄した。PBSさらに120μlを加えて細胞の潤いを保ち、生存性を確実にした。全ての希釈は培地で行って、細胞の生存性を確実にし、細胞のはく離を回避した。この手順の後、NUANCEシステムを用いて多重スペクトル蛍光分析によりスライドを画像化した。蛍光強度の比較可能性のために画像を規準化した。エクスビボ分析樹立KPL4腫瘍を有する免疫不全SCIDベージュマウスにPBS100μl中50μgの複合体を静脈内注射し、それから18時間後にCy5標識DNAプローブを等モル濃度で注射した。腫瘍をそれから48時間後に外植し、MAESTROシステムを用いて多重スペクトル蛍光分析により調べた。結果インビトロ結合アッセイ法複合体はそのFABssLDNA構成成分の各々によって二重にFITC標識されている。検出プローブは二重にCy5標識されたssLDNAの20merのオリゴヌクレオチドプローブであり、これは複合体の95merのssLDNAリンカーとハイブリダイズされうる。XolairCy5とは対照的に、HerceptinCy5は腫瘍細胞を特異的に染色した。FITC標識4D52C495mer複合体は、腫瘍細胞に対しての、複合体と共局在化される検出プローブとの連続的インキュベーションによって分かるようにKPL4腫瘍細胞に特異的に結合し、検出オリゴヌクレオチドプローブCy5と複合体とのハイブリダイゼーションが示唆された。連続的インキュベーションモードにおいて、および予混合の設定において、Her2抗原に対しての腫瘍細胞の特異的染色を実証することができた。図22では、複合体および検出プローブとともにインキュベートされたがん細胞の近赤外像を示す。図の右上では、Cy5標識検出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされた完全アセンブル4D52C495mer複合体のスケッチを示す。図の右中央では、Cy5標識Herceptinの絵図を示す。図の右下では、シグナル強度のバーを示す。図22の左上では、がん細胞へのCy5標識Herceptinの結合を示す。KPL4細胞膜は、DAPIで染色された細胞核周囲の明るく輝く環のように見える。左下では、Cy5標識Xolairのインキュベーションを示す。膜染色を検出することはできないが、細胞核のDAPI染色を検出することができる。図の下中央では、4D52C4FITC複合体の結合を示す。膜結合複合体のフルオレセインシグナルは、DAPIで染色された細胞核周囲の輝く環のように見える。図の上中央では、4D52C4FITC複合体およびCy5標識検出プローブの結合を示す。連続的にハイブリダイズされた、Cy5標識ssLDNA検出プローブによる複合体の検出を認めることができる。検出オリゴヌクレオチドのCy5シグナルは膜染色のように見え、DAPIで染色された細胞核周囲の明るく輝く環を示している。図23では、KPL4細胞の近赤外画像化を示す。図23Aでは、FITC標識4D52C4複合体およびCy5標識検出プローブの連続適用の結果を示す。図23Bでは、予混合されたFITC標識4D52C4複合体およびCy5標識検出プローブとのKPL4細胞のインキュベーションの結果を示す。どちらの画像も膜に局在したシグナルを示す。対照として、細胞をDAPIで染色した。実験から、HER2陽性細胞を特異的に標的化するために、本明細書において報告される複合体をまず最初に適用できることが実証される。第2段階において、標的に結合した複合体とハイブリダイズさせるために、標識された検出プローブを適用することができる。蛍光標識された検出プローブはその結果、オリゴヌクレオチドに基づくエフェクター成分の時間遅延、連続適用および特異的標的指向化の構想の証明となる。この場合、ペイロードはインビトロでの細胞画像化の目的のための蛍光色素である。エクスビボ結合アッセイ法図24に描かれているように、サンプルを最初に複合体と、その後にCy5標識検出プローブとインキュベートさせた実験的設定では強い蛍光シグナルが検出可能である。対照的に、Cy5標識検出プローブだけをKPL4異種移植片に予め注入した腫瘍では蛍光シグナルを検出することができなかった。図24は、NIRF画像化に供した外植KPL4腫瘍を示す。最初の画像では、最初に4D52C4複合体で、その後に検出プローブで連続的に処置したマウスより外植された3つのKPL4腫瘍から得たCy5蛍光シグナルを示す。右画像では、4D52C4複合体を除いて検出プローブだけで3匹のマウスを処置した場合、3つのKPL4腫瘍からは蛍光シグナルが得られなかったことが示されている。実施例10MDAMB175乳がん細胞株における細胞増殖の阻害10ウシ胎仔血清、2mMグルタミンおよびペニシリンストレプトマイシンを補充したDMEMF12培地中で培養されたMDAMB175乳がん細胞2×104個を96ウェルプレートに播種した。それぞれ、抗体および複合体を翌日に、表示濃度で加えた。6日間のインキュベーション後、AlamarBlueを加え、プレートを組織培養インキュベータ中で3~4時間インキュベートした。蛍光を測定し、参照として未処理細胞を用い阻害率を計算した。結果抗HER2抗体2C4は44の最大阻害を示した。抗HER2抗体Herceptinは9の最大阻害を示した。ペルツズマブおよびHerceptinのFAB断片を含む本明細書において報告される複合体は、46の最大阻害を示す。ペルツズマブは、2つのHER2結合部位を有する全長IgG抗体として試験されたが、複合体は、単一のHER2結合部位を有する単一のペルツズマブFab断片を含むことを指摘せねばならない。実施例11複合体の凍結融解安定性複合体は、SEQIDNO73のssLDNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4FABssLDNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5FABssLDNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。TSK3000カラムを用い分析的SECによって複合体50μlを分析した。泳動用緩衝液は01MKH2PO4pH68であった。流速は1ml分であった。クロマトグラムを図25に示す。凍結融解の後、複合体を、再クロマトグラフィーによって分離した。TSK3000カラムを用い分析的SECによって複合体50μlを分析した。泳動用緩衝液は01MKH2PO4pH68であった。流速は1ml分であった。クロマトグラムを図26に示す。