"Phlp6アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子であって、該Phlp6分子はN末端及び/又はC末端を欠失することにより該分子がIgE結合能を少なくとも実質的に欠如している、低刺激性免疫原性分子。Phlp6分子がN末端でトランケートされている、請求項1に記載の免疫原性分子。Phlp6分子がC末端でトランケートされている、請求項1に記載の免疫原性分子。組換え手法によって生成される、請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫原性分子。ペプチド合成化学によって生成される、請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫原性分子。Phlp6アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子の組合せであって、iN末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子、及びiiC末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子を含み、かかる2つの分子が共同してPhlp6の完全な配列を含む、免疫原性分子の組合せ。タンパク質アレルゲンに対するIgE仲介のアレルギーに罹患している哺乳類の減感作のための方法であって、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せの有効量に対して生体内で当該哺乳類の免疫系を提示する段階を含む方法。哺乳類において抗体応答を誘導するための方法であって、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。哺乳類においてT細胞応答を誘導するための方法であって、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。哺乳類において抗体応答を調節し、誘導するための方法であって、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原性分子又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せを投与することを含む方法。哺乳類個体におけるI型アレルギーの生体外診断のための、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せの使用。I型アレルギーに罹患している哺乳類個体の減感作において使用される薬剤の調製のため、又はI型アレルギーの生体内診断において使用される試薬の調製のための、請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫原又は請求項6に記載の免疫原性分子の組合せの使用。本発明の最初の態様としては、Phlp6アレルゲンから誘導される低刺激性免疫原性分子を提供するが、該Phlp6分子は、N末端及び/又はC末端を欠失しており、これにより該分子はIgE結合能を少なくとも実質的に欠如している。N末端又はC末端の欠失はアレルゲンの末端トランケーションであると考えられる。かかる欠失はまた、それぞれアレルゲンのN末端又はC末端部分の内部でも存在しうる。アレルゲン分子の断片は、それ自体当業者には周知であり、組換えDNA手法又はペプチド合成化学によって作製することができる。第二の態様としては、本発明は、iN末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子、及びiiC末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子を含み、かかる2つの分子が共同してPhlp6の完全な配列を含む、免疫原性分子の組合せを提供する。共同してPhlp6の完全なアミノ酸配列を含むため、2つのPhlp6分子のそれぞれの配列は重複し又は隣接しうる。本発明のために有用である断片に必要なi免疫原性であって、且つii非IgE反応性であるPhlp6アレルゲンのN末端及びC末端欠失部分の大きさは、当業者には容易に決定できるであろう。特定のN末端又はC末端欠失分子のIgE結合能の存否は容易に決定でき、IgE反応性の欠如は、その分子がアナフィラキシー副作用を誘発する危険性なしに又は低い危険性で適用できることを示唆する。該分子の免疫原性は、完全なPhlp6アレルゲンに対するポリクローナル抗血清によって認識される能力によって測定することができる。このようにして、完全なアレルゲンに対する防御免疫応答を惹起することができる可能性が非常に高い断片及び断片の組合せを選択しうる。本発明の第三の態様は、特異的減感作療法である。かかる療法はタンパク質アレルゲンについての公知技術として実施され、アレルゲンに対するI型アレルギーに罹患している哺乳類、代表的にはヒト個体に、当該アレルゲンに対するIgG免疫応答を惹起することができる免疫原を繰り返し投与することを含む。免疫原は酸化アルミニウムのような適当なアジュバントと混合することができる。投与は全身的に、たとえば注射、注入等々によって実施しうるが、免疫系の腸管部分にさらすために経口経路も示唆されてきた。NormanPS、アレルギー及びアナフィラキシー反応のための免疫療法の現状CurrentstatusofimmunotherapyforallergiesandanaphylacticreactionsAdv.Internal.Medicine411996681-713も参照のこと。ここでは、投与する免疫原は本発明の最初の態様による免疫原性分子、又はそのような分子の混合物、好ましくは本発明の第二の態様による、iN末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子、及びiiC末端が欠失することによりIgE結合能を少なくとも実質的に欠如しているPhlp6分子であって、かかる2つの分子が共同してPhlp6アレルゲンの完全なアミノ酸配列を含む、Phlp6アレルゲンから誘導される上記の低刺激性免疫原性分子の組合せでありうる。より明細には、免疫原は、患者において抗体応答を誘導するため、及び/又はT細胞応答を惹起するため、及び/又は寛容を誘導するように抗体及びT細胞応答を調節させるために使用しうる。本発明の第四の態様は、第一の態様による免疫原又は第二の態様による免疫原の組合せの、当該免疫原が由来するPhlp6アレルゲンに対するIgA、IgD、IgE、IgG又はIgMクラスの特異性抗体を検出するための免疫測定法における抗原としての使用を提供する。適切なアッセイ変法は、免疫原、サンプル抗体及び対象とするIgクラスに対する抗体間での三重複合系の形成を含む。サンプルは、Igを含有するあらゆる生物学的液体、たとえば血液由来のサンプル血清、血漿、全血、CSF、等々でありうる。特に、低刺激性断片は、治療において当該断片に対する新たな免疫応答を誘導するときの診断モニタリングたとえばIgG測定、T細胞応答の測定のために使用しうる。本発明を以下の非制限的実施例によって説明する。実験材料及び方法生物学的材料、患者血清、抗血清、組換えアレルゲン。チモシー牧草Phleumpratense、ホソムギLoliumperenne、ライムギSecalecereale、ケンタッキースズメノカタビラKentuckybluegrassPoapratensis、コムギTriticumsativum、カラスムギcultivatedoatAvenasativa及びヨシcommonreedPhragmitescommunisからの花粉はAllergonABValinge,Swedenから入手した。チモシー牧草の種子をAustrosaatVienna,Austriaから購入し、4週間生育させて生葉と根を入手した。牧草花粉に対してアレルギー性の患者は4の記載のように特定した。ウサギ抗セロリプロフィリン抗血清RP1が12に記載されている。フロイントアジュバントを用いて、精製組換えPhlp6に対するウサギ抗rPhlp6抗血清を作製したCharlesRiver,Kissleg,Germany。組換えチモシー牧草花粉アレルゲン、rPhlp1、rPhlp2及びrPhlp5を13に記載されているように精製した。組換えチモシー牧草花粉プロフィリンをポリL-プロリンアフィニティークロマトグラフィー6によって精製した。Phlp6アイソフォーム/断片をコードするcDNAの単離と特定。ファージλgt1114において成熟チモシー牧草花粉から構築した発現cDNAライブラリーから、350のIgE反応性クローンを単離した。Phlp6をコードするcDNAと配列相同性を有する6個のcDNAc121、c142、c146、c171、c223、c233をプラスミドpUC18にサブクローニングし、配列決定した16、17。McVectorプログラムKodak,Rochester,NYを用いて配列を分析した。SwissProtデータベースのFastAプログラムGCGパッケージ18によりPhlp6に相同なタンパク質配列について検索を行った。EMBLデータベースからHoll5及びHorv5アレルゲンの配列を取り出した。ClustalW19で多配列アラインメントを作製し、手動で編集した。GDE配列エディターS.Smith,HarvardUniversity,Cambridge,MA及びCOLORMASKJ.Thompson,EMBL,Heidelberg,Germanyを用いて、関連した特性を有する保存された残基に着色した19。EMBLPredictProteinserver20でPHDプログラムによりタンパク質二次構造及び表面可触性の予測を行った。Phlp6IgEエピトープのマッピング、組換えPhlp6の発現と精製。Phlp6アイソフォーム及び断片を発現するファージクローンのIgE結合能をプラークリフトアッセイ21によって検討した。成熟Phlp6アレルゲンをコードするDNAをクローン142DNAからPCR増幅し、pET-17bのNdeI/EcoRI部位にサブクローニングした。組換えPhlp6を液体培養中でE.coliBL21DE3において発現させた。細胞を25mMイミダゾール、pH7.4、0.1TritonX-100に懸濁し、リゾチーム20μg/g細胞の室温で30分間の添加と凍結融解サイクルによって溶解した。DNAを室温で20分間DNAseI0.1mg/g細胞ペレットで消化した。タンパク質抽出物を10,000×gで20分間遠心分離してSorvallRC5C;SS34ローター、不溶性物質を除去した。得られた沈殿物中に硫酸アンモニウム40-60w/vを加えてrPhlp6を濃縮した。沈殿物を10mMTrispH6に溶解し、この緩衝液を透析し、遠心分離20分間、10,000g,SorvallRC5C;SS34ローター後、ジエチルアミノエチルセルロース-SepharoseカラムPharmaciaに注入した。非結合タンパク質を10mMTris、pH6、4v/vイソプロパノールで溶出した。80以上の純度のPhlp6を含む分画をNaOHでpH8の調整し、ジエチルアミノエチルセルロース-Sepharoseカラムで第二のクロマトグラフィー段階に供した。pH8の0-0.5MNaCl勾配での結合タンパク質の溶出により純rPhlp6を含む分画を得て、それをH2Oddで透析した。精製組換えPhlp6のMALDI-TOFマトリックス援用レーザー脱着イオン化-飛行時間型及びCD円偏光二色性分析。飛行時間型CompactMALDIII装置Kratos,Manchester,UKを用いて線形モードでレーザー脱着質量スペクトルを得たpiCHEM,Graz,Austria。JascoPTC-348WIペルチエ型温度制御システムを取り付け、FisonsHAAKEGH水浴に結合したJascoJ-710分光偏光計でCDスペクトルを記録した。7μMのタンパク質濃度で2mm幅-長さの石英キュベットHellma,Mullheim,Baden,Germanyで20°Cで遠紫外CDスペクトルを記録した。220nmで温度上昇の間50°C/時の楕円性を記録することにより、Phlp6の熱変性をモニターした。開始温度20°Cまで冷却したとき50°C/時のCDシグナルの回復を測定することにより、変性プロセスの可逆性を調べた。折りたたみタンパク質の分画をF=1-U[式中、U=Θ220-ΘN/ΘU-ΘN]として算出した。ΘNは天然状態でのタンパク質の楕円性であり、ΘUは変性タンパク質の楕円性である。rPhlp6については、ΘUは85°CでΘ220に等しいと仮定し、ΘNは20°CでΘ220に等しいと仮定した。組換えPhlp6のIgE結合能、天然Phlp6及び他のチモシー牧草花粉アレルゲンとの交叉反応性。IgE抗rPhlp6反応性の発生率を、171名の牧草花粉アレルギー患者からの血清及び対照として非アトピー個人からの血清においてELISAによって測定した13。天然及びrPhlp6上の交叉反応性IgEエピトープの存在をIgE免疫ブロット阻害実験によって検討した4。rPhlp6と組換えチモシー牧草花粉アレルゲンrPhlp1、rPhlp2及びrPhlp5との間の免疫学的関係13を4の記載のようにELISA競合によって検討した。ヒスタミン遊離実験。rPhlp6反応性IgE抗体を有する牧草花粉アレルギー個人のヘパリン化血液サンプルから、デキストラン沈降によって22顆粒球を単離した。細胞を漸増濃度の精製rPhlp5、rPhlp6、及び抗ヒトIgE抗体E124.2.8Dε2,Immunotech,Marseille,Franceと共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンを放射免疫測定法Immunotech,Marseille,Franceによって測定した。皮膚試験。インフォームドコンセントを得たあと、23の記載のように各人の前腕に皮膚穿刺試験を実施した。種々の濃度1μg/ml、10μg/ml、100μg/mlの精製rPhlp6、rPhlp5を含む20μlアリコート及びチモシー牧草花粉抽出物、ヒスタミン及び塩化カリウムALK,Horsholm,Denmarkで各人を穿刺した。他の牧草種におけるPhlp6関連アレルゲン存在の分析及びPhlp6の組織特異的発現。SDS-サンプル緩衝液中で組織を均質化することによって花粉、葉及び根からのタンパク質抽出物を得た24。抽出物を遠心分離して10,000×g、20分間;SorvallRC5C,SS34ローター不溶性物質を除去した。タンパク質抽出物を14SDS-PAGEによって分離し25、ニトロセルロースにブロッティングした26。ニトロセルロース細片をウサギ抗セロリプロフィリン抗血清、RP112、ウサギ抗rPhlp6抗血清及び後者のウサギ免疫前血清で試験した。結合ウサギ抗体を1:1000希釈した125I標識ロバ抗ウサギIg抗血清Amershamで検出した。イムノゴールド電子顕微鏡検査によるPhlp6のinsitu局在。チモシー牧草花粉粒を27の記載のように無水的に固定した。超薄切片を等濃度のウサギ抗rPhlp6IgIg:Gタンパク質精製免疫グロブリン分画又は免疫前Igのいずれかと共にインキュベートした。結合ウサギ抗体を、10nmのコロイド状金粒子Plano,Wetzlar,Germanyに結合したヒツジ抗ウサギIgG抗体で検出した27。低刺激性Phlp6Phleumpratense欠失変異体の構築。N末端及びC末端のPhlp6欠失変異体を作製し、aa1-57及びaa31-110と称した。Phlp6aa1-57及びPhlp6aa31-110をコードするcDNAを、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPhlp6cDNAクローン142のPCR増幅によって得た:EcoRI及びKpnI部位をイタリック体で示し、NdeI部位及びC末端に導入されたHis標識に下線を付している。PCR産物をNdeI/KpnIaa1-57又はNdeI/EcoRIaa31-110で切断し、分取アガロースゲル電気泳動によって精製して、プラスミドpET-17bNovagenにサブクローニングし、E.coliBL21DE3Novagenに形質転換した。ウサギ抗Phlp6抗血清を用いた免疫スクリーニングにより、正しい欠失変異体を発現するコロニーを同定した。陽性クローンからのDNAをQiagentipsQiagen,Hilden,Germanyを用いて単離し、配列決定したMWG-Biotech,Hilden,Germany。E.coliにおけるPhlp6欠失変異体の発現及びIgE結合能の試験組換えPhlp6aa1-57及びPhlp6aa31-110を、液体培地中0.8のOD600、37°Cで5時間、0.5mMイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドで誘導することにより、E.coliBL21DE3において発現させた。等量のrPhlp6、rPhlp6aa1-57及びrPhlp6aa31-110をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースにブロッティングした。ニトロセルロース細片を、アレルギー個人、非アレルギー対照個人からの血清IgE、ウサギ抗Phlp6抗血清及びウサギ免疫前血清と共にインキュベートした。結合IgE抗体を125I標識抗ヒトIgE抗体で検出し、結合ウサギ抗体を125I標識ロバ抗ウサギ抗体で検出した。結果Phlp6のアイソフォーム/断片をコードするcDNAの単離と特定。Phlp6アイソフォーム/断片をコードする6個のcDNAクローンc142、c223、c171、c121、c233、c146を、牧草花粉アレルギー患者からの血清IgEでチモシー牧草花粉λgt11ライブラリーから単離した。上述したクローンの配列をGenBankデータベースに寄託したアクセス番号:Y16955-Y16960。Phlp6クローン142の推定アミノ酸配列は28aa疎水性リーダーペプチドを含んだ。グリシン残基から始まり、アラニン残基の高い含量20.9を示す成熟Phlp6クローン142タンパク質について、分子量11.8kDa、pI5.5と算定した。Phlp6のコンピュータ援用二次構造分析は顕著ならせん含量を示唆し、溶媒可触性の算定によって、N末端アミノ酸の多くが溶媒にさらされているのに対し、C末端アミノ酸は埋め込まれていることが予測される。配列モチーフについての検索によって、1つの潜在的N連結グリコシル化部位NAS:aa15-17、1つのN末端ミリストイル化部位GKAT:aa1-4、2つのcAMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位KATT:aa2-5;KYKT:aa33-36及び2つのペルオキシソーム標的部位GKA:aa1-3;SKA:aa54-56の存在が明らかになった。推定Phlp6アミノ酸配列は、最近提供されたPhlp6配列15と同一性を示し、また5群牧草花粉アレルゲンのN末端部分と類似性を示した。しかし、Phlp6特異的IgEは5群アレルゲンとほとんど若しくは全く交叉反応性を示さない。5群牧草花粉アレルゲンとの比較はVrtala,S.ら、J.Immunol.1999,16310:5489-549637その開示は参照してここに組み込まれるに述べられている。その中の図1Aは、Phlp6変異体及び5群アレルゲンの多配列整列、二次構造及び溶媒可触性の予測を示している。Phlp6のN末端はIgE結合に関連する。ニトロセルロース結合β-gal融合完全rPhlp6c223、c142、N末端トランケートrPhlp6c171、c121、c233、c146及び対照としてβ-gal単独を、9名の牧草花粉アレルギー個人及び1名の非アレルギー個人からの血清IgEに接触させた図1。結果は、2つの完全なPhlp6アイソフォーム及び4個のN末端アミノ酸のみ欠失するPhlp6断片は試験したすべての牧草花粉アレルギー患者からのIgEに強く結合し、部分的Phlp6クローンのIgE結合能はタンパク質のN末端から欠如しているアミノ酸の数に依存して低下することを示した。N末端の30個のアミノ酸を欠失する部分クローンクローン121は既にそのIgE結合能を完全に喪失していた図1。組換えPhlp6のE.coli発現と精製。精製rPhlp6のIgE結合能。E.coliBL21DE3においてrPhlp6を過剰発現させた。いくつかの精製段階の組合せによって純粋な可溶性rPhlp6約5mgタンパク質/リットルE.coli培養を生成し、SDS-PAGEにより低分子量チモシー牧草花粉アレルゲンの1つとして同定した図2A。精製組換えPhlp6のMALDI-TOF分析は、サンプルのMH及びM2H2種に対応する11790と5896の2つの質量/電荷ピークを生じ、推定Phlp6分子量11789Daと一致した。171名の牧草花粉アレルギー患者からの128の血清においてrPhlp6特異的IgE抗体が検出されたが、10名の非アレルギー個人からの血清からは検出されなかった。rPhlp6を有する牧草花粉アレルギー患者からの血清の前吸収は、ニトロセルロースにブロッティングしたチモシー牧草花粉抽出物における10-14kDa部分へのIgE結合を大きく低下させ、rPhlp6と天然Phlp6がIgEエピトープを共有することを示唆した。ELISA競合実験は、低率<20のPhlp5特異的IgEだけがrPhlp6と共に前吸収されうることを明らかにした。rPhlp1、rPhlp2及び組換えチモシー牧草プロフィリンへのIgE結合は、rPhlp6との血清のプレインキュベーション後も低下しなかった。これらの結果により、Phlp6が他の牧草花粉アレルゲンとは異なる重要なアレルゲンとして同定された。安定なすべてのαらせんコンフォメーションにおけるrPhlp6の折りたたみ精製rPhlp6の遠紫外CDスペクトル図2Bは、このタンパク質がかなりの量のαらせん二次構造を含むことを示す。スペクトルは、208nmと220nmの2つの広い最小量と191nmの最大量を特徴とする。二次構造予測37は、顕著なαらせん二次構造含量を示し、CD測定とかなり一致する。rPhlp6の変性推移は一相性であり、61°Cの融点と高度に協同する。85°Cでは、rPhlp6は200nmの典型的最小量を有するランダムコイル構造をとる。rPhlp6は、冷却曲線プロフィール図2C及び85°Cから冷却後20°Cで記録した遠紫外スペクトル図2Bから明らかなように、高度の折りたたみ可逆性を示す。組換えPhlp6は牧草花粉アレルギー患者において用量依存的な好塩基球のヒスタミン遊離と即時型皮膚反応を誘導する。精製rPhlp6は、牧草花粉アレルギー患者の好塩基球から特異的で用量依存的なヒスタミンの遊離を誘導した図3A。活性が高い牧草花粉アレルゲンであるrPhlp514、ValentaとFlicker、未発表データは、rPhlp6に比べてより低濃度でも最大の遊離を誘導した。4名の牧草花粉アレルギー患者においてrPhlp6、rPhlp5及びチモシー牧草花粉抽出物は即時型皮膚反応を誘発したが、非アレルギー患者では反応を生じなかった表1;図3B。塩化ナトリウムに対する反応は認められなかったが、ヒスタミンは試験したすべての個人で膨疹反応を誘発した表1;図3B。6群アレルゲンは花粉特異的タンパク質である。牧草花粉アレルゲンの主要な群はほとんどの牧草種で起こるが4、6群アレルゲンはチモシー牧草Phleumpratense花粉において広汎に生じることが報告された15。ウサギ抗rPhlp6抗血清は、25-28kDaの間で様々な単子葉植物Phleumpratense、Loliumperenne、Secalecereale、Triticumsativum、Avenasativa、Phragmitescommunisからのニトロセルロースブロッティングした花粉抽出物中の5群アレルゲンと交叉反応した図4A、レーン2。11kDaでPhlp6又はPhlp6関連アレルゲンがPhleumpratense及びPoapratensisからの花粉において広汎に検出された。Phlp6cDNA配列から推定したアミノ酸配列内に推定Nグリコシル化部位が認められたが、天然と組換えのPhlp6について同等の分子量が観察されたことから、天然Phlp6の多グリコシル化は排除される図4A、2A。ウサギ抗rPhlp6抗体は、ニトロセルロースブロッティングしたチモシー牧草花粉中11kDaでPhlp6と強く反応したが、葉あるいは根の抽出物とは反応しなかった図4B、レーン2。約14kDaで3つの組織すべてにおいてプロフィリンが検出された図4B、レーン1。チモシー牧草花粉におけるPhlp6の免疫電子顕微鏡的局在。包埋後イムノゴールド電子顕微鏡を用いて、ウサギ抗rPhlp6抗体を成熟チモシー牧草花粉粒内のかなりの部分を満たす多数の多糖類P-粒子に結合した図4C。金粒子の最大の蓄積はP粒子の断面図上の表面に認められ、Phlp6はP粒子内ではなくP粒子上に存在することを示唆した。花粉粒子の他の部分ではほとんど細胞質ゾル、外膜若しくは全くミトコンドリア、内膜抗rPhlp6免疫反応性を認めなかった。同様にアミロプラストではほとんど金粒子が検出されなかった。この局在パターンは、ウサギ抗rPhlp5抗血清がP粒子を標識することができなかったという我々の所見データは示していないと合わせて考えると、P粒子の免疫標識が交叉反応性5群アレルゲンの存在から生じた可能性を排除する。免疫前Igに関して実施した対照実験は、いくつかの非特異的に吸収された金粒子だけを生じた図4D。Phlp6欠失変異体aa1-57、aa31-110はIgE結合能が大きく低下したことを示す。ニトロセルロースブロットした完全なrPhlp6図5A、rPhlp6変異体aa1-57図5B及びrPhlp6変異体aa31-110図5Cを、牧草花粉アレルギー患者からの13の血清、非アトピー個人からの血清及びウサギ抗rPhlp6抗血清に接触させた。13名の牧草花粉アレルギー患者全員が完全な組換えPhlp6に対してIgE反応性を示し図5A、変異体aa1-57は、血清11によって認識され、血清13によって認識は弱くかった図5B。Phlp6変異体aa31-110は血清7及び11とのみ弱く反応した図5C。非アトピー個人からの血清は完全なrPhlp6及び欠失変異体と反応することができなかった。ウサギ抗rPhlp6抗血清は完全なrPhlp6及び2つの欠失変異体に対して同等の強度の反応性を示した図5A-C;レーン15が、ウサギ免疫前血清は当該分子の分子量の範囲内で反応性を示さなかった図5A-C;レーン16。rPhlp6に対するマウス抗rPhlp6又はrPhlp6aa31-110抗血清のIgG1反応性完全なrPhlp6及びrPhlp6aa31-110に対して惹起したマウスIgG1はrPhlp6と反応する表II。rPhlp6誘導体はヒスタミンの遊離誘導能がかなり低下している。牧草花粉に対してアレルギー性の患者からの顆粒球を様々な濃度の精製rPhlp6、rPhlp6aa1-57、rPhlp6aa31-110、rPhlp6aa1-33又は抗IgEmAbE124.2.8Dε2,Immunotech,Marseilles,Franceと共にインキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミンをRIAImmunotechによって測定した図6。精製rPhlp6は、牧草花粉に対してアレルギー性の患者の好塩基球から特異的で用量依存性のヒスタミン遊離を誘導したが、rPhlp6誘導体aa1-57及びaa31-110は1μg/mlの濃度までヒスタミンの遊離を誘導しなかった。Phlp6aa1-33は1μg/mlの濃度でヒスタミンの50遊離を誘導し、これは完全なrPhlp6に比べて約1000倍のヒスタミン遊離の低下に相当する。考察アレルギー患者の約40が牧草花粉との接触後に即時型症状を示す3。我々は、Phlp6と称する、主要なチモシー牧草花粉アレルゲンのアイソフォーム及び断片をコードするcDNAを単離した。Phlp6は、牧草花粉アレルギー患者の75のIgE抗体によって認識される11.8kDaのタンパク質アレルゲンである。従ってrPhlp6のIgE認識の発生率は先に報告された天然Phlp6についての発生率と一致し、炭水化物はPhlp6のIgE認識に関連する役割を果たしていないことを示唆する28、29。天然Phlp6について得られたペプチド配列データと一致して、我々は、rPhlp6の推定繹アミノ酸配列が、25-35kDaの主要牧草花粉アレルゲンのファミリーである5群牧草花粉アレルゲンのN末端部分と高度の配列相同性を示すことが認められた29、14。N末端の疎水性リーダーペプチドの存在により、Phlp6は、5群アレルゲン断片と異なる独立したアレルゲンである。cDNAクローンをコードするPhlp6を分析した他の著者15の提案と一致して、我々は、5群及び6群アレルゲンが、1群及び2/3群牧草花粉アレルゲンについて記述されている30と同様に、共通の祖先遺伝子から進化したのであろうと推測する。Phlp6が牧草花粉アレルゲンの独立した群に属するという仮説も、Phlp6が5群及び他の牧草花粉アレルゲンと交叉反応性IgEエピトープをほとんど共有しないという我々の所見に裏付けられる。溶媒可触性の予測からは、Phlp6のN末端アミノ酸の多くが溶媒に接触しているのに対し、C末端アミノ酸残基の大部分は被覆されていることが示された。証明されてはいないが、この所見はIgEエピトープマッピング実験から得られたデータと一致しており、この実験は、タンパク質のN末端がIgE認識に決定的に関与することを示している。しかしまた、N末端自体が優性IgEエピトープである、若しくはN末端の欠失が立体的Phlp6IgEエピトープに影響を及ぼすという可能性も存在する。E.coliにおけるPhlp6の発現は、αらせん二次構造をほとんど独占的に含む可溶性の折りたたみ組換えタンパク質を多量に生成した。Phlp6のαらせん折りたたみは、ある種のタンパク質がアレルゲンとして働く傾向として共通の構造的特徴が存在しないことがさらに確認された。Phlp6はおそらくすべてαらせんタンパク質である可能性が高いが、主要カバ花粉アレルゲンであるBetv131、及びカバプロフィリン、Betv232はαβ混合折りたたみを有する。CD分光分析によって明らかにされたように、rPhlp6は、他の免疫学的に無関係な花粉アレルゲンたとえばBetv133、Betv26、32と、変性後再び安定な構造に折りたたまれるという顕著な内在傾向を共有する。Phlp6と他の重要な植物アレルゲンが共有するもう1つの特徴は、花粉組織におけるその高い発現である。これまでに特定された植物アレルゲンの大部分が主として成熟花粉において発現されるという事実により、気道を通じた感作の軌跡と解釈することができる34。イムノゴールド電子顕微鏡検査によると、Phlp6は主として成熟花粉のP粒子上に局在した。P粒子は、休眠花粉粒の含量の30までを占め、花粉の発芽の際に成長する花粉管壁内に物質を運ぶ、小さな多糖類含有体である35、36。P粒子は小さなサイズであり<2.5ミクロン、それ故Phlp6を気管支粘膜と直接接触させる呼吸性アレルゲン担体として働くことができるので、P粒子上にPhlp6が生じることと決定的な関連性を有すると考えられる。従って、いくつかの牧草種Phleumpratense、Poapratensisだけが低分子量範囲内10-12kDaにウサギ抗rPhlp6反応性部分を含むが、P粒子と結合したPhlp6の気道深部への侵入により、アレルゲン感作の発生率が高い75ことの説明となるであろう。大腸菌Escherichikacoliに発現させた精製組換えrPhlp6アレルゲンは、牧草花粉アレルギー患者の大半のIgE抗体と反応し、好塩基球のヒスタミン遊離ならびに即時型皮膚反応を誘発した。それ故、このアレルゲンは牧草花粉アレルギーの生体外及び生体内皮膚試験診断のために使用しうる。Phlp6のN末端部分の欠失がアレルゲンのIgE結合能を著しく低下させたという我々の所見により、アフィラキシー副作用の少ない牧草花粉アレルギーの特異的免疫療法のために使用しうるPhlp6欠失変異体を構築することが可能であろうという発想に至った。同様の戦略が最近、主要カバ花粉アレルゲンBetv1の立体的IgEエピトープを崩壊するために適用された23が、Phlp6分子は連続IgEエピトープであるので、Phlp6については予測できなかったであろう。我々は、Phlp6のN末端及びC末端がトランケートされた変種を作製したが、その中で変異体aa1-57とaa31-110はIgE結合能をほとんど完全に消失していた。我々は、組換え分子として又はペプチド化学によって作製したこれら2つの低刺激性Phlp6を牧草花粉アレルギーに対するワクチン候補として使用することを提案する。表の簡単な説明表IrPhlp6に対する即時型皮膚反応。4名の牧草花粉アレルギー患者HP、SF、CS、LW及び2名の非アレルギー個人SV、SSを、精製rPhlp6、rPhlp5、天然チモシー牧草花粉抽出物、ヒスタミン及び等張塩化ナトリウムで皮膚試験した。結果は膨疹反応の平均直径mmで表わしている。表IIrPhlp6に対するマウス抗rPhlp6又は抗rPhlp6aa31-110抗血清のIgG1反応性。"