"パルボウイルスのウイルス様粒子VLPを生成する方法であって、a第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、b前記VP1タンパク質およびVP2タンパク質が発現され、VLPに集合する条件下で前記宿主細胞を維持するステップとを包含する、方法。VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで生成される、請求項1に記載の方法。VP1およびVP2を含有するVLPが生成される、請求項2に記載の方法。前記組換え核酸分子がバイシストロン性ベクターである、請求項1に記載の方法。前記第1の制御エレメントが前記第2の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項1に記載の方法。前記第1の制御エレメントが、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項4に記載の方法。前記第2の制御エレメントが、ADH2/GAPDHプロモーター配列番号19である、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞が酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。前記宿主細胞を、VP1およびVP2が生成され、これらのタンパク質がVLPに集合するのに適した培養条件下で維持する、請求項1に記載の方法。前記VLPを単離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記VLPを、宿主細胞の馴化培地、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせから単離する、請求項10に記載の方法。単離された前記VLPをさらに精製する、請求項11に記載の方法。単離された前記VLPを、スクロースクッション、スクロース勾配遠心分離、クロマトグラフィー法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いてさらに精製する、請求項12に記載の方法。請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子VLP。請求項14に記載のパルボウイルスVLPを含む免疫原性組成物。第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、適切な宿主細胞内にVP1をコードする前記配列とVP2をコードする前記配列とが同量存在する場合、VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで発現される、組換え核酸。前記第1の制御エレメントが弱いプロモーターであり、前記第2の制御エレメントが強力なプロモーターである、請求項16に記載の組換え核酸。前記第1の制御エレメントが前記第2の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項17に記載の組換え核酸。前記修飾が、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項18に記載の組換え核酸。前記第2の制御エレメントが、ADH2/GAPDHプロモーター配列番号19である、請求項16に記載の組換え核酸。前記核酸が、DNAまたはRNAの形態であり、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかである、請求項20に記載の組換え核酸。プラスミドである、請求項21に記載の組換え核酸。前記プラスミドが検出可能なマーカーを含む、請求項22に記載の組換え核酸。請求項16から23までのいずれか一項に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。前記組換え核酸が前記宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、または染色体外のエレメントに保有されている、請求項24に記載の宿主細胞。酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項25に記載の宿主細胞。請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子VLPを、診断用キット内の抗原として用いる方法。生物学的試料中の抗パルボウイルス抗体を検出する方法であって、個体から得られた生物学的試料を準備するステップと、前記試料を、請求項1から13までのいずれか一項に記載のパルボウイルスVLPと組み合わせるステップと、抗体-VLP複合体を検出するステップとを包含し、抗体-VLP複合体が存在することにより、抗パルボウイルス抗体が前記生物学的試料中に存在することが示される、方法。前記生物学的試料が血液試料または血清試料である、請求項28に記載の方法。請求項16に記載の組換え核酸を含む免疫原性組成物を、哺乳動物における免疫応答を上昇させることができる医薬品として使用する方法。前記医薬品を使用して、小児における伝染性紅斑、鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全、免疫不全の患者における貧血、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化、妊娠中の女性における胎児水腫および自然流産からなる群から選択される状態を処置または予防する、請求項28に記載の方法。パルボウイルスVP1および/またはVP2に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、有効量の請求項16から23までのいずれか一項に記載の組換え核酸を投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。前記組換え核酸を筋肉内注射によって投与する、請求項33に記載の方法。パルボウイルスVP1および/またはVP2に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、請求項14に記載のウイルス様粒子または請求項15に記載の免疫原性組成物を有効量で投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。前記ウイルス様または免疫原性組成物を筋肉内注射によって投与する、請求項34に記載の方法。本発明は、一部において、パルボウイルスのウイルス様粒子、例えば、パルボウイルスB19のウイルス様粒子を生成するための方法を提供する。一部の態様では、本発明の方法は、宿主細胞に、パルボウイルスVP1とパルボウイルスVP2の両方を含む組換え核酸、例えば、発現ベクターなどを提供するステップと、宿主細胞を、VP1タンパク質およびVP2タンパク質が発現され、パルボウイルスVLPに集合するassemble条件下で維持するステップとを含む。別の態様では、本発明の方法は、免疫化された宿主においてVLPが形成されるように、宿主において、パルボウイルスVP2と、それよりも低いレベルのパルボウイルスVP1の発現を導くバイシストロン性の核酸ワクチンを提供するステップを含む。本発明は、パルボウイルスのウイルス様粒子VLPを生成する方法であって、a第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、bVP1タンパク質およびVP2タンパク質が発現され、VLPに集合する条件下で宿主細胞を維持するステップとを含む方法に関する。好ましい方法では、VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで生成される。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。特定の態様では、VP1およびVP2を含有するVLPが生成される。組換え核酸分子はバイシストロン性ベクターであることが好ましい。特定の態様では、第1の制御エレメントは、第2の制御エレメントの改変体であり、その改変体は、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む。例えば、第1の制御エレメントは、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位または転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含んでよい。特定の態様では、第2の制御エレメントは、ADH2/GAPDHプロモーター配列番号19である。宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせであってよい。一態様では、宿主細胞を、VP1およびVP2が生成され、これらのタンパク質がVLPに集合するのに適した培養条件下で維持する。方法は、VLPを単離するステップをさらに含んでよい。VLPを、宿主細胞の馴化培地、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせから単離することができる。場合によって、単離されたVLPをさらに精製することができる。単離されたVLPは、スクロースクッションsucrosecushion、スクロース勾配遠心分離、クロマトグラフィー法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いて精製することができる。本発明は、本明細書に記載の任意の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子VLPにも関する。本発明は、パルボウイルスVLPを含む免疫原性組成物にも関する。本発明は、第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、適切な宿主細胞内にVP1をコードする配列とVP2をコードする配列とが同量存在する場合、VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで発現される、組換え核酸にも関する。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。一態様では、第1の制御エレメントは弱いプロモーターであり、第2の制御エレメントは強力なプロモーターである。第1の制御エレメントは第2の制御エレメントの改変体であってよく、その改変体は、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含んでよい。修飾は、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位または転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせであってよい。第2の制御エレメントは、ADH2/GAPDHプロモーター配列番号19であってよい。核酸は、DNAまたはRNAの形態であってよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。組換え核酸はプラスミドであってよい。プラスミドは、検出可能なマーカーを含んでよい。本発明は、本明細書に記載の組換え核酸を含む宿主細胞にも関する。組換え核酸は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてよい、または染色体外のエレメントに保有されていてよい。宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせであってよい。本発明は、本明細書に記載の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子VLPを、治療目的および診断目的で、例えば診断用キット内の抗原として用いる方法にも関する。本発明は、一部において、パルボウイルスB19のVP1およびVP2を同じ宿主細胞において発現させて、その両方のタンパク質を含有するVLPを生成することができるが、VLPの生成は効率的でないという発見に基づく。現在、VP1およびVP2を同じ宿主細胞例えば、酵母細胞において発現させると、VP1の発現により、VP2の発現およびVLPの形成が抑制されることが発見されている。この結果、VLPの形成が非効率的になり、不溶性材料の量が増加する。本発明は、パルボウイルスのVP1タンパク質とVP2タンパク質とを含有するVLPの非効率的な生成に関する問題の解決法を提供する。方法は、宿主細胞において、VP1およびVP2を、VP1がVP2と比較して低いアバンダンスで生成されるように生成することにより、パルボウイルスのVP1タンパク質とVP2タンパク質とを含有するVLPを生成するより優れた方式を提供する。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。本発明は、VP1およびVP2をコードし、宿主細胞における所望の量のタンパク質の発現を駆動する組換え核酸を提供する。例えば、VP1およびVP2の発現を別々のプロモーターによって制御し、各タンパク質の発現を所望の比率に制御することができる。本発明は、組換え核酸を含有する宿主細胞を用いてVP1およびVP2を含有するパルボウイルスVLPを生成するための方法も提供する。これらの方法は、VLPの生成効率の改善をもたらし、トランスフェクション効率の変動性例えば、細胞間の変動性およびバッチ間の変動性、VP2と比較したVP1の発現の変動性、およびVP1によるVP2の発現の抑制を含めた、VP1およびVP2を発現させるために別々のベクターを使用し、それらを一緒に混合して宿主細胞を生成する先行方法に伴う変動性および品質管理の問題を減らす。本発明の他の態様は、組換え核酸、宿主細胞、VLPおよびVLPを含有する免疫原性組成物を生成するための方法を包含する。I.定義本出願において使用される科学用語および技術用語は全て、別段の指定がない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願において使用される場合、以下の単語または句は指定された意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形a1つの、an1つのおよびtheそのは、その内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、a1つのポリヌクレオチドへの言及は、そのようなポリヌクレオチド2つ以上などの混合物を包含する。数値xに関して、用語約は、例えば、x10を意味する。本明細書で使用される場合、用語パルボウイルスは、哺乳動物種例えば、ヒト、イヌ、ニワトリ、ネコ、マウス、ブタ、アライグマ、ミンク、キルハムラットkilhamrat、ウサギlapineに関連する全てのパルボウイルス、および広範には、パルボウイルス科ファミリーの全ての属すなわち、パルボウイルス例えば、イヌパルボウイルス、デペンドウイルス例えば、アデノ随伴ウイルス、エリスロウイルス例えば、パルボウイルスB19およびボカウイルスをいう。パルボウイルスは、ヒトに感染する、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のものであることが好ましい。パルボウイルスはパルボウイルスB19であることが最も好ましい。いくつかの実施形態において、パルボウイルスは、パルボウイルス属由来である。パルボウイルスという用語は、出願時には特徴づけられていない分離株も包含する。パルボウイルスB19種は、3つの別個の遺伝子型に細分されるGallinellaら、2003年;Hokynarら、2002年;Nguyenら、2002年;Servantら、2002年。これらの遺伝子型間のヌクレオチドの相違divergencyは、およそ10であり、プロモーター領域においては20超である。以前B19Vとして公知であったウイルスは全て、遺伝子型1として分類した。遺伝子型2は、比較的まれに見いだされる。遺伝子型2が見いだされる場合、およそ40歳よりも高齢の個体においてはるかに高い頻度で同定される。遺伝子型3のウイルスは、原型protype株V9GenBank受託番号AX003421及び原型株D91.1GenBank受託番号AY083234によって代表される2つのサブタイプにクラスター化されるParsyanら、2007年。遺伝子型3のウイルスは、西アフリカのガーナに特有であることが示されておりCandottiら、2004年、また、ブラジルの特定の地域に存在する可能性がある。用語ポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生成物の最小の長さに限定されない。よって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義の範囲内に含まれる。全長のタンパク質およびそのフラグメントの両方がこの定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後postexpression修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化なども包含する。さらに、本発明の目的のために、ポリペプチドとは、タンパク質が所望の活性を維持する限りは、天然の配列に対して修飾、例えば、欠失、付加および置換など一般に天然に保存されたを含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的変異誘発によるものなど、意図的なものであってよい、または、タンパク質を生成する宿主の変異によるものまたはPCR増幅に起因するエラーなどの偶発的なものであってよい。実質的に精製されたとは、一般に、物質化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物が、その物質が、それが存在する試料における百分率の大部分を構成するように単離することをいう。典型的に、試料において、実質的に精製された成分は、その試料の50、好ましくは80~85、より好ましくは90~95を構成する。目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降が挙げられる。単離されたとは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、その分子が天然に見いだされる、生物全体から分離されており、別個である、または、同じ種類の他の生物学的な高分子の実質的な不在下で存在することを意味する。用語単離されたは、ポリヌクレオチドに関しては、天然では通常それに関連している配列の全体またはその部分を欠く核酸分子;または、天然に存在するのと同様だが、それと結びついた異種配列を有する配列;または染色体から切り離された分子である。組換えとは、本明細書において核酸分子を説明するために使用される場合、その起源または操作によって、それが天然では関連しているポリヌクレオチドの全部または一部と結びついていない、ゲノム起源、cDNA起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語組換えは、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドを発現させることによって生成されるポリペプチドを意味する。一般に、下でさらに記載するように、目的の遺伝子をクローニングし、次いで、形質転換した生物において発現させる。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を生成する。用語形質転換とは、挿入するために用いる方法に関係なく、外因性のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することをいう。例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、形質導入またはf-接合が含まれる。外因性のポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持することができる、あるいは、宿主ゲノムに組み込むことができる。組換え宿主細胞、宿主細胞、細胞、細胞株、細胞培養物、および他のそのような単細胞の実体として培養された微生物またはそれよりも高等の真核細胞株を示す用語は、組換えベクターまたは他の移入DNAのレシピエントとして用いることができる、または用いられてきた細胞をいい、トランスフェクトされた元の細胞の元の後代を包含する。コード配列または選択されたポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列または制御エレメントの制御下に置かれると、invivoで転写されDNAの場合、翻訳されてmRNAの場合ポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、5’アミノ末端の開始コドンおよび3’カルボキシ末端の翻訳終止コドンによって決定することができる。コード配列としては、これに限定されないが、ウイルス、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、ウイルスまたは原核生物のDNAまたはRNA由来のゲノムDNA配列、およびさらには合成DNA配列を挙げることができる。転写終結配列は、コード配列の3’側に位置してよい。典型的な制御エレメントとしては、これらに限定されないが、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列翻訳終止コドンの3’側に位置する、翻訳の開始を最適化するための配列コード配列の5’側に位置する、および翻訳終結配列が挙げられる。用語核酸は、DNAおよびRNAを包含し、また、それらの類似体、例えば、修飾された骨格を含有するものなど例えば、ホスホロチオエートなど、およびペプチド核酸PNAなども包含する。本発明は、上記のものと相補的な配列を含む核酸を包含する例えば、アンチセンスまたはプローブするprobing目的で。作動可能に連結したとは、そう記載されている成分がそれらの通常の機能を果たすように構成されている、エレメントの配置arrangementをいう。よって、コード配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を導くように機能する限りは、コード配列と隣接している必要はない。よって、例えば、介在性の、翻訳されないが転写された配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在してよく、それでも、プロモーター配列はコード配列に作動可能に連結したとみなされ得る。にコードされるとは、ポリペプチド配列またはその部分が、少なくとも3アミノ酸のアミノ酸配列を含有するポリペプチド配列をコードする核酸配列をいう。発現カセットまたは発現構築物とは、目的の配列複数可または遺伝子複数可の発現を導くことができる集合体をいう。発現カセットは、一般に、上記の通り、制御エレメント、例えば、目的の配列複数可または遺伝子複数可に作動可能に連結しているそれらの転写を導くためにプロモーターなどを含み、多くの場合、その上ポリアデニル化配列も含む。本発明のある特定の実施形態の範囲内では、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含有されてよい。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は、1または複数の選択マーカー、プラスミド構築物が一本鎖DNAとして存在することを可能にするシグナル例えば、M13複製開始点、少なくとも1つの多重クローニング部位、および哺乳動物の複製開始点例えば、SV40またはアデノウイルス複製開始点も含んでよい。精製されたポリヌクレオチドとは、本質的に遊離している、例えば、ポリヌクレオチドが天然に関連しているタンパク質を約50未満、好ましくは約70未満、およびより好ましくは少なくとも約90未満含有する目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技法は、当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞を、カオトロピック作用剤を用いて破壊すること、およびポリヌクレオチド複数可およびタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度にしたがった沈降によって分離することが挙げられる。ベクターは、核酸配列を標的細胞に移入することができる例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子キャリア、およびリポソーム。典型的に、ベクター構築物、発現ベクターおよび遺伝子移入ベクターとは、目的の核酸の発現を導くことができる任意の核酸構築物を意味し、これは、核酸配列を標的細胞に移入することができる。よって、これらの用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。本明細書で使用される場合、用語エピトープとは、一般に、T細胞受容体および/または抗体によって認識される抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質抗原に由来する、またはその一部の短いペプチドであることが好ましい。しかし、この用語は、グリコペプチドおよび炭水化物エピトープ、および一次配列は連続していないが最終的に折りたたまれた構造では互いに近傍に位置するペプチドで構成されるグリコシル化などの修飾を伴う、または伴わないタンパク質表面を有するペプチドも包含することが意図される。いくつかの異なるエピトープが単一の抗原性分子に保有され得る。エピトープは、1または複数の他の分子と共有結合的に、または非共有結合的に結びつく2つ以上の分子からできていてよい。用語エピトープは、生物全体を認識する応答を刺激する、アミノ酸または炭水化物の修飾された配列も包含する。選択されたエピトープが、感染症を引き起こす感染性因子のエピトープであれば有利である。本明細書で使用される場合、用語T細胞エピトープは、一般に、T細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいい、B細胞エピトープは、一般に、B細胞応答を誘導することができるペプチド構造の特徴をいう。抗原または組成物に対する免疫学的応答は、被験体における、目的の組成物内に存在する抗原に対する体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的のために、体液性免疫応答とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、細胞性免疫応答は、T-リンパ球および/または他の白血球によって媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の1つの重要な態様は、細胞溶解性T細胞cytolyticT-cellCTLによる抗原に特異的な応答を伴う。CTLは、主要組織適合性複合体MHCにコードされるタンパク質と結びついて提示され、細胞の表面上で発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。CTLは、細胞内の微生物の破壊の誘導および促進、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を助ける。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーT細胞による抗原に特異的な応答を伴う。ヘルパーT細胞は、それらの表面上にMHC分子と結びついたペプチド抗原を提示している細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の機能を刺激すること、およびその活性の焦点を合わせることを助けるように作用する。細胞性免疫応答とは、CD4T細胞およびCD8T細胞に由来するものを含めた、活性化されたT細胞および/または他の白血球によって生成される、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の生成もいう。細胞性免疫応答を惹起する免疫原性組成物またはワクチンは、脊椎動物の被験体を、細胞表面において抗原をMHC分子と結びつけて提示させることによって感作するために役立ち得る。細胞媒介性免疫応答は、それらの表面に抗原を提示している細胞、またはその近傍に向けられる。さらに、抗原に特異的なT-リンパ球を生じさせて、免疫化された宿主の将来の防御を可能にすることができる。特定の抗原の、細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、いくつものアッセイ、例えば、リンパ球増殖リンパ球活性化アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイによって、または、感作された被験体において抗原に特異的なT-リンパ球をアッセイすることによって決定することができる。そのようなアッセイは当技術分野で周知である。例えば、Ericksonら、J.Immunol.1993年151巻:4189~4199頁;Doeら、Eur.J.Immunol.1994年24巻:2369~2376頁を参照されたい。細胞媒介性免疫応答を測定する最近の方法は、細胞内のサイトカインまたはT細胞集団によるサイトカインの分泌を測定することを含む、または、エピトープに特異的なT細胞を測定することによる例えば、四量体技法によってMcMichael,A.J.、およびO’Callaghan,C.A.、J.Exp.Med.187巻9号1367~1371頁、1998年;Mcheyzer-Williams,M.G.ら、Immunol.Rev.150巻:5~21頁、1996年;Lalvan,A.ら、J.Exp.Med.186巻:859~865頁、1997年により概説されている。よって、免疫学的応答とは、本明細書で使用される場合、抗体の生成例えば、細菌毒素、および細胞に進入して複製するウイルスなどの病原体を、毒素および病原体に結合することによって遮断し、典型的に、細胞を感染および破壊から保護する中和性抗体を刺激するものであってよい。目的の抗原は、CTLの生成も惹起することができる。よって、免疫学的応答としては、以下の効果の1または複数を挙げることができる:B細胞による抗体の生成;ならびに/または、目的の組成物またはワクチンに存在する1または複数の抗原を特異的に向けさせるサプレッサーT細胞および/または記憶/エフェクターT細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和するため、および/または抗体-補体、または抗体依存性細胞傷害ADCCを媒介して、免疫化された宿主に防御をもたらすために役立ち得る。そのような応答は、当技術分野で周知の標準の免疫測定法および中和アッセイを使用して決定することができる例えば、Montefioriら1988年JClinMicrobiol.26巻:231~235頁;Dreyerら1999年AIDSResHumRetroviruses1999年15巻17号:1563~1571頁を参照されたい。哺乳動物の先天性免疫系は、病原性生物の分子上の特徴も、免疫細胞上のToll様受容体および同様の受容体分子を活性化することによって認識し、それに応答する。先天性免疫系が活性化されると、種々の非適応性の免疫応答細胞が活性化されて、例えば、種々のサイトカイン、リンフォカインおよびケモカインが生成される。先天性免疫応答によって活性化される細胞としては、単球moncyteおよび形質細胞様plamasacytoid系列MDC、PDCの未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞、ならびにガンマ、デルタ、アルファおよびベータT細胞およびB細胞などが挙げられる。よって、本発明は、先天性応答と適応応答の両方を伴う免疫応答も意図している。免疫原性組成物は、組成物を被験体に投与することにより被験体において目的の抗原性分子に対する体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答が発生する場合の、抗原性分子を含む組成物である。用語免疫原性タンパク質またはポリペプチドは、上記の通り免疫学的応答を惹起するアミノ酸配列をいう。免疫原性タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で使用される場合、前駆体および成熟形態、その類似体、またはその免疫原性フラグメントを含めた、問題のタンパク質の全長の天然配列または組換え配列を包含する。上で定義されたパルボウイルスのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、パルボウイルスに由来する分子であり、それぞれ、これらに限定することなく、パルボウイルスの種々の分離株の任意のものを含む。分子は、問題の特定の分離株に物理的に由来する必要はないが、合成的にまたは組換えによって生成することができる。具体的には、パルボウイルスB19のゲノムは、3つのオープンリーディングフレームを含有する:77kDaの非構造タンパク質であるNS1は、ヌクレオチド436~2451にコードされ;副次的な構造タンパク質であるVP1は、ヌクレオチド2444~4787にコードされ、主要な構造タンパク質であるVP2は、ヌクレオチド3125~4787にコードされるCorcoranら、J.Med.Microb.、2004年。パルボウイルスB19は、構造遺伝子および非構造遺伝子を示差的に発現させることができる単一のプロモーター、p6を用いるBlundellら、1987年、Ozawaら、1987年。前述の番号付けは、パルボウイルスB19のゲノムのヌクレオチド配列に対するものであるが、パルボウイルスの他の遺伝子型および分離株から得られた配列における対応する位置も、本発明に含有されるものと理解されるべきである。VP1またはVP2をコードする核酸のうちのいずれか1つ、ならびにその改変体、例えば、その免疫原性フラグメントなど、ならびにそのような核酸にコードされるポリペプチドを、本発明の実施において用いることができる。本明細書で使用される場合、用語副次的な構造タンパク質または副次的な構造ポリペプチドまたは副次的なカプシドタンパク質または副次的なカプシドポリペプチドまたはVP1は、パルボウイルスに関しては、パルボウイルスのORF2にコードされるポリペプチドと相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それらに対して少なくとも約80~100、これらの範囲内の任意の同一性、例えば、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100の配列同一性などを含めた配列同一性を示す配列を含む。本明細書で使用される場合、用語主要な構造タンパク質または主要な構造ポリペプチドまたは主要なカプシドタンパク質または主要なカプシドポリペプチドまたはVP2は、パルボウイルスに関しては、パルボウイルスのORF3にコードされるポリペプチドと相同または同一である配列を含むポリペプチドをいい、それらに対して少なくとも約80~100、これらの範囲内の任意の同一性、例えば、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100の配列同一性などを含めた配列同一性を示す配列を含む。本明細書で使用される場合、用語ウイルス様粒子またはVLPは、ウイルスカプシドを含有するが、ウイルスのゲノムの全部または一部、具体的には、ウイルスのゲノムの複製成分を欠く非複製的な、非感染性のウイルスの殻をいう。VLPは、一般に、1または複数のウイルスタンパク質、例えば、これらに限定されないが、カプシド、外被、殻、表面、構造タンパク質と称されるタンパク質など例えば、VP1、VP2で構成される。パルボウイルスVLPは、適切な発現系においてVP2を組換え発現させると、自発的に形成され得る。特定のVLPを生成するための方法は当技術分野で公知であり、以下により詳細に考察されている。ウイルスタンパク質を組換え発現させた後のVLPの存在は、当技術分野で公知の従来の技法、例えば、電子顕微鏡法、生物物理学的な特徴付けなどを使用して検出することができる。例えば、VLPは、密度勾配遠心分離によって単離することができ、かつ/または、特徴的な密度バンド形成densitybandingによって同定することができる。あるいは、問題のVLP調製物のガラス化した水性試料において低温電子顕微鏡法を実施し、適切な曝露条件下で画像を記録することができる。本明細書で使用される場合、生物学的試料は、これらに限定されないが、例えば、血液、血漿、血清、排泄物fecalmatter、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚、呼吸器、腸、および泌尿生殖器の外分泌物、涙、唾液、乳、血球、器官、生検材料を含めた、被験体から単離された組織または流体の試料、ならびに、これらに限定されないが、細胞および組織、例えば組換え細胞、および細胞成分を培地中で成長させることによって生じる馴化培地を含めた、invitro細胞培養物の構成成分の試料をいう。具体的には、パルボウイルスは、生物学的試料、例えば、ウイルスに感染した個体由来のエアロゾルまたは呼吸器分泌物または血液などから得ることができる。被験体は、これらに限定することなく、チンパンジーなどの非ヒト霊長類および他の類人猿およびサル種を含めたヒトおよび他の霊長類;農場動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなど;家庭内哺乳動物、例えば、イヌおよびネコなど;げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどを含めた実験動物;家禽、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽の鳥類、アヒル、ガチョウなどを含めた鳥類などを含めた、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。よって、成体個体および新生仔個体のどちらも包含されるものとする。治療有効量は、免疫原性組成物に関しては、抗体を生成させるため、またはパルボウイルス感染を処置もしくは予防するためのいずれかの免疫学的応答を誘導するであろう免疫原例えば、免疫原性ポリペプチド、融合タンパク質、ポリタンパク質、VLP、または抗原をコードする核酸の量を意味する。そのような応答は、一般に、被験体において、組成物に対する抗体媒介性免疫応答および/または分泌性免疫応答もしくは細胞性免疫応答の発生をもたらすであろう。通常、そのような応答は、これらに限定されないが、以下の効果の1または複数を含む;免疫グロブリンA、免疫グロブリンD、免疫グロブリンE、免疫グロブリンGまたは免疫グロブリンMなどの任意の免疫学的クラス由来の抗体の生成;Bリンパ球およびTリンパ球の増殖;免疫学的な細胞immunologicalcellに対する活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルをもたらすこと;ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、および/または細胞傷害性T細胞および/またはγσT細胞集団の増大。本発明の目的のために、アジュバントの有効量は、共投与されたcoadministered抗原または抗原をコードする核酸に対する免疫学的応答を増強する量となる。本明細書で使用される処置は、i伝統的なワクチンの場合と同様に感染または再感染の予防、ii症状の低減または排除、およびiii問題の病原体の実質的な排除または完全な排除、のいずれかをいう。処置は、予防的に感染する前に、または治療的に感染した後に実施することができる。発明を実施するための形態本発明を詳細に説明する前に、本発明は、それ自体が当然変動し得る、特に例示されている分子またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、単に本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、別段の指定のない限り、その全てが当技術分野の通常の技術の範囲内である、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技法および免疫学の従来の方法を用いるであろう。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual第3版、2000年;DNACloning:APracticalApproach、第III巻D.Glover編;OligonucleotideSynthesisN.Gait編、1984年;APracticalGuidetoMolecularCloning1984年;およびFundamentalVirology、第4版、2001年B.N.FieldsおよびD.M.Knipe編;HandbookofExperimentalImmunology、第I~IV巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、BlackwellScientificPublications;A.L.Lehninger、BiochemistryWorthPublishers,Inc.、currentedition;MethodsInEnzymologyS.ColowickおよびN.Kaplan編、AcademicPress,Inc.を参照されたい。本明細書に記載のものと同様または同等であるいくつもの方法および材料を本発明の実施において用いることができるが、本明細書には、好ましい材料および方法が記載されている。さらに、本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものであろうが下記のものであろうが、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。A.核酸本発明は、パルボウイルスVP1およびパルボウイルスVP2をコードする組換え核酸分子に関する。コードされるVP1およびVP2は、任意の所望のパルボウイルス、または任意の所望の組み合わせ由来であってよい。コードされるVP1およびVP2は、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。パルボウイルスは、パルボウイルスB19であることが最も好ましい。一部の態様では、VP1をコードする配列およびVP2をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。VP1をコードする配列およびVP2をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることが好ましい。パルボウイルスのVP1タンパク質およびVP2タンパク質は、天然に存在するタンパク質、例えば、パルボウイルスB19の天然に存在するVP1のアミノ酸配列などと同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を有してよい。所望に応じて、いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、天然に存在する配列と、1または複数のアミノ酸の置換、付加および/または欠失により異なってよい。VP1またはVP2におけるアミノ酸残基の約10未満または約5未満が置換されている、付加されている、または欠失していることが好ましい。VP1タンパク質またはVP2タンパク質のアミノ酸配列は、天然に存在するパルボウイルスのVP1タンパク質またはVP2タンパク質と少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99同一であることが好ましい。アミノ酸配列の変動は、一般に、VP1タンパク質またはVP2タンパク質の間で保存されておらず、よって、タンパク質の、VLPを形成する能力に干渉しない領域において許容される。所望に応じて、変異例えば、アミノ酸の置換、付加または欠失を導入して、ある特定の機能を変化させることができ、例えば、VP1を変異させて、そのホスホリパーゼ活性を不活化することができる。例えば、VP1のアミノ酸配列は、点変異例えば、His153Ala、またはWO06/032697、EP1791858またはUS20070286870に記載の任意の変異を含有してよい。本発明の組換え核酸は、VP1およびVP2の転写および/または翻訳の独立した調節をもたらし、したがって、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、VP2に対して低いアバンダンスで発現される。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。いくつかの実施形態において、VP1をコードするヌクレオチド配列において使用されるコドンおよびVP2をコードするヌクレオチド配列において使用されるコドンは、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、VP2に対して低いアバンダンスで発現されるように選択される。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。これは、例えば、VP2をコードする、コドン最適化されたヌクレオチド配列、および、VP1をコードする、コドン最適化されていないまたは脱コドン最適化codondeoptimizeされたヌクレオチド配列を用いて実現することができる。他の実施形態において、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が適切な宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、VP2に対して低いアバンダンスで発現されるように、VP1をコードするヌクレオチド配列およびVP2をコードするヌクレオチド配列を異なる制御エレメントに作動可能に連結する。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。VP1およびVP2の発現のための制御エレメントは、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、所望の宿主細胞によって、VP2よりも低いアバンダンスで生成されるように選択される。これは、一般に、VP1およびVP2の転写、翻訳、または転写および翻訳に影響を及ぼす制御エレメントを使用して実現される。例えば、VP2をコードするヌクレオチド配列は、強力なプロモーターに作動可能に連結していてよく、VP1をコードするヌクレオチド配列は、弱いプロモーターに作動可能に連結していてよい。使用するプロモーターは、VP1の発現とVP2の発現を独立して調節することを可能にする任意のプロモーターであってよい。酵母において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、pBS24.1に組み込まれたADH2/GAPDHプロモーターである図1。酵母において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、YPTI構成的活性プロモーターである。Searsら、Yeast14巻:783~790頁1998年を参照されたい。酵母または他の宿主細胞において用いるための他の適切な強力なプロモーターおよび弱いプロモーターは当技術分野で公知である。例えば、哺乳動物細胞において発現させるための強力なプロモーターは、CMVプロモーターである。細菌において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、recAプロモーターである。細菌において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、araBADプロモーターである。いくつかの実施形態において、VP2をコードするヌクレオチド配列は、所望の宿主細胞において発現させるのに適したプロモーターに作動可能に連結しており、VP1をコードするヌクレオチド配列は、そのプロモーターの改変体、例えば、発現脱最適化deoptimizeされた改変体などに作動可能に連結している。改変体プロモーターは、VP1の発現をVP2と比較して低下させる例えば、可溶性のVP1を可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成させるために、親プロモーターに対してさまざまな方式で修飾することができる。例えば、改変体プロモーターは、VP1をコードする核酸の上流の転写エレメントの配列の変更、またはVP1をコードする核酸の上流の転写エレメントの一部の欠失、例えば、VP1をコードする核酸の上流の1または複数の転写開始部位の導入による、VP1をコードする核酸の上流の1または複数の転写終止部位の導入による、またはそれらの任意の組み合わせによるTATAボックスまたは接合部位の全部または一部の変更または欠失などによって修飾することができる。これらのプロモーターの機能性部分は、当技術分野で周知であり、任意の所望のプロモーターにおいて容易に同定し、修飾することができる。組換え核酸は、所望に応じて、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、所望の宿主細胞によって、VP2よりも低いアバンダンスで生成されるように、他の調節エレメント、例えば、エンハンサー結合部位、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、誘導性プロモーター、抑制因子、RNAの安定性に影響を及ぼすエレメント、siRNA、スプライス部位など、ならびにそれらの欠失および変更を含有してよい。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ADH2/GAPDHプロモーターに作動可能に連結している、VP2をコードするヌクレオチド配列図6、配列番号19、およびADH2/GAPDHプロモーターの改変体に作動可能に連結している、VP1をコードするヌクレオチド配列を含有し、それにより、VP1の発現がVP2と比較して減少する例えば、可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成される。本発明において用いるのに適した改変体ADH2/GAPDHプロモーターの例としては、プロモーターの1または複数の部分例えば、約1nt~約20ntの部分が天然のパルボウイルス配列の部分と交換されている改変体、例えば、デルタAs改変体など図7、配列番号20、TATAボックスの全部または一部が欠失または変化している改変体、例えば、TATA欠失改変体など図8、配列番号21、1または複数の転写開始配列および/または転写終止配列を含有する改変体、例えば、1SS改変体など図9、配列番号22、およびこれらの修飾の任意の組み合わせを含有するプロモーターが挙げられる。他の実施形態において、VP2をコードするヌクレオチド配列を所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化し、VP1をコードするヌクレオチド配列は所望の宿主細胞において発現させるためのコドン最適化をしない、または例えば、好ましいコドンではないコドンを用いることによって脱コドン最適化codondeoptimizeする。VP1およびVP2の発現を制御する発現制御エレメントは、任意の所望のVP1:VP2の発現比率:、例えば、約49:51、約40:60、約30:70、約25:75、約20:80、約15:85、約10:90、約9:91、約8:92、約7:93、約6:94、約5:95、約4:96、約3:97、約2:98、約1:99、約2:98~約20:80、約5:95~約20:80、約5:95~約15:85、または約7:93~約12:88などが生成するように選択してよい。発現比率は、可溶性のVP1:可溶性のVP2の比率であることが好ましい。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、VP1の発現がVP2の発現に対して低くなることにより、VP1に媒介されるVP2の発現、集合および/または安定性の抑制が低下し、その結果、VP1およびVP2を含有するVLPのより効率的な生成およびより高い収率がもたらされると考えられている。パルボウイルスタンパク質をコードする核酸は、任意の適切な方法を用いて構築することができ例えば、化学合成によって、組換えDNA技術を用いて、また、種々の形態をとってよい例えば、一本鎖、二本鎖、ベクターなど。組換え構築物を生成するための多くの適切な方法が当技術分野では周知であり、慣例的である。例えば、組換え核酸は、VP1タンパク質もしくはVP2タンパク質の部分をコードする配列を含む2以上のオリゴヌクレオチドから、または標準の分子生物学技法を用いてオリゴヌクレオチドをライゲーションして全長のVP1タンパク質もしくはVP2タンパク質をコードする配列を形成することによって生成することができる。例えば、米国特許第6,632,601号および米国特許第6,630,298号を参照されたい。核酸は、実質的に純粋な形態で調製されることが好ましいすなわち、他の宿主細胞または非宿主細胞の核酸を実質的に含まない。目的のVP1タンパク質および/またはVP2タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、感染した個体由来の呼吸器分泌物または血液中に存在するウイルスRNAに由来するゲノムライブラリーから単離することができる。あるいは、パルボウイルスの核酸は、感染したヒトまたは他の哺乳動物から、または感染した個体から収集した呼吸器分泌物もしくは血液から単離することができる。PCRなどの増幅方法を使用して、パルボウイルスのゲノムRNAまたはパルボウイルスをコードするcDNAのいずれかからポリヌクレオチドを増幅することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、化学的に合成することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対する適切なコドンを用いて設計することができる。合成構築物は、VP2タンパク質またはVP1/VP2タンパク質が生成される目的の宿主細胞において発現させるために最適化されたコドンを含有することが好ましい。目的のポリヌクレオチドの完全な配列は、標準の方法によって調製した重複しているオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、完全なコード配列に組み立てることができる。例えば、Edge1981年Nature292巻:756頁;Nambairら1984年Science223巻:1299頁;Jayら1984年J.Biol.Chem.259巻:6311頁;Stemmerら1995年Gene164巻:49~53頁を参照されたい。ポリヌクレオチドは、RNAまたは一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAであってよい。ポリヌクレオチドは、タンパク質および脂質などの他の成分がなく単離されることが好ましい。あるいは、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得ることができる、または、当技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技法、例えば、部位特異的変異誘発および適切な場合にはポリメラーゼ連鎖反応PCR技法などを用いて完全にまたは部分的に合成することができる。例えば、Sambrook、上記を参照されたい。具体的には、所望のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を得る1つの方法は、重複している合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、次いで適切なDNAリガーゼを用いてライゲーションし、ライゲーションされたヌクレオチド配列をPCRによって増幅することによる。例えば、Jayaramanら1991年Proc.Natl.Acad.Sci.USA88巻:4084~4088頁を参照されたい。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成oligonucleotidedirectedsynthesisJonesら1986年Nature54巻:75~82頁、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発Riechmannら1988年Nature332巻:323~327頁およびVerhoeyenら1988年Science239巻:1534~1536頁、およびギャップ形成されたgappedオリゴヌクレオチドの、T4DNAポリメラーゼを用いた酵素的穴埋めQueenら1989年Proc.Natl.Acad.Sci.USA86巻:10029~10033頁を用いることができる。VP1タンパク質および/またはVP2タンパク質をコードする組換え構築物は、発現ベクターなどの適切なベクターにおいて、従来の方法を使用して調製することができる。好ましい組換え構築物、例えば、発現ベクターなどは、パルボウイルスVP1タンパク質をコードする核酸配列およびパルボウイルスVP2タンパク質をコードする核酸配列を含む。組換え構築物は、DNA、RNA、またはRNAとDNAの組み合わせの形態であってよく、また、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。例えば、構築物は、プラスミド、直鎖DNAまたはRNA、mRNA、自己複製するRNA例えば、アルファウイルスベースのレプリコンなどの形態であってよい。所望の宿主細胞において組換えタンパク質を発現させるためのいくつもの適切なベクターが当技術分野では周知であり、慣例的である。適切なベクターは、これらに限定されないが、以下の1または複数を含めたいくつもの成分を含有してよい:複製開始点;選択マーカー遺伝子;1もしくは複数の発現制御エレメント、例えば、転写性の制御エレメントなど例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、および/または1もしくは複数の翻訳シグナル;ならびに選択された宿主細胞例えば、哺乳動物起源の宿主細胞または異種哺乳動物もしくは非哺乳動物種由来の宿主細胞の分泌経路にターゲティングするためのシグナル配列またはリーダー配列。例えば、昆虫細胞における発現のために、適切なバキュロウイルス発現ベクター、例えば、pFastBacInvitrogenなどを使用して、組換えバキュロウイルス粒子を生成することができる。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させるために使用して、組換えタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞における発現のために、所望の哺乳動物の宿主細胞例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞において構築物の発現を駆動するベクターを用いる。同様に、酵母における発現のために、所望の酵母宿主細胞例えば、Saccharomycescerevisiae、Candidaalbicans、Candidamaltosa、Hansenualpolymorpha、Kluyveromycesfragilis、Kluyveromyceslactis、Pichiaguillerimondii、Pichiapastoris、SchizosaccharomycespombeおよびYarrowialipolyticaにおいて発現を駆動するベクターを用いる。ウイルスベクターは、真核細胞において本発明のVLP、例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含めたポックスファミリーのウイルスに由来するものなどのVLPを生成するために用いることができる。さらに、Tomeiら、J.Virol.1993年67巻:4017~4026頁およびSelbyら、J.Gen.Virol.1993年74巻:1103~1113頁に記載のワクシニアに基づく感染/トランスフェクション系も、本発明における用途がある。この系では、まず、細胞に、バクテリオファージのT7RNAポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルスをinvitroで感染させる。このポリメラーゼは、T7プロモーターを担持する鋳型のみを転写するという点で優れた特異性を示す。感染させた後に、細胞を、T7プロモーターによって駆動される目的のDNAを用いてトランスフェクトする。組換えワクシニアウイルス由来の細胞質において発現されたポリメラーゼにより、トランスフェクトされたDNAがRNAに転写され、次いでそれが、宿主の翻訳機構によりタンパク質に翻訳される。あるいは、前駆体系の場合と同様に、T7を精製タンパク質または酵素として加えることができるStudierおよびMoffatt、J.Mol.Biol.1986年189巻:113~130頁。この方法により、多量のRNAおよびその翻訳生成物複数可が、細胞質内で、高レベルで一過性に生成される。組換え核酸は、パルボウイルスB19VP1タンパク質をコードする第1の核酸配列およびパルボウイルスB19VP2タンパク質をコードする第2の核酸配列を含んでよく、各核酸配列は、別々のプロモーターによって制御される。パルボウイルスB19のVP1タンパク質およびVP2タンパク質ならびにそれらのそれぞれの制御配列は、組換え核酸例えば、プラスミドにおいて任意の所望の方向または順番で現れてよく、本明細書で使用される場合、言葉第1の核酸および第2の核酸によって限定されない。組換え核酸は、パルボウイルスB19VP1の発現を、パルボウイルスB19VP2と比較して転写的におよび/または翻訳的に減少させる修飾を含むプラスミドであってよい。修飾は、TATAボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、パルボウイルスB19VP1をコードする核酸の上流の接合部位の配列の欠失または変更、パルボウイルスB19VP1をコードする核酸の上流の1または複数の転写開始部位および/もしくは転写終止部位の導入、またはこれらの修飾の任意の組み合わせであってよい。例えば、修飾は、TATAボックスの一部の欠失およびパルボウイルスB19VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失であってよい、または修飾は、パルボウイルスB19VP1をコードする核酸の上流の2つ以上の転写開始部位および/または転写終止部位の導入であってよい。所望に応じて、組換え核酸は、検出可能なマーカーを含んでよいベクターであってよい。例えば、検出可能なマーカーは、1または複数の抗生物質に対する耐性を付与するポリペプチドであってよい。B.宿主細胞本発明は、本明細書に記載の、パルボウイルスVP1およびパルボウイルスVP2をコードする組換え核酸分子を含有する組換え宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、VP1をコードするヌクレオチド配列およびVP2をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。これらの実施形態において、宿主細胞は、2つの異なる組換え核酸分子を含有する。宿主細胞は、実質的に等量の、VP1をコードするヌクレオチド配列とVP2をコードするヌクレオチド配列例えば、実質的に等量の、2つの異なる組換え核酸を含有することが好ましい。VP1をコードするヌクレオチド配列、VP2をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることがより好ましい。これらの実施形態において、宿主細胞は、複数のコピーで存在し得る単一の組換え核酸分子を含有する。組換え宿主細胞は、本明細書に記載の核酸分子の任意のものを含有してよい。適切な宿主細胞としては、例えば、酵母細胞例えば、Saccharomycescerevisiae、Candidaalbicans、Candidamaltosa、Hansenualpolymorpha、Kluyveromycesfragilis、Kluyveromyceslactis、Pichiaguillerimondii、Pichiapastoris、SchizosaccharomycespombeおよびYarrowialipolytica、昆虫細胞例えば、Aedesaegypti、Autographacalifornica、Bombyxmori、Drosophilamelanogaster、Spodopterafrugiperda、およびTrichoplusiani、哺乳動物細胞例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類例えば、ハムスター、トリの細胞例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ、細菌例えば、E.coli、Bacillussubtilis、およびStreptococcus種、テトラヒメナの細胞例えば、Tetrahymenathermophilaまたはそれらの組み合わせが挙げられる。適切な酵母株としては、例えば、S.cerevisiaeのAD2株、JSC310株、AD3株およびAD4株が挙げられる。多くの適切な昆虫細胞および哺乳動物細胞が当技術分野で周知である。適切な昆虫細胞としては、例えば、Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、シュナイダーS2細胞、およびHighFive細胞親のTrichoplusianiBTI-TN-5B1-4細胞株Invitrogenから得たクローン単離株が挙げられる。適切な哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、ヒト胎児性腎臓細胞HEK293細胞、典型的に、せん断されたアデノウイルス5型DNAにより形質転換される、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞、HeLa細胞、PERC.6細胞ECACC寄託番号96022940、HepG2細胞、MRC-5ATCCCCL-171、WI-38ATCCCCL-75、アカゲザル胎仔肺細胞ATCCCL-160、メイディンダービーウシ腎臓MDBK細胞、メイディンダービーイヌ腎臓MDCK細胞例えば、MDCKNBL2、ATCCCCL34;またはMDCK33016、DSMACC2219、ベビーハムスター腎臓BHK細胞、例えば、BHK21-F、HKCC細胞などが挙げられる。適切なトリの細胞としては、例えば、ニワトリ胚性幹細胞例えば、EBx登録商標細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒルの細胞例えば、AGE1.CR細胞株およびAGE1.CR.pIX細胞株ProBioGen、例えば、Vaccine27巻:4975~4982頁2009年およびWO2005/042728に記載されている、EB66細胞などが挙げられる。適切な昆虫細胞発現系、例えば、バキュロウイルス系などは、当業者に公知であり、例えば、SummersおよびSmith、TexasAgriculturalExperimentStationBulletinNo.15551987年に記載されている。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、とりわけ、Invitrogen、SanDiegoCAからキットの形態で市販されている。トリ細胞発現系も当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,340,740号;同第5,656,479号;同第5,830,510号;同第6,114,168号;および同第6,500,668号;欧州特許EP0787180B;欧州特許出願EP03291813.8;WO03/043415;およびWO03/076601に記載されている。同様に、酵母、細菌および哺乳動物細胞の発現系も当技術分野で公知であり、例えば、GeneticEngineeringBarrら編、1989年Butterworths、Londonに記載されている。C.ウイルス様粒子VLPの生成本発明は、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスVLPを生成するためのプロセスを提供する。VLPは、任意の所望のパルボウイルス由来のVP1およびVP2、または任意の所望の組み合わせを含有してよい。本明細書に記載の通り、VP1タンパク質およびVP2タンパク質は、天然に存在するパルボウイルスのVP1またはVP2と同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を有してよい、あるいは、1もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有してよい。例えば、VP1を変異させて、そのホスホリパーゼ活性を不活化することができる。例えば、VP1のアミノ酸配列は、点変異例えば、His153Ala、またはWO06/032697、EP1791858もしくはUS20070286870に記載の任意の変異を含有してよい。VP1およびVP2を含有するVLPは、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。VLPは、パルボウイルスB19VP1およびパルボウイルスB19VP2を含有することが最も好ましい。プロセスは、VP1およびVP2を生成する宿主細胞を、本明細書に記載の通り、組換え核酸にコードされるVP1タンパク質およびVP2タンパク質が生成され、VP1およびVP2を含有するVLPに集合させる条件下で維持するステップを含む。本発明の方法では、VP1は、宿主細胞により、VP2に対して低いアバンダンスで生成される。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。場合によって、プロセスは、VLPを培養培地から、細胞溶解物もしくはホモジネートから、またはそれらの任意の組み合わせから単離または精製するステップをさらに含む。一部の態様では、方法は、VP1タンパク質およびVP2タンパク質をコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を、VP1およびVP2が発現され、VP1およびVP2が自己集合してVLPを形成するのに適した条件下で培養するステップを含む。VLPの形成に適した条件は周知であり、当業者が容易に決定することができる。例えば、酵母細胞Saccharomycescerevisiaeおよび昆虫細胞SF9におけるウイルス粒子の生成について記載している米国特許第7,527,801号、および、HEK293T細胞におけるVLPの生成について記載しているTaube,S.ら、ArchivesofVirology、150巻:1425~1431頁2005年を参照されたい。所望に応じて、方法は、パルボウイルスVLPを、培養培地、細胞例えば、細胞溶解物またはホモジネートからまたはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含んでよい。一部の好ましい実施形態において、VLPを生成するために用いる宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、またはそれらの組み合わせであり、宿主細胞は、VP2と比較して少ないVP1を生成する。本明細書に記載の通り、宿主細胞は、VP1およびVP2をコードする核酸に作動可能に連結している個々の制御エレメントに起因して、ならびに/またはVP1およびVP2をコードする組換え核酸の他の特徴、例えば、最適化されたコドンの使用および脱最適化deoptimizeされたコドンの使用などに起因して、VP1をVP2と比較して低いアバンダンスで生成する例えば、可溶性のVP1を可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成する。そのような制御エレメント例えば、プロモーターおよび特徴例えば、コドンの使用により、VP1およびVP2の相対的な生成を制御することが可能になる。VP1をVP2よりも低いアバンダンスで生成することを可能にする任意の適切な宿主細胞をこの方法において用いることができる。例えば、酵母細胞例えば、Saccharomycescerevisiae、Candidaalbicans、Candidamaltosa、Hansenualpolymorpha、Kluyveromycesfragilis、Kluyveromyceslactis、Pichiaguillerimondii、Pichiapastoris、SchizosaccharomycespombeおよびYarrowialipolytica、昆虫細胞例えば、Aedesaegypti、Autographacalifornica、Bombyxmori、Drosophilamelanogaster、Spodopterafrugiperda、およびTrichoplusiani、哺乳動物細胞例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類例えば、ハムスター、トリの細胞例えば、ニワトリ、アヒル、およびガチョウ、細菌例えば、E.coli、Bacillussubtilis、およびStreptococcus種、テトラヒメナの細胞例えば、Tetrahymenathermophilaまたはそれらの組み合わせを用いることができる。小規模培養条件および大規模培養条件を含めた、そのような宿主細胞を維持して組換え核酸の発現を可能にするための適切な方法は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞である。より詳細な実施形態において、宿主細胞は、S.cerevisiaeのAD2株、JSC310株、AD3株、AD4株またはそれらの組み合わせなどの酵母細胞である。いくつかの実施形態において、提供される宿主細胞は、VP1をコードする組換え核酸分子およびVP2をコードする組換え核酸分子の2つの異なる組換え核酸分子を含有する。他の実施形態において、提供される宿主細胞は、VP1をコードする配列、VP2をコードする配列、およびそれらのそれぞれの制御エレメントを含む単一の組換え核酸分子複数のコピーで存在してよいを含有する。例えば、これらの実施形態において、組換え核酸は、VP1をコードするヌクレオチド配列が第1の制御配列に作動可能に連結しており、VP2をコードするヌクレオチド配列が第2の制御配列に作動可能に連結しているバイシストロン性ベクターであってよい。例えば、VP2をコードするヌクレオチド配列は、強力なプロモーターに作動可能に連結していてよく、VP1をコードするヌクレオチド配列は、弱いプロモーターに作動可能に連結していてよい。酵母において発現させるための例示的な強力なプロモーターは、pBS24.1に組み込まれたADH2/GAPDHプロモーターである図1。酵母において発現させるための例示的な弱いプロモーターは、YPTI構成的活性プロモーターである。Searsら、Yeast14巻:783~790頁1998年を参照されたい。酵母または他の宿主細胞において用いるための他の適切な強力なプロモーターおよび弱いプロモーターは当技術分野で公知である。使用するプロモーターは、VP1の発現とVP2の発現を独立して調節することを可能にする任意のプロモーターであってよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、VP2をコードするヌクレオチド配列が、所望の宿主細胞において発現させるのに適したプロモーターに作動可能に連結しており、VP1をコードするヌクレオチド配列が、そのプロモーターの改変体、例えば、発現脱最適化deoptimizeされた改変体などに作動可能に連結している組換え核酸を含有する。改変体プロモーターは、VP1の発現をVP2と比較して低下させる例えば、可溶性のVP1を可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成するために、さまざまな方式で親プロモーターに対して修飾することができる。例えば、改変体プロモーターは、VP1をコードする核酸の上流の転写エレメントの一部の欠失、例えば、TATAボックス、接合部位の全部または一部の配列の欠失または変更などによって、VP1をコードする核酸の上流の1または複数の転写開始部位の導入によって、VP1をコードする核酸の上流の1または複数の転写終止部位の導入によって、それらの任意の組み合わせによって修飾することができる。これらのプロモーターの機能性部分は当技術分野で周知であり、任意の所望のプロモーターにおいて容易に同定し、修飾することができる。組換え核酸は、所望に応じて、VP1をコードする配列とVP2をコードする配列が所望の宿主細胞内に同量存在する場合、VP1が、所望の宿主細胞によって、VP2よりも低いアバンダンスで生成されるように、他の調節エレメント、例えば、エンハンサー結合部位、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位など、ならびにそれらの欠失および変更を含有してよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ADH2/GAPDHプロモーターに作動可能に連結している、VP2をコードするヌクレオチド配列図6、配列番号19、およびADH2/GAPDHプロモーターの改変体に作動可能に連結している、VP1をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え核酸を含み、それにより、VP1の発現がVP2と比較して減少する。本発明において用いるのに適した改変体ADH2/GAPDHプロモーターの例としては、プロモーターの1または複数の部分例えば、約1塩基~約20塩基の部分が天然のパルボウイルス配列の部分と交換されている改変体、例えば、デルタAs改変体など図7、配列番号20、TATAボックスの全部または一部が欠失または変化している改変体、例えば、TATA欠失改変体など図8、配列番号21、1または複数の転写開始配列および/または転写終止配列を含有する改変体、例えば、1SS改変体など図9、配列番号22、およびこれらの修飾の任意の組み合わせを含有するプロモーターが挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は、所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化された、VP2をコードするヌクレオチド配列、および所望の宿主細胞において発現させるためにコドン最適化されていない、または例えば、好ましいコドンではないコドンを用いることによって脱コドン最適化codondeoptimizeされた、VP1をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え核酸を含む。提供される宿主細胞は、VP1およびVP2の発現を制御する発現制御エレメントが、任意の所望のVP1:VP2の発現比率が生成するように選択された組換え核酸を含有してよい。例えば、宿主細胞は、VP1およびVP2を、VP1:VP2の発現比率:約49:51、約40:60、約30:70、約25:75、約20:80、約15:85、約10:90、約9:91、約8:92、約7:93、約6:94、約5:95、約4:96、約3:97、約2:98、約1:99、約2:98~約20:80、約5:95~約20:80、約5:95~約15:85、または約7:93~約12:88で生成してよい。発現比率は、可溶性のVP1:可溶性のVP2の比率であることが好ましい。方法の特定の実施形態において、宿主細胞は、VP1およびVP2、好ましくはパルボウイルスB19VP1およびパルボウイルスB19VP2をコードする発現ベクターを含む。例えば、発現ベクターは、VP2をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している調節エレメント、およびVP1をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、その調節エレメントの改変体を含むプラスミドであってよい。改変体調節エレメントにより、VP1の発現がVP2と比較して転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少する。改変体調節エレメントは、例えば、TATAボックス配列の一部の変更または欠失、VP1遺伝子の上流の接合部位の一部の欠失、またはそれらの組み合わせを有してよい。改変体調節エレメントは、その代わりに、またはそれに加えて、1または複数の、VP1コード配列の上流の転写開始部位/転写終止部位の導入を含有してよい。そのような改変体調節エレメント、および本明細書に記載のその他の改変体調節エレメントにより、効率的なVP1/VP2VLPの生成が可能になる。改変体調節エレメントが、VP1をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している場合、改変体調節エレメントは、本明細書に記載の特定の修飾の任意の1または複数を、任意の所望の組み合わせで含有してよい例えば、TATAボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、Aリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更、VP1コード配列の上流の1または複数の転写開始部位および/または転写終止部位の導入、およびそれらの任意の組み合わせ。例えば、VP1をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している改変体調節エレメントは、iTATAボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、およびAリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更;iiTATAボックスの配列の全部または一部の欠失または変更、および1または複数の、VP1コード配列の上流の転写開始部位および/または転写終止部位の導入;またはiiiAリッチ接合領域の全部または一部の欠失または変更、および1または複数の、VP1コード配列の上流の転写開始部位および/または転写終止部位の導入を含んでよい。一部の態様では、方法は、VLPを、宿主細胞の培養培地例えば、馴化培地、宿主細胞例えば、細胞溶解物、細胞ホモジネートまたはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含む。VLPは、宿主細胞の培養培地、すなわち、馴化培養培地から直接単離または精製することが好ましい。しかし、所望に応じて、例えば遠心分離によって宿主細胞を回収することができ、任意の適切な方法を用いて宿主細胞のホモジネートまたは溶解物を形成することができ、そのホモジネートまたは溶解物からVLPを単離することができる。細胞を溶解しても、VLPを実質的にインタクトなままに保つために用いることができる適切な化学的方法、物理的方法または機械的方法は当技術分野で公知であり、例えば、ProteinPurificationApplications:APracticalApproach、E.L.V.HarrisおよびS.Angal編、1990年に記載されている。VLPは、培養培地または宿主細胞、例えば、細胞溶解物またはホモジネートから、任意の適切な方法を用いて単離することができる。VLPの完全性を維持する適切な方法、例えば、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、PEG沈殿、ペレット形成など例えば、Kirnbauerら、J.Virol.1993年67巻:6929~6936頁を参照されたい、ならびにクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフおよびゲルろ過クロマトグラフを含めた標準の精製技法を用いることができる。スクロースクッションまたはスクロース勾配での遠心分離は、VLPを、VP1およびVP2の単量体またはオリゴマーから、および他の細胞成分から単離するための都合のよい方法である。これらの方法は、単独で、連続的に、またはより大きな精製スキームに組み込んで用いることができる。例えば、スクロースクッションまたはスクロース勾配で精製されたVLPは、その後、所望に応じて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過の技法または任意の他の適切な方法を用いてさらに精製することができる。一実施形態において、本発明は、パルボウイルスVLPを宿主細胞から単離する方法であって、宿主細胞の溶解物またはホモジネートを調製するステップと;任意の適切な方法を用いて宿主細胞の溶解物またはホモジネートから前記VLPを分離するステップと;前記VLPをさらに精製するステップとを含む方法を提供する。本発明のこの態様によるVLPの精製は、例えば、スクロース勾配によって精製することを含んでよい。本発明は、さらに、本明細書に記載の方法を用いて作製したVLPを提供する。いくつかの実施形態において、方法は、VP1タンパク質およびVP2タンパク質をコードする組換え核酸を含有する宿主細胞を、VP1およびVP2が発現され、VP1およびVP2が自己集合してVLPを形成するのに適した条件下で培養するステップを含む。所望に応じて、方法は、VLPを、宿主細胞の培養培地例えば、馴化培地、宿主細胞例えば、細胞溶解物、細胞ホモジネートまたはそれらの組み合わせから単離または精製するステップをさらに含んでよい。D.免疫原性組成物本発明は、本明細書に記載の方法によって生成されるVP1およびVP2を含有するパルボウイルスVLPを含む免疫原性組成物、および本明細書に記載のパルボウイルスのVP1およびVP2をコードする組換え核酸を含有する免疫原性組成物も提供する。免疫原性組成物は、単一の型のVLP、または2種以上の異なるVLP、および所望に応じて1または複数の追加的な抗原の混合物を含んでよい。抗原は、例えば、予防的なすなわち、感染を予防するための免疫原性組成物または治療的な感染を処置するための免疫原性組成物中で、個別に、または組み合わせて投与することができる。免疫原性組成物は、所望の効果を実現するために、2回以上与えてよい例えば、初回刺激prime投与、その後の1または複数の追加刺激boost。同じ組成物を、1または複数の初回刺激ステップおよび1または複数の追加刺激ステップで投与してよい。あるいは、初回刺激および追加刺激のために異なる組成物を用いてよい。例えば、核酸組成物を初回刺激のために投与してよく、VLP組成物を追加刺激のために追加してよい、またはその逆もまた同様である。パルボウイルスのVP1およびVP2をコードする組換え核酸を含有する免疫原性組成物において、組換え核酸は、本明細書に記載の任意の組換え核酸、例えば、直鎖DNAまたはRNA、プラスミドDNA、mRNA、自己複製するRNAなどであってよい。所望に応じて、核酸は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性および/または抵抗性を改善するために1または複数の修飾塩基を含有してよい。所望に応じて、免疫原性核酸は、細胞による核酸の取り込みを容易にするため、および/またはヌクレアーゼ分解を低下させるために、1または複数の成分、例えば、カチオン性の微小粒子またはナノ粒子、カチオン性脂質なども含んでよい。免疫原性組成物は、一般に、1または複数の薬学的に許容される賦形剤またはビヒクル、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどを、単独で、または組み合わせて含む。免疫原性組成物は、典型的に、上記の成分に加えて、1または複数の薬学的に許容されるキャリアを含む。これらとしては、それ自体は、組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的に、大型の、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸共重合体、および脂質凝集体例えば、油滴またはリポソームなどなどである。そのようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、補助的な物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などが存在してよい。薬学的に許容される成分の徹底的な考察は、Gennaro2000年Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy.第20版、ISBN:0683306472において入手可能である。薬学的に許容される塩、例えば、無機塩類、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩など、ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩なども、本発明の免疫原性組成物において用いることができる。所望に応じて、抗原は、リポソームおよび粒子キャリア、例えば、ポリD,L-ラクチドco-グリコリドPLGの微小粒子またはナノ粒子などに吸着させる、その中に閉じ込める、またはその他の方法でそれと結びつけることができる。抗原は、免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に結合体化することができる。Ramsayら2001年Lancet357巻9251号:195~196頁;Lindberg1999年Vaccine17Suppl2巻:S28~36頁;ButteryMoxon2000年JRCollPhysiciansLond34巻:163~168頁;AhmadChapnick1999年InfectDisClinNorthAm13巻:113~133頁、vii;Goldblatt1998年J.Med.Microbiol.47巻:563~567頁;欧州特許第0477508号;米国特許第5,306,492;WO98/42721;ConjugateVaccinesCruseら編ISBN3805549326、特に10巻:48~114頁;Hermanson1996年BioconjugateTechniquesISBN:0123423368または012342335Xを参照されたい。本発明の免疫原性組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。例えば、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含んでよい。好ましいアジュバントとしては、これらに限定されないが、下記のアジュバントの以下の1または複数の型が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、投与する前にアジュバントと予め混合することもできる。一実施形態において、免疫原性組成物は、パルボウイルスB19VLP例えば、1ml当たりタンパク質0.05μg、0.5μg、5μgおよびMF59C.1アジュバントを含み、最終的な体積の50がMF59C.1アジュバントである。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、0.8mg/mlのパルボウイルスB19VLPおよびアジュバントとしてMF59C.1を、最終的な体積1:1で含む。ミョウバン一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ミョウバン硫酸アルミニウムカリウムAlKSO42、またはミョウバン誘導体、例えば、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合し、次いで、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて滴定し、沈殿させることによってin-situで形成されるミョウバン誘導体などである。レチノイン酸一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ビタミンAの酸化形態であり、部分的なビタミンA機能のみを持つレチノイン酸である。MF59C.1一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、クエン酸緩衝液中の水中油エマルジョンスクアレンであるMF59C.1である。MF59C.1は、有効なアジュバントであり、パルボウイルスB19に対する高い力価の中和性抗体の生成を増強することが示されているBallouら、JID、187巻:675~678頁2003年。鉱質を含有する組成物本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、鉱質を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などが挙げられる。本発明は、無機塩、例えば、水酸化物例えば、オキシ水酸化物、リン酸塩例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩、硫酸塩などを包含する[例えば、VaccineDesign...1995年PowellNewman編ISBN:030644867X、Plenumの第8章および9章を参照されたい]、または、任意の適切な形態例えば、ゲル、結晶、非晶質などを取り、吸着が好ましい化合物と、異なる鉱質化合物との混合物を包含する。鉱質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる。水酸化アルミニウムとして公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。式AlOOHで表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、水酸化アルミニウムAlOH3のようなその他のアルミニウム化合物から、赤外IR分光法により、特に1070cm-1での吸収バンドおよび3090~3100cm-1での強いショルダーの存在により区別できる[VaccineDesign...1995eds.PowellNewman.ISBN:030644867X.Plenum.の第9章]。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さでの回折バンドの幅widthofthediffractionbandathalfheightWHHにより反映され、結晶性が乏しい粒子は、より小さい晶子サイズのために、より大きな線の広がりを示す。表面積は、WHHが増加するにつれて増加し、より高いWHHの値を有するアジュバントは、抗原吸着のための能力がより大きいことが観察されている。繊維状の形態例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるようなは、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは、典型的に約11であり、すなわちアジュバント自体は生理的pHにて正の表面電荷を有する。pH7.4にてAl1mgあたり1.8~2.6mgのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。リン酸アルミニウムとして公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムであるすなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェートaluminiumhydroxyphosphatesulfate。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、通常、PO4/Alモル比が0.3~1.2である。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により厳密なAlPO4から区別できる。例えば、3164cm-1例えば200°Cに加熱時でのIRスペクトルのバンドは、構造上のヒドロキシルの存在を示す[VaccineDesign...1995eds.PowellNewman.ISBN:030644867X.Plenum.の第9章]。リン酸アルミニウムアジュバントのPO4/Al3モル比は、通常、0.3~1.2、好ましくは0.8~1.2、より好ましくは0.95±0.1である。リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩について、一般的に、非晶質である。典型的なアジュバントは、0.84~0.92のPO4/Alモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、0.6mgAl3/mlで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に、粒子状である例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような板状の形態。この粒子の典型的な直径は、任意の抗原を吸着した後に0.5~20μm例えば約5~10μmの範囲である。pH7.4にてAl1mgあたり0.7~1.5mgタンパク質の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。リン酸アルミニウムのゼロ電荷点PZCは、ヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。PZCは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させることより多いホスフェート=より酸性側のPZC、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えることPZCをより塩基性にするによっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、通常、4.0~7.0、より好ましくは5.0~6.5、例えば約5.7のPZCを有する。本発明の組成物を調製するために用いるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液例えば、リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁物は、滅菌されており、発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁物は、例えば、1.0mMから20mMの間、好ましくは5mMから15mMの間、より好ましくは約10mMの濃度で存在する遊離の水性ホスフェートイオンを含むことができる。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。一実施形態において、アジュバント成分としては、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が挙げられる。この場合、リン酸アルミニウムが水酸化アルミニウムよりも多く、例えば、少なくとも2:1、例えば、≧5:1、≧6:1、≧7:1、≧8:1、≧9:1などの重量比で存在してよい。患者に投与するための組成物中のAlの濃度は、10mg/ml未満、例えば、≦5mg/ml、≦4mg/ml、≦3mg/ml、≦2mg/ml、≦1mg/mlなどであることが好ましい。好ましい範囲は、0.3mg/mlから1mg/mlの間である。最大≦0.85mg/用量が好ましい。油エマルジョン本発明においてアジュバントとして用いるのに適した油エマルジョン組成物としては、MF59などのスクアレン-水エマルジョン[VaccineDesign...1995年PowellNewman編、ISBN:030644867X、Plenumの第10章]マイクロフルダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方した5スクアレン、0.5Tween80、および0.5Span85が挙げられる。完全フロイントアジュバントCFAおよび不完全フロイントアジュバントIFAも用いることができる。種々の適切な水中油エマルジョンが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも1種の油および少なくとも1種の界面活性剤を含み、油複数可および界面活性剤複数可は、生分解性代謝可能かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的には、直径5μm未満であり、有利には、上記エマルジョンは、理想的にはサブミクロンの直径の油滴を有し、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて安定なエマルジョンを得ることにより達成される。220nm未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。本発明は、動物例えば魚類または植物の供給源からのもののような油とともに使用することができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま種子油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび1,2-プロパンジオールの6~10炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって本発明の実施において用いてよい。動物の供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術において周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、5炭素イソプレンユニットで生化学的に合成され、一般的に、テルペノイドとよばれる。サメ肝油は、スクアレン、2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有する。他の好ましい油は、トコフェロールである下記参照のこと。スクアレンを含む水中油エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を用いることができる。界面活性剤は、それらのHLB親水性/親油性比により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、そしてより好ましくは少なくとも16のHLBを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤一般的にTweenとよばれる、特にポリソルベート20およびポリソルベート80;線状EO/POブロックコポリマーのようなDOWFAX商標の商標の下で販売されるエチレンオキシドEO、プロピレンオキシドPOおよび/またはブチレンオキシドBOのコポリマー;反復エトキシオキシ-1,2-エタンジイル基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール-9TritonX-100またはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールが興味深い;オクチルフェノキシポリエトキシエタノールIGEPALCA-630/NP-40;ホスファチジルコリンレシチンのようなリン脂質;トリエチレングリコールモノラウリルエーテルBrij30のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテルBrij界面活性剤として公知である;ならびにソルビタントリオレエートSpan85およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル一般的にSPANとして公知であるを含む界面活性剤を用いることができる。エマルジョンに含むために好ましい界面活性剤は、Tween80ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Span85ソルビタントリオレエート、レシチンおよびTritonX-100である。上記したように、Tween80のような洗浄剤は、以下の実施例にみられる熱安定性に寄与し得る。界面活性剤の混合物、例えばTween80/Span85混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートTween80およびオクトキシノール例えば、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールTritonX-100の組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス9とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび/またはオクトキシノールとを含む。界面活性剤の好ましい量重量は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル例えばTween800.01~1、特に約0.1;オクチル-またはノニルフェノキシポリオキシエタノール例えばTritonX-100またはTritonシリーズのその他の洗浄剤0.001~0.1、特に0.005~0.02;ポリオキシエチレンエーテル例えばラウレス90.1~20、好ましくは、0.1~10、特に0.1~1または約0.5である。本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むが、それらに限定されない:スクアレンとTween80とSpan85とのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの体積での組成は、約5スクアレン、約0.5ポリソルベート80および約0.5Span85であり得る。重量の点において、これらの比率は、4.3スクアレン、0.5ポリソルベート80および0.48Span85になる。このアジュバントは、MF59として公知である。MF59エマルジョンは、有利には、シトレートイオン、例えば10mMクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。スクアレンとαトコフェロールとポリソルベート80とを含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、2~10スクアレン、2~10トコフェロールおよび0.3~3Tween80を有してよく、スクアレン:トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを提供するので、好ましくは≦1例えば、0.90である。スクアレンとTween80とは、約5:2の体積比または約11:5の重量比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、Tween80をPBS中に溶解して2溶液を得て、次いで90mlのこの溶液を、5gのDL-α-トコフェロールおよび5mlスクアレンの混合物と混合し、次いで混合物を微小流動化するmicrofluidiseことにより作製できる。得られるエマルジョンは、100~250nm、好ましくは約180nmの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。スクアレンとトコフェロールとTriton洗浄剤例えばTritonX-100とのエマルジョン。エマルジョンは、3d-MPL下記参照のことも含んでよい。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してよい。ポリソルベート例えばポリソルベート80とTriton洗浄剤例えばTritonX-100とトコフェロール例えばα-トコフェロールスクシネートとを含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの3成分を、約75:11:10の質量比で含んでよく例えば750μg/mlポリソルベート80、110μg/mlTritonX-100および100μg/mlα-トコフェロールスクシネート、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、3d-MPL下記参照のことも含んでよい。水相は、リン酸緩衝液を含有してよい。スクワランとポリソルベート80とポロキサマー401Pluronic商標L121とのエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル-MDPとともにSAF-1アジュバント中で用いられている0.05~1Thr-MDP、5スクワラン、2.5PluronicL121および0.2ポリソルベート80。これは、AFアジュバントにおけるように、Thr-MDPなしで用いることもできる5スクワラン、1.25PluronicL121および0.2ポリソルベート80。微小流動化が好ましい。スクアレンと水性溶媒とポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤例えばポリオキシエチレン12セトステアリルエーテルと疎水性非イオン性界面活性剤例えばソルビタンモノオレエートまたはSpan80のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステルとを含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ/または少なくとも90の油滴体積によるが200nm未満のサイズである。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤例えばドデシルマルトシドおよび/またはスクロースのような糖、および/またはアルキルポリグリコシドの1または複数も含んでよい。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。0.5~50の油と、0.1~10のリン脂質と、0.05~5の非イオン性界面活性剤とを含むエマルジョン。好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。非代謝性油例えば軽鉱油lightmineraloilと少なくとも1種の界面活性剤例えばレシチン、Tween80またはSpan80とのサブミクロンの水中油型エマルジョン。QuilAサポニン、コレステロール、サポニン親油性物質結合体例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、GPI-0100、ジメチルジオクタデシルアンモニウムdimethyidioctadecylammoniumブロミドおよび/またはN,N-ジオクタデシル-N,N-ビス2-ヒドロキシエチルプロパンジアミンのような添加物を含んでよい。鉱油と、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親水性界面活性剤例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび/またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとを含むエマルジョンWO2006/113373を参照のこと。鉱油と、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールと、非イオン性親油性界面活性剤例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび/またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとを含むエマルジョンWO2006/113373を参照のこと。サポニン例えばQuilAまたはQS21とステロール例えばコレステロールとが、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン。組成物中の抗原VLPおよびアジュバントは、典型的に、患者に送達される時には、混和物中にあるであろう。エマルジョンは、抗原VLPと、製造中に混合することができる、または、送達時に即席で混合することができる。よって、アジュバントおよび抗原VLPは、使用時に最終的な処方物にすぐ準備できる、包装または分配されたワクチン中に別々に保持することができる。抗原VLPは、一般に、最終的に2つの液体を混合することによってワクチンを調製するために、水性の形態であろう。混合するための2つの液体の体積比は、変動してよいが例えば、5:1と1:5の間、一般に約1:1である。サポニン処方物VaccineDesign...1995年PowellNewman編、ISBN:030644867X、Plenumの第22章を参照されたいサポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見いだされるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。QuillaiasaponariaMolinaの木の樹皮由来のサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Smilaxornataサルサパリラsarsaprilla、Gypsophillapaniculataブライダルベールbridesveil、およびSaponariaofficianalisソープルートsoaprootから商業的に取得可能である。サポニンアジュバント処方物としては、QS21などの精製された処方物、ならびにISCOMなどの脂質処方物が挙げられる。QS21は、Stimulon商標として販売されている。サポニン組成物は、HPLCおよびRP-HPLCを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-BおよびQH-Cが挙げられる。サポニンはQS21であることが好ましい。QS21の生成方法は、米国特許第5,057,540号に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい。サポニンとコレステロールの組み合わせを使用して、免疫賦活性複合体ISCOMと呼ばれる独特の粒子を形成することができるVaccineDesign...1995年PowellNewman編、ISBN:030644867X、Plenumの第23章。ISCOMは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなども含む。任意の公知のサポニンをISCOMに用いることができる。ISCOMはQuilA、QHAおよびQHCの1または複数を含むことが好ましい。ISCOMは、WO96/33739にさらに記載されている。場合によって、ISCOMは、追加的な洗浄剤を欠いてよい。ビロソームおよびウイルス様粒子ビロソームおよびウイルス様粒子VLPも、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、場合によってリン脂質と組み合わされる、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の1または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができる、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはVLPにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス例えば、HAまたはNAなど、B型肝炎ウイルス例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質など、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA-ファージ、Qβ-ファージ例えば、コートタンパク質など、GA-ファージ、fr-ファージ、AP205ファージ、およびTy例えば、レトロトランスポゾンTyタンパク質p1などに由来するタンパク質が挙げられる。細菌誘導体または微生物誘導体本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖LPSの無毒性の誘導体など、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびADP-リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を包含する。LPSの無毒性の誘導体としては、モノホスホリルリピドAMPLおよび3-O-脱アシル化MPL3dMPLが挙げられる。3dMPLは、4、5または6のアシル化された鎖を有する3脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。好ましい3脱O-アシル化モノホスホリルリピドAの小粒子形態は、EP-A-0689454に開示されている。そのような3dMPLの小粒子は、0.22μmの膜を通して滅菌ろ過するのに十分小さいEP-A-0689454。他の無毒性のLPS誘導体としては、モノホスホリルリピドA模倣体mimic、例えば、RC-529などのアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体などが挙げられる。リピドA誘導体としては、Escherichiacoli由来のリピドAの誘導体、例えば、OM-174などが挙げられる。OM-174は、例えば、Meraldiら2003年Vaccine21巻:2485~2491頁およびPajakら2003年Vaccine21巻:836~842頁に記載されている。本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、CpGモチーフを含有するヌクレオチド配列リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリdG配列を含有する二本鎖RNAおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。CpGは、ヌクレオチドの修飾/類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾などを含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献であるKandimallaら2003年NucleicAcidsResearch31巻:2393~2400頁;WO02/26757、およびWO99/62923は、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、2’-デオキシ-7-デアザグアノシンとの交換を開示している。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Krieg2003年NatureMedicine9巻:831~835頁;McCluskieら2002年FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology32巻:179~185頁;WO98/40100;US6,207,646;US6,239,116;およびUS6,429,199においてさらに考察されている。CpG配列例えば、GTCGTTモチーフまたはTTCGTTモチーフなどは、TLR9に向けられ得るKandimallaら2003年BiochemicalSocietyTransactions31巻第3部:654~658頁。CpG配列は、例えば、CpG-AODNなど、Th1免疫応答の誘導に特異的であってよい、または、例えば、CpG-BODNなどB細胞応答誘導により特異的であってよい。CpG-AODNおよびCpG-BODNは、Blackwellら2003年JImmunol170巻:4061~4068頁;Krieg2002年TrendsImmunol23巻:64~65頁およびWO01/95935において考察されている。CpGは、CpG-AODNであることが好ましい。CpGオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために5’末端を利用できるように構築することが好ましい。場合によって、2つのCpGオリゴヌクレオチド配列を、それらの3’末端に付着させて、イムノマーimmunomerを形成することができる。例えば、Kandimallaら2003年BiochemicalSocietyTransactions31巻第3部:654~658頁およびKandimallaら2003年BBRC306巻:948~953頁;Bhagatら2003年BBRC300巻:853~861頁およびWO03/035836を参照されたい。免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、IC-31商標として公知であるSchellackら2006年Vaccine24巻:5461~72頁。よって、本発明で用いるアジュバントは、i少なくとも1つの好ましくは複数のCpIモチーフすなわち、イノシンと連結してジヌクレオチドを形成しているシトシンを含めたオリゴヌクレオチド例えば、15~40ヌクレオチドとii少なくとも1つの好ましくは複数のLys-Arg-Lysトリペプチド配列複数可を含めたオリゴペプチド例えば、5~20アミノ酸などのポリカチオンポリマーの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、26merの配列5’-IC13-3’配列番号1を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、11-merのアミノ酸配列KLKLLLLLKLK配列番号2を含むペプチドであってよい。細菌ADP-リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、E.coliE.coli熱不安定性エンテロトキシンLT、コレラCT、または百日咳PTに由来することが好ましい。解毒されたADP-リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、WO95/17211に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は、WO98/42375に記載されている。毒素または類毒素は、AサブユニットおよびBサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Aサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく;Bサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたLT変異体、例えば、LT-K63、LT-R72、およびLT-G192などであることが好ましい。ADP-リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にLT-K63およびLT-R72の、アジュバントとしての使用は、Beignonら2002年InfectImmun70巻:3012~3019頁;Pizzaら2001年Vaccine19巻:2534~2541頁;Pizzaら2000年IntJMedMicrobiol290巻:455~461頁;Scharton-Kerstenら2000年InfectImmun68巻:5306~5313頁;Ryanら1999年InfectImmun67巻:6270~6280頁;Partidosら1999年ImmunolLett67巻:209~216頁;Peppoloniら2003年ExpertRevVaccines2巻:285~293頁;Pineら2002年JControlRelease85巻:263~270頁およびTebbeyら2000年Vaccine18巻:2723~34頁に見いだすことができる。有用なCT変異体はCT-E29Hである。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれるDomenighiniら1995年MolMicrobiol15巻:1165~1167頁に記載のADP-リボシル化毒素のAサブユニットとBサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。ヒト免疫調節物質本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキンなど例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12などWO99/40936およびWO99/44636、インターフェロン例えば、インターフェロン-γ、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節物質はIL-12である。生体接着剤bioadhesiveおよび粘膜接着剤mucoadhesive生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェアSinghら2001年JContRelease70巻:267~276頁、または粘膜接着剤、例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体などが挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができるWO99/27960。微小粒子微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリラクチド-co-グリコリドを用いて、生分解性かつ無毒性の材料例えば、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなどから形成された微小粒子すなわち、直径約100nm~約150μm、より好ましくは直径約200nm~約30μm、最も好ましくは直径約500nm~約10μmの粒子が好ましく、場合によって、それを、負に荷電した表面を有するように処理する例えば、SDSを用いてまたは正に荷電した表面を有するように処理する例えば、CTABなどの陽イオン洗浄剤を用いて。リポソームVaccineDesign...1995年PowellNewman編、ISBN:030644867X、Plenumの第13章および14章アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、US6,090,406、US5,916,588およびEPA0626169に記載されている。ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルWO99/52549を包含する。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤WO01/21207ならびに少なくとも1つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールなどと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤WO01/21152が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルラウレス9、ポリオキシエチレン-9-ステオリルsteorylエーテル、ポリオキシエチレンpolyoxytheylene-8-ステオリルsteorylエーテル、ポリオキシエチレン-4-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-35-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-23-ラウリルエーテル。ポリホスファゼンPCPPPCPP処方物は、例えば、Andrianovら1998年Biomaterials19巻:109~115頁およびPayneら1998年AdvDrugDeliveryReview31巻:185~196頁に記載されているムラミルペプチド本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミンthr-MDP、N-アセチル-ノルムラミルnormuramyl-L-アラニル-D-イソグルタミンnor-MDP、およびN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ-エチルアミンMTP-PEが挙げられる。イミダゾキノロンImidazoquinolone化合物本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモドImiquamodおよびその同族化合物例えば、レシキモドResiquimod3Mが挙げられ、Stanley2002年ClinExpDermatol27巻:571~577頁およびJones2003年CurrOpinInvestigDrugs4巻:214~218頁においてさらに記載されている。本発明は、上記のアジュバントの1または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において用いることができる:1サポニンおよび水中油エマルジョンWO99/11241;2サポニン例えば、QS21無毒性のLPS誘導体例えば、3dMPLWO94/00153;3サポニン例えば、QS21無毒性のLPS誘導体例えば、3dMPLコレステロール;4サポニン例えば、QS213dMPLIL-12場合によって、ステロールWO98/57659;53dMPLと、例えば、QS21および/または水中油エマルジョンの組み合わせ欧州特許出願第0835318号、同第0735898号および同第0761231号;6サブミクロンのエマルジョンに微小流動化microfluidizeした、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせた、10スクアラン、0.4Tween80商標、5プルロニック-ブロックポリマーL121、およびthr-MDPを含有するSAF;72スクアレン、0.2Tween80、ならびに、モノホスホリルリピドAMPL、トレハロースジミコレートTDM、および細胞壁の骨格CWS、好ましくはMPLCWSDetox商標からなる群からの1または複数の細菌の細胞壁成分を含有するRibi商標アジュバント系RAS、RibiImmunochem;および81または複数の無機塩類例えば、アルミニウム塩などLPSの無毒性の誘導体例えば、3dMPLなど。免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、VaccineDesign...1995年PowellNewman編ISBN:030644867X.Plenumの第7章に開示されている。水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に小児において有用であり、一般に、抗原はこれらの塩に吸着される。水中スクアレンエマルジョンも、特に高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせとしては、Th1アジュバントとTh2アジュバントの組み合わせ、例えば、CpGとミョウバンの組み合わせ、またはレシキモドResiquimodとミョウバンの組み合わせなどが挙げられる。リン酸アルミニウムと3dMPLの組み合わせを用いてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のVP1およびVP2を含有するパルボウイルスVLP、およびMF59などのアジュバントを含有する免疫原性組成物である。VLPとアジュバント例えば、MF59は、予め混合し、単一の組成物として提供することができる、または、投与する前に混合するための別々の成分として提供することができる。E.投与本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されるであろう。直接的な送達は、例えば、シリンジおよび皮下針を用いた非経口的な注射例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔interstitialspaceへ、または粘膜を通じて、例えば、直腸投与、経口投与例えば、錠剤、噴霧、膣への投与、局所投与、経皮transdermal投与例えば、WO99/27961を参照されたいまたは経皮transcutaneous投与例えば、WO02/074244およびWO02/064162を参照されたい、鼻腔内投与例えば、WO03/028760を参照されたい、眼への投与、耳への投与、肺への投与または他の粘膜投与などによって実現することができる。免疫原性組成物も、皮膚の表面に直接移すことによって局所的に投与してもよい。局所投与は、いかなるデバイスも利用することなく、または包帯または包帯様デバイスを利用して裸の皮膚を免疫原性組成物と接触させることによって実現することができる例えば、米国特許第6,348,450号を参照されたい。投与形式は、非経口的な免疫化、粘膜免疫化、または粘膜免疫化と非経口的な免疫化の組み合わせであることが好ましい。投与形式は、1~3週間離した合計1~2回のワクチン接種での非経口的な免疫化、粘膜免疫化、または粘膜免疫化と非経口的な免疫化の組み合わせであることがさらに好ましい。投与経路は、これらに限定されないが、経口的な送達、筋肉内の送達および経口的な送達および筋肉内の送達の組み合わせを含むことが好ましい。特に好ましい投与形式は、例えば、シリンジおよび皮下針を用いた筋肉内注射によるものである。免疫原性組成物は、2用量で筋肉内に投与することが好ましい。本発明の組成物は、常套的な小児期免疫化と、または青年期の女性に送達されるヒトパピローマウイルスおよび/もしくはB群連鎖球菌groupBstrepワクチン接種と同時に投与することができる。粘膜病原体由来の抗原、例えば、Helicobacterpylori抗原などに対する粘膜免疫応答および全身免疫応答は、粘膜に初回刺激し、その後全身的に追加刺激する免疫化により増強し得ることがすでに実証されているVajdyら2003年Immunology110巻:86~94頁。いくつかの実施形態において、パルボウイルスによる感染を処置または予防するための方法は、それを必要とする被験体に、1または複数のパルボウイルス抗原を含む第1の免疫原性組成物を、粘膜に投与し、次いで、1または複数のパルボウイルス抗原を含む第2の免疫原性組成物を治療有効量で非経口的に投与することを含む。免疫原性組成物は、全身免疫および/または粘膜免疫を惹起するため、好ましくは増強された全身免疫および/または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。免疫応答は、血清IgG免疫応答および/または腸のIgA免疫応答の誘導を特徴とすることが好ましい。上記の通り、初回刺激-追加刺激方法は、1または複数の遺伝子送達ベクターおよび/またはポリペプチド抗原を初回刺激ステップで送達し、その後、1または複数の第2の遺伝子送達ベクターおよび/またはポリペプチド抗原を追加刺激ステップで送達する場合に用いることが好ましい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の1または複数の遺伝子送達ベクターまたはポリペプチド抗原を用いた初回刺激および追加刺激の後に、1または複数のポリペプチドを含有する組成物例えば、パルボウイルス抗原を含むポリペプチドをさらに追加刺激する。VLPは、ポリペプチドを含有する組成物である。VLPは、適切な遺伝子送達ベクターで免疫化した宿主において形成することができる。共投与を伴う任意の方法では、種々の組成物を任意の順序で送達することができる。よって、複数の異なる組成物または分子を送達することを含む複数の実施形態において、核酸の全てがポリペプチドの前に送達される必要はない。例えば、初回刺激ステップは、1または複数のポリペプチドを送達することを含んでよく、追加刺激は、1もしくは複数の核酸および/または1もしくは複数のポリペプチドを送達することを含む。複数のポリペプチドを投与した後に、複数の核酸の投与を行うことができる、またはポリペプチドおよび核酸の投与を任意の順序で実施することができる。よって、本明細書に記載の遺伝子送達ベクターの1または複数、および本明細書に記載のポリペプチドの1または複数を、任意の順序で任意の投与経路によって共投与することができる。よって、本明細書に記載のポリヌクレオチドとポリペプチドの任意の組み合わせを使用して、免疫反応を惹起することができる。i投薬レジメン投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールに従ってもよい。多回用量は、一次免疫化スケジュールおよび/または追加免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路、例えば非経口的な初回刺激および粘膜での追加刺激、粘膜での初回刺激および非経口的な追加刺激などにより与えてよい。例えば、多回用量スケジュールは、初回刺激、その後の2回の追加刺激を含んでよい。初回刺激用量および/または追加刺激用量は、アジュバントと共投与することが好ましいであろう。投薬レジメンにより、抗体応答のアビディティが増強され、中和特性を持つ抗体がもたらされることが好ましい。in-vitro中和アッセイを用いて、中和性抗体について検査することができる例えば、Asanakaら2005年JofVirology102巻:10327頁;Wobusら2004年PLOSBiology2巻12号;e432頁;およびDubektiら2002年JMedicalVirology66巻:400頁を参照されたい。血清抗体レベルとパルボウイルスによって引き起こされる疾患からの防御との相関が強力な場合がある。上記のパルボウイルスVLPを、哺乳動物、例えば、マウス、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与して、パルボウイルスに特異的なT細胞をinvivoで活性化することができる。投与は、針またはシリンジを用いた注射を含めた非経口注射、鼻腔内注射、筋肉内注射または皮下注射を含めた当技術分野で公知の任意の手段によるものでよい。パルボウイルスVLPを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合する様式で、かつ免疫応答例えば、T細胞応答および/または体液性応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するために有効な量で投与する。パルボウイルスに特異的なT細胞応答は、とりわけ、51Cr放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって、またはIFN-γを細胞内染色することによって測定することができる。タンパク質は、パルボウイルスに感染していない哺乳動物に投与することができる、または、パルボウイルスに感染している哺乳動物に投与することができる。組成物中のタンパク質の詳細な投与量は、これらに限定されないが、組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、および全身状態、ならびに組成物の投与形式を含めた多くの因子に左右されるであろう。本発明の組成物の有効量は、常套的な実験のみを用いて容易に決定することができる。適切な用量を同定するためにinvitroモデルおよびinvivoモデルを用いることができる。一般に、0.5mg、0.75mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、5mg、10mg、20mgまたは50mgのパルボウイルスポリペプチドまたはVLPを、大型の哺乳動物、例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトなどに投与するであろう。所望に応じて、共起刺激分子またはアジュバントも、組成物の前、その後、またはそれと一緒に提供することができる。本発明の組成物を送達することによって生じる、パルボウイルスに特異的なT細胞の活性化を含めた哺乳動物の免疫応答は、投与量、投与経路、または追加刺激レジメンを変動させることによって増強することができる。本発明の組成物は、単回投与スケジュール、または、好ましくは、ワクチン接種の一次過程が1~10の別個の用量を含み、その後、その後の免疫応答を維持し、かつ/または強化するために必要な時間間隔で他の用量を与え、例えば、1~4カ月で第2の用量を与え、必要に応じて、その後、数か月後に1または複数の用量を与える多回用量スケジュールで与えてよい。F.免疫応答の効力を決定するための試験治療的な処置の効力を評価する1つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を評価する1つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。本発明の免疫原性組成物のタンパク質成分の免疫原性を評価する別の方式は、タンパク質を組換えによって発現させること、および患者の血清または粘膜からの分泌物を免疫ブロットによってスクリーニングすることである。タンパク質と患者の血清の間の陽性の反応は、患者が以前問題のタンパク質に対する免疫応答を展開したことがあること、すなわち、タンパク質が免疫原であることを示す。この方法は、免疫優性のタンパク質および/またはエピトープを同定するためにも用いることができる。治療的な処置の効力を調査する別の方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を調査する1つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する全身免疫応答をモニターすること例えば、IgG1生成レベルおよびIgG2a生成レベルをモニターすることなどおよび/または粘膜免疫応答をモニターすること例えば、IgA生成レベルをモニターすることなどを伴う。典型的に、血清特異的な抗体応答は、免疫化した後、攻撃する前に決定されるが、一方、粘膜特異的な抗体体応答は、免疫化し、攻撃した後に決定される。現在、本発明のヒトパルボウイルス例えば、パルボウイルスB19免疫原性組成物によって誘導される防御免疫を評価するための、承認された動物モデルはない。しかし、そのような組成物の免疫応答を誘導する能力は、本明細書に記載の通り、適切な動物において評価することができる。本発明の、他の、ヒトパルボウイルスではない免疫原性組成物は、宿主、例えば、ヒトへの投与に先立って、invitro動物モデルおよびinvivo動物モデルにおいて評価することができる。特に有用なマウスモデルとしては、腹腔内免疫化の後に、腹腔内攻撃または鼻腔内攻撃のいずれかを行うモデルが挙げられる。本発明の免疫原性組成物の効力は、invivoにおいて、感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスまたはアカゲザルに、免疫原性組成物を用いて攻撃することによって決定することもできる。免疫原性組成物は、攻撃用株と同じ株に由来してもしなくてもよい。免疫原性組成物は、攻撃用株と同じ株から導き出せることが好ましい。免疫応答は、TH1免疫応答およびTH2応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、改善された、または増強された、または変化した免疫応答であってよい。免疫応答は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であってよい。免疫応答は、増強された全身応答および/または粘膜応答であることが好ましい。増強された全身免疫および/または粘膜免疫は、増強されたTH1免疫応答および/またはTH2免疫応答に反映される。免疫応答の増強は、IgG1および/またはIgG2aおよび/またはIgAの生成の増加を含むことが好ましい。粘膜免疫応答は、TH2免疫応答であることが好ましい。粘膜免疫応答は、IgAの生成の増加を含むことが好ましい。活性化されたTH2細胞は、抗体生成を増強し、よって、細胞外の感染に対する応答において価値がある。活性化されたTH2細胞は、IL-4、IL-5、IL-6、およびIL-10の1または複数を分泌し得る。TH2免疫応答により、将来の防御のためにIgG1、IgE、IgAおよび記憶B細胞が生成され得る。TH2免疫応答は、TH2免疫応答に関連するサイトカイン例えば、IL-4、IL-5、IL-6およびIL-10などの1または複数の増加、またはIgG1、IgE、IgAおよび記憶B細胞の生成の増加のうち1または複数を含んでよい。増強されたTH2免疫応答は、IgG1生成の増加を含むようになることが好ましい。TH1免疫応答は、CTLの増加、TH1免疫応答に関連するサイトカイン例えば、IL-2、IFNγ、およびTNFβなどの1または複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、NK活性の増加、またはIgG2aの生成の増加のうち1または複数を含んでよい。増強されたTH1免疫応答は、IgG2a生成の増加を含むようになることが好ましい。本発明の免疫原性組成物、具体的には、本発明の1または複数の抗原を含む免疫原性組成物は、単独で、または他の抗原と組み合わせて、場合によってTh1応答および/またはTh2応答を惹起することができる免疫調節剤と一緒に用いることができる。免疫応答は、抗体媒介性免疫機構であってよい。抗体は、血清抗体、より好ましくは、中和性血清抗体であることが好ましい。本発明の免疫原性組成物は、主に、抗体力価例えば、全抗体および/または中和性抗体を、任意の適切な方法、例えば、パルボウイルスVP1および/またはVP2に対する免疫応答性を評価するためのウエスタンブロットまたはELISAなどを用いて評価することにより試験することができるWongら、J.ofVirology、82巻5号:2470~2476頁2008年;Bosticら、J.InfectiousDisease、179巻:619~626頁1999年。本発明の免疫原性組成物は、感染に有効に対処するために、細胞媒介免疫応答ならびに体液免疫応答の両方を惹起するようになることが好ましい。この免疫応答により、1または複数の感染性抗原に曝露させると直ちに応答し得る、長く持続する例えば、中和性抗体媒介免疫および細胞媒介免疫が誘導されることが好ましいであろう。例として、患者の血液試料中の中和性抗体の形跡は、それらの形成が、パルボウイルス感染においてウイルスを排除するために決定的に重要であるので、防御についての代理のパラメータとみなされるYoungおよびBrown、NEJM350巻:586~97頁、2004年を参照されたい。本発明は、1または複数の免疫調節剤、例えば、アルミニウム塩などの無機塩など、およびCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物も含む。免疫原性組成物は、アルミニウム塩とCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドの両方を含むことが最も好ましい。あるいは、免疫原性組成物は、ADPリボシル化毒素、例えば、解毒されたADPリボシル化毒素など、およびCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドを含む。1または複数の免疫調節剤はアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントは、上でさらに説明されているTH1アジュバントおよびTH2アジュバントからなる群の1または複数から選択することができる。G.医薬品としての免疫原性組成物の使用本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができることすなわち、免疫原性組成物であるが好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。ワクチンを使用して、小児における伝染性紅斑、赤血球悪液質の患者における一過性の骨髄無形成クリーゼ、通常鎌状赤血球貧血、溶血性貧血または遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全および免疫不全の患者における貧血、免疫抑制された個体における持続感染、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における持続性の、時には致死的な血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化および妊娠中の女性における胎児水腫または自然流産を予防および/または処置することが好ましい。本発明は、本明細書に記載の組成物を用いて免疫応答を誘導する、または増大させるための方法を提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および/または細胞媒介免疫を含んでよい全身免疫および粘膜免疫を含む。免疫応答は、追加刺激応答を含む。本発明は、有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための方法も提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体媒介免疫および/または細胞媒介免疫を伴うことが好ましい。免疫応答は、TH1免疫応答およびTH2免疫応答の一方または両方を含むことが好ましい。方法により、追加刺激応答が生じてよい。哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。免疫原性組成物が、予防的使用のためのワクチンであることが好ましい場合、ヒトは、小児例えば、よちよち歩きの幼児または乳児、好ましくは就学前、好ましくは1歳以下または3歳以降好ましくは1~4歳またはティーンエイジャー青年期であることが好ましい;ワクチンが治療的使用のためのものである場合、ヒトは、ティーンエイジャーまたは成人であることが好ましい。小児用ワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与することもできる。ヒトは、ティーンエイジャー青年期であることが好ましい。ヒトは、青年期前のティーンエイジャーであることがより好ましい。ヒトは、青年期前の女性または男性であることがさらに好ましい。青年期前の男性または女性はおよそ9~12歳であることが好ましい。青年期の男性または女性は、およそ15~19歳であることが好ましい。男性または女性はおよそ20~49歳であることが好ましい。男性または女性は、49歳を超えていることが好ましい。ヒトは高齢者、好ましくはおよそ60~80歳であることが好ましい。本発明の免疫原性組成物例えば、ワクチンが有益であり得る他の集団としては、6~10歳の小児;昼間保育を受けている小児;学齢の小児および上記の小児集団および/または高齢者集団;慢性貧血患者;鎌状赤血球貧血の小児;遺伝性球状赤血球症の小児;女児、出産可能な年齢の青年期または成人の女性、例えば、先天性感染胎児の感染を予防するため;マラリアまたは鉤虫にかかる危険性がある地理的な地域例えば、マラリアまたは鉤虫が風土病である地域に住んでいる小児;免疫抑制される小児または成人例えば、癌患者、移植を待っている患者;失血を伴い、輸血を必要とする可能性が高い外科的処置が予定されている小児または成人;移植レシピエント、および免疫無防備状態の個体が挙げられる。H.キット本発明は、本発明の免疫原性組成物の1または複数の容器を含むキットも提供する。組成物は、個々の抗原がそうであり得るように、液体の形態であってよい、または凍結乾燥されてよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい。キットは、薬剤的に許容できる緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはブドウ糖溶液などを含む第2の容器をさらに含んでよい。これは、他の薬学的に許容される処方用溶液、例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジまたは他の送達デバイスなどを含めた、最終使用者にとって有用な他の材料も含有してよい。キットは、アジュバントを含む第3の成分をさらに含んでよい。キットは、免疫誘導する方法のため、または感染を処置するための使用説明書を含有する添付文書も含んでよい。添付文書は、承認されていないドラフト添付文書であってよい、または食品医薬品局FDAまたは他の規制機関によって承認された添付文書であってよい。本発明は、本発明の免疫原性組成物を予め満たした送達デバイス、例えば、皮下針を有する、または有さないシリンジなども提供する。本発明は、上記の方法によって生成されるVLPを、パルボウイルスについて血清陽性を決定するための抗原として用いる診断用キットも提供する。診断用キットは、本明細書に記載のパルボウイルスVLP、および、個体がパルボウイルスに結合する抗体について血清陽性であるかどうかを決定するための1または複数の補助的な試薬を含有してよい。適切な補助的な試薬としては、例えば、緩衝液、二次抗体または検出抗体例えば、標識された抗ヒトIg抗体、標識された抗イヌIg抗体、検出剤などが挙げられる。一実施例では、キットは、パルボウイルスVLP、およびELISAまたは他の適切な免疫測定法を実施するための補助的な試薬を含有する。キットは、診断アッセイを実施するための説明書をさらに含んでよい。以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。実施例は、単に例示的な目的で提供されており、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものではない。2種の等しい強度のプロモーターの制御下にあるVP1およびVP2を含有する最初のプラスミドを、伝統的な分子生物学的技法を用いて生じさせた。次いで、VP1の前のプロモーターを上記の通り修飾した例えば、TATA欠失、Aリッチ上流配列の種々の欠失、VP1開始コドンの上流の開始/終止部位の導入。第1のステップは、pCDC7酵母発現ベクター図2にクローニングするのに適したMluI-SalI制限末端を有する、VP1のためのPCR生成物、そして、pCDC7の第2の発現カセットにクローニングするのに適したAvrII-NotI制限末端を有する、VP2のためのPCR生成物を生成するためのものであった。さらに、VP1配列またはVP2配列の5’末端の制限部位と開始Metの間にACAAAACAAA配列番号15配列を導入した。VP2については、PCR増幅反応は、100ngのpMK-RG_parvo_shade_vp1、プライマーであるVP2-AN1およびVP2-AN2各50pmol、MgCl2を含む10×緩衝液10μl、それぞれ1.25mMのdNTP16μl、H2O最大100μlおよびRocheExpandHighFidelityPCRキット由来のDNAポリメラーゼ0.75μlを含有した。増幅条件:95°Cで5分、35サイクルの95°Cで30秒、60°Cで1分、72°Cで2分、その後に、単回の72°Cで7分の伸長サイクルおよび4°Cでの保持。VP2PCR反応物を、PromegaWizardPCRPrepsDNAPurificationSystemを使用して精製し、AvrIIおよびNotIを、最終的な体積300μl中各酵素120uで用い、37°Cで3時間消化した。次いで、1685bpのAvrII-NotIフラグメントを、1アガロースGTG遺伝子技術グレードから、QiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて精製した。VP2AvrII-NotIゲル精製PCR生成物15ngを、RocheRapidDNALigationキットを用いて、脱リン酸化された、ゲル精製したpT7Blue2AvrII-NotIベクターとライゲーションした。室温で20分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなHB101を形質転換し、次いで、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した;DNAの一部を、AvrIINotIを用いて消化して、VP2挿入物の存在を確認した。3つの陽性のクローン由来のプラスミドを、配列決定を用いて解析した。VP1については、PCR増幅反応は、100ngのpMK-RG_parvo_shade_vp1、プライマーであるVP1-MS1およびVP1-MS2各50pmol、5’HotMasterMix2.5×40μlおよびH2O最大100μlを含有した。増幅条件:95°Cで5分、35サイクルの95°Cで30秒、60°Cで1分、72°Cで2分、その後に、単回の72°Cで7分の伸長サイクルおよび4°Cでの保持。VP1PCR反応物を、PromegaWizardPCRPrepsDNAPurificationSystemを使用して精製し、MluIおよびSalIを、最終的な体積300μl中各酵素120uで用い、37°Cで3時間消化した。次いで、2366bpのMluI-SalIフラグメントを、1アガロースGTG遺伝子技術グレードから、QiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて精製した。VP1MluI-SalIゲル精製PCR生成物のアリコートを、RocheRapidDNALigationキットを用いて、脱リン酸化された、ゲル精製したpGEM4ZMluI-SalIベクターとライゲーションした。室温で20分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなHB101を形質転換し、次いで、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した;DNAの一部を、MluISalIを用いて消化して、VP1挿入物の存在を確認した。3つまたは4つの陽性のクローン由来のプラスミドを、配列決定を用いて解析した。次に、VP2制限フラグメントおよびVP1制限フラグメントを、配列を確認したサブクローンから調製した。VP2については、10μgのpT7Blue2.AvrII.NotI.Parvo.VP211を、それぞれ最終的な体積200μl中80ユニットのAvrIIおよびNotIを用い、37°Cで2.5時間消化した。VP1については、12μgのpGEM4Z.opti.Parvo.VP13を、それぞれ最終的な体積300μl中100uのMluIおよびSalIを用い、37°Cで3時間消化した。VP1フラグメントにベクターが混入することを防止するために、PvuI酵素をVP1プレップ消化物に含めた。VP2フラグメントおよびVP1フラグメントを、QiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて1アガロースGTGから精製した。バイシストロン性の酵母発現ベクターpCDC7を、AvrIINotIを用いて消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、次いで、QiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて1アガロースGTGから精製した。VP2AvrII-NotIフラグメントおよそ90ngを、RocheRapidDNALigationキットを用いて、反応生成物20μl中約30ngのAvrII-NotIpCDC7ベクターとライゲーションした。室温で20分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなHB101を形質転換し、次いで、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した;プラスミドDNAを、AvrIINotIを用いて消化して、VP2挿入物の存在を確認した。VP1をpCDC7の第2の発現カセットにクローニングするためのベクターを調製するために、およそ10μgのpCDC7.ParvoB19.VP211プラスミドDNAを、それぞれ最終的な体積200μl中100uのMluIおよびSalIを用い、37°Cで3時間消化した。次いで、消化されたプラスミドを、7uの仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用い、37°Cで1時間脱リン酸化した。次に、ベクターをQiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて1アガロースGTGから精製した。最終的に、ゲル精製したVP1MluI-SalIフラグメント約100ngを、pCDC7.ParvoB19.VP211MluI-SalIベクター約60ngと、2つの別々の20μlライゲーション反応においてRocheRapidLigationキットを用いてライゲーションした。室温で20分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなHB101を形質転換し、次いで、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した;プラスミドDNAを、MluISalIを用いて消化して、VP1挿入物の存在を確認した。pCDC7.ParvoB19.VP2.VP12を、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth100mlにおいて増幅のために選択し、その後、QiagenMaxiPrepキットを用いてプラスミドDNAを精製した。次に、ΔTATAプロモーター制限フラグメントを、配列を確認したサブクローンから調製した。pT7Blue2.ΔTATA9およそ8μgを、それぞれ最終的な体積300μl中120ユニットのBamHIおよびMluIを用い、37°Cで4時間消化した。BamHI-MluI酵母発現ベクターを、5μgのpCDC7.ParvoB19.VP2.VP12を、それぞれ反応体積200μl中80ユニットのBamHIおよびMluIを用いて消化し、次いで37°Cで1時間、10uの仔ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することによって調製した。プロモーターおよびベクターフラグメントの両方を、QiagenMinEluteGelExtractionキットを用いて1アガロースGTGから精製した。最終的に、1333bpのBamHI-MluIΔTATAプロモーターフラグメント約20ngを、20μlの反応において約20ngのBamHI-MluIpCDC7ベクター先の段落に記載のと、RocheRapidDNALigationキットを用いてライゲーションした。室温で20分後、ライゲーション反応物を使用してコンピテントなHB101を形質転換し、次いで、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で平板培養した。ミニプレッププラスミドDNAを、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth中で成長させた単一のアンピシリン耐性コロニーから調製した;DNAを、BamHIMluIを用いて消化して、1333bpのΔTATAプロモーターの存在を確認した。pCDC7.ParvoB19.VP2ΔTATA.VP116を、100μg/mlのアンピシリンを含有するTerrificBroth100mlにおいて増幅のために選択し、その後、QiagenMaxiPrepキットを用いてプラスミドDNAを精製した。実施例1酵母におけるパルボウイルスB19の発現パルボウイルスB19のVP2遺伝子およびVP1遺伝子を、以下の通り特徴づけられるS.cerevisiaeAD3において同時発現させた:MATa、leu2、ura3-52、prb1-1122、pep4-3、prc1-407,gal2、[cir○]::pDM15pGAP/ADR1::G418R,::Yip5ΔleuAD。酵母をYEPDプレート上に画線した後、形質転換するためのコンピテント細胞を調製するための単一のコロニーを選択する。酵母の形質転換を、InvitrogenS.C.EasyCompTransformationキットを使用して実施した。ura-8グルコース選択プレート上に形質転換体transformantを得た。ura-8グルコース選択プレート上の単一のコロニーに関して、数個の形質転換体を画線した。次いで、プラスミドのコピー数を増加させるために、単一のコロニーをleu-8グルコース選択プレート上にパッチした。単一のコロニーパッチのうちの数個について小規模発現調査を行った。まず、leu-7.1グルコース培地中で一晩培養物3mlを成長させた。次いで、leu-培養物を、YEPDまたはVeggieYEPD中に1:20希釈した。培養物を30°Cまたは25°Cで48~72時間振とうした。培地からグルコースが枯渇すると誘導が起こった。細胞ペレットを解凍し、水中で洗浄し、目盛り付きのチューブ内でペレットにし、充填細胞体積packedcellvolumeを推定できるようにした。次いで、異なる発現培養物の密度の差異を正規化するために、各ペレットを、充填細胞体積と等しい体積の冷たい溶解緩衝液10mMのNaPO4、pH7.5、0.1TritonX-100、0.5MのNaClに再懸濁させた。細胞/緩衝液懸濁物のアリコートを、洗浄したガラスビーズSigmaG8772を用いて、4°C、最高速度で1時間ボルテックスすることにより溶解した。粗製の溶解物を、4°Cの微量遠心分離機microfuge中、13Kで30分遠心分離して不溶性画分をペレットにした。上清のタンパク質の濃度を決定した後、150μlのSDS試料緩衝液50mMのDTT中で試料300μgを調製した。その間に、不溶性のペレット画分IPを、1mlのSDS試料緩衝液50mMのDTTに再懸濁させた。可溶性画分および不溶性画分の試料を、4~20トリス-グリシンゲルにローディングする前に煮沸した。可溶性画分については、10μl20μgの総タンパク質をローディングし;不溶性のペレットについては、5μlをローディングした。ゲルを2連で泳動させたrun-1つはクーマシー染色InvitrogenSimplyBlueSafestain用であり、1つはパルボウイルスB19に対するマウスモノクローナル抗体SantaCruzsc-58178でプローブするウエスタンブロット用であった。同じプロトコールを使用して4つの異なるコロニーを分析して、コロニー間の変動性を認識した。72時間振とうフラスコ発現培養物4つに、4つの単一の-コロニーLeu-パッチ由来の細胞を接種した。図9bのウエスタンブロットは、各構築物の4つのコロニー由来の可溶性のVP2およびVP1についての変動性の範囲を示す。実施例2パルボウイルスB19精製プロトコールウシ血清アルブミンaluminBSAを用いたBCAタンパク質アッセイPierceを、タンパク質の濃度を決定するための標準の参照として使用した。一部の場合では、BCAの結果で較正することによって示される通り1吸光度単位=1mg/mlと仮定して、280nmにおけるUV吸光度を用いた。InvitrogenからのゲルNuPAGE4~12ビス-トリスカタログ番号NP0322BOXおよびNuPAGEMESSDSRunningBufferカタログ番号NP0002-02を用いてSDS-PAGEを実施した。SDS-PAGEのために用いたマーカーは、Fullrangerainbow分子量マーカーGEHealthcare、カタログ番号RPN800Eであった。NativePAGE3~12ビス-トリスゲルInvitrogenカタログ番号BN1003BOXを、NativePAGERunningbufferキットInvitrogenカタログ番号BN2007およびNativePAGEマーカーInvitrogenカタログ番号151-1901と一緒に用いた。SDSPAGEゲルを、TeknovaからのクーマシーブルーCoomassieBlueR-250染色溶液カタログ番号C1050を用いて染色した。ウエスタンブロット分析によって純度および正体を得るために、SDS-PAGEゲルをI-BlotシステムInvitrogenによってニトロセルロース膜にブロッティングした。酵母の混入物を決定するために、YeastWholeCellELISAキットを使用したS.cerevisiaeHCPELISAKit-CYGNUSTechnologies、F135。VP1とVP2の両方を発現している酵母細胞からパルボウイルスB19のウイルス様粒子VLPを精製した。酵母細胞を溶解緩衝液に再懸濁させ、高圧25,000psiで複数回マイクロフルダイザー内を通過させて細胞を破壊した。低スピードで回転15,000×gさせて細胞の残屑を分離した後、上清を、4時間の高スピード回転100,000×gに供して、20/70スクロースステップクッションに入れた。クッションを分画し、VLPを含有する画分を、緩衝液20mMのトリス、pH7.5、100mMのNaClで希釈した。VLPをcaptoQカラムにローディングし、高塩濃度で溶出した。VLPを含有する溶出画分を濃縮し、緩衝液をより低い塩濃度の緩衝液20mMのトリス、pH7.5、100mMのNaClと交換し、4°Cで貯蔵した。パルボウイルスB19VP1/VP2VLPを、90超の純度にまで精製し、同一のサイズだと考えられる約26nm図11A、11B。ゲルは、VP2/VP1デルタTATAVLPに基づく。部位特異的な変異体を含有する追加的なVLPを構築した。スクロース棚クッションおよび分画38mLのポリアロマーチューブSetonScientific中にスクロース棚を調製した。スクロース棚は2つの層:20スクロース5mLおよび70スクロース26mLを有する。清澄化した溶解物6mLを、スクロースの最上部に穏やかに加えた。このステップは、最大8mLの清澄化した溶解物を用いて実施し、2mL未満の70スクロースを使用した。スクロース棚を、4°C、JS-24ローター内で100,000×gで4時間遠心分離した。PistonGradientFractionatorBioCompを用いて上部からスクロース棚を分画して1mLの画分にした。20:70スクロースの界面において目的のVLPが見いだされた。VLPを含有する画分のBrix値は28.5から38.5の間であった一般に画分12から14の間。VP1とVP2の両方を認識する市販の抗体SantaCruzBioTechカタログ番号sc-71852を用いたウェスタンを実施して、VLPの位置および濃度を調査した。この材料を、4°Cで少なくとも1週間、タンパク質分解せずに貯蔵した。CaptoQクロマトグラフィーVP1/VP2特異的な抗体SantaCruzBioTechカタログ番号sc-71852を用いたウェスタン分析により、スクロース棚から最大量のタンパク質を含有する画分を同定した。これらの画分をプールした、または別々に保持した特定の試行に基づく。これらの画分を、緩衝液A25mMのトリス,100mMのNaCl、pH7.5で1:4希釈し、予め洗浄しかつ予め平衡化したカラムに6cm/時間でローディングした。ローディングされたタンパク質の中になお存在するスクロースにより、タンパク質がより速い流速すなわち、60cm/時間でカラムに結合することが部分的に妨げられた。NaCl勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出した。クロマトグラフィーを以下の通り実行した:緩衝液A:25mMのトリス、100mMのNaCl、pH7.5;緩衝液B:25mMのトリス、2MのNaCl、pH7.5;洗浄:緩衝液Aを用いて5CV;勾配:0~40のB10CV;洗浄:100のB、5CV;流速:0.2ml/min。分画:溶出の間に1ml。約5のBから約10のBまでプール。11.6。緩衝液の交換および濃縮。VP1バンドを超える強度、またはそれと同等の強度のバンドがないようにCaptoQ画分を選択した。これらの画分をプールし、50kDaのカットオフUltra4Millipore-再生セルロースコンセントレーターを用いた濃縮および希釈方法によって25mMのトリス、100mMのNaClに緩衝液交換した。最終濃度は約0.8mg/mLであった。このプロセスにより、>95純粋である材料がもたらされ、内毒素は低い検出可能レベルであったか、検出できないレベルであった。この材料は、使用する前に>1カ月貯蔵することができた。一般的な収率は、バイオマス20グラムに対して、精製された材料およそ1.5mgであった1Lの振とうフラスコでの結果。実施例3パルボウイルスB19VLPの分析VLPの純度クーマシーおよびウェスタン分析によってVLPの純度が示された。クーマシー染色したSDS-PAGEおよび対応するウェスタンの例が図16に示されているVLPの同定2つの抗体を用いてVLPの同定を行った。1つの抗体SantaCruzBioTechカタログ番号sc-71852は、共通のVP2領域を認識し、よって、VP1とVP2の両方を同定することができるα-VP1/VP2抗体。第2の抗体USBioP3113-81Dは、VP1に独特の領域だけを認識し、よって、VP1のみを同定することができる。完全に煮沸されていない画分が還元されると、VP2の二量体がなお目に見える。予測通り、α-VP1抗体で膜をプローブすると、VP2バンドは存在しないが、同じVP1バンドが目に見える。VLPの特徴VLPに集合しなかったタンパク質を除去するためにスクロース棚を用いてVLPを選択した。精製されたVLPを、単量体の含有量について、SEC、nativePAGE、DLSおよび電子顕微鏡法を用いて分析した。結果により、VLPが、VLPを代表する単一の高分子量種で>99であることが確認された図17。VLPの安定性VLPは、MF59中および25mMのトリス、100mMのNaCl緩衝液中の両方で、4°Cで少なくとも3カ月安定に見えた。これは、クーマシー染色したSDS-PAGE、パルボウイルスに特異的な抗体を用いたウェスタン、nativePAGEおよび電子顕微鏡法を用いて検査した。さらに、VLPは、0.05SDSを用いて分裂させて単量体にすることができたが、0.5TritonX-100ではできなかった。内毒素検査タンパク質を、CharlesRiverLaboratoriesEndosafe-PTSシステムを用いて内毒素について分析した。これは、内毒素のLimulusAmebocyteLysate検出を用いるカートリッジに基づくシステムである製品コードPTS20。アッセイを、EndotoxinSpecificBuffer製品コードBG120を製造者の指示通りに用いて実施して、二次的な活性化経路を通じてβ-グルカン酵母細胞壁の成分によって生じる偽のバックラウンドシグナルを減少させた。複数のアッセイからの結果により、材料の用量5μg当たりの範囲が0.036EU/用量から検出可能限界の0.013EU/用量を下回るまでであろうことが実証された。実施例4マウスの免疫原性データBalb/cマウスn=10において免疫原性を試験した。免疫前の血清を、第1の免疫化の前日に取得した。免疫化は、異なるアジュバントリン酸緩衝生理食塩水、ミョウバン、またはMF59とともにさまざまな濃度0.05μg、0.5μgまたは5μgのIMによって施した。20日目にマウスから採血し、21日目にマウスに第2の免疫化を受けさせた。第2の免疫化の3週間後3wp2、41日目にマウスから再度採血し、42日目にマウスに第3の免疫化を施した。56日目2wp3-第2の2週間後および84日目6wp3-第3の6週間後に血清試料を再度取得した。各ワクチン群について血清をプールしたPBSワクチン接種についてn=5、他の全ての群についてn=10。パルボウイルスB19VLPでコーティングしたプレートを用いてIgGELISAを実施した図12。MF59処方物で最も高い力価が実証され、各用量濃度で同様であった。実施例5細胞に基づく中和中和アッセイは、qRT-PCRに基づき、ウイルス基質としてCD36およびおよびグロボシド主要な細胞受容体である赤血球前駆細胞を用いた。アッセイにより、感染中にのみ存在するRNA配列の存在または非存在を測定した。中和力価を決定するために、血清を、ウイルスと一緒にプレインキュベートした後、細胞と混合した。48時間後に細胞を回収し感染についてプローブした。免疫化したマウスについての最も高い中和力価は、6×104であった。このアッセイで検査した回復期のヒト血清は、1×104の中和力価IC50を有した。"