多分散多糖の水溶液がカラム中のイオン交換樹脂に接触し、該多糖は次に水性溶出バッファーによって選択的溶出に供されて、多糖が溶出分画から回収される、多分散系のイオンにより電荷を有する多糖を異なる平均分子量の分画に分離する方法であって、選択的溶出がカラムの樹脂を各々が連続的に異なる一定のイオン強度及び又はpHを有する少なくとも3種類の溶出バッファーで洗浄することを含み、2番目とそれに続くバッファーは直前の段階のバッファーより高いイオン強度及び又はpHを有することを特徴とする、方法。溶出バッファーがすべて同じpHを有する請求項1に記載の方法。連続する段階のイオン強度間の相違が実質的に同じである請求項1に記載の方法。前記の相違が0005から01M、好ましくは0025Mである請求項3に記載の方法。イオン強度が強無機酸と強無機塩基の塩、好ましくは塩化ナトリウムの濃度を変化させることによって変えられる先の請求項のいずれかに記載の方法。溶出バッファーが連続的により高いpHの値を有する請求項1に記載の方法。連続する段階のpH間の相違が実質的に同じである請求項6に記載の方法。前記の相違が02pH単位である請求項7に記載の方法。各々のバッファーのpHが7413の範囲にある先の請求項のいずれかに記載の方法。2番目とそれに続くバッファーは直前の段階のバッファーより高いイオン強度及びpHを有する請求項6~9のいずれかに記載の方法。各々の溶出バッファーが少なくとも10、好ましくは少なくとも15カラム容量の量で使用される先の請求項のいずれかに記載の方法。溶出バッファーが揮発性の酸又は塩基を含みかつ回収が溶出分画からの揮発性の酸又は塩基の揮発を含む先の請求項のいずれかに記載の方法。バッファーがアミン、好ましくはトリエタノールアミンである塩基を含む請求項12に記載の方法。イオン交換樹脂が強い又は弱いアニオン又はカチオン交換媒体である先の請求項のいずれかに記載の方法。多分散多糖の重量平均分子量が少なくとも5kDa、好ましくは少なくとも10kDaである先の請求項のいずれかに記載の方法。選択的溶出が少なくとも5段階を含む先の請求項のいずれかに記載の方法。最初の溶出バッファーのイオン強度が0001から1Mの範囲にある先の請求項のいずれかに記載の方法。多糖が溶出分画で実行される最初の限外濾過の段階を含む段階によって回収される先の請求項のいずれかに記載の方法。多糖が乾燥、好ましくは減圧下、好ましくは凍結乾燥により溶液から最終的に分離される先の請求項のいずれかに記載の方法。イオン交換樹脂と接触する前に非溶媒沈澱の予備的な段階を含む先の請求項のいずれかに記載の方法。多糖が天然の多糖、その加水分解産物又はいずれかの官能化誘導体である先の請求項のいずれかに記載した方法。天然の多糖が細菌の多糖、好ましくは多糖抗原である請求項21に記載の方法。多糖がシアル酸ポリマー又は共重合体、好ましくはポリ、ポリ又は交互の2829結合PSAである請求項21又は請求項22に記載の方法。多糖がCA、又はそれの酸化、還元、アミノ化及び又はヒドラジド誘導体である請求項23に記載の方法。多分散多糖の分子量の多分散度が少なくとも15好ましくは少なくとも20である先の請求項のいずれかに記載の方法。126未満の分子量の多分散度を有するポリシアル酸。多分散度が12以下、好ましくは101から110の範囲にある請求項26に記載のポリシアル酸。CA、又はそれの酸化、還元、アミノ化及び又はヒドラジド誘導体である請求項26又は請求項27に記載のポリシアル酸。少なくとも5kDa、好ましくは少なくとも10kDaの分子量を有する請求項26から28のいずれかに記載のポリシアル酸。細菌の多糖にあるPSAのα28結合形態は免疫原運搬タンパク質に結合したときでさえ、独特に免疫原とならず、それは哺乳類のポリマーとしてその存在を反映しているかもしれない。ポリマーのより短い形態は細胞表面のガングリオシドで見られ、それは体中に広く分布されており、効率的にPSAへの免疫抵抗性を負わせ、保持させると考えられている。近年、PSAの生物学的特性、特にα28結合ホモポリマーPSAの生物学的特性はタンパク質や低分子量薬剤分子の薬物動態特性を改変するために活用されているGregoriadis2001JainetAl2003USA5846951WOA0187922。カタラーゼやアスパラギナーゼを含む多くの治療用タンパク質のPSA誘導体化FernandesandGregoriadis1996and1997は循環半減期に劇的な向上をもたらし、治療用タンパク質に事前にさらされることによる望まない結果として上昇して先在する抗体をものともせず、そのようなタンパク質を使用することが許されるFernandesandGregoriadis2001。多くの点でポリシアル化されたタンパク質の改変された特性はポリエチレングリコールで誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば、各々の場合、半減期は上昇し、タンパク質とペプチドはタンパク質分解により安定で、生物学的活性の保持はPEGよりPSAがより大きく表れるHreczukHirstetal2002。また、慢性的に投与しなければならない治療剤にPEGの使用については疑問があり、なぜならPEGは非常にゆっくりとしか生分解されないしBeranovaetal2000、高分子量の形態が組織に蓄積する傾向があるからであるBendeleetAl1998Conversetal1997。PEG化されたタンパク質は血液循環で複合体の滞留時間に影響も与え得る抗PEG抗体を産生することが発見されているChengetal1990。治療薬に結合した非経口で投与されるポリマーとしてのPEGの確立された歴史にも関わらず、免疫毒性学、薬理学、代謝のよりよい理解が必要とされるHunterandMoghimi2002Brocchini2003。またPEGの蓄積は毒性に導くかもしれないので、高用量を必要とする治療剤へのPEGの利用について懸念がある。それゆえ、自然に人体の一部になる免疫学的に見えない生分解性ポリマーであり、組織のノイラミニダーゼを媒介として非毒性の糖であるシアル酸に分解され得るα28結合PSAはPEGへの魅力的な代替物を提供する。我々のグループは以前に科学論文と登録された特許でタンパク質治療薬の薬物動態特性を向上させる天然のPSAの利用について記載したGregoriadis2001FernandesandGregoriadis199619972001Gregoriadisetal199319982000HreczukHirstetal2002Mital2004Jainetal20032004USA05846951WOA0187922。今、我々はPSA誘導体化タンパク質の新規の組成物及び製造方法を可能にする新規のPSA誘導体を記載する。タンパク質のような治療剤に多糖を結合させる方法は以前記載されているJenningsandLugowski1981USA5846951WOA0187922。これらの方法のいくつかはタンパク質に反応性のあるアルデヒド部分を作るためにポリマーの’非還元’末端を化学的に誘導体化することによる。PSAの還元末端は結合中のタンパク質コンフォーメーションとPSAの化学的完全性を保存するために必要な穏やかな条件下ではタンパク質と弱くしか反応しない。ビシナルジオールを含むシアル酸末端の非還元末端はモノアルデヒド誘導体を生産するために過ヨウ素酸塩で容易に酸化される。この誘導体はタンパク質に対してより反応性であり還元的アミノ化と他の化学作用を経てタンパク質に結合するための適した反応エレメントを構成する。我々はUSA5846951とWOA0187922でこれを以前に述べた。その反応は図1aと2に図示しており、各々の図は、1a末端のシアル酸の非還元末端でタンパク質反応性アルデヒドを形成するために過ヨウ素酸ナトリウムでのCAの酸化を示す、そして2タンパク質のアミノ基と安定的で不可逆的な共有結合を形成するためにシアノ水素化ホウ素ナトリウムとシッフ塩基の選択的還元を示す。還元末端の弱い反応は、過ヨウ素酸塩酸化CAとタンパク質との還元的アミノ化の確立された方法を使用して図1bに述べられている生産物の複雑さを避ける有益な効果に利用され得る。商業的に利用できるポリマー上の論文のほとんどで使用されているは細菌から製造されており、高多分散系である。それらはまた、エンドトキシンや塩などの細菌の汚染物質を含んでいるかもしれない。そのような物質は人間や動物での使用を意図したPSA誘導化治療剤の生産に適しているかもしれないし、そこで医療倫理や規制当局の安全性の必要のために薬剤の化学的、分子的な定義は非常に重要である。それゆえ、我々は多分散多糖の調製物を分子量の狭い範囲内のスピーシーズを各々含む一連の低多分散度分画に分別する新しい方法を開発することにより上の問題を解決した。これらの新しい調製物は特に人間と動物での使用を意図したPSA誘導体化治療剤の生産に適しており、医療倫理や規制当局の安全性の必要のために薬剤の化学的、分子的な定義は非常に重要である。イオン交換クロマトグラフィー法は複合体混合物の分離のための当該技術分野においてよく知られている。一般的に、先行技術はこの分離を達成するためにイオン強度の変化を使用している。十分に電離した電解質溶液中でのイオン強度はI05ΣiCiZi2と定義されている。Constantinoetal1999はHaemophilusinfluenzaetypebとNeisseriameningitidisgroupAとgroupB抗原のような負電荷の多糖の多分散系調製物から高分子量分画の分離に適したクロマトグラフィー法を報告していた。得られた物質はまだ広範囲の分子量を有するスピーシーズを含んでいるが、小さなオリゴ糖は無い。オリゴ糖の除去はこの物質を多糖に基づいたワクチンの使用により適したものにする。低分子量スピーシーズの除去は2段階の溶出過程を使用して達成された。負電荷の多糖である略してHibは、イオン交換樹脂に結合され、低分子量スピーシーズは低イオン強度バッファーでの徹底的な洗浄によって溶出された。中間体と高分子量スピーシーズはカラムに結合したままであり、高イオン強度バッファーで溶出することによって回収された。Zhangetalはコロミン酸ポリマーの分離のための高性能イオン交換クロマトグラフィーの使用を報告した。3種類の原料溶液が硝酸ナトリウムの濃度が連続的により高くなる線形勾配を形成するために一緒に混合された。本発明は線形勾配の溶出よりむしろ一段階の使用によりConstantinoetalとZhangetalの開示と区別され得る。Constantinoetalはカラムからすべての低分子量スピーシーズを除去するために大容量の低イオン強度の洗浄を使用し、それからカラムからすべての他のスピーシーズを除去するために大容量の高イオン強度の洗浄を使用した。これは低多分散度の分画への分離という結果にならなかった。イオン強度のわずかな相違だけ異なる段階を有する本発明に記載の段階的勾配の使用は低多分散度の分画の分離に導く。Ravenscroftetal1999は、イオン交換クロマトグラフィーを使用した低分子量Hibオリゴ糖の分子量測定の手順を開発した。イオン交換はDPの値が10以下を有する小さなオリゴ糖の優れた分離を提供する。これは個々のオリゴマーにイオン交換を使用してオリゴマーの混合物を分離するために開発された。DPは質量分析計で測定され、それから精製されたオリゴ糖は小さなオリゴ糖の分子量の測定を分析用イオン交換を使用して実行されることを可能にするイオン交換カラムを較正するためのスタンダードとして使用された。本発明は良い収率で医薬的に有用なタンパク質ポリマー複合体を提供するために使用されるかもしれない低分散性の多糖分画を生ずる。先行技術のどれもこの方法での多糖の分別する技術を述べていない。本発明によれば、多分散多糖の水溶液はカラム中のイオン交換樹脂に接触し、多糖は水性溶出バッファーによって選択的溶出にかけられ、多糖は溶出分画から回収される多分散のイオンにより電荷を有する多糖を異なる平均分子量の分画に分離する方法が提供され、選択的溶出がカラムの樹脂を連続的に異なる一定のイオン強度及び又はpHを有する少なくとも3種類の溶出バッファーで洗浄することを含み、2番目とそれに続くバッファーは直前の段階のバッファーより高いイオン強度及び又はpHを有することを特徴とする。本方法では、好ましくは溶出バッファーはすべて同じpHを有し、しかし強無機酸や強無機塩基の塩のイオンのような増加するイオン濃度のために連続的により高いイオン強度を有する。好ましくは塩は塩化ナトリウムである。好ましくはイオン強度の増加はNaClの濃度を5100mM、好ましくは25mM増加することによって生み出されるものと同じである。これは0005から01M、好ましくは0025Mのイオン強度の増加に一致する。代替的に、溶出バッファーは連続的により高いpHの値を有し得る。好ましくは、各々の溶離液のpHの間の差異は同じであり、好ましくは02pH単位である。各々のバッファーのpHは好ましくは7413の範囲である。典型的に、最初の溶出バッファーは約74のpHを持ち、少なくとも5回の溶出段階が本方法で使用される。理想的には、すべての溶出バッファーのイオン強度は25M未満である。バッファー中の水素イオンと水酸化物イオンの濃度はとても低いので溶液の総イオン強度へのそれらの寄与は無視できる。イオン強度とpHの増加は分別過程でタンデムに使用されてもよい。代替的に、pH溶出はpH74から少なくとも88まで上昇する一連の段階で最初に使用されてもよく、それからイオン強度溶出が始まってもよい。他の方法として、短い塩勾配が行われた後pHを増加させてもよいが、これは開始のpHが74以上である必要がある。強いイオン交換カラムを使用したときに、低いpHの範囲は分別を可能にする。しかしながら、多くの多糖はこのpHでは安定ではないので、この場合溶出された分画のpHは直ぐに約74に調整すべきである。好ましくは、溶出バッファーは塩基を含んでおり、それは好ましくはトリエタノールアミンである。低イオン濃度溶出バッファーがカラムを通して洗浄される洗浄段階が最初にあることは可能である。例えば、そのような最初の洗浄段階は本方法で使用される必須の3種の溶出バッファーの最初より塩濃度において100mM超より低い塩濃度を有するバッファーで行ってもよい。そのような最初の段階は天然に生じている材料の回収過程での副産物である低分子量の混入物また他の混入物を洗浄するかもしれない。そのような最初の洗浄段階はイオン交換樹脂カラムの容量に基づいて、少なくとも1容量、好ましくは少なくとも15カラム容量を含み得る。イオン交換樹脂のカラムは高さより大きい横断面の直径を有してもよいし、通常のカラムでは横断面の直径より大きい高さを有していてもよいことは注意すべきである。容量は1から5000mLの範囲であってもよい。カラムの高さは1cmから5000cmの範囲であってもよい。断面積は1cmから5000cm2の範囲であってもよい。横断面はどんな形であってもよいかもしれないが、好ましくは円である。我々は各々の必要な溶出段階で各々の溶出バッファーを少なくとも10、好ましくは少なくとも125、最も好ましくは少なくとも15カラム容量を使用することが好ましいことを発見した。好ましくは、溶出バッファーの3カラム容量以下が使用される。75mlのマトリックスでフローレートは好ましくは7ml分である。本発明の方法は好ましくは少なくとも5、例えば20も、一般的には6から12の範囲の連続的に増加するイオン強度の溶出バッファーを用いる溶出の連続段階を含む。これらの必須の段階の最初のイオン強度は、一般に1mMから1Mの範囲にある。塩化物イオンより強い硫酸イオンのような対イオンに対してはより弱いイオン濃度が必要とされるであろう。好ましくは溶出バッファーのイオン強度は強無機酸と強無機塩基、好ましくは塩化ナトリウムの塩濃度を変えることによって変えられる。回収段階に関して、これらは一般的に例えば膜や、例えば限外濾過膜を使用した多糖が塩から分離される段階を伴う。そのような段階はより高濃度の溶液を形成するために多糖の濃縮を可能にするかもしれない。そのような溶液は、例えば連続的な限外濾過や他の濾過段階のような膜処理の付加的な段階にかけられるかもしれない。溶出バッファーは揮発性の酸または塩基を含んでいてもよく、この場合に回収は溶出分画からの揮発性の酸または塩基の揮発を含む。例えば多糖の非溶媒を伴う沈降技術による水性溶液から多糖を回収することは可能であるが、これは各々の溶媒から最後の分離をより難しくするかもしれないので、そのような溶媒を利用しないことが好まれる。結果的に回収の最後の段階は好ましくは水、好ましくは溶出段階から残っているどんな残留揮発性バッファー成分もの蒸発を含む。トリエタノールアミンが存在する好ましい場合で、トリエタノールアミンカチオンとアセタートアニオンの両方が揮発性であり真空下で簡単に取り除くことができる。多糖は最後に、好ましくは減圧下での、乾燥によって溶液から分離され得る。これは好ましくは凍結乾燥によって行われる。沈澱は分別の予備的段階として集団の一部を取り除くためおよびより高分子量の分画の多分散度を減少させるために、好ましくは非溶媒を使用して、実行されるかもしれない。好ましくはディファレンシャルエタノール沈澱が使用される。ここで述べられている本発明はイオン交換樹脂に結合した多分散ポリマー集団からの連続的により高い分子量スピーシーズの段階的除去を提供する段階的勾配戦略の使用である。イオン交換樹脂は任意の強い又は弱いアニオン又はカチオン交換媒体であってもよい。任意の与えられたイオン強度の洗浄液の使用であってもカラムからスピーシーズの複雑な集団を溶出するだろう。タンデムの一連の短い洗浄を使用することによって、各々の段階は次の段階によって溶出されるであろう集団の一部を溶出するが、各々の点での小さな集団だけが実際に溶出されるので、多分散調製物の狭い多分散度を有する分画への分別を容易にする。この方法はまた、例えば塩やエンドトキシンなどの不純物の除去を容易にするかもしれない。IECでは、分子は低い塩濃度では完全に静止したままではない。それらは非常にゆっくりバンドとして動いている。それらのスピードはカラムへの分子の結合定数に依存しており、それはイオン強度で変化する。例えば、結合定数が中間である時、バンドはカラムを通して比較的ゆっくり動き、ある程度まで広がるだろう。結合定数が弱いとき、バンドは非常に速くしかし無視できる広がりで動く。結合定数が強いとき、バンドは非常にゆっくり、通常は広がって動く。線形勾配は広がることを防ぎ、狭いバンドでよく限定されたピークを与える。一方で、段階的勾配は特定の濃度で狭いバンドとして低い結合定数をもって分子を溶出し、広がったバントとして中間の結合定数を有する分子を溶出する。高い結合定数を有する分子はほとんど移動を示さず、それらは通常は広がるだろう。結果は各々の段階が非常に速く上昇しそれからゆっくりテイルを生じながら減少するピークを生み出す。段階的勾配はこの様に振る舞うことがよく述べられている。ピークの上昇は低い結合定数をもつスピーシーズをより多く含んでおり、テイルは中間の結合定数を有するスピーシーズをより多く含んでいる。各々の段階がより長く実行すればするほど、より高いスピーシーズのカラムに残されたものを濃縮しながら中間の結合定数を有するスピーシーズをますます広がらせて、ついにいくつかは溶出する。そこで、段階的勾配はまた線形勾配でより高いイオン強度で降りていき、さらに高いバンドでさえいくらかの移動を引き起こすスピーシーズを溶出する。これは分離を容易にはしないけれど、分別には利益がある。もし2つのスピーシーズが非常に近い結合定数を有するなら、段階的勾配はより高い結合定数を有するスピーシーズの精製または濃縮を提供する。第一段階は両方のスピーシーズを溶出するが、優先的により低い結合定数を有するものがより多く溶出する。第二段階は両方のスピーシーズを溶出するが、低い結合定数のスピーシーズのほとんどは既に以前の段階で除去されているので、分画のほとんどは高い結合定数のスピーシーズである。よく似た結合定数をもつスピーシーズを完全に分離することはできないが、段階的勾配はより高い結合定数をもつ一方の相当な濃縮という結果生じ得る。例としてCAを取り上げると、結合定数は分子における平均電荷の結果である。結合定数の相違は異なるスピーシーズ間の電荷の相違による。41電荷を有するスピーシーズと40電荷を有するスピーシーズの間の電荷比は11電荷を有するスピーシーズと10電荷を有するものの間のものよりかなり低い。電荷モノマーの量が増加すれば、結合定数の間の相違は減少する。より大きな分子量では、それは事実上無視できるようになる。それゆえ線形勾配は低分子量のスピーシーズでは優れた分離の結果となるが、分子量が増加した場合は、分離度は低下する。反対に、段階的勾配戦略は各々の洗浄でより高い分子量のスピーシーズよりもより低いものの方がより多く溶出する。このように段階的勾配は分子量範囲のより高い端に対してはより小さな分散の分画であり、範囲の中間と初期ではより大きな分散となっている。いくつかのパラメーターが分離に影響を与え得る。1pHポリマーにおける電荷はpHに依存するpHが減少すれば電荷は減少するだろうし分子量の範囲のより高い端でのより優れた分離度を提供し得る。2段階的洗浄液の容量多くの洗浄を行うほど、より高い分子量のスピーシーズがより少なく回収されるだろが、それらの多分散度はより低くなる。3段階数段階数はまた重要なパラメーターである。初期の段階を飛ばすことは各分画で得られる平均の大きさの減少という結果になり、分子量が増加するにつれてますます明白ではなくなる多分散度の増加という結果になるかもしれない。もしより多くの段階が使われたなら、ほとんどの分画の分離度が増加するかもしれないが、各々の分画のCAの平均量は減少するであろう。4温度より低い温度は結合強度を増加させ、各々の分画で降りてくるスピーシーズの大きさを減少させるかもしれない。本発明での多分散多糖は、天然で生じている多糖、その加水分解産物又はこれらのどちらかの官能化誘導体であり得る。本発明は例えば多糖抗原のような細菌の多糖のように天然の多糖を分離するのに特に有用である。本発明は、例えばポリ、ポリまたは交互の2829結合PSAのようなシアル酸ポリマーと共重合体を分離するのに特に有用である。好ましくは多糖はコロミン酸またはそれの酸化、還元、アミノ化及び又はヒドラジド誘導体である。多分散多糖の分子量の多分散度は少なくとも11、好ましくは少なくとも20であるべきである。多分散多糖の重量平均分子量が少なくとも1kDaであり、好ましくは少なくとも10kDaであり、好ましくは少なくとも100kDaである場合に、我々は本方法が特別な有用性を有することを見出した。本方法は非常に低い多分散度の多糖分画を作成するのに有用である。例えば、溶出した分画から回収された生産物多糖が好ましくは15未満、最も好ましくは125未満、たとえば11またはそれ以下さえの多分散度を有する。本発明者は約101まで下げた多分散度を達成することができることを見出した。好ましくは多糖開始物質は少なくとも1、より好ましくは少なくとも5、より好ましくは少なくとも10、例えば少なくとも50糖単位を有する。好ましくは多糖は互いにα又はα結合しているシアル酸単位を含むポリシアル酸である。分別される多分散多糖の大きさに特に上限はない。しかしながら、本発明者はPSAの場合に有用なほとんどのポリマーは150kDaまでの重量平均分子量を有していることを見出した。PSAはどんな供給源に由来してもよいが、好ましくは例えば大腸菌K1又はK9株、グループBmeningococciのような細菌供給源、牛のミルクまたはNCAMのような天然供給源に由来する。シアル酸ポリマーはNmeningitidisのグループ135やグループVのようなヘテロ重合ポリマーであってもよいし、合成されていても良い。PSAは塩の形態であっても良いし、フリーの酸であっても良い。それは、細菌の供給源からの回収の後に分子量が減少しているような加水分解された形態であってもよい。PSAは13超、例えば2ほど大きいかそれ以上の多分散度を有するような幅の広い分子量を有する物質であってもよい。好ましくは分子量の多分散度は12未満、例えば101ほどの低さである。次の記述は本発明が特に有用である多糖PSAで実行される本発明の方法の好ましい実施形態について述べる。広い分子量分布を有するPSAの集団はより低い多分散度、すなわち異なる平均分子量を有する分画に分別され得る。分別は好ましくは適切な塩基性バッファーを溶出のために用いたアニオン交換クロマトグラフィーである。多糖がカルボン酸基を有するとき、アニオン交換は特に望ましい。我々は適切なアニオン交換媒体を発見した第四級アンモニウムイオンのペンダント基を有する、活性化されたアガロースに基づいた強いイオン交換物質のような調製媒体。媒体の選択はpH又はイオン強度のどちらが分別の手段であるかに依存しており、それは当業者にとって明らかであろう。溶出バッファーは非反応性であり、望まれる生産物が蒸発によって各々の分画のベースから回収され得るので好ましくは揮発性である。適切な例は、例えばトリエタノールアミンのようなアミンである。回収は例えば凍結乾燥によるものでもよい。分別の方法はPSA開始物質並びにその誘導体に適切である。PCTGB0403488、これとともに同じ日に出願された出願やこれとともに同じ日に出願された出願で述べられている関連する発明での必須の方法の段階の前または後に、該技術は適用され得、そこで本発明者はポリシアル酸とその中で作製される中間体で実行される様々な誘導体化反応を述べている。これは、IECが約5kDa以上の分子量を有するイオン性多糖、特にそのような分子量のPSAを分別するために利用された最初であると信じられている。この発明の更なる局面に従うと、溶出バッファーで好ましくは揮発性の塩基又は酸を使用してIECを用いて5kDaより高い分子量を有するイオン性多糖の集団を分別する方法が提供される。好ましくは多糖はカルボン酸基を有しイオン交換はアニオン交換である。好ましくは溶出バッファーはアミンを、より好ましくはトリエタノールアミンを含む。最も好ましくは多糖は乾燥によって、好ましくは減圧下、最も好ましくは凍結乾燥で分画から回収される。この方法は水中で安定な反応性部分を有するCAや他の天然や合成の電荷を有するポリマーの分別に適用可能である。カチオンとアニオン交換クロマトグラフィーはまた塩もしくはpH勾配を使用した電荷を有するポリマーの分別に使用され得る。これは、IECが沈澱技術及び又は限外濾過法との組み合わせでイオン性多糖を分離するために使用された最初であると信じられている。IEC法は商業的に利用できるPSAとCAに残っているエンドトキシンのような副産物を取り除けるかもしれない。イオン対と疎水的相互作用クロマトグラフィーはまたポリマーとタンパク質ポリマー複合体の分別のために使用され得る。本発明では多糖、好ましくはPSA化合物の一連の狭い多分散度の調製物を生産する新しい方法が提供され、それでは高い多分散度で負電荷を有する開始材料がアニオン交換樹脂に結合し、分画は連続的により高いイオン強度を有する一連の短い洗浄で溶出される。代替の実施形態では、veとve電荷を有する広分散のポリマーとタンパク質多糖複合体がカチオン又はアニオン交換クロマトグラフィーによって各々分別され得る。本発明のもうひとつの局面では、ポリシアリル化されたマクロ分子が上で述べられているのと同じIECと段階的勾配戦略を使用して狭い多分散度の調製物に分別される新しい方法が提供され、そこでの生産物はマクロ分子に結合した開始材料のポリシアル酸の多分散度のために多分散系である。本方法ではパラメーターは好ましくはポリシアリル化されたマクロ分子の分別のために最適化されここで、該生産物はマクロ分子に結合した開始物質PSAの多分散度のために多分散系である、上で述べられているのと同じIECと段階的勾配戦略を使用して狭い多分散度の調製物に分別される。これらの段階は長鎖の開始材料のバックボーンからの鎖中の実質的な開裂がなく、実質的に分子量減少は生じない条件下で実行される。狭分散の多糖は活性基を作成するために使用され得る。例えばアルデヒド基はアミン基含有サブストレートまたはヒドラジン化合物に結合するために適切である。酸化段階の活性化生産物が次にサブストレートの化合物に結合する方法は述べられている。好ましくは結合反応はシッフ塩基を形成するアミンとPSAの結合を伴い、好ましくはその次に第二級アミン部分を作成するための還元が行われる。本方法はタンパク質を誘導体化することに特別な価値があり、そのアミン基はリジン基のイプシロンアミン基またはN末端アミノ基が適切である。本方法はサイトカイン、成長ホルモン、酵素、ホルモン、抗体またはフラグメントのようなタンパク質またはペプチドの治療的に活性のある薬剤を誘導体化することに特別な価値がある。図1と2はそのような反応の反応スキームを示しており、そこで多糖はPSAである。代替的に本方法は、例えばアルデヒドをリポソーム形成成分のアミン基と反応させることによって、リポソームのようなドラッグデリバリーシステムを誘導体化するために使用され得る。他のドラッグデリバリーシステムは我々の以前の事例USA5846951で述べられている。誘導体化され得る他の材料はウィルス、微生物、動物細胞を含む細胞や合成ポリマーを含んでいる。代替的にサブストレートはヒドラジン基を有し得、その場合に生産物はヒドラゾンである。これは望むなら追加的な安定性のためにアルキルヒドラジドに還元されてもよい。タンパク質とドラッグデリバリーシステムの誘導体化は増加した半減期、向上した安定性、減少した免疫原性及び又は溶解度そしてそれゆえ生物学的利用能と薬物動力学特性の制御という結果を生じ得、または活性物の溶解度又は誘導体化活性物を含む溶液の粘性を高め得る。好ましくは溶出した分画から回収した多糖化合物はシアル酸単位を含み、最も好ましくはシアル酸単位からなる。より好ましくは多糖は11000シアル酸単位、例えば10500であり、より好ましくは10から50シアル酸単位を有する。溶出した分画はモノマー、ダイマー、又はより大きなポリマーからなり得る。好ましくは、分画の多分散度は126未満、理想的には12未満、理想的には101から110の範囲にあるだろう。126未満の分子量の多分散度を有するポリシアル酸、特にCAが分離されたのはこれが最初であると信じられる。それゆえ、本発明の更なる局面は126未満、好ましくは12以下、最も好ましくは101から110の範囲にある分子量の多分散度を有するポリシアル酸を提供する。ポリシアル酸はCA、又はそれの酸化、還元、アミノ化及び又はヒドラジド誘導体であリ得る。好ましくは、ポリシアル酸は少なくとも5kDa、好ましくは少なくとも10kDaの分子量を有する。我々がここで述べた分別方法は連続的に規模の拡大が可能であり、再現性がある。それは工業的な規模での生産やCAの多分散度の制御には適切である。ここで述べられている分別技術はCAと同様に他の多糖、タンパク質ポリマー複合体及びワクチンが一様なポリマー鎖長で調製されることを可能にする。本発明は添付の実施例でさらに説明される。材料炭酸アンモニウム、エチレングリコール、PEG、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム、トリエタノールアミン、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、アジ化ナトリウム、PBSタブレット及び分子量マーカーはSigmaChemicalLaboratoryUKから購入された。使用されたCAである直鎖のα結合大腸菌K1PSAはCamidaIrelandから購入された。他の材料は24ジニトロフェニルヒドラジン、透析チューブSepharoseSPHiTrapPD10カラム、トリスグリシンポリアクリルアミドゲル、トリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムのランニングバッファー及びローディングバッファーSepharoseQFF及びDEAE、トリスボラートEDTAポリアクリルアミドゲル、TBEバッファーとローディングバッファーを含んでいた。脱イオン水はElgastatOption4waterpurificationunitから得られた。使用したすべての試薬は分析グレードであった。プレートリーダーはタンパク質の分光光度測定およびCA分析に使用された。方法タンパク質とコロミン酸測定PSAの定量的推定は他でも述べられているようにGregoriadisetal1993FernandesandGregoriadis19961997レゾルシノール法Svennerholm1957によって行われた。タンパク質はビシンコニン酸比色法によって測定された。実施例1単官能性PSAの調製1aCAの活性化新しく調製された002Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液が20°CでCAと混合され、反応混合物は暗所で15分間磁気撹拌された。酸化されたCAは70エタノールを用い、20分間3000gの遠心分離によって沈澱された。上清は取り除かれペレットは最小量の脱イオン水に溶解された。CAは再び70エタノール沈澱させられ、それから12000gで遠心分離された。ペレットは最小量の水で溶解され、凍結乾燥しさらなる使用まで20°Cで保存された。1bCAの還元酸化されたCAは水素化ホウ素ナトリウムの存在下で還元された。新しく調製された15mMの水素化ホウ素ナトリウムは20°CでCAOと混合され、反応混合物は暗所で2時間までの間撹拌された。pHは反応の完了まで7に下げられた。酸化還元されたCAは4°CでpH7の001炭酸アンモニウムバッファーに対して透析された。限外濾過は透析チューブからのCAOR溶液の濃縮のために使用された。濾液は凍結乾燥され、さらに必要となるまで4°Cで保存された。どのようなアルデヒド量の測定も’CA酸化の測定’下で述べられているように測定された。1cCAの再酸化アルデヒド含量がないことを確認した後、CAORがより長い時間の間過ヨウ素酸溶液とともにインキュベートされた点を除いてはCAの活性化の下で報告されているようにCAORは再び酸化された。CAORO生産物の酸化度もまたこの段階から得られる凍結乾燥粉末で測定された。1dCAと誘導体の酸化状態の測定コロミン酸酸化度の定量的推定は24DNPHで行われ、それはカルボニル化合物との相互作用でわずかに溶解性の24ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる。非酸化、酸化、還元及び再酸化が24DNPH試薬に加えられ、溶液は振られてから結晶性沈澱が観察されるまで37°Cで放置されたShrineretal1980。CA酸化度はアルカリ溶液中でのフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄への還元に基づいた方法ParkandJohnson1949で測定され、それは630nmで測定された。この例では、グルコースがスタンダードとして使用された。1eCANH2の調製でCAOは300倍モル過剰のNH4Clを含む脱イオン水の2mlに50mlチューブ中で溶解され、それからNaCNBH4中の5Mストックを最終濃度5mgmlで加えられた。混合物は3日間室温でインキュベートされた。コントロール反応はまたCAOの代わりにコロミン酸で行なわれた。生産物のコロミン酸アミン誘導体は5mlの氷冷エタノールの添加によって沈澱された。沈澱はベンチトップ型遠心分離機で室温下、30分、4000rpmで遠心分離することによって回収された。ペレットは確保し2mlの脱イオン水で再度懸濁し、それから10mlの超遠心分離チューブで5mlの氷冷エタノールで再度沈澱された。沈澱は室温で30分間30000rpmで遠心分離によって集められた。ペレットは2mlの脱イオン水で再度懸濁され、凍結乾燥された。1fアミン含量の分析TNBS分析は生産物に存在するアミノ基の量を測定するために使用されたSatakeetal1960。マイクロタイタープレートのウェル中でTNBSが01Mホウ酸バッファーpH95の90μlに加えられた。これにCAアミドの50mgml溶液10μlが加えられた。405nmの吸光度を測る前にプレートは20分間室温で放置された。グリシンはスタンダードとして01から1mMの濃度範囲で使用された。TNBSは第一級アミン基をトリニトロフェニル化する。アミンのTNP付加物が検出される。2回の冷却エタノール沈澱で精製した生産物のTNBS分析を使用した検査は90近い変換を示した。1gマレイミドポリマーの調製上の実施例1cで合成されたCAOROは20°C、2時間、01M酢酸ナトリウム中でNβマレイミドプロピオン酸ヒドラジドの5モル当量と反応された。生産物のヒドラゾンはエタノール中で沈澱され、酢酸ナトリウム中で再懸濁し、エタノール中で再び沈澱され、水に再度溶解し凍結乾燥した。生産物はタンパク質とペプチドのシステイン部分のチオール基への位置特異的結合にとって有用である。1hゲル浸透クロマトグラフィーCAサンプルはNaNO3CH3CNに溶解され、屈折率による検出とともに2xGMPWXLカラムでクロマトグラフされた。サンプルは045μmナイロン膜で濾過され、移動相として02MNaNO3とCH3CNで7cmminで実行された。実施例1の結果単官能性PSAの調製過ヨウ素酸塩と水素化ホウ素での処理後に内部のα28結合Neu5Ac残基の完全性はGPCよって分析され、酸化されたもの、酸化還元されたもの、2度酸化されたもの、アミノCA材料で得られたクロマトグラフがネイティブのCAのものと比較された。酸化されたもの、還元されたもの、2度酸化されたもの及びネイティブのCAは、連続の酸化、還元段階がポリマー鎖の重大なフラグメント化を生じさせるという証拠はなく、ほとんど一致した溶出プロフィールを示すことがわかった。小さなピークはバッファーの塩を示す。フェリシアニドを用いた2度の酸化過程でのCA中間体の定量分析の結果はネイティブのCAではかすかな黄色の沈澱を、アルデヒドを含むポリマーの形態では強い黄色を与え、室温での10分間の反応後に強い黄色の沈澱という結果になる24DNPHを用いた定性検査の結果と一致する。ポリマーのアミノ化含量は246トリニトロベンゼンスルホン酸分析によって85であることが分かった。PSAアルデヒド誘導体はまたチオール基と反応するのに機能的に有用である反応性のマレイミドを有する安定なヒドラゾンを作成するNマレイミド部分とヒドラジド部分を有する結合化合物と反応させることができた。ポリマーのマレイミド含量はマレイミド分析により95であることが分かった。実施例2IECによるコロミン酸の分別21大規模の分別XK50カラムは900mlのSepharoseQFFを詰められ、フローレート50mlminで洗浄バッファーの3カラム容量で平衡化された。CAがシリンジ口を経由して毎分50mlでカラムにかけられた。この後に洗浄バッファーの15カラム容量でカラムを洗浄した。結合したCAは15カラム量の異なる溶出バッファーで溶出し、最後にすべての残りのCAと他の残留物を取り除くために1000mMNaClを含む同じバッファーで溶出した。フローレートは7ml分であった。サンプルは310kDa膜上で高圧限外濾過によって20mlまで濃縮された。これらのサンプルは4°Cで繰り返しの限外濾過により脱イオン水にバッファーを交換した。サンプルはGPCとnativePAGEによって平均分子量と他のパラメーターについて分析された表1及び2図456。実施例22中間とより小さな規模での分別次のサンプルはより小さな規模で同一の洗浄と勾配系を使用して分別された。生産されたCACAO単官能性CAOCANH2CAMが終始モニターされた。上の手順を使用して生産されたCAの狭い分画が20mM過ヨウ素酸塩で酸化され、ポリマーへの全体的な変化をゲル浸透クロマトグラフィーとnativePAGEで分析された。実施例2の結果大、中、小規模での分別CAとその誘導体は集団の異なるを有する46kDaまでの分子量平均をもち多分散度が11未満の様々な狭いスピーシーズに首尾よく分別された。表1は75mlの規模での227kDaの材料を分別した結果を示す。図7はGPC結果であり、図46はCA分画のnativePAGEである。この方法は各々の規模でほとんど同一の分別プロフィールを有するマトリックスを1mlから900mlの規模に拡大可能であった。より大きなポリマーの分別は90kDaまでのスピーシーズを生じた。この方法はポリマーの大きなバッチでさえ分別のために首尾よく使用され得る。図8は提供された3種のCAサンプルと表3のように分析されたイオン交換によって分離された分画のnativePAGEの結果を示す。PAGE結果はイオン交換分画が狭く分散されていることを示す。これは図7で示されているGPCデータと一致し、それは227kDaCAから分離された分画の3種の結果を示す。227kDaの材料はより大きな規模で分離されている。GPCを使用してイオン交換からの分画が分析される。すべての狭い分画は20mM過ヨウ素酸塩で首尾よく酸化され、生産過程の異なる段階から採取され、GPCとnativePAGEよって分析されたサンプルは分子量と多分散度で変化を示さなかった。サンプルのいくつかのデータは図8で示されている。実施例3CAの分別に影響を与える因子CAの分別に影響を与える様々な因子は研究された図714。実施例3の結果CAの分別に影響を与える因子CAの分別に影響を与える様々な因子が研究された。結合研究はカラム上へのCAの50、100、150及び200mgのローディングによってなされた。CAの200mgを使用して、CAの99超がカラムに結合した。段階的勾配によって、溶出バッファーの1カラム容量でカラムが洗浄された時、ポリマーの多分散度は11を超えることが分かった。15カラム容量でのカラムの洗浄は11未満の多分散度を有するCA分画を生じた。アミノCA、酸化CA及び単官能性CAは多分散度11を有する分画に首尾よく分別されることができた。実施例4成長ホルモンCA複合体の合成参考例2で調製されたCAOと狭分散CAOはGH複合体の調製のために使用された。成長ホルモンCA複合体の調製成長ホルモンは015MPBSに溶解され、異なるCAに共有結合された。異なるCAは個々にCAGHモル比でGHに加えられ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムが4mgmlの最終濃度で加えられた。反応混合物は密閉され35±2°Cで24時間磁気撹拌された。その混合物はそれから70wv飽和度に達するまで連続的に撹拌しながらゆっくり塩を加えることによる硫酸アンモニウム2SO4沈澱にかけられて、4°Cで1時間撹拌され、それから15分間回転させ、ペレットは2SO4の飽和溶液に再懸濁され、15分間再度回転させた。回収された沈澱は1mlPBSpH74に再度溶解され、同じバッファーに対して4°Cで長く透析された。コントロールは非酸化CAの存在下またはCAの非存在下でネイティブのタンパク質を複合体化手順にかけることを含んでいた。タンパク質の付随した変性を避けるために振盪は最小限にしておいた。ポリシアリル化GHはSDSPAGEによって特徴付けされた。ポリシアリル化GHはアニオン交換クロマトグラフィーを通過し、生産物の分画はSDSPAGEにかけられた。実施例4の結果GHCA複合体の合成GHCA複合体は首尾よく合成された。SDSPAGEの結果はコントロールでのサンプルの移動は新しいGHのそれとよく似ていることを示す。複合体レーンではポリシアリル化GHを示す質量の増加を典型的に示すバンドの移動がある。バンド幅は広分散ポリマーとの複合体に比較して狭分散ポリマーとの複合体の場合には顕著に狭くなる。さらに、GH複合体はアニオン交換クロマトグラフィーによって異なるスピーシーズに首尾よく分離された。実施例5CAの沈澱ディファレンシャルエタノール沈澱はコロミン酸の異なる鎖長を沈澱させるのに使用された図1617。実施例5の結果CAの沈澱CAは異なるエタノールの濃度を使用して狭分散の分画に沈澱することはできなかった。しかしながら、ディファレンシャルエタノール沈澱はより小さく幅が狭いCAはより多くのエタノールを必要とすることを示した。幅が広い227kDaのポリマーは生産物ポリマーの収量80を与えて70EtOHで沈澱した。80EtOHの濃度はより低いMW65KDaの80を沈澱させるために必要とされた。この方法はまた生産物に混入した塩の一部を取り除く。実施例6限外濾過によるCAの分別227kDaのサンプルは異なる分子量カットオフ膜上での限外濾過により精製された。すべての場合で濃縮液はGPCとnativePAGEによって検査された図18。実施例6の結果限外濾過によるCAの分別異なる分子量カットオフ膜上での限外濾過によって精製された227kDaのサンプルは膜のカットオフの増加に伴いポリマーの多分散度の減少とより高分子量へのシフトがあったことを示した。図16はアニオン交換クロマトグラフィーと濾過によるCAの分別を示す。CAのIECは濾過による分別に比べてずっと狭い分散のCAを有する分画を生じた。実施例7NMR分光法による特徴付け分別されたCAポリマーはD2Oを使用して不純物に対して1Hと13CNMR分光法によって特徴付けされた。実施例7の結果NMR分光法による特徴付け狭分散ポリマーの分別された物質の1Hと13CNMRには不純物がない。加えて、1HNMRスペクトルでのH3プロトンと13CNMRスペクトルのC2炭素の化学シフトはポリマーが実際に期待されるα28結合シアル酸物質であることを確認する。実施例8IECによるCAの分別81大規模での分別XK50カラムは900mlSepharoseQFFで詰められて、50mlminのフローレートで洗浄バッファー3カラム容量で平衡化された。CAがシリンジ口を経由して毎分50mlでカラムにかけられた。この後に洗浄バッファーの15カラム容量でカラムを洗浄した。結合したCAは異なる塩濃度を含む溶出バッファーの15カラム容量で、そして最後にすべての残りのCAと他の残留物を取り除くために同じバッファーで1000mMNaClで溶出された。サンプルは3又は10kDa膜上での高圧限外濾過、または3kDamwco膜を有するVivaflow50ダイアフィルトレーションのいずれかによって約20mlまで濃縮された。これらのサンプルは4°Cで繰り返しの限外濾過またはVivaflowのいずれかによって脱イオン水にバッファーが交換された。サンプルはGPCとnativePAGEによって平均分子量と他のパラメーターを分析された。82小規模での分別CAはまた異なる塩濃度を含む同一のバッファー系を使用するSepharoseQFFを使用して小規模で分別された。結合したCAは通常のトリエタノールアミンバッファー中の1000mMNaClを使用したカラムの最終洗浄とともに1mlminのフローレートで15カラム容量でカラムを洗浄することによって溶出された。サンプルはVivaspin膜濾過によって約075mlまで濃縮され、バッファーは8°Cで繰り返しの膜濾過によって脱イオン水に交換され、それから凍結乾燥された。サンプルはnativaPAGEによって分析された。実施例8の結果多分散CAは7から97kDまでの範囲の分子量平均を持ち、異なるの集団を有する様々な狭分散のスピーシーズに首尾よく分別された。分析で使用された溶媒はMECN中の02MNaNO3であり、PEOとデキストロンがスタンダードとして使用された。温度は22°C13であり、注入量は100μLであり、フローレートは07mLminであった。nativePAGEによって推定されたおおよその値図21と23はそれぞれ大規模と小規模での39kDaCAポリマーを分別した結果として様々な分画のCAの集団を示す。図22と24は大及び小規模でのCAの分別の結果として得られたnativePAGEである。表4は様々な塩濃度でのIECによって得られた分画のGPC結果である。GPCデータは97kDaまでのスピーシーズが分別方法によって生じていることを示す。これらのより大きな分子量のポリマーはホスフェート分析によってより低い分子量のものに比べてより大きな割合でCAの還元末端に存在するホスフェート部分を有することが示され、それは無機リンの存在の検査である。実施例9GPCによる分別CAの特徴付け例えばCA、CAO、CAOR又はCAOROのどれかを02MNaNO301NaN310アセトニトリル中に溶解し、それから02imナイロン膜上で結果溶液を濾過することによって新しく調製されたCAサンプルは、、GPCによって分析された。サンプルは3重検出GPCシステムを使用した2xGMPWxlカラムでクロマトグラフされた。検出器はOmniSEC31ワークステーションで照合されたViscotekLaserRefractometerとViscotek270DualDetectorからなった。使用された分析条件溶離液CAサンプルを溶解するために使用されたバッファーフローレート07mlminサンプルローディング100μl温度22°C。システムは幅が狭い分子量のポリエチレングリコールと幅が広い分子量のデキストランリファレンス材料で較正された。ポリマーがGPCカラムから溶出された時間は、様々な検出器を使用して分子量に変換された。光分散検出器は絶対分子量の直接の測定値を提供し、カラム較正の必要性を排除する。旋回の半径は測定が一つの角度を使用して行われた場合は計算されない。粘度計は固有の粘度の直接の測定値を提供し、分子の大きさ、立体配座、構造の測定を可能にする。屈折率検出器からの応答はポリマーの濃度に比例する比例定数はdndcである。上で述べられたGPCシステムはCAの多くのパラメーターが測定されるのを可能にする。例えば、数平均分子量と重量平均分子量が得られることができ、これらの数値からCAの多分散度が計算され得る。GPCデータから得られる他の情報はCAの回収割合やポリマーの分岐度を含んでいる。サンプルの正確な濃度はまたdndc値から決定され得る。実施例9の結果表5はCAのIEC分別からのCA分画の分析から得られたパラメーターの範囲の代表的なデータを示す。この表で、次の定義が適用されるMn数平均分子量Mw重量平均分子量MzZ平均分子量Mpピーク平均分子量Mv粘度平均分子量MwMn分子量分布Rh流体力学的径IV固有粘度dndcサンプルの濃度に対する屈折率の変化例えば、27956と26666DaはそれぞれMwとMnであり、それらは1048の多分散度を与えた。表4はIECでの多分散CAの分別でGPC分析によって得られた狭分散分子量の範囲を示しており、一方で図25は狭分散CAサンプルで得られた併用された粘度計、屈折計refratometer及び光散乱曲線の典型的なGPCクロマトグラムを示す。実施例10最適化研究101nativePAGEによるCAの分析の最適化分別された及び分別されていないCAはゲルでのこれらのポリマーの分離を最適化するためにnativePAGEでTBEとトリスグリシンゲルによってさらに分析された。一般的に、狭又は広分散のCAの40igが、ゲルのウェル毎にローディングバッファーの10ilを含む20ilとしてロードされた。ゲルは3種の異なる速度で作動され、それからアリカンブルーで染色され、その後に2酢酸で脱色された。実施例101の結果図26は420トリスグリシン、420及び20TBEゲルでCAの異なる分子量で得られ得る様々な分離度を明らかにする。高及び低分子量CAの良い分離は420及び20TBEゲルで観察され、20TBEゲルでは特に良い分離が観察され得ることがゲルから観察され得る。幅の狭いバンドはゲル速度が150mVcmである時に比べて25又は15mVcmでゲルが作動された時に最もよく観察される。102CAの濃度CAのIEC分別から得られた高圧限外濾過の濾液はVivaflowにより濃縮された。これらのCAサンプルはポリマーのどんな分解に対しても420TBEゲルを使用したnativePAGEによって高圧限外濾過の対応するフィルターとともに分析された。実施例102の結果濾液のVivaflow精製によって得られたCAサンプルのnativePAGEからの結果は両方の材料が同じ分子量を有していたことを示す。高圧限外濾過の濾液中でのCAの存在の観察は、レプテーションとして知られる過程によって説明され得、それによる柔軟性、変形性及びCAポリマーの棒状の立体配座のために、ポリマーは膜を通過することができ濾液中にCAの存在を生じる。ゲルはまたVivaflowと限外濾過の両方がCAのIEC分別によって得られた分画を加工するために首尾よく使用され得ることを証明している。実施例11トリエタノールアミンHClのイオン強度の増加を使用するIECによるCAの分別多分散CAはまたNaClのようなどの塩も不存在下でpH74でのトリエタノールアミン濃度範囲を使用してSepharoseQFFによって分別された。従って、CAはQFFカラムにロードされた。結合したCAは1mlminのフローレートで各々のトリエタノールアミンバッファーの1mlをカラムに通すことにより2000mMトリエタノールアミンを使用したカラムの最終洗浄を伴って溶出された。サンプルは直接凍結乾燥され、それからnativePAGEによって分析された。実施例11の結果図8はCAの分別はpH74で変化するトリエタノールアミン濃度の存在下で達成され得ることを証明している。実施例12トリエタノールアミンアセタートのイオン強度の増加を使用するIECによるCAの分別多分散CAはまたNaClのようなどの塩も不存在下でpH74でのトリエタノールアミンアセタート濃度範囲を使用してSepharoseQFFによって分別された。トリエタノールアミンアセタートバッファーはトリエタノールアミンを使用し、酢酸を用いてpHを74に調整することにより調製された。多分散CAはQFFカラムにロードされた。結合したCAは1mlminのフローレートで各々のトリエタノールアミンアセタートバッファーの1mlをカラムに通すことにより2000mMトリエタノールアミンを使用したカラムの最終洗浄を伴って溶出された。各々の分画の少量のサンプルがそれから微小膜透析系を使用して水とバッファーが交換され、凍結乾燥され、それからnativePAGEによって分析された。実施例12の結果図29はCAの分別はpH74で変化するトリエタノールアミン濃度の存在下で首尾よく達成され得ることを証明している。実施例13pH勾配を使用したCAの分別HEPESとエタノールアミンバッファー系はpH段階的勾配を作るために使用された。pH7678及び80でのバッファーはHEPESの濃度を10から50mMまで増加し、pHをNaOHでおおよその値に設定することを用いて調整された。ナトリウムイオンの濃度は36mMを超えなかった。pH8283858789919395及び97は1Mエタノールアミンのおおよその量をHEPES50mMと混合し、ナトリウムイオン濃度が30mMを超えないことを確認しながら、pHをNaOHで調整することにより作られた。最終のバッファーは70mMエタノールアミンpH11であった。多分散CAの30mgはpH76バッファーに溶解され、同様にpH76バッファーでDEAEsepharoseカラムにかけられた。カラムはpH76バッファーの5mlで洗浄され、その後にカラムに各々のバッファーの2mlを通し、1ml分画を集めた。各々の溶出した分画の500ilが凍結乾燥され、それからnativePAGEによる分析のために脱イオン水の50ilに再度溶解された。実施例12の結果図30はCAの分別が増加するpH強度の存在下で首尾よく達成され得ることを証明している。DEAEsepharoseは高いpHでその電荷を遊離する第三級アミノ基、Nジメチルアミノエチルを有するアニオン交換マトリックスである。このように、高いpHはマトリックスを脱プロトン化し、その電荷を変化させ、カラムにイオン相互作用によって結合されたどんなスピーシーズも溶出するために使用される。混合された勾配はまた、pH勾配が最初に低分子量のスピーシーズを分別するために使用され、その後により高い分子量のスピーシーズを溶出するためにイオン強度勾配が続く箇所で使用され得る。参考文献BendeleASeelyJRicheyCSennelloGShoppGRenaltubularvacuolationinanimalstreatedwithpolyethyleneglycolconjugatedproteinsToxicologicalsciences42152157BeranovaMWasserbauerRVancurovaDStifterMOcenaskovaJMoraMBiomaterials11521524BrocchiniSPolymersinmedicineagameofchessDrugDiscoveryToday8111112ChengTWuMWuPChernJRofferSRAcceleratedclearanceofpolyethyleneglycolmodifiedproteinsbyantipolyethyleneglycolIgMBioconjugatechemistry10520528ChoJWandTroyFAPSAengineeringSynthesisofpolysialylatedneoglycosphingolipidbyusingthepolytranferasefromneuroinvasiveEcoliK1ProceedingsofNationalAcademicSciencesUSA911142711431ConstantinoPetalVaccine17125163ConversCDLejeuneLShumKGilbertCShorrRGLPhysiologicaleffectofpolyethyleneglycolconjugationonstromafreebovinehemoglobinintheconsciousdogafterpartialexchangetransfusionArtificialorgan21369378DyerJRUseofperiodateoxidationinbiochemicalanalysisMethodsofBiochemicalAnalysis3111152FernandesAIGregoriadisGPolysialylatedasparaginasepreparationactivityandpharmacokineticsBiochimicaetBiophysicaActa13412634FernandesAIGregoriadisGSynthesischaracterizationandpropertiesofpolysialyatedcatalaseBiochimicaetBiophysicaActa12939296FernandesAIGregoriadisGTheeffectofpolysialylationontheimmunogenicityandantigenicityofasparaginaseimplicationsinitspharmacokineticsInternationalJournalofPharmaceutics217215224FleuryPLangeJSurl’oxydationdesacidesalcoolsetdessucresparl’acidperiodiqueComptesRendusAcademicSciences19513951397GregoriadisGDrugandvaccinedeliverysystemsinPharmaTechWorldMarketsResearchCentreLimitedLondon172176GregoriadisGFernandesAMcCormackBMitalMZhangXPolysialicacidsPotentialforlongcirculatingdrugproteinliposomeandothermicroparticleconstructsinGregoriadisGandMcCormackBTargetingofDrugsStealthTherapeuticSystemsPlenumPressNewYork193205GregoriadisGFernandesAMitalMMcCormackBPolysialicacidspotentialinimprovingthestabilityandpharmacokineticsofproteinsandothertherapeuticsCellularandMolecularLifeSciences5719641969GregoriadisGMcCormackBWangZLifelyRPolysialicacidspotentialindrugdeliveryFEBSLetters315271276HreczukHirstDJainSGenkinDLaingPGregoriadisGPreparationandpropertiesofpolysialylatedinterferonα2bAAPSAnnualMeeting2002TorontoCanadaM1056HunterACMoghimiSMTherapeuticsyntheticpolymersagameofRussianRouletteDrugDiscoveryToday79981001JainSHirstDHMcCormackBMitalMEpenetosALaingPGregoriadisGPolysialylatedinsulinsynthesischaracterizationandbiologicalactivityinvivoBiochemicaetBiophysicaActa16224229JainSHirstDHLaingPGregoriadisGPolysialylationThenaturalwaytoimprovethestabilityandpharmacokineticsofproteinandpeptidedrugsDrugDeliverySystemsandSciences439JenningsHJLugowskiCImmunogenicityofgroupsABandCmeningococalpolysaccharidetetanustoxoidconjugatesJournalofImmunology12710111018LifelyRGilhertASMorenoCCSialicacidpolysaccharideantigenofNeisseriameningitidisandEscherichiacoliesterificationbetweenadjacentresiduesCarbohydrateResearch94193203MitalMPolysialicacidsaroleforoptimizationofpeptideandproteintherapeuticsPhDThesisUniversityofLondon2004MuflenhoffMEctehardtMGerardySchohnRPolysialicacidthreedimensionalstructurebiosynthesisandfunctionCurrentopinionsinStructuralBiology8558564ParkJTJohnsonMJAsubmicrodeterminationofglucoseJournalofBiologicalChemistry181149151RavenscroftSanjaypleaseaddbibliographicdetailsIdon’thavethisreferenceRothJRutishauserUTroyFAPolysialicacidfrommicrobestomanBirkhauserVerlagBaselAdvancesinLifeSciences1993RouserGFleischerSYamamotoALipids19705494496RutishauserUPolysialicacidasregulatorofcellinteractionsinRUMorgolesandRKMargalisNeurobiologyofGlycoconjugatespp367382PlenumPressNewYork1989SatakeKetalJBiochem47654ShrinerRLFusonRDCCurtinDYMorillTCTheSystematicIdentificationofOrganicCompounds6thedWileyNewYork1980SvennerholmLQuantitativeestimationofsialicacidIIAcolorimetricresorcinolhydrochloricacidmethodBiochimicaetBiophysicaActa24604611TroyFAPolysialylationofneuralcelladhesionmoleculesTrendsinGlycoscienceandGlycotechnology2430449TroyFAPolysialylationFrombacteriatobrainGlycobiology2123ZhangYSeparationofoligopolymerof5NAcetylneuraminicAcid5NGlycolylneuramicAcidand2keto3deooxyDglyceroDgalactononionicAcidbyHighPerformanceAnionExchangeChromatographywithPulsedAmperometricDectectorAnalyticalBiochemistry250245251