"造血系列の細胞の増殖及び/又は分化用の細胞培養培地であり:1~50μgmlの濃度のインスリン;100μgml~2000μgmlの濃度のトランスフェリン;及び1~30の濃度の血漿又は血清;を含有する、当該細胞培養培地。前記インスリンの濃度が8~12μgmlである、請求項1に記載の細胞培養培地。前記トランスフェリンの濃度が300~500μgmlである、請求項1又は2のいずれかに記載の細胞培養培地。前記血漿又は血清の濃度が4~12である、請求項1~3のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更に、ヘパリンを、特に濃度05Ulml~5Ulml、より好ましくは濃度15~35Ulmlで含有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更にエリスロポエチンを含有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更に、幹細胞因子を含有する、請求項1~6のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更に、インターロイキン3を含有する、請求項1~7のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更に、ヒドロコルチゾンを含有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の細胞培養培地。更に、トロンボポエチン、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド、骨形成タンパク質4、血管内皮増殖因子A165及びインターロイキン6から選択される1つ以上の化合物を含有する、請求項1~9のいずれか1項に記載の細胞培養培地。任意でグルタミン又はグルタミン含有ペプチドで補完したIscovesModifiedDulbeccosMediumを含有する、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞培養培地。造血系列の細胞の増殖及び/又は分化のための、請求項1~11のいずれか1項に定義される細胞培養培地の使用。造血幹細胞を増殖させ、そして当該HSCを、網状赤血球、除核細胞及び/又は赤血球細胞に分化させる、請求項12に記載の使用。胚様体を増殖させ、そして当該EBを、網状赤血球、除核細胞及び/又は赤血球細胞に分化させる、請求項13に記載の使用。請求項1~11のいずれか1項に定義される細胞培養培地で細胞を培養する1つ以上の工程を含む、造血系列の細胞を増殖及び/又は分化させる方法。HSCを網状赤血球に分化させる請求項15に記載の方法であり:細胞培養培地中でHSCを7日間培養する第一の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第一の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で3~4日間培養する第二の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第二の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で第一の工程の開始時点から18~21日目まで培養する第三の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;そして網状赤血球を取得する工程;を含む、当該方法。EBを赤血球に分化させる請求項15に記載の方法であり;EBを細胞培養培地中で20日間培養する第一の工程、ここで当該細胞培養培地は、8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;80ngml~120ngmlの濃度のTPO;80ngml~120ngmlの濃度のFLT3リガンド;8ngml~12ngmlの濃度のBMP4;4ngml~6ngmlの濃度のVEGFA165;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;4ngml~6ngmlの濃度のIL6;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第一の工程で取得した細胞を剥離して、当該剥離した細胞を細胞培養培地中で8日間培養する第二の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第二の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で3日間培養する第三の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第三の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で3日間培養する第四の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第四の工程で取得した細胞を10日間培養する第五の工程、ここで当該培養が、:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する細胞培地中で、又は接着性ストローマ層上で実施される;そして赤血球細胞を取得する工程;を含む、当該方法。本発明は、インスリン、トランスフェリン及び血漿又は血清を含有する細胞培養培地が、細胞性ストローマ上での共培養を要さずに、ヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、又はヒト造血幹細胞から、赤血球細胞又は網状赤血球を高効率で生産するのに有効であるという、発明者らによる予期しない知見に基づくものである。故に、本発明は、造血系列の細胞の増殖及び/又は分化用の細胞培養培地であり:1~50μgmlの濃度のインスリン;100μgml~2000μgmlの濃度のトランスフェリン;及び1~30の濃度の血漿又は血清;を含有する、当該細胞培養培地に関する。また、本発明は、造血系列の細胞を増殖及び又は分化させるための、上記細胞培養培地の使用にも関する。本発明は、更に、上記細胞培養培地で細胞を培養する1つ以上の工程を含む、造血系列の細胞を増殖及び又は分化させる方法に関する。本明細書中で、造血系列の細胞という表現は、哺乳類、特にヒトの血液中に見出される細胞、及びそのような血液細胞に分化する傾向がある細胞を指すことを想定する。より具体的には、本発明において、造血系列の細胞は、赤血球細胞赤血球系細胞ともいう及び直接又は間接的に赤血球細胞に分化する傾向にある細胞である、赤血球系列の細胞に関する。当業者に周知であるように、赤血球系列の細胞は、分化の度合の増大により区別され、胚性幹細胞、造血幹細胞、プロ赤芽球、赤芽球、網状赤血球、除核細胞、特に除核赤血球、及び赤血球を含む。本発明に係る造血系列の細胞は、幹細胞、特に胚性幹細胞、成体幹細胞、例えば造血幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚様体、またプロ赤芽球、赤芽球、網状赤血球、及び除核細胞、特に除核網状赤血球を指す。好ましくは、本発明の造血系列の細胞は、ヒト細胞である。iPS細胞は、当該技術分野で周知である。当該細胞は様々な方法で、様々な種類の細胞から取得できる。例えば、iPS細胞は、TakahashiYamanakaCell126663676及びYamanakaetalNature448313317の教示に従い取得できる。本明細書中、増殖という用語は、培養細胞の複製に関するものと想定される。本明細書中、分化という用語は、細胞培養培地への播種に当初使用された細胞には存在しなかった細胞の特徴を細胞培養培地中で培養された細胞が獲得することに関するものと想定される。本明細書中、分化という用語は、特に、更に赤血球への分化に至る経路に細胞をコミットする特徴の獲得を示す。故に、本発明の細胞培養培地は、未分化の細胞、例えば胚性幹細胞、成体幹細胞、例えば造血幹細胞、人工多能性幹細胞、又は胚様体の増殖、並びにそれらを網状赤血球、又は赤血球に分化させるのに特に有用である。本明細書中、細胞培養培地は、真核細胞、特に哺乳類細胞、更に具体的にはヒト細胞の増殖を維持するのに適した任意の培地、特に任意の液体培地に関する。好ましくは、本発明の細胞培養培地は、1~50μgmlの濃度のインスリン;100μgml~2000μgmlの濃度のトランスフェリン;及び1~30の濃度の血漿又は血清;を添加した基礎培養培地からなる。好ましくは、前記基礎培養培地は、それ自体が、真核細胞、特に哺乳類細胞、より具体的にはヒト細胞の増殖を維持するのに適している。そのような基礎培養培地は当業者に周知である。一例として、任意でグルタミン又はグルタミン含有ペプチドが添加されたIscovesModifiedDulbeccosMediumが挙げられる。故に、本発明の細胞培養培地は、好ましくは、任意でグルタミン又はグルタミン含有ペプチドが添加されたIscovesModifiedDulbeccosMediumを更に含有する。好ましくは、本発明のインスリンは、ヒト組換えインスリンである。また、好ましくは、インスリンの濃度は5μgml~20μgml、より好ましくは8μgml~12μgml、そして最も好ましくは10μgmlである。好ましくは、トランスフェリンはヒトトランスフェリンである。好ましくは、トランスフェリンは鉄で飽和されている。また、好ましくは、トランスフェリンの濃度は200μgml~1000μgml、より好ましくは300μgml~500μgml、そして最も好ましくは330μgml又は450μgmlである。トランスフェリンは組換えタンパク質であってもよい。好ましくは、血漿又は血清は、ヒト血漿又は血清である。また、好ましくは、血漿又は血清の濃度は1~20、より好ましくは4~12、尚もより好ましくは5~10、そして最も好ましくは5又は10である。一つの態様において、本発明の細胞培養培地は、更にヘパリンを、05Ulml~5Ulmlより好ましくは15~35Ulmlそして最も好ましくは約2Ulmlの濃度で含有する。好ましくは、本発明の細胞培養培地は、当該細胞培養培地中に血清が含有している場合は、ヘパリンを含有する。他の態様において、本発明の細胞培養培地は、更にエリスロポエチン、特にヒト組換えエリスロポエチンを、好ましくは05Ulml~20Ulml、より好ましくは25Ulml~35Ulmlそして最も好ましくは約3Ulmlの濃度で含有する。他の態様において、本発明の細胞培養培地は、更に、幹細胞因子、特にヒト組換え幹細胞因子を、好ましくは50ngml~200ngmlより好ましくは80ngml~120ngmlそして最も好ましくは約100ngmlの濃度で含有する。他の態様において、本発明の細胞培養培地は、更に、インターロイキン3、特にヒト組換えインターロイキン3を、好ましくは1ngml~30ngml、より好ましくは4ngml~6ngmlそして最も好ましくは約5ngmlの濃度で含有する。更なる態様において、本発明の細胞培養培地は、更に、ヒドロコルチゾンを、好ましくは5x107~5x106M、より好ましくは約106Mの濃度で含有する。尚も他の態様において、本発明の細胞培養培地は、トロンボポエチン、好ましくは組換えヒトトロンボポエチンを、好ましくは20ngml~200ngml、より好ましくは80ngml~120ngml、最も好ましくは約100ngmlの濃度で;FMS様チロシンキナーゼ3リガンド、特に組換えヒトFLT3リガンドを、好ましくは20ngml~200ngml、より好ましくは80ngml~120ngml、最も好ましくは約100ngmlの濃度で;骨形成タンパク質4、特に組換えヒト骨形成タンパク質4を、好ましくは1ngml~20ngml、より好ましくは8ngml~12ngml、最も好ましくは約10ngmlの濃度で;血管内皮増殖因子A165、特に組換えヒトVEGFA165を、好ましくは1ngml~20ngml、より好ましくは4ngml~6ngml、最も好ましくは約5ngmlの濃度で;そしてインターロイキン6、特に組換えヒトIL6を、好ましくは1ngml~20ngml、より好ましくは4ngml~6ngml、最も好ましくは約5ngmlの濃度で;含有する。好ましくは、本発明の細胞培養培地は、造血幹細胞の増殖に、及びHSCを網状赤血球、除核細胞、及び又は赤血球細胞に分化させるのに使用される。また、好ましくは、本発明の細胞培養培地は、胚様体、特に胚性幹細胞から取得した胚様体を増殖し、及びEBを網状赤血球、除核細胞、及び又は赤血球細胞に分化させるのに使用される。当業者にとって明らかなように、網状赤血球、除核細胞、及び又は赤血球細胞は、実質的に純粋な細胞集団として、又は網状赤血球、除核細胞、及び又は赤血球細胞の混合物として取得され得る。好ましくは、本発明の方法は、HSCを、網状赤血球、除核細胞、赤血球、又はそれらの混合物に分化させるためのものであり、当該方法は:細胞培養培地中でHSCを5~9日、好ましくは7日間培養する第一の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第一の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で2~5日、特に3~4日間培養する第二の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第二の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で6~10日、特に第一の工程の開始時点から18~21日目まで培養する第三の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;300~350μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;5x107~5x106Mの濃度のヒドロコルチゾン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;そして網状赤血球、除核細胞、赤血球、又はそれらの混合物を取得する工程;を含む。また、好ましくは、本発明の方法は、EBを、赤血球、網状赤血球、除核細胞又はそれらの混合物に分化させるためのものであり、当該方法は;EBを細胞培養培地中で、15~25日、特に20日間培養する第一の工程、ここで当該細胞培養培地は、8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;3~7の濃度の血漿;15Ulml~25Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;80ngml~120ngmlの濃度のTPO;80ngml~120ngmlの濃度のFLT3リガンド;8ngml~12ngmlの濃度のBMP4;4ngml~6ngmlの濃度のVEGFA165;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;4ngml~6ngmlの濃度のIL6;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第一の工程で取得した細胞を剥離して、当該剥離した細胞を細胞培養培地中で、6~10日、特に8日間培養する第二の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;4ngml~6ngmlの濃度のIL3;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第二の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で、2~4日、特に3日間培養する第三の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;80ngml~120ngmlの濃度のSCF;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第三の工程で取得した細胞を細胞培養培地中で、2~4日、特に3日間培養する第四の工程、ここで当該細胞培養培地は:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する;第四の工程で取得した細胞を、8~12日、特に10日間培養する第五の工程、ここで当該培養が、:8~12μgmlの濃度のインスリン;425~475μgmlの濃度のトランスフェリン;8~12の濃度の血漿;25Ulml~35Ulmlの濃度のヘパリン;25~35Ulmlの濃度のEpo;を含有する細胞培地中で、又は接着性ストローマ層上で実施される;そして赤血球、網状赤血球、除核細胞、又はそれらの混合物を取得する工程;を含む。実施例1:造血幹細胞から網状赤血球のインビトロ生産材料及び方法細胞培養GCSFで動員した正常末梢血細胞を、インフォームドコンセントを経た健康なドナーから取得した。MiniMACSカラムを用いた超磁性マイクロビーズ選択により、CD34細胞を単離した。細胞を、2mMLグルタミン、330μgml鉄飽和トランスフェリン、10μgmlインスリン、2lUmlヘパリンChoay及び5溶媒界面活性剤ウイルス不活性化血漿を添加したIMDM中で培養した。増幅の手順は、3つの工程を含む。第一の工程において、104mlCD34細胞を、106Mヒドロコルチゾン、100ngmlSCF5ngmlIL3及び3lUmlEpoの存在下で培養した。4日目に、細胞培養物を、HC、SCF、IL3及びEpoを含有する4倍の体積の新鮮な培地で希釈した。第二の工程において、細胞を、SCF及びEPOを添加した新鮮な培地中に、105mlで再懸濁した。第三の工程において、細胞をEpoのみ添加した新鮮な培地中で培養した。細胞をカウントして、11日目及び14日目に、それぞれ5x105及び15x106細胞mlに調整した。当該培養物を、37°C、5CO2大気下で維持し、その結果は、プレーティング後の増幅の実際の率を単位として表現された。形態学的分析のため、細胞をMayGrunwaldGiemsa及びニューメチレンブルー試薬で染色し、一方、除核細胞は、XE2100自動装置をを使用して、MCV、MCHC及びMCHを含む、標準的な形態パラメーターにおいてモニタリングした。フローサイトメトリー細胞を、非コンジュゲート又はフルオレセインイソチオシアネート若しくはフィコエリトリンコンジュゲート抗体で標識した。CD71FITC及びCD36FITC、グリコホリンAPE、CD45FITC及びCD34PEに対する抗体を、フェのタイピングに使用した。一次ヒト抗RhD抗体及び二次ヤギPEコンジュゲート抗ヒト抗体を、RhD判定に採用した。解析は、CellQuestソフトウエアを使用して、FACSCaliburフローサイトメーター上で実施した。変形能の測定培養18日目に取得した網状赤血球を白血球除去フィルターを通して除核細胞から分離し、そして除核声望を、エクタサイトメトリー、レーザー回折法により排除した。エクタサイトメーターにおいて、細胞を4ポリビニルピロリドン溶液に懸濁し、そして漸増浸透圧勾配に晒した。細胞のレーザー回折パターンの変化が記録された。この光学的測定は、変形能指数と呼ばれるシグナルを生じる。DI曲線の解析は、170dynescm2のせん断応力を定常的に加えた浸透圧の関数として、細胞膜の動的な変形能の尺度を提供する。DImaxは任意の単位で表現され、DIの最大値として定義され、通常、赤血球の平均の表面積に関連する。Ominは、低張条件でDIの最小値が取得される浸透圧を定義し、初期の表面積体積の比率に依存する。OHyperは、DIが、前記曲線の高張領域におけるDImaxの値の半分に低下する浸透圧であり、MCHCに反比例的に関連する。酵素活性白血球を枯渇させた後に得られる赤血球にディジトニンを加え、Drabkins試薬を使用して、分光光度計によりHbを定量した。Enzymeactivitiesグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸キナーゼの活性は、340nmでのNADPH吸光度の増大の率を測定することにより判定された。SynchronCX4Beckmanスペクトロフォトメーター並びにRandoxLaboratories及びRocheDiagnostics製の試薬が使用された。結果は、Hbのグラムあたりで表された。Hb解析Hbフラクションを分離し、イオン交換高性能液体クロマトグラフィーを使用して定量した。解析は、説明書に従い、洗浄した細胞ペレットにつき、BioRadVariantIIデュアルプログラムを使用して実施された。溶液中の酸素結合平衡酸素結合曲線は、1cmパス長キュベットを取り付けた70mlトノメーター中で、トノメトリーにより判定された。Cary50分光光度計を用いて特別な測定が実施され、温度Peltierモジュールを用いて調整された。解析は、140mMNaCl及び2mMグルコースを含有する50mMbisTris中で実施された。窒素下で激しく脱酸素を行い、赤血球細胞を、純粋酸素をHamiltonシリンジでゴム栓越しに既定体積注入して様々な酸素分圧にしたトノメーターで平衡化した。飽和度は、ソフトウエアScientistの最小二乗フィッティングルーティンを使用して、RBC懸濁物の完全な無酸素及び有酸素のスペクトルの線形結合として、可視及びSoret領域における吸収スペクトルのシミュレーションにより推定された。結果1.1.造血幹細胞の網状赤血球への分化健康なドナーの末梢血をGCSFで動員したものLK細胞に由来するCD34HSCから出発して、5溶媒界面活性剤ウイルス不活性化血漿の存在下での三段階プロトコールが設計された。第一に、細胞の増殖及び赤血球系列へのコミットメントを、7日間、SCF、IL3及びEpoを用いて誘導した。第二に、当該赤血球系列の増殖を、3~4日間、SCF及びEpoを用いて増幅させた。第三の工程で、当該細胞を、18~21日目まで、Epoのみを用いて最後まで成熟するまで維持した。18日目までには平均66200±24000倍にまでCD34細胞が増幅してプラトーに達し、そして18日目までには、74±5が除核細胞となった。この段階で、全ての細胞が網状赤血球の特徴を示すことが、ポリメチン色素及びのフロー解析、及びニューブルーメチレン染色により評価された。平均細胞体積は141±6fLで、平均粒子ヘモグロビン濃度が30-で、そして平均細胞ヘモグロビンは42±1pgであった。この集団の免疫学的特徴は、グリコホリンA、CD71及びCD36を、それぞれ99±1、44±10及び11±4で発現しており、細胞の網状赤血球プロフィールが確認された。1.2.造血幹細胞から生じた網状赤血球の機能解析正確な機能解析を実施するために、培養18日目に取得した網状赤血球を、白血球除去フィルターを通過させて、有核細胞から分離した。これらの網状赤血球はグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼを65±3単位、そしてピルビン酸キナーゼをヘモグロビングラムあたり94±7単位有しており、未成熟な均一赤血球細胞集団の性質を維持していた。これは、それらの細胞がグルタチオンを減少させ、ATPレベルを維持することにより、2,3ジホスホグリセリン酸の正常なレベルを確保することを示唆する。網状赤血球の膜の変形能は、赤血球の伸長を測定する浸透圧スキャンエクタサイトメトリーにより解析された。この手法は変形能指数は、細胞の平均表面積に関連する。より大きい平均体積を有する網状赤血球のDImaxは、予想レベルに対応し、そしてこれらの細胞の通常の変形能が確認された。80mOsmkg未満のOminは、網状赤血球の表面積体積比率の増大、及び浸透圧脆弱性の低下を示し、一方、Ohyperが通常の値であることにより、正常な水和が確認された。これらのデータは、培養網状赤血球において、レオロジー特性が維持されていたことを示す。インビトロで作製した網状赤血球は、ヘモグロビンAを含有しており、これは、これらの条件下で正常なHb合成が行われていることを示す。トノメトリーによる酸素平衡測定で、網状赤血球の懸濁物は、天然のRBCの懸濁物と同様に酸素を結合及び放出することが示された。当該網状赤血球の酸素親和性は28mmHgであって、一方、天然のRBCは26±1mmHgであり、また、Hill係数は、いずれのサンプルも24±01であった。図5は、MWCモデルパラメーターを使用した酸素結合曲線からシミュレーションした、様々なDPGHb4比での酸素結合等温線を表す。これらの結果は、前記網状赤血球中の2,3DPGのレベルは、天然のRBC解糖率で観察されるように、Hbテトラマー濃度に恐らく近いことを示す。2,3DPGの枯渇は、正常な濃度がP50を半分に減少させるのに対して、10mMグルコースでRBCをより長くインキュベーションした後の2,3DPGの増大は、P50を約60上昇させる。実施例2:胚性幹細胞からの赤血球のインビトロ生産材料及び方法未分化hESC培養hES細胞株H1を、20ノックアウト血清代替物及び組換えヒトFGF2を添加したノックアウトDulbeccosmodifiedEaglesmedium中、マイトマイシンで処理した初代マウス胚性線維芽フィーダー細胞上で、1週間ごとに機械的にパッセージして、未分化状態で維持した。胚様体形成初日、未分化hESCをコラゲナーゼIVで処理し、低接着プレートNuncDutscherBrumathFranceに移して、分化培地を添加したノックアウトDMEM中で一昼夜インキュベーションして、胚様体を形成させた。翌日、EBを、450gmL鉄飽和ヒトトランスフェリン、10gmLインスリン、5ヒト血漿及び2UmLヘパリンを含有し、SCF、TPO、FLT3リガンド、ヒト組換え骨形成タンパク質4ヒト組換えVEGFA165、IL3、IL6及びEpoが存在する液体培養培地中に懸濁した。EBを加湿5CO2大気中、37°Cで20日間培養し、2、3日ごとに培地及びサイトカインを交換した。コラゲナーゼBで37°Cウォーターバス中、30分間細胞をインキュベーションすることにより単一の細胞に解離させ、細胞解離緩衝液で10分間37°Cウォーターバス中でインキュベーションし、そして、慎重にピペッティングして、70μmメッシュに通した。cRBCの作製0日~8日:解離させたEBをカウントし、そして10ヒト血漿及び3UmLヘパリンを含有し、SCF、IL3及びEpoが存在するLCM中に1x106細胞mLの密度で播種した。1日目、非接着細胞と接着細胞を、同一の培地及びサイトカイン中で別個に播種し、8日間培養した。4日目、細胞培養培地の4倍の体積のSCF、IL3及びEpoを含有する新鮮な培地を添加した。8日~11日目、細胞を3x105又は105細胞mLの密度で懸濁し、SCF及びEpoを添加した新鮮な培地中で培養した。11日~15日目:細胞を1x106細胞mLの密度で懸濁し、Epoを添加した新鮮な培地中で培養した。15日~25日目:NA及びAD細胞を、10ヒト血漿及びEpoを含有するLCM中に2x106細胞mLで懸濁し、又は接着性ストローマ層上で共培養した。培養は、5CO2大気中、37°Cで行われた。ストローマ細胞接着細胞層の供給源として、MS5ストローマ細胞株、10ウシ胎児血清を添加したαMEM中で正常成人骨髄から樹立した間葉系ストローマ細胞、及び20FCSを含有するIMDMglutamax中で、CD34骨髄細胞を、SCF、FLT3リガンド及びTPOの存在下で10日間、そしてSCF、IL3及びMCSFの存在下で1週間培養して樹立したマクロファージ由来のストローマ細胞の3つが評価された。CD14及びHLADR発現を確認するために、接着性細胞のFACS染色が行われた。半固体培養アッセイBFUE、CFUE及びCFUGM前駆細胞のメチルセルロース培養を試験した。解離したEBの濃度は1x105細胞mLで、コロニーは培養4日及び14日に評点された。未分化hESC、hESC、EB及び分化細胞のフローサイトメトリー解析細胞は01BSAを含有するPBS中で調製され、モノクローナル抗体のカクテルで標識された。サンプルを、CellQuest収集ソフトウエアを有するFACSCaliburフローサイトメーターを用いて分析した。未分化hESC、回収された2日~20日の分散されたEB及び分化の過程の赤血球系細胞のフローサイトメトリー解析のために、以下の抗体:SSEA4PE及びSSEA1PETRA160、TRA181、ヤギ抗マウスIgMPE及びヤギ抗マウスIgGPECD34PE、CD45PE、CD45PC7、CD117PE、CD71FITC、CD36FITC及びCD235aPECD133PEが使用された。生存細胞は解析用に選択され、正の染色及びバックグラウンドの閾値を確立するため、アイソタイプがマッチする適切なコントロールmAbによる染色が使用された。クロマトグラフィー及び質量分析によるcRBCのヘモグロビン組成の測定様々なヘモグロビンフラクションのパーセンテージが、BioRadVariantIIHbanalyzerを用いたCEHPLCにより測定された。培養D15及びD25にhES細胞から取得したcRBC中に含有される異なるグロビン鎖フラクションの分離は、逆相液体クロマトグラフィー及び分光分析により行われた。RPLC解析は、C4Uptisphere上で実施された。溶出は、2つの溶媒系中10CH3CN、及びB03TFA中70CH3CNにより行われた。異なるRPLCピークの積分は、それぞれ単独のグロビン鎖フラクションの面積のパーセンテージを決定することを可能にした。それらの特定及び同定は、グロビン鎖の分離及び回収後、エレクトロスプレーイオン化質量分析により実施された。結果は、ヒトCD34臍帯血細胞から作製したcRBCを用いて得たデータと比較された。cRBCのヘモグロビンの機能性ヘモグロビンと一酸化炭素との結合は、4x10mm光学キュベットを使用する閃光光分解により試験された。端的には、Hbテトラマーに結合するCOのキネティクスが、532nmでの10nsパルスによるリガンドの光解離の後、436nmで解析された。RBCは、低張緩衝溶液中、氷上で30分置いて溶解させられた。15000xgで遠心分離した後、Hbを含有する上澄を膜及び細胞デブリから抜き取り、当該HbサンプルにIHPを添加した。データのシミュレーションは、Scientistの非線形最小二乗プログラムを使用して実施された。結果2.1.赤血球系コミットメント用に調整されたhESCのhEBへの分化EB用の培養培地の確立赤血球の分化経路は、非常に早期に誘導及び刺激された。一方、BMP4の添加は必要不可欠で、CEGFA165も同様であり、8つの異なる実験が、他の2つのパラメーター、サイトカインおよび血清の種類の本質的機能を試験するために実施された。これらの実験を実施した後、EB用の培養培地は、確定した調整赤血球系コミットメントであった。当該培地は5のプールされたヒト血漿、高濃度のトランスフェリン、並びに8つのサイトカインSCF、TPO、FLT3リガンド、組換えヒトBMP4、組換えヒトVEGFA165、IL3、IL6及びEpoのカクテルを含有する。以下に記載するように、これらの培養条件は、最大の数の成熟除核RBCを最終的に取得することを可能とする。2.2.hEBの赤血球系潜在力の判定第一に、最大の赤血球系潜在力を有するhEBの分化段階を同定した。培養2日目と20日目の間のhEBの分化の動態、フローサイトメトリーによる造血及び赤血球生産の特異的マーカーの発現、並びに赤血球系前駆体の形成が解析された。分化の前、hESCは未分化細胞に特異的なマーカーを高レベルで発現しており、造血マーカーのレベルは低く、又は発現していない。これらの未分化細胞のマーカーは13日目まで漸進的に低下し、20日目まで僅かに陽性を維持した。CD34は2~20日にかけて発現し、9日~13日でピークとなった。CD45は、6日~20日にかけて発現し、13日でピークとなった。興味深いことに、トランスフェリン受容体CD71は培養期間中発言を持続し、6~20日にかけて高レベルで発現した。赤血球系マーカーのCD36及びCD235aは、13日以降に弱く発現していた。15日~20日にかけて、hEBは、試験された造血及び赤血球系マーカー:CD45、CD34、CD71、CD36及びCD235aを顕著に発現していた。一方、CFCの数は15日で僅かにピークとなるが低調を維持し、これは、hEBのコロニー形成能力が低いことを示す。これらの結果から、赤血球系列への分化は、培養15~20日のhEBを使用して行われた。2.3.hEBのcRBCへの分化成熟cRBC作製プロトコール発明者らは、10ヒト血漿及び、SCF、IL3及びEpoをベースとする進化したサイトカインのカクテルが存在する液体培地中で培養する工程からなる、単純且つ最適な培養条件を開発した。15日目以降の最後の相において、造血を支持することが知られている3つの異なるストローマ:マウス由来MS5、ヒト由来マクロファージ及び間葉系幹細胞と、ストローマフリー条件の、除核に対する影響が試験された。培養15日~20日のhEBが解離され、再懸濁され、赤芽球の分化成熟用の液体培養プロトコールに従い培養された。一日目、非接着及び接着の2種類の細胞が区別でき、それぞれ全細胞の10及び90を占める。これらの2種類の細胞は、同じプロトコールを使用して並行して培養された。赤血球の成熟は、MGG染色後の細胞の形態、及びフローサイトメトリーにより決定される赤血球系膜抗原の発現に従い、通常評価された。2.4.15日目又は20日目から開始する成熟除核cRBCの生産培養15日目又は20日目のhEBの赤血球系コミットメントは、液体培養後4日で終了し、95を超える赤め球が生産された。最終分化成熟は漸進的に達成され、11日目で除核細胞は3±2であったのが、15日目で17±4、18日目で31±8、そして21日目で48±9であった。25日目の培養終了時点で、58±2が完全に除核されたRBCであった。除核のレベルは、培養された細胞、培養条件、又はストローマの性状に拘らず全く同等であった。培養15日目又は20日目のhEBから作製した赤血球系細胞はcRBCを生産することが出来、除核窓細胞と呼ばれた。これらの液体培養相の過程での唯一の顕著な相異は、NA細胞の増幅がAD細胞よりも顕著であったことである。。故に、106個のhEB由来の細胞から出発して、144x106個、又は82x106個のcRBCが生産された。25.EWCから生産されたcRBCの解析成熟cRBCの膜マーカー生産されたcRBCの膜抗原のフローサイトメトリー解析を、それらの成熟の程度を試験するために行った。培養の終了時点で、全てのcRBCは、CD235a及びCD71を強力に発現していた。CD36の発現は細胞の成熟の進行に伴い低下し、一方、RhD抗原の発現は80以上の細胞で亢進が認められ、cRBCの膜が高いレベルで成熟していることが確認された。cRBCのサイズ液体培養の終わりの25日目に、顕微鏡でcRBCのサイズを測定し、そして末梢血から採取したコントロール成人RBCと比較した。ストローマを用に培養したもの、又はMS5細胞、MSC又はマクロファージ上で共培養した後のものにおいて、cRBCのサイズは同等であり、平均の直径は10μmであった。2.7.cRBCのヘモグロビンの解析cRBCにより合成されたヘモグロビンの種類を解析するため、逆相HPLC及び質量分析を、HPLCによるテトラマーヘモグロビンの同定と組み合わせて、グロビン鎖の試験を行った。RPLC及び質量分析によるcRBC中のグロビン鎖の同定及び定量RPLCによるグロビン鎖の分離により、cRBCのヘモグロビン生産の定量が可能となった:βは1~5、γGは19~29、αは36~43、そしてγAは11~21であった。異なる実験において強度が異なる2つの追加のピークも観察され、それらは胚性の鎖であるε及びζに対応した。ゆえに、胎性の鎖の相当に支配的な合成が認められ、成体の鎖の生産は僅かで、そして胚性の鎖の合成は変動的で10未満、約40がα鎖であった。これらの結果は、RPLCにより溶出したフラクションの質量分析による同定により確認され、臍帯血由来CD34HSC由来のcRBCで取得されるデータと同一であった。CEHPLCにより合成されたヘモグロビンの研究CEHPLCによるテトラマーHbの解析は、HbAが25でHbFが74~80であることを示し、このプロフィールは、臍帯血由来CD34HSC由来のcRBCで取得されるデータと重ね合わせられなかった。これらの結果は、RPLC及び質量分析を使用した当方の知見と一致しており、hESC由来のcRBC中では、最初にテトラマー型の胎性ヘモグロビンが合成されることが実証される。2.8.cRBCヘモグロビンの機能性cRBCヘモグロビンの機能は、閃光光分解後のリガンド結合キネティクスにより評価された。COの光解離後の2つの分子のキネティクスは、ヘモグロビンの機能の敏感な探り針を提供する。故に、2つのヘモグロビンのリガンド結合における第4の状態に対応する2つの相が観察された。早い要素はR状態のテトラマーから生じ、遅い要素はT状態のテトラマーから生じる。高いレベルの光解離において、主要なヘモグロビンは1つ又は2つのリガンドが結合したもので、一方、低いレベルでは、主要なヘモグロビンは、3つのCOがリガンド結合したものである。故に、部分的にリガンド結合した異なるヘモグロビンにおけるアロステリック平衡は、光解離レベルを変化させることにより探られる。正常なHbAのRからTへの遷移は、第二のリガンドのHbテトラマーへの結合の後に起こる。IHP等のアロステリックエフェクターの存在下、切り替えのポイントは後に生じ、内在性のRおよびTの親和性も低下する。cRBC由来のヘモグロビンのCO再結合のキネティクスは、cRBC中の大量のHbFの存在を示したHPLC解析の結果から予想されたように、胎性の血液のサンプルとは殆ど一致しなかった。IHPの添加後、RからTへの遷移は、胎性の血液と同等の程度まで、低親和性のテトラマーに代替された。故に、当該CO閃光光分解実験により、cRBC中のHbFが、生理的条件下だけでなく、強力なアロステリックエフェクターに応答しても動作することが確認された。"