"明細書中に記載の発明。このように、溶骨性骨転移をはじめとする骨溶解または癌転移を予防または処置するための新規薬剤および方法の特定が、当該技術分野において必要とされている。発明の要旨本発明の材料および方法は、当該技術分野における上述および他の要求を満たすものである。本発明は例えば、以下の項目を提供する。項目1非マウスモノクローナル抗体であって、該抗体は、75より多くM-CSFに結合することでモノクローナル抗体RX1と競合し、ここで、該モノクローナル抗体RX1は、配列番号2および4にそれぞれ記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む、非マウス抗体。項目2項目1に記載の抗体であって、該抗体は、モノクローナル抗体RX1と同じM-CSFのエピトープに特異的に結合し、ここで、該モノクローナル抗体RX1は、配列番号2および4にそれぞれ記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を含む、抗体。項目3配列番号120または121の少なくとも4つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープに結合する、項目2に記載の抗体。項目4配列番号120または121を含むM-CSFのエピトープに結合する、項目2に記載の抗体。項目5モノクローナル抗体である、項目1~4のいずれか1項に記載の抗体。項目6キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト遺伝子操作抗体、ヒト抗体、または単鎖抗体である、項目1~4のいずれか1項に記載の抗体。項目7IgG抗体である、項目1~6のいずれか1項に記載の抗体。項目8Fabフラグメント、Fab’2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖Fvフラグメントである、項目1~4のいずれか1項に記載の抗体。項目9少なくとも10-7Mまたはそれより高い、配列番号9のM-CSFに対する親和性Kd解離平衡定数を保持する、項目1~8のいずれか1項に記載の抗体。項目10少なくとも10-8Mまたはそれより高い、配列番号9のM-CSFに対する親和性Kdを保持する、項目9に記載の抗体。項目11少なくとも10-9Mまたはそれより高い、配列番号9のM-CSFに対する親和性Kdを保持する、項目10に記載の抗体。項目12配列番号24と90同一のアミノ酸配列を含む、項目1~11のいずれか1項に記載の抗体。項目13配列番号24を含む、項目11に記載の抗体。項目14配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも1つを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目15配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも2つを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目16配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも3つを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目17配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも4つを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目18配列番号18、21、24、29、32および36のうちの少なくとも5つを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目19配列番号18、21、24、29、32および36の全てを含む、項目1~13のいずれか1項に記載の抗体。項目20配列番号16、19、22、27、30および34のうちの1つ以上をさらに含む、項目11~18のいずれか1項に記載の抗体。項目21配列番号17、20、23、28、31および35のうちの1つ以上をさらに含む、項目11~18のいずれか1項に記載の抗体。項目22配列番号18、21、25、29、32および37のうちの1つ以上をさらに含む、項目11~18のいずれか1項に記載の抗体。項目23配列番号18、21、26、29、33および38に記載の1つ以上のコンセンサスCDRをさらに含む、項目11~18のいずれか1項に記載の抗体。項目24CDRの中の少なくとも1つのアミノ酸が、別の抗MCSF抗体の対応するCDRの対応する残基によって置換されている、項目11~23のいずれか1項に記載の抗体。項目25配列番号4に記載のアミノ酸配列と少なくとも65相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目11~24のいずれか1項に記載の抗体。項目26配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも65相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目11~25のいずれか1項に記載の抗体。項目27ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の1つ以上のHおよび軽鎖可変フレームワーク領域を含む、項目1~26のいずれか1項に記載の抗体。項目28前記ヒト抗体配列が、個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系配列、またはヒトコンセンサス生殖細胞系配列である、項目27に記載の抗体。項目29IgG1定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の抗体。項目30抗体依存性細胞毒性活性または補体依存性細胞毒活性を減少させるIgG1定常領域における変異を含む、項目29に記載の抗体。項目31IgG4定常領域のフラグメントを含む、項目27に記載の抗体。項目32半抗体の形成を減少させるIgG4定常領域における変異を含む、項目31に記載の抗体。項目33アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目34アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目35アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目36アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目37アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目38アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目39アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目40アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目41アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目42アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目43アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目44アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目45アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目46アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目47Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸と同じである、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目48Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸の保存的置換である、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目49Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、配列番号2または4における対応する同じ位置のアミノ酸の非保存的置換である、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目50Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、ヒト抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目51Kabatの番号付けを使用して、少なくとも1つのXが、ヒトコンセンサス抗体配列内の対応する同じ位置のアミノ酸である、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目52前記ヒト抗体配列が、ヒトコンセンサス配列、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはKabatにおけるヒト抗体配列のいずれか1つである、項目50に記載の抗体。項目53配列番号114、116または119に記載の重鎖配列のいずれか1つを含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目54配列番号41または43に記載の重鎖可変領域配列のいずれか1つを含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目55配列番号45、47、48、51、53または136に記載の軽鎖配列のいずれか1つを含む、項目1~32のいずれか1項に記載の抗体。項目56配列番号114に記載の重鎖配列および配列番号47に記載の軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。項目57配列番号116に記載の重鎖配列および配列番号47に記載軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。項目58配列番号119に記載の重鎖配列および配列番号47に記載の軽鎖配列を含む、項目1に記載の抗体。項目59配列番号41または43に記載の可変重鎖アミノ酸配列と少なくとも65同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目60配列番号41または43に記載の可変重鎖アミノ酸配列と少なくとも80同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む、項目59に記載の抗体。項目61配列番号45、47、48、51または53に記載の可変軽鎖アミノ酸配列と少なくとも65同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目33~46のいずれか1項に記載の抗体。項目62配列番号45、47、48、51または53に記載の可変軽鎖アミノ酸配列と少なくとも80同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む、項目61に記載の抗体。項目63項目33~38、53または59~60のいずれか1項に記載の重鎖および項目39~46、54または61~62のいずれか1項に記載の軽鎖を含む、抗体。項目64少なくとも10-7の親和性Kdを有する、項目12~63のいずれか1項に記載の抗体。項目65少なくとも10-9の親和性Kdを有する、項目64に記載の抗体。項目66項目1~65のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む、単離核酸。項目67配列番号1または配列番号40もしくは42に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも65同一である重鎖核酸配列を含む、項目66に記載の単離核酸。項目68配列番号1または配列番号40もしくは42に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも80同一である重鎖核酸配列を含む、項目67に記載の単離核酸。項目69配列番号3または配列番号44、46、52、135もしくは137に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも65同一である軽鎖核酸配列を含む、項目66に記載の単離核酸。項目70配列番号3または配列番号44、46、52、135もしくは137に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも80同一である軽鎖核酸配列を含む、項目69に記載の単離核酸。項目71項目66~70のいずれか1項に記載の単離核酸を含む、ベクター。項目72前記単離核酸が、調節コントロール配列に作動可能に連結されている、項目71に記載のベクター。項目73項目72に記載のベクターまたは項目66~70のいずれか1項に記載の核酸を含む、宿主細胞。項目74項目1~65のいずれか1項に記載の抗体を産生する方法であって、該方法は、前記単離核酸が発現されて該抗体を生産するように項目73に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。項目75前記宿主細胞培養物から前記抗体を回収する工程をさらに包含する、項目74に記載の方法。項目76項目75に記載の方法によって産生される、単離抗体。項目77項目1~5のいずれか1項に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマまたは宿主細胞。項目78毒素に結合体化している、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体。項目79項目1~65または76に記載の抗体のいずれか1つおよび薬学的に適切なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物。項目80第二の治療薬をさらに含む、項目79に記載の薬学的組成物。項目81前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目80に記載の薬学的組成物。項目82前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目80に記載の薬学的組成物。項目83前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目82に記載の薬学的組成物。項目84前記第二の治療薬が、別の抗体である、項目80に記載の薬学的組成物。項目85骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を予防するために、項目1~41または50のいずれか1項に記載のM-CSFに結合する抗体であって、該抗体は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。項目86骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置するために、項目1~65または76のいずれか1項に記載のM-CSFに結合する抗体であって、該抗体は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる、抗体。項目87前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目86に記載の抗体。項目88骨転移癌を予防または処置するために、M-CSFに結合する項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体であって、該転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである、抗体。項目89骨損失を予防または低減するする方法であって、該方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、該疾病に関連する骨損失を予防または低減するために有効な量で、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。項目90骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を治療する処置であって、該方法は、該疾病に関連する骨損失の重篤度を低減させるために有効な量で、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。項目91前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目89または90に記載の方法。項目92骨への転移癌を予防または処置する方法であって、該方法は、転移癌に罹患している被験体に、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。項目93前記転移癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである、項目92に記載の方法。項目94癌を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を、その必要がある被験体に投与する工程を包含する、方法。項目95第二の治療薬を投与する工程をさらに包含する、項目89~94のいずれか1項に記載の方法。項目96前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目95に記載の方法。項目97前記第二の治療薬が、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目95に記載の方法。項目98前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目95に記載の方法。項目99前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目98に記載の方法。項目100前記被験体が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目98または99に記載の方法。項目101前記抗体が、治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効である、項目95~100のいずれか1項に記載の方法。項目102前記被験体が、哺乳動物である、項目89~101のいずれか1項に記載の方法。項目103前記抗体が、腫瘍細胞により誘導される破骨細胞増殖および/または分化の抑制に有効な量で投与される、項目89~101のいずれか1項に記載の方法。項目104前記抗体が、約2μg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量で投与される、項目89~103のいずれか1項に記載の方法。項目105前記抗体が、約0.1mg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量で投与される、項目104に記載の方法。項目106前記抗体が、約0.1mg/kg体重~10mg/kg体重の間の用量で投与される、項目105に記載の方法。項目107骨溶解を示している患者において骨損失を予防または低減するための医薬の製造における、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。項目108骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。項目109前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目108に記載の使用。項目110転移癌を罹患している患者において骨転移癌を処置または予防するための医薬の製造における、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。項目111前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである、項目110に記載の使用。項目112癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造における、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体の使用。項目113前記医薬が、第二の治療薬を使用する処置と合わせられる、項目107~112のいずれか1項に記載の使用。項目114前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目113に記載の使用。項目115前記第二の治療薬が、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目113に記載の使用。項目116前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目113に記載の使用。項目117前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目116に記載の使用。項目118前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目116または117に記載の使用。項目119前記患者が、前記第二の治療薬での前処置を受けている、項目107~112のいずれか1項に記載の使用。項目120前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目119に記載の使用。項目121前記第二の治療薬が、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目119に記載の使用。項目122前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目119に記載の使用。項目123前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目122に記載の使用。項目124前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目122または123に記載の使用。項目125骨溶解を示す患者を処置するための医薬を調製するための、項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体の相乗的組合せの使用であって、ここで、該医薬は、第二の治療薬を使用する処置と合わせられる、使用。項目126前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目125に記載の使用。項目127前記第二の治療薬が、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目125に記載の使用。項目128前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目125に記載の使用。項目129前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目125に記載の使用。項目130前記患者が、ビスホスホネート処置の受容から除外される、項目128または129に記載の使用。項目131前記医薬中の抗体の量が、治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量である、項目113~130のいずれか1項に記載の使用。項目132前記医薬中の抗体の量が、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化を阻害するために有効である、項目107~139のいずれか1項に記載の使用。項目133前記医薬中の抗体の量が、約2μg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量である、項目89~103のいずれか1項に記載の使用。項目134前記医薬中の抗体の量が、約0.1mg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量である、項目104に記載の使用。項目135前記医薬中の抗体の量が、約0.1mg/kg体重~10mg/kg体重の間の用量である、項目105に記載の使用。項目136キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨損失を予防または低減するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。項目137キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者に対する該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。項目138前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病を包含する、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、項目137に記載のキット。項目139キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして骨転移癌を予防または処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。項目140前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである、項目139に記載のキット。項目141キットであって、該キットは、バイアルまたは瓶のような容器にパッケージされた、治療有効量の項目1~65または76のいずれか1項に記載の抗体を備え、そして該容器に貼り付けられるか、または該容器に共にパッケージされたラベルをさらに備え、該ラベルは、該容器の内容物を表示し、そして癌を処置するための該容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供する、キット。項目142第二の治療薬をさらに備える、項目136~141のいずれか1項に記載のキット。項目143前記第二の治療薬が、癌化学療法薬である、項目142に記載のキット。項目144前記第二の治療薬が、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである、項目142に記載のキット。項目145前記第二の治療薬が、ビスホスホネートである、項目142に記載のキット。項目146前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである、項目145に記載のキット。項目147ビスホスホネート処置の受容から除外される患者を処置するための説示を備える、項目136~146のいずれかに記載のキット。項目148治療効果を達成するために必要とされる第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量の抗体を備える、項目136~147のいずれか1項に記載のキット。項目149相乗的用量の抗体を備える、項目136~147のいずれか1項に記載のキット。項目150腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化を阻害するために有効な用量の抗体を備える、項目136~147のいずれか1項に記載のキット。項目151約2μg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目136~147のいずれか1項に記載のキット。項目152約0.1mg/kg体重~30mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目151に記載のキット。項目153約0.1mg/kg体重~10mg/kg体重の間の用量の抗体を備える、項目152に記載のキット。項目154M-CSF特異的抗体についてのスクリーニング方法であって、該方法は、a転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補抗体を接触させる工程;b破骨細胞の形成、増殖および/または分化を検出する工程;ならびにc破骨の細胞形成、増殖および/または分化の減少が検出された場合に、該候補抗体をM-CSF特異的抗体と同定する工程を包含する、方法。項目155前記転移性腫瘍細胞培地が、腫瘍細胞を含む、項目154に記載のスクリーニング方法。項目156前記接触させる工程aがインビボで行われ、前記検出する工程bが、骨転移のサイズおよび/または数を検出する工程を包含し、そして前記候補抗体が、骨転移のサイズおよび/または数の減少が観察された場合にM-CSF特異的抗体として同定される、項目154に記載のスクリーニング方法。項目157前記候補抗体が、M-CSFに結合するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目154~156に記載のスクリーニング方法。項目158前記候補抗体が、M-CSFとそのレセプターM-CSFRとの間の相互作用を阻害するかどうかを決定する工程をさらに包含する、項目154~157に記載のスクリーニング方法。項目159骨転移癌を予防または処置し得るM-CSF特異的抗体を同定する方法であって、該方法は、a配列番号120または121の少なくとも4つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープに対する候補抗体の結合を検出する工程;およびb骨転移癌を予防または処置する該候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程を包含する、方法。項目160アミノ酸配列において、いずれかのXを変更する工程、および該変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、配列番号120または121の少なくとも4つの連続するアミノ酸を含むM-CSFのエピトープに対する結合について試験する工程を包含して例供される、配列番号2に記載の重鎖アミノ酸配列の60までを系統的に変更する方法。項目161アミノ酸配列において、いずれかのXを変更する工程、および該変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、配列番号120または121の少なくとも4つの連続するアミノ酸を含むM-CSFのエピトープに対する結合について試験する工程を包含して例供される、配列番号4に記載の軽鎖アミノ酸配列の60までを系統的に変更する方法。本発明の一つの実施形態において、図4、14および15に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有するマウスモノクローナル抗体RX1、MC1またはMC3のうちのいずれか1つと同じM-CSFのエピトープに特異的に結合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体を提供する。関連実施形態において、ポリクローナル抗体;HumanEngineeredTM抗体をはじめとするモノクローナル抗体;ヒト化抗体;ヒト抗体;キメラ抗体;Fab、Fab’2、Fv、ScFvもしくはSCA抗体フラグメント;ダイアボディdiabody;線状抗体linearantibodyまたはこれらの抗体のうちのいずれか1つの突然変異タンパク質からなる群より選択される、好ましくは少なくとも10-7、10-8もしくは10-9またはそれ以上の結合親和性を保持する上述の抗体を提供する。図4に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体RX1、MC1および/またはMC3と、75より多くM-CSFに結合することで競合する、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体も考えられる。別の実施形態において、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体であって、図12のアミノ酸98~105の少なくとも4、5、6、7または8つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープと結合する非マウスモノクローナル抗体またはその機能フラグメントを提供する。別の実施形態において、本発明は、機能フラグメントを含む非マウスモノクローナル抗体であって、図12のアミノ酸65~73または138~144の少なくとも4、5、6、7または8つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープ5H4またはMC3によって認識されるM-CSFエピトープに相当すると結合する非マウスモノクローナル抗体またはその機能フラグメントを提供する。さらに別の実施形態において、図12のアミノ酸98~105を含むM-CSFのエピトープと結合する上述の抗体またはフラグメントを提供する。関連実施形態において、図4AのCDR3を含む上述の抗体を提供する。別の実施形態において、図4Aに記載のマウス抗体RX1の少なくとも1、2、3、4、5または6つのCDRを含む抗体を提供する。マウス抗体RX1の少なくとも1、2、3、4または5つのCDRを含むそうした抗体は、図16A~Bに記載の抗体5H4の6つのCDRのいずれかのうち少なくとも1、2、3、4または5つのCDRも含むこともできる。あるいは、マウス抗体RX1の少なくとも1、2、3、4または5つのCDRを含む抗体は、図16A~Bに記載の抗体MC1の6つのCDRのいずれかのうち少なくとも1、2、3、4または5つのCDRも含むこともできる。さらに別の代替では、上述の抗体は、図16A~Bに記載の抗体MC3の6つのCDRのいずれかのうち少なくとも1、2、3、4または5つのCDRも含むこともできる。関連実施形態において、図16A~Bに記載のコンセンサスCDRセットのうち少なくとも1、2、3、4または5つのCDRを含むことができる、マウス抗体RX1の少なくとも1、2、3、4または5つのCDRを含む抗体を提供する。さらにもう一つの関連実施形態では、上述の抗体におけるコンセンサスCDRの1つ以上の残基が、抗体マウスRX1、5H4、MC1またはMC3のCDRのいずれかの対応する残基により置換されている。その抗体におけるアミノ酸の1つ以上が、例えばCDRにおける保存的置換ならびに/または低および中リスク残基における保存的もしくは非保存的変更による突然変異を受けていたとしても、所望の結合親和性は保持され得る。本発明の別の実施形態において、図4A、13、14または15に記載のアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む上述の抗体の変異体を提供する。関連実施形態において、図4A、13、14または15に記載のアミノ酸配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を提供する。さらに別の実施形態において、本抗体は、ヒト抗体配列の定常領域および1つ以上の重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域を含む。関連実施形態において、本抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の修飾または非修飾定常領域を含む。好ましい実施形態において、この定常領域は、一定の特性を強化または低下させるように場合によっては修飾されていることがあるヒトIgG1またはIgG4である。IgG1の場合、定常領域、特にヒンジまたはCH2領域に対する修飾により、ADCCおよび/またはCDC活性をはじめとするエフェクター機能を増加または低下させることができる。他の実施形態では、IgG2定常領域を修飾して、抗体-抗原凝集体形成を減少させる。IgG4の場合、定常領域、特にヒンジ領域に対する修飾により、半抗体の形成を減少させることができる。本発明のさらにもうひとつの実施形態において、上述の抗体は、ヒトコンセンサス配列の一部、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはKabat,NCBIIgBlast,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi、KabatDatabasehttp://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html、FTPsiteforKabatRelease5.01992ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/、ImMunoGeneTicsdatabaseMontpellierFrancehttp://imgt.cnusc.fr:8104/、V-Basehttp://www:mrc-cpe.cam.ac.uk/LIST.phpmenu=901、ZurichUniversityhttp://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html、TheTherapeuticAntibodyHumanHomologyProjectTAHHPhttp://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html、ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyDomainshttp://how.to/AnalyseAntibodies/、Humanizationbydesignhttp://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/、AntibodyResourceshttp://www.antibodyresource.com/educational.html、AntibodyEngineeringbyTTWu,HumanaPressにおけるヒト抗体配列のうちのいずれか1つに由来するもしくは基づくものであるか、それを含有する。本発明の好ましい局面において、上述の抗体は、HumanEngineeredTM抗体である。例えば、HumanEngineeredTM抗体配列は、図23~24に記載の配列のいずれか1つである。他のHumanEngineeredTM抗体またはそれらの変異体が、考えられる。例えば、一つの実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、上述のRX1に基づく抗体を提供する。関連実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、重鎖可変領域が、アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。本発明の別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、抗体を提供する。本発明の別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列この場合、Xは、任意のアミノ酸であるを含む、抗体を提供する。さらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列を含む、上述の抗体を提供する。別の実施形態において、軽鎖可変領域が、アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。本発明の別の実施形態において、少なくとも1つのXが、図4Aに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸である、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、少なくとも1つのXが、図4Aに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的置換表1のとおりである、抗体を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、少なくとも1つのXが、図4Aに記載のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸の非保存的置換表1のとおりである、抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、少なくとも1つのXが、ヒト抗体配列内の対応するアミノ酸である、抗体を提供する。上述のHumanEngineeredTM抗体は、ヒト抗体コンセンサス配列の一部、ヒト生殖細胞系配列、ヒトコンセンサス生殖細胞系配列、またはKabat,NCBIIgBlast,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/showGermline.cgi、KabatDatabasehttp://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html、FTPsiteforKabatRelease5.01992ftp://ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat/Rel5.0/、ImMunoGeneTicsdatabaseMontpellierFrancehttp://imgt.cnusc.fr:8104/、V-Basehttp://www:mrc-cpe.cam.ac.uk/LIST.phpmenu=901、ZurichUniversityhttp://www.unizh.ch/~antibody/Sequences/index.html、TheTherapeuticAntibodyHumanHomologyProjectTAHHPhttp://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html、ProteinSequenceandStructureAnalysisofAntibodyDomainshttp://how.to/AnalyseAntibodies/、Humanizationbydesignhttp://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/、AntibodyResourceshttp://www.antibodyresource.com/educational.html、AntibodyEngineeringbyTTWu,HumanaPressにおけるヒト抗体配列のうちのいずれか1つに由来するもしくは基づくものであるか、それを含有する。本発明の別の実施形態において、HumanEngineeredTM抗体配列が、図23~24または29~30に示す配列のうちの一つである、上述の抗体を提供する。別の実施形態において、本抗体は、図19Bに記載の重鎖アミノ酸配列の1つと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本抗体は、図20B~22Bのいずれか1項に記載の軽鎖アミノ酸配列の1つと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、図24C~24Eのうちの1つに記載する配列を有する上述の抗体、例えば5H4、MC1またはMC3抗体は、低、中または高リスク残基を特定するために図24C~24Eに記載のKabatの番号付けを使用し、Studnickaらの米国特許第5,766,886号および本明細書の実施例4Aに記載の方法に従って、HumanEngineeredTMされる。関連実施形態において、重鎖もしくは軽鎖のいずれかまたは両方の全ての低リスク残基が、必要に応じてヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように修飾される、上述の抗体を提供する。同様に、本発明のもう一つの実施形態は、重鎖もしくは軽鎖のいずれかまたは両方の全ての低中リスク残基が、必要に応じてヒト標準免疫グロブリン配列と同じ配列になるように修飾される、上述の抗体を提供する。全ての低リスク残基が修飾されている重鎖を、全ての低および中リスク残基が修飾されている軽鎖と組み合わせることができ、その逆も可能である。同様に、上述のHumanEngineeredTM軽鎖または重鎖を、ヒト化抗体またはキメラ抗体の軽鎖または重鎖と組み合わせることができる。さらに別の実施形態において、本抗体は、Studnicka法に従ってHumanEngineeredTMしたすぐ上に記載の重鎖アミノ酸配列のうちの1つと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、本抗体は、Studnicka法に従ってHumanEngineeredTMしたすぐ上に記載の軽鎖アミノ酸配列のうちの1つと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、上に記載したような重鎖および上に記載したような軽鎖を含む抗体を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体は、少なくとも10[-7]の親和性Kdを有する。関連実施形態において、この抗体は、少なくとも10[-9]の親和性Kdを有する。本発明の別の実施形態において、ポリクローナル抗体;HumanEngineeredTM抗体をはじめとするモノクローナル抗体;ヒト化抗体;ヒト抗体;キメラ抗体;Fab、Fab’2、Fv、ScFvもしくはSCA抗体フラグメント;ダイアボディ;線状抗体linearantibody;またはこれらの抗体のうちのいずれか1つの突然変異タンパク質である上述の抗体を提供する。関連実施形態において、前記モノクローナル抗体は、単離抗体である。本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体の軽鎖をコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。関連実施形態において、前記単離核酸は、図4A、13、14または15に記載の重鎖ヌクレオチド配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である重鎖核酸配列を含む。さらにもう一つの関連実施形態において、前記単離核酸は、図4A、13、14または15に記載の軽鎖ヌクレオチド配列と少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99同一である軽鎖核酸配列を含む。別の実施形態において、上述の単離核酸を含むベクターを提供する。関連実施形態において、単離核酸が、調節コントロール配列に作動可能に連結されている、上述のベクターを提供する。さらに別の実施形態において、上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明では多数の方法が考えられる。例えば、単離核酸を発現して抗体を生産するように上述の宿主細胞を培養することを含む、上述の抗体の生産方法を提供する。関連実施形態において、本方法は、その宿主細胞培養物から抗体を回収する工程をさらに含む。関連実施形態において、上述の方法により生産された単離抗体を提供する。本発明は、上述の抗体を分泌するハイブリドーマも提供する。加えて、毒素に結合体化している上述の抗体を提供する。本発明の別の実施形態において、上述の抗体のいずれか1つおよび薬学的に適切なキャリア、賦形剤または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。関連実施形態において、前記薬学的組成物は、第二の治療薬をさらに含む。さらにもう一つの関連実施形態において、前記第二の治療薬が癌化学療法薬である薬学的組成物を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記第二の治療薬がビスホスホネートである薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、前記第二の治療薬は、別の抗体である。本発明の抗体は、疾病および疾患の処置のために多数の望ましい特性を有すると考えられる。本発明の一つの実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を予防するための、M-CSFに結合する上述の抗体のうちの一つであって、前記疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる抗体を提供する。同様に、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置するための、M-CSFに結合する上述の抗体のうちの一つであって、前記疾病に関連する骨損失の重篤度を有効に低下させる抗体を提供する。多数の疾病および疾患が、本発明の抗体に基づく処置の対象となると考えられる。本発明の一つの実施形態において、前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常、慢性肝疾患肝性骨形成異常、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の抗体を提供する。関連実施形態において、骨転移癌を予防または処置するための、M-CSFに結合する抗体であって、前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病またはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌または子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;ならびに皮膚癌悪性黒色腫または扁平上皮癌を含むである、上述の抗体を提供する。本発明の別の実施形態において、転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補抗体を接触させる工程;破骨細胞形成、増殖および/または分化を検出する工程;ならびに破骨細胞形成、増殖および/または分化の減少が検出された場合に前記候補抗体をM-CSF特異的抗体と特定する工程を含む、M-CSF特異的抗体のスクリーニング方法を提供する。同様に、前記転移性腫瘍細胞培地が腫瘍細胞を含む、上述の方法を提供する。別の実施形態において、前記接触工程aがインビボで行われ、前記検出工程bが、骨転移のサイズおよび/または数の検出を含み、ならびに前記候補抗体が、骨転移のサイズおよび/または数の減少が観察された場合にM-CSF特異的抗体と特定される、上述のスクリーニング方法を提供する。関連実施形態において、前記候補抗体が、M-CSFに結合するかどうかを判定する工程をさらに含む、上述の方法を提供する。同様に、本発明のもう一つの実施形態は、前記候補抗体が、M-CSFとそのレセプターM-CSFRの間の相互作用を阻害するかどうかを判定する工程をさらに含む、上述の方法を提供する。本発明の別の実施形態において、a図12のアミノ酸98~105のうちの少なくとも4つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープに対する候補抗体の結合を検出する工程;およびb骨転移癌を予防または処置する前記候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程を含む、骨転移癌を予防または処置することができるM-CSF特異的抗体を特定する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、a図12のアミノ酸65~73または138~144のうちの少なくとも4つの連続する残基を含むM-CSFのエピトープ5H4またはMC3により認識されるM-CSFエピトープに対応するに対する候補抗体の結合を検出する工程;およびb骨転移癌を予防または処置する前記候補抗体の能力をインビトロまたはインビボでアッセイする工程を含む、骨転移癌を予防または処置することができるM-CSF特異的抗体を特定する方法を提供する。本発明の別の実施形態において、図12のアミノ酸98~105を含むM-CSFのエピトープと結合する抗体のCDRを変更する方法を提供し、この方法は、図4Aに記載のアミノ酸配列のCDR内のアミノ酸を変更すること、および少なくとも10[-7]の親和性KaでM-CSFと結合する抗体を選択することを含む。別の実施形態において、図4Aに記載の重鎖アミノ酸配列の60以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列内のX1~X52のいずれかを変更すること、およびその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図12のアミノ酸98~105を含むM-CSFのエピトープに対する結合について検査することを含む。関連実施形態において、図4Aに記載の軽鎖アミノ酸配列の60以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、アミノ酸配列内のX1~X52のいずれかを変更すること、およびその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図12のアミノ酸98~105を含むM-CSFのエピトープに対する結合について検査することを含む。さらに別の実施形態において、図12のアミノ酸65~73または138~144を含むM-CSFのエピトープ5H4またはMC3により認識されるM-CSFエピトープに対応すると結合する抗体のCDRを変更する方法を提供し、この方法は、図13、14および15に記載のアミノ酸配列のCDR内のアミノ酸を変更すること、および少なくとも10[-7]の親和性KaでM-CSFと結合する抗体を選択することを含む。別の実施形態において、図13、14および15のうちの1つに記載する重鎖アミノ酸配列の60以下を系統的に変更する方法を提供し、この方法は、Studnickaらの米国特許第5,766,886号および本明細書の実施例4Aに記載の方法に従って、および図24C~24Eに記載のKabatの番号付けに従って上述の配列を変更すること、ならびにその変更されたアミノ酸配列を含む抗体を、図12のアミノ酸65~73または138~144を含むM-CSFのエピトープ5H4またはMC3により認識されるM-CSFエピトープに対応するに対する結合について検査することを含む。関連実施形態では、全ての低リスク残基を修飾する。同様に、本発明のもう一つの実施形態では、全ての低および中リスク残基を修飾する。さらにもう一つの実施形態では、プロリンを除く全ての低および中リスク残基を修飾する。本発明の別の実施形態において、上述のプロセスにより設計されたCDRを有する抗体を発現する方法を提供する。別の実施形態において、MCSFと結合する抗体であって、上述の方法を使用して作られる抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、骨損失の予防または低減方法を提供し、この方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか1つを投与すること、それによって前記疾病に関連する骨損失を予防または低減することを含む。関連実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置する方法を提供し、この方法は、前記被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか1つを投与すること、それによって前記疾病に関連した骨損失の重篤度を低下させることを含む。関連実施形態において、前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常、慢性肝疾患肝性骨形成異常、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の方法を提供する。さらに別の実施形態において、骨転移癌を予防または処置する方法を提供し、この方法は、転移癌に罹患している被験体に、治療有効量の上述の抗体のいずれか1つを投与することを含む。関連実施形態において、前記転移癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌、胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである方法を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、骨損失および腫瘍成長を予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の上述の抗体のいずれか1つをその必要がある被験体に投与することを含む。関連実施形態において、前記方法は、第二の治療薬の投与をさらに含む。さらに別の実施形態において、前記第二の治療薬が、癌化学療法薬またはビスホスホネートである方法を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記ビスホスホネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである方法を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記治療薬が細胞毒性化学療法薬である、上述の方法を提供する。別の実施形態において、前記被験体が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする、上述の方法を提供する。さらにもう一つの関連実施形態において、前記抗体が、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効である、上述の方法を提供する。別の実施形態において、前記第二の治療薬は、非M-CSFコロニー刺激因子、例えばG-CSF、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプターである。本発明の別の実施形態において、前記被験体が哺乳動物である、上述の方法を提供する。関連実施形態において、前記哺乳動物は、ヒトである。別の実施形態において、前記抗体が、M-CSFとそのレセプターM-CSFRの間の相互作用を阻害する、上述の方法を提供する。もう一つの関連実施形態において、前記抗体は、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化を抑制する。さらに別の実施形態において、前記抗体が、約2μg/kg体重~30mg/kgの間、0.1mg/kg~30mg/kgの間または0.1mg/kgから10mg/kgの間の用量で投与される、上述の方法を提供する。本発明の別の実施形態において、骨溶解の症状を示している患者において骨損失を予防または低減するための医薬の製造、ならびに骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者を処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択される、上述の使用がさらに考えられる。別の実施形態において、転移癌に罹患している患者において骨転移癌を予防または処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。関連実施形態において、前記転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである。さらに別の実施形態において、癌に罹患している患者を処置するための医薬の製造における本発明の抗体の使用が考えられる。上述の使用のいずれかにおいて、前記医薬と、第二の治療薬を使用する処置とを協調させる。関連実施形態において、前記第二の治療薬は、化学療法薬である。関連実施形態において、前記第二の治療薬は、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。本発明のさらに別の実施形態において、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする、および/または前記患者が、前記第二の治療薬での前処置を受けている、上述の使用が考えられる。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプター、またはビスホスホネートである。さらにもう一つの関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらにもう一つの関連実施形態では、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする。本発明の別の実施形態において、骨溶解の症状を示している患者を処置するための医薬であり、第二の治療薬を使用する処置と協調させる医薬を調製するための、本発明の抗体の相乗的組合せの使用が考えられる。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらにもう一つの関連実施形態において、前記患者が、ビスホスホネート処置を受けられないようにする。前記医薬中の抗体の量が、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量でのものである、上述の使用のいずれかの実施形態が考えら得る。癌に関連する骨損失に関連する上述の実施形態のいずれかにおいて、前記医薬中の抗体の量は、好ましくは、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化の抑制に有効である。上述の医薬のいずれかにおける抗体の量は、約2μg/kg体重~30mg/kgの間であり得る。関連実施形態において、前記医薬中の抗体の量は、約0.1mg/kg体重~30mg/kgの間の用量でのものである。さらに別の実施形態において、前記医薬中の抗体の量は、約0.1mg/kg体重~10mg/kgの間の用量でのものである。本発明は、キットも考えている。一つの実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル前記容器の内容物を表示し、骨損失を予防または低減するための前記容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供するラベルをさらに含むキットを提供する。別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル前記容器の内容物を表示し、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している患者に対する前記容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供するラベルをさらに含むキットを提供する。関連実施形態において、前記疾病が、内分泌障害副腎皮質機能亢進、性機能亢進、原発性もしくは続発性副甲状腺機能亢進、甲状腺機能亢進を含む、高カルシウム血症、欠乏状態くる病/骨軟化症、壊血病、栄養失調を含む、慢性疾患吸収不良症候群、慢性腎不全腎性骨形成異常を含む、慢性肝疾患肝性骨形成異常を含むを含む、薬物糖質コルチコイド糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、ヘパリン、アルコールを含むおよび遺伝性疾患骨形成不全、ホモシスチン尿症を含む、癌、骨粗しょう症、大理石骨病、関節炎および関節リウマチに関連する骨の炎症、歯周病、線維性形成異常ならびに/またはパジェット病をはじめとする、破骨細胞活性の相対的増大に関連する代謝性骨疾患からなる群より選択されるキットを提供する。別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル前記容器の内容物を表示し、骨転移癌を予防または処置するための前記容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供するラベルをさらに含むキットを提供する。関連実施形態において、前記転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病もしくはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管もしくは胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌もしくは子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;または皮膚癌悪性黒色腫もしくは扁平上皮癌を含むである。さらに別の実施形態において、バイアルまたは瓶などの容器にパッケージされた治療有効量の本発明の抗体を含み、ならびに前記容器に貼り付けられた、またはその容器に共にパッケージされたラベル前記容器の内容物を表示し、癌を処置するための前記容器の内容物の使用に関する指示および/または説示を提供するラベルをさらに含むキットを提供する。別の実施形態において、前記キットは、第二の治療薬をさらに含む。関連実施形態において、前記第二治療は、癌化学療法薬、非M-CSFコロニー刺激因子、または抗RANKL抗体、または可溶性RANKLレセプター、またはビスホスホネートである。関連実施形態において、前記ビスホスホネートは、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネートまたはイバンドロネートである。さらに別の実施形態において、前記キットは、ビスホスホネート処置を受けられなくする患者を処置するための説示を含む。別の実施形態において、治療効果を達成するために必要な第二の治療薬の投薬量の低減に有効な用量の抗体を含む上述のキットを提供する。別の実施形態において、前記キットは、相乗的用量の抗体を含む。さらに別の実施形態において、前記キットは、腫瘍細胞によって誘導される破骨細胞増殖および/または分化の抑制に有効な用量の抗体を含む。本発明のさらに別の実施形態において、上述のキットは、約2μg/kg体重~30mg/kgの間の用量の抗体を含む。別の実施形態において、前記キットは、約0.1mg/kg体重~30mg/kgの間の用量の抗体を含む。さらに別の実施形態において、前記キットは、約0.1mg/kg体重~10mg/kgの間の用量の抗体を含む。本発明のさらに別の実施形態において、1つ以上の上述の抗体を含む医薬、および前記医薬を手術または放射線療法と併用すべきであるという説示を含む、パッケージ、バイアルまたは容器を提供する。別の実施形態において、被験体に上述の抗体のいずれか1つを投与する工程および手術または放射線療法で被験体を処置する工程を含む、骨転移癌の予防または処置方法を提供する。別の実施形態において、その表面に膜結合型M-CSFを発現する腫瘍細胞をターゲットにする方法を提供し、この方法は、放射線核種または他の毒素に結合体化している上述の抗体のいずれか1つを投与する工程を含む。さらに別の実施形態において、治療有効量の上述の抗体のいずれか1つを投与することを含む、癌に罹患している被験体の処置方法を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、骨損失を予防する方法を提供し、この方法は、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体に、その被験体によって生産されるM-CSFの中和に有効な量で、癌細胞によって生産されるM-CSFの中和に有効な量より多い量の上述の抗体のいずれか1つを投与することを含む。関連実施形態において、骨溶解を引き起こすか、または骨溶解に寄与する疾病に罹患している被験体を処置する方法を提供し、この方法は、前記被験体に、その被験体によって生産されるM-CSFの中和に有効な量で、癌細胞によって生産されるM-CSFの中和に有効な量より多い量の上述の抗体のいずれか1つを投与することを含む。本発明の一つの実施形態において、抗体RX1、5H4、MC1および/もしくはMC3、または非マウスRX1、5H4、MC1および/もしくはMC3由来の抗体、またはRX1、5H4、MC1および/もしくはMC3競合抗体、ならびに癌治療薬を含む薬学的組成物を提供する。本発明の別の実施形態において、抗体RX1、5H4、MC1および/もしくはMC3、または非マウスRX1、5H4、MC1および/もしくはMC3由来の抗体、またはRX1、5H4、MC1および/もしくはMC3競合抗体を含む医薬、ならびにその医薬を手術または放射線療法と併用すべきであるという説示を含む、パッケージ、バイアルまたは容器を提供する。本発明のさらに別の実施形態において、上述の抗体のいずれか1つを投与する工程を含む、癌に罹患しており、その癌を含む細胞がM-CSFを分泌しない被験体を処置する方法を提供する。詳細な説明転移する能力は、癌の明確な特徴である。転移は、身体の他の部分への癌細胞の拡大、またはこの拡大によって生じる状態を指す。転移は、細胞の遺伝物質の変化、原発性腫瘍を形成するように修飾された細胞の無制御増殖、その原発性腫瘍のための新たな血液補給の発達、その原発性腫瘍からの細胞による循環系の侵襲、身体の他の部分への原発腫瘍細胞の小凝塊の分散およびこれらの部位における続発性腫瘍の成長を含む、複合多工程プロセスである。骨は、ヒト乳癌、肺癌、前立腺癌および甲状腺癌ならびに他の癌において最も一般的な転移部位であり、剖検では60にも上る癌患者に骨転移の罹患が見出せる。骨溶解性骨転移は、他の器官への転移には見られない独特な骨溶解性骨吸収工程を示す。癌転移に関連する骨損失は、破骨細胞石灰化した組織を再吸収する能力を有する多核巨大細胞により媒介され、これは、腫瘍産物により活性化されるようである。コロニー刺激因子CSF-1は、マクロファージコロニー刺激因子M-CSFとしても知られており、これは、破骨細胞形成に不可欠であることが判明した。加えて、M-CSFは、成熟破骨細胞の破骨機能を調節すること、他の可溶性因子と協力してそれらの移動およびそれらの生存を調節すること、ならびに骨芽細胞および線維芽細胞によりもたらされる細胞間相互作用を調節することが証明されたFixeandPraloran,Cytokine10:3-7,1998;Martinetal.,CriticalRev.inEukaryoticGeneExpression8:107-231998。完全長ヒトM-CSFmRNAは、アミノ酸数554の前駆タンパク質をコードしている。可変mRNAスプライシングおよび差別的翻訳後タンパク分解プロセッシングにより、M-CSFは、プロテオグリカンを含有する糖タンパクもしくはコンドロイチン硫酸として血行へ分泌され得るか、M-CSF生産細胞の表面において膜貫通型糖タンパクとして発現され得る。細菌により発現されたヒトM-CSFアミノ末端150アミノ酸完全なインビボ生物活性に必要な最少配列の三次元構造は、このタンパク質がジスルフィド連結型二量体であり、その各単量体は4つのアルファヘリックスの束と1つの非平行ベータシートから成ることを示唆しているPanditetal.,Science258:1358-621992。3つの別個のM-CSF種が、可変mRNAスプライシングにより生産される。その3つのポリペプチド前駆体は、アミノ酸数256のM-CFSα、アミノ酸数554のM-CSFβおよびアミノ酸数438のM-CSFγである。M-CSFβは、膜結合形では発生しない分泌タンパク質である。M-CSFαは、タンパク分解性切断によってゆっくりと放出される膜内在性タンパク質として発現される。M-CSFαは、図10に記載の配列のアミノ酸191~197で切断される。膜結合形のM-CSFは、近接細胞上のレセプターと相互作用することができ、それにより特異的な細胞間接触を媒介する。用語M-CSFは、図12のアミノ酸36~438も包含し得る。様々な形態のM-CSFが、ターゲット細胞上のそのレセプターM-CSFRに結合することにより機能する。M-CSFRは、5つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、1つの膜貫通ドメインおよび1つの細胞内分断Src関連チロシンキナーゼドメインを有する膜貫通型分子である。M-CSFRは、c-fms癌原遺伝子によってコードされる。M-CSFRの細胞外ドメインへのM-CSFの結合は、そのレセプターの二量体化を導き、これが、細胞質キナーゼドメインを活性化して、他の細胞タンパク質の自己リン酸化およびリン酸化を導くHamiltonJ.A.,JLeukocBiol.,622:145-551997;HamiltonJ,A.,ImmunoToday.,187:313-71997。リン酸化した細胞タンパク質は、細胞応答に至る生物学的事象のカスケード有糸分裂、サイトカインの分泌、膜ラッフリング、およびそれ自体のレセプターの転写の調節を誘導するFixeandPraloran,Cytokine10:32-371998。M-CSFは、間質細胞、骨芽細胞および他の細胞で発現される。乳房、子宮および卵巣腫瘍細胞においても発現される。これらの腫瘍における発現の程度は、予後良好および不良と相関するKacinskiAnn.Med.27:79-851995;Smithetal.,Clin.CancerRes.1:313-251995。乳癌におけるM-CSFの発現は、分泌管内癌上皮内癌とは対照的に浸潤腫瘍細胞において頻出するScholletal.,J.Natl.CancerInst.86:120-61994。加えて、M-CSFが、乳腺腫瘍の悪性腫瘍への進行を促進することは証明されているLinetal.,J.Exp.Med.93:727-392001。乳房および卵巣の癌については、M-CSFの生産が、その腫瘍へのマクロファージの動員の原因となるようである。本明細書に示すように、M-CSF特異的抗体、例えば、RX1、5H4、MC1またはMC3抗体は、癌の動物モデルにおいて転移癌細胞による破骨細胞誘導を中和し、および/または骨への転移を減少させる。故に、本発明は、癌、癌転移および癌転移に関連する骨損失を処置または予防するための組成物および方法を提供する。好ましい抗M-CSF抗体マウスRX1は、StudnickaらのHumanEngineeringTM法を基づき、ヒトにおいてさほど免疫原性でないように修飾した。好ましい実施形態では、ヒト環境に対するその免疫原性を低下させると同時に、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いと判定された位置で、ヒト残基に対して、重鎖可変領域の8から12の表面露出アミノ酸残基および軽鎖領域の16~19の表面露出残基の修飾を行った。修飾された重鎖および/または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および/またはκ軽鎖定常領域に連結させた。ヒト重鎖および軽鎖定常領域はいずれも、HumanEngineeredTM抗体可変領域と併用することができる。それらのヒト重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に導入し、結果として生じた組換え免疫グロブリン産物を得、特性付けした。他の例示的な抗M-CSF抗体、例えば、5H4、MC1またはMC3を同様にHumanEngineeredTMした。用語RX1由来の抗体には、以下のうちのいずれか1つが含まれる:1相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図4に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図4に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図4に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1のアミノ酸変異体;2図4に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体RX1の1つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域CDRを含む、好ましくはRX1重鎖の少なくともCDR3を含む、および好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRを含む、M-CSF結合ポリペプチドマウス抗体RX1を除く;3図19Bから22Bに記載の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有するHumanEngineeredTM抗体、または図19Bから22Bの元のHumanEngineeredTM重鎖もしくは軽鎖との少なくとも60、さらに好ましくは少なくとも80、さらに好ましくは少なくとも85、さらに好ましくは少なくとも90、および最も好ましくは少なくとも95のアミノ酸配列同一性例えば、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100同一を含むを有する重鎖もしくは軽鎖を含むそれらの変異体;4図19Bから22BのHumanEngineeredTM抗体の1つもしくはそれ以上のCDRの高リスク残基を含む、好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRの高リスク残基を含む、M-CSF結合ポリペプチドマウス抗体RX1を除く;5図4Bに記載の高リスクアミノ酸残基を保持し、図4Bに記載の低もしくは中リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更を含む、例えば、図4Bに記載の低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または例えば、図4Bに示す中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基での1つもしくはそれ以上の変更を含む、M-CSFに結合する能力を保持する、HumanEngineeredTM抗体または変異体この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体の配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる;こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10-7、10-8もしくは10-9またはそれ以上の親和性でM-CSFに結合し、好ましくは、M-CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。同様に、用語MC3由来の抗体には、以下のうちのいずれか1つが含まれる:1相同性決定のために類似のアミノ酸を考慮に入れて、図15に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99相同である可変重鎖アミノ酸配列を含む、および/または図15に記載するようなアミノ酸配列に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含む変異体をはじめとする、図15に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3のアミノ酸変異体;2図15に記載のアミノ酸配列を有するマウス抗体MC3の1つもしくはそれ以上の相補鎖決定領域CDRを含む、好ましくはMC3重鎖の少なくともCDR3を含む、および好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRを含む、M-CSF結合ポリペプチド場合により、マウス抗体MC3を含む、または除く;3低、中または高リスク残基を特定するために図24C~24Eに記載のKabatの番号付けを使用し、Studnickaらの米国特許第5,766,886号および本明細書の実施例4Aに記載の方法に従ってマウス配列を変更することにより調製したHumanEngineeredTM抗体であって、以下の重鎖のうちの少なくとも1つおよび以下の軽鎖のうちの少なくとも1つを含む抗体:aヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した重鎖またはbヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した重鎖、cヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低リスク残基を修飾した軽鎖またはdヒト標準免疫グロブリン配列と同じ残基になるように、必要に応じて全ての低および中リスク残基を修飾した軽鎖;4元のHumanEngineeredTM重鎖もしくは軽鎖との少なくとも60、さらに好ましくは少なくとも80、さらに好ましくは少なくとも85、さらに好ましくは少なくとも90、および最も好ましくは少なくとも95のアミノ酸配列同一性例えば、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100同一を含むを有する重鎖もしくは軽鎖を含む、前のパラグラフ3における前記抗体の変異体;5図15のマウスMC3抗体の1つもしくはそれ以上のCDRの高リスク残基を含む、好ましくは2つもしくはそれ以上、または3つもしくはそれ以上、または4つもしくはそれ以上、または5つもしくはそれ以上、または6つ全てのCDRの高リスク残基を含む、M-CSF結合ポリペプチド場合により、マウス抗体MC3を含む、または除く;6マウスMC3抗体の高リスクアミノ酸残基を保持し、低もしくは中リスク残基での1つもしくはそれ以上の変更を含む、例えば、低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更および中リスク残基における保存的置換を含む、または例えば、中および高リスクアミノ酸残基を保持し、低リスク残基における1つもしくはそれ以上の変更を含む、M-CSFに結合する能力を保持する、HumanEngineeredTM抗体または変異体この場合の変更は、挿入、欠失または置換を含み、保存的置換であってもよく、あるいはその操作された抗体配列が、ヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系軽鎖もしくは重鎖配列に、より近くなるようすることができる;こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10-7、10-8もしくは10-9またはそれ以上の親和性でM-CSFと結合し、および好ましくは、M-CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。用語5H4由来の抗体またはMC1由来の抗体は、上の説明に従って同様に定義される。本明細書において詳細に説明するような、HumanEngineeredTM抗体または変異体を含むRX1、5H4、MC1またはMC3由来の抗体は、IgG、IgA、IgMまたはIgEなどの異なるアイソタイプのものであり得る。IgGクラスの抗体は、異なる定常領域を含むことができ、例えば、IgG2抗体は、IgG1またはIgG4定常領域を提示するように修飾することができる。好ましい実施形態において、本発明は、修飾または非修飾IgG1またはIgG4定常領域を含むHumanEngineeredTM抗体または変異体を提供する。IgG1の場合、定常領域、特にヒンジまたはCH2領域に対する修飾により、ADCCおよび/またはCDC活性をはじめとするエフェクター機能を増大または低下させることができる。他の実施形態では、IgG2定常領域を修飾して、抗体-抗原凝集体形成を減少させる。IgG4の場合、定常領域、特にヒンジ領域に対する修飾により、半抗体の形成を減少させることができる。特定の例示的な実施形態では、IgG4ヒンジ配列Cys-Pro-Ser-CysのIgG1ヒンジ配列Cys-Pro-Pro-Cysへの突然変異を生じさせる。IgG1またはIgG4定常領域を含有するHumanEngineeredTM抗体が、IgG2定常領域を含有するHumanEngineeredTM抗体と比較して改善された特性を有することを、本明細書において証明する。IgG1またはIgG4Fc領域の選択により、結合親和性、MCSF中和活性、および抗破骨細胞活性が改善された。加えて、IgG1またはIgG4Fc領域の選択により、親マウス抗体によって形成されるものにより近似した抗体-抗体複合体が生じた。このように、ヒンジ領域における可動性は、二量体抗原MCSFに対する抗体の結合ならびにその抗体の中和活性に著しい影響を与えるように見える。本発明では、一般に、修飾または非修飾IgG1またはIgG4定常領域、特に、ヒンジおよびCH2ドメインまたは好ましくは少なくともヒンジドメインを含む重鎖を含有する抗体の調製により、結合親和性が改善され、および/または二量体抗原からの抗体の解離が遅速すると考えられる。用語RX1競合抗体は、以下を包含する:1図4に記載の完全軽鎖および重鎖配列を有するマウスRX1と同じM-CSFのエピトープに結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体;2図12のM-CSFのアミノ酸98~105の少なくとも4つの連続するアミノ酸に結合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体;および3図4に記載の完全配列を有するマウス抗体RX1と、75より多く、80より多く、または81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94もしくは95より多くM-CSFに結合することで競合する非マウスまたは非齧歯動物モノクローナル抗体。こうした抗体は、好ましくは、少なくとも10-7、10-8もしくは10-9またはそれ以上の結合親和性でM-CSFに結合し、および好ましくはM-CSFの破骨細胞発生誘導活性を中和する。用語MC1競合抗体またはMC3競合抗体または5H4競合抗体は、図13、14または15にそれぞれ記載する完全軽鎖および重鎖配列を有するマウス5H4、MC1またはMC3抗体を参照して、ならびに抗体により結合されるM-CSFのエピトープ、例えば、図12のアミノ酸65~73または138~1445H4またはMC3により認識されるM-CSFエピトープに対応するを参照して、同様に定義する。場合により、本願の出願日前に公開された、または本願の出願日前に出願された出願に開示されているキメラ、ヒトまたはヒト化M-CSF抗体はいずれも、本発明の範囲から除外される。本明細書において広く定義する非齧歯動物モノクローナル抗体は、齧歯動物ハイブリドーマにより産出される完全インタクト齧歯動物モノクローナル抗体ではないあらゆる抗体である。従って、非齧歯動物抗体には、具体的には、齧歯動物抗体の変異体、齧歯動物抗体フラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体およびヒト抗体トランスジェニック動物からまたはファージディスプレイ法により生産されたヒト抗体を含むが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、非マウス抗体には、マウス抗体の変異体、マウス抗体フラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体およびヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において用いる腫瘍は、悪性であろうと、または良性であろうと、全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌および癌細胞ならびに前癌および癌組織を指す。用語癌および癌のは、無調節細胞成長を典型的な特徴とする、哺乳動物における生理状態を指すまたは描写する。癌の例には、癌腫;リンパ腫、芽種、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。こうした癌のさらに特定的な例には、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽細胞種、子宮頚癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、ならびに様々なタイプの頭頚部癌が挙げられる。処置は、疾患の発症を予防することまたは疾患の病状を変えることを目的として行う介入である。従って、処置は、治療的処置と予防的prophylacticまたはpreventative処置の両方を指す。処置の必要がある者には、その疾患に既に罹患している者、ならびにその疾患を予防すべきである者が含まれる。腫瘍例えば癌処置において、治療薬は、腫瘍細胞の病理を直接低減することができ、または腫瘍細胞を、他の治療薬による処置、例えば、放射線療法および/もしくは化学療法に対して、より感受性にすることができる。骨溶解などの疾病の臨床症状、生化学的症状、放射線学的症状または自覚症状がある患者の処置は、そうした症状の幾つかもしくは全ての緩和、またはその疾病対する素因の低減を含み得る。癌の病状は、その患者の健康を損なわせる全ての現象を含む。これには、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能化への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症反応または免疫応答の抑制または悪化などが挙げられるが、これらに限定されない。従って、処置後の改善は、腫瘍サイズの低下、腫瘍成長速度の低下、既存の腫瘍細胞もしくは転移細胞の破壊、および/または転移のサイズもしくは数の低下として顕在化され得る。処置のための哺乳動物は、ヒト、家畜、畜産動物、動物園の動物、競技動物またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどをはじめとする、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。本明細書において用いるフレーズ転移癌は、身体の他の部分、特に骨、に拡大する可能性がある癌と定義する。様々な癌が骨に転移し得るが、最も一般的な転移癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌および前立腺癌である。例として、骨に転移する可能性がある他の癌には、腺癌、血液細胞悪性疾患白血病またはリンパ腫を含む;頭頚部癌;胃腸癌食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胆管または胆嚢の癌を含む;女性生殖管の悪性疾患卵巣癌、子宮内膜癌、膣癌または子宮頚癌を含む;膀胱癌;脳の癌神経芽細胞種を含む;肉腫、骨肉腫;および皮膚癌悪性黒色腫またはは扁平上皮癌を含むが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、骨における腫瘍誘導骨溶解性病変の予防および処置を特に考えている。本明細書において用いるフレーズ治療有効量は、所望の処置方式に従って投与されたとき、所望の処置もしくは予防効果または処置もしくは予防応答を惹起する、本発明の実施形態に適するであろう治療用または予防用M-CSF抗体の量を指す、指すという意味である。本明細書において用いるヒトM-CSFは、Kawasakietal.,Science230:2911985、Cerrettietal.,MolecularImmunology,25:7611988、またはLadneretal.,EMBOJournal6:26931987に記載されている成熟ヒトM-CSFα、M-CSFβまたはM-CSFγポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドを指す前記各文献は、本明細書に参考として組み込まれている。こうした専門用語は、これら3つの成熟M-CSFが、上で説明したように異なるアミノ酸配列を有する、および活性形のM-CSFが、ジスルフィド結合型二量体であるという見解を反映しており、従って、用語M-CSFが生物活性形を指す場合、その二量体形を意味する。M-CSF二量体は、二量体化した2つのM-CSFポリペプチド単量体を指し、ホモ二量体同じタイプの2つのM-CSF単量体から成るとヘテロ二量体2つの異なる単量体から成るの両方を含む。M-CSF単量体は、米国特許第4,929,700号に記載されているように、インビトロでM-CSF二量体に転化させることができる前記特許は、本明細書に参考として組み込まれている。抗MCSF抗体本発明は、M-CSF特異的抗体、例えばRX1、5H4,MC1および/またはMC3;M-CSF特異的抗体、例えばRX1、5H4,MC1および/またはMC3を含む薬学的調合物;その薬学的調合物を調製する方法;ならびにその薬学的調合物および化合物で患者を処置する方法を提供する。用語抗体は、最も広い意味で用い、ならびに完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体例えば、二重特異性抗体、抗原に結合することができる抗体フラグメント例えば、Fab’、F’ab2、Fv、単鎖抗体、ダイアボディ、および所望の生物活性を示すのであれば上記のものを含む組換えペプチドを包含する。本明細書において用いる用語モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、前記集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性がある天然突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に方向付けられている。さらに、異なる決定基エピトープに方向付けられた異なる抗体を典型的に含む通常のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に方向付けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、均質培養により合成され、異なる特異性および特性を有する他の免疫グロブリンにより汚染されない点で有利である。修飾語モノクローナルは、実質的に均質な抗体集団から得られる場合の抗体の形質を示すものであり、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈すべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohleretal.,Nature,256,495[1975]が最初に説明したハイブリドーマ法によって調製することができ、または組換えDNA法例えば、米国特許第4,816,567号参照により調製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、Clacksonetal.,Nature,352:624628[1991]およびMarksetal.,J.Mol.Biol.,222:581-5971991に記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリから単離することもできる。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てることができる。5つの主クラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちの幾つかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、IgG1およびIgG3アイソトープは、ADCC活性を有する。抗体フラグメントは、完全長抗体の一部、好ましくはそのインタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab’、Fab’2およびFvフラグメント;ダイアボディ;線状抗体Zapataetal.,ProteinEng.,810:1057-10621995;単鎖抗体分子;および抗体フラグメントから成る多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン分解により、2つの同一の抗原結合フラグメントFabフラグメントと呼ばれ、各々が、単一の抗原結合部位を有すると残余Fcフラグメントこの名前は、35を容易に結晶化するその能力を反映しているが生産される。ペプシン処理により、抗体のVHおよびVLドメインを含む2つの1本鎖FvまたはsFv抗体を有するFab’2フラグメントが生じ、この場合、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、それによってFvは抗原結合に望ましい構造を形成することができる。sFvの概要については、PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibody,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-3151994参照。用語超可変領域、は、抗原結合に責任を負う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、相補鎖決定領域すなわちCDRからのアミノ酸残基[すなわち、Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991により説明されているような、軽鎖可変ドメイン内の残基24~34L1、50~56L2および89~97L3、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基31~35H1、50~65H2および95~102H3]および/または超可変ループからの残基すなわち、[Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901-9171987]により説明されているような、軽鎖可変ドメイン内の残基26~32L1、50~52L2および91~96L3ならびに重鎖可変ドメイン内の残基26~32H1、53~55H2および96~101H3を含む。フレームワークまたはFR残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。用語ダイアボディdiabodyは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖内にある軽鎖可変ドメインVLに連結した重鎖可変ドメインVHを含むVHVL。同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするほど短いリンカーを使用することにより、それらのドメインを別の鎖の相補ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を作らせる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号;国際公開パンプレット第93/11161号;および30Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-64481993において、より詳細に説明されている。一部の実施形態では、少なくとも2つの異なるアイソトープに対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体または変異抗M-CSF抗体をはじめとする、多重特異性例えば、二重特異性モノクローナル抗体を調製することが望ましいこともある。例示的な二重特異性抗体は、M-CSFの2つの異なるエピトープに結合することができる。あるいは、抗M-CSFアームを、T細胞レセプター分子例えばCD2もしくはCD3またはIgGのFcレセプターFcγR、例えばFcγRICD64,FcγRIICD32およびFCγRIIICD16、などの白血球上のターゲット分子に結合するアームと連結させて、細胞の防御メカニズムをM-CSF発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、M-CSFを発現する細胞に細胞毒性剤を局在させることもできる。これらの抗体は、M-CSF結合アームと細胞毒性剤例えば、サポリン、抗インターフェロン-60、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性同位元素ハプテンに結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント例えば、Fab’.sub.2二重特異性抗体として調製することができる。二重特異性抗体を調製するためのもう一つのアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、一次抗体分子の界面からの1つ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖例えば、チロシンまたはトリプトファンで置換する。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの例えば、アラニンまたはトレオニンで置換することにより、二次抗体分子の界面上にその大きな側鎖複数を含むと同じまたは類似したサイズの代償空洞が作られる。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物よりヘテロ二量体の収量を増加させるメカニズムをもたらす。1996年9月6日発行の国際公開パンフレット第96/27011号参照。二重特異性抗体は、架橋またはヘテロ結合体抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体の一方の抗体がアビジンとカップリングし、他方が、ビオチンとカップリングする。ヘテロ結合体化抗体は、従来のあらゆる架橋方法を用いて調製することができる。適する架橋剤は当該技術分野においてよく知られており、米国特許第4,676,980号に多数の架橋技法と共に開示されている。抗体フラグメントから二重特異性抗体を調製する技法もその文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Brennanetal.,Science229:811985には、インタクトな抗体をタンパク分解切断して、Fab’2フラグメントを調製する手順が開示されている。これらのフラグメントをジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定させ、分子内ジスルフィドの形成を抑制する。次に、調製したFab’フラグメントをチオニトロベンゼンTNB誘導体に転化させる。その後、そのFab’-TNB誘導体の一方を、メルカプトエチルアミンでの還元によりFab’-チオールに再び転化させ、等モル量の他方のFab’-TNB誘導体と混合して、二量体特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用することができる。なお、さらなる実施形態では、大腸菌E.coliから直接回収したFab’-SHフラグメントをインビトロで化学的にカップリングさせて、二重特異性抗体を形成することができるShalabyetal.,J.Exp.Med.175:217-2251992。Shalabyetal.,J.Exp.Med.175:217-2251992には、完全ヒト化二重特異性抗体Fab’2分子の生産が記載されている。各Fab’フラグメントを大腸菌から選択的に分泌させ、インビトロでの定方向化学的カップリングに付して、二重特異性抗体を形成した。こうして形成された二重特異性抗体は、HER2レセプターを過発現する細胞および正常なヒトT細胞に結合することができ、ならびにヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘導することができた。組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接調製および単離する様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生産されているKostelnyetal.,J.Immunol.1485:1547-15531992。FosおよびJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により、2つの異なる抗体のFab’部分に連結させた。その抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生産にも利用することができる。Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-64481993により説明されたダイアボディ技法は、二重特異性抗体フラグメントを調製するための代替メカニズムをもたらした。これらのフラグメントは、同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするほど短いリンカーにより軽鎖可変領域VLに連結された重鎖可変領域VHを含む。従って、一方のフラグメントのVHおよびVLドメインをもう一方のフラグメントの相補VLおよびVHドメインと対合させ、それによって2つの抗原結合部位が形成される。1本鎖FvsFv二量体の使用により二重特異性抗体フラグメントを調製するもう一つの戦略も報告されている。Gruberetal.,J.Immunol.152:53681994参照。あるいは、二重特異性抗体は、Zapataetal.ProteinEng.810:1057-10621995に記載されているとおり生産された線状抗体であってもよい。簡単に言うと、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む。線状抗体は、二重特異性であることもあり、または単一特異性であることもある。2より大きな価を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttetal.,J.Immunol.147:601991特定の実施形態において、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体または変異抗M-CSF抗体は、抗体フラグメント、例えば、RX1抗体フラグメント、5H4抗体フラグメント、MC1抗体フラグメントまたはMC3抗体フラグメントである。抗体フラグメントを生産するために、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク分解により誘導された例えば、Morimotoetal.,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-1171992およびBrennanetal.,Science229:811985参照。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接生産され得る。Betteretal.,Science240:1041-10431998には、細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌が開示されている例えば、Betteretal.,Skerraetal.Science240:1038-10411998参照。例えば、Fab’-SHフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてFab’2フラグメントを形成することができるCarteretal.,Bio/Technology10:163-1671992。もう一つの実施形態では、Fab’2は、Fab’2分子の組立てを促進するためにロイシンジッパーGCN4を使用して形成される。もう一つのアプローチによると、Fv、FabまたはFab’2フラグメントを組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技法は、当業者には明らかであろう。単離抗体は、その自然環境の成分から特定され、分離され、回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、その抗体の診断または治療使用を妨げるであろう物質であり、そうしたものには、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質系または非タンパク質系溶質を挙げることができる。好ましい実施形態において、抗体は、1ローリー法により判定して、95重量より高い、最も好ましくは99重量より高い抗体重量に、2スピニングカップシークエネータの使用により、N末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度に、または3クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用する、還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEにより、均質まで精製されるであろう。単離抗体は、組換え細胞の中のインサイチューの抗体を包含する。その抗体の自然環境の少なくとも1つの成分は、存在しないだろうからである。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも1つの精製工程により調製されるであろう。抗体の構造および調製の詳細な説明については、Roth,D.B.,andCraig,N.L.,Cell,94:411-4141998および米国特許第6,255,458号参照これらは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている。簡単に言うと、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするDNAを調製するプロセスは、主としてB細胞を発生させる際に行われる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配列および連結の前、V、D、JおよびコンスタントC遺伝子セグメントが、一般に、一つの染色体上に比較的至近距離で見出せる。B細胞の分化中に、そのV、D、Jまたは軽鎖遺伝子の場合はVおよびJのみ遺伝子セグメントの各々の適切なファミリーメンバーの1つを組み換えて、機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。この遺伝子セグメント再配列プロセスは、逐次的であるように見える。先ず、重鎖のDとJの連結が作られ、続いて重鎖のVとDJの連結、そして軽鎖のVとJの連結が作られる。機能的重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え能力のあるV、DおよびJセグメントに隣接する組換えシグナル配列RSSにより媒介される。直接組換えに必要、十分なRSSは、二回対称七量体、高ATの九量体、および12または23塩基対の介在スペーサ領域を含む。これらのシグナルは、D-JまたはV-J組換えを行う異なる座および種の間で保存され、機能的に互換性である。Oettinger,etal.1990,Science,248,1517-1523およびそこに引用されている参考文献参照。前記七量体は、配列CACAGTGまたはその類似配列を含み、それに非保存配列のスペーサ、そして配列ACAAAAACCまたはその類似配列を有する九量体が続く。これらの配列は、VおよびD遺伝子各々のJ側、すなわち下流側で見出される。生殖細胞系DおよびJセグメントの直ぐ前は、再び2つの組換えシグナル配列であり、最初に九量体、そして次に7量体があり、これらもまた非保存配列により隔てられている。VL、VHまたはDセグメントに続く七量体および九量体配列は、それらによって組み換えられるそのJL、DまたはJHセグメントの前のものに相補的である。七量体配列と九量体配列の間のスペーサは、12塩基対の長さであるか、22塩基対と24塩基対の間の長さである。V、DおよびJセグメントの再配列に加えて、軽鎖のVおよびJセグメントが連結する位置ならびに重鎖のDおよびJセグメントが連結する位置での可変組換えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の主レパートリーにさらなる多様性を生じさせる。軽鎖におけるこうした変異は、典型的にはV遺伝子セグメントの最終コドンおよびJセグメントの最初のコドン内で発生する。連結に関する同様の不正確さが、重鎖染色体のDセグメントとJHセグメントの間で発生し、10ものヌクレオチドにわたることもある。さらに、ゲノムDNAによりコードされない、D遺伝子セグメントとJH遺伝子セグメントの間およびVH遺伝子セグメントとD遺伝子セグメントの間に、幾つかのヌクレオチドを挿入することができる。これらのヌクレオチドの追加は、N領域多様性として知られている。可変領域遺伝子セグメントにおけるそうした再配列およびそうした連結中に発生し得る可変組換えの正味の効果は、一次抗体レパートリーの生産である。Fvは、完全抗体認識および結合部位を含有する最少抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合性会合状態の重鎖可変ドメイン1つと軽鎖可変ドメイン1つの二量体から成る。この立体配置では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VHVI二量体の表面の抗原結合部位を規定する。集合的に、6つのCDRが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかし、完全な結合部位より低い親和性であるが、単一の可変ドメインまたは抗原に対して特異的なCDRを3つしか含まない、Fvの半分でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。Fabフラグメントも、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメインCH1を含有する。Fabフラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインをはじめとする少数の残基が追加されていることが、Fab’フラグメントとは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基複数を含むが遊離チオール基を有するFab’についての本明細書における呼称である。当初、Fab’2抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有する、対のFab’フラグメントとして生産された。中和抗体とは、結合されるターゲット抗原のエフェクター機能を消去するか有意に低下させることができる抗体分子を意味する。従って、中和抗ターゲット抗体は、酵素活性、リガンド結合または細胞内シグナル伝達などのエフェクター機能を消去するか有意に低下させることができる。本明細書において提供する、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失を処置するための組成物および方法は、単独で使用される、または他の治療薬と併用される1つ以上の抗体を利用して、所望の効果を達成することができる。本発明の抗体は、環境抗原との直接接触またはその抗原での免疫化の結果として抗体を生産する動物から単離することができる。あるいは、当該技術分野においてよく知られている抗体発現系の1つを使用して組み換えDNA法により抗体を生産することができる例えば、HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory1998参照。こうした抗体には、組換えIgG抗体、免疫グロブリン由来の配列を有するキメラ融合タンパク抗体、またはHumanEngineeredTM抗体を挙げることができ、これらは全て、本発明に従って癌転移および/または癌転移に関連する骨損失を処置するために使用することができる。インタクトな完全長分子に加えて、用語抗体は、それらのフラグメント例えば、scFv、Fv、Fd、Fab、Fab’およびFab’2フラグメントなど、またはM-CSFもしくはM-CSFRに結合するインタクト分子および/もしくはフラグメントの多量体もしくは凝集体も指す。これらの抗体フラグメントは、抗原に結合し、また例えばガラクトース残基の組み込みによりクリアランスおよび取り込みを助長する構造的特徴を示すように誘導体化することができる。本発明の一つの実施形態において、M-CSFモノクローナル抗体は、本質的にはHalenbeckらの米国特許第5,491,065号1997に記載されているとおり調製することができる前記特許は、本明細書に参考として組み込まれている。例示的なM-CSFモノクローナル抗体には、組替え体と会合している見掛けの配座エピトープまたは天然二量体M-CSFに結合し、それに付随して生物活性を中和するものが挙げられる。これらの抗体は、単量体M-CSFおよび化学的に誘導体化された二量体M-CSFをはじめとする生物不活性形態のM-CSFとは実質的に反応しない。本発明の他の実施形態において、HumanEngineeredTM抗M-CSFモノクローナル抗体を提供する。フレーズHumanEngineeredTM抗体は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体から誘導される抗体を指す。あるいは、HumanEngineeredTM抗体は、親、非ヒト、抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトに投与されたときにその親抗体と比較して減弱された免疫原性を示すキメラ抗体から誘導することができる。本明細書において用いるフレーズキメラ抗体は、典型的には異なる種から生じる2つの異なる抗体から誘導された配列を含有する抗体を指す例えば、米国特許第4,816,567号参照。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般に、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。フレーズ相補鎖決定領域または用語CDRは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性を協力して規定するアミノ酸配列アミノ酸配列を指す例えば、Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:9019171987;Kabatetal.,U.S.Dept.ofHealthandHumanServicesNIHPublicationNo.9132421991参照。フレーズ定常領域は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明において、マウス定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域により置換されている。主題の抗体の定常領域は、ヒト天然免疫グロブリンから誘導される。重鎖定常領域は、5つのアイソタイプアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューのいずれかから選択することができる。本発明の抗体は、約106M-1またはそれ以上、好ましくは約107M-1またはそれ以上、さらに好ましくは約108M-1またはそれ以上、最も好ましくは約109M-1、1010M-1、1011M-1もしくは1012M-1またはそれ以上のKaで抗原に結合する場合、免疫特異的である、または特異的に結合していると言う。抗M-CSF抗体は、宿主組織/被験体組織により発現されたものならびに腫瘍により発現されたものをはじめとする、種々の自然発生形態のM-CSFに結合することができる。本明細書において開示するモノクローナル抗体、例えば、RX1、5H4、MC1またはMC3抗体は、M-CSFに対して親和性であり、少なくとも10-4M、好ましくは少なくとも約10-7Mから約10-8M、さらに好ましくは少なくとも約10-8M、10-10M、10-11Mまたは10-12Mの解離平衡定数Kdを特徴とする。こうした親和性は、従来どおりの技法を使用して、例えば、平衡透析法により;BIAcore2000機器を使用し、その製造業者により概説された一般手順を用いることにより;125I標識M-CSFを使用するラジオイムノアッセイにより;または当業者に知られている別の方法により、容易に判定することができる。親和性データは、例えば、Scatchardetal.,AnnN.Y.Acad.Sci.,51:6601949の方法により分析することができる。従って、好ましいM-CSF抗体が、M-CSFに対して高い親和性度を示し、他の分子に対しては実質的にそれより低い親和性で結合することは、明らかであろう。好ましい抗体は、図4のマウスRX1がM-CSFに結合するのと同様の親和性でM-CSFを結合し、低い免疫原性を示し、および転移性疾患動物モデルにおいて試験したときに癌細胞の転移を阻害する。他の例示的な抗体は、それぞれ図13、14または15のマウス5H4、MC1またはMC3と同様の親和性でM-CSFを結合する。抗体の生産に使用することができる抗原は、例えば、インタクトなM-CSF、またはそのエピトープをその天然配座で提示することができる別のポリペプチドに場合によっては融合している所望のエピトープを保持する、M-CSFのフラグメントであり得る。あるいは、M-CSFを細胞表面で発現する細胞を使用して、抗体を調製することができる。こうした細胞は、M-CSFを発現するように形質転換することができ、またはM-CSFを発現する他の自然発生細胞であってもよい。抗体の調製に有用なM-CSFの他の形態は、当業者には明らかであろう。ポリクローナル抗体ポリクローナル抗体は、好ましくは、適切な抗原およびアジュバントの複数の皮下scまたは腹腔内ip注射により、動物において産生させる。二官能性物質または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基による結合体化、N-ヒドロキシスクシンイミドリシン残基による、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当該技術分野において知られている他の物質を使用して、免疫を受ける種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に、適切な抗原を結合体化することにより、改善された抗体応答を得ることができる。例えば、100μgもしくは5μgのタンパク質もしくは結合体それぞれ、ウサギもしくはマウス用を3容量のフロイト完全アジュバントと併せ、その溶液を複数の部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫する。一ヶ月後、複数部位での皮下注射により、フロイト完全培地中のペプチドまたは結合体の最初の量に対して1/5{比率1/10}で動物を追加免疫する。追加抗原注射後7~14日目に動物から血液採取し、その血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物から血液採取する。好ましくは、同じ抗原のものであるが、異なるタンパク質に結合体化した、および/または異なる架橋剤によって結合体化した結合体で、動物を追加免疫する。結合体は、タンパク質融合のような組換え細胞培養で調製することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を強化する。モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、Kohleretal.,Nature,256:4951975により最初に説明されたハイブリドーマ法を使用して調製することができ、または組換えDNA法により生産することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカークザルを本明細書において説明するとおり免疫して、その免疫処置に使用したタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産するまたは生産することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。その後、適する融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するGoding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103AcademicPress,1986。このように調製したハイブリドーマを、その融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する1つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、その親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠く場合、そのハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンこれらの物質は、HGPRT欠乏細胞の成長を妨げる含むであろうHAT培地。好ましい骨髄腫細胞は、効率的融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定した高レベルの生産を支援し、および培地に対して感受性であるものである。ヒトモノクローナル抗体の生産のために、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞系も記載されているKozbor,J.Immunol.,133:30011984;Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987。例示的なマウス骨髄腫系には、米国、カリフォルニア州、サンディエゴのSalkInstituteCellDistributionCenterから入手できるMOP-21およびM.C.-11マウス腫瘍由来のもの、ならびに米国、メリーランド州、ロックヴィルの米国微生物系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionから入手できるSP-2またはX63-Ag8-653細胞が挙げられる。ハイブリドーマ細胞が成長している培地を抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、またはラジオイムノアッセイRIAもしくは酵素結合イムノソルベントアッセイELISAなどのインビトロ結合アッセイにより判定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャッチャード分析Munsonetal.,Anal.Biochem.,107:2201980により判定することができる。所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を特定した後、それらのクローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp.59-103AcademicPress,1986により成長させることができる。この目的に適する培地には、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞を動物においてインビボで腹水として成長させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により、培地、腹水または血清から適切に分離することができる。抗体の組換え生産従来の手順を用いて例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、モノクローナル抗体をコードするDNAをハイブリドーマ細胞から単離し、塩基配列決定することができる。配列決定には、一般に、昆虫の遺伝子またはcDNAの少なくとも一部の単離が必要である。通常、これには、モノクローナル抗体をコードするDNAまたは好ましくはmRNAすなわち、cDNAのクローニングが必要である。クローニングは、標準的な技法を使用して行われる例えば、Sambrooketal.1989MolecularCloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress参照;これは、本明細書に参考として組み込まれている。例えば、ポリAmRNA、好ましくは膜会合型mRNAの逆転写によりcDNAライブラリを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してそのライブラリをスクリーニングすることができる。しかし、好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを使用して、昆虫の免疫グロブリン遺伝子セグメント例えば、軽鎖可変セグメントをコードするcDNAまたは全長cDNAの部分を増幅する。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクター、に容易にクローニングすることができる。対象となる免疫グロブリンポリペプチドのなんらかの部分の配列を決定することができるのであれば、使用される個々のクローニング法が重要でないことは、理解されるであろう。本明細書において用いる単離核酸分子または単離核酸配列は、1その核酸の天然源に通常付随する少なくとも1つの混在核酸分子から特定および分離されるか、2クローニングされ、増幅され、標識され、または対象となる核酸の配列を決定することができるようにバックグラウンド核酸と別様に区別される、単離されたと見なされる核酸分子である。単離核酸分子は、天然に見られる形態またはセッティング以外のものである。従って、単離核酸分子は、天然細胞中に存在するような核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞とは異なる染色体座にある抗体を通常は発現する細胞に含まれている核酸分子を含む。クローニングおよび塩基配列決定に使用される一つのRNA源は、トランスジェニックマウスからB細胞を得、そのB細胞を不朽細胞に融合させることによって生産させたハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらを簡単にスクリーニングできること、および対象となるヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを容易に選択できることである。あるいは、免疫した動物のB細胞または全脾臓からRNAを単離することができる。ハイブリドーマ以外の源を使用する場合、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列をスクリーニングすることが望ましいであろう。そうしたスクリーニングの一つの方法は、ファージディスプレイ法の使用である。ファージディスプレイは、例えば、Dowerらの国際公開パンフレット第91/17271号、McCaffertyらの国際公開パンフレット第92/01047号、およびCatonandKoprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450-64541990に記載されており、これらの各文献は、本明細書に参考として組み込まれている。ファージディスプレイ法を使用する一つの実施形態では、免疫されたトランスジェニックマウスからcDNA例えば、脾臓cDNAを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えばCDR領域をコードするcDNAを増幅し、増幅された配列をファージベクターに挿入する。パンニングなどの標準的な技法により、所望の結合特性を有する対象となるペプチド、例えば可変領域ペプチド、をコードするcDNAを特定する。増幅し、クローニングした核酸の配列を、その後、決定する。一般的には、免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、場合によっては、可変領域の一部、例えばCDRをコードする部分、のみの配列決定で十分であろう。一般に、塩基配列決定する部分は、少なくとも30塩基の長さであろう。より多くの場合、可変領域の少なくとも約三分の一または少なくとも約二分の一の長さのコーディングを基に、塩基配列決定がなされるであろう。塩基配列決定は、cDNAライブラリから単離されたクローンを用いて行うことができ、またはPCRを用いる場合には、増幅した配列をサブクローニングした後、行うことができ、もしくは増幅したセグメントの直接PCR配列決定により行うことができる。塩基配列決定は、標準的な技法を用いて行う例えば、Sambrooketal.1989MolecularCloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress、およびSanger,F.etal.1977Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467参照;これらは、本明細書に参照として組み込まれている。クローニングされた核酸の配列とヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの公開されている配列を比較することにより、当業者は、塩基配列決定がなされる領域に依存して、iハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド重鎖のアイソタイプを含むの生殖細胞系セグメントの使用法、およびiiN領域付加および体細胞突然変異プロセスから生じた配列をはじめとする重鎖および軽鎖可変領域の配列を容易に決定することができるであろう。一つの免疫グロブリン遺伝子配列情報源は、NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.である。一旦、単離したら、そのDNAを発現ベクター中に配置することができ、それを、その後、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、サルCOS細胞、ヒト胚腎臓293細胞例えば、293E細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体の組換え生産は、当該技術分野ではよく知られている。発現制御配列は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核動物に適する制御配列は、例えば、プロモータ、場合によりオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、作動可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、そのポリペプチドについてのDNAに作動可能に連結されており;プロモータまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合には、そのコード配列に作動可能に結合されており;またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を助長するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されるとは、連結されるDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していると共に読み込み相readingphaseにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接している必要がない。連結は、適便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そうした部位が存在しない場合には、従来の施行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーを使用する。細胞、細胞系および細胞培養物は、多くの場合、区別なく用いており、本明細書における全てのそうした呼称は、後代を包含する。形質転換体および形質転換細胞は、一次対象細胞、および形質転換数にかかわらず、それに由来する培養物を含む。計画的または偶発的突然変異のため、全ての後代のDNA内容が正確に同じであるとはかぎらない。元の形質転換細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異後代を含む。別個の呼称が意図されている場合、それはその文脈から明らかであろう。別の実施形態では、対象となる免疫グロブリンのアミノ酸配列を直接タンパク質配列決定により決定することができる。適するコード化ヌクレオチド配列は、汎用コドン表に従って設計することができる。所望の抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更をコード化DNAに導入することにより、またはペプチド合成により、調製することができる。こうした変異体は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および/または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入および置換のあらゆる併用を行って、最終構築物に到達するが、但し、最終構築物が、所望の特性を有することを条件とする。アミノ酸の変更、例えばグリコシル化部位の数および位置の変更、により、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体または変異抗体の後翻訳プロセスを修飾することもできる。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法には、天然源からの単離天然アミノ酸配列変異体の場合、またはオリゴヌクレオチド媒介または部位特異的突然変異誘導、PCR突然変異誘導、および抗体の以前に調製された変異もしくは非変異バージョンのカセット式突然変異誘導による調製が挙げられるが、それらに限定されない。本発明は、宿主細胞により認識される制御配列に場合によっては作動可能に連結されている本発明の抗体をコードする単離核酸;前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞;ならびに前記核酸を発現するように前記宿主細胞を培養することおよび場合によっては前記宿主細胞培養物または培地から前記抗体を回収することを含み得る、抗体を生産するための組換え法も提供する。抗体の組換え生産については、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニングDNAの増幅のためまたは発現のために複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、容易に単離され、塩基配列決定され。多くのベクターを利用することができる。ベクター成分は、一般に、以下のものの1つ以上を含むが、それらに限定されない:シグナル配列、複製起点、1つ以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモータ、および転写終結配列。1シグナル配列成分本発明の抗体は、直接、組換え生産することができるばかりでなく、異種ポリペプチド好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドであるとの融合ポリペプチドとしても組換え生産することができる。選択されるシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセッシングされるすなわち、シグナルペプチダーゼにより切断されるものである。原核宿主細胞が、天然の抗体シグナル配列を認識およびプロセッシングしない場合、そのシグナル配列を、例えばペクチン酸リアーゼ例えば、pelBアルカリホスファアーゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群より選択されるシグナル配列により置換してもよい。酵母分泌のために、その天然シグナル配列を、例えば酵母転化酵素リーダー、α-因子リーダーサッカロマイセスSaccharomycesおよびクライベロマイセスKluyveromycesα-因子リーダーを含む、酸性ホスファターゼリーダー、C.アルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたは国際公開パンフレット第90/13646号に記載されているシグナルにより、置換してもよい。哺乳動物細胞発現には、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純疱疹gDシグナルを利用することができる。そうした前駆領域についてのDNAを、読み取り枠内で、抗体をコードするDNAにライゲートする。2複製起点成分発現ベクターとクローニングベクターの両方が、選択された1つ以上の宿主細胞においてベクターを複製することができる核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおけるこの配列は、宿主染色体DNAとは無関係にそのベクターを複製することができるものであり、複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母およびウイルスについてのこうした配列は、よく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適し、2μプラスミド起点は酵母に適し、ならびに様々なウイルス起点が哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない一般には、SV40起点が唯一使用され得る。初期プロモータを含有するためである。3選択マーカー成分発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、a抗体または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、テトラサイクリン、G418、ゲネチシン、ヒスチジノールもしくはマイコフェノール酸、に対する耐性を付与する、b栄養要求体欠失を相補する、またはc自然培地から入手することができない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする例えば、杆菌BacilliについてのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。選択機構の一例は、宿主細胞の成長を阻止する薬物を利用するものである。異種遺伝子で首尾よく形質転換されている細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、故に、選択レジメにも生き残る。こうした優性選択の例には、薬物メトトレキセート、ネオマイシン、ヒスチジノール、プロマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンが使用される。哺乳動物細胞に適する選択可能マーカーのもう一つの例は、抗体をコードする核酸、例えばDHFR、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン-IおよびII、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを取り込む能力がある細胞を識別することができるものである。例えば、メトトレキセートMtx、DHFRの競合的拮抗薬、を含有する培地中で形質転換体の全てを培養することにより、DHFR選択遺伝子で形質転換された細胞を先ず識別する。野生型DHFRを利用するときに適切な宿主細胞は、DHFR活性が欠如したチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞系である。あるいは、本発明の抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質およびもう一つの選択可能マーカー、例えばアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼAPHで形質転換または共形質転換された宿主細胞特に、内在性DHFRを含有する野生型宿主は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはG418などの選択可能マーカーに対する選択物質を含有する培地中で細胞を成長させることにより、選択することができる。米国特許第4,965,199参照。酵母での使用に適する選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子であるStinchcombetal.,Nature,282:391979。trp1遺伝子は、トリプトファン中での成長能力が欠如した酵母の突然変異株、例えばATCC番号44076またはPEP4-1、のための選択マーカーをもたらす。Jones,Genetics,85:121977。酵母宿主細胞ゲノム内のtrp1損傷の存在は、トリプトファン不在下での成長による形質転換の検出に有効な環境をもたらす。同様に、Leu2欠失酵母菌株ATCC20,622または38,626は、Leu2遺伝子を有する既知プラスミドにより相補される。ura3欠失酵母菌株は、ura3遺伝子を有するプラスミドにより相補される。加えて、1.6μm環状プラスミドpKD1から誘導したベクターをクライベロマイセスKluyveromyces酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、K.ラクティスK.lactisについての組換え子ウシキモシンの大量生産のための発現系が、報告されている。VandenBerg.Bio/Technology,8:1351990。工業用クライベロマイシン株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌に適するマルチコピー型発現ベクターも開示されている。Fleeretal.,Bio/Technology,9:968-9751991。4プロモータ成分発現ベクターおよびクローニングベクターは、宿主生物により認識される、および抗体をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモータを、通常、含有する。原核宿主での使用に適するプロモータには、アラビノース例えば、araBプロモータphoAプロモータ、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系、アルカリホスファターゼ、トリプトファンtrpプロモータ系、ならびにハイブリッドプロモータ、例えばtacプロモータが挙げられる。しかし、他の既知細菌プロモータが適する。細菌系において使用するためのプロモータは、本発明の抗体をコードするDNAに作動可能に連結されたシャイン-ダルガーノS.D.配列も含有するであろう。真核細胞についてのプロモータ配列は、既知である。実質的に全ての真核遺伝子が、転写が開始される部位から約25~30塩基上流に位置する高AT領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始点から70~80塩基上流に見出せるもう一つの配列は、CNCAAT領域であり、この場合のNは、いずれのヌクレオチドであってもよい。大部分の真核遺伝子の3’末端にはAATAAA配列があり、これは、そのコード配列の3’末端へのポリAテイルの付加に関するシグナルであり得る。これらの配列の全てが、真核発現ベクターに適切に挿入される。酵母宿主での使用に適する促進配列の例には、3-ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ、のためのプロモータが挙げられる。成長条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導プロモータである他の酵母プロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにメタロースおよびガラクトース利用の要因となる酵素についてのプロモータ領域である。酵母発現での使用に適するベクターおよびプロモータは、欧州特許第73,657号にさらに記載されている。酵母エンハンサーも酵母プロモータとともに有利に使用される。哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体の転写は、例えば、エーベルソン白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルスアデノウイルス2など、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、シミアンウイルス40SV40などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモータ、例えばアクチンプロモータまたは免疫グロブリンプロモータから、熱ショックプロモータから得られるプロモータにより制御されるが、但し、そうしたプロモータが宿主細胞系と共存できることを条件とする。SV40ウイルスの初期および後期プロモータは、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限フラグメントとして適便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモータは、HindIIIE制限フラグメントとして適便に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてDNAを発現させるための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変形は、米国特許第4,601,978号に記載されている。単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモータの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ-インターフェロンcDNAの発現に関するReyesetal.,Nature297:598-6011982も参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスレトロウイルスをプロモータとして使用することができる。5エンハンサー成分高等真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。今では哺乳動物遺伝子からの多くのエンハンサー配列グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、およびインスリンが知られている。しかし、一般的には真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例には、複製起点の遅い側bp100~270にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の遅い側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモータの活性化のための促進要素に関するYaniv,Nature297:17-181982も参照。エンハンサーは、抗体をコードする配列に対して5’または3’位でベクターにスプライシングすることができるが、プロモータから5’の座に位置することが好ましい。6転写終結成分真核宿主細胞酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、または他の多細胞生物からの有核細胞において使用される発現ベクターは、転写の終結に必要な配列およびmRNAを安定させるために必要な配列も含有するであろう。こうした配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により3’非翻訳領域から一般に得ることができる。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。一つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開パンフレット第94/11026号、および本明細書に開示する発現ベクター参照。もう一つは、マウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネータである。7宿主細胞の選択および形質転換本明細書において、ベクターでのDNAのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、上で説明した原核動物、酵母または高等真核動物細胞である。この目的に適する原核動物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真性細菌、例えば、エシェリキア属Escherichia、例えば大腸菌E.coli、エンテロバクター属Enterobacter、エルウィニア属Erwinia、クレブシエラ属Klebsiella、プロテウス属Proteus、サルモネラ属Salmonella、例えばネズミチフス菌Salmonellatyphimurium、セラチア属Serratia、例えばセラチアマルセッカンスSerratiamarcecansおよび赤痢菌属Shigellaなどの腸内細菌科Enterobacteriacease;枯草菌B.subtilisおよびB.リシェニフォルミスB.Licheniformis例えば、1989年4月12日公開の旧東ドイツ特許266,710号に開示されているB.リシェニフォルミス41Pなどの杆菌Bacilli;緑膿菌P.aeruginosaなどのシュードモナス属Pseudomonas;ならびにストレプトミセス属Streptomycesが挙げられる。一つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、E.coli294ATCC31,446であるが、大腸菌B株、大腸菌X1776株ATCC31,537および大腸菌W3110株ATCC27,325などの他の株は適する。これらの例は、限定ではなく実例となるものである。原核動物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに適するクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセスセレビジエSaccharomycescerevisiaeまたは一般のパン酵母が、下等真核宿主微生物の間で最も一般的に使用されている。しかし、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe;クライベロマイセスKluyveromyces宿主、例えば、K.ラクティスK.lactis、K.フラギリスK.fragilisATCC12,424、K.ブルガリクスK.bulgaricusATCC16,045、K.ウィッケルアミイK.wickeramiiATCC24,178、K.ワルチK.waltiiATCC56,500、K.ドロソフィラルムK.drosophilarumATCC36,906、K.サーモトレランスK.thermotolerans、およびK.マルキサヌスK.marxianusなど;ヤロウィア欧州特許第402,226号;ピキアパストルスPichiapastors欧州特許第183,070号;カンジダ属Candida;トリコデルマレッシアTrichodermareesia欧州特許第244,234号;アカパンカビNeurosporacrassa;シュワニオミセス属Schwanniomyces、例えば、シュワニオミセス-オキシデンタリスSchwanniomycesoccidentalis;ならびに、糸状菌、例えば、例えばアカパンカビ属Neurospora、ペニシリウム属Penicillium、トリポクラジウム属Tolypocladiumおよびアスペルギルス属Aspergillus宿主[例えば、A.ニデュランスA.nidulansおよび黒色アスペルギルスA.niger]など、のような多数の他の属、種および株が、ここでは利用可能であり、有用である。グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにツマジロクサヨウトウSpodopterafrugiperda毛虫、ネッタイシマカAedesaegypti蚊、ヒトスジシマカAedesalbopictus蚊、キイロショウジョウバエDrosophilamelanogasterショウジョウバエ、およびカイコガBombyxmoriなどの宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が特定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファカリフォルニカAutographacalifornicaNPVのL-1変異体およびカイコガBombyxmoriNPVのBm-5株、を、公的に利用することができ、こうしたウイルスを、特にツマジロクサヨウトウ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従ってここでのウイルスとして使用することができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、タバコ、アオウキクサおよび他の植物細胞の植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。しかし、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養組織培養での脊椎動物細胞の増殖が、常用手順になってきている。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、CHOK1細胞ATCCCCL61、DXB-11、DG-44およびチャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRCHO,Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980をはじめとするチャイニーズハムスター卵巣細胞;SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚腎臓系293細胞、または浮遊培養で成長させるためにサブクローニングした293細胞[Grahametal.,J.GenVirol.36:591977];仔ハムスター腎細胞BHK、ATCCCCL10;マウスセルトリ細胞TM4、Mather,Biol,Reprod.23:243-2511980;サル腎細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頚癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138,ATCCCCL75;ヒト肝細胞HepG2、HB8065;マウス乳腺癌MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-681982;MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞癌系HepG2である。抗体生産のために宿主細胞を上記発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトし、適切な場合にはプロモータの導入、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために変性された通常の栄養培地でそれを培養する。加えて、選択マーカーにより分離された転写単位の複数のコピーを有する新規ベクターおよび被トランスフェクト細胞は、M-CSFをターゲットにする抗体の発現に特に有用であり、好ましい。8宿主細胞の培養本発明の抗体の生産に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ハムのF10Sigma、最少必須培地MEM、Sigma、RPMI-1640Sigmaおよびダルベッコ変性イーグル培地DMEM、Sigmaなどの市販の培地が、宿主細胞の培養に適する。加えて、Hametal.,Meth.Enz.58:441979;Barnesetal.,Anal.Biochem.102:2551980;米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号もしくは同第5,122,469号;国際公開パンフレット第90103430号、同第87/00195号;または米国特許再発行番号30,985に記載されている培地はいずれかも、宿主細胞のための培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモンおよび/または他の成長因子例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子、塩塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩、緩衝液例えば、HEPES、ヌクレオチド例えば、アデノシンおよびチミジン、抗体例えば、GentamycinTM薬、微量元素ミクロモル範囲内の最終濃度で、通常、存在する、無機化合物と定義する、およびグルコースまたは等価エネルギー源を補足することができる。当業者に知られている他のいずれかの必要補足物を適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば温度およびpHなどは、発現のために選択される宿主で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。9抗体の精製組換え法を用いる場合、抗体は、ペリプラスム間隙内で細胞内生産することができ、または微生物培養物からのものを含む培地に直接分泌することができる。抗体を細胞内生産する場合、第一工程として、例えば遠心分離または限外濾過により、特定の破壊組織片、宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか、を除去する。Betteretal.Science240:1041-10431998;ICSUShortReports10:1051990;およびProc.Natl.Acad.Sci.USA90:457-4611993には、大腸菌のペリプラスム間隙に分泌される抗体の単離手順が記載されている[Carteretal.,Bio/Technology10:163-1671992]も参照。微生物細胞または哺乳動物細胞から調製した抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、好ましい精製法は、親和性クロマトグラフィーである。親和性リガンドとしてのプロテインAの適性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンFcドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインAは、ヒトγ1、γ2またはγ4重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができるLindmarketal.,J.Immunol.Meth.62:1-131983。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプに、およびヒトγ3に推奨されているGussetal.,EMBOJ.5:156715751986。親和性リガンドを結合させる基質は、最も多くの場合、アガロースであるが、他の基質を利用することもできる。細孔制御ガラスまたはポリスチレンビニルベンゼンなどの機械的に安定な基質により、アガロースで達成することができるより早い流速および短い加工時間が可能となる。抗体が、CH3ドメインを含む場合、BakerbondABXTM樹脂J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.が精製に有用である。回収すべき抗体によっては、タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラムでの濾過、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンHAROSETMでのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂例えば、ポリアスパラギン酸カラムなどでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈降法も利用することができる。キメラ抗体およびヒト化抗体キメラ抗体またはヒト化抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりヒトにおける免疫原性が低いため、はるかに低い過敏症リスクでヒトの処置に使用することができる。従って、これらの抗体が、ヒトへのインビボ投与を含む治療用途に好ましいこともある。マウスモノクローナル抗体の可変Igドメインが、ヒト定常Igドメインに融合しているキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野において知られている標準的な手順を用いて調製することができるMorrison,S.L.,etal.1984ChimericHumanAntibodyMolecules;MouseAntigenBindingDomainswithHumanConstantRegionDomains,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6841-6855;およびBoulianne,G.L.,etal,Nature312,643-646.1984参照。一部のキメラモノクローナル抗体は、ヒトにおいて低免疫原性であることが証明されているが、それでもやはり、マウス可変Igドメインは、有意なヒト抗マウス応答に導くことができる。ヒト化抗体は、例えば、1ヒトフレームワークおよび定常領域に非ヒト相補鎖決定領域CDRをグラフトする方法当該技術分野においてCDRグラフティングによるヒト化と呼ばれるプロセス、またはあるいは、2全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によりヒト様表面でそれらを覆い隠すcloaking方法当該技術分野ではベニヤリングveneeringと呼ばれるプロセスを含む、さまざまな方法により獲得することができる。本発明におけるヒト化抗体は、ヒト化抗体とベニヤードveneered抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Jonesetal.,Nature321:5225251986;Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,81:685168551984;MorrisonandOi,Adv.Immunol.,44:65921988;Verhoeyeretal.,Science239:153415361988;Padlan,Molec.Immun.28:4894981991;Padlan,Molec.Immunol.313:1692171994;およびKettleborough,C.A.etal.,ProteinEng.47:773831991に開示されており、前記各文献は、本明細書に参考として組み込まれている。特に、齧歯動物抗体は、単独でまたは結合体としてヒトに繰り返しインビボ投与すると、その受容者に齧歯動物抗体に対する免疫応答、いわゆるHAMA応答ヒト抗マウス抗体を生じさせる。HAMA応答は、反復投薬が必要な場合、その薬剤の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性は、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーでの抗体の科学的修飾によって、またはその抗体結合構造をよりヒト様にするように遺伝子操作する方法を使用することによって、低下させることができる。例えば、CEAと結合する齧歯動物抗体の可変ドメインについての遺伝子配列でヒト骨髄腫タンパク質の可変ドメインを置換し、そのようにして組換えキメラ抗体を生産することができる。これらの手順は、欧州特許第194276号、同第0120694号、同第0125023号、同第0171496号、同第0173494号および国際公開パンフレット第86/01533号において詳述されている。あるいは、齧歯動物抗体のCDRの遺伝子配列を単離または合成し、それらで相同ヒト抗体遺伝子の対応する配列領域を置換して、元の齧歯動物抗体の特異性を有するヒト抗体を生産することができる。これらの手順は、欧州特許第023940号、国際公開パンフレット第90/07861号および同第91/09967号に記載されている。あるいは、齧歯動物抗体の可変ドメインの多数の表面残基を相同ヒト抗体上で通常見出せる残基に交換して、残基の表面ベニヤveneerを有する、従って、人体に自己として認識されるであろう、齧歯動物抗体を生産することができる。これらのアプローチは、Padlanetal.,1991Mol.Immunol.28,489により実証されている。CDRグラフティングは、マウス重鎖および軽鎖可変Igドメインからの6つのCDRのうちの1つ以上を、ヒト可変Igドメインの適切な4つのフレームワーク領域に導入することを含み、CDRグラフティングとも呼ばれる。この技法Riechmann,L.,etal.,Nature332,3231988は、足場として保存フレームワーク領域FR1-FR4を利用して、抗原との主接触物であるCDRループを支持する。しかし、CDRグラフティングの不利点は、フレームワーク領域のアミノ酸が、抗原架橋の一因となり得るため、およびCDRループのアミノ酸が、2つの可変Igドメインの会合に影響を及ぼし得るため、元のマウス抗体より実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体を生じ得る点である。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も近似しているヒトフレームワーク領域を選択することによって、および抗原結合部位のコンピューターモデリングを利用したそのフレームワークまたはCDR内の1つのアミノ酸に対する部位特異的突然変異誘導例えば、Co,M.S.,etal.,1994,J.Immunol.152,2968-2976によって、CDRグラフティング技法を改善することができる。抗体をヒト化する一つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖配列とヒト重鎖および軽鎖配列とのアラインメントを行うこと、そうしたアラインメントを基に非ヒトフレームワークを選択し、ヒトフレームワークで置換すること、分子モデルを調製して、そのヒト化配列の立体配座を予測し、親抗体の立体配座と比較することを含む。このプロセスの後、そのヒト化配列モデルの予測立体配座が、親非ヒト抗体の非ヒトCDRの立体配座に厳密に近づくまで、CDRの構造を妨げるCDR領域内の残基の復帰突然変異を繰り返し行う。こうしたヒト化抗体は、例えばAshwellレセプターによる取り込みおよびクリアランスを助長するようにさらに誘導化してもよい例えば、米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号参照;これらの特許は、本明細書に参考として組み込まれている。合理的な設計によるマウスモノクローナル抗体の多数のヒト化が報告されている例えば、2002年7月11日発行の20020091240、国際公開パンフレット92/11018号、米国特許第5,693,762号および同第5,766,866号参照。アミノ酸配列変異体突然変異誘導に好ましい位置である抗体の一定の残基または領域を特定するための一つの有用な方法は、CunninghamandWellsScience,244,1081-10851989により記載されているように、アラニンスキャニング突然変異誘導と呼ばれる。この場合、ターゲット残基のうちの1つの残基またはターゲット残基のグループを特定し例えば、arg、asp、his、lysおよびgluなどの荷電残基、中性または負の電荷を有するアミノ酸最も好ましくはアラニンまたはポリアラニンにより置換して、抗原とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。次に、置換部位にまたは、に対してさらなるまたは他の変異体を導入することにより、その置換に対して官能基的感受性を示すアミノ酸位置をさらに正確にする。このように、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は、前もって定められるが、本質的には突然変異の性質を前もって定める必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の実行を分析するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘導をターゲットコドンまたは領域で行い、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。アミノ酸配列挿入物は、1つの残基から、100またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドにわたる長さのアミノおよび/またはカルボキシ末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、N末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグもしくはサルベージレセプターエピトープに融合した前記抗体抗体フラグメントを含むが挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、例えばN末端またはC末端における、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。用語エピトープ標識されたは、エピトープタグに融合した抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、そのエピトープに対する抗体を作ることができるエピトープを提供するために十分な残基を有するが、その抗体の活性に干渉しないように十分短い。エピトープタグは、好ましくは、そのエピトープに対する抗体が実質的に他のエピトープと交差反応しないように十分に一意的である。適するタグポリペプチドは、一般には少なくとも6のアミノ酸残基を有し、通常は約8~50の間のアミノ酸残基好ましくは約9~30の間の残基を有する。例には、fluHAタグポリペプチドおよびその抗体12CA5[Fieldetal.,Mol.Cell.Biol.8:2159-21651988];c-mycタグおよびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体[Evanetal.,Mol.Cell.Biol.512:3610-36161985];ならびに単純疱疹ウイルス糖タンパクDgDタグおよびその抗体[Paborskyetal.,ProteinEngineering36:547-5531990]が挙げられる。他の例示的なタグは、ニッケルキレート化を用いてそのように標識した化合物を単離することができる多ヒスチジン配列、一般にはヒスチジン残基数約6のものである。当該技術分野においてよく知られており、常用されている他のラベルおよびタグ、例えばFLAG登録商標タグEastmanKodak,Rochester,NYは、本発明に包含される。本明細書において用いる用語サルベージレセプター結合エピトープは、そのIgG分子のインビボ血清半減期を増加させる原因となるIgG分子例えば、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のFc領域のエピトープを指す。もう一つのタイプの変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、除去された抗体分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基、およびその場所に挿入された異なる残基を有する。超可変領もしくはCDR領域またはフレームワーク領域のいずれかにおける置換突然変異誘導も考えられる。保存的置換を表1に示す。最も保存的な置換は、好ましい置換の見出しのもとに見出せる。こうした置換が、生物活性の変化を生じさせない場合には、表1において例示的な置換と命名されている、またはアミノ酸クラスを参照して後でさらに説明するような、より実質的な変化を導入し、それらの産物をスクリーニングしてもよい。抗体の生物学的特性に関する実質的な修飾は、aその置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはらせん立体配座など、bターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、またはc側鎖のかさを維持しながら、それらの効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然残基は、共通の側鎖特性を基に、以下のグループに分けられる:1疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile:2中性親水性:cys、ser、thr;3酸性:asp、glu;4塩基性:asn、gln、his、lys、arg;5鎖の配向に影響する残基:gly、pro;および6芳香族:trp、tyr、phe。保存的置換は、アミノ酸の、そのクラスの別のメンバーでの置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスのメンバーでの置換を含む。モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、HumanEngineeredTM抗体または変異抗体の固有立体配座の維持に関与しないいずれかのシステイン残基を、一般にはセリンで置換して、その分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を抑制することもできる。逆に言えば、システイン結合複数を含むを抗体に追加して、その安定性を改善することができる特に、その抗体が、Fvフラグメントなどの抗体フラグメントである場合。親和性成熟は、親抗体のCDR内に置換を有する抗体変異体の調製およびスクリーニング、ならびにその親抗体を基準にして改善された生物学的特性、例えば結合親和性を有する変異体の選択を含む。こうした置換変異体を調製するための適便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟である。簡単に言えば、幾つかの超可変領域部位例えば、6~7部位を突然変異させて、各部位で可能なアミノ酸置換全てを発生させる。そのようにして調製した抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたM13の遺伝子III産物への融合体として糸状ファージ粒子から一価の様式で提示される。提示されたファージを、その後、それらの生物活性例えば、結合親和性についてスクリーニングする。アラニンスキャニング突然変異誘導を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または加えて、その抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して、その抗体と抗原の間の接点を特定することは、有益であり得る。こうした接触残基および隣接残基は、本明細書において詳しく述べる技法による置換の候補である。こうした変異体を調製していたら、本明細書において説明するように変異体のパネルをスクリーニングし、1つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。抗体変異体は、親抗体を基準にして修飾されたグリコシル化パタン、例えばその抗体において見出せる炭水化物部分1つもしくはそれ以上の欠失、および/またはその抗体中に存在しないグリコシル化部位1つ以上の追加を有する。抗体のグリコシル化は、典型的にはN連結またはO連結のいずれかである。N-連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-トレオニンこの場合のXは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸であるは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合についての認識配列である。ポリペプチド中のこれらのいずれかのトリペプチド配列の存在が、潜在的グリコシル化部位を作る。従って、これらのトリペプチド配列のうちの1つ以上を含有するようにアミノ酸配列を修飾することにより、N-連結グリコシル化部位を抗体に追加することができる。O-連結グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸に対する糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの1つの結合を指し、前記ヒドロキシアミノ酸は、最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリシンを使用することもできる。O-連結グリコシル化部位は、元の抗体の配列に1つ以上のセリンまたはトレオニン残基を挿入するか置換することにより、抗体に追加することができる。例として、図4Aの41~43位でのRX1のアミノ酸NGSは、保持され得る。あるいは、アミノ酸41と42NGのみが、保持され得る。元来、HumanEngineeredTM抗体のアミノ酸変異体は、例えば、図19Bから22Bのいずれかにあるような重鎖または軽鎖いずれかの元のHumanEngineeredTM抗体アミノ酸配列との少なくとも60の、さらに好ましくは少なくとも80、さらに好ましくは少なくとも85、さらに好ましくは少なくとも90、最も好ましくは少なくとも95例えば、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および100を含むのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。本明細書では、この配列に関する同一性または相同性は、配列をアラインし、最大の配列同一性度を達成するために必要に応じてギャップを導入した後のHumanEngineeredTM残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義し、上の表1で定義したようないかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない。N末端、C末端もしくは内部の伸張、欠失、または抗体配列への挿入は、配列同一性または相同性に影響を与えると考えないことにする。従って、配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似点を比較するために一般に用いられている標準的な方法により判定することができる。BLASTまたはFASTAなどのコンピュータプログラムを使用して、2つのポリペプチドを、一方もしくは両方の配列の全長に沿って、または一方もしくは両方の配列の所定の位置に沿ってそれらそれぞれのアミノ酸が最適にマッチングするようにアラインする。これらのプログラムは、デフォルトオープニングペナルティーとデフォルトギャップペナルティーを規定し、またPAM250[標準スコアリングマトリックス;Dayhoffetal.,inAltasofProteinSequenceandStructure,vol.5,supp.31978参照]などのスコアリングマトリックスをそのコンピュータプログラムと共に使用することができる。その後、例えば、同一度を次のように計算することができる:同一マッチの総数に100を掛け、次にそれを、マッチしたスパン内の長いほうの配列の長さと2つの配列をアラインするために長いほうの配列に導入したギャップの数との合計で割る。抗体の他の修飾も考えられる。例えば、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば癌の処置における本抗体の有効性を強化することが望ましいこともある。例えば、システイン残基複数を含むをFc領域に導入し、それによってこの領域における鎖内ジスルフィド結合の形成を可能ならしめることができる。このようにして調製されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、ならびに/または補体媒介細胞致死および抗体依存性細胞毒性作用ADCCの増大を有し得る。Caronetal.,J.ExpMed.176:1911-11951992およびShopes,B.J.Immunol.148:2918-29221992参照。Wolffetal.,CancerResearch53:2560-25651993に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して、抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体を調製することもできる。あるいは、二重Fc領域を有し、その結果、強化された補体溶解およびADCC能力を有し得る抗体を設計することができる。Stevensonetal.,Anti-CancerDrugDesign3:219-2301989参照。加えて、CDR内の配列が、抗体をMHCクラスIIに結合させ、望ましくないヘルパーT細胞応答を誘導し得ることが証明された。保存的置換は、抗体が結合活性を保持することを可能にし、しかもなお、望ましくないT細胞応答を誘導する能力を失わせることができる。マウス可変領域をヒトγ1、γ2、γ3およびγ4定常領域と連結させたキメラ抗体が記載されている、Steplewskietal.,ProcNatlAcadSciUSA.1988;8513:4852-6これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれているも参照のこと。本発明の特定の実施形態では、インタクトな抗体ではなく抗体フラグメントを使用して、例えば腫瘍の進入を増加させることが望ましいことがある。この場合、抗体フラグメントを修飾して、その血清半減期を増させること、例えば、PEGまたは他の水溶性ポリマー多糖類ポリマーを含むなどの分子を抗体フラグメントに付加させて、半減期を増させることが望ましいことがある。これは、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合性エピトープを組み込むことにより例えば、抗体フラグメントの適切な領域の突然変異により、または例えばDNAもしくはペプチド合成によって、そのエピトープをペプチドタグに組み込み、その後、それを抗体フラグメントのいずれかの末端または中間に融合させることにより、達成することもできる国際公開パンフレット第96/32478号参照。サルベージレセプター結合性エピトープは、Fcドメインの1つまたは2つのループからの1つ以上のいずれかのアミノ酸残基が、抗体フラグメントの類似の位置に移入される領域を、好ましくは構成する。さらにいっそう好ましくは、Fcドメインの1つまたは2つのループからの3つ以上の残基が移入される。さらにいっそう好ましくは、このエピトープは、例えば、IgGのFc領域のCH2ドメインから取られ、抗体のCH1、CH3もしくはVH領域、またはそうした領域の1つより多くに移入される。あるいは、このエピトープは、Fc領域のCH2ドメインから取られ、抗体フラグメントのC.sub.L領域もしくはV.sub.L領域、または両方に移入される。Fc変異体およびサルベージレセプターとのそれらの相互作用が記載されている、国際出願国際公開パンフレット第97/34631号、および同第96/32478号も参照のこと。従って、本発明の抗体は、ヒトFc部分;ヒトコンセンサスFc部分;あるいはFcサルベージレセプターと相互作用する能力を保持するそれらの変異体ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾されているか、除去されている変異体、および/またはN末端に1つのmetが付加している変異体、および/またはN末端の20のアミノ酸のうちの1つ以上が除去されている変異体、および/またはC1q結合部位などの補体と相互作用する領域が除去されている変異体、および/またはADCC部位が除去されている抗体を含むを含み得る[例えば、Molec.Immunol.295:633-91992参照]。以前の研究により、FcRについての、主としてIgG残基233~239から成るより低いヒンジ領域に対するヒトおよびマウスIgG上の結合部位が、マッピングされた。他の研究により、さらなる広いセグメント、例えば、ヒトFcレセプターIについてのGly316~Lys338、ヒトFcレセプターIIIについてのLys274~Arg301およびTyr407~Arg416が提案され、またはより低いヒンジの外側の少数の特異的残基、例えば、マウスFcレセプターIIと相互作用するマウスIgG2bについてのAsn297およびGlu318が発見された。ヒトFcレセプターIIIAを有するヒトIgG1Fcフラグメントの3.2Å結晶構造の報告には、FcレセプターIIIAへの結合に関与するものとして、IgG1残基Leu234~Ser239、Asp265~Glu269、Asn297~Thr299およびAla327~Ile332が明確に描写されている。より低いヒンジLeu234~Gly237に加えて、IgGCH2ドメインループFG残基326~330およびBC残基265~271における残基は、FcレセプターIIAへの結合に一定の役割たし得ることが、結晶構造を基に提案された。Shieldsetal.,J.Biol.Chem.,2769:6591-66042001参照これは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている。Fcレセプター結合部位内の残基の突然変異は、結果として、エフェクター機能の変化、例えば、ADCCもしくはCDC活性の変化、または半減期の変化をもたらす。上に記載したように、潜在的突然変異には、アラニンでの置換、保存的置換、非保存的置換、または異なるIgGサブクラスからの同じ位置の対応するアミノ残基での置換例えば、IgG1残基の、その位置における対応するIgG2残基での置換をはじめとする、一つ以上の残基の挿入、欠失または置換が挙げられる。Shieldsらは、全ヒトFcレセプターへの結合に関与するIgG1残基が、ヒンジに隣接するCH2ドメイン内に位置し、次のような2つのカテゴリーに分類されると報告している:1全FcRと直接相互作用することができる位置にはLeu234~Pro238、Ala327およびPro329ならびにことによるとAsp265が挙げられる;2炭水化物の特性または位置に影響を及ぼす位置には、Asp265およびAsn297が挙げられる。FcレセプターIIへの結合に影響を及ぼす追加のIgG1残基は、次のとおりである:最も大きな影響Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298、およびより小さい影響His268、Asn276,His285、Asn286、Lys290、Glu295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322,Lys326,Pro331、Ser337、Ala339、Ala378およびLys414。A327Q、A327S、P329A、D265AおよびD270Aは、結合を減少させた。全FcRについて上で特定した残基に加えて、FcレセプターIIIAへの結合を40またはそれ以上減少させるさらなるIgG1残基は、次のとおりである:Ser239、Ser267Glyのみ、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338およびAsp376。FcRIIIAへの結合を改善した変異体には、T256A、K290A、S298A、E333A、K334AおよびA339Tが挙げられる。Lys414は、FcRIIAおよびFcRIIBに対する結合の40減少を示し、Arg416は、FcRIIAおよびFcRIIIAに対する結合の30減少を示し、Gln419は、FcRIIAへの結合の30減少およびFcRIIBへの結合の40減少を示し、ならびにLys360は、FcRIIIAへの結合の23改善を示した。Prestaetal.,Biochem.Soc.Trans.200130,487-490も参照。例えば、米国特許第6,194,551号その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、ヒトIgGFc領域内のアミノ酸位置329、331または322Kabatの番号付けを使用における突然変異を含有し、これらのうちの幾つかはC1q結合またはCDC活性の低下を提示する、変化したエフェクター機能を有する異性体が記載されている。もう一つの例として、米国特許第6,737,056号その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、ヒトIgGFc領域内のアミノ酸位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439Kabatの番号付けを使用における突然変異を含有し、これらのうちの幾つかはADCCまたはCDC活性の低下に関連したレセプタープロフィールを提示する、変化したエフェクターまたはFc-γ-レセプター結合を有する変異体が記載されている。これらのうち、アミノ酸位置238、265、269、270、327または329における突然変異によりFcRIへの結合の減少が開始し、アミノ酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438または439における突然変異によりFcRIIへの結合の減少が開始し、およびアミノ酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435または437における突然変異によりFcRIIIへの結合の減少が開始する。米国特許第5,624,821号その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、マウス抗体のClq結合活性は、重鎖のアミノ酸残基318、320および322を突然変異させることにより変化させることができること、および残基297Asnの置換の結果として溶解活性が除去されることが報告されている。米国特許出願公開第20040132101号その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、アミノ酸位置240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328もしくは332Kabatの番号付けを使用または位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299,313、325、327、328、329、330もしくは332Kabatの番号付けを使用における突然変異を有し、それらのうちの位置234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330または332における突然変異により、ADCC活性が減少し得るか、Fcγレセプターへの結合が減少し得る変異体が記載されている。Chappeletal.,ProcNatlAcadSciUSA.1991;8820:9036-40その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、IgG1の細胞親和活性がその重鎖CH2ドメインの固有特性であることが、報告されている。IgG1のアミノ酸残基234~237のいずれかにおける単点突然変異は、その活性を有意に低下させるか、完全に破壊した。全結合活性を回復するためには、IgG2およびIgG4への全てのIgG1残基234-237LLGGの置換が必要であった。全ELLGGP配列残基233~238を含有するIgG2抗体は、野生型IgG1より活性であることが、観察された。Isaacsetal.,JImmunol.1998;1618:3862-9その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、FcγR結合に重要なモチーフ内での突然変異グルタメート233からプロリンへ、ロイシン/フェニルアラニン234からバリンへ、およびロイシン235からアラニンへがターゲット細胞の消耗を完全に抑制したことが、報告されている。グルタメート318からアラニンへの突然変異は、マウスIgG2bのエフェクター機能を消去し、ヒトIgG4の効力も低下させた。Armouretal.,MolImmunol.2003;409:585-93その全文、本明細書に参考として組み込まれているでは、野生型IgG1より少なくとも10倍低い効率で活性化レセプター、FcγRIIa、と反応するが、阻害性レセプター、FcγRIIb、へのその結合は4倍しか低減されないIgG1変異体が特定されている。突然変異は、アミノ酸233~236の領域内で、ならびに/またはアミノ酸位置327、330および331でなされた。国際公開パンフレット第99/58572号も参照その全文、本明細書に参考として組み込まれている。Xuetal.,JBiolChem.1994;2695:3469-74その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、IgG1Pro331からSerへの突然変異により、C1q結合が著しく減少し、溶解活性が実質的に消去されたことが、報告されている。対照的に、IgG4におけるSer331のProでの置換は、そのIgG4Pro331変異体に一部の溶解活性40をもたらした。Schuurmanetal,.MolImmunol.2001;381:1-8その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、重鎖間架橋形成に関与するヒンジシステインの1つ、Cys226の突然変異が、結果としてより安定な重鎖間架橋を生じさせることが、報告されている。IgG4ヒンジ配列Cys-Pro-Ser-CysからIgG1ヒンジ配列Cys-Pro-Pro-Cysへの突然変異も、重鎖間の共有結合性相互作用を著しく安定させた。Angaletal.,MolImmunol.1993;301:105-8その全文、本明細書に参考として組み込まれているには、IgG4におけるアミノ酸位置241のセリンからIgG1およびIgG2のその位置で見出せるプロリンへの突然変異により、均質抗体の生産が導かれ、ならびに元のキメラIgG4と比較して血清半減期の延長および組織分布の改善が導かれたことが、報告されている。ヒト抗体およびHumanEngineeredTM抗体HumanEngineeringTM抗体可変ドメインのHumanEngineeringTMは、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Studnickaにより説明された[例えば、Studnickaらの米国特許第5,766,886号;Studnickaetal.ProteinEngineering7:805-8141994参照]。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクが割り当てられた。アミノ酸置換は、次の3つのリスクカテゴリーのうちの一つに分類される:1低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破壊する機会が最も少ないものであり;2中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり、3高リスク残基は、結合にまたは抗体構造の維持に重要であるものであり、ならびに抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が一般には低リスク位置であったとしても、少なくとも中リスク変更での修飾であると一般に考えられる。齧歯動物抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境において免疫原性を低下させる可能性が高いと判定された位置のヒトアミノ酸を置換するように、HumanEngineeredTMされる。低リスク位置にあり、且つ、この方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、齧歯動物可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことによって特定される。個々のVHもしくはVL配列またはヒトコンセンサスVHもしくはVL配列あるいは個々のまたはコンセンサスヒト生殖細胞系配列をはじめとするあらゆるヒト可変領域を使用することができる。いずれかの数の低リスク位置または全ての低リスク位置におけるアミノ酸残基を変更することができる。例えば、アラインされるマウスおよびヒトアミノ酸残基が異なる各低リスク位置でのアミノ酸修飾は、その齧歯動物残基をヒト残基で置換することにより導入される。あるいは、全ての低リスク位置およびいずれかの数の中リスク位置におけるアミノ酸残基を変更することができる。理想的には、最少の免疫原性を達成するために、全ての低および中リスク位置を齧歯動物配列からヒト配列に変更する。修飾された変性重鎖および/または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子が考えられ、それをヒトγ重鎖および/またはκ軽鎖定常領域に連結させる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域はいずれも、IgAいずれかのサブクラスのもの、例えば、IgA1もしくはIgA2、IgD、IgE、IgGいずれかのサブクラスのもの、例えば、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4またはIgMをはじめとするHumanEngineeredTM抗体可変領域と併用することができる。ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞などの宿主細胞に導入し、結果として生じる組換え免疫グロブリン産物を得、特性付けする。トランスジェニック動物からのヒト抗体内在性免疫グロブリン生産を有さず、ヒト免疫グロブリン座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用して、M-CSFに対するヒト抗体を生産することもできる。例えば、国際公開パンフレット第98/24893号には、ヒトIg座を有するトランスジェニック動物が開示されており、この場合の動物は、内在性重鎖および軽鎖座の不活性化のため、機能的な内在性免疫グロブリンを生産しない。国際公開パンフレット第91/741号には、免疫原に対する免疫応答をマウントすることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主も開示されており、この場合の抗体は、霊長類定常および/または可変領域を有し、ならびにこの場合の内在性免疫グロブリンをコードしている座は、置換されているか、不活性化されている。国際公開パンフレット第96/30498号には、哺乳動物において免疫原座を修飾するための、例えば、全てまたは一部の定常または可変領域を置換して修飾抗体分子を形成するための、Cre/Lox系の使用が開示されている。国際公開パンフレット第94/02602号には、不活性化された内在性Ig座および機能的ヒトIg座を有する非ヒト哺乳動物宿主が開示されている。米国特許第5,939,598号には、内在性重鎖を欠き、ならびに1つ以上の異種定常領域を含む外在性免疫グロブリン座を発現するトランスジェニックマウスを作る方法が開示されている。上に記載したトランスジェニック動物を使用することにより、免疫応答を生じさせて抗原分子を選択することができ、ならびに抗体生産細胞をその動物から除去し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生産に使用することができる。免疫化プロトコルおよびアジュバントなどは、当該技術分野において知られており、例えば国際公開パンフレット第96/33735号に記載されているようなトランスジェニックマウスの免疫化に使用される。この出版物には、IL6、IL8、TNFa、ヒトCD4、Lセレクチン、gp39、および破傷風毒素をはじめとする様々な抗原分子に対するモノクローナル抗体が開示されている。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理作用を阻害または中和する能力について検査することができる。国際公開パンフレット第96/33735号には、IL-8で免疫し、IL-8により誘導される好中球機能をブロックしたトランスジェニックマウスの免疫細胞に由来するIL-8に対するモノクローナル抗体が開示されている。トランスジェニック動物を免疫するために使用される抗原に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体も、国際公開パンフレット第96/34096号、ならびに米国特許出願第20030194404号および同第20030031667号に開示されている。Jakobovitsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:25511993;Jakobovitsetal.,Nature,362:255-2581993;Bruggermannetal.,YearinImmuno.,7:331993;米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号、および同第5,545,807号;ならびに米国特許出願第20020199213号も参照。米国特許出願第20030092125号には、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法が開示されている。ヒト抗体は、インビトロ活性化B細胞によって生じさせることもできる米国特許第5,567,610号および同第5,229,275号参照。ファージディスプレイ法からのヒト抗体組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを調製するための技法の開発および線状バクテリオファージの表面でのコード化抗体フラグメントの提示は、ヒト抗体を直接調製する手段をもたらした。ファージ法により生産される抗体は、細菌において抗原結合フラグメント通常はFvまたはFabフラグメントとして生産され、それ故、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の2つの戦略のうちの1つにより導入することができる:フラグメントを操作して、哺乳動物細胞における発現のために完全な抗体にするか、エフェクター機能を誘導することができる第二結合部位を有する二特異性抗体フラグメントにすることができる。典型的に、抗体のFdフラグメントVH-CH1および軽鎖VL-CLをPCRにより別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリの中でランダムに組み換え、それをその後、特定の抗原への結合のために選択することができる。Fabフラグメントをそのファージ表面で発現させる。すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結させる。従って、抗原結合によるFabの選択と共に、Fabコード化配列を選択し、それを、その後、増幅させることができる。数ラウンドの抗原結合および再増幅パニングと呼ばれる手順により、その抗原に特異的なFabを濃縮し、最終的には単離する。1994年、誘導選択guidedselectionと呼ばれる抗体のヒト化のためのアプローチが説明された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためにファージディスプレイ法の力を利用するJespers,L.S.,etal.,Bio/Technology12,899-9031994。このため、マウスモノクローナル抗体のFdフラグメントをヒト軽鎖ライブラリとの組合せで提示することができ、得られたハイブリッドFabライブラリを、その後、抗原を用いて選択することができる。それによって、マウスFdフラグメントは、選択を導くためのテンプレートをもたらす。その後、選択されたヒト軽鎖をヒトFdフラグメントライブラリと組み合わせる。得られたライブラリの選択により、ヒトFabが完全に得られる。ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を誘導するための様々な手順が記載されている例えば、Hoogenboometal.,J.Mol.Biol.,227:3811991;Marksetal.,J.Mol.Biol,222:581-5971991;米国特許第5,565,332号および同第5,573,905号;Clackson,T.,andWells,J.A.,TIBTECH12,173-1841994参照。特に、ファージディスプレイライブラリから誘導された抗体のインビボ選択および進化は、強力なツールとなってきたBurton,D.R.,andBarbasIII,C.F.,Adv.Immunol.57,191-2801994;およびWinter,G.,etal.,Annu.Rev.Immunol.12,433-4551994;米国特許出願番号第20020004215号および国際公開パンフレット第92/01047号;2003年10月9日発行の米国特許出願番号第20030190317号および米国特許第6,054,287号;米国特許第5,877,293号参照。Watkins,ScreeningofPhage-ExpressedAntibodyLibrariesbyCaptureLift,MethodsinMolecularBiology,AntibodyPhageDisplay:MethodsandProtocols178:187-193、および2003年3月6日発行の米国特許出願番号第200120030044772号には、キャプチャーリフト固体支持体上への候補結合分子の固定化を含む方法により、ファージ発現抗体ライブラリまたは他の結合分子をスクリーニングする方法が記載されている。抗体生産物は、本明細書におけるスクリーニング方法と題するセクションで説明するようなアッセイを使用して、または当該技術分野において知られているいずれかの適するアッセイを使用して、活性および本発明の処置方法における適性についてスクリーニングすることができる。他の共有結合修飾抗体の共有結合修飾も、本発明の範囲に包含される。これらは、適用可能ならば、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により行うことができる。抗体の他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはNもしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬と抗体の標的アミノ酸残基を反応させることによって、分子に導入される。最も一般的には、システイン残基をα-ハロアセテートおよび対応するアミン、例えばクロロギ酸またはクロロアセトアミド、と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、.アルファ.-ブロモ-β-5-イミドゾイルプロピオン酸、クロロアセチルリン酸塩、N-アルキルマレイミド、二硫化3-ニトロ-2-ピリジル、二硫化メチル2-ピリジル、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。ヒスチジル残基は、pH5.5~7.0でのジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。この物質が、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。臭化p-ブロモフェナシルも有用である。この反応は、好ましくは、pH6.0で、0.1Mカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニルおよびアミの末端残基は、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの物質の誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転せる効果を有する。アルファ.-アミノ含有残基の誘導体化に適する他の試薬には、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサル、クロロ水素化ホウ素ピリドキサル、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。アルギニル残基は、従来の1つまたは幾つかの試薬、中でもフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリン、との反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のpKaが高いため、その反応をアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンの基ならびにアルギニンイプシロン-アミノ基と反応することができる。チロシル残基の特異的修飾を行うことができ、特に興味深いのは、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入である。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、O-アセチルチロシル化学種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。ラジオイムノアッセイにおいて使用するために、125Iまたは131Iを使用してチロシル残基をヨウ化して標識タンパク質を調製する。カルボキシ側基アスパルチルまたはグルタミルは、カルボジイミドR-N.dbd.C.dbd.N-R’との反応により選択的に修飾され、この場合のRおよびR’は、異なるアルキル基、例えば、1-シクロヘキシル-3-2-モルホリニル-4-エチルカルボジイミドまたは1-エチル-3-4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチルカルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に転化させる。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化して、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にする。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化する。これらの残基の脱アミノ化形態は、本発明の範囲に包含される。他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の.アルファ.-アミノ基のメチル化T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,pp.79-861983、N末端アミンのアセチル化、ならびにいずれかのC末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。もう一つのタイプの共有結合修飾は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングを含む。これらの手順は、N-またはO-連結グリコシル化のためにグリコシル化能力を有する宿主細胞において抗体を生産する必要がない点で有利である。使用するカップリング様式に依存して、糖複数を含むを、aアルギニンおよびヒスチジン、b遊離カルボキシル基、c遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、d遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの、e芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの、またはfグルタミンのアミノ基に結合させることができる。これらの方法は、1987年9月11日発行の国際公開パンフレット第87/05330号、およびAplinandWriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259-3061981に記載されている。抗体上に存在するいずれの炭水化物部分の除去も、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への抗体の暴露を必要とする。この処理の結果、連結糖N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミンを除く大部分または全ての糖が切断されるが、抗体はインタクトのままである。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin,etal.Arch.Biochem.Biophys.259:521987およびEdgeetal.Anal.Biochem.,118:1311981により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraetal.Meth.Enzymol.138:3501987により記載されているように、様々なエンド-およびエキソ-グリコシダーゼの使用により達成することができる。抗体のもう一つのタイプの共有結合修飾は、様々な非タンパク質系ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、または多糖類ポリマー例えば、デキストラン、のうちの1つに抗体を連結させることを含む。こうした方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号、同第4,179,337号、同第4,766,106号、同第4,179,337号、同第4,495,285号、同第4,609,546号、または欧州特許第315456号を参照のこと。遺伝子療法適切な細胞への治療用抗体の送達は、物理的DNA移入法例えば、リポソームもしくは化学的治療の使用またはウイルスベクター例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスもしくはレトロウイルスの使用によるものをはじめとする当該技術分野において知られているいずれかの適するアプローチの使用による、エクスビボ、インサイチューまたはインビボでの遺伝子療法によって行うことができる。例えば、インビボ療法については、所望の抗体をコードする核酸を単独でまたはベクター、リポソームもしくは沈殿物と併用で被験体に直接注射することができ、一部の実施形態では、抗体化合物の発現が望まれる部位に注射することができる。エクスビボ治療については、被験体の細胞を除去し、核酸をこれらの細胞に導入し、修飾された細胞を被験体に直接戻すか、例えば、多孔質膜に内包させ、それをその患者に移植する。例えば、米国特許第4,892,538号および同第5,283,187号参照。生細胞への核酸の導入に利用できる様々な技法がある。これらの技法は、その核酸がインビトロで培養細胞に移入されるのか、またはインビボで所定の宿主の細胞に移入されるのかによって変わる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適する技法には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE-デキストランおよびリン酸カルシウム沈降法の使用が挙げられる。核酸のエクスビボ送達に一般に使用されるベクターは、レトロウイルスである。他のインビボ核酸移入技法には、ウイルスベクター例えば、アデノウイルス、単純疱疹I型ウイルスまたはアデノ随伴ウイルスおよび脂質に基づく系でのトランスフェクションが挙げられる。核酸およびトランスフェクション作用因子は、場合によっては微粒子に関連する。例示的なトランスフェクション作用因子は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、第四アンモニウム両親媒性DOTMAGIBCO-BRLによりLipofectinとして市販されている、臭化ジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムFelgneretal,1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,7413-7417;Maloneetal.1989Proc.NatlAcad.Sci.USA866077-6081;ペンダントトトリメチルアンモニウムヘッドを有する親油性グルタミン酸ジエステルItoetal.1990Biochem.Biophys.Acta1023,124-132;代謝性親脂質、例えば、カチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンDOGS、Transfectam,PromegaおよびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミンDPPESJ.P.Behr1986TetrahedronLett.27,5861-5864;J.P.Behretal.1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6982-6986;代謝性第四アンモニウム塩DOTB、メチル硫酸N-1-[2,3-ジオレイオイルオキシ]プロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムDOTAPBoehringerMannheim、ポリエチレンイミンPEI、ジオレオイルエステル、ChoTB、ChoSC、DOSCLeventisetal.1990Biochim.Inter.22,235-241;3ベータ[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDC-Chol、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE/3ベータ[N-N’,N’-ジメチルアミノエタン-カルバモイル]コレステロールDC-Cholの1対1混合物Gaoetal.,1991Biochim.Biophys.Acta1065,8-14、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミンBehretal.,BioconjugateChem,1994,5:382-389、親油性ポリリシンLPLLZhouetal.,1991Biochim.Biophys.Acta939,8-18、過剰なホスファチジルコリン/コレステロールを伴う水酸化[[1,1,3,3-テトラメチルブチルクレ-ゾキシ]エトキシ]エチル]ジメチルベンジルアンモニウム水酸化DEBDABallasetal.,1988Biochim.Biophys.Acta939,8-18、臭化セチルトリメチルアンモニウムCTAB/DOPE混合物Pinnaduwageetal,1989Biochim.Biophys.Acta985,33-37、グルタミン酸TMAGと、DOPE、CTAB、DEBDA、臭化ジドデシルアンモニウムDDAB、およびホスファチジルエタノールアミンとの混合物でのステアリルアミンとの親油性ジエステルRoseetal.,1991Biotechnique10,520-525、DDAB/DOPETransfectACE,GIBCOBRL、ならびに脂質を有するオリゴガラクトースが挙げられる。移入効率を上昇させる例示的なトランスフェクションエンハンサー作用因子には、例えば、DEAE-デキストラン、ポリブレン、リソソーム破断ペプチドOhmoriNIetal,BiochemBiophysResCommunJun.27,1997;2353:726-9、コンドロイタンに基づくプロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリシンPollardHetal.JBiolChem,199827313:7507-11、インテグリン結合ペプチドCYGGRGDTP、線状デキストラン九糖類、グリセロール、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシド間連結につながれているコレステリル基Letsinger,R.L.1989ProcNatlAcadSciUSA86:17:6553-6、リソホスファチド、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、および1-オレオイルリソホスファチジルコリンが挙げられる。状況によっては、核酸含有ベクターをターゲット細胞に向ける作用因子で核酸を送達することが望ましいことがある。こうしたターゲッティング分子には、ターゲット細胞上の細胞膜タンパク質に特異的な抗体、またはターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドが挙げられる。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞膜タンパク質に結合するタンパク質をターゲッティングに、および/または取り込みの助長に使用することができる。こうしたタンパク質の例には、特定の細胞タイプのほうに向くカプシドタンパク質およびそれらのフラグメント、サイクリング中に内在化されるタンパク質に対する抗体、ならびに細胞内局在化をターゲットにし、細胞内半減期を増させるタンパク質が挙げられる。他の実施形態では、レセプター媒介エンドサイトーシスを用いることができる。こうした方法は、例えば、Wuetal.,1987またはWagneretal.,1990に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの総説については、Anderson1992参照。国際公開パンフレット第93/25673号およびそこに引用されている参考文献も参照。遺伝子療法技術のさらなる総説については、Friedmann,Science,244:1275-12811989;Anderson,Nature,supplementtovol.392,no6679,pp.25-301998;Verma,ScientificAmerican:68-841990;およびMiller,Nature,357:4554601992参照。スクリーニング方法有効な療法は、意図した効果を生じ、有意な毒性がない薬剤の特定に依存する。抗体は、当該技術分野において知られている方法により、結合親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ゲル-シフトアッセイ、ウエスタンブロット法、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、ELISAなどを使用することができ、これらは、例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology1999JohnWileySons,NYに記載されているこれは、その全文、本明細書に参考として組み込まれている。M-CSF上の所望のエピトープに結合する抗体例えば、M-CSFへのRX1、5H4、MC1および/またはMC3の結合を阻害するものについて最初にスクリーニングするために、Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane1988に記載されているようなルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。未知の抗体を、本発明のM-CSF特異性抗体へのM-CSFの結合を阻害するその能力により特性付けする、常用の競合結合アッセイも使用することができる。インタクトなM-CSF、そのフラグメント、または線状エピトープ、例えば、図12のM-CSFのアミノ酸98~105または図12のアミノ酸65~73もしくは138~144により表されるもの5H4またはMC3により認識されるM-CSFエピトープに対応するを使用することができる。エピトープマッピングは、Champeetal.,J.Biol.Chem.270:1388-13941995に記載されている。次にそれらの抗体を破骨細胞発生に対するそれらの影響について検査し、その後、動物に投与することが、さらに考えられる。癌転移に関連する骨損失の予防または処置に潜在的に有用な化合物は、様々なアッセイを使用してスクリーニングすることができる。例えば、候補拮抗薬を先ず培養細胞系で特性付けして、破骨細胞発生の誘導に関してM-CSFを中和するそれらの能力を判定することができる。こうした系には、マウス頭蓋冠骨芽細胞と脾臓細胞の共培養物Sudaetal.,Modulationofosteoclastdifferentiation.Endocr.Rev.13:6680,1992;MartinandUdagawa,TrendsEndocrinol.Metab.9:6-12,1998、マウス間質細胞系例えば、MC3T3-G2/PA6およびST2とマウス脾臓細胞の共培養物Udagawaetal.,Endocrinology125:180513,1989、およびST2細胞と骨髄細胞、抹消血管単核細胞または肺胞マクロファージの共培養物Udagawaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:72604,1990;Sasakietal.,CancerRes.58:4627,1998;Mancinoetal.,J.Surg.Res.100:18-24,2001を挙げることができる。いずれのM-CSF拮抗薬も不在の状態では、そうした共培養で作られた多核細胞は、破骨細胞の主要な基準、例えば、酒石酸耐性酸性ホスファターゼTRAP、破骨細胞のマーカー酵素活性、カルシトニンレセプター、p60C-STC、ビトロネクチンレセプター、ならびに骨および象牙質切片上に吸収ピットを作る能力を満たす。有効なM-CSF拮抗薬の存在により、こうした多核細胞の形成が阻害される。上記共培養系に加えて、破骨細胞発生を阻害する候補M-CSF抗体の能力は、間質細胞負含または骨芽細胞負含の系においてアッセイすることができる。破骨細胞発生に必要なM-CSFは、共培養転移癌細胞例えば、MDA231もしくはこれらの細胞からの調整培地Mancinoetal.,J.Surg.Res.0:18-24,2001によって、または精製M-CSFの添加によって供給することができる。癌転移に関連する骨損失の予防または処置における所定のM-CSF抗体の効能を、当業者によく知られている動物骨転移モデル系のいずれかで検査することもできる。こうしたモデル系には、骨の骨髄腔への腫瘍細胞の直接注射を含むものIngall,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,117:819-22,1964;Falasko,Clin.Orthop.169:207,1982、ラット腹部大動脈への腫瘍細胞の直接注射を含むものPowlesetal.,Br.J.Cancer28:31621,1973、マウス側尾脈またはマウス左心室への腫瘍細胞の直接注射を含むものAuguelloetal.,CancerRes.48:687681,1988が挙げられる。有効なM-CSF拮抗薬が不在の状態で注入された腫瘍細胞から生じた骨溶解性骨転移は、放射線写真骨溶解性骨病変の範囲または組織学および免疫組織化学骨および軟組織により判定することができる。Sasakietal.,CancerRes.55:35517,1995;Yonedaetal.,J.Clin.Invest.99:250917,1997.ClohisyandRamnaraine,OrthopRes.16:6606,1998.Yinetal.,J.Clin.Invest.103:197206,1999。有効なM-CSF抗体が存在する状態では、骨溶解性骨転移は、転移がより少数および/またはより小さくなるように予防または抑制され得る。本発明のM-CSF抗体は、癌転移の予防または処置においても有用である。癌転移の予防または処置における候補M-CSF抗体の有効性は、Fildermanetal.,CancerRes52:36616,1992に記載されているようなヒト羊膜基底膜侵襲モデルを使用してスクリーニングすることができる。加えて、様々なタイプの癌の転移についての動物モデル系のいずれを使用してもよい。そうしたモデル系には、Wengeretal.,Clin.Exp.Metastasis19:16973,2002;Yietal.,CancerRes.62:91723,2002;Tsutsumietal.,CancerLett169:77-85,2001;Tsingotjidouetal.,AnticancerRes.21:9718,2001;Wakabayashietal.,Oncology59:7580,2000;CulpandKogerman,FrontBiosci.3:D67283,1998;Rungeetal.,InvestRadiol.32:2127;Shiodaetal.,J.Surg.Oncol.64:1226,1997;Maetal.,InvestOphthalmolVisSci.37:2293301,1996;Kuruppuetal.,JGastroenterolHepatol.11:2632,1996に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。有効なM-CSF抗体が存在する状態では、癌転移は、転移がより少数および/またはより小さくなるように予防または抑制され得る。特定のM-CSF抗体またはM-CSF抗体の組合せの抗腫瘍活性は、適する動物モデルを使用してインビボで評価することができる。例えば、ヒトリンパ腫細胞が、ヌードマウスまたはSCIDマウスなどの免疫能低下動物に導入される、異種リンパ腫癌モデル。効能は、腫瘍形成、腫瘍退縮または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測することができる。インビトロアッセイの1つの変形局面において、本発明は、a固定されたM-CSFを候補抗体と接触させる工程、およびbM-CSFへの候補抗体の結合を検出する工程を含む方法を提供する。別の実施形態では、候補抗体を固定し、M-CSFへの結合を検出する。固定化は、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィー用樹脂への共有結合、ならびに非共有結合性高親和性相互作用、例えば抗体結合、または固定される化合物がビオチン部分を含む場合のストレプタビジン/ビオチン結合の使用をはじめとする、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれかを使用して達成される。結合の検出は、i固定されない化合物上の放射性標識を使用して、ii非固定化化合物上の蛍光標識を使用して、iii非固定化化合物に対して免疫特異的な抗体を使用して、iv固定される化合物を取り付ける蛍光支持体を励起させる非固定化化合物上の標識を使用して、ならびに当該技術分野においてよく知られており、日常的に実施されている他の技法を使用して、達成することができる。M-CSFの活性または発現を修飾するすなわち、増加させる、減少させる、または阻害する抗体は、M-CSFを発現する細胞とともに推定モジュレータをインキュベートし、M-CSFの活性または発現に対するその推定モジュレータの影響を判定することによって特定することができる。M-CSFポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を修飾する抗体の選択性は、M-CSFポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対するその影響と他の関連化合物に対するその影響を比較することにより、評価することができる。選択的モジュレータには、例えば、抗体および他のタンパク質、ペプチド、またはM-CSFポリペプチドにもしくはM-CSFポリペプチドをコードする核酸に特異的に結合する有機分子が挙げられる。M-CSF活性のモジュレータは、M-CSFポリペプチドの正常または異常活性が関与する疾病および生理状態の処置の際、治療上、有用であろう。本発明は、M-CSFポリペプチドの生物活性と相互作用するか、それらを阻害するすなわち、酵素的活性、結合活性などを阻害する抗体を特定するためのハイスループットアッセイHTSも包含する。HTSアッセイは、効率的な様式での多数の化合物のスクリーニングを可能にする。M-CSFポリペプチドとそれらの結合パートナーの間の相互作用を調査するために、細胞ベースのHTS系が考えられる。所望の特性を有するヒットまたはリード化合物を特定するようにHTSアッセイを設計し、そこから所望の特性を改善するように変形したものを設計することができる。そのヒットまたはリード化合物の化学的修飾は、多くの場合、そのヒットとM-CSFポリペプチドの間の特定可能な構造/活性に基づく。本発明のもう1つの局面は、M-CSFの活性を修飾するすなわち、低下させる抗体を特定する方法に関し、この方法は、M-CSFを抗体と接触させること、およびその抗体がM-CSFの活性を修飾するかどうか判定することを含む。被検抗体存在下での活性を被検抗体不在下での活性と比較する。被検抗体を含有するサンプルの活性が、被検化合物を欠くサンプルにおける活性より低い場合、その抗体の活性は阻害されていよう。当業者によく知られている組み換えポリペプチドの機能的発現に、様々な異種系を利用することができる。こうした系には、細菌Strosberg,etal.,TrendsinPharmacologicalSciences199213:95-98、酵母Pausch,TrendsinBiotechnology199715:487-494、幾つかの種類の昆虫細胞VandenBroeck,Int.Rev.Cytology1996164:189-268、両生類細胞Jayawickremeetal.,CurrentOpinioninBiotechnology19978:629-634および幾つかの哺乳動物細胞系CHO、HEK293、COSなど;Gerhardt,etal.,Eur.J.Pharmacology1997334:1-23参照が挙げられる。これらの例は、線虫から得られた細胞系PCT出願国際公開パンフレット第98/37177号をはじめとする他の可能な細胞発現系の使用を除外するものではない。本発明の1つの実施形態において、M-CSFの活性を修飾する抗体をスクリーニングする方法は、被検抗体をM-CSFポリペプチドと接触させること、およびその抗体とM-CSFとの複合体の存在についてアッセイすることを含む。こうしたアッセイにおいて、リガンドは、一般には標識される。適するインキュベーションの後、遊離リガンドを結合形で存在するものと分離し、その遊離標識または複合体を形成していない標識の量が、M-CSFまたはM-CSFRポリペプチドに結合するその特定の抗体の能力の尺度である。本発明のもう1つの実施形態では、M-CSFポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する抗体フラグメントまたはCDRについてのハイスループットスクリーニングを利用する。簡単に言うと、多数の異なる小ペプチド被検化合物を固体基質上で合成する。それらのペプチド被検抗体をM-CSFポリペプチドと接触させ、洗浄する。その後、当該技術分野においてよく知られている方法により、結合したM-CSFポリペプチドを検出する。本発明の精製ポリペプチドは、上述の薬物スクリーニング法において使用するためのプレートに直接塗布することができる。加えて、非中和抗体を使用して、タンパク質を補足し、それをその固体支持体上に固定することができる。併用療法動物モデルにおいて有効であるM-CSF抗体を1つより多く特定したら、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失に対してさらに改善された効力をもたらすために、2つ以上のそうしたM-CSF抗体を混合することがさらに有利であることがある。癌転移および/または癌転移に関連する骨損失に罹患している、または罹患する素因を有する人または哺乳動物に、1つ以上のM-CSF抗体を含む組成物を投与することができる。2つの治療薬の併用投与は、それらの薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重なりがあるならば、それらの薬剤を同時にまたは同じ経路で投与する必要はない。別の日または週での投与であるような同時または逐次投与が考えられる。M-CSF抗体療法は、癌の全ての期に有用であり得るが、抗体療法は、進行または転移癌に特に適切であり得る。抗体治療法を化学療法または放射線方式と併用することが、化学療法での治療を受けたことがない患者には好ましいこともあるが、抗体療法での治療が、1つ以上の化学療法を受けている患者に指示されるあることもある。加えて、抗体療法は、特に、化学療法薬の毒性に対する耐性が不良な患者において、併用化学療法の低減投薬量の使用を可能にすることもできる。本発明の方法では、単独の抗M-CSF抗体の投与ならびに異なる抗体の併用物、すなわちカクテルの投与が考えられる。こうした抗体カクテルは、一定の利点を有し得る。それらが、異なるエフェクターメカニズムを利用する抗体を含有する、または毒性抗体を免疫エフェクターの機能性に依存する抗体と直接組み合わせるのと同じだからである。併用でのこうした抗体は、相乗的治療効果を示し得る。RX1またはRX1抗体のHumanEngineeredTM誘導体と他の治療薬の併用は、骨破壊性疾患および/または腫瘍成長もしくは転移を経験している患者に対して効果を有し得る。例えば、骨溶解性疾患に罹患している患者を治療するための医薬の製造にRX1抗体を使用することができ、この場合、前記医薬と、抗RANKL抗体、可溶性RANKLレセプター、他のRANKL阻害剤、またはビスホスホネート例えば、Aredia;Zometa;Clodronateを使用する処置とを協調させる。あるいは、骨溶解性疾患に罹患している患者を処置するための治療用医薬の製造において抗RANKL抗体またはビスホスホネートを使用することができ、この場合、前記医薬と、RX1抗体またはRX1のHumanEngineered誘導体を使用する処置とを協調させる。この併用は、処置を受ける患者における相乗効果も有し得る。RX1抗体および他の治療薬を同時に投与する必要はない。RX1またはHumanEngineered変異体および他の治療薬を、互いに1日、1週間、2週間、4週間、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年または2年以内に投与することができる。本発明では、骨溶解性疾患に罹患している患者を処置するための医薬の製造におけるRX1抗体またはRX1抗体のHumanEngineeredTM誘導体の使用も考えられ、この場合、前記医薬は、抗RANKL抗体またはビスホスホネートでの前処置を受けた患者において使用される。前処置は、患者が、RX1またはRX1のHumanEngineeredTM変異体での処置前2年、1年、6ヶ月、3ヶ月、2ヶ月、1ヶ月、2週間、1週間または少なくとも1日以内に処置を受けたことを意味する。RX1抗体またはHumanEngineeredTM変異体は、他の癌療法薬と併用することができる。例えば、癌疾患に罹患している患者を処置するための医薬の製造においてRX1抗体またはHumanEngineered変異体を使用することができ、この場合、前記医薬は、様々な化学療法薬、アンドロゲン遮断薬、および免疫修飾物質例えば、IL-2、GM-CSF、SLC、ビホスホネート例えば、Aredia;Zometa;Clodronate、手術、放射線、細胞毒性化学療法、ホルモン療法例えば、Tamoxifen;抗アンドロゲン療法、抗体療法例えば、RANKL/RANK中和抗体、PTHrP中和抗体、抗Her2抗体、抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗CD22抗体、VEGF抗体、IGFR-1抗体、EphA2抗体、HAAH抗体、TMEFF2抗体、CAIX抗体、治療タンパク質療法例えば、可溶性RANKLレセプター、OPG阻害剤、PDGF阻害剤およびMMP阻害剤、小分子薬物療法例えば、Src-キナーゼ阻害剤、成長因子レセプターのキナーゼ阻害剤、またはRANKL阻害剤、オリゴヌクレオチド療法例えば、RANKLまたはRANKまたはPTHrPアンチセンス、遺伝子療法例えば、RANKLまたはRANK阻害剤、ペプチド療法例えば、RANKLの突然変異タンパク質、ならびに本明細書に記載のタンパク質、ペプチド、化合物および小分子を含むしかし、これらに限定されない他の治療薬および/または手順を使用する処置と協調させる。RX1およびHumanEngineeredTM変異体は、上述の療法での前処置を受けた患者を処置するための医薬の製造において使用することができる。細胞毒性剤は、細胞の機能を阻害もしくは抑制する、および/または細胞の破壊を生じさせる物質を指す。この用語は、放射性同位元素例えば、I131、I125、Y90およびRe186、化学療法薬、および毒素、例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素または合成毒素、あるいはこれらのフラグメントを含むと解釈する。非細胞毒性剤は、細胞の機能を阻害もしくは抑制しない、および/または細胞の破壊を生じさせない物質を指す。非細胞毒性剤は、細胞毒性になるように活性化することができる物質を含み得る。非細胞毒性剤には、ビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子を挙げることができる例えば、米国特許公開第2003/0028071号および同第2003/0032995号参照;これらは、本明細書に参考として組み込まれている。こうした薬剤は、本発明の抗体と結合体化、カップリング、連結または会合させることができる。癌化学療法薬には、アルキル化剤、例えばカルボプラチンおよびシスプラチン;ナイトロジェンマスタードアルキル化剤;ニトロソウレアアルキル化剤、例えばカルムスチンBCNU;代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート;フォリン酸;プリン類似体代謝拮抗物質、メルカプトプリン;ピリミジン類似体代謝拮抗物質、例えばフルオロウラシル5-FUおよびゲムシタビンGemzar登録商標;ホルモン抗新生物薬、例えばゴセレリン、ロイプロリドおよびタモキシフェン;天然抗新生物薬、例えばアルデスロイキン、インターロイキン-2、ドセタキセル、エトポシドVP-16、インターフェロンアルファ、パクリタキセルTaxol登録商標およびトレチノインATRA;抗生物質天然抗新生物薬、例えばブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノマイシンおよびマイトマイシンマイトマイシンCを含む;ならびにビンカアルカロイド天然抗新生物薬、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン;ヒドロキシウレア;アセグラクトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピトスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボキノン、カルボプラチン、カルモフル、クロモマイシンA3、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミドCytoxin登録商標、Schizophyllan、シタラビンシトシンアラビノシド、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、例えばオーリスタチン、CPT-11イリノテカン、ミトザントロン、ビノレルビン、テニポシド、アミノプテリン、カルミノマイシン、エスペラマイシン例えば、米国特許第4,675,187号参照、ネオカルジノスタチン、OK-432、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプロマイシン、ベスタチンUbenimex登録商標、インターフェロン-β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケCoriolusversicolorエキス、テガフール/ウラシル、エストラムスチンエストロゲン/メクロレタミンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、癌患者のための療法として使用される追加の薬剤には、EPO;G-CSF;ガンシクロビル;抗生物質;ロイプロリド;メペリジン;ジドブジンAZT;インターロイキン1から18突然変異体および類似体を含む;インターフェロンまたはサイトカイン、例えばインターフェロンα、βおよびγ;ホルモン、例えば黄体化ホルモン放出ホルモンLHRHおよび類似体ならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモンGnRH;成長因子、例えば形質転換因子-βTGF-β、線維芽細胞成長因子FGF、神経成長因子NGF、成長ホルモン放出因子GHRF、上皮細胞成長因子EGF、線維芽細胞成長因子相同因子FGFHF、肝細胞増殖因子HGFおよびインスリン成長因子IFG;腫瘍壊死因子-αβTNF-αβ;浸潤抑制因子-2IIF-2;骨形態発生タンパク質1~7BMP1~7;ソマトスタチン;チモシン-α-1;γ-グロブリン;スーパーオキシドジムスターゼSOD;補体因子;抗血管新生因子;抗原物質;ならびにプロドラッグが挙げられる。プロドラッグは、親薬と比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低いまたは細胞毒性が無く、ならびに活性なまたはより活性な親形態へ酵素的に活性化するまたは転化させることができる、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Wilman,ProdrugsinCancerChemotherapyBiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast1986、およびStellaetal.,Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery,DirectedDrugDelivery,Borchardtetal.,ed.,pp.247-267,HumanaPress1985参照。プロドラッグには、より活性で、細胞毒性がない薬物に転化させることができる、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または場合により置換されているフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、5-フルオロシトシンおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。ここで使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞毒性薬の例には、上に記載した化学療法薬が挙げられるが、それらに限定されない。投与および調製本発明の方法を実施する際に使用される抗M-CSF抗体は、所望の送達方法に適するキャリアを含む薬学的組成物に調合することができる。適するキャリアには、抗M-CSF抗体と併用したとき、その抗体の抗腫瘍機能を保持し、被験体の免疫系と非反応性である、あらゆる材料を含む。例には、無菌リン酸緩衝食塩液、静菌水などのような多数の標準的な薬学的キャリアのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。様々な水性キャリア、例えば、水、緩衝水、0.4食塩水、0.3グリシンなどを使用することができ、ならびに中等度の化学的修飾などを受けた、安定性向上のための他のタンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどを含むことができる。抗体の治療用調合物は、所望の純度を有する抗体を生理学的に許容される任意のキャリア、賦形剤または安定剤Remington’sPharmaceuticalScience16thedition,Osol,A.Ed.1980と混合することにより、凍結乾燥調合物または水性溶液の形態で保存用に調製することができる。許容されるキャリア、賦形剤または安定剤は、利用される投薬量および濃度で受容者に毒性でなく、そうしたものには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存薬例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール;低分子量約10残基未満ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン;単糖類、二糖類および他の炭水化物グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む;キレート化剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール;塩形成性対イオン、例えばナトリウム;金属錯体例えば、Zn-タンパク質錯体;ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMもしくはポリエチレングリコールPEGが挙げられる。本明細書において、調合物は、処置する特定の適応症のために必要に応じて1つより多くの活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するもの、を含有することもできる。例えば、免疫抑制剤をさらに供給することが望ましいことがある。こうした分子は、意図された目的に有効な量での組合せで安定に存在する。活性成分は、例えばコアセルベーション法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-メチルメタクリレートマイクロカプセルそれぞれの中に、コロイド状薬物送達系例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセルの中に、またはマクロエマルジョンの中に封入することもできる。こうした技法は、Remington’sPharmaceuticalScience16thedition,Osol,A.Ed.1980に開示される。インビボ投与に使用することとなる調合物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成することができる。本抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与および鼻腔内投与、ならびに局所治療のために所望される場合には病巣内投与をはじめとする、あらゆる適する手段により投与される。非経口注入には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮内投与または皮下投与が挙げられる。加えて、本抗体は、パルス注入、特に漸減用量の抗体でのパルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、その投与が短期的なものであるか長期的なものであるかに一部依存して、注射、最も好ましくは静脈内または皮下注射により施される。局所topical投与、特に経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、経口投与または局部local投与、例えば所望の部位の近くにカテーテルを配置することによるもの、をはじめとする他の投与方法が考えられる。本発明の組成物は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、座剤、注射剤、乳剤、エリキシル、懸濁液または溶液の形態であり得る。本組成物は、様々な経路の投与、例えば、経口投与による、経鼻投与による、直腸内投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または腹腔内注射による投与のために調合することができる。以下の在家は、例として与えるものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。経口、口腔内および舌下投与については、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ゲルキャップおよびキャプレットが、固体剤形として許容される。これらは、例えば、本発明の1つもしくはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、少なくとも1つの添加剤、例えばデンプンまたは他の添加剤と混合することにより調製することができる。適する添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルジネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマーまたはグリセリンである。場合により、経口剤形は、投与を助長する他の成分、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤例えばステアリン酸マグネシウム、保存薬例えばパラベンもしくはソルビン酸、酸化防止剤例えば、アルコルビン酸、トコフェロールもしくはシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝液、甘味料、着香剤または香料を含有することができる。錠剤およびピルは、当該技術分野において知られる適切なコーティング材でさらに処理することができる。経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、シロップ、エリキシル、懸濁液および溶液の形態であり得、これらは、不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。薬学的調合物および医薬は、油、水、アルコールおよびこれらの混合物などしかし、それらに限定されないの滅菌液を使用して懸濁液または溶液として調製することができる。経口または非経口投与のために、薬学的に適する界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤を添加してもよい。上述したように、懸濁液は油を含むことができる。そうした油には、落花生油、ごま油、綿実油、トウモロコシ油およびオリーブ油が挙げられるが、これらに限定されない。懸濁製剤は、脂肪酸のエステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドも含有することができる。懸濁調合物は、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールなどしかし、これらに限定されないのアルコールを含むことができる。ポリエチレングリコールなどしかし、これに限定されないのエーテル、鉱物油およびワセリンなどの石油炭化水素、ならびに水も懸濁調合物に使用することができる。経鼻投与のための薬学的調合物および医薬は、適切な溶媒複数を含むおよび場合により他の化合物、例えば安定剤、抗微生物薬、酸化防止剤、pH調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤およびこれらの組合せしかし、それらに限定されない、を含有するスプレー剤またはエアロゾルであり得る。エアロゾル調合物のための噴射剤には、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素系低沸点溶媒を挙げることができる。注射用剤形には、一般に、水性懸濁液または油性懸濁液が挙げられ、これらは、適する分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製することができる。注射用形態は、溶液相でまたは懸濁液の形態であり得、これは、溶媒または希釈剤を用いて調製される。許容される溶媒またはビヒクルには、滅菌水、リンゲル溶液または等張食塩水溶液が挙げられる。あるいは、滅菌油を溶媒または懸濁化剤として利用することができる。好ましくは、前記油または脂肪酸は不揮発性であり、これには、天然もしくは合成油、脂肪酸、モノ、ジもしくはトリグリセリドが挙げられる。注射のための薬学的調合物および/または医薬は、上に記載したような適切な溶液での再構成に適する粉末であり得る。これらの例には、凍結乾燥、回転乾燥もしくはスプレー乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射のための調合物は、安定剤、pH調節剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調節剤およびこれらの組合せを場合により含有することができる。直腸内投与のための薬学的調合物および医薬は、腸、S状結腸および/または直腸内で化合物を放出するために座剤、軟膏、浣腸剤、錠剤またはクリームの形態であり得る。肛門座剤は、本発明の1つもしくはそれ以上の化合物または本化合物の薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を、許容されるビヒクル、例えばカカオ脂またはポリエチレングリコールと混合することにより調製され、前記ビヒクルは、通常の保管温度では固相で存在し、身体内部、例えば直腸内での薬物の放出に適する温度では液相で存在する。ソフトゼラチンタイプの調合物および座剤の調製に油を利用することもできる。懸濁化剤、例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースならびに懸濁液および保存薬も含有し得る懸濁調合物の調製に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液ならびにグリセロールを利用することができる。持効性製剤を調製することができる。持効性製剤の適する例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持効性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレートまたはポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸とyエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセテート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupronDepotTM乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから成る注射用マイクロスフェア、およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン-ビニルアセテートおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーが、100日間にわたって分子を放出することができる一方で、一定のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。内包された抗体は、長期にわたりそのボディーの中にあり続けると、37°Cでの湿度への暴露の結果として変性または凝集することがあり、その結果、生物活性が失われ、免疫原性が変化し得る。関与するメカニズムに依存して安定性についての合理的な戦略を編み出すことができる。例えば、その凝集メカニズムが、チオ-ジスルフィド交換による分子内S--S結合の形成であることがわかった場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、含水率を制御し、適切な添加剤を使用し、特異的ポリマーマトリックス組成物を創り出すことにより、安定化を実現することができる。本発明の調合物は、本明細書において説明するように、短時間作用性、速放性、長時間作用性、または持効性であるように設計することができる。従って、本薬学的調合物は、制御放出用にも調合することができ、または遅速放出用にも調合することができる。本組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、または他の内包形態を含むこともでき、あるいは持続型放出形態で投与して長期保管および/または送達効果をもたらすことができる。従って、本薬学的調合物および医薬は、ペレットまたは柱体に圧縮し、蓄積注射またはインプラント、例えばステントとして筋肉内にまたは皮下に移植することができる。こうしたインプラントには、既知不活性材料、例えば、シリコーンおよび生体分解性ポリマーを利用することができる。上に記載した代表的な剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤およびキャリアが、一般に、当業者に知られており、故に、本発明に包含される。こうした賦形剤およびキャリアは、例えば、Remington’sPharmaceuticalScienceMackPub.Co.,NewJersey1991に記載されているこれは、本明細書に参考として組み込まれている。具体的な投薬量は、疾病の状態、被験体の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投薬間隔、投与経路、排泄率、ならびに薬の組合せに依存して調節することができる。有効量を含有する上記剤形のいずれもが、十分に日常的な経験の範囲内であり、従って、十分に本発明の範囲内である。癌転移または癌転移に関連する骨損失の療法薬として有用なM-CSF抗体は、多くの場合、他の天然免疫グロブリンまたは他の生体分子を実質的に含まずに調製されるであろう。また、好ましいM-CSF抗体は、癌転移または癌転移に関連する骨損失に罹患している、または罹患する素因を有する哺乳動物に投与されたとき、最少の毒性を示すであろう。本発明の組成物は、よく知られている従来の滅菌法により滅菌することができる。得られた溶液は、無菌条件下で使用のためにパッケージするか、濾過し、凍結乾燥させ、その凍結乾燥された製剤を投与前に滅菌溶液と併せる。本組成物は、生理条件に近づけるために、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび安定剤例えば、1.20マルトースなどのような薬学的に許容される補助物質を必要に応じて含有することができる。本発明のM-CSF抗体は、リポソームによって投与することもでき、このリポソームは、様々なタイプの脂質および/またはリン脂質および/または界面活性剤から成る小胞であり、薬物例えば、本明細書に開示する抗体および場合により化学療法薬の送達に有用である。リポソームには、乳剤、フォーム、ミセル、可溶性単層、リン脂質分散液、ラメラ層などが挙げられ、M-CSF抗体のターゲットを特定の組織に合わせるため、ならびに組成物の半減期を増させるためのビヒクルとしての役割を果たすことができる。例えば米国特許第4,378,028号および同第5,019,369号に記載されているような様々な方法をリポソームの調製のために利用することができるこれらの特許は、本明細書に参考として組み込まれている。抗体を含有するリポソームは、例えば、Epsteinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:36881985;Hwangetal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA77:40301980;ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載されているものなどの当該技術分野において知られている方法によって調製される。循環時間が向上されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミンPEG-PEを含む脂質組成物での逆相蒸発法により調製することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるように規定の細孔サイズのフィルタを通して押出される。本発明の抗体のFab’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Martinetal.,J.Biol.Chem.257:286-2881982に記載されているようにリポソームに結合体化させることができる。場合により、化学療法薬例えば、ドキソルビシンをリポソームの中に含める[例えば、Gabizonetal.,J.NationalCancerInst.8119:14841989参照]。これらの組成物中のM-CSF抗体の濃度は、幅広く、すなわち、約10重量未満、通常は少なくとも約25重量から、多くとも75重量乃至は90重量まで変化し得、ならびに選択される特定の投与方式に従って、主として液体体積、粘度などにより選択されるであろう。経口、局所および非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者には周知または明らかであろう。それらは、例えば、Remington’sPharmaceuticalScience,19thed.,MackPublishing.Co.,Easton,PA1995に詳細に記載されているこれは、本明細書に参考として組み込まれている。患者において癌転移および/または癌転移に関連する骨損失を処置するための本発明の組成物の有効量の決定は、当該技術分野においてよく知られている標準的な経験法により達成することができる。例えば、所定の投薬量のM-CSF抗体で処置した被験体からの血清のインビボ中和活性は、Cencietal.,JClin.Invest.1055:1279-87,2000に記載されているように、インビボでマウス単球M-CSFに対して高レベルのレセプターを発現するCD11b細胞、CD11細胞のサブセットのM-CSF誘導増殖および生存を阻害する血清の能力を判定するアッセイを使用して評価することができる。本発明の組成物は、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失に既に罹患しているか、その素因を有する哺乳動物に、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失を予防または少なくとも一部は抑制するために十分な量で投与される。これを達成するために妥当な量を治療有効用量と定義する。M-CSF抗体の有効量は、変化し、その疾病の重篤度、処置を受ける患者の体重および全身の状態に依存するであろうが、一般に、約1.0μg/kg体重から約100mg/kg、または約10μg/kgから約30mg/kgの範囲であり、通常、1適用あたり約0.1mg/kgから約10mg/kgまたは約1mg/kgから約10mg/kgが用いられる。例えば、1回またはそれ以上の別投与によるにしても、または連続注入によるにしても、例えば抗体約10μg/kgから5mg/kgまたは約30μg/kgから約1mg/kgが、患者に投与するための最初の候補投薬量である。投与は、その疾病に対する応答およびその療法に対する患者の寛容性に依存し、必要に応じて、毎日、1日おき、週1度、またはより少ない頻度である。疾病の症状の所望の抑制が発生するまで、長期間、例えば4、5、6、7、8、10もしくは12週またはそれ以上にわたる維持投薬量が必要であり得、投薬量は、必要に応じて調節することができる。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされる。処置する医師により選択される投薬レベルおよびパタンで、1回または複数回の組成物投与を行うことができる。疾病の予防または処置のための適切な抗体投薬量は、上で定義したような処置する疾病のタイプ;その疾病の重篤度および経過;その抗体が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか;以前の療法;患者の臨床履歴;抗体に対する応答;ならびに掛かりつけの医師の自由裁量に依存するであろう。本抗体は、1回でまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与される。とにかく、本調合物は、癌転移および/または癌転移に関連する骨損失を有効に予防するか、その重篤度を有効に最小にするために十分な時間にわたって一定の量のM-CSF抗体を提供しなければならない。本発明の組成物は、単独で投与することができ、または癌転移および/または癌転移に関連する骨損失の処置のための当該技術分野において知られている他の療法と共に補助療法として投与することができる。本抗体組成物は、良好な医学的実践に合うようなやり方で調合され、計量分配され、投与されるであろう。これに関連して考慮する因子には、処置する特定の疾患、処置する特定の哺乳動物、その個々の患者の臨床状態、その疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の日程計画、および医師に知られている他の因子が挙げられる。投与される抗体の治療有効量は、そうした考慮に左右されることとなり、ならびにM-CSFによって媒介される疾病、状態または疾患を予防、改善または処置するために、特に癌細胞を処置するために、最も特に腫瘍細胞転移を処置するために必要な最少量である。そうした量は、宿主に毒性である量または宿主の感染しやすさを有意に高める量より、好ましくは下である。本抗体は、問題の疾患を予防または処置するために現在使用されている1つ以上の薬剤とともに、必要ではないが場合によっては、調合される。例えば、癌の場合、本抗体は、化学療法薬と共に、または上に記載したようなADEPTで投与することができる。こうした他の薬剤の有効量は、その調合物中に存在する抗体の量、疾病、状態もしくは疾患または処置のタイプ、および上で論じた他の因子に依存する。一般に、これらは、本明細書において上で使用したのと同じ投薬量および投薬経路で、または従来利用されている投薬量の約1から99で使用される。本発明のもう1つの実施形態において、癌の処置をはじめとする上に記載した疾病、疾患または状態の処置に有用な材料を含有する製品を提供する。この製品は、容器およびラベルを含む。適する容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器および試験管が挙げられる。これらの容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。この容器は、その状態の処置に有効な組成物を収容でき、無菌取り出し口を有し得る例えば、この容器は、皮下注射針により穴をあけることができるストッパーを有する静脈内適用溶液用バッグまたはバイアルであり得る。本組成物中の活性薬剤は、本発明の抗体である。容器上のまたは容器に付属するラベルは、その組成物が、選ばれた状態の処置に使用されることを示す。この製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液およびデキストラン溶液を含む第二の容器をさらに含むことができる。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、および使用説明を伴う添付文書をはじめとする、市場および使用者の立場から望ましい他の材料を含むことができる。免疫療法癌に罹患している患者の処置に有用な抗M-CSF抗体には、腫瘍に対する強力な免疫応答を起こさせることができるもの、および直接細胞毒性作用をもたらすことができるものが挙げられる。これに関して、抗M-CSF抗体は、補体媒介または抗体依存性細胞性細胞毒性ADCCメカニズムにより腫瘍細胞の溶解を惹起することができ、これら両方のメカニズムが、エフェクター細胞Fcレセプター部位または相補タンパク質との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなFc部分を必要とする。加えて、腫瘍成長に対して直接生物学的効果を発揮する抗M-CSF抗体が、本発明の実施において有用である。そうした直接細胞毒性抗体が作用できる可能性のあるメカニズムには、細胞成長の抑制、細胞分化の修飾、腫瘍血管新生因子プロフィールの修飾、およびアポトーシスの誘導が挙げられる。特定の抗M-CSF抗体が抗腫瘍効果を発揮するメカニズムは、当該技術分野において一般に知られているような、ADCC、ADMMC、補体媒介細胞溶解などを判定するために設計されたインビボアッセイを任意の数使用して評価することができる。一つの実施形態において、免疫療法は、分泌形のM-CSFに対してより膜結合形のM-CSFM-CSFαに対してのほうが高い親和性を有する抗体を使用して行われる。例えば、M-CSFαの切断部位に、もしくはその周囲に、または膜に隣接するM-CSFαの部分に特異的に結合する抗体を調製することができる。こうした抗体は、M-CSFαの可溶性活性部分の切断および放出を有益に抑制することもできる。抗M-CSF抗体は、それらの裸の形もしくは結合体化していない形で投与することができ、またはそれらに結合体化した治療薬を有することができる。一つの実施形態において、抗M-CSF抗体は、放射線増感剤として使用される。こうした実施形態では、抗M-CSF抗体を放射線増感物質に結合体化させる。本明細書において用いる用語放射線増感剤は、電磁放射線に対して放射線増感させるべき細胞の感度を増大させるために、または電磁放射線で処置することができる疾病の処置を促進するために治療有効量で動物に投与される分子、好ましくは低分子量分子と定義する。電磁放射線で処置することができる疾病には、新生物性疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに癌性細胞が挙げられる。本明細書において用いる用語電磁放射線および放射線は、10-20から100メートルの波長を有する放射線を包含するが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態では、γ線10-20から10-13m、X線放射線10-12から10-9m、紫外線10nmから400nm、可視光400nmから700nm、赤外線700nmから1.0mmおよびマイクロ波放射線1mmから30cmの電磁放射線が利用される。放射線増感剤は、電磁放射線の毒性効果に対する癌性細胞の感度を増大させることが知られている。現在、多数の癌治療プロトコルに、X線の電磁放射により活性化される放射線増感剤が利用されている。X線活性化放射線増感剤の例には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない:メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンC、RSU1069、SR4233、EO9、RB6145、ニコチンアミド、5-ブロモデオキシウリジンBUdR、5-ヨードデオキシウリジンIUdR、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジンFUdR、ヒドロキシウレア、シスプラシン、ならびに処置に有効なこれらの類似体および誘導体。癌の光力学的治療PDTには、増感物質の放射線活性化剤として可視光が利用される。光力学的放射線増感剤の例には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない:ヘマトポルフィリン誘導体、Photofrinr、ベンゾポルフィリン誘導体、NPe6、錫エチオポルフィリンSnET2、フェオボルバイド-a、バクテリオクロロフィル-a、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、ならびに処置に有効なこれらの類似体および誘導体。別の実施形態において、本抗体は、予め腫瘍にターゲットを合わせる際に利用するためのレセプター例えばストレプタビジンに結合体化させることができ、この場合、その抗体-レセプター結合体を患者に投与し、その後、キレート化剤を使用してその血行から未結合の結合体除去し、その後、細胞毒性剤例えば、放射性核種に結合体化させるリガンド例えば、アビジンを投与する。さらに、本発明は、検出できるように標識された形態の上記抗体を提供する。抗体は、放射性同位元素、親和性標識例えば、ビオチン、アビジンなど、酵素的標識例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど、蛍光もしくは発光もしくは生物発光標識例えば、FITCまたはローダミンなど、常磁性原子などの使用により、検出できるように標識することができる。こうした標識を達成するための手順は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Sternberger,LA.etal.,J.Histochem.Cytochem.18:3151970;Bayer,E.A.etal.,Meth.Enzym.62:3081979;Engval,E.etal.,Immunol.109:1291972;Goding,J.W.J.Immunol.Meth.13:2151976参照。標識は、抗体に直接または間接的に結合体化させる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体によりそれ自体を検出することができる例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識か、酵素的標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的修飾を触媒することができる。あるいは、標識は、それ自体では検出できないが、検出可能な別の物質例えば、エピトープタグ、またはビオチン-アビジンなどの結合パートナー対の一方などにより結合される要素であり得る。従って、抗体は、その単離を助長する標識またはタグを含むことができ、ならびに抗体を特定する本発明の方法は、その標識またはタグとの相互作用によりM-CSF/抗体を単離する工程を含む。例示的な治療用免疫結合体は、細胞毒性剤、例えば化学療法薬、毒素例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメントに結合体化させた本明細書に記載の抗体、または放射性同位元素に結合体化させた本明細書に記載の抗体すなわち、ラジオ結合体を含む。融合タンパク質は、下でさらに詳細に説明する。免疫結合体生産は、米国特許第6,306,393号に記載されている。免疫結合体は、治療薬を抗体成分に直接結合体化させることにより調製することができる。一般的な技法は、Shihetal.,Int.J.Cancer41:832-8391988;Shihetal.,Int.J.Cancer46:1101-11061990;およびShihらの米国特許第5,057,313号に記載されている。この一般的は方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分と、少なくとも1つの遊離アミン官能基を有し、および多数の薬物、毒素、キレート化剤、ホウ素アデンドまたは他の治療薬が負荷されるキャリアポリマーとを反応させることを含む。この反応の結果、最初にシッフ塩基イミン結合が生じ、それを第二アミンへの還元により安定化して、最終結合体を形成することができる。キャリアポリマーは、好ましくは、アミノデキストランであるか、アミノ残基数が少なくとも50のポリペプチドであるが、他の実質的に同等なポリマーキャリアも使用することができる。最終免疫結合体は、投与の容易さおよび処置での使用に有効なターゲッティングのため、哺乳動物の血清などの水性溶液に好ましくは可溶である。従って、キャリアポリマー上の官能基の可溶化により、最終免疫結合体の血清溶解性が向上されるであろう。特に、アミノデキストランが好ましいであろう。アミノデキストランキャリアとの免疫結合体を調製するプロセスは、典型的に、デキストランポリマー、有利には約10,000~100,000の平均分子量のデキストランで始まる。そのデキストランを酸化剤と反応させて、その炭水化物環の一部の制御酸化を行って、アルデヒド基を生じさせる。この酸化は、従来の手順に従って、NaIO4などの糖分解性化学試薬を用いて適便に行われる。酸化されたデキストランを、その後、ポリアミン、好ましくはジアミン、さらに好ましくはモノ-またはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適するアミンには、エチレンジアミン、プロピレンジアミンまたは他の同様のポリメチレンジアミン、ジエチレントリアミンまたは同様のポリアミン、1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンまたは他の同様のヒドロキシル化ジアミンもしくはポリアミンなどが挙げられる。そのデキストランのアルデヒド基に対して過剰なアミンを使用して、アルデヒド官能基のシッフ塩基基への実質的に完全な転化を確保する。NaBH4、NaBH3、CNなどのような還元剤を使用して、結果として生じるシッフ塩基中間体の還元安定化を行う。結果として生じる付加体を、従来のサイジングカラムに通すことにより精製して、架橋デキストランを除去することができる。アミン官能基を導入するためにデキストランを誘導体化する他の従来的な方法、例えば、臭化シアンとの反応、その後のジアミンとの反応、を使用することもできる。その後、従来の手段により、例えばジクロロへキシルカルボジイミドDCCまたはその水溶性変異体を使用して調製した、活性化形、好ましくは、カルボキシ活性化誘導体でのアミノデキストランを、負荷させる特定の薬物、毒素、キレート化剤、免疫修飾物質、ホウ素アデンドまたは他の治療薬の誘導体と反応させて、中間付加体を形成する。あるいは、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質またはリシンA-鎖などのポリペプチド毒素などをアミノデキストランに、グルタルアルデヒド縮合により、またはそのアミノデキストラン上のアミンとそのタンパク質上の活性化カルボキシル基を反応させることにより、カップリングさせることができる。放射性金属または磁気共鳴強化剤用のキレート化剤は、当該技術分野においてよく知られている。エチレンジアミン四酢酸EDTAおよびジエチレントリアミン五酢酸DTPAの誘導体が、代表である。典型的に、これらのキレート化剤は、そのキレート化剤をキャリアに結合させることができる基を側鎖上に有する。こうした基には、例えば、ベンジルイソチオシアネートが挙げられ、これにより、DTPAまたはEDTAを、キャリアのアミン基にカップリングさせることができる。あるいは、キレート化剤上のカルボキシル基またはアミン基を、活性化、または事前の誘導体化およびその後のカップリングにより、全て、よく知られている手段により、キャリアとカップリグさせることができる。カルボランなどのホウ素アデンドは、従来の方法により抗体成分に結合させることができる。例えば、カルボランは、当該技術分野においてよく知られているように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。こうしたカルボランのキャリア、例えばアミノデキストラン、への結合は、カルボランのカルボキシル基を活性化し、そのキャリア上のアミンと縮合させて、中間結合体を生成することにより、達成することができる。その後、そうした中間結合体を抗体成分に結合させて、下で説明するような処置に有用な免疫結合体を生成する。ポリペプチドキャリアをアミノデキストランの代わりに使用することができるが、そのポリペプチドキャリアは、鎖内に少なくとも50のアミノ酸残基、好ましくは100~5000のアミノ酸残基を有さねばならない。それらのアミノ酸の少なくとも一部は、リシン残基またはグルタメートもしくはアスパルテート残基でなければならない。リシン残基のペンダントアミンならびにグルタミンおよびアスパルテートのペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫修飾物質、キレート化剤、ホウ素アデンドまたは他の治療薬の結合に適便である。適するポリペプチドキャリアの例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、および結果として生じる負荷キャリアおよび免疫結合体に望ましい溶解性を付与するためにこれらのアミノ酸とその他、例えばセリン、の混合型ポリマーが挙げられる。抗体成分との中間結合体の結合体化は、抗体成分の炭水化物部分を酸化し、結果として生じたアルデヒドおよびケトンと、薬物、毒素、キレート化剤、免疫修飾物質、ホウ素アデンドまたは他の治療薬を負荷させた後にキャリア上に残存するアミン基とを反応させることによって行う。あるいは、中間結合体は、治療薬を負荷させた後、中間結合体に導入されたアミン基により、被酸化抗体成分に結合させることができる。酸化は、例えばNaIO4もしくは他の糖分解試薬で化学的に、または例えばノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼで酵素的に、適便に行うことができる。一般に、アミノデキストランキャリアの場合、治療薬を負荷させるためにそのアミノデキストランの全てのアミンが使用されるとはかぎらない。アミノデキストランの残存アミンが、被酸化抗体成分と縮合してシッフ塩基付加体を形成する。それを、その後、通常は水素化ホウ素還元試薬で還元安定化する。本発明の免疫結合体を生成するために、類似の手順を使用する。負荷させるポリペプチドキャリアは、抗体成分の被酸化炭水化物部分との縮合のために残存する遊離リシン残基を好ましくは有する。ポリペプチドキャリア上のカルボキシルは、例えばDCCでの活性化および過剰なジアミンとの反応により、必要に応じてアミンに転化させることができる。最終免疫結合体は、従来の技法、例えば、SephacrylS-300でのサイジングクロマトグラフィーまたは1つもしくはそれ以上のCD84Hyエピトープを使用する親和性クロマトグラフィーを使用して精製する。あるいは、免疫結合体は、抗体成分を治療薬と直接結合体化させることにより調製することができる。この一般手順は、治療薬を被酸化抗体成分に直接結合させること以外は、前記間接的結合体化法に類似している。他の治療薬を本明細書に記載のキレート化剤の代わりに使用することができることは、理解されるであろう。当業者は、過度の実験をせずともに結合体化機構を考え出すことができるであろう。さらなる実例として、ジスルフィド結合形成により被還元抗体成分のヒンジ領域に治療薬を結合させることができる。例えば、破傷風毒素ペプチドは、抗体成分へのそのペプチドの結合に使用される単一システイン残基を用いて構成することができる。代替として、ヘテロ二官能性架橋剤、例えば3-2-ピリジルジチオプロピオン酸N-スクシニルSPDPを使用して、そうしたペプチドを抗体成分に結合させることができる。Yuetal.,Int.J.Cancer56:2441994。こうした結合体化の一般的な技法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Wong,ChemistryOfProteinConjugationandCross-LinkingCRCPress1991;Upeslacisetal.,ModificationofAntibodiesbyChemicalMethods,inMonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications,Birchetal.eds.,pages187-230Wiley-Liss,Inc.1995;Price,ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies,inMonoclonalAntibodies:Production,EnineeringandClinicalApplication,Ritteretal.eds.,pages60-84CambridgeUniversityPress1995参照。抗体と細胞毒性剤の結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-2-ピリジルジチオールプロピオネートSPDP、イミノチオランIT、イミドエステルの二官能性誘導体例えば、アジピン酸ジメチルHCL、活性エステル例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル、アルデヒド例えば、グルタルアルデヒド、ビス-アジド化合物例えば、ビスp-アジドベンゾイルヘキサンジアミン、ビス-ジアゾニウム誘導体例えば、ビスp-ジアゾニウムベンゾイル-エチレンジアミン、ジイソシアネート例えば、2,6-ジイソシアン酸トルイエン、およびビス-活性フッ素化合物例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンを使用して作られる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaetal.,Science238:10981987に記載されているように調製することができる。炭素14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸MX-DTPAは、抗体への放射性核種の結合体化のための例示的なキレート化剤である例えば、国際公開パンフレット第94/11026号参照。上で説明したように、抗体のFc領域内の炭水化物部分を使用して、治療薬に結合体化させることができる。しかし、このFc領域は、抗体フラグメントがその免疫結合体の抗体成分として使用される場合には不在であってもよい。それにもかかわらず、抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に炭水化物部分を導入することができる。例えば、Leungetal.,J.Immunol.154:59191995;Hansenらの米国特許第5,443,953号参照。その操作した炭水化物を、その後、使用して、治療薬に結合させる。加えて、当業者には、結合体化方法の多数の可能な変形形態が認知されていよう。例えば、炭水化物部分を使用してポリエチレングリコールに結合させて、血液、リンパ液または他の細胞外液中のインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を延長することができる。さらに、炭水化物部分および遊離スルフヒドリル基に治療薬を結合させることにより、二価免疫結合体を構築することができる。こうした遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置し得る。抗M-CSF抗体融合タンパク質本発明では、1つ以上の抗M-CSF抗体部分および免疫修飾物質または毒素部分を含む融合タンパク質の使用が考えられる。抗体融合タンパク質の製造方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第6,306,393号参照。インターロイキン-2部分を含む抗体融合タンパク質は、Boletietal.,Ann.Oncol.6:9451995、Nicoletetal.,CancerGeneTher.2:1611995、Beckeretal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA93:78261996、Hanketal.,Clin.CancerRes.2:19511996、およびHuetal.,CancerRes.56:49981996によって記載されている。加えて、Yangetal.,Hum.AntibodiesHybridomas6:1291995には、Fab’2フラグメントおよび腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質が記載されている。組み換え分子が1つ以上の抗体成分および毒素または化学療法薬を含む抗体-毒素融合タンパク質の製造方法も当業者に知られている。例えば、抗体シュードモナスPseudomonasエキソトキシンA融合タンパク質は、Chaudharyetal.,Nature339:3941989、Brinkmannetal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA88:86161991、Batraetal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA89:58671992、Friedmanetal.,J.Immunol.150:30541993、Welsetal.,Int.J.Can.60:1371995、Fominayaetal.,J.Biol.Chem.271:105601996、Kuanetal.,Biochemistry35:28721996、およびSchmidtetal.,Int.J.Can.65:5381996によって記載されている。ジフテリア毒素部分含有抗体-毒素融合タンパク質は、Kreitmanetal.,Leukemia7:5531993、Nichollsetal.,J.Biol.Chem.268:53021993、Thompsonetal.,J.Biol.Chem.270:280371995、およびValleraetal.,Blood88:23421996によって記載されている。Deonarainetal.,TumorTargeting1:1771995には、RNase部分を有する抗体-毒素融合タンパク質が記載されており、一方、Linardouetal.,CellBiophys.24-25:2431994では、DNaseI成分を含む抗体-毒素融合タンパク質が製造された。Wangetal.,Abstractsofthe209thACSNationalMeeting,Anaheim,Calif.,Apr.2-6,1995,Part1,BIOT005の抗体-毒素融合タンパク質中では、その毒素部分として、Geloninが使用された。さらなる例として、Dohlstenetal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA91:89451994には、ブドウ球菌Staphylococcalエンテロトキシン-Aを含む抗体-毒素融合タンパク質が報告された。こうした結合体の調製に適切に利用される、実例となる毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、DNaseI、ブドウ球菌エンテロトキシン-A、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシン、およびシュードモナスエンドトキシンである。例えば、Pastanetal.,Cell47:6411986、およびGoldenberg,CA--ACancerJournalforClinicians44:431994参照。他の適する毒素は、当業者には周知である。本発明の抗体は、プロドラッグ例えば、ペプチジル化学療法薬、国際公開パンフレット第81/01145号参照を活性抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体を結合体させることにより、ADEPTにおいても使用することができる。例えば、国際公開パンフレット第88/07378号および米国特許第4,975,278号参照。ADEPTに有用な免疫結合体の酵素成分には、それをそのより活性で細胞毒性の形態へ転化させるようにプロドラッグに対して作用することができるあらゆる酵素が挙げられる。本発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアルカリホスファターゼ;スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なアリールスルファターゼ;非毒性5-フルオロシトシンを抗癌薬、5-フルオロウラシルに転化させるために有用なシトシンジアミナーゼ;ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペンチダーゼおよびカテプシン例えば、カテプシンBおよびLなどのプロテアーゼ;D-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを転化させるために有用なD-アラニンカルボキシペプチダーゼ;グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に転化させるために有用なβ-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物開裂酵素;β-ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に転化させるために有用なβ-ラクタマーゼ;ならびにそれらのアミン窒素がフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物をそれぞれ遊離薬物に転化させるために有用なペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、当該技術分野においてアブザイムとしても知られている、酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に転化させることができる例えば、Massey,Nature328:457-4581987参照。抗体-アブザイム結合体は、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために、本明細書において説明するとおり調製することができる。本発明の酵素は、上で論じたヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当該技術分野においてよく知られている技法により、抗体に共有結合させることができる。あるいは、当該技術分野においてよく知られている組換えDNA技法例えば、Neubergeretal.,Nature312:604-6081984参照を用いて、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結している、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む、融合タンパク質を構築することができる。非治療用途本発明の抗体は、M-CSFに対する親和精製剤として使用することができ、またはM-CSFタンパク質についての診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織もしくは血清におけるその発現の検出に使用することができる。本抗体は、インビボ診断アッセイに使用することもできる。一般に、これらの目的には、イムノシンチオグラフィーを使用して腫瘍を局在定位することができるように、本抗体を放射性核種例えば、111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32Pまたは35Sで標識する。本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドウィッチアッセイ、例えばELISA、ならびに免疫沈降アッセイなどの周知アッセイ方法いずれにおいても利用することができる。Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158CRCPress,Inc.1987。本抗体は、当該技術分野において知られている方法を使用して腫瘍サンプルを標識する、免疫組織化学に使用することもできる。便宜上、本発明の抗体は、キットすなわち、所定量の試薬と診断アッセイを行うための説示とを併せてパッケージしたもので提供することができる。本抗体が酵素で標識されている場合、キットは、その酵素に必要な基質および補助因子例えば、検出可能な発色団または蛍光体を生じさせる基質前駆体を含むであろう。加えて、他の添加剤、例えば、安定剤、緩衝液例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液などを含むことができる。様々な試薬の相対量を幅広く変化させて、そのアッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度をもたらすことができる。詳細には、試薬は、溶解すると適切な濃度を有する試薬溶液をもたらす賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。本発明を以下の実施例により説明する。これらの実施例は、いかなる点においても制限とは解釈されない。実施例1この実施例は、M-CSF抗体RX1および5A1が、種特異的であること、ならびに抗体RX1、MC1およびMC3が、ヒトM-CSF活性を中和することを示すものである。RX1は、本出願の出願日より1年以上前に入手した市販の抗体である。例示的な市場の供給源には、マウス抗ヒトM-CSFモノクローナル抗体クローン116、692および21Anogen;抗ヒトM-CSF抗体クローン21113.131、26730および26786RDSystems,Inc.;ならびに抗ヒトM-CSF抗体クローンM16AntigenixAmerica,Inc.が挙げられるが、これらに限定されない。RX1および5A1の中和活性を検査するために、M-NFS-60細胞系の増殖アッセイを使用した米国微生物系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionアクセッション番号CRL-1838;米国、メリーランド州、ロックヴィルのATCCから入手でき、Cas-Br-MuLV野生型マウス環境栄養性レトロウイルスで誘導された骨髄性白血病に由来するものであり、インターロイキン3とM-CSFの両方に応答し、ならびにレトロウイルスの組み込みにより生じたトランケート型c-myb癌原遺伝子を含有する。M-NFS-60の増殖は、用量依存的に活性M-CSFを必要とする。このアッセイでは、M-NFS-60細胞を洗浄し、10FBSおよび3000U/mLのM-CSFおよび1Pen/Strepを含有するRPMI1640培地にプレーティングした。ヒトまたはマウス特異的、組換えヒトM-CSF最終濃度10ng/mLでを様々な濃度の抗生物質と共にインキュベータの中で1時間、37°C、5CO2でインキュベートした。インキュベーション後、その混合物を96ウエルマイクロタイタプレート内のM-NFS-60培養物に添加した。1ウエルあたりの全アッセイ量は、100μLであり、10ng/mLのM-CSFを含有し、図5に示す抗体濃度であった。細胞を37°C、5CO2下で72時間インキュベートした後、CellTiterGloアッセイPromegaにより細胞数を定量した。上述のアッセイを抗体MC3およびMC1について繰り返した。図5に示すように、M-CSF抗体RX1および5A1は、種特異的である。細胞増殖は、CellTiterGloアッセイからの蛍光読み取り値として提示し、これは細胞数に対して直線的である。RX1および5A1の種特異的中和活性は、ヒトまたはマウスM-CSF、いずれかの存在下でM-NFS-60を阻害するその能力によって示される。最後に、図5Bに示すように、抗体MC3およびMC1もM-CSF活性の有効な阻害剤である。実施例2この実施例は、抗体RX1が、5mg/kgの用量でヒト異種移植モデルにおいて骨溶解を有効に抑制することを示すものである。週齢4~7週、平均体重約20gの雌ヌードマウスをこの試験において使用した。10μLの食塩水に浮遊させた腫瘍細胞MDA-MB-231、3x105を右頸骨骨髄腔に注射した。腫瘍接種の1日後に後肢の放射線写真を撮ってベースライン画像を得、注射により生じた骨折をチェックした。マウスを、6週間にわたって週1回、5mg/kgで腹腔内注射するPBSおよびRX1を含む処置グループに、1グループにつき10匹で無作為に割り当てた。試験終了時に、再び後肢の放射線写真を撮り、骨損傷についてベースラインと比較した。腫瘍により生じた骨損傷の程度は、図6に示すとおり定義した。5mg/kgのRX1で処置したグループは、腫瘍に起因する損傷からの骨の統計学的に有意な保護を示した。実施例3この実施例は、ヒト乳癌MDA-MB-231を有するマウスに抗体RX1を5mg/kgの濃度で投与したとき、転移数が減少したことを示すものである。週齢4~7週、平均体重約20gの雌ヌードマウスをこの試験に使用した。10μLの食塩水に浮遊させた腫瘍細胞MDA-MB-231、3x105を右頸骨骨髄腔に注射した。腫瘍接種の1日後に右肢の放射線写真を撮ってベースライン画像を得、注射により生じた骨折をチェックした。マウスを、6週間にわたって週1回、5mg/kgで腹腔内注射するPBSおよびRX1を含む処置グループに、無作為にグループ分けした。試験終了時、各処置グループの肢を採取し、転移性肺小結節の計数のためにブアン溶液中に固定した。図7に示すように、ヒト乳癌MDA-MB-231を有するヌードマウスに抗体RX1を5mg/kgの用量で投与すると、転移数は減少する。実施例4この実施例は、RX1抗体のヒト化の手順を詳説するものである。類似した手順を用いて5H4、MC1およびMC3をヒト化する。ヒト化RX1軽鎖および重鎖についての遺伝子設計マウスRX1についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図4Bに記載する。NationalBiomedicalFoundationProteinIdentificationResourceまたは類似のデータベースを使用して同定されたヒト抗体の配列を使用して、ヒト化抗体のフレームワークを提供する。ヒト化重鎖の配列を選択するために、マウスRX1重鎖配列とヒト抗体重鎖の配列とのアラインメントを行う。各位置においてヒト抗体アミノ酸をヒト化配列に対して選択するが、但し、その位置が、下に定義する4つのカテゴリーのうちのいずれの1つにも入らないことを条件とし、入る場合には、マウスRX1アミノ酸を選択する:1その位置が、Kabat,J.Immunol.,125,961-9691980により定義されたような、相補鎖決定領域CDR内に入る;2そのヒト抗体アミノ酸が、ヒト重鎖のその位置では珍しいのに対し、そのマウスRX1アミノ酸は、ヒト重鎖のその位置に一般的である;3その位置が、マウスRX1重鎖のアミノ酸配列においてCDRに直接隣接している;または4そのマウスRX1抗体の3次元モデリングが、そのアミノ酸が抗原結合領域に物理的に近いことを示唆している。ヒト化軽鎖の配列を選択するために、マウスRX1軽鎖配列とヒト抗体軽鎖の配列とのアラインメントを行う。各位置においてヒト抗体アミノ酸をヒト化配列に対して選択するが、その位置も、上に記載した下に繰り返すカテゴリーの1つに入らないことを条件とする:1CDR;2ヒト抗体より典型的なマウスRX1アミノ酸;3CDRに隣接;または4結合領域への3次元近接の可能性。前記重鎖および軽鎖遺伝子の実際のヌクレオチド配列は、次のように選択する:1ヌクレオチド配列が、上に記載したとおり選択したアミノ酸をコードする;2これらのコード配列の5’前記ヌクレオチド配列は、リーダーシグナル配列をコードする。これらのリーダー配列を抗体の代表として選択した;3それらのコード配列3’前記ヌクレオチド配列は、マウスRX1配列の一部である、マウス軽鎖J5セグメントおよびマウス重鎖J2セグメントに続く配列である。これらの配列は、スプライス供与シグナルを含有するため含める;4その配列の各末端において、XbaI部位は、そのXbaI部位で切断し、ベクターのXbaI部位にクローニングすることができる。ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の構築重鎖を合成するために、AppliedBiosystems380BDNAシンセサイザーを使用して4つのオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌクレオチドのうちの2つは、重鎖の各鎖の一部であり、各オリゴヌクレオチドは、アニーリングできるように、約20ヌクレオチドまで次のものとオーバーラップしている。協力してそれらのオリゴヌクレオチドが、全ヒト化重鎖可変領域をカバーし、その各末端の少数の余分なヌクレオチドによりXbaI部位での切断が可能となる。それらのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製する。標準的な手順によりATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、各オリゴヌクレオチドをリン酸化するManiatisetal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.1989。リン酸化されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを共に、40μLのTA33mMTrisアセテートpH7.9、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウムに各々約3.75uMの濃度で懸濁させ、4分間、95°Cに加熱し、ゆっくりと4°Cに冷却する。各オリゴヌクレオチドの反対の鎖を合成することによりそれらのオリゴヌクレオチドから相補遺伝子を合成するために、以下の成分を最終量100uLで添加する:10uLアニーリングしたオリゴヌクレオチド0.16mM各デオキシリボヌクレオチド0.5mMATP0.5mMDTT100ug/mLBSA3.5ug/mLT4g43プロテインDNAポリメラーゼ25ug/mLT4g44/62プロテインポリメラーゼ補助タンパク質25ug/mL45プロテインポリメラーゼ補助タンパク質。この混合物を37°Cで30分間インキュベートする。その後、10uのT4DNAリガーゼを添加し、37°Cで30分間のインキュベーションを再び開始する。それらの反応物を70°Cで15分間インキュベートすることにより、ポリメラーゼおよびリガーゼを不活性化する。XbaIで遺伝子を消化するために、その反応物に200ug/mLのBSAおよび1mMのDTTを含有する50μLの2xTA、43uLの水および5uL中50uのXbaIを添加する。その反応物を3時間、37°Cでインキュベートし、その後、ゲルで精製する。XbaIフラグメントをゲルから精製し、標準的な方法によりプラスミドpUC19のXbaI部位にクローニングする。標準的な技法を使用してプラスミドを精製し、ジデオキシ法を使用して塩基配列を決定する。ヒト化軽鎖および重鎖を発現するプラスミドの構築は、軽鎖および重鎖XbaIフラグメントをそれが挿入されたpUC19プラスミドから単離し、その後、それを適切な発現ベクターのXbaI部位に挿入することによって達成され、その発現ベクターが、適切な宿主細胞にトランスフェクトされると、高レベルの相補重鎖を発現することとなる。ヒト化抗体の合成および親和性発現ベクターをマウスSp2/0細胞にトランスフェクトし、プラスミドを組み込む細胞を、標準的な方法により発現ベクターによってもたらされる選択可能なマーカー複数を含むの基に選択する。これらの細胞が、M-CSFに結合する抗体を分泌したことを検証するために、それらの細胞からの上清を、M-CSFを発現することが知られている細胞と共にインキュベートする。洗浄後、それらの細胞をフルオレセインに結合体化したヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、FACSCANサイトフルオロメータで蛍光について分析する。次の実験のために、ヒト化抗体を生産する細胞をマウスに注射し、結果として生じた腹水を回収する。標準的な技法に従ってAffigel-10支持体カリフォルニア州、リッチモンドのBio-RadLaboratories,Inc.を用いて調製したヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体の親和性カラムを通すことにより、その腹水からヒト化抗体を実質的に均質に精製する。元のマウスRX1抗体を基準にしてヒト化抗体の親和性を判定するために、当該技術分野において知られている技法に従って競合結合実験を行う。実施例4Aこの実施例は、HumanEngineeredTMRX1抗体のクローニングおよび発現、ならびにそうした抗体の精製、および結合活性についての検査を説明するものである。HumanEngineeredTM5H4、MC1およびMC3抗体は、類似の手順を使用して調製する。HumanEngineeredTM配列の設計抗体可変ドメインのHumanEngineeringTMは、抗体の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させる方法として、Studnickaにより説明されている[例えば、Studnickaらの米国特許第5,766,886号;Studnickaetal.ProteinEngineering7:805-8141994参照]。この方法に従って、各可変領域アミノ酸に置換のリスクを割り当てた。アミノ酸置換は、次の3つのカテゴリーのうちの一つに分類される:1低リスク変更は、免疫原性を低下させる可能性が最も高く、抗原結合を破断する機会が最も少ないものであり;2中リスク変更は、免疫原性をさらに低下させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす機会がより多いものであり;3高リスク残基は、結合にまたは抗体の構造の維持に重要であり、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼすであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造的役割のため、プロリンにおける修飾は、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても、一般には少なくとも中リスク変更での修飾であると見なされる。置換的変更は好ましいが、挿入および欠失も可能である。図4Bおよび4Cは、マウスRX1軽鎖および重鎖の各アミノ酸残基についてのリスク割り当てを示すものであり、それぞれ、高、中または低リスク変更として類別されている。この方法を使用して、マウスRX1抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をHumanEngineeredTMした。低リスク位置でのこの方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことにより特定した。個々のVHもしくはVL配列またはヒトコンセンサスVHもしくはVL配列をはじめとするあらゆるヒト可変領域を使用することができる。いずれかの数の低リスク位置または全ての低リスク位置のアミノ酸残基を変更することができる。図19A~BにおけるHumanEngineeredTM低リスク重鎖配列には、ヒトコンセンサスVh2Kabatに基づくものをテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低リスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。図20A~BにおけるHumanEngineeredTM低リスク軽鎖配列には、ヒトコンセンサスκ3Kabatに基づくものをテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低リスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。合計16のアミノ酸低リスク修飾を軽鎖に対して行い、8の低リスク修飾を重鎖に対して行った。同様に、全ての低および中リスク位置でのこの方法による修飾の候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列とヒト可変領域配列とのアラインメントを行うことにより特定した。いずれかの数の低もしくは中リスク位置または全ての低および中リスク位置のアミノ酸残基を変更することができる。図19A~BにおけるHumanEngineeredTM重鎖配列には、ヒトコンセンサスVh2Kabatに基づくものをテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低またはリスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入した。図20A~BにおけるHumanEngineeredTM軽鎖配列には、ヒトコンセンサスκ3Kabatに基づくものをテンプレートとして使用し、マウスアミノ酸残基とヒトアミノ酸残基が低またはリスク位置において異なる各位置には、そのマウス残基をヒト残基で置換アミノ酸修飾を導入した。合計19の低および中リスクアミノ酸修飾を軽鎖に対して行い、12の低および中リスク修飾を重鎖に対して行った。図21A~Bに示すような、54位での修飾をマウスに戻した代替低リスク軽鎖配列も調製した。図21A~Bに示すような、54~56位での修飾をマウスに戻した代替低中リスク軽鎖配列も調製した。最後に、ヒト生殖細胞系VK6サブグループ2-1-1A14をテンプレートとして使用して、図22A~Bに示すようなHumanEngineeredTM低中リスク軽鎖V領域配列も生産した。本発明では、グリコシル化部位を表す図4Aのアミノ酸41~43NGSの保持も考えられる。あるいは、アミノ酸41~43のうちの1つだけまたは2つ例えばNGが保持されこともある。永久細胞系発生のための発現ベクターの調製上で説明した重鎖および軽鎖V領域配列の各々を抗体由来のシグナル配列と共にコードするDNAフラグメントを、人工ヌクレオチド合成を使用して構築した。上で説明した軽鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトκ軽鎖定常領域を含有するベクターpMXP10に挿入した。上で説明した重鎖V領域アミノ酸配列の各々をコードするDNAを、ヒトγ-2重鎖定常領域を含有するベクターpMXP6に挿入した。図29A、29bおよび30に提示する配列を有するヒトγ-1cDNAおよびγ-4ゲノムおよびcDNA定常領域に融合した重鎖V領域アミノ酸配列を含有する追加のベクターを構築した。これらのベクターの全てが、hCMVプロモータおよびマウスκ軽鎖3’非翻訳領域ならびに選択可能マーカー遺伝子、例えば、G418-またはヒスチジノール-耐性トランスフェクタントそれぞれの選択のためのneoまたはhisを含有する。これらの軽鎖および重鎖ベクターを表2および3にそれぞれ記載する。次に、所望のHumanEngineeredTM軽鎖プラス重鎖遺伝子γ-1、γ-2およびγ-4を含むベクターを構築した。これらの2-遺伝子ベクターは、hCMVプロモータの制御下で各抗体鎖、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子、CMVスプライス供与体、SV4016Sスプライスレセプター、ならびにポリA部位を含むマウスκ軽鎖3’非翻訳DNAを含有する。これらは、neoまたはhisなどの選択可能マーカー遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子も含有する。重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の両方を含有するベクターを表4に記載する。軽鎖および重鎖遺伝子各々の2つのコピーを含むベクター4つの遺伝子ベクターも構築することができる。一過性発現のための発現ベクターの調製上で説明した軽鎖または重鎖のいずれかを含有するベクターを一過性トランスフェクションのためにも構築した。これらのベクターは、Epstein-Barrウイルス核抗原を発現するHEK293細胞での複製のために、neoまたはhis遺伝子の代わりにEpstein-BarrウイルスoriPを含有すること以外は、永久トランスフェクションについて上で説明したものと同様である。一過性トランスフェクションのためのベクターを表5および6に記載する。HEK293E細胞におけるHumanEngineeredRX1の一過性発現上で説明したEpstein-BarrウイルスからのoriPおよび軽鎖または重鎖遺伝子を各々が含有する別個のベクターをHEK293E細胞に一過的にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトした細胞を10日以下の間インキュベートさせておき、その後、上清を回収し、プロテインAクロマトグラフィーを使用して抗体を精製した。293E細胞の一過性トランスフェクションにより生産されたタンパク質を下の表7に記載する。永久トランスフェクトされたCHO-K1細胞の発生軽鎖および重鎖遺伝子各々のコピー1つを共に含有する上表4に記載のベクターをEx-Cell302適応CHO-K1細胞にトランスフェクトする。Ex-Cell302培地中での浮遊成長に適合させたCHO-K1細胞を、典型的には40ugの線状化ベクターと共にエレクトロポレーションにかける。あるいは、線状化DNAを線状ポリエチレンイミンPEIと複合させ、トランスフェクションに使用することができる。1FBSおよびG418を補足したEx-Cell302培地が入っている96ウエルプレートに、それらの細胞をプレーティングする。96ウエルプレート内でクローンをスクリーニングし、各トランスフェクションからのクローンのトップから約10を、Ex-Cell302培地が入っている24ウエルプレートに移す。Ex-Cell302培地中、24ウエルプレートで、7および14日間の培養物成長についての生産性の検定を行い、この時、IgGについての免疫グロブリンELISAアッセイにより、培養物の上清を分泌された抗体のレベルについて検査する。Ex-Cell302培地が入っているフラスコにトップクローンを移して振盪する。細胞を浮遊成長に適合させたらすぐにEX-Cell302培地中のこれらのクローンで振盪フラスコ検査を行う。25mLの培地が入っている125mLエルレンマイヤーフラスコ内で10日以下の間、細胞を成長させる。インキュベーション期間の少なくとも1日おきには気体交換ができるようにフラスコを開け、各インキュベーション期間終了時、IgGELISAによってその培地中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルを判定する。2つまたは3つの多ユニット転写ベクターでの同細胞系の多重逐次トランスフェクションの結果、免疫グロブリン生産レベルのさらなる増加、好ましくは300μg/mLまたはそれ以上への増加を示すクローンおよび細胞系が生じる。精製本発明のベクターおよび全ての系統から免疫グロブリンポリペプチドを精製するためのプロセスを設計することができる。当該技術分野においてよく知られている方法に従って、細胞を終結後に濾過によって除去する。濾液をプロテインAカラムに充填する必要な場合には、複数回通す。カラムを洗浄し、その後、発現および分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶離する。抗体産物の調製のために、ウイルス不活性化工程としてプロテインAプールを低pHで保持する最低30分間、最高1時間にわたってpH3。次に吸着カチオン交換工程を用いて、その産物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶離物をウイルス保持フィルタに通して、潜在的ウイルス粒子をさらに取り除く。その濾液を、その産物が結合しないアニオン交換カラムに通すことによりさらに精製する。最後に、産物をダイアフィルトレーションによって調合緩衝液に移すことにより、精製プロセスを終える。保持物を少なくとも1mg/mLのタンパク質濃度に調整し、安定剤を添加する。結合活性組換えHumanEngineeredTM抗体のMCSF結合活性を評価する。プロテインAカラムに通すことにより、振盪フラスコ培養上清からタンパク質を精製し、その後、A280により濃度を決定する。結合アッセイは、上の実施例1において説明しように、または下の実施例12において説明するように行う。ImmulonIIプレートを、PBSコーティング溶液中で予め希釈したsM-CSFでプレコートして、それをマイクロプレートに固定する。0.25から20ug/mLにわたる様々な被検濃度のM-CSFを50uL/ウエルで添加し、4°Cで一晩インキュベートする。その後、プレートをPBS-0.05Tweenで3回洗浄する。PBS-0.05Tweenに1BSAを添加し、その後、37°Cで30分インキュベートすることによって、ブロッキングを行う。免疫グロブリンポリペプチドの希釈物をPBS-0.05Tween1BSA溶液中で調製する。2または3倍系列希釈物を調製し、二重反復または三重反復で添加する100uL/ウエル。37°Cで90分インキュベートした後、そのマイクロプレートをPBS-0.05Tweenで3回洗浄する。シグナルを発生させるために、ペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗ヒトIgGγ特異的またはFc特異的二次抗体を各ウエルに添加し、60分間、37°Cでインキュベートし、その後、クエン酸緩衝液プラス0.012H2O2中0.4mg/mLでOPDを添加する。室温で5~10分後、100uLの1MH2SO4の添加によりアッセイを停止させ、プレートを490nmで読み取る。ヤギ抗ヒトIgGγ特異的抗体とヤギ抗ヒトIgGFc特異的抗体の両方を利用した。実施例5以下の実施例は、修飾または非修飾IgG1またはIgG4定常領域を有するRX1HumanEngineeredTM抗体をはじめとする、RX1由来の抗体またはRX1競合抗体などのM-CSF特異的抗体を使用してヒトを処置する手順を詳説するものである。MC1もしくはMC3由来の抗体またはMC1もしくはMC3競合抗体についても、この手順をなぞることができる。予測される効能を生じる投薬範囲は、2ug/kgから10mg/kgである。この概算は、実験データにより実証される以下の原理に基づくものである:ヒト血漿中のM-CSFレベルの測定値健康な患者と乳癌患者の両方は、約1ng/mLである。M-CSF中和抗体RX1は、1ng/mLのヒトM-CSFに対して2ng/mLのEC50測定値を有する。従って、ヒト血漿中の有効抗体濃度は、そのEC50の10から50,000倍、すなわちヒト血漿中、抗体20ng/mLから100ug/mLであると予測される。PK試験に基づき、ヒトの患者においてこの濃度を実現するためには、2μg/kgから10mg/kgの投薬が、血漿中、20ng/mLから100ug/mLの抗体濃度を達成するために必要である。実施例6この実施例は、皮下モデルにおける抗M-CSFモノクローナル抗体の抗癌活性を評価するための手順を詳述するものである。上の実施例2は、抗M-CSFモノクローナル抗体治療により骨髄における腫瘍成長が有意に抑制されることを示した。この試験の目的は、その抗体が軟組織における腫瘍成長も抑制することができるかどうかを評価することである。この試験には週齢10週で平均体重約20gの雌nu/nuマウスを使用しよう。マウスは、試験開始前少なくとも7日の順化期間に付されることとなる。0日目、ヌードマウスの右側腹部にマウス1匹につき100μLあたり細胞数5x106でSW620ヒト結腸癌細胞を皮下注射することとなる。腫瘍体積が100~200mm3に達したら通常、腫瘍接種の1週間後、マウスを次のような5つのグループに1グループあたりマウス10匹で無作為に割り付けることとなる:1PBS2RX135A14mIgG1rIgG1アイソタイプAbコントロール55A1RX1。マウスは、10mpkの指定の抗体で週1回、4週間にわたって腹腔内処置することとなる。腫瘍体積が2000mm3に達したら、試験を停止することとなる。あるいは、動物は、次の状況のうちのいずれかになったら、安楽死させることにもなる:腫瘍表面潰瘍形成が、全表面積の30より大きい、有意な体重減少>20、脱水、および瀕死の状況。全血を全てのマウスから採取し、単球集団を潜在的代理マーカーとして分析することとなる。腫瘍成長/サイズは、2D分析により測定することとなる。腫瘍の幅および長さの測定値を使用して、腫瘍体積を計算することとなる。軟組織における腫瘍成長は、上述の試験の結果として抑制されるであろうと予測される。実施例7以下の実施例は、癌転移に関連する幾つかの骨溶解性疾患の処置および予防のための併用療法を評価する手順を詳述するものである。実験設計。次のことを除き、上の実施例5において説明した試験を本質的には説明したとおり繰り返す。下の処置グループで述べる抗体または抗体の組合せに加えて、動物たちは、次の追加処置のうちの1つを受けることとなる:1.ビスホスホネート例えば、Aredia;Zometa;Clodronate2.手術3.放射線4.化学療法5.ホルモン療法例えば、Tamoxifen;抗アンドロゲン療法6.抗体療法例えば、RANKL/RANK中和抗体;PTHrP中和抗体7.治療用タンパク質療法例えば、可溶性RANKLレセプター;OPG、ならびにPDGFおよびMMP阻害剤8.小分子薬物療法例えば、Src-キナーゼ阻害剤9.オリゴヌクレオチド療法例えば、RANKLまたはRANKまたはPTHrPアンチセンス10.遺伝子療法例えば、RANKLまたはRANK阻害剤11.ペプチド療法例えば、RANKLの突然変異タンパク質。処置グループは、次のとおりである。上の追加処置は、下ではプラス療法Xと示す:1.PBSのみ2.療法Xのみでの治療3.ラットIgG1アイソタイプコントロール4.マウスIG1アイソタイプコントロール5.RX1抗ヒトMCSFのみ6.5A1ラットIgG1抗マウスMCSFのみ7.ラットIgG1とマウスIgG1アイソタイプコントロールの併用8.RX1と5A1の併用9.ラットIgG1アイソタイプコントロールプラス療法X10.マウスIG1アイソタイプコントロールプラス療法X11.RX1抗ヒトMCSFプラス療法X12.5A1ラットIgG1抗マウスMCSFプラス療法X13.ラットIgG1とマウスIgG1アイソタイプコントロールの併用プラス療法X14.RX1と5A1の併用プラス療法X。投薬:0.1~30mg/kgの各抗体を各動物への投与に使用する。好ましい投薬は、10mg/kgである。投与経路は、IV、IP、SCであり得る。好ましい経路は、IPである。処置は、上の実施例5で説明したような腫瘍細胞注射の翌日に開始することとなる。測定:様々な処置グループ間の骨溶解の重篤度を評価するために、各マウスは、腫瘍細胞注射の翌日、ベースラインFaxitron画像の撮影を受ける。Faxitron画像は、試験終了時8週目にも撮影する。腫瘍細胞が安定してルシフェラーゼを発現するため、Xenogenシステムを使用して同時に腫瘍成長を測定する。癌転移に関連する重症骨溶解性疾患を処置および予防するための併用療法は、抗体療法単独を基準にして、改善されるであろうと予測される。実施例8以下の実施例は、蛍光発光セルソータを使用して、M-CSF特異的抗体が例えば乳癌細胞細胞系MDA231または多発性骨髄腫癌細胞細胞系ARH77に結合する能力を評価するためのプロトコルを提供するものである。先ず、細胞をPBSCa2、Mg2負含で2回洗浄した。各10cmプレートに2mLの3mMEDTAを添加し、プレートを37°Cで、細胞が丸まり、皿から剥離し始めるまで、2~3分間インキュベートした。次に、10mLの緩衝液APBS5FBSを添加し、混合した。この時点で、細胞をペレット化し、PBS5FBSに細胞数約5x106/mLで再び浮遊させ、細胞を100μL/サンプルで細管に入れた。この時点で、0.1~10ug/mLの一次抗体指示濃度でM-CSF抗体またはコントロール抗体を使用を添加した。必要に応じて、5FBS/PBS中で希釈を行った。その後、その混合物を30分間、4°Cでインキュベートした。インキュベーション時間の後、細胞を400gでの5分間の遠心分離により3回洗浄し、細胞をPBSに再び浮遊させた。FITCまたはPE標識抗IgG抗体0.25ug/サンプルを1BSA/PBS中、最適希釈で希釈し、細胞をこの溶液に再び浮遊させ、30分間4°Cでインキュベートした。次に、上で説明したように細胞を3回洗浄した。細胞洗浄後、細胞を0.5mL/サンプルのPI-PBSで再び浮遊させた死滅細胞を生細胞と区別する必要がある場合。後の分析のために、細胞を固定することもできる細胞は、0.1ホルムアルデヒドで固定すると、約3日、存続し得る。次に、標準的な手順を使用して、蛍光発光FACSで細胞を分析した。図8Aおよび8Bに示すように、MCSF特異的抗体RX1は、示されているような様々な抗体濃度で乳癌細胞系MDA231または多発性骨髄腫癌細胞系ARH77に結合させた。実施例9以下の実施例は、M-CSFが多数の癌細胞表面上に頻出することを示すものである。M-CSF特異的抗体RX1を使用して、M-CSFの免疫組織化学染色を次のとおり行った。最初に、スライドガラスをオーブン内で1時間、55~60°Cで加熱し、2~3分間、放置して冷却した。以下の脱ろうおよび再水和パラメータを使用した:a.キシレン3x5分b.100試薬アルコール2x5分c.95試薬アルコール2x4分d.75試薬アルコール2x3分e.50試薬アルコール1x3分g.dIH2O2~3回、短時間すすぐ。過酸化物ブロッキング工程の前に、1xBiogenexCitraPlusを使用して抗原賦活化の準備をした。最初、その溶液を全出力でマイクロ波処理して沸騰させた。その溶液が沸騰したら、マイクロ波装置をさらに13分間、出力レベル2にすばやく設定し、放置して冷却した後、続行した。過酸化物ブロッキング工程は、次のように行った。スライドガラスは、3H2O225mL30から250mLdIH2Oに浸漬し、10分間、室温で置いた。次に、スライドガラスをdIH2Oで2回すすぎ、1XPBSで2分間、2回洗浄した。アビジン/ビオチンブロッキング手順は、次のように行った。スライドガラスを金属ラックの上に平らに置いた。組織の周囲にBluePAPペンを使用した疎水性スライドマーカー。次に、--組織を覆うために十分な--2滴のZymedAvidin試薬Aを添加し、それらのスライドガラスを室温で10分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドガラスを次のように洗浄した:1XPBS中で3分間、2回の洗浄2滴のZymedBiotin試薬B、室温で10分間1XPBS中で3分間、2回の洗浄。タンパク質ブロッキング手順は、次のように行った。先ず、二次抗体種の10血清[から2最終濃度]を添加した。次に、BioGenexPowerBlockをdIH2Oで1Xに希釈した。スライドガラスのラックを8分間、室温でPowerBlockに浸漬し、それらのスライドガラスを1XPBS中で2回すすいだ。一次抗体RX1を添加するために、スライドガラスを金属ラックの上の平らに置いた。各切片を覆うように抗体を添加し約350μL、組織を削り落とさずに、必要な場合にはピペットの先端で抗体を広げた。その後、それらのスライドガラスを1時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、スライドガラスを1xPBSで3回、各回3~5分、洗浄した。この時点で、BioGenexMulti-Linkを切片に適用し、10~11分間、室温でインキュベートした。その後、切片を各回3分洗浄した。BioGenexHRPLabelを切片に適用することにより標識付けを行い、その後、それらを室温で10~11分間インキュベートし、1xPBSで3分間、3回洗浄した。次に、BioGenexH2O2基質をそれらの切片に添加しH2O22.5mLごとに1滴のAEC、室温で10分間、インキュベートした。その後、切片をdIH2Oで数回すすいだ。対比染色工程は、次のように行った。切片を1分間、室温でヘマトキシリンで染色した。次に、それらの切片をH2Oで2回洗浄し、その後、1XPBS中で1分間インキュベートした。その後、切片をH2Oでよくすすいで、PBSを除去した。一滴のBioGenexSuperMountを切片に適用し、その後、一晩、室温で空気乾燥させることによって、切片をマウントした。図9に示すように、M-CSFは、癌細胞表面に頻出する。示されている癌細胞タイプについての切片に次のように評点を付けた:0無染色1染色は、バックグラウンドと同様であった2陽性、しかし弱い染色3陽性で有意な染色4陽性で強い染色。実施例10以下の実施例は、抗体MC1およびMC3を生産するための手順を示すものである。MC1およびMC3は、ヒトM-CSF抗体を中和し、ヒトM-CSFに結合する2つのモノクローナルマウス抗体である。これらの抗体のアミノ酸配列を図14および15にそれぞれ示す。以下を含む一連の工程により、これらを同定した:a組換えヒトM-CSFでBalbCマウスを免疫する工程;bELISA形式でヒトM-CSFに結合する抗体を生産する陽性クローンをスクリーニングする工程;c陽性クローンをサブクローニングして、安定なハイブリドーマクローンを調製する工程;d細胞培養の規模を拡大して、大量の抗体を生産する工程;e前の実施例で説明したような親和分析、細胞結合アッセイおよび中和活性アッセイにおいて抗体を精製および特性付けする工程。図16Aおよび16Bは、抗体RX1、5H4、MC1およびMC3の重鎖および軽鎖のCDRのアラインメントをそれぞれ示すものである。ヒト化およびHumanEngineeredTM変種は、上の実施例において説明したように調製する。実施例11この実施例は、M-CSF抗体RX1および5H4ならびにそれらのFabフラグメントが、異なる中和活性を有することを示すものである。以下の実施例は、抗体RX1、5H4およびMC3が、M-CSFに対して様々な親和性を有することを示すものでもある。この実施例により、上述のインタクトな抗体の親和性が上述の抗体のFabフラグメントを基準にして高いことが、さらに実証される。様々な抗体濃度の存在下でのM-CSF依存性細胞増殖を測定することにより、RX1および5H4のFabフラグメントの中和活性に対するインタクトなRX1および5H4の中和活性を判定した。細胞増殖は、化学発光染料により判定した。図17に示すように、インタクトなRX1が、最も高い効力を有する一方で、RX1のFabフラグメントは、その効力を失い、5H4および5H4Fabフラグメントのように挙動する。Biacore分析を使用して、上述の抗体の結合特性を分析した。M-CSFに対するRX1、5H4およびMC3の相対親和性を判定するために、ウサギ抗マウスFcを、アミンカップイングにより、CM5バイオセンサーチップ上に固定した。その後、1.5μg/mLで3分間、2μL/分で抗マウスFc/CM5バイオセンサーチップを用いて、上述の抗体を捕捉した。MCSFを様々な濃度Rmax約15でその変性バイオセンサー表面上に流した。被検抗体および抗原は、0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCL、3mMEDTA、0.005SurfactantP20HBS-EP中で希釈した。全ての実験は、25°Cで行った。反応速度定数および親和定数は、1:1相互作用モデル/全フィットでBiaevaluationソフトウェアBiacoreを使用して決定した。下の表8に示すように、RX1は、5H4およびMC3を基準にして最も高い親和性でM-CSFに結合する。RX1、5H4およびMC3のインタクトなMabおよびFabフラグメントの結合親和性における相対差を判定するために、Biacore分析において交互配置を使用した。具体的には、M-CSFをアミンカップリングによりCM5バイオセンサーチップ上に固定した。10mM酢酸NapH4.0中0.05μg/mLのM-CSFを5分間、1μL/分で注射して、RL=6~12RUを達成した。被検抗体またはFabフラグメントを様々な濃度でその変性バイオセンサー表面上に流した。被検抗体は、0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCL、3mMEDTA、0.005SurfactantP20HBS-EP中で希釈し、全ての実験を25°Cで行った。反応速度定数および親和定数は、1:1相互作用モデル/全フィットでBiaevaluationソフトウェアBiacoreを使用して決定した。下の表9に示すように、RX1は、検査した他の抗体を基準にして最も高い親和性でM-CSFに結合する。RX1のFabフラグメントは、そのRX1完全タンパク質を基準にして有意に低い親和性でM-SCFに結合する。結合親和性および中和データは、RX1の中和活性が、M-CSFに対するその著しく高い親和性に主として起因すること、そして、この高い親和性が、M-CSF二量体に同時に結合する抗体の両方のアームの能力に少なくとも一部は起因し得ることを示している。実施例12以下の実施例は、抗体RX1、5H4およびMC3により認識されるM-CSF上の線状エピトープすなわち、アミノ酸配列を明らかにするものである。最初、抗体RX1、5H4およびMC3が、線状エピトープを認識するのか、M-CSF内の配座エピトープを認識するのかを判定するように、エピトープマッピング戦略を設計した。従って、抗M-CSF抗体を還元条件下ならびに非還元条件下で0.1μgのM-CSFに対して検査した。M-CSFの非還元形態のみが、各抗体により認識された。これは、認識されるエピトープが、自然界では一貫性がないことを示唆している。次に、M-CSFの線状エピトープを各抗体について決定した。具体的には、対象となるM-CSFフラグメント配列1つのアミノ酸オフセットで合成されたオーバーラップする10量体ペプチドをそのセルロース膜支持体上に負荷させたSPOT膜SigmaGenosysを調製した。その後、これらの膜を上述の抗体でプローブし、反応性SPOTを特定した。その後、膜上のその対応する位置によりペプチド配列を特定し、陽性反応するペプチドの中のオーバーラップするアミノ酸をエピトープとして特定した。図18に示すように、RX1は、5H4およびMC3とは異なる線状エピトープに結合し、これらは、M-CSF上の異なる位置に位置する。RX1は、RFRDNTPN配列番号120またはRFRDNTAN配列番号121、図12のM-CSFのアミノ酸98~105によって表される線状エピトープに結合する。5H4は、ITFEFVDQE配列番号122、図12のM-CSFのアミノ酸65~73によって表される線状エピトープに結合する。MC3は、1ITFEFVDQE配列番号122、図12のM-CSFのアミノ酸65~73および2FYETPLQ配列番号123、図12のM-CSFのアミノ酸138~144によって表される2つの線状エピトープに結合する。実施例13上の実施例4Aで説明したように調製したRX1抗体のHumanEngineeredTM変種の結合親和性を判定した。この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHumanEngineeredTMRX1抗体が、インビトロで異なる親和性でM-CSFに結合することを示すものである。Biacore分析によりインタクトな抗体の結合親和性における相対差を判定するために、M-CSFをアミンカップリングによりCM5バイオセンサーチップ上に固定した。10mM酢酸NapH4.0中0.05μg/mLのM-CSFを5分間、1μL/分で注射して、RL=6~12RUを達成した。被検抗体またはFabフラグメントを、その変性バイオセンサー表面上に、2倍希釈で100nMから1.5nMにわたる様々な濃度で流した。被検抗体は、0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCL、3mMEDTA、0.005SurfactantP20HBS-EP中で希釈し、全ての実験を25°Cで行った。各濃度点および緩衝ブランクを三重反復でランし、3分の会合および8分の解離でデータを回収した。反応速度定数および親和定数は、1:1相互作用モデル/全フィットでBiaevaluationソフトウェアを使用して決定した。下の表10に示すように、heRX1-1.G1およびheRX1-1.G4は、マウスRX1-M-CSFの結合親和性に最も近似した親和性でM-CSFに結合する。対照的に、下の表11に示すように、結合親和性に多少の変動はあるが、γ-2構築物の全てが、親マウス抗体と比較して少なくとも7倍の結合親和性低下を提示する。実施例14この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHumanEngineeredTMRX1抗体が、インビトロで異なる中和活性を有することを示すものである。M-CSF抗体の中和活性を検査するために、M-NFS-60細胞系の増殖アッセイを使用した米国微生物系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionアクセッション番号CRL-1838;米国、メリーランド州、ロックヴィルのATCCから入手でき、Cas-Br.MuLV野生型マウス環境栄養性レトロウイルスで誘導された骨髄性白血病に由来するものである。この細胞系は、インターロイキン3とM-CSFの両方に応答し、ならびにレトロウイルスの組み込みにより生じたトランケート型c-myb癌原遺伝子を含有する。M-NFS-60の増殖は、用量依存的に活性M-CSFを必要とする。このアッセイでは、M-NFS-60細胞を洗浄し、10FBSおよび1Pen/Strepを含有するRPMI1640培地にプレーティングした。組換えヒトM-CSF最終濃度10ng/mLでのもの;これは、3000U/mLのM-CSF活性と等価であるを系列2倍希釈で1ug/mLから0.5ng/mLにわたる様々な濃度で、インキュベータの中で、1時間、37°C、5CO2でインキュベートした。インキュベーション後、その混合物を96ウエルマイクロタイタプレート内のM-NFS-60培養物に添加した。1ウエルあたりの全アッセイ量は、100uLであり、10ng/mLのM-CSFを含有し、示されている抗体濃度であった。細胞を37°C、5CO2下で72時間インキュベートした後、CellTiterGloアッセイPromegaにより細胞数を定量した。各抗体を三重反復で検査し、翌日、反復した1抗体あたり合計6回のアッセイのため。各抗体のIC50を曲線当てはめにより分析した。このアッセイを、ヒト血清中MCSF、MDA231調整培地M-CSFを含有する、カニクイザル血清中MCSF、およびカニクイザル組換えMCSFを使用して反復した。結果を図25組換えMCSF、26ヒト血清中MCSFおよび27MDA231調整培地に、細胞数に対して直線的であるCellTiterGloアッセイからの蛍光読み取り値として提示する。抗体の中和活性は、M-NFS-60細胞の増殖の抑制として示す。結果は、heRX1-1-IgG1およびheRX1-1-IgG4のIC50が、組換えマウス親RX1抗体とほぼ同じであった一方で、heRX1-1-IgG2のIC50は、約2倍から4倍高かったことを示している。下の表12は、上の実施例4Aにおいて説明したように調製した様々なIgG2構築物の相対IC50をIC50倍数減損によって示すものである。これらの構築物のうち、heRX1-1.G2およびheRX1-10.G2が、最少のIC50減少を示した。実施例15この実施例は、異なるIgGサブクラス定常領域を有するHumanEngineeredTMRX1抗体が、インビトロ破骨細胞発生アッセイにおいて異なるTRAP活性を有することを示すものである。ここで説明する実験条件下でヒト骨髄CD34細胞Biowhittakerカタログ番号2M-101A、細胞数3x105/バイアルを破骨細胞に分化するように誘導した。1日目、CD34細胞を1つの凍結バイアルから解凍して、10mLの培地10FCS、1xPenStrepおよび1xフンギソンを含有するAlphaMEMに入れた。細胞を1回洗浄し、2mLの培地に再び浮遊させ、1ウエルあたり100uLで96ウエルプレートに配置した。2日目、元の培地を除去せずに、各ウエルに50uLの4xCSF-1を最終濃度30ng/mLまで、および50uLの4xRANKLsRANKL、ChemiconカタログGF091、10ug/パッケージを100ng/mLの最終濃度まで添加した。7日目、各ウエルに50uLの5xRANKLを100ng/mLの最終濃度まで添加した。17日目、それらの細胞をTRAP活性のために染色しTRAP染色用のLeukocyteAciePhosphataseキット、Sigamカタログ387-A、顕微鏡もとで検査した。M-CSF中和抗体は、アッセイの2日目に添加した。図28に示すように、これらの抗体は、用量依存的に破骨細胞分化を抑制する。破骨細胞分化アッセイにおける抗体の抑制活性は、アッセイの17日目に見ることができる破骨細胞の不足として示す。実施例16異なるIgGサブクラス定常領域を有するHumanEngineeredTMRX1抗体をさらに特性付けした。緩衝液中でM-CSFと抗体を等モル比で併せ、その後、サイズ排除クロマトグラフィーまたは光散乱を使用してその抗体-抗原複合体のサイズを分析することにより、様々なHumanEngineeredTMRX1抗体がMCSFと形成する抗原-抗体複合体を研究した。結果は、マウス親RX1が、約200kDaのMCSFと1:1複合体を形成するように見えることを示した。heRX1-9.G2または1-10.G2抗体は、約400kDaのMCSFと2:1または2:2複合体を形成するように見えた。heRX1-1.G2は、2x106Daより大きいMCSFで大きな格子状凝集体を形成するように見えた。IgG1およびIgG4構築物は、マウス親RX1のものに類似した小さな複合体を形成した。heRX1-1.G4の変性還元および非還元SDS-PAGEは、IgG4変種が、予想通り半抗体を形成するように見えることを示した。上記、本明細書中に引用されている、および/または出願データシートに挙げられている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許出版物の全てが、それら全文、本明細書に参考として組み込まれている。本発明の特定の実施形態を説明のために本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変形を成すことができることは、上述から明らかであろう。"