"スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該スクレロスチンポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体は、i骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位およびiiBMPII型レセプター結合部位のうちの少なくとも1つへの該スクレロスチンポリペプチドの結合を競合阻害し、ここで、該BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;およびAAB33865配列番号110からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むBMPI型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてここで、該BMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;およびNM_001204配列番号113からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る、抗体、またはその抗原結合フラグメント。スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合し、かつスクレロスチンホモダイマーの形成を障害する抗体、またはその抗体結合フラグメントであって、ここで、該スクレロスチンポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含む、抗体、またはその抗原結合フラグメント。前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体。前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体。前記モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、およびハムスターモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項4に記載の抗体。請求項4に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。請求項4に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。前記抗体が、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体。請求項8に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。前記抗原結合フラグメントが、Fab’2、Fab’、Fab、Fd、およびFvからなる群より選択される、請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体。一本鎖抗体を含む、請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体。請求項11に記載の抗体を発現し得る宿主細胞。請求項1または請求項2のいずれか1項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する組成物。SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続したアミノ酸および多くて50個の連続したアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該SOSTポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、非ヒト動物において、該SOSTポリペプチドに特異的に結合し、かつi骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位およびiiBMPII型レセプター結合部位のうちの少なくとも1つへの該SOSTポリペプチドの結合を競合阻害する抗体を誘発し得、ここで、該BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;およびAAB33865配列番号110からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むBMPI型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてここで、該BMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;およびNM_001204配列番号113からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る、免疫原。SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続したアミノ酸および多くて50個の連続したアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原であって、該SOSTポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ペプチドは、非ヒト動物において、該SOSTポリペプチドに特異的に結合し、かつSOSTホモダイマーの形成を障害する抗体を誘発し得る、免疫原。前記ペプチドが、キャリア分子と会合する、請求項14または請求項15のいずれか1項に記載の免疫原。前記キャリア分子が、キャリアポリペプチドである、請求項16に記載の免疫原。前記キャリアポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシニアンである、請求項17に記載の免疫原。SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該方法は、請求項14に記載の免疫原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、a該SOSTポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含み;b該抗体は、i骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位およびiiBMPII型レセプター結合部位のうちの少なくとも1つへの該SOSTポリペプチドの結合を競合阻害し;c該BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;およびAAB33865配列番号110からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸配列を含むBMPI型レセプターポリペプチドに結合し得;そしてd該BMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;およびNM_001204配列番号113からなる群より選択される配列に示されるアミノ酸を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る、方法。SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、該SOSTポリペプチドは、配列番号2、6、8、14、46、または65に示されるアミノ酸配列を含み、該方法は、請求項15に記載の免疫原を用いて非ヒト動物を免疫する工程を包含し、ここで、該抗体は、SOSTホモダイマーの形成を障害する、方法。新しい骨質量の増加を刺激または増強させる薬物を含む、現在実施されている治療戦略はない。本発明は、骨鉱化作用を増大させるために利用され得る組成物および方法を提供し、従って、骨質量を増加させることが所望される、多種多様な状態を処置するために利用され得る。さらに本発明は、他の関連する利点を提供する。発明の要旨上記のとおり、本発明は、TGF-β結合タンパク質の新規クラスまたはファミリー、そして骨ミネラル含有量および骨ミネラル密度を増加させる化合物を選択するためのアッセイ、骨ミネラル含有量および骨ミネラル密度を増加させる化合物、ならびに多種多様な状態の処置または予防においてこのような化合物を利用するための方法を提供する。本発明の一局面の範囲内で、単離された核酸分子が提供され、ここで、この核酸分子は、以下からなる群より選択される:a配列番号1、5、7、9、11、13、もしくは15、またはこれらの相補配列を含む単離された核酸分子;b高ストリンジェンシーの条件下でaの核酸分子に特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子;およびcaまたはbに従うTGF-β結合タンパク質をコードする単離された核酸。本発明の関連局面の範囲内で、単離された核酸分子は、上記で同定された配列のうちの一つの部分のみへのハイブリダイゼーションに基づき提供される例えば、aについて、ハイブリダイゼーションは、配列番号1のヌクレオチド156~539またはヌクレオチド555~687から選択される少なくとも20、25、50、または100ヌクレオチドのプローブであり得る。容易に明らかなように、ハイブリダイゼーションに利用されるべき必要なストリンジェンシーは、プローブのサイズに基づいて変化し得る。例えば、25マーのプローブについては、高ストリンジェンシー条件は、以下を包含し得る:60mMTrispH8.0、2mMEDTA、5×デンハート、6×SSC、0.1w/vN-ラウリルサルコシン、0.5w/vNP-40nonidetP-40、45°Cで一晩、その後45~50°Cで0.2×SSC/0.1SDSで2回洗浄。低ストリンジェンシー条件下の100マーのプローブについては、適切な条件は、以下を包含し得る:5×SSPE、5×デンハート、および0.5SDSで、42~50°Cで一晩、その後2×SSPEまたは2×SSC/0.1SDSで、42~50°Cで2回洗浄。本発明の関連局面内で、配列番号1、5、7、9、11、13、または15と、Wilbur-Lipmanアルゴリズムを利用して50、60、75、80、90、95、または98の相同性レベルで相同性を有する単離された核酸分子が提供される。例えば、このような単離された分子の代表的な例としては、配列番号2、6、10、12、14、または16を含むタンパク質をコードし、かつLipman-Pearsonアルゴリズムを利用して50、60、75、80、90、95、または98レベルの相同性レベルでこれらの配列と相同性を有する核酸分子が挙げられる。単離された核酸分子は、代表的には、100kb未満のサイズ、特定の実施形態の範囲内で、50kb未満、25kb未満、10kb未満、またはさらに5kb未満のサイズである。さらに、他の実施形態の範囲内で、単離された核酸分子は、他の無関係の核酸分子例えば、GenBank登録番号AC003098およびEMB番号AQ171546に記載されるようなサブクローンBACのライブラリー中に存在しない。しかしながら、単離された核酸分子は、関連分子のライブラリー中で見出され得る例えば、米国特許第5,837,458号;同第5,830,721号;および同第5,811,238号に記載されるようにシャッフリングのため。最後に、本明細書中に記載されるような単離された核酸分子は、Dan、Cerberus、Gremlin、またはSCGF米国特許第5,780,263号をコードする核酸分子を含まない。上記の核酸分子を含むクローニングベクター、および上記の核酸分子に操作可能に連結されたプロモーター例えば、調節性配列を含む発現ベクターもまた、本発明によって提供される。適切なプロモーターの代表的な例としては、組織特異的プロモーター、ウイルスベースのプロモーター例えば、CMVベースのプロモーター例えば、CMVI-E、SV40初期プロモーター、およびMuLVLTRが挙げられる。発現ベクターはまた、ウイルスに基づき得るか、またはウイルスに由来し得る例えば、ウイルスベクター。ウイルスベクターの代表的な例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。上記のベクターのいずれかを含むcontainか、または包含するcomprise宿主細胞例えば、ヒト起源、サル起源、イヌ起源、ラット起源、またはマウス起源の宿主細胞を含むもまた、提供される。本発明の他の局面の範囲内で、TGF-β結合タンパク質を産生する方法が、提供され、この方法は、上記の条件下でTGF-β結合タンパク質の産生するために十分な条件下および時間、上述のベクターを含む宿主細胞を培養する工程を包含する。さらなる実施形態において、本方法によって産生されるタンパク質は、例えば、カラムクロマトグラフィー、アフィニティー精製などによってさらに精製され得る。従って、上記の核酸分子例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、または16によってコードされる単離されたタンパク質は、本出願の開示を考慮して容易に産生され得る。上述のタンパク質またはこのフラグメントが、融合タンパク質として産生され得ることに、また注意するべきである。例えば、一局面の範囲内で、上記のような核酸分子によってコードされるTGF-β結合タンパク質、または少なくとも10アミノ酸長、20アミノ酸長、30アミノ酸長、50アミノ酸長、または100アミノ酸長の、その一部分を含む第一のポリペプチドセグメント、および非TGF-β結合タンパク質を含む第二のポリペプチドセグメントを含む融合タンパク質が、提供される。特定の実施形態の範囲内で、第二のポリペプチドは、精製または認識に適切なタグ例えば、複数のアニオン性アミノ酸残基を含むポリペプチド-米国特許第4,851,341号を参照のこと、マーカー例えば、緑色蛍光タンパク質、もしくはアルカリホスファターゼ、または有毒分子例えば、リシンであり得る。本発明の別の局面の範囲内で、TGF-β結合タンパク質の上記のクラスに特異的に結合し得る抗体例えば、ヒトBEERが提供される。種々の実施形態の範囲内で、上記抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体ヒト起源またはマウス起源の抗体であり得る。さらなる実施形態の範囲内で、上記抗体は、全抗体の結合特徴を保持する抗体のフラグメント例えば、Fab’2、Fab2、Fab’、Fab、もしくはFvフラグメント、またはさらにはCDRである。上述の抗体を産生し得るか、または発現し得るハイブリドーマおよび他の細胞がまた、提供される。本発明の関連局面の範囲内で、TGF-β結合タンパク質を検出する方法が提供され、この方法は、上記のとおり抗体をTGF-β結合タンパク質に結合させるために十分な条件下および時間、この抗体をインキュベートする工程、およびこの結合を検出する工程を包含する。種々の実施形態の範囲内で、この抗体は、固体支持体に結合されて、例えば、酵素、蛍光タンパク質、および放射性同位体からなる群より選択されるマーカーを用いて洗浄もしくは分離、および/または標識を容易にし得る。本発明の他の局面の範囲内で、高ストリンジェンシーの条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、もしくは18に従う核酸分子、またはそれに対する相補体とハイブリダイズする単離されたオリゴヌクレオチドが、提供される。さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、または16をコードする配列中に見出され得る。特定の実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、または100ヌクレオチド長である。さらなる実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、別の分子例えば、酵素、蛍光分子、または放射性同位体で標識される。TGF-β結合タンパク質をコードする上記の核酸分子の全てまたは一部分を特異的に増幅し得るプライマーが、また提供される。本明細書中で利用される場合、用語特異的に増幅することとは、上述のTGF-β結合タンパク質を増幅し、他のTGF-β結合タンパク質例えば、Dan、Cerberus、Gremlin、またはSCGF米国特許第5,780,263号を増幅しないプライマーをいうことと理解されるべきである。本発明の関連局面の範囲内で、TGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を検出するための方法が提供され、この方法は、高ストリンジェンシーの条件下で、上記のとおりオリゴヌクレオチドをインキュベートする工程、およびこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。特定の実施形態の範囲内で、このオリゴヌクレオチドは、標識され得るか、そして/または固体支持体に結合され得る。本発明の他の局面の範囲内で、上記のTGF-β結合タンパク質例えば、配列番号2、6、8、10、12、14、または16のうちの1つをコードするRNAを切断し得るリボザイムが、提供される。このようなリボザイムは、DNA、RNA2’-O-メチルリボ核酸を含む、核酸アナログ例えば、ホスホロチオエート結合を有する核酸またはその混合物で構成され得る。これらのリボザイムをコードする核酸分子例えば、DNAまたはcDNA、および上記リボザイムを発現し得るか、または産生し得るベクターはまた、提供される。ベクターの代表的な例としては、プラスミド、レトロトランスポゾン、コスミド、およびウイルスベースのベクター例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスから少なくとも部分的に作製されたウイルスベクターが挙げられる。これらのベクターを含む宿主細胞例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ラット細胞、またはマウス細胞もまた、提供される。特定の実施形態において、この宿主細胞は、上記ベクターで安定的に形質転換され得る。本発明のさらなる局面の範囲内で、合成的に、またはインビトロ転写もしくはインビボ転写のいずれかでリボザイムを産生するための方法が提供される。さらなる実施形態の範囲内で、このように産生されたリボザイムは、さらに精製され得、そして/または薬学的組成物中に処方され得る例えば、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と一緒の、リボザイム、またはリボザイムをコードする核酸分子。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体または本明細書中に記載される他の選択された分子が、薬学的組成物中に処方され得る。本発明の他の局面の範囲内で、配列番号1、3、5、7、9、11、13、もしくは15に従う核酸分子またはそれに対する相補体とハイブリダイズする核酸分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、提供され、ここで、このオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるようなTGF-β結合タンパク質例えば、ヒトBEERの発現を阻害する。種々の実施形態の範囲内で、上記オリゴヌクレオチドは、15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、または50ヌクレオチド長である。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、100ヌクレオチド長未満、75ヌクレオチド長未満、または60ヌクレオチド長未満である。容易に明らかであるように、上記オリゴヌクレオチドは、1種以上の核酸アナログ、リボ核酸、またはデオキシリボ核酸で構成され得る。さらに、上記オリゴヌクレオチドは、1つ以上の結合例えば、共有結合例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホン酸メチル結合、メチレンメチルイミノ結合、モルホリノ結合、アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間intersugar結合、シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合および複素環式糖間結合を含むによって改変され得る。キメラオリゴヌクレオチドの1つの代表的な例は、米国特許第5,989,912号に提供される。本発明のさらに別の局面において、骨鉱化作用を増加するための方法が提供される。この方法は、上に記載されるリボザイムの有効量を、温血動物に導入する工程を包含する。関連する局面において、このような方法は、上記リボザイムを生成するための核酸分子の転写を助ける条件下にて、本明細書中に記載される所望のリボザイムを生成することが可能な核酸分子またはベクターの有効量を、患者に導入する工程を包含する。本発明の他の局面において、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。一実施形態において、その胚細胞および体細胞が上に記載されるTGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子を含むトランスジェニック動物が、提供される。この核酸分子は、遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結され、上記遺伝子は、胚形成期において動物に導入されるか、またはその動物の祖先遺伝子ancestorである。ただし、上記動物はヒトではない。他の実施形態において、トランスジェニックノックアウト動物が提供される。このトランスジェニックノックアウト動物は、その胚細胞および体細胞が、本明細書中に記載のTGF結合タンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズする、内因性核酸分子の少なくとも1つの対立遺伝子の破壊を含む動物を包含する。ここで、この破壊は、破壊を伴わない動物と比較して、上記対立遺伝子由来のメッセンジャーRNAの転写を阻害する。ただし、上記動物はヒトではない。種々の実施形態において、この破壊は、核酸の欠失、置換または挿入である。他の実施形態において、上記トランスジェニック動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタまたはイヌである。本発明のさらなる局面において、TGF-β結合タンパク質遺伝子発現を検出するためのキットが提供される。このキットは、核酸分子を含む容器を備え、ここでこの核酸分子は、以下からなる群より選択される:a配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100、または配列番号101のヌクレオチド配列を含む核酸分子;baのヌクレオチド配列の相補体complementを含む核酸分子;caまたはbの少なくとも15、20、30、50、75,または100のヌクレオチド長のフラグメントである核酸分子。本明細書中に記載されるTGF-β結合タンパク質抗体のうちの1つを含む容器を備える、TGF-β結合タンパク質を検出するためのキットもまた提供される。例えば、本発明の一局面において、選択された分子が、骨ミネラル含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する:a1以上の候補分子を、請求項1に記載の核酸分子によってコードされるTGF-β結合タンパク質およびTGF-βファミリーのタンパク質の選択されたメンバー例えば、BPM5またはBPM6と混合する工程、b上記候補分子が、TGF-βファミリーメンバーのシグナル伝達を変化させるか否か、またはTGF-βファミリーメンバーに対するTGF-β結合タンパク質の結合を変化させるか否かを決定する工程。特定の実施形態において、上記分子は、間葉細胞分化の正の調節因子としての機能に対するTGF-βの能力を変化させる。本発明のこの局面において、上記候補分子は、例えば、シグナル伝達もしくは結合を、減少させる例えば、阻害するか、または増加させる例えば、増強するかのいずれかによって、シグナル伝達または結合を変化させ得る。さらに別の局面において、選択された分子が、骨ミネラル含有量を増加させ得るか否かを決定するための方法が提供される。この方法は、選択された分子が、骨またはそのアナログに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害するかどうかを決定する工程を包含する。骨またはそのアナログの代表的な例としては、生検を介して得られたヒドロキシアパタイトおよび主要なヒト骨サンプルが挙げられる。上に列挙された方法の特定の実施形態において、上記選択された分子は、分子の混合物内に含まれ、これらの方法は、アッセイにおいて機能的である1以上の分子を単離する工程をさらに包含し得る。さらに他の実施形態において、TGF-βファミリーのタンパク質が固体支持体に結合され、TGF-β結合タンパク質の結合が測定されるか、または、TGF-β結合タンパク質が固体支持体に結合され、TGF-βタンパク質の結合が測定される。上に記載されるような方法を利用して、多種多様な分子が、TGF-βファミリーのタンパク質に対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害することによって、骨ミネラル含有量を増加させる能力についてアッセイされ得る。このような分子の代表的な例としては、タンパク質またはペプチド、有機分子、および核酸分子が挙げられる。本発明の他の関連する局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が、提供される。この方法は、本明細書中に列挙されるアッセイから同定された分子の治療的有効量を、温血動物に投与する工程を包含する。別の局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が提供される。この方法は、TGF-βスーパーファミリーのタンパク質骨形態形成タンパク質BMPを含むに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する分子の治療的有効量を、温血動物に投与する工程を包含する。適切な分子の代表的な例としては、アンチセンス分子、リボザイム、リボザイム遺伝子、およびTGF-β結合タンパク質を特異的に認識し、TGF-β結合タンパク質の活性を変化させる抗体例えば、ヒト化抗体が挙げられる。本発明の別の局面において、温血動物中の骨ミネラル含有量を増加させるための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する:aTGF-βファミリーのタンパク質および骨形態形成タンパク質BMPに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する分子の発現に関するベクターを、骨に戻る細胞に導入する工程、およびb温血動物にベクター含有細胞を投与する工程。本明細書中で利用される場合、末梢投与の後に細胞が骨マトリックス中に局在する場合、細胞が、骨に戻ることが理解されるべきである。一実施形態において、このような方法は、上記導入する工程の前に、骨に戻る骨の骨髄から細胞を単離する工程をさらに包含する。さらなる実施形態において、上記骨に戻る細胞は、CD34細胞および骨芽細胞からなる群より選択される。本発明の他の局面において、TGF-βスーパーファミリーのタンパク質に対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する分子が提供される好ましくは、単離される。さらなる実施形態において、上記分子は組成物として提供され得、そして骨吸収のインヒビターをさらに含み得る。このようなインヒビターの代表的な例としては、カルシトニン、エストロゲン、ビスホスホネート、抗吸収活性を有する増殖因子およびタモキシフェンが挙げられる。前述の治療的文脈において利用され得る分子の代表的な例としては、例えば、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンス分子、および/または抗体例えば、ヒト化抗体が挙げられる。このような分子は、それらの選択に依存して、本明細書中に記載のTGF-β結合タンパク質ファミリーメンバーのシグナル伝達または結合を変化させるため、拮抗するため、または作動させるために使用され得る。本発明の種々の実施形態において、上に記載された分子および処置または阻害の方法は、骨粗しょう症、骨軟化症osteomalasia、歯周病、壊血病、クッシング病、骨折ならびに四肢の不動化limbimmobilizationおよびステロイド使用が原因の状態のような状態に関して利用され得る。本発明はまた、TGF-β結合タンパク質であるスクレロスチンsclerostinSOSTに特異的に結合する抗体を提供し、TGF-βスーパーファミリーのメンバー例えば、骨形態形成タンパク質と相互作用するスクレロスチンの領域に由来するスクレロスチンペプチドを含む免疫原を提供する。一実施形態において、本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。上記スクレロスチンポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで上記抗体は、少なくとも1つのi骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位、およびiiBMPII型レセプター結合部位に対するSOSTポリペプチドの結合を競合的に阻害する。ここで、BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;またはAAB33865配列番号110に示されるアミノ酸配列を含む、BMPI型レセプターポリペプチドに結合し得、そしてBMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;またはNM_001204配列番号113に示されるアミノ酸配列を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る。別の実施形態において、本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合し、スクレロスチンホモダイマーの形成を障害する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、上記スクレロスチンポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含む。本発明の特定の特別な実施形態において、上記抗体は、ポリクローナル抗体である。他の実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体であり、その抗体は、マウス、ヒト、ラット、またはハムスターのモノクローナル抗体である。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞または宿主細胞を提供する。本発明の他の実施形態において、上記抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。本発明は、さらに、ヒト化抗体またはキメラ抗体を産生する宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、Fab’2、Fab’、Fab、FdまたはFvのフラグメントである。本発明はまた、一本鎖抗体である抗体を提供し、一本鎖抗体を発現し得る宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、このような抗体および生理学的に受容可能なキャリアを含有する組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続するアミノ酸であって、かつ50個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を提供する。上記SOSTポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記ペプチドは、非ヒト動物において、SOSTポリペプチドに特異的に結合し、少なくとも1つのi骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位、およびiiBMPII型レセプター結合部位に対するSOSTポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を誘発し得る。ここで、上記BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;またはAAB33865配列番号110に示されるアミノ酸配列を含むBMPI型レセプターポリペプチドに結合し得、BMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;またはNM_001204配列番号113に示されるアミノ酸配列を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る。本発明はまた、SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続するアミノ酸であって、かつ50個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を提供する。上記SOSTポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記ペプチドは、非ヒト動物において、SOSTポリペプチドに特異的に結合し、SOSTホモダイマーの形成を障害する抗体を誘発し得る。特定の特別な実施形態において、本発明の免疫原は、キャリア分子と関連する。特定の実施形態において、上記キャリア分子はキャリアポリペプチドであり、特別な実施形態において、上記キャリアポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンkeyholelimpethemocyaninである。本発明はまた、SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。この方法は、SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続するアミノ酸であって、かつ50個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を用いて、非ヒト動物を免疫する工程を包含する。ここで、a上記SOSTポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含む;b上記抗体は、少なくとも1つのi骨形態形成タンパク質BMPI型レセプター結合部位、およびiiBMPII型レセプター結合部位に対するSOSTポリペプチドの結合を競合的に阻害する;c上記BMPI型レセプター結合部位は、GenBank登録番号NM_004329配列番号102;D89675配列番号103;NM_001203配列番号104;S75359配列番号105;NM_030849配列番号106;D38082配列番号107;NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;またはAAB33865配列番号110に示されるアミノ酸配列を含むBMPI型レセプターポリペプチドに結合し得る;そしてd上記BMPII型レセプター結合部位は、GenBank登録番号U25110配列番号111;NM_033346配列番号112;Z48923配列番号114;CAA88759配列番号115;またはNM_001204配列番号113に示されるアミノ酸配列を含むBMPII型レセプターポリペプチドに結合し得る。別の実施形態において、本発明は、SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。上記SOSTポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に示されるアミノ酸配列を含む。この方法は、SOSTポリペプチドの少なくとも21個の連続するアミノ酸であって、かつ50個を超えない連続するアミノ酸を含むペプチドを含む免疫原を用いて、非ヒト動物を免疫する工程を包含する。上記SOSTポリペプチドは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号14、配列番号46、または配列番号65に記載されるアミノ酸配列を含み、ここで、上記抗体は、SOSTホモダイマーの形成を障害する。本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図への参照によって明らかになる。さらに、本明細書中に示される、特定の手順または組成物例えば、プラスミドなどをより詳細に記載する種々の参考文献を含む文書が示され、これらは、その全体が参考として援用される。発明の詳細な説明定義本発明を詳細に記載する前に、特定の用語の定義を記載すること、および以下に使用される略語を列挙し定義することは、その理解のために役立ち得る。分子は、タンパク質またはペプチド例えば、所望の結合親和性を有する抗体、組換え結合パートナー、ペプチド、核酸例えば、DNA、RNA、キメラ核酸分子、および核酸アナログ例えば、PNA;および有機化合物または無機化合物を含むことが理解されるべきである。TGF-βは、TGF-βスーパーファミリーの任意の公知のメンバーまたは新規のメンバーを含むことが理解されるべきであり、TGF-βはまた、骨形態形成タンパク質BMPも含む。TGF-βレセプターは、TGF-βスーパーファミリーの特定のメンバー骨形態形成タンパク質BMPを含むに特異的なレセプターをいうことが理解されるべきである。TGF-β結合タンパク質は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーの特定のメンバーまたはサブセット骨形態形成タンパク質BMPを含むに対する、特異的結合親和性を有するタンパク質をいうことが理解されるべきである。TGF-β結合タンパク質の特定の例としては、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100、および配列番号101によってコードされるタンパク質を含む。TGF-βファミリーのタンパク質および骨形態形成タンパク質BMPに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害するとは、TGF-βのTGF結合タンパク質に対する結合を除くか、または阻害することによって、TGF-βまたは骨形態形成タンパク質BMPの活性化を可能にするか、あるいはそれぞれのレセプターに対するTGF-βファミリーメンバー骨形態形成タンパク質BMPを含むの結合を可能にする分子をいうことが理解されるべきである。このような阻害は、例えば、TGF-βスーパーファミリーの特定のメンバーに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する分子によって、達成され得る。ベクターは、所望のタンパク質の発現に関連し得るアセンブリをいう。上記ベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結する転写プロモーターエレメントを含まなければならない。このベクターは、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNAまたはこの2つの組み合わせ例えば、DNA-RNAキメラから構成され得る。必要に応じて、上記ベクターは、ポリアデニル化配列、1以上の制限酵素認識部位、ならびに1以上の選択可能なマーカー例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼを含み得る。さらに、選択される宿主細胞および使用されるベクターに依存して、他の遺伝的エレメント例えば、複製の起点、さらなる核酸の制限酵素認識部位、エンハンサー、転写の誘導能を与える配列、および選択可能なマーカーもまた、本明細書中に記載のベクターに組み入れられ得る。単離された核酸分子は、生物のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分子である。例えば、真核細胞のゲノムDNAから分離されているTGF結合タンパク質をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノム中に組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。単離された核酸分子は、ゲノムDNA、cDNA、RNAであり得るか、または少なくとも部分的に核酸アナログから構成され得る。単離されたポリペプチドは、細胞成分例えば、現実に上記ポリペプチドに結合する炭水化物、脂質、または他のタンパク様不純物を本質的に混入しないポリペプチドである。好ましくは、このような単離されたポリペプチドは、少なくとも純度約90であり、より好ましくは、少なくとも純度約95であり、最も好ましくは、少なくとも純度約99である。特定の実施形態において、特定のタンパク質の調製物単離が、CoomassieBlue染色を用いたSDS-PAGEゲル上の一本のバンドとしてわずかに現れる場合、特定のタンパク質の調製物は、単離されたポリペプチドを含む。用語単離されたは、有機分子例えば、有機低分子を称する場合、当該分野で周知である方法例えば、NMR、融点を利用して化合物が純度90を超えることを意味する。骨硬化症sclerosteosisは、Hansen1967Hansen,H.G.,Sklerosteose.in:Opitz,H.;Schmid,F.,HandbuchderKinderheilkunde.Berlin:Springerpub.61967.Pp.351-355によって、ファンブッヘム汎発性皮質過骨症hyperostosiscorticalisgeneralisataと類似する障害に対して使用された用語である。しかし、骨硬化症は、多くの事例において、骨の変化の放射線学的様子ならびに非対称性の皮膚の合指症の指標および中指の存在が異なることもあり得る。顎は、この状態において、異常な四角い形を有する。ヒト化抗体は、マウスまたは他の非ヒト動物のモノクローナル抗体の相補性決定領域が、マウスまたは他の非ヒト動物の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変鎖から、ヒト可変領域に移された組換えタンパク質である。本明細書中で使用される場合、抗体フラグメントは、抗体の一部分例えば、Fab’2、Fab2、Fab’、Fabなどである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、完全な抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗TGF-β結合タンパク質のモノクローナル抗体フラグメントは、TGF-β結合タンパク質のエピトープに結合する。用語抗体フラグメントまたは抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、合成タンパク質または遺伝子改変タンパク質もまた包含する。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域ならなるFvフラグメント、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結される組換え単鎖ポリペプチド分子sFvタンパク質、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。検出可能な標識は、ポリペプチド部分例えば、抗体部分または核酸部分に結合体化し得、診断に有用な分子を生成する分子または原子である。検出可能な標識の例としては、キレート剤、感光剤、放射性同位体、蛍光因子、常磁性イオン、酵素および他のマーカー成分が挙げられる。本明細書中に使用される免疫結合体とは、抗TGF-β結合タンパク質抗体または抗体フラグメント、ならびに検出可能な標識またはエフェクター分子を含む分子である。好ましくは、免疫結合体は、結合体化後のTGF-β結合タンパク質に結合する能力を、結合体化の前とおおよそ同じか、あるいはわずかに減少させる。略語:TGF-β-トランスフォーミング成長因子-β;TGF-bBP-トランスフォーミング成長因子-β結合タンパク質一つの代表的なTGF-bBPは、H.Beerとして称される;BMP-骨形態形成タンパク質;PCR-ポリメラーゼ連鎖反応;RT-PCR-逆転写酵素RTを用いてRNAがまずDNAに転写されるPCRプロセス;cDNA-RNA配列をDNA形態にコピーすることによって作製される任意のDNA。上記のように、本発明は、TGF-β結合タンパク質の新規クラスならびに温血動物において骨ミネラル含有量を増加させるための方法および組成物を提供する。簡単には、本発明は、TGF-β結合タンパク質ファミリーの新規メンバーをコードする遺伝子における変異が、正常な個体より1~4倍高い骨ミネラル含有量によって特徴付けられるまれな状態骨硬化症をもたらすという予期せぬ発見に基づく。したがって、以下でより詳細に議論されるように、この発見は、TGF-β結合タンパク質の、TGF-βタンパク質ファミリーおよび骨形態形成タンパク質BMPへの結合を阻害する分子を選択するために利用され得るアッセイ、ならびに温血動物例えば、ヒトを含むの骨ミネラル含有量を増加させるために、このような分子を利用する方法の発達をもたらした。骨硬化症として知られる疾患の議論骨硬化症は、ヒトにおける異常な骨ミネラル密度に関する疾患である。骨硬化症とは、Hansen1967Hansen,H.G.,Sklerosteose:Opitz,H.;Schmid,F.,HandbuchderKinderheilkunde.Berlin:Springerpub.61967.Pp.351-355によって、ファンブッヘム汎発性皮質過骨症に類似しているが、骨変化の放射状の現れ方が異なり、そして多くの症例において人差し指および中指の非対称性の皮膚合指症の存在が異なり得る疾患につけられた用語である。骨硬化症は、現在、常染色体の準優性疾患として公知であり、この疾患は、成人における骨の広範に散在する硬化した病変によって特徴付けられる。この状態は進行性である。骨硬化症はまた、合指症2つ以上の指が一緒になって癒合すると関連する、発生の局面を有する。この骨硬化症候群は、高い身長に関し、多くの罹患した個体は6フィート以上の身長に達する。ホモ接合体の骨ミネラル含有量は、正常な個体において観察されるよりも1~6倍多くあり得、そして骨ミネラル密度は、正常値例えば、罹患していない兄弟からの値を1~4倍上回り得る。この骨硬化症候群は、南アフリカにおいてオランダ人子孫のアフリカーナーにおいて主に発症する。アフリカーナー人口の約1/140個体は、変異遺伝子異型接合体のキャリアである。この変異は、100の浸透度を示す。病理合指症または頭蓋の過成長を伴なわない異型接合体における骨ミネラル密度の増加の事例報告がある。骨硬化症を有する患者において、下垂体-視床下部軸の異常性は観察されなかった。特に、成長ホルモンおよびコルチゾンの過生成は無いように考えられる。さらに、罹患した個体において、性ホルモンのレベルは正常である。しかしながら、骨ターンオーバーマーカー骨芽細胞特異的アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、1型プロコラーゲンC’プロペプチドPICPおよび全アルカリホスファターゼ;Comier,C.,Curr.Opin.inRheu.7:243,1995を参照のことは、この疾患に関連する過骨芽細胞活性hyperosteoblasticactivityが存在するが、骨吸収のマーカーピリジノリン、デオキシピリジノリン、N-テロペプチド、尿のヒドロキシプロリン、血漿酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリジンComier前出を参照のことで測定すると正常~僅かに減少した破骨細胞活性が存在することを示す。骨硬化症は、罹患した個体の生涯の間の、骨格全体にわたる連続的な骨の堆積によって特徴付けられる。同型接合体において、この骨ミネラルの連続的な堆積は、機械的受容器頭蓋skull、顎、頭蓋craniumの存在しない骨格の領域において骨の過成長をもたらす。骨硬化症を有する同型接合体において、頭蓋骨の過成長は頭蓋の圧迫を引き起こし、最終的には脳幹上の過剰な静水圧に起因して死に至らせる。骨格の他の全ての部分において、汎発性の、かつ拡散性の硬化が存在する。長骨の皮質領域は、非常に肥厚され、骨強度の実質的な増大を生じる。小柱の連結の厚みが増すことにより、小柱骨の強度は増大する。硬化骨は、X線に対して著しく不鮮明に現れる。実施例1においてより詳細に記載されるように、骨硬化症候群の原因であるこのまれな遺伝的変異は、TGF-β結合タンパク質ファミリーの新規メンバー1つの代表的な例はH.Beerと称されるをコードする、ヒト第17染色体の領域に局在する。以下により詳細に記載されるように、この発見に基づき、骨ミネラル化のメカニズムはより完全に理解され、骨ミネラル化を増進する分子についてのアッセイ、ならびに骨ミネラル含有量を増すため、および数多くの疾患の処置または予防におけるこのような分子の使用が開発され得る。TGF-βスーパーファミリートランスフォーミング成長因子-βTGF-βスーパーファミリーは、共通の配列エレメントおよび2次構造および3次構造の両方での構造モチーフを共有する種々の成長因子を含む。このタンパク質ファミリーは、広範な細胞型に影響する幅広い生物学的応答を示すことが知られている。TGF-βファミリーメンバーの多くは、胚の発生の間のパターン形成および組織特異化において重要な機能を有し;成体においては、このファミリーメンバーは、例えば創傷治癒および骨修復および骨のリモデリング、ならびに免疫系の調節に関する。TGF-βに加えて、このスーパーファミリーとしては、骨形態形成タンパク質BMP、アクチビン、インヒビン、成長および分化因子GDF、ならびにグリア細胞由来神経栄養因子GDNFが挙げられる。1次分類は、特定のタンパク質を一般的なサブファミリーに分類する、包括的な配列特徴を通じて確立される。サブファミリー内のさらなる層別化は、より小さいグループのメンバー間のより厳密な配列保存により可能である。特定の場合例えば、BMP-5、BMP-6およびBMP-7において、アミノ酸同一性は、より小さいグループのメンバー間で75の高さであり得る。この同一性のレベルは、単一の代表的な配列が、サブグループをより大きなファミリーの他のメンバーから区別する、重要な生物学的エレメントを示すことを可能にする。TGF-β2の結晶構造は決定されてきた。TGF-β2モノマーの一般的な折畳みは、3つのジスルフィド架橋によって形成される、安定的で、コンパクトなシステインノット様構造を含む。1つのジスルフィド架橋により安定化された二量体化は逆行性である。TGF-βは、1型レセプターおよび2型レセプターのヘテロオリゴマーの複合体の形成を誘導することにより信号を出す。TGF-βシグナルの伝達は、膜貫通型セリン/スレオニンキナーゼレセプターの、これら2つの異なる1型サブファミリーおよび2型サブファミリーに関する。少なくとも7つの1型レセプターおよび5つの2型レセプターが、同定されているKawabataら、CytokineGrowthFactorRev.9:49-611998;Miyazonoら、Adv.Immunol.75:115-572000を参照のこと。TGF-βファミリーメンバーは、それらの細胞活動を、内因性のセリン/スレオニンキナーゼ活性を有するレセプターに結合することによって開始する。TGF-βファミリーの各メンバーは、1型レセプターおよび2型レセプターその両方がシグナル伝達に必要であるの特徴的な組み合わせに結合する。TGF-βレセプター活性化についての現在のモデルにおいて、TGF-βリガンドは、2型レセプターTbR-IIにまず結合し、そしてこれは活性化キナーゼを有するオリゴマー形態で細胞膜に生じる。その後、TbR-IIの非存在下ではリガンドに結合し得ない1型レセプターTbR-Iが複合体に補充されて、リガンド/II型/I型の三重複合体を形成する。TbR-IIは、次いで膜近傍領域におけるグリシン残基およびセリン残基の豊富なドメインGSドメインにおいて優勢にTbR-Iをホスホリル化し、そしてそれによってTbR-Iを活性化する。この活性化I型レセプターキナーゼは、次いでI型レセプターキナーゼが特定の遺伝子の転写を調節する場合、核を転位させる、Smadタンパク質ファミリーの特定のメンバーをホスホリル化する。骨形態形成タンパク質BMPは、ヒトにおける骨ミネラル密度決定において重要な調節タンパク質である骨形成の理解における主要な進歩は、インビボでの軟骨および骨の分化を調節する骨形態形成タンパク質BMP骨形成タンパク質OP;osteogenicproteinとしても公知であるの同定であった。BMP/OPは、軟骨の形成、軟骨の肥厚および石灰化、血管の浸潤、骨芽細胞の分化ならびに骨の形成を誘導する事象のカスケードを通じて軟骨内の骨の分化を誘導する。上記のように、このBMP/OPBMP2~14および骨形成タンパク質1および骨形成タンパク質2OP-1およびOP-2例えば、GenBankP12643BMP-2;GenBankP12645BMP3;GenBankP55107BMP-3b、成長/分化因子10GDF-10;GenBankP12644BMP4;GenBankP22003BMP5;GenBankP22004BMP6;GenBankP18075BMP7;GenBankP34820BMP8;GenBankQ9UK05BMP9;GenBankO95393BMP10;GenBankO95390BMP11、成長/分化因子11前駆体GDF-11;GenBankO95972BMP15を参照のことは、TGF-βスーパーファミリーのメンバーである。このBMP/OPサブファミリーメンバー間のこの著しい進化的保存は、それらが動物の正常な発生および正常な機能において重要であることを示唆する。さらに、BMP/OPの複数の形態の存在は、この明白な重複の生物学的な関連性についての重要な疑問を提起する。胎児期後postfetalの軟骨形成および骨形成に加えて、このBMP/OPは、骨格形成skeletogenesis、脳顔面頭蓋および歯の組織の発達を含むにおいて、ならびに胚の発生および腎臓を含む実質器官の器官形成において、複数の役割を果たす。性質は、分化した組織および器官の発生の提供するように合わせられた、共通のおよびいくつかの分子メカニズムに依存するということが現在理解されている。このBMP/OPスーパーファミリーは、高度に保存されているカルボキシ末端領域内のアミノ酸モチーフにおいてわずかなバリエーションを有する分子アイソフォームを展開する、複数の分化した機能のプログラミングにおける自然節減natureparsimonyの適確な例である。BMPは、大きな前駆体タンパク質として合成される。二量体化の際に、このBMPは、細胞内でタンパク質分解的に切断され、次いで細胞から分泌されるカルボキシ末端成熟タンパク質が得られる。BMPは、他のTGF-βファミリーメンバーのように、I型およびII型のセリン/スレオニンキナーゼレセプターの両方に協同的に結合することによってシグナル伝達を開始する。BMPがリガンドとして作用し得るI型レセプターとしては、BMPR-IAALK-3としてもまた公知である、BMPR-IBALK-6としてもまた公知である、ALK-1およびALK-2ActR-Iとしてもまた公知であるが挙げられる。II型レセプターのうち、BMPは、BMPII型レセプターBMPR-II、アクチビンII型ActR-IIおよびアクチビンIIB型ActR-IIBに結合する。Balemansら前出およびその中に引用される参考文献を参照のこと。BMPI型レセプターポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、GenBankデータベースにおいて提供される:例えば、GenBankNM_004329配列番号116によってコードされる配列番号102;D89675配列番号117によってコードされる配列番号103;NM_001203配列番号118によってコードされる配列番号104;S75359配列番号119によってコードされる配列番号105;NM_030849配列番号120によってコードされる配列番号106;およびD38082配列番号121によってコードされる配列番号107。I型レセプターの他のポリペプチド配列は、GenBankデータベースにおいて提供される:例えば、NP_001194配列番号108;BAA19765配列番号109;およびAAB33865配列番号110。BMPII型レセプターポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、GenBankデータベースにおいて提供され、これらとしては、例えば、U25110配列番号122によってコードされる配列番号111;NM_033346配列番号123によってコードされる配列番号112;NM_001204配列番号124によってコードされる配列番号113;およびZ48923配列番号125によってコードされる配列番号114が挙げられる。II型レセプターのさらなるポリペプチド配列はまた、GenBankデータベースにおいて提供される:例えば、CAA88759配列番号115。BMPは、他のシスチンノットタンパク質と同様に、ホモダイマー構造を形成するScheuflerら、J.Mol.Biol.287:103-151999。BMP/TGF-βファミリーに対して実施された進化学的痕跡evolutionarytrace分析によると、BMPI型レセプター結合部位およびBMPII型レセプター結合部位は、BMP構造の表面にマッピングされたInnisら、ProteinEng.13:839-472000。BMP上のこのI型レセプター結合部位の位置は、BMP-2/BMPレセプターIA複合体のX線構造により後に確認されたNickelら、J.JointSurg.Am.83A補遺1Pt1:S7-S142001。予測されるII型レセプター結合部位は、TGF-β3/TGF-βII型レセプター複合体のX線構造と良く一致しHartら、Nat.Struct.Biol.9:203-2082002、これはBMP/BMPレセプターIIA系に非常に類似している。BMP拮抗作用BMPサブファミリーおよびアクチビンサブファミリーは、例えば、TGF-β結合タンパク質によって、重要な翻訳後の調節に供される。複雑な細胞外制御系が存在し、これにより高い親和性のアンタゴニストが合成および運び出され、引き続いて、選択的にBMPまたはアクチビンと複合体化し、それらの生物学的活性を崩壊させるW.C.Smith1999TIG1513~6。多数のこれら天然のアンタゴニストが同定され、そして配列の相違に基づき、このアンタゴニストは、主要な配列保存の欠落に起因して、独立して進化してきたことを示す。これらのアンタゴニストの先行する研究は、BMP-2およびBMP-4と相互作用することおよび中和することに対する異なる優先を強調した。脊椎動物において、アンタゴニストとしては、noggin、コルジンchordin、コルジン様、ホリスタチンfollistatin、FSRP、DNA/Cerberusタンパク質ファミリー、およびスクレロスチンSOSTBalemansら、前出およびその中に引用される参考文献を参照のことが挙げられる。拮抗作用または阻害のメカニズムは、別個のアンタゴニストに対しては異なるようであるIemuraら1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA959337-9342。BMPアンタゴニストnoggin上の、I型レセプター結合部位およびII型レセプター結合部位はまた、マッピングされてきた。Nogginは、高い親和性でBMPに結合するZimmermanら、1996。noggin/BMP-7複合体構造の研究は、この2つのタンパク質の間の結合相互作用を明らかにしたGroppeら、Nature420:636-422002。BMPシグナル伝達複合体のモデル上のnoggin-BMP-7構造の重ね合わせは、noggin結合が、BMP-7上の両方の結合エピトープ対すなわち、BMPI型レセプター結合部位およびBMPII型レセプター結合部位を効果的にマスクすることを示した。システインリッチなnogginの骨格配列は、クリップといわれる約20個のアミノ酸残基残基28~48のN末端セグメントによって先行される。I型レセプター結合部位は、NogginのクリップドメインのN末端部分によって塞がれ、そしてII型レセプター結合部位は、このクリップドメインのカルボキシル末端部分によって塞がれる。nogginのC末端に近いコア領域中の、2つのβ鎖もまた、II型レセプター結合部位においてBMP-7に接触している。この結合様式はnogginダイマーが、BMPダイマー上の全てのレセプター結合部位2つのI型レセプター結合部位および2つのII型結合部位を効率的にブロックすることを可能にする。新規TGF-β結合タンパク質上記のように、本発明は、TGF-β結合タンパク質の新規のクラスを提供する。このタンパク質は、ヒトDAN、ヒトGremlin、およびヒトCerberus、ならびにSCGF米国特許第5,780,263号と比較した場合にほとんど同一のシステインジスルフィド骨格を有するが、ヌクレオチドレベルではほとんど相同性を有さない背景の情報については、一般に、Hsu,D.R.,Economides,A.N.,Wang,X.,Eimon,P.M.,Harland,R.M.,TheXenopusDorsalizingFactorGremlinIdentifiesaNovelFamilyofSecretedProteinsthatAntagonizeBMPActivities、MolecularCell1:673-683,1998を参照のこと。TGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子の新規のクラスの代表的な例は、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100および配列番号101に開示される。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドは、Beerと呼ばれるポリペプチドをコードし、これはまた、本明細書中でスクレロスチンまたはSOSTとも呼ばれる。このクラスの結合タンパク質の代表的なメンバーが、上記TGF-β結合タンパク質例えば、配列番号5および配列番号7の改変体を包含することもまた、理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子例えば、TGF-β結合タンパク質の改変体をコードする単離された核酸分子は、配列番号2、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46、または配列番号65の変形であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子をいう。そのような改変体としては、TGF-β結合タンパク質遺伝子の天然に生じる多型または対立遺伝子改変体、ならびにこれらのアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含有する合成遺伝子が挙げられる。当業者に公知な種々の基準が、ペプチドまたはポリペプチドにおける特定の位置のアミノ酸が類似しているかどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸または保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されているものである。そのような類似の側鎖を有するアミノ酸としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖を有するアミノ酸例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン、非極性側鎖を有するアミノ酸アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;β分岐側鎖を有するアミノ酸例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン、および芳香族側鎖を有するアミノ酸例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンが挙げられる。分類がより困難であると考えられるプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸例えば、Leu、Val、IleおよびAlaと、性質を共有する。特定の状況において、グルタミンのグルタミン酸への置換またはアスパラギンのアスパラギン酸への置換は、類似の置換であると考えられ得る。なぜなら、グルタミンおよびアスパラギンは、それぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるからである。TGF-β結合タンパク質遺伝子のさらなる改変体形態は、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の挿入または欠失を含む核酸分子である。TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子は、その遺伝子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101のヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズするかどうかを決定することにより、同定され得る。さらに、TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子は、システイン骨格を有するタンパク質をコードするはずである。代替として、TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子は、配列比較によって同定され得る。本明細書中で使用される場合、2つのアミノ酸配列は、最大の対応に対して整列された場合にその2つのアミノ酸のアミノ酸残基が同じであれば、100のアミノ酸配列同一性を有する。同様に、2つのヌクレオチド配列は、最大の対応に対して整列された場合にその2つのヌクレオチド配列のヌクレオチド残基が同じであれば、100のヌクレオチド配列同一性を有する。配列比較は、標準的なソフトウェアプログラム例えば、DANSTARMadison、Wisconsinにより製造された、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューター計算組に含まれるソフトウェアプログラムを用いて、実施され得る。最適アラインメントを決定することによって2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に周知である例えば、PeruskiandPeruski,TheInternetandtheNewBiology:ToolsforGenomicandMolecularResearchASMPress,Inc.1997,MethodsinGeneBiotechnology、123頁~151頁CRCPress,Inc.1997における、Wuら編、InformationSuperhighwayandComputerDatabaseofNucleicAcidsandProteinsおよびBishop編、GuidetoHumanGenomeComputing、第2版AcademicPress,Inc.1998を参照のこと。改変体TGF-β結合タンパク質は、配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46または配列番号65に対して、少なくとも50のアミノ酸配列同一性を有するべきであり、そして好ましくは、60、65、70、75、80、85、90または95の同一性を有するべきである。あるいは、TGF-β結合タンパク質改変体は、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101に対して少なくとも70のヌクレオチド配列同一性を有することによって、同定され得る。さらに、本発明は、配列番号1または配列番号100に対して、75、80、85、90または95を超える同一性を有するTGF-β結合タンパク質遺伝子改変体を企図する。TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子または改変体TGF-β結合タンパク質を同定するために使用される特定の方法にかかわらず、改変体TGF-β結合タンパク質または改変体TGF-β結合タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドは、例えば、TGF-βタンパク質ファミリーの選択されるメンバーに結合するその能力および/もしくはTGF-βタンパク質ファミリーの選択されるメンバーのシグナル伝達を阻害するその能力によるか、または抗TGF-β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合するその能力によって、機能的に特徴付けられ得る。本発明は、TGF-β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントを含む。本発明の文脈の中で、TGF-β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントとは、TGF-β結合タンパク質ポリペプチドの一部をコードする核酸分子をいい、このTGF-β結合タンパク質ポリペプチドの一部は、1上に示された機能活性を保持するか、または2抗TGF-β結合タンパク質抗体に対して特異的に結合するかのいずれかである。例えば、本明細書中に記載されるTGF-β結合タンパク質遺伝子の機能的フラグメントは、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101のヌクレオチド配列の一部を含む。2.TGF-β結合タンパク質遺伝子の単離TGF-β結合タンパク質をコードするDNA分子は、例えば、配列番号1に基づくポリヌクレオチドプローブを用いてヒトcDNAライブラリーまたはヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、獲得され得る。例えば、cDNAライブラリーの調製における第一のステップは、当業者に周知の方法を用いてRNAを単離することである。一般的に、RNA単離技術は、細胞を破壊するための方法、RNAのRNase関連分解を阻害する手段およびDNA、タンパク質およびポリサッカリド夾雑物からRNAを分離する方法を提供する。例えば、全RNAは、液体窒素中で組織を凍結し、その凍結組織を乳鉢および乳棒で粉砕してその細胞を溶解し、その粉砕された組織をフェノール/クロロホルム溶液で抽出してタンパク質を除去し、そして塩化リチウムを用いた選択的遠心分離により残りの不純物からRNAを分離することによって、単離され得る例えば、Ausubelら編、ShortProtocolsinMolecularBilogy、第3版、4-1頁~4-6頁JohnWileySons1995[Ausubel1995];Wuら、MethodsinGeneBiotechnology、33頁~41頁CRCPress,Inc.1997[Wu1997]を参照のこと。あるいは、全RNAは粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートで抽出し、有機溶媒で抽出し、そして種々の遠心分離を用いて夾雑物からRNAを分離することによって、単離され得る例えば、Ausubel19954-1頁~4-6頁;Wu199733頁~41頁を参照のこと。cDNAライブラリーを構築するために、ポリARNAは、好ましくは、全RNA調製物から単離される。ポリARNAは、標準的な技術であるオリゴdT-セルロースクロマトグラフィーを用いて、全RNA調製物から単離され得る例えば、Ausubel19954-11頁~4-12頁を参照のこと。二本鎖cDNA分子は、当業者に周知の技術を用いて、ポリARNAから合成され得る例えば、Wu199741頁~46ページを参照のこと。さらに、市販のキットは、二本鎖cDN分子を合成するために使用され得る例えば、LifeTechnologies,Inc.Gaithersburg、Maryland;CLONTECHLaboratories,Inc.PaloAlto、California;PromegaCorporationMadison、Wisconsin;およびStratageneCloningSystemsLaJolla、California。TGF-β結合タンパク質cDNAクローンを得るための基本的なアプローチは、TGF-β結合タンパク質に特異的なcDNA分子中で濃縮された、差し引かれたcDNAライブラリーを構築することによって、改変され得る。差し引かれたライブラリーを構築するための技術は、当業者に周知である例えば、Meth.Enzymol.152:423、1987における、Sargent、IsolationofDifferentiallyExpressedGenes;およびMethodsinGeneBiotechnology、29頁~65頁CRCPress,Inc.1997における、Wuら編、ConstructionandScreeningofSubstractedandCompleteExpressioncDNALibrariesを参照のこと。種々のクローニングベクターは、cDNAライブラリーの構築のために適切である。例えば、cDNAライブラリーは、バクテリオファージ例えば、λgt10ベクター由来のベクターにおいて調製され得る例えば、Huynhら、ConstructingandScreeningcDNALibrariesinλgt10andλgt11DNACloning:APracticalApproachVol.I、Glover編、49頁IRLPress、1985;Wu199747頁~52頁を参照のこと。あるいは、二本鎖cDNA分子は、プラスミドベクター例えば、pBluescriptベクターStratageneCloningSystems;LaJolla、California、LambdaGEM-4PromegaCorp.;Madison、Wisconsinまたは他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、AmericanTypeCultureCllectionRockville、Marylandから入手され得る。クローニングされたcDNA分子を増幅するために、上記cDNAライブラリーは、標準的な技術を用いて、原核生物宿主中に挿入される。例えば、cDNAライブラリーは、コンピテントE.coliDH5細胞中に導入され得、この細胞は、LifeTechnologies,Inc.Gaithersburg、Marylandから入手され得る。ヒトゲノムDNAライブラリーは、当該分野において周知の手段によって調製され得る例えば、Ausubel19955-1頁~5-6頁;Wu1997307頁~327頁を参照のこと。ゲノムDNAは、界面活性剤Sarkosylを用いて組織を溶解し、プロテイナーゼKを用いてその溶解物を消化し、遠心分離によってその溶解物から不溶性の残屑を取り除き、イソプロパノールを用いてその溶解物から核酸を沈殿させ、そして塩化セシウム濃度勾配上で再懸濁されたDNAを精製することによって、単離され得る。ゲノムライブラリーの生成のために適切なDNAフラグメントは、ゲノムDNAのランダムな切断によるかまたは制限エンドヌクレアーゼを用いたゲノムDNAの部分的な消化によって得られ得る。ゲノムDNAフラグメントは、従来技術例えば、適切な終末を生じるための制限酵素消化の使用、DNA分子の所望されない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用および適切なリガーゼを用いたライゲーションに従って、ベクター例えば、バクテリオファージベクターまたはコスミドベクター中に挿入され得る。このような操作のための技術は、当該分野において周知である例えば、Ausubel19955-1頁~5-6頁;Wu1997307頁~327頁を参照のこと。TGF-β結合タンパク質をコードする核酸分子はまた、本明細書中に記載されるように、ヒトTGF-β結合タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いて、以降同じに得られ得る。PCRを用いてライブラリーをスクリーニングするための一般的な方法は、例えば、Yuら、UseofthePolymeraseChainReactiontoScreenPhageLibrariesMethodsinMolecularBiology、Vol.15:PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications、White編、211頁~215頁HumanaPress,Inc.1993によって提供される。さらに、PCRを使用して関連遺伝子を単離するための技術は、例えば、Preston、UseofDegenerateOligonucleotidesPrimersandthePolymeraseChainReactiontoCloneGeneFamilyMembersMethodsinMolecularBiology、Vol.15:PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications、White編、317頁~337頁HumanaPress,Inc.1993によって記載される。あるいは、ヒトゲノムライブラリーは、ResearchGeneticsHuntsville、ALおよびtheAmericanTypeCultureCollectionRockville、Marylandのような商業的な供給源から入手され得る。cDNAクローンまたはゲノムクローンを含むライブラリーは、本明細書中で記載されるような標準的な方法および当該分野で公知の標準的な方法を用いて、配列番号1に基づく1つ以上のポリヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされ得る例えば、Ausubel19956-1頁~6-11頁を参照のこと。本明細書に記載されるように産生された抗TGF-β結合タンパク質抗体はまた、cDNAライブラリーからTGF-β結合タンパク質をコードするDNA配列を単離するために使用され得る。例えば、上記抗体は、λgt11発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され得るか、または上記抗体は、ハイブリッドの選択および翻訳に続く免疫スクリーニングのために使用され得る例えば、Ausubel19956-12頁~6-16頁;Margolisら、ScreeningλexpressionlibrarieswithantibodyandproteinprobesDNACloning2:ExpressionSystems、第2版、Gloverら編、1頁~14頁OxfordUniversityPress1995を参照のこと。TGF-β結合タンパク質cDNAまたはTGF-β結合タンパク質ゲノムフラグメントの配列は、標準的な方法を用いて決定され得る。さらに、TGF-β結合タンパク質プロモーターまたは調節エレメントを含むゲノムフラグメントの同定は、よく確立された技術例えば、欠失分析を用いて達成され得る例えば、一般的に、Ausubel1995、前出を参照のこと。代替として、TGF-β結合タンパク質遺伝子は、双方からプライミングする長いオリゴヌクレオチドおよび本明細書中に記載されるヌクレオチド配列を用いて、DNA分子を合成することによって得られ得る例えば、Ausubel19958-8頁~8-9頁を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる確立された技術は、少なくとも長さ2キロベースのDNA分子を合成する能力を提供するAdangら、PlantMolec.Biol.21:1131、1993;Bambotら、PCRMethodsandApplications2:266、1993;Dillonら、UseofthePolymeraseChainReactionfortheRapidConstructionofSyntheticGenesMethodsinMolecularBiology、Vol.15:PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications、White編、263頁~268頁HumanaPress,Inc.1993;Holowachukら、PCRMethodsAppl.4:299、1995。3.TGF-β結合タンパク質遺伝子の生成改変体TGF-β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子は、本明細書中に記載される手順を用いて、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101に基づくヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブで種々のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得られ得る。TGF-β結合タンパク質遺伝子改変体はまた、合成的に構築され得る。例えば、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46または配列番号65のアミノ酸配列と比較して1つの保存的なアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子が、考案され得る。すなわち、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46または配列番号65の1つ以上のアミノ酸置換を含む改変体が、得られ得、ここで、アルキルアミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中のアルキルアミノ酸に置換され、芳香族アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中の芳香族アミノ酸に置換され、硫黄含有アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸に置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中のヒドロキシ含有アミノ酸に置換され、酸性アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中の酸性アミノ酸に置換され、塩基性アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸に置換され、あるいは、二塩基性一カルボン酸アミノ酸は、TGF-β結合タンパク質アミノ酸配列中の二塩基性一カルボン酸アミノ酸に置換される。一般的なアミノ酸のなかでも、例えば、保存的アミノ酸置換は、以下の群:1グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、2フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、3セリンおよびスレオニン、4アスパラギン酸およびグルタミン酸、5グルタミンおよびアスパラギン、ならびに6リジン、アルギニンおよびヒスチジンの各々の中のアミノ酸の間の置換によって示される。このような置換の作製において、可能な場合、図1に概説されるシステイン骨格を維持することが重要である。TGF-β結合タンパク質遺伝子中の保存的なアミノ酸変化は、ヌクレオチドを、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101に列挙されるヌクレオチドに置換することによって導入され得る。このような保存的なアミノ酸改変体は、例えば、オリゴヌクレオチド誘発性変異誘発、リンカースキャニングlinker-scanning変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いた変異誘発などによって得られ得るAusubel19958-10頁~8-22頁;McPherson編、DirectedMutagenesis;PracticalApproachIRLPress1991を参照のこと。このような改変体の機能的な能力は、標準的な方法例えば、本明細書中に記載されるようなアッセイを用いて決定され得る。あるいは、改変体TGF-β結合タンパク質ポリペプチドは、抗TGF-β結合タンパク質抗体に特異的に結合する能力によって同定され得る。核酸分子の慣習的な欠失分析は、TGF-β結合タンパク質ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的なフラグメントを得るために実施され得る。図示されるように、配列番号1のヌクレオチド配列を有するDNA分子は、一連の入れ子式の欠失を得るために、Bal31ヌクレアーゼで消化され得る。次いで、そのフラグメントは、適切なリーディングフレームの発現ベクター中に挿入され、そして発現されたポリペプチドは、単離され、そして活性または抗TGF-β結合タンパク質抗体に結合する能力について試験される。エキソヌクレアーゼ消化の1つの代替は、オリゴヌクレオチド誘発性変異誘発を使用して、欠失または終止コドンを導入し、所望のフラグメントの生成を指定することである。あるいは、TGF-β結合タンパク質遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。タンパク質の機能分析のための標準的な技術は、例えば、Treuterら、Molec.Gen.Genet.240:113、1993;Contentら、Expressionandpreliminarydeletionanalysisofthe42kDa2-5AsynthetaseinducedbyhumaninterferonBiologicalInterferonSystems,ProceedingofISIR-TNOMeetingonInterferonSystems,Cantell編、65頁~72頁Nijhoff1987;Herschman、TheEGFReceptorControlofAnimalCellProliferation、Vol.1、Boyntonら、編、169頁~199頁AcademicPress1985;Coumailleauら、J.Boil.Chem.270:29270、1995;Fukunagaら、J.Biol.Chem.270:25291、1995;Yamaguchiら、Biochem.Pharmacol.50:1295、1995;Meiselら、PlantMolec.Biol.30:1、1996に記載される。本発明はまた、保存的アミノ酸変化を有する、TGF-β結合タンパク質遺伝子の機能的なフラグメントを企図する。TGF-β結合タンパク質改変体遺伝子は、上で議論されるような配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101のヌクレオチド配列および配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46または配列番号65のアミノ酸配列との同一性レベルを決定することによって、構造に基づいて同定され得る。構造に基づいて改変体遺伝子を同定することの代替的なアプローチは、改変体の可能性があるTGF-β結合タンパク質遺伝子をコードする核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号100または配列番号101のヌクレオチド配列または長さが少なくとも15ヌクレオチド~20ヌクレオチドのその一部を有する核酸分子にハイブリダイズし得るか否かを決定することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示として、改変体TGF-β結合タンパク質配列を有する核酸分子は、例えば、5×SSPE1×SSPE=180mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム、1mMEDTApH7.7、5×Denhardt溶液100×Denhardt’s=2w/vウシ血清アルブミン、2w/vFicoll、2w/vポリビニルピロリドンおよび0.5SDSを含む緩衝液中で、55°C~60°Cで一晩インキュベーションされて、配列番号1由来の配列を有する核酸分子のフラグメントに結合し得る。高ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションの後の洗浄は、代表的に、0.5×SSC1×SSC=150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸三ナトリウムまたは0.5×SSPE中で、55°C~60°Cで実施される。改変体TGF-β結合タンパク質遺伝子の特定のヌクレオチド配列に関わらず、上記遺伝子は、その機能的な活性によってかまたは抗TGF-β結合タンパク質抗体に特異的に結合する能力によって特徴付けられ得る、ポリペプチドをコードする。さらに具体的には、改変体TGF-β結合タンパク質遺伝子は、本明細書中に記載されるヒトTGF-β結合タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性の少なくとも50、そして好ましくは、60超、70超、80超または90超を示すポリペプチドをコードする。4.培養細胞中でのTGF-β結合タンパク質の生成TGF-β結合タンパク質遺伝子を発現するために、上記ポリペプチドをコードする核酸分子は、発現ベクター中での転写発現を制御する調節配列に作動可能に連結され、次いで、宿主細胞中に導入されなければならない。転写調節配列例えば、プロモーターおよびエンハンサーに加えて、発現ベクターは、翻訳調節配列および上記発現ベクターを保有する細胞の選択に適切なマーカー遺伝子を含み得る。真核細胞における外来タンパク質の生成のために適切な発現ベクターは、代表的に、以下を含む1細菌性複製起点および抗生物質耐性マーカーをコードして、細菌宿主中での発現ベクターの増殖および選択を提供する、原核生物DNAエレメント;2転写開始を制御する、真核生物DNAエレメント例えば、プロモーター;ならびに3転写物のプロセシングを制御する、DNAエレメント例えば、転写終結/ポエリアデニル化配列。本発明のTGF-β結合タンパク質は、好ましくは、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物細胞の例としては、アフリカミドリザル腎臓細胞Vero;ATCCCRL1587、ヒト胚性腎臓細胞293-HEK;ATCCCRL1573、乳仔ハムスター腎臓細胞BHK-21;ATCCCRL8544、イヌ腎臓細胞MDCK;ATCCCCL34、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-K1;ATCCCCL61、ラット下垂体細胞GH1;ATCCCCL82、HeLaS3細胞ATCCCCL2.2、ラット肝細胞癌細胞H-4-II-E;ATCCCRL1548、SV40で形質転換されたサル腎臓細胞COS-1;ATCCCRL1650およびマウス胚細胞NIH-3T3;ATCCCRL1658が挙げられる。哺乳動物宿主について、上記転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどに由来し得、ここで、その調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子およびメタロチオネイン遺伝子から得られ得る。転写調節配列は、RNA合成を開始させるために充分なプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインI遺伝子[Hamerら、J.Molec.Appl.Genet.1:273、1982]、疱疹ウイルスのTKプロモーター[McKnight、Cell31:355、1982]、SV40初期プロモーター[Benoistら、Nature290:304、1981]、ラウス肉腫ウイルスプロモーター[Gormanら、Proc.Nat’lAcad.Sci.USA79:6777、1982]、サイトメガロウイルスプロモーター[Foeckingら、Gene45:101、1980]およびマウス乳腺癌ウイルスプロモーターが挙げられる一般的に、Etcheverry、ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCultureProteinEngineering:PrinciplesandPractice、Clelandら編、163頁~181頁JohnWileySons,Inc.1996を参照のこと。あるいは、原核生物プロモーター例えば、バクテリオファージT3RNAポリメラーゼプロモーターは、その原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合に、哺乳動物細胞において、TGF-β結合タンパク質遺伝子発現を制御するために使用され得るZhouら、Mol.Cell.Biol.10:4529、1990;Kaufmanら、NucleicAcidsRes.19:4485、1991。TGF-β結合タンパク質遺伝子はまた、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞中で発現され得る。原核生物宿主においてTGF-β結合タンパク質ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に周知であり、そしてこれらのプロモーターとしては、T4ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、Sp6ポリメラーゼおよびT7ポリメラーゼを識別可能なプロモーター、バクテリオファージλのPRプロモーターおよびPLプロモーター、E.coliのtrpプロモーター、recAプロモーター、熱ショックプロモーター、lacUV5プロモーター、tacプロモーター、lpp-lacSprプロモーター、phoAプロモーターおよびlacZプロモーター、B.subtilisのプロモーター、Bacillusのバクテリオファージのプロモーター、Streptomycesプロモーター、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のblaプロモーターおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick、J.Ind.Microbiol.1:277、1987、Watsonら、MolecularBiologyoftheGene、第4版BenjaminCummins1987およびAusubelら1995によって概説される。好ましい原核生物宿主としては、E.coliおよびBacillussubtilusが挙げられる。E.coliの適切な株としては、BL21DE3、BL21DE3pLysS、BL21DE3pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF’、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451およびER1647が挙げられる例えば、Brown編、MolecularBiologyLabfaxAcademicPress1991を参照のこと。Bacillussubtilusの適切な株としては、BR151、YB886、MI119、MI120およびB170が挙げられる例えば、Hardy、BacillusCloningMethodsDNACloning:APracticalApproach、Glover編IRLPress1985を参照のこと。原核生物宿主中でタンパク質を発現するための方法は、当業者に周知である例えば、Williamら、ExpressionofforeignproteinsinE.coliusingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodiesDNACloning2:ExpressionSystems、第2版、Gloverら編、15頁OxfordUniversityPress1995;Wardら、GeneticManipulationandExpressionofAntibodiesMonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications、137頁Wiley-Liss,Inc.1995;およびGeorgiou、ExpressionofProteinsinBacteriaProteinEngineering:PrinciplesandPractice、Clelandら編、101頁JohnWileySons,Inc.1996を参照のこと。バキュロウイルス系は、クローニングされたTGF-β結合タンパク質遺伝子を昆虫細胞中に導入するための有効な手段を提供する。適切な発現ベクターは、Autographacalifornica核多角体ウイルスAcMNPVに基づいており、そして周知のプロモーター例えば、Drosophila熱ショックタンパク質hsp70プロモーター、Autographacalifornica核多角体ウイルスの前初期遺伝子プロモーターie-Iおよび後初期39Kプロモーター、バキュロウイルスp10プロモーターならびにDrosophilaメタロチオネインプロモーターを含む。適切な昆虫宿主細胞としては、IPLB-Sf-21由来の細胞株、Spodopterafrugiperdaさなぎ卵巣細胞株例えば、Sf9ATCCCRL1711、Sf21AEおよびSf21InvitrogenCorporation;SanDiego、CAならびにDrosophilaSchneider-2細胞が挙げられる。バキュロウイルス系において組み換えタンパク質を生成するための確立された技術は、Baileyら、ManipulationofBaculovirusVectorsMethodsinMolecularBiology、Volume7:GeneTransferandExpressionProtocols、Murray編、147頁~168頁TheHumanPress,Inc.1991によって、Patelら、ThebaculovirusexpressionsystemDNACloning2:ExpressionSystems、第2版、Gloverら編、205頁~244頁OxfordUniversityPress1995によって、Ausubel199516-37頁~16-57頁によって、Richardson編、BaculovirusExpressionProtocolsTheHumanPress,Inc.1995によって、そしてLucknow、InsectCellExpressionTechnologyProteinEngineering:PrinciplesandPractice、Clelandら編、183頁~218頁JohnWileySons,Inc.1996によって、提供される。酵母における発現のためのプロモーターとしては、GAL1ガラクトース、PGKホスホグリセラーゼキナーゼ、ADHアルコールデヒドロゲナーゼ、AOX1アルコールオキシダーゼ、HIS4ヒスチジノールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。多くの酵母クローニングベクターが設計され、そして容易に入手可能である。これらのベクターとしては、YIpベースのベクター例えば、YIp5ベクター、YRpベクター例えば、YRp17、YEpベクター例えば、YEp13およびYCpベクター例えば、YCp19が挙げられる。当業者は、酵母細胞における発現のために適切な、広範な種々のベクターが存在することを理解する。発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、インタクトな植物組織または単離された植物細胞中に導入され得る。植物組織を培養するための一般的な方法は、例えば、Mikiら、ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlantsMethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology、Glickら編、67頁~88頁CRCPress1993によって提供される。発現ベクターは、種々の標準的な技術リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、微小発射物媒介性送達microprojectile-mediateddelivery、エレクトロポレーションなどを用いて宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、上記トランスフェクトされた細胞は、選択され、そして増殖させられて、その宿主細胞ゲノム中に安定に統合された発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。ベクターを真核細胞中に導入するための技術および優性選択可能マーカーを用いてこのような安定な形質転換体を選択するための技術は、例えば、Ausubel1995およびMurry編、GeneTransferandExpressionProtocolsHumanPress1991に記載される。細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞中に発現ベクターを導入するための方法はまた、Ausubel1995によって提供される。哺乳動物細胞系によって生成される外来タンパク質を発現し、そして回収するための一般的な方法は、例えば、Etcheverry、ExpressionofEnginneringProteinsinMammalianCellCultureProteinEngineering:PrinciplesandPractice、Clelandら編、163頁Wiley-Liss,Inc.1996によって提供される。細菌系によって生成されたタンパク質を回収するための標準的な技術は、例えば、Grisshammerら、Purificationofover-producedproteinsfromE.colicellsDNACloning2:ExpressionSystems、第2版、Gloverら編、59頁~92頁OxfordUniversityPress1995によって提供される。バキュロウイルス系から組み換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Richardson編、BaculovirusExpressionProtocolsTheHumanaPress,Inc.1995に記載される。より一般的には、TGF-β結合タンパク質は、標準的な技術例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLCなどによって単離され得る。TGF-β結合タンパク質の単離および精製におけるさらなる改変が、当業者によって考案され得る。例えば、以下に記載されるように得られる抗TGF-β結合タンパク質抗体は、免疫アフィニティー精製によって大量のタンパク質を単離するために使用され得る。5.TGF-β結合タンパク質に対する抗体の産生本発明は、本明細書中で詳細に記載されるように、スクレロスチンに特異的に結合する抗体を提供する。TGF-β結合タンパク質に対する抗体は、例えば、抗原として発現ベクターの産物を用いることによって得られ得る。スクレロスチンに特異的に結合する抗体はまた、本明細書中で提供されるスクレロスチンポリペプチド配列配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46および配列番号65のうちの任意の1つに由来するペプチドを用いることによって、調製され得る。特に有用な抗TGF-β結合タンパク質抗体は、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号46および配列番号65のTGF-β結合タンパク質と、特異的に結合するが、他のTGF-β結合タンパク質例えば、Dan、Cerberus、SCGFまたはGremlinに対しては特異的に結合しない。本発明の抗体そのフラグメントおよび誘導体を含むは、ポリクローナル抗体であってものあるいは特に、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体は、任意の免疫グロブリンクラスに属し得、そして例えば、IgG抗体IgGのアイソタイプを含み、このアイソタイプは、ヒト抗体については、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4として当該分野で公知である;IgE抗体;IgM抗体;またはIgA抗体であり得る。抗体は、家禽または哺乳動物から得られ得、好ましくは、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体または他の霊長類抗体に由来し得る。所望される場合、上記抗体は、内在化抗体internalisingantibodyであ得る。組み換えTGF-β結合タンパク質に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて調製され得る例えば、Greenら、ProductionofPolyclonalAntiseraImmunochemicalProtocolsManson、編、1頁~5頁HumanaPress1992;Williamsら、ExpressionofforeignproteinsinE.coliusingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodiesDNACloning2:ExpressionSystems、第2版、Gloverら編、15頁OxfordUniversityPress1995を参照のこと。ポリクローナル抗体は、代表的に、動物例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒツジにおいて生じるが、本発明の抗TGF-β結合タンパク質抗体はまた、ヒトより下等な霊長類抗体に由来し得る。ヒヒにおいて診断的および治療的に有用な抗体を生じるための一般的な技術は、例えば、Goldenbergら、国際特許公開番号WO91/114651991およびLosmanら、Int.J.Cancer46:310、1990において見られ得る。上記抗体は、少なくとも1つの可変領域ドメインを含むべきである。上記可変領域ドメインは、任意の大きさまたは任意のアミノ酸組成からなり得、そして一般的に、少なくとも1つのフレームワーク配列にはめ込まれた超可変アミノ酸配列を含み、この超可変アミノ酸配列は、抗原結合を担う。一般的な用語において、上記可変V領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖VH可変ドメインおよび/または軽鎖VL可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。従って、例えば、上記V領域ドメインは、モノマーであり得、そしてVHドメインであってもVLドメインであってもよく、ここで、これらのVHドメインまたはVLドメインは、独立して、受容可能な親和性で抗原に結合し得る。あるいは、上記V領域ドメインは、ダイマーであり得、そしてVH-VHダイマー、VH-VLダイマーまたはVL-VLダイマーを含み得、ここで、そのVH鎖およびVL鎖は、非共有結合する本明細書中の以下で、FVと省略される。しかし、所望される場合、上記鎖は、直接的にか例えば、上記2つの可変ドメイン間のジスルフィド結合を介して、またはリンカー例えば、ペプチドリンカーを介してかのいずれかで、共有結合的に結合されて、単鎖ドメイン本明細書中の以下で、scFVと省略されるを形成し得る。上記可変領域ドメインは、天然に存在する任意の可変ドメインまたはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンは、組換えDNA操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、天然の抗体可変領域から、その天然の抗体のアミノ酸配列中またはその配列への挿入、欠失、もしくは変更により作製されたものが挙げられる。この型の特定の例としては、操作された可変領域ドメインが挙げられ、この可変領域は、少なくとも1つのCDRを含み、そして必要に応じて、1つの抗体由来の1以上のフレームワークアミノ酸および第2の抗体由来の可変領域ドメインの残部を含む。この可変領域ドメインは、少なくとも1つの、他の抗体ドメインもしくはそのフラグメントに対してC末端アミノ酸で共有結合され得る。従って、例えば、VHドメインが可変領域ドメインに存在する場合、これは、免疫グロブリンCH1ドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。同様に、VLドメインは、CKドメインもしくはそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、上記抗体はFabフラグメントであり得、上記抗体結合ドメインが、CH1およびCKドメインのC末端にそれぞれ共有結合的に連結された、関連するVHドメインおよびVLドメインを含む。例えば、Fab’フラグメントにおいて見られるようなヒンジ領域ドメインを提供する目的で、またはさらなるドメイン例えば、抗体CH2ドメインおよび抗体CH3ドメインを提供する目的で、このCH1ドメインは、さらなるアミノ酸を用いて延長され得る。抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域CDRをコードするペプチドである。CDRペプチド最小認識単位は、目的の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することにより得られ得る。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ鎖連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することにより調製され得る例えば、Larrickら、Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106,1991;MonoclonalAntibodies:Production,EngineeringandClinicalApplication,Ritterら編、166頁CambridgeUniversityPress1995における、Courtenay-Luck,GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies;およびMonoclonalAbtibodies:PrinciplesandApplications,Birchら編、137頁Wiley-Liss,Inc.1995における、Wardら、GeneticManipulationandExpressionofAntibodiesを参照のこと。本発明において使用するための抗体は、一般的に、従来の免疫手順および細胞融合手順により調製されるモノクローナルであり得るか、または、モノクローナル抗体に由来するフラグメントの場合には、任意の適切な標準的な化学的技術例えば、還元または酵素的切断および/もしくは消化技術例えば、ペプシンを用いる処理を用いて得られ得る。より具体的には、モノクローナル抗TGF-β結合タンパク質抗体は、種々の技術を用いて生成され得る。特定の抗原に対する齧歯類のモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得られ得る例えば、Kohlerら、Nature256:495,1975;およびColiganら編、CurrentProtocolsinImmunology,1:2.5.1~2.6.7JohnWileySons1991[Coligan];DNACloning2:ExpressionSystems,第2版,Gloverら編OxfordUniversityPress1995、93頁におけるPicksleyら、ProductionofmonoclonalantibodiesagainstproteinsexpressedinE.coliを参照のこと。簡単に述べると、モノクローナル抗体は、TGF-β結合タンパク質遺伝子産物を含有する組成物をマウスに注射する工程、血清サンプルを取り出すことにより抗体産物の存在を確認する工程、脾臓を取り出してBリンパ球を得る工程、このBリンパ球を骨髄性細胞と融合させ、ハイブリドーマを生成する工程、このハイブリドーマをクローニングする工程、上記抗原に対する抗体を産生するポジティブクローンを選択する工程、上記抗原に対する抗体を産生するクローンを培養する工程、およびこのハイブリドーマ培養物から抗体を単離する工程により得られ得る。さらに、本発明の抗TGF-β結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原チャレンジに応答して特定のヒト抗体を生み出すように操作されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖の座およびヒト軽鎖の座のエレメントは、内因性の重鎖および軽鎖の座の標的化破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウスの株に導入される。このトランスジェニックマウスは、ヒトの抗原に対して特異的なヒトの抗体を合成し得、そしてこのマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生み出すために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Greenら、NatureGenet.7:13,1994;Lonbergら、Nature368:856,1994;およびTaylorら、Int.Immun.6:579,1994に記載されている。モノクローナル抗体は、十分に確立された種々の技術によりハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。このような単離技術としては、プロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ-排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる例えば、Coliganの2.7.1頁~2.7.12頁および2.9.1頁~2.9.3頁;Bainesら、PurificationofImmunoglobulinIgG、MethodsinMolecularBiology、第10巻、79頁~104頁TheHumanaPress,Inc.1992を参照のこと。特定の用途のために、抗TGF-β結合タンパク質抗体のフラグメントを調製することが望ましくあり得る。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解により得られ得る。抗体フラグメントは、従来の方法により、抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化により得られ得る。例示として、抗体フラグメントは、ペプシンを用いる抗体の酵素的切断により生み出され、Fab’2と表記される5Sのフラグメントを提供し得る。このフラグメントは、チオール還元剤を用いてさらに切断されて、3.5SのFab’の1価フラグメントを生成し得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断に由来するスルヒドリル基に対する保護基を用いて実行され得る。代替として、ペプシンを用いる酵素的切断は、2個の1価のFabフラグメントおよび1個のFcフラグメントを直接的に生み出す。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら、ArchBiochem.Biophys.89:230,1960、Porter,Biochem.J.73.119,1959、Edelmanら、MethodsinEnzymology1:422AcademicPress1967により、ならびにColiganらにより、2.8.1頁~2.8.10頁および2.10頁~2.10.4頁に記載されている。このフラグメントがインタクトな抗体により認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法例えば、1価の軽鎖-重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術もまた使用され得る。あるいは、この抗体は、組換えDNA技術の使用により得られる組換え抗体または操作された抗体であり得、この組換えDNA技術は、抗体の可変領域および/または定常領域をコードするDNAの操作および再発現を含む。このようなDNAは、公知であり、そして/またはDNAライブラリー例えば、ファージ-抗体ライブラリーChiswellら、DJおよびMcCafferty,J.Tibtech.1080~841992を参照のことが挙げられるもしくは所望のものが合成され得るところから容易に入手可能である。標準的な分子生物学的手順および/または化学的手順が、例えば、コドンを導入してシステイン残基をつくり、所望の通りに他のアミノ酸もしくはドメインを改変するか、付加するか、または欠失させるようにDNAを配列決定し、そしてDNAを操作するために使用され得る。可変領域および/または定常領域をコードするDNAを含む1種以上の複製可能な発現ベクターが調製され得、そして適切な細胞系例えば、非産生性骨髄種細胞系例えば、マウスNSO系もしくは細菌例えば、E.coliを形質転換するために使用され得、これらにおいて、上記抗体が生じる。効率的な転写および翻訳を達成するために、各ベクター中のDNA配列は、適切な調節配列特に、可変ドメイン配列に作動可能に連結されたプロモーター配列およびリーダー配列を含むべきである。このようにして抗体を産生するための特定の方法は、一般的に周知であり、そして日常的に使用される。例えば、基本的な分子生物学的手順は、ManiatisらMolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989により記載され;DNA配列決定は、SangerらProc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463,1977およびAmershamInternationalplc配列決定ハンドブックに記載の通りに実行され;特定部位の突然変異誘発は、KramerらNucleicAcidsRes.12,9441,1984の方法;theAnglianBiotechnologyLtdhandbook;KunkelProc.Natl.Acad.Sci.USA82;488~921985;Kunkelら、MethodsinEnzymol.154:367~821987に従って実行される。さらに、多くの刊行物が、例えば、BiotechnologyandGeneticEngineeringReviewsTombs,MP編,10、第1章、1992、Intercept,Andover,UKにおいて、MountainAおよびAdair,JRにより概説されるように、そして国際特許明細書番号WO91/09967において概説されるように、DNAの操作、発現ベクターの作製、および適切な細胞の形質転換による抗体の調製に適切な技術を詳述している。特定の実施形態において、本発明に従う抗体は、この抗体に結合する1種以上のエフェクター-分子またはレポーター分子を有し得、そして本発明は、このような改変型タンパク質にまで及ぶ。レポーター分子は、検出可能な部分あるいは検出可能な標識例えば、酵素、細胞傷害性因子または他のレポーター分子色素、放射性核種、発光基luminescentgroup、蛍光基fluorescentgroup、もしくはビオチンなどであり得る。このTGF-β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診断用の適用および治療上の適用のために放射標識され得る。抗体の放射標識のための技術は、当該分野において公知である。例えば、Adams1998InVivo12:11~21;Hiltunen1993ActaOncol.32:831~9を参照のこと。治療上の適用は、以下により詳細に記載され、そしてTGF-β結合タンパク質に特異的な抗体もしくはそのフラグメントの、他の治療用因子と組み合わせての使用を含む。エフェクター分子またはレポーター分子は、利用可能なアミノ酸側鎖、末端アミノ酸、もしくは、存在する場合には、この抗体に位置するカルボキシレート官能基のいずれかを通して、結合され得るただし、結合もしくは結合プロセスは、この分子の結合の特異性および有用性に悪影響を及ぼさないものとする。特定の官能基としては、例えば、遊離アミノ基、遊離イミノ基、遊離チオール基、遊離ヒドロキシル基、遊離カルボキシル基、もしくは遊離アルデヒド基のいずれかが挙げられる。抗体と、エフェクター分子および/またはレポーター分子との結合は、このような基と、エフェクター分子またはレポーター分子における適切な官能基とを介して達成され得る。この結合は、直接的であっても、間隔基spacinggroupまたは架橋基を通して、間接的であってもよい。エフェクター分子としては、例えば、抗腫瘍性因子、毒素例えば、酵素的に活性な細菌の毒素例えば、P.aeruginosa体外毒素Aまたは植物起源の毒素およびそれらのフラグメント例えば、リシンおよびそのフラグメント;植物ゲロニン、Bryoniadioica由来のブリオジンbryodinなどが挙げられる。例えば、Thrushら、1996、Annu.Rev.Immunol.14:49~71;Frankelら、1996、CancerRes.56:926~32を参照のこと;生物学的に活性なタンパク質例えば、酵素;核酸およびそのフラグメント例えば、DNA、RNAおよびそのフラグメント;天然に存在するポリマーおよび合成ポリマー例えば、ポリサッカライドおよびポリアルキレンポリマー例えば、ポリエチレングリコールおよびその誘導体;放射性核種特に、放射性ヨウ素;およびキレート化金属。適切なレポーター基としては、キレート化金属、蛍光化合物、またはNMR分光法もしくはESR分光法により検出され得る化合物が挙げられる。特に有用なエフェクター基は、カリカエミシンcalichaemicinおよびその誘導体である例えば、南アフリカ特許明細書番号85/8794、88/8127および90/2839を参照のこと。多くの他の毒素化学療法剤、抗有糸分裂因子、抗生物質、アポトーシス誘導剤すなわちアポトーゲンapoptogen、例えば、GreenおよびReed、1998、Science281:1309~1312を参照のことなどは、当業者に公知であり、そして本明細書中で提供される例は、例示的であることが意図されており、本発明の範囲および精神を限定するものではない。特定の抗腫瘍性因子としては、細胞傷害性因子および細胞増殖抑制性因子例えば、アルキル化剤例えば、ナイトロジェンマスタード例えば、クロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロホスファミド、もしくはウラシルマスタードおよびこれらの誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、またはシスプラチン;代謝拮抗物質例えば、葉酸、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸、もしくはフルオロクエン酸、抗生物質例えば、ブレオマイシン例えば、ブレオマイシンスルフェート、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン例えば、マイトマイシンC、アクチノマイシン例えば、ダクチノマイシン、プリカマイシンplicamycin、カリカエミシンcalichaemicinおよびその誘導体、またはエスペラミシンesperamicinおよびその誘導体;有糸分裂阻害剤例えば、エトポシド、ビンクリスチンもしくはビンブラスチンおよびこれらの誘導体;アルカロイド例えば、エリプチシン;ポリオール例えば、タキシシンtaxicin-Iおよびタキシシン-II;ホルモン例えば、アンドロゲン例えば、ドロモスタノロンもしくはテストラクトン、プロゲスチン例えば、酢酸メゲストロールもしくは酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン例えば、ジメチルスチルベストロールジホスフェート、ポリエストラジオールホスフェートもしくはエストラムスチンホスフェートまたは抗エストロゲン例えば、タモキシフェン;アントラキノン例えば、ミトキザントロン、尿素例えば、ヒドロキシ尿素;ヒドラジン例えば、プロカルバジン、あるいはイミダゾール例えば、ダカルバジンが挙げられる。キレート化金属としては、2~8の配位数を有するプラス2価またはプラス3価の金属のキレートが挙げられる。このような金属の特定の例としては、テクネチウムTc、レニウムRe、コバルトCo、銅Cu、金Au銀Ag、鉛Pb、ビスマスBi、インジウムIn、ガリウムGa、イットリウムY、テルビウムTb、ガドリニウムGdおよびスカンジウムScが挙げられる。一般的に、この金属は、望ましくは、放射性核種である。特定の放射性核種としては、99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y、160Tb、153Gdおよび47Scが挙げられる。キレート化金属は、例えば、任意の適切な多座キレート化剤例えば、非環式もしくは環式の、ポリアミン、ポリエーテル例えば、クラウンエーテルおよびその誘導体;ポリアミド;ポルフィリン;ならびにカルボン酸誘導体を用いてキレート化された、上記の金属の型のうちのいずれか1つであり得る。一般的に、キレート化剤の型は、使用する金属に依存する。しかし、本発明に従って結合されるキレート化剤の特に有用な基の1つは、非環式および環式の、ポリアミン、特に、ポリアミノカルボン酸例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸およびこの誘導体ならびに大環状アミン例えば、環式トリ-アザ誘導体および環式テトラ-アザ誘導体例えば、国際特許明細書番号WO92/22583に記載の通り、ならびにポリアミド、特にデスフェリオキサミンおよびこの誘導体を含む。抗体におけるチオール基が結合点として使用される場合、これは、エフェクター分子またはレポーター分子に存在するチオール反応基を用いる反応を通して達成され得る。このような基の例としては、α-ハロカルボン酸またはα-ハロエステル例えば、ヨードアセトアミド、イミド例えば、マレイミド、ビニルスルホンもしくはジスルフィドが挙げられる。これらおよび他の適切な連結手順は、国際特許明細書番号WO93/06231、WO92/22583、WO90/091195およびWO89/01476に一般的にかつより詳細に、記載されている。骨密度を増加させる分子を選択するためのアッセイ上に議論されるように、本発明は、骨密度を増加し得る化合物を選択および/または単離するための方法を提供する。例えば、本発明の1つの局面内では、選択された分子例えば、候補因子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、a選択された分子と、TGF-β結合タンパク質およびTGF-βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーとを混合する工程、bこの選択された分子が、TGF-βファミリーのタンパク質によりシグナル伝達を刺激する工程、またはTGF-β結合タンパク質の少なくとも1つのメンバーへの結合を阻害する工程、を包含する。特定の実施形態内では、この分子は、間充織細胞の分化のポジティブレギュレーターとして機能するTGF-βの能力を増強する。本発明の他の局面内では、選択された分子候補因子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、a選択された分子を、TGF-β結合タンパク質を発現する細胞に曝す工程接触させる工程、混合する工程、あわせる工程、およびb上記曝された細胞において、TGF-β結合タンパク質の発現または活性が減少するか否か、あるいはTGF-β結合タンパク質の活性が減少するか否か、ならびにそれから、この化合物が、骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定する工程、を包含する。1つの実施形態では、上記細胞は、骨生検材料由来の自発的に形質転換されたかまたは形質転換されていない正常なヒトの骨およびラットの頭蓋骨骨芽細胞からなる群より選択される。TGF-β結合タンパク質の発現のレベルを検出するための方法が、当該分野で公知であり、本明細書に記載される広範な種々のアッセイフォーマットで実行され得る。イムノアッセイは、TGF-β結合タンパク質の発現を検出し、そして定量化するために使用され得、これとしては、例えば、逆流免疫電気泳動CIEP、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定法ELISA、免疫ブロットアッセイ例えば、ドットブロットアッセイおよびウエスタンブロット、阻害アッセイもしくは競合アッセイ、ならびにサンドウィッチアッセイ例えば、米国特許第4,376,110号、および同4,486,530号を参照のこと;また、Antibodies:ALaboratoryManual前出も参照のことが挙げられ得る。このようなイムノアッセイは、TGF-β結合タンパク質に特異的な抗体例えば、本明細書中に記載される抗スクレロスチン抗体を使用しても、または上記TGF-β結合タンパク質に結合されるレポーター分子に特異的な抗体を使用してもよい。ポリペプチド発現のレベルもまた、TGF-β結合タンパク質リガンドに結合し得るTGF-β結合タンパク質の量を定量化することにより決定され得る。例として、サンプル中でスクレロスチンをBMPに結合することは、表面プラズモン共鳴SPRにより検出され得る。あるいは、特定のTGF-β結合タンパク質をコードするmRNAの発現のレベルが、定量され得る。このようなアッセイの代表的な実施形態が、以下の実施例5および実施例6に提供される。簡潔に述べると、TGF-βスーパーファミリーのファミリーメンバーまたはTGF-β結合タンパク質が、まず固相に結合され、続いて、候補分子が加えられる。次いで、標識された、上記TGF-βスーパーファミリーのファミリーメンバーまたはTGF-β結合タンパク質がこのアッセイに加えられすなわち、この標識されたポリペプチドは、その固相に結合されたいずれかのポリペプチドに対しても、リガンドである。上記固相が洗浄され、固体支持体上の、結合されたTGF-βスーパーファミリーメンバーの量もしくは標識されたTGF-βスーパーファミリーメンバーの量または結合されたTGF-β結合タンパク質もしくは標識されたTGF-β結合タンパク質が、決定される。本明細書中で記載されるように、骨鉱物含有量を増加させることにおける使用に適切な分子は、TGF-β結合タンパク質とTGF-βスーパーファミリーのメンバーとの結合を、統計的に有意な様式で減少させる分子である。明らかに、本発明内の、使用に適切なアッセイは、実施例2および実施例3に記載される実施形態に限定されるべきではない。特に、多くのパラメーターが、例えば、TGF-βの固相への結合により、または固相の剥離により全体的に変更され得る。本発明の他の局面内では、選択された分子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、a選択された分子候補薬剤を、TGF-βを発現する細胞に曝す接触させる、混合させる、合わせる工程、およびb上記曝された細胞由来のTGF-βの活性が、変化するかどうかを決定し、そしてそれから上記化合物が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定する工程、を包含する。本明細書に記載される方法と同様に、選択された試験化合物に起因するTGF-β結合タンパク質の発現の変化を評価するために種々の方法が利用され得る。本発明の1つの実施形態では、候補薬剤は、本明細書に開示されるTGF-β結合タンパク質スクレロスチンに結合する抗体である。本発明の好ましい実施形態では、TGF-βシグナル伝達経路を調節する抗体を同定するための方法が提供され、この方法は、SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体を、SOSTペプチド本明細書中に開示されるペプチドが挙げられるが、これらに限定されないと、抗体プラスSOST抗体/SOST複合体の形成を可能にする条件下で、これを可能にするのに十分な時間接触させ、次いで、SOST/抗体複合体のレベルを検出例えば、その量を定量し、TGF-βシグナル伝達経路を調節する抗体の存在を決定する工程を包含する。この方法は、SPRを用いて実行されても、または当該分野で公知であり、本明細書中で開示される任意の数の異なるイムノアッセイELISA、イムノブロットなどが挙げられるを用いて実行されてもよい。TGF-βシグナル伝達経路としては、BMPが、細胞上のI型レセプターおよびII型レセプターに結合し、骨鉱物含有量を調節する経路を刺激または誘導するシグナル伝達経路が挙げられる。本発明の特定の好ましい実施形態では、SOSTに特異的に結合する抗体は、骨鉱物含有量を増加するための経路を刺激するか、または高める。このような抗体は、本明細書中に開示される方法を用いて同定され得、抗体とSOST特異的ペプチドとの結合を検出し得る。本発明の方法はまた、抗体がBMPに結合するSOSTの領域または部分領域に位置するSOSTペプチド例えば、SOSTのアミノ末端のペプチドならびにアミノ末端アミノ酸残基およびSOSTのコア領域ドッキングコア例えば、配列番号47~配列番号64、配列番号66~配列番号73、および配列番号92~配列番号95の一部を含むペプチドに結合するか否かを検出することにより、BMPとSOSTポリペプチドとの結合を弱化するか、阻害するか競合的に阻害することを含む、または妨害する抗体を同定するために使用され得る。本発明の方法はまた、SOSTホモダイマーの形成を、弱化するか、妨害するか、または阻害する抗体を同定するために使用され得る。SOSTに特異的に結合するこのような抗体は、この抗体と、SOSTのコア領域またはカルボキシ末端領域例えば、配列番号74~91および96~99に由来するペプチドとの結合を検出することにより同定され得る。本発明の別の実施形態では、選択された分子が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され、この方法は、a選択された分子候補薬剤と、TGF-β結合タンパク質およびTGF-βファミリーのタンパク質の選択されたメンバーとを、混合するかまたは接触させる工程、bこの選択された分子がTGF-βファミリーのタンパク質のシグナル伝達をアップレギュレートするか、またはTGF-β結合タンパク質と上記TGF-βファミリーのタンパク質との結合を阻害するかを決定する工程を包含する。特定の実施形態の中では、この分子は、TGF-βが、間葉細胞の分化のポジティブレギュレーターとして機能する能力を増強する。上に記載される方法と同様に、選択された試験化合物に起因するTGF-βの刺激を評価するために、種々の方法が用いられ得る。1つのこのような代表的な1つの方法が、実施例6において以下に提供されるDurhamら、Endo.136:1374~1380もまた参照のこと。本発明のなお他の局面の中では、選択された分子候補薬剤が骨鉱物含有量を増加し得るか否かを決定するための方法が提供され得、この方法は、選択された分子が、TGF-β結合タンパク質と骨またはそのアナログとの結合を阻害するか否かを決定する工程を包含する。本明細書中で用いられる場合、骨またはそのアナログとは、ヒドロキシアパタイト、または粉末形態の骨、骨粉、またはインタクトな骨からなる表面をいうことが理解されるべきである。上記の方法と同様に、多種多様な方法が、TGF-β結合タンパク質の骨マトリックスへの局在化を阻害するために使用され得る。1つのこのような代表的な方法が、実施例7に以下に提供されるNicolasら、Calcif.TissueInt.47:206~121995もまた参照のこと。本発明の1つの実施形態では、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、TGF-βファミリーメンバーと上記スクレロスチンポリペプチドとの結合を競合的に阻害し得る。上記抗体または抗体フラグメントの、TGF-βファミリーのメンバー例えば、BMPとスクレロスチンとの結合を弱化またはブロックする能力は、本明細書に記載される任意の方法に従って決定され得る。スクレロスチンに特異的に結合する、抗体およびそのフラグメントは、スクレロスチンホモダイマーの形成を弱化させることにより、TGF-βファミリーのメンバーとスクレロスチンとの結合を、弱化、ブロックまたは妨害し得る。スクレロスチンに特異的に結合する抗体はまた、スクレロスチンがBMPに結合するのを阻害するか、または弱化することにより、スクレロスチンの活性を同定するために使用され得る。あるいは、上記抗体またはそのフラグメントは、細胞ベースのアッセイ中に組み込まれ得るか、または、スクレロスチンが既定の活性を有する動物モデル中に組み込まれ、抗体がその活性を変化統計的に有意な様式で、増加または減少させるか否かを決定し得る。スクレロスチンに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメントは、シグナル伝達経路において、このような抗体の効果を試験するために使用され得、これにより上記シグナル伝達経路を調節刺激または阻害し得る。好ましくは、抗体とSOSTとの結合は、シグナル伝達経路の刺激または誘導をもたらす。本明細書において引用される方法は、個々の試験分子の分析を参照し得るが、本発明は、それに限定されるべきではない。特に、選択された分子は、化合物の混合物中に含有され得る。したがって、引用される方法は、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する分子を単離する工程をさらに包含し得る。候補分子多種多様な分子が、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する、その能力についてアッセイされ得る。以下でより詳細に考察される代表例としては、有機分子例えば、有機低分子、タンパク質もしくはペプチド、および核酸分子が挙げられる。本明細書において記載される候補分子が本明細書において記載されるアッセイに利用され得ることが、以下の考察から証明されるはずである。このような分子が種々の診断設定および治療設定に利用され得ることもまた、容易に明らかになるはずである。1.有機分子多くの有機低分子が、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する、その能力についてアッセイされ得る。例えば、本発明の一実施形態の範囲内で、適切な有機分子が、化学物質ライブラリーこのライブラリーにおいては、化学物質は、個別にアッセイされる、またはコンビナトリアルケミストリーのライブラリーこのライブラリーにおいては、複数の化合物が一度にアッセイされて、次いで逆重畳積分されdeconvoluted、最も活性な化合物を決定および単離するのいずれかから選択され得る。このようなコンビナトリアルケミストリーのライブラリーの代表的な例としては、以下によって記載されたものが挙げられる:AgrafiotisらSystemandmethodofautomaticallygeneratingchemicalcompoundswithdesiredproperties、米国特許第5,463,564号;Armstrong,R.W.Synthesisofcombinatorialarraysoforganiccompoundsthroughtheuseofmultiplecomponentcombinatorialarraysyntheses、WO95/02566;Baldwin,J.J.らSulfonamidederivativesandtheiruse、WO95/24186;Baldwin,J.J.らCombinatorialdihydrobenzopyranlibrary、WO95/30642;Brenner,S.Newkitforpreparingcombinatoriallibraries、WO95/16918;Chenera,B.らPreparationoflibraryofresin-boundaromaticcarbocycliccompounds、WO95/16712;Ellman,J.A.Solidphaseandcombinatorialsynthesisofbenzodiazepinecompoundsonasolidsupport、米国特許第5,288,514号;Felder,E.らNovelcombinatorialcompoundlibraries、WO95/16209;Lerner,R.らEncodedcombinatorialchemicallibraries、WO93/20242;Pavia,M.R.らAmethodforpreparingandselectingpharmaceuticallyusefulnon-peptidecompoundsfromastructurallydiverseuniversallibrary、WO95/04277;Summerton,J.E.およびD.D.WellerMorpholino-subunitcombinatoriallibraryandmethod、米国特許第5,506,337号;Holmes,C.MethodsfortheSolidPhaseSynthesisofThiazolidinones,Metathiazanones,andDerivativesthereof、WO96/00148;Phillips,G.B.およびG.P.WeiSolid-phaseSynthesisofBenzimidazoles、Tet.Letters37:4887-90,1996;Ruhland,B.らSolid-supportedCombinatorialSynthesisofStructurallyDiverseβ-Lactams、J.Amer.Chem.Soc.111:253-4,1996;Look,G.C.らTheIndentificationofCyclooxygenase-1Inhibitorsfrom4-ThiazolidinoneCombinatorialLibraries、BioorgandMed.Chem.Letters6:707-12,1996。2.タンパク質およびペプチド広範なタンパク質およびペプチドが、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合のインヒビターに関する候補分子として、同様に利用され得る。a.コンビナトリアルペプチドライブラリーTGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合の推定上のインヒビターであるペプチド分子は、コンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて得られ得る。このようなライブラリーは、当業者によって調製されるか例えば、米国特許第4,528,266号および同第4,359,535号、ならびに特許協力条約公開番号WO92/15679、WO92/15677、WO90/07862、WO90/02809を参照のこと、販売元から購入するか例えば、NewEnglandBiolabsPh.D.TMPhageDisplayPeptideLibraryKitのいずれかであり得る。b.抗体本発明は、スクレロスチンポリペプチドに特異的に結合する抗体、このような抗体を用いるための方法を提供する。本発明はまた、これらの抗体の作製および分析のために使用され得るスクレロスチンポリペプチド免疫原を提供する。この抗体は、TGF-β結合タンパク質であるスクレロスチンポリペプチドの、リガンド特に、骨形態形成タンパク質への結合をブロックまたは障害するのに有用であり得、そしてまた、1種以上の他のリガンドに対するスクレロスチンポリペプチドの結合をブロックまたは障害し得る。タンパク質のTGF-βファミリーの1以上のメンバー1種以上の骨形態形成タンパク質BMPが挙げられるに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する抗体のような分子が、例えば、TGF-βメンバーのTGF結合タンパク質との結合を除去または防止することによってTGF-βファミリーメンバーもしくはBMPの活性化を可能にするか、またはTGF-βファミリーメンバー1種以上のBMPが挙げられるのその各々のレセプターに対する結合を可能にする分子を指すことが、理解されるべきである。本発明はまた、TGF-β結合タンパク質スクレロスチンの1種以上のBMPに対する結合を阻害、防止、または障害し得る抗体またはそのフラグメントを作製および/または同定するのに使用され得る、ペプチド免疫原およびポリペプチド免疫原を提供する。本発明はまた、スクレロスチンホモダイマーの形成を阻害、防止、または障害し得る例えば、統計学的に有意な様式で減少し得る抗体またはそのフラグメントを作製および/または同定するのに使用され得る、ペプチド免疫原およびポリペプチド免疫原を提供する。本発明の抗体は、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増加し、それによって骨ミネラル含有量の低下をもたらす多くの状態を回復させるために有用である。骨ミネラル含有量の低下をもたらす状態としては、例えば、疾患、遺伝的素因、骨の使用不足をもたらす事故例えば、骨折、骨再吸収に影響する治療もしくは骨形成細胞を殺傷する治療、および通常の加齢が挙げられる。宿主動物において抗原性応答を生じる可能性の高いアミノ酸配列を決定するために、スクレロスチン特異的抗体の免疫化および/または分析のために有用なポリペプチドまたはペプチドがまた、当業者に公知の方法および本明細書に記載される方法に従ってTGF-β結合タンパク質の一次、二次、および三次構造を分析することによって選択され得る。例えば、Novotny,Mol.Immunol.28:201-2071991;Berzofsky,Science229:932-401985を参照のこと。モデリングデータおよびX線結晶学的データもまた、TGF-β結合タンパク質のいずれの部分もしくは領域がTGF-β結合タンパク質リガンド例えば、BMPのいずれの部分と相互作用するかを予測および/または同定するために使用され得る。TGF-β結合タンパク質ペプチド免疫原が設計および調製され得、これは、上記相互作用部分もしくは相互作用領域内またはその周りのアミノ酸配列を含む。これらの抗体は、TGF-β結合タンパク質の同じリガンドへの結合をブロックもしくは障害するのに有用であり得、そしてTGF-β結合タンパク質の1種以上の他のリガンドへの結合もまたブロックもしくは障害し得る。本発明によって企図される抗体またはその抗原結合フラグメントとしては、スクレロスチンに特異的に結合し得、そしてTGF-βポリペプチド例えば、BMPのスクレロスチンへの結合を競合的に阻害し得る抗体が挙げられる。例えば、本発明によって企図される抗体は、BMP上のBMPI型レセプター部位への結合もしくはBMPII型レセプター結合部位へのスクレロスチンポリペプチドの結合を競合的に阻害するか、またはBMP上のI型レセプター結合部位およびII型レセプター結合部位の両方へのスクレロスチンの結合を競合的に阻害し得る。理論に束縛されることを望むことなく、抗スクレロスチン抗体がBMPポリペプチドのI型結合部位および/またはII型結合部位のスクレロスチンへの結合を競合的に阻害し、スクレロスチンの拮抗活性をブロックする場合、BMP上のレセプター結合部位は、I型レセプターおよびII型レセプターに結合し、それによって骨鉱化作用を増加させるために利用可能である。TGF-β結合タンパク質例えば、スクレロスチンとTGF-βポリペプチド例えば、BMPとの間の結合相互作用は、一般的に、各リガンド対がホモダイマーを形成する場合に生じる。したがって、スクレロスチンに対して特異的な抗体を、スクレロスチンのBMPへの結合を競合的に阻害することによってスクレロスチンのBMPへの結合をブロック、障害または防止するために使用する代わりにか、またはそれに加えて、スクレロスチン特異的抗体は、スクレロスチンホモダイマー形成をブロックまたは障害するために使用され得る。例示目的で、ヒトNogginの1つのダイマーBMPに高親和性で結合する能力を有するBMPアンタゴニスト;Zimmermanら、上述は、ヒトBMP-7の1つのダイマーとの複合体において単離され、そして多波長異常回折MADGroppeら,Nature420:636-422002によって分析された。本明細書において考察されるように、この研究は、Nogginダイマーが、BMPダイマー上の全レセプター結合部位2つのI型レセプター結合部位および2つのII型レセプター結合部位を効率的にブロックし得ることを明らかにした。BMP-7に接触するNogginのアミノ酸位置は、他のTGF-β結合タンパク質例えば、スクレロスチンSOSTとBMPとの間の相互作用をモデリングし、免疫源として使用されてそのような相互作用をブロックまたは障害する抗体を生成するペプチドの設計を補助することに有用であり得る。本発明の一実施形態において、SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗体結合フラグメントは、骨形態形成タンパク質BMP上に位置するBMPI型レセプター結合部位およびBMPII型レセプター結合部位の少なくとも一方もしくは両方に対するSOSTポリペプチドの結合を競合的に阻害する。これらの抗体が結合するSOST上のエピトープは、SOSTポリペプチド配列番号46のおよそ1~56位のアミノ酸のN末端に位置する連続するアミノ酸配列内を含み得るか、またはそれに含まれ得る。上記ポリペプチドはまた、上記N末端領域をコア領域に連結する短いリンカーペプチド配列例えば、配列番号92ヒトおよび配列番号93ラットにおいて提供されるようなポリペプチドを含み得る。ヒトSOST例えば、配列番号46のより短い代表的なN末端ペプチド配列としては、配列番号47~51が挙げられ、そして代表的ラットSOST例えば、配列番号65ペプチド配列としては、配列番号57~60が挙げられる。SOSTポリペプチドに特異的に結合して、例えば、I型レセプター結合部位およびII型レセプター結合部位の1つ以上に対応するBMPアミノ酸に対する結合をブロックまたは阻害することによって、SOSTポリペプチドのBMPへの結合をブロックするかまたは競合的に阻害する抗体はまた、SOSTのコア領域配列番号46のおよそ57~146位におけるアミノ酸に対応するアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し得る。このコア領域を含むポリペプチドはまた、N末端およびC末端のいずれかもしくは両方において、例えば、このポリペプチドをキャリア分子に結合するのに有用であり得るシステイン残基を含むように伸長するさらなるアミノ酸を含み得る。ヒトSOSTおよびラットSOSTの代表的なコアポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号94および配列番号95で示されるアミノ酸配列を含む。このような抗体はまた、より短いポリペプチド配列に結合し得る。代表的ヒトSOSTコアペプチド配列は、配列番号66~69に提供されており、そして代表的ラットSOSTコア配列は、配列番号70~73に提供されている。別の実施形態において、SOSTポリペプチドに特異的に結合する抗体は、SOSTホモダイマーの形成を障害する阻害、防止またはブロックする、例えば、統計学的に有意な様式で減少させる。SOSTとBMPとの間の相互作用は、SOSTのホモダイマーおよびBMPのホモダイマーに関与し得るので、SOSTのホモダイマー形成を防止または障害する抗体は、それによって骨ミネラル密度を変化させ得る。好ましくは、骨ミネラル密度を増加する。一実施形態において、SOSTのコア領域に結合する抗体は、ホモダイマー形成を妨害する。このような抗体はまた、コア領域例えば、配列番号74、75および98ヒトSOSTおよび配列番号76および99ラットSOSTに対応する連続するアミノ酸配列を含むペプチドに結合し得る。SOSTポリペプチドのC末端領域に配列番号46または65のいずれかのおよそ147~190位アミノ酸に位置するエピトープに結合する抗体もまた、ホモダイマー形成を障害し得る。ヒトSOSTおよびラットSOSTの代表的C末端ポリペプチドは、例えば、それぞれ配列番号96および配列番号97で示されるアミノ酸配列を含む。このような抗体はまた、より短いポリペプチド配列に結合し得る。代表的ヒトSOSTC末端ペプチド配列は、配列番号78~81に提供され、そして代表的ラットSOSTC末端配列は、配列番号86~88に提供される。本明細書に記載される、抗体が特異的に結合し得るSOSTポリペプチドおよびペプチドは、免疫原として有用である。本発明のこれらの免疫原は、動物を免疫化して、BMP上に位置するSOSTのN末端領域に由来するペプチドを含むI型レセプター結合部位もしくはII型レセプター結合部位または両方に特異的に結合する抗体の産生をもたらすか、あるいはSOSTホモダイマー形成を防止し得る、液性免疫応答を惹起するのに使用され得る。免疫原として有用なこのようなSOSTポリペプチドおよびペプチドはまた、抗体を含有するサンプル例えば、精製された抗体、抗血清もしくは細胞培養物上清、またはSOSTに対して特異的な1種以上の抗体を含有し得る他の任意の生物学的サンプルをスクリーニングするための方法に使用され得る。これらのペプチドはまた、生物学的サンプルからSOSTに特異的に結合する抗体を産生する1種以上のB細胞を同定および選択するための方法例えば、プラーク形成アッセイなどに使用され得る。次いで、このB細胞は、当該分野で公知であり本明細書に記載される組み換え分子生物学技術によってクローン化され得、および/または改変され得るSOST特異的抗体をコードするポリヌクレオチドの供給源として、使用され得る。本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルとは、特定の実施形態において、SOSTポリペプチドに対して特異的な、少なくとも1種の抗体を含有するサンプルを指し、生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源から、血液サンプル、生検標本、組織外植体、器官培養物、または他の任意の組織調製物もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。サンプルはさらに、形態学的一体性または物理的状態が、例えば、解剖、分離、可溶化、分取、ホモジェナイズ、生化学的抽出もしくは化学的抽出、粉砕、凍結乾燥、超音波処理、被験体もしくは生物学的供給源に由来するサンプルを処理するための他の任意の手段によって破壊された、組織調製物もしくは細胞調製物を指し得る。被験体もしくは生物学的供給源は、ヒトもしくは非ヒト動物、初代細胞培養物例えば、インビトロで免疫化されたB細胞、または培養に適合された細胞株であり得る。この細胞株としては、染色体に組み込まれている組み換え核酸配列もしくはエピソーム状の組み換え核酸配列を含み得る遺伝的に操作された細胞株、不死化されているか、もしくは不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化しているかもしくは分化可能な細胞株、形質転換細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。SOSTペプチド免疫原はまた、一連のペプチドを合成することによって調製され得る。この一連のペプチドは、全体としてSOSTポリペプチドのポリペプチド配列全体を表現し、各々は、この一連の中の別のペプチドと共通してSOSTアミノ酸配列の一部分を有する。この重複部分は、好ましくは、少なくとも4つのアミノ酸配列、そしてより好ましくは、5、6、7、8、9または10アミノ酸である。各ペプチドは、動物、動物から集められて、いずれの動物がSOSTのTGF-βタンパク質への結合を障害もしくはブロックする抗体を産生しているのかを同定するためのアッセイにおいて試験される血清を免疫化するのに、使用され得る。次いで、抗体は、当該分野で公知の方法および本明細書中で記載された方法に従って、このような同定された免疫化された動物から調製される。TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する抗体は、本明細書において提供される開示を考慮して、容易に調製され得る。特に有用であるのは、配列番号2、6、8、10、12、14、16、46もしくは65のTGF-β結合タンパク質に特異的に結合するが、他のTGF-β結合タンパク質例えば、Dan、Cerberus、SCGFもしくはGremlinには特異的に結合しない、抗TGF-β結合タンパク質抗体である。本発明の文脈の中で、抗体とは、以下を包含すると理解される:モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR移植免疫グロブリン抗体、抗イディオタイプ抗体、およびそれらの抗体フラグメント例えば、Fab、Fd、Fab’およびFab’2、Fv可変領域または相補性決定領域。上記で考察されるように、抗体は、それらが107M-1より大きいかもしくはそれと同等、好ましくは108M-1より大きいかもしくはそれと同等のKaで結合するが他のTGF-β結合タンパク質に結合しない場合か、または106M-1未満かもしくはそれと同等のKaで結合する場合、TGF-β結合タンパク質に対して、または特定のTGF-βファミリーメンバーに対して特異的であると理解される。その同族抗原に対する抗体の親和性はまた、一般に解離定数KDとして表現され、そして抗SOST抗体は、約10-5M未満もしくはそれと同等のKDで結合する場合、より好ましくは約10-6M未満もしくはそれと同等のKDで結合する場合、なおより好ましく約10-7M未満もしくはそれと同等のKDで結合する場合、さらにより好ましくは10-8M未満もしくはそれと同等のKDで結合する場合、TGF-βファミリーメンバーに特異的に結合する。さらに、本発明の抗体は、好ましくは、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合をブロック、障害または阻害する例えば、統計学的に有意に減少する。モノクローナル抗体または結合パートナーの親和性、ならびに結合の阻害は、当業者によって容易に決定され得るScatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660-672,1949を参照のこと。親和性はまた、表面プラズモン共鳴SPR;BIAcore,Biosensor,Piscataway,NJによって決定され得る。表面プラズモン共鳴のため、標的分子は、固相上に固定化されて、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。固定された標的にリガンド結合が生じる場合、局所屈折率が変化し、これはSPR角度の変化をもたらす。この変化は、反射光の強度の変化を検出することによって、リアルタイムでモニタリングされ得る。SPRシグナルの変化率は、分析されて、結合反応の結合および解離相についての見かけ上の速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけ上の平衡定数親和性を与える例えば、Wolffら,CancerRes.53:2560-651993を参照のこと。本発明による抗体は、任意の免疫グロブリンクラス例えば、IgG、IgE、IgM、IgDもしくはIgAに属し得、そしてあるクラスを包含し得る種々のアイソタイプのいずれか例えば、ヒトIgGクラスのIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4であり得る。これは、動物例えば、家禽例えば、ニワトリおよび哺乳動物マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、もしくは他のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、もしくは他の霊長類が挙げられるが、これらに限定されないから得ることができるか、またはそれに由来し得る。抗体は、内在抗体であり得る。当該分野で周知の方法は、TGF-β結合タンパク質例えば、SOSTに対して特異的な抗体、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。抗体はまた、所望の特性を有するように設計された遺伝的に操作された免疫グロブリンIgまたはIgフラグメントとして産生され得る。例えば、説明目的であって限定ではなく、抗体は、第1の哺乳動物種の少なくとも1つの可変V領域ドメインおよび第2の別個の哺乳動物種の少なくとも1つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組み換えIgGを含み得る。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。このようなマウス/ヒトキメラ免疫グロブリンは、マウス抗体に由来する、抗原に対する結合特異性を与える相補性決定領域CDRを、ヒト由来領域フレームワーク領域およびヒト由来定常領域に移植することによってヒト化され得る。これらの分子のフラグメントは、タンパク質分解性消化によってか、または必要に応じてタンパク質分解性消化に続くジスルフィド結合の軽度の還元およびアルキル化によって作製され得る。あるいは、このようなフラグメントはまた、組み換え遺伝学的操作技術によって作製され得る。特定の好ましい抗体は、本明細書において記載されるように、インビトロアッセイにおいてTGF-β結合タンパク質活性を阻害またはブロックする抗体である。TGF-β結合タンパク質への抗体の結合特性は、一般的に、免疫検出法例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイELISA、免疫沈降、免疫ブロッティング、向流免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害アッセイもしくは競合アッセイなどが挙げられるを用いて評価され得る。これらの方法は、当業者によって容易に実施され得る例えば、米国特許第4,376,110号および同第4,486,530号;Harlowら,Antibodies:ALaboratorManual,ColdSpringHarborLaboratory1988を参照のこと。免疫原は、TGF-β結合タンパク質を発現する細胞、精製もしくは部分的に精製されたTGF-β結合ポリペプチド、またはその改変体もしくはフラグメントすなわち、ペプチド、またはTGF-β結合タンパク質に由来するペプチドから構成され得る。このようなペプチドは、より大きなポリペプチドのタンパク質分解切断によって作製され得るか、組み換え分子法によって作製され得るか、または化学的に合成され得る。例えば、TGF-β結合タンパク質をコードする核酸配列が本明細書において提供されて、当業者は、免疫原として使用するためのTGF-β結合タンパク質を慣習的に調製し得る。ペプチドは、本明細書に記載されるような方法および当該分野で公知の方法によって、化学的に合成され得る。あるいは、ペプチドは、TGF-β結合タンパク質のタンパク質分解切断、および当該分野で公知の方法例えば、ポリアクリルアミド電気泳動またはかなり多くの液体クロマトグラフィーまたは他の分離方法によって単離された個々のペプチドによって作製され得る。免疫原として有用なペプチドは、代表的に、本明細書に記載されるようなTGF-β結合タンパク質アミノ酸配列に由来する少なくとも4もしくは5個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を有し得る。そして好ましくは、TGF-β結合タンパク質の少なくとも6、7、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19もしくは20個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列を有し得る。特定の他の好ましいペプチド免疫原は、TGF-β結合タンパク質配列の少なくとも6個のしかし12個以上を超えない連続するアミノ酸を含み、そして他の好ましいペプチド免疫原は、少なくとも21個しかし50個を超えないSOSTポリペプチドの連続するアミノ酸を含む。他の好ましいペプチド免疫原は、TGF-β結合タンパク質配列の、21~25個、26~30個、31~35個、36~40個、41~50個、または任意の自然整数のアミノ酸21個~100個の間21個および100個を含むの連続するアミノ酸、および100個~190個の間の連続するアミノ酸を含む。本明細書に開示されるように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物例えば、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウス、ヒツジ、ヤギ、ヒヒもしくはラットから当業者によって容易に作製され得る。代表的に、TGF-β結合タンパク質または13~20アミノ酸のその固有のペプチドもしくは本明細書において記載されたようなその固有のペプチド好ましくは、グルタルアルデヒドを用いた架橋結合によってキーホールリンペットヘモシニアンに結合したものは、アジュバント例えば、フロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバント、またはRibiAdjuvantSystemCorixaCorporation,Seattle,WAとともに、腹腔内注射、筋肉内注射、眼内注入、皮内注射、または皮下注射することを通じて動物を免疫化するために使用される。例えば、やはりHarlowら,上述を参照のこと。一般的に、第1の注入後、動物は、好ましいスケジュールに従って、特に、抗原、アジュバントあれば、および/または特定の動物種に従って変動し得る1回以上の追加免疫化boosterimmunizationを受ける。この免疫応答は、動物を定期的に採血し、血清を調製して免疫アッセイ例えば、ELISAもしくはオークターロニー拡散アッセイなどで分析し、特定の抗体力価を決定することによってモニタリングされ得る。特に好ましいポリクローナル抗血清は、これらのアッセイ例えば、ELISAの1つにおいて、好ましくはバックグラウンドよりも少なくとも3倍大きい検出可能なシグナルを生じる。一旦動物の力価がタンパク質に対する反応性に関してプラトーに達すると、その動物の毎週の採血によってか、または全採血によってかのいずれかで、より大量の血清を容易に得ることができる。次いで、TGF-β結合タンパク質またはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体が、例えば、プロテインAを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってこのような抗血清から精製され得る。あるいは、TGF-β結合タンパク質もしくはペプチド、または特定の免疫化された動物種のIg定常領域に対して特異的な抗体が適切な固体支持体上に固定されたアフィニティークロマトグラフィーが、実施され得る。本発明で使用するための抗体としては、従来の免疫化、および当該分野で公知である、本明細書に記載されるような細胞融合手順によって調製されるモノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗体は、従来技術を用いて容易に作製され得る例えば、Kohlerら,Nature256:495,1975;Coliganら編,CurrentProtocolsinImmunology,1:2.5.1-2.6.7JohnWileySons1991[Coligan];米国再発行特許発明第32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号、および同第4,411,993号を参照のことこれらは、本明細書において参考として援用される;また、MonoclonalAntibodies,Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses,PlenumPress,Kennett,McKeam,andBechtol編,1980、およびAntibodies:ALaboratoryManual,HarlowおよびLane編,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988を参照のことこれらもまた、本明細書において参考として援用される;PicksleyらProductionofmonoclonalantibodiesagainstproteinsexpressedinE.coli、DNACloning2:ExpressionSystems,第2版,Gloverら編,93頁OxfordUniversityPress1995。抗体フラグメントは、任意の適切な標準的技術例えば、タンパク質分解性消化、または必要に応じてタンパク質分解性消化例えば、パパインもしくはペプシンを用いるに続くジスルフィド結合の弱い還元およびアルキル化を用いて抗体から得ることができる。あるいは、このようなフラグメントはまた、組み換え遺伝学的操作技術によって作製され得る。手短には、一実施形態において、被験体動物例えば、ラットまたはマウスまたはハムスターは、本明細書中で記載されるTGF-β結合タンパク質またはその領域の一部領域内のペプチドを含むで免疫化される。そのタンパク質は、生じる免疫応答を増大させるために、アジュバント例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバントと混合され得る。初期免疫化の一週間後と三週間後との間に、その動物は、別の追加免疫で再免疫化され得、本明細書中に記載されるアッセイを使用してそのタンパク質に対する応答性について試験され得る。一旦その動物が、注射したタンパク質に対する応答性がプラトーに達すると、その動物は屠殺され、多数のB細胞を含む器官例えば、脾臓およびリンパ節は回収される。回収した脾臓および/またはリンパ節細胞懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために、薬物感作される適切な骨髄腫細胞と融合される。適切な骨髄腫株としては、例えば、NS-0、SP20、NS-1ATCC番号TIB18およびP3X63-Ag8.653ATCC番号CRL1580が挙げられる。リンパ系例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、膜融合促進剤例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤と合わされ、次いで、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持するが、非融合骨髄腫細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートされ得る。融合の後、その細胞は、適切な培地例えば、RPMI1640またはDMEMダルベッコ改変イーグル培地JRHBiosciences、Lenexa、Kansasおよびさらなる成分例えば、ウシ胎仔血清FBS、すなわち、Hyclone、Logan、Utah由来またはJRHBiosciences由来を含有する培養プレートに配置され得る。さらに、その培地は、融合脾臓細胞および骨髄腫細胞の増殖を選択的に可能にする試薬例えば、HATヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンSigmaChemicalCo.、St.Louis、Missouriを含有すべきである。約7日後、生じた融合細胞またはハイブリドーマは、TGF-β結合タンパク質使用した抗原に依存してと反応性である抗体の存在を決定するためにスクリーニングされ得、そして、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合をブロックするか、損なうか、または阻害する。スクレロスチンまたはその改変体に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。本発明のタンパク質に対して応答性である抗体の存在を決定するために広範な種々のアッセイが利用され得、それらとしては、例えば、対向免疫電気泳動法、放射性免疫アッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベントアッセイELISA、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロット、免疫沈降法、阻害アッセイまたは競合アッセイおよびサンドイッチアッセイ米国特許第4,376,110号および同第4,486,530号を参照のこと;また、Antibodies:ALaboratoryManual、HarlowおよびLane編、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1988を参照のことが挙げられる。ハイブリドーマは、例えば、限界希釈クローニングによって、または軟質寒天プラーク単離によりクローニングされ、再アッセイされる。従って、所望のタンパク質に対して応答性である抗体を産生するハイブリドーマが単離され得る。ハイブリドーマ培養物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体を産生するための代替的な方法は、ハイブリドーマ細胞を、同系マウス例えば、モノクローナル抗体を含む腹水の形成を促進するために処置された例えば、プリスタンで刺激されたマウスの腹膜腔に注射する工程である。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術によって単離され、精製され得る。このような単離技術としては、プロテインAセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる例えば、Coligan、2.7.1~2.7.12ページおよび2.9.1~2.9.3ページ;Bainesら、MethodsinMolecularBiologyTheHumanaPress,Inc.1992、10巻、79~104ページのPurificationofImmunoglobulinGIgGを参照のこと。モノクローナル抗体は、その抗体の特定の性質例えば、重鎖アイソタイプまたは軽鎖アイソタイプ、結合特異性などに基づいて選択される適切なリガンドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体上に固定された適切なリガンドの例としては、プロテインA、プロテインG、抗定常領域軽鎖または重鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびTGF-β結合タンパク質またはこれらのフラグメントもしくは改変体が挙げられる。さらに、本発明の抗TGF-β結合タンパク質抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通する任意の数の技術によって作製され得る。このような方法としては、ヒト末梢血細胞例えば、Bリンパ球を含むのエプスタインバーウイルスEBV形質転換、ヒトB細胞のインビトロ免疫化、挿入したヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化したトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンV領域ファージライブラリーからの単離、または当該分野で公知の他の手順および本明細書中の開示に基づいた他の手順が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原性誘発に応答した特定のヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから入手され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Greenら、NatureGenet.7:13、1994;Lonbergら、Nature368:856、1994;Taylorら、Int.Immun.6:579、1994;.S.特許第5,877,397号;Bruggemannら、1997Curr.Opin.Biotechnol.8:455~58;Jakobovitsら、1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:525~35に記載される。この技術において、ヒト重鎖座およびヒト軽鎖座の要素は、内因生の重鎖座および軽鎖座の標的化破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの株に導入されるBruggemannら、Curr.Opin.Biotechnol.8:455~581997も参照のこと。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、酵母人工染色体上のミニ遺伝子構築物または導入遺伝子座translociであり得、この酵母人工染色体は、マウスリンパ球様組織のB細胞特異的DNA再構成および超変異を受ける。ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスを免疫化することによって獲得され得、次いで、そのトランスジェニックマウスは、抗原に特異的なヒト抗体を産生し得る。免疫化トランスジェニックマウスのリンパ球細胞は、本明細書中に記載される方法に従って、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために使用され得る。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫化動物の血液から入手され得る。ヒトTGF-β結合タンパク質特異的モノクローナル抗体を作製するための別の方法としては、EBV形質転換によってヒト末梢血細胞を不死化する工程が挙げられる。例えば、米国特許第4,464,456号を参照のこと。TGF-β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、このような不死化B細胞株またはリンパ芽球腫細胞株は、本明細書中に提供される免疫検出方法例えば、ELISAによって同定され得、次いで、標準的クローニング技術によって単離され得る。抗TGF-β結合タンパク質抗体を産生するリンパ芽球腫細胞株の安定性は、当該分野で公知の方法に従ってマウス-ヒトハイブリッド細胞株を産生するために、その形質転換細胞株を、マウス骨髄腫と融合することによって改善され得る例えば、Glaskyら、Hybridoma8:377~891989を参照のこと。ヒトモノクローナル抗体を作製するためのなお別の方法は、インビトロ免疫化であり、これは、ヒト脾臓B細胞を抗原で刺激し、その後、刺激したB細胞をヘテロハイブリッド融合パートナーと融合する工程を包含する。例えば、Boernerら、1991J.Immunol.147:86~95を参照のこと。特定の実施形態において、抗SOST抗体を産生するB細胞が選択され、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、当該分野で公知の分子生物学的技術WO92/02551;米国特許第5,627,052号;Babcookら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843~481996および本明細書中に記載される分子生物学的技術に従ってB細胞からクローニングされる。好ましくは、免疫化した動物由来のB細胞は、SOSTに特異的に結合する抗体を産生する細胞を選択することにより、脾臓、リンパ節または末梢血サンプルから単離される。B細胞はまた、ヒト、例えば、末梢血サンプルから単離され得る。所望の特異性を有する抗体を産生する単一のB細胞を検出するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、プラーク形成、蛍光標示式細胞分取、インビトロ刺激に続く特異的抗体の検出などによる。B細胞を産生する特異的抗体の選択のための方法としては、例えば、SOSTまたはそのペプチドフラグメントを含む軟質寒天中のB細胞の単一細胞懸濁液を調製する工程が挙げられる。B細胞によって産生される特異的抗体の抗原への結合は、複合体の形成を生じ、その複合体は、免疫沈降物として可視的であり得る。特異的抗体を産生するB細胞が選択された後、特異的な抗体遺伝子は、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法に従ってDNAまたはmRNAを単離および増殖する工程によりクローニングされ得る。特定の使用に関して、抗TGF-β結合タンパク質抗体のフラグメントが所望され得る。抗体フラグメント、Fab’2、Fab、Fab’、Fv、Fc、Fdは、抗体全体の抗原結合部位を保持し、従って、同一のエピトープに結合する。抗体に由来するこれらの抗原結合フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解例えば、従来の方法に従った抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化により獲得され得る。例証として、抗体フラグメントは、Fab’2と示される5Sフラグメントを提供するペプシンを用いた抗体の酵素による切断によって産生され得る。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断されて、3.5SFab’一価フラグメントを作製し得る。必要に応じて、この切断反応は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロッキング基を使用して行われ得る。代替物として、パパインを使用する酵素による切断は、二つの一価FabフラグメントおよびFcフラグメントを直接作製する。これらの方法は、例えば、Goldenberg、米国特許第4,331,647号、Nisonoffら、Arch.Biochem.Biophys.89:230、1960;Porter、Biochem.J.73:119、1959;Edelmanら、MethodsinEnzymology1:422AcademicPress1967;およびColiganら、2.8.1~2.8.10頁および2.10~2.10.4頁に記載される。そのフラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断するための他の方法例えば、重鎖を分離して一価軽重鎖フラグメントFdを形成する工程、さらにフラグメントを切断する工程または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝的技術が使用され得る。抗体フラグメントはまた、複合体を形成するために特異的抗原に結合する抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝的に操作されたタンパク質のいずれかであり得る。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなるFvフラグメント、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、ペプチドリンカーによって結合された組換え単鎖ポリペプチド分子scFvタンパク質、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。本発明の抗体は、好ましくは少なくとも一つの可変領域ドメインを含む。この可変領域ドメインは、任意の大きさであり得るかまたはアミノ酸組成物であり得、概して抗原結合を担い、一つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはそのフレーム内である、少なくとも一つの超可変アミノ酸配列を含む。一般論として、可変V領域ドメインは、免疫グロブリン重鎖VH可変ドメインおよび/または免疫グロブリン軽鎖VL可変ドメインの任意の適切な配置であり得る。従って、例えば、V領域ドメインは、単量体であり得、VHドメインまたはVLドメインであり得、それらは、受容可能な親和性で独立に抗原と結合し得る。あるいは、V領域ドメインは、二量体であり得、VH-VH二量体、VH-VL二量体またはVL-VL二量体を含み得る。好ましくは、V領域二量体は、非共有結合的に結合した少なくとも一つのVH鎖および少なくとも一つのVL鎖以下、Fvと呼ぶを含む。所望の場合、この鎖は、例えば、二つの可変ドメイン間のジスルフィド結合によって、またはリンカー例えば、ペプチドリンカーを介してのいずれかで、直接共有結合されて、単鎖FvscFvを形成し得る。可変領域ドメインは、任意の天然に存在する可変ドメインであり得るか、またはその操作されたバージョンであり得る。操作されたバージョンとは、組換えDNA操作技術を用いて作製された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたバージョンとしては、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列中またはそれらのアミノ酸配列に対する挿入、欠失または変化によって、特定の抗体可変領域から作製されたバージョンが挙げられる。特定の例としては、少なくとも一つのCDRを含み、必要に応じて第一の抗体由来の一つ以上のフレームワークアミノ酸および第二の抗体の可変領域ドメインの残りを含む、操作された可変領域ドメインが挙げられる。この可変領域ドメインは、C末端アミノ酸で、少なくとも一つの他の抗体ドメインまたはそのフラグメントに共有結合され得る。従って、例えば、可変領域ドメイン中に存在するVHドメインは、免疫グロブリンCH1ドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。同様に、VLドメインは、CKドメインまたはそのフラグメントに連結され得る。このような方法で、例えば、抗体は、Fabフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、それぞれそのC末端でCH1ドメインおよびCKドメインに共有結合した、関連するVHドメインおよびVLドメインを含む。CH1ドメインは、例えば、Fab’フラグメントに見出されるヒンジ領域もしくはヒンジ領域ドメインの一部を提供するために、またはさらなるドメイン例えば、抗体CH2ドメインおよび抗体CH3ドメインを提供するために、さらなるアミノ酸で伸長され得る。抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域CDRを含むペプチドである。CDRペプチド最少認識単位は、目的の抗体のCDRをコードするポリペプチドを構築することによって獲得され得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、テンプレートとして抗体産生細胞のmRNAを使用する、可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される例えば、Larrickら、Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106、1991;MonoclonalAntibodies:Production,EngineeringandClinicalApplication、Ritterら編、166ページCambridgeUniversityPress1995中のCourtenay-Luck、GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies:およびMonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications、Birchら編、137ページWiley-Liss,Inc.1995中のWardら、GeneticManipulationandExpressionofAntibodiesを参照のこと。あるいは、この抗体は、抗体可変領域および/または定常領域をコードするDNAの操作および再発現を含む組換えDNA技術の使用により獲得される、組換え抗体または操作された抗体であり得る。このようなDNAは公知であり、そして/またはDNAライブラリー例えば、ファージ-抗体ライブラリーChiswellおよびMcCafferty、Tibtech.10:80~841992を参照のことが挙げられるから容易に利用可能であるか、あるいは所望の場合合成され得る。標準的な分子生物学的手順および/または化学的手順は、例えば、システイン残基を作製するためにコドンを導入するため、または所望される場合、他のアミノ酸もしくはドメインを改変、付加もしくは欠失させるために、DNAを配列決定およびDNAを操作するのに使用され得る。TGF-β結合タンパク質に特異的であり、ヒト化抗体を含むキメラ抗体はまた、本発明に従って作製され得る。キメラ抗体は、第一の哺乳動物種由来の少なくとも一つの定常領域ドメイン、および第二の別個の哺乳動物種由来の少なくとも一つの可変領域ドメインを有する例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851~551984を参照のこと。好ましい実施形態において、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体に由来する少なくとも一つの可変領域ドメイン例えば、マウス、ラットまたはハムスターのモノクローナル抗体に由来する可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも一つのヒト定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターにクローニングすることによって構築され得る例えば、Shinら、MethodsEnzymol.178:459~761989;Wallsら、NucleicAcidsRes.21:2921~291993を参照のこと。例として、マウスモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに挿入され得る。別のベクターでは、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列が、ヒトIgG定常領域例えば、ヒトIgG1定常領域をコードする配列を有するフレーム内にクローニングされ得る。選択された特定のヒト定常領域は、特定の抗体に望ましいエフェクター機能例えば、特定のFcレセプターに対する相補的な固定、結合などに依存し得る。好ましくは、構築されたベクターは、キメラ抗体の安定な発現のために真核細胞にトランスフェクトされる。キメラ抗体を作製するための当該分野で公知の別の方法は、相同組換え例えば、米国特許第5,482,856号である。非ヒト/ヒトキメラ抗体は、ヒト化抗体を作製するためにさらに遺伝的に操作され得る。このようなヒト化抗体としては、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリン、少なくとも一つのヒト可変フレームワーク領域および少なくとも一つのヒト免疫グロブリン定常領域に由来する複数のCDRが挙げられ得る。ヒト化抗体を設計するための有用な方法としては、例えば、例証として、限定されずに、キメラ抗体の非ヒトフレームワーク領域に最も相同であるヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられ得る。理論に束縛されることは望まないが、このような方法は、ヒト化抗体がTGF-β結合タンパク質に対する特定の結合親和性を保持する可能性を増加し得、この結合親和性は、いくつかの好ましい実施形態においてTGF-β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに対して実質的に同じ親和性であり得、特定の他の好ましい実施形態において、TGF-β結合タンパク質に対してより大きい親和性であり得る。例えば、Jonesら、1986Nature321:522~25;Riechmannら、1988Nature332:323~27を参照のこと。従って、このようなヒト化抗体の設計は、例えば、コンピュータモデリングによってCDRループ構造および非ヒト可変領域の構造上の決定因子を決定し、次いで、CDRループおよび決定因子と公知のヒトCDRループ構造および決定因子とを比較する工程を包含し得る。例えば、Padlanら、1995FASEB9:133~9;Chothiaら、1989Nature342:377~383を参照のこと。コンピュータモデリングはまた、配列相同性によって選択されたヒト構造テンプレートと非ヒト可変領域とを比較するために使用され得る。例えば、Bajorathら、1995Ther.Immunol.2:95~103;EP-0578515-A3を参照のこと。非ヒトCDRのヒト化が、結合親和性の減少を生じる場合、コンピュータモデリングは、部分的に完全にまたは最適を上回って大きくすなわち、非ヒト化抗体のレベルより高いレベルまで増加する親和性を回復するための部位特異的変異誘発技術または他の変異誘発技術によって変化され得る特定のアミノ酸残基の同定を補助し得る。当業者は、これらの技術に精通していて、このような設計方法に対する多数の変化および改変を容易に理解する。ヒト化抗体を調製するためのこのような一つの方法は、ベニヤリングveneeringと称される。本明細書中で使用される場合、用語ベニヤされたFRveneeredFRおよび組換え的にベニヤされたFRは、全ての天然のFRポリペプチドフォールディング構造を実質的に保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するための、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のV領域由来のFR残基のヒトFR残基での選択的置換をいう。ベニヤリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特性が、抗原結合表面内の重鎖および軽鎖CDRセットの構造および相対的な配置により主に決定されるという理解に基づいている。Daviesら、Ann.Rev.Biochem.59:439~73、1990。従って、抗原結合特異性は、CDR構造、その互いとの相互作用、およびそのV領域ドメインの残りとの相互作用が慎重に維持される場合のみヒト化抗体に保存され得る。弱い免疫原性であるか、または実質的に非免疫原性のベニヤされた表面のいずれかを有するハイブリッド分子を提供するために、ベニヤリング技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外部例えば、溶媒到達可能なFR残基は、ヒト残基で選択的に置換される。ベニヤリングのプロセスは、Kabatのデータベースおよび他のアクセス可能な米国のデータベースおよび外国のデータベース核酸およびタンパク質の両方に対して最新のものにされたSequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第4版U.S.Dept.ofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice,1987におけるKabatらによって編集されたヒト抗体可変ドメインに対する利用可能な配列データの使用を用いる。V領域アミノ酸の溶媒到達性は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメントについての公知の三次元構造から推測され得る。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのFRは、上で同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するFR配列と比較される。次いで、最も相同なヒトV領域は、対応するマウスアミノ酸と残基毎に比較される。ヒトのFRとは異なるマウスのFR中の残基は、当該分野で周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基の交換は、少なくとも部分的に露出される溶媒到達可能である部分でのみ行なわれ、V領域ドメインの三次構造に顕著な効果を有し得るアミノ酸残基例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸の置換に注意が払われる。従って、この様式において、生じたベニヤされた抗原結合部位は、げっ歯類CDR残基、実質的にCDRに隣接する残基、隠されたかまたはほとんど隠された溶媒到達不可能であるものとして同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な例えば、静電気的および疎水的な接触に関与すると考えられる残基、およびCDRループの標準的な三次構造に影響すると考えられるFRの保存された構造上の領域由来の残基を保持するように設計される。これらの設計基準は次いで、抗原結合部位の重鎖と軽鎖の両方のCDRを、げっ歯類抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る、ヒトに現れるFR内に合わせる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用される。TGF-β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに特異的に結合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイによるものである。例えば、Winterら、1994Annu.Rev.Immunol.12:433~55;Burtonら、1994Adv.Immunol.57:191~280を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、TGF-β結合タンパク質またはその改変体もしくはそのフラグメントに特異的に結合するIgフラグメントFab、Fv、sFvまたはそれらの多量体を選択するためにスクリーニングされ得るファージベクターにおいて作製され得る。例えば、米国特許第5,223,409号;WilliamD.Huseら、GenerationofaLargeCombinatorialLibraryoftheImmunoglobulinRepertoireinPhageLambda、Science246:1275~1281、1989年12月を参照のこと;また、L.Sastryら、CloningoftheImmunologicalRepertoireinEscherichiacoliforGenerationofMonoclonalCatalyticAntibodies:ConstructionofaHeavyChainVariableRegion-SpecificcDNALibrary、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5728~5732、1989年8月を参照のこと;また、MichelleAlting-Meesら、MonoclonalAntibodyExpressionLibraries:ARapidAlternativetoHybridomas、StrategiesinMolecularBiology3:1~9、1990年1月;Kangら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4363~66;Hoogenboomら、1992、J.Molec.Biol.227:381~388;Schlebuschら、1997、Hybridoma16:47~52およびこれらに引用される参考文献を参照のこと。組換え技術を介した抗体の産生を可能にする市販の系が、StratageneLaJolla、Californiaから入手可能である。手短には、mRNAはB細胞集団から単離され、λImmunoZapHベクターおよびλImmunoZapLベクター内に重鎖および軽鎖の免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを作製するために使用される。その後、陽性のプラークは、E.coli由来のモノクローナル抗体フラグメントの高レベルの発現を可能にする非溶解性のプラスミドに変換され得る。あるいは、Ig可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むライブラリーは、糸状バクテリオファージ例えば、M13またはその改変体のゲノム内に、ファージ被覆タンパク質をコードする配列とインフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、被覆タンパク質と軽鎖可変領域ドメインおよび/または重鎖可変領域ドメインとの融合物であり得る。特定の実施形態に従って、免疫グロブリンFabフラグメントはまた、ファージ粒子上に提示され得る例えば、米国特許第5,698,426号を参照のこと。これらのベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、またはFabフラグメントまたは抗体を形成するように同時発現され得るHuseら、前出を参考のこと;またSastryら、前出を参考のこと。同様に、抗体の部分またはフラグメントFabフラグメントおよびFvフラグメントはまた、従来の酵素消化技術または組換えDNA技術を使用して、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むことによって、構築され得る。一実施形態において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ由来の可変領域をコードする遺伝子が、その可変領域についてのヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、または販売源から購入され得る。StratageneLaJolla,Californiaは、マウス可変領域についてのプライマーおよびヒト可変領域についてのプライマーとりわけ、VHa領域についてのプライマー、VHb領域についてのプライマー、VHc領域についてのプライマー、VHd領域についてのプライマー、CH1領域についてのプライマー、VL領域についてのプライマー、およびCL領域についてのプライマーを販売している。これらのプライマーは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を増幅するために使用され得る。これらの領域は、その後、ベクターそれぞれ、例えば、ImmunoZAPTMHまたはImmunoZAPTMLStratagene中に挿入され得る。その後、これらのベクターは、発現用のE.coliベースの系、酵母ベースの系、または哺乳動物ベースの系中に導入され得る。これらの技術を利用して、VHドメインとVLドメインとの融合物を含む大量の単鎖タンパク質が、産生され得るBirdら、Science242:423~426,1988参照。さらに、そのような技術は、抗体の結合特性を改変することなく、マウス抗体をヒト抗体へと変化させるために利用され得る。本発明の特定の実施形態において、コンビナトリアルファージライブラリーもまた、非ヒト可変領域のヒト化のために利用され得る。例えば、Rosokら,1996J.Biol.Chem.271:22611~18;Raderら,1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:8910~15を参照のこと。ファージライブラリーは、当該分野で公知の免疫検出方法および本明細書中に記載される免疫検出方法によって目的のIg可変領域を選択するために、スクリーニングされ得る。そのように選択されたファージ中にある挿入された免疫グロブリン遺伝子のDNA配列は、標準的技術によって決定され得る。Sambrookら,2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPressを参照のこと。その後、選択されたIgコード配列が、Igフラグメントの発現のために別の適切なベクター中にクローニングされ得るか、または、必要に応じて、免疫グロブリン鎖全体の発現のために、Ig定常領域を含むベクター中にクローニングされ得る。他の特定の実施形態において、本発明は、多量体抗体フラグメントであるSOST特異的抗体を企図する。有用な方法論が、一般的には、例えば、Haydenら,1997,CurrOpin.Immunol.9:201~12;Colomaら,1997,Nat.Biotechnol.15:159~63において記載される。例えば、多量体抗体フラグメントは、ミニ抗体米国特許第5,910,573号または二重特異的抗体diabodyHolligerら、1997,CancerImmunol.Immunother.45:128~130を形成するためにファージ技術によって作製され得る。本発明の特定の実施形態において、SOSTに特異的な抗体は、細胞内タンパク質として発現される抗体であり得る。このような細胞内抗体はまた、細胞内発現抗体intrabodyとも呼ばれる。このよういな細胞内抗体は、Fabフラグメントを含み得るか、または好ましくは、scFvフラグメントを含み得る例えば、Lecerfら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:4764~492001を参照のこと。CDR領域に隣接するフレームワーク領域は、細胞内還元環境における細胞内発現抗体の発現レベルおよび可溶性を改善するように改変され得る例えば、Wornら,J.Biol.Chem.275:2795~8032000を参照のこと。細胞内発現抗体は、例えば、細胞内発現抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを構築することによって、特定の細胞位置または細胞小器官に指向され得る。このポリヌクレオチド配列は、細胞内において特定の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に融合され得る例えば、Graus-Portaら、Mol.CellBiol.15:1182~911995;Lenerら、Eur.J.Biochem.267:1196~2052000を参照のこと。細胞内発現抗体は、当業者にとって利用可能な種々の技術遺伝子治療ベクターを介すること、もしくは脂質混合物例えば、ImgenexCorporation,SanDiego,CAにより製造されるProvectinTMを介すること、または光化学的内部移行photochemicalinternalization法に従うことを包含するによって、細胞中に導入され得る。TGF-β結合タンパク質に特異的な免疫グロブリン分子中にアミノ酸変異を導入することは、TGF-β結合タンパク質に対する特異性もしくは親和性を増加するため、またはエフェクター機能を改変するために、有用であり得る。TGF-β結合タンパク質に対してより高い親和性を有する免疫グロブリンが、特定の残基の部位特異的変異誘発によって作製され得る。コンピューター支援型3次元分子モデリングcomputerassistedthree-dimensionalmolecularmodelingが、TGF-β結合タンパク質に対する親和性を改善するために、変化されるべきアミノ酸残基を同定するために使用され得る。例えば、Mountainら,1992,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.10:1~142を参照のこと。あるいは、CDRのコンビナトリアルライブラリーが、M13ファージにおいて作製され得、そして改善された親和性を有する免疫グロブリンフラグメントについてスクリーニングされ得る。例えば、Glaserら,1992,J.Immunol.149:3903~3913;Barbasら、1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3809~13;米国特許第5,792,456号を参照のこと。エフェクター機能もまた、部位特異的変異誘発によって変化され得る。例えば、Duncanら、1988,Nature332:563~64;Morganら、1995,Immunology86:319~24;Eghtedarzedeh-Kondriら、1997、Biotechniques23:830~34を参照のこと。例えば、免疫グロブリンのFc部分にあるグリコシル化部位の変異は、その免疫グロブリンが体を結合する能力を変化させ得る。例えば、Wrightら、1997、TrendsBiotechnol.15:26~32を参照のこと。その定常領域ドメインにおける他の変異は、その免疫グロブリンが補体を結合する能力を変化させ得るか、または抗体依存性細胞傷害をもたらし得る。例えば、Duncanら、1988Nature332:563~64;Morganら、1995、Immunology86:319~24;Senselら、1997Mol.Immunol.34:1019~29を参照のこと。特定の実施形態に従って、本明細書中に記載されるIg分子のいずれかの、非ヒト重鎖可変領域、非ヒト軽鎖可変領域、ヒト重鎖可変領域、ヒト軽鎖可変領域、ヒト化重鎖可変領域、またはヒト化軽鎖可変領域が、単鎖FvscFvポリペプチドフラグメント単鎖抗体として構築され得る。例えば、Birdら、1988、Science242:423~426;Hustonら、1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879~5883を参照のこと。多官能性scFv融合タンパク質は、scFvポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、種々の公知のエフェクタータンパク質のいずれかをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列とインフレームの状態で連結することによって、作製され得る。これらの方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、EP-B1-0318554、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、および米国特許第5,476,786号に開示されている。例として、エフェクタータンパク質は、免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。例えば、Hollenbaughら、1995、J.Immunol.Methods188:1~7を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は、酵素である。非限定的な例として、このような酵素は、治療目的での生物学的活性を提供し得るか例えば、Siemersら、1997Bioconjug.Chem.8:510-19を参照のこと、または診断的使用のための検出可能な活性例えば、任意の多数の周知の基質の、検出可能な産物への、西洋ワサビペルオキシダーゼにより触媒される転換を提供し得る。scFv融合タンパク質のなお他の例としては、Ig-毒素融合物、または免疫毒素が挙げられ、これらにおいて、scFvポリペプチドが毒素に連結されている。本明細書中に記載されるscFvまたは任意の抗体フラグメントは、特定の実施形態において、融合タンパク質と抗原例えば、TGF-β結合タンパク質との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドドメインまたはポリペプチドドメインに、融合され得る。例えば、その融合ポリペプチドドメインは、scFv融合タンパク質とTGF-β結合タンパク質との結合を、当業者が精通している種々の技術のうちのいずれかによって検出するための、アフィニティタグポリペプチドであり得る。ペプチドタグの例としては、アビジン、ストレプトアビジン、またはHis例えば、ポリヒスチジンが挙げられる。検出技術としてはまた、例えば、ビオチン配列もしくはビオチン模倣物配列例えば、Luoら、1998、J.Biotechnol.65:225およびその中で引用される参考文献を参照のことに対するアビジン融合タンパク質もしくはストレプトアビジン融合タンパク質の結合、検出可能な部分例えば、標識化部分による融合タンパク質の共有結合改変、融合タンパク質と特定の標識化レポーター分子との非共有結合、酵素活性を有する部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素改変、または固相支持体上における融合タンパク質の固定共有結合固定もしくは非共有結合固定が挙げられ得る。scFv融合タンパク質の構築のための他の有用な親和性ポリペプチドとしては、例えば、WO89/03422、米国特許第5,489,528号、同第5,672,691号、WO93/24631、米国特許第5,168,049号、同第5,272,254号に開示されるような、ストレプトアビジン融合タンパク質;アビジン融合タンパク質例えば、EP511,747参照;酵素例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ;およびStaphylococcusaureusプロテインAポリペプチドが挙げられ得る。本明細書中に記載されるような、TGF-β結合タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知の発現ベクターを使用して、核酸切除、連結、形質転換、およびトランスフェクションのための種々の周知の手順のうちのいずれかに従って、伸長され得そして発現され得る。従って、特定の実施形態において、抗体フラグメントの発現は、原核生物宿主例えば、Escherichiacoliにおいて好ましいものであり得る例えば、Pluckthunら、1989、MethodsEnzymol.178:497~515を参照のこと。他の特定の実施形態において、抗体もしくはそのフラグメントの発現は、真核生物宿主細胞酵母例えば、Saccharomycescerevisiae、Schizosaccharomycespombe、およびPichiapastoris、動物細胞哺乳動物細胞を含む、または植物細胞を含むにおいて好ましいものであり得る。適切な動物細胞の例としては、骨髄腫細胞例えば、マウスNSO株、COS細胞、CHO細胞、またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例としては、タバコ細胞、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、およびイネ細胞が挙げられる。一旦、適切な抗体が得られたならば、それらの抗体は、当業者にとって周知である多くの技術Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowおよびLane編,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988参照によって、単離または精製され得る。適切な技術としては、ペプチドアフィニティカラムもしくはタンパク質アフィニティカラムカラムマトリックスに結合した抗定常領域抗体の使用を含む、HPLCもしくはRP-HPLC、プロテインAカラムもしくはプロテインGカラムにおける精製、またはこれらの技術の何らかの組合せが、挙げられる。c.変異体TGF-β結合タンパク質本明細書中に記載される下記実施例例えば、実施例8および実施例9に記載されるように、ネイティブTGF-β結合タンパク質が特定のTGF-βファミリーメンバーの活性をブロックする能力と競合するTGF-β結合タンパク質の改変バージョンは、骨密度の増加をもたらす。従って、TGF-βファミリーメンバーに結合するがTGF-βファミリーメンバーの機能を阻害しない、TGF-β結合タンパク質の変異体は、この基準を満たす。上記変異体バージョンは、TGF-β結合タンパク質の内因性阻害機能と有効に競合する。d.タンパク質の産生本明細書中に記載されるポリペプチドとしては、TGF結合タンパク質であるスクレロスチンおよびその改変体、ならびにスクレロスチンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが、挙げられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上記遺伝子と実質的に類似する遺伝子誘導体、および単離された核酸分子、ならびに適切な場合には上記遺伝子およびその誘導体によってコードされるタンパク質ペプチドおよびポリペプチドを含むが、挙げられる。本明細書中において使用される場合、ヌクレオチド配列は、aそのヌクレオチド配列が、上記遺伝子および核酸分子のコード領域に由来し、かつ例えば、上記の配列の部分もしくは対立遺伝子改変体を含むか、あるいはTGF-βファミリーのメンバーに対するTGF-β結合タンパク質の結合を阻害する分子をコードする場合;bそのヌクレオチド配列が、中程度のストリンジェンシー下、高ストリンジェンシー下、もしくは非常に高いストリンジェンシー下Sambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,1989参照にて本発明のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能である場合;および/あるいはc上記DNA配列が、aもしくはbにおいて規定されるDNA配列に対して遺伝コードの結果として縮重している場合には、実質的に類似すると見なされる。さらに、本明細書中に開示される核酸分子は、相補配列および非相補配列の両方を、これらの配列が他の点では本明細書中に示される基準を満たす限りにおいては、包含する。本発明の文脈において、高ストリンジェンシーとは、標準的なハイブリダイゼーション条件例えば、5×SSPE、0.5SDS65°C、または等価物を意味する。本明細書中に記載される核酸分子によってコードされるタンパク質の構造は、例えば、P/CGeneorIntelligeneticsSuiteIntelligenetics,MountainView,Californiaの疎水性プロット機能を使用して、またはKyteおよびDoolittleJ.Mol.Biol.157:105~132,1982により記載される方法に従って、一次翻訳産物から予測され得る。本発明のタンパク質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形態でか、または中性形態で、調製され得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加が、アミノ酸配列または核酸配列に対してなされ得る。それらの置換、欠失、または付加の正味の効果は、変異体タンパク質もしくは野生型タンパク質の生物学的活性を保持すること、またはさらに増強もしくは減少することである。さらに、例えば、遺伝コードにおける縮重に起因して、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変動が存在し得る。本明細書中に開示されるタンパク質の他の誘導体は、上記タンパク質と、他のタンパク質もしくはポリペプチドとの結合体を包含する。これは、例えば、タンパク質の精製または同定を促進するために付加され得るN末端融合タンパク質もしくはC末端融合タンパク質の合成によって、達成され得る米国特許第4,851,341号参照、また、Hoppら、Bio/Technology6:1204,1988も参照。あるいは、融合タンパク質例えば、Flag登録商標/TGF-β結合タンパク質が、上記タンパク質の同定、発現、および分析を補助するために、構築され得る。本発明のタンパク質は、本明細書中に記載される広汎な種類の技術を使用して、構築され得る。さらに、ネイティブ配列フラグメントに対する連結を可能にする制限部位が隣接する変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、変異が、特定の遺伝子座において導入され得る。連結の後、生じる再構築された配列は、望ましいアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的またはセグメント特異的変異誘発技術が、必要とされる置換、欠失、または挿入に従って変化された特定のコドンを有する改変遺伝子もしくは改変核酸分子を提供するために、使用され得る。上記に示される改変を生成する例示的方法は、WalderらGene42:133,1986;BauerらGene37:73,1985;CraikBioTechniques,January1985,12~19;SmithらGeneticEngineering:PrinciplesandMethods,PlenumPress,1981;およびSambrookら上記によって開示される。タンパク質の欠失誘導体または短縮誘導体例えば、可溶性細胞外タンパク質はまた、望ましい欠失に近接する簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって、構築され得る。制限の後、突出が埋められ得、そしてDNAが再連結され得る。上記に示される改変を行う例示的方法は、SambrookらMolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989によって開示される。本発明の核酸分子においてなされる変異は、好ましくは、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、その変異は、好ましくは、転写された場合にそのmRNAの翻訳に有害な影響を与える二次mRNA構造例えば、ループまたはヘアピンを生成するようにハイブリダイズし得る、相補的領域を生成しない。変異部位は、予め決定され得るが、その変異自体の性質が予め決定される必要はない。例えば、所定部位における変異の最適な特徴について選択するために、ランダムな変異誘発が、標的コドンにおいて行われ得、発現された変異体が、生物学的活性の獲得もしくは喪失もしくは保持についてスクリーニングされ得る。あるいは、変異は、ネイティブ配列フラグメントに対する連結を可能にする制限部位が隣接する変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座にて導入され得る。連結の後、生じる再構築された配列は、望ましいアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。本発明のタンパク質をコードする核酸分子はまた、PCR変異誘発、化学的変異誘発DrinkwaterおよびKlinedinst,PNAS83:3402~3406,1986などの技術を使用して、強制的ヌクレオチド誤組み込み例えば、LiaoおよびWise,Gene88:107~111,1990によって、またはランダムに変異誘発されたオリゴヌクレオチドの使用Horwitzら、Genome3:112~117,1989によって、構築され得る。本発明はまた、上記遺伝子を発現可能なベクターを含む宿主細胞を培養することによる、上記の遺伝子および核酸分子の操作および発現を提供する。そのようなベクターまたはベクター構築物は、望ましいタンパク質をコードする合成核酸分子またはcDNA由来核酸分子のいずれかを含み、これらは、適切な転写調節エレメントもしくは翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている。適切な調節エレメントは、種々の供給源細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳動物遺伝子、昆虫遺伝子、または植物遺伝子を含むに由来し得る。適切な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサー、またはRNAポリメラーゼ結合配列、転写ターミネーター、およびリボソーム結合配列翻訳開始シグナルを含むが、挙げられる。上記のタンパク質のうちのいずれかをコードする核酸分子は、広汎な種類の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、ウイルス細胞、昆虫細胞、または植物細胞が、挙げられるによって容易に発現され得る。外来DNAを発現するようにそのような細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である例えば、Itakuraら、米国特許第4,704,362号;Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929~1933,1978;Murrayら、米国特許第4,801,542号;Upshallら、米国特許第4,935,349号;Hagenら、米国特許第4,784,950号;Axelら、米国特許第4,399,216号;Goeddelら、米国特許第4,766,075号;およびSambrookら、MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989を参照のこと;植物細胞については、CzakoおよびMarton,PlantPhysiol.104:1067~1071,1994;およびPaszkowskiら、Biotech.24:387~392,1992を参照のこと。本発明を実行するために適切な細菌宿主細胞としては、E.coli、B.subtilis、Salmonellatyphimurium、およびPseudomonas属に入る種々の種、Streptomyces属に入る種々の種、およびStaphylococcus属に入る種々の種、ならびに当業者にとって周知である他の多くの細菌種および本明細書中に記載される他の多くの細菌種が、挙げられる。細菌宿主細胞の代表的な例としては、E.coliDH5αStratagene,LaJolla,Californiaが、挙げられる。細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞において機能するプロモーター、1つ以上の表現型選択マーカー、および細菌複製起点を含む。代表的プロモーターとしては、β-ラクタマーゼペニシリナーゼおよびラクトースプロモーター系Changら、Nature275:615,1978参照のこと、T7RNAポリメラーゼプロモーターStudierら、Meth.Enzymol.185:60~89,1990、λプロモーターElvinら、Gene87:123~126,1990、trpプロモーターNicholsおよびYanofsky,Meth.inEnzymology101:155,1983、ならびにtacプロモーターRussellら、Gene20:231,1982が、挙げられる。代表的な選択マーカーとしては、種々の抗生物質耐性マーカー例えば、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が、挙げられる。宿主細胞を形質転換するために適切な多くのプラスミドが、当該分野で周知であり、そのプラスミドとしては、とりわけ、pBR322Bolivarら、Gene2:95,1977参照;pUCプラスミドであるpUC18、pUC19、pUC118、pUC119Messing,Meth.inEnzymology101:20~77,1983、ならびにVieiraおよびMessing,Gene19:259~268,1982参照;ならびにpNH8A、pNH16a、pNH18a、およびBluescriptM13Stratagene,LaJolla,Californiaが、挙げられる。本発明を実行するために適切な酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、とりわけ、Saccharomycespombe、Saccharomycescerevisiae、Pichia属またはKluyveromyces属、ならびにAspergillus属の種々の種McKnightら、米国特許第4,935,349号が、挙げられる。酵母および真菌のために適切な発現ベクターとしては、とりわけ、酵母用のYCp50ATCC番号37419、ならびにamdSクローニングベクターpV3Turnbull,Bio/Technology7:169,1989、YRp7Struhlら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:1035~1039,1978、YEp13Broachら、Gene8:121~133,1979、pJDB249およびpJDB219Beggs,Nature275:104~108,1978ならびにそれらの誘導体が、挙げられる。酵母において使用するために好ましいプロモーターとしては、酵母グリコール酸遺伝子Hitzemanら、J.Biol.Chem.255:12073~12080,1980;AlberおよびKawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1:419~434,1982またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子Youngら、GeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals,Hollaenderら編,p355,Plenum,NewYork,1982;Ammerer,Meth.Enzymol.101:192~201,1983が、挙げられる。真菌ベクターのために有用なプロモーターの例としては、Aspergillusnidulansグリコール酸遺伝子由来のプロモーター例えば、adh3プロモーターMcKnightら、EMBOJ.4:2093~2099,1985が、挙げられる。この発現単位はまた、転写ターミネーターを含み得る。適切なターミネーターの例は、adh3ターミネーターMcKnightら上記1985である。細菌ベクターと同様に、上記酵母ベクターは、一般的には、選択マーカーを含む。この選択マーカーは、形質転換体が選択されるのを可能にする表現型アッセイが存在する優性表現型を示す多数の遺伝子のうちの1つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するマーカー、抗生物質耐性を提供するマーカー、または細胞が特定の炭素源を利用するのを可能にするマーカーであり、それには、leu2Broachら同書、ura3Botsteinら、Gene8:17,1979またはhis3Struhlら同書が挙げられる。別の適切な選択マーカーは、cat遺伝子である。このcat遺伝子は、酵母細胞に対して、クロラムフェニコール耐性を付与する。真菌を形質転換するための技術は、文献において周知であり、例えば、Beggs同書、HinnenらProc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929~1933,1978、YeltonらProc.Natl.Acad.Sci.USA81:1740~1747,1984、およびRussellNature301:167~169,1983をによって記載されている。宿主細胞の遺伝子型は、発現ベクター上に存在する選択マーカーによって補完される遺伝子欠損を含み得る。特定の主および選択マーカーの選択は、充分に当業者のレベルの範囲内にある。酵母の形質転換のためのプロトコールはまた、当業者にとって周知である。例えば、形質転換は、DNAを用いて酵母のスフェロプラストを調製することHinnenら、PNASUSA75:1929,1978を参照のことによって、またはLiClなどのアルカリ塩で処理することItohら、J.Bacteriology153:163,1983を参照のことによって、容易に達成され得る。真菌の形質転換はまた、CullenらBio/Technology5:369,1987によって記載されるようにポリエチレングリコールを使用して実行され得る。ウイルスベクターは、上記のような望ましいタンパク質をコードする単離された核酸分子の発現を指向するプロモーターを含むベクターを包含する。広汎な種類のプロモーターが、本発明の状況において利用され得る。そのプロモーターとしては、例えば、MoMLLTR、RSVLTR、フレンドMuLVLTR、アデノウイルスプロモーターOhnoら、Science265:781~784,1994、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーター/エンハンサー、後期パルボウイルスプロモーターKoeringら、Hum.GeneTherap.5:457~463,1994、ヘルペスTKプロモーター、SV40プロモーター、メタロチオネインIIa遺伝子エンハンサー/プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、ならびにサイトメガロウイルス最後期プロモーターが、挙げられる。本発明の特に好ましい実施形態において、そのプロモーターは、組織特異的プロモーター例えば、WO91/02805、EP0,415,731;およびWO90/07936参照である。適切な組織特異的プロモーターの代表的な例としては、中性特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来増殖因子βプロモーター、骨形成タンパク質プロモーター、ヒトα1-カイメリンchimaerinプロモーター、シナプシンIプロモーター、およびシナプシンIIプロモーターが、挙げられる。上記のプロモーターに加えて、他のウイルス特異的プロモーター例えば、レトロウイルスプロモーター上記のプロモーターならびにHIVプロモーターなどのプロモーターが挙げられる、肝炎特異的プロモーター、ヘルペス例えば、EBV特異的プロモーター、ならびに細菌特異的プロモーター、真菌特異的プロモーター、または寄生生物例えば、マラリア特異的プロモーターが、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物に感染している特定の細胞もしくは組織を標的とするために、使用され得る。本発明を実行するために適切な哺乳動物細胞としては、とりわけ、COS細胞、CHO細胞、SaOS細胞、骨肉腫、KS483細胞、MG-63細胞、初代骨芽細胞、ならびにヒト骨髄肉腫または哺乳動物骨髄肉腫が、挙げられる。本発明を実行する際に使用するための哺乳動物発現ベクターは、クローン化した遺伝子、核酸分子、またはcDNAの転写を指向することが可能なプロモーターを、含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが、挙げられる。骨特異的プロモーターとしては、骨シアロタンパク質のプロモーターおよびオステオカルシンのプロモーターが、挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーターBoshartら、Cell41:521~530,1985、サイトメガロウイルス最後期プロモーター、SV40プロモーターSubramaniら、Mol.Cell.Biol.1:854~864,1981、MMTVLTR、RSVLTR、メタロチオネイン1、アデノウイルスE1aが挙げられる。細胞プロモーターとしては、マウスメタロチオネイン1プロモーターPalmiterら、米国特許第4,579,821号、マウスVκプロモーターBergmanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:7041~7045,1983;Grantら、NucleicAcidsRes.15:5496,1987およびマウスVHプロモーターLohら、Cell33:85~93,1983が、挙げられる。プロモーターの選択は、少なくとも部分的には、望ましい発現レベルにか、またはトランスフェクトされるレシピエント細胞株に、依存する。このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流に、かつ目的のペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列から上流に位置するRNAスプライス部位を含み得る。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルスおよび/または免疫グロブリン遺伝子から得られ得る。発現ベクターには、目的のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルもまた含まれる。適切なポリアデニル化シグナルとしては、SV40由来の初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナルKaufmanおよびSharp、同書、アデノウイルス5E1B領域およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーターに由来するポリアデニル化シグナルDeNotoら、NucleicAcidRes.9:3719-3730,1981が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターとRNAスプライス部位との間に位置する非コードウイルスリーダー配列例えば、アデノウイルス2三連リーダーtripartiteleaderを含む。好ましいベクターはまた、エンハンサー配列例えば、SV40エンハンサーを含み得る。発現ベクターは、アデノウイルスVARNAをコードする配列もまた含み得る。適切な発現ベクターは、市販の供給源例えば、Stratagene,LaJolla,Californiaから得られ得る。クローニングされたDNA配列を含むベクター構築物は、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってWiglerら、Cell14:725,1978;CorsaroおよびPearson,SomaticCellGenetics7:603,1981;GrahamおよびVanderEb,Virology52:456,1973、エレクトロポレーションによってNeumannら,EMBOJ.1:841-845,1982、またはDEAE-デキストラン媒介性トランスフェクションによってAusubelら編、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.,NY,1987、培養された哺乳動物細胞に導入され得る。ベクターで安定にトランスフェクトされるか、またはクローニングされたDNAが組み込まれた細胞を同定するために、選択マーカーは、一般に、目的の遺伝子またはcDNAとともに細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞において使用するために好ましい選択マーカーとしては、薬物例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。この選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、DHFR遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子である。選択マーカーは、Thillyによって検討されているMammalianCellTechnology,ButterworthPublishers,Stoneham,Massachusettsこれは、本明細書中に参考として援用される。適切なベクターを含む哺乳動物細胞は、一定期間代表的には1~2日間にわたって増殖して、目的のDNA配列を発現し始めることが可能である。薬物選択は、次いで、安定な様式で選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択するために適用される。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクトされた細胞について、薬物濃度は、段階的様式で増大されて、クローニングされた配列のコピーの数の増大について選択され得、それによって、発現レベルが増大され得る。その導入された配列を発現する細胞が選択され、望ましい形態または望ましいレベルで、目的のタンパク質の生成についてスクリーニングされる。次いで、これらの基準を満たす細胞がクローニングされ得、生成のためにスケールアップされ得る。哺乳動物細胞のトランスフェクションについてのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法としては、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス融合媒介性トランスフェクション、アデノウイルス融合媒介性トランスフェクション、およびプロトプラスト融合媒介性トランスフェクションSambrookら,前出を参照のことが挙げられる。裸のベクター構築物はまた、筋細胞または他の適切な細胞によって取り込まれて、その後、哺乳動物または他の動物の筋肉に注射され得る。ポリペプチドの生成のために昆虫宿主細胞および植物宿主細胞を使用する方法は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。当該分野で公知の多くの昆虫宿主細胞はまた、本発明において有用であり得る。例えば、昆虫細胞において異種DNA配列を発現するためのベクターとしてのバキュロウイルスの使用は、Atkinsonらによって検討されているPestic.Sci.28:215-224,1990。当該分野で公知の多くのベクターおよび植物宿主細胞はまた、本発明において有用であり得る例えば、植物細胞において遺伝子および核酸分子を発現するためのAgrobacteriumrhizogenesのベクターとしての使用Sinkarら,J.Biosci.による総説Bangalore11:47-58,1987を参照のこと。本発明の関連する局面において、本発明のタンパク質は、生殖細胞および体細胞が、所望のタンパク質をコードし、かつこの遺伝子の発現に有効なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む、トランスジェニック動物において発現され得る。あるいは、類似の様式において、所望の遺伝子を欠いているトランスジェニック動物が、準備され得る例えば、ノックアウトマウス。このようなトランスジェニック動物は、種々の非ヒト動物マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ヤギ、およびブタが挙げられるにおいて準備され得るHammerら,Nature315:680-683,1985、Palmiterら,Science222:809-814,1983、Brinsterら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442,1985、PalmiterおよびBrinster,Cell41:343-345,1985、ならびに米国特許第5,175,383号、同第5,087,571号、同第4,736,866号、同第5,387,742号、同第5,347,075号、同第5,221,778号、および同第5,175,384号を参照のこと。簡潔には、発現ベクター適切に配置された発現制御配列とともに、発現されるべき核酸分子を含むは、受精卵の前核に、例えば、マイクロインジェクションによって導入される。注入されたDNAの組み込みは、組織サンプルからDNAのブロット分析によって検出される。動物の子孫に伝えられるように、その導入されたDNAが、動物の生殖系列に組み込まれることが好ましい。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用によって、または導入遺伝子の調節された発現を可能にする誘導性プロモーター例えば、メタロチオネイン遺伝子プロモーターPalmiterら,1983,前出の使用によって達成され得る。他の方法の中でも、適切な宿主およびベクター系を培養して、本明細書中に記載の組換え翻訳生成物を生成することによって、タンパク質が単離され得る。このような細胞株の上清またはタンパク質封入体、またはそのタンパク質が上清に排出されない全細胞は、次いで、所望のタンパク質を単離するために、種々の精製手順によって処理され得る。例えば、この上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター例えば、AmiconまたはMilliporePelliconの限外濾過ユニットを使用して濃縮され得る。濃縮の後に、その濃縮物は、適切な精製マトリクス例えば、適切な支持体に結合した抗タンパク質抗体例えば、単離されるべきポリペプチドに特異的に結合する抗体に適用され得る。あるいは、アニオン交換樹脂またはカチオン交換樹脂が、タンパク質を精製するために使用され得る。さらなる代替法として、1種以上の逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLC工程が、そのタンパク質をさらに精製するために使用され得る。本発明のタンパク質を単離するための他の方法は、当該分野で周知である。単離されたポリペプチドの純度は、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載の技術例えば、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー法によって決定され得る。好ましくは、このような単離されたポリペプチドは、少なくとも約90純粋、より好ましくは少なくとも約95純粋、そして最も好ましくは少なくとも約99純粋である。特定の具体的実施形態において、タンパク質は、他の望ましくないタンパク質がSDS-PAGE分析、続いてクーマシーブルー染色に従って全く検出されない場合に、本発明の文脈において単離されたと見なされる。他の実施形態において、望ましいタンパク質は、他の望ましくないタンパク質が、SDS-PAGE分析、続いて銀染色に従って全く検出されないように、単離され得る。3.核酸分子本発明の他の局面において、TGF-βファミリーのメンバーに結合するTGF-β結合タンパク質を阻害し得る核酸分子が提供される。例えば、一実施形態において、TGF-β結合タンパク質核酸配列の発現を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が提供される一般には、Hirashimaら、MolecularBiologyofRNA:NewPerspectivesM.InouyeおよびB.S.Dudock,編,1987AcademicPress,SanDiego,p.401;Oligonucleotides:AntisenseInhibitorsofGeneExpressionJ.S.Cohen,編,1989MacMillanPress,London;SteinおよびCheng,Science261:1004-1012,1993;WO95/10607;米国特許第5,359,051号;WO92/06693;ならびにEP-A2-612844を参照のこと。簡潔には、このような分子は、転写されたTGF-β結合タンパク質mRNA配列の領域に相補的で、かつこの領域とワトソン-クリック塩基対を形成し得るように、構築される。得られた二本鎖核酸は、mRNAのその後のプロセシングを妨害し、それによって、タンパク質合成を防止する実施例10を参照のこと。本発明の他の局面において、TGF-βファミリーのメンバーに結合するTGF-β結合タンパク質を阻害し得るリボザイムが提供される。本明細書中に記載される場合、リボザイムは、特異的認識のためのアンチセンス配列、およびRNA-切断酵素活性を含むRNA分子を含むことが意図される。この触媒性の鎖は、化学量論的濃度を超える標的RNA中の特異的部位を切断する。広く種々のリボザイムが、本発明の文脈において利用され得る例えば、ハンマーヘッドリボザイム例えば、ForsterおよびSymons,Cell48:211-220,1987;HaseloffおよびGerlach,Nature328:596-600,1988;WalbotandBruening,Nature334:196,1988;HaseloffおよびGerlach,Nature334:585,1988によって記載されるもの;ヘアピンリボザイム例えば、Haseloffら,米国特許第5,254,678号1993年10月19日発行、Hempelら,欧州特許公開番号0360257号1990年3月26日公開により記載されるもの;ならびにTetrahymenaリボソームRNAベースのリボザイムCechら,米国特許第4,987,071号を参照のことが挙げられる。本発明のリボザイムは、代表的には、RNAからなるが、DNA、核酸アナログ例えば、ホスホロチオエート、またはこれらのキメラアナログ例えば、DNA/RNA/RNAから構成されてもよい。4.標識遺伝子生成物または上記および下記の候補分子のいずれかは、種々の化合物例えば、蛍光分子、毒素、および放射性核種が挙げられるで標識され得る。蛍光分子の代表例としては、フルオレセイン、Phycobiliタンパク質例えば、フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッドおよびルシフェラーゼが挙げられる。毒素の代表例としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、Shigella毒素、およびPseudomonas外毒素Aが挙げられる。放射性核種の代表例としては、Cu-64、Ga-67、Ga-68、Zr-89、Ru-97、Tc-99m、Rh-105、Pd-109、In-111,I-123、I-125、I-131、Re-186、Re-188、Au-198、Au-199、Pb-203、At-211、Pb-212およびBi-212が挙げられる。さらに、上記の抗体はまた、標識されてもよいし、リガンド結合対の一方のパートナーに結合体化されてもよい。代表例としては、アビジン-ビオチン、ストレプトアビジン-ビオチン、およびリボフラビン-リボフラビン結合タンパク質が挙げられる。本明細書中に記載の分子を、上記の代表的な標識と結合体化または標識するための方法は、当業者によって容易に達成され得るTrichotheceneAntibodyConjugate,米国特許第4,744,981号;AntibodyConjugate,米国特許第5,106,951号;FluorogenicMaterialsandLabelingTechniques,米国特許第4,018,884号;MetalRadionuclideLabeledProteinsforDiagnosisandTherapy,米国特許第4,897,255号;およびMetalRadionuclideChelatingCompoundsforImprovedChelationKinetics,米国特許第4,988,496号を参照のこと;Inman,MethodsInEnzymology,Vol.34,AffinityTechniques,EnzymePurificationPartB,JakobyおよびWilchek編,AcademicPress,NewYork,p.30,1974もまた参照のこと;WilchekおよびBayer,TheAvidin-BiotinComplexinBioanalyticalApplications,Anal.Biochem.171:1-32,1988もまた参照のこと。薬学的組成物上記のように、本発明はまた、薬学的にまたは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに、TGF-βファミリーのメンバーに結合するTGF-β結合タンパク質を阻害する上記の分子の1つを含む種々の薬学的組成物を提供する。一般に、このようなキャリアは、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であるべきである。通常は、このような組成物の調製は、治療剤と、緩衝液、抗酸化物質例えば、アスコルビン酸、低分子量約10残基未満のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物グルコース、マルトース、スクロースまたはデキストリンが挙げられる、キレート剤例えば、EDTA、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤とを合わせる工程を包含する。中性緩衝化生理食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。本発明の薬学的組成物は、種々の異なる経路による投与のために調製され得る。一般に、キャリアの型は、投与様式に基づいて選択される。薬学的組成物は、任意の適切な投与様式例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔投与、直腸投与、膣投与、舌下投与または非経口投与皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿内intracavernous、外耳道内intrameatal、または尿道内の注射または注入が挙げられるが挙げられるについて処方され得る。薬学的組成物例えば、経口投与または注射による送達のためは、液体の形態例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液中にあり得る。液体の薬学的組成物は、例えば、以下のうちの1種以上を含み得る:溶媒または懸濁媒体として作用し得る滅菌希釈剤例えば、注射用水、生理食塩水溶液好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒;抗菌剤;抗酸化剤;キレート剤;緩衝物質例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性の調節のための薬剤例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアル中に封入され得る。生理食塩水の使用が好ましく、注射可能な薬学的組成物は、好ましくは無菌である。本明細書中に記載の組成物は、徐放のために処方され得るすなわち、投与後の化合物のゆっくりとした放出をもたらすカプセルまたはスポンジのような処方物。このような組成物は、一般に、周知の技術を使用して調製され得、例えば、経口用の埋め込み、直腸用の埋め込みもしくは舌下用の埋め込みにより、または所望の標的部位における埋め込みにより投与される。徐放性処方物は、キャリアマトリクス中に分散され、そして/または速度制御膜で取り囲まれたレザバ内に含まれる薬剤を含み得る。このような処方物内で使用するためのキャリアは、生体適合性であり、生分解性でもあり得る;好ましくは、この処方物は、比較的一定のレベルの活性成分の放出を提供する。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、埋め込みの部位、放出の速度およびの予測される持続時間、ならびに処理または予防されるべき状態の性質に依存する。この点で有用な例示的なキャリアは、ポリラクチド-コ-グリコリド、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子を含む。他の例示的な遅延放出キャリアは、超分子生体ベクターsupramolecularbiovectorを含み、これは、非脂質親水性コア例えば、架橋多糖またはオリゴ糖、および必要に応じて、両親媒性化合物例えば、リン脂質を含む外部層例えば、米国特許第5,151,254号およびPCT出願WO94/20078、WO94/23701およびWO96/06638を参照のことを含む。別の例示的実施形態において、生分解性マイクロスフェア例えば、ポリラクテートポリグリコレートが、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号;同第5,075,109号;同第5,928,647号;同第5,811,128号;同第5,820,883号;同第5,853,763号;同第5,814,344号、同第5,407,609号および5,942,252号に開示される。改変されたB型肝炎コアタンパク質キャリア系例えば、WO99/40934、およびこれに引用される参考文献に記載されるもまた、多くの適用のために有用である。別の例示的キャリア/送達系は、粒子-タンパク質複合体例えば、米国特許第5,928,647号に記載されるものを含むキャリアを採用し、これは、宿主におけるクラスI拘束細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導し得る。別の例示的実施形態において、リン酸カルシウムコア粒子が、キャリアとして、または本発明の組成物のための制御放出マトリクスとして使用される。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願番号WO/0046147において開示される。抗SOST抗体および/または調節因子をコードするポリヌクレオチドを含むその結果、このポリペプチドおよび/または調節因子は、インサイチュで生成される薬学的組成物について、このポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系核酸、および細菌発現系、ウイルス発現系および哺乳動物発現系が挙げられるのいずれかに存在し得る。このような発現系にDNAを組み込むための技術は、当業者に周知である。このDNAはまた、例えば、Ulmerら,Science259:1745-1749,1993に記載されるように裸であり得、Cohen,Science259:1691-1692,1993により検討されている。裸のDNAの取り込みは、生分解性ビーズこれは、細胞に効率的に輸送される上にDNAをコーティングすることによって増大され得る。種々の処置レジメン例えば、経口、非経口、静脈内、鼻内、および筋肉内の投与および処方が挙げられるにおいて本明細書中に記載の特定の組成物を使用するための適切な投薬および処置のレジメンの開発は、当該分野で周知であり、これらのうちのいくつかは、例示の全般的目的のために簡潔に以下に議論される。特定の適用において、本明細書中に開示される薬学的組成物は、動物への経口投与を介して送達され得る。よって、これらの組成物は、不活性希釈剤とともに、または同化性可食キャリアとともに処方されてもよいし、あるいは、これらの組成物は、硬質性シェルのゼラチンカプセルまたは軟質性シェルのゼラチンカプセルに閉じこめられてもよいし、あるいは、これらの組成物は、錠剤に圧縮されてもよいし、あるいは、これらの組成物は、食事の食品に直接組み込まれてもよい。特定の状況において、本明細書中に開示される薬学的組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、またはさらに腹腔内に送達することが望ましい。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのうちのいくつかは、例えば、米国特許第5,543,158号;同第5,641,515号および同第5,399,363号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水中に調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにこれらの混合物および油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件の下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含み得る。注射用途に適した例示的薬学的形態としては、無菌の注射用溶液または分散液の即座の調製のための、無菌の水溶液または分散剤および無菌散剤が挙げられる例えば、米国特許第5,466,468号を参照のこと。全ての場合において、その形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなどを含む溶媒または分散媒、これらの適切な混合物、ならびに/または植物性油であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング例えば、レシチンの使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および/または界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進され得る。多くの場合、等張剤例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中で使用することによってもたらされ得る。一実施形態において、水溶液中での非経口投与のために、この溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤が、まず、十分な塩類またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために特に適している。この関係において、本開示に鑑みて、使用され得る滅菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、1投薬量は、1mlの等張性NaCl溶液に溶解され得、1000mlの皮下注入流体に添加され得るか、または推奨される注入部位に注射され得るかのいずれかである例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences,第15版,pp.1035-1038および1570-1580を参照のこと。投薬量のいくらかの変形例が、処置される被験体の条件に依存して必然的に存在する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、当然ながら、好ましくは、FDAOfficeofBiologicsstandardsにより必要とされる無菌性、発熱原性、ならびに全般的な安全性および純度標準を満たす。本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩タンパク質の遊離アミノ基で形成され、無機塩例えば、塩酸またはリン酸もしくは有機酸例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などで形成されるが挙げられる。遊離カルキシル基で形成される塩もまた、無機塩基例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄、および有機塩基例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから得られ得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合性の様式で、かつ治療的に有効であるような量で投与される。キャリアは、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝化剤、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である範囲を除いて、治療用組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分はまた、この組成物に組み込まれ得る。句薬学的に受容可能なとは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応も類似の不適切な反応も生じない、分子実体および組成物をいう。特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、ビヒクルなどが、本発明の組成物を適切な宿主細胞/宿主生物に導入するために使用される。特に、本発明の組成物は、送達のために処方され得、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化される。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合または非共有結合のいずれかにより結合され得る。潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の処方および使用は、一般に、当業者に公知である例えば、Lasic,TrendsBiotechnol.167:307-21,1998;Takakura,NipponRinsho563:691-95,1998;Chandranら,IndianJ.Exp.Biol.358:801-09,1997;Margalit,Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.122-3:233-61,1995;米国特許第5,567,434号;同第5,552,157号;同第5,565,213号;同第5,738,868号および同第5,795,587号各々、その全体が本明細書中に具体的に援用されるを参照のこと。リポソームは、他の手順ではトランスフェクトすることが通常困難である多くの細胞型T細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびPC12細胞で首尾よく使用されてきたRenneisenら,J.Biol.Chem.26527:16337-42,1990;Mullerら,DNACellBiol.93:221-29,1990。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系では代表的な、DNAの長さの拘束がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを、種々の培養された細胞株および動物に導入するために有効に使用されてきた。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の自己免疫応答とも、許容されない毒性とも関連しないようである。特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散し、自然に、多層同心二重層の小胞を形成するこれはまた、多重膜小胞MLVともいうリン脂質から形成される。あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕捉し得る例えば、以下を参照のこと:Quintanar-Guerreroら,DrugDev.Ind.Pharm.2412:1113-28,1998。細胞内ポリマー荷重に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子約0.1μmのサイズは、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計され得る。このような粒子は、例えば、以下に記載されているように作製され得る:Couvreurら,Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.5l:l-20,1988;zurMuhlenら,Eur.J.Phazm.Biopharm.452:149-55,1998;Zambauxら,J.ControlledRelease501-3:31-40,1998;および米国特許第5,145,684号。さらに、本発明の薬学的組成物は、そのような薬学的組成物の使用に関する指示を提供する包装材料とともに容器内に配置され得る。一般に、そのような指示は、試薬濃度を記載する分かりやすい表現、および特定の実施形態では、その薬学的組成物を再構成するのに必要であり得る賦形剤成分または希釈物例えば、水、生理食塩水またはPBSを相対量で含む。処置の方法本発明はまた、骨のミネラル含有量およびミネラル密度を増大させるための方法をも提供する。手短には、多数の状態が、骨ミネラル含有量の喪失を生じる。これら状態としては、例えば、疾患、遺伝的素因、骨の使用の喪失を生じる事故例えば、骨折、骨の再吸収を行う治療剤、骨形成細胞を殺傷する治療剤および正常な加齢が挙げられる。TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する、本明細書において記載される分子の使用を通じて、そのような状態は、処置または予防され得る。本明細書において利用されるように、骨ミネラル含有量は、選択される部位において、骨ミネラル含有量が統計学的に有意な様式で増加した場合例えば、標準偏差の1/2より大きいに増加したと理解されるべきである。骨ミネラル含有量の喪失を生じる広範で種々の状態が、本明細書において記載される分子を用いて処置され得る。そのような状態を有する患者は、周知の技術を利用した臨床診断を通じて同定され得る例えば、以下を参照のこと:Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine,McGraw-Hill,Inc.。処置され得る疾患の代表例としては、異形成が挙げられ得、この疾患では、骨の異常な成長または発達が存在する。そのような状態の代表例としては、以下が挙げられる:軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全、内軟骨腫症、線維性骨形成異常、ゴーシェ病、低リン酸塩血くる病、マーファン症候群、多発性遺伝性外骨腫multiplehereditaryexotoses、神経線維腫症、骨形成不全、大理石骨病、オステオポイキリー、硬化損傷、骨折、歯周疾患、偽関節および化膿骨髄炎。処置または予防され得る他の状態としては、広範な種々の骨減少の原因すなわち、若年時におけるピーク骨格ミネラル含有量を1標準偏差より多く下回る骨ミネラル含有量または密度を生じさせる状態が挙げられる。そのような状態の代表例としては、貧血状態、ステロイドによって生じる状態、ヘパリンによって生じる状態、骨髄障害、壊血病、栄養失調、カルシウム欠乏症、特発性骨粗鬆症、先天性骨減少、先天性骨粗鬆症、アルコール中毒、慢性肝臓疾患、老化、閉経後状態、希発月経、無月経、妊娠、糖尿病、甲状腺機能亢進、クッシング病、先端巨大症、性腺機能低下症、不動すなわち非活動、反射性交感神経性ジストロフィ症候群、一過性局所性骨粗鬆症および骨軟化症が挙げられる。本発明の一つの局面において、骨ミネラル含有量または密度は、温血動物に、治療有効量の、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーメンバーへの結合を阻害する分子を投与することによって増大され得る。処置され得る温血動物の例としては、脊椎動物および哺乳動物の両方を含み、これらには、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられる。治療分子の代表例としては、リボザイム、リボザイム遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体例えば、ヒト化抗体または本明細書に記載されている他の任意の抗体が挙げられる。本発明の他の局面において、骨密度を増大させる方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する:骨にホーミングするhome細胞に、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子の発現を指向するベクターを導入する工程;およびそのベクター含有細胞を温血動物に投与する工程。手短には骨にホーミングする細胞は、患者の骨例えば、骨髄例えば、CD34、骨芽細胞、骨細胞などから得られた細胞、末梢血から、または培養物から直接得られ得る。TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子の発現を指向するベクターは、細胞に導入され得る。適切なベクターの代表例としては以下が挙げられる:以下のようなウイルスベクター:ヘルペスウイルスベクター例えば、米国特許第5,288,641号、アデノウイルスベクター例えば、WO94/26914,WO93/9191;Kollsら,PNAS911:215-219,1994;Kass-Eislerら,PNAS9024:11498-502,1993;Guzmanら,Circulation886:2838-48,1993;Guzmanら,Cir.Res.736:1202-1207,1993;Zabnerら,Cell752:207-216,1993;Liら,HumGeneTher.44:403-409,1993;Caillaudら,Eur.J.Neurosci.510:1287-1291,1993;Vincentら,Nat.Genet.52:130-134,1993;Jaffeら,Nat.Genet.15:372-378,1992;およびLevreroらGene1012:195-202、1991、アデノ随伴ウイルスベクターWO95/13365;Flotteら,PNAS9022:10613-10617、1993、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクターKoeringら,Hum.GeneTherap.5:457-463,1994、天然痘ウイルスベクターPanicaliandPaoletti、PNAS79:4927-4931,1982;およびOzakiら,Biochem.Biophys.Res.Comm.1932653:660,1993、およびレトロウイルス例えば、EP0,415,731;WO90/07936;WO91/0285;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;米国特許第5,219,740号;WO93/11230;WO93/10218。ウイルスベクターは、異なるウイルス由来のまたは非ウイルス供給源の異なるエレメント例えば、プロモーター、エンベロープ配列の混合物を含むように同様に構築され得る。種々の実施形態において、ウイルスベクター自体、またはそのウイルスベクターを含むウイルス粒子のいずれかが以下に記載される方法および組成物において利用され得る。本発明の他の実施形態において、TGF-β結合タンパク質のTGF-βファミリーのメンバーへの結合を阻害する分子をコードする核酸分子は、種々の技術により投与され得る:この技術としては、例えば、ポリLリジンDNA複合体と結合体化されたアシアロオソムコイドASORの投与Cristanoら,PNAS92122-92126,1993,殺傷されるアデノウイルスに連鎖するDNACurielら,HumGeneTher.32:147-154,1992、サイトフェクチン媒介性導入DMRIE-DOPE,Vical,California、直接DNA注入Acsadiら,Nature352:815-818,1991;DNAリガンドWuら,J.ofBiol.Chem.264:16985-16987,1989;リポフェクションFelgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7417,1989;リポソームPickeringらCirc.891:13-21、1994;およびWangら,PNAS84:7851-7855,1987;マイクロプロジェクタイルボンバードメントWilliamnsら,PNAS88:2726-2730,1991;およびタンパク質自体をコードする核酸の、単独VileおよびHart,CancerRes.53;3860-3864,1993またはPEG核酸複合体を利用した直接送達が挙げられる。本発明のベクターによって発現され得る分子の代表的な例としては、リボザイムおよびアンチセンス分子が挙げられ、これらの各々は、以下により詳細に考察される。増大した骨ミネラル含有量の決定は、X線例えば、DualEnergyX-rayAbsorptometryすなわちDEXAの使用を通じて直接的に、または骨代謝回転マーカー例えば、骨芽細胞特異的なアルカリホスファターゼ、オステオカルシン、I型プロコラーゲン、CプロペプチドPICP、および総アルカリホスファターゼ;Comier,C.,Curr.Opin.inRheu.7:243,1995を参照のこともしくは骨吸収のマーカーピリジノリン、デオキシピリジノリン、N-テロペプチド、尿ヒドロキシプロリン、血漿酒石酸耐性酸ホスタファターゼおよびガラクトシルヒドロキシリジン;Comier前出を参照のことにより決定され得る。骨塊の量もまた、体重からまたは当該分野において公知の他の方法によって計算され得るGuinness-Hey,Metab.BoneDis.andRelat.Res.5:177-181,1984を参照のこと。当業者には明らかなように、投与の量および頻度は、処置されるべき適応症の性質および重篤性、所望の応答、患者の状態などに当然に依存する。代表的には、組成物は、種々の上述のような技術によって投与され得る。以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定のために提供されるのではない。実施例1:ヒト第17番染色体のロングアームに対する骨硬化症のマッピングヒトにおける骨硬化症を担う欠損の遺伝子マッピングによって、新規のTGF-β結合タンパク質ファミリーメンバーをコードするヒト第17染色体の領域に対してこの障害を担う遺伝子を位置づけした。骨硬化症において、骨格の骨は、罹患していない被験体のものに比べミネラル密度における顕著な増大を提示する。頭部における骨もまた過剰成長を示す。骨硬化症患者は一般的には健常であるが、患者は、誕生時の合指症の程度の変動および頭蓋骨における頭蓋の圧縮および神経圧縮の程度の変動を示し得る。骨硬化症に関連する遺伝子欠損の連鎖解析を、この疾患が起こった24家族の南アフリカのアフリカーナーの家族から収集したDNAサンプルに対してホモ接合性マッピング法を適用することによって実施したSheffieldら,1994,HumanMolecularGenetics3:1331-1335.IdentificationofaBardet-Biedlsyndromelocusonchromosome3andevaluationofanefficientapproachtohomozygositymapping。南アフリカのアフリカーナー集団は、遺伝的に同質であり;その集団は、少数の始祖からの子孫であり、その始祖は、数世紀前にその地域を植民地化したのであり、そして地理的および社会的な障害によってその始祖から隔離されてきた。骨硬化症は、アフリカーナーコミュニティの外側の世界では世界中どこでも希であり、このことは、遺伝子における変異がその始祖集団に存在し、そしてそれ以来集団の数の増加と共にその数を増やしてきたのであることを示唆する。ホモ接合性マッピングの使用は、劣勢変異に隣接するDNAマッピングマーカーは、近親婚家族および隔離された集団出身の罹患した個体においてホモ接合性であるようであるという仮定に基づく。常染色体からの371のマイクロサテライトマーカーのセットResearchGenetics,Set6を選択して、骨硬化症患者サンプルからDNAのプールを分類した。この分析についてのDNAサンプルは、24家族29名の骨硬化症の患者、59名の罹患していない家族のメンバーおよび同一の集団から関連しない対照個体のセットに由来する.このプールは、4~6の個体からなり、それら個体は罹患した個体、近親婚の家族出身の罹患した個体、両親、および罹患していない兄弟姉妹、あるいは血縁関係のない対照のいずれかである。血縁関係のない個体のプールにおいて、および罹患した個体または家族のメンバーを有するプールのほとんどにおいて,マーカーの分析によって、各々のマーカーについてのいくつかの対立遺伝子サイズが示された。1つのマーカーであるD17S1299は、ホモ接合性の示唆;罹患した個体のプールのいくつかにおいて1つのバンドを示した。すべての24名の骨硬化症家族を、D17S129917ql2-q21の領域に合計で19マーカーを用いて分類した。すべての家族からの罹患した個体は、この領域においてホモ接合性であり、そして29個体のうちの25個体は、コアハプロタイプに対してホモ接合性であった。これらは、各々、D17S1787とD17S930との間の同じ対立遺伝子を有した。他の4名の個体は、このハプロタイプに適合した1つの染色体と、それに適合しなかった第2のものを有した。合計すれば、このデータは、3メガ塩基領域が必然的に骨硬化症の変異を含むことを示唆した。この3メガ塩基領域におけるエキソンのほとんどの配列分析によって、新規TGF-β結合タンパク質コード配列における非センス変異配列番号1の117位のC→T変異は停止コドンを生じる。を同定した。この変異は、アフリカーナー子孫の骨硬化症患者およびキャリアにとって独特であったことを示した。この遺伝子の正体をさらに、そのイントロンにおける変異イントロンお3位におけるA→T変異を同定することによって確認した。これは、骨硬化症と診断された単一の血縁関係のない患者において不適切なmRNAプロセシングを生じる。実施例2:TGF-β結合タンパク質の遺伝子発現の組織特異性A.RT-PCRによるヒトBeer遺伝子発現第一鎖のcDNAを、以下の全RNAサンプルから、市販されるキットSuperscriptPreamplificationSystemforFirst-StrandcDNASynthesis,LifeTechnologies,Rockville,MDを用いて調製した:ヒト脳、ヒト肝臓、ヒト脾臓、ヒト胸腺、ヒト胎盤、ヒト骨格筋、ヒト甲状腺、ヒト下垂体、ヒト骨芽細胞NHOst、CloneticsCorp.,SanDiego,CAから、ヒト骨肉腫細胞株Saos-2,ATCC番号HTB-85、ヒト骨、ヒト骨髄、ヒト軟骨、サバンナサル骨、saccharomycescerevisiaeおよびヒトの末梢球単球。すべてのRNAサンプルは、社内で調製した以下のものを除き、市販の供給源Clontech,PaloAlto,CAから購入した:ヒト骨芽細胞、ヒト骨肉腫細胞株、ヒト骨、ヒト軟骨およびサバンナサル骨。これらの社内のRNAサンプルを、市販のキットTRIReagent、MolecularResearchCenter,Inc.,Cincinnati,OHで調製した。PCRをこれらのサンプルに対して行い、そしてさらに、ヒトゲノムサンプルを対照として行った。センスBeerオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有する:5’-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3’配列番号19。アンチセンスBeerオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した:5’-GCACTGGCCGGAGCACACC-3’配列番号20。さらに、PCRを、コントロールとしてヒトβアクチン遺伝子のためのプライマーを用いて実施した。センスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した:5’-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3’配列番号21。アンチセンスβアクチンオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有した:5’-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3’配列番号22。PCRを、標準的な条件を用いて、25μl反応物中で行った。ここでは、61°Cのアニール温度を用いた。32サイクルのPCRを、Beerプライマーを用いて行い、そして24サイクルを、βアクチンプライマーを用いて行った。増幅後、各反応物からの12μlを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。図2Aを参照のこと。B.マウス胚切片のRNAインサイチュハイブリダイゼーション全長マウスBeercDNA配列番号11を、pCR2.1ベクターInvitrogen,Carlsbad,CA中に、アンチセンス方向およびセンス方向で、製造業者のプロトコールを用いてクローニングした。35SαGTP標識したcRNAセンスおよびアンチセンスの転写物を、Ambion,IncAustin,TXによって供給されるインビトロ転写試薬を用いて合成した。インサイチュハイブリダイゼーションを、LyonsらJ.CellBiol.111:2427-2436,1990のプロトコールにしたがって行った。マウスBeercRNAプローブは、発生中のマウス胚の神経管、肢芽、血管および骨化軟骨において発現される特定のメッセンジャーを検出した。図3のパネルAは、肢l芽、血管bvおよび神経管ntの先端外胚葉性頂堤aerにおいて発現を示す。パネルBは、脳4の第4脳室における発現を示す。パネルCは、下顎ma、頸椎cv後頭骨oc、口蓋paおよび血管bvにおける発現を示す。パネルDは、肋骨rおよび心臓弁vaにおける発現を示す。パネルAは、10.5dpc胚の横断切片である。パネルBは、12.5dpc胚の矢状断面であり、パネルCおよびパネルDは、15.5dpc胚の矢状断面である。ba=鰓弓、h=心臓、te=終脳前脳、b=脳、f=前頭鼻塊、g=腸、h=心臓、j=顎、li=肝臓、lu=肺、ot=耳胞、ao=、sc=脊髄、skm=骨格筋、ns=副鼻腔、th=胸腺、to=舌、fl=前肢、di=横隔膜。実施例3:組み換えBEERタンパク質の発現および精製A.COS-1細胞における発現全長ヒトBeerタンパク質をコードするDNA配列を、以下のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させた:5’オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有し:そしてHindIII制限酵素部位ボールドを持ち、ついで19ヌクレオチドのBeer遺伝子を含み、これは、推定アミノ末端開始コドンATGの前に6塩基対から始まる。3’オリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有し:そして、HindIII制限酵素部位ボールドに続き、逆で相補的な終止コドンCTAに続きFLAGエピトープの逆相補体下線、Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MOに、Beerのカルボキシ末端5アミノ酸をコードするヌクレオチドの逆相補体を含む。PCR産物は、TAクローニングされOriginalTACloningKit,Invitrogen,Carlsbad,CA、そして個々のクローンを、DNA配列決定によってスクリーニングした。ついで、配列を確認したクローンを、HindIIIにより消化し、そして1.5アガロースゲル上で、市販の試薬QIAquickGelExtractionKit,QiagenInc.,Valencia,CAを用いて精製した。ついで、このフラグメントを、HindIII消化し、ホスファターゼ処理したpcDNA3.1Invitrogen,Carlsbad,CAプラスミド中に、T4DNAリガーゼを用いて連結した。DH10BE.coliを形質転換し、そしてLB、100μg/mlアンピリシンプレート上にプレートした。適切な方向に所望の組み換え体を有するコロニーを、以下を用いるPCRベースのスクリーニングにより同定した:T7プロモーター/pcDNA3.1におけるプライミング部位に対応する5’プライマー、および内部BEER配列の逆相補体に対応する配列5’-GCACTGGCCGGAGCACACC-3’配列番号25を有する3’プライマー。クローニングしたフラグメントの配列をDNA配列決定により確認した。COS1細胞ATCC番号:CRL-1650をトランスフェクションのために用いた。50μgの発現プラスミドpcDNABeerFlagを、市販のキットを用いて製造業者が供給するプロトコールに従ってトランスフェクションしたDEAE-DextranTransfectionKit、SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO。トランスフェクション後の最終の培地は、0.1の仔ウシ血清を含むDMEMLifeTechnologies,Rockville,MDであった。培養4日後、その培地を取り出した。組み換えBEERの発現を、SDSPAGEおよび抗FLAG登録商標M2モノクローナル抗体Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MOを用いたウエスタンブロットにより分析した。組み換えBEERタンパク質の精製を、抗FLAGM2アフィニティカラムMammalianTransientExpressionSystem,Sigma-AldrichCo.,St.Louis,MOを用いて実施した。このカラムのプロファイルを、SDSPAGEおよび抗FLAGM2モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。B.SF9昆虫細胞における発現ヒトBeer遺伝子配列を、標準的な条件および以下のプライマーを用いたPCRを用いて、増幅した:センスプライマー:5’-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGAT-3’配列番号26アンチセンスプライマー:5’-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGC-3’配列番号27。得られたcDNAは、2回の改変を有するBeerのコード領域を含んだ。N末端分泌シグナルを除去し、そしてFLAGエピトープタグSigmaをインフレームで挿入物のC末端に融合した。BamH1およびHindIIIクローニング部位を加え、そして遺伝子を標準的な方法を用いてバキュロウイルス発現ベクター中への移入のためにpMelBacベクターInvitrogen中にサブクローニングした。Beerタンパク質を発現する組み換えバキュロウイルスを、BacNBlueトランスフェクションキットInvitrogenを用いて作製し、そして製造業者の指示にしたがって精製した。SF9細胞Invitrogenを10仔ウシ血清を含むTNMFH培地Invitrogen中で維持した。タンパク質発現のために、スピナーフラスコ中のSF9培養物を、10より大きなMOIで感染させた。培地および細胞のサンプルを、5日間にわたり毎日採取し、そして抗FLAGM2モノクローナル抗体Sigmaまたは抗Beerウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによってBeerの発現をモニターした。5日後、バキュロウイルス感染したSF9細胞を遠心分離により採取し、そして細胞に付随するタンパク質を細胞ペレットから、高塩抽出緩衝剤1.5MNaCl、50mMTrispH7.5を用いて抽出した。抽出物300ml培養物中あたり20mlを、遠心分離により明澄化し、4リットルのTris緩衝化生理食塩水150mMNaCl、50mMTrispH7.5に対して3回透析し、そして遠心分離を再び行って明澄化した。この高塩画分をHitrapHeparinPharmacia;5mlベッド容量にアプライし、HEPES緩衝化生理食塩水25mMHEPES7.5、150mMNaClを用いて徹底的に洗浄し、そして結合したタンパク質を150mMNaClから1200mMNaClの勾配で溶出した。Beer溶出物を、約800mMNaClにおいて観察した。Beerを含む画分を、10グリセロールおよび1mMDTTに補充し、そして80°Cで凍結した。実施例4:BEER、GREMLINおよびDANに対するポリクローナル抗体の調製および試験A.抗原の調製ヒトBeer、ヒトGremlinおよびヒトDanのDNA配列を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた標準的なPCR方法を用いて増幅した:H.Beerセンス:5’-GACTTGGATCCCAGGGGTGGCAGGCGTTC-3’配列番号28アンチセンス5’-AGCATAAGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3’配列番号29H.Gremlinセンス:5’-GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3’配列番号30アンチセンス:5’-AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA-3’配列番号31H.Danセンス:5’-ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3’配列番号32アンチセンス:5’-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3’配列番号33。各場合において、列挙されたプライマーは、コード領域全体-分泌シグナル配列を増幅した。これらは、BeerおよびGremlinについてBamHI/HindIIIの部位、そしてDanについてSacI/HindIIIの部位で、細菌性発現ベクターpQE-30QiagenInc.,Valencia,CA内にサブクローニングするための制限部位を含む。pQE30は、クローニング領域の5’末端に6×Hisタグのコード配列を含む。完成した構築物を、E.coli株M-15/pRepQiagenIncに形質転換し、個々のクローンを、配列決定により確認した。M-15/pRep内のタンパク質発現および精製セファロースに結合したNi-NTAに結合する、6×His親和性タグを、製造業者Qiagen,TheQIAexpressionistにより記載されるように実施した。E.coli由来のBeerタンパク質を、6Mグアニジン中での可溶化を用いて有意な量で回収し、2~4Mまで透析して、保存の間の沈殿を防止した。Gremlinタンパク質およびDanタンパク質を、6Mグアニジン中での可溶化を用いてより高い量で回収し、精製後のグアニジン濃度は0.5Mであった。B.ポリクローナル抗体の産生および試験上記の3つの抗原の各々に対するポリクローナル抗体を、標準的なプロトコールを用いて、ウサギ宿主およびニワトリ宿主において産生したRRAntibody,Stanwood,WA;standardprotocolforrabbitimmunizationandantiserarecovery;ShortProtocolsinMolecularBiology.第2版.1992.11.37-11.41.寄稿:HelenM.CooperおよびYvonnePaterson;ニワトリ抗血清は、StrategicBiosolutions,Ramona,CAで作製した。ウサギ抗血清およびニワトリの卵のIgy画分を、ウエスタンブロットにより活性についてスクリーニングした。上記の3つの抗原の各々を、PAGEにより分離し、0.45μmニトロセルロースNovex,SanDiego,CAに移した。この膜を、各片がおよそ75ngの抗原を含むように細片stripに切断した。この細片を、3BlottingGradeBlockBio-RadLaboratories,Hercules,CA中でブロッキングし、1×Tris緩衝化生理食塩水TBS/0.02TWEEN緩衝液中で3回洗浄した。一次抗体ブロッキング緩衝液中、1:100~1:1,000の範囲の希釈物中の予備免疫ビーズ、ウサギ抗血清、またはニワトリの卵IgYを、穏やかに揺り動かしながら、1時間、細片と共にインキュベートした。1×TBS/0.02TWEENでの3回の洗浄を2シリーズ行なった後、二次抗体ペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ウサギ、AmershamLifeScience,Piscataway,NJ;またはペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ニワトリ、JacksonImmunoResearch,WestGrove,PAと共に1時間インキュベートした。1×TBS/0.02TWEENの3回の洗浄の最終サイクルを行い、この細片をLumi-Lightウェスタンブロッティング基質RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germanyを用いて発色させた。C.抗体の交差反応性試験前節において説明したプロトコールに従って、Beer、GremlinまたはDanのニトロセルロース細片を、そのそれぞれのウサギ抗血清またはニワトリの卵IgYの希釈物1:5000および1:10,000、ならびに残りの2つの抗原に対して作製された抗血清またはニワトリの卵Igy希釈物1:1000および1:5000と共にインキュベートした。マッチしない抗体のレベルの増加を実施して、増加した濃度においてのみ見られ得るこれらの抗体による低親和性結合を検出した。発色のプロトコールおよび持続時間は、上記のプロトコールを用いた3つ全ての結合事象について同じものである。試験した抗原のいずれについても、抗原の交差反応性は観察されなかった。実施例5BeerのTGF-βスーパーファミリータンパク質との相互作用TGF-βスーパーファミリーの異なる系統学的アームに由来するタンパク質とのBeerの相互作用を、免疫沈降法を用いて研究した。精製したTGF-β-1、TGF-β-2、TGF-β-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6およびGDNFを、市販の供給源RDsystems;Minneapolis,MNから得た。代表的なロトコールは以下の通りである。部分的に精製したBeerを、HEPES緩衝化生理食塩水25mMHEPES7.5、150mMNaCl中に透析した。免疫沈降を、300μlのIP緩衝液150mMNaCl、25mMTrispH7.5、1mMEDTA、1.4mMβ-メルカプトエタノール、0.5トリトンX100、および10グリセロール中で行なった。30ngの組換えヒトBMP-5タンパク質RDsystemsを、500ngのFLAGエピトープタグ化Beerの存在下および非存在下にて、15μlのFLAG親和性マトリクスSigma;StLouisMOに適用した。このタンパク質を、4°Cにて4時間インキュベートし、次いで、この親和性マトリクスに結合したタンパク質を、IP緩衝液洗浄ごとに1ml中で5回洗浄した。この結合したタンパク質を、60μlの1×SDSPAGEサンプル緩衝液中の親和性マトリクスから溶出した。このタンパク質を、SDSPAGEにより分離し、Beerに結合したBMP-5を、抗BMP-5抗血清ReserchDiagnostics,Incを用いるウエスタンブロットにより検出した図5を参照のこと。Beerリガンド結合アッセイFLAG-Beerタンパク質20ngを、100μlのPBS/0.2BSAに添加し、抗FLAGモノクローナル抗体Sigma;StLouisMOで事前にコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させ、PBS中10のBSAでブロッキングした。これを、室温で60分間実施する。このタンパク質溶液を取り除き、そしてウェルを洗浄して、結合していないタンパク質を取り除く。BMP-5を、PBS/0.2BSA中10pM~500nMの範囲の濃度で各ウェルに添加し、そして、室温で2時間インキュベートする。結合溶液を取り除き、そしてこのプレートを、200μl容量のPBS/0.2BSAで3回洗浄する。次いで、BMP-5のレベルを、ELISAによって、BMP-5抗血清を用いて検出するF.M.Ausubelら1998CurrentProtocolsinMolBiol.Vol211.2.1-11.2.22。特異的な結合を、全結合から非特異的な結合を減算することによって算出し、LIGANDプログラムMunsonおよびPodbard,Anal.Biochem.,107,p220-239,1980により分析する。この方法のバリエーションにおいて、Beerを操作して、ヒトFc融合タンパク質として発現させる。同様に、リガンドBMPを操作して、マウスFc融合として発現させる。これらのタンパク質を一緒にインキュベートし、均質な時間分解蛍光検出G.W.Mellorら,JofBiomolScreening,3291-99,1998を用いて、Mellorらに記載されるようにアッセイを実施する。実施例6TGF-βファミリーメンバーに結合するTGF-β結合タンパク質の阻害についてのスクリーニングアッセイ上記のアッセイを、2つの例外を除いて、繰り返す。第一に、BMP濃度を以前に決定したKdに固定したままにする。第二に、アンタゴニスト候補のコレクションを固定濃度で添加する有機低分子のコレクションの場合は20μM、そして抗体の研究においては1μM。これらのTGF-β結合タンパク質の候補分子アンタゴニストの結合は、種々の化学構造を表す、市販または内部のコレクションに由来する有機化合物を含む。これらの化合物を、DMSO中のストック溶液として調製し、標準的なアッセイ条件下で、1以下の最終容積でアッセイウェルに添加する。これらを、BMPおよびBeerと共に室温で2時間インキュベートし、この溶液を取り除き、そして、結合したBMPを記載されたように定量する。化合物または抗体の非存在下で観察されたBMPの結合の40を阻害する薬剤を、この相互作用のアンタゴニストと考える。これらをさらに、力価研究に基づいて強力なインヒビターとして評価し、これらの阻害定数、およびTGF-β結合タンパク質の結合親和性に対するその影響を決定する。また、同等の特異性のコントロールアッセイを実施して、BMPリガンドの作用に依存するアッセイを使用した研究例えば、BMP/BMPレセプター競合研究を通じて、同定されたアンタゴニストについての選択性プロフィールを確立し得る。実施例7骨マトリクスへのTGF-β結合タンパク質局在化の阻害骨マトリクスヒドロキシアパタイトへの局在化の阻害の評価を、Nicolasの方法Nicolas,V.CalcifTissueInt57:206,1995を改変したものを用いて実施する。簡単に述べると、125Iで標識したTGF-β結合タンパク質を、Nicolas前出により記載されたように調製する。ポリプロピレン濾過膜Polyfiltroninc,WeymouthMAを備え付けた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルにヒドロキシアパタイトを添加する。TGF-β結合タンパク質を、PBS緩衝液中0.2アルブミンに添加する。マトリクスを含むウェルを、この緩衝液で3回洗浄する。吸着したTGF-β結合タンパク質を、0.3MNaOHを用いて溶出し、定量する。TGF-β結合タンパク質を試験分子と一緒にインキュベートし、上記のようにこの混合物をマトリクスに適用することによって、インヒビターの同定を行なう。このマトリクスを、PBS緩衝液中の0.2アルブミンで3回洗浄する。吸着したTGF-β結合タンパク質を、0.3MNaOHを用いて溶出し、定量する。化合物も抗体も存在しない条件下で観察されたTGF-β結合タンパク質の40を阻害する薬剤を、骨局在化のインヒビターと考える。これらのインヒビターを、用量応答研究を通じてさらに特徴づけ、その阻害定数、およびTGF-β結合タンパク質の結合親和性に対するその影響を決定する。実施例8TGF-β結合タンパク質変異体の構築物A.変異誘発pBluescriptSK中の全長TGF-β結合タンパク質cDNAは、変異誘発のための鋳型として機能する。簡単に述べると、適切なプライマー上に提供される考察を参照のことを利用して、VentDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabs,Beverly,MAを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってDNAフラグメントを作製する。このポリメラーゼ連鎖反応を、57°Cのアニーリング温度を用いて、製造業者により提供された緩衝液中で、23サイクル実行する。次いで、この生成物を、2つの制限酵素に曝露して、アガロースゲル電気泳動を用いて単離した後、再び、マッチする配列を酵素的消化により除去したpBRP4-503に連結する。変異体の完全性を、DNA配列決定により確認する。B.変異型TGF-β結合タンパク質の哺乳動物細胞発現および単離変異型TGF-β結合タンパク質のcDNAを、実施例3に記載したpcDNA3.1哺乳動物発現ベクターに移す。配列を確認した後、得られた構築物を、COS-1細胞にトランスフェクトし、分泌されたタンパク質を、実施例3に記載したように精製する。実施例9動物モデル-IBeer遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスの作製CITBマウスゲノムDNAライブラリーResearchGenetics,Huntsville,ALにより分配されるから単離された、約200キロベースkbのBACクローン15G5を使用して、マウスBeer遺伝子の完全配列、ならびにその5’および3’の隣接領域を決定した。遺伝子本体全体約17kbの5’隣接配列および約20kbの3’隣接配列を含む41kbのSalIフラグメントを、SuperCosIコスミドベクターStratagene,LaJolla,CAのBamHI部位にサブクローニングし、E.coli株DH10B内で増殖させた。次いで、このコスミド構築物から、マウスBeer遺伝子全体、ならびに5’および3’の隣接配列それぞれ、17kbおよび14kbを含む35kbのMluI-AviII制限フラグメント配列番号6を、従来の手段を用いてゲル精製し、マウス接合体のマイクロインジェクションDNXTransgenics;米国特許第4,873,191号のために使用した。クローン化したDNAフラグメントがゲノム内にランダムに挿入された創始動物founderanimalを、生きて生まれた仔の5~30の頻度で得た。トランスジーンの存在を、少量のマウス組織例えば、尾の先端から抽出したゲノムDNAのサザンブロット分析を実施することにより確認した。DNAを、以下のプロトコールを用いて抽出した:組織を、200mMNaCl、100mMTrispH8.5、5mMEDTA、0.2SDSおよび0.5mg/mlプロテイナーゼKを含有する溶解緩衝液中、55°Cにて一晩消化した。次の日、このDNAを、フェノール/クロロホルム50:50で一度、クロロホルム/イソアミルアルコール24:1で一度抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。TE10mMTrispH7.5、1mMEDTAに再懸濁して、8~10μgの各DNAサンプルを、EcoRIのような制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動に供し、そして、荷電したナイロン膜例えば、HyBondNAmersham,ArlingtonHeights,ILに移した。次いで、得られたフィルターを、マウスBeer遺伝子座に由来し、かつ内因性遺伝子座に由来するフラグメントおよびトランスジーンに由来する異なるサイズのフラグメントの両方を認識し得る放射能標識したDNAフラグメントと共にハイブリダイズした。ファウンダー動物を正常な非トランスジェニックマウスと交配させ、Beer遺伝子の過剰発現の効果を決定するために十分な数のトランスジェニック子孫および非トランスジェニック子孫を作製した。これらの研究のために、種々の齢の動物例えば、1日齢、3週齢、6週齢、4ヶ月齢を、広範な骨格形成、骨塩密度、骨塩含有量、破骨細胞および骨芽細胞の活性、軟骨内骨化の程度、軟骨形成などを確認するために設計された多数の異なるアッセイに供する。トランスジーンからの転写活性は、種々の組織からRNAを抽出し、そして、トランスジーンが由来するマウス株129Sv/JとDNAマイクロインジェクションのために用いたマウスの株[C57BL5/J×SJK/JF2]との間の一塩基多型を利用するRT-PCRアッセイを用いることによって、決定され得る。動物モデル-II相同組換えによるマウスBeer遺伝子の破壊胚性幹ES細胞における相同組換えを用いて、内因性のマウスBeer遺伝子を不活性化し、その後、機能喪失変異を保有する動物を作製し得る。E.coliのβ-ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を、その発現が、内因性のBeer遺伝子プロモーターおよび翻訳開始シグナルにより制御されるように、ターゲティングベクター内に遺伝子操作する。この方法において、Beer遺伝子発現の空間的かつ時間的なパターンが、ターゲティングされた対立遺伝子を保有する動物において決定され得る。このターゲティングベクターを、まず、pGT-N29NewEnglandBiolabs,Beverly,MAに由来する薬物選択可能なホスホグリセレートキナーゼPGKプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子neoカセットを、クローニングベクターpSP72Promega,Madson,WIにクローニングすることによって構築した。PCRを用いて、P1Creリコンビナーゼの認識部位であるバクテリオファージP1loxP部位Hoessら、PNASUSA,79:3398,1982に、PGKneoカセットを隣接させた。このことにより、ターゲティングされたES細胞、またはES細胞が由来する動物における、neo耐性マーカーのその後の除去が可能となる米国特許第4,959,317号。このPCRプライマーを、34ヌクレオチドntdのloxP配列、12~25ntdのPGKneoカセットの5’末端および3’末端、ならびに、pSP72にクローニングするための制限酵素認識部位センスプライマーにおいてはBamHI、そしてアンチセンスプライマーにおいてはEcoRIから構成された。センスプライマーの配列は、5’-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3’配列番号34であり;アンチセンスプライマーの配列は、5’-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3’配列番号35であった。次の段階は、E.coliのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子、およびpSVβClontech,PaloAlto,CAに由来するSV40ポリアデニル化シグナルを含有する3.6kbのXhoI-HindIIIフラグメントを、pSP72-PGKneoプラスミドにクローニングすることであった。マウスBeer遺伝子座に相同な短いアームshortarmを、BACクローン15G5に由来する2.4kbのフラグメントを増幅することによって作製した。このフラグメントの3’末端は、Beer遺伝子の翻訳開始部位と一致し、そして、PCRにおいて使用したアンチセンスプライマーはまた、そのコード領域がBeer開始部位にインフレームで融合し得るように、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の5’末端に対して相補的な30ntdを含んだ。短いアームをpSP72-βgal-PGKneoプラスミドに導入するために取られたアプローチは、このプラスミドを、β-gal遺伝子の上流にある部位で直線状にし、次いで、このフラグメントを短いアームのPCR産物と同時形質転換し、そして、このPCR産物が相同組換えによって組み込まれたプラスミドを選択することであった。短いアームの増幅のためのセンスプライマーは、この組換え事象を可能にするために、pSP72ベクターに対して相補的な30ntdを含んだ。このセンスプライマーの配列は、5’-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3’配列番号36であり、そして、アンチセンスプライマーの配列は、5’-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3’配列番号37であった。Beer遺伝子座に由来する長いアームlongarmを、希少切断制限酵素部位SgrAI、FseI、AscIおよびPacIを導入するプライマーを用いて、BACクローン15G5に由来する6.1kbのフラグメントを増幅することによって作製した。具体的には、センスプライマーの配列は、5’-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3’配列番号38であり;アンチセンスプライマーの配列は、5’-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3’配列番号39であった。得られたPCR産物を、中間的な工程として、TAベクターInvitrogen,Carlsbad,CAにクローニングした。マウスBeer遺伝子ターゲティング構築物はまた、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復エレメントRSVLTRの制御下に、第二の選択マーカーである、単純疱疹ウイルスIのチミジンキナーゼ遺伝子HSVTKを含んだ。この遺伝子の発現は、哺乳動物細胞を、ガンシクロビルに対して感受性かつ生存不能にする;それゆえ、この構築物が非相同的な事象により組み込まれたネオマイシン耐性細胞に対して選択するための簡便な方法である米国特許第5,464,764号。このRSVLTR-HSVTKカセットを、pPS1337から、後に長いアーム-TAベクタープラスミドのFseI部位およびAscI部位へのクローニングを可能にするプライマーを用いて増幅した。このPCRについて、センスプライマーの配列は、5’-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGATCTGA-3’配列番号40であり;アンチセンスプライマーの配列は、5’-ATTACGGCGCGCCCCTCACAGGCCGCACCCAGCT-3’配列番号41であった。ターゲティングベクターの構築の最終段階は、長いアームおよびRSVLTR-HSVTK遺伝子を含有する8.8kbのSgrAI-AscIフラグメントを、pSP72-短いアーム-βgal-PGKneoプラスミドのSgrAI部位およびAscI部位にクローニングする工程を包含する。このターゲティングベクターを、ES細胞にエレクトロポレーションする前に、AscIまたはPacIのいずれかで消化することによって直線状にした。実施例10アンチセンス媒介性のBeerの不活性化最初のオリゴヌクレオチドの5’末端が、Beer転写物の転写開始AUGと重なり、そして次のオリゴヌクレオチドの5’末端が、BeerのAUGに対して5’方向に5ヌクレオチド増分移動を生じる50ヌクレオチド離れるまでような方法で重なる形式で、17ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する。等価な塩基組成を用いるが、コーディングmRNAに対するあらゆる有意なハイブリダイゼーションを阻害するために、配列は再分配して、対応するコントロールオリゴヌクレオチドを設計および調製する。この試験細胞系への試薬の送達を、カチオン性脂質送達P.L.Felgner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413,1987により行なう。2μgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、100μlの低血清培地Opti-MEMI低血清培地;LifeTechnologies,GaithersburgMDに添加し、そしてこれを、100μlの低血清培地中のLipofectin試薬6μlLifeTechnologies,GaithersburgMDと混合する。これらを混合し、室温にて30分間複合体形成させ、そして、この混合物を、前もって播種しておいたMC3T3E21細胞またはKS483細胞に添加する。これらの細胞を培養し、そしてmRNAを回収する。BeermRNAを、Beer特異的なプライマーと組合せたRT-PCRを用いてモニタリングする。さらに、別々の実験ウェルを回収し、そして、実施例4に記載されたウエスタンブロット法によりタンパク質レベルを特徴付ける。この細胞を収集し、溶解緩衝液50mMTrispH7.5、20mMNaCl、1mMEDTA、1SDS中に再懸濁し、そして、可溶性タンパク質を回収する。この物質を、10~20勾配の変性SDS-PAGEに適用する。分離したタンパク質をニトロセルロースに移し、そして、記載された抗体試薬を用いて、上記のようにウエスタンブロットを実施する。並行して、コントロールオリゴヌクレオチドを同一の培養物に添加し、そして、実験操作を繰り返す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理が、コントロールと混ぜたオリゴヌクレオチドと比較したいずれの場合においても50の変化を生じた場合、BeermRNAまたはBeerタンパク質のレベルの低下を有意であると考える。この方法論は、選択的な遺伝子の不活性化、およびこれらの組織培養モデルにおける、その後の石灰化した小結節の表現型の特徴づけを可能にする。実施例11スクレロスチンコア領域のモデル化相同性認識技術例えば、PSI-BLASTAltschulら、NucleicAcidsRes.25:3389-4021997、FUGUEShiら、J.Mol.Biol.310:243-572001は、SOSTのコア領域SOST_Coreが、シスチンノットの折り畳みを採用することを示唆した。FUGUEは、配列と構造との間の相同性を検出するための感度のいい方法である。実験的に決定された3D構造が公知のヒト絨毛性ゴナドトロピン-βhGC-βは、FUGUEにより、SOST_Coreの最も近い相同体として同定されたShiら、前出。それゆえ、hCG-βは、SOST_Coreのための3Dモデルを構築するための構造的な鋳型として用いられた。SOST_Coreおよびその近い相同体のアラインメントを図7に示す。アラインメントで示される相同体の中でも、hCG-βCGHBのみが既知の3D構造を有した。SOST_CoreとhCG-βとの間の配列同一性は、約25であった。8つのCYS残基が、ファミリー間で保存されており、SOST_CoreとhCG-βとの間の全体的な構造類似性を際立たせている。これらのシスチンの対1-5、3-7、4-8は、ノット配置でジスルフィド結合図7において実線で示すを形成し、これは、シスチンノットの折り畳みに特徴的であった。図7に点線で示される付加的なジスルフィド結合2-6は、このファミリーに固有のものであり、他のシスチンノットファミリー例えば、TGF-β、BMPと、このタンパク質のファミリーを区別した。SOST_Coreを、構造的な鋳型として、hCG-βの3D構造Wuら、Structure2:545-581994であるPDBBermanら、ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.58Pt6Pt1:899-9072002エントリー1HCNを用いてモデル化した。モデルを、MODELERSaliおよびBlundell,J.Mol.Biol.234:779-8151993を用いて計算した。最良なモデルのスナップ写真を図8に示す。多くのシスチンノットタンパク質は、モノマーの疎水性コアを欠いているので、ダイマーを形成するScheuflerら,前出;SchluneggerおよびGrutter,J.Mol.Biol.231:445-581993;Wuら,前出。SOSTは、おそらく同じ規則に従い、そして、その安定性を増すために、ホモダイマーを形成する。ダイマー化したSOST_Core領域についてのモデルを構築することは、以下の理由から、いくつかの課題を提示した:1SOST_CoreとhCG-βとの間の配列類似性が低かった25;2ホモダイマーの代わりに、hCG-βは、hCG-αとヘテロダイマーを形成した;ならびに3モノマーの多数の異なる相対的立体配置が、異なるファミリーに由来するダイマー化したシスチンノットタンパク質例えば、PDGF、TGF-β、ニューロトロフィン、IL-17F、ゴナドトロピンにおいて観察されており、これは、SOSTのダイマー立体配置が、hCG-α/βヘテロダイマー立体配置から有意に偏向し得ることを示唆した。このモデルを構築する際に、手動の調整と組合せて構造重ね合わせ技術を用いて、ヘテロダイマー構造1HCNに由来するhCG-βでhCG-αを置き換え、次いで、擬hCG-βホモダイマー構造に従ってSOST_Coreホモダイマーモデルを構築した。最終的なモデルを図9に示す。実施例12SOST-BMP相互作用のモデリング本実施例は、BMPにおけるI型およびII型レセプター結合部位のタンパク質モデリングを記載し、この結合部位は、BMPとSOSTとの間の相互作用に関係する。競合研究は、SOSTが、BMPへの結合に関してI型レセプターおよびII型レセプターの両方と競合したことを示した。ELISAベースの競合アッセイでは、BMP-6が、スクレロスチンでコーティングした表面300ng/ウェルと高い親和性KD=3.4nMで選択的に相互作用した。増加量のBMPレセプターIAFC融合構築物は、BMP-611nMへの結合に関してスクレロスチンと競合したIC50=114nM。10倍のモル過剰のBMPレセプターは、BMP-6に対するスクレロスチンの結合を約50まで減少させるのに十分であった。この競合を、BMPレセプターII-FC融合タンパク質IC50=36nMおよびDANIC50=43nMでも観察した。このアッセイの特異性を、スクレロスチンとrアクチビンR1B-FC融合タンパク質BMPに結合しなかったTGF-βファミリーメンバーとの間の、BMP-6への結合に関する競合の欠如によって示した。BMPポリペプチドにおけるI型およびII型レセプター結合部位は、マッピングされており、そして空間的に分離していたScheuflerら、前出;Innisら、前出;Nickelら、前出;Hartら、前出。高い親和性でBMPに結合する別のBMPアンタゴニストであるNogginは、NogginのN末端部分を介して、I型およびII型レセプター結合部位の両方においてBMPに接触するGroppeら、前出。C末端付近のコア領域中の2つのβ鎖はまた、II型レセプター結合部位においてBMPに接触する。手動調整されたNogginとSOSTとのアラインメントは、この2つのポリペプチドが、タンパク質のN末端部分間とコア領域との間の配列類似性を共有することを示した。アミノ酸配列アラインメントを、図10に示す。特徴的なcys-knotを形成するシステイン残基が、NogginとSOSTとの間で観察された。全体の配列同一性は、24であり、N末端結合領域アラインメント位置1~45内の配列同一性は、33であった。NogginのN末端結合領域における2つの残基すなわち、アラインメント位置21のLeuLおよび位置23のGluEは、BMP結合において重要な役割を果たすと報告されたGroppeら、前出。両方の残基は、SOSTでも同様に保存された。コア領域アラインメント位置131~228内の配列同一性は、約20であったが、cys-knot骨格は維持され、そして十分な数の重要な残基が保存され、NogginとSOSTとの間の相同性を支持している。Noggin構造をSOSTともまた比較して、どのように2つのSOSTモノマーが二量化するのかを理解した。図11に示されるように、Noggin構造は、N末端領域とコア領域との間のリンカーが、2つの領域を接続することにおいて役割を果たすだけでなく、2つのNogginモノマー間で二量体化界面の一部を形成することを示唆した。NogginとSOSTとの間の1つの主な違いは、N末端領域とコア領域との間のリンカーがSOSTで非常に短かったことであった。SOSTのC末端領域は、SOST二量体化で役割を果たし得る。Nogginの配列はコア領域で終わったが、SOSTは、余剰なC末端領域を有した。Noggin構造では、ジスルフィド結合が2つのNogginモノマーのC末端を接続した。従って、SOSTのC末端領域は、2つのモノマーの界面の近くから始まり、二量体化に寄与し得た。さらに、二次構造予測は、SOSTのC-末端領域のいくらかの部分がヘリックスを形成する傾向を有することを示した。SOST中のこの領域は、おそらくヘリックス-ヘリックスパッキングpackingこれは、Nogginにおける長いリンカーの昨日の模倣であるを通じて二量体化活性に関与し得る。NogginとSOSTとの構造間の別の違いは、アラインメント位置169~185におけるSOSTコア領域におけるアミノ酸挿入であった図10を参照のこと。この挿入は、β-ヘアピンを広げ、これはNoggin構造中の二量体化界面に向いていた図11ではモノマーの中央にかつC末端Cys残基の上にループ領域として示される。この広がったβ-ヘアピンもまた、SOST二量体化に寄与し得た。実施例13SOSTペプチド免疫原の設計および調製本実施例は、SOSTペプチド免疫原の設計を記載し、この免疫原は、動物を免疫しBMPとSOSTとの間の相互作用をブロックしかつSOSTモノマーのダイマー形成を妨げる抗体を生成させるために使用される。BMP結合フラグメントSOSTとNogginとの間の全体的な類似性、および2つのポリペプチドのN末端領域間の類似性は、SOSTがNogginと類似の様式でBMPと相互作用し得ることを示唆する。つまり、SOSTのN末端領域は、BMPにおけるI型およびII型レセプター結合部位の両方と相互作用し得、そしてコア領域図10のアミノ酸アラインメント位置190~220の一部は、II型レセプター結合部位と相互作用し得、その結果、これらのSOST領域に特異的な抗体は、BMPのSOSTへの結合をブッロクするかまたは弱め得る。ラットおよびヒトSOSTに対するこれらのSOSTポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、以下のように提供される。SOST_N_リンカー:N末端領域コア領域に接続する短いリンカーを含むSOST_コア_結合:BMPのII型レセプター結合部位においてBMPと接触する可能性を有するコア領域の部分両方の末端においてわずかに伸ばされてCYS残基アンカーを含む:SOST二量体化フラグメントSOSTのC末端領域は、SOSTホモダイマーの形成に関与する可能性を有する実施例12を参照のこと。伸長したβ-ヘアピンもまた、ホモダイマー形成で役割を果たし得る。このような領域に特異的に結合する抗体は、SOSTモノマーの二量体化を妨げるか弱め得る。このことにより、続いて、SOSTとの間の相互作用を妨げ得る。これらの領域に対応するラットおよびヒトのSOSTにおけるポリペプチドフラグメントは、以下のとおりである。SOST_C:C末端領域SOST_コア_ダイマー:SOST二量体化に関与する可能性を有するコア領域の部分両方の末端でわずかに伸ばされてCys残基アンカーを含む:SOSTのN末端におけるBMP結合フラグメントSOSTの重要なN末端結合領域図10におけるアラインメント位置1~35を、Noggin/BMP-7複合体構造ProteinDataBank登録番号:1M4Uおよびアミノ酸配列アラインメント図10を参照のことを基にモデリングして、BMPと相互作用する可能性を有するSOSTのN末端のアミノ酸残基を同定した。SOSTのモデルは、図12に示されている。比較モデルでは、SOST配列におけるアラインメント位置8矢印および付随の文章を参照のことにおけるフェニルアラニンPhe、Fが、BMPダイマーの表面上の疎水性ポケットに突き出ている。同様のノブ-穴knob-into-holeの特徴が、BMPとI型レセプターとの複合体構造で観察されておりNickelら、前出、レセプターのPhe85が、同様のポケットに適合し、このことがTGF-βスーパーファミリーメンバー例えば、TGF-βファミリー、BMPファミリーなどを含むに対するリガンド-I型レセプター認識において重要な特徴である。このモデルに従って、プロリンProによるターンPro-directedturnもまた保存され、これが、N末端結合フラグメントがBMPダイマー表面に沿って進み、I型レセプター結合部位からその複合体の反対側のII型レセプター結合部位に移動することを可能にする。また、結合フラグメントのカルボキシ末端付近のProが指示する別のターンが保存され、次いでこれは、リンカー領域に接続する。SOSTとBMPとの間の広範な接触は、図12において明らかである。ペプチド免疫原ペプチドを、BMPタンパク質と接触することが予想されるSOSTのN末端領域を含むように設計した。そのペプチド配列を以下に示す。動物を免疫するために、ペプチド配列を重複するように設計し、そして追加のシステインをそのC末端の終端に付加して、KLHへの架橋を容易にした。次いで、このペプチドを、免疫するために使用した。その免疫原のペプチド配列は、以下のとおりである。ヒトSOST:追加のCysを含むヒトSOSTペプチド:ラットSOST:追加のCysを含むラットSOSTペプチド:以下のペプチドを、BMPタンパク質と接触すると予想されるコア領域のアミノ酸部分を含むように設計した。システインを、KLHへの結合のために、各ペプチドのC末端の終端に付加し、その結合ペプチドを免疫に使用した。ドッキングコアN末端ペプチドにおいて、KLHへの二重の結合を回避するために、内部のシステインをセリンに変更した。ヒトSOSTについて:付加されたCys残基を含まないアミノ酸配列:ラットSOSTについて:付加または置換されたCys残基を含まないアミノ酸配列:付加または置換されたCys残基を含むペプチド免疫原:SOSTホモダイマーを形成するように相互作用する可能性のあるSOST内の2つの領域は、Nogginに存在しないSOSTコア領域を有するアミノ酸を含む。この配列を含むように設計したヒトSOSTペプチドは、KLHに結合するC末端CysまたはN末端Cysを有した。ラットSOSTペプチドについて、システインを、その配列のカルボキシ末端に付加した配列番号76。KLH結合ペプチドを免疫のために使用した。ヒトSOSTについて:ラットSOSTについて:付加されたシステインを含むラットSOSTペプチドSOSTホモダイマーを形成するように相互作用する可能性のあるSOST内の第2の領域は、C末端領域を含む。ペプチド免疫原を、この領域内のアミノ酸配列を含むように設計した以下を参照のこと。KLHへの結合のために、システイン残基を、C末端の終端に付加し、その結合ペプチドを免疫のために使用した。ヒトSOSTについて:C末端に付加されたCysを含むペプチド免疫原:ラットSOSTについて:C末端に付加されたCysを含むペプチド免疫原:実施例14TGF-β結合タンパク質に対する抗体の結合を検出するためのアッセイ本実施例は、スクレロスチンに対するリガンド例えば、抗体またはその抗体フラグメントの結合を検出するためのアッセイを記載する。FLAG登録商標-スクレロスチン融合タンパク質を、製造業者SigmaAldrich、St.Louis,MOにより提供されるプロトコールおよび米国特許第6,395,511号に記載のプロトコールに従って調製した。96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルを、抗FLAG登録商標モノクローナル抗体SigmaAldrichでコーティングし、次いで、PBS中の10BSAでブロックする。上記融合タンパク質20ngを100μlPBS/0.2BSAに添加し、96ウェルプレート上へ室温で60分間吸着させる。このタンパク質溶液を取り出し、ウェルを洗浄して未結合の融合タンパク質を除去する。BMP例えば、BMP-4、BMP-5、BMP-6またはBMP-7を、PBS/0.2BSAに希釈し、各ウェルに10pM~500nMの範囲の濃度で添加する。室温で2時間インキュベート後、結合溶液を取り出し、プレートを200μl体積のPBS/0.2BSAで3回洗浄する。スクレロスチンに対するBMPの結合を、標準的なELISA技術例えば、Ausubelら、CurrentProtocolsinMolBiol.Vol211.2.1~11.2.221998を参照のことに従って、そのBMPに特異的なポリクローナル抗血清抗体またはモノクローナル抗体、および適切な酵素結合二段階試薬を用いて検出する。特異的結合を、全結合から非特異的結合を差し引くことによって計算し、LIGANDプログラムMunsonandPodbard,Anal.Biochem.107:220~391980を用いて分析する。BMPに対するスクレロスチンの結合をまた、均一時間分解蛍光検出homogeneoustimeresolvedfluorescencedetectionMellorら、JBiomol.Screening、3:91-991998によって検出する。スクレロスチンをコードするポリヌクレオチド配列を、組換え核酸構築物におけるヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能に連結し、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法に従って、ヒトFc-スクレロスチン融合タンパク質として発現させる。同様に、BMPリガンドを操作し、BMP-マウスFc融合タンパク質として発現させる。これらの2つの融合タンパク質を一緒にインキュベートし、Mellorらによって記載されるようにアッセイを行う。実施例15TGF-β結合タンパク質に対するTGF-βファミリーメンバーの結合を阻害する抗体のためのスクリーニングアッセイ本実施例は、スクレロスチンに対するTGF-βファミリーメンバーの結合を阻害する抗体を検出するための方法を記載する。ELISAを、BMP濃度をそのKd例えば、BIAcore分析によって決定されるで固定した状態にすることを除いて、基本的に実施例14に記載されるように実施する。さらに、抗体または抗体のライブラリーもしくはコレクションを、ウェルに1μMの濃度まで加える。抗体を室温で2時間、BMPおよびスクレロスチンと共にインキュベートし、その溶液を取り出し、そして結合したBMPを記載されるように実施例14定量する。抗体の非存在下で観察されるBMPの結合の40を阻害する抗体は、この相互作用のアンタゴニストであると考えられる。これらの抗体をさらに、潜在的なインヒビターとして、力価研究を実施してTGF-β結合タンパク質の結合親和性におけるそれらの阻害定数および阻害効果を決定することによって評価する。同等の特異性コントロールアッセイもまた、BMPリガンドの作用に依存するアッセイ例えば、BMP/BMPレセプター競合研究を用いて、同定されたアンタゴニストについての選択的プロフィールを確証するために行ってもよい。実施例16骨基質へのTGF-β結合タンパク質局在化の阻害骨基質ハイドロキシアパタイトへの局在化の阻害の評価を、Nicolasの方法Calcif.TissueInt.57:206-121995に対する改変を用いて行う。簡単に述べると、125I標識TGF-β結合タンパク質を、Nicolas前出により記載されるように調製する。ハイドロキシアパタイトを、ポリプロピレン濾過膜Polyfiltroninc,WeymouthMAを備える96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。次いで、PBS緩衝液中の0.2アルブミンに希釈したTGF-β結合タンパク質を、ウェルに添加する。基質を含むウェルをPBS緩衝液中の0.2アルブミンで3回洗浄する。吸着されたTGF-β結合タンパク質を、0.3MNaOHを用いて溶出し、次いで、定量する。ハイドロキシアパタイトに対するスクレロスチンTGF-β結合タンパク質の結合を阻害するかまたは弱める抗体を、TGF-β結合タンパク質をこの抗体と共にインキュベートし、その混合物を上記のように基質に適用することによって同定する。その基質を、PBS緩衝液中の0.2アルブミンで3回洗浄する。吸着されたスクレロスチンを、0.3MNaOHで溶出し、次いで、定量する。抗体の非存在下で観察される結合レベルと比較して、ハイドロキシアパタイトに対するスクレロスチンの結合レベルを少なくとも40阻害する抗体は、骨局在化インヒビターであると考えられる。このような抗体を、用量応答研究でさらに特徴付けして、TGF-β結合タンパク質の結合親和性におけるその阻害定数および阻害効果を決定する。上記から、本発明の特定の実施形態が、例示目的のために本明細書に記載されてきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いては、限定されない。"