"熱安定性DNAポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定する方法であって:a核酸候補混合物を調製し;bあらかじめ決定された温度で、前記ポリメラーゼと核酸候補混合物を接触させ、ここで、その温度で、候補混合物に比較し、前記ポリメラーゼに増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である;c増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配し;そしてd増加した親和性を有する核酸を増幅し、前記ポリメラーゼに対する結合に関し、相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を生じ、ここで前記にて同定された前記ポリメラーゼの核酸リガンドの塩基配列が以下からなる群から選択されるものである:i配列番号89-95、113-114、および116-118の内の一つ;およびii前記iの配列番号の一つと80を超える一次配列相同性を有する配列ことを含む、前記方法。請求項1の方法であって、さらに:e工程b、c、およびdを反復することを含む、前記方法。請求項1の方法であって、前記DNAポリメラーゼが、TZ05ポリメラーゼである、前記方法。請求項1の方法であって、前記核酸候補混合物が一本鎖核酸で構成される、前記方法。熱安定性DNAポリメラーゼの活性を阻害する方法であって、請求項1の方法にしたがって同定された高親和性熱安定性DNAポリメラーゼ核酸リガンドの有効量を、DNA重合反応に添加することを含む、前記方法。請求項5の方法であって、前記DNAポリメラーゼがTZ05ポリメラーゼである、前記方法。以下からなる群から選択される精製されそして単離された、非天然発生核酸:i配列番号89-95、113-114、および116-118の内の一つ;およびii前記iの配列番号の一つと80を超える一次配列相同性を有する配列の核酸であって、熱安定性DNAポリメラーゼの活性を阻害する核酸;およびiii前記iまたはiiの配列に相補的な核酸配列を有する配列。ポリメラーゼ連鎖反応PCRを行う方法であって:a増幅しようとする核酸配列を含む試料を、増幅しようとする配列に隣接する配列と相補的なプライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、および該ポリメラーゼを55°Cで阻害することが可能であり、それにもかかわらず55°Cより高い温度でポリメラーゼが活性化されることを可能にする核酸リガンドと混合し;そしてb標的核酸を融解し、標的核酸にプライマーをアニーリングさせ、そして標的核酸を合成する標準的PCR工程を、混合物の熱反復により行う、ここで、前記核酸リガンドの塩基配列は以下からなる群から選択されるものである:i配列番号89-95、113-114、および116-118の内の一つ;およびii前記iの配列番号の一つと80を超える一次配列相同性を有する配列ことを含む、前記方法。請求項8の方法であって、前記熱安定性DNAポリメラーゼがTZ05ポリメラーゼである、前記方法。熱安定性DNAポリメラーゼの活性を阻害する方法であって、請求項1の方法にしたがって同定された、前記DNAポリメラーゼを阻害する核酸リガンドを、前記リガンドが重合を阻害する温度またはそれ以下の温度で維持されている、DNA重合反応に添加することを含む、前記方法。請求項10の方法であって、前記DNAポリメラーゼがTZ05ポリメラーゼである、前記方法。核酸スイッチを同定する方法であって:a核酸候補混合物を調製し;b熱安定性DNAポリメラーゼと核酸候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物に比較し、前記ポリメラーゼに増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である;c増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物状態から分配し、それにより増加した親和性を有する核酸を、環境パラメーターの変動に際し、前記ポリメラーゼへの親和性を欠くことに基づき、さらに分配し;そしてd増加した親和性を有する核酸を増幅し、ポリメラーゼに対する結合に関し、相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を生じ、ここで前記にて同定された核酸の塩基配列が以下からなる群から選択されるものである:i配列番号89-95、113-114、および116-118の内の一つ;およびii前記iの配列番号の一つと80を超える一次配列相同性を有する配列ことを含む、前記方法。請求項12の方法であって、前記DNAポリメラーゼがTZ05ポリメラーゼである、前記方法。実施例1.実験法A.材料および方法100mMKCl、20mMTris-HClpH8.0、0.1mMEDTA、50グリセロールv/vおよび0.2Tween20からなる緩衝液中に懸濁された組換えTaqポリメラーゼrTaq;Mr94kDa;50mMBicine-KOHpH8.3、90mMKClおよび50グリセロールv/vからなる緩衝液に懸濁された組換えTthポリメラーゼrTth;Mr94kDa;およびサーマス種Z05TZ05polはRocheMolecularSystems,Inc.カリフォルニア州アラメダより購入した。Taq、TthおよびUlTmaDNAポリメラーゼは、PerkinElmerから得た。Ultmaポリメラーゼは、Tmaポリメラーゼの欠失型であり、野生型5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。TliおよびTflDNAポリメラーゼは、Promegaより購入した。TbrポリメラーゼサーマラーゼThermalaseTbrは、AmrescoInc.より得た。対称的分岐3’-3’結合CPGおよびC-6チオール修飾剤ホスホロアミダイトは、Clontechカリフォルニア州パロアルトより得た。ULTRALINKTMヨードアセチルビーズは、PierceChemicalsイリノイ州ロックフォードより購入した。DNAの放射標識に用いた酵素は、BoehringerMannheimインディアナ州インディアナポリスより得た。すべての他の試薬および化学薬品は、解析等級であり、そして標準的な商業的供給源より購入した。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドは、標準的固相シアノエチルホスホロアミダイト化学反応により合成し、そして均一な大きさにする、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動または逆相高圧液体クロマトグラフィーにより、精製した。対称的ホモ二量体は、対称的分岐3’-3’結合CPGを用いて合成した。DNA濃度は、33μg/ml=1A260単位に基づいた。アフィニティービーズの調製5’末端にチオール基を含む、リガンドTQ21配列番号59またはTQ30配列番号50表3いずれか25ナノモルを、製造者の指示にしたがい、AgNO3およびジチオスレイトールDTTで脱保護した。過剰なDTTは、等体積の酢酸エチルを用いた、4回の連続抽出により、除去した。その後、50mMTris-HClpH8.3および5mMEDTAからなる緩衝液で2回洗浄しておいた500μlのULTRALINKTMヨードアセチルビーズと、脱保護リガンドを混合した。反応混合物を、回転プラットホーム上で、室温で2時間、インキュベーションした。ヨードアセチルビーズの未反応部位は、同緩衝液中の0.5Mシステイン溶液50μlと混合物を15分間反応させることにより、キャップ化した。コントロールビーズは、0.5Mシステイン500μlとヨードアセチルビーズ500μlを反応させることにより、調製した。反応後、75μMヘパリン、12.5mMMgCl2、50mMKClおよび10mMTris-HClpH8.3からなるPCR緩衝液500μlで、ビーズを5回洗浄した。B.SELEXSELEX法は、本明細書に完全に援用される、米国特許第5,270,163号に、詳細に記載されている。表1に示されるテンプレートおよびプライマーを用い、室温および上昇した温度で、SELEX実験を行った。室温Taqポリメラーゼに対する選択は、10mMTris-HClpH8.3:22°C、50mMKClおよび2.5mMMgCl2からなる緩衝液Taq結合緩衝液中で、室温で行った。Tthポリメラーゼに対する選択は、50mMBicine-KOHpH8.3:25°C、90mMKClおよび3.5mMMnOAc2からなる緩衝液Tth結合緩衝液中で行った。各SELEX実験は、固定構造の5’および3’領域が隣接する、30ヌクレオチドランダム領域からなる、合成のゲル精製ランダム配列プール一本鎖DNAssDNA表15nmolで開始した。典型的な選択周期では、適切な結合緩衝液に懸濁したssDNAを90°Cで3分間加熱し、氷上で冷却し、そしてその後、室温にした。室温に平衡化すると、競合剤としての2nmolのtRNAおよび0.01ヒト血清アルブミンhSAの存在下で、適切な標的ポリメラーゼとDNAを、15分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター0.45μM、Milliporeを通じ、吸引下で、ニトロセルロースろ過することにより、未結合DNAからポリメラーゼ-DNA複合体を分離した。フィルターを直ちに、結合緩衝液20ml、結合緩衝液中の0.5M尿素、および水中の0.5M尿素で洗浄した。フィルターに保持されたDNAを溶出し、そしてキャリアーtRNA5μgの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。単離DNAを、プライマーセットI表1を用いたPCRにより、増幅した。プライマー鎖の1つは、5’末端に3つの連続するビオチンを含んだ。生じた二重鎖DNAの非ビオチン化鎖を、変性条件下でゲル電気泳動により単離しPagratis1996NucleicAcidRes.24:3645-3646、そして次の選択周期に用いた。続く周期で、標的ポリメラーゼとのインキュベーション前に、DNAプールをニトロセルロースフィルターに通過させ逆選択、ニトロセルロースフィルターに結合するDNA配列を除去した。標的ポリメラーゼのピコモル数は、SELEXの経過中、次第に減少させ、高親和性結合の配列に関する選択圧を増加させた。各選択中のDNA量は、タンパク質量の少なくとも5倍に維持され、高親和性結合DNA配列に関する競合を確実にした。SELEXの進行は、濃縮プールのニトロセルロースフィルター結合解析によりモニターした。最高の親和性の結合を示した濃縮プールは、プライマーセットIIを用いてPCR増幅し、生じた二重鎖DNAの末端にBamHIおよびEcoRI制限部位を取り込んだ。このDNAをゲル精製し、そしてBamHIおよびEcoRIで消化し、そして標準的技術を用い、同一酵素であらかじめ消化されたプラスミドpUC18ベクターにクローニングしたSambrookら1989MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,中,第3部,pC.1.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー。クローンを単離し、そして標準的ジデオキシ配列決定技術により、配列決定したU.S.Biochemical、オハイオ州クリーブランドのSequenaseキット。高温SELEX50mMTricine-KOHpH8.0、50mMKOAcpH7.5、2.5mMMgOAc2および10グリセロールからなる結合緩衝液Tricine緩衝液中で、55°Cで、Taqポリメラーゼに対する高温での親和性選択を行った。本選択の出発ライブラリーは、10mMTris-HClpH8.3、50mMKClおよび2.5mMMgCl2からなる結合緩衝液中で、室温で行った親和性選択由来の12回目の周期のssDNAであった表3DangおよびJayasena1996J.Mol.Biol.264:268。大文字は、5’-TTCTCGGTTGGTTCTCTGGCGGAGC-および-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’固定配列が隣接する、30ヌクレオチドntランダム領域を示す。ファミリーI配列の下線領域は、塩基対形成に関し相補的である。後者のライブラリーは、配列5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-[N]30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’配列番号1;表1を用い、合成ランダム配列ssDNAライブラリーから濃縮した。Tricine結合緩衝液に懸濁した12回目の周期のssDNAライブラリー5nmolを用い、高温親和性選択を開始した。本懸濁物を95°Cで3分間加熱し、氷上で5分間冷却し、そして55°Cにした。2nmolのtRNA競合剤として使用、0.01w/v;最終濃度のhSAヒト血清アルブミンおよびTaqポリメラーゼ125nMをDNA懸濁物に添加し、そして55°Cで15分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター0.45μM;Milliporeを通じ、吸引下で、迅速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合DNAを回収した。フィルターを直ちに、20ml体積の結合緩衝液、続いて同体積の結合緩衝液中の0.5M尿素で洗浄した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ60°Cに温めた。フィルターに保持されたDNAを溶出し、そしてキャリアーとして用いる5μgのtRNAの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。単離DNAは、上述のようにプライマーセットI表1を用いたPCRにより増幅した。Taqpolに対する高親和性結合DNA配列の濃縮を確実にするため、選択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、Taqポリメラーゼおよび各周期で用いられるDNA両方の量を次第に減少させると共に、フィルター保持DNAのストリンジェントな洗浄により、達成した。濃縮ライブラリーの親和性は、ニトロセルロースフィルター結合によりモニターした以下に記載される。8周期の選択後、有意な親和性の改善は見られなかった。8回目の周期のライブラリーを、上述のようにプライマーセットII表1を用いてPCR増幅した。ジデオキシ配列決定技術USBのSequenaseキットにより、形質転換体のDNA挿入物を配列決定することにより、濃縮ライブラリーの複雑さを解析した。50mMTricine-KOH、125mMKOAc、2.5mMMnOAc2および8グリセロールからなる結合緩衝液TZ05pol緩衝液中で、55°Cで、TZ05ポリメラーゼに対する親和性選択を行った。結合緩衝液は、1MTricine-KOHpH8.0、3MKOAcpH7.5、25mMMnOAc2および80グリセロールのストック溶液を混合することにより、調製した。同一条件下で、異なるssDNAライブラリーから出発し、2つの親和性選択を行った。1つの選択は、5nmolの合成ランダム配列ssDNAライブラリー;5’-TTCTCGGTTGGTCTCTGGCGGAGC-[N]30-TCTTGTGTATGATTCGCTTTTCCC-3’配列番号1;表1で開始した。他の選択の出発ライブラリーは、室温で、Taqポリメラーゼに対して行った親和性選択由来の12回目の周期のssDNAライブラリーであった表3。結合緩衝液に懸濁したssDNAライブラリーを95°Cで3分間加熱し、氷上で5分間冷却し、そしてその後、55°Cにした。2nmolのtRNA競合剤として使用、0.01w/v;最終濃度のhSAヒト血清アルブミンおよびTZ05ポリメラーゼ125nMをDNA懸濁物に添加し、そして55°Cで15分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター0.45μM;Milliporeを通じ、吸引下で、迅速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合DNAを回収した。フィルターを直ちに、20mlの結合緩衝液、および結合緩衝液中の0.5M尿素で洗浄した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ60°Cに温めた。フィルターに保持されたDNAを溶出し、そしてキャリアーとして用いた5μgのtRNAの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。単離DNAは、上述のようにプライマーセットI表1を用いたPCRにより増幅した。完全ランダムライブラリーで開始した選択には、標準的PCR増幅を用い、一方、Taqpolに対するあらかじめ選択されたライブラリーで開始した選択には、突然変異性PCR条件を用いた。突然変異性PCRは、生じたPCR産物のヌクレオチド多様性を増加させるよう意図され、以下のように行った。回収DNAは、まず、50mMKCl、10mMTris-HClpH8.3、1.1mMMnCl2、7mMMgCl2、1mMdCTP、1mMdTTP、0.2mMdGTP、0.2mMATPおよび1UのTaqポリメラーゼを含む100μl体積中で、94°C50秒、45°C45秒および72°C45秒を5周期の反復パラメーターで、PCRにより増幅した。上述のPCRから13μlを、上述のものと同じ条件下で、5周期行う、新規の100μlPCRのテンプレートとして用いた。後者の工程をさらに3回繰り返した。4回目の突然変異性PCR由来の13μlを、500μlPCRのテンプレートとして用い、次の選択に用いるssDNAプールを生成した。変性ポリアクリルアミドゲル上で分離された、生じた二重鎖PCR産物の非ビオチン化鎖を単離し、そして次の周期の選択に用いた。TZ05polに対する高親和性結合DNA配列の濃縮を確実にするため、選択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、TZ05ポリメラーゼおよび各周期で用いられるDNA両方の量を次第に減少させると共に、フィルターのストリンジェントな洗浄により、達成した。親和性濃縮は、濃縮ライブラリーの平衡解離定数を測定することにより、モニターした。その後、濃縮ライブラリーを、上述のようにプライマーセットII表1を用いてPCR増幅した。ジデオキシ配列決定技術USBのSequenaseキットにより、形質転換体のDNA挿入物を配列決定することにより、濃縮ライブラリーの複雑さを解析した。C.ニトロセルロースフィルター結合アッセイ室温オリゴヌクレオチドライブラリーおよび個々のリガンドの親和性を評価するため、ニトロセルロースフィルター結合技術を用いた。簡潔には、5’末端で標識したゲル精製32PssDNAプールを結合緩衝液に懸濁し、80°Cに加熱し、氷上で冷却し、そしてその後、室温にした。その後、DNA5-10pMを、0.1μgのtRNAおよび0.01hSAを含む、適切な結合緩衝液50μl中で、多様な量の標的ポリメラーゼと、室温で15分間インキュベーションした。DNA濃度は100pMより低く維持し、過剰なタンパク質濃度の存在下で平衡を確実にした。15分後、結合反応混合物を、あらかじめ湿らせたニトロセルロース/セルロースアセテート混合マトリックスフィルター0.45μm孔サイズ、MilloporeCorporation、マサチューセッツ州ベッドフォードに通過させ、そしてフィルターを直ちに5mlの結合緩衝液で洗浄した。フィルターに結合したDNAの量は、液体シンチレーション計測により、フィルターの放射能を測定することにより、定量化した。タンパク質の非存在下でフィルターに結合したDNAの量を、バックグラウンド訂正に用いた。各フィルターに保持された投入DNAのパーセントを、対応するポリメラーゼ濃度の対数に対しプロットした図1および2。非線形最小二乗法を用い、それぞれ、TaqおよびTthポリメラーゼに対するDNAリガンドの解離定数Kdを得たSchneiderら1995Biochemistry34:9599;Jellinekら1993Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.90:11227-11231。非選択ランダム配列プールは、およそ70nMの概算Kdで、Tthポリメラーゼに結合し図1B黒丸、一方、Taqポリメラーゼに対する本プールの結合のKdはおよそ50-100nMである図1A白丸。12周期の選択後、Taqポリメラーゼに対する結合のKdは、3.5nMであった図1A白丸。選択周期をさらに多くしても、親和性のさらなる改善は生じなかった。このように、Taqポリメラーゼに対する濃縮プールの結果的な親和性は、非選択ランダムプールに比較し、有意に改善された。Tthポリメラーゼで、同様の結果が得られ、10回目の周期からのプールは、5nMのKdを示した図1B白丸。Taqポリメラーゼに関して選択されたssDNAプールは、0.2nMのKdで、Tthポリメラーゼに非常に緊密な結合を示した図2A白丸。2つのポリメラーゼの間のアミノ酸配列同一性はおよそ87であるAsakuraら1993J.Ferment.Bioeng.76:265-269ため、この結果は驚くべきことではない。Tthポリメラーゼに関し選択されたプールは異なる方式でTaqポリメラーゼに結合し、結合は50レベル付近で飽和し図2B白丸、プール中の約半分の配列は、Taqポリメラーゼと相互作用しないことが示唆された。50飽和に基づき、概算Kdは0.3nMである。Tthポリメラーゼを用いて行った10周期の選択から得たssDNA配列を、表2に示す。Tthポリメラーゼ選択由来の29の個々のクローンを配列決定した可変30nt領域のみを表2に示す。配列類似性に基づき、配列を2つのファミリーに分類した。Taqポリメラーゼを用いて行った12周期の選択から得たssDNA配列を、表3に示す。33のユニーク配列を単離した。いくつかの配列中の小文字は、5’固定配列を示し、そして大文字は、30ヌクレオチドランダム領域を示す。配列類似性に基づき、配列を3つのファミリーに分類した。高温TaqおよびTZ05ポリメラーゼに対するアプタマーの結合親和性を、ニトロセルロースフィルター結合技術により、55°Cで測定した。簡潔には、末端標識アプタマーを、それぞれ、多様な濃度のTaqまたはTZ05ポリメラーゼと、50μlの結合緩衝液中で、55°Cで15分間、インキュベーションした。アプタマー-ポリメラーゼ混合物を、あらかじめ55°Cに温めた結合緩衝液を用い、あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター0.45μmに通過させた。55°Cに加熱した同緩衝液5mlを用い、フィルターを直ちに洗浄した。各ポリメラーゼには2つの緩衝液を用いた:50mMKCl、2.5mMMgCl2、10mMTris-HCl22°CでpH8.3、2ng/μlのtRNAおよび0.01hSAからなるTris緩衝液;並びに、50mMTricine-KOHpH8.3、50mMKOAcpH7.5、2.5mMMgOAc2、10グリセロール、2ng/μlのtRNAおよび0.01hSAからなるTaq緩衝液または50mMTricine-KOH、125mMKOAc、2.5mMMgOAc2、8グリセロール、2ng/μlのtRNAおよび0.01hSAからなるTZ05緩衝液。平衡解離定数Kd値は、非線形最小二乗法を用いることにより、計算した。55°Cで、Taqポリメラーゼを用いて行った選択8周期後のssDNA配列およびその発生頻度を表4に示す。個々の配列は表5に示す。各配列に関し、30ntランダム領域のみを示す。全長アプタマー中、ランダム領域は、表1に示される固定配列配列番号1に隣接する。表4でわかるように、出発ライブラリーの複雑さは有意に減少し;そして驚くべきことに、わずか6配列しか見られなかった。表4のデータは、63の読み取り可能な個々の配列の解析から得た。配列類似性に基づき、アプタマーを2つのファミリーに分類した。ファミリーIアプタマーは、出発ライブラリーのファミリーII配列に緊密に関連し表3および4を比較されたい;これらの2つのファミリーは、各表の囲み内に示される類似のコンセンサス配列モチーフを持つ。出発ライブラリーに存在するファミリーI配列のすべて表3は、高温での選択後、完全に消失し、これらのTaqポリメラーゼとの相互作用は、非常に温度感受性であったことを示した。最終ライブラリーでファミリーIIと分類された単一配列は、解析した配列のおよそ10に相当する。本配列は、ファミリーI配列とまったく異なり、そしてコンセンサスモチーフを欠く。出発および最終ライブラリーの配列複雑性の比較により、出発ライブラリー中の特定の配列は、新規選択条件に耐えず、そして順応してヌクレオチドが変化した他の配列が新規条件に耐えたことが示される。TZ05ポリメラーゼを用いて行った2つの選択の経過中、TZ05ポリメラーゼに結合し、そしてまた該ポリメラーゼを阻害する能力に関し、濃縮ライブラリーを試験した。ランダム配列ライブラリーで開始した選択は、選択14周期後、親和性およびTZ05ポリメラーゼ阻害能の有意な改善を示した。本選択に比較し、突然変異性PCRを通じて得た選択の濃縮ライブラリーは、わずか4周期の選択後、TZ05ポリメラーゼ阻害能において、さらにより大きい改善を示した。4周期の選択後、55°Cで、突然変異性条件下でのPCRを行って得たssDNA配列を表5に示す。表に示される30ntランダム領域は、表1に示される固定配列配列番号1に隣接する。括弧内の数字は、その配列が同定された回数を示す。配列類似性に基づき、配列を3つのファミリーに分類した。精査すると、これらの配列が2つの広いカテゴリーに分類されることが明らかになる;グアニンがリッチな配列ファミリーI-IIおよびグアニンが少ない配列ファミリーIIIである。グアニンリッチ配列中のグアニンの分布は、分子内G-四分子構造にフォールディングすることが可能であるようなものである。興味深いことに、これらのグアニンリッチ配列は、表3に複雑性を示す出発ライブラリーには存在しない存在量が少ないため、クローニングにより検出されなかった可能性が最も高い。ファミリーIII中の配列は、グアニンリッチではないが、ランダム配列の3’末端付近にCGTTTTGコンセンサスモチーフを持つ。出発ライブラリー中、ファミリーII配列に同様のコンセンサスモチーフが同定され表3、これらの2つのファミリーが関連しており、そして他方から一方が派生したことが示唆される。出発ライブラリーに存在するファミリーI配列は、TZ05ポリメラーゼに対する高温選択に際し、消失した。同一ライブラリーを、Taqポリメラーゼに対する高温親和性選択に供すると、同様の結果が観察され、出発ライブラリーに見られるファミリーIアプタマーと2つのポリメラーゼの相互作用が温度感受性であり、そして高温での選択に耐えなかったことを示唆する。それらの間でまたは表5に示されるものに配列相同性を持たない13の他の配列もまた同定され、そしてオーファン配列と分類されたデータ未提示。実施例2.ポリメラーゼ阻害活性ポリメラーゼ阻害アッセイは、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび32P-γ-ATPを用い、5’末端で末端標識し、そして変性条件下でゲル電気泳動により精製したテンプレートDNADNA-HP;5’-ATGCCTAAGTTTCGAACGCGGCTAGCCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGT-3’配列番号6;図6を用いて行った図6。それぞれの実験法において、0.25pmolのTaqポリメラーゼ5Uまたは0.125pmolのTthポリメラーゼ2.5Uいずれかを、標準的PCR緩衝液20μl中の5pmol250μMの濃縮プール、ランダムプールまたは特異的DNAリガンドと混合した。5pmol250nMの標識テンプレートDNA-HPを添加し、そして異なる温度で既定の時間、混合物をインキュベーションした。最終濃度125mMにEDTAを添加する5μlの0.5MEDTAことにより、反応を停止した。変性条件下でポリアクリルアミドゲル上でDNAを分離した。オートラジオグラフィーによりゲルを視覚化し、そしてホスホイメージャーにより結合DNAパーセントを定量化した。特定の反応に関する一般的な方法の変動は、明細に示される。オリゴヌクレオチド阻害剤が反応混合物に添加される順序は、テンプレートが最後に添加される限り、問題でない。オリゴヌクレオチドは、機能するのに、PCRの必須の構成要素であるMgイオンを必要とし、そして多くの緩衝液系に耐えるようである。図7は、DNA濃縮プールを用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示する。図8-10は、リガンドTQ30配列番号50およびTQ21配列番号59を用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示する。IC50値の測定IC50値アッセイにおいて、産物の50を生じるのに必要な阻害剤濃度は、ヘアピン伸長アッセイを用いて得た。典型的な阻害アッセイにおいて、20μl反応は、TrisまたはTricine緩衝液TaqおよびTthpolあるいはTZ05緩衝液TZ05pol中に、0.250.04pmolのTaqポリメラーゼ5U1U、0.125pmolのTthポリメラーゼ2.5U、または0.05pmolのTZ05ポリメラーゼ1Uいずれか、オリゴヌクレオチド阻害剤多様な濃度、0.2MdNTPを含んだ。その後、ゲル精製5’末端標識ヘアピンDNA基質DNA-HP;5’-ATGCCTAAGTTTCGAACGCGGCTAGCCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGT-3’配列番号6;図6を、最終濃度250nMまで添加し、そして図レジェンドに示されるように、既定の時間、望ましい温度で、反応をインキュベーションしたTZ05polでは30分間。反応は、5μlの0.5MEDTApH8.0の後、ホルムアミドゲル装填緩衝液を添加することにより、停止した。変性条件下で、10ポリアクリルアミドゲル上で、伸長産物を分離し、そしてホスホイメージャーにより定量化した。阻害剤の存在下で形成された産物の量を、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物パーセントを得た。IT50値の測定ヘアピン伸長反応は、阻害剤濃度が250nMであり、そしてTZ05ポリメラーゼ反応が37°Cで行われたことを除き、上述のものと同じであった。各温度でのインキュベーション時間は、TaqおよびTthpolで1時間、そしてTZ05polで30分間であった。産物量はホスホイメージャーにより定量化し、そして同一温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物パーセントを得た。リガンドTQ30およびリガンドTQ21基質活性の測定各実験法において、5’末端標識リガンドTQ30配列番号50、TQ21配列番号59またはTQ21エチレングリコールリンカーを用い3’キャップ化されたものおよそ3pmolを、5UのTaqポリメラーゼまたは2.5UのTthポリメラーゼいずれかの存在下または非存在下で、20μlの結合緩衝液中、1mMの各dNTPと、室温で16時間、インキュベーションした。TQ21の3’末端のキャップ化は、当業に知られる標準的条件を用い、エチレングリコールリンカーGlenResearchの3’-スペーサーC3支持体を用いて達成した。親和性捕捉アッセイ親和性捕捉反応は:75μMヘパリン、12.5mMMgCl2、1mM各dNTP、50mMKCl、10mMTris-HClpH8.3、5UのTaqポリメラーゼまたは2.5UのTthポリメラーゼおよび250nM5’末端標識ヘアピンアッセイテンプレートDNA-HPを含む、100μl反応体積中で、70°Cで5分間行った。5分後、反応混合物を3倍希釈し、そして4°Cに冷却した。第1周期合成後、15μlのビーズ上述のように調製された、アフィニティービーズまたはコントロールビーズいずれかを4°Cで反応混合物に添加し、そして10分間、穏やかに混合した。標識テンプレートを含む上清を遠心分離後回収し、そしてゲル解析のため取り置いた。その後、75μMヘパリン、12.5mMMgCl2、50mMKClおよび10mMTris-HClpH8.3からなる緩衝液100μlでビーズを5回洗浄した。第2周期合成後、洗浄ビーズを、ポリメラーゼ以外全ての試薬を含む反応混合物の新鮮なアリコットと混合した。70°Cで5分間インキュベーションした後、反応混合物を回収し、そしてゲル電気泳動により解析した。実施例3.エキソヌクレアーゼ阻害アッセイエキソヌクレアーゼ阻害アッセイは、[γ32P]-ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い5’末端で、そして[α32P]-ddATPおよびデオキシターミナルトランスフェラーゼを用い3’末端で、放射標識された、設計テンプレート、5’-TTCGAGCGTGAATCTGAATTCGCGGCTAGCCAGCTTTTGCTGGCTAGCCGCGGTGGGAAACTGAGGTAGGTGTTTTCACCTACCTCAGTTTCCCACC-3’Exo-sub配列番号75を用いて行った。TaqおよびTthpolのための代表的な実験法において、それぞれ、5UのTaqポリメラーゼまたは2.5UのTthポリメラーゼを、標準的PCR緩衝液20μl中で、250nMのリガンドTQ30またはリガンドTQ21と混合し、その後、二重標識Exo-Sub250nM、最後に添加を添加した。室温で16時間インキュベーションした後、最終濃度0.1mMまでEDTAを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で、8ポリアクリルアミドゲル上で、切断産物を分離した。TZ05のための代表的な実験法において、1UのTZ05ポリメラーゼを、TZ05緩衝液50mMTricine-KOH、50mMKOAc、2.5mMMnOAc2、8グリセロール;20μl中で、リガンドと混合し、その後、二重標識Exo-Sub250nM、最後に添加を添加した。45°Cで20分間インキュベーションした後、最終濃度0.1mMまでEDTAを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で8ポリアクリルアミドゲル上で、切断産物を分離した。実施例4.ポリメラーゼ阻害アッセイTQ21配列番号59およびTQ30配列番号50による阻害を、A好熱性DNAポリメラーゼ、B中温性DNAPコントロールとしてTaqポリメラーゼ、およびC逆転写酵素RTに対し、試験した。すべての反応は、250または500nMのリガンドTQ21またはTQ30いずれかを用い、1mM各dNTPの存在下で、HPヘアピンテンプレート実施例2を含む20μl体積中で行った。各ポリメラーゼに関する特定の反応条件は、以下の通りであった:熱安定性ポリメラーゼ:Tmaポリメラーゼ:UlTmaポリメラーゼ6U、10mMTris-HCl、pH8.8、10mMKCl、2.5mMMgCl2および0,002Tween20v/v;Tbrポリメラーゼ2U、10mMTris-HCl、pH8.8、50mMKCl、1.5mMMgCl2および0.01TritonX-100;Tliポリメラーゼ3UおよびTflポリメラーゼ5U、10mMTris-HCl、pH9.0、50mMKClおよび0.1TritonX-100。中温性ポリメラーゼ:Taqポリメラーゼ5U緩衝液の内部コントロールを含むすべてのインキュベーションは、10mMTris-HCl、pH7.5、40mMKCl、5mMMgCl2および7.5mMDTTからなる緩衝液中で行ったクレノウ断片5U;T4DNAポリメラーゼ4U;T7DNAポリメラーゼ7U。逆転写酵素:すべてのインキュベーションは、50mMTris-HCl、pH8.3、60mMNaCl、6mMMgOAc2および10mMDTTからなる緩衝液中で行ったHIV-1RT0.56pmol;AMVRT1U;M-MLVRT10U;SuperscriptIISsriptII10U。実施例5.低コピー数標的の検出ホットスタート条件なしで、Respessら1994InterscienceConferenceonAntimicrobialAgentsandChemotherapy94:110に記載されるように、HIV-2LTRから203bpの標的特異的産物を増幅する系を用い、PCR増幅を行った。すべてのPCR増幅は、100μl反応体積中で、1.3μgのヒト胎盤DNA、0.4mM各dNTP、25pmolの各プライマー、10mMTris-HClpH8.3、2.5mMMgCl2、10グリセロール、0.2pmol5UのTaqポリメラーゼおよびテンプレート図10A-10Cに示されるような、およそのコピー数の存在下で行った。熱反復は、50°C2分の後、94°C30秒;60°C30秒;72°C30秒およびその後、1°C増加の自己伸長autoextended60°Cアニーリングを5周期、TC9600熱反復装置PEAppliedBiosystemsで行った。これに、90°C30秒;65°C30秒;72°C30秒での35周期増幅が続いた。あるいは、HIV-2の末端反復配列LTRを検出するよう設計したPCR増幅を、ホットスタート条件なしで、1μgのヒト胎盤DNAの存在下で行ったRespessら1994InterscienceConferenceonAntimicrobialAgentsandChemotherapy94:110。PCRは、100μl体積中に、15mMTricine-KOHpH8.0、48mMKOAcpH7.5、3.5mMMgOAc2、10グリセロール、0.4mMdNTPおよび0.2pmol5UのTaqポリメラーゼを含んだ。リガンドは50nM濃度で用い、そしてテンプレートを添加する前に反応混合物中に存在した。テンプレートは、50μl体積中に1μgのヒト胎盤DNAと混合したゼロまたはおよそ10コピーのHIV-2テンプレートDNAを含んだ。熱反復は、50°C2分、94°C30秒、60°C30秒1°C/周期の自己伸長で、72°C30秒の後、90°C30秒、65°C30秒および72°C30秒での35周期をTC9600熱反復装置PEAppliedBiosystemsで行った。最後に、反応を72°Cで10分間インキュベーションした。PCR由来の20μlを、非変性条件下で、8ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、解析した。ゲルは、エチジウムブロミド染色により視覚化した。TZ05polに対し選択されたアプタマーの成果は、ホットスタート条件なしに、ヒトゲノムDNAからヒトK-ras遺伝子を増幅するよう設計されたPCR系で評価したNilssonら、1997。PCR増幅は、プライマー、5’-TGAAAATGACTGAATATAAACTT-3’および5’-GATCATATTCGTCCACAAAATGA-3’を用いて行った。すべてのPCRは、GeneAmpPCR系9600Perkin-Elmer上で、30μl反応体積で行った。PCRは、10mMTris-HClpH8.3、50mMKCl、2.5mMMgCl2、1μM各プライマー、200μM各dNTP、または50mMTricine-KOH、125mMKOAc、2.5mMMnOAc2、8グリセロール、1μM各プライマーおよび200μM各dNTPいずれかを含んだ。アプタマーは、ヒト胎盤DNA25ngをテンプレートとして添加する前に、緩衝液および2.5UのTZ05ポリメラーゼを含む反応に存在した。94°C2分間の変性後、94°C30秒、55°C30秒、75°C45秒で、34周期の増幅を行った。これに、72°C5分間の単回インキュベーションが続いた。TBE緩衝液中の3アガロースNuSieveGTG;FMCBioProducts上で、PCRの5μlを泳動することにより、増幅産物を解析した。ゲルは、エチジウムブロミドで染色した後、UV光下で視覚化した。ホットスタートPCRは、製造者の指示にしたがい、AmpliWaxビーズPerkinElmerを用いることにより、行った。全ての他のPCR増幅は、ホットスタート条件なしで行った。NeXstartPCRは、阻害剤として50nM最終濃度のリガンドTQ30およびTQ21を用いて行った。1つの増幅は、比較目的のため、非特異的オリゴヌクレオチド50nM最終濃度の存在下で行った。"