"炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、a防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体、またはb防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体のいずれかをコードする核酸で大腸菌E.coli宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上であることを条件とする方法。該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体をコードする、請求項1に記載の方法。該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが45以上である、請求項2に記載の方法。該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが50から52である、請求項3に記載の方法。該核酸が、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体をコードする、請求項1に記載の方法。ドメインが炭疽菌のPAのドメイン1及び/又はドメイン4である、請求項5に記載の方法。防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体をコードする核酸で形質転換した、組換え大腸菌Escherichiacoli細胞であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上である組換え大腸菌細胞。該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが45以上である、請求項7に記載の組換え大腸菌細胞。該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが50から52である、請求項8に記載の組換え大腸菌細胞。該核酸が、図2に示すような配列番号1又はその修飾形態である、請求項7に記載の組換え大腸菌細胞。該核酸が配列番号1である、請求項10に記載の組換え大腸菌細胞。防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞。核酸が炭疽菌のPAのドメイン1又はドメイン4をコードする、請求項12に記載の組換え大腸菌細胞。炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導するポリペプチドを生成する方法であって、請求項7から13のいずれか一項に記載の細胞を培養し、培養物から防御ポリペプチドを回収することを含む方法。防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上である大腸菌形質転換ベクター。防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクター。防御免疫を誘導し、且つ少なくとも35のGC含量を有するPA又はその変異体をコードする、配列番号1の核酸又はその修飾形態。配列番号1と少なくとも90同一である、請求項17に記載の核酸。配列番号1を含む、請求項18に記載の核酸。このシステムに関する問題は、PAが使用できるようになる前にタグを除去するために、さらなる下流プロセシング段階を必要とすることである。コドンの至適化は、現在既知であり、合成遺伝子の設計において使用される手法である。ほとんどのアミノ酸が2つ以上のコドン配列によってコードされることから、遺伝暗号のある程度の重複性が存在する。様々な生物がこれらの様々なコドンのいずれかを優先的に利用する。コドンを至適化することによって、一般に、特定タンパク質の発現レベルが上昇すると予想される。これは一般に望ましいが、PAの場合のように、より高い発現レベルがタンパク質分解及び/又は細胞毒性をもたらす場合を除く。そのような場合、発現レベルの上昇は反生産的であり、重大な細胞毒性をもたらしうる。しかしながら意外にも、出願人は、これが大腸菌の場合には当てはまらず、この系では、菌株内にタンパク質分解酵素が存在するか否かに関わらず、コドンの至適化が組換えPAの予想外に高いレベルの発現をもたらすことを発見した。さらに、PAの防御ドメインの発現は大腸菌における発現を阻害しないと思われる。天然PAの結晶構造が明らかにされPetosaC.ら、Nature385:833-838,1997、かかる結晶構造は、PAが4つの異なる、機能的に独立したドメインから成ることを示している:1a、1~167アミノ酸と1b、168~258アミノ酸に分けられる、ドメイン1;259~487アミノ酸のドメイン2;488~595アミノ酸のドメイン3及び596~735アミノ酸のドメイン4。出願人は、一部のドメインが、単離isolation、融合タンパク質又はこれらの相互の組合せとして使用したとき驚くほど良好な防御作用を生じるらしいことを確認した。本発明によれば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性試薬が提供され、かかる試薬は、共同して炭疽菌の完全長防御抗原PAの3つまでのドメインを占める1もしくはそれ以上のポリペプチド又はこれらの変異体を含み、該ドメインの少なくとも1つがPAのドメイン1もしくはドメイン4又はその変異体を含む。具体的には、試薬は、個々のポリペプチドがPAの1又はそれ以上の個別ドメインを含む、ポリペプチドの混合物又は融合ペプチドを含む。特に、試薬は、完全長PA以外の形態の、PAのドメイン1もしくはドメイン4又はその変異体を含むポリペプチドを含む。存在する場合には、ドメインは適切に完全であり、特にドメイン1はその完全形態で存在する。ここで使用するときポリペプチドの語はタンパク質及びペプチドを含む。ここで使用するとき、変異体の表現は、配列内の1又はそれ以上のアミノ酸が欠失しているか又はタンパク質のアミノ酸に置換されているが、まだ炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する、基本配列とは異なるアミノ酸の配列を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が広い類似特性を持つ異なるアミノ酸で置き換えられている場合に保存的とみなしうる。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置き換えられている場合である。概して、ポリペプチドの生物活性を変化させない非保存的置換はほとんど起こりえない。適切な変異体は、PA配列と少なくとも60同一、好ましくは少なくとも75同一、より好ましくは少なくとも90同一である。特に、PA配列に対する個々の変異体配列の同一性は、LipmanとPearsonLipman,D.J.Pearson,W.R.1985RapidandSensitiveProteinSimilaritySearches,Science,vol227、p.1435-1441が述べたマルチアラインメントmultiplealignment法を用いて評価することができる。至適化パーセンテージスコアは、Lipman-Pearsonアルゴリズムのための次のパラメータに関して算定すべきである:ktup=1、ギャップペナルティー=4及びギャップペナルティー長=12。類似性を評価する配列を試験配列として使用すべきであり、これは、比較のための基本配列配列番号1を最初にアルゴリズムに組み入れねばならないことを意味する。好ましくは、本発明の試薬は、野生型PAのドメイン1及び/又はドメイン4の配列を持つポリペプチドを含む。本発明の特に好ましい実施形態は、炭疽菌のPAのドメイン4を含む。これらのドメインは、下記の表1に示す次のような配列を含む。これらのアミノ酸番号はWelkosら、Gene691988287-300に示されているような配列を指し、下記にそれぞれ配列番号15図4及び3図3として示している。ドメイン1は、1a及び1bと称される2つの領域を含む。領域1aはアミノ酸1-167を含み、領域1bはアミノ酸168-258である。領域1aは良好な防御応答の誘導のために重要であると思われ、完全なドメインが好ましいと考えられる。特に好ましい実施形態では、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を惹起する免疫原性試薬として、ドメイン1もしくは4又はそれらの防御領域の組合せを使用する。この組合せは、例えば融合ペプチドとして、下記で概説するような本発明の発現系を使用して発現されうる。ドメイン1を用いるときには、PA配列のドメイン2に適切に融合され、好ましくはドメイン2及びドメイン3に融合されうる。そのような組合せ及び予防又は治療におけるそれらの使用は本発明のさらなる態様を構成する。適切には上述したドメインは、好ましくはN-末端グルタチオン-s-トランスフェラーゼGSTとの、融合タンパク質の一部である。GSTはタンパク質の精製を助けるだけでなく、おそらくサイズを上昇させる結果として、アジュバント作用も提供しうる。本発明のポリペプチドは従来の方法によって適切に調製される。例えば、それらは合成されるか、又は組換えDNAテクノロジーを用いて調製されうる。特に、該ドメインをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、それを使用して宿主細胞を形質転換する。宿主細胞の培養とそれに続く所望ポリペプチドの単離は、従来の方法を用いて実施することができる。これらの方法において使用される核酸、ベクター及び形質転換細胞は本発明のさらなる態様を構成する。一般に、使用される宿主細胞は、枯草菌のようなPAの調製において慣例的に使用されるものである。出願人は意外にも、単離又は組合せとしての該ドメインがある種の条件下で大腸菌において成功裏に発現されうることを発見した。そこで、本発明は、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成するための方法であって、a防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体、あるいはb上述したような防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの少なくとも1つの防御ドメイン又はその変異体を含むポリペプチドのいずれかをコードする核酸で大腸菌宿主を形質転換し、形質転換した宿主を培養して、それからポリペプチドを回収することを含み、但し、ポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体である場合、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上であることを条件とする方法を提供する。これらの選択肢を用いて、有利な発現宿主を使用して高い収率の生成物を得ることができる。大腸菌及び炭疽菌のゲノム内のコドン及びそれらが出現する頻度を表わす表を図1に示す。グアニジン及びシトシンが炭疽菌よりも大腸菌においてはるかに高い頻度で出現することは明らかである。コドン使用頻度内容の分析は次のことを明らかにする:それ故、大腸菌によって優先的に選択されるコドンは、可能な場合にはグアニジン又はシトシンを含むものであると思われる。免疫原性タンパク質をコードするために使用される配列において、グアニジン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージを野生型炭疽菌で通常認められるよりも高くすることにより、大腸菌における発現が改善されるようなコドン使用が実現される。適切には、本発明において使用するコード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは、少なくともポリペプチドが防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体である場合には、40以上、好ましくは45以上、最も好ましくは50から52である。これらのユニットをコードする野生型炭疽菌配列を使用して、防御ドメインの高いレベルの発現を実現することができる。しかし、上述したように核酸のGCを高めることによって収率をさらに改善することができる。特定実施形態では、かかる方法は炭疽菌のPAの発現を含む。さらに本発明に従えば、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体をコードする核酸であって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上である核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞が提供される。上述したように、適切には、コード核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージは40以上、好ましくは45以上、最も好ましくは50から52である。適切には、本発明の大腸菌細胞を形質転換するために使用する核酸は合成遺伝子である。特に、核酸は、図2に示すような配列番号1又はその修飾形態である。修飾形態の表現は、本発明に従ったGC含量パーセンテージの必要条件に合致することを条件として、防御免疫応答を誘導するが、何らかの異なるコドンを利用する、PAあるいはそのフラグメント又は変異体をコードする他の核酸配列を指す。適切な修飾形態は、配列番号1に少なくとも80類似する、好ましくは90類似する、最も好ましくは少なくとも95類似する。特に、核酸は配列番号1を含む。代替的実施形態では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸で形質転換した組換え大腸菌細胞を提供する。好ましくは、核酸は炭疽菌のドメイン1又はドメイン4をコードする。さらに本発明に従えば、炭疽菌に対して防御的な免疫応答を誘導する免疫原性ポリペプチドを生成する方法であって、上述したように細胞を培養し、培養から所望するポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。そのような方法は当該技術において周知である。さらなる態様では、本発明は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PA又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターであって、該核酸内のグアニジン及びシトシン残基のパーセンテージが35以上である、大腸菌形質転換ベクターを提供する。本発明のさらにもう1つの態様は、防御免疫応答を誘導しうる炭疽菌の防御抗原PAの防御ドメイン又はその変異体をコードする核酸を含む大腸菌形質転換ベクターを包含する。大腸菌の形質転換において使用するための適切なベクターは当該技術で周知である。例えば、T7発現系は良好な発現レベルを提供する。しかし、特に好ましいベクターは、AveciaUKから入手しうるpAG163を含む。PAをコードし、少なくとも35、好ましくは少なくとも40、より好ましくは少なくとも45、最も好ましくは50から52のGC含量を有する配列番号1の核酸又はその変異体は本発明のさらなる態様を構成する。所望する場合には、PA、変異体又はドメインは、もう1つ別のタンパク質への融合として、例えば異なる免疫を与えるタンパク質、産物の精製を助けるタンパク質、又は正しい翻訳の開始を保証する高度発現タンパク質例えばチオレドキシン、GSTへの融合として発現されうる。場合によっては、系の抑制を改善するためにT7リゾチームのような付加的な系が発現系に加えられるが、本発明の場合には、細胞毒性に関連する問題は認められなかった。本発明の工程ではいかなる適切な大腸菌株も使用できる。いくつかのプロテアーゼを欠損している菌株例えばIon-、ompT-が使用可能であり、それらはタンパク質分解を最小限に抑えると予想される。しかし、出願人は、生成物の良好な収率を達成するためにそのような菌株を使用する必要がないこと、そしてK12のような他の既知の菌株が意外にも高い生成物収率をもたらすことを発見した。菌株の発酵は一般に、当該技術において理解されているような従来の条件下で実施される。例えば、発酵は、プラスミドの維持のための抗生物質を含み、誘導のためのIPTGを添加した複合培地を使用して、好ましくは大きな振とうフラスコにおいて、回分培養として実施することができる。適切には、培養物は回収され、精製のために必要なときまで-20°Cで保存する。大腸菌PA又は変異体又はドメイン発現のための適切な精製スキームは、枯草菌B.subtilis発現において使用されるものから適合させることができる。使用する個々の精製段階は組換えPAの物理的特徴に依存する。典型的には、カラムへの結合の差別化を最大にする条件下でイオン交換クロマトグラフィー分離を実施し、その後浅い勾配から分画を採集する。一部の場合には、所望する特性を備えている産物を得るために単一のクロマトグラフィー段階で十分なこともある。分画は、必要に応じてSDSPAGE又はウエスタンブロット法を使用して、生成物の存在に関して分析することができる。下記に示すように、rPAの完全な又は部分的ドメインである一連の融合タンパク質を成功裏にクローニングし、発現することを達成した。STI胞子の攻撃に対するこれらの融合タンパク質の免疫原性と防御効果をA/Jマウスモデルにおいて評価した。すべてのrPAドメインタンパク質がA/Jマウスにおいて免疫原性であり、GST対照免疫マウスに比べ、攻撃に対して少なくとも部分的な防御を与えた。輸送タンパク質であるドメインタンパク質のN末端に結合したGSTは、免疫動物において抗体反応が刺激されたことが示すようにインビボで、又はウエスタンブロットのあと抗rPA抗血清で融合タンパク質が検出できたことからインビトロでも、融合タンパク質の免疫原性を損なわず、GSTタグがrPAエピトープの認識を妨げないことを示唆した。より大きな融合タンパク質による免疫化が最も高い力価を生じた。特に、完全長GST1-4融合タンパク質で免疫したマウスは、rPA免疫群の約8倍の平均血清抗rPA濃度を生じた図5。開裂したGSTを含むrPAドメイン1-4でマウスを免疫すると、融合タンパク質での免疫によって生じる力価の約半分の力価を生じた。なぜこの融合タンパク質がはるかに免疫原性であるかは不明である。このタンパク質のサイズ上昇が免疫エフェクター細胞にアジュバント作用を及ぼしうることが考えられる。他の融合タンパク質ではサイズ上昇はこの応答を同じ程度には刺激せず、開裂したタンパク質はそれらの融合タンパク質相対物と同様に防御性であったので、GSTタグのアジュバント作用は攻撃に対する防御を増強しなかった。良好な抗rPA力価を持つにもかかわらず、GST1、開裂1、GST1b-2、GST1b-3及びGST1-3で免疫した群においては、102MLDより低い攻撃レベルで防御にある種のブレイクスルーbreakthrough、突破、エスケープが起こり、これらのタンパク質による免疫は、GST対照免疫マウスと比較して、マウスの生存期間を延長させず、マウスは攻撃によって死亡に至った。これは、免疫応答が、感染に対して十分な抵抗性を達成するためにこれらのタンパク質によって適切にプライミングされていなかったことを示唆する。マウス及びモルモットにおける他の試験で示されたようにLittleS.F.ら、1986、Infect.Immun.52:509-512、TurnbullP.C.B.ら、1986、Infect.Immun.52:356-363、PAに対する抗体力価と攻撃に対する防御の間に厳密な相関関係は存在しない。しかし、防御のためにはある程度の抗体の閾値が必要でありCohenS.ら、2000Infect.Immun.68:4549-4558、防御のために免疫応答の細胞媒介性成分も刺激される必要があることを示唆しているWilliamson1989。おそらくドメイン3の不在下ではタンパク質がより一層分解を受けやすいために、SDS-Page及びウエスタンブロット法の結果が示すように、GST1、GST1b-2及びGST1-2は生成された最も安定でない融合タンパク質であり、この不安定性が防御エピトープの喪失をもたらしたと考えられる。タンパク質の高次構造も防御免疫応答を刺激する上で重要であると考えられる。融合タンパク質からドメイン1aを除去すると、それらの完全等価物GST1-2及びGST1-3と比較したとき、低い抗体力価と攻撃に対する低い防御作用を生じた。同様に、GST1単独で免疫したマウスは攻撃に対して部分的に保護されたが、GST1-2融合タンパク質としてドメイン2と組み合わせたときには、102MLD攻撃レベルで完全な防御が認められた。しかし、GST1-2融合タンパク質での免疫によって刺激された免疫応答はより高い103MLD攻撃レベルに対して完全な防御を与えるには不十分であり、これはやはりタンパク質の分解による防御エピトープの喪失によるものであると考えられた。GST4単独、開裂した4単独及び2つの個々に発現されたドメイン、GST1及びGST4の混合物を含めて、ドメイン4を含むトランケートで免疫したすべての群が、103MLDのSTI胞子による攻撃に対して完全に防御された表1。Brossierらは、ドメイン4なしでPAを発現する炭疽菌の突然変異菌株で免疫したマウスにおける防御の低下を示しBrossierF.ら、2000、Infect.Immun.68:1781-1786、これは、GST1-3による免疫が良好な抗体力価にも関わらず防御のブレイクスルーをもたらした今回の試験において確認された。これらのデータは、ドメイン4がPAの免疫優性サブユニットであることを示している。ドメイン4はPAポリペプチドのカルボキシ末端の139アミノ酸である。ドメイン4は、アミノ酸残基679-693の間に位置する小さなループ内及びその近傍であると同定されたVarugheseM.ら、1999Infect.Immun.67:1860-1865、宿主細胞レセプタ結合領域を含むLittleS.F.ら、1996Microbiology142:707-715。それ故、ドメイン4の領域内に突然変異Varughese1999、前出又は欠失Brossier1999、前出を含んで発現されるPAの形態は無毒性であることが明らかにされたので、ドメイン4は宿主細胞の毒性にとって重要である。PAの結晶構造は、ドメイン4、特にドメインの19アミノ酸ループ703-722が、互いに密接に関連する他の3つのドメインよりも露出されていることを示すPetosa1997、前出。この構造配置がドメイン4を免疫エフェクター細胞による認識のために最も目立つエピトープにしていると考えられ、それ故ドメイン4を含む融合タンパク質は最も防御的な免疫応答を誘発する。この研究は防御免疫応答の刺激におけるPAの役割をさらに明らかにし、炭疽感染に対する防御がPAの個々のドメインに帰せられることを示した。ここからは、次のような添付の図面を参照しながら、実施例によって本発明を詳細に説明する。結果は、処置群とで5匹のマウスから得たサンプルの平均士標準誤差で示した。大腸菌における発現の検討rPA発現プラスミドpAG163::rPAを、もとのTcR遺伝子をKmRマーカーに置き換えて改変した。このプラスミドを発現宿主である大腸菌BLRDE3に形質転換し、発現レベルと溶解度を評価した。この菌株は、細胞内プロテアーゼLaIon遺伝子産物及び外膜プロテアーゼOmpTを欠損している。発現試験は、しかしながら、IonK12宿主菌株と比較してこの菌株において可溶性タンパク質の蓄積の改善を示さなかったすなわち過度のタンパク質分解により蓄積が妨げられる。rPAの細胞内タンパク質分解はLaプロテアーゼの作用によるものではないと結論された。発酵分析K12菌株UT5600DE3pAG163::rPAを使用して発酵のさらなる分析を実施した。この培養中のrPAは可溶性分画と不溶性分画に分けられる350mg/L不溶性、650mg/L完全長可溶性と推定されたことが認められた。使用した条件37°C、誘導のための1mMIPTGは振とうフラスコ培養において検出可能な可溶性rPAを生成せず、また上記の実施例1で述べた結果を考慮すると、多量の可溶性rPAの存在は意外である。それにもかかわらず、発酵、誘導及び回収時点の操作は大腸菌K12発現菌株においてrPAの安定な蓄積を可能にすると思われる。最初にUT5600DE3pAG163::rPA発酵からの不溶性封入体として単離した物質から、rPAの試料を作製した。封入体を25mMTris-HClpH8で2回洗い、同じ緩衝液2M尿素で1回洗った。次にそれらを緩衝液8M尿素に可溶化し、細胞破片をペレット化した。25mMTris-HClpH8に希釈し、4°Cで一晩静置インキューベーションして尿素を除去した。希釈した試料をQセファロースカラムにかけ、NaCl勾配でタンパク質を溶出した。最も高純度のrPAを含む分画をプールし、等分して、-70°Cで冷凍した。4-12MES-SDSNuPAGEゲルを用いて既知の標準品に対してこの試料を試験すると、この試料が高純度であり、内毒素汚染が低いことを示した。生成物のさらなる特徴決定生成物のN末端配列決定は、N末端配列がMEVKQENRLL配列番号2から成ることを示した。これは、予想されたように生成物が残存する開始メチオニンを含むことを確認した。物質はウエスタンブロットにおいて反応することが認められた;試料に関するMALDI-MSは約82,700の質量予想質量82,915に比してを示した。高い分子質量と使用した質量標準からの距離66KDaを考慮すると、これは、物質が有意のトランケーションを有していないが、試料内での微小不均一性を排除しないことの示唆であると考えられる。PAの個々のドメインの試験PAの個々のドメインを、PharmaciapGEX-6P-3発現系を使用して、輸送タンパク質グルタチオン-s-トランスフェラーゼGSTとの融合タンパク質の形態で大腸菌における組換えタンパク質として生成した。様々なドメインの配列及びそれらをコードするために使用されるDNA配列を図3として添付している。それぞれのアミノ酸及びDNA配列を下記の表2に示す。これらの融合タンパク質を使用して、総容量100μl中、20v/vアルヒドロゲルに吸着させたそれぞれの融合タンパク質10μgの筋肉内注射によってA/JマウスHarlanOlacを免疫した。動物を2回免疫し、指示されている用量レベルの炭疽菌STI菌株の胞子での攻撃誘発によってそれらの防御免疫の発現を調べた。下記の表は攻撃誘発後14日目の生存動物を示す。データは、GSTとの融合タンパク質の形態であるか否かに関わらず、PAの4つのドメイン全部の組み合わせが高い攻撃レベルまで防御性であったことを示している。123を残してドメイン4を除くと、試験した最も高い攻撃レベル、9×105でブレイクスルーが生じた。ドメイン12は、9×104胞子でドメイン123の組合せと同等に防御性であった。しかし、ドメイン1b2とのGST融合を残してドメイン1aを除去すると、試験した最高攻撃誘発レベル9×104で防御にブレイクスルーが生じ、これはドメイン3を付加することによってわずかだけ改善された。データは、PAによって誘導される防御免疫が個々のドメイン完全なドメイン1及びドメイン4又は4つのドメイン全部からの順列として得られるドメインの組合せに帰せられることを示している。ドメイン4についてのアミノ酸配列及びDNAコード配列を、それぞれ配列番号15及び16として図4に示している。ワクチンとしてのドメインのさらなる試験PAドメイン、アミノ酸1-259、168-488、1-488、168-596、1-596、260-735、489-735、597-735及び1-735それぞれトランケートGST1、GST1b-2、GST1-2、GST1b-3、GST1-3、GST2-4、GST3-4、GST4及びGST1-4をコードするDNAを炭疽菌SterneDNAからPCR増幅し、lacプロモーターの下流のフレーム内で、発現ベクターpGEX-6-P3Amersham-PharmaciaのXhoI/BamHI部位にクローニングした。この系を使用して産生されるタンパク質は、N末端グルタチオン-s-トランスフェラーゼタンパク質GSTとの融合タンパク質として発現された。次にタンパク質発現試験のために、PAドメインをコードするDNAを内包する組換えプラスミドDNAを大腸菌BL21に形質転換した。組換えpGEX-6-P3プラスミドを含む大腸菌BL21を、50μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコール及び1w/vグルコースを含むL-ブロス中で培養した。培養を振とうしながら170回転/分30°CでA600nm0.4にインキュベートした後、0.5mMIPTGで誘導した。培養をさらに4時間インキュベートし、その後10000rpmで15分間遠心分離して回収した。PAトランケート-融合タンパク質の初期抽出は、それらが封入体として産生されたことを示した。細胞ペレットをリン酸緩衝食塩水PBSに懸濁し、氷冷水浴中4×20秒間音波破砕した。懸濁液を15000rpmで15分間遠心分離し、次に室温で1時間、攪拌しながら8M尿素に懸濁することによって細胞ペレットを尿素抽出した。懸濁液を15000rpmで15分間遠心分離し、上清を、400mML-アルギニン及び0.1mMEDTAを含む100mMTrispH8に対して透析したあと、PBSに透析した。PAトランケート-融合タンパク質のリフォールディングの成功により、グルタチオンセファロースCL-4Bアフィニティーカラムで精製することができた。すべての抽出物トランケートGST1b-2、アミノ酸残基168-487を除くを、あらかじめPBSで平衡させた15mlグルタチオンセファロースCL-4BカラムAmersham-Pharmaciaにかけ、回転させながら4°Cで一晩インキュベートした。カラムをPBSで洗い、150mMNaCl、1mMEDTA及び20mM還元グルタチオンを含む50mMTrispH7で融合タンパク質を溶出した。SDS-PAGE分析によって同定したPAトランケートを含む分画をプールし、PBSに対して透析した。BCAPerbioを用いてタンパク質濃度を測定した。しかし、トランケートGST1b-2は、還元グルタチオンを使用したグルタチオンセファロースCL-4Bアフィニティーカラムからは溶出することができず、そのためイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。明細には、トランケートGST1b-2を20mMTrispH8に対して透析した後、同じ緩衝液で平衡させたHiTrapQカラムAmersham-Pharmaciaに充填した。20mMTrispH8中、0-1Mの漸増NaCl勾配で融合タンパク質を溶出した。GST-タンパク質を含む分画をプールし、濃縮して、あらかじめPBSで平衡させたHiLoad26/60Superdex200ゲルろ過カラムAmersham-Pharmaciaに充填した。融合タンパク質を含む分画をプールし、BCAPerbioによってタンパク質濃度を測定した。収率は培養1リットル当り1から43mgであった。フラグメントの分子量及びPAに対する抗体によるそれらの認識を、SDS-PAGE及びウエスタンブロット法を用いて確認した。SDSPage及びウエスタンブロット法によるrPAトランケートの分析は予想されたサイズのタンパク質バンドを示した。検討したすべてのrPAトランケートにおいてある程度の分解が明らかであり、枯草菌で発現される組換えPAとの類似性を示した。rPAトランケート、GST1、GST1b-2及びGST1-2は、ドメイン3の不在下で特に分解を受けやすかった。これはドメイン3内に突然変異を含むrPA構築物についても同様に報告されており、かかるrPA構築物は炭疽菌培養上清から精製することができずBrossier1999、ドメイン3がドメイン1及び2を安定化しうることを示唆している。この試験では、雌性SPF特定病原菌不在A/JマウスHarlanUKを使用した。これらの動物が炭疽感染についての安定したモデルであるためであるWelkos1986。マウスは週齢を一致させ、試験開始時点で7週齢であった。A/Jマウスを試験の1日目と28日目に、総容量100μlのPBS中20の1.3v/vアルヒドロゲルAlhydrogelHCIBiosector,Denmarkに吸着させた10μgの融合タンパク質で免疫した。枯草菌からのrPAMiller1998、組換えGST対照タンパク質、又はGSTタグを除去したドメイン1、4及び1-4を含む融合タンパク質で免疫した群も含めた。免疫用量を後足の2部位に筋肉内投与した。酵素結合イムノソルベント測定法ELISAによる血清抗体分析のために、初期免疫後37日目にマウスから採血した。マイクロタイタープレートImmulon2、DynexTechnologiesを、1プレートにつき2列を除いて、枯草菌から発現させた5μg/mlのrPAMiller1998によって4°Cで一晩被覆し、前記の2列については5μg/mlの抗マウスFabSigma,Poole,Dorsetで被覆した。1v/vTween20を含むPBSPBS-Tでプレートを洗い、PBS中5w/v脱脂粉乳blottoにより37°Cで2時間遮断した。1blotto中で2倍希釈した血清をrPA被覆ウエルに加え、抗Fab被覆ウエルに加えて4°Cで一晩インキュベートしたマウスIgG標準品Sigmaと共に2回分析した。洗浄後、PBS中で1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスIgGSouthernBiotechnologyAssociatesInc.をすべてのウエルに加え、37°Cで1時間インキュベートした。再びプレートを洗ったあと、基質2,2’-アジノビス3-エチルベンズチアゾリン-スルホン酸1.09mMABTS、Sigmaを加えた。室温で20分間インキュベートした後、414nmでウエルの吸光度を測定したTitertekMultiscan,ICNFlow。Titersoftバージョン3.1cソフトウエアを使用して標準曲線を算定した。力価をμgIgG/ml血清で表わし、群平均±平均の標準誤差semを算定した。結果を図5に示す。作製したすべてのrPAトランケートが免疫原性であり、GST1b-2トランケートで免疫した群についての6μg/mlから、GST1-4トランケートで免疫した群における1488μg/mlまでの範囲で、A/Jマウスにおける平均血清抗rPAIgG濃度を刺激した図5。GST対照免疫マウスは、rPAに対する検出可能な抗体を有していなかった。免疫計画の70日目に炭疽菌STI胞子でマウスを攻撃した。攻撃誘発に十分なSTI胞子を株から取り出し、滅菌蒸留水で洗って、1×107及び1×106胞子/mlの濃度になるようにPBSに再懸濁した。それぞれ1×107及び1×106胞子/マウスを含む0.1ml容量を腹腔内投与してマウスを攻撃誘発し、誘発後14日間モニターしてマウスの防御状態を調べた。人道的エンドポイントhumaneend-pointsを厳密に遵守し、致死的感染を有していることを示唆する一連の臨床徴候を示した動物は別により分けた。攻撃誘発後14日間生存した免疫マウスの数を表3に示す。103MLDのSTI胞子で攻撃誘発した群は、GST1、GST1-2及び開裂1で免疫した群及びGST単独で免疫した対照群を除いて、すべて完全に防御された。GST1、GST1-2及び開裂1で免疫した群においては防御に何らかのブレイクスルーが存在し、また対照群はすべて感染のために死亡し、死亡までの平均期間MTTDは2.4±0.2日であった。102MLDのより低い攻撃誘発レベルでは、GST1-2、GST4及び開裂4で免疫した群はすべて完全に防御されたが、他の群では防御に何らかのブレイクスルーが存在した。これらの群において死亡したマウスは平均4.5±0.2日のMTTDであり、4±0.4日のMTTDですべて死亡したGST対照免疫群と有意に異ならなかった。"