"植物、植物部分、または植物細胞から所望のタンパク質を取得するための方法であって、該方法は:a該植物、該植物部分、または該植物細胞からタンパク質の抽出物を調製する工程であって、該植物、該植物部分、または該植物細胞は、該所望のタンパク質を、所望のタンパク質のN末端もしくはC末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチドELPドメインおよびインテインスプライシングエレメントインテインを含むELP-インテインタグを含む融合タンパク質として生成し、該インテインは、該所望のタンパク質のN末端および/もしくはC末端またはそれらの両方と該ELPドメインとの間にある、工程;b必要に応じて、該抽出物から不溶性の物質を除去する工程;c該融合タンパク質を凝集させ、そして該融合タンパク質を該抽出物の残りから分離する工程;d該融合タンパク質を水溶液に再可溶化する工程;必要に応じて、工程cおよびdを繰り返す工程;e該融合タンパク質の切断を行う工程;ならびにf該所望のタンパク質を該タグから分離する工程、を包含する、方法。前記ELPドメインが、少なくとも1つのELPユニットを含む、請求項1に記載の方法。前記融合タンパク質が、前記所望のタンパク質と前記インテインとの間、および/または該インテインと前記ELPとの間、および/またはELPユニットの間に、1つまたはそれより多いリンカー配列をさらに含む、請求項1に記載の方法。組換えタンパク質がレクチンまたはサイトカインである、請求項1に記載の方法。工程cが、適用される温度、pH、溶媒含量および/または装置の1回またはそれより多い調整を含む、請求項1に記載の方法。前記工程cにおける分離が、遠心分離または微細濾過を含む、請求項1に記載の方法。工程dが、凝集物を含む水性混合物の温度、pH、塩および/または他の成分の改変を含む、請求項1に記載の方法。工程eが、前記水溶液のpH、温度および成分を調整することを含む、請求項1に記載の方法。工程fが、前記ELP-インテインタグを凝集させ、そして分離することを含む、請求項1に記載の方法。融合タンパク質を植物細胞において発現させるための、該植物細胞において作動可能な核酸であって、該融合タンパク質は、所望のタンパク質のN末端もしくはC末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチドELPドメインおよびインテインスプライシングエレメントインテインを含むELP-インテインタグを含み、該インテインは、該所望のタンパク質のN末端および/もしくはC末端またはそれらの両方と該ELPドメインとの間にある、核酸。請求項10に記載の核酸を含む、植物、植物細胞、または植物部分。所望のタンパク質のN末端および/またはC末端にELP-インテインタグを有する融合タンパク質を含む融合タンパク質を生成するための方法であって、該方法は、請求項11に記載の植物、植物細胞、または植物部分を培養する工程を包含する、方法。前記ELPドメインが、少なくとも1つのELPユニットを含む、請求項10に記載の核酸。前記融合物が、前記所望のタンパク質と前記インテインとの間、および/または該インテインと前記ELPとの間、および/またはELPユニットの間に、1つまたはそれより多いリンカー配列をさらに含む、請求項10に記載の核酸。組換えタンパク質が、レクチンまたはサイトカインである、請求項10に記載の核酸。前記インテインが、前記所望のタンパク質のN末端と前記ELPドメインとの間にある、請求項10に記載の核酸。前記インテインが、前記所望のタンパク質のC末端と前記ELPドメインとの間にある、請求項10に記載の核酸。所望のタンパク質のN末端もしくはC末端のいずれかまたはそれらの両方において、エラスチン様ポリペプチドELPドメインおよびインテインスプライシングエレメントインテインを含むELP-インテインタグを含む融合タンパク質を含む、植物、植物細胞、または植物部分であって、該インテインは、該所望のタンパク質のN末端および/もしくはC末端またはそれらの両方と該ELPドメインとの間にある、植物、植物細胞、または植物部分。植物における組換えタンパク質のELP融合発現についての多くの以前の報告が、ELP融合タンパク質を精製し得ることを示したが、これらの実験のほとんどは、一過性の遺伝子発現によってタバコの葉において行われ、それは一時的に異種タンパク質の高い蓄積を引き起こし得る。しかし、本発明者らが最初に安定に形質転換したタバコの葉由来のELP-インテインタグに融合した組換えタンパク質、ヒト顆粒球コロニー刺激因子hG-CSFを発現および精製することを試みた時、その発現は非常に低く、そして精製は有意な量の標的タンパク質を回収することにおいて大きな困難に直面したTian,L.ら、未発表。従ってELP融合発現は、ELP-インテイン融合とかなり異なるようであり、そして安定な植物形質転換体におけるELP-インテイン融合発現および精製の状況は、より複雑なようである。再び、条件の慣例的な最適化を採用するべきである。本発明は、植物から組換えタンパク質を発現および精製するための、費用効果が高く、有効であり、かつ拡張性のある方法を提供する。本発明はまた、ELP-インテイン融合タンパク質、その生成および植物形質転換体のための組換え材料および方法にも向けられる。本発明は、植物サンプルから組換えタンパク質を精製するために、ELP-インテイン融合発現および精製システムを利用する。そのような組換えタンパク質は、医薬品、抗体鎖、工業用酵素、および任意の他の有用なタンパク質を含む。これらを、任意の植物およびカルス、葉、種子、根、塊茎、果実および細胞培養物のような、様々な植物部分において生成し得る。その方法は、アフィニティークロマトグラフィーおよび特別な装置の必要なく、ELPの温度感受性の逆相転移inversephasetransitionによって、簡単に行われ、そして工業的な生成のために容易にスケールアップし得る。植物において適用される融合発現戦略の従来の精製方法と比較して、本発明の方法は、自己切断インテインタンパク質を利用して、望ましい組換えタンパク質を融合タグから放出し、従って融合タグ切断のためのプロテアーゼの使用を回避する。1つの局面において、本発明は、植物、植物部分、または植物細胞から所望のタンパク質を得るための方法に関し、その方法は、以下:a当該所望のタンパク質を、所望のタンパク質のN末端またはC末端のいずれかまたはそれらの両方に、エラスチン様ポリペプチドELPドメインおよびインテインスプライシングエレメントインテインを含むELP-インテインタグを含む融合タンパク質として生成する、当該植物、植物部分または植物細胞からタンパク質の抽出物を調製する工程であって、ここでインテインは、所望のタンパク質のNおよび/またはC末端またはそれらの両方とELPドメインとの間にある、工程;b必要に応じて、当該抽出物から不溶性の物質を除去する工程;c融合タンパク質を凝集させ、そして融合タンパク質を抽出物の残りから分離する工程;d融合タンパク質を水溶液に再度可溶化する工程;必要に応じて、工程cおよびdを繰り返す工程;e融合タンパク質の切断を行う工程;およびf所望のタンパク質をタグから分離する工程を包含する。他の局面において、本発明は、当該融合タンパク質のための、植物において作動可能な発現システム、および当該融合タンパク質を含む、または当該発現システムを含む植物、植物部分、または植物細胞、および植物、植物部分、または植物細胞において当該融合タンパク質を生成する方法に関する。本発明は、組換えタンパク質の植物に基づく生成において、標的遺伝子発現を、下流の精製方法と組み合わせる。植物サンプルは、任意の種類の植物、単子葉植物または双子葉植物、およびカルス、葉、種子、根、塊茎、または細胞培養物のような様々な植物部分に由来し得る。サンプルの性質に基づいて、発現および精製のための戦略は変化し得る。例えば、その簡単な溶解を考慮すれば、抽出およびさらなる精製のために、葉およびカルスのような新鮮なサンプルが好ましくあり得、一方、低いタンパク質分解、高いタンパク質含量、および輸送の簡便さの利点を有する種子のような乾燥サンプルは、抽出および精製のための良い開始サンプルである。本発明の方法によって生成および精製された組換えタンパク質は、任意のペプチドサイズであり得、哺乳動物、細菌または植物の任意の供給源に由来し得、そしてヒト、動物、または植物に対して行う任意の機能を有し得る。所望のタンパク質とELP-インテインタグとの融合物を発現するために、ELP-インテインシステムを採用し、ここでインテインはELPおよびその組換えタンパク質の間に位置する。ELPの温度感受性相転移の性質を使用して、融合タンパク質を他の細胞成分から分離し、そしてインテインの自己切断機能が、組換えタンパク質をELP-インテインタグから放出する。切断後、ELP-インテインタグを、ELP相転移によって不溶性の凝集物に変換し得、それを可溶性の組換えタンパク質から容易に分離および除去し得る。その融合タンパク質は、ELPをコードする遺伝子配列、インテインをコードする遺伝子配列、および組換えタンパク質をコードする遺伝子配列を含む、連続的なオープンリーディングフレームの配列によってコードされ、ここでインテイン遺伝子は、ELP遺伝子配列および組換えタンパク質遺伝子配列の間に挿入される。短いアミノ酸配列をコードする、適当なリンカー配列を、望ましいなら、ELPとインテインとの間、またはインテインと組換えタンパク質との間、またはさらにはELPユニットの間にも挿入して、ELP、インテインおよび組換えタンパク質の必要なフォールディングを可能にし得る。1つのELPタンパク質ドメインは、1つまたはそれより多いELPユニット、すなわちV-P-G-X-Gペプチドを含み得、ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸である。ELPユニットの反復回数は、ELPタンパク質の相転移温度に影響を与え得、従ってELPドメインの長さすなわちELPユニットの数を、実施上の要求のために調節し得る。ELPユニットの数は、1から数百まで変動し得る;従って、5、10、20、30、50、100、またはそれより多いユニットを有するELPドメインを採用し得る。中間の数も含まれる。その融合タンパク質は、少なくとも1つのELPドメインを含むが、1つより多いELPドメインを含んでもよい。例えば、2つのELPドメインが、組換えタンパク質のN末端およびC末端に別々に位置し得、インテインタンパク質が、末端およびELPドメインの間にある。インテインは、一般的にELPおよび組換えタンパク質の間に位置し、そして切断部位、インテインのN末端またはC末端を、インテインタンパク質のいくつかのアミノ酸の置換によって調整し得る。pH、チオール試薬の添加および温度の上昇のような、環境条件の変化によって、切断反応をもたらし得る。本発明の1つの実施形態において、組換えタンパク質をELP-インテインから放出するための、そのC末端におけるインテインの切断を、8.5から6.0-6.5へのpH変化によって行い得る。別の実施形態において、インテインを、チオール試薬の添加によって、そのN末端において切断する。インテインの切断部位に接続された、標的タンパク質の最初のアミノ酸または最後のアミノ酸は、切断反応において一定の役割を有し、そして切断の効率を決定し得る。従って、切断を生じさせるために、標的タンパク質の最初のアミノ酸/最後のアミノ酸を変更するまたは維持する、または別のアミノ酸を加えることを考慮しなければならない。1つの実施形態において、組換えタンパク質、すなわちPandanusレクチンPALのN末端に、アミノ酸Metを加える。そのような修飾は、この特定のタンパク質に限らない。それらはその所望のタンパク質の性質に関わらず有益であり得る。もしそのタグがC末端にあるなら、C末端アミノ酸の修飾も望ましくあり得る。組換えタンパク質の植物における蓄積レベルは、常にその続く下流の精製において重要な役割を果たす。一般的に、精製のためには高い蓄積が好ましい。従って、タンパク質発現を増加させ、そして標的タンパク質の特定の器官、組織、または細胞内位置における蓄積を促進するために、強力なプロモーターの使用、コドン使用の最適化、および/または標的化シグナルによるタンパク質の特定の細胞区画への標的化を介して、プラスミド構築物の任意の成分の最適化を行い得る。発現の最適化の1つの実施形態において、ユビキチン融合戦略を使用する。融合発現プラスミドを構築するための、融合タンパク質をコードする核酸配列は、ELP-インテイン融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここでELP-インテイン融合タグをコードする配列は、組換えタンパク質のN末端またはC末端に位置し得る。ELPとインテインとの間および/またはインテインと組換えタンパク質との間および/またはELPユニット自体の間に、任意のリンカー配列が位置し得るが、そのリンカーの配列を、融合タンパク質またはその成分のいずれのフォールディングにも影響しないように選択する。ELPおよびインテインタンパク質ドメインをコードする配列を、ELPユニットの数を調節する、およびインテインタンパク質においてアミノ酸置換を行うことによって、組換えタンパク質の発現および精製を改善するために最適化し得る。プロモーター、適用される任意のシグナルペプチドまたは標的化ペプチド、5’UTR成分、コドン使用、および他の融合組成物の選択によって影響を受ける、転写、翻訳、および翻訳後レベルおよび標的化位置において発現を最適化し得る。Agrobacteriumに媒介される形質転換、および遺伝子銃粒子伝達システムbiolisticparticledeliverysystemのような、ELP-インテイン融合タンパク質の一過性または安定な発現を引き起こす様々な形質転換方法を使用し得る。植物サンプルからの所望のタンパク質の抽出および精製を、以下:a抽出緩衝液、適用される装置、抽出温度、サンプル溶解および融合タンパク質の位置に基づく任意の組織のプレ精製を含むがこれに限らない、抽出技術の最適化;b任意の不溶性成分および他の非特異的成分の除去を含む、ELP相転移による精製前の、粗製抽出サンプルの前処理;c温度、pH、塩成分、適用される装置、さらなるELPタンパク質、または任意の他の成分の添加を含む、ELP相転移を引き起こす条件の調整;d微細濾過、遠心分離、または分離をもたらす任意の他の方法のような、凝集したELP融合タンパク質を他の混入成分から分離する方法の選択;e温度、緩衝液成分、pHおよび適用される任意の装置を含む、凝集したELP融合タンパク質を再び可溶化するための方法の改変;fELP相転移を反復させること、上記で述べたc、d、およびeにおけるELPに基づく精製に関連する異なる方法の組み合わせのような、純粋なELP-インテイン融合タンパク質を得るためのELP相転移の操作の改変;g緩衝液成分、pH、温度、および化学物質の添加のような、インテイン誘発切断を引き起こすための条件の調整;およびh関連するELP相転移および任意のさらなる精製のような、インテイン誘発切断の後に、最終的な切断組換えタンパク質を切断されたELP-インテインタグから分離するための最適化、を含む方法によって慣用的に最適化し得る。時には、インテインの自己切断は、特にpHに応答する本来の切断機能のために、インビボで起こり得、それは細胞内位置、または植物の成長環境によっても変動し得る。下記の実施例において、インビボでELP-インテイン-PAL融合タンパク質の部分的な切断が存在した。しかし、そのインビボ切断は、未切断の融合タンパク質の精製に影響を与えなかった。その方法を、一過性の発現および安定な発現の両方から組換えタンパク質を精製するために行い得る。形質転換方法をまた、実験条件および宿主植物のような実際的な状況によって調整および実施し得る。発現後、タンパク質の抽出が、続く精製工程において重要な因子の1つである。緩衝液成分、pH、温度、細胞を溶解するために適用する装置、および必要な勾配分離を含む、抽出条件の慣例的な最適化を行い得る。抽出方法をまた、当該分野において公知であるように、標的タンパク質の細胞内位置に基づいて調整し得る。本発明の例証となる実施形態において、種子粉末を抽出のために使用し、そして尿素をその抽出緩衝液に加えて、イネ種子のタンパク粒において内因性プロラミンと凝集した融合タンパク質を抽出した。ELP-インテインシステムによる精製の前に、ろ過、遠心分離、または他の可能な手順によって任意の不溶性の組成物を除去するために、前処置を行う必要があり得る。融合タンパク質の溶解度または続くELPの相転移またはインテイン切断に影響を与えるいくつかの成分が抽出緩衝液中に存在するなら、脱塩、透析、ろ過、およびさらなる遠心分離によって、プレ除去pre-clearanceを行い得る。本発明の例証となる実施形態において、抽出緩衝液中の尿素を、脱塩または透析によって除去した。サンプルの抽出後、ELP-インテインシステムによる精製を開始する。上記の背景技術において述べたように、ELPの相転移温度は、ELPタンパク質の長さおよび成分、ELP融合タンパク質の濃度、インテインおよび組換えタンパク質のサイズおよび性質、温度および塩濃度および組成を含む、多くの因子に影響される。ELPの凝集を行うために、好ましくは穏やかな温度および緩衝液成分によって、条件を調整および最適化し得る。凝集工程の後、ELP-インテイン融合タンパク質凝集物を、再可溶化する。一般的に、低温および冷たい緩衝液が、その凝集した融合タンパク質がその可溶性相に戻るのを助ける。再可溶化緩衝液の成分の調整、氷浴または低温インキュベーションの延長によって、または微細濾過および振とうのような、装置の補助によって、最適化を実行し得る。凝集した融合タンパク質の再可溶化後、任意の不溶性の成分を除去するために、さらなる遠心分離が必要であり得る。本発明の1つの実施形態において、融合タンパク質の回収を促進するために、最初のサイクルの遠心分離を置き換えて、微細濾過を使用し、一方第2および第3のサイクルでは通常の遠心分離を適用する。別の実施形態において、例えば一晩、4°Cの撹拌は、ELPの再可溶化を増強する。ELP融合タンパク質を他の混入タンパク質から分離するための統合された手順において、可溶性ELP融合タンパク質の凝集から、凝集した融合タンパク質の可溶性状態への回復までの工程は、1つの分離サイクルとして定義される。純粋な融合タンパク質を得るために、そのサイクルを数回繰り返し得、そしてサイクル中の分離操作を、微細濾過および/または遠心分離によるような、異なる方法によって調整し得る。しかし、広範囲かつより長い分離手順はより高い純度を生じ得るが、融合タンパク質の収率は減少し得る。望ましい純度を有するELP-インテイン融合タンパク質が得られたら、反応pHおよび/または温度を変化させることによって、および/または塩濃度の調整のような他の化学物質を加えることによって、インテインの切断反応を引き起こし得る。切断を加速するために、反応時間の延長および凍結-解凍によるような、さらなる補足的な操作を適用し得る。SDS-PAGEまたは他の方法によって、切断率を推定し得る。好ましくは、切断されたELP-インテインタグを放出された組換えタンパク質から最終的に分離する前に、完全な切断を達成する。ELP-インテインタグおよび組換えタンパク質を、ELP-インテイン部分を凝集させ、そしてそれを上清中の可溶性タンパク質から除去することによって、同様の方式で分離する。望ましい組換えタンパク質の最終産物を、さらに透析または脱塩して、適用した緩衝液中のあらゆる望ましくない小さな成分を除去し得る。下記の1つの実施例において、ELP-インテインタグへの融合物として発現した、PandanusレクチンPALの生成システムとして、トランスジェニックイネ種子を使用した。PALタンパク質は、Pandanusamaryllifolius由来の単子葉植物マンノース結合レクチンである。約12.5kDの分子量Mwを有するPALタンパク質タンパク質配列を図1cに示すは、いくつかのヒト癌細胞系統の増殖に対して阻害活性を示すTian,L.ら、未発表。本発明の融合タンパク質の発現および精製システムの適用可能性も、下記で述べるようにタバコにおいて示す。以下の実施例を、本発明を制限するためではなく、説明するために示す。実施例1トランスジェニックイネ種子からの組換え抗腫瘍タンパク質の精製この実施例において、生成システムとして、トランスジェニックイネ種子を使用し、そして標的タンパク質として、約12.5kDの分子量Mwを有するPandanusレクチンPALタンパク質配列を図1cに示すを使用した。PALは、いくつかのヒト癌細胞系統HepG2、A549、DLD-1、U87およびCapan-2の増殖に対して阻害活性を示す。PALを、ELP-インテインタグへの融合物で発現し、ここでELPは60回反復のVPGXGペプチドを含み、そしてそのインテインタンパク質は、低pHに応答してそのC末端において切断される。ELP-インテインタグを、PALのN末端に挿入し、そしてELP-インテイン-PAL融合タンパク質のイネ種子からの精製後、インテインの切断を、緩衝液pHを低下させることによって引き起こして、標的PALタンパク質をEiタグから分離し得る。ELP-インテイン-PAL融合タンパク質に関する図1aで示す発現カセットを、イネグルテリンGluAGt1プロモーターおよびシグナルペプチドによって駆動する。この配列を、イネ形質転換のために、T-DNAバイナリーベクターpSB130の複数のクローニング部位にクローニングした。その構築物をSAと命名した。Scheller,J.らTransgenicRes.200613:51-57によって記載されたものと同様の方法によって、ELP60ドメインをコードする配列を、図1bに示すELP10遺伝子の6回反復から生成した。SspDnaBインテインインテイン1と呼ばれるおよびリンカー遺伝子を、neb.com/nebecomm/products/productN6952.aspにおいてワールドワイドウェブにおいて見出される、NEBから購入したpTWIN2ベクターリンカー遺伝子に関して5902-5940bpおよびインテイン遺伝子に関して5941-6402bpから得た。ELP10およびインテイン遺伝子の両方を、イネの好ましいコドン使用に関して最適化し、そしてGenScriptCorporationによって合成した。Agrobacterium媒介性形質転換を、イネ品種9983を用いて、上記で述べたベクター構築物によって行った。イネ種子カルス誘導、Agrobacterium媒介性形質転換、セレクションおよびイネ植物の再生を、cambia.org/daisy/cambia/4214.htmlでワールドワイドウェブにおいてCAMBIAによって提供されるプロトコールに従って行った。再生したトランスジェニックイネ小植物を、土壌に移し、そしてChineseUniversityofHongKongのトランスジェニック植物のための施設で育てた。再生したイネ植物に対するPCRによる一次スクリーニングの後、イネ植物のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを、さらにサザンブロッティングによって確認した。1から2コピーの導入遺伝子を含む、いくつかのトランスジェニック植物を得た。成熟陽性トランスジェニックイネ種子を、T1種子として回収した。陽性T1植物から生成したT2種子を、SDS-PAGEおよび特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによるタンパク質分析のために使用した。トランスジェニックイネ種子におけるPALタンパク質発現を、図2に示し、そして下記で説明するように、SDS-PAGEおよび抗-PAL抗体を用いたウェスタンブロット分析によって検出した。成熟イネ種子を、ブレンダーによって粉末に粉砕した。全タンパク質抽出緩衝液0.1MのTris-HCl、pH8.5、50mMのNaCl、5のSDS、4Mの尿素、5のβ-メルカプトエタノールを20μl/mgで種子粉末に加え、そして激しく振とうしながら2~4時間、35~37°Cでインキュベートした。ホモジネート全体を、20,000×gで10分間、室温で2回遠心分離した。上清を、発現分析のために種子からの全抽出タンパク質TEPとして回収した。ウェスタンブロッティングのために、TEPを、ローディングバッファー50mMのTris-HCl、pH8.5、2のSDS、10のグリセロール、0.02のブロモフェノールブルーを用いた15SDS-PAGEによって分離し、そしてPVDF膜に移した。ウサギ由来の抗PAL一次抗体および抗ウサギIgG-ペルオキシダーゼ抗体Sigmaを用いて、ウェスタンブロッティングを行った。E.coliによって生成された組換えPALを、ポジティブコントロールとして使用した。SA形質転換イネ種子において、予測されるMw56kDを有する融合タンパク質を、SDS-PAGE分析において観察し得た。いくつかの融合タンパク質は、SA種子においてインビボで自己切断され、遊離PALを生じ、そしてグリコシル化PALが検出された。独立したイネ系統由来の全種子タンパク質に対するウェスタンブロット分析を、図2aおよび2bに示す。ウェスタンブロッティングによって決定された、インビボの未切断EiP融合タンパク質にのみ注目した場合、SAトランスジェニックイネ種子におけるEiPタンパク質の蓄積レベルは、平均で乾燥種子1gあたり1.40mgに達した。全タンパク質抽出から最終的な精製までの手順を、図3で模式的に示す。一般的に、純粋なEiPタンパク質を得るために、2または3サイクルのELPの相転移が必要であり、そしてこれらの工程の2つにおける一晩のインキュベーションのために、約2~3日が必要であった。より詳細には、全タンパク質を、Bt緩衝液0.1MのTris-Cl、pH8.5;50mMのNaCl;6Mの尿素;0.5のTweenTM-20によって抽出した。その抽出サンプルEXをろ過して、あらゆる破片を除去しEXF、PD-10カラムGEHealthcareによって脱塩するDSか、またはBp緩衝液0.1MのTris-HCl、pH8.5;50mMのNaClで透析して尿素を除去し、そして次いで20,000×gで10分間、4°Cで遠心分離してあらゆる不溶性の破片を除去したDSC。その上清を精製のために回収した。ELPの温度感受性逆相転移を引き起こすために、5MのNaClを1:1v/vの比でサンプルに加え、そしてその混合物を、45°Cで10分間インキュベートした。1回目の精製サイクルを、いくらか改変して、GeらBiotechnolBioeng200695:424-432によって記載されたように行った。NaCl処理サンプルを、MilliporeTMフィルターPES膜、0.22μmを備えたシリンジに移し、そしてろ液を廃棄し、一方凝集したELP-インテイン-PAL融合タンパク質はフィルターに残った。1mlの冷却Bs緩衝液0.1MのTris-HCl、pH8.5;50mMのNaCl;0.1のTweenTM-20を迅速に通過させて、さらなるNaClをフィルターから除去し、そして一部の融合タンパク質が可溶性状態に戻って、そしてフィルターを通過したかもしれないので、洗浄液を回収した。さらに1-3mlまたはもとのTEPサンプルの1/10容積の冷却Bs緩衝液を、プランジャー無しのシリンジに加え、そしてそのシステム全体を、溶出液可溶性EiPを重力によって回収するために、フィルターの下にチューブを置いて、4°Cで一晩維持した。あらゆる残った溶液を、プランジャーで押して、残りの可溶性EiPを回収した。溶出液および洗浄液を、1CSサンプルとして合わせた。2回目のサイクルを、WuらNatureProtoc.20061:2257-2262によって報告されたように、逆相転移手順によって行った。NaCl5Mを、1:1v/vの比で加え、そしてその混合物を、45°Cで10分間インキュベートし、続いてすぐに遠心分離した。ペレットを冷却Bs緩衝液にもとの容積の1/5で再懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら氷上に1時間維持した。4°Cで遠心分離したあと、その上清を2CSサンプルとして回収した。3回目のサイクルを、ペレットを再可溶化するために50mMのPBS緩衝液pH7.2を使用した以外は2回目のサイクルと同様に行った。その上清を3CSサンプルとして回収した。インテインによる切断反応を引き起こすために、1/10容積の1MのTris-HClpH4.5を、6.0-6.5の最終pH値まで、3CSサンプルに加えた。サンプルを室温で2時間、そして次いで4°Cで一晩切断した完全な切断のため。NaClを加えることによってもう一度相転移を行い、続いて遠心分離した。その上清を、最終的な精製標的タンパク質FSとして回収し、そしてペレットを、最終的なELP-インテインタグFPとして再懸濁した。精製EiP融合タンパク質を、2または3回のサイクル後に、SDS-PAGEで観察し得た。切断工程において、低いpHのTris緩衝液を加えることによって達成したpHシフトは、インテイン切断反応を開始したが、4°Cで24から36時間のような、より長いインキュベーションを、完全な切断のために使用する。切断を促進するために、凍結-解凍処理を使用し得る。PALの最終的な上清に、ELP-インテインタグは残っていなかったので、その切断および続く精製工程は有効であった図4、レーンFS。この高度に最適化された方法によって、純粋なPALタンパク質の収量は、乾燥種子1gあたり約30μg~80μgであった。PALは、単子葉植物マンノース結合レクチンに属し、そしてヒト癌細胞の増殖に対して阻害活性を示す図5、サンプルPH。本発明者らは、いくつかの異なるヒト癌細胞系統、HepG2肝臓、A549肺、DLD-1結腸、U87神経膠芽腫およびCapan-2膵臓に対する、増殖阻害活性分析を用いて、イネ種子からELP-インテインシステムによって精製したPALタンパク質の生物活性を試験した。結果は、ELP-インテインシステムによって精製されたPALが、E.coliから精製されたPALタンパク質と同様の用量依存性阻害活性を示し図5に示すように、ELP-インテイン融合発現および精製システムは、組換えタンパク質の生物活性を減少させなかったことを示す。実施例2トランスジェニックタバコからの組換えヒトG-CSFの精製この実施形態において、トランスジェニックタバコ葉を生成システムとして使用し、一方、腫瘍学および感染保護において広く使用されている重要なヒトサイトカインである、ヒト顆粒球コロニー刺激因子hG-CSFを、標的タンパク質として使用した。バイナリーベクターpBI121のCaMV35Sプロモーターを、hG-CSF融合発現キメラを構築するために使用し、そして発現した融合タンパク質を植物細胞分泌経路へ向けるために、ファセオリンシグナルペプチドを導入した。その発現カセットを図6に示す。標的タンパク質の発現を改善するためにユビキチンを導入し、そして内因性ユビキチン特異的プロテアーゼUbpsによって融合タンパク質から正確にプロセシングしたTian,L.およびSun,S.S.M.、BMCBiotechnol201111:91。図6は、カッコによって示されるhG-CSF-インテイン2-ELP110融合タンパク質をコードする配列を示し、そして矢印は、DTTまたはβ-メルカプトエタノールの添加によって引き起こされるインテイン2の切断部位を意味する。hG-CSFを、そのC末端でのインテイン-ELPIEタグとの融合物で発現し、それをhG-CSF-インテイン-ELPまたはGIEとして示し図6、ここでELPは110回反復VPGXGペプチドを含み、一方インテインタンパク質インテイン2と呼ばれるは、ジチオスレイトールDTTまたはβ-メルカプトエタノールのようなチオール試薬の添加に応答してそのN末端で切断される。タバコ葉からのそのGIE融合タンパク質の精製後、インテインの切断を、β-メルカプトエタノールの添加によって引き起こして、標的hG-CSFタンパク質をIEタグから放出した。ELP110遺伝子を、上記で記載したものと同様の方法によって、ELP10遺伝子図1bの11回反復から生成した。MthRIR1インテインおよびリンカー遺伝子を、ワールドワイドウェブでneb.com/nebecomm/products/productN6952.aspにおいてNEBから購入した、pTWIN2ベクターから得たインテイン遺伝子に関しては6445-6846bp、およびリンカー遺伝子に関しては6847-6888bp。pBI121発現ベクター中のキメラ遺伝子を、AgrobacteriumtumefaciensLBA4404に、エレクトロポレーションによって形質転換し、そしてAgrobacteriumによる形質転換を、以前に記載されたように、若いタバコ葉を用いて行ったTian,L.およびSun,S.S.M.、BMCBiotechnol201111:91。植物の再生後、個々の植物を、hG-CSF特異的プライマーを用いてPCRスクリーニングし、そして15個のトランスフェクトした植物のうち11個が陽性の結果を示した。トランスフェクトした植物においてGIEタンパク質の発現を検出するために、全可溶性タンパク質を、抽出緩衝液[0.1Mのリン酸緩衝化食塩水PBS、pH7.2;1mMのEDTA;0.1のTweenTM-20;100mMのアスコルビン酸;2のポリビニルピロリドン;完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤、Roche]によって、21日齢のトランスジェニック植物の新鮮な若い葉から抽出した。新鮮な葉1gを、乳鉢で液体窒素によって粉末に粉砕し、そして1mlの抽出緩衝液を加えた。ホモジネート全体を2mlのエッペンドルフチューブに移し、氷上で15分間インキュベートし、そして20,000×gで、4°Cで10分間遠心分離した。上清を回収し、そしてさらに10分間遠心分離した。最終的な上清を、葉からの全可溶性タンパク質として回収した。葉から抽出された全可溶性タンパク質を、4×ローディングバッファー0.2MのTris-HCl、pH6.8;0.8gのSDS;40のグリセロール;5のβ-メルカプトエタノール;50mMのEDTA;8mgのブロモフェノールブルーで希釈し、5分間沸騰させ、そして15SDS-PAGE上で10μg~50μgのタンパク質/レーンで分離し、続いてクーマシー登録商標ブリリアントブルー染色でタンパク質を可視化した。イムノブロッティングに関して、SDS-PAGEによって分離した全タンパク質を、染色無しに直接PVDF膜に移した。ウサギポリクローナル抗hG-CSF抗体PeproTechおよび抗ELP抗体を一次抗体として、および抗ウサギIgGペルオキシダーゼ抗体Sigmaを二次抗体として用いてウェスタンブロッティングを行い、そしてECL検出システムAmershamCo.、Bucks、UKを用いて現像した。PeproTechから購入した組換えhG-CSFおよびE.coliによって生成されたELP60タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。図7aに示すように、予測される分子量80kDを有するGIE融合タンパク質を、トランスジェニックタバコ葉において、インビボで自己切断無しに合成したが、SDS-PAGEを介しては、野生型WTおよびトランスジェニック植物の間に、タンパク質バンド形成パターンの明確な差は観察されなかった。個々の植物由来の全可溶性タンパク質に対するウェスタンブロット分析を、図7bおよび7cに示す。トランスジェニックタバコ葉におけるGIEタンパク質の蓄積レベルは、平均で、新鮮重量FW1gあたり126μgに達した。全可溶性タンパク質抽出から開始して最終的な精製まで、精製標的タンパク質を得るための手順を、図8に模式的に示す。一般的に、純粋なGIEタンパク質を得るために3回以上のサイクルのELPの相転移が必要であり、この工程のうちの2つにおける一晩のインキュベーションのために、2日以上続くものである。この実施例において、本発明者らは、ELP相転移の効率を改善するために、110個のVPGXG反復から成るELPを使用した。タバコ葉におけるGIE融合タンパク質の蓄積レベルが低いので、精製中のGIEの凝集を引き起こすために、同じ容積の3MNaClの添加および37°Cで1-3時間のインキュベーションを使用した。GIEタンパク質の凝集、続く遠心分離の後、最初のサイクルにおける標的融合タンパク質の再可溶化を、懸濁緩衝液50mMのリン酸緩衝化食塩水PBS、pH7.2;0.1のTweenTM-20;完全プロテアーゼ阻害剤を加え、そして4°Cで一晩撹拌することによって行った。その懸濁液を2000×gで、4°Cで20分間遠心分離し、そして上清をサンプル1CSとして回収した。2回目および3回目のサイクルにおいて、3回目のサイクルにおいて凝集したGIE融合タンパク質を再可溶化するためにプレ切断緩衝液50mMのTris-HCl、pH8.5;50mMのNaCl;1mMのEDTAを使用した以外は、同様の精製方法を使用した。精製手順と共に、抽出物中の色素も、徐々に除去した。インテインの切断を引き起こすために、3回のサイクル後に、β-メルカプトエタノールを10mMの最終濃度までサンプルに加え、そして切断を完了するために、サンプルを室温で30分間、および4°Cで2時間維持した。切断反応をモニタリングするために、部分的なサンプルを、室温で10分間インキュベートした後に回収したサンプルCL。切断後、もう一度ELPの相転移サイクルを、上記で記載したように行い、そして上清中の最終的な切断hG-CSFサンプルFSおよびペレット中のインテイン-ELPタグサンプルFPを回収した。図9を参照のこと。3回のサイクル後、SDS-PAGEにおいて、精製GIE融合タンパク質が明確に観察され得、そしてインテイン切断を引き起こしてhG-CSFをインテイン-ELPタグから放出し得た。図9に示すように、hG-CSFの最終的な上清レーンFSにIEタグは残っていなかったので、切断および続く精製工程は有効であった。最終的なhG-CSFの回収は、新鮮な葉1gあたり10ng~20ngであり、そして発現レベルは、新鮮な葉1gあたり126μgの標的タンパク質であった。ヒトG-CSFは、重要な薬学的タンパク質であり、それを、ヒト免疫不全ウイルスHIV、肺炎、糖尿病性足感染症、白血病、および発熱性好中球減少症fibrileneutropeniaを有する患者において免疫系を強化するために、および化学療法を受けている癌患者を処置して、細胞毒性治療薬によって生じる白血球レベルの減少を軽減するために使用し得る。hG-CSFの最終的な上清上記で記載したサンプルFSを、脱塩し、凍結乾燥し、そしてhG-CSF依存性NFS-60細胞系統の増殖を促進する能力を測定することによって行った生物活性試験のために検出緩衝液50mMのPBS、pH7.2に再懸濁した。この細胞系統は、hG-CSFまたは他の公知の増殖因子の存在下でのみ増殖する。72時間のインキュベーション後、検出緩衝液で処理した細胞は、未処理のサンプルと同様のベースライン増殖レベルを示した。1ngの市販のhG-CSFで処理した場合、NFS-60細胞の増殖は、未処理サンプルCTより260促進され、一方タバコ葉由来の1ngの精製hG-CSFを添加した検出緩衝液を含むサンプルは、NFS-60細胞の増殖を促進する同様の能力captivityを示し、精製hG-CSFは、市販のhG-CSFと同様に生物活性であることを示した。精製GIEタンパク質も試験し、そして生物学的活性を示したが、細胞増殖活性において対応する減少があり、インテイン-ELPタグは、標的hG-CSFの生物活性を破壊しなかったことを示唆する。これらの結果は、ELP-インテイン融合発現および精製システムが、組換えタンパク質の生物活性を減少させないことを確認する。"