"ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理を含み、かつ、複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程と、血小板溶解物を調製する工程と、溶媒洗剤S/Dウイルス不活性化処理を行う工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって前記S/Dを除去する工程であって、該HICは、前記溶解物をHICに充填する工程及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、第2の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む方法。前記血小板溶解物を調製することが、前記S/Dウイルス不活性化処理中に行われる、請求項1に記載の方法。前記S/Dウイルス不活性化処理中に、凝集物低減のサブ工程が行われる、請求項1又は2に記載の方法。前記凝集物低減が濾過によって行われる、請求項3に記載の方法。前記HICが、前記溶解物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンから成り、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、請求項5に記載の方法。S/D除去の前に、前記溶解物を、血小板由来因子と結合することができる分子と接触させることを更に含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記分子が、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項6又は7に記載の方法。前記第2の直交するウイルス不活性化処理が熱不活化を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記血小板が濃縮された分画が、複数のドナーからプールしたアフェレーシスからの洗浄及び/又は白血球低減血小板分画である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記抽出物を凍結乾燥することを更に含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。請求項1~11のいずれか一項の方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物。生物活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来のウイルスに対して安全な血小板抽出物。PDGF-AB、VEGF、及びTGFb1を含み、PDGF-AB:TGF-b1の比が少なくとも0.2である、及び/又はPDGF-AB:VEGFの比が少なくとも45である、請求項13に記載の抽出物。PDGF-ABが濃縮された、請求項12~14のいずれか一項に記載の抽出物。bFGFが濃縮された、請求項12~15のいずれか一項に記載の抽出物。非凝固性である、請求項12~16のいずれか一項に記載の抽出物。凝集物含有量が少ない、請求項12~17のいずれか一項に記載の抽出物。前記抽出物が固形の形態である、請求項12~18のいずれか一項に記載の抽出物。送達剤と共に提供される、請求項12~19のいずれか一項に記載の抽出物。前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される、請求項20に記載の抽出物。組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び/又は炎症の治療用である、請求項12~21のいずれか一項に記載の抽出物。疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって生体液体混合物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法であって、前記生体液体混合物を提供する工程と、前記混合物をHICに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。HICによって生体液体調製物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法であって、前記調製物を提供する工程と、前記調製物をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。前記生体調製物が血小板由来の調製物である、請求項24に記載の方法。前記方法が、前記調製物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、請求項24又は25に記載の方法。前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、請求項26に記載の方法。請求項23~27のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な調製物又は混合物。請求項12~19のいずれか一項に記載の抽出物を収容する容器を含むキット。送達剤を更に含む、請求項29に記載のキット。前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される、請求項29又は30に記載のキット。成長因子及び/又は栄養因子活性を有するタンパク質の混合物を含む、複数のドナーから得られるウイルスに対して安全な血小板抽出物の調製物の必要性が存在する。血小板は、組織再生及び治癒過程の主要段階に関与する因子の完全なアレイを含む。現在、創傷治癒を促進するために、患者由来の全自己活性化血小板が用いられている。しかしながら、全自己血小板の使用には、複数の欠点、とりわけ標準化の欠如が存在すること、患者自身の血小板に治癒に必要な因子が不足している場合があること、特殊な装置が必要であること、手順は時間がかかり、かつ患者自身が行う追加の工程を必要とすること、医学的に訓練された人材を必要とすること、が挙げられる。これらの問題は、例えば、複数のドナーから調製された血小板抽出物を用いることによって解決され得る。しかしながら、ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。更に、血小板抽出物を製造するための追加の工程は、その中に含まれる因子の回収及び活性を含み得る。本発明は、成長因子及び/又は栄養因子の活性を有するタンパク質の混合物を含む、複数のドナー由来の、ウイルスに対して安全な少なくとも二重ウイルス不活性化血小板タンパク質抽出物の長年にわたる必要性を解決する。本発明は、複数のドナー由来の、活性でウイルスに対して安全な血小板抽出物、並びにその調製及び使用に関する。ウイルスに対して安全な血小板抽出物は、活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物を含む。一態様において、本発明は、ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法に関し、該方法は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理、例えば、溶媒洗剤S/Dウイルス不活性化処理と熱不活化とを含む。該方法は、複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程、例えば、複数のドナーからプールしたアフェレーシスから、洗浄及び/又は白血球低減血小板分画を提供する工程と、血小板溶解物を調製する工程と、溶媒洗剤S/Dウイルス不活性化処理を行う工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによってS/Dを除去する工程であって、該HICは、溶解物をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、第2の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む。本発明の一実施形態において、血小板溶解物を調製する工程は、S/Dウイルス不活性化処理中に行われる。本発明の更なる実施形態によると、S/Dウイルス不活性化処理中に、例えば濾過によって、凝集物低減のサブ工程が行われる。本発明の特定の実施形態において、HICは、溶解物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む。更に、本発明の更なる実施形態において、定組成溶液は、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、非定組成溶液は、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む。更に、本発明の更なる実施形態において、溶解物は、S/D除去の前に、血小板由来因子と結合することができる分子例えば、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせと接触させられる。更に、本発明の更なる実施形態において、該抽出物は凍結乾燥される。別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物に関する。本発明は、生物活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来の、ウイルスに対して安全な血小板抽出物を提供する。本発明の一実施形態では、該抽出物は、PDGF-AB、VEGF、及びTGFb1を含み、PDGF-AB:TGF-b1の比は少なくとも0.2である、及び/又はPDGF-AB:VEGFの比は少なくとも45である。本発明の一実施形態では、該抽出物は、PDGF-AB及び/又はbFGFが濃縮される。本発明の一実施形態では、該抽出物は非凝固性である。本発明の一実施形態では、該抽出物は、凝集物含有量が少ない。本発明の一実施形態では、該抽出物は固形である。本発明の一実施形態では、該抽出物は、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される送達剤と一緒に提供される。別の態様において、本発明は、組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び/又は炎症の治療における該抽出物の使用に関する。別の態様において、本発明は、本発明による抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、組織治癒、臓器再構築、及び/又は組織再生の方法に関する。別の態様において、本発明は、本発明による抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、必要とする被験体炎症を治療する方法に関する。本発明の一実施形態では、該抽出物は送達剤と一緒に投与される。本発明は、生体液体混合物を提供する工程と、混合物をHICに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって生体液体混合物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法を提供する。本発明はまた、HICによって生体液体調製物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法であって、該調製物を提供する工程と、調製物をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法を提供する。本発明の一実施形態において、生体調製物は、血小板由来の調製物である。本発明の一実施形態において、該方法は、調製物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む。本発明の一実施形態において、該方法は、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、非定組成溶液が、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、定組成溶液を含む。別の態様において、本発明は、本発明の方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な高い調製物又は混合物を提供する。更に別の態様において、本発明は、本発明による抽出物を収容し、任意に送達剤を含む容器を含むキットを提供する。一実施形態において、送達剤は、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される。本発明は、複数のドナーに由来する、活性を有しかつウイルスに対して安全な少なくとも二重ウイルス不活性化血小板抽出物、並びにその調製及び使用に関する。ウイルスに対して安全な血小板抽出物は、生物活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物を含む。全血輸血から得られる洗浄血小板と比べて、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPは、微量のアルブミンと、場合によっては、少量の他の血漿不純物とを含有することが、本発明により見出された。S/D処理溶解及びウイルス不活性化、S/D除去、凍結乾燥、及び再構成に供されたWAP例えばLYOI抽出物は、生体的に活性であり、細胞株、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC又は3T3線維芽細胞において増殖及び/又は形態の変化、例えば、血管様構造形成血管形成と関連する又はスピンドル様構造の形成運動性の増加の特性を誘発することができることも見出された。該抽出物の活性は、トロンビン、生物活性成分BAC;OmrixBiopharmaceuticalsLtd.製のEVICEL商標フィブリン封止剤において見られるようなフィブリノーゲン成分、又はトロンビンBACFibrinを添加することによって増加することが観察された。ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。通常は、ウイルス及び/又は未知の病原体を伝播させる危険性を最小限に抑えるためにいくつかの手段がとられ、該手段には、特定のウイルスが存在するかどうかに関する提供されたサンプルの定期試験、及び製造プロセスの間のウイルス不活性化/除去工程などが含まれる。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、製品の有益な特性を変更しない少なくとも2つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。HIV、B型肝炎、C型肝炎、及びウエストナイルウイルスなどの脂質エンベロープウイルスは、ウイルスの脂質膜を破壊するS/D処理によって、迅速かつ効果的に不活性化される。次に、抽出物は、第2のウイルス不活性化処理、例えば、熱処理低温殺菌工程又はナノ濾過に供された。抽出物はナノ濾過システムを容易に通過できないことが、本発明によって見出された。驚くべきことに、熱処理低温殺菌によるウイルス不活性化工程は実行可能であり、細胞増殖アッセイ及び形態変化の誘発例えば、血管形成の誘発又はスピンドル状の形状の誘発アッセイにより試験した場合に、生物活性抽出物例えばLYOIIを生じさせることが本発明によって見出された。トロンビン、フィブリノーゲン、又はフィブリンの添加は、抽出物の活性を顕著にすることが見出されたフィブリノーゲン又はフィブリンの添加は管状構造形成を促進し、トロンビンは増殖を増加させる。本発明の一実施形態では、熱処理のため、S/D処理された材料は安定化工程に供された。低温殺菌工程中の安定化剤としての役割を果たすスクロース及びグリシンを、溶液に添加することができる。次いで、溶液は、60±0.5°Cにて9~10.5時間にわたって連続的に混合しながら熱処理することによって低温殺菌され得る。次に、溶液は、例えば、酢酸塩グリシン緩衝液で希釈され得、安定化剤は、例えば、酢酸塩グリシン緩衝液に対する透析濾過によって除去され得る。凝集物質が存在する場合には、例えば、20、5及び1.2μmのフィルタの後0.45μmのフィルタを使用する1回以上の逐次濾過による濾過によって、凝集物質を除去することができる。滅菌濾過は、0.2μmのフィルタを使用して、無菌条件下で実施され得る。溶液は、高圧滅菌したバイアルの中で凍結乾燥され、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で高圧滅菌したゴム栓で密封され得る。二重ウイルス不活性化抽出物は、出発物質の濃度と比較して4倍又は32倍に濃縮され得る例えば、LYOIIIで見られるようにことが、本発明によって見出された。濃縮は、例えば、溶液の透析濾過によって、及び/又は凍結乾燥された抽出物を、凍結乾燥前の抽出物の体積よりも小さい体積に再構成することによって、達成され得る。凝集物質が存在する場合、上記の逐次濾過によって該凝集物質を除去することができる。濃縮された抽出物例えば、LYOIIIは、非常に少量の血漿タンパク質を含むことが見出された。濃縮抽出物例えば、LYOVI及びLYOVIIは凝固可能でないことが見出された。該抽出物は、限界レベルの凝固タンパク質を呈するか、又は凝固タンパク質が完全に欠如していた。生理的に活性なフィブリノーゲンレベルは、当該技術分野において現在用いられている高感度法によって検出不可能であるので、濃縮抽出物には生理的に活性なフィブリノーゲンが欠乏している。非活性化部分トロンボプラスチン時間NAPTT測定試験によって評価すると、抽出物はプロ凝固活性を欠いていた。NAPTTは、本質的に、EuropeanPharmacopoeia7.0.;2.6.22:Activatedcoagulationfactorsmonograph01/2008:20622;inEuropeanPharmacopoeiaStrasburgFrance,CouncilofEurope,2009に記載の通りに実施され得る。凝固因子の欠如もまた、活性化部分トロンボプラスチン時間APTT試験によっても決定された。本発明による血小板抽出物には、凝固因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II、及びIの1つ以上が欠如しており、このことにより該抽出物が非凝固性となることが、この試験によって示された。サンプル中に存在するPDGF-ABの量に正規化すると、抽出物の濃度の増加が、3T3-スイスアルビノマウスSwissalbinomouse線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、濃縮抽出物の影響は、出発物質の溶解物よりも顕著であることが本発明によって見出された。特に、濃縮抽出物の影響は、陽性対照MasterMix、200ng/mLmのTGF-β1、0.5ng/mLのb-FGF、5ng/mLのVEGF、及び300ng/mLのPDGF-AB3を用いて調製された組み換えヒト成長因子のカスタム混合物よりも顕著であった。濃縮抽出物をヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC単層に添加すると、管形成を促進することも見出された。HUVEC単層の管形成における共力効果は、濃縮抽出物をフィブリン封止剤と組み合わせて添加することによって示された。最適なS/Dウイルス不活性化が得られるように、S/D処理中に、凝集物を除去するサブ工程を加えることができる例えば、LYOIVにおいて行われるようなサブ工程。凝集物除去は、例えば、遠心分離;濾過;分取サイズ排除クロマトグラフィーSEC;例えば、100KDのポリエーテルスルホンPES膜、100KDのポリフッ化ビニリデンPVDF膜、300KDのPES膜、ポリプロピレン膜、醉酸セルロース膜を使用する限外濾過によって、及び/又は当該技術分野において周知の任意の他の方法によって行われ得る。任意に、塩化カルシウム又は他のカルシウム塩の添加と清澄濾過とによる凝集物除去の追加工程が含まれる。例えば、最終濃度40mMの塩化カルシウムを添加した後凝集物の沈殿を促進するため、例えば、20、5、1.2、及び0.45μmのフィルタを使用して清澄濾過することができる。一実施形態において、この工程はS/D処理の後に追加される。凝集物除去のためのこれら追加工程は実行可能であり、生物活性抽出物を生じさせることが、本発明によって見出された。凝集物含有量の低い血小板抽出物は、静脈内投与で有利に使用され得る。同様に、凝集物含有量の低い血小板抽出物は、比較的高濃度のカルシウムを含む構成成分と共に使用され得る。凝集物除去に供された抽出物による細胞の処理は、出発物質の溶解物及びPRP-R[PRP放出物、カルシウム及びトロンビンEVICEL商標より入手で活性化される]と同様の方法で、線維芽細胞運動性及び創傷閉鎖スクラッチアッセイを促進することが、線維芽細胞を含有する未コーティングの細胞培養ウェル、及びコラーゲン又はフィブリノーゲンでコーティングされたウェルにおいて見出された。PRP-Rは、インビボ設定における創傷治癒に有効であることが報告されているLacciKM,DardikA,2010。更に、凝集物除去に供された抽出物は、HUVECにおいて、血管形成に関連する強い形態変化を誘発したことが、発明によって見出された。特定の血小板因子は、S/D除去で使用するHICカラムに少なくとも1つの溶離工程を追加し、更に溶離物質を収集することによって、S/D除去工程中に回収され得ることが、本発明によって見出された。かかる因子の1つはPDGF-ABである。本発明に従ってHICを非定組成溶液で洗浄することにより、LYOV、VI、及びVIIで見られるようにPDGF-ABの回収又は濃縮が3倍となり得ることが見出された。PDGF-ABの濃度は、4mLの再蒸留水DDWを用いた再構成の後の最終凍結乾燥物質で測定された。PDGF-ABの濃度は、LYOVIにおいて4,578pg/mL、LYOVにおいて15,028pg/mL、及びLYOVIIにおいて194,353pg/mLであることが見出され、これらは、出発物質として用いた血小板当たりの、LYOVIにおいて約7×10-7pg、LYOVにおいて2.26×10-6pg、及びLYOVIIにおいて3.12×10-5pgのPDGF-ABに相当する。特に、PDGF-ABが濃縮された抽出物が細胞の増殖に与える影響は、組み換えPDGF-ABのみの場合よりも顕著であり、他の血小板の抽出成分が、線維芽細胞の増殖を相乗的に高める得るという事実を指摘した。本発明の方法を用いて濃縮/増加される別の因子は、bFGFFGF-2又はβ-FGFとも称されるである。本発明に従ってHICを非定組成溶液で洗浄することにより、LYOVIで見られるようにbFGFの回収又は濃縮が少なくとも1.8倍となり得ることもまた見出された。bFGFの濃度は36~127pg/mLであることが見出され、これは出発物質として用いた血小板当たり約5.4×10-9~1.95×10-8pgのbFGFに相当する。これら知見は、本発明による抽出物の調製への道筋をつけた。本発明の抽出物は、次の特徴の1つ以上を含む:増殖及び/又は栄養因子例えば、TGF-b1、b-FGF、VEGF、及びPDGF-ABを有するタンパク質を、当該技術分野において周知の血小板因子混合物と比べてよりバランスのとれた組成物と共に含む;二重ウイルス不活性される例えば、S/D処理されかつ低温殺菌される;凝集物含有量が少ない;同じ因子の生理学的比率と同様の比率で該因子を含む;TGF-b1、VEGF、及びPDGF-ABを生理学的にバランスのとれた比率で含む;並びに、血漿不純物の減少例えば、IgG及びフィブリノーゲンレベルの減少を呈する。用語生理学的にバランスのとれた比率は、血小板、濃縮血小板、プールした血小板、白血球低減血小板、プールした白血球低減血小板、洗浄血小板、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAP調製物、血小板抽出物、多血小板血漿放出物PRP-R、血清、及び/又は血小板放出物の生理学的組成物中の因子の比率と同様である、例えば、PDGF-AB:TGF-b1の比率及び/又はPDGF-AB:VEGFの比率を指す。血清は、典型的には、活性化された血小板より放出される増殖/栄養因子を含有する、フィブリノーゲン又は他の凝固因子を有さない血漿を指す。血清の場合、生理学的比率は、血清中に存在する増殖/栄養因子値に従って市販のELISAキットの添付文書に従って計算され得る。このような一例では、PDGF-AB:TGF-b1及びPDGF-AB:VEGFの生理学的比率は、それぞれ0.5及び90.9であることが見出された。一実施形態において、WAP出発物質におけるPDGF-AB:TGF-b1の生理学的比率は、少なくとも0.2、又は約0.2~約0.5の範囲内、例えば、約0.2、0.3、0.36、0.4、0.44、及び0.47である。別の実施形態では、WAP出発物質におけるPDGF-AB:VEGFの生理学的比率は、少なくとも45、又は約45~約103の範囲内、例えば、約45、64、73、76、及び103である。本発明の一実施形態では、本発明による抽出物は、少なくとも0.2であるPDGF-AB:TGF-b1の比率、及び/又は少なくとも45であるPDGF-AB:VEGFの比率を含む。本発明の一実施形態では、本発明による抽出物は、少なくとも約0.56であるPDGF-AB:TGF-b1の比率、及び/又少なくとも約74であるPDGF-AB:VEGFを含むLYOVIIで見られるように。本発明による抽出物は、次の利点の1つ以上を有する:標準化されており、ロバストな安定した生体的性能を可能にする:生物活性、例えば、細胞における増殖及び/又は形態変化の誘発を呈する;組み換えPDGF-ABのみの濃度と比較すると低い濃度のPDGF-ABで高い活性を呈するので、非増殖性細胞における形質転換変化transformationalchangeの可能性が減少する;最適なウイルスに対する安全性を有する;例えば、血漿タンパク質除去工程例えば、洗浄工程に供されなかった血小板濃縮分画から調製された抽出物よりも低レベルの血漿不純物を含むので、改善された免疫学的な安全性を有する;及び非凝集性である。用語ウイルスに対して安全な血小板抽出物は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理に供された抽出物を指す。少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理は、ウイルスを不活性化するために、少なくとも2つの異なりかつ独立した処理を実施することを含む。以下の非限定的な処理の例のうちの2以上の組み合わせを用いることができる。すなわち、低温殺菌処理、溶媒/洗剤S/D処理、ナノ濾過処理、低pH処理、紫外線照射処理、及びチオシアン酸ナトリウム処理。用語ウイルスを不活性化する又はウイルス不活性化は、ウイルスは溶液中に維持されるが、例えば、それらの脂質コーティングを溶解することによって生育不能にする状況、及び/又は、例えば、サイズ排除技術によって、ウイルスが溶液から物理的に除去される状況を指す。用語血小板抽出物は、血小板由来因子を含む混合物を指す。典型的には、抽出物は細胞を含まない。用語溶解物は、細胞膜を破壊することによって細胞が破壊されときに得られる溶液を指す。用語活性血小板抽出物は、成長因子及び/又は栄養因子などの生体的活性物質を含み、かつ、細胞増殖細胞運動の誘発、細胞間相互作用、及び/又は細胞形態変化などであるが、これらに限定されない生物活性を示す血小板抽出物を指す。用語複数のドナー由来の血小板抽出物は、少なくとも2つの個体から調製される血小板抽出物を指す。個体は、ヒト又は他の哺乳類であり得る。用語増殖因子は、典型的には、細胞の成長、増殖、及び/又は分化を促進する作用剤を指す。成長因子の例としては、トランスホーミング成長因子TGF、例えば、TGF-b1、線維芽細胞成長因子FGF、例えば、bFGF、血管内皮成長因子VEGF、血小板由来成長因子PDGF、例えば、PDGF-AB、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。用語栄養因子は、典型的には、細胞の分化及び/又は生存を刺激する作用剤を指す。栄養因子の例としては、接着分子、骨形成タンパク質、サイトカイン、eph受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子FGF、GDNF、ヘパリン結合成長因子、インスリン様成長因子、ニューロトロフィン、セマフォリン、トランスホーミング成長因子TGFβ、チロシンキナーゼ受容体リガンド、及び同類のものが挙げられるが、これらに限定されない。血小板因子は、増殖活性と栄養活性とを有し得る。用語凝集物は、タンパク質凝集体などの固形物を含有する物質塊を指す。タンパク質凝集は、生体的薬物の製造中に起こり得るProteinaggregationandbioprocessing.CromwellME,HilarioE,JacobsonF.AAPSJ.2006Sep15;83:E572-9.Review。タンパク質の凝集物は、可溶性/不溶性、共有結合性/非共有結合性、可逆的/不可逆的、及び/又は天然/変性タンパク質の形態であり得る。例えば、静脈内投与に要求される場合、凝集物は、当該技術分野において周知である様々な技術、例えば、遠心分離、濾過、分取サイズ排除クロマトグラフィーSEC、例えば100KDのポリエーテルスルホンPES膜、100KDのポリフッ化ビニリデンPVDF膜、300KDのPES膜、ポリプロピレン膜、醉酸セルロース膜を使用する限外濾過によって、及び/又は当該技術分野において周知の任意の他の方法によって、抽出物から除去され得る。有利には、本発明の一実施形態では、抽出物は、低い凝集物含有量を示し、静脈内投与で使用することができる。本発明の一実施形態では、次の式に従って凝集物レベル濁度を計算することができる。前記のように測定して、タンパク質1mg当たり0.03OD320以下である抽出物のレベルは、凝集物含有量の少ない抽出物であると考えることができる。本発明の一実施形態では、凝集物含有量は、タンパク質1mg当たり約0.01検出限界~0.03OD320の範囲内である。用語血漿不純物は、例えば、トロンビン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子、第II因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、及びIgGを指す。低レベルの血漿不純物とは、例えば、検出不可能なレベルの生理的に活性なトロンビン凝固時間による、検出不可能なレベルの生理的に活性なフィブリノーゲン凝固時間による、約0.13未満又は約0.034mg/mL未満のフィブリノーゲンELISAによる、約0.004又は0.001mg/mL未満のフィブロネクチン、検出不可能なレベルの生理的に活性なフォンヴィレブランド因子、約0.0013又は0.0014IU/mL未満の第II因子、約0.008又は0.009IU/mL未満の第VII因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第VIII因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第IX因子、約0.003IU/mL未満の第X因子、検出不可能なレベルの生理的に活性な第XI因子及び第II因子、並びに約0.076又は0.011mg/mL未満のIgGを指す。本発明の一実施形態では、フィブリノーゲン濃度ELISAによるは、0.01~0.1mg/mLの範囲内であり、フィブロネクチン濃度は0.002~0.02mg/mLの範囲内であり、第VII因子濃度は0.001~0.01IU/mLの範囲内であり、第X因子濃度は0.001~0.01IU/mLの範囲内であり、IgG濃度は0.01~0.1mg/mLの範囲内である。検出不可能なレベルの凝固因子及び/又は血漿タンパク質不純物を呈する抽出物は、これら因子/タンパク質が欠乏していると考えられる。溶媒/洗剤S/Dウイルス不活性化処理は、典型的には、脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープウイルス又は脂質被覆ウイルスを不活性化するプロセスを指す。処理は、洗剤TritonX-45、TritonX-100、又はTween80など及び溶媒[リン酸トリ-n-ブチルTnBP、リン酸ジアルキル又はリン酸トリアルキルなど]の添加によって実施され得る。脂質被覆ウイルスを非活性化するために用いられる溶媒-洗剤の組み合わせは、例えば、TnBPとTritonX-100の組み合わせ、Tween80とコール酸ナトリウムの組み合わせ、及び他の組み合わせなど、当該技術分野において周知である任意の溶媒-洗剤の組み合わせであり得る。使用する溶媒/洗剤の濃度は、例えば、米国特許第5094960A号及び同第4789545A号で実施されるような、当該技術分野において一般的に用いられる濃度であり得る。本発明の一実施形態では、>0.1のTnBPと>0.1のTritonX-100の組み合わせが用いられる。本発明の別の実施形態では、1のTritonX-100と0.3のTnBPの組み合わせが用いられる。典型的には、溶媒-洗剤がウイルスを不活性化する条件は、5~8のpH値で10~100mg/mLの溶媒/洗剤、及び2~37°Cの温度にて30分~24時間からなる。しかしながら、溶媒/洗剤の他の組み合わせ、及び他の好適な条件が、当業者には明らかであろう。低温殺菌は、典型的には、熱が脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を破壊するプロセスを指す。低温殺菌は、用語熱不活化と置き換えることができる。熱不活化は、59.5~60.5°Cの範囲の温度にて9~10.5時間にわたって行われ得る。例えば、不活性化は、60°Cにて10時間にわたって行われ得る。スクロース及びグリシンなどの安定化剤が、低温殺菌工程中に血小板溶解物に添加され得る。ナノ濾過は、典型的には、Planova商標20N、35N、及び75N;Viresolve/70商標、Viresolve/180商標などのナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスをサンプルから除外するプロセスを指す。フィルタは、70nm未満、好ましくは15~50nmの孔径を有し得る。しかしながら、サンプルからウイルスを低減又は排除するのに十分な孔径を有する任意の膜を、ナノ濾過で採用することができる。ナノ濾過で除去されるウイルスは、エンベロープ[例えばHIV、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルスCMV、エプスタインバールウイルスEBV、単純ヘルペスウイルス]、及び非エンベロープ例えば、A型肝炎ウイルス、パルボウイルスB19、ポリオウイルスであり得る。低pH処理は、典型的には、エンベロープウイルスに対して有効である。本発明の一実施形態では、血小板溶解物は、低pH、典型的にはpH4にさらされ、6時間から21日の間続く。低pH処理は用語酸性pH不活性化と置き換えることができる。用語活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物は、少なくとも4つの異なる血小板由来因子、例えば、成長及び/又は栄養因子を含む組成物を指す。本発明の一実施形態において、該因子は、TGF-b1、b-FGF、VEGF、及びPDGF-ABである。典型的には、本発明の抽出物は、非凝集性であり、低レベルの血漿不純物、例えば、低IgGレベル及び/又は低フィブリノーゲンレベルを示す。例えば、約0.076mg/mL以下のIgG及び約0.034mg/mL以下のフィブリノーゲンといった、3mg/mL未満のIgG及び0.98mg/mL未満のフィブリノーゲンである。用語非凝集性は、抽出物をトロンビンなどの活性化剤と混合しただけでクロットを形成することができない血小板抽出物を指す。活性化剤は、フィブリノーゲンからフィブリンを形成することができる、トロンビンなどの作用剤、及び/又はヘビの毒から得られる溶液を指す。本発明は、成長及び/又は栄養因子例えば、TGF-b1、b-FGF、VEGF、及びPDGF-ABを有するタンパク質を、他の血小板因子混合物に比べてよりバランスのとれた組成物と共に含む、ウイルスに対して安全性な血小板抽出物を提供する。よりバランスのとれた組成物は、複数のドナーから得られ、かつ成長因子活性及び/又は栄養因子活性を有する少なくとも4つの異なるタンパク質例えば、TGF-b1、b-FGF、VEGF、及びPDGF-ABを含み、1つ以上の血小板因子、例えば、PDGF-AB及び/又はbFGFが濃縮されている組成物を指す。PDGF-ABが濃縮された抽出物は、S/D及び非定組成溶液による洗浄のないHICによるS/D除去に供された抽出部よりも、少なくとも3倍多い量、例えば、約3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8倍、又はそれ以上の量のPDGF-ABを含み得る。PDGFが濃縮された抽出物はまた、例えば、S/D処理の前又はS/D処理の後、及び、例えば、HICによるS/D除去の前の等価物質のPDGF-ABの量と同様であるPDGF-ABの量/レベルを含む抽出物、あるいは、出発物質staringmaterialの溶解物中の量と同様のPDGF-ABの量を含む抽出物に関する。PDGF-ABの濃縮は、精製及び/又はクロマトグラフィー工程におけるPDGF-ABの回収を増加させることによって得ることができる。一実施形態において、PDGF-ABの濃縮は、非定組成溶液での洗浄を追加することにより、HIC工程におけるS/D除去中にPDGF-ABの回収を増加させることによって得られる。したがって、本発明による方法により、高収率のPDGF-ABを有する血小板抽出物を得ることができる。bFGFが濃縮された抽出物は、例えば、S/D及び非定組成溶液による洗浄のないHICによるS/D除去に供された同じ抽出物よりも、少なくとも1.8倍多い量、例えば、約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8倍、又はそれ以上の量のbFGFを含み得る。bFGFが濃縮された抽出物は又は、例えば、S/D処理の前又はS/D処理の後、及び、例えば、HICによるS/D除去の前の等価物質のbFGFの量と同様であるbFGFの量を含む抽出物、あるいは、出発物質の溶解物中の量と同様のbFGFの量を含む抽出物に関する。bFGFの濃縮は、精製及び/又はクロマトグラフィー工程におけるbFGFの回収を増加させることによって得ることができる。一実施形態において、bFGFの濃縮は、非定組成溶液での洗浄を追加することにより、HIC工程におけるS/D除去中にbFGFの回収を増加させることによって得られる。したがって、本発明による方法により、高収率のbFGFを有する血小板抽出物を得ることができる。本発明による血小板抽出物は、任意の治療目的のために使用され得る。本発明の抽出物は、例えば、被験体における傷害組織の治癒を促進するのに適している。血小板抽出物は、標的領域への注射用に又は静脈内投与用に使用され得、包帯、発泡体、パッド、及びマトリックス上に適用される/投与されることができ、並びに/又は局所適用のためにフィブリン封止剤と組み合わされて使用され得る。抽出物は、包帯、パッド、発泡体、及びマトリックスなどの様々な送達剤から、所望の場所の中/上に放出され得る。媒介物は、天然及び/又は合成材料で作製され得る。かかる物質の例としては、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコールPVA、ポリエチレングリコールPEG、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート[PHEMA]、寒天、酸化再生セルロースORC、自己組織化ペプチド[SAP]、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明による抽出物とフィブリン封止剤の組み合わせを、ラットの皮下移植モデル[移植組織における組織反応、血管形成、及び全体的治癒を評価するのに一般的に用いられる-InternationalOrganizationforStandartizationISO10993-6,BiologicalEvaluationofMedicalDevices-Part6:TestsforLocalEffectsAfterImplantation2007]で使用すると、フィブリン封止剤のみ又は生理食塩水の使用と比べて、移植後7日後に、より多くの血管形成及びより良好な治癒がもたらされたことが、本発明によって見出された。抽出物は2つの異なる用量で用いられ、以下は実際に投与された、いくつかの成長因子の量である:TGF-b15.27又は52.7ng;PDGF-AB0.1又は1.05ng;bFGF0.0024又は0.024ng;及びVEGF0.023又は0.23ng200μLのフィブリン封止剤と共に投与。抽出物の有益な効果は用量依存的であることが示された。本発明による抽出物は、顕微鏡で決定すると、移植部位に存在するマクロファージ及びリンパ球の数が少ないことから、有害効果を有さないこともまた見出された。本明細書で使用する用語被験体は、ヒトを含む哺乳動物を含む。一実施形態では、被験体は患者である。用語任意の治療目的は、化粧用途のため、及び/又は被験体における任意の疾病、疾患、又は病状のための、任意の治癒的又は予防的治療を指す。例示的な治療目的としては、内部又は外部創傷の早期治癒、即ち、非処置の創傷又は他の既知の創傷治療に比べて創傷を迅速に治癒させる;血管形成、有糸分裂誘発、細胞増殖、好中球及びマクロファージ、コラーゲン合成、遊走、創面収縮、細胞外マトリックス合成、上皮形成、及び走化性を刺激することが必要な任意の外傷又は病状の治療;組織生成、再生、又は再組織化、上皮形成、新血管形成、又は血管形成が必要な外傷又は病状の治療;瘢痕形成を少なくする;術後合併症及び死亡率を低減する;例えば切断部又は潰瘍などの皮膚創傷の治癒、が挙げられるが、これらに限定されない。血小板抽出物は、整形外科例えば、骨修復、関節軟骨修復、膝関節形成術、腰椎固定術、及び椎間板変性において;口腔外科;歯科及び顎顔面外科例えば、チタンインプラントの圧密、上顎洞底挙上術、及び骨再形成;筋肉、腱及び靱帯修復のため;顔面成形手術及び再建外科;慢性的な皮膚創傷の治癒、皮膚火傷治癒、眼科学;顔面神経再生、末梢神経修復、中枢神経系CNS修復脊椎及び/又は脳外科手術、視神経修復、神経圧迫症候群修復、脳神経修復、坐骨神経修復;心臓手術及び肥満手術などであるが、これらに限定されない、様々な手術分野で使用される。抽出物は、患者の身体部位の表面上に投与される。用語表面は、裸眼視力で見ることができる外部表面、及び生物の内部構造の一部である内部身体部位の表面を指す。外部表面としては、顔の皮膚、喉、頭皮、胸、背中、耳、首、手、肘、臀部、膝、及び他の皮膚部位が挙げられるが、これらに限定されない。内部身体部位の例としては、外部環境に露出される体腔又は解剖学的開口部、及び鼻孔、唇、耳、子宮、膣、及び卵巣などの生殖器部、肺、肛門、脾臓、肝臓、並びに心筋などの内部器官が挙げられるが、これらに限定されない。表面は、出血性又は非出血性部位であってよい。あるいは、抽出物は、例えば、皮内、腹腔内、皮下、髄腔内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、及び/又は静脈内に注射によって投与され得る。抽出物はまた、点滴によって投与され得る。用語治療的有効量は、疾病、疾患、又は病状を予防する又は治療するある症状又は全ての症状を緩和するのに必要な用量を指す。有効量は、組成物の投与に応答した、疾病の経過中の任意の変化に基づいて判断され得る。有効用量は、被験体の年齢及び体重、疾患及びその重症度例えば、早期か末期か、並びに当業者によって認識され得る他の要因に応じて変えることができる。抽出物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含むことも可能である。本明細書で使用する用語賦形剤は、抽出物に添加される不活性物質を指す。賦形剤は、例えば、貯蔵中に活性物質がそれらの化学安定性及び/又は生物活性を維持するのを確実にするために、製造プロセスを支援するために、及び/又は審美的理由で例えば、色添加され得る。添加される賦形剤は、一般に、安全かつ非毒性である。本発明による血小板抽出物は、外科用封止剤と組み合わされて使用され得る。生体封止剤例えば、フィブリノーゲン及びトロンビン成分で調製されるフィブリン封止剤など、アクリル酸、シアノアクリル酸、及びポリエチレングリコールPEGポリマーなどの合成封止剤、並びに、例えばゼラチン-ホルムアルデヒド-レゾルシノールGFR接着剤などの生体材料及び合成材料の混合物から作られた半合成封止剤などであるが、これらに限定されない、異なる種類の外科用封止剤を、血小板抽出物と組み合わせて使用することができる。本発明の一実施形態では、血小板抽出物は、フィブリン封止剤成分と組み合わせて使用される。本発明の別の実施形態では、血小板抽出物は合成封止剤と共に使用される。本発明はキットを提供する。キットは、本発明による抽出物を含む容器を含み得る。抽出物は、固形、溶液、又は凍結形態であり得る。抽出物が固形で提供される場合には、キットは、固形抽出物を再構成するための薬学的に許容可能な担体を有する容器を更に含み得る。キットは、抽出物を患者に注射するための1つ以上の注射器及び/又は注射針を更に含み得る。キットは、使用説明書を更に含み得る。説明書は、抽出物を患者に投与するための方法を説明していてもよい。本発明はまた、フィブリン封止剤又は合成封止剤の成分を収容する容器と、本発明の抽出物を収容する容器と、使用説明書とを含むキットに関する。任意に、本発明の抽出物は、フィブリン封止剤の一成分の容器の中に入れられてもよい。また、本発明は、凍結乾燥された抽出物を収容する容器と、再構成溶液又は担体を収容する容器と、使用説明書とを含むキットに関する。フィブリン封止剤成分は、血液組成物から調製され得る。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿などの全血液の生成物であり得る。本発明の一実施形態において、フィブリノーゲン成分は、トラネキサム酸及びアルギニン若しくはリジン、又は混合物、若しくはアルギニン及びリジン、又はそれらの薬学的に許容可能な塩を更に含み得る血漿由来のタンパク質の溶液である生物活性成分BACからなる。BACは、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテートより誘導され得る。用語クリオプレシピテートは、全血より調製した凍結血漿から得られる血液成分を指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、通常は0~4°Cの温度で解凍すると、フィブリノーゲン及び第XIII因子を含む沈殿による上清が形成されることで得ることができる。この沈殿物は例えば遠心分離によって回収することができる。BAC溶液は、例えば、US-B-6,121,232及びPCT国際公開特許WO9833533に記載されるように、第VIII因子、フィブロネクチン、フォンヴィレブランド因子vWF、ビトロネクチン等を更に含む。BAC組成物は、塩酸アルギニンなどの安定化剤を含み得る。典型的には、BAC中のフィブリノーゲンの量は、約40~約60mg/mLの範囲である。BAC溶液中のトラネキサム酸の量は、約80~約110mg/mLであり得る。塩酸アルギニンの量は、約15~約25mg/mLであり得る。任意に、溶液は生理学的適合性を有するpH値に緩衝される。緩衝液は、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及び溶媒としての注射用蒸留水から構成され得る。グリシンは組成物中に約6~約10mg/mLの量で存在してよく、クエン酸ナトリウムは約1~約5mg/mLの範囲でよく、塩化ナトリウムは約5~約9mg/mLの範囲でよく、塩化カルシウムは約0.1~0.2mg/mLの濃度であり得る。別の実施形態では、BAC組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を、例えば、US-B-7,125,569及びPCT国際公開特許WO02095019に記載の方法を用いて、15μg/mL以下、例えば5μg/mL以下のプラスミノーゲンにまで低下させる。この場合、トラネキサム酸、アプロチニンaprotinine、又は任意の他の繊維素溶解阻害剤をBACに添加する必要はない。フィブリン封止剤は、Ca2、第VIII因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フォンヴィレブランド因子vWFなどのクロットの形成を促す成分を含むことも可能であり、これらの成分は、別々の成分として提供されるか又はフィブリン封止剤成分と配合され得る。血液組成物由来のフィブリン封止剤成分は、典型的には、感染性粒子から精製される。精製処置は、ナノ濾過、溶媒/洗浄剤処理によって、及び/又は当技術分野で既知の任意の他の方法によって、実施され得る。用語感染性粒子は、微生物又はプリオンのような微細粒子を指し、これらは生物有機体の細胞に感染する又は伝搬し得る。感染性粒子はウイルス粒子であってもよい。本発明に従って調製される血小板抽出物は、種々の細胞型、例えば、線維芽細胞及び幹細胞、例えば、内皮幹細胞、例えば、HUVECと共に使用され得る。細胞型は、意図する治療的使用に従って決定され得る。例えば、椎間板の再生では、脊索由来の細胞を含む細胞組成物を使用することができる。血管形成の誘発では、内皮幹細胞を使用することができる。本発明の血小板抽出物は、少なくとも2つの異なるウイルス不活性化処理を含む方法によって調製され得、該方法は次の工程を含む:複数のドナーから血小板が濃縮された分画を得る工程、血小板を溶解する工程、溶媒-洗剤S/Dウイルス不活性化処理を行う工程、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによりS/Dを除去する工程、及び第2の直交するウイルス不活性化処理例えば、低温殺菌を実施する工程。HICは、溶解物をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。HICへの溶解物の充填は、カラム内に詰め込まれたHIC樹脂と溶解物とを接触させることによって行われ得る。用語溶解物とHIC樹脂との接触は、広い意味で用いられ、例えば、溶解物内に存在するS/D物質と樹脂との間に結合相互作用が生じるように、溶解物を樹脂の十分近くまで接近させるあらゆるタイプの結合動作を指す。本発明は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理を含む、ウイルスに対して安全な血小板抽出物の調製方法を提供し、該方法は、複数のドナーからの血小板が濃縮された分画を提供する工程と、血小板溶解物を調製する工程と、例えば凝集物が低減した溶解物中で溶媒/洗剤S/Dウイルス不活性化処理を行う工程と、溶解物をHICに装填する工程を含むHICによりS/Dを除去する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離した分画を収集する工程と、第2の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む。血小板を多く含む材料を得ることができる分画としては、血液分画、血漿分画、アフェレーシスから得た洗浄及び白血球低減血小板、及びアフェレーシスから得た血小板が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、複数のドナーからプールした洗浄及び/又は白血球低減血小板が、血小板抽出物の調製のための出発物質staringmaterialとして使用される。有利には、洗浄血小板を出発物質staringmaterialとして使用することにより、上に述べたような血漿不純物が少ない非凝固性の血小板抽出物を得ることができる。典型的には、用語血小板出発物質は、本発明の方法で使用するために複数のドナーから得た、血小板が濃縮された分画を指す。血小板が濃縮された分画は、例えば、全血単位から、血液分画から、及び/又は血漿分画から分離され得る。血小板が濃縮された分画は、アフェレーシス献血から得ることができる。出発物質は、洗浄及び/又は白血球低減され得る。本発明の一実施形態では、血小板が濃縮された分画は、洗浄及び白血球低減され、アフェレーシス献血から得られる。一実施形態において、アフェレーシス白血球低減収集単位中の血小板の最小数は、CircularofInformationfortheUseofHumanBloodandBloodComponentsに明記されている通り、約3.0×1011又はそれ以上である。用語洗浄血小板は、洗浄工程に供された血小板を指す。洗浄手順の間、血小板の損失も起こり得る。洗浄は、0.9塩化ナトリウムを、少量のデキストロースと共に、又は少量のデキストロースなしで用いて行われ得る。洗浄手順は、CircularofInformationfortheUseofHumanBloodandBloodComponentsに詳述されている通りに行われ得る。本発明の一実施形態では、洗浄は次のように行われる。血小板物質単位を緩やかな条件下で遠心分離する。次に、上澄みを廃棄し、血小板ペレットを、緩やかな条件下において生理食塩水で洗浄の合間に遠心分離しながら少なくとも2回洗浄する。洗浄され、再懸濁された血小板は、本発明の方法で使用するまで凍結させることができる。用語白血球低減は、全血中の白血球含有量よりも低い白血球含有量を指す全血中の含有量は、血液単位当たり約1~10×109白血球である。任意の白血球の低減方法例えば、濾過によるを用いて、白血球低減単位leukocytereducedunitを得ることができる。白血球の低減は、アフェレーシス中に実施され得る。本発明の一実施形態では、約8.3×105未満の白血球を含有する血小板の単位を、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用する。別の実施形態では、約5×106未満の白血球を含有する血小板の白血球低減単位を、血小板抽出物の調製のための出発物質として使用する。用語アフェレーシスは、典型的には、一部例えば、血小板が分離されて保持され、残りはドナーに返血される、単一ドナーからの採血を指す。単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、約3.0×1011又はそれ以上の血小板を含有し得る。本発明の一実施形態では、単一ドナーから得られるアフェレーシス血小板の一単位は、最大6.0×1011までの血小板を含有する。血小板の溶解及び血小板に捕獲された因子例えば、様々な血小板成長因子及び/又は栄養因子の放出は、血小板が濃縮された分画を凍結解凍することによって、S/D処理によって、超音波処理によって[Slezaketal.,1987J.Exp.Med.V166p489~505],byFrenchpress[Salganicoffetal.,1975Biochem.Biophys.Actav385p394~411]、及び/又は当該技術分野において周知の他の方法によって行われ得る。本発明の一実施形態では、血小板の溶解は、血小板が濃縮された分画を凍結解凍した後、S/D処理を行うことによって実施される。典型的には、血小板の溶解は、無細胞血小板溶解物を生じさせる。本発明の一実施形態では、抽出物調製物の第1のウイルス不活性化工程は、エンベロープウイルスを排除するための血小板の溶媒-洗剤S/D処理を含む。S/D処理はまた、血小板の溶解、及びそれらの含有物の溶液中への放出を促進する。最適なエンベロープウイルス不活性化では、凝集物除去例えば、濾過によるを含むサブ工程が、S/D処理工程中に行われる。用語S/D除去溶媒-洗剤除去は、S/D処理で使用した溶媒-洗剤の大部分の除去を指す。溶媒-洗剤の除去は、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムHIC、例えば、C-18シリカ充填材料及びSDR溶媒-洗剤除去HyperDの使用を含む。S/D除去は、油抽出工程を更に含み得る。本発明の一実施形態では、細孔容積が架橋疎水性アクリルポリマーで充填されたシリカビーズで作製されるクロマトグラフィー充填材であるSDRHyperDを使用して、溶媒-洗剤を除去する。SDRHyperDは、有利には、疎水性相互作用の混合モード吸着を伴い、分子排除効果に関連する[GuerrierLetal.Specificsorbenttoremovesolvent-detergentmixturesfromvirus-inactivatedbiologicalfluids.JChromatogrBBiomedAppl.1995Feb3;6641:119~125]。C-18溶離条件と比べて、SDR溶離条件を用いると良好な結果が得られることが、本発明によって見出された。一実施形態では、SDR溶離条件を用いて、PDGF-ABの回収を増加させた。HICは、例えば、水性ポリマー樹脂マトリックスで充填されたカラムを指す。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、HICカラムに、結合緩衝液中のS/D処理された溶解物を充填することによって行うことができる。カラムは、例えば、カラムを結合緩衝液で洗浄することにより、S/D処理された溶解物を充填する前に平衡化される。用語平衡化は、カラムが、特定のpH値又はイオン強度といった特定の緩衝液条件に達するようにすること及び/又はカラムが特定の緩衝液条件に達するように調整することを指す。一実施形態において、カラムの調整は、カラムにS/D処理された溶解物を充填する前に、所定のpH値及びイオン強度を有する平衡化緩衝液でカラムを洗浄することによって行われる。本発明の一実施形態では、平衡化緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに5総体積に対するv/vヒト血清アルブミンHSAを含む。本発明の別の実施形態では、平衡化緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに1のヒト血清アルブミン総体積に対するv/vを含む。本発明の別の実施形態では、平衡化緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに0.2のヒト血清アルブミン総体積に対するv/vを含む。本発明の更に別の実施形態では、平衡化緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、0.2のヒト血清アルブミン総体積に対するv/v、並びに1の硫酸デキストラン全重量に対するw/wを含む。平衡化緩衝液は、HSAを約0.2~約5総体積に対するv/vの範囲濃度で含み得る。用語結合緩衝液は、S/D処理された溶解物をクロマトグラフィーカラムに充填する間に用いられる緩衝液を指す。多くの場合、溶解物を装填する前及び/又は装填する間にカラムを調整するために用いられる平衡化緩衝液は、結合緩衝液と呼ばれる。本発明の一実施形態では、結合緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに5総体積に対するv/vヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、結合緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに1のヒト血清アルブミン総体積に対するv/vを含む。別の実施形態では、結合緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、並びに0.2のヒト血清アルブミン総体積に対するv/vを含む。更に別の実施形態では、結合緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシンpH6.8~7.4、0.2のヒト血清アルブミン総体積に対するv/v、並びに1の硫酸デキストラン総重量に対するw/wを含む。結合緩衝液は、約0.2~約5総体積に対するv/vの範囲の濃度のHSAを含み得る。用語非結合物質は、典型的には、平衡で使用したのと同じ緩衝液、及び/又はS/D処理された抽出物をカラムに装填するのに使用した緩衝液結合緩衝液で充填カラムを洗浄した後に収集される分画を指す。有利には、HICを用いるS/D除去工程において、カラムを洗浄して非結合物質を収集した後、生理学的にバランスのとれた比率を有するよりバランスのとれた組成物及び/又は抽出物を得るために、非定組成溶液を使用して特定の成長因子、例えば、PDGF-AB及びbFGFの回収を増加させる。その際、S/D処理された溶解物におけるS/D除去は、結合溶液中のHICにS/D処理された溶解物を充填し、定組成溶液で洗浄し、溶解物を含有する非結合物質を実質的にS/Dを有さずに収集し、次に、HIC樹脂に結合したPDGF-AB、及びおそらく他の因子、例えば、bFGFを、溶離条件を用いて収集することによって行われる。最も一般的な溶離条件は、結合溶液によって形成された因子例えば、PDGF-AB結合環境が消失するように、移動相の組成のずれ又は非定組成溶液を使用する。本発明の一実施形態において、PDGF-ABは、HIC樹脂に結合したPDGF-ABを非定組成溶離条件nonisocraticelutionconditionsを用いて溶離することによって、HICを用いるS/D除去の間に3倍に濃縮される。用語溶離条件は、非定組成条件を用いること、例えば、カラムを充填及び/又は平衡化するために使用した溶液又は条件と異なる、及び/又は先の工程で使用した溶液と異なる溶液又は条件を用いることを指す。溶離条件は、S/Dは実質的にカラムに結合したままであるのに対して、因子が溶離されるようなものである。本発明による方法は、非定組成溶液を用いる少なくとも1つの溶離工程を含む。溶離条件は、典型的には塩濃度の上昇を伴う。C-18樹脂を使用する場合、0.3Mから最大1MのNaClの範囲の濃度を用いるHICの後の、溶離緩衝液のNaCl濃度とPDGF-AB回収との間には正の相関関係が存在する。改善された結果は濃度1Mにおいてにおいて得られたPDGF-AB回収率約30。SDR樹脂を使用する場合、試験したNaCl濃度0.7及び1.5Mの全てで、同様のPDGF-ABの回収が得られた。塩濃度の上昇と組み合わせて緩衝液に有機溶媒を加えることによって、PDGF-ABの溶離条件の更なる改善が得られた。最適な溶離条件は、S/Dは実質的にカラムに結合したままである一方で、因子のほとんどが溶離されるようなものである。PDGF-ABの高い回収率は、C-18及びSDR樹脂の両方において、1M未満のNaCl及び/又は20未満のエタノールを使用して、S/D除去に実質的に影響を与えずに得られることが、本発明によって見出された。b-FGFの溶離の増加は、エタノール及びNaClに加えて、b-FGFを結合可能な分子、例えば、ヘパリンを緩衝液に加えることによって得られることが、本発明によって見出された。S/D除去工程の前に、増殖/栄養因子を結合可能な分子例えば、硫酸デキストランで溶解物をインキュベートし、かかる分子の存在下でS/D除去工程を行うと、PDGF-AB及びb-FGFの回収の最適な結果が得られた。本発明の一実施形態では、使用する溶離溶液は、結合緩衝液と異なる、例えば、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、及び0.2のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なり;20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、及び1のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なり;並びに/又は20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、及び5のヒト血清アルブミンを含有する溶液と異なる。本発明の別の実施形態では、溶離溶液は、酢酸ナトリウム、グリシン、及びヒト血清アルブミン以外の組成物を含む。本発明の別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、及び0.2のヒト血清アルブミン以外の組成物を含む。別の実施形態では、溶離緩衝液は、有機溶媒、塩、及び/又は成長/栄養因子に結合する分子を含む。別の実施形態では、溶離緩衝液は、エタノールを、例えば10~12.5の濃度で、NaClを、例えば0.5M~1Mの濃度で、ヘパリンを、例えば5IU/mLの濃度で、及び/又は硫酸デキストランを、例えば0.1~1の濃度で含む。別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、及び0.2のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、5IU/mLのヘパリン、及び0.2のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、1の硫酸デキストラン、及び0.2のヒト血清アルブミンを含む。別の実施形態では、溶離溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、0.1の硫酸デキストラン、及び0.2のヒト血清アルブミンを含む。更に別の実施形態では、該溶液は、20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、1の硫酸デキストラン、及び0.2のHSAを含む。本発明の一実施形態において、該方法は、2つ以上の溶離工程を含む。そのような場合には、溶離溶液は、先の工程で使用した溶液と異なり、結合緩衝液と同一であり得る。本発明の一実施形態において、非定組成溶液は、5~15のエタノール、0.2M~1.2MのNaCl、及び0.1~1.0のHSA例えば、0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液例えば、20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシン、pH6.8~7.4である。他の可能な塩は、KCl、MgCl2、CaCl2であるが、これらに限定されない。他の可能な溶媒は、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールethyeleneglycolであるが、これらに限定されない。2つの溶離工程である、工程Iでは、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、5IU/mLのヘパリン増殖/栄養因子に結合する分子、及び0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム及び10mMグリシン、pH6.8~7.4を用いて、及び工程IIでは、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシン、pH6.8~7.4を用いて行うことにより、かかる2つの溶離工程の不在下で得る調製物と比べて、PDGF-ABの回収又は濃縮が少なくとも3倍となり、bFGFの回収又は濃縮が約1.8倍となるLYOVIで見られるようにことが、本発明によって見出された。本発明の一実施形態では、非定組成条件による2工程溶離が行われる。本発明の別の実施形態では、該工程の少なくとも一方例えば、第1の工程で使用する非定組成溶液は、ヘパリンなどの成長因子に結合する分子を、2~30IU/mL、2~25IU/mL、2~20IU/mL、2~15IU/mL、2~10IU/mL、又は2~5IU/mLの濃度範囲で含む。本発明の一実施形態では、非定組成溶液は、ヘパリンを5IU/mLの濃度で含む。S/D処理の後でS/D除去工程の前に、最終濃度1w/wの硫酸デキストラン[増殖/栄養因子に結合する分子]でインキュベートする工程を追加することにより、また、一方は、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、0.1の硫酸デキストラン、及び0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシン、pH6.8~7.4を用い、他方は、S/D除去工程の間の酢酸塩グリシン緩衝液中の1の硫酸デキストラン及び0.2のHSAを用いる、2つの溶離工程を行うことにより、かかる溶離なしに得る調製物と比べて、PDGF-ABの回収又は濃縮が約6.6倍となり、bFGFの回収又は濃縮が約2.8倍となり得るLYOVIIに見られるようにことが、本発明に従って更に見出された。これら溶離工程によって、HICによるS/D除去の前の因子の濃度と比較して、bFGFの回収率は85に増加され得、PDGF-ABの回収率は88に増加され得る。驚くべきことに、LYOVIにけるPDGF-ABの全体的な回収率が1.5であるのに比べ、LYOVIIにおける出発物質、WAPからのPDGF-ABの全体的な回収率は、51であった。LYOVIにおける37と比べ、LYOVIIにおけるVEGFの全体的な回収率は73であった。本発明の一実施形態において、本発明の方法は、S/D除去工程に先立って、溶解物を、因子例えば成長因子に結合する分子と接触させる工程を更に含む。因子に結合する分子は、例えば、最終濃度範囲が0.01~1、例えば1w/wの濃度の硫酸デキストランであり得る。このような実施形態では、結合緩衝液は、酢酸ナトリウム、グリシン、及びヒト血清アルブミンに加えて、硫酸デキストランを含む。本発明の別の実施形態では、非定組成溶液は、最終濃度0.1w/wの硫酸デキストランを含む。溶離溶液の順序は、PDGF-AB及びb-FGFの回収レベルの一因となることが、本発明によって見出された。即ち、因子の回収は、異なる非定組成溶液を使用する場合、及び/又は溶離の順序が変更される又は逆になる場合に変化し得る。分子は、接触すると増殖/栄養因子が結合することができる、ヘパリン、硫酸デキストラン、ヘパラン硫酸、及び他の硫酸化多糖類、グリコサミノグリカン、又は多価陰イオン、及び同類のものであり得る。用語分子と因子との間の接触は、広い意味で用いられ、化合物と因子との間に結合相互作用が生じるように、分子を溶解物中に存在する目的の因子の十分近くまで接近させるあらゆるタイプの結合動作を指す。接触は、化合物を溶解物中に導入するなどであるが、これに限定されない、様々な方法で実施され得る。有利には、S/D除去工程の前に、成長因子及び/又は栄養因子に結合する分子と溶解物とを接触させることで、いくつかの因子例えば、PDGF-AB、bFGFの量の増加/濃縮がもたらされる。別の態様において、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって、生体液体物質から溶媒-洗剤S/Dを除去する方法に関する。該方法は、S/Dを含む液体をHICに充填する工程と、非結合分画及び非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。更に、別の態様では、本発明は、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって、生体液体物質から溶媒-洗剤S/Dを除去する方法に関する。該方法は、S/Dを含む液体をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。用語生体液体物質又は生体液体混合物は、生物源から得られる任意の種類の液体物質を指す。該液体物質としては、典型的には、限定するものではないが、全血漿又は血液分画、例えば、低温析出後の血漿、クリオプレシピテート、血漿又は血清;精液;痰;糞便;汗;唾液;鼻粘液;脳脊髄液;PRP-Rなどの血小板由来の分画;及び尿;から得られる調製物、並びに細胞が調製物中に分泌する生体物質を含有する又はもとは細胞内部に存在し、細胞の溶解などの様々な操作に起因して液体調製物に放出された物質を含有する細胞培養液から得られる液体、が挙げられる。一実施形態において、S/Dを除去する方法は、生体液体調製物をウイルス不活性化するプロセスの間に用いることができる。血液及び血漿調製物などの生体的に誘導された液体調製物は、複数の生体的に有用な化合物を精製することができる原料物質として用いられる。かかる化合物の例としては、免疫グロブリン、第VIII因子、アルブミン、α-1-アンチトリプシン、第IX因子、第XI因子、PPSB、フィブリノーゲン、及びトロンビンプロトロンビンが挙げられる。更に、ホルモン、成長因子、酵素、及びリガンドなどの様々な生体生成物は、細胞培養液から得られる生体調製物から単離される。例えば、生体液体調製物のウイルス不活性化プロセスは、a脂質被覆ウイルスを不活性化するのに十分な濃度及び条件下で、生体液体製物を溶媒-洗剤混合物で処理する工程と、baで得た液体調製物をHICに通過させることによって、該液体調製物から溶媒-洗剤混合物を除去する工程と、c非結合分画及び非定組成条件下で溶離された分画を収集する工程と、を含む。別の実施形態では、工程cでは、非定組成条件下で溶離された分画のみが収集され得る。定組成溶液の使用は、典型的には、液体クロマトグラフィーにおける一定組成の移動相の使用に関する。非定組成溶液は、典型的には、例えば、カラムを充填及び/若しくは洗浄するのに用いられる溶液及び/若しくは条件と異なる溶液及び/若しくは条件、並びに/又は、先の工程で用いられた溶液と異なる溶液を指す。非エンベロープウイルスを除去するために、少なくとも第2のウイルス不活性化工程、例えば、熱処理低温殺菌が行われ得る。特定の実施形態では、凝集物含有量の更なる低減は、本発明の方法に、カルシウム補充とその後の清澄濾過の工程を含めることによって得られる。用語カルシウム補充は、カルシウム例えば、カルシウム塩を抽出物/生体液体物質に添加することを指す。カルシウム塩の例としては、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、クロロリン酸カルシウムcalciumchlorophosphate、リン酸二カルシウム及びリン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウム、塩化カルシウム、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。カルシウムは、1~100mMの最終濃度範囲で補充され得る。一実施形態において、CaCl2は、最終濃度40mMになるように抽出物に添加される。抽出物は、カルシウム補充後に50RPMで混合しながら、例えば、25°Cにて30分にわたってインキュベートされ得る。用語清澄濾過は、濾過によって抽出物/生体液体物質から凝集物などの粒子を除去することを指す。多段階濾過工程を実施するとができる。例えば、抽出物は、20、3及び0.45μmのフィルタを通して連続的に濾過され得る。滅菌濾過は、例えば、0.2μmのフィルタによって行われ得る。所望により、本発明の方法によって得た血小板抽出物は、抗凍結剤と共に配合されて凍結乾燥されてもよい。用語抗凍結剤は、凍結中に活性成分例えば、成長因子及び/又は栄養因子の化学安定性及び/又は生物活性を維持するために溶液に添加される物質を指す。抗凍結剤の非限定的な例としては、例えば、単糖類としてグルコースブドウ糖、フルクトース果糖、ガラクトース、及びリボシドサッカライドribosedisaccharides;二糖類としてスクロース、ラクトース、マルトース、及びトレハロース;並びに二糖類、オリゴ糖Disaccharidesoligosaccharidesなどの炭水化物を挙げることができるが、これらに限定されない。他の群はポリオール糖アルコール:マルチトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、及びイソマルトである。炭水化物とは別に、ポリエチレングリコールPEG、ポリエチレンオキシドPEO又はポリオキシエチレンPOE、ポリビニルピロリドンPVPなどの他のポリマーを抗凍結剤として使用することが可能である。他のものとしては、アミノ酸及びポリアミンが挙げられる。用語凍結乾燥は、典型的には、物質を凍結した後、例えば昇華によって、生体反応又は化学反応を支持しないレベルまで水分濃度を低減するプロセスを指す。得られた凍結乾燥された生物的物質は、比較的長期間にわたって貯蔵することが可能である。貯蔵後、凍結乾燥物質は、粉末として使用することができる、又は様々な量の水溶液の添加によって再構成することができる。再構成の間に添加される量は、凍結乾燥前の溶液の体積と同様、それより少ない出発物質の体積と比較すると抽出物の濃縮物が得られる、又はそれより多い出発物質の体積と比較すると抽出物の希釈物が得られる場合がある。所望により、血小板抽出物は、長期貯蔵の目的で又は粉末として使用するために、凍結された状態で又は固体として保存され得る。例えば、本発明の方法によって得た血小板抽出物は、長期貯蔵を目的として、例えば-18°C又はそれより低い温度で冷凍保存されることができる、又は例えば、凍結乾燥された固体として保存され得る。血小板抽出物はまた、例えば2°C~8°Cの温度で冷蔵され得る。凍結乾燥された抽出物は、固体として使用されてもよく、又は使用に先立って薬学的に許容可能な担体の中で再構成されてもよい。用語薬学的に許容可能な担体は、ヒトへの投与又は動物への投与に適した任意の希釈剤及び/又は媒体を指す。担体は、生理食塩水、塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンガーLR、通常生理食塩水中5デキストロース、及び注射用蒸留水などであるが、これらに限定されない、当該技術分野において周知の担体のいずれかから選択することができる。フィブリン封止剤と共に投与する場合、抽出物は、封止成分トロンビン又はフィブリノーゲン中で再構成することができる、又は別の希釈剤又は媒体の中で別々に再構成されることができる。有利には、凍結乾燥サイクル及びその製剤は、例えば緊急な使用を必要とする止血及び治癒を容易にするため、例えばフィブリン封止剤内での抽出物の非常に迅速な再構成を可能とすることができ、この場合には、再構成は数秒以内に有利に行われる。本発明の一実施形態では、迅速な再構成を可能にするため、アルブミンが製剤化して用いられる。本発明は、本発明による血小板抽出物の調製を例示し、インビトロ設定及びインビボ設定におけるその活性を示す以下の実験及び知見に基づく。以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参考として本明細書に組み込まれる。以下の例は例示であり、限定するものではない。材料及び方法。洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAP調製物。血小板物質単位白血球低減アフェレーシス血小板単位を収集し、CircularofInformationfortheUseofHumanBloodandBloodComponents2009年12月に従って処理し、FDA及びUSDepartmentofHealthの適用法令及び規則に適合させた。各単位は、およそ200mLの量を有した。各単位は、検査され、FDAの規制、要件、及びガイドラインに基づいて輸血可能な血液成分の提供にふさわしいと判断された単一ドナーから採取された。FDAによって承認されたキット及び方法B型肝炎ウイルス表面抗原;B型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体;C型肝炎ウイルス抗体;ヒトT細胞白血球ウイルス1型及び2型抗体;ヒト免疫不全ウイルス1型及び2型抗体;核酸増幅検査nucleicacidtechnologytestingNATによるHIV-1;NATによるHCVRNA;NATによるウエストナイルウイルスRNA;及び梅毒血清検査を用いることによって、赤血球抗体に対し非反応性であり、かつこれらウイルスが陰性であることが判明した単位のみが含まれた。白血球低減アフェレーシス収集単位中の血小板の最小数は、情報の回状に定められた通りであった:≧3.0×1011単一全血単位中の血小板の数は、≧5.5×1010である。全単位は、洗浄工程まで、輸血の推奨条件下で維持されたFDAによって承認されたthebloodcollection,processing,andstoragesystemの使用法を参照のこと。洗浄手順。各単位は、無菌条件下で次の通りに洗浄された。1.各単位は、室温にて4658×gで6分にわたって遠心分離された破砕回転翼breakrotorは使用しなかった。こうした緩やかな条件下で、細胞の破損は回避された。2.上澄みを廃棄し、無菌連結された無菌状態を維持するために、閉鎖システムにおいて容器間で液体を移送する方法200mLの生理食塩水中で血小板ペレットを再構成した。3.工程1で指定されたのと同じ条件で第2の遠心分離を行った。4.生理食塩水を廃棄し、ペレット化された血小板を無菌連結された生理食塩水200mLの中に再懸濁した。5.洗浄され、再懸濁された血小板を-20~-30°Cで凍結した。凍結工程は、先の工程から4時間以内に行われた。白血球低減血小板アフェレーシス単位の慎重に実施された上記収集及び洗浄手順は、血液収集センターで行われたRockRiverValleyBloodCenter,Rockford,IL/FDALicense249。最終WAPバッグは、調製日から2か月以内に実験用に供給された。これら単位は、ドライアイスの上で凍結された状態で受領した。実施例1:プールしたWAPから調製されかつ溶媒/洗剤S/Dで処理された凍結乾燥された血小板抽出物。9個のWAPバッグ各バックは約200mLを含有するは、該バックを37°Cの水浴に30分にわたって入れることによって解凍された。次の工程で、WAPバッグを70エタノールで拭き、切り開き、それらの内容物を室温約22°Cにてステンレス鋼製ビーカーの中に注ぎ込んだ。ビーカーを攪拌装置の上に置き、プールしたWAP物質~1800mLを、室温約22°Cにて5分間ゆっくり混合した。攪拌中、200mLの酢酸塩グリシン緩衝液[200mMの酢酸ナトリウムSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA;カタログ番号32318、及び100mMのグリシンSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA;カタログ番号15527pH6.8~7.4]、及びヒト血清アルブミンHSA;総体積に対する最終濃度5v/vPlasbumin25、TalecrisBiotherapuetics,NC,USA;カタログ番号Plasbumin25を、プールしたWAPに添加した。2000mLのうち500mLのサンプルを取り出し、溶媒及び洗剤S/Dで処理し、脂質エンベロープウイルスを不活性化した以下の手順を参照のこと。残り1500mLは、後で分析するために-80°Cで凍結したプールしたWAP。サンプル500mLを冷やした4°Cステンレス鋼製ビーカーに移し、4°Cの水浴に入れた。サンプルを次の通りにS/D処理に供した。1のTritonX-100Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA;カタログ番号20180501及び0.3のリン酸トリ-n-ブチルTnBP;Merckカタログ番号100002v/vを一緒に混合した後、RW20オーバーヘッドスターラーIKA-WerkeGmbHCo.,Staufen,Germanyに接続された3枚羽根ステンレス鋼プロペラを使用して60RPMで攪拌しながらサンプルにゆっくり加えた。サンプルをその後も引き続き4°Cにて4時間にわたって攪拌した。S/D処理の後、S/D除去工程に先立って粗粒子状残骸を除去するために、20、10、及び5μmポリプロピレン製のカプセルフィルタDOLType、MDIAdvancedMicrodevicesPvt.Ltd.,Ambala,India;カタログ番号はそれぞれDOLX5111DDXX101、DOLX5108DDXX101、DOLX5107DDXX101にサンプルを連続して通し、濾過した。S/Dの除去は、SDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorp,PortWashington,NY,USA;カタログ番号20033-01580mLが詰め込まれたXK26/40液体クロマトグラフィーカラムAmershamPharmaciaBiotech,GEHealthcare;カタログ番号18-8768-01を、AKTAprime自動液体クロマトグラフィーシステムGEHealthcareと共に使用して行われた。カラム長さは15cmであった。流量は、試行全体にわたって10mL/分であった。再蒸留水ddH20320mLを用いてカラムを調製し、240mLの酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4及びHSA総体積に対し5v/vでカラムを平衡化した。サンプル500mLを充填した後、カラムを、5HSAv/vを含有する上記の酢酸塩グリシン緩衝液144mL、次いでddH2O144mLで洗浄した。未結合サンプル及び洗浄緩衝液を含む収集した全フロースルー体積は720mLであった。上記の酢酸塩グリシン緩衝液中のD-マンニトールSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA;カタログ番号M9546を、フロースルーで収集した物質に加え最終濃度2v/vになるように、このD-マンニトールは、次の凍結乾燥プロセスの間のタンパク質の抗凍結剤としての役割を果たした。WAPの凍結及び解凍、並びにWAPをS/D処理及びS/D除去に供することで、血小板抽出物/溶解物の調製物を得た。フロースルーで収集した物質を、高圧滅菌したガラス製バイアルFiolaxClear40×22×1mm、Schott,Mullheim,Germany中に分注し各バイアルに2mL、下の表1に詳しく述べられているサイクルに従って凍結乾燥したFreezeDryerEpsilon2-8D、MartinChristGefriertrocknungsanlagenGmbH,OsterodeamHarz,Germany。凍結乾燥物質は、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で、高圧滅菌したゴム栓シリコーン20mm、WestPharmaceuticalServices,Lionville,PA,USA;カタログ番号7001-2742で密封された。プールしたWAPから調製され、S/D及びSDRHyperDクロマトグラフィー樹脂で処理された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOIと呼ばれる。LYOIの精製工程は、単一ウイルス不活性化工程であるS/D処理を含んだ。実施例2:様々な血小板抽出物調製物のタンパク質プロフィールの特徴付け。以下の実験は、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板のタンパク質プロフィールを特徴付け[全血MDABloodBankより入手からの洗浄血小板と比較した場合の、未処理のWAP物質上述のtheUSBloodCollectionCenterから入手]、S/D処理又はS/D処理SDRHyperDクロマトグラフィー樹脂精製がWAPのタンパク質プロフィールに影響を与えたかどうかを調べることを目的とした。S/D処理及びSDRHyperDクロマトグラフィー樹脂精製は上で詳述した通りに行われた。全ての場合において、抽出物は、血小板を凍結解凍し、必要であれば、S/D処理することによって得た。タンパク質プロフィール分析はドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによって行われた。各試験調製物のタンパク質の量は、以下に特定されている。全タンパク質量は、PierceBCAタンパク質アッセイThermoFisherScientificInc.,Rockford,IL,USA;カタログ番号23235を使用し、製造者の使用説明書に従って決定された。SDS-PAGE手順は、次のようなやり方で行われた。調製物を、トリス-グリシンランニング緩衝液Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA;カタログ番号161-0772を有する、4~12のトリス-グリシンゲル1.5mM×10ウェルInvitrogen,Carlsbad,CA,USA;カタログ番号EC6038BOXに充填した。用いた実行条件は、25mA定電流にて1.5時間であり、PowerPack300電源Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USAを使用した。実行工程の後、ゲルを、InstantBlueCoomassieベースの染色液を製造者の使用説明書ExpedeonInc.,SanDiego,CA,USA;カタログ番号ISB01Lに従って使用して、2~8°Cにて一晩染色した。図1は、様々な調製物のタンパク質プロフィールを示す。結果は、全血輸血から得た洗浄血小板レーン3に対し、洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAP;レーン4は微量のアルブミンを含有することを示している。S/D処理後レーン5及びS/D処理SDRHyperDクロマトグラフィー樹脂精製後レーン6のWAPのバンド形成パターンは、出発物質即ち、WAP;レーン4のそれと同様であった。これらの結果は、タンパク質の組成は、上記処理工程中に有意に影響を受けないことを示している。実施例3:LYOIが細胞増殖及び細胞の形態に与える影響。以下の実験は、LYOIプールしたWAPから調製され、S/Dで処理され、SDRHyperDクロマトグラフィー樹脂にさらされ、かつ凍結乾燥された、凍結乾燥血小板抽出物-実施例1に詳述されている通りに調製が、線維芽細胞の細胞増殖に与える生体影響を調べるために行われた。LYOIが細胞増殖に与える影響を、WAPの影響と比較した。細胞増殖アッセイ。この目的のため、3T3-スイスアルビノ線維芽細胞ATCC、カタログ番号CCL92を、25×103細胞/mL2500細胞/ウェルの濃度で、組織培養用の処理をしたCostar社の96ウェルプレートCorningLifeScience,MAUSAの中の100μLの完全増殖培地[4.5gr/Lのグルコースを含有し、4mMのグルタミンBiologicalIndustries,Israel;カタログ番号03-020-1B、10のウシ胎児血清FCS;HyClone,USA;カタログ番号SH30070.03、ペニシリン100U/mL/ストレプトマイシン0.1mg/mL/アンフォテリシンamphotericine0.25μg/mL溶液P/S/A;BiologicalIndustries,Israel;カタログ番号03-033-1Bを添加したDMEMBiologicalIndustries,Israel;カタログ番号01-055-1A]中に播いた。播種した細胞を、5CO2の湿気のある環境中で、37°Cにてインキュベートした。細胞播種から24時間後に、完全増殖培地を廃棄し、ウェルを100μLの飢餓培地で2回洗浄し、100μLの新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた[飢餓培地:4.5gr/Lのグルコースを含有し、4mMのグルタミン、1のMEM-EAGLE非必須アミノ酸BiologicalIndustries,Israel;カタログ番号01-340-1B、1のヒト血清アルブミンPlasbumin25、TalecrisBiotherapeutics,Germany、及びP/S/A上記の濃度を添加したDMEM]。増殖は、プールしたWAP上記の調製参照又は再構成されたLYOIを添加することによる培地の交換の24時間後に誘発された。LYOIは、0.4mLの飢餓培地の中で再構成された凍結乾燥前の物質に比べて5倍の濃度。全タンパク質量は、PierceBCAタンパク質アッセイによって決定された実施例2参照。WAPI及びLYOIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISARDSystems,MNUSAのQuantikine:ヒトTGF-β1カタログ番号DB100B、ヒト線維芽細胞増殖因子カタログ番号HSFB00D、ヒトPDGF-ABカタログ番号DHD00B、ヒトEGFカタログ番号DEG00によって検出し、増殖アッセイ中のウェルに存在する量は次の通りである:WAPI及びLYOIで処理したウェル中、それぞれ、TGF-β1-205及び350ng/mL;bFGF-260及び265pg/mL;PDGF-AB-75及び7ng/mL;並びにEGF-3及び3ng/mL。増殖は、WAP又はLYOI添加の48時間後に、ミトコンドリア活性に基づいて細胞増殖及び細胞生存率定量化するWST-1細胞増殖試薬を製造者の使用説明書RocheDiagnostics,Mannheim,Germany;カタログ番号11-644-807に従って使用して評価した。プレートを、5CO2の湿気のある環境中で、37°Cにて2時間インキュベートした後、1分間振盪した。ELISAリーダーを用いて、サンプルの吸光度を、ブランクとしてのバックグラウンド対照細胞を有さない飢餓培地に対して450nmで測定した。650nmで得た基準値を各値から減算した。プールしたWAP又はLYOで処理した3T3細胞の増殖が、図2に示されている。実験を3回ずつ行った。飢餓培地で成長した細胞0としてマークされているを対照として用いた[-p<0.001t検定分析、0と比較]。結果は、対照0としてマークされているに比べ、WAP及びLYOIを添加することによって、細胞増殖速度が有意に促進されたことを示す。細胞形態。LYOIが細胞の形態に与える影響を、次の2つの異なる細胞株の型を用いてモニターした:新生児由来の内皮幹細胞であるヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC;LonzaSwitzerland;カタログ番号C2519A;及び3T3-スイスアルビノ線維芽細胞。一定の条件の下で、例えば創傷治癒過程の間、線維芽細胞はスピンドル状の形状を獲得する。これら形状は、線維芽細胞の運動性の増加の特性であるParketal.Comparativestudyonmotilityoftheculturedfetalandneonataldermalfibroblastsinextracellularmatrix.YonseiMedJ.2001Dec;426:587~94;Naganoetal.PDGFregulatestheactincytoskeletonthroughhnRNP-K-mediatedactivationoftheubiquitinE3-ligaseMIR.EMBOJ.2006May3;259:1871~82。HUVECは多くの場合、血管様構造体からの様々な物質による血管新生の誘導を評価するために用いられるArnaoutovaI,KleinmanHK.Invitroangiogenesis:endothelialcelltubeformationongelledbasementmembraneextract.NatProtoc.2010;54:628~35。これら形態変化は血管形成に関連する。LYOIが細胞の形態に与える影響をモニターするために、HUVEC又は3T3-スイスアルビノ細胞を、25×103細胞/mL2500細胞/ウェルの濃度で、96ウェルプレートの中の100μLの完全増殖培地[HUVEC:LowSerumGrowthSupplementLSGS;GibcoInvitrogen,CAUSA;カタログ番号S00310及びP/S/A溶液上記濃度を添加したmedium200GibcoInvitrogen,CAUSA;カタログ番号M200500;3T3-スイスアルビノ細胞用:先行実験に記載されている通り]中に播いた。細胞播種から24時間後に、完全増殖培地を廃棄し、各ウェルを100μLの飢餓培地で2回洗浄し、100μLの新鮮な飢餓培地を加えた[HUVEC:2のFCS及びP/S/A上記濃度と同じを添加したmedium200;3T3用:先行実験に記載されている通り]。飢餓培地に変更してから24時間後に、再構成したLYOIウェル当たりの総タンパク質は20mg/mL;再構成は各細胞に適した飢餓培地0.4mLの中で行われたをウェルに加えた。ウェルにおけるTGF-β、bFGF、PDGF-AB、及びEGFの濃度は、増殖アッセイにおけるものと同じである。いくつかのHUVECサンプルに追加処理を行った。いくつかのサンプルには、2IU/mLのトロンビンウェル中の最終濃度[EVICEL商標フィブリン封止剤OmrixBiopharmaceuticalsLtd.のトロンビン成分と同じ溶液]を添加し、いくつかのサンプルには、1:16に希釈したフィブリノーゲン成分ウェル中の最終希釈;使用したフィブリノーゲン成分は、EVICEL商標フィブリン封止剤のBAC成分を添加し、他のサンプルには、LYOI2IU/mLのトロンビンウェル中の最終濃度を添加し、他のサンプルには、LYOI希釈したフィブリノーゲン成分1:16を添加した。希釈は全て飢餓培地中で行われた。飢餓培地で増殖した未処理の細胞を対照として使用した。様々な処理の後48時間3T3;図3又は72時間HUVEC、図4の時点で、細胞の形態を顕微鏡で評価した。各実験を3回ずつ行った。結果は、未処理の3T3-スイスアルビノ細胞図3Aは、菱形の凧状の形状を有したストライプの矢印参照ことを示している。LYOIの添加は図3B、スピンドル様構造連続矢印の形成をもたらした。HUVECの未処理の細胞及びトロンビンで処理した細胞それぞれ、図4A及び図4Cは、菱形の形状ストライプの矢印を有し、LYOIの添加は図4B、血管様構造の形成を誘発した連続矢印。更に、HUVEC細胞を、LYOI及びトロンビン図4D又はLYOI及びBAC図4Fで処理すると、他の処理群に比べて血管様構造の形成の増加がもたらされた。BACのみでの処理図4Eは、軽微な影響をもたらした少数の血管様構造が形成された。実施例4:プールしたWAPから調製され、S/Dで処理され、低温殺菌され、かつ無菌濾過された凍結乾燥血小板抽出物。ヒト血液由来の製品は、ウイルスなどの感染病原体を伝播させる危険性を伴い得る。通常は、ウイルス及び/又は未知の病原体を伝播させる危険性を最小限に抑えるためにいくつかの手段がとられ、該手段には、特定のウイルスが存在するかどうかに関する提供されたサンプルの定期試験、及び製造プロセスの間のウイルス不活性化/除去工程などが含まれる。ウイルス伝播の危険性の効果的な低減は、製品の有益な特性を変更しない少なくとも2つの直交するウイルス不活性化工程を含むことによって達成され得る。HIV、B型肝炎、C型肝炎、及びウエストナイルウイルスなどの脂質エンベロープウイルスは、ウイルスの脂質膜を破壊するS/D処理によって、迅速かつ効果的に不活性化される。低温殺菌は、熱が脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスの両方を破壊するプロセスである。ナノ濾過は、特別なナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープ及び非エンベロープウイルスをサンプルから排除するプロセスである。以下の実施例では、第2のウイルス不活性化工程として低温殺菌を用いる能力を評価した。WAP物質のプールを調製し、次の1~8であることを除いては、実施例1に詳述されている通りにS/D処理した。13個のWAPバッグを使用した総体積600mL。2430mLのサンプルを取り出してS/Dで処理し、残りの170mLは、後で分析するために-80°Cで凍結したプールしたWAPII。3HSAを最終濃度1v/vになるようにLYOIに見られるように5のHSAではないサンプルに添加した。4500mL[430mLのサンプル70mLの酢酸塩グリシン緩衝液200mMの酢酸ナトリウム及び100mMのグリシン]のサンプルをステンレス鋼製ビーカーに移し、25°C実施例1に見られるように4°Cではないに設定された水浴に入れた。5TritonX-100及びTnBPを添加した後、サンプルを25°Cにて2時間にわたって連続的に撹拌したS/D処理が、実施例1の4°Cに対し25°Cと高い温度で行われたので、TritonX-100及びTnBPは、実施例1の4時間に対し、この実験では2時間と短時間で添加された。6S/D除去は、SDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂80mLが詰め込まれたXK26/40液体クロマトグラフィーカラムを、BT300-2J蠕動ポンプMRC,Israel、及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用し、10mL/分の定流量で実施された。カラムを320mLのddH20を用いて調製した後、1のHSAv/v5ではないを含有する240mLの酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4で平衡させた。7サンプル450mLの充填後、カラムを144mLの酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.41のHSAv/vで洗浄し、続いて144mLのddH2Oで洗浄した。8D-マンニトールはフロースルー物質に添加されなかった。次に、S/D処理されたフロースルー物質即ち非結合分画及び洗浄緩衝液610mLを、以下の通りに安定化工程及び低温殺菌に供した。フロースルーサンプル1グラム当たり1グラムのスクロースを、スクロースが完全に溶解するまで混合しながら約22°C、フロースルー物質にゆっくりと加えた。次に、溶液を37±1°Cまで温め、フロースルー物質1g当たり0.11gのグリシンを、混合及び0.5NのNaOHを用いてpHを6.8~7.4に調製しながら、溶液にゆっくりと加えた。pH調製は、グリシンが完全に溶解するまで行われた。その後、フロースルー物質1g当たり0.8gのスクロースを、完全に溶解するまで37°Cで混合しながら徐々に加えた。スクロース及びグリシンは、低温殺菌工程中の安定化剤としての役割を果たすように溶液に添加された。次に、連続的に混合しながら50RPM60°Cにて10時間にわたって熱処理することによって、溶液を低温殺菌した。安定化剤の添加によって形成された得られた粘性溶液を清潔な容器に移すため、最大総体積1830mLまで酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、及び10mMのグリシン、pH6.8~7.4で希釈した。2OmegaMinisette10kDaカセットPallCorp,PortWashington,NY,USAを備えるFiltronUltrafiltrationSystemを用いて、酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4に対して透析濾過を行うことによって、溶液から安定化剤を除去した。透析濾過工程は次の通りに行われた。初めに、サンプルを900mLの体積まで濃縮し、溶液体積を900±100mLに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積5,400mLの酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4に対して透析を行った。次に、透析した溶液を400mLになるまで濃縮した。凝集物質を除去するため、溶液を、5及び1.2μmのSartopurePP2フィルタカタログ番号5591342P5、5591303P5に通し、次に0.45μmのSartopore2フィルタSartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,France;カタログ番号5441306G5に通して、連続的に濾過した。滅菌濾過は、無菌条件下で生体無菌キャビネットの中で、0.2μmのSartopore2フィルタSartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,France;カタログ番号5441307H5を使用して行われた。次に、実施例1に示されているように、溶液を高圧滅菌したガラス製バイアルの中に分注し4mL、凍結乾燥し、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で高圧滅菌したゴム栓で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOIIと呼ばれる。LYOIIの調製は、S/D処理、低温殺菌工程、及び0.2μmを通す最終滅菌濾過を含んだ。実施例5:LYOIIが細胞増殖及び細胞形態に与える影響。以下の実験は、LYOIIプールしたWAPから調製され、S/Dで処理され、SDRHyperDクロマトグラフィー樹脂にさらされ、低温殺菌、無菌濾過、及び凍結乾燥された血小板抽出物が細胞増殖に与える影響を決定することを目的とした。細胞播種濃度及び完全増殖培地交換は、2つの異なる細胞株であるHUVEC及び3T3-スイスアルビノにおいて、実施例3と同様に行われた各細胞型に適合する完全増殖培地及び飢餓培地を用いた;上記培地成分参照;100μLの培地中、1ウェル当たり2500個の細胞。3T3-スイスアルビノ細胞では、プールしたWAPII又は再構成LYOII4mLの溶液から凍結乾燥され、0.5mLの滅菌精製水中で再構成されたLYOII-プールしたWAPIIと比べて8倍に濃縮を加えることによる培地の交換から24時間後に増殖が誘発された。LYOIIの再構成の後、LYOII及びプールしたWAPIIの両方を、適合する飢餓培地で5倍に連続希釈したプールしたWAPIIの開始濃度を1とし、それに基づいて、1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032の相対濃度を用いた;LYOIIの開始濃度を8この濃度は本実験では試験されなかったとし、それに基づいて、1.6、0.32、0.064、0.0128、0.00256の相対濃度を用いた。各希釈から10μLをウェルに加えた初期接種濃度は2500個の細胞;及び100μLの培地。WAPII及びLYOIIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISAQuantikinebyRDSystems,MNUSA:ヒトPDGF-ABカタログ番号DHD00B、ヒトVEGFカタログ番号DVE00によって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPII及びLYOIIで処理したウェル中、それぞれ、bFGF-120及び280pg/mL;VEGF-0.75及び2.7ng/mL;並びにPDGF-AB-80及び36ng/mL。3T3-スイスアルビノ細胞の増殖レベルを、WST-1細胞増殖試薬を使用して48時間後に評価した。プレートを、5CO2の湿気のある環境中で、37°Cにて4時間インキュベートした後。インキュベーション期間の終わりに、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を、実施例3に詳述されている通りに測定した。未処理細胞で得たOD値を得られたOD結果から減算し、計算値をS字用量反応曲線としてプロットした。GraphPadPrismソフトウェアを使用して、R2フィット及び半有効濃度EC50値を算出した。LYOII又はプールしたWAPIIが3T3-スイスアルビノ線維芽細胞に及ぼす増殖促進効果が図5に示されている。実験を3回ずつ行った。結果は、LYOIIが3T3-スイスアルビノに及ぼす増殖促進効果は、出発物質プールしたWAPIIのそれと同様であること示す。これらの結果は、2段階のウイルス不活性化を含むLYOIIの生産過程は、WAP出発物質と比較してその効力に影響を与えないことを示している例えば、EC50値は、プールしたWAPIIで0.018及びLYOIIで0.013であった。HUVECでは、様々な処理[再構成LYOIIと共に、又は再構成LYOIIなしでの、トロンビンT;ウェル中の最終濃度1IU/mL;OmrixBiopharmaceuticalsLtd.のEVICEL商標フィブリン封止剤からのトロンビン成分の添加、及び再構成LYOIIの添加]による培地交換から24時間後に増殖が誘発された。未処理の細胞を基準として用いた0としてマークされている。各処理溶液10μLを各ウェルに加えた。4mLの溶液から凍結乾燥されたLYOIIの再構成は、0.5mLの滅菌精製水中で行われた即ち8倍濃縮。bFGF、VEGF、及びPDGF-ABの濃度は、3T3細胞において行われた増殖アッセイと同じであった。増殖レベルの測定は、処理開始から72時間後に、WST-1細胞増殖試薬によって行われた。インキュベーション期間4時間の終わりに、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。測定は2回ずつ行った。LYOIIの血管形成能を調査するため、第3の複製物をCalcein-AMで染色した結果は下のHUVECにおける血管様構造の形成を参照のこと。LYOII、トロンビン、及びトロンビンLYOIIによる誘発後のHUVECの増殖速度が図6に示されている。これらの結果は、HUVECに対するLYOIIの添加は、対照細胞0、LYOIIを有さない又はトロンビンのみで処理された細胞と比べて、有意に高い増殖をもたらしたことを示している。LYOIIトロンビンTの添加は、LYOIIのみの添加と比べて、より顕著な増殖活性をもたらした。HUVECにおける血管様構造の形成。以下の実験は、基底膜抽出物BMEコーティング上のHUVEC飢餓培地中で成長させたときにHUVECによってもたらされる血管様構造を観察するための陽性対照として実施された。BMEは、細胞粘着、遊走、増殖、及び分化、並びに細胞の成長に影響を与える組織構築において極めて重要な役割を果たすMehtaVB,BesnerGE.HB-EGFpromotesangiogenesisinendothelialcellsviaPI3-kinaseandMAPKsignalingpathways.GrowthFactors.2007Aug;254:253~63;ArnaoutovaI,KleinmanHK.2010。コラーゲンでコーティングされたウェル上のHUVEC飢餓培地中で成長した細胞を、陰性対照として用いた。陽性対照の画像を得るため、上で記載されている通りHUVEC細胞を、1×105細胞/mL10000細胞/ウェルの濃度で、96ウェルプレートの100μLのHUVEC完全増殖培地中に播いた。播種された細胞を、5CO2の湿気のある環境中で、37°Cにてインキュベートした。24時間後、完全増殖培地を廃棄し、100μLの新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた上記実施例3の培地成分参照。細胞播種に先立ち、ウェルは、50μL/ウェルの成長因子を低減した基底膜抽出物BME;Cultrex,TrevigenInc.,MD,USA;カタログ番号3433-005-001で、製造者の手順に従ってコーティングされた、又は濃度3mg/mLの50μL/ウェルのウシのコラーゲンIInvitrogen,CA,USA、カタログ番号A10644-01、ゲル化手順に関する製造者の手順に従って調製でコーティングされた。24時間のインキュベーション期間の後、5μMを37°Cにて30分にわたって添加することによって細胞を染色し、Axiovert200顕微鏡倍率100倍及び530nmの蛍光フィルタCarlZeissMicroImaging,NY,USAを使用して、代表写真を撮った。Calcein-AMは、細胞生存率を試験するため、及び細胞を短期間標識化するために用いられる蛍光染料であり、細胞内に輸送された後、細胞内のエステラーゼ生存細胞に存在するは、メトキシ酢酸基acetomethoxygroupを除去し、分子が中に閉じ込められ、強い緑色蛍光を提供する。死細胞には活性エステラーゼがないので、生細胞のみが標識化される。結果を図7に示す。結果は、血管形成の可能性を反映するはっきりした管状構造が、BEMでコーティングされた表面上で検出された。コラーゲンコーティングでは管形成は観察されなかったデータは示されていない。血管形成を誘発するLYOIIの能力を調査するため、先の実験実施例5の細胞増殖実験からの第3の複製物を、上記のように5μMのCalcein-AMで染色し、Axiovert200顕微鏡倍率200倍及び530nmの蛍光フィルタを使用して、代表写真を撮った。LYOIIによる処理の後にHUVECによってもたらされた血管様構造を図8に示す。再構成LYOIIの添加8Bは、陽性対照の処理BMEコーティング上に播種されたHUVEC、図7と同様に、管状構造の形成の開始をもたらしたことが分かる。誘発された細胞運動性と相関している可能性がある細胞形態変化を誘発するLYOIIの能力を調査するため、実施例5の細胞増殖アッセイと同様の条件で、3T3-スイスアルビノ細胞で実験を行った適合する完全増殖培地及び飢餓培地を使用した。未処理の細胞と比較して、LYOII及びプールしたWAPIIは、菱形の形状からスピンドル様形状への形態変化を誘発したことが観察されたデータは示されていない。別の実験では、フィブリン封止剤又はフィブリノーゲンの存在下で血管様構造を誘発するLYOIIの能力を評価した。フィブリン封止剤は、細胞外基質成分、例えば、フィブロネクチン及びフィブリノーゲンを含むBaretal.Thebindingoffibrinsealanttocollagenisinfluencedbythemethodofpurificationandthecross-linkedfibrinogen-fibronectinheteronectincontentofthefibrinogencomponent.BloodCoagulFibrinolysis.2005;16:111~117。インビボ設定と似た環境条件を作り出すため、フィブリン封止剤の添加を行った。この目的のため、HUVECを、1×105細胞/mL10000細胞/ウェルの濃度で、組織がフィブリノーゲン又はフィブリンで-以下の手順参照プレコートされた培養処理済みのCostar社の96ウェルプレートの、100μLの完全培地中に播種した。24時間後、培地を廃棄し、100μLの飢餓培地を加えた培地は上記成分を含む。フィブリノーゲン又はフィブリンのプレコートは以下の通りに形成された。a.50μLのフィブリノーゲン成分EVICEL商標フィブリン封止剤の成分;OmrixbiopharmaceuticalsLtd.、HUVEC飢餓培地で4mg/mLに希釈を各ウェルに加えた。プレートを37°Cで1時間インキュベートし、溶液を吸引し、ウェルをPBSで2回洗浄した。b.50μL/ウェルのフィブリンを25μLのフィブリノーゲン成分EVICEL商標フィブリン封止剤の成分、HUVEC飢餓培地で8mg/mLに希釈及び25μLのトロンビン成分EVICEL商標フィブリン封止剤の成分、HUVEC飢餓培地で2IU/mLに希釈から形成した。コーティング溶液をウェルに塗布した後、プレートを37°Cで1時間インキュベートした。次に、溶液を吸引し、ウェルをPBSで2回洗浄した。次に、上記の条件下で細胞を播種した100μLの完全増殖培地中10000細胞/ウェル。細胞播種から24時間後に、培地を100μLの飢餓培地と交換した。培地を変えてから24時間後に、10μLのプールしたWAPII又は2mLの滅菌水中で、即ちWAP出発物質の体積に対して2倍の濃度に再構成されたLYOIIを、ウェルに加えた。WAPII及びLYOIIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度は、次の通りであった:WAPII及びLYOIIで処理したウェル中、それぞれ、bFGF-480及び1120pg/mL;VEGF-3及び10.8ng/mL;及びPDGF-AB-320及び144ng/mL。細胞を上記のようにCalcein-AMで染色し、代表写真を倍率100倍で撮った。結果を図9に示す。フィブリノーゲン又はフィブリンでコーティングされた表面は、管形成をもたらすことになる顕著な形態変化を誘発するには不十分であったことが明らかである。しかしながら、LYOII又はプールしたWAPIIのいずれかを、フィブリノーゲン又はフィブリンコーティングと一緒に加えると、管状構造形成を促進した。実施例6:プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPから調製され、S/D処理、低温殺菌、無菌濾過、及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。S/D処理及び熱処理されたWAP物質のプールを、次の1~8であることを除いては、実施例4の通りに調製した。110個のWAPバッグを使用した総体積2000mL。21720mLのサンプルを取り出してS/Dで処理し、残りの280mLは、後で分析するために-80°Cで凍結したプールしたWAPIII。3最終濃度が1のHSAv/vになるようにHSAをサンプルに添加した。4S/D除去は、SDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂295mLが詰め込まれたXK50液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計と共に使用し、40mL/分の定流量で実施された。5フロースルーで収集した物質の体積は2700mLであった。6安定化及び低温殺菌の後に粘性溶液を移動させるため、溶液を総体積8600mLまで酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、及び10mMのグリシンで希釈した。7CentramatePE接線流濾過薄膜カートリッジホルダー4OmegaCentramate10kDa限外濾過カセットPallCorp,PortWashington,NY,USAを使用し、最初にサンプルを3500mLの体積まで濃縮し体積8600mLから、続いて、溶液体積を3500mL±200mLに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積10,320mLの酢酸塩グリシン緩衝液上記と同様に対して透析を行うことによって、透析濾過を行った。次に、透析したサンプルを450mLまで濃縮した開始時体積の約25:1720mLのサンプルを取り出してS/Dで処理した上記工程2を参照のこと。8凝集物質を除去するために、濃縮された透析溶液を、20、5、及び1.2μmのSartopurePP2フィルタに通し、次に0.45μmのSartopore2フィルタに通して連続的に濾過した5及び1.2μmに通すだけでなく、続いて0.45μmにも通した。滅菌濾過は0.2μmを通して行われた。次に、前述のように、濾過したサンプルを分注し4mL、凍結乾燥した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOIIIと呼ばれる。LYOIIと同様に、LYOIIIのウイルス精製工程は、S/D処理、追加の低温殺菌工程、及び最終滅菌濾過を含んだ。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して4倍に濃縮された。実施例7:プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPから調製され、S/D処理、低温殺菌、及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物LYOIII中の血漿タンパク質の濃度。血液凝固に関与するタンパク質を含む様々な血漿タンパク質の濃度を、プールしたWAPIII及びLYOIIIにおいて測定した。LYOIIIの再構成は、凍結乾燥前の体積4mLのddH2O中で行われた。様々なタンパク質の濃度を次のように評価した。以下の修正済みのヨーロッパ薬局方検定0903/1997手順により、トロンビンの凝固活性を測定した。トロンビン標準品Omrix,Israelと0.1フィブリノーゲン溶液EnzymeResearchLaboratories,IN,USAとを、STart4凝固器具DiagnosticaStago,AsnieressurSeine,Franceを使用して混合することによって、対数凝固時間と対数トロンビン濃度とを比較する検量線をプロットした。得られた凝固時間凝固機により自動的に計算、検量線から内挿し、その後希釈係数を乗じたにより、様々なサンプル中のトロンビンの活性を算出した。活性のあるフィブリノーゲンの定量化を、クラウス法に基づく、修正済みのヨーロッパ薬局方検定0903/1997に従って評価した。凝固時間を、STart4凝固器具DiagnosticaStago,AsnieressurSeine,Franceを使用して測定した。この方法では、トロンビンの過剰存在下でフィブリノーゲンEnzymeResearchLaboratories,IN,USAを用いて検量線を作成した後、この検量線からサンプルのフィブリノーゲン濃度を算出する。市販のELISAキットMDBiosciences,Zurich,Switzerland;カタログ番号HFIBKTを製造者の使用説明書に従って使用して、総フィブリノーゲンを測定した。フィブロネクチンの定量化は、市販のELISAキットTechnoclone、カタログ番号TC12030を使用して行われた。フォンヴィレブランド因子vWFの定量化は、ELISAアッセイにより行われた。ポリクローナルウサギ抗ヒトvWF抗体DAKO;カタログ番号A0082、及びポリクローナルウサギ抗ヒトvWFHRPコンジュゲート抗体を、アッセイで使用した。UnicalibratorDiagnosticaStago;カタログ番号00625を使用して標準曲線を作成した。第II因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、及び第XI因子の量は、DiagnosticaStago、AsnieressurSeine、Franceから購入した次の試薬を使用し、STart4凝固器具を用いて決定した:STA-DeficientIIカタログ番号00745、STA-DeficientVIIカタログ番号00743、STA-DeficientVIIIカタログ番号0725、STA-DeficientIXカタログ番号00724、STA-DeficientXカタログ番号00738、及びSTA-DeficientXIカタログ番号00723。全ての試薬は、製造者の使用説明書に従って使用した。IgG濃度は、ウエスタンブロット法による半定量的分析によって、アルカリ性ホスファターゼ結合アフィニィピュアAffiniPureヤギ抗ヒトIgGIgMHLJacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.,PA,USA;カタログ番号109-055-088を使用して測定した。サンプル中のIgG濃度は、ヒトIgGBRPPh.Eur.標準品を用いて作成した検量線から算出した。値は検出限界を指すので、サンプルはこれらタンパク質が欠乏していると考えられる。表2に示される結果は、プールしたWAPIII及びLYOIIIの両方が、非常に少量の血漿タンパク質を含んでいることを示す。LYOIIIにおける凝固タンパク質の限界レベル又は完全欠損は、血小板抽出物を非凝固性にする。これと比べると、BurnoufWO2009/087560に従って調製された血小板抽出物は、高濃度の凝固因子を含有する。LYOIII及びプールしたWAPIIIは、0.08mg/mL未満の活性のあるフィブリノーゲンを含む。実施例8:線維芽細胞の細胞増殖及びHUVECの形態変化にLYOIIIが与える影響。LYOIIIが細胞増殖に与える影響を、3T3-スイスアルビノ細胞を使用し、実施例5に詳述されている通りに行った。4mLの溶液から凍結乾燥され、WAPの開始体積と比較して4倍に濃縮されたLYOIIIを、0.5mLの滅菌精製水の中で再構成した即ち8倍濃縮プールしたWAPIIIの出発体積と比較すると32倍の濃縮。再構成の後、プールしたWAPIII又は再構成LYOIIIを、適切な飢餓培地中で5倍に連続希釈し、各希釈物の10μLを、100μLの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたWAPIIIの開始濃度を1とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。LYOIIIの開始濃度を32とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。WAPIII及びLYOIIIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISARDSystems,MNUSAのQuantikine:ヒトTGF-β1カタログ番号DB100B、ヒト線維芽細胞増殖因子カタログ番号HSFB00D、ヒトVEGFカタログ番号DVE00、ヒトPDGF-ABカタログ番号DHD00Bによって検出し、増殖アッセイ中にウェル中に存在した有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPIII及びLYOIIIで処理したウェル中、それぞれ、TGF-β1-170及び4250ng/mL;bFGF-85及び540pg/mL;VEGF-1及び13ng/mL;並びにPDGF-AB-73及び33ng/mL。標準対照として、組み換えヒト成長因子のカスタム混合物本明細書ではMasterMix;MMと呼ぶを、次の成分を用いて調製した:TGF-β1200ng/mL、b-FGF0.5ng/mL、VEGF5ng/mL、及びPDGF-AB300ng/mL成長因子はRDSystemsから購入した;それぞれ、カタログ番号240-B-010/CF、233-FB-025/CF、293-VE-010/CF、及び222-AB-010。MM混合物も飢餓培地中で5倍に連続希釈し、ウェルに加えた10μL。処理の開始から72時間後に、WST-1細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、OD値から減算した。インキュベーション期間4時間の終わりに、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を3回ずつ行った。共通因子に基づいて様々な物質を比較するために、得られた結果は、PDGF-AB全試験物質中に存在する、3T3細胞増殖を引き起こす成長因子の濃度に正規化された以下参照。PDGF-ABへの正規化は、再構成LYOIII中のPDGF-AB濃度を測定し[市販のELISAキットQuantikine,RDSystems,MN,USA;カタログ番号DHD00B]、相対希釈におけるPDGF-ABの濃度を算出することによって行われた。WST-1細胞増殖試薬によって得たOD結果を、算出したPDGF-AB濃度値に対してプロットした。MasterMixMMを陽性対照として用いた。正規化は特異的ELISAによって評価されたPDGF-AB濃度に対して行われた。3T3-スイスアルビノ細胞に対するLYOIII又はプールしたWAPIIIの増殖促進効果の結果を図10に示す。結果は、サンプル中に存在するPDGF-ABの量に正規化されると、LYOIII又はプールしたWAPIIIの濃度の増加が、3T3-スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、LYOIIIの影響がより顕著であることを示している。特に、両方の処理の影響は、陽性対照MMよりも更に顕著であった。LYOIIIの血管新生効果を評価し、かつLYOIII及びフィブリン封止剤又はその成分の推定される共力効果を調査するために、管形成アッセイを行った。プレート表面への細胞の結合に対する添加剤のあらゆる考えられる影響を排除するために、最初に細胞を播種し、その後初めて様々な添加剤で処理した。この目的のため、HUVECを、50×103細胞/mL5000細胞/ウェルの濃度で、組織培養用の処理をしたCostar社の96ウェルプレートの中の100μLの完全増殖培地上記と同じ成分中に播いた。細胞播種から24時間後に、完全培地を廃棄し、ウェルを100μLの飢餓培地で2回洗浄し、100μLの飢餓培地を各ウェルに加えた上記と同じ成分。培地を交換してから24時間後に、10μLのLYOIII0.5mLの滅菌水中で再構成-プールしたWAPIIIの体積と比較すると32倍に濃縮又はLYOIIIとフィブリン[1IU/mLのトロンビンウェル中の最終濃度及び11.3mg/mL総タンパク質のフィブリノーゲンで形成:トロンビン及びフィブリノーゲンは共に、飢餓培地で希釈されたEVICEL商標フィブリン封止剤OmrixBiopharmaceuticalsLtd.の成分である]との組み合わせを添加することによって、アッセイを開始した。ウェル中のTGF-β、bFGF、VEGF、及びPDGF-ABの濃度は、上記の細胞増殖アッセイと同じであった。上記と同じ濃度のトロンビン及び/又はフィブリノーゲンで処理した細胞を、基準として用いた。様々な処理から48時間後に、5uMのCalcein-AMを37°Cにて30分にわたって使用して細胞を染色し、倍率100倍のAxiovert200顕微鏡及び530nmの蛍光フィルタZeissを使用して、代表写真を撮った。結果を図11に示す。図11に示すように、対照細胞Aに管形成は観察されなかった。また、トロンビン又はフィブリノーゲンのみは、非常に少ない数の細長い細胞及び血管状の形状から評価され得るように、HUVECの形態変化を誘発する最低限の能力しか有さなかったことが明らかであるそれぞれB及びC。フィブリントロンビン及びフィブリノーゲン;Eによる処理は、管形成に向けた細胞の再配列をもたらしたが、明らかな血管構造物は検出されなかった。HUVEC単層へのLYOIIIDの添加は管形成を促進し、これはフィブリンFの添加によって更に増大された。実施例9:プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPから調製され、低凝集条件下でS/Dで処理され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。この実験では、凍結乾燥された血小板抽出物は、次のように解凍される前の凍結物質から調製された。10個のWAPバッグを個別に坪量し、70エタノールで拭き、切り開き、25°Cに調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味WAP重量を算出した各バッグの正味WAP重量は約200gであった。プールした物質を、RW20オーバーヘッドスターラーIKA-WerkeGmbHCo.,Staufen,Germanyに接続されたステンレス鋼製のプロペラを20RPMで使用して、完全に解凍するまで25°Cにてゆっくり混合した。プールしたWAPのオスモル濃度は、275mOsであった[TheAdvanced商標MicroOsmometerModel3300AdvancedInstrumentsInc,Norwood,MA,USAを使用して測定]。10の酢酸塩グリシン緩衝液200mMの酢酸ナトリウム、100mMのグリシン、pH6.8~7.4及び1のHSA溶液の最終体積に対するv/vをプールしたWAPに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、NaClSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAを使用して、緩衝液のオスモル濃度をWAP出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。次の工程において、1のTritonX-100及び0.3のTnBPv/vを、50RPMで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、S/D処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、S/D処理を2つのパートに分割した。最初に、サンプルを30分にわたって連続的に攪拌した後、20、5及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ、並びに0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを通して濾過した。次に、濾過した物質を、25°Cに調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、50RPMにて更に2時間混合した。295mLのSDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorpが詰め込まれたXK50液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用して、S/D除去を行った。1800mLのS/D処理された血小板抽出物をカラムに充填した後、540mLの酢酸塩グリシン緩衝液200mMの酢酸ナトリウム、100mMのグリシン、pH6.8~7.41のHSAv/vで洗浄した。2700mLの総体積をカラムから収集したフロースルー。製造の後の段階を妨げる可能性がある非水溶性の凝集物は、製造プロセスの間に形成されることが見出された。凝集は、カルシウムの存在下で増すこともまた見出された。したがって、早い段階での凝集物の沈殿を促進し、その後清澄濾過によってこれら凝集物を除去するために、カルシウムを使用することを決定した。したがって、S/D除去過程の後に、CaCl2をゆっくりと抽出物に添加し最終濃度が40mMになるように、該抽出物を50RPMで混合しながら、25°Cにて30分にわたってインキュベートした。次に、20、5及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを使用して、生成物を濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例4と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。得られた粘性溶液を清潔な容器に移すため、酢酸塩グリシン緩衝液粘性溶液中の最終濃度は20mMの酢酸ナトリウム、及び10mMのグリシンとなる、pH6.8~7.4及び1のHSAv/vで、総重量が最大11,320mLになるまで希釈した。CentramatePE接線流濾過薄膜カートリッジホルダー4OmegaCentramate10kDa限外濾過カセットPallを使用して、酢酸塩グリシン緩衝液に対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った上記の通り。透析濾過は次の通りに行われた。初めに、抽出物を3600mLの体積まで濃縮し、次に、溶液体積を3600±200mLに維持しながら緩衝液を徐々に加えることによって、総体積10,800mLの酢酸塩グリシン緩衝液に対して透析を行った上記の通り。次いで、透析した溶液を473mLの体積まで濃縮したこれは出発体積の約25である。安定化のため、マンニトールを最終濃度2w/wになるまで溶液に添加した。凝集物質を除去するため、サンプルを20、5及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ、及び0.45μmのSartopore2フィルタに通して連続的に濾過した。滅菌濾過は、0.2μmのSartopore2フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、生成物を無菌条件下で4mLずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOIVと呼ばれる。LYOIVのウイルス精製工程は、S/D処理内に濾過サブ工程を含むS/D処理を含んだ。この工程の濾過は、20、5、1.2、及び0.45μmのフィルタを通して行われた。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間に、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して4倍に濃縮された。実施例10:LYOIVが、線維芽細胞における細胞増殖及び形態変化、並びにHUVECにおける形態変化に与える影響。細胞増殖に対するLYOIVの影響を、実施例5に詳述されている通りに行った。3T3-スイスアルビノ細胞を、25×103細胞/mL2500細胞/ウェルの濃度で、組織培養用の処理をしたCostar社の96ウェルプレートの中の完全増殖培地上で詳述した成分中に播いた。細胞播種後24時間で、完全増殖培地を新鮮な飢餓培地と交換した上述の通り。プールしたWAPIV又は再構成LYOIVの添加によって培地が交換されてから24時間後に、増殖が誘発された。再構成は次の通りに行われた。出発プールしたWAPと比較して4倍に濃縮された4mLの溶液から凍結乾燥されたLYOIVを、0.5mLの滅菌精製水中で再構成した即ち8倍濃縮出発体積のプールしたWAPIVと比較すると32倍濃縮。再構成に続いて、再構成LYOIV又はプールしたWAPIVを、適切な飢餓培地中で5倍に連続希釈し、各希釈物の10μLを、100μLの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたWAPIVの開始濃度を1とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した相対濃度。LYOIVの開始濃度を32とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。WAPIV及びLYOIVの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISA上記と同じキットによって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPIV及びLYOIVで処理したウェル中、それぞれ、TGF-β-230及び2000ng/ml、bFGF-100及び170pg/ml、VEGF-1.25及び8.1ng/ml、PDGF-AB-57及び27ng/ml、並びにトロンボスポンジン-1-60及び330ng/mL。実施例8で調製したMasterMixMMを陽性対照として使用した。この混合物を飢餓培地中で5倍に連続希釈し、10μLをウェルに加えた。MMの最大濃度を30としMM中のPDGF-ABの濃度が30ng/mLであったので、それに基づいて連続的な希釈を算出した。細胞の増殖を、上で詳述されている通りに、処理の開始から48時間後に評価した。WST-1で4時間インキュベートした後、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。得られた結果をPDGF-ABに正規化した上で説明した通り。全ての試験は3回ずつ行われた。結果を図12に示す。結果は、LYOIV及びプールしたWAPIVが、3T3-スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに同様の影響を有したことを示す。得られた結果は、陽性対照MMよりも更に顕著であった。LYOIVが3T3-スイスアルビノ細胞の形態変化に与える影響を評価するため、処理の後に位相差顕微鏡画像を撮った細胞は、実施例10の増殖アッセイと同様に播種され、100μLの飢餓培地に添加した10μLの再構成LYOIV0.5mLの滅菌水中、プールしたWAPIV、及び最大濃度のMM実施例8と同様で処理され、処理後2日目に画像を撮った。ウェル中のTGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB、及びトロンボスポンジン-l濃度は、増殖アッセイと同様であった。代表画像を図13に示す。未処理の線維芽細胞は菱形の形状を有する図13A。3T3-スイスアルビノ線維芽細胞に対するLYOIVBの添加は、菱形の形状の細胞からスピンドル状の形状運動性を有する線維芽細胞の特徴への細胞の形態変化を促進した。これら観察された形態変化は、プールしたWAPIVC及び陽性対照MM;Dで処理した後に観察された変化よりも激しかった。上で示したように、3T3線維芽細胞のスピンドル状の形状は、運動性の潜在性の特性である。次の実験で、創傷遊走アッセイを用いることによって、LYOIVで処理した後の細胞の実際の運動性を評価したLiangetal.インビトロスクラッチアッセイ:インビトロでの細胞遊走を分析するための便利で安価な方法。NatProtoc.2007;22:329~33。3T3-スイスアルビノ細胞を、1×105細胞/mL50,000細胞/ウェルの濃度で、組織培養用の処理をしたCostar社の24ウェルプレートCorningLifeScience,MAUSAの中の0.5mLの完全増殖培地上述の通り中に播いた。播種に先立ち、次の1及び2の一方でウェルをコーティングした。1.コラーゲンコーティング-コラーゲン溶液コラーゲンI、ウシ、5mg/mL、Invitrogen,CA,USA、カタログ番号A10644-01、薄コーティング手順のために製造者の手順に従って調製、10mMの酢酸中50μg/mLの希釈物を使用から12.5μg/cm2。コーティングは製造者の手順に従って塗布された。2.DMEM培地で1mg/mLのフィブリノーゲンに希釈された、EVICEL商標フィブリン封止剤OmrixBiopharmaceuticalsLtd.のフィブリノーゲン成分から250μg/cm2。室温で1時間インキュベートした後、溶液を吸引し、ウェルを新鮮なDMEMで洗浄した。未コーティングのウェルを対照として使用した。細胞播種から6時間後、完全増殖培地を廃棄し、0.5mLの飢餓培地でウェルを2回洗浄し、0.5mL新鮮な飢餓培地を各ウェルに加えた上述の通り。一晩飢餓状態に保った後、p200プラスチックピペットチップを使用してウェルの中央の細胞単層に創傷をつけ、剥離した細胞を飢餓培地と一緒に洗い流し、0.5mLの新鮮な飢餓培地を加えた。プールしたWAPIV、再構成LYOIV2mLの滅菌水中、又はPRP-RPRP-放出物[次の通りに調製:単一ドナーのPRPMDA,BloodBank,Israelによって調製され、かつそこから入手60mLを、1000IU/mLのトロンビンEVICEL商標3mL及び2MのCaCl22mLで活性化した後、3000gで10分にわたり4°Cにて遠心分離し、実験で使用する上澄み27mLを得た]のいずれかを添加した後に、細胞の遊走即ち運動性を評価した。全処理溶液を1:10に希釈し、ウェル50μLに入れた。各処理を2回ずつ行った。WAPIV及びLYOIVの両方におけるいくつかの成長因子の濃度は、次の通りである:ウェル中、それぞれ、TGF-β-920及び8000ng/mL;bFGF-400及び680pg/mL;VEGF-5及び32.4ng/mL;PDGF-AB-228及び108ng/mL;並びにトロンボスポンジン-1-240及び1320ng/mLそれぞれ、WAPIV及びLYOIVに関する。0時点及び24時間後に、創傷の幅を、各ウェルの異なる3か所において、位相差顕微鏡倍率100倍を使用してキャプチャした各処理毎に6枚の写真。各写真で、創傷の幅を5回1ウェル当たり15回測定し、創傷修復woundclosure狭くなった創傷の幅を、同じ位置における処理の開始から24時間後に残っている創傷の割合として算出した。異なる処理における異なる時点での創傷の幅の代表的な位相差写真を図14に示す。異なる処理群における処理の開始から24時間後に残っている割合としての、創傷の修復の定量的評価を図15に示す。結果は、6つの複製物の平均±標準偏差として示されている。結果は、全ての表面上コーティングされた又は未コーティングのウェルで、LYOIVは、プールしたWAPIV及びPRP-Rインビボ設定における創傷治癒に有効であると報告されている、LacciKM,DardikA,2010と同様のやり方で、線維芽細胞運動性及び単層におけるスクラッチの修復を促進した創傷は、対照標準処理よりも狭い。コラーゲンでコーティングされたウェルは、フィブリノーゲンでコーティングされたウェルと比較して、わずかに高い運動性促進効果を示した。HUVECの形態変形を誘発するLYOIVの能力を評価するため、管形成アッセイを行った。これら形態変化は血管形成に関連する。この目的のため、HUVECを、1×105細胞/mL10000細胞/ウェルの濃度で、組織培養用の処理をしたCostar社の96ウェルプレートの中の100μLの飢餓培地2のFCS以外は上記の通り中に播いた。細胞外基質環境をシミュレートするため、細胞播種の前に、ウェルをBMEでコーティングした製造者の手順に従って50μL/ウェル。播種の間、10μLのプールしたWAPIV又はLYOIV2mLの滅菌水中で再構成、プールしたWAPIVの体積に対し8倍に濃縮のいずれかを、指定されたウェルに加えた。ウェル中のTGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB、及びトロンボスポンジン-1の濃度は、上記遊走アッセイと同じであった。BMEコーティング上に播種した未処理のHUVECを基準として用いた。24時間後、細胞を、37°Cで30分にわたり5uMのCalcein-AMで染色し、倍率60倍のAxiovert200顕微鏡及び530nmの蛍光フィルタZeissを使用して代表写真を撮った。結果を図16に示す。図16に見られるように、WAPIVC又は未処理の細胞Aと比較して、LYOIVBは最も高い管形成tubologenic能力を有したLYOIVによる処理は血管様構造形成をもたらした。実施例11:第2のウイルス不活性化工程としてのナノ濾過の使用を評価する。WAP物質のプールを、10個体のドナーから、実施例1に詳述されている通りに調製した2000mL。次に、200mLの酢酸塩グリシン緩衝液及び1のHSAv/vを、プールしたWAPに加えた。50mLのサンプルを取り出し、以下に詳述されている通りにS/Dで処理し、アッセイまで-80°Cで貯蔵した。分析に当たって、サンプルを室温で解凍した後、0.45μmのシリンジフィルタMillex-HVbyMillipore;カタログ番号SLHV033RSを通して濾過したあらゆる粒子状物質を除去するため。50mLのうち約25mLのみが、フィルタが詰まる前に濾過されたので、残りのサンプルに関しては新しいフィルタを使用した。抽出物は、凍結解凍によって、及びS/D処理を行うことによって得られた。解凍後、S/D除去工程を、8mLのSDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorp.が詰め込まれたHR10×10液体クロマトグラフィーカラムAmershamPharmaciaBiotechを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用して行った。プロセスの間に用いたフローパラメータは、1mL/分、最大圧力制限100kPa1.0Barであった。カラムは、32mLの精製水の後、1のHSAv/vを含む24mLの酢酸塩グリシン緩衝液を用いて調製した。カラムに40mLの抽出物サンプルを充填した。抽出物サンプルを充填した後、最初に、1のHSAv/vを含む14mLの酢酸塩グリシン緩衝液でカラムを洗浄した。第2の洗浄工程は、10のエタノール/1MのNaCl/0.2のHSAを含む22mLの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して行われた。後者の洗浄工程は、いくつかの成長因子、例えば、PDGF-AB及びPDGF-BBの回収を増加させることが、我々の実験で判明した実施例12参照。次に、カラムを16mLの精製水で洗浄した。収集されたフロースルーの総体積は80mLであった。初期段階における凝集物の沈殿を促進するため、実施例9に記載のように、CaCl2を用いた沈殿が行われた。CaCl2処理後の抽出物サンプルの清澄濾過は、5μmのカプセルフィルタmdiAdvancedMicrodevicesを使用した後、0.45μmのシリンジフィルタMillex-HVbyMillipore;カタログ番号SLHV033RSを使用して行われた。小さな凝集物を取り除くため、物質を0.2及び0.1μmのフィルタに通過させることによって、ナノ濾過工程の前に前濾過工程を行った。全抽出物サンプル80mLを濾過するため、2つの0.2μm真空フィルタNalgeneSuporMachV50mM及び4つの0.1μmのシリンジフィルタMilliporeのMillexVV;カタログ番号SLVV033RSを使用した。次に、濾過した物質をナノ濾過工程に供した。ナノ濾過システムは、次の通りに一列に組み立てられた:加圧窒素ガスタンク-圧力調整器-250kPa2.5Bar圧力計PG1を有するフィルタハウジングSEALKLEENPallCorp.-バルブ-0.2μmのフィルタSartoriusのMinisart;カタログ番号16534-0.1μmのフィルタMillipore;カタログ番号VVLP02500-100kPa1.0Bar圧力計PG2-PLANOVA75NフィルタAsahiKasei;カタログ番号75NZ-001-100kPa1.0Bar圧力計PG3-PLANOVA35NフィルタAsahiKasei;カタログ番号35NZ-001-100kPa1.0Bar圧力計PG4-PLANOVA20NフィルタAsahiKasei;カタログ番号3520NZ-001。ナノ濾過手順は次の通りに行われた。抽出物サンプルを充填する前に、フィルタハウジングを40mLの精製水PuWで充填し、システムへの窒素ガス流を増加させて圧力を上昇させることによって、システムの性能を試験した。通常の状態で、溶液は、各PLANOVAフィルタを通過した後にわずかな圧力低下があるだけで、システムを貫流するはずである。下の表3に示されるように、40mLのPuWは、圧力が激減することなくシステムを通過した。システムの性能を確認した後、フィルタハウジングを、1のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4抽出物サンプル中の存在するのと同じ緩衝液で充填した。下の表の結果は、圧力レベル及び流量が、緩衝液が全システムを貫流するのを可能にしたことを示す。しかしながら、抽出物サンプルを充填すると、システムを貫流することができなかった。下の表に示されるように、PLANOVA75NPG2の前の圧力読み値は90kPa0.9Barであるのに対し、PLANOVA75Nの後でPLANOVA35NフィルタPG3の前はたったの20kPa0.2Barであり、このことは、サンプルがPLANOVA75Nフィルタを簡単に貫流することができなかったことを示した。結果は、上で詳述されている条件を用いてナノ濾過を第2のウイルス不活性化工程として利用するのは実行可能でないことを示している。実施例12:プールした洗浄アフェレーシス白血球除去血小板WAPから調製され、S/Dで処理され、溶離条件を用いるSDRHyperDクロマトグラフィーによってS/D除去され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。この実験では、凍結乾燥された血小板抽出物を次の通りに調製した。10個のWAPバッグを個別に坪量し、70エタノールで拭き、切り開き、25°Cに調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味WAP重量を算出した。プールしたWAPの総正味重量は1947gであった。プールした物質を、完全に解凍するまで25°Cにてゆっくり混合した実施例9と同じ攪拌条件。プールしたWAPのオスモル濃度は265mOsであった。213mLの酢酸塩グリシン緩衝液最終濃度は20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4、となるように及び1v/v溶液の最終体積に対するのヒト血清アルブミンHSA,TalecrisUSAを、プールしたWAPに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、NaClSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAを使用して、緩衝液のオスモル濃度をWAP出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。1のTritonX-100及び0.3のTnBPv/vを、50RPMで混合しながらプールしたサンプルにゆっくり加えることによって、前述のようにS/D処理を行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、S/D処理の間にサンプルを濾過した。簡潔には、S/Dを加えた後、サンプルを30分にわたって連続攪拌し、続いて、20、3及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceに通して濾過した。次に、濾過した物質を、25°Cに調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、50RPMにて更に2時間混合した。295mLのSDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorpが詰め込まれたXK50液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用して、S/D除去を行った。1800mLのS/D処理された血小板抽出物血小板物質を1620mLを含有をカラムに充填した後、600mLの酢酸塩グリシン緩衝液1のHSAで洗浄した。次に、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のHSAを含有する900mLの酢酸塩グリシン緩衝液で溶離した。最後にカラムを600mLの精製水で洗浄した。未結合及び溶離物質を収集した。総体積3600mLをカラムから収集した。凝集物の沈殿を促進するため、前述のように、S/D除去過程の後にCaCl2をゆっくりと抽出物に添加し最終濃度が40mMになるように、該抽出物を50RPMで混合しながら、25°Cにて30分にわたってインキュベートした。20及び3μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを使用して、生成物を濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例4と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液上記の通りに対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を530mL出発体積の約29になるまで濃縮した。安定化のため、マンニトールを最終濃度2w/wになるまで溶液に添加した。凝集物質を除去するため、サンプルを3μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、0.2μmのSartopore2フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、得られた生成物体積452mLを無菌条件下で4mLずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOVと呼ばれる。LYOVのウイルス精製工程は、S/D処理内に濾過サブ工程を含むS/D処理を含んだ。この工程の濾過は、20、3、1.2、及び0.45μmのフィルタを通して行われた。SDR工程は、非定組成溶液を使用してカラムを洗浄することを含んだ。非定組成溶液は、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液であった。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して約3.5倍に濃縮された。LYOII~LYOVの物質生産過程において、サンプルをSDRクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びSDR樹脂からサンプルを収集した後溶媒及び洗剤除去の後の物質のPDGF-AB含有量を測定した。異なる物質生産過程LYOII~LYOVにおけるPDGF-ABの回収率を表4に示す。市販の特異的ELISAキットQuantikineヒトPDGF-ABイムノアッセイ;製造者:RDsystems;カタログ番号DHD00B、並びにQuantikineHSヒトbFGFカタログ番号DHD00B、及びQuantikineHSヒトbFGFカタログ番号HSFB00Dイムノアッセイ;製造者:それぞれRDsystemsを使用して、PDGF-AB及びbFGF含有量を測定した。表4に示されるように、LYOVの処理中に、上記のようにS/D除去工程において非定組成溶液による溶離工程を加えることにより、PDGF-ABの回収率がより高くなる。溶離工程がある場合のPDGF-ABの回収率は45であり、これと比べてこの工程の不在下での回収率は11~16であり、回収率は約3倍増大した。PDGF-AB及びbFGFの濃度もまた、4mLの再蒸留水DDWによる再構成の後、最終凍結乾燥物質で測定された。PDGF-ABの濃度は15,028pg/mLであり、これは出発物質として用いた血小板当たり2.26×10-6pgPDGF-ABに相当する。bFGFの濃度は36pg/mLであり、これは出発物質として用いた血小板当たり5.4×10-9pgbFGFに相当する。実施例13:線維芽細胞の細胞増殖にLYOVが与える影響。LYOVが細胞増殖に与える影響を、3T3-スイスアルビノ細胞を使用し、実施例5に詳述されている通りに行った。4mLの溶液から凍結乾燥され、WAPの開始体積と比較して4倍に濃縮されたLYOVを、0.5mLの滅菌精製水中で再構成した即ち8倍濃縮プールしたWAPVの開始濃度と比較すると32倍濃縮。再構成に続いて、プールしたWAPV又は再構成LYOVを適切な飢餓培地中で5倍に連続希釈し、各希釈物の10μLを、100μLの飢餓培地を含有するウェルに加えた。プールしたWAPVの開始濃度を1とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。LYOVの開始濃度を32とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。標準対照として、組み換えヒトPDGF-ABRDSystems;カタログ番号222-AB-010を使用した。PDGF-ABもまた飢餓培地中で5倍に連続希釈し、ウェル10μLに加えた。WAPV及びLYOVの両方におけるいくつかの成長因子の濃度をELISA上記と同じキットによって検出し、増殖アッセイ中にウェルに存在する有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPV及びLYOVで処理したウェル中、それぞれ、TGF-β-159.4及び169.8ng/mL;bFGF0.1ng/mL及び0.029ng/mL;VEGF-0.89及び1.05ng/mL;PDGF-AB-56.86及び12ng/mL。処理の開始から72時間後に、WST-1細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、OD値から減算した。インキュベーション期間4時間の最後に、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を3回ずつ行った。WST-1細胞増殖試薬によって得たOD結果を、算出したPDGF-AB濃度値に対してプロットした。結果を図17に示す。結果は、LYOV又はプールしたWAPVの濃度の増加が、3T3-スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルに影響を及ぼし、LYOVの影響が若干少ないことを示している。この明らかな減少は、LYO混合物中に存在し、その回収が先の実施例と比較して有意に増加した1つの成長因子のみPDGF-ABに結果を正規化したことに起因した。特に、両方の処理LYOV及びWAPVの影響は、組み換えPDGF-AB単独による影響よりも顕著であり、このことは、他の血小板の抽出成分が線維芽細胞の増殖を相乗的に高めることを示した。実施例14:上記実施例で調製したLYOI~LYOIVにおいて実施された製造工程の比較。表5は、各LYOの調製において実施された主要な製造工程を要約している。溶離は、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のHSAを含有する酢酸塩グリシン緩衝液20mMの酢酸ナトリウム及び10mMのグリシン、pH6.8~7.4を用いて行われた。実施例15:本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝集物含有量のレベル。タンパク質製剤にける凝集は、生物活性を損ない得るからだけでなく、望ましくない副作用例えば、免疫原性の可能性を増加させるので、望ましくない。凝集はタンパク質安定性も低下させ得る。以下の実施例では、本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝集物含有量を決定した。この目的のため、凝集レベル濁度を、320nmOD320で光学密度を測定しこれは、UltravioletabsorptionSpectroscopy,MachH.etal.,inProteinstabilityandfolding,Ed.ShirleyB.A.pp91~114,1995,HumanaPress,NewJerseyに記載されているように、凝集物の存在を典型的に示す、かつ、血小板抽出物中に高濃度で存在し、バックグラウンド読み値であると考えられたヒト血清アルブミンHSAのOD320読み値を減算することによって決定した。減算の前に、濁度320nmにおける原液の吸光度をタンパク質濃度[PierceBCAタンパク質アッセイThermoFisherScientificInc.,Rockford,IL,USA;カタログ番号23235によって決定]で割ることによって、正規化濁度凝集を得た。凝集物レベルを次式に従って算出した。タンパク質1mg当たり≦0.03より低い、得られた算出OD320レベルは、低凝集物含有量であると考えられた。上記実施例に従って調製した異なる凍結乾燥血小板抽出物LYOII-Vを、凍結乾燥工程前と同じ体積となるようにDDW中で再構成した。次の工程で、1mLのサンプルをアクリル製キュベットSarstedt、カタログ番号67.740の中に移し、ODを、Ultrospec2100pro分光光度計AmershamPharmaciaBiotechを使用して320nmで測定した。これと平行して、HSAのODレベルを320nmで測定し試験抽出物と同じパラメータで、凝集物レベルを上記式に従って算出した異なるHSA濃度を用い、該式に示されるように読み値を溶液の総タンパク質で除した。試験した全ての血小板抽出物の算出されたOD320レベルは、タンパク質1mg当たり≦0.03であることが判明した。したがって、本発明に従って調製した血小板抽出物は、低い凝集物レベルを有した。実施例16:プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPから調製され、S/Dで処理され、非定組成溶液による2段階を用いてSDR溶離され、かつ低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。この実験では、凍結乾燥血小板抽出物を次の通りに調製した。10個のWAPバッグを個別に坪量し、70エタノールで拭き、切り開き、25°Cに調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味WAP重量を算出した。プールしたWAPの総正味重量は1906gであった。プールした物質を、完全に解凍するまで25°Cにてゆっくり混合した実施例9と同じ攪拌条件。プールしたWAPのオスモル濃度は267mOsであった。209mLの酢酸塩グリシン緩衝液最終濃度は20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4及び0.2v/v溶液の最終体積に対するヒト血清アルブミンHSA,TalecrisUSAを、プールしたWAPに添加した。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、NaClSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAを使用して、緩衝液のオスモル濃度をWAP出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。1のTritonX-100及び0.3のTnBPv/vを、50RPMで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、S/D処理を上述の通りに行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、S/D処理の間にサンプルを濾過した。最初に、サンプルを30分にわたって連続的に攪拌した後、20及び3μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを通して濾過した。次に、濾過した物質を、25°Cに調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、50RPMにて更に2時間混合した。295mLのSDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorpが詰め込まれたXK50液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用して、S/D除去を行った。1800mLのS/D処理された血小板抽出物血小板物質を1620mLを含有をカラムに充填した後、600mLの酢酸塩グリシン緩衝液0.2のHSAで洗浄した。ヘパリンは特定の成長因子に結合することで知られている。溶離工程において成長因子を回収する際のヘパリンの効果を調査した。したがって、この実験では、溶離は、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、5IU/mLのヘパリンヘパリンナトリウム-Fresenium5000IU/mL、BodenePTYLtd,SouthAfrica、及び0.2のHSAを含有する600mLの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して行われた。この溶離工程の後に、10のエタノール、1MのNaCl、及び0.2のHSAを含有する600mLの酢酸塩グリシン緩衝液を用いる第2の溶離工程を行った。最後にカラムを300mLの精製水で洗浄した。未結合及び溶離物質を収集し、記録した。総体積3700mLをカラムから収集した。収集した材料を、3及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ、並びに0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを使用して濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例4と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液上記の通りに対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を450mLの体積まで濃縮したこれは出発体積の約25である。安定化のため、マンニトールを最終濃度2w/wになるまで溶液に添加した凝集物質を除去するため、サンプルを3μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、0.2μmのSartopore2フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。得たサンプルを無菌条件下で4mLずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOVIと呼ばれる。LYOVIのウイルス精製工程は、S/D処理内に濾過サブ工程を含むS/D処理を含んだ。この工程の濾過は、20、3、及び0.45μmのフィルタを通して行われた。SDR工程は、非定組成溶液を使用するいくつかの溶離工程を含み、該溶液のうちの1つは5IU/mLのヘパリンを含んだ。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間に、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して4倍に濃縮された。LYOII~LYOIV及びLYOVIの物質生産過程において、サンプルをSDRクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びSDR樹脂からサンプルを収集した後溶媒及び洗剤除去の後の物質のPDGF-AB及びbFGF含有量を測定した。異なる過程におけるPDGF-AB及びbFGFの回収率を表6に示す。PDGF-AB及びbFGF含有量を、上記の市販の特異的ELISAキットを使用して測定した。表6に示されるように、ヘパリンを含む溶離工程を加えることによって、PDGF-ABの回収率だけでなく、bFGFの回収率も有意に向上した。bFGFの回収率は56であり、それに対して非定組成溶液中にヘパリンが存在しない場合LYOVでは37であった。LYOVIにおけるbFGFの回収率と、LYOII~IVにおけるbFGFの回収率とを比較すると、約2倍の増加が観察された。PDGF-AB及びbFGFの濃度も、4mLの再蒸留水DDWによる再構成の後、最終LYOVIで測定された。PDGF-AB及びbFGFの濃度は、それぞれ、4,578及び127pg/mLであり、これは出発物質として用いた血小板当たり7×10-7pgのPDGF-AB及び1.95×10-8pgのbFGFに相当する。実施例17:LYOVIが線維芽細胞の細胞増殖に与える影響。LYOVIが細胞増殖に与える影響を、3T3-スイスアルビノ細胞を使用し、実施例5に詳述されている通りに行った。4mLの溶液から凍結乾燥され、WAPの開始体積と比較して4倍に濃縮されたLYOVIを、0.5mLの滅菌精製水中で再構成した即ち凍結乾燥前の血小板抽出物と比べて8倍濃縮合計で、プールしたWAPVIの出発体積と比較すると32倍濃縮。再構成に続いて、プールしたWAPVI又は再構成LYOVIを、適切な飢餓培地中で5倍に連続希釈し、各希釈物の10μLを、100μLの飢餓培地を含有するウェルの中に充填した。プールしたWAPVIの開始濃度を2.5としこれは凍結乾燥前の血小板抽出物2.5μLを表す。凍結乾燥前の血小板抽出物と比較して4倍に希釈されたWAPを10μL使用した。、それに基づいて連続的な希釈を算出した。試験したLYOVIの開始濃度を80としこれは凍結乾燥前の血小板抽出物80μLを表す-凍結乾燥粉末の再構成後の8倍濃縮物質10μL、それに基づいて連続的な希釈を算出した。WAPVI及びLYOVIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISA上記と同じキットで測定した。増殖アッセイ中にウェルに添加された有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPVI及びLYOVIで処理されたウェル中、それぞれ、TGF-β-180及び2000ng/mL;bFGF-120及び1000pg/mL;VEGF-1.1及び11.7ng/mL;PDGF-AB-84.4及び36.6ng/mL;並びにEGF-3.6及び24.4ng/mL。陽性対照としてPRP-Rを使用した。PRP-Rは、10個体のドナーによるプールしたPRPから調製された。簡潔には、10個のバッグの全血400mL/バッグMDA,BloodBank,Israelより入手を、それぞれ室温にて850×gで10分間遠心分離した。次に、各バッグの得られた上澄み80mLを、室温にて850×gで更に10分間別々に遠心分離した。30mL各バッグから得たのPRP上澄みを収集し、2~8°Cで一晩貯蔵した。翌日、PRPを、1000IU/mLのトロンビン1.5mL及び2MのCaCl21mLで室温にて1時間にわたり活性化させた後、3000gにて10分にわたり4°Cで遠心分離した。最終的に10個体のドナー全ての上澄みをプールし、回転運動によって約10分にわたって一緒に混合した。このプールしたPRP-Rストック総体積170mLを、この実験の出発PRP-R物質として使用した。PRP-R中のTGF-β、bFGF、VEGF、PDGF-AB、及びEGFの濃度は次の通りであった;15ng/mL;2pg/mL;90pg/mL;9ng/mL;及び80pg/mL。調製したPRP-Rを適切な飢餓培地中で5倍に連続希釈し、出発PRP-R10μL及び各希釈物10μLを各ウェルに加えた。PRP-Rの開始濃度を10としたこれは凍結乾燥前の血小板抽出物に相当する。処理の開始から48時間後に、WST-1細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、OD値から減算した。インキュベーション期間4時間の最後に、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を3回ずつ行った。WST-1細胞増殖試薬によって得たOD結果を、実際に細胞に添加した血小板抽出物濃度値に対してプロットした上で説明した通り。結果を図18に示す。結果は、LYOVI、プールしたWAPVI、及びPRP-Rの濃度の増加が、3T3-スイスアルビノ線維芽細胞の増殖レベルを増大させ、LYOVIの影響が少なかったことを示している。実施例18:プールした洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAPから調製され、S/D処理され、硫酸デキストランを使用してインキュベートされ、硫酸デキストラン使用してSDR溶離され、低温殺菌及び濃縮された凍結乾燥血小板抽出物。この実験では、凍結乾燥血小板抽出物を次の通りに調製した。10個のWAPバッグ個別に坪量し、70エタノールで拭き、切り開き、及び25°Cに調整された水浴に浸漬している大きいビーカーの中に凍結物質を入れた。空のバッグを坪量し、空のバッグと中身の詰まったバッグとの間の重量差を利用して、正味WAP重量を算出した。プールしたWAPの総正味重量は1916gであった。プールした物質を、完全に解凍するまで25°Cにてゆっくり混合した実施例9と同じ攪拌条件。プールしたWAPのオスモル濃度は272mOsであった。211mLの酢酸塩グリシン緩衝液最終濃度は20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、pH6.8~7.4及び0.2v/v溶液の最終体積に対するヒト血清アルブミンHSA,TalecrisUSAをプールしたWAPに加えた。プロセスを通じてオスモル濃度レベルを可能な限り一定に保つために、NaClSigma-Aldrich,St.Louis,MO,USAを使用して、緩衝液のオスモル濃度をWAP出発物質のオスモル濃度に合わせて調整した。1のTritonX-100及び0.3のTnBPv/vを、50RPMで混合しながらプールしたサンプルにゆっくりと加えることによって、S/D処理を上述の通りに行った。粒子状物質が存在する可能性によりウイルス不活性化が準最適となるのを回避するため、S/D処理を2つのパートに分割した。最初に、サンプルを30分にわたって連続的に攪拌した後、20及び3μmのSartopurePP2フィルタ、並びに0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを通して濾過した。次に、濾過した物質を、25°Cに調整された水浴に浸漬されているビーカーに戻し、ウイルス不活性化プロセスを継続させるために、50RPMにて更に2時間混合した。硫酸デキストランは特定の成長因子に結合することで知られている。したがって、硫酸デキストランの添加が血小板因子の回収率に与える影響を調査した。硫酸デキストランSigma-Aldrich,Canada;カタログ番号D4911を最終濃度1w/wになるようにサンプルに添加し、50RPMにて20分間攪拌しながら25°Cでインキュベートした。粒子状物質を除去するため、5μmのSartoporePP2フィルタを使用してサンプルを濾過した。次に、295mLのSDRHyperD溶媒-洗剤除去クロマトグラフィー樹脂PallCorpが詰め込まれたXK50液体クロマトグラフィーカラムを、蠕動ポンプ及びUA-6UV/VIS検出器Type11記録計ISCO,NE,USAと共に使用して、S/D除去を行った。1の硫酸デキストラン及び0.2のHSAを含有する900mLの酢酸塩グリシン緩衝液でカラムを平衡化させた。S/D及び硫酸デキストランで処理した血小板抽出物1800mL血小板物質を1620mLを含有をカラムに充填した後、12.5のエタノール、0.5MのNaCl、0.1の硫酸デキストラン、及び0.2のHSAを有する600mLの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して溶離工程を行った。その後、1の硫酸デキストランと0.2のHSAとを含有する600mLの酢酸塩グリシン緩衝液を使用して洗浄した先の工程で用いられた溶液と比較すると非定組成であると考えられる。次に、カラムを300mLの精製水で洗浄した。総体積3000mLをカラムから収集した。収集した材料を、3及び1.2μmのSartopurePP2フィルタ、並びに0.45μmのSartopore2SartoriusStedimBiotechS.A.,Aubagne,Franceを使用して濾過した。次の工程で、この抽出物を、実施例4と同様に安定化工程及び低温殺菌に供した。酢酸塩グリシン緩衝液上記の通りに対して透析濾過を行うことによって、安定化剤の除去を行った。次に、透析した溶液を480mLの体積まで濃縮したこれは出発体積のおよそ27である。安定化のため、マンニトールを最終濃度2w/wになるまで溶液に添加した凝集物質を除去するため、サンプルを3μmのSartopurePP2フィルタ及び0.45μmのSartopore2フィルタに通して濾過した。滅菌濾過は、0.2μmのSartopore2フィルタを使用し、無菌条件下で行われた。次に、得た生成物を無菌条件下で4mLずつ分注し、上で詳述されている通りに凍結乾燥した。凍結乾燥物質を、窒素雰囲気下及び60kPa0.6Barの不完全真空下で密封した。上で調製された凍結乾燥血小板抽出物は、本明細書ではLYOVIIと呼ばれる。LYOVIIのウイルス精製工程は、S/D処理内に濾過サブ工程を含むS/D処理を含んだ。この工程の濾過は、20、3、及び0.45μmのフィルタを通して行われた。SDR除去の前に、血小板抽出物を硫酸デキストランを使用して処理した。SDR工程は、硫酸デキストランの存在下で非定組成溶液を使用するいくつかの溶離工程を含んだ。更に、低温殺菌工程が行われ、最終滅菌濾過が行われた。透析工程の間、透析した溶液の体積は、出発体積と比較して4倍に濃縮された。LYOII~LYOIV及びLYOVIIの物質生産過程において、サンプルをSDRクロマトグラフィー樹脂に充填する前の物質、及びSDR樹脂からサンプルを収集した後溶媒及び洗剤除去の後の物質のPDGF-AB及びbFGF含有量を測定した。異なる物質生産過程におけるPDGF-AB及びbFGFの回収率を表7に示す。PDGF-AB及びbFGF含有量を、上記の市販のELISAキットを使用して測定した。表7に示されるように、硫酸デキストランを使用するインキュベーション及び硫酸デキストランの存在下での溶離を加えることによって、PDGF-AB及びbFGF双方の回収率が有意に向上した。bFGFの回収率は85であり、PDGF-ABの回収率は88であった。驚くべきことに、LYOVIIにおける出発物質からのPDGF-ABの回収率は、LYOVIにおける1.5からLYOVIIにおける51まで増加した。更に、LYOVIIにおける出発物質からのVEGFの回収率は、LYOVIにおける37からLYOVIIにおける73まで増加した。PDGF-AB及びbFGFの濃度は、4mLの再蒸留水DDWによる再構成の後、最終LYOVII物質で測定された。PDGF-AB及びbFGFの濃度は、それぞれ、194,353及び64pg/mLであり、これは出発物質として用いた血小板当たり3.12×10-5pgのPDGF-AB及び1.03×10-8pgのbFGFに相当する。これらの知見は、プロセス工程に硫酸デキストランを加えることは、SDRカラムの下流の因子回収にも好ましい影響をもたらすことを示している。実施例19:LYOVIIが線維芽細胞の細胞増殖に与える影響。LYOVIIが細胞増殖に与える影響を、3T3-スイスアルビノ細胞を使用し、実施例5に詳述されている通りに行った。4mLの溶液から凍結乾燥され、WAPの開始体積と比較して約4倍に濃縮されたLYOVIIを、0.5mLの滅菌精製水中で再構成した即ち8倍濃縮プールしたWAPVIIの出発体積と比較して約32倍の総濃度。再構成に続いて、プールしたWAPVII又は再構成LYOVIIを、飢餓培地中で5倍に連続希釈し、各希釈物の10μLを、100μLの飢餓培地を含有するウェルに加えた。上で説明した通り、プールしたWAPVIIの開始濃度を2.5とし、それに基づいて連続的な希釈を算出し、LYOVIIの開始濃度を80とし、それに基づいて連続的な希釈を算出した。WAPVII及びLYOVIIの両方におけるいくつかの成長因子の濃度を、ELISA上記と同じキットによって測定し、増殖アッセイ中にウェルに添加された有効濃度最高濃度は次の通りである:WAPVII及びLYOVII中、それぞれ、TGF-β-260及び2800ng/ml;bFGF-190及び510pg/ml;VEGF-1.1及び21ng/mL;PDGF-AB-114及び1550ng/mL;PDGF-BB-21及び150ng/mL;並びにEGF-3.1及び33.1ng/mL。更に、実施例16と同様に調製されたWAPVI及びLYOVIを、活性比較のためのアッセイと同じアッセイで試験した実施例16に記載の10μLの連続希釈物;血小板抽出物単位への標準化は実施例17に記載の通りに行われた。処理の開始から48時間に、WST-1細胞増殖試薬を使用して増殖を評価した添加剤を有さない細胞をバックグラウンドとし、OD値から減算した。試薬を使用するインキュベーション期間4時間の最後に、プレートを1分間振盪し、サンプルの吸光度を前述の通りに測定した。試験を3回ずつ行った。WST-1細胞増殖試薬によって得たOD結果を、凍結乾燥が実際に細胞に添加される前に、血小板抽出物単位に対してプロットした上で説明した通り。GraphPadPrismソフトウェアを用いてS字用量反応分析を実施し、EC50値をグラフで示す。結果を図19に示す。結果は、LYOVIEC504.10と比較すると、LYOVIIEC501.26は線維芽細胞の増殖を誘発する上でより有力である一方で、それらの出発物質であるWAPVII及びWAPVIEC50は、それぞれ、0.36及び0.32は、線維芽細胞の増殖レベルに同程度の影響を与えたことを明確に示している。LYOVIIの増殖促進効果はより顕著であり、LYOVIよりも出発WAPに近かった。実施例20:上記実施例で調製したLYOII~VIIにおいて実施された製造工程の比較。表8は、全てのLYOの調製において実施された製造工程を要約している。溶離はエタノール及びNaClの存在下で行われた。溶離はヘパリンの存在下で行われた。溶離は硫酸デキストランの存在下で行われた。実施例21:本発明に従って調製した血小板抽出物におけるいくつかの成長因子の間の比率。以下の実施例は、本発明に従って調製した血小板抽出物におけるいくつかの成長因子の間の比率を示し、求めた比率が生理学的比率に近いかどうかを調べる。生理学的比率は、血清中の成長因子値に従って算出された。これらの値は、上の成長因子測定で使用した特異的ELISAキットの添付文書から得た。血清は、フィブリノーゲン又は他の凝固因子を有さない血漿である。血清は、活性化された血小板によって放出された因子を含有する。TGF-b1、PDGF-AB、及びVEGFのレベルを、上記市販の特異的ELISAキットを使用してLYOVII4mLのDDW中での再構成の後中で測定し、PDGF-AB:TGFb1、及びPDGF-AB:VEGFの比率を算出した。成長因子のレベル及び比率を、それぞれ下の表9及び10に示す。値はng/mLで示されている。上記測定で使用した特異的ELISAキットの添付文書から得た、血清における検出可能な値の平均。表10に示されている結果は、LYOVIIが0.56のPDGF-AB:TGF-b1比血清における生理学的比率である0.5と同様及び74のPDGF-AB:VEGF比を含むことを示している。値は共に、上記実施例の出発物質WAPにおける算出比率内であることが判明した。実施例22:本発明に従って調製した血小板抽出物の凝固活性。以下の実験は、LYOVI~VIIがプロ凝固活性を有するかどうかを判定することを目的とした。血小板抽出物中の活性化された凝固因子の存在を、非活性化部分トロンボプラスチン時間測定試験NAPTTによって評価した。この試験は、EuropeanPharmacopoeia7.0.;2.6.22:Activatedcoagulationfactorsmonograph01/2008:20622;inEuropeanPharmacopoeiaStrasburgFrance,CouncilofEurope,2009に記載のアッセイに基づく。一般に、試験は、凝固カスケードの開始を可能にするために、ヒト血漿へのリン脂質RabbitBrainCephalin、Pel-Freez、カタログ番号41053-2及びカルシウムの添加を含む。ヒト標準血漿Unicalibrator、DiagnosticaStago、カタログ番号0625又はCoagulationReference、TCtechnoclone、参照番号5220120に含まれる不活性凝固因子は、活性凝固因子を含むサンプルの添加の後活性化され、血漿プロトロンビンを活性トロンビンに転換させる。その結果、血漿フィブリノーゲンは不溶性フィブリンに直ちに転換しクロット形成、凝固時間は凝固計STart4CoagulationInstrument、DiagnosticaStago,AsnieressurSeine,Franceによって測定することができる。上記参照対照サンプルにおける因子活性化プロセスは、通常4~7分を要する。並列実験で、血小板抽出物のサンプルをヒト標準血漿中に添加し、凝固時間を上記のように測定する。得られた結果を参照対照サンプルの結果で割る。算出された比率は、試験した血小板抽出物サンプルのプロ凝固活性の尺度となる。1未満の比率は、試験したサンプルが活性化された凝固因子を含有しており、したがってプロ凝固活性を有することを意味する。試験した血小板抽出物は、測定前に4mLの精製水PuWを使用して再構成された。3回の測定の平均値。表11に示される結果は、本発明に従って調製した血小板抽出物は、NAPTTアッセイによって評価すると、プロ凝固活性を有さないことを示している。実施例23:本発明に従って調製した血小板抽出物中の凝固因子の存在の判定。以下の実験は、LYOVI~VII因子が凝固因子を含むかどうかを判定することを目的とした。血小板抽出物中の凝固因子活性又は不活性因子の存在を、活性化部分トロンボプラスチン時間APTT[カオリンセファリン凝固時間KCCT又はカオリン加部分トロンボプラスチン時間PTTKとしても知られる]によって判定した。APTTは、血漿由来のサンプルが凝固を経る可能性を評価することができる、内在性凝固経路の一般的凝固スクリーニング試験である。APTTは、次の凝固因子の存在を検出する:因子XII、XI、IX、VIII、X、V、IIプロトロンビン、及びI。アッセイは、標準化された量のケファリン即ちリン脂質及び第XII因子活性化剤カオリンの存在下での血漿のカルシウム再沈着を含む。アッセイは、試験されるサンプルが999秒後に凝固を示すべきでない限度試験として設計された。アッセイは、キット試薬C.K.PREST登録商標,DiagnosticaStago、参照番号00597試薬1と試薬2とを含むを使用して、製造者の説明書に従って行われた。試験したLYOは、APTT試験を行う前に4mLの精製水PuWを使用して再構成された。RSD-相対標準偏差結果は、APTT試験によると、本発明による血小板抽出物は、凝固因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II、及びIの1つ以上を欠いており、抽出物を非凝固性にしていること示している。実施例24:本発明に従って調製した血小板抽出物がインビボモデルにおける血管形成レベル及び全体的治癒に与える影響。本発明に従って調製した血小板抽出物が血管形成及び全体的治癒に与える影響を、ラットの皮下移植モデルを用いて調べた。このモデルは、移植組織における組織反応、血管形成、及び全体的治癒を評価するためによく使用される[InternationalOrganizationforStandartizationISO10993-6,BiologicalEvaluationofMedicalDevices-Part6:TestsforLocalEffectsAfterImplantation2007]。移植の後3日目及び7日目に2つのパラメータを評価した。10匹の雌ラットをこの実験で使用した。各動物は、背中の両側に沿って皮下組織の中に外科的に作られた2つの皮下ポケットを有した合計で4つのポケット。各ポケットに次の試験物品のうちの1つを充填した:フィブリン封止剤1X血小板抽出物、フィブリン封止剤0.1X血小板抽出物1Xで使用した血小板抽出物の量の10、フィブリン封止剤のみ、及び生理食塩水。試験物品の調製及び投与。フィブリン封止剤1X血小板抽出物-実施例16と同様にLYOVIの調製と同様に4mLの血小板抽出物溶液から調製された凍結乾燥血小板抽出物を、2mLのフィブリノーゲン溶液EVICEL商標フィブリン封止剤OmrixBiopharmaceuticalsLtd.のBAC成分と同様の溶液を使用して再構成することによって、1X血小板抽出物を調製した。血小板抽出物-フィブリノーゲン混合物からの100μLを、100μLのトロンビン溶液EVICEL商標フィブリン封止剤OmrixBiopharmaceuticalsLtd.のトロンビン成分と同様の溶液であるが、40mMの塩化カルシウム溶液中で濃度20IU/mLに希釈、最終トロンビン濃度は10IU/mLであったと混合した。200μLの血小板抽出物-フィブリノーゲン-トロンビン混合物を、上で作ったポケットのうちの1つの中に投与した。フィブリン封止剤0.1X血小板抽出物-0.1X血小板抽出物を、実施例16と同様に調製した400μLの血小板抽出物溶液を凍結乾燥し、2mLのフィブリノーゲン溶液を使用してこの凍結乾燥物を再構成することによって調製した。mLの血小板抽出物-フィブリノーゲン混合物からの100μLを、100μLの希釈トロンビン溶液と混合した使用したフィブリノーゲン及び希釈トロンビン溶液は、上記で特定された通りである。200μLの血小板抽出物-フィブリノーゲン-トロンビン混合物を第2のポケットの中に投与した。0.1X及び1X中に実際に投与したいくつかの成長因子の量は、それぞれ次の通りであった:TGF-b15.27及び52.7ng;PDGF-AB0.1及び1.05ng;bFGF0.0024及び0.024ng;並びにVEGF0.023及び0.23ngフィブリン封止剤200μLと共に投与。フィブリン封止剤-100μLのフィブリノーゲン溶液と100μLの希釈トロンビン溶液とを混合した上述の通り。最終混合部を第3のポケットの中に投与した。生理食塩水-200μLの生理食塩水を第4のポケットの中に投与し、対照群として使用した。4種の試験物質の投与は、各ポケット内に設置した位置標識[サイズ1mm×1mm×5mmの蒸気殺菌した高密度ポリエチレンHDPE]に隣接して行われた後の評価のために投与した正確な位置を標識するため。5匹の動物を各時点移植から3日後及び7日後で人道的に屠殺し、各時点において各動物から4つの移植部位全てを収集し、10中性緩衝ホルマリンに浸漬した。各移植部位から複数の部位を切断し、これらの部位を微視的評価用に処理した。組織部位をヘマトキシリンエオシンにより染色した。異なる試験群の移植領域における血管形成及び全体的治癒を、以下に規定する主観的評価尺度を用いて顕微鏡的に評価した。血管形成の評価尺度:0=なし;1=不十分:限定的、局所的、又は断片的、物品の限定的浸透、1~3の新生血管芽及び限定的な線維芽細胞支持組織;2=可:限局的、多発的、又は拡散、物品への浸透を伴う、毛細管群が適切に線維芽細胞を支持;3=良:物品は組織に完全に浸透、線維芽細胞支持構造を有する毛細管;及び4=優:評価した研究間隔で期待されたよりも良好。全体的創傷治癒の評価尺度:0=なし;1=不十分:対照移植部位よりも低い、外科的処置及び移植後時間での予想よりも低い;2=可:対照移植部位に匹敵又は同じ、外科的処置及び移植後時間での予想とほぼ同じ;3=良:外科的処置及び移植後時間での予想よりもやや良好;及び4=優:外科的処置及び移植後時間での予想以上。異なる試験物品の血管形成及び治癒に関する平均採点値を下の表13に示す。移植後3日後に関しては、研究間隔が非常に短かったので治癒を顕微鏡によって明らかにするには時間が十分でない、全体的治癒を適切に採点することができなかった。両方の間隔において、様々な試験物品による処理後に有害効果は観察されなかった移植部位における少数のマクロファージ及びリンパ球の存在によって顕微鏡で判定した場合。移植後3日の2つの試験されたパラメータにおいて、異なる試験物品の間に有意な差異又は傾向は観察されなかった。したがって、3日間隔は、残りの研究間隔の基準としての役割を果たした。移植後7日では、フィブリン封止剤1X血小板抽出物は、他の試験物品と比較して、より多くの血管形成及びより良好な全体的治癒を伴った表13の平均点を参照のこと。フィブリン封止剤1X血小板抽出物の7日目の血管形成の評点は、移植後3日に観察された評点よりも高かった。フィブリン封止剤0.1X血小板抽出物は、フィブリン封止剤のみ及び生理食塩水の試験物品と比較すると、より多くの血管形成及びより良好な全体的治癒に向けた傾向を示した。実施例25:S/D除去工程における溶離工程中の異なる非定組成条件の影響。以下の実施例では、HICS/D除去工程中の異なる溶離条件がPDGF-AB及びbFGFの回収率に与える影響を調べた。実験は、2つの異なる種類の疎水性樹脂であるHyperDSDRPALL及びC-18Watersを使用して行われた。双方とも石英系である。C-18は、18個の炭素原子を有する疎水性ポリマー部分を有し、これに対してHyperDは、シリカビーズと架橋する疎水性ポリマーを有し、かつ分子排除効果に関連する混合モード吸着を伴う[GuerrierLetal.Specificsorbenttoremovesolvent-detergentmixturesfromvirus-inactivatedbiologicalfluids.JChromatogrBBiomedAppl.1995Feb3;6641:119~125]。2mLの樹脂を直径1cmのBio-Radカラムに詰め込んだ小規模実験。用いた最大流量は0.3mL/分であった。以下の実験全てにおいて、S/Dで処理された血小板溶解物を次の通りに調製した。20mMの酢酸ナトリウム、10mMのグリシン、及び1のHSAv/v溶液の最終体積に対するを含有する洗浄白血球低減アフェレーシス血小板WAP10mLを37°Cで解凍したプールしたWAP物質は、酢酸塩グリシン-HSA緩衝液の添加後に凍結された。次の工程で、1のTritonX-100及び0.3のTnBPを溶液に加え、溶液をインキュベートし、血小板溶解及び抗ウイルス処理のために室温22±2°Cにて2時間にわたりチューブ回転装置の上で混合した。次に、あらゆる粒子状物質を除去するため、溶解物を10μm及び5μmのシリンジフィルタを通して濾過した。別段の指示がない限り、樹脂充填カラムは、S/D処理された溶解物を充填する前に10mLの精製水で洗浄され、10mLの酢酸塩グリシン-HSA緩衝液で平衡化された上記と同じ濃度;試験したpH値。次の工程で、9mLのS/D処理された溶解物をカラムに充填した後、10mLの酢酸塩グリシン緩衝液HSA上記と同じ濃度、試験したpH値で洗浄した。この洗浄工程の後、以下に詳述されるように補充された酢酸塩グリシン-HSA緩衝液非定組成溶液10mLを使用する異なる溶離工程が行われた。洗浄及び溶離物質を収集し、プールした。全実験において、サンプルをクロマトグラフィー樹脂に充填する前の溶解物、及び樹脂からサンプルを収集した後溶媒及び洗剤除去の後の溶解物中のPDGF-AB及びbFGF含有量を測定し、異なる溶離工程における因子の回収率を算出した。両方の因子の含有量を、上記市販の特異的ELISAキットを使用して測定した。実験の第1セットは、S/D除去中の酢酸塩グリシン-HSA緩衝液のNaCl含有量及びpH値が、PDGF-ABの回収率に与える影響を調べた。酢酸塩グリシン-HSA緩衝液を異なるNaCl濃度0.3~1.5Mで補充し、補充した緩衝液を非定組成溶液として用いてSDR溶離工程を行った。結果は、C-18樹脂を使用する場合には、0.3Mから最大で1Mの範囲のNaCl濃度を用いるHICの後、溶離緩衝液のNaCl濃度とPDGF-ABの回収率との間に正の相関関係が存在することを示している。1Mの濃度で最適な結果が得られたPDGF-AB回収率は約30。試験したpHは回収率に影響を与えなかった。SDR樹脂を使用する場合には、NaClの試験濃度0.7及び1.5M全てにおいて同様の回収率が得られた。また、C-18を樹脂として使用する場合と比較して、SDRを樹脂として使用する場合に、より高いPDGF-AB回収率が得られることが観察された3と7のPDGF-AB回収率を比較されたい。実験の別のセットは、S/D除去中の酢酸塩グリシン-HSA緩衝液へのNaCl及びエタノールの両方の添加が、SDR又はC-18カラムからのPDGF-ABの回収率に与える影響を調べた。この目的のため、酢酸塩グリシン-HSA緩衝液を異なるNaCl及びエタノール濃度で補充し、補充した緩衝液を非定組成溶液として使用して、SDR溶離工程を行った。結果は、NaClに加えてエタノールを溶液に添加すると、NaClのみを使用する場合と比較すると、より高い回収率となったことを示している表15の1及び2を表14の2と比較、並びに表15の3を表14の4と比較されたい。最大PDGF-AB回収率は、両方の樹脂タイプにおいて1MのNaCl及び20のエタノールにより得られ、SDR樹脂はより高い回収率を有したことも観察された。実験の前回のセットでは、両方の樹脂タイプにおいて、1MのNaCl及び20のエタノールで補充された酢酸塩グリシン-HSA緩衝液により、最大PDGF-AB回収率が得られたことが示された。実験の次のセットでは、同じ条件下1MのNaCl及び20のエタノールが補充された酢酸塩グリシン-HSA緩衝液でのS/D物質TritonX-100及びTnBP除去の有効性を評価した。注目すべきことには、血液由来の製品中のTritonX-100及びTnBPのそれぞれの許容限度は、5μg/mLである。収集された分画中のTritonX-100及びTnBPの濃度を、S/D除去工程の後に測定した。Tritonx-100は、紫外線検出器を使用する逆相HPLCによって決定し、TnBPは、水素炎イオン化検出器を使用する毛細管ガスクロマトグラフィーによって決定した。S/D物質のレベルは、非定組成条件による溶離に供されていないLYOIVと同様の方法で調製されたS/D処理された溶解物においても評価された大規模調製であるが、S/D除去工程の後にこの手順は中止された。結果を以下の表16に示す。該当なし-データなし結果は、1MのNaCl及び20のエタノール先の実験でPDGF-ABの回収に有効であるとして決定されたを用いて溶離工程を行うことにより、比較的多量のS/D物質例えば、TritonX-100の濃度は5.7又は0.6μg/mLが血小板溶液中に存在することになることを示している。しかしながら、低濃度のNaCl及び/又はエタノールを用いると、共に低濃度のTritonX-100及びTnBPが、S/D物質除去工程の後の血小板溶液中で検出された。更に、結果は、同じ実験条件下では、SDR樹脂を使用する場合と比較して、C-18樹脂を使用する場合に、検出されるS/D物質がより少ないことも示している2と4及び3と5を比較されたい。次の工程では、SDR工程中にNaClとエタノールとの組み合わせを用いて溶離工程を行うことによって、b-FGFの回収率を調べた。異なるイオン強度及び異なるエタノール濃度を調べた。この実験では、SDR樹脂を使用した。結果は、PDGF-AB回収率を効果的に改善することが示された試験した非定組成条件は、b-FGFの回収率にわずかな影響しか有さなかったことを示した1と2~5を比較されたい。溶離工程中のb-FGFの回収率を高め、かつPDGF-ABの回収率を更に高めるため、非定組成溶液へのヘパリン添加の効果を調べた。ヘパリンはいくつかの成長因子に結合することが知られているという理由から、ヘパリンを試験した。この実験では、SDR樹脂を使用した。異なる溶離条件下でのb-FGFの回収率の結果を下の表18に示す。結果は、濃度10及び100IU/mLのヘパリン単独では、明白な効果が低かったことを示した表18の1及び2と表17の1とを比較されたい。しかしながら、濃度範囲2~30IU/mLのヘパリンと、濃度0.5MのNaCl及び濃度範囲12.5~15のエタノールとの組み合わせは、ヘパリン単独使用と比較すると、相乗的に増加したb-FGFの回収率をもたらした3~6と1~2を比較されたい。NaCl濃度が0.5Mから1Mに増加し、エタノール濃度が10に減少すると、回収率は約22に低下した。結果は、試験した条件下では、溶離工程中のヘパリンの添加はPDGF-ABの回収率に影響を与えなかったことも示したデータは示されていない。SDRカラムからのPDGF-AB及びb-FGFの回収率を更に高めるため、次の実験では、溶解物は、S/D除去工程の前に硫酸デキストランを使用してインキュベートされた、及び/又は溶離工程において添加された。ヘパリンと同様に、硫酸デキストランは、様々な成長因子に結合してb-FGF、及びVEGFを安定化させることができる硫酸化多糖類である[Kajio,KawaharaKato1992FEBSv306p243~6;Huangetal.,2007Biomacromoleculesv8p1607~14]。洗浄及び溶離は、表19に詳述されている順番で行われた。硫酸デキストラン0.1又は1を、単独で又はNaCl及びEtOHtpと組み合わせて試験した。硫酸デキストランによる溶解物のインキュベーション条件I-Lを室温にて15分間行った。条件は、溶離1の前のAc-Gly-HSAを使用した洗浄工程を含んだ。条件は、溶離1及び2の前の酢酸塩グリシン-HSA緩衝液を使用した追加の溶離工程を含んだ。条件はCon.と略されており、平衡はEq.と略されており、酢酸塩グリシン-HSAはAGHと略されており、硫酸デキストランはD.S.と略されている。表19から分かるように、溶離溶液の順序は、PDGF-AB及びb-FGFの回収レベルに影響を及ぼす。例えば、条件AとB又は条件EとFとを比較すると、溶離の順序は逆であり、成長因子の回収率に影響を与えた。緩衝液組成も試験した成長因子の回収率に影響を与え、条件KがPDGF-AB及びb-FGFの回収率に好都合であるそれぞれ62及び51。実施の態様1ウイルスに対して安全な血小板抽出物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも2つの直交するウイルス不活性化処理を含み、かつ、複数のドナーから血小板が濃縮された分画を提供する工程と、血小板溶解物を調製する工程と、溶媒洗剤S/Dウイルス不活性化処理を行う工程と、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって前記S/Dを除去する工程であって、該HICは、前記溶解物をHICに充填する工程及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程、を含む、除去工程と、第2の直交するウイルス不活性化処理を実施する工程と、を含む方法。2前記血小板溶解物を調製することが、前記S/Dウイルス不活性化処理中に行われる、実施態様1に記載の方法。3前記S/Dウイルス不活性化処理中に、凝集物低減のサブ工程が行われる、実施態様1又は2に記載の方法。4前記凝集物低減が濾過によって行われる、実施態様3に記載の方法。5前記HICが、前記溶解物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、実施態様1~4のいずれかに記載の方法。6前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンから成り、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、実施態様5に記載の方法。7S/D除去の前に、前記溶解物を、血小板由来因子と結合することができる分子と接触させることを更に含む、実施態様1~6のいずれかに記載の方法。8前記分子が、ヘパリン、硫酸デキストラン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様6又は7に記載の方法。9前記第2の直交するウイルス不活性化処理が熱不活化を含む、実施態様1~8のいずれかに記載の方法。10前記血小板が濃縮された分画が、複数のドナーからプールしたアフェレーシスaphaeresisからの洗浄及び/又は白血球低減血小板分画である、実施態様1~9のいずれかに記載の方法。11前記抽出物を凍結乾燥することを更に含む、実施態様1~10のいずれかに記載の方法。12実施態様1~11のいずれかの方法に従って得ることができる、ウイルスに対して安全な血小板抽出物。13生物活性血小板細胞成長因子及び/又は栄養因子の混合物を含む、複数のドナー由来のウイルスに対して安全な血小板抽出物。14PDGF-AB、VEGF、及びTGFb1を含み、PDGF-AB:TGF-b1の比が少なくとも0.2である、及び/又はPDGF-AB:VEGFの比が少なくとも45である、実施態様13に記載の抽出物。15PDGF-ABが濃縮された、実施態様12~14のいずれかに記載の抽出物。16bFGFが濃縮された、実施態様12~15のいずれかに記載の抽出物。17非凝固性である、実施態様12~16のいずれかに記載の抽出物。18凝集物含有量が少ない、実施態様12~17のいずれかに記載の抽出物。19前記抽出物が固形の形態である、実施態様12~18のいずれかに記載の抽出物。20送達剤と共に提供される、実施態様12~19のいずれかに記載の抽出物。21前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される、実施態様20に記載の抽出物。22組織治癒、臓器再構築、組織再生、及び/又は炎症の治療用である、実施態様12~21のいずれかに記載の抽出物。23実施態様12~21のいずれかに記載の抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、組織治癒、臓器再構築、及び/又は組織再生の方法。24実施態様12~21のいずれかに記載の抽出物の治療的有効量を、必要とする被験体に投与することを含む、必要とする被験体の炎症を治療する方法。25前記抽出物が送達剤と一緒に投与される、実施態様23又は24に記載の方法。26疎水性相互作用クロマトグラフィーHICによって生体液体混合物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法であって、前記生体液体混合物を提供する工程と、前記混合物をHICに充填する工程と、非結合物質及び非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。27HICによって生体液体調製物から溶媒-洗剤S/Dを除去するための方法であって、前記調製物を提供する工程と、前記調製物をHICに充填する工程と、非定組成条件下で溶離された物質を収集する工程と、を含む、方法。28前記生体調製物が血小板由来の調製物である、実施態様27に記載の方法。29前記方法が、前記調製物をHICに充填する工程と、HICを定組成溶液で洗浄する工程と、非結合物質を収集する工程と、HICを非定組成溶液で洗浄する工程と、溶離物質を収集する工程と、を含む、実施態様27又は28に記載の方法。30前記定組成溶液が、酢酸塩グリシン緩衝液及びヒト血清アルブミンからなり、前記非定組成溶液が、有機溶媒及び/又は血小板由来因子に結合することができる分子を含む、実施態様29に記載の方法。31実施態様26~30のいずれかに記載の方法によって得ることができる、ウイルスに対して安全な調製物又は混合物。32実施態様12~19のいずれかに記載の抽出物を収容する容器を含むキット。33送達剤を更に含む、実施態様32に記載のキット。34前記送達剤が、ポリマー、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、アルギネート、コラーゲンマトリックス、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ2-ヒドロキシエチルメタクリレート、寒天、酸化再生セルロース、自己組織化ペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される天然及び/又は合成材料で作製される、実施態様32又は33に記載のキット。"