クロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼをα-グルコース-1-ホスフェート及びアクセプターと接触させ、さらに前記アクセプターをグリコシル化することを有し、前記アクセプターは、アルキルβ-グルコシド、アリールβ-グルコシド、糖脂質、アルキルβ-ソホロシド、アリールβ-ソホロシドまたはソホロ脂質である、配糖体の製造方法。前記クロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼは、クロストリジウムステルコラリウムDSM8532株由来のGenbank番号:U60580の遺伝子によってコード化される、請求項1に記載の方法。前記セロデキストリンホスホリラーゼは、前記セロデキストリンホスホリラーゼのグリコシル化活性を最大50消失させない、少なくとも1つの欠失、置換若しくは付加、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1または2に記載の方法。前記セロデキストリンホスホリラーゼは、組換により発現するセロデキストリンホスホリラーゼである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記アルキルβ-グルコシドはメチルからドデシルβ-グルコシドである、前記アリールβ-グルコシドはp-ニトロフェニルβ-グルコシドである、前記糖脂質はオレイルβ-グルコシドである、または前記ソホロ脂質はオレイルβ-ソホロ脂質である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記アルキルβ-グルコシドはメチル-、ヘキシル-またはオクチルβ-グルコシドである、請求項5に記載の方法。前記配糖体は、アルキルセロビオシド、アリールセロビオシド、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質またはセロビオソホロ脂質である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質またはセロビオソホロ脂質は、セロデキストリンホスホリラーゼを組換により発現する酵母細胞によって生産される、請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。前記酵母はカンジダ属に属する、請求項8に記載の方法。前記α-グルコース-1-ホスフェートはα-ガラクトース-1-ホスフェートに置換される、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。前記セロビオ脂質はラクト脂質に置換される、請求項10に記載の方法。発明の説明本発明は、クロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼCsCDPが、アクセプターであるアルキルβ-グルコシド、アリールβ-グルコシド、アルキルβ-ソホロシド、アリールβ-ソホロシド、糖脂質及びソホロ脂質に対して、ならびにドナーであるガラクトース-1-ホスフェートに対して高い特異性を有するという驚くべき知見に関する。さらに、本発明は、上記CsCDPを用いることにより、以下に制限されないが、セロビオシド、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質、セロビオソホロ脂質及びラクトシド等の対応するグルコシドを効率的に合成または製造することができることを示す。ゆえに、本発明は、まず第一に、クロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼをα-グルコース-1-ホスフェート及びアクセプターと接触させ、さらに前記アクセプターをグリコシル化することを有し、前記アクセプターは、アルキルβ-グルコシド、アリールβ-グルコシド、アルキルβ-ソホロシド、アリールβ-ソホロシド、糖脂質またはソホロ脂質である、配糖体の製造方法に関する。本発明のクロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼは、Reichenbergeretalによって記載されるようなCsCDPを指し、当該分野において既知の方法により得られる。さらに、特に本発明は、クロストリジウムステルコラリウムDSM8532株由来のGenbank番号:U60580の遺伝子によってコード化されるCsCDPを指す。本発明はさらに、組換により発現するセロデキストリンホスホリラーゼであるCsCDPに関する。例えば、本発明のCsCDPをコード化する遺伝子は、適当なプライマーセットを用いるPCRによる等の当該分野において既知の手段によって増幅できる。増幅された遺伝子またはPCR産物は、次に、例えば、細菌である大腸菌または酵母であるカンジダアルビカンス等の当該分野において既知の適当な宿主生物に形質転換するのに使用できる、発現ベクターpTrc99a等の、適当な発現ベクター中にライゲートしてもよい。さらに、当該宿主生物によって生産される酵素を、抽出し、例えば、適当なライジング緩衝液を用いて細胞内CsSDPを抽出し、Ni-NTAgravityflowカラムを用いてHis-標識CsCDPを精製する等の、当該分野において既知の方法によって精製してもよい。これについては、本発明はさらに、セロデキストリンホスホリラーゼのグリコシル化活性を最大5、10、20、30、40または50消失させない、少なくとも1つの欠失、置換若しくは付加、またはこれらの組み合わせを含むCsCDPに関することは明らかである。一実施形態においては、本発明のCsCDPは、セロデキストリンホスホリラーゼのグリコシル化活性を最大50消失させない、少なくとも1つの欠失、置換若しくは付加、またはこれらの組み合わせを含む。換言すると、本発明は、少なくとも1つの欠失、置換若しくは付加、またはこれらの組み合わせを含み、かつ野生型のセロデキストリンホスホリラーゼのグリコシル化活性の95、90、80、70、60または50を保持するCsCDPに関する。グリコシル化活性は、当業者に既知の方法によって測定できる。酵素活性に影響を及ぼさない付加の制限されない例としては、N-またはC-末端でのHis-標識の付加がある。本発明の方法は、本発明のCsCDPを、グルコース-1-ホスフェートまたはガラクトース-1-ホスフェート等の適当なドナー、及びアルキルβ-グルコシド、アリールβ-グルコシド、アルキルβ-ソホロシド、アリールβ-ソホロシド、糖脂質またはソホロ脂質等の適当なアクセプターと接触させることを有する。後者の接触させることは、本発明のセロビオシド、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質、セロビオソホロ脂質及びラクトシドを製造するために、6.5のpHを有する50mMMES緩衝液等の適当な緩衝液中で適当量の酵素、ドナー及びアクセプターを一緒に入れることによって行われうる、または特に本発明のCsCDPを組換により発現する、酵母等の、適当な宿主細胞内で、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質及びセロビオソホロ脂質の製造に関して、行われうる。ゆえに、本発明は、セロデキストリンホスホリラーゼを組換により発現する酵母細胞によって、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質またはセロビオソホロ脂質を生産する上記した方法に関する。上記酵母は、好ましくはカンジダ属に属する。本発明の方法の酵素は、メチル-、エチル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ノニル-、デシル-、ウンデシル-及びドデシルβ-グルコシド等のアルキルβ-グルコシド、p-ニトロフェニルβ-グルコシド等のアリールグルコシド、オレイルβ-グルコシド等の糖脂質、またはオレイルβ-ソホロ脂質等のソホロ脂質に対して驚くべきほど高い活性を示す。したがって、本発明は、上記アルキルβ-グルコシドがメチルからドデシルβ-グルコシドである、上記アリールβ-グルコシドがp-ニトロフェニルβ-グルコシドである、上記糖脂質がオレイルβ-グルコシドである、または上記ソホロ脂質はオレイルβ-ソホロ脂質である、本発明に係る方法に関する。後者の方法は、好ましくは、上記アルキルβ-グルコシドがメチル-、ヘキシル-またはオクチルβ-グルコシドである、本発明に係る方法に関する。本発明の方法は、より詳細には、上記配糖体がアルキルセロビオシド、アリールセロビオシド、セロビオ脂質、セロトリオ脂質、グルコソホロ脂質またはセロビオソホロ脂質である配糖体の製造方法に関する。本発明はさらに、CsCDPがα-グルコース-1-ホスフェートの代わりのドナー基質としてα-ガラクトース-1-ホスフェートで活性があるという驚くべき知見に関するものであるため、本発明の方法はさらに、上記グルコース-1-ホスフェートがα-ガラクトース-1-ホスフェートに置換される、より詳細には、上記セロビオ脂質が対応するラクト脂質に置換される、方法に関する。ここで、本発明を下記実施例によって詳細に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されない。実施例材料および方法試薬セロビオースならびにメチル、ヘキシル及びオクチルβ-グルコシド以外の、すべてのプライマー表1及び化学物質は、Sigmaから購入した。糖脂質であるオレオイルβ-グルコシド及びソホロ脂質であるオレオイルβ-ソホロシドは、従来記載されるのと同様にして製造した。酵素の配列は、AGOWAservicefacilityでチェックした。CsCDPのクローニングおよび発現クロストリジウムステルコラリウムDSM8532のゲノムDNAを、theDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenからオーダーメイドした。このCsCDP遺伝子を、プライマー対1表1を用いて、PCRによって増幅した。次に、このPCR産物を発現ベクターpTrc99aにライゲートした。さらに、6個のヒスチジン残基を、プライマー対2表1を用いて、QuickChangeXLIISiteDirectedMutagenesiskitによりN末端に導入した。この発現プラスミドを用いて、熱ショック処理によって、大腸菌宿主株BL21に形質転換した。37°CでL培地中でA600が0.6に達したら、0.01mMIPTGによって発現を誘導した。4時間発現させた後、この大腸菌細胞を遠心によって集めた。細胞内CsCDPを、pH8.0の50mMNaH2PO4、300mMNaCl及び1mg/mLリゾチームを含む溶菌バッファーによって凍結ペレットから抽出した。CsCDPを、Ni-NTA重力流カラムにより未精製抽出物から精製した。次に、His-標識CsCDPを、50mMNaH2PO4、300mMNaCl及び250mMイミダゾールを含むバッファーpH8.0を用いて溶出した後、MicroconYM-30により、除去し、50mMMESバッファーpH6.5で置換した。酵素の純度を、標準物質としてGEHealthcare製のLMW-SDSマーカーキットを用いて、SDS-PAGEによって確認した。アッセイ方法ThermoScientific製のBCAタンパク質アッセイキットを用いて、タンパク質濃度を測定した。45°Cで、30mMドナーGlc1Pまたは100mMドナーGal1P及び50mMアクセプターを含む50mMMESバッファーpH6.5における5の精製酵素50μg/mL、最終濃度を用いて、活性アッセイを行った。95°Cで5分間、サンプルを失活させた後、オルソリン酸塩Piの量をGawronskiandBenson2004の方法によって測定した。動態研究においてKm及びkcat値をHanesWoolfplotによって算出した。結果1.クロストリジウムステルコラリウム由来のセロデキストリンホスホリラーゼの特性本研究では、大腸菌でのCsCDPの異種発現を初めて達成した。His6-標識した精製CsCDPは、22.4U/mgの比活性を有し、SDS-PAGEで約91kDaの単一のバンドを形成し、これは91.497kDaの理論上の分子量とよく一致する。配糖体合成の点での酵素活性の最適なpH及び温度は、それぞれ、約6.5及び約65°Cであることが分かった図2及び図3が、これらは従来公開されている結果に相当する。CsCDPの基質特異性を11種の異なるアクセプター分子を用いて試験した表2。最も興味深い結果を示す構造を図4に示す。酵素は、アリール及びアルキルβ-グルコシドならびに糖脂質に対して高い活性を示すことが分かった。確かに、p-ニトロフェニルPNPまたはオクチル鎖及び特にオレオイルテイルは、サブサイト2のグルコシル部分と同じくらい効率的に結合するようにみえる。α-グリコシド結合を有する2糖マルトース、スクロースは非常に低いアクセプターであるが、全く活性が検出されなかったアクセプターはラクトースのみであった。後者の分子は、グリコシド結合の結合点である、C4’-ヒドロキシル基の点でセロビオースとは異なるのみである。所定の分子に対する動態パラメーターを測定することによって、CsCDPの基質特異性をより詳細に試験した表3。通常、セロビオース及びGlc1P双方に対するCsCDPのKm値は、クロストリジウムサーモセラム由来のCDPの値よりかなり低い。驚くべきことに、この酵素はまた、α-グルコース-1-ホスフェートGlc1Pの代わりのドナー基質としてのα-ガラクトース-1-ホスフェートGal1Pで活性があることが分かった。しかしながら、活性及び親和性双方が劇的に減少したので、この基質での有効性は約1000倍より低い。2.セロデキストリンホスホリラーゼを用いた糖脂質の生産糖脂質がセロビオースよりCDPに対してより良好なアクセプターであることが分かったが、ソホロ脂質はセロビオースの約1/3の活性を発揮した表4。興味深いことに、ソホロ-及び糖脂質のグリコシル化によって形成された産物はCDPに対するアクセプターとしても作用し、これにより、さらなるグルコース部分を含む産物が形成されることが分かった図5さらに参照。残念なことに、中間化合物が精製形態で市販されていないため、この第二のグルコシル化工程の速度は測定できなった。しかしながら、Gal1Pをドナーとして用いる場合には、単一の産物のみが形成される。これは、CDPがアクセプターとしてのラクトースに対して不活性であるという知見と一致する表2。ホスホリラーゼは可逆反応を触媒するので、基質の完全変を達成するのは困難であり、約30~70の産物収率が平衡状態で一般的に得られる。CDPによって生産される新規な糖脂質の収率を測定するために、アクセプター基質の変換率を明らかに平衡になるまでモニターした。20mMセロビオースをアクセプターとして使用した場合には、最大10mMの無機リン酸塩がドナーGlc1Pから放出されたことから、変換率は約50であることが示される図6。これに対して、グルコ-またはソホロ脂質を同様の濃度で使用したところ、それぞれ、最大27及び25mMのリン酸塩が生成した。確かに、グルコシル化産物が第二の反応のアクセプターとして作用でき、これによりグリコシルドナーをさらに消費できる30mMの出発濃度。さらに、産物は不溶性であり、反応混合物中に白色沈殿物を形成することが分かった。このような挙動は、ほとんどグリコシルドナーが利用できなくなるまで、反応を最後まで誘導する。これは、溶液形態であり続ける単一の産物のみを生成するので、Gal1Pをグリコシルドナーとして使用する100mMの出発濃度場合ではありえない。その結果、ガラクトシル化脂質ではたった50の収率しか得られない図6。グルコシル化反応産物の沈殿物は、遠心によって簡単に回収できるため、その精製を非常に容易にした。ペレットを水及び酢酸エチルで洗浄することによって、それぞれ、少量のドナー及びアクセプターを除去できた。HLPCの分析によって、最初の及び次のグリコシル化反応の産物は3/2の割合で存在することが示された表4。糖脂質アクセプターを用いた反応の産物はセロビオ脂質及びセロトリオ脂質と称されたが、ソホロ脂質アクセプターを用いた反応の産物はグルコソホロ脂質及びセロビオソホロ脂質と呼ばれるであろう。グリコシル化の程度をMS-分析によって確認したところ、2個のグリコシル基の段階的付加が明らかに示された図7。ガラクトシル化産物の精製はややより複雑であり、2回の抽出工程を必要とした、まず、残りのアクセプター基質糖脂質を酢酸エチルで洗浄して除去した。デカンテーション後、溶液のpHを2まで下げて、産物を第2の抽出工程中溶媒相に移動させた。このようにして、水相中に残っているドナーから効率的に分離できた。クロマトグラムでは、1つの産物ピークのみが観察され図7、その分子量はラクト脂質のものと完全に一致する。参考文献