皮膚内部のコラーゲンの状態を評価する方法であって、a皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光SHG光を検出することにより、SHG光画像を取得する工程、b得られたSHG光画像に基づいて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を定量化する工程を含む方法。工程bが、b1SHG光画像内の評価対象領域を選択する工程b2選択された評価対象領域内の輝度に基づいて、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標を算出する工程を含む、請求項1記載の方法。工程b2が、b2-1選択された評価対象領域内の輝度を二次元フーリエ変換し、二次元空間周波数分布を求める工程、b2-2得られた輝度の二次元空間周波数分布をカーブフィッティングし、半値幅を求める工程を含み、得られた半値幅が、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標となる、請求項2記載の方法。工程aにおいて照射される超短パルス光が、フェムト秒モード同期レーザー光である、請求項1~3の何れか一項に記載の方法。工程aにおいて、皮膚の真皮層に超短パルス光を照射する、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。皮膚の老化を評価する方法であって、請求項1~5の何れか一項に記載の方法を用いて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を評価する工程、皮膚内部のコラーゲンの粗密の評価結果に基づいて、皮膚の老化を評価する工程を含む方法。しかし、皮膚の老化を適切に評価する観点からは、真皮層等の皮膚内部におけるコラーゲン状態を非侵襲的且つ直接的に定量化する新たな方法が、依然として求められていた。本発明者等は鋭意検討の結果、真皮層等の皮膚内部に超短パルス光を照射して得られたSHG光画像を用いて、皮膚内部におけるコラーゲンの粗密を定量的に評価する方法を開発した。更に、本方法を用いて得られたコラーゲンの粗密が、皮膚の老化と相関を有し、皮膚の老化の評価に利用できることを見出して、本発明を完成させた。すなわち、本発明の主旨は、以下に存する。1皮膚内部のコラーゲンの状態を評価する方法であって、a皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光SHG光を検出することにより、SHG光画像を取得する工程、b得られたSHG光画像に基づいて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を定量化する工程を含む方法。2工程bが、b1SHG光画像内の評価対象領域を選択する工程b2選択された評価対象領域内の輝度に基づいて、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標を算出する工程を含む、1に記載の方法。3工程b2が、b2-1選択された評価対象領域内の輝度を二次元フーリエ変換し、二次元空間周波数分布を求める工程、b2-2得られた輝度の二次元空間周波数分布をカーブフィッティングし、半値幅を求める工程を含み、得られた半値幅が、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標となる、2に記載の方法。4工程aにおいて照射される超短パルス光が、フェムト秒モード同期レーザー光である、1~3の何れか一項に記載の方法。5工程aにおいて、皮膚の真皮層に超短パルス光を照射する、1~4の何れか一項に記載の方法。6皮膚の老化を評価する方法であって、1~5の何れか一項に記載の方法を用いて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を評価する工程、皮膚内部のコラーゲンの粗密の評価結果に基づいて、皮膚の老化を評価する工程を含む方法。本発明によれば、真皮層等の皮膚内部におけるコラーゲンの状態の指標として、コラーゲンの粗密を非侵襲的且つ定量的に評価することが可能となる。得られたコラーゲンの粗密は皮膚の老化と相関を有し、皮膚の老化の評価に有効に利用できる。[1.コラーゲン状態の評価方法]本発明は、皮膚内部のコラーゲンの状態を評価する方法であって、図1のフローチャートに示すように、以下の工程を有する方法に関する以降本発明のコラーゲン状態の評価方法或いは単に本発明の方法と表示する場合がある。。a皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生した第2高調波発生光SHG光を検出することにより、SHG光画像を取得する工程図1中S1。以降SHG光画像取得工程と表示する場合がある。b得られたSHG光画像に基づいて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を定量化する工程図1中S2。以降コラーゲン粗密定量化工程と表示する場合がある。1-1.aSHG光画像取得工程本工程では、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生したSHG光を検出することにより、SHG光画像を取得する。SHG光とは、ピークパワーの高い超短パルス光が非中心対象性物質に照射されることによって発生する二次の非線形光学応答であり、通常の反射や散乱等の線形光学応答では、周波数ωが変化しないのに対して、SHG光は、周波数が入射光の2倍2ωに変換されることが知られている。図2は、生体SHG光の検出に基づく皮膚内部のコラーゲン状態の測定を説明するための模式図である。皮膚内部に存在するコラーゲン線維の分子は、3重らせん構造の非中心対称性を有するため、特異的にSHG光を発生する生体構成物質として知られている。発生するSHG光の強度は、コラーゲンの濃度や配向等に依存する。このSHG光を検出することにより、皮膚内部におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を取得することができる。皮膚内部のコラーゲンは主に真皮層に局在しているので、図2に示すように、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生する生体SHG光を検出することにより、特に真皮層におけるコラーゲンの密度、分布、配向等の情報を選択的に計測することが可能になる。即ち、かかるSHG光の検出に基づきコラーゲンの状態を評価すれば、皮膚内部のコラーゲン線維分子に固有の非線形光学特性を利用するため、組織染色等が不要であり、生体組織のありのままの状態におけるインビボinvivoでの測定が可能である。また、このようして得られるSHG光の強度は皮膚内部のコラーゲンの濃度に依存しているので、その強度情報からコラーゲンの濃度分布を可視化することができる。SHG光の検出は非線形光学効果を利用した手法であるため、極めて高い空間分解能での三次元イメージングが可能である。上述のように、皮膚の老化に深く関連していると考えられる真皮層のコラーゲンの状態を、非接触で高感度に可視化することが可能な手段はこれまで存在しなかったことから、本発明で使用されるSHG光の検出に基づく手法は、皮膚計測においても革新的な手法であると言える。工程aにおける超短パルス光としては、例えば、フェムト秒モード同期レーザー光が挙げられる。フェムト秒モード同期レーザー光は、フェムト秒10-15秒オーダーの超短パルスレーザー光であり、非常に高い瞬時ピークパワーを有する。このようなフェムト秒モード同期レーザー光の照射手段は特に制限されない。例としては、チタンサファイアレーザー、クロムフォルステライトレーザー、エルビウム添加ファイバーレーザー、イッテルビウム添加ファイバーレーザー、ネオジウムガラスレーザー等のレーザー光源等が挙げられる。超短パルス光の具体的なパルス長は、通常300fsフェムト秒以下、中でも100fs以下が好ましい。下限は特に制限されないが、通常は100fs程度である。パルス幅が短くなればなるほど、SHG光の発生効率は高くなる。また、工程aにおける超短パルス光としては、近赤外領域の波長を有する超短パルス光を使用することが好ましい。近赤外領域は生体組織における吸収と散乱が少なく、良好な生体透過性を有する波長帯であるため、近赤外超短パルス光を用いれば、レーザー光を皮膚内部に対して表皮越しに入射させて生体SHG光を誘起し、その後方散乱SHG光を表皮越しに検出することができる。その他にも、近赤外超短パルス光を用いれば、バックグラウンド光拡散反射光、蛍光との分離が容易である、低侵襲的深浸透性である、熱的ダメージが小さい等の利点が得られる。具体的には、超短パルス光の中心波長が、通常700nmから1550nm程度、中でも800nmから1300nm程度、更には1200nmから1300nm程度の範囲内にあることが好ましい。この観点から、超短パルス光の光源としては、クロムフォルステライトレーザーが好ましい。クロムフォルステライトレーザーを用いれば、例えば、中心波長1250nm近傍の超短パルス光を得ることが可能となる。また、後述の工程b1において毛穴、皮溝、毛陰等の領域を正確に把握し、これら以外の領域を評価対象領域として適切に選択するためには、工程aにおいて、できるだけ広範囲のSHG光画像を撮影することが好ましい。この点でも、クロムフォルステライトレーザーを用いれば、例えば後述の実施例のように、短時間に600μm×600μm等の範囲の画像を取得することが可能である。更に、サンプルを走査して複数の画像を撮影し、これらの画像を並べることにより、広範囲のSHG光画像を取得することも可能である。例えば後述の実施例のように、600μm×600μmの画像例えば図5ab中の四角点線で示す部分画像を4×4枚並べれば、2.4mm×2.4mmの画像例えば図5abの全体画像を取得することができる。評価対象となる皮膚は、人間由来のものでもよく、その他の動物由来のものでもよいが、人間由来のものであることが好ましい。また、生体から採取した皮膚組織を測定してもよいが、本発明の方法の利点である非侵襲性を生かすためには、生体の皮膚を原位置で測定対象とすることが好ましい。皮膚におけるSHG光の測定対象位置も特に制限されず、表皮下の皮膚内部であればよいが、上述のように真皮層のコラーゲンの状態が特に皮膚の老化と深い関連性を有することから、真皮層を測定対象位置とすることが好ましい。真皮層の深さは生物や身体部位によって大きく異なるが、人間の場合には通常、皮膚表面から0.1mm~4mm程度の深さである。なお、上述のSHG光画像取得工程aは、通常のSHG顕微鏡システムにより、好ましくはフェムト秒モード同期レーザー、特にクロムフォルステライトレーザーを用いたSHG顕微鏡システムにより、実施することが可能である。詳細なSHG顕微鏡システムの例については後述する。1-2.bコラーゲン粗密定量化工程本工程では、工程aで得られたSHG光画像に基づいて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を定量化する。本発明者等の検討によれば、加齢や皮膚ダメージ日焼け等により皮膚の老化が進むほど、SHG光画像上に表出される皮膚内部のコラーゲンの密度は粗となる後述の実施例及び図6~8参照。よって、SHG光画像に基づいてコラーゲンの密度を定量化することにより、皮膚の老化等の評価の指標とすることができる。SHG光画像からコラーゲンの粗密を定量化する手法としては、制限されるものではないが、目視観察による定量評価や、二次元フーリエ変換等の公知の手法を用いることができる。好ましい態様によれば、工程bは、図3aのフローチャートに示すように、以下の工程を有する。b1SHG光画像内の評価対象領域を選択する工程図3a中S21。以降評価対象領域選択工程と表示する場合がある。。b2選択された評価対象領域内の輝度に基づいて、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標を算出する工程図3a中S22。以降コラーゲン粗密指標算出工程と表示する場合がある。。1-2-1.b1評価対象領域選択工程本工程では、SHG光画像内の評価対象領域を選択する。皮膚に存在する毛穴、皮溝、毛陰等は、SHG光画像において暗部として表示されるため、皮膚内部のコラーゲンの粗密を正確に定量化するためには、これらの領域以外の領域における情報に基づいて、コラーゲンの粗密の定量化を行うことが好ましい。よって、本工程では、毛穴、皮溝、毛陰等以外の領域から、評価対象となる領域を選択する。評価対象領域の広さは制限されないが、例えば150μm×150μmの範囲とする。また、同一のSHG光画像の中から複数個所の評価対象領域を選択し、これらの箇所について次工程b2においてコラーゲン粗密指標を求め、これらを平均すれば、コラーゲンの粗密をより正確に反映したコラーゲン粗密指標を求めることができるので好ましい。1-2-2.b2コラーゲン粗密指標算出工程本工程では、選択された評価対象領域内の輝度に基づいて、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標以降コラーゲン粗密指標と表示する場合がある。を算出する。具体的な手段は、制限されるものではないが、二次元フーリエ変換等の公知の手法を用いることができる。好ましい態様によれば、工程b2は、図3bのフローチャートに示すように、以下の工程を有し、得られた半値幅がコラーゲン粗密指標となる。b2-1評価対象領域内の輝度を二次元フーリエ変換することにより、二次元空間周波数分布を求める工程図3b中S221。以降二次元フーリエ変換工程と表示する場合がある。。b2-2輝度の二次元空間周波数分布をカーブフィッティング曲面近似し、半値幅を求める工程図3b中S222。以降カーブフィッティング工程と表示する場合がある。。具体的に、工程b2-1二次元フーリエ変換工程では、SHG光画像において選択された評価対象領域内の輝度値を二次元フーリエ変換することにより、二次元空間周波数分布を求める。得られた二次元空間周波数分布における輝度値は、各空間周波数成分のヒストグラムを表すことになる。また、画像中心を空間周波数ゼロとして設定することにより、中心に近いほど空間周波数が低く、中心から離れるに従って空間周波数が高い二次元空間周波数分布が得られる。ここで、本発明者等の知見によれば、実際の測定データの解析結果では、キメの細かい密なコラーゲン線維分布では空間周波数ゼロを中心とした輝度分布の半値幅が小さく、キメの粗い疎なコラーゲン線維分布では空間周波数ゼロを中心とした輝度分布の半値幅が大きくなっていることが確認できる後述の実施例及び図8。すなわち、コラーゲン線維の粗密の状態と輝度分布の半値幅との間に相関関係があると言える。そこで、工程b2-2カーブフィッティング工程では、u軸x軸に沿った空間周波数成分またはv軸y軸に沿った空間周波数成分に沿った輝度データプロットに対して、下記式1のガウス関数をカーブフィッティング曲面近似し、この輝度分布の半値幅を抽出する。上記式中、μは分布曲線の中心値この場合はゼロを示し、σは半値幅標準偏差を示す。こうして得られた半値幅は、コラーゲン線維分布が粗であるほど大きく、コラーゲン線維分布が密であるほど小さくなるため、コラーゲン線維分布の粗密を定量的に表す指標コラーゲン粗密指標となる。よって、この半値幅に基づいて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を評価することが可能となる。なお、上述のコラーゲン粗密定量化工程bは、コンピュータにおいて適切な画像解析ソフトウェア例えばWaveMetrics社製IGORPro登録商標等等を実施することにより、実現することが可能である。[2.コラーゲン状態の評価方法の実施のためのシステム]本発明のコラーゲン状態の評価方法は、SHG顕微鏡装置とコンピュータとを組み合わせたSHG測定解析システムにより、実施することができる。図4は、本発明のコラーゲン状態の評価方法を実施するためのSHG測定解析システムの一例を示す構成概略図である。SHG測定解析システム900は、SHG顕微鏡装置100とコンピュータ200を備える。SHG顕微鏡装置100は、光源1と、皮膚サンプルSに対向する対物レンズ10と、光検出器例えば光電子増倍管等14を備える。光源1と対物レンズ10との間には、NDフィルターneutraldensityfilter2、偏光子3、位相差板4例えば1/4波長板、1/2波長板、ミラー5、ダイクロイックミラー6、ガルバノミラー7、第1レンズ8、及び第2レンズ9がこの順序で配置される。対物レンズ10と光検出器14との間には、第2レンズ9、第1レンズ8、ガルバノミラー7、ダイクロイックミラー6、SHG光透過フィルター13がこの順序で配置される。対物レンズ10はピエゾステージ11に取り付けられ、皮膚サンプルSに対して離接可能に構成される。また、サンプル走査ステージ12によって、対物レンズ10の移動軸に対して垂直な平面上における、対物レンズ10と皮膚サンプルSとの相対位置も調整できるように構成される。なお、実線Xは入射レーザー光超短パルス光、点線Yは反射SHG光を示す。コンピュータ200は、SHG顕微鏡装置100に接続され、その設定制御を行うとともに、光検出器14において得られたSHG光画像のイメージング処理を行う。まず、光源1から超短パルス光Xが出射され、NDフィルター2で適度なレーザー光強度に調節された後、偏光子3並びに位相差板4を通過する。位相差板の種類に応じて得られる偏光は、ミラー5で反射され、ダイクロイックミラー6を透過した後、ガルバノミラー7で反射される。さらに、第1レンズ8と第2レンズ9を通過した後、対物レンズ10によりサンプル走査ステージ12上の皮膚サンプルSに集光される。皮膚サンプルSで発生したSHG光の後方散乱成分Yを対物レンズ10で集光し、入射レーザー光Xと同一の光路を逆に戻す。SHG光Yは、第2レンズ9と第1レンズ8を通過し、ガルバノミラー7で反射される。ダイクロイックミラー6はSHG光Yのみを反射し、SHG光透過フィルター13によってSHG光Yのみが抽出される。抽出されたSHG光Yは、光検出器14で光検出され、その検出結果はコンピュータ200に入力されて、得られたSHG光画像のイメージング処理が行なわれる。入射レーザー光は、偏光子3で直線偏光にされた後、位相差板4例えば、1/4波長板、1/2波長板で任意方向の直線偏光に変換することができる。また、ガルバノミラー7、第1レンズ8、及び第2レンズ9によって、皮膚サンプルS上のビームスポットを調整することにより、皮膚サンプルSの二次元平面内を高速走査することができる。更に、サンプル走査ステージ12によって、皮膚サンプルSを二次元平面内でより広範囲に走査することもできる。かかる構成によれば、皮膚サンプルS上を走査して隣接する複数の画像を撮影し、これらの画像を結合することにより、広範囲のSHG光画像を取得することも可能である。更には、対物レンズ10を取り付けたピエゾステージ11によって、ビームスポットを被サンプル10の深さ方向に走査することも可能である。このようにして、SHG光強度の二次元平面分布又は三次元空間分布を分析することが可能となる。なお、SHG顕微鏡装置100がコンピュータ200と協調することにより、上述のSHG光画像取得工程aを実施する手段即ち、皮膚内部に超短パルス光を照射し、発生したSHG光を検出することにより、SHG光画像を取得する手段が実現されることになる。また、得られたSHG光画像を、コンピュータ200において、適切な画像解析ソフトウェア例えばWaveMetrics社製IGORPro登録商標等等を用いて処理することにより、上述のコラーゲン粗密定量化工程b即ち、SHG光画像に基づいて皮膚内部のコラーゲンの粗密を定量化する手段が実現されることになる。図4に示すSHG測定解析システム900は、あくまでも一例であり、適宜変更を加えることが可能である。例えば、ミラー5は必須の構成要素ではなく、適宜省くことができる。また、深さ光軸方向の分布測定が不要の場合には、ピエゾステージ9を適宜省くこともできる。[3.コラーゲン状態の評価方法の応用]上述の本発明のコラーゲン状態の評価方法によれば、真皮層等の皮膚内部のコラーゲンの粗密を、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能となる。本発明者等は、上述の本発明のコラーゲン状態の評価方法により得られたコラーゲンの粗密が、皮膚の老化と相関を有し、皮膚の老化の評価に有効に利用できることを見出した後述の実施例及び図5~9参照。かかる知見を応用すれば、本発明のコラーゲン状態の評価方法を応用して、皮膚の老化を評価することも可能になる。すなわち、本発明は、皮膚の老化を評価する方法であって、上述の本発明のコラーゲン状態の評価方法を用いて、皮膚内部のコラーゲンの粗密を評価する工程と、得られたコラーゲンの粗密の評価結果に基づいて、皮膚の老化を評価する工程とを有する方法以降本発明の皮膚老化評価方法と表示する場合がある。にも関する。特に、本発明の好適な態様によれば、コラーゲンの粗密を定量的に示す指標コラーゲン粗密指標:例えば半値幅が得られる。かかる指標に基づいて、皮膚内部のコラーゲンが密であるほど皮膚の老化が遅い一方、皮膚内部のコラーゲンが粗であるほど皮膚の老化が進行していると評価することが可能である。本発明の皮膚老化評価方法は、皮膚老化抑制剤抗老化剤の臨床的評価に用いることができる。即ち、本発明の皮膚老化評価方法を用いれば、各種の皮膚老化抑制剤抗老化剤がどの程度の効力を有するかを、非侵襲的且つ定量的に評価することが可能である。また、本発明の皮膚老化評価方法は、皮膚老化抑制剤抗老化剤となる物質のスクリーニングにも用いることができる。即ち、皮膚老化抑制剤抗老化剤の候補となる物質について、それらが実際に皮膚老化を抑制する効果を有するか否かを、本発明の皮膚老化評価方法を用いて評価すれば、生体皮膚を評価系として使用することが可能となり、皮膚老化抑制剤抗老化剤をより確実且つ効率的に選定することが可能となる。自然老化および光老化によるコラーゲン線維構造の変化を調べるため、ヒトの頬部等のインビボinvivoでの測定を行った。顔面部は、自然老化に加えて、紫外線曝露による光老化の影響も受け易いため、老化によるコラーゲン線維構造の変化を観察するという目的に適していると考えられる。ここでは年齢や紫外線履歴の異なる被験者の頬部等における真皮層中のコラーゲン線維構造を観察することで、コラーゲンの構造と加齢や紫外線履歴との関連性を調べた。また、得られた結果を利用して皮膚の老化の評価へと応用することが可能かどうか、定量評価を試みた。[1.実験条件]実験装置としては、図4に示す構成を有するSHG測定解析システム900を用いた。光源1としてはフェムト秒モード同期クロムフォルステライトCrForsteriteレーザー中心波長1250nm、パルス幅100fs、繰返し周波数73MHzを用いた。レーザー光は、油浸対物レンズ10N.A.=0.9、W.D.=350μmを通って皮膚サンプルS上に集光される。対物レンズ10から出射されるレーザーパワーは35mWに設定した。皮膚サンプルSから発生した生体SHG光は、ハーモニックセパレーターガルバノミラー7:反射波長625nmと赤外光カットフィルターSHG光透過フィルターによって基本波成分中心波長1250nmを除去した後に、電子冷却フォトンカウンティング型光電子増倍管光検出器14で高感度計測される。レーザースポットの高速二次元走査X軸、Y軸には、ガルバノミラー7と2枚のリレーレンズ第1レンズ8、第2レンズ9を用いた。600μm×600μmのSHG光画像を取得するのに要する時間は2秒である。さらに、ガルバノミラー7で取得した600μm×600μmイメージを、サンプル走査ステージ12で4枚×4枚並べて取得することにより、大面積SHG光画像撮影2.4mm×2.4mmも可能である。なお、大面積SHG光画像撮影では、測定深さを200μmに固定した。実際の計測時には、対物レンズ10上に円形カバーガラスを置き、被験者が測定部位頬部、前腕屈側の皮膚サンプルSをカバーガラス上に固定して、対物レンズ10とカバーガラスとの間をイマージョンオイルで満たした。それぞれの被験者に対して、深さ方向へのSHG光画像撮影と大面積SHG光画像撮影の2通りの方法で計測を行った。[2.SHG光画像の撮像及び目視観察による評価]様々な被験者の皮膚について、大面積SHG光画像を撮影し、目視観察によるコラーゲン密度の評価を行った。まず、30歳代の男性被験者における前腕屈側及び頬部の大面積SHG光画像を撮影した。得られた前腕屈側及び頬部のSHG光画像をそれぞれ図5a、bに示す。なお、図5~7の各SHG画像は、600μm×600μmの画像例えば図5a、b中の四角囲み点線で示す部分を4×4枚併置して得られた2.4mm×2.4mmの大面積SHG画像である。SHG光画像において、黒丸状の部分が毛穴、黒い線状の部分が皮溝毛陰等、白い繊維状の部分がコラーゲンである。図5a、bより、前腕屈側よりも頬部の方が、大きな毛穴や皮溝毛陰等が多数存在していることが分かる。次に、20歳代及び50歳代の女性被験者における頬部の大面積SHG光画像を撮影した。得られたSHG光画像をそれぞれ図6a、bに示す。加齢と共に、きめ細かい密なコラーゲン線維が減少し、太く粗い疎のコラーゲン線維が顕著になっている様子が確認できる。これは、加齢に伴う細胞活性の減退によってコラーゲンの産生が低下し、キメの細かい新生コラーゲン線維の総量が減少しているためと思われる。次に、紫外線暴露とコラーゲン密度との相関を調べるため、顕著な日焼けを有する20歳代及び50歳代の男性被験者、並びに、顕著な日焼けを有しない20歳代及び50歳代の男性被験者の各々について、頬部の大面積SHG光画像を撮影した。顕著な日焼けを有しない20歳代男性被験者のSHG光画像を図7aに、顕著な日焼けを有する20歳代男性被験者の頬部のSHG光画像を図7bに、顕著な日焼けを有しない50歳代男性被験者の頬部のSHG光画像を図7cに、顕著な日焼けを有する50歳代男性被験者の頬部のSHG光画像を図7dにそれぞれ示す。20歳代及び50歳代の何れの比較においても、顕著な日焼けを有しない被験者と比べて、顕著な日焼けを有する被験者の方が、太く粗い疎のコラーゲン線維が顕著になっており、コラーゲン密度が低かった。20歳代ではその差はそれほど明確ではないが、50代被験者ではより明確な相違が確認された。ここから、若い皮膚では紫外線ダメージに対するコラーゲン産生のターンオーバーが比較的順調なので日焼けによる相違が小さいが、加齢と共に細胞活性が低下してくると、紫外線ダメージに対するコラーゲンのターンオーバーが間に合わなくなり、キメの細かい密なコラーゲン線維が極度に減少した状態になることが解釈される。同様の傾向は、女性被験者においても見受けられた。[3.SHG光画像の撮像及びコラーゲン評価指標による評価]次に、種々の年齢の男性被験者の皮膚について大面積SHG光画像を撮影し、目視観察によるコラーゲン密度の評価を行った。まず、20歳代~60歳代の男性被験者について、頬部の大面積SHG光画像を撮影した工程a。20歳代及び50歳代の男性被験者について得られたSHG光画像の例をそれぞれ図8a-1及びb-1に示す。20歳代の被験者よりも50歳代の被験者の方が、太く粗い疎のコラーゲン線維が顕著になっており、コラーゲン密度が低くなっていることが分かる。次に、得られた各SHG光画像について、コンピュータ上で画像解析ソフトウェアWaveMetrics社製IGORPro登録商標を用いて、以下の処理を行った。まず、毛穴、皮溝、毛陰等に該当しない領域から、150μm×150μmの評価対象領域を5箇所選択した工程b1。選択された各評価対象領域内の輝度を二次元フーリエ変換することにより、空間周波数分布を求めた工程b2-1。図8a-1及びb-1の四角囲み黒線内の領域を評価対象領域として得られた二次元空間周波数分布を、それぞれ図8a-2及びb-2に示す。また、その輝度空間周波数を高さ方向の座標として表した模式的な三次元図を、それぞれ図8a-3及びb-3に示す。ここで、二次元フーリエ解析結果の二次元座標は、X軸方向とY軸方向の空間周波数u軸、v軸を示しており、その分布から空間周波数分布の情報を得ることが出来る。図8a-2、b-2及びa-3、b-3の各々から分かるように、画像中心を空間周波数ゼロとして設定することにより、中心に近いほど空間周波数が低く、中心から離れるに従って空間周波数が高い二次元空間周波数分布が得られている。また、図8a-1~a-3と図8b-1~b-3を対比すると、コラーゲン密度が密である20歳代の被験者よりも、コラーゲン密度が粗である50歳代の被験者の方が、二次元上における輝度の分散が大きくなっていることが分かる。次に、得られたu軸またはv軸に沿った輝度の空間周波数分布のデータプロットに対して、上記式1のガウス関数をカーブフィッティングし、この輝度分布の半値幅を抽出した工程b2-2。こうして得られた半値幅を、各被験者の5箇所の評価対象領域について平均した。得られた半値幅の平均値を図9のグラフに示す。図9のグラフから、加齢と共に半値幅が増大していることから、今回利用した半値幅が、皮膚の老化によるコラーゲンの粗密の変化を反映した指標コラーゲン粗密指標として利用可能であることが分かる。また、日焼けの影響が顕著な50代被験者Jでは、特にこの値が大きくなっていることから、紫外線曝露によるダメージがコラーゲンの粗密に与える影響も、本指標に反映されていることが分かる。