表面上のHA-NA血球凝集素およびノイラミニダーゼ糖タンパク質の量が、直径100nmのビリオンに対して550糖タンパク質よりも多く、188K→E、205M→I、212L→V、216S→G、398E→D、486R→K、563I→R、576I→L、581E→D、584R→Q、586K→R、617D→N、621Q→R、682V→I、および691R→Kから選択される少なくとも2つの特異的アミノ酸改変を有するPB1タンパク質をコードする配列番号1の変異型PB1遺伝子を含む、改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。少なくとも563I→Rおよび682V→Iの改変を有するPB1タンパク質をコードする配列番号1の変異型PB1遺伝子を含む、請求項1に記載の改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。HA-NA表面糖タンパク質の量が直径100nmのビリオンに対して550糖タンパク質よりも多い別のA型インフルエンザウイルス株のPB1遺伝子を含む、請求項1または2に記載の改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。配列番号2の配列を有するH3N2インフルエンザウイルスのPB1遺伝子を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。別のインフルエンザウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む再集合体である、請求項1~4のいずれか一項に記載の改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2、およびH3N1サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む、請求項5に記載の改変されたインフルエンザA/PR/8/34ウイルス。インフルエンザウイルスのHA-NAワクチン糖タンパク質を生産する方法であって、HA-NAワクチン糖タンパク質をコードするHAおよびNA遺伝子を含む請求項5または6に記載の改変されたインフルエンザウイルスを卵または細胞において増幅する、方法。HA-NAワクチンタンパク質が、H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2、およびH3N1サブタイプを有するウイルスの糖タンパク質から選択される、請求項7に記載のインフルエンザウイルスのHA-NAワクチン糖タンパク質を生産する方法。インフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法であって、PB1遺伝子によりコードされるPB1タンパク質に、188K→E、205M→I、212L→V、216S→G、398E→D、486R→K、563I→R、576I→L、581E→D、584R→Q、586K→R、617D→N、621Q→R、682V→I、および691R→Kから選択される少なくとも2つの特異的アミノ酸改変を導入するために前記インフルエンザA/PR/8/34ウイルスの配列番号1のPB1遺伝子を改変することを含む、方法。PB1遺伝子によりコードされるPB1タンパク質に少なくとも2つの特異的アミノ酸改変563I→Rおよび682V→Iを導入するためにインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの配列番号1のPB1遺伝子を改変することを含む、請求項9に記載のインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法。配列番号1のPB1遺伝子を、HA-NA表面糖タンパク質の量が直径100nmのビリオンに対して550糖タンパク質よりも多い別のA型インフルエンザウイルス株のPB1遺伝子で置換することを含む、請求項9または10に記載のインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法。配列番号1のPB1遺伝子を、配列番号2の配列を有するH3N2インフルエンザウイルスのPB1遺伝子で置換することを含む、請求項11に記載のインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法。A/PR/8/34ウイルスが、別のインフルエンザウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む再集合体ウイルスである、請求項9~12のいずれか一項に記載のインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法。A/PR/8/34ウイルスが、H3N2、H2N2、H1N2、H5N2、H5N1、H7N7、H9N2、およびH3N1サブタイプを有するウイルスから選択されるインフルエンザウイルスのHAおよびNA遺伝子を含む再集合体ウイルスである、請求項13に記載のインフルエンザA/PR/8/34ウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質の量を増加させる方法。インフルエンザウイルスのHA-NA糖タンパク質を含む一用量のワクチンの免疫原性を、生産される糖タンパク質のNA/HA比を高めることによって増強する方法であって、前記糖タンパク質が、請求項5または6に記載の改変されたインフルエンザウイルスの、卵または細胞での増幅によって生産される、方法。実施例1:逆遺伝学による組換えウイルスの生産本発明者らは、本発明者らの研究室で開発されたプロトコールに従い、逆遺伝学によって9種類の組換えウイルスを作製した。これらの組換えウイルスのゲノム組成は次の通りである表1。-ウイルスH3N2A/モスクワ/10/99MO-ウイルスH1N1A/PR/8/34PR8-ウイルスA:PR8ウイルスの遺伝的背景にMOのHAおよびNA遺伝子のセグメントを含むクラシックPR8ワクチン再集合体-ウイルスB:PR8ウイルスの遺伝的背景にMOのHA、NAおよびPB1遺伝子のセグメントを含むPR8ワクチン再集合体-ウイルスC:MOのPB1遺伝子のセグメントを含むPR8-ウイルスD:鳥インフルエンザH5N2A/フィンチ/イングランド/2051/91ウイルスFIのHAおよびNA遺伝子のセグメントを含むクラシックPR8ワクチン再集合体-ウイルスE:PR8ウイルスの遺伝的背景にFIのHAおよびNA遺伝子のセグメントとMOのPB1遺伝子のセグメントとを含むPR8ワクチン再集合体-ウイルスF:ヒトH3N2ウイルスA/カルフォルニア/10/04ウイルスCALのHAおよびNA遺伝子のセグメントを含むクラシックPR8ワクチン再集合体-ウイルスG:PR8ウイルスの遺伝的背景にCALのHAおよびNA遺伝子のセグメントとMOのPB1遺伝子のセグメントを含むPR8ワクチン再集合体invitroにおける組換えウイルスの生産は、それぞれ遺伝子のセグメントを含む8つのプラスミドを有する293T細胞のトランスフェクションに基づく。ウイルスの生産は、本研究室にてその独自の分子ツールおよび細胞ツールを用いて行った。9種類の組換えウイルスで得られた生産収量は細胞においては同等であり、組換えウイルスの通常の生産に適合する。実施例2:低温電子顕微鏡による組換えウイルスの表面のHA-NA糖タンパク質密度の比較分析表2逆遺伝学により作製された種々のウイルスを増幅し、スクロースクッション上で精製する。格子上に付着させた精製ウイルスを超低温で冷凍し、低温電子顕微鏡で観察する。表面糖タンパク質GPの密度を、4つの糖タンパク質スパイク間の距離を測定することによって決定しImageJ画像解析ソフトウエア、下式:4πR2R=50nmに従って、直径100nmのウイルスの表面に相関させることによって決定する。結果:ウイルスPR8:直径100nmのウイルスの表面に500GP。ウイルスMO:直径100nmのウイルスの表面に689GP。ウイルスA:直径100nmのウイルスの表面に500GP。ウイルスB:直径100nmのウイルスの表面に700GP。ウイルスC:直径100nmのウイルスの表面に598GP。ウイルスD:直径100nmのウイルスの表面に498GP。ウイルスE:直径100nmのウイルスの表面に640GP。ウイルスF:直径100nmのウイルスの表面に502GP。ウイルスG:直径100nmのウイルスの表面に703GP。-組換えPR8H1N1ウイルスと組換えMOH3N2ウイルスの間には糖タンパク質量に関して有意差があるH3N2ウイルスでは35。-クラシックワクチン組成物に相当する組換えウイルスAは、PR8ウイルスと同等のGP量を有する。-組換えウイルスBMOPB1遺伝子を含むはその表面に、MOウイルスで見られるものと同一のGP量を有する。-PB1遺伝子は、直径100nmのビリオンに対して700GPに相当するGP量を含む組換えワクチンウイルスを得ることを可能とする。-組換えウイルスCはその表面に、ウイルスPR8で見られるものよりも多い量のGPを有する20。-MOPB1遺伝子のセグメントによるGP量の増加が、表面にCAL株のH3N2GPを有する組換えウイルスFおよびGで見られた。-MOPB1遺伝子のセグメントのより媒介されるGP量の増加が、FIH5N2ウイルスの鳥類GPを有する再集合体ワクチンウイルスウイルスDおよびEで見られた。実施例3:組換えウイルスのノイラミニダーゼNA活性の決定および比較表2NA活性は、本研究室によって開発された実験プロトコールを用いて決定した。NA活性は所定量のウイルスに対して決定されるのでRFUは10E5ウイルスを表す、見られた変動はウイルス表面のNAタンパク質の量を反映する同一のNAに関する。NARFU活性の変動ヒトN2ノイラミニダーゼを含むウイルスに関するを下記に示す。MO:10E5のウイルスで29340RFUウイルスA:10E5のウイルスで14600RFUウイルスB:10E5のウイルスで58000RFUウイルスF:10E5のウイルスで13897RFUウイルスG:10E5のウイルスで63470RFUクラシック再集合体ワクチンウイルスである組換えウイルスAおよびFに対して組換えウイルスBおよびGでNA量の増加が見られる。NARFU活性の変動鳥類N2ノイラミニダーゼを含むウイルスに関するを下記に示す。ウイルスD:10E5のウイルスで8450RFUウイルスE:10E5のウイルスで36542RFUクラシック再集合体ワクチンウイルスである組換えウイルスDに対して組換えウイルスEMOPB1遺伝子のセグメントでNA量の増加が見られる。NARFU活性の変動N1ノイラミニダーゼを含むウイルスに関するを下記に示す。ウイルスPR8:10E5のウイルスで14234RFUウイルスC:10E5のウイルスで63540RFUウイルスPR8に対して組換えウイルスCMOPB1遺伝子のセグメントでNA量の増加が見られる。結果として、MOウイルスのPB1遺伝子を含むクラシック再集合体ワクチンウイルスは、クラシックワクチン再集合体で測定されたものよりも大きいNA酵素活性を有する。MOウイルスPB1遺伝子をクラシック再集合体ワクチンウイルスの遺伝的背景に導入すると、ウイルス表面のGP数の増加20~35、ウイルス表面のNA数の増加NA活性の増加が可能となる。実施例4:PR8H1N1ウイルスとMOH3N2ウイルスの間のアミノ酸配列比較による、上記特性を担う特定のH3N2PB1配列の決定PB1タンパク質のタンパク質配列のアライメントは、PR8とMOの間の30アミノ酸の違いを示す。MOPB1タンパク質のタンパク質配列を得るためのPR8PB1タンパク質のタンパク質配列の改変を可能とする指定突然変異誘発の戦略は、本特許出願の対象である突然変異のリストを実証することを可能とした。突然変異のリスト:188K→E、205M→I、212L→V、216S→G、398E→D、486R→K、563I→R、576I→L、581E→D、584R→Q、586K→R、617D→N、621Q→R、682V→Iおよび691R→K。さらに精密化した実験戦略によれば、記載の生物学的プロセスに関与する2つの突然変異を同定することが可能であった。突然変異I563RおよびV682IをPR8ウイルスAPB1タンパク質に導入すると、ウイルスBで見られるものと同様の表現型GPおよびNA活性の量を得ることが可能となる。参照文献