"ヒトの代謝特異体質をinvitroで再現できる単細胞モデルを得る方法であって、該モデルが、ヒトの代謝特異体質を再現するために、随意にデザインされた薬物生体内変換酵素の表現型特性を形質転換細胞に付与する一組の発現ベクターを含んでなるものであり、aフェーズI薬物生体内変換酵素およびフェーズII薬物生体内変換酵素の中から選択される薬物生体内変換酵素をコードする異所DNA配列を含んでなる一組の発現ベクター{ここで、各発現ベクターは、iフェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のセンスmRNA中に転写されるDNA配列センスベクター、およびiiフェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列アンチセンスベクターの中から選択される、異なるフェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素をコードする異所DNA配列を含んでなり、上述の発現ベクターの1以上で形質転換された細胞におけるその異所DNA配列の発現により、形質転換細胞に、フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素の特異的表現型特性が付与される}を用いて、レダクターゼ活性を発現する細胞を形質転換し、その発現ベクターを用いて、その異所DNA配列を一時的に発現し、フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素の異なる表現型特性を呈する細胞を得ること、およびbセンスベクターおよびアンチセンスベクター双方の前記一組の発現ベクターで形質転換され、その結果、所望のフェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素の表現型特性のいずれかを発現する細胞から、ヒトの代謝特異体質をinvitroで再現できる単細胞モデルを構築することを含んでなる、方法。レダクターゼ活性を発現する前記細胞が、腫瘍細胞をはじめとするヒトまたは動物細胞である、請求項1に記載の方法。レダクターゼ活性を発現する前記細胞が、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞および胃腸型CaCO-2細胞の中から選択されるヒト細胞である、請求項1に記載の方法。前記フェーズIおよびフェーズII薬物生体内変換酵素が、オキシゲナーゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼおよび抱合酵素の中から選択されるものである、請求項1に記載の方法。前記フェーズIおよびフェーズII薬物生体内変換酵素が、CYP450依存性モノオキシゲナーゼ、フラビン-モノオキシゲナーゼ、スルホ-トランスフェラーゼ、シトクロムCレダクターゼ、UDP-グルコロニルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼおよびグルタチオントランスフェラーゼの中から選択されるものである、請求項1に記載の方法。フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素をコードする前記異所DNA配列が、CYP450イソ酵素のセンスmRNAまたはアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列、ならびに薬物生体内変換に関与するオキシゲナーゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼおよび抱合酵素のセンスmRNAまたはアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列の群の中から選択されるものである、請求項1に記載の方法。フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素をコードする前記異所DNA配列が、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、GSTA1のセンスmRNAまたはアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列、およびフラビン-モノオキシゲナーゼ、スルホ-トランスフェラーゼ、シトクロムCレダクターゼ、UDP-グルコロニルトランスフェラーゼ、エポキシドヒドロラーゼまたはグルタチオントランスフェラーゼのセンスmRNAまたはアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列の群の中から選択されるものである、請求項1に記載の方法。フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素をコードする前記異所DNA配列が、フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のセンスmRNA中に転写されるDNA配列である、請求項1に記載の方法。フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素をコードする前記異所DNA配列が、フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のアンチセンスmRNA中に転写されるDNA配列である、請求項1に記載の方法。フェーズI薬物生体内変換酵素およびフェーズII薬物生体内変換酵素の中から選択される薬物生体内変換酵素をコードする異所DNA配列を含んでなる前記発現ベクターが、ウイルスベクター、リポソームおよびミセルビヒクルの中から選択されるものである、請求項1に記載の方法。前記発現ベクターが天然または組換えアデノウイルスである、請求項10に記載の方法。フェーズI薬物生体内変換酵素およびフェーズII薬物生体内変換酵素の中から選択される薬物生体内変換酵素をコードする異所DNA配列を含んでなる、様々な量の発現ベクターの併用を含む、請求項1に記載の方法。ヒトにおいて見られる代謝多様性をその細胞中で再現することを目的とする、レダクターゼ活性を発現する細胞の操作における、フェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のセンスまたはアンチセンス発現ベクターの使用。薬物の代謝および/または薬物動態および/または潜在的特異体質性肝毒性および/または潜在的薬剤相互作用を研究する方法であって、その薬物を、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法に従って得られた、ヒトの代謝特異体質をinvitroで再現できる単細胞モデルと接触させることを含んでなる、方法。フェーズIおよびフェーズII薬物生体内変換酵素のセンスおよびアンチセンスmRNAをコードする1以上の発現ベクターを含んでなる、キット。フェーズIおよびフェーズII酵素ならびにシトクロムP450レダクターゼの一組のアデノウイルス発現ベクターを用いることにより、制御可能な様式で生体異物を代謝する能力を任意の細胞系統に付与する方法であって、形質転換細胞に、生体異物を代謝するように随意にデザインされた表現型特性を付与するために、その細胞種を前記アデノウイルス発現ベクターでトランスフェクションすることを含んでなり、形質転換される細胞種の特徴に応じて、次の状況:aシトクロムP450レダクターゼ活性を発現する細胞種の、生体異物生体内変換に関与するP450酵素をコードする異所DNA配列を含んでなる一組の発現ベクターによる形質転換この場合、各発現ベクターは、異なるCYP酵素のセンスmRNAを転写する異所DNA配列を含んでなる、bある細胞種の、フェーズIまたはフェーズII酵素の中から選択される薬物生体内変換酵素をコードする異所DNA配列を含んでなる一組の発現ベクターによる形質転換この場合、各発現ベクターは、異なるフェーズIまたはフェーズII薬物生体内変換酵素のセンスmRNAを転写する異所DNA配列を含んでなる、cCYP遺伝子を含むが、CYPレダクターゼを発現しない細胞種の、そのCYP酵素をコードする異所DNA配列ならびにCYPレダクターゼをコードする配列を含んでなる一組の発現ベクターによる形質転換この場合、各発現ベクターは、CYP酵素のセンスmRNAかCYPレダクターゼのセンスmRNAのいずれかを転写する異所DNA配列を含んでなるの一つが想定され、ここで、前記形質転換細胞内での前記異所配列の全ての発現により、該細胞に一時的な生体異物代謝特性が付与されることを特徴とする、方法。実施例1:組換えアデノウイルスの作製固有のヒト肝臓バンクからの種々のヒト生体内変換酵素のクローニングヒトCYP生体内変換酵素1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5またはGSTA1のクローニングに用いる方法論は、このような酵素をコードする配列をフランキングするプライマーオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト肝臓cDNAライブラリーにおいてhigh-fidelityRT-PCRを行うことである。逆転写酵素RTの反応混合物は、20μl1×逆転写酵素バッファー、DTT10mM、dNTP500μM、3μMプライマーオリゴdT、14、60URnaseOUTおよび250URtaseHからなった。この混合物に1μgの全RNAを加えた。42°Cで60分間反応の行った後、95°Cで5分間加熱し、氷中で急速冷却した。このcDNAを使用まで-20°Cで保存した。使用プライマーオリゴヌクレオチド各CYPに関してそれらのコード配列をフランキングする2対のプライマーオリゴヌクレオチドをデザインした。各プライマーは、その5’末端に、特定の酵素の制限部位に相当する付加的配列を含み、それらをpACCMVベクターにクローニングする[表1参照]。HighFidelityPCR新たに合成したcDNA従来のPCRを行う。このPCR反応は次の反応混合物:3μlのcDNA1/10RT、3μlバッファー10×、50μMdNTP、全1UのHighFidelity、6μMプライマーオリゴヌクレオチド、および水最終量30μlまでとともにサーモサイクラーにて行った。サーモサイクラーで用いるプログラムは、A初期変性:95°C3分;B下記を4サイクル:a.サイクルによる変性:95°C40秒b.環化:58°C45秒各プライマーで異なるc.最終伸張:74°C5分;C下記を30サイクルより特異的:a.サイクルによる変性:95°C40秒b.環化62°C45秒各プライマーで異なるc.その後、最終伸張74°C5分。PCRにより増幅された産物をカラムクロマトグラフィー高純度PCR産物精製キットで精製し、TEバッファーで溶出した。次に、このPCR産物を1.5アガロースゲルでの電気泳動により分析し、臭化エチジウムで可視化し、増幅されたcDNAの大きさを確認した。クローニングされた遺伝子の同定。制限酵素による消化。アガロースゲル。分離。クローニング前に、DNAを、製造者に推奨されているバッファー中、制限酵素とともにインキュベートした。標準的なインキュベーション混合物は、2単位の酵素/DNAμg、10×バッファーおよび蒸留水を含まなければならない。場合により、100μg/mlのBSA、または25°Cでのインキュベーションを必要とする酵素もある。pACCCMV組換えプラスミドの作製apACCMVベクターベクター中へのcDNA断片挿入配列のサブクローニングは、同じ制限酵素を用いた付着末端の連結によって行った。この方法論では、センスおよびアンチセンス方向のクローンが生じる。それ自体の連結の他、再環化を防ぐために、予めベクター末端を脱リン酸化する工程を含み、そのために先の試験管には2μlのCIP20~30U/;GibcoBRLカタログ番号18009019を加え、37°Cで20分間インキュベートした。次に、さらに2μlのCIPを加え、これを56°Cで20分間インキュベートした。酵素を不活性化し、反応を停止させるため、それを75°Cで10分間インキュベートした。このベクターと挿入配列は、連結の障害となり得る残留ヌクレオチド、酵素およびバッファーを除去するために、連結前に精製しなければならない。このため、GeneacleanキットBio101カタログ番号1001-200を用い、TAE-アガロースゲルTris酢酸40mMおよびEDTA2mM中、1アガロースのバンドを精製した。両バンドを精製した後、連結のため、次の反応混合物を調製した:並行して、挿入配列を含まない対照混合物を調製した。周囲温度で2時間競合させた後、細菌をそれらの連結混合物で形質転換した。付着末端の連結は、次の反応混合物を用いて行った:並行して、挿入配列を含まない対照混合物を調製した。周囲温度で2時間競合させた後、細菌をそれらの連結混合物で形質転換した。細菌におけるプラスミドの増幅冷CaC12溶液で予め処理しておいた細菌を用い、それらを競合させ、プラスミドDNAを受容させるように短時間42°Cに置いた。このため、競合細菌100μlに0.1~1μgのcDNAを加え連結、その混合物を氷中に30分間置き、これを1mlのS.O.C.培地GibcoBRLカタログ番号15544-0189中でインキュベートした。次に、100μlを、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地に移し、37°Cで一晩置いた。この後、細菌を増殖させ、それらを用い、以下に記載する手順によりプラスミドDNAを増幅および精製した。形質転換した細菌の単離コロニーを、アンピシリンを含むLB培地2~5ml中で増殖させる。次に、それを8,000rpmで1分間遠心分離し、沈殿を溶解バッファーグルコース50mM、Tris-HCl25mM、pH8.0、EDTAおよび4mg/mlのライソザイムに再懸濁する。この懸濁液を5分間氷上に置き、10,000rpmで5分間遠心分離する。上清を清浄な試験管に移し、500μlのイソプロパノールを加え、15000rpmで10分間遠心分離する。上清を除去し、残渣を70エタノールv/vで洗浄し、乾燥させ、適当な量のTEpH7.5Tris10mM、EDTA1mMに再懸濁する。制限酵素を用いて適切なコロニーを確認した後、残りの培養物を250mlのフラスコに移し、一晩増殖させてプラスミドを増幅させる。従来のキットを用い、この細菌培養物のプラスミドDNAを精製した250~500mlの間。アデノウイルスの作製。293細胞におけるpJM17プラスミドとpAC-CYPプラスミドの同時トランスフェクション。プラスミドの同時トランスフェクションは、相同組換えによって生じた組換えウイルスが複製可能な293細胞系統で行う。これらのプラスミドの同時トランスフェクションは、種々の割合を用い、リン酸カルシウム法によって行った。このため、6cm径の数個のプレートに密集度50~60で接種した。翌日、種々のプラスミドおよび/またはキャリアーならびに対照を含有する試験管を調製し、各試験管の内容物に500μlのHBS2XpH7.15に調整したHepes50mM、NaCl140mM、KCl5mM、グルコース10mMおよびNa2HP041~4mMに滴下し、周囲温度で20分間置いた。次に、それを解離しないように細胞単層上に静かに注ぎ、周囲温度で15分間置き、血清を含む4mlの培地を加え、オーブン内で37°Cにて4~6時間インキュベートし、プレートから培地を除去し、血清または抗生物質を含まない培地1mlを15グリセロールとともに加え、90秒経過させ、5mlPBSを加える。次に、PBSで2回洗浄してグリセロールを完全に除去し、5mlの培地を加え、これをオーブン内で保存し、細胞溶解が見られるまで、3~4日ごとに培地を交換する。組換えプロセスを行った後、ウイルスを293細胞内で複製し、それらの内部で溶解を成し遂げる2~6日。次に、ウイルスをクローニングするが、そのために半固形寒天で覆ったプレート内で、クローニングするDMEMにてウイルスの1/10~1/100連続希釈液を調製し、各希釈液0.5mlを、293細胞を含む6cm径プレートに加え、これらの細胞をオーブン内で37°Cにて1時間、15分ごとに振盪しながらインキュベートする。次に、培地を除去し、その単層を、45°Cに予熱した寒天1.3MEM2×1:1v/vの混合物6mlで覆い、オーブン内で37°Cにてインキュベートする。7~9日後、はげたパッチ、すなわち、293細胞単層が変化した領域が見られる。これらのはげたパッチを選択し、293細胞の新しいプレートで増殖させる。PEG8000沈殿法によるアデノウイルスの精製CsCl勾配方法A、あるいは、同様の結果をもたらす簡単な方法としてポリエチレングリコール方法Bを用いた遠心分離により、純粋なウイルス原液を調製した。方法A293細胞が溶解した際、上清を取り、MgCl21mMおよび0.1Nonidetp40を含むPBSに回収する。方法Bこの場合には、細胞はすでに溶解を受けているので、培地を除去することはできない。Nonidetp40を、0.1となるまで加える。次に、それを周囲温度で10分間振盪し、20,000gで10分間遠心分離する。上清を清浄な試験管に移し、0.5Vの20PEG-8000/NaCl2.5Mを加え、4°Cで1時間振盪しながらインキュベートする。次に12,000gで10分間遠心分離し、その沈殿を、次のバッファー:NaCl135mM、KCl5mM、MgCl21mMおよびTris-HCl10mMpH7.4中、最初の培地量の1/100~1/50で再懸濁する。次に、それを同じバッファーを用い、4°Cで一晩透析し、0.22μmフィルターで濾過してその原液を除菌する。最後にアリコートとし、100μg/mlのBSAとともに-70°Cで保存した。上記の手順に従い、CYP生体内変換酵素CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5またはGSTA1をコードするDNA配列を含む組換えアデノウイルスを作製した。これらの組換えアデノウイルス本発明による発現ベクターは、接頭辞Adアデノウイルスに酵素名を続け、すなわち、それぞれAd-1A1、Ad-1A2、Ad-2A6、Ad-2B6、Ad-2C8、Ad-2C9、Ad-2C18、Ad-2C19、Ad-2D6、Ad-2E1、Ad-3A4、Ad-3A5およびAd-GSTA1と呼称した。実施例2:組換えアデノウイルスによる、Cレダクターゼシトクロム活性を発現する細胞の形質転換実施例1で得られた組換えアデノウイルス[Ad-1A1、Ad-1A2、Ad-2A6、Ad-2B6、Ad-2C8、Ad-2C9、Ad-2C18、Ad-2C19、Ad-2D6、Ad-2E1、Ad-3A4、Ad-3A5およびAd-GSTA1]を用い、感染によりHepG21細胞を形質転換した。密集度70でHepG21細胞の培養物を含む培養培地を吸引した。細胞を各2~3mlの基本培地または生理食塩水バッファーで2回洗浄した。広域のヒト代謝多様性を包含する単細胞モデルを作製するためのウイルス使用量は広範に異なった。1~50MOIの濃度に達するまでアデノウイルスを培養培地で希釈した。細胞を維持するための培地の使用量はプレートサイズによって異なり、最終感染量は通常量の1/4に減る。インキュベーション時間は37°Cで1時間30分~2時間維持した。感染細胞における導入遺伝子の活性は、用いる細胞にもよるが、24後に検出可能となり、48時間後に最大に達する。特定の細胞が収容するウイルスの最大総量には限界がある。この量は、明らかな細胞傷害作用形態、細胞機能が見られるまで、ウイルス量を高めることで判定される。これにより、特定の細胞が許容するウイルス粒子の最大数を確定することができた。図2および3は、薬物代謝に関連のあるヒト酵素の発現を随意にいかにして改変することができるかという具体例を示す。特に、図2は、Ad-2E1の種々のクローンを感染させたHepG21細胞におけるmRNAの増加を示し、一方、図3は、種々の濃度のAd-3A4を感染させ、テストステロンとともにインキュベートしたHepG21細胞における活性の上昇を示す。参照文献"