"下記工程を包含することを特徴とする、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞集団の製造方法。工程1:T細胞を含有する細胞集団からCD8陽性T細胞を除去、又はCD4陽性T細胞を採取する工程、及び工程2:工程1で得られた細胞集団を、下記A及びBの存在下で培養し、かつ当該培養中及び/又は当該培養後の拡大培養中、全部又は一部の期間において、下記Cの存在下で培養する工程。Aフィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドBCD3リガンド、又はCD3リガンド及びCD28リガンドCインターロイキン-4工程2が、請求項1記載のA及びBの存在下で、かつCの存在下で培養し、得られた細胞集団をCの存在下で拡大培養する工程である、請求項1記載の製造方法。工程2が、請求項1記載のA及びBの存在下で、かつCの非存在下で培養し、得られた細胞集団をCの存在下で拡大培養する工程である、請求項1記載の製造方法。工程2が、請求項1記載のA及びBの存在下で、かつCの存在下で培養し、得られた細胞集団をCの非存在下で拡大培養する工程である、請求項1記載の製造方法。更に外来遺伝子を導入する工程を包含する、請求項1~4のいずれか1項に記載の製造方法。請求項1記載のA及びBの、又はBの存在下で、かつCの非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記1~5からなる群より選択される少なくとも1つの細胞が高比率に含有されている、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法で得られる細胞集団。1:CD4陽性CD45RA陽性CCR7陽性T細胞2:CD4陽性CD45RA陽性CD62L陽性T細胞3:CD4陽性CD45RA陰性CCR7陽性T細胞4:CD4陽性CD45RA陰性CD62L陽性T細胞5:CD4陽性CXCR4陽性細胞医薬に使用するための請求項6記載の細胞集団。医薬の製造に用いる、請求項6記載の細胞集団。請求項6記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬。対象に有効量の請求項6記載の細胞集団を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法。本発明の目的は、細胞医療に有効な細胞集団の製造方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、CD4陽性T細胞を拡大培養する際、通常、Th2型細胞への分化誘導に用いられているインターロイキン-4をCD3リガンド、及びフィブロネクチンフラグメントと共に用いて培養を行ったところ、驚くべきことに、Th2型細胞への分化誘導ではなく、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞集団、すなわち、より未分化なCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が高い細胞集団が得られることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明を概説すれば、本発明は、[1]下記工程を包含することを特徴とする、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞集団の製造方法、工程1:T細胞を含有する細胞集団からCD8陽性T細胞を除去、又はCD4陽性T細胞を採取する工程、及び工程2:工程1で得られた細胞集団を、下記A及びBの存在下で培養し、かつ当該培養中及び/又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において、下記Cの存在下で培養する工程、Aフィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドBCD3リガンド、又はCD3リガンド及びCD28リガンドCインターロイキン-4[2]工程2が、[1]記載のA及びBの存在下で、かつCの存在下で培養し、得られた細胞集団をCの存在下で拡大培養する工程である、[1]記載の製造方法、[3]工程2が、[1]記載のA及びBの存在下で、かつCの非存在下で培養し、得られた細胞集団をCの存在下で拡大培養する工程である、[1]記載の製造方法、[4]工程2が、[1]記載のA及びBの存在下で、かつCの存在下で培養し、得られた細胞集団をCの非存在下で拡大培養する工程である、[1]記載の製造方法、[5]更に外来遺伝子を導入する工程を包含する、[1]~[4]のいずれか1つに記載の製造方法、[6][1]記載のA及びBの、又はBの存在下で、かつCの非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記1~5からなる群より選択される少なくとも1つの細胞が高比率に含有されている、[1]~[5]のいずれか1つに記載の製造方法で得られる細胞集団、1:CD4陽性CD45RA陽性CCR7陽性T細胞2:CD4陽性CD45RA陽性CD62L陽性T細胞3:CD4陽性CD45RA陰性CCR7陽性T細胞4:CD4陽性CD45RA陰性CD62L陽性T細胞5:CD4陽性CXCR4陽性細胞[7]医薬に使用するための[6]記載の細胞集団、[8]医薬の製造に用いる、[6]記載の細胞集団、[9][6]記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬、及び[10]対象に有効量の[6]記載の細胞集団を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法、に関する。なお本発明において、拡大培養とは所望の細胞を増殖させる培養細胞数を増加させる培養を意味する。本発明により、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞集団、すなわちCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞を高含有する細胞集団の製造方法が提供される。当該製造方法は細胞増殖率が高い。また当該製造方法により得られる細胞集団は、CD4陽性CD45RA陽性CCR7陽性T細胞、CD4陽性CD45RA陽性CD62L陽性T細胞、CD4陽性CD45RA陰性CCR7陽性T細胞、CD4陽性CD45RA陰性CD62L陽性T細胞、CD4陽性CXCR4陽性細胞の比率が高く、細胞免疫療法による疾患の治療に極めて有用である。本発明において、T細胞はTリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。T細胞には、ヘルパーT細胞Th1型細胞及びTh2型細胞、サプレッサーT細胞、制御性T細胞、CTL、ナイーブT細胞、メモリーT細胞、α鎖とβ鎖のTCRを発現するαβT細胞、γ鎖とδ鎖のTCRを発現するγδT細胞が含まれる。本発明の原料として用いられるT細胞を含有する細胞集団としては、血液末梢血、臍帯血など、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製又は誘導された末梢血単核細胞PBMC、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核細胞などを含む細胞集団が例示される。これらの細胞はIL-2などのサイトカインにより生体内インビボや生体外エクスビボで活性化されていてもよい。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、もしくはそれらを凍結保存したもののいずれも使用することができる。本発明において、フィブロネクチン以下、FNと記載及びFNフラグメントは、天然から得られたもの天然のFNや天然のFNを酵素消化により断片化したFNフラグメント等、又は組換えDNA技術により製造されたもののいずれでもよい。FN及びFNフラグメントは、例えば、ルオスラーティE.らRuoslahtiE.,etal.、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリーJ.Biol.Chem.、第256巻、第14号、第7277~7281頁1981の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なFN及びFNフラグメントとは、これらが天然においてFNと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。本発明において、FN及びFNフラグメントは、単一の分子種を使用してもよく、複数の分子種を混合して使用してもよい。本発明に使用できるFNフラグメント、及び該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカF.らKimizukaF.,etal.、ジャーナルオブバイオケミストリーJ.Biochem.、第110巻、第284~291頁1991、コーンブリットA.R.らKornblihttA.R.,etal.、EMBOジャーナルEMBOJ.、第4巻、第7号、第1755~1759頁1985、及びセキグチK.らSekiguchiK.,etal.、バイオケミストリーBiochemistry、第25巻、第17号、第4936~4941頁1986等より得ることができる。また、FNをコードする核酸配列又はFNのアミノ酸配列は、NCBIReferenceSequenceIDRefSeqID:NM_002026、NP_002017に開示されている。本発明には、細胞接着活性及び/又はヘパリン結合活性を有するFNフラグメントが好適に使用できる。FN中には、細胞表面のインテグリンと結合する活性を有する領域が存在する。当該領域として、VLAverylateantigen-4又はVLA-5結合領域が例示される。FNのC末端側寄りの部位にはIIICSと呼ばれる領域が存在する。ここはCS-1と呼ばれる25アミノ酸からなる領域配列番号1が含まれており、当該領域はVLA-4に対して結合活性を示す。また、FNにはIII型と呼ばれる繰り返し配列が存在しており、N末端側から10番目のIII型の繰り返し配列配列番号2には細胞への結合領域が存在している。前記配列中のVLA-5との結合に中心的な役割を果たす配列は、Arg-Gly-Asp-SerRGDS:配列番号3の4アミノ酸である。C-274配列番号4は前記III型の繰り返し配列配列番号2を含むポリペプチドであり、強い細胞接着活性を有する組換えFNフラグメントの1つである。更に、FNはヘパリンと結合する活性を有している。FNのヘパリン結合領域は、前記III型の繰り返し配列のN末端から12~14番目に相当する。H-271配列番号5はこのヘパリン結合領域からなる組換えFNフラグメントの1つである。本発明には、各領域を単独で含有するFNフラグメントのほか、これら領域の2つ以上が直接、あるいは適切なリンカーを介して結合されたFNフラグメントを使用することができる。これらFNフラグメントに含まれるFN由来の領域は同一のものであっても、異なるものであってもよい。複数の結合領域を分子内に有するFNフラグメントとしては、VLA-4結合領域とヘパリン結合領域を含有するH-296配列番号6、VLA-5結合領域とヘパリン結合領域を含有するCH-271配列番号7、VLA-4結合領域、VLA-5結合領域及びヘパリン結合領域を含有するCH-296配列番号8、VLA-4結合領域及びVLA-5結合領域を含有するC-CS1配列番号9等のポリペプチドが例示される。これら各種ポリペプチドは、J.Biochem.、第110巻、第284~291頁1991に記載されており、その開示に従って作製することができる。CH-296は、レトロネクチンRetroNectin:登録商標の名称でタカラバイオ社より販売されている。更に、本発明に使用するFNフラグメントとしては、FNフラグメントにより所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のFNのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである改変型FNフラグメントであってもよい。例えば、C-274やH-271より1つ又は2つのIII型の繰り返し配列を欠失させたものであってもよい。当該FNフラグメントとしては、国際公開第2008/143255号パンフレットの記載のFNフラグメントが例示される。ここで同等の機能を有するとは、当該改変型FNフラグメントの細胞接着活性及び/又はヘパリン結合活性を調べることにより判断することができる。また、後述の<3>本発明の細胞集団の製造方法において同等の拡大培養率を有すること、もしくは本発明で得られる細胞集団中のCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が同等であることにより判断できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるFNフラグメントその細胞接着ドメインと細胞の接着を公知の方法でアッセイして調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズD.A.らの方法ネイチャーNature、第352巻、第438~441頁1991が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の接着を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるFNフラグメントそのヘパリン結合ドメインとヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズD.A.らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。組換えFNフラグメントの本発明への使用は、入手、取り扱いの容易さの他、その品質の均一性、ウイルス等の混入の危険性が低いという安全面からも好ましい。本発明に使用されるFNフラグメントの分子量には特に制限はないが、好適には1~200kDa、より好適には5~190kDa、更に好適には10~180kDaである。当該分子量は、例えば、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。本発明に使用されるFNフラグメントは、上記に記載の複数の異なるFNフラグメントを混合してA成分として使用することもできる。以下、本発明の製造工程について具体的に説明する。本発明は下記工程を包含することを特徴とする、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞集団の製造方法である。工程1:T細胞を含有する細胞集団からCD8陽性T細胞を除去、又はCD4陽性T細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び工程2:工程1で得られた細胞集団を、下記A及びBの存在下で培養し、かつ当該培養中及び/又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において下記Cの存在下で培養する工程。AFN、FNフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドBCD3リガンド、又はCD3リガンド及びCD28リガンドCインターロイキン-4なお、本願明細書において、前記A、B及びCを本発明における培養成分と記載することがある。また、AFN、FNフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを単にA成分、BCD3リガンド、又はCD3リガンド及びCD28リガンドを単にB成分、Cインターロイキン-4を単にC成分と記載することがある。<1>本発明の工程1本発明の製造方法の工程1では、T細胞を含有する細胞集団からCD8陽性T細胞を除去、又はCD4陽性T細胞を採取することにより、培養に供する細胞集団を調製することが行われる。CD8陽性T細胞の除去は、細胞表面に発現しているCD8を指標として実施することができ、例えば抗CD8抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とT細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したCD8陽性T細胞を除去する、又は、前記担体と結合しない細胞集団を回収することにより実施される。抗CD8抗体が固定化されたビーズとしては、例えば、DynabeadsM-450CD8インビトロジェン社製、Eligixanti-CD8mAbcoatednickelparticlesバイオトランスプラント社製、CliniMACSSystemMiltenyiBiotec社製などが好適に使用できる。以下、本明細書において、T細胞を含有する細胞集団からCD8陽性T細胞を除去した細胞集団をCD8除去細胞集団と称する場合がある。CD4陽性T細胞の採取は、細胞表面に発現しているCD4を指標として実施することができ、例えば抗CD4抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とT細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したCD4陽性T細胞を回収することにより実施される。抗CD4抗体が固定化された前記担体は、例えば、CD4MicroBeads、CliniMACSSystem以上、MiltenyiBiotec社製、DynabeadsM-450CD4インビトロジェン社製などが好適に使用できる。本発明において、T細胞を含有する細胞集団から調製したCD8除去細胞集団、具体的にはT細胞を含有する細胞集団としてPBMCを使用して得られたCD8除去細胞集団は、CD4陽性T細胞とともに単球やマクロファージなどを含有する。従って、CD8除去細胞集団は、細胞表面に発現しているCD4を指標として選別したCD4陽性T細胞のみからなる細胞集団とは異なる。本発明の工程1又は工程2の実施前に、特定の細胞表現型を有する任意の細胞亜集団を採取又は除去することもできる。例えば、PBMCからT細胞を採取した後に前記工程1に供することもでき、またPBMCからT細胞以外の血球成分、例えば単球やマクロファージを除去した後に前記工程1に供することもできる。当該操作については、特に限定はないが、細胞表面上の適当なマーカー、例えばCDマーカーを指標とすることができる。また、PBMCから単球を除去する場合は、単球のプラスティック素材への接着能を利用して、プラスティック製の培養担体で一時的に培養を実施した後に、非接着細胞を回収することで実施することもできる。その他、製造される細胞集団の用途に応じて適宜、任意の細胞亜集団を採取又は除去することができる。<2>本発明の工程2本発明の製造方法の工程2では、工程1で得られた細胞集団を、前記A成分及びB成分の存在下で培養し、かつ当該培養中及び/又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において前記C成分の存在下で培養することにより実施される。当該工程2は、工程1で得られた細胞集団を、前記A成分及びB成分の存在下で刺激し、次いで刺激された細胞集団を拡大培養することにより実施される。さらに当該刺激中及び/又は当該刺激後の拡大培養中の全部もしくは一部の期間において、前記C成分の存在下での培養が行われる。当該工程2としては、以下のような態様が例示される。態様1:工程1で得られた細胞集団を、前記A成分及びB成分の存在下で培養し、かつ当該培養期間中の全部もしくは一部の期間においてC成分を共存させる。当該培養により得られた細胞集団を、更に拡大培養し、かつ当該拡大培養中の全部もしくは一部の培養をC成分の存在下で実施する。態様2:工程1で得られた細胞集団を、前記A成分及びB成分の存在下、かつC成分の非存在下で培養する。当該培養により得られた細胞集団を、更に拡大培養し、かつ当該拡大培養中の全部又は一部の期間の培養をC成分存在下で実施する。態様3:工程1で得られた細胞集団を、前記A成分及びB成分存在下で培養し、かつ当該培養中の全部又は一部の期間においてC成分を共存させる。当該培養により得られた細胞集団を、更に前記C成分非存在下で拡大培養する。当該工程2中の拡大培養は、前記A成分及びB成分の存在下による培養後、培養細胞を当該培養容器中で実施することもでき、もしくは、新たな培養容器に移し、新たな培地を添加し希釈して、実施することもできる。当該拡大培養において、前記A成分及びB成分の存在の有無については特に限定はなく、前記A成分及びB成分が存在したまま拡大培養を行うこともでき、また前記A成分及びB成分のいずれか、もしくは両方を除去した後に拡大培養を行うこともできる。好適には、前記A成分及びB成分の非存在下で行うことが望ましい。なお、当該工程2は、A成分の存在下のみでの培養、B成分の存在下のみでの培養、及びC成分の存在下のみでの培養を個別に実施し、それらを組合せた培養を意味するものではない。本発明の細胞集団の製造方法において、総培養日数は4~20日間とすることが、得られる細胞の質及び培養効率上、好ましい。すなわち、総培養日数が4~20日間である場合、得られる細胞集団は、CD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が高い細胞集団であり、細胞医療分野への使用に極めて適している。なお、総培養日数が4日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。本発明において、総培養日数としては、より好適には5~18日間、更に好適には6~16日間が望ましく、高い拡大培養率を実現し、より多くの細胞を取得するという本発明の所望の効果を実現する観点からは、10~14日間が特に望ましい。従って、本発明における工程2は、培養開始時から4日間以上、好ましくは5~18日間、更に好適には6~16日間実施される。また工程2における前記A成分及びB成分の存在下での培養は、培養開始時から1日間以上、好ましくは2~5日間、より好ましくは2~4日間実施される。工程2における拡大培養は、A成分及びB成分の存在下の培養後、得られた細胞集団を用いて1日間以上、好ましくは2~12日間、より好ましくは2~10日間実施される。なお、当該工程2における、一部の期間とは、A成分及びB成分の存在下で培養し、かつ当該培養中及び/又は当該培養後の拡大培養中のC成分の存在下での培養期間であって、培養開始から培養途中までの期間、培養中のみの期間、又は培養途中から培養終了までの期間を示す。また、当該一部の期間を複数回としてもよい。当該工程2は、免疫療法への使用のために製造される細胞集団の培養工程の全期間としてもよく、また一部の期間としてもよい。当該培養工程の一部の期間である場合、特に限定はないが、工程2の前に、工程1で得られた細胞集団をA成分、B成分及びC成分を含まない公知の培地で培養を行ってもよい。この場合、当該培養で得られた細胞集団は、工程1で得られた細胞集団と実質的に同じ性質を有する細胞集団になるようにすることは言うまでもない。本願発明の工程2は培養初期に実施されることが好ましく、培養開始時に実施されることがより好適である。本発明において、A成分の培養中の総濃度としては、特に限定はなく、例えば0.001~500μg/mL、特に0.01~500μg/mLがより好適である。本発明において、B成分中のCD3リガンドとしては、CD3に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗CD3抗体が例示され、特に好適には抗CD3モノクローナル抗体が例示され、例えばOKT3ジャーナルオブイムノロジーJ.Immunol.、第124巻、第6号、第2708~2713頁1980が例示される。B成分としてCD3リガンドのみを使用する場合、CD3リガンドの培養中の濃度としては特に限定はなく、例えば抗CD3モノクローナル抗体を使用する場合、0.001~100μg/mL、特に0.01~100μg/mLが好適である。本発明において、B成分中のCD28リガンドとしては、CD28に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗CD28抗体、B7-1、B7-2、CD80が例示され、好適には抗CD28モノクローナル抗体が例示される。B成分としてCD3リガンド及びCD28リガンドを使用する場合、CD3リガンド及びCD28リガンドの培養中の濃度としては、特に限定はない。例えば抗CD3モノクローナル抗体及び抗CD28モノクローナル抗体を使用する場合、両抗体の総濃度が0.001~100μg/mL、特に0.01~100μg/mLがより好適である。上記A成分及び/又はB成分は、培地中に溶解して共存させる他、適当な固相、例えばシャーレ、フラスコ又はバック等の細胞培養用器材培養用容器:開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。上記A成分の固相への固定化は、例えば、適当な緩衝液に溶解したA成分を固相と接触させることにより実施でき、国際公開第97/18318号パンフレット、及び国際公開第00/09168号パンフレットに記載の方法によっても実施できる。上記B成分で抗CD3抗体及び抗CD28抗体を使用する場合は、これらの抗体が固定化されたビーズ例えば、DynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28、DynabeadsCD3/CD28、DynabeadsCliniExVivoCD3/CD28いずれもinvitrogen社製を使用することもできる。上記A成分及び/又はB成分を固相に固定化しておけば、培養終了後、細胞と固相とを分離するのみで前記成分と得られた細胞集団とを容易に分離することができ、細胞集団への前記成分の混入を防ぐことができる。前記成分の固定化量は、前記器材又は担体を培養に供した際に、当該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるよう選択されるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。本発明において、C成分であるインターロイキン-4は、天然から得られたもの、又は人為的に合成されたもの、すなわち非天然のもののいずれでもよい。人為的に合成されたものの場合、本発明の所望の効果を有するものであれば、そのフラグメント、例えばN末端側の1~30アミノ酸が欠損したフラグメントであってもよい。また、工程1で得られた細胞集団に発現ベクターを用いてインターロイキン-4遺伝子を導入してインターロイキン-4を産生させても良い。C成分の培養中の総濃度としては、特に限定はなく、例えば0.001~1000ng/mL、特に0.01~100ng/mLがより好適である。本発明の細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、T細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、ケモカイン類、適当なタンパク質、又はその他の成分を含んでいてもよい。ここでサイトカイン類とは、インターロイキン-4以外のサイトカイン類を示し、例えばIL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γなどが例示され、好適には、IL-2を含有する培地が使用される。IL-2の培地中の濃度には特に限定はないが、例えば、好適には0.01~1×105U/mL、特に1~1×104U/mLが好適である。また、ケモカイン類とは、T細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばRANTES、CCL21、MIP1α、MIP1β、CCL19、CXCL12、IP-10、MIGが例示される。この他、レクチンなどのリンパ球刺激因子を添加することもできる。更に、培地中に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、0容量超~20容量が例示され、また培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己培養する細胞と由来が同じであることを意味するもしくは非自己培養する細胞と由来が異なることを意味するのいずれでもよい。また、ヒト血清アルブミンのような、単離された血清成分を添加してもよい。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば10~1×108cells/mL、好適には1×102~5×107cells/mL、更に好適には1×103~2×107cells/mLが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、37°C、5CO2などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。本発明の細胞集団の製造方法には、培養器材としてシャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽又はバイオリアクター等の細胞培養用器材容器を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用CO2ガス透過性バッグが好適である。大量の細胞を必要とする場合には大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系、閉鎖系のどちらでも実施することができるが、好適には得られる細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で実施される。本発明の製造方法において、外来遺伝子を導入する工程を更に包含することができる。なお、外来遺伝子とは、遺伝子導入対象の細胞集団に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象の細胞集団と同種由来のものも包含される。上記外来遺伝子を導入する工程は、本発明の任意の時点で実施することができる。例えば、前記工程1を実施する前の細胞集団、前記工程1で得られた細胞集団、又は前記工程2で得られた細胞集団へ実施してもよい。また、前記工程2と同時もしくは途中で行ってもよい。外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して実施することができる。例えば、ウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターを用いずに実施することができる。それらの方法の詳細については、既に多くの文献が公表されている。前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。導入される細胞の染色体DNA中に当該ベクターに外来遺伝子を安定に組込むことができるレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが特に好適である。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン登録商標、タカラバイオ社製などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、リポソーム、又はリガンド-ポリリジンなどの担体を使用する方法、あるいはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドDNA、直鎖状DNA又はRNAに組込まれた外来遺伝子が導入される。導入される外来遺伝子には特に限定はなく、本発明の製造方法により得られる細胞集団を使用する免疫療法や対象疾患に応じて、任意の遺伝子酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体、アンチセンス核酸やsiRNAsmallinterferingRNA、リボザイムをコードするものが使用できる。これら外来遺伝子としては、例えば、配列特異的RNA分解酵素であるMazFを発現する遺伝子を外来遺伝子としてCD4陽性T細胞に導入することにより抗HIV効果を示すCD4陽性T細胞を取得することができる例えば、国際公開第2007/020873号パンフレット及び国際公開第2008/133137号パンフレット。また、LowaffinityNerveGrowthFactorReceptorの細胞外ドメイン遺伝子ΔLNGFR等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。前記外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミド等に挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列、又はイントロン配列がベクター内に存在していてもよい。<3>本発明の細胞集団の製造方法本発明の製造方法は、その製造の過程において細胞集団の細胞増殖率が高いことを1つの特徴とする。本明細書において、細胞増殖率は拡大培養率とも記載する。細胞増殖率は、ある一定の培養期間において、培養開始時の細胞数が培養後に何倍に増殖したのかを示す数値である。ここで、細胞増殖率が高いとは、本発明の細胞集団の製造方法の培養条件以下、本発明の培養条件と記載するにおける細胞集団の細胞増殖率が、A成分及びB成分の存在下で、かつC成分の非存在下での培養、又はB成分のみの存在下で、かつC成分の非存在下での培養条件以下、本発明の培養条件でない場合と記載するにおける細胞集団の細胞増殖率と比較して高いことを意味する。好適には本発明の培養条件は、本発明の培養条件ではない場合と比較して、培養開始から7日目以降において、5以上、より好ましくは10以上高い細胞増殖率で細胞集団を得ることができる。本発明の製造方法により、CD62L及び/又はCCR7を発現する細胞の含有率が高い細胞集団、すなわちCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率の高い細胞集団が得られる。得られた細胞集団中のCD4陽性ナイーブT細胞比率やCD4陽性セントラルメモリーT細胞比率を調べるには、細胞表面抗原マーカーを測定することにより実施できる。例えば、CD4陽性ナイーブT細胞は、CD45RA陽性CCR7陽性、CD45RA陽性CD62L陽性、CXCR4陽性を示す細胞である。CD4陽性セントラルメモリーT細胞は、CD45RA陰性CCR7陽性、CD45RA陰性CD62L陽性、CXCR4陽性を示す細胞である。これら細胞表面抗原マーカーの陽性率を測定することにより、本発明の製造方法により得られた細胞集団がCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が高い細胞集団であることを確認できる。更に、本発明の製造方法は、前記の方法で得られた細胞集団より、更に、CD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞を分離する工程を包含してもよい。分離は、例えばセルソーター、磁気ビーズ、又はアフィニティーカラム等による公知の手法で行うことができる。また、本発明の方法により製造された細胞集団から、必要に応じてT細胞をクローン化することにより、安定したT細胞株として維持することもできる。本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、公知の方法により更に培養することで新たに細胞集団を得ることもできる。当該工程を実施することにより、更にCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が高い細胞集団を得ることが可能である。<4>本発明により製造される細胞集団、およびその使用本発明は、前記方法により製造される細胞集団も提供する。当該細胞集団は、前述のとおりCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞の含有率が高い細胞集団である。すなわち、当該細胞集団は、A成分及びB成分の、又はB成分の存在下で、かつC成分の非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記1~5からなる群より少なくとも1つが高比率に含有されている細胞集団である。1:CD4陽性CD45RA陽性CCR7陽性T細胞2:CD4陽性CD45RA陽性CD62L陽性T細胞3:CD4陽性CD45RA陰性CCR7陽性T細胞4:CD4陽性CD45RA陰性CD62L陽性T細胞5:CD4陽性CXCR4陽性細胞当該細胞集団としては、CD4陽性ナイーブT細胞及びCD4陽性セントラルメモリーT細胞をより高含有することが望ましいという観点から、好ましくは前記1-5のうち少なくとも2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらに好ましくは4つ以上、さらにより好ましくはすべてが高比率に含有されている細胞集団であることが例示される。本発明は医薬に使用するための細胞集団、医薬の製造に使用するための細胞集団を提供する。当該細胞集団は、本発明により製造される細胞集団である。当該細胞集団を含有する医薬は免疫療法への使用に適している。例えば、本発明により製造された細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦活剤又は安定剤と混合し、点滴剤又は注射剤とすることができる。なお、これら治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量、及び当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。例えば、医薬における本発明の細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には1×103~1×1011cells/mL、より好適には1×104~1×1010cells/mL、更に好適には1×105~1×109cells/mLが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には1×106~1×1012cells/日、より好ましくは、5×106~5×1011cells/日、更に好ましくは1×107~2×1011cells/日が例示される。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤療法治療や放射線治療、又は外科的手術による治療との併用を行うこともできる。前記の細胞集団の投与が有効である疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染症疾患例えばインフルエンザ、結核、HIVHumanImmunodeficiencyVirus、ヒト免疫不全ウイルス感染症、AIDS、MRSA感染症、VRE感染症、もしくは深在性真菌症等が例示される。特に、CD4陽性T細胞に感染するHIVが原因となるHIV感染症、AIDS後天性免疫不全症候群の治療に有用である。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。また、所望の外来遺伝子を導入する工程を包含することにより、得られた細胞集団は所望の外来遺伝子の発現により効果を示すさまざまな疾患の治療又は予防に有用である。また本発明は、対象に有効量の前述の方法により得られる細胞集団を投与することを含む疾患の治療方法又は予防方法を提供する。当該対象とは、前述のような疾患に罹患した患者を示す。当該対象としては、ヒトのほか、非ヒト対象などが挙げられる。本明細書中において有効量とは、前記細胞集団を上記対象に投与した場合に、該細胞集団を投与していない対象と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する当該細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的及び対象の年齢、体重、症状などによって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様にすればよい。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴や注射などにより投与すればよい。また、本発明は、前記の本発明の製造方法により得られる細胞集団に対して、少なくとも1つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたCD4陽性T細胞を含む細胞集団を製造することが可能である。従って、本発明は、更にこうして得られた細胞集団をも提供する。このようにして得られる活性化されたCD4陽性T細胞を含む細胞集団は、前記の製造方法により得られるCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞を含有する細胞集団と同様に医薬の有効成分として使用できる。ここで刺激因子による刺激とは、刺激因子により前記の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化されるものであれば特に限定はなく、例えば、本発明の製造方法により得られるCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞を含有する細胞集団と刺激因子の共存下での培養により実施することができる。本明細書において、前記の刺激因子としてのサイトカインとは、C成分以外のCD4陽性ナイーブT細胞及び/又はCD4陽性セントラルメモリーT細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばIL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-15、IL-7、IFN-α、IL-12、CD40L、IL-27などが例示され、細胞性免疫を増強させる観点からは、IL-2、IFN-γ、IL-12が例示される。なお、本明細書において細胞集団の製造は、当該細胞集団の誘導活性化、維持、拡大培養の各工程、又はこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例で、各実施例中で用いる刺激因子を固定化した培養器材を用いて細胞を培養することを刺激と記載することがある。実施例1インターロイキン-4IL-4及びFNフラグメントCH-296を用いたCD8除去細胞集団の拡大培養1抗ヒトCD3抗体及びCH-296の固定化以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトCD3抗体OKT3、ヤンセンファーマ社製及び配列表の配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するFNフラグメント商品名:レトロネクチン登録商標、タカラバイオ社製、以下、CH-296と記載を固定化した。すなわち12穴細胞培養プレートファルコン社製に終濃度5μg/mLの抗ヒトCD3抗体と終濃度25μg/mLのCH-296を含むACD-A液テルモ社製を0.4mL/ウェルずつ添加した後、37°Cで5時間インキュベートした。その後、各ウェルからCH-296を含むACD-A液を吸引除去後、各ウェルを0.5mLGT-T503培地タカラバイオ社製で2回洗浄し各実験に供した以下、抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートと記載。2CD8除去細胞集団の調製インフォームドコンセントの得られた健常人ドナーから常法に従い調製したヒト末梢血単核細胞PBMCを、2mMEDTA、0.1BSAを含むPBS以下、Buffer1と称すを用いて1×107cells/mLになるように懸濁した。その後、Buffer1で洗浄したCD8ポジティブセレクションビーズDynabeadsM-450CD8:インビトロジェン社製をPBMC1×107cellsあたり2×107ビーズとなるように添加し、ローテーターを用いて4°Cで30分間緩やかに攪拌した後、磁気分離装置MPC-15Dynal社製上に2~3分静置してビーズ非結合細胞を回収した以下、CD8除去細胞集団と記載。回収したCD8除去細胞集団を500×gで5分間遠心したのち、1ヒト自己血清、100IU/mLIL-2Proleukin、ニプロ社製、0.2ヒト血清アルブミンバクスター社製、2.5μg/mLfungizoneブリストルマイヤーズ社製、及び50U/mLペニシリン/ストレプトマイシンインビトロジェン社製を含むGT-T503培地タカラバイオ社製、以下、GT-T503CMと称すを用いて4×105cells/mLになるように懸濁した。3細胞集団の拡大培養実施例1-2で調製したCD8除去細胞集団の培養を行った。なお、培養は10ng/mLのIL-4を含むGT-T503CMで全期間培養する区D0-12区及び培養開始4日目以降に上記濃度のIL-4を含むGT-T503CMで培養する区D4-12区を設定した。ネガティブコントロールとして、IL-4を添加しない区を設定した無添加区。まず、実施例1-1で調製した抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートに、実施例1-2で調製したCD8除去細胞集団を1.3mL/ウェルで添加した。更にhumanrecombinantIL-4RDsystems社製、0.1HSAを含むPBSで10μg/mLとなるように溶解したものをGT-T503CMに20ng/mLとなるように希釈し、上記各ウェルに1.3mLずつ添加したIL-4終濃度:10ng/mL。D4-12区及び無添加区には1.3mLのGT-T503CMを添加し、これらのプレートを37°C、5CO2インキュベータ内で培養した培養0日目。培養開始4日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントし、1×105cells/mLとなるようにGT-T503CMで懸濁し、何も固定化していない12穴細胞培養プレートファルコン社製に4mL/ウェルで添加して更に希釈培養した。この際、D0-12区及びD4-12区は10ng/mLIL-4を含むGT-T503CMで希釈培養を行った。培養7日目に、何も固定化していない12穴細胞培養プレートファルコン社製に、D0-12区及びD4-12区は上記と同様の濃度のIL-4を含むGT-T503CMで5倍希釈し、無添加区はIL-4を含まないGT-T503CMで5倍希釈し、4mL/ウェルで添加して培養した。培養開始11日目には、2倍希釈する以外は培養開始7日目と同様に希釈培養した。培養開始12日目の拡大培養率を表1に示す。なお、拡大培養率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を1として、培養開始12日目の細胞数の倍数を算出した。表1に示されるように、IL-4添加培地で培養した区では、無添加区と比較して高い拡大培養率が得られた。すなわち、抗ヒトCD3抗体及びCH-296を用いたCD4陽性T細胞の培養において、IL-4を用いることにより拡大培養率が増加することが明らかになった。また、培養4日目以降にIL-4添加培地を使用するよりも、培養全期間に使用する方が拡大培養率が高いことが明らかになった。4細胞表面マーカーの解析実施例1-3で得られた培養12日目の細胞集団を、0.1牛血清アルブミンBSA、シグマ社製を含むPBS以下、0.1BSA/PBSと記載で洗浄した。0.1BSA/PBSに細胞集団を懸濁し、抗体反応液1として、FITC標識マウス抗ヒトCD8抗体ベクトンディッキンソン社製、RD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体ベックマンコールター社製、PerCP標識マウス抗ヒトCD3抗体ベクトンディッキンソン社製、PE‐Cy7標識マウス抗ヒトCD62L抗体eBioscience社製、及びAPC‐Cy7標識マウス抗ヒトCD4抗体ベクトンディッキンソン社製を含む抗体液を、更に抗体反応液2として、FITC標識マウス抗ヒトCD8抗体、PE標識マウス抗ヒトCXCR4抗体ベクトンディッキンソン社製、PerCP標識マウス抗ヒトCD3抗体、及びAPC‐Cy7標識マウス抗ヒトCD4抗体を含む抗体液をそれぞれ添加し、抗体反応を行った。その後、0.1BSA/PBSで細胞集団を2回洗浄し、再度0.1BSA/PBSに懸濁した。この細胞集団をフローサイトメトリーFACSCantoII:ベクトンディッキンソン社製に供し、各々の細胞集団のCD3陽性CD4陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。なお、全細胞中のCD3陽性率はすべての試験区で94以上であった。結果を表2に示す。表2に示されるように、IL-4添加培地で培養した区では、無添加区と比較してCD45RACD62L比率、CD45RA-CD62L比率及びCXCR4比率の高い細胞集団が得られた。CD45RACD62LはナイーブT細胞の、CD45RA-CD62LはセントラルメモリーT細胞の、CXCR4はナイーブT細胞及びメモリーT細胞の細胞表面マーカーである。すなわち、抗ヒトCD3抗体及びCH-296を用いたCD4陽性T細胞の培養において、IL-4を添加することにより、CD4陽性ナイーブT細胞及びCD4陽性セントラルメモリーT細胞を高含有する細胞集団を効率的に取得できることが明らかとなった。実施例2IL-4及びFNフラグメントCH-296を用いたCD4陽性T細胞集団の拡大培養1抗ヒトCD3抗体及びCH-296の固定化実施例1-1と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体のみを12穴細胞培養プレートファルコン社製への固定化、及び洗浄を行い、各実験に供した以下、抗ヒトCD3抗体固定化プレートと記載。更に、抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートも調製し、各実験に供した。2CD4陽性T細胞集団の調製インフォームドコンセントの得られた健常人ドナーTK19及びTK29から常法に従い調製したPBMCを、10μg/mLDNaseを含むGT-T503CMに懸濁した。その後、500×gで5分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞集団をBuffer1で1×107cells/80μLになるように懸濁後、humanCD4MicrobeadsMiltenyiBiotec社製を1×107cellsに対して20μL添加し、4°Cで15分間放置した。その後、1×107cellsに対して1.8mLのBuffer1を添加し、300×g、10分間遠心後、上清を除去し、500μLのBuffer1に懸濁した。VarioMACSSeparatorMiltenyiBiotec社製にMACSSeparationLSColumnsMiltenyiBiotec社製をセットし、3mLBuffer1を通した後、上記細胞懸濁液を添加した。その後、5mLBufferで3回洗浄した後、カラムをセパレーターから取り外し、5mLのBuffer1を添加してシリンジにより細胞液を押し出し、CD4陽性T細胞集団を取得した。3細胞集団の拡大培養実施例2-2で調製したCD4陽性T細胞集団の培養を行った。培養は、培養全期間10ng/mLIL-4を含むGT-T503CMを用い、抗ヒトCD3抗体単独刺激を行う区抗CD3刺激区及び抗ヒトCD3抗体とCH-296刺激を行う区抗CD3/CH-296刺激区を設定した。ネガティブコントロールとしてIL-4を添加しない区を設定した無添加区。まず、実施例2-2で調製したCD4陽性T細胞集団を遠心して上清を除去後、IL-4を含むGT-T503CM又はIL-4を含まないGT-T503CMでそれぞれ懸濁し、2×105cells/mLに調製した。実施例2-1で調製した抗ヒトCD3抗体固定化プレート及び抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートに、上記調製した細胞集団をそれぞれ2.6mL/ウェルで添加した。これらのプレートを37°C、5CO2インキュベータ内で培養した培養0日目。培養開始4日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントした。すべての試験区の細胞を1×105cells/mLとなるように、IL-4を含むGT-T503CM又はIL-4を含まないGT-T503CMでそれぞれ懸濁し、なにも固定化していない12穴細胞培養プレートファルコン社製に4mL/ウェルで添加し希釈培養した。培養7日目に、それぞれの培養用培地で4倍希釈し、なにも固定化していない12穴細胞培養プレートファルコン社製に4mL/ウェルで培養した。培養開始10日目には、2倍希釈する以外は培養開始7日目と同様に希釈培養した。培養開始12日目の拡大培養率を表3に示す。なお、拡大培養率は、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を1として、培養開始12日目の細胞数の倍数を算出した。表中、はIL-4を含むGT-T503CMを用いた試験区を示し、-は無添加区を示す。表3に示されるように、抗CD3/CH-296刺激区ではIL-4添加培地で培養することにより、無添加区と比較して顕著に高い拡大培養率が得られた。また、抗CD3刺激区ではドナーによっては増殖促進効果が見られなかった。すなわち、IL-4によるCD4陽性T細胞集団の拡大培養率は、抗ヒトCD3抗体及びCH-296を用いた刺激により特に顕著に高くなることが明らかになった。4細胞表面マーカーの解析実施例2-3で得られた培養12日目の細胞集団を0.1BSA/PBSで洗浄した。0.1BSA/PBSに細胞を懸濁し、FITC標識マウス抗ヒトCD8抗体、RD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体、PerCP標識マウス抗ヒトCD3抗体、PE‐Cy7標識マウス抗ヒトCD62L抗体、及びAPC‐Cy7標識マウス抗ヒトCD4抗体を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、0.1BSA/PBSで細胞を2回洗浄し、再度0.1BSA/PBSに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団のCD3陽性CD4陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。結果を表4及び表5に示す。なお、表中、はIL-4を含むGT-T503CMを用いた試験区を示し、-は無添加区を示す。表4及び表5に示されるように、IL-4添加培地で培養した区では、無添加区と比較してCCR7比率、CD45RACCR7比率、CD45RA-CCR7、CD62L比率、CD45RACD62L比率、及びCD45RA-CD62L比率の高い細胞集団が得られた。これらの陽性細胞率は、抗CD3刺激区と比較して抗CD3/CH-296刺激区でいずれも高く、IL-4添加培地で培養した場合、更にそれらの陽性率の向上が示された。CD45RACCR7はナイーブT細胞の、CD45RA-CCR7はセントラルメモリーT細胞の細胞表面マーカーである。すなわち、抗ヒトCD3抗体及びCH-296を用いたCD4陽性T細胞集団の培養において、IL-4を添加することにより、CD4陽性ナイーブT細胞及びCD4陽性セントラルメモリーT細胞を含む細胞集団を高効率に取得できることが明らかとなった。実施例3IL-4及びFNフラグメントCH-296を用いたΔLNGFR及びMazF遺伝子導入CD4陽性T細胞集団の拡大培養1ΔLNGFR及びMazF遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製ΔLNGFR及びMazF遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製は国際公開第2008/133137号パンフレットの実施例1及び2と同様の方法で行った。すなわち、HIV-LTR-MazFカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入され、かつヒトΔLNGFRがヒトPGKプロモーターの下流に順方向に挿入された組換えレトロウイルスベクタープラスミドpMT-MFR-PL2を取得し、当該プラスミドを用いてエコトロピックMT-MFR-PL2ウイルスを作製した後、これをGaLVレトロウイルスパッケージング細胞PG13に感染させ、高力価のウイルス産生細胞をクローニングしてレトロウイルスベクター産生細胞株PG13/MT-MFR-PL2を樹立した。更に当該産生細胞を用いて、常法によりGaLV/MT-MFR-PL2ウイルス液を取得した。2抗ヒトCD3抗体及びCH-296の固定化実施例1-1と同様の方法で、抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートを調製し、各実験に供した。3CD4陽性T細胞集団の調製実施例2-2と同様の方法で、インフォームドコンセントの得られた健常人ドナーからCD4陽性T細胞集団を取得した。4遺伝子導入及び拡大培養実施例3-3で調製した細胞集団を遠心して上清を除去後、IL-4を含むGT-T503CM又はIL-4を含まないGT-T503CMでそれぞれ懸濁し、2×105cells/mLに調製した。実施例3-2で調製した抗ヒトCD3抗体/CH-296固定化プレートに、上記調製した細胞を2.6mL/ウェルで添加した。これらのプレートを37°C、5CO2インキュベータ内で培養した培養0日目。培養開始4日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントし、細胞を1×105cells/mLとなるように、IL-4を含むGT-T503CM又はIL-4を含まないGT-T503CMでそれぞれ調製した。次に、あらかじめ24穴細胞培養プレートファルコン社製にCH-296を固定化したプレート以下、CH-296固定化プレートと記載するに実施例3-1で調製したGaLV/MT-MFR-PL2ウイルス液をGT-T503で2倍希釈した後、0.5mL/ウェルで添加し、32°C、2000×g、2時間の条件で遠心操作を行い、プレートへのレトロウイルスベクターの結合を行った。次に上清を除き、ウェルを1mL1.5HSAを含むPBSで2回洗浄し、1×105cells/mLとなるように調製した培養開始4日目の細胞液を1mL添加して37°C、5CO2インキュベータ内で培養し、レトロウイルスベクターによる感染を行った。培養開始6日目に、なにも固定化していない12穴細胞培養プレートに4mL/ウェルで5倍希釈培養した。培養開始8日目に、4倍希釈する以外は培養開始6日目と同様に希釈培養した。培養開始12日目の拡大培養率を表6に示す。なお、拡大培養率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を1として、培養開始12日目の細胞数の倍数を算出した。表中、はIL-4を含むGT-T503CMを用いた場合を示し、-は無添加の場合を示す。表6に示されるように、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入を行った場合においても、IL-4添加培地を使用することにより、無添加区と比較して高い拡大培養率が得られることが明らかになった。5遺伝子導入効率及び細胞表面マーカーの解析実施例3-4で得られた培養開始12日目の細胞集団を0.1BSA/PBSで洗浄した。0.1BSA/PBSに細胞を懸濁し、抗体反応液1として、FITC標識マウス抗ヒトCCR7RDsystems社、RD1標識マウス抗ヒトCD45RA抗体、PerCP標識マウス抗ヒトCD3抗体、PE‐Cy7標識マウス抗ヒトCD62L抗体、APC標識マウス抗ヒトLNGFR抗体MiltenyiBiotec社製、及びAPC‐Cy7標識マウス抗ヒトCD4抗体を含む抗体液1、更に抗体反応液2として、PE標識マウス抗ヒトCXCR4抗体PerCP標識マウス抗ヒトCD3抗体、及びAPC‐Cy7標識マウス抗ヒトCD4抗体を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、0.1BSA/PBSで細胞を2回洗浄し、再度0.1BSA/PBSに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団のCD3陽性CD4陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。結果を表7~10に示す。表中、はIL-4を含むGT-T503CMを用いた場合を示し、-は無添加の場合を示す。表7~10に示されるように、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入細胞調製法において、IL-4添加培養区では、遺伝子導入効率への負の影響はなく、更にCCR7比率、CD45RACCR7比率、CD45RA-CCR7、CD62L比率、CD45RACD62L比率、CD45RA-CD62L比率、及びCXCR4比率の高い細胞集団が得られることが明らかになった。すなわち、抗ヒトCD3抗体及びCH-296を用いた遺伝子導入CD4陽性T細胞の培養においても、IL-4を用いることにより、遺伝子導入CD4陽性ナイーブT細胞及び遺伝子導入CD4陽性セントラルメモリーT細胞を含む細胞集団を高効率で増殖できることが明らかとなった。"