"被検体において所望の感度で前立腺癌PCaを診断する方法であって、i前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、ii前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程とを含んでなり、前記生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でPCaに罹患していることを示すものであるとする、方法。工程iが、患者におけるPCaについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記バイオマーカーが、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADTからなる群から選択されるものであり、さらに工程iiが、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定された、PCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよび追加のバイオマーカーのレベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、さらに前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、追加のバイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前記所望の感度でPCaに罹患していることを示すものであるとする、請求項1に記載の方法。PCaを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、i前記治療の実施前に得た前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、ii前記治療の実施中または実施後に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、iii前記治療の実施前および実施中または実施後に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程とを比較することを含んでなり、前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは前記治療の実施後の生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法。工程iおよびiiが、患者におけるPCaについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記さらなるバイオマーカーが、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADTからなる群から選択されるものであり、さらに工程iiiが、前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよび前記追加のバイオマーカーに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかもしくは変化しないこと、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して低下することが、実施した治療が効果があることを示し、あるいは前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していること、または前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、請求項3に記載の方法。被検体における前立腺癌PCaの進行をモニタリングする方法であって、i第1期に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程とii第2期に同一被検体から得た生体液体サンプル中の前記遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものであり、前記第2期が、前記第1期よりも後である工程と、iii第1期および第2期に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程とを含んでなり、第2期でのサンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、第1期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、前立腺癌が被検体において進行していないことを示し、あるいは第2期での被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、第1期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、前立腺癌の進行を示すものであるとする、方法。工程iおよびiiが、患者における前立腺癌についての追加のバイオマーカーのレベルを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADTからなる群から選択されるものであり、さらに工程iiiが、患者における前記バイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカー値に相当するものであり、第2期での被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベルが、第1期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、被検体の陽性進行を示し、あるいは第2期での被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルまたはバイオマーカーレベル値が、第1期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、被検体の陰性進行を示すものであるとする、請求項5に記載の方法。被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、i前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択されるものである工程と、ii前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである工程とを含んでなり、前記生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、前記被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法。工程iが、患者におけるPCaについての追加のバイオマーカーを決定する工程をさらに含んでなり、前記追加のバイオマーカーが、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADTからなる群から選択されるものであり、さらに工程iiが、患者における前記追加のバイオマーカーのレベルを前記バイオマーカーについての所定のカットオフ値と比較する工程をさらに含んでなり、前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよび前記バイオマーカーに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するバイオマーカーレベル値に相当するものであり、さらに前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、前記バイオマーカーのレベルが、前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、請求項7に記載の方法。PCaに罹患しているリスクのある患者集団が、4ng/mLを超えるPSAレベルを有する患者、および/または陽性DREを示す患者で形成されてなる、請求項7または8のいずれか一項に記載の方法。PCaに罹患しているリスクのある患者集団が、10ng/mLよりも低いPSAレベルを有する患者で形成されてなる、請求項9に記載の方法。前記生体液体サンプルが、前立腺マッサージ後に得られる、排泄された尿サンプル由来の沈渣である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。所望の感度が100である、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルが、当該PCA3、PSMAおよびPSGRを測定する同一サンプル中の前立腺特異的ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化されてなる、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前立腺ハウスキーピング遺伝子がPSAであり、PSAの発現レベルがPSAmRNAレベルを測定することによって決定される、請求項13に記載の方法。PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子、および/またはハウスキーピング遺伝子の発現レベルが、定量的PCRによって決定される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。定量的PCRが多重PCRである、請求項15に記載の方法。患者が、孤立性または多発性の高悪性度前立腺上皮内腫瘍に罹患している、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。第1成分と、場合により第2成分とを含んでなるキットであって、第1成分が、下記からなる一連の試薬であり:i遺伝子PCA3の発現レベルを測定可能な試薬;ii遺伝子PSMAの発現レベルを測定可能な試薬;およびiii遺伝子PSGRの発現レベルを測定可能な試薬;第2成分が、1つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な1つまたはそれ以上の試薬からなる、キット。前立腺癌を有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、あるいは被検体における前立腺癌の進行をモニタリングするための、前立腺癌を診断するための、請求項18に記載のキットの使用。前立腺生検の候補と評価される被検体が、4~10ng/mLの血清PSAレベルを有する被検体である、請求項19に記載の使用。本発明の診断方法本発明者らは、PCaと診断された患者の腫瘍サンプルにおいて非PCa参照サンプルに対して差次的に発現する特異的遺伝子の組み合わせを同定し、これを複合ROC分析で分析すると、向上した性能でPCaの検出が可能な複合マーカーを得ることが可能になる。例えば、本発明のFig.2に示すように、複合ROC分析により、AUC0.80でPCaの検出が可能になり、個々のマーカー単独についてのAUCPCA3について0.61;PSGRについて0.64およびPSMAについて0.63と比較して複合ROC分析は向上する。各バイオマーカーにつき1つの検出閾値カットオフを用い;次いで、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、患者を陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値カットオフの範囲にわたって算出した。したがって、第1の態様において、本発明は、被検体において所望の感度でPCaを診断する方法であって、i前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、ii前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを含み、前記生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でPCaに罹患していることを示すものであるとする、方法に関する。本発明は、被検体において所望の感度でPCaを診断する方法であって、i前記被検体から生体液体を準備する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液および前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、ii前記生体液体のサンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程と、iii前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを含み、前記生体液体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前記所望の感度でPCaに罹患していることを示すものであるとする、方法に関する。本明細書中で使用される診断方法という語句は、前述の工程から本質的に構成され得るか、または追加の工程を含み得る方法に関する。しかしながら、好ましい実施形態において、この方法はインビトロで実施されるすなわち、ヒトや動物の体内では実施されない方法であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される診断は、被検体が疾患に罹患している確率を評価することに関する。当業者に理解されるように、このような評価は通常、そうであることが好ましいが、診断される被検体の100について正しいわけではない。しかしながら、この用語は、統計的に有意な部分の被検体が、疾患に罹患しているかまたはその傾向があると同定され得ることを必要とする。当業者は、複数の周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、P値の決定、スチューデントt検定、マンホイットニー検定などを用いることによって、それ以上遅延することなく、ある部分が統計的に有意であるか否かを決定し得る。詳細は、DowdyおよびWearden、StatisticsforResearch、JohnWileySons、NewYork、1983に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95の信頼区間であり、好ましくは少なくとも99の信頼区間である。P値は、好ましくは0.2、0.1、0.05であり、好ましくは0.01である。本発明の診断方法により、被検体がPCaに罹患しているか否かを評価することが可能になる。前立腺癌という用語は、癌の病期にかかわりなく、前立腺の細胞が突然変異して制御不能に増殖を始める、前立腺の任意の癌をいう。患者におけるPCaの進行度は、臨床的および病理組織学的情報を考慮して評価される。癌の病期は、腫瘍サイズT、リンパ節転移の有無N、転移の存在M、および腫瘍悪性度分類Gに基づいて分類される。T1として分類される腫瘍は、前立腺に限定され、小さすぎて直腸指診で触知することができない。T1はさらに、T1a組織サンプル中に5未満の癌細胞およびT1b5を超える細分を含む。T1cは、患者が増加した前立腺特異抗原PSA;後述の定義を参照を有することを示す。腫瘍が直腸指診中に触知されるほど大きければ、T2として分類される。T2aは、前立腺の片側左または右のみが関与することを意味し、T2bは、両側に腫瘍があることを意味する。T2は、一般的に限局性癌と称される。癌がT3であれば、前立腺付近の結合組織T3aまたは精嚢T3bに広がっている。T4は、癌が前立腺に隣接した組織、例えば、膀胱括約筋、直腸または骨盤壁に広がっていることを示す。前立腺癌はまた、骨盤の所属リンパ節の中へ広がる場合もあり、これは、前立腺癌のN1期として評価される。これらT3、T4、およびN1期は、まとめて、局所進行または局所癌と称される。癌が骨等の遠隔部位に広がっている場合は、転移したまたはM1期であると言われる。遠位リンパ節に広がった前立腺癌がM1aとして分類される一方で、骨に広がったものはM1bであり、肝臓または脳等の器官に広がったものはM1cとして評価される。未治療で放置されると、前立腺癌は、ほぼ例外なく骨に転移する。本明細書中で使用される被検体は、哺乳類として分類される任意の動物をいい、家畜、霊長類、およびヒト、例えば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、被検体は、任意の年齢または人種の男性または女性の人間である。好ましい実施形態において、測定が実施される被検体は、4ng/mLよりも高いPSAレベルを示す。さらにより好ましい実施形態において、本発明の方法は、10ng/mLより低いPSAレベル、より好ましくは、4~10ng/mLの間のPSAレベルを示す被検体において実施される。別の実施形態において、本発明の方法は、前立腺生検を受けたことのない被検体において実施される。好ましい実施形態において、本発明の方法が適用される被検体は、孤立性の高悪性度前立腺上皮内腫瘍などの前立腺前癌病変を有する患者をいう。本明細書中で使用される高悪性度前立腺上皮内腫瘍またはHG-PINという用語は、ハイリスクのPCaに関連する病状をいい、異形成、管内異形成、大腺房非定型過形成、非定型原発性過形成、悪性変化を伴う過形成、顕著な非定型性、および管-腺房異形成としても公知である。HG-PINは、高い核/細胞質比、高色素血、粗顆粒状クロマチン、核小体の欠如、孤立性細胞、ならびに細胞および核の多形成によって特徴付けられ得る。PINの診断に用いられる方法は、当該技術分野で公知であり、針生検ならびに癌細胞の増殖および転移能の調節に積極的に関与する細胞骨格結合タンパク質であるエズリンの発現の測定が挙げられるが、これらに限定されないPangら、Urology.2004年3月;633:609~12を参照。また、米国特許第6,054,320号はPINの同定キットを提供している。HG-PINは、孤立性および多発性のHG-PINを含む。したがって、HG-PINと診断された患者は、HG-PINの悪性転換の結果として進行性PCaのリスクが高いので、本発明の方法にとりわけ適した候補である。本明細書中で使用される感度という用語は、サンプルが陽性である場合に、本発明の診断方法が陽性結果を示す確率をいう。感度は、真陽性と偽陰性の合計で真陽性結果を割った数として算出される。感度は、本質的には、ある方法が疾患すなわち、前立腺癌に罹患している者をいかによく正確に特定するかの尺度である。本発明の方法において、カットオフ値は、個体を診断する感度が少なくとも約70であるように選択されることができ、例えば、アッセイされる患者集団の少なくとも60において、あるいはアッセイされる患者集団の少なくとも65、70、75、または80において、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、または少なくとも100であるように選択され得る。第1の工程において、本発明の診断方法は、診断される被検体から単離したサンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルの測定を含む。本発明の方法によって用いられる1つまたはそれ以上の遺伝子の発現レベルという語句は、1つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現の程度をいう。典型的には、所定の遺伝子の発現レベルは、RNA発現レベルを測定することによって決定されることができ、ここでRNA発現レベルという用語は、転写されたRNA、スプライシングされていない初期RNA転写産物または成熟mRNAに変換されたDNA遺伝子配列情報の決定されたレベルをいう。RNA発現は、遺伝子の全RNAまたは部分配列のいずれかのレベルを測定することによってモニタリングされ得る。実質的には、遺伝子の存在の検出、および遺伝子のレベルの定量のための任意の方法を本発明の範囲内で使用して、バイオマーカー遺伝子によってコードされるmRNAを検出し、およびmRNAのレベルを定量し得る。非限定的な例として、特定の実施形態において、サンプル中の特定のRNAの量を測定するために、当業者に公知の方法を用いて、バイオマーカー遺伝子PSGRに関してサンプルから転写されたRNAを抽出および定量し得る。RNA分析プロトコルについては、引用して本明細書に組み込む、国際公開WO2008/121132号および国際公開WO98/24935号を参照されたい。簡潔に言うと、RNAは、任意の組織、体液、細胞例えば、循環腫瘍細胞などのサンプルから抽出される。例えば、細胞を溶解して、RNAを適当な溶液中に溶出させ得る。RNA抽出に続いて、逆転写酵素を用いて第一鎖合成を行い得る。次いで、遺伝子増幅、より詳細には定量的PCRアッセイを行い、目的の遺伝子を、例えば18SrRNAなどの内部マーカーに対して較正し得るが、例えば28S-25SrRNAおよび5SrRNAなどの任意の他の内因性マーカーも用いられ得る。サンプルの測定を多重反復で、例えば3回反復で行う。本発明の実施形態において、qPCRはAppliedBiosystemsにより市販されているような増幅、レポーター試薬および機器を用いて実行される。標的転写産物の規定の増幅効率を考慮すると、増幅された標的テンプレートからのシグナルが検出可能であるポイント例えば、サイクル数またはctは、測定サンプル中の特定のメッセージ転写産物の量に直接関連し得る。同様に、蛍光、酵素活性、壊変毎分、吸光度などの他の定量化可能なシグナルは、標的テンプレートの既知濃度と相関がある場合例えば、参照標準曲線または限定的な変動性を有する標準に対して正規化されている場合、未知サンプル中の標的テンプレート数を定量化するのに用いられ得る。増幅方法に限定されないが、定量遺伝子発現技術は標的転写産物の増幅を利用し得る。標的転写産物の増幅の代わりに、または増幅と組み合わせて、増幅産物の指数関数的増加により生じる内部マーカーについてのレポーターシグナルの定量も用いられ得る。標的テンプレートの増幅は、等温遺伝子増幅法によって、またはPCRなどの熱サイクルによる遺伝子増幅によって、達成され得る。特定のRNAを、メッセージ特異的プライマーまたはランダムプライマーを用いて増幅する。特異的プライマーは、ヒトおよび他の動物から得たゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリー由来の情報を含む公共データベース例えば、Unigene,NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine,Bethesda,MDから得たデータから合成され得る。試験サンプルまたは指標サンプルから得られる特定のRNAから選択的に増幅するために、プライマーを選択する[例えば、RTPCR,RNAMethodologiesの第15章.ALaboratoryGuideforIsolationandCharacterization.第2版,1998,RobertE.Farrell,Jr.編,AcademicPress;または第22章pp.143~151,RNAIsolationandCharacterizationProtocols.MethodsinMolecularBiology,第86巻,1998,R.RapleyおよびD.L.Manning編,HumanPress,または第14章Statisticalrefinementofprimerdesignparameters;または第5章,pp.55~72,PCRApplications:protocolsf第1orfunctionalgenomics,M.A.Innis,D.H.GelfandおよびJ.J.Sninsky編,1999,AcademicPressを参照]。増幅は、等温条件でおこなうか、またはサーマルサイクラー[例えば、AppliedBiosystemsから入手されるABI9600または9700または7700]を用いて行う。増幅された核酸は、増幅プライマーについて記載したように公知のデータベースから同定および合成される蛍光タグ化した検出オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される[例えば、Taqman商標PCRReagentKit,Protocol,品番402823,RevisionA,1996,AppliedBiosystemsを参照]。例えば、限定されないが、増幅されたcDNAは、適当な検出システム、例えばABIPrism登録商標7900SequenceDetectionSystemAppliedBiosystemsを用いて検出および定量される。試験サンプル中に含まれる特定のRNAの量は、観察された蛍光の相対量と関連し得る例えば、AdvancesinQuantitativePCRTechnology:5’NucleaseAssays,Y.S.lieおよびCJ.Petropolus,CurrentOpinioninBiotechnology,1998,9:43~48,またはRapidThermalCyclingandPCRKinetics,pp.211~229,PCRapplicationsの第14章:protocolsforfunctionalgenomics,M.A.Innis,D.H.GelfandおよびXJ.Sninsky編、1999;AcademicPressを参照。特定の実施形態において、定量化PCRqPCRを用いて、PSGR、PCA3、およびPSMA遺伝子の発現レベルを検出および定量する。遺伝子発現レベルの従来の定量方法は、例えば、Sambrookら、2001Molecularcloning:toLaboratoryManual、第3版、ColdSpringHarborLaboratoryPress,N.Y.,第1~3巻に掲載されている。PCA3という用語は、第9染色体上に位置する非タンパク質コード遺伝子に相当する前立腺癌抗原3NCBI受託番号AF103907またはNR_015342として公知の遺伝子をいい、95を超える原発性PCa検体およびPCa転移において高度に過剰発現している前立腺特異的非コードRNAをコードしている。本明細書中で使用されるPSMAという用語は、前立腺特異的膜抗原として公知であり、FOLH1葉酸ヒドロラーゼ前立腺特異的膜抗原1としても公知の遺伝子をいい、少なくとも2つの転写変異体NM_004476およびNM_001014986としてNCBIで同定をコードしており、前立腺上皮細胞において高度かつ特異的に発現しており、PCaならびに他の固形腫瘍の新生血管系において強力にアップレギュレートされている完全非脱離性のII型膜タンパク質をコードしているintegralnon-shedtype2membraneproteinをコードしている[Elsasser-Beile,U.ら、CurrDrugTargets10:118~252009]。本明細書中で使用されるPSGRという用語は、OR51E2嗅覚レセプター、ファミリー51、サブファミリーE、メンバー2、NM_030774としても公知の前立腺特異的Gタンパク質共役レセプターをいい、高度に前立腺組織特異的でありその腫瘍に関連して過剰発現する、Gタンパク質共役ORファミリーのメンバーである。確かに、本発明を実施するのに有用なポリヌクレオチドとしては、変異体、ホモログ、サブタイプ、対立遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。変異体遺伝子が、天然の遺伝子と同様のPcaの発現レベルと存在との間の相関を示す限り、本発明の配列はPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の機能的変異体をコードしている必要はないことが理解されるものとする。本明細書中で使用される変異体という用語は、PSGRポリヌクレオチドから1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により生じるポリヌクレオチドをいう。PSGRの変異体としては、PSGRmRNAに対して少なくとも70、有利には少なくとも75、典型的には少なくとも80、好ましくは少なくとも85、より好ましくは少なくとも90、さらにより好ましくは少なくとも95、97、98または99の相同度を示すポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。2つのポリヌクレオチド配列間の相同度は、例えば、当該分野の技術水準で公知の標準的な配列アラインメントアルゴリズム、例えばBLAST[AltschulS.F.ら、Basiclocalalignmentsearchtool.JMolBiol.1990Oct5;2153:403~10]などによる、従来の方法によって決定され得る。本発明において、サンプルまたは生物学的サンプルという用語は、被検体から単離した生物学的材料を意味する。本明細書中で使用される生体液体という用語は、前立腺組織または細胞由来の核酸供給源を提供するサンプルをいい、例えば、前立腺細胞、前立腺組織、前立腺液、尿、射精液、精液などが挙げられる。実際には、前立腺細胞は、PCaを有する男性の尿中に検出され得るので、尿などの流体の使用が推奨される。特定の実施形態において、本発明によるバイオマーカーの決定に用いられるサンプルは、好ましくは前立腺マッサージ例えば、DRE後かまたは前立腺生検後生検後かまたは自然排尿によって得られた尿サンプルである。好ましくは、本発明による方法は、PM例えば、DRE後に得られた尿サンプルの使用を含む。このサンプルは、より広く男性集団に受け入れられる最小の侵襲性技術と、正確な診断に十分な細胞を得る可能性との間の最良の妥協案であると考えられる。別の実施形態において、本発明によるバイオマーカーの決定に用いられるサンプルは、前立腺圧出液または前立腺切除によって得られたサンプルである陰性コントロールとして有用。排泄された尿サンプルの最初の部分は最も高い濃度の前立腺分泌物および尿道分泌物を含むので[IwakiriJら、JUrol149:783~61993]、PM後の排泄された尿サンプル採集を選択した。さらに、このタイプのサンプルは、射精液または前立腺圧出液よりも男性にとって提供することをより受け入れやすい検体である。第2の工程において、本発明の方法は、前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程を含み、ここで、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において決定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当する。カットオフ値という用語は、PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子発現レベルに関して、患者の発現レベルが前記カットオフまたは参照レベルよりも高い場合、被検体が所定の感度でPCaに罹患している可能性があることを示す参照発現レベルをいう。典型的には、カットオフ値は受診者動作特性曲線ROC曲線を用いて算出される。実際には、受診者動作特性曲線ROC曲線は典型的に、正常すなわち、外見上健康および疾患集団における相対頻度に対して変数値をプロットすることによって算出される。任意の特定のマーカーまたはマーカーのパネルすなわち、前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに関して、疾患に罹患している被検体および罹患していない被検体についてのマーカーレベルの分布は重複する可能性がある。そのような条件下では、試験によって正常と疾患を100の確度で完全に区別することはできず、重複する領域は、試験によって正常と疾患を区別できない領域であることを示している。閾値またはカットオフ値を選択し、それより上または疾患によってマーカーがどのように変化するかによってはそれより下では試験は異常であるとみなされ、それより下では正常であるとみなされる。ROC曲線下面積は、感知された測定値によって状態を正確に特定できる確率の尺度である。試験結果から必ずしも正確な数値が得られない場合でも、ROC曲線を使用することができる。結果のランク付けができれば、ROC曲線を作成することができる。例えば疾患サンプルについての試験結果を程度例えば1=低、2=正常、および3=高に従ってランク付けしてもよい。このランク付けを正常集団における結果と相関させてROC曲線を作成してもよい。これらの方法は当該分野で周知である。例えば、Hanleyら1982Radiology143:29~36を参照されたい。好ましくは、閾値は、ROC曲線面積が約0.5を超える、より好ましくは約0.7を超える、さらにより好ましくは約0.8を超える、なおより好ましくは約0.85を超える、最も好ましくは約0.9を超えるように選択される。この場合の約という用語は、所定の測定値の/-5を意味する。ROC曲線の横軸は1-特異度を表し、偽陽性の割合とともに上昇する。曲線の縦軸は感度を表し、真陽性の割合とともに上昇する。したがって、選択された特定のカットオフについて、1-特異度の値を決定し、対応する感度を求め得る。ROC曲線下面積は、測定されたマーカーレベルによって疾患または状態を正確に特定できる確率の尺度である。したがって、ROC曲線下面積を使用して、試験の有効性を決定し得る。ある実施形態において、被検体から得たマーカーレベルのプロファイルが特定の診断/予後診断の指標であるか否かの決定は、パネル中の1つまたはそれ以上のマーカーに関する特定の閾値に依存しない。むしろ、本発明はマーカーパネルプロファイル全体の統一的な評価を利用し得る。そのようなマーカーパネルにおける変化の特有のフィンガープリントパターンは、事実上、特異的な診断または予後診断の指標として機能し得る。本明細書中で説明するように、変化のパターンは、単一のサンプルから、あるいはパネルまたはパネル応答値の1つまたはそれ以上のメンバーにおける経時変化から得ることができる。本明細書中のパネルとは、一連のマーカーを意味する。本明細書中で後述されるように、パネル応答値は、好ましくは、特定のマーカーパネルの感度すなわち、真陽性の、様々なカットオフでのパネルについての1-特異度すなわち、偽陽性に対するROC曲線をプロットすることにより決定される。これらの方法において、被検体由来マーカー測定値のプロファイルがともに考慮され、診断または予後診断の包括的確率数値スコアとしてまたはパーセンテージリスクとして表わされるがもたらされる。そのような実施形態において、あるマーカーサブセットの上昇は、ある患者における特定の診断/予後診断の十分な指標となり得る一方で、異なるマーカーサブセットの上昇は、別の患者における同一のまたは異なる診断/予後診断の十分な指標となり得る。重み係数も、パネルにおける1つまたはそれ以上のマーカーに適用され得る。例えば、特定の診断/予後診断を識別する際に、あるマーカーが非常に高い有用性を有する場合、所定レベルにおいてそのマーカー単独で陽性結果を十分に示すように、そのマーカーが重み付けされ得る。同様に、重み係数により、特定のマーカーは所定レベルでは陽性結果を十分に示し得ないが、別のマーカーも分析に寄与する場合にのみ結果を示し得る。連続スケールで測定されたマーカーについて、ROC曲線は、可能性のあるすべてのカットオフポイント値について評価された、真陽性のフラクションの、偽陽性のフラクションに対するプロットである。双対する結果すなわち、前立腺癌が存在するか否かについて、ROC曲線により、コントロールから症例を区別するためのマーカーの識別能を定量化する。曲線下面積AUCの標準偏差およびAUC間の差異は、DeLongらBiometrics,1988,44:837~845のU統計量またはブートストラップリサンプリング法を用いて算定される。好ましくは、まず各バイオマーカーについてのk要素検出閾値を用いてkマーカーについてROC曲線を決定し、次いでその少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超える場合に試験が陽性であると認定される。感度および特異度の値は典型的に、点群を生じ得るk要素閾値の範囲にわたって算出される。新たなマーカーについての最適ROC曲線点は、以下の方法で得ることができる:固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲内で、特異度についての最大値を選択した。ある実施形態において、マーカーおよび/またはマーカーパネルは、少なくとも約70の感度、より好ましくは少なくとも約80の感度、さらにより好ましくは少なくとも約85の感度、より一層好ましくは少なくとも約90の感度、そして最も好ましくは少なくとも約95の感度であると同時に、少なくとも約70の特異度、より好ましくは少なくとも約80の特異度、さらにより好ましくは少なくとも約85の特異度、より一層好ましくは少なくとも約90の特異度、そして最も好ましくは少なくとも約95の特異度を示すように選択される。特に好ましい実施形態では、感度および特異度の両方が少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約80、さらにより好ましくは少なくとも約85、より一層好ましくは少なくとも約90、そして最も好ましくは少なくとも約95である。この場合の約という用語は、所定の測定値の/-5を意味する。当業者は、診断または予後診断の指標と、将来的な臨床転帰の診断または予後リスクとの関連付けが統計分析によって為されることを理解するであろう。例えば、統計的に有意なレベルで決定された場合、マーカーレベルがXよりも高い患者は、マーカーレベルがX以下の患者よりも有害転帰を生じる可能性が高いことを示し得る。さらに、ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は、患者の予後を反映し、そしてマーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合、2またはそれ以上の集団を比較し、信頼区間および/またはp値を測定することにより決定される。例えば、DowdyandWearden,StatisticsforResearch,JohnWileyandSons,NewYork,1983を参照されたい。本発明の好ましい信頼区間は90、95、97.5、98、99、99.5、99.9および99.99であり、好ましいp値は0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、および0.0001である。本明細書中で使用される前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団という用語は、前立腺癌を検出し得る1つまたはそれ以上のアッセイに基づき前立腺癌に罹患しているリスクを示すと診断された患者の集団をいう。集団は、例えば、3人、4人、5人、10人、15人、20人、30人、40人、50人またはそれ以上の患者を含み得る。PCaに罹患しているリスクのある患者としては、下記の診断特性の1つまたはそれ以上を示す患者が挙げられるが、これらに限定されない:-DRE陽性、すなわち、RichieJPらUrology,1993,42:365~74およびCarvalhalGFらJ.Urol.,1999,161:835~9によって記載されるような、検者が手袋をして潤滑させた指を直腸に挿入して、前立腺の大きさ、形状、および触感を調べる手順により検出される、でこぼこな、硬い、またはごつごつした領域の存在。DREは前立腺の背部を評価するにすぎないが、PCaの85は前立腺のこの部分に生じる。DREで触知され得るPCaは一般に、より進行性である。-経直腸超音波前立腺超音波、超音波スキャンまたは超音波検査としても公知であり、体の一部を高周波音波に暴露して体内の画像を作成する工程を含む。超音波画像はリアルタイムに取り込まれるので、内臓の構造および動き、ならびに血管を流れる血液を示し得る。-血中PSAレベルの上昇:血中PSAレベルの上昇を示す患者における生検の決定レベルについての基準は存在しないが、種々のPSA値が決定レベルとして任意に選択されており、詳細には、50歳男性において、PCa検出に加えて1994年のFDAのベースになった臨床試験において生検についての決定レベルとして4ng/mLよりも高いレベルが選択され;前立腺癌、肺癌、大腸癌および卵巣癌PLCO試験において生検決定レベルとして4ng/mLが用いられ、欧州PCaスクリーニング無作為化試験ERSPCおよびProtecT試験において3ng/mLが用いられ、2007年の米国包括的癌ネットワークNCCNガイドラインにおいて2.5ng/mLが用いられている。PSAレベルは癌以外にも多くの理由で変化し得る。高PSAレベルの2つの一般的な原因は、前立腺の肥大前立腺肥大症BPHおよび前立腺の感染前立腺炎である。-前立腺酸性ホスファターゼPAPの血中レベルの上昇。-50歳よりも高齢の患者。好ましい実施形態において、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団の患者は、PSAレベルが4ng/mLよりも高い患者、および/または陽性DREを示す患者である。さらにより好ましい実施形態において、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団は、望ましくない多数の偽陽性および偽陰性と関連する血清または血液中PSAレベルに相当する、いわゆるグレーゾーンの範囲内に見られるPSAレベルを有する患者で形成される。典型的には、グレーゾーンは4ng/mLよりも高く10ng/mLよりも低いPSAレベルに相当する。より好ましい実施形態において、本発明の方法が実施される被検体は、生検が実施されたことのない患者である。所定の患者におけるPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子のレベルを、多重マーカーROC曲線分析を用いて所望の感度で最大の特異度を与えるように決定された各遺伝子についての発現レベルと比較したら、少なくとも1つの上記遺伝子の発現レベルが前記所定の発現レベルより高い場合に、患者が所望の感度で前立腺癌を有すると診断される。検査対象の被検体のサンプル中の遺伝子の発現レベルの有意な上昇という用語は、本明細書中で使用される場合、カットオフ値に対して発現レベルが少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、またはそれよりも上昇していることをいう。本明細書中で使用される特異度という用語は、サンプルが陽性でない場合に、本発明の診断方法が陰性結果を示す確率を意味する。特異度は、真陰性結果を真陰性と偽陽性の合計で割った数として算出される。特異度は本質的に、ある方法が前立腺癌を有さない者をいかに良く除外するかの尺度である。本発明の方法において、PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現についてのカットオフ値は、感度が少なくとも約70である場合に、アッセイされる患者集団の少なくとも60において、あるいはアッセイされる患者集団の少なくとも65、70、75または80において、個体診断の特異度が70~100の範囲、例えば、少なくとも75、80、85、90または95であるように選択され得る。本発明の実施例に示すように、本方法により感度96および特異度40でPCaの存在を診断することが可能になり、陽性および陰性的中率はそれぞれ49および95であったFig.2。本明細書中で使用される陰性的中率という用語は、NPVと同義であり、前立腺癌を有さないと診断された個体が実際にその疾患を有さない確率を意味する。陰性的中率は、真陰性を真陰性と偽陰性の合計で割った数として算出され得る。本明細書中で使用される陽性的中率という用語は、PPVと同義であり、線維症を有すると診断された個体が実際にその状態を有する確率を意味する。陽性的中率は、真陽性を真陽性と偽陽性の合計で割った数として算出され得る。本発明の方法により、本発明の方法で測定した少なくとも1つのマーカーの発現が、基準となるカットオフ値よりも高い場合、本診断方法の特異度を実質的に低下させることなく、所望の感度でPCaの検出が可能になる。この驚くべき効果は、種々の遺伝子の発現の変化が、腫瘍の起源、腫瘍サブタイプ、進行度に依存して、患者によって異なり得るという事実に起因すると考えられる。このような状況では、単一の遺伝子または遺伝子のペアワイズ組み合わせの決定では、場合によっては正確に診断されず、感度が低下することもあるだろう。本発明による方法により、3つの遺伝子すべての発現を測定することによって、特異度に影響を与えることなく感度を高めることが可能になる。当業者に理解されるように、少なくともPCA3の、少なくともPSMAの、または少なくともPSGRの発現レベルがカットオフ値よりも高い場合、診断は陽性になり得る。さらに、上記3つの遺伝子のうちの2つの発現レベルが各遺伝子についての基準値よりも高い場合、例えば、PCA3およびPSMAレベルが高くなる場合、PCA3およびPSGRが高くなる場合、またはPCA3およびPSGRが高くなる場合にも、陽性診断が下される。さらに、PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルが同時に高くなる場合、陽性診断になる。本発明によって提供されるPCaの診断方法は、分析を受ける被検体由来の前立腺細胞を含む尿サンプルを用いて実施され得るので、非侵襲的方法であり、その高い感度および特異度96の感度で40の特異度が得られるに起因して信頼性が高く、さらに、陽性的中率および陰性的中率はそれぞれ49および95である。したがって、まとめると、これらの結果を用いて、通常の泌尿器科業務に容易に組み込み得るPCaの高度に特異的な試験を開発することが可能であり、とりわけ後述するような特に臨床的に価値のある患者群血清PSAが4~10ng/mLであって、生検歴のない患者において、PSA試験の低い特異度に起因する多数の不必要な生検を有意に減少させ得る。好ましい実施形態において、PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルは、サンプル中のこれらの遺伝子の発現レベルの上昇が前立腺細胞の悪性増殖の結果ではなく、むしろ例えばBPHにおいて生じるような非悪性前立腺成長の結果である場合があることを考慮して、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを用いて正規化される。さらに、本方法は、これらのマーカーを発現している前立腺以外の組織由来の細胞を含むサンプル中で実施され得る。特に、本方法が尿沈渣中で実施される場合、癌細胞の他に、尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞を検知する可能性がある。したがって、好ましい実施形態において、本マーカーパネルを形成する種々の遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の量に対して正規化される。本明細書中で使用される正規化という用語は、定量的数値を、他の遺伝子分析によって得られる遺伝子発現量と比較し得る数値に変換することを意味する。典型的には、遺伝子発現量の正規化のための指標として、一定に発現しているハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現レベルを用いることによって正規化を行う。本明細書中で使用されるハウスキーピング遺伝子という用語は、すべての組織において普遍的遍在的に発現している遺伝子をいう。これらの遺伝子は、すべての細胞が生存するのに必要な基本的で重要な機能を示すタンパク質をコードしている。ハウスキーピング遺伝子は、特に細胞増殖期および生物成長期にはいくらか変動があるものの、通常すべての細胞および組織において同程度のレベルで発現している。一般に用いられるハウスキーピング遺伝子としては、GAPDHグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、βアクチン遺伝子、チューブリン遺伝子、リボソームの18Sまたは28SrRNAサブユニットをコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子の例示的なリストは、例えば、TrendsinGenetics,19,362~3652003に掲載されている。好ましい実施形態において、ハウスキーピング遺伝子は前立腺ハウスキーピング遺伝子である。本明細書中で使用される前立腺ハウスキーピング遺伝子という用語は、前立腺細胞において、その細胞が正常前立腺細胞であるか前立腺腺癌細胞であるかにかかわらず一定レベルで発現している遺伝子をいう。この遺伝子により、サンプル中の前立腺由来細胞の数を検出することが可能になる。したがって、好ましい実施形態において、本発明の第1の方法は、PCA3、PSMAおよびPSGRを定量するサンプルと同一サンプル中の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対する正規化後の、PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルの使用を含む。本発明における使用に適した前立腺ハウスキーピング遺伝子としては、PSASokollら、1997,Urol.Clin.NorthAm.24:253~259、DD3CancerRes.,1999,59:5975~9、HPG-1、PSM、NKX3、前立腺の6回膜貫通型上皮抗原STEAP、Trp-p8Tsvalerら、前立腺酸性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、チモシンb-15、HPC1基礎前立腺遺伝子、hKLK2遺伝子によってコードされる前立腺特異的腺性カリクレインタンパク質hK2、hKLK3遺伝子によってコードされる前立腺特異的抗原タンパク質hK3PSA、SIM2遺伝子国際公開WO09135019A号、ERG遺伝子国際公開WO09135019A号、TMPRSS2、PSMすなわち前立腺特異的膜抗原Fairら、1997,Prostate32:140~148、PSCAすなわち前立腺幹細胞抗原Reiterら、1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:1735~1740、TMPRSS2Linら、1999.CancerRes.59:4180~4184、PDEFOettgenら、2000,J.Biol.Chem.275:1216~1225、PSG-1すなわち前立腺特異的遺伝子-1Herness,2003,CancerRes.63:329~336、PCA3Bussemakersら、1999,CancerRes.59:5975~5979、国際公開WO98/045420号、国際公開WO01/0235号、国際公開WO2004/070056号、国際公開WO2005/003387号、PCGEM1Srikantanら、2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:12216~12221、ならびに遺伝子P704P、P712P、およびP775PStolkら、2004.Prostate60:214~226が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前立腺ハウスキーピング遺伝子はPSA遺伝子である。本明細書中で使用されるPSAという用語は、前立腺の腺上皮細胞によるアンドロゲン制御下で発現し、精漿中に分泌されて液化するセリンプロテアーゼ活性を有する糖タンパク質をコードしている、第19染色体上に位置する遺伝子をいう。PSAタンパク質は通常、前立腺に限局しているが、癌またはBPHなどの前立腺疾患の場合にはPSAが血液中に漏出して、タンパク質複合体に結合していたり結合していなかったりといった種々の形態で存在するEl-Shirbiny,1994,Adv.Clin.Chem.31:99。血清総PSA濃度の測定は、前立腺癌患者のスクリーニングおよび管理において最も頻繁に用いられるFDA承認の生化学試験の1つである。これまでの研究では、PSAを用いたスクリーニングをDREおよび経直腸超音波と併用すると、未だ前立腺のみに局在している場合が多い早期PCaの検出が増加することが示唆されているBrawerら,1992,J.Urol.147:841。血清PSAはまた、治療後、特に外科的前立腺切除後の患者のモニタリングにも有用である。しかしまた、総PSA測定により特定される異常に高いレベルを示す患者の多数は、後に前立腺癌を有さないことが判明する。最近、遊離型/総PSAパーセント比測定の概念が、4~10ng/mLの間のPSAを有する男性におけるPCaスクリーニングの特異性を高めることが示されたLetranら,1998,J.Urol.160:426。好ましい実施形態において、PSAmRNAレベルを用いて正規化を行う。本発明者らはまた、PSA密度PSADまたは血清PSAレベルを含む群から選択される、前立腺癌についての追加のバイオマーカーを組み込むことにより、マーカーパネルの診断価値がさらに高まり得ることも未出した。したがって、本発明の実施例に示すように、PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルならびにPSADを含むマーカーパネルにより、AUC0.89で前立腺癌の診断が可能であるのに対して、PSADを含まない上記3つの発現レベルの使用では、AUCが0.82となる。複合マーカーモデルについての感度は96、特異度は40であった。陽性的中率および陰性的中率は、それぞれ49および95であったFig.2を参照。バイオマーカーという用語は、当該技術分野全般にわたって用いられ、プロセス、事象または状態の特有の生物学的指標または生物学的に誘導された指標を意味する。追加のバイオマーカーを診断方法に組み込むために、i研究対象の患者における追加のバイオマーカー値の測定、iiバイオマーカー値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較ここで、前記カットオフ値は、複合4マーカーパネルを用いて算出されたROC曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当するが必要である。ここで、追加のバイオマーカーはPSADであり、本発明の診断方法はさらに、i研究対象の患者におけるPSAD値の測定、iiPSAD値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較ここで、前記カットオフ値は、複合4マーカーパネルを用いて算出されたROC曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当するを含む。ここで、追加のバイオマーカーはPSAであり、本発明の診断方法はさらに、i研究対象の患者におけるPSA値の測定、iiPSA値と前記パラメータについてのカットオフ値との比較ここで、前記カットオフ値は、複合4マーカーパネルを用いて算出されたROC曲線を用いた場合に、所望の感度で最も高い特異度を示すカットオフ値に相当するを含む。したがって、好ましい実施形態において、本発明の診断方法はさらに、工程i患者におけるPSADの測定、工程ii患者におけるPSAD値とPSADについての所定のカットオフ値との比較ここで、前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において決定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSADに基づいて算出されたROC曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSAD値に相当するを含み、最後に、患者が前立腺癌を示すか否かについて決定を行うここで、前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇している場合、またはPSAD値が前記所定のカットオフ値に対して上昇している場合、被検体が前記所望の感度でPCaに罹患していることを示す。本明細書中で使用されるPSA密度またはPSADという用語は、体液サンプル由来のPSA値を前立腺体積で割って得られるPSA値をいう。例:PSA密度PSAD=PSA値/前立腺体積PSADPSA/前立腺体積値は、サンプル例えば、血清、血液など、好ましくは血清中のPSA濃度および前立腺体積エコグラフィーecographyを測定することにより、以下の式に従って決定され得る:PSA密度=PSA体積/前立腺体積サンプル例えば、血清、血液など中のPSA濃度は、前述のような当業者に周知の従来方法例えば、免疫学的方法などを含む、サンプル中のPSA濃度を決定する任意の方法によって決定され得る。前立腺体積は、当業者に周知の従来方法式H×W×L×0.52を用いたいわゆるTRUS検査を含むがこれに限定されないを含む、前立腺の体積を測定する任意の方法によって測定され得る。前立腺体積は、典型的には、超音波測定最大径で行う経直腸超音波測定TRUSを含むがこれに限定されないに基づいて決定される。さらに別の特定の実施形態において、TRUS測定は、H×W×L×0.52の楕円体体積法によって算出される。この体積は、前立腺全体の測定を行うことによって算出され得るか、あるいは、転移帯TZ/尿道周囲良性前立腺腺葉腺腫の体積も得ることができ、これらの値を用いてPSA密度を決定する。経直腸超音波またはTRUSは、音波を用いて前立腺のビデオ画像を作成する、5~15分の外来患者手順である。この手順は、小さな潤滑させたプローブの直腸中への配置を含み、このプローブが音波を発し、この音波が前立腺に入ってエコーを生じる。前立腺腫瘍は、正常前立腺組織とは異なるエコーを生じることが多い。跳ね返ったエコーは、エコーのパターンを前立腺の像に変換するコンピュータに送られる。TRUSを用いて前立腺の重量を推定し、医師がPSA密度について理解を深めるのに役立ち、これによりBPHをPCaと識別するのに役立つ。前立腺体積を測定する楕円体体積法は、前立腺の体積を評価する方法であり、TRUS手順の重要かつ不可欠な部分である。いくつかの式が用いられているが、最も一般的な式は楕円体式であり、前立腺の3寸法の測定が必要である。寸法はまず、軸面において、最大横断寸法の推定点で横断および前後寸法を測定することによって決定される。膀胱頸部により前立腺の頭側範囲が不明瞭になることが多いため、縦寸法は、正中線から少し離れた矢状面において測定される。次いで、以下のように楕円体積式が適用される:体積=高さ×幅×長さ×0.52。また、前立腺体積は、PSA、cPSAPSAとα1-アンチキモトリプシン、遊離型PSA、B-PSA良性PSA;PRO-PSA前立腺癌と関連し、天然プロPSAならびに不完全プロPSA形態である[-2]pPSAおよび[-4]pPSAからなる、遊離型PSAの前駆体アイソフォームおよび/またはヒトカリクレインHK2測定の組み合わせを用いることにより、非侵襲的に測定され得る。本明細書中で使用されるPSAという用語は、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーであって前立腺の細胞によって産生される、33kDaキモトリプシン様タンパク質の血清中濃度に関する。本明細書中で使用される血清総PSAレベルという用語は、PSAの血清中濃度に関し、遊離型PSA非結合型であるか、別の物質に結合していないPSAと結合型PSAα-1アンチキモトリプシンACT、α-1-アンチトリプシンAT、プロテアーゼCインヒビターPCl、およびα-2マクログロブリンmacroglobupsilonlinA2Mなどの別の物質に結合しているPSAの合計に相当する。本明細書中で使用される血清遊離型PSAレベルという用語は、非結合型であるか別の物質に結合していないPSAの量をいう。本明細書中で使用される血清遊離型PSAの、血清総PSAに対する比という用語は、遊離型PSA非結合型であるか、別の物質に結合していないPSAと結合型PSAα-1アンチキモトリプシンACT、α-1-アンチトリプシンAT、プロテアーゼCインヒビターPCl、およびα-2マクログロブリンmacroglobupsilonlinA2Mなどの別の物質に結合しているPSAの血清中濃度の比をいう。本明細書中で使用されるプロPSAという用語は、PSAの前駆体形態をいう。PSAの完全長前駆体形態は、7アミノ酸のプロペプチドすなわち、リーダーペプチドであるAPLILSRを含み、その後に237アミノ酸の成熟PSAタンパク質が続いている。プロPSAの完全長アミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、KumarA.らCancerRes,1997,57:3111~3114によって完全に記載されている。本発明の目的では、プロペプチド配列の最後のアミノ酸Rを、[-1]アミノ酸と数える。例えば[-7]プロPSAとは、その末端がプロペプチドの-7アミノ酸a.a.から始まるプロPSAである。これは完全長プロPSAを含む。[-5]プロPSAは、プロPSAの末端がプロペプチドの-5a.a.から始まることを示し、これはプロペプチド配列の最後の5アミノ酸配列を含む。本発明の目的では、プロPSAは、プロペプチドの任意のアミノ酸から始まる末端を有する、完全長形態のプロPSAと切断形態のプロPSAとの両方を包含するものとする。すなわち、プロPSAは、[-1]プロPSA、[-2]プロPSA、[-3]プロPSA、[-4]プロPSA、[-5]プロPSA、[-6]プロPSA、[-7]プロPSA、またはこれらの組み合わせであってもよい。PSA倍加時間という用語は、治療期間にわたる血清PSAの倍加数と定義される。本発明の方法により、少なくとも1つの上記マーカーがカットオフ値に対して有意に上昇している、PCaに罹患している患者の識別が可能になる。当業者に理解されるように、少なくともPCA3の、少なくともPSMAの、または少なくともPSGRの発現レベルあるいは少なくともPSAD/血清PSAがカットオフ値よりも高い場合、診断は陽性になり得る。さらに、これら3つのマーカーのうち少なくとも2つの発現レベルが各遺伝子についての基準値よりも高い場合、例えば、PCA3レベルおよびPSGRレベルが高くなる場合、PCA3レベルおよびPSMAレベルが高くなる場合、PCA3レベルおよびPSAD/血清PSAレベルが高くなる場合、PSGRおよびPSMAレベルが高くなる場合、PSGRレベルおよびPSAD/血清PSAが高くなる場合、またはPSMAレベルおよびPSAD/血清PSAが高くなる場合にも、陽性診断が下される。さらに、PCA3、PSMA、およびPSGRの発現レベルが同時に高くなる場合、PCA3、PSMAの発現レベルおよびPSAD/PSA血清値が同時に高くなる場合、PCA3およびPSGRの発現レベルおよびPSAD/PSA血清値が同時に高くなる場合、ならびにPSGRおよびPSMAの発現レベルおよびPSAD/PSA血清が同時に高くなる場合、陽性診断になる。PCa治療に対する反応を評価またはモニタリングする方法本発明の教示は、PCaを有する被検体に行った治療の有効性をモニタリングおよび決定するのに用いられ得る。詳細には、本発明は、種々のマーカーの発現レベルが、所定の治療に対してPCaが応答するか否かをモニタリングするのに用いられ得るという事実に基づく。しかしながら、前立腺の外科的切除により、種々のマーカーの産生を担う器官がもはや存在しないので、これらのマーカーはもはや発現しなくなる。したがって、本発明の方法は、患者が前立腺を完全には切除しない方法例えば、放射線療法、化学療法などで治療されているような場合に、特に有用である。したがって、別の態様において、本発明は、PCaを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、i前記治療の実施前に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、ii前記治療の実施後に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、iii前記治療の実施前および後に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを比較することを含み、前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に低下するかまたは変化しないことが、実施した治療が効果があることを示すものであるとする、方法に関する。また、別の態様において、本発明は、PCaを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法であって、i前記治療の実施前に得た前記被検体から単離したサンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、ii前記治療の実施後に得た前記被検体から単離したサンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、iii前記治療の実施前および後に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを比較することを含み、前記治療の実施後の被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、実施した治療が効果がないことを示すものであるとする、方法に関する。本明細書中で使用される治療に対する応答を評価またはモニタリングするという語句は、PCaを有する被検体に実施した治療に対する前記被検体の応答を決定する可能性に関する。PCa治療において、癌を除去するかまたは封じ込めるために様々な治療が用いられ得る。PCaの治療は、監視療法、ホルモン療法、密封小線源治療前立腺密封小線源治療および外照射療法を含む放射線療法、高密度焦点式超音波療法HIFU、化学療法、またはいくつかの組み合わせを含み得る。どの選択が最良であるかは、病期、グリーソンスコア、およびPSAレベルに依存する。他の重要な因子は、その男性の年齢、全身的健康、ならびに潜在的治療および起こり得る副作用に対する感情である。すべての治療は、勃起不全および尿失禁などの重大な副作用を伴う可能性があるので、治療の議論は、治療の目標とライフスタイル変更のリスクとのバランスに重点を置く場合が多い。簡潔に言うと、上述の要因例えば、被検体の年齢、ならびに癌の大きさ、位置、および段階によって、i化学療法などの細胞毒性/細胞増殖抑制治療癌に対する医薬生成物を用い、その医薬生成物が血管を通って体内を循環する際に癌性細胞を破壊する;放射線療法高エネルギー放射線を用いて癌細胞を死滅させる、および抗腫瘍薬;および/またはii免疫療法投与された化合物が、癌に対する免疫システムの生来の機能を刺激、増強または強化することにより、癌性細胞を認識して体内から除去するが用いられ得る。したがって、本発明の方法により、任意の治療に対する、特に任意の細胞毒性/細胞増殖抑制治療に対する、より詳細には化学療法、放射線療法、抗腫瘍薬またはこれらの組み合わせによる治療に対する、PCaを有する被検体の応答を決定することが可能になる。適当な化学療法薬としては、アルキル化剤[例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、BBR3464、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドIfosmade、メルファラン、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、ThioTPA、ウラムスチン、など];代謝拮抗薬[例えば、プリンアザチオプリン、メルカプトプリン、ピリミジンカペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、葉酸メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、など];ビンカアルカロイド[例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、など];タキサン[例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、BMS-247550、など];アントラサイクリン[例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、マイトマイシン、など];トポイソメラーゼインヒビター[例えば、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、など];モノクローナル抗体[例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、など];光増感剤[例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、ベルテポルフィン、など];チロシンキナーゼインヒビター[例えば、グリベック商標];上皮増殖因子レセプターインヒビター[例えば、イレッサ商標、エルロチニブタルセバ商標、ゲフィチニブ、など];FPTアーゼインヒビター[例えば、FTIRl15777、SCH66336、L-778,123、など];KDRインヒビター[例えば、SU6668、PTK787、など];プロテアソームproteosomeインヒビター[例えば、PS341、など];TS/DNA合成インヒビター[例えば、ZD9331、ラルチトレキセドRaltirexedZD1694、トムデックス、ZD9331、5-FU、など];S-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼインヒビター[例えば、SAM468A、など];DNAメチル化剤[例えば、TMZ、など];DNA結合剤[例えば、PZA、など];O6-アルキルグアニンAGTに結合して不活化する薬剤[例えば、BG];c-ra/-lアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド[例えば、ISIS-5132CGP-69846A];腫瘍免疫療法;ステロイド性および/または非ステロイド性抗炎症薬[例えば、コルチコステロイド、COX-2インヒビター];またはアリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、ダサチニブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、およびトレチノインなどの他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。適当な化学療法薬は、TheMerckIndexinCD-ROM,第13版などの文献にさらに詳細に記載されている。本発明態様によると、第1期に得たPCaを有する被検体由来のサンプル第1被検体サンプルにおいて測定された遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルと、第2期に得たPCaを有する被検体由来のサンプル第2被検体サンプルにおいて測定された遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルとを比較して、PCaを有する前記被検体における治療に対する応答の有効性を評価またはモニタリングすることが可能になる。第2被検体サンプルは、第2期に、すなわち、第1期の後の任意の時間に、例えば、第1被検体サンプルの1日後、1週間後、1か月後、2か月後、3か月後、1年後、2年後、またはそれ以降に、第1測定が得られたPCaを有する同一被検体から採取され得る。特定の実施形態において、第1被検体サンプルは、被検体が治療例えば、化学療法、または放射線療法を受ける前に採取され、そして第2被検体サンプルは、治療後に採取される。別の特定の実施形態において、第1被検体サンプルは、被検体が治療例えば、化学療法、または放射線療法を始めた/受けた後に採取され、そして第2被検体サンプルは、その後、有効性が評価またはモニタリングされる一連の治療の間の異なる時期に採取される。これらの方法により、以前にPCaと診断された選択被検体に対する特定の治療の評価が可能になる。したがって、前記治療が前記被検体におけるPCaを治療するのに有効でない場合、前記治療を変更して新たな治療を設計し、前記被検体におけるPCaを治療すべきである。一連の新たな治療は、本方法によって容易に追随され得る。本発明の診断方法に関して前述したように、バイオマーカー遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルは、例えばqPCRのような、当該技術分野で公知の任意の適当な手段によって決定され得る。測定は、実質的に反復可能な条件下で行われる。異なる時期での被検体サンプル第1および第2被検体サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定したら、第1被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第2被検体サンプル中の前記遺伝子の各々の発現に有意な低下が認められる場合、同定が必要である。検査対象の第2被検体サンプル中の遺伝子の発現の低下は、前記第2被検体サンプル中の発現レベルが第1被検体サンプル中のその発現レベルに対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100すなわち、存在しない低下している場合、前記第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して有意な低下とみなされる。同様に、検査対象の第2被検体サンプル中の遺伝子の発現の上昇は、前記第2被検体サンプル中の発現レベルが第1被検体サンプル中のその発現レベルに対して少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも100、少なくとも110、少なくとも120、少なくとも130、少なくとも140、少なくとも150、またはそれ以上上昇している場合、前記第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して有意な上昇とみなされる。同様に、第2被検体サンプル中の発現レベルが原文欠落である場合に、検査対象の第2被検体サンプル中の遺伝子の発現が前記第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して変化しない場合、それらの発現レベルは2つの測定間で実質的に一定であることを示す。例として、一定の発現レベルは、第1測定が105以下、104以下、103以下、102以下、101以下、99以上、98以上、97以上、97以上、96以上または95以上であることを示す。したがって、第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルにおける有意な低下は、PCaを有する被検体に実施された治療が効果があることを示す。反対に、第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な低下が達成されない場合変化なしまたは有意な上昇、あるいは、第1被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに対して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な上昇が達成される場合、前記被検体に実施された治療は、前記被検体におけるPCaの治療に効果がなく;したがって、前記治療を変更して新たな治療を設計し、前記被検体におけるPCaを治療すべきである。一連の新たな治療は、本方法によって容易に追随され得る。さらに、本発明によるPCa治療に対する応答を評価またはモニタリングする方法は、少なくとも1つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも追加のバイオマーカー値がカットオフ値よりも低い場合に治療が効果があるとみなされるか、あるいは少なくとも1つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも追加のバイオマーカー値がカットオフ値よりも高い場合に治療が効果がないとみなされるように、種々の遺伝子の発現レベルとPCaについての追加のバイオマーカーの値を組み合わせることによって、さらに改善され得る。本発明の診断方法に関して説明する場合、追加のバイオマーカーは、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの、血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADTまたはPSAからなる群から選択される。したがって、好ましい実施形態において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程iおよびiiを行うことによって実施されるが、ここで工程iおよびiiは、患者におけるPSADの決定をさらに含み、ここで工程iiiは、患者におけるPSADレベルをPSADについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSADに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSAD値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの低下または前記所定のカットオフ値に対するPSAD値の低下が検出される場合に治療が効果があるか否かについて、あるいは、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの上昇もしくは変化なしまたは前記所定のカットオフ値に対するPSAD値の上昇もしくは変化なしが検出される場合に治療が効果がないか否かについて、結論が得られる。したがって、好ましい実施形態において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程iおよびiiを行うことによって実施されるが、ここで工程iおよびiiは、患者におけるPSAの決定をさらに含み、ここで工程iiiは、患者におけるPSAレベルをPSAについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSAに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSA値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの低下または前記所定のカットオフ値に対するPSA値の低下が検出される場合に治療が効果があるか否かについて、あるいは、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの上昇もしくは変化なしまたは前記所定のカットオフ値に対するPSA値の上昇もしくは変化なしが検出される場合に治療が効果がないか否かについて、結論が得られる。被検体におけるPCaの進行のモニタリング本発明の教示は、被検体におけるPCaの進行をモニタリングするのにも用いられ得る。したがって、別の態様において、本発明は被検体におけるPCaの進行をモニタリングする方法であって、a第1期に前記被検体から単離した生体液体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、b第2期に単離した同一被検体の生体液体サンプル中の前記遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択され、前記第2期が、前記第1期よりも後である、工程と、c前記第1期および第2期に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを含み、第2期での被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、第1期での前記発現レベルに対して有意に低下するかまたは変化しないことが、PCaが被検体において進行していないことを示すものであるとする、方法に関する。また、被検体におけるPCaの進行をモニタリングする方法であって、a第1期に得た被検体サンプル中のPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、b第2期に得た同一被検体のサンプル中の前記遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択され、前記第2期が、前記第1期よりも後である、工程と、c前記第1期および第2期に得た前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを含み、第2期での被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、第1期での前記発現レベルに対して有意に上昇していることが、PCaが進行していることを示すものであるとする、方法。本発明中で使用されるPCaの進行をモニタリングするという語句は、予後を決定すると同義であり、PCaと診断された患者における疾患の進行を示す1つまたはいくつかのパラメータの決定に関する。PCaと診断された被検体の変化を決定するのに適したパラメータは、腫瘍反応、再発のリスク、被検体の無病生存率および/または全生存率の群から選択される。本明細書中で使用される再発のリスクという語句は、無病生存期間後に再びPCaおよび/または後発転移を発症している被検体の確率と理解され;無病生存率は、癌が検出されない治療後の期間と理解され;そして被検体の全生存率は、診断または治療時から、規定の期間後に生存している被検体のパーセンテージと理解される。本明細書中で使用される疾患進行は、原文欠落を意味する。好ましい実施形態において、PCaの進行をモニタリングする方法は、臓器限局疾患OCDから非臓器限局疾患NOCDへの分化を検出するのに用いられ得る。別の好ましい実施形態において、PCaの進行をモニタリングする方法は、悪性前立腺癌または臨床的に重要な/低悪性度のPCaの予測に用いられ得る。本発明の態様によると、第1期に得たPCaを有する被検体由来のサンプル第1被検体サンプルにおいて決定された遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルならびに第2期に得たPCaを有する被検体由来のサンプル第2被検体サンプルにおいて決定された遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルを、各々の遺伝子についてのカットオフ値前記カットオフ値は、上記で定義されたように決定されると各々比較する。第2被検体サンプルは、第2期に、すなわち、第1期の後の任意の時間に、例えば、第1被検体サンプルの1日後、1週間後、1か月後、2か月後、3か月後、1年後、2年後、またはそれ以降に、第1測定が得られたPCaを有する同一被検体から採取され得る。特定の実施形態において、第1被検体サンプルは、被検体が治療例えば、化学療法、または放射線療法を受ける前に採取され、そして第2被検体サンプルは、治療後に採取される。別の特定の実施形態において、第1被検体サンプルは、被検体が治療例えば、化学療法、または放射線療法を始めた/受けた後に採取され、そして第2被検体サンプルは、その後、一連の治療の間の異なる時期に採取される。これらの方法により、以前にPCaに罹患していると診断された選択被検体におけるPCaの進行の評価が可能になる。したがって、PCaが予後不良である場合、さらなる治療を設計して、前記被検体におけるPCaを治療すべきである。前記新たな治療後のPCaの進行は、本発明の教示によって容易に追跡され得る。本発明の診断方法に関して前述したように、バイオマーカー遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルは、例えばqPCRのような、当該技術分野で公知の任意の適当な手段によって決定され得る。測定は、実質的に反復可能な条件下で行われる。異なる時期での被検体サンプル第1および第2被検体サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現レベルを測定したら、第1被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現に有意な上昇が認められる場合、同定が必要である。あるいは、所望であれば、第1被検体サンプル中の前記遺伝子バイオマーカーの発現レベルと比較して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現の有意な低下または変化なしが認められる場合、分析してもよい。バイオマーカー遺伝子の発現レベルに適用される有意な上昇、有意な低下および変化なしという用語は、既に定義されている。したがって、第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対する、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルの有意な上昇は、検査対象の被検体におけるPCaが進行中であるすなわち、予後不良であることを示し;したがって、検査対象の被検体に実施される治療を変更し、新たな治療を設計して前記被検体におけるPCaを治療すべきである。被検体におけるPCaの進行は、本方法によって容易に追跡され得る。反対に、第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルにおいて有意な上昇が達成されない場合、あるいは、第1被検体サンプル中の前記バイオマーカー遺伝子の各々の発現レベルに対して、第2被検体サンプル中の少なくとも1つの前記バイオマーカー遺伝子の発現レベルに有意な低下が達成される場合、検査対象の被検体におけるPCaは進行中ではないすなわち、予後不良ではない。さらに、本発明によるPCaの進行をモニタリングする方法は、少なくとも1つの上記遺伝子の発現レベルまたは少なくとも前記追加のバイオマーカーの値がカットオフ値よりも低い場合に疾患が進行していないとみなされるように、種々の遺伝子の発現レベルとPCaについての追加のバイオマーカーの値とを組み合わせることによって、さらに改善され得る。上記に説明したように、追加のバイオマーカーは、PSADおよびPSAからなる群から選択される。したがって、別の態様において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程iおよびiiを行うことによって実施されるが、ここで工程iおよびiiは、患者におけるPSADの決定をさらに含み、ここで工程iiiは、患者におけるPSADレベルをPSADについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSADに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSAD値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの上昇または変化なし、あるいは前記所定のカットオフ値に対するPSAD値の上昇または変化なしが検出される場合に、PCaが進行中であるか否かについて結論が得られる。別の態様において、本発明による治療に対する応答をモニタリングする方法は、上記で定義された工程iおよびiiを行うことによって実施されるが、ここで工程iおよびiiは、患者におけるPSAの決定をさらに含み、ここで工程iiiは、患者におけるPSAレベルをPSAについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、ここで前記所定のカットオフ値は、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSAに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSA値に相当する。最終的に、本方法により、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対する前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルの上昇または変化なし、あるいは前記所定のカットオフ値に対するPSA値の上昇または変化なしが検出される場合に、PCaが進行中であるか否かについて結論が得られる。生検のための患者の選択上記のように、本発明の教示は、生検のための患者を選択するのに用いられ得る。実際に、PSA試験の特異度が低いために多くの不必要な生検が実施されている。これは特に、グレーゾーンと言われている、4.0~10.0ng/mLの間の範囲に血清PSAレベルを有する患者における場合であり、PSADは総PSAよりも有意に正確であった[OhoriMら、Urology46:666~711995]。本発明者らが示すように、本発明のマーカーパネルの適用により、高い感度および特異度で患者がPCaに罹患しているか否かについての決定が可能になり、その結果、不必要な生検の数を有意に減少させ得る。例えば本発明の実施例に示すように、特に臨床的に価値のある群血清PSAが4~10ng/mLの範囲であって、生検歴なしにおいて、本発明によって提供される3成分バイオマーカーをPSADと組み合わせて用いて回避され得る生検の数は、回避される生検=真陰性偽陰性として算出され:-感度100で、32.5の生検が回避され、そして-感度96で、41.6の生検が回避され得る。これは、欧州全体で年間に回避される生検約126,750~162,240回に相当する。したがって、別の態様において、本発明は、被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価する方法であって、i前記被検体から単離した生体液体サンプル中の遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの発現レベルを測定する工程であって、前記生体液体が、尿、前立腺分泌物、射精液、前立腺マッサージ後の尿からなる群から選択される、工程と、ii前記PCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の各々についての所定のカットオフ値と比較する工程であって、各遺伝子についての前記所定のカットオフ値が、前立腺癌に罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMAおよびPSGR遺伝子の発現レベルに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関する前記遺伝子の発現レベルに相当するものである、工程とを含み、前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して有意に上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。被検体が前立腺を受けるべきか否かを評価する方法は、追加の前立腺バイオマーカーの決定によって改善され得る。詳細には、追加のマーカーは、PSA密度PSAD、血清遊離型PSAレベル、血清総PSAレベル、血清遊離型PSAレベルの、血清総PSAレベルに対する比、プロPSAレベル、およびPSA倍加時間PSADT本発明の診断方法に関して上記に説明されるように定義および算出されるであることができる。本発明の方法によって分析される患者は、好ましくは以前に前立腺生検を受けたことのない患者である。別の好ましい実施形態において、本発明によって分析される患者は、以前に少なくとも1回の生検、以前に少なくとも2回の生検、以前に少なくとも3回またはそれ以上の生検を受けたことのある患者である。したがって、好ましい態様において、本発明は、本発明による生検のための患者を選択する方法であって、工程iは、患者におけるPSADを決定する工程をさらに含み、工程iiは、患者におけるPSADレベルをPSADについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSADに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSAD値に相当するものであり、そして前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、PSAD値が前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。別の好ましい態様において、本発明は、本発明による生検のための患者を選択する方法であって、工程iは、患者におけるPSAを決定する工程をさらに含み、工程iiは、患者におけるPSAレベルをPSAについての所定のカットオフ値と比較することをさらに含み、前記所定のカットオフ値は、PCaに罹患しているリスクのある患者集団において測定されたPCA3、PSMA、PSGR遺伝子の発現レベルおよびPSAに基づいて算出されたROC受診者動作特性曲線において、前記所望の感度で最も高い特異度と相関するPSA値に相当するものであり、そして前記サンプル中の少なくとも1つの前記遺伝子の発現レベルが、前記遺伝子についての前記所定のカットオフ値に対して上昇していること、または、PSA値が前記所定のカットオフ値に対して上昇していることが、被検体が前立腺生検の候補であることを示すものであるとする、方法に関する。好ましい実施形態において、被検体が前立腺生検を受けるべきか否かを評価するための方法は、PSAレベルが4ng/mLよりも高い患者、陽性DREを示す患者、または50歳よりも高齢の患者で形成される。より好ましい実施形態において、PCaに罹患しているリスクのある患者集団は、PSAレベルが10ng/mLよりも低い患者で形成される。本発明のキット別の態様において、本発明は、第1成分と、場合により第2成分とを含むキットであって、第1成分が、下記からなる一連の試薬であり:i遺伝子PCA3の発現レベルを測定可能な試薬;ii遺伝子PSMAの発現レベルを測定可能な試薬;およびiii遺伝子PSGRの発現レベルを測定可能な試薬;第2成分が、1つまたはそれ以上の前立腺ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定可能な1つまたはそれ以上の試薬からなる、キットに関する。本発明のキットは、PCaの診断のために、すなわち、患者がPCaに罹患しているか否かを評価するために、あるいはPCaを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするために、すなわち、PCaと診断された被検体における治療の効果を評価するために、あるいは被検体におけるPCaの進行または分化をモニタリングするために、すなわち、PCaと診断された被検体の予後を決定するために、用いられ得る。本発明に関し、キットは、輸送および保管が可能なように包装された、本発明の方法を実施するのに必要な種々の試薬を含む製品と理解される。キットの構成要素を包装するのに適した材料としては、クリスタル、プラスチックポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど、ビン、バイアル、紙、封筒などが挙げられる。さらに、本発明のキットは、キット中の種々の構成要素の同時使用、逐次使用または個別使用のための説明書を含み得る。前記説明書は、印刷物の形態であるか、または例えば電子記憶媒体磁気ディスク、テープなど、光媒体CD-ROM、DVDなどの、被検体に読まれ得るような説明書を保存可能な電子支持体の形態であってもよい。さらにまた、メディアは前記説明書を提供するインターネットアドレスInternetadDRMssesを含み得る。遺伝子の発現レベルを測定可能な試薬は、遺伝子の発現レベルを測定すること、例えばRNA材料の抽出など、例えば対応するmRNAのレベルの測定などが可能な化合物または一連の化合物、例えばRTによって対応するcDNAを合成するためのプライマー、DNAの増幅のためのプライマー、前記遺伝子によってコードされるmRNAと特異的にハイブリダイズ可能なプローブまたは対応するcDNA、Taqmanプローブなどを意味する。特定の実施形態において、本発明のキットは、qPCRアッセイで用いられるように設計される。さらに、好ましい実施形態では、本発明のキットの第1構成要素は、遺伝子PCA3、PSMAおよびPSGRの各々に対する特異的Taqmanプローブからなる。qPCR分析で用いられる遺伝子発現アッセイは、当業者によって設計され得るか、または例えばAppliedBiosystemsから、コードHs01371938-m1PCA3、Hs00379515-m1PSMAおよびHs00951952-m1PSGR実施例1のもとに市販されている。別の態様において、本発明は、PCaの診断のための、PCaを有する被検体における治療に対する応答を評価またはモニタリングするための、被検体におけるPCaの進行をモニタリングするための、あるいは患者が前立腺生検を受けるべきか否かを決定するための、本発明のキットの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明のキットの使用は、4~10ng/mLの血清PSAレベルを有する被検体において実施される。本発明を以下の実施例によって以下に詳述するが、これらは単に例示的なものであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。実施例1尿におけるPCaの早期検出のための3遺伝子パネルの同定1.材料および方法1.1患者、および尿の採取本検査は、バルデブロン病院の治験審査委員会によって承認された。すべての尿サンプルは、バルデブロン病院バルセロナ-スペインの泌尿器科から得られ、前立腺生検を受けた198人の男性から前立腺マッサージPM直後に採取された。生検の指標は、異常な直腸指診DREおよび/または4ng/mLよりも高い血清PSAであった。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。他の既知の腫瘍がある患者および/またはPCa治療歴のある患者は検査から除外した。これらの154人の患者の臨床的および病理学的情報データを表1に示す。PM方法:PMは、前立腺の底から頂部および各葉の側方から中線に激しい指圧を規則正しくかけることによって行った。生検方法およびPCa検出率:生検は、エンドファイア型超音波トランスデューサFalcon2101、B-KMedicalInc.および自動18ゲージニードルBardInc.を用いて行った。すべての手順において採取した最小数のコアは10個であり、1~8個の間の追加のコアをViennanomogram[Remziら、J.Urol.2005;174:1256~60;考察1260~1;著者回答1261]に従って採取した。検査を行った全被検体群について、198検体のうち154検体で分析に十分なRNAが得られ、情報価値のある検体率7891の患者がPCaを有し、28が良性に相当した。前立腺生検によるPCa検出率は3757/154であった。生検を行うか否かを決定するのに特に臨床的に価値のある、PSA4~10ng/mL範囲内で、生検歴なしの77人の患者の亜群において、PCa検出率は3628/77であった表1。1.2サンプル調製尿サンプル約50mLの初尿を採尿カップに採取し、氷上で保持し、実験室に輸送し、そして30分以内に加工した。尿サンプルを4°Cで10分間、2,500×gで遠心分離し、次いでペレットを冷リン酸緩衝化生理食塩水PBS1×で2回洗浄した。最後に、ペレットをRNA抽出まで-80°Cで1:5RNALaterAmbionで保存した。1.2.1RNA単離およびプレ増幅QIAamp登録商標ViralRNAMiniKitQiagenを用いて、尿RNAを抽出した。SuperScriptIII逆転写酵素Invitrogenを用いて1本鎖cDNA合成を実施し、プレ増幅まで-80°CでTaqManPreampMasterMixKitAppliedBiosystemsを用いて保存した。1.2.2定量PCR分析3つの推定PCa尿バイオマーカーPCA3、PSMAおよびPSGRを、本発明者らによって選択した。TaqMan登録商標遺伝子発現アッセイAppliedBiosystemsを用いて前記3つの推定PCa尿バイオマーカーおよびコントロール転写物PSAを分析するために、定量的PCRqPCRを用いた。ABIPrism7900qPCR装置において3連で反応を行い、標準偏差STDEVが0.38の値よりも低い結果のみを採用した。閾値をqPCRの対数期に設定した。ABIPrism7900SDSソフトウェアV2.3AppliedBiosystemsを用いて、各プレートについて同一のベースラインおよび閾値を設定してデータ分析を行い、各サンプル中のすべての遺伝子についての閾値サイクルCt値を得た。尿沈渣中に正常に見出される非癌性細胞、例えば、尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞においても前記マーカーが発現しているかもしれない可能性を排除するために、臨床検体中の含有量を前立腺由来RNAの量に正規化した。尿中には比較的少数の前立腺細胞しか見出されないので、qPCRの前にcDNAプレ増幅工程を行った。本発明者らは、次いで、検体に情報価値があるか否か、すなわちRNAの存在量が正確な結果を得るのに十分であるか否かを決定するために、プレ増幅の前に、ctPSAのqPCRカットオフを35よりも低く規定した。各マーカーについて、logctマーカー/ctPSA×1000としてスコアを算出した。各マーカーについてのカットオフ値を決定し、マーカーがカットオフ値を超えた場合に検体を陽性とカウントした。1.3統計分析PCa生検個体と陰性生検個体との間の平均値を比較することによって、候補バイオマーカーの特徴付けを達成した。データの分布が正常である場合はウェルチ補正したt検定を用い、その他の場合にはマンホイットニー検定を用いた。正規性はシャピロウィルクの正規性検定で検証した。すべての検定は、分散を安定化させるために適用される対数変換データで実施した。多変量解析を用いて、候補マーカーと疾患状態との間の関連を調査した。受診者動作特性ROC曲線および曲線下面積AUCを用いて、PCa群の患者をその他から識別するための尺度としての各マーカースコアの性能を評価した。PSAの場合と同様に、各マーカーについてROC曲線を個々に算出し、マーカーの組み合わせについて多変量ROCmultiROCを算出した。簡潔に言うと、各バイオマーカーにつき1つの検出閾値を用い;次いで、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超えた場合、新たなマーカーを陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値の範囲にわたって算出した。新たなマーカーについてのMultiROC曲線点群は、以下の方法で得た:固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲から、特異度についての最大値を選択した。2つ以上のマーカーkを組み合わせるために、以下の手順に従った:まず、各バイオマーカーにつき1つのk成分検出閾値を用い;次いで、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超えた場合、新たなマーカーを陽性と認定した。感度および特異度の値は、k成分閾値の範囲にわたって算出した。これにより点群を得た。新たなマーカーについての最適ROC曲線点群は、以下の方法で得た:固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲内で、特異度についての最大値を選択したBaker,S.G.,JNatlCancerInst2003,95,511~515。kが増加すると計算の複雑性が指数関数的に増すので、同時に3つのマーカーのみを加えた。最適ROC曲線点をもたらすk成分カットオフ値を用いて、k多重マーカーに新たな変数の追加を行った。これらのk成分閾値を新たな変数の値と組み合わせて、新たな最適ROC曲線を得るために用いられるk1成分検出閾値を得た。統計分析は、PASWV17.0、およびフリー統計的言語R、およびBioconductorprojecthttp://www.bioconductor.orgのROCパッケージを用いて行った。複合マーカーと個々のマーカーとの間の結果予測性能を比較するために、MultiROC曲線下面積AUCmを測定した。複合モデルが、固定感度で個々のバイオマーカーよりも有意によく結果を予測し得るか否かを決定するために、本発明者らは、比率についてのZ検定を用いて、対応する偽陽性率を比較した。Z検定のための偽陽性率の分散の計算を、PSMA、PSGR、およびPCA3各々単独について、KrzanowskiらJ.Biopharm.Stat.2009;20:485~487に説明されるように実施した。本発明者らは、PSMA、PSGR、PCA3、およびPSAの組み合わせPSMA_PSGR_PCA3_PSAの場合に、再サンプリング手法を用いた。これらの比較におけるP値は、偽発見率手順[J.R.Stat.Soc.Ser.BMethodol1995;57:289~300に従い、多重検定問題について補正した。バイオマーカーの組み合わせの性能を示すROC曲線の作成における主要な懸念は、過剰適合である。このバイアスを制御するために、本発明者らは折半50法に基づく手法を用いて結果を検証したJ.Clin.Epidemiol.2001;54:774~781。簡潔に言うと、サンプルの50をトレーニングセットとして用いて、ROC曲線を計算した。このROC曲線を用いて、規定された一連の感度90~100を得るのに必要なカットオフ値を決定した。したがって、決定したカットオフを用い、試験サンプルを用いて各感度に対応する特異度を推定した。この手順を500回繰り返し、全反復後に得られる平均値を計算することによって、最終推定を得た。統計分析は、PASWV17.0、およびフリー統計的言語R、およびBioconductorprojecthttp://www.bioconductor.orgのROCパッケージを用いて行った。2.結果前立腺生検によるPCa検出率は、3757/154であった。検査を行った全被検体群について、198検体のうち154検体で分析に十分なRNAが得られ、情報価値のある検体率78.8PCaを有する患者について95.0および良性患者について70.3に相当した。PCaを有する患者を針生検陰性の患者から識別し得るか否かを決定するために、154人の患者からPM後に得られた尿沈渣において、PCA3、PSGR、PSMAおよび追加の臨床的パラメータを試験した。PCA3p=0.018、PSGRp<0.001、PSMAp=0.016およびPSADp=0.027は、統計学的に有意であったがFig.1A~D箱髭図、一方、PSAp=0.55、遊離型PSA[fPSA]p=0.60および前立腺体積[PSTVOL]p=0.053は、統計学的有意性を示さなかった。多変量解析後、本発明者らは、ROC曲線分析についてPCA3、PSGR、PSMA、およびPSADを選択して、診断有効性を視覚化し、尿サンプルの遺伝子に基づくqPCRアッセイのデータをまとめた。以下のAUC値を得た:PCA30.60、PSGR0.64、PSMA0.62、およびPSAD0.61Fig.2。有意水準P面積=0.5は、それぞれp=0.043、0.002、0.012および0.051であった。種々のバイオマーカーの組み合わせにより単一バイオマーカーよりも性能を改善し得るか否かを決定するために、MultiROC手法PSMA_PSGR_PCA3を用いて、かつ従来の二項ロジスティック回帰分析を用いて、PSMA、PSGR、およびPCA33Mを組み合わせた。癌の多因子性により、ある患者においてマーカーAが陽性であり、別の患者においてマーカーBが陽性であり得るという可能性がある。ロジスティックモデルは、ロジスティック曲線を患者についての疾患の確率に適合させる。この技術を用いて、個々の重みを各々に割り当てると、両マーカーの組み合わせは本質的に直線である。これは、両マーカーの発現が各マーカー単独よりも有意であるという仮定の下で有効である。しかしながら、AまたはBのいずれかの発現が単独で、患者を分類するのに十分である場合、情報の損失がある。そのため、本発明で開発されたモデルにおいて、複合マーカーは、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、陽性と認定した。MultiROCモデルの性能は、ロジスティック回帰分析よりも優れていたFig.3。3MPSMA_PSGR_PCA3についてのMultiROC下面積は、0.74[0.68~0.80]であったFig.2。それらの間で比較を行い、以下の結果を得た:3M対PCA3P=0.0071、3M対PSGRP=0.0493、3M対PSMAP=0.0253、PSMA対PSGRP=0.75、PSMA対PCA3P=0.69、およびPSGR対PCA3P=0.46表2。PSMAについての感度および特異度の合計を最大にすると、アッセイ感度は81[68~90]、そして特異度は41[31~52]であった。PSGRについては、アッセイ感度63[49~77]および特異度64[54~73]、そしてPCA3については、感度86[74~94]および特異度35[27~45]を達成した。3Mについては、感度89[79~95]および特異度45[35~57]であった。ROC曲線の統計比較を表2に示す。感度を臨床的に価値のある値の範囲である90~100に固定することによって、PSMA、PSGR、PCA3および3Mを比較した場合、感度100で個々のマーカーについての特異度は0まで低下するが、複合モデルは特異度29[21~39]を維持したFig.2。標準Z検定を行い、これらの差異が有意か否かを調べた。例えば、96の感度について、以下のP値を得た:3MとPSMAとの比較;P1/40.0001、3MとPSGRとの比較;P1/40.0002、3MとPCA3との比較;P1/40.0006。このデータを検証するために、本発明者らは500回反復での折半法によって検証を行った。本発明者らは、感度90~100の範囲で検証ROC曲線を構築した表3。次いで、3マーカーモデル3MをPSADPSA/PSTVOLと組み合わせて新たなマーカーとした。このために、本発明者らは、各バイオマーカーにつき1つの4成分マーカー検出閾値を用いた。複合マーカーは、少なくとも1つのマーカーがその検出閾値を超えた場合に、陽性と認定した。ROC曲線を描くために、本発明者らは、感度および特異度の値を4成分閾値の範囲にわたって算出した。したがって、本発明者らは、感度についての値を固定することができた。特異度についての最大値は、感度値に合致させて本発明者らが得た特異度の範囲内から選択した。複合マーカーモデルについてのAUCは、0.80[0.71~0.83]であった。感度96で、特異度は40であった。陽性および陰性的中率は、それぞれ48および95であったFig.2。表4は、前記組み合わせ[PCA3、PSRGおよびPSMAおよびPSAD]の数値を含む。PSA4~10ng/mLの患者における3マーカーモデル生検を行うべきか否かを決定するために、特に臨床的に価値のある亜群を試験した。この群は、結果が4~10ng/mLの間のPSA診断グレーゾーンであった、前立腺生検PB歴のない82人の患者から構成された。PBによるPCa検出率は3428/82であった表1。検査を行った全被検体群について、93検体のうち82検体で分析に十分なRNAが得られ、情報価値のある検体率88.2に相当した。単変量解析によって全マーカーを試験し、PCaを有する患者を陰性PBの患者と区別し得るか否かを調べた。以下の結果を得た:PSMAp=0.003、PSGRp=0.009、PCA3p=0.025、PSADp=0.036Fig.1および前立腺体積p=0.02は統計的に有意であったが、一方、PSAp=0.26およびfPSAp=0.67は、全く統計学的有意性を示さなかった。本発明者らは、以下のAUC[95CI]値を得た:PSMA0.74[0.63~0.86]、PSGR0.66[0.54~0.79]、およびPCA30.61[0.48~0.74]。3MについてのAUCは0.82[0.77~0.86]、3MとPSADの組み合わせについてのAUCは0.80であったFig.4。ROC曲線の統計比較を表2に示す。PSMAについての感度および特異度の合計を最大にすると、感度は64[44~81]、そして特異度は70[56~82]であった。PSGRについて、感度は61[41~79]および特異度は70[56~82]であり、そしてPCA3について、アッセイ感度は71[51~87]および特異度は54[40~67]であった。3Mについて、本発明者らは、感度89[72~96]および特異度57[44~70]を達成した。次いで、本発明者らは、感度を臨床的に価値のある値の範囲である90~100に固定することによって、PSMA、PSGR、PCA3および3Mを比較した。感度100で個々のマーカーについての特異度は0まで低下するが、複合モデルは特異度46[37~63]を維持した。本発明者らは、PSMAについて4[1~13]、PSGRについて12[6~24]、およびPCA3について0[0~7]の感度を得たFig.3。2つの比率についての標準試験を感度90~100の範囲において行い、これらの差異が有意か否かを調べた。感度90~100の範囲における検証ROC曲線を表5に示す。例えば、感度96について、本発明者らは以下のP値を得た:3MとPSMAとの比較、p=0.0005、3MとPSGRとの比較、p<0.0001、3MとPCA3との比較、p=0.0001。回避し得る生検数の決定最後に、回避し得る生検数を、群全体およびPSA4~10ng/mLの群において、複合マーカーモデル3Mを用いて、回避される生検=真陰性偽陰性として算出した。感度96について、PSAの全範囲および繰り返し生検を含む群全体において233MvPSAで23の生検を回避することができた。この場合の陽性的中率PPVおよび陰性的中率NPVは、それぞれ46および94であった。生検歴がなく、かつ結果がPSAグレーゾーンの4~10ng/mLの間である、特に価値のある臨床リスク群の分析において、感度96で34の生検を回避することができた。PPVおよびNPVは、それぞれ51および96であったFig.5。3つのマーカーの組み合わせPCA3、PSMAおよびPSGRは、PSMA、PCA3およびAMACRの組み合わせよりも高い感度を示すスコアの決定は、前述のように実施した。各バイオマーカーにつき1つの検出閾値カットオフを用い;次いで、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超えた場合に、患者を陽性と認定した。感度および特異度の値は、閾値カットオフの範囲にわたって算出した。固定した感度値に対して、その感度値に合致した点群における特異度の範囲から、特異度についての最大値を選択した。上記の例において、PCA3、PSMA、PSGRおよびPSMAの相対発現は、25人の患者のコホート48がPCaを有するから測定した。PCA3、PSMAおよびPSGRについてのカットオフ組み合わせそれぞれは、10.3、16.57、および1.43により、92の感度および67の特異度を得た。一方、PCA3およびPSMAについて同一のカットオフで、またAMACRについてカットオフ102での、PCA3、PSMAおよびAMACRの組み合わせにより、ともにより低いかつ感度の差異がかなり大きい77の感度および64の特異度を得た。次いで、感度および特異度の合計を算出したそれぞれ、1.6および1.4。PCA3、PSMAおよびPSGRの組み合わせにより、PCA3、PSMAおよびAMACRの組み合わせよりも高い値を得た。AMACRについてより低いカットオフを用いると、感度は上昇するが特異度が低下し、したがって、これは実行可能な代替案ではない。例えば、カットオフ96により、感度84.62および特異度54.55となるが、一方、感度および特異度の合計は1.4のままであり、これは全体としてより良い結果ではないことを示している。この例は、少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超える場合に患者がPCaについて陽性であると判定する方法により、特異度が低下することなく感度が上昇することを示す。単一マーカーで用いるカットオフを変更すると、常に感度および特異度が同時に変化するので、これは驚きである。一般に、感度を上げるためにより低いカットオフを用いると、特異度値が低下する。驚いたことに、PCA3、PSMAおよびPSGRの組み合わせを用いると、各マーカーを単独で用いた場合と比較して、より高くかつより特異的なカットオフ値を用いて同じ感度値に到達することが可能であった。この例は、3つのマーカーPCA3、PSMAおよびPSGRのいずれかについての少なくとも1つのスコアがその検出閾値を超える場合に、患者がPCaについて陽性であると認定する方法により、個々のマーカー各々で用いたのと同じ感度値で、より多くの患者を同定することができることを示す。PSGRにより、PCA3およびPSMAのレベルが低い前立腺癌患者16番および25番を同定することができた。PSMAにより、PCA3およびPSGRのレベルが低い前立腺癌患者19番を同定することができた左パネル。この組み合わせにより、前立腺癌に一般的な転移の不均一性のより多くが攻略されるので、より大きなPCa患者プールの同定が可能になる。対照的に、PSGRの代わりにAMACRと組み合わせると、この感度および特異度の組み合わせで、さらなる患者は同定されなかった右パネル。3.考察本発明者らは、PM後の尿沈渣におけるPCaについての多重qPCRベースの試験を開発した。追加の臨床的パラメータの組み込みにより、診断精度をさらに改善し得る。このパラメータの1つはPSADであり得る。グレーゾーンといわれる、血清PSAの範囲4.0~10.0ng/mLにおいて、PSADは総PSAよりも有意に正確であったOhoriMら、1995、Urology46:666~71。したがって、本発明者らは、前立腺生検を行うか否かを決定するための判断基準としてPSADを含めた。PCa細胞において高度に過剰発現している前立腺特異的mRNAは、理想的な標的である。これらの遺伝子は、尿沈渣中に正常に見出される非癌性細胞、例えば尿路上皮、腎臓、膀胱または血液由来の細胞においても発現し得るので、臨床検体中の含有量を前立腺由来RNAの量に正規化しなければならない。これは、診断指標として遺伝子/PSAmRNA濃度の比を用いることによって達成される。血中タンパク質濃度とは対照的に、PSAmRNA発現は正常前立腺細胞において比較的一定であることが示されており、PCa細胞におけるPSA発現の弱いダウンレギュレーションのみが報告されている[MengFJら,CancerEpidemiolBiomarkersPrev11:305~92002]。本検査で用いた遺伝子は、非腫瘍性前立腺組織と比較して、前立腺腫瘍において高いアップレギュレーションを示した。したがって、前立腺腫瘍におけるPSAのダウンレギュレーションは、腫瘍遺伝子/PSA比を高めると考えられる。PSAは、尿中に存在する他の細胞、例えば移行上皮、血液または腎臓においては発現しないので、前立腺ハウスキーピング遺伝子として用いられ得る。検体に情報価値があったか否か、すなわちRNAの存在量が正確な結果を得るのに十分であったか否かを決定するために、本発明者らはPSAmRNA収量を用いた。なぜなら、PSAmRNAは前立腺細胞にのみ存在し、尿中に存在する他の細胞型の多様な含有量によって影響を受けないためである。PCA3発現についての尿ベースの試験は、大規模なスクリーニングプログラムにすでに記述されているが、癌発生の不均一性を考慮に入れた診断プロファイルに基づく研究は2つしかない。種々のバイオマーカーの組み合わせにより、単一マーカーよりも明らかに性能が改善されるはずである。これを達成するために、本発明者らは、複合ROC分析において、3つの最良のマーカーPCA3、PSGRおよびPSMAと新たなマーカーPSADとの組み合わせによって作製した尿転写物の新規多重パネルを用いた。分析した検査群において、複合マーカーモデルについてのAUC0.80は、個々のマーカー単独についてのAUC:PCA30.60、PSGR0.64およびPSMA0.62と比較して、著しく改善された。例えば、PCA3のスコア7.23を、PSGRについてのスコア65.51、PSMAについての46.61、およびPSADの0.21と組み合わせると、高い診断精度でROC曲線上の点に対応した:感度および特異度それぞれ96および40Fig.2。血清PSA4~10ng/mLで、生検歴なしの患者のみを分析すると、複合マーカーモデルについて、感度96およびAUC0.89で、特異度は62に改善されたFig.4。本発明者らと以前の研究とは、患者尿中のPCA3転写物を検出するために異なる方法論を用い、そしてそれらの多くは検査群において同じPCa有病率約35を用いていないので、AUCを直接比較するのは不適当であった;しかしながら、本発明者らは、上述の検査による結果または血清PSAと比較した場合、PCA3がAUCの改善を示すことを示した。重要なことに、本発明者らは、複合モデルがPCA3単独と比較して的中可能性を有意に改善することを実証した。複合バイオマーカーアプローチの基礎をなす原理は、乳癌患者における高い再発リスクの同定に提供された試験と一致している[PaikSら;NEnglJMed351:2817~262004yvandeVijverMJら、N.Engl.J.Med.347:1999~20092002]。要約すると、本発明者らは、前立腺生検に参加している患者由来の尿沈渣における多重qPCRアッセイが、血清PSAまたはPCA3単独よりも優れていることを示した。これらの知見を臨床に翻訳するために、偽陰性および偽陽性の相対的重要性を考慮することが必要である。したがって、本発明者らは、感度を高い範囲90~100に固定して、対応する特異度を算出することを提案した。本発明者らが高いパーセンテージを選択した理由は、生検を行うべきか否かを決定する試験において、偽陰性は偽陽性よりも悪いためである。これは、癌症例を見落とすことにより、患者にとって致命的な結果になり得るためである[Pepeら、2008,J.Natl.CancerInst.,100:1432~1438]。感度が100に近いと、個々のマーカーについての特異度はしばしば劇的に低下する。本検査では、感度100でPSMA、PSGR、およびPCA3についての特異度は0であったが、複合モデル3Mは29の特異度を維持した。3MをPSAと組み合わせて用いても、それ以上の利点はなかった29。本発明によって得られる複合3-マーカーモデルPSAの結果は、特異度を低下させることなく感度の全体的な上昇をもたらした。臨床に翻訳したところ、本発明者らはPSA試験単独と同じく高い感度を達成したが、特異度が著しく上昇した。本方法を感度100で用いると、33の生検が回避され、そして感度96で42の生検が回避され得た。これは、欧州全体で回避される生検のおおよその年間数126,750~162,240回に相当した。本検査および他の検査の可能性のある限界として、用いたPCa陰性患者の定義は、最近の陰性生検に基づいている。しかしながら、陰性の前立腺生検を示す患者の32に対して12が、後日、実際はPCaと診断されるので、この定義は問題であり得る[CerveraDevalJら、ActasUrol.Esp.28:666~712004およびRaberMら、Arch.Ital.Urol.Androl.72:197~92000]。その結果、陰性の生検所見を有する多くの男性が、PCaを排除するために繰り返し生検を受け、したがって、生検は陰性であったが陽性試験で陽性である、かなりの数の個体が存在する。それにもかかわらず、本発明によって得られたデータは、PCaについての正確な診断試験を目指して本発明によって提供される4マーカー非侵襲性アッセイ法の適用可能性を支持するものである。"