乳腺細胞における特異的な発現を可能にするプロモーターの転写制御下に置かれたヒト血漿リン脂質転送タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む1又はそれより多いコピー数の導入遺伝子をゲノム中に含み、活性型ヒトPLTPを乳に分泌することを特徴とするトランスジェニック動物。ウサギであることを特徴とする請求項1に記載のトランスジェニック動物。請求項1又は2に記載のトランスジェニック動物の乳。活性型ヒトPLTPの産生のための原材料としての請求項3に記載の乳の使用。乳を清澄化すること、及び乳清を回収することを含むことを特徴とする請求項3に記載の乳から組換えヒトPLTP製剤を製造する方法。乳清からPLTPを抽出することを更に含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。乳清からのPLTPの抽出が、ヘパリン上でのアフィニティクロマトグラフィにより行われる請求項6に記載の方法。請求項5~7のいずれか1つに記載の方法により得ることができる組換えヒトPLTP製剤。敗血症ショックの予防又は治療に用いるための請求項8に記載の組換えヒトPLTP製剤。しかしながら、この発現系は、以前に記載されたものと同様に、それを治療目的で用いるのはもちろんのこと、インビボでその活性を試験することを可能にする程度に十分な量のPLTPの産生さえ可能にするものではない。したがって、組換えPLTPのソースを利用可能にすることが望ましい。トランスフォームされた細胞の培養物による治療上重要なタンパク質の生産の代替法は、トランスジェニック動物による、特にその乳におけるそれらの生産である。このアプローチは、理論的には多くの利点を有する。しかしながら、トランスジェニックマウスの乳において天然のヒトタンパク質のそれに類似する生物学的特性を有する組換えタンパク質プラスミノーゲンインヒビターを生産する可能性は何年も前に証明されたが、トランスジェニック動物の乳において首尾よく産生することが可能なタンパク質の数は依然として比較的限られたままである。実際、発現される興味あるタンパク質の性質に特に依存する多くの要因が成功又は失敗を決定し得る。これらの要因には、特に、乳腺において、天然のヒトタンパク質のそれに類似する翻訳後修飾を示すタンパク質を産生する宿主の能力である。この要因は、乳において、非常に多くかつ多様性ある翻訳後修飾を有し、肝臓において天然に産生されるPLTPのようなタンパク質を組換え形態で産生することを構想する場合に特に重要である。実際、乳腺の細胞は、肝細胞のそれとは異なる翻訳後修飾の能力を有する。例えば、トランスジェニック動物の乳における産生が最も研究されているタンパク質の一部である凝固因子の場合、ヒトプロテインCを乳腺において発現するトランスジェニックマウスは、プロペプチドの切断及びγカルボキシル化を正しく行うことができなかったことが観察されている。類似の観察がトランスジェニックブタにおいて、プロテインC及び第IX因子についてなされている。もう一つの重要な要因は、乳が構成する環境である。それは、タンパク質及び脂質が非常に豊富な多成分複合媒体である。それは、それ自体、水相である乳清中のカゼインミセルのコロイド溶液である液体中の脂肪球のエマルジョンの形態にある。乳清は、ラクトース、ミネラル塩、並びにビタミン及び水溶性タンパク質をとりわけ含む。カゼインミセルは、多様な程度リン酸化されており、かつリン酸基を介してカルシウムと結合している様々なタイプのカゼインからなる超分子構造である。脂質の大半は、リン脂質及び中性脂肪と結合した様々なタンパク質から主になる複合体アセンブリであるリポタンパク質の膜乳脂肪球皮膜で覆われた球状小滴の形態で乳中に分散している。PLTPの高い親油性並びにそのコレステロール、リン脂質及びジアシルグリセリド結合能を考慮すれば、それが乳において組換え形態で産生されるならば、脂肪球皮膜と好ましく結合することが推測され得る。更に、PLTP活性が、結合しているリポタンパク質構造のタイプに依存することが知られているという限りにおいて、PLTPと乳脂肪球皮膜との相互作用の効果は、予測するのが難しいようである。更に、トランスジェニック動物の乳において産生される興味ある組換えタンパク質の精製は、従来、カゼインミセルを、及び脂肪球を除去することを意図する乳を清澄化する工程をもって開始する。次いで、興味あるタンパク質を乳清から精製する。このアプローチは、一般的に、親水性タンパク質の場合に効果的である。しかしながら、タンパク質がカゼインミセルにより又は脂肪球により捕捉されるならば、その精製は、その生物学的活性に有害であるリスクを有する、より一層激烈な方法の使用を必要とし得る。それにも拘らず、今回、本発明者らは、驚くべきことに、その乳腺でヒトPLTPをコードする配列を発現するトランスジェニックウサギが、その乳において活性型組換えPLTPを産生すること、及び更に、このPLTPが乳清から抽出できることを見出した。実施例1:ヒトPLTPをコードする配列を含むトランスジェニック生成ベクターの構築中間ベクターへのPLTPcDNAのクローニング5の位置においてコンセンサスコザック配列及びユニークMluI制限部位により、並びに3の位置において2つの終止コドン及びNheI制限部位に接したヒトPLTP前駆体をコードする、戻し翻訳した合成cDNA配列を合成し、プラスミドpBluescriptに由来する、アンピシリン耐性遺伝子及び細菌性ColE1複製起点を含む中間ベクターにクローニングした。トランスジェニック生成ベクタークローニングに用いたトランスジェニック生成ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子及び細菌性ColE1複製起点を有するプラスミドpPolyIIIに由来する。このトランスジェニック生成ベクターは:63kbpのウサギWAPプロモーター上流のニワトリβグロビン遺伝子5HS4インスレーター配列の二量体;転写エンハンサーを含むウサギβグロビン遺伝子の第2のイントロン;R領域およびHTLV1U5領域の始めと融合したSV40の前初期遺伝子の5UTR配列を含む第2の転写エンハンサー;マウスIgG重鎖のmu領域に由来する第3の転写エンハンサー及びヒト成長因子ホルモンの転写ターミネーターを含む発現カセットを含む。このカセットは、第2及び第3の転写エンハンサーの間に位置するMluIサイト及びNheIサイトを含む。それは、プラスミドpPolyIIIの配列の切除を可能にするNotIサイトにより両側を挟まれている。中間ベクターからMluINheI消化により回収されたPLTPをコードするDNAインサートを発現カセットのMluI及びNheIサイトの間に挿入した。得られたトランスジェニック生成ベクターは、その5~3方向に、iニワトリβグロビン遺伝子の5HS4インスレーター配列の二量体、ii63kbpのウサギWAPプロモーター、iii第1の転写エンハンサーを含むイントロン、iv第2の転写エンハンサー、vヒトPLTPcDNA、vi第3の転写エンハンサー、及びvii転写ターミネーターを含むインサートを含む。上記のように、組換えベクターを含むコロニーは、それらのアンピシリン耐性に基づいて選択され、次いで制限フラグメントの分析及びその後のシーケンシングによりインサートの存在を確認する。実施例2:乳腺においてヒトPLTPを発現するトランスジェニックウサギの作製トランスジェニックウサギを慣用のマイクロインジェクション技術により得た。トランスジェニック生成のためのインサートの調製組換えPLTPをコードする配列を含むトランスジェニック生成ベクターを制限酵素NotIにより消化し、導入遺伝子を含むインサートをアガロースゲル上で単離し、次いでElutipD上で製造業者の説明書に従って精製し、エタノールで沈殿させ、次いで10mMTrisHCl01mMEDTApH74を含むバッファー中に採取した。ドナー及びレシピエントのウサギの準備卵胞の発達を刺激するために、ブタFSHを用いて、16~30週齢の胚ドナーのニュージーランドウサギを3日間皮下経路により処置した。3日目に、ウサギはhCGホルモンの静脈内注入を受け、次いでメスを交配させる。レシピエントのウサギは、18~20週齢である。精管切除されたオスと交配させる前にメスを昼間の長い周期で1週間保持するか、又はホルモン処置のいずれかにより同期化された偽妊娠を誘発する。収集した胚のマイクロインジェクション及び移植4日目に、交配の18~19時間後、DNAのマイクロインジェクションを行うために、ドナーのウサギから胚を収集する。回収後直ちにDNAのマイクロインジェクションを行う。1細胞期の胚をノマルスキーレンズ及びマイクロマニピュレータを備えた倒立型顕微鏡のもとで培地の小滴中に置いた。ピペットを用いて、個々の胚を適切な場所に配置し、固定した。10mMTrisHCl01mMEDTApH74を含むバッファー中に導入遺伝子を1ngμlから6ngμlまで変動し得る濃度に希釈し、好ましくは、注入用ピペットの助けにより胚の雄性前核中にマイクロインジェクションする。マイクロインジェクションに続き、胚を培地中で1~5時間インビトロで維持する。次いで、マイクロインジェクションされた胚の質を実体顕微鏡のもとで素早く評価する。次いで、同期化されたレシピエントのウサギの卵管のルーメン中への全身麻酔下で、外科的手順を用いて、インタクトな単細胞の胚を再移植する。分娩は、胚移植の29~31日後に自然に起こり得る。必要であれば、それは、31日目にオキシトシンを注入することにより誘発する。生まれた若いウサギの数は、再移植された胚の数と比較して、5~20のオーダーである。実施例3:トランスジェニックウサギの選抜及び特徴決定胚発生の過程中、マイクロインジェクションされた組換えDNAは、ゲノム中にランダムに組み込まれる。新生ウサギは、耳の生検により導入遺伝子の存在について試験する。ゲノムDNAを抽出し、組換えインサートに特異的なプライマーを用いてPCR分析を行う。導入遺伝子が検出されたウサギをFoundersF0という。founderF0系を、iゲノム中に組み込まれた導入遺伝子のコピー数の分析、及びii組込み部位の数の決定により更に特徴決定した。各々のfounderF0系のゲノム中に組み込まれた導入遺伝子のコピー数は、定量PCRにより及びサザンブロッティングにより決定した。この数は、系統に依存して、1コピー細胞~100コピー細胞程度で変動する。また、組込み部位の数も、サザンブロッティングにより決定した。この数は、系に依存して、1~3部位ゲノムで変動する。実施例4:トランスジェニックウサギの乳におけるヒト組換えPLTPの発現の評価実施例3のF0トランスジェニックウサギの乳中のリン脂質転送活性を評価した。そのために、乳サンプルにおけるPLTPによるリン脂質転送活性を、RoarBiomedicalIncからの市販キットを用いて、製造業者の推奨に従って測定した。蛍光リン脂質、この場合ホスファチジルコリンは、リポソームタイプの供与体基質と結合しているとき、自己消光状態で存在する。PLTPのリン脂質転送活性は、蛍光リン脂質が、インキュベーション用培地に存在する、例えばVLDLタイプの受容体リポタンパク質に転移するときに、漸増蛍光強度により測定する。図1は、非トランスジェニックウサギ又はWTウサギの乳、及びPLTPについてのトランスジェニックウサギのいくつかの系、すなわちPLTPTgWAPウサギの乳におけるリン脂質転送活性の比較を表す。WTウサギの乳において顕著なリン脂質転送活性が検出されないとき、PLTPTgWAPウサギの乳は、合成リポソームと血漿VLDLリポタンパク質との間の時間依存的な蛍光リン脂質交換能を示す。最も高いリン脂質転送活性を示す乳13は、タンパク質の精製に用いた。実施例5:トランスジェニックウサギの乳からの活性型ヒトPLTP製剤の製造1酸性pH及び室温におけるカゼインの沈殿1容量の乳を、2容量の05mMEDTApH80及び7容量のミリQ水と混合する。EDTAは、カルシウムイオンをキレート化すること、及びPLTPの部分を保持することができるカゼインミセルを破壊することを可能にする。カゼインを完全に沈殿させるために、氷酢酸を撹拌しながら滴下により加えることにより、pHを4まで徐々に下げる。2低速遠心分離及びpHの中和による乳清の清澄化酸性pHにおけるカゼインの沈殿後、10分間2000g及び4°Cにおける混合物の遠心分離。脂質上清とタンパク質ペレットとの間に位置する中間清澄化フラクションの回収。pH74を得るのに十分な量の固体Trisを用いる中性化。このようにして回収したフラクションのグラスファイバーフィルター上での濾過。それは、カラム上への注入前の慣用の濾過である。それは、大きいサイズの凝集体及び/又は粒子を除去すること、及びこのことにより、これら大きいサイズの凝集体及び/又は粒子による妨害を回避することによってカラムを保護することが可能となる。3ヘパリンセファロースカラム上でのアフィニティクロマトグラフィによるPLTPの抽出/精製20mMTrisバッファーpH74で予め平衡化されたHeparinSepharose6FastFlowカラム上への室温における清澄化及び濾過されたタンパク質フラクションの注入。注入速度:蠕動ポンプを用いて1ml分。20mMTrisバッファーpH74を用いる一晩のカラムのリンス。AktaFPLCシステムへのロードされたカラムの接続。20mMTrisバッファーpH74の20mMTris1MNaClバッファーpH74への不連続勾配のプログラミング。150mmolPBSlNaClバッファーpH74に対するフラクションの透析。各々のフラクションにおけるリン脂質転送活性を測定し、BCAタンパク質アッセイについての値と比較する。結果50mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて行った抽出の結果を図2及び3に説明する。図2に示されるように、スキムミルクフラクションのタンパク質は、ヘパリンカラムから、不連続NaCl勾配に従ういくつかの連続ピーク中に溶出する。いくつかの不連続ピークは、最も高いNaCl濃度において溶出する。リン脂質転送活性の測定結果を以下の表Iにまとめる。リン脂質転送比活性の欄は、それが開始時の乳よりも50倍以上高いフラクション167、175及び178において最も高い。図3は、これらのフラクションが、それぞれ30及び60kDaの見かけ分子量を有する2つの優勢なタンパク質からなることを示す。30kDaのバンドは、WT及びPLTPTgWAPの乳において多量に見られるカゼインに相当する。60kDaのバンドは、PLTPについて従来から報告されているMWの領域にある。100mMの増大を伴う不連続NaCl勾配を用いて行った抽出の結果を、図4~6及び以下の表IIにより説明する。最も高いリン脂質転送比活性を示すフラクションは、300mMNaClの段階で溶出する。このフラクションは、開始時の乳よりも44倍高い比活性を有する。変性条件下における電気泳動分析は、PLTPに相当する60kDaにおける主要なバンド、及びカゼインに相当する30kDaにおけるよりはっきりとしたバンドを再び示す。より低い強度でバンドを染色する2回目の電気泳動は、最も活性なフラクション68について60kDaのシングルバンドを示す。これらの結果は、ヒトPLTPが、最も高いリン脂質転送比活性を示すフラクションの主要な構成要素であることを示す。実施例6:PLTPノックアウトマウスにおけるエンドトキシンショックの予防のためのトランスジェニックウサギの乳から得られたヒトPLTPの使用以前のデータは、マウスの内因性PLTP遺伝子の無力化が、LPSを中和及び解毒化する能力を野生型WTマウスと比較して減少させることを示している。致死量のLPSの注入後の死は、WTマウスよりもPLTPKOマウスにおいて早く起こる。外因性組換えPLTP供給が、動物におけるLPSの解毒化及びエンドトキシンショック耐性を増大できるかどうか判定するために、PLTPKOマウスは、腹腔内経路による時間0における致死量又は亜致死量のLPS注入、その後のPBSバッファー又は上記の実施例5に記載されるようにしてトランスジェニックウサギの乳から調製した組換えPLTPの連続的な静脈内注入により受容した。次いで、循環中のサイトカイン濃度及びリン脂質転送PLTP活性のアッセイのために、GAUTIERらにより記載されたプロトコルに従って、後眼窩穿刺により血漿を回収した。最後に、最初のLPS注入後4日間にわたって致死率を記録した。図7は、組換えPLTP又はPBSバッファーの注入後のマウスにおける血漿リン脂質転送活性を示す。この血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容したマウスと比較して、組換えPLTP注入の30分後に顕著に高い。活性の増大は、最初のPLTP注入の90分後に消失するが、4時間の時点において起こる第3の注入の60分後に顕著なままである。同様に、t9hの時点において、血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容した動物と比較して、組換えPLTPを受容した動物において顕著に高い。t24時間の時点において、t8hの時点で最後の組換えPLTP注入を受けた動物は、PBSバッファーを受容した動物と比較して、血漿リン脂質転送活性の増大をもはや示さない。これらの結果は、PLTPKOマウスにおける外因性PLTPの注入が、60分オーダーの持続性を有する血漿リン脂質転送活性の顕著でかつ一過性の上昇をもたらすことを示す。サイトカインIL6、IL10、MCP1、IFNγ及びTNFαの産生に対する組換えPLTPの効果を研究するために、亜致死量のLPS腹腔内注入を一回受けている動物は、次いで、PBSバッファー又は組換えPLTPの数回の静脈内注入を受けた。イソフルランで麻酔した動物における後眼窩血液サンプルを、T0、T30min、T1h30min、T5h、T9h及びT24hの時点で回収し、サイトカインをアッセイした。結果を図8及び9により説明する。5mgkgのLPS単回用量の注入後、循環中のサイトカイン濃度は、研究した24時間の間に、最初の増加段階後に減少段階を有し、t24hにおいて、t0の時点においてPLTPKOマウスで測定されたバックグラウンド値をもたらす2段階の変動を辿る。組換えPLTPを受容したマウスにおいて、PBSを受容したマウスと比較して、循環中のIL6、IL10及びIFNγ濃度の顕著な減少が様々な時点で観察された。サイトカインIL6、IL10、MCP1、IFNγ及びTNFは、著しくより低いIL6及びIFNγ産生を伴う2段階曲線を示す。研究した24時間の間、曲線下面積の算出は、PBSを受容したマウスよりもむしろ静脈内経路により組換えPLTPを受容したマウスにおいて、著しく低い値のIL6及びIFNγを示す。死に対する外因性PLTPの効果を研究するために、15mgkgの単回致死量のLPSの腹腔内注入に続いて、LPS注入後t15分、t1h、t2h、t3h、t4h、t5h、t7hの時点における一連の外因性PLTP静脈内注入を行った。LPS注入後T0、T1h30min及びT6hの時点において、麻酔した動物の後眼窩血液サンプルを回収し、血漿リン脂質転送活性を測定した。動物の生存期間を並行して書き留めた。結果を図10及び11に説明する。図10に示されるように、血漿リン脂質転送活性は、PBSバッファーを受容したマウスと比較して、組換えPLTPを受容したマウスにおいて、2回目の注入の30分後に著しく高い。活性増大は、t6hの時点、すなわち組換えPLTPの4回目の注入後1時間において観察される。またも、これらの結果は、PLTPKOマウスにおける外因性PLTPの累積的注入が、少なくとも60分の持続性を有する血漿リン脂質転送活性の顕著でかつ一過性の上昇をもたらすことを示す。KaplanMeier曲線は、PBSバッファーを受容した動物と比較した、外因性の組換えPLTPを受容した動物の生存の延長を示す。生存の平均期間は、PBSを受容したマウスについて336±54hであり、PLTPを受容したマウスについて771±62hである。これらの結果は、一回のLPS腹腔内注入によりエンドトキシンショックに服した動物における外因性PLTP供給の有益な効果を立証する。LPS注入に続く最初の数時間の間の連続的なPLTP注入は、炎症性サイトカインの産生を著しく減少させ、生存を延長する。実施例7:PLTPノックアウトマウスのエンドトキシンショック予防におけるトランスジェニックウサギの乳から得られた活性型又は不活化されたヒトPLTPの使用実施例6において観察された死に対する外因性PLTPの効果を確認するために、単回致死量のLPS腹腔内注入に続いて、LPS注入後t1h、5h、10h、24h、32h、48h、56h、72h及び80hの時点において、実施例5に記載されるようにしてトランスジェニックウサギの乳から調製した組換えPLTPの一連の静脈内注入を行った。図12に表したように、時間の関数としての生存率を追跡した。活性型組換えPLTPの効果を、実施例5に従って精製した組換えPLTP製剤を2時間65°Cで加熱することにより不活化されたPLTPのそれと比較した。KaplanMeier曲線をカイ二乗検定により比較した。4日後、LPS及びその後不活化されたPLTPを注入された全てのマウスが死んだ。活性型組換えPLTPの注入は、動物の生存を非常に顕著に増大させることを可能にする。60を超えるマウスが持続的に死を免れた。したがって、外因性の活性型組換えPLTPの静脈内注入は、加熱により不活化された同一のPLTPとは対照的に、致死量のLPS注入を受けたPLTPKOマウスの生存を増大する。実施例4と同様、市販キットの助けを用いる蛍光によって、不活化されたPLTPのリン脂質転送活性を測定し、PBSバッファー、活性型組換えPLTP、野生型マウス血漿及びPLTPKOマウス血漿のものと比較した。図13に示す結果は、WTマウス血漿及び活性型組換えPLTPだけがリン脂質転送活性を検出することを可能にし、不活化された組換えPLTPは、PBSバッファー及びPLTPKOマウス血漿と同様に、顕著な活性をもたらさないことを示す。これらの結果は、一回のLPS腹腔内注入によりエンドトキシンショックに服した動物における外因性PLTP供給の有益な効果を確認する。LPS注入に続く最初の数時間の間のPLTPの連続注入は、生存を著しく延長する。