"配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号5;配列番号5の相補体;配列番号6;配列番号6の相補体;配列番号7;配列番号7の相補体;配列番号8;配列番号8の相補体;配列番号112;配列番号112の相補体;配列番号113;配列番号113の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;ならびに配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。配列番号1の全部または一部;配列番号1の相補体の全部または一部;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。少なくとも1つのヌクレオチド配列が、異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。配列番号50、配列番号93、配列番号94、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、および配列番号131からなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。少なくとも約50ヌクレオチドの長さである、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。少なくとも約100ヌクレオチドの長さである、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。少なくとも約100ヌクレオチドの長さである、請求項6に記載の単離ポリヌクレオチド。請求項1に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、植物体の形質転換ベクター。ディアブロティカDiabrotica属生物が、セイヨウトウモロコシ根虫DvvirgiferaLeConte;ノーザンコーンルートワームDbarberiSmithandLawrence;サザンコーンルートワームDuhowardi;メキシカンコーンルートワームDvzeae;D.バルテアータDbalteataLeConte;D.u.テネラDutenella;およびジュウイチホシウリハムシDuundecimpunctataMannerheimからなる群から選択される、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。リボ核酸RNA分子である、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。デオキシリボ核酸DNA分子である、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。配列番号136を含む、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチド。請求項11に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させる二本鎖リボ核酸分子。請求項12に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させる二本鎖リボ核酸分子。ポリヌクレオチド配列を鞘翅目有害生物と接触させることにより、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド配列と特異的に相補的な内因性のヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項13に記載の二本鎖リボ核酸分子。前記リボヌクレオチド分子を鞘翅目有害生物と接触させることにより、鞘翅目有害生物を死滅させるか、またはこれらの成長、生殖、および/もしくは摂食を阻害する、請求項15に記載の二本鎖リボ核酸分子。第1のポリヌクレオチド配列、第2のポリヌクレオチド配列、および第3のポリヌクレオチド配列を含み、第1のポリヌクレオチド配列が、請求項1に記載のポリヌクレオチドを含み、第3のポリヌクレオチド配列が、第2のポリヌクレオチド配列を介して第1のポリヌクレオチド配列に連結され、第3のポリヌクレオチド配列が、実質的に第1のポリヌクレオチド配列の逆相補体であり、リボ核酸へと転写されるとき、第1のポリヌクレオチド配列と第3のポリヌクレオチド配列とがハイブリダイズして二本鎖リボヌクレオチド分子を形成するようになる、請求項13に記載の二本鎖リボ核酸分子。第2のポリヌクレオチド配列が、配列番号136を含む、請求項17に記載の二本鎖リボ核酸分子。約50~約300ヌクレオチドの間の長さの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド。約50~約300ヌクレオチドの間の長さの二本鎖リボ核酸分子および一本鎖リボ核酸分子からなる群から選択される、請求項11に記載の単離ポリヌクレオチドの発現から生成させるリボ核酸分子。少なくとも1つのヌクレオチド配列が、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチドを含む植物体の形質転換ベクター。請求項1に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された細胞。原核細胞である、請求項22に記載の細胞。真核細胞である、請求項22に記載の細胞。植物細胞である、請求項24に記載の細胞。請求項1に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された植物体。単離ポリヌクレオチドを含む、請求項26に記載の植物体の種子。少なくとも1つのヌクレオチド配列を、二本鎖リボ核酸分子としてその中で発現させる、請求項26に記載の植物体。トウモロコシZeamays細胞である、請求項25に記載の細胞。トウモロコシZeamaysである、請求項26に記載の植物体。少なくとも1つのヌクレオチド配列を、植物体においてリボ核酸分子として発現させ、鞘翅目有害生物が植物体の一部を摂取すると、リボ核酸分子が、少なくとも1つのヌクレオチド配列と特異的に相補的な内因性の鞘翅目有害生物のヌクレオチド配列の発現を阻害する、請求項26に記載の植物体。配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号5;配列番号5の相補体;配列番号6;配列番号6の相補体;配列番号7;配列番号7の相補体;配列番号8;配列番号8の相補体;配列番号112;配列番号112の相補体;配列番号113;配列番号113の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;ならびに配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される複数のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。ヌクレオチド配列の各々が、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項32に記載の単離ポリヌクレオチドを含む植物体の形質転換ベクター。請求項32に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された細胞。請求項32に記載の単離ポリヌクレオチドで形質転換された植物体。複数のヌクレオチド配列を、二本鎖リボ核酸分子として植物細胞内で発現させる、請求項35に記載の植物体。トウモロコシZeamays細胞である、請求項34に記載の細胞。トウモロコシZeamaysである、請求項36に記載の植物体。鞘翅目有害生物がディアブロティカDiabrotica属種である、請求項31に記載の植物体。鞘翅目有害生物が、セイヨウトウモロコシ根虫DvirgiferavirgiferaLeConte、ノーザンコーンルートワームDbarberiSmithandLawrence、メキシカンコーンルートワームDvirgiferazeaeKrysanandSmith、サザンコーンルートワームDundecimpunctatahowardiBarber、D.バルテアータDbalteataLeConte、D.ウンデキンプンクタタテネラDundecimpunctatatenella、およびジュウイチホシウリハムシDundecimpunctataundecimpunctataMannerheimからなる群から選択される、請求項39に記載の植物体。請求項30に記載の植物体から生成させる作物生成物であって、検出可能量の、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチドを含む作物生成物。鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物と接触させると鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能する二本鎖リボ核酸分子を含む作用物質を施すステップを含み、作用物質が、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法。鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物と接触させると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能する、第1のポリヌクレオチド配列および第2のポリヌクレオチド配列を含む作用物質を施すステップを含み、第1のポリヌクレオチド配列が、配列番号2の約19~約30の連続ヌクレオチドに対する約90~約100の配列同一性を呈示する領域を含み、第1のポリヌクレオチド配列が、第2のポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする方法。第1のポリヌクレオチド配列が、配列番号1を含むディアブロティカDiabrotica属遺伝子;液胞ATPアーゼのHサブユニット;およびRho1低分子GTP結合タンパク質からなる群から選択される鞘翅目有害生物遺伝子の約19~約30の連続ヌクレオチドに対する約90~約100の配列同一性を呈示する領域をさらに含む、請求項39に記載の方法。鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む形質転換された植物細胞を、鞘翅目有害生物の宿主植物体に施すステップを含み、ポリヌクレオチドを発現させて、集団に属する鞘翅目有害生物と接触させると鞘翅目有害生物における標的配列の発現を阻害するように機能し、鞘翅目有害生物または鞘翅目有害生物の集団の成長の、形質転換された植物細胞を欠く同じ種の宿主植物体における成長と比べた減殺を結果としてもたらすリボ核酸分子を生成させる方法。リボ核酸分子が二本鎖リボ核酸分子である、請求項45に記載の方法。鞘翅目有害生物の集団が、形質転換された植物細胞を欠く同じ種の宿主植物体に発生する鞘翅目有害生物の集団と比べて低減される、請求項45に記載の方法。植物体における植物鞘翅目有害生物の発生を防除する方法であって、鞘翅目有害生物の食餌中に、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを施すステップを含む方法。食餌が、ポリヌクレオチドを発現させるように形質転換された植物細胞を含む、請求項48に記載の方法。穀物トウモロコシの収率を改善する方法であって、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをトウモロコシ植物体へと導入して、トランスジェニックのトウモロコシ植物体を生成させるステップと;トウモロコシ植物体を栽培して、少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現させるステップとを含み、少なくとも1つのヌクレオチド配列の発現により、鞘翅目有害生物の感染または成長および鞘翅目有害生物の感染に起因する収率の損失を阻害する方法。少なくとも1つのヌクレオチド配列の発現により、トウモロコシ植物体の一部に接触した鞘翅目有害生物における、少なくとも第1の標的遺伝子を抑制するRNA分子を生成させる、請求項50に記載の方法。トランスジェニック植物細胞を生成させる方法であって、植物細胞を、プロモーターおよび転写終結配列に作動的に連結されたポリヌクレオチドであって、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換するステップと、形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと;少なくとも1つのヌクレオチド配列をそれらのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと;形質転換された植物細胞を、少なくとも1つのヌクレオチド配列によりコードされるリボ核酸分子の発現についてスクリーニングするステップと;dsRNAを発現させる植物細胞を選択するステップとを含む方法。鞘翅目有害生物抵抗性のトランスジェニック植物体を生成させる方法であって、請求項52に記載の方法を介して生成させたトランスジェニック植物細胞をもたらすステップと;トランスジェニック植物体をトランスジェニック植物細胞から再生させるステップとを含み、少なくとも1つのヌクレオチド配列によりコードされるリボ核酸分子の発現が、形質転換された植物体に接触する鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに十分な方法。配列番号2;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号112;配列番号113;および配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含み、ディアブロティカDiabrotica属遺伝子の少なくとも19の連続ヌクレオチドを有する断片からなる群から選択される基準ポリヌクレオチドと実質的に相同な少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む単離核酸。ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも80同一な、請求項54に記載の単離核酸。ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも90同一な、請求項54に記載の単離核酸。ポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドと少なくとも95同一な、請求項54に記載の単離核酸。配列番号2が、中程度の厳密性の条件下で少なくとも1つのポリヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項54に記載の単離核酸。配列番号2が、高度な厳密性の条件下で少なくとも1つのポリヌクレオチドとハイブリダイズする、請求項54に記載の単離核酸。請求項54に記載の単離核酸を含む、植物細胞、植物組織、植物部分、または植物体。本明細書では、例えば、セイヨウトウモロコシ根虫DvvirgiferaLeContewesterncornrootworm:WCR;ノーザンコーンルートワームDbarberiSmithandLawrencenortherncornrootworm:NCR;サザンコーンルートワームDuhowardiBarbersoutherncornrootworm:SCR;メキシカンコーンルートワームDvzeaeKrysanandSmithMexicancornrootworm:MCR;D.バルテアータDbalteataLeConte;D.u.テネラDutenella;およびジュウイチホシウリハムシDuundecimpunctataMannerheimを含めた鞘翅目有害生物を防除するための核酸分子例えば、標的遺伝子、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA、およびそれらを用いる方法が開示される。具体例では、鞘翅目有害生物における1または複数の天然の核酸配列の少なくとも一部と相同でありうる例示的な核酸分子が開示される。これらの例およびさらなる例では、天然の核酸配列は、標的遺伝子であって、その産物が、例えば、かつ、限定せずに述べると、代謝過程に関与する場合もあり、生殖過程に関与する場合もあり、幼虫の発育に関与する場合もある、標的遺伝子でありうる。一部の例では、標的遺伝子の発現に対する、それと相同な配列を含む核酸分子による翻訳後阻害は、鞘翅目有害生物において致死性の場合もあり、成長および/または生殖の減殺を結果としてもたらす場合もある。具体例では、D_vir_c47185_Caf1180;D_vir_c1229_VatpaseC;D_vir_c1319_VatpaseH;およびContig_01_Rho1_1-191_CDC42からなるリストから選択される少なくとも1つの遺伝子を、転写後サイレンシングのための標的遺伝子として選択することができる。特定の例では、翻訳後阻害に有用な標的遺伝子が、本明細書でD_vir_c1229_VatpaseC配列番号2と称するヌクレオチド配列またはその相同体を含む、液胞ATPアーゼのCサブユニットである。したがって、本明細書では、D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2の配列、その相補体、およびこれらのいずれかの特定の新規の断片を含む単離核酸分子が開示される。また、標的遺伝子産物例えば、D_vir_c47185_Caf1180;D_vir_c1229_VatpaseC;D_vir_c1319_VatpaseH;およびContig_01_Rho1_1-191_CDC42からなる群から選択される遺伝子の産物内のアミノ酸配列と少なくとも85同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も開示される。特定の例では、核酸分子が、本明細書でD_vir_c1229_VatpaseC配列番号2と称するヌクレオチド配列またはその相同体を含む、液胞ATPアーゼのCサブユニットの遺伝子によりコードされるポリペプチド内のアミノ酸配列と少なくとも85同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子産物内のアミノ酸配列と少なくとも85同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列を含む核酸分子もさらに開示される。また、鞘翅目有害生物の標的遺伝子、例えば、D_vir_c47185_Caf1180;D_vir_c1229_VatpaseC;D_vir_c1319_VatpaseH;および/またはContig_01_Rho1_1-191_CDC42の全部または一部と相補的なiRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子を生成させるのに用いられうるcDNA配列も開示される。具体的な実施形態では、dsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNAを、植物または細菌などの遺伝子改変生物を介して、invitroまたはinvivoにおいて生成させることができる。具体例では、D_vir_c1229_VatpaseC、またはその特定の新規の断片と相補的なiRNA分子を生成させるのに用いうるcDNA分子が開示される。鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段、および鞘翅目有害生物に対する抵抗性を植物体にもたらす手段もさらに開示される。鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段は、配列番号7、8、10、11、49、50、86、87、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、127、128、129、130、131のうちのいずれか、またはその相補体からなる一本鎖RNA分子または二本鎖RNA分子である。鞘翅目有害生物に対する抵抗性を植物体にもたらす手段は、プロモーターに作動可能に連結された、鞘翅目有害生物において不可欠な遺伝子の発現を阻害する手段をコードする核酸配列を含むDNA分子であって、トウモロコシ植物体のゲノムへと組み込むことが可能なDNA分子である。鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能するiRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子を鞘翅目有害生物に施すステップを含み、iRNA分子が、配列番号1;配列番号1の相補体;配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号1~4のうちのいずれかの全部または一部を含むディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号1~4のうちのいずれかの全部または一部を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号1~4のうちのいずれかの全部または一部を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;および配列番号1~4のうちのいずれかの全部または一部を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全部または一部を含む方法が開示される。具体例では、鞘翅目有害生物の集団を防除する方法であって、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における生物学的機能を阻害するように機能するiRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子を鞘翅目有害生物に施すステップを含み、iRNA分子が、配列番号1の全部または一部;配列番号1の全部または一部の相補体;配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号5の全部または一部;配列番号5の相補体の全部または一部;配列番号6の全部または一部;配列番号6の相補体の全部または一部;配列番号7;配列番号7の相補体;配列番号8;配列番号8の相補体;配列番号112;配列番号112の相補体;配列番号113;配列番号113の相補体;配列番号1を含むディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列の全部または一部;配列番号1を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体の全部または一部;配列番号1を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の全部または一部;および配列番号1を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体の全部または一部からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む方法が開示される。本明細書ではまた、食餌ベースのアッセイにおいて、またはdsRNA、siRNA、miRNA、および/もしくはhpRNAを発現させる遺伝子改変された植物細胞において、dsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNAを、鞘翅目有害生物に施しうる方法も開示される。これらの例およびさらなる例では、dsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNAを、鞘翅目有害生物の幼虫に摂取させることができる。次いで、本発明のdsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNAを摂取させる結果として、幼虫においてRNAiをもたらすことができ、これにより、鞘翅目有害生物の生存能力に不可欠な遺伝子のサイレンシングを結果としてもたらし、最終的には幼虫の死滅をもたらすことができる。したがって、鞘翅目有害生物の防除に有用な、例示的な核酸配列複数可を含む核酸分子を鞘翅目有害生物に施す方法が開示される。具体例では、本発明の核酸分子を用いることにより防除される鞘翅目有害生物がWCRまたはNCRでありうる。前出の特色および他の特色は、付属の図を参照して記載されている、以下のいくつかの実施形態についての詳細な説明から一層明らかとなろう。I.いくつかの実施形態の概観本明細書では、鞘翅目有害生物の発生を遺伝子的に防除するための方法および組成物が開示される。また、鞘翅目有害生物の集団のRNAiを介する防除のための標的遺伝子として用いられる、鞘翅目有害生物の生活環に不可欠な1または複数の遺伝子を同定する方法も提供される。成長、生存、発育、および/または生殖に不可欠な1または複数の標的遺伝子を抑制するために、dsRNA分子をコードするDNAプラスミドベクターをデザインすることができる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子のコード配列または非コード配列と相補的な核酸分子を介する、標的遺伝子の発現の転写後抑制または標的遺伝子の阻害のための方法が提供される。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物に、標的遺伝子のコード配列または非コード配列と相補的な核酸分子の全部または一部から転写される、1または複数のdsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNA分子を摂取させ、これにより、植物保護効果をもたらすことができる。したがって、一部の実施形態は、標的遺伝子産物の発現に対する配列特異的な阻害を伴い、標的遺伝子複数可のコード配列および/または非コード配列と相補的なdsRNA、siRNA、miRNAおよび/またはhpRNAを用いて、鞘翅目有害生物の少なくとも部分的な防除を達成する。例えば、配列番号1~8、50、93、94、98~103、111~113、および127~131のうちの1つに示されるヌクレオチド配列およびその断片を含む、単離および精製された核酸分子のセットが開示される。一部の実施形態では、安定化させたdsRNA分子例えば、配列番号117~120を、これらの配列もしくはそれらの断片、またはこれらの配列のうちの1つを含む遺伝子から、標的遺伝子の転写後サイレンシングまたは阻害のために発現させることができる。特定の実施形態では、単離および精製された核酸分子が、配列番号2および/または配列番号5および6のいずれかの全部または一部を含む。一部の実施形態は、そのゲノム内に少なくとも1つのiRNA例えば、dsRNA分子をコードする少なくとも1つの組換えDNA配列を有する組換え宿主細胞例えば、植物細胞を伴う。具体的な実施形態では、dsRNA分子複数可を発現させ、鞘翅目有害生物に摂取させて、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を転写後サイレンシングさせるかまたは阻害することができる。組換えDNA配列は、例えば、配列番号1~8、50、93、94、98~103、111~113、および127~131のうちのいずれか、配列番号1~8、50、93、94、98~103、111~113、および127~131のうちのいずれかの断片、もしくは配列番号1~8、50、93、94、98~103、111~113、および127~131のうちの1つを含む遺伝子の部分的な配列、またはこれらの相補体を含みうる。具体的な実施形態は、そのゲノム内に、配列番号2および/または配列番号5および6のいずれかの全部または一部を含む、少なくとも1つのiRNA例えば、dsRNA分子をコードする組換えDNA配列を有する組換え宿主細胞を伴う。鞘翅目有害生物に摂取させると、iRNA分子複数可は、鞘翅目有害生物における、配列番号2、5~8、112、および113を含む標的液胞ATPアーゼのCサブユニット遺伝子の発現をサイレンシングさせるかまたは阻害し、これにより、鞘翅目有害生物における成長、発育、生殖、および/または摂食の停止を結果としてもたらすことができる。一部の実施形態では、そのゲノム内に少なくとも1つのdsRNA分子をコードする少なくとも1つの組換えDNA配列を有する組換え宿主細胞が、形質転換された植物細胞でありうる。一部の実施形態は、このような形質転換された植物細胞を含むトランスジェニック植物体を伴う。このようなトランスジェニック植物体に加えて、それらの各々が組換えDNA配列複数可を含む、任意のトランスジェニック植物世代の後代植物体、トランスジェニック種子、およびトランスジェニック植物生成物の全てが提供される。具体的な実施形態では、本発明のdsRNA分子を、トランスジェニック植物細胞において発現させることができる。したがって、これらの実施形態および他の実施形態では、本発明のdsRNA分子を、トランスジェニック植物細胞から単離することができる。具体的な実施形態では、トランスジェニック植物が、トウモロコシcornZeamays、ダイズsoybeanGlycinemax、およびイネPoaceae科の植物を含む群から選択される植物である。一部の実施形態は、鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法を伴う。これらの実施形態および他の実施形態では、dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供することができる。具体的な実施形態では、dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を、プロモーターに作動的に連結することができ、また、転写終結配列にも作動的に連結することができる。具体的な実施形態では、鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法は、a植物細胞を、dsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換するステップと;b形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を含む植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと;cベクターをそのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと;d選択された形質転換植物細胞が、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるdsRNA分子を含むことを決定するステップとを含みうる。植物は、そのゲノムにベクターを組み込み、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるdsRNA分子を含む植物細胞から再生させることができる。したがって、また、そのゲノムに組み込んだdsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含むトランスジェニック植物体であって、ベクターのヌクレオチド配列によりコードされるdsRNA分子を含むトランスジェニック植物体も開示される。具体的な実施形態では、植物におけるdsRNA分子の発現が、例えば、形質転換された植物体、植物体の一部例えば、根、または植物細胞の摂食を介して、形質転換された植物体または植物細胞に接触する鞘翅目有害生物の細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートするのに十分である。本明細書で開示されるトランスジェニック植物体は、鞘翅目有害生物の発生に対する抵抗性および/または増強した耐性を提示しうる。特定のトランスジェニック植物体は、WCR;NCR;SCR;MCR;D.バルテアータDbalteataLeConte;D.u.テネラDutenella;およびジュウイチホシウリハムシDuundecimpunctataMannerheimからなる群から選択される、1または複数の鞘翅目有害生物に対する抵抗性および/または増強した耐性を提示しうる。本明細書ではまた、iRNA分子などの防除剤を、鞘翅目有害生物へと送達する方法も開示される。このような防除剤は、鞘翅目有害生物が、摂食するか、成長するか、または宿主に対して他の形で虫害を引き起こす能力の障害を、直接的または間接的に引き起こしうる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における少なくとも1つの標的遺伝子を抑制する安定化dsRNA分子を鞘翅目有害生物へと送達し、これにより、鞘翅目有害生物による植物の虫害を軽減するかまたは消失させることを含む方法が提供される。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害する方法が、鞘翅目有害生物における成長、発育、生殖、および/または摂食の停止を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、方法は、最終的に鞘翅目有害生物の死滅を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、本発明のiRNA例えば、dsRNA分子を含む組成物例えば、局所組成物であって、植物、動物、および/または植物環境もしくは動物環境において用いられて鞘翅目有害生物の発生の消失または低減を達成する組成物が提供される。具体的な実施形態では、組成物は、鞘翅目有害生物へと施される栄養組成物または食餌供給源でありうる。一部の実施形態は、栄養組成物または食餌供給源を鞘翅目有害生物に摂食可能とするステップを含む。iRNA分子を含む組成物の摂取は、鞘翅目有害生物の1または複数の細胞を介する分子の取込みを結果としてもたらすことが可能であり、鞘翅目有害生物の細胞複数可における少なくとも1つの標的遺伝子の発現の阻害を結果としてもたらしうる。本発明のiRNA分子を含む1または複数の組成物を鞘翅目有害生物の宿主に施すことにより、鞘翅目有害生物が存在する任意の宿主組織または環境において、鞘翅目有害生物による植物体もしくは植物細胞の摂取、または植物体もしくは植物細胞に対する虫害を制限するかまたは消失させることができる。本明細書で開示される組成物および方法を、鞘翅目有害生物による虫害を防除するための他の方法および組成物と組み合わせて併せて用いることができる。例えば、植物を鞘翅目有害生物から保護するための、本明細書で説明されるiRNA分子は、1または複数の、鞘翅目有害生物に対して効果的な化学的薬剤、鞘翅目有害生物に対して効果的なバイオ殺虫剤、輪作、または本発明のRNAiを介する方法およびRNAi組成物の特色とは異なる特色を呈示する組換え遺伝子法例えば、植物における、鞘翅目有害生物に有害なタンパク質例えば、Btトキシンの組換え生成の使用をさらに含む方法において用いることができる。II.略記法dsRNA二本鎖リボ核酸GI成長阻害NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationgDNAゲノムDNAiRNA阻害的リボ核酸ORFオープンリーディングフレームRNAiリボ核酸干渉miRNA阻害性マイクロリボ核酸siRNA低分子阻害性リボ核酸hpRNAヘアピンリボ核酸UTR非翻訳領域WCRセイヨウトウモロコシ根虫westerncornrootwormDiabroticavirgiferavirgiferaLeConteNCRノーザンコーンルートワームnortherncornrootwormDiabroticabarberiSmithandLawrenceMCRメキシカンコーンルートワームMexicancornrootwormDiabroticavirgiferazeaeKrysanandSmithPCRポリメラーゼ連鎖反応RISCRNA誘導サイレンシング複合体SCRサザンコーンルートワームsoutherncornrootwormDiabroticaundecimpunctatahowardiBarberIII.用語後続する記載および表では、多数の用語を用いる。このような用語により与えられる範囲を含め、本明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解をもたらすために、以下の定義が提供される。鞘翅目有害生物:本明細書で用いられる鞘翅目有害生物という用語は、ディアブロティカDiabrotica属の害虫であって、トウモロコシおよび他のイネ科の植物を常食とする害虫を指す。具体例では、鞘翅目有害生物が、セイヨウトウモロコシ根虫DvvirgiferaLeConteWCR;ノーザンコーンルートワームDbarberiSmithandLawrenceNCR;サザンコーンルートワームDuhowardiSCR;メキシカンコーンルートワームDvzeaeMCR;D.バルテアータDbalteataLeConte;D.u.テネラDutenella;およびジュウイチホシウリハムシDuundecimpunctataMannerheimを含むリストから選択される。接触生物との:核酸分子に関して本明細書で用いられる、生物例えば、鞘翅目有害生物との接触または生物例えば、鞘翅目有害生物による取込みという用語は、核酸分子の生物への内部化を包含し、例えば、かつ、限定せずに述べると、これには、生物による分子の摂取例えば、摂食を介する;生物を、核酸分子を含む組成物と接触させること;および、生物を、核酸分子を含む溶液により浸漬することが含まれる。コンティグ:本明細書で用いられるコンティグという用語は、単一の遺伝子供給源に由来する、重複するDNAセグメントのセットから再構築されたDNA配列を指す。トウモロコシ植物体:本明細書で用いられるトウモロコシ植物体という用語は、種であるトウモロコシZeamaysmaizeの植物体を指す。発現:本明細書で用いられる、コード配列例えば、遺伝子またはトランス遺伝子の発現とは、核酸転写単位のコードされる情報例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含めたが、タンパク質の合成を包含することが多い、細胞の作動的部分、非作動的部分、または構造的部分へと転換される過程を指す。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、細胞、組織、または生物の、遺伝子発現を増大または減少させる作用物質への曝露の影響を受ける場合がある。遺伝子の発現はまた、DNA→RNA→タンパク質の経路のいずれの地点においても調節されうる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、RNAの輸送およびプロセシング、mRNAなどの中間的分子の分解、または、それらが作製された後における特異的なタンパク質分子の活性化、不活化、局在化、もしくは分解に作用する制御を介して生じる場合もあり、これらの組合せを介して生じる場合もある。遺伝子発現は、限定せずに述べると、ノーザンブロット、RT-PCR、ウェスタンブロット、またはinvitro、insitu、もしくはinvivoにおけるタンパク質活性アッセイ複数可が含まれる、当技術分野で知られる任意の方法により、RNAレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。遺伝物質:本明細書で用いられる遺伝物質という用語は、全ての遺伝子、ならびにDNAおよびRNAなどの核酸分子を包含する。阻害:コード配列例えば、遺伝子に対する効果について記載するのに用いる場合に本明細書で用いられる阻害という用語は、コード配列から転写されるmRNAおよび/またはコード配列のペプチド産物、ポリペプチド産物、もしくはタンパク質産物の細胞内レベルの測定可能な低下を指す。一部の例では、発現をほぼ消失させるように、コード配列の発現を阻害することができる。特異的な阻害とは、特異的な阻害が達成される細胞における他のコード配列例えば、遺伝子の発現に結果的に影響を及ぼすことのない、標的コード配列の阻害を指す。単離された:単離された生物学的成分核酸またはタンパク質などのは、この成分が自然発生するnaturallyoccurs生物の細胞における他の生物学的成分、すなわち、他の染色体内DNAおよび染色体内RNAならびに染色体外DNAおよび染色体外RNAならびにタンパク質から実質的に分離されているか、これらとは別に生成しているか、またはこれらとは隔絶して精製されている。単離された核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法を介して精製される核酸分子およびタンパク質を包含する。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現を介して調製される核酸およびタンパク質のほか、化学合成される核酸分子、タンパク質、およびペプチドも包含する。核酸分子:本明細書で用いられる核酸分子という用語は、ヌクレオチドのポリマー形態を指す場合があり、これは、RNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーを包含しうる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す場合がある。本明細書で用いられる核酸分子は、核酸およびポリヌクレオチドと同義である。別段に指定しない限り、核酸分子は、通常少なくとも10塩基の長さである。核酸分子のヌクレオチド配列は、慣例により、分子の5’端から3’端へと読み取られる。ヌクレオチド配列の相補体とは、ヌクレオチド配列のヌクレオ塩基による塩基対すなわち、A-T/U、およびG-Cを形成する、ヌクレオ塩基の5’側から3’側への配列を指す。核酸配列の逆相補体とは、ヌクレオチド配列のヌクレオ塩基による塩基対を形成する、ヌクレオ塩基の3’側から5’側への配列を指す。核酸分子は、DNAの一本鎖形態および二本鎖形態;RNAの一本鎖形態;ならびにRNAの二本鎖形態dsRNAを包含する。ヌクレオチド配列または核酸配列という用語は、個別の一本鎖または二重鎖としての核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を指す。リボ核酸RNAという用語は、iRNA阻害的RNA、dsRNA二本鎖RNA、siRNA低分子干渉RNA、mRNAメッセンジャーRNA、miRNAマイクロRNA、hpRNAヘアピンRNA、tRNA転移RNA対応するアシル化アミノ酸により帯電している場合であれ、帯電していない場合であれ、およびcRNA相補的RNAを包含する。デオキシリボ核酸DNAという用語は、cDNA、ゲノムDNA、およびDNA-RNAハイブリッド体を包含する。核酸セグメントおよびヌクレオチド配列セグメント、またはより一般にセグメントという用語は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしたかまたはコードするように適合させうる、ゲノム配列、リボソームRNA配列、転移RNA配列、メッセンジャーRNA配列、オペロン配列、および操作された低分子ヌクレオチド配列の全てを包含する機能的な用語として当業者により理解されるであろう。オリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドとは、短鎖の核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントを切断することにより形成することもでき、個別のヌクレオチド前駆体を重合化することにより形成することもできる。自動式合成器は、数百塩基対の長さまでのオリゴヌクレオチドの合成を可能とする。オリゴヌクレオチドは、相補的なヌクレオチド配列に結合しうるため、DNAまたはRNAを検出するためのプローブとして用いることができる。DNAからなるオリゴヌクレオチドオリゴデオキシリボヌクレオチドは、DNA配列およびRNAcDNAへと逆転写される配列を増幅するための技法であるPCRにおいて用いることができる。PCRでは、オリゴヌクレオチドを典型的にプライマーと称し、DNAポリメラーゼにオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を複製させる。核酸分子は、天然ヌクレオチド結合および/または非天然ヌクレオチド結合を介して併せて連結された、天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの一方または両方を包含しうる。核酸分子は、化学的または生化学的に修飾される場合もあり、当業者に容易に理解される通り、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有する場合もある。例えば、このような修飾には、標識、メチル化、天然ヌクレオチドのうちの1または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾例えば、非帯電結合:例えば、リン酸メチル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、カルバメート結合など;帯電結合:例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合など;懸垂部分:例えば、ペプチド;挿入剤:例えば、アクリジン、ソラーレンなど;キレート化剤;アルキル化剤;および修飾された結合:例えば、αアノマー核酸などが含まれる。核酸分子という用語はまた、一本鎖立体構成、二本鎖立体構成、部分的二重鎖立体構成、三重鎖立体構成、ヘアピン状立体構成、環状立体構成、およびパッドロック状立体構成を含めた任意の位相的立体構成も包含する。DNAに関して本明細書で用いられるコード配列、構造的ヌクレオチド配列、または構造的核酸分子という用語は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写およびmRNAを介して、ポリペプチドへと最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。RNAに関するコード配列という用語は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、5’末端における翻訳開始コドンおよび3’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コード配列には、ゲノムDNA、cDNA、EST、および組換えヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。ゲノム:本明細書で用いられるゲノムという用語は、細胞の核内で見出される染色体DNAを指し、また、細胞の細胞内成分中に見出される細胞小器官DNAも指す。本発明の一部の実施形態では、DNA分子が植物細胞のゲノム内に組み込まれるように、DNA分子を植物細胞に導入することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、DNA分子を、植物細胞の核DNAへと組み込むこともでき、植物細胞の葉緑体DNAまたはミトコンドリアDNAへと組み込むこともできる。細菌に適用される場合のゲノムという用語は、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を指す。本発明の一部の実施形態では、DNA分子が細菌のゲノム内に組み込まれるように、DNA分子を細菌に導入することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、DNA分子が、染色体に組み込まれる場合もあり、安定的プラスミドとして配置される場合もあり、安定的プラスミド内に配置される場合もある。配列同一性:2つの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で用いられる配列同一性または同一性という用語は、指定された比較域にわたる対応が最大となるようにアラインした場合に同じである2つの配列における残基を指す。本明細書で用いられる配列同一性の百分率という用語は、比較域にわたり最適にアラインされた2つの配列例えば、核酸配列を比較することにより決定された値を指す場合があり、比較域内の配列の一部は、2つの配列の最適のアライメントのための基準配列付加または欠失を含まないと比較して、付加または欠失すなわち、ギャップを含みうる。同一なヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較域内の位置の総数で除し、結果に100を乗じ、配列同一性の百分率を得ることにより、百分率を計算する。基準配列と比較して全ての位置において同一な配列を、基準配列と100同一であるといい、この逆もまた成り立つ。当技術分野では、配列を比較のためにアラインする方法がよく知られている。例えば、SmithおよびWaterman1981、AdvApplMath2482;NeedlemanおよびWunsch1970、JMolBiol48443;PearsonおよびLipman1988、ProcNatlAcadSciUSA852444;HigginsおよびSharp1988、Gene73237~44;HigginsおよびSharp1989、CABIOS5151~3;Corpetら1988、NucleicAcidsRes1610881~90;Huangら1992、CompApplBiosci8155~65;Pearsonら1994、MethodsMolBiol24307~31;Tatianaら1999、FEMSMicrobiolLett174247~50において、多様なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが記載されている。配列アライメント法および相同性の計算についての詳細な検討は、例えば、Altschulら1990、JMolBiol215403~10において見出すことができる。NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBIによるBasicLocalAlignmentSearchToolBLAST商標;Altschulら1990は、いくつかの配列解析プログラムとの関連で用いるために、NationalCenterforBiotechnologyInformationBethesda、MDおよびインターネット上を含めたいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを用いてどのようにして配列同一性を決定するかについての説明は、インターネット上のBLAST商標についてのヘルプセクション下で入手可能である。核酸配列を比較するためには、デフォルトのパラメータに設定されたデフォルトのBLOSUM62行列を用いて、BLAST商標BLASTnプログラムのBLAST2配列関数を使用することができる。この方法を介して評価する場合、基準配列に対する類似性がさらに大きな核酸配列は、同一性百分率の増大を示す。特異的にハイブリダイズ可能な/特異的に相補的な:本明細書で用いられる特異的にハイブリダイズ可能なおよび特異的に相補的なという用語は、核酸分子と標的核酸分子との間で安定的で特異的な結合が生じるように、十分な程度の相補性を示す用語である。2つの核酸分子間におけるハイブリダイゼーションは、2つの核酸分子の核酸配列間におけるアンチパラレルアライメントの形成を伴う。次いで、2つの分子は、向かい合う鎖における対応する塩基と水素結合を形成して、十分に安定であれば当技術分野でよく知られる方法を用いて検出可能な二重鎖分子を形成することが可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列と100相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるために存在しなければならない配列相補性の大きさは、用いられるハイブリダイゼーション条件の関数である。結果として特定の程度の厳密性をもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択したハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズさせる核酸配列の組成および長さに応じて変化する。洗浄回数および洗浄緩衝液の組成もまた厳密性に影響を及ぼすが、一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度とりわけNa濃度および/またはMg濃度が、ハイブリダイゼーションの厳密性を決定する。当業者には、特定の程度の厳密性を達成するのに要請されるハイブリダイゼーション条件に関する計算が知られており、例えば、Sambrookら編、MolecularCloningALaboratoryManual、2版、1~3巻、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、1989、9および11章;ならびにHamesおよびHiggins編、NucleicAcidHybridization、IRLPress、Oxford、1985において論じられている。核酸ハイブリダイゼーションに関するさらに詳細な指示および指針は、例えば、Tijssen、Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays、LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiologyHybridizationwithNucleicAcidProbes、I部、2章、Elsevier、NY、1993;およびAusubelら編、CurrentProtocolsinMolecularBiology、2章、GreenePublishingandWileyInterscience、NY、1995において見出すことができる。本明細書で用いられる厳密な条件は、ハイブリダイゼーション分子と標的核酸分子内の相同な配列との間のミスマッチが20未満である場合に限りハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。厳密な条件は、さらなる特定のレベルの厳密性も包含する。したがって、本明細書で用いられる中程度の厳密性条件とは、配列のミスマッチが20を超える分子はハイブリダイズしない条件であり;高度な厳密性の条件とは、ミスマッチが10を超える配列はハイブリダイズしない条件であり;極めて高度な厳密性の条件とは、ミスマッチが5を超える配列はハイブリダイズしない条件である。以下は、代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。高度な厳密性の条件少なくとも90の配列同一性を共有する配列を検出する:5×のSSC緩衝液中65°Cで16時間にわたるハイブリダイゼーション;2×のSSC緩衝液中室温で15分間ずつ2回にわたる洗浄;0.5×のSSC緩衝液中65°Cで20分間ずつ2回にわたる洗浄。中程度の厳密性の条件少なくとも80の配列同一性を共有する配列を検出する:5×~6×のSSC緩衝液中65~70°Cで16~20時間にわたるハイブリダイゼーション;2×のSSC緩衝液中室温で5~20分間ずつ2回にわたる洗浄;1×のSSC緩衝液中55~70°Cで30分間ずつ2回にわたる洗浄。厳密でない制御条件少なくとも50の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする:6×のSSC緩衝液中室温~55°Cで16~20時間にわたるハイブリダイゼーション;2×~3×のSSC緩衝液中室温~55°Cで20~30分間ずつ少なくとも2回にわたる洗浄。連続核酸配列に関して本明細書で用いられる実質的に相同なまたは実質的な相同性という用語は、厳密な条件下で基準核酸配列とハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を指す。例えば、配列番号1~6のうちのいずれかの基準核酸配列と実質的に相同な核酸配列とは、厳密な条件例えば、前出で示した中程度の厳密性の条件下で、配列番号1~6のうちのいずれかの基準核酸配列とハイブリダイズする核酸配列である。実質的に相同な配列は、少なくとも80の配列同一性を有しうる。例えば、実質的に相同な配列は、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94約95、約96、約97、約98、約98.5、約99、約99.5;および約100など、約80~100の配列同一性を有しうる。実質的な相同性の特性は、特異的なハイブリダイゼーションと密接に関連する。例えば、特異的結合が所望される条件下で、例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件下で核酸の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が認められる場合、核酸分子は特異的にハイブリダイズ可能である。本明細書で用いられるオルソログという用語は、一般的なヌクレオチドの祖先配列から生じ、2つ以上の種において同じ機能を保持しうる、2つ以上の種における遺伝子を指す。5’→3’方向で読み取られる配列の全てのヌクレオチドが、3’→5’方向で読み取られる場合の他の配列の全てのヌクレオチドと相補的である場合、本明細書で用いられる2つの核酸配列による分子は、完全な相補性を呈示するという。基準ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列の逆相補体配列と同一な配列を呈示する。当技術分野では、これらの用語および説明が十分に定義されており、当業者により容易に理解される。作動可能に連結された:第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係にある場合、第1のヌクレオチド配列は、第2の核酸配列と作動可能に連結されている。組換えにより生成させる場合、作動可能に連結した核酸配列は一般に連続であり、2つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合は、同じリーディングフレームにおいて例えば、ポリシストロニックのORFにおいて連続である。しかし、作動可能に連結するのに、核酸が連続である必要はない。制御配列およびコード配列に言及して用いられる場合の作動可能に連結されたという用語は、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。調節配列または制御エレメントとは、転写のタイミングおよびレベル/量、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終結配列、ポリアデニル化認識配列などを包含しうる。特定の調節配列は、それと作動可能に連結されたコード配列の上流および/または下流に配置することができる。また、コード配列に作動可能に連結された特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖に配置することもできる。プロモーター:本明細書で用いられるプロモーターという用語は、転写の開始点から上流に位置することが可能であり、転写を開始するためのRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与しうるDNAの領域を指す。プロモーターは、細胞において発現させるためのコード配列に作動可能に連結することもでき、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し、これを、細胞において発現させるためのコード配列に作動可能に連結することもできる。植物プロモーターとは、植物細胞における転写を誘発することが可能なプロモーターでありうる。発生制御developmentalcontrol下にあるプロモーターの例には、葉、根、種子、線維、木部導管、仮道管、または厚膜組織など、特定の組織における転写を優先的に誘発するプロモーターが含まれる。このようなプロモーターは、組織に好ましいと言われる。特定の組織だけにおける転写を誘発するプロモーターは、組織特異的と言われる。細胞型特異的プロモーターは、主に、1または複数の器官の特定の細胞型、例えば、根または葉の維管束細胞における発現を駆動する。誘導的プロモーターは、環境制御下にありうるプロモーターの場合がある。誘導的プロモーターを介する転写を誘発しうる環境条件の例には、嫌気的条件および光の存在が含まれる。組織特異的プロモーター、組織に好ましいプロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導的プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターとは、大半の環境条件の下で、または大半の細胞型もしくは組織型において活性でありうるプロモーターである。本発明の一部の実施形態では、任意の誘導的プロモーターを用いることができる。Wardら1993、PlantMolBiol22361~366を参照されたい。誘導的プロモーターにより、誘導作用物質に応答する転写速度を増大させる。例示的な誘導的プロモーターには、銅に応答するACEI系に由来するプロモーター;ベンゼンスルホンアミド系除草剤用解毒剤に応答するトウモロコシに由来するIn2遺伝子;Tn10に由来するTetリプレッサー;およびその転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されうるステロイドホルモン遺伝子に由来する誘導的プロモーターが含まれるがこれらに限定されないSchenaら1991、ProcNatlAcadSciUSA880421。例示的な構成的プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルスCaMVに由来する35Sプロモーターなどの植物ウイルスに由来するプロモーター;コメアクチン遺伝子に由来するプロモーター;ユビキチンプロモーター;pEMU;MAS;トウモロコシH3ヒストンプロモーター;およびセイヨウアブラナBrassicanapusALS3構造遺伝子に対して5’側のXba1/NcoI断片または前記のXba1/NcoI断片に対するヌクレオチド配列の類似性であるALSプロモーターが含まれるがこれらに限定されない国際PCT公開第WO96/30530号。加えて、本発明の一部の実施形態では、任意の組織特異的プロモーターまたは組織に好ましいプロモーターも利用することができる。組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたコード配列を含む核酸分子で形質転換された植物体は、もっぱらまたは優先的に特異的な組織においてコード配列の産物を生成させるができる。例示的な組織特異的プロモーターまたは組織に好ましいプロモーターには、ファゼオリン遺伝子に由来するプロモーターなど、根に好ましいプロモーター;cabまたはルビスコに由来するプロモーターなど、葉特異的プロモーターおよび光誘導プロモーター;LAT52に由来するプロモーターなど、葯特異的プロモーター;Zm13に由来するプロモーターなど、花粉特異的プロモーター;およびapgに由来するプロモーターなど、小胞子に好ましいプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。形質転換:本明細書で用いられる形質転換または形質導入という用語は、1または複数の核酸分子の細胞への導入を指す。核酸分子が、核酸分子の細胞内ゲノムへの組込みを介して、またはエピソームの複製を介して、細胞により安定的に複製されている場合、細胞は、細胞へと形質導入された核酸分子により形質転換されている。本明細書で用いられる形質転換という用語は、核酸分子をこのような細胞へと導入しうる全ての技法を包含する。例にはウイルスベクターによるトランスフェクション;プラスミドベクターによる形質転換;電気穿孔Frommら1986、Nature319791~3;リポフェクションFelgnerら1987、ProcNatlAcadSciUSA、847413~7;マイクロインジェクションMuellerら1978、Cell15579~85;アグロバクテリウムAgrobacterium属を介する導入Fraleyら1983、ProcNatlAcadSciUSA804803~7;直接的なDNAの取込み;およびパーティクルガンKleinら1987、Nature32770が含まれるがこれらに限定されない。トランス遺伝子:外因性の核酸配列である。一部の例では、トランス遺伝子が、鞘翅目有害生物において見出される核酸分子と相補的なヌクレオチド配列を含むdsRNA分子の一方または両方の鎖をコードする配列でありうる。さらなる例では、トランス遺伝子がアンチセンスの核酸配列の場合があり、アンチセンスの核酸配列の発現が、標的核酸配列の発現を阻害する。なおさらなる例では、トランス遺伝子が、遺伝子配列例えば、除草剤抵抗性遺伝子の場合もあり、工業的または薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子の場合もあり、所望の農業形質をコードする遺伝子の場合もある。これらの例および他の例では、トランス遺伝子が、トランス遺伝子のコード配列に作動可能に連結された調節配列例えば、プロモーターを含有しうる。ベクター:例えば、形質転換された細胞を生成させるために細胞へと導入される核酸分子である。ベクターは、複製起点など、それが宿主細胞においてを複製することを可能とする核酸配列を包含する。ベクターの例には、外因性DNAを細胞へと送入するプラスミド;コスミド;バクテリオファージ;またはウイルスが含まれるがこれらに限定されない。ベクターはまた、1もしくは複数の遺伝子、アンチセンス配列、および/または選択マーカー遺伝子、ならびに当技術分野で知られている他の遺伝子エレメントも包含する。ベクターは、細胞に形質導入する場合もあり、細胞を形質転換する場合もあり、細胞に感染させる場合もあり、これにより、ベクターがコードする核酸分子および/またはタンパク質を細胞に発現させる。場合によって、ベクターは、核酸分子の細胞への導入を達成する一助となる物質例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなども包含する。収率:同時に、かつ、同じ条件の下で栽培する同じ栽培地において、基準品種の収率と比べて約100以上で安定化している収率である。具体的な実施形態では、収率の改善または収率を改善するとは、同時に、かつ、同じ条件の下で栽培する穀物に対して有害な、著明な密度の鞘翅目有害生物を含有する同じ栽培地における基準品種の収率と比べて105~115以上で収率を安定化させた栽培品種を意味する。特別に示されるかまたは示唆されない限り、あるa、あるan、およびそのという用語は、本明細書で用いられる少なくとも1つのを意味する。別段に特別に説明されない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、LewinB、GenesV、OxfordUniversityPress、1994ISBN0198542879;Kendrewら編、TheEncyclopediaofMolecularBiology、BlackwellScienceLtd、1994ISBN0632021829;およびMeyersRA編、MolecularBiologyandBiotechnologyAComprehensiveDeskReference、VCHPublishersInc、1995ISBN1560815698において見出される。別段に言及しない限り、全ての百分率は重量により、全ての溶媒の混合物の比率は容量による。全ての温度は、摂氏度による。IV.鞘翅目有害生物の配列を含む核酸分子A.概観本明細書では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子が記載される。記載される核酸分子には、標的配列例えば、天然遺伝子および非コード配列、dsRNA、siRNA、hpRNA、およびmiRNAが含まれる。例えば、一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における1または複数の天然の核酸配列の全部または一部と特異的に相補的でありうるdsRNA、siRNA、miRNA、および/またはhpRNA分子が記載される。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、天然の核酸配列複数可が、1または複数の標的遺伝子であることが可能であり、例えば、かつ、限定せずに述べると、その産物は、代謝過程に関与する場合もあり、生殖過程に関与する場合もあり、幼虫の発育に関与する場合もある。本明細書で説明される核酸分子は、この核酸分子が特異的に相補的である少なくとも1つの天然の核酸配列を含む細胞に導入されると、細胞においてRNAiを誘発し、結果的に天然の核酸配列複数可の発現を低減する場合もあり、これを消失させる場合もある。一部の例では、それと特異的に相補的な配列を含む核酸分子による標的遺伝子の発現の低減または消失は、鞘翅目有害生物において致死性の場合もあり、成長および/または生殖の減殺を結果としてもたらす場合もある。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における少なくとも1つの標的遺伝子であって、D_vir_c47185_Caf1180配列番号1;D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2;D_vir_c1319_VatpaseH配列番号3;およびContig_01_Rho1_1-191_CDC42配列番号4を含むリストから選択されるヌクレオチド配列を含む標的遺伝子を選択することができる。特定の例では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子であって、液胞ATPアーゼのCサブユニットをコードし、配列番号2を含む、標的遺伝子が選択される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、D_vir_c47185_Caf1180配列番号1;D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2;D_vir_c1319_VatpaseH配列番号3;およびContig_01_Rho1_1-191_CDC42配列番号4のうちの1つによるタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも85同一な例えば、約90、約95、約96、約97、約98、約99、約100、または100同一な連続アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子でありうる。標的遺伝子は、鞘翅目有害生物における任意の核酸配列であって、その転写後阻害が、鞘翅目有害生物に対して有害効果を及ぼすか、または鞘翅目有害生物からの保護利益を植物にもたらす核酸配列でありうる。具体例では、標的遺伝子が、配列番号2のタンパク質産物のアミノ酸配列と少なくとも85同一であるか、約90同一であるか、約95同一であるか、約96同一であるか、約97同一であるか、約98同一であるか、約99同一であるか、約100同一であるか、または100同一な連続アミノ酸配列を含む液胞ATPアーゼのCサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子である。本発明により、その発現が、鞘翅目有害生物におけるコード配列によりコードされる天然のRNA分子の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列が提供される。一部の実施形態では、発現させたRNA分子を鞘翅目有害生物に摂取させた後、鞘翅目有害生物の細胞におけるコード配列を下方制御することができる。具体的な実施形態では、鞘翅目有害生物の細胞におけるコード配列の下方制御は、鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および/または生殖に対する有害効果を結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、標的配列は、5’UTRなど、転写された非コードRNA配列;3’UTR;スプライシングされたリーダー配列;イントロン配列;アウトロン配列例えば、トランススプライシングにおいてその後修飾される5’UTRRNA;ドナトロン配列例えば、トランススプライシングのためのドナー配列を提供するのに要請される非コードRNA;および標的鞘翅目有害生物遺伝子の他の転写された非コードRNAを包含する。このような配列は、モノシストロニック遺伝子およびポリシストロニック遺伝子のいずれにも由来しうる。したがって、本明細書ではまた、一部の実施形態との関連で、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むiRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNAも説明される。一部の実施形態では、iRNA分子は、複数の標的配列の全部または一部、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の標的配列と相補的なヌクレオチド配列複数可を含みうる。具体的な実施形態では、iRNA分子を、invitroにおいて生成させることもでき、invivoにおいて植物または細菌などの遺伝子改変生物によって生成させることもできる。また、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、および/またはhpRNA分子を生成させるのに用いられうるcDNA配列も開示される。特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えDNA構築物もさらに記載される。形質転換された宿主標的は、組換えDNA構築物から有効レベルのdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、および/またはhpRNA分子を発現させうる。したがってまた、植物細胞において機能的な異種プロモーターに作動可能に連結された少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む植物体の形質転換ベクターであって、ヌクレオチド配列複数可の発現が、鞘翅目有害生物における標的配列の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子を結果としてもたらすベクターも記載される。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子には、ディアブロティカDiabrotica属から単離される天然の核酸配列であるD_vir_c1229_VatpaseC配列番号2;発現させると、D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2によりコードされる天然のRNA分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列;D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2と特異的に相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むiRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA;D_vir_c1229_VatpaseC配列番号2と特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、および/またはhpRNA分子を生成させるのに用いられうるcDNA配列;ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えDNA構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの1または複数を含む組換えDNA構築物が含まれうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物を防除するのに有用な核酸分子に、配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属の液胞ATPアーゼのCサブユニットの断片;発現させると、配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のディアブロティカDiabrotica属のRNA分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部と特異的に相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むiRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部と特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、および/またはhpRNA分子を生成させるのに用いられうるcDNA配列;ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えDNA構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの1または複数を含む組換えDNA構築物が含まれうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用なさらなる核酸分子には、D_vir_c47185_Cafl180配列番号1;D_vir_c1319_VatpaseH液胞ATPアーゼのHサブユニット配列番号3;およびContig_01_Rho1_1-191_CDC42Rho1低分子GTP結合タンパク質配列番号4;発現させると、D_vir_c47185_Cafl180配列番号1によりコードされる天然のRNA分子と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含むRNA分子を結果としてもたらすヌクレオチド配列;D_vir_c1319_VatpaseH配列番号3;またはContig_01_Rho1_1-191_CDC42配列番号4;D_vir_c47185_Cafl180配列番号1と特異的に相補的な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むiRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA;D_vir_c1319_VatpaseH配列番号3;またはContig_01_Rho1_1-191_CDC42配列番号4;D_vir_c47185_Cafl180配列番号1と特異的に相補的なdsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、および/もしくはhpRNA分子を生成させるのに用いられうるcDNA配列;D_vir_c1319_VatpaseH配列番号3;またはContig_01_Rho1_1-191_CDC42配列番号4;ならびに特定の宿主標的の安定的形質転換を達成するのに用いられる組換えDNA構築物であって、形質転換された宿主標的が前出の核酸分子のうちの1もしくは複数を含む組換えDNA構築物が含まれうる。B.核酸分子本発明はとりわけ、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害するiRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子;および細胞または微生物においてiRNA分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能なDNA分子を提供する。本発明の一部の実施形態は、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号5;配列番号5の相補体;配列番号6;配列番号6の相補体;配列番号7;配列番号7の相補体;配列番号8;配列番号8の相補体;配列番号112;配列番号112の相補体;配列番号113;配列番号113の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;ならびに配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される、少なくとも1つの例えば、1つ、2つ、3つ以上のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。具体的な実施形態では、単離核酸配列の、鞘翅目有害生物との接触または鞘翅目有害生物による取込みが、鞘翅目有害生物の成長、発育、生殖、および/または摂食を阻害する。一部の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号1の全部または一部;配列番号1の相補体の全部または一部;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される、少なくとも1つの例えば、1つ、2つ、3つ以上のヌクレオチド配列をさらに含みうる。具体的な実施形態では、単離核酸配列の、鞘翅目有害生物との接触または鞘翅目有害生物による取込みが、鞘翅目有害生物の成長、発育、生殖、および/または摂食を阻害する。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、細胞または微生物においてiRNA分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な、少なくとも1つの例えば、1つ、2つ、3つ以上のDNA配列を含みうる。このようなDNA配列複数可は、DNA分子を含む細胞において、コードされるdsRNA分子複数可の転写を誘発または増強するように機能するプロモーター配列に作動可能に連結することができる。一実施形態では、少なくとも1つの例えば、1つ、2つ、3つ以上のDNA配列が、配列番号2に由来しうる。配列番号2の派生体は、配列番号2の断片を包含する。一部の実施形態では、配列番号2の断片が、例えば、配列番号5および6のうちのいずれかの少なくとも約19の連続ヌクレオチド、または前出のうちのいずれかの相補体を含みうる。したがって、配列番号2の断片は、例えば、配列番号2の19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含むことが可能であり、配列番号5および6のうちのいずれかの全部もしくは一部、またはそれらの相補体を含みうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、配列番号2の断片が、例えば、配列番号2の約19を超える連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号2の断片は、例えば、配列番号2の19、20、21、約25例えば、22、23、24、25、26、27、28、および29、約30、約40例えば、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、および45、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200以上の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体、ならびに配列番号5および6のいずれかの全部または一部、またはそれらの相補体を含みうる。具体的な実施形態では、細胞または微生物においてiRNA分子として発現して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な、少なくとも1つのDNA配列は、配列番号1、3、または4を含む群から選択されるヌクレオチド配列に由来するDNA配列複数可をさらに含みうる。配列番号1、3、または4を含む群から選択されるヌクレオチド配列の派生体は、配列番号1、3、または4のうちの1または複数の断片を包含する。一部の実施形態では、配列番号1、3、または4のうちの1または複数の断片が、例えば、配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも約19の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号1、3、または4のうちの1または複数の断片は、例えば、配列番号1、3、または4の配列のうちのいずれかの19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、配列番号1、3、または4のうちの1または複数の断片が、例えば、配列番号1、3、または4のうちのいずれかの約19を超える連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。したがって、配列番号1、3、または4のうちの1または複数の断片は、例えば、配列番号1、3、または4のうちのいずれかの19、20、21、約25例えば、22、23、24、25、26、27、28、および29、約30、約40例えば、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、および45、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200以上の連続ヌクレオチド、またはそれらの相補体を含みうる。一部の実施形態は、部分的または完全に安定化させたdsRNA分子を、鞘翅目有害生物へと導入して、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の発現を阻害することを含む。iRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNAとして発現し、鞘翅目有害生物に取り込まれると、配列番号1~4のうちのいずれかの1または複数の断片を含む核酸配列は、死滅、成長阻害、性比の変化、同腹子数の低減、感染の停止、および/または鞘翅目有害生物による摂食の停止のうちの1または複数を引き起こしうる。例えば、一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の標的遺伝子配列と実質的に相同であり、配列番号2、または配列番号5および6のいずれかの全部または一部を含む、約19~約300ヌクレオチドを包含するヌクレオチド配列を含むdsRNA分子が提供される。配列番号2、または配列番号5および6のいずれかの全部または一部と実質的に相同な少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むdsRNA分子の具体的な例は、限定せずに述べると、少なくとも19、20、21、約25例えば、22、23、24、25、26、27、28、および29、約30、約40例えば、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、および45、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200以上のヌクレオチドの長さでありうる。このようなdsRNA分子は、配列番号1、3、および/または4の1または複数の断片をさらに含みうる。このようなdsRNA分子の発現は、例えば、dsRNA分子を取り込む鞘翅目有害生物において死滅をもたらしうる。特定の実施形態では、本発明により提供されるdsRNA分子が、配列番号2を含む標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列、および/または配列番号5および6のいずれかの全部または一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、鞘翅目有害生物におけるその標的遺伝子の阻害が、鞘翅目有害生物の成長、発育、または他の生物学的機能に不可欠な、タンパク質作用物質またはヌクレオチド配列作用物質の低減または除去を結果としてもたらす。選択されたヌクレオチド配列は、配列番号2、配列番号5および6のいずれかの全部または一部を含む配列番号2に示されるヌクレオチド配列の連続断片、または前出のいずれかの相補体に対する約80~約100の配列同一性を呈示しうる。例えば、選択されたヌクレオチド配列は、配列番号2、配列番号5および6のいずれかの全部または一部を含む配列番号2に示されるヌクレオチド配列の連続断片、または前出のいずれかの相補体に対する約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94約95、約96、約97、約98、約98.5、約99、約99.5、または約100の配列同一性を呈示しうる。具体的な実施形態では、本発明により提供されるdsRNA分子は、配列番号1、3、および4のうちの1つを含む標的遺伝子と相補的な1または複数のヌクレオチド配列をさらに含むことが可能であり、鞘翅目有害生物におけるその標的遺伝子の阻害が、鞘翅目有害生物の成長、発育、または他の生物学的機能に不可欠な、タンパク質作用物質またはヌクレオチド配列作用物質の低減または除去を結果としてもたらす。一部の実施形態では、細胞または微生物においてiRNA分子として発現して、標的遺伝子の発現を阻害することが可能なDNA分子が、1または複数の標的の鞘翅目有害生物種において見出される、天然の核酸配列の全部または一部と特異的に相補的な単一のヌクレオチド配列を含む場合もあり、このDNA分子が、複数のこのような特異的に相補的な配列からキメラとして構築される場合もある。一部の実施形態では、核酸分子は、スペーサー配列により隔てられる第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含みうる。スペーサー配列とは、これが所望される場合に、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列との間の二次構造の形成を容易にするヌクレオチドの任意の配列を含む領域でありうる。一実施形態では、スペーサー配列は、mRNAのセンスまたはアンチセンスコード配列の一部である。スペーサー配列は代替的に、核酸分子へと共有結合的に連結することが可能なヌクレオチドまたはそれらの相同体の任意の組合せを含みうる。例えば、一部の実施形態では、DNA分子は、1または複数の異なるRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能であり、異なるRNA分子の各々が、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含み、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列が互いと相補的である。第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列とは、RNA分子内でスペーサー配列を介して接続することができる。スペーサー配列は、第1のヌクレオチド配列または第2のヌクレオチド配列の一部を構成しうる。第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むRNA分子の発現は、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列の特異的なハイブリダイゼーションを介して、本発明のdsRNA分子の形成をもたらしうる。第1のヌクレオチド配列または第2のヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物に固有の核酸配列例えば、標的遺伝子、または転写される非コード配列、その派生体、またはそれと相補的な配列と実質的に同一でありうる。dsRNA核酸分子は、重合化したリボヌクレオチド配列の二本鎖を含み、リン酸-糖骨格またはヌクレオシドに対する修飾を包含しうる。RNA構造における修飾は、特異的な阻害を可能とするように調整することができる。一実施形態では、siRNA分子を生成させうるような遍在的な酵素過程を介して、dsRNA分子を修飾することができる。この酵素過程では、真核生物におけるDICERなどのRNアーゼIII酵素を、invitroまたはinvivoにおいて利用することができる。Elbashirら2001、Nature411494~8;ならびにHamiltonおよびBaulcombe1999、Science2865441950~2を参照されたい。DICERまたは機能的に同等なRNアーゼIII酵素は、大型のdsRNA鎖および/またはhpRNA分子を、それらの各々が約19~25ヌクレオチドの長さである小型のオリゴヌクレオチド例えば、siRNAへと切断する。これらの酵素を介して生成するsiRNA分子は、2~3ヌクレオチドの3’突出、ならびに5’側のリン酸末端および3’側のヒドロキシル末端を有する。RNアーゼIII酵素を介して生成するsiRNA分子は、細胞内で一本鎖RNAへと巻き戻されて分離される。次いで、siRNA分子は、標的遺伝子から転写されるRNA配列と特異的にハイブリダイズされ、その後、いずれのRNA分子も、固有の細胞内RNA分解機構を介して分解される。この過程は、標的生物において標的遺伝子によりコードされるRNA配列の効果的な分解または除去を結果としてもたらしうる。帰結は、標的とされた遺伝子の転写後サイレンシングである。一部の実施形態では、内因性のRNアーゼIII酵素を介して異種核酸分子から生成したsiRNA分子が、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の下方制御を効率的に媒介しうる。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、invivoにおける分子間ハイブリダイゼーションを介してdsRNA分子を形成することが可能な、一本鎖RNA分子へと転写されうる少なくとも1つの非天然ヌクレオチド配列を包含しうる。このようなdsRNA配列は、典型的に自己組織化し、鞘翅目有害生物の栄養供給源中に施されて、標的遺伝子の転写後阻害を達成することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、それらの各々が鞘翅目有害生物における異なる標的遺伝子と特異的に相補的な2つの異なる非天然ヌクレオチド配列を含みうる。このような核酸分子が、dsRNA分子として鞘翅目有害生物へと施されると、このdsRNA分子は、鞘翅目有害生物における少なくとも2つの異なる標的遺伝子の発現を阻害する。C.核酸分子の獲得鞘翅目有害生物における多様な天然配列は、iRNAなどの本発明の核酸分子およびiRNAをコードするDNA分子をデザインするための標的配列として用いることができる。しかし、天然配列の選択は、単純な過程ではない。鞘翅目有害生物における少数の天然配列だけが、効果的な標的となる。例えば、本発明の核酸分子により特定の天然配列を効果的に下方制御しうるかどうか、または特定の天然配列の下方制御が鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および/もしくは生殖に対して妨害的効果を及ぼすかどうかを確実に予測することはできない。ESTなど、鞘翅目有害生物から単離される大半の鞘翅目有害生物の天然配列例えば、米国特許第7,612,194号および米国特許第7,943,819号で列挙される天然配列は、WCRまたはNCRなどの鞘翅目有害生物の成長、生存能力、増殖、および/または生殖に対して妨害的効果を及ぼさない。鞘翅目有害生物に対して妨害的効果を及ぼしうる天然配列のうちのいずれを、宿主植物体におけるこのような天然配列と相補的な核酸分子を発現させる組換え法において用い、宿主植物体に害をもたらすことなく、摂食されると鞘翅目有害生物に対する妨害的効果をもたらしうるのかも予測できない。一部の実施形態では、本発明の核酸分子例えば、鞘翅目有害生物の宿主植物体に施されるdsRNA分子を、代謝的または異化的な生化学経路、細胞分裂、生殖、エネルギー代謝、消化、寄生などに関与するアミノ酸配列など、鞘翅目有害生物の生存に不可欠なタンパク質またはタンパク質の一部をコードするcDNA配列を標的とするように選択する。本明細書で記載される通り、その少なくとも1つのセグメントが、標的病原体の細胞内で生成するRNAの少なくとも実質的に同一なセグメントと特異的に相補的な1または複数のdsRNAを含有する組成物を標的生物が摂取すると、標的の死滅または他の阻害が結果としてもたらされうる。鞘翅目有害生物に由来するDNAまたはRNAのヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物による発生に対して抵抗性の植物細胞を構築するのに用いることができる。鞘翅目有害生物の宿主植物体例えば、トウモロコシZmaysまたはダイズGmaxは、例えば、本明細書で提供される鞘翅目有害生物に由来するヌクレオチド配列のうちの1または複数を含有するように形質転換することができる。宿主へと形質転換されたヌクレオチド配列は、形質転換された宿主における細胞内または生物学的流体中のdsRNA配列へと形成される1または複数のRNAをコードし、したがって、鞘翅目有害生物がトランスジェニック宿主と栄養関係を形成する場合/形成するときにdsRNAを摂取可能とすることが可能である。これは、鞘翅目有害生物の細胞における1または複数の遺伝子の発現の抑制、および死滅またはその成長もしくは発育の阻害を結果としてもたらしうる。したがって、一部の実施形態では、本質的に鞘翅目有害生物の成長、発育、および生殖に関与する遺伝子を標的とする。本発明において用いられる他の標的遺伝子には、例えば、鞘翅目有害生物の生存能力、運動、移動、成長、発育、感染性、摂食部位の確立、および生殖において重要な役割を果たす標的遺伝子が含まれる。したがって、標的遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子の場合もあり、転写因子の場合もある。加えて、本発明において用いられる鞘翅目有害生物の天然ヌクレオチド配列はまた、その機能が当業者に知られており、そのヌクレオチド配列が標的である鞘翅目有害生物のゲノムにおける標的遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な植物遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、または害虫遺伝子の相同体例えば、オルソログにも由来しうる。当業者には、ハイブリダイゼーションを介して知られているヌクレオチド配列を伴う遺伝子の相同体を同定する方法が知られている。一部の実施形態では、本発明は、iRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子を生成させるためのヌクレオチド配列を含む核酸分子を得る方法を提供する。このような一実施形態は、a鞘翅目有害生物におけるdsRNAを介する遺伝子抑制に際して、1または複数の標的遺伝子を、それらの発現、機能、および表現型について解析するステップと;bcDNAライブラリーまたはgDNAライブラリーを、dsRNAを介する抑制解析における成長表現型または発育表現型の変化例えば、低減を提示する、標的とされる鞘翅目有害生物に由来するヌクレオチド配列またはその相同体の全部または一部を含むプローブでプロービングするステップと;cプローブと特異的にハイブリダイズするDNAクローンを同定するステップと;dステップbで同定されたDNAクローンを単離するステップと;eステップdで単離されたクローンを含むcDNA断片またはgDNA断片を配列決定するステップであって、配列決定された核酸分子により、RNA配列またはその相同体の全部または実質的部分が転写されるステップと;f遺伝子配列の全部もしくは実質的部分、またはsiRNAもしくはmiRNAもしくはhpRNAもしくはmRNAもしくはdsRNAを化学合成するステップとを含む。さらなる実施形態では、iRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子の実質的部分を生成させるヌクレオチド配列を含む核酸断片を得る方法は、a標的とされる鞘翅目有害生物に由来する天然のヌクレオチド配列の一部と特異的に相補的な第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマーを合成するステップと;bステップaの第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるクローニングベクター中に存在するcDNA挿入配列またはgDNA挿入配列を増幅するステップであって、増幅された核酸分子により、siRNA分子またはmiRNA分子またはhpRNA分子またはmRNA分子またはdsRNA分子の実質的部分が転写されるステップとを包含する。本発明の核酸は、多数の手法を介して単離することもでき、増幅することもでき、生成させることもできる。例えば、iRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子は、gDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリーまたはその一部に由来する標的核酸配列例えば、標的遺伝子または転写される標的の非コード配列のPCR増幅を介して得ることができる。DNAまたはRNAは、標的生物から抽出することができ、当業者に知られる方法を用いて、これから核酸ライブラリーを調製することができる。標的生物から生成させたgDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーは、PCR増幅および標的遺伝子の配列決定に用いることができる。確認されたPCR産物を、invitroにおける転写のための鋳型として用いて、最小限のプロモーターによりセンスRNAおよびアンチセンスRNAを生成させることができる。代替的に、核酸分子は、ホスホルアミダイト化学反応などの標準的な化学反応を用いる自動式DNA合成器例えば、P.E.Biosystems,Inc.FosterCity、Calif.製の392型または394型のDNA/RNA合成器の使用を含めた、多数の技法例えば、Ozakiら1992、NucleicAcidsResearch、205205~5214;およびAgrawalら1990、NucleicAcidsResearch、185419~5423を参照されたいのうちのいずれかを介して合成することができる。例えば、Beaucageら1992、Tetrahedron、482223~2311;米国特許第4,980,460号、同第4,725,677号、同第4,415,732号、同第4,458,066号、および同第4,973,679号を参照されたい。また、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなどの非天然骨格基を結果としてもたらす代替的な化学反応も使用することができる。当業者は、本発明のRNA分子、dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、またはhpRNA分子を、手作業による反応を介して化学的または酵素的に生成させることもでき、自動式反応を介して化学的または酵素的に生成させることもでき、RNA分子、dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、またはhpRNA分子をコードする配列を含む核酸分子を含むinvivoの細胞において生成させることもできる。RNAはまた、部分的な有機合成を介して生成させることもでき、完全な有機合成を介して生成させることもできる任意の修飾リボヌクレオチドを、invitroにおける酵素的合成を介して導入することもでき、有機合成を介して導入することもできる。RNA分子は、細胞内のRNAポリメラーゼにより合成することもでき、バクテリオファージのRNAポリメラーゼ例えば、T3RNAポリメラーゼ、T7RNAポリメラーゼ、およびSP6RNAポリメラーゼにより合成することもできる。当技術分野では、ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現に有用な発現構築物が知られている。例えば、国際PCT公開第WO97/32016号;ならびに米国特許第5,593,874号、同第5,698,425号、同第5,712,135号、同第5,789,214号、および同第5,804,693号を参照されたい。化学合成されるか、またはinvitroにおける酵素的合成を介して合成されるRNA分子は、細胞へと導入する前に精製することができる。例えば、RNA分子は、溶媒もしくは樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはこれらの組合せを介して混合物から精製することができる。代替的に、化学合成されるか、またはinvitroにおける酵素的合成を介して合成されるRNA分子を、例えば、試料の加工に起因する喪失を回避するために、精製を伴わないかまたは精製を最小限として用いることもできる。RNA分子は、保管のために乾燥させることもでき、水溶液中に溶解させることもできる。溶液は、dsRNA分子二重鎖のアニーリングおよび/または安定化を促進する緩衝剤または塩を含有しうる。実施形態では、dsRNA分子を、単一の自己相補的RNA鎖を介して形成することもでき、2つの相補的RNA鎖から形成することもできる。dsRNA分子は、invivoで合成することもでき、invitroで合成することもできる。細胞の内因性RNAポリメラーゼにより、invivoで1つまたは2つのRNA鎖の転写を媒介することもでき、クローニングされたRNAポリメラーゼは、invivoまたはinvitroで転写を媒介するのに用いることもできる。鞘翅目有害生物における標的遺伝子の転写後阻害は、宿主の器官型、組織型、または細胞型における特異的な転写を介して例えば、組織特異的なプロモーターを用いることにより宿主の標的とすることもでき;宿主における環境状態の刺激を介して例えば、感染、ストレス、温度、および/または化学的誘導剤に応答する誘導的プロモーターを用いることにより宿主の標的とすることもでき;かつ/または宿主の発達段階または年齢において転写を操作することにより例えば、発達段階特異的なプロモーターを用いることにより宿主の標的とすることもできる。invitroで転写される場合であれ、invivoで転写される場合であれ、dsRNA分子を形成するRNA鎖は、ポリアデニル化される場合もされない場合もあり、細胞の翻訳装置を介してポリペプチドへと翻訳されることが可能な場合も可能でない場合もある。D.組換えベクターおよび宿主細胞の形質転換一部の実施形態では、本発明また、細胞例えば、細菌細胞、酵母細胞、または植物細胞へと導入されるDNA分子であって、RNAへと発現し、鞘翅目有害生物により摂取されると、鞘翅目有害生物の細胞、組織、または器官における標的遺伝子の抑制を達成するヌクレオチド配列を含むDNA分子も提供する。したがって、一部の実施形態は、植物細胞においてiRNA例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNA分子として発現して、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害することが可能な核酸配列を含む組換え核酸分子を提供する。発現を誘発または増強するために、このような組換え核酸分子は、1または複数の調節配列を含むことが可能であり、これらの調節配列は、iRNAとして発現することが可能な核酸配列に作動可能に連結することができる。植物において遺伝子抑制分子を発現させる方法は知られており、本発明のヌクレオチド配列を発現させるのに用いることができる。例えば、国際PCT公開第WO06073727号;および米国特許公開第2006/0200878A1号を参照されたい。具体的な実施形態では、本発明の組換えDNA分子は、dsRNA分子をコードする核酸配列を含みうる。このような組換えDNA分子は、摂取されると、鞘翅目有害生物の細胞における内因性の標的遺伝子複数可の発現を阻害することが可能なdsRNA分子をコードしうる。多くの実施形態では、転写されるdsRNA分子は、安定化形態で、例えば、ヘアピン構造およびステムループ構造として施すことができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、dsRNA分子のうちの1つの鎖を、配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号5;配列番号5の相補体;配列番号6;配列番号6の相補体;配列番号7;配列番号7の相補体;配列番号8;配列番号8の相補体;配列番号112;配列番号112の相補体;配列番号113;配列番号113の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2、5~8、112、および/または113のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;ならびに配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列から転写させることにより形成することができる。dsRNA分子の1つの鎖はまた、配列番号1;配列番号1の相補体;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号1、3、または4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と実質的に相同なヌクレオチド配列からの転写を介しても形成することができる。具体的な実施形態では、dsRNA分子をコードする組換えDNA分子は、少なくとも1つのプロモーターと比べて、一方のヌクレオチド配列がセンス配向性であり、他方のヌクレオチド配列がアンチセンス配向性であり、センスヌクレオチド配列とアンチセンスヌクレオチド配列とが約5~約1000ヌクレオチドのスペーサー配列を介して連結または接続されるようにコード配列が配置された、少なくとも2つのヌクレオチド配列を含みうる。スペーサー配列は、センス配列とアンチセンス配列との間でループを形成しうる。センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子例えば、配列番号1~4のうちの1つを含む遺伝子またはその断片のヌクレオチド配列と実質的に相同でありうる。しかし、一部の実施形態では、組換えDNA分子は、スペーサー配列を伴わないdsRNA分子をコードしうる。実施形態では、センスコード配列とアンチセンスコード配列の長さが異なりうる。鞘翅目有害生物に対する有害効果または鞘翅目有害生物に関する植物保護効果を有するものとして同定された配列は、本発明の組換え核酸分子内に適切な発現カセットを創出することにより、発現させるdsRNA分子へと容易に組み込むことができる。例えば、このような配列は、標的遺伝子配列例えば、配列番号2、および配列番号5および/または6のいずれかの全部または一部を含む配列に対応する第1のセグメントを取り込み;この配列を第1のセグメントと相同または相補的ではない第2のセグメントのスペーサー領域へと連結し;これを第3のセグメントであって、その少なくとも一部が第1のセグメントと実質的に相補的な第3のセグメントへと連結することによりステムループ構造を伴うヘアピンとして発現させることができる。このような構築物は、第1のセグメントの第3のセグメントとのハイブリダイゼーションを介してステムループ構造を形成し、ループ構造形態が第2のセグメントを含む。例えば、米国特許公開第US2002/0048814号および同第US2003/0018993号;ならびに国際PCT公開第WO94/01550号および同第WO98/05770号を参照されたい。dsRNA分子は、例えば、siRNA生成の増強をもたらすか、またはメチル化を低減して、dsRNAヘアピンプロモーターの転写に関わる遺伝子サイレンシングを阻止するさらなる植物用発現カセットにおいて、例えば、標的とされる遺伝子の断片を共発現させることにより、鞘翅目有害生物の天然配列を標的とするsiRNAの生成を増強する、ステムループ構造例えば、ヘアピンなどの二本鎖構造の形態で生成させることができる。本発明の実施形態は、鞘翅目有害生物を阻害するレベルで1または複数のiRNA分子の発現を達成するための、本発明の組換え核酸分子の植物への導入すなわち、形質転換を包含する。例えば、組換えDNA分子は、直鎖状プラスミドまたは閉じた環状プラスミドなどのベクターでありうる。ベクター系は、宿主のゲノムへと導入されるDNAの全体を併せて含有する、単一のベクターまたはプラスミドの場合もあり、2つ以上のベクターまたはプラスミドの場合もある。加えて、ベクターは、発現ベクターでありうる。例えば、本発明の核酸配列は、1または複数の宿主において連結されたコード配列または他のDNA配列の発現を駆動するように機能する適切なプロモーターの制御下で、ベクターへと適切に挿入される。多くのベクターがこの目的で利用可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターへと挿入される核酸のサイズおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能例えば、DNAの増幅またはDNAの発現およびそれが適合可能な特定の宿主細胞に応じて多様な成分を含有する。例えば、鞘翅目有害生物に対する抵抗性をトランスジェニック植物体に付与するために、組換えDNAを、組換え植物体の組織内または体液中のiRNA分子例えば、dsRNA分子を形成するRNA分子へと転写させることができる。iRNA分子は、宿主植物体種を常食としうる鞘翅目有害生物において転写される、対応するヌクレオチド配列と実質的に相同であり、これと特異的にハイブリダイズ可能な、ヌクレオチド配列を含みうる。鞘翅目有害生物は、例えば、iRNA分子を含むトランスジェニック宿主植物体の細胞または体液を摂取することにより、トランスジェニック宿主植物体の細胞において転写されるiRNA分子に接触しうる。したがって、トランスジェニック宿主植物体に発生する鞘翅目有害生物におけるiRNA分子を介して、標的遺伝子の発現が抑制される。一部の実施形態では、標的である鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を抑制する結果として、有害生物に対して抵抗性の植物を得ることができる。本発明の組換え核酸分子で形質転換された植物細胞と栄養関係にある鞘翅目有害生物へのiRNA分子の送達を可能とするためには、植物細胞におけるiRNA分子の発現すなわち、転写が要請される。したがって、組換え核酸分子は、核酸分子が増幅される細菌細胞、または核酸分子が発現する植物細胞などの宿主細胞において機能する異種プロモーター配列など、1または複数の調節配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含みうる。本発明の核酸分子において用いるのに適するプロモーターには、それらの全てが当技術分野でよく知られる、誘導的プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、または構成的プロモーターが含まれる。このようなプロモーターについて記載する非限定的な例には、米国特許第6,437,217号トウモロコシRS81プロモーター;同第5,641,876号コメアクチンプロモーター;同第6,426,446号トウモロコシRS324プロモーター;同第6,429,362号トウモロコシPR-1プロモーター;同第6,232,526号トウモロコシA3プロモーター;同第6,177,611号トウモロコシの構成的プロモーター;同第5,322,938号、同第5,352,605号、同第5,359,142号、および同第5,530,196号35Sプロモーター;同第6,433,252号トウモロコシL3オレオシンプロモーター;同第6,429,357号コメアクチン2プロモーター、およびコメアクチン2イントロン;同第6,294,714号光誘導的プロモーター;同第6,140,078号塩誘導的プロモーター;同第6,252,138号病原体誘導的プロモーター;同第6,175,060号リン欠損誘導的プロモーター;同第6,388,170号双方向性プロモーター;同第6,635,806号γ-コイキシンプロモーター;ならびに米国特許出願第09/757,089号トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーターが含まれる。さらなるプロモーターには、ノパリンシンターゼNOSプロモーターEbertら1987、ProcNatlAcadSciUSA84165745~9およびオクトピンシンターゼOCSプロモーターこれらのいずれもが、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensの腫瘍誘導性プラスミドにおいて保有される;カリフラワーモザイクウイルスCaMV19SプロモーターなどのカリモウイルスプロモーターLawtonら1987、PlantMolBiol9315~24;CaMV35SプロモーターOdellら1985、Nature313810~2;フィグウォートモザイクウイルス35SプロモーターWalkerら1987、ProcNatlAcadSciUSA84196624~8;スクロースシンターゼプロモーターYangおよびRussell1990、ProcNatlAcadSciUSA874144~8;R遺伝子複合体プロモーターChandlerら1989、PlantCell11175~83;クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター;CaMV35S米国特許第5,322,938号、同第5,352,605号、同第5,359,142号、および同第5,530,196号;FMV35S米国特許第6,051,753号および同第5,378,619号;PC1SVプロモーター米国特許第5,850,019号;SCP1プロモーター米国特許第6,677,503号;ならびにAGRtu.nosプロモーターGenBank受託番号第V00087号;Depickerら1982、JMolApplGenet1561~73;Bevanら1983、Nature304184~7が含まれる。具体的な実施形態では、本発明の核酸分子は、根特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターを含む。根特異的プロモーターは、もっぱら根組織におけるかまたは優先的に根組織における作動可能に連結された配列の発現を駆動する。当技術分野では、根特異的プロモーターの例が知られている。例えば、米国特許第5,110,732号;同第5,459,252号;および同第5,837,848号;ならびにOppermanら1994、Science263221~3;およびHirelら1992、PlantMolBiol20207~18を参照されたい。一部の実施形態では、本発明による、鞘翅目有害生物を防除するためのヌクレオチド配列または断片は、2つの根特異的プロモーターであって、トランスジェニック植物細胞において作動可能であり、そこにおいて発現して、その後、前出で記載したdsRNA分子を形成しうるトランスジェニック植物細胞においてRNA分子を生成させるプロモーターの間でクローニングすることができる。植物組織において発現するiRNA分子は、標的遺伝子の発現の抑制を達成するように、鞘翅目有害生物に摂取させる。場合によって、対象の核酸分子に作動可能に連結されうるさらなる調節配列は、プロモーター配列と、翻訳リーダー配列として機能するコード配列との間に配置される5’UTRを包含する。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたmRNAに存在し、一次転写物のプロセシングおよび/またはRNAの安定性に影響を及ぼしうる。翻訳リーダー配列の例には、トウモロコシ熱ショックタンパク質リーダーおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー米国特許第5,362,865号、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ならびに他のリーダーが含まれる。例えば、TurnerおよびFoster1995、MolecularBiotech33225~36を参照されたい。5’UTRの非限定的な例には、GmHsp米国特許第5,659,122号;PhDnaK米国特許第5,362,865号;AtAnt1;TEVCarringtonおよびFreed1990、JVirol641590~7;およびAGRtunosGenBank受託番号第V00087号;およびBevanら1983、Nature304184~7が含まれる。場合によって、対象の核酸分子に作動可能に連結されうるさらなる調節配列はまた、3’側非翻訳配列、3’側転写終結領域、またはポリアデニル化領域も包含する。これらは、ヌクレオチド配列の下流に配置される遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルおよび/または転写もしくはmRNAのプロセシングに影響を及ぼすことが可能な他の調節シグナルをもたらすポリヌクレオチドを包含する。ポリアデニル化シグナルは、植物においてポリアデニル酸ヌクレオチドのmRNA前駆体の3’端への付加を引き起こすように機能する。ポリアデニル化配列は、多様な植物遺伝子に由来する場合もあり、T-DNA遺伝子に由来する場合もある。3’側転写終結領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼの3’側領域nos3’;Fraleyら1983、ProcNatlAcadSciUSA804803~7である。Ingelbrechtら、1989、PlantCell1671~80では、異なる3’側非翻訳領域の使用例が提供されている。ポリアデニル化シグナルの非限定的な例には、エンドウPisumsativumRbcS2遺伝子Ps.RbcS2-E9;Coruzziら1984、EMBOJ31671~9およびAGRtu.nosGenBank受託番号第E01312号に由来するポリアデニル化シグナルが含まれる。一部の実施形態は、1または複数の本発明のヌクレオチド配列に作動的に連結された上記の調節配列のうちの少なくとも1つを含む単離および精製されたDNA分子を含む植物体の形質転換ベクターを包含しうる。発現させると、1または複数のヌクレオチド配列は、鞘翅目有害生物における天然のRNA分子の全部または一部と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含む、1または複数のRNA分子を結果としてもたらす。したがって、ヌクレオチド配列複数可は、標的とされる鞘翅目有害生物のRNA転写物に存在するリボヌクレオチド配列の全部または一部をコードするセグメントを含む場合があり、標的とされる鞘翅目有害生物の転写物の全部または一部の逆反復配列を含みうる。植物体の形質転換ベクターは、複数の標的配列と特異的に相補的な配列を含有する場合があり、したがって、標的である鞘翅目有害生物の1または複数の集団または種の細胞において、2つ以上の遺伝子の発現を阻害する複数のdsRNAの生成を可能とする。異なる遺伝子に存在するヌクレオチド配列と特異的に相補的なヌクレオチド配列のセグメントは、トランスジェニック植物体において発現させるための単一の複合核酸分子へと組み合わせることができる。このようなセグメントは、連続の場合もあり、スペーサー配列により隔てられる場合もある。一部の実施形態では、本発明の少なくとも1つのヌクレオチド配列を既に含有する本発明のプラスミドは、少なくとも1つの元のヌクレオチド配列と同じ調節エレメントに作動可能に連結されたさらなるヌクレオチド配列複数可を、同じプラスミドに逐次的に挿入することにより修飾することができる。一部の実施形態では、核酸分子を、複数の標的遺伝子を阻害するようにデザインすることができる。一部の実施形態では、阻害される複数の遺伝子を、同じ鞘翅目有害生物種から得ることができ、これにより、核酸分子の有効性を増強することができる。他の実施形態では、遺伝子を、異なる鞘翅目有害生物に由来させることができ、これにより、作用物質複数可が効果的となる鞘翅目有害生物の範囲を拡張することができる。複数の遺伝子が、抑制または発現および抑制の組合せの標的とされ、ポリシストロニックのDNAエレメントを作製することができる。本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞などの形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含みうる。選択マーカーはまた、本発明の組換え核酸分子を含む植物体または植物細胞を選択するのにも用いることができる。マーカーは、バイオサイド抵抗性、抗生剤抵抗性例えば、カナマイシン、GeneticinG418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなどをコードする場合もあり、除草剤抵抗性例えば、グリホセートなどをコードする場合もある。選択マーカーの例には、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、G418などを用いて選択されうるneo遺伝子;ビアラホス抵抗性をコードするbar遺伝子;グリホセート抵抗性をコードする、突然変異体のEPSPシンターゼ遺伝子;ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子;イミダゾリノン抵抗性またはスルホニルウレア抵抗性を付与する、突然変異体のアセト乳酸シンターゼ遺伝子ALS;およびメトトレキサート抵抗性のDHFR遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリンなどに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。このような選択マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号;同第5,633,435号;同第5,780,708号;および同第6,118,047号において例示されている。本発明の組換え核酸分子またはベクターはまた、スクリーンマーカーも包含する。スクリーンマーカーを用いて、発現をモニタリングすることができる。例示的なスクリーンマーカーには、多様な発色基質が知られている酵素をコードするβ-グルクロニダーゼ遺伝子またはuidA遺伝子GUSJeffersonら1987、PlantMolBiolRep5387~405;植物組織におけるアントシアニン色素赤色の生成を制御する産物をコードするR遺伝子座遺伝子Dellaportaら1988、MolecularcloningofthemaizeRnjallelebytransposontaggingwithAc、18thStadlerGeneticsSymposium、PGustafsonおよびRAppels編NewYorkPlenum、263~82ページ;β-ラクタマーゼ遺伝子Sutcliffeら1978、ProcNatlAcadSciUSA753737~41;多様な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子例えば、PADAC、発色性セファロスポリン;ルシフェラーゼ遺伝子Owら1986、Science234856~9;発色性カテコールを転換しうるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子Zukowskiら1983、Gene462~3247~55;アミラーゼ遺伝子Ikatuら1990、BioTechnol8241~2;チロシンをDOPAおよび凝縮してメラニンへとなるドパキノンへと酸化することが可能な酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子Katzら1983、JGenMicrobiol1292703~14;ならびにα-ガラクトシダーゼが含まれる。一部の実施形態では、前出で記載した組換え核酸分子を、トランスジェニック植物体を創出し、植物において異種核酸を発現させて、鞘翅目有害生物に対する易感染性の低減を呈示するトランスジェニック植物体を調製する方法において用いることができる。植物体の形質転換ベクターは、例えば、iRNA分子をコードする核酸分子を、植物体の形質転換ベクターへと挿入し、これらのベクターを植物へと導入することにより調製することができる。宿主細胞を形質転換する適切な方法には、プロトプラストの形質転換例えば、米国特許第5,508,184号を参照されたいを介する方法、乾燥/阻害を介するDNAの取込み例えば、Potrykusら1985、MolGenGenet199183~8を参照されたいを介する方法、電気穿孔例えば、米国特許第5,384,253号を参照されたいを介する方法、炭化ケイ素繊維による撹拌例えば、米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号を参照されたいを介する方法、アグロバクテリウムAgrobacterium属を介する形質転換例えば、米国特許第5,563,055号;同第5,591,616号;同第5,693,512号;同第5,824,877号;同第5,981,840号;および同第6,384,301号を参照されたいを介する方法、およびDNAでコーティングした粒子の加速化例えば、米国特許第5,015,580号;同第5,550,318号;同第5,538,880号;同第6,160,208号;同第6,399,861号;および同第6,403,865号を参照されたいを介する方法など、DNAを細胞へと導入しうる任意の方法が含まれる。トウモロコシを形質転換するのに特に有用な技法は、例えば、米国特許第7,060,876号および同第5,591,616号;ならびに国際PCT公開第WO95/06722号において記載されている。これらの技法などの技法を適用することにより、事実上任意の種の細胞を安定的に形質転換することができる。一部の実施形態では、形質転換するDNAを、宿主細胞のゲノムへと組み込む。多細胞種の場合、トランスジェニック細胞を、トランスジェニック生物内へと再生させることができる。これらの技法のうちのいずれかを用いて、例えば、トランスジェニック植物体のゲノムにおいて1または複数のiRNA分子をコードする、1または複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物体を生成させることができる。発現ベクターを植物へと導入するのに最も広く利用される方法は、アグロバクテリウムAgrobacterium属による天然の形質転換系に基づく。A.ツメファシエンスAtumefaciensおよびA.リゾゲネスArhizogenesは、植物細胞を遺伝子的に形質転換する植物病原性の土壌細菌である。A.ツメファシエンスAtumefaciensおよびA.リゾゲネスArhizogenesのTiプラスミドおよびRiプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換の一因となる遺伝子を保有する。Ti腫瘍誘導プラスミドは、T-DNAとして知られ、形質転換される植物へと導入される、大型のセグメントを含有する。Tiプラスミドの別のセグメントであるvir領域は、T-DNA導入の一因となる。T-DNA領域は、末端の反復配列により境界づけられている。改変バイナリーベクターでは、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、T-DNAの境界配列により境界づけられる外来のDNAを導入するのに、vir領域の機能を利用する。T領域はまた、トランスジェニック植物体およびトランスジェニック細胞を効率的に回収するための選択マーカー、ならびに核酸をコードするdsRNAなど、導入するための配列の挿入のための複数のクローニング部位も含有する。したがって、一部の実施形態では、植物体の形質転換ベクターは、A.ツメファシエンスAtumefaciensのTiプラスミド例えば、米国特許第4,536,475号、同第4,693,977号、同第4,886,937号、および同第5,501,967号;ならびに欧州特許第EP0122791号を参照されたい、またはA.リゾゲネスArhizogenesのRiプラスミドに由来する。さらなる植物体の形質転換ベクターには、例えば、かつ、限定せずに述べると、HerreraEstrellaら1983、Nature303209~13;Bevanら1983、Nature304184~7;Kleeら1985、BioTechnol3637~42;および欧州特許第EP0120516号により記載されたベクター、ならびに前出のうちのいずれかに由来するベクターが含まれる。植物と天然で相互作用するシノリゾビウムSinorhizobium属、リゾビウムRhizobium属、およびメソリゾビウムMesorhizobium属など、他の細菌を改変して、多数の多様な植物への遺伝子導入を媒介することができる。これらの植物関連共生細菌は、ディスアームドTiプラスミドおよび適切なバイナリーベクターの両方を取り込むことにより、遺伝子導入にコンピテントとすることができる。外因性DNAをレシピエント細胞へと供給した後は一般に、さらなる培養および植物体の再生のため、形質転換された細胞を同定する。形質転換された細胞を同定する能力を改善するために、形質転換細胞を生成させるのに用いた形質転換ベクターと共に、既に示した選択マーカー遺伝子またはスクリーンマーカー遺伝子を利用することを所望することができる。選択マーカーを用いる場合は、潜在的に形質転換された細胞集団内で、細胞を1または複数の選択性作用物質へと曝露することにより、形質転換された細胞を同定する。スクリーンマーカーを用いる場合は、細胞を、所望されるマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。選択性作用物質への曝露後に生存する細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性のスコアをもたらした細胞は、植物体の再生を支援する培地中で培養することができる。一部の実施形態では、任意の適切な植物組織の培養培地例えば、MS培地およびN6培地を、増殖制御因子などのさらなる物質を組み入れることにより改変することができる。組織は、植物再生の試みを開始するのに十分な組織が利用可能となるまで、増殖制御因子を伴う基本培地上で維持することもでき、手作業による選択ラウンドを繰り返した後で、組織の形態が再生に適切となるまで例えば、少なくとも2週間増殖制御因子を伴う基本培地上で維持し、次いで、シュート形成に資する培地へと移すこともできる。培養物は、十分なシュートの形成が生じるまで定期的に移す。シュートが形成されたら、それらを根の形成に資する培地へと移す。十分な根が形成されたら、さらに成長および成熟させるために植物を土壌へと移すことができる。再生しつつある植物体における対象の核酸分子例えば、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を阻害する1または複数のiRNA分子をコードするDNA配列の存在を確認するために、多様なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、PCR、ならびに核酸の配列決定などの分子生物学的アッセイ;例えば、免疫学的手段ELISAおよび/またはウェスタンブロットを介するかまたは酵素的機能を介する、タンパク質産物の存在の検出などの生化学アッセイ;葉アッセイまたは根アッセイなどの植物部分アッセイ;ならびに再生させる植物体の全体についての表現型の解析が含まれる。例えば、組込みイベントは、例えば、対象の核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR増幅を介して解析することができる。PCRによる遺伝子型決定には、ポリメラーゼ連鎖反応PCRにより、ゲノムへと組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予測される宿主植物体の単離カルス組織に由来するゲノムDNAを増幅した後の、PCR増幅産物の標準的なクローニングおよび配列解析が含まれるがこれらに限定されないと理解される。PCRによる遺伝子型決定法は、十分に記載されており例えば、RiosGら2002、PlantJ32243~53、任意の植物種例えば、トウモロコシZmaysまたはダイズGmaxまたは細胞培養物を包含する組織型に由来するゲノムDNAに適用することができる。アグロバクテリウムAgrobacterium属に依存する形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物体は、典型的に1つの染色体へと挿入された単一の組換えDNA配列を含有する。単一の組換えDNA配列は、トランスジェニックイベントまたは組込みイベントと称する。このようなトランスジェニック植物体は、挿入される外因性配列に対して半接合である。一部の実施形態では、それ自体に対して外因性である単一の遺伝子配列を含有する独立の分離個体であるトランスジェニック植物体、例えば、F0の植物体を接触体交配自家受粉させてF1種子を生成させることにより、トランス遺伝子に関してホモ接合のトランスジェニック植物体を得ることができる。生成したF1の種子の4分の1は、トランス遺伝子に関してホモ接合である。発芽しつつあるF1の種子は、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体との識別を可能とするSNPアッセイまたは熱増幅アッセイすなわち、接合性アッセイを用いてヘテロ接合性について調べうる植物体を結果としてもたらす。具体的な実施形態では、植物細胞において、鞘翅目有害生物に対する阻害効果を及ぼす、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上の異なるiRNA分子を生成させる。iRNA分子例えば、dsRNA分子は、異なる形質転換イベントに導入される複数の核酸配列から発現させることもでき、単一の形質転換イベントに導入される単一の核酸配列から発現させることもできる。一部の実施形態では、複数のiRNA分子を、単一のプロモーターの制御下で発現させる。他の実施形態では、複数のiRNA分子を、複数のプロモーターの制御下で発現させる。複数の核酸配列であって、それらの各々が、鞘翅目有害生物の同じ種の異なる集団、または鞘翅目有害生物の異なる種における、1または複数の鞘翅目有害生物内の異なる遺伝子座例えば、配列番号2および配列番号1、3、および4のうちの1または複数により規定される遺伝子座と相同である、複数の核酸配列を含む単一のiRNA分子を発現させることができる。組換え核酸分子による植物の直接的な形質転換に加えて、少なくとも1つのトランスジェニックイベントを有する第1の植物を、このようなイベントを欠く第2の植物と交配することにより、トランスジェニック植物体を調製することもできる。例えば、iRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を、形質転換に適する第1の植物系列に導入して、トランスジェニック植物体を生成させ、このトランスジェニック植物体を、第2の植物系列と交配して、iRNA分子をコードするヌクレオチド配列を、第2の植物系列の遺伝子バックグラウンドへと遺伝子移入することができる。本発明の一部の実施形態はまた、本発明のヌクレオチド配列のうちの1または複数を含有する組換え植物体または種子から生成させる、本発明の配列のうちの1または複数を含有する作物生成物も包含する。本発明の配列のうちの1または複数を含有する作物生成物には、植物の粗挽き粉、油、粉末粒もしくは全粒、または種子、あるいは組換え植物体の任意の粗挽き粉、油、または粉末粒もしくは全粒を含む任意の食餌生成物、あるいは本発明の配列のうちの1または複数を含有する種子が含まれることを意図するがこれらに限定されない。本明細書で想定される1または複数の作物または作物生成物における本発明の配列のうちの1または複数の検出は、事実上、この作物または作物生成物が、dsRNAを介する遺伝子抑制法を用いて植物病害を防除する目的で、本発明のヌクレオチド配列のうちの1または複数を発現させるようにデザインしたトランスジェニック植物体からなることの証拠である。一部の態様には、形質転換された植物細胞に由来するトランスジェニック植物体に生成させた種子および作物生成物が包含され、種子または作物生成物は、検出可能量の本発明の核酸配列を含む。一部の実施形態では、このような作物生成物は、例えば、トランスジェニック植物体を得、それらから食餌foodまたはfeedを調製することにより生成させることができる。例えば、かつ、限定せずに述べると、本発明の核酸配列のうちの1または複数を含む作物生成物には、植物の粗挽き粉、油、粉末粒もしくは全粒、または種子、および組換え植物体の任意の粗挽き粉、油、または粉末粒もしくは全粒を含む任意の食餌生成物、あるいは本発明の核酸配列のうちの1または複数を含む種子が含まれる。1または複数の作物または作物生成物における本発明の配列のうちの1または複数の検出は、事実上、作物または作物生成物が、鞘翅目有害生物を防除する目的で、本発明のiRNA分子のうちの1または複数を発現させるようにデザインしたトランスジェニック植物体からなることの証拠である。一部の実施形態では、本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物体または種子はまた、限定せずに述べると、配列番号1~4により規定される遺伝子座以外の、鞘翅目有害生物における遺伝子座を標的とするiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント;鞘翅目有害生物以外の生物例えば、植物寄生性の線虫における遺伝子を標的とするiRNA分子が転写されるトランスジェニックイベント;殺虫性タンパク質例えば、バチルスチューリンゲンシスBacillusthuringiensisの殺虫性タンパク質をコードする遺伝子;除草剤耐性遺伝子例えば、グリホセートに対する耐性をもたらす遺伝子;および収率の増大、脂肪酸代謝の変化、または細胞質雄性不稔性の回復など、トランスジェニック植物体における所望の表現型に寄与する遺伝子を含めた、そのゲノムにおける少なくとも1つの他のトランスジェニックイベントも包含しうる。具体的な実施形態では、本発明のiRNA分子をコードする配列を、植物における病害防除形質および他の害虫防除形質と組み合わせて、植物病害および虫害の防除を増強するのに所望される形質を達成することができる。顕著な作用方式を使用する害虫防除形質を組み合わせることにより、例えば、圃場において形質複数可に対する抵抗性が生じる可能性が低減されるために、単一の防除形質を保有する植物を上回る優れた耐久性により保護されたトランスジェニック植物体をもたらすことができる。V.鞘翅目有害生物における標的遺伝子の抑制A.概観本発明の一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な少なくとも1つの核酸分子であって、鞘翅目有害生物におけるRNAiを介する遺伝子サイレンシングをもたらす核酸分子を鞘翅目有害生物へと施すことができる。具体的な実施形態では、iRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNAを、鞘翅目宿主へと施すことができる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、この核酸分子を鞘翅目有害生物と接触させることにより鞘翅目有害生物へと施すことができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、鞘翅目有害生物への給餌基質、例えば、栄養組成物で提供することができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の防除に有用な核酸分子を、鞘翅目有害生物に摂取させる核酸分子を含む植物物質の摂取を介して施すことができる。特定の実施形態では、核酸分子が、例えば、組換え核酸配列を含むベクターによる植物細胞の形質転換および形質転換された植物細胞からの植物物質または全植物体の再生を介して植物物質へと導入された組換え核酸配列の発現を経て植物物質中に存在する。B.RNAiを介する標的遺伝子の抑制実施形態では、本発明は、例えば、標的配列と特異的に相補的なヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの鎖を含むiRNA分子をデザインすることにより、鞘翅目有害生物例えば、WCRまたはNCRのゲノムおよび/またはcDNAライブラリーにおいて不可欠な天然のヌクレオチド配列例えば、不可欠な遺伝子を標的とするようにデザインしうるiRNA分子例えば、dsRNA、siRNA、miRNA、およびhpRNAを提供する。このようにデザインされたiRNA分子の配列は、標的配列と同一な場合もあり、iRNA分子とその標的配列との特異的なハイブリダイゼーションを阻止しないミスマッチを組み込む場合もある。本発明のiRNA分子は、鞘翅目有害生物において遺伝子を抑制し、これにより、植物例えば、iRNA分子を含み、保護される形質転換植物において有害生物により引き起こされる虫害のレベルまたは発生率を低減する方法において用いることができる。本明細書で用いられる遺伝子抑制という用語は、発現の転写後阻害および転写の抑制を包含する、遺伝子またはコード配列からのタンパク質の発現の低減を含め、mRNAへの遺伝子転写およびその後におけるmRNAの翻訳の結果として生成したタンパク質のレベルを低減するよく知られた方法のうちのいずれかを指す。転写後阻害は、遺伝子から転写されたmRNAまたは抑制の標的とされたコード配列の全部または一部と、抑制に用いられる対応するiRNA分子との間の特異的な相同性を介する。かつ、転写後阻害は、細胞においてリボソームに結合可能なmRNA量の実質的で測定可能な低減を指す。iRNA分子がdsRNA分子である実施形態では、dsRNA分子を、酵素であるDICERにより、短鎖のsiRNA分子約20ヌクレオチドの長さであるへと切断することができる。dsRNA分子に対するDICER活性を介して生成する二本鎖siRNA分子は、2つの一本鎖siRNA:パッセンジャー鎖およびガイド鎖へと分離することができる。パッセンジャー鎖は、分解することが可能であり、ガイド鎖は、RISCへと組み込むことができる。転写後阻害は、ガイド鎖の、mRNA分子の特異的に相補的な配列との特異的なハイブリダイゼーション、および酵素であるArgonauteRISC複合体の触媒成分を介するその後の切断を介して生じる。本発明の実施形態では、iRNA分子の任意の形態を用いることができる。当業者は、dsRNA分子は典型的に、調製時およびiRNA分子を細胞へと施すステップにおいて一本鎖RNA分子より安定的であり、また、細胞においても典型的により安定的であることを理解するであろう。したがって、一部の実施形態では、例えば、siRNA分子およびmiRNA分子は同等に効果的でありうるが、dsRNA分子は、その安定性のために選択することができる。具体的な実施形態では、invitroにおいて、鞘翅目有害生物のゲノム内のヌクレオチド配列によりコードされる核酸分子と実質的に相同なiRNA分子を生成させるように発現させうるヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。特定の実施形態では、invitroにおいて転写されたiRNA分子が、ステムループ構造を含む安定化dsRNA分子でありうる。翅目有害生物が、invitroにおいて転写されたiRNA分子に接触した後は、鞘翅目有害生物における標的遺伝子例えば、不可欠な遺伝子の転写後阻害が生じうる。本発明の一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドを含む核酸分子の発現を、鞘翅目有害生物における標的遺伝子を転写後阻害する方法であって、ヌクレオチド配列が配列番号2;配列番号2の相補体;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2の少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号2を含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号2を含む天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される方法において用いる。特定の実施形態では、核酸分子が、配列番号5~8、112、および/または113のうちのいずれかの全部または一部例えば、配列番号5および6のうちのいずれかの全部または一部を含む。特定の実施形態では、前出のうちのいずれかと少なくとも80同一な例えば、80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100、および100同一な核酸分子の発現を用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の少なくとも1つの細胞内に存在するRNA分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、ヌクレオチド配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドを含む、少なくとも1つのさらなる核酸分子の発現を、鞘翅目有害生物における標的遺伝子を転写後阻害する方法であって、ヌクレオチド配列が配列番号1;配列番号1の相補体;配列番号3;配列番号3の相補体;配列番号4;配列番号4の相補体;配列番号1、3、および4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、および4のうちのいずれかの少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物例えば、WCRの天然コード配列;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の相補体;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の相補体;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含むディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含む、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体;配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片;および配列番号1、3、および4のうちのいずれかを含む、天然のRNA分子へと転写される、ディアブロティカDiabrotica属生物の天然の非コード配列の、少なくとも19の連続ヌクレオチドによる断片の相補体からなる群から選択される方法において用いることができる。特定の実施形態では、前出のうちのいずれかと少なくとも80同一な例えば、80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100、および100同一な核酸分子の発現を用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、鞘翅目有害生物の少なくとも1つの細胞内に存在するRNA分子に特異的にハイブリダイズする核酸分子を発現させることができる。RNAiによる転写後阻害系は、遺伝子の突然変異、株の多型、または進化的分岐に起因することが予測されうる、標的遺伝子における配列の変化を許容しうることが、本発明の一部の実施形態の重要な特色である。導入された核酸分子が、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAと特異的にハイブリダイズ可能である限りにおいて、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAと絶対的に相同である必要はない場合がある。さらに、導入された核酸分子は、標的遺伝子の一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAと比べて全長核酸分子である必要はない場合がある。本発明のiRNA法を用いる標的遺伝子の阻害は、配列特異的である、すなわち、iRNA分子複数可と実質的に相同なヌクレオチド配列を遺伝子阻害の標的とする。一部の実施形態では、標的遺伝子配列の一部と同一なヌクレオチド配列を含むRNA分子を阻害に用いることができる。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、標的遺伝子配列と比べて1カ所または複数カ所の挿入、欠失、および/または点突然変異を伴うヌクレオチド配列を含むRNA分子を用いることができる。具体的な実施形態では、iRNA分子と標的遺伝子の一部とは、例えば、少なくとも約80、少なくとも約81、少なくとも約82、少なくとも約83、少なくとも約84、少なくとも約85、少なくとも約86、少なくとも約87、少なくとも約88、少なくとも約89、少なくとも約90、少なくとも約91、少なくとも約92、少なくとも約93、少なくとも約94、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、少なくとも約99、少なくとも約100、および100の配列同一性を共有しうる。代替的に、dsRNA分子の二重鎖領域は、標的遺伝子転写物の一部と特異的にハイブリダイズ可能でもありうる。特異的にハイブリダイズ可能な分子では、より大きな相同性を呈示する全長未満の配列が、より長い、相同性の小さな配列を相殺する。標的遺伝子転写物の一部と同一なdsRNA分子の二重鎖領域のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約25、50、100、200、300、400、500、または少なくとも約1000塩基でありうる。一部の実施形態では、20~100ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。具体的な実施形態では、約200~300ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。具体的な実施形態では、標的遺伝子のサイズに応じて、約500~1000ヌクレオチドを超える配列を用いることができる。特定の実施形態では、著明な阻害が生じるように、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現を、鞘翅目有害生物の細胞において、少なくとも10、少なくとも33、少なくとも50、または少なくとも80阻害することができる。著明な阻害とは、検出可能な表現型例えば、成長の停止、摂食の停止、発育の停止、および害虫の死滅など、または阻害される標的遺伝子に対応するRNAおよび/または遺伝子産物の検出可能な減少を結果としてもたらす閾値を超えた阻害を指す。本発明の特定の実施形態では、鞘翅目有害生物の実質的に全ての細胞において阻害が生じるが、他の実施形態では、標的遺伝子を発現させる細胞のサブセットだけにおいて阻害が生じる。一部の実施形態では、転写の抑制は、プロモーターのトランス抑制と称する事象をもたらす、プロモーターのDNA配列またはその相補体に対する実質的な配列同一性を呈示するdsRNA分子の細胞における存在によって介在される。遺伝子抑制は、鞘翅目有害生物であって、例えば、dsRNA分子を含有する植物物質を摂取するかまたはこれに接触することにより、このようなdsRNA分子を摂取するかまたはこれに接触しうる、鞘翅目有害生物における標的遺伝子に対して効果的でありうる。プロモーターのトランス抑制において用いられるdsRNA分子は、鞘翅目有害生物の細胞における1または複数の相同であるかまたは相補的な配列の発現を阻害または抑制するように、特別にデザインすることができる。植物細胞における遺伝子発現を制御する、アンチセンスに配向するかまたはセンスに配向したRNAを介する転写後遺伝子抑制は、米国特許第5,107,065号;同第5,759,829号;同第5,283,184号;および同第5,231,020号において開示されている。C.鞘翅目有害生物へと施されたiRNA分子の発現鞘翅目有害生物におけるRNAiを介する遺伝子阻害のためのiRNA分子の発現は、多くのinvitroフォーマットまたはinvivoフォーマットのうちの任意の1つにより実施することができる。次いで、例えば、iRNA分子を有害生物と接触させることによりiRNA分子を鞘翅目有害生物へと施すこともでき、有害生物にiRNA分子を摂取させることによりこれを施すこともでき、iRNA分子を他の形で内部化することによりこれを施すこともできる。本発明の一部の実施形態は、鞘翅目有害生物の形質転換された宿主植物体、形質転換された植物細胞、および形質転換された植物体の後代を包含する。形質転換された植物細胞および形質転換された植物体を操作して、例えば、異種プロモーターの制御下で、iRNA分子のうちの1または複数を発現させて、有害生物からの保護効果をもたらすことができる。したがって、摂食時の鞘翅目有害生物にトランスジェニック植物体またはトランスジェニック植物細胞を摂取させると、有害生物に、トランスジェニック植物体またはトランスジェニック細胞において発現したiRNA分子を摂取させることができる。本発明のヌクレオチド配列はまた、多種多様な原核生物および真核生物の微生物宿主に導入して、iRNA分子を生成させることもできる。微生物という用語は、細菌および真菌などの原核生物種および真核生物種を包含する。遺伝子発現のモジュレーションは、このような発現の部分的な抑制または完全な抑制を包含しうる。別の実施形態では、鞘翅目有害生物における遺伝子発現を抑制する方法が、有害生物の宿主の組織に、遺伝子抑制量の少なくとも1つのdsRNA分子であって、その少なくとも1つのセグメントが鞘翅目有害生物の細胞内のmRNA配列と相補的な、本明細書で記載されるヌクレオチド配列から転写されるdsRNA分子を施すステップを含む。本発明に従う、病原性微生物が摂取する、siRNA、miRNA、またはhpRNA分子など、その修飾形態を含めたdsRNA分子は、配列番号1~4からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子から転写されるRNA分子と少なくとも約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または約100同一でありうる。したがって、本発明のdsRNA分子を転写するための非天然ヌクレオチド配列および組換えDNA構築物が含まれるがこれらに限定されない、単離されて実質的に精製された核酸分子であって、鞘翅目有害生物へと導入されると、鞘翅目有害生物における内因性のコード配列または標的コード配列の発現を抑制または阻害する核酸分子が提供される。具体的な実施形態は、植物寄生性鞘翅目有害生物における1または複数の標的遺伝子の転写後阻害および植物寄生性鞘翅目有害生物集団の防除のためのiRNA分子を送達するための送達系を提供する。一部の実施形態では、送達系が、宿主であるトランスジェニック植物細胞または宿主細胞において転写されるRNA分子を含む宿主細胞の内容物の摂取を含む。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、安定化させた本発明のdsRNA分子を転写する組換えDNA構築物を含有するトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物体を創出する。特定のiRNA分子をコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物体を、組換えDNA法当技術分野では、この基本的技法がよく知られているを使用することにより生成させて、本発明のiRNA分子例えば、安定化させたdsRNA分子をコードするヌクレオチド配列を含む植物体の形質転換ベクターを構築し;植物細胞または植物体を形質転換し;転写されたiRNA分子を含有するトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物体を生成させることができる。鞘翅目有害生物に対する抵抗性をトランスジェニック植物体に付与するために、例えば、組換えDNA分子を、dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、またはhpRNA分子などのiRNA分子へと転写することができる。一部の実施形態では、組換えDNA分子から転写されるRNA分子は、組換え植物体の組織内または体液中にdsRNA分子を形成しうる。このようなdsRNA分子は、部分的に、宿主植物体に寄生しうる種類の鞘翅目有害生物内のDNA配列から転写される、対応するヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を含みうる。鞘翅目有害生物内の標的遺伝子の発現は、dsRNA分子により抑制され、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現の抑制は、鞘翅目有害生物に対して抵抗性であるトランスジェニック植物体を結果としてもたらす。dsRNA分子のモジュレート効果は、有害生物において発現する多様な遺伝子であって、例えば、これらには細胞内代謝または細胞内形質転換の一因となる内因性の遺伝子が含まれ、これらには、ハウスキーピング遺伝子;転写因子;脱皮関連遺伝子;ならびに細胞内代謝または正常な成長および発育に関与するポリペプチドをコードする他の遺伝子が含まれる遺伝子に適用可能であることが示されている。一部の実施形態では、invivoにおけるトランス遺伝子または発現構築物からの転写のために、調節領域例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、およびポリアデニル化シグナルを用いて、1または複数のRNA鎖を転写させることができる。したがって、前出で示した通り、一部の実施形態では、iRNA分子を生成させるのに用いられるヌクレオチド配列を、植物の宿主細胞において機能的な1または複数のプロモーター配列に作動可能に連結することができる。プロモーターは、通常宿主ゲノム内に常在する内因性のプロモーターでありうる。作動可能に連結されたプロモーター配列の制御下にある本発明のヌクレオチド配列は、その転写および/または結果として得られる転写物の安定性に有利な影響を及ぼすさらなる配列でさらに挟むことができる。このような配列は、作動可能に連結されたプロモーターの上流、発現構築物の3’端の下流に配置することができ、プロモーターの上流および発現構築物の3’端の下流のいずれにおいても生じうる。一部の実施形態は、植物を常食とする鞘翅目有害生物により引き起こされる、宿主植物体例えば、トウモロコシ植物体に対する虫害を低減する方法であって、宿主植物体に、本発明の少なくとも1つの核酸分子を発現させる形質転換された植物細胞を施すステップを含み、核酸分子複数可が、鞘翅目有害生物により取り込まれると、鞘翅目有害生物における標的配列の発現を阻害するように機能し、この発現の阻害が、鞘翅目有害生物の死滅、成長の低減、および/または生殖の減殺を結果としてもたらし、これにより、鞘翅目有害生物により引き起こされる宿主植物体に対する虫害を低減する方法を提供する。一部の実施形態では、核酸分子複数可が、dsRNA分子を含む。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子複数可は、各々が鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むdsRNA分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子複数可が、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な1つのヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、穀物トウモロコシの収率を増大させる方法であって、本発明の少なくとも1つの核酸分子をトウモロコシ植物体へと導入するステップと;トウモロコシ植物体を栽培して核酸配列を含むiRNA分子を発現させるステップとを含み、核酸配列を含むiRNA分子の発現が、鞘翅目有害生物の虫害および/または成長を阻害し、これにより、鞘翅目有害生物の発生に起因する収率の損失を軽減するかまたは消失させる方法が提供される。一部の実施形態では、iRNA分子は、dsRNA分子である。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子複数可は、各々が、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むdsRNA分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子複数可は、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な1つのヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、鞘翅目有害生物における標的遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、植物細胞を、本発明の少なくとも1つの核酸分子をコードする核酸配列であって、プロモーターおよび転写終結配列に作動的に連結されたヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換するステップと;形質転換された植物細胞を、複数の形質転換された植物細胞を包含する植物細胞培養物を生じさせるのに十分な条件下で培養するステップと;核酸分子をそれらのゲノムへと組み込んだ形質転換植物細胞を選択するステップと;形質転換された植物細胞を、組み込まれた核酸分子によりコードされるiRNA分子の発現についてスクリーニングするステップと;iRNA分子を発現させるトランスジェニック植物細胞を選択するステップと;選択されたトランスジェニック植物細胞を鞘翅目有害生物に摂食させるステップとを含む方法が提供される。植物体はまた、組み込まれた核酸分子によりコードされるiRNA分子を発現させる、形質転換された植物細胞から再生させることもできる。一部の実施形態では、iRNA分子がdsRNA分子である。これらの実施形態およびさらなる実施形態では、核酸分子複数可は、各々が鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な複数のヌクレオチド配列を含むdsRNA分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子複数可は、鞘翅目有害生物の細胞内で発現する核酸分子と特異的にハイブリダイズ可能な1つのヌクレオチド配列からなる。本発明のiRNA分子は、植物細胞のゲノムへと組み込まれる組換え遺伝子からの発現産物として植物種例えば、トウモロコシの種子内に組み込むこともでき、植え付ける前に種子に適用されるコーティングまたは種子の処置へと組み込まれるものとして植物種例えば、トウモロコシの種子表面に組み込むこともできる。組換え遺伝子を含む植物細胞は、トランスジェニックイベントであると考えられる。また、iRNA分子を鞘翅目有害生物へと送達するための送達系も包含される。例えば、本発明のiRNA分子は、鞘翅目有害生物の細胞へと直接導入することができる。導入する方法には、iRNAの鞘翅目有害生物の宿主に由来する植物組織との直接的な混合のほか、本発明のiRNA分子を含む組成物の宿主植物体組織への適用も含まれる。例えば、iRNA分子を、植物表面へと噴霧することができる。代替的に、微生物を介してiRNA分子を発現させ、微生物を植物表面へと適用することもでき、注射などの物理的手段を介して根または茎へと導入することもできる。また、前出で論じた通り、トランスジェニック植物体を遺伝子的に操作して、植物体に発生することが知られている鞘翅目有害生物を死滅させるのに十分な量で少なくとも1つのiRNA分子を発現させることもできる。また、化学合成または酵素的合成を介して生成させたiRNA分子を、一般的な農作業に見合った形で処方し、植物病害を防除するためのスプレー式の製品として用いることもできる。処方物は、葉面を効率的に覆うのに要請される適切な粘着剤および湿潤剤のほか、iRNA分子例えば、dsRNA分子を紫外線損傷から保護するための紫外線保護剤を包含しうる。このような添加剤は、バイオ殺虫剤業界で一般に用いられており、当業者によく知られている。このような適用は、他のスプレー式の殺虫剤適用生物学法ベースの適用または他の形の適用と組み合わせて、植物の鞘翅目有害生物からの保護を増強することができる。本明細書で引用される刊行物、特許、および特許出願を含めた全ての参考文献は、それらが本開示の明示的な詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、各参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に指示され、本明細書でその全体において示されたと仮定した場合と同じ程度にこのように組み込まれる。本明細書で論じられる参考文献は、本出願の出願日以前におけるそれらの開示だけを目的に提示される。本明細書におけるいずれの内容も、先行の発明のために、本発明者らがこのような開示に先行する権利が与えられていないことの容認としてみなされるべきではない。以下の実施例は、特定の具体的な特色および/または態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特色または態様に限定するものとしてみなすべきではない。実施例材料および方法試料の調製およびバイオアッセイMEGAscript登録商標RNAiキットAMBION、FosterCity、CAを用いて、多数のdsRNA分子Caf1-180;液胞ATPアーゼv-ATPアーゼサブユニットC領域1;v-ATPアーゼサブユニットC領域2;v-ATPアーゼサブユニットH領域1;v-ATPアーゼサブユニットH領域2;およびRho1を含めたを合成および精製した。精製されたdsRNA分子はTE緩衝液中で調製し、全てのバイオアッセイは、この緩衝液からなる対照処置であって、WCRの死滅または成長阻害についてのバックグラウンドの基準として用いられる対照処置を含有した。バイオアッセイ緩衝液中のdsRNA分子の濃度は、NanoDrop商標8000分光光度計ThermoScientific、Wilmington、DEを用いて測定した。新生虫の幼虫に人工の害虫用食餌を施すバイオアッセイにおいて、試料を害虫の活動性について調べた。WCRの卵は、CropCharacteristics,Inc.Farmington、MNから得た。害虫バイオアッセイ専用にデザインした128ウェルのプラスチック製トレーC-DInternational、Pitman、NJによりバイオアッセイを実施した。各ウェルは、鞘翅目の害虫を成長させるためにデザインされた約1.0mLの食餌を含有した。タンパク質試料のアリコート60μLずつを、各ウェル40μL/cm2の1.5cm2の食餌表面へと、ピペットを介して送達した。dsRNA試料の濃度は、ウェルの表面積1平方センチメートル当たりのdsRNA量ng/cm2として計算した。処理したトレーは、食餌表面の液体が蒸発するか、または食餌へと吸収されるまで、ドラフト内で保持した。孵化後数時間以内に、加湿したラクダ体毛ブラシで個別の幼虫を採取し、処理した食餌の上に置いたウェル1つ当たり1匹または2匹ずつの幼虫。次いで、128ウェルのプラスチック製トレーの虫を群棲させたウェルを透明なプラスチック製の接着シートで密封し、換気してガスを交換させた。バイオアッセイトレーは、制御された環境条件28°C、相対湿度約40、16:8[明期:暗期]の下で9日間にわたり保持し、その後、各試料に曝露した害虫の総数、死滅した害虫の数、および生存する害虫の体重を記録した。各処置について、死滅百分率、平均生存時体重、および成長阻害を計算した。成長阻害は、平均生存時体重の減少として定義した。成長阻害GIは、以下の通りに計算した:GI=[1-TWIT/TNIT/TWIBC/TNIBC][式中、TWITは、処置時における生存害虫の全体重であり;TNITは、処置時における害虫の総数であり;TWIBCは、バックグラウンドの基準緩衝液対照時における生存害虫の全体重であり;TNIBCは、バックグラウンドの基準緩衝液対照時における害虫の総数である]。GI50は、GI値が50となるときの食餌中の試料濃度となるように決定する。LC5050の致死濃度は、被験害虫のうちの50が死滅するときの食餌中の試料濃度として記録する。JMP商標ソフトウェアSAS、Cary、NCを用いて、統計学的解析を行った。多連のバイオアッセイにより、試料の摂取は、コーンルートワーム幼虫に対する驚くべき、かつ、予測外の死滅および成長阻害を結果としてもたらすことが裏付けられた。候補標的遺伝子の同定初齢WCR幼虫は、この成長段階におけるトランスジェニック昆虫抵抗法による防除であれば有利であるため、トランスクリプトーム解析のために選択した。約0.9gmの初齢WCR幼虫セイヨウトウモロコシ根虫DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte;孵化の4~5日後、16°Cで保持したの完全体から全RNAを単離し、以下のフェノール/TRIREAGENT登録商標ベースの方法MolecularResearchCenter、Cincinnati、OH;型番:TR118を用いて精製した。10mLのTRIREAGENT登録商標を伴う15mLのホモジナイザー内、室温で、均一な懸濁液が得られるまで幼虫をホモジナイズした。室温で5分間にわたるインキュベーション後、ホモジネートを1.5mLのマイクロ遠心管試験管1本当たり1mLずつへと分注し、200μLのクロロホルムを添加し、混合物を15秒間にわたり十分に振とうした。室温で10分間にわたり静置して抽出を可能とした後、4°C、12,000×gの遠心分離を介して相を分離した。上相約0.6mLを構成するを別の1.5mLの滅菌試験管へと注意深く移し、室温の等容量0.6mLのイソプロパノールを添加した。室温で5~10分間にわたるインキュベーションの後、混合物を、12,000×g4°Cまたは25°Cで8分間にわたり遠心分離した。上清を注意深く除去および廃棄し、75のエタノールでボルテックスすることによりRNAペレットを2回にわたり洗浄し、各回の洗浄の後、7,500×g4°Cまたは25°Cで5分間にわたる遠心分離を介して回収した。エタノールを注意深く除去し、ペレットを3~5分間にわたり通気乾燥させ、次いで、ヌクレアーゼを含まない滅菌水中で溶解させた。260nmおよび280nmにおける吸光度Aを測定することにより、RNA濃度を決定した。約0.9gの幼虫からの典型的な抽出により、1mgを超える全RNAがもたらされ、A260/A280比は1.9であった。こうして抽出されたRNAは、さらにプロセシングするまで-80°Cで保管した。RNAの品質は、アリコートを、1のアガロースゲル中で泳動させることにより決定した。アガロースゲル溶液は、オートクレーブ処理した10×のTAE緩衝液トリス酢酸EDTA;1×濃度とは、0.04Mのトリス酢酸である、オートクレーブ処理した容器内のDEPCジエチルピロカルボネート処理水で希釈した1mMのEDTAエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩、pH8.0を用いて作製した。1×のTAEは、ランニングバッファーとして用いた。使用前に、RNAseAway商標InvitrogenInc.、Carlsbad、CAにより、電気泳動タンクおよびウェルフォーミングコームを洗浄した。2μLのRNA試料を、8μLのTE緩衝液pH7.0の10mMトリスHCl;1mMのEDTAおよび10μLのRNA試料用緩衝液Novagen登録商標;型番:70606;EMD4Bioscience、Gibbstown、NJと混合した。試料を70°Cで3分間にわたり加熱し、室温まで冷却し、ウェル1つ当たり5μLずつを投入した1μg~2μgのRNAを含有する。分子サイズ比較のために、市販のRNA分子量マーカーを、個別のウェル内で同時に泳動させた。ゲルは、60vで2時間にわたり泳動させた。市販のサービスプロバイダーEurofinsMWGOperon、Huntsville、ALを介して、ランダムプライミングを用いて、幼虫の全RNAから標準化されたcDNAライブラリーを調製した。標準化された幼虫のcDNAライブラリーを、EurofinsMWGOperonにおいて、GSFLX454Titanium商標シリーズの化学反応を介して、1/2のプレートスケールで配列決定した結果として、平均の読取り長を348bpとする600,000超の読取りがもたらされた。350,000の読取りを、50,000超のコンティグへと編成した。一般に公開されるプログラムであるFORMATDBNationalCenterforBiologicalInformationNCBIから入手可能であるを用いて、未編成の読取りおよびコンティグの両方を、BLASTableデータベースへと変換した。ショウジョウバエDrosophila属およびトリボリウムTribolium属などの他の害虫における特定の遺伝子による致死性のRNAi効果に関する情報を用いて、RNAiの標的とするための候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、鞘翅目の害虫における生存および成長に不可欠であると仮定された。選択された標的遺伝子の相同体を、以下で記載するトランスクリプトーム配列データベースにおいて同定した。PCRを介して標的遺伝子の全長配列または部分配列を増幅し、二本鎖RNAdsRNAを生成させるための鋳型を調製した。候補タンパク質のコード配列を用いるTBLASTN検索は、ディアブロティカDiabrotica属配列についての未編成の読取りまたは編成されたコンティグを含有するBLASTableデータベースに照らして行った。ディアブロティカDiabrotica属配列への有意なヒットコンティグの相同性についてe-20を超え、未編成の配列読取りの相同性についてe-10を超えると定義されるは、NCBInon-redundantdatabaseに照らしてBLASTXを用いて確認した。このBLASTX検索の結果により、TBLASTN検索において同定されたディアブロティカDiabrotica属の相同体の候補遺伝子配列が、実際に、ディアブロティカDiabrotica属の遺伝子を含むか、またはディアブロティカDiabrotica属の配列において検索可能な、ディアブロティカDiabrotica属以外の候補遺伝子配列への最良のヒットであることが確認された。大半の場合において、タンパク質をコードすると注記されたトリボリウムTribolium属の候補遺伝子は、ディアブロティカDiabrotica属のトランスクリプトーム配列における1または複数の配列との明白な配列相同性を示した。少数の場合において、ディアブロティカDiabrotica属以外の候補遺伝子との相同性により選択されたディアブロティカDiabrotica属のコンティグまたは未編成の配列読取りの一部は重複するが、コンティグの編成によりこれらの重複を接合することはできないことが明確であった。これらの場合には、Sequencher商標v4.9GeneCodesCorporation、AnnArbor、MIを用いて、配列をより長いコンティグへと編成した。配列番号1~4を含めた複数の候補標的遺伝子を、WCRにおいて鞘翅目有害生物の死滅または成長、発育、もしくは生殖の阻害をもたらしうる遺伝子として同定した。ディアブロティカDiabrotica属の候補遺伝子相同体の配列の全長クローンまたは部分クローンを用いて、dsRNAを合成するためのPCR用単位複製配列を生成させた。配列番号1は、D_vir_c47185に対応し、これは、Caf1-180の相同体であり、本明細書では、Caf1-180と称する。ショウジョウバエDrosophila属のCaf1-180は、新たに合成されたDNAおよびCaf1-180へとヒストンを送達するときに機能することが示されている。ショウジョウバエDrosophila属のCaf1-180における機能喪失突然変異は、幼虫の成長および発育の停止、ならびに幼虫の死滅を引き起こすことが示されているKlapholzら2009、Chromosoma1182235~48;Tylerら2001、MolCellBiol21196574~84;Songら2007、DevBiol3111213~22。配列番号2は、D_vir_c1229に対応し、これは、液胞ATPアーゼサブユニットCの相同体であり、本明細書では、VatpaseCと称する。配列番号5~8は、VatpaseCの不連続配列の断片である。配列番号3は、D_vir_c1319に対応し、これは、液胞ATPアーゼサブユニットHの相同体であり、本明細書では、VatpaseHと称する。配列番号9~11は、VatpaseHの不連続配列の断片である。ショウジョウバエDrosophila属の液胞ATPアーゼは、Notchシグナル伝達に関与するマルチサブユニットのプロトン輸送体であるVaccariら2010、Development137111825~32。ショウジョウバエDrosophila属の液胞ATPアーゼサブユニットにおける機能喪失突然変異は、劣性の致死性突然変異であることが示されているAllanら2005、PhysiolGenomics222128~38;およびDaviesら1996、JBiolChem2714830677~84。VATPaseCVha44およびVATPaseHVhaSFDは、ショウジョウバエDrosophila属の液胞ATPアーゼのサブユニットのうちの2つである。配列番号4は、Contig_01_Rho1_1-191_CDC42であり、本明細書ではRho1と称する。ショウジョウバエDrosophila属のRho1は、アクチンフィラメントの編成および解体を制御するときに機能し、ショウジョウバエDrosophila属のRho1における機能喪失突然変異は、細胞内の成分運動、シナプスのリモデリング、幼虫の発育、およびストレスへの応答に著明な影響を及ぼすFoxら2005、Development132214819~31;Kadandaleら2010、ProcNatlAcadSciUSA1072310502~7;RosalesNievesら2006、NatCellBiol84367~76;MagieおよびParkhurst2005、DevBiol2781144~54;ならびにXuら2008、DevBiol321188~100。標的遺伝子の増幅PCRを介して、各標的遺伝子のコード領域の一部を増幅するためのプライマーをデザインした。表1を参照されたい。必要な場合は、T7ファージのプロモーター配列TTAATACGACTCACTATAGGGAGA配列番号12を、増幅されたセンス鎖またはアンチセンス鎖の5’端へと組み込んだ。表1を参照されたい。WCRからゲノムDNAを抽出し、PCR反応を介してゲノムDNAから天然の標的遺伝子配列の全部または一部を増幅するのにPCRプライマーを用いた。RNAi構築物PCRを介する鋳型の調製およびdsRNAの合成invitroにおいてdsRNAを生成させるための特異的な鋳型をもたらすのに用いた戦略を図1に示す。dsRNAの合成において用いることを意図する鋳型DNAは、表1のプライマー対およびWCRの初齢幼虫から単離された全RNAから調製した第1鎖のcDNAをPCR鋳型として用いるPCRを介して調製した。選択された各標的遺伝子領域について、2つの個別のPCR増幅を実施した。第1のPCR増幅では、T7プロモーター配列を、増幅されたセンス鎖の5’端に導入した。第2の反応では、T7プロモーター配列を、アンチセンス鎖の5’端に組み込んだ。次いで、標的遺伝子の各領域についてPCR増幅した2つの断片をほぼ等量で混合し、dsRNAを生成させるための転写鋳型として混合物を用いた図1。製造元FosterCity、CAの指示書に従い、Ambion登録商標MEGAscript登録商標RNAiキットを用いて、二本鎖RNAを合成および精製した。特定のプライマーにより増幅されるdsRNA鋳型の配列は、配列番号86Caf1-180;配列番号7および8VatpaseC;配列番号10および11VatpaseH;ならびに配列番号87Rho1であった。dsRNAの濃度は、NanoDrop商標8000分光光度計ThermoScientific、Wilmington、DEを用いて測定した。植物体の形質転換ベクターの構築:方法1標準的なMultiSiteGateway登録商標Invitrogenクローニング法を用いて、WHISKERS商標を介してトウモロコシ細胞を形質転換するためのヘアピンRNAhpRNA発現ベクターを構築した。形質転換の後でトウモロコシ細胞をスクリーニング/選択するのに利用する2つのマーカー遺伝子である、黄色蛍光タンパク質遺伝子YFP;Shaginら2004、MolBiolEvol215841~50および除草剤耐性遺伝子ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPAT;Wehrmannら1996、NatBiotechnol14101274~8のために、個別のエントリーベクターを構築した。これらの各々の発現は、コメアクチン1プロモーターOsAct1;米国特許第5,641,876号のコピーにより制御した。トウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子に由来する3’側非翻訳領域を含む断片ZmPer5の3’UTRv2;米国特許第6,699,984号を用いて、遺伝子の転写を終結させた。また、hpRNAを生成させるためにデザインした第3の種類のエントリーベクターも、Caf1-180遺伝子またはVatpaseC遺伝子の断片を利用して構築した。表2に示されるプライマーを用いてヘアピンを合成するために、Caf1-180およびVatpaseCの標的遺伝子領域を増幅した。標的遺伝子断片の2つのコピーであって、ST-LS1イントロン配列Vancanneytら1990、MolGenGenet2202245~50により隔てられる2つの断片を、互いと向かい合う配向性で配置する単一の転写単位内でことにより、RNAの一次転写物による分子間のヘアピン形成を促進した。mRNA一次転写物の生成は、トウモロコシユビキチン1プロモーター米国特許第5,510,474号のコピーにより駆動した。したがって、mRNA一次転写物は、2つの遺伝子断片配列を、イントロン配列により隔てられる大型で互いに逆行する反復配列として含有する。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する3’側非翻訳領域ZmLipの3’UTR;米国特許第7,179,902号を含む断片を用いて、遺伝子の転写を終結させた。配列番号49は、Caf1-180ヘアピン形成配列を提示し、配列番号50は、VatpaseCヘアピン形成配列を提示する。Caf1-180およびVatpaseCの各々について、hpRNAの発現エントリーベクターの2つの変化形を構築した。エントリーベクターの第1の変化形では、トウモロコシのコンセンサス翻訳開始コンテキスト配列は、第1の標的遺伝子断片配列の5’端に隣接して順行の配向性で存在するすなわち、プロモーターに対してセンスの配向性にある、mRNAの5’側非翻訳リーダー配列に存在した。第2の変化形では、トウモロコシのコンセンサス翻訳開始配列を除外した。Invitrogen製のLRCLONASEIIPLUS商標を用いて、3つのエントリーベクターおよびデスティネーションベクターpDAB104124により、標準的なGATEWAY登録商標組換え反応を実施した。完成したhpRNA発現ベクターでは、hpRNAカセットを、YFP遺伝子発現カセットとPAT遺伝子発現カセットとで挟んだ。WHISKERS商標を介して形質転換するための断片の精製は、YFP/hpRNA/PAT発現ベクターDNAを、BclICaf1-180構築物の場合またはBbsIに加えたAfeIVatpaseC構築物の場合で消化して、ベクター骨格内に存在する細菌のスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を除去した後、高圧液体クロマトグラフィーHPLCを介して調製的スケールで達成した。植物体の形質転換ベクターの構築:方法2WHISKERS商標デスティネーションベクター:標準的な一部位GATEWAY登録商標INVITROGENクローニング法を用いて、WHISKERS商標を介してトウモロコシ細胞を形質転換するためのヘアピンRNAhpRNA発現ベクターを構築した。2つのマーカー遺伝子を、デスティネーションベクターpDAB108916と称するへと組み込み、形質転換の後でトウモロコシ細胞をスクリーニングおよび選択するのに利用した。黄色蛍光タンパク質遺伝子YFP;Shaginら2004、MolBiolEvol215841~50を目視によるスクリーニングに用い、除草剤耐性遺伝子ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼPAT;Wehrmannら1996、NatBiotechnol14101274~8を形質転換細胞の選択に用いた。2つのマーカー遺伝子の各々の発現は、トウモロコシ条斑ウイルスコートタンパク質遺伝子の5’UTRの一部GENBANK受託番号:X01633およびトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ1遺伝子に由来するイントロン1GENBANK受託番号:X04049から編成されたキメラ5’UTR配列を含む、サトウキビ桿状バドナウイルスSCBVプロモーター米国特許第6,489,462号の個別のコピーにより制御した。トウモロコシリパーゼ遺伝子に由来する3’UTRZmLipの3’UTR;米国特許第7,179,902号を含む断片およびジャガイモバレイショSolanumtuberosumStPinIIの3’UTRに由来する3’UTRを含む断片Anら1989、PlantCell1115~122を用いて、それぞれYFP遺伝子およびPAT遺伝子の転写を終結させた。hpRNAを生成させるためにデザインした第1のエントリーベクターは、Caf1-180v3のセンス配列ST-LS1イントロン配列番号95を保有するDNA断片およびCaf1-180v3アンチセンス配列配列番号96を保有する断片を利用して構築した。これらの断片は、市販品の販売業者DNA2.0;MenloPark、CAに個別に合成させた。合成断片は、標準的なクローニング法を介して適切な配向性で接合し、配列番号97のヘアピン形成構築物を形成し、構築物をエントリーベクター内のプロモーターと3’UTR配列との間でクローニングした。mRNA一次転写物の生成は、トウモロコシユビキチン1プロモーター米国特許第5,510,474号のコピーにより駆動する一方、トウモロコシペルオキシダーゼ5遺伝子に由来する3’側非翻訳領域ZmPer5の3’UTRv2、米国特許第6,699,984号を含む配列を用いて、標的遺伝子断片の転写を終結させた。標的遺伝子断片の2つのコピーであって、ST-LS1イントロン配列Vancanneytら1990、MolGenGenet2202245~50により隔てられる2つの断片を、互いと向かい合う配向性で配置する単一の転写単位内でことにより、RNAの一次転写物による分子間のヘアピン形成を促進した。したがって、mRNA一次転写物は、2つの遺伝子断片配列を、イントロン配列により隔てられる大型で互いに逆行する反復配列として含有する。INVITROGEN製のLRCLONASEIIPLUS商標を用いて、構築したCaf-180v3ヘアピンエントリーベクターおよびデスティネーションベクターであるpDAB108916による標準的なGATEWAY登録商標組換え反応を実施した。完成したCaf-180v3hpRNA発現ベクターpDAB109830では、YFP遺伝子発現カセットを、hpRNA発現カセットとPAT遺伝子発現カセットとで挟んだ。同様にして、標準的な一部位GATEWAY登録商標クローニング法を用いて、WHISKERS商標を介するトウモロコシ細胞の形質転換のための他のヘアピンRNAhpRNA発現ベクターを構築した。これらのさらなるベクターは、VatpaseCv3、VatpaseCv4、VatpaseHv1、およびRho1v1のためのhpRNA構築物を含んだ。標準的なクローニング法により適切な配向性配列番号100で接合した、VatpaseCv3のセンスST-LS1イントロン配列配列番号98およびVatpaseCv3のアンチセンス配列配列番号99を含む合成断片を利用して、hpRNAを生成させるためにデザインした第2のエントリーベクターを構築した。VaptaseCv3エントリーベクターを、デスティネーションベクターpDAB108916によるGATEWAY登録商標クローニングに用いて、VatpaseCv3hpRNA発現ベクターであるpDAB109828を構築した。標準的なクローニング法により適切な配向性配列番号103で接合した、VatpaseCv4のセンスST-LS1イントロン配列配列番号101およびVatpaseCv4のアンチセンス配列配列番号102を含む合成断片を利用して、hpRNAを生成させるためにデザインした第3のエントリーベクターを構築した。VatpaseCv4エントリーベクターを、デスティネーションベクターpDAB108916によるGATEWAY登録商標クローニングに用いて、VatpaseCv4hpRNA発現ベクターであるpDAB109838を構築した。標準的なクローニング法により適切な配向性配列番号106で接合した、VatpaseHv1のセンスST-LS1イントロン配列配列番号104およびVatpaseHv1のアンチセンス配列配列番号105を含む合成断片を利用して、hpRNAを生成させるためにデザインした第4のエントリーベクターを構築した。VatpaseHv1エントリーベクターを、デスティネーションベクターpDAB108916によるGATEWAY登録商標クローニングに用いて、VatpaseHv1hpRNA発現ベクターであるpDAB109829を構築した。標準的なクローニング法により適切な配向性配列番号109で接合した、Rho1v1のセンスST-LS1イントロン配列配列番号107およびRho1v1のアンチセンス配列配列番号108を含む合成断片を利用して、hpRNAを生成させるためにデザインした第5のエントリーベクターを構築した。Rho1v1エントリーベクターを、デスティネーションベクターpDAB108916によるGATEWAY登録商標クローニングに用いて、Rho1v1hpRNA発現ベクターであるpDAB109834を構築した。WHISKERS商標を介する形質転換は、精製された環状プラスミドDNAを用いて達成した実施例9。アグロバクテリウムAgrobacterium属のデスティネーションベクター:標準的なGATEWAY登録商標INVITROGENクローニング法を用いて、アグロバクテリウムAgrobacterium属を介するトウモロコシ胚形質転換のためのヘアピンRNAhpRNA発現ベクターを構築した。Caf-180v3、VatpaseCv3、VatpaseHv1、およびRho1v1のhpRNAを生成させるために上記で調製したエントリーベクターを、デスティネーションベクターpDAB108915をアグロバクテリウムAgrobacterium属による植物体の形質転換のためのバイナリーベクターとして構築するGATEWAY登録商標クローニングに用いた。T-DNAのレフトボーダーの反復配列とライトボーダーの反復配列との間には、上記のSCBVプロモーターの転写制御下でAAD1タンパク質米国特許第7,838,733号をコードする配列を含む植物選択マーカー/除草剤耐性遺伝子を組み入れる。aad1mRNAの転写終結およびポリアデニル化は、本質的に、GENBANK商標受託番号:gb|L35913.1|MZELIPASEの塩基921~1277として、米国特許第7,179,902号において開示される、トウモロコシリパーゼの3’UTRを介して決定した。結果として得られるhpRNAのバイナリー発現ベクターを、pDAB109817Caf-180v3のための、pDAB109815VatpaseCv3のための、pDAB109816VatpaseHv1のための、およびpDAB109821Rho1v1のためのと名付けた。トウモロコシを形質転換するため、2011年7月29日に出願されたPCT国際特許出願第PCT/US11/046028号において記載される通り、hpRNAのバイナリー発現ベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのディスアームド株であるDAt13192へと導入した。候補標的遺伝子のスクリーニング実施例2において同定された標的遺伝子配列の一部は阻害するが全ては阻害しないようにデザインした合成dsRNAを食餌ベースのアッセイにおいてWCRへと投与したところ、死滅および成長阻害を引き起こした。このアッセイにおいて、Caf1-180、VatpaseC、VatpaseH、およびRho1は、スクリーニングされた他のdsRNAを上回る有効性の大幅な増大を呈示することが観察された。多連のバイオアッセイにより、Caf1-180配列番号110によるdsRNA;VatpaseC領域1配列番号111によるdsRNA;VatpaseC領域1の短鎖配列番号112によるdsRNA;VatpaseC領域2配列番号113によるdsRNA;VatpaseH領域1配列番号114によるdsRNA;VatpaseH領域2配列番号115によるdsRNA;およびRho1配列番号116によるdsRNAへと転写された構築物の各々の摂取が、驚くべきことに、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫の頑健な死滅および成長阻害を結果としてもたらすことが裏付けられた。表3および4は、これらのdsRNAに対する9日間にわたる曝露後における、WCR幼虫に対する食餌ベースの給餌バイオアッセイの結果を示す。図2~4は、例示的な核酸分子で処理した鞘翅目有害生物の死滅および成長阻害についての変動図を示す。ディアブロティカDiabrotica属種の特定の遺伝子を、RNAiを介する害虫の防除のために利用しうることが既に示唆されている。906の配列を開示する米国特許公開第2007/0124836号、および9,112の配列を開示する米国特許第7,614,924号を参照されたい。しかし、RNAiを介する害虫の防除に有用であることが示唆されている多くの遺伝子が、ディアブロティカDiabrotica属を防除するのに有効でないことが決定された。また、Caf1-180、VatpaseC、VatpaseH、およびRho1の各々が、RNAiを介する害虫の防除に有用であることが示唆されている他の遺伝子と比較して、ディアブロティカDiabrotica属の驚くべき、かつ、予測外の優れた防除を提供することも決定された。米国特許第7,614,924号では、アネキシン、βスペクトリン2、およびmtRP-L4の各々が、RNAiを介する害虫の防除において有効であることが示唆された。配列番号51は、アネキシン領域1のDNA配列であり、配列番号52は、アネキシン領域2のDNA配列である。配列番号53は、βスペクトリン2領域1のDNA配列であり、配列番号54は、βスペクトリン2領域2のDNA配列である。配列番号55は、mtRP-L4領域1のDNA配列であり、配列番号56は、mtRP-L4領域2のDNA配列である。また、YFP配列配列番号57も、陰性対照として、dsRNAを生成させるのに用いた。実施例4の方法を介してdsRNAを生成させるのに、これらの配列の各々を用い、dsRNAの各々を、上記の同じ食餌ベースのバイオアッセイ法を介して調べた。表5は、アネキシン、βスペクトリン2、およびmtRP-L4によるdsRNA分子を生成させるのに用いたプライマーの配列を列挙する。表6は、これらのdsRNA分子に対する9日間にわたる曝露後における、WCR幼虫に対する食餌ベースの給餌バイオアッセイの結果を示す。多連のバイオアッセイにより、これらのdsRNAの摂取が、上記のセイヨウトウモロコシ根虫の幼虫の死滅および成長阻害を結果としてもたらさないことが裏付けられたが、これは、TE緩衝液、YFP、または水の対照試料により見られることである。配列の長さのVatpaseCdsRNAの有効性に対する効果349~500bpのサイズにわたる液胞ATPアーゼサブユニットCVatpaseCによるdsRNAは、給餌アッセイにおいて、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対して活性であった表3。dsRNA分子の有効性の長さへの依存性を決定するため、VatpaseCdsRNAの長さを変化させて調べた。配列は、VatpaseCのコード配列配列番号2の174塩基対のセグメントのうち、5’末端の15、25、50、および100塩基、ならびに3’末端の100、50、25、および15塩基を表すように選択した。15bpおよび25bpの5’側および3’側のVatpaseC配列を表すdsRNA断片は、市販品の販売業者INTEGRATEDDNATECHNOLOGIES;Coralville、IAに合成させた表7。50bpおよび100bpの5’側および3’側のdsRNA断片、ならびに全長174bpのdsRNA断片を、表8に列挙されるプライマーを用いる、MEGAscript商標RNAiキットAMBION登録商標、FosterCity、CAの指示書に従い、T7RNAポリメラーゼを用いて、PCR増幅したDNA鋳型から生成させた。多様な長さのDNA鋳型を増幅するのに用いたプライマーの組合せを、表9に列挙する。VatpaseCによるdsRNAすなわち、VatpaseC5’-15、VatpaseC5’-25、VatpaseC5’-50、VatpaseC5’-100、VatpaseC3’-15、VatpaseC3’-25、VatpaseC3’-50、VatpaseC3’-100、およびVatpaseC-174の各々を、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫による給餌アッセイを用いて、活性致死性について、単一用量1000ng/cm2で調べた。表10に示される通り、これらのdsRNA試料の活性摂食の9日目における幼虫の死滅百分率により測定したは異なる。15bpおよび25bpのVatpaseCによるdsRNA試料5’側および3’側の両方の摂食は、著明な幼虫の死滅を誘導しなかったが、これは、YFPによるdsRNAを用いる陰性対照と同様の結果である。しかし、100bpの5’側および3’側のVaptaseCによるdsRNA、ならびに174bpの5’側および3’側のVaptaseCによるdsRNAのいずれもが、同様に予測外の高度な幼虫の死滅を結果としてもたらした。2つの50bpのdsRNA試料は、給餌アッセイにおいて異なる結果を示し、VatpaseC5’-50dsRNA試料が、著明な幼虫の死滅を結果としてもたらさないが、著明な成長阻害を示したのに対し、VatpaseC3’-50dsRNA試料は、100bpおよび174bpのdsRNA試料により得られる値とほぼ同程度に高度なレベルである、ほぼ60の死滅を引き起こした表10。さらに、VatpaseCによるdsRNAの活性を6つの被験用量1.0、3.9、62.5、250、および1000ng/cm2で決定し、相対LC50値および相対GI50値を得た表11。VatpaseC3’-100試料により得られるLC50値は3.01ng/cm2であり、観察される最低値すなわち、最高度の効能であった。VatpaseC-174試料により得られるLC50値が9.81ng/cm2であることは、特に注意される。トウモロコシ植物体においてVatpaseCv4ヘアピンを生成させるようにデザインした構築物は、温室栽培される植物により調べた場合の活性を示した実施例10;表18。このVaptaseCv4配列の断片166bpが、本明細書で記載されるVatpaseC-174配列とほぼ同一であり、本明細書で記載されるVatpaseC-174配列は、166bpのVaptaseCv4配列の断片の5’端における8bpATGACTGAだけを欠く。dsRNA配列の変化のVatpaseCによるdsRNAの有効性に対する効果標的配列と完全に相補的なわけではない例えば、標的のmRNAとの同一性が95にとどまるdsRNA分子も、鞘翅目有害生物を防除するのに効果的である。非相補的な塩基をVatpaseCによるdsRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入した結果として、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間のミスマッチがもたらされたかつ、結果的に、dsRNAとinvivoにおける標的のmRNAとの間のミスマッチがもたらされた。マッチが不完全なdsRNAの、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対する殺虫活性への効果を、食餌バイオアッセイにより測定した。一度にVatpaseCによるdsRNAをコードする2つのDNA鎖のうちの1つだけを突然変異させ、各突然変異部位に単一の非相補的なヌクレオチドを人工的に導入した。突然変異部位は、VatpaseCによるdsRNAをコードするDNAの突然変異鎖の全長に沿って20ヌクレオチド間隔で恣意的に配置した。天然ヌクレオチドを置換するように選択したヌクレオチドの識別は、突然変異部位と向かい合う非突然変異鎖におけるヌクレオチドと相補体をなさない突然変異部位のいずれかの側における近位のヌクレオチドから行った。万一3つ以上のヌクレオチドが所与の位置において同じである場合は、天然のヌクレオチドを置換するのに、最も近接する異なるヌクレオチドを選択した。相補性が不完全であるが実質的に相同な2つのVatpaseCv4によるdsRNAすなわち、v4.1およびv4.2をデザインし、生成させ、殺虫活性について調べた。いずれのdsRNAも、166bpのVatpaseCv4配列に加えて、各RNA鎖の5’端にT7プロモーターを介する転写のアーチファクトである6つのヌクレオチドGGGAGAを含んだ。したがって、各dsRNAの全長は178bpであった。非相補的な塩基をアンチセンス鎖へと導入して、VatpaseCv4.1と実質的に相同なdsRNAをデザインし、生成させた。このdsRNAは、以下のステップにより達成した:1アンチセンス鎖配列を、20ヌクレオチドごとに突然変異を導入するようにデザインした;2突然変異アンチセンス鎖のDNA配列または天然のセンス鎖DNA配列すなわち、突然変異を伴わないを含むDNA断片を化学合成したIDT;3突然変異アンチセンス鎖を含むDNAオリゴヌクレオチドとセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドとをアニーリングさせて、二本鎖分子を形成した;35’末端のT7プロモーター配列を含むプライマーを使用するPCR増幅を用いて、T7プロモーター配列を両方の鎖の5’端へと組み込み、これにより、dsRNAを合成するのに十分な鋳型をもたらした;および4T7RNAポリメラーゼを用い、販売元の指示書に従いAMBION登録商標MEGAscript商標RNAiキットを用いて、dsRNA合成を達成した。センス鎖配列に20塩基間隔で導入した突然変異を有するしかし、天然のアンチセンス鎖配列を有する、VatpaseCv4.2と実質的に相同なdsRNAを、上記の方法の適切な改変を介して得た。さらに、天然配列すなわち、完全に相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するを含むVatpaseCv4dsRNAを構築し、セイヨウトウモロコシ根虫の幼虫に対する食餌ベースの給餌アッセイ既に記載した方法を用いて実施したにおいて、実質的に相同なdsRNAであるVatpaseCv4.1およびv4.2との有効性の比較のための対照として用いた。7つの用量のこれらのdsRNA0.2、1.0、3.9、15.6、62.5、250、および1000ng/cm2を、セイヨウトウモロコシ根虫の初齢幼虫による給餌バイオアッセイにおいて調べ、LC50値およびGI50値を得た。アッセイは、2回にわたり個別に実施し、各回の実験を2連で行った。実質的に相同なVatpaseCv4.1アンチセンス鎖がミスマッチするdsRNAについて計算したLC50は、780.9ng/cm2であり、天然のすなわち、突然変異させていないVatpaseCv4dsRNAについて得られるLC50の7.9倍であった表12。この結果は、VatpaseCv4.1dsRNAの178塩基のアンチセンス鎖は8つの突然変異塩基を含有したが、dsRNAを摂取した後に致死性の効果を誘導するのに十分な、標的である鞘翅目有害生物のmRNA鎖との相同性が存在したことを示す。実質的に相同なVatpaseCv4.2センス鎖がミスマッチするdsRNAについて計算したLC50値は、868.6ng/cm2であり、これは、VatpaseCv4.1により得られる値と同様であり、VatpaseCv4dsRNAについてのこれらのアッセイにおいて得られる値の8.8倍であった。これらの結果は、dsRNAのセンス鎖においてミスマッチを含む実質的に相同なdsRNAが、dsRNAを摂取した後に致死性の効果を誘導するのに十分な、標的である鞘翅目有害生物のmRNA鎖との相同性を保持することを裏付ける。これらの給餌アッセイでは、VatpaseCv4.1dsRNAおよびVatpaseCv4.2dsRNAのGI50値が、天然のすなわち、突然変異させていないVatpaseCv4dsRNAについて計算した値より高値であることがさらに見出された表12。したがって、VatpaseCv4.1dsRNAおよびVatpaseC4.2dsRNAは、鞘翅目有害生物により摂取されると、成長阻害の改善および死滅の改善のいずれを誘導することも可能であることがわかる。アグロバクテリウムAgrobacterium属を介する、殺虫性ヘアピンdsRNAを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成穂の滅菌および胚の単離:未成熟のトウモロコシ胚を、温室において成長させ、自家受粉または近親受粉させて穂を生成させたトウモロコシZeamaysの近交系であるB104植物体から得た。穂は、受粉の約9~12日後に採取した。実験日において、穂を次亜塩素酸ナトリウムの20溶液6.15中に浸漬することにより表面滅菌し、20~30分間にわたり振とうした後、滅菌水中で3回にわたりすすいだ。滅菌の後、未成熟の接合胚1.5~2.4mmを各穂から無菌的に切開し、液体の接種用培地2.2gm/LのMS用塩Frameら、2011、前出;1XのISUModifiedMSVitaminsFrameら2011、GeneticTransformationUsingMaizeImmatureZygoticEmbryos、PlantEmbryoCultureMethodsandProtocolsMethodsinMolecularBiology、TAThorpeおよびECYeung編、SPRINGERSCIENCEANDBUSINESSMEDIALLC、327~341ページ;68.4gm/Lのスクロース;36gm/Lのグルコース;115mg/LのL-プロリン;100mg/Lのミオイノシトール;および200μMのアセトシリンゴンDMSO中で調製した;pH5.4を含有するマイクロ遠心分離管へと無作為的に分配した。所与の実験セットについて、プールされた穂に由来する胚を、各回の形質転換に用いた。アグロバクテリウムAgrobacterium属の培養の開始:上記の実施例4におけるバイナリー形質転換ベクターを含有するアグロバクテリウムAgrobacterium属のDAt13192株のグリセロール原液を、適切な抗生剤を含有するAB最小培地プレートWatsonら1975、JBacteriol123255~64上に線状播種し、20°Cで3~4日間にわたり増殖させた。単一のコロニーを各プレートから採取し、適切な抗生剤を含有するYEPプレート10gm/Lの酵母抽出物;10gm/LのPeptone;および5gm/LのNaClへと線状播種し、20°Cで1~2日間にわたりインキュベートした。アグロバクテリウムAgrobacterium属の培養物および共培養:アグロバクテリウムAgrobacterium属のコロニーを、YEPプレートから採取し、50mLのディスポーザブルの試験管における10mLの接種用培地中に懸濁させ、分光光度計を用いて、細胞密度を0.2~0.4のOD550550nmで測定した光学密度へと調整した。アグロバクテリウムAgrobacterium属の培養物を、125rpm室温のロータリーシェーカー上でインキュベートする一方、胚の切開を実施した。未成熟の接合胚滅菌したトウモロコシ穀粒から既に単離し、1mLの接種用培地内に入れたを接種用培地中で1回洗浄した。2mLのアグロバクテリウムAgrobacterium属懸濁液を胚の各試験管へと添加し、試験管を、10~15分間にわたりシェーカープラットフォーム上に置いた。胚を共培養用培地4.33gm/LのMS用塩;1×のISUModifiedMSVitamins;30gm/Lのスクロース;700mg/LのL-プロリン;KOH中3.3mg/LのDicamba3,6-ジクロロ-o-アニス酸または3,6-ジクロロ-2-メトキシ安息香酸;100mg/Lのミオイノシトール;100mg/Lのカゼインの酵素的加水分解物;15mg/LのAgNO3;DMSO中に100μMのアセトシリンゴン;および3gm/LのGELZAN商標SIGMA-ALDRICH登録商標;pH5.8へと移し、胚盤を上向きに方向づけ、25°C、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で3日間にわたりインキュベートした。カルスによる推定イベントの選択および再生:共培養期の後、胚を静置用培地4.33gm/LのMS用塩;1×のISUModifiedMSVitamins;30gm/Lのスクロース;700mg/LのL-プロリン;KOH中3.3mg/LのDicamba;100mg/Lのミオイノシトール;100mg/Lのカゼインの酵素的加水分解物;15mg/LのAgNO3;0.5gm/LのMES2-N-モルホリノエタンスルホン酸一水和物;PHYTOTECHNOLOGIESLABORATORIES登録商標、Lenexa、KS;250mg/Lのカルベニシリン;および2.3gm/LのGELZAN商標;pH5.8へと移し、25°C、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で3日間にわたりインキュベートした。胚を選択用培地1100nMのR-ハロキシホップ酸0.0362mg/Lを伴う静置用培地上記からなるへと移し、暗所または28°C、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で7~14日間にわたりインキュベートした。増殖しつつある胚発生カルスを選択用培地2500nMのR-ハロキシホップ酸0.1810mg/Lを伴う静置用培地上記からなるへと移し、28°C、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で14~21日間にわたりインキュベートした。この選択ステップは、トランスジェニックカルスがさらに増殖および分化することを可能とした。増殖しつつある胚発生カルスを、前再生用培地4.33gm/LのMS用塩;1×のISUModifiedMSVitamins;45gm/Lのスクロース;350mg/LのL-プロリン;100mg/Lのミオイノシトール;50mg/Lのカゼインの酵素的加水分解物;1.0mg/LのAgNO3;0.25gm/LのMES;NaOH中0.5mg/Lのナフタレン酢酸;エタノール中2.5mg/Lのアブシシン酸;1mg/Lの6-ベンジルアミノプリン;250mg/Lのカルベニシリン;2.5gm/LのGELZAN商標;および500nMのR-ハロキシホップ酸;pH5.8へと移し、28°C、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で7日間にわたり培養した。シュート様芽を伴う胚発生カルスを、再生用培地I4.33gm/LのMS用塩;1×のISUModifiedMSVitamins;60gm/Lのスクロース;100mg/Lのミオイノシトール;125mg/Lのカルベニシリン;3.0gm/LのGELZAN商標;および500nMのR-ハロキシホップ酸;pH5.8へと移し、24時間の光強度50μEm-2秒-1の明所下で7日間にわたり培養した。一次根を伴う小型シュートを、PHYTATRAYS商標PHYTOTECHNOLOGIESLABORATORIES登録商標中のシュート/根用培地4.33gm/LのMS用塩;1×のISUModifiedMSVitamins;30gm/Lのスクロース;100mg/Lのミオイノシトール;3.5gm/LのGELZAN商標;pH5.8へと移し、27°C、16:8時間の光強度140~190μEm-2秒-1の明所:暗所下で7日間にわたりインキュベートした。推定トランスジェニック小植物体をトランス遺伝子のコピー数について解析し、土壌へと移した。種子の生成:植物体は、METRO-MIX商標360無土壌栽培用培地SUNGROHORTICULTURE;Bellevue、WAへと移植し、栽培室で低温に馴らした。次いで、植物体を、SUNSHINECUSTOMBLEND商標160土壌混合物へと移植し、温室内で開花期へと発育させた。種子生成のための調節受粉を実施した。温室栽培される植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例12で記載される方法を介して実施した。根評点が0.75以上の植物体は、種子生成用の5ガロンの移植鉢へと速やかに移植した。移植植物体は、殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫による虫害および温室における害虫の開放を阻止した。種子生成のために、B104植物体を、非トランスジェニックB104花粉ドナー植物体と異系交配させた。これらの植物体に生成させた種子は、T1およびその後の世代の植物体における評価のために取り置く。Caf1-180v3ヘアピンdsRNA実施例4;プラスミドpDAB109817における構築物をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウムAgrobacterium属のDAt13192株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシB104植物体を生成させた。これらの温室栽培されるトランスジェニック植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例12で記載される方法を介して実施した。YFPを生成させるための遺伝子を含有するが、dsRNAを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミドpDAB101556で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表13に示す。VatpaseCv3ヘアピンdsRNA実施例4;プラスミドpDAB109815における構築物をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウムAgrobacterium属のDAt13192株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシB104植物体を生成させた。これらの温室栽培されるトランスジェニック植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例12で記載される方法を介して実施した。YFPを生成させるための遺伝子を含有するが、dsRNAを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミドpDAB101556で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表14に示す。VatpaseHv1ヘアピンdsRNA実施例4;プラスミドpDAB109816における構築物をコードする植物用の発現構築物を含むアグロバクテリウムAgrobacterium属のDAt13192株を用いて、トランスジェニックのトウモロコシB104植物体を生成させた。これらの温室栽培される植物体についてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイは、実施例12で記載される方法を介して実施した。YFPを生成させるための遺伝子を含有するが、dsRNAを生成させるための遺伝子は含有しない同様のプラスミドpDAB101556で形質転換された植物体を陰性対照として用いた。これらのバイオアッセイの結果を、表15に示す。WHISKERSを介する殺虫性Caf1-180v3ヘアピンdsRNAを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成植物ゲノムへと安定的に組み込んだキメラ遺伝子の発現を介して、1または複数の殺虫性dsRNA分子例えば、配列番号1~4のうちの1つを含む遺伝子を標的とするdsRNA分子を含めた少なくとも1つのdsRNA分子を生成させる植物体を生成させた。植物を形質転換するためのDNA分子は、実施例4において記載される通りに調製し、WHISKERSを介する形質転換米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号;米国特許公開第2008/0182332号;ならびにPetolinoおよびArnold2009、MPaulScott編、MethodsinMolecularBiologyTransgenicMaize、526巻、HumanaPress、NY、59~67ページにおいて本質的に記載されているにより、Hi-IIの懸濁細胞培養物中のトウモロコシ細胞へと送達した。植物細胞の形質転換および選択:標準的な無菌法を用いて、WHISKERSを介する形質転換のための全ての手順を実施し、一般にPetolinoおよびArnold2009、前出により記載された方法に従った。30mLの沈殿した懸濁細胞に、70mLの条件付け培地すなわち、細胞を増殖させた培地を加えて、175mLのNALGENE商標ディスポーザブル円錐形底遠心管THERMOFISHERSCIENTIFIC;型番:3145-0175内に5のココナッツ水SIGMAALDRICH、St.Louis、MO;型番:C5915を含有する200mLの新鮮なH9CP4.33gm/LのMSBasalSaltPHYTOTECHNOLOGIESLABORATORIES、型番:M524;30.0gm/Lのスクロース;100.0mg/Lのミオイノシトール;200mg/Lのカゼインの酵素的加水分解物;2.0mg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸;2.0mg/Lのナフタレン酢酸;691mg/LのL-プロリン;2.0mg/Lのグリシン;0.5mg/LのチアミンHCl;0.5mg/LのピリドキシンHCl;0.05mg/Lのニコチン酸;pH6.0培地へと移すことにより、HiIIトウモロコシZeamaysの胚発生細胞懸濁液Armstrongら1991、MaizeGenetCoopNewslett6592~3を継代培養した。次いで、希釈した細胞を、暗所内28°C、120rpmの回転半径を1インチとするジャイロロータリーシェーカー上の1Lの滅菌ディスポーザブル細胞培養フラスコにおいてインキュベートし、上記の通り3.5日ごとに細胞を継代培養した。継代培養の1日後、およびトランスフェクション手順の18~24時間前に、30mLの沈殿細胞を含有する50mLのH9CP培地を、1Lの滅菌フラスコ内に150mLの新鮮なGN6培地3.99gm/Lの、ビタミンを伴うChuN6BasalSaltPHYTOTECHNOLOGIESLABORATORIES、型番:C167;30gm/Lのスクロース;100mg/Lのミオイノシトール;2mg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸;pH6.0へと添加し、培養物を、上記の通り、ジャイロロータリーシェーカー上でインキュベートした。GN6培地中で18~24時間にわたるインキュベーションの後に、細胞懸濁液の全体を、無菌の175mLのディスポーザブル円錐形底遠心管へと移し、細胞を1~3分間にわたり沈殿させたところ、約40mLの細胞容量が得られた。使用済みの培地は注意深くデカントし、ピペットを介して残存する液体を除去して、水分を含んだ細胞塊を生成させた。細胞を、遠心管内に約180mLの高浸透圧培地GN6-SM;45gm/Lのソルビトールおよび45gm/Lのマンニトールを補充したGN6培地中に再懸濁させ、培養物を、室温23°C~25°Cで約30分間にわたるが、45分間を超えないように卓上用ロッカーシェーカー上に置いた。30分間にわたる浸透圧処置の後、細胞を遠心管内で3~5分間にわたり沈殿させた。次いで、ピペットを介し、細胞を攪乱しないように注意しながら液体を注意深く除去し、遠心管の50mLの目盛まで減量した。プラスミドDNAをトウモロコシの懸濁培養細胞へと送達するために、適量のGN6-SM培地を滅菌オートクレーブ処理した乾燥ウィスカーへと添加することにより、BIOGRADE商標SC-9炭化ケイ素製WHISKERSADVANCEDCOMPOITEMATERIALS、Greer、SC;ロット番号:981011-101の5w/w懸濁液5mLを調製した。pDAB109830のDNA適量実施例4を、遠心管典型的には40mL細胞の80μg/50mL懸濁液へと添加し、キャップで緊密に密栓し、遠心管を静かに旋回させて内容物を混合した。遠心管を、遠心管をしっかりと保持するように改変した市販の塗料ミキサーREDDEVIL商標Model5400;Minneapolis、MNにしっかりと固定し、10~20秒間にわたり振とうした。培地の浸透圧を低減するために、約150mLの新鮮な培地GN6-SM:GN6;v/vで2:1で約200mL最終容量まで希釈した後、細胞を、卓上用ロッカーシェーカー上、RTで約1時間にわたりインキュベートした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、約8.3mLのアリコート中でピペットを介して、細胞を濾紙上に等分に分配するように注意しながら、70mmの滅菌WHATMAN商標4濾紙THERMOFISHERSCIENTIFICへと移した。フィルターは、100×20mmのプラスチック製プレート内のGN6寒天培地上に置き、次いで、暗所のプラスチック製ボックス内28°Cで7日間にわたりインキュベートした。形質転換の1週間後、細胞を保持する濾紙を、100×20mmのプレート内1.0mg/Lのビアラホスを含有するGN6-1H2.5gm/LのGELZAN商標を補充したGN6培地固形寒天培地による新鮮なプレートへと移し、暗所内28°Cでインキュベートした。ビアラホスは、HERBIACE登録商標活性成分20日本、東京、明治製菓株式会社として提供されている。1週間後、各濾紙の細胞内容物を、37°C~40°Cの15mLのGN6軟質アガロース培地7.0gm/LのSEAPLAQUE商標Agarose;LONZA、Rockland、MEを伴うGN6培地を含有する50mLの滅菌ディスポーザブル遠心管へと掻爬することにより、細胞を軟質寒天中に包埋し、施栓した遠心管を十分に振とうし、次いで、遠心管の内容物を、GN61H固形寒天培地を含有する100×25mmの4つのプラスチック製プレートへと等分に注入した。各プレートを撹拌して、表面を細胞懸濁液の均一層でコーティングし、固形化したら、プレートを暗所内28°Cでインキュベートした。インキュベーションの6~10週間後、十分に増殖して現出しつつあるコロニーを、GN61H寒天培地を含有する新鮮なプレートへと移した。これらの候補形質転換コロニーを、選択培地上で2~4週間にわたり増殖させ、質量約50~200mgの組織を有する安定的イベントを確立し、次いで、これを分子解析にかけた。候補イベントに由来するカルス細胞の0.1mLパックの試料をサンプリングし、1.2mLのCOSTAR商標ポリプロピレンクラスター試験管CORNING,INC.;Corning、NYに入れ、-80°Cで凍結させた。分子解析:カルス細胞イベントを、Per5の3’UTRのリアルタイム定量的PCRを介して、全長転写物の相対発現について解析し、内部のトウモロコシ遺伝子TIP41様タンパク質に照らした比較によりコピー数を推定した。RNeasy商標96キットQIAGEN、Valencia、CAを用いて、RNAを単離した。第1の洗浄RW1の後、RDD緩衝液中のQIAGENRNアーゼ非含有DNアーゼでカラムを処理したキットにより示唆されている代替的プロトコールに従う。実質的に製造元の推奨するプロトコールに従い、5μLの変性RNAを伴う10μLの反応容量中のHIGHCAPACITYcDNASYNTHESISKITINVITROGENを用いて、第1の鎖のcDNAを調製した。ランダムプライマーとオリゴdTとを組み合わせた作業用原液を調製するために、プロトコールを若干改変して、100μMのT20VNオリゴヌクレオチドIDT10μLの、ランダムプライマー原液ミックスの1mL試験管への添加を含めた。cDNAを合成した後、ヌクレアーゼ非含有水で試料を1:3に希釈し、アッセイするまで-20°Cで保管した。10μL反応容量中、LIGHTCYCLER商標480ROCHEDIAGNOSTICS、Indianapolis、INにより、リアルタイムPCRを実施した。全てのアッセイに、鋳型を伴わないミックスだけの陰性対照を組み入れた。また、検量線のため、試料の交差汚染の基準となる供給源プレートには、ブランク供給源ウェル内の水も組み入れた。反応は、0.5μMのROCHEUNIVERSALPROBE商標、および10μMの標的遺伝子および基準遺伝子に対するプライマーにより行った。プライマー配列を表16に示す。PCR反応の条件は、以下の通りであった:195°Cで10分間にわたる標的の活性化;243サイクルにわたる95°Cで10秒間にわたる変性および60°Cにおける伸長;372°Cで1秒間にわたる捕捉;および440°Cで10秒間にわたる冷却。データ解析:データは、販売元の推奨に従い、Cq値を計算するための二次導関数最大値のアルゴリズムを用いる相対的定量化を介して、LIGHTCYCLER商標Softwarev1.5を用いて解析した。発現を解析するため、2つの標的間におけるCq値の差違の比較に依拠し、最適化されたPCR反応では、全てのサイクルにおいて産物は倍加するという仮定の下でベース値を2に選択するΔCt法を用いて発現値を計算したすなわち、2-CqTARGET-CqREF。トランスジェニック植物体の再生:inplantaにおける害虫バイオアッセイのために、一部の安定的に形質転換されたイベントを、植物体へと再生させた。選択過程の後、カルス培養物を、前再生用28培地ビタミンを伴う4.33gm/LのMSBasalMedium;30.0gm/Lのスクロース;5mg/Lの6-ベンジルアミノプリン;25μg/Lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸;2.5gm/LのGELZAN商標;および1.0mg/Lのビアラホスへと移した。移したカルス培養物は、持続的な白色蛍光約50μEm-2秒-1下、28°Cで7日間にわたりインキュベートした。再生させるため、培養物を、再生用培地36ビタミンを伴う4.33gm/LのMSBasalMedium;30gm/Lのスクロース;2.5gm/LのGELZAN商標;および1.0mg/Lのビアラホスへと移し、小植物体を生成させ、持続的な白色蛍光下、28°Cで最長3週間にわたり成長させた。小植物体が適切な成長段階に到達したら、それらを鉗子およびメスで摘出し、寒天を含有する20×100mmの試験管へと移し、2日間にわたり明所に置いた。トランスジェニック植物体に固有の識別子を割り当て、環境制御チャンバー昼間温度を約28°Cとし;夜間温度を24°Cとし;補充の照明による明期を16:8としたへと移した。トランスジェニック植物体を、試験管から3.5インチの移植鉢へと移植し、1~2週間にわたり環境制御チャンバーに戻して、植物体を馴致する一助とした。次いで、トランスジェニック植物体を温室へと移し、害虫給餌バイオアッセイのために、ROOTRAINER商標1個当たり、イベント1例当たりの植物体1体で、小型の移植鉢からROOTRAINERS商標TINUS商標350-4型;SPENCER-LEMAIREINDUSTRIES;Acheson、Alberta、Canadaへと移植した。ROOTTRAINERS商標への移植の約4日間後、T0の植物体は、害虫給餌バイオアッセイの準備ができていた。実施例12に記載される方法を介して害虫給餌バイオアッセイを実施した。ヘアピンdsRNAを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、WCRによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、dsRNA転写物の高度な発現レベルPer5の3’UTRについての相対的PCRスコアリングにより測定したを呈示する植物体において明らかであった。配列番号97を含むRNAiヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のTIP41様基準遺伝子の16倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表17に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちのわずか3と比較して、RNAiトランスジェニック植物体のうちの36がWCRによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。T0のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体は、非トランスジェニックの対照植物体と比較して、WCRによる根切りのかなりの低減を示した。WHISKERSを介する殺虫性VatpaseCv3ヘアピンdsRNAおよび殺虫性VatpaseCv4ヘアピンdsRNAを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成プラスミドであるpDAB109828およびpDAB109838による形質転換実施例4を介して、VatpaseCv3ヘアピンdsRNAまたはVatpaseCv4ヘアピンdsRNAを発現させるHiIIトウモロコシのトランスジェニック植物体をもたらすために、実施例9で記載した形質転換法を用いた。実施例9で記載したスクリーニング法に従い、分子スクリーニングを実施し、実施例12で記載されるバイオアッセイ法に従い、セイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイを実施した。ヘアピンdsRNAを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、WCRによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、dsRNA転写物の高度な発現レベルPer5の3’UTRについての相対的PCRスコアリングにより測定したを呈示する植物体において明らかであった。配列番号100VatpaseCv3または配列番号103VatpaseCv4を含むRNAiヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のTIP41様基準遺伝子の20倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表18に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちの0と比較して、RNAiトランスジェニック植物体のうちの43がWCRによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。T0のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体のみが、WCRによる根切りのかなりの低減を示した。WHISKERSを介する殺虫性VatpaseHv1ヘアピンdsRNAを含むトランスジェニックトウモロコシ組織の生成プラスミドであるpDAB109829による形質転換実施例4を介して、VatpaseHv1ヘアピンdsRNAを発現させるHiIIトウモロコシのトランスジェニック植物体をもたらすために、実施例9で記載した形質転換法を用いた。実施例9で記載したスクリーニング法に従い、分子スクリーニングを実施し、実施例12で記載されるバイオアッセイ法に従い、セイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイを実施した。ヘアピンdsRNAを生成させるトランス遺伝子の存在および発現は、WCRによる根切りの低減を結果としてもたらし、これは、dsRNA転写物の高度な発現レベルPer5の3’UTRについての相対的PCRスコアリングにより測定したを呈示する植物体において明らかであった。配列番号106を含むRNAiヘアピンを含有し、相対発現レベルが内部のTIP41様基準遺伝子の18倍であるこれらのイベントについてのセイヨウトウモロコシ根虫バイオアッセイの結果を、表19に示す。結果は、非トランスジェニックの被験対照植物体のうちの0と比較して、RNAiトランスジェニック植物体のうちの60がWCRによる虫害の低減を裏付けた驚くべき結果を示す。T0のトランスジェニックトウモロコシ植物体において生物学的応答は可変的であるが、トランスジェニック植物体のみが、WCRによる根切りのかなりの低減を示した。トランスジェニックトウモロコシについての害虫バイオアッセイセイヨウトウモロコシ根虫WCR:DiabroticavirgiferavirgiferaLeConteの卵は、土壌中のものをCropCharacteristicsFarmington、MNから受領した。卵は、28°Cで10~11日間にわたりインキュベートした。卵から土壌を洗い落とし、0.15の寒天溶液に入れ、濃度を、0.25mLのアリコート1つ当たりの卵約75~100個へと調整した。孵化プレートを卵懸濁液のアリコートを伴うペトリディッシュ内で調製して、孵化速度をモニタリングした。トウモロコシ植物体の周囲の土壌に、WCRの卵150~200個を群棲させた。2週間にわたり害虫に摂食させ、その後、各植物体に根評点をつけた。グレーディングには、Node-InjuryScaleを利用したOlesonら2005、JEconEntomol9811~8。根評点が0.75以上の植物体は、種子生成用の5ガロンの移植鉢へと速やかに移植した。移植植物体は、殺虫剤で処理して、さらなる根切り虫による虫害および温室における害虫の開放を阻止した。種子生成のために、HiII植物体を、近交系のトウモロコシである5XH751花粉ドナーと異系交配させた。これらの植物体に生成させた種子は、T1およびその後の世代の植物体における評価のために取り置く。鞘翅目有害生物の配列を含むトランスジェニックトウモロコシZeamays実施例8および9で記載した通りに、10~20体のT0のトランスジェニックトウモロコシZeamays植物体を生成させる。さらに10~20体の、配列番号1~4に示されるRNAi構築物のためのヘアピンdsRNAを発現させる独立のT1トウモロコシZeamays系列を、コーンルートワーム攻撃のために得る。これらは、RT-PCRを介して確認する。場合によって、独立のT1系列から選択される全RNAを、RNAi構築物の各々におけるヘアピンカセットのpdkイントロンに結合するようにデザインしたプライマーを伴うRT-PCRに用いる。加えて、場合によって、RNAi構築物における各標的遺伝子に特異的なプライマーは、inplantaにおけるsiRNAの生成に要請されるあらかじめプロセシングされたmRNAを増幅し、その生成を確認するのに用いる。各標的遺伝子に所望されるバンドの増幅により、各トランスジェニックトウモロコシZeamaysにおけるヘアピンRNAの発現が確認される。その後、場合によって、標的遺伝子のdsRNAヘアピンのsiRNAへのプロセシングは、RNAブロットハイブリダイゼーションを用いて、独立のトランスジェニック系列において確認する。トランスジェニックのRNAi系列と野生型トウモロコシZeamaysとの表現型の比較鞘翅目有害生物のヘアピンdsRNAを創出するために選択された標的遺伝子または標的配列は、任意の知られた植物遺伝子または植物配列との類似性を有さない。よって、これらの遺伝子または配列を標的とする構築物による植物体全体にわたるRNAiの生成または活性化がトランスジェニック植物体に対して有害効果を及ぼすことは予測されない。しかし、トランスジェニック系列の発達および形態的特徴は、野生型の植物体のほか、空のヘアピンベクターで形質転換されたトランスジェニック系列の植物体と比較される。植物体の根、シュート、茎葉、および生殖特徴が比較される。トランスジェニック植物体および野生型植物体の根の長さおよび成長パターンには観察可能な差違が見られない。草高、葉の枚数およびサイズ、開花時期、花のサイズ、ならびに外観などの植物体のシュート特徴は同様である。一般に、invitroおよび温室内の土壌中で培養した場合、トランスジェニック系列と標的iRNA分子の発現を伴わない系列とでは、観察可能な形態的差違が見られない。鞘翅目有害生物の配列およびさらなるRNAi構築物を含むトランスジェニックトウモロコシZeamays鞘翅目有害生物以外の生物を標的とするiRNA分子へと転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックトウモロコシZeamaysの植物体を、アグロバクテリウムAgrobacterium属またはWHISKERS商標を介する形質転換を介して形質転換して、1または複数の殺虫性dsRNA分子例えば、配列番号1~4のうちの1つを含む遺伝子を標的とするdsRNA分子を含めた少なくとも1つのdsRNA分子を生成させる。本質的に実施例4で記載される通りに調製される植物体の形質転換用のDNA分子の調製物を、鞘翅目有害生物以外の生物を標的とするiRNA分子へと転写されるそのゲノムにおける異種コード配列を含むトランスジェニックトウモロコシZeamaysの植物体から得られるHi-IIトウモロコシの懸濁細胞培養物へと送達する。鞘翅目有害生物抵抗性のトランスジェニック植物体inplantaにおいて標的遺伝子に対応するdsRNA、siRNA、またはmiRNAを送達し、その後、摂食を介してこれを鞘翅目有害生物に取り込ませる結果として、RNAを介する遺伝子サイレンシングによる標的遺伝子の下方制御がもたらされる。標的遺伝子の機能が重要であれば、鞘翅目有害生物の成長、発育、および生殖が影響を受け、WCR、NCR、SCR、MCR、D.バルテアータDbalteataLeConte、D.u.テネラDutenella、およびジュウイチホシウリハムシDuundecimpunctataMannerheimのうちの少なくとも1つの場合であれば、寄生、摂食、発育、および/もしくは生殖の成功に失敗することがもたらされるか、または発育の1もしくは複数の段階における鞘翅目有害生物の死滅がもたらされる。次いで、標的遺伝子の選択およびRNAiの成功裏の適用を用いて、鞘翅目有害生物を防除する。各RNAi構築物について10~20体ずつの独立のT1トウモロコシZmaysトランスジェニック系列を、5~10連でコーンルートワーム種に攻撃させる。攻撃は、各コーンルートワーム種について2連ずつとする。RNAi系列のT1種子を発芽させ、抵抗性の植物を、発芽後10~15日間にわたり改変Knop培地へと移す。野生型対照トウモロコシZmaysの種子も同時に発芽させ、コーンルートワーム感染に用いる。対照では、1または複数のRNAi構築物を保有するトランスジェニックトウモロコシZmays系列の場合より著明に多くの>50コーンルートワームが生存する。iRNAのアバンダンスは、定量的リアルタイムRT-PCRを用いて、野生型植物体およびトランスジェニック植物体の根を常食とするコーンルートワームにおいて測定する。1または複数のRNAi構築物を保有するトランスジェニックトウモロコシZmays系列では、対照植物体より著明に多くのiRNA分子が見出される。これらの結果は、トランスジェニック系列が標的遺伝子に対応するsiRNAをプロセシングし、これらのsiRNAが、摂食するコーンルートワームにより取込み可能であることを示す。より重要であるが、結果は、全ての標的遺伝子に対するRNAiを介する阻害が、標的であるコーンルートワームの成長、発育、および生存能力に影響を及ぼすことを示す。さらに、ミスマッチ配列を伴うRNAi分子であって、標的遺伝子に対する配列同一性が80を超えるRNAi分子は、野生型配列と同様の形でコーンルートワームに影響を及ぼす。ミスマッチ配列が天然配列と対合して、同じRNAi構築物においてヘアピンdsRNAを形成すれば、植物体によりプロセシングされた、摂食する鞘翅目有害生物の成長、発育、および生存能力に影響を及ぼすことが可能なsiRNAが送達される。"