培養ブロスが、5g/Lから10g/Lの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のG-CSFを得るための改良方法。抗生物質による高選択圧を維持するのに加えて、プラスミド安定性は、ベクター構築の段階で改善され得る非特許文献22および23。方法において、プラスミド安定性は、栄養飢餓を避けるなどの、培養条件を調節することによって改善され得る非特許文献24。大規模な基質制限フェドバッチ培養方法を実行する間、栄養制限/栄養飢餓は差し迫った問題であり、あまりに頻繁に、または大量に抗生物質を加えることは、複雑さが低い方法での、高収量の産物およびプラスミドの高安定性を維持するためには非現実的であり高価な溶液である。したがって、単純でロバストな方法を用いて、プラスミドの高安定性を維持することによって、G-CSFを高体積収量で調整する代替方法を開発する、明らかな必要性が存在する。本発明は、生産培地および培養ブロスにおいて、高濃度の、マグネシウムイオンもしくはナトリウムイオンと組み合わせたカリウムイオンを用いて、培養物でのプラスミドの高安定性を維持することによって、大腸菌において高体積収量で顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを生産するための、非循環フェドバッチ培養方法について記述する。本発明は、体積収量volumetricyieldsが改善された水準での、顆粒球コロニー刺激因子G-CSFの産生のための、発酵方法の改善に関する。それはまた、さらにはG-CSFの高体積収量につながる、プラスミドの安定性の改良に関する培養条件を開示する。本発明の方法は、生産培地での高濃度の、ナトリウム、マグネシウムなどの他の無機塩と組み合わせて、高濃度のカリウムの存在下で実行される、複数回誘導multipleinductionsを介しての、非循環フェドバッチ培養方法に関与する。驚くべきことに、これ以降詳細に記述される、本発明での塩を用いるこのような方法を、特異的な高成長速度と組み合わせて用いた場合には、プラスミドの高安定性がそれでもなお維持され、さらなる体積収量の増加へとつながる。本発明は、以下にさらに詳細に記述される。任意の顆粒球コロニー刺激因子G-CSFともまた呼ばれるポリペプチドを利用してよい。用語顆粒球コロニー刺激因子またはG-CSFは、天然のG-CSF、突然変異タンパク質、断片、融合タンパク質、アナログおよびそれらの派生物であって、天然のhG-CSFのレセプター結合活性の少なくとも60を生物学的に示すか、あるいはアミノ酸同一性で少なくとも約80を保持しているものを意味する。このようなG-CSF配列の例には、Genbank配列番号GI:27437048が含まれ、それらは、米国特許第4810643号に記載される。大腸菌細胞は、当該技術分野に著名な形質転換技術を用いて、他のベクター成分とともに、G-CSFならびにt7、tacおよび類似のプロモーターから選択される適切なプロモーターのコード配列を含む、適切な発現ベクターで形質転換される。以下で記載される方法において、発酵とは、G-CSFの産生のための、微生物、好ましくは組換え大腸菌の好気生育を意味する。このような方法では、成長のバッチ段階batchphaseとは、播種後の、もし必要があれば発酵槽の培養ブロスに水酸化アンモニウムを加えるのを除いては、栄養物のない期間を指す。培養ブロスは、細胞、培地ならびにもしあれば培地と細胞の派生物の懸濁液である。成長段階での基質制限フェドバッチ培養とは、主な炭素/エネルギー源例えばグルコースの濃度が制限されているような方法で、フェドバッチ培養基を培養ブロスに加えることによって、バイオマスの主要な増加少なくとも2倍にが生じる成長段階でのそれを意味する。前記培地の流量が、培養物の特異的な成長速度を決定する。前誘導培地とは、誘導体例えばIPTGを加える前に、培養ブロスに加えられる培養基とは異なる組成物を有する培地を指す。誘導とは、誘導体例えばIPTGおよびラクトースの添加によって、先行技術によって知られているツールによって決定されるように、細胞中のG-CSFの濃度を感知できるほどに増加させる方法である。生産培地は、培養基growthmediaとは異なる組成物を有し、G-CSF遺伝子の誘導の間、発酵槽中の培養ブロスに添加される。生産培地は、基質例えばグルコースの濃度を制限するような方法でも、加えられた。生産培地の流量は、生産段階の間の培養物の特異的な成長速度を決定する。G-CSFをコードする適切な発現ベクターで事前に形質転換された、宿主である大腸菌は、最初にシェーカーフラスコ内で37°Cで培養して、発酵槽のための種を成長させた。この種培養物を、発酵槽中の無菌の培養基を播種するために用いた。組換え大腸菌培養物が成長をし始め、培養ブロス中のグルコース濃度が0.5g/L以下にいったん落ちると、発酵の成長段階での基質制限フェドバッチ培養モードが開始される。基質制限フェドバッチ培養の態様で、フェドバッチ培養用培養基の供給が、成長段階の間、指数的にまたは定速で連続して、あるいは不連続で続けられた。培養ブロス中の、乾燥細胞重量で1~60g/Lの細胞密度およびグルコース濃度が0.5g/L未満に到達した後、前生産培地を添加し、続いて生産培地の供給を開始して、連続または不連続の基質制限態様で続けた。G-CSFの複数回誘導を、IPTGで行った。誘導体の添加の間もしくは後、平均的な特異的成長速度は減少しない。pHを約5~7に維持する。温度を約30~42°Cに維持する。前生産培地を添加して2から48h後に、培地を取り除いて、記載される技術に従い、ダウンストリーム処理downstreamprocessingを行った。成長段階の培地は、グルコース、グリセロール、などまたはそれらの混合物を含む群から選択される炭素およびエネルギー源、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆soyabeanカゼイン加水分解物など、またはそれらの混合物を含む群から選択される複合培地成分、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、チアミン、グリシン、および塩化亜鉛を含む群から選択される、適切な塩/栄養物を含む。エアレーション、撹拌、播種、播種の時間などのような、他の発酵条件は、便宜上すべて取り入れるものは、先行技術で周知である。前生産培地は、例えばチアミン、グリシンなどまたはそれらの混合物のような栄養物、カナマイシン、およびアンピシリンなどのような抗生物質とともに、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、大豆カゼイン加水分解物から選択される、複合培地成分を含む。適切な塩は、培地が高濃度水準のKイオンをNaもしくはMgイオンのいずれかとともに含む、クエン酸、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素カリウム、酪酸ナトリウム、および塩化亜鉛を含む群から選択される。生産培地は、前生産培地の構成成分に加えて、炭素源を含む。適切な炭素源は、グリセロール、グルコース、フルクトースなどまたはそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の好ましい炭素源はグルコースである。生産段階の間、培養ブロスは、NaもしくはMgイオンのいずれかとともに高濃度水準のKイオンで維持される。培養ブロス中で、Kイオンの濃度は約60mMから約300mM、Naイオンの濃度は約60mMから約300mM、Mgイオンの濃度は約150mMから約250mMで維持される。好ましい実施態様では、培養ブロス中、Kイオンの濃度は90mMから150mM、Naイオンの濃度は60mMから120mM、およびMgイオンの濃度は180mMから220mMの範囲である。さらなる実施態様では、高濃度5g/Lから10g/Lの範囲でのチアミンの添加により、5~6g/Lの範囲のG-CSFの収量が提供される。本発明の方法により、成長段階および生産段階75~90を通して、プラスミドの高安定性の維持を伴う、G-CSFの高収量5~9.5g/Lでの産生がもたらされる。ある態様において、本発明は以下の通りである:[態様1]NaまたはMgから選択される高濃度の無機陽イオンとともに、60mMから180mMの濃度範囲でKイオンを含む培養ブロスでの発酵での、高体積収量の顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを得るための改良方法。[態様2]前記Naイオンの濃度が90mMから300mMの範囲であり、Mgイオンの濃度が150mMから250mMの範囲である、態様1に記載の方法。[態様3]前記培養ブロスが、酵母抽出物、トリプトン、ペプトン、カゼイン酵素加水分解物、および大豆カゼイン加水分解物からなる群から選択される複合培地成分を含む、態様1または2に記載の方法。[態様4]基質制限フェドバッチ培養方法である、態様1から3のいずれか一項に記載の方法。[態様5]生産段階の間に、遺伝子の複数回誘導を行う、態様1から4のいずれか一項に記載の方法。[態様6]前記培養ブロスがさらに、グルコース、グリセロール、およびフルクトースから選択される炭素源を含む、態様1から5のいずれか一項に記載の方法。[態様7]生産段階と前生産段階の間に、平均的な特異的成長速度が同一であるように維持される、態様1から6のいずれか一項に記載の方法。[態様8]Kイオンの濃度が90mMから150mMであり、Naイオンの濃度が60mMから120mMであり、Mgイオンの濃度が180mMから220mMの濃度である、態様1から7のいずれか一項に記載の方法。[態様9]プラスミドの安定性が少なくとも75である、態様1から8のいずれか一項に記載の方法。[態様10]培養ブロスへの60mMから180mMの範囲でKイオンの添加によってG-CSFのプラスミド安定性を改善させる方法。[態様11]生産段階の抗生物質の濃度が、成長段階で用いられる濃度よりも低い、態様1から10のいずれか一項に記載の方法。[態様12]iG-CSFをコードする適切な発現ベクターであらかじめ形質転換された適切な大腸菌の培養物を発酵槽に播種する工程と、iiバイオマスを増加させるための、成長段階のバッチ培養およびフェドバッチ培養のモードの工程と、iii適切な前誘導培地の添加の工程と、iv前記遺伝子の複数回誘導を行う前記基質制限フェドバッチ培養モードでの適切な生産培地の添加の工程を含み、v前記培養ブロス中のK、NaおよびMgイオンの最終濃度が、態様1から11の一項もしくは複数項に規定された濃度である、G-CSFの生産方法。[態様13]前記G-CSFの体積収量が5g/Lから9.5g/Lの範囲である、態様1から12のいずれか一項に記載の方法。[態様14]培養ブロスが、5g/Lから10g/Lの範囲でチアミンを含む、発酵での高体積収量のG-CSFを得るための改良方法。以下に、本発明の例示として実施例を開示する。プラスミドの安定性および体積収量に関するNaおよびKイオンの高濃度の効果この実験を30Lの発酵槽で実行した。ヒトG-CSF遺伝子で形質転換された大腸菌BL21DE3細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。組成物播種前の濃度KH2PO413.3g/LNH42HPO44.0g/L酵母抽出物1.0g/Lグルコース10.0g/Lクエン酸1.7g/LMgSO47H2O1.2g/L微量要素溶液20.0mL/LTraceelementsolutionカナマイシン50mg/L微量金属溶液:組成物濃度FeCl36H2O0.162g/LZnCl24H2O0.0144g/LCoCl26H2O0.12g/LNa2MoO42H2O0.012g/LCaCl22H2O0.006g/LCuCl21.9g/LH3BO30.5g/L基質制限フェドバッチ培養モードに、以下のフェドバッチ培養用培養基を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた:組成物濃度グルコース700g/LMgSO47H2O20g/L微量要素溶液20mL/Lカナマイシン500mg/L成長段階では、水酸化アンモニウムを、6.8~7.0の範囲にpHを維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。バッチ2で600nmで約50AUの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。組成物濃度酵母抽出物84.38g/L塩化カリウム75.41g/L塩化ナトリウム123.13g/L塩化水素チアミン8.44g/L培養ブロス中のカリウムおよびナトリウム陽イオンの最終濃度は、それぞれ約120mMおよび250mMであった。以下の生産培地の供給を、続いて開始した。組成物濃度グルコース270g/LMgSO47H2O1g/L酵母抽出物214g/L塩化水素チアミン7g/L塩化カリウム8.94g/Lバッチ2でのみ塩化ナトリウム17.5g/Lバッチ2でのみG-CSF遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したIPTG溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、pH6.8に維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。バッチ2の生産段階の間に用いられたカナマイシンの量一度のみ37.5mgが添加されたは、バッチ1で用いられた量複数回添加、2925mgの約1であったので、プラスミドの安定性に関する塩の効果について試すこととなった。プラスミドの安定性は、はじめに無菌的に最後のバッチのサンプルを無菌チューブに回収してから、カナマイシン50mg/L有りもしくはなしのLB培地上に、適切に希釈したサンプルを適量、無菌的に塗ることによって決定した。プレートを37°Cで48時間インキュベーションしてから、統計的に有意性のあるコロニーを、これらのプレートでカウントした。カナマイシンを含むプレートで得られるコロニー数を、カナマイシンを含まないプレートで得られるコロニー数で割ることによって得られる値を、プラスミドの安定性を計算するために用いた。バッチ2のプラスミド安定性96.8は、バッチ1のプラスミド安定性45.0と比較して2倍以上であったので、プラスミド安定性を改善するのにナトリウムおよびカリウムイオンの重要性が示された図1。G-CSFの体積収量は、SDS-PAGEの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのGCSFバンドの比重のdensitometric定量化によって決定し、バッチ1で5.38g/Lおよびバッチ2で5.81g/Lであった。バッチ2の体積収量は、バッチ1のそれより約8高かった図2。[実施例2]プラスミドの安定性および体積収量に関するマグネシウムおよびカリウム陽イオンの高濃度の効果この実験を30Lの発酵槽で実行した。両バッチバッチ3およびバッチ4の生産段階培地は、マグネシウム陽イオンの濃度のみを除いて、カリウム陽イオンの濃度をも含む、同一であり、その結果は、カリウムおよびマグネシウム陽イオンの組み合わせの効果を反映した。ヒトG-CSF遺伝子で形質転換された大腸菌BL21DE3細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。組成物播種前の濃度KH2PO413.3g/LNH42HPO44.0g/L酵母抽出物1.0g/Lグルコース10.0g/Lクエン酸1.7g/LMgSO47H2O1.2g/L微量要素溶液20.0mL/Lカナマイシン50mg/L微量金属溶液:組成物濃度FeCl36H2O0.162g/LZnCl24H2O0.0144g/LCoCl26H2O0.12g/LNa2MoO42H2O0.012g/LCaCl22H2O0.006g/LCuCl21.9g/LH3BO30.5g/L基質制限フェドバッチ培養モードに、以下のフェドバッチ培養用培養基を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた:組成物濃度グルコース700g/LMgSO47H2O20g/L微量要素溶液20mL/Lカナマイシン500mg/L成長段階では、水酸化アンモニウムを、6.8~7.0の範囲にpHを維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。600nmで約50AUの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。組成物濃度酵母抽出物84.38g/L塩化カリウム75.44g/L塩化水素チアミン8.38g/L硫酸マグネシウム187.06g/Lバッチ4でのみ以下の生産培地の供給を、続いて開始した。組成物濃度グルコース270g/L硫酸マグネシウム1g/Lバッチ3でのみ硫酸マグネシウム50.3g/Lバッチ4でのみ酵母抽出物214g/L塩化水素チアミン7g/L塩化カリウム8.94g/LG-CSF遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したIPTG溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、pH6.8に維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン一度のみ37.5mgが添加されたを用いた。培養ブロス中のカリウムおよびマグネシウム陽イオンの濃度は、生産段階の間、それぞれ約120mMおよび200mMであった。プラスミドの安定性は、前に記載したように決定した。バッチ4のプラスミド安定性97.3は、バッチ3のプラスミド安定性91.8と比較して約6高かったので、プラスミド安定性を改善するのにマグネシウムおよびカリウムイオンの有効性が示された図3。マグネシウムおよびカリウム陽イオンの存在下で得られるプラスミド安定性は、バッチ1生産段階での高濃度の塩がないでのそれより116.2高かった。G-CSFの体積収量は、SDS-PAGEの後に、信憑性のあるスタンダードを用いた標準プロットに対してのGCSFバンドの比重の定量化によって決定し、バッチ3で5.48g/Lおよびバッチ4で8.35g/Lであった図4。バッチ4の体積収量は、バッチ1のそれより約55高かった。[実施例3]体積収量に関しての生産段階の間の高特異的な成長速度の効果この実験を30Lの発酵槽で実行した。両バッチバッチ4およびバッチ5の生産段階の培地組成物は、マグネシウムおよびカリウム陽イオンの濃度を含めて同一であった。バッチ5の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は、バッチ4の生産段階のそれより高かった。ヒトG-CSF遺伝子で形質転換された大腸菌BL21DE3細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。組成物播種前の濃度KH2PO413.3g/LNH42HPO44.0g/L酵母抽出物1.0g/Lグルコース10.0g/Lクエン酸1.7g/LMgSO47H2O1.2g/L微量要素溶液20.0mL/Lカナマイシン50mg/L微量金属溶液:組成物濃度FeCl36H2O0.162g/LZnCl24H2O0.0144g/LCoCl26H2O0.12g/LNa2MoO42H2O0.012g/LCaCl22H2O0.006g/LCuCl21.9g/LH3BO30.5g/L基質制限フェドバッチ培養モードに、以下のフェドバッチ培養用培養基を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた:組成物濃度グルコース700g/LMgSO47H2O20g/L微量要素溶液20mL/Lカナマイシン500mg/L成長段階では、水酸化アンモニウムを、6.8~7.0の範囲にpHを維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。600nmで約50AUの光学濃度に到達した後に、以下の組成物から成る、前誘導培地を培養ブロスに加えた。組成物濃度酵母抽出物84.38g/L塩化カリウム75.44g/L塩化水素チアミン8.38g/L硫酸マグネシウム187.06g/L以下の生産培地の供給を、続いて開始した。組成物濃度グルコース270g/L硫酸マグネシウム50.3g/L酵母抽出物214g/L塩化水素チアミン7g/L塩化カリウム8.94g/LG-CSF遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したIPTG溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、pH6.8に維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。選択圧を加えるために、カナマイシンを培養物に添加した。生産段階の間、等量のカナマイシン一度のみ37.5mgが添加されたを用いた。バッチ4の生産段階の間の平均的な特異的成長速度は約0.04l/hであり、バッチ5のそれは約0.07l/hであった。G-CSFの体積収量は、すでに述べたようにして、バッチ4で8.35g/Lであり、バッチ5で9.94g/Lであると決定された。バッチ5の体積収量はバッチ4のそれより約19高かった図5。両バッチの最後のバッチのサンプルでのプラスミド安定性は高かった>75。[実施例4]体積収量に関しての生産段階での高濃度のチアミンを用いる効果この実験を30Lの発酵槽で実行した。ヒトG-CSF遺伝子で形質転換された大腸菌BL21DE3細胞の種培養物を、以下の組成物の培養基に播種した。組成物播種前の濃度KH2PO413.3g/LNH42HPO44.0g/L酵母抽出物1.0g/Lグルコース10.0g/Lクエン酸1.7g/LMgSO47H2O1.2g/L微量要素溶液20.0mL/Lカナマイシン50mg/Lバッチ1においてアンピシリン100mg/Lバッチ6において微量金属溶液:組成物濃度FeCl36H2O0.162g/LZnCl24H2O0.0144g/LCoCl26H2O0.12g/LNa2MoO42H2O0.012g/LCaCl22H2O0.006g/LCuCl21.9g/LH3BO30.5g/L基質制限フェドバッチ培養モードに、以下のフェドバッチ培養用培養基を添加することにより、バイオマスの重要な増加がもたらされた:組成物濃度グルコース700g/LMgSO47H2O20g/L微量要素溶液20mL/Lカナマイシン500mg/Lバッチ1においてアンピシリンバッチ6においてのみ培養ブロスに各添加50mg/Lで。バッチのフェドバッチ培養成長段階の間に、全部で6回の添加がなされた。成長段階では、水酸化アンモニウムを、pH約6.8を維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。600nmで約50AUの光学濃度に到達した後に、以下の生産培地の供給を開始した。組成物濃度グルコース270g/LMgSO47H2O1g/L酵母抽出物214g/L塩化水素チアミン7g/Lバッチ1においてのみカナマイシン2.925gバッチ1で複数回添加されたアンピシリン2.689gバッチ6で複数回添加されたG-CSF遺伝子の発現を、培養ブロスにろ過滅菌したIPTG溶液を複数回添加することによって誘導させた。生産段階では、水酸化アンモニウムを、pH6.8に維持するためのpH調節剤として用いた。温度を37°Cに維持した。G-CSFの体積収量は、すでに述べたようにして決定された。バッチ1高チアミンバッチの最後のバッチのサンプルでの体積収量は、バッチ64.86g/Lのそれよりも約10.7高かったので、G-CSFの体積収量を改善させるのに、高濃度のチアミンの効果が示された図6。方法の利点1高体積収量により、スモールスケールでの収量がより多くなるので、スケールアップに関する資本支出を制限するのが可能になる。2高体積収量は、非常に低いコストの培地成分マグネシウム、カリウムおよびマグネシウム塩を用いて達成される。3高プラスミド安定性を有する培養により、例えば高特異的な成長速度の条件でのG-CSF遺伝子の発現のような、代謝性ストレスの高い条件でのG-CSFの体積収量を産生することがより可能になる。