"イソギンチャクスチコダクチラヘリアンサスStichodactylahelianthusから得られるタンパク質及び抗原のリポソームベシクル中への共カプセル化を含む細胞免疫反応を誘発するためのワクチンビヒクル。脂質ベシクルがDPPC及びChoを当モル比で含む請求項1記載のワクチンビヒクル。イソギンチャクスチコダクチラヘリアンサスStichodactylahelianthus由来のタンパク質がStII、StI及びそれらの変異体を含む群から選ばれる、請求項1記載のワクチンビヒクル。Stトキシンの変異体がStIW111C、StIW111Cirrev又は熱不活性化StIIを含む群から選ばれる、請求項3記載のワクチンビヒクル。抗原が、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患を含む群から選ばれる病変に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項1記載のワクチンビヒクル。抗原が、癌に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項5記載のワクチンビヒクル。抗原が、AIDSに関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項5記載のワクチンビヒクル。抗原が、結核に関連したタンパク質又はポリペプチドである、請求項5記載のワクチンビヒクル。請求項1~9のいずれか一項に記載のワクチンビヒクルを含み、免疫性アジュバントを欠くワクチン組成物。癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患を含む群から選ばれる疾病に罹っている患者の免疫反応を増大させるために有用な請求項9記載のワクチン組成物の使用。腫瘍疾患の免疫療法における応用の観点から、抗原への特異的な細胞性免疫反応を誘発することができ、バクテリアトキシンを含む組成物よりも攻撃性の少ない新しいワクチン製剤を得ることが望ましい。驚くべきことに本発明の著者らは、抗原を孔形成又は溶菌活性を示さないものも含めて記載されたトキシンの変異体のいずれかとともにワクチン製剤リポソーム-St内にカプセル化して皮下にsc又は筋肉内にim投与すると、CTL反応の典型的なエンハンサー、非修飾の抗体レベル、及びリポソーム抗原により誘発された混合Th1/Th2反応として従来技術と考えられるポリイノシン酸:ポリシチジル酸ポリI:C、PICを用いた陽性対照群で観察されるよりも、標的細胞の溶菌がずっと高い割合で誘発される。これは、タンパク質抗原に対する細胞性及び体液性の両方の反応を生じるリポソーム-Stシステムのポテンシャルを示しており、ワクチン化目的のためのこの製剤の使用に関連している。本発明の目的は、St類として知られるDPPCとCho共カプセル化トキシンとタンパク質抗原のリポソーム調製に基づくワクチンビヒクルである。DPPCとChoのリポソーム製剤ではSt類として知られるトキシンの変異体例えばStIW111C及びStIW111Cirrevがタンパク質抗原とともにカプセル化されており、このリポソーム調製も本発明の主題である。他の局面では、強力な抗原特異的なCTL反応の誘発のためにscで又はimで投与した抗原とともにトキシンを含むこのワクチンビヒクルに基づくワクチン組成物もまた、本発明の主題である。本発明の他の目的は、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患からなる群から選ばれる疾患に罹っている患者の免疫反応の強化のためにscで又はimで投与した抗原とともにトキシンを含むこのワクチンビヒクルに基づく、上記のワクチン組成物の使用である。他の局面では、本発明の主題はまた、癌及び細胞内病原体により引き起こされる感染性疾患からなる群から選ばれる疾患に罹っている、免疫反応の強化を必要とする患者を治療する方法であって、トキシンSt類又はその変異体を疾患に関連のある抗原とともに含むこのワクチンビヒクルに基づくワクチン組成物をscで又はimで投与することを含む上記方法である。さらに本発明はまた、抗原を発現する腫瘍細胞による攻撃に対するそのようなワクチン組成物によって提供される保護、腫瘍の割合の低減、及び癌患者の生存率の上昇に関する。それ故、抗原に関連する病気の開始の予防方法もまた本発明の目的である。本発明のワクチンビヒクルはStを抗原とともにカプセル化するDPPC:Choの1:1モル比でのDRVリポソームの水性分散系に基づいており、最終的には水と混和性で、無毒性の、刺激性のない他の共溶媒を含むことができ、通常注射可能な薬剤組成物に使用されるようなベシクル、例えば糖、ポリエチレングリコール等の脱安定化を引き起こすことがない。本発明のリポソーム製剤は脱水-再水和手順により得られ、DPPCとChoの1:1モル比により構成され、抗原をSt変異体又はそれらの可逆的不活性化変異体のいくつかで共カプセル化することにより得られ、該ワクチン組成物は抗原特異的CTL免疫反応を促進することができ、腫瘍細胞の投与に対して保護的になることができる。本発明の一つの態様では、ワクチン組成物は抗原としてタンパク質OVAを含むが、抗原は、治療的見地から、このタンパク質抗原に対して特異的なCTL免疫反応を誘発するよう関連した疾病に関連したいかなるタンパク質やポリペプチドであることができる。例えば、抗原は癌に関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよく、AIDSに関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよく、又は結核に関連したタンパク質又はポリペプチドであってもよい。本明細書に記載されるリポソームは、KirbyとGregoriadisによりBiotechnology,1984,2,979-984で報告された水和-再水和技術により得られ、これらは抗原や免疫調節タンパク質のような不安定な分子の高い効率のカプセル化と保持により特徴付けられるいくつかの脂質二重膜により取り囲まれた内部水相を有するベシクルである。DPPC:Choの1:1モル比でのクロロホルム溶液を濃縮し、30分間真空下に保持した。脂質は脱イオン水で、DPPCの相転移温度Tcより高い温度T>45°Cで水和した。得られた多重ラメラベシクルMLVの懸濁液を、超音波及び休止サイクル又は孔径100nmのポリカーボネート膜による押出しにより、SUV又はLUVそれぞれ、小単一ラメラベシクル及び大単一ラメラベシクルに変換する。得られたベシクルをタンパク質溶液と混合した。脂質:タンパク質の関係を16~64μmolの脂質:1.8~7nmolの抗原及び0.5~2nmolのStとし、20~24時間凍結乾燥した。再水和は脱イオン水で行い30分間45°C未満の温度で攪拌した。リポソーム中にカプセル化されていない材料を、リン酸緩衝塩溶液PBSpH7.4NaCl136mmol/L,KH2PO41.47mmol/L,Na2HPO49.55mmol/L,KCl2.68mmol/Lで洗浄し、次いで10000gで15分間遠心分離することにより除去した。このような製剤は、PBS中に懸濁させて4°Cで1ヶ月の保存後も70の保持をしつつ、約50に亘るSt類の様々な変異体についてのカプセル化効率に到達した。StIとStIIトキシンを、Lanioetal.によりToxicon.2001,39,187-94に記載された手順によりイソギンチャクStichodactylahelianthusから単離し、精製した。組み換えスチコリシンISticholysinIrStI及びrStI変異体、StIW111Cを、Pazosetal.によりToxicon,2006,48,1083-1094に、及びPentonetal.によりProteinEngDesSel.2011,24,485-493にそれぞれ記載された手順に従って得た。本発明のワクチンビヒクルに使用されるSt類の濃度は0.25~1μMの範囲であり、16~64mMの総脂質濃度の範囲でリポソームの懸濁液中1~3.5μMの濃度範囲で抗原と共カプセル化されている。好ましくは、本発明のワクチンビヒクルは0.3~0.4nmolの量のSt類を含んでおり、200μLの体積中総脂質の20μmolのリポソーム懸濁液中1~2nmolの抗原とともに共カプセル化されている。本発明におけるワクチンに使用される用量範囲はsc又はimで、1~2nmol50~100mgの抗原である。本発明のワクチン組成物の重要な特徴は、記載されたもの以外に免疫学的なアジュバントを欠いているということである。上に説明したように、リポソームベシクル中にカプセル化されたバクテリアの孔形成性トキシンがCTL反応を増大させることができることは従来技術から知られていたが、バクテリアのトキシンに基づくワクチン組成物の使用がヒトに悪影響をもたらすことが知られている。しかし、本発明の著者らは予期せぬことに、非バクテリア性のトキシンが同じ免疫刺激剤効果を持っていることを見出した。さらに、本発明の著者らはトキシンの孔形成活性とCTL反応の刺激剤効果とを切り離すことに成功し、これがこのワクチンビヒクルに対してヒトでの臨床的使用にとって大きな利点をもたらすのである。本発明のワクチンビヒクルにおいて、リポソーム中に抗原とともに分子StIW111Cirrev又は熱不活性化StIIを共カプセル化したものを用いて得られた結果は、リポソーム-Stの製剤による抗原特異的CTL免疫反応の増大と膜内で孔を形成するこれらのタンパク質の能力との間に絶対的な依存性がないことを示している。C57BL/6マウスの骨髄から単離され、インビトロでStIIに暴露されたた樹状細胞DCの成熟の試験では、このタンパク質の能力がその活性変異体にだけではなく熱不活性化変異体においても、CDの活性化を誘発することが示された。これは同様の条件下でLPS陽性対照で見られることと同様である。膜中に孔を形成するSt類の能力を、Toxicon,2001,39,15471560にMartinezetal.により記載されているように、カルボキシフルオレッセインCFの入ったLUVの溶血活性アッセイと透過性を試験することにより評価した。CFをカプセル化するDPPC:Cho1:1のリポソームベシクルの透過性を分析することにより、卵黄ホスファチジルコリンとSM1:1陽性対照からなるベシクルで観察されるものと比較して、St類が透過活性を示さないことが示された。Pentonetal.によりProteinEngDesSel.2011,24,485-493にちょうど記載されているように、還元剤として2-メルカプトエタノール2-MEの存在下及び非存在下で溶血活性アッセイとSDS-PAGEによりジスルフィド結合により安定化された不活性ダイマーを変異体StIW111Cが形成することが証明された。モデル細胞として赤血球中で孔を形成するダイマー構造の不活性は、膜と会合していないことの結果である。2-ME0.1mol/LとのインキュベーションによりStIW111Cを還元し、カラムPD-10でのろ過により還元剤を除去し、そしてただちにStIW111Cmonomerをホモ二官能性試薬ビスマレイミドヘキサンBMHとともに4°Cで2時間、StIW111Cmonomer:BMH1:1~2:1のモル比でインキュベーションすることに基づくStIW111CStIW111Cirrevの不可逆的ダイマー種を得る手順が確立された。StIW111Cirrevを還元剤の存在下でSuperdex75HR10/300カラムでゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。不可逆的ダイマーを得たこと及びその純度は還元条件下でSDS-PAGEにより証明した。不可逆的ダイマーは94の純度で得られ、可逆的ダイマーの汚染はわずか6であった。機能活性の欠如は溶血活性アッセイにより証明した。熱処理によるStII不可逆的不活性化はMartinezetal.によるToxicon,2001,39,15471560に記載の手順に従って行い、膜中で孔を形成する能力の全体的な欠損を溶血活性アッセイによりチェックした。インビボでの抗原特異的細胞毒性免疫反応及び予防的シーンでの抗腫瘍免疫性を増大させる能力に関連したリポソーム-St系における様々な分子種St類の免疫調整剤特性は、マウス株C57BL/6の実験モデルにおいて、抗原OVA及び腫瘍細胞系E.G7、OVApAc-neo-OVAの相補的DNAでトランスフェクトされMoore,etal.,Cell,1988,54:777-85、AmericanTypeCulturesCollectionATCC,VAから得られるネズミEL-4胸腺腫のサブクローンを用いて測定することができるKusmartsevyGabrilovich,JLeukocBiol.,2003,74:186-96。本発明の著者らはまた、抗原を含むワクチンビヒクルリポソーム-Stでの予防的接種がStIIを含まないリポソームにより生じるよりも高い抗腫瘍保護を誘発することを見出した。これらの結果は、抗原タンパク質を用いると他のアジュバントの必要性なく、リポソーム-St系が機能的に強固で保護的な抗腫瘍反応を誘発するのに有効であることを実証している。そして、この製剤を組み合わせ療法で用いればその抗腫瘍効果をさらに増大させるかもしれない。以下の実施例では、本発明の目的であるインビボでの抗原特異的細胞毒性反応及びワクチン組成物の予防的シーンにおける抗腫瘍免疫性を誘発する免疫効果を、St類を含まない他の非リポソーム的製剤に関して証明する比較実験的詳細が含まれている。実施例1タンパク質抗原として野生型StI又はStII及びOVAを用いるワクチンビヒクルの細胞毒性とCTL反応の評価リポソームに基づいたワクチンビヒクルを先述のように調製した。DPPCとChoモル比1:1からなるDRVベシクルにおいて、モデル抗原としてのOVAとSt類StI又はStIIをリン酸緩衝塩溶液PBSpH7.4中、モル比で10μmolの総脂質:1.1nmolのOVA、及び0.3nmolのStと共カプセル化した。この手順に従い、二つのワクチン組成物を得た。ワクチン組成物A:6.6nmol50μgのOVAをカプセル化するDPPC:Cho60μmolの総脂質のDRVリポソームワクチン組成物B:6.6nmol50μgのOVAと1.88nmolのStI又はStIIを共カプセル化するDPPC:Cho60μmolの総脂質のDRVリポソーム15匹のC57BL/6メスのマウス体重18-20gを選び、各々3匹のマウスの5つの実験グループに分けた。グループ1陰性対照をsc経路で0、12、13及び14日目に0.2mLリン酸緩衝塩溶液PBSで接種した。グループ2陽性対照を12日目に22.2nmol1mgのOVAとともに、及び100μgのポリイノシン酸-ポリシチジル酸PIC、TLR3合成リガンド及びCTL反応の古典的誘発剤Hamilton-Williamsetal.J.Immunol.,2005,174:1159-63とともに混合してsc経路で接種し、13日及び14日目にマウスは再び100μgのPICを摂取した。グループ3はsc経路で0及び12日目に0.2mLワクチン組成物A1.1nmol又は50μgのOVAに等価で接種した。グループ4は皮下経路で0及び12日目に0.2mLワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgのStIに等価で接種した。グループ5はsc経路で0及び12日目に0.2mLワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgのStIIに等価で接種した。実験の20日目に、C57BL/6非免疫化マウス由来の脾臓細胞を二つの濃度のカルボキシ-フルオレッセインジアセタートスクシンイミジルエステルCFSEそれぞれ0.33及び5μmol/Lでインキュベートした。最も高い蛍光強度で標識した細胞も、C57BL/6マウス株に対してMHCIハプロタイプの関連で1μmol/LのOVA257-SIINFEKL-264免疫優勢ペプチドとインキュベートした。その後、標識した細胞の両集団を1:1に混合し、実験グループ1~5を尾の静脈により、0.2mLの合計体積中30x106細胞の混合物で接種した。16時間後にマウスを犠牲にし、標的細胞の溶菌を免疫部位に近い鼠径リンパ節においてフローサイトメトリーFACSにより決定した。図1はOVA及びSt類を共カプセル化するリポソームでマウスを免疫化することによりインビボで生じた細胞毒性を示す。St類StI又はStIIを共カプセル化するリポソームで免疫化された動物は、OVAに特異的なCD8T細胞毒性リンパ球反応CTLを、陽性対照群よりも統計的に高く示した。さらに、OVAのみを含むリポソームは、このアッセイの古典的な陽性対照PICと統計的に同様のCTL反応を誘発した。実施例2OVAタンパク質モデルにおけるワクチンビヒクルの抗腫瘍保護の誘発抗腫瘍保護を誘発するリポソームベースのワクチンの能力を研究した。この目的を達成するために、体重18~20gの60匹のC57BL/6のメスのマウスを選び、各々20匹のマウスの3つのアッセイグループに分けた。グループ1陰性対照をim経路で0及び12日目に0.2mLリン酸緩衝塩溶液PBSで接種した。グループ2は0及び12日目に実施例1に記載の0.2mLワクチン組成物A1.1nmol又は50μgのOVAに等価で接種した。グループ3はim経路で0及び12日目に実施例1に記載の0.2mLワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgのStIIに等価で接種した。グループ1~3のすべてに19日目に腫瘍系E.G7からの3x105個の細胞を皮下経路で投与した0.2mL。動物を0日目から個別に分け、以下のパラメータを週に3回測定した。腫瘍体積、進行時間、及び生存率。得られた結果を以下に記載する。進行時間進行時間は各動物が腫瘍を接種した瞬間から腫瘍が現れるまでに経過した時間を特徴付けるパラメータである。実験の終結時に腫瘍を示さなかったマウスに関しては、進行時間は60日とみなした。進行時間が延長するという効果は、癌に対するワクチンにとって高度に望ましいパラメータであるということである。図2Aに見られるように、グループ3の動物は実施例1に記載された、本発明の対象でもあるワクチン組成物製剤Bでワクチン接種されており、最も顕著な結果を示した。生存率このパラメータは免疫化された動物がOVA発現腫瘍細胞E.G7を投与されて生きている時間を増大させるワクチンの能力を評価する。このパラメータは日数で測定され、非処理の動物の生存率と比較されるので相対的な性質を有している。グループ間の生存率結果に見られる差の統計的な有意性を証明するためにLog-Rankテストを用いた。図2Bは、実施例1に記載され、本発明の対象でもあるワクチン組成物Bを接種したグループ3の動物が腫瘍接種後もより長く生存するものであることを明確に示している。実施例3St類変異体の溶血活性赤血球膜内の孔形成は細胞溶菌を引き起こすコロイド浸透圧ショックを起こす。いわゆるポーリンの孔形成能の後にはその溶血活性HAが続き、これは細胞溶菌による赤血球懸濁液のみかけの吸光度λ=600nmの損失を測定することにより実験的に決定することができる。アッセイでは、還元条件下2-ME0.1mol/lと非還元条件下で、アッセイ中比較的高いタンパク質濃度0.15μmol/lで、StIW111C不可逆的不活性ダイマーのHAStIW111Cirrevを可逆的ダイマーStIW111CのHAと比較した。Toxicon,2009,548:1135-47でAlvarezetal.により報告されたStI/StIIのHAと比較する。図3に示された溶血の時間的進行は、StIW111Cirrevが非還元条件下では不活性であったことを示している。還元条件下では、StIW111Cirrevは完全に還元された又は非還元下のいずれかのStIW111Cより低い活性を示した。実施例4不活性化したStIIの孔形成能の評価2時間80°Cで加熱することにより不可逆的に不活性化したStIIによる膜に孔を形成する能力の損失は溶血活性試験を用いて登録した。図4は活性タンパク質と比較した、熱的に不活性化したStIIについての溶血活性の欠落を示す。実施例5DC成熟化についてのワクチンビヒクルの効果StIIにより誘発されたDCの成熟化を、5CO2チェンバー中で37°Cで24時間、20μgのポリミキシンBpmxB、LPSの脂質A分画への結合によるエンドトキシンの生物学的活性の中和剤の存在下又は非存在下で、活性StII0.1nmol又は2μg又は熱処理により不活性化されたもの4μgに暴露されたC57BL/6マウスの骨髄から得られた細胞中で評価した。陽性対照として、LPS2μgを用い、陰性対照はRPMI培地プラス30pmxBであった。マウス骨髄から抽出した細胞を6穴プレートを用いて1穴当たりRPMI上600000DC前駆体の数で培養した。10のウシ胎仔血清BFS、400μLのGMCSF及びRPMIを添加し1穴当たり3mLとした。図5は、インビトロでのこれらの細胞の活性及び熱不活性化StII変異体の両方への曝露の結果としてDC活性化を指し示す分子マーカーCD80、CD86及びCD40の増加を示す。結果は陽性対照で得られた結果に相当する。実施例6抗原タンパク質としてSt変異体及びOVAを用いるワクチンビヒクルの細胞毒性とCTL反応の評価可逆的StIW111C又は不可逆的StIW111Cirrev低孔形成活性のStIダイマー変異体と熱的不活性化StII変異体を、10μmolの総脂質:1.1nmolのOVA、0.3nmolのStIW111C、StIW111Cirrev、又は熱不活性化StIIの比で、PBSpH7.4中、DPPC:Cho1:1のリポソームにOVAとともに共カプセル化し、これらのワクチン製剤のインビボでのOVA特異的細胞毒性活性を誘発する能力を評価した。これらのアッセイでは、実施例1に記載したように本質的に同じワクチン組成物を用いた。組成物Bの場合には、様々なStの変異体を用いた。ワクチン組成物A:6.6nmolのOVAをカプセル化するDPPC:Cho60μmolの総脂質のDRVリポソームワクチン組成物B:6.6nmolのOVAと1.875nmolのStStIW111C,StIW111Cirrev又は野生型StII又は熱不活性化StIIを共カプセル化するDPPC:Cho60μmolの総脂質のDRVリポソーム第1のアッセイでは、12匹のメスのC57BL/6マウス体重18-20gを選び、各々3匹のマウスの4つの実験グループに分けた。グループ1陰性対照を皮下経路で0及び12日目に0.2mLのPBSで接種した。グループ2陽性対照は0及び12日目に0.2mLのワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgの野生型StIIに等価で接種した。グループ3は皮下経路で0及び12日目に0.2mLのワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgのStIW111Cに等価で接種した。グループ4は皮下経路で0及び12日目に0.2mLのワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgのStIW111Cirrevに等価で接種した。図6Aは、低孔形成活性のSt変異体を含むリポソームLP/OVAStIW111C又はLP/OVAStIW111Cirrevで免疫化された動物が、リポソームにOVAとともに共カプセル化されたときLP/OVAStII、StIIとともに得られるのと統計的に同様の細胞毒性反応を示す。他のアッセイでは、9匹のメスのC57BL/6マウス体重18-20gを選び、各々3匹のマウスの3つのグループに分けた。グループ1陰性対照は皮下経路で0及び12日目に0.2mLのリン酸緩衝塩溶液PBSで接種した。グループ2は0及び12日目に0.2mLのワクチン組成物A1.1nmol又は50μgのOVAに等価で接種した。グループ3は皮下経路で0及び12日目に0.2mLワクチン組成物B1.1nmol又は50μgのOVA及び0.3nmol又は6.25μgの不活性化StIIに等価で接種した。図6Bは、OVAと完全に熱不活性化したStII変異体を共カプセル化するリポソームによる免疫化が、抗原のみを含むリポソームにより誘発されたものよりも有意に高く、野生型のStI/StIIを含むリポソーム製剤で観察されたのと同様の、OVA特異的な細胞毒性活性を発揮した。実験結果は、抗原をスチコリシン変異体とともに共カプセル化する本発明の対象であるリポソームワクチンが、孔形成能を示さないものと一緒であっても、強力で強固で機能的な抗原特異的CTL反応を誘発し、これはインビボCTLアッセイで使用した古典的陽性対照PICにより引き出されるものよりもずっと大きかったことを示した。予防的シナリオでのリポソーム-St製剤は腫瘍移植の時間的進行を有意に増大させ、PBSのみを摂取したものと比較して評価したグループでは生存率を有意に増大させた。要するに、リポソーム-Stでのワクチン化は、抗原のみを含むリポソームベシクルで観察されたものよりも良好な結果を示した。"