"式で表される新規化合物:式中、L、MおよびNは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ低級アルキルまたはオキソここでLおよびMの少なくとも1つは水素以外の基であり、五員環は1または複数の二重結合を有していてもよい;R’およびRは、水素、低級アルキル、アリール、アルキル-またはアリール-スルホニル、低級アルケニルまたは低級アルキニル;Bは、-CH2-CH2-、-CH=CH-または-C≡C-;R1は、非置換またはハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、オキソ、アリールまたは複素環基で置換された飽和または不飽和二価低~中級脂肪族炭化水素残基であり、脂肪族炭化水素における少なくとも1の炭素原子は任意に酸素、窒素または硫黄によって置換されていてもよい;そして、Raは、非置換またはハロゲン、オキソ、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、シクロ低級アルキル、シクロ低級アルキルオキシ、アリール、アリールオキシ、複素環基または複素環オキシ基で置換された飽和または不飽和の低~中級脂肪族炭化水素残基;シクロ低級アルキル;シクロ低級アルキルオキシ;アリール;アリールオキシ;複素環基;複素環オキシ基。化合物が13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGE1N-エチルアミドである、請求項1に記載の化合物。化合物が13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGF1αN-エチルアミドである、請求項1に記載の化合物。化合物が13,14-ジヒドロ-15-ケト-17-フェニル-18,19,20-トリノールPGF2αN-エチルアミドである、請求項1に記載の化合物。化合物が13,14-ジヒドロ-15-ケト-20-エチル-PGF2αN-エチルアミドである、請求項1に記載の化合物。合成例113,14-ジヒドロ-15-ケト-17-フェニル-18,19,20-トリノール-PGF2αN-エチルアミド5の調製1→23,4-ジヒドロ-2H-ピラン0.70ml,7.67mmolを、無水ジクロロメタン10ml中の化合物10.350g,0.737mmolの溶液に添加した。この溶液に、カンファースルホン酸7mg,0.03mmolを添加した。混合物を室温で30分間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、ジクロロメタンで2回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。蒸発後の残渣をシリカゲルカラムのクロマトグラフィーBW-300150g、酢酸エチル:ヘキサン=1:3にかけ、化合物20.463g、0.720mmol、97.7収率を無色油として得た。2→3エタノール14ml中の化合物20.889g、1.38mmolの溶液に、1N-水酸化ナトリウム水溶液6.9ml、6.9mmolを添加した。反応混合物を室温で16時間攪拌した。混合物を氷浴中で冷却し、次いで酢酸エチルと水を混合物に添加した。1N-塩酸7ml、7mmolを混合物のpHが4となるまで添加した。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で2回洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。有機層の蒸発により粗化合物30.878gを無色油として得た。粗化合物3を精製せずに以後の反応に用いた。3→4カルボニルジイミダゾール0.448g、2.77mmolを無水THF9.0ml中の粗化合物30.878g、1.38mmolの溶液に添加した。混合物を室温で2時間攪拌した。THF溶液中の2M-エチルアミン2.77ml、5.54mmolを反応混合物に添加した。混合物を室温で1時間攪拌し、1N-塩酸に注ぎ、次いで酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D150g、酢酸エチル:ヘキサン=3:1により化合物40.817g、1.30mmol、化合物2に基づく収率94.1を得た。4→5酢酸9.8mlと水4.9mlをTHF4.9ml中の化合物40.815g、1.30mmolの溶液に添加した。混合物を50°Cで3時間攪拌し、次いで0°Cまで冷却した。2N-水酸化ナトリウム水溶液を混合物に、混合物のpHが9となるまで添加した。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D100g、2-プロパノール:酢酸エチル=5:100により無色油0.485g、1.17mmol、89.9収率を得た。さらなる分取HPLCYMC-PakRI-053-15、Φ50250mm-SIL120A、2-プロパノール:n-ヘキサン=18:82、溶媒流速=100ml/分による精製により化合物50.417g、1.12mmol、86.3収率を得た。化合物5の1H-NNRスペクトル200MHz/CDCl3δTMS=0ppm7.33-7.135H、m、5.841H、br、5.28-5.502H、m、4.18-4.071H、m、3.90-3.801H、m、3.262H、dq、J=5.6、7.3Hz、3.202H、br、2.94-2.862H、m、2.80-2.712H、m、2.60-2.522H、m、2.50-1.904H、m、2.172H、t、J=7.0Hz1.90-1.566H、m、1.47-1.252H、m、1.133H、t、J=7.3Hz合成例2N1-エチル-7-[2,4aR,5R,7aR-2-1,1-ジフルオロペンチル-2-ヒドロキシ-6-オキソぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ヘプタンアミド7の調製サブロット-1カルボニルジイミダゾール79.5mg、0.490mmolを無水THF5ml中の化合物6174.0mg、0.446mmolの溶液に添加した。混合物を室温で3時間攪拌し、次いでTHF溶液中の2M-エチルアミン0.87ml、1.74mmolを混合物に添加した。混合物を室温で12時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液10mlと酢酸エチル10mlを反応混合物に攪拌しながら添加した。水層を有機層から分離し、酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D10g、ヘキサン:酢酸エチル=1:2により無色油117.5mg、0.281mmol、63.0収率を得た。サブロット2カルボニルジイミダゾール105.9mg、0.653mmolを無水THF3ml中の化合物6229.2mg、0.587mmolの溶液に添加した。混合物を室温で2時間攪拌し、次いでTHF溶液中の2M-エチルアミン1.2ml、2.4mmolを混合物に添加した。混合物を室温で1時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液10mlと酢酸エチル10mlを反応混合物に攪拌しながら添加した。水層を有機層から分離し、酢酸エチルで2回抽出した。混合有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D10g、ヘキサン:酢酸エチル=2:3により無色油195.7mg、0.469mmol、79.8収率を得た。これら2つの上記サブロットを合同させた。合同させた生成物301.4mgをさらに分取HPLCMerckLichrosorbDIOL-7μm、Φ25250mm、2-プロパノール:n-ヘキサン=10:100、溶媒流速=40ml/分で精製して化合物7209.6mg、69.5回収率を得た。化合物7の1H-NNRスペクトル200MHz/CDCl3δTMS=0ppm5.421H、br、4.26-4.101H、m、3.292H、dq、J=5.6、7.2Hz、2.831H、br、2.581H、dd、J=17.6、7.3Hz、2.211H、dd、J=17.6、11.5Hz、2.142H、t、J=7.5Hz、2.10-1.735H、m、1.73-1.2117H、m、1.143H、t、J=7.2Hz、0.943H、t、J=7.1Hz合成例3N1-エチル-7-[2,4aR,5R,6S,7aR-2-1,1-ジフルオロペンチル-2,6-ジヒドロキシぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ヘプタンアミド15の調製8→93,4-ジヒドロ-2H-ピラン4.22ml、46.11mmolとカンファースルホン酸42.16mg、0.181mmolを0°Cの無水ジクロロメタン90ml中の化合物82.87g、4.216mmolの溶液に添加した。反応混合物を0°Cで50分間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を反応混合物に添加した。混合物を室温に昇温し、ジクロロメタン50mlで3回抽出した。混合有機層を水180mlと飽和塩化ナトリウム水溶液180mlで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーBW-300154g、ヘキサン:酢酸エチル=8:1により化合物93.42g、4.476mmol、定量的収率を得た。9→10THF溶液中の1M-テトラブチルアンモニウムフルオライド5.371ml、5.371mmolを0°Cの無水THF10.7ml中の化合物93.42g、4.476mmolの溶液に滴下した。混合物を室温で4時間攪拌した。酢酸アンモニウム水溶液200mg/ml、10.3mlを反応混合物に添加した。混合物を10分間攪拌し、ジイソプロピルエーテルで3回抽出した。混合有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液50mlで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーBW-300170g、ヘキサン:酢酸エチル=3:1により化合物102.73g、4.200mmol、93.8収率を得た。10→11エタノール2ml中の化合物10130.4mg、0.200mmolの溶液を0°Cに冷却した。1N-水酸化ナトリウム水溶液0.8ml、0.80mmolを該溶液に15°Cより低温で滴下した。混合物を室温で3.6時間攪拌し、次いで蒸発させた。残渣に、水1mlを添加し混合物のpHを希塩酸の添加により3-4に調整した。混合物を酢酸エチル20mlで3回抽出した。混合有機層を水30ml、2回と飽和塩化ナトリウム水溶液30mlで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー15-水含有FL-60D10g、ヘキサン:酢酸エチル=3:2により化合物11106.2mg、0.1894mmol、94.7収率を得た。11→12デス-マーティンぺリオディナン1.68g、3.970mmolを0°Cの無水ジクロロメタン63ml中の化合物111.21g、1.985mmolの溶液に添加した。反応混合物を室温で1時間攪拌した。チオ硫酸ナトリウム水溶液39.8mlを反応混合物に添加した。次いで反応混合物を酢酸エチル50mlで3回抽出した。混合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー15-水含有FL-60D55g、ヘキサン:酢酸エチル=3:1により化合物121.06g、1.890mmol、95.2収率を得た。12→13木炭上の10-パラジウム69.1mgを酢酸エチル34.6ml中の化合物12345.7mg、0.619mmolの溶液に添加した。混合物を水素雰囲気中で3時間攪拌した。反応混合物をセライト登録商標パッドでろ過し、触媒を除去した。上記の一連の操作を5回繰り返し、水素化反応を完了させた。ろ液の濃縮により化合物13330.4mg、0.589mmol、95.2収率を得た。13→14カルボニルジイミダゾール143.4mg、0.884mmolを無水THF6.7ml中の化合物13330.4mg、0.589mmolの溶液に添加した。混合物を室温で3時間攪拌した。反応混合物に、THF中の2M-エチルアミン溶液0.589ml、1.179mmolを添加し室温で1時間攪拌した。反応混合物に、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加した。混合物を酢酸エチル20mlで3回抽出した。混合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50mlと飽和塩化ナトリウム水溶液50mlで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー15-水含有FL-60D16.5g、ヘキサン:酢酸エチル=2:1により化合物14311.6mg、0.530mmol、90.0収率を得た。14→15酢酸4.2mlと水2.1mlをTHF2.1ml中の化合物14344.0mg、0.585mmolの溶液に添加した。混合物を50°Cで3時間攪拌し、次いで0°Cに冷却した。2N-水酸化ナトリウム水溶液を反応混合物に添加した。混合物を酢酸エチル50mlで3回抽出した。混合有機層を水35mlと飽和塩化ナトリウム水溶液35mlで2回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー15-水含有FL-60D14g、ヘキサン:酢酸エチル=1:1その後酢酸エチルに変更により化合物15227.9mg、0.543mmol、92.8収率を得た。さらに分取HPLCMerckLichrosorbDIOL-7μm、Φ25250mm、2-プロパノール:n-ヘキサン=12:88、溶媒流速=35ml/分での精製により化合物15151.0mg、0.3599mmol、61.5収率を得た。化合物15の1H-NNRスペクトル200MHz/CDCl3δ5.431H、br、4.32-4.151H、m、3.96-3.840.28H、m、3.79-3.610.72H、m、3.292H、dq、J=5.6、7.3Hz、2.86-2.800.55H、m、2.70-2.640.55H、m、2.540.72H、dd、J=15.8、7.0Hz、2.430.72H、dd、J=15.8、5.2Hz、2.152H、t、J=7.1Hz、2.25-1.0923.45H、m、1.143H、t、J=7.2Hz、0.923H、t、J=7.1Hz合成例413,14-ジヒドロ-15-ケト-20-エチル-PGF2αN-エチルアミド20の調製16→173,4-ジヒドロ-2H-ピラン2ml、21.9mmolとカンファースルホン酸20mg、0.09mmolを無水ジクロロメタン30ml中の化合物161.00g、2.36mmolの溶液に添加した。混合物を2時間攪拌した。反応混合物に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液20mlを添加し、激しく攪拌した。水層を有機層から分離し、ジクロロメタンで2回抽出した。混合有機層を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーBW-30070g、ヘキサン:酢酸エチル=3:7により化合物171.45g、2.45mmol、定量的収率を得た。17→181N-水酸化ナトリウム水溶液11.8ml、11.8mmolを0°Cのエタノール20ml中の化合物171.45g、2.36mmolの溶液に添加した。混合物を室温に昇温し、5.5時間攪拌した。混合物を0°Cで1N-塩酸12.4ml、12.4mmolで酸性にした。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー15-水含有FL-60D14g、ヘキサン:酢酸エチル=10:0→9:1→8:2→7:3→6:4→5:5→4:6→3:7により化合物181.19g、2.16mmol、92.0収率を得た。18→19カルボニルジイミダゾール265mg、1.64mmolを無水THF10ml中の化合物18600.3mg、1.09mmolの溶液に添加した。混合物を室温で1.5時間攪拌した。混合物に、2M-エチルアミンTHF溶液3.0ml、6.0mmolを添加し、1時間攪拌した。反応混合物を0°Cに冷却し、冷1N-塩酸の添加により酸性pH=3にした。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D25g、ヘキサン:酢酸エチル=1:1により化合物19497.0mg、0.86mmol、78.9収率を得た。同時に、化合物18117.4mg、19.6回収率を回収した。カルボニルジイミダゾール69.0mg、0.43mmolを、無水THF2ml中の回収した化合物18117.4mgの溶液に添加した。混合物を室温で2時間攪拌した。混合物に、2M-エチルアミンTHF溶液3.0ml、6.0mmolを添加し、1時間攪拌した。反応混合物を0°Cに冷却し、次いで冷1N-塩酸の添加により酸性pH=3にした。混合物を酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。残渣のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーFL-60D5g、ヘキサン:酢酸エチル=1:1により化合物19113.2mg、0.20mmol、92.0収率を得た。上記の2つのバッチを合同させて、610mgの化合物19を得た。19→20酢酸6mlと水2mlをTHF2ml中の化合物19603.0mg、1.07mmolの溶液に添加した。混合物を45°Cで2.5時間攪拌し、次いで室温に冷却した。反応混合物に、8N-水酸化ナトリウム水溶液13ml、酢酸エチル20mlおよび水20mlを添加した。混合物を激しく攪拌した。水層を有機層から分離し、次いで酢酸エチルで3回抽出した。混合有機層を水と飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで蒸発させた。2回のシリカゲルカラムでのクロマトグラフィー第一精製:FL-60D25g、ヘキサン:2-プロパノール=100:10/第二精製:FL-60D18g、ヘキサン:2-プロパノール=100:5により化合物20336.4mg、0.918mmol、85.8収率を得た。化合物20の1H-NNRスペクトル200MHz/CDCl3δ5.741H、br、5.45-5.362H、m、4.19-4.111H、m、3.96-3.841H、m、3.282H、dq、J=5.7、7.3Hz、3.051H、br、2.70-1.959H、m、2.422H、t、J=7.4Hz、1.95-1.2018H、m、1.143H、t、7.2Hz、0.883H、t、J=7.3Hz試験例1方法全細胞パッチクランプ法を用いて化合物113,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGE1と化合物213,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-18S-メチル-PGE1の組換えhClC-2クロライドチャンネルに対する効果を評価した。この試験例においては、それぞれの化合物の、ヒトClC-2hClC-2を形質移入されたヒト上皮腎臓HEK細胞に対する効果を調べ、その結果を非-形質移入HEK細胞と比較した。ClC-2形質移入ヒト上皮腎臓HEK細胞を調製し、使用した。AmericanTypeCultureCollectionから得たHEK-293細胞を、リポフェクタミンを用いて哺乳類発現ベクターpcDNA3.1中のHis-およびT7-タグ付加したヒトClC-2cDNAで、37°Cで5時間、無血清培地中で形質移入した。細胞を血清含有培地に再懸濁し、300μg/mlのG-418GIBCOInvitrogenの存在下で培養した。生存細胞を拡張させ、Cl-電流とClC-2mRNAの発現を確認するため試験し、ClC-2mRNAを発現する細胞を凍結保存した。研究時に、凍結した細胞を解凍し、37°Cで5/95CO2/O2にて、5不活性化ウマ血清、0.1mM非必須アミノ酸、2mML-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100ユニット/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩を追加したMEMGIBCOInvitrogen中に維持した。全細胞パッチクランプ測定において、電流は40mVから-140mVの間の、最初の保持電位-30mVから開始して20mVずつ増加する電圧固定パルス1500m秒持続によって誘発した。電流をパルスの開始から50-100m秒後に測定した。外部溶液は135mMNaCl、1.8mMCaCl2、1mMMgCl2、5.4mMKCl、10mMグルコース、および10mMHEPESpH7.35を含有する標準Tyrode溶液とした。ピペット溶液は、130mMCsCl、1mMMgCl2、5mMEGTA、および10mMHEPESpH7.35とした;ピペット内には1mMATP-Mg2pH7.4も含めた。ピペットはホウケイ酸ガラスから調製し、2段ナラシゲNarashigeプラーにより引っ張り、1-1.5MΩの抵抗を得た。データはDigidata1200デジタイザーおよびAxopatch1D増幅器を備えたAxopatchCV4headstageにより得た。データをpClamp604、ロータスLotus123およびOriginソフトウェアを用いて分析した。化合物1と化合物2は1DMSO中最終濃度1μMで用いた。結果表1に示すように、1DMSOは対照電流に対して影響を及ぼさなかった。hClC-2対照を形質移入されたHEK細胞におけるCl電流は、1μMの化合物1および1μMの化合物2によって活性化された。化合物1も化合物2も非-形質移入細胞におけるCl電流を増加させなかった。これらの研究により、化合物1と化合物2がClC-2チャンネルオープナーであることが示された。N.S.:有意差無し化合物1:13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGE1--7-[2R,4aR,5R,7aR-2-1,1-ジフルオロペンチル-2-ヒドロキシ-6-オキソぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ヘプタン酸化合物2:13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-18S-メチル-PGE1--7-{4aR,5R,7aR-2-[3S-1,1-ジフルオロ-3-エチルペンチル]-2-ヒドロキシ-6-オキソぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル}ヘプタン酸試験例2方法健康な個体由来のヒト気道細胞系であり、ClC-2および嚢胞性線維症膜貫通レギュレーターCysticFibrosisTransmembraneRegulatorである、ClチャンネルCFTRを含む16HBE14o-細胞;および嚢胞性線維症患者由来のヒト気道細胞系であり、機能的形態のClC-2および欠陥形態のCFTR△F508CFTRを含むCFBE41o-細胞を用いた。両方の細胞を10FBSHyclone、20mML-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを追加したMEMで、フィブロネクチン/コラーゲン/BSAでコーティングしたフラスコ中で培養した。所望の場合、細胞を0.3cm2コラーゲン-コーティングした透過性のフィルターBiocoatに播種した。24時間後、頂端側の培地を除去し、細胞を空気-水の界面で培養した。空気-水の界面で培養している間、細胞の基底外側に培地が与えられ、培地を一日おきに交換した。細胞を集密するまで増殖させた。短絡回路電流測定を用いて空気-水の界面で増殖させた細胞の分極した集密培養物におけるCl輸送を評価した。0.3cm2の透過性の支持フィルターにおいて増殖させた集密細胞単層における短絡回路電流測定のためにプレキシグラスplexiglassチャンバーWorldPrecisioninstruments、Sarasota、FLを用いた。電気計測は7402C電圧固定装置BioengineeringDepartment、IowaUniversityを用いて行った。温度を熱水をチャンバーのウォータージャケットに循環させることにより37°Cに保持した。増幅器の出力をアナログチャートレコーダーにプロットした。被験化合物の添加後の短絡回路電流における変化△Iscをフィルター面積0.3cm2に対して標準化し△Isc/cm2として報告した。16HBE14o-およびCFBE41o-細胞における短絡回路電流測定はLoflingetalL7008、1999、この参考文献は引用により本出願に含まれるに記載のように行った。側底膜溶液は、116mMNaCl、24mMHCO3、3mMKCl、2mMMgCl2、0.5mMCaCl2、3.6mMHEPESナトリウム、4.4mMHEPES水素pH7.4および10mMグルコースを含むものとした;頂端膜浴溶液は側底膜溶液と以下の点を除いては同じとした;Cl-濃度をNaClをグルコン酸ナトリウムに置換することにより低下させ、グルコン酸によるCa2のキレート化を補うためにCaCl2を0.5mMから2mMに上昇させた。両溶液にCO2/O25/95を通気し、これによって溶液の混合が促された。すべての場合において、側底膜は200μg/mlナイスタチンによって透過性にした。化合物1および化合物2を最終濃度1μMにて用いた。DMSOの最終濃度は1とした。結果表2に示すように、1μMの化合物1は16HBE14o-細胞における短絡回路電流を増加させた。化合物1による活性化の程度は、9.56±0.095μA/cm2であった。化合物2も16HEB14o-細胞において短絡回路電流を11.6±1.3μA/cm2増加させた。1DMSOによる負の効果は大きく、およそ-10.5±2.0μA/cm2であった。DMSOにより短絡回路電流が大幅に減少したにもかかわらず、化合物1と化合物2の正味の効果はこれら細胞で正であった。表2に示すように、1μMの化合物1はCFBE41o-細胞における短絡回路電流を5.0±0.04μA/cm2増加させた。1DMSOは短絡回路電流を-5.7±1.8μA/cm2減少させた。DMSOによる大きな負の効果にかかわらず、化合物1はCFBE細胞におけるCl電流において正味の正の増加をもたらした。これらの結果は化合物1と化合物2はともに16HBE14o-細胞におけるClチャンネルのオープナーであり、化合物1はCFBE41o-細胞におけるhClC-2のオープナーであることを示す。試験例3方法AS-HBEは、CFTRの最初の131ヌクレオチドをアンチセンス方向に発現するヒト気管支上皮HBE細胞系アンチセンスCFTR16HBE14o-細胞、HBE-AS;AS-HBEとも称されるである。その結果、AS-HBE細胞はCFTR転写産物を欠き、機能性のCFTRを欠く。しかしながら、AS-HBE細胞はその起源である親細胞系、16HBE14o-細胞と同様に機能性のClC-2を発現する。AS-HBE細胞を37°Cで5/95CO2/O2にてアール塩Earlssalt、L-グルタミンGIBCOInvitrogen、10熱不活性化胎仔ウシ血清、100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン硫酸塩および400μg/mlG-418GIBCOInvitrogenを追加した最小必須培地MEMGIBCOInvitrogen、Carlsbad、CAに維持した。細胞を空気-液体界面でヒト血漿フィブロネクチンGIBCOInvitrogenおよびビトロゲンでコーティングしたバイオコートインサートBiocoatinserts上で増殖させた。試験例2に記載したのと同様にして、AS-HBE細胞における短絡回路電流測定を行った。短絡回路電流における変化△Iscをフィルター面積0.3cm2に対して標準化し、△Isc/cm2として報告した。被験化合物は最終濃度250nMで用いた。結果表3はAS-HBE細胞における短絡回路電流に対する被験化合物の効果を示す。結果は本発明の化合物が有効なClC-2チャンネルオープナーであることを示す。化合物1および2:試験例1を参照されたい。化合物3:13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGE1N-エチルアミドN1-エチル-7-[2,4aR,5R,7aR-2-1,1-ジフルオロペンチル-2-ヒドロキシ-6-オキソぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ヘプタンアミド化合物4:15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGE1化合物5:2-デカルボキシ-2-2-カルボキシエチル-13,14-ジヒドロ-15-ケト-16、16-ジフルオロ-20-エチル-PGE1イソプロピルエステルイソプロピル--9-[4aR,5R,7aR-2-1,1-ジフルオロヘプチル-2-ヒドロキシ-6-オキソぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ノナノエート化合物6:PGF2α化合物7:PGI2-Na試験例4方法試験例1に記載の方法に従って、全細胞パッチクランプ測定を行った。被験化合物によって誘導される電流の増加は被験化合物の添加後の対照からのpA/pFの変化△pA/pFとして報告した。被験化合物は最終濃度100nMにて用いた。結果表4は被験化合物のClC-2を形質移入されたHEK細胞におけるClC-2活性化に対する効果を示す。結果は本発明の化合物が有効なClC-2チャンネルオープナーであることを示す。化合物1および2:試験例1を参照されたい。化合物8:13,14-ジヒドロ-16,16-ジフルオロ-PGE1化合物9:13,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-PGF1αN-エチルアミドN1-エチル-7-[2,4aR,5R,6S,7aR-2-1,1-ジフルオロペンチル-2,6-ジヒドロキシぺルヒドロシクロペンタ[b]ピラン-5-イル]ヘプタンアミド試験例5方法密着結合している集密単層由来のヒト腸細胞系である、T84細胞を用いた。該細胞系は短絡回路電流Iscを用いたCl-輸送の研究に広く用いられている。これら細胞はCFTRとClC-2との両方を含む。T84ヒト腸上皮細胞をpH7.4で162-cm2のフラスコCorningCostar、MAでダルベッコ改変イーグル培地と6胎仔ウシ血清FBS、15mMHEPES、14.3mMNaHCO3、および抗生物質/抗真菌剤を追加したHam’sF-12栄養分混合物の1:1混合物中で集密まで増殖させた。フラスコを毎週継代し、3日ごとに栄養を与えた。実験用の細胞単層をコラーゲン-コーティングした透過性の支持体Biocoat上で集密するまで増殖させた。単層に3日ごとに栄養を与え、安定な経上皮耐性が達成された後、およそ播種の714日後に用いた。試験例2の記載と同様にして、T84細胞における短絡回路電流測定を行った。短絡回路電流における変化△Iscをフィルター面積0.3cm2に対して標準化し、△Isc/cm2として報告した。化合物1を最終濃度50nMにて用いた。結果表5はT84細胞における短絡回路電流に対する化合物1の効果を示す。結果は、化合物1がヒト腸細胞系、T84においてCl-輸送を活性化したことを示す。化合物1:試験例1を参照されたい。試験例6方法少なくとも16時間絶食させたWistar系雄性ラット6週齢、体重180~210gに、化合物113,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-プロスタグランジンE1の1、10あるいは100μg/kgを5mL/kgの容量で経口投与した。対照群には、媒体0.5エタノール0.01ポリソルベート80含有蒸留水を同容量経口投与した。投与30分後に動物をエーテル麻酔下で開腹した。十二指腸起始部と回腸末端部をそれぞれ糸で結紮後、腸管を摘出した。各動物の腸内液をそれぞれ集めた後、10,000×g、5分間遠心した。上清を分取後、腸液上清中のクロライドイオン濃度をクロライドカウンターCL-7、平沼産業を用い測定した。対照群と化合物1各用量投与群間の比較にDunnett検定法を用いた。p値0.05未満を統計的有意差ありと判定した。結果各群の腸液内クロライドイオン濃度を表6に示す。化合物1の1、10及び100μg/kgの投与により、腸管内クロライドイオン濃度は、用量依存的に増加した。化合物1の1μg/kg投与群から対照群と比較し有意な腸液内クロライドイオン濃度の増加が認められた。以上の結果は、腸管において化合物1がクロライドチャンネルをオープンすることにより、クロライドイオンの輸送を積極的に促進することを示している。Dunnett検定:対照群と比較し、P<0.01試験例7方法雄性ウイスターラット6週齢、体重:180~210gに、化合物213,14-ジヒドロ-15-ケト-16,16-ジフルオロ-18S-メチル-プロスタグランジンE1の100μg/kgを1日3回7日間経口投与した。対照群n=7には、同容量の媒体0.01ポリソルベート80、0.5エタノール含有蒸留水を投与した。投与最終日の翌朝最終投与の約17時間後、エーテル麻酔下でラットの総胆管内にポリエチレンカテーテルPE10、BectonDickinsonandCompanyを挿入した。ラットをボールマンケージに収容後1時間放置し麻酔から覚醒させた。カテーテル挿入1~2時間後の1時間に排出された胆汁を採取後、胆汁中クロライドイオン濃度をクロライドカウンターCL-7、平沼産業株を用い測定した。対照群と化合物2投与群間の比較にStudentのt検定法を用いた。p値0.05未満を統計的有意差ありと判定した。結果各投与群の胆汁内クロライドイオン濃度を表7に示す。化合物2投与群の胆汁中クロライドイオン濃度は、対照群と比較し有意に増加した。以上の結果は、肝臓において化合物2がクロライドチャンネルをオープンすることにより、クロライドイオンの輸送を積極的に促進することを示している。Studentのt検定:対照群と比較し、p<0.05試験例8方法雄性白色家兎に、生理食塩液、点眼液媒体、化合物1の0.0001点眼液あるいは0.001点眼液を、30μL/眼の容量で点眼した。点眼前0時間および点眼2、4、6、および8時間後に、キャピラリーピペットを用い、下眼瞼の結膜嚢内から涙液5μLを採取した。採取した涙液を蒸留水で5倍に希釈した後、クロライドカウンターCL-7、平沼産業株を用い、クロライドイオン濃度を測定した。対照群と化合物1各用量投与群間の比較にStudentのt検定法およびWilcoxon検定法を用いた。p値0.05未満を統計的有意差ありと判定した。結果各投与群の涙液中のクロライドイオン濃度を表8に示す。涙液中のクロライドイオン濃度は、対照群と比べ、化合物1の投与により濃度依存的に増加した。対照群と比較し、0.0001化合物1点眼液群では点眼後4および8時間後に、0.001化合物1点眼液群では点眼後2、4および8時間後に、それぞれ有意な涙液中クロライドイオン濃度の増加が認められた。以上の結果は、点眼により眼において化合物1がクロライドチャンネルをオープンすることにより、クロライドイオンの輸送を積極的に促進することを示している。Studentのt検定:対照群と比較し、p<0.05、p<0.01Wilcoxon検定:対照群と比較し、[]p<0.05、[]p<0.01"