"台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法であって、転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して台木に輸送し、転写型遺伝子サイレンシングを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする方法。転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するsiRNAを産生することができる、CoYMVプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする請求項1記載の方法。植物の形質転換個体の取得方法であって、請求項1記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする方法。そこで本発明は、TGSを発動させるためのsiRNAを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することを目的とする。上記の点に鑑みてなされた本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、請求項1記載の通り、TGSを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して台木に輸送し、TGSを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする。また、請求項2記載の方法は、請求項1記載の方法において、TGSを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するsiRNAを産生することができる、CoYMVプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする。また、本発明の植物の形質転換個体の取得方法は、請求項3記載の通り、請求項1記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする。本発明によれば、TGSを発動させるためのsiRNAを用い、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法を提供することができる。本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、TGSを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して台木に輸送し、TGSを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とするものである。本発明において、TGSを発動させるためのsiRNAを穂木において産生せしめる方法としては、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するsiRNAを産生することができるベクターを、例えば、AgrobacteriumtumefacienceEHA105株などのアグロバクテリウムに導入した後、siRNA産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを穂木として用いる植物の葉片に自体公知の方法で感染させ、ベクター内のT-DNAの挿入によって目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得し、この再分化個体を育成して穂木として用いる方法が挙げられる必要であれば例えばBurow,M.D.ら、PlantMol.Biol.Rep.8:124-139.1990やRatchlif,F.CG.ら、PlantCell11:1207-1216.1999などを参照のこと。siRNA産生ベクターとしては、プロモーターとターミネーターの間に、標的遺伝子のプロモーター領域のセンス鎖配列部分的であってもよいとそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列InvertedRepeatSequence構造を組み込んだ構成を有するものが挙げられる逆位方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい。穂木において産生されたsiRNAを篩管を通して台木に効率的に輸送するためには、プロモーターは、篩管輸送の起点である伴細胞で特異的に機能するプロモーター、例えば、CoYMVCommelinayellowmottolevirusプロモーターを用いることが望ましい。なお、ターミネーターとしては、植物体内でターミネーターとして機能する例えばNOSターミネーターなどが挙げられる。本発明の適用対象となる植物は、台木と穂木のいずれについても接ぎ木が成立する植物であれば特段の制限はない。接ぎ木の手法は自体公知の手法であってよい。本発明によれば、ソース力が強い穂木からシンク力が強い台木に接ぎ木を介してsiRNAを輸送させることで、台木においてTGSが効果的に発動され、台木を形質転換することができる。台木において発動されたTGSは後代に遺伝するので、台木の主根の篩管に隣接する内鞘細胞pericyclecellが分裂して形成される側根から組織培養を通して再分化個体を取得したり、いわゆるひこばえが見られる植物例えばブルーベリーやリンゴなどの果樹においては根系不定芽体Rootsuckerを再分化個体として取得したりすれば、これらはサイレンシングが維持された形質転換個体であるので、品種改良個体として育成することができる。以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。1TGS発動siRNAを穂木において産生させるためのsiRNA産生ベクターの作製CaMV35Sプロモーターの-32~-342bpの領域OkanoY.ら、PlantJournal53:65-77.2008とそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列構造の間にCAT1カタラーゼ遺伝子由来のイントロン配列長:201bp、OhtaS.ら、PlantandCellPhysiology31:805-813.1990をスペーサーとして連結して組み込んだ。このユニットをバイナリーベクターpE2113-GUSMitsuharaI.ら、PlantCellPhysiology37:49-59.1996.のBamHI/SacI部位のGUSbeta-glucuronidase遺伝子と入れ換えて35S:35S-IRを構築した。次に、伴細胞で特異的に機能するプロモーターであるCoYMVpをpCOIMatsuda、Y.ら、Protoplasma220:51-58.2002によりPCR増幅し、これを35S:35S-IRのSalI/BamIH部位と入れ換えることで、目的のsiRNA産生ベクターCoYMV:35S-IRを得た図1のsilencerを参照。2siRNA産生ベクターのアグロバクテリウムへの導入アグロバクテリウムとしてAgrobacteriumtumefacienceEHA105株を用い、その単一コロニーをLB培地組成は表1参照に抗生物質50mg/LのRifampicinを添加した培地に植え付け、28°Cで24時間振盪培養し、継代してさらに12時間振盪培養した。その後、4°Cにて6000rpmで10分間遠心し、回収した菌を滅菌水および10グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを10グリセロール1mLで懸濁し、そのうちの40μLを1で作製したsiRNA産生ベクター0.5~1.0μgと混合し、混合液をキュベットに移し、20kV/cm,6msの条件でエレクトロポレーションすることで、siRNA産生ベクターをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にLB培地1mLを加え、1.5mLチューブに回収し、28°Cで24時間培養した。抗生物質50mg/LのRifampicinおよび50mg/LのKanamycinを含むLB寒天培地上に培養液を塗布し、28°Cで3日間培養した。得られたコロニーを新しいLB培地で培養し、アグロバクテリウム感染に用いた。3siRNA産生ベクターを保持するアグロバクテリウムのタバコ科植物への感染LB培地5mLに抗生物質50mg/LのRifampicinおよび50mg/LのKanamycinを添加し、siRNA産生ベクターを保持するアグロバクテリウムを28°Cで一晩培養し、継代してさらに12時間振盪培養した。その後、室温にて3000rpmで20分間遠心し、回収した菌をOD600=1.0になるように懸濁液培地組成は表2参照に懸濁した。こうして調製したsiRNA産生ベクターを保持するアグロバクテリウムの懸濁液に、明所条件下で無菌的に栽培した発芽後15日目のNicotianabenthamianaの個体の葉片を浸漬することでアグロバクテリウム感染を行った後、常法に従って目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得した。4台木と穂木の接ぎ木明所条件下の温室にてMSagar0.7で栽培した発芽後7日目のNicotianabenthamiana16C図1のtargetに示されるこの実施例における標的遺伝子産生ベクターである35S:mGFPが導入された緑色蛍光タンパク質産生形質転換体。JonesL.ら、PlantCell11:2291-2301.1999の個体の胚軸部位子葉より約5mm下を水平に剃刀で切断し、この根側を台木とした。一方、3でsiRNA産生ベクターを保持するアグロバクテリウムを感染させた発芽後7日目のNicotianabenthamianaの個体にも同様の処置を行い、この子葉側を穂木とした。両者の胚軸部位をシリコンチューブ長さ:2mm×外径:0.5mm×内径0.4mm内にて密着させて接ぎ木した。全ての操作は無菌的に顕微鏡下で行った。接ぎ木した個体は、無菌シャーレ内のアガロース3mmキューブを利用して正立させた。7日後にチューブを外してロックウールNittoBosekiCo.にて液体肥料OtsukaHouseNos.1and2,OtsukaChemicalCo.を用いて栽培した。5TGS発動の観察接ぎ木した7日後に行った。可視光下とUV下において接ぎ木個体を観察した結果を図2に示す35SIR/16c:左が可視光下で右がUV下。←は接ぎ木点。なお、図2には、siRNA発現ユニットを含まないベクターを用いて同様の操作を行って得た接ぎ木個体の可視光下とUV下において観察した結果をあわせて示すEmpty/16c:左が可視光下で右がUV下。←は接ぎ木点。また、それぞれの接ぎ木個体のサンプルを7低融点アガロースブロックに包埋し、ビブラトームSeries1500Leica,St.Louis,MOを用いて100μm厚の切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡ConfocallaserscanningmicroscopysystemFluoVie1000,Olympus,Tokyoを用いて台木の主根からの側根の分岐部分を観察した結果を図3に、側根の先端を観察した結果を図4にそれぞれ示す図3の右側と図4の下側が可視光下で図3の左側と図4の上側がUV下。図2から明らかなように、siRNA産生ベクターを用いて得た接ぎ木個体35SIR/16cは、siRNA発現ユニットを含まないベクターを用いて得た接ぎ木個体Empty/16cと異なり、接ぎ木点付近に若干の緑色蛍光が認められたが、この部分を除けば緑色蛍光は認められず、穂木において産生されたsiRNAが篩管を通して長距離輸送されて台木においてTGSを効果的に発動したことがわかった。また、図3と図4から明らかなように、siRNA産生ベクターを用いて得た接ぎ木個体では、台木の主根の篩管周辺でTGSが顕著に発動されること別途の実験による主根の断面のTGS発動の観察によっても確認済み、ここから形成される側根は全体にわたってTGSが発動していることがわかった。なお、TGSが発動している側根の切片を用いた組織培養によって得られたカルス由来の再分化個体について緑色蛍光の有無を確認したところ、TGSが後代に遺伝し、サイレンシングが維持されていることで、緑色蛍光は認められなかった。なお、比較実験として、台木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して穂木に輸送した場合、穂木の展開葉においてTGS発動が認められたが、TGSの発動部位は葉身全域ではなく葉脈に沿った箇所に限られていた。腋芽のシンク力を高めるための切り戻しを行っても葉身全域でのTGS発動は認められなかった。よって、穂木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して台木に輸送することによる台木におけるTGS発動の方が、台木において産生されたsiRNAを接ぎ木を介して穂木に輸送することによる穂木におけるTGS発動よりも効果的であり、サイレンシングが維持された形質転換個体を取得する上においても有利であることがわかった。"