共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、前記光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、閾値を超える強度を有する信号を前記発光粒子の光を表す信号として選択的に検出し、前記閾値が前記光検出領域内の該光検出領域よりも狭い領域に包含された発光粒子からの光を表す信号が選択的に検出されるよう設定されることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が、前記光検出領域内の最大強度点から前記光検出領域の周縁に向かって前記発光粒子から放出され検出される光の強度が低減する分布であることを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記光検出領域よりも狭い前記領域に一時に包含される発光粒子の数が実質的に一つ以下となるよう前記閾値が設定されることを特徴とする方法。請求項3の方法であって、前記選択的に検出された信号の数を計数して前記光検出領域よりも狭い前記領域に包含された発光粒子の数を決定する過程を含むことを特徴とする方法。請求項4の方法であって、更に、前記決定された発光粒子の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。請求項4の方法であって、前記光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に基づいて前記決定された発光粒子の数から前記閾値とは異なる別の閾値を設定した場合に検出されるべき前記発光粒子の数を算出することを特徴とする方法。請求項6の方法であって、前記算出された前記発光粒子の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。請求項3の方法であって、前記選択的に検出される前記発光粒子からの光を表す信号の数が所定の数となる閾値を決定し、前記閾値の大きさに基づいて前記発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする方法。請求項1の方法であって、前記発光粒子が励起光を照射されることにより光を放出する粒子であり、前記光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が前記光検出領域内の前記励起光の強度分布と一致していることを特徴とする方法。請求項1乃至9のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。上記のFCS、FIDA等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカルボリュームの体積は、1fL程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、1nM程度若しくはそれ以上であり、1nMを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカルボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献6~8に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が1nM未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、FCS、FIDA等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、FCS、FIDA等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域以下、光検出領域と称する。の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術以下、走査分子計数法と称する。によれば、測定に必要な試料がFCS、FIDA等の光分析技術と同様に微量例えば、数十μL程度であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、FCS、FIDA等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。ところで、上記の走査分子計数法では、試料溶液内にて光検出領域の位置を移動しながら計測された光強度値若しくはフォトンカウント値の時系列のデータに於いて、発光粒子からの光に相当する光強度の増大、即ち、或る閾値以上の光の強度の典型的には、釣鐘状のプロファイルの増大が観測されたときに、一つの発光粒子が光検出領域内に包含されたと判定し、これにより、一つの発光粒子の存在の検出が為される。しかしながら、この構成に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度が比較的高いために、一時的に二つ以上の発光粒子が光検出領域内に包含され、それらの発光粒子の光が同時に観測される時間が発生する場合、即ち、光強度データ上で複数の発光粒子からの光を表す信号の一部が時間的に重なる場合には、それぞれの発光粒子を別々に区別して検出することが困難となり、発光粒子の数、又は濃度若しくは数密度等の情報を正確に取得できなくなり得る。実際、後に記載される実施例に示されている如く、試料溶液中の発光粒子の濃度が高くなると約1nM以上、発光粒子の検出数は、試料溶液中の発光粒子の濃度から期待される数を下回り、発光粒子の検出数の精度が悪化することが見出されている。かかる一時に二つ以上の発光粒子が光検出領域に包含された状態が発生することによる問題は、一時に光検出領域内に包含される発光粒子の数が実質的に常に一つ以下となるように顕微鏡の光学系に於いて励起光の集光状態又はピンホールの径を変更して光検出領域を縮小することにより、解決可能であるが、実際に光検出領域を縮小するための光学系の変更及び調整は困難であり又装置の構成が複雑と成り得る。しかしながら、この点に関し、本発明の発明者は、光強度データに於いて発光粒子に対応する光強度の増大を判別するための閾値を高くすると、みかけの光検出領域を小さくでき、光検出領域の大きさを実際に小さくすることと略同等の作用効果が得られることを見出した。一般に、走査分子計数法を実施する光分析装置に於いて、単一の発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なっており、典型的には、発光粒子の位置が光検出領域の略中心領域に在るときに光強度は最大となり以下、光検出領域内に於ける発光粒子の光強度が最大となる位置を最大強度点と称する。、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、最大強度点から周縁に向かって強度が低減する略釣鐘状のプロファイルを有しており、光検出領域の移動中に於ける発光粒子の通過経路が光検出領域の最大強度点に近いほど、対応する光の信号の強度が高くなる。従って、或る閾値以上の強度の光の信号に対応する発光粒子の通過経路は、光検出領域内の最大強度点を含む光検出領域よりも狭い領域内にあり、かかる光検出領域よりも狭い領域外を通過する発光粒子の光の強度は、前記の閾値を下回ることとなる。そして、光強度データ上で発光粒子に対応する光を表す信号の判別のための閾値を増大するほど、選択される信号に対応する発光粒子の通過位置は、より狭い領域内に限定されることとなる。換言すれば、発光粒子の信号の判別のための閾値の増大又は変更により、みかけの光検出領域即ち、発光粒子が検出される領域或いは発光粒子の信号として検出される信号を生ずる発光粒子の通過する領域の縮小又は調節が可能となる下記注参照。かかる本発明者の見出した知見によれば、測定データの解析処理の修正だけで、試料溶液中の発光粒子の濃度が高いときでも一時に包含する発光粒子の数が実質的に常に一つ以下となる領域を画定し、その領域内を通過する単一の発光粒子を個別に検出することができ、発光粒子の数、濃度、数密度等の情報が精度よく取得可能となる。[注発光粒子は、試料溶液中で三次元的に均等に分散していると考えられるので、移動中の光検出領域内に二つ以上の発光粒子が包含される際に、発光粒子の信号のピーク点信号強度の極大点が重なることは非常に稀であり、殆どの場合、各々の信号のピーク点は互いにずれているため、重複した信号の最大値は、一つの発光粒子の信号のピーク強度に比して然程に大きくはならない。また、みかけの光検出領域の外を通る発光粒子は、みかけの光検出領域から離れるほど、その数は多くなるが、光の強度はみかけの光検出領域内を通る発光粒子よりも低い。従って、或る閾値に対するみかけの光検出領域の外を通過する二つ以上の発光粒子の光が重複しても、その光の信号の強度の最大値は、殆どの場合、閾値を下回り、発光粒子の信号として検出されず、発光粒子の信号として検出される信号は、殆どの場合、みかけの光検出領域の中を通過した発光粒子の信号であると考えられる。]かくして、本発明の一つの課題は、上記の知見を用いて、走査分子計数法に於いて、光検出領域内に複数の発光粒子が一時に包含されることに起因して、発光粒子の検出数の精度が悪化することを回避するための新規な方法を提供することである。また、本発明のもう一つの課題は、上記の知見を用いて、走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度が高い場合に、発光粒子の検出数の精度の悪化を回避し、発光粒子の検出数を良好に計測可能な発光粒子の濃度域を拡大することである。本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して光強度データを生成する過程と、光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、閾値を超える強度を有する信号を発光粒子の光を表す信号として選択的に検出し、前記の閾値が、光検出領域内の該光検出領域よりも狭い領域に包含された発光粒子からの光を表す信号が選択的に検出されるよう設定されることを特徴とする方法によって達成される。かかる構成に於いて、試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。。なお、本明細書に於いて、信号という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることが期待される。従って、逐次的に検出された光に於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。その際、本発明に於いては、上記に述べた知見、即ち、発光粒子の信号の強度がその発光粒子の光検出領域の通過位置によって異なるという知見に基づいて、光検出領域内の該光検出領域よりも狭い領域に包含された発光粒子からの光を表す信号が選択的に検出されるよう閾値が設定される。かかる構成によれば、任意に閾値の設定を変更することにより、みかけの光検出領域の大きさの調整が可能となり、光検出領域内の任意の特定の領域を通過する発光粒子の存在を選択的に検出することが可能となる。なお、既に述べた如く、典型的には、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、光検出領域内の最大強度点から光検出領域の周縁に向かって発光粒子から放出され検出される光の強度が低減する分布、即ち、発光粒子の位置が最大強度点から光検出領域の周縁へ近づくほど光強度が低減する分布である特に、発光粒子が励起光を照射されることにより光を放出する粒子であり、光検出領域が励起光の集光領域により画定される場合には、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は光検出領域内の励起光の強度分布と一致する。。従って、閾値を増大するほど、みかけの光検出領域を最大強度点が含まれるより狭い領域に絞り込むことが可能となる。また、走査分子計数法では、典型的には、単一の発光粒子の信号を個別に検出することにより、発光粒子の数、濃度等の情報を得ることが好ましいので、上記の本発明の構成に於いて、閾値は、好適には、光検出領域よりも狭い領域みかけの光検出領域に一時に包含される発光粒子の数が実質的に一つ以下となるよう設定される。この点に関し、閾値は、みかけの光検出領域に一時に包含される発光粒子の数が一つ以下となるように理論的に、例えば、設計から見積もられる光検出領域の大きさに基づいて決定されてもよいが、通常は、光検出領域の大きさの理論値を精度よく決定することは困難なので、試行実験を何度か繰り返すことにより、一時に包含される発光粒子の数が一つ以下となるみかけの光検出領域を与える閾値を決定するようになっていてよい。なお、後に示す実施例から理解される如く、みかけの光検出領域に一時に包含される発光粒子の数が一つ以下となるように閾値を設定しなくても、発光粒子の数、濃度等の情報を取得することは可能である。本発明に於いて重要なことは、閾値を適宜設定することにより、みかけの光検出領域の大きさを適宜設定できるという点であることは理解されるべきである。上記の本発明の実施の態様の一つに於いては、選択的に検出された信号の数を計数して光検出領域よりも狭い領域みかけの光検出領域に包含された発光粒子の数を計数するようになっていてよい粒子のカウンティング。その場合、検出された発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の同定された発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。具体的には、例えば、複数の試料溶液の数密度若しくは濃度の比、或いは、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比が算出されるか、又は、濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を用いて、絶対的な数密度値又は濃度値が決定されてよい。或いは、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積及び/又はみかけの光検出領域の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。また、本発明の別の態様として、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に基づいて、粒子のカウンティングにより決定された発光粒子の数から、かかる粒子のカウンティングを行った際の閾値とは異なる別の閾値を設定した場合に検出されるべき発光粒子の数を算出することも可能である。後の実施形態の説明の欄に記載されている如く、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布は、粒子のカウンティングにより決定された発光粒子の数に基づいて近似的に決定可能である。そして、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が決定されると、任意の閾値に対するみかけの光検出領域の大きさを見積もることが可能となる。みかけの光検出領域内を通過する発光粒子の数は、そのみかけの光検出領域の大きさに比例すると考えられるので、粒子のカウンティングを行った際の閾値に対するみかけの光検出領域の大きさと別の閾値に対するみかけの光検出領域の大きさとの比に基づいて、別の閾値を設定した場合に検出されるべき発光粒子の数が算出されることとなる。かかる粒子のカウンティングを行った際の閾値とは異なる別の閾値を設定した場合に検出されるべき発光粒子の数が得られると、互いに異なる閾値を用いて検出された粒子の数の比較が容易となり、発光粒子の数密度又は濃度等に関する情報を得る際に有利となる。なお、粒子のカウンティングを行った際の閾値とは異なる別の閾値を設定した場合に検出されるべき発光粒子の数を用いて、発光粒子の数密度又は濃度を決定するようになっていてよい。更に、本発明のもう一つの態様として、光検出領域よりも狭い領域に一時に包含される発光粒子の数が実質的に一つ以下となるよう閾値が設定される場合には、選択的に検出される発光粒子からの光を表す信号の数が所定の数となる閾値を検出し、検出された閾値の大きさに基づいて発光粒子の数密度又は濃度を決定するようになっていてもよい。後の実施形態の欄に於いて記載されている如く、発光粒子の数密度又は濃度は、選択的に検出される信号数とみかけの光検出領域の大きさとから与えられるところ、信号数とみかけの光検出領域の大きさとは、伴に閾値の関数であり信号数とみかけの光検出領域の大きさは、閾値が高くなるほど伴に低減する。、みかけの光検出領域の大きさは、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布のパラメータによって表すことができる。従って、発光粒子の数密度又は濃度は、閾値と、光検出領域に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布のパラメータと、選択的に検出される信号数とによって表すことが可能であり、或る選択的に検出される信号数を与える閾値を検出すれば、発光粒子の数密度又は濃度を決定することが可能となる。実際、後に記載される実験例によれば、或る選択的に検出される信号数を与える閾値から、発光粒子の数密度又は濃度を決定できることが明らかになった。かかる態様は、走査分子計数法に於いて、任意の試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を検出するために有利に用いることが可能である。上記の本発明の構成に於ける光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、1つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、1つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に関して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度ブラウン運動による粒子の平均の移動速度よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が1つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、1つの発光粒子から複数回、その存在を表す信号が検出されてしまう可能性があり、検出された信号と1つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、1つの発光粒子を、1つの信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性特に、拡散係数に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。なお、本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなくアーティファクトの無い状態で安定した状態にて、光の計測が可能である例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、FCS、FIDA等の場合と同様に微量1~数十μL程度の試料溶液にて計測及び分析が可能である。本発明の方法は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなどの溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。総じて、本発明の方法では、走査分子計数法に於いて、発光粒子の信号の強度がその発光粒子の光検出領域内での通過位置によって異なっていることから、発光粒子の信号の判別のための閾値の設定を変更することにより、みかけの光検出領域の大きさの調整が可能となるという点に注目し、閾値を適宜設定することによって、みかけの光検出領域光検出領域内の該光検出領域よりも狭い領域を画定し、そのみかけの光検出領域に包含された発光粒子からの光を表す信号を選択的に検出することが試みられる。かかる本発明の構成によれば、発光粒子の信号の検出に於いて参照する領域みかけの光検出領域が実際の光検出領域よりも相対的に狭くなることから、かかる領域内に包含される発光粒子の数が二つ以上となる可能性は、実際の光検出領域内の発光粒子の数が二つ以上となる可能性よりも低くなるので、より正確に単一の発光粒子の数を計測し、発光粒子の濃度又は数密度等に関する情報を取得することが可能となる。従って、試料溶液中の発光粒子の濃度が比較的高く、これにより、実際の光検出領域内の発光粒子の数が二つ以上となる可能性が高くなる場合でも、閾値を適宜設定することによって、発光粒子の信号の検出に於いて参照する領域内に一時に包含される発光粒子の数が一つ以下となる状態を実現でき、そこに於いて、単一の発光粒子の個別検出、その数の計数或いは濃度若しくは数密度等に関する情報の取得が可能となる。換言すれば、本発明によれば、走査分子計数法が良好な精度にて適用可能な発光粒子の濃度域又は数密度域が高濃度又は高密度側に拡大することが可能となる。かくして、本発明の方法によれば、走査分子計数法の利用可能な試料溶液の範囲が拡大され、分子間相互作用の観測及び分析などの走査分子計数法の応用範囲の拡大が期待される。本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。光分析装置の構成本発明による方法は、基本的な構成に於いて、図1Aに模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1Aを参照して、光分析装置1は、光学系2~17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光Exが、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1~数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域励起領域が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光Emは、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1Bに模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1Bに例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1~10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカルボリュームと称される。コンフォーカルボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aを経て、バリアフィルター14を透過してここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、1つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図1Cに模式的に例示されている如く、反射ミラー7の向きを変更するミラー偏向器17が採用されてよい。かかるミラー偏向器17は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器17は、コンピュータ18の制御の下、光検出器16による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよいコンピュータ18に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。。なお、図示していないが、対物レンズ8を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ図示せずには、観察するウェル10を変更するべく、マイクロプレート9の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置17aが設けられていてよい。ステージ位置変更装置17aの作動は、コンピュータ18により制御されてよい。発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域光検出領域のみで光の放出があるので、ピンホール13は、除去されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系2~5が省略されてよい。更に、光分析装置1に於いては、図示の如く、複数の励起光源2が設けられていてよく、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器16も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。本発明の方法の原理発明の概要の欄に記載されている如く、本発明の方法は、端的に述べれば、上記の如き共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光検出に於いて、発光粒子の信号の強度がその発光粒子の光検出領域内での位置によって異なり、発光粒子の信号の判別のための閾値の設定によって、みかけの光検出領域の大きさが変化するという原理に基づき、走査分子計数法に於いて、閾値を適宜設定することにより、みかけの光検出領域の大きさを調整するというものである。そして、好適には、みかけの光検出領域内に一時包含される発光粒子の数が一つ以下となるように、即ち、発光粒子の信号として検出される信号の各々が単一の発光粒子に対応するように、或いは、単一発光粒子が確実に個別に検出されるように、発光粒子の信号の判別のための閾値を設定し、その状態で、試料溶液内を光検出領域により走査する間の発光粒子の数を計数し、より高精度にて、発光粒子の濃度又は数密度等の情報を取得することが試みられる。以下、走査分子計数法及び本発明の方法の原理について説明する。1走査分子計数法の原理FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図10Aに模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度フォトンカウントが検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図10Bに描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号フォトンカウントが、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。そこで、本願出願人は、特願2010-044714及びPCT/JP2011/53481に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きFCS、FIDA等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく走査分子計数法を提案した。走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構ミラー偏向器17を駆動して光路を変更し、図2にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域CVの位置を移動しながら、即ち、光検出領域CVにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図2Aの如く、光検出領域CVが移動する間図中、時間to~t2に於いて1つの発光粒子の存在する領域を通過する際t1には、発光粒子から光が放出され、図2Bに描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度Emのパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域CVの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図2Bに例示されている如きパルス状の信号有意な光強度を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、FCS、FIDA等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。2.本発明によるみかけの光検出領域の大きさの調節の原理上記の走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子の数密度が高い場合には、光検出領域内に一時に二つ以上の発光粒子が包含される可能性が高くなる。例えば、図3Aに模式的に描かれている如く、光検出領域CVの移動中に発光粒子αが光検出領域から抜け出す前に、発光粒子βが光検出領域内へ進入するとき、図3Bの右方に示されている如く、時系列光強度データ上に於いて、発光粒子αの信号と発光粒子βの信号との一部が互いに重複することとなる。その場合、発光粒子α、βの信号のプロファイルは、図中、点線にて示されている如く、それら二つの発光粒子の信号を別々に検出することが困難となる形状となり、かかる互いに重複した二つ以上の発光粒子の信号が一つの発光粒子の信号として検出される場合がある。実際、試料溶液中の発光粒子の数密度が高い場合、典型的には、約1nM程度まで高くなると、走査分子計数法により発光粒子の光として検出される信号数は、実際の濃度から期待される数より大幅に少なくなることが分かっており、かかる信号数の低減は、互いに重複した二つ以上の発光粒子の信号を一つの発光粒子の信号としてカウントしているためであると考えられる。上記の如き互いに重複した二つ以上の発光粒子の信号を排除して単一の発光粒子の各々が個別に検出される時系列光強度データを生成する一つの手法としては、図3A中にて点線に描かれている如く、光検出領域を縮小し、光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が実質的に常に一つ以下となる状態を達成することが考えられる。しかしながら、光検出領域の縮小には原理的な限界があり領域の大きさを光の波長以下に縮小することはできない。、また、装置の構成が複雑となるので、実際に光検出領域を縮小することは、極めて困難である。しかしながら、本発明によれば、時系列光強度データから発光粒子の光の信号を検出する際の信号処理を修正するだけで、図3Aにて点線に描かれている如き、光検出領域内の該光検出領域よりも狭い領域を通過する発光粒子の光の信号を選択的に検出でき、互いに重複した二つ以上の発光粒子の信号を一つの発光粒子の信号として検出してしまう可能性が大幅に低減される。光検出領域に於いて、そこを通過する発光粒子から放出され光検出器まで到達する光の強度は、光検出領域に於ける発光粒子の位置によって異なる。例えば、発光粒子が照明光を照射されて発光する粒子である場合、照明光の光検出領域内に於ける光の強度は、典型的には、光検出領域集光領域の略中心にて最大となり、かかる最大強度点から略放射方向に低減する。従って、発光粒子の光強度は、発光粒子が光検出領域の略中心を横切る際に最大となり、発光粒子の位置が光検出領域の周縁へ近づくほど、光強度は徐々に低減する。即ち、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布は、図3C左上に例示されている如き釣鐘状の分布となっており、例えば、図3Aに描かれている如く、図中、点線に描かれている領域を通過する発光粒子γの光強度は、点線に描かれている領域外を通過する発光粒子α、βの光強度よりも高くなる図3B参照。かくして、端的に述べれば、発光粒子の信号の強度を参照すれば、発光粒子の光検出領域内に於ける通過範囲が概ね特定されることとなる。そして、時系列光強度データから発光粒子の信号を検出する際に、閾値を設定し、その閾値を超える強度を有する信号のみを有意な信号として検出すれば、その閾値以上の光強度を与える領域を通過した発光粒子に対応する信号のみを拾い出すことが可能となる。また、図3C左上の如く、閾値をIth0→Ith1→Ith2の順に上げる場合には、拾い出される発光粒子の通過した領域が、図3C左下及び右下の断面図及び斜視図に描かれている如く、CV→qCV1→qQV2の順に縮小されることとなる。換言すれば、時系列光強度データの信号の分析処理に於いて、或る閾値例えば、Ith1、Ith2を設定することにより、単一の発光粒子を検出する領域、つまり、みかけの光検出領域例えば、qCV1、qCV2が画定され、そのみかけの光検出領域内を通過する発光粒子の信号のみを選択的に検出できることとなる。なお、上記の如く、発光粒子の信号の選択が信号の強度の高低により為される場合、もし二つ以上の発光粒子が同時に光検出領域に進入し、それらの発光粒子の信号のピーク最大値の時間に殆どずれがないときには、それらの発光粒子がみかけの光検出領域を通過しているか否かによらず、それらの発光粒子の信号は、互いに区別されることなく、一つの発光粒子の信号として検出され得る。しかしながら、発光粒子は、試料溶液中に三次元的に分散していることから、二つの発光粒子が同時に光検出領域に進入することは発光粒子の数密度が相当に高くならない限り稀であり、また、光検出領域内に於ける発光粒子の検出される光の強度分布が釣鐘状の分布であり、発光粒子の位置が光検出領域の周縁に近いほど発光粒子の強度が低減することから、仮に二つの発光粒子が略同時に光検出領域に進入し、それらの信号の重複した信号の強度の最大値が増大したとしても、殆どの場合、光検出領域の中心付近に位置する単一の発光粒子の光の強度に比して低いと考えられる発光粒子数は、高光強度のものほど、少なくなるので、高光強度の発光粒子が重なる確率は、低光強度の発光粒子が重なる確率よりも大幅に少なくなる。。従って、上記の如く、閾値を適宜設定することにより、一つの発光粒子の信号として検出される互いに重複した二つ以上の発光粒子の信号は実質的に排除される。上記の本発明による閾値を適宜設定してみかけの光検出領域の大きさを調節する構成に於いて、閾値とみかけの光検出領域の大きさとは、以下の関係式により関連付けられる。即ち、図3C左上に例示されている如き、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がガウス関数で近似できる場合、閾値Ithは、光強度分布の最大値ImaxImaxは、単一発光粒子の最大光強度に相当する。、分布の半値半幅w、強度のバックグラウンドIbg及びみかけの光検出領域の断面半径最大強度点からの距離rを用いて、により表される。みかけの光検出領域の移動方向に垂直な方向の断面積Sが近似的にS=πr2により与えられるとするとより厳密には、光検出領域の断面は楕円であるが、演算の簡略化のため、円にて近似する。以下同様。、みかけの光検出領域の断面積Sと閾値Ithとの関係は、により与えられる。また、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がローレンツ関数で近似できる場合、閾値Ithは、により表されるので、みかけの光検出領域の断面積Sと閾値Ithとの関係は、により与えられる。ところで、試料溶液内にて走査速度移動速度uにて光検出領域を移動する際に、体積Vを有するみかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が常に一つである場合、測定時間tに於いて検出される発光粒子数Pmaxは、Pmax=Sut/V...5にて与えられる。即ち、測定時間tの光測定に於いて、発光粒子数がPmaxを超えると、体積Vを有するみかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が2つ以上と成り得ることになる。換言すれば、本発明に於いて、みかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が実質的に常に一つ以下となるようにする閾値の設定は、検出される発光粒子数Pthが、Pth≦Pmax...6の条件を満たすように為される。従って、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がガウス関数で近似できる場合、式5及び式2により、閾値を、が成立するように設定すれば、みかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が実質的に常に一つ以下となった状態が実現される。また、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度の分布がローレンツ関数で近似できる場合、式5及び式4により、閾値を、が成立するよう設定すれば、みかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が実質的に常に一つ以下となった状態が実現される。上記の式7又は8の条件に関して留意されるべきことは、試料溶液中の発光粒子の濃度が高いほど、式7又は8の条件を満たす閾値Ithは高くなる一方、発光粒子の濃度が低いほど、検出される発光粒子数Pthが低減するということである。従って、みかけの光検出領域内に一時に包含される発光粒子数が実質的に常に一つ以下となった状態にて良好な精度にて種々の分析に十分な発光粒子数が得られるようにするためには、観測対象となる試料溶液中の発光粒子の濃度に応じて、適切な閾値が選択されることが好ましい。走査分子計数法の処理操作過程図1Aに例示の光分析装置1を用いた本発明の方法に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、1発光粒子を含む試料溶液の調製過程、2試料溶液の光強度の測定処理過程、及び3測定された光強度の分析処理過程が実行される。図4は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。1試料溶液の調製本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識蛍光分子、りん光分子、化学生物発光分子が任意の態様にて付加された粒子であってよい。2試料溶液の光強度の測定本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動試料溶液内の走査を行いながら、光強度の測定が為される図4-ステップ100。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置図示せずに記憶されたプログラム試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7ガルバノミラーを駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎BINTIMEに、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行されることが好ましい。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本実施形態に於いて観測対象となる発光粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図5Aに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化発光粒子からの光を表す信号を特定することが困難となる。そこで、好適には、図5Bに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図5Cの上段に例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度拡散移動速度よりも速く設定される。具体的には、拡散係数Dを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Woの光検出領域コンフォーカルボリュームを通過するときに要する時間Δtは、平均二乗変位の関係式2Wo2=6DΔt...9から、Δt=2Wo2/6D...10となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度拡散移動速度Vdifは、概ね、Vdif=2Wo/Δt=3D/Wo...11となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10-10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10-3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル典型的には、励起光強度分布と略同様となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。3光強度の分析上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。i発光粒子に対応する信号の検出及び数密度又は濃度の決定時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図5Bに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値Ioを超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値Ioを超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:I=Aexp-2t2/a2...12であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイルバックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイルに対して式12をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出及びカウンティングを行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ図5C、最上段検出結果未処理に対して、スムージング平滑化処理が為される図4-ステップ110、図5C中上段スムージング。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度走査速度、BINTIMEに応じて適宜設定されてよい。次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号以下、パルス信号と称する。が存在する時間領域パルス存在領域を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算されるステップ120。時系列光強度データの時間微分値は、図5C中下段時間微分に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定されるステップ130。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ図5C下段釣鐘型関数フィッティング、釣鐘型関数のパルスのピーク最大値の強度Ipeak、パルス幅半値全幅Wpeak、フィッティングに於ける最小二乗法の相関係数等のパラメータが算出されるステップ140。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定されるステップ150。なお、かかるステップでは、パルスのピーク強度については、かかる強度が閾値を超えているか否かが判定されるところ、後により詳細に説明される如く、本発明の方法に於いては、かかる閾値が適当なみかけの光検出領域を画定するべく設定される。かくして、図6A左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図6A右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。上記のステップ130~150の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されるステップ160。なお、図示していないが、時系列光強度データの全域のパルス信号の探索中に、検出されたパルス信号の数を計数するようになっていてよい。また、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。時系列光強度データに於ける発光粒子の数密度又は濃度は、発光粒子に対応する信号の数カウント値と、時系列光強度データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて決定可能である。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、発光粒子の濃度が既知の溶液参照溶液について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と参照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の発光粒子としては、好ましくは、各発光粒子と同様の波長特性を有する発光標識蛍光色素等であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度数密度Cの参照溶液について、その発光粒子の検出数がNであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Vtは、Vt=N/C...13により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の発光粒子の濃度数密度cは、c=n/Vt...14により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係式13の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。ii閾値の設定上記のステップ150では、時系列光強度データ上に於ける有意なパルス信号が発光粒子の信号であるか否かを判定する際、時系列光強度データ上のパルス信号に対して釣鐘型関数をフィッティングして得られたピーク強度が閾値を超えているか否かが判定される。かかる閾値判定に於いて、本発明の方法では、閾値は、単に発光粒子の信号とノイズとを見分けるためだけでなく、みかけの光検出領域を画定するために設定され、かかるみかけの光検出領域を通過した発光粒子の信号が、発光粒子の信号として検出される。この閾値の設定は、好適には、みかけの光検出領域内に包含される発光粒子数が常に実質的に1つ以下となるように、即ち、上記の式7又は8の条件が成立するよう為される。しかしながら、上記の式7又は8の条件を成立させる閾値を即座に決定することは困難である。従って、典型的には、発光粒子の濃度の異なるいくつかの参照溶液について上記に説明した光強度の測定を行って得られた光強度データに於いて、閾値を種々変更しながら粒子の検出及びカウンティングを実行し、発光粒子の濃度に対して発光粒子の信号として検出されるパルス数が比例する結果を与える閾値を探索することにより発光粒子の低濃度域から高濃度域に亘ってパルス数が発光粒子の濃度に比例するとき、各パルス信号が単一の発光粒子に対応すると解釈される。、種々の発光粒子の濃度に応じた適切な閾値が予め決定されるようになっていてよい。或る試料溶液について走査分子計数法による検査を行う場合の閾値の設定に於いては、想定される発光粒子の濃度に応じて、予め決定された閾値のうち、適切な閾値が選択される。後述の実施例1に記載されている如く、典型的な実験条件に於いて、発光粒子の信号とノイズとを区別するための閾値の設定では、発光粒子の濃度が100pMを超えると、上記の式7又は8の条件が成立しなくなる。従って、発光粒子の濃度が0~100pMについては、発光粒子の信号とノイズとを区別するための閾値が採用され、発光粒子の濃度が100pM~1nMの場合に、より高い閾値が選択されるようになっていてよいiiiパルス数の換算上記の如く、発光粒子の濃度に応じて異なる閾値を選択して発光粒子数パルス数を計数する場合、互いに異なる閾値を用いて得られた発光粒子数の結果を比較することは困難となる。既に述べた如く、発光粒子の濃度が高くなると、上記の式7又は8の条件を満たす閾値が高くなる一方、発光粒子の濃度が低いほど、検出される発光粒子数が低減するので、良好な精度にて発光粒子数を計測するためには、試料溶液中の発光粒子の濃度に応じて適切な閾値が選択されるのが好ましいところ、或る発光粒子濃度の試料溶液について検出される発光粒子数は、閾値によって変化するので、異なる閾値を用いて検出された発光粒子数をそのまま互いに比較することはできない。例えば、上記の如く、典型的な測定条件に於いて、発光粒子の濃度が100pM未満の試料溶液と発光粒子の濃度が1nM前後の試料溶液に対して適切な閾値は、互いに異なるので、発光粒子数は、それぞれ別々の閾値を用いて計数することが好ましい。しかしながら、発光粒子の濃度が100pM未満の試料溶液についての発光粒子数と、発光粒子の濃度が1nM前後の試料溶液についての発光粒子数とを比較する際に、発光粒子数の差をそのまま検出することはできない。そこで、本発明の方法の一つの態様に於いては、或る閾値を用いて得られた発光粒子数から別の閾値を設定した場合に検出されるべき発光粒子数を算出することが試みられる。詳細に述べれば、或る閾値Ith2を用いて得られたパルス数Pth2と別の閾値Ith1を用いて得られるべきパルス数Pth1との比は、閾値Ith2を設定した場合のみかけの光検出領域の走査方向に垂直な方向の断面積Sth2と閾値Ith1を設定した場合のみかけの光検出領域の走査方向に垂直な方向の断面積Sth1の比に等しいと考えられるので、別の閾値Ith1を用いて得られるべきパルス数Pth1は、Pth1=Sth1/Sth2Pth2...15により与えられる。Sth1、Sth2は、それぞれ、式2[ガウス関数の場合]又は式4[ローレンツ関数の場合]により与えられるので、光検出領域内の光強度分布の最大値Imax、分布の半値半幅w、閾値Ith、バックグラウンドIbgが分かれば、式15を用いて、閾値Ith2を用いて得られたパルス数Pth2から別の閾値Ith1を用いて得られるべきパルス数Pth1への換算が為されることとなる。光検出領域内の光強度分布の最大値Imax、分布の半値半幅w及びバックグラウンドIbgは、任意の手法で決定されるようになっていてよい。一つの手法として、例えば、光検出領域内に包含される発光粒子数が常に1つ以下である場合の閾値とその閾値で得られる発光粒子数との関係から、光強度分布の最大値Imax、分布の半値半幅w及びバックグラウンドIbgを決定することができる。具体的には、まず、測定時間tの光強度データに於いて閾値Ithを設定して検出される発光粒子数Pは、みかけの光検出領域の走査方向に垂直な方向の断面積S、走査速度u及び発光粒子の濃度cを用いてP=cNASut...16により与えられる。ここで、NAは、アボガドロ数である。みかけの光検出領域の走査方向に垂直な方向の断面積Sが、S=πr2[rは、みかけの光検出領域の断面半径]により与えられるとすると、式16からが得られる。従って、或る発光粒子の濃度が既知の溶液について、閾値Ithと、その閾値での発光粒子数Pに基づいて得られたみかけの光検出領域の断面半径rとの複数の組が得られれば、式1又は3を用いて、光強度分布の最大値Imax及び分布の半値半幅wを算出することが可能となる。より具体的には、例えば、後の実施例2にて示される如く、発光粒子の濃度が既知の溶液について得られた光強度データに於いて、閾値Ithを変更しながら、各閾値に於ける発光粒子数Pを計数し、発光粒子数Pから算出されたみかけの光検出領域の断面半径rが算出される。しかる後、一連の、みかけの光検出領域の断面半径rに対する閾値Ithに対して、式1又は3をフィッティングすることにより、光強度分布の最大値Imax及び分布の半値半幅wを決定することができる。バックグラウンドは、フィッティングによらず、光強度データを参照して適宜設定されてもよい。かくして、上記の如く、或る閾値を用いて得られた発光粒子数を別の閾値を用いて得られるべき発光粒子数へ換算可能になると、互いに異なる閾値を用いて得られた発光粒子数の結果を比較することが容易となる。iv一定の発光粒子数を与える閾値を用いた発光粒子濃度の推定上記の式16から、発光粒子濃度cは、c=P...18により与えられ、みかけの光検出領域の断面積Sは、式2又は4により与えられる閾値Ithの関数である。従って、発光粒子濃度cは、P、Ith及び光検出領域内の光強度分布のパラメータImax、w、Ibgを用いて算出することができる。この点に関し、或る閾値Ith、その閾値を用いて得られた発光粒子P及び濃度cの関係は、光強度分布がガウス関数により近似できる場合光強度分布がローレンツ関数により近似できる場合により与えられるので、光強度分布のパラメータImax、w、Ibgは、種々の発光粒子濃度が既知の溶液について得られた光強度データに於いて、或る一定の発光粒子数Poを与える閾値Ithoを探索した後、複数の発光粒子濃度cと閾値Ithoとの組に対して式19又は20をフィッティングすることにより得られる。そして、任意の試料溶液について測定された光強度データからその試料溶液中の発光粒子の濃度を決定する際には、光強度データに於いて前記の一定の発光粒子数Poを与える閾値Ithoを検出し、検出されたIthoとPoとから発光粒子の濃度が決定される。かかる手法によれば、一定の発光粒子数Poを観測対象となる試料溶液中の発光粒子濃度の全域に亘って上記の式7又は8の条件が成立する値に設定することにより、試料溶液中の発光粒子濃度によらず、みかけの光検出領域内に一時に二つ以上の発光粒子が包含されることに起因する発光粒子数の誤差を回避しながら、発光粒子濃度の決定が可能となる。かくして、上記の本発明の方法によれば、走査分子計数法に於いて光強度データから発光粒子の信号を検出する際の閾値を適切に設定することによって、二つ以上の発光粒子の信号が重複した信号が実質的に存在しない状態にて単一の発光粒子の個別の検出が可能となり、発光粒子の数、濃度又は数密度の情報をより精度よく取得できることとなる。そして、本発明によれば、走査分子計数法の適用可能な発光粒子の濃度域が特に高濃度側に拡大される。上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。発光粒子信号の検出のための閾値の変更走査分子計数法による光測定により得られた時系列光強度データからの発光粒子の信号の検出に於いて、発光粒子の信号を判別するための閾値を変更することによりみかけの光検出領域が調整されることを検証した。試料溶液として、リン酸緩衝液0.05Tween20を含む中に、発光粒子として蛍光色素ATTO633を、1pM、10pM、100pM、1nMにて、それぞれ、含む溶液を調製した。光の測定に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた1分子蛍光測定装置MF-20オリンパス株式会社を用い、上記の2試料溶液の光強度の測定にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列光強度データフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、633nmのレーザー光を用い、バンドパスフィルターを用いて、660-710nmの波長帯域の光を測定し、時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、30mm/秒とし、BINTIMEを10μ秒とし、各試料溶液について2秒間の測定を3回ずつ行った。光強度の測定後、上記の3i発光粒子に対応する信号の検出に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、ガウス関数に於けるピーク強度、パルス幅半値全幅、相関係数を決定した。そして、下記の条件20μ秒<パルス幅<400μ秒ピーク強度>閾値Ith[pc/10μs]...A相関係数>0.95を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視した。なお、閾値Ithは、0.5~3.0フォトン/10μ秒の範囲にて下記に説明される如く設定した。なお、フォトン数に小数点以下の表示が現れるのは、フォトンカウントデータをスムージングするためである。即ち、フォトンカウント値は、スムージング処理によって連続的な値として扱われる。図7A及びBは、それぞれ、上記の条件Aに於いて、閾値Ith=0.5[pc/10μs]及び閾値Ith=2.0[pc/10μs]とした場合のパルス数発光粒子の信号として検出された信号数を発光粒子濃度に対してプロットしたグラフであり、図7Cは、閾値Ithを、0.5ずつ3.0まで変更した場合の濃度に対するパルス数の変化を示している各点は、3回の測定の平均値である。これらの図を参照して、いずれの場合も、パルス数は、発光粒子濃度と伴に単調に増加したこのことは、予め既知の発光粒子濃度の溶液を用いてパルス数を計測しておくことにより、任意の溶液中の発光粒子濃度が走査分子計数法により決定できることを示している。。しかしながら、図7A又は図7Cから明らかな如く、閾値が小さい場合~1.5に於いては、濃度が100pMを超えると、濃度が1pMから100pMまでのパルス数から外挿される直線を下回り、パルス数の濃度に対する線形性が維持されなかった。これは、発光粒子濃度が高いことにより、二つ以上の発光粒子の重複した信号が1つの発光粒子の信号として検出されてしまったためであると考えられる。一方、図7C又は図7Bから明らかな如く、閾値を増大すると2.0~、観測された全濃度域で、パルス数は、発光粒子濃度に略比例した。閾値の増大により光強度の高い信号のみが選択されること、及び、光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布が略釣鐘状であることこのことは、個々のパルス信号の形状が略釣鐘状であることからも理解される。を考慮すると、上記の結果によれば、閾値の増大によって、検出される発光粒子の存在領域即ち、みかけの光検出領域が光強度分布に於いて強度の高い領域に縮小され、これにより、二つ以上の発光粒子の重複した信号が検出される可能性が大幅に低減し、実質的に単一の発光粒子の信号のみが発光粒子の信号として検出されるようになったと考えられる。かくして、上記の結果によれば、発光粒子濃度に応じて閾値を適宜設定することにより、みかけの光検出領域が調整され、包含される発光粒子の数が実質的に常に1つ以下となるようみかけの光検出領域を画定することにより、単一の発光粒子を個別に検出し、発光粒子の数、濃度又は数密度等の情報をより精度よく取得できることが確かめられた。光検出領域内に於ける発光粒子の光の強度分布の決定光検出領域内の発光粒子から放出され検出される光の強度分布のパラメータピーク強度Imax、半値半幅w、バックグラウンドIbgを、みかけの光検出領域の移動方向に垂直な方向の断面半径rと、閾値Ithとから決定した。みかけの光検出領域の移動方向に垂直な方向の断面半径rは、式17を用いて、発光粒子濃度が既知の試料溶液について得られた光強度データであって光検出領域内の発光粒子数が実質的に常に1つ以下であるデータ上に於いて閾値Ithを変更しながら得られる発光粒子数Pから算出した。具体的には、実施例1の10pMATTO633の試料溶液について得られた光強度データに於いて、閾値Ithを変更しながら発光粒子数Pを検出し、各発光粒子数Pから式17によりみかけの光検出領域の断面半径rを算出した。図8Aは、みかけの光検出領域の断面半径rに対して閾値Ithをプロットした図であるなお、同図に於いて、実際に得られるデータ点は、右半分の□点であり、左半分のデータ点は、0点軸を対称軸として右半分のデータを反転した点である。。理解されるべきことは、図8Aのプロット点は、光検出領域の移動方向に垂直な方向の断面に於ける光検出領域内の発光粒子から放出され検出される光の強度分布のプロファイルを表しているということである。即ち、式1又は3から理解される如く、みかけの光検出領域の断面半径rは、閾値Ithに等しい強度の発光粒子の存在する線領域を画定するので、みかけの光検出領域の断面半径rに対する閾値Ithの関係は、発光粒子の存在位置の光検出領域の中心最大強度点からの距離とその位置にて発光粒子から放出され検出される光強度の関係に相当する。図8Aのプロットの分布の形状は、ローレンツ関数の形状と良い一致を示している。そこで、図8Aのデータに対して非線形最小二乗法を用いて式3をフィッティングしたところ図中の実曲線、光検出領域内の発光粒子から放出され検出される光の強度分布のピーク強度Imaxは、5.81[pc/10μs]であり、wは、0.57[μm]、Ibgは、0.0[pc/10μs]と算定された。かくして、上記の方法によれば、閾値Ithと発光粒子数Pとを用いて、光検出領域内の発光粒子から放出され検出される光の強度分布のパラメータが算出され、光検出領域内の発光粒子からの光の強度分布を近似的に決定できることが確かめられた。パルス数の換算実施例1に於いて得られた光強度データから異なる閾値を用いて検出された発光粒子数を、3iiiパルス数の換算に記載した手法により、別の閾値を用いた場合に検出されるべき発光粒子数に換算した。具体的には、100pMATTO633の試料溶液について、閾値=2.0[pc/10μs]として検出された発光粒子数と、1nMATTO633の試料溶液について、閾値=3.0[pc/10μs]として検出された発光粒子数を、それぞれ、式15及び式4を用いて、閾値=1.0[pc/10μs]として発光粒子の信号検出を行った場合に検出されるべき発光粒子数に換算した。なお、その際、式4に於ける各パラメータは、実施例2で得られた値、即ち、Imax=5.81、w=0.57、Ibg=0.0を用いた。図8Bは、閾値=1.0[pc/10μs]として発光粒子の信号検出を行った場合の発光粒子濃度に対する検出された発光粒子数換算前と、閾値=2.0[pc/10μs]を用いて検出された100pMATTO633の試料溶液についての発光粒子数及び閾値=3.0[pc/10μs]を用いて検出された1nMATTO633の試料溶液についての発光粒子数を、それぞれ、閾値=1.0[pc/10μs]を用いて発光粒子の信号検出を行った場合に検出されるべき発光粒子数に換算した値換算後とを、発光粒子濃度に対してプロットしたグラフ図である。閾値=2.0[pc/10μs]を用いて検出された100pMATTO633の試料溶液についての発光粒子数は、閾値=1.0[pc/10μs]の場合、2093.7個3回の測定の平均値だったのに対し、閾値=2.0[pc/10μs]を用いた場合の数[917個3回の測定の平均値]を閾値=1.0[pc/10μs]の場合に換算した値は、2316.3個となった。また、閾値=3.0[pc/10μs]を用いて検出された1nMATTO633の試料溶液についての発光粒子数は、閾値=1.0[pc/10μs]の場合、8264.3個3回の測定の平均値だったのに対し、閾値=3.0[pc/10μs]を用いた場合の数[6293.3個3回の測定の平均値]を閾値=1.0[pc/10μs]の場合に換算した値は、32365.7個となった。また、図8Bから理解される如く、閾値=1.0[pc/10μs]にて発光粒子の信号の検出をした場合には、実施例1にて示した場合と同様に、発光粒子濃度が100pM~1nMに於いて、パルス数は、それよりも低濃度域の値から直線的に外挿した値を大幅に下回っているのに対し、上記の換算により得られた発光粒子濃度が100pM~1nMのパルス数は、それよりも低濃度域の値から直線的に外挿される値に近づいた。この結果は、式15及び式2又は4を用いることにより、或る閾値を用いて検出された発光粒子数から別の閾値を用いた場合に検出されるべき発光粒子数を推定できることを示唆している。かかる手法によれば、式7又は8が成立する閾値が異なる少なくとも二つの試料溶液について、それぞれ別々の閾値を用いて発光粒子数を検出した場合でも、それらの発光粒子数を同一の閾値を用いた場合に検出されるべき発光粒子数に換算し、これにより、互いに比較することが可能となる。例えば、発光粒子濃度の高い試料溶液については、式7又は8が成立する高い閾値にて発光粒子数の検出を実行した後、検出された発光粒子数を、本来、式7又は8が成立しない閾値を用いた場合に検出されるべき発光粒子数に換算し、その換算された発光粒子数と、発光粒子濃度の低い試料溶液について得られた発光粒子数とを比較するといった解析が可能となる。一定の発光粒子数を与える閾値を用いた発光粒子濃度の推定実施例1に於いて得られた各試料溶液についての時系列光強度データを用いて、或る一定の発光粒子数を与える閾値に基づいて、発光粒子の濃度が推定できることを確かめた。具体的には、まず、各試料溶液についての時系列光強度データに於いて、発光粒子数が20個となる閾値を決定した。図9は、発光粒子濃度に対する発光粒子数が20個となる閾値黒丸と、かかる閾値の点に対して、非線形最小二乗法を用いて式20[ローレンツ関数]をフィッティングして得られた曲線実線とを示している。図から理解される如く、発光粒子数が20個となる閾値は、発光粒子濃度の増大と共に単調に増大し、式20によるフィッティング曲線に良好に一致した。式20中のパラメータは、それぞれ、Imax=8.7[pc/10μs]、w=2.9μmであった。かくして、濃度が未知の試料溶液の光強度データに於いて、一定の発光粒子数を与える閾値を検出することにより、その試料溶液中の発光粒子濃度が検出できることが確かめられた。上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の方法に従って、走査分子計数法に於いて発光粒子の信号の検出のための閾値を適宜設定することにより、みかけの光検出領域が画定され、実質的に、そのみかけの光検出領域内を通過した発光粒子の信号のみを選択的に検出することが可能となる。そして、みかけの光検出領域は、実際の光検出領域よりも狭いので、二つ以上の発光粒子の信号が重複してなる信号が発光粒子の信号として検出される可能性が大幅に低減される。従って、単一の発光粒子の信号が精度良く個別に検出され、試料溶液中の発光粒子濃度に対応した発光粒子数の検出が可能となる。かかる構成によれば、試料溶液中の発光粒子濃度が比較的高く、実際の光検出領域に二つ以上の発光粒子が一時に包含された状態の生ずる可能性が高い場合でも、走査分子計数法を良好に適用可能となるので、走査分子計数法が利用可能な発光粒子濃度の範囲が拡大されることとなる。