"患者における炎症性および/または心血管の疾患または病態の存在を判定する方法であって、i前記患者から採取した体液の試料を線維芽細胞活性化タンパク質FAPの発現についてアッセイすることこの場合、該FAPの発現、もしくは対照試料と比較した該FAPの発現増加が、前記患者における前記疾患もしくは前記病態についての指標となる、および/またはii前記患者から採取した血栓もしくはプラークの試料をFAPの発現についてアッセイすることこの場合、前記患者から採取した体液試料におけるその発現と比較したFAPの発現増加が、前記疾患もしくは前記病態の指標となるを含む方法。前記体液が血液である、請求項1に記載の方法。前記疾患が、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、心筋梗塞等の卒中もしくは急性冠症候群、心臓発作、慢性肝疾患、大脳静脈血栓症、深在性静脈血栓症及び肺塞栓症からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。前記病態が、易損性アテローム性動脈硬化性プラークまたはアテローム血栓症である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。前記試料をFAPのタンパク質またはmRNAについてアッセイすることを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。前記アッセイが、イムノアッセイである、請求項5に記載の方法。前記アッセイが、免疫組織化学的アッセイである、請求項6に記載の方法。前記アッセイが、蛍光励起サイトメトリーFACS、間接的ELISA、サンドイッチELISAまたは細胞培養ELISAを含む、請求項7に記載の方法。前記イムノアッセイが、前記試料と、FAPに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体とを接触させることを含む、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。前記モノクローナル抗体が、マウス抗ヒト抗体である、請求項9に記載の方法。請求項1から4のいずれ一項に記載の疾患または病態の診断または処置に使用するための、iFAPの存在もしくは活性を検出できるおよび/またはiiFAPの活性もしくはその発現を阻害できる化合物を含む組成物。i医薬組成物であり、且つ医薬的に許容される担体を含む、またはii診断用組成物であり、且つ、場合により、前記化合物のおよび/もしくはFAPの検出に適する手段を含む、請求項11に記載の組成物。前記活性が、酵素的活性である、請求項11または12に記載の組成物。血液凝固の阻害に使用するための、請求項13に記載の組成物。前記化合物が、FAPに結合できる、またはFAPをコードする核酸分子に結合できる、請求項11から14のいずれか一項に記載の組成物。前記化合物が、FAPに特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項15に記載の組成物。前記モノクローナル抗体が、ヒト抗体である、請求項16に記載の組成物。前記化合物が、FAPアンタゴニストである、請求項11から14のいずれか一項に記載の組成物。前記アンタゴニストが、ペプチドまたはペプチド類似体である、請求項17に記載の組成物。処置される患者が、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法に従って診断されている、請求項12から19のいずれか一項に記載の医薬組成物。凝固障害の予防または処置に使用するための、FAPを含む医薬組成物。前記凝固障害が、血友病である、請求項21に記載の組成物。血液凝固をinvitroで増進するための試薬としてのFAPの使用。患者におけるFAP遮断薬の治療効果および/または効率を試験するためのROTEM/NATEMの使用。本発明は、概して、炎症性および/または心血管の疾患または病態、例えば易損性アテローム性動脈硬化性プラークおよび/またはアテローム血栓症、の調査、予防および処置のための手段および方法および組成物に関し、これらの手段および方法および組成物では、線維芽細胞活性化タンパク質FAP発現または活性を判定し、それが患者における前記疾患または病態の指標となる。実施例において実証するように、驚くべきことに、本発明に従って、FAP酵素の発現および/または増加した発現もしくは活性、例えば体液試料中のFAPタンパク質および/または該タンパク質のフラグメントもしくは触媒生成物の酵素活性、の判定により、炎症性および/または心血管の疾患の判定が可能であることを発見した。加えて、健常ボランティアから得たものなどの対照と比較して、試料中のFAPタンパク質またはそのフラグメントの発現増加および/または活性増加は、前記疾患のリスクまたは進行の指標となることを発見した。線維芽細胞活性化タンパク質FAPは、上皮性腫瘍間質、関節炎、および創傷治癒の際に活性化された線維芽細胞によって発現されるが、健常組織では依然として殆ど検出できない、膜結合型構成的活性セリンプロテアーゼである15-17。FAPは、ジペプチジルペプチダーゼIV活性、プロリルエンドペプチダーゼ活性、およびI型コラーゲン特異的活性を呈示する酵素である17-19。ヒトFAPのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であり、公的データベース、例えば、PubMedCentralによって入手できる。例えば、対応する参考文献も列挙しているNIH遺伝子配列データベースGenebankをはじめとする、米国国立バイオテクノロジー情報センターNationalCentreforBiotechnologyInformation:NCBIが提供しているインターネットページ経由で得ることができる。例えば、線維芽細胞活性化タンパク質FAPのヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、アクセッション番号NM_004460およびAAB_496652.1で入手できる。下に記載する実験データに従って、本発明の一つの目的は、ヒトアテローム性動脈硬化症の際のFAP発現の特徴を明らかにし、プラーク不安定性とのその関連性を検査して、FAP関連炎症性疾患および/または心血管疾患に罹患している被験者を診断および処置するための方法および組成物を提供することである。易損性アテローム性動脈硬化性プラークにおけるコラーゲン分解は、該プラークをより破壊しやすくさせる。線維芽細胞活性化タンパク質FAPは、そのコラゲナーゼ活性により、腫瘍形成に関与する。しかし、易損性ヒトプラークにおけるFAPの意義は、今までのところ依然として不明である。したがって、本発明の一つの目的は、ヒトアテローム性動脈硬化症の際のFAP発現の特徴を明らかにし、プラーク不安定性とのその関連性を調べ、前記疾患に罹患している被験者を診断および処置できる方法を提供することである。さらに、本発明のもう一つの目的は、FAPの誘導機序、その下流効果、ならびにFAP発現および活性に対する抗体の中和能力を判定することである。特に、FAPが、急性冠症候群ACSを有する患者の破裂しやすい冠動脈プラークおよび内皮細胞において発現されることを、驚くべきことに、証明することができた。本発明は、FAP介在コラーゲン分解が炎症性シグナル伝達によって誘導され、それをFAPタンパク質の阻害剤またはアンタゴニストによって中和できるという観察に基づく。本発明は、FAPが、HASMCにおけるマクロファージ由来TNFαによって誘導され、易損性ヒトプラークと関連し、破裂しやすい線維性キャップのコラーゲン破壊の一因となる、という驚くべき知見も提供する。本発明によって、初めて、炎症性および/または心血管の疾患の特徴を、それぞれ、より早期に、すなわち該疾患がまだ臨床的に無症状である間に、明らかにするための方法を提供することができる。したがって、本発明は、アテローム性動脈硬化症関連疾患に罹患している被験者におけるアテローム性動脈硬化性プラークの進行および易損性のグレードを診断するためのバイオマーカーとしてFAPを提供する。さらに、本発明は、心筋梗塞、卒中のリスクを有する、または心筋梗塞、卒中に罹患している、または心血管の病態を経験した患者の処置のための薬剤を提供する。より具体的には、本発明は、患者における炎症性疾患および/または心血管疾患或いは病態の存在を判定する方法に関し、この方法は、i患者から採取した第一の試料を線維芽細胞活性化タンパク質FAPの発現についてアッセイすることこの場合、該FAPの発現、もしくは典型的には健常被験者から採取した第二の、すなわち対照試料と比較した該FAPの発現増加が、前記患者における前記疾患もしくは前記病態についての指標となる、および/またはii前記患者から採取した血栓もしくはプラークの第一の試料をFAPの発現についてアッセイすることこの場合、前記患者から採取した体液の第二の試料におけるその発現と比較したFAPの発現増加が、前記疾患もしくは前記病態の指標となるを含む。好ましい実施形態において、前記体液試料は、血液から得られる。FAPが急性心不全を有する患者の血漿において増されることを実証することにより、本発明の方法の汎用性をさらに証明することができた。例えば、急性心不全および有意なプラーク冠動脈造影図により冠動脈の>30の閉塞を経験している患者から採取した末梢血血漿におけるFAP発現は、有意なアテローム性動脈硬化症のリスク因子または徴候を有さない健常患者からの試料と比較して有意に増加される。本発明の範囲内で行われる実験に従って、FAP血漿レベルが、急性冠症候群ACSを有する患者において上昇されることを明らかにすることができた。詳細には、FAPレベルは、安定した冠動脈疾患CADを有する患者において上昇される。さらに、不安定狭心症を有する患者およびST上昇型心筋疾患STEMIを有する患者において、CADを呈示していないCAD患者と比較して上昇されたFAPレベルを検出することができた。実施例13および図17参照。さらに、実施例11および対応する図15において詳細に概説するように、フローサイトメトリー分析は、血栓顆粒球ではFAP発現増進を認めるが、心筋梗塞に罹患している患者から吸引した冠動脈からの血栓の他の分析細胞集団ではFAP発現増進を認めないことが、驚くべきことに、本発明により判明した。本発明の方法の第一の選択肢iの一つの実施形態では、前記第一の試料を冠動脈から、および前記第二の試料を末梢静脈または大動脈洞から採取することができる。この実施形態では、冠循環のFAPレベル上昇それ自体が、本発明に従ってプラーク易損性の指標となり得る。加えて、本発明に従って実施される実験により、FAPが、心筋梗塞を有する患者から得た閉塞している血栓において発現される実施例12および図16参照ことはもちろん、実施例9および図13にて説明するように、心筋梗塞後に死亡した患者から得た破裂しやすいヒト冠動脈においても発現されることが明らかになった。本発明の方法の第二の選択肢iiの一つの実施形態では、前記第一の試料を、好ましくは、冠血栓、腸骨動脈、頸動脈および/もしくは冠動脈における血栓、冠ステント由来血栓、冠血栓白血球、冠血栓血小板、冠動脈アテローム性動脈硬化性プラーク内皮、冠動脈アテローム性動脈硬化性プラーク線維性キャップ、冠動脈アテローム性動脈硬化性プラーク脂質および/もしくは壊死性コア、冠動脈プラーク外膜、または頸動脈プラークから得る。白血球は、単球、顆粒球好塩基球、好中球および好酸球を含む、B細胞、T細胞ヘルパー、細胞傷害性、記憶、調節、ナチュラルキラーNKおよびガンマデルタT細胞サブセットを含むを含む。本発明の第二の実施形態は、FAP発現が、急性心筋梗塞を有する患者では末梢血と比較して冠血栓におけるほうが増進されるという観察に基づく、図14および実施例10参照。さらに、より詳細なフローサイトメトリー分析によって、FAPが、ヒト冠血栓において顆粒球CD66b陽性により発現されるが、単球CD14陽性ではされないことが明らかになった。実施例11および図15参照。最後に、本発明の実験により、ST上昇型心筋梗塞STEMI冠動脈血栓および末梢動脈閉塞性疾患PAOD大腿動脈血栓に罹患している患者からの末梢血および閉塞している血栓の試料を分析すると、慢性血栓ではなく急性血栓において、増進されたFAP発現が認められた。実施例12および図16参照。以前に、国際公開第2006/010517号パンフレットにおいて、FAPは、発現プロフィールのみに基づいて、癌、呼吸器疾患、皮膚科的疾患、代謝性疾患、炎症、胃腸系疾患、血液学的疾患、筋骨格疾患、神経疾患、泌尿器疾患、内分泌疾患およびまた心血管疾患を含む、様々な疾患と関連づけられている。しかし、炎症性疾患および病態へのFAP発現の信頼できる関連づけはなされていない。さらに、様々なヒト組織において測定された相対発現レベルのいずれかが、有意なものであるという証拠、ましてや疾患または病態を予測する上で決め手となり、信頼できるという証拠を提供できる臨床データは、まったく開示されていない。加えて、凝固およびアテローム血栓症におけるFAPの役割は説明されていない。しかし、所与の標的が、臨床評価の際にバイオマーカーとして役立つことができる可能性を秘めていると推断するためには、その発現が特定の病態に明確に起因しなければならない。でなければ、偽陽性または他の人為的結果を生ずるリスクが生ずる。それ故、国際公開第2006/010517号パンフレットの教示によるFAPの発現レベルの測定では、特定の病態の存在または発症リスクについて、たとえあるとしても、決定的なことを導き出せない。逆に、本発明に従って実施した実験は、FAPが、アテローム性動脈硬化症およびアテローム血栓症と関連づけられること、ならびにアテローム性動脈硬化症およびアテローム血栓症において直接的且つ病理学的役割を有することを初めて明らかにした。臨床的に、FAPは、プラーク破裂および心筋梗塞の明確な臨床イベントと関連づけられる。詳細には、FAP発現がヒト大動脈アテロームにおいて、および破裂しやすい冠動脈の線維性キャップにおいて増進されること、ならびに炎症性マクロファージ負荷量と相関することを発見した。FAPがアテローム性動脈硬化性プラークのコラーゲンを分解することを初めて証明することができた。さらに、FAPが血液凝固を加速し、その結果、より安定した血餅形成を生じさせることを初めて証明する。したがって、FAPは、動脈の炎症に関連した様々な疾患についてのマーカーであり得、治療標的でもあり得る。本発明によると、炎症性疾患および/または心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、卒中または急性冠症候群、例えば心筋梗塞心臓発作、慢性肝疾患、大脳静脈血栓症、深在静脈血栓症及び肺塞栓症からなる群から選択される。本発明の方法で処置、予防または診断することができる炎症性疾患、例えば心血管疾患、のさらなる例としては、血栓動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、突然心臓死、高血圧性心疾患、非冠血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症、小血管疾患、血管性認知症、腎症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、気腫および慢性肺疾患、または介入手技血管外傷に対する手技に関連した心血管の病態、例えば、血管形成術、ステントテント留置、合成もしくは中性延長グラフト後の再狭窄、が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記病態は、易損性アテローム性動脈硬化性プラークまたはアテローム血栓症である。本発明は、上述の疾患のマーカーとしてのヒト線維芽細胞活性化タンパク質FAPの使用を開示する。FAPの測定を、前記疾患の早期検出に利用することができ、または前記疾患に罹患しており治療的処置を受けている患者の調査に利用することができる。したがって、FAP発現は、被験者の治療法の成功の指標にもなり得る、すなわち、例えば血栓およびプラークの、それぞれ、再発または寛解の指標にもなり得る。本発明の方法は、様々な方法でのFAP発現アッセイを含む。例えば、FAPタンパク質、FAPの触媒生成物または基質、下流および上流シグナル伝達化合物、ならびにFAPのmRNAレベルおよび遺伝子発現を分析して、上述の疾患の一つに罹患しているまたは罹患が疑われる患者におけるFAPの存在の判定に十分なデータを得ることができる。本発明の好ましい実施形態において、上述の方法は、前記試料をFAPタンパク質またはmRNAについてアッセイすることを含む。それにより、FAPタンパク質発現のアッセイは、疾患の存在を示し、およびさらなる候補バイオマーカーもアッセイするときには対照としても役立ち得る。加えて、FAPの発現レベルを用いて、アテローム性動脈硬化性プラークの進行および易損性のグレードを判定することができ、この場合、強い発現は、高い易損性グレードと相関し、弱いFAP発現レベルは、炎症性疾患の発症の指標すなわち低い易損性グレードとなる。この情報を前記患者の処置または診断にさらに利用することができる。FAP発現は、炎症性刺激によって誘発され、易損性ヒト冠動脈プラークにおいて増進される。FAPのコラーゲン分解活性の抗体ベースの阻害は、易損性アテローム性動脈硬化性プラークについての標的治療および分子イメージングの機会をもたらす。さらにもう一つの態様において、本発明は、FAP介在コラーゲン分解の治療的阻害を研究するためのinvivo系を提供する。図12に図示し、実施例6においてさらに説明するように、FAP発現は、ApoE-/-マウスの大動脈アテローム性動脈硬化性プラークにおいて増進される。アポリポタンパク質EノックアウトマウスApoE-/-は、アテローム形成を研究するための確立したモデルである。さらなる解釈については、SteinbergNEnglJMed3201989年、915-924およびZhangScience2581992年、468-471を参照のこと該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。ApoE-/-マウスは、減少した血清アポリポタンパク質Eを有し、低コレステロール食を用いたときでさえ脂質異常およびアテローム性動脈硬化症を呈示する。本発明によると、ApoE-/-マウスモデルは、FAP介在コラーゲン分解の治療的阻害に用いることができ、また、マウス抗FAP遮断抗体を適用することにより、アテローム性動脈硬化症マウスにおけるプラーク安定性に対するFAP阻害の効果の同定に寄与することができる。さらに、FAPは、ApoE-/-マウスモデルのアテローム性動脈硬化性プラークにおいて発現されるので、このモデルを、陽性対照として用いるため、FAP二重ノックアウトマウスモデルFAP-/-と交雑させて、FAP阻害の最大効果を判定することができた。当業者には理解されるように、FAPを、炎症性疾患、例えば心血管疾患、の評価に有用であるマーカーとして同定した。FAPの同定および評価を様々な免疫診断手順またはアッセイによって達成することができ、また、FAPの同定および評価を用いて、本発明の成果に匹敵する結果に至ることができる。本発明の好ましい実施形態において、前記アッセイは、イムノアッセイである。適するイムノアッセイを、例えば、免疫沈降法、粒子イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイRIA、酵素EIAイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイFIAまたは化学発光イムノアッセイのように、直接形式または間接形式のいずれで利用してもよい。FAPの発現を、該ポリペプチドに特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを使用して、検出および測定するための様々なプロトコルが、当該技術分野において公知である。好ましい実施形態において、前記イムノアッセイは、前記試料とFAPに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体とを接触させることを含む。FAPに対する抗体は、例えば、様々な販売元Abcam、AbDSerotec、AbnovaCorporationなどから市販されている。好ましい実施形態において、前記アッセイに使用される抗体は、モノクローナル抗体である。適するモノクローナル抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ブタ、イヌ、ネコにおいて産生されるか、または任意の他の動物起源であり得、好ましくは、上記方法による抗体は、マウス抗ヒト抗体および/またはウサギ抗ヒト抗体である。FAPの検出に適する抗体および方法は、国際公開第2007/111657号パンフレットにおけるページ6ffの実施例IIおよびページ9ffの実施例IVにも詳細に記載されており、該参考文献のそれぞれの開示内容は、参照により本明細書に援用されている。この国際出願には、関節リウマチに関連した静止期細胞におけるFAP発現が記載されている。本発明とは対照的に、前記国際出願は、排他的に滑膜組織、すなわち滑膜細胞においてFAPを検出する方法を用いている。しかし、そのような静止期細胞は、好ましくは本発明の方法には含まれず、本発明の方法では、好ましくは、血液などの循環体液試料の試料を使用し、これらの試料のほうが、被験者から簡便に得ることができ、容易にアッセイすることもできる。したがって、本発明は、国際公開2007/111657号パンフレットにおいて特許請求され、開示されているような筋線維芽細胞様滑膜細胞をFAPについてアッセイすることによる関節リウマチの診断方法を含まない。FAPのエピトープに特異的に結合する抗体はもちろん、免疫組織化学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、細胞蛍光励起サイトメトリーおよび/もしくは細胞分取法FACS、磁気励起細胞分取法MACSまたは当該技術分野において公知の他の免疫化学的アッセイも、診断的におよび治療的に使用することができる。一般情報およびプロトコルは、Raem,ArnoldM.、Immunoassays、第1版、Munich、Heidelberg:Elsevier、SpektrumAkademischerVerlag.、2007年、DavidWild編集:TheImmunoassayHandbook、第3版、ElsevierSciencePublishingCompany、Amsterdam、Boston、Oxford2005年に開示されている。好ましい実施形態での上述の方法における前記アッセイは、免疫組織化学的アッセイである。直接的または間接的、サンドイッチおよび細胞培養酵素結合免疫吸着アッセイELISA、サンドイッチ型アッセイを含む実施例を、FAPの同じエピトープに指向される捕捉および標識用抗体を用いて行うことができる。典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、FAPに対する特異性を有する第一の抗体を固体または半固体支持体に共有結合させるか、または受動的に結合させる。前記支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に用いられているポリマーは、ニトロセルロース、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレンまたはこれらの混合物もしくは誘導体である。前記固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレートの形態であってもよいし、またはイムノアッセイの実施に適するいずれの他の表面であってもよい。結合プロセスは、当該技術分野において周知である。様々な形式のELISAの実施のための一般的な形式およびプロトコルは、当該技術分野において開示されており、診断分野の当業者に公知である。例えば、Ausubel編集、CurrentProtocolsinMolecularBiology、第5版、JohnWileySons,Inc,NY,2002のChapter11を参照することができる。FACSおよび/またはフローサイトメトリーは、自動装置を使用して細胞亜集団を分析する方法である。これは、医学研究所ならびに生物医学的および生化学的調査に広く用いられており、様々な本および論文、例えば、FlowCytometryandSorting、M.R.Melamedら編集WileyandLiss、1990年において、ならびにジャーナル、例えば、CytometryおよびtheAmericanJournalofClinicalPathologyにおいて論じられている。FACS分析は、蛍光励起細胞分取法ばかりでなくフローサイトメトリーも含む場合があり、この場合、従来のフローサイトメトリーが、固定および透過性細胞の分析を可能にし、それらの細胞は、分析後に廃棄される。蛍光励起細胞分取法は、蛍光をはじめとする光学的特性に基づいて個々の細胞を分取するために用いられる。これを用いて、比較的短期間に細胞の大集団をスクリーニングし、それによって分取された細胞を、適する手段によってさらに処理または分析することができる。他のスクリーニング法としては、Gaines1999年Biotechniques264:683-688に記載されているような、磁気励起細胞分取法MACSが挙げられる。プロトコル、手段および方法についてのさらなる参考は、当該技術Ormerod,M.G.編集2000年FlowCytometry-Apracticalapproach、第3版、OxfordUniversityPress、Oxford、UKISBN0199638241、HandbookofFlowCytometryMethodsbyJ.PaulRobinsonISBN0471596345ら、CurrentProtocolsinCytometry、Wiley-LissPubから得ることができる。好ましい実施形態において、本発明による方法は、試料をFAPタンパク質についてアッセイすることを含み、前記アッセイは、蛍光励起サイトメトリーFACS、間接的ELISA、サンドイッチ-ELISAまたは細胞培養ELISAを含む。しかし、本発明は、抗体に限定されない。FAPタンパク質に結合する作用因子、例えば、相互作用するタンパク質またはペプチドまたは抗体由来分子、例えば特にFab、FvもしくはscFvフラグメントなども使用することができる。抗体またはそれらのフラグメントは、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies,ALaboratoryManual、CSHPress、ColdSpringHarbor、1988または欧州特許出願公開第0451216号明細書およびそれらに引用されている参考文献に記載されている方法を用いることによって得ることができる。当業者には理解されるように、特定の結合剤FAP複合体の量を測定するためのそれらの非常に多数の方法は、すべて、関連教科書例えば、TijssenP.またはDiamandis,E.P.およびChristopoulos,T.K.、Immunoassay、AcademicPress.、Boston、1996年に詳細に記載されている。あるいは、特に、本発明の方法の第二の選択肢iiでは、核酸ベースの手段をFAPのアッセイに用いる、すなわち、FAPのmRNAまたはタンパク質の発現を判定することによりFAPをアッセイする。生体試料からの細胞におけるRNA発現レベルの判定に適する技術例えば、ノーザンブロット分析、RT-PCR、insituハイブリダイゼーションは、当業者には周知である。例えば、核酸抽出バッファーの存在下での均質化、その後の遠心分離によって、細胞から全細胞RNAを精製することができる。核酸を沈降させ、DNaseでの処置および沈殿によってDNAを除去する。次いで、標準的な技術に従ってアガロースゲルでのゲル電気泳動によりRNA分子を分離し、ニトロセルロースフィルタに転写する。次いで、加熱によって、そのRNAをそのフィルタに固定させる。特定のRNAの検出および定量を、当該RNAに相補的な適切に標識されたDNAまたはRNAプローブを使用し行う。例えば、MolecularCloning:ALaboratorvManual、J.Sambrookら編集、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1989年、Chapter7参照該参考文献の全開示が参照により援用されている。ノーザンブロットハイブリダイゼーションに適するプローブは、FAPの核酸配列から作成することができる。標識DNAおよびRNAプローブの調製方法、ならびに標的ヌクレオチド配列へのそれらのハイブリダイゼーションのための条件は、MolecularCloning:ALaboratorvManual、J.Sambrookら編集、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、1989年、Chapters10および11に記載されており、該参考文献の開示は、参照により本明細書に援用されている。例えば、核酸プローブを、例えば、放射性核種、例えば3H、32P、33P、14Cもしくは35S、重金属、または標識リガンドための特異的結合対メンバーとして機能することができるリガンド例えば、ビオチン、アビジンもしくは抗体、蛍光分子、化学発光分子、酵素、またはこれらに類するもので標識することができる。Rigbyら、J.Mol.Biol.1131977年、237-251のニックトランスレーション法またはFeinbergら、Anal.Biochem.1321983年、6-13のランダムプライミング法のいずれかによって、プローブを高特異的活性に標識することができ、前記参考文献の全開示は、参照により本明細書に援用されている。後者は、一本鎖DNAからまたはRNAテンプレートから高特異的活性の32P標識プローブを合成するために選ばれる方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って高放射活性ヌクレオチドで既存のヌクレオチドを置換することにより、108cpm/マイクログラムより十分高い特異的活性を有する32P標識核酸プローブを調製することが可能である。その後、ハイブリダイズしたフィルタを写真フィルムに露出させることによって、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー検出を行うことができる。ハイブリダイズしたフィルタにより露出された写真フィルムの比重走査によって、FAPmRNA遺伝子転写レベルの正確な測定値が得られる。もう一つのアプローチとして、ニュージャージー州ピスカタウェイのAmershamBiosciencesから入手できるMolecularDynamics400-B2DPhosphorimagerなどのコンピュータ画像処理システムにより、FAPmRNA遺伝子転写レベルを定量することができる。DNAまたはRNAプローブの放射性核種標識が実際的でない場合、ランダム-プライマー法を用いて、類似体、例えばdTTP類似体5-N-N-ビオチニル-イプシロン-アミノカプロイル-3-アミノアリルデオキシウリジン三リン酸、をプローブ分子に組み込むことができる。このビオチン化プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素にまたは呈色反応を生じさせる酵素に連結されたビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体例えば、抗ビオチン抗体、との反応によって、検出することができる。ノーザンおよび他のRNAハイブリダイゼーション技術に加えて、insituハイブリダイゼーション技術を用いてRNA転写レベルの判定を行うことができる。この技術は、ノーザンブロッティング技術より要する細胞が少なく、ならびに顕微鏡カバーガラス上に全細胞を堆積させること、および該細胞の核酸含量を、放射性または別様に標識された核酸例えば、cDNAまたはRNAプローブを含有する溶液で探索することを含む。この技術は、被験者からの組織生検試料の分析に特によく適している。insituハイブリダイゼーション技術の実施は、米国特許第5,427,916号明細書に詳細に記載されており、該参考文献の全開示が参照により本明細書に援用されている。FAPmRNAのinsituハイブリダイゼーションに適するプローブは、その核酸配列から作成することができる。細胞内のFAPmRNA遺伝子転写産物の相対数は、FAPmRNA遺伝子転写産物の逆転写、続いての該逆転写産物のポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRによる増幅によって判定することもできる。FAPmRNA遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば、同じ試料内に存在するハウスキーピング遺伝子からのmRNAのレベル、との比較で定量することができる。内部標準としての使用に適するハウスキーピング遺伝子としては、例えば、5SrRNA、U6snRNAまたはtRNAが挙げられる。定量的RT-PCRのための方法およびその変法は、当業者の技術常識の範囲内である。上述の疾患または病態を同定、診断または処置するために、本発明は、FAP分子の活性または発現に影響を及ぼすことによって、炎症性疾患を抑制、低減、低下または遅延できる小分子を含む組成物を提供する。FAPの阻害または低減は、特定の分子をFAPのDNAもしくはRNAもしくはポリペプチドにターゲッティングすることによって、またはFAPの阻害剤の活性化或いはFAPの活性化因子の不安定化によって達成することができる。一つの実施形態において、本発明は、上で定義したとおりの疾患または病態の診断または処置に使用するための、iFAPの存在もしくは活性を検出できる、および/またはiiFAPの活性もしくは発現を阻害できる、化合物を含む組成物に関する。さらに、本発明は、上で説明したような相互作用分子または化合物と、場合により、医薬的に許容される担体とを含む、炎症性および/または心血管の疾患を処置または診断するための組成物に関する。言い換えると、本発明による組成物は、i医薬組成物であり得、医薬的に許容される担体を含む。または、ii診断用組成物であり得、場合により、FAPの直接的もしくは間接的検出に適する手段を含む。本発明の組成物の第二の選択肢ii、すなわち診断用組成物、に関して、前記化合物は、本明細書において上でFAP発現の判定について説明したもののうちのいずれか一つ、例えば抗FAP抗体ならびにFAP特異的核酸プローブおよびプライマー、であることがある。好ましくは、前記診断用組成物を、本明細書において前に説明した本発明の方法に使用する。さらに、抗FAP抗体および等価なFAP結合分子を例えば、蛍光、放射性、酵素、核磁気、重金属標識すること、およびそれらを使用して、核医学画像診断技術に類似した様式でinvivoでFAPを検出して、組織、細胞、またはFAPを発現する他の材料、例えば血栓およびプラーク、を検出することができる。MRIまたはPETにより検出可能な画像診断用プローブをFAPおよびプラークにターゲッティングさせることによって、例えば心筋梗塞のより明確な生前診断のための生物学的マーカー、治療の効力をモニターするための手段、を得ることができる。したがって、本発明のさらなる実施形態は、FAP、例えば血栓およびプラーク内のFAP、をインビボで検出するための組成物、治療および/もしくは診断薬をFAPにターゲッティングさせる組成物、血栓およびプラーク形成を抑制する組成物、または体液からのFAPのもしくは病的FAP発現細胞の体外抽出のための組成物、を調製するための、FAP結合分子、例えば抗FAP抗体またはその結合フラグメント、の使用に関する。本発明の組成物、の第一の選択肢i、すなわち医薬組成物に関して、医薬的に許容される担体および投与経路は、当業者に公知の対応する文献から得ることができる。本発明の医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法に従って調合することができる。例えば、theUniversityofScienceinPhiladelphiaによるRemington:Scienceandpracticeofpharmacy2000年、ISBN-0-683-306472参照。適する医薬用担体の例も当該技術分野において公知であり、それらとしては、リン酸緩衝液、食塩溶液、水エマルジョン、エマルジョン、例えば油/水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物を周知の従来の方法によって調合することができる。前記医薬組成物を適する用量で被験者に投与することができる。それらの適する組成物の投与を様々な方法で行うことができる。例としては、経口的、鼻腔内的、直腸的、局所的、腹腔内的、静脈内的、筋肉内的、皮下的、真皮下的、経皮的、経腱鞘的および経頭蓋的方法による、医薬的に許容される担体を含有する組成物の投与が挙げられる。鼻内噴霧製剤などのエーロゾル製剤は、保存薬および等張剤を伴う活性薬剤の精製水溶液または精製された他の溶液を含む。そのような製剤は、好ましくは、鼻粘膜と適合性のpHおよび等張状態に調整される。直腸内または膣内投与用の製剤は、適する担体を用いて坐剤として提供することができる。様々なタイプの投与に適している製剤に関するさらなるガイダンスは、Remington’sPharmaceuticalSciences、MacePublishingCompany、Philadelphia、PA、第17版1985年および対応する最新版において見出すことができる。薬物送達法の寸評については、Langer、Science2491990年、1527-1533を参照のこと。医学分野では周知であるように、いずれの一患者のための投薬量も、その患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与回数および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物をはじめとする、多くの要因に依存する。加えて、他の薬剤の共投与または逐次投与が望ましいことがある。治療有効用量または量は、症状または病態の改善に十分な活性成分の量を指す。上記の化合物の治療効力および毒性、例えば、ED50集団の50において治療的に有効な量およびLD50集団の50に対して致死的な用量は、細胞培養物または実験動物での標準薬学的手順によって判定することができる。治療効果と毒性効果との用量比が治療指数であり、それを比率、LD50/ED50、として表すことができる。本発明の組成物中の化合物は、FAPの活性、発現またはプロセッシングを直接阻害し得る。例えば、前記化合物は、FAPタンパク質またはそのフラグメントと相互作用し例えば結合し、そのFAP活性、例えばコラゲナーゼ活性および血液凝固活性、を遮断するまたは低減させることができる。さらに好ましい実施形態において、前記組成物は、酵素活性である活性を有する化合物を含む。さらにもう一つの実施形態において、前記組成物は、FAPのプロセッシングを阻止することができ、例えば、前記化合物は、次のうちの一つ以上を阻害することができる:前駆体から活性形態へのFAPの変換、またはFAPの活性形態もしくは潜在形態の放出もしくは分泌。あるいは、前記組成物または化合物は、活性、例えば酵素活性、または上流活性化因子の発現もしくは腫瘍壊死因子アルファTNF-αの発現もしくはトランスフォーミング増殖因子ベータTGF-βの発現、潜在形態から活性形態へのFAPの変換に関与する酵素、または下流FAP活性化標的、を阻害することによりFAPを間接的に阻害することができ、あるいはFAP阻害剤の活性もしくは発現、または下流FAP阻害剤標的を増加させることができる。本発明のさらなる局面は、実施例8におよび図9から図11に示すように、FAPがヒト血液凝固速度を加速するという驚くべき発見に基づく。血液凝固または血餅は、身体の治癒過程の自然な部分である。損傷領域周辺の血液密集は、保護バリアを形成するが、最終的には自然に消滅する。しかし、血餅は、循環系に干渉すると危険になる。血栓血餅は、死亡および能力障害の主原因である。血栓は、卒中、心臓発作、肺塞栓症、および癌の合併症をはじめとする、健康問題の原因である。好ましい実施形態において、本発明による組成物は、血液凝固の阻害に関する使用に適している。本発明のもう一つの実施形態において、前記医薬組成物中の化合物は、例えば、FAPmRNAの転写もしくは翻訳を低減させることにより、またはFAPmRNAもしくはタンパク質の安定性を低減させることにより、FAPの発現を阻止するまたは低減させることができる。そのために、前記化合物は、FAP核酸、例えば二本鎖RNAdsRNA分子、マイクロRNAmiRNA、アンチセンス分子、リボザイム、三重らせん分子またはこれらの任意の組み合わせ、の発現または翻訳の阻害剤である。本発明の一つの好ましい実施形態において、前記化合物は、FAPまたはそれをコードする核酸分子に結合できる。本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記化合物は、小分子、例えば化学薬剤、小有機分子、例えば天然生成物ライブラリの生成物もしくは組み合わせ、ポリペプチド、例えば抗体、例えばFAP特異的抗体、ペプチド、ペプチドフラグメント、例えば基質フラグメント、例えばI型コラーゲンのフラグメント、ペプチドミメティックpeptidometicまたはモジュレーターである作用因子である。好ましくは、前記化合物は、FAP特異的抗体であり、そのような抗体を産生させる手段および方法は、上で説明した。本発明によるさらなる好ましい実施形態において、前記化合物は、FAPに特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体および合成抗体、である。好ましくは、前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体の産生に適する方法およびガイダンスは、国際公開第2008/081008号パンフレットに詳細に記載されており、該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。本明細書において用いる場合の抗体は、インタクト免疫グロブリン分子はもちろん、FAPのエピトープを結合することができるそれらのフラグメント、例えばFab、Fab’2およびFv、も含む。前記化合物は、FAPポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストである場合もあり、それらは、酵素活性、発現、翻訳後修飾によりまたは他の手段によってFAP活性に対して効果を発揮する化合物である。FAPのアゴニストは、FAPに結合したときにFAPの活性を増加させるまたは延長する分子である。FAPのアゴニストとしては、FAPを活性化する、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子または任意の他の分子が挙げられる。一つの実施形態において、本発明は、前記化合物がFAPアンタゴニストである組成物に関する。FAPアンタゴニストは、例えば、FAPに結合した時にFAPの活性の継続期間の量を減少させる分子である。阻害剤またはアンタゴニストは、FAPポリペプチドの活性、mRNAまたはDNAのレベルまたはその発現を阻害することでき、この阻害は、酵素活性の減少による、あるいはFAPの翻訳または転写、FAPの結合特性または任意の他の生物学的、機能的もしくは免疫学的特性に影響を及ぼすことによる、FAPの活性の変化を指す。アンタゴニストは、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、小有機化合物、ペプチド様物質、アプタマーまたはPNAであり得るMilner、NatureMedicine11995年、879-880、Hupp、Cell831995年、237-245、Gibbs、Cell791994年、193-198、Gold、Ann.Rev.Biochem.641995年,736-797。そのような上述の化合物の調製および利用のために、当業者は、当該技術分野において公知の方法、例えば引用文献の中で言及されているものを用いることができる。前記アンタゴニストがペプチドまたはペプチド類似体である組成物が、本発明では好ましい。FAP活性の阻害に使用するためのペプチドまたはペプチド類似体を得るために適する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、国際公開第2006/125227号パンフレットに詳細に記載されており、該参考文献のFAP阻害剤に関する開示内容は、参照により本明細書に援用されている。この出願には、N末端がブロックされたペプチドプロリンボロナート化合物の使用が、FAPタンパク質を阻害するために用いられて、癌などの高増殖性障害の処置に用いられる方法が記載されている。本発明による医薬組成物または診断用組成物を提供するためのさらなる手段および方法は当業者に公知であり、例えば、国際公開第2006/010517号に記載されている、上記のものも参照該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物を、本明細書に記載の本発明の方法に従って診断された患者の処置に使用する。一つの実施形態では、関連障害、例えばアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、血栓症、心不全、狭心症、突然心臓死または心血管の病態、を処置するために使用されている抗炎症薬と併用で被験者に投与するために、本発明の化合物または医薬組成物を設計する。好ましい心血管障害としては、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、急性症候群、動脈瘤および卒中が挙げられる。好ましい実施形態において、処置および/または診断される被験者は、FAP介在/関連障害もしくは疾患、例えば本明細書に記載するような炎症性疾患および/もしくは心血管疾患、に罹患している、または該障害もしくは疾患のリスクがあるヒトである。最も好ましくは、前記被験者は、アテローム性動脈硬化症に罹患している、またはアテローム性動脈硬化症の罹患リスクのあるヒトである。例えば、前記被験者は、早期、中間型もしくは進行アテローム性動脈硬化症を有するヒト、またはアテローム性動脈硬化性プラーク破裂のリスクのあるヒトである。前記方法は、FAPの活性、発現、翻訳またはプロセッシングを阻害する薬剤、例えば、本明細書に記載するような化合物、をFAPおよび/またはFAP介在血液凝固の低減または阻害に有効な量で被験者に投与する段階を含む。好ましい実施形態において、前記方法は、投与段階の前または後に被験者におけるFAPの核酸またはタンパク質発現レベルまたは活性を評価する段階をさらに含む。例えば、被験者、例えばアテローム性動脈硬化性プラーク破裂のリスクのある患者、を前記化合物を投与する前または投与した後に評価することができる。被験者が、所定のレベルより上のFAPレベルを有する場合、治療を開始または継続することができる。本発明は、血栓塞栓性疾患、好ましくは、凝固障害、例えば血液凝固障害、恒常性または凝固障害を伴う様々な血液疾患の予防または処置にも関する。血液凝固障害の典型的な例としては、凝固障害、例えば、血友病A、血友病B、ヴィレブランド病、播種性血管内凝固DIC、重症肝疾患、およびビタミンK欠乏症、ならびに任意の他の原因が挙げられる。実施例8および図9から図11におけるトロボエラストグラフィー分析によって示すように、本発明に従って実施した実験により、FAPタンパク質が血液凝固を増進し得ることが明らかになった。詳細には、漸増インキュベーション期間、漸増濃度の組換えヒトFAPで処置したNATEMアッセイからの代表ROTEM読出しを示した。該読出しは、FAPが、ヒト血液凝固の速度を加速することを明示している。ROTEM登録商標は、回転トロンボエラストメトリーを表し、古典的トロンボエラストグラフィーの強化版である。トロンボエラストグラフィーROTEM登録商標は、血餅形成およびその後の分解のグラフ表示をもたらす、当業者には周知の技術である。加熱されたカップの中で血液がインキュベートされる。光学検波器である検出器系に接続されたピンをそのカップの中に吊るす。カップおよびピンを互いに対して4_45¢の角度に振動させる。この運動をピンから始める。カップとピンの間に線維素が形成すると、伝達された回転がピンで検出され、トレースが生成される。試料が凝固したときの弾性喪失が、軸の回転の変化をもたらす。その後、これらの得られたデータがトロンボエラストグラムで視覚化される。詳細はLuddingtonら、Clin.Lab.Haem.272005年、81-90参照該参考文献の開示内容は、参照により本明細書に援用されている。好ましい実施形態において、本発明は、潜在的組換え凝固因子またはその阻害剤をスクリーニングするための、ここでおよび実施例8において説明するようなROTEM/NATEMの使用に関する。有利には、本発明は、患者におけるFAP遮断薬の治療効果および/または効力を試験するためのROTEM/NATEMの使用に関する。ここで、本発明は、組換えタンパク質、すなわちFAP、の凝固促進活性を検査するためのROTEM/NATEM技術の使用を初めて提供する。本発明に従って、このアプローチを用いて、ヒト血液におけるFAP遮断の治療効果凝固を遅らせることおよび/またはFAP適用の治療的効果血液凝固を加速することを試験することができる。本発明のもう一つの実施形態では、この方法を用いて、FAP遮断薬の効力を試験することができ、そのような遮断薬の有効用量を決定することもできる。したがって、さらなる態様において、本発明は、組換えタンパク質またはそれらの阻害剤の凝固活性を同定および分析するための、上述のROTEM/NATEMシステムの使用に関する。既に述べたように、本発明は凝固障害の診断方法も提供する。当該システムでは血液凝固をinvivoで増進するための試薬としてのFAPが使用され得る。好ましい実施形態において、本発明は、前記使用および凝固障害の予防または処置のための、FAPを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、前記凝固障害は、血友病である。したがって、本発明に従えば、血液凝固を増進させるための試薬としてFAPをinvitroで使用することができよう。したがって、本発明は、個人の血液凝固障害の診断のための、または個人が該血液コンジュゲーション障害を獲得するリスクの判定のための、invitro法を提供する。上の開示は、本発明を一般に説明するものである。本明細書の本文全体を通して幾つかの文献を引用している。さらなる引用文献は、特許請求の範囲の直前の本明細書末尾にて見出すことができる。すべての引用参考文献本出願全体を通して引用されている参考文献、発行特許、公開特許出願、および製造業者の仕様書、指示書などを含むの内容は、参照により本明細書に特に援用されているが、さらに言えば、引用されているいずれの文献も、本発明に関する先行技術であることを認めるものではない。単に例示を目的として本明細書に提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない以下の詳細な説明および実験を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。下記の実施例は、本発明のさらなる説明となるが、いかなる点においても本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。ここで利用するものなどの従来の方法の詳細な説明は、引用文献の中で見出すことができる。TheMerckManualofDiagnosisandTherapy、第17版、BeersおよびBerkow編集MerckCo.,Inc.2003年も参照のこと。本発明の実施は、別の指示がない限り、当業者の技術常識の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来の技術を利用することとなる。分子遺伝学および遺伝子工学に関する方法は、一般に、以下の参考文献に記載されている:MolecularCloning:ALaboratoryManual、Sambrookら、1989年MolecularCloning:ALaboratoryManual、第2版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、DNACloning、第IおよびII巻Glover編集、1985年、OligonucleotideSynthesisGait編集、1984年、NucleicAcidHybridizationHamesおよびHiggins編集、1984年、TranscriptionAndTranslationHamesおよびHiggins編集、1984年、CultureOfAnimalCellsFreshneyおよびAlan、Liss,Inc.、1987年、GeneTransferVectorsforMammalianCellsMillerおよびCalos編集、CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology、第3版Ausubelら編集、およびRecombinantDNAMethodologyWu編集、AcademicPressの現行版に記載されている。GeneTransferVectorsForMammalianCellsMillerandCalos編集、1987年、ColdSpringHarborLaboratory、MethodsInEnzymology、第154および155巻Wuら編集、ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress、1986、Perbal、APracticalGuideToMolecularCloning1984年、論文、MethodsInEnzymologyAcademicPress,Inc.、N.Y.、ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyMayerおよびWalker編集、AcademicPress、London、1987年、HandbookOfExperimentalImmunology、第I-IV巻WeirおよびBlackwell編集、1986年。本開示において言及する遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、供給業者、例えばBioRad、Stratagene、Invitrogen、およびClonTech、から入手できる。細胞培養および培地回収に関する一般技術は、LargeScaleMammalianCellCultureHuら、Curr.Opin.Biotechnol.81997年、148、Serum-freeMediaKitano、Biotechnology171991年、73、LargeScaleMammalianCellCultureCurr.Opin.Biotechnol.21991、375、およびSuspensionCultureofMammalianCellsBirchら、BioprocessTechnol.191990年、251、ExtractinginformationfromcDNAarrays、Herzelら、CHAOS11、2001年、98-107に概説されている。サイトメトリーにおいて使用するための標識抗体および他の薬剤の設計および構築のための材料および技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、Baileyら2002年Biotech.Bioeng.806、670-676、CarrollおよびAl-Rubeai2004年Expt.Opin.Biol.Therapy4:1821-1829、Yoshikawaら2001年Biotech.Bioeng.74:435-442、Mengら2000年Gene242:201-207、Borthら2001年Biotechnol.Bioeng.714:266-273、Zeydaら1999年Biotechnol.Prog.15:953-957、Klucherら1997年NucleicAcidsRes.2523:4853-4860、およびBrezinskyら2003年J.Imumunol.Methods277:141-155に記載されている。実験手順アテローム性動脈硬化症性プラークの特性評価大動脈狭窄のための手術または大動脈弁置換術を受けた患者から上行大動脈プラーク生検材料を得る。大動脈プラークを切片にし、Movatペンタクローム、オイルレッドO、抗CD68およびvonKossa染色を用いて、米国心臓協会AmericanHeartAssociation:AHA基準20、21に従ってグレード分類する。急性心筋梗塞後に死亡した患者から冠動脈を得、切片作製のためにパラフィンに包埋する。組織切片中のコラーゲンに対するMasson染色により、易損性冠動脈プラークの特徴を明らかにする。線維性キャップを、内腔と壊死性コアを隔てる高コラーゲン組織として識別する2。50μm未満の最小線維性キャップ厚を有するプラークを不安定なものとして分類し、これに対して65μmより厚い線維性キャップ厚を有するプラークを安定したものとして分類する2。免疫蛍光および免疫組織化学ヒト上行大動脈からの横断切片10μm厚および冠動脈プラークのパラフィン包埋切片4μm厚をスライドガラスにマウントする。CD68、フォンヴィレブランド因子、アルファ平滑筋アクチンまたはI型コラーゲンに対して指向された購入抗体を用いてFAPおよび細胞特異的マーカーに対して組織切片を標識し、ジアミノベンジジン用のABC染色キットカリフォルニア州バーリンゲームのVectorLabsを使用して蛍光標識二次抗体または免疫染色用のビオチン標識二次抗体で視覚化。免疫蛍光パラフィン包埋冠動脈切片をA246で標識し、その後、Cy5標識二次ヤギ抗マウスIgG115-175-146、JacksonImmunoResearchで標識する。免疫蛍光の詳細な方法については、各生検検体の3隣接切片で、CD68SC-9139、カリフォルニア州サンタクルーズのSantaCruz、フォンヴィレブランド因子vWF、F3520、カリフォルニア州カールズバッドのSigma-Aldrich、アルファ-平滑筋アクチンαSMA、Ab5694、AbcamまたはI型コラーゲンAb292、Abcamに対して指向されたウサギ抗体を使用して、マクロファージ、内皮細胞および平滑筋細胞とのFPAの共局在を判定し、その後、Cy3標識抗ウサギIgG111-165-144、JacksonImmunoResearchを使用して蛍光標識を行う。DAPID9542、Sigma-Aldrichを核の蛍光対比染色に使用する。アイソタイプ対照抗体を使用して、抗原結合特異性に対処する。Tris緩衝グリセロール50mg/mLのn-プロピルガレートが補足された、pH9.5の0.1MTris-HClとグリセロールとの3:7混合物を用いて、染色試料にカバーガラスをかぶせる。免疫組織化学95°C賦活化用バッファー2mMクエン酸ナトリウム、pH7.6中での20分のインキュベーション後、冠動脈プラークのパラフィン包埋切片における抗原性賦活化処理を行う。FAPの触媒インサートに対して産生されたウサギポリクローナル抗体A246、Ab28246、マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcamおよびウサギアイソタイプ対照Ab37415、Abcamを使用して、FAPを染色する。大動脈プラークの凍結切片を氷冷アセトン中で5分間固定し、FAPに対するマウスモノクローナルF19、ニューヨーク州ニューヨークのSloan-KetteringInstituteによって提供されたものと適切なマウスアイソタイプ対照401401、カリフォルニア州サンディエゴのBioLegendを染色する。一次抗体をビオチン標識ヤギ抗マウス115-066-003、ペンシルバニア州ウエストグローヴのJacksonImmunoResearchおよびビオチン標識ヤギ抗ウサギ111-066-003、JacksonImmunoResearchで標識し、ジアミノベンジジン用のABC染色キットカリフォルニア州バーリンゲームのVectorLabsを使用して染色する。画像解析1μm/画素より上の空間分解能での省電力撮像に、蛍光カメラDFC350FX、Leicaを装着した蛍光顕微鏡DM60000B、ドイツ、WetzlarのLeicaを使用する。単一光学面で多チャネル共焦点顕微鏡TCSSP2、Leicaを使用してより高倍率で共局在分析を行う。詳細な画像解析法は、すぐ下の定量的画像解析セクションで説明する。定量的画像解析大動脈組織切片の単一チャネル蛍光画像3隣接切片の1切片につき9画像を、タグ付き画像ファイル形式taggedimagefileformat:TIFFで0~255の間のバイナリ画素強度での定常カメラ設定で撮る。群ごとに、追加の隣接組織切片をアイソタイプ対照抗体で染色して、バックグラウンド閾値を決定する。各チャネルについてのバックグラウンド強度閾値を、対照染色において画素の95が出した強度に設定する。バックグラウンド強度閾値未満の画素は、定量から除外する25。Matlabミシガン州ノヴァイのMathworksによる画像解析ソフトウェアを使用して、残りの画素を合計し、画素の総数で割って平均画素強度を算出し、および陽性画素を合計して、陽性面積を算出する26。単一平面で高分解能の共焦点顕微鏡を使用して、定量的共局在分析を行う。各組織切片に関して2つのTIFF画像を別個の蛍光チャネルから取り込み、前に説明したようにバックグラウンドシグナルを引く。細胞特異的マーカーについて陽性の画素と共局在したFAP陽性画素の合計として、共局在係数を算出する27、28。細胞ヒト大動脈内皮細胞HAECは、弁修復のための手術を受けた患者から得た肉眼病変のない上行大動脈の生検材料から単離し、ヒト大動脈平滑筋細胞は購入しHASMC、Promocell、末梢血単球、マクロファージ、および泡沫細胞は、健常発端者probandの末梢血から単離する。細胞単離、増殖および純度検証の詳細な方法については、下記を参照されたい。細胞単離、増殖および評価内皮細胞単離のために、大動脈内腔をPBSで洗浄し、2型コラゲナーゼを含有するDMEM350U/mL、ニュージャージー州レークウッドのWorthington中で30分間インキュベートし、穏やかに撹拌して血管壁から内皮を解離させる。CD34に対する磁気ビーズ分離130-046-702、ドイツGladbachのMiltenyiBiotechによって内皮細胞をさらに精製する。HAECを内皮細胞増殖培地EGM2、Gibcoで増殖させ、FACS分析によってvWF発現>98の特徴を明らかにする。貪食単球を単離するために、健常発端者から50mLの末梢静脈血をEDTA入り採血管に採集し、ハンクス緩衝塩溶液で2倍希釈し、Ficoll勾配で回転させる20分、400G、24°C。CD14についての磁気ビーズ分取130-050-201、MiltenyiBiotecによりバッフィーコートから単球を選択して、94CD64に対するFACSを超える最終純度を得る。ポリスチレン6ウエルプレートにおいて、10熱不活化、低内毒素ウシ胎児血清Gibcoと50nM組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子AF-300-03、ニュージャージー州ロッキーヒルのPeprotechとを含有するRPMI-1640Gibco中で、48時間ごとに培地を交換しながら7日にわたって単球をマクロファージに分化させる。抗CD68FACS分析を用いて、マクロファージ分化を評価する。未固定細胞中のF19、およびFACS分析のためのCy5コンジュゲート二次抗体、および適切なマウスIgGアイソタイプ対照抗体を使用して、すべての細胞タイプに関してFAPを測定する。無血清マクロファージ培地SFM、Gibco中で48時間、マクロファージを100μg/mLの酸化低密度リポタンパク質BT-910、スイスAllschwilのBioConceptで刺激することにより、泡沫細胞を産生させる。脂質取り込みをオイルレッドO染色O0624、Sigma-Aldrichによって評価する。大動脈および冠動脈検体大動脈狭窄のための手術を受けた患者から、上行大動脈プラーク生検材料を得る。弁欠損を修復するための手術を受けた患者から、プラークのない大動脈生検材料を得る。これらの試料を、4°Cに予冷した滅菌ダルベッコ変性イーグル培地DMEM、カリフォルニア州カールズバッドのGibcoに直接入れ、研究所の氷上に移し、組織ザイモグラフィーのためにOptimalCuttingTemperatureCompoundカリフォルニア州トランスのTissue-Tek中で凍結する。急性心筋梗塞後に死亡した患者から冠動脈を得、4パラホルムアルデヒド溶液中に24時間入れておく。FAP誘導アッセイ3、5、10、20、40マクロファージ調整SFMを添加した飢餓培地で48時間、静止期HASMCを処置する。FAP発現に対するTNFαの効果を判定するために、20マクロファージ調整SFMおよびTNFα中和抗体Ab6671、AbcamまたはIgGアイソタイプ対照Ab27478、Abcam抗体を添加した飢餓培地で静止期HASMCを処置する。組換えヒトTNFα300-01A、Peprotechを使用して、静止期HASMCにおいて用量および時間依存的様式でFAP発現を誘導する。下で詳述する細胞膜ELISAによって、すべてのFAPレベルを定量する。末梢血由来マクロファージを48時間、SFM6ウエルプレートにおいて2mL/ウエル中でインキュベートし、上清を滅菌濾過し、等分し、-80°Cで凍結させる。購入したヒト大動脈平滑筋細胞HASMC、PromocellをFACS分析によってαSMA純度>96について検証し、継代4で、96ウエル黒色細胞培養試験プレートに、10ウシ胎児血清3302-P250302、ドイツAidenbachのPANBiotechを添加したDMEM10938、Gibco中5×104細胞/cm2の密度でプレーティングし、24時間放置して付着させた後、1ウシ血清アルブミンを添加したAdvancedDMEM12491-015、カリフォルニア州カールズバッドのInvitrogen飢餓培地中で一晩、静止状態にする。3、5、10、20、40マクロファージ調整SFMを添加した飢餓培地で48時間、静止期HASMCを処置する。FAP発現に対するTNFαの効果を判定するために、20マクロファージ調整SFMおよびTNFα中和抗体Ab6671、AbcamまたはIgGアイソタイプ対照Ab27478、Abcam抗体を添加した飢餓培地で静止期HASMCを処置する。組換えヒトTNFα300-01A、Peprotechを使用して、静止期HASMCにおいて用量および時間依存的様式でFAP発現を誘導する。定量のために、細胞をPBSで洗浄し、4ホルマリン中で30分間固定し、FAPに対してF19で標識する。ホースラディッシュペルオキシダーゼELISAキットカリフォルニア州フリーモントのAnaspecを使用して培養物を酵素標識し、酵素反応生成物を蛍光プレートリーダーで定量する。バックグラウンド値を引き、すべての値を未処置/未調整対照群に正規化する。ザイモグラフィー直接急冷ブタゼラチンDQゼラチン、D12054、Invitrogenを、黒色96ウエルプレートにおいて、反応バッファーpH7.6の、0.5MTris-HCl、1.5MNaCl、50mMCaCl2、および2mMアジ化ナトリウムおよび0、10、20、40nMの組換えヒトFAP中、100μg/mLの最終濃度に希釈する。切断されたゼラチンを0.5、8および24時間の時点で定量し、バックグラウンド蛍光を引いた。FAPの触媒インサートに対して産生されたA246およびそれに対応するアイソタイプ対照IgGAb27478、Abcamを反応バッファー中の20mMFAPおよび100μg/mLDQゼラチンに添加し、24時間後に分析して遮断効力を判定する。A246は、FAP特異的ペプチドに対して産生され、免疫原アフィニティー精製されたウサギポリクローナルであり、線維芽細胞活性化タンパク質を特異的に認識するが、他のジペプチジルペプチダーゼファミリーメンバーを認識しないAbcam、Ab28246。継代4でのコンフルエントなHASMCをA246または抗体対照で30分間処置し、PBSで洗浄し、その後、反応溶液中の100μg/mLDQゼラチン100μLのもとに4時間置いた後、プレートリーダーで蛍光分析した。insituザイモグラフィーは、ヒト大動脈アテローム性動脈硬化性プラークの5μm凍結切片を用いて行い、該凍結切片を、非阻害性F19およびCy5標識二次抗体を使用してFAPに対して染色し、その後、50nM濃度のA246またはアイソタイプ対照で一晩処置する17。その後、処置済みおよび未処置の切片を、ウシ皮膚からの10直接急冷I型コラーゲンD12060、Invitrogenを含有する温かいPBS中1アガロースでマウントし、2時間後、37°Cで共焦点顕微鏡によって撮像する。定量のために、バックグラウンドシグナルをアイソタイプ対照画像から引き、両方のFAP切断I型コラーゲンについて陽性である画素を、1生検材料につき3隣接切片からの9画像の平均として定量する。直接急冷ブタゼラチンを黒色96ウエルプレート内の漸増濃度の組換えヒトFAPに添加する。FAP特異的ペプチドに対して産生されたウサギポリクローナルであって、免疫原アフィニティー精製され、FAPを特異的に認識するが、他のジペプチジルペプチダーゼファミリーメンバーを認識しないものであるA246Abcam、Ab28246で、FAP阻害を行う。切断されたゼラチンを0.5、8および24時間の時点で蛍光プレートリーダーによって定量し、バックグラウンド蛍光を引く。insituザイモグラフィーは、ヒト大動脈アテローム性動脈硬化性プラークの凍結切片5μmを用いて行い、該凍結切片を、非阻害性F19およびCy5標識二次抗体を使用してFAPに対して染色し、その後、50nM濃度のA246またはアイソタイプ対照で一晩処置する。その後、処置済みおよび未処置の切片を、ウシ皮膚からの10直接急冷I型コラーゲンD12060、Invitrogenを含有する温かいPBS中1アガロースでマウントし、2時間後、37°Cで共焦点顕微鏡によって撮像し、前に説明したように定量する。統計解析一元配置ANOVAを用いて組織学的結果および細胞培養結果を比較し、関連性をピアソン相関係数によって算出する。スチューデントt検定をザイモグラフィーの比較に用いる。MatLabバージョン、R2007bを用いて、すべての統計解析を行う。データを平均±SDとして提示する。有意性は、p<0.05のレベルで許容される。実施例1:FAPは進行したヒト大動脈プラークでは平滑筋細胞により発現されるがマクロファージによっては発現されない隣接凍結切片におけるFAPについての免疫蛍光染色は、AHAグレード分類基準によって特性評価したとき、プラークのない大動脈に対して線維性アテロームでのほうが増進された発現を示す図1A。FAPについての陽性染色は、健常上行大動脈には実質的にみとめられないが、タイプII-IIIおよびタイプIV-Vプラークでは段階的増加が観察される図1B。定量的画像解析は、FAPが、進行した大動脈プラークではプラークのない大動脈または早期プラークと比較して有意に増加することを示した図1C。ヒトアテローム性動脈硬化性プラークにおけるFAP発現細胞タイプの特徴を明らかにするために、マクロファージCD68陽性細胞として同定、平滑筋細胞αSMA陽性細胞および内皮細胞vWF陽性細胞においてFAPの免疫蛍光共染色を行う図2A。共焦点画像解析は、平滑筋細胞によるFAP発現を明らかにするが、マクロファージまたは内皮細胞によるFAP発現は示さない図2B。血管細胞によるinvitroでのFAP発現を検証するために、HASMCαSMA陽性細胞、HAECvWF陽性細胞、末梢血由来単球CD64陽性、マクロファージCD68陽性および泡沫細胞オイルレッドO陽性マクロファージにおいてFAPのFACS分析を行う。FACS分析は、HASMCにおける高度の構成的FAP発現、HAECにおけるわずかな発現を明らかにするが、末梢血由来単球、マクロファージまたは泡沫細胞による発現は示さない図3。実施例2:FAP発現はヒト冠動脈アテロームの安定した厚い線維性キャップに対して不安定な薄い線維性キャップでのほうが増進される臨床的に意義のあるアテローム性動脈硬化症病変におけるプラークの易損度とFAPの関連性を判定するために、急性心筋梗塞後に死亡した患者から得た破裂しやすいヒト冠動脈のMasson法青色でコラーゲンを染色を行う。線維性キャップ厚に基づき、これらの検体を不安定な薄いキャップ<50μmまたは安定した厚いキャップ>65μmの線維性アテロームとして特性評価する。隣接切片における免疫組織学的および免疫蛍光染色は、安定した厚い線維性キャップに対して不安定な薄い線維性キャップでのほうが増進されたFAP発現を示すことを明らかにした図4A。共焦点画像解析は、ヒト冠動脈線維性アテロームの安定した厚い線維性キャップに対して不安定な薄い線維性キャップでのほうがFAP発現の有意な増加を示すことを明らかにした図4B。実施例3:FAP発現はヒト大動脈アテローム性動脈硬化症性プラークにおけるマクロファージ負荷量と関連する免疫蛍光染色は、代表大動脈脂肪線条においてマクロファージに隣接した内側の細胞でのFAP発現を明らかにする図5A。FAPと炎症との関係の特徴を明らかにするために、ヒト大動脈プラークにおけるFAPとマクロファージ免疫蛍光シグナル強度図5Bを比較する。多数のプラーク進行段階でマクロファージ負荷量とFAP発現との間に正の相関関係を認めるR2=0.763、n=12、図5C。実施例4:マクロファージ由来TNFαは培養ヒト大動脈平滑筋細胞においてFAP発現を誘導するマクロファージとFAP発現HASMCの間のシグナル伝達機序を解明するために、HASMCをマクロファージ調整培地に48時間曝露して、プラーク炎症に適用可能な条件をシミュレートする。培養HASMCは、マクロファージ調整培地に応じてFAPの有意な用量依存的増加を示し、最大効果は48時間後に20培地濃度で観察される図6A。この効果は、マクロファージ調整培地をTNFα中和抗体で処置すると消える図6B。TNFαによるパラクリン誘導FAP発現を確認するために、組換えヒトTNFαを使用して、HASMCにおけるFAPを用量および時間依存的様式で誘導する。最大応答は、30ng/mLで48時間後に確認される図6Cおよび6D。実施例5:大動脈線維性キャップにおけるゼラチン分解活性はFAP中和抗体によって阻害される免疫蛍光分析は、大動脈線維性キャップの低I型コラーゲン領域におけるFAP発現増進を明らかにした図7A。組換えヒトFAPは、用量および時間依存的にゼラチンを分解する図7B。FAPの触媒性部位に対して指向された抗体であるA246は、組換えヒトFAPと活性化HASMCの両方のゼラチン分解活性を低減させる図7Cおよび7D。IgG対照抗体で処置した大動脈線維性キャップは、FAPと切断I型コラーゲンとの共局在を示すが、Ab246処置プラークは、I型コラゲナーゼ活性とのFAPの有意に低減された共局在をはっきりと示す図7E。共焦点画像解析は、A246処置線維性キャップが、FAP発現部位において切断I型コラーゲンの減少を示すことを明らかにする図7F。実施例6:FAP発現はApoE-/-マウスの大動脈アテローム性動脈硬化性プラークにおいて増進される8週齢で開始して12週間、高コレステロール食総コレステロール1.25、ResearchDietsからのRD12108を給餌した雄アテローム性動脈硬化症アポリポタンパク質EノックアウトApoE-/-マウスC57BL/6Jバックグラウンドn=5の大動脈根におけるプラークを分析する。同じ期間、正常な食餌を用いた野生型WT雄C57BL/6Jマウスn=4を健常対照として使用する。イソフルランによって安楽死させたマウスの大動脈根を正常食塩水ですすぎ、切除し、直ちにOCTに包埋し、切片作製のために凍結する。ApoE-/-ノックアウトマウスのアテローム性動脈硬化性プラークにおいて確認されたFAPの存在により、FAP中和抗体の静脈内注射によるin-vivoFAP阻害研究のためのこのモデルの使用の正当性が立証される図12。実施例7:ヒト末梢血中の可溶性FAPを定量するためのサンドイッチELISAを確立したU型透明96ウエルマイクロタイタープレート抗FAP抗体を被覆してFAPタンパク質を検出することができるプレートを使用して、標準的なプロトコルを用いて、サンドイッチELISAを行うことができる。3から300ng/mLの濃度の100μLの組換えFAPタンパク質rhuFAP溶液をウエルに添加して、1時間、25°Cでインキュベートする。試料のインキュベーション後、ウエルを2回洗浄し、1ウエルにつき100μLの第一の検出抗体mAbFAPを添加し、プレートをインキュベートする1時間、25°C。3回の洗浄段階の後、100μLの第二の蛍光検出抗体1:3000希釈したものを添加し、インキュベートする25°Cで1時間。インキュベーション後、ウエルを3回洗浄する。すべての試料を三重反復で試験し、結果を標準曲線に対して比較する。3~300ngの精製ヒトFAPを使用して、アッセイ感度レベルおよび範囲を判定した図8。天然バックグラウンドをシミュレートするために、1μgの大腸菌E.coli全細胞抽出物を各試料に添加してもよい。この数は、ブランクシグナル標準偏差の3倍のバックグラウンドシグナル平均より上であるシグナルに相当する。FAP量と蛍光シグナルの間で観察される依存性を、現実の試料に関するFAP濃度の推定に用いることができる。結果を図8に示す。実施例8:FAPはヒト血液凝固速度を加速するROTEM/NATEMROTEM登録商標、ドイツMunichのPentapharmCO技術を、製造業者の指示書に従って用いる。末梢血試料を健常発端者からクエン酸塩のチューブに採取し、組換えヒトFAPrhuFAP0、0.875μg/mL、1.750μg/mLおよび3.5μg/mLで0から5時間までの間、調整する。対照血液試料は、組換えFAPなしでインキュベートする。NATEMアッセイからの代表ROTEM読出しは、FAPがヒト血液凝固速度を加速することを明らかにした図9。加えて、組換えヒトFAPで処置した健常患者血液試料では、凝固時間、血餅形成時間、アルファ角および血餅硬度が増加される。20ng/mL未満の内因性血漿FAPレベルを呈示する6名の健常発端者から血液を採取し、0.175μg/mL、1.75μg/mLおよび3.5μg/mLの用量の組換えヒトFAPで調整し、0、2.5時間および5時間、インキュベートする。それによって、FAPが凝固時間および血餅形成時間を加速し、アルファ角および最大血餅硬度を増すことが、観察される図10。これらの結果を、NATEM技術を利用することにより、さらに確認する。上で説明したように試料を処置する。そのようにして、5時間のインキュベーションで1.75ug/mLのFAPで調整したとき、ビークル処置対照と比較して、絶対凝固時間および血餅形成時間は、5/6の発端者において減少し、アルファ角は、5/6の患者において増加し、および最大血餅厚は、4/6の発端者において増加したことが判明した図11。実施例9:FAPは易損性の薄いキャップの冠動脈線維性アテロームの内皮において発現されるヒトパラフィン包埋冠動脈プラークおよび内胸動脈からの横断切片4μm厚をスライドガラスにマウントする。95°C賦活化用バッファー2mMクエン酸ナトリウム、pH7.6中での20分のインキュベーション後、パラフィン包埋切片における抗原性賦活化処理を行った。FAPの触媒インサートに対して産生されたウサギポリクローナル抗体A246、Ab28246、マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcamおよびウサギアイソタイプ対照Ab37415、Abcamを使用して、FAPを染色した。マウスモノクローナル抗体303108、BioLegendおよびそれに対応するアイソタイプ対照400123、BioLegendを使用してCD31を染色した。一次抗体をビオチン標識ヤギ抗マウス115-066-003、ペンシルバニア州ウエストグローヴのJacksonImmunoResearchおよびビオチン標識ヤギ抗ウサギ111-066-003、JacksonImmunoResearchで検出し、ABC染色キットカリフォルニア州バーリンゲームのVectorLabsを使用して染色した。ヒト冠動脈線維性キャップの内皮におけるFAP発現を判定するために、本発明者らは、心筋梗塞後に死亡した患者から得た破壊しやすいヒト冠動脈、および対照としての健常内胸動脈において、HE染色を行った。免疫組織学的染色は、線維性アテローム内皮におけるFAP発現を明らかにした図13。実施例10:FAP発現は末梢血と比較してヒト冠血栓でのほうが増進されるヒトパラフィン包埋血栓および末梢血切片からの横断切片4μm厚をスライドガラスにマウントした。95°C賦活化用バッファー2mMクエン酸ナトリウム、pH7.6中での20分のインキュベーション後、冠血栓および末梢血のパラフィン包埋切片における抗原性賦活化処理を行った。FAPの触媒インサートに対して産生されたウサギポリクローナル抗体A246、Ab28246、マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcamおよびウサギアイソタイプ対照抗体Ab37415、Abcamを使用してFAPを染色した。一次抗体をビオチン標識ヤギ抗ウサギ111-066-003、JacksonImmunoResearch抗体で検出し、ABC染色キットカリフォルニア州バーリンゲームのVectorLabsを使用して染色した。隣接パラフィン包埋切片におけるFAPについての免疫組織化学的染色は、末梢血に対してヒト冠血栓でのほうが増進されたFAP発現を明示する図14。実施例11:FAPはヒト冠血栓における顆粒球によって発現される心筋梗塞に罹患している患者の冠動脈から血栓を吸引した。クエン酸塩が添加されたチューブに各患者から5mLの末梢血を血栓吸引前1分未満に採取した。50μLのActilyseを含有する1mLのAcutaseに末梢血1mLおよび冠血栓材料を入れ、37°Cで1時間、穏やかに振盪した。注射器からの軟質ゴムを使用するセルストレーナー孔径40μmによる取捨により、細胞凝集物をさらに解離させた。次いで、両方の試料を400Gで5分間回転させ、上清を除去した。次いで、1μg/mLのFc受容体用ブロッキング剤を含有するFACSバッファー1FCSおよび5mMEDTAを含有するPBSに細胞ペレットを再浮遊させ、30分間4°Cでインキュベートした。その後、FAPに対する蛍光タグ付き抗体クローンF19、顆粒球に対する蛍光タグ付き抗体CD66b、BioLegend555724、単球に対する蛍光タグ付き抗体CD45、BioLegend345809およびTリンパ球に対する蛍光タグ付き抗体CD3、BioLegend555332で細胞を標識した。フローサイトメトリーを用いて、単球、T細胞および顆粒球を含む血栓白血球細胞集団に対するヒト末梢血でのFAP発現を定量する。定量分析は、血栓顆粒球においてFAP発現増進を明らかにした。他の分析した細胞集団ではFAPの発現増進を認めなかった図15A~F。実施例12:顆粒球におけるFAP発現はSTEMI患者の血栓において増進されるが、PAOD患者の血栓では増進されない末梢動脈閉塞性疾患に罹患している患者の大腿動脈から血栓を吸引した。クエン酸塩が添加されたチューブに各患者から5mLの末梢血を血栓吸引の数秒前に採取した。血栓および血液検体をリン酸緩衝食塩水に入れ、処理のために研究所に移した。上の実施例11で与えた説明に従って、POAD血栓検体を調製した。顆粒球特異的FAP発現が、急性アテローム血栓症に関連するかどうかを評価するために、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、STセグメント上昇型心筋梗塞STEMI冠動脈血栓および末梢動脈閉塞性疾患PAOD大腿動脈血栓に罹患している患者からの末梢血および閉塞性血栓におけるFAP発現を定量した。急性形成された冠血栓は、慢性末梢動脈由来血栓と比較して増加されたFAP発現を示した図16。実施例13:血漿FAPレベルは急性冠症候群ACSを有する患者において上昇される冠動脈疾患CAD、安定狭心症、不安定狭心症およびSTEMIを有さない患者から5mLの血液をクエン酸塩のチューブに採取した。血液を10分間、400Gで回転させ、血漿層を抽出し、後の分析まで-80Cで凍結させた。可溶性FAPについてのサンドイッチELISAを次のように行った。FAPの触媒インサートに対して産生されたウサギポリクローナル抗体A246、Ab28246、マサチューセッツ州ケンブリッジのAbcamを捕捉抗体として使用し、mAbFAPを検出抗体として使用した。3から5000ng/mL濃度のヒト組換えFAPタンパク質rhuFAP溶液をウエルに添加して、標準曲線を確立する。捕捉抗体で被覆した後、プレートを血漿試料および標準物質とともに1時間、25°Cでインキュベートした。試料のインキュベーション後、ウエルを1ウエルにつき100μLのPBSで2回洗浄した。検出抗体mAbFAPを添加し、プレートをインキュベートした1時間、25°C。3回の洗浄段階の後、100μLの第二のHRP標識検出抗体を添加し、インキュベートした25°Cで1時間。インキュベーション後、ウエルを3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して検出用シグナルを生じさせた。結果として生じたシグナルを、プレートリーダーを使用して読み取って、血漿試料中のFAP濃度を判定した。ELISA分析は、CADを有さない患者と比較してACSを有する患者でのほうが上昇したFAP血漿レベルをあきらかにした図17。結論アテローム性動脈硬化性プラークの線維性キャップは、内腔と血栓形成性壊死性コアの離隔に欠くことができない。線維性キャップの機械的強度はコラーゲンによってもたらされるので、コラーゲンを分解するMMPおよびシステインプロテアーゼは、プラーク不安定性および急性血栓イベントの発生と関連づけられる29-33。本研究は、構成的活性セリンプロテアーゼFAPとプラーク進行および易損性を結びつけ、1FAP発現が、ヒト大動脈アテロームと破裂しやすい冠動脈の線維性キャップにおいて増進されること、2FAPが、HASMCにおいて発現され、炎症性マクロファージ負荷量と相関すること、3FAPが、HASMCにおいてパラクリンシグナル伝達によりマクロファージ由来TNFαによって誘導されること、4FAPがヒトアテロームの線維性キャップのコラーゲンを切断すること、および5FAP介在コラゲナーゼ活性が、ヒト線維性キャップにおいてFAP遮断抗体により阻害されることを証明する。非常に多くの研究が、マトリックス分解性コラゲナーゼ、例えばMMP1、2および9、ならびにシステインプロテアーゼ、例えばカテプシンSおよびK、を血管再構築およびプラーク破裂に関係づけている13、30、34。ここに提示する知見は、FAPが、ヒトアテローム性動脈硬化症におけるコラーゲン分解に関与する、初めて判明した平滑筋細胞由来セリンプロテアーゼである証拠を提供する。FAP発現は、急性心筋梗塞後に死亡する患者から単離される破裂しやすいヒト冠動脈の線維性キャップにおいて特に増進される。FAPの有害なコラーゲン分解活性は、線維性キャップにおけるFAP介在コラーゲン分解、および低コラーゲン線維性キャップ組織におけるその共局在によって証明される。これらの知見は、破裂しやすいプラークおよび急性冠症候群ACSを有する患者に適用することができるものであり、潜在的臨床的意義は高い。炎症は、アテローム性動脈硬化性プラークにおいてコラゲナーゼを誘導することが証明されている、プラーク易損性のもう一つの重要な特徴である4、35、36。このパラダイムと一致して、本発明者らは、HASMCにおけるFAP発現が、中間型および進行したヒトアテローム性動脈硬化性プラークにおいてマクロファージ負荷量と関連することを証明する。FAPは、マクロファージによって発現されない。しかし、マクロファージ由来TNFαは、培養平滑筋細胞においてFAP発現の用量および時間依存的増加を誘導した。これらの結果は、FAPが、パラクリン媒介炎症経路により平滑筋細胞において誘導されることを示し、それによって、アテローム性動脈硬化症における炎症誘導コラゲナーゼ発現の概念を裏付ける証拠増加に寄与する6、11、29、37。このような知見は、TNFα経路などの重要な抗炎症性機序に対するアテローム保護的介入を調査するためのさらなる研究の動機になり得るだろう。平滑筋細胞におけるその発現に加えて、構成的FAP発現をヒト大動脈内皮細胞においてもinvitroで検出することができる。内皮細胞活性化は、アテローム形成における重要な段階である38。活性化された内皮細胞は、それ自体が線維性キャップ分解性コラゲナーゼを発現し、線維性キャップ分解性平滑筋細胞と協同的に作用することも証明されている5、32、39。観察された内皮細胞のFAP発現能力は、内皮細胞と平滑筋細胞の両方による線維性キャップの協調リモデリングに関する概念を裏付ける。さらに、プラークへの血液由来炎症性細胞の動員の促進により、活性化内皮細胞もまたマクロファージ由来サイトカイン放出を増進し、平滑筋細胞を活性化し、そしてFAPを誘導し得る。したがって、活性化平滑筋細胞および内皮細胞は、プラーク不安定性を促進する点で共犯者として作用し得る。アテローム形成性プロテアーゼは、易損性アテローム性動脈硬化性プラークのinvivo分子イメージングに活用することができる酵素的挙動を呈示する40。実際、最近の光イメージング研究は、カテプシンK酵素的切断後に増幅シグナルを出し、それによってinvivoイメージングについてのシグナル対ノイズ比を局所的に増加させる、プロテアーゼ特異的蛍光色素標識ペプチドを利用している8、9、41。プロテアーゼは、ヒト冠動脈プラーク易損性と関連づけられているので、FAPは、さらなるinvivo分子イメージング研究の標的としてのこの可能性を共有するだろう。FAP介在ゼラチナーゼ活性をinvitroで検出できるが、FAPに基づく分子イメージングの実現可能性を判定するためにはさらなる研究が必要である。破裂しやすい冠動脈プラークおよび内皮細胞におけるFAPの発現は、ACSを有する患者へのさらなる調査の拡大の動機となる。本発明の研究は、FAP介在分解が、炎症性シグナル伝達によって誘導されることおよび遮断抗体によって中和され得ることを実証するものであり、それによって、アテローム性動脈硬化症および他のFAP関連炎症性疾患、例えば関節リウマチおよび腫瘍形成、におけるさらなるFAPターゲッティングのフィージビリティースタディーの実施を促すものである。参考文献1FarbABurkeAPTangALLiangYMannanPSmialekJVirmaniRCoronaryplaqueerosionwithoutruptureintoalipidcoreAfrequentcauseofcoronarythrombosisinsuddencoronarydeathCirculation199693135413632VirmaniRBurkeAPFarbAKolodgieFDPathologyofthevulnerableplaqueJournaloftheAmericanCollegeofCardiology200647C13C183vanderWalABeckerAvanderLoosCDasPSiteofintimalruptureorerosionofthrombosedcoronaryatheroscleroticplaquesischaracterizedbyaninflammatoryprocessirrespectiveofthedominantplaquemorphologyCirculation19948936444ShahPFalkEBadimonJFernandezOrtizAMailhacAVillarealLevyGFallonJRegnstromJFusterVHumanmonocytederivedmacrophagesinducecollagenbreakdowninfibrouscapsofatheroscleroticplaquesPotentialroleofmatrixdegradingmetalloproteinasesandimplicationsforplaqueruptureCirculation199592156515695RajavashisthTBXuXPJovingeSMeiselSXuXOChaiNNFishbeinMCKaulSCercekBSharifiBShahPKMembranetype1matrixmetalloproteinaseexpressioninhumanatheroscleroticplaquesCirculation199999310331096CrisbyMNordinFredrikssonGShahPKYanoJZhuJNilssonJPravastatintreatmentincreasescollagencontentanddecreaseslipidcontentinflammationmetalloproteinasesandcelldeathinhumancarotidplaquesImplicationsforplaquestabilizationCirculation20011039269337HermanMPSukhovaGKLibbyPGerdesNTangNHortonDBKilbrideMBreitbartREChunMSchonbeckUExpressionofneutrophilcollagenaseinhumanatheromaAnovelcollagenolyticpathwaysuggestedbytranscriptionalprofilingCirculation2001104189919048AikawaENahrendorfMFigueiredoJLSwirskiFKShtatlandTKohlerRHJafferFAAikawaMWeisslederROsteogenesisassociateswithinflammationinearlystageatherosclerosisevaluatedbymolecularimaginginvivoCirculation2007116284128509JafferFAKimDEQuintiLTungCHAikawaEPandeANKohlerRHShiGPLibbyPWeisslederROpticalvisualizationofcathepsinkactivityinatherosclerosiswithanovelproteaseactivatablefluorescencesensorCirculation20071152292229810SchafersMRiemannBKopkaKBreyholzHJWagnerSSchafersKPLawMPSchoberOLevkauBScintigraphicimagingofmatrixmetalloproteinaseactivityinthearterialwallinvivoCirculation20041092554255911DeguchiJoAikawaMTungCHAikawaEKimDENtziachristosVWeisslederRLibbyPInflammationinatherosclerosisVisualizingmatrixmetalloproteinaseactioninmacrophagesinvivoCirculation2006114556212HermanMPSukhovaGKKisielWFosterDKehryMRLibbyPSchonbeckUTissuefactorpathwayinhibitor2isanovelinhibitorofmatrixmetalloproteinaseswithimplicationsforatherosclerosisTheJournalofClinicalInvestigation20011071117112613SukhovaGKShiGPSimonDIChapmanHALibbyPExpressionoftheelastolyticcathepsinssandkinhumanatheromaandregulationoftheirproductioninsmoothmusclecellsTheJournalofClinicalInvestigation199810257658314KongYZYuXTangJJOuyangXHuangXRFingerleRowsonGBacherMScherLABucalaRLanHYMacrophagemigrationinhibitoryfactorinducesmmp9expressionImplicationsfordestabilizationofhumanatheroscleroticplaquesAtherosclerosis200517820721515BauerSJendroMWadleAKleberSStennerFDinserRReichAFaccinEGoddeSDingesHMullerLadnerURennerCFibroblastactivationproteinisexpressedbyrheumatoidmyofibroblastlikesynoviocytesArthritisResearchTherapy20068R17116EdosadaCYQuanCWiesmannCTranTSutherlinDReynoldsMElliottJMRaabHFairbrotherWWolfBBSelectiveinhibitionoffibroblastactivationproteinproteasebasedondipeptidesubstratespecificityJBiolChem20062817437744417ParkJELenterMCZimmermannRNGarinChesaPOldLJRettigWJFibroblastactivationproteinadualspecificityserineproteaseexpressedinreactivehumantumorstromalfibroblastsJournalofBiologicalChemistry1999274365053651218LevyMTMcCaughanGWAbbottCAParkJECunninghamAMMullerERettigWJGorrellMDFibroblastactivationproteinAcellsurfacedipeptidylpeptidaseandgelatinaseexpressedbystellatecellsatthetissueremodellinginterfaceinhumancirrhosisHepatology1999291768177819AertgeertsKLevinIShiLSnellGPJenningsAPrasadGSZhangYKrausMLSalakianSSridharVWijnandsRTennantMGStructuralandkineticanalysisofthesubstratespecificityofhumanfibroblastactivationproteinαJournalofBiologicalChemistry2005280194411944420StaryHCChandlerABDinsmoreREFusterVGlagovSInsullWJrRosenfeldMESchwartzCJWagnerWDWisslerRWAdefinitionofadvancedtypesofatheroscleroticlesionsandahistologicalclassificationofatherosclerosisAreportfromthecommitteeonvascularlesionsofthecouncilonarteriosclerosisamericanheartassociationCirculation1995921355137421StaryHCChandlerABDinsmoreREFusterVGlagovSInsullWJrRosenfeldMESchwartzCJWagnerWDWisslerRWAdefinitionofadvancedtypesofatheroscleroticlesionsandahistologicalclassificationofatherosclerosisAreportfromthecommitteeonvascularlesionsofthecouncilonarteriosclerosisamericanheartassociationArteriosclerThrombVascBiol1995151512153122RettigWJPilarGCBeresfordHROettgenHFMelamedMROldLJCellsurfaceglycoproteinsofhumansarcomasDifferentialexpressioninnormalandmalignanttissuesandculturedcellsProcNatlAcadSciUSA1988853110311423DippoldWGLloydKOLiLucyTCIkedaHOettgenHFCellsurfaceantigensofhumanmalignantmelanomaDefinitionofsixantigenicsystemswithmousemonoclonalantibodiesProcNatiAcadSciUSA1980776114611824SmithPDMcLeanKJMurphyMAWilsonYMurphyMTurnleyAMCookMJAbrightnessareaproductbasedprotocolforthequantitativeassessmentofantigenabundanceinfluorescentimmunohistochemistryBrainResearchProtocols200515212925LandmannLMarbetPColocalizationanalysisyieldssuperiorresultsafterimagerestorationMicroscopyResearchandTechnique20046410311226MosedaleDMetcalfeJGraingerDOptimizationofimmunofluorescencemethodsbyquantitativeimageanalysisJHistochemCytochem1996441043105027ZinchukVZinchukOOkadaTQuantitativecolocalizationanalysisofmulticolorconfocalimmunofluorescencemicroscopyimagesPushingpixelstoexplorebiologicalphenomenaActaHistochemCytochem20074010111128AgnatiLFFuxeKTorvinenMGenedaniSFrancoRWatsonSNussdorferGGLeoGGuidolinDNewmethodstoevaluatecolocalizationoffluorophoresinimmunocytochemicalpreparationsasexemplifiedbyastudyona2aandd2receptorsinchinesehamsterovarycellsJHistochemCytochem20055394195329HanssonGKInflammationatherosclerosisandcoronaryarterydiseaseNEnglJMed20053521685169530GalisZSKhatriJJMatrixmetalloproteinasesinvascularremodelingandatherogenesisThegoodthebadandtheuglyCircRes20029025126231NewbyACDualroleofmatrixmetalloproteinasesinintimalthickeningandatheroscleroticplaquerupturePhysiolRev20058513132SluijterJPGPulskensWPCSchoneveldAHVelemaEStrijderCFMollFdeVriesJPVerheijenJHanemaaijerRdeKleijnDPVPasterkampGMatrixmetalloproteinase2isassociatedwithstableandmatrixmetalloproteinases8and9withvulnerablecarotidatheroscleroticlesionsAstudyinhumanendarterectomyspecimenpointingtoarolefordifferentextracellularmatrixmetalloproteinaseinducerglycosylationformsStroke20063723523933SukhovaGKSchonbeckURabkinESchoenFJPooleARBillinghurstRCLibbyPEvidenceforincreasedcollagenolysisbyinterstitialcollagenases1and3invulnerablehumanatheromatousplaquesCirculation1999992503250934LutgensSPMCleutjensKBJMDaemenMJAPHeenemanSCathepsincysteineproteasesincardiovasculardiseaseFASEBJ2007213029304135BrownDLHibbsMSKearneyMLoushinCIsnerJMIdentificationof92kdgelatinaseinhumancoronaryatheroscleroticlesionsAssociationofactiveenzymesynthesiswithunstableanginaCirculation1995912125213136AikawaMRabkinESugiyamaSVoglicSJFukumotoYFurukawaYShiomiMSchoenFJLibbyPAnhmgcoareductaseinhibitorcerivastatinsuppressesgrowthofmacrophagesexpressingmatrixmetalloproteinasesandtissuefactorinvivoandinvitroCirculation200110327628337SpagnoliLGBonannoEMaurielloAPalmieriGPartenziASangiorgiGCreaFMulticentricinflammationinepicardialcoronaryarteriesofpatientsdyingofacutemyocardialinfarctionJAmCollCardiol2002401579158838SzmitkoPEWangCHWeiselRDdeAlmeidaJRAndersonTJVermaSNewmarkersofinflammationandendothelialcellactivationPartiCirculation20031081917192339SkinnerMPRainesEWRossRDynamicexpressionofalpha1beta1andalpha2beta1integrinreceptorsbyhumanvascularsmoothmusclecellsAlpha2beta1integrinisrequiredforchemotaxisacrosstypeicollagencoatedmembranesTheAmericanJournalofPathology19941070108140MatterCMStuberMNahrendorfMImagingoftheunstableplaqueHowfarhavewegotEurHeartJ2009302566257441AikawaEAikawaMLibbyPFigueiredoJLRusanescuGIwamotoYFukudaDKohlerRHShiGPJafferFAWeisslederRArterialandaorticvalvecalcificationabolishedbyelastolyticcathepsinsdeficiencyinchronicrenaldiseaseCirculation200911917851794"