"tim-3IgVドメインおよびtim-3細胞内ドメインを含む単離ポリペプチドであって、該ポリペプチドが、tim-3ムチンドメインまたはtim-3膜貫通ドメインを含まない、単離ポリペプチド。前記ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。前記ポリペプチドが、マウスポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。前記tim-3IgVドメインが、配列番号13のアミノ酸22~131を含む、請求項1に記載のポリペプチド。前記tim-3IgVドメインが、配列番号14のアミノ酸22~132を含む、請求項1に記載のポリペプチド。前記tim-3細胞内ドメインが、配列番号13のアミノ酸226~301を含む、請求項1に記載のポリペプチド。前記tim-3細胞内ドメインが、配列番号14のアミノ酸217~281を含む、請求項1に記載のポリペプチド。配列番号2に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。配列番号6に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。配列番号4に示されるアミノ鎖配列を含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。前記ポリペプチドが、配列番号8に示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。免疫グロブリンのFcドメインをさらに含む、請求項1に記載の単離ポリペプチド。請求項1に記載の単離ポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。請求項1に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸。配列番号1に示される核酸配列を含む、請求項14に記載の単離核酸。配列番号3に示される核酸配列を含む、請求項14に記載の単離核酸。高ストリンジェンシー条件下で可溶性tim-3をコードする核酸にハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長tim-3をコードする核酸にはハイブリダイズしない、単離核酸。前記可溶性tim-3をコードする核酸が、配列番号1に示される核酸配列を含む、請求項17に記載の単離核酸。配列番号5に示される核酸配列を含む、請求項18に記載の単離核酸。前記全長tim-3をコードする核酸が、配列番号11に示される核酸配列を含む、請求項17に記載の単離核酸。配列番号15に示される核酸配列を含む、請求項18に記載の単離核酸。前記可溶性tim-3をコードする核酸が、配列番号3に示される核酸配列を含む、請求項17に記載の単離核酸。配列番号7に示される核酸配列を含む、請求項22に記載の単離核酸。前記全長tim-3をコードする核酸が、配列番号12に示される核酸配列を含む、請求項17に記載の単離核酸。請求項17に記載の単離核酸によってコードされる単離ポリペプチド。itim-3のIgVドメインを含むポリペプチド、およびii増殖性状態の処置またはTh2媒介状態の処置のための被験体への組成物の投与についての説明書を包含する、薬学的パッケージ。前記増殖性状態が、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、ホジキンリンパ腫、消化管癌、または胃癌である、請求項26に記載の薬学的パッケージ。iガレクチン-9ポリペプチドを含むポリペプチド、およびii自己免疫障害を処置するために、被験体へ組成物を投与するための説明書を備える、薬学的パッケージ。配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号13に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには結合しない、単離抗体またはそのフラグメント。前記抗体が、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項29に記載の抗体。前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項29に記載の抗体。請求項31に記載のモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞株。配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号14に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドには結合しない、単離抗体またはそのフラグメント。前記抗体が、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項33に記載の抗体。前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項33に記載の抗体。請求項35に記載のモノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞株。免疫応答の調節を必要とする被験体の免疫応答を調節する方法であって、該被験体に治療有効量のtim-3活性を調節する因子を投与する工程を包含する、方法。免疫応答を調節する工程が、Th1応答を増加させるかTh2応答を減少させる工程を包含し、前記因子がtim-3活性を減少させる、請求項37に記載の方法。前記被験体が増殖性状態を罹患している、請求項38に記載の方法。前記増殖性状態が、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、消化管癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、またはこれらの組み合わせである、請求項39に記載の方法。前記被験体がTh2媒介性障害を罹患している、請求項38に記載の方法。Th2媒介性障害が、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー、食物アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、または糸球体腎炎である、請求項41に記載の方法。前記因子が、可溶性tim-3の発現を阻害する、請求項38に記載の方法。前記因子が、抗体またはそのフラグメントである、請求項38に記載の方法。前記抗体またはそのフラグメントが、tim-3に結合する、請求項44に記載の方法。前記抗体またはそのフラグメントが、tim-3の細胞外ドメインに結合する、請求項44に記載の方法。前記因子が、配列番号13のアミノ酸30~128を含むポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項44に記載の方法。前記因子が、tim-3へのガレクチン-9の結合を減少させる、請求項47に記載の方法。前記因子が、i配列番号13のアミノ酸30~128;またはiii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一であるアミノ酸配列、を含むポリペプチドを含む、請求項38に記載の方法。前記ポリペプチドが、ペグ化されている、請求項49に記載の方法。前記ポリペプチドが、aヒト血清アルブミン;またはb免疫グロブリンのFcドメインを含む、請求項49に記載の方法。前記因子が、tim-3のIgVドメイン、tim-3の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのFcドメインを含むポリペプチドを含むが、tim-3のムチンドメインまたはtim-3の膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含まない、請求項38に記載の方法。前記因子が、tim-3ポリペプチドまたはガレクチン-9ポリペプチドの発現レベルを減少させる、請求項38に記載の方法。前記因子が、二本鎖RNAアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項53に記載の方法。前記因子が、ガレクチン-9への全長tim-3の結合を阻害する、請求項38に記載の方法。前記因子が、i配列番号13のアミノ酸30~128を含むポリペプチドのiiガレクチン-9への結合を阻害する、請求項38に記載の方法。ガレクチン-9が、配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む、請求項56に記載の方法。ガレクチン-9が、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む、請求項56に記載の方法。前記因子が、炭水化物を含む、請求項39に記載の方法。前記炭水化物が、ラクトースまたはβ-ガラクトシドである、請求項59に記載の方法。前記因子が、グリコシル化ポリペプチドを含む、請求項59に記載の方法。前記因子が、ペクチンまたは修飾ペクチンを含む、請求項59に記載の方法。免疫応答を調節する工程が、Th1応答を減少させるかTh2応答を増加させる工程を包含し、前記因子がtim-3活性を増加させる、請求項37に記載の方法。前記被験体が、自己免疫疾患を罹患している、請求項63に記載の方法。前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群ALPS、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、糸球体腎炎、ギヤン-バレー症候群、乾癬、または重症筋無力症である、請求項64に記載の方法。前記被験体が、移植片対宿主病HVGDを罹患している、請求項63に記載の方法。前記被験体が、器官移植レシピエントである、請求項63に記載の方法。前記因子が、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドである、請求項63に記載の方法。前記抗体が、tim-3およびガレクチン-9に特異的な二重特異性抗体である、請求項68に記載の方法。tim-3への前記因子の結合が、tim-3の細胞内ドメインのリン酸化を増加させる、請求項63に記載の方法。前記因子が、tim-3リガンドである、請求項63に記載の方法。全長tim-3への前記tim-3リガンドの結合が、tim-3の細胞内ドメインのリン酸化を増加させる、請求項71に記載の方法。前記tim-3リガンドが、ガレクチン-9ポリペプチドを含む、請求項71に記載の方法。前記因子が、ガレクチン-9の2つの炭水化物認識ドメインCRDの少なくとも1つを含むポリペプチドである、請求項63に記載の方法。前記ポリペプチドが、ガレクチン-9の2つのCRDドメインを含む、請求項74に記載の方法。前記因子が、配列番号10または配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項63に記載の方法。前記ポリペプチドが、配列番号10または配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも90同一であるアミノ酸配列を含む、請求項76に記載の方法。前記ポリペプチドが、配列番号10または配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも95同一であるアミノ酸配列を含む、請求項76に記載の方法。tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する方法であって、以下:a試験因子の存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程;および、b該tim-3ポリペプチドと該ガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の効果を決定する工程;を包含し、それにより、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調節する因子を同定する、方法。免疫応答を調節する因子を同定する方法であって、以下:a試験因子の存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程;およびb該tim-3ポリペプチドと該ガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する該試験因子の効果を決定する工程;を包含し、それにより、免疫応答を調節する因子を同定する、方法。工程bが、試験因子の存在下でのtim-3/ガレクチン-9複合体の形成を、適切なコントロールと比較する工程を包含する、請求項80に記載の方法。前記適切なコントロールが、前記試験因子の非存在下での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む、請求項81に記載の方法。前記因子が、tim-3とガレクチン-9との間の結合を増加させる、請求項80に記載の方法。前記因子が、tim-3とガレクチン-9との間の結合を減少させる、請求項80に記載の方法。前記因子が、低分子化合物、抗体、またはポリペプチドである、請求項80に記載の方法。前記tim-3ポリペプチド、前記ガレクチン-9ポリペプチド、またはその両方が細胞内で発現する、請求項80に記載の方法。前記複合体の形成を検出する工程が、レポーター遺伝子の発現を検出する工程を包含し、該レポーター遺伝子の発現が該複合体の形成に依存する、請求項86に記載の方法。前記tim-3ポリペプチド、前記ガレクチン-9ポリペプチド、またはその両方が、蛍光分子で標識されている、請求項80に記載の方法。前記ガレクチン-9ポリペプチドが、i配列番号10のアミノ酸1~323、ii配列番号19のアミノ酸1~355、iii配列番号10のアミノ酸1~323と少なくとも90同一であるアミノ酸配列、またはiii配列番号19のアミノ酸1~355と少なくとも90同一であるアミノ酸配列、を含む、請求項80に記載の方法。前記tim-3ポリペプチドが、i配列番号13のアミノ酸30~128、またはii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一であるアミノ酸配列、を含む、請求項80に記載の方法。前記免疫応答が、Th1免疫応答である、請求項80に記載の方法。前記免疫応答が、Th2免疫応答である、請求項80に記載の方法。薬物発見ビジネスを実施する方法であって、以下:atim-3とガレクチン-9との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程;b動物における有効性および毒性について、工程aで同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行う工程;および、c工程bで許容可能な治療プロフィールを有すると同定された1つ以上の化合物を含む薬学的調製物を処方する工程;を包含する、方法。薬物発見ビジネスを実施する方法であって、以下:atim-3とガレクチン-9との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程;b動物における有効性および毒性について工程aで同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを必要に応じて行う工程;ならびに、c工程aで同定された化合物またはそのアナログに関するさらなる薬物の開発および/または販売に対する権利を第三者に供与する工程;を包含する、方法。前記工程aで同定された化合物またはそのアナログの販売に基づいて特許権使用料を徴収する工程をさらに包含する、請求項84に記載の方法。可溶性tim-3を発現する細胞を、可溶性tim-3の発現を減少させるのに十分な量の二本鎖RNAと接触させる工程を包含する、tim-3活性を増加させる方法であって、該二本鎖RNAが、該細胞中の全長tim-3の発現を阻害せず、それによりtim-3活性を増加させる、方法。前記二本鎖RNAが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1を含む核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号11を含む核酸とはハイブリダイズしない、請求項96に記載の方法。前記二本鎖RNAが、配列番号15に示される核酸配列を含む、請求項97に記載の方法。前記二本鎖RNAが、siRNAまたはヘアピンRNAである、請求項96に記載の方法。前記接触させる工程が、被験体への前記二本鎖RNAの投与によって達成される、請求項96に記載の方法。可溶性tim-3をコードする核酸の存在を検出する工程を包含する、可溶性tim-3遺伝子発現を検出する方法であって、該可溶性tim-3をコードする核酸の検出が、可溶性tim-3遺伝子発現を示す、方法。したがって、tim-3機能を調整し、それによって免疫応答を調整する薬剤を同定することが依然として必要とされている。本発明のいくつかの態様は、このような薬剤、このような薬剤の同定方法、およびこのような薬剤を使用した免疫応答の調整方法を提供する。発明の要旨本発明は、新規のポリペプチド、核酸、および組成物を提供し、免疫応答の調整で有用なものが含まれる。本発明は、必要とする被験体の免疫応答の調整方法および免疫応答を調整するために使用することができる薬剤の同定方法をさらに提供する。本発明は、tim-3IgVドメインおよびtim-3細胞内ドメインを含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、tim-3ムチンドメインまたはtim-3膜貫通ドメインを含まない、単離ポリペプチドを提供する。本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性tim-3をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長tim-3をコードする核酸とハイブリダイズしない単離核酸を提供する。このような核酸は、特に、免疫応答の調整に有利である。さらに、本発明は、itim-3のIgVドメインを含むポリペプチドと、ii増殖性状態の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。本発明は、さらに、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。同様に、本発明は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。本発明は、被験体に治療有効量のtim-3活性を調整する薬剤を投与する工程を含む、被験体の免疫寛容などの被験体の免疫応答を調整する方法を提供する。本発明はまた、被験体のTh1応答およびTh2応答などの免疫応答の調整方法を提供する。本発明は、さらに、免疫応答を調整する薬剤の同定方法およびtim-3とガレクチン-9などのそのリガンドとの間の結合相互作用を調整する薬剤の同定方法を提供する。本発明は、さらに、本明細書中に記載の任意の障害の治療薬の製造のための薬剤を提供する。被験体への薬剤の投与による障害の治療または防止のための本明細書中に開示の任意の方法を、これらの障害の治療薬の製造における薬剤の使用に適用することができる。例えば、1つの特定の実施形態では、Th2媒介性障害の治療薬の製造にtim-3IgV-HSA融合タンパク質を使用することができるのに対して、Th2媒介性障害の治療薬の製造にペグ化ガレクチン-9ポリペプチドを使用することができる。発明の詳細な説明i概説本発明は、Th1細胞活性の調整および免疫応答免疫寛容および移植免疫寛容が含まれるが、これらに限定されないの調整のための試薬、組成物、および方法に関する。本発明は、マウスおよびヒトにおけるtim-3のIgVドメインおよび細胞内ドメインを含むがムチンおよび膜貫通ドメインを欠くtim-3の可溶型をコードするtim-3の新規のスプライスイソ型の発見に一部由来する。本発明は、tim-3可溶性イソ型またはそのフラグメントをコードする単離核酸を提供する。本発明は、さらに、可溶性tim-3および免疫グロブリンのIgFcなどの他のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。さらに、本発明は、可溶性tim-3タンパク質の発現および/または機能を調整するが全長tim-3の発現および/または機能を調整しない試薬を提供する。本発明はまた、リガンドによるtim-3の活性化の遮断によってTh1細胞の活性化1細胞の増殖が含まれるが、これらに限定されないならびにサイトカインIL-2およびIFN-γの産生が増加するという発見に一部由来する。さらに、本発明は、マウスモデルで免疫寛容および移植免疫寛容を確立するためにリガンドとのtim-3相互作用などのtim-3活性が必要であるという発見に由来する。さらに、本発明はまた、ガレクチン-9がtim-3リガンドであるという発見に由来する。ガレクチン-9は、種々の細胞型上の至るところに発現し、且つβ-ガラクトシドに結合するガレクチンファミリーのメンバーである。2つのガレクチン-9形態長鎖long型および単鎖short型がヒトで説明されている。ヒト単鎖イソ型は、長鎖イソ型中のN末端炭水化物結合ドメインと連結ペプチドとの間に存在する31アミノ酸ヒト長鎖イソ型の残基149~180を欠く。ヒトおよびマウスの単鎖ガレクチン-9アミノ酸配列をそれぞれ配列番号10および17に列挙し、その対応するDNAコード配列を配列番号9および16に列挙する。マウスおよびヒトの長鎖ガレクチン-9アミノ酸配列を、それぞれ配列番号18および19に列挙する。ヒト単鎖ガレクチン-9イソ型では、N末端およびC末端炭水化物認識ドメインCRDは、それぞれ16~146および195~322にわたる。これらは、149~174にわたるリンカーペプチドGenbankアクセッション番号NP_002299を参照のことによって連結されている。ヒト長鎖イソ型中の2つのCDRは、それぞれ残基16~146および227~354にわたる。ガレクチン-9アミノ酸およびDNAコード配列は、米国特許第6,468,768号および同第6,027,916号本明細書中で参考として援用されるにも記載されている。したがって、本発明は、Th1および/またはTh2応答の増加または減少などの免疫応答の調整方法を提供し、免疫寛容および移植免疫寛容の増加または減少方法も提供する。本発明の1つの態様は、tim-3IgVドメインおよびtim-3細胞内ドメインを含み、tim-3ムチンドメインまたはtim-3膜貫通度面を含まない単離ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトまたはマウスポリペプチドなどの哺乳動物ポリペプチドである。1つの実施形態では、tim-3IgVドメインは、配列番号13のアミノ酸22~131または配列番号14のアミノ酸22~132を含む。1つの実施形態では、tim-3細胞内ドメインは、配列番号13のアミノ酸226~301または配列番号14のアミノ酸217~281を含む。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは他のキャリアタンパク質のFcドメインをさらに含む。本発明は、さらに、本明細書中に記載の単離ポリペプチドを含む組成物を提供する。1つの実施形態では、組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。本発明はまた、本明細書中に記載のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性tim-3をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で全長tim-3をコードする核酸とハイブリダイズしない単離核酸配列番号5に記載の配列を含む核酸などを提供する。本発明の別の態様は、薬学的パッケージを提供する。特定の態様は、itim-3のIgVドメインを含むポリペプチドと、ii増殖性状態の治療またはTh2媒介病態の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。特定の実施形態では、増殖性状態は、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、ホジキンリンパ腫、消化管癌、または胃癌である。特定の実施形態では、iガレクチン-9ポリペプチドを含むポリペプチドと、ii自己免疫障害の治療のための被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。本発明は、さらに、免疫試薬を提供する。特定の態様では、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しないか、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメント配列番号6または8に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する抗体などを提供する。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。本発明は、さらに、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。本発明の1つの態様は、被験体の免疫応答の調整方法を提供する。本発明の1つの態様は、被験体に治療有効量のtim-3活性を調整する薬剤を投与する工程を含む、必要とする被験体の免疫応答を調整する方法を提供する。1つの好ましい実施形態では、免疫応答の調整は、Th1応答を増加させるかTh2応答を減少させる工程を含み、薬剤はtim-3活性を減少させる。tim-3活性の減少によってTh1応答を増加させるかTh2応答を減少させる本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、被験体は、増殖性状態または喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、消化管アレルギー、食物アレルギー、好酸球増加症、結膜炎、もしくは糸球体腎炎などのTh2媒介性障害を罹患している。別の特定の実施形態では、薬剤は可溶性tim-3の発現を阻害する。tim-3活性を減少させる薬剤は、tim-3に結合する抗体、tim-3の細胞外ドメインに結合する抗体、配列番号13のアミノ酸30~128に結合する抗体などの抗体またはそのフラグメントであり得る。tim-3活性の減少によってTh1応答を増加させるかTh2応答を減少させる本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤は、tim-3へのガレクチン-9の結合を減少させる。特定の実施形態では、薬剤は、i配列番号13のアミノ酸30~128;またはii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド薬は、ペグ化またはヒト血清アルブミンもしくは免疫グロブリンのFcドメインなどの血漿タンパク質への融合などによってそのインビボでの安定性を増加させるように修飾されている。特定の実施形態では、薬剤は、tim-3のIgVドメイン、tim-3の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのFcドメインを含むが、tim-3のムチンドメインまたはtim-3の膜貫通ドメインを含まないポリペプチドを含む。特定の実施形態では、薬剤は、tim-3ポリペプチドまたはガレクチン-9ポリペプチドの発現レベルを減少させる。特定の実施形態では、薬剤は、二本鎖RNAアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、薬剤は、ガレクチン-9への全長tim-3の結合を阻害するi配列番号13のアミノ酸30~128を含むポリペプチドのiiガレクチン-9配列番号10または配列番号19中などへの結合を阻害する薬剤など。別の実施形態では、tim-3/ガレクチン-9結合を減少させる薬剤は、炭水化物ラクトース、β-ガラクトシドなど、グリコシル化ポリペプチド、ペクチン、または修飾ペクチンを含む。被験体の免疫応答を調整する方法の1つの好ましい実施形態では、免疫応答の調整はTh1応答を増加させるかTh2応答を減少させる工程を含み、薬剤はtim-3活性を減少させる。特定の実施形態では、被験体は、自己免疫障害、移植片対宿主病HVGDを罹患しているか、被験体は器官移植レシピエントである。tim-3活性の増加によってTh1応答を減少させるかTh2応答を増加させる本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤は、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドである。特定の実施形態では、抗体は、tim-3およびガレクチン-9に特異的な二重特異性抗体である。別の特定の実施形態では、tim-3への薬剤の結合により、tim-3の細胞内ドメインのリン酸化が増加する。別の特定の実施形態では、薬剤は、天然に存在するリガンドの組換えバージョンなどのtim-3リガンドである。別の特定の実施形態では、全長tim-3へのtim-3リガンドの結合により、tim-3の細胞内ドメインのリン酸化が増加する。別の特定の実施形態では、tim-3リガンドはガレクチン-9ポリペプチドを含む。別の特定の実施形態では、薬剤は、ガレクチン-9の2つの炭水化物認識ドメインCRDの少なくとも1つを含む。別の特定の実施形態では、ポリペプチドはガレクチン-9の2つのCRDドメインを含む。別の特定の実施形態では、薬剤は、配列番号10または配列番号18に記載のアミノ酸配列と少なくとも80、90、または95同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明の1つの態様は、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。1つの特定の態様は、a試験薬testagentの存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程と、btim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤が同定されることとを含む、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。別の態様は、a試験薬の存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程と、btim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程とを含む、免疫応答を調整する薬剤の同定方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程bが、試験薬の存在下でのtim-3/ガレクチン-9複合体の形成を適切なコントロールと比較することを含む。適切なコントロールが、試験薬の非存在下での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。免疫応答を調整する薬剤の同定方法のいくつかの実施形態では、免疫応答は、Th1免疫応答またはTh2免疫応答である。免疫応答を調整する薬剤またはtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤を同定する方法を、インビトロまたはインビボで行うことができる。特定の実施形態では、tim-3ポリペプチド、ガレクチン-9ポリペプチド、またはその両方が細胞内で発現する。特定の実施形態では、複合体形成の検出がレポーター遺伝子発現の検出を含み、レポーター遺伝子の発現が前記複合体の形成に依存する。別の特定の実施形態では、tim-3ポリペプチド、ガレクチン-9ポリペプチド、またはその両方が蛍光分子で標識されている。別の特定の実施形態では、上記方法におけるガレクチン-9ポリペプチドが、i配列番号10のアミノ酸1~323、ii配列番号19のアミノ酸1~355、iii配列番号10のアミノ酸1~323と少なくとも90同一のアミノ酸配列、iii配列番号19のアミノ酸1~355と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、上記方法のtim-3ポリペプチドが、i配列番号13のアミノ酸30~128、またはii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含む。本発明は、さらに、atim-3とガレクチン-9との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程と、b動物における有効性および毒性について工程aで同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングtherapeuticprofilingを行う工程と、c許容可能な治療プロフィールを有すると工程bで同定された1つまたは複数の化合物を含む薬学的調製物を処方する工程とを含む、薬物発見ビジネスの実施方法を提供する。本発明は、さらに、atim-3とガレクチン-9との間の結合に影響を及ぼす化合物を同定する工程と、b任意選択的に動物における有効性および毒性について工程aで同定された化合物またはそのさらなるアナログの治療プロファイリングを行う工程と、c工程aで同定された化合物またはそのアナログに関する薬物の開発および/または販売権利を第三者に供与する工程とを含む、薬物発見ビジネスの実施方法を提供する。特定の実施形態は、工程aで同定された化合物またはそのアナログの販売に基づいて特許権使用料を徴収する工程をさらに含む。本発明は、さらに、可溶性tim-3を発現する細胞を可溶性tim-3の発現を減少させるのに十分な量の二本鎖RNAを接触させる工程と、前記二本鎖RNAが細胞中の全長tim-3の発現を阻害せず、それによりtim-3活性が増加することとを含む、tim-3活性を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、二本鎖RNAが高ストリンジェンシー条件下で配列番号1を含む核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下で配列番号11を含む核酸とハイブリダイズしない。別の特定の実施形態では、二本鎖RNAは、配列番号15に記載の核酸配列を含む。別の特定の実施形態では、二本鎖RNAはsiRNAまたはヘアピンRNAである。別の特定の実施形態では、被験体への二本鎖RNAの投与によって接触させる。本発明は、さらに、可溶性tim-3をコードする核酸の存在を検出する工程と、前記可溶性tim-3をコードする核酸の検出が可溶性tim-3遺伝子発現を示すこととを含む、可溶性tim-3遺伝子発現の検出方法を提供する。本発明の実施は、他で示さない限り、当業者の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献に記載されている。例えば、MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,ed.bySambrook,FritschandManiaisColdSpringHarborLaboratoryPress:1989;DNACloning,VolumesIandIID.N.Glovered.,1985;OligonucleotideSynthesisM.J.Gaited.,1984;Mullisetal.U.S.PatentNo:4,683,195;NucleicAcidHybridizationB.D.HamesS.J.Higginseds.1984;TranscriptionAndTranslationB.D.HamesS.J.Higginseds.1984;CultureOfAnimalCellsR.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987;ImmobilizedCellsAndEnzymesIRLPress,1986;B.Perbal,APracticalGuideToMolcularCloning1984;thetreatise,MethodsInEnzymologyAcademicPress,Inc.,N.Y.;GeneTransferVectorsForMammalianCellsJ.H.MillerandM.P.Caloseds.,1987,ColdSpringHarborLaboratory;MethodsInEnzymology,Vols.154and155Wuetal.eds.,ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiologyMayerandWalker,ends.,AcademicPress,London,1987;HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI-IVD.M.WeirandC.C.Blackwell,eds.,1986;ManipulatingtheMouseEmbryo,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986を参照のこと。これらの引例の内容全体が本明細書中で参考として援用される。2定義便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される一定の用語をここに集めている。他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。冠詞aおよびanは、本明細書中で、1つまたは1つを超える冠詞の文法上の対照物をいうために使用される。例として、anelementは、1つのエレメントまたは1つを超えるエレメントを意味する。用語~が含まれるは、句~が含まれるが、これらに限定されないを意味するように使用され、これと交換可能に使用される。用語またはは、本明細書中で、他で明確に示されない限り、用語および/またはを意味するように使用され、これと交換可能に使用される。用語~などは、本明細書中で、句~などであるが、これらに限定されないを意味する用に使用され、これと交換可能に使用される。用語核酸は、デオキシリボ核酸DNAなどのポリヌクレオチド、適切な場合には、リボ核酸RNAをいう。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されたRNAまたはDNAのアナログ、記載の実施形態に適用可能な場合、一本鎖センスまたはアンチセンスおよび二本鎖ポリヌクレオチドが含まれると理解すべきである。用語ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書中で交換可能に使用される。用語防止するは、当該分野で認識されており、局所再発例えば、痛みなどの病態、癌などの疾患、心不全などの症候群の合併症syndromecomplex、または任意の他の病状に関して使用される場合、当該分野で十分に理解されており、疾患発症前に、組成物を投与していない被験体と比較して被験体の病状の頻度を減少させるか、重症度を軽減させるか、症状の発症を遅延させる組成物を投与する工程を含む。したがって、癌の防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した予防的治療を受けた患者集団における検出可能な癌成長の減少および/または未処置コントロール集団と比較した処置集団で検出可能な癌成長の出現の遅延例えば、統計的および/または臨床的に有意な量が含まれる。感染の防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した処置集団での感染症の診断数の減少および/または未処置コントロール集団と比較した処置集団での感染症の症状の発症の遅延が含まれる。痛みの防止には、例えば、未処置コントロール集団と比較した処置集団での被験体が経験した痛みの頻度の減少、重症度の軽減、または遅延が含まれる。本明細書中で使用される、用語有効量は、所望の結果を得るために必要な投薬量および期間で有効な量を定義する。本発明の化合物の有効量は、動物の病状、年齢、性別、および体重などの要因によって変化し得る。最適な治療応答を得るために投薬計画を調整することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与することができるか、治療状況の要件で示されるように、用量を比例的に減少させることができる。本明細書中で使用される、被験体は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいう。被験体の例には、非ヒト霊長類、げっ歯類、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ、および魚類が含まれる。本明細書中で使用される、目的のタンパク質の変異型は、1つまたは複数のアミノ酸が変化したアミノ酸配列をいう。変異型は、置換されたアミノ酸が類似の構造または化学的性質を有する保存的変化例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換を有し得る。より稀には、変異型は、非保存的変化例えば、グリシンのトリプトファンへの置換を有し得る。類似のわずかな変異には、アミノ酸の欠失、挿入、またはその両方も含まれ得る。生物学的または免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失することができるかどうかの決定のガイダンスを、当該分野で周知のコンピュータプログラム例えば、DNASTARソフトウェアを使用して見出すことができる。本明細書中で使用される、Th1関連障害は、基準例えば、正常なコントロールと比較して、例えば、異常な、例えば、Th1細胞の活性例えば、Th1細胞応答またはTh1細胞数の増加に関連する疾患または病態である。Th1関連障害の例には、例えば、自己免疫障害多発性硬化症、関節リウマチ、I型糖尿病、およびクローン病が含まれる。本明細書中で使用される、Th2関連障害は、基準例えば、正常なコントロールと比較して、例えば、異常な、例えば、Th2細胞の活性例えば、Th2細胞応答またはTh2細胞数の増加に関連する疾患または病態である。Th2関連障害の例には、例えば、喘息、アレルギー、および抗体成分に関連する障害例えば、関節リウマチが含まれる。本明細書中で使用される、用語アナログには、基準配列に対して1つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を含むアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、保存的または非保存的性質を示し得る。保存アミノ酸置換は、本発明のタンパク質の1つまたは複数のアミノ酸の類似の電荷、サイズ、および/または疎水性のアミノ酸への置換を含む。保存的置換のみが行われた場合、得られたアナログは機能的に等価なはずである。非保存的置換は、アミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸の異なる電荷、サイズ、および/または疎水性を有する1つまたは複数のアミノ酸への置換を含む。アミノ酸挿入は、1アミノ酸残基または2~15アミノ酸長の範囲の連続的アミノ酸からなり得る。欠失は、アミノ酸配列からの1つまたは複数のアミノ酸または不連続部分の除去からなり得る。欠失アミノ酸は、連続していても連続していなくてもよい。用語組換えは、天然に隣接しない配列を含む任意の核酸を意味するために本明細書中で使用される。組換え核酸を、例えば、分子生物学的方法の使用によってインビトロで生成するか、相同組換えまたは非相同組換えによる新規の染色体位置での核酸の挿入によってインビボで生成することができる。用語アゴニストは、タンパク質例えば、ポリペプチドXの生物活性を模倣または上方制御する例えば、増強または捕捉する薬剤をいう。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも1つの生物活性を有するその誘導体であり得る。アゴニストは、遺伝子発現を上方制御するかタンパク質の少なくとも1つの生物活性を増加させる化合物であり得る。アゴニストはまた、ポリペプチドの別の分子例えば、標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増加させる化合物であり得る。用語アンタゴニストは、タンパク質の少なくとも1つの生物活性を下方制御する例えば、抑制または阻害する薬剤をいう。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子例えば、標的ペプチドまたは酵素基質との間の相互作用を阻害または減少させる化合物であり得る。アンタゴニストはまた、遺伝子発現を下方制御するかタンパク質発現の存在量を減少させる化合物であり得る。用語治療効果は、薬理学的に活性な物質によって生じる、動物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒトにおける局所的または全身的効果をいう。したがって、この用語は、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは防止、または所望の身体的もしくは精神的発達および状態の強化における使用を意図する任意の物質を意味する。句治療有効量は、任意の治療に適用可能な妥当な利益/リスク比でいくつかの所望の局所的または全身的効果が得られるような物質の量を意味する。一定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指標および溶解性などに依存する。例えば、本発明の方法によって発見された一定の化合物を、このような治療に適用可能な妥当な利益/リスク比を得るのに十分な量で投与することができる。用語障害の治療を必要とする被験体は、このような障害を有すると診断されたかこのような障害を有する疑いのある被験体である。本明細書中で使用される他の技術用語は、これらが使用される分野で通常の意味を有し、McGraw-HillDictionaryofChemicalTermsおよびStedman’sMedicalDictionaryなどの種々の技術用語辞典によって例示されている。3核酸一定の態様では、本発明は、ヒト可溶性tim-3ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離および/または組換え核酸例えば、配列番号1および5などを提供する。本発明の1つの態様は、配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。配列番号1は、ヒト可溶性tim-3イソ型のDNAコード配列である。ヒト可溶性tim-3は、ヒト全長tim-3の細胞内ドメイン配列番号13の残基226~301に融合したIgVドメイン配列番号13の残基22~131を含む。1つの実施形態では、本発明によって提供された可溶性ヒトtim-3核酸は、さらに、翻訳ポリペプチドのN末端で全長tim-3のシグナル配列配列番号13のアミノ酸残基1~21をコードする。本発明の別の態様は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むヒト可溶性tim-3ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。同様に、本発明の別の態様は、マウス可溶性tim-3ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離および/または組換え核酸例えば、配列番号3および7などを提供する。本発明の1つの態様は、配列番号3に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。配列番号3は、マウス可溶性tim-3イソ型のDNAコード配列である。マウス可溶性tim-3は、マウス全長tim-3の細胞内ドメイン配列番号14の残基217~281に融合したIgVドメイン配列番号14の残基22~132を含む。1つの実施形態では、本発明によって提供されたマウス可溶性tim-3核酸は、さらに、翻訳ポリペプチドのN末端で全長tim-3のシグナル配列配列番号14のアミノ酸残基1~21をコードする。本発明の別の態様は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むマウス可溶性tim-3ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。本発明の核酸は、配列番号1、3、5、および7の変異型を含む核酸を含むとさらに理解される。変異ヌクレオチド配列には、置換、付加、または欠失などによって1つまたは複数のヌクレオチドが異なる配列対立遺伝子変異型などが含まれ、したがって、例えば、遺伝コードの縮重によって配列番号1、3、5、および7に示すコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列が含まれる。例えば、可溶性tim-3ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号1および3の配列または配列番号2および4のポリペプチドをコードする配列と少なくとも90、95、99、または100同一の配列を含む核酸であり得る。2配列の間の配列の比較および同一率および類似率の決定を、数学アルゴリズムを使用して行うことができる。ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987;およびSequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991。1つの好ましい実施形態では、2つのアミノ酸配列間の同一率を、Blossom62行列またはPAM250行列のいずれかを使用してGCGソフトウェアパッケージhttp://www.gcg.comで利用可能のGAPプログラムに組み込まれたNeedlemanandWunschJMol.Biol.48:444-4531970アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の同一率を、NWSgapdna-CMP行列を使用したGCGソフトウェアパッケージDevereux,J.,etal.,NucleicAcidsRes.121:3871984http://www.gcg.comで利用可能のGAPプログラムを使用して決定する。別の実施形態では、2つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一率を、ALIGNプログラムバージョン2.0に組み込まれたE.MyersandW.MillerCABIOS,4:ll-171989のアルゴリズムを使用して決定する。他の実施形態では、変異型はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1および3に示す核酸配列のコード配列とハイブリダイズする配列が含まれる。1つの実施形態では、変異ヌクレオチド配列は、ムチンおよび膜貫通ドメインを欠く可溶性tim-3ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、変異ヌクレオチド配列は、tim-3リガンド例えば、ガレクチン-9に結合することができる可溶性tim-3ポリペプチドをコードする。当業者は、DNAハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変更することができることを容易に理解する。例えば、約45°Cでの6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCでのハイブリッド形成およびその後の50°Cでの2.0×SSCの洗浄を行うことができる。例えば、洗浄工程中の塩濃度を、50°Cで約2.0×SSCの低ストリンジェンシーから50°Cで約0.2×SSCの高ストリンジェンシーまで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度を、室温約22°Cの低ストリンジェンシー条件から約65°Cの高ストリンジェンシー条件まで増加させることができる。温度および塩の両方を変化させるか、温度または塩濃度を一定に保持して他の変量を変更することができる。1つの実施形態では、本発明は、室温で6×SSCおよびその後の室温での2×SSCの洗浄を行う低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸を提供する。遺伝コードの縮重のために配列番号1および3と異なる単離核酸も本発明の範囲内である。例えば、1つを超えるトリプレットによって多数のアミノ酸が指定される。同一アミノ酸を特定するコドンすなわち、同義語例えば、CAUおよびCACはヒスチジンの同義語であるにより、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えないサイレント変異が起こり得る。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の1つまたは複数ヌクレオチドのこれらの変動が天然の対立遺伝子の変動によって所与の種の個体間で存在し得ることを認識する。任意および全てのこのようなヌクレオチドの変動および得られたアミノ酸多型は本発明の範囲内である。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で可溶性tim-3をコードする核酸とハイブリダイズするが、tim-3膜貫通ドメインまたはtim-3ムチンドメインをコードしない核酸を提供する。1つの実施形態では、これらの核酸は、少なくともtim-3のIgVドメインをコードする。これらの核酸は、IgVまたは細胞内ドメイン内に変異、欠失、または挿入を有する可溶性tim-3タンパク質をコードし得る。1つの実施形態では、核酸は、ガレクチン-9などのtim-3リガンドに結合することができるポリペプチドをコードする。1つの実施形態では、これらの核酸は、変異しているか変異していない可溶性tim-3および血清アルブミンまたは免疫グロブリンのFcドメインなどの別のタンパク質由来の1つまたは複数のドメインを含む融合タンパク質をコードする。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下または生理学的条件下で可溶性tim-3をコードする核酸とハイブリダイズするが、高ストリンジェンシー条件下または生理学的条件下で全長tim-3をコードする核酸とハイブリダイズしない核酸を提供する。1つの実施形態では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1に記載の核酸ヒト可溶性tim-3をコードするとハイブリダイズするが、配列番号11に記載の核酸全長ヒトtim-3をコードするとハイブリダイズしない単離核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号3に記載の核酸マウス可溶性tim-3をコードするとハイブリダイズするが、配列番号12に記載の核酸全長マウスtim-3をコードするとハイブリダイズしない単離核酸を提供する。好ましい実施形態では、このような単離核酸は、ヒトおよびマウスtim-3のIgVおよび細胞内ドメインコード配列を連結する可溶性tim-3cDNA中で見出される新規のスプライス部位にわたる。別の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号5および7に記載のヌクレオチド配列を有する。これらの核酸を、可溶性tim-3をコードする核酸を検出するためにTh1細胞中のtim-3をコードする核酸の存在の検出、本明細書中に記載の方法で使用することができる。一定の態様では、可溶性tim-3ポリペプチドをコードする核酸およびその変異型を使用して、直接送達などの核酸送達によって生物または細胞中の可溶性tim-3発現を増加させることができる。本発明の核酸治療構築物を、例えば、細胞中で転写された場合に可溶性tim-3ポリペプチドをコードするRNAを産生する発現プラスミドとして送達することができる。本発明はまた、可溶性tim-3をコードする核酸の存在を検出する工程と、前記可溶性tim-3をコードする核酸の検出が可溶性tim-3遺伝子発現を示すこととを含む、可溶性tim-3遺伝子発現の検出方法を提供する。好ましい実施形態では、核酸はmRNAである。可溶性tim-3をコードするmRNAの検出を、当該分野で一般的に公知のmRNA分子検出方法ノーザンブロット、逆転写mRNAのPCR増幅、DNAマイクロアレイが含まれるを使用して行うことができる。別の実施形態では、可溶性tim-3遺伝子発現を、抗体、好ましくは、可溶性tim-3に結合するが全長tim-3に結合しない抗体を使用して検出する。4RNA干渉、リボザイム、およびアンチセンス一定の態様では、本発明は、全長tim-3、可溶性tim-3、またはtim-3リガンドの操作典型的には、遺伝子発現の減少のためのRNAi、リボザイム、アンチセンス、および他の核酸に関連する方法および組成物に関する。本発明の1つの態様では、方法および組成物は、tim-3のたった1つの形態全長または可溶性形態のいずれかに特異的である。本発明の別の態様では、操作されるtim-3リガンドはガレクチン-9である。本発明の一定の実施形態は、RNA干渉RNAiによってtim-3またはガレクチン-9などのそのリガンドの1つの形態のノックダウンのための材料および方法を使用する。RNAiは、真核生物中で起こり得る配列特異的転写後遺伝子発現の過程である。一般に、この過程は、特定の配列に相同な二本鎖RNAdsRNAによって誘導される特定の配列のmRNAの分解を含む。例えば、特定の一本鎖mRNAssmRNAの配列に対応する長いdsRNAの発現がそのメッセージを不安定にし、それによって対応する遺伝子の発現を干渉する。したがって、任意の選択された遺伝子を、その遺伝子のmRNAの全部または実質的部分に対応するdsRNAの移入によって抑制することができる。長いdsRNAが発現される場合、最初に、リボヌクレアーゼIIIによっていくつかの例では21~22塩基対長ほどのより短いdsRNAオリゴヌクレオチドにプロセシングされるようである。さらに、比較的短い相同dsRNAの移入または発現によってRNAiを行うことができる。実際、比較的短い相同dsRNAの使用は、以下に考察する一定の利点を有し得る。哺乳動物細胞は、二本鎖RNAdsRNAによって影響を受ける少なくとも2つの経路を有する。RNAi配列特異的経路では、上記のように、最初のdsRNAが短い干渉siRNAに分解される。siRNAは、各3’末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有する約19ヌクレオチドのsiRNAを形成する約21個のヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する。短い干渉RNAは、分解のために特定の伝令RNAをターゲティングすることが可能な配列情報を提供すると考えられている。対照的に、非特異的経路は、少なくとも30塩基対長である限り、任意の配列のdsRNAによって誘発される。dsRNAは2つの酵素PKRその活性形態で翻訳開始因子eIF2のリン酸塩を形成して全てのタンパク質合成を遮断するおよびRNAアーゼL全mRNAをターゲティングする非特異的酵素を合成する2’,5’オリゴアデニル酸合成酵素2’,5’-ASを活性化するので、非特異的効果が生じ得る。非特異的経路は、ストレスまたはウイルス感染に対する宿主応答を示すことができ、一般に、本発明の好ましい方法において非特異的経路の効果を最小にすることが好ましい。注目すべきなのは、より長いdsRNAは、非特異的経路の誘導に必要なようであり、したがって、RNAiによる遺伝子抑制を行うためには約30塩基対より短いdsRNAが好ましいHunteretal.1975JBiolChem250:409-17;Mancheetal.1992MolCellBiol12:5239-48;Minksetal.1979JBiolChem254:10180-3;およびElbashiretal.2001Nature411:494-8を参照のこと。RNAiは、多数の異なる生物エレガンス線虫例えば、Fireetal.1998Nature391:806-11、マウスの卵および胚Wiannyetal.2000NatureCellBiol2:70-5;Svobodaetal.2000Development127:4147-56、ならびに培養RAT-1線維芽細胞Bahraminaetal.1999MolCellBiol19:274-83が含まれるにおける遺伝子発現の減少または消失で有効であることが示されており、真核植物および動物で利用可能な古代に進化した経路のようであるSharp2001GenesDev.15:485-90。RNAiは、種々の細胞型HeLa細胞、NIH/3T3細胞、COS細胞、293細胞、およびBHK-21細胞が含まれるにおける遺伝子発現の有効な減少手段であることが証明されており、典型的には、アンチセンス技術を使用して達成されるレベルよりも低いレベルに遺伝子発現を減少させ、実際はしばしば発現全体が消失するBass2001Nature411:428-9を参照のこと。哺乳動物細胞では、siRNAは、アンチセンス実験で典型的に使用される濃度よりもはるかに低い濃度で有効であるElbashiretal.2001Nature411:494-8。RNAiを行うために使用される二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは30塩基対未満であり、より好ましくは、約25、24、23、22、21、20、19、18、または17塩基対のリボ核酸を含む。任意選択的に、本発明のdsRNAオリゴヌクレオチドは、3’オーバーハング末端を含み得る。例示的2-ヌクレオチドの3’オーバーハングは、任意の型のリボヌクレオチド残基から構成され、細胞培養培地中およびトランスフェクトされた細胞内でsiRNAのヌクレアーゼ耐性を増強することができるElbashietal.2001Nature411:494-8を参照のこと。50、75、100、またはさらに500塩基対またはそれ以上のより長いdsRNAを、本発明の一定の実施形態で使用することもできる。RNAi実施のための例示的なdsRNA濃度は、約0.05nM、0.1nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、25nM、または100nMであるが、処置される細胞、遺伝子標的、および当業者が容易に識別可能な他の因子の性質に依存して他の濃度を使用することができる。例示的dsRNAを、化学合成するか、適切な発現ベクターを使用してインビトロまたはインビボで産生することができる。例示的合成RNAには、当該分野で公知の方法例えば、ExpediteRNAホスホアミダイトおよびチミジンホスホアミダイトProligo,Germanyを使用して化学合成された21ヌクレオチドのRNAが含まれる。当該分野で公知の方法を使用して合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製することが好ましいElbashiretal.2001GenesDev.I5:188-200を参照のこと。より長いRNAを、当該分野で公知のT7RNAポリメラーゼプロモーターなどのプロモーターから転写することができる。インビトロプロモーター下流の可能な両方向で存在する1つのRNA標的が標的の両鎖を転写して、所望の標的配列のdsRNAオリゴヌクレオチドが作製される。tim-3またはガレクチン-9が二本鎖RNAの標的である場合、tim-3核酸またはガレクチン-9核酸中に示される核酸配列の一部ストリンジェントな条件下および/または生理学的条件下で配列番号1、3、9、10、11、もしくは12またはその相補物のいずれかとハイブリダイズする核酸などを含むように上記RNA種のいずれかをデザインする。目的が全長tim-3の活性を減少させることである場合、全長tim-3の発現を下方制御することができるが、可溶性tim-3の発現を下方制御することができない二本鎖RNA試薬が好ましい。したがって、RNA試薬は全長tim-3レベルを減少させることができる一方で、可溶性tim-3はガレクチン-9などのtim-3リガンドを漸増してtitrate全長tim-3との相互作用を防止することができる。この実施形態では、RNA種を、全長tim-3中に存在するが可溶性tim-3に存在しないムチンドメインまたは膜貫通ドメインをコードするmRNA領域を含むようにデザインすることができる。本発明の関連する態様は、可溶性tim-3を発現する細胞を可溶性tim-3発現の阻害に十分な量の二本鎖RNAと接触させる工程と、二本鎖RNAが全長tim-3発現を阻害しないこととを含む、可溶性tim-3の発現の阻害によるtim-3活性を増加させる方法を提供する。1つの実施形態では、二本鎖RNAは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号1を含む核酸とハイブリダイズするが、同一条件下で配列番号11を含む核酸とハイブリダイズしない。別の実施形態では、二本鎖RNAは、生理学的条件下で配列番号1を含む核酸とハイブリダイズするが、同一条件下で配列番号11を含む核酸とハイブリダイズしない。好ましい実施形態では、二本鎖RNAの一方の鎖は、配列番号15に記載の核酸配列を含む。tim-3を発現する単離細胞または被験体、好ましくはヒトで本発明の方法を行うことができる。標的がガレクチン-9である場合、RNA種は、ガレクチン-9核酸中に示される核酸配列の一部例えば、ストリンジェントな条件下および/または生理学的条件下で配列番号9またはその相補物とハイブリダイズする核酸などを含み得る。オリゴヌクレオチドデザインで使用される特定の配列は、標的の発現された遺伝子メッセージ内に含まれるヌクレオチドの任意の連続配列であり得る。当該分野で公知のプログラムおよびアルゴリズムを使用して、適切な標的配列を選択することができる。さらに、特定された一本鎖核酸配列の二次構造を予想するためにデザインされたプログラムを使用し、折り畳まれたmRNAの曝露された一本鎖領域中に生じる可能性が高い配列の選択によって最適な配列を選択することができる。適切なオリゴヌクレオチドデザインのための方法および組成物を、例えば、米国特許第6,251,588号その内容が本明細書中で参考として援用されるで見出すことができる。伝令RNAmRNAは、一般に、リボヌクレオチド配列内でのタンパク質合成を指示するための情報を含む線状分子と考えられているが、研究により、ほとんどのmRNA中に存在する多数の二次構造および三次構造が明らかとなっている。RNA中の二次構造エレメントは、同一RNA分子の異なる領域間のWatson-Crick型相互作用によって大部分が形成される。重要な二次構造エレメントには、分子内二本鎖領域、ヘアピンループ、二重鎖RNA中のバルジ、および内部ループが含まれる。二次構造が互いに接触した場合に三次構造エレメントが形成され、一本鎖領域と接触した場合により複雑な三次元構造が産生される。多数の研究者が多数のRNA二重鎖構造の結合エネルギーを測定しており、RNAの二次構造を予想するために使用することができる規則が導かれている例えば、Jaegeretal.1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:77061989;andTurneretal.1988Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.17:167を参照のこと。規則は、RNA構造エレメントの同定、特に、スプライシングRNAi、リボザイム、またはアンチセンス技術のために標的にmRNAの好ましいセグメントを授与することができる一本鎖RNA領域の同定で有用である。したがって、mRNA標的の好ましいセグメントを、RNAi媒介dsRNAオリゴヌクレオチドのデザインならびに本発明の適切なリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムのデザインのために同定することができる。dsRNAオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知のリポソームなどのキャリア組成物例えば、異常な細胞株の製造によって記載されたリポフェクタミン2000LifeTechnologiesを使用した異種標的遺伝子でのトランスフェクションによって細胞に移入することができる。内因性遺伝子のターゲティングのためのdsRNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、オリゴフェクタミンLifeTechnologiesを使用して行うことができる。蛍光顕微鏡を使用してhGFPコードpAD3の同時トランスフェクション後の哺乳動物細胞株のトランスフェクション効率をチェックすることができるKehlenbacketal.1998JCellBiol141:863-74。RNAiの有効性を、dsRNA移入後の多数のアッセイのいずれかによって評価することができる。これらには、新規のタンパク質合成が抑制された後の内因性プールの代謝回転のための十分な時間を経た後のtim-3ポリペプチド可溶性形態および/または全長形態が含まれるまたはtim-3リガンドガレクチン-9などを認識する抗体を使用したウェスタンブロット分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、既存の標的mRNA全長tim-3、可溶性tim-3、またはガレクチン-9のmRNAなどのレベルを決定するためのノーザンブロット分析が含まれる。さらなる組成物、方法、およびRNAiテクノロジーの適用は、米国特許第6,278,039号、同第5,723,750号、および同第5,244,805号本明細書中で参考として援用されるに記載されている。tim-3およびガレクチン-9のmRNA転写物を触媒的に切断するようにデザインしたリボザイム分子を使用して、本tim-3またはガレクチン-9のmRNAの翻訳を防止することもできる例えば、1990年10月14日公開のPCT国際公開WO90/11364;sarveretal.1990Science247:1222-1225、および米国特許第5,093,246号を参照のこと。リボザイムは、特定のRNA切断を触媒することができる酵素RNA分子である概説については、Rossi1994CurrentBiology4:469-471を参照のこと。リボザイムの作用機構は、リボジム分子の相補標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成およびその後のエンドヌクレアーゼ的切断事象を含む。リボザイム分子の組成物は、好ましくは、tim-3またはガレクチン-9に相補的な1つまたは複数の配列およびmRNA切断または機能的な等価な配列を担う周知の触媒配列を含む例えば、米国特許第5,093,246号その全体が本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。部位特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムを使用して標的mRNAを破壊することができる一方で、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって予想される位置でmRNAを切断する。好ましくは、標的mRNAは、以下の2つの塩基配列を有する:5’-UG-3’。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当該分野で周知であり、HaseloffandGerlach1988Nature334:585-591により完全に記載されている:PCT出願番号WO89/05852号その内容が本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。ハンマーヘッドリボザイム配列を、インビボでの切断効率を増加させるために運搬RNAtRNAなどの安定なRNAに埋め込むことができるPerrimanetal.1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6175-79;deFeyter,andGaudron,MethodsinMolecularBiology,Vol.74,Chapter43,ExpressingRibozymesinPlants,EditedbyTurner,P.C,HumanaPressInc.,Totowa,N.J。特に、tRNA融合リボザイムのRNAポリメラーゼIII媒介発現は、当該分野で周知であるKawasakietal.1998Nature393:284-9;Kuwabaraetal.1998NatureBiotechnol.16:961-5;andKuwabaraetal.1998Mol.Cell2:617-27;Kosekietal.1999JVirol73:1868-77;Kuwabaraetal.1999ProcNatlAcadSciUSA96:1886-91;Tanabeetal.2000Nature406:473-4を参照のこと。典型的には、所与の標的cDNA配列内に多数の潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する。好ましくは、非機能的mRNA転写物の有効性を増大させて細胞内蓄積を最小にするために、切断認識部位が標的mRNAの5’末端付近に存在するようにリボザイムを操作する。さらに、例えば、標的の長鎖形態および単鎖形態のC末端アミノ酸ドメインの異なる部分をコードする標的配列中に存在する任意の切断認識部位の使用により、一方または他方の標的形態の選択的ターゲティングが可能であり、したがって、標的遺伝子産物の一方の形態に対して選択的効果を有する。遺伝子ターゲティングリボザイムは、必ず2つの領域それぞれ少なくとも5個、好ましくはそれぞれ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の連続ヌクレオチド長の標的mRNAに相補的なハイブリッド形成領域を含む。tim-3標的mRNAは、配列番号1、3、5、または7のいずれかを含む。ガレクチンmRNA配列は、配列番号9を含む。さらに、リボザイムは、標的センスmRNAを自己触媒的に切断する高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する。本発明は、治療薬標的候補遺伝子などのtim-3またはガレクチン-9タンパク質をコードするセンスmRNAとハイブリッド形成し、それによりもはや機能的ポリペプチド産物を合成するために翻訳されることができないようにセンスmRNAとハイブリッド形成してこれを切断するリボザイムにまで及ぶ。本発明のリボザイムには、RNAエンドリボヌクレアーゼ以後Cech型リボザイムテトラヒメナ中に天然に存在するものIVSRNAまたはL-19IVSRNAおよびThomasCechandcollaboratorsZaug,etal.1984Science224:574-578;Zaug,etal.1986Science231:470-475;Zaug,etal.1986Nature324:429-433UniversityPatentsInc.による国際公開特許出願番号WO88/04300;Been,etal.1986Cell47:207-216によって詳細に記載のものなども含まれる。Cech型リボザイムは、標的RNAの切断後に標的RNA配列とハイブリダイズする8塩基の活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子または核酸配列中に存在する8塩基対の活性部位配列をターゲティングするCech型リボザイムを含む。リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド例えば、安定性、ターゲティングなどの改良のためから構成され得るが、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法は、トランスフェクトされた細胞が内因性標的メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するような強力構成性polIIIまたはpolIIプロモーターの調節下でのリボザイムをコードするDNA構築物の使用を含む。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒性を示すので、より低い細胞内濃度で有効である。一定の実施形態では、RNAiによる有効なノックダウンに十分な配列部分を最初に同定することよってリボザイムをデザインすることができる。次いで、同一の配列部分を、リボザイムに組み込むことができる。本発明のこの態様では、リボザイムまたはRNAiの遺伝子ターゲティング部分は、少なくとも5個、好ましくはそれぞれ6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個またはそれ以上のtim-3核酸またはガレクチン-9核酸の連続ヌクレオチドの実質的に同一の配列である。長鎖標的RNA鎖では、二次構造または三次構造内に隠れるので、有意な数の標的部位がリボザイムに接近することができないBirikhetal.1997EurJBiochem245:1-16。標的RNAの接近可能性の問題を克服するために、典型的には、コンピュータで作製した二次構造の予想を使用して、一本鎖であるか開いた立体配値である可能性が最も高い標的を同定するJaegeretal.1989MethodsEnzymol183:281-306を参照のこと。他のアプローチは、非常に多数の候補ハイブリッド形成オリゴヌクレオチド分子の評価を含む二次構造を予想するための体系的アプローチを使用するMilneretal.1997NatBiotechnol15:537-41;およびPatzelandSczakiel1998NatBiotechnol16:64-8を参照のこと。さらに、米国特許第6,251,588号その内容が本明細書中で参考として援用されるは、標的核酸配列へのハイブリッド形成の潜在性を予想するためのオリゴヌクレオチドプローブ配列の評価方法を記載している。本発明の方法は、一本鎖であると予想される標的mRNA配列の好ましいセグメントを選択する方法の使用、さらに、本発明のRNAiオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方のデザインにおける標的mRNAの約10~20個の連続ヌクレオチドを含むことが好ましい同一または実質的に同一の標的mRNA配列の便宜的使用を提供する。5ポリペプチド一定の態様では、本開示により、通常はタンパク質と会合し得る他のタンパク質またはタンパク質を含む特定の複合体から単離されているか実質的に含まない可溶性tim-3ポリペプチドの単離および/または精製形態が利用可能になる。一定の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、配列番号2、4、6、または8のアミノ酸配列と少なくとも90、95、97、99、または100同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。2つのポリペプチド間のアミノ酸同一性を、PAM250行列に基づいたアラインメントアルゴリズムなどのアラインメントアルゴリズムを使用した2つのポリペプチド配列の最初のアラインメントによって決定することができる。一定の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、配列番号2、4、6、および8のいずれかと少なくとも90、95、97、99、または100同一のアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドであり、好ましくは、前記一部は、Th1細胞の活性化の調整に十分であるかtim-3リガンドに結合することができる部分などの機能的部分である。1つの実施形態では、一部は、tim-3のIgVドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含む。一定の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、配列番号1、3、5、および7の核酸配列と少なくとも90、95、97、99、または100同一の核酸配列を含む核酸が細胞中に発現される場合に得られるポリペプチドである。一定の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、精製されているか部分精製されている。いくつかの実施形態では、可溶性tim-3のIgVドメインは、配列番号13のアミノ酸22~131を含む。他の実施形態では、配列番号14のアミノ酸22~132を含む。1つの実施形態では、本発明によって提供された可溶性tim-3ポリペプチドの細胞内ドメインは配列番号13のアミノ酸226~301を含む一方で、別の実施形態では、配列番号14のアミノ酸217~281を含む。本発明は、さらに、可溶性tim-3ポリペプチドおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を含む。1つの実施形態では、可溶性tim-3タンパク質は、IgVドメインを含むが、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠く。一定の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドおよび免疫グロブリンエレメントを含む融合タンパク質を提供する。1つの実施形態では、本発明は、タンパク質がtim-3のムチンドメインまたはtim-3の膜貫通ドメインを含まない、tim-3のIgVドメイン、tim-3の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのFcドメインを含むポリペプチドを提供する。tim-3ポリペプチドは、マウスまたはヒトであり得る。例示的免疫グロブリンエレメントは、ヒトIgG1重鎖のFcドメインのような定常領域であるBrowningetal.,J.Immunol.,154,pp.33-461995。可溶性受容体-IgG融合タンパク質は、一般的な免疫試薬であり、その構築方法は当該分野で公知である例えば、米国特許第5,225,538号、同第5,766,883号、および同第5,876,969号その全てが本明細書中で参考として援用されるを参照のこと。いくつかの実施形態では、本発明の可溶性ペプチドをFc変異型に融合する。関連する実施形態では、本発明の修飾タンパク質は、免疫グロブリンのFc領域とのtim-3およびガレクチン-9融合タンパク質を含む。公知のように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、4つまたは5つのドメインを含む。ドメインを、連続的に、以下のように命名されている:CH1-ヒンジ-CH2-CH3-CH4。重鎖ドメインのDNA配列は、免疫グロブリンクラス間で交差相同性cross-homologyを有し、例えば、IgGのCH2ドメインは、IgAおよびIgDのCH2ドメインと相同であり、IgMおよびIgEのCH3ドメインと相同である。本明細書中で使用される、用語免疫グロブリンFc領域は、免疫グロブリン鎖定常領域、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部分またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンFc領域は、1CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン、2CH1ドメインおよびCH2ドメイン、3CH1ドメインおよびCH3ドメイン、4CH2ドメインおよびCH3ドメイン、または52つまたはそれ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含み得る。好ましい実施形態では、免疫グロブリンFc領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含み、好ましくはCH1ドメインを欠く。1つの実施形態では、重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンクラスはIgGIgγγサブクラス1、2、3、または4である。他の免疫グロブリンクラスであるIgAIgα、IgDIgδ、IgEIgε、およびIgMIgμを使用することができる。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第5,541,087号および同第5,726,044号で考察されている。特定の結果を得るための一定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内であると見なされる。免疫グロブリンFc領域をコードするDNA構築物の一部は、好ましくは、ヒンジドメインの少なくとも一部、好ましくはFcγのCH3ドメインまたはIgA、IgD、IgE、もしくはIgM中の相同ドメインの少なくとも一部を含む。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は本発明の実施で有用であり得ることが意図される。1つの例は、Fc受容体に対する親和性が減少したFc変異型を作製するために上部CH2領域にアミノ酸置換を導入することであろうColeetal.1997J.IMMUNOL.159:3613。当業者は、周知の分子生物学技術を使用してこのような構築物を調製することができる。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボ安定性を増大させるためか、その生物活性もしくは局在化を調整するためか、融合タンパク質の精製を容易にするための可溶性tim-3ポリペプチドおよび第2の異種ポリペプチドを含む。tim-3可溶性融合タンパク質を生成するために使用することができる他の例示的異種タンパク質には、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、アルカリホスファターゼAPなどの酵素活性、または血球凝集素HAなどのエピトープタグが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、典型的には循環時に20時間を超える半減期を有する安定な血漿タンパク質を使用して、tim-3またはガレクチン-9との融合タンパク質を構築する。このような血漿タンパク質には、免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンが含まれるが、これらに限定されない。可溶性tim-3またはガレクチン-9分子を特定の細胞型または組織型にターゲティングすることができる配列を可溶性tim-3に結合させて特異的に局在化した可溶性tim-3融合タンパク質を作製することもできる。1つの好ましい実施形態では、本発明は、アルブミンへのtim-3またはガレクチン-9の融合物を提供する。本明細書中で使用される、アルブミンは、集合的に、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列または1つまたは複数のアルブミンの機能活性例えば、生物活性を有するアルブミンフラグメントもしくは変異型をいう。特に、アルブミンは、ヒトアルブミンもしくはそのフラグメント欧州特許第201239号、同第322094号、WO97/24445、WO95/23857号を参照のこと、特に、ヒトアルブミンの成熟形態または他の脊椎動物由来のアルブミンをいう。特に、本発明のアルブミン融合タンパク質には、ヒトアルブミンの天然に存在する多型性変異型およびヒトアルブミンのフラグメントWO95/23857を参照のこと例えば、欧州特許第322094号に開示のフラグメントすなわち、HAPnnは369~419であるが含まれ得る。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に、任意の哺乳動物例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、ニワトリおよびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、tim-3またはガレクチン-9タンパク質と異なる動物に由来し得る。いくつかの実施形態では、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分は、血清アルブミンのフラグメントに対応する。血清アルブミンポリペプチドのフラグメントには、アミノ末端またはC末端から1つまたは複数の残基が欠失したポリペプチドが含まれる。一般的に言えば、HAフラグメントまたはHA変異型は、少なくとも100アミノ酸長、好ましくは少なくとも150アミノ酸長である。HA変異型は、少なくとも1つのHAの全ドメインからなるかこれを含み得る。ヒトアルブミンのドメインは、米国特許出願番号2004/0171123号に記載されている。一定の実施形態では、本発明は、可溶性tim-3ポリペプチドをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、本発明はまた、可溶性tim-3ポリペプチドおよび関連誘導体を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明のポリペプチドを、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞例えば、バキュロウイルス発現系を使用、酵母、または哺乳動物細胞で発現することができる。1つの実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドを作製して哺乳動物細胞によって分泌させ、可溶性tim-3ポリペプチドを培養培地から精製する。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性tim-3ポリペプチドの産生方法に関する。治療有効性もしくは予防有効性または安定性例えば、exvivo有効期間およびインビボでのタンパク質分解耐性の強化などの目的のために本tim-3ポリペプチドの構造を調整することも可能である。このような修飾ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質形態の少なくとも1つの活性を保持するようにデザインされた場合、本明細書中により詳細に記載されているtim-3ポリペプチドの機能的等価物と見なされる。このような修飾ポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によって産生することができる。例えば、ロイシンからイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの孤立置換isolatedreplacementまたはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似の置換すなわち、保存的変異体が得られた分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想することが妥当である。保存的置換は、その側鎖中で関連するアミノ酸ファミリー内で起こるものである。一般に、遺伝的にコードされたアミノ酸を、以下の4つのファミリーに分類することができる:1酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、2塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン、3非極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および4非荷電性で極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、共に芳香族アミノ酸として分類される。類似の様式では、アミノ酸レパートリーを、以下のようにグループ化することができる:1酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、2塩基性=リジン、アルギニン、ヒスチジン、3脂肪族=グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニンセリンおよびトレオニンは、任意選択的に、脂肪族ヒドロキシルとして個別に分類される、4芳香族=フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、5アミド=アスパラギン、グルタミン、ならびに6硫黄含有=システインおよびメチオニン。例えば、Biochemistry,2nded.,Ed.byL.Stryer,W.H.FreemanandCo.,1981を参照のこと。ポリペプチドのアミノ酸配列変化によって機能的ホモログが得られるかどうかを、変異ポリペプチドが野生型タンパク質に類似の様式で細胞中で応答する能力の評価によって容易に決定することができる。例えば、tim-3ポリペプチドのこのような変異形態を、例えば、Th1細胞によるサイトカイン分泌を調整する能力またはガレクチン-9などのtim-3リガンドに結合する能力について評価することができる。1つを超える置換が起こるポリペプチドを、同一の様式で容易に試験することができる。一定の態様では、本可溶性tim-3およびガレクチン-9ポリペプチドの機能的変異型または修飾形態には、可溶性ポリペプチの少なくとも一部および1つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。このような融合ドメインの周知の例には、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用なポリヒスチジン、Glu-Glu、グルタチオンSトランスフェラーゼGST、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG、および免疫グロブリン重鎖定常領域Fc、マルトース結合タンパク質MBPが含まれるが、これらに限定されない。アフィニティ精製の目的のために、グルタチオン樹脂、アミラーゼ樹脂、およびニッケルまたはコバルト結合樹脂などのアフィニティクロマトグラフィ用の関連マトリクスを使用する。当該分野で周知の別の融合ドメインは、緑色蛍光タンパク質GFPである。融合ドメインには、特定の抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列であるペプチドタグも含まれる。特定のモノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、FLAG、インフルエンザウイルス血球凝集素HA、およびc-mycタグが含まれる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって組換えタンパク質が遊離する第Xa因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ結合部位を有する。次いで、その後のクロマトグラフィによる単離によって遊離タンパク質を融合ドメインから単離することができる。本発明によって提供されるか本発明の方法で使用されるtim-3およびガレクチン-9ポリペプチドのいくつかは、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ADP-リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、スモイル化sumoylation、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が含まれる。結果として、修飾可溶性ポリペプチドは、脂質、ポリサッカリドもしくはモノサッカリド、およびリン酸塩などの非アミノ酸エレメントを含み得る。本発明の1つの特定の実施形態では、本tim-3およびガレクチン-9可溶性ポリペプチドの修飾形態は、本可溶性ポリペプチドの非タンパク質性ポリマーへの連結を含む。1つの特定の実施形態では、ポリマーは、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192、または同第4,179,337号に記載の様式のポリエチレングリコールPEG、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。PEGは、市販されているか当該分野で周知の方法によるエチレングリコールの開環重合によって調製することができる周知の水溶性ポリマーであるSandlerandKaro,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,Vol.3,pages138-161。用語PEGは、PEGのサイズまたは末端修飾と無関係に任意のポリエチレングリコール分子を含むように広範に使用され、式:X-OCH2CH2On-1CH2CH2OH1式中、nは20~2300であり、XはHまたは末端修飾基例えば、C1~4アルキルであるで示すことができる。1つの実施形態では、本発明のPEGは、片端が水酸基またはメトキシであるすなわち、XはHまたはCH3であるメトキシPEG。PEGは、結合反応に必要であるか、分子の化学合成に起因するか、分子の一部と最適な距離を得るためのスペーサーである化学基をさらに含むことができる。さらに、このようなPEGは、互いに連結した1つまたは複数のPEG側鎖からなり得る。1つを超えるPEG鎖を有するPEGを、多分岐PEGmultiarmedPEGまたは分岐PEGと呼ぶ。分岐PEGを、例えば、種々のポリオールグリセロール、ペンタエリスリオール、およびソルビトールが含まれるへのポリエチレンオキシドの付加によって調製することができる。例えば、四分岐four-armedbranchedPEGを、ペンタエリスリオールおよびエチレンオキシドから調製することができる。分岐PEGは、例えば、欧州特許第0473084号および米国特許第5,932,462号に記載されている。PEGの一形態には、リジンの第1級アミノ基を介して連結した2PEG側鎖PEG2が含まれるMonfardini,C.,etal.,BioconjugateChem.6199562-69。ペプチドまたはタンパク質へのPEG抱合は、一般に、PEGの活性化および活性化PEG-中間体の標的タンパク質/ペプチドへの直接的カップリングを含むか、リンカーに結合させ、その後の活性化して標的タンパク質/ペプチドにカップリングするAbuchowski,A.etal,J.Biol.Chem.,252,35711977andJ.Biol.Chem.,252,35821977,Zalipsky,etal.,andHarriset.al.,in:PolyethyleneglycolChemistry:BiotechnicalandBiomedicalApplications;J.M.Harrised.PlenumPress:NewYork,1992;Chap.21and22。当業者は、例えば、ペグ化tim-3またはガレクチン-9ポリペプチドをどのようにして治療で使用するか、所望の投薬量、循環時間、タンパク質分解耐性、免疫原性、および他の検討材料に基づいてPEGの適切な分子量を選択することができる。PEGおよびタンパク質特性を増強するためのその使用についての考察については、N.V.Katre,AdvancedDrugDeliveryReviews10:91-1141993を参照のこと。本発明の1つの実施形態では、リジンなどのtim-3またはガレクチン-9ポリペプチド上のアミノ基と反応させるために、PEG分子を活性化することができるBenchamC.O.etal.,Anal.Biochem.,131,251983;Veronese,F.M.etal.,Appl.Biochem.,11,1411985.;Zalipsky,S.etal.,PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,adrs9-110ACSSymposiumSeries4691999;Zalipsky,S.etal.,Europ.Polym.J.,19,1177-11831983;Delgado,C.etal.,BiotechnologyandAppliedBiochemistry,12,119-1281990。別の実施形態では、PEG分子を、tim-3またはガレクチン-9上のスルフヒドリル基にカップリングすることができるSartore,L.,etal.,Appl.Biochem.Biotechnol.,27,451991;Morpurgoetal.,Biocon.Chem.,7,363-3681996;Goodsonetal.,Bio/Technology19908,343;米国特許第5,766,897号。米国特許第6,610,281号および同第5,766,897号は、スルフヒドリル基にカップリングすることができる例示的反応性PEG種を記載している。いくつかの実施形態では、ペグ化tim-3またはガレクチン-9タンパク質は、N末端アミノ酸のαアミノ基に共有結合したPEG分子を含む。部位特異的N末端還元アミノ化は、Pepinskyetal.,2001JPET,297,1059および米国特許第5,824,784号に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を使用したタンパク質の還元的アミノ化のためのPEG-アルデヒドの使用は、米国特許第4,002,531号、Wiederetal.,1979J.Biol.Chem.254,12579、およびChamowetal.,1994BioconjugateChem.5,133に記載されている。6免疫試薬本発明は、さらに、tim-3ポリペプチドマウスおよびヒトポリペプチドが含まれるに結合することができる免疫試薬、好ましい実施形態では、可溶性tim-3に結合するが全長tim-3に結合しない免疫試薬を提供する。本発明の1つの態様は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。配列番号2はヒト可溶性tim-3タンパク質であり、配列番号13はヒト全長tim-3タンパク質である。したがって、このような抗体は可溶性ヒトtim-3に結合するが、全長ヒトtim-3に結合しない。本発明の別の態様は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合するが、配列番号14に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合しない単離抗体またはそのフラグメントを提供する。配列番号4はマウス可溶性tim-3タンパク質であり、配列番号14はマウス全長tim-3タンパク質である。したがって、このような抗体は可溶性マウスtim-3に結合するが、全長マウスtim-3に結合しない。可溶性tim-3に結合するが全長tim-3に結合しない特定の抗血清を、例えば、可溶性tim-3タンパク質中に含まれるが全長タンパク質に含まれないアミノ酸配列を有するペプチドに対する免疫原の生成によって生成することができる。このようなペプチドは、可溶性tim-3のIgVドメインと細胞内ドメインとの間の連結部をつなぐことができる。この連結部は、全長tim-3配列中に存在せず、IgVと細胞内ドメインとの間にムチンおよび膜貫通ドメインが挿入されている。1つの実施形態では、配列番号6の16アミノ酸のヒト可溶性tim-3ペプチドを、このような抗体を生成するための免疫原として使用する。マウスtim-3と等価な抗体を生成するために、配列番号8のペプチドを使用することができる。当業者は、C末端、N末端、またはその両方のさらなる残基での伸長または免疫原性もしくは可溶性を増強するための所望の短縮によってこのペプチドを操作することができる。さらに、キャリアに抱合するかさらなる所望の性質を付与するために、システイン基または他の残基をペプチドに付加することができる。同様に、全長tim-3に結合するが可溶性tim-3に結合しないペプチドを、その配列がtim-3の全長形態で見出されるが可溶性形態で見出されないペプチドを使用して生成することができる。例えば、このようなペプチドは、tim-3膜貫通ドメインの配列、より好ましくはtim-3ムチンドメインの配列に対応することができる。あるいは、これらのペプチドは、全長tim-3のIgVドメインとムチンドメインとの間または全長tim-3の膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の連結部をつなぐ配列を含み得る。ニワトリ、哺乳動物マウス、ハムスター、ヤギ、モルモット、またはウサギなどを、記載のペプチド変異型のいずれかの免疫原性形態例えば、抗体応答を誘発することができる免疫原性フラグメントで免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、キャリアへの抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。例えば、1つの本タンパク質のペプチジル部分を、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準的なELISAまたは免疫アッセイを抗原としての免疫原と共に使用して、抗体レベルを評価することができる。免疫化後に抗血清を得ることができ、所望ならば、標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を血清からさらに単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、免疫化動物から抗体産生細胞リンパ球を採取し、標準的な体細胞融合手順によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術KohlerandMilstein,Nature,256:495-497,1975によって最初に開発された並びにヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozbaretal.,ImmunologyToday,4:72,1983、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.pp.77-96,1985が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、tim-3ペプチドに特異的に反応性を示す抗体および単離されたモノクローナル抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができる。したがって、本発明の別の態様は、本明細書中に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。次いで、抗体を、全長tim-3および可溶性tim-3に対する結合特異性について試験することができる。例えば、ヒト可溶性tim-3のIgV細胞内ドメイン連結部に対応する配列番号6のペプチドに対して生成された抗体を膜へのtim-3ポリペプチドの固定および抗体を使用したウェスタンブロットの実施によってtim-3のいずれかの形態に結合する能力について試験することができる。当業者は、抗体がタンパク質に結合するかどうかを決定する任意の日常的方法を使用することができる。他の実施形態では、全tim-3可溶性タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成し、その後に可溶性tim-3のみに特異的な抗体を同定するためにこれらが全長tim-3タンパク質に結合するかどうかについてスクリーニングすることができる。本明細書中で使用される、用語抗体は、本明細書中に記載のタンパク質またはこのようなタンパク質を含む複合体とも特異的に反応するフラグメントが含まれることを意図する。従来技術を使用して抗体を断片化し、フラグメントを全抗体について上記と同一の様式でスクリーニングすることができる。例えば、Fab’2フラグメントを、ペプシンでの抗体の処理によって生成することができる。得られたFab’2フラグメントを、ジスルフィド結合を還元するように処理してFab’フラグメントを産生することができる。本発明の抗体は、二重特異性分子およびキメラ分子ならびに一本鎖scFv抗体が含まれることがさらに意図される。本抗体には、例えば、米国特許第5,585,098号に記載のように調製することができる三量体抗体およびヒト化抗体が含まれる。単鎖抗体も本発明の範囲内である。全てのこれらの抗体の修飾形態および抗体のフラグメントは、用語抗体に含まれることが意図される。7Tim-3/ガレクチン-9免疫調整薬の同定本発明の別の態様は、免疫調整応答を調整する薬剤の同定方法例えば、Tim-3とガレクチン-9との間の相互作用を調整する薬剤の同定方法などを提供する。1つの態様では、本発明は、ガレクチン-9などのtim-3リガンドへのtim-3の結合を遮断する薬剤の同定方法を提供する。この相互作用を遮断する薬剤は、tim-3の活性化を防止してTh1応答を増加させ、そして/またはTh2応答を減少させると予想されるであろう。別の態様では、本発明は、ガレクチン-9などのtim-3リガンドへのtim-3の結合を促進するか、tim-3へのリガンド結合を模倣する薬剤の同定方法を提供する。このような薬剤は、tim-3の活性化を促進してTh1応答を減少させ、そして/またはTh2応答を増加させると予想されるであろう。したがって、本明細書中に記載の方法を使用して同定した薬剤を使用して、必要とする被験体のTH1およびTH2応答を調整することができる。1つの態様では、本発明のtim-3/ガレクチン-9の同定により、X線結晶学、ニューロン回折、核磁気共鳴分光分析、および多の技術を使用して同定することができるtim-3およびガレクチン-9の構造の特徴に基づいたアゴニストおよびアンタゴニストの合理的デザインが容易になる。合理的薬物デザイン方法は、当該分野で周知であるChemicalandStructuralApproachestoRationalDrugDesign,DavidBWeiner,WilliamV.Williams,CRCPress1994;RationalDrugDesign:NovelMethodologyandPracticalApplications,Vol.719,AbbyL.ParrillEditor,AmericanChemicalSociety1999;Structure-basedLigandDesign,KlausGubernator,Wiley,JohnSons,Incorporated1998を参照のこと。本発明の関連する態様は、tim-3ポリペプチドおよび/またはガレクチン-9ポリペプチドを含む再構成タンパク質調製物を提供する。特定の実施形態では、再構成組成物中の少なくとも1のタンパク質がtim-3ポリペプチドおよびガレクチン-9ポリペプチドであり、少なくとも2、3、4、5、10、20、30、40、または50がより好ましい。1つの実施形態では、再構成組成物中のタンパク質は、組換えタンパク質である。本発明の別の態様は、tim-3とガレクチン-9との間の複合体の形成を促進または遮断する薬剤のスクリーニング方法を提供する。このような方法をインビトロまたは細胞中で行うことができ、タンパク質の一方および両方の全長タンパク質または可溶性フラグメントすなわち、膜貫通ドメインを欠くフラグメントなどのそのフラグメントを使用して実施することができる。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態では、tim-3のIgVおよび任意選択的にムチンドメインを含む可溶性タンパク質を使用する。種々の他の試薬を、スクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適なタンパク質-タンパク質結合を容易にし、そして/または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される塩、中性タンパク質例えば、アルブミン、界面活性剤などが含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌薬などのアッセイ効率を改善する試薬を使用することもできる。必要な結合を得るために、成分の混合物を任意の順序で添加する。任意の適切な温度典型的には、4°Cと40°Cとの間でインキュベーションを行う。最適な活性が得られるインキュベーション期間を選択するが、高処理スクリーニングが容易になるように最適化することもできる。典型的には、インビトロアッセイには0.1時間と1時間との間で十分である。本発明の薬剤の同定方法は、各ウェル中での異なる試験化合物または試験化合物群を使用したマルチウェルプレート例えば、96ウェルプレートでの化合物ラブラリーのスクリーニングに十分に適切である。特に、組み合わせライブラリーと共に本方法を使用することができる。これらの方法を、任意の許容可能な縮小方法によるアッセイ系24、48、96、または384ウェル/プレートなどのマルチウェルプレート、マイクロチップ、またはスライドが含まれるが、これらに限定されないに縮小することができる。有利にはより少量の試薬および他の材料を含むマイクロチップ支持体上で実施するためにアッセイサイズを減少させることができる。高処理スクリーニングの一助となるプロセスの任意の縮小は、本発明の範囲内である。本発明の1つの特定の態様は、Th1機能を調整する治療薬の同定方法を提供する。したがって、本発明の1つの態様は、1薬剤の非存在下でtim-3とガレクチン-9ポリペプチドが物理的に相互作用する条件下で、tim-3ポリペプチドまたはそのフラグメント、ガレクチン-9ポリペプチドまたはそのフラグメント、および薬剤を組み合わせる工程と、2薬剤が相互作用を妨害するかどうかを決定する工程と、任意選択的に、3相互作用を妨害する薬剤について、Th1細胞の活性化を促進する能力をさらに評価する工程とを含む、薬剤のTh1活性かを調整する能力を評価する方法を提供する。本発明の別の特定の態様は、a試験薬の存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程と、btim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤が同定されることとを含む、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合を調整する薬剤の同定方法を提供する。本発明の関連する特定の態様は、a試験薬の存在下でtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとを接触させる工程と、btim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの結合に対する試験薬の効果を決定する工程と、それにより、免疫応答を調整する薬剤が同定されることとを含む、免疫応答を調整する薬剤の同定方法を提供する。本明細書中に記載のtim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の相互作用の検出方法の1つの実施形態では、ガレクチン-9ポリペプチドは、i配列番号10のアミノ酸1~323、ii配列番号19のアミノ酸1~355、iii配列番号10のアミノ酸1~323と少なくとも90同一のアミノ酸配列、またはiii配列番号19のアミノ酸1~355と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、tim-3ポリペプチドは、i配列番号13のアミノ酸30~128、またはiii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの態様では、インビトロアッセイによって薬剤を同定する。種々のアッセイ形式が十分であり、本開示に照らして、本明細書中に明確に記載されていないアッセイ形式でさえも当業者に把握されている。タンパク質複合体の形成などの条件に近いアッセイ形式酵素活性を多数の異なる形式から得ることができ、無細胞系例えば、精製タンパク質または細胞溶解物に基づいたアッセイおよびインタクトな細胞を使用する細胞ベースのアッセイが含まれる。簡潔な結合アッセイを使用して、tim-3またはガレクチン-9に結合する薬剤を検出することもできる。このような結合アッセイは、tim-3ポリペプチドとガレクチン-9ポリペプチドとの間の相互作用の破壊によって作用する薬剤を同定することもできる。試験すべき薬剤を、例えば、細菌、酵母、または他の生物例えば、天然産物によって産生することができるか、化学的に産生することができるか例えば、ペプチド模倣物がふくまれる小分子、組換えによって産生することができる。tim-3およびガレクチン-9は膜貫通タンパク質であるので、tim-3とガレクチン-9との間の複合体形成を調整する薬剤を同定するために記載されたアッセイおよび方法の好ましい実施形態は、全長タンパク質よりもむしろこれらのタンパク質の可溶性形態を使用する。可溶性形態には、膜貫通ドメインを欠くものおよび/またはIgVドメインまたは同族結合パートナーに結合する能力を保持するそのフラグメントを含むものが含まれる。化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査される化合物数を最大にするための高処理アッセイが望ましい。無細胞系で実施され、精製もしくは半精製タンパク質または溶解物を使用して開発することができるアッセイを、しばしば、迅速に開発され、且つ試験化合物によって媒介される分子標的の変化を検出することが可能なように作製することができるという点で、一次スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性および/または生物学的利用能の影響を、一般に、インビトロ系で無視することができ、その代わり、アッセイは、主に、他のタンパク質との結合親和性の変化または分子標的の酵素的特性の変化として現れ得る分子標的に対する薬物の効果が注目される。本発明のアッセイの好ましいインビトロ実施形態では、再構成tim-3/ガレクチン-9複合体は、少なくとも半精製タンパク質の再構成混合物を含む。半精製は、再構成混合物で使用されたタンパク質が以前に他の細胞またはウイルスタンパク質から分離されていることを意味する。例えば、細胞溶解物と対照的に、tim-3/ガレクチン-9複合体形成に関与するタンパク質は、混合物中の他の全てのタンパク質と比較して少なくとも純度50で存在し、より好ましくは、純度90~95で存在する。本方法の一定の実施形態では、再構成タンパク質混合物は、再構成混合物がtim-3/ガレクチン-9複合体のアセンブリおよび/または分解を測定する能力を妨害するか変化させる可能性がある他のタンパク質細胞起源またはウイルス起源などを実質的に欠くような高度に精製されたタンパク質の混合によって誘導される。候補薬剤の存在下または非存在下におけるtim-3/ガレクチン-9複合体のアッセイを、反応物質の含有に適切な任意の容器中で行うことができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠沈管が含まれる。スクリーニングアッセイでは、試験薬の効果を、例えば、速度、定常状態、および/または反応終点に対する試験薬の効果によって評価することができる。本発明の1つの実施形態では、tim-3/ガレクチン-9複合体のアセンブリまたは安定性を妨害する能力に基づいて阻害剤を検出する薬物スクリーニングアッセイを得ることができる。例示的結合アッセイでは、目的の化合物を、tim-3/ガレクチン-9複合体を含む混合物と接触させる。tim-3/ガレクチン-9複合体の検出および定量により、2つのポリペプチド間の相互作用の阻害または増強に対する化合物の有効性を決定する手段が得られる。化合物の有効性を、種々の濃度の試験化合物を使用して得られたデータからの用量応答曲線の作成によって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを得るためのコントロールアッセイも行うことができる。コントロールアッセイでは、複合体形成を、試験化合物の非存在下で定量する。種々の技術によって複合体形成を検出することができる。例えば、複合体形成の調整を、例えば、検出可能に標識されたタンパク質例えば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識されたタンパク質、免疫アッセイ、またはクロマトグラフィ検出を使用して、定量することができる。表面プラズモン共鳴システムBiacoreInternationalABUppsala,Swedenから市販されているものなどを使用して、タンパク質-タンパク質相互作用を検出することもできる。本明細書中に記載のタンパク質およびペプチドを固定することができる。しばしば、タンパク質の1つの非複合体化形態からの複合体の分離を容易にし、アッセイの自動化に適応するようにペプチドおよびポリペプチドを固定することが望ましい。ペプチドおよびポリペプチドを、プレート、ビーズ、またはフィルターなどの任意の固体マトリクスに固定することができる。ペプチドまたはタンパク質を、ポリペプチドに結合する反応基を含むマトリクス上に固定することができる。あるいはまたは組み合わせて、タンパク質中のシステインなどの反応基は、マトリクスと反応して結合することができる。別の実施形態では、ポリペプチドは、高い親和性でビオチンと結合するストレプトアビジンとの融合タンパク質などのマトリクスに対する結合親和性が高い別のポリペプチドとの融合タンパク質として発現することができる。例示的実施形態では、タンパク質が不溶性マトリクスと結合するドメインが付加された融合タンパク質を得ることができる。例えば、グルタチオントランスフェラーゼと融合したtim-3のIgVドメインを含むGST-TIM-3-IgVドメイン融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズSigmaChemical,St.Louis,MOまたはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着させ、その後、ガレクチン-9もしくはそのフラグメント例えば、35S標識ポリペプチドおよび試験化合物と組み合わせ、複合体が形成される条件下でインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズを洗浄して任意の非結合相互作用タンパク質を除去し、直接または複合体の解離後の上清中例えば、マイクロタイタープレートを使用する場合のマトリクスビーズ結合放射性標識を測定した。あるいは、非結合タンパク質の洗い流し後、複合体をマトリクスから分離し、SDS-PAGEゲルによって分離し、マトリクス結合画分中に見出された相互作用ポリペプチドレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量することができる。上記アッセイの種々の修正形態が本発明の範囲内に含まれると理解される。例えば、タンパク質の役割を切り替えることができる--すなわち、ガレクチン-9タンパク質を固体支持体に固定し、tim-3タンパク質を含む溶液を結合したガレクチン-9タンパク質と接触させることができる。さらに、固定タンパク質または遊離タンパク質を、結合アッセイ前に試験化合物に曝露し、この前曝露効果をコントロールと比較して評価することができる。この様式で同定された化合物は、ガレクチン-9へのtim-3の結合またはその逆も阻害する。あるいは、tim-3およびガレクチン-9の混合後に試験化合物を添加することができる。このようなアッセイにおいて結合レベルを減少させるのに有効な化合物は、ガレクチン-9タンパク質からtim-3を分離するか、その逆を分離する。ウェスタンブロットに加えて、マルチウェルELISA型アプローチなどの他のより迅速な検出スキームを使用することができる。例えば、部分的に精製された例えば、上記のGST法tim-3タンパク質を、プレートへのタンパク質を含む溶液の導入およびプラスチックへのタンパク質の結合によってマルチウェルプレート例えば、96ウェルプレート中のウェルの下部に付着させることができる。次いで、過剰なタンパク質含有溶液を洗い流し、非特異的結合部位をブロッキングするためにブロッキング溶液例えば、ウシ血清アルブミンBSAを含むを導入する。次いで、プレートを数回以上洗浄し、ガレクチン-9タンパク質を含む溶液、実験コントロールに対するウェルの場合は試験化合物を添加する。異なるウェルは、異なる試験化合物、異なる濃度の同一の試験物質、異なるtim-3タンパク質もしくはガレクチン-9タンパク質、または異なる濃度のtim-3タンパク質もしくはガレクチン-9タンパク質を含み得る。さらに、この検出スキームに対する種々の修正形態を得ることができると理解される。例えば、マルチウェルプレートのウェルをtim-3タンパク質よりもむしろガレクチン-9タンパク質を含むポリペプチドでコーティングし、遊離tim-3タンパク質の添加時の結合相互作用をアッセイすることができる。ウェルを、固定すべきタンパク質の付着を増強し、そして/または非特異的結合レベルを減少させる化合物で予備コーティングすることもできる。例えば、ウェルを、グルタチオンを含むように誘導体化し、曝露された結合部位との既知の方向での固定化タンパク質の付着を促進するためにBSAで予備コーティングすることができる。このようなアッセイで有用な検出方法には、抗体ベースの方法すなわち、遊離タンパク質に指向する抗体、遊離タンパク質に組み込まれたレポーター部分蛍光標識などの直接検出、および近位proximityエネルギー移動法固定化タンパク質または固体支持体に組み込まれた分子の蛍光またはシンチレーションが得られる放射性遊離タンパク質などなどが含まれる。本発明のガレクチン-9タンパク質へのtim-3タンパク質の結合に影響を与えることができる化合物の同定方法のさらに別のバリエーションは、アフィニティバイオセンサー法の使用である。このような方法は、圧電効果、電気化学、または光学的方法偏光解析法、導光板、および表面プラズモン共鳴SPRなどに基づき得る。SPRは、実時間の分子相互作用のモニタリングに特に有利であり、上記考察の方法よりも2タンパク質間の結合相互作用に対する試験化合物の効果の高感度且つ総合的な分析が可能である。しかし、この利点は、マルチウェルプレートベースの方法と比較して技術の処理速度の低さによって幾らか打ち消される。上記のように、試験化合物は、化合物がガレクチン-9タンパク質へのtim-3タンパク質の結合に対して任意の効果を有しすなわち、化合物が結合を増減させる場合、効果が閾値を超える場合上記の本発明の実施者によって所望のレベルに設定されている;例えば、結合の数倍の増加または数倍の減少、tim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質の間の結合に効果を有するということができる。好ましくは、結合に対する効果は有意な効果である。本明細書中で使用される、用語有意な、詳細には、有意な効果は、標準的な統計的検定を使用して統計的に有意な比較される2群間の定量可能なパラメータの相違をいう。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態では、工程bは、試験薬の存在下でのtim-3/ガレクチン-9複合体の形成の適切なコントロールとの比較を含む。いくつかの実施形態では、適切なコントロールは、試験薬の非存在下での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の複合体の形成を含む。したがって、本発明の1つの実施形態では、a試験化合物の存在下でtim-3タンパク質をガレクチン-9タンパク質と接触させる工程と、btim-3タンパク質およびガレクチン-9タンパク質の結合に対する試験化合物の効果を決定する工程と、c結合範囲に対するその測定された効果が閾値レベルを超える場合に化合物が有効であると同定する工程とを含む、tim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質との間の結合に影響を与える化合物のスクリーニング方法を提供する。用語tim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質との間の結合に影響を与えるは、試験化合物により、その非存在下でのtim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質との間の結合コントロールと比較してその存在下でのtim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質との間の結合に相違が生じることを意味する。好ましくは、この結合の相違は、有意な相違である。特定の実施形態では、有意な相違は、少なくとも10、20、30、40、50、75、100、150、200、または500の結合の増加または減少を含む。化合物は、結合を阻害または増強することができるか、tim-3に対する影響の点からみて、アンタゴニスト、アゴニストとして作用することができるか、他のアゴニストまたはアンタゴニストの効果を増強する化合物として作用することができる。tim-3タンパク質とガレクチン-9タンパク質との間の結合に対する試験化合物の効果を定量するために使用される測定型は、アッセイおよび検出方法の型に依存し、当業者はこれを容易に決定することができる。例えば、検出手段としてウェスタンブロッティングを使用する生物学的スクリーニングを使用する場合、デンシトメトリーを使用して結合を測定することができる。デンシトメトリー値を正規化し、一連のコントロールサンプルすなわち、試験化合物を含まないの間のシグナルの変化量に基づいて閾値レベルを設定することができる。変化が小さいほど、正確に検出することができる試験化合物の影響が小さくなる。本発明のアッセイのなおさらなる実施形態では、本アッセイを補助する細胞培養技術を活用して、tim-3/ガレクチン-9複合体をホールセルで生成する。例えば、下記のように、哺乳動物細胞または酵母細胞などの真核細胞培養系でtim-3/ガレクチン-9複合体を構成することができる。当業者に公知の他の細胞を使用することができる。ホールセル中での本アッセイの利点には、インヒビターの治療的使用が必要であることにより密接に近い環境で機能的なインヒビターを検出する能力薬剤の細胞への侵入を増大させる能力が含まれるが含まれる。さらに、以下の例などのアッセイの一定のインビボでの実施形態は、試験薬を高処理で分析することができる。tim-3/ガレクチン-9複合体の成分は、アッセイを補助するために選択された細胞に対して内因性であり得る。あるいは、いくつかまたは全ての成分は、外因性供給源に由来し得る。例えば、組換え技術発現ベクターの使用などによるおよび融合タンパク質自体または融合タンパク質をコードするmRNAの微量注入によって、融合タンパク質を細胞に移入することができる。さらに別の実施形態では、一方および他方へのタンパク質の結合を破壊する薬剤のその後の検出のために、tim-3およびガレクチン-9ポリペプチドを使用して、捕捉アッセイを得ることができる米国特許第5,283,317号;Zervosetal.1993Cell72:223-232;Maduraetal.1993JBiolChem268:12046-12054;Barteletal.1993Biotechniques14:920-924;andIwabuchietal.1993Oncogene8:1693-1696も参照のこと。酵母2ハイブリッドタンパク質相互作用アッセイを使用して、ガレクチン-9タンパク質へのtim-3タンパク質の結合に影響を与える化合物を同定することもできる。アッセイは、ほとんどの真核生物転写アクチベーターがモジュラーであるすなわち、アクチベーターが、典型的には、転写を活性化する活性化ドメインおよびアクチベーターをDNA分子の適切な領域に局在化するDNA結合ドメインを含むという所見に基づく。2ハイブリッド系では、第1の融合タンパク質は、DNA結合ドメインに融合した相互作用タンパク質対の一方を含み、第2の融合タンパク質は転写活性化ドメインに融合した相互作用タンパク質対の他方を含む。2つの融合タンパク質は、同一細胞中で独立して発現し、融合物の相互作用タンパク質部分の間の相互作用は、レポーター遺伝子転写の活性化によって検出される転写活性化因子の融合を再構成する。少なくとも2つの異なる細胞ベースの2ハイブリッドタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ系を使用して、結合相互作用が評価され、そして/または相互作用タンパク質が同定されている。これらの両方は、融合ハイブリッドタンパク質対を使用し、対の一方が転写活性化因子の転写活性化ドメインに融合した2つの相互作用タンパク質の一方を含み、対の他方が転写活性化因子のDNA結合ドメインに融合した2つの相互作用タンパク質の他方を含む。別の実施形態では、一方のタンパク質は、細胞表面などの細胞上で発現するのに対し、他方のタンパク質は、複合体を形成するなどのために精製または部分精製して細胞と接触させた天然または組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、tim-3とガレクチン-9との間の結合相互作用を調整すると同定された薬剤を、実験の項に記載のアッセイなどの使用によってインビトロまたはインビボでのT細胞によるTh1/Th2応答の誘導に対するその効果などの機能的効果についてさらに評価することができる。いくつかの実施形態では、病態の動物モデルをさらに使用して、本明細書中に記載の方法自己免疫性脳脊髄炎実験モデル、2型真性糖尿病モデルとしてのKKAyマウス、およびファブリー病モデルαGALノックアウトなどを使用して同定した薬剤を特徴づける。使用することができるヒト疾患のさらなるマウスモデルについては、Bedelletal.,GenesDev.1997Jan1;111:11-43も参照のこと。試験薬または試験化合物は、試験されることが望まれる任意の薬剤または化合物であってよく、タンパク質抗体が含まれる、ペプチド、核酸RNA、DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸が含まれる、炭水化物、有機化合物、無機化合物、天然産物、ライブラリー抽出物、体液、およびtim-3とガレクチン-9ポリペプチドとの間の結合への影響について試験することが望ましい他のサンプルが含まれるが、これらに限定されない。特に、試験化合物は、tim-3タンパク質のペプチド模倣物またはそのフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、試験薬は精製または部分精製した薬剤であるのに対し、他の実施形態では、精製されていない。試験薬は、多数の化学的クラスを含むが、典型的には有機分子、好ましくは、分子量が50ダルトン以上で約2,500ダルトン未満の小有機化合物である。試験薬は、タンパク質との構造的相互作用水素結合が含まれるに必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも1つのアミン基、カルボニル基、水酸基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも2つの化学的官能基が含まれる。試験薬は、しばしば、1つまたは複数の上記官能基に置換された環式炭素構造もしくは複素環式構造および/または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。試験薬は、生体分子ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはその組み合せが含まれるが、これらに限定されない中に見出される。試験薬は、広範な種々の供給源合成化合物または天然化合物のライブラリーが含まれるから得られる。例えば、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および直接的な合成に多数の手段無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチド発現が含まれるが利用可能である。小有機物/ペプチドのライブラリーを、Bondelleetal.1995TrendsAnal.Chem.14:83;theAffymaxU.S.Patents5,359,115and5,362,899;Ellmanの米国特許第5,288,514号;Stilletal.のPCT公開WO94/08051号;Chenetal.1994JACS116:2661;Kerretal.1993JACS115:252;PCT公開W092/10092号、W093/09668号、およびWO91/0787号;ならびにLeaneretal.のPCT公開W093/20242号などに記載の組み合わせ技術を使用して生成することができる。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であるか、容易に産生される。あるいは、天然または化学的に産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修飾し、これを使用して、組み合わせライブラリーを産生することができる。公知の薬物を、直接または無作為な化学修飾アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などに供して、例えば、構造アナログを生成することができる。他の実施形態では、試験薬は、tim-3、ガレクチン-9、またはそのフラグメントのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくかこれらに由来する化合物である。本発明で使用することができるペプチド模倣物を、非天然アミノ酸、高次構造の制限、等比体積置換などを使用した公知のアナログペプチド配列の構造修飾によって得ることができる。本ペプチド模倣物は、ペプチド合成構造と非ペプチド合成構造との間の構造上の空間の連続体continuumを構成する。したがって、アナログペプチド模倣物は、薬理作用団の描写および親アナログペプチド活性を有する非ペプチド化合物へのペプチドの翻訳の補助で有用であり得る。さらに、本開示から明らかなように、本tim-3配列およびガレクチン-9配列のミメトープmimetopeを提供することができる。このようなペプチド模倣物は、非加水分解性例えば、プロテアーゼまたは対応するペプチドを分解する他の生理学的条件に対する安定性の増加、特異性および/または潜在性の増加、ならびにペプチド模倣物の細胞内局在化のための細胞透過性の増加などの特性を有し得る。例示を目的として、本発明のペプチドアナログを、例えば、ベンゾジアゼピン例えば、Freidingeretal.inPeptides:ChemistryandBiology,G.R.Marshalled.,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988を参照のこと、置換γラクタム環Garveyetal.inPeptides:ChemistryandBiology,G.R.Marshalled.,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988,pal23、C-7模倣物Huffmanetal.inPeptides:ChemistryandBiology,G.R.Marshalled.,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988,p.105、ケト-メチレン偽ペプチドEwensonetal.1986JMedChem29:295;andEwensonetal.inPeptides:StructureandFunctionProceedingsofthe9thAmericanPeptideSymposiumPierceChemicalCo.Rockland,IL,1985、αターンジペプチドコアNagaietal.1985TetrahedronLett26:647;andSatoetal.1986JChemSocPerkinTrans1:1231、α-アミノアルコールGordonetal.1985BiochemBiophysResCommun126:419;andDannetal.1986BiochemBiophysResCommun134:71、ジアミノケトンNatarajanetal.1984BiochemBiophysResCommun124:141、およびメチレンアミノ修飾Roarketal.inPeptides:ChemistryandBiology,G.R.Marshaled.,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988,pl34を使用して生成することができる。また、一般に、SessionIII:Analyticandsyntheticmethods,inPeptides:ChemistryandBiology,G.R.Marshalled.,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988を参照のこと。本アナログペプチド模倣物を生成するために実施することができる種々の側鎖置換に加えて、本発明は、詳細には、ペプチド二次構造の高次構造が制限された模倣物の使用を意図する。ペプチドのアミド結合の多数の代理物が開発されている。頻繁に使用されているアミド結合の代理物には、以下の基が含まれる:itrans-オレフィン、iiフルオロアルケン、iiiメチレンアミノ、ivホスホンアミド、およびvスルホンアミド。いくつかの実施形態では、試験薬がtim-3またはガレクチン-9ポリペプチドの間の結合に影響を与えることができるかどうかを決定する前にtim-3またはガレクチン-9タンパク質に結合する能力について試験薬を予備選択する。1つの実施形態では、試験薬を、tim-3またはガレクチン-9ポリペプチに結合する能力について最初に選択することができる。試験薬を、ペプチドライブラリーまたはファージディスプレイライブラリーなどの試験薬のライブラリーのスクリーニングによって予備選択することができる。8組成物、処方物、およびパッケージング本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載の核酸、ポリペプチド、または薬剤を含む組成物を提供する。1つの実施形態では、組成物は、薬学的組成物である。本発明で使用される薬学的組成物を1つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用した従来の様式で処方することができる。したがって、化合物およびその生理学的に許容可能な塩および溶媒和物を、例えば、エアゾール、静脈内、経口、または局所経路による投与のために処方することができる。投与は、病変内、腹腔内、皮下、筋肉内、または静脈内への注射、注入、リポソーム媒介送達、局所、髄腔内、歯内嚢、直腸、気管支内、鼻腔内、経粘膜、腸内、経口、眼内、または耳内送達を含み得る。本発明の例示的組成物は、任意選択的に許容可能な賦形剤を含むリポソーム系などの送達系と混合したRNAiを含む。好ましい実施形態では、注射のために組成物を処方する。技術および処方を、一般に、Remmington’sPharmaceuticalSciences,MeadePublishingCo.,Easton,PAで見出すことができる。全身投与のために、注射筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が含まれるが好ましい。注射のために、本発明の化合物を、溶液、好ましくは、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。さらに、化合物を固体形態で処方し、使用直前に再溶解するか再懸濁することができる。経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、結合剤例えば、α化pregelatinisedトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース、充填剤例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム、潤滑剤例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ、崩壊剤例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム、湿潤剤例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなどの薬学的に受容可能な賦形剤を使用した従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。錠剤をコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができるか、使用前に水または他の適切な賦形剤で構成するための乾燥生成物として提供することができる。このような液体調製物を、懸濁剤例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂、乳化剤例えば、レシチンまたはアカシア、非水性賦形剤例えば、ationdオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分留植物油、および防腐剤例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸などの薬学的に受容可能な添加剤を使用した従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味物質、着色料、および甘味料を含み得る。活性化合物を制御放出するための経口投与用調製物を適切に処方することができる。口腔投与のために、組成物は、従来の様式で処方した錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入による投与のために、本発明の化合物を、適切な高圧ガス例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスを使用した圧縮パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で都合良く送達させる。圧縮エアゾールの場合、一定量を送達させるバルブを準備することによって投薬単位を決定することができる。例えば、吸入器または注入器で使用するための化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含むゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。注射例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のための化合物を処方することができる。注射用処方物を、防腐剤を添加した単位投与形態例えば、アンプルまたは複数回投与用コンテナmulti-dosecontainerで示すことができる。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液、乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤例えば、滅菌無発熱物質水で構成するための粉末形態であり得る。例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の座剤の基剤を含む座剤または保持浣腸剤などの直腸組成物に化合物を処方することもできる。前記の処方物に加えて、デポー調製物として化合物を処方することもできる。このような長期作用処方物を、移植例えば、皮下または筋肉内または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切な高分子もしくは疎水性材料例えば、許容可能なオイル中の乳濁液、イオン交換樹脂、やや溶けにくい誘導体例えば、やや溶けにくい塩を使用して処方することができる。経粘膜手段または経皮手段によって全身投与を行うこともできる。経粘膜投与または経皮投与のために、処方において透過すべきバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を使用して、透過を容易にすることができる。経粘膜投与を、鼻内噴霧または座剤によって行うことができる。局所投与のために、本発明のオリゴマーを、当該分野で一般的に公知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに処方する。治癒を促進するために、洗浄液を局所的に使用して損傷または炎症を治療することができる。組成物を、所望ならば、有効成分を含む1つまたは複数の単位投薬形態を含み得るパックまたは分注デバイス中に提供することができる。パックは、例えば、ブリスター包装などの金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたは分注デバイスに投与説明書を同封することができる。核酸投与を含む治療のために、本発明のオリゴマーを、種々の投与様式全身および局所もしくは局部投与が含まれるのために処方することができる。技術および処方を、一般に、Remmington’sPharmaceuticalSciences,MeadePublishingCo.,Easton,PAに見出すことができる。全身投与のために、注射筋肉内、静脈内、腹腔内、節内intranodal、および皮下への注射が含まれるが好ましく、本発明のオリゴマーを、溶液、好ましくは、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。さらに、オリゴマーを固体形態に処方し、使用直前に再溶解または再懸濁することができる。凍結乾燥形態も含まれる。経粘膜手段または経皮手段によって全身投与を行うこともできるか、化合物を経口投与することができる。経粘膜投与または経皮投与のために、処方において透過すべきバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は当該分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のための胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、界面活性剤を使用して、透過を容易にすることができる。経粘膜投与を、鼻内噴霧または座剤によって行うことができる。経口投与のために、オリゴマーを、カプセル、錠剤、およびトニックなどの従来の経口投与形態に処方する。局所投与のために、本発明のオリゴマーを、当該分野で一般的に公知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに処方する。本発明の薬剤および組成物の毒性および治療有効性を、例えば、LD5050の集団が死滅する用量およびED5050の集団で治療的に有効な用量の決定のための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手段によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として示すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することができるが、非感染細胞への潜在的損害を最小にし、それにより副作用を軽減するための罹患組織部位にこのような化合物をターゲティングする送達系をデザインするように注意すべきである。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための投薬量範囲の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、ED50を含む循環濃度の範囲内であり、ほとんど毒性がないか全く毒性がないことが好ましい。投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物について、細胞培養アッセイから治療有効用量を最初に評価することができる。細胞培養において決定されたIC50すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を決定することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤の有効量は、約1mg/kg被験体体重と約50mg/kg被験体体重との間である。1つの実施形態では、薬剤の有効量は、約2mg/kg被験体体重と約40mg/kg被験体体重との間である。1つの実施形態では、薬剤の有効量は、約3mg/kg被験体体重と約30mg/kg被験体体重との間である。1つの実施形態では、薬剤の有効量は、約4mg/kg被験体体重と約20mg/kg被験体体重との間である。1つの実施形態では、薬剤の有効量は、約5mg/kg被験体体重と約10mg/kg被験体体重との間である。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を1日に少なくとも1回投与する。1つの実施形態では、薬剤を毎日投与する。1つの実施形態では、薬剤を1日おきに投与する。1つの実施形態では、薬剤を6~8日毎に投与する。1つの実施形態では、薬剤を毎週投与する。化合物および/または薬剤の被験体への投与量に関して、当業者は、適量の決定方法を理解している。本明細書中で使用される、用量または量は、障害を抑制するか、障害を治療するか、被験体を治療するか、被験体が障害を罹患するのを防止するのに十分な量であろう。この量を有効量とみなすことができる。当業者は、被験体治療のための必要量を決定するために簡潔な適定実験を行うことができる。本発明の組成物の用量は、被験体および使用される特定の投与経路に依存して変化する。1つの実施形態では、投薬量は、約0.1μg/kg被験体体重~約100,000μg/kg被験体体重の範囲であり得る。組成物に基づいて、連続ポンプなどによって連続的に送達させるか定期的に送達させることができる。例えば、1つまたは複数の個別の事象で送達させることができる。当業者は、過度に実験することなく特定の複数回投与の所望の間隔を決定することができる。有効量は、特に、化合物のサイズ、化合物の生分解性、化合物の生体活性、および化合物の生物学的利用能に基づき得る。化合物が迅速に分解されない場合、生物的に利用できる場合、および活性が高い場合、少量で有効である。有効量は当業者に公知であり、化合物の形態、化合物のサイズ、および化合物の生体活性にも依存する。当業者は、バイオアッセイにおいて生体活性を決定し、それにより、有効量を決定するために、化合物に対して経験的活性試験を日常的に行うことができる。上記方法の1つの実施形態では、化合物の有効量は、約1.0ng/kg被験体体重~約100mg/kg被験体体重である。上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約100ng/kg被験体体重~約50mg/kg被験体体重である。上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約1μg/kg被験体体重~約10mg/kg被験体体重である。上記方法の別の実施形態では、化合物の有効量は、約100μg/kg被験体体重~約1mg/kg被験体体重である。化合物、組成物、および/または薬剤の投与時期に関して、当業者は、このような化合物および/または薬剤をいつ投与するのかを決定することができる。投与は、一定期間連続的であるか、周期的および特定の期間投与することができる。化合物を、1時間毎、毎日、毎週、毎月、毎年例えば、徐放形態送達させるか、一度に送達させることができる。送達は、一定期間の連続的送達例えば、静脈内送達であり得る。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を、1日に少なくとも1回投与する。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を、毎日投与する。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を、1日おきに投与する。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を、6~8日毎に投与する。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、薬剤を、毎週投与する。本発明の別の態様は、itim-3のIgVドメインを含むポリペプチドと、ii腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、精巣癌、消化管癌、および胃癌からなる群から選択される増殖性状態に罹患した被験体への組成物の投与についての説明書とを含む薬学的パッケージを提供する。9免疫応答の制御方法本発明の1つの態様は、免疫応答の調整方法Th1またはTh2応答、免疫寛容、および移植免疫寛容の調整方法などであるが、これらに限定されないを提供する。本明細書中で使用される、用語調整は、増加または減少をいう。本出願の免疫応答の制御方法は、可溶性tim-3を含む融合タンパク質を使用したtim-3リガンドの判定により、Th1応答が増強され、末梢性寛容の確立が取り消され、移植免疫寛容が減少するという発見に一部基づく。それに反して、tim-3リガンドとして出願人によって発見された哺乳動物へのガレクチン-9の投与により、Th1応答が減少する。本発明の別の態様は、治療有効量のtim-3、ガレクチン-9、またはその両方の発現または活性を減少させる薬剤すなわち、tim-3またはガレクチン-9のアゴニストまたはガレクチン-9へのtim-3の結合を増加させる薬剤を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体の免疫寛容を減少させ、Th1媒介免疫応答を減少させ、そして/またはTh2媒介免疫応答を減少させる方法を提供する。tim-3活性の減少による免疫応答の減少およびTh1媒介応答の増加は、癌免疫療法で有利である。免疫系は、腫瘍抗原を寛容し得るので、腫瘍が免疫監視を回避することができる。本発明の1つの態様では、tim-3活性を減少させる薬剤を、増殖性状態を罹患した被験体に投与する。用語癌および腫瘍は交換可能に使用され、両用語は増殖性状態をいう。1つの実施形態では、癌は、カポジ肉腫、慢性白血病、前立腺癌、乳癌、肉腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、リンパ腫、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭扁平上皮細胞癌、および消化管癌または胃癌からなる群から選択される。別の実施形態では、癌は、基底細胞癌、胆道癌;膀胱癌;骨の癌;脳腫瘍およびCNS癌;乳癌;子宮頸癌;絨毛癌;結腸直腸癌;結合組織癌;消化器管癌;子宮内膜癌;食道癌;眼球の癌;頭頸部癌;胃癌;上皮内新生物;腎臓癌;喉頭癌;白血病;肝臓癌;肺癌例えば、小細胞および非小細胞;リンパ腫ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫が含まれる;黒色腫;骨髄腫;神経芽細胞腫;口腔癌例えば、唇、舌、口、および咽頭;卵巣癌;膵臓癌;前立腺癌;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫;直腸癌;気管支癌;肉腫;皮膚癌;胃癌;精巣癌;甲状腺癌;子宮癌;泌尿器系の癌、並びに他の癌腫および肉腫からなる群から選択される。別の実施形態では、tim-3活性の阻害によってTh1活性化を増加させるために使用される薬剤を使用して、被験体のワクチンに対する免疫応答を増強する。1つの特定の実施形態では、ワクチンに対する免疫応答を増強するために、tim-3活性を阻害する薬剤tim-3IgVドメインを含むポリペプチドまたは全長tim-3とtim-3リガンドとの間の複合体形成を阻害する抗体などをワクチンと共に投与する。ワクチンには、ウイルス感染または細菌感染の防止を意図するワクチンが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ワクチン接種前に薬剤を投与し、他の実施形態では、ワクチンを被験体に投与した後に薬剤を投与する。さらに別の態様では、本発明は、tim-3、ガレクチン-9、またはその両方の発現または活性を減少させる薬剤すなわち、tim-3アンタゴニストまたはガレクチン-9アンタゴニストの投与またはtim-3へのガレクチン-9の結合を減少させる薬剤を被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体のTh2関連応答例えば、アレルギー反応または喘息反応を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させる方法を特徴とする。本明細書中で使用される、Th2媒介障害は、Th2免疫応答の発生に関連する疾患をいう。本明細書中で使用される、Th2免疫応答は、少なくとも1つのTh2-サイトカインまたはTh2-抗体の誘導をいう。好ましい実施形態では、1つを超えるTh2-サイトカインまたはTh2-抗体が誘導される。したがって、Th2媒介疾患は、Th2応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも1つのTh2-サイトカインもしくはTh2-抗体の部分的もしくは完全な誘導または少なくとも1つのTh2-サイトカインもしくはTh2-抗体レベルの増加をいう。これらの障害は当該分野で公知であり、例えば、喘息およびアレルギーアレルギー性鼻炎、消化管アレルギー食物アレルギーが含まれるが含まれるなどのアトピー性病態、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、一定の病原体感受性蠕虫感染症例えば、リーシュマニア症などおよび一定のウイルス感染症ヒト免疫不全ウイルスHIVが含まれる、一定の細菌感染症結核および結節性らいが含まれるが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、Th2関連応答は、喘息またはアレルギーである。本明細書中で定義される、喘息は、長期間にわたる個体の可逆的気流の制限である。喘息は、気道壁中の好酸球、肥満細胞、好塩基球、およびCD25Tリンパ球などの細胞の存在によって特徴づけられる。種々の伝達および生物学的エフェクター特性を有するサイトカイン活性のために、これらの細胞は密接に相互作用する。ケモカインは、細胞を炎症部位に誘引し、サイトカインはケモカインを活性化し、粘膜の炎症および損傷が起こる。この過程の慢性化により、基底膜の肥厚および線維形成などの二次的変化が起こる。この疾患は、種々の刺激に対する気道の過剰な反応性の増加および気道炎症によって特徴づけられる。喘息と診断された患者は、一般に、長期間複数の徴候喘鳴、喘息性発作、およびメタコリン攻撃誘発に対する陽性反応すなわち、約4mg/ml未満のメタコリン攻撃誘発に対するPC20が含まれるを示す。診断ガイドラインは、例えば、NationalAsthmaEducationProgramExpertPanelGuidelinesforDiagnosisandManagementofAsthma,NationalInstitutesofHealth,1991,Pub.No.91-3042に見出すことができる。本明細書中で使用される、用語アレルギーは、物質アレルゲンに対して獲得された過敏症いう。アレルギー性病態には、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、皮膚の掻痒蕁麻疹、および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性病態が含まれる。アレルギーを有する被験体は、アレルゲンに反応してアレルギー反応を示すか示すリスクのある被験体である。アレルゲンは、疑いのある被験体にアレルギー反応または喘息反応を誘導することができる物質をいう。アレルゲンのリストは多数存在し、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、埃、真菌の胞子、および薬物例えば、ペニシリンが含まれ得る。目的のアレルゲンには、苺、ピーナッツ、乳タンパク質、卵白などの食品中に見出される抗原が含まれる。目的の他のアレルゲンには、花粉、動物の鱗屑、家ダニのフンなどの種々の大気中アレルゲンが含まれる。分子クローニングされたアレルゲンには、ヤケヒョウダニDerP1;ホソムギ花粉由来のLolpl-V;多数の昆虫毒キバハリアリおよびミルメシアピロスラ由来の毒;セイヨウミツバチのハチ毒ホスホリパーゼA2PLA2および抗原5S;ススメバチであるベスプラマクリフロンスおよびホワイトフェースドホーネットwhitefacedhornetであるドリコベスプラマクラタが含まれる;多数の花粉タンパク質カバノキ花粉、ブタクサ花粉、パロールParolヒカゲミズの主なアレルゲン、および交差反応アレルゲンParj1パリエタリアジュダイカ由来が含まれる、および他の大気花粉オリーブ、アルテミシア属、イネ科などが含まれる。目的の他のアレルゲンは、吸血節足動物例えば、双翅目蚊ハマダラカ属、ヤブカ属、ハボシカ属、イエカ属;ハエサシチョウバエ属、ヌカカ属特に、ブヨ、メクラアブ、およびヌカカが含まれる;ダニカクマダニ属、カズキダニ属、オトビウス属;ノミ例えば、ノミ目ネズミノミ属、ヒトノミ属、およびネコノミが含まれるに起因するアレルギー性皮膚炎を担うアレルゲンである。特定のアレルゲンは、多糖類、脂肪酸部分、タンパク質であり得る。本発明の1つの特定の態様は、治療有効量のポリペプチドを被験体に投与する工程と、前記ポリペプチドが、i配列番号10、ii配列番号18、iii配列番号10と少なくとも90同一であるか類似するアミノ酸配列、iv配列番号18と少なくとも90同一であるか類似するアミノ酸配列を含むこととを含む、被験体のアトピー性疾患を予防するか罹患する可能性を減少させる方法を提供する。本発明によれば、tim-3またはガレクチン-9活性を調整するか、tim-3とガレクチン-9との間の複合体形成を調整する薬剤を、免疫応答の調整または障害または病態の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、手術、照射、または化学療法を使用して従来のように治療することができる。その後、微小転移の休止を延長して任意の残存する原発性腫瘍を安定化するために、可溶性tim-3-IgFc融合タンパク質などのtim-3活性を減少させる薬剤を被験体に投与することができる。いくつかの実施形態では、tim-3活性を減少させる薬剤は、全長tim-3の発現と比較して可溶性tim-3の発現を優先的に阻害する。いくつかの実施形態では、ガレクチン-9へのtim-3の結合を遮断する薬剤は、抗体またはその抗原に対する高い結合親和性を保持した抗体フラグメントなどの抗体フラグメントである。このような抗体は、ガレクチン-9またはtim-3のいずれか、特にtim-3の細胞外ドメインへの結合によってtim-3/ガレクチン-9結合を遮断することができる。特定の実施形態では、薬剤は、配列番号13のアミノ酸30~128を含むポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントである。当業者は、tim-3細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を生成することができ、この抗体を、本発明によって提供された方法を使用して、全長tim-3へのtim-3リガンドガレクチン-9などの結合を遮断する能力についてさらに試験することができる。好ましい抗体は、抗体自体が全長tim-3活性のアクチベーターとして作用せずに全長tim-3とそのリガンドとの間の結合相互作用を遮断するであろう。実験手順に記載のアッセイを使用して、当業者は、免疫化マウスへの抗体の投与およびマウスの脾臓から単離したTh1細胞によるインビトロ増殖およびサイトカイン産生についての試験などによって候補抗体がtim-3活性のアクチベーターであるかどうかを決定することができる。免疫寛容を減少させるための好ましい抗体は、tim-3へのtim-3リガンドの結合を遮断するが、tim-3の活性化を誘導しないすなわち、Th1細胞増殖およびサイトカイン放出を抑制しないであろう。1つの実施形態では、tim-3機能を阻害するために使用される薬剤は、抗体を含む。1つの実施形態では、抗体は、tim-3のIgVドメイン配列番号13のアミノ酸30~128に結合して全長tim-3へのtim-3リガンドの結合を遮断する。1つの実施形態では、tim-3リガンドはガレクチン-9である。したがって、別の実施形態では、抗体はガレクチン-9に結合する。結合時、抗体は、ガレクチン-9と全長tim-3との間の物理的相互作用を防止することができる。別の実施形態では、被験体におけるガレクチン-9への全長tim-3の結合を遮断する薬剤は、内因性tim-3とガレクチン-9への結合を競合する組換えtim-3ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、薬剤は、i配列番号13のアミノ酸30~128またはii配列番号13のアミノ酸30~128と少なくとも90同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ポリペプチド薬は、ペグ化され、そして/またはヒト血清アルブミンまたは免疫グロブリンのFcドメインとの融合タンパク質である。別の実施形態では、被験体においてTh1細胞を活性化するか免疫寛容を減少させる方法で使用される薬剤は、配列番号2のアミノ酸配列を有する可溶性tim-3ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、薬剤は、tim-3のIgVドメイン配列番号11のアミノ酸30~128を含む。さらに別の実施形態では、可溶性tim-3ポリペプチドは、tim-3のIgVドメイン、任意選択的にtim-3の細胞内ドメイン、および免疫グロブリンのFcドメインを含むが、tim-3のムチンドメインやtim-3の膜貫通ドメインを含まない。好ましい実施形態では、これらのポリペプチドはガレクチン-9に結合する。これらのポリペプチドの変異型tim-3リガンドの結合を増加させる変異型などを使用することもできる。いくつかの実施形態では、tim-3活性を減少させる薬剤は、i配列番号13のアミノ酸30~128を含むポリペプチドのiiガレクチン-9ガレクチン-9の長鎖形態または単鎖形態などへの結合を阻害する。出願人は、ラクトースがtim-3へのガレクチン-9の結合を阻害することを発見した。したがって、1つの実施形態では、ガレクチン-9への全長tim-3の結合を阻害する薬剤は、ラクトースまたはペクチン/修飾ペクチンなどの炭水化物を含む。修飾ペクチンは、米国特許公開公報2003/0004132号および同第2002/0187959号に記載されている。別の実施形態では、Th1応答を促進し、そして/またはTh2応答を阻害するように活性化するための本明細書中に記載の方法で使用される薬剤は、全長tim-3ポリペプチドまたはガレクチン-9などのtim-3リガンドの発現レベルを減少させる。1つの実施形態では、薬剤は、本発明によって提供された二本鎖RNA種であり、全長tim-3またはtim-3リガンドガレクチン-9などを指示するものが含まれる。好ましい実施形態では、Th1応答を促進し、そして/またはTh2応答を阻害するように活性化するための本明細書中に記載の方法で使用される薬剤またはtim-3機能を阻害するために使用される薬剤は、例えば、分子量が約2,000ダルトン未満であり、tim-3のガレクチン-9などのそのリガンドへの結合を遮断するペプチドまたはオリゴヌクレオチド以外の有機小分子である。このような薬剤を、例えば、本発明によって提供された方法を使用して同定することができる。別の実施形態では、tim-3機能を阻害する薬剤は、tim-3に結合するガレクチン-9の一部の構造を模倣したペプチドまたはペプチド誘導体である。このようなペプチドは、tim-3とそのリガンドとの間の機能的相互作用の防止によって拮抗競合物として作用することができる。1つの実施形態では、リガンドはガレクチン-9である。本発明によれば、その発現レベルの減少またはtim-3/リガンド複合体の形成の減少などによってtim-3活性を減少させる薬剤を、増殖性状態の治療のための他の組成物および手順と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、手術、照射、または化学療法を使用して従来のように治療することができ、その後、微小転移の休止を延長して任意の残存する原発性腫瘍を安定化するために、tim-3またはガレクチン-9などのtim-3リガンドに対する二本鎖RNA、抗体、または小分子インヒビターを投与することができる。本発明の別の態様は、tim-3、ガレクチン-9、またはその両方の発現または活性を増加させるか、ガレクチン-9へのtim-3の結合を増加させる有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、このような治療を必要とする被験体におけるTh1媒介障害を治療または予防するか、罹患する可能性を減少させる方法を提供する。本発明はまた、被験体のTh1媒介免疫応答を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させるのに十分な量でtim-3またはガレクチン-9アゴニスト本明細書中に記載のtim-3またはガレクチン-9アゴニストを被験体に投与する工程を含む、必要とする被験体のTh1関連応答を減少させるか、阻害するか、抑制するか、改善するか、遅延させる方法を特徴とする。Th2媒介障害と対照的に、本明細書中で使用される、Th1媒介障害は、Th1免疫応答の発生に関連する疾患をいう。本明細書中で使用される、Th1免疫応答は、少なくとも1つのTh1-サイトカインまたはTh1の誘導をいう。好ましい実施形態では、Th1サイトカインまたはTh1-抗体を誘導する。したがって、Th1媒介疾患は、Th1応答の誘導に関連する疾患であり、少なくとも1つのTh1-サイトカインまたはTh1-抗体の部分的もしくは完全な誘導または少なくとも1つのTh1-サイトカインまたはTh1-抗体レベルの増加をいう。これらの障害は当該分野で公知であり、例えば、自己免疫特に、臓器特異的疾患、乾癬、Th1炎症障害、細胞外寄生虫感染症例えば、蠕虫に対する応答、固形臓器同種移植片拒絶例えば、急性腎臓同種移植片拒絶、B型肝炎HBV感染に関する症状例えば、HBV急性期または回復期、慢性C型肝炎HCV感染、インスリン依存性糖尿病IDDM、多発性硬化症MS、亜急性リンパ球性甲状腺炎無痛性甲状腺炎、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、急性移植片対宿主病GvHD、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ウェゲナー病、炎症性筋障害、シェーグレン症候群、ベーゲット症候群、関節リウマチ、ライム関節炎、および原因不明の再発性流産が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Th1関連障害は、アテローム性動脈硬化症、細胞外寄生虫感染症、B型肝炎HBV感染に関する症状例えば、HBV急性期または回復期、慢性C型肝炎HCV感染、無痛性甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、糸球体腎炎、抗糸球体基底膜病、ウェゲナー病、炎症性筋障害、シェーグレン症候群、ベーゲット症候群、関節リウマチ、および原因不明の再発性流産からなる群から選択される。本明細書中に記載のTh1媒介免疫応答を減少させる方法は、被験体の自己免疫疾患を治療するのに特に有利であり得る。1つの実施形態では、本発明の被験体のTh1応答を減少させる方法は、自己免疫疾患を罹患しているか発症リスクが高い被験体に適用する。自己免疫疾患は、被験体自身の抗体が宿主組織と反応するか免疫エフェクターT細胞が内因性自己ペプチドと自己反応して組織を破壊する疾患クラスである。したがって、自己抗原と呼ばれる被験体自身の抗原に対して免疫応答が開始される。本明細書中で使用される、自己抗原は、正常な宿主組織の抗原をいう。正常な宿主組織は、癌細胞を含まない。したがって、自己免疫疾患という状況において、自己抗原に対して開始された免疫応答は望ましくない免疫応答であり、正常組織の破壊および損傷に寄与するのに対して、癌抗原に対して開始される免疫応答は望ましい免疫応答であり、腫瘍または癌の破壊に寄与する。自己免疫疾患には、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスSLE、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症MG、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡例えば、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合性結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、インスリン抵抗性、および自己免疫性真性糖尿病1型真性糖尿病;インスリン依存性真性糖尿病が含まれるが、これらに限定されない。最近、自己免疫疾患は、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病も含むと認識されている。1つの特定の実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、I型糖尿病、橋本甲状腺炎、クローン病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、胃炎、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ増殖性症候群ALPS、自己免疫性ブドウ膜網膜塩、糸球体腎炎、ギヤン-バレー症候群、乾癬、および重症筋無力症からなる群から選択される。別の実施形態では、Th1媒介障害は、移植片対宿主病HVGDである。関連する実施形態では、被験体は、臓器または組織移植レシピエントである。本発明のさらに別の態様は、tim-3もしくはガレクチン-9の機能、発現、またはガレクチン-9へのtim-3の結合を増加させる治療有効量の薬剤を被験体に投与する工程を含む、被験体の移植免疫寛容を増加させる方法を提供する。1つの特定の実施形態では、被験体は、同種移植片のレシピエントである。移植片は、任意の臓器または組織移植片心臓、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、骨髄、皮膚、または軟骨が含まれるが、これらに限定されないであり得る。本明細書中で使用される、移植免疫寛容は、レシピエントの免疫系によるドナー臓器拒絶の欠如をいう。さらに、組織または細胞移植片を拒絶する可能性を抑制または減少するための薬剤を使用することができる。本明細書中で使用される、用語薬剤および化合物には、タンパク質および非タンパク質部分の両方が含まれる。薬剤は、合成されたか、組換え技術によって作製されたか、天然供給源から単離した任意の化学物質元素、分子、化合物、薬物であり得る。例えば、薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくは抗体フラグメント、ペプトイド、糖類、ホルモン、または核酸分子アンチセンスまたはRNAi核酸分子などであり得る。さらに、薬剤は、コンビナトリアルケミストリーによって作製され、例えば、ライブラリーに集められる小分子またはより複雑な分子であり得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル、および有機溶媒の他のクラスを含み得る。薬剤はまた、細胞細菌、動物、または植物の溶解物または成長培地から単離した天然産物または遺伝子操作された産物であり得る。1つの実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤Th2応答の促進および/またはTh1応答の阻害に使用される薬剤などは、全長tim-3のリガンドへの結合を促進する。好ましい実施形態では、tim-3リガンドはガレクチン-9である。薬剤は、それ自体がtim-3に結合するか、それ自体がガレクチン-9などのtim-3リガンドに結合することができ、tim-3とリガンドとの間の結合相互作用を増加させるポリペプチドであり得る。本明細書中に記載の方法の1つの実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤はtim-3リガンドである。このようなリガンドの例はガレクチン-9である。したがって、いくつかの実施形態では、薬剤はガレクチン-9ポリペプチドを含む。別の実施形態では、薬剤は、ガレクチン-9の2つの炭水化物認識ドメインCRDの少なくとも1つすなわち、少なくともN末端、C末端、またはその両方を含むポリペプチドを含む。別の実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤は、配列番号10または配列番号18に記載のアミノ酸配列と少なくとも80同一のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。別の実施形態では、配列は、配列番号10または配列番号18に記載のアミノ酸配列と85、90、95、96、97、98、99、または100同一である。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ヒトガレクチン-9の少なくとも1つのCRDのアミノ酸配列と少なくとも80、90、または95同一である。別の実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤は、tim-3受容体の活性化においてガレクチン-9として機能することができるペプチド模倣物または小分子である。ペプチドまたは小分子はtim-3に結合するガレクチン-9の表面と構造が類似し得るので、ペプチドまたは小分子は結合時にtim-3を活性化してtim-3の活性化およびTh1細胞の活性化を増加させることができる細胞増殖およびサイトカインの分泌の増加が含まれる。特定の実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤は、tim-3の細胞内ドメインのチロシンリン酸化を促進する。別の実施形態では、本明細書中に記載の方法においてtim-3活性を増加させる薬剤は、抗体またはそのフラグメントである。tim-3に結合してリガンド結合を模倣し、それにより細胞内シグナル伝達が行われる抗体を生成することができる。tim-3の細胞外ドメインに結合する抗体の生成の際、当業者は、抗体がtim-3を活性化してTh1細胞増殖を抑制し、サイトカイン放出を減少させ、寛容を増加させるかどうかを試験することができる。実験手順に記載の方法を使用して、抗体結合により全長tim-3が活性化されるかどうかを決定することができる。特定の実施形態では、tim-3活性を増加させる抗体は、tim-3およびガレクチン-9に特異的な二重特異性抗体である。さらに別の実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤は、可溶性tim-3の発現または機能を減少させるが、全長tim-3の発現または機能には直接影響を与えない。1つの実施形態では、薬剤は、可溶性tim-3の発現を特異的に阻害する二本鎖RNA種配列番号15のヌクレオチド配列を含むものなどである。このような二本鎖RNAを、二本鎖ヘアピンRNAとして投与することができる。別の実施形態では、tim-3活性を増加させる薬剤は、可溶性tim-3に特異的に結合するが全長tim-3に結合しない抗体本発明によって提供される抗体などである。配列表の説明配列番号1は、ヒト可溶性tim-3イソ型のコード配列である。配列番号2は、ヒト可溶性tim-3タンパク質である。配列番号3は、マウス可溶性tim-3イソ型のコード配列である。配列番号4は、マウス可溶性tim-3タンパク質である。配列番号5は、ヒト可溶性tim-3cDNAの新規のスプライス部位と同一の16ヌクレオチドのDNAフラグメントである。配列番号6は、ヒト可溶性tim-3タンパク質の新規のIgVドメイン/細胞内ドメイン連結部と同一の16アミノ酸のペプチドである。配列番号7は、マウス可溶性tim-3cDNAの新規のスプライス部位と同一の16bpのDNAフラグメントである。配列番号8は、マウス可溶性tim-3タンパク質の新規のIgVドメイン/細胞内ドメイン連結部と同一の16アミノ酸のペプチドである。配列番号9は、ヒトガレクチン-9のコード配列単鎖形態である。配列番号10は、ヒトガレクチン-9のアミノ酸配列単鎖形態である。配列番号11は、全長ヒトtim-3のコード配列である。配列番号12は、全長マウスtim-3のコード配列である。配列番号13は、全長ヒトtim-3のアミノ酸配列である。配列番号14は、全長マウスtim-3のアミノ酸配列である。配列番号15は、ヒト可溶性tim-3の新規のスプライス部位に対応する16ヌクレオチドのRNA配列である。配列番号16は、マウスガレクチン-9のコード配列である。配列番号17は、マウスガレクチン-9のアミノ酸配列である。配列番号18は、マウスガレクチン-9のアミノ酸配列長鎖形態であるGenbankアクセッション番号NP_034838も参照のこと。配列番号19は、ヒトガレクチン-9のアミノ酸配列長鎖形態であるGenbankアクセッション番号NP_033665も参照のこと。本発明を一般的に記載し、以下の実施例を参照することによって本発明はより深く理解される。実施例は本発明の一定の態様および実施形態の例示のみを目的として含まれ、本発明を制限することを意図しない。実施例は、2つの部に分けられ、それぞれ実施例で使用した方法の説明のみを含む。第1実験A.方法s-Tim-3のクローニング脾細胞を、1μg/mLのコンカナバリンASigma,St.Louis,MOで活性化した。活性化の48時間後、細胞を回収し、製造者の説明書に従って、TRIzol試薬Invitrogenを使用してRNAを抽出した。SuperscriptII逆転写キットInvitrogen,LosAngeles,CAを使用して、RNAを逆転写した。fl-Tim-3およびs-Tim-3の両方の増幅のために、SmaI制限オーバーハングを有するTim-3プライマーを、Tim-3遺伝子の5’TIM-3-F:5’GCCCGGGAGGAGCTAAAGCTATCCCTACACA3’および3’TIM3-R:5’GCCCGGGCCAATGAGGTTGCCAAGTGACATA3’UTR中にデザインした。DNAサーマルサイクラーPerkin-Elmer,Chicago,ILにて、95°Cで1分間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、および72°Cで90秒間の伸長を1サイクルとして35サイクルの反応を行った。反応を、72°Cで10分間の最後の伸長で完了した。全産物を、1.2アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで視覚化した。T細胞の分子およびTim-3-リガンド染色全脾細胞およびリンパ節細胞を、ナイーブC57BL/6マウスJacksonLaboratories,BarHarbor,MEから採取し、CD4T細胞をカラムで精製したRDSystems,Minneapolis,MN。CD4T細胞を、CD25、CD62L、CD45RB、CD44、およびCD54に対するmAbPharmingen,SanDiego,CAで染色した。細胞をビオチン化ex-Tim-3-Ig、s-Tim-3-Ig、またはhIgGで染色し、ストレプトアビジン-PEを、フローサイトメトリーでの検出のための二次検出試薬として使用した。AE7ハトシトクロムc特異的I-Ek制限Th1クローン34,45およびLR1F1PLP139~151が変化したペプチドQ144HSLGKQLGHPDKF特異的I-As制限Th2クローン36を、0.1M非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム1mM、L-グルタミン2mM、MEM必須ビタミン混合物1×、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100U/ml、ゲンタマイシン0.1mg/ml、10熱不活化ウシ胎児血清BioWhittaker,Incorporated,Walkersville,MD、アスパラギン0.1mM、葉酸0.1mg/ml、および2-メルカプトエタノール5×10-5MSigma,St.Louis,MO、0.6T細胞成長因子T-Stim,CollaborativeBiomedicalResearch,Bedford,MA、および0.06組換えIL-2を補足したDMEM中に維持した。細胞を、6、34に記載のように静止/刺激プロトコール刺激培地は、T-Stimおよびr-IL-2を含まない完全培地であるで維持し、s-Tim-3-Ig結合について染色した。増殖アッセイ雌SJL/Jマウス6~12週齢JacksonLaboratory,BarHarbor,MEの各側腹部に、フロイント完全アジュバントCFADifco,KansasCity,MOで乳化した50μgのPLP139~151ペプチドHSLGKWLGHPDKFQualityControlledBiochemicals,Boston,MAを皮下s.c.注射した。マウスに、100μgex-Tim-3-Igもしくはs-Tim-3-Igまたは100μgコントロールhIgGもしくは100μlPBSのいずれかを1日おきに腹腔内注射した免疫化日から開始し0日目、8日目まで係属する。10日目にマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。5×105細胞/ウェルの細胞を丸底96ウェルプレートFalcon,BectonDickinson,LosAngeles,CAにプレートし、0~100μg/mlPLP139~151を48時間添加し、プレートに1μCi3[H]-チミジン/ウェルで16~18時間パルスした。組み込まれた放射性標識チミジンを、BetaPlateシンチレーションカウンターPerkinElmerWallacInc,Atlanta,GAを使用して測定した。データを、三連のウェルの平均cpmとして示す。細胞分離実験のために、CD11b細胞およびB220細胞を、MACSSort磁性ビーズMiltenyiBiotech,Auburn,CAによるポジティブ選択によって精製し、CD3T細胞を、CD11b細胞およびB220細胞の枯渇後にネガティブ選択カラムRDSystems,Minneapolis,MNによって精製した。105細胞/ウェルのCD3T細胞をプレートし、2×105細胞/ウェルのCD11b細胞およびB220細胞をプレートした。寛容誘導実験のために、SJLマウスを、50μgPLP139~151/CFAを使用してs.c.で免疫化すると同時に、寛容を誘導するために500μgの可溶性PLP139~151を腹腔内注射した。5×105細胞/ウェルの脾細胞および2×105細胞/ウェルのリンパ節細胞をプレートした。サイトカインELISA定量的捕捉ELISAによって、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、およびTNF-αについてサイトカイン産生を測定した。簡単に述べれば、マウスIL-2クローンJES-1A12、IL-4クローンBVD4-1D11、IL-10クローンJES5-2A5、IFN-γクローンR4-6A2、およびTNF-αクローンG281-2626に対する精製ラットmAbを、PharmingenSanDiego,CAから入手し、これを使用してELISAプレートImmulon4,DynatechLaboratories,Chantilly,VAをコーティングした。Pharmingenの組換えマウスサイトカインを使用して、検量線を構築し、マウスIL-2クローンJES6-5H4、IL-4クローンBVD6-24G2、IL-10クローンSXC-1、IFN-γクローンXMG1.2、およびTNF-αクローンMP6-XT3に対するビオチン化ラットmAbを二次抗体として使用した。プレートを、TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg,MDを使用して発色させ、停止液の添加後にBenchmarkマイクロプレートリーダーBio-RadLaboratories,Hercules,CAを使用して450nmの値を読んだ。BrdU組み込み10日目にPLP139-151/CFA免疫化したTim-3-IgまたはhIgG処置マウスから脾臓を取り出し、5×105~1×106個の全脾臓細胞96ウェルの丸底プレートを、5~10μM5-ブロモデオキシウリジンSigma,St.Louis,MOと共に37°C、10CO2中で48時間インキュベートした。48時間後、細胞を、CD3-CyC、CD25-PE、およびCD69-PEに対するmAbPharmingen,SanDiego,CAで染色した。次いで、細胞を固定し、透過処理しCytoperm,Pharmingen,SanDiego,CA、DNアーゼISigma,St.Louis,MOで処置した。次いで、細胞をBrdUに対するFITC抱合mAbまたはアイソタイプコントロールとしてのマウスIgG1で染色し、FACSBectonDickinson,LosAngeles,CAによって分析した。B.第1実験の例実施例1:細胞外免疫グロブリンドメインを含むが、全長Tim-3のムチンドメインを欠く可溶性Tim-3の同定マウスTim-3遺伝子の5’および3’非翻訳領域UTR中にプライマーをデザインし、これを使用してPCRによってコンカナバリンAcon-A活性化脾細胞から生成したcDNAからTim-3を増幅した。約1kbのTim-3の全長形態に加えて、サイズが800bpの別のアンプリコンを同定した図1A、レーン1。1kbアンプリコンの推定アミノ酸翻訳により、シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、ムチンドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含むTim-3の全長膜固定形態fl-Tim-3と一致する読み取り枠ORFが証明された図1B。800bpの産物由来のORFの分析により、シグナルペプチドドメイン、IgVドメイン、および細胞質ドメインのみを含み、ムチンドメインおよび膜貫通領域を欠くTim-3の新規のイソ型の存在が証明された図1B、1C。ムチンドメインおよび膜貫通ドメインの非存在は、ムチンTim-3遺伝子からのエクソン3、4、および5のスプライシングと一致する図1C。これらのデータにより、800bpアンプリコンによってコードされる産物は、細胞質ドメインに融合したマウスTIM-3の細胞外ドメインのIGV部分を含むTim-3の選択的にスプライシングされた可溶性形態s-Tim-3であることが示唆される。実施例2.可溶性Tim-3-Ig融合タンパク質の構築潜在的Tim-3-リガンドおよびTIM-3とのその機能的インビボ相互作用を同定するために、Tim-3の全長形態および可溶性形態の両方のための可溶性融合タンパク質をデザインした21。マウスTim-3の全細胞外部分をコードするが膜貫通および細胞質テールを含まないcDNAを、ヒトIgG1FcテールをコードするcDNAと融合して、全長Tim-3-Ig融合タンパク質ex-Tim-3-Igを形成した。細胞外ドメイン図1A、1BのIgV部分のみを含むTim-3の分泌形態の存在に照らして、可溶性Tim-3-Ig融合タンパク質s-Tim-3-Igを形成するために、ヒトIgG1FcテールをコードするcDNAと融合したマウスTim-3のIgV部分をコードするcDNAからなる第2の融合タンパク質を構築した。これらの構築物を、NS.1B細胞に安定にトランスフェクトし、上清からタンパク質を精製した21。実施例3.CD4T細胞はTim-3-リガンドを発現する細胞がTim-3-リガンドを発現するかどうかを決定するために、ナイーブ非免疫かSJL/J、NOD、C57BL/6、およびBALB/cマウス由来の全脾細胞を、ex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igで染色し、種々の細胞表面マーカーについて同時染色した。フローサイトメトリーで分析した場合、各株から得たCD4T細胞は、s-Tim-3-Igまたはex-Tim-3-Ig融合タンパク質のいずれかで染色した場合にTim-3-リガンド発現について陽性であった。精製CD4T細胞を細胞表面活性化マーカーのパネルについて同時染色した場合、ex-Tim-3-Igおよびs-Tim-3-Ig染色の両方によって評価したところ、ナイーブCD25-、CD62L、CD44lo、CD45RBhi、CD54-および活性化記憶/調節CD25、CD62L-、CD44hi、CD45RBlo、CD54集団は共にTim-3-リガンドを発現することが見出された図2A。CD4T細胞を精製してCD25発現について分取した場合、CD425集団およびCD425-集団は共にTim-3-リガンドを発現した。しかし、分取した細胞をインビトロで48時間漸増濃度の抗CD3/抗CD28およびIL-2で活性化した場合、CD4CD25T細胞はTim-3-リガンドの発現を保持するのに対して、CD4CD25-細胞は下方制御された。全脾臓由来のCD11c樹状細胞およびCD11bマクロファージの小画分もTim-3-Ig融合タンパク質によって染色されたが、全脾臓由来のB細胞B220、CD19はTim-3-リガンドについていずれの融合タンパク質でも染色されなかった。CD4T細胞はTim-3-Ig融合タンパク質で陽性染色されるので、長期Th2およびTh2クローンのパネルを、Tim-3-リガンドの発現について試験してTh1細胞またはTh2細胞におけるTim-3-リガンドの選択的発現が存在するかどうかを決定した。興味深いことに、Th1細胞およびTh2細胞は、静止状態のs-Tim-3-Igでの染色について陽性である一方で0日目、図2B、これらの細胞株の活性化によりTim-3-リガンド発現が下方制御された4日目、図2b。活性化から7~10日目に、その時点で静止しているT細胞クローンにおけるTim-3-リガンド発現が下方制御された10日目、図2b。したがって、静止Th1細胞およびTh2細胞の両方でTim-3-リガンドが発現し、活性化時に発現が下方制御するようである。これらのデータは、CD4CD25-T細胞エフェクターT細胞を含むが活性化時にTim-3-リガンド発現が下方制御されることを証明する第2実験由来のデータと一致する。実施例4.Tim-3-Igのインビボ投与によって過剰増殖が誘導される一連のTh1免疫応答の間のTim-3/Tim-3-リガンド相互作用のインビボでの役割を決定するために、SJL/Jマウスを、ミエリンプロテオリピドタンパク質PLP139-151を含むフロイント完全アジュバントCFAで免疫化し、ex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-IgおよびヒトIgGhIgGまたはコントロールとしてPBSで処置した。10日目に処置したマウスを屠殺し、脾臓をインビトロで再刺激して増殖およびサイトカイン産生を決定した。コントロールhIgGまたはPBS処置マウス由来の全脾細胞は、抗原再刺激を行わない場合に低いバックグラウンド基底応答を示し図3A、PLP139-151ペプチドの添加によって増殖の用量依存性増加が証明された図3B。逆に、ex-Tim-3-Igまたはex-Tim-3-Igで処置したマウス由来の脾細胞は抗原再刺激を行わない場合に基底増殖が非常に高く、いくつかの実験では、120,000cpmにもなった図3A。しかし、特定の抗原PLP139-151をex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Ig処置マウス由来の細胞培養中で増加させた場合、増殖応答の大きな増加は認められなかった図3B。まとめると、これらのデータにより、いずれかの融合タンパク質で処置した免疫化マウス由来の脾臓細胞がインビボで増殖し、それによりさらなる抗原刺激を行うことなくインビトロで増幅し続けることが示唆される図3A、3B。実施例5.Tim-3のインビボ投与によって増幅されたTh1サイトカイン産生が誘導される増幅細胞もサイトカインを産生するかどうかを決定するために、48時間後にインビトロ培養物から上清を採取し、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、およびINF-γについてのサイトカインELISAを行った。分析により、抗原再刺激を行わない場合にex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igで処置した免疫化SJL/Jマウス由来の脾細胞が大量のTh1サイトカイン、IL-2、およびIFN-γを産生することが明らかとなった図3A。対照的に、コントロールPBSまたはhIgGで処置したマウス由来の脾細胞は、抗原再刺激を行わない場合にIL-2またはIFN-γのいずれも産生しなかった図3A。ex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igで処置したマウス由来の脾細胞は、PLP139-151ペプチド再刺激後にインビトロで大量のIL-2およびIFN-γも分泌した図3B。コントロールPBSまたはhIgGで処置したマウス由来の脾細胞は、IFN-γをほとんどまたは全く産生せず、PLP139-151ペプチドの再刺激時にIL-2を産生しただけであった図3B。まとめると、これらのデータにより、ex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igでのインビボ処置によってexvivoでのTh1細胞の過剰増殖およびTh1サイトカインの放出が誘導されることが明らかとなった。実施例6.過剰増殖およびTh1サイトカイン産生はTim-3-Ig処置マウス中のT細胞によって媒介される免疫化されたTim-3-Ig処置マウスで増殖する細胞型の表現型を決定するために、CD3T細胞、CD11bマクロファージ、およびB220B細胞の細胞集団を、免疫化マウスの脾臓から精製した。精製後、細胞集団を個別に培養し、インビトロで再度組み合わせ、3[H]-チミジン組み込みによって検出される増殖能力について評価した。全ての細胞型のうち、ex-Tim-3-Igで処置したマウス由来の精製CD3T細胞はペプチド再刺激を行わずに非常に増殖するのに対して、コントロールhIgG処置マウス由来のCD3T細胞は低いバックグラウンド増殖レベルしか示さなかった図4A。コントロールhIgG処置マウス由来のB220B細胞またはCD11b細胞の各集団は、低い増殖を示した約10,000cpm;図4A。ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のB細胞およびCD11b細胞がhIgG処置コントロールマウス由来のB細胞およびCD11b細胞の2倍の増殖を示す一方で約20,000cpm;図4A、この増殖はex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞の増殖と比較して最小であった。これにより、ex-Tim-3-Ig処置マウスから採取されたT細胞は過剰増殖するが、B220B細胞やCD11bマクロファージは過剰増殖しないことが示唆された。これは、活性化および拡大の大部分がCD11b/F4-80マクロファージ集団で認められるが、T細胞区画やB細胞区画では認められないという抗TIM-3抗体処置マウスにおける所見と対照的である20。Tim-3-Ig処置マウスにおける過剰増殖表現型についてのリンパ球に対する依存性は、免疫化RAG-2-/-マウスへのTim-3-Igの投与から得たデータによってさらに支持される。SJL-RAG-2-/-マウスをPLP139-151を含むCFAで免疫化してex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igで処置した場合、抗原再刺激に対する増殖バックグラウンドや応答が認められず、免疫化融合タンパク質処置マウスから採取した脾細胞で認められたバックグラウンド応答がT細胞および/またはB細胞の存在に依存することが示唆される。非免疫化マウスへのex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Igの投与もバックグラウンド増殖応答を増加させたが、T細胞応答をヒトIgまたはTim-3-Ig融合タンパク質のいずれかで再現することができなかったので、これは融合タンパク質中に存在するヒトFcテールに対するポリクローナル応答に起因しなかった。さらに、非免疫化マウスにおけるヒトIgの投与によって基底増殖応答は誘導されなかった図3A。これにより、非免疫化マウスにおけるわずかに継続している免疫応答をTim-3-Ig投与によって明らかにすることもできることが示唆される。hIgG処置マウス由来のCD3T細胞をhIgG処置マウス由来のB220B細胞またはCD11b細胞と混合した場合、増殖は低いままであり約20,000cpm、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のB220B細胞またはCD11b細胞の添加によってわずかに増加するだけであった約30~40,000cpm図4A。ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞をhIgGまたはex-Tim-3-Ig処置マウスのいずれか由来のB220B細胞と培養した場合、最も高い増殖が認められた~約150,000cpm図4A。興味深いことに、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞をhIgGまたはex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD11b細胞と混合した場合、Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞で認められた自発的増殖が顕著に減少した精製CD3T細胞のみについては、90,000cpmから30~38,000cpmに低下図4A。まとめると、これらのデータにより、免疫応答の継続中のex-Tim-3-Igの投与によってCD3T細胞の過剰増殖が誘導され、APCの増殖への影響はより少ないことが示唆される。B220B細胞は、その供給源に関係なく、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のT細胞増殖を増強するのに対し、CD11bマクロファージはex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞の自発的過剰増殖を阻害した。これらの各細胞集団のサイトカイン分泌パターンを決定するために、48時間後に上清を採取し、ELISAによってIL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、およびINF-γ産生について分析した。ex-Tim-3-Ig処置マウス由来の各細胞集団でIL-2の産生が見出された一方で、ex-Tim-3-Igで処置したマウス由来のCD3T細胞は大部分のIFN-γ産生を担った図4B。B220B細胞またはCD11bマクロファージex-Tim-3-IgまたはhIgG処置マウスのいずれか由来の添加により、CD3T細胞によってex-Tim-3-Ig処置マウスからIL-2が分泌された。逆に、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞へのB220B細胞またはCD11bマクロファージの添加により、これらのCD3T細胞由来のIFN-γ産生が減少した図4B。要するに、これらのデータは、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞の過剰増殖によってIFN-γが大量に産生されたが、IL-2の産生にAPCは必要ないことを証明する。ex-Tim-3-Igでのインビボ処置に応答して過剰増殖する細胞をさらに特徴づけるために、5-ブロモデオキシウリジンBrdU循環細胞によって組み込まれるチミジンアナログを組み込んだ細胞の表現型を決定した。Tim-3-Ig処置群における活性化CD3CD25細胞の比率は、hIgG処置コントロール群の2~3倍であった。このデータから図4C、hIgG処置コントロールと比較した場合にBrdUが組み込まれたTim-3-Ig処置マウス由来のCD3T細胞の比率が増加することも明らかであった。このデータは、コントロールhIgG処置マウス由来の細胞と比較してTim-3-Ig処置マウス由来の全脾細胞で認められたCD3CD25細胞およびCD3CD69細胞の比率の増加と一致した。この所見はインビトロ増殖およびサイトカインデータを支持し図4A、4B、Tim-3-Ig処置免疫化マウス由来のT細胞が高度に活性化された急速に増殖する細胞であることが確認された図4C。実施例7.マウスへのTim-3-Igの投与によって寛容の誘導が無効にするインビボでのTim-3-Igの投与によってIL-2産生の増幅を伴ってTh1細胞が過剰に活性化されるので、出願人は、Tim-3-Igの投与によって末梢性寛容の誘導を防止するか無効にすることができると仮定した。SJL/Jマウスを高用量の可溶性PLP139-151ペプチドで寛容化し、同時にCFA中に乳化したPLP139-151で免疫化した。この寛容化プロトコールによってPLP139-151特異的T細胞がその後の活性化に寛容性を示すようになり、細胞増殖が低下してIL-2を産生しない24。寛容誘導に対するex-Tim-3-Igの効果を試験するために、寛容化マウスを、Tim-3-IgまたはコントロールPBSまたはhIgGで8日間1日おきに処置し、10日目にリンパ節および脾臓を取り出し、増殖およびサイトカイン産生によるPLP139-151に対するインビトロリコールrecall応答について試験した。流入領域リンパ節でT細胞が誘導されて最初に活性化されるので、脾臓に加えて、流入領域リンパ節における寛容の誘導を試験した。図5に示すように、可溶性PLPで寛容化した免疫化マウス由来のリンパ節細胞は、コントロールPBS寛容化hIgG処置群と比較して、PLP139-151での再刺激に対する増殖が有意に増加した。Tim-3-Igを寛容誘発用量のPLP139-151と同時投与した場合、コントロール非寛容化マウスと比較して類似するかさらに高い有意な増殖応答が認められ、寛容誘導に伴ってTim-3-Igが消失または妨害されることが証明された図5。コントロールhIgG処置群においてPLP139-151での寛容化によってIL-2およびIFN-γ産生が完全に喪失する一方で、Tim-3-Igで処置したマウスは、インビトロにて同族抗原で再刺激した場合にTh1サイトカインを産生し続けた図5。マウスの脾臓における寛容誘導の効果を決定した。図5Aに示すように、PLP免疫化マウスにおける可溶性PLP139-151の同時インビボ投与によってPLP139-151ペプチドに対する増殖応答が劇的に増加し、可溶性139-151のインビボでT細胞寛容を誘導する能力が確認された。hIgGまたはPBSの可溶性PLP139-151との投与によって寛容誘導は変化しなかった図6A。しかし、ex-Tim-3-Igを寛容誘発用量のPLP139-151と共に投与した場合、ex-Tim-3-Ig処置マウス由来の脾細胞の増殖は、非寛容化コントロール動物由来の脾細胞で得られた増殖と等価であった図6A。したがって、Tim-3-Igの投与により、寛容の誘導を克服するか消失させ、T細胞が拡大する。高用量の可溶性抗体はTh1細胞の寛容を支配的に誘導し、特にIL-2産生を阻害することが知られているので、出願人は、次に、寛容化マウスの脾臓におけるサイトカインの産生を調査した。48時間後にインビトロ培養物から上清を採取し、寛容化してTim-3-Ig処置したマウス由来の脾細胞がサイトカインを産生するかどうかを決定するために、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、およびINF-γについてのサイトカインELISAを行った。予想どおり、PLP免疫化マウスへの可溶性PLPの投与によってIL-2産生が阻害された図6B。ex-Tim-3-Igの同時投与により、IL-2産生が劇的に増加し、非寛容化PLP免疫化マウスと比較した場合に、ex-Tim-3-Ig処置マウスにおいてより低い抗原濃度でIL-2が産生された図6B。PLP免疫化マウスがいかなる有意なIFN-γまたはIFN-α産生を示さないのに対し、寛容化マウスのTim-3-Ig処置により、インビトロでの再刺激時に脾臓培養物からIFN-γおよびIFN-αが劇的に産生された図6B。最も高い用量の特異的抗原でのインビトロ再刺激においてのみ、寛容化されたex-Tim-3-Ig処置マウス由来の上清で低レベルのIL-4およびIL-10が認められた図6B。C.第1実験の考察Th1特異的膜貫通タンパク質としてのTim-3の発見により、Th1細胞とTh2細胞を表現型で区別する新規の手段が得られる。完全に分化したcommittedTh1上で発現したこの細胞表面タンパク質の機能的役割の調査を開始する。最初の研究は、一連の免疫応答中の抗Tim-3抗体の投与によって自己免疫疾患EAEが悪化し、マクロファージの活性化および拡大が起こることを示した20。本明細書中に記載のデータで可溶性Tim-3融合タンパク質の使用によるTim-3/Tim-3-リガンド相互作用のインビボ効果の調査を開始する。免疫応答の継続中におけるインビボでのex-Tim-3-Igまたはs-Tim-3-Ig融合タンパク質の投与により、抗原再刺激を行わない場合でさえもTh1サイトカインIFN-γおよびIL-2の自発的産生を伴ってT細胞が過剰増殖した。さらに、Tim-3-Igは、高用量の可溶性抗原の投与によって媒介された寛容の誘導を消失または妨害した。ナイーブマウスから採取してTim-3-Igで染色したリンパ性細胞のフローサイトメトリー分析により、Tim-3のリガンドがCD4T細胞上で発現することが明らかとなった。さらに、T細胞クローンTh1表現型またはTh2表現型のいずれかがTim-3-Igに結合する。少数のCD11c樹状細胞およびCD11bマクロファージもTim-3-Igで染色されるようであるが、CD4T細胞はTim-3-リガンドを発現する主要な細胞型であった。Tim-3に関する本発明者らの最初の所見が、抗Tim-3抗体での免疫化SJL/Jマウスの処置によってマクロファージとTh1細胞との間の細胞間相互作用を介して全脾細胞の基底増殖が増加することを示したので、このデータは一見驚くべきものであった20。これにより、Tim-3のリガンドがマクロファージ上で潜在的に発現することおよび抗Tim-3抗体がそのリガンドを介してマクロファージを活性化するためにTh1細胞上でTim-3を同時キャッピングするか、負のシグナルを遮断してマクロファージを活性化することが示唆された。考えられる解釈の1つは、im-3のリガンドを有し得る小さいが潜在的に重要なマクロファージ集団が抗体投与によってこの様式で活性化されたということである。別の可能性は、インビボでの抗Tim-3抗体処置の際に認められるマクロファージ活性化は他のT細胞上に発現したTim-3-リガンドとのTim-3の相互作用破壊の二次的結果であり得るということである25。最終的に分化したTh1細胞上でTim-3-リガンドが発現し、且つCD4T細胞上で潜在的なTim-3-リガンドが発現することを知ることにより、これらのパートナーがどのようにしてインビボで相互作用するのかという問題が提起される。Tim-3融合タンパク質がTim-3-リガンドとインビボで相互作用することができる少なくとも2つの潜在的機構が存在する。第1に、Tim-3-Igは、一連の免疫化中にインビボでCD4T細胞に結合し、このリガンドを介してシグナルを発し得る。このシグナルは、優先的にナイーブCD4T細胞をTh1細胞に分化するか、これらのCD4T細胞の活性化状態を増加させることができる。CFA中のPLP139-151での免疫化によって得られたTh1環境を仮定すると、これらの活性化細胞は優先的にTh1表現型に二分polarizeされるので、有意に増加したT細胞増殖およびTh1サイトカインであるIFN-γおよびIL-2の産生が説明される。しかし、プレート結合抗体によるCD3架橋を使用するか使用しないT細胞に対するTim-3-リガンドの直接架橋により、Th1細胞の過剰増殖やTh1サイトカインの産生は誘導されない。これにより、Tim-3-リガンドのTim-3-Igライゲーションによって実際は活性化することができないか、Th1二分化条件下にてインビボで固有に起こり得ることが示唆される。第2の可能性は、Tim-3-Igがリガンド保有細胞T細胞、マクロファージ、および/または樹状細胞上でTim-3-リガンドに結合し、それにより、二分化Th1細胞上でTim-3と相互作用する能力を遮断することができることである。Tim-3とTim-3-リガンドとの間の相互作用の正常な生理学的機能がTh1応答を下方制御することである場合、Tim-3-Igの投与によるリガンドの遮断により、認められたTh1細胞増殖の増加およびTh1サイトカイン産生が説明される。本明細書中に記載のデータおよび第2の実験のデータは、Tim-3とそのリガンドとの相互作用が阻害的相互作用であり、且つTim-3-Ig投与によりこの負の相互作用が遮断されてTh1細胞が発現するという仮説を支持する。この可能な機構は、Tim-3-Igの投与によって末梢性寛容の誘導が無効にするというデータによってさらに支持され、Tim-3とTim-3-リガンドとの間の生理学的相互作用がTh1細胞の発現を制限するのに役立ち、エフェクターTh1細胞の寛容の誘導に寄与することが示唆される。Tim-3-Igが寛容誘導を無効にすることができる少なくとも2つの可能な機構が存在する。Tim-3-IgはエフェクターTh1細胞を過剰に活性化することができ、それによって産生されたIL-2は高用量可溶性抗原によるアネルギーの誘導を防止することができる。しかし、別の可能性は、Tim-3-Igが低親和性TCR/MHC-ペプチド相互作用によって通常増殖することができない非寛容化T細胞中で増殖およびエフェクター機能を誘導することができ、正味の結果が非応答よりもむしろT細胞拡大であることである。高用量寛容がしばしばTh1細胞を寛容化する一方で、Th2細胞が節約sparingまたは拡大することが知られている26。Tim-3-Igの投与によりTh1細胞のこの寛容誘導が無効になるので、Th2細胞は影響を受けないままであり、インビトロでの脾細胞の再刺激の際に認められたTh2サイトカインであるIL-4およびIL-10が産生される図5B。本発明者らの結果により、Tim-3/Tim-3-リガンド経路が寛容誘導に重要であり得ることが示唆される。興味深いことに、寛容誘導にCTLA-4が必要であることも示された27。寛容誘導におけるTim-3およびTim-3-リガンドの重要性を考慮すると、Tim-3/Tim-3-リガンド経路がCTLA-4と類似の形式であるがエフェクターTh1細胞に特異的に免疫応答の負のレギュレーターとして機能することができることが可能である。Tim-3の可溶性のIgドメインのみの形態の発見により、Th1応答の制御における可溶性Tim-3の役割が問題として提起される。このTim-3の可溶性スプライス変異型は、T細胞によって可溶性分子として作製された他の免疫調節/阻害受容体例えば、CTLA-4に類似し、受容体のこれらの可溶性の選択的スプライシング形態は自己免疫疾患に対する感受性および耐性で重要な役割を果たすことが示されている23。しかし、この段階では、Th1細胞分化のどの時点でs-Tim-3が作製されるかおよびどのように機能するのかは明らかでない。本データによって示唆されるように、Tim-3/Tim-3-リガンド相互作用が阻害相互作用である場合、s-Tim-3-Igの産生により、この阻害効果を遮断し、Th1細胞の拡大および分化を促進するように作用することができる。Tim-3-リガンドへのTim-3の結合がTim-3-リガンドへの膜結合ex-Tim-3の阻害的結合と競合する場合にこれが起り得る。この競合は、Tim-3-リガンドへのex-Tim-3のライゲーションを減少または防止することができ、その後、Th1応答の下方制御を減少させるか無効にする。mRNAおよびタンパク質レベルでのs-Tim-3に対するex-Tim-3の産生の潜在的調節により、エフェクターTh1細胞の免疫機能の動的調節手段を得ることができる。s-Tim-3はIgVドメインのみを含むがムチンドメインを欠くので、このデータにより、Tim-3の免疫調節活性の大部分をそのIgドメインによって媒介することができることがさらに示唆される。予備データにより、s-Tim-3-IgがCD4T細胞への高親和性/アビディティ結合を示し、インビボでより強力な免疫調節効果も媒介することが示唆される。ピコルナウイルス科のメンバーポリオウイルスおよびライノウイルスなどおよびヒト免疫不全ウイルスHIVは後続の機能ドメインよりもむしろ受容体のIgドメインに結合することが以前に示されている28~31。さらに、havcr-1ピコルナウイルス科のメンバーであるA型肝炎ウイルスHAVの受容体は、havcr-1のN末端システインCysリッチ領域受容体のIgドメインの一部であるを介してHAVに結合することが示されている28、29。havcr-1がマウスTim-1のヒトホモログTim遺伝子ファミリーのメンバーであると仮定すると19、Tim-3が類似の様式でそのIgドメインを介してそのリガンドと相互作用することができることは理にかなっている。Tim-3の全長膜固定形態の一部であるムチンドメインの潜在的な機能的役割は不明確である。havcr-1のトレオニン/セリン/プロリンTSPリッチなムチン様領域がHAVへの結合を容易にするために細胞表面上にCysリッチ領域を広げるのに役立ち得ると主張されている28,32。Tim-3のムチンドメインは、機能的結合様式よりもむしろ類似の構造で機能することができる。別の可能性は、Tim-3のムチンドメインがセクレチンと相互作用することができる炭水化物部分を提示することができるので、エフェクターTh1細胞の輸送を容易にすることができることである。リンパ球ホーミング促進におけるこのような役割は、構造的に類似の多ドメイン受容体MAdCAM-1のムチン領域のためであると主張されている33。まとめると、これらのデータにより、Tim-3のそのリガンドとの相互作用によって正常なT細胞免疫応答中にTh1細胞の発現および機能を調節する阻害経路が得られることが示唆される。この経路はまた、エフェクターTh1細胞の末梢性寛容の調節で重要な役割を果たし得る。D.参考文献第2の実験A.序論TヘルパーTh前駆細胞のTエフェクター集団への分化およびクローン性増殖は、適応免疫応答において重要な役割を果たし、細胞内のウイルスおよび病原菌に対して防御する。しかし、Thエフェクター細胞の非拘束活性化も多数の炎症性障害の根底にあることが示されている。この文脈では、Th1エフェクター細胞は、関節リウマチ、炎症性腸疾患IBD、および他の自己免疫障害I型糖尿病および多発性硬化症1、2ならびに同種移植片拒絶3、4が含まれるの病理発生に関与する。対照的に、Th2細胞の活性化は、アレルギー性喘息5の病理発生において重要な役割を果たし、移植片寛容の獲得に関与している3、4。T細胞活性化および分化様式の範囲を、主にT細胞受容体TCR媒介刺激の持続時間および強度によって決定する6。さらに、多数の同時刺激分子および補助分子TNF受容体7および免疫グロブリンIgスーパーファミリーメンバー8ならびにIL-2などのサイトカインが含まれるは、クローン性増殖、欠失、および/またはアネルギー誘導の範囲を調節する9。しかし、出願人はナイーブT細胞の活性化を調製する多数の細胞機構および分子機構を認識している一方で、エフェクターT細胞の小集団の運命を決定する分子は依然として解明されていない。IgスーパーファミリーメンバーTIM-3T細胞免疫グロブリンドメイン、ムチンドメインは、Monneyetal.10によって分化したTh1細胞上で優先的に発現される膜貫通タンパク質として最初に記載された。実験的アレルギー性能脊髄炎EAETh1媒介自己免疫疾患のモデルでは、抗TIM-3モノクローナル抗体mAbのインビボ投与により、脳内により重篤な炎症性事象およびより重篤な疾患を発症する。これらの所見に基づいて、TIM-3は、EAEにおける組織破壊性免疫応答の負のレギュレーターとして提案された10。しかし、これらのデータがTIM-3によって得られる負のシグナルの阻害を反映しているかどうかまたはインビボでのmAbのTIM-3架橋がT細胞活性化および疾患の悪化を誘導するための正のシグナルを発するかどうかについては不確かなままである。本明細書中に報告した結果に基づいて、出願人は、TIM-3のその推定リガンドへの固定により、インビボでの炎症反応を抑制するための阻害シグナルが得られると結論づけた。Tim-3-Ig融合タンパク質処置を介したTIM-3経路の遮断は、NOD非肥満性糖尿病モデルにおける糖尿病の発症が促進し、CTLA4およびドナー特異的輸液DST抗CD154CD40L処置強力な同時刺激遮断ベースの寛容促進移植プロトコール11~13の組み合わせのMHC適合同種移植片の寛容を誘導する能力を無効にする。関連する正確な機構が依然としてほとんど解明されていないが、出願人は、調節T細胞の免疫応答を抑制する能力の調整によって、TIM-3が少なくとも一部の自己免疫応答および同種免疫応答の結果を調節すると提案する。B.方法マウス全マウスを、TheJacksonLaboratoriesBarHarbor,MEから入手し、関連機関および州のガイドラインにしたがって、MilleniumPharmaceuticals,Inc.Cambridge,MA,USA、BethIsraelDeaconessMedicalCenterBoston,MA,USA、またはDRFZBerlin,Germanyの従来の動物施設にて特定の無病原体条件下で維持した。マウスTIM-3の同定およびクローニングTh1特異的ライブラリーを、ClontechPCR-SelectcDNASubtractionKitClontech,PaloAlto,CAを使用して生成した。活性化Th1クローン由来のRNAをテスターとして使用し、活性化Th2クローン由来のRNAをドライバーとして使用した。各クローン由来のプラスミドDNAを、ナイロンフィルターにスポットし、Th1およびTh2RNA由来の一本鎖プローブとハイブリッド形成させた。Th1ライブラリー中のクローンのうちの1つは857bpのcDNAからなり、これを使用し、マウスTh1細胞由来のcDNAライブラリーを使用して全長クローンを得た。その後にヒトホモログを同定し、ヒト脾臓cDNAライブラリーから配列決定した。マウス抗原特異的Th1AE7andDorrisおよびTh2D10.G4、DAX、CDC25クローンを、10~14日毎にペプチド、マイトマイシンC処理APC、およびIL-2100U/mlで刺激した。細胞を抗CD3mAb2C11,Pharmingenで活性化し、RNAを単離した。次いで、TIM-3cDNAの差分発現を、静止および抗CD3活性化クローン由来のノーザンブロットによって確認した。TIM-3mAbおよびTIM-3融合タンパク質の生成TIM-3の細胞外ドメインを含むDNA配列をPCR増幅し、CD5シグナル配列およびヒトIgG定常領域を含むベクターにクローン化した。COS細胞をトランスフェクトし、組換えタンパク質をプロテインAカラムで精製した。Wkyラットを、精製マウスTIM-3融合タンパク質100μgを含むCFAで免疫化し、i.p.および皮下に追加免疫した。脾細胞をSP/2骨髄腫細胞と融合し、得られたクローンをTim-3トランスフェクトCHO細胞への結合についてスクリーニングした。これらのクローンのうちの1つ8H7を、ICOSトランスファクタントではなくTIM-3への特異的結合に基づいて選択した。抗TIM-38H7mAbを、特異的抗体BDPharmingen,SanDiego,CAを使用してラットIgG1としてアイソタイプ分類を行った。第1の実験に記載用に、ex-Tim-3-Igおよびs-Tim-3-Igを、ヒトIgG1Fcテール融合タンパク質として構築し、NS.1中で発現させた。TIM-3L染色実験のために、ビオチン化TIM-3関連融合タンパク質またはヒトIgG1を蛍光色素抱合ストレプトアビジンBDPharMingenと共に使用した。島移植以前に記載のように島移植を行った51。約700DBA/2H-2dの島を、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病C57BL/6H-2bの腎被膜下に移植した。同種移植片の機能を、連続的血糖測定によってモニタリングした。使用した寛容化プロトコールは、移植28日前-28日目の107DBA/2脾細胞のi.v.投与および-28日目、-26日目、-24日目の250μgのハムスターmAb抗マウスCD154MR1、IgG2a、ATCCHB11048、AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MDのi.p.投与からなる。ex-Tim-3-IgコントロールhIgG1を、250μgの用量で-28日目、-26日目、-24日目にi.p.投与した。選択されたレシピエントでは、200μgのラット抗マウスCD25mAbPC61、5.3、IgG1、ATCCTB222も-40日目、-38日目、-36日目i.p.投与した。出願人は、以前に、このような用量で投与した抗CD25mAbが二次リンパ器官および末梢血の両方で80を超えるCD4CD25T細胞を消失すると判断している。いくつかの実験では、移植から0、2、4、6、8日後の0.1μgのCTLA4Igの投与によって寛容が誘導された。リアルタイムPCR実験トリゾールtrizolを使用して島移植片から総RNAを抽出し、MultiscribedReverseTranscriptaseEnzymePEAppliedBiosystems,FosterCity,CAを使用して逆転写を行った。ABI7700配列検出システムPEAppliedBiosystemsを使用して、リアルタイムPCRを行った。mRNAレベルを定量するために、標的遺伝子の発現を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化し、データを、研究サンプルと較正サンプルとの間のcDNA相違の相対倍率として示した。TIM-3プライマー/プローブ配列は以下である:プローブ、5-’ACAGCTGCCTGCCCAGTGCCC-3’;正方向プライマー、5’-GCCGGTGGACCTCAGTTTC-3’;逆方向プライマー5’-TGGGAGCCAGCACAGATCA-3’。GAPDH、IFN-γ、IL-4、およびIL-10プライマー/プローブ組を、ApplicedBiosystemsから購入した。皮膚同種移植片レシピエントへの細胞養子免疫伝達リンパ節細胞の単一細胞懸濁液を、ナイーブC3H/HeマウスH-2kまたは107DBA/2脾細胞28日前;-28および抗CD154-28日目、-26日目、および-24日目に250μgまたは抗CD154ex-Tim-3-Ig-28日目、-26日目、および-24日目にそれぞれ250μgのいずれかのi.v.注射で処置したC3H/Heマウスから得た。細胞を、蛍光色素抱合抗CD25および抗CD4全てBDPharMingenで染色し、MoFlo登録商標高処理細胞分取器Cytomation;FortCollins,COで分取した。CD4CD25-およびCD4CD25調製物の純度は、一貫して90超であった。種々の数のCD4CD25T制御因子regsおよびCD4CD25-エフェクターT細胞を、24時間後に同種DBA/2皮膚移植を受けたC3H/HeScidマウス宿主の尾静脈に注射した。いくつかの実験では、3回分の250μgのex-Tim-3-Igを、皮膚移植から0、2、および4日後に投与した。全層DBA/2の尾皮膚同種移植を以前に記載のように行い52、移植片の生存を毎日モニタリングした。拒絶を、皮膚移植片の完全な壊死と定義する。T細胞集団のドナーとしての野生型C57BL/6マウスおよびDBA/2皮膚同種移植片のレシピエントとしてのC57BL/6Rag-/-を使用して、類似の実験を行った。インビトロ増殖アッセイCD4T細胞小集団の増殖を評価するために、CD4CD25およびCD4CD25-T細胞を以前に記載のように分取し、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中にて5×105/mLの細胞密度で2μg/mL抗CD3mAb、5μg/mL抗CD28mAb、および100U/mLのrIL-2全てPharMingenと共に培養した。細胞を回収し、ビオチン化s-Tim-3-IgまたはコントロールヒトIgG1およびその後のストレプトアビジン-シトクロムで24時間および48時間染色し、フローサイトメトリーによって分析した。C.第2の実験の例実施例11.TIM-3リガンドはCD4T細胞上に発現するTIM-3の構造は、粘膜アドレシン細胞接着分子1MAdCam-1をいくらか連想させ、2つのIgドメインおよびムチンリッチ領域を含む10。推定TIM-3リガンドTIM-3Lの分布を評価するために、マウスTIM-3全長またはex-Tim-3-Igの細胞外ドメインまたは短縮した可溶性Igドメインのみs-TIM-3-Ig16を組み込んだヒトIgG1由来Fc融合タンパク質を生成した。ex-Tim-3-Igおよびs-TIM-3-Igは共に静止CD4T細胞に結合するがCD8、B220、CD11b細胞に結合せず図8C、s-TIM-3-Ig結合がより強力であった。脾臓CD11c樹状細胞図7Aへのいくつかの結合も認められたが、染色パターンはCD4T細胞よりもはるかに一貫性が低かった。ex-Tim-3-Igと比較したs-TIM-3-Igを用いて認められた増幅染色パターンに基づいて、TIM-3のIgドメインは、TIM-3Lとの相互作用を担うようである。実施例12.活性化後にCD4CD25-T細胞はTIM-3L発現を下方制御するが、CD4CD25調節T細胞は下方制御しない静止条件では、TIM-3関連融合タンパク質は、エフェクターCD4CD25-T細胞および調節CD4CD25T細胞小集団の両方を同様に結合する図7B、上のパネル。TIM-3が調節またはエフェクターCD4T細胞のいずれかの機能を選択的にターゲティングすることができる潜在的機構を同定するために、s-TIM-3-Igの結合によって評価した、インビトロ活性化後のCD4CD25-およびCD4CD25T細胞上でのTIM-3Lの発現速度を研究した。抗CD3および抗CD28mAbでの刺激により、培養の最初の24時間ではTIM-3L発現は変化しなかった図7B、中央のパネル。対照的に、培養48時間後の活性化CD4CD25-T細胞に対するTIM-3L発現は下方制御される一方で、CD4CD25調節T細胞に対するTIM-3L発現は残存した図7Bの下のパネル。CD4CD25-T細胞に対するTIM-3L発現の下方制御は、コンカナバリンAまたはLPSでのインビトロ活性化時にも認められた。活性化調節T細胞における推定TIM-3Lの優先的発現を、活性化Th1細胞上のTIM-3の発現によってモニタリングする。したがって、出願人は、TIM-3/TIM-3L相互作用がTh1媒介免疫応答における免疫調節および寛容の獲得および/または維持に重要であるという仮説を調査した。実施例16.TIM-3経路の遮断は同種移植片モデルの寛容の獲得を防止する移植免疫寛容をTh1およびTh2二分化条件下で行うことができる一方で4、25、26、Th2に対するTh1の免疫偏向immunodeviationにより、寛容の発生が容易になる4、27。実際、多数の寛容化免疫抑制投薬計画の結果は、Th2型同種移植片応答への免疫偏向に関連する4。同種移植片寛容の獲得におけるTh1特異的TIM-3細胞表面タンパク質の役割を解明するために、CD40-CD154同時刺激遮断を達成するためにレシピエントをドナー特異的注入DSTと抗CD154CD40Lとの組み合わせで処置した島同種移植片モデルを使用した11、12、28。このモデルでは、移植1ヶ月前に投与した単回用量のDSTおよび抗CD154により、MHC適合島同種移植片の不確実な生存が確実になる。さらに、処置した長期生存移植レシピエントは同一ドナー由来の第2の移植片を容易に受け入れる一方で、第三者の移植片を容易に拒絶し、処置がドナー特異的同種移植片拒絶を誘導することを示す12、28。対照的に、未処置コントロールレシピエントでは、島浸潤性リンパ球浸潤物が移植から7日後に認められ、ほとんどの同種移植片が移植から20日目までに完全に破壊される12、28。TIM-3発現がこのモデルに関連するかどうかを決定するために、リアルタイムPCR実験を実施して、処置レシピエントおよびコントロールレシピエントにおける移植片内遺伝子発現を比較した。移植7日後に処置宿主およびコントロール宿主の両方で高い移植片内γINFおよびTIM-3遺伝子発現がみとめられる一方で図8A、長期生存寛容レシピエントにおける同種移植片応答移植120日目を、平滑末端化TIM-3およびγIFN移植片内遺伝子発現によって特徴づける図8A。IL-2の移植片内発現は、7日目の処置および未処置宿主の両方においてTIM-3およびγIFNの移植片内発現と密接に関連する。対照的に、7日目および120日目で拒絶された移植片と比較したところ、DST抗CD154処置宿主においてIL-4およびIL-10の移植片内発現の2~3倍の増加が認められる。したがって、処置はTh2型遺伝子発現の上方制御に関連する一方で、Th1応答は移植免疫寛容の維持期120日目に起こるが、誘導期7日目に起こらない。次に、完全なTIM-3経路には移植免疫寛容の達成が必要であるかどうかを評価した。DST抗CD154とのex-Tim-3-Igの投与により、島同種移植片寛容の獲得が防止されて、急速に拒絶される図8B。さらに、ex-Tim-3-Ig投与により、高用量の抗CD154での単剤療法によって媒介される寛容の誘導も無効になる。TIM-3経路が抗CD154/-DST処置で寛容化される機能のみにおいて重要であるかどうかを決定するために、CTLA4Ig投与によって寛容化される移植モデルにおけるTIM-3遮断の効果を試験した。インビボでのCTLA4Igの作用機構は、抗原反応性T細胞増殖の阻害ならびに免疫調節および末梢性寛容の誘導の両方に関与する30~32。CTLA4Ig処置によって9つの処置したレシピエントのうちの7つで島同種移植片が不正確に生着する一方で、ex-Tim-3-Igの同時投与によって同種移植片の大部分が拒絶された図8C。第1の実験の結果をまとめると、これらのデータは、TIM-3が免疫寛容の重要なレギュレーターであることを明らかに示す。実施例16.TIM-3遮断はCD4CD25-T細胞が同種移植片を拒絶する能力を抑制するナイーブCD4CD25調節T細胞の能力を排除しない出願人は、以前に、CD4CD25調節T細胞がDST抗CD154で誘導された寛容状態の維持に重要に関与すると判断している12。出願人は、本発明で、この調節T細胞サブセットも移植免疫寛容の誘導期に必要であるかどうかを試験した。興味深いことに、CD4CD25T細胞サブセットの枯渇の結果がex-Tim-3-Ig投与によって誘導された効果と類似し、島同種移植片の急速な拒絶が抗CD25mAb処置宿主で認められた図9A。これらの結果に基づいて、ナイーブ宿主中に存在するCD4CD25調節T細胞を保有するTIM-3LによるTh1エフェクター細胞上で発現したTIM-3の関与がその免疫抑制機能の必要条件であり得ると仮定した。ナイーブマウスから採取した調節T細胞がTIM-3が関与しないでその免疫抑制機能を発揮することができるかどうかを決定するために、TIM-3遮断の非存在下でCD4CD25-T細胞によって媒介される同種移植片拒絶を防止するナイーブCD4CD25T細の能力を評価する養子免疫伝達実験を行った。このモデルでは、わずか1×105個のCD4CD25-またはCD8T細胞の免疫不全MHC不適合皮膚同種移植片レシピエントへの導入によって急速な皮膚同種移植片拒絶が起こる一方で、導入されたナイーブCD4CD25T細胞は拒絶を誘導してCD4CD25-エフェクターT細胞集団が移植片を破壊するのを防止する33、34。DBA/2皮膚同種移植片のC3H/HeScidレシピエントへのex-Tim-3-Igの投与により、導入されたナイーブCD4CD25T細胞の同時導入CD4CD25-T細胞が同種移植片拒絶するのを防止する能力を阻害しなかった図9B。ナイーブCD4CD25T細胞をナイーブCD4CD25-T細胞またはTh1二分化CD4T細胞のいずれかと同時培養し、ex-Tim-3-Igの非存在下で可溶性抗CD3で刺激した場合、インビトロで同様の結果が認められた。さらに、1×105個のCD4CD25-T細胞のみの導入により、ex-Tim-3-IgまたはコントロールhIgGを投与したかと無関係に等しい急速な皮膚移植片拒絶が生じた。まとめると、これらの結果は、ナイーブ同種抗原未経験マウスから採取したCD4CD25調節T細胞がTIM-3と関与せずにTh1依存性細胞変性応答を抑制することができることを示す。したがって、TIM-3遮断は抗原未経験CD4CD25T細胞の免疫調節エフェクター機能を消失せず、CD4CD25-T細胞が皮膚同種移植片を拒絶する能力を顕著に増強しない。実施例17.TIM-3は同種抗原特異的CD4CD25調節T細胞集団の有効性の強化を調節する移植免疫寛容を引き起こすいくつかの治療計画は、抗原特異的CD4CD25調節T細胞の有効性を強化することが知られている33~35。同種抗原特異的CD4CD25T細胞の生成に対するDST抗CD154処置の影響を決定するために、ナイーブ宿主またはDST抗CD154で処置したマウスから採取したCD4CD25T細胞の免疫抑制能力を比較するためのさらなる養子免疫伝達実験を行った。処置または未処置のナイーブマウスから採取したCD4CD25-またはCD8T細胞は急性皮膚同種移植片拒絶を促進する能力を変更せずCD4CD25-T細胞のデータを図9Cに示す、このモデルでは、DST抗CD154処置はエフェクターT細胞集団に大きな影響を与えないことを示す。対照的に、DST抗CD154処置宿主から分取したCD4CD25T細胞は、ナイーブマウスから採取したCD4CD25T細胞よりもナイーブCD4CD25-T細胞に対する免疫抑制効果がはるかに高かった。したがって、高いCD4CD25:CD4CD25-比4:1で導入した場合にナイーブCD4CD25T細胞はCD4CD25-T細胞が皮膚同種移植片を拒絶するのを防止することができる一方で図9C、中央のパネル、DST抗CD154処置宿主から採取したCD4CD25T細胞のみでは1:1の調節T細胞:エフェクターT細胞比で有効な免疫抑制を媒介することができる図9C、右のパネル。顕著には、DST抗CD154処置後に認められたこの増強された免疫抑制表現型は非常にドナー特異的であり、これは、DST抗CD154を使用して異なるドナー株C57BL/6に対して寛容化された宿主から採取したCD4CD25T細胞が、ドナーDBA/2皮膚同種移植片に反応してナイーブCD4CD25T細胞よりも高い移植片防御効果を媒介しなかったからである皮膚同種移植片生存時間の中央値は、それぞれ14日および12日、n=5および7。さらに、DSTおよび抗CD154は共に免疫調節効果の増強に必要であり、これは、CD40-CD154同時刺激遮断を使用しない同種抗原の供給がインビボでのCD4CD25T細胞の免疫抑制機能に対して検出可能な効果を示さなかったからである。これらの所見により、DST抗CD154が、ドナー特異的CD4CD25調節T細胞の免疫抑制機能の増強によって寛容化効果を大いに発揮することが示唆される。次いで、出願人は、TIM-3経路がこの治療効果に重要であるかどうかという問題に取り組んだ。CD4CD25T細胞をDST抗CD154処置マウスから採取し、その免疫抑制機能を、DST、抗CD154、およびex-Tim-3-Igで処置した宿主から得た調節T細胞の免疫抑制機能とインビボで比較した。DST抗CD154処置によって付与された増強された同種抗原特異的抑制表現型は、ex-Tim-3-Igの同時投与によって消失し図9D、これは、ex-Tim-3-Igを投与した処置宿主から採取したCD4CD25T細胞がナイーブ調節細胞よりも高い抑制効果を発揮しなかったからである図9D。これらの実験では、ex-Tim-3-IgをCD4CD25T細胞ドナーにのみ投与し、皮膚移植片レシピエントを全く処置しないので、ex-Tim-3-Ig処置によりCD4CD25T細胞とCD4CD25-T細胞との間の相互作用を妨害される可能性が最小になる。実際、本発明者らの養子免疫伝達モデルでは、出願人は、移植後のex-Tim-3-Igの投与により、前に生成されたドナー特異的CD4CD25T細胞の防御効果を無効にしないことに気づいた。まとめると、本発明者らのデータにより、iTIM-3経路が寛容誘導の間にCD4CD25T細胞によってドナー特異的免疫調節特性の獲得を容易にし、iiTIM-3/TIM-3L相互作用がドナー特異的CD4CD25免疫調節T細胞の生成に重要であるが、免疫抑制エフェクター機能に重要ではないことが示唆される。実施例18.TIM-3リガンドとしてのガレクチン-9の同定推定TIM-3リガンドの発現の分布を分析するために、TIM-3-Ig融合タンパク質による細胞表面染色を使用して、TIM-3リガンド発現細胞型をスクリーニングした。flTIM-3-IgおよびsTIM-3-Igは共に静止CD4T細胞ならびに脾臓CD11c樹状細胞およびCD11bマクロファージの小集団に結合するが、CD8またはB220細胞に結合しないことが示されSabatosetal.NatImmunol4:1102-1110,Sanchez-Fueyoetal.NatImmunol4:1093-1101、これは、TIM-3リガンドが主に静止CD4T細胞上で発現することを示す。したがって、多数のT細胞株/T細胞リンパ腫をスクリーニングした。FACSの結果は、試験した3つのT細胞株はこれまでのところsTim-3-Igに結合するがヒトIgG1コントロールに結合せず、そのうちのTK-1T細胞リンパ腫がsTim-3-Igに最も結合することを証明した図10A。flTIM-3-Igによる染色は類似の結果を示した図10A。特異的細胞外膜結合TIM-3結合タンパク質を同定するために、生きたTK-1細胞をビオチン標識し、ホールセル溶解物を、TIM-3-Ig融合タンパク質とのインキュベーションによる破壊アッセイに供した。SDS-PAGE-ウェスタンブロットの結果は、flTim-3-IgおよびsTim-3-Igが共に分子量範囲が40~60kDのタンパク質またはタンパク質複合体を沈殿させることができることを証明した図1b、レーン1、2。TIM-2-IgまたはhIgG破壊タンパク質由来のコントロール群と比較して図10b、レーン3、4、40~60kDのバンドは、flTIM-3-IgおよびsTIM-3-Igに特異的である。PNGアーゼFによってN結合オリゴ糖鎖を除去した場合、分子量が40~60kDのバンドは35kDに減少した。35S-Met代謝標識TK-1細胞由来の細胞溶解物を使用した同一の実験により、この35kDのバンドの汚染可能性がさらに排除された。銀染色SDS-PAGEゲルから抽出した35kDバンドの質量分析により、タンパク質がガレクチン-9リンパ球および他の細胞型上で発現する多数のガレクチンファミリーと同定された。実施例19.ガレクチン-9とTIM-3との間の特異的相互作用ガレクチンは、細胞表面上の糖部分に結合するための炭水化物認識ドメインCRDを含むβ-ガラクトシド結合レクチン群であり、レクチンは、免疫細胞のホメオスタシスの主なレギュレーターであるRabinovichetal.TrendsImmunol23:313-320;Rabinovichetal.BiochimBiophysActa1572:274-284。ガレクチンは、ER-ゴルジ経路分泌のためのシグナルペプチドを含まない。IL-1のように、ガレクチンは別経路を介して細胞外に分泌される。TK-1細胞由来の総RNAを、ガレクチン-9cDNAをクローン化するためのRT-PCRのために調製した。2つのガレクチン-9コード配列をクローン化し、その後標準ガレクチン-9cDNAとして見出され、ガレクチン-9の2つのCRDドメインのヒンジ領域中に31個のアミノ酸が挿入されているその長鎖イソ型は腸上皮で主に発現されると報告されている。ガレクチン-9とTIM-3との間の相互作用を確認するために、両ガレクチン-9イソ型cDNAを、EGFPタンパク質をバイシストロン性に発現する発現ベクターにサブクローン化した。ガレクチン-9発現プラスミドがCHO細胞に一過性にトランスフェクトされた場合、EGFPを発現する細胞はガレクチン-9を同時に発現する。一過性トランスフェクションでは、ガレクチン-9の発現は、細胞表面上で検出されなかった。一過性にトランスフェクトされたCHO細胞におけるガレクチン-9の発現を別の輸送機構から分離することが可能である。したがって、タンパク質産物が細胞質中に蓄積され得る。細胞内染色によってEGFP陽性のトランスフェクトされたCHO細胞由来のsTim-3-IgおよびflTIM-3-Igによる同一の陽性染色パターンが明らかとなることが確かであり、TIM-3融合物と相互作用する場合に標準的なガレクチン-9とその長鎖イソ型との間の相違が示唆されない。しかし、これらはいずれもhIgGコントロールに結合することができない図11A。ガレクチン-9とTIM-3との間の結合特異性を証明するために、ガレクチン-9を一過性にトランスフェクトしたCHO細胞を、細胞内染色に供した。flTIM-3-IgおよびsTIM-3-Igは、ガレクチン-9発現細胞中で全ての陽性染色を有する唯一の融合タンパク質である。それに反して、TIM-2-Ig、TIM-4-Ig、およびhIgGは同一のトランスフェクトされたCHO細胞に結合することができず、TIM-3は、他のTIMファミリーメンバーと比較してガレクチン-9に対する親和性が最も高いと示唆される。別のアプローチとして、精製組換えガレクチン-9をsTIM-3-Igによって特異的に破壊することができるが、TIM-2およびTIM-4Ig融合物ではできない図11C。他方では、flTIM-3-IgおよびsTIM-3-Igのみが共にガレクチン-9発現細胞への陽性結合を示すのに対して、細胞が非常に高いレベルのこれらのタンパク質を発現しない限り、これらはガレクチン-1、3、および4に結合せず、TIM-3とこれらのガレクチンとの間の一定レベルの非特異的相互作用が示唆される図11C。要するに、ガレクチン-9は、TIM-3細胞外部分に特異的に結合するタンパク質である。flTIM-3-IgおよびsTIM-3-Igは共にガレクチン-9に結合することができるので、TIM-3上のIgVドメインは、ガレクチン-9との相互作用を担い得る。インキュベーション緩衝液にラクトースを添加した場合、ガレクチン-9とTIM-3との間の相互作用は、用量依存性様式で細胞内染色および破壊アッセイの両方で弱まった図12A。さらに、N末端CRDまたはC末端CRDのいずれかを破壊する変異ガレクチン-9構築物はTIM-3に対する相互作用を部分的に喪失するのに対して、両CRDドメインの二重変異によってTIM-3への結合が完全に無効になった図12B。したがって、ガレクチン-9とTIM-3との間の相互作用は、ガレクチン-9中のCRDドメインに依存する。実施例20.エフェクターTh1細胞の調節におけるTIM-3-ガレクチン-9の役割出願人は、アポトーシス機構によるTh1細胞増殖の調節およびホメオスタシスにおけるガレクチン-9-TIM-3経路の機能的役割を仮定した。エフェクターT細胞中のガレクチン-9のアポトーシス効果を試験するために、DO11.10トランスジェニックマウス由来のナイーブ脾臓CD4T細胞を、CD4T細胞ネガティブ選択カラムによって精製し、CD4CD62L細胞について分取した。細胞をVOAペプチドおよび照射APCにてインビトロで刺激し、インビトロで少なくとも3ラウンドTh1細胞およびTh2細胞に二分した。活性Th1細胞を組換えガレクチン-9で処置した場合、大部分の細胞で細胞死が誘導された。それに反して、活性化Th2細胞は、ガレクチン-9誘導細胞死に耐性を示した図13。AE7Th1細胞株およびD10G4Th2細胞株に対して行ったさらなる実験は、インビボでの組換えガレクチン-9によって誘導された類似の細胞死効果を証明した。実施例21.組換えガレクチン-9はTh1細胞活性化を弱めるTh1免疫応答中のガレクチン-9とTIM-3との相互作用のインビボ効果を決定するために、C57BL/6Jマウスを、MOG35-55を含むフロイント完全アジュバントCFAで免疫化した。組換えガレクチン-9100μgを、3日目から9日目まで免疫化マウスにi.p.注射した。細胞増殖およびサイトカイン産生アッセイのために、脾細胞を採取した。しかし、PBS処置コントロール群と比較して、ガレクチン-9投与は3Hチミジン組み込みによって脾細胞増殖を変化させないが、ELISAの結果は、50を超えるIFN-γ産生の減少を示した。ELISPOTは、ガレクチン-9処置脾臓由来のより少ない細胞がIFN-γおよびIL-2を産生することをさらに証明した。興味深いことに、PBS処置マウスと比較して、IL-4およびIL-5産生は変化しなかった図14。実施例22.EAE処置におけるガレクチン-9-TIM-3の治療効果TIM-3は、Th1細胞応答および末梢性寛容の調節において重要な機能を有することが証明されている。その発現は、EAEおよびヒト多発性硬化症MSの病理学と相関する。興味深いことに、星状細胞におけるガレクチン-9の発現は、IL-1βによって誘導され、このタンパク質がCNSにおける炎症の制限に関与し得ることを示すYoshidaetetal.Neuroreport12:3755-3758。TIM3-TIM-3リガンド相互作用がTh1応答を調節して免疫寛容を促進することができるので、これらの機能がTIM-3-ガレクチン-9の相互作用によって媒介されることが可能である。この可能性に取り組むために、組換えガレクチン-9を、MOGペプチド35-55/CFA免疫化C57BL/6Jマウスに免疫化した日から1日おきに投与する。疾患をモニタリングし、脳および脊髄を組織病理学的に試験する。TIM-3の機能的リガンドとして、ガレクチン-9投与は、EAEの重症度を減少させるか、そして/またはEAEに対する寛容を誘導すると予想される。コントロールとして、出願人は、C57BL/6JバックグラウンドにおけるTim-3-/-マウスも試験する。Tim-3欠損マウスはガレクチン-9投与の影響を受けないと予想される。D.第2の実験の考察Th1またはTh2経路へのTh前駆体の拡大および分化は、細菌、ウイルス、自己抗原、および同種抗原の結果を調節する。これらのT細胞応答の範囲は、サイトカインおよび補助分子群TNF受容体7およびIgスーパーファミリー8が含まれるの影響を受ける。TIM-3は、Monneyetal.10によってEAEにおける組織破壊免疫応答の負のレギュレーターとして最近同定された新規のTh1特異的Igスーパーファミリーメンバーである。このモデルでは、抗TIM-3mAb処置によってマクロファージの数および活性レベルならびに脳内組織の損傷の重症度を増加させた。これらの結果に基づいて、抗TIM-3はTh1細胞の脳への移動の強化またはTIM-3と推定阻害TIM-3Lとの間の相互作用の遮断によってマクロファージを活性化することができることを提案した。出願人は、活性化Th1およびTh2クローンの遺伝子発現プロフィールの比較によってTIM-3を同定し、出願人は、自己免疫モデルおよび同種免疫モデルにおいてTIM-3がTh1媒介応答の制限で重要な役割を果たすこと、およびこれらの効果がCD4CD25調節T細胞集団の免疫抑制機能の調整によって少なくとも一部が媒介されるようであるということを報告する。CD4CD25調節T細胞は、自己寛容の維持36~38および同種移植片の長期許容12、34、35で中心的役割を果たす。その正確な作用機構は依然として定義されていないが、細胞-細胞接触相互作用および可溶性因子がその免疫抑制機能に関与する39、40。本発明者らの結果は、TIM-3はこれらのCD4CD25T細胞が免疫抑制効果を送達する分子経路ではないことを示し、これは、ナイーブまたは寛容宿主由来のCD4CD25T細胞はインビボおよびインビトロの両方におけるTIM-3の有効な発現を欠くCD4CD25T細胞を強く抑制することができる図9B。しかし、TIM-3/TIM-3L感受性経路は、DST抗CD154処置などの寛容治療薬の投与後に出現するドナー特異的CD4CD25調節T細胞の機能的生成を担う図9D。したがって、TIM-3依存性経路および非依存性経路は共にCD4CD25T細胞依存性免疫調節に関与する。TIM-3およびそのリガンドを含む正確な細胞および分子の相互作用は依然として完全に解明されていないにもかかわらず、TIM-3およびTIM-3Lで認められる発現パターン図8A~Dにより、TIM-3陽性Th1エフェクター細胞とTIM-3L陽性調節T細胞との間の直接相互作用は、CD4CD25T細胞が増強された免疫抑制機能を獲得する機構を構成し得ることが示唆される。あるいは、TIM-3L発現がいくつかの樹状細胞でも認められると仮定すると、調節T細胞に対するTIM-3の効果を、APCの介入によって直接発揮することができる。この最後の解釈は、CD4CD25T細胞媒介免疫調節の調整における樹状細胞表現型の役割に関する所見と一致するであろう41、42。最後に、TIM-3がライゲーション時にsrcキナーゼを漸増することができ、それによって下流シグナル伝達事象に影響を与えることができるという事実は、TIM-3ライゲーションはTh1細胞自体に対して直接阻害シグナルも発揮することができることを示す。それにもかかわらず、ex-Tim-3-Ig処置移植レシピエントの脾臓におけるIL-2およびγIFN産生エフェクターT細胞の頻度が有意に増加しないことにより、移植においてTIM-3がエフェクターT細胞集団よりも調節に対して強力な効果を示すことが示唆される。本発明者らの所見は、DST抗CD154が移植における寛容の誘導を促進する機構に新規の洞察をもたらす。抗CD154誘導免疫抑制環境における宿主T細胞への同種抗原の提供により、アネルギーおよび/またはアポトーシスによって同種反応性CD4およびCD8Tリンパ球が直接不活化され、その後寛容状態を自己永続することができる調節T細胞の発現を促進すると現在理解されている11~13、28、43。出願人は、ポリクローナル系においてDST抗CD154が主に同種抗原特異的様式でCD4CD25T細胞の免疫抑制機能の増加によって作用する一方で、エフェクターT細胞集団の同種移植片を拒絶する能力に対する処置の効果はあまり強力ではないことを示す証拠を提供する。CD40-CD154同時刺激を行わない同種抗原を使用した以前の偶然によってこれらのTIM-3感受性免疫調節網が誘導される機構が推定される。同種ペプチドを認識することができる調節T細胞クローンは選択的増殖を受け44、45、そして/またはより有効な免疫抑制機能を獲得し、それにより、ドナー特異的免疫調節回路強化される。実際、本発明者らのモデルにおけるDST単剤療法の効果の欠如により、エフェクターT細胞のアポトーシスおよびアネルギーを促進することが公知のCD154遮断13、43が調節T細胞の機能および生存を許容するかさらに増強することが示唆される。あるいは、CD40-CD154同時刺激遮断は常在APCの表現型を調整し、それにより活性化されたナイーブドナー反応性T細胞の免疫調節区画に漸増させることができる。興味深いことに、APC上のCD40発現の欠如は、いくつかの場合、CD4調節T細胞の生成49によって抗原特異的寛容を促進すると報告されている46~49。したがって、本発明者らの所見に基づいて、出願人は、CD40およびTIM-3は拮抗作用を有し、そのバランスは寛容と免疫の決定のチェックポイントとして役立つと推測する。免疫寛容を促進するTIM-3/TIM-3L経路の重要性は、DST抗CD154が移植免疫寛容を達成する機構に排他的に制限されない。実際、ex-Tim-3-IgがCTLA4Ig処置後に寛容誘導を無効にするという本発明者らの所見に基づいて図9D、出願人は、TIM-3はTh1媒介免疫応答の調節および免疫寛容の発生の促進で基本的役割を果たすと結論づけることができる。要するに、出願人は、IgスーパーファミリーメンバーであるTIM-3が積極的なTh1媒介自己免疫応答および同種免疫応答を阻害するように機能することを記載している。これらの効果は、少なくとも一部が、CD4CD25調節T細胞の免疫抑制効力の調節を媒介するようである。したがって、Th1細胞上のTIM-3発現は、炎症性Th1依存性T細胞応答を弱めて関連組織損傷を制限する働きをする重要なチェックポイントを提供する。E.参考文献等価物当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を理解し、または確認し得る。このような等価物は、特許請求の範囲により包含されることが意図される。種々の出版物が、本出願を通して引用される。これらの出版物の内容は、本明細書により参考として本出願に援用される。配列表"