"対象における乳癌の再発の指標である複数の所定の代謝物バイオマーカーのパネルを検出するための方法であって、前記対象から体液のサンプルを得る工程と、前記サンプルを分析して、前記パネルにおける代謝物バイオマーカーの各々の存在および量を決定する工程とを包含し、前記パネル中の前記代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、対象における乳癌の再発の指標である、方法。前記体液が、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である、請求項1に記載の方法。複数の代謝物バイオマーカーの前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、N-アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、2-ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、3-メチル-2-ヒドロキシ-2-ペンテン酸、ドデカン酸、1,2,3,トリヒドロキシプロパン、β-アラニン、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも7つの化合物からなる、請求項1に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる、請求項3に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、請求項3に記載の方法。前記パネルが、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、請求項3に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる、請求項3に記載の方法。前記パネル中の代謝物バイオマーカーが、乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、前記サンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、前記サンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、前記サンプルを質量分析測定に供することによって前記サンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、前記核磁気共鳴測定の結果および前記質量分析測定の結果を分析して、前記サンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、前記スペクトルを多変量統計分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が乳癌の状態と相関するかを決定する工程とによって決定される、請求項1に記載の方法。哺乳動物対象において二次的な腫瘍細胞増殖を検出する方法であって、前記対象から体液のサンプルを得る工程と、前記サンプルを分析して、所定のバイオマーカーのパネルにおいて各々の代謝物バイオマーカーの存在および量を決定する工程とを包含し、前記パネル中の前記代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、哺乳動物対象における二次的な腫瘍細胞増殖の指標である、方法。体液が血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である、請求項9に記載の方法。複数の代謝物バイオマーカーの前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、N-アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、2-ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、3-メチル-2-ヒドロキシ-2-ペンテン酸、ドデカン酸、1,2,3,トリヒドロキシプロパン、β-アラニン、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも7つの化合物からなる、請求項9に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる、請求項11に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、請求項11に記載の方法。前記パネルが、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる、請求項11に記載の方法。前記パネルが、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる、請求項11に記載の方法。前記パネル中の代謝物バイオマーカーが、乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、前記サンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、前記サンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、前記サンプルを質量分析測定に供することによって前記サンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、前記核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、前記サンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、前記スペクトルを多変量統計分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が二次的な腫瘍細胞増殖と相関するかを決定する工程とによって決定される、請求項9に記載の方法。生体サンプル内の乳癌の再発の状態を検出するための方法であって、前記サンプルを、核磁気共鳴分析と質量分析とを組み合わせた分析に供することによって前記サンプル内の1つ以上の代謝物種を測定する工程であって、前記分析によって前記サンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、前記個々のスペクトルピークを統計学的パターン認識分析に供して、前記サンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、前記1つ以上の代謝物種の測定値と乳癌の状態とを関連付ける工程とを包含する、方法。前記1つ以上の代謝物種が、2-メチル、3-ヒドロキシブタン酸;3-ヒドロキシ酪酸塩;コリン;ギ酸塩;ヒスチジン;グルタミン酸;N-アセチル-グリシン;ノナン二酸;プロリン;トレオニン;チロシン;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。前記サンプルが、体液を含む、請求項17に記載の方法。前記体液が血清である、請求項19に記載の方法。前記質量分析が、二次元ガスクロマトグラフィとカップリングした質量分析を含む、請求項17に記載の方法。2-メチル、3-ヒドロキシブタン酸;3-ヒドロキシ酪酸塩;コリン;ギ酸塩;ヒスチジン;グルタミン酸;N-アセチル-グリシン;ノナン二酸;プロリン;トレオニン;チロシン;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも1つの代謝物種またはその一部を含む、乳癌を検出するためのバイオマーカー。2-メチル、3-ヒドロキシブタン酸;3-ヒドロキシ酪酸塩;コリン;ギ酸塩;ヒスチジン;グルタミン酸;N-アセチル-グリシン;ノナン二酸;プロリン;トレオニン;チロシン;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、1つ以上の代謝物種またはその一部を含む、複数のバイオマーカーからなるパネル。再発乳癌の慣用的な調査のための一般的な方法としては、定期的なマンモグラフィ検査、自己診断または医師の行う理学的検査および血液試験が挙げられる。このような試験の能力は不十分であり、調査のための広範な検討でも有効性は証明されていない。多くの場合、マンモグラフィは、小さい局所再発を見逃すか、または偽陽性をもたらし、その結果、感度および特異性が低く、不必要な生検につながる。より鋭敏かつ早期の検出方法への必要性が満たされていないという観点から、ここ10年程度、再発乳癌検出および疾患進行のモニタリングのための多数の新規なアプローチの開発が、血液に基づく腫瘍マーカーまたは遺伝的プロファイルを用いて行われた。インビトロの診断IVDマーカーとしては、癌胎児性抗原CEA、癌抗原CA15-3、CA27.29、組織ポリペプチド抗原TPA、および組織ポリペプチド特異的抗原TPSが挙げられる。このような分子マーカーは、有望であると考えられる。なぜなら、これらのマーカーに基づく診断の結果が、臨床家の専門知識および経験と無関係であり、組織病理学のような従来の病理学的試験と通常関連するサンプリングエラーを可能性としては回避するためである。しかし、現在のところ、これらのマーカーは、望ましい感度および特異性がなく、再発から遅れて応答する場合が多く、代替的なアプローチの必要性が強調される。患者の相対生存におけるほぼ50までの改善が、臨床的な無症候期に再発を検出することによって達成可能である、これは、二次的な腫瘍細胞増殖の指標であるバイオマーカーに基づく信頼できる試験の必要性を示している。しかし、癌胎児性抗原および癌抗原のような循環中の腫瘍マーカーに基づく市販の非侵襲性の試験の能力は、早期検出を改善するために有意な価値であるにはあまりに低い。この理由は、これらのマーカーのレベルが、乳癌とは関係のない多数の他の悪性および非悪性の条件で上昇するからである。このような限界を考慮して、アメリカ臨床腫瘍学会ASCO:AmericanSocietyofClinicalOncologistsのガイドラインは、これらのマーカーの使用を、多数の他の検査および検討と組み合わせて、能動的な治療の間の転移性疾患を有する患者のモニタリングにのみ推奨している。代謝物プロファイリングまたはメタボロミクス代謝学は、血液および尿のようなサンプルの代謝物プロファイルの全体的分析または標的化分析に由来する低分子のパネルに基づいて疾患を検出し得る。代謝物プロファイリングでは、生体サンプル中に存在する数百の低分子約1,000Da未満の定量分析のため、核磁気共鳴NMR分光法および質量分析法MSのような高解像度の分析方法が用いられる。代謝物プロファイルの複雑性のため、多変量の統計学的方法がデータ分析のために広く用いられる。わずかな刺激に対してさえ代謝物プロファイルが高感度であることにより、リアルタイムでの種々の生体変動biologicalperturbationsの早期の発現を検出する手段を得ることができる。代謝物プロファイリング方法を用いて特定した多様なバイオマーカーのパネルの存在を検出する、感度および特異性の程度が高い、再発乳癌のためのモニタリング試験を提供する。この試験は、現在利用可能なモニタリング診断試験よりも約1年早く、乳癌の再発を検出し得る。バイオマーカーのパネルは、血清サンプルの代謝物プロファイルを作成するために、核磁気共鳴NMRと2次元のガスクロマトグラフィクロマトグラフィ-質量分析GC×GC-MSとの組み合わせを用いて特定される。乳癌を再発した患者由来のサンプルと、疾患の所見のない患者由来のサンプルとの間で、特定された代謝物シグナルを比較すべく、NMRおよびGC×GC-MSのデータを多変量統計法により分析する。好ましい実施形態では、対象における乳癌の再発の指標である複数の所定の代謝物バイオマーカーのパネルを検出するための方法が開示されており、この方法は、この対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを分析して、このパネルにおける代謝物バイオマーカーの各々の存在および量を決定する工程とを包含し、このパネルのこの代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、対象における乳癌の再発の指標である。典型的には、上記体液は、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である。好ましくはこの体液とは、血清である。好ましい実施形態では、複数の代謝物バイオマーカーの上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、N-アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、2-ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、3-メチル-2-ヒドロキシ-2-ペンテン酸、ドデカン酸、1,2,3,トリヒドロキシプロパン、β-アラニン、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも7つの化合物からなる。別の好ましい実施形態では、上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。さらに好ましい実施形態では、上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。別の好ましい実施形態では、上記パネルは、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。さらに別の好ましい実施形態では、上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。好ましい実施形態では、上記パネル中の代謝物バイオマーカーは、乳癌の状態が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、このサンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、このサンプルを質量分析測定に供することによってこのサンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、この核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、このサンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを作成する工程と、このスペクトルを多変量統計分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が所定の乳癌の状態と相関するかを決定する工程とによって決定される。別の好ましい実施形態では、哺乳動物対象において二次的な腫瘍細胞増殖を検出する方法が開示されており、この方法は、対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを分析して、所定のバイオマーカーのパネルにおいて各々の代謝物バイオマーカーの存在および量を決定する工程とを包含し、このパネル中のこの代謝物バイオマーカーの各々の存在および量が、全体として、哺乳動物対象における二次的な腫瘍細胞増殖の指標である。典型的には、上記体液は、血液、血漿、血清、汗、唾液、喀痰または尿である。好ましくはこの体液は血清である。好ましい実施形態では、複数の代謝物バイオマーカーの上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、N-アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、2-ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、3-メチル-2-ヒドロキシ-2-ペンテン酸、ドデカン酸、1,2,3,トリヒドロキシプロパン、β-アラニン、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる群より選択される少なくとも7つの化合物からなる。別の好ましい実施形態では、上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。さらに好ましい実施形態では、上記パネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。別の好ましい実施形態では、このパネルは、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。さらに別の好ましい実施形態では、このパネルは、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。好ましい実施形態では、上記パネル中の代謝物バイオマーカーは、二次的な腫瘍細胞増殖が既知である対象から体液のサンプルを得る工程と、このサンプルを核磁気共鳴測定に供することによって、このサンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、このサンプルを質量分析測定に供することによってこのサンプル中の1つ以上の代謝物種を測定する工程と、この核磁気共鳴測定の結果および質量分析測定の結果を分析して、このサンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、このスペクトルを多変量統計分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、どの代謝物種が二次的な腫瘍細胞増殖と相関するかを決定する工程とによって決定される。別の好ましい実施形態では、生体サンプル内の乳癌の再発の状態を検出するための方法が開示されており、この方法は、核磁気共鳴分析と質量分析とを組み合わせた分析にサンプルを供することによってこのサンプル内の1つ以上の代謝物種を測定する工程であって、この分析によってこのサンプル内に含まれる1つ以上の代謝物種の代表的な個々のスペクトルピークを含むスペクトルを生成する工程と、この個々のスペクトルピークを統計学的パターン認識分析に供して、このサンプル内に含まれる少なくとも1つ以上の代謝物種を特定する工程と、この1つ以上の代謝物種の測定値と乳癌の状態とを関連付ける工程とを包含する。好ましくは、上記1つ以上の代謝物種は、2-メチル、3-ヒドロキシブタン酸;3-ヒドロキシ酪酸塩;コリン;ギ酸塩;ヒスチジン;グルタミン酸;N-アセチル-グリシン;ノナン二酸;プロリン;トレオニン;チロシン;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。典型的には、上記サンプルは、体液、好ましくは血清を含む。典型的には、上記質量分析は、二次元クロマトグラフィガスクロマトグラフィとカップリングした質量分析を含む。別の好ましい実施形態では、本発明は、乳癌を検出するためのバイオマーカーのパネルであって、このパネルは、2-メチル、3-ヒドロキシブタン酸;3-ヒドロキシ酪酸塩;コリン;ギ酸塩;ヒスチジン;グルタミン酸;N-アセチル-グリシン;ノナン二酸;プロリン;トレオニン;チロシン;およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも1つの代謝物種またはその一部を含んでいるパネルを提供する。本発明の教示の上述の態様およびそれらを達成する方式は、さらに明白になり、その教示は、添付の図面と組み合わせて行われる以下の実施形態の説明を参照すればさらに理解される。ここでは対応する参照符号は、いくつかの図面を通して対応する部分を示す。1つの好ましい実施形態では、代謝物プロファイリング方法を用いて開発された再発乳癌についてのモニタリング試験が開示される。核磁気共鳴NMRおよび二次元のガスクロマトグラフィ-質量分析法GC×GC-MS方法の組み合わせを用いて、本発明者らは、以前に診断され、外科的に処置された56例の乳癌患者由来の257例のレトロスペクティブな過去に遡っての連続的な経時的な血清サンプルの代謝物プロファイルを分析した。116例の連続サンプルは、再発乳癌の20例の患者由来であって、141例のサンプルは、6年までのサンプル収集の間に臨床上疾患の所見のない無病生存の36例の患者由来であった。NMRおよびGC×GC-MSデータを、再発サンプルと、無病生存のサンプルとの間で特定された代謝物のシグナルを比較するために多変量統計法によって分析し、1セットの40個のバイオマーカーを得た下の表2。11個の代謝物マーカーNMRから7つ、およびGC×GC-MSから4つのサブセットを、全ての患者サンプルの分析から、ロジスティック回帰および5分割交差検証を用いることによって選択した。リーブワンアウト交差検証によってこれらのマーカーを用いて構築された部分最小二乗判別分析モデルによって、86という感度および84という特異性が得られた受信者動作特性曲線下面積=0.88。驚くべきことに、55の患者について、再発することが、臨床上の再発の診断の1年以上平均で13カ月前に正確に予想され得、このことは、現在の乳癌-モニタリングアッセイCA27.29を上回る大きな改善である。下に記載される本発明の開示の実施形態は、網羅的でもなく、以下の詳細な説明に開示される正確な形態に対してその開示を限定するものでもない。むしろ、この実施態様は、当業者が、本発明の開示の原理および実施を評価し理解し得るように選択され記載される。他に規定されない限り、本明細書に用いられる全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書において用いる場合、代謝物とは、以下のような、エネルギーを生み出して用いる体内の全ての物理的および化学的なプロセス、例えば、食物および栄養の消化、尿および便を通じた廃棄物の排出、呼吸、血液循環および温度調節の間に生成されるかまたは用いられる任意の物質を意味する。代謝前駆体という用語は、代謝物が生成される由来の化合物を指す。代謝産物という用語は、代謝経路の一部である任意の物質例えば、代謝物、代謝前駆体を指す。本明細書において用いる場合、生体サンプルとは、対象から得られたサンプルを指す。好ましい実施形態では、生体サンプルは、限定はしないが、血液、血漿、血清、汗、唾液喀痰を含む、尿などからなる生体液体液の群から選択され得る。本明細書において用いる場合、血清とは、フィブリン塊および血球の除去後に得られた血液の体液部分を指し、循環血液中の血漿とは区別される。本明細書において用いる場合、血漿とは、凝集後に得られ、血清とは識別される、血液の非細胞部分の液体を指す。本明細書において用いる場合、対象とは、任意の温血動物、特に、例としては、限定するものではないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種;家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ;家庭内動物、例えば、イヌおよびネコ;実験動物、例としては、げっ歯類、例えば、マウス、ラットおよびモルモットなどのような分類の多数の哺乳動物を指す。この用語は、特定の年齢または性別を指すのではなく、従って、雄性または雌性にかかわらず、成体および新生の対象を包含する。本明細書において用いる場合、検出するとは、サンプル中の物質単数または複数の有無を特定する工程と、サンプル中の物質単数または複数の量を定量する工程と、および/または物質の種類を特定する工程とを包含する方法を指す。検出するとは、同様に、対象における乳癌組織または乳癌再発の有無を特定する工程を包含する方法を指す。質量分析計とは、気相イオンの質量対電荷比に変換され得るパラメータを測定する気相イオン分光計を指す。質量分析計は一般には、イオン源および質量分析器を備える。質量分析計の例は、飛行時間、磁場型、四重極フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクタ分析器およびそれらのハイブリッドである。質量分析法とは、気相イオンを検出するための質量分析計の使用を指す。包含する、含む、備えるcomprises、含んでいるcomprisingなどの用語は、米国特許法においてそれらに属するとみなされる広範な意味を有するものとし、包含する、含む、備えるincludes、含んでいるincludingなどを意味し得る。本発明は、記載される装置の特定の構成要素または記載される方法の工程段階に限定されず、そのようなものとして装置および方法が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定されると解釈されるべきではないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形不定冠詞/1つの、あるa、anおよび定冠詞/この、そのtheとは、その文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を包含する。本開示は、乳癌の早期の再発を検出するのに有効であるとして選択された、選択されたバイオマーカーのパネルに基づくモニタリング試験を提供する。この試験は、高い程度の臨床感度および臨床特異性を有し、現在のモニタリング診断よりもかなり早期の時点で乳癌再発を検出できる。この試験は、核磁気共鳴NMRおよび質量分析法MS技術の組み合わせを利用する生体サンプル分類法に基づく。さらに具体的には、本発明の技術は、NMRと二次元のガスクロマトグラフィ-質量分析法GC×GC-MSとの組み合わせを利用して、患者の血清サンプルで見い出される1セットの代謝物種を含む低分子バイオマーカーを特定する。これらの特定されたバイオマーカーのパネルは、再発のサンプルと、無病生存のサンプルとの間で特定された代謝シグナルを比較することによって早期のステージで再発乳癌を検出するのに有効であることが見い出され、現在利用可能な診断試験または臨床診断よりも1年早く再発の指標が得られる。代謝物プロファイリングは、生体サンプル中に存在する数百の低分子約1000ダルトン未満の定量分析のためのハイスループットの分析方法、例えば、核磁気共鳴分光法および質量分光法を利用する。代謝物プロファイルの複雑性のため、データ分析のために多変量統計法が広範に用いられる。わずかな刺激に対しても高感度である代謝物プロファイルは、リアルタイムで種々の生体変動の早期の発現を検出する手段を提供することができる。本発明の研究では、代謝物プロファイリング方法を用いて、再発乳癌に対して感受性であるとともに血清サンプル中で検出される代謝物を決定および選択した。NMRおよび二次元のガスクロマトグラフィ分解MS2DGC-MS方法の組み合わせを利用して、1セットの257のレトロスペクティブ連続血清サンプルに基づく早期乳癌再発検出のためのモデルを構築して実証バリデートした。本モデルのために選択された誘導された代謝物バイオマーカーの能力は、現在用いられている分子マーカーCA27.29の能力と比較して極めて好ましく匹敵した。このことは、代謝物プロファイリング方法が、処置された乳癌患者の追跡調査のための鋭敏な試験を保証することが示している。具体的には、60を超える再発性患者が、臨床的な診断による再発の検出の10カ月より前に特定され得る。結果の試験によって、再発乳癌の早期の検出のための鋭敏かつ特異的なモデルが得られる。この代謝物プロファイルは、NMRおよびMS方法のプラットフォームを用いて開発されたが、当業者は、これらの特定のバイオマーカーが、適切な感度の別の方法、例えば、HPLC、イムノアッセイ、酵素的アッセイ、または臨床化学方法によって検出され得ることを認識するであろう。本発明の一実施形態では、サンプルは、長期間にわたって個体から収集され得る。個体から経時的に多数のサンプルを得ることは、早期検出の結果を検証ため、および/または例えば、病理学の結果としてマーカーパターンにおける変化を特定するために用いられうる。本発明の一実施形態では、サンプルは、追加の調製および/または分離の手順なしで分析される。本発明の別の実施形態では、サンプルの調製および/または分離は、限定はしないが、収集されたサンプルの種類および/または検索された代謝産物の種類次第で、任意の以下の手順を包含し得る:多量のポリペプチド例えば、アルブミンおよびトランスフェリンの除去;防腐剤および検量体の追加、サンプルの脱塩;サンプル物質の濃縮;タンパク質消化;ならびに画分収集。本発明のさらに別の実施形態では、サンプル調製技術は、情報の多い代謝産物を濃縮して、情報が少ないかまたは全くないポリペプチドまたは他の物質血清に極めて豊富であるかまたは天然であるものなどを除去する。本発明の別の実施形態では、サンプル調製は、マニフォールドまたは調製/分離装置で行われる。このような調製/分離装置は、例えば、マイクロフルイディクス微小流体装置、例えば、カセットであってもよい。本発明のさらに別の実施形態では、調製/分離装置は、検出装置と直接または間接的に連結する。このような調製/分離装置は、例えば、フルイディクス流体装置であってもよい。本発明の別の実施形態では、所望されないポリペプチド例えば、多量の、情報にならない、または検出できないポリペプチドの除去は、高親和性の試薬、高分子量フィルター、カラム精製、超遠心および/または電気透析を用いて達成され得る。高親和性試薬としては、特定のpH、イオン値または界面活性剤の強度を有する豊富なポリペプチドまたは試薬に選択的に結合する、抗体が挙げられる。高分子量フィルターとしては、サイズおよび分子量に基づいて分子を分離する膜が挙げられる。このようなフィルターはさらに、逆浸透、ナノフィルトレーションナノ濾過、限外濾過およびマイクロフィルトレーション精密濾過を使用してもよい。限外濾過は、所望されないポリペプチドを除去するための別の方法を構成する。限外濾過では、粒子の沈殿またはその欠失を光学系でモニターしながら約60,000回転/分rpmでサンプルを遠心する。最後に、電気透析は、電位勾配の影響下でイオン透過性膜を通じて1つの溶液から別の溶液にイオンが移送される電気膜処理である。電気透析に用いられる膜は、正の電荷または負の電荷を有するイオン、および反対の電荷の拒絶イオンを選択的に輸送する能力を有するので、電気透析は、電解質の濃縮、除去または分離に有用である。本発明の別の実施形態では、マニフォールドまたはマイクロフルイディクス装置は、電気透析を行って、高分子量ポリペプチドまたは望ましくないポリペプチドを除去する。電気透析を最初に用いて、ほぼ3530kDより低い分子のみが第二のチャンバへ通過することを可能にしてもよい。極めて低い分子量カットオフほぼ500Dを有する第二の膜によって、より小さい分子が第二のチャンバを出ることが可能になる。サンプルの調製の際、目的の代謝産物は、本発明の別の実施形態で分離され得る。分離は、調製物と同じ位置で、または別の位置で行われ得る。本発明の一実施形態では、分離は、分離が生じる同じマイクロフルイディクス装置で、ただし、装置上の異なる位置で生じる。サンプルは、電場を含む、種々の手段を用いて最初のマニフォールド位置からマイクロフルイディクス装置へ移動され得る。本発明の別の実施形態では、サンプルは、逆相ビーズおよび有機溶媒溶出、例えば、50メタノールを用いて、マイクロフルイディクス装置へのそれらの移動の間に濃縮される。これによって、分子は、マイクロフルイディクス装置の分離装置上のチャネルまたはウェル中に溶出される。クロマトグラフィは、複数の物質の一部を分離するための別の方法を構成する。クロマトグラフィは、種々の物質の種々の吸収および溶出に基づく。液体クロマトグラフィLCは、例えば、非移動層を移動する液体担体の使用を包含する。従来のLCカラムは、ほぼ4.6mmの内径、およびほぼ1ml/分の流速を有する。マイクロ-LCMicro-LCは、ほぼ1.0mmの内径およびほぼ40μl/分の流速を有する。キャピラリーLCは、ほぼ300imの内径およびほぼ5μl/分の流速を有するキャピラリーを利用する。ナノ-LCは、50μm-1mmの内径および200nl/分の流速で利用可能である。HPLCに比較したナノ-LCの感度はほぼ3700倍である。本発明の追加の実施形態に適切な他の種類のクロマトグラフィとしては、限定はしないが、薄層クロマトグラフィTLC、逆相クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィHPLC、およびガスクロマトグラフィGCが挙げられる。本発明の別の実施形態では、サンプルは、キャピラリー電気泳動分離を用いて分離される。これは、分子を、所定のpHまたは疎水性でのそれらの電気泳動の移動度に基づいて分離する。本発明の別の実施形態では、サンプルの調製および分離は、マイクロフルイディクス技術を用いて組み合わされる。マイクロフルイディクス装置は、マイクロチャネル構造を用いた異なる位置間において分析物および溶出物などの種々の試薬を含む液体を輸送し得る装置である。適切な検出方法とは、少なくとも50μMの体液サンプル中の分析物の検出のための感度を有する方法である。特定の実施形態では、この検出方法の感度は、少なくとも1μMである。他の実施形態では、検出方法の感度は、少なくとも1nMである。本発明の一実施形態では、サンプルは、事前の調製および/または分離なしに検出装置に直接送達され得る。本発明の別の実施形態では、一旦調製および/または分離されれば、代謝産物は、検出装置に送達され、この検出装置がサンプル中の代謝産物を検出する。本発明の別の実施形態では、溶出液または溶液中の代謝産物は、エレクトロスプレーイオン化ESIによって検出装置に送達される。本発明のさらに別の実施形態では、ナノスプレーイオン化NSIが用いられる。ナノスプレーイオン化は、ESIの小型版であり、極めて限られた容積のサンプル液を用いて低い検出限界を提供する。本発明の別の実施形態では、分離された代謝産物は、マイクロフルイディック装置に組み込まれたエレクトロスプレーイオン化エミッター統合型ESIマイクロフルイディック装置につながるチャネルに直接供される。このような統合型のESIマイクロフルイディック装置は、検出に最適な流速および複雑度でサンプルを検出装置に提供し得る。さらに、マイクロフルイディック装置は、最適のサンプル捕獲のために検出装置と配置されてもよい。適切な検出装置とは、限定するものではないが、IR赤外線分光法、NMR核磁気共鳴を含み、バリエーション、例えば、相関分光法COSy、核オーバーハウザー効果分光法NOESY、およびローテーティングフレーム核オーバーハウザー効果分光法ROESY:rotatingframenuclearOverhausereffectspectroscopy、およびフーリエ変換、2-DPAGE技術、ウエスタンブロット技術、トリプシンマッピング、インビトロ生物学的アッセイ、免疫学的分析、LC-MS液体クロマトグラフィ-質量分析法、LC-TOF-MS、LC-MS/MS、およびMS質量分析法を含む、代謝産物の存在および/またはレベルを検出できる任意の装置または実験方法であり得る。NMR分光法の適用に依拠する分析のために、分光法は、一次元、二次元もしくは多次元のNMR分光法として、または他のNMR分光検査技術によって、とりわけクロマトグラフィ法とも組み合わされて例えば、LC-NMR行われてもよい。該当の代謝産物の決定に加えて、1H-NMR分光法は、同じ検討の試行でさらに代謝産物を決定する可能性をもたらす。1つの検討の試行で複数の代謝産物の評価を組み合わせることが、いわゆるパターン認識のために使用され得る。一般に、単一の代謝物濃度の単独の決定と比較して、選択された代謝物、すなわち、特定されたバイオマーカーのパネルのプロファイルに基づく評価および結論の強さは改善される。免疫学的分析のため、例えば、免疫学的試薬例えば、抗体の使用は一般には、他の化学的および/または免疫学的試薬と組み合わせて、反応を誘導するか、または反応産物をもたらし、これが次に目的の代謝産物単数または複数の群全体、サブグループまたは亜種の検出および測定を可能にする。高い選択性でかつ高感度10~1000pg、または0.02~2ピコモルという適切な免疫学的検出方法例えば、バルドB.A.らBaldo,B.A.etal.、1991年、ASpecific,SensitiveandHigh-CapacityImmunoassayforPAF,Lipids2612巻:1136~1139ページは、体液サンプル中の0.5~21ng/mlの分析物を検出し得るコーニーS.J.らCooney,S.J.etal.、QuantitationbyRadioimmunoassayofPAFinHumanSaliva,Lipids2612巻:1140~1143ページ。本発明の一実施形態では、質量分析法は、所定のサンプル中に存在する代謝産物を検出することに依拠する。本発明の別の実施形態は、ESI-MS検出装置である。このようなESI-MSは、飛行時間TOF質量分析システムを利用し得る。四重極質量分析法、イオントラップ質量分析法、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴FTICR-MSが同様に、本発明の追加の実施形態において考慮される。本発明の別の実施形態では、検出装置は、分離/調製装置またはマイクロフルイディック装置サンプル中の代謝産物の全てではないが多くの急速なアッセイを可能にすると連結する。分析のための連続サンプル流を可能にし、検出プロセス例えば、ESI-MSを通じて高感度をもたらす質量分析計が利用され得る。本発明の別の実施形態では、質量分析計は、1つ以上のエレクトロスプレー、2つ以上のエレクトロスプレー、3つ以上のエレクトロスプレー、または4つ以上のエレクトロスプレーと連結する。このようなエレクトロスプレーは、単一または複数のマイクロフルイディクスの装置に由来し得る。本発明の別の実施形態では、利用される検出システムによって、検出装置中に導入されたほとんど、または全ての代謝産物の捕獲および測定が可能になる。本発明の別の実施形態では、検出システムによって、代謝産物の規定の組み合わせプロファイルprofile、パネルpanel、アンサンブルensemble、または複合、コンポジットcompositeにおける変化の検出が可能になる。実施例本実施例では、NMRおよび2DGC×GC-MSの方法の組み合わせを用いて、以前に診断され、外科的に処置された56例の乳癌患者由来の257例のレトロスペクティブな連続血清サンプルの代謝物プロファイルを分析した。116例の連続血清サンプルは再発乳癌の20例の患者由来であり、141例の血清サンプルは、サンプル収集期間の間に臨床的に無病生存の36例の患者由来であった。NMRおよびGC×GC-MSのデータを、多変量統計法によって分析して、再発サンプルと無病生存のサンプルとの間で特定された代謝物シグナルを比較した。11の代謝物マーカー7つはNMRからで、4つはGC×GC-MSからを、5分割交差検証を用いるロジスティック回帰モデルによって全ての患者サンプルの分析から選択した。リーブワンアウト交差検証によってこれらのマーカーを用いて構築されたPLS-DAモデルによって、86という感度および84という特異性が得られたAUROC>0.85。驚くべきことに、60を超える患者が、臨床上の再発の診断の10カ月平均で前に、再発することが正確に予想され得、このことは、現在の乳癌モニタリングアッセイCA27.29を上回る大きな改善を示す。本発明者らが知っている限りでは、これは、代謝物プロファイルに基づいて再発乳癌の早期検出のための予測モデルを開発して予備検証した最初の研究である。詳細には、2つの進歩した分析的方法NMRおよびMSの組み合わせによって、再発乳癌の早期の検出のための強力なアプローチが得られる。サンプル収集257例の血清サンプル56例の乳癌患者由来の各々400マイクロリットルμl以下を、MDアンダーソン癌センターM.D.AndersonCancerCenter米国テキサス州ヒューストンHouston所在から入手した。これらの保存血清サンプルは、1997年から2003年の間に、MDアンダーソン癌センター米国テキサス州ヒューストン所在に登録された乳癌患者である女性ボランティア年齢40歳~75歳から1患者あたり平均で5連続の時間経過サンプルを収集したものである。乳癌再発に関してMDアンダーソンの腫瘍学者による追跡調査は、CA27.29、CEA、および/またはCA125IVDの結果、患者の症状、最初の乳癌のステージ、ホルモン受容体およびリンパ節の状態ステータスを含む要因の組み合わせに基づいた。56例の患者のうち、乳癌は20例で、局所でまたは遠位臓器で再発し、残りの36例は、サンプリング期間も、以後2年間も再発無病生存NEDであった。再発の乳癌患者から全部で116例の血清サンプルを得たが、これは、臨床上再発と診断されるより3カ月早く再発前Pre収集した67例のサンプルと、再発の±3カ月内に収集された再発中18例のサンプルと、再発が診断された後3カ月より遅くに再発後収集された31例のサンプルとから構成された。残りの141例のサンプルは、患者がそのサンプル収集期間をこえて少なくとも2年間にわたってNEDのままである症例である。ほぼすべてのサンプルを収集の時点でCA27.29値について評価し、その結果比較に用いることができた。研究のサンプルは、収集からそれをパーデュー大学の評価研究室に移すまでドライアイス上で、-80°Cで維持し、研究室で再度、研究終了まで-80°Cで凍結保存した。血清サンプルおよび添付の臨床データは、本研究に移る前には適切に特定されていなかった。表1では、癌患者の臨床パラメータおよび個体群統計学的特性をまとめる。1HNMR分光法解凍後、200マイクロリットルμLの血清を、330μLのD2Oおよび5μLのアジ化ナトリウム12.3nmolと混合した。サンプル溶液を、60秒間ボルテックスして、1分あたり8000回転RPMで5分間遠心分離した。その後、530μLのアリコートを、NMR測定のために、標準の5ミリメートルmmのNMRチューブに移した。60μLの0.012の3-トリメチルシリルプロピオン-2,2,3,3-d4酸ナトリウム塩TSP溶液をD2O中に含有する外側キャピラリーチューブガラスステム同軸インサート、OD2mmを、化学シフト周波数標準δ=0.00ppmとして、およびロッキング目的のために用いた。全てのNMR実験は、25°Cで、ブルカーDRX500メガヘルツBrukerDRX500MegahertzMHz分光計低温プローブを装備したおよび三軸磁場勾配で行った。2つの1HNMRスペクトルを、各々のサンプル、標準IDNOESYNuclearOverhauserEffectSpectroscopyおよびCPMGCarr-Purcell-Meiboom-Gillパルスシーケンス水前期飽和と対にしたについて測定した。各々のスペクトルについては、32のトランジエントを32kデータポイントおよび6000Hzのスペクトル幅を用いて収集した。0.3Hzのライン広幅化に対応する指数関数重み関数を、フーリエ変換適用前に自由誘導減衰FIDに適用した。各々のピークを積分し、次いで水および尿のピークを排除して総NMRスペクトル強度総合計の値を用いて正規化した。BrukerXWINNMRソフトウェアバージョン3.5を用いる位相整合およびベースライン補正の後、処理したデータを、さらなる分析のためにASCIIフォーマットに保存した。GC×GC-MSタンパク質の沈殿は、1.5mLのエッペンドルフチューブ中で200μLの血清と400μLのメタノールとを混合することによって各々のサンプルについて行った。この混合物を短時間ボルテックスし、次いで-20°Cで30分間保持した。14,000RPMで10分間、冷たく保ちながらサンプルを遠心分離した。上層上清を、さらに使用するために別のエッペンドルフチューブに移した。クロロホルム200μLをタンパク質ペレットと混合して、14,000RPMでさらに10分間遠心分離した。遠心分離後、アリコート試料の一部を移して、前の工程由来のメタノール上清溶液と合わせた。得られた混合物を凍結乾燥して、SpeedVacSavantAES2010を用いて5時間、溶媒を除去した。次いで、各々の乾燥したサンプルを、50μLの無水ピリジンに溶解して、短時間のボルテックスの後に、約20分間、超音波処理した。この溶液の20μLを、20μLの誘導体化試薬MTBSTFAN-メチル-N-tert-ブチルジメチルシリル、トリフルオロアセトアミドレジス社Regis、米国イリノイ州モートングローブMortonGrove所在と混合した。この混合物に対する、活性なtert-ブチルジメチルシリル基を含有するこの誘導体化剤の添加によって、生体サンプル中に存在する代謝物のヒドロキシル、アミンまたはカルボン酸のような官能基は活性化される。次いで、このサンプルを、反応に影響するように60°Cで1時間インキュベートした。誘導体化後、溶液の内容物を、分析のためにガラスGCオートサンプラーバイアルに移した。二次元のGC×GC-MS分析を、ペガサスPegasus登録商標飛行時間質量分析計と組み合わされたアジレントAgilent6890ガスクロマトグラフアジレントテクノロジー社AgilentTechnologies、米国カリフォルニア州パロアルトPaloAlto所在から構成されるPegasus4Dシステムレコ社LECO、米国ミシガン州セントジョセフSt.Joseph所在を用いて行った。第一の次元のクロマトグラフィ分離を、DB-5キャピラリーカラム30m×0.25mmの内径、0.25μmのフィルム厚で行った。第一のカラムの末端で、溶出されたサンプルを4秒間クリオトラッピングcryotrappingすることによって凍結し、次いで急速に加熱して、第二の次元のクロマトグラフィカラムDB-17、1m×0.1mm内径、0.10μmフィルム厚に送った。第一のカラム温度の勾配は、0.2分の保持時間で50°Cで開始され、次いでこれは10°C/分の速度で300°Cまで増大され、この温度が5分間保持された。第二のカラム温度の勾配は、対応する第一のカラム温度の勾配よりも20°C高く、同じ速度および保持時間とした。第二の次元の分離時間は、4秒間に設定した。高純度ヘリウムを搬送ガスとして、1.0mL/分の流速で用いた。入口および移動ラインのための温度は、280°Cに設定し、イオン源は、200°Cに設定した。検出およびフィラメントバイアス電圧は、それぞれ1600Vおよび-70Vに設定した。50~600m/zにおよぶ質量スペクトルを、50Hzの比率で収集した。LECOChromaTOFソフトウェアバージョン4.10を、自動ピーク検出および質量スペクトル解析のために用いた。NISTMSデータベースNISTMSSearch2.0、NIST/EPA/NIHMassSpectralLibrary;NIST2002を、データ処理およびピークマッチングのために用いた。全ての特定された化合物の質量スペクトルを、NISTデータベースNISTMSSearch2.0、NISTEPA/NIHMassSpectralLibrary;NIST2002における標準の質量スペクトルと比較した。さらに、特定されたバイオマーカー候補物を、購入されて、同一の実験条件下で行われた真正の市販のサンプルの質量スペクトルおよび保持時間から確認した。代謝物の特定および選択各々のサンプル由来のNMRスペクトルを、0ppmで3-トリメチルシリルプロピオン-2,2,3,3-d4TSP酸ナトリウム塩シグナルを参照して整列させた。0.5~9.0ppmの範囲内のスペクトル領域を、残留の水ピークおよび尿のシグナルを含んだ4.5~6.0ppmの領域を排除した後に分析した。早期の乳癌検出で研究において最初に特定された、バイオマーカーに対応する22のスペクトルの領域を、さらなる分析のためのバイオマーカー候補物として選択した。選択された領域における各々の代謝物の統計学的有意性を、トレーニングセットにおいてスチューデントのt検定を用いてP値を算出することによって決定した。代謝物のプールをさらに増強するため、再発サンプルとNEDサンプルとの間のピークの強度における最も高い相違に基づき18個の追加の代謝物を標的化MS分析のために特定した表2。ソフトウェアプログラムを内部開発し、これらの代謝物シグナルをGC×GC-MSデータセットから抽出した。このプログラムは、m/zの入力値および保持時間範囲に基づいて、代謝物のスペクトルを、LECOChromaTOFソフトウェアパッケージv1.61で利用可能な標準的なNISTライブラリー由来の特徴的な実験的質量スペクトルにマッチングした後、各々の代謝物についてのクロマトグラフィピークを積分する。本発明の方法を用いて特定されるバイオマーカーの完全なセットは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、アスパラギン、コリン、クレアチニン、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、イソロイシン、乳酸塩、リシン、メチオニン、N-アセチルアスパラギン酸塩、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、2-ヒドロキシブタン酸、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、3-メチル-2-ヒドロキシ-2-ペンテン酸、ドデカン酸、1,2,3,トリヒドロキシプロパン、β-アラニン、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、グリシン、ノナン二酸、ノナン酸、およびペンタデカン酸からなる表2。さらなる分析を、図4A~図4Kおよび図5A~図5Rの箱髭図に図示されるように、バイオマーカーのサブセットで行った。このバイオマーカーのサブセットは、3-ヒドロキシ酪酸塩、アセト酢酸塩、アラニン、アルギニン、コリン、クレアチニン、グルタミン酸、グルタミン、ギ酸塩、ヒスチジン、イソ酪酸塩、乳酸塩、リシン、プロリン、トレオニン、チロシン、バリン、ヘキサデカン酸、アスパラギン酸、ドデカン酸、アラニン、フェニルアラニン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、9,12-オクタデカジエン酸、酢酸、N-アセチルグリシン、ノナン二酸、およびペンタデカン酸からなる。バイオマーカーのさらなるサブセットまたはパネルが、予測モデルの開発およびモデルのバリデーションのために選択され、これは、代謝物、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、チロシン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。あるいは、8つのバイオマーカーのサブセットまたはパネルが選択され、これは、代謝物である、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる。他の実施形態では、7つのバイオマーカーのサブセットまたはパネルが選択され、これは、3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリンおよびチロシンからなる。予測モデルの開発およびバリデーション予測モデルを開発するための最も高いスコアを有する代謝物を選択するために、NED群、再発後群、および再発中群由来のサンプルを用いた。再発前のサンプルは、臨床診断前での正確な疾患状態の決定におけるあいまい性を回避するために省いた。再発後および再発中対NEDのサンプルを5つの交差検証CV群に分けた。22のNMRおよび18のGC×GC/MS検出代謝物シグナルのロジスティック回帰モデルを用いる多変量分析を、4つのCV群に適用して、得られたモデルを用いて、5番目のCV群の分類の構成要素を予測した。ロジスティック回帰手順の出力は、マーカーのランク付けされたセットである。誤分類のエラー率が最も低く、かつ予測力が最も高いモデルをもたらしたNMRおよびGCのマーカーの最も好ましい組み合わせ確保されるとともに、全てのサンプルを用いる最終予測モデルを構築するために使用された。図1Aは、一実施形態にかかり、バイオマーカー選択、モデル開発およびバリデーションの方法100を示すフローチャートである。全部で257例の血清サンプル再発患者由来の116サンプル、NED患者由来の141サンプルが提供される110。サンプルを、診断時点付近および診断後、NEDn=141および再発サンプルn=49からなるトレーニングセット112、ならびに再発診断前のサンプルからなるサンプルのテストセット114に分割した。サンプルのトレーニングセットを、患者の5交差検証群に分けた130および132。ロジスティック回帰を、5分割の交差検証を用いてバイオマーカー選択のために用いた。モデル構築は、リーブワンアウトインターナル交差検証による、部分最小二乗判別分析PLS-DAモデリングを用いた140。バリデーションは、診断前サンプル114に対してモデル150を提供すること、リーブワンペイシェントアウト交差検証を用いる予測を提供すること160、および予測スコアを得ること170によって行った。図1Bは、バイオマーカー選択、モデル開発、およびバリデーションの別の実施形態を示すフローチャートである200。全部で257例の血清サンプル再発患者由来の116サンプル、NED患者由来の141サンプルが提供される110。サンプルを、無作為にトレーニングセットn=140、66例の再発サンプルおよび74例のNEDサンプル212、ならびにテストセットn=117サンプル、50例の再発サンプルおよび50例のNEDサンプル214に分割した。変数選択は、ロジスティック回帰を用いて行い230、予測モデルは、NMR研究で特定した7つのバイオマーカーおよびGC研究で特定した4つのバイオマーカーに基づいて構築した240。バリデーションは、テストセット214に対してモデル250を提供すること、分類予測を提供すること260、および予測スコアを得ること270によって行った。それらの能力に基づいて、11の代謝物マーカーNMR由来の7つおよびGC×GC-MS由来の4つを、モデル構築のために選択した。これらのマーカーについてのNMRおよびMSデータを、PLS-DAモデリングのためのPLSツールボックスエイゲンベクトルリサーチ社EigenvectorResearch,Inc、バージョン4.0をインストールしたMatlabソフトウェアマスワークス社Mathworks、米国マサチューセッツ州所在中にインポートした。リーブワンアウト交差検証を選択して、潜在的変数LVの数を、交差検証の平均二乗根誤差RMSECVに応じて選択した。R統計パッケージバージョン2.8.0を用いて、受信者操作特性ROC曲線を作成した。モデルの感度、特異性および受信者操作特性曲線下面積AUROCを算出して比較した。これらのマーカーの能力をまた、再発の臨床的診断の前後、サンプル収集の時点に基づいて評価した再発後対NED、再発中対NED、および再発前対NED。各々のサンプルの分類の構成要素を、決定して、患者の状態と比較した。ROC曲線を作成して、AUROC、感度、および特異性を算出した。モデル由来のスコアを、スケーリングして、0~100の範囲を得て、再発状況についてのカットオフ値を、感度と特異性との間の賢明な選択によって決定した。乳癌の初期ステージ、ER/PRステータスおよび再発部位を参照したモデルの能力もまた評価した。最終的に、NMRおよびMS代謝物マーカーの能力もまた、サンプルを無作為に2つの部分、トレーニングセット141サンプルおよびテストセット116サンプルに分けることによって試験し、図1Bに図示されるように分析した。22のNMRおよび18のGC×GC/MSで検出した代謝物の多変量ロジスティック回帰を、トレーニングデータセットに適用して、変数選択を最適化した。10分割交差検証を、この手順の間に用いた。導出されたモデルを、次いで、サンプルのテストセットに対して検証した。テストセットのサンプルは全て、変数選択およびモデル構築に用いたのとは異なる患者からのものであった。1HNMRスペクトルおよびGC×GC/MSスペクトルの分析CPMG配列を用いて得られた乳癌血清サンプルのNMRスペクトルは、高分子由来のシグナルを欠き、糖、アミノ酸およびカルボン酸を含む多数の低分子についてのシグナルを明らかに示した。再発後患者由来の代表的なNMRスペクトルを、図2Aに示す。個々の代謝物を、サンプル条件におけるわずかな相違から生じるわずかなシフトを考慮して、NMRデータベースを用いて特定した。本研究では、本発明者らは、乳癌の以前の研究においてNMRによって検出された22の代謝物に集中した。高感度のMSにより、各々のGC×GC-MSスペクトルは、ほぼ300という代謝物についてのピークを示し、これはNISTデータベースにおける公知の代謝物との類似性によって特定された。図2Bは、図2Aに示されるのと同じ再発乳癌患者についての典型的なGC×GC-MSスペクトルを示す。NMRによって検出される代謝物のパネルを増強するため、再発サンプルとNEDサンプルとの間のピーク強度における相違に基づいてGC×GC-MSデータの分析において18の追加の代謝物を標的した。GC×GC-MSスペクトルにおける代謝物の特定は、実験の質量スペクトルと、NISTデータベースにおけるスペクトルとの比較に基づき、割り当てはさらに、真正の市販のサンプルのGC×GC-MSスペクトルと比較することによって確認した。グルタミン酸についてのこのバリデーション手順の例は、図3A~3Fに図示しており、このように特定された22のNMRおよび18のGC-MS代謝物のリストは、上の表2に含まれる。バイオマーカーの選択およびバリデーション最初のデータ分析は、22のNMRおよび18のMS代謝物の能力を試験すること、およびこれらのデータから最も高いランクを有するマーカーを選択して、診断の正確性を最大化することに集中した。変数選択プロトコールを利用し、およびロジスティック回帰分析から、11個の代謝物7つは、NMRで特定し、4つはMSによって特定のサブセットを、それらの最も高いランク付けおよび予測正確性に基づいて選択して、バイオマーカーの試験パネルを形成した。下の表3は、11個のバイオマーカーのリスト、およびそれらのP値を、再発前対NED、および再発中および再発後=再発対NEDの比較について全てのサンプルを用いて示す。一般には、再発中および再発後=再発対NED比較についてのこれらのマーカーの個々のP値は、極めて低いが、ロジスティック回帰によって高度にランク付けされたにもかかわらず4つの例外があった。これらの4例のうち2つでは、特定された代謝物は、再発中対NED、または再発後対NEDのいずれかについてただし両方ではない低いP値を示した。その後の分析は、上記の表3に列挙された11のNMR/MSバイオマーカーに基づいた。乳癌の再発の分類における代謝物マーカーの能力を、個々におよび集合的に試験した。個々のバイオマーカーの箱髭図を、図4A~図4K、および図5A~図5Rに示す。図4A~図4Kは、7つのNMRおよび4つのGC×GC/MSマーカーに関し、全てのサンプルについて、再発後患者に加えて再発中患者再発対NED患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ25パーセンタイルおよび75パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。y軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図4Aは、ギ酸塩のNMRデータに基づく。図4Bは、ヒスチジンのNMRデータに基づく。図4Cは、プロリンのNMRデータに基づく。図4Dは、コリンのNMRデータに基づく。図4Eは、チロシンのNMRデータに基づく。図4Fは、3-ヒドロキシ酪酸塩のNMRデータに基づく。図4Gは、乳酸塩のNMRデータに基づく。図4Hは、グルタミン酸塩のGC×GC/MSデータに基づく。図4Iは、N-アセチル-グリシンのGC×GC/MSデータに基づく。図4Jは、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図4Kは、ノナン二酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5A~図5Rは、追加のマーカーについて、全てのサンプルについて、再発後患者に加えて再発中患者再発対NED患者の間の識別を相対ピーク積分として表して図示する箱髭図を示す。箱の真ん中部分の水平線は、平均に相当するが、箱の底と頂部の境界は、それぞれ25パーセンタイルおよび75パーセンタイルに相当する。下側および上側のひげは、それぞれ最小値および最大値に相当するが、白抜き丸印は異常値である。y軸は、方法のセクションで記載したとおり相対ピーク積分を示す。図5Aは、アルギニンのNMRデータに基づく。図5Bは、ドデカン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5Cは、アラニンのNMRデータに基づく。図5Dは、アラニンのGC×GC/MSデータに基づく。図5Eは、フェニルアラニンのNMRデータに基づく。図5Fは、フェニルアラニンのGC×GC/MSデータに基づく。図5Gは、アスパラギン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5Hは、グルタミン酸塩のNMRデータに基づく。図5Iは、トレオニンのNMRデータに基づく。図5Jは、バリンのNMRデータに基づく。図5Kは、アセト酢酸塩のNMRデータに基づく。図5Lは、リシンのNMRデータに基づく。図5Mは、クレアチニンのNMRデータに基づく。図5Nは、イソ酪酸塩のNMRデータに基づく。図5Oは、ヘキサデカン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5Pは、9,12-オクタデカジエン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5Qは、ペンタデカン酸のGC×GC/MSデータに基づく。図5Rは、酢酸のGC×GC/MSデータに基づく。図6Aは、再発後および再発中=再発サンプル由来のデータ対NEDサンプル由来のデータを用いて、図1Aに図示され、下に記載されるPLS-DAモデルから作成したROC曲線、ならびに同じサンプルに対するCA27.29の能力を示す。図6Bは、2つのサンプル分類についての箱髭図を示し、これは、モデル予測スコアを用いることによってNED患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示している。再発後サンプルおよび再発中サンプル対NEDサンプルを用いるPLS-DA分析由来の予測モデルについてのROC曲線は極めて良好で、0.88というAUROC、86の感度、および84という特異性を、選択されたカットオフ値で有する図6A。再発乳癌とNEDとの間のモデルの識別力のさらなる比較を、全ての再発後サンプルおよび再発中サンプル対NEDサンプルについてのモデルのスコアを用いて示した図6Bの箱髭図で示す。図6Cは、図1Bに図示される第二の統計的アプローチに基づくテストサンプルセットを用いることによってPLS-DA予測モデルから作成したROC曲線を示す。図6Dは、2つのサンプル分類についての箱髭図を示し、これは、テストセット由来の予測スコアを用いることによってNED患者由来のサンプルと再発サンプルとの識別を示している。同じ11個のバイオマーカーが、ノナン二酸これは全体の13番目にランク付けされたを除いて、ロジスティック回帰によってトップにランク付けされた。しかし、これは、整合性および比較の目的のためにこの第二の分析における11マーカーのモデルの一部として含まれた。図6Cに示されるとおり、サンプルのテストセットは、0.84というAUROCを生じ、ここで感度は78で、特異性は85であった。このようにして得られたテストセットのROCプロットはまた、第一の統計的分析によって得られたものに匹敵した図6A。さらに、再発乳癌およびNEDの両方についての平均スコア図6Dは、図6Bに示されるスコアと十分匹敵した。再発スコアとNEDスコアとの間の相違は、トレーニングセットP=1.40×10-5およびテストセットP=2.25×10-4の両方について統計的に非常に高かった。この第二の統計分析の結果によって、サンプルのデータセットおよび本発明者らの統計的分析から導かれる代謝物プロファイルが完全に一貫しているという証拠が得られる。代謝物プロファイリングの結果と同じサンプルについて得られたCA27.29データとの比較を下の表4に示しており、これによって、インビトロの診断IVD試験で現在利用可能なCA27.29を超える本発明の好ましい実施形態によって提供される感度の大きい改善が示される。引き続き、乳癌再発の早期検出のためのモデルの予測力を評価した。再発性乳癌患者由来の全てのサンプルを、各々の患者について診断の時点t=0に関してグループ化した。互いに5カ月内のサンプルをグループとし、月の平均値を各々のグループ群に割り当てた。月数および印は、臨床診断の前すなわち、負の時間または後正の時間でサンプルを収集した時間の平均に相当する。再発が正確に診断された患者の割合を、モデルを用いて算出した。図7Aには、血液サンプル収集時間の関数として患者の割合のプロットが示される。比較のため、サンプル収集の時点で得られた、従来の癌抗原マーカーCA27.29についての結果もまた図7Aに示す。ここでは、37.7U/mLというCA27.29についての推奨されるカットオフ値を、同じセットのサンプルについて、臨床感度および臨床特異性の算出のために用いた。図に示されるとおり、BCRバイオマーカープロファイル1およびCA27.29の両方について、正確に診断された患者数は、後の時点では増大する。しかし、臨床診断の時点では、BCRバイオマーカープロファイル1に基づく本発明者らのモデルは、再発性患者の75を検出したが、CA27.29のマーカーでは、わずか16しか検出しない。さらに、再発患者のうち55が、臨床的に診断される約13カ月前に、BCRバイオマーカープロファイル1を用いて特定された。これに対し、CA27.29で特定されたのは約5であった。NED患者についての結果の同様の比較では、サンプル収集の期間にわたって患者のほぼ90が真の陰性であると正確に診断されたことが示されるとともに、代謝物プロファイリングモデルの能力は、CA27.29の能力に匹敵したことが示される図6。しかし、時間とともに特異性はある程度低下した閾値を54まで増大させることにより、特異性は約94まで増大すると同時に、感度は68に低下した。98特異性についての閾値は65であって、94についての閾値は41であった。図7Aは、カットオフ閾値48を用い、11マーカーモデル黒塗り四角を用いて正確に特定された再発患者の割合を、CA27.29試験黒塗り三角を用いて正確に特定された再発患者の割合と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す。図7Bは、カットオフ閾値48を用い、11マーカーモデル黒塗り四角を用いて正確に特定されたNED患者の割合を、CA27.29試験黒塗り三角を用いて正確に特定されたNED患者の割合と比較して、時間の関数として示す。図7Cは、カットオフ閾値54を用い、11マーカーモデル黒塗り四角を用いて正確に特定された再発患者の割合を、CA27.29試験黒塗り三角を用いて正確に特定された再発患者の割合と比較して、全ての再発患者についての時間の関数として示す。図7Dは、カットオフ閾値54を用い、11マーカーモデル黒塗り四角を用いて正確に特定されたNED患者の割合を、CA27.29試験黒塗り三角を用いて正確に特定されたNED患者の割合と比較して、時間の関数として示す。別にまた、最初の診断での癌のステージ、再発の種類、エストロゲンER、図8AおよびプロゲステロンPR、図8Bの受容体ステータスに基づき、再発乳癌患者についてこのモデルを試験した。図8Aおよび図8Bは、同じ11のバイオマーカーモデルおよびカットオフ閾値48を用いて、再発と正確に特定された再発患者の割合を、患者のエストロゲン受容体ERステータス図8Aおよびプロゲステロン受容体PRステータス図8Bに基づき時間の関数として示す。図8Aでは、ERマイナスのステータスを黒塗りの三角によって示し、ERプラスのステータスを黒塗りの四角によって示す。図8Bでは、PRマイナスのステータスを黒塗りの三角によって示し、PRプラスのステータスを黒塗りの四角です。特に、この結果は、ER陽性患者とER陰性患者との間、PR陽性患者とPR陰性患者との間における著しい相違を示す。一方で、ER陽性患者およびPR陽性患者についてのモデルは、全てのサンプルが一緒に試験された場合、ER陰性患者およびPR陰性患者の40近くが臨床的な診断の早くも28カ月に検出されたことに匹敵した。しかし、その後において検出されたER陰性およびPR陰性患者の割合は、ERおよびPR陽性の患者と比較して10~20低かった。予測モデルに基づく追加の分析は、トレーニングサンプルセットを用いた変数選択に由来し図1B、独立したサンプルセットテストセット由来のサンプルの分類の構成要素の予測もまた良好な能力をもたらした。図9A~図9Dは、図1Bで図示される統計的なアプローチを用いるトレーニングセット図9Aおよびテストセット図9Bを用いた予測モデルから作成したROC曲線を示す。2つのサンプル分類についての箱髭図は、トレーニングセット図9Cおよびテストセット図9Dに由来する予測スコアを用いて、NEDサンプルと再発サンプルとの間の識別を示している。図9Bに示されるとおり、サンプルのテストセットでは、0.84というAUROCを生じ、感度は78で、特異性は85であった。テストセットのROCプロットは、トレーニングセットのプロットに匹敵した図9A。再発乳癌およびNEDの両方についての平均スコアでさえ、トレーニングセット由来のスコアに十分匹敵した図9Cおよび9D。図10は、再発した乳癌患者と無病生存の患者との間の有意な統計的相違を示した代謝物についての変化した代謝経路のまとめである。実線で囲って示された代謝物は、再発患者では下方制御されたが、破線で囲って示された代謝物は、上方制御された。代謝物プロファイルで用いられる11の代謝物に加えて、表2由来の多数の他の関連の代謝物を図10に示す。本研究は、乳癌再発の早期検出のための代謝学に基づく方法の実施形態を図示する。本検討は、分析的技術、NMRおよびMSの組み合わせ、ならびに乳癌の再発に対して感受性である代謝物の群を特定するための進歩した統計学を利用する。本発明者らは、有意に改善された感度および特異性でもって、無病生存から再発を識別する新規な方法を示した。この予測モデルを用いて、患者の60近くにおける再発が、従来の方法に基づいて再発が診断されるより10~18カ月ほど早く検出された。代謝物レベルにおける変動は、最初の分析で用いた全ての40の代謝物について検出されたが表2、上記、最も高いランク付けおよび異なるカットオフレベルに基づいて選択された少数の代謝物を含むいくつかの群は改善されたモデルを提供した。特に、11の代謝物のパネルNMR由来の7つおよびGC由来の4つ;表3、上記は、NEDから再発を識別することに大きく貢献した。さらに、これらの11の代謝物由来の予測モデルは、単一の分析方法、すなわちNMRまたはMS由来の個々の代謝物、または代謝物の群を用いて誘導されたモデルに比べた場合、感度および特異性の両方に関して有意に優れていた。再発の早期検出に関して図7A~図7D、11の代謝物のパネルに基づくモデルは、腫瘍マーカーCA27.29を含む、患者に用いられた診断方法を上回って機能し、単一のマーカーに基づく現在利用可能な試験と比較して再発のための早期の検出および処置の選択肢について有意な改善をもたらし得る。代謝物がさらに少ないパネルでの他のモデルを評価すれば、これらの実施形態も、有用な結果をもたらし得るであろうことが示される。代謝物である、コリン、グルタミン酸、ギ酸塩、ヒスチジン、プロリン、3-ヒドロキシ-2-メチル-ブタン酸、N-アセチルグリシン、およびノナン二酸からなる8つのバイオマーカーパネルNMRによって検出される4つの代謝物、およびGC×GC-MSによって検出される4つの代謝物のAUROCは、0.86であったが、代謝物である3-ヒドロキシ酪酸塩、コリン、ギ酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、プロリン、およびチロシンからなる7つのバイオマーカーパネルNMR単独によって検出される7つの代謝物を用いるは、0.80というAUROCを有した。これらの結果によって、乳癌の再発を検出するために有用なパネル内の個々のバイオマーカーは、表2の他の化合物によって欠失または置換される場合があり、乳癌の再発を検出するための有用性はやはり保持していることが示される。11個の選択されたバイオマーカーのパネルの実施形態は、アミノ酸代謝ヒスチジン、プロリン、チロシンおよびトレオニン、リン脂質代謝コリンおよび脂肪酸代謝ノナン二酸を含む、乳癌に関連する7つの経路の代謝活性の鋭敏な変化を示す。腫瘍形成の代謝物の局面の多数の検討によって、これらの代謝物の大多数と乳癌との関連が示された。図4に示されるとおり、乳癌の再発は、ギ酸塩図4A,ヒスチジン図4B、プロリン図4C、コリン図4Dノナン二酸図4K、N-アセチル-グリシン図4Iおよび3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸図4Jを含む多数の代謝物についての平均濃度の低下と関連し、実施例において上で開示されたとおり、それらの低下によって示されるが、一方でチロシン図4Eおよび乳酸塩図4Fの平均濃度は増大する。同様に、表2および図5は、以下のアミノ酸代謝の経路における代謝物について乳癌再発と関連した変化を示す。すなわち、アラニン図5C、図5D、アルギニン図5A、クレアチニン図5M、リシン図5L、トレオニン図5I、フェニルアラニン図5Eおよび図5F、およびバリン図5Jである。本開示の原理を組み込んでいる例示的な実施形態を上記に開示してきたが、本開示は、開示された実施形態に限定されるものではない。代わりに、本出願は、その一般的原理を用いる開示の任意の変形、用途または適合を包含するものとする。さらに、本出願は、本開示が関連し、添付の特許請求の制限内におさまる、当該分野で公知であるかまたは慣行内の実務である場合、本開示からのこのような逸脱を包含するものとする。"