"Cry34タンパク質、Cry35タンパク質及びCry6A殺虫タンパク質を生産する、トランスジェニック植物。Cry3B及びCry3Aからなる群より選択される第四の殺虫タンパク質をさらに生産する、請求項1に記載のトランスジェニック植物。前記DNAを含む、請求項1から2のいずれかに記載の植物の種子。請求項1から2のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場。非Btリフュージ植物をさらに含む圃場であって、前記リフュージ植物が、前記圃場内のすべての作物植物の40未満を構成する、請求項4に記載の植物の圃場。前記リフュージ植物が、前記圃場内のすべての作物植物の30未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。前記リフュージ植物が、前記圃場内のすべての作物植物の20未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。前記リフュージ植物が、前記圃場内のすべての作物植物の10未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。前記リフュージ植物が、前記圃場内のすべての作物植物の5未満を構成する、請求項5に記載の植物の圃場。リフュージ植物がない、請求項4に記載の植物の圃場。前記リフュージ植物が、区画又は植栽帯内に存在する、請求項5に記載の植物の圃場。非Btリフュージ植物からのリフュージ種子と請求項3に記載の複数の種子とを含む種子の混合物であって、前記リフュージ種子が前記混合物中のすべての種子の40未満を構成する、種子の混合物。前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の30未満を構成する、請求項12に記載の種子の混合物。前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の20未満を構成する、請求項12に記載の種子の混合物。前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の10未満を構成する、請求項12に記載の種子の混合物。前記リフュージ種子が、前記混合物中のすべての種子の5未満を構成する、請求項12に記載の種子の混合物。請求項3に記載の複数の種子を含む種子袋又は容器であって、ゼロのリフュージ種子を含む、袋又は容器。昆虫によるCryタンパク質に対する抵抗性の発生を管理する方法であって、種子を作付けして、請求項5又は10に記載の植物の圃場を作ることを含む方法。前記植物が、10エーカーより多くを占有する、請求項5から11のいずれかに記載の圃場。前記植物が、とうもろこし植物である、請求項1から2のいずれかに記載の植物。前記Cry35タンパク質が、配列番号1及び配列番号2からなる群より選択される配列と少なくとも95同一であり、前記Cry6A殺虫タンパク質が、配列番号4と少なくとも95同一であり、並びに前記Cry34タンパク質が、配列番号3と少なくとも95同一である、請求項1から2のいずれかに記載の植物の植物細胞。前記Cry35タンパク質が、配列番号1及び配列番号2からなる群より選択される配列を含み、前記Cry6A殺虫タンパク質が、配列番号4を含み、並びに前記Cry34タンパク質が、配列番号3を含む、請求項1から2のいずれかに記載の植物。請求項21に記載の植物細胞を生産する方法。ルートワーム昆虫を防除する方法であって、前記昆虫をCry34タンパク質、Cry35タンパク質及びCry6A殺虫タンパク質と接触させることによる方法。前記Cry34タンパク質が、Cry34Aタンパク質であり、前記Cry35タンパク質が、Cry35Aタンパク質であり、前記Cry6Aタンパク質が、Cry6Aaタンパク質である、請求項1に記載の植物。前記Cry34タンパク質が、Cry34Aaタンパク質であり、前記Cry35タンパク質が、Cry35Aaタンパク質である、請求項1に記載の植物。前記Cry3Aタンパク質が、Cry3Aaタンパク質であり、前記Cry3Bタンパク質が、Cry3Baタンパク質である、請求項2に記載の植物。前記Cry34タンパク質が、Cry34Aタンパク質であり、前記Cry35タンパク質が、Cry35Aタンパク質であり、前記Cry6Aタンパク質が、Cry6Aaタンパク質である、請求項24に記載の方法。前記Cry34タンパク質が、Cry34Aaタンパク質であり、前記Cry35タンパク質が、Cry35Aaタンパク質である、請求項24に記載の方法。Cry34Ab/35Abタンパク質についての配列は、例えば、バシラススリンジエンシスBacillusthruingiensis分離株PS149B1から得ることができる。本発明に従って使用するための他の遺伝子、タンパク質配列、及び源分離株については、例えば、Crickmoreらのウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.htmlを参照のこと。本発明は、Cry34Ab/35Ab殺虫タンパク質を、これらのCryタンパク質系のいずれか単独他方を伴わないに対する抵抗性を発生し得るコーンルートワーム集団によるコーンルートワーム摂食に起因する損害及び収穫量低下からトウモロコシを防護するために、Cry6Aa毒素と併用することを含む。従って、本発明は、コーンルートワームによるCry6Aa及び/又はCry34Ab/35Abに対する抵抗性の発生を予防するための害虫抵抗性管理IRMスタックを教示する。本発明は、Cry6Aa毒素タンパク質及びCry34Ab/35Ab毒素系を生産する細胞を含む有害生物ルートワームを防除するための組成物を提供する。本発明は、さらに、Cry6Aaタンパク質とCry34Ab/35Ab二成分毒素の両方を生産するように形質転換された宿主を含み、該宿主は、微生物又は植物細胞である。加えて、本発明は、有害生物ルートワームを防除する方法を提供することを意図しており、この方法は、前記有害生物又は前記有害生物の環境と、Cry6Aaタンパク質を含有する及びさらにCry34Ab/35Ab二成分毒素を含有する有効量の組成物とを接触させることを含む。本発明の実施形態は、Cry34Ab/35Ab二成分毒素をコードする植物発現可能遺伝子とCry6Aaタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子とを含むとうもろこし植物、及びそのような植物の種子を含む。本発明のさらなる実施形態は、Cry34Ab/35Ab二成分毒素をコードする植物発現可能遺伝子とCry6Aaタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子とが遺伝子移入されたとうもろこし植物、並びにそのような植物の種子を含む。実施例において説明するように、放射標識Cry35Abコア毒素タンパク質を使用する競合的受容体結合研究は、Cry35Abが結合するCRW昆虫組織サンプルにおいてCry6Aaコア毒素タンパク質が結合について競合しないことを示す。図2参照。これらの結果は、Cry6Aaタンパク質とCry34Ab/35Abタンパク質の組み合わせが、いずれかのタンパク質系のみに対するCRW集団における抵抗性の発生を軽減するための有効な手段であることを示している。従って、上に記載した又は本明細書の他の箇所に記載するデータに一部基づいて、Cry34Ab/35Ab及びCry6Aaタンパク質を使用して、CRWによる抵抗性発生の予防又は軽減するためのIRM組み合わせを生成することができる。他のタンパク質をこの組み合わせに加えて、例えば、害虫防除スペクトラムを拡大することができる。本ペア/組み合わせを、幾つかの好ましいトリプルスタック又はピラミッドで、ルートワームを防除するためのさらに別のタンパク質、例えばCry3Ba及び/又はCry3Aa、と併用することもできる。ルートワームに対するRNAiは、尚さらなる選択肢である。例えば、BaumetalNatureBiotechnologyvol25no11pp13221326を参照のこと。従って、本組み合わせは、ルートワームに対する多重作用機作を提供する。Cry34Ab/35Abタンパク質とCry3Aaタンパク質の組み合わせに関する米国特許出願第61/327,240号2010年4月23日出願、Cry34Ab/35Abタンパク質とCry3Baタンパク質の組み合わせに関する米国特許出願第61/476,005号2011年4月15日出願、及びCry3AaとCry6Aaの組み合わせに関する米国特許出願第61/477,447号2011年4月20日出願の開示に照らして、本発明の幾つかの好ましいトリプルスタックは、Cry34Ab/35Ab及びCry3Aa及び/又はCry3Baタンパク質と組み合わせたCry6Aaタンパク質を含む。cry6Aa遺伝子、cry34Ab/35Ab遺伝子、並びにcry3Aa及び/又はcry3Ba遺伝子を含む、トウモロコシをはじめとする、トランスジェニック植物は、本発明の範囲に含まれる。従って、そのような実施形態は、3つの作用機作で昆虫を標的にする。さらに、これらのデータ及び教示に照らして、Cry34A/35Aとペアにする基本的組み合わせとして本明細書において例示するCry6Aaの代わりにCry3Ba又はCry3Aaを代用することができるだろう。本発明の展開選択肢は、ジアブロティカ種が問題となるトウモロコシ栽培地におけるCry6Aa及びCry34Ab/35Abタンパク質の使用を含む。もう1つの展開選択肢は、Cry6Aa及びCry34Ab/35Abタンパク質の一方又は両方と他の形質との併用であるだろう。Bt毒素が、Cry6Aa及びCry34Ab/35Abなどの一定のクラス内であっても、ある程度異なる場合があることは、当業者には理解されるであろう。遺伝子及び毒素。用語単離されたは、天然に存在しない構築物中のポリヌクレオチドを、又は精製された状態の若しくは別様に自然に存在しない状態のタンパク質を指す。本発明に従って有用な遺伝子及び毒素としては、開示する完全長配列ばかりでなく、これらの配列のフラグメント、変異体、突然変異体、及び本明細書において具体的に例示する毒素の特徴的殺有害生物活性を保持する融合タンパク質も挙げられる。本明細書において用いる場合、遺伝子の変異体又は異形という用語は、同じ毒素をコードする、又は殺有害生物活性を有する等価の毒素をコードする、ヌクレオチド配列を指す。本明細書において用いる場合、用語等価の毒素は、標的有害生物に対して請求項記載の毒素と同じ又は本質的に同じ生物活性を有する毒素を指す。本発明に従ってトリプルスタックで使用する場合、同じことがCry3にも当てはまる。これらのタンパク質のドメイン/サブドメインを交換してキメラタンパク質を作製することができる。Cry34/35タンパク質に関しては米国特許第7,309,785号及び同第7,524,810号を参照のこと。前記’785特許は、トランケートされたCry35タンパク質も教示している。トランケートされた毒素を本明細書においても例示する。本明細書において用いる場合、境界線は、RevisionoftheNomenclaturefortheBacillusthuringiensisPesticidalCrystalProteinsNCrickmoreDRZeiglerJFeitelsonESchnepfJVanRieDLereclusJBaumandDHDeanMicrobiologyandMolecularBiologyReviewsVol62807813に従って、おおよそ95Cry6Aa及びCry34Ab及びCry35Ab、78Cry6A及びCry34A及びCry35A及び45Cry6及びCry34及びCry35配列同一性を表す。本発明に従って例えばトリプルスタックで使用する場合、同じことがCry3にも当てはまる。活性毒素をコードする遺伝子を幾つかの手段によって同定及び得ることができることは当業者には明らかであろう。本明細書において例示する特定の遺伝子又は遺伝子部分は、培養物寄託機関に寄託されている分離株から得ることができる。これらの遺伝子、又はそれらの部分若しくは変異体は、合成的に、例えば遺伝子合成装置の使用によって、構築することもできる。遺伝子の異形は、点突然変異を行うための標準的な技術を用いて容易に構築することができる。また、標準的な手順に従って市販のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを使用して、これらの遺伝子のフラグメントを作製することができる。例えば、Bal31などの酵素、又は部位特異的突然変異誘発を用いて、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切除することができる。様々な制限酵素を使用して、活性フラグメントをコードする遺伝子を得ることもできる。プロテアーゼを使用して、これらのタンパク質毒素のフラグメントを直接得ることができる。例示する毒素の殺有害生物活性を保持するフラグメント及び等価物は、本発明の範囲内であるだろう。また、遺伝コードの冗長性のため、様々な異なるDNA配列が、本明細書において開示するアミノ酸配列をコードする場合がある。同じ又は本質的に同じ毒素をコードするこれらの代替DNA配列を作り出すことは、十分に当業者の技能の範囲内である。これらの変異体DNA配列は、本発明の範囲内である。本明細書において用いる場合、本質的に同じ配列への言及は、殺有害生物活性にあまり影響を及ぼさないアミノ酸置換、欠失、付加又は挿入を有する配列を指す。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントもこの定義に含まれる。本発明に従って有用な毒素をコードする遺伝子及び遺伝子部分を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能ヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な標識によって検出可能でる場合があり、又は国際出願番号国際公開第93/16094号に記載されているように生得的に蛍光性にされている場合がある。当分野において周知であるように、プローブ分子と核酸サンプルが、それら二分子間の強力な結合を形成することによってハイブリダイズする場合、道理上、このプローブ及びサンプルは実質的に相同であると想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKellerGHMMManakDNAProbesStocktonPressNewYorkNYpp169170に記載されているような当分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度と温度の組み合わせの幾つかの例は、次のとおりであるストリンジェンシーが低い順に:室温で2XSSPE又はSSC;42°Cで1XSSPE又はSSC;42°Cで0.1XSSPE又はSSC;65°Cで0.1XSSPE又はSSC。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが発生したかどうかを公知の手法で判定する手段を提供する。そのようなプローブ分析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に従ってプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、DNA合成装置又は標準的な手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列をPCRプライマーとして使用して、本発明の遺伝子を増幅することもできる。変異体毒素。本発明の一定の毒素を本明細書の中で具体的に例示してきた。これらの毒素は、単に本発明の毒素の例示であるので、本発明が、例示する毒素と同じ又は同様の殺有害生物活性を有する変異体又は等価の毒素及び等価の毒素をコードするヌクレオチド配列を含むことは、容易に分かるはずである。等価の毒素は、例示する毒素とのアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸同一性は、一部の実施形態において、典型的には75より大きく、又は好ましくは85より大きく、好ましくは90より大きく、好ましくは95より大きく、好ましくは96より大きく、好ましくは97より大きく、好ましくは98より大きく、又は好ましくは99より大きい。アミノ酸同一性は、生物活性の原因となる、又は結局は生物活性の原因である三次元配座の決定に関係する、毒素の重要領域において典型的に最も高いであろう。これに関して言えば、一定のアミノ酸置換は、これらの置換が、活性にとって重要でない領域にある場合、又はその分子の三次元配座に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、許容され及び予想され得る。例えば、アミノ酸を次のクラスに配属することができる:非極性、非荷電極性、塩基性、及び酸性。あるクラスのアミノ酸を同じタイプの別のアミノ酸で置き換える保存的アミノ酸置換は、その置換がその化合物の生物活性を著しく改変しない限り、本発明の範囲内に入る。表1は、各クラスに属するアミノ酸の例のリストを提供するものである。場合によっては、非保存的置換を行うこともできる。重要な要因は、これらの置換が、前記毒素の生物活性を有意に損なってはならないということである。組換え宿主。本発明の毒素をコードする遺伝子を多種多様な微生物又は植物宿主に導入することができる。毒素遺伝子の発現は、殺有害生物剤の細胞内生産及び維持を直接又は間接的に生じさせる結果となる。接合伝達及び組換え伝達を用いて、本発明の両方の毒素を発現するBt株を作り出すことができる。他の宿主生物を前記毒素遺伝子の一方又は両方で形質転換させ、その後、使用して相乗効果を果たすことができる。適する微生物宿主、例えばシュードモナス属Pseudomonas、を用いて、該微生物を有害生物の生育環境に適用することができ、そこで該微生物は増殖し、摂取されることとなる。結果として有害生物は防除されることとなる。あるいは、毒素遺伝子の宿主としての役割を果たす微生物を、毒素の活性を延長する及び細胞を安定させる条件下で、処理することができる。毒素活性を保持するその処理された細胞を、標的有害生物の環境に適用することができる。本IRM遺伝子の少なくとも1つを含む本発明の植物からの非再生可能/非全能性植物細胞は、本発明に含まれる。植物形質転換。本発明の好ましい実施形態は、本殺虫タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子での植物の形質転換である。形質転換植物は、該形質転換植物の細胞内の防除量の本殺虫タンパク質又はその変異体の存在のおかげで、昆虫標的有害生物による攻撃に対して抵抗性である。B.t.殺虫毒素の殺虫特性をコードする遺伝物質を、特定の害虫によって食された植物のゲノムに導入することにより、成虫又は幼虫は、餌物植物の消費後、死滅するだろう。非常に多くの単子葉植物及び双子葉植物分類が形質転換されている。トランスジェニック普通作物並びに果実及び野菜は、商業的関心対象である。そのような作物としては、とうもろこし、イネ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ属、コムギ、ワタ、ラッカセイ、トマト、ジャガイモなどが挙げられるが、それらに限定されない。外来遺伝物質を植物細胞に導入するための、並びに導入された遺伝子を安定的に維持及び発現する植物を得るための、幾つかの技術が存在する。そのような技術としては、微粒子にコーティングされた遺伝物質の直接細胞への加速米国特許第4945050号及び同第5141131号が挙げられる。アグロバクテリウム技術を用いて植物を形質転換させることもできる、例えば、米国特許第5177010号、同第5104310号、欧州特許出願第0131624号B1、同第120516号、同第159418号B1、同第176112号、米国特許第5149645号、同第5469976号、同第5464763号、同第4940838号、同第4693976号、欧州特許出願第116718号、同第290799号、同第320500号、同第604662号、同第627752号、同第0267159号、同第0292435号、米国特許第5231019号、同第5463174号、同第4762785号、同第5004863号、及び同第5159135号参照。他の形質転換技術としては、WHISKERS商標技術が挙げられる、米国特許第5302523号及び同第5464765号参照。電気穿孔法技術も植物を形質転換させるために使用されている、国際公開第87/06614号、米国特許第5472869号、同第5384253号、国際公開第9209696号、及び同第9321335号参照。これらの形質転換特許及び公報のすべてが参照により組み込まれる。植物を形質転換させるための非常に多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも様々であり得る。そのような組織としては、胚形成組織、カルス組織タイプI及びII、胚軸、分裂組織などが挙げられるだろうが、それらに限定されない。当業者の技能の範囲内の適切な技術を用いて、ほぼすべての植物組織を分化中に形質転換させることができる。上で論じたような当分野において周知である様々な技術を用いて、本毒素のいずれかをコードする遺伝子を植物細胞に挿入することができる。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカーと大腸菌Escherichiacoliにおいて機能し得る複製系とを含む多数のクローニングベクターを、高等植物への挿入のための外来遺伝子の調製及び修飾に利用することができる。そのような操作は、例えば、所期の用途の必要に応じて突然変異、トランケーション、付加又は置換の挿入を含み得る。前記ベクターは、例えば、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184などを含む。従って、Cryタンパク質又は変異体をコードする配列をベクターの適する制限部位に挿入することができる。結果として生じたプラスミドを大腸菌E.coliの細胞の形質転換に使用し、それらの細胞を適切な栄養培地において培養し、その後、採取し、溶解して、作業可能な量のプラスミドを回収する。配列分析、制限フラグメント分析、電気泳動、及び他の生化学的-分子生物学的方法が、一般に、分析法として実施される。それぞれの操作の後、使用したDNA配列を切断し、次のDNA配列に連結させることができる。操作されたDNA配列それぞれを同じ又は異なるプラスミドにおいてクローニングすることができる。植物細胞の形質転換のためのT-DNA含有ベクターの使用は徹底的に研究されており、EP120516LeeandGelvinFraleyetalandAnetalに十分に記載されており、当分野において定着している。挿入されたDNAは、一旦、植物ゲノムに組み込まれてしまえば、その後の世代全体にわたって比較的安定している。植物細胞を形質転換させるために使用されるベクターは、除草剤又は抗生物質、例えば、とりわけ、ビアラフォス、カナマイシン、G418、ブレオマイシン又はヒグロマイシンに対する抵抗性をそれらの形質転換細胞に付与するタンパク質をコードする選択可能マーカー遺伝子を通常は含有する。従って、個々に利用される選択可能マーカー遺伝子は、形質転換細胞の選択を可能にするが、挿入DNAを含有しない細胞の成長は、その選択的化合物によって抑制されない。宿主細胞へのDNAの挿入には多数の技術を利用できる。それらの技術としては、アグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciens又はアグロバクテリウムリゾゲネスAgrobacteriumrhizogenesによって形質転換剤として送達されるT-DNAでの形質転換が挙げられる。加えて、送達すべきDNAを含有するリポソームと植物プロトプラストの融合、DNAの直接注入、微粒子銃形質転換微粒子ボンバードメント、又は電気穿孔法、及び他の可能な方法を利用してもよい。本発明の好ましい実施形態において、植物は、タンパク質コーディング領域のコドン使用量が植物にとって最適化されている遺伝子で形質転換されるであろう。例えば、参照により本明細書によって組み込まれる米国特許第5380831号を参照のこと。また、有利には、トランケートされた毒素をコードする植物が使用されるであろう。前記トランケートされた毒素は、典型的に、その完全長毒素の約55から約80をコードするであろう。植物において使用するための合成B.t.遺伝子を作り出す方法は、当分野において公知である。形質転換技術にかかわらず、遺伝子は、植物細胞においてB.t.殺虫毒素遺伝子及び変異体を発現することに適応させた遺伝子伝達ベクターに、該ベクターに植物プロモーターを含めることによって、組み込まれる。植物プロモーターに加えて、植物細胞において外来遺伝子を発現させるために、様々な源からのプロモーターを効率的に使用することができる。例えば、細菌起源のプロモーター、例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモータ及びマンノピンシンターゼプロモーター、を使用することができる。非バシラススリンジエンシスプロモーターを一部の好ましい実施形態では使用することができる。植物ウイルス起源のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルスCauliflowerMosaicVirusの35S及び19Sプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルスCassavaVeinMosaicVirusのプロモーターなどを使用することができる。植物プロモーターとしては、リブロース-1,6-二リン酸RUBPカルボキシラーゼ小サブユニットssu、ベータ-コングリシンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ADHアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、ADFアクチン解重合因子プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、及び組織特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を向上させることができる一定のエンハンサー配列要素を含有することもある。典型的なエンハンサーとしては、ADH1-イントロン1及びADH1-イントロン6が挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターを使用してもよい。構成的プロモーターは、ほぼすべての細胞タイプにおいて及びほぼ常に継続的遺伝子発現を命令する例えば、アクチン、ユビキチン、CaMV35S。組織特異的プロモーター例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ACPアシルキャリアータンパク質プロモーターは、特定の細胞又は組織タイプ、例えば葉又は種子、における遺伝子発現の責任を負うものであり、これらのプロモーターも使用することができる。植物の一定の発育段階中に活性であり、特定の植物組織及び器官において活性でもあるプロモーターを使用することもできる。そのようなプロモーターの例としては、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシの毛に特異的、ワタ繊維特異的、種子内胚乳特異的、篩部特異的などであるプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。一定の状況下では、誘導性プロモーターの使用が望ましいことがある。誘導性プロモーターは、特定のシグナル、例えば、物理的刺激例えば、熱ショック遺伝子;光例えば、RUBPカルボキシラーゼ;ホルモン例えば、糖質コルチコイド;抗生物質例えば、テトラサイクリン;代謝産物;及びストレス例えば、干ばつに応答しての遺伝子の発現に責任を負う。植物において機能する他の望ましい転写及び翻訳要素、例えば、5’非翻訳リーダー配列、RNA転写終結配列及びポリアデニレート付加シグナル配列を使用してもよい。非常に多くの植物特異的遺伝子伝達ベクターが当分野に公知である。害虫抵抗性IR形質を有するトランスジェニック作物は、北米中のトウモロコシ及びワタ植物において優勢であり、これらの形質の取り扱いは世界的に拡大している。IR形質と除草剤耐性HT形質とを併せ持つ商用トランスジェニック作物が、多数の種子会社によって開発されている。これは、B.t.殺虫タンパク質によって付与されるIR形質と、アセト乳酸シンターゼALS阻害剤、例えばスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリドなど、グルタミンシンセターゼGS阻害剤、例えばビアァフォス、グルホシネートなど、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼHPPD阻害剤、例えばメソトリオン、イソキサフルトールなど、5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼEPSPS阻害剤、例えばグリホサートなど、並びにアセチル補酵素AカルボキシラーゼACCase阻害剤、例えばハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどに対する耐性などのHT形質との組み合わせを含む。遺伝子導入で得たタンパク質が、除草剤化学クラス、例えばフェノキシ酸系除草剤及びピリジルオキシ酢酸オーキシン系除草剤国際公開第2007/053482A2号参照、又はフェノキシ酸系除草剤及びアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤国際公開第2005107437A2、A3号、に対して耐性を植物にもたらす、他の例は、公知である。IR形質によって多数の有害生物の問題を防除できることは、価値のある商品概念であり、この製品概念の利便性は、害虫防除形質及び形質及び雑草防除形質が同じ植物に兼備されれば向上される。さらに、本発明のものなどのB.t.殺虫タンパク質によって付与されるIR形質と、上で述べたものなどの1つ又はそれ以上の追加のHT形質、加えて、1つ又はそれ以上の追加のインプット形質例えば、B.t.由来の若しくは他の殺虫特性によって付与される他の害虫抵抗性、RNAiなどのメカニズムによって付与される害虫抵抗性、線虫抵抗性、病害抵抗性、ストレス耐性、改善された窒素利用能など又はアウトプット形質例えば、高い含油量、健康な油組成、栄養改善などの単一植物兼備により、向上された価値を得ることができる。そのような兼備は、従来の育種育種スタックによって達成されることがあり、又は付帯的に、多数の遺伝子の同時導入を伴う新規形質転換事象分子スタックとして達成されることがある。恩恵としては、害虫を管理できること、並びに生産者及び/又は消費者に二次的な恩恵をもたらす作物植物における改善された雑草防除が挙げられる。このように、本発明を他の形質と併用して、任意の数の農耕学的問題点を柔軟に及び費用効果的に制御することができる改善された作物品質の完全な農耕学的パッケージを提供することができる。形質転換された細胞は、通常の様式で植物内部で成長する。それらは、生殖細胞を形成することができ、及び形質転換された形質を後代植物に伝えることができる。そのような植物を通常の様式で成長させることができ、同じ形質転換遺伝因子又は他の遺伝因子を有する植物と交配することができる。結果として生じたハイブリッド個体は、対応する表現型特性を有する。本発明の好ましい実施形態において、植物は、コドン使用量が植物にとって最適化されている遺伝子で形質転換されるであろう。例えば、米国特許第5,380,831号参照。加えて、植物において使用するための合成Bt遺伝子を作り出すための方法は、当分野において公知である。好ましい形質転換植物の1つの非限定的な例は、Cry6Aaタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含む、及びさらに、Cry34Ab/35Abタンパク質をコードする第二のセットの植物発現可能遺伝子を含む、稔性とうもろこし植物である。同系交配とうもろこし系統へのCry6Aa-及びCry34Ab/35Ab-決定形質の伝達又は遺伝子移入は、循環選抜育種法によって、例えば戻し交配によって、達成することができる。この場合、所望の反復親を、Cry決定形質に適する遺伝子を保有するドナー同系交配体一回親と先ず交配させる。次に、この交配種の後代を交配して反復親に戻し、その後、その結果として生じた後代を、一回親から伝達されるべき所望の形質について選抜する。所望の形質についての選抜を伴う反復親との三世代、好ましくは四世代、さらに好ましくは五世代又はそれ以上の世代の戻し交配の後、その後代は、伝達される形質を制御する遺伝子座についてヘテロ接合性であるだろうが、殆どの又はほぼすべての他の遺伝子については反復親と同様であるだろう例えば、PoehlmanSleperBreedingFieldCrops4thEd172175FehrPrinciplesofCultivarDevelopmentVol1TheoryandTechnique360376参照。害虫抵抗性管理IRM戦略。例えば、Roushらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための二毒素戦略ピラミッディング又はスタッキングとも呼ばれるを概説している。35317771786。ウェブサイト上で、アメリカ合衆国観光保護庁UnitedStatesEnvironmentalProtectionAgencyepa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htmは、標的有害生物に対して活性な単一のBtタンパク質を生産するトランスジェニック作物と共に使用するための非トランスジェニックすなわち、非B.t.リフュージ非Bt作物/トウモロコシの区画を設けることについて、以下の要件を発表している。マツマダラメイガcornborer防護BtCry1Ab又はCry1Fトウモロコシ製品についての具体的な構造化要件は、次のとおりである:構造化リフュージ:コーンベルト内に20非レプチドプレラ属Btトウモロコシリフュージ;コットンベルト内に50非レプチドプレラ属Btリフュージ;区画内部すなわち、Bt圃場内外部すなわち、任意交配を最大にするためのBt圃場から1/2マイル可能な場合には1/4マイル以内の離隔した圃場圃場内植栽帯In-fieldStrips植栽帯は、幼虫移動の影響を低減させるために少なくとも4畝幅好ましくは6畝でなければならない加えて、全米トウモロコシ生産者協会NationalCornGrowersAssociationも、彼らのウェブサイト:ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-cornで、リフュージ要件に関する同様のガイダンスを提供している。例えば:マツマダラメイガIRMの要件:-貴方のトウモロコシ畑の少なくとも20をリフュージハイブリッドのために作付けすること-ワタ生産地では、リフュージは50でなければならない-リフュージハイブリッドから1/2マイル以内に作付けしなければならない-リフュージをBt圃場内の植栽帯として作付けすることができる;リフュージ植栽帯は、少なくとも4畝幅でなければならない-標的昆虫のために経済的許容限界に達する場合にのみ、リフュージを従来の殺有害生物剤で処理してもよい-Bt系噴霧可能殺虫剤をリフュージトウモロコシに対して使用することはできない-適切なリフュージを、Btトウモロコシを有するすべての農地に作付けしなければならないRoushらが例えば、1780頁及び1784頁右列で述べているように、それぞれが標的有害生物に対して有効であり、交叉抵抗性が殆ど又は全くない2つのタンパク質のスタッキング又はピラミッディングは、より小さいリフュージの使用を可能にし得る。Roushは、好結果のスタックについては10リフュージ未満のリフュージサイズで単一のピラミッディングされていない形質のための約50リフュージに匹敵する抵抗性管理を提供できることを示唆している。現在利用できるピラミッディングされたBtトウモロコシ製品について、アメリカ合衆国環境保護庁U.S.EnvironmentalProtectionAgencyは、単一形質製品についてのもの一般に20より有意に少ない一般に5非Btトウモロコシの構造化リフュージを作付けすることを求めている。リフュージのIRM効果をもたらすための様々な方法があり、それらとしては、Roushetal.supra、及び米国特許第6,551,962号によってさらに論じられているように、圃場における様々な幾何学的作付けパターン例えば上述のもの及び袋詰め種子混合物in-bagseedmixtureが挙げられる。上記百分率又は類似のリフュージ比率を、本ダブル又はトリプルスタック又はピラミッドに用いることができる。本明細書の中で言及又は引用するすべての特許、特許出願、仮出願、及び出版物は、それらが本出願の明確な教示と矛盾しない程度に、それら全体が参照により組み込まれる。以下は、本発明を実施するための手順を例証する実施例である。これらの実施例を限定と見なすべきではない。別の注記がない限り、すべての百分率は重量によるものであり、及びすべての溶媒混合物の比率は容量によるものである。すべての温度は、摂氏度でのものである。具体的な指示又は含意がない限り、用語a、an及びtheは、本明細書において用いる場合、少なくとも1を意味する。実施例1Cry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1完全長毒素をコードする発現プラスミドの構築。完全長Cry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1Cryタンパク質をそれぞれ生産するように遺伝子操作で作り変えられたシュードモナスフルオレッセンスPseudomonasfluorescensPf発現プラスミドの構築には標準的なクローニング法を用いた。NewEnglandBioLabsNEB;マサチューセッツ州イプスウィッチからの制限エンドヌクレアーゼをDNA消化に使用し、InvitrogenからのT4DNAリガーゼをDNAライゲーションに使用した。PlasmidMimiKitQiagen、カリフォルニア州バレンシアをその供給業者の指示書に従って使用して、プラスミド調製を行った。アガロースTris-アセテートゲル電気泳動の後、MilliporeUltrafree登録商標-DAカートリッジマサチューセッツ州ビルリカを使用して、DNAフラグメントを精製した。基本クローニング戦略は、完全長のこれらのCryタンパク質のコーディング配列CDSを、Cry34Ab1及びCry35Ab1についてはpMYC1803における並びにCry6Aa1についてはpDOW1169におけるSpeI及びXhoI又はXhoIと適合性であるSalI制限部位に、それぞれサブクローニングすること、それによって、それらを、それぞれプラスミドpKK223-3PLPharmacia、ウィスコンシン州ミルウォーキーからのPtacプロモーター及びrrnBT1T2又はrrnBT2ターミネータの発現制御下に置くことを必要とした。pMYC1803は、RSF1010複製起点と、テトラサイクリン抵抗性遺伝子と、DNAフラグメント含有タンパク質コーディング領域を導入することができる制限酵素認識部位の前にリボソーム結合部位とを有する中コピー数プラスミドである米国特許出願第20080193974号。Cry34Ab1とCry35Ab1両方についての発現プラスミドを電気穿孔法によってP.フルオレッセンス株MB214に形質転換させ、SOC-Soy加水分解物培地に回収し、20μg/mLテトラサイクリンを含有する溶原培地LysogenybrothLB培地にプレーティングした。発現ベクターpDOW1169は、pMYC1803に類似しているが、pDOW1169は、ウラシルをコードする遺伝子pyrFを保有し、この遺伝子は、ウラシルを欠くM9最小培地のプレートでの形質転換にP.フルオレッセンスウラシル栄養要求性菌株例えばDPf10が使用されたときに形質転換体をスクリーニングするためのマーカーとして使用されたSchneideretal.2005。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第20060008877号、同第20080193974号及び同第20080058262号から入手できる。miniprepプラスミドDNAの制限消化によって、コロニーをさらにスクリーニングした。挿入物を含有する選択されたコロニーのプラスミドDNAは、商業的シークエンシング供給業者、例えばeurofinsMWGOperonアラバマ州ハンツヴィル、との契約によりシークエンシングされた。配列データを集め、Sequencher商標ソフトウェアGeneCodesCorp、ミシガン州アナーバーを使用して分析した。実施例2成長及び発現。Bt受容体結合及び昆虫バイオアッセイをはじめとする特性づけのためのCry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1毒素の振盪フラスコ生産での成長及び発現分析を、発現構築物を持つ振盪フラスコ成長P.フルオレッセンス株例えば、Cry34Ab1についてはクローンpMYC2593、Cry35Ab1についてはpMYC3122、及びCry6Aa1についてはpDAB102018によって遂行した。20μg/mLテトラサイクリンを補足したP.フルオレッセンス培地で一晩成長させたCry34Ab1及びCry35Ab1についての種培養物を使用して、20μg/mLテトラサイクリンを伴う200mLの同培地に接種した。しかし、Cry6Aa1についての種培養物は、M9最小ブロスにおいて一晩成長させ、それを使用して、抗生物質なしの200mLのP.フルオレッセンス培地に接種した。24時間、28~30°Cで、300rpmで振盪しながらの最初のインキュベーションの後、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGの添加により、PtacプロモーターによるCry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1毒素の発現を誘導した。誘導時に及び誘導後の様々な時点で培養物をサンプリングした。600nmでの光学密度OD600により、細胞密度を測定した。実施例3振盪フラスコサンプルの細胞分画及びSDS-PAGE分析。各サンプリング時、サンプルの細胞密度をOD600=20に調整した。1mLアリコートを14,000×gで5分間、遠心分離する。細胞ペレットを-80°Cで凍結させた。EasyLyse商標細菌タンパク質抽出溶液EPICENTRE登録商標Biotechnologies、ウィスコンシン州マディソンを使用して、凍結細胞ペレットサンプルから可溶性及び不溶性画分を生成した。各細胞ペレットを1mLEasyLyse商標溶液に再浮遊させ、溶解バッファでさらに1:4希釈し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。溶解産物を14,000rpmで20分間、4°Cで遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。その後、ペレット不溶性画分を等容量のリン酸緩衝食塩水PBS;11.9mMNa2HPO4、137mMNaCl、2.7mMKCl、pH7.4に再浮遊させた。サンプルを、β-メルカプトエタノールを含有する4×Laemmliサンプルバッファと3:1で混合し、5分間沸騰させた後、NuPAGENovex4-20Bis-TrisゲルInvitrogen、カリフォルニア州カールズバッドに負荷した。電気泳動は、推奨NuPAGEMOPSバッファ中で行った。SimplyBlue商標SafeStainをその製造業者Invitrogenのプロトコルに従って用いてゲルを染色し、Typhoon画像形成システムGEHealthcareLifeSciences、ペンシルバニア州ピッツバーグを使用して画像形成した。実施例4封入体調製。SDS-PAGE及びMALDI-MSマトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析によって実証されるように、不溶性B.t.殺虫タンパク質を生産したP.フルオレッセンスから、Cryタンパク質封入体IB調製を行った。誘導後48時間のものから作成したP.フルオレッセンス細胞ペレットを37°C水浴で解凍した。それらの細胞を、溶解バッファ50mMTris、pH7.5、200mMNaCl、20mMEDTA二ナトリウム塩エチレンジアミン四酢酸、1TritonX-100、及び5mMジチオトレイトールDTTに再浮遊させて25w/vにした;Cry34Ab1及びCry35Ab1についてのみ使用直前に5mL/Lの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテルP8465Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイスを添加した。最低設定でホモジナイザーTissueTearor、BioSpecProducts,Inc.、オクラホマ州バートルズヴィルを使用して、細胞を浮遊させた。金属製スパチュラで混ぜることによって25mgのリゾチームSigmaL7651、白色鶏卵からのものをその細胞浮遊液に添加し、その浮遊液を室温で1時間インキュベートした。その浮遊液を氷で15分間冷却し、その後、BransonSonifier250を使用して音波処理した1分セッションを2回、50デューティサイクル、30アウトプット。細胞溶解産物を顕微鏡検査によって点検した。追加の25mgのリゾチームを必要に応じて添加し、インキュベーション及び音波処理を繰り返した。細胞溶解が顕微鏡検査によって確認されたら、溶解産物を11,500×gで25分間4°C遠心分離してIBペレットを形成し、上清を廃棄した。IBペレットを100mL溶解バッファに再浮遊させ、ハンドミキサーで均質化し、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、IBペレットが堅くなり、オフホワイトの色になるまで、そのIBペレットを50mL溶解バッファへの再浮遊、音波処理及び遠心分離によって繰り返し洗浄した。最終洗浄については、2mMEDTAを含有する滅菌濾過0.22μm蒸留水にIBペレットを再浮遊させ、遠心分離した。2mMEDTAを含有する滅菌濾過蒸留水に最終ペレットを再浮遊させ、1mLアリコートを-80°Cで保存した。実施例5SDS-PAGE分析及び定量。IBペレットの1mLアリコートを解凍し、滅菌濾過蒸留水で1:20希釈することによって、IB調製物中のタンパク質のSDS-PAGE分析及び定量を行った。次に、その希釈サンプルを4×還元用サンプルバッファ[250mMTris、pH6.8、40グリセロールv/v、0.4ブロモフェノールブルーw/v、8SDSw/v及び8β-メルカプト-エタノールv/v]と共に沸騰させ、Novex登録商標4~20Tris-グリシン、122ウエルゲルInvitrogen上に負荷し、1×Tris/グリシン/SDSバッファInvitrogenで泳動させた。ゲルをおおよそ60分間、200ボルトで泳動させて、染色し、脱染しdistained、その後、SimplyBlue商標SafeStainInvitrogen手順を行った。同じゲルでのウシ血清アルブミンBSAサンプル泳動についての濃度測定値を比較することによって標的バンドの定量を行って、Bio-RadQuantityOneソフトウェアを使用して標準曲線を生成した。実施例6封入体の可溶化。50~70mg/mLのCry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1タンパク質をそれぞれ含有するP.フルオレッセンスクローンMR1253、MR1636及びDPf13032からの10mLの封入体浮遊液をEppendorfモデル5415C微量遠心管の最高設定おおよそ14,000×gで遠心分離して、封入体をペレット化した。保存用バッファ上清を除去し、50mLコニカルチューブの中で、Cry34Ab1及びCry35Ab1の両方については25mLの100mM酢酸ナトリウムバッファ、pH3.0、並びにCry6Aa1については50mMCAPS[3-シクロヘキシルアミノ-1-プロパンスルホン酸3-cyclohexamino1-propanesulfonicacid]バッファ、pH10.5でそれぞれ置換した。ピペットを使用して封入体を再浮遊させ、ボルテックスにかけて徹底的に混合した。4°Cで一晩、穏やかに揺動するプラットフォーム上にそれらのチューブを置いて、完全長Cry34Ab1、Cry35Ab1及びCry6Aa1タンパク質を抽出した。それらの抽出物を30,000×gで30分間、4°Cで遠心分離し、可溶化された完全長Cryタンパク質を含有するそれらの得られた上清を保存した。実施例7完全長プロトキシンのトランケーション。完全長Cry35Ab1をキモトリプシンでトランケート又は消化して、Cryタンパク質の活性形態であるそのキモトリプシンコアを得た。具体的には、可溶化された完全長Cry35Ab1を、キモトリプシンウシ膵臓Sigma、ミズーリ州St.と共に、100mM酢酸ナトリウムバッファ、pH3.0、中、50:1=Cryタンパク質:酵素、w/wで、4°Cで、穏やかに振盪しながら2~3日間インキュベートし、完全活性化又はトランケーションをSDS-PAGE分析によって確認した。完全長Cry35Ab1の分子質量は、≒44kDaであり、そのキモトリプシンコアは、≒40kDaであった。その完全長及びキモトリプシンコアのアミノ酸配列を、配列番号1及び配列番号2として提供する。キモトリプシンコアもトリプシンコアもCry34Ab1については入手できず、及びまた完全長Cry6Aa1は、標的昆虫コーンルートワームに対してそのキモトリプシン又はトリプシンコアより有意に活性である。従って、完全長Cry34Ab1及びCry6Aa1を結合アッセイに用いた。完全長Cry34Ab1及びCry6Aa1のアミノ酸配列を、配列番号3及び配列番号4として提供する。実施例8Cry毒素の精製。イオン交換クロマトグラフィーシステムを使用して、キモトリプシン処理Cry35Ab1及び完全長Cry6Aa1をさらに精製した。具体的には、Cry35Ab1消化反応物を30,000×gで30分間、4°Cで遠心分離し、その後、0.22μmフィルタに通して脂質及びすべての他の粒子を除去し、得られた溶液を、AmiconUltra-15再生セルロース遠心濾過装置10,000分子量カットオフ;Milliporeを使用して5倍濃縮した。その後、使い捨てPD-10カラムGEHealthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ又は透析を使用して、サンプルバッファを、Cry34Ab1及びCry35Ab1の両方について20mM酢酸ナトリウムバッファ、pH3.5に変えた。ATKAExplorer液体クロマトグラフィーシステムAmershamBiosciencesを使用して、それらをさらに精製した。Cry35Ab1について、バッファAは、20mM酢酸ナトリウムバッファ、pH3.5であり、及びバッファBは、バッファA1MNaCl、pH3.5であり、その一方で、Cry6Aa1について、バッファAは、50mMCAPS、pH10.5であり、及びバッファBは、50mMCAPS、pH10.5、1MNaClであった。トランケートされたCry35Ab1については、HiTrapSP5mLカラムGEを使用した。バッファAを使用してカラムを十分に平衡させた後、Cry35Ab1溶液をカラムに5mL/分の流量で注入した。1mL/画分で5mL/分での0~100のバッファB勾配を使用して溶離を行った。完全長Cry6Aa1については、CaptoQ、5mL5mLカラムGEを使用し、すべての他の手順は、Cry35Ab1についてのものと同様であった。選択された画分の、最高品質の標的タンパク質を含有する画分をさらに選択するための、SDS-PAGE分析の後、それらの画分をプールした。精製Cry35Ab1キモトリプシンコアについては、上で説明したようにバッファを20mMBist-Tris、pH6.0と交換した。精製Cry6Aa1については、10mMCAPS、pH10.5に対する透析によって塩を除去した。SDS-PAGE、及びBSAを標準物質として用いるTyphoon画像形成システムGE分析を用いて定量した後、サンプルを、後の結合アッセイのために4°Cで保存した。完全長Cry34Ab1は、酸性バッファでの可溶化後、SDS-PAGE分析によって判断して既に純粋であったので、さらに精製しなかった。実施例9BBMV調製。昆虫中腸の刷子縁膜小胞BBMV調製物を、Cry毒素受容体結合アッセイのために広範に使用した。本発明において使用するBBMV調製物は、Wolferbergeretalによって記載された方法を用いて第3齢のウエスタンコーンルートワームジアブロティカヴィルギフェラヴィルギフェラDiabroticavirgiferavirgiferaLeConteの単離された中腸から調製した。ロイシンアミノペプチダーゼを前記調製物中の膜タンパク質のマーカーとして使用し、以前に記載されているように、粗製ホモジネート及びBBMV調製物のロイシンアミノペプチダーゼ活性を判定した。ブラッドフォード法1976を用いて、BBMV調製物のタンパク質濃度を測定した。実施例10125I標識。飽和及び競合結合アッセイのために、125Iを使用して精製完全長Cry34Ab1、キモトリプシン処理Cry35Ab1、及び完全長Cry6Aa1を標識した。放射標識がCry毒素の生物活性を無効にしないことを保証するために、Pierce登録商標IodinationBeadsPierceBiotechnology,ThermoScientific、イリノイ州ロックフォードの指示書に従うことによりNaIを使用して低温ヨウ素標識化を行った。バイオアッセイの結果は、ヨウ素標識化Cry35Ab1キモトリプシンコア及び完全長Cry6Aa1両方がウエスタンコーンルートワームの幼虫に対して依然として活性であるが、ヨウ素標識化がCry34Ab1を不活性化することを示した。予想どおり、125I-Cry34Ab1は、昆虫BBMVに特異的に結合しなかったので、Cry34Ab1には膜受容体結合を評定するために別の標識方法が必要である。125I-Cry35Ab1及び125I-Cry6Aa1をPierce登録商標IodinationBeadsPierce及びNa125Iで得た。Zeba商標DesaltSpinColumnsPierceを使用して、ヨウ素標識化タンパク質から取り込まれない又は遊離125Iを除去した。ヨウ素標識化Cryタンパク質の比放射能は、1~5uCi/ugの範囲であった。標識及び結合アッセイの多数のバッチを行った。実施例11飽和結合アッセイ。以前に記載されているように、125I標識Cry毒素を使用して飽和結合アッセイを行った。昆虫BBMVへのCry35Ab1及びCry6Aa1の特異的結合を判定するために、並びに結合親和性解離定数、Kd及び結合部位濃度所与の量のMMVに特異的に結合する毒素の量、Bmaxを推定するために、一連の漸増濃度の125I-Cry35Ab1又は125I-Cry6Aa1のいずれかを、それぞれ、所与の濃度0.1mg/mLの昆虫BBMVと共に、0.1BSAを補足した150uLの20mMBis-Tris、pH6.0、150mMKCl中、室温で60分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。20,000×gで、室温で8分間の遠心分離により、浮遊液中の遊離毒素から、BBMVに結合した毒素を分離した。0.1BSAを含有する900uLの氷冷した同じバッファでそのペレットを2回洗浄した。ペレットに残存する放射能をCOBRAIIAuto-GammacounterPackard、aCanberracompanyで測定し、全結合を考究した。別の系列の結合反応を並行して準備し、BBMVのすべての特異的結合部位を完全に占有するように500~1000倍過剰の対応する非標識毒素を結合反応のそれぞれに含め、それを使用して非特異的結合を判定した。全結合から非特異的結合を引くことによって、特異的結合を推定した。GraphPadPrism5.01GraphPadSoftware、カリフォルニア州サンディエゴを実行することにより、使用した標識毒素の濃度に対するピコモルあたりのBBMVタンパク質に特異的に結合した毒素分子数pmolを用いてこれらの毒素のKd及びBmax値を推定した。MicrosoftExcel又はGraphPadPrismプログラムのいずれかを使用して、チャートを作成した。実験を少なくとも3回繰り返した。これらの結合実験は、125I-Cry35Ab1と125I-Cry6Aa1の両方がBBMVに特異的に結合できることを明示した図1A及び1B。125I-Cry35Ab1及び125I-Cry6Aa1は、結合親和性、それぞれ、Kd=11.66±11.35、7.99±4.89nM、及び結合部位濃度、それぞれ、Bmax=5.19±3.02、2.71±0.90pmole/ugBBMVを有した。実施例12競合結合アッセイ。Cry35Ab1及びCry6Aa1が同じセットの受容体を共有するかどうかを判定するために、競合結合アッセイをさらに行った。Cry35Ab1同種競合結合アッセイのために、漸増量0~5,000nMの非標識Cry35Ab1を、先ず、5nM標識Cry35Ab1と混合し、その後、それぞれ、所与の濃度0.1mg/mLのBBMVと共に室温で60分間インキュベートした。BBMVと結合した125I-Cry35Ab1の百分率を、それぞれの反応について、非標識競合物不在での最初の特異的結合と比較して決定した。125I-Cry35Ab1と非標識Cry6Aa1の間の異種競合結合アッセイを行って、それらが同じセットの受容体単数又は複数を共有するかどうかを特定した。これは、BBMV上の推定受容体単数又は複数について標識Cry35Ab1と競合させるために反応に含める競合物としての非標識Cry6Aa1の量を増加させることによって果たした。実験を少なくとも3回繰り返した。実験結果は、Cry35Ab1が、モル濃度がおおよそ100nM5nM125I-Cry35Ab1と比較して20倍過剰に増加すると、50を超えてそれ自体を置換できることを明示した。残りの約50は、上で説明したような飽和結合結果に基づいて、置換され得ない非特異的結合と見なした。これは、この特異的結合が、20倍過剰の非標識Cry35Ab1によって完全に置換されたことを示唆している図2。しかし、Cry6Aa1は、125I-Cry35Ab1を置換することができなかった。これらのデータは、Cry35Ab1がCry6Aa1と受容体を共有しないことを示す。非標識Cry34Ab1を使用して放射標識Cry6Aaと結合について競合させる、又は非標識Cry6Aa1を使用して、別の標識法を用いて標識したCry34Ab1と競合させる、Cry34Ab1とCry6Aa1が受容体を共有するか否かについての試験は、未だ行っていない。参考文献BradfordMM1976ArapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofproteindyebindingAnalBiochem72248254LiHOppertBHigginsRAHuangFZhuKYBuschmanLL2004aComparativeanalysisofproteinaseactivitiesofBacillusthuringiensisresistantandsusceptibleOstrinianubilalisInsectBiochemMolBiol34753762LiHOppertBGonzalezCabreraJFerreJHigginsRABuschmanLLandZhuKYandHuangF2004bBindinganalysisofCry1AbandCry1AcwithmembranevesiclesfromBacillusthuringiensisresistantandsusceptibleOstrinianubilalisBiochemBiophysResCommun3235257SchneiderJCJeningsAFMunDMMcGovernPMChewLC2005AuxotrophicmarkerspyrFandproCcanreplaceantibioticmarkersonproteinproductionplasmidsinhighcelldensityPseudomonasfluorescensfermentationBiotechnologyProgress21343348WolfersbergerMGLuthyPMaurerAParentiPSacchiFGiordanaBHanozetGM1987PreparationandpartialcharacterizationofaminoacidtransportingbrushbordermembranevesiclesfromthelarvalmidgutofthecabbagebutterflyCompBiochemPhysiol86A301308米国特許出願第20080193974号2008BACTERIALLEADERSEQUENCESFORINCREASEDEXPRESSION米国特許出願第20060008877号2006Expressionsystemswithsecsystemsecretion米国特許出願第20080058262号2008rPAoptimization"