RNA分子を含む水疱性口内炎ウイルスであって、該RNA分子が、3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を含む、水疱性口内炎ウイルス。IFNポリペプチドがヒトIFNβポリペプチドである、請求項1記載のウイルス。NISポリペプチドがヒトNISポリペプチドである、請求項1記載のウイルス。哺乳動物細胞に感染すると、IFNポリペプチドを発現する、請求項1記載のウイルス。哺乳動物細胞に感染すると、NISポリペプチドを発現する、請求項1記載のウイルス。RNA分子を含む水疱性口内炎ウイルスを含む組成物であって、該RNA分子が、3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を含む、組成物。IFNポリペプチドがヒトIFNβポリペプチドである、請求項6記載の組成物。NISポリペプチドがヒトNISポリペプチドである、請求項6記載の組成物。前記ウイルスが哺乳動物細胞に感染するとIFNポリペプチドを発現する、請求項6記載の組成物。前記ウイルスが哺乳動物細胞に感染するとNISポリペプチドを発現する、請求項6記載の組成物。3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を含む核酸鎖を含む、核酸分子。IFNポリペプチドがヒトIFNβポリペプチドである、請求項11記載の核酸分子。NISポリペプチドがヒトNISポリペプチドである、請求項11記載の核酸分子。水疱性口内炎ウイルスを含む組成物を、癌細胞を含む哺乳動物に投与する段階を含み、該水疱性口内炎ウイルスが、3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を含むRNA分子を含み、該組成物の該哺乳動物への投与が、該水疱性口内炎ウイルスが該癌細胞に感染して感染癌細胞を形成する条件下で行われ、該感染癌細胞がIFNポリペプチドおよびNISポリペプチドを発現し、かつ該哺乳動物内の癌細胞数が該投与後に低減する、癌を処置する方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項14記載の方法。IFNポリペプチドがヒトIFNβポリペプチドである、請求項14記載の方法。NISポリペプチドがヒトNISポリペプチドである、請求項14記載の方法。水疱性口内炎ウイルスを含む組成物を、腫瘍を含む哺乳動物に投与する段階を含み、該水疱性口内炎ウイルスが、3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を含むRNA分子を含み、該組成物の該哺乳動物への投与が、該水疱性口内炎ウイルスが該腫瘍の腫瘍細胞に感染して感染腫瘍細胞を形成する条件下で行われ、該感染腫瘍細胞がIFNポリペプチドおよびNISポリペプチドを発現する、哺乳動物における腫瘍の退縮を誘導する方法。該哺乳動物がヒトである、請求項18記載の方法。IFNポリペプチドがヒトIFNβポリペプチドである、請求項18記載の方法。NISポリペプチドがヒトNISポリペプチドである、請求項18記載の方法。詳細な説明本文書は、水疱性口内炎ウイルスに関連する方法および材料を提供する。たとえば、本文書は、水疱性口内炎ウイルス、VSVポリペプチドをコードする核酸分子、水疱性口内炎ウイルスを作製する方法、および癌を処置するために水疱性口内炎ウイルスを用いる方法を提供する。本明細書において記述される水疱性口内炎ウイルスは、VSVNポリペプチド、VSVPポリペプチド、VSVMポリペプチド、VSVGポリペプチド、VSVLポリペプチド、IFNポリペプチド、およびNISポリペプチドをコードする核酸分子を有するように設計することができる。水疱性口内炎ウイルスに関連して本明細書において記述される配列は、水疱性口内炎ウイルスのネガティブセンスゲノムの生成を可能にするウイルスゲノムのポジティブセンスcDNAをコードするプラスミドに組み入れられると認識されるであろう。このように、たとえばVSVポリペプチドをコードする核酸配列は、そのポリペプチドをコードするたとえば、直接翻訳を介してポジティブセンス転写物の鋳型であるRNA配列を意味することができると認識されるであろう。IFNポリペプチドをコードする核酸を、VSVMポリペプチドをコードする核酸の下流に配置することができる図1A。たとえば、IFNポリペプチドをコードする核酸を、VSVMポリペプチドをコードする核酸とVSVGポリペプチドをコードする核酸のあいだに配置することができる。そのような位置により、非癌様組織における生得の抗ウイルス免疫応答を活性化するために有効である量のIFNポリペプチドをウイルスに発現させることができ、したがって、癌細胞における効率的なウイルス複製を妨害することなく、可能性があるウイルスの毒性を軽減することができる。IFNポリペプチドをコードする任意の適切な核酸を、水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。たとえば、IFNβポリペプチドをコードする核酸を、水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができるIFNβポリペプチドをコードする核酸の例には、GenBank登録商標アクセッション番号NM0021762GI番号50593016に記載される核酸配列のヒトIFNβポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号NM0105101GI番号6754303、BC1193951GI番号111601321、またはBC1193971GI番号111601034に記載される核酸配列のマウスIFNβポリペプチドをコードする核酸、およびGenBank登録商標アクセッション番号NM0191271GI番号9506800に記載される核酸配列のラットIFNβポリペプチドをコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。NISポリペプチドをコードする核酸を、VSVGポリペプチドをコードする核酸の下流に配置することができる図1A。たとえば、NISポリペプチドをコードする核酸を、VSVGポリペプチドをコードする核酸と、VSVLポリペプチドをコードする核酸のあいだに配置することができる。そのような位置により、a感染細胞においてヨウ化物を選択的に蓄積させるために有効であり、それによって放射性同位元素を用いるウイルス分布のイメージングおよび感染した癌細胞を標的とする放射線療法の両方が可能となる量、ならびにb感染した細胞に対して毒性となるほど多くはない量のNISポリペプチドをウイルスに発現させることができる。NISポリペプチドをコードする任意の適切な核酸を水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。たとえば、ヒトNISポリペプチドをコードする核酸を、水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができるNISポリペプチドをコードする核酸の例には、GenBank登録商標アクセッション番号NM0004532GI番号164663746、BC1050491GI番号85397913、またはBC1050471GI番号85397519に記載される核酸配列のヒトNISポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号NM0532482GI番号162138896、AF3803531GI番号14290144、またはAF2350011GI番号12642413に記載される核酸配列のマウスNISポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号XM524154GI番号114676080に記載される核酸配列のチンパンジーNISポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号XM541946GI番号73986161に記載される核酸配列のイヌNISポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号XM581578GI番号297466916に記載される核酸配列のウシNISポリペプチドをコードする核酸、GenBank登録商標アクセッション番号NM214410GI番号47523871に記載される核酸配列のブタNISポリペプチドをコードする核酸、およびGenBank登録商標アクセッション番号NM052983GI番号158138504に記載される核酸配列のラットNISポリペプチドをコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入される核酸たとえば、NISポリペプチドをコードする核酸および/またはIFNポリペプチドをコードする核酸を、ウイルスポリメラーゼによる挿入された核酸配列の転写にとって必要な遺伝子転写開始および終止コードを含むウイルス遺伝子内領域に隣接させることができる。そのようなウイルス遺伝子内領域の例には、図10に記載される領域が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。VSVNポリペプチド、VSVPポリペプチド、VSVMポリペプチド、VSVGポリペプチド、およびVSVLポリペプチドをコードする本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスの核酸配列は、GenBank登録商標アクセッション番号NC001560GI番号9627229に記載されるVSVインド株に由来することができ、またはVSVニュージャージー株に由来することができる。1つの局面において、本文書は、3から5方向に、VSVNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVPポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVMポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、IFNポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、VSVGポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、NISポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードするポジティブセンス転写物の鋳型である核酸配列を有する核酸分子たとえば、RNA分子を含む水疱性口内炎ウイルスを提供する。そのような水疱性口内炎ウイルスは、細胞たとえば、癌細胞に感染することができ、感染細胞によるIFNポリペプチドおよびNISポリペプチドの発現を指示することができる。任意の適切な方法を用いて、核酸たとえば、IFNポリペプチドをコードする核酸および/またはNISポリペプチドをコードする核酸を水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。たとえば、他書で記述される方法ObuchietalJVirol77884356GoeletalBlood110234250andKellyetalJVirol84155062を用いて、核酸を水疱性口内炎ウイルスのゲノムに挿入することができる。任意の適切な方法を用いて、本明細書において記述される核酸分子を含む水疱性口内炎ウイルスを同定することができる。そのような方法は、PCRならびにノザンおよびサザン分析などの核酸ハイブリダイゼーション技術を含むがこれらに限定されるわけではない。いくつかの場合において、免疫組織化学および生化学技術を用いて、特定の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を検出することによって、水疱性口内炎ウイルスが、その特定の核酸分子を含むか否かを判定することができる。もう1つの局面において、本文書は、VSVNポリペプチド、VSVPポリペプチド、VSVMポリペプチド、IFNポリペプチド、VSVGポリペプチド、NISポリペプチド、およびVSVLポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。たとえば、本明細書において提供される核酸分子は、VSVNポリペプチドをコードする核酸配列、VSVPポリペプチドをコードする核酸配列、VSVMポリペプチドをコードする核酸配列、IFNポリペプチドをコードする核酸配列、VSVGポリペプチドをコードする核酸配列、NISポリペプチドをコードする核酸配列、およびVSVLポリペプチドをコードする核酸配列を含む1つの核酸分子でありうる。本明細書において用いられる核酸という用語は、RNAたとえば、ウイルスRNAと、cDNA、ゲノムDNA、および合成たとえば、化学合成DNAを含むDNAの両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖でありうる。一本鎖核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖でありうる。さらに、核酸は、環状または直線状でありうる。本文書はまた、癌を処置するたとえば、腫瘍の大きさを低減させる、腫瘍の成長を阻害する、または生存している腫瘍細胞の数を低減させる方法を提供する。たとえば、本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスを、腫瘍の大きさを低減させるために、癌細胞または腫瘍の成長を阻害するために、および/または哺乳動物内での生存している癌細胞数を低減させるために、癌を有する哺乳動物に投与することができる。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、そのウイルスの利用可能なコピー数を典型的に少なくとも2倍たとえば、5倍から10倍、50倍から100倍、500倍から1000倍、またはさらに5000倍から10000倍まで増加させるために、宿主細胞において繁殖させることができる。いくつかの場合において、本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、標準的な細胞培養培地たとえば、5~10ウシ胎児血清を添加したDMEMまたはRPMI1640において37°Cで5CO2中において所望の濃度が得られるまで拡大させることができる。ウイルス力価は典型的に、細胞たとえば、BHK21細胞を培養物に接種することによってアッセイされる。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、たとえば、癌細胞群たとえば腫瘍に直接注射することによって、または癌細胞に静脈内送達することによって、癌患者に投与することができる。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、骨髄腫たとえば、多発性骨髄腫、黒色腫、神経膠腫、リンパ腫、中皮腫、ならびに肺、脳、胃、結腸、直腸、腎臓、前立腺、卵巣、乳腺、膵臓、肝臓、および頭頚部の癌が挙げられるがこれらに限定されるわけではない異なるタイプの癌を処置するために用いることができる。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、生物学的に適合性の溶液または薬学的に許容される送達媒体において、癌細胞群に直接たとえば、腫瘍内または全身たとえば、静脈内投与することによって、患者に投与することができる。適切な薬学的製剤は、部分的に、使用および、経皮または注射などの侵入経路に依存する。そのような剤形は、組成物または製剤が標的細胞すなわち、ウイルスが送達されることが望ましい細胞に到達するのをまたはその効果を発揮するのを妨害してはならない。たとえば、血流に注射される薬理学的組成物は、可溶性であるべきである。投与される用量は、患者によって異なるがたとえば、腫瘍の大きさに応じて、有効量は、任意の有害な副作用が存在するか否かと共に癌細胞の成長が低減されるか否かに関してモニタリングしながら、安全であることが証明されているウイルス濃度を下限として設定して、1012pfuまでの高用量まで用量を増加させることによって決定することができる。治療的有効量は典型的に、癌細胞数または腫瘍の大きさの少なくとも10の低減を提供する。用量漸増試験を用いて、所定のウイルス処置に関して所望の効果を得ることができるたとえば、NiesandSpielbergPrinciplesofTherapeuticsInGoodmanGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeuticsedsHardmanetalMcGrawHillNY1996pp4362を参照されたい。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、たとえば、約103pfuから約1012pfuたとえば、約105pfuから約1012pfu、約106pfuから約1011pfu、または約106pfuから約1010pfuの範囲の用量で送達することができる。治療的有効量を、反復用量で提供することができる。反復投与は、臨床症状もしくは腫瘍の大きさの観察またはモニタリングアッセイにより、癌細胞群もしくは腫瘍が縮小を停止しているか、または腫瘍がなおも存在しているがウイルス活性の程度が低下していることが示される場合に適切である。反復用量は、初回に用いられた経路と同じ経路によって、またはもう1つの経路によって投与することができる。治療的有効量は、いくつかの個別の用量で送達することができたとえば、数日または数週間離して、かつ1つの態様において、1回から約12回の用量が提供される。または、本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスの治療的有効量を、徐放性製剤によって送達することができる。いくつかの場合において、本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、癌細胞内でのウイルスの複製および拡散を促進する薬理物質またはウイルス毒性から非癌細胞を保護する物質と共に送達することができる。そのような物質の例は、他書で記述されているAlvarezBreckenridgeetalChemRev109312540。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスは、徐放性を提供するデバイスを用いて投与することができる。水疱性口内炎ウイルスの徐放性製剤は、たとえばポリマー賦形剤たとえば、膨張可能または非膨張可能ゲルまたはコラーゲンを含むことができる。水疱性口内炎ウイルスの治療的有効量を、ポリマー賦形剤内で提供することができ、賦形剤/ウイルス組成物は、癌細胞の部位にたとえば、腫瘍の近位にまたは腫瘍内に移植される。体液の作用は賦形剤を徐々に溶解して、一定時間のあいだウイルスの有効量を徐々に放出する。または徐放性デバイスは、一連の活性層とスペーサー層の交互層を含むことができる。そのようなデバイスの各活性層は、典型的に、賦形剤に包埋されたウイルス用量を含む一方、各スペーサー層は、賦形剤のみまたは低濃度のすなわち、有効量より低いウイルスを含む。デバイスの各連続層が溶解すると、ウイルスのパルス用量が送達される。スペーサー層の大きさ/処方により投与間隔が決定され、用いられる治療レジメンに従って最適化される。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスを、直接投与することができる。たとえば、ウイルスを、皮膚を通して触診可能な腫瘍たとえば、乳癌腫瘍に直接注射することができる。そのような方法において、超音波による誘導も同様に用いることができる。または、ウイルスの直接投与は、カテーテル線または他の医療用アクセスデバイスを介して達成することができ、かつ癌細胞群の位置を特定するためにイメージングシステムと共に用いることができる。この方法により、移植可能な投与デバイスは典型的に、医療用アクセスデバイスに挿入されたガイドワイヤを用いて癌細胞群の近位に配置される。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスの有効量を、露出した手術野において見ることができる癌細胞群に直接投与することができる。いくつかの場合において、本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスを、全身に送達することができる。たとえば、全身送達は、注射を介して、または剤の多数回用量を投与するために設計された静脈内送達デバイスを介して静脈内に達することができる。そのようなデバイスには、翼付静注針、末梢静脈カテーテル、ミッドラインカテーテル、末梢穿刺中心静脈カテーテル、および外科的に留置されたカテーテルまたはポートが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において提供される水疱性口内炎ウイルスによる治療の経過は、臨床症状の変化を評価することによって、または癌細胞数もしくは腫瘍の大きさを直接モニタリングすることによって、モニタリングすることができる。固形腫瘍の場合、ウイルス処置の有効性は、処置の前後での腫瘍の大きさまたは重量を測定することによって評価することができる。腫瘍の大きさは、直接たとえば、キャリパーを用いて、またはイメージング技術たとえば、X線、磁気共鳴イメージング、またはコンピューター断層撮影を用いることによって、または非イメージング光学データたとえば、スペクトルデータの評価から測定することができる。癌細胞群たとえば、白血病細胞の場合、ウイルス処置の有効性は、処置の前後での患者の血液中の白血病細胞の絶対数を測定することによって決定することができる。ウイルス処置の有効性はまた、癌特異的抗原のレベルをモニタリングすることによっても評価することができる。癌特異的抗原には、たとえば癌胎児抗原CEA、前立腺特異抗原PSA、前立腺酸ホスファターゼPAP、CA125、αフェトプロテインAFP、糖質抗原153、および糖質抗原194が挙げられる。本発明はさらに、以下の実施例において説明されるが、これらは添付の特許請求の範囲において記述される本発明の範囲を制限しない。実施例1-IFNポリペプチドおよび/またはNISポリペプチドを発現する水疱性口内炎ウイルスを用いる1回投与静脈内ウイルス療法は、腫瘍崩壊性の腫瘍減量および残留疾患の免疫療法による根絶を仲介するマウスIFNβポリペプチドを発現するように設計された水疱性口内炎ウイルスVSVmIFNならびにマウスIFNβポリペプチドおよびヒトNISポリペプチドの両方を発現するように設計された水疱性口内炎ウイルスVSVmIFNNIS;図1Aを、他書ObuchietalJVirol77884356GoeletalBlood110234250KellyetalJVirol84155062andLawsonetalProcNatlAcadSciUSA92447781ErratuminProcNatlAcadSciUSA929009で記述された方法と類似の方法を用いて作製した。同様に、ヒトIFNβポリペプチドおよびヒトNISポリペプチドを発現するように設計された水疱性口内炎ウイルスVSVhIFNNIS;図1Aも作製した。簡単に説明すると、所望のトランスジーンの核酸配列を、PCRを用いて特異的制限部位によって生成した。トランスジーンを、5から3方向にVSVゲノムのポジティブ鎖をコードするプラスミドの特異的挿入部位に挿入した。改変プラスミドを拡大させて、必要なT7ポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスによる感染ならびにVSVウイルスタンパク質N、P、およびLのトランスフェクションによって感染ウイルスを回収した。これによって、感染性ビリオンに構築されるネガティブセンスウイルスゲノムを生成することができる必要なウイルスポリペプチドの産生が可能となった。回収したウイルスを増幅して、感染用量を適切な培養細胞株たとえば、BHK21細胞において測定した。これらの水疱性口内炎ウイルスを作製するために用いたマウスIFNβポリペプチドの核酸配列は、GenBank登録商標アクセッション番号NM0105101GI番号6754303に記載される。これらの水疱性口内炎ウイルスを作製するために用いたヒトIFNβポリペプチドの核酸配列は、GenBank登録商標アクセッション番号NM0021762GI番号50593016に記載される。これらの水疱性口内炎ウイルスを作製するために用いたヒトNISポリペプチドの核酸配列は、GenBank登録商標アクセッション番号NM0004532GI番号164663746に記載される。ヒトNISポリペプチドをコードする核酸を、VSVGポリペプチドをコードする核酸の上流に挿入した場合には、機能的ビリオンは生成されなかった。この理由は、細胞が生存してウイルス繁殖を可能にするためにはNIS発現レベルが高すぎたように思われるためである。NISポリペプチドをコードする核酸をVSVGポリペプチドをコードする核酸の下流に挿入すると、より低い量のNISポリペプチドが産生されて、それによって効率的なウイルス繁殖のみならず、感染細胞における機能的ヨウ化物取り込みにとって十分な量のNISポリペプチドが可能となったことにより、機能的NIS発現ビリオンが生成された図2B。VSVMポリペプチドをコードする核酸と、VSVGポリペプチドをコードする核酸のあいだにIFNポリペプチドをコードする核酸を挿入すると、細胞に感染して、感染細胞の上清において観察されるIFNポリペプチド発現レベルの有意な増加を生じるウイルスが得られた図2A。VSVIFNNISウイルスは、インビトロで感染細胞において効率的に複製することができ、同様に、感染細胞の放射性ヨウ化物取り込み能によって示されるように、高レベルの機能的NISを発現することが可能であった図2B。2つのVSVIFNNISウイルスの精製保存株を、BHKハムスター細胞において滴定して図1B、細胞上清を採取して、ウイルスによってコードされたIFNβの分泌を確認した。高濃度のヒトまたはマウスIFNβが、VSVhIFNNISおよびVSVmIFNNISをそれぞれ感染させたBHK細胞の上清に検出され図1D、放射性ヨウ素の取り込み試験により、ウイルス感染細胞における放射活性ヨウ素の過塩素酸塩感受性すなわち、NIS仲介性濃度が確認され図1C、この濃度は高多重度の感染後24時間で最大に達した。5TGM1およびMPC11マウス骨髄腫細胞株が免疫コンピテント同系マウスにおいて皮下または正常位の腫瘍を信頼可能に形成することから、VSVIFNNISウイルスのインビボ活性を評価するために、これらのマウス骨髄腫細胞株を選択したLichtyetalHumGeneTher15821831andTurneretalHumanGeneTherapy911211130。いずれの株も、VSVIFNNIS感染に対して感受性であることが確認され図1E、機能的なNIS発現、IFNβ放出、およびその後の殺細胞が得られた。静脈内に投与したVSVIFNNISウイルスが、腫瘍血管から滲出して、腫瘍の実質内に拡散することができるか否かを判定するために、皮下5TGM1またはMPC11腫瘍を同系マウスにおいて成長させ直径約5mm、108TCID50VSVIFNNISウイルスの1回静脈内用量を投与し、かつウイルスがコードするNIS発現の生体分布を、トレーサーとして99mTcO4半減期6時間を用いるSPECTCTイメージングによって非侵襲的に毎日モニタリングした図3A。これらのトレーサー取り込み試験により、ウイルスが、腫瘍血管から効率よく滲出することが示され、ウイルスが皮下腫瘍の中で急速に拡散している可能性があることを示唆した。ウイルスが実際に腫瘍実質内で複製および拡散していることを確認するために、VSVIFNNISウイルス投与後24、48、および72時間目でSPECTCTイメージングの直後に、選択した腫瘍を採取して、i生存しているNIS発現腫瘍細胞を検出するためのオートラジオグラフィー、iiVSV抗原を検出するための免疫蛍光IF、およびiii死細胞または死につつある細胞を同定するためのTUNEL染色に供した。図3Bに示されるデータを注意深く分析すると、中心の腫瘍細胞はアポトーシスが進行しつつあるが、周辺部の細胞は生存したままで同様に図8を参照されたい、NISを発現し図5、および99mTc04を濃縮する図9、ほぼ球状の大きなVSV感染域が存在することが示された。IFおよびTUNELデータの定量的分析により、ウイルス投与後24時間から48時間のあいだにウイルス感染細胞およびアポトーシス細胞数の有意な増加が示された図3C。感染後72時間までに、拡大しつつあるVSV感染域は、大部分が癒合して、広範囲の腫瘍の破壊が起こった図3Bおよび図8。ウイルス投与後最初の24時間のあいだの非常に初期の時点におけるウイルス拡散の動態を特徴決定するために、さらに実験を行った図4A。ウイルスのIV投与6時間後に採取して、VSVおよびCD31陽性血管の両方に関して染色した腫瘍切片の分析により、ほとんどが腫瘍血管付近に存在する個々の散乱したVSV感染細胞が明らかとなった。12時間までに、ウイルス感染細胞の小さい集塊を見ることができ、18時間までにそれらは有意に成長して、24時間までにそれらは、中心部でアポトーシスが進行しつつあり周辺部が生存している、という既に記述された典型的な外観を示した。これらの二重CD31VSV染色切片の分析図4A、パネルi~viにより、図4Bにおいて高倍率で示されるように、腫瘍血管の内側に並ぶ内皮細胞が、VSV感染腫瘍細胞によって完全に取り囲まれた場合でさえ、VSV感染に屈しなかったことが示された。6、12、18、および24時間の時点での感染中心の平均直径横切る細胞数として測定をプロットすることにより図4C、ウイルスが一定の速度で遠心状に拡散して、拡大しつつある球体中の細胞の各連続層に感染するにはおよそ2時間を要するように思われた。それゆえ、各感染中心への新しい細胞の累増速度は、感染が進行すると増加して、ウイルス送達後24時間までに各中心は細胞およそ10000個を含むと推定された。インビボにおける感染腫瘍細胞の感染から死滅までのおよその時間を決定するために、腫瘍内感染の進行しつつある端部の生存しているVSV感染すなわち、TUNEL陰性、VSV陽性細胞の環状端の平均直径は、およそ細胞10個であると測定された図4D。このように、ウイルスは遠心状に拡散して、ウイルスが隣接する細胞に移行するにはおよそ2時間を要したが図4C、細胞死は、感染細胞の環状端が細胞10個分の直径に進行するまで起こらなかった図4D。これらの知見を併せると、感染細胞がアポトーシスとなるにはおよそ20時間を要すると結論された。ウイルスの効率的な滲出および急速な腫瘍内拡散が腫瘍の退縮に関連するか否かを判定するために、5TGM1皮下腫瘍を有するさらなる群のC57KaLwRijマウスを、108TCID50VSVIFNNISの1回静脈内用量によって処置して、毎日の健康状態のチェックおよび腫瘍の測定によって長期間追跡した。腫瘍は、VSVmIFNNISおよびVSVhIFNNIS処置動物の大多数において急速に退縮した図6A。時に見られる非常に早期の死亡は神経毒性に関連しておらず、公式には証明されていないが、急速な腫瘍溶解症候群によると思われた。興味深いことに、ウイルス療法の投与後2または3週間目に、VSVhIFNNIS処置によって処置した動物のほとんどにおいて腫瘍の再発が認められたが、これにより、VSVmIFNNISによって処置した動物では認められず図6Aおよび6B、ウイルスによってコードされるマウスIFNβは、この同系の免疫コンピテントマウスモデルにおいて残留疾患の完全な根絶に至る機構を活性化できるが、ヒトIFNβは活性化できないことを示唆した。マウスの全てがその時点までに高い力価の抗VSV抗体を有したことから図6C、再発した腫瘍をVSVIFNNISによって再度処置することは試みなかった。ウイルス処置動物における血清IFNβレベルの測定により、ウイルスにコードされるこのサイトカインが、ウイルス投与後初期の時点でウイルス感染腫瘍細胞によって血流に放出されることが示された図7A。インターフェロンβの抗腫瘍作用は、腫瘍細胞増殖の直接阻害、ナチュラルキラー細胞活性化、抗血管新生、および抗腫瘍T細胞応答の増強を含む。しかし、インビトロでの5TGM1およびMPC11骨髄腫細胞の増殖は、高濃度のIFNβであっても有害な影響を受けなかった図1F。その上、ウイルス処置腫瘍のCD31またはCD3染色切片の分析では、抗血管新生活性の阻害のいかなる証拠も、または宿主Tリンパ球による腫瘍浸潤のいかなる証拠も認められなかった図4B。しかし、その腫瘍が再発しなかったウイルス処置動物は、5TGM1腫瘍細胞による再接種に対して抵抗性であることが見いだされ図7B、マウスが5TGM1特異的抗腫瘍免疫を発達させたことを示している。同系のVSV感染骨髄腫細胞が、特異的抗骨髄腫免疫応答を誘発できるか否かを判定するために、同系のマウスを、皮下腫瘍細胞移植の1日後または5日前にVSV感染5TGM1細胞107個の1回皮下注射によって免疫した。腫瘍の成長は遅れ、それによって腫瘍接種の5日前に免疫したマウスでは生存の有意な増強が得られ図7C、VSV感染腫瘍細胞が、適度の抗腫瘍免疫応答を誘発したことを示している。しかし、VSV感染腫瘍細胞ワクチンは、小さくとも確立された腫瘍を有するマウスでは検出可能な抗腫瘍活性を示さず、抗腫瘍免疫が、疾患負荷量が最小である状況に限って有効であることを示唆した。VSVmIFNNIS処置マウスにおける腫瘍再発率がより低いことが、抗腫瘍T細胞応答を増強するウイルスにコードされるIFNβに起因するか否かを判定するために、抗CD4および抗CD8抗体のカクテルを用いて、T細胞を枯渇させた。腫瘍は、T細胞の枯渇状態によらず、静脈内VSVmIFNNIS治療に等しく良好に反応したが、腫瘍の再発率は、T細胞枯渇マウスにおいて有意に高かった図7Dおよび7E。これらの結果は、VSVmIFNNISによる腫瘍溶解性の減量後の残留腫瘍細胞の根絶が、ウイルスにコードされるマウスIFNβによってその増幅が刺激される腫瘍特異的T細胞によって仲介されたことを示している。Goelらの参考文献Blood110234250において記述され、免疫コンピテント5TGM1同系多発性骨髄腫マウスモデルC57BlKalwRijHsdにおいて弱い腫瘍溶解効能を示したVSVΔ51NISウイルスと比較すると、VSVIFNおよびVSVIFNNISウイルスは、非常に優れた複製動態を示した。さらに、VSVΔ51NISウイルスと比較すると、VSVIFNNISウイルスは、インビトロでより高いNISポリペプチド発現を誘導した。インビボ治療試験により、VSVIFNおよびVSVIFNNISウイルスの各々の1回静脈内用量が、皮下または正常位の5TGM1骨髄腫腫瘍を有する免疫コンピテントマウスの腫瘍の退縮を促進して、生存を有意に延長することが証明された。VSVIFNNISウイルスによって処置したマウスにおいて行ったTc99mイメージング試験は、腫瘍特異的ウイルスNISポリペプチド発現および腫瘍内ウイルス拡散と同時に増加する放射性同位元素取り込みを示した。さらに、VSVIFNおよびVSVIFNNISウイルスによる処置後に神経毒性は示されなかった。これらの結果は、VSVIFNNISウイルスを、ウイルス生体分布の非侵襲的イメージングおよび放射線ウイルス療法のために放射性同位元素と組み合わせることができる、癌たとえば、多発性骨髄腫のための治療物質として用いることができることを示している。本明細書において提供される結果は、ヒトIFNβおよびヒトNISをコードする水疱性口内炎ウイルスが、多発性骨髄腫の免疫コンピテントマウスモデルにおいてインビボで腫瘍溶解効能を示すことを証明している。全身投与されたウイルスは、腫瘍において複製することができ、機能的NISポリペプチドの十分なレベルを発現して、腫瘍溶解活性を発揮して腫瘍の退縮を誘導して生存を改善し、およびVSVΔ51NISウイルスと比較して優れたNIS発現および腫瘍溶解活性を示すことができた。細胞培養およびウイルス細胞株を、10ウシ胎児血清FBS、100UmLペニシリンおよび100mgmLストレプトマイシンを添加した培地において培養した。AmericanTypecellcultureATCCから得たBHK21およびMPC11細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地DMEMにおいて成長させた。5TGM1細胞を、DrBabatundeOyajobiUTHealthSciencesCenterSanAntonioTXから得て、イスコブ改変ダルベッコ培地IMDMにおいて成長させた。B16マウス黒色腫細胞は、RVileから得て、DMEMにおいて成長させた。細胞株は全て、マイコプラズマ混入に関して試験陰性であった。VSVポジティブ鎖アンチゲノムを含むpVSVXN2プラスミド内、機能的トランスジーン発現にとって必要な推定VSV遺伝子間配列TATG7CTAACAGの後に続くMGおよびGL遺伝子接合部に、制限部位を遺伝子工学により作製したSchnelletalJVirol7023182323。マウスIFNβ、ヒトIFNβ、およびNIS遺伝子をコードするcDNAに隣接する制限部位を、PCRによって生成した。マウスまたはヒトIFNβを1つのNotI部位MG接合部に組み入れて、NISをXhoIおよびNheI部位GL接合部に組み入れて、VSVIFNNISプラスミドを生成した。VSVIFNNISウイルスを、他書で記述される方法WhelanetalProcNatlAcadSciUSA9283888392を用いてレスキューした。次にウイルスをBHK21細胞において増幅させて、細胞上清の濾過によって精製し、10wvスクロース中での遠心分離によって沈降させた。連続希釈したウイルス保存株を用いて、感染後のウイルス力価をBHK21細胞において測定して、SpearmanandKarberの式を用いて決定した組織培養感染量TCID50を測定した。インビトロでのウイルス特徴決定BHK21細胞の感染MOI10、37°Cで1時間後の上清中のウイルス力価を測定した。インビトロの放射性ヨウ化物の取り込みを測定するために、細胞を、放射標識NaI1×105cpmのI125の存在下で、100μM過塩素酸カリウムKClO4の存在下または非存在下で、10mMHEPESN2ヒドロキシエチルピペラジンN2エタンスルホン酸、pH73を添加したハンクス緩衝塩類溶液HBSS中でインキュベートした。感染細胞の上清中のIFNβ分泌を、マウスまたはヒトIFNβPBLInterferonsourceに対する酵素免疫測定法ELISAを用いて決定した。IFN反応性を比較するために、細胞を100UmLマウスIFNβと共に12時間プレインキュベートした後、VSVGFPを感染させた。生存細胞の増殖を、MTTアッセイATCCによって評価した。VSVIFNNISMOI10による5TGM1およびMPC11の殺細胞を、MTTアッセイによって感染後の明記された時点で同様にモニタリングして、無処置細胞の百分率として示した。インビボ試験5TGM1またはMPC11マウス骨髄腫細胞5×106個を、6~10週齢の同系雌性C57Bl6KaLwRijHarlanNetherlandsまたはBalbcマウスTaconicの右脇腹皮下にそれぞれ移植した。腫瘍の負荷量を、キャリパーによる連続測定によって測定した。マウスに、VSVIFNNIS1×108個01mLまたは同量のPBSの1回静脈内用量を尾静脈注射により投与した。05mCiTc99mの腹腔内IP投与後にSPECTCTイメージングを行って、他書で記述されているように定量したPenheiteretalAJRAmJRoentgenol195341349。高解像度腫瘍分析24時間間隔で採取した腫瘍を切片作製のためにOCT中で凍結した。腫瘍切片を、オートラジオグラフィーによって、ならびにiMayoClinicのウイルスベクター製造研究室内で生成されたポリクローナルウサギ抗VSVの後にAlexa標識抗ウサギIgG二次抗体InvitrogenMolecularProbesを用いたVSV抗原に関する免疫蛍光IFによって、iiTUNEL染色DeadEnd商標FluorometricTUNELkitPromegaによる細胞死に関する免疫蛍光によって、およびiiiヘキスト33342Invitrogenを用いた細胞核に関する免疫蛍光によって、分析した。画像の定量を、VSVmIFNNIS処置腫瘍n=3個処置後72時間での腫瘍n=2個を除くからの4つの無作為な画像について、ImageJソフトウェアを用いて行い、腫瘍面積の百分率としてVSVまたはTUNEL領域を得た。6時間間隔で得た腫瘍のIF分析により、VSV抗原が検出され、およびラット抗マウスCD31抗体BDPharmingenを用いて腫瘍血管が検出された。腫瘍内病巣の大きさを、腫瘍2個から病巣7~8個を測定すること、および直径を腫瘍細胞の大きさの平均値個々の細胞50個の直径測定に基づいてによって除することによって定量して、多数の細胞における病巣直径を得た。ほぼ球状の病巣の体積を、式v=43を用いて推定した。生存しているVSV感染細胞の環状端の幅の平均値も同様に、VSVIFNNIS投与後48時間で採取した腫瘍n=3個のIF画像から定量した。免疫コンピテントマウスにおける免疫研究抗ウイルス抗体の生成を測定するために、熱不活化血清の連続2倍希釈液を、500TCID50VSVGFPと共にプレインキュベートした後、これを用いてBHK21細胞に感染させた。VSVにCPEを誘導させる最小血清希釈をプロットした。血清中のインビボIFNβ分泌を、ELISAによって測定した。5TGM1ワクチン接種を、VSVmIFNNIS感染細胞MOI1001×107個を、同系マウスの左脇腹に皮下注射することによって投与した。C57Bl6KaLwRijマウスにおいて、抗CD4および抗CD8抗体を1週間に3回腹腔内投与各50μgした後、毎週の維持用量を投与することによりT細胞枯渇試験を行った。統計学的方法データの視覚的表示を用いて、域外値または正規範囲からの実質的な逸脱に関して評価して、記述されている場合にはt検定を利用した。全ての場合において、多数の比較に関して補正されない両側のP値を提供した。生存の差に関する比較を、カプランマイヤー生存曲線からログランク検定を用いて行った。動物試験において腫瘍再発率を比較する場合、試料規模が小さいことからフィッシャー正確確率検定を利用した。他の態様本発明は、その詳細な説明と共に記述してきたが、前述の説明は、本発明を説明するためであり、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると意図されないと理解されるべきである。他の局面、長所、および変更は添付の特許請求の範囲の範囲内である。