低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子。側鎖基が、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、およびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される、請求項1に記載の分子。因子VIII分子がBドメイン末端欠失型変異体である、請求項1または2のいずれか一項に記載の分子。側鎖基が末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている側鎖基の除去をもたらす、請求項3に記載の分子。末端欠失型BドメインのO連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートし、因子VIIIの活性化が、共有結合でコンジュゲートしている親水性ポリマーの除去をもたらす、請求項4に記載の分子。O連結オリゴ糖がBドメインの末端欠失によって形成されるOグリコシル化部位に結合する、請求項5に記載の分子。残基1680に点突然変異を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の分子。残基1670~1684にわたる領域で1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の分子。側鎖基がPEGである、請求項1~8のいずれか一項に記載の分子。低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の分子の作製方法。請求項10に記載の方法によって得ることができる分子。それを必要とする患者に請求項1~9および11のいずれか一項に記載の分子の治療的有効量を投与する工程を含む、血友病疾患の治療方法。請求項1~9および11のいずれか一項に記載の分子の医薬としての使用。血友病の治療のための医薬の製造のための、請求項1~9および11のいずれか一項に記載の分子の使用。請求項1~9および11のいずれか一項に記載の分子を含む医薬組成物。現在の治療に関する推奨は、従来のオンデマンド治療から、予防へと推移しつつある。フォンウィレブランド因子に結合した内因性FVIIIの循環における半減期は、12~14時間であり、したがって、患者が実質的に無症状の生存を享受するには、毎週複数回にわたり予防治療を実施するべきである。多くの患者、とりわけ、小児および若年者にとって、静脈内投与は、大きな不都合およびまたは痛みを随伴する。したがって、好ましくは構造が均質で、好ましくは安全で、かつ1週当たりの因子VIII投与の回数を低減するために好ましくは相当に長い循環半減期を有する、因子VIII活性を有する新規因子VIII生成物の必要が当技術分野にある。そのような分子を得、生成するための比較的単純な方法の必要が当技術分野にさらにある。本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。本発明は、そのような分子の作製方法、ならびにそのような分子の使用にさらに関する。そのような分子は、改変された循環半減期を有する。定義フォンウィレブランド因子vWFは血漿中に存在する大きな単量体多量体の糖タンパク質であり、内皮、巨核球および内皮下結合組織で構成的に生成される。その一次機能は他のタンパク質、特に因子VIIIへの結合であり、それは創傷部位への血小板粘着で重要である。因子VIIIはvWFに結合するが、循環内では不活性である。vWFに結合していないとき、因子VIIIは速やかに分解するか取り除かれる。したがってFVIIIでのvWF結合能力の低下または撤廃は、長期循環半減期を有する因子FVIII変異体を得る上で非常に望ましくない手法であるとこれまでみなされてきた。用語低減されたvWF結合能力は、本明細書で因子VIII変異体を包含するものとし、そこでvWF結合能力は少なくとも50、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも90、最も好ましくは約100低減される。vWFへのFVIII結合は、ELISAのようなアッセイによって、または表面プラズモン共鳴を用いて固定化vWFへの直接結合として測定することができる。EP0319315で開示されるように、vWFへの結合を担う因子VIIIの領域は、残基1670~1684にわたる領域である。この領域を含む因子VIIIの点突然およびまたは欠失突然変異体は、vWFに結合する能力を改変すると想定される。本発明による特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異を含む変異体が含まれるY1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680CおよびE1682T。WO09156137は、PEGなどの側鎖基とコンジュゲートしていない、低減されたvWF結合を有する融合タンパク質を開示する。その中のタンパク質は、様々な比較検定法との関連で明らかに有用である。因子VIII分子FVIII因子VIIIは、主に肝細胞によって生成される、大きな複合糖タンパク質である。FVIIIは、シグナルペプチドを含む2351アミノ酸からなり、相同性によって定義されるようにいくつかの異なるドメインを含む。3つのAドメイン、特異なBドメインおよび2つのCドメインがある。ドメインの順序は、NH2A1A2BA3C1C2COOHのように記載することができる。FVIIIは、BA3境界で分離される2つの鎖として血漿中を循環する。これらの鎖は、二価金属イオン結合によって連結される。A1A2B鎖は重鎖と呼ばれ、A3C1C2は軽鎖と呼ばれる。内因性因子VIII分子は、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールとしてinvivoで循環する。invivoでおそらく起こることは、様々なサイズのBドメインを有する分子のプールをもたらすBドメインの段階的な酵素除去である。Bドメインの最後の部分が除去される740位での切断は、トロンビン活性化に関連して起こると一般に思われている。しかし、例えば740位の切断部位が損なわれている因子VIII変異体が活性である可能性を、除外することができない。本明細書で用いる因子VIIIまたはFVIIIは、内在性の凝固経路のメンバーであって血液凝固に必須であるヒト血漿糖タンパク質を指す。天然のFVIIIは、配列番号1に示す完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1のアミノ酸741~1648にわたっている。配列番号1野生型のヒト凝血因子VIIATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY配列番号2ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIFDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY配列番号3ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDICDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本発明による因子VIII分子は、配列番号2の残基1670~1684のvWF結合領域内には1または複数の変化も当然存在するが、残りのドメインは、配列番号1のアミノ酸番号1~740および1649~2332に示される配列に緊密に対応する、Bドメイン末端欠失型因子FVIII分子でありうる。しかし、本発明によるBドメイン切断分子は、配列番号1に示される配列と若干異なりうるが、これは、vWF結合能を低減する目的で、突然変異を導入するという事実のために、残りのドメインが、配列番号1に示されるアミノ酸配列とは若干、例えば、約1、2、3、4または5異なりうることを意味する。さらに、例えば、LRP、各種の受容体、他の凝血因子、細胞表面など、他の各種の構成要素、グリコシル化部位の導入およびまたは除去などにより、因子VIIIの結合能を修飾するために、分子内の他の位置にアミノ酸修飾を導入することが妥当である。本発明による因子VIII分子は、因子VIII活性を有するが、これは、凝血カスケード内で、FVIIIと機能的に類似するかまたは同等の形で機能し、活性化血小板においてFIXaと相互作用することによりFXaの形成を誘導し、血栓の形成を支援する能力を意味する。活性化は、invitroにおいて、例えば、血栓解析、内因性トロンビンポテンシャル解析など、当技術分野でよく知られる技法により評価することができる。本発明による因子VIII分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、および100であるか、または100をさらに超えるFVIII活性を有する。融合タンパク質融合タンパク質キメラタンパク質とは、元は個別のタンパク質をコードする、2つ以上の遺伝子を接合することにより創出されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を伴う単一のポリペプチドが結果としてもたらされる。本発明の融合タンパク質は、FVIIIポリペプチドおよび少なくとも1つの他のポリペプチドを含む。融合タンパク質は、少なくとも1つのリンカーを任意選択で含むことができる。したがって、FVIIIポリペプチドは、他のポリペプチド部分に直接的に連結されなくてもよい。他のポリペプチド部分はFVIIIポリペプチド鎖のN末端またはC末端に連結することができるか、FVIIIポリペプチド鎖の内部位置に挿入することができる。好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、Bドメイン欠失FVIIIのBドメインリンカーに挿入される。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のN末端でvWF結合a3領域を置換する。別の好ましい実施形態では、他のポリペプチド部分は、FVIII軽鎖のC末端に連結される。他のポリペプチドは、例えばヒト血清アルブミン、抗体結合ポリペプチド、Fc受容体、ヒトFcyRI、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、抗体のFc部分、転移、アルブミン結合ポリペプチドまたはトランスフェリン結合ポリペプチドに由来する1つまたは複数のアミノ酸配列を含むことができる。Bドメイン因子VIIIのBドメインは、配列番号1のアミノ酸741~1648にわたっている。Bドメインはいくつかの異なる部位で切断され、循環血漿中のFVIII分子の大きな異質性をもたらす。かなりグリコシル化されたBドメインの正確な機能は、未知である。知られているのは、凝固カスケードでのFVIII活性のためにドメインが不必要であるということである。機能のこの見かけの欠如は、Bドメイン欠失末端欠失型FVIIIが、完全長天然FVIIIで見られるものと同一のinvivo特性を有するらしいという事実によって支えられる。しかし、Bドメインが、少なくとも無血清条件の下で細胞膜との結合を低減することができることの兆候がある。Bドメイン末端欠失欠失型因子VIII分子内因性の全長FVIIIは、単鎖前駆体分子として合成される。分泌される前に、前駆体は、重鎖および軽鎖へと切断される。組換えBドメイン欠失FVIIIは、2つの異なる戦略により生成させることができる。Bドメインのない重鎖および軽鎖を2つの異なるポリペプチド鎖として個別に合成するか、またはBドメイン欠失FVIIIを、単鎖前駆体ポリペプチド鎖として合成し、これを、全長FVIII前駆体と同じ形で重鎖および軽鎖へと切断する。Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドでは、重鎖部分と軽鎖部分とが通常、リンカーにより隔てられている。Bドメイン欠失FVIII内に免疫原性エピトープを導入する危険性を最小化するために、リンカー配列は、FVIIIのBドメインに由来することが好ましい。少なくとも、リンカーは、Bドメイン欠失FVIII前駆体ポリペプチドを重鎖および軽鎖へと切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。全長FVIIIのBドメインでは、アミノ酸1644~1648が、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失FVIIIが活性化するとリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖内に配置される。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビンの活性化による、残りのFVIII分子からのリンカーの除去に影響を与える可能性は低い。Bドメインの欠失は、FVIIIを生成させるのに有利である。それにも関わらず、生成能を低下させることなく、Bドメインの一部をリンカー内に組み入れることもできる。生成能に対するBドメインの負の影響が、Bドメインの特定のサイズまたは配列に帰せられたことはない。末端欠失型Bドメインは、複数のOグリコシル化部位を含有しうる。しかし、好ましい実施形態によれば、該分子が、末端欠失型Bドメイン内に含むO結合オリゴ糖は、1つ、代替的に、2つ、3つ、または4つだけである。好ましい実施形態によれば、末端欠失型Bドメインが含む潜在的なOグリコシル化部位は1つだけであり、親水性ポリマーが、共有結合によりこのOグリコシル化部位にコンジュゲートされる。本発明によるBドメイン末端欠失型分子のO連結オリゴ糖は、組換え手段によりおよびまたはBドメインの末端欠失による隠れたOグリコシル化部位の曝露のいずれかによって人工的に作製されたOグリコシル化部位に結合することができる。いずれにしても、Bドメイン末端欠失型因子VIIIアミノ酸配列を設計し、その後、末端欠失型BドメインでOグリコシル化部位の可能性を予測するコンピュータ分析にアミノ酸配列をかけることによって、そのような分子を作製することができる。そのようなグリコシル化部位を有する比較的高い可能性を有する分子を適する宿主細胞で合成し、続いてグリコシル化パターンを分析し、その後末端欠失型BドメインでO連結グリコシル化を有する分子を選択することができる。因子VIII分子は、酵素または化学的コンジュゲーション法のいずれか、例えばシアリン酸誘導体と組み合わせたシアリルトランスフェラーゼまたはグリカン酸化を用いて、選定された試薬による以降の改変のためのアルデヒドを形成するコンジュゲーション点の役目を果たすこともできる、いくつかのN連結オリゴ糖も含む。組換え因子VIIIタンパク質の生成に適する宿主細胞は、その分子がグリコシル化されることを保証するために、好ましくは哺乳動物起源である。本発明の実施では、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくは、それらに限定されないが、CHO、COS1、ベイビーハムスター腎臓、およびHEK293細胞系を含む確立された哺乳動物細胞系である。好ましいBHK細胞系は、tkts13BHK細胞系であり、以降BHK570細胞と称す。BHK570細胞系は、ATCC受託番号CRL10314の下で、AmericanTypeCultureCollection、12301ParklawnDr、Rockville、MD20852から入手可能である。tkts13BHK細胞系は、受託番号CRL1632の下でもATCCから入手可能である。好ましいCHO細胞は、受託番号CCI61の下でATCCから入手可能なCHOK1細胞系ならびに細胞系CHODXB11およびCHODG44である。他の適する細胞系には、それらに限定されないが、ラットHepI、ラットHepII、TCMK、ヒト肺、NCTC1469DUKX細胞、およびDG44が含まれる。また、3T3細胞、ナマルバ細胞、骨髄腫および他の細胞との骨髄腫の融合体も有用である。一部の実施形態では、細胞は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する、それらが由来する細胞型と質的または量的に異なるスペクトルの酵素を発現する細胞などの、突然変異細胞または組換え細胞であってよい。DUKX細胞が特に好ましい。現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベイビーハムスター腎臓および骨髄腫細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞である。したがって、Bドメインを末端欠失させることによって因子VIIIBドメインの隠れたOグリコシル化部位の活性化が可能のようである。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、この現象は変更される末端欠失型Bドメインでの分子の三次構造に帰することができるかもしれない。したがって、隠れたOグリコシル化部位は末端欠失型Bドメインでのグリコシル化を受けやすくする。この手法の1つの利点は、例えばアレルゲン性に関して有利な安全性プロファイルを有する組換え分子の提供である。別の利点は、組換えタンパク質に人工Oグリコシル化部位を組み入れることが困難であると前に判明しているので、Bドメインでのグリコシル化部位の生来の豊富さのために、この手法がBドメインにO連結オリゴ糖を有するBドメイン末端欠失型変異体を得るより単純な手法となることであろう。wtFVIII分子のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による分子中の末端欠失型Bドメインの長さは、約10から約800アミノ酸、例えば約10から約700アミノ酸、例えば約12~500アミノ酸、12~400アミノ酸、12~300アミノ酸、12~200アミノ酸、15~100アミノ酸、15~75アミノ酸、15~50アミノ酸、15~45アミノ酸、20~45アミノ酸、20~40アミノ酸または20~30アミノ酸の範囲であってよい。末端欠失型Bドメインは、重鎖およびもしくは軽鎖の断片およびまたはwtFVIII分子で見出されない人工的に導入された配列を含むことができる。用語Bドメイン末端欠失およびBドメイン欠失は、本明細書で互換的に用いることができる。循環における半減期の改変本発明による分子は、野生型の因子VIII分子と比較して、循環における半減期が改変され、循環における半減期が延長されることが好ましい。循環における半減期は、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、好ましくは少なくとも20、好ましくは少なくとも25、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも35、好ましくは少なくとも40、好ましくは少なくとも45、好ましくは少なくとも50、好ましくは少なくとも55、好ましくは少なくとも60、好ましくは少なくとも65、好ましくは少なくとも70、好ましくは少なくとも75、好ましくは少なくとも80、好ましくは少なくとも85、好ましくは少なくとも90、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも125、より好ましくは少なくとも150、より好ましくは少なくとも175、より好ましくは少なくとも200、および最も好ましくは少なくとも250または300延長されることが好ましい。このような分子は、循環における半減期が、少なくとも400、500、600、またはさらに700延長されることがなおより好ましい。側鎖側鎖基本発明によるFVIII変異体は、翻訳後修飾を通して、または融合タンパク質の形で側鎖基と共有結合でコンジュゲートされてもよい。したがって、以下のFVIIIの側鎖基改変の1つまたは複数を実行することができるアルキル化、アシル化、エステル形成、ジスルフィドまたはアミド形成、その他。これには、ペグ化FVIII、システインペグ化FVIIIおよびその変異体が含まれる。本発明によるFVIII変異体は、生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、親水性ポリマー、ポリペプチド、XTENポリマー、PAS化またはHAP化、アルブミン結合ペプチドなどとコンジュゲートされてもよい。本発明によるFVIIIは、任意選択でリンカーを通して1つまたは複数の疎水性の側鎖基によってコンジュゲートされてもよい。12部分を有する化合物は、本発明との関連で可能なアルブミン結合剤である。疎水性の側鎖基は、そのような側鎖基がアルブミンと非共有の複合体を形成することが可能であり、それによって、改変FVIII変異体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊してFVIII変異体を放出するという事実のために血流中での改変FVIII変異体の循環を促進するという事実のために、アルブミン結合剤と呼ばれることがときにある。FVIIIは、WO03031464で開示される方法に基本的に従って、化学的方法ならびに酵素的グリコ改変法を用いて改変することができる。酵素法は、いかなる有機溶媒の使用も避ける利点、ならびに一般に非常に部位特異的である利点を有する。用語ペグ化FVIIIは、PEG分子とコンジュゲートしているFVIIIを意味する。PEG分子は、任意のアミノ酸残基または炭化水素部分を含むFVIIIの任意の部分へ結合させることができることを理解するべきである。用語システインペグ化FVIIIは、FVIIIに導入されたシステインのスルフヒドリル基とコンジュゲートしているPEG分子を有するFVIIIを意味する。PEGは、デキストランなどの多糖と比較して架橋が可能な反応性基をわずかしか有しないので、適するポリマー分子である。特に、その結合化学が比較的単純であるので、単官能PEG、例えばメトキシポリエチレングリコールに関心が高い。したがって、架橋のリスクが除去され、生じるポリペプチドコンジュゲートはより均一であり、ポリペプチドとのポリマー分子の反応は制御がより容易である。ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合を実行するために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性型で、すなわち反応性官能基と一緒に提供される。ペグ化は、ポリペプチド上の全ての利用できる給合基とのコンジュゲーションに向けることができるか、1つまたは複数の特異的な給合基、例えばN末端アミノ基、NおよびまたはO連結グリカンなどに向けることができる。さらに、コンジュゲーションは1段階で、または段階的に達成することができる。OおよびまたはN連結グリカンに側鎖基を結合するための酵素的手法は、WO03031464に開示されている。融合タンパク質融合タンパク質キメラタンパク質は、当初別々のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子の連結を通して作製されるタンパク質である。この融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能特性を有する単一のポリペプチドを生じる。したがって本発明によるFVIII変異体の側鎖は、FVIIIと融合したポリペプチドの形となることができる。したがって本発明によるFVIII変異体は、FVIIIに長期にわたる半減期を付与することができるペプチド、例えば抗体およびFc融合誘導体またはFc融合タンパク質と融合させてもよい。本明細書でFc融合タンパク質は、任意の抗体アイソタイプに由来してよいFcドメインに融合しているFVIIIを包含するものとするが、IgG抗体の比較的長い循環半減期のためにIgGFcドメインが多くの場合好ましい。特定のエフェクター機能、例えば補体結合およびまたは特定のFc受容体への結合を調整するために、Fcドメインはさらに改変されてもよい。FcRn受容体に結合する能力を有するFcドメインとのFVIIIの融合は、wtFVIIIタンパク質の半減期と比較して長期にわたる循環半減期の融合タンパク質を一般にもたらす。IgGFcドメインの234位、235位および237位での突然変異は、FcγRI受容体への結合の減少、ならびにおそらくFcγRIIaおよびFcγRIII受容体への結合の減少も一般にもたらす。これらの突然変異はFcRn受容体への結合を変更せず、それはエンドサイトーシス再利用経路によって長い循環半減期を促進する。好ましくは、本発明による融合タンパク質の改変IgGFcドメインは、以下の、特定のFc受容体への親和性の低下およびC1q媒介補体結合の減少をそれぞれもたらす突然変異の1つまたは複数を含む。理論によって縛られることなく、正常なvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるよりも、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子へ側鎖基を結合させるためにそれがより効率的に機能する理由は、側鎖基の相対サイズが大きな因子VIIIvWF複合体で比較的小さいということであると想定される。遊離の因子VIIIをクリアランスから保護することにおいて、比較的大きな側鎖基がより効率的に機能すると仮定される。FVIIIの半減期がvWFのそれと関連するとさらに仮定される。vWFに結合する能力の低下したFVIII分子は、通常ならばvWFによって保護されているクリアランスエピトープを曝露させた可能性が最も高い。したがって、側鎖基を結合することによって、このクリアランス保護を回復させることができると仮定される。他の場合には、例えば抗体断片などの側鎖基の給合は、例えば比較的長い循環半減期を有するタンパク質、細胞または血小板に分子を結合することによって機能することができる。親水性ポリマー本発明による改変基親水性ポリマーは、好ましくは天然に存在しない。一例において、天然に存在しない改変基は、少なくとも1つのポリマー部分が天然に存在しないポリマー改変基である。別の例では、天然に存在しない改変基は、改変炭水化物である。改変基による官能基化の座位は、改変糖がポリペプチドに酵素的に加えられることをそれが阻止しないように選択される。改変糖は、改変基で官能基化され、グリコシルトランスフェラーゼなどの天然であるか改変された酵素の基質である、任意のグリコシル模倣部分も指す。ポリペプチドに加えられるポリマー改変基は、そのようなポリペプチドの特性、例えばその生物学的利用能、生物的活性または体内でのその半減期を変更することができる。本発明による例示的なポリマーには、線状または分枝状であってよい水溶性ポリマーが含まれ、1つまたは複数の独立して選択されるポリマー部分、例えばポリおよびその誘導体を含むことができる。本発明によるポリマー改変基には、水溶性ポリマー、例えばポリおよびその誘導体、ポリおよびその誘導体などが含まれてよい。用語水溶性は、水へのなんらかの検出可能な程度の溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出およびまたは定量化する方法は、当技術分野で周知である。本発明による例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、サッカライド、ポリ、ポリ、ポリなどが含まれる。ペプチドは混合した配列を有することができ、例えばポリなど、単一のアミノ酸で構成されてもよい。例示的な多糖は、ポリである。例示的なポリは、ポリ、例えばmPEGである。ポリは例示的なポリアミンであり、ポリ酸は代表的なポリである。本発明による水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリであってよい。本発明との関連で用語PEGには、アルコキシPEG、二官能性PEG、マルチアームPEG、分岐PEG、分枝状PEG、ペンダントPEG、またはその中の分解可能な結合を有するPEGを含む、その形態のいずれかのポリが含まれる。ポリマー骨格は、線状または分枝状であってよい。分枝状ポリマー骨格は、当技術分野で一般に公知である。一般的に、分枝状ポリマーは、中央の枝コア部分および中央の枝コアに連結する複数の線状ポリマー鎖を有する。PEGは、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加によって調製することができる分枝形で一般に用いられる。中央の枝部分は、リジンまたはシステインなどのいくつかのアミノ酸に由来することもできる。一例において、分枝状ポリはRmのような一般形で表すことができ、式中、Rはグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部分を表し、mはアーム数を表す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第5932462号に記載のものなどのマルチアームPEG分子を、ポリマー骨格として用いることもできる。他の多くのポリマーも、本発明に適する。非ペプチド性で水溶性のポリマー骨格が、本発明で特に有用である。適するポリマーの例には、それらに限定されないが、他のポリ、例えばポリ、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ、ポリアルコール、ポリ、ポリ、ポリ、ポリ、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5629384号に記載のもの、ならびにそのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が含まれる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化してよいが、それは一般的に約100Daから約160000Da、例えば約5000Daから約100000Daの範囲である。より具体的には、本発明によるコンジュゲートした各親水性ポリマーのサイズは、約500Daから約80000Daまで、例えば約1000Daから約80000Daまで、約2000Daから約70000Daまで、約5000から約70000Daまで、約5000から約60000Daまで、約10000から約70000Daまで、約20000から約60000Daまで、約30000から約60000Daまで、約30000から約50000Daまで、または約30000から約40000Daまで変化してよい。これらのサイズは、正確な測定値でなく推定値を表すことを理解すべきである。好ましい実施形態によると、本発明による分子は、親水性ポリマー、例えば10000、40000または80000Da約5000、約4000、約3000、約2000または約1000DaのサイズのPEGなどの不均一な集団とコンジュゲートされる。アルブミン結合剤コンジュゲート側鎖基タンパク質のinvivo特性は、アルブミン結合側鎖を用いて向上させることができることが知られている。そのような側鎖またはアルブミン結合剤は、投与の前にタンパク質に結合させることができ、例えば、invivoでタンパク質を安定させることができるか、タンパク質のinvivo半減期を向上もしくは延長させることができる。それによって、アルブミン結合剤は血流による誘導体の循環を促進することができる。アルブミン結合剤は、ペプチド誘導体およびアルブミンの複合体が徐々にだけ崩壊して活性医薬成分を放出するという事実のために、それが結合しているタンパク質の作用時間を延長させるか引き延ばす作用を有することができる。したがって、好ましい置換基または側鎖は、全体としてアルブミン結合部分と呼ぶことができる。アルブミン結合剤は、アルブミン結合に特に関連し、それによって血流中の循環の延長に関連する部分を含むことができ、その部分はしたがって延長部分と呼ぶことができる。延長部分は、ペプチドへのその給合点と比較して好ましくはアルブミン結合部分の反対側の末端に、またはその近くにある。好ましい実施形態では、アルブミン結合剤は、アルブミンと非共有結合性の複合体を形成することが可能である側鎖であるか、それを含む。アルブミン結合剤は、アルブミンに非共有結合的におよびまたは可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、アルブミンに特異的に結合することができる。下記の方法から明らかであるように、アルブミン結合剤はシクロデキストリンに結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに非共有結合的におよびまたは可逆的に結合することができる。アルブミン結合剤は、シクロデキストリンに特異的に結合することができる。本明細書に記載されるアルブミン結合剤は、一般に疎水性の基である。アルブミン結合部分の他の部分、すなわち延長部分およびペプチドへの給合点の中間の部分は、リンカー部分、リンカー、スペーサーなどと呼ぶことができる。しかし、そのようなリンカーの存在は任意選択であり、したがってアルブミン結合部分は延長部分と同一であってよい。特定の実施形態では、アルブミン結合部分およびまたは延長部分は親油性であり、およびまたは生理的pHで負に荷電している。アルブミン結合部分およびまたは延長部分は、アルキル化、アシル化もしくはアミド形成などのコンジュゲーション化学によってペプチドのアミノ基と共有結合することができるか、またはエステル化、アルキル化、オキシム化などによってヒドロキシル基と共有結合することができる。好ましい実施形態では、アルブミン結合部分およびまたは延長部分の活性エステルは、アミド結合の形成の下で、シアル酸残基またはシアル酸誘導体のアミノ基と共有結合する。本目的のために、用語アルブミン結合部分、延長部分およびリンカーには、これらの分子の未反応形ならびに反応形が含まれる。一方または他方の形が意味されるかは、その用語が用いられる文脈から明らかである。アルブミン結合部分は、脂肪酸または脂肪二酸、またはその誘導体もしくはそのいずれかであってよいか、それを含むことができる。用語脂肪酸は、4から28個の炭素原子、例えば16個の炭素原子を有する脂肪族モノカルボン酸を指す。それは好ましくは非分枝状であり、およびまたは偶数であり、それは飽和であるか、不飽和であってよい。用語脂肪二酸は、上で定義される脂肪酸であるが、オメガ位置にさらなるカルボン酸基を有するものを指す。したがって、脂肪二酸はジカルボン酸である。命名法は当技術分野で通常のものであり、例えばCOOHならびにHOOCはカルボキシを指し、C6H4はフェニレンを、COならびにOCはカルボニルを、C6H5Oはフェノキシを指す。好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、2~80個のC原子、好ましくは5~70個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、存在する場合、リンカー部分が、4~20個のヘテロ原子、好ましくは2~40個のヘテロ原子、より好ましくは3~30個のヘテロ原子を有する。ヘテロ原子の特に好ましい例は、N原子およびO原子である。H原子はヘテロ原子ではない。別の実施形態では、リンカーが、少なくとも1つのOEG分子、およびもしくは少なくとも1つのグルタミン酸残基、またはそうではなくて対応するラジカル2O2OCH2COを名指すものであるを含む。好ましい一実施形態では、リンカー部分が、アミド結合によりシアル酸残基に連結される、ジカルボキシル残基を含む。好ましい例では、ジカルボキシル残基が、2~30個のC原子、好ましくは4~20個のC原子、より好ましくは4~10個のC原子を有する。さらなる好ましい実施形態では、ジカルボキシル残基が、0~10個のヘテロ原子、好ましくは0~5個のヘテロ原子を有する。別の好ましい例では、リンカー部分が、その遠位カルボキシル基を介して、アミド結合によりシアル酸残基に連結された、アミノ基および遠位カルボキシル基の両方を含有する基を含む。好ましい一実施形態では、この基が、OEG基である。アミノ酸であるグルタミン酸は、2つのカルボン酸基を含む。そのガンマカルボキシ基は、シアル酸残基もしくはシアル酸誘導体のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は、OEG分子のアミノ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGlu残基のアミノ基とのアミド結合を形成するのに用いられることが好ましい。Gluのアミノ基は、延長部分のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合はOEG分子のカルボキシ基とのアミド結合、または存在する場合は別のGluのガンマカルボキシ基とのアミド結合を形成する。このようなGluの組入れを、場合によって簡単に、ガンマGluと称する。O連結オリゴ糖NグリカンおよびOグリカンの両方は、そのタンパク質を生成する細胞によってタンパク質に結合される。発生期のタンパク質がリボソームから小胞体に転位されるに従い、細胞性Nグリコシル化機構はアミノ酸鎖のNグリコシル化シグナルを認識してグリコシル化する。同様に、Oグリカンはアミノ酸鎖の特定のOグリコシル化部位に結合されるが、Oグリコシル化を誘発するモチーフはNグリコシル化シグナルより非常に不均一であり、アミノ酸配列のOグリコシル化部位を予測する我々の能力はなお不十分である。したがって、人工Oグリコシル化部位の構築には、多少の不確実性が付随する。したがって、末端欠失型因子VIIIBドメインのO連結オリゴ糖は、天然に存在するO連結グリコシル化配列または組換え技術によって人工的に構築されたO連結グリコシル化配列と共有結合させることができる。本発明の好適な実施例によると、O連結オリゴ糖は、野生型因子VIII分子のグリコシル化に曝露されていないが、Bドメインの末端欠失の結果としてOグリコシル化にアクセス可能になっている天然に存在するO連結グリコシル化配列に連結される。その例は、Bドメインが配列番号1中のアミノ酸742~763に対応する、Bドメイン末端欠失型因子VIII変異体である。Bドメインがいくぶん異なる場所で末端欠失型されるとしても、すなわち末端欠失型Bドメインが742~763リンカーと比較していくぶん短いか長い場合でも、この末端欠失型変異体中の隠れたOグリコシル化部位がグリコシル化されることはありそうである。人工Oグリコシル化部位の生成ではなくBドメインの末端欠失によって隠れたOグリコシル化部位を活性化させることによるこの手法は、有利な安全性プロファイルを有する分子を作製する利点を有する。因子VIIIBドメインの他のOグリコシル化部位は、異なる方法で分子を末端欠失させることによって同様に活性になることができる。シアリルトランスフェラーゼシアリルトランスフェラーゼは、発生期のオリゴ糖にシアリン酸を移す酵素である。各シアリルトランスフェラーゼは、特定の糖基質に特異的である。シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸付加糖脂質の末端部分に、または糖タンパク質のNもしくはO連結糖鎖にシアリン酸を加える。それらが作用する受容体構造に基づいて、およびそれらが形成する糖結合の種類に基づいて識別することができる約20個の異なるシアリルトランスフェラーゼがある。本発明による好ましいシアリルトランスフェラーゼは、ST3GalIおよびST3GalIIIである。したがって、例えば特異的シアリルトランスフェラーゼの選択およびまたは特定のグリコシル化パターンを有する因子VIII分子の操作によって、本発明によるコンジュゲート因子VIII分子の構造を操作することができる。O連結オリゴ糖のグリコペグ化Oグリカンの生合成は、生合成の比較的初期にシアル酸残基を加えることによって改変すること、および終了することができる。特定のシアリルトランスフェラーゼ酵素は、GalNAcαSerThrに、またはCore1GalT作用の後の早期のOグリカンコアサブタイプに作用することが可能である。用語T抗原は、Galβ13GalNAcαSerThr二糖の存在と関連している。これらの構造の生成は同じ基質に対してのグリコシルトランスフェラーゼ間の競合を含み、したがってゴルジ装置の中のグリコシルトランスフェラーゼの発現レベルおよび細胞内分布が、Oグリカンの生合成および多様化での構造的結果を決定する。Galβ13GalNAcαSerThr二糖だけが、グリコペグ化のために適合する。しかし、この構造の利用できる量は、シアリダーゼまたはCore1GalTまたはその組合せによるタンパク質の処理を通して、大いに増強することができる。グリコペグ化処理の結果、標的タンパク質のGalβ3GalNAcαSerThr二糖へのα3結合を通して、シアリン酸PEGが天然の構造に加えられる。他の親水性ポリマーを、O連結オリゴ糖に結合することもできる。Oグリカンを通してFVIIIへ他の親水性ポリマーを酵素的にコンジュゲートするための基本的な要件は、WO03031464に開示されるように、遊離アミノ基を通してグリシルシアリン酸誘導体にそれらを結合させる能力である。当業者に公知である多様な結合化学を通してこれを達成することができる。活性化生体適合性ポリマーの例には、ポリアルキレン酸化物、例えばそれらに限定されないが、ポリエチレングリコール、2エチルホスホリルコリンポリマー、デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸もしくは特定のペプチド配列のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン無水マレイン酸コポリマー、ポリスチレン無水リンゴ酸コポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解産物、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラゲナン、ペクチン、アルギン酸加水分解産物、他のバイオポリマーおよびその任意の同等物が含まれる。例えばWO0331464に開示されるように、側鎖基はN連結オリゴ糖に結合することができる。そのような方法は、因子VIII分子へのいくつかの側鎖基の給合をしばしばもたらす。医薬組成物本明細書では、医薬組成物が、例えば、RTU滅菌水性組成物、または、例えば、水中もしくは水性緩衝液中で再構成しうる乾燥滅菌組成物など、非経口投与に適する、本発明による因子VIII分子を含む組成物を包含することを意味することが好ましい。本発明による組成物は、各種の薬学的に許容される賦形剤、安定化剤などを含みうる。このような組成物中のさらなる成分には、保湿剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調整剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質、および双性イオンが含まれうる。このようなさらなる成分が、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害な影響を与えるべきでないことは当然である。非経口投与は、シリンジ、場合によって、ペン型シリンジによる皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射を介して実施することができる。代替的に、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、鼻腔内スプレーまたは肺内スプレーの形態でFVIII化合物を投与するための溶液または懸濁液でありうる組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば、注射針なしの注射による、もしくはパッチ、場合によって、イオントフォレーシスパッチによる経皮投与、または経粘膜投与、例えば、口腔内投与にも適合させうる。本明細書で用いられる治療という用語は、それを必要とする任意のヒト対象または他の動物対象に対する医学的治療を指す。前記対象は、前記特定の治療の使用が、前記ヒト対象または他の動物対象の健康に有益であることを示す一時的または決定的な診断を施した治療者による身体検診を受けていることが期待される。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康状態に従い、個体により異なりうる。したがって、前記治療は、予防的治療の場合もあり、緩和的治療の場合もあり、対症的治療の場合もあり、かつまたは治癒的治療の場合もある。第1の態様では、したがって本発明は、低減されたvWF結合能力を有し、少なくとも1つの側鎖基と共有結合でコンジュゲートしている組換え因子VIII分子に関する。一実施形態では、側鎖基は、親水性ポリマー、アルブミン結合剤、抗体またはその断片、トランスフェリンおよびアルブミンからなる群の1つまたは複数から選択される。好ましい実施形態では、因子VIII分子はBドメイン末端欠失型変異体であり、側鎖基は任意選択で末端欠失型Bドメインと共有結合でコンジュゲートされ、それによって因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた側鎖基の除去をもたらす。別の実施形態では、Bドメイン末端欠失型分子は、末端欠失型BドメインのO連結オリゴ糖を通して親水性ポリマーと共有結合でコンジュゲートされ、因子VIIIの活性化は共有結合でコンジュゲートされた親水性ポリマーの除去をもたらす。そのようなOグリコシル化部位は、好ましくはBドメインの末端欠失によって構築される。さらに別の好ましい実施形態では、本発明による分子は、残基1680の点突然変異を含む。別の好ましい実施形態では、因子分子は、残基1670~1684にわたる領域で、1つまたは複数のアミノ酸の欠失を含む。したがって、本発明による分子は、vWF結合ドメインの中に点突然変異および欠失の両方を含むことができる。特に好ましい実施形態によると、側鎖基はPEGである。本発明の別の態様は、低減されたvWF結合能力を有する因子VIII分子への側鎖基の給合を含む、本発明による分子の作製方法に関する。そのような方法によって得ることができる、または得られる分子も、本発明の一部である。本発明の第3の態様は、それを必要とする患者に本発明による分子の治療的有効量を投与することを含む、血友病疾患の治療方法に関する。本発明の第4の態様は、本発明による分子の医薬として使用に関する。第5の態様は、血友病の治療のための医薬の製造のための、本発明による分子の使用に関する。最後の態様は、本発明による分子を含む医薬組成物に関する。組換えBドメイン末端欠失型Oグリコシル化因子VIIIおよびその変異体、例えば因子VIIIまたは因子VIIIの生成細胞系および培養工程因子VIIIのcDNAを用いて、哺乳動物用の発現プラスミドを構築した。プラスミドは、Y1680F突然変異を含むBドメイン欠失因子VIII、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1~740を含む因子VIII重鎖、および全長ヒト因子VIIIのアミノ酸1649~2332を含む因子VIII軽鎖をコードする。重鎖配列および軽鎖配列は、全長ヒト因子VIIIのアミノ酸741~750および1638~1648による配列を含む21アミノ酸のリンカーにより連結した。配列番号4で定義されるリンカーを含むFVIII変異体は、本明細書でN8と呼ぶこともできる。このプラスミドによってコードされる因子VIIIアミノ酸配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3に示す通りである。チャイニーズハムスター卵巣細胞に、このプラスミドをトランスフェクトし、ジヒドロ葉酸レダクターゼ系により選択し、最終的に、動物成分非含有培地中で培養されるクローン懸濁液生成細胞をもたらした。工程の第1のステップは、作業用の細胞バンクバイアルに由来する細胞バイアルを、化学的に規定された、動物成分非含有増殖培地へと接種することである。まず融解後、細胞を、T型フラスコ内でインキュベートする。融解の1または2日後、細胞をシェーカーフラスコへと移し、細胞密度を02~30×106個mlに維持するために、培養物容量を系列希釈により拡張する。次のステップは、シェーカーフラスコ中の培地を、種培養用バイオリアクターへと移すことである。ここで培養物容量をさらに拡張してから、最終的に生成用バイオリアクターへと移す。化学的に規定された、同じ、動物成分非含有培地を、全ての接種物拡張ステップに用いる。生成用バイオリアクターへと移した後で、培地に、生成物濃度を増大させる成分を補充する。生成用バイオリアクターでは、サイクル時間を3日間とする反復バッチ工程で細胞を培養する。回収時には、培養物容量の80~90を、回収タンクへと移す。次いで、初期細胞密度を得るために、残りの培養液を、新鮮な培地で希釈し、次いで、新規の増殖期を開始する。遠心分離および濾過により回収バッチを洗浄し、保持タンクへと移してから、精製工程を開始する。保持タンク内の細胞を含まない回収物に緩衝液を添加し、pHを安定化させる。生成試行が終了するまでに、細胞バンクの生成を終了させるために、細胞を回収して凍結させる。この細胞バンクを、マイコプラズマ、滅菌性、およびウイルス汚染について検査する。精製細胞培養培地から、Bドメイン欠失因子VIIIを単離するために、CaptoMMCカラムにおける濃縮ステップ、ELISAおよびクロマトグラフィーによるステップ、アニオン交換クロマトグラフィーステップ、ならびに最後のゲル濾過ステップを含めた、4ステップの精製手順を用いた。典型的には、以下の手順を使用した11リットルの滅菌濾過培地を、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、50mMのNaCl、002のTween80、pH75中で平衡化したCaptoMMCによるカラムへと、流速15ml分で送入した。75mlの緩衝液Aでカラムを洗浄した後、15MのNaClを含有する75mlの緩衝液Aで洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、8Mのエチレングリコール、pH75により、流速1ml分でタンパク質を溶出させた。8mlの画分を回収し、因子VIII活性について比色アッセイでアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約50mlのプール容量を得た。因子VIIIに対するモノクローナル抗体を発生させた。さらなるエピトープマッピングにより、この抗体F25は、アミノ酸残基725~740の重鎖最C末端配列を認識することが判明した。本質的に、製造元により説明される通りに、ゲル1ml当たり24mgの密度で、F25抗体を、NHS活性化セファロース4FFに連結した。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、pH73で10倍に希釈し、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、150mMのNaCl、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73で平衡化したF25Sepharoseカラムへと、流速05ml分で適用した。UVシグナルが一定となるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、UVシグナルが一定となるまで、再度、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、065MのNaCl、pH73で洗浄した。20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、25MのNaCl、50のエチレングリコール、pH73により、流速1ml分で、因子VIIIを溶出させた。1mlの画分を回収し、因子VIIICについてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約25mlのプール容量を得た。イオン交換ステップのために、緩衝液A20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、pH73および緩衝液B20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、1MのNaCl、pH73を調製した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分で、MacroPrep25QSupportによるカラムを平衡化した。前出の工程によるプールを、緩衝液Aで10倍に希釈し、流速2ml分でカラムへと送入した。85の緩衝液A15の緩衝液Bにより、流速2ml分でカラムを洗浄し、流速2ml分で120mlの15緩衝液B~70緩衝液Bにわたる直線勾配により、因子VIIIを溶出させた。2mlの画分を回収し、実施例3で説明されているように因子VIII活性についてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約36mlのプール容量を得た。前出の工程によるプールを、20mMのイミダゾール、10mMのCaCl2、002のTween80、1Mのグリセロール、150mMのNaCl、pH73で平衡化した調製グレードのSuperdex200カラムへと1ml分で適用し、溶出させた。3mlの画分を回収し、因子VIIICについてアッセイした。因子VIIIを含有する画分をプールし、通常約57mlのプール容量を得た。因子VIIIを含有するプールを、80°Cで保存した。FVIIICおよびELISAの測定により判定される通り、上記の4ステップの精製手順を用いることにより、約15の全収量が得られた。組換えOグリコシル化因子VIIIのペグ化の手法以下の手法を用いて、実施例1で得られる組換え因子VIII分子をポリエチレングリコールとコンジュゲートさせる。グリコペグ化反応が効率的であるために、5mgmlのFVIII濃度が必要とされる。FVIIIはその濃度で通常可溶性でないので、選択された緩衝液組成のスクリーニングを行ったを参照。これらの検討事項に基づき、pH60の50mMMES、50mMCaCl2、150mMNaCl、20グリセロールを含む緩衝液が適する反応緩衝液であると見出された。前記のように精製された組換えFVIIIは、段階溶出を用いるPoros50HQカラム、SartoriusVivaspinフィルター、10kDaカットオフ、またはAmicon10kDaMWCOPESフィルターでのイオン交換によって、反応緩衝液中で6~10mgmLの濃度まで濃縮した。FVIIIのグリコペグ化は、因子VIIIを、シアリダーゼ、CMPSAグリセロールPEG40kDaおよびMBPST3Gal1と反応緩衝液中で混合することによって開始された。反応混合液は、全体の約20~30の変換収率まで、32°Cでインキュベートされた。インキュベーションの後、試料を緩衝液Aで希釈し、Source15Qカラムに加えた。結合した材料を緩衝液Aで洗浄し、段階勾配を用いて緩衝液Bで溶出させた。グリコペグ化因子VIIISAグリセロールPEG40kDaを、約25の緩衝液Bでカラムから溶出させた。シアリダーゼ処理の間にNグリカンに曝露させた遊離のガラクトース部分をブロックするために、因子VIIISAグリセロールPEG40kDaのプール画分を、CMPSAおよびMBPSBDST3Gal3と反応緩衝液50mMMES、20mMCaCl2、150mMNaCl、10mMMnCl2、20グリセロール、pH60中で混合し、32°Cで11時間インキュベートした。生じたキャップ付のグリコペグ化因子VIIISAグリセロールPEG40kDaを、50mMMES、50mMCaCl2、150mMNaCl、10グリセロール、pH60で平衡させたSuperdex200カラムでのゲル濾過によって、cmpSAおよびST3GalIIIから分離した流速025mL分。生成物因子VIIISAグリセロールPEG40kDaは38分後に溶出する。ピーク分画を収集、等分し、以降の分析にかけた。Oグリカン40kDaグリコPEGBDDFVIIIY1680F水中のイミダゾール、塩化カルシウム、ツイーン80、塩化ナトリウムおよびグリセロールからなる緩衝液中のBDDFVIIIY1680Fを解凍した。アルスロバクターウレアファシエンスからのシアリダーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびシチジンモノホスフェートN5PEGグリセロールノイラミン酸、CMPSAグリセロールPEG40kDaを加えた。最終容量は、15mlであった。生じた混合液は、摂氏32度で24時間放置した。混合液を緩衝液Aにイミダゾール、塩化カルシウム、ツイーン80およびグリセロールで20mlに希釈した。生じた混合液をMonoQ550GLカラムに加えた。緩衝液Aで固定化された物質を洗浄し、その後0~100の緩衝液Bにイミダゾール、塩化カルシウム、ツイーン80、塩化ナトリウムおよびグリセロールの勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。収集した物質を、シチジンモノホスフェートN5アセチルノイラミン酸およびシアリルトランスフェラーゼと混合した。最終容量および濃度は、それぞれ256mlならびに046mgml、0132mgmlおよび54マイクロモルであった。混合液を摂氏32度で1時間放置し、その時間に混合液を緩衝液Aで20mlに希釈した。生じた混合液をMonoQ550GLカラムに加えた。緩衝液Aで固定化された物質を洗浄し、その後0~100の勾配を用いてそれをカラムから溶出させた。単離した分画中のタンパク含有量は、SDSPAGEゲルを用いて評価した。選択された分画をプールし、AmiconUltra遠心管を用いて濃縮した。濃縮後の容量は、05mlであった。生じた溶液を、水中のヒスチジン、塩化カルシウム、ツイーン80、塩化ナトリウムおよびショ糖からなる緩衝液で前平衡させたSuperose610300GLカラムに加えた。前述の緩衝液および06ml分の流動を用いて、混合液の構成成分を15カラム容量にわたり1mlのサイズの分画に分離した。選択された分画をプールした。Peg30KマレイミドによるY1680Cのペグ化試薬1BDDFVIIIN8Y1680C、1200μl、濃度80μgml、96μg、緩衝液20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MNaCl、1Mgグリセロール、pH73に054nmol2トリスカルボキシエチルホスフィン700等量00315μmモル9μg。1mgのTCEPを、1mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MGグリセロール、pH73、1MNaClに溶解させた。この溶液の109μlを用いた。330kDaPEGマレイミド、10等量、180μg。48mgの30kDaPEGマレイミドを、24mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MGグリセロール、pH73、1MNaClに溶解させた。この溶液の90μlを用いた。VivaPピュアスピンカラムおよびProspinのために用いた緩衝液緩衝液A20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mグリセロール、pH73緩衝液B20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mグリセロール、pH7325mMNaCl緩衝液C20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mグリセロール、pH7350mMNaCl緩衝液D20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mグリセロール、pH73200mMNaCl緩衝液E20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mグリセロール、pH731MNaClBDDFVIIIN8Y1680Cを室温で解凍し、5ml管にプールした。TCEP溶液の109μlの量を加えた。混合液を、5°Cで30分間インキュベートした。次に、TCEPを除去した反応混合液を、42mlの20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MGグリセロール、pH73で希釈し、塩濃度を31mMにした。溶液を、VivapPureQmaxiMに加えた。平衡化10mlの緩衝液Aを加え、2000gで2分間遠心回転させる試料ローディング希釈試料の4×11mlを加えた。各々について、2000gで2分間遠心回転させる。溶出緩衝液B10mlの緩衝液Bを加え、2000gで2分間遠心回転させる。溶出緩衝液C10mlの緩衝液Cを加え、2000gで2分間遠心回転させる。溶出緩衝液D10mlの緩衝液Dを加え、2000gで2分間遠心回転させる。溶出緩衝液E2×750μlの緩衝液Eを加え、2000gで1分間遠心回転させる。脱ブロックされたタンパク質は、緩衝液Eによる溶出からの第一分画で収集されたNanodropによる測定で103μg、137μgml。次に、NAP10カラム、および溶出剤として20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MGグリセロール、pH73、1MNaClを用いて、それを緩衝液交換した。全ての物質を含む1200μlの単一の分画を収集した。この分画に、30kDaPEGマレイミド溶液の90μlを加えた。反応混合液を5°Cで20時間インキュベートし、その後のSDSPAGEゲル分析によってFVIIILCバンドの強度の低下、および同時により高い分子量の新しいバンドの存在が示された。次に前記のように反応混合液を42mlの緩衝液20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1MGグリセロール、pH73で希釈し、VivapureQmaxiMスピンカラムに加え、緩衝液BからEを通して溶出させた。67μgの量のタンパク質誘導体を収集し、濃度89μgml、750μl、それをSuperdex20010300カラムに加え、ヒスチジン、CaCl2、ツイーン80、NaCl、ショ糖、pH7で溶出させた。95から12分間の保持時間で溶出した物質を収集し、一ペグ化BDDFVIIIN8Y1680C突然変異体、35μg、14μgmlを提供した。分画のSDSPAGE分析は、PEGがLCに結合している、化合物の正しい構造を示した。上記のプロトコルを用いて、一ペグ化BDDFVIIIY1680C化合物を調製した。この化合物では、PEG基はBDDFVIIIの1680位へ結合している。この特定の改変は、2つの同時作用を生むvWF結合の減少およびPEG媒介半減期の延長。発色性アッセイで測定されるFVIIICrFVIII化合物のFVIII活性は、以下の通りにCoatestSP試薬を用いて発色性FVIIIアッセイで評価されたrFVIII試料およびFVIII標準を、Coatestアッセイ緩衝液に希釈した。試料、標準および緩衝液陰性対照の50μlを、2反復で96穴マイクロタイタープレートに加えた。CoatestSPキットからの因子IXa因子X試薬、リン脂質試薬およびCaCl2を513で混合し、これの75μlをウェルに加えた。室温で15分間のインキュベーションの後、50μlの因子Xa基質S2765トロンビン阻害剤I2581ミックスを加え、反応体を室温で10分間インキュベートした後、25μlの1Mクエン酸、pH3を加えた。Spectramaxマイクロタイタープレートリーダーで415nmの吸光度を測定し、620nmの吸光度を参照波長として用いた。陰性対照の値を全ての試料から引き、プロットされた吸光度値対FVIII濃度の線形回帰によって較正曲線を作成した。HPLCで測定されたタンパク質濃度で試料の活性を割ることによって、比活性を計算した。軽鎖に対応するクロマトグラム中のピーク下面積を積算し、濃度がアミノ酸分析で測定された野生型未改変rFVIIIの平行分析で同じピークの面積と比較することによって、試料濃度を決定した。Oグリコペグ化rFVIII化合物については比FVIIIC活性が維持されたことを、Table1のデータは実証する。1段階クロットアッセイで測定されるFVIIICrFVIII化合物のFVIIICは、以下の通りに1段階FVIIIクロットアッセイでさらに評価したrFVIII試料およびFVIII標準を、HBSBSA緩衝液で約10Umlに希釈し、その後VWFを含んでいるFVIII欠損血漿で10倍に希釈した。試料は、その後HBSBSA緩衝液で希釈した。APTTクロット時間は、単一因子プログラムを用いるACL300RまたはACL5000機器で測定した。VWFを含むFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、およびSynthASil、InstrumentationLaboratoryをaPTT試薬として用いた。クロット機器では、希釈された試料または標準を、FVIII欠損血漿、aPTT試薬と37°Cで混合する。塩化カルシウムを加え、クロット形成までの時間を濁度で測定する。試料中のFVIIICは、FVIII標準の希釈溶液のクロット形成時間の標準曲線に基づいて計算される。Table1のデータは、凝固と発色活性との間の比を示す。FVIII欠損およびVWF欠損マウスでのrFVIIIの薬物動態rfviii変異体の薬物動態は、FVIII欠損マウスマウス、Taconicmbで育成で、またはvWF欠損マウスで評価された。vWFKOマウスは13の正常なFVIIICを有していたが、FVIIIKOマウスは検出可能なFVIIICを有していなかった。25グラムの概算重量を有する16~28週齢の雌雄混合群を用いた。マウスは、尾静脈からrFVIIIの単一のiv注射を受けた。コーティングされていないガラス毛管を用いて、投与から最高64時間後までの時点で眼窩叢から採血した。3つの試料を各マウスからとり、2つから4つの試料を各時点で収集した。クエン酸ナトリウムで血液を直ちに安定させ、4容のFVIIIcoatestsp緩衝液で希釈した後、4000×gで5分間の遠心にかけた。希釈血液から得られた血漿をドライアイスの上で冷凍し、80°Cで保存した。FVIIICは、実施例4に記載の発色性アッセイで測定した。winnonlinプロバージョン41ソフトウェアを用いて、ノンコンパートメント法によって薬物動態分析を実行した。Table2は、薬物動態パラメータの推定値を示す半減期、クリアランスおよび平均滞留時間。データは、ペグ化の結果クリアランスが減少し、半減期および平均滞留時間が増加したことを示す。BDDFVIIIはvWFKOマウスでは速く消去され、そのことは、vWFが循環中でFVIIIのための担体および安定剤であるとの一般に容認されている仮説に一致する。vWFKOマウスが10K~80Kのグリコペグ化BDDFVIIIをivで投与された場合、BDDFVIIIと比較して5~22倍の増加に対応する末端T12の増加が観察され、グリコペグ化がvWFへのFVIII結合の重要性を低下させたことを示唆している。結合したPEG部分の増加に従ってBDDFVIIIのvWFへの結合が減少することを示した、BDDFVIIIPEGvWF結合で得られた予備データにこれは一致する。興味深いことに、グリコペグ化は、FVIIIKOマウスと比較してvWFKOマウスでBDDFVIIIの曝露プロファイルをほとんど正常化した。結合したPEG基が大きいほど、FVIIIKOとvWFKOマウスとの間で薬物動態学の差はより小さい。グリコペグ化されたBDDFVIII変異体の半減期の間の比は、PEG基のサイズの増加にともなって減少した。グリコペグ化された変異体の曝露は、未改変のBDDFVIIIと比較してvWF依存性が低いことをこれは示す。vWF結合が欠損しているFVIII変異体を用いる場合、FVIIIKOマウスで類似した傾向を観察することができる。血友病AマウスのFeCl3によって誘導された損傷モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果マウスをケタミンVet100mgkg、キシラジンVet注射溶液56mgkgおよびアトロピン03mgkgの混合物で麻酔にかけ、体温を維持するために加熱パッドの上に置いた。その後頸動脈を露出させ、05PSBNanoprobeを動脈周囲に置いた。FeCl3損傷の誘導の5分前に、試験化合物を側部尾静脈に注射した。10FeCl3溶液に短時間浸した濾紙をプローブに隣接した動脈の周囲に置き、3分後に除去することによってFeCl3損傷を誘導した。FeCl3飽和濾紙の除去後、動脈を09NaClで3回洗浄し、最後に、流動プローブ中の空気を排気して血流の最適化された測定を確保するためにSurgilubeを適用した。FeCl3の除去後、最初の血流があまりに低い場合、または流動が測定不能の場合は、マウスを除外した。FeCl3飽和濾紙を除去してから25分間、ADinstrumentsからのソフトウェアChart5を用いて血流を記録した。データ分析特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPadPrismバージョン5を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P005は、統計的に有意であるとみなした。結果FeCl3損傷の後、正常に機能している凝固系を有するマウスの全ての血管は33分以内に閉塞し、閉塞までの平均時間は24±02分であった。FVIIIノックアウトマウスのいずれも、25分の観察時間中に閉塞しなかった。NNC012900009105の用量依存性は、閉塞までの時間を短縮したに対応する。閉塞までの時間は、ビヒクル処置動物と比較して5または10IUkgのいずれかによる処置の後、有意により短かった。Advateの類似した効果が観察され、AdvateとNNC012900009105との間で効果に統計的差はなかった。血友病Aマウスの尾処理出血モデルにおけるvWF結合能力が欠如しているFVIII変異体の止血効果マウスにペントバルビタールで麻酔をかけ、体温を維持するために加熱パッドの上に置いた。鋭いメスで尾部の先端の4mmを切断することによって、出血を誘導した。切断の10分前に、14mLの生理食塩水を含む試験管に尾を入れ、切断の5分前に、尾静脈注射によって試験化合物を5mLkgの量で投与した。血友病Aマウスおよび正常な凝固をもつ動物を、同じ量のビヒクルで処置した。動物を安楽死させた後に、30分間にわたって血液を収集した。血液減少は、ヘモグロビンの量を定量化することによって測定した。したがって、4000×で5分間の遠心によって赤血球を単離した。上清を廃棄し、ヘモグロビン試薬で細胞を溶解した。4000×gで5分間の遠心によって細胞片を除去した。試料を550nmで読みとり、ヘモグロビン総量を標準曲線から決定した。データ分析特記しない限りデータは平均±SEMで提示し、GraphPadPrismバージョン5を用いて分析した。2つの化合物の効果は、一元配置ANOVAを用いて、続いて多重比較のためのチューキーの検定を用いて比較した。P005は、統計的に有意であるとみなされた。結果FVIIIノックアウトマウスの尾部出血モデルにおけるAdvateの用量反応相関は、前に完全に調査されている。200IUkgのAdvateは血液減少および出血時間を正常化し、血液減少および出血時間のED50値はそれぞれ39および28IUkgであった。NNC012900009105の止血効果を試験するために、20および280IUkgの効果をAdvateの同じ用量と比較した。NNC012900009105は、ビヒクル処置動物と比較して、血液減少および出血時間を有意に低減した。AdvateとNNC012900009105との間でその効果の差は観察されなかった。Advateの20IUkgの効果は、以前の試験から予想されるよりも顕著であった。これは、Advateの実際に投与される活性の差および尾部出血方式の一般的変動に起因する合併効果による可能性が最も高い。したがって、両試験で20IUkgを投与することが意図されたが、投与溶液中のFVIII活性の分析は、活性が現在および以前の試験で意図されたものよりそれぞれ20高かったことおよび15低かったことを示した。しかし、現在の試験で両化合物は同等のFVIII活性で投与されたので、NNC012900009105およびAdvateが同等の効果を有するとの試験の全体的な結論をこれが変更することはない。vWFに結合しない血小板結合特性によるFVIII変異体の生成。抗GPIIaIIIB抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、AP3を、SMARTRACEcDNA増幅キットを用いてAP3抗体を発現するハイブリドーマ細胞から単離されたRNAから増幅した。2つのAP3鎖の可変領域の増幅のために用いたプライマーは、以下の通りであった重鎖汎用プライマーミックスA長い5ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT3短い5ctaatacgactcactatagggc3プライマー695gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg3軽鎖汎用プライマーミックスA5ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT3短い5ctaatacgactcactatagggc3プライマー3125gtctaccacaacacacgtgac3配列決定のためにZeroBluntTOPOPCRクローニングキットを用いてpCR4ベクターに可変領域をクローニングした。その後、可変領域をpTT5ベースの発現ベクター中のネズミIgG1枠組みにサブクローニングした。完全長AP3abをコードする2つの鎖を、Hek2936E細胞で一時的に発現させた。静止中の血小板への完全長抗体の結合は、FACS分析によって確認された。AP3抗体の軽鎖および重鎖の可変領域をコードするDNA配列に基づき、AP3abの2つの単鎖抗体フォーマットを生成した。AP3abの2つの単鎖フォーマットを、その後pTT5ベースの発現ベクターにサブクローニングした。静止中の血小板のGPIIaIIIBへの2つの単鎖抗体の結合は、FACS分析によって確認された。標準の分子生物学方法を用いてAP3LCHCscFvまたはAP3HCLCscFvをBDDFVIIIのaaR761とQ1686との間に挿入することによって、AP3LCHCscFvまたはAP3HCLCscFvとBドメイン欠失a3ドメイン欠失FVIIIとの間の融合タンパク質を作製した。配列番号11AP3LCHCscFVFLAGDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDK配列番号12AP3HCLCscFVFLAGQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRDYKDDDDKこれらの構築物に基づいて、変異体AP3scFvLCHCC34SS248Cを、標準の分子生物学方法を用いて生成することができた。Nプロピオニルアミノ10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の生成工程13プロピオン酸25ジオキソピロリジニル1イルエステル3マレイミドプロピオン酸をテトラヒドロフランに溶解した。2スクシンイミド1133テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびエチルジイソプロピルアミンをその後加えた。NNジメチルホルムアミドを加えた。ゆっくりと回転する間、反応混合液を室温で撹拌した。混合液を2分間撹拌した。NNジメチルホルムアミドを加えた。混合液を室温で25時間撹拌した。それをジクロロメタンで希釈し、その後硫酸水素ナトリウムの10水溶液、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液および水で洗浄した。それを硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、120gの3プロピオン酸25ジオキソピロリジニル1イルエステルを与えた。MSmz289、MNaのために必要とされる2891HNMRδ282302394、673。工程2NプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸を、テトラヒドロフランおよびジクロロメタンの混合物に溶解した。ジクロロメタン中の3プロピオン酸25ジオキソピロリジニル1イルエステルの溶液を加えた。エチルジイソプロピルアミンを加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。ジクロロメタンおよびエチルジイソプロピルアミンを加えた。アミノメチル化ポリスチレン樹脂を加えた。混合液を室温で1時間ゆっくりと撹拌した。樹脂を濾過によって除去した。25°Cの浴温で溶媒を真空中で除去した。残基をジクロロメタンに溶解した。エーテルを加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で2時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させ、標記化合物の38mgを与えた。DMSOd6での1HNMRスペクトルは、マレイミド基の存在を示した。FVIIIへのAP3scFvLCHCC34SS248Cのコンジュゲーション工程1AP3scFVC24SS248CのCys248へのNプロピオニルアミノ10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の結合pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、1Mのグリセロールからなる緩衝液中のトリスホスフィンハイドロクロリドの溶液を、でpH75に調整した100mMHEPESおよび150mMNaClの溶液中の、そのC末端にFlagタグを有し、余分のCysがSS橋を通して248位のシステインに結合したAP3scFvLCHCC34SS248Cの053mgmlの濃度の溶液に加えた。反応混合液を20°Cで静かに振盪した。それを2つの部分に分けた。pH70に調整した25mMHEPESの緩衝液を用いて、その各々をPD10カラムに加えた。カラムの溶出液を合わせた。pH70に調整した25mMHEPESの緩衝液中のNプロピオニルアミノ10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の溶液を、タンパク質の溶液に加えた。反応混合液を20°Cで4時間静かに振盪した。それを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10°Cで10分間の4000rpmの超遠心にかけた。混合液を精製までフリーザーに保存した。精製のために、混合液を解凍した。それを、1ml分の流動の直径16mmおよび長さ60cmの床サイズを有するSuperdex200ゲル、およびpH80に調整した25mMトリスおよび150mMNaClの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールして、161mgの所望のタンパク質を与えた。SDSPAGEゲルは、予想通りであった。工程2pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、150mMNaCl、002ツイーン80および1Mのグリセロールからなる緩衝液中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液を、カットオフが10kDaのAmicon超遠心装置に入れた。pH80に調整した25mMトリスおよび150mMNaClの溶液中のAP3scFvC24SS248CのCys248へのNプロピオニルアミノ10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の給合生成物の溶液を加え、pH607に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、10グリセロール、002ツイーン80、500mMNaClからなる緩衝液をその後加えた。混合液を、10°Cで20分間の4000rpmの超遠心にかけた。FVIIIの残りの量は、0800mlまたは125mgmlであった。Aウリファシエンスからのシアリダーゼの溶液およびST3GalIの溶液をその後加えた。反応混合液を32°Cで1分間静かに振盪し、その後32°Cで18時間放置した。それを精製までフリーザーで保存した。反応混合液を解凍した。それを2つの部分に分け、それぞれを、030ml分の流動の直径10mmおよび長さ300mmの床サイズのSuperose6ゲル、および溶離液としてpH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、150mMNaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む両方のランの全ての分画をプールした。それらをカットオフ10kDaのAmicon超遠心装置に入れ、10°Cで18分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、150mMNaClおよび1Mのグリセロールからなる緩衝液中のCMPNアセチルノイラミン酸の溶液、およびST3GalIIIの033mgml溶液をその後加えた。反応混合液を300rpmで静かに振盪し、その後精製までフリーザーで保存した。反応混合液を2つの部分に分けた。その各々を、000045mmフィルターに通して濾過した。CNBrで活性化の後にF25抗体を結合させておいた、直径5mmおよび長さ5cmの床サイズのセファロースカラムにそれらを加えた。F25は、FVIIIの公知の抗体である。負荷後、pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、150mMNaClおよび1Mグリセロールからなる緩衝液によって、カラムを06ml分の流動で3CVについて洗浄した。その後、pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80および650mMNaClからなる緩衝液によって、それを06ml分の流動で3CVについて洗浄した。最後に、pH735に調整した、50vvエチレングリコール水溶液中の20mMイミダゾール、10mMCaCl2、002ツイーン80、25MNaClからなる緩衝液によって、化合物を6CVの範囲内で01ml分の流動で溶出させた。所望の生成物を含む両方のランの分画をプールした。それらを10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、10°Cで14分間の4000rpmの超遠心にかけた。残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、17mMCaCl2、001ツイーン80、03MNaCl、88mMショ糖からなる緩衝液を用いる、050ml分の流動の、直径10mmおよび長さ30cmの床サイズのSuperose6材料でのサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。適する純度の所望の化合物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを、9°Cで12分間の4000rpmの超遠心にかけた。1446のモル吸光度を用いて、収量は00176mgのFVIIIへのAP3scFvLCHCC34SS248Cのコンジュゲートであると判明した。非還元条件下のSDSPAGEゲルによる分析は、予想通りであった。N10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の生成工程1N10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸NO25シチジリルξノイラミン酸を、pH89に調整した50mMトリスからなる緩衝液に溶解した。現在のpHを検査し、01N塩酸の添加によってpH89に調整した。THFを加えた。310kDaペギルプロピオン酸Nヒドロキシスクシンイミジルエステルの最終的な量の約半分を加えた。反応混合液を室温で撹拌した。1時間の後、310kDaペギルプロピオン酸Nヒドロキシスクシンイミジルエステルの第二の半分を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。THFは、25°Cの浴温で真空中で除去した。残りの混合液を濾過し、直径26mmおよび長さ10cmの床サイズのG25ゲルを7ml分の流動で用いて、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の化合物を含む分画をプールして凍結乾燥し、N10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸を含む453mgの物質を与えた。DMSOd6で実施された1HNMRスペクトルは、シチジリル部分ならびにフルオレニル9イルメトキシカルボニル部分の存在を示した。材料をフリーザーで保存した。この反応を、1gの310kDaペギルプロピオン酸Nヒドロキシスクシンイミジルエステルおよび90mgのO25シチジリルξノイラミン酸で繰り返した。炭酸水素アンモニウムの50mM水溶液中の、アセトニトリル中の炭酸水素アンモニウムの5mM水溶液からなる混合液の30~50の勾配を用いて、直径2cmのHPLCC4カラムで精製を実施した。所望の化合物を含む分画を収集して凍結乾燥し、288mgの所望の化合物を与えた。1HNMRスペクトルは、上記の実験で見出された1HNMRスペクトルに一致した。工程2NプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸N10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸を、NNジメチルホルムアミドに溶解した。ピペリジンを加えた。透明溶液を室温で20分間撹拌した。エーテルを加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で15時間放置した。沈殿を濾過によって単離した。それをジクロロメタンに溶解した。エチルジイソプロピルアミンを加えた。エーテルを加えた。形成された沈殿を加齢させるために、混合液を室温で16時間放置した。沈殿を濾過によって単離し、真空中で乾燥させた。DMSOd6での1HNMRスペクトルは9Hフルオレン9イルメトキシカルボニル基のシグナルを示さなかったが、シチジリル部分に帰属されるシグナルが見出された。物質をフリーザーで保存した。工程34ホルミル安息香酸25ジオキソピロリジン1イルエステルトリエチルアミンおよび2スクシンイミド1133テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを、NNジメチルホルムアミド中の4ホルミル安息香酸の溶液に連続して加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。それを酢酸エチルで希釈し、硫酸水素ナトリウムの10水溶液で洗浄した。水相を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を塩水および水の混合液で洗浄した。合わせた有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エチルから再結晶させて、189gの4ホルミル安息香酸25ジオキソピロリジン1イルエステルを与えた。1HNMR。δ295804、8321015。工程4NプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸を、ジクロロメタンに溶解した。エチルジイソプロピルアミンを溶液に加えた。ジクロロメタン中の4ホルミル安息香酸25ジオキソピロリジン1イルエステルの溶液を加えた。反応混合液を室温で16時間撹拌した。溶媒を25°Cの浴温で真空中で除去した。残渣を炭酸水素アンモニウムの25mM水溶液に懸濁した。非可溶性物質を濾過によって除去した。それを5つの部分に分けた。その各々を、25mM炭酸水素アンモニウムの緩衝液を用いて、7ml分の流動による直径26mmおよび長さ10cmのカラム上のG25を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の物質を含む全ての分画を合わせ、凍結乾燥した。DMSOd6での1HNMRスペクトルは、アルデヒド部分およびシチジリル部分の両方の存在を示した。得られた物質をフリーザーで保存した。OグリカンでのFVIIIへのアブシキシマブのコンジュゲーション工程1アブシキシマブの1つのN末端へのN10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸のコンジュゲーション市販のアブシキシマブの溶液を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH74に調整した25mMHEPESからなる緩衝液を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10°Cで10分間実行した。pH74に調整した25mMHEPESからなる緩衝液を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10°Cで10分間実行した。pH74に調整した25mMHEPESからなる緩衝液を加えた。超遠心を4000rpmにおいて10°Cで10分間実行した。065mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH74に調整した25mMHEPESからなる緩衝液を加えた。pH70に調整した25mMHEPESからなる緩衝液中のN10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸の溶液を加えた。反応混合液を20°Cで3分間、300rpmで静かに振盪した。新たに調製されたナトリウムシアノボロハイドライドの10M水溶液を加えた。反応混合液を20°Cにおいて300rpmで静かに振盪した。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部を加えた。1時間後、ナトリウムシアノボロハイドライド溶液の別の一部を加えた。溶液を20°Cで16時間、300rpmで静かに振盪した。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、18°Cで10分間の4000rpmの超遠心にかけた。0360mlの残りの溶液を濾過し、1ml分の流動の16mm×60cmの床サイズを有するSuperdex200ゲルでの、pH80に調整した25mMトリス、150mMNaClの緩衝液を溶離液として用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画を合わせて2つのバッチにした。それらのバッチの各々を、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それらを10°Cで10分間の4000rpmの超遠心にかけて、それぞれ267mgおよび327mgを与えた。定量化のために、1094のモル吸光度をNanodrop分光光度計で用いた。SDSPAGEによる生成物の分析は、アブシキシマブの1つのN末端とのN10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸のコンジュゲートの予想と一致した。工程2FVIIIのOグリカンへのアブシキシマブのコンジュゲーションpH735に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、150mMNaCl、002ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液を、pH735に調整した20mMイミダゾール、10mMCaCl2、150mMNaCl、002ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液中の、重鎖のC末端にSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRの残留Bドメイン配列を有するBドメイン欠失FVIIIの溶液に加えた。pH80に調整した25mMトリス、150mMNaClからなる緩衝液中の、アブシキシマブの1つのN末端とのN10kDaペギルプロピオニルアミノアセチルO25シチジリルξノイラミン酸のコンジュゲートの溶液を加えた。溶液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10°Cで20分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH735に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、150mMNaCl、002ツイーン80および1Mグリセロールからなる緩衝液を加えた。溶液を10°Cで30分間の4000rpmの超遠心にかけ、14mlの容量の溶液が残された。Aウリファシエンスのシアリダーゼの溶液およびST3GalIの溶液をその後加えた。反応混合液を32°Cで15分間静かに振盪した。その後、反応混合液を32°Cで205時間静置させた。反応混合液を10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。それを、10°Cで15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0300mlの残りの溶液は、pH7に調整した10mMヒスチジン、17mMCaCl2、001ツイーン80、03MNaCl、88mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、05ml分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。pH607に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、10グリセロール、002ツイーン80、500mMNaClからなる緩衝液を加えた。溶液を、10°Cで15分間の4000rpmの超遠心にかけた。pH607に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、10グリセロール、002ツイーン80、500mMNaClからなる緩衝液を加えた。溶液を、10°Cで15分間の4000rpmの超遠心にかけた。0220mlの残りの溶液をプラスチック反応器に入れた。pH607に調整した20mMヒスチジン、10mMCaCl2、10グリセロール、002ツイーン80、500mMNaClからなる緩衝液中の市販のCMPNeuNAcの溶液を加えた。反応混合液を32°Cで1時間、300rpmで静かに振盪した。それを、pH7に調整した10mMヒスチジン、17mMCaCl2、001ツイーン80、03MNaCl、88mMショ糖からなる緩衝液を溶離液として用い、05ml分の流動の、10mm×300mmの床サイズのSuperose6材料を用いるサイズ除外クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含む分画をプールし、10kDaのカットオフのAmicon超遠心装置に入れた。プールを10°Cで5分間の4000rpmの超遠心にかけ、OグリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物の00358mgの0275mlの溶液を与えた。定量化のために、1315のモル吸光度をNanodrop分光光度計で用いた。SDSPAGE分析は、OグリカンでのFVIIIとのアブシキシマブのコンジュゲーション生成物のSDSPAGEの予想に一致した。