"細胞抽出用試薬、及びmicroRNA用標識試薬又は標識化microRNAを含み、さらに当該microRNA用標識物質との反応試薬を含む、microRNAの標的遺伝子検出用キット。細胞抽出用試薬が、002~10vvの非イオン性界面活性剤を含み、pH73~80である、請求項1に記載のmicroRNAの標的遺伝子検出用キット。細胞抽出用試薬に、さらにRNase阻害剤及び/又はプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項2に記載のmicroRNAの標的遺伝子検出用キット。細胞抽出用試薬が、25mMTris60mMKCl25mMEDTA005vvNP40RNase阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項1~3のいずれか1に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出用キット。microRNA用標識物質が、ビオチンを含み、当該標識用物質との反応試薬がアビジンを含む、請求項1~4のいずれか1に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出用キット。さらに、逆転写酵素を含む、請求項1~5のいずれか1に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出用キット。細胞抽出液に標識化microRNAを加え、当該標識化microRNAと前記細胞抽出液中に含まれるRNAと反応させた後、当該標識化microRNAを回収することを特徴とする、microRNAの標的遺伝子の検出方法。以下の工程を含む、請求項7に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出方法:1採取した細胞又は組織を、細胞抽出用試薬で処理し、細胞抽出液を調製する工程;2標識化した特定のmicroRNAを、前記1の工程で調製した細胞抽出液に加える工程;3前記1の工程で調製した細胞抽出液中に含有されるmRNAと、前記標識化した特定のmicroRNAを反応させる工程;4前記1の工程で調製した細胞抽出液中に含有される特定のmRNAと前記標識化した特定のmicroRNAとの複合体を形成させる工程;5前記microRNA標識物質を、標識用物質との反応試薬を用いて反応させ、当該標識化microRNAを回収することで、前記4で形成した複合体を回収する工程。標識化microRNAがビオチン化microRNAであり、ビオチンとアビジンを反応させ、当該ビオチン化microRNAを回収する、請求項7又は8に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出方法。さらに、前記5において回収した複合体から、標識化microRNAと反応したmRNAを回収し、逆転写酵素を用いて、標識化microRNAの標的遺伝子に対応するcDNAを作製する工程を含む、請求項8又は9に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出方法。前記作製したcDNAを分析する工程を含む、請求項10に記載のmicroRNAの標的遺伝子の検出方法。本発明は、miRNAの標的遺伝子を検出するための検出用キットを提供することを課題とする。さらには、細胞にベクターを介して遺伝子の導入操作を行なう必要なく、簡便にmiRNAの標的遺伝子を検出する方法を提供することを課題とする。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、緩和な条件で細胞抽出液を作製し、細胞抽出液に標識したmiRNAを添加し、標識物質を回収することで、容易にmiRNAの標的遺伝子に対応するmRNA以下、標的遺伝子に対応するmRNAを、単に標的遺伝子mRNAという。を回収し得ることを見出した。そこで、細胞抽出用試薬、及びmiRNA用標識試薬又は標識化miRNAを含み、さらに当該miRNA用標識物質との反応試薬を含む、miRNAの標的遺伝子検出用キットからなる本発明を完成した。すなわち本発明は、以下よりなる。1.細胞抽出用試薬、及びmiRNA用標識試薬又は標識化miRNAを含み、さらに当該miRNA用標識物質との反応試薬を含む、miRNAの標的遺伝子検出用キット。2.細胞抽出用試薬が、002~10vvの非イオン性界面活性剤を含み、pH73~80である、前項1に記載のmiRNAの標的遺伝子検出用キット。3.細胞抽出用試薬に、さらにRNase阻害剤及び/又はプロテアーゼ阻害剤を含む、前項2に記載のmiRNAの標的遺伝子検出用キット。4.細胞抽出用試薬が、25mMTris60mMKCl25mMEDTA005vvNP40RNase阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含む、前項1~3のいずれか1に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出用キット。5.miRNA用標識物質が、ビオチンを含み、当該標識用物質との反応試薬がアビジンを含む、前項1~4のいずれか1に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出用キット。6.さらに、逆転写酵素を含む、前項1~5のいずれか1に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出用キット。7.細胞抽出液に標識化miRNAを加え、当該標識化miRNAと前記細胞抽出液中に含まれるRNAと反応させた後、当該標識化miRNAを回収することを特徴とする、miRNAの標的遺伝子の検出方法。8.以下の工程を含む、前項7に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出方法:1採取した細胞又は組織を、細胞抽出用試薬で処理し、細胞抽出液を調製する工程;2標識化した特定のmiRNAを、前記1の工程で調製した細胞抽出液に加える工程;3前記1の工程で調製した細胞抽出液中に含有されるmRNAと、前記標識化した特定のmiRNAを反応させる工程;4前記1の工程で調製した細胞抽出液中に含有される特定のmRNAと前記標識化した特定のmiRNAとの複合体を形成させる工程;5前記miRNA標識物質を、標識用物質との反応試薬を用いて反応させ、当該標識化miRNAを回収することで、前記4で形成した複合体を回収する工程。9.標識化miRNAがビオチン化miRNAであり、ビオチンとアビジンを反応させ、当該ビオチン化miRNAを回収する、前項7又は8に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出方法。10.さらに、前記5において回収した複合体から、標識化miRNAと反応したmRNAを回収し、逆転写酵素を用いて、標識化miRNAの標的遺伝子に対応するcDNAを作製する工程を含む、前項8又は9に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出方法。11.前記作製したcDNAを分析する工程を含む、前項10に記載のmiRNAの標的遺伝子の検出方法。本発明のmiRNA標的遺伝子検出用キットを用いると、特定のmiRNAに対する標的遺伝子mRNAを回収することができる。さらには、標的遺伝子mRNAのみならず、miRNAと標的遺伝子mRNAとの複合体形成に関わるmRNA以外のRNAや、各組織、各細胞に特異的に発現し、miRNAの反応に関わっている蛋白を回収することにも利用できる。この標的遺伝子mRNAの回収技術に、cDNAの合成ステップやクローニングステップ、検出ステップを組み合わせることで、標的遺伝子のクローニングや標的遺伝子の分析同定を行うことができる。また、本発明のmiRNA標的遺伝子検出用キットを用いると、レトロウイルス等のベクターを使用する必要がないため、取り扱いが容易であり、1回の回収操作で標的遺伝子mRNAを回収可能なことから、標的遺伝子mRNAを従来技術に較べて安定な状態で回収することができる。さらに、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出用キットは、培養細胞に限らず、様々な組織から得た検体に対して使用することができ、特定のmiRNAの標的遺伝子mRNAを回収することができる為に、各種の癌組織や疾病組織、実験動物、植物など様々な分野から取得した検体に応用が可能である。その結果、様々な疾病の原因となるmiRNAの真の標的遺伝子を容易に同定することが可能となり、その基盤研究に基づく新しい分子標的薬の開発につながるものと期待される。本発明は、miRNAの標的遺伝子検出用キットに関し、さらにはmiRNAの標的遺伝子の検出方法に関する。本明細書では、まずはじめにmiRNAの標的遺伝子の検出方法について説明し、その後miRNAの標的遺伝子検出用キットについて説明する。本発明のmiRNAの標的遺伝子の検出方法は、採取した細胞を緩和な条件で抽出処理した細胞抽出液に、標識化miRNAを加え、当該標識化miRNAと前記細胞抽出液中に含まれるRNAと反応させた後、当該標識化miRNAを回収することによる。具体的には、以下の工程を含む、miRNAの標的遺伝子の検出方法による。1採取した細胞又は組織を、細胞抽出用試薬で処理し、細胞抽出液を調製する工程;2標識化した特定のmiRNAを、前記1の工程で調製した細胞抽出液に加える工程;3前記1の工程で調製した細胞抽出液中のRNAと前記標識化した特定のmiRNAを反応させる工程;4前記1の工程で調製した細胞抽出液中の特定のRNAと前記標識化した特定のmiRNAとの複合体を形成させる工程;5前記miRNA標識物質を、標識用物質との反応試薬を用いて反応させ、当該標識化miRNAを回収することで、前記4で形成した複合体を回収する工程。本発明において、細胞抽出液を作製するための検体としては、細胞が含まれるのであればよく、特に限定されない。例えば、培養細胞であってもよいし、ヒトやヒト以外の動物より採取した組織や細胞であってもよい。また、植物から採取した組織や細胞であってもよい。動物の種についても特に限定されず、miRNAとその標的遺伝子mRNAが含まれる可能性がある組織又は細胞であればよい。例えば、ヒトから採取した組織や細胞の例としては、具体的には血液、尿、唾液、皮膚、生検試料、各種臓器から取得される組織や細胞などが挙げられる。例えば、各種臓器から取得される組織として、術後得られる組織などが挙げられる。細胞抽出液は、上記により採取した細胞や組織等の各種検体を、細胞抽出用試薬で処理することにより作製することができる。ここにおいて、miRNAとその標的遺伝子mRNAは、通常は生きている細胞内で反応することから、可能な限り生きている状態に近い状態の細胞抽出液を作製することが重要である。従って、緩和な条件で細胞抽出液を作製することが必要であり、そのような細胞抽出用試薬を用いることが必要である。上記の細胞抽出用試薬として、002~10vv、好ましくは005~05vv、より好ましくは005~01vvの非イオン性界面活性剤を含み、pH73~80、好ましくはpH73~75、さらに好ましくはpH73~74の試薬を用いるのが好適である。さらには、RNase阻害剤及び/又はプロテアーゼ阻害剤を含んでいてもよい。最も好ましい細胞抽出用試薬の組成として、25mMTris60mMKCl25mMEDTA005vvNP40RNase阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含む試薬が挙げられる。また、細胞抽出液を作製する際の処理温度は、細胞内に含まれるプロテアーゼの活性が低い温度、例えば0~10°C、好ましくは0~6°C、より好ましくは、0~4°Cで処理するのが好適である。例えば、氷上で処理するのが好適である。上記採取した細胞や組織等の各種検体を細胞抽出用試薬で処理する前に、PBSや生理食塩液等の適当な溶液で、細胞や組織等の各種検体を洗浄したり、物理的処理により破砕処理を行うなどの処理を施すことができる。また、上記細胞抽出用試薬で処理した後、攪拌や振とう、超音波処理などの物理的処理や、遠心処理、組織に適した他の界面活性剤の追加処理などを適宜行なってもよい。本発明の検査方法において、目的とする特定のmiRNAの標的遺伝子mRNAを回収するために、miRNAを標識することが必要である。本明細書の標識物質としては、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン等を挙げることができる。特にビオチン等で標識するのが好適である。miRNAの標識方法としては、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる標識方法を適用することができ、特に限定されない。この場合の標識物質は、リンカーを介して標識してもよいし、リンカーを介さなくてもよい。例えば、miRNAの5末端をリン酸化し、3末端をビオチン化するのが好適である。miRNAの3末端とビオチン等の標識物質の間に、チオール基SSを含んでいてもよい。miRNAを標識するために、市販の標識用試薬キットを使用してもよい。後述する本発明のmiRNAの標的遺伝子検出用キットに、miRNA用標識試薬を含めるのが好適である。また、後述するように、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出用キットに、特定のmiRNAについて、既に標識したもの、即ち標識化miRNAを含めてもよい。この場合は、本発明の検出方法において標識化miRNAを利用することができるため、miRNAの標識化工程を省略することができる。さらに、本発明のmiRNAの標的遺伝子の検出方法において、標識化した特定のmiRNAを細胞抽出液中に含まれる標的遺伝子mRNAと反応させることが必要である。より確実に反応を進めるために、標識化miRNAセンス鎖は、アンチセンス鎖とともに二本鎖RNAとすることができる。当該特定のmiRNAのアンチセンス鎖を作製し、センス鎖とアンチセンス鎖を、高温、例えば60~75°C、好ましくは70°C付近で保温した後、自然冷却又は恒温装置による冷却によりアニールさせて、二本鎖とすることができる。二本鎖のmiRNAの場合は、両鎖の3末端側の数塩基分、例えば2塩基を突出するように設計することができる。また、センス鎖とアンチセンス鎖は、ミスマッチ構造を含んでいてもよい。センス鎖が細胞抽出液中の標的遺伝子mRNARICS複合体に結合できるようにするため、アンチセンス鎖の一部であるガイド鎖がセンス鎖から分離しやすいように、ミスマッチを含んでいるのが好適である。次に、標識化した特定のmiRNAを、前記作製した細胞抽出液に加える工程;当該細胞抽出液中のRNAと前記標識化した特定のmiRNAを反応させる工程;及び当該細胞抽出液中の特定のRNAと前記標識化した特定のmiRNAとの複合体を形成させる工程について説明する。本工程は、一連の流れにおいて実施される。上記標識化した特定のmiRNAを細胞抽出液に加え、適当な温度及び時間、例えば約4°Cで、10~120分、好ましくは20~60分、より好ましくは30分程度反応させた後、さらに20~35°C、好ましくは30°Cで、30~180分、好ましくは30~120分、より好ましくは40~60分反応させることで、前記標識化した特定のmiRNAと細胞抽出液中のmRNAとを反応させることができ、さらに前記標識化した特定のmiRNAと当該細胞抽出液中に存在する標的遺伝子mRNAとの複合体標識miRNA標的遺伝子mRNA複合体を形成させることができる。この過程で、標識化miRNAは、RISC複合体に取り込まれ、二本鎖miRNAのアンチセンス側の一部であるガイド鎖が、センス鎖から離れて成熟miRNAとなり、標的遺伝子mRNAが、miRNARISC複合体に結合すると考えられる。前記形成したmiRNAと標的遺伝子mRNAの複合体標識miRNA標的遺伝子mRNA複合体を回収する工程について説明する。前記標識化miRNAに係る標識物質を捕捉することで、当該複合体を回収することができる。例えば、標識物質がビオチンの場合には、固相に固定したアビジン化合物、例えばストレプトアビジンと反応させることで、ビオチン化miRNAと当該ビオチン化miRNAの標的遺伝子mRNAとの複合体を回収することができる。ストレプトアビジンを固定した固相としては、ビーズ、メンブレン、ガラススライド又はマイクロプレートであってもよい。固相の素材は特に限定されないが、具体的にはアガロースやポリメタクリル酸メチルなどのプラスチック、ガラスなどが挙げられる。また、マイクロビーズとしては、磁性ビーズであってもよい。ストレプトアビジンを固定したマイクロビーズを用いることで、当該ビーズを回収することで、ビオチン化miRNAを含む複合体を回収することができる。また、磁性ビーズを用いる場合は、粒子径や物理学的性質を適宜選択することで非特異反応を抑制することができる。例えば、粒子径については10μmと28μmの場合では、10μmのほうが非特異反応が大きい傾向が認められ、親水性の磁性ビーズでは、疎水性磁性ビーズに比べて非特異反応が大きい傾向が認められる。マイクロビーズ等の固相と共に回収したビオチン化miRNAは、自体公知の方法でストレプトアビジンとビオチン化miRNAを含む複合体を分離することで、ビオチン化miRNAを含むビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を回収することができる。ストレプトアビジンとビオチン化miRNAを含む複合体を分離は、例えば高濃度ビオチン処理を行ってもよい。miRNAの3末端とビオチン等の標識物質の間に、チオール基SSを含む場合は、還元剤処理によってSS結合を切断することによってもよい。ストレプトアビジンとビオチン化miRNAを含む複合体を分離する際に、非特異反応を軽減化させるために、洗浄液の組成等を適宜選択することができる。例えば、高塩濃度の洗浄液を用いることで、非特異反応を軽減化することができる。100mM以上、好ましくは250mM、より好ましくは400mM以上の塩濃度の洗浄液を用いることで、非特異反応を抑制することができる。回収した標識miRNA標的遺伝子mRNA複合体を、以降PullDown複合体という場合もある。さらに、標識miRNA標的遺伝子mRNA複合体から、標的遺伝子mRNAを分離する方法は、一般的なRNAの抽出方法を適用することができる。RNAの抽出方法は自体公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には、以下の方法が挙げられる。回収された複合体に、酸性グアニジンフェノールクロロホルムAcidGuanidiniumPhenolChloroform法などのRNA抽出溶液を加え、蛋白を変性させて分離することができる。又は、市販のRNA抽出溶液ISOGENNipponGene社、TRIzolInvitrogen社、RNAzolコスモバイオ社、QIAzolQIAGEN社などを使用してもよい。例えば、クロロホルムを添加後、約4°Cで遠心処理し、RNAを含む上清を得ることができる。上清にイソプロピルアルコールを加えてエタノール沈殿を行い、約4°Cで遠心処理することにより標的遺伝子mRNAを分離することができる。上記により回収した標的遺伝子mRNAから、逆転写酵素を用いて、自体公知の方法によりcDNAを作製することができる。作製した標的遺伝子のcDNAを利用し、1標的遺伝子を増幅可能なプライマーを用いて、PCR法等の遺伝子増幅方法により標的遺伝子を増幅する、2直接標的遺伝子の配列を読む、32本鎖cDNAに変換後クローニングして標的遺伝子cDNAを回収する、4蛍光標識を施しアレイ解析のプローブとして使用する、などができる。本発明のmiRNAの標的遺伝子の検出方法は、標的遺伝子を同定するのみならず、標的遺伝子をクローニングすることも含まれる。標的遺伝子をクローニングすることで、標的遺伝子を分析することもできるし、標的遺伝子より合成された蛋白質の機能を解析することもできる。本発明において、cDNAを分析するとは、cDNAをPCR等の手法を用いて遺伝子増幅し、増幅産物を分析したり、cDNAの塩基配列そのものを分析することなどが含まれる。本発明は、上記miRNAの標的遺伝子の検出のために提供されるmiRNA標的遺伝子検出用キットをも提供する。当該キットには、少なくとも細胞抽出用試薬、及びmiRNA用標識試薬又は標識化miRNAを含み、さらに当該miRNA用標識物質との反応試薬を含む。上記キットに含まれる細胞抽出用試薬は、002~10vv、好ましくは005~05vv、より好ましくは005~01vvの非イオン性界面活性剤を含み、pH73~80、好ましくはpH73~75、さらに好ましくはpH73~74の試薬を用いるのが好適である。さらには、RNase阻害剤及び/又はプロテアーゼ阻害剤を含んでいてもよい。最も好ましい細胞抽出用試薬の組成として、25mMTris60mMKCl25mMEDTA005vvNP40RNase阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤を含む試薬が挙げられる。RNase阻害剤は、80~1000Unitml、好ましくは約250Unitml程度含まれていればよい。また、プロテアーゼ阻害剤は、1~100μgml、好ましくは1~5μgml程度含まれていればよい。プロテアーゼ阻害剤として、例えば2μgmlアプロチニンAprotinin、2μgmlロイペプチンLeupeptin、2μgmlペプスタチンAPepstatinA、100μgmlPMSFPhenylmethylsulfonylfluorideのいずれかを適宜使用することができ、他にアンチパインAntipain、TLCK、TPCK、E64、ベスタチンBestatin等などのプロテアーゼ阻害剤を用いてもよい。上記キットに含まれる試薬のうち、標識に係る試薬がmiRNA用標識試薬の場合は、当該miRNA用標識試薬を用いて目的とする特定のmiRNAを標識することができる。この場合、特定のmiRNAは、キットに含まれないものであってもよく、自由に所望のmiRNAを標識化することができる。従って、当該キットは、幅広く所望のmiRNAに適用することができる。一方、標識に係る試薬は、目的とする特定のmiRNAが既に標識化された標識化miRNAを含む試薬であってもよい。この場合は、キットに含まれるmiRNAが既に特定されているので、標識化されたmiRNAに対する標的遺伝子を検出できるのみであるが、独自で標識化処理を省略できる点で、便利である。ここで、標識物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチドタグに使用される化学物質などが挙げられるが、使用の容易さを鑑みると、ビオチンやジゴキシゲニンが好適であり、特に好適にはビオチンが挙げられる。上記キットに含まれるmiRNA用標識物質との反応試薬は、標識物質を検出可能な試薬であればよい。例えば標識物質がビオチンの場合は、反応試薬にはアビジン化合物、具体的にはストレプトアビジンを含むのが好適である。ビオチンとストレプトアビジンは物理的に結合することで、ビオチン化した物質を捕捉することができる。例えばストレプトアビジンを固相に固定することで、ビオチン化した物質を固相に捕捉することができる。より具体的には、アガロースビーズや磁性ビーズなどの固相にストレプトアビジンを固定し、当該ビーズを回収することでビオチン化した物質を回収することができる。本発明のmiRNA標的遺伝子検出用キットには、さらにDNA分解酵素や逆転写酵素も含めてもよい。上記のキット構成物を用いて標的遺伝子mRNAを回収し、混入しているDNAをDNA分解酵素で分解した後に、当該標的遺伝子mRNAに逆転写酵素を作用させることで、標的遺伝子のcDNAを作製することができる。作製したcDNAは、標的遺伝子のクローニングに使用してもよいし、PCR等の遺伝子増幅処理を行なってもよいし、cDNAの塩基配列そのものを分析してもよい。なお、本発明のmiRNAの標的遺伝子を検出するに際し、目的とする特定のmiRNAについて事前に標的遺伝子予測ソフトによる標的遺伝子絞り込みを行なってもよいし、ルシフェラーゼレポーター解析による絞込みを行なった後に、本発明の方法によりmiRNAの標的遺伝子を検出してもよい。また、上記絞込みを行なわずとも、本発明の方法によりmiRNAの標的遺伝子mRNAを容易に回収可能である。上記説明したように本発明のmiRNAの標的遺伝子の検出方法は、標的遺伝子を同定するのみならず、標的遺伝子をクローニングすることも可能である。標的遺伝子をクローニングすることで、標的遺伝子を分析することもできるし、標的遺伝子より合成された蛋白質の機能を解析することもできる。本発明の理解を助けるために、本発明を実施するまでの予備検討としての参考例を示し、さらに実施例、比較例、実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。参考例1標的遺伝子予測ソフトによる標的遺伝子絞り込み本発明者らはこれまでに、ヒト肺癌細胞13検体と同一患者の正常肺組織13検体のRNAを用いて、miRNAアレイと約200種類のmiRNAのTaqManリアルタイム定量RTPCRを行った。その結果、複数のmiRNAが肺癌細胞で発現増加していることを見出した。その中でも顕著13例中10例に発現の高かったmiR183に注目した。このmiRNAが高頻度で癌細胞内に高発現していることより、このmiRNAの標的遺伝子が何であるかを調べることが重要であると考えた。そこでまず、標的遺伝子予測ソフトを用いて検討することにした。本発明者らは、細胞増殖、アポトーシス、癌抑制遺伝子というキーワードと、シード配列の7塩基が完全一致し、非シード配列内で5塩基以上が一致する条件で、標的遺伝子予測ソフトmiGTS協和発酵キリン制作ソフトを行った結果、1495の標的遺伝子候補を得た図1参照。このように、標的遺伝子予測ソフトを用いて解析しても、miRNAの標的遺伝子を絞り込むことは困難であることが確認された。参考例2ルシフェラーゼレポーター解析による絞込み参考例1で選別された1495の標的候補遺伝子群から23種の候補遺伝子BTG1、DNMT3A、FAT、PPP2CA、RREB1、RSU1、SEL1L、TNFSF12、TNFRSF9、TNFRSF10B、TNFRSF14、SOCS6、SURB7、BCL2L11、LATS2、PDCD4、SMU1、ING3、ST7L、ARHGAP21、BRMS1L、AMID、VIL2を適宜選別した。選別した標的候補遺伝子mRNAの3非翻訳領域に位置する標的配列23bpを用いて、ルシフェラーゼレポーター解析を行うことにした図1参照。miR183の標的遺伝子としてすでに報告されたVIL2をポジティブコントロールとした。まず、各標的候補遺伝子の3UTRに見出された標的配列からなるDNAを合成し、レポーターであるルシフェラーゼ遺伝子の3UTRに位置するようにプラスミドを設計し、miR183の標的配列が正方向、又は、逆方向に入ったルシフェラーゼプラスミドを作製した。本参考例で使用したルシフェラーゼプラスミドは、Yangらの方法YangYChaerkadyRBeerMAMendellJTPandeyAProteomics2009913741384に記載の方法に従い作製した。当該標的配列が正方向に入ったルシフェラーゼプラスミドは、miR183を発現している細胞内に導入された際、細胞内のmiR183により蛋白発現が抑制されてしまい、標的配列が逆方向に入ったルシフェラーゼプラスミドのルシフェラーゼ活性よりも減少すると考えられる。そこで作製した各プラスミド正方向、逆方向を、miR183を発現しているHEK293細胞ヒト胎児腎細胞に、遺伝子導入用試薬、LipofectamineTM2000Invitrogen社を用いて遺伝子導入し、24時間後、DualLuciferaseReporterAssaySystemPromega社を用いてルシフェラーゼ活性の測定を行った。その結果、候補遺伝子BTG1、DNMT3A、FAT、PPP2CA、RREB1、RSU1、SEL1L、TNFSF12、TNFRSF10B、SOCS6、BCL2L11、LATS2、PDCD4、ING3、ARHGAP21、BRMS1L、AMID、VIL2においては、正方向挿入型はコントロール標的配列が逆方向挿入型と比較して、ルシフェラーゼ活性を抑制することができた図2A。よって、これらの候補遺伝子は、確かにmiR183の標的遺伝子である可能性が考えられた。そこで次に、これら抑制効果が確認された候補遺伝子に関して、正方向挿入型のルシフェラーゼの遺伝子導入時に、antimiR183LNAアンチセンス鎖ヌクレオチドを加えて、細胞内のmiR183をノックダウンすることにより、ルシフェラーゼ活性が復活活性増加を示す遺伝子BTG1、DNMT3A、FAT、PPP2CA、RREB1、RSU1、SEL1L、TNFSF12、SOCS6、PDCD4、ARHGAP21、BRMS1L、AMID、VIL214種を候補遺伝子として同定した図2B。これらの候補遺伝子中には、miR183の標的遺伝子としてすでに報告されているVIL2が含まれていることが確認された。そこで、これらの14種の候補遺伝子は、確かにmiR183の標的遺伝子である可能性が示された。しかし、これでもまだ、真の標的遺伝子であるかどうかは不明のままであった。比較例生きた細胞への遺伝子導入操作後、AGO蛋白を回収することによる標的遺伝子mRNAの回収方法本比較例では、miRNA複合体蛋白の一つ、AGO蛋白を回収することにより、miRNAの標的遺伝子mRNAを回収する方法を試みた。miRNA発現ベクターと、FLAGタグ付AGOの発現ベクターを、HEK293細胞内で強発現させ、FLAG抗体ビーズでFLAGタグ付AGO蛋白を免疫沈殿させることにより、複合体として回収されるmiRNAの標的遺伝子mRNAを分離した図3参照。FLAGタグ付AGO1及びAGO2の発現ベクターは、AGO1及びAGO2の各cDNAをFLAGタグ発現ベクターpCMVTag4Aベクター:Stratagene社に各々組み込むことにより構築した。また、miR183発現ベクターは、primiR183配列をmiR発現用ベクターpSilencerTMベクターに組み込むことにより構築した。トランスフェクション試薬LipofectamineTM2000:Invitrogen社を用いて、これらの発現ベクターをHEK293細胞に導入した。トランスフェクションの48時間後、細胞をPBSで洗浄し、スクレーパーで細胞を回収した。回収した細胞に、細胞抽出液25mMTrisHCl、150mMKCl、2mMEDTA、05NP40、80URNaseInhibitorABI社、1×ProteinaseInhibitorcocktailSigma社を添加し、氷上で、ボルテックスミキサーにて10秒間隔で10分間処理を行い、細胞を破砕した。その後4°Cで12000g、15分間、遠心処理し、上清細胞抽出液を回収した。当該細胞抽出液におけるFLAGAGO蛋白の発現は、FLAG抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。また、miR183の発現に関しては、もともとの細胞内のmiR183の発現量に比して、miR183発現ベクターから数十倍の成熟miRNA40倍程度が発現することをTaqManmiRNAassayにより確認した。次に、上記細胞抽出液について、FLAG抗体ビーズでFLAGAGO蛋白を免疫沈殿して回収した後、回収した免疫沈殿物からRNA抽出溶液ISOGENNipponGene社を用いてmRNAを精製し、逆転写酵素によりcDNAを作製し、cDNAのクローニングを行った。得られた200クローンの塩基配列を解析した。解析したcDNAの塩基配列をもとに遺伝子を同定し、その3非翻訳領域を調べてみたが、miR183の結合配列を有する遺伝子を得ることは出来なかった。強発現させたmiR183以外のmiRNAの標的遺伝子mRNAも、AGO蛋白と共に多数回収されるためと考えられた。よって、FLAGtagを付加した細胞内のAGO蛋白を回収する方法では、導入した特定のmiRNAの標的遺伝子mRNAを回収することはできなかった。実施例1ビオチン化miRNAを用いたmiRNA標的遺伝子の検出miR183本実施例は、培養細胞中のmiRNAの標的遺伝子を検出することを目的とした。本実施例におけるmiRNA標的遺伝子の検出方法を示すフローチャートを図4に示した。培養細胞として、HEK293細胞を用いた。特定のmiRNAに対する真の標的遺伝子を同定するためには、当該特定のmiRNA本実施例では、miR183と物理的に結合したmRNAを捕まえなくてはならないと考え、標識化miRNAを用いた回収法を開発した。本実施例では、ビオチン化miR183及びコントロールとして、ビオチン化let7bを作製した。1-1ビオチン化miRNAの作製miR183及びlet7bについて、miRNAのセンス鎖の5末端をリン酸化、3末端をビオチン化したmiRNAと、miRNAのアンチセンス鎖の5末端をリン酸化したガイド鎖を作製した。miRNAのビオチン化の方法は、ファスマック社のRNA合成法に従った。上記ビオチン化したmiRNAとそのガイド鎖を100mMNaCl溶液中70°Cで保温したのち、自然冷却によりアニールさせ、二本鎖miRNAを作製した。この状態では、両鎖の3末端の2塩基が一本鎖で本来の配列で突出した状態になるように設計をした。ここで、ガイド鎖配列番号2の3末端から4塩基目に、ミスマッチを生じるように変異を挿入したものを利用した図5参照。miR183の塩基配列センス5PUAUGGCACUGGUAGAAUUCACUbiotin3配列番号1アンチセンス5PUGAAUUCUACCAGUGCCACAAG3配列番号21-2細胞抽出液の作製HEK293細胞約2×107cells:90mm培養用ディッシュをPBSで洗浄し、スクレーパーで細胞を回収した。回収した細胞に、以下に記載の細胞抽出液を添加し、氷上で、ボルテックスミキサーにて10秒間隔で10分間処理を行い、細胞を破砕した。その後4°Cで12000g、15分間、遠心処理し、上清細胞抽出液を回収した。細胞抽出用試薬組成25mMTris60mMKCl25mMEDTA005NP4080URNaseInhibitor1×ProteinaseInhibitorcocktail1-3ビオチン化二本鎖miRNAと細胞抽出液中のRNAとの反応上記2で回収して得た細胞抽出液に、上記1で作製したビオチン化二本鎖miRNA14μgμlを10μl加え、4°Cで30分、その後、30°Cで60分反応させた。この過程で、ビオチン化二本鎖miRNAは、RISC複合体に取り込まれ、ガイド鎖がセンス鎖から離れて放出されて成熟miRNAとなり、標的遺伝子mRNAがmiRNARISC複合体に結合すると考えられた。これにより、ビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を含む溶液が得られた。1-4ビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体の回収上記3で得たビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を含む溶液に、ストレプトアビジンアガロースビーズInvitrogen社50μlを添加し、4°Cで1時間処理した。当該処理液を、5000回転で3分間遠心処理し、ストレプトアビジンアガロースビーズによるビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を回収し、回収した。以降、本方法で回収されたビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を、単にPullDown複合体という場合もある。その後、500μlの洗浄液20mMTrisHCl350mMKCl002NP40を用い、上記と同条件にて遠心処理を5回繰り返し、洗浄を行った。沈澱に回収されたPullDown複合体からDNAを除去するため、DNA除去試薬キット100μlの1×DNasebuffer、DNaseを用いて37°Cで30分処理後、95°Cで10分加熱処理した。その後、RNA抽出溶液ISOGEN;NipponGene社でRNAの精製を行い、標的遺伝子mRNAを回収した。実験例1-1RTPCRによる標的遺伝子mRNAの分析本実験例では、上記実施例1により回収された標的遺伝子mRNAが、参考例1及び2で絞り込まれた遺伝子に対応するか否かを検証する目的で分析を行なった。実施例1で回収された標的遺伝子mRNA群中に、参考例1で示した標的遺伝子予測ソフトmiGTS解析と、参考例2で示したルシフェラーゼ解析結果で得られたmiR183の標的遺伝子mRNAが含まれるかを確認するため、標的候補であるBTG1RSU1ING3ARHGAP21VIL2DNMT3APPP2CARREB1SEL1LSOCS6BCL2L11PDCD4BRMS1LLATS2の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCRを行った。miR183の標的遺伝子としてすでに報告のあるVIL2をポジティブコントロールとした。一方、コントロールmiRNAのlet7bは、その配列の違いより14種の候補遺伝子を標的とはしていないと考えられる。そこで、実施例1で得られたビオチン化let7bから回収されたlet7bの標的遺伝子mRNAを比較対照miR183のネガティブコントロールとして解析した。実施例1で回収された標的遺伝子mRNA群について、逆転写酵素を用いてcDNAを作製し、標的候補遺伝子特異的プライマーを用いて、RTPCR解析を行った図6上段。RTPCRにより得られた増幅産物についてアガロースゲルにより分析した結果、ビオチン化miR183で回収された候補遺伝子PPP2CAはポジティブコントロールのVIL2と同程度のバンド強度を示し、次いでBTG1RREB1BCL2L11PDCD4LATS2の各遺伝子についてもバンドが検出された。ネガティブコントロールとしたビオチン化let7bを用いて回収したlet7bの標的候補遺伝子mRNAについて、上記と同様に標的候補各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行ったところ、いずれの遺伝子に係るバンドも検出されなかった図6中央。以上により、ビオチン化miR183を用いた回収技術により、参考例2で絞り込んだ候補遺伝子14種のうち7種に係るmRNAが回収されたことを示しており、7種の遺伝子は、確かにmiR183特異的な標的遺伝子であることが示唆された。図6下段は、本実験例に使用したHEK293細胞抽出液に含まれるmRNAについて、上記と同様に候補遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCRを行ったところ、すべての遺伝子が含まれているという結果を示す。実験例1-2miR183による標的候補遺伝子PPP2CAの発現制御の確認1本実験例では、標的候補遺伝子PPP2CAについて、本当に細胞内でmiR183による抑制がなされているかを、ウエスタンブロット法により確認した。miR183を過剰発現させるためにprimiR183を組み込んだpSilencerTMベクターを作製した。miR183とは配列の異なるmiR1を組み込んだpSilencerTMベクター、及びpSilencerTMベクターをネガティブコントロールとし、比較対照とした。各ベクターを導入したHEK293細胞を、48時間培養した。上記各ベクターを導入した各細胞をPBSで洗浄後、チューブに移した。5000回転で3分間の遠心処理後、得られた細胞に、2×SDS用緩衝液100mMTrisHCl200mMジチオスレイトール4SDS02ブロモフェノールブルー20グリセロールを50μl加え、5分間100°Cで加熱し、細胞を溶解した。前記処理した細胞溶解液15μlを、12SDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、iBlotTMゲルトランスファーシステムInvitrogen社にてPVDFポリフッ化ビニリデン膜に蛋白のブロッティングを行った。転写されたPVDF膜はブロッキングバッファーでブロッキングしたのちに、PPP2CA蛋白に対するマウスモノクローナル抗体Abcam社を反応させた。PVDF膜を洗浄後、VecstainABCAPkitVectorLaboratories社で標識し、アルカリホスファターゼの基質であるCDPstarRoche社を添加し、生じた蛍光をルミノイメージアナライザーFUJIFILM社にて取り込んだ。上記の結果、pSilencerTMベクターのみを導入した細胞図7、レーン2;NC細胞及びmiR1を組み込んだpSilencerTMベクターを導入した細胞レーン3;miR1細胞ネガティブコントロールに較べて、miR183を過剰発現させるためにprimiR183を組み込んだpSilencerTMベクターを導入した細胞レーン1;miR183細胞では、PPP2CA蛋白は顕著に発現を抑制されることが明らかになった。以上の結果より、候補遺伝子PPP2CAはmiR183の真の標的遺伝子の一つであることが示唆された。実験例1-3miR183による候補遺伝子PPP2CAの発現制御の確認2本実験例は、miR183アンチセンスの導入により細胞内のmiR183をノックダウンさせると、候補遺伝子PPP2CAmRNAからのPPP2CA蛋白の発現変動はどうなるかを観察するために、検討を行なった。miR183に対するアンチセンスLockedNucleicAcid;LNAをLu65a細胞ヒト肺癌細胞に導入した。ネガティブコントロールとして、GFP遺伝子に対するLNAを細胞に導入した。各LNAを導入した細胞を48時間培養し、実験例2と同手法により細胞を溶解した。実験例2と同手法により各細胞溶解液を12SDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、PVDF膜に蛋白のブロッティングを行い、PPP2CA蛋白に対するマウスモノクローナル抗体Abcam社を反応させた図8。レーン1は未処理のLu65a細胞、レーン2はGFP遺伝子に対するLNAネガティブコントロール導入細胞、レーン3はアンチセンスmiR183LNA導入細胞である。アンチセンスmiR183LNAで細胞内のmiR183をノックダウンしたところ、PPP2CA蛋白の発現が増加することが示された。以上の結果より、候補遺伝子PPP2CAはmiR183の真の標的遺伝子の一つであることが明らかとなった。実験例1-4miR183の標的遺伝子PPP2CAの作用miR183の真の標的遺伝子の一つであることが示唆された標的遺伝子PPP2CAについて調べてみると、セリンスレオニンホスファターゼのサブユニットであり、DNA修復や癌抑制に関与していることが報告されている遺伝子であった。標的遺伝子PPP2CAがDNA修復の関与することから、カンプトテシンCPT添加によりDNA損傷を誘導し、標的遺伝子PPP2CAの有無による細胞への影響を調べた。miR183が低発現しているLu99c肺癌細胞株にmiR183発現ベクターを導入後、CPT終濃度0、200nM、400nM、600nM、800nM、1000nMを添加し、24時間後に細胞数を測定した図9。miR183発現ベクターの導入により標的遺伝子PPP2CAの発現を抑制すると、DNA修復が阻害され、アポトーシスが促進され細胞生存率の減少がみられた図9。また、標的遺伝子PPP2CAが癌抑制にも関与することから、miR183が高発現しているLu65a肺癌細胞株に標的遺伝子PPP2CA発現ベクターを導入し過剰発現させ、生存細胞数を測定した。標的遺伝子PPP2CAを強制発現させた細胞では、日毎に細胞数が減少していることが分かった図10。これらの結果は、肺癌におけるmiR183の過剰発現が、標的遺伝子PPP2CAの発現を翻訳レベルで阻害し、DNA安定性及び癌抑制機能の欠如を引き起こすことにより発癌に関与することを示唆している。以上より、検出されたmiR183の標的遺伝子PPP2CAが、細胞癌化に重要な作用を及ぼしていることが明らかとなった。本発明miRNAの標的遺伝子の検出方法は、今後miRNAの新しい標的遺伝子を検出することができ、その機能を明らかにする研究に大きく貢献すると期待される。実施例2PullDown複合体の確認miR183本実施例では、実施例1のビオチン化miRNAを用いたmiRNAの標的遺伝子検出方法により得たPullDown複合体について、当該PullDown複合体中のビオチン化miRNA及びAGO2蛋白を確認し、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出方法が機能的に行われるかの検証を行った。実施例1の1-1ビオチン化miRNAと同手法によりビオチン化miR183を作製し、同1-2細胞抽出液と同手法によりHEK293細胞の細胞抽出液を作製した。この細胞抽出液500μlにビオチン化二本鎖miR1831000pmoleを加えたチューブを5本作製し、4°Cで30分間、その後、30°Cで60分間反応させ、ビオチン化miRNA標的遺伝子mRNAを含む溶液を得た。当該複合体を含む溶液に、ストレプトアビジンアガロースビーズStreptavidinMuteinMatrixNo03708152001:Roche社を添加し、各チューブを4°Cで0分、2分、12分、24分、1時間、処理した。同1-4と同手法によりPullDown複合体を得、洗浄を行った。2-1PullDown複合体中のビオチン化miRNAの回収確認本実験例では、実施例2のストレプトアビジンアガロースビーズで0、2、12、及び24分間反応させて得た各PullDown複合体を実施例1の1-4のRNA精製方法に従って処理し、RNAを回収した。TaqManMicroRNAReverseTranscriptionkitAppliedBiosystems社を用いて、回収した各RNA試料からcDNAを合成した。得られたcDNAについて、TaqManMicroRNAAssaykitAppliedBiosystems社とRealTimePCR機7300RealTimePCR:AppliedBiosystems社を用いて、ビオチン化miR183の検出を行った。各cDNA試料について、各々2ウェルずつRealTimePCRを行った。その結果、各cDNA試料について、ビオチンとストレプトアビジンとの反応時間が長い場合に、PCRの早いサイクル数でビオチン化miR183が検出されることが確認された図11。すなわち、ビオチンとストレプトアビジンとの反応時間を長くするにつれて、より多くのビオチン化miR183が回収されることが確認された。従って、本発明の方法によりビオチン化miRNAが回収できることが明らかとなった。2-2PullDown複合体中のAGO2蛋白の確認実施例2のPullDown複合体中にAGO2蛋白が存在するか否かを確認した。ストレプトアビジンアガロースビーズで1時間反応して得たPullDown複合体を試料とし、抗AGO2抗体に対するウエスタンブロットを行った。実験例1-2と同手法により、試料を8SDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動後、PVDF膜に蛋白をブロッティングし、抗AGO2抗体AntiHumanAGO2monoclonalantibody;和光純薬工業No01620861、抗マウス抗体とVecstatinABCAPkitVectorLaboratories社で反応させ、蛍光イメージをイメージアナライザーLAS1000FUJIFILM社にて取り込んだ。その結果、ビオチン化miR183を加えずに同様に反応させたNegativecontrolにはAGO2蛋白は検出されないが、ビオチン化miR183を加えて反応させたPullDown複合体にはAGO2蛋白約95kDaが検出された。これにより、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出方法において、ビオチン化miRNAは確かにAGO2蛋白と複合体を形成していることが明らかになった図12。実施例3ビオチン化miRNAのリン酸化miR183本実施例では、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出に使用するビオチン化miRNAのリン酸化の必要性を確認した。実施例1の1ビオチン化miRNAの作製と同手法により、miR183のmiRNAのセンス鎖の5末端をリン酸化したmiRNAを作製したファスマック社、コスモバイオ社。コントロールとして、5末端をリン酸化していないmiR183を作製したコスモバイオ社。いずれのmiR183も3末端はビオチン化し、ガイド鎖は5末端をリン酸化した。上記ビオチン化したmiRNAとそのガイド鎖を100mMNaCl溶液中70°Cで保温したのち、自然冷却によりアニールさせ、二本鎖miRNAを作製した。miRNAのセンス鎖及びガイド鎖の塩基配列は、配列表の配列番号1及び2図5参照に従い、両鎖の3末端の2塩基が1本鎖で本来の配列で突出した状態になるように設計をした。ガイド鎖の3末端から4塩基目に、ミスマッチを生じるように変異を挿入した。上記の各種ビオチン化miRNAを用いて実施例1の1-2~1-3の処理を行った。実施例2と同手法によりストレプトアビジンアガロースビーズで1時間反応させてPullDown複合体を得た。実施例2の2-2と同手法によりPullDown複合体にAGO2蛋白が含まれているかどうかウエスタンブロット法により確認した。その結果、図13に示すように、5末端リン酸化miR183を用いて作製したPullDown複合体にはAGO2蛋白約95kDaが検出されたlane1、及びlane2が、5末端がリン酸化されていないmiR183を用いたPullDown複合体にはAGO2蛋白がほとんど検出されなかったlane3。この結果は、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出方法に使用するビオチン化miRNAには5末端についてリン酸化標識が必要であることを示している。実施例4アガロースビーズへの非特異的吸着本発明のmiRNAの標的遺伝子検出におけるPullDown複合体を得る際、ビオチン化miRNAを含まない陰性コントロールの系であっても、ストレプトアビジンアガロースビーズにmRNAが非特異的に吸着することがある。本実施例では、ビオチン化miRNAを含まない陰性コントロールの状態で、実施例1の1-2~1-3の処理を行った。得られた複合体から1-4の方法によりPullDown複合体を得る際の、miRNAとストレプトアビジンアガロースビーズInvitrogen社との反応処理後の洗浄条件を確認した。ビオチン化miRNAを含まない陰性コントロールの系による実施例1の1-4の方法により得られたPullDown複合体について、以下に示す7種類の洗浄液を用いて洗浄条件を検討した。洗浄液は、20mMTrisHClと05NP40を共通とし、KClが60mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mMの各濃度とした。各洗浄液500μlで5分間処理した後、5000回転で3分間遠心処理し、得られた沈殿物について、同条件にて洗浄と遠心処理を合計5回繰り返した。実施例1の1-4に従ってRNAを精製し、cDNA合成した。ストレプトアビジンアガロースビーズへのmRNAの非特異的吸着を検定するために、ここではmiR183の標的候補遺伝子であるBCL2L11遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、洗浄液のKClの塩濃度が400mMの場合に、mRNAの非特異的吸着の低減化が確認された図14。実施例5磁性ビーズによる非特異的吸着率本実施例では、ビオチン化miRNAを含まない陰性コントロールの系でPullDown複合体を得る際に、ストレプトアビジンアガロースビーズのかわりに、ストレプトアビジン磁性ビーズとの反応処理による非特異的吸着率の差を確認した。実施例4と同手法によりPullDown複合体を得る際のストレプトアビジンアガロースビーズのかわりに4種類のストレプトアビジン磁性ビーズDynaBeadsM280粒径28mm疎水性、DynaBeadsT1粒径28mm親水性、DynaBeadsM270粒径10mm疎水性及びDynaBeadsC1粒径10mm親水性いずれもInvitrogen社製を用いた。洗浄液として実施例4のKClが400mMの溶液を用いた。回収及び洗浄の際、遠心処理ではなく磁石付きチューブホルダーにて磁性ビーズを回収した。実施例1の1-4に従ってRNAを精製し、cDNA合成した。上記各種磁性ビーズへのmRNAの非特異的吸着を検定するために、ここではmiR183の標的遺伝子であるVIL2、BCL2L11並びにlet7bの標的遺伝子であるE2F6、SOCS41の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、親水性であり粒子径が小さいビーズは非特異的吸着が高いことが確認された図15。実施例6ビオチン化miRNAへのチオール基付加についてmiR183本実施例では、本発明の方法によるmiRNAの標的遺伝子検出方法のうち、ビオチン化miRNAの配列について検討を行った。本実施例では、miRNA配列と3末端ビオチンの間にチオール基SS結合を含むmiRNAを作製したファスマック社。前記配列のチオール基を含むmiRNA500pmoleを用いて、ビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を得、実施例1の1-4と同手法によりビオチン化miRNA標的遺伝子mRNA複合体を含む溶液とストレプトアビジンビーズを用いて回収した。実施例5と同様に400mMKClの洗浄液を用いて5回洗浄した後、100mM還元剤ジチオトレイトールで42°C10分間処理してSS結合切断処理を行い、ストレプトアビジンビーズからmiR183複合体を遊離させた。遊離させたmiR183複合体を含む抽出液について、さらに1-4と同手法によりRNAの精製とcDNA合成を行い、miR183の標的候補遺伝子であるVIL2及びLATS2の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、本実施例のチオール基を含むビオチン化miRNA500pmoleで標的遺伝子のPCR産物が検出されたレーン1が、ビオチンのみ500pmoleの陰性コントロールでは検出されなかった。以上により、miRNA配列と3末端ビオチンの間にチオール基を含むmiRNAを用いて、PullDown複合体を得、還元剤でSS結合を切断することにより、標的遺伝子を回収することが可能であることが明らかとなった図16。実施例7高濃度ビオチン処理miR183本実施例では、本発明の方法によるmiRNAの標的遺伝子検出方法のうち、ストレプトアビジンビーズからPullDown複合体を得る際、高濃度ビオチンで置換してビオチン化miRNAを含むPullDown複合体を遊離させることについて検討を行った。本実施例では、実施例1の1-1ビオチン化miRNAに従いビオチン化miR183500pmole及び陰性コントロールとして、ビオチン化miR183500pmoleのかわりに、ビオチンB4501:Sigma社、500pmoleを用いて実施例1の1-2~1-3の処理を行った。得られた複合体をストレプトアビジンビーズStreptavidinMuteinMatrix:Roche社、又は、SoftLinkSoftReleaseAvidinResin:Promega社で処理し、回収した。実施例5と同様に400mMKClの洗浄液を用いて5回洗浄後、5mMビオチン溶液前述の400mMKClの洗浄液中に5mMビオチンとRNase阻害剤を含むで沈殿物を撹拌し、すぐに5000回転で3分間の遠心処理を行い、ストレプトアビジンビーズからビオチン化miR183複合体を遊離させた。遊離させたmiR183複合体を含む抽出液について、実施例1の1-4と同手法によりRNAの精製とcDNA合成を行い、miR183の標的候補遺伝子であるPDCD4及びLATS2各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、いずれのストレプトアビジンビーズレーン1,2=Roche社、レーン3,4=Promega社についても、高濃度ビオチン処理でストレプトアビジンビーズからビオチン化miRNA複合体を置換し、遊離させることが可能であることが明らかとなった図17。実施例8ビオチン化miRNAを用いたmiRNA標的遺伝子の検出let7b本実施例では、実施例1のmiRNA標的遺伝子の検出方法について、ビオチン化miRNAとして、let7bを用いて標的遺伝子を検出した。実施例1の1ビオチン化miRNAに従い、センス鎖は5末端リン酸化、3末端ビオチン修飾付き、ガイド鎖は5末端リン酸化修飾のみのビオチン化let7bと陰性コントロールとしてのビオチン化miR183を合成したファスマック社。実施例1と同手法によりストレプトアビジンビーズStreptavidinMuteinMatrix:Roche社を用いてPullDown複合体を得、実施例5と同様に400mMKClの洗浄液を用いて5回洗浄後、ビーズに結合している複合体からRNAの精製とcDNA合成を行った。得られたcDNAについて、let7bの標的候補遺伝子であるE2F6及びSOCS42各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、let7bの標的候補遺伝子であるE2F6とSOCS4はビオチン化let7bで回収したmRNAには含まれているが、陰性コントロールビオチン化miR183で回収したmRNAには含まれていないことが明らかになった図18。このことは、PullDown複合体から精製して得られる標的遺伝子mRNAは、用いたビオチン化miRNAに特異的であることを示している。let7bの塩基配列センス5PUGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUUbiotin3配列番号3アンチセンス5PCCACACAACCUACUACCUUAAG3配列番号4実施例9ビオチン化miRNAを用いたmiRNA標的遺伝子の検出let7b2本実施例では、実施例1のmiRNA標的遺伝子の検出方法について、ビオチン化miRNAとして、let7bを用いて標的遺伝子を検出した。本実施例では、陰性コントロールとして、ビオチン化miR183のかわりにビオチン化miR29aを用いたほかは、実施例8と同手法により行った。ビオチン化miR29aについても、センス鎖は5末端リン酸化、3末端ビオチン修飾付き、ガイド鎖は5末端リン酸化修飾のみのものを作製したファスマック社。let7bの標的候補遺伝子であるPRDM2、E2F2、TUSC2、SRSF8の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、let7bの候補遺伝子であるE2F2、TUSC2、SRSF8はビオチン化let7bで回収したmRNAには含まれているが、陰性コントロールビオチン化miR29aで回収したmRNAには含まれていないことが明らかになった図19。このことは、PullDown複合体から精製して得られる標的遺伝子mRNAは、用いたビオチン化miRNAに特異的であることを示している。miR29aの塩基配列センス5PUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAbiotin3配列番号5アンチセンス5PACCGAUUUCAGAUGGUGCCAAG3配列番号6実施例10ビオチン化miRNAを用いたmiRNA標的遺伝子の検出miR19a1本実施例では、実施例1のmiRNA標的遺伝子の検出方法について、ビオチン化miRNAとしてmiR19aを用いて標的遺伝子を検出した。実施例1の1-1ビオチン化miRNAに従い、センス鎖は5末端リン酸化、3末端ビオチン修飾付き、ガイド鎖は5末端リン酸化修飾のみのビオチン化miR19を合成したファスマック社。合成されたビオチン化miR19a400pmole、及び、陰性コントロールとしてビオチンB4501:Sigma社、400pmoleを用いて実施例1の1-2~1-3の処理を行い、得られた複合体から1-4と同手法によりストレプトアビジンビーズStreptavidinMuteinMatrix:Roche社を用いてPullDown複合体を得、実施例5と同様に400mMKClの洗浄液を用いて5回洗浄した。その後、5mMビオチン溶液前述の400mMKClの洗浄液中に5mMビオチンとRNase阻害剤を含むで沈殿物を42°Cで5分間処理し、同様に遠心処理して、ストレプトアビジンビーズからPullDown複合体ビオチン化miR19aを遊離させた。上記の5回目の洗浄液と、5mMビオチンによる抽出液、及び、残りのストレプトアビジンビーズから、実施例1の1-4と同手法によりRNAの精製とcDNA合成を行い、miR19aの標的候補遺伝子であるSOX4、INHBB、TP53INP1、PTP4A1、TNFAIP3、HIC1、CNKSR2の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、miR19aの標的候補遺伝子は、いずれの遺伝子も、陰性コントロールと比べて、ビオチン化miR19aを用いて回収したステップのうち、5mMビオチンによる抽出液、又は、残りのストレプトアビジンビーズに存在していることが明らかになった図20。このことは、得られる標的遺伝子mRNAは、用いたビオチン化miRNAに特異的であることを示している。miR19aの塩基配列センス5PUGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGAbiotin3配列番号7アンチセンス5PAGUUUUGCAUAGAUUUGCAUAAG3配列番号8実施例11ビオチン化miRNAを用いたmiRNA標的遺伝子の検出miR19a2本実施例では、実施例1のmiRNA標的遺伝子の検出方法について、ビオチン化miRNAとして、miR19aを用いて標的遺伝子を検出した。本実施例では、実施例10と同手法によりPullDown複合体を得、同様に洗浄を行い実施例5と同様に400mMKClの洗浄液を用いて5回洗浄後、ビーズに結合している複合体からRNAの精製とcDNA合成を行った。陰性コントロールについても実施例10と同手法により行った。得られたcDNAについて、本実施例ではmiR19aの標的候補遺伝子であるJAZF1、TNF、SMAD4、HIP1、HIC1、LRP12、TNFRSF12A、TUSC2、SIVA1の各遺伝子特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。その結果、miR19aの標的候補遺伝子9個はビオチン化miR19aで回収したmRNAには含まれているが、陰性コントロールで回収したmRNAには含まれていないことが明らかになった図21。このことは、PullDown複合体から精製して得られる標的遺伝子mRNAは、用いたビオチン化miRNAに特異的であることを示している。実施例12Natural型miRNAによるmiRNA標的遺伝子の検出miR183本実施例では、実施例1のmiRNA標的遺伝子の検出方法について、ビオチン化miRNAとして従来型miRNAとNatural型miRNA特異的プライマーを用いてRTPCR解析を行った。図22。miR183の塩基配列従来型センス5PUAUGGCACUGGUAGAAUUCACUbiotin3配列番号1アンチセンス5PUGAAUUCUACCAGUGCCACAAG3配列番号2miR183の塩基配列Natural型センス5PUAUGGCACUGGUAGAAUUCACUbiotin3配列番号1アンチセンス5PGUGAAUUACCGAAGGGCCAUAA3配列番号9その結果、調べたmiR183の標的候補遺伝子すべては、従来型miRNA、及び、Natural型miRNAより得たPullDown複合体ビオチン化miR183には含まれているが、陰性コントロールでは含まれていないことが明らかになった。このことは、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出方法には、ビオチン化した、従来型miRNA及びNatural型miRNAが使用可能であることを示唆している。従来型miRNAでも、Natural型miRNAでも、センス鎖の配列は全く同じであり、RISCに取り込まれたセンス鎖ビオチン化miRNA1本鎖が回収されることを考慮すると、本発明のmiRNAの標的遺伝子検出方法には、ミスマッチを含む、又は含んでいない、いずれのビオチン化miRNAでもよいことが裏付けられる。"