病原体に対する持続性免疫および防御を生成させるのに有用な合成免疫原であって、該免疫原が一般式:[式中、X1=配列番号1~98から選択されるプロミスキャスCD4Tヘルパーエピトープまたは無X2=配列番号99~103から選択されるプロミスキャスCD8T細胞傷害性エピトープまたは無X1=無の場合、X2=配列番号99~103、およびX2=無の場合、X1=配列番号1~98;Y=リジン;およびS=セリン]によって表される、合成免疫原。式:[式中、X1=配列番号1~98から選択されるプロミスキャスCD4Tヘルパーエピトープ;およびY=リジン;およびS=セリン]によって表される、請求項1に記載の免疫原。式:[式中、X2=配列番号99~103から選択されるプロミスキャスCD8T細胞傷害性エピトープ;およびY=リジン;およびS=セリン]によって表される、請求項1に記載の免疫原。式:[式中、Y=リジンおよびS=セリン]によって表される、請求項1に記載の免疫原。配列番号1~103によって表されるプロミスキャスエピトープが、結核菌Mycobacteriumtuberculosis由来である、請求項1に記載の免疫原。TLRリガンドが、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12およびTLR13リガンドからなる群より選択される、請求項1に記載の免疫原。TLRリガンドが、ジアシルリポペプチド、トリアシルリポペプチド、リポアラビノマンナンおよびリポ多糖からなる群より選択される、請求項1に記載の免疫原。TLRリガンドが、S23ビスプロピル]システインまたはPam2Cysである、請求項1に記載の免疫原。結核菌Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、HLAクラスI、すなわちHLAA、HLAB、HLAC、およびHLAクラスII、すなわちHLADR、HLADP、HLADQ分子への結合に基づいて同定される、請求項1に記載の免疫原。結核菌Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、T細胞増殖ならびにIFNγおよびIL4の分泌に基づいて同定される、請求項1に記載の免疫原。MHCHLA発現を強化する、請求項1に記載の免疫原。CD80、CD86およびCD40から選択される共刺激分子の発現を強化する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、CD69およびCD44の発現をアップレギュレートすることによって、CD4およびCD8T細胞の増殖を強化する、請求項1に記載の免疫原。結核菌Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、サイトカインIL2、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IFNγ、TNFαおよびIL12の分泌を調整する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、中枢およびエフェクターT細胞記憶の両方を含むCD4およびCD8T細胞記憶を強化する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、メモリーCD4およびCD8T細胞上のCD44、CD62LおよびCD127の発現を調整する、請求項1に記載の免疫原。結核菌Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、サイトカインIL2、IL4、IL12、IFNγおよびIL12の分泌に基づいて同定される、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、結核菌Mtuberculosisに対する肺および肺外免疫を増強する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、身体の肺および肺外領域における結核菌Mtuberculosisの成長を制限する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、PD1のような免疫抑制分子の発現をダウンレギュレートする、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが調節性T細胞の生成を阻害する、請求項1に記載の免疫原。プロミスキャスエピトープが、健常および結核患者から得られたヒトリンパ球による増殖およびIFNγの分泌を誘導することができる、請求項1に記載の免疫原。TLRリガンドをアジュバントとして利用し、それゆえに、追加のアジュバントを必要としない、請求項1に記載の免疫原。樹状細胞、マクロファージおよびB細胞のような抗原提示細胞にターゲティングされる、請求項1に記載の免疫原。ナノ粒子にコーティング/カプセル化されている、請求項1に記載の免疫原。マンノシル化リポソームまたは抗DEC205抗体でタグ付けされたリポソームに共有結合捕捉されている、請求項1に記載の免疫原。請求項1に記載の免疫原を、場合によっては医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む、医薬注射可能組成物。対象における結核に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、治療有効量の、請求項1に記載の免疫原を、場合によっては医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に投与することを含む方法。[発明の目的]そこで、本発明の主目的は、上に詳述した欠点を取り除く免疫原を開発することである。本発明のもう一つの目的は、結核、ブルセラ症、リーシュマニア症、リステリア症、ハンセン病、マラリア、腸チフス、トリパノソーマ症、レンサ球菌、AIDSの原因因子である細胞内病原体、ならびにがん、アレルギーおよび自己免疫のような疾患に対する持続性防御免疫を生成させるのに有用な免疫原を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、ヒトにおけるHLA拘束性を回避することができる免疫原を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、TLRリガンドにカップリングされた、Mtuberculosisプロテオーム由来のプロミスキャスペプチドエピトープを含む免疫原を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、永続的なCD4およびCD8T細胞記憶を強化し、結核に対する防御免疫を付与する、Mtuberculosis由来の脂質化プロミスキャスペプチドエピトープを提供することである。本発明のもう一つの目的は、サイトカインであるインターフェロンγIFNγおよびインターロイキン12IL12の分泌を主に誘導することができる、Mtuberculosis由来の脂質化プロミスキャスペプチドエピトープを提供することである。本発明のもう一つの目的は、身体の肺および肺外領域における細菌負荷量を低減することができる、Mtuberculosis由来の脂質化プロミスキャスペプチドエピトープを提供することである。本発明のもう一つの目的は、該免疫原を含む医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、ナノ粒子への、Mtuberculosisのプロミスキャスペプチドエピトープの表面コーティングまたはカプセル化に基づくワクチンを提供することである。[発明の要約]本発明は、細胞内病原体、とりわけMtuberculosisに対する効果的な免疫応答を引き出すためのプロセスに関する。これは、TLRリガンドに連結されたMtuberculosis由来のプロミスキャスペプチドエピトープを含む合成免疫原を開発することによって達成される。該免疫原は、遊離型であってもよいし、ロバストな持続性防御免疫応答を効果的に引き出すことができるように、ナノ粒子およびまたはリポソーム中にカプセル化されていてもよい。本発明はさらに、Mtuberculosisに対する持続性免疫を付与するために、ナノ粒子への、Mtuberculosisのプロミスキャスペプチドエピトープの表面コーティングまたはカプセル化に基づくワクチンの形態にある医薬組成物に関する。開発された免疫原は、所望の免疫応答を惹起するために、マンノシル化リポソームまたは抗DEC205抗体でタグ付けされたリポソームに共有結合捕捉されていてもよい。開発された合成免疫原は、配列番号1~103表1によって表されるMtuberculosisプロテオーム由来のプロミスキャスペプチドエピトープを含む。プロミスキャスペプチドは、HLAクラスIHLAA、B、CおよびHLAクラスIIHLADR、DP、DQ分子への結合、T細胞増殖、サイトカインIL2、IL4、IL12、IFNγ分泌、ならびにインシリコ法に基づいて同定される。同定されたMHCIおよびMHCII結合性プロミスキャスペプチドは、セリンおよびまたはリジンリンカーを介した前記ペプチドへの共有結合に適する、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、TLR13から選択されるTLRリガンド例えばジアシルリポペプチド、トリアシルリポペプチド、リポアラビノマンナンlipoarabinomanan、リポテイコ酸、dsRNA、リポ多糖、フラジェリン、ジアシルリポペプチド、イミダゾキノリンおよびCpGオリゴヌクレオチドなどに共有結合される。さらに、ペプチドがAPCとりわけ樹状細胞によってCD4およびCD8T細胞に効果的に提示されるように、ペプチドを合成ナノ粒子またはリポソーム中にカプセル化してもよい図1。したがって本発明は、Mtuberculosisに対する持続性免疫を生成させるのに有用な合成免疫原を提供し、ここで、該免疫原は、一般式1:[式中、X1=配列番号1~98から選択されるプロミスキャスCD4Tヘルパーエピトープまたは無X2=配列番号99~103から選択されるプロミスキャスCD8T細胞傷害性エピトープまたは無X1=無の場合、X2=配列番号99~103、およびX2=無の場合、X1=配列番号1~98;Y=リジン;およびS=セリン]によって表される。ある実施形態において、本発明は、CD4T細胞応答とCD8T細胞応答の両方を引き出すために、TLR2リガンドPam2Cysに連結され、樹状細胞にターゲティングされる、Mtuberculosisから選択されるプロミスキャスペプチドいくつかのMHCIおよびMHCII分子に結合する能力を有するものを含む、合成ワクチンを提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、TLR2リガンドPam3Cysに連結されたMtuberculosisのプロミスキャスペプチドを含む合成ワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLR2リガンドリポペプチドMALP2に連結されたMtuberculosisのプロミスキャスペプチドを含む合成ワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLR4リガンドリポ多糖LPSに連結されたMtuberculosisのプロミスキャスペプチドを含む合成ワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLR9リガンドCpGオリゴヌクレオチドCpGODNに連結されたMtuberculosisのプロミスキャスペプチドを含むワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、ナノ粒子への、Mtuberculosisのプロミスキャスペプチドの表面コーティングまたはカプセル化に基づくワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、リポソームへの、Mtuberculosisのプロミスキャスペプチドの表面コーティングまたはカプセル化に基づくワクチンを提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、MtuberculosisのプロミスキャスCD4およびCD8エピトープをTLRアゴニストと混合することによって、ワクチンを提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、MtuberculosisのプロミスキャスCD4およびCD8エピトープをナノ粒子と混合することによる、ワクチンを調製するためのプロセスを提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、MtuberculosisのプロミスキャスCD4およびCD8エピトープをリポソームと混合することよる、ワクチンを調製するためのプロセスを提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、ワクチンを調製するためのプロセスであって、カプセル化の主な理論的根拠が、核酸TLR3、7、9のリガンドの場合およびTLRリガンドが主として細胞内にある場合がそうであるように、共有結合にはあまり適さない状況のためである、プロセスを提供する。しかし同じ戦略を、TLR2、4および5にも同様に適用することができる。なぜなら、それらは主として表面に発現するものの、エンドソームコンパートメントにおいても発現するからである。もう一つの実施形態において、本発明は、式:[式中、X1=配列番号1~98から選択されるプロミスキャスCD4Tヘルパーエピトープ;およびY=リジン;およびS=セリン]によって表される免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、式:[式中、X2=配列番号99~103から選択されるプロミスキャスCD8T細胞傷害性エピトープ;およびY=リジン;およびS=セリン]によって表される免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、式:[式中、Y=リジンおよびS=セリン]によって表される免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、配列番号1~103によって表されるプロミスキャスエピトープがMycobacteriumtuberculosis由来である、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLRリガンドが、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12およびTLR13リガンドからなる群より選択される、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLRリガンドが、ジアシルリポペプチド、トリアシルリポペプチド、リポアラビノマンナンおよびリポ多糖lipopolysacharideからなる群より選択される、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLRリガンドがS23ビスプロピルシステインPam2Cysである、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、HLAクラスIHLAA、B、C分子およびHLAクラスIIHLADR、DP、DQ分子への結合に基づいて同定される、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、T細胞増殖ならびにIFNγ、IL2、IL4およびIL12の分泌に基づいて同定される、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープがMHCHLA発現を強化する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、CD80、CD86およびCD40から選択される共刺激因子の発現を強化する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープがCD4およびCD8T細胞の増殖を強化し、かつCD69およびCD44の発現をアップレギュレートする、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスエピトープが、サイトカインIL2、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IFNγおよびTNFαの分泌を調整する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが、中枢およびエフェクターT細胞記憶の両方を含むCD4およびCD8T細胞記憶を強化する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが、メモリーCD4およびCD8T細胞におけるCD44、CD62LおよびCD127の発現を調整する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが、Mtuberculosisに対する肺および肺外免疫を増強する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが、PD1のような免疫抑制分子の発現をダウンレギュレートする、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが調節性T細胞の生成を阻害する、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、プロミスキャスエピトープが、IFNγの分泌を誘導することにより、健常患者および結核患者からのヒトリンパ球の増殖を誘導することができる、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、TLRリガンドをアジュバントとして利用し、それゆえに、追加のアジュバントを必要としない、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、樹状細胞、マクロファージおよびB細胞のような抗原提示細胞にターゲティングされる、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、ナノ粒子にコーティング/カプセル化されている、免疫原を提供する。さらにもう一つの実施形態において、本発明は、マンノシル化リポソームまたは抗DEC205抗体でタグ付けされたリポソームに共有結合捕捉されている、免疫原を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、該免疫原を、場合によっては医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む、医薬注射可能組成物を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、対象における結核に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、治療有効量の該免疫原を、場合によっては医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に投与することを含む方法を提供する。[発明の詳細な説明]使用する略号:TB:結核、Mtuberculosis:MycobacteriumtuberculosisBCG:カルメットゲラン桿菌BacillusCalmetteGuerinTLR:Toll様受容体HLA:ヒト白血球抗原MHC:主要組織適合遺伝子複合体DC:樹状細胞APC:抗原提示細胞L21:X1=配列番号2かつX2=0である免疫原L91:X1=配列番号1かつX2=0である免疫原p21:配列番号2によって表されるプロミスキャスエピトープp91:配列番号1によって表されるプロミスキャスエピトープPBMC:末梢血単核球PBS:リン酸緩衝食塩水PPD:精製ツベルクリンpurifiedproteinderivativePam2Cys:S23ビスプロピルシステインBMDC:骨髄由来DCAb:抗体pi:免疫処置後Mtuberculosis由来のペプチドおよびエピトープという用語は本発明においては交換可能に使用されている。本発明は、Mtuberculosis由来のプロミスキャスペプチドと、TLRリガンド[TLR]の生化学とを利用して、プロミスキャスCD4およびまたはCD8ペプチドエピトープがリジンおよびまたはセリンリンカーを介してTLRリガンドTLR1~TLR13と物理的に関連付けられている合成免疫原を設計する。これらは、共有結合することによって、または最終的には抗原提示細胞とりわけ樹状細胞によってヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞に効果的に提示されるであろう合成ナノ粒子またはリポソーム中にそれらをカプセル化することによって、医薬的に投与可能な形態で調製される。また、場合によっては、該免疫原が、それを医薬上許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせることにより、ワクチンの形態で調製される。Mtuberculosisプロテオーム由来のプロミスキャスペプチドをインシリコツールおよびまたは実験的方法を使って同定したところ、全部で103個であることがわかった。それらを表1に掲載する。この表には、本発明において使用したMtuberculosisの103個のCD4およびCD8プロミスキャスエピトープの全ての配列番号と配列が示されている。次に、同定されたペプチドを、そのペプチドへの共有結合に適したTLRリガンドに共有結合した後、合成ナノ粒子およびリポソームに混合およびまたはカプセル化した。本願において選ばれた実施例として使用するプロミスキャスT細胞エピトープは、ペプチド結合アッセイ参照結合ペプチドを使用するものおよびまたはT細胞増殖およびIFNγ、IL2、IL4分泌を使って同定されたAgrewalaandWilkinson199719981999;Weicholdetal2007。列挙したペプチド配列は、IEDB予測サーバーを使ってコンピュータで予測し、IC50<500の結合カットオフと、最低3つのHLAアレルに結合するペプチドの能力とに基づいて選択した。また、数個のペプチドをインビトロ結合アッセイおよびCD8T細胞溶解アッセイに基づいて選択したAxelssonRobertsonetal2009;Masemolaetal2004。上述の方法で試験したMtuberculosis由来のプロミスキャスペプチドエピトープの配列は、配列番号1~103[表1]によって表される。プロミスキャスペプチドへのTLRリガンドの共有結合:配列番号1~103によって表されるペプチドエピトープを、標準的Fmoc技法を使って合成した。コンストラクトが2つ以上のポリペプチドを有する場合は、それらをリジン残基で連結した後、免疫原性を強化するために、そしてまた、ペプチドをTLRリガンドに連結することを可能にするために、2つのセリン残基を付加した。確立された方法Jacksonetal2004を使って、ペプチドセリンリンカーを伴うものを、TLRリガンドにカップリングした。手短に言うと、過剰の合成TLRリガンド、OベンゾトリアゾールNNNNテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、および1ヒドロキシベンゾトリアゾールを、ジクロロメタン[DCM]に溶解し、3倍過剰のジイソプロピルエチルアミンを加えた。次に、この溶液を、レジン結合ペプチド前もって合成したものに加えてリポペプチドを生成させ、それをレジンから切り出し、逆相クロマトグラフィーを使って精製した。免疫原の免疫原性を増加させるために、2つのセリン残基をペプチドの後ろに付加した。上で調製した免疫原を、APCの表面に発現したTLR、ならびにMHCクラスIおよびII分子に結合させた。TLRのトリガリングはAPCの成熟ならびに共刺激分子およびサイトカインのアップレギュレーションをもたらした。成熟APCは、CD4およびCD8T細胞にペプチドを効果的に提示し、Mtuberculosisに対するロバストな免疫応答を引き出す図1。この戦略は、インビボで直接使用することもできるし、あるいはインビトロで、DCにこの免疫原をパルスし、トリガーしてから、防御免疫を誘導するために宿主に養子移入することもできる。ペプチドおよびTLRリガンドのカプセル化:例えば核酸TLR3、7、9のリガンドがそうであるように共有結合が容易でない場合、およびTLRリガンドが主として細胞内にある場合には、カプセル化を行う。ただし、TLR2、4および5にも、同じ戦略を適用することができる。なぜなら、それらはエンドソームコンパートメントでも発現しているからである。Mtuberculosis由来のプロミスキャスCD4およびCD8エピトープを、これらのペプチドに共有結合することができない核酸のようなTLRリガンドと混合するか、または共有結合したTLR2、4リガンド-プロミスキャスエピトープを、ポリγグルタミン酸、ポリジメタクリレート、2ジエチルアミノエチルメタクリレート、アミノエチルメタクリレート、メチルメタクリレートmehtylmethacrlateなどを使って、樹状細胞に取り込まさせるためのナノ粒子様複合体の形でカプセル化した。さらにまた、この戦略に特別な変更を加えて、樹状細胞を標的にすることもできる。全てのAPCは抗原を貪欲に取り込むことができる。APCのなかで、樹状細胞は直径500~700nmまでの大サイズの粒子を取り込むことができる。しかし、ナノ粒子にカプセル化された抗原の効果的な免疫処置のためには、サイズを200nm以下にすべきである。それゆえに、直接的免疫処置の場合は直径200nmの粒子が、また、カプセル化された材料のインビトロ添加後に、生体系に養子移入する場合は500nmのカプセル化粒子が、理想的であるだろう。Mtuberculosis由来のプロミスキャスCD4およびCD8T細胞エピトープを、これらのペプチドに共有することができない核酸のようなTLRリガンドと混合し、共有結合したTLR2、TLR4リガンド-プロミスキャスエピトープを、樹状細胞に取り込まさせるためのナノ粒子様複合体の形でカプセル化した。APCはカプセル化されたコンストラクトを貪欲に取り込み、ひとたびそれがエンドソームコンパートメントに達すると、TLRリガンドがAPCを活性化し、CD4T細胞エピトープがMHCII分子に負荷されて、CD4T細胞に提示されるであろう。CD8T細胞エピトープはMHCI分子に負荷され、効果的なCD8T細胞プライミングを引き出して、最終的にはロバストなCD4およびCD8T細胞応答につながるであろう。データによれば、脂質化プロミスキャスペプチドは、多くのマウス系統においてロバストナT細胞応答を与える図2。さらにまた、ヒトにおけるHLA拘束性を回避することもできる図3。さらに、これはDC成熟を強化し、主としてTh1応答をもたらす図4、5。この戦略を使って、多くの病原性生物およびがん、アレルギーのような一連の疾患に対する効果的な免疫応答を生成させることができる。以下の実施例は例示のために記載するに過ぎず、したがって本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。実験動物.実験には6~8週齢の雌BALBc、C3He、およびC57BL6マウスを使用した。別段の言及がある場合を除き、全ての実験をBALBcで行った。防御試験には雌DuncanHartleyモルモット6~8週齢を使用した。動物は、InstituteofMicrobialTechnologyインドチャンディーガルおよびNationalJALMAInstituteforLeprosyandOtherMycobacterialDiseasesNJILOMDインドアグラのバイオセーフティーレベル3施設において飼育した。動物にはペレット飼料と水を自由に摂取させた。患者および健常ボランティア.喀痰陽性肺結核患者およびPPD健常ボランティアの血液からPBMCを分離した。免疫処置.開発された免疫原性リポペプチド20nmol匹でマウスを免疫処置した。21日後に、ブースター用量10nmolを投与した。ブースター免疫処置の45日後に動物を屠殺した。長期T細胞記憶試験および防御試験の場合は、リポペプチドまたは対照非脂質化ペプチドを腹腔内に免疫処置し20nmolマウスまたは100nmolモルモット、21日後に、ブースター10nmolマウスおよび50nmolモルモットを接種した。比較のために、BCG1×106CFU匹で動物を免疫処置した。動物を75日間休ませてから、生Mtuberculosisによるエアロゾルチャレンジを行った。チャレンジの30日後に動物を屠殺した。[実施例1]脂質化ペプチドの合成:ペプチドおよびリポペプチドの合成、精製、および特徴づけは、以下に詳述する手順に従って行った。CD4T細胞エピトープとCD8T細胞エピトープの間に脂質を取り付けることができるように、レジン結合ペプチドのほぼ中央で、2つのエピトープの間の一点に、FmocリジンMttOHを挿入した。ペプチド合成の完成後に、DCM中の1TFAを使って30~45分間にわたる連続フロー洗浄により、Mtt基を除去した。次に、露出したεアミノ基に、Pam2Cysを、既述の手順に従ってカップリングしたZengetal1996。Pam2Cys部分とペプチド部分の間のセリンの存在は免疫原性を改善する。それゆえに、Pam2Cys含有ペプチド免疫原のペプチド部分と脂質部分の間に、2残基のセリンを組み込んだ。これは、単に、脂質部分を共有結合する前に、ペプチドに2つのセリン残基を逐次的に付加することによって行われた。この方法を使用して、単一のプロミスキャスCD4またはCD8T細胞エピトープを含有するコンストラクト、またはCD4およびCD8T細胞エピトープをどちらも含有するコンストラクトを合成した。免疫原性は、マウス、モルモットにおいて、またヒトリンパ球を使って、実験的に検証した。単純な配列については、自動合成装置の使用は時間の節約になり、問題も比較的少ないが、ペプチドを手動で合成することによって、より高い自由度と、アセンブリプロセスの制御が可能になることがわかった。これは、任意の時点で迅速かつ容易な介入が可能になることから、難しい配列の合成にとっては特に重要である。本実験室においてペプチドの手動合成に日常的に使用されている装置は、ガラス製多岐管最大4つの焼結ガラス漏斗を支えることができ、それにより、最大4つのペプチドの同時合成を可能にするものを取り付けたフラスコからなる。溶媒を各漏斗から吸引することができるように、フラスコの側枝には、真空ポンプが取り付けられる。多岐管には、減圧を4つの漏斗全てにあまねく適用するか、または個々の漏斗に制限することができるように配置された弁も含まれている。ペプチド合成に利用することができる固相支持体の選択肢は非常に多く、ペプチド化学者を目指す人は、ほんの少し時間を費やすだけで、実行可能な手段に精通することになるはずである。ただし、MHCIIに結合するように設計されたTヘルパー細胞エピトープおよびMHCI分子の溝にフィットするように設計された細胞傷害性T細胞エピトープのためには、遊離カルボキシルCOOH基をC末端に含有するペプチドをアセンブルするためのレジンすなわちRappPolymereのTentagelSPHBレジンを使用すべきである。配列番号1[SEFAYGSFVRTVSLPVGADE]K配列番号2[FVRSSNLKF]を含む免疫原の合成の場合は、1gのTentagelSRAMレジンを焼結ガラス漏斗にはかりとり、室温のDMF中で少なくとも30分間は膨潤させた。1.レジン上のFmoc保護NH2基を露出させるために、ピペリジンまたはDMF中の25DBUで5分間×2回処理した後、DMFで4回洗浄した。2.092mmolのFmocアミノ酸すなわち、支持体の置換レベルに対して4倍過剰のアミノ酸をきれいな乾燥プラスチックチューブSarstedt、ドイツにはかりとった;[容量10mLのチューブが理想的である]。アミノ酸の量に対して等モル量のHOBTおよびHBTUを、2mLのDMFおよび固相支持体の置換レベルに対して6倍過剰のDIPEAに加えた。ボルテックスおよび超音波処理により、完全に溶解した。3.ガラス焼結フィルター漏斗中の膨潤レジンから、真空ポンプを使った吸引によってDMFを除去し、活性化されたアミノ酸溶液を加えた。スパチュラで撹拌し、室温で30~45分間、ときおり撹拌しながらインキュベートした。4.30~45分後に、アミノ酸溶液を吸引し、次に、レジンをDMFで2回洗浄した。5.レジンのビーズを数粒、パスツールピペットで、エッペンドルフチューブに移し、2滴のDIPEAを加えた後、5滴のTNBSA溶液を加えた。目視または顕微鏡下でビーズを調べた。1分後にビーズが無色であるなら、アシル化は完了しており、次のステップを行った。ビーズ中にわずかでも橙色があれば、それは遊離アミノ基の存在と不完全なカップリングを示す。その場合は、TNBSA試験が陰性になるまで、ステップ2~5を繰り返すべきである。6.カップリングされたアミノ酸のNFmoc基を、ステップ1を実行することによって除去した。Fmoc基の除去は、陽性の橙色変化をもたらすTNBSA試験を行うことによって確認した。7.次のアミノ酸を使って、配列番号103が完成するまで、ステップ2~6を繰り返した。8.脂質の取り付けを可能にするために、KOHを使ってステップ3~6を繰り返すことで、2つのエピトープの間に脂質を取り付けることができるようにした。9.配列番号1に対応するアミノ酸でステップ2~6を繰り返した。10.ペプチドのN末端を一時的にブロックするためにGlyOHを使ってステップ3~6を繰り返した。Boc保護基は、アセンブルされた生成物のレジンからの切り出しとそれに付随する側鎖保護基の除去までは、脂質の取り付けに使用した条件による除去に対して耐性である。11.この時点で、レジン上の完成したペプチドを、DMF、DCM、およびメタノール中で逐次洗浄し、減圧下で乾燥し、非脂質化ペプチド対照として使用するために切り出す準備が整うまでは、乾燥雰囲気下に室温で保存した。12.ステップ11に続けて、レジンをDMC中の1TFAで、12分間×5回、処理することで、2つのエピトープの間に位置するリジン残基の側鎖からMtt基を除去した。13.介在リジン残基の露出したεアミノ基に2つのセリンをカップリングするために、ステップ2~6を繰り返し、2番目のセリン残基からFmoc基を除去した。この時点で、ペプチドは、脂質取り付けのための準備が整っている。ペプチドへのTLRリガンドPam2Cysの取り付けSシステインの合成1.トリエチルアミン6g、82mL、58mmolを、水中のlシステイン塩酸塩3g、19mmolおよび3ブロモプロパン12ジオール42g、236mL、27mmolに加えた。この均一溶液を3日間、室温に保った。2.この溶液を減圧下、4°Cで濃縮して白色残渣とし、それをアセトンで3回洗浄し、乾燥することにより、Sシステインを、白色無定形粉末24g、123mmol、647として得た。この生成物は、これ以上精製せずに、次のステップに使用した。NフルオレニルメトキシカルボニルSシステインFmocDhcOHの合成1.Sシステイン245g、126mmolを20mlの9炭酸ナトリウムに溶解した。2.フルオレニルメトキシカルボニルNヒドロキシスクシンイミド345g、105mmolのアセトニトリル20mL溶液を加え、その混合物を2時間撹拌した。水240mLで希釈し、ジエチルエーテル25mL×3で抽出した。3.濃塩酸で水相をpH2に酸性化した後、酢酸エチル70mL×3で抽出した。4.抽出物を水50mL×2および飽和塩化ナトリウム溶液50mL×2で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。-20°Cでエーテルおよび酢酸エチルから再結晶することにより、無色の粉末28g、67mmol、638を得た。レジン結合ペプチドへのFmocDhcOHのカップリング1.DMF3mL中のFmocDhcOH100mg、024mmolを、HOBT36mg、024mmolおよびDICI37al、024mmolを使って、0°Cで5分間、活性化した。2.この混合物を、レジン結合ペプチド006mmol、025gのアミノペプチドレジンが入っている容器に加えた。2時間振とうした後、濾過によって溶液を除去し、レジンをDCMおよびDMF30mL×3で洗浄した。TNBSA試験を使って反応の完了を監視した。FmocDhcペプチドレジンの2つのヒドロキシ基のパルミトイル化1.パルミチン酸307mg、12mmol、DICI230L、15mmolおよびDMAP146mg、012mmolを3mLのDCMに溶解した。2.レジン結合FmocDhcペプチドレジン006mmol、025gを上記の溶液に懸濁し、室温で16時間、振とう下に保った。濾過によって上清を取り除き、ウレアの残渣を全て除去するために、DCMおよびDMFで十分に洗浄した。Fmoc基の除去は、25DBU5分×2で達成した。固相支持体からのリポペプチドの切り出しこの手順では、リポペプチドまたはペプチドを固相支持体から切り出すと同時に、側鎖保護基を有するアミノ酸から側鎖保護基を除去する。1.減圧乾燥したレジンを、きれいな乾燥マッカートニーガラス瓶に移し、3mLの切り出し試薬88TFA、5フェノール、5水、および2TIPSを加えた。2.窒素を穏やかに吹き込み、ときおり撹拌しながら少なくとも3時間は放置した。3.その混合物を、非脱脂綿nonadsorbentcottonwoolを詰めた5mLシリンジの筒に移し、プランジャーを使って、ペプチド含有上清をきれいな乾燥10mL遠心チューブに吐出した。4.その溶液を穏やかな窒素気流下で体積が約500μLになるまで蒸発させた。5.10mLの冷ジエチルエーテルをペプチド溶液に加え、激しくボルテックスすることで、ペプチドを沈殿させた。6.ペプチド材料を沈降させるために遠心分離し、ジエチルエーテルを吸引することによって洗浄し、沈殿物を冷ジエチルエーテルに再懸濁した後、冷ジエチルエーテルで2回洗浄した。7.最終洗浄後に、残っているジエチルエーテルを吸引し、ペレットを換気フード中で約1時間乾燥させた。8.沈殿物を01TFA水溶液に溶解し、凍結乾燥した。9.逆相クロマトグラフィーを使って生成物純度を評価し、質量分析によってターゲット配列の忠実度fidelityを評価した。簡単に述べると、T細胞エピトープを、マイコプラズマ由来のマクロファージ活性化リポペプチド2MALP2の脂質構成要素に相当する脂質部分Pam2Cysにコンジュゲートした。配列番号1~98によって表されるCD4T細胞プロミスキャスペプチドを、Mtuberculosisの16kDa分泌タンパク質から選択し、Pam2Cysにコンジュゲートすることで、免疫原L91を作製した。配列番号99~103によって表されるCD8プロミスキャスT細胞エピトープを、Mtuberculosisの抗原85Bから選択した。対照リポペプチドは、配列KYVKQNTLKLを含有するインフルエンザヘマグルチニンウイルスHA由来のエピトープを使って合成した。全てのペプチドのN末端を2つのセリン残基で修飾し、次に脂質部分Pam2Cysで修飾することにより、合成リポペプチドを得た。[実施例2]マウスおよびモルモットにおける防御試験動物を上述のように免疫処置し、75日間休ませた。次に、それらを、100CFUマウスまたは30CFUモルモットのMtuberculosisH37Rvに、エアロゾル経路で曝露し、30日後に屠殺した。肺におけるマイコバクテリア負荷量をCFUプレーティングによって推定した。組織病理学的分析のために、ホルマリン固定組織を加工し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。結果リポペプチドの免疫処置はロバストなTh1免疫応答をもたらす配列番号1を含有する免疫原性リポペプチドで免疫処置したマウスを45日間休ませ、リコール応答について調べた。ペプチドによる再刺激時に、CD4TヘルパーT細胞におけるIFNγの優勢な生産図6が観察された。リポペプチドの免疫処置はマウスにおいてMtuberculosisに対する防御をもたらす配列番号1SEFAYGSFVRTVSLPVGADEを含有する調製された免疫原リポペプチドを使って実験的結核からの防御が果たされうるかどうかを調べた。マウスにリポペプチドまたは対照BCG、遊離ペプチド、インフルエンザヘマグルチニン由来の無関係なリポペプチド、およびプラセボをワクチン接種した。その後、ワクチン接種後75日目に、マウスに、Mtuberculosisをエアロゾルチャレンジし、30日後に屠殺した。配列番号1を含有する免疫原リポペプチドで免疫処置したマウスは、BCGp<005および他の対照と比較して、マイコバクテリウムの成長を有意に制限することが観察された図7。リポペプチドによる免疫処置はモルモットにおいてMtuberculosisに対する防御をもたらす次の一組の実験は、モルモットにおいて、配列番号1SEFAYGSFVRTVSLPVGADEを含有する免疫原リポペプチドによるワクチン接種が、実験的結核からの防御を果たしうるかどうかを証明するために行った。DuncanHartleyモルモットに、調製したリポペプチドまたは対照プラセボ、BCG、遊離ペプチド、およびインフルエンザヘマグルチニンウイルス由来の無関係なリポペプチドをワクチン接種した。その後、ワクチン接種後75日目に、動物にMtuberculosisをエアロゾルチャレンジし、30日後に屠殺した。配列番号1を含有する免疫原リポペプチドで免疫処置した動物は、肺に抱える細菌負荷が、BCGおよび他の対照と比較して有意に低いことが観察された図8。[実施例3]エアロゾル感染および肺におけるマイコバクテリア負荷量MtuberculosisH37Rvの凍結ストックを37°Cで素速く融解し、10000×gで10分間遠心分離し、PBSTween80で2回洗浄した。吸入曝露システムGlasCol、インディアナ州テレホートを使って約100個マウスまたは30個モルモットの生細菌を肺に沈着させることで曝露の24時間後のCFUプレーティングによって調べた、ペプチドBCGプラセボ免疫処置動物に、規格化された低用量のエアロゾル感染で、チャレンジした。感染の30日後に、肺を収穫し、Tween80005が補足された7H9中でホモジナイズした。個々の肺のホモジネートを連続希釈したものを、チオフェンカルボキシルヒドラジドTCH、2μgmlおよびOADCを含有するミドルブルック7H11上にプレーティングした。37°Cで3~4週間のインキュベーション後にCFUを計数した。リポペプチドの免疫処置はマウスにおいて結核に対する防御をもたらす.配列番号1SEFAYGSFVRTVSLPVGADEを含有する調製された免疫原リポペプチドを使って、実験的結核からの防御が果たされうるかどうかを調べた。マウスにリポペプチドまたは対照BCG、遊離ペプチド、インフルエンザヘマグルチニン由来の無関係なリポペプチド、およびプラセボをワクチン接種した。その後、ワクチン接種後75日目に、マウスに、Mtuberculosisをエアロゾルチャレンジし、30日後に屠殺した。配列番号1を含有する免疫原リポペプチドで免疫処置したマウスは、BCGp<005および他の対照と比較して、マイコバクテリウムの成長を有意に制限することが観察された図7。リポペプチドによる免疫処置はモルモットにおいて結核に対する防御をもたらす次の一組の実験は、モルモットにおいて、配列番号1SEFAYGSFVRTVSLPVGADEを含有する免疫原リポペプチドによるワクチン接種が、実験的結核からの防御を果たしうるかどうかを証明するために行った。DuncanHartleyモルモットに、調製したリポペプチドまたは対照プラセボ、BCG、遊離ペプチド、およびインフルエンザヘマグルチニンウイルス由来の無関係なリポペプチドをワクチン接種した。その後、ワクチン接種後75日目に、動物に、Mtuberculosisをエアロゾルチャレンジし、30日後に屠殺した。配列番号1を含有する免疫原リポペプチドで免疫処置した動物は、肺に抱える細菌負荷が、BCGおよび他の対照と比較して有意に低いことが観察された図8。[実施例4]脾臓からのリンパ球の単離脾臓を無菌的に摘出し、単細胞懸濁液を調製した。RBCをACK溶解バッファーNH4Cl015M、KHCO310mM、EDTA88μMによって溶解し、PBSで三回洗浄し、完全培地[CM;FBS10を含有するRPMI1640]に再懸濁した。脾細胞2×105ウェルを96ウェルU底プレート中で48~72時間培養した。異なる濃度のペプチドを培養物に加えた。前もって設定された用量50または100ngmlの市販超高純度Pam2CysInvivogenを対照として使用した。リポペプチド免疫処置マウスからのリンパ球は、ペプチドによるリコール刺激に対し、T細胞増殖およびIFNγ分泌によって、効果的に応答した図2および5B。[実施例5]増殖アッセイT細胞増殖アッセイは、ヒトPBMCまたはマウス脾細胞をペプチドと共にそれぞれ72時間および48時間インキュベートすることによって設定した。その後、[3H]チミジン05μCiウェルを取り込ませた。16時間後に、プレートを収穫し、取り込まれた放射能を測定した。細胞増殖アッセイは、既述のとおりに設定したSinghetal2011。簡単に述べると、脾臓およびまたはリンパ節から単離したリンパ球2×105細胞ウェルを、96ウェルU底プレートにおいて、異なる濃度のL91F91と共に、200μlの完全RPMI1640中で、三つ一組にして培養した。48時間および72時間後に、培養物に05μCiの[3H]チミジンをパルスした。16時間後に、TomtecHarvester96Tomtec、コネティカット州ハムデンを使って、プレートを収穫した。取り込まれた放射能をWallac1450MicrobetaTriluxβシンチレーション計数器PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサムによって測定した。ヒトリンパ増殖の場合は、PPDボランティアまたは喀痰陽性結核患者から血液20mlをバキュテイナーに採取した。Histopaque1077を製造者の指示に従って使用することにより、末梢単核球PBMCを密度勾配法で単離した。1FBSを含有するPBS中で精製PBMCを4回洗浄した。細胞2×105細胞ウェルを、U底96ウェルプレートにおいて、ペプチドと共に、CM2メルカプトエタノールを含まないもので、三つ一組にして培養した。細胞を72時間インキュベートした後、05μCiの[3H]チミジンをパルスした。上述のように、16時間後にプレートを収穫した。結核患者の末梢血単核球の刺激におけるリポペプチドの影響を図9に図解する。配列番号1SEFAYGSFVRTVSLPVGADEを含有する免疫原性リポペプチドは、非脂質化ペプチド対応物と比較して、ヒトPBMCの増殖を強化した。興味深いことに、最もよい応答は、CD4ヘルパーエピトープ配列番号1とCD8細胞傷害性エピトープ配列番号103の両方を含有するリポペプチド免疫原コンストラクトで得られることが観察された。[実施例6]細胞内染色リンパ球2×106細胞mlを、96ウェルプレートにおいて、三つ一組にして、ペプチドと共に48時間培養した。細胞をプールし、洗浄バッファーFBS1を含有するPBSで2回洗浄した。細胞を、PMA50ngmlおよびイオノマイシン1μgmlで、6時間37°C、再刺激し、最後の4時間はブレフェルジンA10μgmlを培養物に加えた。6時間の活性化後に、細胞を染色バッファーPBS中のBSA1、NaN3001で2回洗浄した。Fc受容体を24G2でブロッキングしてから、CD4を、抗マウス蛍光色素標識mAbで染色した。細胞を染色バッファーで2回洗浄し、パラホルムアルデヒド2中で固定した。次に、それらをPBSFCS1中のサポニン001透過処理バッファーで透過処理した。これに続いて、透過処理バッファーサポニン001を含有する染色バッファー中で、蛍光色素標識抗サイトカインAbまたはそのアイソタイプ対照と共にインキュベートした。各ステップのインキュベーション期間は30分4°Cとし、そうでない場合は言及する。最後に、細胞をパラホルムアルデヒド1中で固定し、FACSAriaIIで取得し、データをFACSDIVABDBiosciences、カリフォルニア州サンホゼによって解析した。リポペプチド免疫処置マウスからのリンパ球は、ペプチドによるリコール刺激に対し、IFNγの分泌によって、効果的に応答した図6。注目すべきことに、IFNγの分泌はCD4T細胞に特異的であった。ペプチド構成要素が存在しない場合、Pam2Cysだけでは、CD4T細胞におけるIFNγの生産は引き出されなかった。統計解析.GraphPadInStat3ソフトウェアにより、対応のないスチューデントt検定およびスチューデントニューマンクールズ多重比較検定で、データを解析した。[本発明の利点]本エピトープは正確に定義されており;抗原中の自己反応部分を避けることができる。甚だしいプロセシングを必要としない。開発された免疫原はアジュバントを何ら必要としない。完全合成物である。CD4T細胞とCD8T細胞をどちらも活性化することができる。免疫応答をTh1型に傾ける。ナイーブT細胞を活性化することができる。持続性メモリーT細胞の生成を誘導することができる。身体の肺および肺外領域における細菌負荷量を低減することができる。[表1]配列番号とそれぞれの配列使用したプロミスキャスエピトープ[ペプチド]の一覧