アクチビンA及びヒト胚性幹細胞のインビトロ子孫である内胚葉細胞の集団を含み、前記内胚葉細胞の集団が、Sox17を発現する細胞、HNF3βを発現する細胞およびHNF4αを発現する細胞を含む、細胞培地。ナトリウムブチラートをさらに含む、請求項1に記載の細胞培地。Sox17が、未分化細胞におけるSox17発現の100倍を超えて発現される、請求項2に記載の細胞培地。HNF3βが、未分化細胞におけるHNF3β発現の10倍を超えて発現される、請求項2に記載の細胞培地。実施例6この分化の段階的アプローチは当業者への手引きとして意図したものであり、特記しない限り本発明を限定するものではない。分化経路はさらなる段階に分類することが可能であり、段階的分化は付加的様式で最適化することができる。例えば、膵前駆細胞と成熟膵島の間の潜在的中間体は、膵内分泌を形成するように拘束された前駆細胞である。一方、状況に応じて、効果的な分化剤を組み合わせ、異なる段階の細胞に同時に作用させても、または分化経路を下るカスケード効果を促進してもよい。所望の最終段階の細胞集団は、一部その使用目的に依存することになる。例えば、拘束された膵島前駆細胞は、汎発性膵島機能不全の治療およびインビトロでの膵島分化の研究に非常に価値がある場合がある。初期の前駆細胞ほど自己複製のより優れた能力を有する可能性がある。ホルモンの即時産生が必要とされる場合は、高レベルのインスリン合成または他の内分泌物合成を示す成熟細胞集団である。分化過程を目的に応じて合わせ、所望の成熟レベルをもたらす段階で過程を停止させる。以下の項では、記載した方法で分化を促進する上で効果的な、組織培養および遺伝子トランスフェクション技術を提供する。分化過程の開始内胚葉細胞に向けてpPS細胞の分化を開始するには、2つのアプローチが存在する。1つは、細胞を新しい基層上にプレーティングすること、または培地を交換して細胞外基質または分化を阻害する可溶性因子を除去することである。これは直接分化法と称される場合があり、国際公開公報第0151616号および米国特許公報第20020019046号において一般用語として記載されている。通常、直接分化法では、分化過程における残りのフィーダー細胞に起因して起こりうる問題を回避するために、pPS細胞の無フィーダー培養から開始することが好ましい。実施例4は、初期分化因子を含む培地を導入することにより、消化管内胚葉が直接分化によって産生される例を提供する。もう一方のアプローチは未分化pPS細胞を懸濁培養中に添加することであり、これにより頻繁に細胞に胚様体または凝集塊を形成させることになる。例えば、短時間のコラゲナーゼ消化によりpPS細胞を回収し、塊に解離し、非接着性の細胞培養プレート中で継代する。数日おきに凝集塊に培地を添加し、適切な期間後、典型的には4~8日後に回収する実施例1および5。いくつかの例においては、培地中の他の因子により分化が増強される:例えば、レチノイン酸実施例5またはジメチルスルホキシドDMSO。条件に応じて、凝集塊は一般に、実質的頻度の内胚葉細胞を含む細胞種の不均一な集団を形成することから開始することになる。次に胚様体を分散させ、分化過程の次の段階のために、非接着性のプレートおよび適切な培地を用いて、ラミニンまたはフィブロネクチン等の基層上に再プレーティングするか、または懸濁培養で継代することができる。直接分化または凝集塊での分化は、以下に記載するマーカーを用いて内胚葉細胞の存在についてモニターすることができる。十分な比率の内胚葉が得られると、細胞を再プレーティングするか、またはさもなくば段階IIを開始するように操作する。ある状況において、膵島細胞の分化または維持は、α細胞、β細胞、およびδ細胞が直接相互作用できるように細胞が微量塊例えば、50~5000細胞として維持される場合に増強され得る。このような方法で共通前駆細胞が作製されると、以下の項に記載するように、この細胞を特異的分化因子と共に培養する、およびまたは膵島特異的遺伝子またはプロモーターで誘導することができる。可溶性因子を用いての膵島細胞にさらに向けた分化の駆動培養物を膵島経路のさらに下流の段階に向けて駆動するため、pPS細胞またはその分化した子孫を膵島分化因子の混合物中で培養してもよい。それぞれの因子は、単独でまたは組み合わせで、所望の細胞種への変換頻度を増加させ、膵島表現型を有する細胞の増殖をもたらし、他の細胞種の増殖を阻害し、または別の様式で膵島細胞を濃縮する可能性がある。本発明を実施するために、膵島細胞が濃縮される機構を理解する必要はない。以下は候補分化因子の限定されないリストである。表1pPS細胞から膵島細胞を分化させるための因子同じ受容体に結合する他のリガンドまたは抗体も、本開示に引用する任意の受容体リガンドと同等物であると考えられ得る。典型的に、分化混合物中では少なくとも2つ、3つ、またはそれ以上のそのような因子が組み合わされる。ヒトタンパク質が好ましいが、種相同体および変種も使用され得る。任意のこれら因子の代わりに、当業者は、受容体特異的抗体等の、同じ受容体に結合するまたは同じシグナル伝達経路を促進する他のリガンドを使用してもよい。さらに、分化を異なる経路の下流に駆動するように存在する可能性がある他の因子の効果を中和するために、培地中に他の化合物を含めてもよい。マトリックスストラテジーを用いて任意のこれら因子の有効性を実験的に決定し、膵島細胞経路の1段階または複数段階下流に分化を促進し得る組み合わせを導き出すことができる。有効性は、以下に記載するような表現型マーカーを用いて、意図する中間体または最終段階の細胞の表現型の出現をモニターすることにより評価する。例えば、膵臓内分泌部の分化または増殖を誘導すると思われる因子を、標準培養条件においてPdx1発現を誘導する能力について、続いてインスリン発現を誘導する能力について試験する。一部要因配置実験ストラテジーを用いて、効果的な様式でいくつかの化合物をスクリーニングすることができる。各因子を2つのレベルに割り当てる。例えば、培養マトリックスに、1つのレベルにはフィブロネクチンをもう1つのレベルにてはラミニンを割り当てる。64の因子の組み合わせ64実験において、統計学的に確固とした様式で、15~20の群によるどの因子が分化に有意に影響を及ぼすかを決定することが可能である。本ストラテジーによる解析に適切な組み合わせには、シクロパミン、TGFファミリーメンバーTGFα、アクチビンA、アクチビンB、TGFβ1、TGFβ3、エキセンディン4、ニコチンアミド、nブチラート、DMSO、オールトランスレチノイン酸、GLP1、骨形態形成タンパク質BMP2、BMP5、BMP6、BMP7、インスリン様増殖因子IGFI、IGFII、線維芽細胞増殖因子FGF7、FGF10、bFGF、FGF4、他の増殖因子EGF、ベータセルリン、成長ホルモン、HGF、他のホルモンプロラクチン、コレシトキニン、ガストリンI、胎盤性ラクトゲン、TGFβファミリーアンタゴニストノギン、フォリスタチン、コルディン、IBMX、ウォルトマンニン、デキサメタゾン、Reg、INGAP、cAMPまたはcAMP活性化因子フォルスコリン、および細胞外基質成分ラミニン、フィブロネクチンが含まれる。表現型マーカーにより出現する細胞集団を評価し、かつ発現パターンを解析して、分化経路においてどの因子が正または負の影響を有するかを決定する。遺伝子改変細胞を用いた分化の方向づけまたはモニタリング分化または分離のストラテジーを最適化する上で、組織特異的プロモーターがレポーター遺伝子の発現を駆動する、ベクターで遺伝子改変した細胞を用いることが役立つ場合がある。膵島前駆細胞に特異的である適切なプロモーターには、Pdx1NT009799、ニューロゲニン3NT008583、ニューロNeuroD1NT005265、ネスチンNT004858、およびPtf1ap48NT008705の転写を駆動するプロモーターが含まれる。成熟膵島細胞に特異的である適切なプロモーターは、インスリンGenabankアクセッション番号NT009308、グルカゴンNT022154、ソマトスタチンNT005962、または膵ポリペプチドNT010755の発現を駆動するプロモーターである。選択したプロモーターの最小限の効果的な配列上流配列の約05~5kBをPCRにより増幅し、適切なレポーター遺伝子の発現を駆動する位置で、標準的なプラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターに結合する。適切なレポーター遺伝子は、蛍光分子緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ等をコードするか、検出可能な酵素アルカリホスファターゼ等をコードするか、または抗体またはレクチン結合によって検出され得る細胞表面抗原任意の異種性タンパク質または炭水化物を産生する。組織特異的プロモーターをトランスフェクションした細胞を用いて、既に記載した様式で分化手順を最適化することができる。例えば、トランスフェクションした未分化pPS細胞または分化の初期段階にある細胞を様々な分化計画に供し、次に膵島特異的プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子を発現する細胞の比率について解析することができる。これにより、効果的な分化剤、培養環境、およびタイミングの迅速な読み取りが提供される。次に最適な手順を未分化細胞に用いて、天然の遺伝子型を有する高品質な膵島系譜集団を産生することができる。組織特異的プロモーターをトランスフェクションした細胞を、機械的選別を達成する手段として使用することもできる。例えば、プロモーターは、ネオマイシン耐性遺伝子薬剤G418に対する耐性を付与するまたはブラストサイジン耐性遺伝子等の薬剤耐性表現型の発現を駆動してよい。この場合、ひとたび細胞を分化させたら、所望の細胞種の増殖を促進する薬剤と共にそれら細胞を培養する。または、レポーター遺伝子は、蛍光分子をコードするかまたは検出可能な表現抗原の発現をもたらしてもよい。この場合、関心対象の細胞は、直接的もしくは間接的蛍光に基づく細胞選別により、または免疫吸着により、分化細胞集団から選別される。選別段階中に非複製型である非組み込み型ベクターアデノウイルスベクター等を一過性トランスフェクションに用いることができ、このベクターは次の細胞の増殖に際に細胞の天然の遺伝子型をそのままにして希釈除去されることになる。細胞を膵島細胞またはその前駆細胞の分化経路のさらに下流に直接駆動させる目的で、細胞を遺伝子改変することもできる。通常膵島細胞で発現されるある遺伝子の意図的な上方制御により、それほど分化していない細胞に、より成熟した膵島細胞に適した遺伝子発現プロファイルが補充されることが仮定される。適切な遺伝子には、下流遺伝子の発現に影響を及ぼし得る転写制御因子をコードする遺伝子が含まれる。膵臓個体発生のための候補には、およそ経路でのその位置の順にSox17Genabankアクセッション番号NM022454、Hlxb9NT005515、Pdx1NT000209、ニューロゲニン3NM020999、Pax4NM006193またはニューロD1NM002500、Isl1NM002202、Nkx22NM002509、およびNkx61NM006168が含まれる。本アプローチの例を実施例6に提供する。膵島細胞分化パラダイムにおいて細胞の形質導入によって誘導されるニューロゲニン3の発現は、下流の制御遺伝子および膵島ホルモンをコードする遺伝子の発現を増強する。ニューロゲニンはneuroD関連bHLH転写因子のファミリーである:神経系の発達において活発な神経決定遺伝子。分化細胞の特徴細胞は、形態学的特徴の顕微鏡観察、発現された細胞マーカーの検出または定量等の表現型基準、インビトロで測定可能な機能的基準、および宿主動物に注入した際の挙動に従い、特徴づけされ得る。表現型マーカー本発明の細胞は、それらが様々な種類の膵島細胞に特有の表現型マーカーを発現するか否かに従って特徴づけされ得る。有用なマーカーには、表2に示すマーカーが含まれる。表2細胞同定のための表現型マーカー組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフロー免疫細胞化学法、または細胞内または細胞表面マーカーについての免疫組織化学法例えば、固定化細胞または組織切片等の、任意の適切な免疫学的技術を用いて検出することができる。フローサイトメトリー解析の詳細な方法は、Gallacherら、Blood961740、2000に記載されている。細胞表面抗原の発現は、標準的な免疫細胞化学法またはフローサイトメトリーアッセイ法において、選択的に細胞を固定化した後、および選択的に標識二次抗体または標識を増幅する他の結合体を用いて、有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合した場合に陽性と定義される。特異的抗体の現在の供給源には以下のものが含まれる:インスリン、SigmaAldrichI2018;グルカゴン、SigmaAldrichG2654;ソマトスタチン、SantaCruzBiotechsc7820;ニューロゲニン3、ChemiconAB5684;ネスチン、BDTransductionLabsN17220;αアミラーゼ、SigmaAldrichA8273;Glut2、AlphaDiagnosticsGT22A。組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット解析法、ドットブロットハイブリダイゼーション解析法、または標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法RTPCRによりmRNAレベルで検出することもできる。さらなる詳細については、米国特許第5843780号を参照されたい。本開示に記載する特定マーカーの配列データは、GenBank等の公的データベースから入手可能である。最初の評価は、広範な個体発生プロファイルを提供するマーカーの組み合わせを用いて行われ得る:例えば、初期膵細胞についてのPdx1;初期膵内分泌細胞についてのNgn3;および成熟β細胞についてのインスリン。上記の分化パラダイムから定期的に例えば週に1度細胞を回収し、分化速度を決定する。これらのマーカーについて試験結果が陽性であった細胞は、次にIAPPおよびNkx61等の他のマーカーの発現について解析することができる。細胞が特徴づけられると、分化因子の組み合わせおよび各段階のタイミングを最適化することができる。本発明のある態様は、少なくとも2、5、10、またはそれ以上の細胞が、先に引用した表面マーカーを単独でまたは組み合わせて有する集団に関連する。内分泌機能は多くの研究および治療応用に重要であり、その場合、そのような内分泌細胞に分化し得る前駆細胞と同様に、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを分泌する細胞を少なくとも5含む集団に特に関心が持たれる。α細胞、β細胞、およびδ細胞間の相互作用が、脱分化の防止および効果的な内分泌の維持に重要である可能性があることは、本発明の仮説である。本発明はまた、自身の作製する基質に結合した、培養液中に供給される基質成分に結合した、またはマイクロカプセル化された、これらの細胞種を2つまたは3つ含む細胞の集団または塊おそらく大きさは50~5000細胞を含む。未分化pPS細胞が残存する比率が低い集団もまた望ましい。好ましい集団は、SSEA4ve、Oct4ve、または内因性テロメラーゼ逆転写酵素の発現陽性が1または02未満である。好ましい集団はまた、肝細胞アルブミン陽性細胞、骨格筋細胞myoD陽性、平滑筋細胞平滑筋アクチン、線維芽細胞形態を有する細胞、または神経細胞βチューブリンIIIまたはNCAM陽性細胞等のある種の他の細胞種を、比較的低い比率で3000molwtの多糖ポリマーで構成される球状の半透膜中にマクロカプセル化された膵島細胞について記載している。米国特許第6023009号では、アガロースおよびアガロペクチンでできた半透膜中にマクロカプセル化された膵島細胞について記載している。この種のマイクロカプセルは糖尿病患者の体腔への投与に適しており、組織適合性問題または細菌への感受性を減少させる上でいくらかの利点を有すると考えられる。糖尿病患者への移植のため、または体外療法のためのさらに複雑な装置もまた意図している。米国特許第4378016号では、体外部分、皮下部分、およびホルモン産生細胞を含む交換式外皮を含む人工内分泌線について記載している。米国特許第5674289号では、周囲の組織に開放された1つまたは複数の血管新生チャンバーに対して半透膜によって分離された膵島チャンバーを有する、バイオ人工膵臓について記載している。有用な装置は典型的に、膵島細胞を含むのに適したチャンバー、および膵島細胞から分泌されたタンパク質を収集し、かつまた膵島細胞に例えば循環グルコースレベル等のシグナルを戻すことも可能にし得る、半透膜によって膵島細胞から分離されたチャンバーを有する。本発明の特定の態様の限定されないさらなる例として、以下の実施例を提供する。実施例実施例1:胚幹細胞の無フィーダー増殖未分化ヒト胚幹hES細胞の樹立株は、基本的にフィーダー細胞を含まない培養環境で維持した。標準的な手順に従って単離した初代マウス胚線維芽細胞mEFを用いて、馴化培地をあらかじめ調製した国際公開公報第0151616号。hES細胞は、マトリゲル登録商標をコーティングしたプレート上で継代した。播種から1週間後、培養物はコンフルエントになり継代可能となった。これらの条件下で180日を超えて維持した培養物は、ES用の形態を示し続けた。SSEA4、Tra160、Tra181、およびアルカリホスファターゼは、免疫細胞化学法によって評価されるようにhESコロニーから発現されていたが、コロニー間の分化細胞からは発現されていなかった。多能性は、それら培養物を特定の細胞種を形成する確立した手順に供することにより確認した。実施例2:hES細胞からの肝細胞の導出サブコンフルエントな培養物中でDMSOを用いる全体的な分化過程を開始するストラテジーにより、未分化hES細胞をヒト肝細胞の特徴を有する細胞に分化させた。次にNaブチラートを添加することにより、細胞を誘導して肝細胞用様細胞を形成させる。手短に説明すると、分割後2~3日間、hES細胞を未分化培養条件下で維持した。この時点で、細胞は50~60コンフルエントであり、培地を1DMSOを含む非馴化SR培地と交換した段階II。4日間毎日培養物にSR培地を添加し、その後1DMSOおよび25Naブチラートを含む非馴化SR培地に交換し、6日間毎日培養物にこの培地を添加した段階III。次にこの培養物をコラーゲン上に再プレーティングし、肝細胞増殖因子の混合物を含む肝細胞成熟培地中で培養した段階IV。手順を表3に要約する。表3肝細胞分化手順図1は得られた肝細胞様細胞を示す。左列:倍率10X;右列:倍率40X。ブチラートの存在下で4日目までは、培養物中の80を超える細胞は直径が大きく、大きな核および顆粒状の細胞質を含むA列。SR培地中で5日後、細胞をHCMに切り替えた。2日後、多くの細胞が多核化し、大きな多角形型を有する列B。HCM中で4日目までに、多核化多角形細胞が一般的になり色の濃い細胞質を有するが列C、このような基準からこれらの細胞は新たに単離されたヒト成人肝細胞列Dまたは胎児肝細胞列Eに類似していると言える。実施例3:肝細胞経路における初期細胞からのインスリン分泌細胞の取得インスリン分泌細胞は、先の実施例に記載する肝細胞分化手順を改変して用い、H9株のhES細胞から導出した。簡潔に説明すると、段階Iでは、実施例1に記載するようにマウス胚線維芽細胞によって馴化したSR培地を用いて、hES細胞を最終継代後7~8日間を超えてコンフルエントになるまで増殖させた。段階IIでは、培地を1DMSOを含む非馴化SR培地と交換し、そこに10μMシクロパミンを添加して細胞を4日間培養した。段階IIIでは、05mMブチラート肝細胞手順よりも5倍低い、10μMシクロパミン、4nMアクチビンA、および10mMニコチンアミドを含む、B27添加物を加えたRPMI1640中で、細胞を11日間培養した。次に細胞を回収し、固定し、インスリン発現について染色するとともにSigmaマウスモノクローナル抗インスリン抗体を1500に希釈して使用、核を検出するためDAPIで対比染色した。段階IVでは、B27を添加しかつ潜在的膵島分化因子を含むRPMIRPMI1640B27中で11日間培養することにより、細胞が成熟化する。図2は、段階IVにおいて、細胞を4nMアクチビンA、4nMベータセルリン、10nMIGF1、および10mMニコチンアミドと共に培養した結果を示す。上のパネルの円は、DAPIで青く染まった核を表す。視野の中心部にある拡散した染色は赤色蛍光染色であり、細胞内で合成され固定されたインスリンを表す。ウェル内の約1の細胞がインスリンを産生していると推測された。同じスライド上の他の細胞塊またはアイソタイプ対照中には、インスリン染色は認められなかった。実施例4:消化管内胚葉形成の最適化による膵島細胞経路への導入本実施例では、子宮で起こる通常の発達を模倣した、pPS細胞からの膵島の段階的誘導の例を提供する。標準的な無フィーダー条件によりhES細胞のH7株およびH9株をコンフルエントになるまで増殖させ、これを実験の出発材料とした。分化を開始させるため、培地をB27Invitrogenおよび以下の選択肢のうちの1つを添加したRPMI1640に交換した:さらなる添加物なし培地対照4nMアクチビンARDSystems05mMブチラートナトリウムSigmaアクチビンAおよびブチラートの両方。全部で8日間の処理日数の期間、培地を毎日交換した1日を除いて。この期間の最後に、培地を除去して細胞をPBSですすぎ、RTL溶解緩衝液Qiagen400μLを添加して細胞溶解液を調製した。製造業者の説明に従ってQiagenRNAイージーミニキットRNAeasyMinikitを使用し、RNAを調製した。RNAをDNAseで処理し、製造業者の説明に従ってInvitrogen増幅前一本鎖cDNAキットPreamplificationFirstStrandcDNAkitを使用し、ランダムにプライミングした一本鎖cDNAを調製した。Sox17、HNF1α、およびHNF3βに対するプライマーおよびプローブセットを使用し、各cDNA試料について標準的なリアルタイムRTPCRタックマンTaqmanを実施した。発現レベルを標準化するため、シコフィリンcycophilinAppliedBiosystemsに対するプローブおよびプライマーセットを用いて平行したタックマンアッセイを行った。膵臓標準物質と比較した各試料の相対存在量は、デルタデルタCt法deltadeltaCtmethodAppliedBiosystemsにより算出した。図3は、消化管内胚葉のマーカーの発現レベルを示す。結果は、ヒト胎児膵臓における発現レベルに対して標準化してある。比較のため、未分化hES細胞開始細胞株における発現レベルも示してある。3つのマーカーは、アクチビンAおよび酪酸ナトリウムの組み合わせによって最も効果的に誘導された。Sox17は未分化H9株において高レベルで発現されたが23相対発現、2つの添加物により32相対発現レベルにまで誘導された100倍を超える増加。H7株では誘導レベルはより劇的であり、胎児膵臓の0007倍から胎児膵臓の79倍になった10000倍を超える増加。HNF3βは、05未満の相対発現から51または63にまで増加した10倍を超える増加。HNF4αのレベルは、01未満の相対発現から10を超えるまでに増加した10倍を超える増加。これら3つのマーカーの強力な誘導により、これらのhES由来細胞が消化管内胚葉の重要な特徴を有することが確認される。次にこれらの細胞を継代培養し、膵臓形成を誘導する因子で処理し、重要な膵臓マーカーPdx1の誘導によってモニターする。実施例5:長期凝集塊培養における添加物の使用による膵島細胞の取得hES細胞のH7株を、実施例1のようにmEF培地中で未分化形態で増殖させた。次に、11のmEF馴化培地とDFBからなる混合培地中で、これらの細胞を懸濁培養で胚様体を形成する増殖させた。DFB培地とは、B27添加物1x、インスリン25μgml、プロゲステロン63ngml、プトレシン10μgml、セレンセレナイトの形態、100ngml、トランスフェリン50μgml、および甲状腺ホルモン受容体リガンドT340ngmlを添加したDMEMF12培地である。翌日、10μMオールトランスレチノイン酸を添加した。3日目に培地を10μMオールトランスレチノイン酸を添加したDFBに交換し、その後7日間1日おきに培地を添加した段階1。段階2を開始するため、オールトランスレチノイン酸を除去し、ノギン200ngml、EGF20ngml、およびbFGF2ngmlを含む培地と交換した。14日間、1日おきに細胞に培地を添加した。段階3では、ノギン、EGF、およびbFGFを取り除き、細胞をニコチンアミド10mMを含むDFB中で培養した。5日間、1日おきに培地を交換した。次にコーティングしたチャンバースライド上に細胞をプレーティングして1日培養し、固定してインスリンのcペプチドまたはソマトスタチンに対する抗体で染色した。cペプチドとは、分泌前に除去されるプロインスリンの成分である。これは、細胞から合成されるインスリンを、培地中の成分として存在するインスリンと識別するのに有用である。図4は結果を示す。上と中央のパネルは低倍率および高倍率でのインスリンcペプチドについての染色を示すものであり、これにより成熟膵β細胞の塊が示される。下のパネルは、膵島δ細胞のマーカーであるソマトスタチンについての染色を示す。タックマンリアルタイムRTPCRにより、インスリンおよびグルカゴンがこれらの細胞によって発現されることがmRNAレベルで確認された。実施例6:ニューロゲニン3遺伝子発現による最終段階の膵島経路の駆動本実験は、分化の段階IIIの期間中に膵島細胞系譜に特有の遺伝子発現プロファイルを補充する上での、膵島関連遺伝子の過剰発現の有効性を実証する。構成的プロモーターの制御下に転写制御遺伝子ニューロゲニン3Ngn3を含む、アデノウイルスベクターを構築した。AdNgn3は、AdMAX商標ベクター構築キットMicrobixBiosystems、トロントを用いて構築した、複製欠損である、E1およびE3が欠失した組換えアデノウイルス5に基づくベクターである。Ngn3cDNA645bpGenbankアクセッション番号NT020999を、pDC515シャトルベクターのmCMVマウスサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターの下流にクローニングした。ATG開始コドンのすぐ上流にある天然配列TAGAAAGGを、共通コザック配列GCCACCと置換した。相同組換えが起こるように、Ngn3挿入断片を含むシャトルプラスミドとAdゲノムプラスミドAdMAXプラスミドを、E1を発現する293細胞に同時トランスフェクションした。プラークを単離してウイルス保存液を293細胞で増幅し、その後CsCl密度勾配遠心法により精製した。A260での吸光度を測定してウイルス粒子濃度を決定し、標準的なプラークアッセイ法により感染力価を決定した。実施例5のように、H7株のヒトES細胞を混合培地中に懸濁して培養した。翌日、培地にオールトランスレチノイン酸10μMを添加した。7日後、EBをEGF20ngmlおよびbFGF2ngmlを添加したDFB培地中のマトリゲル登録商標上にプレーティングした。培養してから5日後、細胞に感染効率50でAdNgn3を感染させた。AdGFP緑色蛍光タンパク質の遺伝子を含む同等のベクター、直接分化は見込まれないを陰性対照として使用した。感染効率50のAdNgn3またはAdGFPを、6ウェルプレート中のEGF20ngmlを含むDFB培地1mL中の細胞に添加して4時間直接作用させ、その後各ウェルに同じ培地をさらに2mL添加した。その後、1日おきに培地を補充した。感染から2日後または8日後に細胞を回収し、実施例4と同様にリアルタイムRTPCRによる解析のためにRNAを単離した。免疫組織化学法のためにチャンバースライド上にプレーティングした細胞を4パラホルムアミドで固定し、ブロッキングし、グルカゴンに対する抗体11000で、その後FITC標識ヤギ抗マウスIgG1500で染色した。図5は、形質導入から9日後の、ニューロゲニン3形質導入細胞の免疫細胞化学染色を示す。このプレーティングされた胚様体は、実質的なレベルの抗体検出可能なグルカゴン発現を示す。図6および6は、陰性対照斜線棒と比較したニューロゲニン3形質導入細胞黒棒におけるmRNA発現レベルを示す。リアルタイムRTPCRデータは、ヒト胎児膵臓における発現レベルに対して標準化してある。ニューロゲニン3の下流に存在するいくつかの遺伝子が、対照と比較して、形質導入細胞において特異的に上方制御されていることが認められた。ニューロD1およびNkx22はどちらも2日目までに実質的に上方制御され;Nkx61は8日目までに上方制御されていた。インスリンおよびグルカゴン発現もまた8日目までに上方制御されており、このことから、遺伝子トランスフェクションストラテジーにより臨床的に重要な膵島細胞の最終段階産物を作製する細胞への成熟が実質的に改善されることが示された。当業者は、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明が日常的な最適化の問題として変更され得ることを理解すると考えられる。多数の従属する特許請求の範囲を認める管轄において要求されるべき本発明の態様には、以下のものが含まれる。1少なくとも5の細胞が内因性遺伝子由来の以下のタンパク質の1つまたは複数を分泌する、霊長動物多能性幹pPS細胞を分化させることによって得られる単離された細胞集団:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド。2インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、およびソマトスタチン分泌細胞を含む、霊長動物多能性幹pPS細胞を分化させることによって得られる単離された細胞塊。3少なくとも5の細胞が以下のマーカーの少なくとも2つを発現する、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団:Pdx1、Ngn3、インスリン、IAPP、およびNkx61。4含んでいる未分化pPS細胞が1未満である、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団。5高血糖NODマウスに移植した場合に、空腹時グルコースレベルを200mgdL未満に低下させる、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団。6テロメラーゼ逆転写酵素TERTを高レベルで発現するように遺伝子改変した、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団。7霊長動物胚幹細胞の樹立株と同じゲノムを有する、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団。8前記請求項のいずれか一項記載の分化細胞集団、およびそれが得られる元となった未分化pPS細胞株を含む、2つの細胞集団。9膵島細胞分化因子の混合物中でpPS細胞またはその子孫を培養し、それによって少なくとも5の細胞が内因性遺伝子由来の以下のタンパク質の少なくとも1つを分泌する細胞集団を取得する段階を含む、ポリペプチド分泌細胞を取得するための方法:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチド。10pPS細胞が分化して、胚様体、または肝細胞もしくは腸管内皮の特徴を有する細胞を形成する、請求項9記載の方法。11膵島細胞分化因子の混合物が以下の少なくとも1つを含む、請求項9~10記載の方法アクチビンA、ニコチンアミド、シクロパミン、ベータセルリン、およびIGF1。12膵島細胞分化因子の混合物がTGFβアンタゴニストおよび1つまたは複数のマイトジェンを含む、請求項9~10記載の方法。13細胞を遺伝子改変してニューロゲニン3等の膵転写因子の発現をもたらす段階をさらに含む、請求項9~12記載の方法。14請求項9~13のいずれか一項記載の方法に従って得られる、請求項1~8記載の分化細胞集団。15a請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団を培養する段階、およびb培養細胞によって分泌されるインスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンを回収する段階を含む、インスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンを産生する方法。16a請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団、およびb細胞集団の通過を妨げるが、細胞集団によって分泌されるインスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンの通過を可能にする半透膜を含む、インスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンを産生する装置。17請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団を含む、薬学的組成物。18化合物を請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団と混合する段階、化合物と混合したことに起因する細胞集団における任意の表現型変化または代謝変化を判定する段階、およびその変化を化合物がインスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンの分泌を調節する能力と関係づける段階を含む、膵島細胞機能を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。19被験者に請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団を投与する段階を含む、被験者において膵島細胞機能を再構成する方法。20被験者に請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団を投与する段階を含む、被験者において1型糖尿病を治療する方法。21インスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンの欠損に関連する病態を治療する医薬品の調製における、請求項1~8記載の分化細胞集団または請求項9~13記載の方法によって得られる分化細胞集団の使用。22病態が1型糖尿病である、請求項18記載の使用。23pPS細胞がヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団、装置、方法、または使用。24pPS細胞がヒト胚幹細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の細胞集団、装置、方法、または使用。分化および成熟の過程のhES由来肝細胞を示す10X、40X。A列は、5mMn酪酸ナトリウムを含む培地中で培養してから4日後の細胞を示す。培養物中の80を超える細胞が、大きな核および顆粒状の細胞質を含む。細胞を特殊化した肝細胞培地に切り替えて2~4日間培養した列BおよびC。多核化多角形細胞が一般的でなる。ES由来肝細胞は、新たに単離されたヒト成人肝細胞列Dおよび胎児肝細胞列Eと形態学的特徴を共有する。インスリンを発現しているhES由来細胞を示す。分化ストラテジーは、肝細胞と膵細胞は共通の初期前駆細胞を有するという仮説に基づく。シクロパミンを培地中に含めたことを除いては、初期の分化は肝細胞のものと類似している。次に細胞を、膵島分化因子であるアクチビンA、ニコチンアミド、シクロパミン、および低濃度のnブチラートと共に培養した。最後に、細胞をアクチビンA、ベータセルリン、ニコチンアミド、およびIGF1と共に11日間培養し、膵島細胞の増殖を促進した。DAPIに染まった細胞核を上のパネルに示す。下のパネルの対応する視野は、インスリンに対する拡散した赤色抗体染色を示す。hES細胞が段階的様式で膵島個体発生の経路に沿って方向づけられる手順の結果を示す。3つの消化管内胚葉マーカーの発現をmRNAレベルでアッセイし、膵臓での発現レベルに対して標準化した。未分化細胞または非特異的に分化した細胞における発現は低かったが、nブチラートおよびアクチビンAの組み合わせは消化管内胚葉の特徴を有する細胞の分化または選択をもたらした。hES細胞が、移行する培地、および次のマイトジェンおよび膵島分化因子ノギンを含む培地中の長期凝集塊培養物に添加される手順の結果を示す。上と中央のパネルは低倍率および高倍率でのインスリンcペプチドについての染色を示すものであり、これにより成熟膵β細胞の塊が示される。下のパネルは、δ細胞のマーカーであるソマトスタチンについての染色を示す。転写制御遺伝子ニューロゲニン3を含むベクターをトランスフェクションしてから9日後の、膵島細胞分化パラダイムにおける細胞を示す。細胞は、高レベルの抗体検出可能なグルカゴン発現を示す。陰性対照斜線棒と比較したニューロゲニン3形質導入細胞黒棒におけるmRNA発現レベルを示す。トランスフェクションした遺伝子は、2日目には下流遺伝子ニューロD1およびNkx22の上方制御を引き起こし、ひいてはインスリンおよびグルカゴンの発現増強をもたらす。