"以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番した第251-256アミノ酸残基の1もしくは複数に置換を含むように、対応する修飾されていないIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiアミノ酸配列CPSCP配列番号1中のセリン残基のプロリンへの置換を含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質であって、修飾されたそれらの生体内半減期が、対応する修飾されていないものと比べて延長される、抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番した置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように、対応する修飾されていないIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質であって、修飾されたそれらの生体内半減期が、対応する修飾されていないものと比べて延長される、抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、超ヒト化superhumanised登録商標抗体、脱免疫化抗体、または化粧張り抗体である、請求項1または2に記載の免疫グロブリン。以下の:iヒトまたはヒト化Fab;iiKabatのEUインデックスに従って付番した第251-256アミノ酸残基の1もしくは複数に置換を含むように、対応する修飾されていないIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiiアミノ酸配列CPSCP配列番号1中にセリン残基のプロリンへの置換をを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された抗体であって、修飾された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質の生体内半減期が、対応する修飾されていない抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質と比べて延長される、抗体。以下の:i抗体フラグメント;iiKabatのEUインデックスに従って付番した第251-256アミノ酸残基の1もしくは複数に置換を含むように、対応する修飾されていないCH2ドメインに対して修飾したヒトIgG4CH2ドメイン;およびiiiアミノ酸配列CPSCP配列番号1中にセリン残基のプロリンへの置換をを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された免疫グロブリン構築物であって、修飾されたその生体内半減期が、対応する修飾されていないものと比べて延長される、免疫グロブリン構築物。ヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインを含んでいる、請求項5に記載の免疫グロブリン構築物。KabatのEUインデックスに従って付番した置換M252Y、S254T、およびT256Eを含んでいる、請求項5に記載の免疫グロブリン構築物。前記抗体フラグメントが、iFabフラグメント、iiFdフラグメント、iiiFvフラグメント、ivdAbフラグメント、v単離されたCDR領域、viFab’2フラグメント、vii一本鎖Fv分子scFv、viii二重特異性一本鎖Fv、ならびにix二重特異性抗体、x三重特異性抗体およびxi四重特異性抗体から選択される、請求項5に記載の免疫グロブリン構築物。iKabatのEUインデックスに従って付番した置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように、対応する修飾されていないIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン、ならびにiiKabatのEUインデックスに従ってコアヒンジ領域配列内にアミノ酸置換S228Pを含むヒトIgG4を含むように遺伝子組換えにより融合されるか、化学的に結合されるか、または遺伝子操作された、生理活性分子を含み、延長された生体内半減期を有する免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。前記生理活性分子が、タンパク質、非タンパク質性物質または非免疫グロブリンタンパク質である、請求項9に記載の免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。以下の:i生理活性分子;iiKabatのEUインデックスに従って付番した第251-256アミノ酸残基の1もしくは複数に置換を含むように、IgG4CH2ドメインに対して修飾したヒトIgG4CH2ドメイン;およびiiiアミノ酸配列CPSCP配列番号1内にKabatのEUインデックスによるとS228P置換として記述されるセリン残基のプロリンへの置換を含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する免疫グロブリンIgG4融合タンパク質であって、修飾されたその生体内半減期が、対応する修飾されていないものと比べて延長される、免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。ヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインを含んでいる、請求項11に記載の免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。KabatのEUインデックスに従って付番した置換M252Y、S254T、およびT256Eを含んでいる、請求項11に記載の免疫グロブリンIgG4融合タンパク質。部分を含むように、化学的に結合したか、遺伝子組換えにより融合したか、または遺伝子操作した、請求項1~8のいずれか1項に記載の抗体または免疫グロブリン構築物。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように、対応する修飾されていないヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、IL-5に特異的に結合する単離された抗体である、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体であって、修飾されたその生体内半減期が、対応する修飾されていないもの半減期と比べて延長される、抗体。前記の対応する修飾されていない抗体が、hu39D10である、請求項15に記載の抗体。配列番号6に規定される定常重鎖配列および配列番号7に規定される重鎖可変領域配列を含んでいる、請求項15または16に記載の抗体。配列番号8に規定される可変および定常領域配列を含んでいる軽鎖をさらに含んでいる、請求項で15~17のいずれか1項に記載の抗体。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように、対応する修飾されていないヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、CD33に特異的に結合する単離された抗体である、請求項1~4のいずれか1項に記載の抗体であって、修飾されたその生体内半減期が、対応する修飾されていないもの半減期と比べて延長される、抗体。本発明に従って修飾された抗CD33抗体が、抗体huMab195である、請求項19に記載の抗体。配列番号11に規定される重鎖配列および配列番号12に規定される軽鎖配列を含んでいる、請求項19または20に記載の抗体。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番した第251-256アミノ酸残基の1もしくは複数に置換を含むように、対応する修飾されていないIgG4Fc領域またはその修飾されていないFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiアミノ酸配列CPSCP配列番号1中にセリン残基のプロリンへの置換またはKabatのEUインデックスによる置換S228Pを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質の、薬剤への使用。単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質が、KabatのEUインデックスに従って付番した置換M252Y、S254T、およびT256Eを含んでいる、請求項22に記載の使用。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように、対応する修飾されていないヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに対して修飾したヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるヒトIgG4コアヒンジ領域配列;を含んでいる、延長された生体内半減期を有する単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質の、対象の疾患を処置または予防するための薬剤の製造における使用。請求項15~18のいずれか1項に記載の修飾された抗IL-5抗体を対象に投与することを含む、余分な好酸球産生を特徴とする対象の疾患を処置する方法。前記疾患が、アトピー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、喘息、重度の喘息、慢性好酸性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、小児脂肪便症、チャーグストラウス症候群、好酸球性筋肉痛症候群、特発性好酸球増加症候群、偶発性血管性浮腫を含めた浮腫性反応、蠕虫感染、オンコセルカ皮膚炎、好酸球性食道炎、好酸球性胃炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性小腸炎、好酸球性結腸炎、鼻マイクロポリポーシス、鼻ポリポーシス、アスピリン不耐喘息、閉塞型睡眠時無呼吸、慢性喘息、クローン病、強皮症、および心内膜線維症から成る群から選択される、請求項25に記載の方法、または請求項22~24のいずれか1項に記載の使用。前記疾患が自己免疫疾患である、請求項25に記載の方法、または請求項22~24のいずれか1項に記載の使用。請求項19~21のいずれか1項に記載の修飾された抗CD33抗体を対象に投与することを含む、対象の癌疾患を処置する方法。前記疾患が急性骨髄性白血病である、請求項28に記載の方法または請求項22~24のいずれか1項に記載の使用。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254TおよびT256Eを定常領域配列またはそのFcRn結合ドメインに導入すること;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pをコアヒンジ領域配列に導入すること;を含む、ヒトまたはヒト化IgG4アイソタイプ抗体、あるいはIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン、およびIgG4ヒンジ領域を含んでいる免疫グロブリン構築物の生体内半減期を延長する方法。以下の:iKabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254TおよびT256EをヒトIgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメインに導入すること;およびiiKabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228PをヒトIgG4コアヒンジ領域配列に導入すること;を含む、IgG4Fc領域またはそのFcRn結合ドメイン、およびIgG4ヒンジ領域を含んでいる免疫グロブリンIgG4融合タンパク質の生体内半減期を延長する方法。配列番号14を含んでいる融合タンパク質としてそれを遺伝子操作することによってタンパク質の生体内半減期を延長するための、請求項31に記載の方法。配列番号14を含んでいる融合タンパク質。配列番号14のC末端に直に結合された単独のリジンを含んでいる、請求項33に記載の融合タンパク質。以下の:i非IgG4抗体の重鎖定常領域を、KabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように修飾されたヒトIgG4定常領域またはそのFcRn結合ドメインと置き換えること;およびii非IgG4抗体のヒンジ領域を、KabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるIgG4ヒンジ領域と置き換えること;を含む、非IgG4抗体のエフェクター機能を低減する方法。以下の:iヒト以外のIgG4抗体の重鎖定常領域を、KabatのEUインデックスに従って付番したアミノ酸置換M252Y、S254T、およびT256Eを含むように修飾されたヒトIgG4定常領域またはそのFcRn結合ドメインと置き換えること;およびiiヒト以外のIgG4抗体のヒンジ領域を、KabatのEUインデックスによるアミノ酸置換S228Pを含んでいるIgG4ヒンジ領域と置き換えること;を含む、ヒト以外のIgG4抗体の生体内半減期を延長する方法。請求項1~21のいずれか1項に記載の抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質をコード化する核酸。請求項1~21のいずれか1項に記載の抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質を発現する形質転換細胞。請求項1~21のいずれか1項に記載の抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質をコードする核酸を含んでいる形質転換細胞。医薬的に許容され得る賦形剤と一緒に請求項1~21のいずれか1項に記載の単離された抗体、免疫グロブリン構築物または免疫グロブリンIgG4融合タンパク質を含んでいる医薬組成物。実施例1材料と方法hu39D10とそのバリアントの作製ヒトIgG4重鎖定常領域をコード化する遺伝子を、QuickclonecDNALibraryClontechMountainViewCAから単離し、そしてpTT5発現ベクターDurocheretalNucleicAcidsResearchvol30No2ppe9内にクローン化した。Fcドメインに先に記載した変異を導入するために、1もしくは複数の変異を伴う相補的配列から成る2つのプライマーのセットを合成し、そしてPCRベースの部位特異的変異誘発に使用した。Igκ発現ベクターを、同様の手段によって組み立てた。hu39D10可変領域図1をコード化するDNAフラグメントを、PCRベースの遺伝子アッセンブリによって18個重鎖または16個軽鎖のオリゴヌクレオチドを使用して、公開されているタンパク質配列USRE39,548Eからリバースデザインした。フラグメントを、クローニングのためにベクターに組み込まれた制限部位を使用することで発現ベクターにクローン化した。hu39D10の重鎖および軽鎖の最終的なアミノ酸配列を図1に示す。図面もまた、4つのアミノ酸置換を含むhu39D10の配列を示すYTES228P、配列番号6。hu39D10およびバリアントの発現と精製hu39D10とそのバリアントのためのpTT5発現ベクターを、DurocheretalNucleicAcidsResearchvol30No2ppe9に従ってHEK2936E細胞内に形質移入した。トランスフェクションの6日間後に、培養液を分け取り、そして、ProteinG-アガロースビーズGEHealthcareLifeSciencesPiscatawayNJを使用した親和性精製にかけた。FcRn/β2ミクログロブリン複合体発現構築物の作製ヒトFcRnとβ2ミクログロブリンをコード化するDNAフラグメントを、SuperscriptIIIFirststrandSynthesiskitInvitrogenCarlsbadCAを使用し、ヒトUniversalRNABioChainHaywardCAのヒト全RNAのプールを使用して合成したcDNAから単離した。FcRnの細胞外ドメイン第24-290アミノ酸とβ2ミクログロブリンの成熟部分第21-119アミノ酸を、個別にpTT5発現ベクター内にクローン化した。ヒトFcRn細胞外ドメインとβ2ミクログロブリンの配列を、図2と図3にそれぞれ示す。FcRn/β2ミクログロブリン複合体の発現と精製ヒトFcRnとβ2ミクログロブリンを製造するためのpTT5発現ベクターを、HEK2936E細胞に同時形質移入した。トランスフェクションの6日後に、培養液を、分け取り、そしてIgGSephasoreビーズGEHealthcareLifeSciencesPiscatawayNJを使用した親和性精製にかけた。FcRn/β2ミクログロブリン複合体に対するhu39D10およびバリアントの親和性を計測するためのELISAMaxisorp96-ウェルプレートThermoFisherScientificRochesterNYを、5μg/mlの抗β2ミクログロブリンモノクローナル抗体によってコーティングした。次に、ウェルを、PBSで洗浄し、Superblockブロッキング溶液ThermoFisherScientificRockfordILで処置した。次に、FcRn/β2ミクログロブリン複合体を、5μg/mlのSPBS6T50mMのリン酸ナトリウムバッファーpH6.0、150mMNaCl、0.05のTween-20中に希釈し、そして加えて、室温で60分間、コート化抗β2ミクログロブリン抗体に捕獲させた。次に、ウェルを、SPBS6Tで洗浄し、次に、SPBS6T中でhu39D10またはそのバリアントに晒し、そして室温で60分間インキュベートした。インキュベーションで形成されたhu39D10/FcRn複合体を、室温で30分間、抗ヒトκHRPコンジュゲートSourthernBiotechnologyBirminghamAL;SPBS6Tで1/5000に希釈のFab’2フラグメントでプローブした。SPBS6Tで洗浄した後に、シグナル検出のために100μlのTMBSigmaを各ウェルに添加した。次に、50μlの2N硫酸を加え、発色現像を止め、次いで、A450をVmaxプレートリーダMolecularDevicesSunnyvaleCAで計測した。FcRnに対するIgGバリアントの親和性を、GraphPadSoftwareLaJollaCAによるPrismソフトウェアを使用して計算し、そしてプロットした。結果と結論図4に示したように、ヒトFcRnに対するhu39D10の親和性EC50=3.8nMは、YTE変異群を加えることによって、4.7倍高まったEC50=0.81nMに。S228P変異の更なる付加は、FcRn親和性に対して効果がなかったEC50=0.81nM、YTE変異を有するhu39D10と同じ。FcRnと相互作用するFcの領域からS228P変異が遠かったので、この結果は予期外ではなかった。この結果に基づいて、当業者は、循環半減期に対してYTEとS228P変異群の間にいずれの相乗効果も期待しないだろう。実施例2PK試験マウスPK試験を、それらの内在性FcRnはノックアウトされているが、ヒトFcRnがノックインされているマウスPetkovaetalInternationalImmunologyvol18No12pp17591769に記載の4919Tg276半接合マウスモデルを用いて、Jackson試験所-ウエストSacramentoCAによって実施した。0日目に、各群の7匹のマウスに、hu39D10またはそのバリアントを腹腔内IP200μgに与えた。血漿サンプルを調製するために、各マウスで、2、12、24時間および2、4、7、10、14、18、21、および28日間に後眼窩洞から採血した。血漿サンプル中のhu39D10およびバリアントを計測するELISAMaxisorp96-ウェルプレートThermoFisherScientificRochesterNYを、冷蔵庫内で一晩、PBS中の2μg/mlの遺伝子組換えIL-5hu39D10抗原;RDSystemsMinneapolisMNでコーティングした。次に、ウェルをPBSで洗浄し、非特異的結合を最小限にするために、200μlのSuperblockブロッキング溶液ThermoFisherScientificRockfordILで30分間ブロッキングした。次に、血漿サンプルを、PBS-Tween20PBSTで1/50に希釈し、IL-5コートウェルに添加した。加えて、遺伝子組換えhu39D10標準を、2のマウス血清SigmaAldrichStLouisMOを含むPBSTで希釈し、定量化のための検量線を作るためにコート化ウェルに添加した。室温にて60分間のインキュベーション後に、ウェルをPBSTで洗浄し、次に、抗ヒトFc-HRPコンジュゲートSigmaAldrichStLouisMO、PBSTで1/1000に希釈を加え、室温にて30分間インキュベートした。そして、ウェルをPBSTで洗浄した。シグナル検出のために、100μlのTMBSigmaAldrichStLouisMOを各ウェルに添加した。次に、50μlの2N硫酸を加えて、発色現像を止め、そして次に、A450をVmaxプレートリーダMolecularDevicesSunnyvaleCAで計測した。血漿中のhu39D10およびバリアントの濃度を、PrismGraphPadSoftwareLaJollaCAソフトウェアを使用して、hu39D10の検量線を使用して計算した。各マウスついて、1日目に計測した濃度100と規定と比較したhu39D10の相対濃度を、時間の関数としてプロットした。個々の動物におけるhu39D10またはそのバリアントの半減期もまた、指数関数的減衰とゼロの漸近線を前提として、ソフトウェアを使用して計算した。複合変異S228PYTEを有するバリアントの半減期計算において、計算した半減期を延長する2つの異常値結果すなわち2匹のマウスからの結果を、平均半減期の計算のために除外した。結果と考察図5に示したように、S228P変異を有するhu39D10の血清中半減期t1/2=6.5日間は、修飾されていないFcを有するhu39D10t1/2=4.6日間と比較して42延長された。YTE変異もまた、血清中半減期の75t1/2=8.0日間の有意な延長を示す。驚いたことに、組合せた場合、S228PとYTE変異群がさらに相乗効果的に血中半減期を延長したt1/2=13.3日間まで。YTE変異へのS228P変異の追加は、単独のYTEに対して血中半減期を66または5.3日間延長したのに対して、S228Pの半減期延長は、非YTE変異IgG4においては421.9日の延長に留まった。S228PとYTE変異の間の相乗効果を欠くとき、S228P変異は、YTE変異hu39D10において、非YTE変異hu39D10においてそれがなしたのと同じかまたは少ないくらいの半減期の延長しか起こさないが、YTEおよびS228P変異群の両方を有するhu39D10に関して11日間以下の半減期をもたらす。Fc定常領域内の増加する変異数に起因する抗薬物免疫応答の促進の機会を増大するにもかかわらず、この相乗効果のため、抗体またはFc融合タンパク質ベースの薬物の非常に長い半減期を達成するために同じ分子内にYTEとS228P変異群を組合せることが有益であると結論づけられる。実施例3材料と方法huMab195およびそのFcバリアントの作製CD33結合抗体huMab195可変領域をコード化するDNAフラグメント図6を、PCRベースの遺伝子アッセンブリによって18個重鎖と18個軽鎖のオリゴヌクレオチドを使用して、公開されたタンパク質配列US5,693,761からリバースエンジニアリングした。そして、重鎖および軽鎖可変領域フラグメントを、前項に記載のヒトIgG4天然とバリアント発現ベクターにクローン化して、天然IgG4定常ドメイン配列を有するhuMab195のIgG4/κバージョン、またはS228P変異、YTE変異、またはその両方のS228PおよびYTE変異群を含んでいるバージョンを作製した。S228PとYTE変異群の両方を有するhuMab195IgG4重鎖の配列を、軽鎖配列のように図6に示す。huMab195およびバリアントの発現と精製huMab195とそのバリアントのpTT5発現ベクターを、実施例2に記載のとおり、様々なIgG4タンパク質を産生させるように、HEK2936E細胞内に形質移入した。そして、これらのタンパク質を、実施例2のようにProteinG-アガロースビーズを使用して精製した。ヒトCD33細胞外ドメインの作製ヒトCD33細胞外ドメインhCD33ECD、リーダー配列を含む第1-258アミノ酸をコード化するDNAフラグメントを、QuickcloneヒトcDNALibraryClontech、MountainViewCAから増幅した。トロンビン切断部位Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Serが続くHis6タグをコードするDNAを、これらの配列を担持するプライマーを使用したPCRによってhCD33ECDフラグメントの3’末端に加えた。次に、his6-タグ付与hCD33ECDコードDNAフラグメントを、PCRによってFcコード化ヒトIgG1DNAフラグメントに連結しhCD33ECD-Fc、そしてpTT5発現ベクター内にクローン化した。hCD33ECD-Fcのタンパク質配列を図7に示す。ヒトCD33細胞外ドメインの発現と精製hCD33ECD-Fc融合タンパク質をコードするpTT5発現ベクターを、HEK2936E細胞内に形質移入し、次に、培養液を取り分け、そしてProteinG-アガロースビーズGEHealthcareLifeSciencesPiscatawayNJを使用した親和性精製にかけた。hCD33ECDを単離するために、精製した融合タンパク質をトロンビンEMDChemicalsSanDiegoCAで処理し、Fc部分を取り出した。そして、hCD33ECDを、NiNTA-アガロースQiagenGmbHHildenGermany親和性クロマトグラフィーによって単離した。PK試験マウスPK試験を、それらの内在性FcRnはノックアウトされているが、ヒトFcRnがノックインされているマウスPetkovaetalInternationalImmunologyvol18No12pp17591769に記載の4919Tg276半接合マウスモデルを用いて、Jackson試験所-ウエストSacramentoCAによって実施した。0日目に、各群の7匹のマウスに、huMAb195またはそのバリアントを腹腔内IP200μgに与えた。投与の2、12、24時間および2、4、7、10、14、18、21、および28日間後に、各マウスから採血して、血漿サンプルを調製した。血漿サンプル中のhuMAb195およびバリアントを計測するためのELISAMaxisorp96-ウェルプレートThermoFisherScientificRochesterNYを、PBS中の2μg/mlの遺伝子組換えhCD33ECDでコーティングした。次に、ウェルをPBSで洗浄し、Superblockブロッキング溶液ThermoFisherScientificRockfordILでブロッキングした。次に、血漿サンプルを、PBS-Tween20PBSTで1/50に希釈し、hCD33ECDコートウェルに添加した。平行して、既知濃度の遺伝子組換えhuMab195標準を、2のマウス血清SigmaAldrichStLouisMOを含むPBSTで希釈し、定量化のための検量線を作るためにコート化ウェルに添加した。室温にて60分間のインキュベーション後に、ウェルをPBSTで洗浄し、次に、抗ヒトκフラグメントHRPコンジュゲートInvitrogenCarlsbadCA、PBSTで1/2000に希釈を加え、室温にて30分間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、実施例2に記載のとおり、シグナルを現像し、計測し、そして分析した。結果と考察図8に示したように、S228P変異を有するhuMab195の血清中半減期t1/2=2.0日間は、修飾されていないFcを有するhuMAb195t1/2=1.6日間と比較して26延長された。YTE変異もまた、血清中半減期の110t1/2=3.4日間の有意な延長を示した。S228PとYTE変異群が組合わせられたとき、半減期はさらに14日間まで延長され、YTEバリアントと比較して312の延長であった。相乗効果を欠くとき、YTE含有huMab195へのS228P変異の追加からの最大の延長は26であり、4.3日間の半減期をもたらすが、観察された14日間より有意に短かかった。この第2の実施例では、ヒトIgG4抗体へのS228PおよびYTE修飾が、ヒトFcRnを持つ対象におけるIgG4抗体の血中半減期を延長するそれらの効果が相乗的であるという観察を確認した。そうした相乗効果は、増大する免疫原性の可能性にもかかわらず、同じタンパク質に対するこれらの2つの修飾の使用を正当化し得る。"