"配列番号1に記載されるヤエヤマヒメボタルLuciolafiliformisyayeyamanaに由来する変異型ルシフェラーゼ。Photinuspyralisホタルルシフェラーゼ、コメツキムシ赤色ルシフェラーゼおよび配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼの各々が誘起する発光に比べて高い発光強度を示す発光を誘起する活性を有する請求項1に記載の変異型ルシフェラーゼ。配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長と同じかまたはそれよりも長い最大発光波長を有する発光を誘起する請求項1に記載の変異型ルシフェラーゼ。前記発光が、赤色発光を示す請求項3に記載の変異型ルシフェラーゼ。a配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む変異型ルシフェラーゼb配列番号10に示されるアミノ酸配列に対して80以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む変異型ルシフェラーゼおよびc配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む変異型ルシフェラーゼおよびd配列番号1に示されるアミノ酸配列の286番目のセリンに対応するアミノ酸残基がアラニンに置換された変異を含む変異型ルシフェラーゼからなる群より選択される請求項1乃至4のいずれか1項に記載の変異型ルシフェラーゼ。請求項1から5の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。配列番号11、配列番号12、配列番号14または配列番号16に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の核酸。本発明の目的は、ルシフェリンを発光させる新規ルシフェラーゼを提供することにある。本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタルLuciolafiliformisyayeyamanaに由来する。本発明によれば、ヤエヤマヒメボタル由来の変異型ルシフェラーゼが提供される。本発明の実施形態は、ヤエヤマヒメボタルLuciolafiliformisyayeyamanaに由来する変異型ルシフェラーゼに関する。ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ATPの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、ホタルルシフェラーゼの基質となるルシフェリンおよびそのアナログを意味する。ルシフェリンアナログは、例えば、WO2009/096197及びWO2010/106896に基質として記載された物質である。具体的には、例えば、ジメチルアニリン-モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体及びD-ルシフェリンの誘導体である。実施形態に係るルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタルLuciolafiliformisyayeyamanaに由来する変異型ルシフェラーゼである。ヤエヤマヒメボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科ホタル属に属すホタルである。この明細書および特許請求の範囲では、ヤエヤマヒメボタルから得られた変異型ルシフェラーゼを、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、変異型ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ、変異型等と称する。また、ここにおいて、ヤエヤマヒメボタルから得られたルシフェラーゼであって何ら変異処理を受けていないものを、野性型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、野性型ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼ、野性型ルシフェラーゼ、野性型等と称する。図1は、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示している。この図に示されるとおり、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼにより誘起された発光の最大発光波長は、pH8.0、pH7.5、pH7.0、pH6.5、pH6.0およびpH5.5において、それぞれ、約574nm、約574nm、約582nm、約605nm、約614nmおよび約616nmであり、pHが下がるほど最大発光波長が長くなる傾向がみられる。ここで、最大発光波長とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、発光反応に関する性質を向上させる変異であってよい。例えば、発光強度を高める変異であってよい。発光強度が低い化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の低さのために30分間の露出時間が必要となる場合、30分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の低さのために長い露出時間を必要とする場合、1枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して高い発光強度を有する発光を誘起し得る。従って、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、かかる好ましい実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、例えば、Photinuspyralisに由来するルシフェラーゼによる発光強度の1.2倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、3.0倍以上、3.5倍以上または4.0倍以上の発光強度を示し得る。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、コメツキムシ由来の赤色ルシフェラーゼCBRルシフェラーゼによる発光強度の2.0倍以上、3.0倍以上、4.0倍以上、5.0倍以上、6.0倍以上、7.0倍以上、8.0倍以上、9.0倍以上または10倍以上の発光強度を示し得る。さらに、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼによる発光強度の1.2倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、3.0倍以上、3.5倍以上または4.0倍以上の発光強度を示し得る。発光反応に関する性質を向上させる変異とは、さらに、例えば、最適pHを変更する変異、最適温度を変更する変異、分解安定性を向上させる変異等であってよい。変異の別の例は、発光スペクトルの最大発光波長がシフトする変異である。このような変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを発光反応の酵素として用いた場合、野生型を用いた場合と比較して、最大発光波長がシフトした発光スペクトルが得られる。図1に示されるとおり、pH7.0の環境下において野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを用いた場合、最大発光波長が574nm付近となる発光が生じるが、このような変異によって、最大発光波長が長波長側または短波長側にシフトする。このような変異を有する変異型ルシフェラーゼにおいて、最大発光波長のシフトは、発光反応におけるpH条件を特定のpHにした場合にのみ生じてもよい。例えば、pH6.5未満の範囲およびpH7.0を超える範囲ではシフトが生じないものの、pH6.5からpH7.0の範囲においてシフトが生じてよい。この変異型ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼまたはその他の変異型ルシフェラーゼとともに細胞内に発現させた場合、これらのルシフェラーゼを、最大発光波長の差異に基づいて区別することができる。したがって、マーカーとしてこれらのルシフェラーゼを利用する研究において、最大発光波長がシフトした変異型ルシフェラーゼを使用することで、マーカーの選択肢を増やすことができる。先述の変異は、最大発光波長のシフトにより発光色の変化を生じさせるものであってもよい。例えば、変異により、発光反応の発光色は緑色から赤色へと変化する。このような変異型ルシフェラーゼを使用した発光反応の観察により、細胞内の機能をより詳細に調べることが可能になる。例えば、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼとを、それぞれ、異なる2つのタンパク質に融合させて同一細胞内で発現させ、発光色の差に基づき、その細胞内のそれぞれのタンパク質の挙動を識別することができる。この場合、発光色の異なる発光反応は、1種類の基質のみを使用することによって達成することができ、実験上の簡便さの点で有利である。また、異なる細胞内で目的のタンパク質を発現させ、それぞれの細胞において異なる発光色を示す発光を誘起する場合においても、使用する基質は1種類のみでよいことから、さらに、コストの観点からも有利である。実施形態に係るルシフェラーゼによれば、発光観察に使用される基質と酵素とを様々に組み合わせることにより発光観察の適用範囲が拡大されることが期待される。具体的には、ルシフェリンとルシフェラーゼとの組合せを選択することにより、異なる発光波長及び/又は発光色を有する複数の発光を得て、発光波長及び/又は発光色の相違を利用して、細胞内の現象を観察することができる。このような新規のルシフェラーゼが提供されることにより、細胞の機能解析に利用される発光反応の酵素の選択肢を増やし、これにより酵素と基質との組合せのバリエーションを増やすことができる。また、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼの性質に変化を与えない変異であってよい。例えば、発光反応に対する寄与率の高い配列またはドメインにおいては変化がなく、発光反応に対する寄与率の低い配列またはドメインについて変化が生じる変異であってよい。具体的には、例えば、発光反応にあまり関与しない部位を削る変異、そのような部位に特定の配列を挿入する変異、末端に特定の配列を付加する変異等であってよい。さらに、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼとしての発光活性以外の性質を変化させる変異であってよい。例えば、実験的な操作性を向上させる変異であってよい。具体的には、例えば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合にその可溶性を高める変異であってよい。上記のような発光強度を高める変異、最大発光波長がシフトする変異および発光強度の温度依存性が変化する変異は、任意の組み合わせで同時に導入することができ、または互いに独立して導入することができる。実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号10に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、ヤエヤマヒメボタルから得られた野生型のルシフェラーゼの変異体である。この変異体は、配列番号1に記載される野性型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列上の283番目のセリンに対応するアミノ酸残基が、アラニンによって置換されている。この変異型ルシフェラーゼをコードする核酸は、例えば、配列番号11に示される塩基配列を有する核酸である。配列番号11に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号2の塩基配列に対して、後述のような哺乳細胞における発現に対するコドン最適化を施し、更に、対応するアミノ酸配列上で上述の置換が生じるような変異を入れたものである。配列番号10に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、特定のpHにおいて最大発光波長のシフトが生じている。このように発光スペクトルに最大発光波長のシフトを生ずる変異型ルシフェラーゼは、当該ルシフェラーゼが触媒する発光反応において、例えば、赤色の発光を生ずる。発光反応において赤色の発光を生ずる変異型ルシフェラーゼを以降、赤色変異型ルシフェラーゼ、赤色ルシフェラーゼ、赤色変異型または赤色変異体という。図2には、基質としてD-ルシフェリンを用いた場合におけるHeLa細胞中での野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼとその変異型ルシフェラーゼ、P.ピラリスルシフェラーゼプロメガ社、Luc2ルシフェラーゼおよびコメツキ由来の赤色発光ルシフェラーゼプロメガ社、CBRルシフェラーゼによるルシフェリンの発光強度を比較したグラフが示されている。ここでは、P.ピラリスルシフェラーゼプロメガ社、Luc2ルシフェラーゼによる発光強度を1としたときの相対的な値が示されている。この図から、特定の哺乳細胞内での測定条件下において、赤色変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼは、P.ピラリスルシフェラーゼにより達成される発光強度の3.20倍、CBRルシフェラーゼにより達成される発光強度の9.70倍の発光強度を達成していることがわかる。また、野生型ルシフェラーゼにより達成される発光強度の2.06倍の発光強度を達成していることがわかる。なお、図2においては、基質として、D-ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これ以外の他の基質を使用することもできる。例えば、WO2009/096197及びWO2010/106896に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン-モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリンの誘導体及びD-ルシフェリンの誘導体である。また、図3には、D-ルシフェリンを基質として使用した場合にこれら3種のルシフェラーゼの各々により誘起された発光の発光スペクトルが示されている。ヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼは、HeLa細胞内において、最大発光波長を野生型の607nmから613nmにシフトさせることができる。長い波長を有する光は、生体内での透過性がより優れている。そのため、この変異型ルシフェラーゼを用いることにより、組織、胚および個体を測定の対象とする場合のように、ルシフェリンから光の検出手段までの間に遮蔽物が多く介在する場合であっても、発光強度の低下を抑えて発光を検出することができる。なお、CBRルシフェラーゼの最大発光波長は620nmである。図4は、近赤外ルシフェリンアナログであるジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリン具体的には、アカルミネ登録商標、和光純薬社製を基質として使用した場合においてこれら3種のルシフェラーゼおよびP.ピラリスルシフェラーゼの各々が誘起する発光の発光強度を示す。この図において、ヤエヤマヒメボタルの赤色変異体による発光の発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼの約3.8倍、CBRルシフェラーゼの約9.7倍である。このように、特定の実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合、従来の赤色ルシフェラーゼであるCBRルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。なお、図4において、基質として、ジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリンを使用した場合の発光強度について示したが、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた発光反応においては、これ以外の他の基質を使用することもできる。例えば、WO2009/096197及びWO2010/106896に記載されている基質を使用することができる。当該基質は、例えば、ジメチルアニリン-モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、これらの誘導体、ジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリンの誘導体及びD-ルシフェリンの誘導体である。上記の変異は、配列番号1とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号1との対応関係を考慮して変異を導入することができる。たとえば、そのようなタンパク質にS286A変異を導入したい場合、配列番号1と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号1に示されるアミノ酸配列の286番目のSに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をAに置換することでS286A変異を導入することができる。ここにおいて対応するアミノ酸残基は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。また、実施形態は、赤色変異体に対して更なる変異を導入した変異型ルシフェラーゼも含む。例えば、赤色変異体に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。あるいは、赤色変異体に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した変異型ルシフェラーゼを含む。具体的には、実施形態は、赤色変異体のアミノ酸配列配列番号10との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる変異型ルシフェラーゼを含む。実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。変異型ルシフェラーゼとは、野性型ルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に任意の変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および/または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の変異または1から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の1から20のアミノ酸の変異、より好ましくは1から15のアミノ酸の変異、より好ましくは1から10のアミノ酸の変異、より好ましくは1から5のアミノ酸の変異、より好ましくは1から4のアミノ酸の変異、より好ましくは1から3のアミノ酸の変異、より好ましくは1または2のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、96以上、97以上、98以上または99以上の相同性を有する。本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、ヤエヤマヒメボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばDNAまたはRNAを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの遺伝子とは、主として、mRNAに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の例は、配列番号11に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号11の配列を有する遺伝子は赤色変異体をコードする。配列番号11は、配列番号2に記載するヤエヤマヒメボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対して変異を導入することで得られる配列である。この配列を有する遺伝子は、ヤエヤマヒメボタルからクローニングされた塩基配列に変異を加えたものであり、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ配列番号10をコードする。実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列において変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸である。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、野性型ルシフェラーゼの特徴、すなわちルシフェラーゼ活性が得られる限りにおいて好ましくは従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および/または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号12に示される塩基配列である。当該塩基配列は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列配列番号11からBamHIおよびEcoRIの認識配列を無効にしたものである。そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう最適化とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号14に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列配列番号11のBamHIおよびEcoRIの認識配列を無効にし、且つ哺乳細胞における発現にコドンを最適化することにより得られた核酸である。なお、コドンが最適化されたルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号13に示される。実施形態に係る核酸は、Kozak配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Kozak配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Kozak配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Kozak配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るKozak配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したKozak配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Kozak配列としてgccrccatgg配列番号6rはグアニンまたはアデニンを意味するの配列を含む。Kozak配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、プロモーター配列や発現を調節するための配列およびマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。本発明のさらに他の実施形態は、先述のベクターを含んだキットに関する。このキットは、2種類以上のベクターを含んでいてもよく、そのうちの少なくとも1つは、実施形態に係るベクターである。好ましくは、2種類以上のベクターは、それぞれ、ルシフェラーゼをコードする塩基配列を含んでおり、これらのルシフェラーゼは、各々、異なる発光色及び/又は発光波長を示す発光反応を触媒する。このようなキットを使用することによって、例えば、発光色及び/又は発光波長の相違に基づき、複数のタンパク質の挙動を同時に観察することができる。また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料インビボ、インビトロに関する種々の使用イメージング、測光等に有効に適用できる。本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、DNA中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程;および、前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察タイムラプスを含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。1つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ATPおよびMg2イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。上記特開2009-545436号公報に開示された野性型ヤエヤマボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列配列番号2は、以下の通りである。ATGGAAATGGAAAAGGAAGAGAATGTTGTGTATGGCCCTCAGCCATTCTACCCCATTGAAGCAGGATCCGCAGGAATACAGTTACATAAGTACATGCATCAATATGCACAACTTGGAGCAATCGCTTTTAGTAATGCTCTTACCGGAGTTGATATTTCTTACCAAGAATACTTTGATATAACGTGCCGTCTAGCTGAGGCCATGAAAAATTATGGTATGACGCAGGAAGGACGTATTGCTTTGTGCAGTGAAAATTGTGAAGAATTCTTTATTCCTGTGGTTGCTGGTCTTTACATCGGGGTAGGTGTTGCACCTACTAATGAAATCTACACTCTCCGTGAATTAAATCACAGTTTGGGTATCGCAGAACCGACTATTGTATTCAGCTCCAGAAAAGGCTTACCGAAAGTTCTGGAAGTACAAAAAAATGTTACATGTATCAAAACAATTGTCATATTAGATAGTAAAGTAAACTTTGGAGGTTACGATTGTGTAGAAACTTTCATTAAGAAAAATGTACCGTCAGGTTTTCAACCAAGTAGCTTTAAACCGATGGATGTTAAGAATCGTAAAGAACACCTTGCTCTACTTATGAATTCCTCTGGCTCTACTGGTCTACCTAAAGGTGTACAAATTACACACGAAGGCACTGTTACCAGATTCTCACATGCCAAGGATCCCATTTACGGAAATCAAGTTTCGCCTGGCACTGCTATTTTAACCGTCGTTCCATTCCACCATGGATTCGGTATGTTTACCACTTTAGGATACTTTGCTTGTGGATACCGTGTTGTCATGTTAACAAAATTCGATGAAGAACTATTCTTGAAAACGCTGCAAGACTATAAATGTACCAGTGTGATTCTTGTGCCAACATTATTCGGCATCCTTAACAAAAGTGAATTGATCGATAAATTTGATTTATCTAATCTAACTGAAATTGCTTCTGGTGGAGCTCCTTTGGCAAAGGAAGTTGGTGAAGCTGTTGCCAGACGATTTAATCTACCCGGCATCCGCCAGGGATACGGTTTAACAGAAACGACATCGGCTTTCATTATTACTCCAGAAGGTGACGATAAACCTGGAGCATCTGGGAAAGTAGTACCCTTGTTCAAAGTAAAAGTTATTGATCTTGACACTAAAAAAACATTGGGTGTCAATCGACGAGGAGAGATCTGTGTAAAAGGACCTAGTCTTATGAAAGGCTATGTTCGTAATCCAGAAGCAACAAAAGAAATTATTGATGATGAAGGCTGGATGCACACTGGCGATATTGGATATTACGATGAGGACGAACATTTCTTCATTGTAGATCGTTTGAAATCATTAATCAAATACAAAGGGTACCAGGTACCGCCTGCTGAATTAGAATCCGTTCTTTTGCAACATCCAAATATATTTGACGCTGGTGTAGCTGGTGTCCCCGATCCTGAAGCTGGTGAACTTCCAGGGGCTGTAGTTGTATTGGAAAAAGGAAAGACTATGACCGAGAAGCAAATTGTGGAATACGTTAATAGTCAAGTAGTAAACCACAAACGTTTACGTGGTGGCGTTCGATTTGTGGATGAAGTACCAAAAGGCCTTACTGGAAAAATTGATGCTAAAGTAATTAGAGAAATCCTTAAGAAACCACAATCCAAGATGTAAまた、配列番号2に示される塩基配列をアミノ酸へ翻訳した配列配列番号1は、以下の通りである。MEMEKEENVVYGPQPFYPIEAGSAGIQLHKYMHQYAQLGAIAFSNALTGVDISYQEYFDITCRLAEAMKNYGMTQEGRIALCSENCEEFFIPVVAGLYIGVGVAPTNEIYTLRELNHSLGIAEPTIVFSSRKGLPKVLEVQKNVTCIKTIVILDSKVNFGGYDCVETFIKKNVPSGFQPSSFKPMDVKNRKEHLALLMNSSGSTGLPKGVQITHEGTVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRVVMLTKFDEELFLKTLQDYKCTSVILVPTLFGILNKSELIDKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGIRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLFKVKVIDLDTKKTLGVNRRGEICVKGPSLMKGYVRNPEATKEIIDDEGWMHTGDIGYYDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGVPDPEAGELPGAVVVLEKGKTMTEKQIVEYVNSQVVNHKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKVIREILKKPQSKM[実施例1:野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの発光スペクトル測定]1.野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET-Bベクターインビトロジェンに導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。1-1.野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変特開2009-545436号公報に開示された塩基配列配列番号2によれば、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで羊土社、2001年発行、p.17-25に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。配列番号3は、以下の通りである。ATGGAAATGGAAAAGGAAGAGAATGTTGTGTATGGCCCTCAGCCATTCTACCCCATTGAAGCAGGTTCCGCAGGAATACAGTTACATAAGTACATGCATCAATATGCACAACTTGGAGCAATCGCTTTTAGTAATGCTCTTACCGGAGTTGATATTTCTTACCAAGAATACTTTGATATAACGTGCCGTCTAGCTGAGGCCATGAAAAATTATGGTATGACGCAGGAAGGACGTATTGCTTTGTGCAGTGAAAATTGTGAAGAGTTCTTTATTCCTGTGGTTGCTGGTCTTTACATCGGGGTAGGTGTTGCACCTACTAATGAAATCTACACTCTCCGTGAATTAAATCACAGTTTGGGTATCGCAGAACCGACTATTGTATTCAGCTCCAGAAAAGGCTTACCGAAAGTTCTGGAAGTACAAAAAAATGTTACATGTATCAAAACAATTGTCATATTAGATAGTAAAGTAAACTTTGGAGGTTACGATTGTGTAGAAACTTTCATTAAGAAAAATGTACCGTCAGGTTTTCAACCAAGTAGCTTTAAACCGATGGATGTTAAGAATCGTAAAGAACACCTTGCTCTACTTATGAACTCCTCTGGCTCTACTGGTCTACCTAAAGGTGTACAAATTACACACGAAGGCACTGTTACCAGATTCTCACATGCCAAGGACCCCATTTACGGAAATCAAGTTTCGCCTGGCACTGCTATTTTAACCGTCGTTCCATTCCACCATGGATTCGGTATGTTTACCACTTTAGGATACTTTGCTTGTGGATACCGTGTTGTCATGTTAACAAAATTCGATGAAGAACTATTCTTGAAAACGCTGCAAGACTATAAATGTACCAGTGTGATTCTTGTGCCAACATTATTCGGCATCCTTAACAAAAGTGAATTGATCGATAAATTTGATTTATCTAATCTAACTGAAATTGCTTCTGGTGGAGCTCCTTTGGCAAAGGAAGTTGGTGAAGCTGTTGCCAGACGATTTAATCTACCCGGCATCCGCCAGGGATACGGTTTAACAGAAACGACATCGGCTTTCATTATTACTCCAGAAGGTGACGATAAACCTGGAGCATCTGGGAAAGTAGTACCCTTGTTCAAAGTAAAAGTTATTGATCTTGACACTAAAAAAACATTGGGTGTCAATCGACGAGGAGAGATCTGTGTAAAAGGACCTAGTCTTATGAAAGGCTATGTTCGTAATCCAGAAGCAACAAAAGAAATTATTGATGATGAAGGCTGGATGCACACTGGCGATATTGGATATTACGATGAGGACGAACATTTCTTCATTGTAGATCGTTTGAAATCATTAATCAAATACAAAGGGTACCAGGTACCGCCTGCTGAATTAGAATCCGTTCTTTTGCAACATCCAAATATATTTGACGCTGGTGTAGCTGGTGTCCCCGATCCTGAAGCTGGTGAACTTCCAGGGGCTGTAGTTGTATTGGAAAAAGGAAAGACTATGACCGAGAAGCAAATTGTGGAATACGTTAATAGTCAAGTAGTAAACCACAAACGTTTACGTGGTGGCGTTCGATTTGTGGATGAAGTACCAAAAGGCCTTACTGGAAAAATTGATGCTAAAGTAATTAGAGAAATCCTTAAGAAACCACAATCCAAGATGTAA1-2.野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET-Bベクターの制限酵素サイトBamHI-EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRにはポリメラーゼKOD-Plus-東洋紡績株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。最終濃度が等倍の10×PCRBuffer、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が1.0mMのMgSO4、最終濃度が0.02U/μlのTOYOBOKOD-Plus-1U/μl、最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマー対を含む20μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてBamHIとEcoRI認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を0.4μl加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、55°C30秒および68°C2分を30サイクル繰り返し、最後に68°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用10×HBufferを4μl、制限酵素BamHI東洋紡績株式会社および制限酵素EcoRI東洋紡績株式会社を各2μlならびに滅菌脱イオン水32μlを加えて溶解し、37°Cで2時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるDNAバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからWizardRSVGelandPCRClean-UpSystemプロメガを用いてDNAを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、LigationPackニッポンジーンをマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素BamHIと制限酵素EcoRIで処理したpRSET-Bベクターに抽出したDNAを導入した。このベクターDNAを大腸菌JM109DE3株に形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーPCRを実施し、pRSET-Bに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーPCRは、T7promoterPrimer5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’:配列番号7およびT7ReversePrimer5’-CTAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’:配列番号8のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μlおよび最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマーを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を25サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP-ITを用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKitを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、70エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi-DiFormamideアプライドバイオシステムズを15μl加え、溶解させた。この溶液を94°C2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをAppliedBiosystems3130xlジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、配列番号3の塩基配列が、正常に遺伝子発現ベクターpRSET-Bに導入されていることを確認した。2.発光タンパク質の精製JM109DE3を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42°Cで1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37°Cで20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート100μg/mlアンピシリンを含むにストリークし、37°Cで一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37°Cで24時間、18°Cで24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1MTris-HCl溶液pH8.0に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離15000rpm、10分し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi-Agar懸濁液500μlと0.1MTris-HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4°Cの条件で行った。25mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD-10GEヘルスケアでろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6ザルトリウスで限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50グリセリン溶液とした。保存は-20°Cで行った。3.発光スペクトルの測定測定のための装置としてLumiFlSpectroCaptureATTOを用い、0.1Mクエン酸/0.1MNa2HPO4bufferpH6.0-8.0に1mMD-ルシフェリン、2mMATPおよび4mMMgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図1に示す。図1より、取得された野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼによる発光スペクトルは、pH7.5の環境において、574nm付近に最大発光波長を示すことがわかる。また、最大発光波長は、pH8.0、pH7.0、pH6.5、pH6.0およびpH5.5のそれぞれにおいて、約574nm、約582nm、約605nm、約614nmおよび約616nm、であり、pHが下がるほど最大発光波長は長くなる傾向がみられた。[実施例2:変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの作製とHeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較]1.変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの作製下記のとおり、変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子配列番号4に対し、配列番号5のアミノ酸配列上286番目のセリンに対応するアミノ酸残基をアラニンに置換する変異S286Aを導入した。当該変異は、配列番号9に示すプライマーCTACAAGTGCACCnnnGTGATCCTGGTGCCC:配列番号9を用いた。なお、上記哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子配列番号4は、以下の通りである。ATGGAAATGGAAAAAGAGGAAAACGTCGTCTACGGCCCCCAGCCCTTCTACCCTATCGAAGCCGGCTCTGCCGGCATCCAGCTGCACAAGTACATGCACCAGTACGCCCAGCTCGGAGCCATTGCCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCAGCTACCAGGAATACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGCCGAGGCCATGAAGAACTACGGCATGACCCAGGAAGGCCGGATCGCCCTCTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCATCCCCGTGGTGGCCGGCCTGTATATCGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGAGAGAGCTGAACCACAGCCTGGGAATCGCCGAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAGAAAGGGCCTGCCCAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAAACGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAAGTGAACTTCGGCGGCTACGACTGCGTGGAAACCTTCATCAAAAAGAACGTGCCCAGCGGCTTCCAGCCCAGCTCCTTCAAGCCCATGGACGTGAAGAACCGGAAAGAGCACCTGGCCCTGCTGATGAACAGCAGCGGCTCTACCGGCCTGCCTAAAGGGGTGCAGATCACACACGAGGGCACCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCCTGCGGCTACAGAGTGGTCATGCTGACCAAGTTCGATGAAGAACTGTTCCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCTCTGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAACAAGAGCGAGCTGATCGACAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCCGGAATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAAACCACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAAGTGAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCGTGAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCAGCCTGATGAAGGGCTACGTGCGGAATCCTGAGGCCACCAAAGAGATCATCGACGACGAGGGCTGGATGCACACCGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGACGCTGGCGTGGCCGGCGTGCCAGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCTGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGACCATGACCGAGAAGCAGATCGTGGAATACGTGAACAGCCAGGTGGTCAACCACAAGCGGCTGAGAGGCGGCGTGCGCTTTGTGGATGAGGTGCCAAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAAGTGATCCGGGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA変異の導入は文献の記載に基づいて行ったAsakoSawanoandAtsushiMiyawaki,NucleicAcidsResearch,2000,Vol.28,No.16。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。作製したヤエヤマヒメボタル変異型ルシフェラーゼを赤色変異体と称する。これは、S286A変異を有する。この赤色変異体S286Aは、更にKozak配列の付与による変異を有する。赤色変異体のアミノ酸配列は配列番号10に記載され、この赤色変異体をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号11に記載される。赤色変異体のアミノ酸配列配列番号10は、以下の通りである。MEMEKEENVVYGPQPFYPIEAGSAGIQLHKYMHQYAQLGAIAFSNALTGVDISYQEYFDITCRLAEAMKNYGMTQEGRIALCSENCEEFFIPVVAGLYIGVGVAPTNEIYTLRELNHSLGIAEPTIVFSSRKGLPKVLEVQKNVTCIKTIVILDSKVNFGGYDCVETFIKKNVPSGFQPSSFKPMDVKNRKEHLALLMNSSGSTGLPKGVQITHEGTVTRFSHAKDPIYGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRVVMLTKFDEELFLKTLQDYKCTAVILVPTLFGILNKSELIDKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGIRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLFKVKVIDLDTKKTLGVNRRGEICVKGPSLMKGYVRNPEATKEIIDDEGWMHTGDIGYYDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGVPDPEAGELPGAVVVLEKGKTMTEKQIVEYVNSQVVNHKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKVIREILKKPQSKM赤色変異体をコードする遺伝子の塩基配列配列番号11は、以下の通りである。ATGGAAATGGAAAAAGAGGAAAACGTCGTCTACGGCCCCCAGCCCTTCTACCCTATCGAAGCCGGCTCTGCCGGCATCCAGCTGCACAAGTACATGCACCAGTACGCCCAGCTCGGAGCCATTGCCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCGTGGACATCAGCTACCAGGAATACTTCGACATCACCTGTCGGCTGGCCGAGGCCATGAAGAACTACGGCATGACCCAGGAAGGCCGGATCGCCCTCTGCAGCGAGAACTGCGAAGAGTTCTTCATCCCCGTGGTGGCCGGCCTGTATATCGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCCTGAGAGAGCTGAACCACAGCCTGGGAATCGCCGAGCCCACCATCGTGTTCAGCAGCAGAAAGGGCCTGCCCAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAAACGTGACCTGCATCAAGACCATCGTGATCCTGGACAGCAAAGTGAACTTCGGCGGCTACGACTGCGTGGAAACCTTCATCAAAAAGAACGTGCCCAGCGGCTTCCAGCCCAGCTCCTTCAAGCCCATGGACGTGAAGAACCGGAAAGAGCACCTGGCCCTGCTGATGAACAGCAGCGGCTCTACCGGCCTGCCTAAAGGGGTGCAGATCACACACGAGGGCACCGTGACCAGATTCAGCCACGCCAAGGACCCCATCTACGGCAACCAGGTGTCCCCTGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCCTGCGGCTACAGAGTGGTCATGCTGACCAAGTTCGATGAAGAACTGTTCCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGCGGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGGCATCCTGAACAAGAGCGAGCTGATCGACAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAACCTGCCCGGAATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAAACCACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGTTCAAAGTGAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCGTGAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCAGCCTGATGAAGGGCTACGTGCGGAATCCTGAGGCCACCAAAGAGATCATCGACGACGAGGGCTGGATGCACACCGGCGACATCGGCTACTACGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCAGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGACGCTGGCGTGGCCGGCGTGCCAGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCTGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAGGGCAAGACCATGACCGAGAAGCAGATCGTGGAATACGTGAACAGCCAGGTGGTCAACCACAAGCGGCTGAGAGGCGGCGTGCGCTTTGTGGATGAGGTGCCAAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAAGTGATCCGGGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA2.HeLa細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較次に、ヤエヤマヒメボタル野生型および赤色変異体ルシフェラーゼによるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌスピラリスPhotinuspyralisルシフェラーゼプロメガ社、Luc2ルシフェラーゼおよびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBRプロメガ社、CBRルシフェラーゼと比較した。ヤエヤマヒメボタル野生型ルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸および赤色変異体の遺伝子を含む核酸に対してKozak配列を付与した。なお、これら2種の配列配列番号15および配列番号16とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列を、それぞれ、pF9ACMVhRLucneoFlexivectorPromegaのマルチクローニングサイトのSgfIおよびPmeIのサイト間に挿入した。pF9Aベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子hRLucをベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。同様の手順に従って、フォティヌスピラリスPhotinuspyralisルシフェラーゼおよびCBRルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸をpF9Aベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。発光強度比較はDual-Glo登録商標LuciferaseAssaySystem米国プロメガ社製、製品番号E2940を用いて実施した。得られた4種のプラスミドを、48穴のプレートに播種したHeLa細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、24時間後PBSで細胞を洗浄した。48穴プレートの各ウェルに2mMD-ルシフェリン/CO2IndependentMediumInvitrogenを200μlずつ添加し、37°C、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensorATTOを用いて90分間発光強度を測定した。90分経過時点の発光強度を4種ルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を37°C、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensorを用いて15分間発光強度を測定した。ヤエヤマヒメボタル野生型ルシフェラーゼ、赤色変異体、P.ピラリスルシフェラーゼLuc2ルシフェラーゼ、プロメガ社およびCBRルシフェラーゼプロメガ社による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図2に示す。図2において、発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度を1としたときの比で表わされている。図2に示されるように、D-ルシフェリンを発光基質とした場合、HeLa細胞における野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼよって得られた発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の1.55倍であった。赤色変異体によって得られた発光強度は、P.ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の3.20倍であった。また、ヤエヤマヒメボタルの赤色変異体ルシフェラーゼの発光強度は、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼCBRの発光強度の約9.7倍であった。次に、HeLa細胞で発現させた各種ルシフェラーゼ野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ、ヤエヤマヒメボタル赤色変異体およびコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼCBRの発光スペクトルを測定した。測定は、上記の方法で遺伝子導入培養したHeLa細胞をはがし,2mMのD-ルシフェリンを含むCO2IndependentMediumInvitrogenを500μlに件濁して、LumiFlSpectroCaptureATTOを用で測定した。温度は37°Cである。その結果を図3に示す。ヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼは、HeLa細胞内において、最大発光波長を野生型の607nmから613nmにシフトさせることができる。このとき、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼの最大発光波長は620nmである。しかし、発光強度はヤエヤマヒメボタルの赤色変異体の方が約9.7倍明るいことになる。このように、特定の実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合は、従来の赤色ルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。[実施例3:近赤外発光ルシフェリンアナログを用いた場合のHeLa細胞におけるヤエヤマヒメボタル変異体ルシフェラーゼの発光強度およびスペクトルの比較実施例2にて作製したルシフェラーゼ遺伝子を含む4種類野生型ヤエヤマヒメボタル、ヤエヤマヒメボタル赤色変異体、P.ピラリス、コメツキ由来CBRのプラスミドを、実施例2と同様にHeLa細胞に導入し,近赤外発光ルシフェリンアナログジメチルアニリン-ジエン型ルシフェリン、アカルミネ登録商標、和光純薬社製を発光基質として使用し、温度37°Cで、各種ルシフェラーゼにより得られる発光強度とスペクトルを測定した。ただし、近赤外発光ルシフェリンアナログの濃度は1mMである。図4に、各種ルシフェラーゼにより得られた発光強度の比較図を示している。発光強度は野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼおよびヤエヤマヒメボタルの赤色変異型により得られた発光強度は、それぞれ、P.ピラリスによる発光強度の1.02倍および3.84倍であった。また、これらにより得られた発光強度は、それぞれ、コメツキ由来の赤色ルシフェラーゼCBRによる発光強度の3.4倍および12.8倍であった。図5は、近赤外発光ルシフェリンアナログを基質として用いた場合の、HeLa細胞37°Cにおける野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼおよびヤエヤマヒメボタル赤色変異型ルシフェラーゼにより誘起された発光の発光スペクトルを示している。図5より、両者ともに661nmの発光波長を示し、変異による波長のシフトは生じないことがわかる。図6は、近赤外発光ルシフェリンを用いた場合の、HeLa細胞37°Cにおけるコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼCBRにより誘起された発光の発光スペクトルを示している。図6より、CBRによる発光は、ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼと同じ条件では発光スペクトルが測定できないほど発光強度が弱いことが示された。"