"抗癌剤による治療法に対するトリプルネガティブ腫瘍細胞の感受性を決定するための方法であって、a腫瘍細胞を溶解して、細胞抽出物を作製するステップと、b細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルを決定するステップと、cステップbにおいて決定された細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルを、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの参照発現レベルと比較するステップとを含み、細胞抽出物における参照発現レベルと比較して低レベルのVEGFR2発現、低レベルのc-KIT発現、高レベルのHER1発現及び/又は低レベルのIGF-1R発現の存在が、腫瘍細胞が抗癌剤に対し感受性であることを示す方法。抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、ワクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。抗癌剤が、ベバシズマブアバスチン登録商標、カルボプラチン及びパクリタキセルの組み合わせである、請求項1に記載の方法。パクリタキセルが、ナノ粒子アルブミン結合nabパクリタキセルである、請求項3に記載の方法。参照発現レベルが、癌細胞株から作成された検量線から算出される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。検量線が、癌細胞株から調製された複数濃度の系列的に希釈された細胞抽出物から作成される、請求項5に記載の方法。癌細胞株が、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rを発現する、請求項5又は6に記載の方法。細胞抽出物における参照発現レベルと比較して中~高レベルのVEGFR2発現、中~高レベルのc-KIT発現、低~中レベルのHER1発現及び/又は中~高レベルのIGF-1R発現の存在が、腫瘍細胞が抗癌剤に対し抵抗性であることを示す、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物におけるVEGFR2及びc-KIT及び/又はHER1の発現レベルを決定するステップを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R及び/又はAKTの活性化レベルを決定するステップを更に含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物における1つ又は複数の追加的なシグナル伝達分子の発現及び/又は活性化レベルを決定するステップを更に含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。1つ又は複数の追加的なシグナル伝達分子が、HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2MAPK1、ERK1MAPK3、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、受容体二量体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。腫瘍細胞が、腫瘍から得られた循環腫瘍細胞又は穿刺吸引FNA細胞である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。腫瘍細胞が試料から単離される、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。試料が、トリプルネガティブ転移性乳癌の対象から得られる、請求項15に記載の方法。試料が、全血、血清、血漿又は腫瘍組織試料である、請求項15又は16に記載の方法。ステップaの前に腫瘍細胞を抗癌剤と接触させるステップを更に含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。ステップcにおいて得られた比較の結果を、利用者に可読形式で提供するステップdを更に含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルが、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの全タンパク質レベルを検出することにより決定される、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルが、近接二重検出アッセイにより決定される、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。近接二重検出アッセイが、協調的酵素増強反応免疫測定法CEERである、請求項21に記載の方法。抗癌剤による治療法に対するトリプルネガティブ乳腺腫瘍の反応を予測するための方法であって、aトリプルネガティブ乳腺腫瘍から得られた腫瘍細胞を溶解して、細胞抽出物を作製するステップと、b細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルを決定するステップと、cステップbにおいて決定された細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルを、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの参照発現レベルと比較するステップとを含み、細胞抽出物における参照発現レベルと比較して低レベルのVEGFR2発現、低レベルのc-KIT発現、高レベルのHER1発現及び/又は低レベルのIGF-1R発現の存在が、抗癌剤による治療法に対する反応を予測する方法。抗癌剤が、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、ワクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。抗癌剤が、ベバシズマブアバスチン登録商標、カルボプラチン及びパクリタキセルの組み合わせである、請求項23に記載の方法。パクリタキセルが、ナノ粒子アルブミン結合nabパクリタキセルである、請求項25に記載の方法。参照発現レベルが、癌細胞株から作成された検量線から算出される、請求項23~26のいずれか一項に記載の方法。検量線が、癌細胞株から調製された複数濃度の系列的に希釈された細胞抽出物から作成される、請求項27に記載の方法。癌細胞株が、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rを発現する、請求項27又は28に記載の方法。細胞抽出物における中~高レベルのVEGFR2発現、中~高レベルのc-KIT発現、低~中レベルのHER1及び/又は中~高レベルのIGF-1R発現の存在が、抗癌剤による治療法に対する反応の欠如を予測する、請求項23~29のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物におけるVEGFR2及びc-KIT及び/又はHER1の発現レベルを決定するステップを含む、請求項23~30のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物におけるVEGFR2、c-KIT、HER1、IGF-1R及び/又はAKTの活性化レベルを決定するステップを更に含む、請求項23~31のいずれか一項に記載の方法。細胞抽出物における1つ又は複数の追加的なシグナル伝達分子の発現及び/又は活性化レベルを決定するステップを更に含む、請求項23~32のいずれか一項に記載の方法。1つ又は複数の追加的なシグナル伝達分子が、HER2、p95HER2、HER3、HER4、PI3K、AKT、MEK、PTEN、SGK3、4E-BP1、ERK2MAPK1、ERK1MAPK3、PDK1、P70S6K、GSK-3β、Shc、c-MET、VEGFR1、VEGFR3、受容体二量体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。腫瘍細胞が、トリプルネガティブ乳腺腫瘍から得られた循環腫瘍細胞又は穿刺吸引FNA細胞である、請求項23~34のいずれか一項に記載の方法。腫瘍細胞が試料から単離される、請求項23~35のいずれか一項に記載の方法。試料が、トリプルネガティブ転移性乳癌の対象から得られる、請求項36に記載の方法。試料が、全血、血清、血漿又は腫瘍組織試料である、請求項36又は37に記載の方法。低レベルのVEGFR2発現の存在が、より長期の無進行生存PFS持続期間を予測する、請求項23~38のいずれか一項に記載の方法。低レベルのc-KIT発現の存在が、より長期のPFS持続期間を予測する、請求項23~39のいずれか一項に記載の方法。高レベルのHER1発現の存在が、より長期のPFS持続期間を予測する、請求項23~40のいずれか一項に記載の方法。VEGFR2、c-KIT又はHER1単独の発現レベルと比較して、低レベルのc-KIT発現及び/又は高レベルのHER1発現の存在と組み合わせた低レベルのVEGFR2発現の存在が、より長期のPFS持続期間を予測する、請求項23~41のいずれか一項に記載の方法。ステップaの前にトリプルネガティブ乳腺腫瘍から得られた腫瘍細胞を抗癌剤とインキュベートするステップを更に含む、請求項23~42のいずれか一項に記載の方法。ステップcにおいて得られた比較の結果を、利用者に可読形式で提供するステップdを更に含む、請求項23~43のいずれか一項に記載の方法。VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルが、VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの全タンパク質レベルを検出することにより決定される、請求項23~44のいずれか一項に記載の方法。VEGFR2、c-KIT、HER1及び/又はIGF-1Rの発現レベルが、近接二重検出アッセイにより決定される、請求項23~45のいずれか一項に記載の方法。近接二重検出アッセイが、協調的酵素増強反応免疫測定法CEERである、請求項46に記載の方法。0172次の実施例は、請求されている本発明の説明のために提示されているが、それを限定するためのものではない。0173PCT国際公開第2010/132723号の実施例は、全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれている。実施例1.例示的な近接アッセイスライド形式0174本実施例は、協調的酵素増強反応免疫測定法CEERとしても知られている本発明の近接アッセイの好ましい一実施形態を説明する。本実施形態の近接アッセイは、循環腫瘍細胞CTC及び/又は組織試料例えば、FNAにおける標的タンパク質の発現及び活性化を測定する抗体マイクロアレイに基づくプラットフォームを用いる。非限定的な例として、本実施形態の近接アッセイは、CTC又は腫瘍組織におけるHER1等の1つ又は複数の標的タンパク質のタンパク質発現レベル及び/又は活性化状態の解析に用いることができる。ある事例において、本実施形態の近接アッセイは、CTC-ProfilerVeridexを用いて、約7.5mlの全血から抗Ep-CAM抗体でコーティングされた磁気粒子により単離されたCTCを利用する。続いて、単離されたCTCは、その後のErbB経路発現及び/又は活性化の免疫解析前に増殖因子例えば、EGFヘレグリンで刺激することができる。別の事例において、本実施形態の近接アッセイは、例えば、トリプルネガティブ乳癌試料等、新鮮凍結転移性生検を包含する腫瘍組織試料を利用する。0175特定の事例において、本実施形態の近接アッセイは、スライド形式を用い、複数の検量物質及び対照を包含する。図1は、全及びリン酸化HER1及びHER2レベルを解析するための例示的なスライド形式のアレイ設計を示す。各スライドに16パッドが存在し、各パッドは300スポットを収容できる。16パッドのニトロセルローススライド上にプリントするために接触マイクロアレイプリンタを用いた。各スポットは、系列希釈で3回反復してプリントされた追跡用色素及び特異的捕捉抗体Ab又は対照のいずれかを包含する。1mg/ml、0.5mg/ml及び0.25mg/mlの捕捉Abをプリントする。全及びリン酸アッセイの両方において、配向参照として精製IgGをプリントした。BSA-リン酸を試薬対照としてプリントした。分析的キャリブレーション反応を8パッドにおいて行い、内部品質管理反応を2パッドにおいて行う。各スライドは、最大4種の未知患者試料の処理を可能にする。全標的タンパク質又はリン酸化された活性化タンパク質の発現は、対象タンパク質を発現する陽性細胞株から得られた希釈ライセートの検量線の計算に基づく単位である、コンピュータ処理単位CUで報告することができる。試料毎に2種の別個のスライドを用いる。一方のスライドは、全血から単離された細胞における標的タンパク質の発現を検出するためのものであり全アッセイスライド、もう一方は、標的タンパク質活性化の程度を検出するためのリン酸化検出用であるリン酸アッセイスライド。0176一実施形態において、患者及び健常対照個体から得られた全血は、EDTAチューブ内に採取される。採血の際の皮膚細胞の混入を妨げるため、本出願人らの手順は、最初に採取された3mLの血液を廃棄する或いはCTC計数及びCellSearchキットを用いた視覚的な免疫染色のためにCellSaveチューブ内に採取することを規定する。次に、2本の追加的なEDTAチューブを用いて、各チューブ7.5mLの全血を採取する。次に、自動磁気細胞分離装置VeridexAutoPrepを用いて各チューブからCTCを単離する。濃縮された試料を組み合わせ、続いて増殖因子で刺激する。次に、活性化された細胞を溶解し、直ちに処理するか、或いはその後の免疫解析のために-80°Cで保存する。別の一実施形態において、新鮮凍結転移性生検等の腫瘍組織の細胞を得て、溶解して、細胞抽出物を作製し、続いて直ちに処理するか、或いはその後の免疫解析のために-80°C保存する。0177本実施形態の近接アッセイは、細胞ライセートにおけるタンパク質標的を免疫マイクロアレイ表面上の捕捉抗体とインキュベートすることにより開始される。細胞ライセートにおける任意のHER1又は他のRTK若しくはシグナル伝達経路タンパク質は、その対応する捕捉抗体と結合し、その後、2種の追加的な検出用抗体により独自の免疫複合体が形成される。検出用抗体の一方は、グルコース酸化酵素GOとコンジュゲートして、グルコース存在下でH2O2を生成する。第二のHRPコンジュゲート検出用抗体が免疫複合体内で近接して結合すると、陽性シグナルが生成される。その後、チラミド介在性のシグナル増幅プロセスが、アッセイの感受性を増強する。タンパク質検出の特異性は、異なるエピトープと3種の特異的なAbとの同時発生的な結合により増強され、感受性の高さは、増幅により単細胞となることができる。図2は、リン酸化HER1を検出するための例示的な近接アッセイの模式図を示す。0178本明細書に記載されているマイクロアレイプラットフォームは、マルチプレックス化の利益をもたらす。アッセイを拡大する能力は、利用可能性が限定的な試料における複数の受容体及びシグナリング分子の測定によるハイコンテンツ解析を可能にする。マイクロアレイは、スケーラブルscalableであり、臨床上有用な診断アッセイに必要なスループットを達成する可能性を有する。実施例2.トリプルネガティブ転移性乳癌TNMBCにおけるEGFR及びVEGFR2発現は、Nab-パクリタキセルnabP/カルボプラチンC/ベバシズマブB化学療法に対する反応を予測する。背景0179エストロゲン、プロゲステロン又はヒト上皮増殖因子受容体2HER2受容体の発現を立証しないトリプルネガティブ転移性乳癌TNMBCの患者は、予後不良に直面するDent、R.ら、ClinCancerRes.1315Pt1:4429~44342007。この状態には、治療法及び予測マーカーの改善が必要とされる。0180Bベバシズマブ;アバスチン登録商標及びCカルボプラチンの組み合わせは、TNMBC等、多くの固形腫瘍において有効である。Nab-パクリタキセルnabP;アブラキサン登録商標は、腫瘍により分泌されるアルブミン結合タンパク質であるSPARCを潜在的に標的とする。0181タキサン及び白金に基づく化学療法は、転移性乳癌の第一選択治療において有意な活性を有し、組み合わせて投与した場合特に有効であるPerez、E.A.、Oncologist95:518~5272004;Perez、E.A.ら、Oncology692:117~1212005;O’ShaughnessyJ.、Oncologist10Suppl3:20~292005。0182ナノ粒子アルブミン結合nab-パクリタキセルは、標準パクリタキセルと比較して有効性及び耐容性を改善したGradishar、W.J.ら、JClinOncol.2331:7794~78032005。0183白金剤の中でも、カルボプラチンは、タキサンと組み合わせると、シスプラチンと同様の有効性でより優れた耐容性を示すと考えられており、非血液毒性リスクはより低いが、血液毒性リスクはやや高いGainford、C.ら、ProcAmSocClinOncol.19:113、Abstract4392000;Perez、E.A.ら、Cancer881:124~1312000;Perez、E.A.ら、Oncology692:117~1212005。カルボプラチンをドセタキセルではなくパクリタキセルと組み合わせると、好中球減少症の発生率は低下するPerez、E.A.ら、Cancer881:124~1312000;Perez、E.A.ら、Oncology692:117~1212005。0184ベバシズマブは、血管内皮増殖因子VEGFを標的として血管新生を阻害するモノクローナル抗体である。タキサンに基づく化学療法にベバシズマブを加えると、転移性乳癌の女性における治療奏効率及び無進行生存PFSを有意に改善するMiller、K.D.ら、NEnglJMed.35726:2666~26762007;Miles、D.W.ら、CancerRes.6924S:495s、Abstract412009;Robert、N.J.ら、JClinOncol.2715suppl:42s、Abstract10052009。目的0185本試験は、無処置TNMBCの登録転移性生検bxsを用いて、1TNMBCにおけるシグナリング経路の発現/活性化を説明し、2TNMBCにおけるこれらの発現パターンを反応と相関させた。方法0186治験開始時に得られた新鮮凍結転移性生検を用いて、シグナリング経路タンパク質例えば、HER1EGFR、HER2、HER3、インスリン様増殖因子受容体1IGF1-R、c-KIT、c-MET、PI3K、AKT、MAPK及び/又はVEGFR2の発現及び活性化を評価した。CEER等、近接アッセイプラットフォームを用いて、網羅的経路タンパク質発現及び活性化を決定した。log順位検定を用いて、無進行生存PFSと、経路タンパク質のタンパク質発現又は活性化との間の関連性を検査した。本試験に用いた腫瘍組織試料は、その開示全体が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれている、次のClinicalTrials.gov識別子:NCT00479674の進行中の臨床試験、表題トリプルネガティブエストロゲン、プロゲステロン又はHer2受容体の発現を立証しない転移性乳癌におけるアブラキサン登録商標、カルボプラチン及びベバシズマブ[トリプレット療法]の第II相試験から得た。結果018711/1861生検において全EGFRが発現したが、3/1817において活性化した。PI3K及びAKTは、それぞれ11/1861及び8/1844患者において過剰発現し、6/1833生検において同時発現した。17種の転移性生検において、より高い全EGFR発現33wks対22wks、p=0.14及びより低いVEGFR2発現33wks対18wks、p=0.16が見られた。CEERにより全測定を行った。結論0188Nab-パクリタキセル/カルボプラチン/ベバシズマブは、優れた耐容性及びTNMBCの有効な治療法をもたらす。全EGFRの過剰発現及びより低いVEGFR2レベルは、TNMBCにおけるトリプレット療法に対する反応の適中率もたらす。リアルタイム転移性生検は、原発性及び転移性腫瘍の間で重要な変化が生じることを示し、これらの変化は、TNMBCの反応の予測マーカーの定義に非常に影響力がある。実施例3.トリプルネガティブ転移性乳癌TNMBCにおけるカルボプラチンC/ベバシズマブBを含有する治療法に対する反応を予測するための網羅的経路プロファイリング0189背景:TNMBCにおける治療法及び予測マーカーの改善が必要とされる。Bアバスチン及びCカルボプラチンの組み合わせは、TNBC等の多くの固形腫瘍において活性を有する。本試験は、無処置TNMBCのアーカイブ的な原発性及び転移性生検bxsを用いて、1原発性及びTNMBCにおけるVEGFR2の発現レベルを決定し、2TNMBCにおける様々なシグナリング経路タンパク質の発現/活性化を説明し、3TNMBCにおけるこれら発現パターンを反応と相関させた。0190方法:トリプルネガティブ乳癌コア生検検体を採取し、-80°Cで適切に凍結させた。新規イムノアッセイ方法を適用して、1000ng~5000ngの凍結組織におけるシグナリングタンパク質の発現及び活性化レベルを調査した。CEERプラットフォームakaCOPIAは、マルチプレックス型免疫マイクロアレイプラットフォームであり、これは非常に高い分析感度及び特異性をもたらすシグナル生成/増幅のチャネリング現象のための2種の検出用抗体の共局在を必要とする独自の免疫複合体の形成を利用するものである。0191結果:本試験は、各検体およそ3~1000腫瘍細胞/1000ng~5000ng細胞ライセートにおいてCK値の変動する度合いを同定した。これらのTNMBCにおいて、HER2発現レベルは、低から中程度0~2、IHC当量の範囲に及び、18試料中17試料において認められたことが判明した。18試料中1試料は、実質的に高レベルのHER2発現IHC3レベルを有していた。検体の50はHER2リン酸化を示さなかったが、残りの50は変動レベルの活性化HER2を示した。これらの試料におけるHER1、HER3、IGF1-R、c-KIT、c-MET、PI3K、Shc、VEGFR2及びAKTの発現/活性化の有病率も解析した。0192結論:リアルタイム転移性生検は、原発性及び転移性腫瘍の間で重要な変化が生じ、これらの変化が反応予測マーカーの定義において非常に影響力があることを示す。全及び活性化EGFRの過剰発現並びにより低いVEGFR2レベルは、TNMBCにおけるトリプレット療法BCNab-パクリタキセルに対する反応の適中率をもたらす。疾病プロファイルは変動することが多いため、伝達経路タンパク質の変化のモニタリングは、治療法調整に有用となるであろう。実施例4.乳癌患者における複数のシグナル経路タンパク質の機能プロファイリング要約0193新規又は獲得抵抗性の機構の一つに、アミノ末端細胞外ドメインを欠いた様々な形態の切断型HER2/ERBB2受容体t-ERBB2の発現がある。t-ERBB2アイソフォームの非限定的な例として、p110、p95HER2p95m、p95c及びp95nが挙げられる。原発性及び転移性腫瘍におけるトランス活性化潜在能力を有する様々な形態のHER2受容体及び他の受容体チロシンキナーゼRTKをプロファイリングするための方法は、変化する疾病発生における有用な洞察をもたらし得る。本実施例は、様々なER/PR/HER2状態の230乳癌におけるその発現及び活性化に関するシグナル伝達経路タンパク質パネルのプロファイリングの成功を説明する。特に、本明細書に記載されている新規近接介在性免疫マイクロアレイ方法を用いて、ヒト乳腺腫瘍試料における全及びリン酸化t-ERBB2の化学種のレベルを調査した。本実施例は、t-ERBB2アイソフォームが、強いERBB2陽性腫瘍31試料のうち16試料、52において検出され、38試料中10試料において32リン酸化されたことを示す。序文0194トラスツズマブ抵抗性に関する数種の機構が報告されている。第一に、他の機構の中でも特に、他のRTKIGF1-R等の活性化及び切断型HER2の蓄積は頻繁に報告されている。特に、p95HER2として集合的に知られているHER2のアミノ末端切断型のカルボキシル末端フラグメントは、HER2発現乳癌細胞株及び腫瘍において頻繁に発見される。様々なシグナル伝達経路及びフィードバックループ間のクロストークは、特定の治療圧力又は経路耽溺下で腫瘍のエスケープ機構をもたらし、経路ネットワーク解析を行うための網羅的診断ツールを必要とする。数個の選択されたバイオマーカーに対し行われた現在のIHC/FISHに基づく技術により得られた臨床情報に基づく治療決定は、異種疾病を急速に発展している患者の治療において有効ではないであろう。本実施例は、検出用抗体の異なる配置が、切断型標的例えば、p95HER2のその全長対応物例えば、HER2からの差次的な検出を可能にすることを立証する。特に、本実施例は、転移性腫瘍の急速凍結組織及び穿刺吸引液両方のヒト試料における全及びリン酸化t-ERBB2化学種のレベルを定量化するための、新規の高度感受性及び特異的抗体マイクロアレイ形式の協調的酵素増強反応免疫測定法CEERの使用を説明する。本実施例は、HER2、p95HER2、HER1、HER3及びIGF1R並びに下流シグナル伝達タンパク質のPI3K、Shc及びc-METの機能状態発現及び活性化の解析を更に立証する。方法0195マルチプレックス型マイクロアレイプリント:非接触プリンタNanoplotter、GeSiMを用いて、捕捉抗体AbをニトロセルロースコーティングガラススライドONCYTE登録商標、GraceBio-Labs上にプリントした。スポット直径はおよそ175μmであり、プリントしたスライドを乾燥チャンバー内にて4°Cで維持した。各スポットは、追跡用色素及び特異的捕捉Abを包含した。およそ500pLの捕捉Abを、1mg/mL、0.5mg/mL及び0.25mg/mLの系列希釈濃度で3回反復してプリントした。陰性対照として精製マウスIgGをプリントした。各スライドは、各スライド実験実施における試料の正確な定量化のための検量線作成のための細胞株対照を含有する。各アレイスライドから得られたデータの品質を保証するため、各スライドにおいて内部品質管理試料の実験を実施した。0196抗体コンジュゲーション及び精製:標的特異的Ab及び対応する検出用酵素を二官能性架橋剤、サクシニミジル-4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボン酸SMCCにより活性化し、デキストランと結合して、抗体-デキストラン-酵素ポリマーコンジュゲートを作製した。分子ふるいカラムを用いたHPLCによりコンジュゲートを精製した。競合ELISAにより精製コンジュゲートにおけるAb活性を検出し、各検出用酵素に特異的な機能アッセイにより酵素活性を検出した。0197協調的酵素増強反応免疫測定法CEER:図3に表す通り、組織ライセート中に存在する標的タンパク質は、ニトロセルロース表面上にプリントされた特異的捕捉抗体と結合し、非結合非標的タンパク質をスライドから除去する。捕捉された標的タンパク質における別のエピトープに対するグルコース酸化酵素GOとコンジュゲートした一方の検出用抗体と、標的タンパク質におけるリン酸化部位又は別の非重複エピトープに特異的なHRPとコンジュゲートした他方の検出用抗体との間の酵素による相互作用は、シグナル生成及びその後のチラミド介在性シグナル増幅を生じる。特に、免疫マイクロアレイスライドをTBST50mMTris/150mMNaCl/0.1Tween-20、pH7.2~7.4で2回リンスし、80μLのWhatmanブロッキングバッファーで1時間RTにてブロッキングし、次に、TBSTで2回洗浄した。80μLの希釈バッファー2BSA/0.1TritonX-100/TBS、pH7.2~7.4に系列的に希釈した細胞ライセート対照及び試料をサブアレイに添加し、スライド上の標準を指定し、次に1時間RTにてインキュベートした。インキュベーション後、スライドを4回、各回3分間洗浄した。検出用Abを80μLの反応バッファーに添加し、2時間RTにてインキュベートした。TBSTで洗浄することによって非結合二次検出用Abを除去した後に、50mMグルコース/PBS中の5μg/mlのビオチン-チラミド400μg/mLエタノール、PerkinElmerLifeScienceを80μL添加し、15分間暗所でインキュベートした。TBSTで4回、各回3分間洗浄することにより、GO-HRPの導くチラミド介在性シグナル増幅プロセスを終了した。2BSA/0.1Triton/TBS中の0.5μg/ml1:4000希釈ストレプトアビジンSA-Alexa647PBSに溶解、Invitrogenを40分間添加することにより、ビオチン-チラミドの局所堆積を検出した。インキュベーションを終了したらスライドをTBSTで4回洗浄し、乾燥し、マイクロアレイスキャナーで走査するまで暗所で維持した。0198tErbB2例えば、p95HER2濃縮:ErbB2の細胞外ドメインECDに特異的な磁気標識抗体を用いて全長p185-ErbB2受容体を細胞ライセートから除去した。その結果得られたp185-ErbB2除去細胞ライセートは、ECDを欠くt-ERBB2受容体タンパク質を含有し、その後に解析を行ってt-ERBB2発現及び活性化レベルを定量化した。0199臨床試料:ILSBioから急速凍結乳癌組織を購入した。全患者は、第II又はIII期腺管癌のコーカサス人種であった。ErbB2-IHC状態は全試料に利用できる。急速凍結組織試料を100μLの溶解バッファーに溶解した。溶解した試料を氷上で30分間維持し、遠心分離した。上清のタンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキットPierceにより決定し、その後の解析の前にその結果得られたライセートを-80°Cで保存した。全身性治療法を開始しようとしている進行性の測定可能な転移第IIIB期又は第IV期乳癌患者からFNA試料を採取した。患者は、組織学的又は細胞学的に確認された浸潤性乳癌であった。G23ゲージ針を用いてFNA試料を採取した。溶解バッファーを含有する採取バイアル内にFNA試料を直ちに注射し、その後の解析のために一晩輸送した。0200IP-ウエスタンブロッティング:細胞ライセートを、ERBB2のICDに対する抗体とコンジュゲートした磁気ビーズと共に一晩振盪器にて4°Cでインキュベートした。免疫磁気により濃縮したライセートをβ-メルカプトエタノールを含有する試料バッファー中に再懸濁し、5分間煮沸し、RTへと冷却し、NuPageInvitrogen4~12ゲルにローディングした。泳動が終了したら、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレンへと転写し、続いて洗浄し、5ミルクブロットblottoでブロッキングし、1次Ab、続いて2次Abとインキュベートし、その後、NBT/BCIPを用いて検出プロセスを行った。0201CEERデータ解析:各スライドを3種の光電子増倍管PMTゲインgain設定で走査して、有効ダイナミックレンジを増加させた。3回反復してプリントした反復スポットのバックグラウンド補正したシグナル強度を平均化した。各試薬ブランクの相対蛍光値を各試料から差し引いた。数種の品質基準を用いて、スポットフットプリントの制限、スポット反復の変動係数、パッド全体のバックグラウンド及び試薬ブランクの強度を包含する更なる解析から得られたデータにフィルターをかけた。アッセイ毎に、BT474細胞から調製された系列的に希釈した細胞ライセートから検量線を作成した。捕捉抗体濃度及びPMTの関数として生じる5種のパラメータ方程式にデータを適合させた。各曲線をlogシグナル強度の関数としてプロットし、相対蛍光単位RFU対log濃度として測定し、標準細胞株BT474と参照した。各希釈液及びゲインから得られた個々の予測を単一の最終予測に平均化した。結果0202ヒト細胞及び腫瘍におけるt-ERBB2の発現。ヒト細胞及び腫瘍試料におけるERBB2アイソフォームのレベル及び活性化を評価するため、新規抗体捕捉及び近接ベースの免疫マイクロアレイプラットフォームであるCEERを用いた図3。CEERは、標的特異的捕捉抗体及び2種の追加的な検出用抗体の間の免疫複合体形成を必要とする。検出用抗体の一方はグルコース酸化酵素GOとコンジュゲートし、他方は西洋わさびペルオキシダーゼHRPとコンジュゲートする。検出用抗体は、捕捉されたタンパク質における2種の異なるエピトープ標的発現レベルを決定する、或いはリン酸化ドメイン及び1種の代替的なエピトープ標的活性化レベルを決定すると結合することができる。免疫複合体におけるGOは、グルコース等の基質が供給されると、共局在するHRPへと導かれる過酸化水素H2O2を生成し、これにより分析感度を増強する。アッセイ配置は、複数の捕捉/検出用抗体間の免疫複合体形成の成功を必要とするため、プラットフォームは、複数の標的タンパク質における同時解析に必要な特異性を生じる。図4に示す通り、本方法は、BT474細胞株における全及びリン酸化ERBB2を一桁の分析感度で検出することができる。全長p185-ERBB2の除去あり又はなしの、BT474細胞の差次的なERBB2プロファイリングERBB2-ECD及びERBB2-ICD捕捉の比較は、およそ1.2×106ERBB2受容体/細胞のこのERBB2増幅細胞株におよそ4.4のt-ERBB2又はほぼ52800tERBB2受容体/細胞が存在することを示した図5。020374名の患者から得られた凍結乳腺腫瘍試料を、免疫組織化学的解析を用いてERBB2レベルに関して点数化し、次にCEERを用いて解析した表3。74種の試料のうち、24種はERBB2低/陰性IHCによるスコア=0~1であり、19種は中程度のERBB2発現スコア=2を有し、残りの31種は、高発現のERBB2スコア=3を有していた。CEER解析により、予想通り、ERBB2低又は陰性腫瘍で、有意なレベルの切断型ERBB2を発現したものはなかった。各試料におけるERBB2及びt-ERBB2並びにリン酸化t-ERBB2のレベルBT474細胞を参照として、RTK分子/細胞で示すを表2にまとめる。しかし、1019種のうち2種の中程度ERBB2陽性腫瘍はt-ERBB2を発現し、5231種のうち16種の高度ERBB2陽性腫瘍はt-ERBB2を発現した。更に、t-ERBB2アイソフォームは、中程度ERBB2陽性腫瘍10、19試料のうち2種及び高ERBB2腫瘍32、31種のうち10種の両方においてリン酸化されていた。有意なレベルのtERBB2リン酸化及び中程度レベルのt-ERBB220330及び24913のみを有する試料が存在しており、これは、t-ERBB2が、他のRTKとの相互作用により活性化され得るため可能となり得る。腫瘍CEER-ERBB2プロファイリング及びERBB2のIP-ウエスタン解析の例をそれぞれ図6表2における下線を引いた試料及び図7表2における四角で囲んだ試料に提示する。その上、8名の乳癌患者の転移性部位から得られたFNAを解析した。ERBB2陽性疾病の3種の試料は、t-ERBB2及びリン酸化t-ERBB2の変動の度合いを示したが表3、ERBB2陰性癌から得られた試料は、t-ERBB2発現を示さなかった。拡大したRTKプロファイリングにおいて、8C3-005-006においてIGF1R及びc-MET発現が検出されたが、これは、ERBB2陽性FNA試料におけるより低レベルのt-ERBB2だがより高レベルのpt-ERBB2の原因となり得る。0204図8に示す通り、174種のBCA試料における広範囲の経路タンパク質発現及び活性化を観察した。各マーカーの最も強いシグナルを有する試料を最も暗い色で示す。CEER-HER2は、IHC-HER2状態と高い相関を示した。CEER及びIHC間で不調和なHER2状態は、IP-ウエスタンにより解決し、>98相関を示した。HER3-Pレベルは、HER3-T及びPI3K活性化と高度の相関を示した。cMETプロファイルもPI3K活性化と強い相関を示した。HER2の非過剰発現だが有意なレベルを有するBCA組織の27IHCによる2のうち12/45及び21IHCによる0/1のうち11/53は、発現したHER2受容体の5を超えるリン酸化を示した。結論0205HER2及びその変種型並びに他のRTKの状態は、一次又は獲得抵抗性のいずれかによりトラスツズマブに反応しないHER2陽性BCA患者の潜在的な機構に関する決定的な情報を提供する。本明細書に記載されているCEER解析を利用して、有効な標的治療法を選択するために、BCA患者をそのシグナル伝達タンパク質に関してプロファイルすることができる。実施例5.トリプルネガティブ転移性乳癌TNMBCにおける治療法に対する反応を予測するための網羅的経路プロファイリング0206TNBCにおける治療法及び予測マーカーの改善が必要とされる。本試験は、Bアバスチン登録商標[ベバシズマブ]、Cカルボプラチン及びnabPアブラキサン登録商標で治療トリプレット療法しているトリプルネガティブ乳癌患者から得られたコア生検検体を用いて、1TNMBCにおける様々なシグナリング経路タンパク質例えば、VEGFR2、c-KIT、HER1等の発現及び活性化のレベルを決定し、2TNMBCにおけるこれらの発現及び活性化パターンを反応と相関させた。0207Bアバスチン登録商標[ベバシズマブ]、Cカルボプラチン及びnabPアブラキサン登録商標による治療の開始前の患者から得られたトリプルネガティブ乳癌コア生検試料n=17を採取し、-80°Cで適切に凍結した。新規イムノアッセイ方法を適用して、1000ng~5000ngの凍結組織におけるシグナリングタンパク質の発現及び活性化レベルを調査した。本明細書に記載されている通り、協調的酵素増強反応免疫測定法CEER協調的近接免疫測定法COPIAとしても知られているは、チャネリング現象のために2種の検出用抗体の共局在を必要とする独自の免疫複合体の形成を利用して非常に高い分析感度及び特異性を生じるシグナル生成/増幅を達成する、マルチプレックス型免疫マイクロアレイプラットフォームである。図9は、対照T47D乳癌細胞及びヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECと比較したトリプルネガティブ乳癌コア生検試料における、CEERによる機能的経路プロファイリングの一例を提示する。特に、TNMBCにおける次のシグナリング経路タンパク質の発現及び活性化をCEERにより評価した。EGFRHER1、HER2、HER3、c-Met、IGF-1R、c-KIT、PI3K、SHC、AKT及びVEGFR2。0208無進行生存PFSも決定した。マーカー毎に、カットオフ値に基づき試料を高及び低群に分割した。例えば、カットオフ値は、群サイズを同等化するため中央値又はその近似値を選択することができる例えば、8=低、9=高。パラメトリックt検定を用いて、タンパク質発現及び活性化をPFSと相関させる。低例えば、中央値を下回る対高例えば、中央値を上回る群のPFSを比較した。図10は、マーカー毎の低及び高試料群のPFS間のこのような比較の結果を説明する。特に、図10における表は、低c-KIT又は低VEGFR2発現が、より高レベルの該マーカーと比較して有意により長期のPFS持続期間と関連することを示す低全c-KITレベルの42.1週間PFS対、高全c-KITレベルの20.7週間PFS;低全VEGFR2レベルの39.9週間PFS対、高全VEGFR2レベルの20.9週間PFS。図10における表は、低IGF-1R活性化、低c-KIT活性化、低IGF-1R発現及び低HER1活性化がそれぞれ、より高レベルの該マーカーと比較してより長期のPFS持続期間と関連することも示す。その上、図10における表は、高HER1発現が、より低レベルの該マーカーと比較してより長期のPFS持続期間と関連することを示す高全HER1レベルの36.8週間PFS対、低全HER1レベルの23.4週間PFS。図11における表は、タンパク質発現及び活性化をPFSと相関させるためのノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を用いた類似の解析を説明する。低c-KIT又はVEGFR2発現は、より高レベルの該マーカーと比較して有意により長期のPFS持続期間と関連することを再度示す。0209図12は、c-KIT及びVEGFR2両方の発現レベルの測定が、TNMBCにおけるトリプレット療法に対する反応の決定の適中率を増加させることを示す。特に、低c-KIT及びVEGFR2発現レベルの組み合わせどちらも高くないが、一方又は両方のマーカーが高い試料一方が高い又は両方とも高いと比較して有意により長期のPFS持続期間と関連することが判明した。0210図13は、VEGFR2及びHER1両方の発現レベルの測定が、TNMBCにおけるトリプレット療法に対する反応の決定の適中率を増加させることを示す。特に、高HER1及び低VEGFR2発現レベルの組み合わせどちらも悪くないは、HER1発現が低い及び/又はVEGFR2発現が高い一方が悪い又は両方とも悪い試料と比較して有意により長期のPFS持続期間と関連することが判明した。0211図14は、A全VEGFR2、B全c-KIT及びC全HER1の増加レベルと、PFSの長さにより示されるトリプレット療法に対する反応との間の相関を説明する。特に、より低い全VEGFR2又はc-KITレベルは、TNMBCにおけるトリプレット療法に対する反応と関連し、一方、より高い全HER1レベルは、TNMBCにおけるトリプレット療法に対する反応と関連した。0212結論として、本実施例は、1c-KIT及びIGF-1R両方の活性化リン酸化及び全レベルの間に相関が存在し、2低VEGFR2又はc-KIT発現レベルが反応を予測し、3高EGFR例えば、白金に基づく治療法に対し反応する筈の発現レベルは反応と相関するが、高P-EGFRレベルは相関せず、4一般に、経路活性化例えば、P-c-KIT、p-IGF-1R、p-EGFR、p-AKTその他が低い場合例えば、高度増殖腫瘍ではない、患者は、カルボプラチン、Nab-パクリタキセルPactitaxel及びアバスチンのトリプレット療法に対しより高いPFSを有し、5併用療法のため、全VEGFR2発現を全c-KIT又はEGFR発現へと加えると、より優れた適中率をもたらすことを立証する。実施例6.腫瘍組織採取及び処理0213腫瘍組織又はFNA試料は、本明細書に記載されている近接アッセイ例えば、CEERを用いてシグナル伝達経路を調べるために、癌患者から得ることができる。例えば、経路解析のための試料は、切片を作製し又は凍結FNA手順を行うことにより凍結組織から得ることができる。特定の事例において、その後のプロファイル解析のために凍結検体の組織切片作製を行う。ある特定の他の事例において、臨床環境において患者及び異種移植片から試料を得るために、相対的非浸潤性FNA手順を行う。0214凍結組織試料は、次の方法により採取することができる。オプション1.組織切片採取:1.試料切断を行うプラスチック秤量ボートをドライアイス上に維持する。a.材料を冷却するため、かみそりの刃又はミクロトームの刃、細型ピンセット及び予めラベルした試料採取バイアルをドライアイス上に維持すること。2.凍結ヒト癌組織を-80°Cフリーザーから取り出し、試料を直ちにドライアイス上に移す。3.凍結組織をドライアイス上の秤量weightingボートに置き、かみそりの刃又はミクロトームの刃を用いて凍結組織の小片を切断し10μm切片×3、予冷したピンセットを用いて組織を、予冷し予めラベルした試料採取バイアルに移す。4.蓋を閉め、ドライアイス上に維持する。5.採取した検体を、先ず二重のビニール袋、次に発泡スチロールStyrofoam容器一次容器内に適量のドライアイスと共に置く。a.少なくとも6~8ポンドのドライアイスを用いること。夏季にはより多量を用いること。注:適正な量のドライアイスは、輸送会社と協議した後に決定されるであろう。b.必要な認可及び文書に関して国際輸送プロセスのための輸送会社と協議すること。c.湿氷wetice又は冷却剤即ち、CoolPacksを用いないこと。6.要求書及び試料リストが箱の中、二重袋の外側に置かれていることを確認する。7.容器をしっかりと密封し、凍結組織-解凍不可のラベルを貼る。オプション2.凍結組織からのFNA調製:1.-80°Cフリーザーから凍結ヒト癌組織を取り出し、試料バイアルを直ちにドライアイス上に移す。2.FNA手順の準備が整った試料は、湿氷上に10分間置いて組織を軟化させる必要がある。3.FNA試料採取は、軟化した凍結組織に23又は25ゲージ針を5~10回通すことにより行うと良い。残った試料バイアルをドライアイスに戻す。4.FNA試料採取バイアル蓋をアルコールで拭く。5.凍結FNA組織は、100μlのタンパク質後期溶液proteinlatersolutionPrometheusLaboratories;カリフォルニア州サンディエゴを含有する採取バイアルへと直接注射することにより採取すると良い。内容物を穏やかに混合することにより、採取した組織材料を分散する。6.FNA採取バイアルを片手で堅く保持し、高速指タッピングほぼ15回を行って、完全な細胞溶解を確実にする可能であればボルテックス攪拌10秒間。7.採取した検体を、先ず二重のビニール袋、次に発泡スチロール容器一次容器にCoolPackと共に置く。a.必要な認可及び文書に関して国際輸送プロセスのための輸送会社と協議すること。8.要求書及び試料リストが箱の中、二重袋の外側に置かれていることを確認する。9.容器をしっかりと密封し、生物検体のラベルを貼る。実施例7.癌細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質の定量化のためのデータ解析0215本実施例は、特定の対象分析物に対し作成された検量線に対する、生物試料例えば、血液又は腫瘍組織における1つ又は複数のシグナル伝達タンパク質等の1つ又は複数の分析物の発現及び/又は活性化レベルの定量化を説明する。0216一部の実施形態において、各CEERスライドは、3種の光電子増倍管PMTゲイン設定で走査されて、感度を改善し、サチュレーションの影響を低減する。PerkinElmerScanArray発現ソフトウェアは、スポット発見及びシグナル定量化に用いられる。各スポットの識別子をGenePixArrayList.galファイルからインポートする。その結果得られたデータセットにスライドにおける各臨床試料の非特定de-identified試験特異的な数値を取り込む。0217他の実施形態において、3回反復してプリントした反復スポットのバックグラウンド補正したシグナル強度を平均化する。各試薬ブランクの相対蛍光値を各試料から差し引く。数種の品質基準を用いて、スポットフットプリントの制限、スポット反復の変動係数、パッド全体のバックグラウンド及び試薬ブランクの強度等の更なる解析から得られたデータにフィルターをかける。0218アッセイ毎に、MD-468HER1陽性、SKBr3HER2陽性、BT474HER2及びp95HER2陽性、HCC827c-MET及びHER1陽性、IGFで刺激したT47DIGF1R陽性及び/又はHRGで刺激したT47DHER3陽性等の細胞株から調製した系列的に希釈した細胞ライセートの複数例えば、2、3、4、5、6、7種等の濃度からS字形検量線を作製することができる。各曲線は、シグナル強度対log濃度由来単位、CUコンピュータ処理単位の関数としてプロットすることができる。データは、非線形回帰により5種のパラメータ方程式5PLと適合させることができRitz、C.及びStreibig、J.C.、J.StatisticalSoftware、12、1~222005、捕捉抗体の全3種の希釈を同時に適合させることができる。適合は、オープンソースの統計ソフトウェアパッケージであるRを用いて行うことができるDevelopmentCoreTeam,R:Alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing.RFoundationforStatisticalComputing、オーストリア、ウィーン、ISBN3-900051-07-0、URLhttp://www.R-project.org.R2008。数理モデルのオーバーパラメータ化を回避し、それにより精度を改善するため、4種のパラメータを制約することができる一方、各希釈を個々の屈曲点に対し解くことができる。45、50及び60の各PMTゲイン設定に対しこのプロセスを繰り返すことができる。これは、捕捉抗体の3種の希釈及び3種のPMT走査からアッセイ毎に作成された9種の検量線を生じる。検量線の適合が、0.95未満のR2を有し、よってその後予測を改善する場合、アッセイに本来備わる重複性は、1つ又は複数の希釈/走査組み合わせを排除させる。0219CU算出検量線に基づく-それぞれの検量線例えば、3種の捕捉抗体希釈及び3種のPMTゲインセット走査から得られた個々の予測は、単一の最終予測と組み合わせることができる。予測毎に、検量線における点の傾きを算出する。この傾きはx軸におけるlog単位で得られる、即ち、傾きの分母における単位は、logコンピュータ処理単位CUである。第二に、予測の加重平均を算出するが、加重は傾きから決定される。特に、加重を合計し、各点は、全傾きで割ったその傾きに等しい加重をなされる。各アッセイは、公知の対照の予測に対し検証することができる。0220本明細書に引用されているあらゆる刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照により組み込まれていると特にまた個々に示されているかの如く、参照により本明細書に組み込まれている。理解を明確にするために上述の発明を例示及び実施例により詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく特定の変更及び修正を行ってよいことは、当業者であれば、本発明が教示するところを踏まえつつ容易に理解できるであろう。"