pH感受性抗α5β1インテグリン抗体の精製のための方法であって、以下:a基質と結合した抗体アフィニティーマトリックス上へ当該抗体を吸着させ;そしてb約30から約55のpHを有す溶出液を使用して当該基質-結合抗体アフィニティーマトリックスから当該抗体を溶出する、を含んで成る方法。以下のステップ:c前記精製した抗体を回収する、を更に含んで成る、請求項1に記載の方法。前記溶出液が約33から約55のpHを有す、請求項1に記載の方法。前記溶出液が約35から約55のpHを有す、請求項1に記載の方法。前記溶出液が約35から約42のpHを有す、請求項1に記載の方法。前記溶出液が約42から約55のpHを有す、請求項1に記載の方法。前記抗体が、SEQIDNOS26、16及び20から成る群から選定される配列を有する可変重鎖領域、並びにSEQIDNOS812、18及び22から成る群から独立的に選定される可変軽鎖領域を含んで成る、請求項1に記載の方法。前記抗体アフィニティーマトリックスは、ポリペプチド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、核酸アプタマー、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、マルチタンパク質複合体、生物学的膜、ウィルス、プロテインA、プロテインG、レクチン、及びFc受容体から成る群から選定される、請求項1に記載の方法。塩基性溶液により溶出された抗体を含む前記溶出溶液を中和するステップを更に含んで成り、それによって当該中和された溶液のpHが約60から約80の間になる、請求項2に記載の方法。キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体により調節される生理学的な影響を評価するための方法であって、当該方法は以下:a脈管再生可能な生育組織サンプルを提供し;b脈絡膜の新生血管形成を生み出すために十分な生育組織中で病変を作り出し;c生育組織へキメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体の1以上の投与量を適用し;そしてd当該投与された再血管形成のための生育組織をモニタリングすることを含んで成る方法。ステップaの前記生育組織が眼組織である、請求項10に記載の方法。前記眼組織が生きている霊長類動物の目の一部分である、請求項11に記載の方法。前記ステップcの適用が、ヒト化された抗α5β1インテグリン抗体をガラス体内へ注入することを含んで成る、請求項12に記載の方法。前記生育組織が眼の黄斑である、請求項11に記載の方法。前記作製ステップが、レーザー光により前記生育組織を接触させることを含んで成る、請求項10に記載の方法。前記レーザー光が約300から約700mワットであり、暴露時間がわずか01秒である、請求項15に記載の方法。前記ステップbの病変が、直径約50から約100μmである、請求項10に記載の方法。前記モニタリングステップが、ステップcにおいて投与された病変を定期的に撮影することを含んで成る、請求項10に記載の方法。前記モニタリングステップが、更に眼球の後眼房の間接的な検眼鏡検査実験、及び前眼部の生体顕微鏡検査実験を含んで成る、請求項18に記載の方法。前記モニタリングステップは、フルオレセイン染色を静注すること、及びフルオレセイン血管造影法により生育組織を調査することを含んで成る、請求項10に記載の方法。ステップの前記キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体が、抗体又はFabフラグメントである、請求項10に記載の方法。ステップの前記ヒト化抗α5β1インテグリン抗体が、SEQIDNOS26、16及び20から成る群から選定される配列を有する可変重鎖領域、並びにSEQIDNOS812、18及び22から成る群から独立的に選定される可変軽鎖領域を含んで成る、請求項10に記載の方法。キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体のポリペプチドをコードする核酸であって、SEQIDNOS26、812、16、18、20、22、25、26、28、31及び32から成る群から選定されるアミノ酸配列を含む前記ポリペプチドをコードする核酸。前記ポリペプチドが一本鎖抗体又はFabである、請求項23に記載の核酸。前記ポリペプチドがSEQIDNOS26及び28を含んで成る、請求項24に記載の核酸。前記ポリペプチドがSEQIDNOS25及び26を含んで成る、請求項23に記載の核酸。前記ポリペプチドがSEQIDNOS31及び32を含んで成る、請求項23に記載の核酸。SEQIDNOS26、812、16、18、20、22、25、26、28、31及び32から成る群から選定される1以上のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。アミノ酸配列SEQIDNOS25及び26を含んで成る、請求項28に記載のポリペプチド。アミノ酸配列SEQIDNOS26及び28を含んで成る、請求項28に記載のポリペプチド。アミノ酸配列SEQIDNOS31及び32を含んで成る、請求項28に記載のポリペプチド。SEQIDNOS15、17、19、21、23、24、27、29及び32から成る群から選定される1以上の核酸を含んで成るベクター。前記核酸がSEQIDNOS19及び21を含んで成る、請求項32に記載のベクター。SEQIDNOS15、17、19、21、23、24、27、29及び32から成る群から選定される1以上の核酸を含んで成る発現ベクターにより形質転換された細胞。前記ベクターが核酸SEQIDNOS19及び21を含んで成る、請求項34に記載の細胞。以下:aSEQIDNOS:1、7、16、18、20、22、25、26、28、31及び32から成る群から選定された1以上のアミノ酸配列を含む第一の出所からの第一のポリペプチド配列;及びb第二の出所の抗体の不変領域配列を含む第二の出所からの第二のポリペプチド、を含んで成る、キメラ抗α5β1インテグリン抗体であり、ここで第一及び第二のポリペプチド配列は、α5β1インテグリンと免疫反応性であるタンパク質複合体を形成する抗体。前記第一のポリペプチド配列がSEQIDNOS25及び26を含んで成る、請求項36に記載のキメラ抗体。前記第一のポリペプチド配列がSEQIDNOS26及び28を含んで成る、請求項36に記載のキメラ抗体。前記第一のポリペプチド配列がSEQIDNOS31及び32を含んで成る、請求項36に記載のキメラ抗体。前記抗体がSEQIDNOS:1、7、16、18、20、22、25、26、28、31及び32から成る群から選定されたアミノ酸配列を含む、キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体を含んで成る医薬組成物。前記抗体がアミノ酸配列SEQIDNOS25及び26を含んで成る、請求項40に記載の医薬組成物。前記抗体がアミノ酸配列SEQIDNOS26及び28を含んで成る、請求項40に記載の医薬組成物。前記抗体がアミノ酸配列SEQIDNOS31及び32を含んで成る、請求項40に記載の医薬組成物。損傷した組織にキメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体の1回以上の投与を適用させることを含んで成る、損傷した組織中の血管形成を調節する方法。前記キメラ化又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体がSEQIDNOS20、22、25、26、28、31及び32から成る群から選定されるアミノ酸を含んで成る、請求項44に記載の方法。以下:aSEQIDNOS26、16、20から成る群から選定される可変重鎖領域、及びSEQIDNOS812、18、22から成る群から独立的に選定された可変軽鎖領域を含んで成る治療抗体を含む医薬を提供し、b損傷した組織に治療抗体を適応し、ここで当該損傷した組織が新生血管形成を通してその血流を増加させることにより損傷に応答し、そして当該治療抗体が前記新生血管形成を阻害する、を含んで成る治療抗体を投与する方法。前記医薬が注入可能なものである、請求項46に記載の方法。前記適用ステップが全身的に医薬を注入することを含んで成る、請求項46に記載の方法。前記損傷した組織が片眼又は両眼である、請求項46に記載の方法。前記損傷した組織が、個体の両眼であり、そして当該適用ステップでは片眼に医薬を注入し、それによって当該医薬が両目に接触することにより損傷した組織における新生血管形成を阻害する、を含んで成る、請求項46に記載の方法。年齢に関連する黄斑変質、及び糖尿病性網膜症のような病理学的症状では、網膜への酸素の利用能が減少し、血管内皮成長因子のような新脈管形成成長因子の分泌を刺激する低酸素症がもたらされる。この分泌は眼組織への内皮細胞の異常な移動及び増殖を引き起こす。これは視覚組織の血管化をもたらし、そして角膜の傷、網膜剥離、及びコロイド中の流体物蓄積を誘発することができ、それぞれが視覚に悪影響を与え、そして失明へと導く。新脈管形成は、乾癬、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、及び潰瘍性大腸炎及びクーロン病のような炎症性腸疾患を含む、炎症性疾患の進行及び悪化にも関連する。炎症性関節疾患、例えば関節を取り巻く領域へのリンパ球の流入では、滑膜表層での新脈管形成を刺激する。この増加した脈管構造は、関節中の軟骨と骨の破壊を促進する白血球のより多くの流入手段を提供する。脈管形成性血管新生では、腸において同様な効果をもたらす炎症性腸疾患を発生させる。冠状動脈におけるアテローム性動脈硬化症のプラークへの毛細血管成長は、新脈管形成を誘導する成長因子に関連する他の病理学的症状を表す。新生血管が形成されるプラーク中への過剰な血流は、血液で満たされたプラークの破裂及び出血をもたらすことができ、放出された血液凝固物は冠動脈血栓症をもたらし得る。癌、視覚疾患、及び炎症性疾患のような、かかる異なる疾患における新脈管形成の関与は、これらの疾患を治療するための手段として新脈管形成を特異的に阻害する方法を同定するための努力を導いた。癌患者のための、かかる治療方法は、標的腫瘍細胞だけでなく、患者の中で正常に増殖する血液細胞、上皮細胞、及び腸管腔を覆う細胞等の細胞も殺し又は傷つけるような現行の化学療法として使用される方法をしのぐ実質的な利点を提供することができる。化学療法作用物質によるかかる非特異性殺傷は、良くても不快な副作用をもたらし、そしてしばしば患者が受け入れがたい病的状態、又は死をもたらし得る。事実、所望されない副作用は、患者が受け入れ得る治療をしばしば制限する癌治療に関連する。発明の概略本発明は、α5β1インテグリンに対する治療的キメラ及びヒト化抗体;これらの抗体の精製方法、及び所望されない組織での新脈管形成を含む症状の治療におけるそれらの使用方法を提供する。1の態様では、本発明は、SEQIDNOS:112、16、18、20、22、2526、28、3132から成る群から選定される1以上のアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を有するキメラ又はヒト化抗-α5β1インテグリン抗体のポリペプチドをコードする核酸を含んで成る。最適には、当該核酸は、SEQIDNOS:26、812、16、18、20、22、2526、28、3132から成る群から選定されたアミノ酸配列を含むキメラ又はヒト化抗-α5β1インテグリン抗体のポリペプチドをコードする。この核酸によりコードされるペプチドは、一本鎖抗体又はFabであってよく、更にジスルフィド架橋により結合したいくつかのペプチドを含むFab又は抗体であってよい。本発明はSEQIDNOS:112、16、18、20、22、2526、28、3132から成る群から選定される1以上のアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を有する。最適には核酸は、SEQIDNOS:26、812、16、18、20、22、2526、28、3132から成る群から選定された1以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。これらのポリペプチドは、キメラ、ヒト及びヒト化抗体並びにFabフラグメントを含む。他の態様では、本発明はキメラ抗α5β1インテグリン抗体を含む。これらの抗体は、SEQIDNOS:1、7、16、18、20、22から成る群から選定されたアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性、を有するアミノ酸配列を含む第一の出所からの第一のポリペプチドを含み;そして第二の出所の抗体の不変領域と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性、を有する第二の出所からの第二のポリペプチドを含み、ここで第一及び第二のポリペプチドは、α5β1インテグリンと免疫反応性であるタンパク質複合体を形成する。好適な態様では、不変領域の第二の出所がヒトIgGである。他の好適な態様は、不変領域がヒトIgG4である。他の好適な態様は、キメラ抗体は、SEQIDNOS:1、7、16、18、20、22から成る群から選定された1以上のアミノ酸配列を含む第一の出所からの第一のポリペプチド配列を含み;そして第二の出所の抗体の不変領域を含む第二の出所からの第二のポリペプチド配列を含み、ここで第一及び第二のポリペプチド配列は、α5β1インテグリンと免疫反応性であるタンパク質複合体を形成する。最適な態様では、本発明は重鎖アミノ酸配列SEQIDNO25及び軽鎖アミノ酸配列SEQIDNO26を含むキメラ抗α5β1インテグリン抗体を含む。他の態様では、本発明はSEQIDNO19を含むキメラ抗-α5β1インテグリン抗体重鎖可変領域、及びSEQIDNO21を含むキメラ抗-α5β1インテグリン抗体重鎖可変領域をコードする核酸を含む。更なる好適な態様では、本発明は重鎖アミノ酸配列SEQIDNO25及び軽鎖をアミノ酸配列SEQIDNO26含む、キメラ抗-α5β1インテグリン抗体由来のFabフラグメントを含む。最適な態様では、当該Fabフラグメントは、重鎖アミノ酸配列SEQIDNO28及び軽鎖アミノ酸配列SEQIDNO26を含む。更なる好適な態様では、本発明は、重鎖アミノ酸配列SEQIDNO25及び軽鎖アミノ酸配列SEQIDNO26を含むキメラ抗-α5β1インテグリン抗体から由来するヒト化抗体を含む。最も好適な態様では、ヒト化抗体は重鎖アミノ酸配列SEQIDNO28及び軽鎖アミノ酸配列SEQIDNO26を含む。他の態様において、本発明は、SEQIDNOS15、17、19、21、23、24、27、29、30から成る群から選定された任意の1以上の核酸を含む発現ベクターを含む。好適な態様では、発現ベクターは、SEQIDNOS19及び21を含む。他の態様では、本発明は、SEQIDNOS15、17、19、21、23、24、27、29、30から成る群から選定された任意の1以上の核酸を含む発現ベクターにより形質転換された細胞を含む。好適な態様では、発現ベクターはSEQIDNOS19及び21を含む。他の態様では、本発明は本明細書において発表するキメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体を含む医薬組成物を含む。いくつかの態様では、これらの組成物は、炎症を減少させる治療成分の取り込み又は局在化を増強させる作用物質を含んでよく、或いはさもなければ、局在化緩和を供する作用物質を含んでよい。本態様の1の観点では、医薬組成物は、損傷した組織に直接塗る局所クリームを含む。他の観点では、医薬は損傷した眼に直接適用する点眼溶液である。更に他の観点では、傷ついた個体の片目又は両目の組織を治療するために、或いは腫瘍組織における新生血管形成を妨げるため、全身に適用できる注入可能な医薬である。他の態様では、本発明は損傷組織における血管形成を制御する方法を含む。これらの方法は、物理的又は化学的損傷、或いは疾患の結果と成り得る組織への損傷において、キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体の1以上の投与を適用させることを含む。他の態様では、本発明は:SEQIDNOS:26、16、20から成る群から選定される配列を有す可変重鎖領域及びSEQIDNOS:812、18、22から成る群から個々に選定される可変軽鎖領域を含む治療抗体を含む医薬を提供し;そして損傷組織へ治療抗体を適用する、を含む治療抗体を投与する方法を含んで成る。当該発明の本態様では、損傷した組織は新生血管形成を通してその血流を増加させることにより損傷へ応答し、そして当該治療抗体は、この新生血管形成を阻害する。1の観点では、当該方法は、両眼に病気を有す個体の疾患眼又は損傷眼中のガラス体中;両眼を治療するに十分である片眼のガラス体に治療抗体を注入することを含む。他の態様では、本発明は抗α5β1インテグリン抗体の精製のための方法を含む。当該方法は基質と結合した抗体アフィニティーマトリックス上へ抗体を吸着させること、及び約pH30から約pH55を有す溶出液を使用して基質-結合抗体アフィニティーマトリックスから抗体を溶出することを含む。当該方法は、更に精製した抗体を回収することを含んでよい。本手順を用いた精製を受け入れ得る抗体は、アミノ酸SEQIDNOS:112、16、18、20、22において存在する抗体から独立して選定された少なくとも2つのCDR領域を含む抗体を含んで成る。好適には選定されたCDRsの一つが、VL鎖由来及びその他のVH鎖由来である。本精製方法のいくつかの観点では、当該溶出液は約33から約55のpHを有す。他の観点では、溶出液のpHは約35から約55である。更に他の観点では約35から約42のpHを有す溶出液を含む。更なる観点では、約42から約55の範囲のpHである溶出液を有す。本発明の他の態様では、抗体及びFabフラグメントの両方を含む、ヒト化抗α5β1インテグリン抗体により調節される生理学的な影響を評価するための方法を含んで成る。本方法は脈管再生可能な生育組織サンプルを提供し;脈絡膜の新生血管形成を生み出すために十分な生育組織中で病変を作り出し;生育組織へ1回以上のヒト化抗α5β1インテグリン抗体の投与を適用し;そして投与された再血管新生のための生育組織をモニタリングすることを含んで成る。好適な態様では、当該評価方法は生育組織として眼組織を含む。いくつかの態様では、眼の黄斑を使用する。また考慮すべきは、使用される眼組織が生きている霊長類動物例えばcynomologousサルのもので評価される方法であることである。他の態様では、評価方法はキメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体をガラス体に注入することを含む。本発明の1の観点は、両眼を損傷した固体への片眼への抗体の注入は、両眼に存在する損傷組織に接触する抗体をもたらす。生理学的な効果を評価するための本法の他の観点は、生育組織をレーザー光に接触させることにより病変を作り出すことを含む。このレーザー光は約300から約700mワットにすることができ、そしてその暴露時間はわずか01秒、好適には005秒未満、及び最適には約001秒未満にすぎない。病変は直径200μm未満、好適には100μm未満、更に好適には約50から約100μmであるべきであり、そして最適には約75から25μmである。当該方法のいくつかの観点は、ヒト化抗-α5β1インテグリン抗体を1回以上の投与で適用することにより処置された病変を定期的に撮影することを含むモニタリングステップを含んで成る。他の観点では、モニタリングステップは、更に眼球の後眼房の間接的な検眼鏡検査実験及び前眼部の生体顕微鏡検査実験を含む。他の観点では、当該方法はフルオレセイン染色を静注すること、及びフルオレセイン血管造影法により生育組織を調査することを含むモニタリングステップを含んで成る。キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体により調節される生理学的な効果を評価するための方法は、ここでのキメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体の一の観点も含み、SEQIDNOS:16、16、20から成る群から選定されるアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、更に好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を有す可変重鎖領域を含み、並びにSEQIDNOS:712、18、22から成る群からのアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、更に好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を独立に選定し、且つ有す可変軽鎖領域を含む。最適には、ヒト化抗α5β1インテグリン抗体は、SEQIDNOS:16、16、20から成る群から選定される配列を有する可変重鎖領域、及びSEQIDNOS:712、18、22から成る群から個々に選定された可変軽鎖領域を含んで成る。キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体により調節される生理学的効果を評価するための方法は、キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体が、SEQIDNOS26、16、20から成る群から選定される配列を有する可変重鎖領域、及びSEQIDNOS:812、18、22から成る群から独立して選定される可変軽鎖領域を含む、という更に1の観点を含んで成る。発明の詳細な説明I.定義特に断わりのない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明に属する分野における当業者により一般に理解される意味を有す。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くの一般的な定義と共に当業者に提供される:Singleton等DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology;TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology;TheGlossaryofGenetics5thEdRRieger等SpringerVerlag及びHaleMarhamTheHarperCollinsDictionaryofBiology。本明細書において用いられる以下の用語は、特に制限のない限り本来の意味を有す。本明細書において使用される抗体とは、免疫学的に特異的な抗原と反応性である免疫グロブリン分子を言うことを含み、そしてポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む。当該用語はキメラ抗体例えば、ヒト化ネズミ抗体及びヘテロ接合抗体例えば2つに特異的な抗体のような遺伝子操作された形態も含む。当該用語抗体とは、抗原-結合能例えば、Fab、F2、Fab、Fv及びrIgGを有すフラグメントを含む抗体の形態と結合する抗原も含む。また、PierceCatalogandHandbook19941995を参照。例えばKubyJlmmunology3rdEdWHFreemanCoNewYorkも参照。当該用語は組換え型一本鎖Fvフラグメントとも言う。当該用語抗体は、2価又は2特異性分子、ダイアボディー、トリアボディー、及びテトラボディーも含む。2価及び2特異性分子は、例えばKostelny等JImmunol148:1547PackandPluckthunBiochemistry31:1579Hollinger等1993supraGruber等JImmunol:5368Zhu等ProteinSci6:781Hu等CancerRes56:3055Adams等CancerRes53:4026及びMcCartney等ProteinEng8:301で発表されている。免疫学的に特異的な抗原と反応性である抗体は、ファージ又は同様のベクター中の組換え抗体ライブラリーからの選定のような組換え方法によって例えばHuse等Science24612751281Ward等Nature341544546及びVaughan等NatureBiotech14309314参照、或いは抗原で免疫化した動物又は抗原をコードするDNAにより生産することができる。典型的に、免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有する。それぞれの重鎖及び軽鎖は、不変領域及び可変領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は3つの超可変領域により中断される4つのフレームワーク領域を含み、相補性決定領域又はCDRsとも呼ばれる。フレームワーク領域及びCDRsの範囲は定義された。異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、相対的に種内で保存される。軽鎖及び重鎖構成要素が組合されたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、3次元の空間にあるCDRsを配置するため及び並べるために提供される。CDRsは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。それぞれの鎖のCDRsは、N末端から順番に数えて典型的にCDR1、CDR2、及びCDR3と言い、そして典型的に特定のCDRが位置する鎖によっても同定される。このようにして、VHCDR3は、それが見出された抗体の重鎖の可変ドメイン中に位置するが、一方、VLCDR1は、それが見出された抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のCDR1である。VHに関しては、Fv、scFv、又はFabの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を言う。VLに関しては、Fv、scFv、dsFv又はFabの軽鎖を含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を言う。一本鎖Fv又はscFvという表現は、伝統的な2本鎖抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが結合して1つの鎖を形成した抗体を言う。典型的には、正しいフォールディング及び活性結合サイトの創生のためリンカーペプチドが2つの鎖間に挿入される。キメラ抗体とは、不変領域、又はそれらの一部が変化され、置換され、又は変換され、その結果抗原結合サイトが異なる又は変化したクラス、エフェクター機能及び/又は種の不変領域へ結合し、或いはキメラ抗体へ新規特性を与える全体的に異なる分子例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤等へ結合した免疫グロブリン分子;或いは可変領域又はそれらの一部が、異なる又は変化した抗原特異性を有する可変領域に変化され、置換され、又は変換された免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体とは、所望される特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギのような非ヒト種ドナー抗体の相補性決定領域由来残基で置き換えられた受容抗体のCDR由来残基を有すヒト免疫グロブリンを含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応の非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、受容抗体中においても、導入されたCDR又はフレームワーク配列中においても、いずれにも見出されない残基を含んでもよい。一般的にヒト化抗体は、少なくとも1つ、及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろうし、その中でCDR領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのそれらと一致し、並びにフレームワーク領域FRの全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン共通配列のそれらである。またヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン不変領域の少なくとも一部分を含み、典型的にヒト免疫グロブリンの一部分を含むであろう;Riechmann等Nature332:323329;及びPrestaCurrOpStructBiol2:593596。ヒト化は本質的には以下の方法Winter及びcoworkers;Riechmann等Nature332:323327;Verhoeyen等Science239:15341536で、ヒト抗体の配列と対応するげっ歯動物のCDRs又はCDR配列で置換することにより実施できる。従ってかかるヒト化抗体は、キメラ抗体であり、ここで完全なヒト可変ドメインと比較した実質的少なさは、非ヒト種由来の対応配列で置き換えられた。エピトープ又は抗原決定基とは、抗体と結合する抗原上のサイトを言う。エピトープは連続するアミノ酸又はタンパク質の3次フォールディングにより並置された不連続のアミノ酸、の両方により形成することができる。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的に変質溶媒への暴露で保持される一方、3次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的に変質溶媒での処理で失われる。エピトープは独自の立体コンホメーション中に、典型的には少なくとも3つ、及びより通常には少なくとも5又は8-10のアミノ酸を含む。エピトープの立体コンホメーションを決定する方法は、例えば、x線結晶学及び2次元核磁気共鳴を含む。例えば、EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiologyVol66GlennEMorrisEdを参照。pH感受性抗α5β1インテグリン抗体とは、特異的にα5β1インテグリンを認識し、そして中性又は塩基性pHでリガンドとしてα5β1インテグリンを用いた免疫精製へかけた場合、溶液からの沈殿物を言う。pH感受性抗α5β1インテグリン抗体は、典型的に図1に描かれたVH又はVL配列のいずれかから独立して選定された2以上のCDR配列を含む。新脈管形成及び新生脈管形成とは、典型的に傷害、損傷、又は疾患への応答における新規血管の形成を言う。本出願の目的のための用語損傷、及び同じ文法のバリエーションは、新脈管形成を含む組織応答においてもたらされる傷害、疾患、又は他の事象を含む。新脈管形成は、腫瘍形成及び腫瘍転移、並びに胚形成、成長及び高等動物への発達の間に惹起される。本明細書中における2以上の核酸又はポリペプチド配列との関係での用語同一の又はパーセント同一性とは、同一である2以上の配列又はサブ配列、或いは以下に記載の欠失パラメーターによるBLAST又はBLAST20配列比較アルゴリズムを用いて、或いはマニュアル整列及び視覚検査により測定した場合、同一とされるアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定されたパーセンテージ即ち、比較ウィンドウ又は示された領域で最大限に一致させるため比較及び整列された場合、指定された領域での約60の同一性、好適には70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、又は更に高い同一性を有する2以上の配列又はサブ配列を言う。それ故、かかる配列は実質的同一といえる。この定義は検査配列の補足にも言及又は適用してよい。当該定義は欠失及び/又は追加を有す配列、並びに置換を有す配列、並びに、例えば多型体又は対立遺伝子の天然の変異体、及び人工変異体も含む。以下に記載するように、好適なアルゴリズムは、gaps等で説明することができる。好適には、同一性は、少なくとも長さ約25個に渡る領域のアミノ酸又はヌクレオチドにおいて、より好適には長さ50100個に渡る領域のアミノ酸又はヌクレオチドにおいて存在する。配列の比較のために、典型的に1の配列は、検査配列と比較される対照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いた時、検査及び対照配列はコンピューターに入力され、サブ配列座標が指定され、そしてもし必要ならば、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好適には、欠失プログラムパラメーターを使用することができ、或いは別のパラメーターを指定することができる。配列比較アルゴリズムは、その後プログラムパラメーターに基づき、対照配列に関連する検査配列についてのパーセント配列同一性を計算する。本明細書において使用される比較ウィンドウとは、典型的に20から600、通常では約50から約200、更に通常では約100から約150から成る群から選定された連続する位置の数の一つのセグメントを言うことを含み、その中で配列は、最適に2つの配列を並べた後、連続する位置の同一数の対照配列と比較することができる。比較のための配列整列方法は当業界において周知である。比較のための最適な配列整列は、例えば、SmithWatermanAdvApplMath2:482のローカル相同アルゴリズムにより、NeedlemanWunschJMolBiol48:443の相同整列アルゴリズムにより、PearsonLipmanProcNat1AcadSciUSA85:2444の類似方法の調査により、それらのアルゴリズムの遂行をコンピュータ化することにより、又はマニュアル整列及び視覚検査により参照行うことができる。アルゴリズムの好適な例は、Altschul等NucAcidsRes25:33893402及びAltschul等JMolBiol215:403410中で発表された、BLAST及びBLAST20アルゴリズムを含む配列の同一性及び配列の類似性のパーセントを決定するために適するものである。BLAST及びBLAST20は、本発明の核酸及びタンパク質の配列の同一性パーセントを決定するために本明細書において発表されたパラメーターと共に使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、theNationalCenterforBiotechnologyInformationを通して公的に入手できる。本アルゴリズムは、クエリー配列中データベース配列中での同一の長さの単語により整列する時、いくつかの陽性閾値スコアTと適合するか、又は条件を満たすかのいずれかの長さWの短い単語を同定することによって、ハイスコアリング配列ペアを最初に同定することに関与する。Tは、近隣の単語スコア閾値として言及される。これらの最初の近隣の単語のヒットは、それらを含むより長いHSPsを見つけるための最初の検索のシードとして働く。単語のヒットは、累積的な整列スコアが増加できる限り、それぞれの配列に沿って両範囲内に拡張される。累積的なスコアは、例えば、ヌクレオチド配列、パラメーターMスコア;常に>0及びNを用いて計算される。アミノ酸配列のためのスコアリングマトリックスは、累積的なスコアを計算するために使用される。それぞれの範囲においてヒットする単語の拡張は:累積的な整列スコアが最大に達したその数値から数量XthequantityXにより低下させられた時;累積的スコアが1以上のネガティブ-スコアリング残基整列の蓄積のためにゼロ以下になる時;或いは各々の配列の最後に達する時、停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、及びXは感受性及び整列の速さを測定する。当該BLASTNプログラムは11の単語の長さの欠失、10の期待値、M5、N4及び両標準品との比較として使用される。アミノ酸配列に関するBLASTPプログラムは、3の単語の長さの欠失、及び10の期待値、並びに50のBLOSUM62スコアリングマトリックスHenikoffHenikoffProcNatlAcadSciUSA89:10915参照整列、10の期待値、M5、N4、及び両標準品の比較として使用される。BLASTアルゴリズムは、2つの配列間で同様の統計解析も実施するを参照。BLASTアルゴリズムによって提供される1の類似測定は、最小総計確率であり、それは偶然発生するであろう2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列との間が組合される確立の表示を提供する。例えば、仮に検査する核酸と対照核酸との比較において、最小総計確率が約02未満、より好適には約001未満、そして最適には約0001未満である場合、核酸は対照配列と類似していると考えられる。Log値は、大きなネガティブナンバー、例えば5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170、等であってよい。2つの核酸配列又はポリペプチドが、実質的に同一であるということの表示は、以下に記載するように第一の核酸によりコードされたポリペプチドは、第二の核酸によりコードされたポリペプチドに対して生起した抗体と免疫学的に交差反応性である、ということである。このように、ポリペプチドは、典型的に、例えば2つのペプチドが保存的な置換のみ異なるような、第二のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという他の表示は、後述するように、2つの分子又はそれらの相補物のストリンジェント条件下において互いにハイブリダイズするものをいう。2つの核酸配列が実質的に同一であるという更なる他の表示は、配列を増幅するために同一のプライマーを使用できることである。用語単離された、精製された又は生物学的に純粋とは、実質的に又は本質的に通常ではその天然状態において見出されるようなものを伴う成分が存在しない物質を言う。精製及び均質とは、典型的にポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて測定される。調製品において存在する優性物質であるタンパク質又は核酸は、実質的に精製されたものである。特に、単離された核酸は、天然にはその遺伝子に隣接し、且つこの遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。用語精製されたとは、いくつかの態様において、電気泳動ゲル中において本質的に1のバンドの出現を与える核酸又はタンパク質を言う。好適には、少なくとも純度85、より好適には少なくとも純度95、及び最適には少なくとも純度99である核酸又はタンパク質を意味する。精製する又は精製とは、他の態様において精製された組成物から少なくとも1の混入物を除去することを意味する。この意味において、均質である化合物、例えば純度100に精製されるような精製は要求されない。用語ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質とは、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーを言及するために相互交換できるように用いられる。当該用語は、天然アミノ酸、及び天然アミノ酸ポリマーと一致する人工的な化学模倣物、修飾された残基を含むそれら、並びに非天然アミノ酸ポリマーである1以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸ポリマーに適用される。用語アミノ酸とは、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同じような機能である、類似物及びアミノ酸模倣物を言う。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたアミノ酸、並びにその後修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びOホスホセリンである。アミノ酸類似物とは、天然アミノ酸、例えば水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基と結合したα炭素を有するような、同一の基本化学構造を有する化合物を言う例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニオンメチルスルホニウム。かかる類似物は、R基又は修飾ペプチド骨格を有してよいが、天然に発生するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、一般的なアミノ酸の化学構造と異なる構造を有すが、その機能は天然に発生するアミノ酸と類似する化学物質を言う。アミノ酸は、本明細書において、一般的に公知の3の文字、又はIUPACIUBBiochemicalNomenclatureCommissionが推奨する1の文字で言及できる。同様に、一般に受け入れられている1の文字コードで言及できる。保存的修飾変異体とは、アミノ酸及び核酸配列の両方に適応される。特に核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を言い、或いはアミノ酸配列をコードしない核酸の場合、本質的に同一又は連結例えば天然では連続する配列している配列を言う。遺伝子コードの縮重のため、多くの数の機能的に同一の核酸は、大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG及びGCUは、アミノ酸アラニンを全てコードする。従って、コドンにより指定されるアラニンの全ての位置で、コドンは、コードしたポリペプチドを変化させず、指示される対応のコドンとは異なるものへ変化させることができる。かかる核酸変異体は、サイレント変異体であり、保存的に修飾された変異体の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列は、核酸のサイレント変異体としても記載される。当業者は核酸中のそれぞれのコドンの一定の関連が、機能的に同一の分子を産するために修飾できることを認識するであろう。従って、しばしば発現産物に関連するが実際のプローブには関連しない、示された配列にポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異体が必然的に含まれている。当業者は、アミノ酸配列として、化学的に類似するアミノ酸を有するアミノ酸置換基をもたらすように変化する保存的に修飾された変異体であるコードされた配列中の1のアミノ酸を変化、付加、又は欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への、個々の置換、欠失、又は付加を、或いはアミノ酸の少量のパーセンテージを認識するであろう。機能基的に類似のアミノ酸を提供する保存的な置換基表は、当業界において周知である。かかる保存的に修飾された変異体は更なるものであり、そして本発明の多型変異体、種間の相同体、及び対立遺伝子を排除するものではない。典型的に互いに保存的な置換基は、例えば、1アラニン、グリシン;2アスパラギン酸、グルタミン酸;3アスパラギン、グルタミン;4アルギニン、リシン;5イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン;6フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン;7セリン、スレオニン;及び8システイン、メチオニンを含む参照。ラベル又は検出可能な成分は、分光器的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理学的手段による検出可能な組成物である。例えば、有用なラベルは、蛍光染色、電子密度試薬、酵素例えば、ELISAで一般に用いられる、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及びタンパク質、或いは検出可能性を成すことができる他の構成要素例えばペプチド中へ放射性ラベルを組み入れる、又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いるを含む。放射性同位元素は、例えば3H、14C、32P、35S、又は125Iであってよい。いくつかのケースにおいて、特に抗α5β1インテグリン抗体を使用する場合、放射性同位元素は以下に記載するように毒性成分として使用される。当該ラベルは任意の部位で抗体中へ導入することができる。それらの方法を含み、使用され得るラベルへ抗体を結合させるための当業界における任意の方法は、Hunter等Nature144:945;David等Biochemistry13:1014;Pain等JImmunolMeth40:219;及びNygrenJHistochem及びCytoclaem30:407で発表された方法を含む。放射線ラベルされたペプチド又は放射線ラベルされた抗体組成物の寿命は、放射性ラベルされたペプチド又は抗体を安定化させる物質及び変性からそれを保護する物質を添加することにより延ばすことができる。放射ラベルしたペプチド又は抗体を安定化させる任意の物質又は物質の組合せは、米国特許No5961955において開示されたそれらの物質を含んで使用してよい。抗体アフィニティーマトリックスとは、抗体へ優先的に結合することができる任意の物質を言う。抗体アフィニティーマトリックス材料は、ポリペプチド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、アプタマーを含む核酸、又はそれらの結合物例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質を含む。一定の例では、抗体アフィニティーマトリックス材料は、マルチタンパク質複合体、生物学的膜、又はウィルスのようなマクロ分子構造にすることができる。抗体アフィニティーマトリックス材料の他の例は、プロテインA、プロテインG、レクチン、及びFc受容体である。プロテインAとは免疫グロブリンのFc部位、特に多くの数の種から由来するIgGsへ結合することができる黄色ブドウ球菌により産生される高い安定性の表面受容体を言う。1のタンパク質A分子は、少なくともIgGの2分子と同時に結合することができる。プロテインGとは、高い親和性でIgGと結合する連鎖球菌からの細胞表面関連タンパク質を言う。それは3つの相同性の高いIgG結合ドメインを有す。参考文献において使用される場合例えば、細胞に、又は核酸、タンパク質もしくはベクターに使用される場合の用語組換え体とは、異種の核酸もしくはタンパク質、又は変性した天然の核酸もしくはタンパク質の導入により修飾された細胞、核酸、タンパク質又はベクター、或いはそのように修飾された細胞から由来する細胞を指す。従って、例えば、組換え細胞は、天然形態の細胞中では見出されない遺伝子を発現し、或いは、本来異常発現する、あまり発現しない、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。本明細書における用語組換え核酸とは、本来invitroにおいて形成される核酸、一般的には天然では通常見いだされない形態に核酸が操作されることによる核酸例えばポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼを用いるを意味する。本方法において、異なる配列の作用可能式な連結が達成される。このようにして直鎖の形態において単離された核酸、又は通常では結合されないDNA分子を結紮することによりinvitroにおいて形成される発現ベクターは、共に本発明の目的のための組換え体に検討される。一度、組換え核酸が作製され、そして宿主細胞又は生物へ再導入された場合、それは非組換え的に複製されるであろう即ち、invivo操作よりもむしろ宿主細胞のinvivo細胞機構を使用すると理解されるが;しかしながら、かかる核酸は、一度組換え的に生産された場合、たとえ非組換え的にサブ配列に複製されたとしても、なお本発明の目的のための組換え体が検討される。同様に、組換えタンパク質とは、組換え技術、即ち上記組換え核酸の発現を通した組換え技術を用いて作製されたタンパク質である。用語異種のとは、核酸の一部を参照することにより使用する場合、天然において互いに同一の関連性が通常見出されない2以上のサブ配列を含む核酸を示す。例えば、当該核酸は、例えば、新規機能の核酸例えば1の起源由来のプロモーター、及び他の起源由来のコード領域を作るために配列させた関連性のない遺伝子からの2以上の配列を有し、典型的に組換え的に生産される。同様に、異種タンパク質はしばしば天然において互いに同一の関連性を見出されない2以上のサブ配列を言うであろう。プロモーターとは、核酸の転写を指示する核酸調節配列のアレイとして定義される。本明細書において使用されるプロモーターは、ポリメラーゼIIタイププロモーター、TATA要素の場合のような、転写の開始サイトに近い不可欠な核酸配列を含む。プロモーターは、転写の開始サイトから数千ほどの塩基対が位置することができる末端のエンハンサー又はリプレッサー要素も任意に含む。構成プロモーターは、大部分の環境及び発達の条件下で活性である。誘導性プロモーターは、環境又は発達の制御下で活性である。用語操作可能式に連結したとは、核酸発現調節配列、及び第二の核酸配列との間の機能的連結を言い、ここでの発現調節配列は、第二の配列に相当する核酸の転写を指示する。発現ベクターとは核酸構成物であり、宿主細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸要素により、組換え的又は合成的に生産される。発現ベクターは、プラスミド、ウィルス、又は核酸フラグメントの部分と成り得る。典型的には、発現ベクターは、作用可能式にプロモーターへ連結される転写されるべき核酸を含む。抗体への特異的結合又は特異的免疫反応という表現は、タンパク質又はペプチドについて言及する場合、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の中で、そのタンパク質の存在が確定的である結合反応を言う。このように、指定されたイムノアッセイ条件下において、特異的抗体は、少なくともバックグラウンドの2倍、及びより典型的にはバックグラウンドの10から100倍以上で特定のタンパク質に結合する。かかる条件下における抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に特異的であるために選定される抗体を要求する。例えば、特定のタンパク質、多型変異体、対立遺伝子、オルソログ、及び保存的に修飾された変異体、又はスプライス変異体、又はそれらの一部に対し生起させた抗体は、他のタンパク質ではなく、α5β1インテグリンと特異的に免疫反応性であるポリクローナル抗体のみ得るために選定することができる。この選定は他の分子と交叉反応する抗体を減じることによって達成され得る。多様なイムノアッセイの形態は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選定するために使用してよい。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選定するために日常的に使用されているを参照。組織培養における癌細胞、形質転換された細胞又は形質転換とは、新規の遺伝的な材料の取り込みを必ずしも含まない自発的、又は誘導された表現型の変化を言う。形質転換は形質転換ウィルスによる感染、及び新規ゲノムDNAの導入、又は外因DNAの取り込みにより引き起こすことができるが、自発的に又は発癌物質の暴露によって内因性遺伝子を突然変異させて引き起こすこともできる。形質転換は細胞の不死化、異常型の成長調節、非形態学的変化、及び/又は悪性のような表現型の変化に関連するFreshneyCultureofAnimalCellsaManualofBasicTechnique参照。II序論本発明は、既存の抗α5β1インテグリン抗体の特性を改良させたキメラ及びヒト化抗α5β1インテグリン抗体を提供する。本発明は、新規抗体を含む医薬組成物、並びに新血管形成により悪化した病態及び組織への傷害を治療するための改良方法も提供する。本発明のキメラ又はヒト化抗体は、人間へ投与する場合、既存の形態よりも長い半減期及び少ない抗原性を有す。当該改良は図2中の図式で図解し、そして当該改良は、ネズミ抗α5β1インテグリンIIA1抗体のフレ-ムワーク及び不変領域をヒト化抗体へ変化させることを含む。ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用のために少なくとも3つの潜在的な利益を有す。第一に、例えば、補体-依存細胞毒性、又は抗体-依存細胞性細胞毒性によって標的細胞をより効果的に破壊するため、ヒト免疫システムとより良い相互作用をすることができる。第二に、ヒト免疫システムは、異物として抗体を認識しないはずである。第三に、より少量及びより少ない投与回数で与えた場合のヒト循環における半減期は、天然に発生するヒト抗体と類似となるであろう。構造的に、ヒト化抗体は、一般的にヒト由来の不変及びフレームワーク領域を有し、そして抗-α5β1インテグリン抗体を生起させた動物の抗体に由来する相補性ドメイン領域を有する。構造的に、キメラ抗体は、抗-α5β1インテグリン抗体を生起させた動物由来抗体に由来する可変-鎖領域、及びヒト由来の不変鎖領域を有する。機能的にキメラ及びヒト化抗-α5β1インテグリン抗体の両方は、α5β1インテグリンを特異的に認識し、そしてα5β1インテグリンがその受容体と相互作用することを阻害する。ヒト化及びキメラ抗α5β1インテグリン抗体を調製するための多種の方法を本明細書において提供する。ヒト化抗体は、一般的にヒト不変及び/又は可変領域ドメイン、或いは特定の変化体を担持するマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は他の種から由来するキメラ又は突然変異モノクローナル抗体である。ヒト化及びキメラ抗-α5β1インテグリン抗体を生産するための技術は当業者に周知であり、そして本明細書における参考文献及び引用特許において見出すことができる。III組換えキメラ及びヒト化抗-α5β1インテグリン抗体、及びそこから由来するFabフラグメントの調製本発明の抗体は、抗-α5β1インテグリン抗体生産を導くため、α5β1インテグリン又はそれらから由来するペプチドを有す動物を免疫化することにより調製される。抗体を発現するリンパ性組織はその後単離され、そして抗-α5β1インテグリン抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を精製する。当該精製された核酸は、その後、α5β1インテグリンを特異的に認識するキメラ、ヒト化、一本鎖、Fab又はFab2抗体をコードする核酸を作製するため組換え的に操作される。組換え的に操作された核酸は、その後、抗-α5β1インテグリン抗体-産生細胞を作製するために使用される。これらの細胞は、α5β1インテグリンをその受容体と結合することを阻害又は予防するモノクローナル抗体を生産し、感受性の高い組織における新脈管形成の阻害をもたらす。A.抗α5β1インテグリン抗体を産生する細胞、及び抗α5β1インテグリン抗体をコードしている核酸の生産組換えキメラ及びヒト化抗-α5β1インテグリン抗体を調製するために、非-ヒト抗-α5β1インテグリン抗体をコードしている核酸を最初に単離する必要がある。これは、典型的に動物、例えば、マウスを5αβ1インテグリン又はそこから由来する抗原性ペプチドで免疫化することによりなされる。典型的には、マウス当たりおよそ50マイクログラムのタンパク質抗体により2回腹腔内で免疫化される。免疫化されたマウス由来血清は、かかるポリペプチドを発現している任意の宿主システムにおける免疫組織学又は免疫細胞学によって、及び発現したポリペプチドによるELISAによって、抗体活性を検査することができる。免疫組織学では、本発明の活性抗体はアビジン-ペルオキシダーゼ及び色素性のペルオキシダーゼ基質により追跡されるビオチン接合型抗-マウス免疫グロブリンを用いて同定することができる。かかる試薬の調製は;例えば、ZymedCorpSanFranciscoCalifから商業的に入手し得る。本発明により検出され得る活性抗体を血清に含むマウスを、融合させそしてハイブリドーマを生産するために3日後に殺してからそれらの脾臓を除去することができる。かかるハイブリドーマの陽性上清液を、例えばウェスタンブロット分析のような、当業者にとって一般的なアッセイを用いて同定することができる。所望される抗体鎖をコードする核酸を、例えばハイブリドーマmRNA又は脾臓mRNAを用いることによって、重鎖及び軽鎖遺伝子のPCR増幅のための鋳型としてその後単離できるHuse等Science246:1276。抗体及び細胞内発現抗体の両方を産生する核酸は、本技術を用いたネズミモノクローナルハイブリドーマから引き出すことができる;BioccaS等BiochemandBiophysResComm197:422427MhashilkarAM等EMBOJ14:15421551。これらのハイブリドーマは抗体の構造のためによく特徴付けられた試薬の信頼できる供給源を提供し、特に一度それらのエピトープ反応性及び親和性が特徴付けられた場合に有用である。単離された細胞からの核酸の単離は、更にClacksonT等Nature352:624628andPortolanoS等supra;BarbasCF等supra;MarksJD等supra;BarbasCF等ProcNatlAcadSciUSA88:79787982において検討されている。B組換え抗体の作製非-ヒトのヒト化形態抗体は、免疫グロブリンのキメラ分子、免疫グロブリン鎖又はそれらのフラグメント2又は他の抗原結合配列であり、非-ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。ヒト化抗体は、所望される特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギのような非ヒト種ドナー抗体のCDR由来残基で置き換えられた受容物の相補性決定領域を形成する残基を有すヒト免疫グロブリン受容抗体を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が対応の非-ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体は、導入されたCDR又はフレームワーク配列中に受容抗体中のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、非-ヒト免疫グロブリンのそれらと対応するCDR領域の全て又は実質的に全て、及びヒト免疫グロブリン共通配列のそれらであるFR領域の全て又は実質的に全てを有す、少なくとも1つ、及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン不変領域、典型的にヒト免疫グロブリンの不変領域の少なくとも一部も含むであろう;Riechmann等Nature332:323329;及びPrestaCurrOpStructBiol2:593596。ヒト化抗体を産生する方法は当業界において周知であり、そして他でも十分に発表されている。例えば、Queen等米国特許Nos:5530101;5585089;5693761;5693762;6180370参照個々については、全文中に参考文献により組み入れられている。抗体は当業界において公知である多様な技術、例えば、CDR移植、ベニアリング又は再表面化;Studnicka等ProtEng7:805814;Roguska等ProcNatlAcadSci91969973、及び鎖シャフリング、を用いてヒト化することができ、それらの全文は参考文献により本明細書に組み込まれている。多くの方法は、組換えキメラ抗体を生産するため発表された。キメラ抗体を形成するためタンパク質ジスルフィド結合を通して結合された抗体ドメインの調節された転位は利用され得る:95991981。組換えDNA技術は、マウス抗体可変軽鎖及び重鎖ドメインをコードするDNA配列とヒト抗体軽鎖及び重鎖不変ドメインの間の遺伝子融合を構築するためにも使用できる。例えばMorrison等ProcNatlAcadSciUSA81:685168551984;MorrisonScience229:12021207;Oi等BioTechniques4:214221;Gillies等JImmunolMethods125:191202;米国特許Nos5807715;4816567;及び4816397、及びそれらの全文は参考文献により本明細書に組み込まれている。ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位又は相補性決定領域をコードするDNA配列は、ヒト抗体重鎖及び軽鎖のフレームワークをコードするDNA配列中へ分子手段により移植することができる:522525、1986;Riechmann等Nature332:3233271988。発現した組換え産物は再形成物又はヒト化抗体と呼ばれ、そしてヒト抗体軽鎖又は重鎖のフレームワーク、及びネズミモノクローナル抗体の抗原認識部位、CDRsを含む。ヒト化抗体を生産するための他の方法は、参考文献によって本明細書に組み入れた米国特許No5639641において発表された。この方法は、再表面化を経由して、可変領域におけるヒト表面の存在のため、治療の有効性を改善させたヒト化げっ歯動物抗体を提供する。当該方法において:抗体重鎖及び軽鎖可変領域のプールの部位の整列は、重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面露出位置の一式を与えるために作成し、ここでの全ての可変領域のための整列部位は少なくとも約98同一であり;アミノ酸残基を露出する重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面の一式は、げっ歯動物抗体のために定義され;アミノ酸残基を露出した重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面の一式は、同定されるアミノ酸残基を露出するげっ歯動物表面の一式と大部分が密接に同一であり;ステップにおいて定義されるアミノ酸残基を露出する重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面の一式は、げっ歯動物抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の5Å以内にあるそれらのアミノ酸残基を除き、ステップにおいて同定されるアミノ酸残基を露出した重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク表面の一式に置き換えられ;そして結合特異性を有するヒト化げっ歯動物抗体を生産する。ヒト化抗体の生産のための類似の方法は、米国特許Nos5693762;5693761;5585089;及び5530101に発表され、それぞれ参考文献により本明細書に組み入れられた。これらの方法は、1以上の相補性決定領域、並びに可能な限りのドナー免疫グロブリン由来の追加のアミノ酸及び受容するヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域、を有するヒト化免疫グロブリンを生産することに関与する。それぞれのヒト化免疫グロブリン鎖は、通常更にCDRsを含み、ドナー免疫グロブリンフレームワークからのアミノ酸は、ドナーの免疫グロブリン中、又は分子モデルによって予測されるそれらの約3Å以内にあるCDRに直に連続する1以上のアミノ酸等との結合親和性をもたらすため、CDRsと相互作用することができる。重鎖及び軽鎖は、米国特許Nos5693762;5693761;5585089;及び5530101に発表された通り、多様な位置基準の任意の1つ、任意の組合せ、又は全てを用いることによって各々がデザインされ得る。完全な抗体へ組合せた場合、ヒト化免疫グロブリンはヒトにおいて実質的に非抗体的であり、そして起源抗原へのドナー免疫グロブリンと実質的に同一の親和性を保持する。ヒト化抗体を生産するための更なる方法は、それぞれ参考文献として本明細書中に組み入れた米国特許Nos5565332及び5733743に発表されている。またファージミドライブラリーをヒト化抗体の概念に組み入れるこの方法は、本明細書において詳細に説明した。一般的な意味における当該方法は、重要な抗原に対する抗体又は抗体の集団の抗原結合サイト由来配列を利用する。従って、一つのげっ歯動物抗体のため抗体の抗原結合サイトの部分を含む配列は、組合わせることで完全な抗原結合サイトを作り出すことができるヒト抗体の多様な配列レパートリーと組合せることができる。同様な方法で抗原と接触させて作成するような、もとのげっ歯動物抗体の配列部位だけを有する当該抗原結合サイトは、CDR移植により作製されたものとは異なる本方法により作製された。選定されたヒト配列は、それらのもとの結合サイト由来抗原とは異なる配列であるようであり、そして別の方法では、それらのもとの結合サイト由来抗原と接触させて作製する。しかしながら、抗原へのもとの配列部分の結合、並びに抗原及びその抗原の結合サイトの形状により課せられる制約は、抗原の同一の領域又はエピトープへのヒト配列の新規接触を強いるようである。従ってこの方法は、エピトープ刷り込み選定と呼ばれた。動物抗体とともに出発する場合の1つの方法は、部分的なヒト抗体である抗体の選定に帰着する。かかる抗体は、治療において直接又はわずかな主要な残基の改変後、使用されるようにヒト抗体と、配列において類似するに十分なものでありうる。選定された抗体のげっ歯動物構成成分とヒト配列との相違点は、ヒト配列の残基と異なるそれらの残基を置き換えることによって例えば、個々の残基の部位特異的突然変異誘発により、又は全ループのCDR移植により最小限にすることができる。しかしながら、全ヒト配列を有する抗体を作製することもできる。従って、EISはそれぞれ動物の抗体と同じエピトープと結合する部分的なヒト抗体、或いは部分的なヒト抗体と同じエピトープと結合する全体的なヒト抗体を作製するための方法を提供する。EISにおいて、抗体フラグメントのレパートリーは、線状ファージの表面上に提示することができ、そして抗体結合活性を有するフラグメントをコードする遺伝子は抗原へのファージの結合によって選定される。本発明における使用のため考慮されるヒト化抗体のための更なる方法は、各々参考文献によって本明細書中に組み入れられた米国特許Nos5750078;5502167;5705154;5770403;5698417;5693493;5558864;4935496;及び4816567に発表されている。一本鎖抗体生産のため発表された技術はは、α5β1インテグリンへの一本鎖ヒト化抗体を生産するために適用することができる。C組換えキメラ又はヒト化抗体の発現結果物である抗体は、抗体をコードする核酸を含む1以上のベクターを通して発現され得る。好適には抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸セグメントは、IRES配列の調節下でコードしている核酸の一つの転写を伴う、一つの転写ユニット中にある。ベクターは、WO9364701中に発表されているように、標的決定部位例えば細胞表面受容体に対するリガンド及び核酸結合部位を有する化学的接合体、ウィルスベクター、PCTUS9502140に発表されたような標的部位及び核酸結合部位を含む融合タンパク質、プラスミド、ファージ等を含む。当該ベクターは染色体性、非染色体性又は合成性であってよい。好適なベクターはウィルスベクター、融合タンパク質及び化学的接合体を含む。レトロウィルス性ベクターはネズミ白血病ウィルスを含む。DNAウィルスベクターは、好適である。これらのベクターは、orthopox又はavipoxベクターのような、poxベクター、単純ヘルペスIウィルスベクターGellerAI等JNeurochem64487;LimF等DNACloning:MammalianSystemsDGloverEd;GellerAI等ProcNatlAcadSci:USA90:7603;GellerAI等ProcNatlAcadSciUSA87:1149のようなヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクターLeGalLaSalle等Science259:988;Davidson等NatGenet3219;Yang等JVirol692004及びアデノ関連ウィルスベクターKaplittMG等NatGenet8:148を含む。Poxウィルスベクターは細胞質中へ遺伝子を導入する。Avipoxウィルスベクターは、核酸の短期発現のみをもたらす。アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター及び単純ヘルペスウィルスベクターは、神経細胞中へ核酸を導入するために好適である。アデノウィルスベクターはアデノ関連ウィルスより短期間での発現をもたらす。即ちHSVベクターよりも短い。特に選定されるベクターは、標的細胞及びその処理条件に依存するであろう。導入は例えば、感染、トランスフェクション、形質導入又は形質転換といった標準技術によって可能である。遺伝子移転の様式例は、例えばnakedDNA、CaP04沈殿、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、及びウィルスベクターを含む。ベクターは、神経膠腫のような本質的に任意の所望される標的細胞を標的とするために使用することができる。例えば、定位のインジェクションは、所望される位置へベクターを導くために用いることができる。更に、その粒子は、SynchroMed注入システムのようなミニポンプ注入システムを用いて脳室内へ注入することにより運搬することができる。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法は、大きな分子の脳の広い領域への効果的な運搬を証明し、そして標的細胞へのベクターの運搬において有用となり得る;Morrison等AmJPhysiol266:292305。他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内及び皮下注射、並びに経口又は他の公知の投与経路を含み使用することができる。D組換え抗体の単離及び特徴化本明細書において使用される用語抗体とは、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びにF2及びFabタンパク分解性フラグメントのような抗原-結合フラグメントを含む。キメラ抗体、Fvフラグメント、1本鎖抗体等、並びに合成抗原結合ペプチド類及びポリペプチド類といった、遺伝学的に操作された完全な抗体又はフラグメントも含む。非ヒト抗体は、ヒトフレームワーク及び不変領域上へ非ヒトCDRsのみを移植することにより、又は非-ヒト可変ドメイン全体を組み込むことにより、ヒト化され得る。いくつかの例では、ヒト化抗体は適当な結合特徴を増強するためにヒト可変領域フレームワークドメイン中の非-ヒト残基を保持してよい。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期は増加し、そしてヒトへの投与における免疫副作用の可能性は減少するであろう。或いは本明細書において有用である抗体を生産又は選定するための技術は、invitroにおける、α5β1インテグリンタンパク質又はペプチドへのリンパ球の暴露、及びファージ又は類似ベクターにおける抗体提示ライブラリーの選定を含む。Eアフィニティー精製抗体プール又は血清のアフィニティー精製は、技術者により均質な試薬を提供する。アフィニティーカラムを形成するための抗体アフィニティーマトリックスを用いた抗-α5β1インテグリン抗体を高めるための方法は、当業界において周知であり、商業的に入手できる。簡潔には、抗体アフィニティーマトリックスを、アフィニティー支持体へ結合させる、PharmaciaBiotech参照。抗体を含む混合物は、その後抗体の結合したアフィニティーマトリックスにかけられる。結合した抗体は、当業界においてありふれた通常の技術により放出され、濃縮された抗体プールをもたらす。高濃度の抗体プールは、その後更に免疫学的試験に用いることができ、それらのいくつかは、実施例の方法により本明細書に開示される。本発明の抗体を単離するために使用される抗体アフィニティーマトリックスは、本発明の抗-α5β1インテグリン抗体を特異的に認識するようにデザインされていないにもかかわらず、これは抗体精製におけるアフィニティーマトリックスの用途を制限するものではなく、なぜなら抗体は性状がモノクローナル組換えタンパク質として、発現されるからである。単離された抗-α5β1インテグリン抗体は、上記の通り、おそらくα5β1インテグリンの変異体であると思われる第二のタンパク質を比較するため、競合的結合イムノアッセイにおいて使用することができる。この比較を行うために、2つのタンパク質は広範な濃度の幅でそれぞれアッセイされ、そして固定化されたタンパク質への抗血清の50結合阻害に必要なそれぞれのタンパク質の量が決定される。50結合阻害に必要な第二のタンパク質の量が、50結合阻害に必要なα5β1インテグリンの量の10倍未満である場合、当該第二のタンパク質は、α5β1インテグリンに対し産生される抗体へ特異的に結合するものとする。FpH感受性抗体精製本発明のいくつかの抗体は、中性又は塩基性pHでアフィニティー精製を行う時、沈殿する傾向を示す。この問題に着手する本発明の他の観点は、図15、10、11及び13において示されたアミノ酸配列を含む抗体、並びにマウス可変領域を含む、又はマウス可変領域と80以上の配列同一性を有する、又は図15中に含まれる抗体のCDR領域と80以上の配列同一性を有するキメラ抗体を含むpH感受性抗体の精製のための方法に関する。当該方法は、例えば結合した抗体アフィニティーマトリックスを含むイオン交換カラムのようなクロマトグラフィーカラムを用いる抗体のためのアフィニティークロマトグラフィーを処理することを一般に含み、引き続き約30から約55のpH、好適には約33から約55、及び最適には約35から約42、又は約42から約55のいずれかのpHで抗体を溶出することを含む。この範囲の中でのより低いpH値は、小スケールでの精製により適している一方、約42又はより高いpHは、大スケールでの操作により適することが考慮される。この範囲の中での精製工程の操作は、生産物の凝集を殆ど又は全く、最適には本質的に凝集を全く生産しない。アフィニティークロマトグラフィーは、当業界において、抗体又は他の生物学的に活性な巨大分子のような物質を単離又は精製するための1の公知手段である。これはカラム上に固定した抗体と特異的に結合する1以上のリガンドを含むクロマトグラフィーカラムに抗体を含む溶液を通過させることにより、一般に達成される。かかるグループはリガンドアフィニティー反応を通して溶液から抗体を抽出することができる。一度達成されると、当該抗体はカラムから溶出されることにより回収され得る。従って、本発明のこの観点は、基質と結合した抗体アフィニティーマトリックスを用いる抗α5β1インテグリン抗体の精製方法を含み、ここで当該改良は、約30から約55のpHを有す溶出液を用いて基質結合抗体アフィニティーマトリックスから抗体を溶出することを含む。より詳細には、本発明のこの観点は:基質へ結合した抗体親和性マトリックス上へ抗体を吸着させ;及び約30から約55のpHを有す溶出液を用いて基質-結合抗体アフィニティーマトリックスから抗体を溶出する、を含む抗-α5β1インテグリン抗体の精製方法を含んで成る。いくつかの態様において、当該方法はc精製された抗体を回収するステップも含む。しかしながら、抗体が更に精製又は処理された場合、その後の特異的な回収ステップは、この時点では重要でなくてよい。当該精製方法は、基質に結合した抗体アフィニティーマトリックス上への抗体の吸着に関与する。抗体アフィニティーマトリックスの多種の形態を使用してよい。唯一の要求は、抗体アフィニティーマトリックス分子は、精製されるべき抗体と結合する能力を有すことである。例えば、天然起源から単離された抗体アフィニティーマトリックス、組換えDNA技術によって生産された抗体アフィニティーマトリックス、抗体アフィニティーマトリックスの修飾された形態、又は問題の抗体結合能を保持したそれらの材料のフラグメントを使用してよい。抗体アフィニティーマトリックスとして使用するための模範的な材料は、ポリペプチド、ポリサッカライド、脂肪酸、脂質、核酸アプタマー、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、マルチタンパク質複合体、生物学的膜、ウィルス、プロテインA、プロテインG、レクチン、及びFc受容体を含む。抗体アフィニティーマトリックスは、一般的な相互作用によって、、又は特異的な相互作用によって、又はリガンド及び固相の間の共有結合によって、固相又は支持体へ結合される。或いは、中間体化合物又はスペーサーは固相へ結合することができ、そして抗体アフィニティーマトリックスはその後、アフィニティーマトリックスをスペーサーへ結合させることにより、固相上で固定化できる。スペーサーはそれ自体遊離抗体アフィニティーマトリックスに対し、特異的結合アフィニティーを有するリガンドとなることができる。抗体アフィニティーマトリックスは多様な基質又は支持体へ結合することができる。典型的に、イオン交換又はカップリング樹脂はこの目的のために使用される。抗体は多様な手段を用いて基質-結合抗体アフィニティーマトリックス上へ吸着させてよい。おそらく、カラム手順が使用され、そして抗体は適当な緩衝剤により調製された緩衝溶液を用いてカラムへ吸着される。典型的な緩衝剤及び操作条件は、当業界において周知である。抗体は慣習的な方法例えば緩衝溶液を用いてカラムから抗体を溶出するを用いて基質結合抗体アフィニティーマトリックスから溶出させてよい。沈殿を最小にするために、pH感受性抗α5β1インテグリン抗体は、好適にはpH35で、01Mのグリシンを含む緩衝溶液により溶出される。分解及び又は変性を最小にするために、緩衝溶液の温度を10°C未満に保ち、又はより好適には4°C未満に保つ。同じ理由で、抗体を酸性pHへ曝す時間は最小限にすべきでもある。例えば、溶出した抗体溶液へ、塩基性溶液の前もって決められた量を付加することにより、これは達成される。好適にはこの塩基性溶液は緩衝溶液であり、より好適には揮発性の塩基性緩衝溶液であり、最適にはアンモニア溶液である。基質結合抗体アフィニティーマトリックスからの抗体の溶出は、当業界において周知の多様な方法によってモニターされてよい。例えばカラム手順が採用された場合、フラクションはカラムから収集されてよく、そしてタンパク質の存在はフラクションの吸着量を測定することにより決定される。仮に既知の特異的抗体を精製する場合、カラムから収集されたフラクション中の抗体の存在は、例えば、ラジオイムノアッセイRIA又は酵素イムノアッセイEIAのような、イムノアッセイ技術により測定され得る。本発明の方法は、精製した抗体を実質的に分解させず、又は基質へ結合する抗体アフィニティーマトリックスに有害的に作用しない、任意の都合の良い温度で実施できる。好適には、室温が採用される。抗体アフィニティーマトリックスカラムから溶出した抗体は、所望されるならば、当業界における公知の多種の方法を用いて回収してよい。Gアビディティ検査アビディティ検査は、α5β1インテグリンの1以上のエピトープを特異的に認識する抗体を同定するために、当業者によりなされる。抗体が特異的に結合しているとは:1抗体が結合活性の閾値レベルを見せるか、及び又は2抗体が近縁のポリペプチド分子と有意に交叉反応をしないか、で定義される。第一に、106mol1以上、好適には107mol1以上、より好適には108mol1以上、及び最適には109mol1以上の結合親和性Kaでα5β1インテグリンポリペプチド、ペプチド又はエピトープへ結合した場合、本明細書における抗体は特異的に結合する。抗体の結合アフィニティーは、当業者により、例えばScatchard分析、又はBIAコアを使用する表面プラスモン共鳴により容易に決定することができる。第二に、抗体が近縁のポリペプチドと有意に交叉反応をしない場合、抗体は特異的に結合する。近縁のポリペプチド分子と有意に交叉反応をしない抗体とは、例えば、標準的なウェスタンブロット分析を用いて、それらが既知の近縁のポリペプチドは検出しないが、α5β1インテグリンポリペプチドを検出する場合である。既知の近縁のポリペプチドの例は、オルソログ、タンパク質のインテグリンファミリーのメンバーである同一種由来タンパク質、図1の整列中に見られるポリペプチド、突然変異α5β1インテグリンポリペプチド等である。更に、抗体はα5β1インテグリンと特異的に結合する集団を単離するため、既知の近隣のポリペプチドに対してスクリーニングされてよい。例えば、ヒトα5β1インテグリンポリペプチドに対して生起した抗体は、不溶性マトリックスに結合した近縁のポリペプチドへ吸着し;ヒトα5β1インテグリンポリペプチドへの特異的な抗体は、適当な緩衝剤条件下でのマトリックスを通して流されるであろう。かかるスクリーニングは、密接に近縁のポリペプチドと非-交叉反応性であるポリクローナル及びモノクローナル抗体を単離できるColdSpringHarborLaboratoryPress1988;CurrentProtocolsinImmunologyCooligan等NationalInstitutesofHealthJohnWileyandSonsInc1995。特異的抗体のスクリーニング及び単離は、当業界において周知であるRavenPress1993Getzoff等AdvinImmunol43:1981988;MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticeGodingJWAcademicPressLtd1996;Benjamin等AnnRevImmunol2:671011984参照。かかるアッセイの代表的な例は:現行の免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素連結免疫吸着アッセイ、ドットブロット又はウェスタンブロットアッセイ、阻害又は競合アッセイ、及びサンドウィッチアッセイを含む。免疫学的手順及びイムノアッセイの手順の検討は、BasicandClinicalImmunologyを参照。IV新脈管形成調節における有効性の測定方法本発明はヒト化抗α5β1インテグリン抗体により調節された生理学的効果を評価するための方法を提供する。閾値の問題として、これらの方法は、安全、且つ治療効果量を決定するため、本発明の抗体を含む組成物のスクリーニングを許容する。治療の間、これらの方法のいくつかは、最適な臨床効果を提供するため進捗をモニタリングし、そして用量を調節することに応用できる。当該方法は、分析も治療も両方できる生育組織を提供することを含んで成る。即ち、不朽化を含み、組織が損傷した時、所望されない脈絡膜の新生血管形成反応が起こり、それが阻害又は妨げられた場合、患者の予後及び/又は損傷した組織の治癒が改善されるであろう組織を提供する。典型的な組織は、腫瘍及び眼組織、特に眼の黄斑を含む治療又は試験のために適している。用語腫瘍とは、任意の新規の病理学的組織成長を意味するために本明細書において広く用いられる。本発明の目的は、新脈管形成により一部分の腫瘍を特徴付けることである。腫瘍は良性、例えば、血管腫、神経膠腫、奇形腫等であってよく、又は悪性、例えば、癌腫、肉腫、神経膠芽腫、星状細胞種、神経眼腫、網膜眼腫等であってよい。用語腫瘍とは、一般的に良性又は悪性腫瘍を言うために使用され、そして用語癌とは、一般的に悪性腫瘍転移性であってもなくてもよいを言うために使用される。悪性腫瘍は、例えば血管を新規に形成することによるα5β1発現に関連する新脈管形成によって少なくとも一部分が特徴付けられる腫瘍を提供する肺癌、乳癌、前立腺癌、頸部癌、膵臓癌、結腸癌及び卵巣癌のような癌腫;及び骨肉種及びKaposs肉腫のような肉腫を本発明の方法を用いて診断することができる。試験のため、これらの組織は公知の手段によって単離することができ、そしてその出所は当業者に容易に入手され得る。本発明の治療的抗体の効果を検査するための生育組織を用いた場合、当該組織は最初に病変を作り出すため、そして脈絡膜の新生血管形成を促すために傷つけなければならない。傷をつけることは、機械的、化学的、又は生物学的手段を含む任意の適宜手段により達成され得る。傷つけることの模範的な機械的手段は、切断、貫通、又はクランプを含む。化学的手段はネクローシス、アポトーシス、又は細胞同士の接触阻止を惹起する組織への試薬の適用を含む。生物学的手段はウィルス、バクテリア、又はプリオンのような感染性試薬による処置を含む。病変を作製するための好適な方法は、レーザーの使用を通すことである。組織を傷つけることができる任意のレーザーは、好適なタイプであるCO2ガスレーザー、IRISMedical登録商標PortableSlitLampAdaptorを有するOcuLightGLLaserPhotocoagulatorである最適なタイプを使用する。他のレーザー源も、約300から約700mワットのレーザーライトを発生できること、且つ病変が直径200μm未満、好適には100μm未満、より好適には約50から約100μm、及び最適には直径約75から25μmにできることを条件に適している。典型的には、当該レーザーライトは第二のフラクションのための組織へ適用される。通常は05秒未満、より好適には01秒未満、最適には005秒未満である。適用される抗体は、キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体である。好適には、本抗体はSEQIDNOS16、16及び20から成る群から選定されるアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を有する可変重鎖領域を含み、SEQIDNOS712、18及び22から成る群から独立的に選定され、並びに当該群からのアミノ酸配列と65の配列同一性、好適には75より高い配列同一性、より好適には85、90、95、97又は99の配列同一性を有する可変軽鎖領域を含む。最適には、キメラ又はヒト化抗α5β1インテグリン抗体は、SEQIDNOS26、16、20、25、28及び31から成る群から選定された配列を有する可変重鎖領域、並びにSEQIDNOS812、18、22、26及び32から成る群から独立的に選定される可変軽鎖領域を含む。本発明の抗体は多様な経路、例えば静脈内、経口、又は治療されるべき領域へ直接的に例えば、新形成腫瘍中へ直接的に;眼に関与する病理学的症状への点眼により;或いは関節に関与する症状のあるところの滑液中へ投与することができる。個体に投与される治療抗体の量は、診断目的か、又は治療目的であるか、に一部分依存するであろう。診断又は治療方法のために投与する薬剤の効果量を決定するための方法は、当業界において周知であり、そして第I相、第II相及び第III相臨床試験を含む。本発明の方法を用いた場合の効果量は、例えば、個々の検査対象への滴定投与、及び新脈管形成阻害の機能としてのチャート進行により決定することができる。医薬の総量は、ボーラス又は比較的短期間注入によるいずれかの単一投与量として対象へ投与することができ、或いはより延長した期間で投与される断片化した治療プロトコールにおける複数投与量を用いて投与することができる。上記の留意点として、当業者は、部位への効果量を供給するため要求される特別な試薬の濃度、又は多くの要因年齢及び対象の一般的な健康状態、並びに投与経路、投与された治療薬の数、そしてその医薬の性質を含むに依存する個体におけるα5β1インテグリン発現に関連する新脈管形成の部位を知っているであろう。これらの因子の観点において、当業者は、そのリガンドとα5β1インテグリンの特異的結合を有効に妨げるための効果量を得るための特定の投与量を調整するだろう。それによって新脈管形成の減少又は阻害をもたらす。臨床的に関連する進捗のモリタリングは、本発明の他の観点である。モニタリングは、当業界において公知の任意の適した方法によって実施され得る。好適な方法は、顕微鏡検査、核磁気共鳴及びX線を含む。眼組織の場合において、後眼房の間接的な検眼鏡検査、及び前眼部の生体鏡実験を使用できる。脈絡膜の新生血管形成の範囲をモニタリングする好適な方法は、静脈内フルオレセイン染色及びフルオレセイン血管造影により生育組織を検査することによる。新生脈管形成を阻害又は妨げる抗-α5β1インテグリン抗体の効力をスクリーニングするための好適な方法は、動物の網膜内に病変を作製すること、病変に抗-α5β1インテグリン抗体を適用すること、そしてその後、損傷した組織中での新生脈管形成の進捗を、適したコントロール実験と比較してモニタリングすること、による。このアプローチは、後述の実施例6中において詳細に検討されている。これらの試験は、固体の片眼への抗-α5β1インテグリン抗体の適用は、個体の両眼に存在する病変の治療をもたらすという驚くべき発見を導いた。それは損傷した組織において新規に形成された血管がもれやすいことを示唆し、そして全身血に入る片眼への抗体の適用をもたらし、もう片眼へ抗体を運搬する。抗体全体又はFabフラグメントか否は無関係であることを有すこの結果は、治療において使用される。これらの結果は、本発明の抗α5β1インテグリン医薬抗体を、全身的に、例えば、静脈内注射により投与することによる眼の病変の新規の治療方法を示す。V医薬的使用本発明の更なる態様は、本明細書において発表する治療抗体を含む医薬組成物を含んで成る。これらの組成物は、炎症を減少させ、又は別の方法で局所的な苦痛の除去を提供する治療成分の取り込み又は局在化を増強させる作用物質を含んでよい。α5β1インテグリン発現に関連する新脈管形成を減少させ、又は阻害するにおいて有用な本発明の抗体、或いは当該抗体を含む医薬組成物は、新脈管形成により、少なくとも1部分、特徴化された任意の病理学的症状を治療するために使用することができる。当業者は当該作用物質を、例えば経口又は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、髄液嚢内、腹腔内、槽内、もしくは受動的、例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入、を使用して経皮吸収を促進させることを含む多様な経路により投与することができることを知っているであろう。更に、当該抗体は注射、管移入、坐剤、経口又局所経由により投与することができ、局所経由は、例えば、当該抗体を含む軟膏又はパウダーの直接適用による受動的なものであるか、或いは例えば、点鼻スプレー又は吸入器を使用する能動的なものでもよい。抗体は、所望されるならば組成物の1つの成分が適切なガスである局所スプレーとして投与することもできる。医薬組成物は、所望されるならば、リポソーム、ミクロスフェア又は他のポリマーマトリックス中に組み入れることもできるを参照。例えばリン脂質、又は他の脂質から成るリポソームは、毒性がなく、生理学的に許容され、そして比較的簡単に作成及び投与される代謝され得る担体である。α5β1インテグリン発現に関連する新脈管形成は、例えば糖尿病性網膜症で苦しんでいる個体の網膜中で局部的に発生させることができ、或いは、例えば、リウマチ性関節炎又は転移性悪性新生物で苦しんでいる個体に、より全身的に発生させることができる。新脈管形成の領域は、局所化することができ、又はより全身的に分散させることができるので、当業者は、この要因の一部分に基づき、本発明の治療抗体の特定の投与経路及び投与方法を選定するであろう。例えば、糖尿病性網膜症で苦しんでいる個体において、α5β1インテグリン発現に関連する新脈管形成が網膜に位置する場合、当該作用物質を直接眼に投与することができる点眼剤として使用するために適する医薬組成物に製剤化することができる。比較して、転移性癌腫で苦しむ個体において、医薬組成物中の当該作用物質は、静脈内、経口、又は他の当該作用物質を全身的に分散させる方法によって投与することができる。このように、本発明の抗体は、多様な経路、例えば、静脈内、経口、又は処置される部位中に直接、例えば、新形成腫瘍中へ直接;眼に関与する病理学的症状への点眼経由:又は関節に関与する症状における滑液内へ、投与することができる。治療抗体は、個体におけるα5β1インテグリンのその特異的リガンドへの特異的結合を妨げるに十分な量である効果量を投与される。一般的にアンタゴニスト作用物質は、適用によりそれらが若干変わるにもかかわらず、約00001から100mgkg体重の用量で投与される。上記で検討された有効性試験の結果に基づき、当業者は施された治療の有効量の幅を決定することができるであろう。投与量の評価は、例えば局所的に投与された作用物質に応じて調整することができる。本発明の抗体を投与する好適な方法は、皮下、静脈内、或いは損傷で苦しむ関節又は組織中への直接的注入、のいずれかの方1法による。例えば、網膜組織が損傷を受けた時、本発明の治療抗体は、影響を受けた眼の中へガラス体内から注入することができる。本発明の驚くべき結果は、片眼へ施された処置が両眼への臨床的に有益な効果を導くことである。それは、新規に形成された血管はもれやすいものであると考えられ、このことは第一の眼に施された抗体が血流中を通過し、そこで第二の眼に輸送されることを可能にする。このように眼に適用される場合、投与量は好適には5μM未満、より好適には05から2μMの間、及び最適には01から10μMの間である。示されたところでの治療は、所定の投与部位又は投与期間に応じて複数の投与形態をとることができる。複数の形態における投与量は、全て同一であってよく、又は独立して決定及び適用することができる。この結果は、治療抗体の全身的適用の効果量を含み、新脈管形成に関連する病変を治療する追加の方法も導き、ここで損傷した組織の新脈管形成が阻害され、又は妨げられる。本明細書において引用する全ての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が参考文献によって組み入れられたことを詳細に及び個々に示すように、参考文献により本明細書中に組み入れた。上述の発明を明確にさせるため、及び理解するため、図解及び実施例により一部が詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲の意図及び範囲から離れず、そこへの一定の変化及び改変を作製することができることを本発明の技術面での当業者は容易に理解するであろう。実施例上記提供された開示から理解できるように、本発明は多種多様な適用を有す。従って、以下の実施例は目的を説明するために提供され、そして任意の方法において、本発明に制限を構成することを意図したものではない。当業者等は、本質的に同様の結果を生じさせるために変化又は修飾させることができる多種の非基準的パラメーターのバラエティーを容易に認識するであろう。ネズミIIAI抗α5β1インテグリン由来M200キメラの構築本実施例は、キメラ抗体M200の構築を説明する。AIIA1並びに2004VH及びVLドメインの出発DNA配列マウス抗ヒトα5β1インテグリン抗体、IIA1の可変重鎖及び軽鎖ドメインは、IIA1ハイブリドーマcDNAからクローン化され、そして2004抗体の最初の構築の部分として配列決定される。図3は、IIA1VH及びVLドメインのcDNA配列を示す。IIA1由来2004マウスヒトキメラIgG4抗体の構築を通じて、サイレントXhoI制限サイトを、IIA1VH及びVLの両方のフレームワーク4領域中に導入した。DEF38IIAlヒトG4キメラ及びNEF5IIA1Kキメラ発現構築体中に見出されるものとして、それらのサイレントXhoIサイトを含む2004VH及びVLDNA配列を、図4に示す。これらの2004VH及びVL配列は、出発ポイントとして、全てのサブ配列組換えDNA操作に使用した。BM200VH及びVLミニエクソンのデザイン発現プラスミドDEF38IIA1ヒトG4キメラ、及びNEF5IIA1Kキメラ中の2004VH及びVLドメインを、介在イントロンなしでサイレントXhoIサイトを通してそれらの連続する不変ドメインと直接融合させる。ゲノムDNAに基づく所望される抗体発現ベクターと適合性のあるこのような可変ドメインを作製するために、可変コード領域の3’末端での機能的ドナースプライスサイトを再度作り出す‘ミニエクソン’をデザインすることが必要であった。配列の比較では、それぞれネズミJH4及びJK1セグメントを利用したIIA1のVH及びVL領域を露出させ;その結果、当該ミニエクソンを、VH及びVLドメイン中の最後のアミノ酸に従う、天然のネズミJH4及びJK1ドナースプライスサイトを再度作り出すようにデザインした。更に、当該XhoIサイトを除去し、起源IIA1ハイブリドーマ中で見出されたとしてフレームワーク4配列を回復させた。当該ミニエクソンには、制限サイト:VHミニエクソンのための5及び3XbaIサイト、及びVLミニエクソンのための5MluI及び3XbaI、が隣接した。組換え抗体可変ドメインは、時々所望されない選択的alternativemRNAスプライスサイト従って、選択的にスプライスされたmRNA物質を発生させることができるを含む。かかるサイトは、理論上では、ネズミ可変ドメイン中に存在することができるが、異種の発現細胞及び/又はキメラ不変領域からの新規の受容サイトとの関係でのみ活性化し始める。コードされたアミノ酸配列が未変化のまま、潜在的な選択的スプライスサイトを除去するためにコドン縮重を利用することは、かかる所望されない選択的スプライシングを排除することができる。M200VH及びVLミニエクソン中の任意の潜在的な選択的スプライスサイトを検出するため、出発デザインはCenterforBiologicalSequenceAnalysisfromtheTechnicalUniversityofDenmark製のスプライスサイト予測プログラムにより分析された。両200Mミニエクソンのため、正確なドナースプライスサイトが同定されたが;潜在的な選択的ドナースプライスサイトは、VHミニエクソンのCDR3及びVLミニエクソンのCDR1の中で検出された。使用されるこれらのスプライスサイトの可能性を除去するために、一つのサイレンス塩基対の変化をミニエクソンデザインに作製した。VHデザインの場合において、グリシン100でのサイレントGGTからGGAコドンへの変化が作製され;VLデザインのためバリン29でのサイレントGTAからGTCコドンへの変化が作製された。両ケースにおいてこれらのサイレント変化はV遺伝子中の潜在的な第二のスプライシングドナーシグナルを排除した。隣接する制限サイト、ネズミドナースプライスサイトを含み、2004XhoIサイトを除去され、そして潜在的な選択的ドナースプライスサイトの除去されたM200VH及びVLミニエクソンのための最終デザインを、図5に示す。CM200VHミニエクソン及びプラスミドp200MHの構築図5Aに示す通り、M200VHのためにデザインされたミニエクソンは、出発ポイントとして2004発現プラスミドDEF38IIAlヒトG4キメラを用いたPCRに基づく突然変異誘発により構築した。簡潔には、2004VH領域は、DEF38IIAlヒトG4キメラから2004VHシグナル配列の5末端をアニールし、そしてKozak配列及びXbaIサイトを付加するプライマー110、並びに2004VHの3末端をアニールし、そしてXbaIサイトを付加するプライマー104を用いて増幅した。469塩基対PCRフラグメントは、pCR4BluntTOPOベクター中でクローン化し、そしてプラスミドp200MVH21を産していることをDNA配列により確認した。本中間体プラスミドは、その後CDR3中の潜在的な異常型スプライスサイトを除去するため、そしてVHコード領域の3’末端でネズミJH4ドナースプライスサイトを付加するために、第二のPCR突然変異誘発反応において使用された。2つの相補的プライマー、111及び112は、M200VHのCDR3中におけるグリシン100で、GGTをGGAコドンへ変化させることを導くようにデザインされた。プライマー110及び112は、M200VHのミニエクソンの5’末端から395bpのフラグメントを産するためPCR反応において使用され、そしてプライマー111及び113の別個のPCR反応は、M200VHミニエクソンの3’末端から101bpのフラグメントを産する。当該2つのPCR産物は、低融点の15アガロースゲル上で精製し、組合せ、そしてプライマー110及び113を用いて最終的なPCR反応中で結合した。最終的な465bpのPCR産物を精製し、XbaIで消化し、そしてXbaI消化された、且つshrimpアルカリホスファターゼ処理されたベクターpHuHCg4D中でクローン化した。最終的なプラスミド、p200MHは、XbaIサイト間の200MVHミニエクソンのための正確な配列を確実にするため、及びXbaIXbaI挿入体の正しい配向を確かめるため、DNAシーケンシングにかけた。DM200VLミニエクソン及びプラスミドp200MLの構築図5Bに示すように、M200VLのためにデザインされたミニエクソンを、出発点として2004発現プラスミドNEF5IIA1Kを用いて、PCRに基づく突然変異誘発により構築した。当該VL領域を、シグナル配列の5’末端をアニールし、そしてKozak配列及びMluIサイトを付加するプライマー101、並びに2004VLの3’末端をアニールし、そしてXbaIサイトを付加するプライマー102を用いて、NEF5IIA1Kから増幅させた。当該432bpPCRフラグメントをpCR4BluntTOPOベクター中でクローン化し、そしてプラスミドp200MVL33を産しているかをDNAシーケンシングにより確認した。この中間体プラスミドは、CDR1中の潜在的に異常型のスプライスサイトを除去するため、そしてVLコード領域の3’末端でネズミJK1ドナースプライスサイトを付加するために、その後第二のPCR突然変異誘発反応中で使用した。2つの相補的プライマー、114及び115は、VLドメインのCDR1中のバリン29でGTAからGTCコドンへの変化を導くようにデザインされた。プライマー101及び115を、VLミニエクソンの5’末端から182bpのフラグメントを産するためにPCR反応中で使用し、そしてプライマー114及び116による別個のPCR反応は、VLミニエクソンの3’末端からの280bpフラグメントを産する。2つのPCR産物は、低融点の15アガロースゲル上で精製し、組合せ、そしてプライマー101及び116を用いて最終的なPCR反応中で結合させた。最終的な431bpPCR産物を精製し、MluI及びXbaIで消化し、そしてMluI及びXbaI消化された軽鎖発現ベクターpHuCkappargptdE中でクローン化した。最終的なプラスミド、p200MLは、MluI及びXbaIサイト間でのVLミニエクソンのための正確な配列を確実にするため、DNAシーケンシングへかけた。E最終的な発現プラスミドp200Mを作製するためのプラスミドp200MH及びp200MLの組合せ一つのプラスミドからM200を発現させるためのp200MH及びp200MLは、EcoRIによって消化され、そしてp200MHから完全なIgG4重鎖遺伝子を運搬するEcoRIフラグメントを、プラスミドp200Mを産するためEcoRI線形化p200ML中へ結紮した。p200Mのエンドトキシン不存在プラスミドの大スケールでの調製は、エンドトキシン不存在プラスミドMaxiprepキットを使用するEcoli培養の25リットルから調製した。当該プラスミド構造は、酵素BamHI、XbaI、及びFspIによる制限酵素マッピングにより確認した。M200VH、VL、Cκ、及びCγ4全体をコードする領域は、DNAシーケンシングにより確認した。完全なM200重鎖及びM200軽鎖のDNA配列を図9に示す。M200重鎖及びM200軽鎖全体に対応するアミノ酸配列を図10に示す。M200由来FabフラグメントF200の作製本実施例はFabフラグメントF200の作製を説明する。Fabフラグメントは酵素的消化によりM200IgG出発原料から作製する。出発IgGは20mMリン酸ナトリウム、20mMNアセチルシステインpH70中に緩衝液交換する。可溶性パパイン酵素を付加し、そして当該混合物を37°Cで4時間回転させる。消化後、当該反応混合物をFcフラグメントを除去するため、プロテインAを充填したカラムに通し、そして未消化のIgGを除去する。四チオン酸ナトリウムを10mM付加し、そして30分間室温で培養する。最終的に、本調製は、F200溶液を産するために20mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、pH74中で緩衝液交換する。それはFabフラグメントであるから、当該F200軽鎖DNA及びアミノ酸配列はM200軽鎖と同一である。完全なF200重鎖DNA及びアミノ酸配列を図11に示す。InvitroにおけるM200による内皮増殖の阻害本実施例は内皮増殖へのM200抗体の効果を説明する。M200はα5β1インテグリンに対するモノクローナル抗体を高特異的機能的に遮断する。HUVECを、図14に示す濃度で、多種の抗体の存在下において、5000細胞ウェルの密度の96ウェルプレート中に播種した。プレートを10μgmLのフィブロネクチン又は01のポリLリシンのいずれかにより前処理し、そして熱変性させた2BSAにより遮断した。細胞をおよそ2ngmlのVEGF、bFGF又は両方を含む、血清が存在しない限定培地で生育した。プレーティング後4日間、細胞生育可能性のある合計を、テトラゾリウム塩、MTT25ジフェニルテトラゾリウムブロマイドアッセイアッセイの使用IntJRadiatOncolBiolPhys15699702RomijnJCVerkoelenCFSchroederFHinvitroにおけるヒト前立腺癌細胞株へのMTTアッセイの適用:ホルモン刺激成長及び薬剤誘導細胞増殖抑制及び細胞毒性効果の検査条件の確立並びに評価Prostate12:99110参照を用いて評価した。データはバックグランドを差し引き、そして抗体を欠くコントロールへ標準化される。それぞれのデータポイントは3倍に集積され、そして示された当該データは3つの別個の実験で表される。図14に示すように、HUVEC成長はPLL及びフィブロネクチンの両方において用量依存的にM200により阻害され、一方、コントロールIgGは反応がなかった。更にM100は、細胞成長を阻害する同一の能力を見せる。重要なことは、図14に示す通り、当該高アフィニティー、抗VEGFmAb、HuMV833遮断機能は、全ての検査された条件下において45nM;40の最大阻害HUVEC成長の著しく少ない阻害を発揮する。M200及びHuMV833を一緒にすることによる細胞の負荷は、阻害応答の増加をもたらさなかった。図15Aにおいて見られるデータは、上記の通りフィブロネクチン上のHUVEC増殖アッセイにおいてVEGFのより高い濃度を含んだ。図15Aにおいて見られるように、VEGFにより刺激されたフィブロネクチン上でのHUVEC増殖は、HuMV833によるのと同程度にM200により阻害される。このようにM200で仲介される細胞増殖抑制剤の効果は、VEGFの成長を刺激するレベルで上昇した場合でさえ、明白であった。2つの高アフィニティー抗体はM200イディオタイプ領域に対して上昇し、そしてα5β1インテグリンに対するM200の結合遮断を決定した。当該2つの抗イディオタイプmAbsは、上記HUVEC増殖アッセイの中に含まれ、HUVEC成長のM200依存的阻害への効果のため、評価された。両mAbsは、HUVEC増殖を阻害するため、M200の能力を阻害することができる。15Bに示す通り、M200の阻害活性は、M200に対する抗イディオタイプmAbsにより完全に逆転させられた。従って、これらの結果は、抗VEGF抗体HuMV833の重複するメカニズムを通して、更に別個のいくつかの観点も通して、M200がHUVEC増殖を阻害することを示唆する。残存する内皮細胞へのM200の効果本実施例は、残存する内皮細胞へのM200抗体の効果を説明する。所定のインテグリンに対する抗体はinvitro及びinvivoにおいて細胞死を導くことができる。最近では、α5β1mAbを遮断する機能は、培養されたヒト内皮細胞においてアネキシンV染色、カスパーゼ3開裂、及びDNA切断により測定されたようなアポトーシスを促進させることを示した。同様にアネキシンV染色は、M200又はHuMV833に曝された成長したHUVECで実施した。血清不存在培地におけるHUVEC成長は、M200、HuMV833又はスタウロスポリンの存在下において成長した。細胞死はアネキシンValexa488、及びHoechst33258による染色によって評価し、蛍光顕微鏡により引き続き評価した。並行して、細胞死はプレート化後、16時間フローサイトメトリーにより引き続き評価された図16B。図16A及び16Bに示す通り、細胞は、上昇したアネキシンV染色を示すM200を負荷されたが、HuMV833による負荷はなされなかった。従って、HuMV833と対比してM200は、内皮細胞中の細胞死を促進させると思われる。更に、増殖細胞に対するM200の老化への効果を比較した。HUVECは、血清及び成長因子の存在下でプレート化し、そして増殖を許容させ中央パネル、集合体を成長させ、又は血清及び対数増殖期後の成長因子を欠如させた右パネル。それぞれの場合において、細胞は未処理で放置されるか、又は16時間M200、又はスタウロスポリンで培養し、そしてアネキシンValexa488で染色した。図17に示す通り、M200は分割しているHUVECの中で細胞死を引き起こすが、しかしHUVECは接触阻止又は成長因子を退けることのいずれかによる老化をもたらさない。これらの結果はM200が増殖している内皮細胞中で細胞死を選択的に促進させることを示唆する。InvitroにおけるF200の管形成阻害本実施例は、invitroでのF200による新脈管形成阻害において、管形成アッセイの論証を説明する。HUVECsは、ヒト血清及び成長因子の混合物図18Aにおけるアッセイは、001mgmlのrTGFα及び0lmgmlのVEGF及びHGFの両方を補足した培地を含む;図18Bにおけるアッセイは、0lmgmlのVEGF単一物を補足した培地を含む;及び図18Cにおけるアッセイは、01mgmlbFGF単一物を補足した培地を含むと一緒にフィブリン塊フィブリノゲン及びaトロンビンから調製されたの中へ一つの細胞浮遊物として混合された。検査抗体は、示された濃度で培地へ付加した。96時間かけて、当該一つの細胞HUVECsは移動し、他の細胞及びマトリックスと接触し、コードを形成し、そして最終的に3次元の管様構造物を形成し始める。管形成の範囲は4ホルムアルデヒドにより固定し、そしてAlexa488phalloidinで染色することにより6日後に定量した。図18中に蛍光で描かれた平均値のイメージ及びグラフにより示す通り、管形成はF200の存在により著しく阻害された。管形成阻害は成長因子、VEGF、HGF及びrTGFαを有すそれら2つの混合物の存在中で観察された。InvivoにおけるM200及びF200による霊長類動物の眼中のCNVの阻害本実施例は、霊長類動物の眼の黄斑へのレーザー傷害後の脈管発達へのM200及びF200Fabの効果を説明する。動物モデルにおける脈絡膜の新生血管形成のバックグランドの文献記載試験は:SRyan円板状の黄斑変質における網膜下の新生血管形成の実験モデルの開発TransactionsoftheAmericanOphthalmologicalSociety77:707745;SJRyan網膜下の新生血管形成:実験モデルのnaturalhistoryArchivesofOphthalmology100:18041809;MJTolentino等フルオレセイン化した抗血管内皮成長因子抗体の血管造影、及び実験的脈絡膜の新生血管形成におけるデキストランArchivesofOphthalmology118:7884を含む。A実験デザイン計8のサルが以下の表に示す通りの治療群に割り当てられた。M200及びF200は運搬緩衝溶液中で投与された。Rituxan登録商標をコントロール投与として使用した。脈絡膜の新生血管形成は、以下に記載の通りそれぞれの動物の両眼の黄斑へのレーザー処置により1日で導かれた。全ての動物に表1で示すように4週間週1回M200、F200、又はコントロールを投与した。投与初日は、1日目と称した。標準技術を用いて、動物の臨床的サイン、体重、及び他のパラメーターの変化を評価した。全ての動物を28日目で安楽死させた。B脈絡膜の新生血管形成のレーザー導入動物はレーザー処置前に一晩断食させて投与した。動物は、レーザー処置及び投与手順のため、塩酸ケタミンにより、引き続き、静脈内へのケタミン及びジアゼパムの組合せ有効性のためにより落ち着かせた。脈絡膜の新生血管形成は、両眼の黄斑へのレーザー処置により導いた。病変は、レーザーOcuLightGLLaserPhotocoagulatorwithaIRISMedicalPortableSlitLampAdaptorにより標準化された9スポットグリッドパターンにおいて黄斑中に置かれた。右目中のレーザースポットは、左眼中の配置を映す。おおよそのレーザーパラメーターは以下の通り:スポットサイズ:50100μm;レーザー強度:300700ミリワット;暴露時間:01秒である。それぞれの動物のパラメーターを、レーザー処置の当日に記録した。写真はデジタルCCDカメラによりTRC50EX網膜カメラ及び又はSL4EDスリットランプを用いて撮影した。C投薬免疫グロブリン、又はコントロール品目の硝子体内への注入はそれぞれの眼で実施した。1日目の注入に引き続き迅速にレーザー処置を施す。投薬前に、散瞳剤をそれぞれの眼に滴下した。眼を希釈消毒液でゆすぎ、当該消毒液を09殺菌食塩水ですすぎ、そして2滴の局所麻酔薬を眼中へ滴下した。目蓋鏡を処置の間、目蓋を開けたまま挿入し、そして眼球を後退させた。投薬シリンジの注射針を、およそ4mm後方の縁への強膜及び平面部に通した。当該注射針を、中央のガラス体中へのレンズ後方へ導いた。検査品目をガラス体中へゆっくり注入した。ピンセットは、注射針の回収前にシリンジに巻き付く結膜をつかむために使用した。結膜がピンセットでつかまれる間に、短時間で注射針を回収した。瞼鏡をその後取り外した。投与後迅速に、任意の視認できる投与後の問題を同定するために、間接的な検眼鏡により眼を検査した。局所抗生物質Tobrex登録商標又は相当物は、感染予防のために、投与後迅速に、及び投与1日経過後に、それぞれの眼に投与することができる。当該動物は麻酔から十分に回復した時、ケージに戻された。以下の表中のスケジュールに基づき1週間投与した:示されたグラム投薬量レベルは、個々の眼のためのものである。平均2mlの眼容量と考え、片目ごとの投与量は、~150μgmlM200、及び~50μgmlF200であった。両ケースともM200又はF200のモル濃度はlμMであった。D新脈管形成阻害のモニタリング間接的な検眼鏡検査は、後眼房を検査するために使用され、そして生体鏡検査は、眼の前部セグメントを検査するために使用された。眼は標準の手順RobertBHackett及びTOMcDonald1996Dermatotoxicology第5版EdByFBMarzulli及びHIMaibachHemispherePublishingCorpWashingtonDCを用いて記録された。フルオレセイン血管造影法は、病変形成の前、並びに5、12、19及び26日に続けて起こる病変時、そして治療開始時に実施した。ケタミン及びジアゼパムの組合せ物は、鎮静の維持を与えることができる。目蓋鏡は目蓋を収縮させるために使用した。フルオレセイン染料の投与前、それぞれの動物を、撮影を通して頭部の位置を維持するであろう眼科の椅子に配置した。眼底カメラを用いて撮影した。イメージをTOPCONIMAGEnetシステムを用いて取り込んだ。フルオレセイン染色を頭部又は伏在静脈を経由して注入した。CNV病変に関連したフルオレセインの漏れをモニターするために、動脈相を含む前期動静脈相及びいくかの後期動静脈相に染料注入を追跡するいくつかの時点で、カラー及び黒白写真を撮影した。未変化のイメージは記憶及び持ち運びのためにコンパクトディスクへ移転することができる。更に、眼を写真に撮ってよい。動物は本手順の前に塩酸ケタミンにより軽度に鎮静化させてよく、そして散瞳させる溶液の数滴を、当該試験を促進させるためにそれぞれの眼の中に点眼した。E結果フルオレセイン血管造影イメージの分析は、13日及び20日のCNVの存在を明確に示すそれらの群を使用することにより産出した。CNVは、コントロール群中及び5で28日まで持続した。対照的に、当該CNVはM200及びF200で処置された眼及び5において著しく減少した。図19において見られるように、20日でのM200で処置した眼はコントロールのみで処置された眼と比較してCNVの徴候が殆ど見られなかった。図2025は、個々のサルの右眼におけるNCV上でのM200及びF200の効果を、同じサルの左眼と13日、20日及び27日で比較した効果を示す。CNVの著しい減少が、未処置の眼と比較して、M200又はF200のいずれかで処置された個々の眼中で観察された。CNV中の相対的な減少は、F200により処理された個体の中でより大きくなると思われる。しかしながら、この明白な相違は個体の未処置の左目中へ血流を通すM200の漏れのためであると信じられている。すなわち、個々の右眼におけるM200処置は、左眼中のCNVも阻害し、両眼間での明白な相違がより少なくなる結果をもたらす。対照的に、未処置の眼を通して漏れないM200は、固体の両眼間でのCNV阻害に更に大きな相違をもたらす。M200、F200及びヒト化変異体の結合アフィニティーA表面プラスモン共鳴による動力学的分析AABlB2Fc及びIIA1、M200又はF200の間のアフィニティーは、BIAcore3000及び2000を用いて分析された。IIA1、M200又はF200は標準的なアミンカップリングキットを用いてPioneerF1チップ上に固定された。表面プラスモン共鳴は24°Cで50ul分の流動比率で測定した。AABlB2Fcの注入は、180秒かけて行う。その後3時間解離をモニターした。結合動力学はBIA評価プログラムを用いて、5つの異なる検体の濃度で獲得されたデータから計算した。2重の参照は、コントロールのみ、参照の表面及び緩衝剤からの応答を除去するために適用した。KDは検体の一連の濃度からのセンサーグラムの会合及び解離相を同時に適合させることにより得られた。M200KDが0367±0132nMになるように決定した。F200KDが0332±0065nMとなるように決定した。B競合ELISAアッセイによるHuM200アフィニティーELISA結合競合アッセイは、IIA1及びM200を比較したHuM200の結合アフィニティーを決定するために実施してよい。96ウェルELISAプレートのウェルは、4°Cで一晩かけて02M炭酸ナトリウム炭酸水素ナトリウム緩衝剤中において10μgml組換え可溶性組換えヒトα5β1インテグリンFc融合タンパク質の100μlで覆った。洗浄緩衝剤で洗浄した後、ウェルを30分間200μlのSuperblockBlockingBufferで遮断し、そしてその後、洗浄緩衝剤で洗浄した。ELISA緩衝剤中のビオチン化したネズミIIA1及び競合抗体の混合物をウェルごとに100μlの最終容積中でELISAプレートに適用させた。ELISAプレートを1時間室温で培養し、そして当該ウェルを洗浄緩衝剤で洗浄した。その後、ELISA緩衝剤中で100μlの11000希釈したHRPを接合させたストレプトアビジンをそれぞれのウェルへ適用させた。05時間、室温で培養した後、洗浄緩衝剤で洗浄し、100μlのTMB基質をそれぞれのウェルに付加した。吸着をVERSAmaxマイクロプレートリーダーを用いて450nmで読んだ。反応中における最終競合濃度は、450nmでの吸着に対比させてプロットした。HuM200は、図13に見られるように重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む。HuM200はIgG4由来の不変領域を含む。M200、HuM200g2m3Gの第二のヒト化バージョンはHuM200と同一の可変ドメインを含むが、IgG2の不変領域を含む。図26において見られるように、M200抗体、HuM200G4及びHuM200g2m3Gの2つのヒト化バージョンは、M200とほぼ同一の結合アフィニティーカーブを見せる。更に、HuM200G4及びHuM200g2m3Gは、それぞれ1318μgml及び1028μgmlのIC50値を有す。これらの数値はM200のために観察されたものと比較することができ、そしてIIA1よりも軽度に高い。