"Fc媒介性エフェクタ機能が欠損している修飾されたFc領域を有する、IgG1型の抗huTNFR1抗体。該Fc領域が、該エフェクタ機能を下方制御するための突然変異を含む、請求項1に記載の抗体。該Fc領域が、該エフェクタ機能を下方制御するために糖鎖工学処理されている、請求項1または2に記載の抗体。該Fc領域が、E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330SおよびP331Sからなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を有する重鎖を含む、請求項1~3のいずれかに記載の抗体。huTNFR1の膜遠位CRD1と、CRD2のサブドメインA1とを含むエピトープに特異的に結合する、請求項1~4のいずれかに記載の抗体。huTNFR1のN末端領域のアミノ酸1~70によって表わされるエピトープに特異的に結合する、請求項1~5のいずれかに記載の抗体。該H398抗体によって認識される該エピトープに特異的に結合する、請求項1~6のいずれかに記載の抗体。少なくとも2つの結合部位によってhuTNFR1に特異的に結合する、請求項1~7のいずれかに記載の抗体。ヒト化H398抗体である、請求項1~8のいずれかに記載の抗体。請求項1~9のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬品。組換え型哺乳類発現系を用いる請求項1~9のいずれかに記載の抗体の産生方法。CHO産生細胞株を用いる、請求項11に記載の方法。抗TNF治療薬での治療に代わるものとして、作動性TNFR1シグナル伝達複合体を形成することなくTNF拮抗薬として使用されるIgG1型の抗huTNFR1抗体。抗TNFまたは非生物学的DMARD治療薬が失敗した場合の二次治療としての請求項13に記載の使用のための抗体。自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、鬱血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、脳卒中、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの急性および慢性神経変性疾患、または癌を治療する際に使用される、請求項13または14に記載の使用のための抗体。本発明によれば、TNFR2に結合するような交差反応を生じることなくヒトTNFR1を標的とする抗体を産生した。TNFR1の選択的阻害により、TNFR2によって媒介される有利な免疫応答を維持しながら、TNFの炎症誘発活性または炎症性応答を中和する有利な状況が得られる。具体的には、huTNFR1を標的とする全長ヒト化IgG1抗体ここではATROSABと呼ぶを調製した。Fc媒介性エフェクタ機能およびそれぞれの細胞傷害性を回避するために、ADCCおよびCDCが欠損した重鎖を使用した。従って、本発明に係る抗体によって、TNFのTNFR2への結合の阻害またはFc媒介性細胞傷害性などの望ましくない副作用を回避することができる。ATROSABは、哺乳類細胞で産生し、親マウスH398IgGに類似した結合および中和挙動を示した。しかし、驚くべきことに、そのような全長抗体で予測されていた作動活性は全く認められなかった。抗TNFR1抗体、特にhtf-9抗体は、これまで、二価の結合および架橋性によりTNFR1シグナル機能を活性化する作動活性を有していると言われてきた。従って、下方制御されたFcエフェクタ機能を有するIgG1型の抗huTNFR1抗体はいずれもそのような作動活性を示さないということは予測されていなかった。上記仮定とは対照的に、H398抗体は、そのような望ましくないTNFR1作動活性が欠如していることが分かった。従って、驚くべきことだが、Fc受容体を介して抗体分子のFc部分に導かれる免疫エフェクタ細胞によって媒介されるTNFR1シグナル伝達または細胞傷害性を活性化することで誘発されるような副作用を伴わないTNF拮抗薬として本発明の抗体を使用することができる。本明細書に使用されているIgG1型の抗体という用語は、抗体がIgG1Fc領域を含む限り、天然抗体、突然変異抗体および半合成抗体などの抗原に結合することができるあらゆる種類の抗体を指すものとする。上記用語は具体的には、重鎖によって決定される構造、具体的にはIgG1Fc領域、好ましくはヒトFcフラグメント、各変異体およびそれらの誘導体などを有するIgG1型の抗体を指すものとする。具体的な態様は、全長IgG1抗体またはIgG1Fc領域を含む抗体ドメインの組み合わせを指す。具体的な構築物の中には、Fc領域などの抗体定常領域と組み合わせられた可変領域dAb、Fd、Vλ、Vκ、VH、VHHなどの重鎖および軽鎖のドメインのように、抗原結合機能を有するあらゆる抗体可変領域がFc領域と組み合わせているものもある。IgG抗体は、4つのペプチド鎖からなる約150kDaの大きな分子である。上記抗体は、約50kDaの2つの重鎖と、約25kDaの2つの軽鎖を含み、よって、四量体の四次構造を呈している。2つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いにかつ軽鎖にそれぞれ結合している。得られた四量体は、一緒にY字型を形成する2つの部分を有する。二股部分の各端部は、抗原結合部位を含む。本発明の抗体を、二重もしくは多重特異的結合または二価もしくは多価結合のために修飾してもよく、本発明に係る抗体では、抗原のエピトープのために、好ましくは少なくとも2つ以上、例えば、少なくとも3つもしくは4つの特異的結合部位が得られる。本発明に係る好ましい二価の抗体は、好ましくは抗体可変領域VH/VLによって形成された2つの結合部位によってTNFR1に結合する。本発明に従って使用されるFc領域という用語は、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と通常相互作用する抗体の尾部領域を指す。この特性により、抗体は免疫系を活性化することができる。IgG1では、Fc領域は、抗体の2つの重鎖の第2CH2および第3CH3の定常領域に由来する2つの同一のタンパク質フラグメントで構成されている。IgGのFc領域は、高度に保存されたN-結合型グリコシル化部位を有する。この部位に結合されるN-結合型糖鎖は主に、複合型の二分岐フコシル化コア構造である。さらに、少量のこれらのN-結合型糖鎖は、バイセクティングGlcNAcおよびα-2,6結合したシアル酸残基も有する。本発明に係る抗体をマウスの抗体などの齧歯類の抗体として提供することもできるが、ヒトの患者で使用されるキメラ抗体を含むヒトもしくはヒト化抗体を提供することが好ましい。抗体が所望の抗原に結合する限り、抗体のヒト化技術に関して制限はない。ヒト化の例としては、相補性決定領域移植CDR移植、特異性決定残基移植SDR移植、可変領域の表面再建、構造に基づく選択およびCDR移植によるヒト化、ならびに脱免疫化戦略20が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用されているヒト化抗体という表現は、タンパク質工学を使用して、例えば齧歯類の抗体の定常領域および/または可変領域のフレームワークまたはフレームワーク残基をヒト抗体に存在する配列と交換することによって外来の非ヒトタンパク質配列の量を減少させたあらゆる抗体を意味する。本発明の具体的な態様では、本発明に係る抗体は、ヒト由来のアミノ酸配列と非ヒト例えば齧歯類由来のアミノ酸配列とを含むヒト化抗体である。好ましい態様では、本発明の抗体またはFc領域は、例えば組換え型核酸技術によって得られるヒト化抗体に由来している。この点に関しては、本抗体またはその少なくとも1つのフラグメントは、huTNFR1との相互作用に対して悪影響を有しない限り、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸または核酸などの1つ以上の突然変異体または変異体を含んでもよい。さらに、本抗体は、huTNFR1の相互作用に対して好ましい効果を有し、かつ前記分子の拮抗活性を高める付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸または核酸などの1つ以上の突然変異体または変異体を含んでもよい。特に、そのような突然変異された変異体は、良好な親和性および/または良好な阻害活性を有する。例えば、本抗体は、マウス抗体H398と同じ結合特異性を有するヒト化抗体であってもよく、また、そのような親抗体に由来していることが好ましい。結合特異性は同じであることが好ましいが、微細特異性は、ヒト化または他の突然変異技術により変えてもよい。一例によれば、TNFR1中和活性を呈するマウス抗ヒトTNFR1モノクローナル抗体H398をヒト化させた。このヒト化抗体は、Fc媒介性エフェクタ機能が欠損している修飾されたFc領域を含むIgG1分子ATROSABに転換されている。CHO細胞で産生した精製ATROSABは、親マウス抗体H398と同じ親和性により、ヒトおよびアカゲザルTNFR1-Fc融合タンパク質ならびに組換え型TNFR1融合タンパク質が形質移入されたマウス胎児線維芽細胞に対して強い結合を示した。キメラのヒト/マウスTNFR1分子を用いて、ATROSABのエピトープを、第1のシステインリッチドメインCRD1と、CRD2のA1サブドメインとを含むN末端領域アミノ酸残基1~70でマッピングした。生体外では、ATROSABは、アポトーシス誘導ならびにIL-6およびIL-8産生などのNFκB依存性遺伝子発現の活性化のような典型的なTNF媒介性応答を効果的に阻害した。さらに、ATROSABは、TNFのTNFR1への結合を模倣せず、よって、TNFの非存在下でHeLaまたはHT1080細胞による望ましくないサイトカイン発現および放出を惹起しないことが分かった。さらに、ヒトの末梢血T細胞および顆粒球に対するATROSABの作動活性は、T細胞活性化および酸素産生それぞれのTNF依存性細胞応答モデルでは認めることができなかった。本発明の最も好ましい抗体が、本質的にhuTNFR1の少なくとも膜遠位CRD1とCDR2のサブドメインA1とを含むかそれらからなるエピトープに結合することが分かった。具体的な態様では、本発明に係るhuTNFR1抗体は、huTNFR1への結合を与える、例えば配列番号1~6またはそれらの一部からなる群から選択される国際公開第2008/113515号に記載されているようなH398の1つ以上の相補性決定領域CDRを含む。配列番号1~6のCDRは任意の組み合わせで存在していてもよく、前記CDRの例えば2つ、3つ、4つ、5つまたは6つが存在していてもよい。さらに、本発明のhuTNFR1抗体がヒトTNFR1に対する十分な親和性を示す限り、CDRのいずれかの複数のコピーまたは遺伝的変異体が本抗体中に存在していてもよい。具体的な態様によれば、本発明のhuTNFR1抗体は、重鎖VHの可変領域として配列番号7に係るアミノ酸配列と、軽鎖VLの可変領域として配列番号8に係るアミノ酸配列とを含む。配列番号1~8は以下のとおりである:配列番号1:CDR1GlyTyrThrPheThrAspPheTyrIleAsn配列番号2:CDR2TrpIleGlyGluIleTyrProTyrSerGlyHisAlaTyrTyrAsnGluLysPheLysAla配列番号3:CDR3TrpAspPheLeuAspTyr配列番号4:CDR4ArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuHisTrpTyr配列番号5:CDR5LeuLeuIleTyrThrValSerAsnArgPheSer配列番号6:CDR6SerGlnSerThrHisValProTyrThr配列番号7:VHGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySerSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspPheTyrIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyGluIleTyrProTyrSerGlyHisAlaTyrTyrAsnGluLysPheLysAlaArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgTrpAspPheLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSer配列番号8:VLAspIleValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrProGlyGluProAlaSerIleSerCysArgSerSerGlnSerLeuLeuHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuHisTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSerProGlnLeuLeuIleTyrThrValSerAsnArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysSerGlnSerThrHisValProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArg本発明のさらに別の態様では、huTNFR1抗体は、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む。huTNFR1抗体のhuTNFR1への結合またはヒトに投与された場合の免疫原性応答に対して悪影響が全くないか容認できるものである限り、本発明で使用可能なタグに関して特定の制限はない。好適なタグの例としては、Hisタグ、Mycタグ、FLAGタグ、Strepタグ、カルモジュリンタグ、GSTタグ、MBPタグおよびSタグが挙げられる。抗体またはFc分子の誘導体とは、本明細書では、1種以上のペプチド、ポリペプチドまたは抗体ドメインなどのタンパク質ドメインとの任意の組み合わせ、および/または本発明の抗体のあらゆるドメインが任意の位置で1種以上の他のタンパク質他の抗体または抗体ドメイン、リガンド、酵素および毒素などと結合もしくは融合し得る融合タンパク質として理解される。また、本発明の抗体の誘導体を、共有結合、静電的相互作用、ジスルフィド結合などの各種化学的手法によって他の物質に会合もしくは結合させることによって得てもよい。抗体に結合させる他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはそれらの任意の組み合わせ例えば、PEG、プロドラッグまたは薬物であってもよい。また、誘導体は、相同なアミノ酸配列を有する抗体を含んでいてもよく、そのアミノ酸配列は、非天然もしくは化学修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。さらなる誘導体は、抗体フラグメントまたは変異体として提供される。本明細書に使用されている抗体フラグメントという用語は、所望の抗原huTNFR1の結合部位に結合する能力を有する限り、上に定義した抗体の任意の部分を意味する。さらに、本発明に係る抗体フラグメントは、前記抗体からのいくつかの異なる部分を含み、いずれの場合もFc領域を含む。変異体という用語は、特に、欠失、置換するか挿入断片を特異的抗体領域、好ましくは定常領域内に挿入して抗体エフェクタ機能または半減期を操作するか、例えば親和性成熟法によって挿入断片を可変領域内に挿入して抗原結合特性を向上させるような、例えば部位特異的変異誘発法によって得られた突然変異体を指すものとする。例えばランダム化法によって得られる所望の位置での点突然変異を含む公知の突然変異誘発法のいずれかを用いてもよい。場合によっては、例えば、任意の可能なアミノ酸または好ましいアミノ酸の選択のいずれか一方により位置をランダムに選択して、抗体配列をランダム化する。変異体という用語は具体的には、機能的に活性な変異体を指す。本明細書に使用されている抗体などの分子の機能的に活性な変異体という用語は、配列中あるいは配列の両端のいずれか一方もしくは両方における1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失または置換によってこの配列の修飾から得られる配列であって、その修飾により、この配列の活性が影響を受けない特に損なわれない配列を意味する。選択された標的抗原に対して特異性を有する結合部位の場合、例えば、特異的エピトープに対する微細特異性、親和性、結合活性、KonもしくはKoff速度などを変更するように、分子の機能的に活性な変異体が変更されている可能性はあるが、所定の結合特異性をなお有しているであろう。好ましい態様では、機能的に活性な変異体は、a当該分子の生物学的に活性なフラグメントであり、当該フラグメントは、当該分子の配列の少なくとも50、好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、なおより好ましくは少なくとも90、さらにより好ましくは少なくとも95、最も好ましくは少なくとも97、98または99を含み、b少なくとも1つのアミノ酸の置換、付加および/または欠失によって当該分子に由来しており、ここで、機能的に活性な変異体は、当該分子またはその一部に対して配列同一性を有し、例えば、抗体の少なくとも50、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、なおより好ましくは少なくとも90、さらにより好ましくは少なくとも95、最も好ましくは少なくとも97、98または99の配列同一性を有し、かつ/またはc当該分子またはその機能的に活性な変異体と、さらに当該ポリペプチドもしくはヌクレオチド配列に相同でない少なくとも1つのアミノ酸またはヌクレオチドとからなり、好ましくは、ここでは、機能的に活性なFc変異体は、ヒトIgGFcの天然に生じる変異体のいずれかに由来している配列番号9:TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK機能的に活性なFc変異体は、上記配列を変えることによって得てもよく、かつ抗体を安定化させるか長期の半減期を与える能力などの各配列によって呈されるものに類似した生物学的活性を有することを特徴とする。本発明に係る抗体で使用される好ましいFc変異体は、Fcエフェクタ機能を低下させるための突然変異体を含む。機能的に活性な変異体は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列の配列変更によって得てもよく、ここで、本発明の組み合わせで使用される場合、配列変更は、変更されていないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持している。そのような配列変更としては、保存的置換、付加、欠失、突然変異および挿入を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一態様では、本発明に係る抗体の機能的に活性な変異体は、本質的に上記変異体と同一であるが、異なる生物種の相同な配列に由来しているという点でそのポリペプチドまたはヌクレオチド配列とはそれぞれ異なる。これらを天然に生じる変異体ともいう。機能的に活性な変異体という用語は、天然に生じる対立遺伝子変異体ならびに突然変異体または任意の他の天然に生じない変異体も含む。当該技術分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、本質的にポリペプチドの生物学的機能を変えない1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することを特徴とするポリペプチドの代替形態である。保存的置換は、それらの側鎖および化学的特性に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、無電荷の極性側鎖、小さな側鎖、大きな側鎖などを有するアミノ酸である。本明細書で同定されているポリペプチド配列に関するアミノ酸配列の同一性の割合は、必要であれば配列同一性の最大の割合を達成するために、どのような保存的置換も配列同一性の一部としてみなさずに、配列をアライメントし、かつギャップを導入した後の特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じ候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義する。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要なあらゆるアルゴリズムを含むアライメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。本明細書に使用されている特異的に結合するまたは特異的結合という用語は、異種な分子集団の中で目的の同族リガンドを決定するような結合反応を指す。従って、指定された条件例えば、免疫学的測定法の条件で、本発明に係る抗体は、その特定の標的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。特異的結合は、標的の同一性あるいは選択されるような高度、中度もしくは程度の結合親和性または結合活性に関して結合が選択的であることを意味する。選択的もしくは特異的結合は通常、結合定数または結合動態が少なくとも10倍異なり、好ましくは差異が少なくとも100倍であり、より好ましくは少なくとも1000倍である場合に達成される。抗体またはFc領域という用語は、具体的には、不十分なFc受容体結合特性を有するそれらの突然変異体または機能的に活性な変異体、例えば、糖鎖工学処理されたFc領域または下方制御されたエフェクタ機能および/または長期の半減期を有するものを含むものとする。本発明の目的のために使用されているエフェクタ機能という用語は、抗体のFc領域に結合するエフェクタリガンドによって媒介される効果を意味するものとする。例示的なエフェクタリガンドは、免疫グロブリンに結合するFc受容体またはFc受容体様分子である。Fc受容体は、免疫系の保護機能に寄与するナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球および肥満細胞などの特定の細胞の表面に存在するタンパク質である。それらが認識する抗体の種類に基づいて分類されるいくつかの異なる種類のFc受容体が存在し、最も一般的なクラスの抗体であるIgGに結合するものは、Fcγ受容体FcγRまたはFcgRと呼ばれている。FcγRファミリーには、いくつかのメンバー:FcγRICD64、FcγRIIACD32a、FcγRIIBCD32b、FcγRIIIACD16a、FcγRIIIBCD16bが含まれる。エフェクタ分子の中には、C1qなどの補体タンパク質も含まれる。別のFc受容体、胎児性Fc受容体FcRnもIgGに結合し、この抗体の保存および半減期に関わる。本発明によれば、FcRnによって媒介される機能が下方制御されていないことが好ましい。下方制御するという用語は、核酸またはポリペプチドなどの遺伝子発現産物の遺伝子発現もしくは活性の遺伝子突然変異もしくは下方制御により、具体的には、少なくとも部分的にエフェクタリガンドなどのリガンドの結合阻害を含む、親和性、結合活性または特異性のような結合特性の減少により、遺伝子もしくは遺伝子群またはポリペプチドによって媒介される効果の減少を指すものとする。それにより、ADCCおよび/またはCDCの減少を呈する抗体を得ることができる。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害ADCCは、結合された抗体の定常領域を認識するFc受容体を有する細胞によって抗体被覆された標的細胞を死滅させることである。大部分のADCCは、それらの表面にFc受容体FcgRIIIすなわちCD16を有するNK細胞によって媒介される。典型的なアッセイでは、新しく単離したエフェクタ細胞の添加前に連続希釈した抗体と共にインキュベートしたRamos細胞のような標的細胞を用いる。次いで、ADCCアッセイ試料をさらに数時間インキュベートし、細胞傷害率を検出する。通常、標的:エフェクタの比は、約1:16であるが、1:1~1:50であってもよい。補体依存性細胞傷害CDCは、標的細胞表面に結合した抗体が補体を固定し、それにより膜侵襲複合体が形成され、それが標的細胞膜に穴を作り、その後に細胞溶解が生じるという、細胞を死滅させる機序である。一般に使用されるCDCアッセイでは、ADCC測定と同じ手順に従うが、エフェクタ細胞の代わりに血清を含有する補体を用いる。本発明に係る抗体は、Fc媒介性エフェクタ機能が欠損しているFc領域と、好ましくは対照と比べて細胞溶解率を有意に減少させるように、好ましくはADCCおよびCDCアッセイのうちのいずれか一方で測定される下方制御された細胞傷害活性とを有する。絶対減少率は、好ましくは10超、より好ましくは20超、さらにより好ましくは30、40、50、60、70、80、90超である。最も好ましくは、本抗体は、ADCCまたはCDC活性のうちの少なくとも1つを本質的に含まず、例えば、自然の未修飾の抗体と比べて10未満の典型的なADCCおよび/またはCDC活性を有する。本明細書に使用されている本質的に含まないという用語は、標準的なアッセイで測定されるそのような活性が完全に欠如しているそれらの抗体の変異体も指すものとする。エフェクタ機能を効果的に下方制御するためのFc領域内の特異的点突然変異は当該技術分野でよく知られている。特に好ましい突然変異を、異なるFcγ受容体FcgRのためのヒトIgG上の結合部位領域に用い、それによりFcgRによる免疫増強を抑止する。FcgRのためのヒトおよびマウスのIgG上の結合部位を、最初にIgG残基233~239からなる下部のヒンジ領域に対してマッピングした。さらに広い区域、例えばGly316~Lys338をヒトFcγRIにのために、Lys274~Arg301およびTyr407~Arg416をヒトFcγRIIIのために測定した。ヒトFcγRIIIAとのヒトIgG1Fcフラグメントの3.2オングストロームの結晶構造は、IgG1残基Leu234~Ser239、Asp265~Glu269、Asn297~Thr299およびAla327~Ile332がFcγRIIIAへの結合に関与していることを詳細に示していた。ヒトFcγR受容体FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAのためのヒトIgG1の高解像度マッピングに関する概説は、Shieldsら6591604Epub2000Nov28によって提供されている。本明細書に使用されている点突然変異という用語は、単一の塩基ヌクレオチドが遺伝物質DNAまたはRNAの別のヌクレオチドと置換されている単一の塩基置換を指すものとする。本発明に係る抗体のアミノ酸配列の全ての番号付けは、KabatのEUインデックスに従っている。本発明に従って使用されているFc領域は、特異的突然変異または発現系の選択に応じて、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体配列またはFc領域に関する糖鎖工学処理されたという用語は、糖鎖工学により修飾されたADCCおよび/またはCDCを有するグリコシル化変異体を指すものとする。全ての抗体は、重鎖定常領域の保存された位置に炭水化物構造を含み、各アイソタイプは、N-結合型炭水化物構造の異なる配列を有し、これは、タンパク質集合、分泌または機能活性に可変的に影響を与える。IgG1型抗体は、各CH2ドメイン内のAsn297に保存されたN-結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Asn297に結合した2つの複合型二分岐オリゴ糖は、CH2ドメイン間に埋没されており、ポリペプチド骨格との広範囲な接触を形成し、それらの存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害ADCCなどのエフェクタ機能を媒介するのに不可欠である。例えばN297を例えばAもしくはT299に突然変異させることによりN297のN-結合型糖鎖を除去すると、典型的に、ADCCが減少したグリコシル化Fcが生じる。抗体グリコシル化での主な差異は細胞株間で生じ、さらに僅かな差異は、異なる培養条件で培養された所与の細胞株で認められる。細菌性細胞中での発現により、典型的には、本質的にADCCおよび/またはCDC活性を有しないグリコシル化抗体が得られる。本発明に係る抗体を、例えば、有機分子、酵素標識、放射性標識、有色標識、蛍光標識、発色標識、発光性標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド金およびそれらの混合物からなる群から選択される標識またはリポーター分子に結合することが好ましい。例えばアッセイシステムまたは診断方法で、標識またはリポーター分子に結合した抗体を使用してもよい。本発明に係る抗体を、例えば、結合アッセイ例えばELISAおよび結合試験で、結合体を簡単に検出することができる他の分子に結合してもよい。本発明に係る抗体の産生および特性評価方法は、当該技術分野でよく知られている。好ましい態様では、抗体変異体を産生し、かつhuTNFR1を発現する細胞を用いる1種以上の細胞系アッセイまたは生体内アッセイを用いて、所定の特性についてスクリーニングする。そのようなアッセイでは、拮抗活性および作動活性を測定するために、例えばTNFαの存在および非存在下で細胞を結合することができるように、通常は本抗体を外から加える。これらのアッセイは、典型的に免疫グロブリンの機能に基づいており、すなわち、抗体がhuTNFR1に結合し、かつ、例えば競合的結合アッセイにおけるTNFαの前記細胞への結合の遮断、TNF/受容体結合の阻害、TNF具体的にはIL6またはIL8などの炎症性インターロイキンの存在または非存在下でのサイトカイン発現の減少およびアポトーシスなどのいくつかの生化学的事象を媒介する能力に基づいている。そのようなアッセイでは、抗体への細胞応答、例えば、細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、あるいは天然遺伝子またはリポーター遺伝子の細胞発現などの転写活性化を監視することが多い。いくつかのアッセイでは、さらなる細胞もしくは成分すなわち標的細胞に加えて、例えば血清補体、または末梢血単球PBMC、NK細胞およびマクロファージなどのエフェクタ細胞を加える。そのようなさらなる細胞は、任意の生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルに由来していてもよい。細胞死または生存率の監視方法は、当該技術分野で知られており、色素、免疫化学的試薬、細胞化学的試薬および放射性試薬の使用が挙げられる。例えば、カスパーゼ染色アッセイにより、アポトーシスが測定でき、放射性基質またはアラマーブルーなどの蛍光色素の取り込みまたは放出により、細胞の増殖または活性化が監視できるようにしてもよい。また、細胞系アッセイでは、機能をアッセイするための方法として転写活性化を利用してもよい。この場合、上方制御され得る天然遺伝子または免疫グロブリンをアッセイすることにより応答を監視してもよく、例えば、特定のインターロイキンの放出を測定してもよく、あるいは、読み出しは、レポーター構築物によるものであってもよい。細胞系アッセイでは、本発明に係る抗体の存在に対する応答として細胞の形態学的変化を測定することもある。本発明の抗体は、望ましくない炎症性応答、アポトーシスおよび壊死を生じさせ得るTNFαの血中濃度の上昇によって引き起こされる炎症反応を減少させるTNF拮抗活性を有することが好ましい。好ましい抗体は、例えば、以下の例によってさらに説明する試験システムによって、最大半値の飽和濃度のTNF、好ましくは1~100nMの範囲のTNFを用いる細胞系アッセイで測定されるような、100nM未満、好ましくは20nM未満、より好ましくは10nM未満、最も好ましくは一桁のナノモルの範囲内のIC50に相当する拮抗活性を有する。TNF様作動活性を、同じ細胞系アッセイであるが、例えば以下の例によってさらに説明する試験システムにより、TNFを用いずに測定することが好ましい。本発明の抗体は、TNFの非存在下でHeLaもしくはHT1080細胞をインキュベートすると、サイトカインが僅かにのみ誘発され、例えば、少なくとも5nMまたは約10nMの濃度で、IL6もしくはIL8レベルが0.5ng/ml未満で上昇する場合に、有意な作動活性を有していないものとすることが好ましい。好ましくは、サイトカイン産生が僅かであるかマイナスであり、それを10pg/105細胞未満の量で測定することができる。好ましい例では、サイトカインの発現および放出は、18時間で2.5pg/100,000細胞未満である。従って、好ましくは、作動活性が、比較され得るTNF濃度の応答の10未満、好ましくは同等のTNF応答の5未満である。本発明に係る例示的な抗体は、IL6またはIL8などの炎症性サイトカインの発現または放出を惹起しないことが特に証明された。それにより、望ましくない炎症性疾患または組織損傷を回避することができる。さらに、Fcエフェクタ機能によって引き起こされる望ましくない細胞傷害性を最小限まで減少させる。そのような副反応の減少は、慢性疾患を治療するための医薬品を提供する上で特に有用である。本発明の抗体は、例えば大腸菌の細胞膜周辺腔での発現によって、あるいは酵母または哺乳類などの真核生物発現系における例えば、CHO、HEKまたはヒト産生宿主細胞株による分泌タンパク質としての発現によって、宿主細胞を用いる組換え型発現系により産生される組換え型タンパク質として提供されることが好ましい。発現系という用語は、それらの配列で形質転換されたかそれらが形質移入された宿主がコード化タンパク質を産生することができるように機能可能に連結した所望のコード配列および対照配列を含む核酸分子を指す。形質転換を達成するために、当該発現系をベクターに含めてもよいが、関連するDNAを宿主染色体の中に組み込んでもよい。あるいは、生体外での転写/翻訳のために発現系を使用することができる。チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞は、抗体産生のために最も一般的に使用されている。好適なグリコシル化パターンを提供するだけでなく、これらの細胞により、遺伝的に安定で、非常に生産的なクローン細胞株の一貫した産生が可能となる。それらは、無血清媒体を用いて単純なバイオリアクターで高密度に培養することができ、安全かつ再現可能なバイオプロセスの開発を可能にする。無血清条件で、任意に動物由来のどのようなタンパク質/ペプチドも含まない培地で、株化、順化および完全培養される場合、宿主細胞が最も好ましい。本発明に係る好ましい医薬組成物は、治療的有効量の上に定義したhuTNFR1抗体と、任意に、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される塩、補助剤、安定化剤、希釈剤および溶媒またそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1種以上のさらなる成分とを含む。本発明によれば、患者の治療方法は、治療的有効量の上に定義したhuTNFR1抗体を、それを必要としている患者に投与する工程を含む。治療的有効量は、典型的に0.5~500mg、好ましくは1~400mgの範囲、さらにより好ましくは最大300mg、最大200mg、最大100mgまたは最大10mgであるが、例えば急性疾患状態を治療するために、より高い用量を指示してもよい。一態様では、本発明に係る抗体は、患者に投与されると治療的に活性となる薬剤である。あるいは、本発明に係る抗体は、限定されるものではないが、TNFα拮抗薬、抗炎症薬、サイトカイン、増殖因子または他の治療薬などの1種以上の他の治療薬と併用投与される。TNF拮抗性抗体を、1種以上の他の治療薬、好ましくは抗TNF抗体などの抗TNF治療薬と同時または連続的に投与してもよい。抗TNF治療薬が有効でなかった場合の二次治療として、急性もしくは慢性的治療のうちのいずれか一方として、本発明の抗体を患者に投与することが好ましい。特に好ましい医学的使用は、慢性疾患の治療のための使用である。好ましい適応症は典型的に、抗TNF治療薬の適応症に関するものであり、従来の抗TNF治療薬に代わるものとして本発明の抗体を使用する。具体的には、本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、若年性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、多発性硬化症、鬱血性心不全、代謝性疾患、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、脳卒中、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの急性および慢性神経変性疾患を治療するのに適している。さらなる適当な適応症としては、潰瘍性大腸炎および他の慢性炎症性および/または自己免疫疾患、急性劇症ウイルス性もしくは細菌性感染症、代謝性疾患、急性神経変性疾患、慢性神経変性疾患、原因となる病的メディエータとしてTNF/TNFR1を有する遺伝性疾患好ましくは周期症候群およびケルビム症から選択されるおよび癌が挙げられる。本発明の抗体および1種以上の治療的に活性な薬剤が製剤化される医薬組成物が想定される。本発明の抗体の好適な製剤は、所望の程度の純度を有する前記抗体を、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって貯蔵用に調製される。生体内投与のために使用される製剤は無菌である。これは、無菌濾過膜または他の方法による濾過によって、容易に達成される。また、免疫リポゾームとして、および/またはマイクロカプセルに封入して、本明細書に開示されている抗体および他の治療的に活性な薬剤を製剤化してもよい。好ましくは無菌水溶液の形態の本発明の抗体を含む医薬組成物を、限定されるものではないが、皮下、静脈内、経口、鼻腔内、耳内、経皮、粘膜、局所例えば、ゲル、軟膏、ローション、クリームなど、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸内または眼内投与などの様々な方法で投与してもよい。上記記載は、以下の実施例を参照することで、より完全に理解されるであろう。但し、そのような実施例は、本発明の1つ以上の態様を実施する方法の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。材料西洋ワサビペルオキシダーゼHRPに結合した抗マウスIgGFc特異的抗体、HRPに結合した抗ヒトIgG全分子、Fc特異的、Fab特異的抗体をそれぞれ、Sigma社タウフキルヘン、ドイツから購入した。PE標識した抗マウス全分子および抗ヒトIgGγ鎖特異的抗体をそれぞれ、Sigma社タウフキルヘン、ドイツから購入した。TNFR1-FasMEF-TNFR1-FasおよびTNFR2-FasMEF-TNFR2-Fasが形質移入されたマウス胚性線維芽細胞MEFをそれぞれ、RPMI1640培地5FCS、2mMのL-グルタミン、2μg/mlのピューロマイシンで培養した。ヒト横紋筋肉腫細胞株Kym-1を、RPMI1640培地10FCS、2mMのL-グルタミンで培養し、HT1080wt細胞およびHeLa細胞を、RPMI1640培地5FCS、2mMのL-グルタミンで培養した。IZI061IgGATROSABの産生CHO細胞での産生のために最適化されたIgκシグナル配列およびコドンを含む、ATROSABの軽鎖および重鎖をコードするDNAを、国際公開第2008/113515A2号の配列情報を用いて合成により産生したGeneart社、レーゲンスブルク、ドイツ。軽鎖LCDNAを、BamHI/NotIフラグメントとしてシャトルベクターpCV072Celonic社、ユーリッヒ、ドイツにクローン化し、重鎖HCDNAを、KasI/NheIフラグメントとしてpFUSEInvivoGen社、トゥールーズ、フランスにクローン化した。pFUSEによってコードされるFc領域を変化させて、正しい好ましいアロタイプG1m1,17E356D、M358L、G431Aを再構成した。pFUSE-HCをSmiISwaIで消化し、全HC発現カセットを含む得られた平滑末端フラグメントを、PsiIで消化したpCV072-LCにクローン化した。このバイシストロン性発現カセットでは、軽鎖はPhEF1-HTLVプロモータの制御下にあり、重鎖遺伝子はPCMVの増強プロモータによって制御される。安定に形質移入されたCHO細胞を、CDM4PermABThermoFischer社、エーレムボードヘム、ベルギーで培養し、大豆加水分解産物供給溶液KerryBioscience社、アルメレ、オランダを含む25LのウェーブバイオリアクターシステムSartoriusStedim社、メルズンゲン、ドイツで、流加モードで培養した。タンパク質AクロマトグラフィGEHealthcare社、ウプサラ、スエーデンと、次いでSartobindQsingleSepminiSartoriusStedim社、メルズンゲン、ドイツによる膜中間工程とを用いて、抗体を細胞培養上清から精製した。最終生成物を緩衝液交換工程によって得た。TNFR1-Fc融合タンパク質の産生UniProtKBSwiss-ProtエントリP19438ヒト学名:HomosapiensTNFR1の配列情報を用い、個々のドメイン間に適当な制限部位を導入して、pSecTagL1-FcpSecTag-FcHisから修飾、339908にクローン化して、ヒトTNFR1aa29~211、アカゲザルTNFR1aa27~209およびマウスTNFR1aa30~212の細胞外領域をコードするDNAを合成により産生したGeneart社、レーゲンスブルク、ドイツ。ヒトTNFR1-FcとマウスTNFR1-Fcとの間の異なる領域を交換して、キメラのヒト/マウスTNFR1-Fc融合タンパク質を産生した。リポフェクタミンInvitrogen社、カールスルーエ、ドイツを用いて、HEK293細胞にプラスミドDNAを形質移入し、MulleretalJBiolChem2821265060に記載されているように、ゼオシンの存在下で安定に形質移入されたクローンを選択した。細胞を、90の集密状態になるまで、RPMI5FCS、2mMのL-グルタミンで培養した。タンパク質の産生のために、培地をOptiMEMIInvitrogen社、カールスルーエ、ドイツで交換し、上清を3~4日毎に回収した。タンパク質Aクロマトグラフィにより、タンパク質を細胞培養上清から精製した。簡潔に言うと、上清を、1/10体積の1MのTrisHClpH8.0を添加してpH8に調整し、タンパク質AセファロースCL-4BカラムSigma社、タウフキルヘン、ドイツに充填した。結合されたタンパク質を、100mMのグリシンpH3.0で溶離し、1/10体積の1MのTrisHClpH8.0を添加して中和し、画分を含むタンパク質をPBSに対して透析した。タンパク質濃度を測光法で測定し、SDS-PAGEと、HRPに結合した抗IgGFc特異的抗体Sigma社、タウフキルヘン、ドイツを用いる免疫ブロット法で、純度を分析した。タンパク質の特性評価BioSuite商標250高解像度SEC5μmWaters社、エシュボルン、ドイツを用いるHPLCで、サイズ排除クロマトグラフィSECを行った。以下の標準的なタンパク質:アポフェリチン443kDa、β-アミラーゼ200kDa、ウシ血清アルブミン67kDa、炭酸脱水酵素29kDa、アプロチニン6.5kDaを使用した。親和性の測定抗体の親和性を、水晶振動子マイクロバランス法QCM、AttanaA100CFastシステム、ストックホルム、スエーデンで測定した。0.005Tween20のPBS溶液中で、25~35μl/分の流速で結合実験を行い、温度を20°Cに制御した。製造業者の手順書に従って、50μg/mlの濃度でアミン結合によりTNFR1-Fc融合タンパク質をAttanaカルボキシルセンサチップに化学的に固定すると、約200Hzのシグナルの増加周波数の変化が生じた。62.5~3.9nMの濃度で抗体を分析した濃度ごとに4回の測定。10mMのグリシン-HClpH3.0でチップを再生した。Attester評価での基準として使用するために、各試料注入前に緩衝液注入を行った。データをAttester3.0バージョン3.1.1.8、Attana社、ストックホルム、スエーデンで収集し、ClampXPMyszkaおよびMorton、1998で分析した。物質輸送モデルMyszka、1997をデータに当てはめた。ELISA組換え型ヒトTNFR1-Fc融合タンパク質を、96ウェルプレート50ng/ウェル、PBS溶液に4°Cで一晩固定した。2w/vの粉ミルク/PBSで2時間ブロッキングした後、組換え型抗体フラグメントを二つ組で滴定し、RTで1時間インキュベートした。TMB基質1mg/mlのTMB、酢酸ナトリウム緩衝液pH6.0、0.006のH2O2を用いて、HRPに結合した抗ヒトIgGFab特異的抗体およびHRPに結合した抗マウスIgGFc特異的で検出を行った。50μlの1MのH2SO4で反応を停止させた。ELISAリーダーで、吸光度を450nmで測定した。フローサイトメトリフローサイトメトリにより、TNFR1-FasまたはTNFR2-Fasが形質移入されたMEF細胞への結合を分析した。細胞2×105を連続希釈した抗体と共に4°Cで4時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、結合された抗体を、PEで標識したヤギの抗マウスもしくは抗ヒト抗体で検出した。細胞をフローサイトメトリCytomicsFC500、Beckman-Coulter社、クレーフェルト、ドイツで分析した。データを、WinMDIプログラムバージョン2.9で評価し、GraphPrismソフトウェアラホヤ、米国を用いて、3種類の独立した結合曲線を当てはめた。細胞傷害性Kym-1細胞1.5×104細胞/100μlを、96ウェルプレートで一晩培養した。培地で、抗体図に示されている濃度と共に三つ組で1時間プレインキュベートした後に、一定量のヒト可溶性TNFα培地に1.25ng/mlを加えた。7時間後、細胞をクリスタルバイオレット20メタノール、0.5クリスタルバイオレットで15分間染色した。ウェルをH2Oで洗浄し、空気乾燥した。染料をメタノールで15分間溶解し、550nmで光学濃度を測定したTecaninfiniteM200、クライルスハイム、ドイツ。IL-6およびIL-8アッセイHT1080細胞2.0×105細胞/100μlを、96ウェルプレートで一晩培養した。翌日、培地を交換して、構成的に産生されたIL-8を除去し、細胞を連続希釈したヒト可溶性TNFと共に二つ組でさらに18時間インキュベートした。製造業者の手順書に従って、IL-8サンドイッチELISAImmunoTools社、フリーゾイテ、ドイツにより、IL-8の産生および培養上清中への分泌の誘導を測定した。さらに、細胞を、TNFα一定の1ng/mlの存在下で連続希釈した抗体と共にインキュベートし、18時間インキュベートした後に、IL-8の分泌について分析した。同じ方法で、製造業者の手順書に従い、IL-6サンドイッチELISAImmunoTools社、フリーゾイテ、ドイツを用いて、HeLa細胞からのIL-6のTNF媒介性分泌に対する抗体の阻害効果を分析した。TNFの非存在下で作動活性を測定した。CDC活性:C1qへの結合標準的なC1q結合アッセイでも、ATROSABの作動活性の欠如を実証した。C1qは、補体活性化の古典経路のC1複合体の第1の亜成分であり、細胞溶解にも関与している。従って、化合物がC1qに結合することにより、補体活性化と、その後に細胞溶解が生じる。行った実験では、免疫グロブリンであるハーセプチントラスツズマブ、Roche社を陽性対照として使用し、免疫グロブリンG2aを陰性対照として使用した。ハーセプチンは、細胞溶解を誘導することが知られており、かつ転移性乳癌および胃癌の治療に使用されている。図11に示すように、ATROSABは、C1qに有意に結合せず、これは、本調査で比較物として使用した非選択的TNF受容体拮抗薬であるレミケードインフリキシマブ、Centocor社とは明らかに対照的である。これらの結果により、ATROSABは補体依存性細胞傷害性を誘導しないことが分かる。結果IZI061IgGATROSABの産生および結合活性エフェクタ機能が失われた重鎖InvivoGen社カリフォルニア州サンディエゴ製のIgG1e3工学処理済Fc;E233P/L234V/L235A/ΔG236およびA327G/A330S/P331S置換を含むヒトFc配列番号9の配列を有するhIgG1e3-Fc1配列を用いて、ヒト化抗ヒトTNFR1FabIZI061国際公開第2008/113515号をヒトIgG1に転換した。上記配列情報を、図9配列番号10~18に示す。この抗体ATROSABをCHO細胞で産生した。ATROSABの25L規模の産生を、ウェーブシステムにおいて、1200万細胞/mLを超える最大の細胞密度で15日間の期間にわたって行った。SDS-PAGE分析およびサイズ排除クロマトグラフィで、純度および完全性を確認した図1a、b。ATROSABは、ヒトIgG1Fc領域に融合したTNFR1の細胞外領域からなる組換え型ヒトTNFR1-Fcへの強い結合を示した図1c。親抗体であるH398は、ELISAで同じ結合を示した。ヒトFasの細胞内領域にそれぞれ融合したTNFR1およびTNFR2の細胞外領域からなる融合タンパク質TNFR1-Fas、TNFR2-Fasが形質移入されたマウス胚性線維芽細胞MEFを用いて、ATROSABのフローサイトメトリ分析により、TNFR1に対する選択性を確認した2774415563。このアッセイでは、結合は、MEF-TNFR1-Fasでのみ認められ、MEF-TNFR2-Fasでは認められなかった図2a、b。ATROSABのMEF-TNFR1-Fasへの結合は、抗体濃度の滴定によって示されているようにH398の結合に匹敵していた図2c。EC50値は、ATROSABおよびH398のどちらについても約0.1nMであった。次いで、組換え型マウスTNFR1-FcおよびアカゲザルTNFR1-Fc融合タンパク質について種特異性を調べた。ELISAでは、ヒトおよびアカゲザルTNFR1-Fcではこの2種類の抗体の結合が観察されたが、マウスTNFR1-Fcでは観察されなかった図3b。親和性の測定固定化TNFR1-Fcを用いた水晶振動子マイクロバランス法により、ATROSABのTNFR1に対する親和性を測定した。H398のヒトTNFR1-FcおよびアカゲザルTNFR1-Fcに対する親和性と同様に、ATROSABは、nM以下の親和性でヒトおよびアカゲザルTNFR1-Fcに結合した図4、表1。より早いKoff速度により、一価のscFvIZI061では、約10倍で減少した親和性が測定され、これは、ATROSABおよびH398の二量体TNFR1-Fc融合タンパク質への結合が結合活性効果による影響を受けることを示している。ATROSABの拮抗活性ATROSABは、Kym-1細胞のTNF誘導性アポトーシスを用量依存的に阻害した図5。このアッセイでは、90の細胞傷害性を生じさせるTNF濃度を使用した。約最大半値の細胞傷害性、すなわち55の生存細胞が、ATROSABでは60nM、H398では8nMでそれぞれ観察された。次いで、HeLa細胞からのIL-6とHT1080細胞からのIL-8のTNF誘導性分泌に対するATROSABの効果をそれぞれ調べた。TNFは、HeLa細胞からのIL-6の強い分泌を用量依存的に誘導し、4nMのTNF200ng/mlと共に18時間インキュベートした後に約700pg/mlのIL-6に到達した。同様に、TNFは、HT1080細胞からのIL-8の分泌を誘導し、4nMのTNFと共に18時間インキュベートした後に約7000pg/mlに到達した図6c、d。ATROSABおよびH398は、20pMのTNF1ng/mlによって用量依存的に誘導されるHeLa細胞からのIL-6およびHT1080細胞からのIL-8の放出を阻害した図6a、b。これらのアッセイでは、IL-6放出の阻害図6aおよびIL-8放出の阻害図6bのためのIC50値はそれぞれ、ATROSABでは60nM、H398では6nMであった。HeLa細胞またはHT1080細胞をTNFの非存在下でATROSABおよびH398のそれぞれと共にインキュベートすると、非常に狭い用量範囲でサイトカインの放出が僅かに誘導された。約10nMの濃度でのみ、比較され得るTNF濃度4nMで3~4.5の応答に相当するIL-6レベルの僅かな上昇が観察された未処理の細胞の15pg/mlに対して40~60pg/ml、すなわち25~45pg/mlの誘導。IL-8では、そのレベルが、未処理の細胞の80pg/mlから、抗体とのインキュベート後に、同等のTNF応答の約2に相当する約200pg/mlまで上昇した。陰性対照として含めたヒトIgGは、サイトカインの放出に対して全く効果を有していなかった。血漿中半減期CD1マウスへの単回用量の静脈内注射後に、ATROSABおよびH398の半減期を測定した。7日間の期間にわたって抗体の濃度をELISAで測定し、すなわち機能性抗体分子を検出した。どちらの抗体も、ATROSABでは10.5±2.8dn=2、H398では8.1±1.5dn=3の消失半減期で、血液からの類似した消失を示した図7。エピトープマッピングH398およびATROSABはマウスTNFR1に結合しないため、エピトープマッピングのためにドメイン交換戦略を適用した図8。これらのキメラTNFR1-Fc分子への結合をELISAで分析した。全ての構築物は、ヒトTNFに結合することができたが、構築物3および4は、キメラ分子がリガンド結合活性を保持していることが実証されているにも関わらず、他の構築物と比べて僅かな結合の減少を示した。ヒトのCRD1および2が対応するマウスのドメイン構築物3またはCRD1のみが対応するマウスのドメイン構築物4によって置換されたキメラの分子では、ATROSABおよびH398への結合は全く認められなかった。さらに、ヒトTNFR1のCRD1のA1ドメインのみが対応するマウスの配列構築物5で交換されている場合に、結合は全く認められなかった。ヒトのCRD1構築物7またはヒトのCRD1のA1ドメイン構築物6を含むマウスTNFR1についても、結合は大きく減少し、これは、完全な結合のためにさらなる領域が必要であることを示していた。CRD2のサブドメインA1を含めるようにヒト部分を拡大すると、H398およびATROSABがそれに対して強い結合を示すキメラTNFR1が得られた構築物8。従って、TNFR1のN末端領域のエピトープ残基は、残基1~70を含む。この領域では、ヒトTNFR1とマウスTNFR1との間では15個の残基が異なっているが、ヒトTNFR1とアカゲザルTNFR1との間では1つの残基のみが異なっている図8b。この残基Ile21は、アカゲザルおよびマウスTNFR1ではバリンによって置換されている。ヒトTNFR1とマウスTNFR1との間で異なる残基のいくつかは、Pro23、Gln24、Tyr30、Asn31、Ser57、Ser59、His66およびHis69を含む受容体とTNFとの相互作用部位に露出されている。エピトープをさらに狭めるために、CRD1のサブドメインA1に位置しているP23およびGln24をキメラTNFR1h12A1m2B24内の対応するマウス残基で交換した構築物10、図8a,b。これらの突然変異により、適用したアッセイ条件では、ATROSABおよびH398の結合は完全に失われた。考察ここで、ヒト化TNFR1特異的拮抗性モノクローナル抗体のIgG1誘導体ATROSABの産生について述べる。その長い半減期、安定的な産生および二価による結合の上昇を理由に、IgG型を選択した。ATROSABは、ADCCおよびCDCの活性化が不十分なFc領域を有する。ATROSABおよびその親マウス抗体による受容体選択的阻害により、TNF媒介性細胞死ならびにNF-κB誘導性IL-6およびIL-8放出の阻害によって示されているように、TNFR1の異なったシグナル伝達経路の遮断が生じた。どちらのサイトカインも炎症のバイオマーカであり、例えば、関節リウマチにおける活性な疾患の発症時に上昇する。マウスH398およびヒト化一価Fabの拮抗活性は、リガンド結合の阻害に基づいていると言われていた。キメラのマウス/ヒトTNFR1-Fc融合タンパク質に対してドメイン交換戦略を用いることにより、ATROSABおよびH398によって認識されるエピトープがCRD2のサブドメインA1も含み、すなわちエピトープ全体がTNFR1のN末端領域のアミノ酸1~70に覆われていることが分かる。CRD2のサブドメインA1も抗体結合に必要であるという発見は、立体的阻害がTNF作用の中和を引き起こしていることを暗示している。結合されたTNFを有するTNFR1の構造図7は、同定されたエピトープ領域が、主にCRD2およびCRD3に位置しているTNF結合部位に少なくとも部分的に重なっていることを示している。さらに、部位特異的突然変異誘発法により、CRD1のサブドメインA1の残基Pro23およびGln24が抗原および種特異性に直接寄与していることが明らかとなった。CRD1はリガンド結合に直接関与していないが、TNFR1シグナル伝達に強く関与しているため、この事実は興味深い。CRD1は、その後のCRD2の立体構造を安定化させることにより高親和性リガンド結合を制御しており、CRD1の除去により、リガンド結合が失われる。さらに、CRD1は、同種親和性の受容体/受容体相互作用部位、すなわち機能性TNFRシグナル複合体の産生に不可欠なプレリガンド結合アセンブリドメインPLADを含む。従って、ATROSABのCRD1への結合により、立体障害によって、あるいは立体構造変化を誘導することによって、TNFを変位させるだけでなく、同型のPLAD相互作用も阻害し、それにより機能性TNFRシグナル複合体の形成を阻止することができた。ATROSABは、H398と比べて、拮抗活性の僅かな減少を示した。水晶振動子マイクロバランス法およびTNFR1発現細胞を用いたフローサイトメトリ測定で測定されるように、組換え型ヒトTNFR1に対するどちらの抗体の親和性も類似していたため、この減少は恐らく親和性の変化によるものではないようである。現在では、ATROSABおよびH398が、僅かに異なる方法で結合すること、あるいはエピトープを含む同定された領域aa1~70内の僅かに異なる領域に結合することを無視することはできない。露出されている残基の部位特異的突然変異誘発法によるさらなるエピトープマッピングを行えば、ATROSABおよびH398の立体構造エピトープの正確な位置確認ならびにリガンド阻害の機序に対する洞察が得られるであろう。抗体H398およびATROSABの両方について、TNFの非存在下での樹立細胞株を用いた高感度生体外アッセイにより、非常に狭い用量範囲での軽微な刺激活性が明らかとなった。同じアッセイで、ATROSABおよびH398の一価のFabフラグメントについて、4種類の対数用量範囲にわたって刺激活性を全く認めることができなかったため、サイトカイン放出に対する二価の抗体のこの僅かな効果は、受容体の架橋によって引き起こされていると思われた。但し、TNF治療に対する細胞応答で比べた場合、ピーク時で2~5の真のTNF応答に達する二価の抗体のこの軽微な活性は無視してもよいと思われる。さらに、T細胞活性化およびO2産生それぞれのTNF依存的細胞応答モデルにおいて、新しく単離したヒト末梢血T細胞および顆粒球に対して、TNFR1特異的抗体の作動活性は全く認めることができなった。重要なことに、ヒトTNFR1に対するものと同様の親和性でATROSABがアカゲザルTNFR1に結合することを実証することができたため、ATROSABのアカゲザルにおける生体内評価が可能となった。コラーゲン誘発性関節炎CIAモデルは、可能なRA治療のために認められている標準であり、アカゲザルでは、早くも再現性良く誘導することができた。十分に確立されているヒトとの近接さ生理学的、解剖学的、遺伝学的、微生物学的および免疫学的により、アカゲザルにおけるCIAは、新規な治療法の安全性および有効性の評価のための非常に有用な前臨床モデルの代表であり、非ヒト霊長類におけるATROSABの中和活性および安全性の分析を可能にする。ATROSABなどのTNFR1選択的拮抗薬により、抗TNF治療が失敗したか疾患の進行をさらに激化させた場合に、多発性硬化症、鬱血性心不全、代謝性疾患2型糖尿病、サイトカイン放出症候群、敗血症性ショック、急性神経変性疾患脳卒中および慢性神経変性疾患アルツハイマー病およびパーキンソン病などの疾患のための新しい治療選択が可能になる。ATROSABは、抗TNF治療に臨床的に応答することが既に知られている疾患、特にTNFR1の特異的阻害およびTNFR2機能の維持が有望な治療法と思われる疾患において、特に有用な代替治療法になることができる。"