"又はを含む相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートであって、Mは生物活性分子であり、xは生体分子に共役した開裂可能-連結ポリマーの数で、x≧1であり、nはn≧2であり、Pはポリマー又はポリマー脂質であり、Pnは多数のポリマー性のアーム又は部分piecesであり、これらのタイプ及びサイズは同一又は異なってもよく、Lは、少なくとも1つの開裂可能な連結及び少なくとも1つの持続性の連結を含む機能連関部分moietyであり、若しくは、Lnは全て放出可能な結合であり、Rはポリマーと生体分子との間に接続した開裂不可能なスペーサーであり、Cは生体分子に結合できる共役基であることを特徴とする、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。コンジュゲート化ポリマーは、持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIaであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。コンジュゲート化ポリマーは、全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIbであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。コンジュゲート化ポリマーは、持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIaであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。コンジュゲート化ポリマーは、全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIbであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記持続性の連結は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、ウレア、エーテル、ウレタン、スルフィド、チオウレア、チオカルバメート、チオカルバミド及びジチオカルバメートからなる群から選択され、前記放出可能な結合連結は、カルボン酸エステル、カーボネート、スルホン酸エステル、リン酸エステル、アシルイミダゾ、カルバメート-イミダゾ及びジスルフィドの連結からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記開裂可能な連結は、invivoで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で分解可能、pHで誘導される加水分解可能、pHで誘導される自己開裂可能、生理学的に開裂可能、invivoの物質で誘導される開裂可能、生化学反応で誘導される開裂可能又は化学的に開裂可能であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ及びスルファターゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項7に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記ポリマー性のアーム又は部分piecesのPnは、ポリエチレングリコールPEG、メトキシ-ポリエチレングリコール、アルキルキャップ化ポリエチレンオキシド、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化グリコール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキサゾリン、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、及び、これらのコポリマー、ブロックポリマー、ターポリマー及び混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。Pが、約50から約40,000までの範囲の分子量を有するPEGポリマーであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。約5000から約40,000までの範囲の分子量を有するPEGポリマーであることを特徴とする、請求項10に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。Cは、活性エステル、混合化無水物、アルキルアルデヒド、芳香族アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される共役部分moietyであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記活性エステルは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、アクリルイミダゾ又はトリクロロフェニルカーボネートからなる群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。Rは、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸であり、非タンパク質のアミノ酸は、ホモシステイン、ホモセリン又はオルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記nは2n=2であり、前記タイプIの相乗性開裂可能-分枝状ポリマーコンジュゲートは、を含み、持続性-開裂可能-連結のアーム2つの分枝状ポリマータイプIaに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結であり、全部-開裂可能-連結のアーム2つの分枝状ポリマータイプIbに対して、L1及びL2の両方は開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記nは2n=2であり、前記タイプIIの相乗性開裂可能-直鎖状ポリマーコンジュゲートは、を含み、持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIaに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結であり、全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIbに対して、L1及びL2の両方は開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。P1及びP2は、メトキシポリエチレングルコールであり、Rは、又はによって示される構造を有するメトキシポリエチレングルコールと接続したリジンであり、a結合は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、チオカルバメート、チオカルバミド、ウレタン及び及びジチオカルバメートからなる群から選択される持続性の連結であり、a結合は、α又はε-アミノ基のいずれかに結合され、b結合は、カルボン酸エステル、カーボネート、及び、カルボキシ-イミダゾからなる群から選択される開裂可能な連結であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。遊離のアミノは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、アシルイミダゾ、アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される活性化部分moietiesを含むスペーサーをさらに接続することを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。mPEG-OH又はmPEG誘導体を用い、活性化、共役及びアシル化の操作を介してカルボキシル基に形成される開裂可能な連結と、mPEG求電子誘導体でのアシル化、共役及び縮合を介するアミノ基に形成される持続性の連結と、スペーサー部分moietyの挿入及び活性化と、及び、開裂可能-持続性-混合型連結の合成のために用いれる保護、脱保護の操作とを含む、持続性-開裂可能-連結のポリマー、全部-開裂可能-連結のポリマー、及び、非対称の分枝状アームのポリマーを調製するために用いられることを特徴とする、合成方法。前記持続性-開裂可能-連結の分枝状PEG誘導体は、Lysα-10KmPEG、カルバメート;20KmPEGエステルε-スベリン酸スクシンイミジル、化合物5を含むことを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記持続性-開裂可能-連結の分枝状PEG誘導体は、Lysα-10KmPEG、アミド;20KmPEG、エステルε-スベリン酸スクシンイミジル、化合物6を含むことを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記持続性-開裂可能-連結の分枝状PEG誘導体は、Lyss-10KmPEG、カルバメート;20KmPEG、エステルα-スベリン酸スクシンイミジル、化合物7を含むことを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記持続性-開裂可能-連結の分枝状PEG誘導体は、Lysε-10KmPEG、アミド;20KmPEG、エステルα-スベリン酸スクシンイミジル、化合物8であることを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記持続性-開裂可能-連結の分枝状PEG誘導体は、3-マレイミドプロピオニルLysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル、化合物9であることを特徴とする、請求項17に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記コンジュゲートは、1つの成分又は多くの成分からなる混合物であることができ、Mは、これらに限定されない、タンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、1本鎖抗体、核酸、DNA、RNA、RNAi、siRNA、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ホルモン、神経伝達物質、炭水化物、二糖、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド、薬物、及び、低分子からなる群である、生体分子であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。Mは、サイトカイン、エポエチンアルファ、果粒球コロニー刺激因子G-CSF、エタネルセプト、インターフェロン、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンアルファコン1、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、インターフェロンγ-1b、インターロイキン、TNF-α、インシュリン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラコシダーゼ、レテラプスretelapse、ラスブリカーゼ、ラロニダーゼ、オプレルベキン、ドルナーゼα、コラゲナーゼ、アニストレプラーゼ、アガルシダーゼ、成長因子、ヘモグロビン、血液凝固因子、血液凝固因子VII、VIIa、VIII及びIXなどからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mは、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターフェロンガンマ-1b、及び、インターフェロン-λインターフェロンラムダを含むインターフェロンであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mは、インターフェロン-α-2a、インターフェロン-α-2b、インターフェロン-α-1、インターフェロンアルファコン-1及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン―αであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mはインターフェロン-α-2bであり、Rは、請求項17に記載された構造のリジンであり、P1及びP2はmPEGであり、それぞれは約50から40,000までの範囲の分子量を有し、L1結合は、アミド、カルバメート又はアミンの連結であり、L2結合は、カルボン酸エステル又はカーボネートの連結であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mはサイトカインであり、Rは、請求項17に記載された構造のリジンであり、P1及びP2はmPEGであり、それぞれは約50から40,000までの範囲の分子量を有し、L1結合は、アミド、カルバメート又はアミンの連結であり、L2結合は、カルボン酸エステル又はカーボネートの連結であることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。活性化部分moietiesを有する前記リジンは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、及び、アシルイミダゾの部分moietiesからなる群から選択されることを特徴とする、請求項29又は30のいずれかに記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。活性化部分moietiesを有するリジンは、特定のタンパク質のN末端のコンジュゲート化のためにアルキル又は芳香族アルデヒドから選択されることを特徴とする、請求項29又は30のいずれかに記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。1つの要素、x=1を含むことを特徴とする、相乗性インターフェロンα-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルε-スベリン酸コンジュゲート。コンジュゲートは、x=1ないし2又はx=1ないし3の組成を有する混合物を含むことを特徴とする、請求項33に記載の相乗性インターフェロンα-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルε-スベリン酸コンジュゲート。インターフェロンαがインターフェロンα-2bであることを特徴とする、請求項33又は34のいずれかに記載の相乗性インターフェロンα-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲート。より大きな治療効果を達成するために、増加した生物活性と、増大した薬理学的特性とを提供する、持続性の、invivoで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果生体分子薬物送達システムであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。増加した、着実な、及び、持続した抗ウイルス活性を達成のために、増加したインターフェロン活性と、増大した薬理学的特性とを提供するためのインターフェロンαの、持続性の、invivoで酵素制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムであることを特徴とする、請求項33に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mは、サイトカイン又はインターロイキンであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。前記Mは、血液凝固因子VII、VIIa、VIII及びIXであることを特徴とする、請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート。請求項1に記載の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートの有効量の、それを必要とする被験者への投与を含むことを特徴とする、治療方法。本発明の少なくと1つの態様は、新規の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプIa、Ib、IIa及びIIbを提供し、それらは、開裂可能な連結を介して分枝状又は直鎖状のポリマーに共有結合した生体分子である。本明細書で用いられるところの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、invivoで投与されるとき、コンジュゲート化されていない生体分子の対応物と比較して、又は、その代替として、開裂不可能な連結を介して同一のポリマーにコンジュゲートされる生体分子と比較して、生体分子の、増大した生物活性と、改善した薬理学的特性とを提供する持続性のlong-acting、制御された持続的放出及び/又はハイブリッド相乗効果システムである。本発明の少なくとも1つの態様は、式I又はIIを有する相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートに関し、又はMは生物活性分子であり、xは生体分子に共役した開裂可能なポリマーの数で、x≧1あり、nはn≧2であり、Pは、ポリマー又はポリマー脂質であり、Pnは、タイプ及びサイズが同一又は異なってもよい多数のポリマー性のアーム又は部分piecesであり、Lは、少なくとも1つの開裂可能な連結及び少なくとも1つの持続性の連結を含む機能連関部分moietyであるか、若しくはLnは放出可能な連結であり、及び、Rは、ポリマーと生体分子と間に接続された開裂不可能なスペーサーであり、Cは、生体分子に結合可能な共役基である。本発明の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、少なくとも4タイプのコンジュゲート、すなわち、タイプIa、Ib、IIa及びIIbの生体分子-ポリマーコンジュゲートを含む。タイプIaの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、分枝状ポリマー間に持続性-開裂可能-連結を含む。タイプIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、分枝状ポリマー内に全部-開裂可能-連結を含む。タイプIIaは、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、直鎖状ポリマー間に持続性-開裂可能-連結を含む。タイプIIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、直鎖状ポリマー間に全部-開裂可能-連結を含む。したがって、本発明の相乗性バイオコンジュゲートで用いられる、現在、開示された新規の持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結は、構成内に分枝状又は直鎖状のいずれかのポリマーを含むことができる。タイプIは、分枝状の開裂可能な連結ポリマーであり、タイプIIは、直鎖状の開裂可能な連結ポリマーである。本明細書で用いられるところの開裂可能な連結は、invivoで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で開裂可能、又は、pH-依存型の加水分解可能な連結を含む。タイプIの分枝状の開裂可能な連結ポリマーは、持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIa及び全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIbを含む。タイプIIの直鎖状の開裂可能な連結のポリマーは、持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIa及び全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIbを含む。本明細書で用いられるところの持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーは、開裂可能及び持続性の両方の連結を含み、Lnの連結は開裂可能-持続性-混合型-連結である。全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマーは開裂可能な連結のみを含み、Lnの連結は開裂可能な連結のみである。血漿及び/又はinvivoでは、持続性-開裂可能-連結のポリマータイプIa又はタイプIIaの相乗性バイオコンジュゲートは、酵素反応を介して、より小さなサイズの生物活性ポリマー-スペーサー-生体分子断片及びポリマーを含むより小さな部分moietiesに開裂され、変換される。血漿及び/又はinvivoでは、全部-開裂可能-連結のポリマータイプIb又はタイプIIbの相乗性バイオコンジュゲートは、酵素反応を介して、より小さなサイズの生体分子-スペーサー断片及びポリマーを含むより小さな部分moietiesに分解される。本発明の少なくとも1つのメリットは、本発明のバイオコンジュゲートが、生物活性を発揮するための適切な立体的特徴を有するだけでなく、身体から容易に排泄されるか、若しくは除去される部分moietiesに開裂される、多数の生物活性断片に分解されることである。対照的に、従来技術の従来のタンパク質コンジュゲートは、前記ポリマーが血漿中に安定的に留まり、結果として、分解不可能なポリマー性部分moietiesの全身毒性及び望ましくない組織蓄積を増幅するように、ポリマー性アームを連結している持続性の連結を介して連結される分枝状ポリマーである。本発明のもう1つの実施態様は、以下の式IIIで検討され、ここで、式IIの構造内でn=2である。したがって、相乗性生体分子-分枝状ポリマーコンジュゲートは、以下の構造を有する前記式IIIによって示される。したがって、タイプIaの持続性-開裂可能-連結混合型-持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結である。タイプIbの全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマーに対して、L1及びL2の両方は前記開裂可能な連結である。式Iによる少なくとももう1つの実施態様は、n=2のとき、式IVを有する構造によって示される相乗性生体分子-直鎖状ポリマーコンジュゲートである。したがって、タイプIIaの持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結である。タイプIIbの全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーに対して、L1及びL2の両方は前記開裂可能な連結である。新規の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート相乗効果バイオポリマーは、生体分子-ポリマーコンジュゲートのinvivoで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。前記相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、invivoの酵素反応を介して、より小さなサイズだが、より活性の高い生体分子-ポリマー断片又は生体分子-スペーサーコンジュゲートにゆっくりと分解される。前記相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲート、及び、放出された生体分子-ポリマー断片又は生体分子-スペーサーコンジュゲートから生成された、増大した複合生物活性が、生体分子関連治療のための薬物相乗作用を提供する。本発明の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、最適な治療効果を達成するための生体分子の増大した薬動力学的PK及び薬物動態学的PDな特性をさらに提供する独特な生体分子の送達システムである。本発明の主要なメリットの1つは、大きい生体分子-ポリマー、及び、放出されたより小さな生体分子-ポリマーコンジュゲートからの複合生物活性を通じて、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートがinvivoでハイブリッド相乗効果生物活性を生成できることである。それとは異なり、コンジュゲートが、血漿でポリマー性アームを放出しないように、つまり一定の生物活性を有するように、従来の分枝状ポリマー-生体分子コンジュゲートは持続性のポリマー性連結のみを含む。本発明の少なくとももう1つのメリットは、有益な治療効果のための生体分子-ポリマーコンジュゲートの総合的なPK-PDプロファイルを最大化するために、大きい生体分子-ポリマーコンジュゲートのPK特性と、小さい生体分子-ポリマー又は生体分子-スペーサーコンジュゲートのPD特性とのメリットを統合する独特な相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートということである。さらなるメリットは、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートが、invivoでかさばったポリマーを放出することによって、生体分子-ポリマーのサイズを低下するための連結開裂メカニズムを提供すること、つまり、毒性を低下することである。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、血友病に対しての第VII因子、第VIII因子、第IX因子などのような予防的治療のための従来のタンパク質-ポリマーを超えるメリットを提供する。新規の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、血漿で増加した、着実な、及び、持続した生体分子薬物活性を達成するために、invivoでのハイブリッド相乗効果生物活性及び薬理学的な特性を提供する。つまり、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、従来のポリマーコンジュゲートを超える十分な利益を提供する。本発明のもう1つの態様は、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートを調製する方法を提供する。本発明のこの態様では、相乗性生体分子コンジュゲートを調製するために、上述の持続性-開裂可能-連結及び全部-開裂可能-連結のポリマーを合成する方法が記載される。もう1つの実施態様では、また、リンカーポリマーを事前に合成するための方法が記載される。本発明のさらなる態様は、相乗性インターフェロン-αポリマーコンジュゲート相乗効果IFN-αポリマーコンジュゲートを生成するために、持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーをインターフェロン-αに連結することに関する。新規の相乗効果インターフェロン-αポリマーコンジュゲートは、酵素反応を介してinvivoで部分的なポリマー性アームを放出し、より小さいが、より高い活性のインターフェロン-αポリマーコンジュゲートに変換し、増加したインターフェロン複合生物活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な複合特性とを生じる。従来のインターフェロン-α-ポリマーコンジュゲートと異なり、本発明の新規の相乗性インターフェロン-α-ポリマー相乗効果IFN-α-ポリマーコンジュゲートは、大きなインターフェロン-α-ポリマーコンジュゲートと、小さなインターフェロン-α-ポリマーコンジュゲートとを組み合わせた最適の薬理学的な特性をinvivoで供給する、インターフェロン-αのinvivoで制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。相乗効果IFN-α-ポリマーコンジュゲートは、血漿で増大した、着実な及び持続的な抗ウイルス活性を達成するために、より長いT12を有する大きいインターフェロン-α-ポリマーと、より高い生物活性を有する小さいインターフェロン-α-ポリマーとの利点を統合する。臨床的に、前記相乗効果IFN-α-ポリマーは、治療に関連したインターフェロン-αのための投与量、投与頻度、又は、疾患治療期間のその後の減少でも、より大きなウイルス学的応答の持続を実現することをもたらすことができる。したがって、前記相乗効果IFN-α-ポリマーコンジュゲートは、従来のペグ化インターフェロン-αコンジュゲートを超える顕著な臨床的メリットを提供することができる。発明の詳細な説明生体分子前駆体Probiomolecule-PEGコンジュゲートの発明は、米国特許出願番号12/302,238号で言及され、その内容はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。持続性-開裂可能-連結また、混合型-持続性-開裂可能-連結として本明細書で言及する又は全部-開裂可能-連結の分枝状又は直鎖状のポリマーは、同一の特許出願に記載される連結を含む。本発明の少なくとも1つの態様は、開示について、PK及びPDの特性を増大することによって達成した、請求項に記載のリンカーによって提供したinvivoでの有効性の予期しない増加である。生体分子の送達に対しての従来技術の欠点の1つは、ペプチド及びタンパク質の化合物が血漿半減期が非常に短いことである。一般的に、前記短い血漿半減期は、体循環期間で生じる酵素分解と同様に、速い腎クリアランスに起因する。血漿半減期を延長し、同時に、invivoでの治療タンパク質の効果を改善するための戦略を提供するとは予想されれない。前記予想外の観察は、請求項に記載の化合物及び構造のPK及びPD間で得られた重要なバランスcriticalbalanceを達成することに起因する。本発明の少なくとも1つの態様は、最大のPK-PDプロファイルを提供できる即座に開示される構造である。結合親和性の低下によって生じる効能の低下が、延長された血漿循環時間によって生じた全体的な全身曝露の増加によって補われるように、持続性のタンパク質-PEG連結によって提供される延長血漿半減期の特徴を統合したタンパク質-PEG連結の持続的、かつ、遅延性の開裂がタンパク質の薬物のinvivoでの有効性を変えることを本発明は開示する。したがって、本発明は、開示されたコンジュゲートのPK-PDプロファイルを調和することによって関心とする生体分子の治療上の利益を総合的に増強することを開示する。この成果は、前記予測不可能な技術で前もって決して気付かない、予想外の治療上の利益を提供する。タンパク質のコンジュゲート化のための、分枝状の持続性-連結PEG2、UPEG、Y字型又は直鎖状の持続性-連結のPEGリンカーSC-PEGなどを利用する従来技術に記載された従来のペグ化方法論と異なり、本発明は、持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結を介して生物活性分子に結合した分枝状又は直鎖状のポリマーリンカーを含む相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートの4タイプを提供する。これらのコンジュゲートは、持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプ1a、及び、全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIb、及び、持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマータイプIIa、及び、全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーIIbと接続した生体分子を含む。本発明は相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートを提供し、それらは開裂可能-連結ポリマータイプIa、Ib、IIa及びIIbに共有結合した生体分子である。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、送達される治療剤のために、増大した生物活性と、改善した薬理学的特性とを提供するinvivoでの持続性の持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。有機化学及びプロドラッグ科学の当業者は、持続性の又は安定的な連結が、共有結合及びinvivoで分解不可能な共有結合であることを十分に理解するであろう。言い換えれば、これらは、血漿で容易に開裂しない加水分解不可能な連結である。しかし、放出可能な又は開裂可能な連結は、血漿で加水分解可能又は分解可能な連結としてみなされる。本明細書で用いられるところの、持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結における開裂可能-連結とは、invivoのとき、連結が開裂されるように連結する結合をいう。前記連結は、血漿で開裂可能な、酵素で分解可能な、pHで誘導される加水分解可能な、pHで誘導される自己開裂可能な、invivoの物質で誘導される開裂可能な、生化学反応で誘導される開裂可能な又は化学的に開裂可能なものを含む。開裂可能-連結ポリマーリンカーを結合することから生成される新規の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、上述のような以下の式I及びIIに対応する、本発明の少なくとも1つの開裂可能な連結を含むことができる。又はMは生物活性分子であり、xはx≧1の数であり、nはn≧2として定義される数であり、Pは、ポリマー又はポリマー脂質であり、Pnは、タイプ及びサイズが同一又は異なってもよい多数のポリマー性のアーム又は部分piecesであり、Lは、ポリマーとスペーサーとの間で接続した機能的な連結か、若しくはポリマー間の連結であり、そして、Lは、少なくとも1つの開裂可能な連結及び少なくとも1つの持続性の連結を含む、機能連関部分moietyであり、若しくはLnは全部-開裂可能-連結であり、Rは、ポリマーと生体分子との間で接続した開裂不可能な化合物又はスペーサー部分moietyであり、そして、Rは、タイプIの分枝状ポリマーのためにPに連結するための少なくとも2つの官能基を有し、Cは生体分子に結合可能な共役基である。もう1つの実施態様では、本発明は、少なくとも1つの持続性の連結及び少なくとも1つの放出可能な連結を有するための連結部分moietyを含む、上述の式I及びIIを必要とする。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートのために用いられるポリマーは、好ましくは、水溶性である。前記ポリマーは、ポリエチレングリコールPEG又はポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチル化ポリオールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、これらのコポリマー、ブロックポリマー、ターポリマー及び混合物を含むが、これらに限定されない。また、モノメトキシポリエチレングリコールmPEGのようなアルキル末端を含むポリアルキレンオキシドが含まれる。ポリアルキレンオキシドホモポリマーに加えて、ポリエチレンイミン、デキストラン、PEG-脂質、ポリマー脂質、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ポリマー及び類似の種類のポリマーのような他のポリマーを用いることができる。ポリエチレングリコールPEG及びモノメトキシポリエチレングリコールmPEGは、特に好ましいポリマーである。PEGの分子量は、約50から約40,000までの範囲である。5,000から40,000までの範囲の分子量を有するPEGは、タンパク質のコンジュゲート化のために特に有用である。ポリマーに接続される脂質部分moietyは、脂肪酸アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及び、ポリケチド、ステロール脂質、及び、プレノール脂質、リン脂質、及び、セラミドを含むが、これらに限定されない。特に好ましいポリマー脂質は、PEG-リン脂質及びPEG-セラミドである。持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結のポリマー脂質は生物活性分子を有するリポソーム又はナノ粒子を形成するために用いることができる。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、リポソーム又はナノ粒子であることができる。スペーサーRは、化学品、薬物、ペプチド、アミノ酸、非タンパク質のアミノ酸、非タンパク質のアミノ酸誘導体、アミノ酸誘導体、DNA断片又はRNA断片、又は、これらの混合物を含むが、これらに限定されない。加えて、タイプIの分枝状ポリマーのアミノ酸は、リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸からなる群から選択される。さらに、タイプIの分枝状ポリマーの非タンパク質のアミノ酸は、ホモシステイン、ホモセリン又はオルニチンからなる群から選択される。前記スペーサーRは、他の化学品とさらに接続したアミノ酸又は非タンパク質のアミノ酸であることができる。本明細書で用いられるところの、開裂可能な連結とは、invivoで開裂可能、血漿で開裂可能、酵素で分解可能、pH依存性の加水分解可能、pHで誘導される自己開裂可能、生理学的に開裂可能、invivoの物質で誘導される開裂可能、生化学反応で誘導される開裂可能又は化学的に開裂可能である。前記開裂可能な連結は、カルボン酸エステル、カーボネート、スルホン酸エステル、リン酸エステル、アシルイミダゾ、カルバメート-イミダゾ及びジスルフィドの群を含むが、これらに限定されない。invivo及び/又は血漿で連結を開裂することに関係する酵素は、加水分解酵素、還元酵素及び酸化酵素を含む。前記酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、プロテアーゼ、ジスルフィドリダクターゼ、ケトリダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ぺルオキシダーゼ、及び、アミンオキシダーゼを含むが、これらに限定されず、エステラーゼ、ホスファターゼ及びスルファターゼが特に好ましい酵素である。カルボン酸エステル及びカーボネートの連結は、エステラーゼ酵素によって開裂される。したがって、本明細書の加水分解可能な酵素という用語は、前記酵素によって分解又は開裂される全ての連結を含む。持続性の連結は、血漿で開裂不可能である。前記持続性の連結は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、ウレア、エーテル、ウレタン、スルフィド、チオウレア、チオカルバメート、チオカルバミド及びジチオカルバメートの基groupを含むが、これらに限定されない。Cの共役基は、求電子又は求核基を含む。前記求電子基は、N-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステル、p-ニトフェニルエステル、スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、ウレタンスクシンイミジルsuccinimidylurethane、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、塩化スルホニル、アルデヒド、カーボネート、イミドエステル、無水物、混合化無水物、マレイミド、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル誘導体、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、及び、チオジスルフィド交換試薬exchangereagentsを含むが、これらに限定されない。前記求核官能基は、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド、カルバジン酸塩、アシルヒドラジド、セミカルバメート及びヒドラジンを含むが、これらに限定されない。xがx≧1であるとき、前記Cの共役基を介して生物活性分子に結合した開裂可能-連結ポリマーの数は、1つから多数の開裂可能なポリマーまで変更することができる。本発明の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、さまざな数の開裂可能-連結ポリマーを含む生体分子の混合物であることができる。前記混合物は、異なるxの数を含むコンジュゲートの組み合わせであることができる。例えば、混合物は、生体分子-モノポリマーx=1及び生体分子-ジポリマーx=2の特定の百分率からなる。また、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過、血液透析濾過、透析、遠心分離などのような方法によって所望の数の開裂可能-連結ポリマーのためにさらに精製されることができる。持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結のポリマーに結合したMの生物活性分子生体分子は、タンパク質、糖タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、1本鎖抗体、モノクローナル抗体、核酸、DNA、RNA、RNAi、siRNA、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ホルモン、神経伝達物質、炭水化物、糖、二糖、脂質、リン脂質、糖脂質、ステロール、アミノ酸、ヌクレオチド、細胞透過性ペプチド、低分子薬物などを含むが、これらに限定されない。相乗性生体分子-PEGのためのPEGの持続性-開裂可能-連結及び全部-開裂可能-連結を適用するための可能性のある生体分子は、サイトカイン、エポエチンアルファ、果粒球コロニー刺激因子G-CSF、エタネルセプト、インターフェロン、インターフェロンα-2a、インターフェロンα-2b、インターフェロンアルファコン1、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、インターフェロンγ-1b、インターロイキン、TNF-α、インシュリン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラコシダーゼ、レテラプスretelapse、ラスブリカーゼ、ラロニダーゼ、オプレルベキン、ドルナーゼα、コラゲナーゼ、アニストレプラーゼ、アガルシダーゼ、成長因子、ヘモグロビン、血液凝固因子、血液凝固因子VII、VIIa、VIII及びIXなどを含むが、これらに限定されない。上述したように、本発明は、分枝状及び直鎖状の開裂可能-連結ポリマーと結合した4タイプの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプIa、Ib、IIa及びIIbを含む。タイプIaの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーを含む。タイプIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマーを含む。タイプIIaの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、前記持続性-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーを含む。タイプIIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーを含む。例えば、n=2の場合には、開裂可能-連結の分枝状ポリマータイプIと結合した相乗性コンジュゲートは、式IIIによって表される。持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーと結合したタイプIaの相乗性コンジュゲートに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結である。x=1の場合には、前記タイプIaの相乗性コンジュゲートは、invivo及び/又は血漿で酵素制御分解反応によってP1-L1-R-C-M及びP2にゆっくりと変換される。この独特な相乗性生体分子-ポリマーは、酵素分解の結果として形成される大きいサイズの相乗性生体分子-ポリマーと、小さく断片化した生体分子-ポリマーコンジュゲートとを含む、2つの複合活性生体分子-ポリマーコンジュゲートをinvivoで提供する。全部-開裂可能-連結の分枝状ポリマーと結合したタイプIbの相乗性コンジュゲートに対して、L1及びL2の両方は開裂可能な連結である。x=1のとき、前記タイプIbの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御された反応を介してinvivo及び/又は血漿でR-C-M、P1及びP2にゆっくりと変換される。この相乗性生体分子-ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子-ポリマーと、小さく断片化した生体分子-スペーサーコンジュゲートとを含む、複合生体分子-ポリマーコンジュゲートをinvivoで提供する。一般的に、大きい分子サイズの生体分子-ポリマーコンジュゲートは、血漿循環時間がより長いが、生物活性が低い。小さい分子サイズの生体分子のポリマーコンジュゲートは、血漿循環時間がより短いが、生物活性が増加する。従来の分枝状又は直鎖状のポリマーコンジュゲートと異なり、独特のタイプIan=2又はIbn=2の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、大きな断片化した生体分子-ポリマーコンジュゲートと、小さな断片化した生体分子-ポリマーコンジュゲートとによって生成される2つの生物活性を統合し、したがって、増加した複合生物活性をinvivoで提供する。さらに、血漿での生物活性は、大きいサイズの相乗性コンジュゲートから放出された小さいサイズの生体分子-ポリマーコンジュゲートからの生物活性をゆっくりと増加するために持続され得る。大きい分子サイズの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、薬物吸収、分布、分布体積Vd及び血漿半減期を含む、よりよいPK特性を提供する。相乗性生体分子-ポリマーからの小さい分子サイズの、分解された生体分子-ポリマー又は生体分子-スペーサーコンジュゲートは、より良い薬物動態学的な特性を達成するためのより高い生物活性を有する。したがって、相乗性生体分子-ポリマーは、増大した複合生物活性と、相乗的に改善したバイオコンジュゲートの薬動力学的及び薬物動態学的な特性をinvivoで提供するために、大きいサイズの生体分子-ポリマー及び小さいサイズの生体分子-ポリマーのコンジュゲートの多数n>2又は2つn=2のコンジュゲート性能のメリットを統合する。n>2又はx>2に対して、相乗性生体分子-ポリマーは、増加した複合生物活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な複合特性とをinvivoで提供するために、大きいサイズの生体分子-ポリマー及び小さいサイズの生体分子-ポリマーのコンジュゲートの多数のコンジュゲート効果のメリットを統合する。本発明によると、本発明のコンジュゲート由来のより小さなPEGポリマーは、それらは結合部位で立体障害をより少なく示すため、天然型と比較してより長い血漿半減期を有し、さらに、標的部位でより有効である。さらに、大きいサイズの生体分子-PEGコンジュゲート及びより小さなサイズの生体分子-PEGコンジュゲートの血漿濃度によって示される、調和したPK-PDの関係は、invivoで総合的な生物活性を増大する。前記柔軟性は、血流の循環に不適当である従来技術のポリマーよりも顕著に優れている。n=2の場合に、関裂可能-連結の直鎖状ポリマーと結合した相乗性コンジュゲートタイプIIは式IVによって示され、P1及びP2は同一又は異なるポリマーのタイプ及びサイズでもよく、L1の連結は、持続性又は開裂可能な連結であることができ、L2の連結は開裂可能である。開裂可能なスペーサーは、P1及びP2の間に埋め込まれてもよい。前記開裂可能なスペーサーの化合物は、式I及びIIに記載されるような放出可能な連結Lを含む。持続性-開裂可能-連結の分枝状ポリマーと結合したタイプIIaの相乗性コンジュゲートに対して、L1は持続性の連結であり、L2は開裂可能な連結である。x=1の場合に、タイプIIaの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御されるメカニズムを介して、invivoでP1-L1-R-C-M及びP2にゆっくりと変換される。この独特な相乗性生体分子-ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子-ポリマーと、小さく断片化した生体分子-ポリマーコンジュゲートとを含む、2つの活性生体分子-ポリマーコンジュゲートをinvivoで提供する。全部-開裂可能-連結の直鎖状ポリマーと結合したタイプIIbの相乗性コンジュゲートに対して、L1及びL2の両方は開裂可能な連結である。x=1の場合に、タイプIIbの相乗性コンジュゲートは、酵素で制御される反応を介してinvivoでR-C-MP1P2にゆっくりと変換される。この相乗性生体分子-ポリマーは、大きいサイズの相乗性生体分子-ポリマーと、小さい生体分子-スペーサーコンジュゲートとを含む、複合生体分子-ポリマーコンジュゲートをinvivoで提供する。x=1及びn=2のとき、invivo及び/又は血漿で、持続性-開裂可能-連結の分枝状又は直鎖状のポリマーを有する相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプ1a又はIIaは、式I及び式IIのP2及びP1-L1-R-C-M断片に分解される。invivoでの相乗性コンジュゲートは、大きいサイズの相乗性コンジュゲートと、放出された小さいサイズの生体分子ポリマーとの両方を含むハイブリッド生物活性コンジュゲートであり、したがって、ハイブリッド相乗効果活性と、相乗的で増大したPK及びPDの特性とを提供する。同じ方法で、x=1及びn=2のとき、invivo及び/又は血漿で、全部-開裂可能-連結の分枝状又は直鎖状のポリマーを有する相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプIb又はIIbは、式I及び式IIのP2及びP1及びR-C-M断片に分解される。invivoでの前記相乗性コンジュゲートは、大きいサイズの相乗性コンジュゲートと、放出された小さいサイズの生体分子-スペーサーコンジュゲートとの両方を含むハイブリッド生物活性コンジュゲートであり、したがって、ハイブリッド相乗効果活性と、相乗的で増大した薬動力学的及び薬物動態学的的な特性とを提供する。持続性のポリマーの連結を有する従来の分枝状ポリマーコンジュゲートと対照的に、本発明の独特の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプIa、Ib、IIa、IIbは、持続性の同期された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムであり、invivo及び/又は血漿の酵素で制御される様式で薬物相乗作用を提供するためにinvivoで前記ハイブリッド活性生体分子を供給する。タイプIa及びIIaの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、酵素反応を介して血漿でより小さな生体分子-ポリマー断片に変換される。タイプIb及びIIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、酵素で制御される反応を介して、スペーサーを含む生物活性分子に変換される。新規の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、in-vivoでハイブリッド生体分子-ポリマーコンジュゲートから生成した多数の効果を統合し、したがって、増大した複合生物活性と、PK及びPDの相乗効果特性とを提供する。少なくとも1つの実施態様では、本発明の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、invivoでかさばったポリマーを放出することによって生体分子-ポリマーのサイズを低下させるための開裂可能な連結を提供し、したがって、毒性は低下する。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、血友病に対しての第VII因子、第VIIa因子第VIII因子、第IX因子、多発性硬化症に対してのインターフェロン-β、ゴーシェ病及び他の遺伝性疾患に対してのグルコセレブロシダーゼなどのような可能性のある予防的治療のための従来のタンパク質-ポリマーを超えるメリットを提供する。本発明のもう1つの態様では、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、非経口、経鼻、直腸、経口又は局所のような多くの経路によって投与できる。非経口投与とは、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内の注射又は他の適切な注入手法のいずれかをいう。本発明のより好ましい実施態様では、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートに結合した開裂可能-連結ポリマーは、以下の明確な特徴を有する。1.前記ポリマーは、少なくとも1つの開裂可能な連結及び1つの持続性の連結か、若しくは、全部-開裂可能-連結を含む。2.結合したポリマー性の部分moietiesのサイズは、同程度であるか、若しくは同程度ではない。3.結合したポリマー部分moietiesのタイプは、同一であるか、若しくは異なる。例えば、PEG及びPEIポリエチレンイミン部分moietiesを含む開裂可能-連結ポリマーは、RNAi、siRNA又はDNAの供給のために用いられてもよい。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートの構成に対して、本発明は、開裂可能-連結ポリマーのために同一又は異なるタイプ及びサイズのポリマーを用いる選択肢を提供し、したがって、タンパク質のコンジュゲート化を最適化するために、適切な連結、ポリマータイプ及びポリマーサイズを選択することで有意義なメリットを提供する。ペグ化に対して、ポリエチレングリコールは、コンジュゲート化のために用いられるポリマーである。分枝状のアーム2つのPEGポリマーの持続性-開裂可能-連結を有するタイプIの相乗性生体分子-PEGコンジュゲートは、以下の式Vとして記載される。本式において、PEGA及びPEGBのポリマーは、同一又は異なる分子量であってもよい。タイプIaの相乗性生体分子-PEGコンジュゲートに対して、α結合は持続性の連結であり、β結合は開裂可能な連結である。タイプIaの相乗性生体分子-PEGは、酵素反応を介してinvivo及び/又は血漿で、より小さな生体分子-スペーサー-PEGAコンジュゲートにゆっくりと変換される。タイプIbの相乗性生体分子-PEGに対して、α結合及びβ結合の両方は、血漿で開裂可能な連結である。前記連結は、異なるタイプの放出可能な官能基であることができる。対称なアームを有する従来の分枝状PEGリンカーと異なり、本発明は、対称又は非対称の開裂可能な-分枝状の、及び、開裂可能な-持続性の-分枝状のPEGリンカーのいずれかを合成するための方法を提供する。本発明の合成方法論は、タンパク質のコンジュゲート化のための所望の持続性の開裂可能なPEG及び全部開裂可能なPEGポリマーを合成するために、さまざまな連結及び異なるサイズのPEGポリマーを選択することで有意義なメリットを提供する。加えて、同一の方法論は、所望のポリマー、連結断片及びポリマーサイズのための従来の分枝状ポリマーの合成のために適用できる。混合型-持続性-開裂可能-連結を含む開裂可能な分枝状PEGポリマーリンカーはPEGA、α;B、βとして表され、A及びBはPEGポリマーのサイズを示し、α及びβは連結のタイプである。例えば、Lysα-10KmPEG、カルバメート;20KmPEG、エステルスベリン酸スクシンイミジル化合物5は、カルバメート、及び、10KDa及び20KDaのPEGポリマーそれぞれと接続したエステルの連結を含む、持続性-放出可能-連結の分枝状の30KDaのポリマーである。また、PEG化合物10のアスパラギン酸カルバメート;エステル及び化合物11のグルタミン酸カルバメート;エステルは、混合型-持続性-開裂可能-連結の分枝状PEGポリマーである。タイプIIの相乗性生体分子-PEGは、直鎖状だが、開裂可能なPEG連結で結合した生体分子である。生体分子に結合したPEGポリマーの数は、1本のポリマー鎖から複数のポリマー鎖に変化できる。2つのPEGポリマーを含む直鎖状のPEG鎖と接続したタイプIIの相乗性生体分子-PEGの式は以下のように示される。上記式において、PEGA及びPEGBは、同一又は異なる分子量であってもよい。スペーサー又は主成分分子basemoleculeが、生体分子及びPEGAの間に埋め込まれる。タイプIIaの相乗性生体分子-PEGに対して、α結合は持続性の連結であり、β結合は開裂可能な連結である。開裂可能なスペーサーは、PEGA及びPEGBの間に埋め込まれてもよい。開裂可能なスペーサー化合物は、式I及びIIで示されるような放出可能な連結Lを含む。タイプIIaの相乗性生体分子-PEGは、酵素反応を介して血漿でより小さな生体分子-スペーサー-PEGAコンジュゲートにゆっくりと変換される。タイプIIbの相乗性生体分子-PEGに対して、α結合及びβ結合の両方は、開裂可能な連結である。前記連結は、異なるタイプの開裂可能な連結であることができる。PEG化合物の混合型の機能的な連結は、符号:α、β、γ、σなどで示される。タイプIb及びタイプIIbの両方の相乗性生体分子-PEGに対して、生体分子-スペーサーコンジュゲートの構成の、α及びβの両方の結合は、血漿で開裂可能である。生体分子とPEGAとの間のスペーサーは、特別な使用のために設計することができる。スペーサーは、血液脳関門を透過するための薬物、アミノ酸、ペプチド又はエンハンサーか、若しくは生体分子の効能を改善するエンハンサーであることができる。PEGA又はPEGBは、約50から約40,000までの間の分子量を有する。バイオコンジュゲートに接続したPEGポリマーは、約100から約200,000までの間の分子量を有する。好ましい実施態様では、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートに対して、PがPEGであり、PEG又はmPEGの分子量は、5,000、10,000、12,000、20,000、30,000、40,000又はそれらを混合した範囲内である。本発明の1つの態様は、Rのスペーサーが、式VI及びVIIによって示される構造を有する、持続性-開裂可能-連結のアーム2つの分枝状メトキシポリエチレングリコールに接続したリジンであることである。又はa結合は、アミド、カルバメート、カルバミド、イミド、アミン、チオカルバメート、チオカルバミド、ウレタン及びジチオカルバメートからなる群から選択される持続性の連結を指定し、a結合は、α又はεのアミノ基のいずれかに接続され、b結合は、カルボン酸エステル、カーボネート及びカルボキシル-イミダゾcarboxyl-imidazoからなる群から選択される開裂可能な連結であり、混合型の連結a及びbはそれらの混合物であり、mPEGA又はmPEGBは約50から40,000までの分子量を有し、リジン混合型の連結の二置換mPEGは、約100から80,000までの分子量を有する。タンパク質のコンジュゲート化のために、リジン-mPEGA-mPEGBポリマーの遊離のアミノは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトフェニルエステル、N-スクシンイミジルカーボネート、p-ニトロフェニルカーボネート、アシルイミダゾ、アルデヒド、マレイミド、ハロアセチル、カルボン酸、ヒドロキシル、イソシアネート、イソチオシアネート、カルボニル、チオール、ジスルフィド、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド及びヒドラジンからなる群から選択される活性化される部分moietiesを含むスペーサーをさらに接続する。もう1つの実施態様では、前記a連結はアミン結合であり、前記α又はεの第1アミノ基は、フォーク状ポリマーを形成するための求電子基、すなわち、2つのポリマー鎖と接続したα又はεのアミンを含む第2ポリマーとの反応を受けることができる。化合物5及び7の両方は30KDaの分枝状カルバメートエステルの混合型連結のPEG誘導体であり、化合物5及び7の違いは、10kのPEG持続性カルバメートの連結部位である。化合物5及び7の10kのPEGカルバメート連結部位は、それぞれ、リジン-α及びリジン-εである。化合物6及び8の両方は30KDaの分枝状エステル-アミドの混合型連結のPEG誘導体であり、化合物6及び8の違いは、10kのPEG持続性アミドの連結部位である。化合物6及び8の10kのPEGアミドの連結部位は、それぞれ、リジン-α及びリジン-εである。化合物9は、タンパク質のサルファチオ部分moietyのコンジュゲート化のためのマレイミド共役基を含む、30KDaの分枝状エステル-カルバメートの混合型連結のPEGである。化合物10及び11は、PEGポリマーを連結するための主成分化学品としてアスパラギン酸及びグルタミン酸を用いる分枝状エステルアミドの混合型連結のタイプである。タンパク質のコンジュゲート化のためのさまざまな求電子及び求核官能基式中のCの共役基は、実施例に記載された方法として、合成、活性化又は挿入することができる。本発明は、生体分子のコンジュゲート化のための持続性-開裂可能-連結及び全部-開裂可能-連結のポリマー誘導体と、非対称性の分枝状アームポリマーとの合成の方法論を提供する。前記合成の方法論は、持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結のポリマーの合成のための保護、脱保護、活性化及び挿入の方法及び操作を含むが、これらに限定されない。また、本発明は、適合した持続性のPEGのサイズ、適合した放出可能なPEGのサイズ、適合した持続性の連結、適合した放出可能な連結、適合した混合型のPEG及びポリマーのリンカー及び適合した異なる混合型のポリマーを選択、最適化及び合成するための完全な道具箱を提供する。また、本発明は、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートを調製するための方法を提供する。コンジュゲート化のために、開裂可能-連結のポリマーは、アミノ、チオ、アルデヒド、カルボキシル及びN末端からなる群から選択される活性部位を有する生体分子に一般的に接続される。好ましい実施態様では、最適な生体分子はインターフェロンである。本明細書で用いられるところのインターフェロンという用語とは、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターフェロンガンマ-1b、及び、インターフェロン-λインターフェロンラムダをいう。インターフェロン-αは、インターフェロン-α-2a、インターフェロン-α-2b、インターフェロン-α-1、インターフェロンアルファコン-1及びコンセンサスインターフェロンを含む。インターフェロンはサイトカインとして知られる糖タンパク質の広い分類に属し、広範な感染及び増殖性疾患に対する治療能を有する。インターフェロンは、抗ウイルス、免疫調節及び抗腫瘍の活性のような生物学的効果を有するタンパク質であるアルファインターフェロンIFN-αを含む。組換えIFN-αは、慢性C型肝炎、慢性B型肝炎、有毛細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、悪性黒色腫、及び、慢性骨髄性白血病を含む、多くの疾患を治療するための治療剤として用いられている。本発明の少なくとも1つの態様は、相乗性インターフェロンPEG相乗効果IFN-PEGコンジュゲートを生成するために、インターフェロンを共役するための持続性-開裂可能-連結の分枝状PEGポリマーを提供する。本発明の新規の相乗効果IFN-PEGコンジュゲートは、インターフェロンの、独特なinvivoで酵素で制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。相乗効果IFN-PEGは、インターフェロンの増加した複合抗ウイルス活性と、増大した薬動力学的及び薬物動態学的な特性とを提供するため、大きい分子のIFN-PEGコンジュゲートと、放出されたより小さな分子のIFN-PEGコンジュゲートとのメリットを統合する。インターフェロン-αに対して、本発明の独特な相乗性インターフェロン-α-PEG相乗効果IFN-α-ポリマーコンジュゲートは、インターフェロン-αを送達するために、酵素反応メカニズムを介して、制御され、同期された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムをinvivoで提供する高度なインターフェロン-αの薬物送達技術である。相乗効果IFN-α-ポリマーは、持続的な吸収、増大した抗ウイルス活性、持続的な抗ウイルス活性、延長した循環半減期、低減した免疫原性及び毒性、及び、増大した効能を達成するために、増大したインターフェロン-αの生物活性と、ハイブリッド相乗効果の薬理学的特性とを提供する。さらに、相乗効果IFN-α-ポリマーの持続した抗ウイルス活性と、増大したPK及びPDの特性とは、薬効を増加し、臨床的に、C型ウイルス患者に対して、ウイルス学的応答のより大きな持続と、その後の投与量、投与頻度又は疾患治療期間の低減との達成をもたらすことができる。相乗性インターフェロン-α-30kPEGα-10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲート[相乗効果IFN-α-30kPEGα、β]実施例6は、開裂可能な20kmPEGエステルの連結と、持続性の10kmPEGカルバメート連結とを含む。コンジュゲートのエステルの連結は、より小さいが、より活性の高いα-インターフェロン-ε-アミド-リジン-α-カルバメート-10kmPEGコンジュゲートを生成するために、invivoの血漿酵素エステラーゼによってゆっくりと加水分解される。この独特な酵素で制御された持続的放出の本発明の相乗効果IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートは、相乗効果IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートと、放出されたIFNα-10kPEG断片との増大した複合活性によるinvivoで増加した抗ウイルス効果を提供する。皮下投与の場合には、より大きな分子サイズを有する相乗効果IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートは、より少ない分布体積で分配され、早期に肝臓に送達されるようなメリットを有し、したがって、より長い血漿半減期を有する。しかしながら、酵素的な加水分解を通じて相乗効果IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートからゆっくりと生成されるIFNα-10kPEG断片は、より高い抗ウイルス活性を有する。相乗効果IFN-α-30kPEGα、βのハイブリッド相乗効果システムは、増加した及び持続した血清抗ウイルス活性を達成するための相乗作用を提供する。インターフェロンに結合される持続性の開裂可能なPEGポリマーの数は、1つx=1から多数の分枝状ポリマーx>1までの変えることができる。本発明の相乗効果IFN-α-30kPEGα、βを含む相乗性インターフェロン-PEGコンジュゲートは、1つの開裂可能-連結ポリマーか、若しくはさまざまな数の開裂可能-連結ポリマー、好ましくはx=1ないし2か、若しくはx=1ないし3のインターフェロンの混合物を含むインターフェロンであることができる。本発明の相乗性インターフェロン-PEGコンジュゲートでは、接続された持続性-開裂可能-連結又は全部-開裂可能-連結の分枝状PEGポリマーに対するPEG又はmPEGの好ましい分子量は、5,000、10,000、12,000、20,000、30,000、40,000Da又はこれらを混合したものである。相乗性インターフェロン-PEGコンジュゲートに対して、結合されるPEGポリマーの好ましいサイズは、約10,000から約60,000Daまでである。相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートのアプローチは、インターフェロン及びインターロイキンを含むサイトカインに対して特に有益である。タイプIa及びIIaの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、より小さなサイズだが、より活性の高い生体分子-ポリマーコンジュゲート断片をinvivoで提供するために、一部分のポリマー部分moietiesをゆっくりと放出することができる。タイプIb及びIIbの相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、非常により小さいが、より活性の高い生体分子-スペーサーコンジュゲートをinvivoで生成するために、全てのポリマー部分moietiesをゆっくりと放出することができる。したがって、相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートタイプ1a、IIa、Ib又はIIbの量は、invivoでゆっくりと減少し、invivoの酵素で制御されるメカニズムを介して、より小さなサイズの生体分子-ポリマー又は生体分子-スペーサーコンジュゲートの同期した持続的放出を提供する。invivoのハイブリッド生体分子-ポリマーコンジュゲートは、コンジュゲートの複数の効果を統合し、したがって、増大した複合生物活性と、相乗性PK及びPDの特性とを提供する。実施例以下の例は本発明の特定の態様を例示し、これらに限定するものではない。Fmoc-LysBoc-20KmPEGエステル1ジシクロヘキシルカルボジイミド166mg、0.8mmolが、氷水浴で冷却した無水ジクロロメタン中の20kDamPEG1g、0.05mmol及びFmoc-LysBoc-OH117mg、0.25mmol溶液に添加され、混合液は窒素下で攪拌され、一晩室温に温められた。Ν,Ν’-ジシクロヘキシル尿素が濾過によって反応混合液から除去された。濾液は真空で乾燥された。残渣は無水ジクロロメタンに溶解され、白色固体がtert-ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿された。白色固体の生成物1が収集され、tert-ブチルメチルエーテルで洗浄された。Fmoc-Lysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル34mLのトリフルオロ酢酸が、無水ジクロロメタン4mL中のFmoc-LysBoc-20KmPEGエステル10.8g、0.04mmol溶液に添加された。反応は1時間室温で攪拌され、白色固体がtert-ブチルメチルエーテル70mLによって沈殿された。固体の生成物Fmoc-Lys-20KmPEGエステル2が収集され、tert-ブチルメチルエーテルによって洗浄された。無水塩化メチレン9mL中のFmoc-Lys-20KmPEGエステル20.35g、0.018mmol、10KmPEGスクシンイミジルカーボネートSC-mPEG225mg、0.022mmol及びトリエチルアミン110mg、1.08mmol溶液が、窒素下の室温で一晩攪拌された。反応混合液は、真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮された。生成物Fmoc-Lysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル3は、tert-ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿され、濾過され、そして、収集された。生成物3は、クロマトグラフィーによってさらに精製できる。30kDaLysα-10kPEGカルバメート、20kPEGエステルスベリン酸スクシンイミジルエステル5Fmoc-Lysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル30.5g、0.016mmolは、11mLのジクロロメタン/ジエチルアミン5:6混合液に溶解され、反応混合液は室温で3.5時間攪拌された。固体の生成物4は、tert-ブチルメチルエーテル70mLを添加することによって沈殿され、濾過され、そして、収集された。無水塩化メチレン7mL及びジメチルホルムアミド3mLの混合液中のLysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル40.4g、0.013mmol、スベリン酸ビスN-ヒドロキシスクシンイミドエステル26mg、0.07mmol及びトリエチルアミン3mg、0.03mmol溶液が、窒素下の室温で9時間攪拌された。反応混合液は真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮され、白色固体がtert-ブチルメチルエーテルを添加することによって沈殿された。固体の生成物5が収集され、tert-ブチルメチルエーテルによって洗浄された。Lysα-10KmPEG、アミド-20KmPEGエステルスベリン酸スクシンイミジル6本実施例では、エステル-α-アミド-混合型-連結の分枝状PEG誘導体6が、10kダルトンSC-PEGが10kダルトンmPEG-SCMmPEGスクシンイミジルカルボキシメチルに置換されることを除いては、実施例1、2及び3に記載された方法で合成された。mPEG-SCM:CH3O-CH2CH2On-CH2-CO2-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル。Lysε-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステルα-スベリン酸スクシンイミジル7本実施例では、エステル-ε-カルバメート-混合型-連結の分枝状PEG誘導体7は、Fmocステップの非ブロック化が、t-Bocステップの非ブロック化の前に行われたことを除いては、実施例1、2及び3に記載された方法で合成された。Lysε-10KmPEG、アミド-20KmPEGエステルα-スベリン酸スクシンイミジル8本実施例では、エステル-ε-アミド-混合型-連結の分枝状PEG誘導体8は、10kダルトンSC-PEGが、10kダルトンmPEG-SCMmPEGスクシンイミジルカルボキシメチルに置換されることを除いては、実施例5に記載された方法で合成された。mPEG-SCM:CH3O-CH2CH2On-CH2-CO2-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル。3-マレイミドプロピオニルLysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル97mLの無水塩化メチレン/ジメチルホルムアミド5:2混合溶媒中のLysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル40.3g、0.01mmol、3-マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシシンイミドエステル18.6mg、0.07mmol及びトリエチルアミン7.1mg、0.07mmol溶液が、窒素下、室温で一晩攪拌された。反応混合液は真空下で溶媒を部分的に除去することによって濃縮され、白色固体がtert-ブチルメチルエーテル80mLを添加することによって沈殿された。固体の生成物9は収集され、tert-ブチルメチルエーテルによって洗浄された。30kDa3-マレイミドプロピオニルLysα-10KmPEG、カルバメート-20KmPEGエステル相乗性生体分子-PEGコンジュゲートを生成するためのスルフヒドリルチオ含有生体分子との共役に用いられる。相乗性インターフェロンα-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲートの調製5mLの2mM酢酸5mL中の組換えインターフェロンα2.8mg/mLは、2mLの350mMリン酸緩衝液、pH8と混合された。平衡化後、82mgのLysα-10kPEGカルバメート、20kPEGエステルスベリン酸スクシンイミジルエステル5、活性化30,000ダルトンの混合型-開裂可能-連結の分枝状PEGがIFN-α溶液に徐々に添加され、室温で3時間攪拌された。モノ、ジ及びトリPEG分枝状ポリマー組成物x=1ないし3を含むIFN-α反応混合液は、30kダルトンの分子量分画膜ザルトリウスステディムビバスピン20を用いて濃縮され、所望の相乗性インターフェロンα-2b-30kPEGコンジュゲートを収集するために、サイズ排除又はイオンクロマトグラフィーによってさらに精製された。収集された相乗性インターフェロンα-モノ30kPEGコンジュゲートは、30kダルトンの分子量分画膜ザルトリウスステディムビバスピン20を用いて濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィー及びSDS-PAGE電気泳動で確認された。インターフェロン-α-2b-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲートの分解と、10kPEG-インターフェロンの放出とに対しての実験は、ヒトの血漿で37°Cで行われた。持続性のカルバメート及び放出可能なエステルの連結を含む、相乗性インターフェロンα-30kPEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲートは、ヒト血漿で37°Cで0.5から36時間までの範囲のさまざまな時間インキュベーションされた。一定分量の血漿サンプルは回収され、アセトニトリル、又は、アセトニトリル/メタノールの有機溶媒で処理され、ボルテックスされ、遠心分離され、そして、濃縮された。その後、溶液残渣は、10kPEG-インターフェロン-α-2bの放出を確かめるため、サイズ排除クロマトグラフィーによって、若しくは銀又はヨウ素染色でbis-Tris4-12SDS-PAGEゲルで分析された。生物学的データ本実施例では、IFNα-2b、IFN-12kPEG及び実施例8からの相乗性30kIFNα-2b-PEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲートのinvitroの抗ウイルス活性が、EMCVで感作されたNewWish細胞を用いるCPEアッセイで決定された。この細胞変性効果アッセイは、ウイルスに誘導された細胞溶解でのインターフェロンの阻害効果を測定する。アッセイのエンドポイントは、ウイルスで誘導された標的細胞を50保護するIFNの希釈物である。インターフェロンの存在量は、インターフェロンの参照基準と比べて決定される。相乗性30KIFNα-2b-PEGの抗ウイルス活性は、IFNα-2bの抗ウイルス活性の約12であった。結果が表1に記載される。薬動力学的パラメーター本実施例では、さまざまな薬動力学的データがBALB/Cマウスへの皮下注射後にもたらされた。薬動力学的パラメーターは、3日間にわたって取られた時点の同一量のインターフェロンを摂取しているマウス4匹の血液から得られた平均値を用いて決定された。IFN-α-2b-12kPEG及び相乗効果-30kIFNα-2b-PEGに対して、血液サンプルは、注射後1、6、24、48及び72時間で取り出された。IFNα-2bに対して、血液サンプルは、注射後1、3、6及び24時間で取られた。その後、PKパラメーターが、時間に対する抗ウイルス活性のプロットから評価され、評価された。比較薬動力学的パラメーターが表に記載される。皮下注射の場合に、薬動力学的データは、30kダルトンの分子量の混合型-持続性-開裂可能-連結の分枝状PEGポリマーとともに調製された相乗効果30kIFNα-2b-PEGは、哺乳類において、天然のインターフェロンα-2bや、従来のPEGリンカーと結合したIFNα-2b-12kPEGよりも非常に優れていることを表す。相乗効果30kIFNα-2b-PEGの血清半減期は、非修飾型のインターフェロンα-2bや、IFNα-2b-12kPEGそれぞれの血清半減期と比較して71及び3.3倍で予想外に長い。相乗性30kIFNα-2b-PEGのハイブリッド相乗作用は、非修飾型のインターフェロンα-2bと比較して、50倍をこえる血漿AUCの予想外の顕著な増加をもたらす。ましてやなおさら予想外だったのは、相乗効果30kIFNα-2b-PEGでさえも、IFNα-2b-12kPEGと比較して、2.6倍の予想外に長いAUCを有する。本発明の相乗効果IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートの薬動力学的は、大きいIFN-30kPEGコンジュゲートと、小さい10kIFN-α-PEGコンジュゲートとの2つのPK特性を統合し、時間に対する血清抗ウイルス活性の非常に均一なプロファイルを提供する。pKのデータは、継続的な抗ウイルス保護を提供するinvivoで増加した、持続した、及び、着実なインターフェロン活性のレベルを示す。また、持続した抗ウイルス活性、より長い血清半減期、及び、より大きなAUCは、相乗作用IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートは、より効果があり、臨床的に、より大きく持続したウイルス学的応答の達成をもたらすことができることを示す。明らかに、相乗性30kIFNα-2b-PEG10kmPEGカルバメート、20kmPEGエステルコンジュゲートは、哺乳類で非修飾型のIFNα-2b及びIFNα-2b-12kPEGを超える確かなメリットを有する。相乗性IFN-α-30kPEGα、βコンジュゲートは、C型肝炎に対して投与量、投与頻度、又は治療期間の低減をもたらすことができる総合的な薬動力学的及び薬物動態学的な特性を予想外に改善する。BOC:tert.ブチルオキシカルボニルFmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニルmPEG20K:mPEG分子量20KダルトンmPEG10K:mPEG分子量10Kダルトン本発明の開裂可能-連結-ポリマーのリンカーに結合することによって効果的に修飾することができるタンパク質、高分子及び低分子の治療剤を含む数千の生体分子が存在することが強調されるべきである。本発明の相乗性生体分子-ポリマーコンジュゲートは、増加した及び持続した生物活性、増大したPK及びPDの特性、延長した循環半減期、低減した毒性、及び、増大した効能などの従来のペグ化生体分子コンジュゲートを超える多くの可能性のある臨床的メリットをもたらすことができる、生体分子の独特な、酵素で制御された持続的放出及びハイブリッド相乗効果システムである。"