1以上のシステイン残基を介してFVIIIに共役する、生体適合性ポリマー。1以上の還元型システインジスルフィド結合を介してFVIIIに共役する、請求項1に記載の生体適合性ポリマー。FVIIIでジスルフィド結合を形成した2つのシステイン残基の硫黄残基を架橋するリンカー基によってFVIIIに共役する、請求項2に記載の生体適合性ポリマー。前記リンカー基が、基R1前記R1は、直接結合、C1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリール基もしくはヘテロアリール基であるを介して前記生体適合性ポリマーと共役する、請求項3に記載の生体適合性ポリマー。R1が、フェニル、ベンゾイル、ナフチル、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、またはプリンから選択される、請求項4に記載の生体適合性ポリマー。FVIIIのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の2つの硫黄原子間のリンカー基が、3-炭素架橋を有する、請求項3~5のいずれか1項に記載の生体適合性ポリマー。FVIIIのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の2つの硫黄原子間のリンカー基が、CH22CHCO-である、請求項3~6のいずれか1項に記載の生体適合性ポリマー。前記共役体が、下記構造:この際、R1は、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり;前記アリール基が、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み;適当なヘテロアリール基が、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み;前記ポリマーへの連結が、加水分解に不安定な結合、または安定な結合によるものである、を有する、請求項1~7のいずれか1項に記載の生体適合性ポリマー。約5~100kDaの分子量を有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の生体適合性ポリマー。請求項1~9のいずれか1項に記載の1以上のシステイン残基を介してFVIIIに共役する生体適合性ポリマーを含む、薬剤組成物。製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体を含む、請求項10に記載の薬剤組成物。他の薬剤活性のある物質をさらに含む、請求項10または11に記載の薬剤組成物。非経口投与に適する、請求項10~12のいずれか1項に記載の薬剤組成物。皮内、皮下、および筋肉内注射、並びに静脈内または骨内注入に適する、請求項10~13のいずれか1項に記載の薬剤組成物。溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態を有する、請求項10~14のいずれか1項に記載の薬剤組成物。前記FVIII共役体が、未修飾のFVIIIと比べて長い半減期を有する、請求項10~15のいずれか1項に記載の薬剤組成物。前記FVIII共役体が、未修飾のFVIIIと比べて高いAUCを有する、請求項10~16のいずれか1項に記載の薬剤組成物。前記FVIII共役体が、未修飾のFVIIIと比べて高いバイオアベイラビリティを有する、請求項10~17のいずれか1項に記載の薬剤組成物。前記FVIII共役体が、未修飾のFVIIIと比べて低い免疫原性を有する、請求項10~17のいずれか1項に記載の薬剤組成物。請求項10~19のいずれか1項に記載の薬剤組成物を必要のある患者に投与することを含む、血液凝固疾患または外傷の治療方法。前記血液凝固疾患が、血友病Aである、請求項20に記載の治療方法。請求項12~21のいずれか1項に記載のFVIII共役体を含む薬剤組成物を、必要のある患者に投与することを含む、血友病A、または外傷を有する哺乳動物の関節血症、出血、胃腸出血、および月経過多症の危険性を低減する方法。前記組成物が、皮下に投与される、請求項22に記載の方法。前記組成物が、静脈内に投与される、請求項22に記載の方法。前記組成物が、1~14日に1度投与される、請求項22に記載の方法。FVIIIの機能の欠損の特徴を有する血液凝固疾患の治療、または外傷の治療に使用される1以上のシステイン残基を介してFVIIIに共役する、生体適合性ポリマー。下記:この際、R1は、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり;前記アリール基が、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み;適当なヘテロアリール基が、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み;前記ポリマーへの連結が、加水分解に不安定な結合、または安定な結合によるものである、の生体適合性ポリマーおよびFVIIIの共役体の調製方法であって、aFVIIIの2つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、2つの遊離チオール基を生成し;b共役二重結合を有する共役試薬および脱離基の第1のチオレート付加反応を行い;c前記脱離基の脱離によって、共役二重結合を生成し;さらにd第2のチオレート付加反応を行い、2つの硫黄原子間に3-炭素架橋を形成することを含む、方法。前記共役試薬は、下記式:この際、R1は、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基である置換基であり;前記アリール基が、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み;適当なヘテロアリール基が、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み;前記ポリマーへの連結が、加水分解に不安定な結合、または安定な結合によるものであり、およびLが、脱離基である、を有する、請求項27に記載の方法。本発明の第一の態様によると、1以上のシステイン残基を介してFVIIIに共役した生体適合性ポリマーが提供される。前記生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコールPEG、ポリ-ホスファチジルコリンPC、ポリプロピレングリコールPPG、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体、ポリエチレンオキシドPEO、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリサッカライド、ポリα-ヒドロキシ酸、ポリビニルアルコール、ポリホスホスファスファゼン、ポリN-アクリロイルモルフォリン、ポリアルキレンオキシドポリマー、ポリマレイン酸、ポリDL-アラニン、カルボキシメチルセルロール、デキストラン、デンプンまたはデンプン誘導体、ヒアルロン酸、キチン、ポリメタクリレート、ポリシアル酸PSA、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリアミノ酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されうる。前記生体適合性ポリマーは、直鎖または分岐鎖の構造を有していてもよい。さらなる実施形態においては、生体適合性ポリマーは、制限されないが、FVII、アルブミン、トランスフェリン、モノクローナル抗体、抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体、VL、VH、Fab、Fab’2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fc及、およびこれらの組み合わせ等の免疫グロブリンからなる群から選択されるタンパク質でありうる。1以上の生体適合性ポリマーが、必要であれば1以上のシステイン残基を介して各FVIII分子に共役してもよい。遊離システイン残基は、システインジスルフィド結合を還元した結果である。本発明に係る生体適合性ポリマーは、1以上の還元型システインジスルフィド結合を介してFVIIIに共役してもよい。前記共役は、FVIIIでジスルフィド結合を形成した2つのシステイン残基の硫黄残基を架橋するリンカー基によるものであってもよい。前記ジスルフィド結合は、したがって、天然のジスルフィド結合であっても、組換により導入されたジスルフィド結合であってもよい。前記PEG分子は、任意の適当な分子量、例えば、5~100kDa、10~500kDa、好ましくは5~30kDaまたは10~30kDaを有していてもよい。適当な分子量としては、10、20、または30kDaを含む。好ましくは、FVIII共役体の生体適合性ポリマー部分は、2つのシステイン残基に結合してもよく、これによりFVIIIにジスルフィド結合を形成する。したがって、リンカーを含むPEGはジスルフィド結合を架橋する。このような共役方法の例は、国際公開第2005007197号、国際公開第2009047500号、および国際公開第2010010324号に記載される。本発明の一実施形態において、生体適合性ポリマーは、図2に示されるスキームに従ってFVIIIに共役できる。図2では、基R1が生体適合性ポリマーおよびFVIII分子のジスルフィド結合の硫黄原子を結ぶリンカー基の間に示される。R1は、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基でありうる置換基を示し;この際、アリール基は、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み;適当なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み;ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合、または安定な結合によるものである。アリールまたはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基は、例えば、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N--NR’COR、-NR3、-NH3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、-C≡CR、-C=CR2、および13C=CHRこの際、RまたはR’は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基好ましくはC1-6またはアリール好ましくはフェニル基を表すから選択される1以上の同一または異なる置換基を含む。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。一実施形態において、R1の置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基は、R1ユニットを生体適合性ポリマーに連結するアミドNHCO基で置換されたアリールまたはヘテロアリール基を含む。FVIIIのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の2つの硫黄原子間のリンカー基は、3-炭素架橋を有していてもよい。一実施形態において、FVIIIのシステイン残基間の元のジスルフィド結合の2つの硫黄原子間のリンカー基は、CH22CHCO-である。本発明の一実施形態において、前記生体適合性ポリマーは、上記のようにして共役してもよく、この際、生体適合性ポリマーに共役したFVIIIを含む組成物は下記構造を有する:本発明の最も広義な意味では、前記試薬は下記のように表されうる:この際、R1は上記と同様の定義であり、およびLは脱離基である。Lは、-SR、-SO2R、-OSO2R、-NR3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン例えば、フッ素または塩素、または-OWを表してもよく、この際、Rは、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基例えば、C1-6アルキルまたはアリール基例えば、フェニルを表し、Wは、少なくとも1個の電子求引性置換基を含む置換されたアリール基例えば、フェニルを表す。一実施形態において、前記脱離基LがSO2R2この際、R2は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基例えば、C1-6アルキルまたはアリール基例えば、フェニルを表すであり、R1は上記と同様の定義であり、前記共役試薬は、下記式を有する:一実施形態において、前記生体適合性ポリマーはPEGであってもよく、前記脱離基は-SO2R2であってもよく、この際、R2は上記と同様の定義であり、前記試薬は下記のとおりである:本発明の他の実施形態において、前記共役試薬は、生体適合性ポリマーがアミド部分CONHを介して連結する特定の配列から形成されてもよく、この際、Lは上記と同様の定義の脱離基である。換言すると、R1はR3-CONHであり、前記試薬は下記式を有する:R3は、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、または置換されてもよいアリールもしくはヘテロアリール基でありうる置換基を示し;この際、アリール基は、フェニル、ベンゾイル、およびナフチル基を含み;適当なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンを含み;ポリマーへの連結は、加水分解に不安定な結合、または安定な結合によるものである。アリールまたはヘテロアリール基に存在しうる特定の置換基は、例えば、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N--NR’COR、-NR3、-NH3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン、例えば、フッ素または塩素、-C≡CR、-C=CR2、および13C=CHRこの際、RまたはR’は、それぞれ独立して、水素原子またはアルキル基好ましくはC1-6またはアリール好ましくはフェニル基を表すから選択される1以上の同一または異なる置換基を含む。電子求引性置換基の存在が特に好ましい。部分CONHが存在し、前記脱離基が-SO2R2であり、R2およびR3が上記と同様の定義である一実施形態において、前記試薬は下記のとおりである:前記共役試薬の上記と同様の定義のR1における置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基がアミドNHCO基によって置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり、R3が上記と同様の定義であるこのような実施形態において、前記共役タンパク質の構造は下記のとおりでありうる:生体適合性ポリマーがPEGである場合、PEGがポリエチレン部分であり、Lが上記した定義と同様の脱離基である、本発明の本実施形態における共役試薬は、下記のとおりである:反応条件が中性または若干塩基性である場合には、下記試薬が使用されうる:より酸性の条件では、上記試薬は以下に示される下記分子、PEGモノ-スルホンを形成してもよく、これはまた本明細書に記載される共役反応への使用に適する。前記第VIII因子は、任意の好適な原料由来のものでありうる。第VIII因子は組換DNA技術を使用して生産されてもよく、または血漿から精製されてもよい。第VIII因子は、その活性断片または突然変異タンパク質を含む。本明細書中で使用される突然変異タンパク質との語は、元のFVIIIと比較して得られた産物の活性を顕著に変化させることなく、FVIIIの天然成分の1以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換されるもしくは欠失する、または1以上のアミノ酸残基がFVIIIの元の配列に付加する、FVIIIタンパク質のアナログを意味する。これらの突然変異タンパク質は、既知の合成法および/もしくは部位特異的突然変異誘発技術、または上記に適切な他の既知の技術によって調製される。本発明に係る突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下で、本発明に係る、FVIIIをコード化する、DNAまたはRNAにハイブリダイズする、DNAまたはRNA等の核酸によってコード化されるタンパク質を含む。ストリンジェントな条件との語は、ハイブリッド形成および次の洗浄条件を意味し、当業者はこれを従来ストリンジェントと称するSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY。下記に制限されるものではないが、ストリンジェントな条件の例としては、例えば5分間、2×SSCおよび0.5SDS、15分間、2×SSCおよび0.1SDS;37°Cで30~60分間、0.1倍SSCおよび0.5SDS、並びにその後68°Cで30~60分間、0.1×SSCおよび0.5SDS中で、研究されるハイブリッドの計算上のTm未満の12~20°Cの洗浄条件を含む。当業者は、ストリンジェントな条件は、DNA配列、オリゴヌクレオチドプローブ10~40塩基等、またはオリゴヌクレオチドプローブ混合物の長さによっても異なることは理解している。プローブ混合物を使用する場合には、SSCの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリドTMACを使用することが好ましい。このような突然変異タンパク質は、実質的に同様の、またはより高いFVIIIへの活性を有するように、FVIIIの配列と十分重複したアミノ酸配列を有することが好ましい。FVIIIの特徴的な活性の一つとしては、血液凝固カスケードへの参加能があり、FVIII活性を検出するためのアッセイは本明細書に記載される。突然変異タンパク質がかなりのFVIII活性を有する限り、これはFVIIIと実質的に同様の活性を有すると考えられうる。ゆえに、このような突然変異タンパク質を本明細書に記載されるアッセイにかけることを含む定常的な実験によって、所定の突然変異タンパク質が少なくとも実質的にFVIIIと同じ活性を有するかどうかを決定できる。好ましい実施形態において、このような突然変異タンパク質は、FVIIIのアミノ酸配列と少なくとも40の同一性または相同性を有する。より好ましくは、FVIIIのアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、または最も好ましくは少なくとも90、95もしくは99の同一性または相同性を有する。同一性は、配列を比較することによって決定される、2以上のポリペプチド配列または2以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。通常、同一性は、比較する配列の長さにわたって、それぞれ、2つのポリヌクレオチドまたは2つのポリペプチド配列の精密なヌクレオチド-ヌクレオチドまたはアミノ酸-アミノ酸の対応を意味する。精密な対応が存在しない配列では、同一性が測定される。通常、比較される2つの配列を、配列間の最大の相関性があるように並べる。これは、アライメントの度合いを上げるために、1または2つの配列中にギャップを挿入することを含みうる。同一性は、比較されるそれぞれの配列の全長にわたって測定されてもよくいわゆる、グローバルアライメント、これは同じまたは極めて類似の長さの配列に特に適切であり、またはより短い所定の長さにわたって測定されてもよくいわゆる、ローカルアライメント、これは長さが異なる配列により適切である。2以上の配列の同一性または相同性を比較する方法は当該分野において既知である。ゆえに、例えば、WisconsinSequenceAnalysisPackageversion91で利用できるプログラム、例えば、プログラムBESTFITおよびGAPを用いて、2つのポリヌクレオチド間の同一性や2つのポリペプチド配列間の同一性や相同性を測定してもよい。BESTFITは、SmithandWatermanのローカルホモロジーアルゴリズムを使用し、2つの配列間で類似する最適な単一の領域を見出す。配列間の同一性および/または類似性を測定する他のプログラムもまた当該分野において既知であり、例えば、プログラムwwwncbinlmnihgovのNCBIのホームページでアクセス可能のBLASTファミリーやFASTAがある。本発明に従って使用できるFVIIIの突然変異タンパク質は、本明細書に提示される教示やガイダンスに基づいて、過度の実験を必要とすることなく、当業者によって定常的に得られる置換ペプチドとして実質的に相当する配列の有限なセットを含む。本発明に係る突然変異タンパク質の好ましい変更は、同類置換として知られているものがある。FVIIIの同類アミノ酸置換は、グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するような十分に同様の生化学的特性を有するグループ内の同義的アミノ酸を含む。アミノ酸の挿入および欠失はまた、特に挿入または欠失が数個のアミノ酸、例えば、30個以下、好ましくは10個以下を含み、機能的な立体配置に重要なアミノ酸、例えば、システイン残基を除去または置換しない場合には、その機能を変えることなく上記配列中でなされてもよいことは明らかである。このような欠失および/または挿入によって生産されたタンパク質および突然変異タンパク質は本発明の技術的範囲に含まれる。ゆえに、アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、しばしば他のアミノ酸脂肪族側鎖を有するアミノ酸に置換されてもよい。これらの可能性のある置換のうち、比較的短い側鎖を有することからグリシンおよびアラニンを他のアミノ酸の置換に使用すること、並びに疎水性のより大きな脂肪族側鎖を有することからバリン、ロイシン、およびイソロイシンを他のアミノ酸の置換に使用することが好ましい。他のアミノ酸に置換されることの多い他のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン芳香族側鎖を有するアミノ酸;リジン、アルギニン、およびヒスチジン塩基性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩酸性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギンおよびグルタミンアミド側鎖を有するアミノ酸;並びにシステインおよびメチオニン硫黄含有側鎖を有するアミノ酸を含む。このような置換は、しばしば同類または半同類アミノ酸置換と称する。本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸変更は、適当な技術を用いることによって、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いることによってなされる。本発明の技術的範囲に含まれるアミノ酸置換または挿入が、天然または非天然のアミノ酸を用いて作製できることは理解されるべきである。天然または合成アミノ酸を使用するか否かにかかわらず、L-アミノ酸のみが存在することが好ましい。加えて、FVIIIおよび他のペプチドまたはタンパク質断片を含む融合タンパク質はまた、融合タンパク質がFVIIIの活性を保持する場合に使用されうる。本明細書における融合タンパク質との語は、一般的な意味では、水素結合または塩架橋等の化学的な手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結合によって、または双方によって、1以上のタンパク質が一緒に結合することを意味する。本明細書中で使用される機能的誘導体との語は、FVIIIの誘導体、およびこれらの突然変異タンパク質を包含し、これらは、残基の側鎖として生じる官能基から調製されてもよく、または当該分野において既知の手段によってN-もしくはC-末端基への付加であり、製薬上許容できる限り、即ち、FVIIIの活性と実質的に同等であるタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を付与しない限り、本発明に包含される。これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第1級もしくは第2級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分例えば、アルカノイルまたはカルボキシルアロイル基を用いて形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN-アシル誘導体、または、例えば、使用できるヒドロキシル基のグリコシル化等を含む、アシル部分を用いて形成される遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体例えば、セリルまたはトレオニル残基の誘導体を含む。本発明に係るFVIIIの活性断片は、本明細書に記載されるようなFVIIIの断片または突然変異タンパク質であってもよい。断片との語は、分子のサブセット、すなわち、所望の生物学的活性を保持するより短いペプチドを意味する。断片は、FVIIIのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、得られた断片について本明細書に記載されるようにその性質を試験することによって容易に調製されうる。ポリペプチドのN-末端またはC-末端のいずれかから一度に1個のアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは既知であり、所望の生物学的活性を保持する断片を決定することは、定常的な実験を含むのみである。FVIIIの活性画分、その突然変異タンパク質および活性断片として、本発明は、当該画分がFVIIIと実質的に同等の活性を有する場合には、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片もしくは前駆体単独、または、これらと結合する関連分子もしくは残基、たとえば、糖もしくはホスフェート残基、または前記タンパク質もしくはこれらの糖の残基の凝集体をともに包含する。本明細書における塩との語は、FVIII分子またはその類似体のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の双方を意味する。カルボキシル基の塩は、当該分野において既知の手段によって形成され、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、または亜鉛塩等、および例えば、トリエタノールアミン等のアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成される塩等の有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、鉱酸、例えば、塩酸または硫酸との塩、および有機酸、例えば、酢酸またはシュウ酸との塩が挙げられる。いうまでもなく、このような塩は、本明細書に記載されるFVIIIの生物学的活性を保持している必要がある。本明細書において使用される第VIII因子共役体またはFVIII共役体との語は、生体適合性ポリマー部分を含むように修飾された第VIII因子を意味し、これは、未修飾の第VIII因子と比べて改善された薬物動態学的特性を有する。前記薬物動態学的プロファイルにおける改善は、後述のパラメータ:効力、安定性、濃度曲線下面積、循環半減期、および免疫原性または交差反応性の1以上における改善として見られる。未修飾FVIIIに比べて、本発明のFVIII共役体は、未修飾FVIIIに比べた場合の、濃度曲線下面積AUC、Cmax、クリアランスCL、半減期、血漿滞留時間、およびバイオアベイラビリティを含む、薬物動態学的特性の1以上の改善を示す。患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書で使用される濃度曲線下面積またはAUCは、0から無限大の時間の関数としての患者の体循環での薬剤濃度を記載する濃度曲線下の全面積として規定される。本明細書中で使用される、クリアランスまたは腎クリアランスとの語は、1分あたりに排出される一定薬剤量を含む血漿の容積として規定される。患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される半減期またはt1/2との語は、患者の薬剤の血漿濃度が半分に減少するのに必要な時間として規定される。複数のクリアランスメカニズム、再分配、および当該分野において既知の他のメカニズムによってペプチド薬剤と関連する半減期がより長くなる場合がある。一般的に、アルファ相およびベータ相半減期は、アルファ相が再分配に関連し、ベータ相がクリアランスに関連するように規定される。しかしながら、ほとんどで、血流に限定されるタンパク質薬剤では、少なくとも2種のクリアランス半減期が存在しうる。アルファ相およびベータ相半減期へのPEG化の正確な影響は、当該分野において既知であるように、大きさおよび他のパラメータによって変化するであろう。半減期のさらなる説明は、PharmaceuticalBiotechnologyに見出される。患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される滞留時間との語は、投薬後に患者の体内に薬剤がとどまる平均時間として規定される。患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される免疫原性との語は、投薬後、または繰り返し投薬後の、薬剤の患者の免疫応答の誘発しやすさとして規定される。患者にペプチド薬剤を投与する際の、本明細書中で使用される交差反応性との語は、非共役薬剤の、投薬後、または繰り返し投薬後の、薬剤が患者に生じている抗体に結合する傾向として規定される。FVIII共役体は、例えば、非共役のFVIIIと比較して、治療的有用性を提供する。このような治療的有用性としては、特に制限されないが、循環半減期の増加、免疫原性の減少、交差反応性の低減、活性の上昇、必要投与量の低減、および別の投与経路の可能性例えば、皮下を含む。本発明によると、生体適合性ポリマーとのFVIIIの共役体は、薬剤組成物におけるFVIIIの利用可能性を促進する。さらに、生体適合性部分は、FVIIIを分解および抗体反応から保護しうる。FVIII共役体は、循環半減期を延ばし、これにより、投与量の節約効果が得られ、投与回数を減少できる。第VIII因子は、ジスルフィド結合でPEGと共役するためのPolyTherics社のTheraPEG商標技術を用いてPEG化されうる。多くのモノPEG化第VIII因子FVIIIは、例えば、10、20、および30kDaのPEG試薬を用いて調製される。前記PEG化FVIIIの凝集活性は、凝固アッセイを用いてinvitroで試験されうる。第VIII因子は、数十年間市販されており、また、血液製剤としての血漿ドナーから精製され、または組換DNA技術により製造されうる。FVIIIとの共役体を形成するであろうポリエチレングリコールポリマーはいくつかの異なるタイプがある。単一ポリエチレングリコール鎖を有する直鎖のPEGポリマーがあり、分岐鎖のまたは分岐したPEGポリマーがある。分岐鎖のポリエチレングリコールは、統一基を介して一緒に結合する2以上の別の直鎖のPEG鎖を含む。例えば、2個のPEGポリマーがリジン残基によって一緒に結合してもよい。一方の直鎖のPEG鎖がα-アミノ基に結合し、他方のPEG鎖がε-アミノ基に結合する。リジンコアの残りのカルボキシル基は、タンパク質に共有結合するために利用可能な状態で残っている。直鎖および分岐鎖のポリエチレングリコールポリマーの両方はある範囲の分子量で市販されている。本発明の一態様では、FVIII-PEG共役体は、FVIIIに結合した1以上の直鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各PEGは、約2kDa~約100kDaの分子量を有する。本発明の他の態様では、FVIII-PEG共役体は、FVIIIに結合した1以上の直鎖のポリエチレングリコールポリマーを含み、この際、各直鎖のPEGは、約5kDa~約40kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のPEGは、約10kDa~約30kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のPEGは、約20kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各直鎖のPEGは、約10kDa未満の分子量を有する。特定の実施形態において、FVIII-PEG共役体がFVIIIに結合した1超の直鎖のPEGポリマーを含む場合には、例えば、2、3、または8個までの直鎖のPEGポリマーがFVIIIに結合する。実施形態によっては、FVIII-PEG共役体は複数の直鎖のPEGポリマーを含み、この際、各直鎖のPEGは約10~30kDaの分子量を有する。本発明のFVIII-PEG共役体は、FVIIIに結合した1以上の分岐鎖のPEGポリマーを含み、この際、各分岐鎖のPEGは約2kDa~約100kDaの分子量を有する。本発明の他の態様では、FVIII-PEG共役体は、FVIIIに結合した1以上の分岐鎖のPEGポリマーを含み、この際、各分岐鎖のPEGは約5kDa~約40kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のPEGは、約5kDa~約30kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のPEGは、約20kDaの分子量を有する。特定の実施形態においては、各分岐鎖のPEGは、約10kDa未満の分子量を有する。特定の実施形態において、FVIII-PEG共役体がFVIIIに結合した1超の分岐鎖のPEGポリマーを含む場合には、例えば、2、3、または8個までの分岐鎖のPEGポリマーがFVIIIに結合する。実施形態によっては、FVIII-PEG共役体は8個以下の直鎖のPEGポリマーを含み、この際、各分岐鎖のPEGは約10~30kDaの分子量を有する。FVIII-PEG共役体は、以下に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー等の当該分野において既知のクロマトグラフ法、アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離によって精製されうる。上述したように、PolyThericsは、部位特異的PEG化を目的としてタンパク質中の天然の硫黄原子の選択的化学を利用できるTheraPEG商標として知られる技術を開発した。この技術はまた、新規な硫黄含有基が組換または他の手段によって導入されたタンパク質およびペプチドに適用できる。PolyThericは、ジスルフィド結合がPEG連結炭素架橋の付加によってより安定にできること、および3次元構造を保持し、かつ、タンパク質の機能を維持しつつタンパク質中のジスルフィド結合にこのような修飾を行うことが可能であることを示す。これにより、初めて、ジスルフィド結合を形成して、天然のまたは選択的に操作されたタンパク質において部位特異的に目的とするタンパク質に生体適合性ポリマーを共役する2個の硫黄原子の共役チオール選択性を利用できるようになった。本アプローチの一例としては、PEG部分をFVIIIタンパク質に付加するまたはFVIIIをPEG化する技術を使用することがある。ジスルフィド架橋共役試薬は、相互マイケルおよびレトロマイケル反応されることが可能である潜在的に交差共役する系である。これにより、天然のジスルフィド基の還元によって生成した2個の遊離チオールが、もとのジスルフィド結合の2個の硫黄基を連結する3-炭素架橋を介して再アニールすることができる例えば、PEG部分を付加する共役反応の概略図に関する図2を参照。共役試薬は、FVIIIタンパク質をPEG化するのに使用される生体適合性ポリマーとしてPEGを含む場合には、PEG化試薬として記載されうる。機構的に、共役試薬の共役二重結合は、連続の付加反応を開始する必要がある。チオレート付加が起こると、残っているスルフィン酸部分が除去できる。これにより、第2のチオレートアニオンの付加および2つの硫黄原子間の3-炭素架橋の形成のための別の共役二重結合が生成する。最終産物は、炭素架橋のいずれかの側に2つの非常に安定なチオール-エーテル結合である。本発明の第2の態様によると、本発明の第一の態様に関連して規定された1以上のシステイン残基を介してFVIIIに共役した生体適合性ポリマーを含む薬剤組成物が提供される。本発明に係る薬剤組成物は、さらに製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体を含んでもよい。経口投与に適用される薬剤組成物は、カプセル等の不連続単位として、溶液、シロップ、または懸濁液として水性もしくは非水性液体における;または食用発泡体もしくはホイップとして;またはエマルジョンとして提示されてもよい。錠剤または硬質ゼラチンカプセルに適する賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩などが挙げられる。軟質ゼラチンカプセルと一緒に使用するのに適する賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液状ポリオールなどが挙げられる。溶液およびシロップの調製に使用されうる賦形剤としては、例えば、水、ポリオール、および糖が挙げられる。懸濁液の調製では、油例えば、植物油を使用して、水中油型または油中水型懸濁液が形成されうる。担体が固体である鼻腔内投与に使用される薬剤組成物は、鼻から吸い込むように、すなわち、鼻のそばに近づけた粉末の容器から鼻腔を介して急速吸入することによって、投与される、例えば、20~500ミクロンの粒径を有する粗粉末を含む。鼻腔用スプレーとして、または点鼻薬として投与されるための、担体が液体である適当な組成物は、活性成分の水性または油性溶液を含む。吸入用によって投与されるのに使用される薬剤組成物は、様々なタイプの定量加圧型のエアロゾル、ネブライザー、または吸入器によって生成する微粒子ダストまたはミストを含む。非経口投与に使用される薬剤組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象となるレシピエントの血液と製剤を実質的に等張にする溶質を含みうる、水性および非水性滅菌注射溶液;並びに懸濁化剤および増粘剤を含みうる、水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。注射溶液に使用されうる賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および植物油が挙げられる。本組成物は、単回投与用または頻回投与用容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアル瓶に入れられてもよく、また、使用する直前に、滅菌液、例えば、注射用水の添加のみが必要なフリーズドライ凍結乾燥状態で貯蔵されてもよい。即時調製の注射溶液および懸濁液を滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。通常、薬剤組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、塩本発明の物質はそれ自体が製薬上許容できる塩の形態で提供されてもよい、緩衝液、被覆剤、または抗酸化剤を含んでもよい。本組成物はまた、本発明の物質に加えて治療上活性のある薬剤を含んでもよい。本発明の薬剤組成物は、製薬上許容できる希釈剤、アジュバント、または担体と組み合わせて使用されてもよい。このような賦形剤としては、以下に制限されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられる。本薬剤組成物は、例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、骨内、鼻腔内、または他の経路などによって、患者の病気を治療するのに有効な効果的な公知の方法で投与されてもよい。治療でまたは予防として、活性剤を、注射可能な組成物として、例えば、滅菌水性分散液、好ましくは等張液として患者に投与してもよい。哺乳動物、特にヒトに投与する場合には、活性剤の1日あたりの投与量は0.01mg/kg体重以上であり、具体的には約1mg/kg程度であると予想される。ともかく、主治医が患者に最も適切であろう実際の投与量を決定するであろうし、これは患者の年齢、体重、性別、および応答性等の因子によって異なるであろう。上記投与量は、平均的な症例の具体例である。いうまでもなく、より高いまたはより低い投与量が好ましい場合もあり、このような場合も本発明の範囲に含まれる。本発明の物質の投与量は、処置すべき病気または疾患、処置すべき患者の年齢や状態などに応じて、広範な上限下限で変化し、最終的には、主治医が使用するのに適切な量を決定するであろう。この投与量は、必要に応じて頻繁に繰り返されてもよい。副作用が発症する場合には、一般的な臨床でのプラクティスに従って、投与の量および/または頻度を減らしてもよい。一実施形態においては、薬剤組成物を1~14日毎に1回投与してもよい。本発明の第三の態様によると、第二の態様の薬剤組成物および他の薬剤活性のある物質が提供される。上記他の薬剤活性のある物質は、FVIIIの活性を促進するまたは向上させるものであってもよく、例えば、他の血液凝固因子がある。本発明の薬剤組成物は、単独で、または治療用化合物もしくは分子、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、または抗生剤等の、他の化合物と組み合わせて使用されてもよい。このような他の化合物との投与は、同時であっても、別個であってもまたは順次であってもよい。化合物は、必要であれば指示書を含んでもよいキットの形態で調製されてもよい。好ましくは、本発明の薬剤組成物および他の治療用化合物は、必要とする患者に直接投与される。本発明はまた、本発明の薬剤組成物、および以下に制限されないが、経口投与用のカプセル、肺への投与用の吸入器及び静脈内投与用の注射溶液等の投与ビヒクルを含む部分のキットを提供する。本発明の第4の態様によると、本発明の薬剤組成物を血液凝固疾患を治療する必要のある患者に投与することを有する血液凝固疾患の治療方法が提供される。したがって、本発明の上記態様はまた、当該方法におけるこのような組成物の使用を包含する。血液凝固疾患は、血液凝固因子の機能の欠損または自己抗体の生成によって生じる可能性がある。血液凝固疾患の例としては、血友病A、後天的血友病Aがある。本明細書中で使用される、治療との語は、ヒトまたは非ヒト動物に有益でありうるいずれのレジメをも包含する。非ヒト動物の治療は、ウマおよびコンパニオンアニマル例えば、ネコやイヌならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科の動物等の農場/農業動物などの、家畜の治療にまで拡張される。治療は、現存の症状または疾患について行われても、または予防予防的治療を目的としてもよい。治療は、遺伝病または後天的な疾患に対してであってよい。治療は、急性または慢性の症状に対してであってよい。本発明の第5の態様によると、生体適合性ポリマーおよびFVIIIの下記共役体の調製方法が提供される。この際、前記方法は、aFVIIIの2つのシステイン残基間のもとのジスルフィド結合を還元して、2つの遊離チオール基を生成し;b共役二重結合を有する共役試薬および脱離基の第1のチオレート付加反応を行い;c前記脱離基の脱離によって、共役二重結合を生成し;さらにd第2のチオレート付加反応を行い、2つの硫黄原子間に3-炭素架橋を形成することを含む。このような方法において、前記共役試薬は、下記式を有していてもよい。前記共役試薬は、下記式:この際、R1は上記と同様の定義であり、Lは上記と同様の定義の脱離基である。本発明の上記実施形態のさらなる態様は、共役試薬の様々な構造に関して、上記したのと同様である。上記と同様の定義である置換基この際、R1およびR2は上記と同様の定義であるを有する、使用できる共役試薬の一例としては、下記のとおりである。この際、脱離基は、SO2R2として表されるスルフィニル基である。生体適合性ポリマーがPEGである場合には、共役試薬この際、R2およびR1は上記と同様の定義であるは下記のとおりでありうる。本発明の第2以降の好ましい態様は、必要であれば適宜修飾して、第1の態様と同様である。ここで、本発明を、下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は参考を目的とし、本発明を限定するものではない。ここで、本発明を、下記実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は詳細に説明するのみのために存在する。実施例1:FVIIIのジスルフィドPEG化ヒトFVIIIのジスルフィドPEG化を、ShaunaketalinNatChemBiol2006231231に記載される方法を改変した方法に従って行う。実施例2:ジスルフィド結合の還元TheraPEG商標PEG化方法は、ジスルフィド結合の還元が必要である。還元は、セレノシスタミンSeCysの存在または不存在下のいずれかにおいて、ジチオトレイトールDTT、2-メルカプトエタノール、またはトリス2-カルボキシエチルホスフィンTCEP等の好適な還元剤を用いて行われる。用いられる還元剤の濃度は、例えば、0.5~5mmのDTTまたは低い過剰モルのTCEPである。実施例3:FVIIIのPEG化FVIIIのPEG化のためにTheraPEG商標を使用する最初の評価が小スケール反応例えば、5~20μgFVIIIで行われる。これにより、PEG試薬を用いてPEG化FVIIIを再現性良く調製するのに使用される条件を同定できる。タンパク質分解を防止、またはタンパク質の安定性を支援するために、ベンズアミジンまたは他の添加剤が添加されうる。反応をスケールアップ例えば、0.2~0.3mgFVIIIして、初期のインビトロ評価用のPEG化FVIIIを作製する。異なるPEG分子量例えば、10、20、および30kDaおよび所定数の共役PEG部分例えば、1~8を有するPEG-FVIIIサンプルの範囲をインビトロ分析用に作製する。PEG化反応の温度の効果は、FVIIIのPEG-FVIIIへの変換率に効果があるかどうかを測定することによって評価されうる。ただし、初期のインビトロ評価が、高温例えば、10~30°CでPEG化産物の活性にマイナス効果があることを示す場合、以降の反応は低温例えば、2~10°Cで行われる。本技術分野において既知の様々な精製技術が、PEG化材料の単離および精製に用いられうる。このような技術としては、特に制限されないが、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、沈殿および膜を用いた分離を含む。さらにインビトロ評価用の材料のより大量に作製するために、反応を、例えば、1mgFVIIIにスケールアップさせる。小スケールの反応で決定した条件下で、FVIIIのPEG化体が調製される。精製後、PEG化産物を、例えば、SDS-PAGEまたはSE-HPLCで分析して純度を求め、好適なタンパク質アッセイ、例えば、BCAアッセイで定量される。これらの方法のすべては、当該技術分野の当業者において周知である。実施例4:PEG化FVIIIのインビトロ活性の評価FVIIIおよびPEG化FVIIIの活性は、クロマトグラフィーアッセイおよび修飾活性化部分トロンボプラスチン時間凝固アッセイを用いて測定される。クロマトグラフィーアッセイ前記クロマトグラフィーアッセイは、着色基質の形成によってFVIIIの活性を測定するものであり、凝固形成を伴わない。発色アッセイに係る工程の概略図である図3を参照。トロンビンによって活性化されると、第VIII:C因子は第IXa因子、リン脂質、およびカルシウムとともに酵素複合体を形成し、第X因子および第Xa因子を活性化する。第VIII:C因子は、第VIII:C因子の補因子活性を評価するための発色アッセイである。第IXa因子、リン脂質PLPs、およびカルシウムの一定量存在下、トロンビン活性化第VIII:C因子は、過剰となる一定濃度でアッセイに供給される第X因子を、第Xa因子に活性化する酵素複合体を形成する。この活性は、一定量および過剰量の第IXa因子の存在下において阻害要因となる第VIII:C因子の量に直接的に相関がある。次いで、生成された第Xa因子が、特異的第Xa因子着色基質Sxa-11における活性によって、正確に測定される。第Xa因子は、基質を開裂してpNAを放出する。生じたpNAの量は、第Xa因子活性に直接比例する。最終的に、アッセイしたサンプルにおける第VIII:C因子の量と、放出されたpNAの量によって、405nmのカラー現像で測定された、生じた第Xa因子活性との間には直接相関がある。第VIII因子の活性に基づく、5つの薬理学的な第VIII因子産物を用いたアッセイの比較研究は、Butenasらによって行われた2004104Abstract4012。凝固アッセイ凝固FVIIIの試験方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間aPTTに基づく一段階アッセイである。FVIIIは、第IXa因子、カルシウム、およびリン脂質の存在下、第X因子の第Xa因子への酵素的変換において、補酵素として作用する。凝固物の形成にかかる時間秒と、FVIII濃度の対数との間には、反比例の関係がある。組成物1.第VIII因子欠損血漿、HelenaBiosciences、カタログ番号51932.aPTT-ES試薬、HelenaBiosciences、カタログ番号53973.塩化カルシウム溶液、0.025mol/L希釈した試験サンプル25μlをインキュベートし、FVIII欠損血漿25μlを、予め加温したaPTT-ES試薬50μlとともにインキュベートさせる。活性化剤により接触システムが開始する。次いで、リン脂質の存在下、内因性経路の残りが行われる。37°Cで正確に3分インキュベーションを行った後、0.025mol/Lの塩化カルシウム50μlを添加し、凝固を開始させる。前記凝固時間は、SysmexCA50凝固分析器で測定した。FVIIIおよびPEG化FVIIIは、WHO国際FVIII基準NIBSCに対して測定される。未知のサンプルの活性レベルは、既知活性のFVIII標準物質の一連の希釈物から作成された検量線に対する、試験物質の様々な希釈物の凝固時間を比較することによって内挿され、また、1mL当たりの国際単位IU/mLで報告される。PEG化FVIIIの特異的凝固活性の保持率もまた算出される。PEG化FVIIIが未修飾のFVIIIと同じ速度で凝固するかどうかを評価するために、散乱光検出における2~80に変化する間の凝固時間を測定し、凝固時間を散乱光の変化率に対してプロットする。曲線の傾きは、凝固反応の速度とされる。これは、FVIIIおよびPEG化FVIIIの同じ4つの濃度を用いることによって行われる。