"ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することを特徴とする、ストラメノパイルの形質転換方法。ストラメノパイルがラビリンチュラ類である、請求項1に記載のストラメノパイルの形質転換方法。ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、請求項2に記載のストラメノパイルの形質転換方法。微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、請求項3に記載のストラメノパイルの形質転換方法。微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、請求項4に記載のストラメノパイルの形質転換方法。ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、請求項1ないし5のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、請求項6に記載のストラメノパイルの形質転換方法。脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、請求項7に記載のストラメノパイルの形質転換方法。脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、請求項7に記載のストラメノパイルの形質転換方法。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、請求項1ないし9のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、請求項1ないし10のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、請求項1ないし11のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、請求項12に記載のストラメノパイルの形質転換方法。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することを特徴とする、ストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。ストラメノパイルがラビリンチュラ類である、請求項14に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、請求項15に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、請求項16に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、請求項17に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、請求項14ないし18のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、請求項19に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、請求項20に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、請求項20に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、請求項14ないし22のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、請求項14ないし23のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、請求項14ないし24のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、請求項25に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。請求項14ないし26のいずれかに記載の方法により、ストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法。脂肪酸が不飽和脂肪酸である、請求項27に記載の方法。不飽和脂肪酸が炭素数18~22の不飽和脂肪酸である、請求項28に記載の方法。請求項27ないし29のいずれかに記載の方法により得られた高度に脂肪酸を蓄積させたストラメノパイルから取得した脂肪酸。脂肪酸組成の改変を目的としてその遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することにより形質転換されたストラメノパイル。ラビリンチュラ類である、請求項31に記載のストラメノパイル。ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、、請求項32に記載のストラメノパイル。微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、請求項33に記載のストラメノパイル。微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、請求項34に記載のストラメノパイル。ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、請求項31ないし35のいずれかに記載のストラメノパイル。脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、請求項36に記載のストラメノパイル。脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、請求項37に記載のストラメノパイル。脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、請求項37に記載のストラメノパイル。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、請求項31ないし39のいずれかに記載のストラメノパイル。ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、請求項31ないし40のいずれかに記載のストラメノパイル。さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、請求項31ないし41のいずれかに記載のストラメノパイル。脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、請求項42に記載のストラメノパイル。本発明は、ストラメノパイルの有用物質の産生能力を向上させるために、ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制して形質転換することを目的とする。ストラメノパイルの有用物質の産生に係わる遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制して有用物質の産生能力を改変することにより、ストラメノパイルが産生する脂肪酸組成の改変方法、ストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法、不飽和脂肪酸の製造方法、不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイル、これら不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイルから不飽和脂肪酸を生産して提供することを目的とする。本発明により、ストラメノパイルが産生する脂肪酸組成を改変すること、およびストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法が提供され、高度不飽和脂肪酸をより効率的に製造することが可能となる。本発明者らは、上記の従来技術の状況に鑑み鋭意研究の結果、ストラメノパイルの高度に不飽和脂肪酸を産生する能力を向上させるために、ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制して形質転換することに成功し、さらに、ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊あるいは発現抑制することによりストラメノパイルが産生する脂肪酸組成の改変を行なう方法、およびこの形質転換ストラメノパイルに高度に不飽和脂肪酸を蓄積させる方法を見出しその実用化のための研究、開発をさらに増進することにより本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の1ないし12に記載のストラメノパイルの形質転換方法を要旨とするものである。1ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することを特徴とする、ストラメノパイルの形質転換方法。2ストラメノパイルがラビリンチュラ類である、上記1に記載のストラメノパイルの形質転換方法。3ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、上記2に記載のストラメノパイルの形質転換方法。4微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、上記3に記載のストラメノパイルの形質転換方法。5微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、上記4に記載のストラメノパイルの形質転換方法。6ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、上記1ないし5のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。7脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、上記6に記載のストラメノパイルの形質転換方法。8脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、上記7に記載のストラメノパイルの形質転換方法。9脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、上記7に記載のストラメノパイルの形質転換方法。10ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、上記1ないし9のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。11ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、上記1ないし10のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。12さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、上記1ないし11のいずれかに記載のストラメノパイルの形質転換方法。13脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、上記12に記載のストラメノパイルの形質転換方法。また、本発明は、以下の14ないし26に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法を要旨とするものである。14ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することを特徴とする、ストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。15ストラメノパイルがラビリンチュラ類である、上記14に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。16ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、上記15に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。17微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、上記16に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。18微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、上記17に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。19ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、上記14ないし18のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。20脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、上記19に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。21脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、上記20に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。22脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、上記21に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。23ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、上記14ないし22のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。24ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、上記14ないし23のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。25さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、上記14ないし24のいずれかに記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。26脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、上記25に記載のストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法。また、本発明は、以下の27ないし29に記載のストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法を要旨とするものである。27上記14ないし26のいずれかに記載の方法により、ストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法。28脂肪酸が不飽和脂肪酸である、上記27に記載の方法。29不飽和脂肪酸が炭素数18~22の不飽和脂肪酸である、上記28に記載の方法。また、本発明は、以下の30に記載の脂肪酸を要旨とするものである。30上記27ないし29のいずれかに記載の方法により得られた高度に脂肪酸を蓄積させたストラメノパイルから取得した脂肪酸。また、本発明は、以下の31ないし43に記載の形質転換されたストラメノパイルを要旨とするものである。31脂肪酸組成の改変を目的としてその遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制することにより形質転換されたストラメノパイル。32ラビリンチュラ類である、上記31に記載のストラメノパイル。33ラビリンチュラ類がラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、アウランティオキトリウム属Aurantiochytrium、ヤブレツボカビ属、ウルケニア属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属する微生物である、上記32に記載のストラメノパイル。34微生物がThraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseum、ParietichytriumspまたはSchizochytriumspである、上記33に記載のストラメノパイル。35微生物がThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358、ParietichytriumspSEK571またはSchizochytriumspTY12AbFERMABP11421である、上記34に記載のストラメノパイル。36ストラメノパイルの遺伝子が脂肪酸生合成関連遺伝子である、上記31ないし35のいずれかに記載のストラメノパイル。37脂肪酸生合成関連遺伝子がポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子である、36に記載のストラメノパイル。38脂肪酸鎖長伸長酵素がC20エロンガーゼである、上記36に記載のストラメノパイル。39脂肪酸不飽和化酵素がΔ12デサチュラーゼである、上記37に記載のストラメノパイル。40ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊する方法が、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃法によって機能欠損型の遺伝子あるいは遺伝子をコードする領域を欠失したDNA断片を導入することを特徴とする、上記31ないし39のいずれかに記載のストラメノパイル。41ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に発現抑制する方法が、アンチセンス法あるいはRNA干渉であることを特徴とする、上記31ないし40のいずれかに記載のストラメノパイル。42さらに脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子を導入することを特徴とする、上記31ないし41のいずれかに記載のストラメノパイル。43脂肪酸不飽和化酵素に関連する遺伝子がω3デサチュラーゼである、上記42に記載のストラメノパイル。本発明により、ストラメノパイルの有用物質の産生能力を向上させるために、ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制して形質転換することを目的とする。ストラメノパイルの有用物質の産生に係わる遺伝子を遺伝子工学的に破壊または/および発現抑制して有用物質の産生能力を改変することにより、ストラメノパイルが産生する脂肪酸組成の改変方法、ストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法、不飽和脂肪酸の製造方法、不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイル、これら不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイルから不飽和脂肪酸を生産して提供され、ストラメノパイルが産生する脂肪酸組成を改変すること、およびストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法が提供され、高度不飽和脂肪酸をより効率的に製造することが可能となる。近年、脂質の生理活性や薬理作用についての研究が進み不飽和脂肪酸の代謝において様々の化学物質への変換とその働きについての解明がなされている。特に飽和脂肪酸、モノエン酸、不飽和脂肪酸の栄養学上の好ましい比率やエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の魚油由来のω3系n3系ともいうの脂肪酸とリノール酸を中心とする植物由来のω6系n6系ともいうの脂肪酸の比率が疾病との関連の中で重用視されている。しかしながら、動物は脂肪酸不飽和化酵素デサチュラーゼ、desaturaseの欠損または低下から一部の不飽和脂肪酸を食物として摂取しなければならない。これらの脂肪酸を必須脂肪酸またはビタミンFとよび、リノール酸LA、γ-リノレン酸GLA、アラキドン酸AAまたはARA等がこれにあたる。不飽和脂肪酸の生成には、脂肪酸不飽和化酵素デサチュラーゼという酵素が関与する。脂肪酸不飽和化酵素デサチュラーゼには1脂肪酸のカルボニル基から決まった位置に二重結合不飽和結合ともいうを作るタイプ例:Δ9デサチュラーゼはカルボニル炭素を1番目の炭素とした場合の、9番目の位置に二重結合を作る。および2脂肪酸のメチル末端から特定の位置に二重結合を作るタイプ例:ω3デサチュラーゼはメチル末端を1番目とした場合の、3番目の位置に二重結合を作るがあり、これらデサチュラーゼによる二重結合の生成不飽和化と、いくつかの異なるエロンガーゼによる鎖長延長が繰り返されることにより、不飽和脂肪酸が生合成されることが知られている。例えば、Δ9デサチュラーゼは、体内でパルミチン酸から合成されたか外部から直接摂取されたステアリン酸を不飽和化することによってオレイン酸OAを合成する。またΔ6、Δ5、Δ4デサチュラーゼはアラキドン酸AA、エイコサペンタエン酸EPA、そしてドコサヘキサエン酸DHAのような高度不飽和脂肪酸の合成に必要な脂肪酸不飽和化酵素デサチュラーゼである。一方、ストラメノパイルに属するラビリンチュラ類Labyrinthulomycetesには、ヤブレツボカビ科スラウストキトリウム科とも言うThraustochytriaceaeおよびラビリンチュラ科Labyrinthulaceaeの2つの科が存在する。これらはアラキドン酸、EPA、DTA、DPA、DHA等の高度不飽和脂肪酸を蓄積する微生物として知られている。本発明は、ストラメノパイルの遺伝子を遺伝子工学的に破壊あるいは発現抑制することを特徴とするストラメノパイルの形質転換方法に関するものである。特に、脂肪酸生合成に関連する遺伝子を破壊あるいは発現抑制する形質転換方法、それによるストラメノパイルの脂肪酸組成の改変方法、ストラメノパイルに高度に脂肪酸を蓄積させる方法及び不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイル、これら不飽和脂肪酸含量の増加したストラメノパイルから不飽和脂肪酸を生産する方法を開発し、提供することが可能となった。本発明は、ストラメノパイルのエロンガーゼ/デサチュラーゼ経路を構成する酵素を操作してストラメノパイルが産生する脂肪酸組成を変化させることを含むものであり、特に、1脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の破壊または/および発現抑制、2ポリケチド合成酵素遺伝子の破壊または/および発現抑制、3脂肪酸不飽和化酵素の破壊または/および発現抑制、3ポリケチド合成酵素遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、または脂肪酸不飽和化酵素のうち二者あるいは全ての破壊または/および発現抑制、4脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子の破壊または/および発現抑制および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、5ポリケチド合成酵素遺伝子の破壊または/および発現抑制および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、6脂肪酸不飽和化酵素の破壊または/および発現抑制および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、6ポリケチド合成酵素遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素遺伝子、または脂肪酸不飽和化酵素のうち二者あるいは全ての破壊または/および発現抑制および脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の導入、によってストラメノパイルが産生する脂肪酸組成を改変することができる。次に、本発明について更に詳細に説明する。[微生物]本発明の脂肪酸改変方法で用いる微生物としては、脂肪酸生合成に関連する遺伝子を破壊または/および発現抑制することにより脂肪酸組成が改変されるであろうと思われるストラメノパイルであれば特に限定されないが、特に好ましくはラビリンチュラ類を対象とする。ラビリンチュラ類としては、ラビリンチュラ属、アルトルニア属、アプラノキトリウム属Aplanochytrium、イァポノキトリウム属、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloides、シゾキトリウム属、ヤブレツボカビ属、またはウルケニア属、アウランティオキトリウム属、オブロンギキトリウム属Oblongichytrium、ボトリオキトリウム属Botryochytrium、パリエティキトリウム属Parietichytrium、またはシクヨイドキトリウム属Sicyoidochytriumに属するものが挙げられる。尚、学術的に、ラビリンチュロイデス属Labyrinthuloidesはアプラノキトリウム属Aplanochytriumと同義と解釈されているLeanderCelesteADavidPorterMycotaxonvol76439444。本発明で用いるラビリンチュラ類としては、ヤブレツボカビ属、およびパリエティキトリウム属Parietichytriumに属する微生物が好ましく、その中でも特に好ましくは、Thraustochytriumaureum、Parietichytriumsarkarianum、Thraustochytriumroseumが挙げられ、具体的にはThraustochytriumaureumATCC34304、ParietichytriumsarkarianumSEK364、ThraustochytriumroseumATCC28210、ParietichytriumspSEK358FERMBP11405、またはParietichytriumspSEK571FERMBP11406の菌株が挙げられる。ThraustochytriumaureumATCC34304及びThraustochytriumroseumATCC28210はATCCに寄託されており、一般に分譲されている。ParietichytriumsarkarianumSEK364株は、石垣島吹通川の河口域で採取した表層水10mLを試験管に入れ、松花粉を添加して室温で放置した。7日後に松花粉を無菌寒天培地2gグルコース,1gペプトン,05g酵母エキス,02gクロラムフェニコール,15g寒天,蒸留水100mL,海水900mLに塗布し、5日後に出現したコロニーを分離し培養することを数回繰り返し、菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東111中央第6に受託番号FERMBP11298として平成22年9月24日に国際寄託されており、そこから入手可能である。ParietichytriumspSEK358株は、石垣島宮良川河口域から採取した海水サンプルを、上記同様に培養し菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東111中央第6に受託番号FERMBP11405として平成23年8月11日に国際寄託されており、そこから入手可能である。ParietichytriumspSEK571株は、西表島後良川河口域から採取した海水サンプルを、上記同様に培養し菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東111中央第6に受託番号FERMBP11406として平成23年8月11日に国際寄託されており、そこから入手可能である。SchizochytriumspTY12Ab株は、種子島の沿岸で採取された枯れ葉から、上記同様に培養し菌体を分離した。この株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター茨城県つくば市東111中央第6に受託番号FERMABP11421として平成23年9月29日に国際寄託されており、そこから入手可能である。[脂肪酸生合成に関連する遺伝子]本発明における脂肪酸生合成関連遺伝子は、ストラメノパイル、特にラビリンチュラ類において脂肪酸生合成に関連する酵素の遺伝子であれば特に限定されない。このような遺伝子として、ポリケチド合成酵素遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素エロンガーゼ遺伝子、あるいは脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が挙げられる。本発明においては、これらのうちどちらか片方、あるいは両方とも遺伝子工学的に破壊あるいは発現抑制の対象とする。この時、遺伝子破壊または/および発現抑制の対象となる遺伝子は、そのストラメノパイルにおいてもしポリケチド合成酵素が所望の脂肪酸以外の脂肪酸を産生する場合は、例えばそのオープンリーディングフレームが対象となる。また脂肪酸鎖長伸長酵素であれば、所望の脂肪酸を他の脂肪酸に変換する酵素に関連する遺伝子が対象となり、例えばエイコサペンタエン酸EPAを所望する時には、エイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸DPAに変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはC20エロンガーゼ遺伝子を破壊または/および発現抑制すれば良い。また脂肪酸不飽和化酵素であれば、所望の脂肪酸を他の脂肪酸に変換する酵素に関連する遺伝子が対象となり、例えばオレイン酸を所望する時には、オレイン酸をリノール酸に変換するのに関わる脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子、具体的にはΔ12デサチュラーゼ遺伝子を破壊または/および発現抑制すれば良い。また所望の脂肪酸に応じてポリケチド合成酵素遺伝子、脂肪酸鎖長伸長酵素エロンガーゼ遺伝子、あるいは脂肪酸不飽和化酵素のうち2者又は全てについて遺伝子破壊または/および発現抑制しても良い。さらに、上記の通り遺伝子工学的に遺伝子破壊または/および発現抑制した形質転換株に、脂肪酸生合成に関連する遺伝子を導入しても良い。この際、導入する遺伝子は所望する脂肪酸を生合成する酵素に関連する遺伝子が対象となり、例えばエイコサペンタエン酸を所望する時には、アラキドン酸AAをエイコサペンタエン酸に変換する脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子、具体的にはω3デサチュラーゼ遺伝子を導入すれば良い。[ポリケチド合成酵素及び脂肪酸鎖長伸長酵素]ポリケチド合成酵素ポリケチドシンターゼ、polyketidesynthasePKSはスターター基質アセチルCoA、脂肪酸CoAエステル、ベンゾイルCoA、クマロイルCoAに伸長鎖基質を複数回縮合する反応を触媒する酵素であり、一般に植物や真菌等の二次代謝産物の生合成に関わる酵素として知られているが、ある種の生物においては高度不飽和脂肪酸の生合成にも関与することが報告されている。例えば海洋細菌Shewanellaはこの酵素によりエイコサペンタエン酸EPAを生産する非特許文献8。ある種のストラメノパイルでもポリケチド合成酵素が同様に高度不飽和脂肪酸の生合成に関わることが知られており、またラビリンチュラ類ではその遺伝子配列も明らかにされている。例えば特許文献7に記載のように、Schizochytrium属のラビリンチュラのポリケチド合成酵素遺伝子はOrfA、OrfB、OrfCの3つのオープンリーディングフレームからなる。また特許文献8に記載のように、Ulkenia属のラビリンチュラのポリケチド合成酵素遺伝子も3つのオープンリーディングフレームを持つとされている。また、本発明の脂肪酸鎖長伸長酵素エロンガーゼ、elongaseは、脂肪酸の鎖長を伸長する機能を有するものであれば特に限定されないが、C18エロンガーゼ遺伝子、C20エロンガーゼ遺伝子を好適に例示することができる。かかるC18エロンガーゼ遺伝子、C20エロンガーゼ遺伝子は、炭素数18、20の脂肪酸をそれぞれ2炭素鎖ずつ伸長して炭素数20、22の脂肪酸とするものであり、これらの脂肪酸鎖長伸長酵素は様々な生物に広く存在するが、ストラメノパイルにも存在し例えばThraustochytrium属のラビリンチュラ類にも存在することが報告されている非特許文献9。C18エロンガーゼはγ-リノレン酸GLAからジホモ-γ-リノレン酸DGLAへの変換およびステアリドン酸STAからエイコサテトラエン酸ETAへの変換を触媒する。C20エロンガーゼはアラキドン酸AAからドコサテトラエン酸DTAへの変換およびエイコサペンタエン酸EPAからn3ドコサペンタエン酸DPA225n3への変換を触媒する。したがい、例えばステアリドン酸STAを所望する時には、ステアリドン酸をエイコサテトラエン酸ETAに変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはC18エロンガーゼ遺伝子を破壊または/および発現抑制すれば良い。また例えばエイコサペンタエン酸EPAを所望する時には、エイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸DPAに変換するのに関わる脂肪酸鎖長伸長酵素の遺伝子、具体的にはC20エロンガーゼ遺伝子を破壊または/および発現抑制すれば良い。さらに、当該ストラメノパイルにおいてもし所望以外の脂肪酸がポリケチド合成酵素によって生合成される場合は、ポリケチド合成酵素遺伝子を破壊または/および発現抑制すれば良い。なお、非特許文献5ではSchizochytrium属のラビリンチュラのポリケチド合成酵素遺伝子を破壊した株はドコサヘキサエン酸を生合成する能力を失い、高度不飽和脂肪酸を加えた培地以外では生育できないという結果を示している。しかし本発明においては、ある種のラビリンチュラはポリケチド合成酵素遺伝子を破壊しても、高度不飽和脂肪酸を加えない培地でも生育が可能であり、上述のような遺伝子の破壊や発現抑制によって所望する高度不飽和脂肪酸を得ることが可能である。[脂肪酸不飽和化酵素]本発明の脂肪酸不飽和化酵素デサチュラーゼ、desaturaseは脂肪酸不飽和化酵素としての機能を有するものであれば特に限定されない。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては動物由来、植物由来等その由来は特に制限されないが、Δ4デサチュラーゼ遺伝子、Δ5デサチュラーゼ遺伝子、Δ6デサチュラーゼ遺伝子、Δ12デサチュラーゼ遺伝子、ω3デサチュラーゼ遺伝子等の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を好適に例示することができ、これらは単独でまたは多重に用いることができる。かかるΔ4デサチュラーゼ遺伝子、Δ5デサチュラーゼ遺伝子、Δ6デサチュラーゼ遺伝子、Δ12デサチュラーゼ遺伝子は、脂肪酸の末端カルボキシル基の炭素デルタエンドから数えて、それぞれ4番目、5番目、6番目、12番目の炭素において不飽和結合を形成するものであり、これらの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、例えば微細藻類由来のΔ4デサチュラーゼ遺伝子非特許文献6を具体的に挙げることができる。さらに具体的には、Δ5デサチュラーゼとしては、Taureum由来Δ5デサチュラーゼ、ThraustochytriumspATCC26185DictyosteliumdiscoideumRattusnorvegicusMusmusculusHomosapiensCaenorhabditiselegansLeishmaniamajorに由来するΔ5デサチュラーゼ等が例示される。また、Δ12デサチュラーゼとしては、ピンギオ藻Pinguiochrysispyriformis由来Δ12デサチュラーゼ、真菌および原虫由来Δ12デサチュラーゼが例示される。ω3デサチュラーゼは、脂肪酸の炭素鎖のメチル末端から数えて3番目の位置に二重結合を形成するものであり、例えばミズカビ由来のω3デサチュラーゼ非特許文献10等が例示される。Δ5デサチュラーゼは、例えば、ジホモ-γ-リノレン酸DGLAからアラキドン酸AAへの変換およびエイコサテトラエン酸ETAからエイコサペンタエン酸EPAへの変換を触媒する。Δ6デサチュラーゼは例えば、リノール酸LAからγ-リノレン酸GLAへの変換およびα-リノレン酸ALAからステアリドン酸STAへの変換を触媒する。ω3デサチュラーゼはアラキドン酸からエイコサペンタエン酸への変換を触媒する。また、リノール酸LAはオレイン酸OAからΔ12デサチュラーゼにより生産される。[産生不飽和脂肪酸]ストラメノパイル内で発現する脂肪酸不飽和化酵素により生成される不飽和脂肪酸は、例えば、炭素数18~22の不飽和脂肪酸である。用いる脂肪酸不飽和化酵素の種類や脂肪酸基質の種類によって異なるが、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸EPAを好適に例示することができ、これらの他にα-リノレン酸ALA、オクタデカテトラエン酸OTA、184n3、エイコサテトラエン酸ETA、204n3、n3ドコサペンタエン酸DPA、225n3、テトラコサペンタエン酸TPA、245n3、テトラコサヘキサエン酸THA、246n3、リノール酸、γリノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、n6ドコサペンタエン酸等を挙げることができる。[脂肪酸生合成関連酵素遺伝子源]本発明においてポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素エロンガーゼ、および/または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子源として利用できる生物は、特に属、種あるいは株などを限定するものではなく、高度不飽和脂肪酸生産能を有する生物であればいずれのものでも用いることができる。これらの生物は、例えば微生物であれば公的微生物寄託機関で容易に入手することができる。このような微生物としては、モリテラ属Moritellaに属する細菌モリテラマリナMoritellamarinaMP1株ATCC15381等が例示され、デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子源の例として本株を用いる場合の方法について以下に説明する。しかしながら、ここで示す方法はデサチュラーゼエロンガーゼ経路を有する全ての生物種から、その構成遺伝子であるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の単離を行う際に適応が可能である。MP1株からデサチュラーゼおよびもしくはエロンガーゼ遺伝子を単離するためには、それぞれの目的酵素遺伝子のアミノ酸配列において、保存された領域を推定することが必要である。例えば、デサチュラーゼにおいては一つのシトクロムb5ドメインと3つのヒスチジンボックス、エロンガーゼにおいては2つのヒスチジンボックスが生物種を通して保存されていることが知られている。より具体的には、様々な生物種由来の既知のデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ遺伝子のアミノ酸配列を、clustalwプログラム非特許文献7を使用した多重アライメントによって比較することで、目的酵素の保存領域を推定することができる。さらには、既知の他生物由来デサチュラーゼおよびもしくはエロンガーゼにおいて、同じ基質特異性を有するデサチュラーゼもしくはエロンガーゼ遺伝子のアミノ酸配列を多重アライメントによって比較することで、同じ基質特異性を有するデサチュラーゼおよびもしくはエロンガーゼに特異的な保存領域を推定することも可能である。次に、推定した保存領域を元に様々な縮重オリゴヌクレオチドプライマーを作製し、MP1株由来cDNAライブラリーを鋳型にしたPCR、RACE法などを行うことで、MP1株由来目的遺伝子の部分配列を増幅する。引き続き、得た増幅産物をプラスミドベクターにクローニング後、常法により塩基配列を決定し、既知の酵素遺伝子と比較することにより、MP1株より目的酵素遺伝子の一部が単離できたことを確認する。目的酵素遺伝子全長取得には、得た部分配列をプローブとしたハイブリダイゼーション法によるスクリーニング、もしくは目的遺伝子の部分配列から作製したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたRACE法を行う。ポリケチド合成酵素は、特許文献7に記載のPUFAPKSの配列を参考に、常法によってクローニングすることができる。[その他遺伝子源]GFPGreenFluorescentProteinは非特許文献11あるいは非特許文献12、EGFPEnhancedGFPは特許文献6、ネオマイシン耐性遺伝子は非特許文献13が、それぞれ参考になる。[ストラメノパイルの脂肪酸生合成関連遺伝子の破壊]ストラメノパイルの脂肪酸生合成関連遺伝子の破壊方法としては、従来の微生物への遺伝子破壊する方法が適用でき、組換え発現ベクターを細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。例えば、Thraustochytriumaureumの遺伝子を破壊する場合には、まずThraustochytriumaureumから常法によりゲノムDNAを抽出し、ゲノムライブラリを作製する。次に破壊対象となる目的遺伝子のDNA配列を基にゲノムウォーキング用プライマーを設定し、作製したゲノムライブラリを鋳型にPCRを行い、Thraustochytriumaureumの目的遺伝子の上流配列および下流配列を取得する。取得した配列を遺伝子破壊の際の相同組換領域として両側に配し、間に選択のための薬剤マーカー遺伝子を挿入する。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてThraustochytriumaureumに導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法ないしはサザンハイブリダイゼーション法にて相同組換株の同定を行う。Thraustochytriumaureumは2倍体であることから、線状化したDNAを遺伝子銃法にて細胞に導入し、相同組換株を同定するまでの工程を2回繰り返すことにより、目的遺伝子が破壊されたThraustochytriumaureumを得ることができる。目的遺伝子が2以上ある場合には、以上の操作を繰り返すことにより、2以上の目的遺伝子の破壊された株を得ることができる。この時、Thraustochytriumaureumが2倍体であることから、1つの遺伝子につき2種類ずつ、選択マーカーを用意する必要がある。また、例えば、ParietichytriumsarkarianumのC20エロンガーゼを破壊する場合には、まずParietichytrium属より常法によりゲノムDNAを抽出し、ゲノムを解読する。既知のC20エロンガーゼ遺伝子と相同性の高い遺伝子配列を検索し、この遺伝子配列の開始コドンから終止コドンまでをPCRにて増幅する。遺伝子配列のほぼ中央に、突然変異導入法により制限酵素サイトを挿入し、この制限酵素サイトに選択のための薬剤マーカー遺伝子カセットを挿入する。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてParietichytriumsarkarianumSEK364に導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法にて相同組換株の同定を行う。ParietichytriumsarkarianumSEK364が2倍体であることから、線状化したDNAを遺伝子銃法にて細胞に導入し、相同組換株を同定するまでの工程を2回繰り返すことにより、C20エロンガーゼ遺伝子が破壊されたParietichytriumsarkarianumSEK364を得ることができる。この時、ParietichytriumsarkarianumSEK364が2倍体であることから、2種類の選択マーカーを用意する必要がある。また、例えば、ThraustochytriumaureumATCC34304由来OrfA破壊株のΔ4デサチュラーゼを破壊する場合には、まずThraustochytriumaureumATCC34304より常法によりゲノムDNAを抽出し、ゲノムを解読する。既知のΔ4デサチュラーゼと相同性の高い遺伝子配列を検索し、この遺伝子配列の上流領域から終止コドン付近までをPCRにて増幅する。突然変異導入法により、開始コドンを含むORFの一部を欠損させると同時に制限酵素サイトを挿入し、この制限酵素サイトに選択のための薬剤マーカー遺伝子カセットを挿入する。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてThraustochytriumaureumATCC34304由来OrfA破壊株に導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法にて相同組換株の同定を行う。ThraustochytriumaureumATCC34304が2倍体であることから、線状化したDNAを遺伝子銃法にて細胞に導入し、相同組換株を同定するまでの工程を2回繰り返すことにより、Δ4デサチュラーゼ遺伝子が破壊されたThraustochytriumaureumATCC34304由来OrfA破壊株を得ることができる。この時、ThraustochytriumaureumATCC34304が2倍体であることから、2種類の選択マーカーを用意する必要がある。また、ThraustochytriumroseumのC20エロンガーゼを破壊する目的で、ThraustochytriumaureumのC20エロンガーゼ遺伝子配列を用いた。Thraustochytriumaureumより、常法によりゲノムDNAを抽出し、C20エロンガーゼ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでをPCRにて増幅する。遺伝子配列のほぼ中央に、突然変異導入法により制限酵素サイトを挿入し、この制限酵素サイトに選択のための薬剤マーカー遺伝子カセットを挿入する。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてThraustochytriumroseumに導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法にて相同組換株の同定を行う。Thraustochytriumroseumが2倍体であることから、線状化したDNAを遺伝子銃法にて細胞に導入し、相同組換株を同定するまでの工程を2回繰り返すことにより、C20エロンガーゼ遺伝子が破壊されたThraustochytriumroseumを得ることができる。この時、Thraustochytriumroseumが2倍体であることから、2種類の選択マーカーを用意する必要がある。本発明におけるストラメノパイルの脂肪酸生合成関連遺伝子の破壊の詳細については、実施例に具体的に記載した。また、形質転換の対象となるストラメノパイルも特に限定されるものではなく、前述するように、ラビリンチュラ類を好適な例として挙げることができる。例えば、ParietichytriumspSEK358株のC20エロンガーゼを破壊するため、実施例3-6で作製したパリエティキトリウム属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターを使用した。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてParietichytriumspSEK358株に導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法にて相同組換株の同定を行った実施例9参照。また、例えば、ParietichytriumspSEK571株のC20エロンガーゼを破壊するため、実施例3-6で作製したパリエティキトリウム属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターを使用した。このDNAを線状化し、遺伝子銃法にてParietichytriumspSEK571株に導入、薬剤含有プレート上で約1週間培養する。薬剤耐性を獲得した細胞から常法によりゲノムDNAを抽出し、PCR法にて相同組換株の同定を行った実施例10参照。発現ベクターとしては特に限定されるものではなく、遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモータ配列を選択し、これと本発明の遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。ベクターは環状あるいは線状化したものを用いることができる。発現ベクターには、好ましくは少なくとも1つの選択マーカーを含む。このような選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、蛍光蛋白質マーカー、あるいはこれらの融合マーカーなどが挙げられ、例えば栄養要求性マーカーとしてはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子など、薬剤耐性マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子など、蛍光蛋白質マーカーとしてはGFP、EnhancedGFPなど、また融合マーカーとしては例えば蛍光蛋白質マーカーと薬剤耐性マーカーを融合させたもの、具体的にはGFP融合ゼオシン耐性遺伝子などが挙げられる。これら選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係る脂肪酸不飽和化酵素を融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、GFPをマーカーとして用い、本発明に係る脂肪酸不飽和化酵素をGFP融合ポリペプチドとして発現させてもよい。遺伝子破壊のための遺伝子導入方法としては、エレクトロポレーションまたは遺伝子銃を用いることが好ましい。本発明においては、脂肪酸生合成関連遺伝子が破壊されることによって、当該遺伝子を破壊する前と比較して、細胞の脂肪酸組成が変化する。すなわち、脂肪酸生合成関連遺伝子が破壊されることにより、脂肪酸組成の改変という効果が得られる。さらに、このようにして脂肪酸生合成関連酵素遺伝子を破壊したストラメノパイルに、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することにより、所望の脂肪酸をより多く得ることも可能となる。この時、さらに導入する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子として、ω3デサチュラーゼ遺伝子を導入することが好適である。ストラメノパイルの形質転換により、産生する脂肪酸組成が改変されたストラメノパイル微生物が得られる。この脂肪酸生合成関連遺伝子が破壊されてなるストラメノパイルは、例えば、不飽和脂肪酸の製造に利用することができる。不飽和脂肪酸の製造には、上述の産生脂肪酸組成が改変されたストラメノパイルを使用すればよく、その他の工程、製造設備器具等の諸条件については、特に限定されるものではない。不飽和脂肪酸の製造には、上述の改変方法によって産生する脂肪酸組成が改変された微生物を培養する工程を含み、微生物およびその培地を利用して、不飽和脂肪酸を製造する。上記細胞の培養条件培地、培養温度、通気状態等は、細胞の種類や、目的とする不飽和脂肪酸の種類、その量等に応じて適宜設定することができる。なお、本発明での不飽和脂肪酸とは、不飽和脂肪酸を含む物質をも意味し、その含有量、純度、形状、組成、等は特に限定されるものではない。つまり、本発明では、脂肪酸組成が改変された細胞またはその培地自体を、不飽和脂肪酸とみなしてもよい。また、この細胞または培地から不飽和脂肪酸を精製する工程をさらに含んでいてもよい。不飽和脂肪酸を精製する方法としては、不飽和脂肪酸を始めとする脂質複合脂質を含むの精製方法として公知である方法を適用することができる。[ストラメノパイルに高度に不飽和脂肪酸を蓄積させる方法]ストラメノパイルに不飽和脂肪酸を蓄積させるには、形質転換した本発明のストラメパイルを培養することにより達成される。例えば、通常用いられる固体培地あるいは液体培地等で培養する。この時、用いられる培地としては、例えば炭素源としてグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプン、グリセリン等、また窒素源として酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等、また無機塩としてリン酸カリウム等、その他必要な成分を適宜組み合わせた培地であり、ラビリンチュラ類を培養するために通常用いられるものであれば特に限定されないが、特に好ましくは酵母エキスグルコース培地GY培地が用いられる。培地は調製後、pHを3.0~8.0の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により滅菌して用いる。培養は、10~40°C、好ましくは15~35°Cにて、1~14日間、通気撹拌培養、振とう培養、あるいは静置培養で行えば良い。産生した不飽和脂肪酸を回収するには、ストラメノパイルを培地で生育し、その培地から得た微生物細胞を処理し、細胞内脂質高度不飽和脂肪酸を含む油脂含有物あるいは高度不飽和脂肪酸を放出させ、その放出された細胞内脂質を含む培地から脂質を回収する。すなわち、このようにして培養したストラメノパイルを遠心分離等回収し、細胞を破砕し定法に従い適当な有機溶媒を用いて細胞内の脂肪酸を抽出することにより、高度不飽和脂肪酸含有率の増加した油脂を得ることができる。本発明は、脂肪酸生合成関連遺伝子、詳しくはポリケチド合成酵素、脂肪酸鎖長伸長酵素、および/または脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を破壊または/および発現抑制した形質転換ストラメノパイルを培養することにより、ストラメノパイルが産生する脂肪酸の組成が改変されるが、これはストラメノパイルの脂肪酸生合成関連遺伝子が破壊または/および発現抑制されたことにより、当該ストラメノパイルにおいて所望の脂肪酸がさらに別の脂肪酸に変換されることなく蓄積されることによる。また、遺伝子破壊または/および発現抑制した形質転換ストラメノパイルにさらに脂肪酸不飽和化酵素関連遺伝子を導入することにより、所望の脂肪酸の前駆脂肪酸の所望の脂肪酸への変換能を強化することにより、所望の脂肪酸が蓄積されることによる。また、本発明の不飽和脂肪酸は、種々の医薬品、食品、または工業製品も含まれ、その利用分野は特に限定されない。また、本発明の不飽和脂肪酸含有油脂が含まれる食品には、サプリメント等の健康食品や、食品添加物等が含まれる。また、工業製品としては、人以外の生物を対象とした飼料、フィルム、生分解性プラスチック、機能性繊維、潤滑油、洗剤等が挙げられる。次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。[ラビリンチュラ類とその培養法保存法]1本発明で使用する菌株ThraustochytriumaureumATCC34304及びThraustochytriumroseumATCC28210は、ATCCより分譲を受けた。また、ParietichytriumsarkarianumSEK364FERMBP11298、ParietichytriumspSEK358FERMBP11405及びParietichytriumspSEK571FERMBP11406は甲南大学理工学部より分譲を受けた。SchizochytriumspTY12AbFERMABP11421は宮崎大学農学部より分譲を受けた。2培地組成i.寒天平板培地組成PDA寒天平板培地078ポテトデキストロース寒天培地、175シーライフ、121寒天末を混合し、121°Cで20分間オートクレーブ滅菌を行った。十分に冷却後に、バクテリアのコンタミネーションを防ぐために終濃度が100μgmlとなるようにアンピシリン酸ナトリウムを添加し、シャーレに分注して平らな所に静置して固化させた。ii.液体培地組成GY液体培地318グルコース、106乾燥酵母エキス、175シーライフを混合し、121°Cで20分間オートクレーブ滅菌後に、100μgmlのアンピシリン酸ナトリウムを添加した。PD液体培地048ポテトデキストロース、175シーライフを混合し、121°Cで20分間オートクレーブ滅菌後に、100μgmlのアンピシリン酸ナトリウムを添加した。3培養方法i.寒天平板培養ラビリンチュラ菌体を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて接種し、25°Cで静置培養することでコロニーを出現させた。その継代培養に関しては、コロニーを白金耳で釣菌して滅菌生理食塩水に懸濁後、その懸濁液を白金耳、もしくはスプレッダーを用いて塗布することで行った。尚、必要に応じて平板上の菌体を液体培地に接種することで、液体培養への転換を行った。ii.液体培養ラビリンチュラ菌体を接種し、三角フラスコ、もしくは試験管を用いて、25°C、150rpmの回転数で攪拌しながら懸濁培養を行った。その継代培養に関しては、増殖が確認された対数増殖期~定常期までの培養液を、新しいGYもしくはPD液体培地に対して1200~110容添加することで行った。尚、必要に応じて細胞培養液をPDA寒天平板培地に塗布することで、寒天平板培養への転換を行った。4ラビリンチュラ類の保持保存法継代培養に加えて、グリセロールストック作製による凍結保存を行った。すなわち、GY液体培地を用いた対数増殖期~定常期の細胞懸濁液に対して、終濃度が15のグリセロールを添加し、80°Cのディープフリーザー中にて保存した。[ThraustochytriumaureumのC20エロンガーゼ遺伝子の破壊]実施例2-1TaureumATCC34304由来totalRNAの抽出、およびmRNAの精製GY液体培地を用いた培養3日目のTaureumATCC34304培養液を、3500xgで15分間遠心することでその菌体を回収した。得た菌体を滅菌生理食塩水に懸濁後に再遠心操作を行うことで菌体を洗浄し、液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰した。得た細胞破砕液中からセパゾールRNAISuperを使用してtotalRNAを抽出した。引き続き、OligotexTMdT30mRNAPurificationKitを使用し、添付のマニュアルに従いtotalRNAからmRNAの精製を行った。得たtotalRNAおよびmRNAは適当量のTEに溶解後、ホルマリン変性ゲルを用いた電気泳動を行った。その結果、totalRNAの抽出が成功していること、totalRNAからmRNAが精製されていること、およびRNAがRNaseによる分解を受けていないことを確認した。また、RNAの分解を極力避けるために、本実験操作を通じてゴム手袋やマスク等を着用し、器具は全てRNaseフリーのもの、もしくはジエチルピロカーボネート処理によってRNaseを失活したものを使用した。またRNAを溶解する際は、ジエチルピロカーボネート処理した滅菌ミリQ水に、組換え型RNaseインヒビターであるRNaseOUTTMを添加した溶液を使用した。実施例2-2RACE法によるTaureumATCC34304由来エロンガーゼ遺伝子の単離エロンガーゼ遺伝子に高度に保存されるヒスチジンボックスを標的として、正方向、および逆方向の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの合成は、DNA合成機を用いて行った。次に、SMARTTMRACEcDNAAmplificationKitを使用して、添付のマニュアルに従って3’および5’末端に合成アダプターを付加した3’および5’RACEcDNAライブラリそれぞれを作製した。それらを鋳型として、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述した縮重オリゴヌクレオチドeloFおよびeloRを用いた3’および5’RACEPCRcycles94°C1min94°C30sec60°C30sec72°C3min30cycles72°C10min4°C∞を行ったところ、特異的に増幅した3’および5’RACE産物のバンドが確認された。次に、該当RACE産物全量を1アガロースゲルによる電気泳動に供し、分離したDNA断片を清浄なカッター等で切り出し、非特許文献20記載の方法に従ってアガロースゲルからDNA断片を抽出した。次に、pGEMTeasyVectorを使用して該当DNA断片のTAクローニングを行い、Sangerらの方法によってそれらの塩基配列を決定した。具体的には、BigDyeRTerminatorv31CyeleSequencingKitおよび3130ジェネティックアナライザを使用し、添付マニュアルに従ったダイターミネーター法による塩基配列決定を行った。その結果、3’RACE産物においてはelo1およびelo2と名付けた190bpおよび210bpの2種の配列、5’RACE産物においてはelo3と名付けた200bpの1種の配列の同定に成功した。これらelo1、elo2、およびelo3の配列は、種々のエロンガーゼ遺伝子の配列と有意な相同性を示すことから、TaureumATCC34304由来エロンガーゼ遺伝子の部分配列であることが示唆された。更に、elo1、elo2、およびelo3それぞれに関して再度オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、RACEによるcDNA配列の取得を試みた。以下に作製したオリゴヌクレオチドプライマーを示す。elo1正方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、elo2正方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマー、elo3正方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマー。作製した正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前述に記載した方法と同様に、RACEおよび該増幅産物の塩基配列解析を行った。その結果、elo1に関しては特異的に増幅した3’および5’RACE産物が得られ、それらの重複部分が完全に一致することから、1139bpのelo1cDNA配列であることが明らかになった。同様に、elo3に関しても特異的に増幅した3’および5’RACE産物が得られ、それらの重複部分が完全に一致することから、1261bpのelo3cDNA配列であることが明らかになった。配列解析の結果、elo1は275アミノ酸残基をコードする825bpの翻訳領域から成り、BLAST検索の結果、種々のエロンガーゼ遺伝子と有意な相同性を示すのみならず、公知のTaureum由来推定Δ5エロンガーゼ遺伝子の配列と完全に一致することが分かった。一方、elo3は317アミノ酸残基をコードする951bpの翻訳領域から成ることが推定され、BLAST検索の結果、種々のエロンガーゼ遺伝子と有意な相同性を示すことから、TaureumATCC34304由来推定エロンガーゼ遺伝子であることが確認された。尚、両遺伝子の推定アミノ酸配列中には、エロンガーゼ遺伝子に高度に保存されるHisboxが見出された。以上の結果を受けて、elo1およびelo3遺伝子をTaureumATCC34304由来推定エロンガーゼ遺伝子とし、それぞれをTaELO1、TaELO2と命名した。実施例2-3TaELO1およびTaELO2の系統樹解析種々のエロンガーゼは、基質特異性により1SFAMUFAelongases2PUFAelongasesおよび3PUFAelongasesの3つのグループに大別される。Meyerらが行ったエロンガーゼの系統解析によると、その基質特異性と系統関係がよく一致することが分かっている。そこでMeyerらの方法に準じて、TaELO1、TaELO2、および他生物由来の種々のエロンガーゼ遺伝子の系統解析を行った。具体的には、CLUSTALWプログラム非特許文献7を使用した近隣結合法非特許文献14による分子系統樹を作製した。その結果、TaELO1およびTaELO2は、PUFAelongasesのグループに分類されることが明らかになり、決まった鎖長の多価不飽和脂肪酸に作用することが示唆された図2実施例2-4出芽酵母Saccharomycescerevisiaeを宿主としたTaELO1およびTaELO2の発現と、遺伝子導入株の脂肪酸組成の解析TaELO1およびTaELO2を出芽酵母Scerevisiaeを宿主として発現させるために、それぞれの発現ベクターを構築した。以降にその概略を示す。TaELO1の翻訳領域の配列を元に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーおよびE1XbaI;5’TGTCTAGAACGCGCGGACGGTCGCGAAA3’を作製した。E1HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位を有する。また、酵母のコンセンサス配列AAAUGUCU;下線部は開始コドンを参考に、TaELO1の開始コドン近傍の配列を改変している。E1XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位を有する。同様に、TaELO2の翻訳領域の配列を元に1対のオリゴヌクレオチドプライマーおよびE2XbaI;5’CATCTAGACTCGGACTTGGTGGGGGCGCTTG3’を作製した。E2HindIIIは正方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端に制限酵素HindIII部位を有する。また、酵母のコンセンサス配列を参考に、TaELO2の開始コドン近傍の配列を改変している。E2XbaIは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであり、5’末端にXbaI部位を有する。以上の2種のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、実施例2-2記載の5’RACEcDNAライブラリを鋳型にPCRを行い、5’末端に制限酵素HindII、3’末端に制限酵素XbaIサイトを有し、開始コドン近傍が酵母のコンセンサス配列に改変された949bpのTaELO1翻訳領域、および967bpのTaELO2翻訳領域を増幅した。尚、PCR酵素は伸長ミスを避けるために校正活性の高いPrimeSTARRDNApolymeraseを使用したPCRcycles98°C2min98°C5sec60°C5sec72°C15min30cycles72°C7min4°C∞。次に、増幅したPCR産物を1アガロースゲルにて分離後、該DNA断片を切り出しアガロースゲルから抽出した。さらに、制限酵素HindIIIおよびXbaIで処理した後に再度アガロースゲルを用いた精製を行い、制限酵素HindIIIおよびXbaI処理により直鎖化した出芽酵母用発現ベクターpYES2CTに、DNALigationKitを使用して連結することで環状化ベクターを構築した。また塩基配列を解析することで、pYES2CTに導入したTaELO1およびTaELO2翻訳領域の配列に、PCR伸長ミスによる変異が導入されていないことを確認した。以上の結果により、TaELO1の発現ベクターpYEELO1、およびTaELO2の発現ベクターpYEELO2の構築に成功した。構築した2種の発現ベクター、およびpYES2CTを非特許文献15および非特許文献16記載の方法に従い、酢酸リチウム法によって出芽酵母Scerevisiaeに導入し形質転換体の選別を行った。次に、得た形質転換体をQiuらの方法に準じて培養し、菌体由来脂肪酸の抽出とメチルエステル化を行った。ただし、培地にはΔ9エロンガーゼの基質としてαlinolenicacidおよびlinoleicacidを、Δ6エロンガーゼの基質としてstearidonicacidおよびγlinolenicacidを、Δ5エロンガーゼの基質として、eicosapentaenoicacidおよびarachidonicacidを、それぞれ終濃度で02mM添加した上で培養を行っている。引き続き、Abeらの方法非特許文献17に従い、メチルエステル化脂肪酸のガスクロマトグラフィーGC解析を行った。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。その結果、pYEELO1導入株においては、ステアリドン酸STAをエイコサテトラエン酸、γ-リノレン酸GLAをジホモ-γ-リノレン酸に変換する宿主にはないΔ6エロンガーゼ活性を示す一方で、α-リノレン酸ALAをエイコサテトリエン酸、リノール酸LAをエイコサジエン酸に変換するΔ9エロンガーゼ活性、エイコサペンタエン酸EPAをω3ドコサペンタエン酸、アラキドン酸AAをドコサテトラエン酸に変換するΔ5エロンガーゼ活性をも示すことが分かった表1。またpYEELO2導入株においては、EPAをω3DPA、AAをDTAに変換する宿主にはないΔ5エロンガーゼ活性を示す一方で、STAをETA、GLAをDGLAに変換する僅かなΔ6エロンガーゼ活性を示すことが分かった。以上の結果により、TaELO1はΔ6Δ9Δ5エロンガーゼであり、TaELO2はΔ5Δ6エロンガーゼであることが確認され、実施例2-3、図2で示した系統樹解析によるTaELO1およびTaELO2の基質特異性予想とは異なる結果を示した。実施例2-5PCRゲノムウォーキング法によるTaELO2ORF上流および下流領域の取得TaELO2を破壊するためのターゲッティングベクターにおいて、相同組換え部位となるTaELO2ORF上流および下流領域の取得を、PCRゲノムウォーキング法によって行った。以下その概要を示す。GY液体培地を用いた培養3日目のTaureumATCC34304菌体を液体窒素で急速凍結して乳鉢中で粉末状になるまで擂り潰し、非特許文献18に記載の方法に従ってゲノムDNAを抽出後に適当量のTEに溶解した。ゲノムDNAの量と純度の検定は、OD260およびOD280測定によって行った。次に、TaKaRaLAPCRTMinvitroCloningKitを用いて、添付のプロトコールに従い各種制限酵素で切断したゲノムDNAに、制限酵素サイトを有するカセット配列を付加したゲノムDNAライブラリを構築した。次に、作製したゲノムDNAライブラリを鋳型にして、TaELO2の配列を元に作製した正方向オリゴヌクレオチドプライマーE2XbaIおよびelo3F1、もしくは逆方向オリゴヌクレオチドプライマーE2HindIIIおよびelo3R1を使用して、キット付属のカセット配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと共に添付のプロトコールに従ったnestedPCRを行った。その結果、1122bpのTaELO2ORF上流配列、および1204bpのTaELO2ORF下流配列の取得に成功した。実施例2-6Neorを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築fusionPCRによってTaELO2ORF上流配列人工合成NeorTaELO2ORF下流配列を連結したDNA断片を作製した。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。KOProFSmaIProRSNeoFSNeoRTermFKOTermRSmaIこれらのオリゴヌクレオチドプライマーのうち、KOProFSmaIProRは実施例2-5に記載したTaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にしたTaELO2ORF上流配列の増幅、SNeoFSNeoRは人工合成Neorを鋳型にした人工合成Neorの増幅、TermFKOTermRSmaIは実施例2-5に記載したTaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にしたTaELO2ORF下流配列の増幅に使用した。尚、PCR反応条件は変性温度を98°C10秒とし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTmおよび増幅産物の長さによって適宜調節して行った。その結果、2696bpのTaELO2ORF上流配列人工合成NeorTaELO2ORF下流配列の連結に成功し、これをpGEMTeasyVectorPromega社製を使用してTAクローン化したものをノックアウトベクターとし、pTKONeorを名付けた。実施例2-7TaureumATCC34304へのTKONeorの導入実施例2-6で作製した人工合成Neorを選択マーカーとしたTaELO2ターゲティングベクター、pTKONeorを鋳型とし、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKOProFSmaIKOTermRSmaI、およびPrimeSTARHSDNApolymeraseを用いて、TaELO2ORF上流配列人工合成NeorTaELO2ORF下流配列を増幅しPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C3min30cycles68°C10min4°C∞、1アガロースゲルを用いた電気泳動後に該DNA断片を抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。DNA断片の量と純度の検定は、OD260およびOD280測定によって行った。得られたDNA断片を、以降TKONeorと呼称する。次に、遺伝子銃法によるDNAの打ち込み操作を行った。すなわち、GY液体培地を用いて、TaureumATCC34304を25°C、150rpmで対数増殖期中期~後期まで培養後に、3500xg4°C10min遠心し上清を除いた。次に、得た菌体を元の培養液の100倍濃縮となるようにGY液体培地に再懸濁し、うち20μl分の細胞懸濁液を、1mgmlG418を含有する直径5cmのPDA寒天平板培地上に、直径3cm程度に薄く均一に塗布して乾燥させた。これに対し、PDS1000Heシステムを使用して、targetdistance6cm、vacuum26inchesHg、microcarriersize06μm、Rupturedisk1100psiの条件で打ち込み操作を行った。その後PDA寒天平板培地に100μlのPD液体培地を滴下して菌体を拡げ直して静置培養を行った。その結果、47x101cfuμgDNAの効率でG418耐性能が付与された形質転換体が得られた。実施例2-8TKONeorを導入した形質転換体のゲノムDNAを鋳型としたPCR形質転換体7コロニーを爪楊枝で釣菌後に、05mgmlG418を含有するGY液体培地に植菌した。複数回継代後に、実施例2-5記載の方法で菌体からゲノムDNAを抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。抽出したゲノムDNAの量と純度の検定はOD260およびOD280測定によって行った。次に、得た形質転換体および野生株のゲノムDNAを鋳型として、様々なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてPCRを行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、Neor検出SNeoFおよびSNeoR、KO確認1KOProFSmaIおよびKOTermRSmaIKO確認2E2KOProFEcoRVおよびSNeoRKO確認3SNeoFおよびE2KOTermREcoRVTaELO2増幅E2HindIIIおよびE2XbaIである。その結果、解析した7クローンのうち6クローンはランダムインテグレーションによる形質転換体であったが、1クローンは相同組換えによってTaELO2ORFがNeorへ置き換わっていることが確認された。しかし同時に、TaELO2ORFが増幅することが分かった。以上のことから、TaureumATCC34304は2倍体以上であるか、もしくはTaELO2がマルチコピー遺伝子である可能性が示唆された。実施例2-9サザンブロッティングによるTaELO2のコピー数の確認以下の実験はDIG説明書集日本語版8thRocheAppliedScience非特許文献25記載の方法に準じて行った。すなわち、野生株のゲノムDNAを各種制限酵素で切断後、1レーンあたり25μgずつ07のSeaKemRGTGRagaroseを使用した電気泳動に供した。これをナイロンメンブランにトランスファーし、PCRDIGProbeSynthesisKitを使用して作製したDIGラベルプローブと48°C、16hrでハイブリダイズさせた。DIGラベルプローブ作製に用いた1対のオリゴヌクレオチドプライマーは、TaELO2detFおよびTaELO2detRであるPCRcycles98°C2min98°C30sec65°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法NBTBCIP溶液を用いて行った。その結果、各種制限酵素で処理したレーン全てにシングルバンドが検出されることから、TaELO2はシングルコピー遺伝子であることが示された。このことから、TaureumATCC34304が2倍体以上であることが示唆された。実施例2-10TKONeorを導入した形質転換体のサザンブロッティングによる評価実施例2-9記載の方法でサザンブロッティングを行った。すなわち、1対のオリゴヌクレオチドプライマーuprobeFおよびuprobeRを用いてPCRPCRcycles98°C2min98°C30sec65°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞で増幅したDIGラベルプローブを用いて、EcoRVおよびPstIで消化した野生株と形質転換体のゲノムDNAに対する発色法NBTBCIP溶液を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、野生型アリルは約12kbpのDNA断片が検出されるが、相同組換えによってTaELO2ORFがNeorへ置き換わっている変異アリルでは、約25kbpのDNA断片が検出される。解析の結果、形質転換体においては変異型アリルと同時に野生型アリルのバンドも検出されることから、TaureumATCC34304は2倍体以上であることが示された。実施例2-11Hygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築残存した野生型アリルを破壊するために、Hygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターの構築を行った。先ず、fusionPCRによってTaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列とHygrの連結を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す。ubi600pFubihygroRubihygroFhygroRこれらのオリゴヌクレオチドプライマーのうち、ubi600pFubihygroRは実施例2-5に記載したTaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にしたTaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列の増幅に使用した。ubihygroFhygroRはpcDNA31Zeoを鋳型にした人工合成Hygrの増幅に使用した。尚、PCR反応条件は変性温度を98°C10秒とし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTmおよび増幅産物の長さによって適宜調節して行った。その結果、1636bpのTaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列Hygrの連結に成功し、これをpGEMTeasyVectorPromega社製を使用してTAクローン化したものをpTub600Hygrと名付けた。続いて、pTub600Hygrを鋳型とし、PrimeSTARHSDNApolymeraseを使用して、1対のオリゴヌクレオチドプライマーubi600pFNheIおよびhygroRXbaIを用いてPCRPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C3min30cycles68°C10min4°C∞を行い、5’末端にNheI、3’末端にXbaIサイトを付加したTaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列HygrDNA断片を調製した。また、実施例2-6記載のpTKONeorを鋳型とし、PrimeSTARHSDNApolymeraseを使用して、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKOvecFXbaIおよびKOvecRNheIを用いてPCRPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C3min30cycles68°C10min4°C∞を行い、実験例2-6記載のpTKONeorのNeorを除去し3’末端にNheI、5’末端にXbaIサイトを付加した直鎖状ベクターを調製した。両DNA断片を制限酵素NheIおよびXbaIで消化後にアガロースゲルを用いた精製を行い、LigationConvinienceKitを用いて環状ベクターを構築した。構築したHygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターは、pGEMTeasyVectorPromega社製を基本骨格とし、挿入配列として3537bpのTaELO2ORF上流配列TaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列HygrTaELO2ORF下流配列を有している。これをpTKOub600Hygrと命名した。実施例2-12KOub600Hygrの再導入とゲノムDNAを鋳型にしたPCR、サザンブロッティング、RTPCRによる形質転換体の評価構築したHygrを選択マーカーとしたTaELO2ターゲッティングベクターpTKOub600Hygrを鋳型として、1対のオリゴヌクレオチドプライマーKOProFSmaIKOTermRSmaI、およびPrimeSTARHSDNApolymeraseを用いて、TaELO2ORF上流配列TaureumATCC34304由来ユビキチンプロモーター配列HygrTaELO2ORF下流配列を増幅しPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C35min30cycles68°C10min4°C∞、得られたDNA断片をKOub600Hygrと名付けた。これを実施例2-6で得た形質転換体に対して同様の手法で導入し、1mgmlG418含有PDA寒天平板培地上で24時間静置培養後、菌体を回収して1mgmlG418および2mgmlハイグロマイシンBを含有するPDA寒天平板培地上で静置培養を続けたところ、多数の形質転換体が得られた。そのうち50クローンを釣菌し、1mgmlG418および2mgmlハイグロマイシンB含有GY液体培地中で複数回継代培養後に、実施例2-5記載と同様の手法でゲノムDNAを抽出し、エタノール沈殿後に適当量のTEに溶解した。抽出したゲノムDNAの量と純度の検定はOD260およびOD280測定によって行った。次に、得た形質転換体および野生株のゲノムDNAを鋳型として、様々なオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてPCRPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C10min4°C∞を行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、TaELO2ORF検出SNeoFおよびSNeoR、KO確認E2KOProFEcoRVおよびubihygroRである。その結果、解析した50クローンのうち、14クローンがTaELO2ORFを置換する形での相同組み換えを起こした形質転換体であることが示唆された。またそれらのクローンに関しては、TaELO2ORFが増幅しないことが確認された。引き続き、実施例2-10記載の手法を用いたサザンブロッティングを行った。すなわち、1対のオリゴヌクレオチドプライマーuprobeFおよびuprobeRを用いて調製したDIGラベルプローブを用いて、EcoRVおよびPstIで消化した野生株と形質転換体のゲノムDNAに対する発色法NBTBCIP溶液を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、野生型アリルは約12kbpのDNA断片、相同組換えによってTaELO2ORFがNeorへ置き換わっている変異アリルでは約25kbpのDNA断片、相同組換えによってTaELO2ORFがHygrへ置き換わっている変異アリルでは約19kbpのDNA断片が検出される。解析の結果、得た形質転換体では約25kbpの野生型アリルのバンドが消失し、代わりにTaELO2ORFがHygrへ置き換わっている約19kbpの変異アリルのバンドが新たに検出された。同様に、1対のオリゴヌクレオチドプライマーTaELO2probeFおよびTaELO2probeRを用いて、PCRPCRcycles98°C2min98°C30sec65°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞でTaELO2を検出するDIGラベルプローブを調製し、EcoRVで消化した野生株と形質転換体のゲノムDNAに対する発色法NBTBCIP溶液を用いたサザンブロッティングを行った。この場合、TaELO2は約25kbpのDNA断片として検出される。解析の結果、野生株ではTaELO2が検出されるのに対し、形質転換体では全く検出されないことが分かった。さらに、TaELO2破壊をmRNAレベルで検証するために、RTPCRによるTaELO2mRNAの検出を行った。GY液体培地を用いた培養3日目の野生株、および形質転換体の菌体から実施例2-1の場合と同様にセパゾールRNAISuperを使用してtotalRNAを抽出した。引き続き、RNeasyMiniKitを使用して添付のプロトコールに従いクリーンナップしたtotalRNA50μgを、50UのRecombinantDNaseIを使用して37°Cで1時間処理し、コンタミしたゲノムDNAの分解除去を行った。続いて、得たtotalRNAを鋳型として、oligoprimerおよびPrimeScriptReverseTranscriptaseを使用し、添付のマニュアルに従い1本鎖cDNAライブラリを調製した。さらに、得た1本鎖cDNAライブラリを鋳型として、1対のオリゴヌクレオチドプライマーE2HindIIIおよびE2XbaI、およびLAtaqHotStartVersionを使用し、TaELO2ORFを増幅PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C10min4°C∞した。その結果、野生株では検出されるTaELO2mRNAが、形質転換体では全く検出されないことが分かった。以上の結果から、TaELO2を完全に破壊したTaELO2欠損ホモ接合体の取得に成功したことが分かった。またこの結果から、TaureumATCC34304が2倍体であることが判明した。実施例2-13野生株、およびTaELO2欠損ホモ接合体の脂肪酸組成の比較実施例2-12で得たTaELO2欠損ホモ接合体と野生株の脂肪酸組成を、メチルエステル化した脂肪酸のGC解析によって行った。すなわち、GY液体培地で培養5日後のTaELO2欠損ホモ接合体と野生株の菌体を回収し、実施例2-4記載の方法で菌体由来脂肪酸の抽出とメチルエステル化、およびGC解析を行った。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。その結果、TaELO2欠損ホモ接合体では、TaELO2の基質となるEPA量が野生株の2倍程度まで増加すると共に、下流の代謝産物であるDHA量の減少が観察された。ラビリンチュラにおいて、デサチュラーゼエロンガーゼ経路を構成する遺伝子の破壊による脂肪酸組成を改変した例は本発明が初である。すなわち、ラビリンチュラTaureumにおいてデサチュラーゼエロンガーゼ経路がPUFA生合成に関与することを明確に示したのみならず、その構成遺伝子のノックアウトによって、脂肪酸組成の改変が可能であることを意味している。将来的には、外来デサチュラーゼエロンガーゼ遺伝子の過剰発現やPUFAPKS遺伝子のノックアウト等を組み合わせたPUFA生合成経路の人工構築によって、産業上有用なPUFAを選択的に大量生産するラビリンチュラ類分子育種が可能であると予想される。[ParietichytriumsarkarianumのC20エロンガーゼ遺伝子の破壊]実施例3-1SV40terminator配列のサブクローニングpcDNA31MycHisvectorを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseによりSV40terminator配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO58はSV40terminator配列上に設定し、BglIIおよびBamHIリンカー配列を含む。RHO52はSV40terminator配列上に設定し、BglII配列を含む。RHO5834mer5’CAGATCTGGATCCGCGAAATGACCGACCAAGCGA3’、RHO5224mer5’ACGCAATTAATGTGAGATCTAGCT3’。下記の条件で増幅後、pGEMTeasyvectorにクローニングした。PCRcycles98°C2min98°C30sec60°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH27と名付けた。サブクローニングしたSV40terminator配列を含むプラスミドを図11に示す。実施例3-2人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットの作製ThraustochytriumaureumATCC34304株をGY培地で培養し、対数増殖期後期の細胞を4°C、3500×g、5min遠心してペレットにし、液体窒素にて凍結後破砕した。細胞破砕液をフェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。TE溶液に溶解した核酸を37°C、30minRNase処理してRNAを分解し、再度フェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりubiquitinpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO53はubiquitinpromoter配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む。TKO1はubiquitinpromoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO5336mer5’CCCAGATCTGCCGCAGCGCCTGGTGCACCCGCCGGG3’、TKO158mer5’CGTGAAGGCCGTCCTGTTCAATCATGTTGGCTAGTGTTGCTTAGGTCGCTTGCTGCTG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C1min。人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製により人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TKO2はubiquitinpromoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO57は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含み、BglIIリンカー配列を有する。TKO254mer5’AGCGACCTAAGCAACACTAGCCAACATGATTGAACAGGACGGCCTTCACGCTGG3’、RHO5726mer5’CAGATCTCAAAAGAACTCGTCCAGGA3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C1min。配列番号54および57を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってRHO53およびRHO57を用いFusionPCRを行った。酵素はLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製を使用し、PCRcycles94°C2min94°C20sec55°C30sec68°C1min30cycles68°C1minただし55°Cから68°Cへは1°C10secとしたの条件で増幅後、BglIIにて消化した。。上記のようにしてFusionしたThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinpromoter-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を、BglIIにて消化し、これを実施例3-1記載pRH27のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH31と名付けた。作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを図13に示す。実施例3-3ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットの作製ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりubiquitinpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO53はubiquitinpromoter配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む。KSO8はubiquitinpromoter配列とハイグロマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO5336mer5’CCCAGATCTGCCGCAGCGCCTGGTGCACCCGCCGGG3’、KSO858mer5’TCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATGTTGGCTAGTGTTGCTTAGGTCGCTTGCTGCTG3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。pcDNA31Hygroを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、KSO7はubiquitinpromoter配列とハイグロマイシン耐性遺伝子配列を含む。RHO56はハイグロマイシン耐性遺伝子を含み、BglIIリンカー配列を有する。KSO756mer5’AGCGACCTAAGCAACACTAGCCAACATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTG3’、RHO5636mer5’CAGATCTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGG3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。配列番号61および63を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってRHO53およびRHO56を用いてFusionPCRを行った。酵素はLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製を使用し、下記の条件で増幅後、BglIIにて消化した。PCRcycles94°C2min94°C20sec55°C30sec68°C1min30cycles68°C1min。ただし55°Cから68°Cへは1°C10secとした。上記のようにしてFusionしたThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinpromoter-pcDNA31Hygro由来ハイグロマイシン耐性遺伝子を、BglIIにて消化し、これを実施例3-1、図11記載pRH27のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH32と名付けた。作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを図15に示す。実施例3-4パリエティキトリウム属C20エロンガーゼ遺伝子のクローニング実施例3-2記載の方法で抽出したParietichytriumsarkarianumSEK364ゲノムDNAを抽出し、ゲノムを解読した。C20エロンガーゼ遺伝子に保存される領域を標的として、正方向、および逆方向のオリゴヌクレオチドを合成した。次に、実施例3-2に記載の方法で調製したParietichytriumsarkarianumSEK364ゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチドPsTaELO2F1およびPsTaELO2R2を用いたPCRを、LAtaqHotstartversionを用いて行ったPCRcycles98°C1min98°C10sec60°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞。得た特異的増幅産物をゲル精製し、ダイレクトシーケンスによってその塩基配列を解析したところ、既知のC20エロンガーゼ遺伝子の配列と有意な相同性を示すことから、ParietichytriumsarkarianumSEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子の部分配列であることが示唆された。続いて、実施例2-2の場合と同様に、3’および5’RACEによるParietichytriumsarkarianumSEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子のクローニングを行った。まず、正方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーおよびを設計した。次に、SMARTTMRACEcDNAAmplificationKitによって作製したcDNAライブラリを鋳型に、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチドPsRACEF1もしくはPsRACER1を用いた3’および5’RACEPCRcycles94°C30sec5cycles94°C30sec70°C30sec72°C3min5cycles94°C30sec68°C30sec72°C3min25cycles4°C∞を行った。続いて、得た両RACE産物を鋳型として、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチドPsRACEF2もしくはPsRACER2を用いたnestedPCRPCRcycles94°C1min94°C30sec68°C30sec72°C3min25cycles72°C10min4°C∞を行った。得た特異的産物をゲル精製し、pGEMTeasyVectorを使用したTAクローン化後に塩基配列を解析した結果、ParietichytriumsarkarianumSEK364由来C20エロンガーゼ遺伝子であることが確認された。さらに、実施例3-2に記載の方法で抽出したParietichytrium属のゲノムDNAを鋳型にし、LAtaqHotstartversionによりC20エロンガーゼ遺伝子配列を含む配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記のとおりで、RHO153は開始codonを含み、リンカー配列としてBamHIサイトを有する。RHO154は終止codonを含み、リンカー配列としてBamHIサイトを有する。RHO15332mer5’CCCGGATCCATGGCAGCTCGCGTGGAGAAACA3’、RHO15433mer5’CCCGGATCCTTACTGAGCCTTCTTGGAGGTCTC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C2min。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子936bpをクローニングした。これをpRH80と名付けた。アミノ酸配列を配列番号:77に示す。実施例3-5パリエティキトリウム属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミド作製実施例3-4で作製したpRH80を鋳型に、C20エロンガーゼ遺伝子配列中腹部分にBglIIサイトを挿入する様、逆向きに設定したprimersetを用意し、PrimeSTARMaxDNAPolymeraseにて増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りでともにBglIIリンカー配列を有する。RHO15526mer5’ACAAAGATCTCGACTGGACCGACACC3’、RHO15627mer5’AGTCGAGATCTTTGTCAGGAGGTGGAC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec56°C15sec72°C1min30cycles72°C1min。上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH83と名付けた。BglIIサイトを挿入したC20エロンガーゼ遺伝子配列935bpを配列番号:80に示す。作製したParietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミドを図17に示す。実施例3-6ターゲティングベクターの作製人工合成ネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子実施例3-2記載のpRH31をBglIIにて消化し、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例3-5記載pRH83のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH85と名付けた。実施例3-3記載のpRH32をBglIIにて消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例3-5記載pRH83のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH86と名付けた。作製した2種のターゲティングベクターを図18に示す。実施例3-7C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例3-6で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、RHO153およびRHO154をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例3-6記載pRH85を鋳型とした際に得られる導入断片は2661bpで、Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。実施例3-6記載pRH86を鋳型とした際に得られる導入断片は2892bpで、Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-ハイグロマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。ParietichytriumsarkarianumSEK364株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1550PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり10から20個の薬剤耐性株を得た。実施例3-8C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、ParietichytriumsarkarianumSEK364株、および、C20エロンガーゼ遺伝子ヘテロ相同組換体、C20エロンガーゼ遺伝子ホモ相同組換体遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、LAtaqHotstartversionを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図19に示す。RHO184はC20エロンガーゼ上流、RHO185は下流、RHO142およびRHO143は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上、RHO140およびRHO141はハイグロマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。RHO14020mer5’GGTTGACGGCAATTTCGATG3’、RHO14122mer5’CCTCCTACATCGAAGCTGAAAG3’、RHO14221mer5’CTTCTCGGGCTTTATCGACTG3’、RHO14322mer5’TAAGGTCGGTCTTGACAAACAG3’、RHO18424mer5’AGTAGTCCCCGATTTGGTAGTTGA3’、RHO18522mer5’GGCAGAGAGCAAAAACACGAGC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C4min30cycles68°C7min。野生型アリルに増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリルおよびハイグロマイシン耐性遺伝子アリルに増幅のないC20エロンガーゼノックアウト株が得られた。実施例3-9C20エロンガーゼ破壊による脂肪酸組成の変化ParietichytriumsarkarianumSEK364、および遺伝子破壊株を、GY培地で培養した。対数増殖期後期の細胞を4°C、3000rpm、10min遠心してペレットにし、09NaClに懸濁、洗浄する。つづいて4°C、3000rpm、10min遠心し、ペレットを滅菌水に懸濁、洗浄した。それをさらに3000rpm、10min遠心し、上清を除き、凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞に2mlのmethanolicKOH75KOHin95methanolを加え、ボルテックス後、超音波で菌体を破砕した80°C、30min。ついで、500μlの滅菌水を加えてボルテックスした後、2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を捨てる。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を捨てた。残った下層に1mlの6NHClを添加してボルテックスした後、2mLのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルに2mlの3NmethanolicHClを添加し、80°Cで一晩インキュベートした。サンプルを室温まで冷まし、1mlの09NaClを添加した。ついで、2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを少量添加後、ボルテックス。3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルを05mlのnhexaneに溶解し、1μlをGC解析にかけた。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。この結果、ParietichytriumsarkarianumSEK364においてC20エロンガーゼをノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。。図22に野生型株を100ととした時の割合を示す。これらの結果、アラキドン酸が約10倍、EPAが約8倍に増加し、またDPAが約14、DHAが約15に減少した。[ThraustochytriumaureumのPUFAPKS経路関連遺伝子OrfAの破壊]実施例4-1PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAの上流配列のクローニング実施例3-2記載の方法で、ThraustochytriumaureumATCC34304よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを用い、LAPCRTMinvitroCloningKitを使用して、ゲノムカセットライブラリを作製した。特許文献7に記載のPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA上にPCRlowerprimerRHO2023mer5’CGATGAAAGGTCACAGAAGAGTC3’を設定し、上記記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせてDNAを増幅した1stPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。つづいて、1stPCR増幅産物を100倍希釈し、PCRlowerprimerRHO20および上記記載のKit付属ネスティッドプライマーを組み合わせてDNAを増幅した2ndPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。OrfAの上流3181bpを含む3377bpのDNA断片をクローニングした。OrfAの上流DNA配列情報として3181bpが明らかになった。実施例4-2PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAの下流配列のクローニング実施例4-1で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。特許文献7に記載のPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA上にPCRupperprimerRHO2121mer5’CAGGGCGAGCGAGTGTGGTTC3’を設定し、実施例4-1記載の方法でDNAを増幅した。得られたDNA断片をpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。OrfAの下流1160bpを含む1204bpのDNA断片をクローニングした。配列番号94上に再度PCRupperprimerRHO2820mer5’TGATGCCGATGCTACAAAAG3’をクローニングした。OrfAの下流DNA配列情報として通算2551bpが明らかになった。実施例4-3PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAターゲティングベクターの作製ThraustochytriumaureumATCC34304のゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製により18SrDNA配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO30は18SrDNA配列上に設定した。TMO31は18SrDNA配列とEF1αpromoter配列を含む。TMO3030mer5’CGAATATTCCTGGTTGATCCTGCCAGTAGT3’、TMO3146mer5’GTAACGGCTTTTTTTGAATTGCAGGTTCACTACGCTTGTTAGAAAC3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C2min30cycles72°C2min。また、ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製によりEF1αpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO32は18SrDNA配列とEF1αpromoter配列を含む。TMO33はEF1αpromoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。TMO3246mer5’GGTTTCCGTAGTGAACCTGCAATTCAAAAAAAGCCGTTACTCACAT3’、TMO3346mer5’GCGTGAAGGCCGTCCTGTTCAATCATCTAGCCTTCCTTTGCCGCTG3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。人工合成ネオマイシン耐性遺伝子を鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製により人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO34はEF1αpromoter配列と人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列を含む。TMO35は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列とEF1αterminator配列を含む。TMO3445mer5’CATCGGCAAAGGAAGGCTAGATGATTGAACAGGACGGCCTTCACG3’、TMO3546mer5’GCGCATAGCCGGCGCGGATCTCAAAAGAACTCGTCCAGGAGGCGGT3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。また、ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製によりEF1αterminator配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO36は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列とEF1αterminator配列を含む。TMO37はEF1αterminator中に設定した。TMO3646mer5’TCCTGGACGAGTTCTTTTGAGATCCGCGCCGGCTATGCGCCCGTGC3’、TMO3730mer5’CACTGCAGCGAAAGACGGGCCGTAAGGACG3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C2min30cycles72°C2min。配列番号98、101、104、107を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってFusionPCRを行った。酵素にはLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製を用いた。初回の増幅には、TMO30およびTMO33のset、TMO34およびTMO37のsetを用いた。2度目の増幅はTMO30およびTMO37のsetを用いた。PCR反応の条件は変性温度を98°C10secとし、アニーリングおよび伸長反応はプライマーのTm値および増幅断片の長さによって適宜調節した。上記のようにして連結したDNA断片をTaureum18SrDNA中のEcoRIサイト、および、TaureumEF1αterminator中のNcoIサイトで切り出し、pGEMTeasyvector由来のvectorにつなぎ換えた。これをpRH5と名付けた図24。ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にし、実施例4-1で明らかにした上流配列中にPCRprimerを設定し、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりDNAを増幅した。この増幅により、1218bpのDNA断片が得られた。これをターゲティングベクターの5’相同領域とした。用いたPCRprimerは下記の通りで、それぞれリンカー配列としてEcoRIサイト、もしくはHindIIIサイトを付加した。RHO3332mer5’CCCGAATTCGGACGATGACTGACTGACTGATT3’、RHO3428mer5’CCCAAGCTTGTCTGCCTCGGCTCTTGGT3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec57°C30sec72°C1min30cycles72°C3min。ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にし、実施例4-2で明らかにした下流配列中にPCRprimerを設定し、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりDNAを増幅した。この増幅により、1000bpのDNA断片が得られた。これをターゲティングベクターの3’相同領域とした。用いたPCRprimerは下記の通りで、ともにリンカー配列NcoIサイトを付加した。RHO2928mer5’CCCCCATGGTGTTGCTGTGGGATTGGTC3’、RHO3030mer5’CCCCCATGGCTCGGTTACATCTCTGAGGAA3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec57°C30sec72°C1min30cycles72°C3min。増幅した上流配列を図24記載pRH5中のEcoRIサイトおよびHindIIIサイトに連結した。増幅した下流配列をNcoIサイトに連結した。このベクターをpRH21と名付けた。作製した人工合成ネオマイシン耐性遺伝子を使用したターゲティングベクターpRH21を図25に示す。実施例4-4PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAターゲティングベクターの作製ハイグロマイシン耐性遺伝子実施例3-3記載pRH32を鋳型にし、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりubiqitinpromoterハイグロマイシン耐性遺伝子断片を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO59はubiquitinpromoter上に設定し、リンカー配列HindIIIサイトを付加した。RHO60はハイグロマイシン耐性遺伝子配列を終止codon含み、リンカー配列SphI、SalIを有する。RHO5936mer5’CCCAAGCTTGCCGCAGCGCCTGGTGCACCCGCCGGG3’、RHO6043mer5’CCCGCATGCGTCGACTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGG3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。増幅した断片を実施例4-3記載pRH21のHindIIIおよびSphIサイトに連結した図26、pRH30。ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型にし、実施例4-2で明らかにした下流配列中に作製したPCRprimerを用いて、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。この増幅により、1000bpのDNA断片が得られた。これをターゲティングベクターの3’相同領域とした。用いたPCRprimerは下記の通りで、ともにリンカー配列SalIサイトを付加した。RHO6129mer5’CCCGTCGACGTGTTGCTGTGGGATTGGTC3’、RHO6229mer5’CCCGTCGACTCGGTTACATCTCTGAGGAA3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec57°C30sec72°C1min30cycles72°C3min。増幅した下流配列をpRH30のSalIサイトに連結した。これをpRH33と名付けた。作製したハイグロマイシン耐性遺伝子を使用したターゲティングベクターpRH33を図27に示す。実施例4-5PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAターゲティングベクター導入実施例4-3および4-4で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO30およびRHO33をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec60°C30sec72°C1min30cycles72°C3min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例4-3記載pRH21を鋳型とした際に得られる導入断片は3705bpで、ThraustochytriumaureumOrfA遺伝子上流-EF1αpromoter配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ThraustochytriumaureumOrfA遺伝子下流という並びになる。実施例4-4記載pRH33を鋳型とした際に得られる導入断片は3826bpで、ThraustochytriumaureumOrfA遺伝子上流-ubiquitinpromoter配列-ハイグロマイシン耐性遺伝子配列-ThraustochytriumaureumOrfA遺伝子下流という並びになる。ThraustochytriumaureumATCC34304株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は4~6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。実施例4-6PUFAPKS経路関連遺伝子OrfAジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304、および、ヘテロ相同組換体、ホモ相同組換体PKS経路関連遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。ゲノムDNAを制限酵素で切断後、1ウェルあたり約2~3μgずつ07SeaKemGTGアガロースゲルタカラバイオ社製に電気泳動した。これをナイロンメンブレンにトランスファーし、DIGシステムを使用して作製したprobeと54°C、16hrでハイブリダイズさせた。probe作製に用いたprimerは下記の通り。5’側RHO3722mer5’GAAGCGTCCCGTAGATGTGGTC3’、RHO3821mer5’GCCCGAGAGGTCAAAGTACGC3’、3’側RHO3920mer5’GCGAGCCCAGGTCCACTTGC3’、RHO4022mer5’CAGCCCGATGAAAAACTTGGTC3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec60°C30sec、72°C2min30cycles72°C3min。使用した制限酵素およびprobeの位置は図28に示した。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法NBTBCIP溶液を用いて行った。5’側および3’側の解析いずれにおいても、薬剤耐性遺伝子が相同組換えをおこした際あらかじめ予想されるサイズに、バンドが観察された。実施例4-7PUFAPKS経路関連遺伝子:OrfAの破壊による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。脂肪酸組成の変化を図30に示す。図31に野生型株を100ととした時の割合を示した。この結果、ThraustochytriumaureumにおいてPUFAPKS経路関連遺伝子:OrfAを破壊すると、DPAC225n6に増加傾向、DHAC226n3に減少傾向が見られた。[ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊]実施例5-1ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子の上流配列のクローニング実施例4-1で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。実施例2-5記載のC20エロンガーゼ遺伝子上流配列上にPCRlowerprimerRHO7122mer5’GGGAGCGCAGGGAAAACGGTCT3’を作製し、実施例4-1記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせて遺伝子を増幅した1stPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。続いて、1stPCR増幅産物を100倍希釈し、PCRlowerprimerRHO7220mer5’CCAGCCCACGTCGTCGGAGC3’および実施例4-1記載のKit付属ネスティッドプライマーを組み合わせて遺伝子を増幅した2ndPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。C20エロンガーゼ遺伝子の上流-3277bp~-981bpの領域を含む2297bpのDNA断片をクローニングした。実施例5-2C20エロンガーゼ遺伝子の下流配列のクローニング実施例4-1で作製したゲノムカセットライブラリを鋳型として使用した。実施例2-5記載のC20エロンガーゼ遺伝子下流配列上にPCRupperprimerRHO8723mer5’GCCGCTCATGCCCACGCTCAAAC3’を作製し、実施例4-1記載のKit付属カセットプライマーと組み合わせて遺伝子を増幅した1stPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。続いて、1stPCR増幅産物を100倍希釈し、PCRlowerprimerRHO7323mer5’CTTTCGGCTGCCAGGAATCTACG3’および実施例4-1記載のKit付属ネスティッドプライマーを組み合わせて遺伝子を増幅した2ndPCRcycles98°C2min98°C30sec56°C30sec72°C4min30cycles72°C5min。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。C20エロンガーゼ遺伝子の下流1106bp~3294bpの領域を含む2189bpのDNA断片をクローニングした。実施例5-3ブラストサイジン耐性遺伝子カセットの作製ThraustochytriumaureumATCC34304よりゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりubiquitinpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO53はubiquitinpromoter配列上に設定、BglIIリンカー配列を含む。RHO48はubiquitinpromoter配列とブラストサイジン耐性遺伝子配列を含む。RHO4858mer5’CTTCTTGAGACAAAGGCTTGGCCATGTTGGCTAGTGTTGCTTAGGTCGCTTGCTGCTG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C1min。pTracerCMVBsdlacZを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferによりブラストサイジン耐性遺伝子を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、RHO47はubiquitinpromoter配列とブラストサイジン耐性遺伝子配列を含む。RHO49はブラストサイジン耐性遺伝子配列を含み、BglIIリンカー配列を有する。RHO4754mer5’AGCGACCTAAGCAACACTAGCCAACATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATC3’、RHO4938mer5’CCCAGATCTTAGCCCTCCCACACATAACCAGAGGGCAG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C1min。配列番号135および137を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってRHO53およびRHO49を用いてFusionPCRを行った。酵素はLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製を使用し、下記の条件で増幅後、BglIIにて消化した。PCRcycles94°C2min94°C20sec55°C30sec68°C1min30cycles68°C1min。ただし55°Cから68°Cへは1°C10secとした。上記のようにしてFusionしたThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinpromoter-pTracerCMVBsdlacZ由来ブラストサイジン耐性遺伝子を、BglIIにて消化し、これを実施例3-1記載pRH27のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH38と名付けた。作製したブラストサイジン耐性遺伝子カセットを図33に示す。実施例5-4GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットの作製ThraustochytriumaureumATCC34304よりゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymerasewithGCBufferタカラバイオ社製によりubiquitinpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO38はubiquitinpromoter配列上に設定した。TMO39はubiquitinpromoter配列とEnhancedGFP遺伝子配列を含む。TMO3829mer5’TCGGTACCCGTTAGAACGCGTAATACGAC3’、TMO3941mer5’TCCTCGCCCTTGCTCACCATGTTGGCTAGTGTTGCTTAGGT3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。EnhancedGFP遺伝子配列clontech社製を鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製によりEnhancedGFP遺伝子配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO40はubiquitinpromoter配列とEnhancedGFP遺伝子配列を含む。RHO91はEnhancedGFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。TMO4041mer5’ACCTAAGCAACACTAGCCAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3’、RHO9158mer5’GAACGGCACTGGTCAACTTGGCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAA3’。PCRcycles98°C10sec98°C10sec58°C30sec72°C2min30cycles72°C2min。配列番号141および144を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製により、FusionPCRを行った。PrimerにはTMO38およびRHO91を用い、条件はPCRcycles94°C2min94°C20sec55°C30sec68°C2min30cycles68°C2minただし、55°Cから68°Cへは1°C10secとした。配列番号147を鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製によりubiquitinpromoter配列-EnhancedGFP遺伝子配列を増幅した。用いたprimerは下記の通り。RHO53はubiquitinpromoter配列を含み、BglIIサイトを有する。RHO91はEnhancedGFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C2min30cycles68°C2min。pcDNA31Zeoを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製によりゼオシン耐性遺伝子配列を増幅した。RHO92はEnhancedGFP配列およびゼオシン耐性遺伝子配列を含む。RHO64はゼオシン耐性遺伝子配列を含み、BglIIサイトを有する。RHO9254mer5’CGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGT3’、RHO6438mer5’CCCAGATCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCAC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C1min。配列番号148および149を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってLAtaqHotstartversionタカラバイオ社製によりFusionPCRを行った。PrimerにはRHO53およびRHO64を用い、条件はPCRcycles94°C2min94°C20sec68°C2min30cycles68°C2minただし55°Cから68°Cへは1°C10secとした。上記のようにしてFusionしたThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinpromoter-EnhancedGFP遺伝子-pcDNA31Zeo由来ゼオシン耐性遺伝子図35、1677bp、配列番号:152をBglIIにて消化し、これを実施例3-1記載pRH27図11のBamHIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH51と名付けた。作製したGFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットを図36に示す。実施例5-5C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台となるプラスミド作製ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型に、PrimeSTARHSDNApolymeraseタカラバイオ社製により、C20エロンガーゼ遺伝子およびその周辺配列をPCR法にて増幅した2884bp、配列番号:153。用いたPCRprimerは下記の通りで、いずれもEcoRIリンカー配列を含み、KSO9はC20エロンガーゼ遺伝子上流中に、KSO10はC20エロンガーゼ遺伝子下流に設定した。KSO950mer5’CCCGAATTCACTAGTGATTCTCCCGGGTGGACCTAGCGCGTGTGTCACCT3’、KSO1040mer5’CCCGAATTCGATTATCCCGGGGCCGAGAACGGGGTCGCCC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C35min30cycles68°C10min。酵素はPrimeSTARHSDNAPolymeraseタカラバイオ社製を使用し、増幅後、EcoRIにて消化したのち、pBluescriptvectorEcoRIサイトにクローニングした。大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した図37。図37記載のプラスミドを鋳型に、C20エロンガーゼ遺伝子配列部分を欠失し、BglIIサイトを挿入する目的で、逆向きに設定したprimersetを用意し、PrimeSTARMaxDNAPolymeraseタカラバイオ社製にて増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、ともにBglIIリンカー配列を有する。RHO6938mer5’CCCAGATCTACCTGTTTCCGGCTGGCTCCCGAGCCATG3’、RHO7038mer5’CCCAGATCTGGTCGCGTTTACAAAGCAGCGCAGCAACA3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C15min30cycles68°C15min上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH40と名付けた。作製したC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台となるプラスミドを図38に示す。実施例5-6ターゲティングベクターの作製ブラストサイジン耐性遺伝子およびGFP融合ゼオシン耐性遺伝子実施例5-3記載のpRH38をBglIIにて消化し、ブラストサイジン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例5-5記載のpRH40のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH43と名付けた。実施例5-4記載のpRH51をBglIIにて消化し、GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例5-5記載のpRH40のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH54と名付けた。作製した2種のターゲティングベクターを図39に示す。実施例5-7ThraustochytriumaureumOrfA破壊株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例5-6で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、KSO11およびKSO12をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。KSO11はThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子上流に、KSO12はThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子下流に設定した。KSO1131mer5’CTCCCGGGTGGACCTAGCGCGTGTGTCACCT3’、KSO1227mer5’ATCCCGGGGCCGAGAACGCCCTCGCCC3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例5-6記載pRH43を鋳型とした際に得られる導入断片は3215bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子上流-ubiquitinpromoter-ブラストサイジン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる。実施例5-6記載pRH54を鋳型とした際に得られる導入断片は3887bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子上流-ubiquitinpromoter-EnhancedGFP遺伝子配列-ゼオシン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる。実施例4記載のPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA遺伝子破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は4~6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。実施例5-8C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、ThraustochytriumaureumおよびThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊株からゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。ゲノムDNAを制限酵素で切断後、1ウェルあたり約2~3μgずつ07SeaKemGTGアガロースゲルタカラバイオ社製に電気泳動した。これをナイロンメンブレンにトランスファーし、DIGシステムを使用して作製したprobeと51°C、16hrでハイブリダイズさせた。probe作製に用いたprimerは下記の通り。5’側RHO9421mer5’ACGTCCGCTTCAAACACCTCG3’、RHO9524mer5’TCGGAACAACTGGAACAACTAAAG3’、3’側RHO9622mer5’ATGTCGCTCTCCTTCTTCTCAG3’、RHO9721mer5’TCGGCTCCTGGAAAGTGCTCT3’。PCRcycles98°C2min98°C30sec58°C30sec、72°C1min30cycles72°C3min。使用した制限酵素およびprobeの位置は図40に示した。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法NBTBCIP溶液を用いて行った。5’側および3’側の解析いずれにおいても、薬剤耐性遺伝子が相同組換えをおこした際あらかじめ予想されるサイズに、バンドが観察された。この実験により、ThraustochytriumaureumATCC34304株は、PKS経路関連遺伝子OrfAおよびC20エロンガーゼ遺伝子を欠損しても栄養要求性にならないことが分かった。実施例5-9ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。脂肪酸組成の変化を図42に示す。また、図43に野生型株を100とした時の割合を示す。この結果、ThraustochytriumaureumOrfA破壊株においてC20エロンガーゼ遺伝子を破壊すると、C204n6が約8倍に増加、C205n3が約4倍に増加、C226n3が約15倍に減少した。[ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるω3デサチュラーゼ遺伝子の発現]実施例6-1ミズカビSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子のクローニングと遺伝子発現プラスミドの作製実施例3-2記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型に、LATaqwithGCBufferタカラバイオ社製、BufferII使用によりubiquitinpromoter配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO42はubiquitinpromoter配列上、RHO53よりも上流に設定、KpnIリンカー配列を含む。TMO43はubiquitinpromoter配列とSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列を含む。TMO4229mer5’TCGGTACCCGTTAGAACGCGTAATACGAC3’、TMO4345mer5’TTCGTCTTATCCTCAGTCATGTTGGCTAGTGTTGCTTAGGTCGCT3’。PCRcycles96°C2min98°C20sec60°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。次に、Saprolegniadiclinaを、1LあたりDGlucose318g、YesatExtract106g、を含有する培地脱イオン水で調整で培養した。対数増殖期後期の細胞を4°C、3500×g、5min遠心してペレットにし、液体窒素にて凍結破砕した。細胞破砕液をフェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。TE溶液に溶解した核酸を37°C、30minRNase処理してRNAを分解し、再度フェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。A260280を測定し、DNA純度、および濃度を算出した。このようにして得られたSaprolegniadiclinaのゲノムDNAを鋳型に、LATaqwithGCBufferタカラバイオ社製、BufferII使用によりSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO44はubiquitinpromoter配列とSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列を含む。TMO45はSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列およびubiquitinterminatorを含む。TMO4443mer5’CCTAAGCAACACTAGCCAACATGACTGAGGATAAGACGAAGGT3’、TMO4540mer5’ATACTACAGATAGCTTAGTTTTAGTCCGACTTGGCCTTGG3’。PCRcycles96°C2min98°C20sec60°C30sec72°C1min30sec30cycles72°C1min30sec。ThraustochytriumaureumATCC34304ゲノムDNAを鋳型に、LATaqwithGCBufferタカラバイオ社製、BufferII使用によりubiquitinterminator配列を増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、TMO46はSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列およびubiquitinterminatorを含む。TMO47はubiquitinterminator配列上に設計し、KpnIリンカー配列を含む。TMO4644mer5’CCAAGGCCAAGTCGGACTAAAACTAAGCTATCTGTAGTATGTGC3’、TMO4745mer5’TCGGTACCACCGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGCAGTT3’。PCRcycles96°C2min98°C20sec60°C30sec72°C1min30cycles72°C1min。配列番号167、170、173を鋳型に、非特許文献19記載の方法に従ってTMO42およびTMO47を用いてFusionPCRを行った。酵素はLATaqwithGCBufferタカラバイオ社製、BufferII使用を使用し、下記の条件で増幅した。PCRcycles96°C2min98°C20sec55°C30sec68°C3min30cycles68°C3min。ただし55°Cから68°Cへは1°C10secとした。実施例5-3記載pRH38を鋳型にRHO84およびRHO52を用いてPCRを行った。RHO84はubiquitinpromoter上に設定、KpnIリンカー配列を有する。RHO52はSV40terminator配列上に設定、BglIIリンカーを有する。酵素はLAtaqHotstartversionを使用し、下記の条件で増幅後、pGEMTeasyvectorにクローニングした。RHO8436mer5’CCCGGTACCGCCGCAGCGCCTGGTGCACCCGCCGGG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30sec30cycles68°C3min。大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH45と名付けた。図44でFusionしたThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinpromoter-Saprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子-ThraustochytriumaureumATCC34304由来ubiquitinterminatorを、KpnIにて消化し、これをpRH45のKpnIサイトに繋いだ。出来たプラスミドを大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH48と名付けた。作製したSaprolegniadiclina由来ω3デサチュラーゼ遺伝子発現プラスミドを図46に示す。実施例6-2ThraustochytriumaureumOrfA破壊株へのミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現プラスミド導入実施例6-1で作製したターゲティングベクターを鋳型に、TMO42およびRHO52をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製によりDNAを増幅した。PCRcycles94°C30sec72°C1min5cycles94°C30sec70°C30sec72°C1min5cycles94°C30sec68°C30sec72°C1min25cycles72°C2min。10アガロースゲルより増幅産物を回収し、エタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。PCRによって得られる導入断片は3777bpで、ubiquitinpromoter-ω3デサチュラーゼ遺伝子-ubiquitinterminator-ubiquitinpromoter-ブラストサイジン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列という並びになる。実施例4で作製したThraustochytriumaureumOrfA破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は4~6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり20から30個の薬剤耐性株を得た。実施例6-3ミズカビ由来ω3デサチュラーゼ遺伝子発現株の取得実施例3-2記載の方法で、実施例3で作製したThraustochytriumaureumOrfA破壊株およびω3デサチュラーゼ遺伝子発現株からゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、LAtaqHotstartversionを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図47に示す。TMO42はubiquitinpromoter上、RHO49はブラストサイジン耐性遺伝子上に設定した。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C4min30cycles68°C7min。予想されるサイズに増幅するバンドが確認できた。導入した発現断片がゲノムに安定に導入された株が単離できた。実施例6-4PUFAPKS経路破壊株におけるω3デサチュラーゼ発現による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法で、実施例4で作製したThraustochytriumaureumOrfA破壊株および実施例6-3で作製したω3デサチュラーゼ発現株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。この結果、ω3デサチュラーゼ発現株ではn6系列の脂肪酸が減少し、n3系列の脂肪酸に増加傾向が見られた。図50に野生型株を100ととした時の割合を示す。これらの結果、アラキドン酸が約17、DPAが約110に減少し、またEPA、DHAともに約3倍に増加した。[ThraustochytriumroseumのC20エロンガーゼ遺伝子の破壊]実施例7-1Troseum由来C20エロンガーゼ遺伝子のクローニングThraustochytriumroseumATCC28210株のC20エロンガーゼ遺伝子に保存される領域を標的として、正方向、および逆方向の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。次に、実施例2-5記載の方法と同様の手法で抽出したTroseumゲノムDNAを鋳型として、Advantage2PolymeraseMixを使用したPCRPCRcycles94°C1min94°C30sec55°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞を行った。得た特異的産物を、2アガロースゲル電気泳動による分離後に精製し、pGEMTeasyVectorを使用して該DNA断片のTAクローニングを行った後に、その塩基配列を解析した。その結果、既知のTaureum由来C20エロンガーゼ遺伝子の配列と極めて高い配列同一性を示すことから、Troseum由来C20エロンガーゼ遺伝子の部分配列であることが示唆された。続いて、実施例2-2の場合と同様に、3’および5’RACEによるTroseum由来C20エロンガーゼ遺伝子のクローニングを行った。まず、以下に示すオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。正方向オリゴヌクレオチドプライマー、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび。次に、SMARTTMRACEcDNAAmplificationKitによって作製したcDNAライブラリを鋳型に、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチド8F1もしくは8R1を用いた3’および5’RACEPCRcycles94°C30sec5cycles94°C30sec70°C30sec72°C3min5cycles94°C30sec68°C30sec72°C3min25cycles4°C∞を行った。さらに5’RACEにおいては、得たRACE産物を鋳型として、合成アダプター特異的なオリゴヌクレオチド、および前述したオリゴヌクレオチド8R2を用いたnestedPCRPCRcycles94°C1min94°C30sec68°C30sec72°C3min25cycles72°C10min4°C∞を行った。得た両特異的産物をゲル精製し、pGEMTeasyVectorを使用したTAクローン化後に塩基配列を解析した結果、実施例2-2記載のTaureumATCC34304由来C20エロンガーゼと完全に一致した。そこで次に、推定翻訳配列を増幅する正方向、および逆方向のオリゴヌクレオチドを合成し、TroseumゲノムDNAを鋳型として、AdvantageGC2polymeraseMixを用いたPCRPCRcycles94°C1min94°C30sec65°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞を行った。得た特異的産物をゲル精製し、ダイレクトシーケンスによる塩基配列解析を行った結果、Troseum由来C20エロンガーゼ遺伝子は、TaELO2と同一であった。以上の結果から、本配列はThraustochytriumaureumC20エロンガーゼの配列と完全に一致するものであることが判明した。その塩基配列を配列番号:186に、アミノ酸配列を配列番号:187に示す。実施例7-2C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミド作製ThraustochytriumaureumATCC34304株を、GY培地で培養した。対数増殖期後期の細胞を4°C、3500×g、5min遠心してペレットにし、液体窒素にて凍結後破砕した。細胞破砕液をフェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。TE溶液に溶解した核酸を37°C、30minRNase処理してRNAを分解し、再度フェノール抽出後、エタノール沈殿させ、沈殿をTE溶液に溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、LAtaqHotstartversionによりC20エロンガーゼ遺伝子配列を含む配列を増幅したPCRcycles98°C2min98°C10sec68°C1min30cycles68°C2min。用いたPCRprimerは実施例2-8記載のE2KOProFEcoRV、およびE2KOTermREcoRVである。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH59と名付けた。作製したpRH59を鋳型に、C20エロンガーゼ遺伝子配列中腹部分にBglIIサイトを挿入する様、逆向きに設定したprimersetを用意し、PrimeSTARMaxDNAPolymeraseにて増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、ともにBglIIリンカー配列を有する。RHO12027mer5’GACAAAGATCTCGACTGGAGCGACCAC3’、RHO12127mer5’GTCGAGATCTTTTGTCAGGAGGTGCAC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec56°C15sec72°C1min30cycles72°C1min。上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH64と名付けた。BglIIサイトを挿入したC20エロンガーゼ遺伝子配列951bpを配列番号:191に示す。作製したThraustochytriumroseumC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミドを図52に示す。実施例7-3ターゲティングベクターの作製人工合成ネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子実施例3-2記載のpRH31をBglIIにて消化し、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例7-2記載pRH64のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH65と名付けた。実施例3-3記載のpRH32をBglIIにて消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例7-2記載pRH64のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH66と名付けた。作製した2種のターゲティングベクターを図53に示す。実施例7-4C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例7-3で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、翻訳開始点を含む正方向プライマーおよび翻訳終止点を含む逆方向プライマーをprimerとして用いて、PrimeSTARGXLpolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec6030sec72°C3min30cycles。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例7-3記載pRH65を鋳型とした際に得られる導入断片は2655bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。実施例7-3記載pRH66を鋳型とした際に得られる導入断片は2887bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子前半-ubiquitinpromoter配列-ハイグロマイシン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。Thraustochytriumroseum株をGY培地中で7日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法により、マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:900PSIの条件で導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、PDA平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり、20個程度の薬剤耐性株を得た。実施例7-5C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定ThraustochytriumroseumATCC28210株、C20エロンガーゼ遺伝子ヘテロ相同組換体、およびC20エロンガーゼ遺伝子ホモ相同組換体遺伝子破壊株についてGY培地で培養後、得られた細胞を4°C、3000rpm、10min遠心してペレットにし、20μlのSNET溶液20mMTrisHClpH805mMNaCl03SDS200μgmlProteinaseKにけん濁後、55°C6h999°C5minで細胞を溶解した。得られた細胞溶解液を10倍希釈したものを鋳型とし、MightyAmpDNApolymeraseを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図54に示す。RoseumFはC20エロンガーゼ上流、RoseumRは下流、NeoFおよびNeoRは人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上、HygFおよびHygRはハイグロマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。RoseumF26mer5’GCTCGGCTGGAAGTTGAGTAGTTTGC3’、RoseumR24mer5’TCTTTCTTCGTCGACGTCCCACTG3’、NeoF24mer5’ATGATTGAACAGGACGGCCTTCAC3’、NeoR24mer5’TCAAAAGAACTCGTCCAGGAGGCG3’、HygF24mer5’ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCG3’、HygR25mer5’CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec60°C15sec68°C4min30cycles。野生型アリルに増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリルおよびハイグロマイシン耐性遺伝子アリルに増幅のあるC20エロンガーゼノックアウト株が得られた。実施例7-6C20エロンガーゼ破壊による脂肪酸組成の変化ThraustochytriumroseumATCC28210株および遺伝子破壊株を、GY培地にて培養した。対数増殖期後期の細胞を4°C、3000rpm、10min遠心してペレットにし、09NaClに懸濁、洗浄した。つづいて4°C、3000rpm、10min遠心し、ペレットを滅菌水に懸濁、洗浄した。これを3000rpm、10min遠心し、上清を除き、凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞に2mlのmethanolicKOH75KOHin95methanolを加え、ボルテックス後、超音波で菌体を破砕した80°C、30min。500μlの滅菌水を加えてボルテックスした後、2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を捨てた。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を捨てた。残った下層に1mlの6NHClを添加してボルテックスした後、2mLのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルに2mlの3NmethanolicHClを添加し、80°Cで一晩インキュベートした。サンプルを室温まで冷まし、1mlの09NaClを添加した。2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを少量添加後、ボルテックスした。3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルを02mlのnhexaneに溶解し、2μlをGC解析にかけた。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。この結果、ThraustochytriumroseumにおいてC20エロンガーゼをノックアウトすると、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。図57に野生型株を100とした時の割合を示す。これらの結果、アラキドン酸が約12倍、EPAが約16倍、DPAが約12倍、およびDHAが約15倍にそれぞれ増加した。ThraustochytriumaureumATCC34304OrfA破壊株におけるΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊実施例8-1ThraustochytriumaureumATCC34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071bp~Δ4デサチュラーゼ遺伝子内1500bpの配列のクローニング実施例3-2に記載の方法で抽出したThraustochytriumaureumATCC34304株のゲノムDNAを解読し、既知のΔ4デサチュラーゼと相同性の高い遺伝子配列を検索した。この検索結果をもとに2種のPCRprimerを設計した。TMO3は、ThraustochytriumaureumATCC34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071~1049bpに位置する配列で、TMO4は、開始コドンから数えて1477~1500bpに位置するたんぱく質コーディング領域内の配列である。TMO323mer5’GGCGGAGCGAAGTGTGAAAGTTA3’、TMO424mer5’GCGACAGCATCTTGAAATAGGCAG3’。この2種のprimerを使用し、ThraustochytriumaureumATCC34304株のゲノムDNAを鋳型に、LAtaqHotstartversionタカラバイオ社製によりThraustochytriumaureumATCC34304株のΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流1071bp~Δ4デサチュラーゼ遺伝子内1500bpの配列を増幅した。増幅条件は下記の通り。PCRcycles98°C2min98°C20sec60°C30sec72°C3min30cycles72°C8min。得られたDNA断片はpGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpTM1と名付けた。実施例8-2Δ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための、土台となるプラスミド作製実施例8-1で作製したpTM1図58を鋳型に、Δ4デサチュラーゼ遺伝子上流60bpおよびΔ4デサチュラーゼ遺伝子内の開始コドンを含む556bpの配列を欠失させ、かつ、欠失部分にBglIIサイトが生じる様、逆向きに設定したprimersetを用意した。TMO7、TMO8ともにBglII配列を包含する。増幅にはPrimeSTARMaxDNAPolymeraseタカラバイオ社製を使用した。TMO725mer5’CAGGAGATCTCCAAGTCGCGATTCA3’、TMO826mer5’CTTGGAGATCTCCTGCCCGTCCCGAA3’。PCRcycles98°C3min98°C10sec55°C15sec72°C30sec30cycles72°C30sec。上記条件で増幅後、アガロースゲルに泳動して精製した。得られたDNA断片を大腸菌に導入して増幅し、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpTM2と名付けた。作製したΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター作製のための土台となるプラスミドを図59に示す。実施例8-3ターゲティングベクターの作製ブラストサイジン耐性遺伝子およびGFP融合ゼオシン耐性遺伝子実施例5-3記載のpRH38をBglIIにて消化し、ブラストサイジン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例8-2記載のpTM2のBglIIサイトに繋いだ。これをpTM6と名付けた。実施例5-4記載のpRH51をBglIIにて消化し、GFP融合ゼオシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例8-2記載のpTM2のBglIIサイトに繋いだ。これをpTM8と名付けた。作製した2種のターゲティングベクターを図60に示す。実施例8-4ThraustochytriumaureumOrfA破壊株へのΔ4デサチュラーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例8-3で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、TMO3およびTMO4をprimerとして用いて、PrimeSTARHSDNApolymeraseにより遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C3min98°C10sec55°C5sec72°C4min30cycles72°C3min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例8-3記載pTM6を鋳型とした際に得られる導入断片は3264bpで、ThraustochytriumaureumΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流-SV40terminator配列-ブラストサイジン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter-ThraustochytriumaureumΔ4デサチュラーゼ遺伝子内の配列という並びになる。実施例8-3記載pTM8を鋳型とした際に得られる導入断片は3935bpで、ThraustochytriumaureumΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流-SV40terminator配列-ゼオシン耐性遺伝子配列-EnhancedGFP遺伝子配列-ubiquitinpromoter-ThraustochytriumaureumΔ4デサチュラーゼ遺伝子内の配列という並びになる実施例4記載のPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA遺伝子破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は4~6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり100から200個の薬剤耐性株を得た。実施例8-5Δ4デサチュラーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、Thraustochytriumaureumおよび、ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊株からゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、MightyAmpDNApolymeraseを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図61に示す。TMO1はΔ4デサチュラーゼ遺伝子上流、TMO2はΔ4デサチュラーゼ遺伝子下流、RHO198およびRHO49はブラストサイジン耐性遺伝子上、RHO128はEnhancedGFP遺伝子上、RHO64はゼオシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。TMO123mer5’AAAAGAACAAGCCCTCTCCTGGA3’、TMO223mer5’GAGGTTTGTATGTTCGGCGGTTT3’、RHO19826mer5’TGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGG3’、RHO12822mer5’GACCTACGGCGTGCAGTGCTTC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C4min30sec30cycles68°C4min。野生型アリルに増幅がなく、ブラストサイジン耐性遺伝子アリルおよびゼオシン耐性遺伝子アリルに増幅のあるΔ4デサチュラーゼ遺伝子ノックアウト株が得られた。この実験により、ThraustochytriumaureumATCC34304株は、PKS経路関連遺伝子OrfAおよびΔ4デサチュラーゼ遺伝子を欠損しても栄養要求性にならないことが分かった。実施例8-6ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるΔ4デサチュラーゼ遺伝子の破壊による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。脂肪酸組成の変化を図63に示す。また、図64に野生型株を100ととした時の割合を示す。この結果、ThraustochytriumaureumOrfA破壊株においてΔ4デサチュラーゼ遺伝子を破壊すると、C225n6およびC226n3がほとんど生合成されなくなり、C224n6およびC225n3が蓄積した。ParietichytriumspSEK358株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊実施例9-1ParietichytriumspSEK358株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例3-6記載pRH85図18で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO153およびRHO154をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例3-6記載pRH85を鋳型とした際に得られる導入断片は2661bpで、Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。ParietichytriumspSEK358株をGY培地中で3日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:900PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、05mgmlG418含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり10から30個の薬剤耐性株を得た。実施例9-2C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、ParietichytriumspSEK358株、および、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、MightyAmpDNApolymeraseを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは実施例3-8記載、図19に示す。RHO184はC20エロンガーゼ上流、RHO185は下流、RHO142およびRHO143は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C2min30cycles68°C7min。野生型アリルに増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリルに増幅があるC20エロンガーゼノックアウト株が得られた。実施例9-3C20エロンガーゼ破壊による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でParietichytriumspSEK358株および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。脂肪酸組成の変化を図66に示す。また、図67に野生型株を100ととした時の割合を示す。この結果、ParietichytriumspSEK358株においてC20エロンガーゼをノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。具体的には、アラキドン酸が約7倍、EPAが約11倍に増加し、またDPAが約115、DHAが約18に減少した。ParietichytriumspSEK571株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の破壊実施例10-1ParietichytriumspSEK571株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例3-6記載pRH85図18で作製したターゲティングベクターを鋳型に、RHO153およびRHO154をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例3-6記載pRH85を鋳型とした際に得られる導入断片は2661bpで、Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-Parietichytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。ParietichytriumspSEK571株をGY培地中で3日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1550PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、05mgmlG418含有PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり5から15個の薬剤耐性株を得た。実施例10-2C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、ParietichytriumspSEK571株、および、C20エロンガーゼ遺伝子破壊株よりゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、MightyAmpDNApolymeraseを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズは実施例3-8記載、図19に示す。RHO184はC20エロンガーゼ上流、RHO185は下流、RHO142およびRHO143は人工合成ネオマイシン耐性遺伝子上に、それぞれ設定した。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C2min30cycles68°C7min。野生型アリルに増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリルに増幅があるC20エロンガーゼノックアウト株が得られた。実施例10-3C20エロンガーゼ破壊による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でParietichytriumspSEK571株および遺伝子破壊株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。脂肪酸組成の変化を図69に示す。また、図70に野生型株を100ととした時の割合を示す。この結果、ParietichytriumspSEK571株においてC20エロンガーゼをノックアウトすると、炭素鎖長22以上の脂肪酸が減少し、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した。具体的には、アラキドン酸が約4倍、EPAが約8倍に増加し、またDPAが約112、DHAが約112に減少した。ThraustochytriumaureumATCC34304由来Δ12デサチュラーゼ遺伝子の破壊実施例11-1ThraustochytriumaureumATCC34304由来Δ12デサチュラーゼ遺伝子の単離ThraustochytriumaureumATCC34304のゲノムDNAを鋳型として、正方向オリゴヌクレオチドプライマーTw3F1、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーTw3R1を用いたPCR使用酵素:LAtaqHotStartVersionTaKaRa社製、PCRcycles98°C2min98°C30sec53°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞によって、ThraustochytriumaureumATCC34304由来Δ12デサチュラーゼ遺伝子を増幅した。その結果、395アミノ酸配列番号:216をコードする1185bp配列番号:217のORFを有する新奇遺伝子配列を取得した。当該遺伝子のアミノ酸配列中には、desaturaseに共通して保存され、活性部位を構築するとされる3つのヒスチジンボックスが保存されていた図71。またBlast検索の結果、Thalassiosirapseudonana、Micromonassp、Phaeodactylumtricornutum由来Δ12デサチュラーゼとアミノ酸レベルで41、44、41と高い同一性を示す図71ことから、本遺伝子はThraustochytriumaureumATCC34304由来Δ12デサチュラーゼ遺伝子であることが強く示唆された。以降、本遺伝子をTΔ12dと呼称する。実施例11-2出芽酵母Saccharomycescerevisiaeを宿主としたTΔ12dの発現と、遺伝子導入株の脂肪酸組成の解析ThraustochytriumaureumATCC34304のゲノムDNAを鋳型として、正方向オリゴヌクレオチドプライマーTw3Hind3F、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーTw3Xba1Rを用いたPCR使用酵素:LAtaqHotStartVersionTaKaRa社製、PCRcycles98°C2min98°C30sec53°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞を行うことで、TΔ12dの両端にHindIIIおよびXbaIサイトを付加したDNA断片を調製した。続いて、当該DNA断片をpYES2CTベクターのHindIIIXbaIサイトに組み込むこで、TΔ12dの発現ベクター、pYESTD12を構築した。次に、pYESTD12とpYES2CTそれぞれを、酢酸リチウム法によって酵母に導入した。得たTΔ12d過剰発現株の脂肪酸組成のGC解析を行ったところ、LAC182Δ912およびC162Δ912のリテンションタイムに相当する位置に、mock導入株pYES2CT導入株には見られない新規ピークが確認された。図72にGC解析のチャート図、および乾燥菌体あたりの脂肪酸量を示す。一方、TΔ12d過剰発現株は他の脂肪酸LA、GLAC183Δ6912、C202Δ1114、DGLAC203Δ81114、ARAC204Δ581114、DTAC224Δ7101316に対する変換活性を示さないことが確認された。以上の結果から、TΔ12dはThraustochytriumaureumATCC34304由来Δ12デサチュラーゼ遺伝子であることが明確に示された。実施例11-3TΔ12dターゲッティングベクターの構築ThraustochytriumaureumATCC34304のゲノムDNAを鋳型として、TΔ12dORF上流、および下流配列1001bpをPCR使用酵素:PrimeSTARGXLTaKaRa社製、PCRcycles98°C2min98°C30sec53°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞によって増幅した。用いた正方向、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、TD12dupFおよびTD12dupR、TD12ddownF39mer5’GGAGCACAAGAGATCTAGCTCTGGCTCAAGGGACACCGT3’配列番号:222およびTD12ddownR24mer5’CACAGAAACTGCCTTCACGGGTCT3’配列番号:223である。続いて、得た両DNA断片を、間にBglIIサイトを導入する形でfusionPCRによって連結し、これをpGEMTeasyVectorPromega社製に組込んだ。次に、得たベクターのBglIIサイトに、実施例3-3記載のハイグロマイシン耐性遺伝子カセット、および実施例5-3記載のブラストサイジン耐性遺伝子カセットを組み込むことでTΔ12dKOターゲッティングベクターを構築し、それぞれをpTD12dKOHyg、およびpTD12dKOBlaと名付けた。以上のTΔ12dKOターゲッティングベクター構築スキームを図73に示す。実施例11-4ThraustochytriumaureumATCC34304に対するTΔ12dターゲッティングベクターの導入とTΔ12d破壊株の取得Splitmarker法による効率的な相同組換え体の取得を目指し、pTD12dKOHygを鋳型として、PCR使用酵素:LAtaqHotStartVersionTaKaRa社製、PCRcycles98°C2min98°C30sec60°C30sec72°CXmin30cycles72°C7min4°C∞によって2つの相同組換え断片を増幅し、これを遺伝子銃法にてThraustochytriumaureumATCC34304に導入した。相同組換え断片の増幅に用いた正方向、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、TD12dupFおよびHygKnockR、HygKnockF24mer5’TGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAG3’およびTD12ddownRである。その結果、TΔ12dの1つ目のアリルを破壊した相同組換え体を取得した。続いて、pTD12dKOBlaを鋳型とし、正方向、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーTD12dupFおよびTD12ddownR配列番号:223を用いて、PCR使用酵素:LAtaqHotStartVersionTaKaRa社製PCRcycles98°C2min98°C30sec60°C30sec72°C3min30cycles72°C7min4°C∞によって2つ目のアリルを破壊する目的の相同組換え断片を増幅し、これを1つ目のアリルを破壊した相同組換え体に導入した。TΔ12dの完全破壊は、以下に示すゲノムDNAを鋳型にしたPCRおよびRTPCRによる、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびTΔ12dの検出、もしくはサザンブロッティングによって検証した。図75に野生株、TΔ12dの1つ目のアリルを破壊した株、およびTΔ12d破壊株2つのアリルを破壊した株における、それぞれのゲノムDNAを鋳型にしたPCRによって、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびTΔ12dを増幅した結果を示す。この結果から、TΔ12d破壊株は導入した相同組換え断片中に含まれるハイグロマイシン耐性遺伝子、およびブラストサイジン耐性遺伝子の増幅が確認されるが、破壊したTΔ12dの増幅が認められないことが示された。尚、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびTΔ12dの増幅に用いた正方向、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーはHygFおよびHygR25mer5’CTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG3’、BlaFおよびBlaR、Tw3F1およびTw3R1である。また、図76に野生株、TΔ12dの1つ目のアリルを破壊した株、およびTΔ12d破壊株において、RTPCRによってハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、およびTΔ12dのmRNAを検出した結果を示す。この結果から、TΔ12d破壊株は導入した相同組換え断片中に含まれるハイグロマイシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子mRNAが検出されるが、破壊したTΔ12dmRNAは検出されないことが示された。尚、用いたプライマーはゲノムDNAを鋳型にしたPCRと同じである。さらに、ThraustochytriumaureumATCC34304のゲノムDNAを鋳型として、2つのDIGラベルプローブを調製し、それらを用いたサザンブロッティングを行った。尚、DIGラベルプローブの調製に使用した正方向、および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーはKOupprobeF123mer5’GGGGTCGGCCGGTGCAGCCTTAG3’およびKOupprobeR1、およびKOdownprobeF3およびKOdownprobeR3である。その結果、TΔ12d破壊株において、野生型アリルのバンドの消失が認められ、代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子、およびブラストサイジン耐性遺伝子を含む相同組換え断片のバンドが検出された。以上のゲノムDNAを鋳型にしたPCR、RTPCR、およびサザンブロッティングの結果によって、TΔ12dの破壊が明確に示された。実施例11-5TΔ12d破壊株の表現型解析250mlのGY液体培地で5日間培養した菌体を10mlずつ回収し、OD600nmにおける吸光度を測定した。さらに、測定後の菌体を回収し、滅菌超純水で1回洗浄した後、凍結乾燥機を行い、デシケーターで1時間乾燥後の乾燥菌体重量を測定した。その結果、野生株株と1つ目のアリルを破壊した株、およびTΔ12d破壊株の増殖に有意な違いはみられなかった。続いて、野生株株と1つ目のアリルを破壊した株、およびTΔ12d破壊株の脂肪酸組成のGC解析を行った。その結果、多くの脂肪酸組成の変化が観察され、特にTΔ12d破壊株においてはC181n9OAの蓄積が顕著に観察された。図79に脂肪酸組成の割合を、図80に乾燥菌体1mgあたりの脂肪酸量を示す。ThraustochytriumaureumATCC34304OrfA遺伝子破壊株における、C20エロンガーゼ遺伝子破壊およびω3デサチュラーゼ遺伝子の発現実施例12-1C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現ベクターの作製ブラストサイジン耐性遺伝子実施例5-6記載、pRH43図39を鋳型に、2つの制限酵素KpnIサイトを欠失させ、かつ、欠失部分にBamHIサイトが生じる様、逆向きに設定したprimersetを用意した。RHO189、RHO190ともにBamHI配列を包含する。増幅にはPrimeSTARMaxDNAPolymeraseタカラバイオ社製を使用した。RHO18928mer5’TTAGCGGGATCCCAATTCGCCCTATAGT3’、RHO19027mer5’AATTGGGATCCCGCTAAGTATCTCCCG3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec55°C15sec72°C40sec31cycles72°C1min。上記条件で増幅後、アガロースゲルに泳動して精製した。得られたDNA断片を大腸菌に導入して増幅し、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH101と名付けた。pRH101を鋳型に、制限酵素KpnIサイトを挿入する様、逆向きに設定したprimersetを用意した。RHO191、RHO192ともにKpnI配列を包含する。増幅にはPrimeSTARMaxDNAPolymeraseタカラバイオ社製を使用した。RHO19128mer5’AGATCTGGTACCGCAGCGCCTGGTGCAC3’、RHO19227mer5’GCTGCGGTACCAGATCTGGTCGCGTTT3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec55°C15sec72°C40sec31cycles72°C1min。上記条件で増幅後、アガロースゲルに泳動して精製した。得られたDNA断片を大腸菌に導入して増幅し、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH102と名付けた。実施例6-1記載のpRH48をKpnIにて消化し、ミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現カセットを含むDNA断片をpRH102のKpnIサイトに繋いだ。これをpRH103と名付けた。作製したC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現ベクターpRH103を図83に示す。実施例12-2ThraustochytriumaureumOrfA破壊株へのC20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現ベクターの導入実施例5-6記載C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターpRH54を鋳型に、KSO11実施例5-7記載、配列番号:159およびKSO12実施例5-7記載、配列番号:160をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製により遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec68°C2min30cycles68°C2min。これを、フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。この時得られる導入断片は3887bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子上流-ubiquitinpromoter-EnhancedGFP遺伝子配列-ゼオシン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる。実施例12-1記載、C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現ベクターpRH103を制限酵素BamHIにて消化し、フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。この時得られる導入断片は5611bpで、ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子上流-ubiquitinpromoter-ミズカビ由来ω3デサチュラーゼ遺伝子配列-ubiquitinterminator-ubiquitinpromoter-ブラストサイジン耐性遺伝子配列-SV40terminator-ThraustochytriumaureumC20エロンガーゼ遺伝子下流という並びになる。実施例4記載のPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA遺伝子破壊株をGY培地中で4日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は4~6時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、20から60個の薬剤耐性株を得た。実施例12-3C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現ベクターがゲノムに挿入された相同組換体の同定実施例3-2記載の方法で、ThraustochytriumaureumPUFAPKS経路関連遺伝子OrfA破壊株および、ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子の1本目アリル相同組換体および破壊株からゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。ゲノムDNAを制限酵素で切断後、1ウェルあたり約2~3μgずつ07SeaKemGTGアガロースゲルタカラバイオ社製に電気泳動した。これをナイロンメンブレンにトランスファーし、DIGシステムを使用して作製したprobeと51°C、16hrでハイブリダイズさせた。5’側のprobe作製には、RHO94、およびRHO95を用いた。3’側のprobe作製には、RHO96、およびRHO97を用いた。増幅条件は下記の通りで、増幅にはLAtaqHotstartversionを使用した。PCRcycles98°C2min98°C30sec58°C30sec、72°C1min30cycles72°C3min。使用した制限酵素およびprobeの位置は図84に示した。ハイブリダイズしたプローブの検出は発色法NBTBCIP溶液を用いて行った。5’側および3’側の解析いずれにおいても、薬剤耐性遺伝子が相同組換えをおこした際あらかじめ予想されるサイズに、バンドが観察された。実施例12-4ThraustochytriumaureumOrfA破壊株におけるC20エロンガーゼ遺伝子破壊かつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法でThraustochytriumaureumATCC34304野生型株およびPKS経路orfA遺伝子とC20エロンガーゼ遺伝子の2重破壊かつミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。脂肪酸組成の変化を図86に示す。また、図87に野生型株を100とした時の割合を示す。この結果、ThraustochytriumaureumOrfA破壊株においてC20エロンガーゼ遺伝子を破壊しかつミズカビ由来ω3デサチュラーゼを発現させると、C204n6が約6倍に増加、C205n3が約10倍に増加、C226n3が約116倍に減少した。ParietichytriumspSEK571C20エロンガーゼ遺伝子破壊株におけるω3デサチュラーゼ遺伝子の発現実施例13-1ハイグロマイシンを薬剤耐性マーカーとするミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現プラスミドの作製ハイグロマイシンを薬剤耐性マーカーとするミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現プラスミドの作製にあたり、pGEMTeasyvectorに、パリエティキトリウム属C20エロンガーゼ上流配列904bp、配列番号:239およびパリエティキトリウム属C20エロンガーゼ下流配列721bp、配列番号:240をサブクローニングし、制限酵素サイトを一部改変したプラスミドpRH107図88を土台として使用した。参考のためpRH107の全配列を示す4592bp、配列番号:241。この発現プラスミド作製の土台となる配列は、本実験における細胞導入時、積極的には使用しないので、これと類似の実験をする際、土台として用いるベクターとして必ずしもpRH107を使用する必要はない。これと類似の実験をする際はKpnIサイトとBamHIサイトを一か所ずつ近接して持つ特徴を有するクローニングベクターで代用が可能である。このとき、KpnIサイトとBamHIサイトの間の配列は、ω3デサチュラーゼ遺伝子発現カセットと、薬剤耐性遺伝子発現カセットの間のlinkerとして細胞に導入されることになるので、両者の間の長さは短いほどよい。本実験例ではパリエティキトリウム属C20エロンガーゼ下流配列37bp配列番号:242がこれに該当する。実施例6-1記載のpRH48をKpnIにて消化し、ミズカビ由来ω3デサチュラーゼ遺伝子カセットを含むDNA断片を、pRH107のKpnIサイトに繋いだ。これをpRH108図89と名付けた。実施例3-3記載のpRH32をBglIIにて消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片をpRH108のBamHIサイトに繋いだ。これをpRH109と名付けた。実施例13-2ParietichytriumspSEK571C20エロンガーゼ遺伝子破壊株へのミズカビ由来ω3デサチュラーゼ発現プラスミド導入実施例13-1で作製したpRH109を鋳型に、TMO42およびRHO52をprimerとして用いて、PrimeSTARMaxDNApolymeraseタカラバイオ社製によりDNAを増幅した。PCRcycles94°C30sec72°C1min5cycles94°C30sec70°C30sec72°C1min5cycles94°C30sec68°C30sec72°C1min25cycles72°C2min。10アガロースゲルより増幅産物を回収し、エタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。PCRによって得られる導入断片は4448bpで、ubiquitinpromoter-ω3デサチュラーゼ遺伝子-ubiquitinterminator-ubiquitinpromoter-ハイグロマイシン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列という並びになる。実施例10で作製したParietichytriumspSEK571C20エロンガーゼ遺伝子破壊株をGY培地中で3日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1550PSIにより導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、PDA寒天平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり5から20個の薬剤耐性株を得た。実施例13-3ミズカビ由来ω3デサチュラーゼ遺伝子発現株の取得実施例3-2記載の方法で、実施例10で作製したParietichytriumspSEK571C20エロンガーゼ遺伝子破壊株、およびω3デサチュラーゼ遺伝子発現株からゲノムDNAを抽出後、A260280を測定しDNA濃度を算出した。これを鋳型にし、LAtaqHotstartversionを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅に用いる組み合わせ、増幅産物の予想サイズを図91に示す。RHO90はubiquitinpromoter上、RHO141はハイグロマイシン耐性遺伝子上に設定した。PCRcycles98°C2min98°C10sec68°C4min30cycles68°C7min。予想されるサイズに増幅するバンドが確認できた。導入した発現断片がゲノムに安定に導入された株が単離できた。実施例13-4ParietichytriumspSEK571C20エロンガーゼ遺伝子破壊株におけるω3デサチュラーゼ発現による脂肪酸組成の変化実施例3-9記載の方法で、ParietichytriumspSEK571株およびω3デサチュラーゼ遺伝子発現株を培養、凍結乾燥後、脂肪酸をメチルエステル化し、GCを用いて解析した。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。この結果、ω3デサチュラーゼ発現株ではn6系列の脂肪酸が減少し、n3系列の脂肪酸に増加傾向が見られた。図94に野生型株を100ととした時の割合を示す。これらの結果、アラキドン酸が約12に減少し、EPAは約14倍に増加した。Schizochytrium属のC20エロンガーゼ遺伝子の破壊実施例14-1Schizochytrium属由来のC20エロンガーゼ遺伝子のクローニングSchizochytrium属より抽出したゲノムDNAを鋳型として、BamHIサイトを含む正方向オリゴヌクレオチドプライマーRHO134、およびBamHIサイトを含む逆方向オリゴヌクレオチドプライマーRHO135を用いたPCR使用酵素:LAtaqHotStartVersionTaKaRa社製、PCRcycles98°C2min98°C30sec53°C30sec72°C1min30cycles72°C7min4°C∞によって、Schizochytrium属由来C20エロンガーゼ遺伝子を増幅した。得た両特異的産物をゲル精製し、pGEMTeasyvectorにクローニングし、大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH70と名付けた図95。塩基配列を解析した結果、315アミノ酸配列番号:247をコードする945bp配列番号:248のORFを有する新奇遺伝子配列を取得した。実施例14-2C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミド作製実施例14-1で作製したpRH70図95を鋳型に、C20エロンガーゼ遺伝子配列中腹部分にBglIIサイトを挿入する様、逆向きに設定したprimersetを用意し、PrimeSTARMaxDNAPolymeraseにて増幅した。用いたPCRprimerは下記の通りで、ともにBglIIリンカー配列を有する。RHO13625mer5’CATCGAGATCTTCGTGTTTGTCCAC3’、RHO13725mer5’ACGAAGATCTCGATGCGGGCGTCCC3’。PCRcycles98°C2min98°C10sec56°C15sec72°C1min30cycles72°C1min。上記条件で増幅後、BglIIにて消化したのち、セルフライゲーションした。ライゲーションしたサンプルは大腸菌にて増幅後、DyeTerminatorCycleSequencingKitBECKMANCOULTER社製を用いて配列を確認した。これをpRH71と名付けた。BglIIサイトを挿入したC20エロンガーゼ遺伝子配列945bpを配列番号:251に示す。作製したSchizochytrium属C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクターの作製のための土台プラスミドを図96に示す。実施例14-3ターゲティングベクターの作製人工合成ネオマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子実施例2-2記載のpRH31をBglIIにて消化し、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例14-2記載pRH71図96のBglIIサイトに繋いだ。これをpRH73と名付けた。実施例2-3記載のpRH32をBglIIにて消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むDNA断片を実施例14-2記載pRH71図96のBglIIサイトに繋いだ。これをpKSSKOと名付けた。作製した2種のターゲティングベクターを図97に示す。実施例14-4C20エロンガーゼ遺伝子ターゲティングベクター導入実施例14-3で作製した2種類のターゲティングベクターを鋳型に、翻訳開始点を含む正方向プライマーおよび翻訳終止点を含む逆方向プライマーをprimerとして用いて、PrimeSTARGXLpolymeraseにより遺伝子を増幅した。PCRcycles98°C2min98°C30sec6030sec72°C3min30cycles。フェノールクロロホルム抽出、クロロホルム抽出後、DNAをエタノール沈殿させ、沈殿を01×TEに溶解した。A260280を測定しDNA濃度を算出した。実施例14-3記載pRH73図97を鋳型とした際に得られる導入断片は2644bpで、Schizochytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-SV40terminator配列-人工合成ネオマイシン耐性遺伝子配列-ubiquitinpromoter配列-Schizochytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。実施例14-3記載pKSSKO図97を鋳型とした際に得られる導入断片は2881bpで、Schizochytrium属C20エロンガーゼ遺伝子前半-ubiquitinpromoter配列-ハイグロマイシン耐性遺伝子配列-SV40terminator配列-Schizochytrium属C20エロンガーゼ遺伝子後半という並びになる。SchizochytriumspTY12Ab株をGY培地中で7日間培養し、対数増殖期にある細胞を遺伝子導入に使用した。OD6001~15相当分の細胞に対し、0625μgのDNA断片を遺伝子銃法により、マイクロキャリア:06micronの金粒子、targetdistance:6cm、chambervacuum:26mmHg、Rupturedisk:1100PSIの条件で導入した。遺伝子導入した細胞は24時間のリカバリータイムの後、PDA平板培地に塗布した。この結果、1撃ちこみあたり、20個程度の薬剤耐性株を得た。実施例14-5C20エロンガーゼ遺伝子ジーンターゲティング相同組換体の同定SchizochytriumspTY12Ab株FERMABP11421、C20エロンガーゼ遺伝子ヘテロ相同組換体、およびC20エロンガーゼ遺伝子ホモ相同組換体遺伝子破壊株についてGY培地で培養後、得られた細胞を4°C、3000rpm、10min遠心してペレットにし、20μlのSNET溶液20mMTrisHClpH805mMNaCl03SDS200μgmlProteinaseKにけん濁後、55°C6h999°C5minで細胞を溶解した。得られた細胞溶解液を10倍希釈したものを鋳型とし、MightyAmpDNApolymeraseを用いてゲノム構造確認のPCRを行った。用いたprimerの位置、増幅産物の予想サイズを図98に示す。プライマーは実施例14-4で用いたSorfF、及びSorfRの組み合わせで行った。PCRcycles98°C2min98°C10sec60°C15sec68°C4min30cycles。野生型アリルに増幅がなく、人工合成ネオマイシン耐性遺伝子アリルおよびハイグロマイシン耐性遺伝子アリルに増幅のあるC20エロンガーゼノックアウト株が得られた図99。実施例14-6C20エロンガーゼ破壊による脂肪酸組成の変化SchizochytriumspTY12Ab株および遺伝子破壊株を、GY培地にて培養した。対数増殖期後期の細胞を4°C、3000rpm、10min遠心してペレットにし、09NaClに懸濁、洗浄した。つづいて4°C、3000rpm、10min遠心し、ペレットを滅菌水に懸濁、洗浄した。これを3000rpm、10min遠心し、上清を除き、凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞に2mlのmethanolicKOH75KOHin95methanolを加え、ボルテックス後、超音波で菌体を破砕した80°C、30min。500μlの滅菌水を加えてボルテックスした後、2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を捨てた。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を捨てた。残った下層に1mlの6NHClを添加してボルテックスした後、2mLのnhexaneを加えてボルテックスした。続いて3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルに2mlの3NmethanolicHClを添加し、80°Cで一晩インキュベートした。サンプルを室温まで冷まし、1mlの09NaClを添加した。2mlのnhexaneを加えてボルテックスした。3000rpmで10min遠心し、上層を回収した。再び2mlのnhexaneを加えてボルテックスし、3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層に無水硫酸ナトリウムを少量添加後、ボルテックスした。3000rpmで10min遠心して、上層を回収した。回収した上層を窒素ガスで濃縮乾固した。濃縮乾固したサンプルを02mlのnhexaneに溶解し、2μlをGC解析にかけた。GC解析にはガスクロマトグラフGC2014島津製作所社製を使用し、カラム:HRSS1030mx025mm;信和化工社製、カラム温度:150°C→5°Cmin→220°C10min、キャリアガス:He13mLminの条件で行った。この結果、SchizochytriumspTY12Ab株においてC20エロンガーゼをノックアウトすると、炭素鎖長20の脂肪酸が増加した図100。図101に野生型株を100とした時の割合を示す。これらの結果、アラキドン酸が約17倍、EPAが約13倍、DPAが約11倍、およびDHAが約09倍にそれぞれ変化した。"