"精製されたボツリヌス毒素A型製剤を、pHは4.5ないし6.5の範囲、塩化ナトリウムNaClの濃度を0.02ないし0.2Mに調節して添加した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階;及び上記亜分画のうちA260/A280の値が0.4ないし0.6の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含んでなることを特徴とする非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法。請求項1によって分離精製されたものであって、毒素100U/ml当りZnイオンが少なくとも150ppb、Feイオンが少なくとも80ppb、Mgイオンが少なくとも140ppbで含まれることを特徴とする非拡散型ボツリヌス毒素。請求項2の非拡散型ボツリヌス毒素をその半数致死量の1.5ないし3倍の量でマウスの右下肢に注射し、右下肢の筋肉と呼吸筋の麻痺有無と致死有無を判断することを特徴とする非拡散型ボツリヌス毒素を判別する方法。本発明は、上記の問題点を解決するために提案されるものであり、酸沈殿又は酸沈殿後のクロマトグラフィーによって精製された既存のボツリヌス毒素A型製剤を塩化ナトリウムを使用して陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーして3つの異質な亜分画が存在することを確認し、そのうちの一つの亜分画が筋麻痺活性を有しながらも体内非拡散型であることを確認した。すなわち、本発明は、体内非拡散型でありながら局所制限的に筋麻痺活性を有する非拡散型ボツリヌス毒素とこれを分離する方法を提供するところにその目的がある。上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、精製されたボツリヌス毒素A型製剤を、pHは4.5ないし6.5の範囲、塩化ナトリウムNaClの濃度を0.02ないし0.2Mに調節して添加した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階;及び上記亜分画のうちA260/A280の値が0.4ないし0.6の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含んでなることを特徴とする。上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素は、上記した方法によって分離精製されたものであって、毒素100U/ml当りZnイオンが少なくとも150ppb、Feイオンが少なくとも80ppb、Mgイオンが少なくとも140ppbで含まれることを特徴とする。上記した目的を達成するための一例として、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素を判別する方法は、上記非拡散型ボツリヌス毒素をその半数致死量の1.5ないし3倍の量でマウスの右下肢に注射し、右下肢の筋肉と呼吸筋の麻痺有無と致死有無を判断することを特徴とする。上記した本発明によれば、目的とする部分に筋麻痺効果が発生し、それ以外の部分には毒素が拡散せず、筋麻痺効果が早く持続的に発生する局所筋麻痺効果を有する非拡散型ボツリヌス毒素を得ることができる。また本発明によれば、既存と異なって各生産配置別にタンパク質対比毒素力価が高い非拡散型ボツリヌス毒素を得ることができる。また本発明によれば、陰イオンクロマトグラフィー条件を調節して拡散性毒素と混合しない非拡散型ボツリヌス毒素を多量に得ることができる。以下、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法を段階別に具体的に説明する。本発明は、精製されたボツリヌス毒素A型製剤を塩化ナトリウムNaClの濃度を調節して添加した陰イオンクロマトグラフィーを遂行して亜分画を分離する段階と、上記亜分画のうちA260/A280の値が0.4ないし0.6の水準を維持する非拡散性ボツリヌス毒素分画を収得する段階を含んでなることを特徴とする。本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、既存の酸沈殿法や酸沈殿後にイオン樹脂クロマトグラフィーを利用して得られたボツリヌス毒素を再び本発明の発明者によって提案された新しい陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィー法を適用して非拡散型ボツリヌス毒素の分画を獲得する方法である。したがって、本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法には、クロストリジウムボツリヌムClostridiumbotulinumA型菌株培養液からボツリヌス毒素A型製剤を酸沈殿させるか、酸沈殿後にクロマトグラフィーによって分離し精製して得られたボツリヌス毒素A型製剤を使用する。上記した精製されたボツリヌス毒素A型製剤を塩化ナトリウムを使用して陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行する場合、イオン交換樹脂から3つの亜分画を得ることができる。上記陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーを遂行するために使用される緩衝液は酢酸ナトリウムsodiumacetate緩衝液であり、ここに亜分画を得るために添加される塩化ナトリウム濃度を順次に高めて分離される各分画を取る。塩化ナトリウムを使用しない場合濃図0MNaClに分離される分画は、体内拡散型活性分画peakI、pIであることが確認され、塩化ナトリウムの濃度を0.02ないし0.2Mにした場合に分離される分画は、体内非拡散型活性分画peakII、PIIであることが確認されており、塩化ナトリウムの濃度を1Mにした場合に分離される分画は、体内拡散型非活性分画peakIII、pIIIであることが確認された。すなわち、上記したpIIを得るために使用される塩化ナトリウムの濃度は0.02ないし0.2Mの範囲であり、塩化ナトリウムを使用しないか、塩化ナトリウムの濃度が上記範囲より高いか低い場合には、収得される亜分画にpI又はpIII分画が混合することがあり得るため、本発明で目的とする局所的筋麻痺効果を有する非拡散型活性分画を得ることが困難である。一方、上記の通り塩化ナトリウムを使用した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーの場合、緩衝液のpHが4.5ないし5.5の範囲で遂行される場合、分離する亜分画のうちpI又はpIII分画の混合程度が少なくなりpII分画の純度が高くなる。これはA260/A280を比較するかマウスの右下肢筋肉注射時の麻痺部位の程度で確認することができる。また、上記の通り塩化ナトリウムを使用した陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーの場合、精製されたボツリヌス毒素A型製剤の試料量が、使用される陰イオンイオン交換樹脂クロマトグラフィーカラム体積対比1/5ないし1倍の範囲で遂行される場合、pIIの分画量が大きくなる。すなわち、カラムの体積が1mlで、精製されたボツリヌス毒素A型製剤の試料量が0.2ないし1mlの場合に得られるpIIの分画量は20ないし50の範囲で現われる。一方、上記した本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法によって得られたpII分画は、マウスを使用して確認した半数致死量totalLD50が1×105ないし5×105U/mlで現われる等、安定しているものと確認された。また、処置対象に投与時に目的部位以外に拡散する現象がなく、市販製品と比較する場合、筋麻痺効果の開始が有意的に早く、筋麻痺持続時間が長いということを確認することができる。また、上記した本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法によって得られた非拡散型ボツリヌス毒素pII分画は、毒素100U/ml当りZnイオンが少なくとも150ppb、Feイオンが少なくとも80ppb、Mgイオンが少なくとも140ppbで含まれる。本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の精製方法は、既存の方法によって精製されたボツリヌス毒素A型よりMg、Fe及びZnの含量が有意的に高く現われる特徴があることを確認した。このような本発明の精製方法によって得られた非拡散型ボツリヌス毒素は、その半数致死量の1.5ないし3倍の量でマウスの右下肢に注射時、右下肢の筋肉は麻痺する反面、呼吸筋の麻痺や致死活性がないものと確認され、これにより本発明の非拡散型ボツリヌス毒素の拡散有無を判別することができる。以下本発明を実施例及び図面等に基づいて具体的に説明するところ、本発明が次の実施例及び図面等によって限定されるものではない。以下、本発明の実施例等で使われた市販製品は、USP7,354,740[Animalproductfreesystemandprocessforpurifyingabotulinumtoxin]に開示された方法によって製造されたアラガン社Allergan、Incのボトックス製剤Lot:C2066C2、C2481C2であるが、本発明がここに提示された市販製品や方法によって精製されたボツリヌス毒素A型製剤にのみ適用されるのではなく、その他の酸沈殿等によって精製されたボツリヌス毒素A型製剤として使用可能なものなら充分に適用することができるものである。実施例1.陰イオンイオン樹脂クロマトグラフィー分離分画ボツリヌス毒素培養液を既存の酸沈殿法で精製した精製物を試料として陰イオンクロマトグラフィーを実施して3つの亜分画を分離し、分離結果は図1に示した[pI、PeakI体内拡散型活性分画;pII、PeakII体内非拡散型活性分画;pIII、PeakIII非活性分画]。陰イオンイオン交換クロマトグラフィー時の使用器機はAKTAFPLCGEHealthcareで、使用カラムcolumnはHitrapDEAEFF1mlGEhealthcare、Cat17-5055-01、使用緩衝液bufferはランニング緩衝液runningbufferとして酢酸ナトリウム緩衝液SodiumAcetatebufferpH5.5、エルーション緩衝液elutionbufferだった。酢酸ナトリウムに1M塩化ナトリウムpH5.5、エリューションElution条件0MNaClでunboundwashpI、体内拡散型活性分画した後、0.05MNaClpII、体内非拡散型活性分画を利用してピークpeakを分離し、1MNaClでエリューションelutionpIII、非活性分画、流速Flowrate1ml/min、試料前処理として酸沈殿後に脱塩desaltingして使用した。実施例2.バッファーBufferのpH変化によるピークPeak変化及び特性上記陰イオンイオン交換クロマトグラフィー時に使用したバッファーのpHの変化に伴う亜分画のピークは、図2に示した。図2に図示したように、バッファーのpHが4.5ないし5.5の範囲の場合、pIIのピークが大きくなることを確認することができる。バッファーのpHに伴う亜分画のA260/A280は次表1に示し、半数致死量TotalLD50Unitを次表2に示した。上記表1に示されたように、バッファーのpHが4.5ないし5.5の範囲の場合、A260/A280が0.45ないし0.6と示されて投与試料として適するものと判断することができる。したがって、精製された体内非拡散型活性分画pIIを得るためには、バッファーのpHを4.5ないし5.5に調節するのが望ましいのである。上記表2に示されたように、バッファーのpHが5.0ないし5.5の範囲の場合、半数致死量が0.8×105ないし3.5×105U/mlと示されてpIIの回収率が高いものと判断することができる。したがって、安定した体内非拡散型活性分画pIIを得るためには、バッファーのpHを5.0ないし5.5に調節するのが望ましいのである。実施例3.試料量sampleloadingの変化によるピーク変化及び特性実施例1と同一の方法で亜分画を得るが、このための試料の量変化による各亜分画pI、pII及びpIIIのピーク特性変化を図3に示し、各亜分画別A260/A280の変化を次表3に示し、半数致死量TotalLD50Unitを次表4に示した。上記表3に示されたように、試料量が0.25ないし2mlの範囲の場合、A260/A280が0.4ないし0.6と示され、投与試料として適するものと判断することができる。したがって、体内非拡散型活性分画pIIを多量に得るためには、試料量をカラム体積対比1/5ないし2倍の範囲で調節するのが望ましいのである。上記表4に示されたように、試料量が0.25ないし1mlの範囲の場合、半数致死量が0.8×105ないし3.5×105U/mlと示され、pIIの回収率が高いものと判断することができる。したがって、安定した体内非拡散型活性分画pIIを得るためには、試料量をカラム体積対比1/5ないし1倍の範囲に調節するのが望ましいのである。実験例1.筋麻痺効果の比較試験方法1右下肢筋肉注射方法上記実施例1によって分離された亜分画の筋麻痺効果を確認するために、マウスを使用して右下肢筋肉注射法を遂行した。使用したマウスICRMouse、female、4week、18~22gは実験群当り10匹であり、マウスの重さを正確に測定して記録した。50μlハミルトン注射器に上記亜分画を1U/20μl濃度で単位に合うように空気なく満たしてからICRマウスの右側後脚の足首部位で針を3cmほど入れて筋肉内に注射した。筋肉内注射後、時間帯別に次表5に提示された麻痺指数及び測定基準に準して麻痺指数及び死亡有無を観察してその結果を図4に示した。図4に図示されたように、上記実施例1で分離した亜分画のうち体内非拡散型活性分画pIIは拡散型活性分画pIに比べて投与用量対比有意な生存率増加をにせA、投与用量2Uで時間経過に伴う生存率はpII100対比pI0の極端的な差を示したことBを確認することができる。実験例2.市販製品と体内非拡散型活性分画pII間の体内拡散性比較市販製品アラガン社ボトックスLot:C2066C2、C2481C2と上記実施例1によって分離された亜分画pIIの筋麻痺効果を確認するために、マウスを使用して右下肢筋肉注射法を遂行した。使用したマウスICRMouse、female、4week、18~22gは実験群当り10匹であり、マウスの重さを正確に測定して記録した。50μlハミルトン注射器に精製前試料と亜分画pIIを1U/20μl濃度で単位に合うように空気なく満たしてからICRマウスの右側後脚の足首部位で針を3cmほど入れて筋肉内に注射した。筋肉内注射後、体内拡散性を観察するために、マウスの麻痺程度を肉眼で確認し、注射後12時間が経過したマウスの状態を写真図5に示し、投与時間及び投与量に伴う死亡有無を観察した結果を図6に示した。また、筋麻痺効果の開始時間は図7に示し、筋麻痺効果の持続時間を図8に示した。図5に図示されたように、pIIは筋肉内注射した右下肢が麻痺するが、既存市販製品は腰及び反対側の脚まで拡散して麻痺したことを示している。図6に図示されたように、pIIは市販製品に比べて投与用量対比有意な生存率増加をみせA、投与用量2Uで時間経過に伴う生存率はpII100対比既存技術製造品0の極端的な差を示すことを確認することができるB。図7に図示されたように、pIIは市販製品に比べて投与用量1Uで筋麻痺効果の開始が有意的に早く現われることを確認することができる。図8に図示されたように、pIIは市販製品に比べて投与用量0.5Uで筋麻痺効果の持続期間が80日以上長かった。実験例3.ボツリヌス毒素凍結乾燥物のイオン含量分析市販製品アラガン社ボトックスLot:C2066C2、C2481C2と上記実施例1によって分離された亜分画pIIの凍結乾燥物間のイオン含量についての分析を遂行した。市販製品と比較するためにpII分画を希釈して同じ量のボツリヌス毒素100Uと付随添加物を瓶に入れて凍結乾燥を遂行し、マウス半数致死試験法を利用して市販製品とpII凍結乾燥物間の活性が同一であることを確認した後イオン含量分析を進行した。二つの凍結乾燥物を蒸溜水10mlを用いて溶かした後、誘導結合プラズマ質量分析機を利用してイオン含量を測定し、その結果を次表7に示した。上記表7に示されたように、本発明によって精製された非拡散型ボツリヌス毒素pII分画の凍結乾燥物が市販製品に比べてMg、Fe、Znイオンの含量が有意的に高いことを確認することができた。以上で説明した本発明は、前述の実施例及び添付された図面によって限定されるものではなく、本発明の技術的思想を脱しない範囲内でさまざまな置換、変形及び変更が可能なことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に明白なことである。"