"配列番号1~27のいずれかを含む、単離DNA配列。配列番号1~27のいずれかからなる、請求項1記載の単離DNA配列。DNA増幅において使用するための請求項1または2に記載の単離DNA配列。プローブが蛍光標識されていてもよい、プライマーまたはプローブとして使用するための請求項3記載の単離DNA配列。核酸単離に続いて核酸増幅、続いてリアルタイムPCRのステップを含む、核酸検出のための方法。核酸増幅が、PCR、NASBAまたはその他の核酸増幅技術を含む、請求項5記載の方法。リアルタイムPCRが蛍光標識プローブを使用する、請求項5または6のいずれかに記載の核酸検出のための方法。検出されるべき核酸がDNAまたはcDNAである、請求項5~7のいずれかに記載の方法。核酸がSARSコロナウイルスcDNAである、請求項8記載の方法。下記ステップ:i生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、ii核酸を増幅すること、所望によりPCR、NASBAまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そしてiiiリアルタイムPCRを用いて、ステップで産生される核酸を増幅および検出すること、を含む、請求項5~9のいずれかに記載の方法。得られた核酸がRNAである場合、ステップi後のさらなるステップがあり、該ステップは逆転写酵素を用いてRNAをcDNAに変換することを含む、請求項10記載の方法。プライマーおよびまたはプローブが、ステップおよびで使用される、請求項5~11のいずれかに記載の方法。プライマーおよびまたはプローブが、少なくとも一部分のSARSコロナウイルスcDNAに結合する、SARSコロナウイルスcDNAを検出するための、請求項12記載の方法。使用されるプライマーおよびプローブが、配列番号1~27を含む単離DNA配列に一致する、請求項13記載の方法。ステップで使用されるプライマーがプローブと重複しない、請求項14記載の方法。ステップで使用されるプライマー対が、配列番号1、2、3、4または5;および6、7、8、9または10のいずれかに一致する、請求項14記載の方法。ステップで使用されたプライマー対が、配列番号26および27のいずれかと一致する、請求項14記載の方法。ステップで使用したプライマー対が、配列番号11、12、13、14または15;および16、17、18、19または20のいずれかに一致する、請求項14または15のいずれかに記載の方法。ステップで使用されたプローブが、配列番号21、22、23、24または25のいずれかに一致する、請求項16~18のいずれかに記載の方法。核酸を検出する方法において使用するための請求項1記載の単離DNA配列。核酸がSARSコロナウイルスRNAまたはcDNAである、請求項20に記載した使用のための単離DNA配列。下記ステップ:i生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、ii核酸を増幅すること、所望によりPCR、NASBAまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そしてiiiリアルタイムPCRを用いて、ステップから核酸を増幅および検出すること、を含む、核酸の検出方法において使用するための組成物の製造における、請求項1記載の単離DNA配列の使用。核酸がDNAまたはcDNAである、請求項22記載の使用。核酸がSARSコロナウイルスcDNAである、請求項23記載の使用。ウイルスがSARSコロナウイルスであり、該プライマーが配列番号1~27からなり、ウイルス感染を検出するための診断用試験キットの製造におけるSARSコロナウイルスに特異的なプライマーの使用。配列番号1~27に一致する2以上の単離DNA配列を含む、SARS診断用試験キット。配列番号1、2、3、4または5、および6、7、8、9または10のいずれかに一致しているプライマーを含む、請求項26記載のSARS診断用試験キット。配列番号26および27のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項26記載のSARS診断用試験キット。配列番号11、12、13、14または15、および16、17、18、19または20のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項26~28のいずれかに記載のSARS診断用試験キット。配列番号21、22、23、24または25のいずれかに一致するプローブを含む、請求項29記載のSARS診断用試験キット。生物学的または環境サンプル中のSARSコロナウイルスを検出するための診断用試験キットであって、iサンプルからSARSコロナウイルスRNAを単離するための単離用剤、ii標的分子を複製するための核酸複製剤であって、標的分子はSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列に相補的な核酸配列を包含する、そしてiii標的分子を検出するための核酸検出剤であって、該核酸検出剤が検出分子を包含する、を含む、キット。標的分子がcDNA分子である、請求項31記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。請求項31または32記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、該核酸複製剤は、第一の精製かつ単離されたDNA分子を包含しており、このDNA分子は、第一の精製かつ単離されたDNA分子が酵素およびDNAヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたDNA分子がSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のcDNA配列と結合する場合にSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のcDNA配列に相補的なDNA配列を包含しているDNA配列を生成するように、SARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列と結合するためのDNA配列を含んでいる、キット。第一のDNA配列が、配列番号6、7、8、9または10、あるいは配列番号26および27に記載のDNA配列のいずれか一つと結合し、配列番号1、2、3、4または5のDNA配列のいずれか一つをコードする、請求項31~33のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。請求項31~33のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、該核酸複製剤は、第二の精製かつ単離されたDNA分子を包含しており、このDNA分子は、第二の精製かつ単離されたDNA分子が酵素およびDNA配列の存在下で伸張し、第二の精製かつ単離されたDNA分子が少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのcDNA配列と結合する場合に第一回目の増幅中に生成された少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのcDNA配列に相補的なDNA配列を包含しているDNA配列を生成するように、第一回目の増幅によって産生されたSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のDNA配列に結合するためのDNA配列を含んでいる、キット。第二のDNA配列が、配列番号11、12、13、14または15に記載のDNA配列のいずれか一つを、配列番号16、17、18、19または20に記載のDNA配列のいずれか一つと一緒にコードしている、請求項32または33のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。複製されたDNA産物が、さらなる増幅の前にまず希釈される、請求項31~36のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。検出分子が、標的分子に結合するためにSARSコロナウイルスのRNA配列に相補的な少なくとも一部分をコードしているDNA配列;およびシグナル生成器を包含する、請求項31~37のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。第一のDNA分子のDNA配列が第二のDNA分子と重複しない、請求項38記載のキット。シグナル発生物が、適当な検出器において検出され、定量され得る光子を放出するように刺激され得る、蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたはその他の分子、のいずれか1つを含む、請求項38または39に記載のキット。検出分子が、配列番号21~25のDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項38~40のいずれかに記載のSARSコロナウイルスを検出するためのキット。この発明の目的は、感染の初期段階にあるヒトを同定できるような、SARSコロナウイルスを包含する核酸を検出するための高感度な方法を提供することである。また、この発明の目的は、核酸を検出するために、使用し易い診断用キットを設計することである。本発明の要約一般的に、本発明は、様々な生物学的または環境サンプルから、例えばコロナウイルス核酸を抽出および検出するための方法を提供し、その方法は、次のステップ、ASARSコロナウイルスを含有すると疑われるサンプルを回収すること、B回収したサンプルからリボ核酸RNAを抽出すること、CRNA/DNA増幅技術を用いて、特異的な標的配列を増幅すること、そしてDDNA増幅技術および適当な伝達系、例えば、Taqman登録商標プローブまたは分子ビーコンなどを包含する蛍光遺伝子プローブを用いて、標的増幅核酸産物を検出すること、を含む。さらに、本発明は、標的分子を複製するための核酸複製剤、ここで標的分子はSARSコロナウイルスのRNA配列に相補的な少なくとも一部分を含有する核酸配列であるおよび複製された標的分子を増幅し、増幅中に複製産物を検出するための核酸複製剤および核酸検出剤、を包含するSARSコロナウイルスを検出するためのキットを提供する。これらの剤は、複製産物を増幅し得るプライマー対および増幅産物に相補的である蛍光遺伝子プローブを包含する。本発明の第一態様に従って、配列番号1~27のいずれかに記載の単離DNA配列が提供される。第二態様に従って、DNA増幅の際にプライマーまたは蛍光標識プローブとして使用するための配列番号1~27のいずれかに記載のものを含む単離DNA配列が提供される。プライマーまたはプローブは、配列番号1~27のいずれかを含み得る。本発明の第三態様に従って、核酸単離に続くDNA増幅によって、その後のリアルタイムPCRのステップを含む核酸検出方法が提供される。好ましくは、DNA増幅はPCR、NASBAまたは他の適当な核酸増幅技術を含む。最も好ましくは、該方法は下記ステップ:i生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、ii核酸を増幅すること、所望によりPCR、NASBAまたは他の核酸増幅技術を使用すること、そしてiiiリアルタイムPCRを用いて、ステップで産生した核酸を増幅および検出すること、を含む。より好ましくは、ステップは、PCRを用いて核酸を増幅することを含む。ステップは、前増幅ステップとしても知られる。この増幅ステップは、DNA増幅およびPCRによる検出を含み得る。あるいは、NASBを用いてもよい。ステップの別の適当な核酸増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応に続くアガロースゲル電気泳動、ネスティドPCR、リアルタイムTaqman登録商標PCR、分子ビーコンPCR、等温でキメラプライマーにより開始される核酸増幅から選択され得る。本発明の方法は、この新規の核酸増幅技術の組合せによって達成される。前増幅ステップに続くリアルタイムPCRのこの組合せは、核酸を検出するための高感度な方法を有利に提供する。これは、ウイルスまたは他の病原体により感染した初期段階にあるヒトを容易に同定することを可能にする。さらに、本発明の別の態様は、核酸を検出する方法における使用のための配列番号1~27を含む単離DNA配列に関し、核酸の検出方法における使用のための組成物の製造において、次のステップ:i生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、ii核酸を増幅すること、所望により、PCR、NASBAまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そしてiiiリアルタイムPCRを用いて、ステップから核酸を増幅および検出すること、を含む配列番号1~27を含む単離DNA配列の使用に関する。ステップiiは、前増幅ステップとして知られる。前増幅は、PCRまたはNASBAによって実施され得る。この前増幅ステップのために使用されるプライマーは、どの方法を用いるかによって異なる。検出されるべき核酸は、SARSコロナウイルスRNAまたはcDNAから誘導されるのが好ましい。本発明は、一般的に、生物学的または環境サンプルにおけるSARSコロナウイルスを検出するための診断用試験キットに関し、下記のステップ:プライマーに各々一致する。本発明は、図面を参照して説明される。好ましい実施態様の詳細な説明急速に、核酸増幅は、患者組織における感染生物体の存在を直接示すことによって多くの疾患の診断を確認するための標準的な臨床検査方法となってきた。該方法は、それらの特異性および感度により、迅速に感染を確認でき、抗ウイルス治療の効果をモニターされるようになったので、SARSの発生中に不可欠なものとなった。SARS-CoVに対する宿主抗体の存在を証明することによるSARS診断アッセイは、ELISAおよび免疫蛍光などを用いて開発されてきた。しかし、そのような試験は、核酸方法の感度を欠くことが多く、抗体が検出レベルに達するまでに7-21日を要するので、新たに感染した患者を検出できない。本発明は、核酸、例えば、生物的および環境サンプル中のSARSコロナウイルスのRNAまたはcDNA、を検出するための高感度な方法を提供する。かかる生物サンプルは、血液、痰、血清、血漿、鼻喉頭上部スワブ、口腔咽頭スワブ、尿、便、その他体液、および環境サンプル、例えば、水、汚水、廃棄物などを包含する。核酸検出のための本発明の方法は、前増幅ステップ後のリアルタイムPCRを包含する。LauらArealtimePCRforSARScoronavirusincorporatingtargetgenepreamplificationBiochemicalandBiophysicalResearchCommunication31212901296の内容目録を、出典明示により本明細書の一部とする。PCRおよびリアルタイムPCRは、当業者には既知の技術である。蛍光定量化を用いるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRは、DNAの検出について迅速で高感度かつ高特異的な方法であり、SARSコロナウイルス核酸の検出に適用され得る。この技術単独についての結果は、3時間程度で得ることができる。RT-PCRは、蛍光性の定量を用い得るが、蛍光定量のみに限定しない。RT-PCRは、例えば、好ましくは片方では蛍光吸収成分により標識し、そしてもう片方で蛍光放出成分により標識された別のDNAオリゴヌクレオチド分子の使用を包含する。さらなるDNAオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチドプライマー間の目的とする核酸の領域とハイブリダイズする。そのため、シグナル発生物は、適当な検出器で検出でき、定量化できる光子を放出するように刺激され得る蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたは他の分子であり得る。増幅の開始ラウンドの産物が、その後の増幅のためのテンプレートとして使用されるネスティッドPCR方法は、多くの標的遺伝子の検出の適合度および感度を増加させるとよく知られている。かかる前増幅方法は、従来のPCR技術以上にそれらの一般に秀でた感度のために、様々なリアルタイムPCRの適用には不必要であると考えられている。しかしながら、目的の標的遺伝子が少なく、およびまたは他の汚染物質がバックグラウンド中に存在する状況では、驚くべき事に、本発明による前増幅が、検出限界を改善するのに有利であることがわかった。本発明の方法、すなわち前増幅後のリアルタイムPCRは、増強されたリアルタイムPCREnhancedRealtimePCRとして本明細書中に示す。前増幅は、PCR、NASBAまたは他の核酸増幅技術によっておこり得る。このERT技術の1つの利点は、驚くべきことに、検出限界は、通常のTaqManリアルタイムPCRの100倍以上であるTCID50までであり、従来のPCRの108倍以上であることが見出された。さらなる利点は、この増強されたリアルタイムPCR検出についてのターンアラウンド時間が、約55時間要することである。全体の検出方法の時間をさらに短縮し、試験の感度を増加させるために、前増幅のためにNASBA技術とリアルタイムPCRとを組み合わせる方法が使用され得る。前増幅ステップがNASBAを含有する場合に、有利なことには、ターンアラウンド時間が4時間の範囲内であることがわかった。すなわち、この組合せられた前増幅RT-PCR技術についての検出限界および時間に関する利点は、双方予想外のことであり、また有利なものであった。ERTは、陽性と陰性サンプルとを明確な手法で識別することを可能にし得る。これは、いかなる誤診断または解釈も許容してはならない臨床診断において特に重要である。同一サンプルを標準的なリアルタイムPCRによって分析する時に、SARS-CoV陽性および陰性増幅曲線が、別のものと近接して重複する傾向がある場合に、陽性および陰性シグナル間の判別はより不明瞭である。そのため、リアルタイムPCRの結果を解釈する際に、経験が浅い臨床医は、ERTにより得られた増強された結果を用いて、陽性と陰性シグナルとの違いを容易に区別することが可能である。これは、従来のリアルタイムPCRを超える本発明の非常に重要な利点である。増強されたリアルタイムPCRの増強された感度により、単なる臨床診断以上に多くの分野への適用を可能とする。媒介物および汚水がSARS発生と関連すると考えられるなら、核酸検出方法を環境サンプルに適用するにふさわしいことは明らかである。共有面積の表面をSARS-CoV核酸のエビデンスについて試験することは、疾患の伝搬をモニターする機会および洗浄滅菌方法の効力をモニターする機会を提供する。SARSの徴候および症状は、特に高リスク患者、例えば発熱しない老人では非常に変化し易いので、SARS-CoVの存在を決定するための高感度な方法は、医療環境におけるウイルスの伝搬を制限するのに非常に有用である。早期検出は、地域発生を含めて、より迅速に実行されるべき緊急プランを可能にし、社会的関心そして潜在的な経済効果を制限して、SARS-CoVの国際的蔓延を防止することを可能にする。この発明の好ましい実施態様は、図を参考にして説明される。表1は、図1~3に使用される符号の説明を示す。生物サンプル、例えば鼻咽頭スワブanoropharyngealswab中のSARSコロナウイルス濃度は、SARSコロナウイルスウイルスRNAの存在の検出を生物サンプルに対して直接実施できないような非常に低い濃度かもしれない。検出目的のための十分な量まで、ウイルスRNA分子の数を増加させるために、適当な増幅技術が必要とされる。ポリメラーゼ連鎖反応は、DNA増幅についての特別な用途をもった柔軟な技術であると知られている。RNAのDNAへの変換は、PCRプロセスを、RNAゲノムを有する病原体、例えばSARSコロナウイルスをカバーするよう拡張することを可能にする。次いで、増幅されたDNA分子は、適当な技術のいずれによって検出してもよいSARSコロナウイルスは、リボ核酸の1本鎖の形態でその遺伝物質を含有する。該ウイルスRNAは、その再生に必要な遺伝子を含有し、その主な遺伝子の1つはポリメラーゼとよばれている。この遺伝子は、分子の5’末端から数えて、約2800個のヌクレオチド長である。図1は、検出キットによってSARSコロナウイルスの検出のための全体的な方法を示す。図1に示したように、RNAの1本鎖形態である標的SARSコロナウイルスのウイルス核酸分子は、最初に生物サンプルから抽出される。不都合のない生物サンプル型は、血液、血清血漿、末梢血液単核細胞末梢血液リンパ球PBMC/PBL、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚創傷スワブ、髄液、頸管塗抹、膿サンプル、食品基盤foodmatricesおよび脳、脾臓および肝臓を含む身体様々な部分からの組織を包含し得る。列挙されていない他のサンプルを用いてもよい。単離用剤は、この発明の検出キットの核酸抽出方法を達成する。標的SARSコロナウイルスウイルスRNA分子10が生物サンプルから抽出された後に、サンプル中のRNA分子の量は検出されるべき十分な量では存在しないかもしれない。そのため、SARSコロナウイルスウイルスRNA分子の一部が、適当な増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応またはNASBAまたはRT-PCRによって、標的核酸分子に複製される。次いで、標的核酸分子は、適当な方法によって検出されうる。RT-PCRに先立って、前増幅ステップを使用することは、驚くべきことに、従来のPCR技術単独によって提供される以上に、より高い検出レベル、改善された感度およびより短い時間を含めて、ある範囲の価値を提供する。次いで単離および増幅方法の詳細を説明する。核酸単離SARSコロナウイルスウイルスRNA分子10は、適当な単離用剤を生物サンプルに適用することによって生物サンプルから単離され得る。好ましくは、溶菌剤が、単離用剤の前に用いられ得る。溶菌剤、例えば溶菌緩衝液は、タンパク質および脂質を溶解すること、そしてこれらの材料がより簡単にサンプルから除去され得るように生物サンプル中のタンパク質を変性させることに関与する。さらに、溶菌剤は、長期貯蔵目的のために、RNA分子を安定化するために緩衝液として働き得る。図2に示したとおり、RNA分子は、室温で48時間まで、溶菌緩衝液中で安定であり得るし、-70°Cで無期限に貯蔵され得る。そのように行う利点は、かかるプロセスを行うのに適当でない試料採取場所で、分析を行う必要がないことである。適当な溶菌緩衝液の例は、5Mのグアニジンチオシアン酸塩およびTris/HClを包含し得る。かかる溶菌緩衝液は、当業者にはよく知られている。タンパク質および脂質の溶解、タンパク質の変性、RNA分子の安定化という目的をなお達成し得る様々な組成物を有する溶菌剤は、この発明の検出キットにおいて利用され得る。溶菌剤を生物サンプルに適用した後の次のステップは、単離用剤の使用によるサンプル由来の核酸分子の単離である。図2は、検出キットにおける全体的な単離方法を説明するものである。溶菌剤を生物サンプルに適用した後、核酸と共に他の望ましくない成分は、溶液形態にある。次いで、この溶液を、核酸に対して高親和性を有する小さなクロマトグラフィーカラム12に供する。非核酸成分を、洗浄によりカラムから除去し得る。次いで、核酸を、適当な溶離剤を用いてカラムから特異的に溶出し得る。ここで説明した核酸精製方法は、当業者には既知である。サンプル中に含まれる核酸が単離された後に、必要であれば、その後SARSコロナウイルスウイルスRNA分子が、その後、逆転写酵素の使用により相補的DNAコピーへと変換されるように、増幅剤が核酸の混合物に用いられてもよい。この方法は、当業者には既知である。cDNAへの変換は、ある特定の状況にのみ必要とされる。すなわち、RNAまたはcDNAが、前増幅に使用される方法によって、次のステップに対するテンプレートとなり得る。前増幅ステップ:SARSコロナウイルスゲノムの一部が、いわゆる前増幅ステップにおいて、例えば、PCR技術またはNASBAまたはその他の適当な核酸増幅技術によって検出目的のために複製される。増幅中に、cDNAおよび一本鎖RNAの両方が合成される。NASBAは、核酸の増幅のための連続的な、等温の、酵素を基にした方法である。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼH、RNAポリメラーゼおよび2つの特異的に設計されたDNAオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。NASBAは、RNAをcDNAに変換する必要がないので、RNAに対して直接機能し得る。配列番号26および27は、NASBA前増幅ステップにおいてプライマーとして使用され得る。一方、従来のPCRまたはその他の核酸増幅技術もまた、この前増幅ステップにおいて使用され得る。配列番号1~10は、前増幅PCRステップにおいてプライマーとして使用され得る。一方、配列番号11~20は、この前増幅PCRステップについてはプライマーとして使用され得る。PCRのために、SARSRNAは、まずcDNAに変換され、次いでこれを前増幅PCRのためのテンプレートとして使用する。PCRによる前増幅ステップ:図3に示したように、増幅プロセスは、95°Cに加熱することによって1本鎖形態となっている標的SARSコロナウイルスのウイルスcDNA、またはヌクレオチド18404から18386は、プライマーAにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号4または5が、プライマーAにおいて結合目的のために使用され得る。この発明の目的のために、プライマーBをSARSコロナウイルスのウイルスcDNAに結合するために適当な領域が、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18157から18179の間の領域であることが見出された。これらの試験で使用したタイプの生物体は、SARSコロナウイルスHKU-39849GenBankAccessionnumberAY278491である。従って、プライマーBの結合配列は、好ましくは、図4において配列番号6に記載のSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18157から18179の間の領域に相補的であるDNA配列を包含する。配列番号6が、5’-3’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。あるいは、SARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18125から18144またはヌクレオチド18103から18122が、プライマーBにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号9または10は、プライマーBにおいて結合目的のために使用され得る。プライマーAおよびBがSARSコロナウイルスのウイルスcDNAに結合した後に、プライマーAおよびBが、プライマーAおよびBの3’末端で適当なヌクレオチドの存在下で、適当なポリメラーゼ、例えばTaqDNAポリメラーゼの作用を介して伸張される。こうして、一部のSARSコロナウイルスウイルスRNAに相補的である下記配列DNA配列を包含する伸張されたプライマーAおよびBが、産生される。適当な増幅プログラムの適用によって、SARSコロナウイルスcDNAは、二本鎖DNA産物の過剰量に変換され得る。適当な増幅プログラムは下記である:NASBAによる前増幅:一方、前増幅は、核酸の増幅のために連続した、等温の、酵素を基にした方法であるNASBAによって生じさせ得る。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼH、RNAポリメラーゼおよび2つの特別に設計されたDNAオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。増幅中、cDNAおよび1本鎖RNAの両方が合成される。そうして、TaqManリアルタイムPCRは、NASBA産物中のcDNAの存在と共に行われうる。RNAは、NASBAについてのテンプレートとして作用できる、そのため、この状況ではSARSRNAをcDNAに変換する必要はない。NASBAを実行するための適当なプライマーは、SARSNASBAT7プライマーおよびSARSNASBAECLプライマー各々に対応する配列番号26および27を包含する。これらのNASBAプライマーは、前増幅ステップでPCRプライマー配列番号1~10の代わりに使用され得る。リアルタイムPCR:検出方法の感度を高めるために、前増幅ステップ、すなわちPCR反応またはNASBAの産物は、別の増幅方法、すなわちRT-PCR方法において使用される。必要なら、プライマー配列番号1~10を代わりに使用してもよいが、配列番号11~20は、RT-PCRを実施するためのプライマーとして使用され得る。配列番号21~25は、RT-PCRにおけるプローブとして使用される。検出目的を達成するために、前増幅ステップ、例えばPCRまたはNASBAの増幅された2本鎖DNA産物26は、RT-PCRを利用するさらなる増幅方法、好ましくは、TaqMan定量化リアルタイムPCRに対するテンプレートとして使用され得る。別の増幅のためのテンプレートとして使用され得る前に、複製されたDNAは、後続の増幅方法の効率を最高にするために、適当な液体で最初に希釈しなければならない。複製したDNA分子のための適当な希釈剤は、ヌクレアーゼ不含水または緩衝液を包含する。RT-PCR方法のための適当な増幅プログラムは下記である:増幅の程度は、適当な装置、例えばABIPrism7700遺伝子検出システムにおいて、自動的にモニターされ得る。RT-PCRによる増幅には、2つのDNAオリゴヌクレオチドプライマーおよびプライマーDおよび蛍光遺伝子プローブが必要である。この発明の目的のために、プライマーCがSARSコロナウイルスのウイルスcDNA増幅産物に結合するための適切な領域は、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18264から18245の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、SARSコロナウイルスHKU-39849GenBankAccessionnumberAY278491である。従って、プライマーCの結合配列は、好ましくは、図4の配列番号11に記載されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18264から18245の間の領域に相補的であるDNA配列を包含する。配列番号11は、5’-3’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に関して結合の方向は、バックからフロントである。あるいは、SARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18295から18314、またはヌクレオチド18322から18304は、プライマーCにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号14または15が、プライマーCにおいて結合目的のために使用され得る。この発明の目的のために、プライマーDがSARSコロナウイルスのウイルスcDNA増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18193から18211の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、SARSコロナウイルスHKU-39849,GenBankAccessionnumberAY278491である。従って、プライマーDの結合配列は、図4で配列番号16に記載されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18193から18211の間の領域に相補的であるDNA配列を包含するのが好ましい。配列番号16は、5’-3’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。あるいは、SARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18219から18336、またはヌクレオチド18205から18220は、プライマーDにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号19または20が、プライマーDにおいて結合目的のために使用され得る。この発明の目的のために、プライマーEがSARSコロナウイルスのウイルスcDNA増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18217から18234の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、SARSコロナウイルスHKU-39849,GenBankAccessionnumberAY278491である。従って、プローブEの結合配列は、図4で配列番号21に記載されたSARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18217から18234の間の領域に相補的であるDNA配列を包含するのが好ましい。あるいは、SARSコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド18241から18260、またはヌクレオチド18228から18246は、プローブEにおいて結合目的のために使用される。あるいは、配列番号24または25が、プローブEにおいて結合目的のために使用され得る。プライマーCおよびDが、2本鎖産物を形成するために、適当な酵素、例えばTaqDNAポリメラーゼおよび追加のヌクレオチドの作用を介して、3’末端から伸張される。増幅中に、プローブEは、DNAポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ作用により置換され、減成される。これは、増幅の程度、すなわち増幅産物の濃度に相関し得る蛍光シグナルの増加を生じる。このように、RT-PCR増幅方法の産物は、下記DNA配列を各々含有する大量の標的DNA分子である:リアルタイムプローブの配列は、増幅されたDNA産物のどのような領域にも相補的であり、その末端がプライマーCおよびDによって定義され得る。しかし、これは増幅反応の発生を防止するため、該プローブ配列はプライマーCおよびDのものと重複し得ない。増強されたリアルタイムPCR前増幅およびリアルタイムPCR技術を組み合わせたこの技術は、増強されたリアルタイムPCRとして示される。図3は、PCRおよびRT-PCRの組合せによって、SARSコロナウイルスウイルスRNAの増幅のための概略図を示す。この新規アッセイの目立った態様は、RT-PCRの第二回目のラウンドのテンプレートとして、前増幅ステップ、例えば従来のPCRまたはNASBAの開始ラウンドいずれかの増幅産物の使用である。この組合せ技術は、SARS-CoV検出の感度を増加させる。所望により、同一プライマーは、従来のPCRおよびRT-PCR段階による開始前増幅のために使用され得る。この追加の前増幅ステップは、臨床サンプル中のSARS-CoVの検出の感度を改善する。表2は、列挙したプライマー配列が、CUHKAG03AY345988GenBank配列を基にしたSARS配列にどのように対応するかを示す。配列番号4、9、14、19、24は、SARSヌクレオカプシドタンパク質遺伝子から得られる、配列番号5、10、15、20および25は、SARSポリメラーゼPol遺伝子から得られる。さらに、本発明は、生物学的または環境サンプル中のSARSコロナウイルスの検出するためのキット製造において、第一および第二の精製かつ単離されたDNA分子の使用に関し、ここで、該SARSコロナウイルスのRNA分子は単離用剤によって生物学的または環境サンプルから単離される;標的分子は、第一および第二の精製かつ単離されたDNA分子を包含する核酸複製剤によって複製され、該標的分子は、SARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列に相補的な核酸配列と検出分子に結合するための核酸配列を包含し、該標的分子は核酸検出剤によって検出され、該核酸検出剤は検出分子を包含する。RNAまたは他の核酸であり得るが、好ましくは、標的分子はcDNA分子である。第一の精製かつ単離されたDNA分子は、第一の精製かつ単離されたDNA分子が酵素およびDNAヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたDNA分子がSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のcDNA配列と結合する場合にSARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列に対して相補的なDNA配列を包含しているDNA配列を生成するように、SARSコロナウイルスの少なくとも一部分のRNA配列と結合するためのDNA配列を含んでいる。より好ましくは、第一のDNA配列は、配列番号1、2、3、4または5に記載のDNA配列対の一つ、配列番号6、7、8、9または10に記載のDNA配列対のいずれか一つをコードし得る。一方、第一のDNA配列は、配列番号26および27に記載のDNA配列対をコードし得る。さらに、核酸複製剤は、少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのRNA配列に相補的なDNA配列を包含するDNAに結合する場合、少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのRNA配列をコードするDNA配列を含むDNA配列を生成するために、酵素およびDNAヌクレオチドの存在下で伸張するように、少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのRNA配列に相補的なDNA配列を含むDNA分子を包含する第二の精製かつ単離されたDNA分子を包含し得る。より好ましくは、DNA配列は、配列番号11、12、13、14または15に記載のDNA配列対のいずれか一つを、配列番号16、17、18、19または20に記載のDNA配列対のいずれか一つと組み合わせて、コードする。複製されたDNA産物は、さらに増幅する前に希釈され得る。検出分子は、標的分子に結合するための、少なくとも一部分のSARSコロナウイルスのRNA配列をコードするDNA配列およびシグナル発生物を包含し得る。シグナル発生物は、適当な検出器において検出および定量し得る光子を放出するように刺激し得る次のうちの一つを含みうる:蛍光遺伝子分子、分子ビーコン、その他の分子。好ましくは、検出分子のDNA配列は、配列番号20から25に記載のDNA配列対のいずれか一つをコードする。本発明は、下記の非限定的な実施例で説明される。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更および修飾が下記実施例および方法に適用され得ることに注目すべきである。実施例下記実施例で使用した成分および遺伝子プロトコールを、下記に説明する:サンプル核酸を単離するために使用したサンプルは、SARS患者から得たもので、中国の北京にある病院から提供された。ボックスAMastermixdUTPを有するdNTPs、HotStartTaqDNAポリメラーゼ、MgCl2、ウラシルNグリコシラーゼ含有物および不動対照PassiveReference。SARSプライマーSARSに関連のあるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子領域に相補的なDNAオリゴヌクレオチド、かつ配列番号1~20および26および27の包含物。SARSプローブSARSと関連があるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の領域に相補的なDNAオリゴヌクレオチドであって、蛍光放出標識と蛍光消光分子の両方で標識され、配列番号21~25を包含するものである。02mMの各SARSプライマー024mMTaqManSARSプローブを、ユニバーサルマスターミックスに添加した。SARS陽性コントロールSARSに関連するコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の一部分を含有する、高精製度かつ非感染プラスミド。試薬調整のためのプロトコールボックスA要求されているように、RNeasyMiniカラムの十分な数を調製した。RLT緩衝液、RW1緩衝液およびRPE緩衝液を要求されているように調製し、室温にゆっくりと温めた。70のエタノールおよびヌクレアーゼ不含水を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。ボックスBMastermix、SARSプライマー、SARSプローブ、精製した核酸テンプレートおよびヌクレアーゼ不含水を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。核酸抽出プロトコール1.サンプル04mlおよびRLT緩衝液04mlを一緒に混合した。2.70エタノール04mlをチューブに添加した。3.溶液混合物06mlを、RNeasyカラムに添加した。該チューブをゆっくりと締めて、15秒、約10000xgで遠心分離した。洗液flowthroughを、回収チューブ2mlに取った。ステップ3を繰り返した。4.RW1緩衝液07mlをRNeasyカラムに添加した。チューブをゆっくりと締め、15秒間、約10000xgで遠心分離し、カラムを洗浄した。洗液flowthroughを廃棄した。5.RPE緩衝液05mlを、RNeasyカラムに添加し、15秒、約10000xgで遠心分離した。洗液を廃棄した。ステップ5を繰り返した。6.該カラムを、さらに2分、約10000xgで遠心分離した。7.RNeasyカラムを、新規の15ml回収チューブに移した。RNase不含水を、シリカゲル膜上に直接ピペットで移し、3分間室温でインキュベートした。8.RNAを、1分、約10000xgで遠心分離に供し、溶出した。9.核酸、RNAを得た。配列決定プロトコールアンプリコンが、目的の標的配列決定反応と一致することを確認するために増幅反応の産物を配列決定した。配列決定反応は、製品説明書に従って市販購入し得る配列決定キットを用いて行った。DNA配列を、373Asequencersystemを用いて配列決定反応を解析することによって得た。DNA配列を、theNationalCenterforBioethechnologyInformationから利用できるBLAST配列比較ツールを用いて分析した。実施例1:前増幅のためのPCRを用いる増強強化リアルタイムPCRPCR前増幅全容量25μlにおいて、下記成分を混合した:ヌクレアーゼ不含水、0.2mMdNTP、1UPlatinumTaqDNAポリメラーゼ、5mMMgCl2、1xPCR緩衝液、プライマーおよびcDNAテンプレート。PCR増幅を、下記の温度プロファイルを用いてMasterCyclerで行った:リアルタイムPCRPCR前増幅の第一のラウンドの後、一部分の産物を、RT-PCRを利用するさらなる増幅のためのテンプレートとして使用した。PCR成分を、表3で記載した割合で混合した。表3RT-PCR装置を、表4の増幅プロファイルを用いてプログラムした。PCR前増幅に続くRT-PCRを用いるSARSコロナウイルス検出の結果を、表5および6に示した。該結果を、PerkinElmerABI310GeneticAnalyzerおよび上記した一般的なプロトコールを用いるDNA配列決定によって確認した。SARS患者から得られた核酸サンプルに対する種々の増幅方法の比較表5および6に示した結果を、様々な患者サンプルから単離された核酸を増幅することを試みることによって得た。サンプルは、SARS患者から得られ、中国の上海の病院から提供された。各サンプルを、3つの異なる方法によって試験した:iアガロースゲル電気泳動を用いる従来のPCRiiリアルタイムTaqManPCR、およびiii新規に説明した方法、前増幅ステップを用いる増強されたRT-PCR。従来のPCRを、PCR前増幅と同じプロトコールを用いて実施した。リアルタイムTaqManPCRを、ERT方法と同じプロトコールを用いて実施した。感度試験の結果コロナウイルスRNAを抽出し、cDNAへ転写した。該cDNAを連続希釈し、表6に記載の3つの方法によって試験した。実施例2前増幅についてPCRを用いる増幅されたリアルタイムPCR臨床サンプルを、疑わしいか、もしくは潜在的SARS症例として診断された120人の患者から回収し、実施例1のプロトコールを用いて、従来のPCRの後のアガロースゲル電気泳動、従来のTaqManリアルタイムPCRおよび本発明の増強されたTaqManリアルタイムPCRアッセイによって分析した。ERTを用いて、SARS-CoVポリメラーゼ遺伝子の約190bp領域を、従来のPCRによりcDNAから増幅させた。アンプリコンを配列決定し、SARS-CoVの予測領域と一致することを確認した。続いて、このPCR産物を、RT-PCRプライマーを用いる増強されたリアルタイムPCRプロトコールのためのテンプレートとして使用した。このプロトコールについて、標準的なリアルタイム方法による21120、および様々な従来のPCR方法による106のみの平均と比較して、28120患者サンプルをSARS-CoV陽性と同定した。適当な陰性、陽性およびPCR阻害コントロールを、増幅方法の各段階で用いた。臨床サンプルについて標準的および増強されたリアルタイムPCRデータの選択を示した。SARS-CoV陽性およびSARS-CoV陰性サンプルの間の明確な判別は、明らかである。陽性および陰性シグナルの間の判別は、同一サンプルを標準的なリアルタイムPCRによって分析し、そこでSARS-CoV陽性および陰性増幅曲線が、お互いに密接に重なる傾向がある場合には、一層不明瞭である図7。ERTによって得られた増強された結果を用いて、陽性および陰性シグナル間を容易に区別するようにリアルタイムPCRの結果を判断することは、さらに容易である。増強されたリアルタイムPCR方法は、従来のリアルタイムPCR方法と比較して、SARS-CoV陽性サンプルのためのサイクル時間値の低下を導く。Ct値<350は、そうでないものからのSARS-CoV核酸を含有するサンプル間を明白に区別するための適当なカットオフ値である。分析感度各増幅方法の検出限界を、香港の患者から得たSARS-CoVの培養サンプルから抽出した全核酸を連続希釈することによって測定した。従来のPCR、標準的なリアルタイムPCRおよび増強されたリアルタイムPCR方法の検出限界は、各々2x1055TCID50ml、2x10105TCID50mlおよび2x10125TCID50mlに相当する。このように、増強されたリアルタイムPCR方法は、標準的なリアルタイムPCRよりも少なくとも102倍以上の高い感度であり、SARS-CoVの分子検出のために現在使用されている従来のいずれのPCR技術よりも107倍以上感度が高い。ウイルス培養によるSARS-CoVの検出は、増強されたリアルタイムPCRによって検出された328の症例のみがウイルス培養によるSARS-CoVに対して陽性であった場合、感度が最も低い方法といえる。増強されたリアルタイムPCR方法は、いくつかの症例において、その他のいかなるアッセイによっても確認されなかったSARS-CoV陽性サンプルを検出することが、わかった。このように、診断の精度を改善するどのような新規の検出方法も、臨床医に利用し得る一揃いの診断ツールへの価値ある追加である。従来のPCRおよびリアルタイムPCR単独では、少数のSARS-CoV陽性の症例を同定しただけであった。結果を、ウイルス培養によって328症例で確認した。増強されたリアルタイムPCR方法の限界は、標準的なリアルタイムPCRアッセイよりも102倍以上高く、従来のPCR方法よりも107倍以上高い。アッセイの増強された感度が、将来SARS発生中の疾患の蔓延を制御する助けとなり得る。実施例3:前増幅についてNASBAを用いる増強されたリアルタイムPCRを反応混合物に添加した。短時間の混合後、41°Cに冷却し、5分インキュベートした。該反応混合物を、短時間回転させ、次いで15時間、41°Cでインキュベーションに供した。TaqManリアルタイムPCRNASBA前増幅の第一回目のラウンド後に、次のようにRT-PCRを利用したさらなる増幅のためのNASBA産物をテンプレートとして使用したNASBA増強されたリアルタイムPCRの結果コロナウイルスNASBA産物は、表7、8および9に示したとおり、TaqManリアルタイムPCRによって、上手く増幅され、検出されることがわかった。NASBATaqManPCRの反応条件は最適化されていることを見出した。NASBATaqManおよび通常のNASBAの感度は類似しており、おおよそTCID502×1055である。表7から、その試験は、TCID50x10-8の低いレベルまで検出され得るし、NASBATaqmanPCRと同じレベルであることがわかった。しかしながら、NASBAECLの読取りは、他の陽性シグナルとは非常に異なる7407である。そのため、実際の状況では、この結果を、陽性と簡単に判断できない。しかし、NASBAリアルタイムPCRについては、Ctは716であり、他の陽性シグナルと類似している。従って、我々のNASBAリアルタイムPCRは、従来のNASBA方法よりも有利である。上記実施例に示したように、その検出キットが、種々の試験場所において従来的に使用され得ることが認識され得る。さらに、検出キットは、既存方法よりも使用するのに比較的容易であり、より短時間で検出結果を提供することができ、該検出結果は、所望であれば3時間以内で利用し得る。DNAを基にした検出システムであるので、特異性および感度は増強され、実施例に記載の検出キットがSARSコロナウイルスに特異的である、またウイルスが検出のための標的分子へ複製されるので、サンプル中のSARSコロナウイルスの濃度はもはや重要ではない。この発明の好ましい実施態様が前段に記載されているが、この発明の修飾および別の形式が可能であり、請求項に記載のとおり、かかる修飾および形式が、依然この発明の範囲内であることは当業者には明白に理解されるであろう。さらに、この発明の実施態様は、実施例または図によってのみ、制限的に説明されるものではない。"