"明細書中に記載の発明。発明の要旨本発明は、安全かつ有効な腫瘍血管標的化、抗新脈管形成および腫瘍破壊のための新規な方法および組成物を提供することによって、当該分野の前述のおよび他の要求に取り組む。この方法および組成物はまた驚くべきことに、ウイルス進入および伝播を阻害することにおいて、そしてウイルス感染および疾患を処置するために有効である。本発明は、腫瘍脈管構造における陰イオン性リン脂質の発現および役割、ならびにウイルス進入および伝播におけるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の関与に関する驚くべき発見に一部は基づく。本発明はさらにアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する、特に有利な抗体および免疫複合体、ならびにホスファチジルエタノールアミンに結合するペプチドベースの誘導体の新規なクラスを提供する。概説第一の全体的な実施形態において、本発明は、陰イオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルリノシトールPI、ホスファチジン酸PAおよびホスファチジルグリセロールPGおよびホスファチジルセリン、PSが腫瘍脈管構造の接近可能でかつ安定な標的可能マーカーであるという予期せぬ発見に基いた腫瘍血管標的化、腫瘍画像化および処置のための新規な方法を提供する。PA、PI、PGおよび他の陰イオン性リン脂質成分に対する抗体が固形腫瘍の脈管構造に特異的に局在するという予期せぬ発見から、この実施形態が得られた。本実施形態内のさらなる局面は、陰イオン性リン脂質例えば、PA、PIおよびPGおよびPSに対する裸の抗体が、エフェクター分子例えば、毒素または凝固剤に対する結合の非存在下でインビボにおいて、腫瘍血管の新脈間形成を特異的に阻害して、腫瘍脈管構造の破壊および腫瘍壊死を誘導するという予期せぬ発見から発展した。従って、本発明は、陰イオン性リン脂質に結合する、単一成分の抗体ベースの治療を用いる、血管標的化、抗新脈管形成および腫瘍処置の安全かつ有効な方法を提供する。本発明の背景にある驚くべき特徴は、腫瘍脈管内皮細胞の表面に対する陰イオン性リン脂質の移動が、細胞障害およびアポトーシス性または他の細胞死機構とは独立して、少なくともかなりの部分で生じるということである。従って、腫瘍脈管構造における陰イオン性リン脂質発現は、細胞死および破壊の結果ではなく、その要因でもないが、形態学的にインタクトな血管上皮細胞で生じる。これは、腫瘍脈管構造における陰イオン性リン脂質発現が一過性ではなく、治療介入のための標的を提供するのに十分安定であることを意味する。陰イオン性リン脂質が腫瘍脈管構造において安定に誘導されるという発見を考慮すれば、本発明はさらに、陰イオン性リン脂質に対する抗体の免疫複合体を用いた腫瘍脈管構造の画像化および破壊のための、ある範囲の新規な方法および組成物を提供する。これらの免疫複合体は、治療因子例えば、毒素および凝固因子に作動可能に結合された陰イオン性リン脂質に対する抗体を含み、そして腫瘍血管内皮細胞膜の表面への診断剤および治療剤の特異的な送達において有用である。この治療剤は、腫瘍血管内皮細胞膜との最初の接触で送達されて、標的細胞内への急速な進入、または凝固カスケードの成分であるエフェクター細胞との急速な会合のいずれかなどが可能になる。第二の全体的な実施形態において、本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する多数の好ましい抗体および関連の免疫複合体および組成物を提供するが、この抗体は、当該分野で公知の抗体を上回る利点を提供する構造および特性を有する。これらのいわゆる第二世代secondgeneration抗体または改良抗体は好ましくは、抗ガンおよび抗ウイルス、ならびに本明細書に開示される他の処置方法において用いられる。本発明によって提供されるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する新しいクラスの抗体は、当該分野において、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体に通常ともなう病原性の特性のない治療抗体を提供することによって、先行技術における種々の欠点を克服する。本発明は、部分的には、腫瘍血管内皮細胞におけるリン脂質の挙動に対する本発明者らの固有の観察から開発された新規な免疫化およびスクリーニングの技術を用い、そして疾患に伴う抗リン脂質抗体から生成された抗体を遠ざけることで、開発された。このような抗体は固有の特性および安全性の改善を有するだけでなく、競合研究において既存の抗体以上に有効である。本発明のこれらの局面の組成物および方法はまた、提供された特定のカテゴリーの抗体を用いる免疫複合体および組み合わせの使用にまで拡大される。本発明の前には、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合し、かつ本明細書に開示される新しい抗体の特性を有する抗体は、未知であった。しかし、本明細書に開示された本発明の開示を考慮して、新規な候補抗体を生成するための方法論、およびこのような抗体を試験してさらなる有用な抗体を候補物のプールから同定するための技術を有する技術がここで提供される。従って、本発明を考慮して、先行技術の抗体にともなう顕著な欠点および副作用を被ることのない、有利な特性、ならびにアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質結合プロフィールを有する、ある範囲の抗体を作製することができる。従って、このような抗体は、ガンおよびウイルス感染の血管形成の阻害および処置を含む、種々の実施形態で用いることができる本明細書に提供される新規な免疫化技術およびスクリーニング技術に加えて、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合して、かつ多数の有利な特性を有する抗体を、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4を用いて競合アッセイおよび/または機能的アッセイによって同定することができる。現在では、1B12、3B10、9D2および3G4抗体が好ましい。なぜなら、これらの抗体はリン脂質結合のために血清を要さないからである。モノクローナル抗体9D2および3G4がさらに好ましく、モノクローナル抗体3G4ATCC4545が現在最も好ましい。前述の抗体のいずれか、好ましくは3G4と競合するさらなる抗体を特定するために、好ましいアッセイは、現在のところELISAベースの競合アッセイであり、その多数を本明細書に記載しており、その作用する実施例を開示している。第三の全体的な実施形態において、本発明は、アミノリン脂質、ホスファチジルエタノールアミンPEに結合する細胞不透過性ペプチドベースの誘導体の新規なクラスを提供する。これらのPE-結合ペプチド誘導体PE-bindingpeptidederivativesは、少なくとも第一のPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを含むが、これらは、好ましくはPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを改変して、実質的に細胞不透過性または実質的に非細孔形成のPE結合構築物を形成することによって、非特異的な毒性を実質的に防止するように改変されている。実質的に細胞不透過なPE結合構築物またはデュラマイシンの生成は好ましくは、少なくとも第一の細胞不透過性基に対してPE結合ペプチドまたはデュラマイシンを結合することによって達成される。多数の例示的なデュラマイシン誘導体の合成が本明細書に記載される。この細胞不透過性基単数または複数は、低分子であっても、不活性キャリアであってもよいし、またはそれ自体が、得られた構築物へさらなる標的機能、例えば、腫瘍脈管構造への標的化を付与する標的化因子であってもよい。従って、PE結合ペプチドは、不活性キャリアに連結された唯一の標的化因子であってもよく、または各々がこの構築物に標的化機能を付与する2つの因子のうちの1つであってもよい。さらに、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、エフェクターに作動可能に連結され、その結果PE結合ペプチドまたはデュラマイシンが、標的化機能を提供し、この結合された因子は、一旦標的細胞に送達されれば、実質的な治療効果を有する。好ましい実施形態は、抗ウイルス因子、例えば、ヌクレオシドに連結されたPE結合ペプチドまたはデュラマイシンである。PEは、正常な条件下で正常細胞の表面から本質的に欠失するので、本発明の実質的に細胞不透過性のPE結合ペプチドは、疾患に関連する異常な細胞単数または複数、例えば、腫瘍脈管内皮細胞、増殖している細胞および/またはウイルス感染した細胞の表面でPEに選択的に結合するように機能する。このような異常な標的細胞に対する結合の際、PE結合構築物または誘導体がそれらの細胞におけるPE機能を阻害するかまたは遮断し、これによって、例えば、腫瘍の処置および/またはウイルス疾患において、全体的な治療の利点を生じる。ウイルスの侵入および伝播を阻害することにおける、実質的に細胞不透過性のPE結合ペプチドの首尾よい使用が本明細書において開示される。PE結合ペプチドが抗ウイルス剤、例えば、シドフォビルcidofovirに結合される実施形態では、増強されかつさらに安全な抗ウイルス処置が提供される。第四の全体的な実施形態では、本発明はさらに、ウイルスの感染および疾患の処置における使用のための、ウイルスの複製、感染および伝播を阻害するために重要な新規なクラスの組成物および方法を提供する。これらの方法は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えば、PS、PE、PI、PAおよびPG、特にPSおよびPEに結合する抗体およびペプチドが安全かつ有効な抗ウイルス因子であるという驚くべき洞察に基づく。この洞察が正しいことを証明しているだけでなく、本発明は、ウイルス伝播と戦うことにおける、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する抗体およびペプチドの予期せぬ有効な用途を示すデータを提供する。このデータは、これらの因子が、ある範囲のウイルス感染および関連の疾患の処置において広範に適用可能であることを意味する。これらの発見はさらに、新しいカテゴリーの免疫複合体、組成物、キットおよび使用の方法を包含するが、ここでは、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、詳細にはPSおよびPEに対する抗体が抗ウイルス剤に作動可能に連結される。実質的に細胞不透過性のPE結合ペプチド誘導体、例えばデュラマイシンペプチド誘導体がまた、抗ウイルス剤に連結されてもよい。これによって、これらの因子の各々が、ウイルス感染した細胞に固有に標的化された新しい抗ウイルス薬を提供する。従って、異常な新脈間形成、ガンおよびウイルス感染および疾患の処置において有効な新規で安全な治療因子の開発が当該分野における進歩である。本発明の種々の方法および組成物はまた、比類なく有効であるが、併用処置方法を提供するために他の治療および因子と組み合わせて、そして本発明の関連の組成物、薬学的組成物およびキットと組み合わせて、有利に用いることができる。従って、第五の全体的実施形態において、本発明はさらに、本明細書においてさらに詳細に例示される、驚くべきことに十分一緒に働くように選択されかつ開発されている、例えば、ガンの処置のための、特定の併用組成物、方法およびキットを提供する。第二世代の抗体探究された特性を有する抗体の生成において十分に機能するように開発された特定の方法が、本明細書の実施例IVにおいて記載されて、添付の未決のクレーム中に具体化されている。これらの方法によって、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2および3G4、特に、3G4ATCC4545によって例示されるような本発明の有利な抗体の生成が可能になった。従って、本発明は精製された抗体、その抗原結合フラグメントおよび免疫複合体を提供し、これが少なくとも1つのアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに結合して、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対する結合について、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4、好ましくは9D2または3G4ATCC4545、そして最も好ましくは3G4と効率的に競合する。本出願全体を通じて用いる場合、1つのaおよびanという用語は、その後に上限が特に言及される場合を除いて、参照される構成要素または工程の少なくとも1つの、少なくとも第一の、1つ以上の、または複数のを、意味するという意味で用いられる。従って、本明細書において用いられる場合、抗体とは、少なくとも第一の抗体を意味する。組み合わせの作動可能な限界およびパラメーターは、任意の単一の因子の量と同様に、本開示に照らして当業者には公知である。特定の局面において、抗体は、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対する結合について、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4、好ましくは9D2または3G4、そして最も好ましくは3G4ATCC4545と効率的に競合するか、または表4に示される、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4、好ましくは9D2または3G4、そして最も好ましくは3G4のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質結合プロフィールを有する;そして血清依存性ではなく、すなわち、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する結合のために血清を要しない;疾患を有する患者から由来しない、そしてインビトロにおいて凝固反応を有意に阻害せず、インビボで顕著な血栓を生じるか、またはループス性抗凝固因子活性を有する。好ましくは、このような抗体はまた、文献の抗体例えばIgGに比較して、コントロールの研究における有利な機能的特性の構造的特性、または範囲もしくは程度において、改善を実証しており、高い親和性を有するか、または活性化された内皮細胞に対する結合の増強、内皮細胞増殖もしくは新脈管形成の阻害の増大、腫瘍血管局在化の改善、抗ガンおよび/もしくは抗ウイルス効果を示す。従って、本発明の特定の局面は、前述の他の開示および固有の有利な特性を有する抗体の、本発明者らの独自の驚くべき生成に基づく。ここで、好ましい抗体のパネルおよび多数の特定の好ましい抗体が提供されており、本発明はさらに規定のエピトープ特異性のあるクラスの抗体を包含する。ここでこのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合について、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4、好ましくは9D2または3G4、そして最も好ましくは3G4ATCC4545と効率的に競合し、その結果それらは、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4、好ましくは9D2または3G4、そして最も好ましくは3G4ATCC4545と本質的に同じエピトープに結合する。特許請求される本発明は、本明細書および容易に利用可能な技術的参考文献、ノウハウ、および出発材料に従って可能になる。それにもかかわらず、本出願人、BoardofRegents,TheUniversityofTexasSystemのために、3G4モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株のサンプルを、AmericanTypeCultureCollectionATCC,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,U.S.A.に寄託のために提出した。このサンプルは、AvidBioservices,Inc.,14272FranklinAvenue,Tustin,CA92780,U.S.A.特許権者の子会社、PeregrinePharmaceuticals,Inc.,によって、2002年7月08日の週に提出され、2002年7月10日および7月12日に受領されて、生存可能であることが示され、2002年7月30日にATCC受託番号PTA4545が与えられた。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項およびその規則ブタペスト条約のもとで行なわれた。ハイブリドーマは、付属の特許請求の範囲を有する米国特許の刊行物に基づきブタペスト条約の条件のもとでATCCによって入手可能になる。寄託されたハイブリドーマの利用可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限のもとで認可された権利に反して、本発明の実施のための許諾として解釈されるべきではない。抗体のパネル、本明細書に開示され、当該分野で公知の好ましい抗体および技術の観点から、当業者は、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合して、有利な特性を有する、新しいクラスの抗体が提供される。これらの抗体は、モノクローナル抗体1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、9D2または3G4に類似しているかまたは、それらベースである。好ましくは、本発明の抗体は、9D2ベースか、または9D2様の抗体であり、最も好ましくは、本発明の抗体は、3G4ベースか、または3G4様の抗体である。類似している抗体の以下の説明は、簡便のために3G4抗体ATCC4545に関して提供されるが、1B9、1B12、3B10、2G7、7C5、および9D2抗体の各々に適用可能であるとして参考として本明細書中に詳細に援用される。3G4様抗体は、モノクローナル抗体3G4ATCC4545と実質的に同じエピトープに結合するか、またはモノクローナル抗体3G4ATCC4545と本質的に同じエピトープで、少なくとも第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントである。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体3G4ATCC4545と同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体3G4ATCC4545とほぼ、実質的に、もしくは本質的に同じ、または同じエピトープに結合するという用語は、ある抗体がモノクローナル抗体3G4ATCC4545と交差反応するということを意味する。交差反応性の抗体とは、モノクローナル抗体3G4ATCC4545と実質的にもしくは本質的に同じ、あるいは同じエピトープ、エピトープ部位または共通のアミノリン脂質もしくは陰イオン性リン脂質のエピトープを認識するか、それに結合するか、またはそれに免疫特異性を有する抗体であり、その結果、少なくとも1つのアミノリン脂質もしくは陰イオン性リン脂質、2つ以上のアミノリン脂質もしくは陰イオン性リン脂質、または、モノクローナル抗体3G4ATCC4545が結合する全てのアミノリン脂質もしくは陰イオン性リン脂質へ結合し得るモノクローナル抗体3G4ATCC4545と効率的に競合し得る。3G4-交差反応性抗体は、簡潔に3G4様抗体および3G4ベースの抗体と名付けられ、このような用語は、本明細書中で、交換可能に用いられて、組成物、用途および方法に適用される。モノクローナル抗体3G4ATCC4545とほぼ、実質的に、本質的に同じかまたは同じエピトープに結合する1つ以上の抗体の同定は、いまや直接的な技術的問題であって、有利な特性を有する3G4が提供されている。交差反応性抗体の同定は参照抗体に対する比較で決定されるので、参照抗体3G4および試験抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、モノクローナル抗体3G4と同じかまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するために必要な方法ではないことが理解される。しかし、3G4によって結合されるエピトープ上のかなりの情報が、本明細書に含まれており、エピトープマッピングをさらに行なうことができる。交差反応性抗体の同定は、抗体競合を評価し得る種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか1つを用いて容易に決定できる。このようなアッセイの全てが当該分野で慣用的であり、本明細書においてさらに詳細に記載される。米国特許第6,342,219号および同第6,342,221号の各々が、所定の抗体、例えば3G4と同じであるかまたは実質的にもしくは本質的に同じエピトープに結合するか、あるいは抗原への結合について所定の抗体と効率的に競合する抗体を作製する方法に関与する本発明の教示をさらに補足するという目的で参考として本明細書に詳細に援用される。例えば、試験されるべき試験抗体が異なる起源の動物から得られるか、または異なるアイソタイプの動物である場合でさえ、コントロール3G4および試験抗体が混合されるかまたは予め吸着される、そしてアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質抗原組成物、好ましくはPSに適用される、簡易な競合アッセイが使用され得る。アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質抗原組成物とは、本明細書に記載される、例えば表4に記載されるような3G4結合抗原を含む任意の組成物を意味する。従って、ELISAおよびウエスタンブロッティングベースのプロトコールは、このような簡易な競合研究における使用に適切である。特定の実施形態では、当業者は、抗原組成物への添加の前に、一定時間、コントロール抗体3G4と種々の量の試験抗体とを事前混合する例えば、1:10または1:100。他の実施形態では、コントロールおよび種々の量の試験抗体は、抗原組成物への曝露の間に、単に混合されてもよい。任意の事象では、種またはアイソタイプの二次抗体を用いることによって、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体の存在によってその結合が減少される、結合したコントロール抗体だけを検出することができる。コントロール抗体と任意の試験抗体種またはアイソタイプにかかわらずとの間の抗体競合研究を行なうことにおいて、例えば、引き続く同定を可能にするビオチンまたは酵素または、さらに、放射性標識のような検出可能な標識を用いてコントロール3G4を最初に標識してもよい。これらの場合、当業者は、標識されたコントロール抗体を試験されるべき試験抗体とともに種々の比例えば、1:10、1:100または1:1000で事前混合するかまたはインキュベートし、次いで必要に応じて、適切な期間後に標識されたコントロール抗体の反応性をアッセイして、これを、競合する可能性のある試験抗体がインキュベーション中に含まれないコントロール値と比較する。アッセイはここでも、抗体ハイブリダイゼーションに基づくある範囲の免疫学的アッセイのうちの任意の1つであってもよい。そしてコントロール抗体は、それらの標識を検出する手段によって例えば、ビオチン化抗体の場合には、ストレプトアビジンを用いて、または酵素標識と組み合わせた色素生産性基質例えば、ペルオキシダーゼ酵素と組み合わせた3,3’5,5’-テトラメチルベンジジンTMB基質を用いることによって、または放射性標識を簡易に検出することによって検出される。コントロール抗体と同じエピトープに結合する抗体は、結合について効率的に競合し得、従って、結合標識の低下で証明されるとおり、コントロール抗体結合を有意に低下させる。完全に無関係な抗体が非存在下でこの標識されたコントロール抗体の反応性は、コントロールの高値である。コントロールの低値は、競合が生じて標識された抗体の結合が減少する場合、標識された3G4抗体と、正確に同じタイプの未標識の抗体3G4とをインキュベートすることによって得られる。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識された抗体反応性の有意な低下は、同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち、標識された3G4抗体と交差反応する試験抗体の指標である。有意な低下は、再現性reproducibleであり、すなわち、結合の低下が一貫して観察される。有意な低下significantreductionとは、本出願に関しては、約1:10~約1:1000の間の任意の比で、少なくとも約70、約75または約80の再現性の低下ELISAにおける、1つ以上のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対する3G4の結合においてとして規定される。さらによりストリンジェントな交差ブロッキング活性を有する抗体は、約1:10~約1:1000の間の任意の比で、少なくとも約82、約85、約88、約90、約92または約95程度の再現性の低下ELISAまたは他の適切なアッセイにおける、1つ以上のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対する3G4の結合においてを示す。1つ以上のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する3G4結合における約97または約96程度の再現性の低下を示すような完全またはほぼ完全な交差ブロッキングは、決して本発明を行なうために必要ではないが、特に除外はされない。第二世代の抗体全体に関しては、この第二世代の抗体がホスファチジルセリンへの結合について効率的に競合する場合、少なくともホスファチジルセリンに結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体がホスファチジン酸への結合について効率的に競合する場合、少なくともホスファチジン酸に結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体がホスファチジルイノシトールへの結合について効率的に競合する場合、少なくともホスファチジルイノシトールに結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体がホスファチジルグリセロールへの結合について効率的に競合する場合、少なくともホスファチジルグリセロールに結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体がカルジオリピンへの結合について効率的に競合する場合、少なくともカルジオリピンに結合する抗体を参照して;そして必要に応じて、この第二世代の抗体がホスファチジルエタニールアミンへの結合について効率的に競合する場合、少なくともホスファチジルエタノールアミンに結合する抗体を参照して;競合が測定され得る。特定の実施形態において、第二世代の抗体は、この第二世代の抗体が第一および第二のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する結合について効率的に競合する場合、少なくとも第一および第二のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体が第一、第二および第三のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する結合について効率的に競合する場合、少なくとも第一、第二および第三のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体を参照して;この第二世代の抗体が第一、第二、第三および第四のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する結合について効率的に競合する場合、少なくとも第一、第二、第三および第四のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体を参照して;あるいはこの第二世代の抗体が第一、第二、第三、第四および第五のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する結合について効率的に競合する場合、少なくとも第一、第二、第三、第四および第五のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体を参照して;測定され得る。さらなる実施形態において、第二世代の抗体は、少なくとも1つのアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する顕著な結合を示し、コリン含有の中性のリン脂質に対する検出可能な結合を示さず、そして本発明のモノクローナル抗体、好ましくは3G4ATCC4545と効率的に競合する抗体として特徴付けられ得る。特定の実施形態では、この抗体は、陰イオン性リン脂質、PS、PA、PI、PGおよびCLに対する有意な結合を示し;PS=PA=PI=PG>CL>>PEというリン脂質結合プロフィールを有し、ここで、>はこのようなリン脂質に対する結合における少なくとも2倍の相違を示し、そして>>は、このようなリン脂質に対する結合における少なくとも10倍の相違を示し;ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンに対する検出可能な結合を示さず;そして各々の陰イオン性リン脂質PS、PA、PI、PGおよびCLに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCC4545と効率的に競合する。好ましくは、第二世代の抗体は、前述の特徴を有し、また活性化された細胞、分裂中の細胞、傷害された細胞、アポトーシス性の細胞、またはウイルス感染した細胞の細胞表面に存在する少なくとも1つの陰イオン性リン脂質に対する顕著な結合を示す。さらに好ましくは、この抗体はまた、静止期の細胞を有意に変更することなく分裂している内皮細胞の増殖を有意に阻害して、さらに好ましくは、有意な狼瘡性抗凝固因子活性を有さない。機能的に、第二世代の抗体は好ましくは、新脈管形成を抑制し、抗腫瘍効果および抗ウイルス効果を好ましくはインビボで有し、そしてさらに好ましくは、その際に、動物または患者において重大な血栓合併症を生じることがない。従って、好ましい抗体は、抗新脈管形成剤、抗腫瘍血管剤、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤の組み合わせた特性を保有する。本発明は、ハイブリドーマATCC4545によって生成されたモノクローナル抗体3G4、またはこのようなモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントによって例示される。モノクローナル抗体3G4ATCC4545と実質的に同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、本発明の別の局面である。本発明に従う組成物、免疫複合体、医薬、組み合わせ、反応混液、キット、第一および第二の医薬の用途、ならびにすべての方法の以下の説明において、抗体および免疫複合体、またはその抗原結合領域という用語は、他に特定して言及するか、または科学用語から明らかにならない限り、ある範囲の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質の抗体、ならびに特定の3G4交差反応性抗体をいう。抗体および免疫グロブリンという用語は、本明細書において用いる場合、広義には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む、任意の免疫学的結合因子をいう。重鎖の定常ドメインのタイプに依存して、抗体は5つの主なクラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのうちの1つが割り当てられる。これらのうちのいくつかはさらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと命名される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は周知である。概して、本発明において抗原結合領域以外の抗体が用いられる場合、IgGおよび/またはIgMが好ましい。なぜなら、それらは生理学的な状況で最も一般的な抗体であるからであり、それらは実験設定において最も容易に作製されるからである。哺乳動物抗体の軽鎖lightchainは、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、2つの明白に別個のタイプ:カッパκおよびラムダλのうちの1つに割り当てられる。本発明の抗体におけるκまたはλ軽鎖の使用に対して本質的に優先性はない。モノクローナル抗体MAbまたはその誘導体の使用はかなり好ましい。MAbは、特定の利点、例えば、再現性および大規模生産性を有することが認識されており、これによって臨床での処置に適切になる。このように、本発明はマウス、ヒト、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにはカエルまたはニワトリにさえ起源するモノクローナル抗体を提供する。マウス、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体が一般に好ましい。当業者に理解されるように、抗体という言葉によって包含される免疫学的結合試薬は、全ての種に由来する全ての抗体、およびその抗原結合フラグメントまで伸展し、これには、二量体抗体、三量体抗体および多量体抗体;二価特異的抗体;キメラ抗体;ヒトおよびヒト化抗体;組み換え抗体、操作された抗体およびラクダ化camelizedcamelised抗体、ならびにそれらのフラグメントが挙げられる。従って、抗体という用語は抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をいうために用いられる。そしてこの用語は、抗体フラグメント例えば、Fab’、Fab、Fab’2、単一ドメイン抗体DABs、Fv、scFv単鎖Fv、直鎖状抗体、二価抗体、ラクダ化抗体などを包含する。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製して用いるための技術は、当該分野で周知である詳細には、本明細書中に参考として援用される、Kabatら、1991を参照のこと。二価抗体は詳細には、さらにEP404,097およびWO93/11161に記載され、その各々は本明細書において参考として詳細に援用されている;一方直鎖状抗体はさらに、参考として本明細書中に詳細に援用される、Zepataら1995に記載される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも約75、より好ましくは少なくとも約80、さらに好ましくは、少なくとも約85、さらに好ましくは、少なくとも約90、そして最も好ましくは少なくとも約95程度のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む少なくとも第一の可変領域を含む少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を含む;ここでこの抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体は、3G4抗体によって例示されるように、少なくとも実質的に、本発明の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の生物学的特性を維持する。本発明のこれらおよび他の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の配列に対する同一性または相同性は、本明細書中では、必要であれば、最大の配列同一性パーセントを達成するように配列および導入ギャップを整列させた後に、配列番号2もしくは配列番号4の配列に対して、または本発明の別の抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体の配列に対して同一である、候補配列における、アミノ酸残基の割合として規定される。配列比較のために用いられる抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の実質的に同じかまたはさらに有効な生物学的特性の維持は特に重要である。このような比較は、例えば、本明細書に詳細に記載される種々のアッセイのうちの1つ以上を用いて、容易に行なわれる。特定の好ましい実施形態において、本発明の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体は、配列番号1または配列番号3の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列領域を含む可変領域によって例示されるような、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第一の可変領域を含む。このような配列は、重鎖および軽鎖の可変領域のCDR1-3相補性決定領域を含む3G4ScFvのVhおよびVκの配列である。他の好ましい実施形態では、オリジナルの抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体、例えば3G4ATCC4545に比較して、強化されるかまたは優れた特性を有する第二世代の抗体が提供される。特定の実施形態では、使用される抗体は、ヒト化された部分的ヒト抗体またはヒト抗体である。ヒト化された抗体は一般にはマウス、ラットまたは他の非ヒト種由来のキメラモノクローナル抗体であって、ヒトの定常領域および/または可変領域のドメイン部分的ヒトキメラ抗体を保有する。本発明における使用のための種々のヒト化モノクローナル抗体は、キメラ抗体であり、ここではマウス、ラットまたは他の非ヒトモノクローナル抗体の少なくとも第一の抗原結合領域、または相補性決定領域CDRが、ヒト抗体定常領域またはフレームワーク上に作動可能に結合されるかまたは接合される。本明細書における使用のためのヒト化モノクローナル抗体はまた、1つ以上の選択されたアミノ酸がヒト抗体においてさらに一般的に観察されるアミノ酸について変化されている非ヒト種由来のモノクローナル抗体であってもよい。これは慣用的な組み換え技術、詳細には部位特異的突然変異形成の使用によって容易に達成できる。ヒト化された抗体ではなく、ヒト抗体全体をまた調製して、本発明において用いてもよい。このようなヒト抗体は、抗原提示細胞および抗体産生細胞を含むヒト被験体から混合された末梢血リンパ球の集団を簡単に得ることによって、そしてこの細胞集団を、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプルと混合することによってインビトロで刺激することによって、健常被験体から得ることができる。ヒト抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞は、一旦得られれば、ハイブリドーマおよび/または組み換え抗体産生において用いられる。ヒトモノクローナル抗体産生のためのさらなる技術は、ヒト抗体ライブラリーを含むトランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスを、免疫学的に有効な量のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプルを用いて免疫する工程を包含する。これはまた、ハイブリドーマおよび/または組み換え抗体産生におけるさらなる操作のためのヒト抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞を生成するが、これは末梢血球ではなく脾臓細胞がトランスジェニック動物またはマウスから容易に得られ得るという利点を伴う。本発明による抗体は、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたはそれと競合する抗体を選択することによって容易に調製され得る。適切な調製プロセスおよび方法は:a候補の抗体産生細胞を調製する工程;およびbこの候補の抗体産生細胞から、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたはそれと競合する抗体を選択する工程、を包含する。適切な抗体産生細胞を調製して、それから抗体を獲得する1つのプロセスは、所定の患者においてインサイチュで行なわれてもよい。すなわち、要するに免疫原性のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質のサンプルの免疫学的に有効な量を患者に提供することで、適切な抗体産生を生じる。従って、この抗体は、なお抗体産生細胞から得られるが、それは宿主から単離されて引き続いて患者に提供されなければならないわけではなく、腫瘍脈管構造に自然に局在することが可能であって、その生物学的な抗腫瘍効果を発揮することが可能である。しかし、このような実施形態は、現在好ましくない。インビトロでアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を用いて末梢血リンパ球を刺激することによって、適切な抗体産生細胞をまた得ることが可能であり、抗体は引き続き単離され、そして/または精製されることが可能である。他の方法は、少なくとも第一の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質成分を含む免疫組成物を動物に投与する工程、および、この免疫された動物からモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたは競合する抗体を選択する工程とを包含する。これらの方法は一般に:a免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含有する組成物の少なくとも1回の用量および必要に応じて2回以上の用量を動物に投与することによってこの動物を免疫する工程と;bこの免疫された動物から適切な抗体産生細胞、例えば、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するか、または、競合する抗体を産生する抗体産生細胞を獲得する工程、を包含する。本明細書において用いる場合、好ましい免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含む組成物とは、活性化された内皮細胞を含む組成物である。活性化された内皮細胞は好ましくは、細胞生存度を実質的に維持して、内皮細胞の表面で少なくとも1つの陰イオン性リン脂質の発現を刺激するのに有効な時間、内皮細胞を活性化して、そして/または腫瘍環境を模倣する、少なくとも第一の条件下に、または少なくとも第一の因子と接触させて内皮細胞をおくことによって調製される。活性化された内皮細胞を調製するのに有効な例示的な条件は、低酸素性および/または酸性環境である。活性化された内皮細胞を調製するのに有効な要因の例は、有効な濃度のH2O2、トロンビン、炎症性サイトカイン単数または複数例えば、IL-1α、IL-1β、インターフェロンまたはTNFαであって、そして一般的には腫瘍環境を模倣する条件および/または要因の組み合わせである。免疫プロセスの性質、または免疫された動物のタイプにかかわらず、適切な抗体産生細胞が免疫された動物から得られ、そして好ましくはヒトの手によってさらに操作される。免疫された動物とは、本明細書において用いる場合、他に特に言及しない限り、非ヒト動物である。任意の抗体産生細胞が用いられてもよいが、最も好ましくは、抗体産生細胞の供給源として脾臓細胞が得られる。抗体産生細胞は:a適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞と不死細胞とを融合して、本発明に従うモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを調製する工程;およびbハイブリドーマから本発明に従う適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を獲得する工程、を包含する調製的プロセスにおいて用いられ得る。適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を産生する細胞、ハイブリドーマおよび抗体とは、抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体、好ましくはモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたは競合する抗体を産生するか、またはそのような抗体として存在するものである。従って、ハイブリドーマベースのモノクローナル抗体の調製方法は:a免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含む組成物、好ましくは活性化された内皮細胞を含む組成物の少なくとも1回の用量および必要に応じて2回以上の用量を動物に投与することによって動物を免疫する工程;bこの免疫された動物からモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの収集物を調製する工程;c本発明による少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたは競合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を産生する、少なくとも第一のハイブリドーマをこの収集物から選択する工程;およびd少なくとも第一の抗体産生ハイブリドーマを培養して、少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を提供する工程と;そして好ましくはeこの培養された少なくとも第一のハイブリドーマから少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を獲得する工程、を含む方法を包含する。モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を同定する工程において、選択工程は:aアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSサンプルと、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545および候補抗体の有効量とを接触させる工程;およびbこの候補抗体が、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSサンプルに対する3G4抗体の結合を実質的に低下させる能力を決定する工程であって;ここでこの候補抗体のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSサンプルに対する3G4抗体の結合を実質的に低下させる能力が、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の指標である、工程、を包含し得る。この選択工程はさらに:a第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSと、有効な結合量のモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545とを接触させる工程、およびアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を決定する工程;b第二のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質サンプル、好ましくはPSと、有効な結合量のモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545とを有効な競合量の候補抗体と組み合わせて接触させる工程、およびこの候補抗体の存在下で、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を決定する工程;およびcアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSに対して結合する3G4の量を、好ましくは少なくとも約80まで低下させる候補抗体を選択する工程によって、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を同定する工程、を包含してもよい。本明細書において用いられる全ての選択基準は好ましくは、タンパク質と結合体化されているアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する、患者の病理学的抗体を模倣し得る抗体を産生することに伴う欠点を回避するために、血清の非存在下で行なう。非ヒト動物が免疫に用いられる場合、このようなハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体は、多くの場合、非ヒト構成を有し得る。このような抗体は、当業者に公知であり本明細書中にさらに開示されるように、必要に応じてヒト化プロセス、移植または変異に供されてもよい。あるいは、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを含むトランスジェニック動物例えばマウスを用いてもよい。従って、このような動物の免疫化は直接、適切なヒト抗体の産生を生じる。適切な抗体産生細胞の産生後に、最も好ましいハイブリドーマを、これがヒト抗体または非ヒト抗体のいずれを産生しようと、モノクローナル抗体コード核酸をクローニングして、組み換えモノクローナル抗体を調製してもよい。任意の組み換えクローニング技術を利用してもよいが、これには、抗体コード核酸配列の合成をプライムするPCRTMの使用が包含される。従って、さらに適切なモノクローナル抗体調製方法としては、以下:a少なくとも第一の適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体をコードする核酸分子またはセグメントを、適切な抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体産生細胞、好ましくはハイブリドーマから得る工程;およびb組み換え宿主細胞において核酸分子またはセグメントを発現して、本発明による組み換え抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質モノクローナル抗体を得る工程のように、抗体産生細胞を用いる工程を含む方法が挙げられる。しかし、組み換えモノクローナル抗体の調製に理想的に適切である、他の強力な組み換え技術が利用可能である。このような組み換え技術としては、ファージミドライブラリーベースのモノクローナル抗体調製方法が挙げられ、これは:a免疫学的に有効な量の免疫原性アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質を含む組成物、好ましくは活性化された内皮細胞を含む組成物の少なくとも1つの用量および必要に応じて2つ以上の用量を動物に投与する工程によって動物を免疫する工程;bこの免疫された動物の抗体産生細胞から、好ましくは脾臓から単離されたRNAを発現する組合せの免疫グロブリンファージミドライブラリーを調製する工程;c少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に交差反応するかまたは競合する抗体を発現する少なくとも第一のクローンをこのファージミドライブラリーから選択する工程;d抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体をコードする核酸を、少なくとも第一の選択されたクローンから獲得して、組み換え宿主細胞においてこの核酸を発現して、少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を提供する工程;および、好ましくはe少なくとも第一の選択されたクローンから得られた核酸によって発現される少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体を獲得する工程、を包含する。ここでも、このようなファージミドライブラリーベースの技術において、ヒト抗体遺伝子ライブラリーを保有するトランスジェニック動物を使用して、これによって組み換えヒトモノクローナル抗体を産生してもよい。第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体核酸セグメントの調製の様式にかかわらず、さらなる適切な抗体核酸セグメントは、標準的な分子生物学的技術によって容易に調製され得る。任意の改変体、変異体または第二世代の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体核酸セグメントが本発明における使用に適切であることを確認するために、核酸セグメントを試験して本発明による抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の発現を確認する。好ましくは、この改変体、変異体または第二世代の核酸セグメントをまた、標準的な、より好ましくは標準的なストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを確認するために試験する。例示的に適切なハイブリダイゼーション条件としては、約7のドデシル硫酸ナトリウムSDS、約0.5MNaPO4、約1mMEDTAにおける約50°Cでのハイブリダイゼーション;および約1SDSを用いた約42°Cでの洗浄が挙げられる。種々の組み換えモノクローナル抗体が、ヒト起源であろうと非ヒト起源であろうと、容易に調製できるので、本発明の任意の処置方法は、患者において少なくとも第一の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の生物学的に有効な量を発現する少なくとも第一の核酸セグメントを動物または患者に提供することによって実行できる。抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質、3G4様または3G4ベースの抗体を発現する核酸セグメントは、一般に少なくとも発現構築物の形態であり、そしてウイルス内または組み換え宿主細胞内に含まれる発現構築物の形態であってもよい。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは、一般に、ウイルスベクターであり、例えば、組換えレトロウイルス、単純ヘルペスウイルスHSV、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスAAV、サイトメガロウイルスCMVなどに含まれる。細胞不透過性デュラマイシン誘導体本発明はさらに、実質的に細胞不透過性のPE結合構築物を形成するように改変されている少なくとも第一のPE結合ペプチドを含む、実質的に細胞不透過性のホスファチジルエタノールアミンPE結合ペプチド構築物および誘導体を提供する。好ましくは、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に、生物学的にまたは治療上有効な量の少なくとも第一の実質的に細胞不透過性のPE結合構築物を含む薬学的組成物を提供するが、これは、実質的に細胞不透過性のPE結合構築物を形成するように改変されている少なくとも第一のPE結合ペプチドを含む。従って、実質的に細胞不透過性のPE結合構築物は、薬学的、薬理学的および治療的、すなわち、医学用途のため、好ましくはウイルス感染を処置するのにおける使用のための構築物である。特定の実施形態では、本発明はビオチンに連結されたシンナマイシン以外に実質的に細胞不透過性のPE結合構築物を提供する。最も好ましくは、本発明の実質的に細胞不透過性のPE結合ペプチド誘導体は、実質的に細胞不透過性のデュラマイシンペプチド誘導体およびその薬学的組成物である。デュラマインペプチドは代表的に、少なくとも第一の細胞不透過性基に対する作動可能な結合によって、実質的に細胞不透過性のデュラマイシン誘導体を形成するように改変される。細胞不透過性基の作動可能な結合は、配列番号9におけるアミノ酸位置2のリジン残基を介してもよい。細胞不透過性基は、生理学的なpHで正または負の電荷を有してもよいし、または極性であってもよい。例示的な基としては、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、カルボキシル基、フェノール基、4級アンモニウムイオン、およびアミノ基が挙げられる。ビオチンに連結されたデュラマイシンを含む薬学的組成物は、本発明内の特定の例である。実質的に細胞不透過性のデュラマイシンはまた、糖、オリゴ糖、または多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはポリアルコール基に作動可能に連結されてもよい。特定の細胞不透過性デュラマイシンは、不活性なキャリアタンパク質例えば、ニュートラビジン、ストレプトアビジン、アルブミンまたは不活性な免疫グロブリンキャリアタンパク質に作動可能に連結されたものであり、その中でもヒトIgGHIgGに結合されたデュラマイシンが特に好ましい。細胞不透過性デュラマイシンの他の例は、標的因子に連結されたもの、好ましくは腫瘍細胞、腫瘍脈管構造もしくは腫瘍間質に、またはウイルスに感染された細胞に結合したものである。腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍間質の成分に結合する標的化因子の例は、その各々が本明細書において参考として明確に援用される、米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号および同第6,036,955号に教示される。腫瘍処置:本発明はさらに、少なくとも第一の精製された抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体であって、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープ、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体に結合するものを含む組成物を提供する。このような組成物は好ましくは、薬学的に受容可能な組成物であって、これには非経口投与のため、例えば静脈内投与のため、またはリポソームとしてもしくはエアロゾルとしての投与のために処方された組成物が挙げられる。本発明は、3G4交差反応性抗体、3G4様抗体、または3G4に基づく抗体を含む抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、ならびに実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の多数の方法および用途を提供する。全ての方法に関与して、用語1つのaおよびanは、特に言及される場合を除いて、言及される方法における工程のうち少なくとも1つのatleastone、少なくとも第一のatleastafirst、1つ以上のoneormoreまたは複数のapluralityを意味するために用いられる。これは特に、処置される方法における投与工程に関連する。したがって、本発明は異なる用量が使用され得るだけでなく、異なる回数の用量、例えば、複数回の注射または吸入に及ぶ、注射または吸入が用いられてもよい。併用療法が用いられ、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または免疫結合体もしくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与の前後かまたは間に投与されてもよい。重要な生物学的意味を有する種々の有用なインビトロ方法および用途が提供される。最初に提供されるのは、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSまたはPEを結合する方法およびその結合における用途であって、これは一般に、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくはPSまたはPEを含む組成物と、少なくとも第一の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体とを、あるいは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体とを、効率的に接触させる工程を包含する。この接触させる工程は、結合された複合体の形成を可能にするのに有効な条件下であり、そしてそのように形成された任意の複合体が検出される。この検出方法および用途は、生物学的サンプルと関連して、例えば、アポトーシス、腫瘍およびウイルスに感染した細胞の診断において用いられてもよく、そしてそれに基づく診断キットがまた提供される。好ましくは本発明の抗体、抗原結合フラグメントおよび免疫結合体を使用する増殖阻害方法および用途が提供される。内皮細胞増殖および/または遊走を阻害する方法は一般に、内皮細胞の集団を含む細胞または組織の集団と、生物学的に有効な量の少なくとも第一の抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む組成物とを、内皮細胞増殖および/または遊走を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。前述の方法および用途は、インビトロおよびインビボで行なうことができる。後者の場合、組織または細胞は、動物内部に位置し、そして抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体がこの動物に投与される。両方の場合とも、この方法および用途は、血管形成を阻害するための方法および用途となり、これは潜在的に血管形成性の血管を含む組織かまたはその血管の集団と、生物学的に有効な量の少なくとも第一の抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む血管新生阻害組成物とを、血管形成を阻害するのに有効な条件下で接触させる工程を包含する。潜在的に血管形成性の血管の集団をエキソビボで維持する場合、本発明は薬物開発プログラムにおいて有用性を有する。インビトロのスクリーニングアッセイにおいて確実な陽性および陰性のコントロールを用いることは、血管形成を阻害するかまたは促進する薬物の開発において、そして血管形成性のプロセスに対するさらなる情報の描写において、第一の工程として有用である。潜在的に血管形成性の血管の集団が動物または患者内に位置する場合、血管新生阻害組成物を、治療の形態でこの動物に投与する。所望されない、不適切な、異常な、過剰なそして/または病理的な血管形成によって特徴付けられる任意の疾患または障害を有するかまたは発症しているリスクのある動物および患者について、血管新生阻害および抗血管性治療が提供される。広範な疾患および障害において異常な血管形成が生じるので、所定の血管新生阻害治療は、任意の受け入れ可能なモデルシステムで有効であることが一旦示されれば、血管形成に関連する疾患および障害の範囲全体を処置するために用いられ得ることが当業者には十分理解される。本発明の方法および用途は、任意の形態の血管新生した腫瘍;加齢性黄斑変性症を含む黄斑変性症;関節リウマチを含む関節炎;アテローム性動脈硬化症およびアテローム斑;糖尿病性網膜症および他の網膜症;グレーブス病を含む甲状腺過形成;血管腫;血管新生緑内障;および乾癬を有するかまたは発症するリスクを有する動物および患者における使用を特に意図する。本発明の方法および用途はさらに、動静脈奇形AVM、髄膜腫および、血管形成術後の再狭窄を含む血管再狭窄を有するかまたは発症するリスクのある動物および患者の処置を意図する。治療方法および用途の他の意図される標的は、血管線維症、皮膚炎、子宮内膜症、血友病性関節、肥厚性瘢痕、炎症性疾患および障害、化膿性肉芽腫、強皮症、滑膜炎、トラコーマおよび血管接着を有するかまたは発症するリスクを有する動物および患者である。参考として本明細書に詳細に援用される、米国特許第5,712,291号に開示されるとおり、前述の処置群の各々は、本発明によって処置されるべき状態の決して網羅的なタイプではない。米国特許第5,712,291号は、特定の特異的な目的のために参考として本明細書に援用される。この目的としては、血管新生阻害治療によって有効に処置され得る多数の他の状態を同定する目的;一旦血管形成阻害化合物の規定のカテゴリーが開示され請求されればこの場合、抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、全ての血管新生性疾患の処置が統合された概念に相当することを示す目的;ならびに全ての血管形成性疾患の処置が単一のモデル系のみに由来するデータによって可能になることを示す目的が挙げられる。血管形成性および血管の疾患の処置に加えて、本発明の重要なかつ統合された局面は、ガンを有するかまたはガンを発症するリスクがある動物および患者を処置するための組成物および方法である。全てのガン処置方法および用途は、少なくとも第一の精製された抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与または使用を包含する。このような構築物はガンを有する動物または患者に、治療上有効な量で投与される。本発明のガン処置方法は、抗体を用いる方法でさえ、抗血管効果および/または血管新生阻害の効果を発揮することのみには依存しない。本発明のガン処置方法および用途は、血管化した固体腫瘍、転移性腫瘍または原発性腫瘍からの転移を有するかそれらを発症するリスクのある動物および患者を含む、全ての形態のガンを処置するのに適切である。未結合体化のまたは裸の抗体nakedantibodiesおよびそのフラグメント、ならびに抗体またはその抗原結合フラグメントが治療剤に作動可能に連結されている免疫結合体の両方とも、本発明の抗ガンの局面において用いることができる。従って、他に特に言及するか、または科学的用語で明確にしない限り、抗体およびそのフラグメントという用語は、本明細書において用いる場合、別の因子、特に、治療剤または診断剤に結合されない、未結合体化または裸の抗体またはフラグメントを意味する。これらの定義は、抗体の改変、例えば、抗体または他のエフェクターと抗体の組み合わせの生物学的半減期、親和性、結合力または他の特性を改善するための改変などを除外しない。ガンを処置するための免疫結合体に基づく方法において、抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗ガン効果を直接または間接的に有し得る任意の1つ以上のある範囲の生物学的、治療的および/またはいわゆる第二の抗ガン剤抗アミノリン脂質抗体自体または抗陰イオン性リン脂質抗体自体、第一の血管新生阻害因子であるに作動可能に連結される。従って、本発明はさらに、腫瘍に対して選択された治療剤または診断剤を送達するための方法、およびその送達における使用を提供する。このような実施形態は、診断または治療の因子が抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体に作動可能に連結される少なくとも第一の免疫結合体を含む生物学的有効量の組成物を、腫瘍を有する動物または患者に投与する工程を包含する。従って、本発明の組成物、ならびに方法および使用は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体であって、必要に応じて少なくとも第一の生物学的、治療的または診断的な因子に作動可能に連結される抗体を含む組成物を包含する。この抗体は、好ましくは、放射性療法剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、抗チューブリン薬、抗細胞性、細胞傷害性因子またはサイトカインにまたは以下に考察されるような抗ウイルス薬に連結される。結合のための特定の好ましい因子は、例えば、複合体を化学療法のための代理のマーカーとして用いることを可能にする、インビボの診断剤である。抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4ベースの治療複合体における使用のために好ましい因子は、その抗体および/または特定の腫瘍タイプまたは患者について選択された抗体の効果を補完または増強する因子である。抗体の効果を補完または増強する治療剤としては、放射性因子、血管浸透性増強因子、特定のサイトカイン、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、および抗チューブリン薬で、このうち任意の1つ以上を一緒に用いることができる。現在好ましい因子は、細胞毒性因子、ゲロニン;TNFα、IL-12およびLEC肝臓発現ケモカインのようなサイトカイン;表Eに示されるような血管新生阻害効果を有する抗ガン剤;表Fにおけるような、アポトーシスを誘導する抗ガン剤;およびコンブレタスタチンcombretastatinファミリー由来の抗チューブリン薬である。特に好ましい因子はドセタキセルである。本発明のガン処置組成物および方法はまた、他の治療剤および診断薬とともに用いることができる。治療剤と組み合わせた抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体に関して、組み合わせた使用とはまた、組み合わせた組成物、製剤、カクテル、キット、方法を包含し、ここで治療剤はプロドラッグの形態である。組み合わせたガン治療方法は、少なくとも第一の精製された抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と本質的に同じエピトープに結合するもの、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体が、ガンを有する動物または患者に、治療上有効な量の少なくとも第二の治療剤または抗ガン剤と組み合わせて投与される方法である。本発明はさらに、組成物、薬学的組成物、治療キットおよび医療用カクテルを提供する。これは必要に応じて、少なくとも第一の組成物または容器中に、生物学的に有効な量の少なくとも第一の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体;および生物学的に有効な量の少なくとも第二の生物学的因子、成分またはシステム、好ましくは少なくとも第二の治療剤または抗ガン剤を含む。少なくとも第二の生物学的因子、成分またはシステムはしばしば、治療剤または診断剤、構成要素またはシステムであるが、しばしばそうではない。例えば、少なくとも第二の生物学的因子、構成要素またはシステムは、抗体の改変のため、および/またはこの抗体に対する他の因子の結合のための成分を含んでもよい。特定の好ましい第二の生物学的因子、構成要素またはシステムは、プロドラッグまたはプロドラッグを作製して用いるための成分であり、これには、プロドラッグ自体を作製するための成分、およびこのようなプロドラッグまたはADEPTの実施形態において機能する本発明の抗体に適合するための構成要素を含む。処置されるべき疾患がガンである場合、少なくとも第二の治療剤または抗ガン剤が治療キットまたはカクテルに含まれる。少なくとも第二の抗ガン剤は、第一の抗ガン剤である、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4構築物、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体を参照して、選択される。従って、本発明の抗体は化学療法剤、放射線治療剤、サイトカイン、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、または抗ガン免疫毒素またはコアグリガンドと組み合わされてもよい。化学療法剤chemotherapeuticagentsとしてはまた、遺伝子、ベクター、アンチセンス構築物およびリボザイムが挙げられる。現在好ましい第二の抗ガン剤は、表Eにあるような血管新生阻害効果を有する抗ガン剤;表Fにあるようなアポトーシスを誘導する抗ガン剤、およびコンブレタスタチンファミリー由来の抗チューブリン薬である。特に好ましい因子はドセタキセルである。本発明の組成物、キットおよび/または医薬に関して、治療剤の組み合わせた有効量は、単一の容器または容器手段内に含まれてもよく、または別個の容器もしくは容器手段内に含まれてもよい。カクテルは一般に、併用使用組み合わせた使用のために一緒に混合される。静脈投与のために処方された因子がしばしば好ましい。画像化成分がまた含まれてもよい。キットもまた、少なくとも第一の抗体を用いるための指示書を含み得、そして1つ以上の他の生物学的因子が含まれる。一般的に言えば、少なくとも第二の抗ガン剤がまた、動物または患者に、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体と実質的に同時に投与されてもよい;例えば、単一の薬学的組成物から、またはほぼ一緒に投与された2つの薬学的組成物から。あるいは、少なくとも第二の抗ガン剤は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与に対して連続して動物または患者に対して投与されてもよい。連続してatatimesequentialとは、本明細書において用いる場合、少なくとも第二の抗ガン剤が、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与とは別の時点で動物または患者に投与されるようにずらされたstaggeredことを意味する。2つの因子は、2つの因子がそのそれぞれの治療効果を発揮することを可能にするように効率的に離れた時点で投与され、すなわち、それらは、生物学的に有効な時間間隔で投与される。少なくとも第二の抗ガン剤は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤または実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与前の生物学的に有効な時点で投与されてもよく、あるいはその治療剤投与後の生物学的に有効な時点でこの動物または患者に投与されてもよい。好ましくは、検出可能に標識された抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体構築物を用いて、腫瘍画像化をもまた行ない得る。本発明に従う画像化は、アポトーシス前細胞およびアポトーシス細胞を検出し得、それによってこれは代理マーカーとして治療後に用いることができる。あるいは、形成された画像は、用いられるべき治療剤の結合部位の指標であるので、画像化は処置の前に行なってもよい。従って、ガン処置は:a腫瘍を有する動物または患者に対して、腫瘍結合剤または抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体に作動可能に連結された診断剤を含む、診断上最小量の少なくとも第一の検出可能に標識された腫瘍結合因子、好ましくは抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体構築物を投与して、それによって腫瘍の検出可能な画像を形成することによって、腫瘍の画像を形成する工程;およびb次に、同じ動物または患者に対して、少なくとも第一の裸の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4抗体またはこのような抗体を用いる治療剤-抗体構築物の治療上最適の量を投与して、これによって抗腫瘍効果を生じる工程、によって実行され得る。従って、一般には:a検出可能に標識された腫瘍結合因子、好ましくは抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体構築物の診断上有効な量を含む第一の薬学的組成物であって、この腫瘍結合因子または抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく抗体に作動可能に連結された検出可能な因子を含む組成物;およびb治療上有効な量の少なくとも1つの裸の抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4抗体またはこのような抗体を用いる治療剤-抗体構築物を含む第二の薬学的組成物、を含む、画像および処置処方物または医薬が提供される。ウイルス感染の処置:本発明の特に重要かつ驚くべき成果は、ウイルス感染を処置または予防するための組成物、組み合わせ、キット、方法、使用、および医薬に関する。本発明の抗ウイルス処置方法は、本発明の前述の任意の1つ以上、およびさらなる治療剤の投与または使用に関する。最初の例において、本発明の抗ウイルス組成物および処置方法は、組成物に関して、そしてガン処置に関して上記されるように、少なくとも第一の精製された抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメント、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体もしくは抗原結合フラグメント、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の投与および使用に関する。実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体のうち、使用に好ましいのは、実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体、例えば、ビオチンに連結されたデュラマイシン、またはHIgGに連結されたデュラマイシンである。本発明の抗体およびペプチドと、ウイルス感染との間の驚くべき相関を考慮すれば、本発明はさらに、ウイルス感染を処置する際の使用のための一連の新規な治療剤を提供する。特に、本発明は、少なくとも第一の抗ウイルス剤に作動可能に連結された、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、特にPSおよびPEに対する抗体を提供する。本発明はさらに、少なくとも第一の抗ウイルス剤に作動可能に連結された、実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくはデュラマイシンペプチド誘導体を提供する。本発明の抗体およびペプチドに対する結合のための適切な抗ウイルス剤としては、表Gに示されるものが挙げられる。従って、全体として、本発明の抗ウイルス組成物および処置方法は、治療上有効な量の少なくとも第一の精製された抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは抗ウイルス免疫結合体、必要に応じて、モノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメント、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体、またはその抗ウイルス免疫結合体を含む組成物を、ウイルス感染した動物または患者に投与する工程に関する。本発明の抗ウイルス処置方法および使用は、動物および患者において、さらには植物においてさえ全てのウイルスを処置するのに適切である。本発明の治療剤は、ウイルス進入を阻害し得るが、好ましくは、感染された宿主細胞からのウイルスの複製、出現および伝播を阻害し得る。本発明は、表Hにおいて本明細書に列挙されるような、脊椎動物特にヒトに感染する全てのウイルス、および特にヒトにおいて病原性であるウイルスを、処置するために適切である。本発明によって処置され得るウイルス感染および関連の疾患としては、CMV、RSVおよびアレナウイルス感染を処置することによって例示されるような、表Jに記載されるウイルスおよび疾患、ならびに肝炎、インフルエンザ、肺炎、ラッサ熱およびAIDSが挙げられる。本発明の抗ウイルス処置組成物および方法はまた、他の治療剤および診断剤と組み合わせて用いられてもよい。これらの組み合わされた使用は、組み合わせた組成物、製剤、カクテル、キットおよび処置方法において別の抗ウイルス剤と組み合わされる。前述のガン処置および抗ウイルス処置の方法および使用はしばしば、動物または患者への、薬学的に有効な組成物の全身的な投与例えば、経皮注射、筋肉内注射、静脈内注射などによる投与を包含する。ウイルス感染、特に呼吸ウイルス感染を処置するために、エアロゾルを用いて達成され得る場合、肺への送達が好ましい。しかし、治療剤が腫瘍またはウイルス感染部位へ局在することを可能にする投与の任意の経路が採用される。従って、他の適切な送達の経路としては、経口、直腸、経鼻、局所および膣が挙げられる。参考として本明細書に詳細に援用される米国特許第5,753,230号における他の免疫学的因子について記載されるように、関節炎の処置のための使用および方法、例えば、滑膜内投与が使用され得る。眼に関連する条件については、眼科の処方物および投与を企図する。本明細書において用いる場合投与とは、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体または3G4に基づく治療剤、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくはデュラマイシン誘導体の、治療効果を発揮するのに有効な量単数または複数で、かつ時間単数または複数での供給および送達を意味する。タンパク様治療剤の受動的投与は、一般に、一部は、その単純さおよび再現性のために好ましい。しかし、投与という用語は、本明細書において、治療剤が送達される任意のかつ全ての手段を意味するとして用いられる。従って、投与とは、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤またはデュラマイシン誘導体の治療剤を有効な様式で生成する細胞の供給を包含する。このような実施形態では、一般に治療を中止するために除去し得る、選択的に透過性の膜、構造物または不浸透性のデバイス中に細胞を処方またはパッケージングすることが所望され得る。この用量が厳密にモニターされかつ制御されることを可能にする非侵襲的な方法を表す場合、外因性の投与が、なお一般に好ましい。本発明の治療方法および使用はまた、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体をコードする核酸、3G4に基づく治療剤またはデュラマイシン誘導体治療剤の、そのインビボでの発現を生じるのに有効な様式での提供におよぶ。任意の遺伝子治療技術、例えば、裸のDNA送達、組換え遺伝子およびベクター、細胞に基づく送達が使用され得、これは、患者の細胞のエキソビボ操作などを含む。リポソームおよびステルス化リポソームは、いくつかの実施形態における使用に好ましい。本発明の薬学的組成物および処置方法は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、必要に応じてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じエピトープに結合する抗体、またはこのような抗体の抗原結合フラグメントもしくは免疫結合体、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくは実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体の治療的に有効な量を使用する。治療効果および結果として治療上有効な量は、ガン処置対抗ウイルス処置における異なるパラメーターによって測定される。ガン処置においては、因子の量は、腫瘍細胞、腫瘍または腫瘍内血管内皮細胞の少なくとも一部を特異的に殺傷するために;腫瘍細胞、腫瘍または腫瘍内血管内皮細胞の少なくとも一部においてアポトーシスを特異的に誘導するために;腫瘍または腫瘍内血管の少なくとも一部において凝固を特異的に促進するために;腫瘍の血液輸送血管の少なくとも一部を特異的に閉塞または破壊するために;腫瘍の少なくとも一部において壊死を特異的に誘導するために;そして/または動物または患者に対する投与の際に腫瘍退行または寛解を誘導するために、有効である。ウイルス感染および関連の疾患を処置するのにおいて、因子の量は、ウイルス感染を進行させるための要件、例えば、ウイルス進入、および好ましくはウイルス複製、出現および感染した宿主細胞からの伝播のうちの1つ以上を阻害するために有効である。この量はまた、ウイルス複製、伝播および感染の進行を妨げる様式でウイルス感染した細胞の少なくとも一部を殺傷または除去し得る。全体的に、この因子の量は、動物または患者に対する投与の際にウイルス感染を低下させるか、有意に低下させるかまたは根絶させるために有効である。本明細書において用いる場合、優先的におよび特異的にという用語は、抗アミノリン脂質抗体もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、3G4に基づく治療剤、または実質的に細胞不浸透性のPE結合ペプチド誘導体、好ましくはデュラマイシン誘導体が、疾患部位に実質的に規定されて、動物または被験体の正常な健常な組織における凝固、破壊および/または組織壊死を実質的に生じない、抗ガンまたは抗ウイルスの効果を達成することを意味する。従って、健常な細胞および組織の構造および機能は本発明の実施によって維持され、実質的に損なわれない。本明細書の図面の部分は、本発明特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。本特許の米国出願は、少なくとも1つのカラー図面を含む。このカラー図面を含む本特許のコピーは、必要な料金の要求および支払いに応じて特許商標庁から提供される。本発明は、例えば、以下の項目を提供する。項目1精製された抗体、または抗原結合フラグメント、またはその免疫複合体を含む組成物であって、該抗体がホスファチジルセリンに結合し、かつホスファチジルセリンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、組成物。項目2前記抗体がさらに、ホスファチジン酸に結合し、かつホスファチジン酸に対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。項目3前記抗体がさらに、ホスファチジルイノシトールに結合し、かつホスファチジルイノシトールに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。項目4前記抗体がさらに、ホスファチジルグリセロールに結合し、かつホスファチジルグリセロールに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。項目5前記抗体がさらに、カルジオリピンに結合し、かつカルジオリピンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。項目6前記抗体がさらに、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピンに結合し、かつホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールおよびカルジオリピンの各々に対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目1に記載の組成物。項目7前記抗体がさらにホスファチジルエタノールアミンに結合する、項目1に記載の組成物。項目8前記抗体がさらに、ホスファチジルエタノールアミンに結合し、かつホスファチジルエタノールアミンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する、項目7に記載の組成物。項目9前記抗体が、表4に記載されるモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じリン脂質結合プロフィールを有する、項目1に記載の組成物。項目10前記抗体が、表3に記載されるホスファチジルセリンについてのモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545の親和性と少なくとも等しいホスファチジルセリンについての親和性を有する、項目1に記載の組成物。項目11前記抗体が、表4に記載されるモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と実質的に同じリン脂質結合プロフィールを有し、表3に記載されるホスファチジルセリンについてのモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545の親和性と少なくとも等しいホスファチジルセリンについての親和性を有する、項目1に記載の組成物。項目12前記抗体がモノクローナル抗体である、項目1に記載の組成物。項目13前記抗体がIgG抗体である、項目1に記載の組成物。項目14前記抗体が抗体の抗原結合フラグメントである、項目1に記載の組成物。項目15前記抗体がscFv、Fv、Fab’、Fab、二価抗体、直鎖状抗体または抗体のFab’2抗原結合フラグメントである、項目14に記載の組成物。項目16前記抗体がCDR、一価フラグメント、ラクダ化camelizeまたは単一ドメインの抗体である、項目14に記載の組成物。項目17前記抗体がヒト、ヒト化もしくは部分的ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントである、項目1に記載の組成物。項目18前記抗体が、ヒト抗体フレームワークまたは定常領域に作動可能に連結された該抗体の抗原結合領域を含む、項目17に記載の組成物。項目19前記抗体がキメラ抗体である、項目1に記載の組成物。項目20前記抗体が二重特異性抗体である、項目1に記載の組成物。項目21前記抗体が組み換え抗体である、項目1に記載の組成物。項目22前記抗体が操作された抗体である、項目1に記載の組成物。項目23前記抗体が、活性化された内皮細胞を用いて動物を免疫する工程と、ホスファチジルセリンに結合し、かつホスファチジルセリンに対する結合についてモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545と効率的に競合する抗体を該免疫された動物から選択する工程とを包含するプロセスによって調製される、項目1に記載の組成物。項目24前記抗体が、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列領域を含む少なくとも第一の可変領域を含む、項目1に記載の組成物。項目25前記抗体がモノクローナル抗体3G4ATCCPTA4545である、項目1に記載の組成物。項目26前記抗体が少なくとも第一の生物学的因子に作動可能に連結される、項目1~25のいずれか1項に記載の組成物。項目27前記抗体が、実質的に不活性なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する少なくとも第一の因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。項目28前記抗体が、実質的に不活性なプロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する、アリールスルファターゼ、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、カテプシン、D-アラニルカルボキシペプチダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、β-ラクタマーゼ、ペニシリンアミダーゼ、またはシトシンデアミナーゼに作動可能に連結される、項目27に記載の組成物。項目29前記抗体が、実質的に不活性なリン酸塩プロドラッグを切断して実質的に活性な薬物を遊離する、アルカリホスファターゼに作動可能に連結される、項目27に記載の組成物。項目30前記抗体が少なくとも第一の治療因子または診断因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。項目31前記抗体が少なくとも第一の治療因子に作動可能に連結される、項目30に記載の組成物。項目32前記抗体が少なくとも第一の化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、ステロイド、抗代謝物、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、抗チューブリン薬、抗生物質、サイトカイン、アルキル化剤または凝固剤に作動可能に連結される、項目31に記載の組成物。項目33前記抗体が、TNFα、IL-12またはLECに作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。項目34前記抗体が、内皮細胞の増殖または細胞分裂を殺傷または抑制し得る、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤または抗細胞性剤に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。項目35前記抗体が植物由来、真菌由来または細菌由来の毒素に作動可能に連結される、項目34に記載の組成物。項目36前記抗体が、鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、αサルシン、ゲロニン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エピポドフィロトキシン、ジフテリア毒素またはPseudomonas外毒素に作動可能に連結される、項目35に記載の組成物。項目37前記抗体が、リシンA鎖または脱グリコシル化リシンA鎖に作動可能に連結される、項目36に記載の組成物。項目38前記抗体が、血管新生阻害因子に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。項目39前記抗体が、抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。項目40前記抗体が、コルヒチン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデスシンおよびコンブレタスタチンからなる群より選択される抗チューブリン薬に作動可能に連結される、項目39に記載の組成物。項目41前記抗体が、凝固物に作動可能に連結される、項目32に記載の組成物。項目42前記抗体が、診断剤、画像化剤または検出可能因子に作動可能に連結される、項目30に記載の組成物。項目43前記抗体が、X線検出可能化合物、放射性イオンまたは核磁気スピン共鳴同位体に作動可能に連結される、項目42に記載の組成物。項目44前記抗体が、aX線検出可能化合物ビスマスIII、金III、ランタンIIIまたは鉛II;b検出可能な放射性イオン銅67、ガリウム67、ガリウム68、インジウム111、インジウム113、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、水銀197、水銀203、レニウム186、レニウム188、ルビジウム97、ルビジウム103、テクネチウム99mもしくはイットリウム90;またはc検出可能な核磁気スピン共鳴同位体コバルトII、銅II、クロムIII、ジスプロシウムIII、エルビウムIII、ガドリニウムIII、ホルミウムIII、鉄II、鉄III、マンガンII、ネオジムIII、ニッケルII、サマリウムIII、テルビウムIII、バナジウムIIまたはイッテルビウムIII;に作動可能に連結される、項目43に記載の組成物。項目45前記抗体が、ビオチン、アビジンまたは色素生産性基質との接触の際に着色された生成物を生成する酵素に作動可能に連結される、項目42に記載の組成物。項目46前記抗体が、少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目31に記載の組成物。項目47前記抗体が、表Gの抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目46に記載の組成物。項目48前記抗体が、シドフォビルまたはAZTに作動可能に連結される、項目46に記載の組成物。項目49前記生物学的因子をコードするDNAセグメントに作動可能に連結された抗体をコードするDNAセグメントを、同じリーディングフレーム中に含む組み換えベクターを発現することによって調製された融合タンパク質として、生物学的因子に該抗体が作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。項目50前記抗体が、生物学的に遊離可能な結合または選択的に切断可能なリンカーを介して、前記生物学的因子に作動可能に連結される、項目26に記載の組成物。項目51前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む薬学的に受容可能な組成物である、項目1に記載の組成物。項目52前記薬学的に受容可能な組成物が非経口投与のために処方される、項目51に記載の組成物。項目53前記薬学的に受容可能な組成物がリポソーム処方物である、項目51に記載の組成物。項目54前記薬学的に受容可能な組成物がステルス化またはPEG化されたリポソーム処方物である、項目53に記載の組成物。項目55前記薬学的に受容可能な組成物が前記抗体でコーティングされる、ステルス化またはPEG化されたリポソーム処方物である、項目53に記載の組成物。項目56前記組成物が第二の生物学的因子をさらに含む、項目1に記載の組成物。項目57前記組成物が第二の治療因子をさらに含む、項目56に記載の組成物。項目58前記第二の治療因子が血管新生阻害因子である、項目57に記載の組成物。項目59前記第二の治療因子が抗ガン剤である、項目57に記載の組成物。項目60前記抗ガン剤が、DNA複製、有糸分裂または染色体分離を干渉する化合物である、項目59に記載の組成物。項目61前記抗ガン剤が、化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、抗チューブリン薬または腫瘍標的化化学療法剤、放射性治療剤、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子または抗チューブリン薬である、項目59に記載の組成物。項目62前記抗ガン剤が、シトシンアラビノシド、メトトレキセート、アミノプテリン、デメコルチン、ミトラマイシン、クロラムブシル、メルファラン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ベラパミル、タモキシフェン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル5FU、カンプトセシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、シスプラチン、ブレオマイシン、コンブレタスタチンまたはシクロフォスファミドである、項目61に記載の組成物。項目63前記抗ガン剤がドセタキセルである、項目61に記載の組成物。項目64前記抗ガン剤が抗チューブリン薬、腫瘍標的化抗チューブリン薬またはチューブリン活性を干渉する化合物である、項目61に記載の組成物。項目65前記抗ガン剤が、腫瘍細胞もしくは腫瘍間質の接近可能な成分に、または腫瘍脈管構造もしくは腫瘍内脈管構造の表面発現された、表面接近可能な、表面局在した、サイトカイン誘導性もしくは凝固剤誘導性の成分に結合する標的化領域に作動可能に連結された治療因子を含む標的化因子-治療剤構築物である、項目61に記載の組成物。項目66前記抗ガン剤がリポソーム処方物内に分散される、項目59に記載の組成物。項目67前記抗ガン剤が、前記抗体でコーティングされているステルス化またはPEG化リポソーム処方物内に分散される、項目59に記載の組成物。項目68前記第二の治療剤が抗ウイルス因子である、項目57に記載の組成物。項目69前記抗ウイルス因子が表Gから選択される抗ウイルス因子である、項目68に記載の組成物。項目70前記抗ウイルス因子がシドフォビルまたはAZTである、項目68に記載の組成物。項目71細胞不浸透性基に作動可能に連結されたデュラマイシンペプチドを含む、実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体を含む組成物。項目72前記デュラマイシンペプチドが、生理学的pHで正の電荷を有する基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目73前記デュラマイシンペプチドが、生理学的pHで負の電荷を有する基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目74前記デュラマイシンペプチドが、ビオチンに、または硫酸塩、スルホン酸塩、ホスホン酸塩、カルボキシル、フェノール、四級アンモニウムイオンもしくはアミン基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目75前記デュラマイシンペプチドが、糖、オリゴ糖またはポリ多糖、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはポリアルコール基に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目76前記デュラマイシンペプチドがタンパク質に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目77前記デュラマイシンペプチドが、不活性なキャリアタンパク質に作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目78ニュートラビジン、ストレプトアビジン、アルブミンまたは不活性な免疫グロブリンキャリアタンパク質に、デュラマイシンペプチドが作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目79腫瘍細胞、腫瘍脈管構造または腫瘍間質に結合する、標的化タンパク質、抗体、またはその抗原結合領域に、前記デュラマイシンペプチドが作動可能に連結される、項目71に記載の組成物。項目80前記実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体が、図13A~図13Oのいずれか1つに記載される実質的に細胞不浸透性のデュラマイシン誘導体である、項目71に記載の組成物。項目81少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結されたデュラマイシンペプチドを含む組成物。項目82前記デュラマイシンペプチドが、表Gから選択された少なくとも第一の抗ウイルス因子に作動可能に連結される、項目81に記載の組成物。項目83前記デュラマイシンペプチドがシドフォビルまたはAZTに作動可能に連結される、項目81に記載の組成物。項目84治療における使用のための、項目1~83のいずれか1項に記載の組成物。項目85血管形成を阻害することにおける使用のための、項目1~84のいずれか1項に記載の組成物。項目86ガンを処置するのにおける使用のための、項目1~85のいずれか1項に記載の組成物。項目87ウイルス感染を処置するのにおける使用のための、項目1~86のいずれか1項に記載の組成物。項目88血管形成を阻害することによって疾患を処置するための医薬の製造における項目1~87のいずれか1項に記載の組成物の使用。項目89黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、関節炎、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、甲状腺過形成、グレーブス病、血管腫、血管新生緑内障または乾癬を処置するための医薬の製造における項目1~88のいずれか1項に記載の組成物の使用。項目90ガンを処置するための医薬の製造における項目1~89のいずれか1項に記載の組成物の使用。項目91ウイルス感染を処置するための医薬の製造における項目1~90のいずれか1項に記載の組成物の使用。項目92表Jに記載のウイルス病を処置するための医薬の製造における項目1~91のいずれか1項に記載の組成物の使用。項目93CMV、RSVまたはアレナウイルスの感染を処置するための医薬の製造における項目1~92のいずれか1項に記載の組成物の使用。例示的な実施形態の詳細固体腫瘍およびガン腫は、ヒトにおける全てのガンの90より多くに相当する。モノクローナル抗体および免疫毒素の使用は、リンパ腫および白血病の治療において検討されているVitettaら,1991が、これらの因子は、ガン腫および他の固体腫瘍に対する臨床試験においては失望すべきことに有効ではなかったAbramsおよびOldham,1985。抗体に基づく処置が有効でないことについての主な理由は、高分子は固体腫瘍に容易に輸送されないということである。一旦、腫瘍塊内になっても、これらの分子は、腫瘍細胞、線維性間質、間質性圧力勾配および結合部位障壁の間の緊密な結合の存在に一様に起因して分布することができないDenekamp,1990;Dvorakら,1991。固体腫瘍を処置するための新規なストラテジーを開発することにおいて、腫瘍細胞ではなく腫瘍の脈管を標的する工程を包含する方法によって別個の利点が得られる。腫瘍血管の有効な破壊または遮断は、腫瘍を通じた血流を停止させ、腫瘍細胞死亡の崩壊を生じる。抗体毒素および抗体凝固構築物、腫瘍血管を選択的に破壊および/または閉塞するVTAの例は既に、腫瘍脈管構造の特定の標的および破壊において大きな効果を発揮しており、腫瘍壊死を生じるBurrowsら,1992;BurrowsおよびThorpe,1993;WO93/17715;WO96/01653;Huangら,1997;各々が参考として本明細書に援用される。VTAは、固体腫瘍の既存の血管に対してその一次的な作用を発揮し、新しい血管形成を妨げる血管新生阻害因子とは異なる。他のガン治療を上回るVTAの多くの利点がある。第一に、単一の血管によって、栄養が供給されて、数百または数千の腫瘍細胞からの代謝物の廃棄物の除去が促進されており、血流の上流および下流をブロックするためには1つのポイントを損傷させるだけでよい。従ってVTAは樹立された腫瘍には特に有効である。第二に、内皮細胞殺傷は有用な機構の1つであるが必要ではない。血液凝固の形状または開始位置の変化は十分であり得る。第三に内皮細胞は血流に隣接し、十分な薬物送達を保障する。第四に、標的は、薬物耐性を付与する遺伝的変異を獲得する可能性の低い正常な二倍体細胞である。第五に生物学的活性の代理のマーカーすなわち血流は測定可能である。第六に、血管機能に対する一時的な効果は有意な抗腫瘍効果について十分であり得る。研究によって、インビボにおいて99を上回る腫瘍細胞が、虚血の2時間の間に殺傷され得ることが示される。最終的に、脈管形成インヒビターとは異なり、VTAは、数ヶ月または数年を超える慢性的な投与ではなく、従来の処置と協同作用するためには間欠的な投与しか必要としない。細胞傷害性VTAは、以下の特許に記載されている:各々が参考として本明細書に援用される、米国特許第5,660,827号、同第5,776,427号、同第5,855,866号、同第5,863,538号、同第5,965,132号、同第6,004,554号、同第6,051,230号、同第6,261,535号、および同第6,451,312号。腫瘍脈管構造に対して凝固因子を特異的に送達するために抗体、成長因子または他の結合リガンドが用いられる場合、このような因子はコアグリガンドcoaguligandsと名付けられる。コアグリガンドVTAは、以下の特許に記載される:各々が参考として援用される、米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号および同第6,036,955号。コアグリガンドにおける使用のための現在好ましい凝固因子は、短縮型組織因子truncatedTissueFactortTFHuangら、1997;WO96/01653;米国特許第5,877,289号である。TFは、血液凝固の主な開始因子であるRufら、1991;Edgingtonら、1991。損傷の部位で、血液中の第VII/VIIa因子は、血管周囲の組織における細胞上のTFに接触して結合する。TF:VIIa複合体は、リン脂質表面の存在において、因子IXおよびXを活性化する。これが次に、トロンビンおよびフィブリンの形成を導き、最終的に血液凝固をもたらすRufおよびEdgington,1994。細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを欠く、組換えの短縮型の組織因子tTFは、ネイティブなTFよりも凝固を誘導する能力の大きさが約5分の1である可溶性のタンパク質であるStoneら、1995;Huangら、1997。この理由は、TFが、効率的にIXaまたはXaを活性化する、VIIaとの複合体についてリン脂質と関連する必要があるということである。しかし、抗体または因子を標的化する手段によって腫瘍血管内皮に対してtTFが送達される場合、これは脂質表面に近位に戻されて血栓形成性の活性を回復するHuangら、1997;米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号および同第6,036,955号。従って、腫瘍脈管構造を選択的に血栓症にさせるコアグリガンドが作製される。短縮されたTFは、脈管標的化コアグリガンドにおける使用が推奨されるいくつかの利点を有する:ヒトtTFは容易に利用可能であり、ヒトタンパク質は、ヒトにおいては免疫原性が無視できるかまたは低い;ヒトtTFは、マウスを含む実験動物において完全に機能的である;標的されたtTFは非常に強力である。なぜなら、凝固タンパク質のカスケードの活性化を誘引して、大きく増幅された効果を生じるからである米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号。腫瘍内皮から入手できるが、正常な内皮細胞からはかなり損なわれている、一連の適切な標的分子が記載されている。例えば、発現された標的、例えば、エンドグリン、Eセレクチン、Pセレクチン、VCAM-1、ICAM-1、PSMA、TIE、LAM-1と反応性のリガンド、VEGF/VPFレセプター、FGFレセプター、αvβ3インテグリン、プレイオトロピンまたはエンドシアリンが利用されてもよい各々が参考として本明細書に援用される、米国特許第5,855,866号、同第5,877,289号;Burrowsら.,1992;BurrowsおよびThorpe,1993;Huangら,1997;Liuら,1997;Ohizumiら,1997。吸着された標的は、別の適切な群、例えば、VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMP、TIEに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォーム米国特許第5,877,289号、同第5,965,132号、同第6,051,230号および同第6,004,555号。フィブロネクチンアイソフォームは、インテグリンファミリーのレセプターに結合するリガンドである。腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームは、腫瘍脈管および腫瘍間質の両方の標的可能成分である。モノクローナル抗体BC-1Carnemollaら、1989は腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームに特異的に結合する。天然の腫瘍環境によって、またはその後のヒトによる介入によって誘導可能な他の標的はまた、米国特許第5,776,427号、同第5,863,538号および同第6,036,955号に記載のとおり、標的可能な実体である。正常な組織および腫瘍血管誘導における以前の抑制と組み合わせて用いる場合、MHCクラスII抗原も、標的として用いることができる米国特許第5,776,427号、同第5,863,538号、同第6,004,554号および同第6,036,955号。臨床的適用のために現在好ましい1つの標的は、脈管内皮接着分子-1VCAM-1である米国特許第5,855,866号、同第5,877,289号、同第6,051,230号、同第6,004,555号および同第6,093,399号。VCAM-1は細胞接着分子であって、炎症性サイトカインIL-1α、IL-4Thornhillら、1990およびTNFαMunro,1993によって誘導され、そしてそのインビボでの役割は、急性炎症の部位に対して白血球を補充することであるBevilacqua,1993。VCAM-1は、神経芽細胞腫Pateyら、1996、腎臓ガン腫Drozら,1994、非小細胞性肺ガンStaal-vandenBrekelら、1996、ホジキン病Pateyら、1996および肉管肉腫Kuzuら、1993を含む多数のヒト悪性腫瘍において、そして良性腫瘍、例えば、血管腫angiomaPateyら、1996および血管腫hemangiomaKuzuら、1993において、脈管内皮細胞に存在する。ヒトのVCAM-1の構成的発現は、甲状腺、胸腺および腎臓においてわずかな血管にKuzuら、1993;BruijnおよびDinklo,1993、そしてマウスにおいては、心臓および肺における血管に対して限定されるFriesら、1993。本明細書において提示される特定のデータは、米国特許第5,855,866号、同第5,877,289号、同第6,051,230号、同第6,004,555号および同第6,093,399号に提供されるデータをさらに補足し、抗VCAM-1tTFコアグリガンドの投与から生じる血栓および腫瘍梗塞の選択的誘導を示す。提示される結果は、L540ヒトホジキンリンパ腫を保有するマウスを用いて生成した。SCIDマウスにおいて異種移植片として成長させた場合、この腫瘍は、炎症性サイトカインの発現Diehlら、1985ならびにその脈管構造におけるVCAM-1および他の内皮細胞活性化分子の存在に関してヒト疾患に対して密接な類似性を示す。tTFが抗VCAM-1抗体に直接結合した、共有結合した抗VCAM-1tTFコアグリガンドを用いて、固体L540ホジキン腫瘍を有するマウスにおいて、コアグリガンドが腫瘍血管に対して選択的に局在し、これらの血管の血栓を誘導し、腫瘍全体を通じた壊死の発生を生じ、そして腫瘍増殖を遅延させることが、本明細書中で示される。腫瘍は一般に、コアグリガンドに対して応答するには少なくとも約0.3cmの直径である必要があった。なぜなら、VCAM-1はさらに小さい腫瘍からは欠失していたからである。推定上、小さい腫瘍では、腫瘍に浸潤する腫瘍細胞または宿主細胞によって分泌されるサイトカインのレベルは、VCAM-1誘導には低すぎる。これは、米国特許第5,855,866号、同第5,877,289号、同第6,051,230号、同第6,004,555号および同第6,093,399号における研究によるが、ここでは、本発明はさらに大きい固体腫瘍において最も有用であることが示された。VCAM-1染色は、腫瘍の末梢において最初にさらに観察されたが、コアグリガンドは明白に血液輸送血管に対して結合して閉塞した。そのとき、それによって全ての腫瘍領域において血流を短縮することができた。さらに、本発明者らの1人は、コアグリガンドの最初の投与によって生じたトロンビン生成が、中央の血管でのVCAM-1のさらなる誘導を導く可能性が高くSluiterら、1993、これによって腫瘍内領域の増幅されたシグナルおよび明白な破壊が生じると考える。さらなる標的可能マーカーのこのタイプの凝固剤誘導性発現、およびこれによるシグナル増幅はまた、米国特許第6,036,955号に開示される。本明細書に示されるとおり、マウスの心臓および肺におけるVCAM-1発現血管に対する局在化は、抗VCAM-1コアグリガンドの投与の際に観察されたが、この構築物は、このような非腫瘍部位において血栓を誘導しなかった。さらに、抗VCAM-1コアグリガンドは、特異性の無関係なコントロールのコアグリガンドほどマウスに対して毒性ではなかった。そしてこれによってもやはり、心臓および肺の血管におけるVCAM-1の構成的発現は毒性を導かなかったことが示された。このデータは、VCAM-1がヒトにおける腫瘍血管内皮の天然に存在するマーカーであることを考えれば、コアグリガンド治療の直接的な臨床的進歩に重要である。しかし、この現象によって、また本発明者らは、腫瘍脈管構造破壊に対する全体的に異なるアプローチにつながる固有の洞察を得た。A.アミノリン脂質に対する裸の抗体を用いた腫瘍処置本発明者らは、抗VCAM-1コアグリガンドが、心臓および肺における血管上で構成的に発現されるVCAM-1に対して結合するが、その血管において血栓は生じない能力の背景の機構を理解しようと努めた。心臓および肺における腫瘍環境のプロトロンビン性質および任意の線維素溶解性素因と一般的に結び付いた、この実験的な観察については多くの科学的な可能性がある。概して、凝固系フィブリン沈着と線維素溶解系酵素によるフィブリンの分解との間に生物学的平衡がある。しかし、悪性疾患において、特にガン腫において、この平衡は崩壊されて、凝固の異常な活性化凝固性亢進またはプロトロンビン状態prothromboticstateが生じる。広範な研究にもかかわらず、腫瘍環境のプロトロンビン性質について明白な分子説明は、最近まで認識できなかった。多くの可能性のある選択肢の詳細な解析後、本発明者らは、抗VCAM-1コアグリガンドが正常な組織の血管において血栓を生じ得ないことはアミノリン脂質、ホスファチジルセリンPSがこのような血管の内面から欠失したことに起因したと判断した。従って、この理論を完成させるために、ホスファチジルセリンがこれらの正常な血管から欠失することを示さなければならないだけでなく、腫瘍関連血管の内面上のその存在が実証されなければならない。従って、本発明者らは、免疫組織化学染色を用いて、腫瘍保有マウスへ静脈内注射したモノクローナル抗ホスファチジルセリン抗PS抗体の分布を評価した。これらの研究によって、心臓および肺におけるVCAM-1発現血管がPSを欠くことが明らかになったが、VCAM-1発現血管は腫瘍においてPSを発現した。PSに結合するアネキシンVがインビトロおよびインビボの両方で抗VCAM-1tTFコアグリガンド作用をブロックするという本発明者らの知見によって、コアグリガンド作用における表面PS発現の必要性がさらに示される。従って、正常な心臓および肺の血管において抗VCAM-1コアグリガンドの血栓性の影響がないことが少なくとも部分的に説明された:アミノリン脂質、ホスファチジルセリンの非存在は、凝固複合体が集合し得る凝固促進性の表面が正常な血管に欠けるということを意味する。表面PSの非存在下で、抗VCAM-1tTFがVCAM-1を発現する心臓および肺血管に結合するが、血栓を誘導できない。対照的に、腫瘍におけるVCAM-1発現血管は、表面PSの同時発生的な発現を示す。従って、コアグリガンドは、腫瘍血管に結合して、凝固因子を活性化し、局所的に閉塞性血栓を形成する。抗VCAM-1コアグリガンドの腫瘍特異性血栓効果を描写することに加えて、腫瘍血管の管腔表面におけるアミノリン脂質、ホスファチジルセリンの特異的発現によってまた、本発明者らは、観察はされたが、初期の研究では理解できなかったプロトロンビン表現型を説明することができた。PS発現は、腫瘍脈管構造のプロトロンビン状態における有意な役割を示す。代表的なアミノリン脂質、ホスファチジルセリンが腫瘍血管の管腔表面上に特異的に発現されたが正常な血管では発現されなかったという発見後に、本発明者らは、他のアミノリン脂質が、治療介入についての標的として能力を有したことを判断した。従って、本発明者らは、アミノリン脂質、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンPEを標的することに基づいて、腫瘍脈管構造標的化および処置方法を開発した。本発明者らの研究の特に驚くべき局面は、未結合の抗アミノリン脂質抗体の投与が腫瘍処置において有効であったことである。これは、アミノリン脂質に結合する未結合または裸のnaked抗体を用いる腫瘍処置の重要な新しい手段を生じる。これらの腫瘍脈管構造標的化および処置方法は、本明細書において参考として援用される米国特許第6,406,693号に記載される。当該分野で受容される動物モデルにおける抗腫瘍効果は、米国特許第6,406,693号に実証され、本明細書で拡張されるが、アミノリン脂質が腫瘍脈管構造の安全かつ有効な標的可能なマーカーとして作用する能力は、米国特許第6,406,693号の以前の研究からは予測できなかった。腫瘍脈管構造の特定のマーカーとしてのアミノリン脂質の発見が証明されるとすぐに、本発明者らは、腫瘍処置における使用のための、ある範囲のアミノリン脂質標的免疫毒素およびコアグリガンドの開発を開始した。米国特許第6,406,693号において例示されるように、これによって腫瘍処置における使用のための裸の抗アミノリン脂質抗体の予期されない発見が導かれた。腫瘍脈管構造に対して毒素または凝固因子を送達する状況では、アミノリン脂質標的化の能力を検討することにおいて、裸の抗PS抗体が任意のさらなるエフェクター部分の非存在においてインビボで腫瘍脈管構造に対する破壊的効果を有したことを、本発明者らは、思いがけなくも見出した。腫瘍壊死をもたらす、抗アミノリン脂質抗体が腫瘍脈管構造に特異的に局在する能力および付随する破壊的効果を発揮する能力の両方ともほとんど予期されなかった。本発明は、数ある実施形態の中でも、腫瘍処置における裸の抗体としての使用のための驚くべきかつ改善された第二世代の抗PS抗体を提供する。一群の第二世代の抗PS抗体が本明細書に開示されており、そのうちモノクローナル抗体9D2および3G4ATCC4545が、このような有利な特性を有するさらなる抗体の生成および選択のための特定の免疫およびスクリーニングの技術とともに、現在好ましい。抗PS抗体による腫瘍血管に対する脈管構造の損傷は、少なくとも一部は宿主エフェクターを通じて媒介されることも本明細書に示される。本発明者らのこれらおよび他の洞察によって、裸の抗体での処置を、本明細書で教示されるように、単独で用いられる場合でも、他の抗癌因子と組み合わせて用いられる場合でも、最適化することが可能になる。B.陰イオン性リン脂質に対する抗体を用いる腫瘍処置米国特許第6,406,693号は、アミノリン脂質であるホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンが、異なる細胞における原形質膜二重層の内面に正常に隔離されることGaffetら、1995;Julienら、1995、ならびにこのリン脂質隔離が非対称な二重層貫通を生み出すことを説明する。膜非対称性の存在は何度か考察されているが、その存在の理由ならびにその生成および制御のための機構についての理由は、特に血小板以外の細胞については、十分には理解されていないWilliamsonおよびSchlegel,1994。PSが腫瘍血管内皮細胞の表面にトランスロケートすること、およびこれが少なくとも主な部分では、アポトーシスまたは他の細胞死機構とは独立して生じることを本発明者らは、初期に実証した米国特許第6,406,693号。従って、腫瘍環境におけるPS表面発現は、細胞死の結果ではなく、即時の細胞破壊を誘引することもない。種々の固形腫瘍におけるインタクトな血管内皮細胞において一貫して検出されるPS露出にもかかわらず、腫瘍血管内皮は、実のところアポトーシス性ではないが、形態学的に健常正常な組織におけるものとは異なるがかつ代謝的に活性である。これは、PS標的化に基づく治療方法には重要であり、このことは腫瘍血管内皮細胞における外膜へのPSのトランスロケーションがPSについて十分に安定性であって、首尾よい治療裸の抗体または治療複合体のいずれかを用いるのために標的可能な部分として機能することを意味する。米国特許第6,406,693号および以下の同第6,312,694号の重要な発見にもかかわらず、腫瘍血管内皮細胞のリン脂質ベースの標的化の示唆は、PSおよびPEのようなアミノリン脂質の標的化に限定された。異なるリン脂質およびアミノリン脂質についての精巧な特異性を有する生物学的ツールの開発を通じて、本発明者らはここで、腫瘍血管内皮細胞上で驚くべき上方制御される新しいカテゴリーのリン脂質を同定した。これらは腫瘍脈管構造の特異的かつ安定なマーカーでもあり、これによって陰イオン性リン脂質に結合する裸の抗体および免疫複合体の両方を用いる治療介入が可能になることが本明細書において示される、陰イオン性リン脂質である。陰イオン性リン脂質は正常な条件のもとで休止状態である哺乳動物細胞の表面からは大きく損なわれている。原形質膜の最も豊富な陰イオン性リン脂質である、ホスファチジルセリンは、正常な条件下でほとんどの細胞型における原形質膜の内部小葉部分に厳密に隔離されるWilliamsonおよびSchlegel,1994;ZwaalおよびSchroit,1997。別の主な陰イオン性リン脂質であるホスファチジルイノシトールPIはまた、原形質膜の内部小葉部分に優先的に位置するCalderonおよびDeVries,1997。少量の陰イオン性リン脂質であるホフファチジン酸PAおよびホスファチジルグリセロールPGは、わずかな細胞型においてのみ調べられているが、それらはまた原形質膜の内部小葉部分に主に位置すると思われるHinkovska-Galchevaら、1989。別の陰イオン性リン脂質であるカルジオリピンCardiolipinCLはミトコンドリア膜に存在しており、原形質膜には存在しないDaum,1985。天然のリン脂質はまた、原形質膜において非対称的に分布する。中性のアミノリン脂質、ホスファチジルエタノールアミンPEは、優位に内部小葉部分上にある。コリン含有中性リン脂質であるホスファチジルコリンPCおよびスフィンゴミエリンSMは、優位に外部小葉部分上にある。PS非対称性は、PEの非対称性とともに、外部小葉部分から原形質膜の内部小葉部分へのアミノリン脂質の輸送を触媒する、ATP依存性輸送体であるアミノリン脂質転位酵素Mg2ATPアーゼによって維持されるSeigneuretおよびDevaux、1984。PSおよびPEの非対称性の損失または崩壊は、原形質膜におけるこれらのリン脂質の外向きの動きから生じ、そして転位酵素の阻害Bitbolら、1987;Comfuriusら、1990、PS輸送体の活性化および/またはスクランブラーゼscramblase酵素である全てのリン脂質を双方向的に輸送するCa2依存性酵素の活性化のいずれかによって生じるZhaoら、1998。PS非対称性の損失は、細胞損傷、プログラムされた細胞死およびアポトーシスBlankenbergら、1998;Bombeliら、1997、細胞老化HerrmannおよびDevaux,1990、血小板の活性化Roteら、1993;Zwaalら、1989、損傷Boyleら、1996および悪性形質転換Sugimuraら、1994を含む、種々の病理学的および生理学的条件下で観察される。PSの露出はまた、筋芽細胞SessionsおよびHorwitz,1981および栄養膜Adlerら、1995の細胞内融合、細胞遊走Vogtら、1996および細胞脱顆粒Demoら、1999においてある役割を果たす。内皮細胞は、トロンビンQuら、1996、カルシウムイオノフォアまたはホルボールエステルJulienら、1997、高脂血症Lupuら、1993および非溶解性濃度の補体タンパク質C5b-9Christiansenら、1997によって誘導されるCa2フラックスの増大に応答してPSを外部移行する。自然発生的PS露出がまた、外因性の活性化因子も細胞障害も存在しない条件下で悪性細胞において観察されているUtsugiら、1991。いくつかの主な結果は、膜PS露出を伴う。食作用性マクロファージは、PS陽性の老化細胞およびアポトーシス細胞を認識し、それに結合して、排除するMcEvoyら、1986;TaitおよびSmith,1999。PSはまた、トロンビン活性化内皮細胞に対するTリンパ球の結合を媒介するQuら、1996。補体系は、PSによって活性化されて、PS陽性細胞の溶解に寄与するTestおよびMitsuyoshi,1997。最終的に、PS露出は、凝固複合体のアセンブリおよび活性化のために負に荷電された脂質表面を提供することによってBeversら、1985;Dachary-Prigentら、1996内皮上の凝固促進シフトに対して貢献するWilliamsonおよびSchlegel,1994;Bombeliら、1997。腫瘍内皮のプロトロンビン形質は久しく認識されているDonatiおよびFalanga,2001。科学的文献におけるPSに対する集中、ならびにPSおよびPEのようなアミノリン脂質に対して限定された本発明者らの初期の研究にもかかわらず米国特許第6,406,693号および同第6,312,694号、本発明者らは、さらに広いカテゴリーのリン脂質が腫瘍脈管構造上に露出され得ると仮説を立てた。腫瘍微小環境のストレス条件の増大に起因して、本発明者らは、ある範囲の陰イオン性リン脂質が腫瘍脈管構造上で上方制御され得、これによって治療介入のための潜在的な新しい機会が得られると理由付けた。腫瘍内皮の損傷および活性化が、以下によって生じることを本発明者らは、理解した:1内皮を活性化して細胞接着分子の発現を誘導する、インターロイキン-1および腫瘍壊死因子のような腫瘍由来サイトカインShaughnessyら、1989;Orrら、2000;2内皮に結合する白血球によって生成された反応性酸素種ROSOrrら、2000;ならびに3代謝の副産物としてShaughnessyら、1989;Soaresら、1994、または低酸素への曝露およびそれに続く再酸素化への曝露の結果として腫瘍細胞自体によって生成されたROSZuluetaら、1995。これらの観察によって、Ca2フラックスが腫瘍内皮内のこれらのストレスによって生成され得ること、次に、スクランブラーゼの活性化またはアミノリン脂質転位酵素の阻害を通じて、PSおよびPEの露出を生じることが示唆された。しかし、本発明者らは、アミノリン脂質PSおよびPEだけではなく、陰イオン性リン脂質は、腫瘍脈管構造上で上方制御され得るという仮説までこれらの洞察を拡大した。細胞表面陰イオン性リン脂質を検出するために、本発明者らは、陰イオン性リン脂質と反応するが中性のリン脂質とは反応しない、新しいモノクローナル抗体9D2を生成した。従って、9D2は、一般的なアミノリン脂質結合剤とは区別される。なぜなら、9D2は陰イオン性アミノリン脂質であるPSには結合するが、中性のアミノリン脂質であるPEには結合しないからである。9D2抗体はまた、陰イオン性リン脂質に加えてPEに強力に結合する、天然のリガンドであるアネキシンVよりも、陰イオン性リン脂質に特異的であるBlankenbergら、1998。本出願において詳細に記載されるとおり、本発明者らは、9D2およびアネキシンVが、種々の型の固形腫瘍を保有するマウスに対する静脈注射後に腫瘍内皮に特異的に局在することを見出した。この知見によって、陰イオン性リン脂質が腫瘍脈管内皮の表面上に慣用的に露出されて、腫瘍治療および画像化の標的分子として用いられ得るという本発明者らの仮説が確証される。従って、本発明は、裸の抗体に関して、そして細胞毒性薬物、サイトカイン、凝固因子などの送達において、陰イオン性リン脂質を標的し、腫瘍を処置するのにおける使用のための、ある範囲の新しい方法および抗体ベースの組成物を提供する。PSを標的化するのに加えて、米国特許第6,406,693号および同第6,312,694号に教示のとおり、本発明によって標的化するための現在好ましい陰イオン性リン脂質は、PI、主な陰イオン性リン脂質、PAおよびPGであり、特定の実施形態ではCLも標的化することが意図される。本発明から得られる主な知見の1つは、陰イオン性リン脂質が腫瘍内皮の表面に露出されるということである実施例VI。この現象は陰イオン性リン脂質に対して選択的に結合する2つの独立した試薬特にこの点を確証するために本発明者らによって開発されたモノクローナル抗体9D2、およびアネキシンVを用いて実証された。9D2抗体および競合抗体は本発明のさらに好ましい成分である。9D2抗体およびアネキシンVは、リポソームとして、プラスチックに吸着された陰イオン性リン脂質、または活性化された内皮細胞もしくはアポトーシス性内皮細胞の膜表面上に提示された陰イオン性リン脂質に対して、高い親和性および特異性でインビトロで結合する。9D2はPS、PAおよびCLに強力に結合するが、PIおよびPGに対しては結合が弱い。アネキシンVは、前に見出されたとおり、PS、CL、PA、PIおよびPGに加えてPEに結合するAndreeら、1990;Schlaepferら、1987;Bousteadら、1993;BlackwoodおよびErnst,1990。9D2抗体による陰イオン性リン脂質の認識は、血清の存在下および非存在下において同一であって、このことは、結合が血清補因子を必要としないことを示す。陰イオン性リン脂質に対する9D2の結合は、Ca2イオンを必要としないが、アネキシンVの結合はCa2を必要とした。PSでコーティングされたプレートに対する交差ブロック研究によって、9D2およびアネキシンVは、PSに対する各々の他の結合をブロックしないことが示された。このことによって、2つの試薬が、PS分子を、またはさらに可能性が高いのは、異なって充填された形態のPSの上の異なるエピトープを、認識することが示される。アネキシンVは、平面PS表面に対して結合すると考えられるが、抗PS抗体は、六方充填されたPSに結合すると考えられるRauchおよびJanoff、1990。両方の形態がPSコーティングプレート上におそらく存在する。これらの実際的な交差ブロック研究実施例VIはまた、陰イオン性リン脂質に対する結合について効率的に競合する抗体、すなわち本質的に同じエピトープに結合する抗体は、一旦参照抗体例えば、9D2が提供されれば、容易に同定され得るということを示すのに役立つ。本出願はまた、9D2抗体およびアネキシンVが、インビボで試験された全ての腫瘍の壊死領域およびその周囲において、腫瘍血管に、そして腫瘍細胞に特異的に局在することを示す実施例VI。腫瘍における血管の15~40が、陰イオン性リン脂質陽性内皮を有した。対照的に、正常組織において、検出可能な外部移行した陰イオン性リン脂質血管を有する血管はなかった。9D2による腫瘍脈管構造の染色の特異性は、以下によって実証された:1コントロールラットIgMによる腫瘍血管染色の欠失;2陰イオン性リン脂質から調製されたリポソームによるインビトロでのH2O2処理内皮細胞に対する9D2結合またはアネキシンV結合をブロックするが、ただし中性のリン脂質から調製されたリポソームの場合はブロックしないこと;3界面活性剤または有機溶媒での腫瘍切片からのリン脂質の抽出が染色を無効にしたという知見;ならびに4正常な器官における静止期内皮に対する9D2またはアネキシンVのいずれかの局在化の欠失。腫瘍脈管構造上に9D2またはアネキシンVによって局在される主な陰イオン性リン脂質は、PSである可能性が高い。なぜなら、これが最も豊富な陰イオン性リン脂質であって、その細胞表面上での露出は、環境的影響または傷害によって調節されるからである。しかし、他の陰イオン性リン脂質例えば、PI、PA、PGはまた、量が少ないが、露出される可能性が高い。9D2によって検出されないが、主な中性リン脂質であるPEは、PSとともに、腫瘍血管で観察されるアネキシン局在化に対して寄与する可能性が高い。PEはまた、腫瘍内皮上に露出されることが公知であり、そして原形質膜中のPEの位置は、PSに対して類似の様式で調節される米国特許第6,406,693号。PEは、PSよりも遅い速度だが、アミノリン脂質転位酵素によって部分的には原形質膜の内部小葉部分に隔離されDevaux,1992、スクランブラーゼによって外部表面に輸送されるZhouら、1997。PEは、PS同様に、アポトーシスおよび細胞活性化の間に露出されるEmotoら、1997;UmedaおよびEmoto,1999。腫瘍内皮細胞上の陰イオン性リン脂質の露出の機構を検討するために、インビトロにおける内皮細胞を、腫瘍微小環境に存在することが公知の種々の要因および条件で処理する一連の研究を行なった実施例VII。低酸素とその後の再酸化、酸性度およびトロンビンは、生存している内皮細胞上のPS露出を全ての細胞がアポトーシスである場合にみられるレベルの10~22まで増大した。炎症性サイトカインTNFαおよびIL-1はまた、PS露出の弱いが明確な誘導を生じた。これらの知見は、腫瘍においては、脈管内皮上の陰イオン性リン脂質の露出が、炎症性サイトカイン、トロンビンおよび酸性度と組み合わせた低酸素/再酸化によって誘導されるという可能性と一致する。本発明を行なうのに正確な機構を理解する必要はないが、ROSは、代謝の副産物として腫瘍細胞によって、または低酸素に応答して、生成され得るZuluetaら、1995。腫瘍細胞によって放出されたサイトカインは、活性化されたマクロファージ、多形核細胞および血小板の腫瘍内皮への接着ならびにROSのさらなる分泌を媒介する内皮上の白血球接着分子を誘導し得る。次いで、ROSは、おそらく、Ca2の流入または細胞内貯蔵からのCa2の放出WangおよびJoseph,2000を生じることによって、チオール含有輸送分子の酸化、または脂質の過酸化を通じたPSトランスロケーションを誘導し得るHerrmannおよびDevaux,1990。PSおよび他の陰イオン性リン脂質の露出は部分的には、久しく認識されている腫瘍内皮の凝固促進状態を説明するDonatiおよびFalanga,2001。陰イオン性リン脂質は、凝固因子がその上で濃縮してアセンブルする表面を提供するBeversら、1985;Dachary-Prigentら、1996。陰イオン性リン脂質は、腫瘍への白血球浸潤を補助する、循環中のマクロファージMcEvoyら、1986、Tリンパ球Quら、1996および多形核細胞の付着部位も提供する。従って、陰イオン性リン脂質に結合する抗体および他のリガンドは、腫瘍血管の標的化、画像化および/または処理のために用いられ得る。陰イオン性リン脂質は、以下のいくつかの理由のために腫瘍標的血管として魅力的である:それらは豊富であるPSは、細胞1個あたり3×106個の分子で存在する;それらは、血液中の血管標的因子により結合のために直接接近可能である、腫瘍内皮の管腔表面に存在する;それらは、多様な固形腫瘍において大部分の腫瘍内皮細胞上に存在する;そしてそれらは、全ての正常組織において内皮には本質的に存在しない。薬物または凝固剤を使用する血管標的化因子は、大きい固形腫瘍を有するマウスでは、高度に有効であり、時には治療的であることが示されているHuangら、1997;Nilssonら、2001;米国特許第5,660,827号、同第5,776,427号、同第5,855,866号、同第5,863,538号、同第5,965,132号、同第6,004,554号、同第6,051,230号、同第6,261,535号、同第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号および同第6,036,955号。従って、本発明は、ヒトにおけるガンの診断および処置において腫瘍脈管構造を標的するのにおける使用のための陰イオン性リン脂質に対する裸の抗体および脈管標的化因子を提供する。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する裸の抗体が腫瘍処置においてどのように機能するかという正確な分子的理解は、処置を実施するために必要でないが、本発明者らは、観察された内皮細胞死滅を説明し得るいくつかの機構を熟慮した。好ましい機構特に、本明細書において記載される3G4抗体については、Fcドメイン媒介性免疫エフェクター機構、例えば抗体依存性細胞傷害ADCC、補体依存性細胞傷害CDCおよび抗体媒介性食作用である。細胞媒介性の細胞傷害、補体媒介性溶解および/またはアポトーシス、抗体誘導性細胞シグナル伝達および/または細胞骨格に対する障害もまた、関与し得る。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対するインタクトな抗体特に3G4の、脈管内皮細胞表面に対する結合は、脈管管腔へ抗体のFc部分が突出するということを意味する。抗体Fcフラグメントは補体経路を活性化するので、観察された細胞破壊は、補体指向性の溶解の結果であり得る。従って、抗体結合は、補体依存性の凝固カスケードを活性化し、多成分複合体をアセンブルさせ、最終的には、標的細胞を透過性にする溶解性複合体を生成させる。補体活性化ADCCはまた、補体が抗体コーティング標的細胞に結合し、そして補体のレセプターを有する細胞例えば好中球が標的細胞を溶解する破壊において、作動し得る。裸の抗体または未結合体化抗体その抗原結合フラグメントを含むは、腫瘍脈管内皮細胞の表面で陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に結合するので、それらの抗体は、管腔表面上で抗体コーティングを形成する。これは、免疫エフェクター細胞例えば、細胞傷害性T細胞および/またはナチュラルキラーNK細胞を誘引するように機能し得、これが次に脈管内皮細胞上で細胞媒介性細胞傷害性効果を発揮する。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する抗体結合はまた、腫瘍脈管内皮細胞においてアポトーシスを誘導し得る。実際にアポトーシスを誘導するPSPSがアポトーシスから生じるマーカーであるのではなくに対する抗体結合の報告は知られていないが、本発明者らは、観察された抗腫瘍効果について、これが別の可能性のある機構であると考える。腫瘍血管内皮細胞の表面における陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する抗体結合が、細胞の細胞骨格組織化において障害を生じ得ることも可能である。細胞骨格は表面膜の組織化においてある役割を果たすので、そして抗体結合は膜を破壊またはさらに破壊し得るので、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する抗体の結合は、二重層と相互作用する細胞骨格タンパク質に対して変化を伝達し得る。細胞骨格タンパク質の空間的組織化は、膜安定性および細胞形状を制御することが既に公知であり、そしていくつかの細胞骨格平衡の妨害は細胞完全性に対する遠大な結果を有し得る可能性がある。本発明の操作のさらなる機構は、内皮細胞表面での陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する抗体の結合が、今のところ規定されていない経路によってシグナル伝達を開始し得るということであるかもしれない。抗体結合はまた、例えば、膜レセプター、シグナル伝達タンパク質、膜チャネルなどの構成および/または相互作用を変更することによって、公知のシグナル伝達経路を妨害し得る。細胞破壊アポトーシスのシグナルは、開始されてももしくは模倣されてもよいし、そして/または保存シグナル/恒常性シグナルが阻害されてもよい。科学的に興味深いが、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する裸の抗体によって達成された脈管破壊の正確な性質を決定することは、処理を行なう必要はない。これらのカテゴリーの抗体の投与がインビボにおいて特定の抗腫瘍効果を有利に生じることが示されていることを考慮すると、この現象の基礎となる分子機構にかかわりなくこの処置が利用され得る。従って陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に結合する裸の抗体の使用は、腫瘍治療における重要な進歩を示し、調製および費用において利点が得られる。C.陰イオン性リン脂質に対する抗体およびアミノリン脂質に対する抗体本発明は、腫瘍脈管構造のマーカーの新しいカテゴリーである陰イオン性リン脂質を同定するので、1つ以上の陰イオン性リン脂質に結合する、裸の抗体および免疫複合体を、必要に応じてアミノリン脂質と組み合わせて、腫瘍診断および腫瘍処置において、ここで用いてもよい。C1.ポリクローナル抗体抗体を調製および特徴付けるための手段は、当該分野において周知である。例えば、Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory、1988を参照のこと;本明細書中で参考として援用される。ポリクローナル抗血清を調製するために、動物を免疫原性陰イオン性リン脂質および/またはアミノリン脂質本明細書中で教示されるように、H2O2および他の薬剤で処理された細胞を含むを含む組成物で免疫し、そして抗血清をこの免疫した動物から収集する。広範な動物種が、抗血清の生成のために使用され得る。代表的に、抗抗血清の生成のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウサギの比較的大容量の血液が理由で、ウサギは、ポリクローナル抗体の産生のために好ましい選択である。ポリクローナル抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原ならびに免疫に使用される動物の性質に依存して変動する。以下の種々の経路が、本発明の免疫原を投与するために使用され得る;皮下、筋内、皮内、静脈内、腹腔内、および脾臓内。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすることによって、モニターされ得る。第2の、追加免疫注射もまた与えられ得る。追加免疫する工程および力価測定する工程のプロセスは、適切な力価が達成されるまで反復される。所望の力価レベルが得られた時点で、この免疫した動物を採血し得、そして血清が単離および保存され得る。動物はまた、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る。当該分野において周知のように、特定の組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強され得る。例示的なアジュバントとしては完全フロイントアジュバント殺傷されたMycobacteriumtuberculosisを含有する、免疫応答の非特異的刺激物質;不完全フロイントアジュバント;および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質をキャリアと連結することによってか、またはVEGFをキャリアにカップリングすることによって達成され得るように、宿主免疫系を追加免疫することもまた所望され得る。例示的なキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニンKLHおよびウシ血清アルブミンBSAである。オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。当該分野においてまた公知であるように、所定の組成は、その免疫原性において変動し得る。しかし、VEGFに対する抗体の産生は著しくは困難でない。例えば、高度に特異的な抗ホスファチジルセリン抗体は、ホスファチジルセリン含有ポリアクリルアミドゲルおよびホスファチジルセリン-チトクロムcベシクルの筋肉内注射によって免疫されたウサギにおいて惹起されたManeta-Peyretら、1988;1989;各々が、本明細書中において参考として援用される。アクリルアミド移植片の使用は、抗体産生を増強したManeta-Peyretら、1988;1989。この様式で惹起された抗ホスファチジルセリン抗体は、ヒト血小板においてインサイチュでホスファチジルセリンを検出し得るManeta-Peyretら、1988。Inoue、RoteおよびRauchのグループもまた、抗PS抗体および抗PE抗体を開発した以下を参照のこと。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する抗体の作製は、種々の手段によって達成され得るが、特定の好ましい方法は、本明細書中において、実施例IVに記載される。C2.モノクローナル抗体モノクローナル抗体MAbを産生するための種々の方法がまた、現在当該分野において十分に周知である。最も標準的なモノクローナル抗体の産生技術は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するための技術と同じ系に沿って開始するAntibodies:ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、1988;本明細書中で参考として援用される。ポリクローナル抗体応答は、免疫原性陰イオン性リン脂質および/またはアミノリン脂質組成物を用いて動物を免疫することによって開始され、そして所望の力価レベルが得られる時点で、その免疫した動物を用いてMAbを産生し得る。好ましくは、本明細書中に開示される特定のスクリーニングおよび選択技術が、求められる後の特性を有する抗体を選択するために使用される。MAbは、米国特許第4,196,265号これは、本明細書中で参考として援用されるに例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製され得る。代表的に、この技術は、選択された免疫原組成物を用いて適切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を与え得るGoding、1986、第60~61頁;本明細書中で参考として援用されるが、マウスが好ましい。そして、BALB/cマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物を与えるので最も好ましい。免疫後に、所望の抗体を産生する潜在能を有する体細胞詳細には、Bリンパ球B細胞が、MAb産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器でこの脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約5×107~2×108のリンパ球を含む。次いで、免疫した動物由来の抗体産生Bリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、次いで所望の融合細胞ハイブリドーマのみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖し得なくさせる酵素欠損を有する。当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得るGoding、第65~66頁、1986;Campbell、第75~83頁、1984;各々は、本明細書中で参考として援用される。例えば、免疫した動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/1.Ag4l、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、およびS194/5XX0Bulが使用され得;ラットについて、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F、4B210、または上記に列挙されたマウス細胞株のうちの1つが使用され得;そしてU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、およびUC729-6はすべて、ヒト細胞融合に関連して有用である。抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子化学的または電気的の存在下で、4:1の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包含するが、この比率はそれぞれ約20:1~約1:1まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、KohlerおよびMilstein1975;1976;各々、本明細書中で参考として援用されるによって記載されており、そしてポリエチレングリコールPEG例えば、37v/vPEGを使用する融合方法は、Gefterら1977;本明細書中で参考として援用されるに記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切であるGoding、第71~74頁、1986;本明細書中で参考として援用される。融合手順は通常、低い頻度約1×10-6~1×10-8で生存可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞特に、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞から識別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを倍地に補充するHAT培地。アザセリンが使用される場合、ヒポキサンチンを培地に補充する。好ましい選択培地は、HATである。ヌクレオチドサルベージ経路を機能し得る細胞のみが、HAT培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼHPRTを欠損し、そしてそれらは生存し得ない。B細胞はこの経路を機能し得るが、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約2週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびB細胞から形成されたそれらのハイブリッドである。この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の抗VEGF反応性について個々のクローンの上清を試験すること約2~3週間後によって、実施される。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイdotimmunobindingassayなど。次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々のVEGF抗体産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンは無限に増殖されて、MAbを提供する。細胞株は、2つの基本的様式でMAb産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射しばしば、腹膜腔内へされ得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この動物の体液例えば、血清または腹水を穿刺して、高濃度でMAbを提供し得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、MAbは培養培地中に自然に分泌され、ここからMAbは高濃度で容易に獲得され得る。いずれかの手段によって産生されたMAbは、一般に、例えば、濾過、遠心法、および種々のクロマトグラフィー方法例えば、HPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーこれらの精製技術はすべて、当業者に周知であるを使用して、さらに精製される。これらの精製技術は各々、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分別を含む。抗体の調製に特に適切な分析方法としては、例えば、プロテインA-Sepharoseクロマトグラフィーおよび/またはプロテインG-Sepharoseクロマトグラフィーが挙げられる。D.陰イオン性リン脂質に対する第二世代の抗体およびアミノリン脂質に対する第二世代の抗体本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対して結合する第二世代の抗体を提供する。この抗体は、特性が改善されており、そして/または先行技術における抗体と関連する欠点を被らない。一群のこのような抗体が本明細書に開示されており、そのうちモノクローナル抗体9D2および3G4が現在好ましく、3G4ATCC4545抗体が特に好ましい。本発明はまた、特定の免疫技術およびスクリーニングの技術を提供し、これによって、有利な特性を有し、かつ/または欠点が少ない、~様like抗体または競合competing抗体を生成することが可能になる。D1.抗体の特性本発明の第二世代の抗体は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合するが、このようなリン脂質に対する抗体に通常は関連する病原性の特性は有さない。これは、本発明者らによって開発された新規な免疫技術およびスクリーニングの技術によって部分的には可能になった。抗リン脂質症候群APSは、抗カルジオリピンanti-cardiolipin抗体および狼瘡性抗凝固抗体lupusanticoagulantantibodiesと命名された自己抗体と関連する。これらの症候群は、静脈および動脈の血栓塞栓、血小板減少および多数の神経学的症状に対する素因に関連する。従って、これらの患者における抗リン脂質抗体は病原性抗体である。抗リン脂質抗体および抗PS抗体として何年も記載されているが、このような病原性抗体は実際に、カルジオリピン、PSまたはその両方に結合するタンパク質補因子を認識するが、一方、リン脂質自体は認識しないGalliら、1990;1993;McNeilら、1990;Rote,1996。抗カルジオリピン抗体は、β2-糖タンパク質I上の特定の領域残基281と残基288との間を認識するが、狼瘡性抗凝固抗体はプロトロンビンを認識する。同様に、疾患状態で存在する抗PE抗体は、タンパク質例えば、低分子量および高分子量のキニノーゲンHK、プレカリクレインおよび第XI因子と組み合わせて、PEに結合するSugiおよびMcIntyre,1995;1996a;1996b。この型のタンパク質認識に基づいて、患者における抗リン脂質抗体は、リン脂質からタンパク質補因子に代わって、これによって疾患の症状を生み出す。本発明の抗体は、タンパク質補因子と組み合わされたアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対して結合しないことに基づいて特に選択されているが、むしろ真のtrue抗リン脂質抗体である。従って、本発明の抗体は、タンパク質補因子に結合せず、リン脂質からタンパク質補因子に代わりもせず、従って投与に安全である。実際に、本発明の抗体を高用量で長期間用いて処理したマウスは、凝固能力の変化を示さなかったが、マウスは、抗カルジオリピン抗体または狼瘡抗凝固抗体を注射した場合、APSと反応した。背景にある機構にもかかわらず、ヒト集団に存在する抗リン脂質抗体は、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデスBranchら、1987;Staubら、1989;DrouvalakisおよびBuchanan、1998;Smirnovら、1995;Rauchら、1986;RauchおよびJanoff、1990および再発性流産Roteら、1995;Rote、1996;Vogtら、1996;1997;Katsuragawaら、1997と関連する。本発明の抗体がマウスまたはサルに投与される場合、このような症状は関係がない。また、本発明の抗体例えば、9D2抗体および3G4ATCC4545抗体によって認識されるエピトープは、アネキシンVによって認識されるのと同じではない。このことは、本明細書において、この因子がリン脂質に対するお互いの結合を交差ブロックしないと示される。3G4抗体および9D2抗体によって認識されるエピトープはおそらく、免疫原性の形態である、PSの六方充填型である。アネキシンVは、六方晶系の形態に加えて平坦なPSに結合する可能性が高い。六方晶系の形態のPSは細胞活性化と関連して原形質膜への隆起中に、そしてアポトーシス細胞上の小胞bleb中に濃縮される。従って、本発明の抗体例えば、9D2抗体および3G4ATCC4545抗体の制限された分布は、検出可能な毒性の欠失および抗体の凝固に対する効果の欠失にさらに寄与する。有利な特性を有するか、および/または副作用が減少しているかもしくは本質的に副作用がない、アミノリン脂質に対する抗体および陰イオン性リン脂質に対する抗体を生成するために、本発明は、好ましい免疫方法およびスクリーニングの方法を提供する。他の免疫技術および抗体は文献Umedaら、1989;Igarashiら、1991;Roteら、1993に報告されており、これには、関与する脂肪酸鎖の型について、報告された特異性を有するものを含むLevyら、1990;Qamarら、1990。しかし、本発明の免疫技術、および詳細には、血清に依存しない抗体の選択によって、特定の利益が得られる。Umedaら1989は、ホスファチジルセリンの立体特異的エピトープを認識するモノクローナル抗体の生成を報告した。しかし、Umedaのシステムは、Salmonellaでコーティングされたアミノリン脂質サンプルを用いてマウス脾臓へのホスファチジルセリンの直接免疫を用いるという欠点を被るUmedaら、1989。Umedaら1989によって報告される多くの抗体がまた、抗凝固活性を示すが、これは、本発明の抗体には関係しない欠点である。3G4抗体の結合プロフィールは、Umedaら1989のPSC8抗体の結合プロフィールとは異なる。本発明の抗体はまた、結合についてさらなる標的を提供し得る、全てのまたはほとんどの陰イオン性リン脂質を認識するという利点を有する。従って、本発明の第二世代の抗体は、本明細書において表4に開示されるように、9D2抗体または3G4ATCC4545抗体と実質的に同じかまたは同じリン脂質特異性を有するとして、そして血清依存性ではないとして、規定され得る。Igarashiら1991はまた、抗PS抗体の誘導を報告しているが、ここでも、脾臓内免疫を使用しており、抗原を再度静脈内注射した場合、力価のごくわずかな増大が観察された。Igarashiら1991由来のほとんどのMAbがDNAと交差反応して、多くが狼瘡性抗凝固活性を示したが、そのうちのどの欠点も、本発明者らによって開発された抗体には存在しなかった。本発明の3G4抗体の好ましい結合プロフィールはまた、Igarashiら1991の表1における抗体の結合プロフィールとは異なる。他の研究者が、1種より多くの陰イオン性リン脂質と交差反応するマウスモノクローナル抗体の狼瘡性抗凝固活性を報告しているAlvingら、1987;RauchJanoff,1990が、本発明者らは、狼瘡性抗凝固活性のない抗体を得るのには困難を経験しなかった。これは、本発明による方法、抗体および競合抗体の明確な利点である。Rauchら1986、Hasegawaら1994、Ravirajanら1995およびMenonら1997に記載されるとおり、患者からの抗体の使用を回避することに加えて、本出願はまた、文献に由来する既存の抗体例えばRoteら1993によって記載される3SB抗体と並行して比較して、本発明によって提供される抗体の有利な特性を実証する。3SB抗体は本明細書に開示される種々の方法における使用に適切な特性を有するが、本発明者らによって開発された抗体は、それにもかかわらず、例えば、3SB抗体に対する3G4抗体の抗ウイルス効果の増大によって本明細書において示されるように、競合的研究において3SB抗体を凌ぐ実施例XIII。本発明の抗体はまた、その親和性によって特徴付けられ得る。本発明の前に、文献中の抗体は比較的弱い親和性を有した報告されている。従って、特定の実施形態では、本発明の第二世代の抗体は、詳細には、本明細書に記載されるように表3に開示されるとおりELISAにおいて測定した場合の親和性が、PSについての9D2抗体または3G4ATCC4545抗体の親和性に少なくとも等しいというPSについての親和性を有する抗体として、そして血清依存性でないとして、規定される。さらに詳細には、本発明の第二世代の抗体は、表3に開示されるように、PSについての9D2抗体または3G4ATCC4545抗体の親和性に少なくとも等しいというPSについての親和性を有する抗体であるとして、そして表4に開示されるように、9D2抗体または3G4ATCC4545抗体と実質的に同じかまたは同じリン脂質特異性を有するとして、そして血清依存性ではないとして、規定される。最も好ましくは、この第二世代の抗体は、表4に開示されるように3G4ATCC4545抗体と同じリン脂質特異性を有するとして、そして血清依存性ではないとして、表3に開示されるとおり、PSについての3G4ATCC4545抗体の親和性に少なくとも等しいというPSについての親和性を有する抗体である。D2.CDR技術抗体は、可変領域および定常領域から構成される。抗体に関して本明細書において用いる場合、可変という用語は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列が広範に異なることを意味し、そしてその特定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特異性において用いられる。しかし、この可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均一には分散されない。これは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において、超可変領域と名付けられた3つのセグメントに以下に考察されるラクダ化camelized抗体以外は集中される。可変ドメインのさらに高度に保存された部分は、フレームワーク領域FRと呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメイン各々は、4つのFRそれぞれ、FR1、FR2、FR3およびFR4を含み、これはループ連結を形成する3つの超可変領域に接続されたβシート構成を主に採用しており、そしてある場合には、βシート構造の一部を形成する。各々の鎖における超可変領域は、FRと密接に近接して一緒に保持されて、他の鎖由来の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与するKabatら、1991本明細書において参考として具体的に援用される。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害における抗体の関与を示す。本明細書において用いる場合、超可変領域という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、相補性決定領域またはCDRすなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基24~34L1、50~56L2および89~97L3、ならびに重鎖可変ドメインにおける31~35H1、50~56H2および95~102H3;本明細書において参考として詳細に援用される、Kabatら、1991、および/または超可変性ループすなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基26~32L1、50~52L2および91~96L3、ならびに重鎖可変ドメインにおける26~32H1、53~55H2および96~101H3由来のアミノ酸残基を含む。フレームワーク残基またはFR残基は、本明細書に規定される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。3G4抗体ATCC4545のVh鎖およびVκ鎖のDNA配列および推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号1、2、3および4として本明細書に提供する。これらの配列は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のCDR1-3を包含する。本明細書に提供される配列および他の情報、ならびに当該分野の知識を考慮して、ある範囲の3G4様の改善された抗体および抗原結合領域をここで調製することが可能であり、従ってこれは本発明に包含される。特定の実施形態において、本発明は、ATCC4545として寄託されたハイブリドーマによって生成された抗体の少なくとも1つのCDRを提供する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに結合し、そしてATCC4545として寄託されたハイブリドーマによって生成される抗体の少なくとも1つのCDRを含む、CDR、抗体またはその抗原結合領域を提供する。本発明のさらなる局面は、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDR、またはその改変体もしくは変異型に関する。本発明の他の局面は、CDR、抗体またはその抗原結合領域に関しているが、これは少なくとも1つの第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに結合し、配列番号2もしくは配列番号4、またはその改変型もしくは変異型のアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含み、ここでこのような改変型もしくは変異型は、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに対する結合を維持する。1つの特定の実施形態において、3G4抗体ATCC4545のフレームワーク領域がマウスから、ヒトでの免疫原性を低下させるヒトのIgG例えばヒトIgG1または他のIgGサブクラスへ変化されている、抗体またはその抗原結合領域を本発明は提供する。他の実施形態において、3G4抗体ATCC4545の配列を、当該分野で公知のように、T細胞エピトープの存在について検討する。次いで、背景にある配列を変化させて、T細胞エピトープを除去、すなわち、抗体を脱免疫deimmunizeすることができる。3G4抗体のVh鎖およびVκ鎖のDNA配列およびアミノ酸配列配列番号1、2、3および4の利用可能性は、ある範囲の抗体が、ここでCDR技術を用いて調製され得ることを意味する。詳細には、無作為な変異をCDRにおいて作製して、その産物をスクリーニングして、高い親和性および/または高い特異性を有する抗体を同定する。このような変異および選択は、慣用的に抗体の分野で行われる。本明細書に開示される有利なスクリーニング技術を考慮すれば、これは本発明における使用に特に適切である。これらの技術を用いて、抗体改変体であって、それが調製される親の抗体例えば9D2抗体および3G4ATCC4545抗体に対して改善された生物学的特性を有する抗体改変体を、生成する。このような改変体、または第二世代の化合物は代表的には、親の抗体の1つ以上の置換された超可変領域残基を含む実質的な改変体である。このような置換改変体を生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。ファージディスプレイを用いる親和性成熟において、いくつかの超可変領域部位例えば、6~7部位を変異させて、各々の部位で全ての可能なアミノ置換を生成する。このように生成された抗体改変体は、各々の粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物に対する融合物として糸状ファージ粒子から一価の様式で提示される。次いで、ファージディスプレイ改変体を、本明細書に開示されるように、その生物学的活性例えば、結合親和性についてスクリーニングする。改変のための候補の超可変領域部位を特定するために、抗原結合に対して有意に寄与する同定された超可変領域残基に対してアラニンスキャニング変異誘発を実施してもよい。CDRシャッフリングおよび移植技術はまた、本発明の抗体好ましくは9D2抗体および3G4ATCC4545抗体とともに用いることができる。CDRシャッフリングは、CDR配列を特定のフレームワーク領域に挿入する参考として本明細書に詳細に援用される、Jirholtら、1998。CDR移植技術によって、単一のマスターフレームワークへのCDR配列の無作為な組み合わせが可能になる各々が本明細書において参考として詳細に援用される、Soderlindら、1999,2000。このような技術を用いて、例えば、3G4ATCC4545抗体のCDR配列を、変異誘発して複数の異なる配列を作製し、これを足場配列に組み込んで、得られた抗体改変体を所望される特徴例えばより高い親和性についてスクリーニングする。本開示における情報に照らして、抗体好ましくは9D2抗体および3G4ATCC4545抗体の抗原結合フラグメントはまた、安定性の向上を得ながら、最小化され得る。これは、免疫グロブリンVHドメインおよびVH様ドメインに基づいて単一ドメインの結合タンパク質を調製することによって達成できる本明細書において参考として援用される、Nuttallら、2000。あるいは、またはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を描写しかつ解析して、抗体と標的のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質例えばPSとの間の接触ポイントを同定し得る。このような接触残基および隣接する残基は、置換についての候補である。一旦このような改変体が生成されれば、本明細書に記載のように、その改変体の群をスクリーニングに供して、1つ以上の関連のアッセイにおいて、類似するが異なるかまたはさらに優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択する。D3.ラクダ化camelized抗体本発明の抗体のさらなる例は、ラクダ化camelized抗体である。ラクダおよびラマCamelidae、ラクダ科由来の抗体としては、軽鎖を欠き、従って重鎖のみによって形成される、特有の種類の抗体が挙げられる。これらは、ラクダ化抗体camelizedと命名されている。このような抗体の抗原結合部位は、VHHVHHと呼ばれる単一のドメインである。3G4ATCC4545抗体のVh鎖およびVκ鎖のDNA配列およびアミノ酸配列は、本明細書に提供されている配列番号1、2、3および4ので、3G4抗体のラクダ化バージョンが調製され得る。変異および構造的適合を行なって、十分な変動性を保持しつつ、単一ドメインHVVへとVH-VL対のVHを作り直し得る本明細書において参考として詳細に援用されるMuyldermansら、2001。このようなVHH構築物は、強力な抗原結合能力を有する、小さく頑丈でかつ効率的な認識単位RiechmannおよびMuyldermans,1999であり、これによって従来のVH-VL対に接近不能である新規なエピトープと相互作用するというさらなる利点を得ることができる。従って、ラクダ化抗体は、Fvフラグメントに対して似ているが、さらなる利点を有し得る。米国特許第5,800,988号、同第6,005,079号、PCT出願番号WO94/04678、PCT出願番号WO94/25591、RiechmannおよびMuyldermans1999およびMuyldermansら2001は各々が、ラクダ化された抗体の生成をなおさらに記載して可能にするために、参考として本明細書に詳細に援用される。従って、3G4抗体からのCDRは、Camelidae抗体の重鎖免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワークに移植され得る。D4.CDR配列従って、本発明のさらなる局面は、抗体の重鎖および軽鎖例えば9D2および3G4、そして好ましくは3G4ATCC4545の重鎖および軽鎖のCDR領域をコードする単離されたDNAセグメントおよび組み換えベクター、ならびに、DNA技術の適用を通じて、このようなCDR領域を発現する組み換え宿主細胞およびファージを作製および使用することに関する。従って、本発明は、ATCC4545として寄託されたハイブリドーマによって生成された抗体の少なくとも1つのCDRをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、CDR、抗体またはその抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供するが、このポリヌクレオチドは、少なくとも第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに結合し、そしてATCC4545として寄託されたハイブリドーマによって生成された抗体の少なくとも1つのCDRを含む。本発明のさらなる局面は、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列、またはその改変体型もしくは変異型を有する、少なくとも1つのCDRをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明の他の局面は、CDR、抗体またはその抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関し、このポリヌクレオチドは、少なくとも第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに結合し、そして配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列、またはその改変体型もしくは変異型のアミノ酸配列を有する、少なくとも1つのCDR含み、ここでこのような改変体型または変異型は、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに対する結合を維持する。本発明の他の局面において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその改変型もしくは変異型を含む。詳細には、この単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1もしくは配列番号3のヌクレオチド配列、またはその改変型もしくは変異型を含み、このヌクレオチド配列は、少なくとも第一のアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに結合する、CDR、抗体またはその抗原結合領域をコードし、ここでこのような任意の改変型または変異型は、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくはPSに対する結合を維持する。従って、本発明は、総ゲノムDNAを含まず、そして抗陰イオン性リン脂質または抗アミノリン脂質抗体の重鎖および軽鎖例えば9D2および3G4、そして好ましくは3G4ATCC4545の、重鎖および軽鎖のCDR領域を発現し得る、任意の哺乳動物好ましくはヒトまたはマウスから単離可能なポリヌクレオチドセグメントおよびDNAセグメントに関する。本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドセグメントおよびDNAセグメントという用語は、特定の種の総ゲノムDNAから単離されているポリヌクレオチド分子およびDNA分子をいう。ポリヌクレオチドセグメトおよびDNAセグメントという用語内に含まれるのは、DNAセグメントおよびこのようなセグメントのさらに小さいセグメントであり、これはまた、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組み換えベクターでもある。同様に、抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質抗体の重鎖および軽鎖例えば9D2および3G4、そして好ましくは3G4の重鎖および軽鎖の精製されたCDR領域をコードするコードセグメントまたは単離された遺伝子部分を含むDNAセグメントとは、このようなコード配列を含むDNAセグメントをいい、そして特定の局面では、調節配列であって、他の天然に存在する遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されたものをいう。これに関して、遺伝子という用語は、単に機能的タンパク質コード単位、機能的ポリペプチドコード単位または機能的ペプチドコード単位をいうために用いられる。当業者によって理解されるとおり、この機能的な用語は、適切な抗原結合タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するかまたは発現するように適合され得る、ネイティブな抗体コード配列、およびそれより小さい操作されたセグメントを包含する。他のコード配列から実質的に単離されたとは、目的のコードセグメントまたは単離された遺伝子部分が、DNAセグメントのコード領域の有意な部分を形成すること、およびこのDNAセグメントが、天然に存在するコードDNAの大部分例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子もしくはcDNAコード領域を含まないということを意味する。当然ながら、このことは、もともと単離されたDNAセグメントをいい、人為的にこのセグメントに後で付加された遺伝子もコード領域も除外しない。特定の実施形態では、本発明は、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列に対して、少なくとも約75、より好ましくは、少なくとも約80、より好ましくは、少なくとも約85、より好ましくは少なくとも約90、91、92、93、94および最も好ましくは、少なくとも約95、96、97、98もしくは99程度のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列領域を含む、少なくとも第一の配列領域を含む、抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体の重鎖および軽鎖例えば9D2および3G4、そして好ましくは3G4重鎖および軽鎖のCDR領域をコードするDNA配列を組み込む、単離されたコードセグメントまたは単離された遺伝子部分および組み換えベクターに関する;ここでこのCDR領域は、配列番号2または配列番号2のアミノ酸配列のCDR領域の生物学的特性を少なくとも実質的に維持する。本明細書において開示されるように、この配列は、特定の生物学的に機能的な等価なアミノ酸または保存的置換を含んでもよい。他の配列は、当業者によって公知であって本明細書にさらに記載されるように、CDRまたはCDRを含む抗体の特性を改善するように意図的に操作された、機能的に等価でないアミノ酸または非保存置換を含み得る。アミノ酸および核酸の配列は、さらなる残基、例えば、さらなるN末端もしくはC末端のアミノ酸、または5’もしくは3’の配列を含んでもよく、そしてそれでも、好ましくはタンパク質発現が関与する生物学的なタンパク質活性の維持または改善を含む上記の規準をこの配列が満たす限り、本発明の配列に相当する。末端配列の付加は、コード領域およびまたは制御領域の5’または3’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含む。従って、本発明の核酸セグメントは、他のDNA配列例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなどと組み合わされてもよく、その結果その全体的な長さはかなり変えられ得る。従って、ほとんどの任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ると考えられるが、全体の長さは、意図される組み換えDNAプロトコールにおける調製および使用の容易さによって限定されることが好ましい。従って、組み換えベクターは本発明のさらなる局面を形成する。特に有用なベクターは、DNAセグメントのコード部分がプロモーターの制御下に位置するベクターであることが企図される。概して、排他的ではないが、組み換えプロモーターまたは異種のプロモーターすなわち、その天然の環境におけるコード配列とは通常では関連しないプロモーターが使用される。このようなプロモーターとしては、このプロモーターが、発現のために選択された細胞型、生物または動物においてさえ、DNAセグメントの発現に有効に指向する限りは、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、真核生物プロモーターおよび哺乳動物プロモーターを挙げ得る。タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型の組み合わせの使用は、分子生物学の当業者に公知である。使用されるプロモーターは、構成的であってもよく、または誘導性であってもよく、そして組み換えタンパク質または組換えペプチドの大規模産生において有利であるような、導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指向する適切な条件下で用いられ得る。本発明の核酸配列の発現は、当業者によって公知であり、本明細書にさらに記載される、任意の1つ以上の標準的技術によって都合よく達成され得る。例えば、融合タンパク質の組み換え発現の後の説明は、核酸レベルで別のコード配列に作動可能に会合されない抗体および抗体フラグメントに対して同等に十分にあてはまる。E.さらなる抗体調製技術E1.ファージミドライブラリー由来の抗体組換え技術は、今や、一定範囲の抗体をコードする組換え遺伝子に由来する所望の特異性を有する抗体の調製を可能にしているVanDijkら、1989;本明細書中に参考として援用される。特定の組換え技術は、免疫した動物の脾臓から単離されたRNAから調製されるコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を包含するMorrisonら、1986;WinterおよびMilstein、1991;Barbasら、1992;各々が本明細書中に参考として援用される。このような方法のために、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーは免疫した動物の脾臓から単離されたRNAから調製され、そして適切な抗体を発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞を用いてパニングすることにより選択される。従来のハイブリドーマ技術を超えるこのアプローチの利点は、約104倍もの多くの抗体が1回で生成およびスクリーニングされ得ること、ならびに新たな特異性がH鎖およびL鎖の組み合わせにより生成されることである。このことは、生成される適切な抗体の割合をさらに増大させる。細菌中で、多様な抗体分子の大きなレパートリーを生成するための1つの方法は、ベクターとしてバクテリオファージλを利用するHuseら、1989;本明細書中に参考として援用される。λベクターを使用する抗体の生成は、DNA配列の重鎖および軽鎖集団を別々の開始ベクターへクローニングすることを包含する。このベクターは、引き続きランダムに組み合わされて、抗体フラグメントを形成するために重鎖および軽鎖の同時発現を指向する単一のベクターを形成する。重鎖および軽鎖のDNA配列は、選択された抗原で免疫された動物に由来する脾臓細胞またはそれらのハイブリドーマから単離されたmRNAの増幅により好ましくは、PCRTMまたは関連増幅技術により得られる。重鎖および軽鎖の配列は、代表的には、開始ベクターへの重鎖および軽鎖セグメントのクローニングを容易にするために、増幅されたDNAセグメントの末端に制限部位を組み込むプライマーを使用して増幅される。完全にまたは部分的に合成的である抗体結合部位すなわちパラトープの大きなライブラリーを作製およびスクリーニングするための別の方法は、糸状ファージ例えば、M13、flまたはfdに由来するディスプレイベクターを利用する。これらの糸状ファージディスプレイベクターファージミドともいわれるは、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリーを生じる。この技術は、糸状ファージ複製のアセンブリ段階の間に遺伝子産物および遺伝子を連結するための手段として、糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメインを使用し、そしてこれは、コンビナトリアルライブラリーから抗体をクローニングおよび発現するために使用されているKangら、1991;Barbasら、1991;各々が本明細書中に参考として援用される。糸状ファージディスプレイのためのこの一般的技術は、米国特許第5,658,727号本明細書中に参考として援用されるに記載される。大部分の一般的認識において、この方法は、単一のベクター系を使用して、抗体遺伝子レパートリーから予め選択されたリガンド-結合特異性を同時クローニングおよびスクリーニングするための系を提供する。予め選択されたリガンド-結合能力についてライブラリーの単離されたメンバーをスクリーニングすることにより、ライブラリーに由来するメンバーをコードする遺伝子を単離するための簡便な手段を用いて、発現された抗体分子の結合能力の相関づけが可能になる。発現およびスクリーニングの関連づけは、機能的抗体のアセンブリを可能にするための細菌細胞のペリプラズムへの融合ポリペプチドの標的化と、目的のライブラリーメンバーの簡便なスクリーニングを可能にするためのファージアセンブリの間の糸状ファージ粒子のコートへの融合タンパク質の標的化との組み合わせにより達成される。ペリプラズム標的化は、融合ポリペプチド中の分泌シグナルドメインの存在により提供される。ファージ粒子への標的化は、融合ポリペプチド中の糸状ファージコートタンパク質膜アンカードメインすなわち、cpIII由来か、またはcpVIII由来の膜アンカードメインの存在により提供される。糸状ファージベースのコンビナトリアル抗体ライブラリーの多様性は、重鎖および軽鎖の遺伝子のシャッフリングにより、ライブラリーのクローニングされた重鎖遺伝子の1つ以上の相補性決定領域を改変することにより、または誤りがちなerror-proneポリメラーゼ連鎖反応によりライブラリーへランダム変異を導入することにより増大され得る。ファージミドライブラリーをスクリーニングするためのさらなる方法は、米国特許第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,403,484号;および同第5,223,409号各々が本明細書中に参考として援用されるに記載される。大きなコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングするための別の方法が開発され、この方法は、M13、flまたはfdのような糸状バクテリオファージの表面での多様な重鎖および軽鎖配列の集団の発現を利用する米国特許第5,698,426号;本明細書中に参考として援用される。多様な重鎖Hcおよび軽鎖Lc配列の2つの集団は、ポリメラーゼ連鎖反応PCRTMにより合成される。これらの集団は、発現のために必要なエレメントを含む、別個のM13ベースのベクターにクローニングされる。重鎖ベクターは、重鎖配列の翻訳がgVIII-Hc融合タンパク質を生成するように、遺伝子VIIIgVIIIコートタンパク質配列を含む。2つのベクターの集団は、HcおよびLcの配列を含むベクター部分のみが単一の環状ベクターに連結されるように、ランダムに組み合わされる。組み合わされたベクターは、M13での2つのポリペプチドのアセンブリおよび表面発現のためにHcおよびLcの配列の両方の同時発現を指向する米国特許第5,698,426号;本明細書中に参考として援用される。組み合わせ工程は、単一のベクターに2つの多様な集団内の異なるHcコ-ド配列およびLcコード配列をランダムに結びつける。各々の独立したベクターから与えられたこのベクター配列は、生存ファージの生成のために必要である。さらに、擬gVIII配列は2つの開始ベクターのうちの一方のみに含まれるので、Lc会合gVIII-Hc融合タンパク質としての機能的抗体フラグメントの同時発現は、ベクター配列が単一のベクター内に連結されるまではファージ表面で達成され得ない。抗体ライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー株において行われる。Hc配列とgVIII配列との間のアンバー停止コドンは、非サプレッサー株において2つの成分を連結しない。非サプレッサー株から生成されたファージを単離し、そしてサプレッサー株を感染させることは、発現の間に、gVIII配列にHc配列を連結させる。感染後にサプレッサー株を培養することは、gVIII融合タンパク質gVIII-Fab融合タンパク質としてライブラリー内の全ての抗体種をM13ファージの表面で同時発現させることを可能にする。あるいは、このDNAは、非サプレッサー株から単離され得、次いで、同じ効果を達成するようにサプレッサー株に導入され得る。表面発現ライブラリーは、標準的アフィニティー単離手順により予め選択された分子を結合する特異的Fabフラグメントについてスクリーニングされる。このような方法としては、例えば、パニングParmleyおよびSmith、1988;本明細書中に参考として援用される、アフィニティークロマトグラフィーおよび固相ブロッティング手順が挙げられる。パニングは、高力価のファージが容易に、迅速かつ少容量でスクリーニングされ得るので好ましい。さらに、この手順は、集団内の微量なFabフラグメント種を選択し得る。この微量のフラグメント種は、他の方法では検出不能であり、そして実質的に均質な集団にまで増殖されない。選択されたFabフラグメントは、このファージ集団の増殖後に、ポリペプチドをコードする核酸を配列決定することにより特徴づけられ得る。抗体の多様なライブラリーを作製し、所望の結合特異性についてスクリーニングするための別の方法は、米国特許第5,667,988号および同第5,759,817号各々が、本明細書中に参考として援用されるに記載される。この方法は、免疫グロブリン可変重鎖および可変軽鎖の可変ドメインのCDR領域に縮重、ならびにファージミドの表面での変異誘発したポリペプチドのディスプレイを組み込むために、縮重オリゴヌクレオチドおよびプライマー伸長反応を用いるファージミドライブラリーの形態での、ヘテロダイマーの免疫グロブリン分子のライブラリーの調製を包含する。それ以降、ディスプレイタンパク質は、予め選択された抗原に結合する能力についてスクリーニングされる。ヘテロダイマー免疫グロブリン分子を生成するための方法は、一般に、1目的の重鎖または軽鎖のV領域コード遺伝子をファージミドディスプレイベクターに導入すること;2無作為化された結合部位をファージミドディスプレイタンパク質ベクターへ、抗体V領域遺伝子のCDRに対する相同性の領域を含み、そして無作為化したコード配列を生成するための縮重領域を含むオリゴヌクレオチドでのプライマー伸長により導入して、各々がファージミド表面ディスプレイタンパク質上に提示される異なる推定結合部位を発現し得るディスプレイベクターの大きな集団を形成すること;3糸状ファージ粒子の表面でディスプレイタンパク質および結合部位を発現させること;ならびに4アフィニティー技術例えば、予め選択された抗原に対するファージ粒子のパニングを用いて表面発現したファージ粒子を単離スクリーニングし、このことによって、予め選択された抗原に結合する結合部位を含むディスプレイタンパク質を含む1種以上のファージミドを単離することを包含する。抗体の多様なライブラリーを作製し、そして所望の結合特異性についてスクリーニングするためのこの方法のさらなるバリエーションは、米国特許第5,702,892号本明細書中に参考として援用されるに記載される。この方法においては、重鎖配列のみが用いられ、この重鎖配列は、CDRI超可変領域またはCDRIII超可変領域のいずれかをコードする全てのヌクレオチド位置で無作為化され、そしてCDRにおける遺伝的可変性は、任意の生物学的プロセスとは独立して生成される。この方法において、2つのライブラリーを操作して、重鎖遺伝子構造の骨格内のオリゴヌクレオチドモチーフを遺伝的にシャッフルする。CDRIまたはCDRIIIのいずれかのランダム変異によって、重鎖遺伝子の超可変領域は、高度に多様な配列の収集物を生じるように再構築された。変異した遺伝子配列の収集物によりコードされる重鎖タンパク質は、2つの免疫グロブリン鎖の一方のみを必要とするが、免疫グロブリンの結合特性の全てを有する潜在能力を保有した。詳細には、この方法は、免疫グロブリン軽鎖タンパク質の非存在下で行われる。改変した重鎖タンパク質を提示するファージライブラリーは、固定化されたリガンドとともにインキュベートされて、固定化されたリガンドに特異的に結合する組換えタンパク質をコードするクローンが選択される。次いで、結合したファージを固定化されたリガンドから解離し、そして細菌宿主細胞中での増殖により増幅させる。個々のウイルスプラーク各々が異なる組換えタンパク質を発現するは拡大され、次いで、個々のクローンは結合活性についてスクリーニングされ得る。E2.ヒトリンパ球由来の抗体リン脂質に対する抗体は、ヒト集団において存在する。しかし、これらの抗体は、代表的には、疾患と関連し、本発明におけるそれらの使用は、好ましくは、避けられるべきである。しかし、健常な被験体由来のヒトリンパ球は、本発明における使用のための抗体を作製するための開始物質として適切であるとして使用され得る。インビトロ免疫、または抗原刺激をまた使用して、ヒト抗体を生成し得る。このような技術を使用して、正常な健全な被験体由来の末梢血リンパ球を単にインビトロにおいて陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質で抗体産生細胞を刺激することにより刺激し得る。このようなインビトロ免疫は、一般的に、リンパ球の混合集団混合リンパ球培養物、MLC中での非免疫Bリンパ球の抗原特異的活性化を含む。インビトロ免疫はまた、B細胞増殖因子およびB細胞分化因子ならびにリンホカインにより支持され得る。これらの方法により産生される抗体は、しばしば、IgM抗体であるBorrebaeckら、1986;本明細書中に参考として援用される。別の方法が記載され米国特許第5,681,729号、本明細書中に参考として援用される、ここで、主にIgGまたはIgA抗体を産生するヒトリンパ球が得られ得る。この方法は、一般的な意味において、免疫不全動物へヒトリンパ球を移植し、その結果、ヒトリンパ球が動物の身体内に取りこまれ;抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を生成するように所望の抗原を用いて動物を免疫し;そして動物から抗体を産生するヒトリンパ球を回収する工程を包含する。従って、産生されたヒトリンパ球を使用して、抗体を産生するヒトリンパ球を不死化し、抗体を産生する得られた不死化ヒト起源リンパ球をクローニングし、そしてクローニングされた不死化ヒト起源リンパ球から所望の抗原に特異的なモノクローナル抗体を回収することによりモノクローナル抗体を産生し得る。この技術において使用され得る免疫不全動物は、動物にヒトリンパ球が移植された場合に拒絶を示さない免疫不全動物である。このような動物は、物理的、化学的、または生物学的な処置により人工的に調製され得る。任意の免疫不全動物が使用され得る。ヒトリンパ球は、ヒト末梢血、脾臓、リンパ節、扁桃腺などから得られ得る。動物における移植されたヒトリンパ球の取りこみは、単に動物にヒトリンパ球を投与することにより達成され得る。投与経路は制限されず、そして例えば、皮下、静脈内、または腹腔内であり得る。ヒトリンパ球の用量は制限されず、そして通常は、動物あたり106~108のリンパ球であり得る。次いで、免疫不全動物は、所望の抗原で免疫される。免疫後、ヒトリンパ球が、任意の慣習的な方法により、血液、脾臓、リンパ節または他のリンパ組織から回収される。例えば、単核細胞は、Ficoll-Hypaque比重:1.077遠心法により分離され得、そしてプラスチックディッシュ吸着法により単球が回収され得る。免疫不全動物由来の夾雑細胞は、動物細胞に特異的な抗血清を用いることにより取り除かれ得る。抗血清は、例えば、免疫不全動物の脾臓細胞で第2の異なる動物を免疫し、そして異なる免疫動物から血清を回収することにより得られ得る。抗血清での処置は、任意の段階で実施され得る。ヒトリンパ球はまた、マーカーとして、細胞表面上で発現されるヒト免疫グロブリンを使用する免疫学的方法により回収され得る。これらの方法により、一つ以上の選択された陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に特異的なIgG抗体およびIgA抗体を主に産生するヒトリンパ球が得られ得る。次いで、モノクローナル抗体が、不死化、選択、細胞増殖、および抗体産生によりヒトリンパ球から得られる。E3.ヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウス組換え技術は、今や抗体の調製のために利用可能である。上記に開示される組換え免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、別の分子クローニングアプローチは、抗体をヒト抗体ライブラリーを含有するトランスジェニックマウスから調製することである。このような技術は、米国特許第5,545,807号に記載され、これは、本明細書に参考として援用される。最も一般的な意味において、これらの方法は、その生殖系統に、ヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料か、または免疫グロブリンのレパートリーをコードするように再編成され得る遺伝子材料を挿入したトランスジェニック動物の産生を包含する。挿入された遺伝子材料は、ヒト供給源から産生され得るか、または合成により産生され得る。その材料は、公知の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードし得るか、または改変された免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするように改変され得る。挿入された遺伝子材料は、トランスジェニック動物において発現され、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを産生する。その遺伝子材料は、たとえ、その挿入された遺伝子材料が、生殖系列の誤った位置に、または誤った相対位置に組み込まれたとしても、その一部が挿入された遺伝子材料に由来する免疫グロブリンのレパートリーが、産生され得るように、トランスジェニック動物において再編成されることが見出される。その挿入された遺伝子材料は、プラスミドおよび/またはコスミドのような原核生物ベクターにクローン化されたDNAの形態であり得る。より大きなDNAフラグメントは、酵母人工染色体ベクターを使用してBurkeら、1987;本明細書中に参考として援用される、または染色体フラグメントを導入することによりRicherおよびLo、1989;本明細書中に参考として援用される挿入される。その挿入された遺伝子材料は、従来の様式で宿主に例えば、注入によって、または他の手順によって、受精卵または胚性幹細胞に導入され得る。好ましい局面において、得られるトランスジェニック動物が、免疫グロブリンを産生するときに、挿入されたヒト遺伝子材料のみを使用するように、免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子材料をはじめから保有しない宿主動物が利用される。これは、関連する遺伝子材料を欠失する天然に存在する変異体宿主を使用して、または人工的に、例えば、細胞株で、関連する遺伝子材料が除去されている宿主を究極的に作製するために、変異体を作製することによってのいずれかで、達成され得る。宿主動物が免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子材料を保有する場合、トランスジェニック動物は、天然に存在する遺伝子材料および挿入された遺伝子材料を保有し、そして天然に存在する遺伝子材料、挿入された遺伝子材料、および両方のタイプの遺伝子材料の混合物に由来する免疫グロブリンを産生する。この場合、その所望の免疫グロブリンは、トランスジェニック動物に由来するハイブリドーマを、例えば、抗体遺伝子発現の対立遺伝子排除の現象または示差的染色体損失を利用して、スクリーニングすることによって得られ得る。一旦適切なトランスジェニック動物が調製されると、その動物は、所望の免疫原で単に免疫される。挿入される材料の性質に依存して、その動物は、外来起源のその遺伝子材料が、免疫グロブリンの一部のみをコードする場合、例えば、混合されたマウス/ヒト起源のキメラ免疫グロブリンを産生し得る;または、その動物は、外来起源の遺伝子材料が、免疫グロブリン全体をコードする場合、完全に外来の免疫グロブリン例えば、完全にヒト起源のを産生し得る。ポリクローナル抗血清は、免疫に続いて、トランスジェニック動物から産生され得る。免疫グロブリン産生細胞は、目的の免疫グロブリンを産生する動物から除去され得る。好ましくは、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物から、例えば、その動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合し、そして得られるハイブリドーマをスクリーニングして所望の抗体を産生するものを選択することによって、産生される。このようなプロセスのための適切な技術は、本明細書に記載される。代替のアプローチにおいて、その遺伝子材料は、所望の抗体が、動物の血清のような体液、またはミルク、初乳もしくは唾液のような外部分泌液において産生されるような様式で、動物に組み込まれ得る。例えば、インビトロでヒト免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする遺伝子材料を、ミルクタンパク質をコードする哺乳動物の遺伝子に挿入し、次いで、その遺伝子をその哺乳動物の受精卵に、例えば、注入により、導入することによって、その卵は、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子材料に少なくとも部分的に由来する免疫グロブリンを含有するミルクを産生する成体雌哺乳動物に成長し得る。次いで、所望の抗体は、ミルクから回収され得る。このようなプロセスを行うための適切な技術は、当業者に公知である。上記のトランスジェニック動物は、通常、単一のアイソタイプの、より詳細にはB細胞成熟に必須であるアイソタイプ例えば、IgMおよびたぶんIgDのヒト抗体を産生するために利用される。ヒト抗体を産生するための別の好ましい方法は、米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,611,016号;および同第5,770,429号各々が本明細書に参考として援用されるに記載される技術を使用することである。そこでは、B細胞発生のために必要とされるアイソタイプから他のアイソタイプへ変換し得るトランスジェニック動物が記載される。Bリンパ球の発生において、その細胞は、まず生産的に再編成されたVHおよびVL領域によって決定される結合特異性を有するIgMを産生する。その結果、各B細胞およびその子孫細胞は、同じLおよびH鎖V領域を有する抗体を合成するが、これらは、H鎖のアイソタイプを交換し得る。ミューまたはデルタ定常領域の使用は、交互のスプライシングによって大部分決定され、IgMおよびIgDが、単一の細胞において同時発現されることを可能にする。他の重鎖アイソタイプγ、α、およびεは、遺伝子再編成事象が、CミューエキソンおよびCデルタエキソンを削除した後に、天然においてのみ発現される。この遺伝子の再編成プロセスは、アイソタイプスイッチングと呼ばれ、代表的には、各重鎖遺伝子のすぐ上流に位置するデルタを除くいわゆるスイッチセグメント間の組換えによって生じる。個々のスイッチセグメントは、2kbと10kbとの間の長さであり、そして主に短い反復した配列からなる。これらの理由により、導入遺伝子は、転写調節配列を、アイソタイプスイッチングに利用されるべき各スイッチ領域の約1~2kb上流内に組み込んでいることが好ましい。これらの転写調節配列は、好ましくは、プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み、そしてより好ましくは、スイッチ領域に天然に結合するすなわち、生殖系統の構成において生じる5’隣接すなわち、上流領域を含む。1つのスイッチ領域からの5’隣接配列は、導入遺伝子構築のために異なるスイッチ領域に作動可能に連結され得るが、いくつかの実施形態では、導入遺伝子構築物に組み込まれている各スイッチ領域は、天然に存在する生殖系統構成においてすぐ上流に存在する5’隣接領域を有することが好ましい。免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する配列情報は、公知であるMillsら、1990;Siderasら、1989;各々、参考として本明細書に援用される。米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,661,016号;および第5,770,429号に記載される方法では、トランスジェニック動物内に含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、アイソタイプのスイッチングに至るB細胞発達の経路を通じて正確に機能する。従って、この方法では、これらの導入遺伝子は、アイソタイプスイッチングおよび以下の1つ以上を生成するように構築される:1高レベルおよび細胞型特異的発現、2機能的遺伝子再配置、3対立遺伝子排除の活性化および対立遺伝子排除に対する応答、4十分な一次レパートリーの発現、5シグナル伝達、6体細胞過剰変異、および7免疫応答の間の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。導入遺伝子機能に対する重要な要件は、広範な範囲の抗原に対する二次免疫応答の引金となるために十分に多様性である一次抗体レパートリーの生成である。再配置された重鎖遺伝子鎖は、各々がいくつかのエキソンによりコードされる、シグナルペプチドエキソン、可変領域エキソンおよび多ドメイン定常領域の領域のタンデムアレイからなる。これらの定常領域遺伝子の各々は、異なるクラスの免疫グロブリンの定常部分をコードする。B細胞発達の間に、V領域近位定常領域は欠失し、新たな重鎖クラスの発現に至る。各重鎖クラスについて、RNAスプライシングの選択的パターンが、膜貫通免疫グロブリンおよび分泌された免疫グロブリンの両方を生じる。ヒト重鎖遺伝子座は、2Mbにまたがるほぼ200V遺伝子セグメント、約40kbにまたがるほぼ30D遺伝子セグメント、3kb内のクラスターである6つのJセグメント、およびほぼ300kbにわたって広がる9つの定常領域遺伝子セグメントからなる。全長遺伝子座は、第14染色体の長腕の遠位部分のほぼ2.5Mbにまたがる。6つの公知のVHファミリーのすべてのメンバー、DおよびJ遺伝子セグメント、ならびにμ、δ、γ3、γ1およびα1定常領域を含む重鎖導入遺伝子フラグメントは公知であるBermanら、1988;参考として本明細書に援用される。すべての必要な遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖遺伝子座からの調節配列を含むゲノムフラグメントもまた同様に構築される。首尾良く再配置された免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子の発現は、通常、トランスジェニック非ヒト動物において内因性免疫グロブリン遺伝子の再配置を抑制することによって優性効果を有する。しかし、特定の実施形態では、例えば、導入遺伝子と内因性Ig配列との間のトランススイッチングにより、ヒト可変領域および非ヒト例えばマウス定常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないように、内因性Ig遺伝子座の完全不活性化を行うことが所望される。胚性幹細胞技術および相同的組換えを用い、内因性免疫グロブリンレパートリーを容易に排除し得る。さらに、内因性Ig遺伝子の抑制は、アンチセンス技法のような種々の技法を用いて達成され得る。本発明の他の局面では、トランススイッチされた免疫グロブリンを生成することが所望され得る。このようなキメラトランススイッチ免疫グロブリンを含む抗体は、例えば、宿主細胞においてエフェクター機能の保持のために、非ヒト例えばマウス定常領域を有することが所望される種々の適用のために用いられ得る。マウス定常領域の存在は、ヒト定常領域に比べ、例えば、このようなキメラ抗体がマウス疾患モデルにおいて試験され得るように、マウスエフェクター機能例えば、ADCC、マウス補体固定化を提供するという利点を与え得る。動物試験の次に、ヒト可変領域コード配列が、例えば、PCRTM増幅または供給源ハイブリドーマクローンからのcDNAクローニングにより単離され、そしてヒト治療使用により適切なヒト配列抗体をコードするための所望のヒト定常領域をコードする配列にスプライスされ得る。E4.ヒト化抗体一般に、ヒト抗体は、ヒト治療における使用に少なくとも3つの可能な利点を有する。第1に、そのエフェクター部分はヒトであるので、例えば、補体依存性細胞傷害性CDCまたは抗体依存性細胞傷害性ADCCによって標的細胞をより効率的に破壊するために、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用し得る。第2に、ヒト免疫系は、異物として抗体を認識しない。第3に、ヒト循環中の半減期は、天然に存在するヒト抗体と類似であり、より少なくかつより少ない用量を与えることを可能にする。ヒト抗体を調製する種々の方法が本明細書中に提供される。ヒト抗体に加えて、ヒト化抗体は多くの利点を有する。ヒト化抗体は、一般に、ヒト定常および/または可変領域ドメインまたは特定の変更を保持する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたはその他の種からのキメラまたは変異体モノクローナル抗体である。いわゆるヒト化抗体を生成するための技法は、当業者に周知である。ヒト化抗体もまた、先行する利点を共有する。第1に、エフェクター部分はなおヒトである。第2に、ヒト免疫系は、フレームワークまたは定常領域を異物として認識せず、そしてそれ故、このような注入抗体に対する抗体応答は、完全に異物であるマウス抗体に対してより少ない。第3に、注入されたヒト化抗体は、注入されたマウス抗体とは反対に、天然に存在するヒト抗体により類似する半減期を有し、またより少なくかつより少ない頻度の用量を与える。ヒト化抗体を産生する多くの方法が記載されている。新たな人工タンパク質分子またはキメラ抗体を形成するための、タンパク質ジスルフィド結合を通じて連結される抗体ドメインの制御された再配置が利用され得るKoniecznyら、1981;本明細書中に参考として援用される。組換えDNA技術もまた、マウス抗体可変軽鎖および重鎖ドメインと、ヒト抗体軽鎖および重鎖定常ドメインとをコードするDNA配列間の遺伝子融合を構築するために用いられ得るMorrisonら、1984;本明細書中に参考として援用される。マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分または相補性決定領域CDRをコードするDNA配列を、ヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワークをコードするDNA配列中に分子手段により挿入し得るJonesら、1986;Riechmannら、1988。発現された組換え産物は、新形態またはヒト化抗体と呼ばれ、そしてヒト抗体軽鎖または重鎖およびマウスモノクローナル抗体の抗原認識部分であるCDRのフレームワークを含む。ヒト化抗体を生成する別の方法が、米国特許第5,639,641号に記載され、本明細書中に参考として援用される。この方法は、再現により、可変領域においてヒト表面の提示に起因する改良された治療効力を有するヒト化げっ歯類抗体を提供する。この方法では:1抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置アラインメントを生成し、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露位置のセットを与える。ここで、すべての可変領域に対するアラインメント位置は、少なくとも約98同一である;2重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットがげっ歯類抗体またはそのフラグメントに対して規定される;3このげっ歯類表面曝露アミノ酸残基のセットに最も近接して同一である、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが同定される;4工程2で規定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットが、げっ歯類抗体の相補性決定領域の任意の残基の任意の原子の5Å内にあるようなアミノ酸残基を除いて、工程3で同定された重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットで置換される;および5結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体が産生される。ヒト化抗体の産生についての類似の方法は、米国特許第5,693,762号;同第5,693,761号;同第5,585,089号;および同第5,530,101号各々が本明細書中で参考として援用されるに記載される。これらの方法は、1以上の相補性決定領域CDRおよびドナー免疫グロブリンに由来するさらなるアミノ酸ならびに受け入れているヒト化免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリンを産生することを包含する。各々のヒト化免疫グロブリン鎖は、通常、CDRに加えて、ドナー免疫グロブリン中のCDRに直接隣接する1以上のアミノ酸または分子モデリングにより推定される約3Å以内の1以上のアミノ酸のような、CDRと相互作用して結合親和性をもたらし得るドナー免疫グロブリンフレームワークに由来するアミノ酸を含む。重鎖および軽鎖は、米国特許第5,693,762号;同第5,693,761号;同第5,585,089号;および同第5,530,101号各々が本明細書中で参考として援用されるに記載される種々の位置基準の、いずれか1つ、任意の組合せ、または全てを使用することによって、各々設計され得る。インタクトな抗体に組み合わされる場合、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、そして本来の抗原に対するドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を保持する。ヒト化抗体を産生するためのさらなる方法は、米国特許第5,565,332号および同第5,733,743号各々が本明細書中で参考として援用されるに記載される。この方法は、抗体をヒト化する概念を、本明細書中にもまた詳細に記載されるファージミドライブラリーと組み合わせる。一般的な意味では、この方法は、目的の抗原に対する抗体または抗体の集団の抗原結合部位に由来する配列を利用する。従って、単一のげっ歯類抗体について、抗体の抗原結合部位の部分を含む配列は、組み合せて完全な抗原結合部位を作製し得るヒト抗体の配列の多様なレパートリーと組み合せられ得る。このプロセスにより作製される抗原結合部位は、本来のげっ歯類抗体の配列の部分のみが同様の様式にて抗原と接触するようであるという点で、CDRグラフティングgraftingにより作製される抗原結合部位とは異なる。選択されたヒト配列は、配列において異なるようであり、そして本来の結合部位のそれらからの抗原と代替的に接触する。しかし、抗原に対する本来の配列の部分の結合ならびに抗原およびその抗原結合部位の形状により課される制約は、抗原の同じ領域またはエピトープに対するヒト配列の新たな接触を駆動するようである。従って、このプロセスは、エピトープインプリント選択EISと呼ばれている。動物の抗体で開始して、1つのプロセスは、部分的にヒト抗体である抗体の選択を生じる。このような抗体は、治療において直接的にまたは少数の重要な残基の変更の後に使用されるべきヒト抗体と配列において十分に類似し得る。ヒト配列を有する選択された抗体のげっ歯類成分の間の配列の差異は、例えば、個々の残基の部位特異的変異誘発によってか、またはループ全体のCDRグラフティングによって、ヒト配列の残基で異なる残基を置換することによって最小化され得る。しかし、完全なヒト配列を有する抗体もまた、作製され得る。従って、EISは、それぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する部分的なヒト抗体またはそれぞれ、動物または部分的なヒト抗体と同じエピトープに結合する完全なヒト抗体を作成するための方法を提供する。EISにおいて、抗体フラグメントのレパートリーは、糸状ファージの表面上に提示され得、そして抗原結合活性を有するフラグメントをコードする遺伝子は、抗原へのファージの結合によって選択され得る。本発明の使用に意図される抗体をヒト化するためのさらなる方法は、米国特許第5,750,078号;同第5,502,167号;同第5,705,154号;同第5,770,403号;同第5,698,417号;同第5,693,493号;同第5,558,864号;同第4,935,496号;および同第4,816,567号各々は、本明細書中で参考として援用されるに記載される。E5.PCRTMによる変異誘発部位特異的変異誘発は、基礎となるDNAの特異的な変異誘発を通して、個々の抗体の調製において有用な技術である。この技術はさらに、ヒト化しようとしなかろうと、DNA内に1以上のヌクレオチド配列の変化を導入することによって、1以上の前述の考慮を援用して、配列改変体を調製および試験するすばやい能力を提供する。多くの方法が、変異誘発における使用について適切であるが、ポリメラーゼ連鎖反応PCRTMの使用は、一般的に現在好ましい。この技術は、所定のDNA配列中に所望の変異を導入するための迅速かつ効率的な方法を提供する。以下のテキストは、所定の配列によってコードされるアミノ酸を変えるために使用され得るような、配列中に点変異を導入するPCRTMの使用を特に記載する。この方法の適応もまた、DNA分子中に制限酵素部位を導入するために適切である。この方法において、合成オリゴヌクレオチドは、増幅したセグメントの一方の端に点変異を組み込むために設計される。PCRTMの後に、増幅したフラグメントは、クレノーフラグメントで処理することによって、平滑末端にされ、次いで、この平滑末端フラグメントは、配列分析を容易にするためにベクター中に連結され、そしてサブクローニングされる。変異誘発することを所望するテンプレートのDNAを調製するために、このDNAは、高コピー数のベクター例えば、pUC19中に、変異される領域に隣接する制限部位を使用して、サブクローニングされる。次いで、テンプレートのDNAは、プラスミドのミニプレップを使用して調製される。親配列に基づくが、所望の点変異を含みかつ制限酵素部位によってその5’末端に隣接される、適切なオリゴヌクレオチドプライマーが、自動化合成機を使用して合成される。約15塩基程度のテンプレートDNAに相同なプライマーが、一般に必要とされる。プライマーは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製され得るが、これは、PCRTMの使用について絶対に必要ではない。次いで、このオリゴヌクレオチドの5’末端は、リン酸化されるべきである。このテンプレートDNAは、所望の点変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCRTMによって増幅されるべきである。増幅緩衝液中のMgCl2の濃度は、一般に約15mMである。一般に、約20~25サイクルのPCRTMが、以下の通りに実行されるべきである:95°Cにて35秒の変性;50°Cにて2分のハイブリダイゼーション;および72°Cにて2分の伸長。PCRTMは、一般に、72°Cでの約10分間の最後のサイクルの伸長を含む。最後の伸長工程の後に、約5ユニットのクレノーフラグメントが、反応混合物に添加され、約30°Cにてさらに15分間インキュベートされるべきである。クレノーフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性は、末端を平らにし、そして平滑末端クローニングに適切にするために必要とされる。得られた反応混合物は、一般に、この増幅が推定される産物を生じたことを確認するために、非変性アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるべきである。次いで、大部分のミネラルオイルを除去し、クロロホルムで抽出して残っているオイルを除去し、緩衝化フェノールで抽出し、次いで100エタノールを用いる沈澱により濃縮することによって、反応混合物を処理する。次に、このオリゴヌクレオチドに使用された隣接配列で切断する制限酵素を用いて増幅したフラグメントのおよそ半分を消化するべきである。この消化したフラグメントは、低ゲル化/融点アガロースゲル上にて精製される。このフラグメントをサブクローニングするため、そして点変異を調べるために、平滑末端のライゲーションによって、適切に消化されたベクター中に2つの増幅したフラグメントをサブクローニングする。これは、ミニプレップを使用して、プラスミドDNAが引き続き調製され得るE.coliを形質転換するために使用される。次いで、プラスミドDNAの増幅した部分は、正確な点変異が作製されたことを確認するためにDNA配列決定によって分析される。TaqDNAポリメラーゼは、DNAフラグメント中にさらなる点変異を導入するので、これは、重要である。点変異の導入はまた、一連のPCRTM工程を使用してもたらされ得る。この手順において、この変異を含む2つのフラグメントは、互いにアニールされ、そして相互に開始する合成によって伸長される。次いで、このフラグメントは、第2のPCRTM工程によって増幅され、それによって上記のプロトコルに必要とされる平滑末端のライゲーションを回避する。この方法において、テンプレートDNAの調製、オリゴヌクレオチドプライマーの作製および第1のPCRTM増幅は、上記のように実行される。しかし、このプロセスにおいて、選択されたオリゴヌクレオチドは、約15~約20個の間の塩基のストレッチについてテンプレートDNAと相同なはずであり、そしてまた約10塩基以上だけで互いに重複しなければならない。第2のPCRTM増幅において、上記の条件を使用して、各々の増幅したフラグメントおよび各々の隣接する配列プライマーを使用して、そして約20~約25の間のサイクルについてPCRTMを実行する。再度、このフラグメントをサブクローニングし、そして上記に概説した工程を使用して点変異が正確であったことを調べる。前述の方法のいずれかを使用して、可能な限り小さなフラグメントを増幅することによって、変異を導入することが、一般に好ましい。もちろん、パラメータ例えば、GC含量およびこのオリゴの長さによって一般に影響される、オリゴヌクレオチドの融解温度はまた、注意深く考慮されるべきである。これらの方法の実行、および必要な場合、それらの最適化は、当業者に公知であり、そして本明細書中に参考として援用される、種々の刊行物例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiology、1995にさらに記載される。部位特異的変異誘発を実行する場合に、表Aは、参考として用いられ得る。E6.抗体フラグメントおよび誘導体元々の陰イオン性リン脂質またはアミノリン脂質に対する抗体の供給源とは無関係に、インタクトな抗体、抗体マルチマー、または抗体の種々の機能的な抗原結合領域のいずれか1つは、本発明において使用され得る。例示的な機能領域は、抗体のscFv、Fv、Fab’、FabおよびFab’2フラグメントを含む。このような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり、そして本明細書中にてさらに例示される。抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、延長した半減期は、腎臓内のインタクトな抗体の能動的な再吸収免疫グロブリンのFc片の特性から生じ得る。従って、IgGベースの抗体は、それらのFab’対応物よりも遅い血中クリアランスを示すことが予測される。しかし、Fab’フラグメントベースの組成物は、一般に、より良好な組織浸透能力を示す。抗体フラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる免疫グロブリン全体のタンパク質分解によって得られ得る。パパイン消化により、2つの同一の抗原結合フラグメントFabフラグメントおよび残りのFcフラグメントと呼ばれ、Fabフラグメントは、各々が単一の抗原結合部位を有するが得られる。パパインはまず、活性部位中のスルフヒドリル基を、システイン、2-メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールで還元することによって活性化されなければならない。ストック酵素中の重金属は、最大の酵素活性を補償するために、EDTA2mMでのキレート化によって除去されるべきである。酵素および基質は、通常、1:100の重量比で一緒に混合される。インキュベーションの後に、この反応は、ヨードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的なアルキル化によってか、または単純に透析によって停止され得る。この消化の終了は、SDS-PAGEによってモニターされ、そして種々の画分は、プロテインA-Sepharoseまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離されるべきである。ウサギおよびヒト起源のIgGからのFab’2フラグメントの調製のための通常の手順は、酵素のペプシンによる限定されたタンパク質分解である。この条件100×抗体過剰w/w酢酸緩衝液中pH4.5、37°Cは、抗体が重鎖内のジスルフィド結合のC末端側にて切断されることを示唆する。マウスIgGの消化の速度は、サブクラスで変動し得、いくらかの未消化または完全に消化したIgGなしで、活性Fab’2の高収率を得ることは、困難であり得る。特に、IgG2bは、完全な分解を受けやすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために異なるインキュベーション条件これらの全ては、当該分野で公知であるを必要とする。インタクトな抗体のペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有するFab’2フラグメントが得られ、そしてなお抗原を架橋し得る。ペプシンによるラットIgGの消化は、0.1M酢酸緩衝液、pH4.5、中での透析、次いで1w/wペプシンを用いる4時間のインキュベーションを含む条件を必要とする;IgG1およびIgG2a消化は、初めに4°Cで16時間の0.1Mホルメート緩衝液、pH2.8、続いて酢酸緩衝液に対して透析される場合に、改善される。IgG2bは、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.8中のstaphylococcusV8プロテアーゼ3w/wにおける37°Cで4時間のインキュベーションでより一貫した結果を生じる。Fabフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメインCH1を含む。Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の1以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端でのいくつかの残基の付加によって、Fabフラグメントと異なる。Fab’2抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するFab’フラグメントの対として、本来生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングは公知である。Fvフラグメントは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接した共有結合con-covalentassociationした1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインとのダイマーから構成される。各可変ドメインの3つの超可変領域が、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用することは、この構成内にある。集合的に、6つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメインまたは抗原に対して特異的な3つの超可変領域のみを含むFvの半分でさえ、全結合部位よりも低い親和力であるが、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。単鎖FvまたはsFv抗体フラグメントここで、単鎖としても公知は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これはsFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。以下の特許は、抗体の機能的な抗原結合領域抗体のscFv、Fv、Fab’、FabおよびFab’2フラグメントを含むの調製および使用に関する本教示をなおさらに補足する目的のために、本明細書中に参考として具体的に援用される:米国特許第5,855,866号;同第5,877,289号;同第5,965,132号;同第6,093,399号;同第6,261,535号;および同第6,004,555号。WO98/45331もまた、抗体の可変領域、超可変領域、および相補性決定CDR領域の調製をなおさらに記載および教示することを含む目的のために、本明細書中に参考として援用される。さらに、本発明の範囲内のscFv構築物の首尾良い産生は、実施例XIVに詳細に記載される。diabodyは、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントであり、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖VH-VLにおいて軽鎖可変ドメインVLに接続された重鎖可変ドメインVHを含む。同じ鎖上で2つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと対を形成することを強いられ、そして2つの抗原結合部位を作製する。diabodyは、EP404,097およびWO93/11161各々、本明細書中に参考として具体的に援用されるに記載される。線形抗体linearantibodyこれは、二特異的または一特異的であり得るは、Zapataら1995本明細書中に参考として具体的に援用されるに記載されるように、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型FdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含む。抗体のFab’フラグメントまたは抗原結合フラグメントの使用において、組織貫通に対する付帯利益と共に、その半減期を増加するようにフラグメントを改変することにより、さらなる利点を引き出し得る。種々の技術例えば、抗体分子自身の操作または改変、およびまた不活性なキャリアへの結合が使用され得る。薬剤を標的に送達するのではなく、半減期を増加させるただ一つの目的のために、任意の結合が注意深くアプローチされるべきであり、その際にFab’および他のフラグメントは、組織を貫通するように選択される。それでもなお、非タンパク質ポリマー例えば、PEGなどへの結合が意図される。従って、結合ではなく改変は、抗体フラグメントをより安定にし、そして/または身体における異化作用の速度を減少させるように、抗体フラグメントの構造を改変することに基づく。このような改変の1つのメカニズムは、L-アミノ酸の代わりのD-アミノ酸の使用である。このような改変の導入は、得られた分子がなお所望の生物学的特性を保持していることを確実にするために、得られた分子の厳密な試験を次に必要とすることを当業者は理解する。さらなる安定化改変は、N末端もしくはC末端のいずれか、またはその両方への、安定化部分の付加の使用を含み、これは、一般的には生物学的分子の半減期を延ばすために使用される。例示のみの目的で、アシル化またはアミノ化によって末端を改変することを所望し得る。本発明と共に使用するための適度な結合型改変は、サルベージレセプター結合エピトープを抗体フラグメントに組み込む工程を包含する。これを達成するための技術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、または抗体フラグメントに付着するペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。WO96/32478は、このような技術をさらに説明する目的のために、本明細書中に参考として具体的に援用される。サルベージレセプター結合エピトープは、代表的には、抗体フラグメントの類似の位置に移されるFcドメインの1つまたは2つのラップlop由来の3つ以上のアミノ酸の領域である。WO98/45331のサルベージレセプター結合エピトープは、本発明と共に使用するために、本明細書中に参考として援用される。F.陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に結合する免疫複合体本発明者らは、以前に、腫瘍脈管構造を標的化する際に使用するためのアミノリン脂質に結合するある範囲の免疫複合体を開発した米国特許第6,312,694号、本明細書中において具体的に援用される。これらの因子は、腫瘍および腫瘍内脈管構造に結合した治療剤を送達するために、アミノリン脂質結合タンパク質例えば、アネキシンおよびキニノゲン、およびアミノリン脂質に対する抗体例えば、PSおよびPEを使用する。本発明は、ここで、改善された特性を有する選択された抗PS抗体例えば、3G4ATCC4545および9D2を提供し、これらおよび競合する抗体は、ここでまた、免疫結合体の抗体部分として使用され得る。アミノリン脂質に結合する脈管標的因子の使用米国特許第6,312,694号に加えて、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質が安定でありそして標的化可能な実体であるという本発明の発見は、ある範囲の新たな腫瘍脈管標的化因子の使用を提供する。新規化合物アミノリン脂質に関する先の研究において提案されていないは、腫瘍および腫瘍内脈管構造においてアップレギュレートされる陰イオン性リン脂質に、毒素、サイトカイン、凝固剤および他の治療剤を送達するための陰イオン性リン脂質に対する抗体を使用する。裸の抗体に関して上に詳述されるように、本発明のこれらの局面の開発は、異なるリン脂質、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する優れた特異性を有する生物学的ツール特に抗体の作製を必要とした。本発明が陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質例えば、PS、PE、PI、PAおよびPG、最も具体的には、PSおよびPEが、安全で、抗ウイルス治療に有効な標的であることを示しているので、これらの成分特にPSおよびPDに結合するペプチドは、ここで、ある範囲の公知の抗ウイルス剤に有利に結合し得る。これらの抗ウイルス結合体は、ペプチドベースの結合体および抗体ベースの結合体の両方を含み、これらの後者は、抗ウイルス免疫結合体またはイムノビロシドimmunovirocideと呼ばれ得る。本発明のこれらの局面において、陰イオン性リン脂質に対する任意の抗体が、第2世代の抗体特に、9D2様抗体および3G4様抗体を用いて、免疫結合体、免疫毒素またはコアグリガンドcoaguligandを調製するために使用され得、それらの有利な陰イオン性リン脂質結合プロフィールが好ましい。このような免疫結合体において使用するための因子としては、好ましくは、抗細胞因子または細胞毒性因子、凝固剤凝固因子、サイトカイン、放射線治療剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導剤、抗チューブリン薬物および抗ウイルス剤およびPE結合ペプチド例えば、本明細書中に詳細に開示されるような、デュラマイシンduramycin誘導体が挙げられる。抗ウイルス免疫結合体において、本明細書中に開示されるような第2世代の抗体を使用するための要件はないが、これらが特に使用され得る。アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対する任意の抗体が、このように、抗ウイルス剤に連結されて、本発明に従って、抗ウイルス免疫結合体またはイムノビロシドを形成し得る。F1.毒素および抗細胞性薬剤特定の適用のために、治療剤は、内皮細胞の増殖または細胞分裂を消失または抑制する能力を有する、細胞傷害性薬剤または薬理学的薬剤、特に細胞傷害性薬剤、細胞分裂抑制剤か、そうでなければ抗細胞性薬剤特に、腫瘍内皮細胞または腫瘍細胞に対するである。一般に、本発明のこれらの局面は、陰イオン性リン脂質好ましくは、9D2ベースの抗体または3G4ベースの抗体に結合されて、そして標的化される内皮に活性な形態で送達され得る任意の薬理学的薬剤の使用を企図する。例示的な抗細胞性薬剤には、化学療法剤および細胞毒が挙げられる。使用され得る化学療法剤には以下が挙げられる:ホルモン例えば、ステロイド;代謝拮抗薬例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセートまたはアミノプテリン;アントラサイクリン;マイトマイシンC;ビンカアルカロイド類;デメコルチン;エトポシド:ミトラマイシン:抗腫瘍アルキル化剤例えば、クロラムブシルまたはメルファラン。他の実施形態は、サイトカインのような薬剤を含み得る。基本的には、標的化された内皮細胞の部位での血液成分への標的化、インターナリゼーション、放出および/または提示を可能にする様式で、抗体に首尾良く結合され得るか、またはそれと会合され得る限り、任意の抗細胞性薬剤が使用され得る。例えば、標的抗原が、毒性化合物による効率的な中毒と一致する経路によってインターナライズしない場合、化学療法剤例えば、抗腫瘍薬物、サイトカイン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、ホルモンなどを標的化することが望まれる場合のような状況が存在し得る。種々の化学療法剤および他の薬理学的薬剤ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセート、ビンブラスチン、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモンtrenimonおよびα-アマニチンを含むは、現在では、抗体に首尾良く結合され、そして薬理学的に機能することが示されている。他の状況において、細胞毒に基づく治療由来の任意の潜在的な副作用が、DNA合成インヒビター例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、アドリアマイシンなどの使用によって除去され得る。従って、これらの薬剤は、本発明における使用のための抗細胞性薬剤の好ましい例である。細胞分裂抑制剤に関して、そのような化合物は、一般に、標的細胞の天然の細胞周期を、好ましくはその細胞が細胞周期からはずされるように妨害する。例示的な細胞分裂抑制剤は含む。陰イオン性リン脂質に対する抗体好ましくは、9D2ベースの抗体または3G4ベースの抗体に結合体化され得る、広範な種々の細胞傷害剤が公知である。例には、いくつか例を挙げると、例として以下が挙げられる多くの有用な植物由来毒素、真菌由来毒素または細菌由来毒素が挙げられる:種々のA鎖毒素、特にリシンA鎖;リボソーム不活化タンパク質例えば、サポリンまたはゲロニン;α-サルシン;アスペルギリン;レストリクトシンrestrictocin;リボヌクレアーゼ例えば、胎盤リボヌクレアーゼ;ジフテリア毒素;およびpseudomonas外毒素。毒素のうちゲロニンgeloninおよびリシンA鎖の使用が好ましい。脈管形成された腫瘍の腫瘍内血管において発現するマーカーに結合するか、結合へと利用可能であるか、吸着されるかまたは局在化される免疫結合体のエフェクターまたは毒素部分としてのゲロニンの使用は、米国特許第6,051,230号これは、本明細書中において具体的に援用されるおよび米国特許第6,451,312号特に、標的化剤としてVEGFに結合したゲロニンに関するに記載される。リシンA鎖に関して、さらに好ましい毒素部分は、炭水化物残基を改変または除去するように処理された毒素A鎖、いわゆる脱グリコシル化A鎖dgAである。脱グリコシル化リシンA鎖は、その極度の有効性、より長い寿命のため、そして臨床等級および規模での製造に経済的に適切であるために好ましい。最も小さな分子であるが、にもかかわらず適切な生物学的応答を提供することが可能な分子を使用することは、薬理学的見地から望ましくあり得る。例えば、十分な抗細胞応答を提供するより小さなA鎖ペプチドを使用することが望まれ得る。この目的のために、リシンA鎖は、NagaraseSigmaによる30のN末端アミノ酸の除去によって切り詰めされ得、そしてなお十分な毒素活性を保持し得ることが発見されている。所望される場合、この切り詰めされたA鎖は、本発明に従って結合体において使用され得ることが提案される。あるいは、毒素A鎖部分への組換えDNA技術の適用は、本発明によるさらなる利益を提供することが理解され得る。生物学的に活性なリシンA鎖のクローニングおよび発現が達成されているという点で、現在では、より小さいまたは他の様式の改変体ペプチドであるが、にもかかわらず適切な毒素活性を示す改変体ペプチドを同定および調製することが可能である。さらに、現在では、リシンA鎖がクローニングされているという事実によって、部位特異的変異誘発の適用が可能であり、それを通じて、A鎖由来ペプチドが容易に調製およびスクリーニングされ得、そして本発明と組み合わせての使用のためのさらなる有用な部分が得られる。F2.サイトカインサイトカインおよびケモカインは、本発明の抗体に連結するための因子の特定の例である。ある範囲のサイトカインが使用され得、これには、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-13、TGF-β、M-CSF、G-CSF、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、IFN-α、IFN-βが挙げられる。より好ましいサイトカインとしては、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、GM-CSF、IFNγ、単球化学誘引物質タンパク質-1MCP-1、血小板由来増殖因子-BBPDGF-BB、およびC-反応性タンパク質CRPなどが挙げられる。特に好ましい例は、TNFα、TNFα誘導因子およびIL-12である。TNFαは、脈管浸透性を増加する。この因子は、本発明の抗体への結合を企図し、特に、得られる免疫結合体は、癌の処置のための併用療法において使用される。この抗体は、結合したTNFαを腫瘍環境に送達し、そして腫瘍における向上した脈管浸透性により、第2の抗癌剤の腫瘍内への侵入を容易にし、従って、全体的な抗主要行かを増幅する。scFv構築物は、このような実施形態における使用に特に企図される。これは、部分的に、3量体としてのTNFαおよびscFV構築物が、容易に3量体化し得ることが理由である。例えば、IL-12は、抗体に結合され得、そして腫瘍血管を攻撃するように、宿主の防御を変えるために使用され得る。IL-12を使用する際、抗原結合領域のscFv形態は、好ましくあり得る。サイトカインLEC肝臓発現ケモカイン、NCC-4、HCC-4、またはLMCとしても公知は、別の好ましい成分であるGiovarelliら、2000。LECは、樹状細胞、単球、T細胞、NK細胞および好中球に対した走化性であり、従って、宿主媒介抗腫瘍応答を改善し得る。F3.凝固因子陰イオン性リン脂質に対する抗体、またはアミノリン脂質、または本発明の好ましい9D2抗体および3G4抗体ATCC-4545に基づく第2世代の抗体は、コアグリガンドを形成するために、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分に連結され得る。米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号が、コアグリガンドを形成するために、抗体と凝固剤の作動可能な会合をさらに記載する目的で、本明細書中において具体的に援用される。本発明の抗体は、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分に連結され、コアグリガンドを形成し得る。ここで、この抗体は、凝血薬または凝固因子に直接的に連結され得るか、または凝血薬もしくは凝固因子を結合し、次いでそれらを放出する第2の結合領域に連結され得る。本明細書中で使用される用語凝血薬および凝固因子を各々使用して、適切な条件下、好ましくは特定のインビボ環境例えば、腫瘍血管構造に提供される場合に、凝固を直接的または間接的に刺激し得る成分をいう。好ましい凝固因子は、組織因子組成物例えば、切り詰めされたTFtTF、ダイマーTF分子、マルチマーTF分子および変異体TF分子である。切り詰めされたTFtruncatedTFtTFは、膜結合欠損に、この特性における変化をもたらすために十分なアミノ酸配列を除去することによってされているTF構造をいう。この状況において十分な量とは、TF分子を膜中に進入させるか、またはTFタンパク質の機能的な膜結合を他の様式で媒介するに元々十分な、膜貫通アミノ酸配列の量である。従って、このような十分な量の膜貫通配列の除去は、リン脂質膜結合能を欠損した切り詰めされた組織因子タンパク質またはポリペプチドを生じ、その結果、このタンパク質は、実質的に、リン脂質膜に有意に結合しない可溶性タンパク質である。従って、切り詰めされたTFは、実質的に、標準的なTFアッセイにおいて第VII因子を第VIIa因子に変換し得ず、そしてなお第VIIa因子の存在下で第X因子を活性化することを含む、いわゆる触媒活性を保持する。米国特許第5,504,067号、同第6,156,321号、同第6,132,729号および同第6,132,730号は、そのような短縮された組織因子タンパク質をさらに記載する目的のために、特に本明細書中において参考として援用される。好ましくは、本発明のこれらの局面における使用のための組織因子は、一般に、タンパク質の膜貫通領域および細胞質領域アミノ酸220~263を欠く。しかし、切り詰めされたTF分子が、219アミノ酸という正確な長さの分子に限定される必要はない。組織因子組成物はまた、ダイマーとして有用であり得る。任意の切り詰めされた組織因子構築物、変異された組織因子構築物、または他の組織因子構築物は、本発明における使用のためにダイマー形態で調製され得る。当業者に公知のように、このようなTFダイマーは、分子生物学および組換え発現の標準的な技術を使用することによって調製され得る。ここで2つのコード領域は、インフレームに調製され、そして発現ベクターから発現される。同様に、種々の化学結合技術が、TFダイマーの調製と組み合わせて使用され得る。個々のTFモノマーは、結合の前に誘導体化され得る。すべてのこのような技術は、当業者に容易に公知である。所望される場合、組織因子ダイマーまたはマルチマーは、生物学的に放出可能なbiologically-releasable結合例えば、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列を介して結合され得る。例えば、腫瘍環境内で優先的に配置されるか、または活性である酵素についての切断部位を含むペプチドリンカーが意図される。そのようなペプチドリンカーの例示的な形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第IXa因子、第Xa因子またはメタロプロテイナーゼ例えば、コラーゲナーゼ、ゲラチナーゼまたはストロメライシンによって切断されるペプチドリンカーである。特定の実施形態において、組織因子ダイマーはさらに、後にリン脂質膜と組織因子の機能的会合を特定の所定の条件下のみであるが強化するために、妨げられた疎水性膜挿入部分を含み得る。切り詰めされた組織因子の状況において記載される場合、疎水性膜会合配列は、一般に、それらの疎水性の性質に起因して、リン脂質環境との会合を促進するアミノ酸のストレッチである。同様に、脂肪酸は、潜在的な膜挿入部分を提供するために使用され得る。このような膜挿入配列は、それらの付着がTF構築物の機能的特性を妨げない限り、TF分子のN末端もしくはC末端のいずれかに位置され得るか、または一般に膜の任意の他の点に付加され得る。妨げられた挿入部分の意義は、TF構築物が腫瘍環境に位置するまで、それは非機能性を保持し、そして疎水性付加が、接近可能になり、そしてなおさらに膜との物理的会合を促進するのを可能にすることである。再度、生物学的に放出可能な結合および選択的に切断可能な配列が、この点において特に有用であり、結合または配列のみが、腫瘍環境内の局在化および特定の酵素または他の生物活性分子への曝露の際に切断または他の様式で改変されることが意図される。他の実施形態において、tTF構築物は、マルチマーまたはポリマーであり得る。この状況において、ポリマー構築物は、3以上の組織因子構築物を含む。マルチマーTF構築物またはポリマーTF構築物は、少なくとも第2および第3のTF分子または誘導体に作動可能に結合された第1のTF分子または誘導体を含む構築物である。マルチマーは、約3~約20のこのようなTF分子を含み得る。マルチマーまたはポリマー内の個々のTF単位はまた、所望される場合、選択的に切断可能なペプチドリンカーまたは他の生物学的に放出可能な結合によって連結され得る。再度、上記に議論されたTFダイマーに関して、構築物は、組換え操作および発現を用いるか、または標準的な合成化学を用いるかのいずれかで容易に作製され得る。本発明の状況において有用ななおさらなるTF構築物は、第VII因子を活性化する能力が欠損している変異体である。そのような第VII因子活性化変異体は、一般に、機能的な第VII/VIIa因子を結合し、第X因子をタンパク質分解性に活性化するが、第VII因子をタンパク質分解性に活性化する能力が実質的に存在しないTF変異体として本明細書中において定義されている。従って、そのような構築物は、第VII因子活性化活性を欠くTF変異体である。そのような第VII因子活性化変異体が、腫瘍特異的凝固を促進する際に機能する能力は、腫瘍血管構造へのそれらの特異的送達、および血漿中における低いレベルでの第VIIa因子の存在に基づく。そのような第VII因子活性化変異体標的化剤結合体の投与の際に、変異体は、血管新生化腫瘍の血管構造内に局在化される。局在化の前に、TF変異体は、一般に、第VII因子を第VIIa因子に変換し得ないことに基づいて、任意の他の身体部位における凝固を促進し得ない。しかし、次いで、腫瘍領域内の局在化および蓄積の際に、変異体は、外因性の凝固経路を開始するために血漿から十分な第VIIa因子と出会い、腫瘍特異的血栓症を導く。外因性の第VIIa因子もまた患者に投与され得る。種々の第VII因子活性化変異体のうちの任意の1つ以上が調製され、本発明と組み合わせて使用され得る。第VII/VIIa因子についてのTF分子上の認識部位に関して、有意な量の科学知識が存在する。従って、第VII活性化領域が、一般にTF分子のおよそアミノ酸157~およそアミノ酸167の間に位置することが理解される。しかし、この領域の外側の残基もまた、第VII活性化活性に関連することが判明し得、従ってTF配列のおよそアミノ酸106~およそアミノ酸209に一般に位置する残基の任意の1つ以上に変異を導入することが考慮され得るWO94/07515;WO94/28017;各々、本明細書中において参考として援用される。米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号および同第6,036,955号に詳細に記載されるように、種々の他の凝固因子は、以下に示される薬剤によって詳述されるように、本発明と組み合わせて使用され得る。トロンビン、第V/Va因子および誘導体、第VIII/VIIIa因子および誘導体、第IX/IXa因子および誘導体、第X/Xa因子および誘導体、第XI/XIa因子および誘導体、第XII/XIIa因子および誘導体、第XIII/XIIIa因子および誘導体、第X因子アクチベーターおよび第V因子アクチベーターが、本発明において使用され得る。ラッセルクサリヘビ蛇毒第X因子アクチベーターは、本発明における使用について意図される。ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第X因子アクチベーターについて特異的なモノクローナル抗体もまた産生されており、そして二重特異性結合リガンドの部分として因子を特異的に送達するために使用され得る。トロンボキサンA2は、血小板ミクロソーム中の酵素シクロオキシゲナーゼおよび酵素トロンボキサンシンテターゼの連続的作用によって、エンドペルオキシドから形成される。トロンボキサンA2は血小板によって容易に産生され、そして血小板凝集を生成するその能力が理由で強力な血管収縮薬である。トロンボキサンA2およびその活性なアナログは、本発明の用途のために意図される。トロンボキサンシンターゼ、および血小板活性化プロスタグランジンを合成する他の酵素もまた、本発明の状況において凝固薬として使用され得る。トロンボキサンシンターゼに対するモノクローナル抗体、およびトロンボキサンシンターゼのイムノアフィニティ精製は公知であり;ヒトトロンボキサンシンターゼについてのcDNAも同様である。α2-抗プラスミン、すなわち、α2-プラスミンインヒビターは、プラスミノゲンアクチベーターによって誘導されるフィブリン血餅の溶解を効率的に阻害するように機能する、ヒト血漿において天然に存在するプロテイナーゼインヒビターである。α2-抗プラスミンは、特に強力なインヒビターであり、そして本発明の用途のために意図される。α2-抗プラスミンについてのcDNA配列が利用可能である場合、組換え発現および/または融合タンパク質が好ましい。α2-抗プラスミンに対するモノクローナル抗体もまた利用可能であり、これは本発明の二重特異性結合リガンドの実施形態において使用され得る。これらの抗体は、標的部位に外因性α2-抗プラスミンを送達するために使用されるか、または内因性α2-抗プラスミンを収集し、そして標的領域内でそれを濃縮するために使用され得る。F4.抗チューブリン薬一連の薬物は、チューブリン活性との干渉を介してその効果を行使する。チューブリンの機能は、有糸分裂および細胞の生存能力に不可欠であるので、特定の抗チューブリン薬は、強力な化学療法剤である。いくつかの周知であってかつ本発明とともに使用するための現在好ましい抗チューブリン薬は、コルヒチン;タキサン例えば、タキソール;ビンカアルカロイド類例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンデスチン;およびコンブレタスタチンcombretastatinである。他の適切な抗チューブリン薬は、サイトカラシン類B、J、Eを含む、ドラスタチンdolastatin、オーリスタチンauristatinPE、パクリタキセル、ウスチロキシンustiloxinD、リゾキシンrhizoxin、1069C85、コルセミドcolcemid、アルベンダゾール、アザトキシンazatoxinおよびノコダゾールである。米国特許第5,892,069号、同第5,504,074号、および同第5,661,143号各々本明細書中に詳細に参考として援用されるに記載されるように、コンブレタスタチン類は、一般に細胞有糸分裂を阻害するエストラジオール誘導体である。本発明と組合せて使用され得る例示的なコンブレタスタチンとしては、コンブレタスタチンA、Bおよび/またはDを基本とするコンブレタスタチンならびに米国特許第5,892,069号、同第5,504,074号、および同第5,661,143号に記載されるコンブレタスタチンが挙げられる。コンブレタスタチンA-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3およびB-4は、上記の型の例である。米国特許第5,569,786号および同第5,409,953号は、コンブレタスタチンA-1、A2、A-3、B-1、B-2、B-3およびB-4の各々の単離、構造的特徴付けおよび合成、ならびにこのようなコンブレタスタチンを使用して新生物性増殖を処置するための処方物および方法を記載する目的のために、本明細書中に参考として援用される。任意の1つ以上のこのようなコンブレタスタチンは、本発明と組合せて使用され得る。米国特許第5,892,069号、同第5,504,074号、同第5,661,143号および同第4,996,237号各々詳細に本明細書中で参考として援用されるに記載されるように、コンブレタスタチンA-4はまた、本発明と共に使用され得る。米国特許第5,561,112号は、適切なコンブレタスタチンA-4プロドラッグこれらは、本発明とともに組合せて使用することが意図されるを適切に記載するために、本明細書中に参考として援用される。米国特許第4,940,726号本明細書中に参考として詳細に援用されるは、コンブレタスタチンD-1およびコンブレタスタチンD-2と称される大環状ラクトンを詳細に記載し、これらは、本発明の組成物および方法と組み合わせて使用され得る。米国特許第5,430,062号本明細書中に参考として詳細に援用されるは、抗癌活性を有するスチルベン誘導体およびコンブレタスタチンアナログに関し、これらは本発明と組合せて使用され得る。F5.抗脈管形成剤抗脈管形成剤は、本発明の抗体およびペプチドへの結合に有用である。多くの抗癌剤が、それらの作用の機構の一部として、抗脈管形成効果を有する。併用療法で使用するために記載されるこのような任意の1つ以上の薬剤表Eに含まれるがまた、本明細書中に記載されるように、本発明の抗体に結合体化され得る。特定の他の薬剤が、作用の一次的な機構として、抗脈管形成効果を有することが発見されるか、設計されるか、または選択された。このような薬剤の例は、以下に記載され、これらのうちの任意がまた、免疫結合体を調製するために使用され得るか、または本発明の併用療法において別々に使用され得る。種々の疾患状態で顕著であるように、新脈管形成の処置に有用である多数のチロシンキナーゼインヒビターが、現在公知である。これらとしては、例えば、米国特許第5,639,757号具体的に、参考として本明細書中で援用されるの4-アミノピロール[2,3-d]ピリミジンが挙げられる。これはまた、本発明と組み合わせて使用され得る。VEGDR2レセプターを介するチロシンキナーゼシグナル伝達を媒介し得る有機分子のさらなる例は、キナゾリン化合物および米国特許第5,792,771号具体的に、脈管形成疾患の処置における本発明と共に使用するためのさらなる組み合わせを記載する目的で、参考として本明細書中で援用されるの組成物である。他の化学クラスの化合物はまた、新脈管形成を阻害することが示されており、そして本発明と組み合わせて使用され得る。例えば、米国特許第5,972,922号具体的に、参考として本明細書中で援用されるに記載されるステロイド例えば、新脈管形成の4,911-ステロイドおよびC21-酸化ステロイドじは、併用治療において使用され得る。米国特許第5,712,291号および同第5,593,990号各々、参考として本明細書中で援用されるは、サリドマイドならびに関連する化合物、前駆体、アナログ、代謝物および加水分解産物を記載する。これらもまた、新脈管形成を阻害するために本発明と組み合わせて使用され得る。米国特許第5,712,291号および同第5,593,990号における化合物は、経口的に投与され得る。組合せ治療に関して有用である、さらなる例示的な抗新脈管形成剤は、表Bに列挙される。ここで列挙される各薬剤は、例示であって、限定することを意味しない。本発明と共に使用するための他の抗脈管形成剤としては、アンギオスタチンおよびエンドスタチンが挙げられる。アンギオスタチンと呼ばれるタンパク質は、米国特許第5,776,704号;同第5,639,725号および同第5,733,876号において開示されている。これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。アンギオスタチンは、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約38kDa~約45kDaの分子量を有するタンパク質であり、これは、プラスミノゲン分子のほぼクリングル領域1~4を含む。アンギオスタチンは、一般に、インタクトなマウスプラスミノゲン分子のアミノ酸番号98から開始するマウスプラスミノゲンのフラグメントと実質的に類似のアミノ酸配列を有する。アンギオスタチンのアミノ酸配列は、種の間でわずかに変化する。例えば、ヒトアンギオスタチンにおいて、このアミノ酸配列は、上記のマウスプラスミノゲンフラグメントの配列と実質的に類似であるが、活性なヒトアンギオスタチン配列は、インタクトなヒトプラスミノゲンアミノ酸配列のアミノ酸番号97または99のいずれかで開始し得る。さらに、ヒトプラスミノゲンは、類似の抗脈管形成活性を有するので、マウス腫瘍モデルにおいて示されるように使用され得る。特定の抗脈管形成治療剤は、腫瘍後退を引き起こすことが既に示されており、アンギオスタチンがこのような薬剤の1つである。エンドスタチンendostatin、コラーゲンXVIIIの20kDaのCOOH末端フラグメント、細菌性多糖類CM101、および抗体LM609もまた、血管静止angiostatic活性を有する。しかし、それらの他の特性を考慮して、これらは、脈管形成を阻害するだけではなく、大部分規定されていない機構によって腫瘍脈管の破壊を開始するので、抗脈管治療剤または腫瘍脈管毒素と呼ばれる。アンギオスタチンおよびエンドスタチンは、マウスにおいて、腫瘍増殖を阻害するだけでなく腫瘍後退もまたもたらす能力が実証された最初の新脈管形成インヒビターであるので、これらは熱心な研究の焦点となる。エラスターゼ、マクロファージメタロエラスターゼMME、マトリリシンmatrilysinMMP-7、および92kDaゼラチナーゼB/IV型コラゲナーゼMMP-9を含む、プラスミノゲンからアンギオスタチンを生成することが示される複数のプロテアーゼが存在する。MMEは、腫瘍においてプラスミノゲンからアンギオスタチンを生成し得、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSFは、アンギオスタチンの生成を誘導するマクロファージによってMMEの発現をアップレギュレートする。アンギオスタチン生成におけるMMEの役割は、MMEが患者由来の肝細胞癌の臨床サンプルにおいて実際に発現されるという知見によって支持される。アンギオスタチンを生成し得ると考えられる別のプロテアーゼは、ストロメライシン-1MMP-3である。MMP-3は、インビトロにおいてプラスミノゲンからアンギオスタチン様フラグメントを生成することが示されている。アンギオスタチンについての作用機構は現在のところ明らかではなく、これが、プログラム化された細胞死または有糸分裂の阻止を受けるように内皮細胞を誘導する内皮細胞上の同定されていない細胞表面レセプターに結合すると推定されている。エンドスタチンは、その生物学はあまり明白ではないものの、さらにより強力な抗新脈管形成および抗腫瘍剤であるようである。エンドスタチンは、マウスにおける多くの腫瘍モデルにおいて後退を生じることにおいて有効である。腫瘍は、エンドスタチンに対する耐性を発生させず、そして複数のサイクルの処置後に、腫瘍は、休眠状態に進入し、この間、これらは容量において増加しない。この休眠状態において、アポトーシスを受ける腫瘍細胞の割合は増加し、そして本質的に同じサイズをとどめる集団を生じた。エンドスタチンは、その効果を媒介する未同定の内皮細胞表面レセプターに結合すると考えられる。FolkmanおよびO’Reileyらへの米国特許第5,854,205号本明細書中で参考として詳細に援用されるは、内皮細胞増殖および脈管形成のインヒビターとしてのエンドスタチンおよびその使用に関する。エンドスタチンタンパク質は、コラーゲンXVIII型のC末端フラグメントに対応し、そしてこのタンパク質は、種々の供給源から単離され得る。米国特許第5,854,205号はまた、エンドスタチンが、コラーゲンXVIII型、コラーゲンXV型、またはBOVMPE1プロガストリンpregastricエステラーゼのフラグメントのアミノ酸配列を有し得るということを教示する。エンドスタチンの他の抗脈管形成タンパク質、特にアンギオスタチンとの組み合わせはまた、米国特許第5,854,205号に記載され、その結果、組合された組成物は、脈管形成依存性腫瘍塊を効果的に後退させ得る。CM101は、細菌性ポリサッカリドであり、これは、腫瘍において新血管炎症を誘導する能力において十分に特徴付けられている。CM101は、補体系の活性化を刺激する脱分化した内皮上で発現されるレセプターに結合し、そして架橋する。それはまた、腫瘍を選択的に標的するサイトカイン駆動化炎症応答を開始する。これは、発現VEGFおよびそのレセプターをダウンレギュレートする固有の抗病理新脈管形成剤である。CM101は、現在、抗癌剤として臨床試験中であり、そしてこれと組み合わせて使用され得る。トロンボスポンジンthrombospondinTSP-1および血小板因子4PF4もまた、本発明において使用され得る。これらはともに、へパリンと会合する新脈管形成インヒビターであり、そしてまた血小板α-顆粒において見出される。TSP-1は、細胞外マトリクスの構成成分である、大きな450kDaのマルチドメイン糖タンパク質である。TSP-1は、HSPG、フィブロネクチン、ラミニン、および種々の型のコラーゲンを含む、細胞外マトリクスにおいて見出される多くのプロテオグリカン分子に結合する。TSP-1は、インビトロにおいて内皮細胞遊走および増殖、ならびにインビボにおいて新脈管形成を阻害する。TSP-1はまた、形質転換された内皮細胞の悪性表現型および腫瘍形成を抑制し得る。腫瘍抑制遺伝子p53は、TSP-1の発現を直接的に調節することが示されており、その結果、p53活性の損失は、TSP-1生成における劇的な減少、および腫瘍が開始する新脈管形成を付随する増大を生じる。PF4は、ケモカインのCXCELRファミリーのメンバーである70aaタンパク質あり、これは、インビトロにおける内皮細胞の増殖およびインビボにおける新脈管形成を強力に阻害し得る。腫瘍内に投与された、またはアデノウイルスベクターによって送達されたPF4は、腫瘍増殖の阻害を生じ得る。インターフェロンおよびメタロプロテイナーゼインヒビターは、本発明に従って送達され得る、2つの他のクラスの天然に存在する脈管形成インヒビターである。インターフェロンの抗内皮活性は、1980年代初期から公知であるが、阻害の機構は、未だ明確でない。これらが内皮細胞の移動を阻害し得ること、およびこれらが、腫瘍細胞による新脈管形成プロモーターの産生を阻害する能力によっておそれく媒介される、インビボでのいくつかの抗新脈管形成活性を有することは公知である。血管腫瘍は具体的に、インターフェロンに感受性であり、例えば、増殖中の血管腫はIFNαで首尾よく処置され得る。メタロプロテイナーゼの組織インヒビターTIMPは、天然に存在するマトリックスメタロプロテアーゼMMPのインヒビターのファミリーであり、これもまた、新脈管形成を阻害し得、そして本発明の処置プロトコルにおいて使用され得る。MMPは、新脈管形成プロセスにおいて重要な役割を果たす。なぜなら、これらは、血管網を拡大または再構築する場合、内皮細胞および線維芽細胞が移動するマトリックスを分解するからである。実際、MMPの1つのメンバーであるMMP-2は、おそらくこの目的のためにインテグリンαvβ3を介して活性化された内皮と会合することが示されている。この相互作用がMMP-2のフラグメントによって崩壊されられる場合、次いで新脈管形成はダウンレギュレートされ、そして腫瘍増殖において阻害される。新脈管形成を阻害する多くの薬理学的物質が存在し、これらの任意の1以上が本発明の一部として使用され得る。これらの物質としては、AGM-1470/TNP-470、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾールCAIが挙げられる。フマギリンは、1990年に新脈管形成の強力なインヒビターであることが見出されており、そしてそれ以来、フマギリンの合成アナログである、AGM-1470およびTNP-470が開発されてきた。これら両方の薬物は、インビトロでの内皮細胞増殖およびインビボでの新脈管形成を阻害する。TNP-470は、ヒトの臨床試験で広範に研究され、そのデータは長期の投与が最適であることを示唆する。サリドマイドは、元来鎮静薬として使用されていたが、強力な催奇形物質であることが見出され、そして中止された。1994年に、サリドマイドは新脈管形成インヒビターであることが見出された。サリドマイドは現在、抗癌剤および血管性の眼疾患の処置として臨床試験されている。CAIは新脈管形成の低分子量の合成インヒビターであり、これは、アクチンの再組織化、内皮細胞の移動およびコラーゲンIV上での延展を妨げる、カルシウムチャネルブロッカーとして作用する。CAIは生理学的に達成可能な濃度で新生血管形成を阻害し、そして癌患者によって経口的に十分許容される。CAIを用いた臨床試験によって、処置前に進行性の疾患を有する癌患者の49において疾患の安定化を生じた。ヘパリンまたはヘパリンフラグメントの存在下のコルチゾンは、内皮細胞増殖をブロックすることによってマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示された。ステロイドおよびヘパリンの相加的な阻害効果に関与する機構は明らかでないが、ヘパリンが内皮細胞によるステロイドの取り込みを増加させ得ると考えられる。この混合物は、新しく形成された毛細血管の下の基底膜の溶解を増加させることが示されており、そしてこれはまた、相加的な血管抑制angiostatic効果についての可能性のある説明である。ヘパリン-コルチゾール結合体はまた、インビボでの強力な血管抑制効果活性および抗腫瘍効果活性を有する。さらに特定の新脈管形成インヒビターが、本発明の腫瘍標的化方法を使用して腫瘍に送達され得る。これには、抗侵襲性因子Anti-InvasiveFactor、レチノイン酸およびパクリタキセル米国特許第5,716,981号;参考として本明細書中に援用される;AGM-1470Ingberら、1990;参考として本明細書中に援用される;サメ軟骨抽出物米国特許第5,618,925号;参考として本明細書中に援用される;陰イオン性ポリアミドオリゴマーまたは陰イオン性ポリ尿素オリゴマー米国特許第5,593,664号;参考として本明細書中に援用される;オキシンドールoxindole誘導体米国特許第5,576,330号;参考として本明細書中に援用される;エストラジオール誘導体米国特許第5,504,074号;参考として本明細書中に援用される;およびチアゾールピリミジン誘導体米国特許第5,599,813号;参考として本明細書中に援用されるが挙げられるが、これらに限定されない。これらはまた、本発明の併用使用のための、抗新脈管形成組成物としての使用が意図される。αvβ3インテグリンのアンタゴニストを含む組成物はまた、本発明と組合せて新脈管形成を阻害するために使用され得る。米国特許第5,766,591号参考として本明細書中に援用されるに開示されるように、RGD含有ポリペプチドおよびその塩環状ポリペプチドを含むは、αvβ3インテグリンアンタゴニストの適切な例である。アンギオポイエチンangiopoietinがTie2に対するリガントであるので、Tie2レセプターを介するシグナル伝達を変えることに基づく治療的介入の他の方法がまた、本明細書と組み合わせて使用され得る。例えば、Tie2を活性化をブロックし得る可溶性Tie2レセプターLinら、1998aが使用され得る。組換えアデノウイルス遺伝子治療を使用するこのような構築物の送達は、癌の処置および転移の減少において有効であることが示されているLinら、1998a。アンギオポエチンは、VEGFファミリーのメンバーと同様に、血管内皮に特異的な増殖因子であるDavisおよびYancopoulos、1999:Holashら、1999;本明細書中で参考として援用される。最初に記載されたアンギオポエチンは、天然に存在するレセプター賦活体またはアゴニストであるアンギオポエチン-1Ang-1;配列番号1および配列番号2、および天然に存在するレセプターアンタゴニストであるアンギオポエチン-2Ang-2;配列番号3および配列番号4であった。この両方は、内皮細胞チロシンキナーゼレセプターTie2によって作用する。2つの新しいアンギオポエチンである、アンギオポエチン-3マウスおよびアンギオポエチン-4ヒトもまた同定されたValenzuelaら、1999。アンギオポエチン-3は、Ang-2のようなアンタゴニストとして作用するようであるが、アンギオポエチン-4は、Ang-1のようなアゴニストとして機能するようであるValenzuelaら、1999。アンギオポエチン-3と呼ばれるタンパク質はまた、ヒト心臓からクローニングされ、そして内皮細胞に対してマイトジェン効果を有さないと報告されたKimら、1999。VEGFは、血管発達の早期の段階のために必要であるが、アンギオポエチン-1は、一般に、血管新生のより後期の段階に必要とされる。従って、VEGFは、内皮細胞分化、増殖および初期の血管形成を促進するように作用する。アンギオポエチン-1は、Tie2レセプターを介して、成熟管の維持および安定化を促進するように作用する。従って、アンギオポエチン-1は、成熟因子または安定化因子であり、これは、内皮細胞と周囲の支持細胞との間の相互作用を促進することにより未成熟の血管を成熟した血管に変換するHolashら、1999。F6.アポトーシス誘発剤本発明はまた、腫瘍内の任意の細胞腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含むにおいてアポトーシスを誘発する因子を送達するために使用され得る。多くの抗癌剤は、その作用機構の一部として、アポトーシス誘発効果を有する。併用療法において使用するために記載された任意の1つ以上のこのような薬剤表Fに含まれるはまた、本明細書中に記載されるように、本発明の抗体に結合体化され得る。特定の他の薬剤が、一次的な機構として、アポトーシス効果を有することが発見されるか、設計されるか、または選択された。このような因子の例は、以下に記載され、これらのうちの任意がまた、免疫結合体を調製するために使用され得るか、または本発明の併用療法において別々に使用され得る。多くの形態の癌において、腫瘍抑制遺伝子例えば、p53における変異が報告されている。p53の不活性化は、アポトーシスの促進の不全を生じる。この不全によって、癌細胞は、細胞死へと運命付けられるよりむしろ、腫瘍形成を進行させる。従って、腫瘍抑制因子の送達もまた、細胞死を刺激するために本発明での使用が意図される。例示的な腫瘍抑制因子としては、p53、網膜芽細胞腫遺伝子Rb、ウィルムス腫瘍WT1、baxα、インターロイキン-1b-変換酵素およびファミリー、MEN-1遺伝子、神経芽細胞腫I型NF1、cdkインヒビターp16、結腸直腸癌遺伝子DCC、家族性腺腫症ポリポーシス遺伝子FAP、多発性腫瘍抑制遺伝子MTS-1、BRCA1ならびにBRCA2が挙げられるがこれらに限定されない。使用のために好ましいのは、p53米国特許第5,747,469号;同第5,677,178号;および同第5,756,455号;各々は、参考として本明細書中に援用される、網膜芽細胞腫、BRCA1米国特許第5,750,400号;同第5,654,155号;および同第5,710,001号;同第5,756,294号;同第5,709,999号;同第5,693,473号;同第5,753,441号;同第5,622,829号;および同第5,747,282号;各々は、参考として本明細書中に援用される、MEN-1GenBank登録番号U93236号およびアデノウイルスE1A米国特許第5,776,743号;参考として本明細書中に援用されるの遺伝子である。アポトーシスまたはプログラムされた細胞死を阻害する他の発癌遺伝子としては、bcr-abl、bcl-2bcl-1とは異なる、サイクリンD1;GenBank登録番号M14745、X06487;米国特許第5,650,491号;および同第5,539,094号;各々が本明細書中において参考として援用される;およびファミリーメンバーBcl-xl、Mcl-1、Bak、A1、A20を含むが挙げられる。bcl-2の過剰発現は、最初に、T細胞リンパ腫において発見された。bcl-2は、Bax、アポトーシス経路におけるタンパク質に結合し、不活化することによって発癌遺伝子として機能する。bcl-2機能の阻害は、Baxの不活化を妨げ、アポトーシス経路が進行し得る。このように、このクラスの発癌遺伝子の阻害例えば、アンチセンスヌクレオチドを使用するは、アポトーシスの増強が所望される局面において本発明における使用に企図される米国特許第5,650,491号;同第5,539,094号;および同第5,583,034号;各々が、本明細書中において参考として援用される。本発明の抗体により送達され得る他の組成物としては、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドTRAILと称されるをコードする遺伝子、およびTRAILポリペプチド米国特許第5,763,223号;参考として本明細書中に援用される;米国特許第5,605,826号参考として本明細書中に援用される24kDアポトーシス関連プロテアーゼ;Fas関連因子1、FAF1米国特許第5,750,653号;参考として本明細書中に援用されるが挙げられる。インターロイキン-1β-変換酵素およびファミリーのメンバーこれらもまた、アポトーシスを刺激することが報告されているの提供もまた、本発明のこれらの局面における使用のために意図される。以下のような化合物もまた使用され得る;カルボスチリルcarbostyril誘導体米国特許第5,672,603号;および同第5,464,833号;各々は、参考として本明細書中に援用される;分枝状アポトーシス原性apogenicペプチド米国特許第5,591,717号;参考として本明細書中に援用される;ホスホチロシンインヒビターおよび非加水分解性ホスホチロシンアナログ米国特許第5,565,491号;および同第5,693,627号;各々は、参考として本明細書中に援用される;RXRレチノイドレセプターのアゴニスト米国特許第5,399,586号;参考として本明細書中に援用される;さらには、抗酸化剤米国特許第5,571,523号;参考として本明細書中に援用される。チロシンキナーゼインヒビター例えば、ゲニステインもまた、本発明の抗体に連結され得る参考として本明細書中に援用される米国特許第5,587,459号により支持されるように。F7.抗ウイルス薬剤陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質特に、PSおよびPEは、ウイルス感染細胞において曝露され、本発明の抗体例えば、9D2および3G4ATCC4545抗体はまた、任意の1つ以上の抗ウイルス薬剤に連結され得る。本発明のこれらの局面の元にあるさらなる理由、およびその利点は、PE結合ペプチド、抗ウイルス結合体に関して、以下にさらに詳細に記載される。例示的な抗ウイルス剤は、抗体に連結するためであるか、またはペプチドはまた、PE-結合ペプチド、本発明の抗ウイルス結合体と関連してさらに詳細に記載される。任意の1つ以上の抗ウイルス剤表Gに含まれるが、本明細書中に記載されるように、本発明の抗体に結合体化され得る。このような抗ウイルス剤はまた、本発明の抗ウイルス治療と組み合わせて別々に使用され得る。G.生物学的機能性等価物抗体およびエフェクターの等価物またはさらなる改良物が、今や、一般には上記に提供される物質を出発点として使用して作製され得る。改変および変化が、このような抗体の構造中になされ得、そしてさらに類似または他の様式の所望の特徴を有する分子を入手し得る。例えば、特定のアミノ酸が、相互作用性結合能例えば、アミノリン脂質、PSおよびPEへの結合のかなり大きな損失なしに、タンパク質構造において他のアミノ酸の代わりに置換され得る。これらの考察もまた、毒素、抗脈管形成剤、アポトーシス誘発剤および凝血薬などにあてはまる。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列または、当然のことながら基礎のDNA配列中でなされ得、にもかかわらず類似アゴニストの特性を有するタンパク質を入手し得る。従って、種々の変化が、それらの生物学的有用性または活性のかなり大きな損失なく、抗体または治療剤の配列または、基礎のDNA配列になされ得ることが意図される。基礎のDNA配列を変異することから作製される生物学的機能性等価物は、本明細書中の表Aにおいて提供されるコドン情報、および部位特異的変異誘発に関する支持する技術的詳細を用いてなされ得る。分子の所定の部分内になされ得、なお受容可能なレベルの等価な生物学的活性を有する分子を生じ得る変化の数に対して限界が存在するという概念が、生物学的機能性等価物タンパク質またはペプチドの定義に固有であることもまた、当業者に十分に理解される。従って、生物学的機能性等価物タンパク質およびペプチドは、本明細書中において、ほとんどまたはすべてではないが特定のアミノ酸が置換され得るタンパク質およびペプチドとして規定される。当然のことながら、異なる置換を有する複数の異なるタンパク質/ペプチドは、本発明に従って容易に作製および使用され得る。アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖の置換の相対的類似性例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖置換のサイズ、形状および型の分析によって、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に荷電した残基であること;アラニン、グリシンおよびセリンはすべて類似のサイズであること;そして、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはすべて一般的に類似の形状であることが示される。従って、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン;アラニン、グリシンおよびセリン;ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書中において、生物学的機能性等価物として規定される。より定量的な変化を生じさせる際に、アミノ酸の疎水親水指数が考慮され得る。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特徴に基づいて疎水親水指数を指定されており、これらは以下である:イソロイシン4.5;バリン4.2;ロイシン3.8;フェニルアラニン2.8;システイン/シスチン2.5;メチオニン1.9;アラニン1.8;グリシン-0.4;トレオニン-0.7;セリン-0.8;トリプトファン-0.9;チロシン-1.3;プロリン-1.6;ヒスチジン-3.2;グルタミン酸-3.5;グルタミン-3.5;アスパラギン酸-3.5;アスパラギン-3.5;リジン-3.9;およびアルギニン-4.5。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する際の疎水親水アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野において理解されるKyteおよびDoolittle、1982、本明細書中で参考として援用される。特定のアミノ酸が、類似の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を保持することは公知である。疎水親水指数に基づいた変化を生じさせる際に、疎水親水指数が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0.5以内である置換がさらにより特に好ましい。従って、アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換され、そしてなお生物学的に等価なタンパク質を入手し得ることが理解される。米国特許第4,554,101号本明細書中で参考として援用されるにおいて詳述されるように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に指定されている:アルギニン3.0;リジン3.0;アスパラギン酸3.0±1;グルタミン酸3.0±1;セリン0.3;アスパラギン0.2;グルタミン0.2;グリシン0;トレオニン-0.4;プロリン-0.5±1;アラニン-0.5;ヒスチジン-0.5;システイン-1.0;メチオニン-1.3;バリン-0.5;ロイシン-1.8;イソロイシン-1.8;チロシン-2.3;フェニルアラニン-2.5;トリプトファン-3.4。親水性値に基づいた変化を生じさせる際に、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、そして±0.5以内である置換がさらにより特に好ましい。H.結合体アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体改善された特性を有する選択された抗PS抗体、例えば、9D2および3G4ATCC4545を含むは、免疫毒素を調製するための抗細胞剤および細胞傷害剤;コアグリガンドを調製するための直接的または間接的のいずれかのコアグリガンド;または抗ウイルス性免疫結合体またはイムノビロシドを調製するための抗ウイルス剤例えば、ヌクレオシドに結合体化され得るか、または結合され得るか、または作動可能に関連し得る。PE結合ペプチド例えば、デュラマイシンはまた、ある範囲のPE結合ペプチド誘導体および抗ウイルス性ペプチド結合体を調製するために、不活性なキャリア、標的剤または抗ウイルス剤に結合体化され得るか、または結合され得るか、または作動可能に関連し得る。共有結合が好ましいものの、作動可能な結合のための他の手段がまた使用され得る。例えば、連結される構築物は、アビジン:ビオチン架橋を使用して作製され得る。当業者に利用可能な知識に加えて、同一出願人の米国特許第6,093,399号は、抗体および標的化剤の生物学的薬剤および治療剤に作動可能に結合する際のアビジン:ビオチンの使用をさらに記載し可能にするために、本明細書中において具体的に援用される。2つの薬剤がまた、第2の結合領域好ましくは、抗体またはその抗原結合領域によって結合され得る。これは、コアグリガンドによって例示され、この標的化剤は、第2の結合領域によって凝固剤に連結される米国特許第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号、各々が、本明細書中において参考として援用される。これは、癌の処置において作製され、首尾良く使用された。第1の標的化剤が抗体または抗原結合領域である場合、抗体、または抗原結合領域でもある第2の結合領域の使用は、二重特異的抗体構築物を生じる。一般に、二重特異的抗体の調製および使用は、当該分野で周知であり、本明細書中にさらに開示される。免疫結合体技術は、ここで、一般的に当該分野で公知である。しかし、特定の利点が、特定の好ましい技術調製および引き続く臨床的投与のための精製の両方の適用を介して達成され得る。例えば、IgGベースの構築物が、代表的に、それらのFab’対応物よりもより良い結合能力および血液クリアランスを示すものの、Fab’フラグメントに基づく構築物は、一般的に、より良い組織浸透能力を示す。さらに、多くのタイプのジスルフィド結合含有リンカーが、公知であり、抗体およびペプチド結合体において首尾良く利用され得、特定のリンカーが、一般的に、異なる薬理学的特性および能力に基づいて、他のリンカーよりも好ましい。例えば、立体的に妨害されるジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでより大きな安定性を生じることに起因して好ましく、これによって作用物での結合の前での凝固剤の放出を妨げる。架橋リンカーの各タイプ、ならびに架橋がどのように実行されるかは、得られる結合体の薬物動力学を変化する傾向がある。作用の意図される部位この部位で、結合体が良好な放出特性を有するを除いて、体内のいたる場所で見出される条件下でインタクトなままである結合体を有することが望ましくあり得る。従って、特定の架橋スキーム特に、使用される特定の架橋試薬および架橋される構造を含むは、いくらかの有用性がある。結合体化される特定の薬剤に依存して、抗体またはPE結合ペプチドおよび第二の薬剤または治療剤を作動可能に結合するペプチドスペーサーを提供することが必要であり得るかまたは所望され得る。特定のペプチドスペーサーは、ジスルフィド結合されたループ構造に折り畳まれ得る。次いで、ループ内のタンパク質分解切断は、ヘテロダイマーポリペプチドを生成し、ここでこの抗体および治療剤は、単一のジスルフィド結合のみによって連結される。このような毒素の例は、リシンA鎖毒素である。特定の他の毒素化合物が利用される場合、非切断可能ペプチドスペーサーが、融合タンパク質の抗体および毒素化合物を作動可能に結合するために提供され得る。非切断可能ペプチドスペーサーとともに使用され得る毒素は、それら自体が、タンパク質分解切断によって、細胞傷害性ジスルフィド結合形態に変換され得る毒素である。このような毒素化合物の例は、Pseudonomas外毒素化合物である。種々の化学治療剤および他の薬理学的薬剤が、ここで、抗体に首尾良く結合体化され、そして薬理学的に機能することを示した。調査されている例示的な抗新生物剤としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、および種々の他のものが挙げられる。さらに、他の薬剤例えば、ネオカルジノスタチンneocarjinostatin、マクロマイシン、トレニモンtrenimonおよびα-アマニチンが記載されている。これらの結合方法が、本明細書中での使用のために適合され得る。抗体またはPE結合ペプチドに対する任意の共有結合が、機能的部位とは異なる部位で理想的になされるべきである。従って、組成物は、特に、得られる構築物がなお意図される抗原またはPEに結合し、そして結合される薬剤が、実質的に生物学的活性を実質的に維持し、および/または構築物から放出される場合に、生物学的活性を回復するように、有意に損なうことなく、その異図とされる機能を各領域が実行する、任意の操作様式で連結される。H1.生化学架橋剤上記に提供される一般の情報に加えて、抗体またはPE結合ペプチドは、特定の好ましい生化学架橋剤を使用して、治療剤または他の薬剤に結合体化され得る。架橋試薬は、2つの異なる分子の官能基を共に結ぶ分子架橋を形成するために使用される。段階的な様式にて2つの異なるタンパク質を連結するために、所望されないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤が、使用され得る。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、表Cにおいて参照される。ヘテロ二官能性架橋剤は、2つの反応基一方は、一般に、第1級アミン基例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応し、そして他方は、一般にチオール基例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなどと反応するを含む。第1級アミン反応基を通じて、この架橋剤は、あるタンパク質例えば、選択された抗体、フラグメント、またはPE結合ペプチドのリジン残基と反応し得、このチオール反応基を通じて、第1のタンパク質と既に結び付けられている架橋剤は、他のタンパク質例えば、凝血薬のシステイン残基遊離のスルフヒドリル基と反応する。従って、組成物は、一般に、架橋の目的に利用可能な官能基を有するか、または有するように誘導体化される。この要件は、広汎な種々の基がこの様式において使用され得るという点で限定的であるとは考えられない。例えば、第一級アミン基または第二級アミン基、ヒドラジド基またはヒドラジン基、カルボキシル基、アルコール基、ホスフェート基、あるいはアルキル化基は、結合および架橋のために使用され得る。架橋剤の2つの反応基の間のスペーサーアームは、種々の長さおよび化学組成を有し得る。より長いスペーサーアームは、結合体成分のより良好な可撓性を可能にし、その一方、架橋におけるいくつかの特定の成分例えば、ベンゼン基は、反応基にさらに安定性を、または種々の局面の作用に化学結合の耐性の増大例えば、還元剤への耐性のジスルフィド結合を与え得る。ペプチドスペーサー例えば、L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Alaの使用もまた、意図される。血中にて合理的な安定性を有する架橋剤が用いられることが好ましい。標的化剤および毒素因子または凝固因子を結合体においてに首尾よく用いられ得る、多くの型のジスルフィド結合含有リンカーが、公知である。立体的に妨害されるジスルフィド結合を含むリンカーが、インビボでより大きな安定性を生じることを証明し得、このことは、作用部位での結合の前に因子の放出を妨げる。従って、これらのリンカーは、連結剤の1つの好ましい群である。イムノトキシンにおける使用に最も好ましい架橋試薬のうちの1つは、SMPTである。SMPTは、隣接するベンゼン環およびメチル基により立体的に妨害されているジスルフィド結合を含む、二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、チオレート陰イオン組織および血中に存在し得るグルタチオンのようなによる攻撃から結合を保護し、それによって腫瘍部位への結合した薬剤の送達の前に結合体の脱カップリングを防ぐため際に役立つ機能を提供すると考えられる。SMPT剤はまた、本発明の二重特異性リガンドと組み合せて使用され得ることが意図される。多くの他の公知の架橋試薬のように、SMPT架橋試薬は、官能基例えば、システインのSHまたは第一級アミン例えば、リジンのε-アミノ基を架橋する能力を与える。別の可能な型の架橋剤は、切断性ジスルフィド結合例えば、スルホスクシンイミジル-2-p-アジドサリチルアミドエチル-1,3’-ジチオプロピオネートを含有する、ヘテロ二官能性感光性フェニルアジドを含む。N-ヒドロキシ-スクシンイミジル基は、第一級アミノ基と反応し、そしてフェニルアジド光分解の際は、任意のアミノ酸残基と非選択的に反応する。妨害されたhindered架橋剤に加えて、妨害されていないリンカーもまた、本明細書に従って用いられ得る。保護されたジスルフィドを含まないかまたは生成しないと考えられる、他の有用な架橋剤には、SATA、SPDPおよび2-イミノチオレンが挙げられる。このような架橋剤の使用は、当該分野において十分に理解されている。一旦結合体化されると、この結合体は、非結合体化抗体またはペプチドおよび他の薬剤から、ならびに他の夾雑物から分離される。多数の精製技術が、結合体を臨床的に有用にするに十分な程度の純度の結合体を提供する使用に利用可能である。サイズ分離例えば、ゲル濾過、ゲル浸透、または液体高速クロマトグラフィーに基づく精製方法は、一般に、最も有用である。他のクロマトグラフィー技術例えば、Blue-Sepharose分離もまた、使用され得る。H2.生物学的に放出可能なリンカー任意の結合部分は、血液において合理的な安定性を有し、疾患、例えば、腫瘍部位に標的化する前に、付着した薬剤の実質的な放出を予防することが、好ましいけれども、特定の局面において、生物学的に放出可能な結合および/または選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカーの使用が、意図される。生物学的に放出可能な結合および選択的に切断可能なスペーサーまたはリンカーは、循環において合理的な安定性をなお有する。従って、本発明に従う抗体またはPE結合ペプチドは、生物学的に放出可能な結合を介して1以上の治療剤に結合され得る。ScFvフラグメントは、特定の実施形態において好ましいけれども、標的化薬剤または抗体の任意の形態は、使用され得、これは、インタクトな抗体を含む。生物学的に放出可能な結合または選択的に加水分解可能な結合は、唯一または優先的に特定の条件下で、放出可能、切断可能、または加水分解であるすべての結合を含む。これは、米国特許第5,474,765号および同第5,762,918号各々は、本明細書中で特異的に参考文献として援用されるに記載されるように、ジスルフィド結合およびトリスルフィド結合ならびに酸標識結合が挙げられる。治療剤の本発明の抗体またはPE結合ペプチドへの付着のための酸感応性スペーサーの使用は、特に意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物は、細胞内の酸区画内で放出される。酸感応性放出は、細胞外で起こり得るが、特定の標識の後、好ましくは腫瘍部位に対して起こることが意図される。特定の現状で好ましい例としては、酸感応性スペーサーを介してコルヒチンまたはドキソルビシンに結合された2C3様抗体が挙げられる。抗体の糖質部分を介する付着はまた、意図される。このような実施形態において、治療剤または治療薬物は、細胞内の酸性区画内で放出される。抗体またはPE結合ペプチドはまた、生物学的に放出可能な結合を介して治療剤の付着を可能にする官能基を導入するように誘導され得る。従って、抗体またはPE結合ペプチドは、ヒドラジド基、ヒドラジン基、1級アミン基または2級アミン基において側鎖ターミネートを導入するように誘導され得る。治療剤は、Schiffの塩基結合、ヒドラゾンもしくはアシルヒドラゾン結合またはヒドラジドリンカーを介して結合体化され得る米国特許第5,474,765号および同第5,762,918号、各々は、本明細書中で参考として特異的に援用される。米国特許第5,474,765号および同第5,762,918号各々は、本明細書中で参考として特異的に援用されるに記載されるように、抗体またはPE結合ペプチドは、酵素感応性の1以上の生物学的に放出可能な結合ペプチド結合、エステル、アミド、リン酸ジエステルおよびグリコシドが挙げられるを介して治療剤に操作可能に付着され得る。本発明の特定の好ましい局面は、優先的に疾患部位、特に、腫瘍環境内に位置する、ペプチターゼおよび/またはプロテイナーゼに対する少なくとも第1切断部位を含むペプチドリンカーの使用に関する。従って、付着された治療剤の抗体媒介送達は、疾患部位または腫瘍環境内で特異的に切断を生じ、活性薬剤の特異的放出を生じる。特定のペプチドリンカーは、再構築に関する1以上の酵素によって認識される切断部位を含む。ウロキナーゼ、プロ-ウロキナーゼ、プラスミン、プラスミノゲン、TGFβ、スタフィロキナーゼ、トロンビン、第IXa因子、第Xa因子またはメタロプロテイナーゼ例えば、間質性コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、またはストロメライシンに対する切断部位を含むポリペプチドリンカーは、特に好ましい。米国特許第6、004、555、米国特許第5,877,289および同第6,093,399号は、さらなる記載ならびに標的薬剤-治療剤構築生物学的に放出可能な結合ならびに選択的に切断可能なリンカーおよびペプチドを含むを作製かつ使用する方法を可能にする目的のために、本明細書中で参考として特異的に援用される。特に、1999年3月2日に発行された米国特許第5,877,289号は、さらなる記載ならびに標的薬剤-治療剤構築ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第IXa因子、第Xa因子またはメタロプロテイナーゼ例えば、間質性コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、またはストロメライシンによって腫瘍環境内で切断される選択的に切断可能なペプチドリンカーを含むを作製かつ使用する方法を可能にする目的のために、本明細書中で特異的に参考として援用される。現状で好ましい選択的に切断可能なペプチドリンカーは、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼマトリックスメタロプロテアーゼまたはMMPとしても公知である例えば、間質性コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシンに対する切断部位を含むリンカーである。本発明に関して有意に使用され得るさらなるペプチドリンカーとしては、例えば、プラスミン切断可能配列例えば、プロウロキナーゼによって切断可能なもの、TGFβ、プラスミノゲンおよびスタフィロキナーゼ;第Xa因子切断可能配列;MMP切断可能配列例えば、ゼラチナーゼAによって切断可能なもの;コラゲナーゼ切断可能配列例えば、ウシ皮膚コラーゲンα1I鎖、ウシ皮膚コラーゲンα2I鎖、ウシ軟骨コラーゲンα1II鎖、ヒト肝臓コラーゲンα1III鎖、ヒトα2M、ヒトPZP、ラットα1M、ラットα2M、ラットα1I32J、ラットα1I327J、およびヒト線維芽細胞コラゲナーゼ自己分解切断部位が挙げられる。当業者に利用可能な知識に加えて、同一出願人の米国特許第6,342,219号、同第6,524,583号、同第6,342,221号および同第6,416,758号における表B2からの文書および配列が、このような切断可能な配列の使用を記載しそして可能にする目的で、本明細書中において具体的に援用される。H3.二重特異性抗体二重特異性抗体は、一般的に、1つのアームが、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合し、そして二重特異的抗体が、抗原結合部位とは異なる部位において治療剤に結合する限り、使用され得る。一般に、二重特異性抗体の調製はまた、当該分野において周知である。1つの方法は、一方で、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に対して特異性を有する抗体を、他方で、治療剤を、別々に調製することを含む。ペプシンのFab’γ2フラグメントを、2つの選択した抗体から調製し、続いて各々を還元し、別々のFab’γSHフラグメントを提供する。次に、カップリングする2つのパートナーの1つにあるSH基を、o-フェニレンジマレイミドのような架橋剤を用いてアルキル化し、遊離のマレイミド基を1つのパートナー上に提供する。次にこのパートナーを、チオエーテル結合の手段によって他方と結合させ、所望のFab’γ2ヘテロ結合体を生成し得る。SPDPまたはプロテインAを用いて架橋を行うか、または三重特異性構築物を調製する他の技術が、公知である。二重特異性抗体を生成する他の方法は、2つのハイブリドーマを融合して、クアドローマquadromaを形成することである。本明細書において使用する場合、用語クアドローマは、2つのB細胞ハイブリドーマの融合産物を記載するために使用される。ここで、標準的な技術を用いて、2つの抗体産生ハイブリドーマを融合して、娘細胞を産生し、そして免疫グロブリン遺伝子のクローン型の両方のセットの発現を維持する細胞が、次いで選択される。クアドローマを産生する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも1つの酵素を欠失する変異体の選択を包含する。次に、この第1の変異型ハイブリドーマ細胞株は、その連続する生存を妨げる、例えば、ヨードアセトアミドに致死的に曝露された第2のハイブリドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に処理されたハイブリドーマから、その酵素欠失についての遺伝子を獲得することにより、第1のハイブリドーマの救済、および第1のハイブリドーマとの融合を介する第2のハイブリドーマの救済を可能とする。同一のアイソタイプであるが、異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が好ましいが、しかし必要ではない。好ましいクアドローマの単離のための代替的なアッセイが存在すれば、混合されたサブクラスの抗体は、使用可能である。より詳細には、クアドローマの開発およびスクリーニングの1つの方法は、第1の選択されたMAbを分泌するハイブリドーマ株を得る工程、およびこのハイブリドーマを、必須の代謝酵素ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTについて欠失させる工程を包含する。ハイブリドーマの欠失変異体を得るために、細胞を、8-アザグアニンの漸増濃度1×10-7M~1×10-5Mの存在下で増殖させる。変異体を、限界希釈によってサブクローニングし、そしてそのヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジンHAT感受性について試験する。この培養培地は、例えば、10FCS、2mML-グルタミンおよび1mMペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEMからなり得る。第2の所望のMAbを産生する相補的なハイブリドーマ細胞株を使用して、標準的な細胞融合技術によって、クアドローマを生成する。手短には、4.5×107のHAT感受性の第1の細胞を、2.8×107HAT耐性の第2の細胞不可逆的生化学的インヒビターであるヨードアセトアミドの致死用量リン酸緩衝化生理食塩水中に5mMで、融合前に30分間氷上で前処理したと混合する。細胞融合は、ポリエチレングリコールPEGを使用して誘導し、そしてこの細胞を96ウェルのマイクロ培養プレート中にプレートする。クアドローマを、HAT含有培地を使用して選択する。二重特異性抗体含有培養物を、例えば、固相アイソタイプ特異的ELISAおよびアイソタイプ特異的免疫蛍光染色を使用して、同定する。二重特異性抗体を同定するための、1つの同定実施形態において、マイクロタイタープレートのウェルFalcon、BectonDickinsonLabwareを、親ハイブリドーマ抗体の1つと特異的に相互作用し、そして両方の抗体との交差反応性を有さない試薬で、コートする。プレートを洗浄し、ブロックし、そして試験する上清SNを各ウェルに添加する。プレートを室温で2時間インキュベートし、上清を棄て、プレートを洗浄し、そして希釈したアルカリホスファターゼ-抗-抗体結合体を、室温で2時間添加する。プレートを洗浄し、そしてホスファターゼ基質例えば、p-ニトロフェニルホスフェートSigma、St.Louisを各ウェルに添加する。プレートをインキュベートし、3NNaOHを各ウェルに添加して反応を停止し、そしてELISAリーダーを使用して、OD410値を測定する。別の同定実施形態において、ポリL-リジンを用いて前処理したマイクロタイタープレートを使用して、各ウェルに標的細胞の1つを結合し、次にその細胞を固定化し例えば、1グルタルアルデヒドを使用する、そして二重特異性抗体を、インタクトな細胞に結合するその能力について試験する。さらに、FACS、免疫蛍光染色、イデオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイ、および抗体の特徴付けの分野において一般的な他の方法を、本発明の方法と組み合わせて使用し、好ましいクアドローマを同定し得る。クアドローマの単離に続いて、二重特異性抗体を他の細胞性産物から精製する。この精製は、免疫グロブリン精製の分野において当業者に公知の、種々のタンパク質単離手順によって達成され得る。抗体を調製する手段、および特徴付ける手段は、当該分野において周知である例えば、Antibodies:ALaboratoryManual、1988を参照のこと。例えば、選択されたクアドローマの上清をプロテインAセファロースカラムまたはプロテインGセファロースカラムを通過させて、IgGを結合させるアイソタイプに依存する。次に結合した抗体を、例えば、pH5.0クエン酸緩衝液を使用して溶出する。BsAbを含む溶出画分を、等張緩衝液に対して透析する。あるいは、溶出液をまた、抗-免疫グロブリンセファロースカラムを通過させる。次に、BsAbを、3.5M塩化マグネシウムを用いて溶出する。次に、この方法において精製されたBsAbを、例えば、上記の標的細胞のアイソタイプ特異的ELISAおよび免疫蛍光染色アッセイによって、結合活性について試験する。精製されたBsAbおよび親抗体はまた、SDS-PAGE電気泳動と、その後の銀染色またはクマシー染色によって、特徴付け、および単離され得る。この手順は、親抗体の一方が、他方の抗体よりも大きな分子量を有し、BsAbのバンドが2つの親抗体の中間に移動する場合に、可能である。サンプルの還元は、2つの見掛け上異なる分子量を有する重鎖の存在を確認する。H4.融合タンパク質および組換え発現アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体9D2および3G4ATCC4545抗体を含むおよび改善された特性を有する他の競合抗体、ならびにPE結合ペプチドはまた、分子生物学技術を使用して融合タンパク質を作製するために使用され得る。任意の融合タンパク質が、任意の抗体、PE結合ペプチドおよび第二の薬剤または治療剤本明細書中に開示されるならびに当該分野で公知のものを使用して設計および作製され得る。融合タンパク質技術は、他の改変例えば、CDR配列の最適化、選択的に切断可能なペプチド配列を介する連結などを有する融合タンパク質を調製するために容易に適合可能である。このような目的を達成するための組換えDNA技術の使用は、現在、当業者に標準的操作である。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ組換え/遺伝的組換えが挙げられる。さらに、DNA合成およびRNA合成は、自動合成装置を使用して実施され得る例えば、Sambrookら、1989本明細書中に参考として援用されるに記載される技術を参照のこと。このような融合タンパク質の調製は、一般的に、所望の融合タンパク質をコードする単一のコード領域を調製するために、第1および第2のDNAコード領域の調製、およびそのような領域をインフレームで機能的に連結または結合することを伴う。本発明の状況において、抗体配列は、治療剤をコードするDNA配列とインフレームで連結される。構築物のどの部分がN末端領域またはC末端領域として調製されるかが、特に関連するとは一般に考えられない。一旦、所望のコード領域が生成されると、発現ベクターが作製される。発現ベクターは、挿入されたDNA領域の上流に、そのDNAの転写を促進するように作用し、そして従ってコードされる組換えタンパク質の発現を促進するように作用する1つ以上のプロモーターを含む。これが、組換え発現の趣意である。免疫結合体のいわゆる組換えバージョンを獲得するために、ベクターが、組換え細胞内で発現される。原核生物系または真核生物系における発現のためのDNAセグメントの操作は、組換え発現における当業者に一般的公知の技術によって実施され得る。実質的に任意の発現系が、この発現において使用され得ると考えられる。本発明の免疫結合体は、真核生物発現系例えば、CHO細胞において首尾良く発現され得る。しかし、E.colipQE-60のような細菌発現系が、構築物の大規模調製および引き続く精製のために特に有用であると考えられる。cDNAはまた細菌系において発現され、発現されるそのコードタンパク質はβ-ガラクトシダーゼ、ユビキチン、SchistosomajaponicumグルタチオンS-トランスフェラーゼなどを伴う融合物として発現され得る。細菌発現は、使用の容易さ、およびそれによって得られる物質の品質に関して、真核生物発現を超える利点を有すると考えられる。微生物発現に関して、組換え宿主細胞における遺伝子の発現と関連して本発明の開示をなおさらに補充する目的のために、米国特許第5,583,013号;同第5,221,619号;同第4,785,420号;同第4,704,362号;および同第4,366,246号が、本明細書中で参考として援用される。組換え的に生成される免疫結合体は、ヒト投与のために精製および処方され得る。あるいは、免疫結合体コードする核酸は、遺伝子治療を通して送達され得る。裸の組換えDNAまたはプラスミドが使用され得るが、リポソームまたはベクターの使用が好ましい。特定ウイルスが、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に進入する能力、および宿主細胞ゲノムに組込みそして安定的および効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、それらを、哺乳動物細胞内に外来遺伝子を移入させるための魅力的な候補にさせている。本発明における使用のために好ましい遺伝子治療ベクターは、一般的にウイルスベクターである。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組込むそれらの能力、大量の外来性遺伝物質を移入させるそれらの能力、広範なスペクトルの種および細胞型に感染するそれらの能力、および特定の細胞株にパッケージングされるそれらの能力に起因して、遺伝子送達ベクターとして見こまれている。他のウイルス例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスHSV、サイトメガロウイルスCMV、およびアデノ随伴ウイルスAAV例えば、米国特許第5,139,941号本明細書中で参考として援用されるに記載されるウイルスもまた、遺伝子移入のためのベクターとして作用されるように操作され得る。外来性遺伝物質を受容し得るいくつかのウイルスは、それらが適応し得るヌクレオチドの数、およびそれらが感染する細胞の範囲において限定されるが、これらのウイルスは、遺伝子発現を首尾良くもたらすことが実証されている。しかし、アデノウイルスは、それらの遺伝産物を宿主ゲノム中に組込まず、従って遺伝子発現のために宿主の複製を必要としない。これは、迅速な遺伝子発現、効率的な遺伝子発現、異種遺伝子発現についてそれらを理想的に適合させる。複製欠損した感染性ウイルスを調製する技術は、当該分野において周知である。特定のさらなる実施形態において、遺伝子治療ベクターはHSVである。HSVを魅力的なベクターにする因子は、ゲノムの大きさおよび組織化である。HSVは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットを組込むことは、より小さな他のウイルス系よりもあまり問題ではない。さらに、変動する性能例えば、時間的、強度を有する種々のウイルスコントロール配列の利用能は、他の系におけるよりも高い程度で発現を制御することを可能にする。ウイルスが比較的少数でスプライシングされるメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすることもまた有用である。HSVはまた、操作が比較的容易であり、そして高い力価まで増殖され得る。もちろん、ウイルス送達系を使用する際には、所望されない夾雑物例えば、不完全干渉ウイルス粒子または発熱物質を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製し、その結果、ベクター構築物を受容する細胞、動物、または個体において不都合な反応を全く引き起こさないことが所望される。ベクターを精製する好ましい手段としては、浮遊密度勾配の使用例えば、塩化セシウム勾配遠心分離が挙げられる。I.結合および機能アッセイ本発明が動物およびヒトの処置レジメンにおいて有意な有用性を有するものの、多くの他の特異的および信頼できる使用多くのインビトロ実施形態における特定の使用を含むも有する。これらの使用の特定のものは、抗体、ペプチドおよび免疫結合体の特異的結合特性に関連する。本発明の構築物の各々が、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に結合する少なくとも1つの抗体またはペプチド成分を含む点で、これらは、種々の結合実施形態有用な結合アッセイを含むにおいて使用され得る。結合される薬剤の存在関連する場合は、有利な特性を提供するが、任意の結合アッセイにおける第1の抗体の有用性を否定しない。従って、適切な有用な結合アッセイは、本明細書中にさらに記載されるように、当該分野で一般的に使用されるものイムノブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、RIA、ELISA、免疫組織化学、蛍光活性化細胞選別FCS、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む。特定の標準的な結合アッセイは、イムノブロット、ウェスタンブロット、ELISAおよび関連アッセイのような、固体支持体マトリクス例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組合せ上に固定される。他の重要なアッセイは、細胞を使用し、本発明の成分が、細胞表面において、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質を用いてアッセイに使用され得る。このようなアッセイは、前臨床試験例えば、薬物の設計、作用の機構の試験および/または組み合わせた使用のための治療剤の選択に関するにおいて適用され得る。さらなるインビトロアッセイは、異常な細胞活性化および/またはアポトーシスに関連した疾患の診断に有用であり、細胞表面でのアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の存在の試験は、特に有用である。本発明の構築物は、このように、免疫組織化学において、新鮮凍結およびホルマリン固定の両方、パラフィン包埋組織ブロック;蛍光活性化細胞選別、フローサイトメトリーまたはフローマイクロフルオロメトリーと組み合わせて使用され得る。これらの本発明の構築物は、免疫沈降、抗原精製実施形態例えば、アフィニティークロマトグラフィー二重特異的抗体の場合さえ含む、同時の一つ以上の抗原の一工程の迅速な精製;および本明細書中に提示される上表を与えられる当業者に公知の多くの他の結合アッセイにおいてさらなる実際的な使用を有する。本発明の構築物のなおさらなる実際的な使用は、機能的アッセイ多くのインビトロおよびエキソビボのアッセイおよびシステムを含むにおけるコントロールとしてである。本発明の抗体、ペプチド、および結合体の結合特性および機能的特性が本明細書中に開示されるように特に特異的であるので、このようなコントロールの使用は、実際に非常に価値がある。本発明のこのような実際的な適用からの利点があるアッセイとしては、例えば、細胞表面でのアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の検出に関するアッセイが挙げられる。これらのアッセイシステムはまた、インビトロまたはエキソビボで薬物スクリーニングアッセイへと開発され得、ここで、十分に規定された特性を有する生物学的材料の現在の提供provisionが特に重要である。例えば、類似した、等価な、または改善された結合特性を有する低分子の選択におけるポジティブコントロールとして本発明の構築物を使用すること例えば、薬物スクリーニングおよび開発において。J.薬学的組成物本発明の治療剤は、一般に、薬学的組成物として処方される。薬学的組成物は、少なくとも本発明の第1の治療剤薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に、溶解または分散したの生物学的または治療的有効量を含む。組み合わせ治療もまた意図され、そして同じ型の基礎をなす薬学的組成物を、単一医薬および組み合わせ医薬の両方について使用し得る。句薬学的に受容可能、または薬理学的に受容可能とは、必要に応じて、動物またはヒトに投与された場合、有害な、アレルギー性のまたは他の有害な反応を生じない分子全体または組成物をいう。獣医学的使用、本発明に等しく包含され、そして薬学的に受容可能な処方物は、臨床的および/または獣医学的使用の両方のための処方物を含む。本明細書において使用する場合、薬学的に受容可能なキャリアとしては、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のための、そのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物中でのその使用が意図される。ヒトへの投与のために、調製物は、FDA官庁の生物製剤の基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。補助的な活性成分もまた、組成物中に組込まれ得る。単位用量処方物は、特定の時機に合わせられた送達に適合される投与成分の用量または副用量を含む。例えば、例示的な単位用量処方物は、日用量もしくは日用量単位もしくは日副用量または週用量もしくは週用量単位もしくは週副用量などを含む処方物である。J1.注射可能処方物本発明の治療剤は、しばしば、非経口投与例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮を介する注射のための処方、またはぜん動投与および腫瘍もしくは疾患部位腔内投与中への直接滴下を含む他の経路のための処方のために処方される。抗体、免疫結合体またはペプチド結合体を活性成分として含有する水性組成物の調製は、本明細書の開示を参照すれば、当業者に公知である。代表的には、そのような組成物は、水溶液または懸濁液のいずれかにおいて、注射可能な薬剤として調製され得る;注射前の液体への添加において、溶液または懸濁液を調製するための使用に適切な固体形態もまた調製され得る;そしてその調製物はまた、乳化され得る。注射での使用に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌懸濁液;ゴマ油、ピーナッツオイル、または水性プロピレングリコールを含む処方物;および滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能懸濁液の即時調製のための滅菌粉末、が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌であるべきであり、そして注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下において安定であるべきであり、そして微生物例えば、細菌および真菌の混入作用に対して、保護されるべきである。治療剤は、中性または塩の形態において、滅菌水性組成物中に処方され得る。遊離の塩基、または薬理学的に受容可能な塩としての治療剤の溶液は、界面活性剤例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水中で調製され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸添加塩タンパク質の遊離のアミノ基を用いて形成される、および無機酸例えば、塩酸またはリン酸または有機酸例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される塩などが挙げられる。遊離のカルボキシ基を用いて形成される塩はまた、無機塩基例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄IIIおよび有機塩基例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導され得る。適切なキャリアとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒および分散媒体が挙げられる。多くの場合において、等張剤例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。適切な流動性は、例えば、コーティング剤例えば、レシチンの使用によって、分散の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって、および/または界面活性剤の使用によって、維持され得る。貯蔵および使用の通常の条件下において、全てのそのような調製物は、防腐剤を含有し、微生物の増殖を防ぐべきである。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、遅延型吸収剤例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。処方の際、または処方前に、治療剤は、広範に透析され、所望されない低分子物質を除去するか、および/または、適切な場合、所望のビヒクル中へのより容易な処方のために凍結乾燥されるべきである。滅菌の注射可能溶液は、必要とされる量の活性薬剤を、適切な溶媒中に、上記に列挙した他の種々の成分とともに取り込まれ、必要に応じて、その後に濾過滅菌されることにより調製される。一般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙される必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に取り込まれることにより、調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分、および以前に滅菌濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥およびフリーズドライ技術である。本発明に従う適切な薬学的組成物は、一般に、受容可能な薬学的希釈剤または賦形剤例えば、滅菌水溶液と混合された治療剤のある量を含み、意図される使用に依存して、ある範囲の最終濃度を生じる。調製の技術は、Remington’sPharmaceuticalSciences、第16版、MackPublishingCompany、1980本明細書において参考として援用されるによって例示されるように、一般に当該分野において周知である。エンドトキシンの混入は、安全なレベルに最小限に維持されるべきである例えば、0.5ng/mgタンパク質未満ことを理解するべきである。さらに、ヒトへの投与について、調製物は、FDA官庁の生物製剤基準によって必要とされる、滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を充たすべきである。処方の際に、抗体または免疫結合体溶液は、投薬量処方と適合する様式において、およびそのような治療的有効量において、投与される。J2.徐放性処方物処方物は、種々の投薬形態例えば、上記の注射可能な溶液の型において容易に投与されるが、他の薬学的に受容可能な形態例えば、錠剤、ピル、カプセルまたは経口投与のための他の固体、座剤、腟坐薬、経鼻溶液またはスプレー、エアロゾル、吸入剤、リポソーム形態などもまた意図される。投与形態の型は、処置される疾患または障害に適合される。薬学的遅放性カプセルまたは徐放性組成物または調製物が、使用され得、そして一般的に適用可能である。徐放性処方物は、一般に、長期間にわたって一定の薬物レベルを生じるように設計され、そして本発明に従う治療剤を送達するために使用され得る。遅放性処方物は、代表的に、疾患部の近位例えば、腫瘍またはウイルス感染の部位に移植される。徐放性調製物の適切な例としては、抗体または免疫結合体を含む固形疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形された物品例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、以下が挙げられる:ポリエステル;ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレートまたはポリビニルアルコール;ポリラクチド例えば、米国特許第3,773,919号;L-グルタミン酸およびγエチルL-グルタメートのコポリマー;非分解性エチレン-酢酸ビニル;分解性乳酸-グリコール酸コポリマー例えば、LupronDepotTM乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる注射可能なミクロスフェア;およびポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸のようなポリマーは、分子を100日間にわたって放出し得、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短期間で放出する。カプセル化抗体が身体内に長時間残留する場合、37°Cで湿気に曝露される結果としてこれらは変性または凝集し得、従って生物学的活性を減少し、かつ/または免疫原性を変化する。合理的なストラテジーは、関与する機構に依存した安定化に利用可能である。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド相互変換を介した分子間S-S結合形成に関与する場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加物の使用、特定のポリマーマトリクス組成物の開発などによって達成される。J3.リポソームおよびナノカプセル特定の実施形態において、リポソームおよび/またはナノカプセルもまた、治療剤とともに使用され得る。リポソームの処方および使用は、以下に要約されるように、当業者に、一般に公知である。本発明は、抗体、リポソームおよび化学療法剤の特定の組合せ以下に記載されるを提供する。さらに、リポソーム処方物は、本発明の治療剤のいずれかの慣用的な成分として使用され得る。リポソームは、水性媒体中に分散されるリン脂質から形成され、そして自発的に多層の同心の二重層ビヒクル多層ビヒクルMLVとも称するを形成する。MLVは、一般に、25nm~4μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、中心に水溶液を含有する、直径200~500Åの範囲の小さな単層のビヒクルSUVを生じる。リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理学的特徴は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオンおよび極性物質に対する低い浸透性を示し得るが、高温において、その浸透性を顕著に変化させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として公知の密接に充填された、規則正しい構造から、流体状態として公知の疎に充填された、より規則正しくない構造への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度において生じ、そしてイオン、糖および薬物の浸透性を増加する。リポソームは、4つの異なる機構を通じて、細胞と相互作用する:マクロファージおよび好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス;非特異的な弱い疎水的な力、もしくは静電的な力のいずれかによるか、または細胞表面成分との特異的な相互作用による細胞表面への吸着;リポソーム含有物の細胞質への同時放出をともなう、リポソームの脂質二重層の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合;および、リポソームの内容物の会合をいずれもともなわない、リポソーム脂質の、細胞膜または細胞内オルガネラ膜への移入、あるいはその逆。1つより多い機構が同時に作動し得るが、リポソームの処方を変化させることは、作動する機構を変更し得る。ナノカプセルは、一般に、安定にかつ再現性のある方法において、化合物を捕獲し得る。細胞内へのポリマー性の過剰負荷に起因する副作用を避けるために、そのような超微細粒子約0.1μmのサイズが、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用において意図され、そしてそのような粒子は、容易に作製され得る。J4.眼性処方物眼の多くの疾患特に、脈管形成成分を有するものは、本発明によって処置され得る。例えば、眼の脈管新生疾患、年齢関連黄斑変性症、糖尿病性網膜症、未熟成の網膜症、角膜移植拒絶、脈管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ならびに角膜脈管新生または網膜/脈絡膜脈管新生と関連する他の疾患本明細書中で以下に記載される。従って、本発明の治療剤は、眼性溶液として使用するために適切な薬学的組成物の調製において有利に使用され得、この薬学的組成物は、硝子体内および/または房内intracameral投与のための組成物を含む。前述の障害または他の障害の処置のために、治療剤は、従来の薬学的慣行例えば、Remington’sPharmaceuticalSciences第15編、1488~1501頁MackPublishingCo.,Easton,PAを参照のことに従って調製された眼性調製物の形態で処置の必要な非験体の眼に投与される。眼性調製物は、薬学的に受容可能な溶液、懸濁液または軟膏中に約0.01~1重量、好ましくは約0.05~約0.5重量の濃度で治療剤を含む。濃度のいくらかの変更は、使用する特定の化合物、処置される被験体の状態などに依存して必要に生じ、そして処置の担当者は、個々の被験体について最も適切な濃度を決定する。眼性調製物は、好ましくは、滅菌水溶液の形態であり、所望の場合、さらなる成分、例えば、防腐剤、緩衝液、弾力剤、酸化防止剤および安定剤、非イオン性湿潤剤または浄水剤、粘性増加剤などを含む。このような溶液において使用するための適切な防腐剤としては、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。適切な緩衝液としては、約pH6とpH8との間、好ましくは、約pH7とpH7.5との間のpHを維持するために十分な量の、ホウ酸、炭酸水素ナトリウムおよびカリウム、ホウ酸ナトリウムおよびカリウム、炭酸ナトリウムおよびカリウム、酢酸ナトリウム、ビリン酸biphosphateナトリウムなどが挙げられる。適切な弾力剤は、デキストラン40、デキストラン70、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、などであり、眼性溶液の塩化ナトリウム当量は、0.9±0.2の範囲である。適切な酸化防止剤おおび安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸水素ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤剤および浄水剤としては、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー282およびチロキサポールが挙げられる。適切な粘性増加剤としては、デキストラン40、デキストラン70、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。眼性調製物は、例えばドロップの形態で従来の方法によってか、または眼性溶液中に眼を浸すことによって処置の必要な被験体の眼に局所的に投与される。J5.局所処方物広範な意味で、局所投与のための処方物は、口頬側を介してかつ皮膚を通して送達するための処方物を含む。局所送達システムはまた、投与される成分を含む経皮的パッチを含む。皮膚を通す送達は、所望の場合、イオン注入または電気的運搬によってさらに達成され得る。口において局所投与するための適切な処方物は、風味のある基礎原料の成分、通常は、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ;不活性基礎原料例えば、ゼラチンおよびグリセリンの活性成分またはショ糖およびアカシアを含む香錠;ならびに適切な液体キャリアで投与される成分を含むうがい薬が挙げられる。皮膚に局所投与するための適切な処方物としては、軟膏、クリーム、ゲルおよび泥膏薬学的に受容可能なキャリアで投与される成分を含むが挙げられる。局所使用例えば、クリーム、軟膏およびゲルでのための治療剤としては、当該分野で周知のような、脂肪性基剤または水溶性軟膏剤の調製物が挙げられる。例えば、これらの組成物は、野菜オイル、動物性脂肪、が挙げられ、そしてより好ましくは、石油から得た半個体炭化水素が挙げられ得る。使用される特定の成分は、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステルワックス、オレイン酸、オリーブオイル、パラフィン、ペトロラタム、白色ペトロラタム、鯨蝋、グリセリンデンプン、白色ワックス、黄色ワックス、ラノリン、無水ラノリンおよびモノステアリン酸グリセリルが挙げられ得る。種々の水溶性軟膏剤が、使用され得、グリコールエーテルおよび誘導体、ポリエチレングリコール、ポリオキシル40ステアレート、ならびにポリソルベートが挙げられる。直腸投与のための処方物は、適切な塩基例えば、ココアバターまたはサリチレートを含むとともに坐剤として与えられ得る。窒投与のための適切な処方物は、さらなる活性成分例えば、当該分野で適切であると知られるキャリアを含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、泥膏、包状物、またはスプレー処方物として与えられ得る。J6.鼻性処方物鼻経路および呼吸器経路を介する局所送達は、種々の状態を処置するため特に、本発明の抗ウイルス処置方法における使用のために意図される。これらの送達経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために適切である。従って、鼻性投与のための適切なキャリアにおける活性成分の処方物は、本発明内に含まれ、例えば、鼻性溶液、スプレー、エアロゾルおよび吸入抗原が挙げられる。キャリアが個体である場合、処方物は、例えば、20~500ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗散剤が挙げられ、例えば、鼻に近接して維持される散剤のコンテナから鼻経路を通る急速な吸入によって投与される。キャリアが液体である適切な処方物は、鼻投与において有用である。鼻溶液は、通常は、ドロップまたはスプレーで鼻経路に投与されるように設計される水溶液であり、そしてそれらが、多くの局面において鼻分泌と類似であり、通常の線毛作用が維持されるように調製される。従って、鼻水溶液は、通常、等張性であり、そして5.5~6.5のpHを維持するようにわずかに緩衝化される。さらに、必要な場合、眼性調製物において使用される防腐剤と類似の抗菌防腐剤および適切な薬物安定剤は、処方物中に含まれ得る。種々の市販の鼻性調製物は、公知であり、そして例えば、抗生物質および抗ヒスタミン剤が挙げられ、ぜん息予防に使用される。吸入薬および吸入剤は、薬物または化合物の患者の呼吸樹への送達のために設計される薬学的調製物である。蒸気または霧が、投与され、そして有効領域に到達する。この経路はまた、薬剤を全身性循環に送達するために使用され得る。吸入薬は、鼻または口呼吸性経路によって投与され得る。吸入薬溶液の投与は、この液滴が十分に良質でかつサイズが均一であり、その結果、この霧が、細気管支に到達する場合にのみ、有効である。製品の別のグループ吸入薬としても公知であり、そして時には、吸入剤といわれるは、特異的送達システムの使用によって呼吸経路に運ばれる良質の散剤薬物または液体薬物例えば、薬学的エアロゾルを含み、液体ガス噴霧剤中に薬物の溶液または懸濁液を維持する。適切なバルブおよび口アダプターを通して放出される場合、吸入薬の測定用量は、患者の呼吸路に進められる。粒子サイズは、この型の調製物の投与において主に重要である。肺腔への穿通のための最適粒子サイズは、0.5~7μmのオーダーであると、報告されてきた。良質の霧は、加圧エアロゾルによって産生され、それによって、それらの使用の利点が、考慮される。K.診断および治療キット本発明はまた、処置方法、組合せ処置方法ならびに/または画像化および処置実施形態において使用するための、本発明の少なくとも1つの第1の治療剤すなわち、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質およびに結合する、抗体、免疫結合体またはペプチド結合体を含む診断キットおよび治療キットを提供する。このようなキットは、一般的に、少なくとも第1の適切な容器または容器手段、少なくとも1つの治療剤、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体、免疫結合体またはペプチド結合体の薬学的に受容可能な処方物を含む。キットは、例えば、前臨床的、臨床的および/または獣医学的実施形態での使用のための記載された指示書または電子指示書を備え得る。キットはまた、他の組成物、薬学的に受容可能な処方物および第2の生物学的および治療的薬剤併用療法ならびに/または診断および画像化のためを含むを含み得る。例えば、このようなキットは、任意の1つ以上のある範囲の化学治療剤、放射線療法剤または抗脈管形成剤、抗腫瘍細胞、抗腫瘍脈管構造または抗腫瘍間質抗体、免疫毒素またはコアグリガンド、抗ウイルス剤および/または診断成分または診断薬剤を含み得る。併用療法において使用するためならびに/または診断および画像化のための記載された指示書または電子指示書もまた含まれ得る。キットは、任意のさらなる成分を伴うかまたは伴わないで、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する第1抗体、免疫結合体またはペプチド結合体を含む単一容器を有し得るか、あるいは、これらは、各所望の薬剤のための異なる容器を有し得る。併用療法が提供される場合、単一の容器が、等しいモルの組合せで、または他方が過剰な一方の成分を有してのいずれかで予め混合され得る。あるいは、本発明の一次的な薬剤および第2の生物学的および治療的薬剤例えば、第2の抗癌剤または抗ウイルス剤、キットが、患者への投与の前に、キットの異なる容器内で別々に維持され得る。診断成分は、ほとんど大部分、少なくとも第2の容器1つ以上の治療剤を含む他の容器または第1の容器とは異なるで維持される。診断キットは、一次的治療剤と同じアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する標識された抗体またはペプチド、あるいは処置される疾患を診断するために適切な任意の他の薬剤を含み得る。キットは、インビトロでの使用、インビボでの使用のため診断剤、またはこのような薬剤の両方を含み得る。キットは、例えば、前臨床的、臨床的および/または獣医学的実施形態での使用のための記載された指示書または電子指示書を備え得る。インビトロでの免疫検出のために、抗体は、固体支持体例えば、マイクロタイタープレートの壁に結合し得るが、再構成のために抗体溶液または粉末が、好ましい。免疫検出キットは、好ましくは、少なくとも第1の免疫検出試薬を含む。キットの免疫検出試薬は、種々の形態のいずれか1つ例えば、インビボで使用される、抗体に結合するかまたは連結した検出可能な標識を含むを取り得る。第2の結合リガンドに結合するかまたは連結した検出可能な標識もまた、企図される。例示的な二次リガンドは、第1の抗体に対する結合親和性を有する第2抗体である。本発明のキットでの使用のためのさらに適切な免疫検出試薬は、第2の抗体に対する結合親和性を有する第3の抗体とともに、第1の抗体に対する結合親和性を有する第2抗体を含む二成分試薬を含み、第三の抗体は、検出可能な標識に連結されている。多くの例示的な標識が当該分野において公知であり、全てのこのような標識が、本発明とともに使用され得る。これらのキットは、完全に結合体化された形態で、中間の形態で、またはキットの使用者によって結合体化されるように別々の部分として、のいずれかで抗体標識結合体を含み得る。画像化キットは、好ましくは、インビボ検出可能な標識に既に結合された標的薬剤または抗体を含む。しかし、標識および結合手段は、別々に供給され得る。診断キットのいずれの形態も、さらに、コントロール薬剤例えば、適切なアリコートの生物学的組成物標識されているかまたは標識されていないを含み得、これは、検出アッセイのための検量線を調製するために使用され得る。このキットの成分が、1つ以上の液体中で提供される場合、液体は、好ましくは、水溶液であり、特に滅菌水溶液が好ましい。しかし、このキットの成分は、乾燥粉末において提供され得る。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。この溶媒もまたキット内の別の容器中で提供され得る。治療用キットおよび診断用キットの容器は、一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み、これらの中で治療剤および任意の他の所望の薬剤が、好ましくは適切なアリコートで、配置され得る。少なくとも2つの別々の成分が好ましいので、キットは、好ましくは、少なくとも2つのこのような容器を含む。このキットは、滅菌の、薬学的に受容可能な緩衝液または他の希釈剤を含むための第3/第4の容器もまた、含み得る。このキットはまた、治療剤を動物または患者に投与するための手段例えば、1つ以上の針またはシリンジ、あるいは点眼剤、ピペット、または他のそのような装置を含み、その手段によって、この処方物が、動物に注入され得るか、または身体の疾患領域に適用され得る。本発明のキットはまた、代表的に、バイアルなど、および他の成分を、市販のために密接な拘束において含む手段例えば、射出成形またはブロー成形したプラスチック容器を含み、これらの手段の中で、所望のバイアルおよび他の装置が配置され、そして保持される。L.免疫検出および画像化本発明はさらに、インビトロおよびインビボでの診断法および画像化法を提供する。このような方法は、診断情報、予後情報および/または画像情報例えば、脈管形成疾患およびウイルス感染、好ましくは、腫瘍処置および画像化方法に関連するを生成する際の使用に適用可能である。本発明の方法は、インビトロでの診断試験例えば、サンプルが非侵襲的に得られ、好ましくは、高スループットアッセイにて試験され得るか、そして/または曖昧および確認における臨床診断が望まれるを含む。インビボ診断および画像化の分野において、本発明の抗体およびペプチドは、1つ以上の検出可能な薬剤に連結され、そして必要に応じて、処置の前に第1工程として、脈管形成部位または腫瘍の画像を形成するために使用される。L1.免疫検出法およびキット従って、本発明は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を結合、精製、除去、定量またはさもなければ一般には検出するため例えば、活性化細胞およびアポトーシス細胞および関連する疾患の診断において使用するための、免疫検出法に関する。本発明の抗体例えば、9D2および3G4ATCC4545が、インビボ下記にて、単離された組織サンプル、生検またはスワブにおいて、そして/またはホモジナイズされた組織サンプルにおいて、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を検出するために使用され得る。このような免疫検出法は、明らかな診断的有用性を有するが、また、非臨床サンプルに例えば、抗原サンプルの力価測定などにおいても適用を有する。種々の有用な免疫検出法の工程は、科学文献例えば、Nakamuraら、1987、本明細書中に具体的に参考として援用されるに記載されている。一般には、免疫結合法は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を含むと疑われるサンプル好ましくは、細胞表面にアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質を有することが疑われる細胞を得る工程、およびそのサンプルを本発明の抗体例えば、9D2または3G4ATCC4545と、免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下で接触させる工程を包含する。次いで、結合プロセスの間に形成される任意の免疫複合体が検出され、好ましくは、定量される。分析されるサンプルは、細胞サンプル例えば、実験室において特定の試験条件下に曝露された細胞であり得る。サンプルはまた、動物または患者1つ以上の細胞型の活性化またはアポトーシスと関連する疾患を有することが疑われるもの由来の生物学的サンプルであり得る。このようなサンプルは、組織切片または試料、生検、スワブ、またはスメア試験サンプル、ホモジナイズされた組織抽出物または分離もしくは精製されたこれらの形態であり得る。免疫複合体一次免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれを可能にするに十分な時間の間、選択した生物学的サンプルをその抗体と接触させることは、一般には、そのサンプルに抗体を単に添加し、そして存在する任意のアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質と免疫複合体を形成するすなわち、結合するに十分に長い時間その混合物をインキュベートすることである。この時点の後、そのサンプル-抗体組成物例えば、組織切片、またはELISAプレートが、一般には洗浄されて、非特異的結合したすべての抗体種が除去されて、一次免疫複合体中の特異的に結合した抗体のみ検出することが可能になる。免疫複合体の検出は、当該分野で周知であり、そして多数のアプローチの適用を介して達成され得る。これらの方法は、一般的には、標識またはマーカー例えば、当該分野で公知の任意の放射性、蛍光性、生物学的または酵素的な、タグもしくは標識の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;3,996,345号;同第4,277,437号;同第4,275,149号および同第4,366,241号各々が、本明細書中で参考として援用されるが挙げられる。色素形成基質との接触に際して有色生成物を生成する酵素の使用が、一般的に好ましい。二次結合リガンド例えば、第2の抗体またはビオチン/アビジンリガンド結合配置もまた、当該分野で公知であるように、使用され得る。検出において使用される本発明の抗体例えば、9D2または3G4ATCC4545自体は、検出可能な標識に連結され得、次いでこの標識が簡単に検出され、それにより組成物中の一次免疫複合体の量を決定することが可能になる。好ましくは、この一次免疫複合体は、本発明の抗体について結合親和性を有する第2の結合リガンドによって検出される。この場合において、その第2の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。この第2の結合リガンド自体は、しばしば抗体であり、従って、二次抗体と呼ばれ得る。この一次免疫複合体は、この標識された二次結合リガンドまたは抗体と、二次免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下かつそれを可能にするに十分な時間の間、接触される。次いで、この二次免疫複合体は、一般的には、非特異的に結合したすべての標識二次抗体またはリガンドを除去するために洗浄され、次いでその二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。さらなる方法は、2工程アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。第1の抗体に結合親和性を有する第2の結合リガンド例えば、抗体が、上記のように二次免疫複合体を形成するために使用される。洗浄の後、その二次免疫複合体は、その第2の抗体に結合親和性を有する第3の結合リガンドまたは抗体と、免疫複合体三次免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下かつそれを可能にするに十分な時間、接触させられる。この第3のリガンドまたは抗体は、そのようにして形成された三次免疫複合体の検出を可能にする、検出可能な標識に連結される。この系は、所望ならば、シグナル増幅を提供し得る。臨床的診断またはモニタリングは、種々の疾患特に、細胞表面での増加したアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の曝露と関連するものを有する患者に適用され得る。アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の検出、あるいは正常な被験体由来の対応する生物学的サンプルのレベルと比較した、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質のレベルの上昇は、このような疾患を有する患者を示す。しかし、当業者に公知であるように、このような臨床診断は、この方法に基礎基づいて孤立しては行われないだろう。当業者は、バイオマーカーの有意な発現ポジティブな同定を示すとバイオマーカーの低レベル発現またはバックグラウンド発現との間を識別することに非常に精通している。実際、バックグラウンド発現レベルは、しばしば、カットオフを形成するために使用され、このカットオフを超える染色の増加が、有意またはポジティブと記録される。L2.インビボ画像化本発明は、種々のインビボ診断および画像化の実施形態を提供する。本発明の特定の局面は、インビボ診断および画像化について、新規な驚くべき有効な組成物に関する。例えば、本発明の新規な抗PS抗体の任意の1つ以上のパネル好ましくは、9D2または3G4ATCC4545抗体または類似の性質を有する競合する抗体が、インビトロで検出可能な薬剤に連結されて、本発明の免疫診断結合体を形成する。抗体がこの分野において重要な発展を示しているものの、得られる免疫診断は、現在、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の検出と連結されて、任意の以前に記載された診断実施形態または画像化実施形態において使用され得る。これに関して、本発明の抗体を含む免疫診断9D2または3G4ATCC4545抗体または類似の性質を有する競合する抗体を含むは、脈管血栓症特に、心臓または心臓近く例えば、深静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、心房性細動、補綴心臓血管材料に伴う問題、発作などを画像化する際に使用され得る。本発明のこのような組成物はまた、例えば、膿瘍、再狭窄、関節の炎症および止血性障害例えば、動脈、冠状、静脈および大脳の塞栓などのような状態において、活性化血小板を画像化する際に使用され得る。本発明の免疫診断組成物好ましくは、9D2または3G4ATCC4545抗体または類似の性質を有する競合する抗体を含むものがまた、アポトーシス細胞を検出する際に使用され得、これは、増加したまたは不適切なアポトーシスが生じる種々の疾患の診断および画像化において使用され得る。本発明は、さらに、インビボ診断および画像化におけるある範囲の新規な方法を提供し、これには、本明細書中に提供される抗体のパネルの使用が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、PI、PAおよびPGのような陰イオン性リン脂質が腫瘍の脈管構造に接近可能であり、安定な標的化可能マーカーであるという予期しない発見に基づいて、本発明は、PI、PAおよびPGに結合する免疫診断剤の投与を含む腫瘍の診断および画像化のための方法を提供し、これは、固形腫瘍の脈管構造に特異的に局在化する。さらに、ウイルス感染細胞は、PS、PE、PI、PAおよびPG、好ましくはPSおよびPEのようなアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に結合する免疫診断結合体を使用して、ここで検出され得、そしてウイル感染が診断され得る。本発明のインビボ画像化組成物および方法は、画像化それ自体で、または処置の前に信頼のある画像を形成するために身体の部位を予め画像化する際に使用され得る。好ましくは、画像化は、腫瘍の画像化である。これらの組成物および方法はまた、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質と関連する他の疾患または状態例えば、細胞活性化および/またはアポトーシスを含むもの脈管形成疾患、アテローム性硬化症、ウイルス感染、および診断目的もしくは予後目的または処置を設計するために内部画像が望ましい他のこのような状態を含むの画像化および診断に適用され得る。これらの実施形態において、抗体およびペプチド好ましくは、本発明の抗体例えば、9D2または3G4ATCC4545および類似の抗体が、検出可能な標識に作動可能に結合、連結または結合体化される。検出可能な標識は、それらの特異的な機能特性、または化学的特徴に起因して検出され得る化合物あるいはエレメントであり、その使用により、それらが付着する成分が検出可能になり、そして所望であれば、さらに定量可能になる。インビボでの診断プロトコルまたは画像化方法のための抗体およびペプチド結合体において、非侵襲的方法を用いて検出され得る標識が必要である。抗体および結合リガンドにそれらを付着させる方法のような多くの適切な画像化剤が、当該分野において公知である例えば、米国特許第5,021,236号および同第4,472,509号を参照のこと。両方とも本明細書中に参考として援用される。特定の付着方法は、例えば、抗体に付着されたDTPAのような有機キレート剤を使用する金属キレート複合体の使用を含む米国特許第4,472,509号。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のような結合剤の存在下で酵素と反応され得る。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらの結合剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により、調製される。検出可能な標識の例は、常磁性イオンである。この場合、適切なイオンとしては、以下が挙げられる:クロムIII、マンガンII、鉄III、鉄II、コバルトII、ニッケルII、銅II、ネオジムIII、サマリウムIII、イッテルビウムIII、ガドリニウムIII、バナジウムII、テルビウムIII、ジスプロシウムIII、ホルミウムIII、およびエルビウムIIIガドリニウムが特に好ましい。他の状況例えば、X線画像化において有用なイオンは、以下を含むがそれらに限定されない:ランタンIII、金III、鉛IIおよび特にビスマスIII。蛍光標識には、ローダミン、フルオレセイン、およびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、しばしば、イソチオシアネート中間体を介して結合される。診断的適用のための放射性同位体の場合、適切な例としては、以下が挙げられる:14炭素、51クロム、36塩素、57コバルト、58コバルト、銅67、152Eu、ガリウム67、3水素、ヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素131、インジウム111、59鉄、32リン、レニウム186、レニウム188、75セレニウム、35硫黄、テクネチウム99m、およびイットリウム90。125Iは、しばしば、特定の実施形態において使用するために好ましく、そしてテクネチウム99mおよびインジウム111はまた、しばしば、それらが低エネルギーでありかつ広範囲での検出に適しているために好ましい。本発明における使用のための放射性標識された抗体およびペプチドが、当該分野で周知の方法により生成され得る。例えば、放射性同位体金属イオンを抗体に結合するために、しばしば使用される中間体官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸DTPAおよびエチレンジアミンテトラ酢酸EDTAである。モノクローナル抗体はまた、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、および次亜塩素酸ナトリウムのような化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼのような酵素酸化剤と接触することによりヨウ素化され得る。本発明による抗腫瘍抗体は、リガンド交換プロセスにより、例えば、二価のスズの溶液で過テクネチウム酸pertechnateを還元し、Sephadexカラム上でその還元されたテクネチウムをキレート化し、そしてこのカラムに抗体を適用することにより、テクネチウム99mで標識され得る;かまたは直接的標識技術により、例えば、過テクネチウム酸、SNCl2のような還元剤、ナトリウム-カリウムフタレート溶液のような緩衝溶液、およびその抗体をインキュベートすることにより、標識され得る。上記の型の検出可能に標識された抗体および結合リガンドのいずれかが、画像化単独または処置の前に疾患部位または腫瘍の画像を形成するためのいずれかで、本発明の画像化の局面において使用され得る。いずれに方法においても、この方法は、一般的に、動物または患者に、非侵襲的な方法によって検出可能なマーカーに結合された抗体または結合リガンドの診断的有効量を投与する工程を包含する。抗体または結合リガンド-マーカー結合体は、疾患部位例えば、腫瘍または腫瘍脈管構造においてアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質の曝露を発現する細胞に局在化および結合するのに十分な時間を可能にする。次いで、患者は、検出可能なマーカーを同定するために、検出デバイスに曝露され、このようにして、疾患部位または腫瘍の画像を形成する。核磁気スピン-共鳴同位体例えば、ガドリニウムは、核磁気画像化装置を使用して検出され;そして放射性物質例えば、テクネチウム99mまたはインジウム111は、ガンマシンチレーションカメラまたは検出器を使用して検出される。米国特許第5,627,036号はまた、検出可能に標識された構築物の個々の血液内への安全かつ効果的な導入に関するさらなるガイダンス、および例えば、ガンマシンチレーションカメラを使用するかまたは磁気共鳴測定によって体外的に検出可能な標識薬剤の分布を決定するための方法を提供する目的で、本明細書中において具体的に参考として援用される。画像化実施形態のための投薬量は、一般的に、治療用よりも少ないが、患者の年齢および体重に依存する。患者1人当たり、0.1mg、0.5mgまたは約1mgと約9mgまたは10mgとの間、より好ましくは、約1mgと約5~10mgの間の抗体または結合体リガンド-結合体の1回の用量が有用であると企図される。L3.癌治療のための代理マーカーインビボ診断および画像化に関して、本発明は、さらに、癌治療のための代理マーカーとして使用するための組成物および方法を提供する。このような実施形態は、アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に結合する抗体、好ましくは、インビボ検出可能な薬剤に連結された、PS、および最も好ましくは、9D2または3G4ATCC4545抗体または競合抗体の使用に関する。現在の使用において多くの抗癌治療は、アポトーシスおよび壊死を誘導する。アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質特に、PSは、アポトーシス前およびアポトーシス細胞のマーカーである。従って、適切な抗体、好ましくは、9D2、3G4ATCC4545または競合抗体での画像化は、アポトーシス前細胞およびアポトーシス細胞を同定するために使用され得、従って、治療の進行に関する情報を提供し得る。これは、本明細書中において使用されるように、癌治療のための代理マーカーによって意味されることである。本発明の抗体好ましくは、9D2または3G4ATCC4545抗体または類似の特性を有する競合抗体の使用は、癌治療のための代理マーカーとしての特定の利点を提供する。例えば、アポトーシス前細胞を同定する能力は、特に有利である。抗体の特異性はまた、医師により意味のある画像化を提供する。また、これらの抗体の安全性プロフィールは、印象的であり、例えば、アネキシンが凝固と関連する欠点を受けるので、アネキシン対して利点を提供する。従って、上記の任意のインビボ診断および画像化方法が、単純に、癌治療を受ける患者における使用によって、癌の治療のための代理マーカーとして診断的使用のために適合され得る。M.腫瘍処置本発明の重要な局面は、悪性疾患、腫瘍および脈管新生化腫瘍の処置に関する。これは、脈管新生が多かれ少なかれ重要である腫瘍、およびプロトロンビン血管を有する腫瘍を含む。良性腫瘍の処置が本発明に含まれ、例えば、聴覚神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫およびBPHが挙げられる。血液の腫瘍例えば、白血病および骨髄の種々の急性または慢性の新生物形成疾患の処置もまた包含される。本発明は、任意の悪性腫瘍脈管成分を有するかまたは有さないか関わらずの処置に幅広く適用可能である。処置される腫瘍としては、固形腫瘍、特に癌腫酸素および栄養の提供のための脈管成分を必要とするが挙げられる。本発明を使用して処置され得る例示的な固形腫瘍としては、限定しないが、以下が挙げられる:肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、頚部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、扁平細胞の癌、腺癌、小細胞癌、メラノーマ、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫。本発明は、固形腫瘍を呈する任意の患者の処置における使用を企図される。一般的に、本発明は、全てのサイズの腫瘍約0.3~0.5cm以上を含むもの、0.5cmより大きいサイズの腫瘍、および約1.0と約2.0との間のサイズの腫瘍を呈する患者を処置するために使用され得るが、ヒトにおいて見出される最も大きな腫瘍までを含む腫瘍がまた処置され得る。本発明が、一般的に、予防的preventiveまたは予防的prophylactic処置として意図されないが、本発明の使用は、中程度または大きなサイズのみの腫瘍を有する患者の処置に特に制限されない。本発明のこれらの局面の元にある多くの理由が存在する。例えば、中程度以上の原発性腫瘍を呈する患者はまた、転移腫瘍の種の初期段階で小さなサイズであることが考えられる種々の他の転移性腫瘍を有し得る。本発明の抗アミノリン脂質抗体または抗陰イオン性リン脂質抗体、あるいはPE結合ペプチド誘導体、あるいは組合せは、一般的に、患者の全身循環内に投与されることを考慮すると、これらは、自然に、二次のより小さな転移性腫瘍に対する効果を有するものの、これは、処置の最初の意図ではないかもしれない。さらに、全体としての腫瘍質量が単一の小さな腫瘍である状況においてさえ、特定の有利な抗腫瘍効果が、本書値の使用から生じる。本発明と関係する使用についてより適切な患者に関して本明細書中に提供されるガイダンスは、特定の患者のプロフィールが、本発明による処置についての患者の選択を補助し得るという教示として意図される。特定の患者の予備選択、または患者のカテゴリーは、癌を有する全ての患者の処置に関係する本発明の有用性を、いかなる方法でも否定しない。さらなる考慮は、本発明の抗体治療によって提供される腫瘍に対する攻撃が、腫瘍をさらなる治療処置を受けやすくさせ、その結果、引き続く処置は全体的な相乗効果を生じるか、完全な寛解または治癒を導きさえする。任意の特定の型の腫瘍が本発明を使用する処置から除外されることは考えられない。しかし、腫瘍細胞の型は、他の治療剤、特に化学療法剤および抗腫瘍細胞イムノトキシンを組合せた本発明の使用に関連し得る。本発明が、腫瘍脈管構造の標的化および破壊をその作用の様式内で含み、その脈管系は実質的または全体的に全ての固形腫瘍で同じであるために、本発明の方法論は、腫瘍細胞自体の特定の表現型または遺伝子型に無関係に、全ての固形腫瘍の処置に広範に、または全体的に適用可能であることが理解される。本明細書中に提示されるデータは、幅広い範囲の異なる腫瘍モデルにおいて印象的な結果を示すように思われる。治療的有効用量は、例えば、本明細書中に詳述される研究に示されるように、動物モデルからのデータを使用して、そしてある範囲の治療剤を使用する臨床的なデータから、容易に決定可能である。固形腫瘍を保持する実験動物は、臨床環境に移行する前に適切な治療用量を最適化するために、しばしば使用される。このようなモデルは、効果的な抗癌ストラテジーを予測する際に非常に信頼性があることが公知である。例えば、固形腫瘍を保持するマウス例えば、本実施例で使用されるは、前臨床試験において広範に使用される。本発明者らは、このような分野で受容されるマウスモデルを使用して、最小の毒性で有益な抗腫瘍効果を与える治療剤の作用範囲を決定した。本発明に関連して付随する安全性の利益を考慮して腫瘍治療の点で、他の脈管治療を使用する成功に関する化学文献および特許文献を参照し得る。例として、米国特許第5,855,866号;同第5,877,289号;同第5,965,132号;同第6,051,230号;同第6,004,555号;同第5,776,427号;同第6,004,554号;および同第6,036,955号;ならびに同第6,093,399号の各々が挙げられ、これらは、本発明に適用され得る、このような薬剤の使用をさらに記載する目的で、本明細書中に参考として援用される。米国特許第6,312,694号および同第6,406,693号は、PSおよびPEならびに関連する免疫結合体に対する非結合体化抗体を使用する投薬および処置についてのガイダンスについて、本明細書中に参考としてさらに具体的に援用される。当該分野で公知のように、臨床処置に進める前に、前臨床試験と関係するガイドラインとして使用され得る、現実的目的が存在する。しかし、受容されるモデルにおいてすでに実証された安全性に起因して、本発明の前臨床試験は、有効性を確認するというよりも、最適化である。従って、前臨床試験は、最も有利な薬剤、用量または組み合わせを選択するために利用され得る。任意の一定して検出可能な抗腫瘍効果検出可能な腫瘍脈管構造後退、血栓および/または破壊、ならびに腫瘍壊死を含むを生じる任意の抗体用量、組合せ方法または医薬が有用な発明をなお規定する。退行、血栓、破壊および壊死効果は、好ましくは、約10と約40~50との間の腫瘍血管および腫瘍組織において観察され、約50と約99との間までのこのような効果が観察される。本発明はまた、腫瘍の下流の脈管に効果的であり得るすなわち、特に腫瘍から放出されるサイトカインがこれらの脈管に作用し、それらの抗原性プロフィールを変化させるので、少なくとも排出脈管のサブセットを標的化する。治療の抗腫瘍効果が、この範囲の下端に向かうような状況下でさえ、この治療が、特定の腫瘍の状況における他の全ての公知の治療となお等価であるか、またはより効果的でさえあることがあり得ることもまた理解される。特定の腫瘍が中期間または長期間効果的に処置され得ないことは臨床医に不幸にも明らかであるが、特に一般的に提案されている他のストラテジーと少なくともほぼ同様に効果的である場合、それは、本発明の治療の有用性を否定しない。血管新生化腫瘍の処置のための、抗アミノリン脂質抗体または陰イオン性リン脂質抗体、PE結合ペプチド誘導体または組み合わせの治療薬の適切な用量を設計する際に、臨床投与のための適切な用量に到達するために、本明細書中に記載される動物研究および文献における技術的常識から容易に推定し得る。このコンバージョンを達成するために、当業者は、実験動物の単位質量あたり投与される薬剤の質量を計算し、そして好ましくは、実験動物とヒト患者との間の体表面積の差異を計算する。全てのこのような計算は、当業者に周知でありそして慣用的である。例えば、マウス研究において使用される治療剤の首尾良い用量を採用し、そして質量および表面積に基づいて標準計算を適用する場合、ヒト患者における使用のため薬剤の有効用量は、患者当たり約1mgと約500mgとの間の抗体、好ましくは、患者当たり約10mgと約100mgとの間の抗体である。従って、この情報を使用して、本発明者らは、ヒト投与のための有用な低用量は、患者当たり、約1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、15mg、20mg、25mg、または約30mgなどであり;そしてヒト投与のための有用な高用量は、患者当たり約250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mgまたは約500mgなどである。ヒト投与のための有用な中程度の用量は、患者当たり、約35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、または約225mgなどであることが企図される。一般的に、患者当たり、約5~100mg、約10~80mg、約20~70mg、約25~60mg、または約30~50mgの間の用量範囲が好ましい。しかし、上記に引用されたいずれかの例示的用量を用いる任意の特定の範囲または特定の記載された範囲の間の任意の中間の値が意図される。記載された範囲にかかわらず、本明細書中に提示されるパラメータおよび詳細なガイダンスを考慮して、活性な範囲または最適な範囲にさらなる変更が、本発明内において包含される。従って、特定の薬剤と組合わせにおいて、低用量がより適切であり得、そして特に、本発明の構築物の増強された安全性を考慮すると、高用量がなお許容され得ることは理解されるべきである。ヒトまたはヒト化抗体およびヒトエフェクターの使用は、健常組織における有意な毒性または副作用の機会をさらに減少して、本発明を臨床使用のためにさらに安全にする。本発明の治療レジメの意図は、一般的に、受け入れられない毒性に関連するレベル未満の用量をなお維持しながら、有意な抗腫瘍効果を生成することである。用量自体の変化に加えて、投与レジメはまた、処置ストラテジーを最適化するために採用され得る。現在の好ましい処置ストラテジーは、約1mg~500mg、好ましくは、約10mg~100mgの抗体、あるいはこれらを含む治療カクテルterapeuticcocktailを、約7日間に約3回で投与することである。例えば、用量は、およそ1日目、およそ3日目または4日目、および6日目または7日目に与えられる。特定の用量自体の投与において、好ましくは薬学的受容可能な組成物無菌性、発熱性、純度および一般的な安定性のFDA基準に従うを患者に全身的に提供する。静脈内注射が、一般的に好ましく、最も好ましい方法は、約1時間または2時間などの期間にわたって連続注入を使用することである。本発明を使用する処置の前にこのようなパラメータを決定することは必要ではないが、本明細書中に詳述される研究が、注射の約12~24時間以内に固形腫瘍の血管において特異的に観察される少なくともいくらかの血栓を生じること、および腫瘍細胞自体が、約24~72時間以内に死滅し始めることに留意すべきである。広範な腫瘍壊死は、一般的に、次の約48~96時間で観察され、60までおよび60を超える壊死が、観察される。当然、広範な使用の前に、臨床試験が実施される。臨床試験の実行の種々のエレメント患者の処置およびモニタリングを含むは、本発明の開示に照らして当業者に公知である。以下の情報は、このような治験を確立する際の使用のための一般的なガイドラインとして提示されている。第1の処置研究について選択される患者は、従来の治療の少なくとも1つの過程に応答せず、そして身体検査、実験技術、および/またはX線撮影手段によって決定されるような客観的に測定可能な疾患を有する。いずれの化学療法も、本研究に入る少なくとも2週間前に停止する。マウスモノクローナル抗体または抗体部分を使用する場合、患者はマウス免疫グロブリンに対するアレルギーの病歴を有さない。特定の利点は、三管腔ポートtriplelumenportを有する中心静脈カテーテルの留置を使用する際に見出される。この治療は、例えば、0.22μフィルターを使用して濾過され、そして適切に例えば、生理食塩水で100mlの最終用量に希釈される。使用の前に、この試験サンプルはまた、同様の様式で濾過され、そしてA280を測定することによって濾過の前後でその濃度を評価される。予想される回収率は、87~99の範囲内であり、次いで、タンパク質の損失についての調整が補正される。この構築物は、約4~24時間の期間にわたって投与され、各患者は、2~7日間の間隔で2~4回の注入を受ける。投与はまた、7日間にわたって一定速度の注入によって実施され得る。任意の用量レベルで与えられる注入は、観察される任意の毒性に依存する。従って、グレードIIの毒性が、任意の単回注入後または一定速度注入の間の特定の期間で達した場合、毒性が改善されない限り、さらなる用量を中止するか、またはその一定速度注入を停止する。漸増用量は、約60の患者が、任意のカテゴリーにおいて、受け入れられないグレードIIIまたはIVの毒性を示すまで、患者群に投与される。この値の2/3である用量が、安全用量として定義される。身体検査、腫瘍測定、および実験室試験は、もちろん、処置前および1ヶ月後までの間隔で実施される。実験室試験としては、全血球計数、血清クレアチニン、クレアチニンキナーゼ、電解質、尿素、SGOT、窒素、ビリルビン、アルブミン、および全血清タンパク質が挙げられる。処置後60日までに採取された血清サンプルは、投与された構築物、およびそのいずれかの部分に対する抗体の存在について放射免疫アッセイによって評価される。任意の標準的アッセイ例えば、ELISAまたはRIAのようなを使用する、血清の免疫学的分析は、治療剤の薬物動態およびクリアランスの評価を可能にする。抗腫瘍応答を評価するために、患者を、最後の注入の、48時間後~1週間後に、そして再び30日後に試験するべきである。触知可能な疾患が存在した場合、全ての塊の二つの垂直直径perpendiculardiameterを、処置の間毎日、治療完了後1週間以内、および30日で測定すべきである。触知可能でない疾患を測定するために、連続CTスキャンが、胸部、腹部、および骨盤の全体を通して、1cm間隔で、48時間~1週間で、そして30日で再び実施され得る。組織サンプルはまた、組織学的におよび/あるいはフローサイトメトリーにより、疾患部位から、または適切であれば血液もしくは体液サンプルからの生検を用いて評価されるべきである。臨床応答は、受容可能な基準により規定され得る。例えば、完全な応答は、処置の1カ月後、全ての測定可能な腫瘍がみられないことにより規定され得る。これに対し、部分的な応答は、処置の1カ月後に、増大を示す腫瘍部位なしでの、全ての評価可能な腫瘍小節の垂直直径の積の和の50またはそれ以上の減少により規定され得る。同様に、混合応答は、処置の1カ月後に、一つ以上の部位での進行を伴った、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の50以上の減少により規定され得る。上記のような臨床試験の結果を鑑みて、さらにより正確な処置レジメが処方され得る。そうであったとしても、投与量におけるいくらかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して、後で必要であり得る。投与に責任をもつ医者は、本開示に鑑みて、個々の被験体に適切な用量を決定し得る。このような最適化および調節は、当該分野において慣用的に実施され、そして過剰な実験量をけっして反映しない。N.併用腫瘍療法本発明の処置方法は、患者が示す特定の腫瘍、疾患または障害の処置において一般に使用される任意の他の方法と組み合わされてもよい。詳細な治療アプローチがそれ自体で患者の状態に対して有害であることが知られておらず、そして本発明の抗アミノリン脂質または抗陰イオン性リン脂質に基づく処置に有意に反作用しない限り、本発明とのその組み合わせが考えられる。非悪性疾患の併用療法も意図される。このような特定の例は、良性の前立腺過形成BPHであり、これは当該分野で現在行なわれる他の処置との組み合わせで処置されてもよい。例えば、PSAのようなBPH内に局在するマーカーに対する免疫毒素の標的化。固体腫瘍処置に関して、本発明は、古典的なアプローチ、例えば外科手術、化学療法、放射線療法、サイトカイン療法、血管新生抑制などと組み合わせて用いられ得る。従って、抗体、免疫複合体またはペプチド複合体を、外科手術または放射線治療と同時に、または前後に用いる;あるいは従来の化学療法剤または放射線治療剤、サイトカイン、血管新生阻害因子、アポトーシス誘導性因子、標的化免疫毒素またはコアグリガンドなどとともに、またはその前後に患者に投与する、併用療法を本発明は提供する。適切な治療因子の多くの例は、本発明の免疫複合体の局面と関連して上記されている。治療複合体の一部としての使用のために最初に記載された任意の因子はまた、本発明の併用療法において別々に用いられてもよい。外科手術に関しては、任意の外科的介入を本発明と組み合わせて実施してもよい。放射線療法と組み合わせて、DNA損傷を腫瘍細胞内に局所的に誘導するための任意の機構、例えば、γ放射線、X線、UV照射、マイクロ波およびさらには電子発光などが考えられる。腫瘍細胞への放射性同位体の指向性の送達もまた考えられ、これは、標的化抗体または他の標的化方法と組み合わせて用いられ得る。ガン処置における物質の組み合わせの一般的使用が周知である。例えば、米国特許第5,710,134号参考として本明細書に援用されるは、非毒性物質またはプロドラッグprodrugsと組み合わせて腫瘍における壊死を誘導する成分を開示する。壊死的プロセスによって自由になる酵素は、非毒性のプロドラッグprodrugを毒性の薬物drugへ切断し、これが腫瘍細胞死をもたらす。また、米国特許第5,747,469号参考として本明細書において援用されるは、p53およびDNA損傷因子をコードするウイルスベクターの併用使用を開示する。任意のこのような類似のアプローチを本発明とともに用いることができる。1つ以上の因子を、本発明の抗体、免疫複合体およびペプチドに基づく治療剤と組み合わせて用いる場合、併用結果が、各々の処置を別々に行なう場合に観察される効果の相加的なものである必要はない。少なくとも相加作用が一般に所望されるが、単一での治療の1つを上回る抗腫瘍効果の任意の増大が有益である。また、併用処置が相乗作用を示すための特定の要件はないが、これは特に見込みがあって有利である。N1.第二の抗ガン剤の選択本明細書において用いる場合、本発明の一次治療因子primarytherapeuticagentsは、抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質の抗体、免疫複合体またはPE結合ペプチド誘導体および結合体である。本明細書において用いる場合、二次治療因子secondarytherapeuticagentsは、第二の、別個の治療因子または抗ガン剤、すなわち、一次治療因子以外のotherthan治療剤または抗ガン剤である。任意の二次治療因子は、本発明の併用療法において用いられ得る。また、二次治療因子または二次抗ガン剤は、以下の手引きに従って、相加作用、相加作用より大きい作用および潜在的に相乗的な作用を達成するという観点で選択され得る。併用された抗腫瘍治療を行なうために、動物または患者に、本発明の抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、免疫複合体またはPE結合ペプチドに基づく治療剤を、別の、すなわち、第二の別個の抗ガン剤と組み合わせて、その動物または患者において、その併用された抗腫瘍作用を得るのに有効な様式で、単に投与する。従って、この因子は、腫瘍または腫瘍脈管構造内に組み合わされて存在し、その腫瘍環境において組み合わせた作用をするのに有効な量で、かつ有効な時間で提供される。この目的を達成するために、本発明の一次治療剤および第二の別個の抗ガン因子を動物に実質的に同時に、単一の組成物として投与してもよく、または異なる投与経路を用いて2つの別個の組成物として投与してもよい。あるいは、本発明の抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、免疫複合体、またはPE結合ペプチドに基づく治療剤は、例えば、数分から数週間の間隔で、第二の別個の抗ガン剤と前後してもよい。本発明の一次治療剤および第二の別個の抗ガン剤が動物に別々に適用される特定の実施形態では、各々の因子は腫瘍に対して有利に組み合わされた効果をさらに発揮することができるように、各々の送達の間に長時間経過して失効しないことを確実にする。このような場合、腫瘍を両方の因子と、互いの約5分~約1週内に、より好ましくは互いの約12~72時間内に、最も好ましくはわずか約12~48時間の遅延時間で、接触させることを考慮する。離れたタイミングの併用療法のための二次治療因子は、以下に考察される規準を含む、特定の規準に基づいて選択され得る。しかし、1つ以上の第二の別個の抗ガン剤の事前の投与または引き続く投与の選択の優先は、所望の場合に実質的に同時投与でそれを使用することを妨げない。第二に、本発明の一次治療因子の前の先立ったpriorto投与のために選択され、そして増大されかつ潜在的に相乗的である作用を達成するように設計された別個の抗ガン剤は、腫瘍脈管構造内にアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質の発現を誘導する因子を含む。例えば、局所的なカルシウム産生を刺激して、原形質膜の外面へPSおよび他のリン脂質を移動する膜輸送因子を活性化し、腫瘍内皮細胞を傷害し、前アポトーシス性変化を生じ、そして/または腫瘍内皮細胞においてアポトーシスを誘導する因子は一般に、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発現を増大させる。このような因子の例は、ドセタキセルおよびパクリタキソールである。次いで、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質は、本発明の抗体を用いて標的され得、これによって全体的な治療効果を増幅して、また宿主エフェクターを介した攻撃の増大が得られる補体、ADCC、抗体媒介性食作用、CDC。血管形成、再構築または活性化内皮細胞についての選択性を有する薬物、例えば、腫瘍血管には存在するが、正常な休止期の血管には存在しない薬物がまた、腫瘍内皮細胞の表面上でPSおよび他のリン脂質の露出を選択的に生じるために用いられ得る。このような因子の例は、コンブレタスタチンおよびドセタキセルである。これもやはり、抗体結合の増大および宿主エフェクター機構の開始の増強をもたらす。第二に、本発明の一次治療因子に引き続くsubsequentto投与のために選択された、そして増大されかつ潜在的に相乗的な作用を達成するために設計された別個の抗ガン剤としては、この一次治療因子の効果から利益がある因子が挙げられる。本発明の抗アミノリン脂質もしくは抗陰イオン性リン脂質抗体、免疫複合体、またはペプチドに基づく治療剤は、腫瘍破壊を生じる。従って、引く続く投与のための有効な第二の、別個の抗ガン剤としては、転移を阻害する血管新生阻害因子;細胞内抗原に特異的な抗体がインビボにおいて悪性細胞から接近可能になるように壊死性腫瘍細胞を標的する因子各々が参考として本明細書に援用される、米国特許第5,019,368号、同第4,861,581号および同第5,882,626号;および末梢で生存し得る任意の腫瘍細胞を攻撃する、化学療法剤および抗腫瘍細胞免疫複合体が挙げられる。いくつかの状況では、処置の期間を有意に延ばすことが所望され得、各々の投与の間に、数日間2、3、4、5、6または7、数週間1、2、3、4、5、6、7または8またはさらに数ヶ月間1、2、3、4、5、6、7または8経過する。これは、本発明の一次治療因子のような1つの処置が、腫瘍を実質的に破壊し、そして血管新生阻害因子の投与のような別の処置が、微小転移または腫瘍再増殖を妨げることが、意図される状況の場合に、有利である。しかし、効率的な創傷治癒を可能にするため、外科手術後、血管新生阻害因子は、注意深く投与されなければならない。次いで、血管新生阻害因子は、患者の一生涯投与されてもよい。一次治療因子または第二の別個の抗ガン因子のいずれかの2つ以上の投与が利用されることもまた想定される。一次治療因子および第二の別個の抗ガン剤は、別々の日または週に、互換可能に投与されてもよい;または1つの因子の処置の手順の後に他の処置の手順が行なわれてもよい。いずれの場合においても、併用療法を用いて腫瘍回帰を達成するために必要なことは、投与の回数にかかわらず、抗腫瘍効果を発揮するのに有効な併用量で両方の因子を送達することが全てである。実質的に、同時にまたは続けてのいずれで投与されようと、本発明の抗アミノリン脂質および抗陰イオン性リン脂質抗体、ならびに治療剤は、1つ以上の化学療法剤または薬物と組み合わせて投与され得る。化学療法薬物は、増殖する腫瘍細胞を殺傷し得、これによって処置全体によって生み出される壊死領域を増強する。これによって薬物は、本発明の一次治療因子の血栓性作用を増強し得る。ほとんどのガン化学療法薬物は、分裂している酸素化された細胞に選択性である。これらは、併用療法において有利である。なぜなら、化学療法薬物は、本発明の一次治療因子とは異なる標的に対して作用し、これがさらに完全な抗血管または抗腫瘍効果をもたらすからである。例えば、化学療法薬物は、腫瘍末梢の、急速に分裂している酸素化された腫瘍細胞に対して選択的に活性であるが、本発明の因子は、活性化反応性酸素種が豊富である、抑制されたstressed腫瘍コアにおける血管または腫瘍細胞に対して主に作用する。腫瘍末梢において十分に酸素化された脈管形成性血管に選択性である血管新生阻害薬物はまた、併用で有効である。なぜなら、本発明の因子は、腫瘍コアにおける比較的低酸素で静止状態の血管に対して作用するからである。腫瘍血管において血栓の形成を誘導することによって、本発明の一次治療因子はまた、腫瘍内に薬物を保持または捕獲することによって化学療法薬物の作用を増強し得る。従って、化学療法剤は、腫瘍内に保持されるが、残りの薬物は身体から排出される。従って腫瘍細胞は、より高濃度の薬物により長時間曝される。腫瘍内の薬物のこの捕獲によって、薬物の用量を減らすことが可能になり、処置はさらに安全かつさらに有効になる。本発明における併用使用のためのさらなる薬物は、一次治療因子の作用によって薬物に対して感作sensitizedされている細胞に作用して、その結果、その抗腫瘍効果を達成するために必要とされる第二の薬物の用量が低下される薬物である。例えば、これは、第二の薬物の作用の主な成分が腫瘍血管で発揮されて本発明の抗体または因子が薬物に対して細胞を感作する場合に生じ得る。本発明の一次治療因子が、直接またはサイトカイン放出の刺激によるかのいずれかによって、第二の薬物に対して腫瘍細胞を感作する場合も同じことがあてはまる。併用療法のための他の適切な二次抗ガン剤は、例えば、免疫系の免疫抑制成分の活性を選択的に阻害することによって、宿主エフェクター細胞の活性を増強するものである。このような因子は、その機構の一部としてエフェクター細胞による攻撃を刺激する本発明の一次治療因子がさらに積極的に働くことを可能にする。このような因子の例はドセタキセルである。一次治療因子の作用の正確な機構単数または複数の理解は本発明の処置を行なうために必要ではないが、このような機構に関連するデータおよび理論的な推察を用いて、本発明における組み合わせた使用のための特定の第二の抗ガン剤を選択することができる。選択された併用療法の有効性によって、次に作用のもとのデータおよび提唱される機構が支持され、これによってまた、併用療法を行なうための第二の抗ガン剤の好ましいカテゴリーがもたらされる。アポトーシスを誘導する薬物は、併用療法における使用のために好ましい。例えば、ドセタキセルは、アポトーシスを誘導し、従ってPSは、微小管に対する結合および細胞有糸分裂の破壊によって露出するHotchkissら、2002。臨床濃度未満のドセタキセルを用いた、腫瘍血管をライニングする内皮細胞および腫瘍細胞の処置は本明細書においてインビトロにおける3G4抗体の強力な結合によって実証されるとおり、細胞表面でPS発現を誘導することが示されている。本発明の抗体の抗腫瘍効果が、抗体媒介性食作用の増大によって示されるように免疫エフェクター機能のFcドメイン媒介性増強を誘導するということを本発明者らはまた決定した。従って、この抗体はまた、他のFcドメイン媒介性機能、例えば、ADCC、CDC、サイトカイン産生の刺激、およびこのような機構の組み合わせを発揮するはずである。これはまた、ドセタキセルに関連する。なぜなら、他の研究は、ドセタキセルを用いた乳ガン患者の処置が、血清IFN-γ、IL-2、IL-6およびGM-CSFサイトカインレベルにおける増大をもたらし、これがナチュラルキラーNK細胞およびリンホカイン活性化キラーLAK細胞の活性を増強することによって、これらの患者における抗腫瘍免疫応答を増強するということを示しているからであるTsavarisら、2002。従って、本発明者らは、ドセタキセルがPS発現および投与された抗体の結合の両方を誘導し、また免疫エフェクターの活性を増強し、これが抗腫瘍効果を媒介すると判断した。前述の考慮に基づいて、本発明者らは、3G4抗体によって例示されるような本発明の抗体の、ドセタキセルとの組み合わせが、同所性MDA-MB-435ヒト乳ガン異種移植片を保有するマウスにおいて、ドセタキセルまたは3G4のいずれか単独よりも有意に優れていたことを示した実施例XX。従って、アポトーシスを誘導するドセタキセルおよび他の化学療法剤は、本発明の併用療法における使用のための好ましい因子である。アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質に対する抗体と、アポトーシスを誘導する化学療法薬物、例えばドセタキセルとの組み合わせは、腫瘍脈管内皮細胞および腫瘍細胞成分を相乗作用的に攻撃するはずであり、これは処置有効性の有意な増強だけでなく、毒性の低下ももたらす。これらの組み合わせは、乳ガン処置における使用、詳細には、ドセタキセルと本発明の抗体とを用いるメトロノームのような化学療法の併用が意図される。N2.内毒素内毒素および解毒された内毒素誘導体は、併用処置において、好ましくは低用量で用いられ得る本明細書において参考として詳細に援用される、PCT公開第WO03/028840号。動物での使用のために、詳細にはヒトにおける使用のために好ましい、種々の解毒された内毒素が利用可能である。解毒および精練された内毒素、ならびにそれらの組み合わせは、各々が参考として本明細書において詳細に援用される、米国特許第4,866,034号;同第4,435,386号;同第4,505,899号;同第4,436,727号;同第4,436,728号;同第4,505,900号に記載される。非毒性の誘導体モノホスホリル脂質AMPLは、本発明において用いられ得る解毒された内毒素の1例である。MPLは、ヒトについて安全であることが公知である;アジュバントとしてMPLを用いる臨床試験によって、外来患者でさえ、ヒトでの使用については100μg/m2が安全であることが示されている。N3.サイトカインサイトカイン療法は、組み合わせの治療レジメンのための有効なパートナーであることが証明されている。本発明の組み合わせアプローチにおいて、種々のサイトカインが使用され得る。サイトカインの例としては、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNFα、TNFβ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γが挙げられる。サイトカインは、患者の状態およびサイトカインの相対的な毒性のような、臨床的指標と整合する標準的レジメンに従って投与される。ウテログロビンはまた、転移を防止または阻害するために用いられ得る米国特許第5,696,092号;参考として本明細書に援用される。N4.TNFαおよびTNFαの誘導因子TNFαおよびTNFαの誘導因子はまた、本発明と組み合わせて用いられ得る。TNFαは、脈管透過性を増大し、従って、腫瘍への抗ガン剤の浸透を促進することにおいて有用である。抗体局在化は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を標的化する場合には決して問題ではない。なぜなら本発明においては、TNFαの併用使用は、腫瘍への他の化学療法剤および免疫複合体の接近を容易にし得、そして遠くの腫瘍細胞への本発明の抗体の結合を増大さえするからである。低レベルの内毒素であるRac1アンタゴニスト、例えば、弱毒化されるかまたは操作されたアデノウイルス、DMXAAおよびFAA、CM101およびサリドマイドがまた使用されてもよい。Rac1アンタゴニストは、本発明の併用処置において用いられてもよい。なぜなら1細胞あたり約5000個のDNA粒子でCD14と独立してTNF上方制御が生じるからであるSanliogluら、2001。CM101、サリドマイドおよびDMXAAがまた、標準的用量または低下した用量で、これと組み合わされて用いられてもよい。N5.化学療法剤背景にある機構単数または複数にかかわらず、種々の化学療法剤が、本明細書に開示される併用処置方法において用いられ得る。併用療法について考えられる化学療法剤としては、例えば、タモキシフェン、タキソール、ビンブラスチン、エトポシドVP-16、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル5FU、カンプトテシン、アクチノマイシン-D、マイトマイシンC、コンブレタスタチン類、さらに詳細には、ドセタキセルタキソテール、シスプラチンCDDP、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキセート、パクリタキセル、およびビンクリスチン、ならびにその誘導体およびプロドラッグが挙げられる。当業者に理解されるように、適切な用量の化学療法剤は、一般に、臨床治療においてすでに利用されてきており、ここで、この化学療法剤は、単独で、または他の化学療法剤と組み合わせて投与される。しかし、ここで、本発明によって提供される利点に起因して、低用量が、可能である。例示のみのために、シスプラチンのような薬剤、および他のDNAアルキル化剤が使用され得る。シスプラチンは、ガンを処置するために広範に使用され得、臨床適用において使用される有効な用量は、総計3つの経路について3週間毎に5日間20mg/m2である。シスプラチンは、経口で吸収されず、従って、注射を介して、静脈内で、皮下で、腫瘍内で、または腹腔内で送達されねばならない。さらに有用な薬剤は、DNA複製、有糸分裂、染色体分離および/またはチューブリン活性に干渉する化合物を含む。このような化学療法剤化合物には、アドリアマイシンドキソルビシンとしてもまた公知である、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。新形成の処置のための臨床設定において広範に使用されるので、これらの化合物は、静脈内では、アドリアマイシンについて21日間隔で25~75mg/m2からエトポシドについては35~50mg/m2までの範囲の用量で、静脈内にボーラス注射を通じて、または経口的に静脈内用量の2倍で、投与される。ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤もまた使用され得る。特に有用なものは、広範な試験を受け、そして容易に利用可能な薬剤である。そのようなものとして、5-フルオロウラシル5-FUのような薬剤は,新形成組織によって優先的に使用され、新形成細胞に対する標的化のためにこの薬剤を特に有用にさせる。非常に毒性の5-FUは、広範囲のキャリア局所を含むにおいて適用可能であるが、3~15mg/kg/日の範囲の用量を有する静脈内投与が一般に使用される。併用療法に関して有用な例示的な化学療法剤は、表Dにおいて列挙される。そこで列挙される各薬剤は、例示的であり、そしていかなるようにも限定することを意味しない。当業者は、Remington’sPharmaceuticalSciences第15版、第33章特に624頁~652頁に指向される。投薬量におけるいくらかの改変は、おそらく、処置されるべき被験体の状態に依存して生じる。処置を施す医師は、個々の被験体について適切な用量を決定し得る。N6.抗脈管形成用語脈管形成とは、一般的に組織または器官への新規な脈管の生成をいう。通常の生理学的条件下で、ヒトまたは動物は、特定の制限された状況においてのみ脈管形成を受ける。例えば、脈管形成は、通常、組織治癒、胎児および胚の発生、および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において観察される。しかし、新たな証拠として、脈管形成が、例えば、副腎組織、前立腺および卵巣における特定の正常な状態において重要であることが示される。本発明の治療剤抗脈管形成が、作用の様式だけでないは、従って、所望のまたは生理学的脈管形が、本発明を使用する場合、阻害されない点で、顕著な抗脈管形成治療に対する利点を、有する例えば、抗体A4.6.1Brem、1998;Bacaら、1997;Prestaら、1997。非制御持続および/または非調節脈管形成は、種々の疾患状態に関連し、腫瘍の発生および転移の間に生じる。制御脈管形成および非制御脈管形成は、類似の様式で進行すると考えられる。内皮細胞および周皮細胞基底膜によって囲まれるは、毛細血管を形成する。脈管形成は、内皮細胞および白血球によって放出される酵素による、基底膜の侵食から始まる。内皮細胞血管の管腔を裏打ちするは、基底膜を通って突出する。脈管形成刺激物によって、内皮細胞が、侵食される基底膜を通って移動するように誘導する。移動する細胞は、親の血管から出芽sproutを形成し、ここで内皮細胞が、有糸分裂および増殖を行う。内皮出芽は、互いに吸収して、毛細管ループを形成し、新たな血管を作製する。脈管形成がいくつかの正常組織において必要とされる新たな証拠にも関わらず、抗脈管形成治療は、腫瘍および他の疾患の処置においてなお重要である。従って、抗脈管形成治療は、本発明の併用処置における使用のために意図される。本発明の低い比較的頻繁な用量の治療剤と脈管形成を阻害する薬剤との組み合わせは、特に意図される。併用療法と関連して有用な例示的な抗脈管形成剤は、免疫結合体とともに上に記載される。任意の1つ以上のこのような薬剤表Bに含まれるは、本発明とともに併用療法において使用され得る。アンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチンおよびマスピンが現在好ましい。多くの公知の抗ガン剤もまた、それらの作用機構の一部として抗脈管形成効果を有する。これらの薬剤表Eの薬剤によって例示されるは、本発明の併用療法の局面における使用に特に企図されるこれらは、上記のように、本発明の抗体に結合体化され得る。さらに、αvβ3に対する抗体LM609はまた、腫瘍後退を誘導し、併用療法において使用され得る。インテグリンαvβ3アンタゴニスト例えば、LM609は、脈管形成内皮細胞のアポトーシスを誘導し、静止血管に影響を与えないで残す。LM609または他のαvβ3アンタゴニストはまた、αvβ3とMMP-2との相互作用を阻害することによって作用し得、タンパク質分解酵素が、内皮細胞および線維芽細胞の移動において重要な役割を果たすと考えられる。LM609による脈管形成内皮のアポトーシスは、脈管ネットワークの残りに対するカスケード効果を有し得る。実際に、腫瘍脈管ネットワークが、増殖するための腫瘍のシグナルに完全に応答することを妨げることは、ネットワークの部分的なまたは完全な崩壊を開始し得、腫瘍細胞の死および腫瘍容積の減少を生じる。エンドスタチンおよびアンギオスタチンが同様な様式で機能することが可能である。LM609が静止脈管に影響しないが、腫瘍後退を引き起こし得るという事実は、抗腫瘍効果を得るために、腫瘍内の全ての血管が処置のために標的される必要があるわけではないことを強く示唆する。アンギオスタチンに対する抗体はまた、米国特許第5,520,914号具体的に本明細書中において参考として援用されるに記載されるように使用され得る。FGFが脈管形成と関連するので、FGFインヒビターがまた使用され得る。特定の例は、アルチャランarcharanスルフェートのようなグリコサミノグリカンを含む、それらの主要な反復単位として、2-O硫酸化ウロン酸で配列を交代するN-アセチルグルコサミンを有する化合物である。このような化合物は、米国特許第6,028,061号本明細書中において具体的に参考として援用されるに記載され、そして併用して使用され得る。N7.VEGFインヒビターVEGFは、低酸素および発ガン性変異によって誘導される多機能性サイトカインである。VEGFは、胚形成における脈管ネットワークの発生および維持の最初の刺激物である。これは、強力な浸透性誘導剤、内皮細胞化学走化性剤、内皮生存因子、および内皮細胞増殖因子として機能する。その活性は、正常な胚発生に必要とされる。なぜなら、VEGFの一方または両方の対立遺伝子の標的化された破壊が、胚の死を生じるからである。1つ以上のVEGF阻害方法の使用は、本発明の併用療法の好ましい局面である。病理学的状態における脈管形成の第1の刺激としてのVEGFの認識は、VEGFの活性を遮断する種々の方法を導いた。開発された任意のVEGFインヒビターは、ここで、有利にこれとともに使用され得る。従って、VEGFシグナル伝達を妨害するために設計された、以下の中和抗VEGF抗体、可溶性レセプター構築物、アンチセンスストラテジー、RNAアプタマーおよびチロシンキナーゼインヒビターの任意の1つ以上が、使用され得る。適切な薬剤としては、中和抗体Kimら、1992;Prestaら、1997;Sioussatら、1993;Kondoら、1993;Asanoら、1995、可溶性レセプター構築物KendallおよびTomas、1993;Aielloら、1995;Linら、1998;Millauerら、1996、チロシンキナーゼインヒビターSiemeisterら、1998、アンチセンスストラテジー、RNAアプタマーおよびVEGFまたはVEGFレセプターに対するリボザイムSalehら、1996;Chengら、1996が挙げられる。アンタゴニスト特性を有するVEGFの改変体もまた、WO98/16551に記載されるように使用され得る。上記参考文献の各々が、本明細書中において具体的に援用される。VEGFに対するブロッキング抗体は、特に、単純さのために、特定の実施形態において好ましい。VEGFに対するモノクローナル抗体は、ヒト腫瘍異種移植片増殖およびマウスにおける腹水形成を阻害することが示されているKimら、1993;Meisianoら、1998;Luoら、1998a;1998b;Borgstromら、1996;1998;各々が、本明細書中において参考として援用される。抗体A4,6.1は、VEGFR1およびVEGFR2の両方に結合するVEGFを遮断し得る高親和性抗VEGF抗体であるKimら、1992;Wiesmannら、1997;Mullerら、1998;Keytら、1996;各々が、本明細書中において参考として援用される。A4.6.1は、最近、一価ファージディスプレイ技術によってヒト化され、現在、抗ガン剤として第I期の臨床試験にあるBrem、1998;Bacaら、1997;Prestaら、1997;各々が、本明細書中において参考として援用される。A4.6.1のFabフラグメントによって結合されたVEGFのアラニン走査変異誘発およびX線結晶は、A4.6.1が結合するVEGFに対するエピトープが、アミノ酸89~94の辺りで中心であることを示した。この構造データは、A4.6.1が、VEGFをVEGFR2への結合から競合的に阻害するが、おそらく立体障害によって、VEGFがVEGFR1へ結合することを阻害することを示すMullerら、1998;Keytら、1998;各々が、本明細書中において参考として援用される。A4.6.1は、本発明とともに使用され得る。しかし、2C34545と呼ばれる新規な抗体が現在好ましく、これは、VEGFと2つのVEGFレセプターのうちの1つのみとの相互作用を選択的に遮断する。2C3は、内皮細胞のVEGF媒介増殖を阻害し、強力な抗腫瘍活性を有し、そしてVEGFとVEGFR2KDR/Flk-1との相互作用を選択的に遮断するが、VEGFR1FLT-1を遮断しない。A4.6.1と対照的に、2C3は、マクロファージ化学走化性VEGFR1によて媒介されるの付随した阻害無しに、VEGFR2によって誘導される脈管形成の特異的阻害を可能にし、従って、より安全な治療剤であると企図される。米国特許第6,342,219号、同第6,342,221号、同第6,416,758号、および同第6,416,758号は、2C3抗体ならびに抗脈管形成治療およびVEGF阻害におけるその使用をさらに記載するために、本明細書中で具体的に参考として援用される。N8.アポトーシス誘導剤本発明の治療剤はまた、好ましくは、腫瘍腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞を含む内で任意の細胞のアポトーシスを誘導する処置方法と組み合わされる。アポトーシスを誘導する例示的な薬剤は、免疫結合体とともに上に列挙される。任意の1つ以上のこのようなアポトーシス誘導剤が、本発明の抗体に連結されること無しに、本発明の併用療法において使用され得る。多くの公知の抗ガン剤がまた、それらの作用機構の一部として、アポトーシス誘導効果を有する。これらの薬剤表Fにおける薬剤によって例示されるは、本発明の併用療法の局面における使用のために特に企図されるこれらは、上記のように、本発明の抗体に結合体化され得る。N9.免疫毒素およびコアグリガンド本発明はまた、標的タンパク質が腫瘍細胞のマーカー、腫瘍脈管構造または腫瘍支質に向けられる、他の免疫毒素またはコアグリガンドとともに使用され得る。PE結合ペプチドを標的化する際に使用するための本明細書中に記載される標的化剤のいずれかが、これらの実施形態において使用され得る。免疫毒素において、結合される薬剤は、抗細胞剤または細胞傷害剤、サイトカイン、放射線治療剤、抗脈管形成剤、アポトーシス誘導剤および抗チューブリン薬物を含む。コアグリガンドにおいて、結合される薬剤は、コアグリガンドである。米国特許第5,855,866号、同第5,965,132号、同第6,261,535号、同第6,051,230号、同第6,451,312号免疫毒素、同第6,093,399号、同第6,004,555号、同第5,877,289号、および同第6,036,955号コアグリガンドが、このような構築物を例示するために、本明細書中で具体的に参考として援用される。N10.ADEPTおよびプロドラッグ治療本発明の抗体9D2、3G4ATCC4545および類似の抗体は、プロドラッグと組み合わせて使用され得、ここでこの抗体は、プロドラッグ活性化成分例えば、抗体に接触した際にのみ、プロドラッグをより活性な形態へ変換するプロドラッグ活性化酵素と作動可能に付随される。この技術は、一般にADEPTと称され、そして例えば、WO95/13095;WO97/26918、WO97/24143および米国特許第4,975,278号および同第5,568,568号これらは、各々具体的に本明細書中に参考として援用されるにおいて記載される。本明細書中で使用される場合、用語プロドラッグは、プロドラッグが基づく親の薬物と比較して腫瘍血管内皮細胞を含む標的細胞に対する減少した細胞傷害性または他の抗細胞性効果を及ぼす生物学的にかまたは薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。好ましくは、プロドラッグまたは前駆体形態は、有意な減少を及ぼすか、またはより好ましくは、ネイティブまたは親の形態と比較して、無視できる細胞傷害性または抗細胞性効果を及ぼす。プロドラッグは、活性化されているかまたは変換されて、その薬物のより活性な親の形態を生じ得る。プロドラッグを作製しそして使用する技術的能力は、当業者の範囲内である。Willmanら1986およびStellaら1985は、種々のプロドラッグの作製方法および使用方法に関する記載および技術をさらに供給する目的のために参考として本明細書中に各々具体的に援用される。本発明の文脈で使用され得る例示的なプロドラッグ構築物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ホスフェート含有プロドラッグ米国特許第4,975,278号、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチドベースのプロドラッグ米国特許第5,660,829号;同第5,587,161号;同第5,405,990号;WO97/07118、D-アミノ酸改変プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ米国特許第5,561,119号;同第5,646,298号;同第4,904,768号、同第5,041,424号、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ米国特許第4,975,278号、必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグおよびさらには5-フルオロシトシン米国特許第4,975,278号および5-フルオロウリジンプロドラッグなどこれらの特許の各々は、本明細書中に参考として具体的に援用される。プロドラッグの形態で使用され得る治療剤または細胞傷害性薬物の型は、実質的には限られる。より細胞傷害性薬剤は、このような送達の形態には好ましく、たとえば、コアグラントプロドラッグとしての使用にあまり好ましくないの送達より好ましい。プロドラッグが実質的に不活性であり、そして放出されたかまたは活性化された薬物が、実質的にかまたは意図される目的のための活性を有するように構築物を設計することが、プロドラッグの形成において必要とされる全てである。もとのプロドラッグに関する種々の改良もまた、WO95/038380;EP751,144アントラサイクリン;WO97/07097シクロプロピルインドール;およびWO96/20169に開示されるように、公知でありかつ本明細書との使用について意図される。例えば、Kmが減少したプロドラッグは、米国特許第5,621,002号本明細書中に参考として特に援用されるに記載され、これは本発明の状況において使用され得る。細胞内にて実行されるプロドラッグ治療もまた、WO96/03151本明細書中に参考として特に援用されるに例示されるように公知であり、そして本明細書を用いて実施され得る。ADEPTにおける使用のために、そのプロドラッグをより活性な薬物へと活性化または変換する因子が、本発明の抗体に作動可能に結合される。従って、この抗体は、脈管形成部位内または腫瘍部位内で、プロドラッグ変換能力を局在化し、活性薬物がそのような領域のみで産生され、そして循環中または健常組織においては産生されないようにする。本発明の抗体に結合してプロドラッグ活性化にて機能し得る酵素としては、ホスフェート含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのアルカリホスファターゼ米国特許第4,975,278号;スルフェート含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのアリールスルファターゼ米国特許第5,270,196号;ペプチドに基づくプロドラッグと組み合わせた使用のためのペプチダーゼおよびプロテアーゼ例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ米国特許第5,660,829号;同第5,587,161号;同第5,405,990号およびカテプシンカテプシンBおよびLを含む;D-アミノ酸修飾プロドラッグと組み合わせた使用のためのD-アラニルカルボキシペプチダーゼ;グリコシル化プロドラッグと組み合わせた使用のための炭水化物切断酵素例えば、β-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ米国特許第5,561,119号;同第5,646,298号;β-ラクタム含有プロドラッグと組み合わせた使用のためのβ-ラクタマーゼ;アミノ窒素にてフェノキシアセトアミド基またはフェニルアセトアミド基で誘導体化された薬物と組み合わせた使用のためのペニシリンアミダーゼ例えば、ペニシリンVアミダーゼ米国特許第、975,278号またはペニシリンGアミダーゼ;ならびに5-フルオロシトシンに基づくプロドラッグ米国特許第4,975,278号と組み合わせた使用のためのシトシンデアミナーゼ米国特許第5,338,678号;同第5,545,548号が、挙げられるがこれらに限定されず、これらの特許各々は、本明細書中に参考として特に援用される。酵素活性を有する抗体触媒抗体またはアブザイムとして公知もまた、プロドラッグを活性な薬物へと変換するために使用され得る。従って、本発明の抗体好ましくは、9D2および3G4および類似の抗体に基づくアブザイムは、本発明の別の局面を形成する。アブザイムを生成する技術的能力もまた、Masseyら1987このアブザイムの教示を補足する目的で、本明細書中に参考として特に援用されるに例示されるように、当業者の範囲内に存在する。カルバメート位置例えば、窒素マスタードアリールカルバメートでプロドラッグの分解を触媒し得る触媒抗体が、EP745,673本明細書中に参考として特に援用されるに記載されるように、さらに意図される。O.抗体コーティングリポソームおよび治療剤リポソーム処方物は、しばしば、治療剤および薬剤において使用される。しかし、最初の研究においてリポソームの生体分布は、このような処方物が、ヒトにおいて幅広く適用可能でないことを意味する。ステルスstealthまたはステルス化リポソームおよび処方の技術は、このように開発され、これは、リポソームがより長く循環することを可能にする。ステルス化リポソームにおける使用のための好ましい薬剤は、ポリエチレングリコールPEGであり、そして得られるリポソームはまた、PEG化リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、ガン患者において腫瘍に、細胞傷害剤を送達する際に使用するために提案されている。ある範囲の薬物は、ステルスリポソームに組み込まれているシスプラチンRosenthalら、2002、TNFαKimら、2002、ドキソルビシンSymonら、1999およびアドリアマイシンSinghら、1999各々が、本明細書中において具体的に参考として援用されるを含む。しかし、最近の報告は、転移性乳ガンの処置においてステルスリポソームドキソルビシンおよびビノレルビンの予期しない低い効力を示したRimassaら、2003。本発明は、改善されたステルス化リポソーム処方物を提供し、当該分野の種々の欠点を克服し、ここで、ステルス化リポソームは、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質、好ましくは、PSまたはPEに結合する抗体と機能的に関連するかまたはコーティングされる。9D2、3G4ATCC4545および本発明の類似の競合抗体が、このような使用に好ましいが、任意の抗体、またはその抗原結合領域アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合するが使用され得る。二価抗体または抗体部分は、本発明のこれらの局面において必要とされない。任意のステルス化リポソームが、新規なリポソーム処方物の基礎を形成し得、そして好ましくは、PEG化リポソームが使用される。ステルス化リポソームは、コーティングされる。すなわち、アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合する抗体と作動可能にまたは機能的に関連する。作動可能にまたは機能的に関連は、抗体が、標的アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質好ましくは、PSまたはPEに特異的に結合する能力を保持し、それによってステルス化リポソームおよびその任意の内容物をPSおよび/またはPEポジティブ細胞例えば、腫瘍細胞および腫瘍脈管内皮細胞に送達または標的化するように、なされる。本発明の抗体コーティングステルス化リポソームは、単独で使用され得る。しかし、好ましくは、このようなリポソームはまた、1つ以上の第2の治療剤例えば、抗ガン剤または化学療法剤第1の治療剤が、抗体自体であるを含む。第2の治療剤は、一般的に、リポソームのコア内であるとして記載される。抗体への結合体のためにまたは併用療法のために、当該分野で公知であり、そして/または本明細書中に記載される任意の1つ以上の第2の抗ガン剤または化学療法剤が、本発明の抗体コーティングステルスリポソームにおいて使用され得る。例えば、任意の化学療法剤または放射線療法剤、サイトカイン、抗脈管形成剤またはアポトーシス誘導剤。化学療法剤において現在好ましいのは、抗チューブリン薬物、ドセタキセルおよびパクリタキセルである。さらに、本発明の抗体コーティングステルス化リポソームはまた、ウイルス感染および疾患を処置する際に使用するための1つ以上の抗ウイルス薬物を装填され得る。抗ガン剤とともに、抗体への結合体のためにまたは併用療法のために、当該分野で公知であり、そして/または本明細書中に記載される、第2の抗ウイルス薬物の任意の1つ以上が、本発明の抗体コーティングステルス化リポソームにおいて使用され得る。シドファビルおよびAZTは、現在好ましい例である。P.抗脈管、抗脈管形成および他の治療本発明はまた、異常な脈管形成が関与する他の疾患プロトロンビン血管を有する疾患および障害を含むの処置において使用され得る。治療機構のみではないが、本発明の抗体、免疫結合体およびペプチドベース治療剤はまた、異常な脈管形成例えば、種々の疾患および障害に寄与するを有する動物および患者を処置するために使用され得る。抗脈管形成、プロトロンビン脈管構造または他の抗脈管機構に基づくか否かに関わらず、本発明は、流行したおよび/または臨床的に重要なガン処置の分野以外の疾患を処置するために使用され、これには、以下が挙げられる:関節変形、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、グレーヴズ病、血管性再狭窄以下の再狭窄を含む:血管形成術、動静脈機能不全AVM、髄膜腫、血管腫および血管新生緑内障。介入についての他の標的には、以下が挙げられる:血管線維腫、アテローム性動脈硬化症斑、角膜移植新生血管形成、血友病性関節、肥大性瘢痕、オースラー-ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、脈管接着、滑膜炎、皮膚炎、種々の他の炎症性疾患および障害、ならびに子宮内膜症。本発明によって処置可能なさらなる疾患および障害、ならびにこのような脈管形成障害の統一的な基礎が、以下に記載される。異常な脈管構造および脈管形成が関連する1つの顕著な疾患は、慢性関節リウマチであり、ここで、関節の滑膜内壁における血管は、脈管形成を起こす。新しい脈管ネットワークの形成に加えて、内皮細胞は、パンヌス増殖および軟骨破壊に導く、因子および反応性酸素種を放出する。脈管形成に関連する因子は、慢性関節リウマチの慢性的な炎症状態に能動的に寄与し、そして維持するのを助け得る。脈管形成に関連する因子はまた、変形性関節症において役割を有し、関節の破壊に寄与する。種々の因子VEGFを含むが、慢性関節リウマチおよび変形性関節炎の病態に関係することが示されている。異常な脈管構造および脈管形成を含む疾患の別の重要な例は、眼血管新生疾患である。この疾患は、眼の構造例えば、網膜または角膜への新しい血管の侵入によって特徴付けられる。それは、失明に最も一般的な原因であり、そして約20の眼の疾患に関係する。加齢性黄斑変性において、関連した視覚問題は、網膜色素上皮の真下での維管束組織の増殖を有するブルーフ膜における欠陥を介する脈絡膜毛細管の内殖によって引き起こされる。脈管形成損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症と関連する。本発明に従って処置され得る角膜新生血管形成に関連する他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:流行性角結膜炎、ビタミンA欠損、コンタクトレンズ過剰装着overwear、萎縮性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状角膜炎乾燥症、シェーグレン症sjogrens、しゅさ性挫瘡、フリクテン症phylectenulosis、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学的やけど、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純疱疹感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポージ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角膜炎、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ヴェーゲナー類肉腫症、強膜炎、スティーヴンズ-ジョンソン疾患、脈絡放射状角膜切開、および角膜移植片graph拒絶。本発明に従って処置され得る網膜/脈絡膜新生血管形成に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉鎖、動脈閉鎖、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎/硝子体炎vitritis、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデスerythematosis、未熟児網膜症、イールズ病、ベチェット病Bechetsdisease、網膜症または脈絡膜炎を引き起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭の先天的な構造上の欠損、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー処置後の合併症。本発明に従って処置され得る他の疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ルベオーシス角の新生血管形成に関連する疾患、および増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む維管束組織または線維性組織の異常増殖によって引き起こされる疾患糖尿病と関連するかしないか。慢性炎症はまた、異常な脈管構造および病理学的新脈管形成に関連する。潰瘍性大腸炎およびクローン病のようなこのような疾患状態は、新しい血管の炎症性組織への内殖とともに、組織学的変化を示す。南アメリカに見出されるバルトネラ症細菌性感染は、脈管内皮細胞の増殖によって特徴付けられる慢性的な段階を生じ得る。異常な脈管構造および脈管形成に関連する別の病理学的役割は、アテローム性動脈硬化症に見出される。血管の管腔内に形成されるプラークは、脈管形成刺激活性を有することが示されている。ヒト冠状動脈硬化の進行において、および閉塞性冠疾患における再疎通プロセスにおけるVEGFのような脈管形成マーカーの病態生理学的重要性についての特定の証拠がある。本発明は、このような状態のための有効な処置を提供する。小児期の最も頻繁な脈管形成疾患の1つは、血管腫である。ほとんどの場合において、腫瘍は良性であり、そして介入なく退行する。より重篤な場合において、腫瘍は、大きな空洞性かつ浸潤性の組織に進行し、そして臨床的な合併症を作り出す。血管腫の全身的な形態である、血管腫症hemangionmatosesは、高い死亡率を有する。現在使用される治療法を用いて処置され得ない治療耐性血管腫が存在する。新脈管形成はまた、オースラー-ウェーバー-ランデュ病、つまり遺伝性出血性毛細管拡張症のような遺伝性疾患に見出される損傷についての原因である。これは、血管またはリンパ管の複数の小さな血管腫、腫瘍によって特徴付けられる遺伝疾患である。血管腫は、皮膚および粘膜に見出され、しばしば、鼻出血鼻血または胃腸出血によって、ならびにときどき肺および肝動静脈瘻を伴って生じる。新脈管形成はまた、生殖および創傷治癒のような通常の生理学的プロセスに関係する。新脈管形成は、排卵、およびまた、受精後の胞胚の着床において重要な工程である。新脈管形成の阻止により、排卵をブロックするために、または胞胚による着床を防止するために無月経を誘導し得る。創傷治癒において、過剰修復または線維増殖症は、外科手順の有害な副作用であり得、そして新脈管形成によって引き起こされ得るか、または悪化され得る。接着は、手術の頻繁な合併症であり、そして小腸閉塞症のような問題に導く。これは、本発明によって処置され得る。前述の疾患および障害の各々はまた、全てのタイプの腫瘍とともに、本発明に従う処置が考えられる。米国特許第5,712,291号は、本明細書において参考として詳細に援用されており、一旦脈管形成の阻害が特定の因子を用いて示されれば、その因子などを用いる異常な脈管形成に関連する広範な疾患の処置は合理的に実行できるという当該分野における知識をさらに実証する。米国特許第6,524,583号はまた、同様の目的のために、そしてこの原理が抗体に基づく治療剤を用いる脈管形成の阻害および血管形成性疾患の処置にあてはまるということを詳細に実証するために、本明細書において参考として詳細に援用される。従って、腫瘍保有マウスにおける3G4抗体ATCC4545の血管新生阻害効果図17Aは、3G4などの抗体が広範な血管形成性疾患を処置するために適切である重要な証拠である。本発明はさらに、他の疾患を処置するのにおける使用のための組成物および方法を提供するが、ここではアミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質、詳細にはPSおよびPEがある役割を果たす。例えば、PSは細胞接着、炎症性応答および敗血性ショックに関与するので、PSに対する抗体が、炎症性および敗血症ショックの処置において用いられ得る。3G4ATCC4545または同様の抗体の使用は、このような実施形態、詳細にはこのような抗体のFab二量体に好ましい。デュラマイシンFab二量体はまた、敗血性ショックを処置するのにおける使用について特に考慮される。アミノリン脂質および/または陰イオン性リン脂質、詳細にはPSはまた、鎌状赤血球貧血に、詳細にはクリアランス機構の一部として関与する。従って、PSに対する抗体は、鎌状赤血球貧血を処置または緩和するために用いられ得る。3G4ATCC4545または同様の抗体の使用が、詳細にはそのFab二量体の使用が好ましい。ほとんどの細菌が、陰イオン性リン脂質PAを発現する。従って、必要に応じて他の陰イオン性リン脂質に対する結合をともなう、PAに結合する抗体が、抗細菌因子として用いられ得る。本発明の抗体は、E.coliにおいて調製され得、従って、どのような状況でも殺菌性であるというわけでないが、インビボにおける抗細菌性の役割は、補体結合能力から生じると考えられる。従って、抗体フラグメントでなくインタクトな抗体は、抗細菌因子として用いられるべきである。3G4ATCC4545および同様の抗体は、このような実施形態における使用に好ましいが、補体を結合しかつPAに結合する任意の抗体、例えば表4の他のPA結合抗体を使用してもよい。身体自体のリン脂質に対して抗体が生成される自己免疫障害である抗リン脂質症候群およびループス狼瘡は、流産および血小板減少症低い血小板数を含む凝固障害に関連する。従って、これらの患者における抗リン脂質抗体は、血栓を生じる病原性抗体である。しかし、本発明の抗体は、このような副作用を示すことなく、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に結合する。従って、本発明の抗体は、抗リン脂質症候群、その関連の疾患および合併症を処置するのにおける使用が考えられる。抗リン脂質症候群を有する患者において循環する病原性抗リン脂質抗体は、β2-糖タンパク質I、プロトロンビン、キニノーゲン、プレカリクレインおよび第XI因子のようなタンパク質と組み合わせて、PS、PEおよび他のリン脂質に対して結合すると考えられるRote,1996;SugiおよびMcIntyre,1995;1996a;1996b。PSに結合したβ2-糖タンパク質Iおよびプロトロンビンは、それぞれ、抗カルジオリピン抗体およびループス抗体についての一次抗原であることが報告されている。本発明の抗体は、血清タンパク質の存在下でのみアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対して結合しないことに基づいて特に選択されている。従って、リン脂質成分への結合によって、本発明の抗体は、このような患者における病原性の抗体との拮抗および競合における使用を意図しており、従って、身体におけるそのリン脂質タンパク質標的からの病原性抗体と入れ代わる。Q.PE結合ペプチド誘導体および結合体抗体および免疫複合体に加えて、本発明はさらに、詳細には、腫瘍およびウイルス疾患の処置における、PE結合ペプチド誘導体および種々の用途を提供する。現在好ましいPE結合ペプチド構築物および誘導体は、デュラマイシンと命名されたペプチドに基づくものである。PE結合ペプチドおよびデュラマイシン誘導体の3つの一般的カテゴリーが本発明によって提供されるが、そのうちの2つはこの構築物の標的化部分としてPE結合ペプチドまたはデュラマイシンを使用し、他のもう一方は、主にこの構築物のエフェクター部分としてデュラマイシンなどの因子を用いる。標的化因子としてのPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンの使用は、それが得られた構築物に対して選択性の結合能力を付与する能力に基づく。従って、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを含む構築物または結合体は、PE発現細胞、例えば、腫瘍脈管内皮細胞、悪性腫瘍細胞、増殖細胞および/またはウイルスに感染した細胞に特異的に結合する。PE結合ペプチド、例えば、デュラマイシンは、PE標的化機能に加えて生物学的活性を有するので、治療結合体を達成するために、治療因子へデュラマイシンのようなPE結合ペプチドを結合体化することは必要ない。しかし、デュラマイシンのようなPE結合ペプチドは、その天然の形態で毒性を伴うので、このペプチドは毒性を減らすために改変されるべきである。毒性は、ペプチドがクラスターを形成する能力、細胞膜に細孔を形成する能力、および細胞へ一般的に浸透するかまたは透過する能力に関連する。従って、これらの機能は、PE結合ペプチドがクラスターを形成すること、細胞へ浸透すること、および非特異的に毒性であることを有意にまたは実質的に妨げるように、減弱されなければならない。好ましくは、PEに対して結合する能力は実質的に維持されるが、PE結合ペプチドがクラスターを形成し細胞に浸透する能力は実質的に阻害され、従って、細胞毒性は、有意に低下されるかまたは無効になる。本発明によって提供される毒性の低下したPE結合ペプチド誘導体の第一のカテゴリーは、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンが比較的または実質的に細胞不浸透性にされるカテゴリーである。これは好ましくは、細胞不浸透性基に対する結合によって達成され、これは正の電荷もしくは負の電荷を有する小型の基または極性の基であってもよいし、不活性キャリアの形態であってもよい。本明細書において用いる場合、細胞不浸透性基cellimpermeantgroupおよび細胞不浸透性PE結合ペプチドcellimpermeantPE-bindingpeptideという用語は、絶対的というよりも相対的であって、改変されたPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンをいうが、ここでクラスターを形成して細胞に浸透する能力は有意に、そして好ましくは実質的に低下されているものをいう。得られた細胞不浸透性PE結合ペプチドは、細胞の外側にPEおよび会合した膜分子をトラップすることによって、および/またはペプチドコーティング細胞上に宿主防御をもたらすことによって機能し得る。PE結合ペプチド誘導体のこのカテゴリー内では、特定の構築物が宿主防御の補充を強化し、これによってその治療的活性を増強する。例えば、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンが免疫グロブリンに結合される場合、免疫グロブリンは、不活性なキャリアとして、および免疫エフェクターとしての両方で機能し得る。これは、いわゆる無関係な特異性irrelevantspecificityの免疫グロブリンに、そして抗原結合能を有さない免疫グロブリン誘導体、例えばFc領域にあてはまる。結合した免疫グロブリンまたは免疫グロブリン誘導体のおかげで、このような構築物は、例えば、免疫エフェクター細胞を誘引および/または活性化することによって、PE発現細胞に対して宿主防御を向け直すことができる。本発明のPE結合ペプチド誘導体の第二の一般的なカテゴリーにおいて、このペプチドは、細胞浸透および得られる毒性を減らすように依然として改変されるが、小さい細胞不浸透性基も不活性キャリアも用いず、得られる構築物の血液および組織の分布を変化させる因子が用いられる。好ましい例は、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンが、腫瘍細胞、腫瘍または腫瘍内脈管構造または腫瘍間質の成分に結合する標的因子に結合するものである。PE結合ペプチド自体が標的化特性をなお有するが、本発明のこれらの局面では、標的因子は主に標的組織へ、例えば腫瘍環境へ、構築物を指向し、そして結合されたPE結合ペプチド、例えばデュラマイシンは、送達の際に治療効果を発揮する。PE結合ペプチド誘導体の第三の一般的なカテゴリーは、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンの、PE発現細胞に対してこの誘導体を局在化させる標的因子としての使用に戻る。ウイルスに感染した細胞は、正常な未感染の細胞とは対照的に、細胞表面でPEを発現するので、抗ウイルス剤に対してデュラマイシンのようなPE結合ペプチドを連結することによって、有効な標的された抗ウイルス剤が得られる。PE結合ペプチド部分、好ましくはデュラマイシンは、さらなる治療効果を有し得るが、結合された抗ウイルス剤は、このような構築物内の一次治療因子であるように設計される。架橋リンカー、ペプチドスペーサー、ビオチン:アビジン構築物および組み換え発現を含む、上記の結合体化技術のいずれかが、本発明によるデュラマイシン誘導体を調製するために用いられ得る。例えば、デュラマイシン分子内の結合の有利な部位は、デュラマイシン配列配列番号9;図13P;Hayashiら、1990におけるアミノ酸位置2でのリジン残基に対する。しかし、この部位での連結は、本発明の要件ではない。従って、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、架橋目的のために利用可能な官能基を有するように誘導体化され得る。広範な種々の基、例えば、一級または二級のアミン基、ヒドラジド基またはヒドラジン基、カルボキシルアルコール、リン酸、カルバミン酸およびアルキル化の基がこの様式で用いられ得る。従って、結合のための因子抗ウイルス剤を含むが、シッフ塩基結合、ヒドラゾンまたはアシルヒドラゾン結合またはヒドラジドリンカーを通じて結合体化されてもよい各々が本明細書において参考として詳細に援用される、米国特許第5,474,765号および5,762,918号。Q1.PE結合および抗細菌ペプチド任意のPE結合ペプチドを本発明のこれらの局面において用いてもよい。例えば、低分子および高分子のキニノーゲンはPEに結合することが公知である。ヒトタンパク質を含む、種々のこのような結合タンパク質についてのタンパク質およびDNAの配列は当該分野で公知であり、そのことからPE結合ペプチドの使用が容易になる。例えば、高分子量および低分子量のキニノーゲンについてのヒトの遺伝子およびタンパク質は、各々が本明細書において参考として詳細に援用される、Kitamuraら1985およびKellermannら1986に記載される。米国特許第6,312,694号は、PE結合タンパク質、例えば、キニノーゲンおよびそのPE結合フラグメントを用いる、特定のPE結合結合体を記載する。米国特許第6,312,694号においては、PE結合タンパク質またはそのPE結合フラグメントは、抗細胞anticellular因子、毒素および凝固因子に作動可能に連結される。本発明の場合、PE結合ペプチドは、不活性キャリア、腫瘍標的因子または抗ウイルス因子に結合される。結合のための本発明の因子およびそれらの使用方法は、驚くべき進歩であるが、米国特許第6,312,694号は、PE結合ペプチド、例えば、キニノーゲンのPE結合ペプチドフラグメントをさらに記載しかつ使用可能にする目的で参考として本明細書に詳細に援用される。本発明における使用のための現在好ましいPE結合ペプチドは、PE結合分子、デュラマイシンに基づくペプチドである。デュラマイシン2622U90,Moli1901は、ランチバイオティックlantibioticファミリー由来の抗菌ペプチドであり米国特許第4,452,782号;Shotwellら、1958;NakamuraおよびRacker,1984、そしてランチバイオティックファミリーの他のメンバーが本発明において用いられ得る。PE結合ペプチドが、構築物の標的因子として用いられる場合、例えば、不活性なキャリアまたは抗ウイルス剤に連結される場合、ランチバイオティックPE結合ペプチドは、PE結合活性を実質的に保持するべきである。構築物において治療因子として用いられる場合、詳細には腫瘍標的化因子に対して結合される場合、PE結合活性のある程度の損失についてのさらなる許容が存在する。実質的にPEに結合する候補ペプチドを確認または同定するために候補ペプチドを試験することは、本開示に照らせば単刀直入な問題であって、例えば、本明細書に記載される任意の1つ以上のELISAを用いて達成できる。本明細書におけるPE結合ペプチドとしての使用のためのランチバイオティックは、好ましくは、デュラマイシンと実質的に同じPE結合活性を示し、さらにより好ましくは、デュラマイシンのような他のリン脂質を上回るPEについて実質的に同じ特異性も示す。このような特性はまた、本開示に、詳細には実施例に照らして容易に決定できる。上記の規準に基づいて、以下のランチバイオティックは、本発明の構築物および結合体の一部として用いられ得る:デュラマイシン、シンナマイシン、アクタガルディンactagardine、アンコベニンancovenin、エピデルミン、ガリデルミン、ランチオペプチン、メルサシジン、ナイシン、Pep5およびサブチリン。デュラマイシンは本発明の全ての局面における使用のための最も好ましいPE結合ペプチドである。デュラマイシンは、抗菌剤であり、これはまた、喘息、慢性気管支炎およびMycobacteriumtuberculosis感染各々が参考として本明細書に援用される;米国特許第5,849,706号;同第5,716,931号;同第5,683,675号;同第5,651,957号;および同第5,512,269号ならびに嚢胞性線維症McNultyら、2003を処置するのにおける使用について示唆されている。しかし、デュラマイシンは、細胞不浸透性基に対する結合体化についても、詳細にはウイルス感染の処置における使用についても、以前には記載も示唆もされていない。シンナマイシンRo09-0198は、PEに結合する、関連する分子であるWakamatsuら、1986;Choungら、1988a;1988b。標識されたシンナマイシンは、PEの二重層を貫通する移動Aokiら、1994;Emotoら、1996およびインビトロにおけるT細胞のアポトーシスの間のPE露出Emotoら、1997;UmedaおよびEmoto、1999を研究するためのプローブとして用いられている。しかし、本発明によるシンナマイシン誘導体の治療的な使用は、以前には記載も示唆もされていない。従って、ジンナマイシンに基づく本発明のPE結合ペプチド誘導体を含む薬学的組成物、およびその種々の医学的用途は、このような組成物がウイルス感染を処置するのにおける使用を意図される場合に特に、当該分野における進歩である。以下の抗菌性ペプチドはまた、本発明の結合体において、詳細には腫瘍標的化因子に結合された治療因子として用いられ得る;シスチバイオティックcystibiotics、例えば、ペディオシンAcH/PA1、ロイコシンA/Ual187、メセンテリシンY105、サカシンA、サカシンP、ラクタシンF、セレイン7/8およびカルノバクテリオシン、例えば、カルノバクテリオシンA、BM1およびB2;ならびにチオールバイオティックthiolbiotics、詳細にはラクトコッキンlactococcin、例えば、ラクトコッキンB、A、Ma、Na、GaおよびG。Q2.細胞不浸透性基細胞不浸透性基に、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンを結合させることは、ペプチドがクラスターを形成する能力を低下させ、実質的にPE結合ペプチドが正常細胞へ浸透することを妨げ、従って毒性を低下させる。しかし、PE結合特性は、維持されており、その結果、このペプチドは、表面上に露出されたPEを有する異常な細胞または感染した細胞に対して局在化し得る。例示的な細胞不浸透性基としては、生理学的なpHで正の電荷または負の電荷を保有する基、例えば、硫酸イオン、スルホン酸イオン、リン酸イオン、カルボキシルイオン、フェノールイオン、四級アンモニウムイオンおよびアミン基が挙げられる。さらなる例は、極性の基、例えば、単純な糖および多糖、アミノ酸およびポリアルコールである。デュラマイシンは詳細には、ビオチンに連結されて、ビオチン化PE結合ペプチドを形成してもよく、これが、薬学的組成物または医薬、詳細にはウイルス感染を処置することを意図するものに分散されてもよい。細胞不浸透性基はまた、ポリペプチド、タンパク質または免疫グロブリンであってもよく、そのいずれも不活性キャリアとして、または標的化因子として機能し得る。Q3.不活性キャリアPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、不活性な細胞不浸透性キャリアに対する結合によって細胞不浸透性にされ得る。PE結合活性が実質的に破壊されない限り、広範な不活性な細胞不浸透性キャリアを、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンに結合体化して、細胞不浸透性PE結合ペプチドを調製し得る。不活性キャリアは好ましくは、それが動物または患者への投与の際に、なんら重大な望ましくない効果を生じないように、生物学的に適合性であるべきである。キャリアタンパク質が用いられてもよく、そして例示的なタンパク質はアルブミンおよびグロブリンである。ニュートラビジンおよびストレプトアビジンがしばしば好ましい。ポリサッカライドおよびPEGを含む、天然または合成のポリマーのような非タンパク質キャリアもまた用いられ得る。特定の実施形態において、キャリアは免疫グロブリンまたはその部分である。ヒト免疫グロブリンHIgGは、ヒトの投与に好ましい。免疫グロブリンはまた、以下に考察されるように標的化機能を付与し得る。不活性キャリアとして、免疫グロブリンは、結合体に対して標的化機能を付与しない点で、無関係の特異性irrelevantspecificityのものである。しかし、特定のタイプの免疫グロブリンの選択を通じて、依然として特定の利点を得ることができる。例えば、免疫グロブリンのFc部分は、宿主免疫細胞を補充して、これによって宿主防御をさらに刺激するために用いられ得る。Q4.標的化因子不活性キャリアへの結合ではなく、PE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、標的因子、詳細には腫瘍細胞、腫瘍または腫瘍内脈管構造または腫瘍間質の成分へ結合する因子への結合によって細胞不浸透にされ得る。標的化因子は、標的組織、好ましくは腫瘍環境へこの構築物を指向し、そして結合されたPE結合ペプチド、好ましくはデュラマイシンは、送達の際に治療効果を発揮する。適切な標的化因子は、腫瘍細胞に結合する、抗体および他の因子のような成分である。腫瘍細胞に結合するbindtoatumorcell因子とは本明細書においては、本明細書においてさらに記載されるとおり、腫瘍細胞の任意の接近可能な構成要素単数または複数に結合するか、または腫瘍細胞にそれ自体が結合するかそうでなければ会合する、ある構成要素に結合する、標的化因子として定義される。このような腫瘍細胞標的化因子および結合リガンドのほとんどが、細胞表面腫瘍抗原またはマーカーに結合する因子、詳細には抗体であることが考えられる。多くのこのような抗原は、抗原結合および腫瘍標的化における使用のための種々の抗体と同様に公知である。従って、本発明は、同定された腫瘍細胞表面抗原に結合する、そして/またはインタクトな腫瘍細胞に結合する標的因子を包含する。米国特許第5,877,289号;同第6,004,555号;同第6,036,955号;同第6,093,399号の表Iおよび表IIの、同定される腫瘍細胞表面抗原およびインタクトな腫瘍細胞は、適切な腫瘍細胞表面抗原を例証する目的で参考として本明細書に詳細に援用される。腫瘍細胞結合領域の例は、細胞表面腫瘍抗原p185HER2、ミルクのムチンコアタンパク質、TAG-72、ルイスLewisaまたはガン胎児性抗原CEAに結合する抗体の抗原結合領域を含むものである。腫瘍細胞結合領域の別の群は、抗体9.2.27、OV-TL3、MOv18、B3ATCCHB10573、KS1/4ベクターpGKC2310NRRLB-18356またはベクターpG2A52NRRLB-18357、260F9ATCCHB8488またはD612ATCCHB9796を含む細胞から得られるに結合する腫瘍関連抗原に結合する抗体の抗原結合領域を含むものである。D612は、米国特許第5,183,756号に記載されており、そしてATCCアクセッション番号HB9796を有し;B3は米国特許第5,242,813号に記載されて、ATCCアクセッション番号HB10573を有し;そして組み換えおよびキメラのKS1/4抗体は、米国特許第4,975,369号に記載される;各々が参考として本明細書に援用される。腫瘍細胞の標的可能な成分としてはさらに、壊死性かさもなければ損傷された腫瘍細胞から遊離された成分が挙げられ、これにはサイトゾルおよび/または核の腫瘍細胞抗原が挙げられる。これらは好ましくは、浸透性であるように誘導され得る細胞に、または哺乳動物の正常な、生きている細胞の外側には存在せず接近可能でもない実質的に全ての新形成のおよび正常な細胞の細胞ゴーストに存在する、不溶性の細胞内抗原単数または複数である。AlanEpsteinおよび同僚に対して発行された米国特許第5,019,368号、同第4,861,581号および同第5,882,626号は各々が、インビボにおいて悪性細胞から接近可能になる細胞内抗原に特異的な抗体を作製して使用する方法をさらに記載して教示する目的のために参考として本明細書に詳細に援用される。記載される抗体は、哺乳動物の悪性細胞の細胞内成分に十分特異的であるが、細胞外成分には特異的ではない。例示的な標的としてはヒストンが挙げられるが、壊死性腫瘍細胞から特異的に放出された全ての細胞内成分が包含される。血管新生した腫瘍を有する動物または患者に対する投与の際、このような抗体は、インビボに存在して悪性細胞の少なくとも一部を壊死性にさせる腫瘍再構築のプロセス単数または複数に起因して、血管新生した腫瘍が自然に壊死性の腫瘍細胞を含むという事実のおかげで悪性細胞に局在する。さらに、腫瘍壊死を増強する他の治療剤と組み合わせたこのような抗体の使用は、標的化および引き続く治療の有効性を増強するように機能する。従って、これらのタイプの抗体は、本明細書に開示されるような標的因子として用いられ得る。腫瘍内皮細胞および間質に存在するマーカーに結合するが、正常な細胞、内皮細胞および間質からはほとんど欠失されている、ある範囲の適切な標的因子が利用可能である。腫瘍脈管構造標的化のために、標的化抗体またはリガンドはしばしば、血管新生された腫瘍の腫瘍内血管によって発現されるか、そこに吸着されるか、その上で誘導されるか、さもなければそこに局在するマーカーに結合する。従って、腫瘍脈管構造の構成要素componentsoftumorvasculatureとは、これらの細胞表面レセプターまたは分子に結合され得る、腫瘍脈管内皮細胞表面分子および任意の構成要素、例えば増殖因子の両方を含む。以下の特許は、腫瘍脈管構造の、発現されるか、吸着されるか、誘導されるか、または局在されるマーカーに対して指向される標的化因子の調製および使用に関する本発明の教示をさらに補充する目的のために、本明細書に参考として詳細に援用される:米国特許第5,855,866号;同第5,776,427号;同第5,863,538号;同第5,660,827号;同第5,855,866号;同第5,877,289号;同第6,004,554号;同第5,965,132号;同第6,036,955号;同第6,093,399号;同第6,004,555号。腫瘍および腫瘍内血管の表面発現標的の例としては、脈管細胞表面レセプターおよび細胞接着分子が挙げられる参考として本明細書に詳細に援用される、ThorpeおよびRan,2000、表1を参照のこと。適切な例としては、例えば、TEC-4、TEC-11、E-9およびSnef抗体によって標的されるエンドグリンendoglin;例えば、H4/18抗体によって標的される、E-セレクチン;例えばE1/6および1.4c3抗体によって標的されるVCAM-1;例えば、FB5抗体によって標的されるエンドシアリン;例えば、LM609およびペプチド標的化因子によって標的されるαvβ3インテグリン;多数の抗体によって、詳細にはVEGFによって標的されるVEGFレセプターであるVEGFR1;同様に多数の抗体、例えば、3E7およびGV39によって標的されるVEGFレセプター複合体;ならびにJ591のような抗体によって標的されるPSMA。エンドグリン、TGFβレセプター、Eセレクチン、Pセレクチン、VCAM-1、ICAM-1、LAM-1と反応性のリガンド、VEGF/VPFレセプター、FGFレセプター、αvβ3インテグリン、プレイオトロピン、エンドシアリンのような例はさらに、各々が参考として本明細書に援用される、米国特許第5,855,866号;同第5,877,289号;同第6,004,555号;同第;6,093,399号に記載され使用可能にされる。さらなる適切な例としては、特定のペプチド標的化因子によって各々標的される、プロテオグリカン、例えば、NG2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼMMP、例えば、MMP2およびMMP9が挙げられるThorpeおよびRan,2000。これらは、血管再構築の部位である、腫瘍における標的可能部分として発現される再構築酵素の例である。さらなる適切な標的はトロンボモジュリン、Thy-1およびシスタチンである。腫瘍内皮細胞において増加した配列を同定する研究によってまた、標的可能な腫瘍血管マーカーとして、トロンボモジュリン、MMP11ストロメリシン、MMP2ゲラチナーゼおよび種々のコラーゲンが同定され、これはまた本明細書において参考として詳細に援用される米国特許第6,004,555号および同第6,093,399号にも一致している。別の適切な標的はPSMA前立腺特異的膜抗原である。モノクローナル抗体7E11によって最初に規定されたPSMAは、前立腺ガンのマーカーとしてもともと同定されており、2型組み込み型膜糖タンパク質として公知である。7E11抗体は、生きた細胞においては結合について利用できない、PSMAの細胞内エピトープに結合する。従って、本発明の状況では、PSMAは細胞外ドメインに対する抗体を用いて標的される。このような抗体は、肺、結腸および乳房を含む種々のガン腫における腫瘍脈管内皮構造と反応するが、正常な脈管内皮細胞とは反応しない。PSMAの外部ドメインに結合する多くの抗体は容易に利用可能であって、本発明において用いられ得る。モノクローナル抗体3E11、3C2、4E10-1.14、3C9および1G3は、PSMAタンパク質の細胞外ドメインの異なる領域について特異性を示し、そして本明細書における使用に適切である。PSMAの細胞外ドメインの3つのさらなる抗体は、J591、J415およびPEQ226.5であって、これは腫瘍関連脈管構造におけるPSMA発現を確認し、本発明において用いられ得る。PSMAおよびその改変体をコードする核酸はまた容易に利用可能であるので、米国特許第5,935,818号および同第5,538,866号、必要に応じて、さらなる抗体を生成してもよい。参考として本明細書に詳細に援用される米国特許第6,150,508号は、本発明において用いられ得る、PSMAの細胞外ドメインに結合する種々の他のモノクローナル抗体を記載する。細胞表面で発現されたPSMAと反応性の35個の例示的なモノクローナル抗体のうちの任意の1つ以上を用いてもよい。これらとしては、3F5.4G6ATCCHB12060;3D7-1.I.ATCCHB12309;4E10-1.14ATCCHB12310;3E11ATCCHB12488;4D8ATCCHB12487;3E6ATCCHB12486;3C9ATCCHB12484;2C7ATCCHB12490;1G3ATCCHB12489;3C4ATCCHB12494;3C6ATCCHB12491;4D4ATCCHB12493;1G9ATCCHB12495;5C8B9ATCCHB12942;3G6ATCCHB12485;および4C8B9ATCCHB12492が挙げられる。PSMAの細胞外ドメインを認識するさらなる抗体またはその結合部位は、各々が参考として本明細書に詳細に援用される、米国特許第6,107,090号および同第6,136,311号に記載される。詳細には4つのハイブリドーマ細胞株が記載されており、これはE99、J415、J533およびJ591ATCCHB-12101、HB-12109、HB-12127、およびHB-12126であって、従ってその任意の1つ以上が、請求された発明に従って、標的化因子として用いられ得る。吸着されたadsorbed標的に結合する標的化因子は、別の適切な基、例えば、腫瘍または腫瘍内脈管構造細胞表面レセプターに結合するリガンドまたは増殖因子に結合するものである。このような抗体としては、VEGF、FGF、TGFβ、HGF、PF4、PDGF、TIMPまたは腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームに結合する抗体が挙げられる米国特許第5,877,289号;同第5,965,132号;同第6,093,399号および同第6,004,555号;各々が本明細書において参考として援用される。他の適切な標的抗体、またはそのフラグメントは、リガンド-レセプター複合体または増殖因子-レセプター複合体に存在するが、個々のリガンドまたは増殖因子およびレセプターの両方に存在しないエピトープに結合するものである。このような抗体は、細胞表面に提示された場合、リガンド-レセプター複合体または増殖因子-レセプター複合体を認識して結合するが、遊離のリガンドまたは増殖因子または複合体化していないレセプターには結合しない。従って、結合したレセプター複合体boundreceptorcomplexとは本明細書において用いる場合、増殖因子レセプターのようなそのレセプターにリガンドまたは増殖因子が特異的に結合する場合に生成される得られる複合体をいう。これらの局面は、VEGF/VEGFレセプター複合体によって例示される。このようなリガンド-レセプター複合体は、非腫瘍関連内皮細胞上よりも腫瘍関連内皮細胞上に有意に多数存在し、従って、抗複合体抗体によって標的され得る。抗複合体抗体は、モノクローナル抗体2E5、3E5および4E5ならびにそのフラグメントを含む。サイトカインおよび凝固剤によって天然におよび人工的に誘導可能な抗原も標識され得る。例示的なサイトカイン誘導性抗原は、Eセレクチン、VCAM-1、ICAM-1、エンドグリン、LAM-1と反応性のリガンド、およびさらにはMHCクラスII抗原であって、これは、単球、マクロファージ、肥満細胞、ヘルパーT細胞、CD8陽性T細胞、NK細胞またはさらには腫瘍細胞によって遊離され得るように、例えば、IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-βまたはIFN-γによって誘導される。さらなる誘導性抗原としては、凝固因子によって、例えば、トロンビン、第IX/IXa因子、第X/Xa因子、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ、MMPによって誘導可能な抗原が挙げられる。概して、トロンビンによって誘導される抗原が用いられる。この群の抗原としては、Pセレクチン、Eセレクチン、PDGFおよびICAM-1が挙げられ、Pセレクチンおよび/またはEセレクチンの誘導および標的が一般に好ましい。他の実施形態では、本発明の脈管構造および間質標的化因子以下を参照は、標的化因子であって、それ自体は抗体ではなくその生物学的リガンド、または一部である。生物学的リガンドbiologicalligandsとはこの意味で、サイトカイン、ホルモン、増殖因子などによって例示されるように、間質中または血管細胞に接近可能な、細胞表面分子、例えばレセプターに結合するかまたは会合する分子である。任意のこのような増殖因子またはリガンドが、疾患関連間質または脈管構造に、例えば、腫瘍脈管構造内皮細胞の表面に存在する特定の生物学的レセプターに結合する限り、これが用いられてもよい。本発明のこれらの局面における使用のための適切な増殖因子としては、例えば、VEGF/VPF血管内皮増殖因子/血管透過性因子、FGF線維芽増殖因子ファミリーのタンパク質、TGFβトランスフォーミング成長因子B、腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォーム、散乱係数/肝細胞増殖因子HGF、血小板因子4PF4、PDGF血小板由来増殖因子、TIMP、またはさらにはIL-8、IL-6もしくは第XIIIa因子が挙げられる。VEGF/VPFおよびFGFがしばしば好ましい。さらなる適切な標的化因子は、腫瘍関連間質に結合する因子である。腫瘍進行の間に、周囲の組織の細胞外マトリックスは、2つの主なプロセスを通じて再構築される:正常な組織の細胞外マトリックス成分のタンパク質分解性分解;ならびに腫瘍誘導性サイトカインによって活性化された腫瘍細胞および間質性細胞による細胞外マトリックス成分の新規な合成。これらの2つのプロセスは、腫瘍細胞外マトリックスtumorextracellularmatrixまたは腫瘍間質tumorstromaを生成するが、これは腫瘍進行に対して寛容であり、正常組織の細胞外マトリックスまたは間質とは定性的かつ定量的に別個である。従って腫瘍間質tumorstromaは、正規の組織に存在しない標的可能な成分を有する。本発明における使用のための特定の好ましい腫瘍間質標的因子は、基底膜マーカー、IV型コラーゲン、ラミニン、硫酸ヘパラン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、活性化血小板、LIBS、RIBSおよびテネイシンに結合する因子である。以下の特許は、腫瘍間質標的化因子の調製および使用に関する本発明の教示をさらに補強する目的で参考として本明細書に詳細に援用される:米国特許第5,877,289号;同第6,093,399号;同第6,004,555号;および同第6,036,955号。腫瘍関連間質の成分としては、間質、細胞外マトリックスおよび結合組織の構造的および機能的成分が挙げられる。従って、腫瘍間質標的化因子としては、基底膜マーカー、IV型コラーゲン、ラミニン、フィブリン、硫酸ヘパラン、プロテオグリカン、糖タンパク質、陰イオン性多糖類例えば、ヘパリンおよびヘパリン様成分およびフィブロネクチンのような成分に結合する因子が挙げられる。例示的な有用な抗体は、種々の良性および悪性の腫瘍の間質において発現された高分子量の細胞外糖タンパク質であるテネイシンに結合する抗体である。従って、抗テネイシン抗体は、標的化因子として用いられ得る参考として本明細書に詳細に援用される、米国特許第6,093,399号および同第6,004,555号。さらに適切な標的化因子としては、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、および浸潤性リンパ球または白血球に結合する抗体およびリガンドが挙げられる。活性化された血小板activatedplateletは、腫瘍間質のさらなる成分である。なぜなら血小板は、活性化された場合に間質に結合して、これによってこのような血小板が本発明によって標的され得るからである。さらに適切な間質性標的化因子、抗体およびその抗原結合領域は、誘導性inducible腫瘍間質成分、例えば、サイトカインによって誘導性の成分、および特に、凝固因子、例えばトロンビンによって誘導性の成分に結合する。好ましい抗間質性抗体の群は、フィブリノーゲン上のRIBSレセプター誘導性結合部位に結合するものである。従って、RIBSは標的可能な抗原であり、間質でのその発現は、活性化された血小板によって指示される。活性化された血小板上のLIBSリガンド誘導性結合部位に結合する抗体がまた有用である。腫瘍関連間質の特に好ましい標的可能な要素は、現在のところ、腫瘍関連フィブロネクチンFNアイソフォームである。フィブロネクチンは、細胞外マトリックスおよび体液の両方の多機能の高分子量糖タンパク質成分である。それらは、多くの異なる生物学的プロセス、例えば、正常な細胞形態学の確立および維持、細胞遊走、止血および血栓症、創傷治癒および発ガン性トランスフォーメーションに関与する。フィブロネクチンアイソフォームは、インテグリンファミリーのレセプターに結合するリガンドである。腫瘍関連フィブロネクチンアイソフォームtumor-associatedfibronectinisoformは、腫瘍脈管構造および/または腫瘍間質の一部であると考えることができる。フィブロネクチンアイソフォームは、転写、転写後および翻訳後のレベルでもたらされる、広範な構造的異質性を有する。フィブロネクチンにおける構造的多様性は最初に、少なくとも20の異なるアイソフォームを生成するための一次フィブロネクチン転写物の3つの領域ED-A、Ed-BおよびIIICSの選択的スプライシングによってもたらされる。組織特異的および発生上特異的な様式で調節されるのと同様に、フィブロネクチン-プレ-mRNAのスプライシングパターンは、形質転換された細胞においておよび悪性腫瘍において調節低下されることが公知である。実際に、ED-A、ED-BおよびIIICSの配列を含むフィブロネクチンアイソフォームは、正常細胞におけるよりもトランスフォームされた細胞および悪性腫瘍細胞においてさらに大きい程度まで発現される。詳細には、ED-B配列を含むフィブロネクチンアイソフォームBアイソフォームは、胎児および腫瘍組織において、そして創傷治癒の間に高度に発現されるが、正常な成体の組織における発現に限定される。Bフィブロネクチン分子は、成熟血管において検出不能であるが、正常な状況例えば、子宮内膜の発達、病理的な血管形成例えば、糖尿病性網膜症および腫瘍発達においては血管形成性血管において上方制御される。従って、フィブロネクチンのいわゆるBアイソフォームB-FNは本発明での使用に特に適切である。ED-B配列は、単一のエキソンによってコードされる完全なIII型相同性反復であって、91アミノ酸を含む。Bアイソフォーム自体の存在は、腫瘍誘導性新抗原neoantigenを構成するが、さらに、ED発現は、III型リピート7先行するED-B内の通常潜在性の抗原を露出する;このエピトープは、ED-Bを欠くフィブロネクチン分子においては露出されないので、ED-B発現は直接および間接的に新抗原の発現を誘導する。この潜在性の抗原性部位は、モノクローナル抗体BC-1の標的を形成するEuropeanCollectionofAnimalCellCultures,PortonDown,Salisbury,UK,番号88042101。BC1抗体は、本発明の脈管標的化成分として用いられ得る。ED-Bアイソフォームに特異性を有する改善された抗体は、参考として本明細書に援用されるWO97/45544に記載される。このような抗体は、糸状バクテリオファージの表面上に提示されたヒト抗体可変性領域のライブラリーから単鎖FvsscFvとして得られているWO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236およびWO93/19172も参照のこと。抗体ファージライブラリーを用いて、特定のscFvが、これらの抗原が固体表面上でコーティングされる場合パニングpamming、ED-Bドメインを含む組み換えフィブロネクチンフラグメント上で、そして組み換えED-B自体の上の両方での直接選択によって単離され得る。抗原のこれらの同じ供給源はまた、親和性成熟affinitymaturationのプロセスにおいて親のクローンに対して改善された特性を有する第二世代secondgenerationscFvを生成するために首尾よく用いられている。単離されたscFvは、好ましくはNグリカナーゼを用いた事前の処置なしに、ヒトフィブロネクチンのBアイソフォームと強力かつ特異的に反応する。従ってWO97/45544の抗体は特にその使用が考慮される。抗腫瘍適用において、これらのヒト抗体抗原結合ドメインは有利である。なぜならそれらはヒト投与の際に有する副作用が少ないからである。参照抗体は、ED-Bドメインに直接結合する。好ましくは、抗体は、ヒトフィブロネクチンED-Bおよび非ヒトフィブロネクチンED-B、例えばマウスのフィブロネクチンED-Bの両方に結合して、動物モデルにおける試験および解析を可能にする。この抗体フラグメントは、単鎖FvscFv、Fab、Fab’、Fab’2、Fabc、Facbおよび二重特異性抗体diabodiesに拡大する。フィブロネクチンのEDドメインに特異的なさらなる改善された抗体は、WO99/58570に記載のように、ナノモル未満の解離定数で生成されており、従ってその使用にさらに好ましい。これらの標的化因子は、この因子および関連の抗体を作製して使用する方法を教示する目的で参考として本明細書において詳細に援用されるWO99/58570に記載されるL19抗体によって例示される。これらの抗体は、フィブロネクチンのED-Bドメインの特徴的なエピトープに特異的な親和性を有し、かつED-Bエピトープに対して改善された親和性を有する。このような改善された組み換え抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーからscFv形式で利用可能である。H10およびL19のうちL19は、ナノモル未満の濃度でフィブロネクチンのED-Bドメインについての解離定数を有するが、このH10およびL19に加えて、本明細書において参考として詳細に援用されるWO99/58570の技術は、同様の抗体を調製するために用いられ得る。抗体ファージディスプレイライブラリーからのフィブロネクチンのED-Bドメインに特異的なヒトscFv抗体フラグメントの単離、およびナノモル未満の親和性でED-Bに結合するヒトscFv抗体フラグメントの単離は、WO99/58570の実施例1および2に詳細に記載される。従って、好ましい抗体としては、フィブロネクチンのED-Bドメインの特徴的エピトープに特異的な親和性を有する抗体が挙げられるが、この抗体は、ED-Bエピトープについて改善された親和性を有し、この親和性は、ナノモル未満の範囲であり、この抗体は、ED-Bフィブロネクチンを認識する。他の好ましい形式では、抗体はscFvであるかまたは組み換え抗体であり、そしてその親和性は、そのCDR残基に限定された数の変異を導入することによって改善される。変異されるべき例示的な残基としては、VHドメインの31~33、50、52および54、ならびにVLドメインの残基32および50が挙げられる。このような抗体は27~54pMのKdでフィブロネクチンのED-Bドメインに結合し得る;L19抗体またはL19の機能的に等価な改変体によって例示されるとおり。Q5.抗ウイルス結合体正常な条件下で、PEは、細胞表面には露出されない。しかし、種々の疾患状態において、PEは1つ以上の細胞タイプの細胞表面で露出される。例えば、腫瘍脈管構造内の内皮細胞は、PE陽性になり、HuIgGに結合体化されたデュラマイシンを用いる首尾よい腫瘍処置によって本明細書において示されるように、PE指向された治療剤によって標的され得る。PEはまた、ウイルス感染した細胞の細胞表面で露出され、従ってこれは本発明のPE結合ペプチド誘導体を用いる治療介入のさらなる標的である。実際、本出願は、ビオチンおよびHuIgGに連結されたデュラマイシン誘導体によって例示されるとおり、デュラマイシン誘導体が、インビトロおよびインビボの両方で有効な抗ウイルス剤であることを示す。AZT、アシクロビル、ガンシクロビル、シドフォビルシトシン誘導体および新規な抗ウイルス薬を含むいくつかの抗ウイルス薬物は、毒性/有効性によって制限される。ウイルス感染の間のPEにおける変化に関するその観察に基づいて、さらにもとのPE結合ペプチド誘導体の有効性に照らして、本発明者らは、毒性の低下および有効性の増大を伴う新規な抗ウイルス治療剤を設計することによって抗ウイルス分野での問題に取り組んだ。本発明の新規な抗ウイルス治療剤において、抗ウイルス薬は、PE結合ペプチドに連結され、これがウイルス感染した細胞に対して結合した抗ウイルス薬を送達するように機能する。さらに、本発明者らは、本発明のPE結合ペプチド、抗ウイルス誘導体の発達に関して以下の観察を有する。PE結合ペプチド誘導体、例えば、デュラマイシン-L-ビオチンが、全身投与の後でさえ、インビボにおいて、詳細には肺において、マクロファージによって取り込まれることを示すために本明細書においてデータが提示される。感染の際、多くのウイルスは、最初に細網内皮細胞系RESの細胞を通過して、マクロファージはウイルス取り込みのための主な細胞である。従って、デュラマイシンのようなPE結合ペプチドに対する抗ウイルス薬の結合によって、薬物の抗ウイルス効果は、侵入するウイルスを排出することを担う主な細胞タイプマクロファージに指向される。従って、PE結合ペプチド誘導体は、全身投与後に肺においてマクロファージに局在し、当然有用である。エアロゾルを介することを含むさらに直接的な手段での肺への投与もまた想定される。従って、本発明は、広範に適用可能な実際的な抗ウイルス修復を提供することによってウイルス処理分野における重要な欠点を解決する。従って、本発明の新規な抗ウイルス治療剤は、好ましくは、2つの薬剤を連結するための生物学的に解放できるかまたは加水分解的に変化しやすい結合を用いて、抗ウイルス薬に結合するPE結合ペプチド、例えばデュラマイシンを含む。将来の抗ウイルスとして開発される任意の因子を含む、任意のある範囲の抗ウイルス因子は、PE結合ペプチドに連結され、本発明による有利な抗ウイルス治療剤を形成し得る。いわゆる古典的な抗ウイルス剤に加えて、他のDNA/RNAインヒビターをPE結合ペプチドに結合して、抗ウイルス治療剤を形成してもよい。例示的な抗ウイルス剤は、表Gに列挙されており、その任意の1つ以上を、PE結合ペプチドに結合して本発明の抗ウイルス結合体を調製してもよいし、または本発明の抗ウイルス併用療法において別々に用いてもよい。抗ウイルス因子および薬物の範囲内で、PE結合ペプチドへの連結のためにはAZTおよびシドフォビルが現在好ましい。選択された抗ウイルス薬、PE結合ペプチドにかかわらず、抗ウイルス結合体は肺においてマクロファージに、ウイルス感染した細胞に結合し、そしてまたウイルス粒子に結合してもよい。用いられるリンカーまたは結合体化技術に依存して、抗ウイルス薬は、標的細胞の表面で放出されて、次いで細胞に取り込まれてもよい。好ましくは、結合体自体が細胞、例えばマクロファージまたはウイルス感染した細胞に取り込まれる。取り込みは、天然に生じてもよいし、またはウイルス媒介されてもよい。一旦細胞内に入れば、抗体結合体と同様に、リンカーの加水分解によって活性な抗ウイルス剤が遊離される。デュラマイシン-シドフォビル抗ウイルス剤についての適切な結合選択肢の1例は、図13Rに記載される。この例では、デュラマイシン-シドフォビル結合体は、肺においてマクロファージに結合するように、そして細胞に取り込まれるように設計される。リンカーの加水分解はホスホラミダイトの分解および、活性なシドフォビルまたは細胞浸透性誘導体図13RのRの遊離をもたらして、これがシドフォビルを破壊する。生物学的に不安定な結合を含む他の結合、例えば、ジスルフィド、酸不安定性、酵素切断可能または加水分解可能な結合などが用いられ得る。従って、治療剤に対して抗体を連結するのにおける使用のために記載される、生物学的に遊離可能であるかまたは選択的に加水分解可能な任意の結合を、本発明の抗ウイルス誘導体であるPE結合ペプチドと組み合わせて用いてもよい。リンカーの選択は、特定のPE結合ペプチド、例えばデュラマイシンによっては限定されない。なぜならこのペプチドは、上記のような選択された抗ウイルス剤の結合を可能にする官能基を導入することによって誘導体化され得るからである。R.抗ウイルス処置方法本発明はさらに、ウイルス感染を処置するのにおける使用のために、必要に応じて抗ウイルス剤に結合体化された、ある範囲の抗体、免疫複合体およびPE結合ペプチド誘導体を提供する。この処置レジメン、および詳細には用量は一般に、本発明のガン処置局面について上記されたとおりであって、この適応性は本発明全体の利点である。作用の特定の機構単数または複数の理解は、本発明の抗ウイルス処置を行なうのに必要ではないが、本明細書の実施例によって支持されるとおり、ウイルス処置の基礎にある特定の理由は以下のとおりである。最も重要な機構は、ウイルス複製および宿主細胞の活性化と関連していると考えられる。ウイルス感染の間、このウイルスは、細胞の内側での複製プロセスの間に細胞を活性化する。細胞活性化のこのプロセスは、ヘルペスウイルス、C型肝炎およびHIV-1について示されるとおり、ウイルス複製に必須である。ウイルスの発達は、ウイルスおよび宿主の両方の遺伝子発現を活性化する。例えば、PichindeウイルスおよびMachupoウイルスの複製は、複製周期後期でアクチノマイシンDによって阻害され、このことは宿主細胞遺伝子転写がウイルス複製の完成に必要であることを示す。ウイルスによる宿主細胞の活性化は、細胞の陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、例えばPSおよびPEを外面化させる。詳細には、本発明者らは、ウイルス活性化が細胞内へCa2流入を生じ、これがスクランブラーゼを活性化して、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、詳細にはPSおよびPEを外面化させると判断する。陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、好ましくはPSおよびPEに結合する抗体、ペプチド誘導体、および結合体は、次いで活性化プロセスに結合して、これを妨害し、これによってウイルスが適切に複製され得ることを妨げる。本実施例によって、本発明がウイルス感染の後期プロセスにおいて機能して、ウイルスの成熟または出現をブロックすることが示される。本発明者らの研究によって、本発明の因子の阻害性効果が広範に適用可能であることが示される。なぜなら、この因子は異なる発現機構を用いるウイルス上で作動することが示されているからである。例えば、本実施例は、ゴルジ由来開口分泌小胞から逃避するヘルペスウイルスCMVのブロック、ならびに原形質膜から直接出芽する、アレナウイルスPichindeウイルスおよびパラミクソウイルスRSVのブロックを実証する。ウイルス感染した細胞は、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、詳細にはPSおよびPEを外面化させ、これは正常には細胞内であり、すなわち、原形質膜の内面に限局される。ウイルスの逃避の間、リン脂質は、逃避の部位で再分布して、これは原形質膜からのウイルスの出芽または開口分泌の間の膜屈曲に適合し、そして陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質が、このプロセスの間に外面化される。従って、本発明の抗体、ペプチド誘導体および結合体は、外面化した陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、詳細にはPSおよびPEに結合して、感染した細胞からのウイルスの逃避をブロックする。ウイルス感染した細胞への本発明の構築物の結合も、本実施例に示される。本発明の抗体、ペプチド誘導体および結合体はさらに、外面化された陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、詳細にはPSおよびPEに結合し得、そしてウイルス遺伝子発現および/または複製のために必要な1つ以上のシグナル伝達経路を妨げる。さらに、エンベロープのあるビリオン自体は、それらの外面に、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質、例えばPSおよびPEを有する可能性が高い。ウイルスは転位酵素を欠いて、リン脂質を対称に維持するかまたは修復するので、PSおよびPEのようなリン脂質の連続的な露出が期待される。従って、本発明の抗体、ペプチド誘導体および結合体は、マクロファージのような宿主細胞によるオプソニン作用、補体結合、食作用および遊離のウイルス粒子の排泄を生じ得る。本発明のさらなる局面において、ウイルスは、感染および/または合胞体syncitia形成のために陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質を必要とするようである。本発明の抗体、ペプチド誘導体および結合体はさらに、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に対する結合によってウイルスのライフサイクルのこれらの局面をブロックし得る。前述の洞察に従って、そして本実施例に照らして、本発明についてのウイルス処置のスペクトルは、エンベロープの有無、DNAまたはRNAにかかわらず、任意のウイルスに拡大する。本発明の陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に結合する抗体、ペプチド誘導体および結合体は少なくとも部分的には、細胞の内側のウイルス複製をブロックし、そして/または細胞からのウイルスの逃避を防止するので、本発明はエンベロープのあるウイルスのみの処置にも任意の特定のウイルスにも限定されず、これは重要な利点である。例えば、本発明に引き続いて公開された研究によって、アネキシンVおよびPSのビヒクルがマクロファージのHIV-1感染を阻害し得るが、T細胞のHIV-1感染も他のウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルスGおよびアンホトロピックマウス白血病ウイルスも阻害できないということが報告されるCallahanら、2003。天然には、本発明の抗体、ペプチド誘導体および結合体は、エンベロープのあるウイルス上で、詳細には、PSおよびPEの、陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質を有するウイルスにおいて、エンベロープの外面上で作用し、ここでこの抗体、ペプチド誘導体および結合体は、ウイルスのクリアランスおよび/または標的細胞のウイルス進入の阻害を生じる。従って、本発明の重要な局面は、これが普遍的に適用可能であり、例えばバイオテロの一部として作製された、組み換えの、操作された、および合成のウイルスの処置に適切であるということである。実際、本発明は、動物およびヒトの処置には限定されない。ウイルス分類群において見出される宿主のカテゴリーとしては、藻類、古細菌、細菌、真菌、無脊椎動物、マイコプラズマ、植物、原生動物、スピロプラズマおよび脊椎動物が挙げられるので、本発明を用いて、農業で重要なウイルスを含む、任意のこのような設定におけるウイルス感染および複製を阻害することができる。脊椎動物におけるウイルス感染および関連の疾患の処置は現在好ましく、そして脊椎動物に感染する、表Hのウイルスのうちの任意の1つ以上が、本発明を用いて阻害され得、そして生じた感染が処置され得る。表H脊椎動物のウイルス哺乳動物におけるウイルス感染および関連に疾患を処置するのにおける本発明の使用が、詳細には貴重であるかまたは価値のある動物、例えば、競走馬および家庭用ペット、ならびにヒトの消費のための食品を直接生産するために例えば、肉または間接的に生産するために例えば、乳および卵用いられる動物および鳥類に関して、好ましい。ヒト処置に加えて、本発明の例示的な実施形態としては、ウマ、イヌ、ネコなどの処置;ウシ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、バイソン、ラマ、シカ、オオジカ、および他の大型動物、ならびに仔ウシおよび仔ヒツジを含む、その若齢動物の処置が挙げられる。天然に存在するウイルスについてか、またはバイオテロによって作製されるウイルスについてかにかかわらず、ヒトの処置は、特に好ましい。天然に存在するウイルスおよび生じた疾患に関して、本発明はここでもその適用において限定されない。従って、表Jにおけるウイルスの任意の1つ以上が本発明を用いて阻害され得、これによってその得られた感染および疾患が処置され得る。表Jヒトにおけるウイルス疾患本発明は詳細には、CMV関連疾患、例えば、ウイルス性肺炎、単球細胞症関連の先天性奇形難聴および精神遅延;気管支炎およびウイルス性肺炎、インフルエンザ、感冒およびSARSを含む、呼吸器疾患、例えばRSVによって生じる疾患;AIDS;肝炎;ウイルス感染に関連するガン;単球細胞症;および天然痘の処置における使用が考慮される。他の実施形態では、本発明者らは詳細には、ヒトにおいて病原性である、アレナウイルスの阻害を意図する。アレナウイルスとしては、ラッサ熱ラッサウイルスおよびリンパ球性脈絡髄膜炎LCMVの原因である旧世界ウイルスが挙げられる。ラッサ熱は、西アフリカにおいて風土性であって、1年に300,000人におよぶ人が罹患し、3000例に及ぶ死亡が生じる。ラッサ熱での感染は、約10日内で熱および倦怠感を生じる。腹部疼痛、悪心、嘔吐および下痢が一般的である。咽頭炎および咳も発症し得る。神経学的症状は一般に軽度である。さらに重篤な場合には、血管漏出症候群、例えば、浮腫および胸水が存在する。患者のほぼ四分の一で出血がみられる。この疾患は、心血管系の変化を生じ得、ついにはショックおよび死亡に至る。アレナウイルスはまた、アルゼンチン出血熱フニンウイルス、ボリビア出血熱マチュポウイルスおよびベネスエラ出血熱グアナリトウイルスの原因である、抗原的に異なる新世界ウイルスを含む、そのようなウイルスである。これらのウイルスの全てが、潜在的なバイオテロ兵器のCDCカテゴリーAのリストにある。アミノリン脂質または陰イオン性リン脂質とは関連しないが、ウイルスに結合する他の抗体が、承認薬へと直接開発された。これは、免疫抑制された患者においてCMV感染を抑制するために用いられるCytoGamについて、および呼吸器合胞体ウイルスから新生児を防御するために用いられるSynagisにあてはまる。従って、組織中のウイルスに接近して中和するモノクローナル抗体の使用には問題はない。抗腫瘍実施形態に適切な用量はまた、抗ウイルス処置に適切である。同様に、複数回の投与が慢性の感染に用いられ得、そして高用量が急性の感染に用いられ得る。ここでもガン処置局面に開示されるように、IV、IM、SC、肺または気道に対するエアロゾルとしてなど、を含む、任意の適切な経路の投与が使用され得る。本発明によって提供される治療剤は、広範なスペクトルの抗ウイルス活性を有する有用な因子である。多数の致命的なウイルスに対して有効であることに加えて、この因子はまた、ウイルスの正確な性質が未知である設定でさえ、ウイルスに対する曝露後に投与され得る。従って、本発明の抗ウイルス治療剤は、特定のワクチンの開発、生成または送達に伴う時間および費用とは著しく対照的に、病原体の同定と治療の送達との間に長時間を要さない。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。この実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分機能することが本発明者らによって発見された本発明の技術に従い、従ってその実施のために好ましい様式で構成されることが考慮され得るということが当業者に理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、多くの変化が、開示されている特定の実施例においてなされ得、さらには類似または同様の結果が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく獲得可能であるということを理解すべきである。実施例I抗VCAM-1-tTFコアグリガンドを用いた腫瘍処置本実施例は、腫瘍保有動物に対する腫瘍脈管標的化凝固因子コアグリガンドcoaguligandの投与後に生じるインビボにおける腫瘍脈管構造の特異的な凝固、および得られた抗腫瘍効果を示す。このコアグリガンドでは、VCAM-1血管内皮接着分子-1、VCAM-1に対する抗体を、腫瘍脈管構造に対して改変型のヒト凝固因子である短縮型組織因子truncatedTissueFactortTFを送達するための標的因子として用いる。マウスVCAM-1に対するラットIgG1抗体を分泌するMK2.7ハイブリドーマを、AmericanTypeCultureCollectionATCC,Rockville,MD;ATCCCRL1909から入手した。マウスウイルスタンパク質p30gagに対するラットIgG1抗体を分泌するR187ハイブリドーマをまた、ATCCから入手して、抗VCAM-1抗体についてのアイソタイプマッチングしたコントロールとして用いた。皮下のL540ヒトホジキン腫瘍を保有するマウス由来の主な器官および腫瘍の血管を、抗VCAM-1抗体を用いてVCAM-1発現について免疫組織化学的に検査した。陽性コントロールとして用いた抗エンドグリン抗体MJ7/18によって染色した総腫瘍血管のうち20~30で、全体的に、VCAM-1発現が観察された。腫瘍保有動物および正常動物の両方において、心臓および肺において、VCAM-1の構成的な血管発現が見出された。VCAM-1発現が厳密に血管外である精巣では、強力な間質染色が観察された。皮下のL540腫瘍を保有するマウスに、抗VCAM-1抗体を静脈内注射して、2時間後にこのマウスを放血させた。この腫瘍および正常な器官を取り出して、凍結切片を調製して、免疫組織化学的に検査して抗体の位置を決定した。抗VCAM-1抗体は、腫瘍、心臓および肺の内皮細胞で検出された。染色は特異的であった。なぜなら、内皮の染色は、無関係の特異性の種アイソタイプマッチングした抗体であるR187を注射したマウスの腫瘍および器官において観察されたからである。抗VCAM-1抗体の局在化は、精巣でも心臓および肺以外のどの正常な器官でも見出されなかった。抗VCAM-1tTF結合体またはコアグリガンドを、短縮された組織因子tTFを用いて調製した。抗VCAM-1tTFコアグリガンドの静脈内投与によって、腫瘍保有マウスにおいて、正常な組織における血管と対比して、腫瘍血管の選択的な血栓症が誘導される。0.4~0.6cmの直径の皮下L540腫瘍を保有するマウスに抗VCAM-1tTFコアグリガンドを投与した。コアグリガンド注射の前には、腫瘍は正常であって、均一な形態を有して壊死の領域はなかった。腫瘍は十分に血管新生されて、自発的な血栓症血管も出血も全くなかった。コアグリガンド注射の4時間内に、腫瘍血管のうち最初の染色はわずか20~30にもかかわらず、40~70の血管が血栓症になった。血栓症になった血管は、閉塞性の血小板凝集体、充填された赤血球およびフィブリンを含んだ。いくつかの領域では、血管は、腫瘍間質内に破裂した流出している赤血球を有した。コアグリガンド注射の24時間後まで、血管は閉塞されたままであって、過度の出血が腫瘍全体にわたって広がった。腫瘍細胞は、お互いから分離され、濃縮された核を有し、そして細胞溶解を被った。72時間まで、進行した壊死が、腫瘍全体にわたって明白であった。最初のコアグリガンド誘導性トロンビン沈着は、中枢の血管におけるVCAM-1標的抗原の誘導の増大をもたらし、これによって標的化および腫瘍破壊の増幅が得られる可能性が高い。腫瘍血管上での抗VCAM-1tTFの血栓性作用は、抗原特異的である。等量で投与したコントロール試薬ではtTF単独、抗VCAM-1抗体単独、tTFに加えて抗VCAM-1抗体または無関係な特異性のコントロールのコアグリガンド血栓を生じなかった。腫瘍血管の血栓に加えて、本研究によってまた、抗VCAM-1tTFコアグリガンドの静脈内投与が、正常な器官で血管の血栓を誘導しないことが示される。正常なマウスまたはL540腫瘍保有マウスの心臓および肺における血管でのVCAM-1の発現にかかわらず、抗VCAM-1tTFコアグリガンド投与後に血栓は生じなかった。4時間前でも24時間前でも、5~45μgのコアグリガンドを注射した25匹のマウスでは、血栓、組織障害、形態の変化の兆候はどれも見られなかった。同じマウス由来の心臓および肺の正常な組織学的外見は、大きい腫瘍血栓を有した。全ての他の主な器官脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、小腸、精巣もまた、形態の変化を有さなかった。コアグリガンド処置マウス由来の器官および腫瘍の凍結切片は、抗TF抗体10H10、または抗ラットIgG抗体のいずれで発色した場合でも同時発生的な染色パターンを有し、これによってこのコアグリガンドが心臓、肺および腫瘍における血管に局在することが確認された。染色の強度は、コアグリガンドが高濃度で直接切片に適用され、続いて抗TFまたは抗ラットIgGのいずれかでの発色された場合に見られるものと同じであって、このことは結合の飽和がインビボで保持されていたことを示した。これらの研究によって、心臓および肺における正常な脈管構造でのVCAM-1に対するコアグリガンドの結合は、血栓を誘導するほど有意ではないこと、そして腫瘍脈管構造は、コアグリガンドを支持するためのさらなる因子を提供することが示される。0.3~0.4cm3のL540腫瘍を保有するSCIDマウスにおいて、抗VCAM-1tTFコアグリガンドの抗腫瘍活性を決定した。4日の間隔で静脈内に3回、この薬物を投与した。抗VCAM-1処置したマウスの平均腫瘍容積は、他の全ての群に比較して21日の処置で有意にP<0.001低下した。特定のコアグリガンドで処置した全部で15匹のマウスのうち9匹が、腫瘍容積の50より大きい低下を示した。この効果は特異的であった。なぜなら、未結合のtTF、コントロールIgGコアグリガンド、ならびに遊離の抗VCAM-1抗体およびtTFの混合物は腫瘍増殖に影響しなかったからである。実施例II腫瘍血管上のホスファチジルコリン発現心臓および肺におけるVCAM-1陽性脈管構造上の抗VCAM-1tTFの血栓性効果の欠失を説明するために、正常な血管と腫瘍血管との間の異なるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えば、PSおよびPEの局在化という本発明者らの発展させた概念を確認した。詳細には、彼らは、正常な組織における内皮細胞が、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えばPSおよびPEを、原形質膜のリン脂質二重相の内面に分離して、ここでPSは血栓性反応に関与することができないが;一方、腫瘍の内皮細胞は、原形質膜の外面に対してアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を転位させ、ここでPSはコアグリガンドの凝固作用を支持し得るという仮説をたてた。細胞表面でのPS発現によって、凝固が可能になる。なぜなら、PS発現によって、膜に対する凝固因子の結合が可能になり、凝固開始複合体のアセンブリが協調されるからである。腫瘍血管内皮細胞の表面に対するアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質転位の本発明者らのモデルは、本明細書において開発されたとおり、PS発現が細胞死の後に生じず、そして必然的に細胞死を誘発しないという点で驚くべきである。従って、腫瘍上皮細胞表面でのアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発現は、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えばPSおよびPEが、治療介入のための標的可能な実体として機能することを可能にするのに十分安定である。腫瘍血管内皮細胞が、原形質膜の管腔表面上でPSを発現するという仮説を確認するために、本発明者らは、以下の免疫組織化学研究を用いて、L540腫瘍保有マウスへの静脈内注射後の抗PS抗体の分布を決定した。A.方法両方ともマウスのモノクローナルIgM抗体である、抗PS抗体および抗カルジオリピン抗体を、実施例IVに記載のとおり、Roteら1993、本明細書において参考として援用されるによって生成して、特徴付けした。3SBの主な反応性はPSとの反応であるが、3SBはまた、正常な細胞における内部小葉部分に緊密にやはり分離される原形質膜の比較的少ない成分である、陰イオン性リン脂質、ホスファチジン酸との反応性も有する。L540腫瘍保有マウスに、抗PSまたは抗カルジオリピンマウスIgM抗体のいずれか20μgをiv注射した。10分後、マウスを麻酔して、その血液循環をヘパリン処理した生理食塩水で灌流させた。腫瘍組織および正常組織を取り出して、急速凍結させた。器官および腫瘍の連続切片を、抗PS抗体の検出のためにHRP標識抗マウスIgMを用いるか、または抗VCAM-1抗体、続いてHRP標識抗ラットIgを用いて染色した。凍結された切片上で膜リン脂質を保存するために、以下のプロトコールを開発した。2.5mMCa2を含有するDPBSを用いて動物を灌流させた。組織を3-アミノプロピルトリエトキシシランでコーティングしたスライド上に装填して、24時間染色した。スライドの固定にも洗浄にも、有機溶媒、ホルムアルデヒド、界面活性剤は用いなかった。2.5mMCa2および0.2ゼラチンを含有するDPBSによってスライドを再水和した。同じ溶液をまた用いて、切片を洗浄して過剰の試薬を除去した。HRP標識した抗マウスIgMを用いて、室温で3.5時間切片をインキュベートして、抗PSIgMを検出した。B.結果この免疫組織学研究によって、抗PS抗体は、VCAM-1を欠き得る腫瘍の中央領域の血管を含むほとんどの腫瘍血管に10分以内で局在したことが示された。VCAM-1が陽性であった血管はまたPSについても陽性であった。従って、腫瘍におけるVCAM-1発現血管上ではPSの同時発現が存在する。インビボの局在化研究において、心臓および肺のVCAM-1陽性脈管構造を含む正常な器官では染色された血管はなく、このことは内皮細胞の外部表面からはPSが欠けていることを示す。対照的に、正常な組織および腫瘍の切片をインビトロで抗PS抗体を用いて直接染色した場合、正常な組織と腫瘍、内皮または他の細胞タイプとの間には相違はみられず、このことはPSがこれらの細胞内に存在するが、腫瘍の内皮細胞の表面でのみ発現されたことを示す。PS検出の特異性は、2つの独立した研究によって確認された。第一に、示差的に負に荷電された脂質、カルジオリピンに対するマウスIgMモノクローナル抗体は、インビボで腫瘍にもどの器官にも存在しなかった。第二に、アセトンを用いた凍結切片の事前処置は、おそらく結合した抗PS抗体と一緒に脂質を抽出したという理由によって、抗PS抗体を用いた染色を無効にした。実施例IIIアネキシンVはコアグリガンド活性をブロックする。本実施例によって、インビトロおよびインビボにおけるPS機能をブロックする、高い親和性のPS結合リガンド、アネキシンVを用いる研究から、コアグリガンド活性における表面PS発現の役割のさらなる証拠が得られる。A.アネキシンVは第X因子のインビトロでのコアグリガンド活性化をブロックするアネキシンVがコアグリガンドによって誘導される第Xa因子形成に影響を与える能力を、色素生産性アッセイによって決定した。IL-1α刺激したbEnd.3細胞を、抗VCAM-tTFとともにインキュベートし、そしてサポニンで透過化処理した。アネキシンVを、0.1~10μg/mlの範囲の濃度で添加し、そして細胞を、希釈したProlexTの添加前に30分間インキュベートした。アネキシンVの存在下または非存在下で生成した第Xa因子の量を、決定した。各処置を2連で行い、そして少なくとも2回繰り返した。コアグリガンド作用における表面PS発現の必要性はさらに、アネキシンVこれは、高親和性でPSに結合するが、bEnd.3細胞に結合される抗VCAM-1tTFがインビトロで第Xa因子を生成する能力をブロックするという本発明者らの発見によって示される。抗VCAM-1tTFとともにプレインキュベートされた、透過化処理された細胞に添加されたアネキシンVは、用量依存性様式で第Xa因子の形成を阻害した図3。アネキシンVの非存在下で、細胞結合コアグリガンドは、60分、10,000細胞あたり95ngの第Xa因子を産生した。漸増量のアネキシンV1mlあたり1μgの範囲での添加は、第Xa因子の産生を阻害した。1mlあたり10μgでは、アネキシンVは、第Xa因子の産生を58阻害した。アッセイの間のアネキシンVの濃度の増加によるさらなる阻害は観察されず、このことは、アネキシンVが、1mlあたり10μgで全ての利用可能な結合部位を飽和したことを示す。B.:アネキシンVはインビボでコアグリガンド活性をブロックするアネキシンVのインビボでコアグリガンド誘導性血栓症を阻害する能力を、L540ホジキン腫保有SCIDマウスにおいて試験した。腫瘍を、上記の実施例IIに記載のようにマウスにおいて増殖させた。1群あたり2匹のマウス直径0.5cmの腫瘍サイズを、以下の試薬のいずれか1つで尾静脈を介して静脈内注射した:a生理食塩水;b100gのアネキシンV;c40μgの抗VCAM-1tTF;d100μgのアネキシンV、続いて2時間後に40μgの抗VCAM-1tTF。最後の注射の4時間後、マウスを麻酔し、そしてヘパリン化生理食塩水で灌流した。腫瘍を取り出し、4ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、そしてヘマトキシレン-エオシンで染色した。血栓が形成された血管および血栓が形成されていない血管の数を計数し、そして血栓の割合を算出した。アネキシンVはまた、インビボでの抗VCAM-1tTFコアグリガンドの活性をブロックする。腫瘍保有マウスの群を、方法に記載の通りに、コントロールまたは試験試薬の1つで処置した。マウスに以下を与えた:a生理食塩水;b100gのアネキシンV;c40μgの抗VCAM-1tTFコアグリガンド;またはd100のアネキシンV、続いて2時間後に40μgの抗VCAM-1tTFコアグリガンド。同一の結果が、1群あたり両方のマウスで得られた。自発的な血栓、出血または壊死は、生理食塩水を注射したマウス由来の腫瘍において観察されなかった。アネキシンV単独での処置は、腫瘍形態を変更しなかった。本明細書中で示される他のデータによれば、40μgの抗VCAM-1tTFコアグリガンドは、全腫瘍血管の70において血栓を生じた。血管の大部分は固まった赤血球および血餅で閉塞し、そして腫瘍細胞は互いに分離した。コアグリガンド誘導性抗腫瘍効果すなわち、静脈内血栓および腫瘍細胞形態における変化の両方は、マウスをアネキシンVで前処置することによって完全に消失した。これらの知見は、コアグリガンドの抗腫瘍効果が、腫瘍脈管構造の妨害によって媒介されることを確認する。これらのデータはまた、PSが、インビボでのコアグリガンド誘導性血栓に必須であることを実証する。実施例IVアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体の生成本実施例は、腫瘍血管内皮細胞におけるアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の転位に対するその観察に照らして、本発明者らによって設計された、そしてアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の転位に対する抗体の生成において十分に機能するように開発された、免疫プロトコールを記載する。アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質、例えばPSおよびPEと反応性の多数の抗体が得られた。本実施例および以下の実施例において、簡便性のために、PSと反応性の抗体を抗PS抗体anti-PSantibodyと命名してもよいが、特定のこれらの抗体の結合はPSには限定されず、本明細書に示されるような特定の他のアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に拡大される。A.免疫プロトコールさらに強力な免疫原として免疫系にアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を提示するために、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を、アミノリン脂質陽性細胞および陰イオン性リン脂質陽性細胞として処方した。他の膜成分によって囲まれる、膜に挿入されたアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質は、抗体を惹起するためのさらに良好な構成およびクリアランス速度を有する。この意図は、この例ではPSで例示されるようなアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質を発現する自家の細胞を用いて免疫コンピテントな動物を免疫することであって、ここでこの動物は、全ての自己表面抗原に対して抗体を生成しないが、膜露出リン脂質、例えばPSを外来の要素として認識する。この手順は、任意のアミノリン脂質陽性細胞および陰イオン性リン脂質陽性細胞を用いる、任意の標準的な実験動物、例えば免疫コンピテントなBALB/cマウスおよびルイスLewisラットの使用に適用可能である。BALB/cマウスおよびマウス内皮細胞bEnd.3不死化マウスBALB/c株内皮細胞を最初に選択した。10CO2インキュベーター中で、9ml/500mlHEPES緩衝液を含有する10DMEM中でbEnd.3を培養した。所望の細胞が得られるまで、bEnd.3細胞をT175TCフラスコ中で増殖させた。代表的には、各々のフラスコは、約70~80コンフルエンスで、約3×106個の細胞を有し、そして各々のマウスには、1×106個~20×106個の細胞、1×107個におよぶ細胞をあたえなければならない。bEnd.3細胞を50μM~200μMの過酸化水素を用いて1または2時間37°Cで処理して、免疫の前に陰イオン性リン脂質、例えばPSを曝す。H2O2のストックは、[9.8M];30v/vである。これを1:1000に希釈して、次いで0.4mlを、40mlの培地を含むT175TCフラスコ中に100μMのH2O2の最終濃度まで添加する。細胞を37°Cで1時間維持した。回収のために、細胞を、暖かいPBS10mMEDTAを用いて3×洗浄して、培地中の全てのBSAまたは血清タンパク質を除いた。穏やかなトリプシン処理によって細胞を取り外して、洗浄し、1000rpmで5分間遠心分離した。この上清を吸引して、適切な容積まで添加することなく細胞をDMEMに再懸濁して各々のマウスは約1×107個の細胞を含む200μlを投与される、氷上で保持した。この方式で処理した細胞を、1mlのシリンジおよび23ゲージの針を用いて各々のマウスの腹腔内に注射した200μlの細胞懸濁液。3~4週間の間隔で3~7回マウスを免疫した。第二のブースト追加免疫から開始して、各々のブーストの10日後、マウスを放血することによって免疫血清を収集した。抗PSについての血清力価をELISAによって試験した。自家のPS陽性細胞を用いたこれらの免疫では、自己抗体の非制限的な産生は生じなかったが、PSと反応性であるか、他のアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質と組み合わせてPSと反応性である抗体の産生に限定された。別の研究では、200μMの過酸化水素を用いて2時間処置したbEnd.3内皮細胞を用いて雌性のルイスLewisラットを免疫した。この処置によって、125I標識されたアネキシンVによって検出した場合、70~90の細胞において外面に対する陰イオン性リン脂質の転位が生じた。処置した細胞を洗浄して脱離させて、カウントした。2百万個の細胞を滅菌PBSに再懸濁して、注射の間、3週間の間隔で5回腹腔内注射した。陰イオン性リン脂質に対するポリクローナル抗体の力価を、各々の免疫の2日後に決定した。B.高力価の抗血清陰イオン性リン脂質、例えばPSと反応性の抗体の極度に高い力価を有するマウスを得た表1。マウスは、なんら毒性の兆候を示さなかった。この免疫プロトコールは、ラット全体よりもマウスで有効であったが、ラットの免疫は、有効であって、9D2抗体が産生された以下を参照のこと。表1抗PSIgG抗体生成さらなる免疫において、種々のマウスを、過酸化水素処理bEnd.3細胞を用いて3回免疫して、その血清を最初の免疫の54日後に試験した。血清内のPSと反応性のIgG抗体を、抗マウスIgG、Fc特異的二次抗体を用いて検出して、血清内のIgM抗体を抗マウスIgGμ特異的二次抗体を用いて検出した。PSと反応性のIgGおよびIgM抗体を有する多数の有効な抗血清を、この免疫プロトコールを用いて得たが、そのうちIgG抗体を有する抗血清が一般に有効であった。これらの方法をここで用いて、例えば、以下に記載の3G4抗体との効率的な競合についてスクリーニングされた抗PS抗体を含む、さらなる特定の抗PS抗体を生成することができる。代表的には、PSについての所望の抗血清のIgG力価が200,000を上回ったが、PC力価は50,000未満である場合、モノクローナル抗体を生成するために融合が実施され得る。また、これらの方法は、H2O2を用いた最初の細胞処置に限定されない。なぜなら、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発現を誘導する他の方法が用いられてもよいからである。例えば、TNFおよびアクチノマイシDでの処置は、別の有用な方法である。1例では、サブコンフルエント約85コンフルエンスのbEnd.3細胞を、10ng/mlのマウスTNFおよび1μg/mlのアクチノマイシンDを用いて37°Cで16時間、インキュベーター中で処置した。次いで、上記の概要のような免疫手順を通じて細胞を採取した。C.IgGおよびIgMモノクローナル抗体免疫した動物由来の脾細胞とミエローマパートナーP3X63AG8.653細胞ATCC,Rockville,MDとを融合することによってハイブリドーマを得た。腫瘍処置において有用なモノクローナル抗体を調製するための本発明者らの技術の重要な局面は、選択ストラテジーであり、これはアミノリン脂質または陰イオン性リン脂質に結合するが、中性のリン脂質には結合しない抗体を選択するためのスクリーニングの工程を包含する。別の重要な局面は、血清の非存在下で、血清の存在下と同様に強力に、PSコーティングしたプレートに結合する抗体を選択することである。これは、抗リン脂質症候群を生じるかまたはそれに寄与すると考えられる、PSおよび血清タンパク質の複合体を認識する抗体を排除するために行なわれる。例えば、PSと反応性のモノクローナル抗体を単離するためのストラテジーは、抗マウスIgG、Fcγ特異的二次抗体を用いて、PSコーティングプレート上のハイブリドーマ上清をスクリーニングする工程を包含した。スクリーニングを最初に、4つのリン脂質PS,ホスファチジルセリン;PE、ホスファチジルエタノールアミン;CL、カルジオリピン;およびPC、ホスファチジルコリンならびにbEnd3細胞に対して行なった。中性のリン脂質、PCと反応性のクローンを、bEnd3細胞と非反応性のクローンと同様に破棄した。高い結合の抗PSクローンを選択した。PSのみに反応性、またはPSについて強力な優先度を有するウェルを最初にサブクローニングして、他の陰イオン性リン脂質に対する結合と組み合わせたPS反応性を示すウェルを二番目にサブクローニングした。以下の特定の研究においては、Roteら1993によって記載されたように生成された3SB、D11およびBA3と命名されたマウスモノクローナルIgM抗体もまた含まれた。3SB抗体は、抗PS抗体としてその文献に記載されて、D11抗体は、抗カルジオリピン抗CL抗体としてその文献に記載される。これらの抗体の生成および特徴づけの詳細は、Roteらによって報告された1993,参考として本明細書に援用される。本発明者らによって生成される各々の選択されたハイブリドーマのアイソタイプを決定した。IgGクラスの抗体は、代表的には高い親和性、インビボでの低いクリアランス速度、ならびに精製、改変および取り扱いの簡便性を含む、IgMを上回る多くの利点を有するので、それらの生成が特に所望される。相同なIgGアイソタイプを有するウェルに集中するため、IgMまたは異なるIgの混合物を含むウェルを破棄するかまたは再クローニングした。高度に陽性のクローンのサブクローニングを3~4回繰り返した。ELISAによって決定される、代表的なIgGおよびIgM抗体のアイソタイプを表2に示す。本発明者らは、3G4に対する称号を変更する前に3G4抗体F3-G4と最初に命名した。これは、生物学的材料におけるいかなる変化も反映しない。抗体の血清依存性または非依存性も、表2に記載される。表2抗PS抗体のアイソタイプおよび血清依存性D.ELISAプロトコールおよびモノクローナル抗体特徴づけ抗体をELISAによってさらに研究して、3SBおよびD11と比較した。本研究で用いた抗PSELISAは以下のとおり行なう。特別な相違が特定されない限り、これが本出願の研究全体を通じて用いたELISAの形式である。抗原PSを用いるELISAを例示する2.5mlのボトル中に、P-664125mg10mg/ml溶媒はクロロホルム:MeOH95:5。同じプロトコールを用いて、他のリン脂質を用いてもよい。PSまたは他のリン脂質のストック溶液を、アリコートにして、気密容器に-30°Cで保管しなければならない。好ましい96ウェルプレートは、DynatechU底Immulon1DynatechLabs,カタログ番号011-010-3550である。本明細書において用いられる標準的なブロッキング緩衝液は、PBSに溶解した10ウシ血清である。他のブロッキング溶液は適切であるが、界面活性剤はブロックおよび洗浄溶液から排除されなければならない。一次抗体は試験サンプルまたは混合物である。好ましい二次抗体はヤギ、抗マウスIgG-HRPである。発色溶液は、10mlの0.2MNa2PO4、10mlの0.1Mクエン酸、OPDの10mgの錠剤1つ、および10μlの過酸化水素である。停止溶液は0.18MH2SO4である。このプロトコールは、以下のようにPSを用いて96ウェルプレートをコーティングする工程を必要とする:PSストック溶液をn-ヘキサン注で10μg/mlまで希釈してよく混合する。各々のウェルに50μlを添加して、これを1時間エパポレートさせる。200μlの10血清または他のブロッキング緩衝液を各々のウェルに加えて、カバーして、室温で2時間、または4°Cで一晩維持する。PBSを用いてプレートを3回洗浄する。一次抗体ブロッキング緩衝液中で希釈を添加して、37°Cで2時間インキュベートする。PBSを用いて3回洗浄する。100μl/ウェルの二次抗体代表的には、ヤギ、抗マウスIgG-HRPまたは他の適切な二次抗体を添加して、37°Cで1時間インキュベートする。PBSを用いてプレートを3回洗浄する。各々のウェルに100μlの発色溶液を添加することによってELISAを発色させて、10分間発色させ、次いで、各々のプレートに100μlの停止溶液を加えて、O.D.を490nmで読みとる。以下の結果は、9D2、1B12、3G4および1B9について示している。PSについてのこれらの抗体の親和性を確認して、3SBに対して比較した。新規な抗体の特定の相対的な親和性は3SBに比較してかなり改善されている表3。表3抗PS抗体の相対的親和性1組織培養上清の希釈に基づく;捕獲抗体として抗マウスまたはラットIgのいずれかを用いるサンドイッチELISAによって、IgGおよびIgMの濃度を決定した。全てのクローンが平均10~15μg/mlのIgを分泌する。2変換のために用いたMW:IgM-900kDa、IgG-150kDa、アネキシンV-36kDa3PSに対するアネキシンVの親和性は、0.1nM~1nMの範囲である。この表における値は、抗PS抗体についてと同じELISA条件を用いてストレプトアビジン-HRPによって検出された市販のビオチン化アネキシンVの結合に相当する。抗体の特異性は、以下のリン脂質を用いてコーティングしたプレートを用いるELISAによって決定された:PS、ホスファチジルセリン;PE、ホスファチジルエタノールアミン;PI、ホスファチジルイノシトール;PA、ホスファチジン酸;PG、ホスファチジルグリセロール;PC、ホスファチジルコリン;CL、カルジオリピン;およびSM、スフィンゴミエリン。3SBおよびD11に比較した、9D2、1B12、3G4および1B9の特異性プロフィールを表4に示す。表4抗PS抗体のリン脂質特異性1>という記号は、同一の抗体濃度で試験した種々のリン脂質に対する結合における少なくとも2倍の相違を示す。2>>という記号は、同一の抗体濃度で試験した種々のリン脂質に対する結合における少なくとも10倍の相違を示す。1B9、2G7および7C5という抗体は、本質的に同じく挙動する。これらの抗体は、PSのみを認識して、PSに対する結合について血清または血清タンパク質を要する。種々のリン脂質に対する1B9、2G7および7C5の結合を、10ウシ血清の存在下でのみアッセイしたが、他の抗体の結合は、血清の有無のいずれかにおいて試験した。1B9、2G7および7C5以外の抗体については、血清の存在は、特定のリン脂質に対する結合における優先度を変化させない。3G4、3B10および9D2を含む後者の群は、血清の非存在下でPSに対する結合の好ましい特性を有する。3SB抗体は、血清の有無においてインタクトな細胞上のPSを認識する。3SBの主な反応性はPSとの反応であるが、これはまた、原形質膜の比較的わずかな成分であるホスファチジン酸との反応性を有するHinkovska-Galchevaら、1989。3SBは本質的に、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトール、ならびにホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンとの反応性を欠く表4。PSは、原形質膜の最も豊富な陰イオン性リン脂質であって、正常な条件下で正常な細胞において原形質膜の内部小葉に厳密に隔離される。PSはアミノリン脂質である。PEはまた、アミノリン脂質であるが、PEは天然であって陰イオン性ではない。中性のアミノリン脂質であるよりも、PEはPSと同様に挙動して、正常には原形質膜の内部小葉に厳密に隔離される。PIは、原形質膜の別の主な陰イオン性リン脂質であって、これはさらに正常な条件下では正常な細胞における内部小葉構造に厳密に隔離される。PAおよびPGは、原形質膜のわずかな陰イオン性リン脂質であって、これも通常は内部小葉構造に隔離される。CLは、ミトコンドリア膜に存在する陰イオン性リン脂質であって、代表的には原形質膜には存在しない。PCおよびSMは、原形質膜の、コリン含有の中性のリン脂質である。PCおよびSMの各々は、正常な条件下では外部の小葉構造に主に局在する。正常な血管と腫瘍血管との間の示差的なアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発現についての本発明者らのモデルを踏まえて、選択されたプロトコールを用いて開発された抗体で、中性のリン脂質、PCおよびSMと反応したものはなかった。1B9抗体は、PSと特異的であったが、9D2、1B12および3G4は、表4に示される優先度で陰イオン性リン脂質およびアミノリン脂質に結合した。9D2抗体も実施例VIに記載される。実施例V外面化したホスファチジルセリンは腫瘍血管の全体的なマーカーである。本実施例によって、PSの露出がマウスにおいて増殖する10個の異なる固体腫瘍の各々について内皮細胞上で生じ、実施例IIに記載されるL540腫瘍モデルには限定されないことが示される。インビボにおける外面化したPSは、種々のタイプのヒトおよびマウスの腫瘍を保有するマウスへPSに対するモノクローナル抗体を静脈内注射することによって検出された。抗PS抗体は、全ての10個の異なる腫瘍モデルにおいて血管内皮に特異的に結合することが示される。同じマウス由来の正常な器官における血管内皮は染色されなかった。アイソタイプマッチしたコントロールモノクローナル抗体は、腫瘍細胞または正常細胞のいずれにも局在しなかった。アポトーシス性細胞がまた免疫組織化学的に同定されたが、ここで腫瘍における極めて少数の内皮細胞がアポトーシスのマーカーを発現した。従って、本実施例によって、腫瘍における血管内皮細胞はPSを外面化するが、正常な血管はPSを外面化しないことが示される。露出したPSを有するほとんどの腫瘍内皮細胞はアポトーシスを起こさなかった。従って、PSは、腫瘍脈管構造の豊富でかつ利用しやすいマーカーであって、腫瘍血管画像化および治療について用いることができる。A.L540、H358およびHT29腫瘍これらの研究で用いた抗PS抗体は、3SBと命名されたマウスモノクローナルIgM抗体だった実施例IV、Roteら、1993。3SBは、主にPSに結合するがまた、PSのような分布を有する比較的わずかな陰イオン性リン脂質であるPAとも反応する。用いた抗CL抗体は、D11と命名されたマウスモノクローナルIgM抗体であった実施例IV、Roteら、1993。腫瘍または正常な血管内皮でのPS露出は最初に、3つの動物腫瘍モデルで試験された:L540ヒトホジキンリンパ腫、NCIH358ヒト非小細胞肺ガンNSCLCおよびHT29ヒト結腸直腸ガン。インビボで腫瘍を増殖させるため、2×106個の細胞を、SCIDマウスの右脇腹に注射して、腫瘍を0.8~1.2cmの直径にさせた。大きい腫瘍約800mm3を超える容積を保有するマウスに、20μgの抗PSまたは抗CL抗体のいずれかを、尾静脈を介して静脈内注射した。注射の1時間後、マウスを麻酔して、その血液循環を、ヘパリン処理した生理食塩水で灌流させた。腫瘍および正常な器官を取り出して、凍結切片の調製のために急速凍結した。ヤギ抗マウスIgMμ特異的-HRP結合体、続いてカルバゾールでの発色を用いてマウスIgMを検出した。1切片あたり少なくとも10個の無作為な領域を×40の倍率で検査して、陽性血管の平均割合を算出した。抗PS抗体は、マウスIgMの検出によって示されるとおり、インビボで3つの腫瘍全てHT29、L540およびNCI-H358の脈管構造に特異的に存在した。この最初の研究では、腫瘍における染色された血管の平均割合は、HT29について80、L540について30、そしてNCI-H358について50であった。腫瘍の全ての領域における血管が染色され、小さい毛細管および大きい血管の両方が染色されていた。どの正常組織においても抗PS抗体での血管染色は観察されなかった。腎臓では、尿細管は抗PSおよび抗CLのレシピエントの両方で染色されて、これはこの器官を通じたIgMの分泌に関連する。抗CL抗体は、腎臓以外のどのような腫瘍組織または正常組織においても検出されなかった。これらの知見によって、腫瘍内皮のみが原形質膜の外部にPSを露出させることが示される。B.小さいおよび大きいL540腫瘍膜の内面に対してPSを隔離する能力を腫瘍脈管構造が失う時点を推定するため、140~1600mm3の容積におよぶL540腫瘍において、抗PS局在化を検査した。マウスをその腫瘍サイズに応じて3つの群に分けた:140~300、350~800および800~1,600mm3。小さいL540腫瘍300mm3までを保有する3匹のマウスでは抗PSAbは検出されなかった。抗PSAbは、中間のサイズのL540腫瘍の群において5匹のうち3匹の動物に、そして大きいL540腫瘍を保有する全てのマウスにおいて4匹中4匹局在した表5。全てのPS陽性血管の割合汎内皮マーカーMeca32によって同定されるは、L540中間群において10~20であって、大きいL540腫瘍の群において20~40であった表5。表5中間および大きいサイズの腫瘍において検出されたPS外面化L540Cy腫瘍を保有するマウスを、腫瘍サイズに応じて3つの群に分割した。20μgの抗PS抗体を静脈内注射して、1時間循環させた。抗マウスIgMペルオキシダーゼ結合体を用いて凍結切片でマウス抗体を検出した。†汎内皮AbMeca32を用いて血管の総数を決定した。PS陽性およびMeca陽性の血管を腫瘍の1断面あたり4領域でカウントした。同じ群内のPS陽性血管の範囲を示す。C.L540、H358、HT29、Colo26、B16および3LL腫瘍同じ抗PS3SB抗体および抗CLD11抗体を用いて、腫瘍および正常血管内皮上のPS露出を、さらなる3つの動物腫瘍モデル全部で6つを用いるさらなる研究において試験した:L540ヒトホジキンリンパ腫、NCIH358ヒト非小細胞肺ガンNSCLC、HT29ヒト結腸直腸ガン、Colo26マウス結腸ガン、B16マウス黒色腫、および3LLマウス肺腫瘍。これらの研究では、SCIDマウスにおいて腫瘍を皮下で増殖させて、0.4~0.7cm3の容積にさせた。1群あたり3匹以上のマウスを用いた。抗PSまたは抗CLマウスIgM抗体30μg/マウスを含む200μlの生理食塩水を静脈内注射した。30分後、このマウスを屠殺して、放血して、その血液循環をヘパリン処理した生理食塩水で灌流させた。ほとんどの器官および腫瘍を回収して、凍結切片の調製のために急速凍結した。ヤギ抗マウスIgMμ特異的HRP結合体を用い、続いてカルバゾールを用いた発色によって、マウスIgMを検出した。腫瘍の連続切片を、マウス血管の汎内皮マーカーに対するモノクローナル抗体MECA32を用いて染色した。PS陽性血管を形態学的に、そして抗マウスIgMおよびMECA32での同時染色によって同定した。1切片あたり少なくとも10の無作為な領域1領域あたり0.317mm2を、2つの独立した観察によって盲検的に検査した。PSについて陽性に染色したMECA32陽性血管の割合を算出した。各々のタイプの3つの腫瘍を、各々2つの別の研究において検査した。平均値および標準誤差SEを算出した。各々の群における総血管数およびPS陽性血管数の腫瘍間の変動は約10であった。この研究の6つの腫瘍全てがPS陽性血管を有した表6。3SBによるPSの検出は、特異的であった。なぜなら、抗CL抗体を用いては腫瘍内皮の染色は観察されなかったからである表6;図1。抗PSまたは抗CL抗体の血管局在化は、腎臓以外の正常な器官では観察されなかった抗PSおよび抗CLレシピエントの両方における尿細管染色は、この器官を通じたIgMの分泌を反映する。表6腫瘍血管に対する抗PS抗体の特異的局在化この結果は、1領域の0.317mm2あたりのMECA32染色された血管のうちのPS陽性血管の平均±SE割合として示される。各々のタイプの6つの腫瘍を解析した。1領域の0.317mm2あたりのMECA32陽性血管の平均数は、それぞれL540、H358、HT29、B16、3LLおよびColo26腫瘍について25、21、17、18、27および22±10の血管であった。†非抗原特異的尿細管染色は、抗PSおよび抗CLレシピエントの両方で可視であった。これらの研究では、PS陽性血管の割合は、Colo26腫瘍での10からB16腫瘍での40に及んだ。抗PSIgMは、腫瘍の全ての領域において毛細血管および細静脈の内腔表面に存在した。PS陽性血管は、壊死および壊死の周囲の領域において特に一般的であるようである。陽性の血管は一般に形態学的異常を示さなかったが、これは光学顕微鏡によって明らかになった。壊死領域にたまたま局在した血管は、悪化の形態学的兆候を示した。抗PS抗体ただし抗CL抗体ではないはまた、壊死性およびアポトーシス性の腫瘍細胞に局在した。これらの制御された研究によって、PSは種々の腫瘍において血管内皮の内腔表面に一貫して露出されるが、正常な組織には露出されず、そして腫瘍脈管構造発現はモデル特異的ではないことが実証される。D.PS陽性腫瘍血管のほとんどがアポトーシス性ではない。二重標識技術を用いて、腫瘍切片におけるアポトーシス性内皮細胞を同定した。内皮細胞を、汎内皮的な細胞マーカーであるMECA32を用いて同定した。2つの独立したマーカー:瀕死の細胞における細胞質の変化を同定する、カスパーゼ3の活性フォームKrajewskaら、1997、および核変化を有する細胞を同定する、断片化されたDNAGavrieliら、1992を用いてアポトーシス細胞を免疫組織化学的に同定した。ウサギ抗カスパーゼ3特異的抗体RD、Minneapolis,MN、続いてアルカリホスファターゼに結合体化された抗ウサギIgGAP,Pierce,Rockford,ILとのインキュベーションによって、活性なカスパーゼ3を検出した。他の腫瘍切片を、検出試薬として抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合体を用いて、TunelアッセイApopTagTMキット、Oncor,MDによって解析した。切片をアポトーシスマーカーピンクおよび内皮細胞マーカー、MECA32褐色について二重に染色した。内皮細胞およびアポトーシス細胞のマーカーが同時に存在する場合、両方の色が同じ細胞で明白に可視であった。6つのタイプの腫瘍のうち5つHT29、H358、B16、Colo26、L540において、内皮細胞は、いずれのアポトーシスマーカーも示さなかった表7。腫瘍のうち6番目のタイプである3LLは、壊死の領域に局在した2~3のアポトーシス内皮細胞を示した。対照的に、アポトーシス悪性細胞は、全てのタイプの腫瘍において共通であった。アポトーシス腫瘍細胞の割合は、L540腫瘍における1~2から3LL腫瘍における12.6~19.6に及んだ。表7腫瘍におけるアポトーシスマーカーの発現カスパーゼ-3またはTunelのいずれかについて陽性であった腫瘍細胞または腫瘍血管の割合を、1切片あたり10倍大きいパワーで決定した。この分野を、腫瘍の中央を通じて端部から2つの垂直方向にそって無作為に選択した。6匹のマウス由来の腫瘍における陽性の細胞または血管の割合の平均±SEを示す。†3LL腫瘍の壊死領域に時折存在する血管100を超える内の1は、アポトーシスの両方のマーカーを示した。E.MDA-MB-231およびMethA腫瘍腫瘍血管内皮細胞上でのPS露出をまた、マウスで増殖しているMDA-MB-231ヒト乳房腫瘍において、および皮下で増殖しているマウスMethA線維肉腫において検査した。これらの研究において用いた抗体は、実施例IVに記載のように生成された、9D2抗体であって、これは陰イオン性リン脂質と反応性である。実施例VIに詳細に記載されるように、9D2は、L540、NCI-H358およびB16腫瘍における腫瘍血管に、そしてSCIDマウスの乳腺脂肪パッドにおいて同所性に増殖しているMDA-MB-231乳房腫瘍のモデルおよび皮下で増殖しているマウスMethA線維肉腫に局在した。9D2は、全ての5つの腫瘍において腫瘍血管に局在した。腫瘍における血管内皮細胞は、別個の膜染色を示した。9D2抗体はまた、壊死およびアポトーシス性腫瘍細胞の膜および細胞質に局在した。9D2抗体の血管局在は、試験された10個の正常な器官のうち9個で観察されなかったが、ここでは腎臓における尿細管の非特異的染色が観察された。二重染色研究も実施したが、ここでは同所性MDA-MB-231乳房腫瘍を保有するマウスにビオチン化した9D2抗体を静脈内注射して、その後に凍結した切片を後にFITC結合体化MECA32を用いて染色した実施例VI。MECA32陽性血管のうち約40が9D2に結合した。F.MD-MBA-435腫瘍さらなる乳ガンモデルにおいては、腫瘍血管内皮上のPS露出を、マウスで増殖しているMDA-MB-435ヒト乳ガン細胞中で検査した。これらの研究で用いた抗体は、3G4抗体のキメラバージョンch3G4である。3G4抗体生成は実施例IVに記載され、そしてキメラ3G4抗体の生成は、実施例XIXに詳細に記載される。MDA-MB-435モデルにおける腫瘍血管内皮に対するch3G4の局在化は、実施例XIXにさらに詳細に記載されており、図22に示される。要するに、腫瘍をMD-MBA-435細胞を用いて樹立して、キメラ3G4抗体のビオチン化バージョンおよび無関係の特異性のコントロールIgGを投与した。腫瘍切片をCy3結合体化ストレプトアビジンで染色してビオチン化タンパク質を検出した。MECA32抗体に続いてFITCタグ化抗ラットTgG二次抗体を用いる二重染色を行なって、血管内皮を検出した。この検出方法は、赤および緑を用いてビオチン化タンパク質および血管内皮細胞を標識して、その結果、内皮細胞に結合したビオチン化タンパク質は、集束型converged画像で黄色にみえる図22。この研究によって、腫瘍脈管内皮細胞に対するキメラ3G4抗体の特異的な局在化が示された。G.RIP-タグ腫瘍10番目のモデルについて、腫瘍血管内皮に対するPSの露出を、多段階の発現のRIP-TagトランスジェニックマウスモデルRIP1-Tag2において検査した。このトランスジェニックマウスモデルでは、あらゆるマウスが、インスリン産生β細胞におけるSV40T抗原Tagガン遺伝子の発現の結果として12~14週齢までに膵臓の島腫瘍を発症する。腫瘍は、過剰増殖性島から多段階で発症して、悪性に進行するには血管形成性の切り替えを要する。マトリックスメタロプロテイナーゼ9が血管形成切り替えを制御するREF。UCSFの病理学の教授であるDonaldMcDonald博士と共同してRIP1-Tag2モデルにおいて、9D2局在化研究を行なった。全てのマウスが小さい高度に血管新生された固体腫瘍を有する場合、9D2を、10週齢で開始してRIP1-Tag2マウスに静脈内注射した。厚い80μm腫瘍切片の二重染色を実施して、腫瘍および正常な膵臓に局在した9D2およびCD31を同定した。膵臓腫瘍における血管の約50CD31陽性が、局在化した9D2を有したが、正常な島における血管は染色されなかった。コントロールラットIgMを注射されたマウスが有した腫瘍血管の染色は弱くかつまれであった。内皮細胞をこえる血管外組織への9D2およびコントロールラットIgMのある程度の漏出がまた出現した。従って、本実施例によって、腫瘍中の血管内皮細胞がその管腔表面にPSおよび陰イオン性リン脂質を外面化して、ここでそれらはインビボにおいて抗PS抗体によって結合され得ることが確認される。PSは、正常組織における血管内皮細胞の外面には欠けており、このことはPS認識抗体、アネキシンVおよび他のリガンドが、固体腫瘍における血管の選択的画像化または破壊のための細胞毒性薬物、凝固剤および放射性核種を送達するために用いられ得ることを示す。PS陽性腫瘍内皮細胞は、ほとんどの部分について、この研究で用いられる腫瘍において生存可能であると考えられた。これは、アポトーシスのマーカーを示さず、これは、VCAM-1、Eセレクチンおよび他の急速に代謝されたタンパク質の発現によって示されるとおり、形態学的にインタクトであってかつ代謝的に活性である。アポトーシスの指標としてしばしばみなされるが、PS露出は、悪性細胞Raoら、1992、Utsugiら、1991活性化血小板Roteら、1993、ならびに種々の段階の遊走、細胞間質浸潤および融合の胚性トロホブラストAdlerら、1995を含む、いくつかのタイプの生存細胞において、観察されている。細胞死に対するPS露出とコミットメントとの間の関係がないことはまた、プロアポトーシス刺激の除去後にPSの非対称性および増殖を正常に修復するプレアポトーシス性Bリンパ球細胞上で示されているHammillら、1999。正常な生存細胞において、PS露出はおそらく、細胞へのCa2フラックスを誘導するリガンド-レセプター相互作用のような表面事象によって誘発されるDillonら、2000。Ca2フラックスは、スクランブラーゼを活性化してZhaoら、1998、アミノリン脂質転位酵素を同時に阻害するComfuriusら、1990。腫瘍血管上のPSは、いくつかの理由のためにガン画像化または治療についての標的として魅力的である:PSは豊富である1細胞あたり約3×106個の分子;PSは腫瘍内皮細胞の管腔表面にあり、これは血液中の血管標的化因子による結合について直接利用可能である;PSは、多様な固体腫瘍において腫瘍内皮細胞のうち高い割合で存在し、PSは、今まで試験された全ての正常組織における内皮細胞には欠けている。従って、腫瘍脈管構造上の未結合の抗体、血管標的因子およびPSに対する画像化剤は、ヒトでのガンの検出および処置のために用いることができる。実施例VI陰イオン性リン脂質を腫瘍血管の表面上に露出させる。陰イオン性リン脂質は、正常な条件下で、哺乳動物細胞の原形質膜の外部小葉からはほとんど欠けている。例えば、細胞表面上のホスファチジルセリンの露出が、アポトーシス、壊死、細胞損傷、細胞活性化および悪性転換の間に生じる。本実施例は、陰イオン性リン脂質に対して結合する特定の抗体および天然のリガンドの両方の局在化によって実証されるとおり、陰イオン性リン脂質がインビボにおいて腫瘍脈管構造上で上方制御されることを示す。陰イオン性リン脂質を特異的に認識するモノクローナル抗体9D2を、種々の同所性または異所性の腫瘍を保有するマウスに注射した。他のマウスには、陰イオン性リン脂質に結合する天然のリガンドであるアネキシンVを投与した。9D2およびアネキシンVの両方は、全ての腫瘍における血管内皮に、そしてまた壊死の領域中のおよびその周囲の腫瘍細胞に特異的に局在した。腫瘍血管において15~40の内皮細胞が染色された。正常な内皮細胞では局在化は検出されなかった。腫瘍の微小環境に存在することが公知の種々の要因および腫瘍関連状態を、9D2およびアネキシンV結合によって判定されるように、培養された内皮細胞における陰イオン性リン脂質の露出を生じる能力について試験した。低酸素/再酸素化、酸性度、トロンビンおよび炎症性サイトカインは全てが陰イオン性リン脂質の露出を誘導した。過酸化水素もまた強力な誘導因子であった。炎症性サイトカインおよび低酸素/再酸素化との併用処置によって相加作用よりも大きい効果が得られた。従って、インビボにおける腫瘍内皮上の陰イオン性リン脂質の実証された露出は、サイトカインおよび反応性酸素種による傷害および活性化によって生じる可能性が高い。この機構にかかわらず、陰イオン性リン脂質は、腫瘍血管標的化、画像化および治療について現在用いることができる腫瘍血管のマーカーである。A.材料および方法1.材料Na125Iは、AmershamArlingtonHeights,ILから入手した。ダルベッコ改変イーグル組織培養培地、およびCa2およびMg2を含有するダルベッコPBSをGibcoから入手したGrandIsland,NY。ウシ胎仔血清をHycloneLogan,Utahから入手した。L-α-ホスファチジルセリン、L-α-ホスファチジルコリン、カルジオリピン、L-α-ホスファチジルエタノールアミン、L-α-ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、O-フェニレンジアミン、過酸化水素およびトロンビンをSigmaSt.Louis,MOから入手した。24ウェルの平底プレートをFalconBectonDickinsonおよびCo.,LincolnPark,NJから入手した。組み換え肝細胞増殖因子HGFまたは散乱因子およびアクチノマイシンDは、CalbiochemSanDiego,CAからであった。組み換えマウスインターロイキン-1α、βおよび腫瘍壊死因子αTNFαを、RDSystemsMinneapolis,MNから購入した。ユニバーサルタイプIUniversalTypeIのインターフェロン全てのタイプのインターフェロンの代わりになるハイブリッドタンパク質をPBLBiomedicalLaboratoriesNewBrunswick,NJから購入した。組み換えのヒト血管内皮増殖因子121VEGF、ヒト血小板由来増殖因子-BB、インターロイキン-6IL-6、インターロイキン-8IL-8、インターロイキン-10IL-10およびヒト線維芽細胞増殖因子-2FGF-2をPeproTechRockyHill,NJから購入した。2.抗体MECA32、汎マウス内皮細胞抗体は、Dr.E.ButcherStanfordUniversity,CAから入手して、免疫組織学的研究のための陽性コントロールとして用いた。この抗体の詳細は公表されているLeppinkら、1989。西洋ワサビペルオキシダーゼHRPに結合体化したウサギ抗ラット免疫グロブリン二次抗体、ラット抗マウス免疫グロブリン二次抗体、ならびにヤギ抗マウス二次抗体および抗ラット二次抗体は、DacoCarpinteria,CAまたはJacksonImmunoreserarchLabsWestGrove,PAのいずれかから購入した。これらの研究で用いた9D2抗体は、実施例IVに記載されたように生成した。9D2は、陰イオン性リン脂質と反応性のラットモノクローナル抗体である。9D2のリン脂質特異性のさらなる特徴付けは、本実施例の結果の節に記載される。3.細胞末期の疾患を有する患者由来のL540Cyホジキンリンパ腫細胞は、V.Diehl教授Koeln,Germanyから提供された。NCI-H358ヒト非小細胞肺ガンは、AdiGazdar博士SouthwesternMedicalCenter,Dallas,TXから提供された。MethAマウス線維肉腫およびMDA-MB-231ヒト乳ガンは、AmericanTypeCellCollectionRockville,MDから入手した。マウス脳内皮腫株bEnd.3は、WernerRisau教授MaxPlankInstitution,Munich,Germanyから提供されて、10FBSを有するDMEM中で維持した。成体ウシ大動脈内皮ABAE細胞は、CloneticsSanDiego,CA;Walkerville,MDから購入した。ABAE細胞は、10血清および2ng/mlのbFGFを含有するDMEM中で維持した。4.組織培養bEnd.3,ABAE細胞およびL540Cyリンパ腫以外の全ての腫瘍細胞を、10ウシ胎仔血清、2mML-グルタミン、2単位/mlペニシリンGおよび2μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。L540Cy細胞は、同じ添加物を含むRPMI1640中で維持した。細胞を週に1回継代培養した。0.2EDTAを含有するPBSにおいて0.125トリプシンを用いてbENd.3細胞のトリプシン処理を行なった。インビトロ研究については、24ウェルプレートにおいて1mlの培養培地に10×103細胞/mlの密度で内皮細胞を播種して、アッセイでの使用の前に48~96時間インキュベートした。各々の研究の24時間前に培地を再生した。5.プラスチック固定リン脂質との反応性リン脂質をn-ヘキサンに50μg/mlの濃度まで溶解した。この溶液の100μlを96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えた。空気中の溶媒のエバポレーション後に、このプレートを、2mMCa2を含有するDPBSに溶解した10ウシ胎仔血清結合緩衝液を用いて2時間ブロックした。初期濃度6.7nMで、10血清の存在下において結合緩衝液中で、9D2抗体またはアネキシンVを希釈した。連続2倍希釈物をプレート中で調製した1ウェルあたり100μl。次いで、このプレートを室温で2時間インキュベートした。このプレートを洗浄して、それぞれHRPに対して結合体化したヤギ抗ラットIgMおよびウサギ抗ヒトアネキシンVによって、続いてHRPに結合体化されたヤギ抗ウサギIgGによって全て1:1000希釈、9D2およびアネキシンVを検出した。色素生産性の基質OPDを用い、続いてマイクロプレートリーダーMolecularDevices,PaloAlto,CAを用いて490nmでプレートを読み取ることによって、二次試薬を検出した。9D2抗体結合の特異性を、無関係の特異性のコントロールのラットIgMPharmingen,SanDiego,CAを用いることによって確証した。Ca2依存性であるリン脂質に対するアネキシンV結合の特異性を、5mMEDTAを含有するDPBS中に試薬を希釈することによって決定した。さらなる陰性コントロールは、0.2の界面活性剤Tween20を含有する結合緩衝液を用いてプレートを洗浄する工程から構成された。この処置によって脂質を抽出して、これによってプラスチックに吸着されたリン脂質を除去する。9D2抗体もアネキシンVも、界面活性剤で洗浄したプレートには結合しなかった。6.培養された内皮細胞の表面上の陰イオン性リン脂質の検出内皮細胞が約70コンフルエンスに達するまで内皮細胞を増殖させた。PS露出を誘導するために、細胞をH2O2200μMを用いて37°Cで1時間処置した。コントロールのスライドおよび処置したスライドをCa2およびMg2含有DPBSを用いて洗浄して、同じ緩衝液に希釈した0.25グルタルアルデヒドで固定した。50mMのNH4Clとの5分間のインキュベーションによって過剰なアルデヒド基をクエンチした。リン脂質の検出に対する界面活性剤および有機溶媒の効果を試験するために、いくつかのスライドをアセトンを用いるか5分、または1v/vTritonTMX-100を含有するPBSを用いてプレインキュベートした。細胞をDPBSCa2、Mg2および0.2w/vゼラチン含有を用いて洗浄して、1μg/mlのビオチン化アネキシンVPharmingen,SanDiego,CAとともに、または1μg/mlの9D2抗体とともにインキュベートした。インキュベーションの2時間後、細胞を0.2ゼラチン緩衝液とともに洗浄して、ストレプトアビジン-HRP1:500希釈とともにインキュベートした。無関係の特異性のラットIgMおよびストレプトアビジン単独を、これらの研究における陰性コントロールとして用いた。全ての工程を室温で行なった。O-フェニレンジアミン0.5mg/mlおよび過酸化水素0.03w/vを含有するクエン酸-リン酸緩衝液、pH5.5を添加することによってHRP活性を測定した。15分後、100μlの上清を96ウェルプレートに移して、100μlの0.18MH2SO4を添加して、その吸光度を490nmで測定した。あるいは、PS陽性細胞をカルバゾール基質の添加によって検出して、不溶性の赤褐色の沈殿を得た。各々の研究を、二連でかつ少なくとも2回繰り返して行なった。7.リン脂質に対する9D2およびアネキシンV結合のリポソームによる阻害リン脂質認識の特異性をさらに、種々のリポソームを用いた競合アッセイによって確認した。リポソームを、5mgの単一のリン脂質を含有するクロロホルムの溶液から調製した。この溶液を窒素下で乾燥して、丸底ガラスフラスコ中に薄層を形成させた。次いで、10mlのTris緩衝液0.1M、pH7.4を添加して、フラスコを2分間に5回超音波処理した。9D2またはアネキシンV6.66nMを200μg/mlのリポソーム溶液とともに室温で1時間プレインキュベートした。この混合物をリン脂質コーティングしたプレートまたは内皮細胞単層に加えた。異なるリポソームの有無において固定されたリン脂質または細胞表面に対して9D2が結合する能力を上記のように決定した。8.固定されたPSに対する結合についての9D2およびアネキシンVの競合10倍モル過剰のN-ヒドロキシスクシンイミドビオチンSigma,MOを用いて精製されたタンパク質を室温で1時間インキュベートすることによって、ビオチン化9D2抗体およびアネキシンVを調製した。遊離のビオチンをPBSに対する透析によって除去した。ビオチン化手順は、いずれのタンパク質のPS結合能力も損なうことはなかった。競合研究について、未改変のタンパク質およびビオチン化タンパク質を10倍モル過剰の未改変のタンパク質と事前混合した。次いで、この混合物をPSコーティングプレートに加えた。結合した試薬を、1:1000に希釈されたストレプトアビジン-HRP結合体によって検出した。競合物の非存在下での各々の試薬のPSへの結合を100値として採用した。9.皮下移植された腫瘍の増殖局在化研究のために、2×107個のL540ヒトホジキンリンパ腫細胞または他の腫瘍タイプの1×107個の細胞をSCIDマウスCharlesRiver,Wilmington,MAの右脇腹に皮下注射した。腫瘍を0.4~0.7cm3の容積まで到達させた。1群あたり最小3匹の動物のを用いた。研究を少なくとも3回繰り返した。10.ヒトMDA-MB-231乳ガンの同所性モデル雌性のnu/nuマウスまたはSCIDマウスをCharlesRiverから購入した。MDA-MB-231ヒト乳腺ガン細胞を、公表されたプロトコールPrice,1996に従って乳腺脂肪パッドに移植した。要するに、マウスを麻酔して外胸部にわたって皮膚に5mmの切開を作製した。乳腺パッドを露出させて、0.1mlの生理食塩水に再懸濁した1×107個のMDA-MB-231細胞の注射のための正確な部位を確認した。11.インビボにおける腫瘍保有マウスにおける陰イオン性リン脂質の検出9D2またはアネキシンVが凍結組織の切片に直接付与される免疫組織化学技術では、原形質膜の内部小葉構造と外部小葉構造との上の陰イオン性リン脂質の間が識別されない。外部に位置するリン脂質を検出するために、本質的に以前に記載されたような方法を行なった実施例V;Ranら、1998。腫瘍保有SCIDマウスに、50μgの9D2もしくはビオチン化9D2抗体、または100μgのビオチン化アネキシンVのいずれかを静脈内注射した。60分後にマウスを屠殺して、その血液循環を放血して、以前に記載されたようにヘパリン処理生理食塩水を用いて灌流させたBurrowsら、1992。全ての主な器官および腫瘍を回収して、凍結切片の調製のために急速凍結させた。切片を10血栓含有PBSでブロックした。スライド処理の間のリン脂質の損失を妨げるために、界面活性剤および有機溶媒をブロッキング緩衝液および洗浄緩衝液から除外した。ヤギ抗ラットIgMμ特異的-HRP結合体を用い、続いてカルバゾールまたはDABを用いた発色によって、ラットIgMを検出したFriesら、1993。HRPに結合体化されたストレプトアビジンによってビオチン化試薬を検出した。生理食塩水または無関係の特異性のラットIgMを注射したマウス由来の腫瘍切片を陰性コントロールとして使用した。さらなるコントロールは、1Triton溶液またはアセトン中で10分間、スライドをインキュベートする工程から構成された。これらの処置によってリン脂質が抽出される。これらの条件下でシグナルを検出した。1つの強拡大視野あたりの陽性血管の数を×100の倍率で決定した。1切片あたり少なくとも10の視野を試験して、陽性の血管の平均割合を算出した。9D2またはアネキシンVの存在下におけるこの方法による切片の染色によって、インビボにおいて試薬による結合に利用可能な外面化した陰イオン性リン脂質を有する細胞を検出する。12.PS陽性腫瘍血管の同定および定量局在化した9D2抗体またはアネキシンVを有する構造を、DAB染色した切片上の形態学的外観によって、および凍結組織の連続切片上の汎内皮細胞マーカーMECA32を用いた同時染色によって、血管として同定した。腫瘍の連続切片においてMECA32、9D2またはアネキシンVによって染色した血管をカウントすることによって、DAB染色した切片上の定量を行なった。9D2抗体、コントロールラットIgMまたはアネキシンVを注射した6匹のマウス由来の各々の腫瘍タイプの6つのスライドを試験した。1切片あたり少なくとも10個の無作為の視野1視野あたり0.317mm2を、2人の独立した観察者によって、盲検的にスコア付けした。9D2、アネキシンVまたはMECA32によって染色された血管の平均数および標準誤差を算出した。各々の腫瘍タイプ群において決定した9D2またはアネキシンVの陽性血管の平均数を、同じ腫瘍群におけるMECA32陽性血管の平均数と比較した。9D2またはアネキシンV陽性血管の割合を算出した。さらなる研究において、MDA-MB-231腫瘍0.3~0.7cm3の容積を保有するマウスに、50μgのビオチン化9D2、コントロールIgMまたはアネキシンVを静脈内注射した1群あたりマウス6匹。ビオチン化試薬を最初にストレプトアビジン-Cy3結合体とともにインキュベートして、PBS中で洗浄し、次いでMECA32抗体、その後にFITCタグ化抗ラットIgG二次抗体とともにインキュベートした。それぞれ、Cy3赤およびFITC緑蛍光について適切なフィルターでとった単一の画像をデジタルカメラによって撮影して、コンピューターに送信した。黄色融合された緑および赤の蛍光の結果を示す10個の無作為の視野1視野あたり0.317mm2の画像を、Metaviewソフトウェアの補助によって重ね合わせた。同じ方法を用いて、コントロールラットIgMまたは生理食塩水を注射したマウス由来の腫瘍を解析した。9D2またはアネキシンVが局在化した血管の割合を以下のように算出した:1視野あたりの黄色の血管の平均数を緑の血管の平均数総数で割って100を掛ける。B.結果1.9D2抗体およびアネキシンVのリン脂質特異性9D2抗体は、ELISAにおいて、特異的に陰イオン性リン脂質PS、PA、CL、PI、PGを認識して、中性のリン脂質PE、PCおよびSMとは有意な反応性を有さなかった図2A;表8。ELISAにおけるリン脂質に対する9D2の結合の強度の順序は、PA>PS=CL>PG=PIであった。結合は抗原特異的であった。なぜなら無関係の特異性であるいくつかのコントロールラットIgMでは結合は観察されなかったからである。ELISAプレートに吸着された任意の陰イオン性リン脂質に対する9D2の結合は、任意の陰イオン性リン脂質から調製されたリポソームによってブロックされたが、任意の中性のリン脂質から調製されたリポソームによってはブロックされなかった。aFridrikksonら、1999から採用した総リン脂質の割合。割合は異なる細胞タイプについて変化し得る。アネキシンVはまた、陰イオン性リン脂質に結合したが、その結合はアネキシンVが中性のリン脂質であるPEにも強力に結合するという点で9D2の結合よりも特異性が劣った。ELISAにおけるリン脂質に対するアネキシンVの結合の強度の順序は、PI>PS=PE=PA=CL>PGであった表8。アネキシンVについてのこれらの知見は、初期のデータと一致するAndreeら、1990。9D2の結合は、5mMEDTAの存在によっては影響されず、このことはこの結合には陰イオン性リン脂質に対する結合にCa2を要さないことを示した。対照的に、陰イオン性リン脂質に対するアネキシンの結合は、陰イオン性リン脂質またはPEに対する結合についてCa2に対するその公知の依存性から予想されるように、5mMEDTAの存在下で無効にされたSchlaepferら、1987;BlackwoodおよびErnst,1990。9D2もアネキシンVも、リン脂質でコーティングされているELISAプレートに結合せず、そのため0.2Tween含有生理食塩水で洗浄され、それらの結合が吸着されたリン脂質に対したものであったことが確認された。9D2およびアネキシンVは、ヘパリンにも、硫酸ヘパランにも、または二本鎖もしくは一本鎖のDNAにも検出可能には結合しなかった。2.9D2抗体およびアネキシンVは、PSに対するお互いの結合を交差ブロックしなかった9D2抗体およびアネキシンVがPSに対する結合について競合するか否かを試験するために、PSコーティングしたプレート上でビオチン化タンパク質を用いて、交差ブロック研究を行なった。ビオチン化9D2抗体およびアネキシンVの結合を、それぞれ10倍モル過剰の未改変9D2およびアネキシンVによってブロックした表9。しかし、未改変のアネキシンVは、ビオチン化9D2がPSプレートに対して結合する能力に影響しなかった。同様に、未改変の9D2抗体の添加は、ビオチン化アネキシンVがPSプレートに対して結合する能力に影響しなかった表9。aアネキシンVまたは9D2抗体は、ビオチン化試薬を10倍モル過剰上回って事前混合された。マイクロタイタープレート上のPSに対するビオチン化試薬の結合を、ストレプトアビジン-HRPによって検出した。b競合物の非存在下でのビオチン化試薬の反応性を100とした。三連の決定の平均値を示す。SDは、平均値の10未満であった。これらの結果によって、9D2抗体およびアネキシンVが、PSコーティングプレートに対するお互いの結合を交差ブロックしないことが示される。なぜなら9D2抗体およびアネキシンVはPS分子上の異なるエピトープを認識するか、またはプラスチック上に吸着されたPSの異なる構成を認識するからである3.細胞表面上に外面化された陰イオン性リン脂質に対する結合細胞表面に対する9D2抗体およびアネキシンVの結合を、マウスbEnd.3内皮細胞またはウシABAE細胞を用いて試験した。9D2もアネキシンVも、静止条件下でいずれの細胞タイプの非透過性単層にも結合しなかった。このことは、原形質膜の陰イオン性リン脂質のほとんどが細胞質ドメインに対して正常に隔離されることを示す。対照的に、内皮細胞の90~100においてアポトーシスを生じる条件下で細胞をTNFαおよびアクチノマイシンDとともにプレインキュベートした場合、強力な染色が観察された。9D2およびアネキシンVが細胞表面上のリン脂質に結合されたことを確認するために、H2O2処置したbEnd.3細胞を、種々の競合するリポソームの有無において9D2抗体またはアネキシンVとともにインキュベートした。陰イオン性リン脂質は、それらが毒性濃度未満100~200μMのH2O2を用いて事前処置された場合に、非アポトーシス性の生存可能なbEnd.3細胞上に露出されたRanら、2002。H2O2処理されたbend.3細胞に対する9D2抗体の結合は、陰イオン性リン脂質を含むリポソームによって阻害されたが、中性のリン脂質を含むリポソームによっては阻害されなかった図3。細胞に対する9D2結合の阻害の大きさは、プラスチック固定されたリン脂質を用いて得られた結果に極めて一致して、PA>PS>CL>PG>PIの順で変化した図2Aおよび図2B。同様に、H2O2処置した細胞に対するアネキシンVの結合は、PS、PA、PE、CLならびに、それより低い程度ではPIおよびPGを含むリポソームによってブロックされた。SMまたはPCを含むリポソームは、プラスチック固定されたリン脂質を用いて得られた結果と全く一致して、細胞に対するアネキシンV結合をブロックしなかった。これらの結果によって、H2O2処置された内皮細胞における陰イオン性リン脂質に9D2が結合するが、アネキシンVは陰イオン性リン脂質に加えてPEに結合することが確認された。4.インビボにおける細胞上で外面化した陰イオン性リン脂質の検出9D2またはアネキシンVが凍結組織の切片に直接加えられる、直接免疫組織化学技術では、原形質膜の内部小葉構造および外部小葉構造の上の陰イオン性リン脂質の間は識別されない。外側に位置するリン脂質を検出するために、9D2およびアネキシンVを腫瘍保有マウスに静脈内注射して、腫瘍血管に対する局在化を直接免疫組織化学によって決定した。種々のタイプの固体腫瘍を保有するマウスに、9D2抗体またはビオチン化アネキシンVを静脈内注射して、その1時間後に屠殺して、その腫瘍および正常な組織を取り出して、凍結切片を調製した。組織の凍結切片を切断して、HRP標識抗ラットIgMを用いるか、HRP標識化ストレプトアビジンを用いて染色して、注射後にどの細胞に9D2およびアネキシンVが結合したかを決定した。血管を形態学的に、そして連続切片上の汎内皮細胞抗体MECA32によるその陽性の染色から同定した。5.腫瘍保有マウスにおける9D2抗体およびアネキシンの体内分布9D2抗体およびアネキシンVは、この研究に含まれた5つ全ての腫瘍において腫瘍血管に局在した図4;表10。腫瘍は以下であった:SCIDマウスの乳腺脂肪パッドにおいて正所性に増殖しているヒトMDA-MB-231乳ガン;皮下で増殖しているヒトL540ホジキン腫瘍;皮下で増殖しているヒトNCI-H358NSCLC;皮下で増殖しているマウスB16黒色腫、および皮下で増殖しているマウスMethA線維肉腫。a腫瘍保有マウスにおける9D2抗体およびラットIgMコントロールの局在を、抗体50μgの注射、生理食塩水を用いてマウスの血液循環を灌流させること、および抗マウスIgMペルオキシダーゼ結合体を用いることにより組織の切片上で抗体を検出することによって決定した。1領域0.317mm2あたりのMECA32染色血管のPS陽性血管の平均±SE割合として結果を示す。各々のタイプの6つのサンプルを解析した。1領域0.317mm2あたりのMECA32陽性血管の平均数は、それぞれ、MDA-MB-231、L540cy、H358、B16およびMethA腫瘍について23、25、21、18および19±10の血管であった。bアネキシンVの局在化は、ビオチン化アネキシンV注射と、それに続くストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ結合体を用いる凍結切片上での検出によって決定された。c非抗原特異的尿細管染色は、9D2およびコントロール抗体レシピエントの両方で可視であった。9D2およびアネキシンVは、本質的に同じパターンの染色を示した。腫瘍血管に対する9D2抗体の局在化は特異的であった。なぜなら腫瘍内皮の染色が無関係な特異性のラットIgMで観察されなかったからである。おそらく、腫瘍血管外へのコントロールラットIgMの漏出がある程度まで生じるが、血管外のIgMの染色は、間接的な免疫組織化学によって識別するには拡散しすぎているかまたは弱すぎた。9D2抗体またはアネキシンVの血管局在化は、試験した10個の正常な器官のうち9つでは観察されなかった表10。腎臓では、抗原特異的ではないと考えられる尿細管の染色が観察された。おそらくは尿細管を通したIgMまたはその代謝物の分泌のおかげで、この器官は9D2およびコントロールラットIgMレシピエントの両方で染色された。生理学的な血管形成の部位である卵巣は試験しなかった。9D2およびアネキシンV陽性血管の割合は、MDA-MB-231腫瘍における40からH358腫瘍における15に及んだ。陰イオン性リン脂質陽性血管は、腫瘍の全ての領域における毛細管および血管の管腔表面に存在したが、特に壊死の領域およびその周辺では優勢であった。ほとんどの陰イオン性リン脂質陽性血管は、光学顕微鏡によって明らかである形態学的異常を示さなかった。まばらに存在する血管、詳細には壊死領域に位置する血管は、悪化の形態学的兆候を示した。9D2抗体およびアネキシンVはまた、壊死細胞およびアポトーシス腫瘍細胞に局在したが、コントロールIgMの局在化は検出不能であった図4。これらの知見によって、陰イオン性リン脂質は、種々の腫瘍における血管内皮細胞の管腔表面に存在するが、正常な組織には存在しないことが実証される。6.二重染色研究正所性MDA-MB-231乳房腫瘍を保有するマウスにビオチン化9D2抗体、ビオチン化コントロールIgMまたはビオチン化アネキシンVを静脈内注射した二重染色研究を行なった。1時間後、マウスを屠殺して、その腫瘍を取り出して、凍結切片を切断した。次いで腫瘍切片をCy3結合体化ストレプトアビジンを用いて染色して、ビオチン化タンパク質を検出し、FITC結合体化MECA32を用いて染色して血管内皮細胞を検出した。この検出方法では赤および緑によってビオチン化タンパク質および血管内皮細胞を標識した。ビオチン化タンパク質が内皮に結合した場合、集束型画像convergedimageは黄色になる。これらの研究では、ビオチン化9D2およびアネキシンVはほとんどが、血管内皮に結合するようであった。なぜならそれらの染色パターンは、MECA32の染色パターンに収斂したからである。間接的な免疫組織化学によって得られた結果と極めて一致して、約40のMECA32陽性血管が9D2およびアネキシンVに結合した。腫瘍間質へのビオチン化タンパク質の漏出は、二重染色で検出されたが、それは間接的な免疫組織化学によっては明らかではなかった。ビオチン化タンパク質は、血管のうちわずか約5の周囲の血管内皮の外側に見出された。無関係の特異性のビオチン化ラットIgMを注射されたマウス由来の腫瘍において、ビオチン化IgMはまた、血管のうちほぼ同様の割合約5の周囲の腫瘍間質に漏出したが、ほとんどは血管内皮によって結合されないようであった。おそらく、二重染色技術によって検出されるが、ただし間接的な免疫組織化学技術によっては検出されない、血管外遊出した9D2およびアネキシンVの検出は、過去の技術のさらに大きい感度、および2つの染色パターンが比較され得るさらに大きい精度を反映する。注射されていないコントロール腫瘍は、ストレプトアビジン-Cy3によって完全に染色され、このことは赤い蛍光が局在化されたタンパク質に相当することを示す。実施例VII腫瘍環境における陰イオン性リン脂質膜転位腫瘍血管内皮細胞に固有のインビボ表面マーカーとしてのアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質の発見によって、このような分子の転位および外膜発現に対する腫瘍の微小環境の効果をさらに検討するように本発明者らは促された。本実施例は、腫瘍内の条件を模倣する特定の条件に対して細胞内皮をインビトロで暴露することによって、インタクトな生存可能な細胞において、初期に観察されたアミノリン脂質および陰イオン性リン脂質表面発現が再現されることを示す。A.材料および方法1.アネキシンVのヨウ素化組み換えヒトアネキシンVは、ET12a-Panionicリン脂質1プラスミドUniversityofWashington,SeattleのJ.Tait博士から入手で形質転換したE.coliから精製した。タンパク質の純度およびPSに対する結合を、それぞれSDS-PAGEおよびPSコーティングされたプラスチックで確認した。ウサギポリクローナル、アフィニティー精製抗アネキシンV抗体を用いてPSに結合したアネキシンVを検出した。アネキシンVは、Bocci1964によって記載されたとおりクロラミンTを用いて125Iで放射性標識した。比活性は、Brandfordアッセイ1976で測定した場合、タンパク質1μgあたり約1×106cpmであった。2.内皮細胞処置表11に挙げた濃度のサイトカインまたは増殖因子を用いて内皮細胞を処置した。全ての試薬を10の血清を含む培地中で希釈して、細胞とともに37°Cで24時間インキュベートした。低酸素の効果を研究するため、細胞を24ウェルプレートに播種して、48時間、加湿した正常酸素雰囲気21O2、5CO2中でインキュベートさせ、その後に密閉したチャンバBillupsRothenbergInc.,DelMar,Ca中で加湿した低酸素雰囲気1O2、5CO2、94N2に移した。細胞を低酸素チャンバにおいて37°Cで24時間インキュベートして、次いで37°Cで正常酸素環境に4時間戻した。この細胞を同一継代からの平行培養と比較して、同じ日に播種して、完全に正常酸素条件下で維持した。いくつかの研究において、低酸素チャンバに移す前に、IL-1α10ng/mlおよびTNFα20ng/mlを培地に加えた。酸性微小環境の効果を試験するために、必要量のHClを用いて種々のpH7.3から6.2の間におよぶに調節した、重炭酸塩を欠く増殖培地に細胞を曝露させた。CO2の非存在下で37°Cで細胞をインキュベートした。培養の24時間の間、培養培地が割り当てられたpHを保持することを確認した。これらの実験条件は、ウシまたはマウスの内皮細胞のいずれにも毒性ではなく、付着した単層の細胞形態学にも生存度にも影響を有さなかった。3.125I標識したアネキシンVによる培養内皮細胞上でのPSの検出上記の試薬を用いた処置後に、処置した細胞およびコントロール細胞を、7.1ピコモルの125I標識アネキシンV200μl/ウェルを含有する結合緩衝液とともにインキュベートした。室温での2時間のインキュベーション後、細胞を徹底的に洗浄して、0.5MのNaOHに溶解した。0.5mlの全体容積をプラスチックチューブに移して、ガンマカウンターでカウントした。5mMEDTAの存在下で非特異的結合を決定して、実験値から差し引いた。その結果を、1×106個の細胞について正規化した、細胞結合したアネキシンVの正味のピコモルとして表現した。アクチノマイシンDおよびTNFα各々の成分の50ng/mlで同時にい処置した細胞上で、アネキシンVの最大結合を決定した。以前に報告されたとおり、これらの因子は、内皮細胞のうち90~100でアポトーシスおよびPS露出を生じるLucasら、1998。未処置の細胞に対する125IアネキシンVの基礎的な結合を、10血清を含む培地の存在下で決定した。未処置の培養物に結合した125IアネキシンVの量を、処置した培養物における量から差引きした。PSの露出を以下の式に従って算出した:実験条件下の細胞結合アネキシンVピコモルを最大アネキシンV結合ピコモルで割り、100を掛けた。各々の研究を二連で行い、少なくとも3回行なった。平均値を算出した。これらの別の実験からのSEの平均値は5未満であった。B.結果1.H2O2による誘導マウスbEnd.3内皮細胞を、50,000細胞/ウェルの初期密度で播種した。24時間後に細胞を、漸増濃度10μM~500μMのH2O2とともに37°Cで1時間インキュベートするか、または未処置のままにした。インキュベーションの終わりに細胞を0.2ゼラチン含有PBSで3回洗浄して、0.25グルタルアルデヒドで固定した。同一のウェルを抗PSIgMで染色するか、またはトリプシン処理してトリパンブルー排除試験によって生存度について評価した。抗PS染色のために、2ゼラチンを用いた10分間のブロッキング後に、細胞を2μg/mlの抗PS抗体とともにインキュベートし、続いて抗マウスIgM-HRP結合体を用いて検出した。高濃度のH2O2に対する内皮細胞の暴露によって約90の細胞においてPS転位が生じる。しかし、これには、基板からの細胞の脱離および約50~60までの細胞生存度の低下をともなう。細胞生存度の低下を伴う表面PS発現の関連は理解可能であるが、それでもなお約90の転位が観察され、これには細胞生存度のわずか50~60の低下しか伴わないということは注目される。より低濃度のH2O2を用いることで、細胞生存度において感知できるほどの低下なしに有意なPS発現が得られた。例えば、PSは20μM程度の低濃度でH2O2を用いて、全てのH2O2処置したウェルにおける約50の細胞の細胞表面で検出された。これらの低いH2O2濃度下で、プラスチックおよびお互いに対して強固に結合したままの細胞は、形態学的変化を示さず、そして細胞傷害性の兆候も有さなかったことに注目することが重要である。詳細な解析によって本質的に100の細胞間接触、適切な細胞形状の保持およびインタクトな細胞骨格が明らかになった。従って、低レベルのH2O2によって誘導された50のPS表面発現が細胞集団で観察され、ここでは細胞生存度は、コントロールの未処置細胞に同一であったすなわち、95。高いH2O2濃度に関連したPS発現には、細胞損傷と伴い、そして高いH2O2濃度に対して曝露されたPS陽性細胞は、脱落されて、浮かび、そして細胞骨格が破壊されていた。低濃度H2O2の存在下での細胞生存度の維持は、他の実験からのデータと一致する。例えば、Schorerら1985は、15μMH2O2で処置したヒト臍静脈内皮細胞HUVECが平均90~95の生存度5~10の傷害として報告されたであったが、1500μMH2O2に暴露された細胞ではわずか0~50の生存度50~100損傷されたであったことを示した。インビトロにおける腫瘍環境を模倣するためのH2O2の使用はまた、腫瘍環境が、H2O2および他の反応性酸素種を生成する炎症性細胞、例えば、マクロファージ、PMNおよび顆粒球において豊富であるという点でも適切である。安定な腫瘍血管マーカーと前には決して結び付けられていないが、炎症性細胞は、H2O2の存在を要する反応性酸素種に関する機構によって内皮細胞損傷を媒介することが公知であるWeissら、1981;Yamadaら、1981;Schorerら、1985。実際に、インビトロにおけるPMNの刺激は、細胞死クロム遊離アッセイによって測定されるも細胞剥落も生じることのない、致死に至らない内皮細胞損傷を生じるのに十分なH2O2の濃度を生じること;およびこれらのH2O2濃度がインビボで局所的に獲得可能であることが研究によって示されているSchorerら、1985。現在のインビトロ転位データは、抗PS抗体がインビボで腫瘍血管内皮細胞に特異的に局在して、正常な組織における細胞には結合しないことを示す、初期の結果と相関している。インビボのような濃度のH2O2が細胞完全性を破壊することなく内皮細胞表面に対するPS転位を誘導するという知見は、もとのインビボデータおよび本発明者らの治療アプローチを確証することに加えて重要な意味を有する。ヒト、ウシおよびマウスの内皮細胞は全てが、正常な条件下ではPS陰性であることが公知である。任意の以前に考証されたPS発現は常に、細胞損傷および/または細胞死に関連している。これは正常な生存度が維持される本研究においては事情が異なる。これによって、腫瘍血管内皮におけるPS転位が、細胞損傷とは関係のない生化学的機構によって媒介されることが示される。これは、形態学的にインタクトな内皮細胞におけるPS表面発現の最初の実証であり、そしてPS発現がアポトーシス経路単数または複数から切り離され得るという最初の開示であると考えられる。本発明の実現可能性に戻れば、これらの観察によってやはり、PSが一過性ではなく持続できる腫瘍血管のマーカーであって、治療介入のための適切な候補物であることが確認される。2.トロンビンによる誘導トロンビンはまた、PS発現を増大するが、H2O2と同じ程度までではないことが観察された。このデータはまた、本発明者らによって開発されたPS発現の腫瘍誘導モデルの欠くことのできない部分である:正常組織におけるトロンビン誘導性PS表面発現はまた、さらなる凝固物である。なぜなら、PS発現は凝固開始複合体のアセンブリを協調させるからである。腫瘍環境は、腫瘍血管が凝固する傾向があるように血栓促進性プロトロンビン性であることが公知である米国特許第5,877,289号。トロンビンは、凝固カスケードの産物であるので、これは腫瘍血管に存在する。実際、トロンビンの存在は、VCAM発現を誘導して、これは本発明者らが腫瘍血管の標的可能マーカーとしてVCAMを開発する能力に貢献する米国特許第5,855,866号;同第5,877,289号。従って、トロンビンがまたPS発現を誘導するということを示す本発明のデータは、裸の抗体および治療結合体を用いてアミノリン脂質を標的化することに関係し、さらに組織因子を含む抗VCAMコアグリガンドの有益な効果を説明する実施例I。3.酸化的ストレスの他の因子インビトロにおけるマウスbEnd.3またはウシABAE細胞を、多くの腫瘍の微小環境に存在するLichtenbeldら、1996;Harrisら、1996種々の濃度の因子および条件、例えば、低酸素/再酸素化、トロンビン、酸性度、炎症性サイトカインおよび過酸化水素を用いて24時間処置した表11。PSおよび陰イオン性リン脂質の外面化を、125IアネキシンV結合を測定することによって定量した。アネキシンV結合の量を、アクチノマイシンDおよびTNF-αを用いる併用処置によって、細胞のうち90~100のアポトーシスが誘導された細胞での量と比較した。アクチノマイシンDおよびTNFαは、文献報告Raoら、1992とよく一致して、両方の細胞タイプにおいて106個の細胞あたり6.2ピコモルのアネキシンVの結合1細胞あたり3.8×106個のアネキシンVの分子を誘導した。この値を外面化された陰イオン性リン脂質の最大レベルとした。表11では、用いられるサイトカイン、増殖因子およびトロンビンの濃度を、培養された内皮細胞に対して最大の刺激効果を有する文献の値から選択した。これらの濃度は、形態学的外観、脱落のないこと、およびトリパンブルーの取り込みのないことによって判定されるとおり、試験の期間24時間を通じて毒性を生じなかった。使用されるH2O2の濃度は、選択された条件下で細胞傷害性を生じない最大濃度であった。125IアネキシンVの基礎的な結合を増殖培地単独の存在下で決定した。アクチノマイシンDおよびTNFαを用いた併用処置によるアポトーシスの導入後に最大のPS露出を決定した。3つの別の研究からの繰り返しの平均を示す。標準誤差は5未満であった。未処理の細胞を、アネキシンVまたは抗PS9D2抗体結合によって判定されるように、外面化したPSをほとんど欠いた表11。増殖媒体単独の存在下での基礎的結合は、それぞれABAEおよびbEnd.3細胞について、0.44および0.68ピコモルの125IアネキシンVであった。これは、同じ条件下で約10の細胞がビオチン化アネキシンVに結合するという知見とよく関連して、それぞれ、ABAEおよびbEnd.3細胞について約7.1および10.9の最大の結合に相当した。VEGF、HGF、FGF、TGFβ1、PDGF、IL-6、IL-8およびIL-10は、未処置の細胞について基礎的レベルを上回って125IアネキシンVの結合を増大しなかった。炎症伝達物質IL-1α、IL-1β、TNFαおよびインターフェロンは、ABAE細胞について最大レベルの5~8およびbEnd3細胞について3~14に及ぶ、PSおよび陰イオン性リン脂質の転位において少ないが再現性の増大を生じた。低酸素/再酸素化、トロンビンまたは酸性の外部条件pH6.8~6.6によって、ABAE細胞については最大レベルの8~20、およびbend.3細胞については最大レベルの17~22におよぶ、PSおよび陰イオン性リン脂質の中程度の高い外面化が誘導された。100~200μMの過酸化水素を用いた処置後にPSおよび陰イオン性リン脂質転位における最大の増加が観察された。この処置によって、125IアネキシンV結合によって判定されるように、両方の細胞タイプにおけるPSのほぼ完全な95外面化が生じた表11。免疫組織化学的に判定されたとおり、ABAEおよびbEnd.3細胞の70より多くがビオチン化アネキシンVに結合した。PSおよび陰イオン性リン脂質転位が低酸素/再酸素化、トロンビン、酸性度、TNFα、IL-1またはH2O2を用いた処置によって生成された内皮細胞は、アッセイの期間24時間中、マトリックスに結合したままであり、細胞間接触を保持し、トリパンブルー色素を排除する能力を保持した。誘導性因子が除去されるか、または培養条件が正常に戻された後に、正常なPSおよび陰イオン性リン脂質の配向は、ほとんどの細胞において24~48時間後に回復された。H2O2の直接の適用によって、または低酸素/再酸素化、酸性度、トロンビンもしくは炎症性サイトカインによって間接的に、生み出された穏やかな酸化的ストレスが生存可能な内皮細胞上のPSおよび陰イオン性リン脂質の一過性の転位を誘発することがこれらの結果によって示される。4.炎症性サイトカインおよび低酸素/再酸素化の併用効果ABAEおよびbEnd.3細胞をIL-1αまたはTNFαの存在下で低酸素/再酸素化に供した場合、強化されたPSおよび陰イオン性リン脂質露出が観察された。サイトカインの非存在下で、低酸素/再酸素化は、ABAE細胞によるPS露出を、アポトーシス濃度のアクチノマイシンDおよびTNFαで処置した細胞について最大レベルの15~17.5まで増大した。毒性未満の濃度のIL-1αまたはTNFαの存在下で、低酸素/再酸素化は、陰イオン性リン脂質露出をそれぞれ最大の26および33まで増大した図5;表11。低酸素/再酸素化の非存在下でのサイトカインの効果との比較によって、サイトカインおよび低酸素/再酸素化の組み合わせがPS露出に対して相加作用よりも大きい作用であったことが示される。同様の効果がbEnd.3細胞上で観察された。従って、腫瘍環境においては、低酸素/再酸素化によって誘導されたPSおよび陰イオン性リン脂質の露出は、炎症性サイトカインによって、そしておそらくは酸性度およびトロンビンのような他の刺激によって増幅され得る。これらのインビトロ研究は、インビボにおける腫瘍内皮細胞に対するPS露出の機構の解明に役立った。それらによって、インビボにおいて腫瘍における刺激を模倣する細胞傷害性を生じずに、種々の要因が内皮細胞に対するPS露出を誘導するということが示される。低酸素とその後の再酸素化、酸性度およびトロンビンが、生存可能な内皮細胞上のPS露出を最も増大した。炎症性サイトカインTNFαおよびIL-1αはまた、PS露出の弱いが明確な誘導を生じた。これらの条件は、以下の理由によってインビボでの腫瘍における主な誘導性刺激である可能性が高い:iPS陽性内皮細胞は、低酸素、酸性度、血栓症になった血管、および浸潤性宿主白血球が通常観察される、壊死および壊死の周囲の領域において優勢である;ii低酸素/再酸素化がインビトロにおける内皮細胞に対するTNFαおよびIL-1の弱いPS露出活性を増幅するという知見は、低酸素およびサイトカイン分泌腫瘍および宿主細胞が共存する腫瘍におけるインビボ状況と相関する;iii低酸素/再酸素化およびトロンビンは、NADPHオキシダーゼ様膜酵素の活性化を通じて内皮細胞において反応性酸素種ROSを生成することが報告されているZuluetaら、1995。悪性細胞によって生成されたROSは、内皮細胞の損傷に寄与し得るShaughnessyら、1989。過酸化水素は、本研究において見出された培養された内皮細胞上のPS露出の最も強力な誘導因子であって、これによってROSの関与についての直接の支持が得られる。外面化したPSによって、凝固因子がその上に濃縮およびアセンブルする陰性のリン脂質表面が得られる。これは、長らく認識されている腫瘍内皮上の凝固促進性の状況に寄与し得る。PSはまた、腫瘍への白血球浸潤を補助する、循環しているマクロファージMcEvoyら、1986、Tリンパ球Quら、1996および多形核球細胞についての付着部位を提供する。腫瘍内皮上のPSに対する活性化マクロファージ、多形核細胞および血小板の付着は、反応性酸素種のさらなる分泌およびPS露出のさらなる増幅をもたらし得る。実施例XIII:アネキシン結合体の抗腫瘍効果アミノホスホリピドが腫瘍脈管構造の安定なマーカーであるという驚くべき知見はまた、抗体-治療剤構築物がガン治療に使用され得ることを意味する。標的剤としての抗体の使用に加えて、本発明者らは、アネキシン、および他のアミノホスホリピド結合タンパク質もまた、治療剤を腫瘍脈管構造に特異的に送達するのに使用され得ると結論付けた。以下のデータは、アネキシン-TF構築物のインビボ投与から生じる抗腫瘍効果を示す。A.方法アネキシンV-tTF結合体を調製し、そして固形腫瘍を有するnu/nuマウスに投与した。この腫瘍は、少なくとも約1.2cm3の腫瘍を形成したヒトHT29結腸直腸腺ガン細胞から形成された。アネキシンV-tTFコアグリガンド10μgを静脈内投与し、そして24時間循環させた。生理食塩水で処置したマウスを、コントロールマウスとして別々に維持した。1日の処置期間の後、このマウスを屠殺し、そして放血させ、そしてこの腫瘍および主な器官を分析のために採取した。B.結果アネキシンV-tTF結合体が、HT29腫瘍保有マウスにおいて特定の腫瘍血管凝固を誘導することを見出した。アネキシンv-tTF結合体処置した動物における腫瘍血管の約55が、1回の注射後に血栓形成した。対照的に、コントロール動物の腫瘍脈管構造において血栓、最小限に現れた。実施例IX3SB抗PS抗体の抗腫瘍効果本実施例は、同系および異種の腫瘍モデルを用いる抗PS抗体の抗腫瘍効果を示す。本研究で用いる3SB抗体は、PSおよびPAに結合するが、本質的にPEとの反応性は欠く。この抗PS抗体は、血栓および腫瘍壊死を伴った腫瘍血管傷害を生じた。抗PS抗体の効果を、3SB抗体を用いる同系および異種の腫瘍モデルにおいて最初に試験した。同系のモデルについて、マウス結腸直腸ガンColo26の1×107個の細胞Dr.lanHart,ICRF、Londonから入手をBALB/cマウスの右脇腹に皮下注射した。異種モデルにおいては、雄性CB17SCIDマウスの右脇腹に1×107個の細胞を皮下注射することによってヒトホジキンリンパ腫L540異種移植片を樹立した。処置の前に約0.6~0.9cm3のサイズまで腫瘍を増殖させた。腫瘍保有マウス1群あたり4匹に20μgの3SB抗PS抗体IgM、コントロールのマウスIgMまたは生理食塩水を腹腔内注射した。48時間の間隔で処置を3回繰り返した。動物を腫瘍測定および体重について毎日モニターした。腫瘍容積を実施例Iに記載のとおり算出した。腫瘍が2cm3に達するか、または腫瘍が壊死もしくは潰瘍形成の兆候を示す前にマウスを屠殺した。同系および異種の腫瘍の両方の増殖を3SB抗PS抗体を用いた処置によって効率的に阻害した図6Aおよび図6B。抗PS抗体は、血栓および腫瘍壊死を伴った腫瘍血管傷害を生じた。ブロックされた血管の周囲の血餅の存在および腫瘍塊の分解が証明された。定量的に、3SB抗PS抗体処置は、大きいColo26腫瘍図6AおよびL540腫瘍図6Bを保有するマウスにおけるコントロール腫瘍容積の60まで腫瘍増殖を阻害した。生理食塩水またはコントロールのIgMで処置したマウスでは、腫瘍増殖の遅延は見出されなかった。抗PS抗体で処置したマウスでは毒性は観察されず、正常な器官では、未処置または生理食塩水で処置されたマウスと識別できない、未変化の形態が保存されていた。腫瘍の退行は最初の処置の24時間後に開始して、腫瘍はその後6日間サイズが低下し続ける。これは同系および免疫無防備状態腫瘍モデルの両方で観察され、このことはこの効果が免疫状態依存性機構単数または複数によって媒介されることを示した。さらに、腫瘍負荷の減少は、1500mm3より大きい腫瘍を保有するコントロールのマウスに比べて、動物の意識の覚醒の向上および一般的に健常な外観を伴っていた。最初の処置の7~8日後に腫瘍の再増殖が生じた。L540腫瘍の抗PS処置で得られた結果は以下の利用のためにさらに納得される。とりわけ、L540腫瘍処置において観察された腫瘍壊死は、L540腫瘍においてPSに陽性に染色された血管の割合がHT29およびNCI-H358腫瘍におけるよりも少ないという事実にかかわらず生じた。このことは、他の腫瘍タイプを処置した場合、さらに急速な壊死が生じる可能性が高いということを意味する。さらに、L540腫瘍は、清澄な組織学的切片を提供して、実際に壊死に対して耐性であることが公知なので、一般に実験モデルとして選択される。実施例X陰イオン性リン脂質に対する抗体9D2の抗腫瘍効果本実施例は、インビボにおける抗腫瘍研究において、PSおよび他の陰イオン性リン脂質に結合する、9D2抗体の効果を実証する。陰イオン性リン脂質9D2に結合する高用量>150μgのラット抗体を、H358腫瘍を保有するヌードマウスに注射した。免疫局在化研究によって、これが腫瘍内皮に強力に局在した4が、正常な血管による9D2の非特異的な結合が、高用量に起因していくらか低いレベルで観察されたことが示された無関係の特異性のコントロールのIgM抗体について観察されるように。腹水産物にL540腫瘍を有するSCIDマウスに9D2を腹腔内注射した場合、腫瘍は壊死して崩壊した。L540腫瘍を有するSCIDマウスへのコントロール抗体MK2.7、ラットIgGの注射の際、同様の効果は観察されなかった。次いで、インビボでのL540腫瘍の増殖に対する9D2抗PS抗体の効果をさらに正確に決定した。腫瘍が200~250μlに達した場合、処置を開始した0日。0日から7日まで、マウスに約150μgのIgM200μl上清または200μlの10DMEMを腹腔内注射した。7日から22日まで、マウスに約300μgのIgM400μl上清または400μlの10DMEMを腹腔内注射した。22日が処置の最終日であって、マウスを屠殺した。表12に示すとおり、10~22日まで、腫瘍増殖は一般に約40~50まで阻害される。研究の終わりに、2000μl容積を超える腫瘍を有するのはコントロール群での9匹中9匹に比べて、処置群ではわずか4匹のマウスであった。別のインビボ研究では、CB17SCIDマウスにおけるL540腫瘍の増殖に対するラット抗PS抗体の効果を、腫瘍細胞注射後45日間追跡した。これらの腫瘍保有マウスを、毎日300μgの抗PS抗体を腹腔内に用いて処置するか、またはコントロールとして毎日300μlの10DMEMを腹腔内に用いて処置した。腫瘍処置の種々のパラメーターは、コントロールに比べて処置群において著しく良好であった表13。1処置後示した時点で60日対90日、処置したマウスにおいては測定するには腫瘍が小さすぎる2リンパ節における転移さらなる研究では、9D2抗体を、L540腫瘍を有するマウスに1週あたり3回100μgの用量で腹腔内注射した。週に2回ノギスで腫瘍サイズを測定した。コントロール群に比較した抗腫瘍効果を図7に示す。カッコの数は、1群あたりのマウスの総数あたりの退行した腫瘍を有するマウスの数を示す。実施例XI抗PS抗体3G4の抗腫瘍効果本実施例は、同系および異種の腫瘍モデルにおいて抗PS抗体3G4を用いて、さらなる抗腫瘍効果を実証する。本研究で用いる3G4抗体は、PSおよび他の陰イオン性リン脂質に結合するIgG抗体である実施例IV。A.動物腫瘍研究についてのプロトコール同系および異種の腫瘍モデルにおいて3G4の効果を検討した。動物腫瘍処置研究のための一般的プロトコールは以下のとおり行なう。特に相違を示さない限り、これは本出願の研究全体にわたって用いたプロトコールである。動物は、CharlesRiverLaboratoriesから入手した。マウスは4~5週齢の雌性C.B-17SCIDまたはFoxChaseSCIDマウスである。マウスをオートクレーブしたケージで、無菌の食物および水で、無菌的な取り扱いで飼育した。ラミナーフローのフードにおいて全ての手順を行なった。マウスを1週間馴化させて、次いで耳にタグを付けて、血液サンプル約75~100μlを尾静脈から採取して、ELISAによって漏出をチエックする。漏出ELISA試験をできないマウスは試験手順には用いるべきではない。耳にタグ付けして血液サンプルを取り出した2~3日後に、乳房の脂肪パッドMFPに、または右の脇腹に皮下的に、腫瘍細胞をマウスに同所性に注射する。同所性モデルでは、1×107個の細胞を含む0.1mlのDMEMを麻酔されたマウスのMFPに局所注射する。マウスを0.075mlのマウスカクテル腹腔内注射によって麻酔する。このマウスカクテルは5mlケタミン100mg/ml;2.5mlキシラジン20mg/ml;1mlアセプロマジン10mg/ml;11ml滅菌水である。投与量は、30分間にわたりIP経路を介して体重20~30グラムあたり0.1mlである。つまさき/足のピンチに応答しないことを測定した場合、一旦マウスを麻酔すれば、マウスを左を下にして横にさせて、頭部のすぐ後ろおよび右前脚/背中領域周囲を70エタノールで拭く。2~3mmの切開を右前脚のすぐ後ろ胸部側方で行い、これによって、皮膚弁を持ち上げた場合、白っぽい脂肪パッドが明らかになる。1mlのシリンジおよび27ゲージの針を用いて0.1mlの細胞を脂肪パッドに注射して、この脂肪パッドに小疱を生成する。9mm滅菌創傷クリップを用いて切開を閉鎖する。マウスをそのケージに戻して、麻酔から覚醒して動くまで観察する。術後の健康状態を確認し、もし窮迫の何らかの兆候が観察されれば、その動物にアセトアミノフェン0.24mg/mlコデイン0.024mg/mlを含む飲料水を与える。創傷クリップは1週後に除去する。この方法を用いて、細胞を選択された部位に正確において、皮下領域にはいれない。腫瘍は14~15日では約200μlの容積L×W×Wであって、摂取率は本質的に100である。皮下モデルにおいては、マウスに代表的には、1×107個の細胞を含む0.2mlを注射する。マウスを麻酔せず、ただしマウス皮膚の確実なグリップを用いて拘束して、右脇腹を曝す。23ゲージの針を備える1mlのシリンジを用いて、マウスの皮膚の直下に1×107個の細胞を含む200μlを注射して、小疱が示される。注射部位からの少量の液体漏出が観察されるのは珍しいことではない。この漏出を減らすために皮下注射から針を抜く場合にねじれ運動を用いてもよい。腫瘍容積はL×W×Hによって測定する。灌流プロトコールでは、マウスに1000Uのヘパリンを含有する0.2mlの生理食塩水を静脈内注射する。次いで、0.1mlのマウスカクテルを用いたマウス腹腔内注射によってマウスを鎮静する。つまさき/足にピンチングされる場合に反射がないということで測定されるように一旦マウスが十分に鎮静されれば、胸腔を開口して心臓および肺を露出させる。チューブおよび灌流ポンプに接続した30ゲージ針を左心室に挿入する。右心室を切りとって、これによって血液を滴下させ得る。1分あたり1mlの速度で12分間、生理食塩水をポンピングする。灌流の終わりに、この針およびチューブを抜き取る。免疫組織化学または病理にいずれかのさらなる研究のために組織を取り出す。B.腫瘍処置結果同系モデルについては、MethAマウス線維肉腫腫瘍細胞を用いた。異種モデルの1つにおいて、ヒトMDA-MB-231乳ガン細胞を、乳腺脂肪パッドに播種した。別の異種モデルでは、細胞を注射することおよび腫瘍を処置の前に500mm3を超えるサイズまで増殖させることによって、大きいヒトホジキンリンパ腫L540異種移植片を樹立した。腫瘍保有マウス1群あたり10匹に、コントロールに対して、100μgの3G4抗PS抗体IgGを腹腔内注射した。処置は週に3回繰り返した。動物を腫瘍測定のために週に2回モニターした。同系および異種の腫瘍の両方の増殖は、3G4抗PS抗体での処置によって効率的に阻害された。最初の20~30日間の処置を図8A、図8Bおよび図8Cに示す。この抗体は、腫瘍血管損傷、局所的血栓および腫瘍壊死を生じた。同系のMethA腫瘍細胞の処理は特に首尾よく、そして乳腺脂肪パッドにおいて増殖しているヒトMDA-MB-231乳ガン細胞の処置も腫瘍退行を生じた図8Aおよび図8B。壊死に耐性であることが公知の大きいL540腫瘍を保有するマウスでさえ、3G4抗体処置は、コントロールに比べて腫瘍増殖を阻害した。腫瘍増殖の遅延はコントロールマウスでは見いだされなかった。抗PS抗体で処置したマウスでは毒性は観察されなかった。腫瘍をまたMD-MBA-435細胞を用いて樹立して上記のように処置した。これらの腫瘍の増殖はまた、3G4抗体での処置によって効率的に阻害された。60日間の大きいL540腫瘍、MDA-MB-231およびMD-MBA-435腫瘍細胞の処置を図8D、図8Eおよび図8Fに示す。この抗体は、腫瘍血管損傷、血栓および壊死および腫瘍増殖の遅延を生じ、毒性の証拠はなかった。MD-MBA-435ルシフェラーゼ細胞は、Barcelona、SpainのAngelsSierraJimenez博士から入手して、10DMEM中で増殖させた。マウスに上記のような腫瘍細胞を注射して、注射の2週後にこの腫瘍を測定して容積を記録した。同様の平均容積200mm3の腫瘍でのマウスの処置を、コントロールに対して、実施例XIXに記載のように生成した、3G4抗体およびキメラ3G4抗体を用いて行った。15日の腹腔内注射800μgによって処置を開始して、35日の400μgの最終注射まで2~3日ごとに200μgの注射を続けた。腫瘍容積およびマウス体重を注射の日に測定した。マウスを屠殺して、生理食塩水を12分間灌流させた。器官および腫瘍を取り出して、液体窒素中で急速凍結させて、免疫組織化学的解析のために腫瘍を切片化した。この研究によって、コントロールに対して、3G4抗体およびキメラ3G4抗体の両方とも腫瘍増殖を効率的に遅延させたことが示された図8G。実施例XIICMVに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果驚くべきことに、腫瘍脈管構造からウイルス感染へ分野を切り替えて、本発明者らは次に、アミノリン脂質および陰イオン性リン脂質に対する抗体がまた抗ウイルス効果を発揮する可能性が高いと判断した。本実施例は実際に、サイトメガロCMV感染の処置において3G4抗体を最初に用いて、これが真実であることを示す。A.方法1.インビトロにおけるCMV感染細胞の処置6ウェルプレート中のヒト二倍体包皮線維芽細胞HHF-R2のコンフルエントな単層を、前に記載されたように、緑色蛍光タンパク質GFPを発現するヒトCMVAD169を用いて、MOI=0.01で感染させたBresnahanら、1996。要するに、この細胞を、1ウェルあたり1mlの総容積でウイルスとともに、37°Cで90分間インキュベートした。感染の間、プレートを30分ごとに穏やかにロッキングさせた。感染後、細胞上清を取り出してDMEM/10FBS/pen-strep1ウェルあたり2mlを各々のウェルに添加した。3G4またはアイソタイプマッチングしたコントロール抗体GV39Gの希釈物100μg/mlおよび50μg/mlをウェルに添加した。感染した細胞を37°Cで、全部で19日間インキュベートさせた。各々のウェルにおいて培地および抗体を3日ごとに交換した。19日目に各々のウェル由来の細胞および上清を回収して、プラークアッセイを行なうまで-80°Cで凍結させた。2.蛍光顕微鏡組み換えCMVは、SV40プロモーターの制御下でGFPを発現する。従って、感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で緑になる。これらの研究では、抗体で処置したCMV感染細胞は、2日目、3日目および9日目に蛍光顕微鏡下で観察された。3.プラークアッセイ標準的プロトコールと用いてプラークアッセイを行なった。要するに、凍結細胞細胞懸濁液を37°Cで急速に融解して、1000rpmで1分間、遠心分離によって砕片を除去した。細胞上清の種々の希釈物を、6ウェルプレート中のHHF-R2細胞のサブコンルフエントな単層に加えて、その細胞を37°Cで90分間インキュベートさせたこのプレートを30分ごとに穏やかにロッキングさせた。感染後に、細胞上清を取り出して、2mlのDMEM/10FBSと交換した。4日目に、各々のウェルの上清を取り出して、細胞に0.01の低融点のアガロース/DMEM/10FBSを重層した。このプレートを感染後、37°Cで、全部で14日間インキュベートさせた。14日目に、感染した単層を10緩衝化ホルマリンで固定して、メチレンブルーで染色して、プラークを可視化した。B.結果1.3G4がCMVのウイルス伝播を阻害する3G4がCMV感染および複製に対して阻害性効果を有するか否かを検討するために、コンフルエントなヒト線維芽細胞を、低いm.o.iでCMVを添加する前に、3G4で前処置した。これらの研究において用いられるCMVは、緑色蛍光タンパク質GFPを発現する。従って、感染された細胞は、蛍光顕微鏡下で観察された場合に緑になる。処置の3日目に、抗体の50μg/mlおよび100μg/mlの両方を用いて、未処置のウェルにおいて、および3G4またはアイソタイプマッチングコントロール抗体GV39Gで処置したウェルにおいて、両方とも単一の感染細胞が存在する。従って、3G4を用いた線維芽細胞の処置は、細胞へのウイルスの侵入を有意に阻害しないようである。しかし、9日目には、3G4処置対コントロールGV39G処置ウェルにおける感染細胞の数に劇的な相違が存在する図9Aおよび図9B;上側の右のパネルを中央および下部の右側のパネルと比較する。ウイルスは、コントロールウェルにおいては単層の約80に感染しているが、ウイルスは、3G4処置ウェルにおいては最初の単一感染した細胞に限定される。従って、3G4は、もとの感染細胞から周囲の細胞へのCMVの伝播を制限する。ウイルス伝播の阻害は、細胞が100μg/ml図9Aおよび50μg/ml図9Bで処置された場合に観察される。2.ウイルス阻害は、抗体濃度依存性である低m.o.iでの抗ウイルス効果に必要な3G4の濃度を決定するために、感染した細胞を、異なる濃度の3G4およびコントロール抗体GV39Gで処置した。図10に示されるように、3G4を100μg/mlおよび50μg/mlで用いて細胞間の伝播の完全な阻害が観察される。細胞を25、12.5および6.25μg/mlの3G4で処置した場合、GFP陽性CMV感染細胞の数が増大される。3G4は、これらのさらに低濃度の一次感染細胞からのウイルス伝播を完全には妨げないが、依然として意味のある抗ウイルス効果を有する。なぜなら、GV39G処置したコントロールウェルに比較して3G4処置したウェルでは、みられるGFP陽性CMV感染細胞はわずかであるからである図10。3.低M.O.Iでのウイルスロードの定量抗体処置後のウイルスロードを決定するプラークアッセイを行なうことによって3G4の抗ウイルス効果を定量した。このコントロールは、未処置の細胞、GV39G抗体、およびC44抗体を用いるさらなる抗体コントロール、コルヒチンに対するマウスIgG2aアイソタイプ抗体を含んだ。100μg/mlの3G4で感染させた感染細胞の処置m.o.i=0.01pfu/細胞によって、コントロールGV39G処置細胞に比較して、ウイルス力価において劇的である6log10の低下が得られた図11A。この阻害は、ウイルス複製のほぼ99.9999阻害に変換する。50μg/mlの濃度での3G4を用いた処置によって、3G4での処置によって、GV39G処置に比較してウイルス力価の3.5のlog10の低下が生じる。3G4を25μg/mlおよび12.5μg/mlで用いたところ、結果はさらに劇的であって、6.25μg/mlでさえ阻害効果がやはり観察される図11A。4.高M.O.I.でのウイルスロードの定量3という高m.o.i.で感染された線維芽細胞の3G4処置によってまた、ウイルス力価の劇的な低下が生じる。100μg/mlでは、3G4での処置は、コントロールのGV39G処置細胞に比較してウイルス力価の5log10の低下が生じた図11B。50μg/mlでは、3G4が、GV39Gに比較して3logまでウイルス複製を阻害した図11B。5.後期段階での複製の阻害CMV複製サイクルのどの段階が3G4によってブロックされるかを決定するために、タイミング的な添加研究を行なった。このために、感染後種々の時点で高m.o.i.で感染した線維芽細胞に3G4を加えた。ウイルスロード細胞および上清の両方においてを標準的なプラークアッセイを用いて定量した。感染後24時間までの3G4の添加によって、ウイルス力価におけるlog10の5~6の低下が生じた図11C。しかし、3G4の添加が48時間まで遅れた場合、3G4の阻害性効果は、log10で2まで低下して、添加が72時間~96時間まで遅れた場合、阻害性効果がさらに低下された。これによって、感染後24~48時間の間に生じるCMV複製の後期段階を3G4が妨害することが示される。従って、3G4は、感染もごく早期もしくは早期の遺伝子発現も有意に妨害しない。これは、例えば、後期遺伝子発現、ウイルスDNA合成、ウイルスパッケージングまたは出現に対してよりも、ウイルス複製周期の後期に作用する。実施例XIIIRSVに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果実施例XIIに示されるCMVに対する劇的な抗ウイルス効果に加えて、本実施例は、呼吸器合胞体ウイルスRSV複製の阻害における3つの異なる抗PS抗体の使用を実証する。A.方法1.インビトロにおけるRSV感染細胞の処置A549細胞を、3つのCoaster12ウェル組織培養プレートにおいて100コンフルエンスまで増殖させた。200μLの最小基本イーグル培地を全てのウェルに添加した。抗リン脂質抗体Abを各々のプレートの9つのウェルに添加100μLに100μgして、30分後に最初の9ウェルのうちの6つにおける細胞をRSV長型株を含む100μLの容積を1のMOIで用いて感染させた。3つの残りのウェルを感染されていない、抗体処置ウェルのまま残した。抗体を有さない3つの他のウェルを、RSVを上記と同じMOIで用いて感染させた。各々のプレートを用いて3つの異なる抗体:3G4、3SBおよび1B9を試験した実施例IV。細胞を5CO2において40°Cで2時間インキュベートして、次いで600μLの培地を、各々のウェルに添加して1mLにした。A549細胞プレートをコントロールとして同じ条件で維持した。上清を感染後に4時間、24時間および72時間で収集した。各々の時点で、各々のプレートから4つのウェルをサンプリングした:1つのウェルにはAb処理細胞のみがあり、2つのウェルにはAb処理した/RSV感染細胞があり、そして1つのウェルにはRSV感染細胞のみがあった。このサンプルをプラークアッセイまで-80°Cで凍結させた。2.プラークアッセイプラークアッセイを前に記載の通り行なったKischら、1963;Grahamら、1988。要するに、凍結細胞の細胞上清を37°Cで急速融解させた。未希釈の細胞上清から3段の10倍希釈を行なった:10-1、10-2および10-3。各々の希釈の100μLに加えて未希釈のサンプルを、全て3連の80コンフルエントHep-2細胞株プレートに接種した。プレートを5CO2,40°Cインキュベーターに5日間入れた。5日目に、このプレートを発色させて、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、各々のウェルにおけるプラークを明らかにした。このプラークを、解剖顕微鏡を用いてカウントして、pfuプラーク形成単位/mLにおけるRSVウイルスロードを算出した。B.結果図12に示されるとおり、3SBまたは1B9のいずれかを用いるRSV感染細胞の処置によって、ウイルス複製の対数低下が生じた。感染した細胞を3G4で処置した場合、抗ウイルス効果が、さらに証明された。3G4を用いた処置によって、ウイルス力価において2log10の低下が得られた図12。阻害は、CMVで見られるよりも低く、これは3G4の濃度が低かった25~50μg/mlためである可能性が最も高い。実施例XIV短鎖抗PS抗体抗腫瘍因子単独として、腫瘍に対して結合した治療因子を送達するための標的化因子として、および抗ウイルス剤としての使用を含む、本明細書に記載される抗PS抗体の多くの使用を考慮すれば、本実施例は、短鎖scFv抗PS抗体を生成するのに適切な技術を記載しており、すなわち、ここではVHドメインおよびVLドメインがペプチドリンカーによって一般に結合される短鎖ポリペプチド鎖に存在する。A.ファージ抗体ライブラリーの調製細菌ライブラリーの二次ストック約1×1010クローンを100μg/mlアンピシリンおよび1グルコースを含む100ml2×TYに接種した。これをODが600nmで0.5になるまで、37°Cで振盪しながら増殖させた。M13KO7ヘルパーファージを1013pfuで添加して、37°Cの水浴中で振盪せずに30分間インキュベートさせた。感染した細胞を3,500gで10分間遠心分離した。このペレットを100μg/mlアンピリシンおよび75μg/mlカナマイシンを含む200mlの2×TYに再懸濁して、振盪しながら30°Cで一晩インキュベートさせた。培養物を10,800gで10分間遠心分離した。1/5容積のPEG/NaClをこの上清に加え、十分に混合させて、4°Cに1時間おいた。次いで、10,800gで30分間遠心分離した。このペレットを40mlのPBSに再懸濁して8mlPEG/NaClを添加した。これを混合して4°Cに20分間おいた。次いで、これを10,800gで10分間遠心分離して、上清を吸引した。このペレットを2mlの10ヒト血清に再懸濁して、微小遠心分離機で11,600gで10分間遠心分離して、残りの細菌の破片のほとんどを除去した。プレパンpre-panするために、10ヒト血清におけるファージ抗体ライブラリーをPCコーティングディッシュに添加して、室温で60分間インキュベートした。B.ビオチン化リポソーム上の選択20μmolのホスファチジルイノシトールおよび20μmolのビオチン化ホスファチジルセリンを10mlのヘキサンに溶解した。この溶液を、回転エバポレーターを用いてフラスコの表面上に薄層に乾燥させた。2mlPBSを添加して、槽を4°Cで30分間超音波処理した。次いで、100μlのファージscFvおよび100μlビオチン化リポソームを10のヒト血清の存在下で混合して、室温で1時間穏やかに回転させた。室温で30分間600μl2.5カゼイン/0.5BSAを添加することによって100μlストレプトアビジンM-280ダイナビーズを用いてブロッキングを行なった。4~5分間、MPC-EMagneticParticleConcentratorfromDynalを用いてブロッキング緩衝液からビーズを分離した。100μlのPBSにビーズを再懸濁した。100μlのブロックされたストレプトアビジンダイナビーズDynabeadsをビオチン化抗原に結合したファージに添加して、室温で15分間穏やかに回転させた。MPC-Eを用いて5分間分離を達成して、上清を流し出した。これを1mlPBSを用いて5分間洗浄した。各々の洗浄のために、ビーズを再懸濁してMPC-Eを用いて沈下させた。最終的に、ファージを300μl100mMトリエーテルアミンに30分間再懸濁することによってビーズから溶出させた。150μl1MTrispH=7.4を中和のために添加した。MPC-Eを用いてビーズを再度分離した。150μlのファージ上清を用いて、対数期の10mlTG1細菌に感染させた。10mlの培養物を20μg/mlアンピシリンの存在下で37°Cで1時間振盪させた。アンピシリンを最終濃度50μg/mlまで添加して、さらに1時間振盪させた。1013pfuM13ヘルパーファージをこの培養物に添加して、100μg/mlアンピシリンを含む100ml2TY培地に移して、37°Cで1時間振盪させた。カナマイシンを最終濃度100μg/mlまで添加して、30°Cで一晩振盪させた。ファージ調製手順を繰り返して、選択手順をさらに3~4回繰り返した。C.モノクローナル単鎖抗体ELISAプレートからの個々のHB2151コロニー4回の選択後を、96ウェルプレート中に100μg/mlのアンピシリンおよび1グルコースを含有する500μl2×TY中に接種して、37°Cで一晩振盪しながら300rm.増殖させた。このプレートからの5μlを、1ウェルあたり100μg/mlのアンピシリンを含有する500μl2×TYを含有する第二の96ウェルプレートに移して、振盪しながら37°Cで3時間増殖させたOD600=0.9。100μg/mlアンピシリン、10mMIPTG最終濃度は1mMを含有する50μl2×TYを各々のウェルに添加して、これを振盪しながら30°Cで一晩増殖させた。これを1,800gで10分間遠心分離して、以下のELISAにおいて100μlの上清を用いた。10μg/mlの濃度で、エタノールに溶解したPSを用いて、96ウェルプレートDYNEXIMMULON登録商標1BをコーティングしたP664110mg/ml溶媒は、クロロホルム:MeOH95:5であった。10μg/mlのPCを同じ方法でコーティングした。これらのプレートを冷室で4°Cでエバポレートした。250μl2.5カゼインを各々のウェルに添加して、そのプレートをカバーして、37°Cで1時間ブロックした。PBSを用いてウェルを3回リンスして、可溶性のscFvを含有する100μl/ウェル10ヒト血清および100μl/ウェルの上清を添加して、37°Cで60分間インキュベートした。溶液を廃棄して、PBSを用いて6回洗浄した。100μl9E10を含有する5カゼイン/0.5BSA-PBS1:5000希釈を各々のウェルに添加して、37°Cで1時間インキュベートしてPBSを用いて6回洗浄した。100μlHRPヤギ抗マウス抗体1:10000希釈を各々のウェルに添加して、37°Cで1時間インキュベートして、PBSを用いて5回洗浄した。100μl0.05OPDを各々のウェルに添加して、5分間発色させた。100μl0.18MH2SO4を添加して反応を停止させてO.D.490で読み取った。抗原陽性クローンを2×TYAGプレート上にストリークして、30°Cで一晩増殖させた。陽性の単一のコロニーを3ml2×TYAG培地中に拾い上げて、37°Cで12時間増殖させた。プラスミドを抽出して、scFv遺伝子挿入物を酵素消化およびPCRによってチェックした。正確なサイズの挿入物を有するものを配列決定した。正確なサイズの挿入物を有するコロニーを100ml2×TYAG培地中で増殖させて、37°COD600=0.5で振盪させた。これらを900ml2×TYAに移して、OD600=0.9まで増殖させた。1MIPTGを最終濃度1mMに添加して30°Cで一晩振盪させた。前と同じELISA方法を用いて上清をチェックした。Niアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて周辺質画分からscFvタンパク質を精製した。D.結果4回のパンニング後、以下のクローンはPSプレート上の見込みのあるELISAシグナルを生じて、正確なサイズの挿入物を有する:3E5、3A2、G5、C8、E4および4D5。これらをサブクローニングさせたが、ここではE4は、5つの陽性のサブクローンを有して、4D5は、5つの陽性のサブクローンを有した表14。表14:PSプレート上のELISA一旦陽性クローンが同定されれば、それらのクローンを配列決定した。ScFv核酸およびクローン3A2のタンパク質の配列を、それぞれ配列番号5および配列番号6に示す。陽性クローンを大規模に増殖させて、Nickelアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いてscFvを精製させた。Phastゲル電気泳動を用いて、精製されたscFvを得た。実施例XVPE結合ペプチド誘導体の合成本実施例は、腫瘍およびウイルス疾患を処置するのにおける使用のための例示的なPE結合ペプチド誘導体および結合体の設計および合成に関する。例示的なデュラマイシン誘導体の構造は、図13A~図13Oのパネルに示されており、これは以下の説明に合致する。A.DLB0.387mlの0.1MNaHCO3を含有する水に溶解された0.5mg0.25μmolのデュラマイシンを0.113mg0.25μmolのNHS-LC-ビオチンSigmaに添加した。この反応混合物を室温で1時間、次いで4°Cで一晩インキュベートさせた。サンプルをシリカカラムにロードして、0.1トリフルオロ酢酸TFAを用いて洗浄して、0.1TFAおよび70CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、遠心分離によって濃縮した。総収量は0.5mgであった図13A。B.DIB0.286mlの0.1MNaHCO3を含有する水に溶解された0.5mg0.25μmolのデュラマイシンを0.034mg0.25μmolの2-イミノチオラン塩酸塩2-ITに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートさせた。0.13mg0.26μmolのヨードアセチル-LC-ビオチンPierceを添加して、その反応物を室温で1時間、そして4°Cで一晩インキュベートさせた。サンプルをシリカカラムにロードして、0.1TFAを用いて洗浄して、0.1TFAおよび70CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、遠心分離によって濃縮した。総収量は0.5mgであった図13B。C.DLB4NA0.5mlの0.1MNaHCO3を含有する水に1.9mg0.94μmolのデュラマイシンを溶解した。ここに、0.4mg0.88μmolのNHS-LC-ビオチンSigmaを含有する200μlジメチルホルムアミドDMFを添加した。この混合物を室温で4時間インキュベートさせた。10mg0.17μmolニュートラビジンNAを含有する1mlをこの反応混合物に添加して、これを室温で2時間、次いで4°Cで一晩インキュベートさせた。次いでこの反応混合物を、PBS緩衝液を含むG-25カラム容積50ml上にロードさせた。この画分を収集して、SDSPAGEphastゲルによって解析した。タンパク質含有画分7~16を一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌して、280nmでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。総収量は5.1mgであった。次いで、サンプルをFPLCによって分画した。以下に相当する3つのピークを収集した:ピーク1:[DLB4NA]3画分17~23;ピーク2:[DLB4]2画分2433およびピーク3:DLB4NA画分35~48。全てのサンプルを0.22μmのフィルターを通した濾過によって滅菌した。得られた最終収量は以下であった:0.34mgの[DLB4NA]3;0.59mgの[DLB4]2および1.41mgのDLB4NA図13C。D.DLB4NA-F0.61mgのDLB4NAを含有するPBS緩衝液を、0.005mgN-ヒドロキシスクシンイミジルフルオレセインNHS-フルオレセインSigmaを含有するDMFに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この反応物をPD10カラム10mlに分画した。DLB4NA-Fを、タンパク質含有画分3および4に溶出させて、これを一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。総収量は0.5mgであった図13D。E.DIMnHIgGヒトIgGHIgGを最初に以下のとおり精製した:1.3mlHIgGこれは、1mMEDTA、pH9を有するホウ酸緩衝液に100mg/mlHIgG、22.5mg/mlグリシンおよび3mg/mlアルブミンを含んだを、FPLCS200、250mlカラムに加えた。この画分を収集して、phastゲル上でSDSPAGEによって解析した。単量体のIgGを含む画分21~32を一緒にプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。280nmでの吸光度によって決定される総収量は111mgであった。精製したHIgG55mgを13mlのホウ酸緩衝液、pH9に含むを、0.5mlの、SMCCPierceを含むDMFに1.003mgに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートした。同時に、6mgのデュラマイシンを含む別の反応混合物3μmol;0.5ml0.1MNaHCO3に溶解されるおよび0.413mg2-IT3μmol;0.1MNaCO3に含まれるを室温で1時間インキュベートさせた。反応の終了後、2つの反応混合物を合わせて、室温で2時間、そして4°Cで一晩インキュベートさせた。この反応産物を、phastゲル上のSDSPAGEによって解析した。この反応産物を、ホウ酸緩衝液、pH9を含むFPLCカラムにロードした。三量体5~14、二量体15~24、および単量体25~37に相当するFPLC画分をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。単量体の総収量は54.6mgであった。5~7つのデュラマイシン基をHigGの各々の分子に結合させた図13E。F.DIMnHIgG-F1mg0.7mlのDIMnHIgGを、5μlの、NHS-フルオレセインを含有するDMFに添加した。反応混合物を室温で1時間インキュベートして、PD-10カラムで脱塩した。タンパク質含有画分2~3をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。総収量は0.9mgであった図13F。G.DIMnHIgG-Bおよび[DIMnHIgG]2-B[DIMnHIgG]2のビオチン化誘導体を合成するために、0.66mg1mlの[DIMnHIgG]2を8μlの、1mg/mlのNHS-LC-ビオチンPierceを含有するDMFに添加した。この混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この反応混合物をPD-10カラムで脱塩した。タンパク質含有画分3および4をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。最終の収量は0.46mgであった。単量体DIMnHIgGのビオチン化を同じ様式で行なった。要するに、1.06mg0.75mlのDIMnHIgGを、12μlの1mg/mlNHS-LC-ビオチンを含有するDMFに添加した。室温での1時間のインキュベーション後、反応産物をPD-10カラムで脱塩した。タンパク質含有画分3および4をプールして、0.22μmフィルターを通した濾過によって滅菌した。最終の収量は0.62mgであった図13G。H.DIB4NA2mg0.99μモルのデュラマイシンを、0.5ml0.1MNaHCO3に溶解して、0.136mg0.99μmolの2-ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。その後に、0.483mg0.95μmolのヨードアセチル-LC-ビオチンPierceを添加してその反応混合物を室温で1時間インキュベートした。10mg0.17μmolのニュートラビジンを含む1mlのH2Oを添加して、4°Cで一晩インキュベートした。反応混合物をFPLCによって分画した。3つの異なるピークを収集してプールした:[DIB4NA]3画分17~23;[DIB4NA]2画分24~33およびDIB4NA画分35~48。全てのサンプルを0.22μmのフィルターを通した濾過によって滅菌した。得られた最終収量は以下であった:0.87mgの[DIB4NA]3;1.25mgの[DIB4NA]2;および1.83mgのDIB4NA図13H。I.DIB4NA-B0.023mg0.3μmolのDIB4NAを、0.9μgのNHS-LC-ビオチンPierceに添加した。この反応物を室温で1時間インキュベートして、次いでPD10カラムで脱塩した。総収量は0.04mgであった図13I。J.DS-10.5ml0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した5mg2.5μmolのデュラマイシンを、0.319mg2.6μmolの1,3プロパンスルトンに添加した。この混合物を4°Cで一晩インキュベートした。このサンプルをシリカカラムにロードして、0.1TFAで洗浄して、0.1TFAおよび70CH3CNを用いて溶出させた。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は5mgであった図13J。K.DS-20.3ml0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した1mg0.497μmolのデュラマイシンを、0.072mg0.523μmolの2-ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。0.125mg0.49μmolのSBF-塩化物Pierceを添加した。この反応混合物を室温で1時間および4°Cで一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は1mgであった図13K。L.DS-30.4ml0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した1mg0.497μmolのデュラマイシンを、0.109mg0.592μmolの2-スルホ安息香酸環状無水物に添加した。この反応物を室温で1時間、4°Cで一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラム上で精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は1mgであった図13L。M.DS-40.5mlの、0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した0.25mg0.124μmolのデュラマイシンを、0.017mg0.124μmolの2-ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この混合物を0.049mg0.124μmolのEllman試薬に添加した。この混合物を室温で2時間および4°Cで一晩インキュベートした。250μlの1mg/mlの4-アミノ-5-ヒドロキシ-2,7-ナフタレンジスルホン酸一ナトリウム塩水和物を100μlの1mg/ml2-ITに添加した。この反応物を室温で1時間インキュベートした。50μlの反応混合物を前の反応物に添加して、室温で1時間インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した図13M。N.DS-50.5ml0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した5mg2.5μmolのデュラマイシンを、0.356mg2.6μmolの1,3-ブタンスルトンに添加した。この混合物を4°Cで一晩インキュベートした。このサンプルをシリカカラムにロードして、0.1TFAで洗浄して、0.1TFAおよび70CH3CNで溶出した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した。総収量は5mgであった図13N。O.DC-10.5ml0.1MNaHCO3を含有する水に溶解した0.25mg0.124μmolのデュラマイシンを、0.017mg0.124μmolの2-ITに添加した。この反応混合物を室温で1時間インキュベートした。次いで、この混合物を0.049mg0.124μmolのEllman試薬に添加した。この混合物を室温で2時間および4°Cで一晩インキュベートした。このペプチドをシリカカラムで精製した。この溶出物を収集して、減圧下での遠心分離によって濃縮した図13O。実施例XVIデュラマイシン誘導体はPEに特異的に結合する本実施例は、実施例XVにおいて合成されたデュラマイシン誘導体がPSに特異的であり、従って細胞不浸透性の標的化または抗ウイルス剤に対して連結すること、ならびに腫瘍およびウイルス疾患の処置における使用によって設計されたとおり用いることができることが示される。デュラマイシン誘導体の特異性、詳細には他のリン脂質よりもPEに対する結合を試験するために、一連の競合ELISAを行なった。PEに対する結合についてDIBまたはDLBのいずれかと競合するデュラマイシン誘導体の能力を以下の方法で試験した。PEおよびPCをエタノール中で別々に溶解した。最終濃度は5μg/mlであった。96ウェルELISAプレートDYNEXIMMULON登録商標1Bの各々のウェルに100μlを添加した。これらのプレートを冷室において4°Cでエバポレートした。250μl2.5カゼインを各々のウェルに添加して、カバーして37°Cで1時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を破棄して、100μl2.5カゼインを各ウェルに添加した。DIMnHIgG、DIB4NA、DLB4NA、DS、デュラマイシンおよびDIBのようなプレートを横切る連続希釈としてデュラマイシン化合物を添加した。DIMnHIgGの出発濃度は、1.4mg/mlであって、DIB4NA出発濃度は800μg/mlであって、DLB4NA出発濃度は800μg/mlであった。これらを37°Cで1時間インキュベートして、PBSを用いて5回洗浄した。100μlHRP-ストレプトアビジン1:5000希釈を各々のウェルに添加して、37°Cで1時間インキュベートして、PBSを用いて5回洗浄した。100μlの0.05OPDを各々のウェルに添加して、5分間発色させた。100μl0.18MH2SO4を添加して、反応を停止させて、O.D.490で読み取った。得られたデータを作表して、次いでグラフにプロットした。図14Cおよび図14Dにおけるデータによって例示されるように、デュラマイシン誘導体の濃度の増大につれて、490nmでの吸光度は低下して、このことはデュラマイシン誘導体が、ホスファチジルエタノールアミンに対する結合について、DIBおよびDLBと競合することを示す。デュラマイシン構築物のリン脂質結合プロフィールを、さらなるELISAを用いて確認した。各々の試験脂質PS、PE、PI、CL、PC、PG、SMおよびコレステロールをエタノール中に別々に溶解して、これを用いてELISAプレートをコーティングした。デュラマイシン化合物を、このプレートを横切って連続希釈として添加した。インキュベーションおよび洗浄工程の後に、上記のように、二次検出試薬を各々のウェルに添加して、比色アッセイを用いて反応性を決定した。デュラマイシンビオチン誘導体、DIBおよびDLBについて代表的なリン脂質結合プロフィールを図14Aに示した。DIBおよびDLBは、PEについて特異的であり、ここではPS、PI、CL、PC、PGおよびSMの各々についての結合は無視できるかまたは検出不能であることが示されている。DIMnHIgG-Bおよび[DIMnHIgG]2-Bは本質的にDLBと同じ結合プロフィールを有した。PSに対する最小結合は、高濃度のDIBで観察されたが図14A、これは、この研究の状況では意味がない。なぜならPSに対する結合は、PE結合について飽和しているかまたは最大半減のDIB濃度では検出不能であったからである。従って、このデュラマイシン構築物はホスファチジルエタノールアミンに特異的に結合する。血清はデュラマイシン誘導体によるPE結合に対して有意な効果を有さないことも示された。これは血清BSAの有無におけるPEコーティングELISAプレートに対するデュラマイシンビオチン誘導体であるDLBの結合によって例示されており、ここでは結合プロフィールは有意な相違を示さない図14B。実施例XVIIPE結合ペプチド誘導体の抗ウイルス効果実施例XIIおよび実施例XIIIに示されるとおり、抗PS抗体によって媒介される抗ウイルス効果に加えて、本実施例は、他の共通のアミノリン脂質PEに特異的に結合するペプチド誘導体の抗ウイルス効果を実証する。A.方法1.インビトロにおけるCMV感染細胞の処置6ウェルプレートにおけるヒト二倍体包皮線維芽細胞HHF-R2のコンフルエント単層を、実施例XIIに記載されるように、MOI=0.01で、緑色蛍光タンパク質GFPを発現するヒトCMVAD169を用いて感染させたBresnahanら、1996。この細胞を1ウェルあたりの1.5mlの総容積でウイルスとともに37°Cで90分間インキュベートした。感染の間、30分ごとにこのプレートを穏やかにロッキングさせた。感染の後に、細胞上清取り出して、DMEM/10FBS/pen-strep1ウェルあたり2mlを各々のウェルに添加した。デュラマイシン誘導体DLB4NA、DIMnHIgG、DS-1、DS-2、DS-3およびDC-1の種々の希釈物を、ウイルスの添加前にそのウェルに添加してその後に感染させた。感染した細胞を37°Cで全部で14日間インキュベートさせた。各々のウェルにおいて培地およびデュラマイシン誘導体を3日ごとに置き換えた。2.蛍光顕微鏡実施例XIIに記載のとおり、組み換えCMVは、SV40プロモーターの制御下でGFPを発現する。従って、感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で緑にみえる。これらの研究では、デュラマイシン誘導体で処置したCMV感染した細胞は、4日および6日に蛍光顕微鏡下で観察された。B.結果4日目に、未処理のウェルならびにDLB4NAおよびDIMnHIgGで処理したウェルに単一の感染したGFP陽性緑色細胞がある図15、左パネル。従って、これらのデュラマイシン誘導体でのHHF-R2細胞の処置は、細胞へのウイルスの侵入を阻害しないようである。デュラマイシン誘導体DS-1、DS-2およびDS-3が細胞へのウイルス進入を阻害するといういくつかの前段階的な証拠がある。DLB4NAおよびDIMnHIgGでの処置の6日後、未処置ウェル対デュラマイシン誘導体処置ウェルにおける感染したGFP陽性細胞の数は著しく異なる図15、中央のパネル。6日目までに、ウイルスは、未処理のウェルにおいて周囲の細胞に4日目にみられる単一の感染した細胞から伝播した図15、上部、左パネルと中央パネルを比較する。しかし、DLB4NAおよびDIMnHIgGで処理したウェルにおいては6日目において、ウイルスは、もとの1つだけ感染した細胞に限定される図15、中央および底部、左パネルと中央パネルを比較する。従って、DLB4NAおよびDIMnHIgGは、CMVの伝播を、もとの感染した細胞から周囲の細胞に制限する。細胞を種々の濃度のDLB4NA100μg/mlおよび50μg/mlおよびDIMnHIgG200μg/mlおよび100μg/mlで処理した場合の、ウイルス伝播の阻害を観察する。実施例XVIII3G4抗体の利点実施例IVに記載のように、本発明者らの固有のプロトコールによって開発された3G4抗体は、文献の抗PS抗体を上回る多くの利点を有するが、これには卓越した抗PS抗体である3SBが挙げられるRoteら、1993。本実施例は、これらの特有の利点を記載する。A.クラスおよび特異性3G4はIgG抗体であり、一方3SBはIgMである。IgGクラスの抗体は、高い親和性、インビボにおける低いクリアランス速度、ならびに精製、改変および取り扱いの容易さを含む、IgMを超える多くの利点を有する。IgM抗体である3SBのPS結合の、3G4および別のIgG抗体との比較を図19Aおよび図19Bに示す。3G4は、ほぼ同じ強度を有する陰イオン性リン脂質であるPS、PA、PI、PGおよびCLと強力に反応して、アミノリン脂質PEに対しては弱い強度で結合する。これは、PCおよびSMとの反応性は有さず、そして結合特異性プロフィール:PS=PA=PI=PG>CL>>PEを有する実施例IV;表4。3G4は、ヘパリンにも、硫酸ヘパランにも、または二本鎖もしくは一本鎖のDNAにも、ウエスタンブロットでbEnd.3細胞から抽出された細胞タンパク質にも検出可能には結合しない。3G4の結合は、5mMEDTAの存在によって影響されず、このことはCa2が陰イオン性リン脂質に対する3G4結合に必要ないことを示す。3G4は、リン脂質でコーティングされたELISAプレートに結合せず、そのため0.2Tween20を含む生理食塩水で洗浄されて、これによってこの結合が吸収されたリン脂質に対してであったことが確認された。3G4によって認識されるエピトープは、陰イオン性リン脂質のホスホグリセロールコア内に存在すると考えられ、これは全ての哺乳動物種由来のリン脂質において同じである。従って、この抗体は、マウスおよびヒトのリン脂質の両方と反応し、これは前臨床開発および臨床開発について重要である。3G4は、天然のリガンドであるアネキシンVよりも陰イオン性リン脂質に対してさらに特異的である。3G4とは異なり、アネキシンVはまた、生理学的な濃度のCa2で、中性のリン脂質に強力に結合する。陰イオン性リン脂質についての3G4の特異性は、異なるリン脂質から形成されたリポソームを用いて、免疫されたPSに対する3G4結合と競合するアッセイによって確認された。5mgの単一のリン脂質を含むクロロホルムの溶液からリポソームを調製した。この溶液を窒素下で乾燥させて、丸底ガラスフラスコにおいて薄層を形成させた。次いで、10mlのTris緩衝液0.1M、pH7.4を添加して、このフラスコを2分間5回超音波処理した。3G4抗体0.1μg/mlを、緩衝液かまたは種々のリン脂質リポソームのいずれかに添加して、室温で30分間プレインキュベートさせた。この混合物をPSコーティングプレートに添加して標準的ブロッキング後、1時間インキュベートして、洗浄し、二次抗体を添加した。1時間後、このプレートを洗浄して、OPDを用いて5分間発色させた。実施例IVに示されるとおり、3G4は、固定されて、固定されたPEに対してより少ない程度まで結合するが、固定されたPCに対しては結合しないとき、PS、PA、PI、PGおよびCLに結合する。種々のリポソームの有無において、3G4が固定されたPSに結合する能力を図20に示す。これらのリポソーム競合研究からの結果によって、ELISAプレートに対して吸着されたPSに対する3G4の結合は、PS、PA、PI、PGおよびCLから調製されたリポソームによってブロックされたが、PEおよびPCから調製されたリポソームは、3G4結合において検出可能な低下を生じなかったことが示される図20。また、SMリポソームは、阻害性ではなかった。B.細胞増殖の阻害3G4は、PSおよび他の陰イオン性リン脂質を外面化する、活性化された、分裂中の、傷害されたアポトーシスおよび悪性の細胞に結合する。3G4抗体は、インビトロにおいて内皮細胞の増殖を阻害して、静止期細胞と対照的に、分裂している内皮細胞の顕著な選択性阻害を示す。インビトロにおけるbEnd.3細胞の増殖に対する、抗PS抗体3G4、9D2、3B10、1B9、2G7、7C5および3SBの効果を決定した。bEnd.3細胞10,000/ウェルを48ウェルプレートに播種して、結合させた。20DMEM単独コントロールまたは抗体を含む20DMEM1ウェルあたりの20μg~40μg総IgGを、播種後4時間添加した。各々のクローンを2つの別のプレートにおいて三連で試験した。細胞を48時間後および96時間後に脱離させた。細胞カウントを各々のウェルにおいて決定した。1処置あたりの平均細胞数を算出した。3G4および9D2抗体が、特に有効であって、続いて、3SBおよび3B10であって、1B9、2G7および7C5は阻害性効果が少ない。各々の抗体が、静止期のコンフルエントな細胞とは対照的に、分裂しているサブコンフルエントな内皮細胞の選択性阻害を示す。競合的研究において、3G4が最大の阻害効果を示し、続いて9D2であって、その各々が3SBよりも阻害性であった図16。C.抗腫瘍効果3G4は、インビボにおいて腫瘍血管内皮細胞の表面に結合する。種々の腫瘍を保有するマウスに静脈内注射した場合、3G4は腫瘍に特異的かつ一貫して局在するが、正常な器官には局在しない。染色は腫瘍血管内皮図22、壊死領域および個々の悪性細胞で観察された。腫瘍には、腫瘍内皮および腫瘍細胞の両方の同時の標的を可能にする、3G4についてのマルチ結合部位が存在する。3G4は、インビボにおいて血管形成および腫瘍増殖を抑制し、そして腫瘍保有マウスにおいて検出可能な器官毒性を示さない。最初の研究では、抗体が腫瘍血管損傷を生じ、血管分布および腫瘍壊死を低下させる、同系および異種の腫瘍モデルにおいて3G4は、印象的な抗腫瘍効果を示している実施例XI。樹立された腫瘍の退行は、処置された動物のうち30~50で観察されている。3G4抗体の代表的な血管新生抑制および血管標的化効果を、それぞれ図17Aおよび図17Bに示す。3G4で処置したMDA-MB-231正所性腫瘍を保有するヌードマウスからの腫瘍切片の解析によって、全ての処置腫瘍において血管新生抑制効果が明らかになった。図17Aは、コントロール抗体とは対照的に、3G4で処置したマウスからの腫瘍の代表的画像を示す。このコントロールの腫瘍は、壊死の兆候を示さず、そして腫瘍血管上で検出された汎内皮細胞マーカーCD31によって実証されるように、高度に血管新生されている図17A、左パネル。対照的に、3G4で処置したマウスからの腫瘍は、80~90の壊死およびCD31陽性構造のほぼ完全な消失を示し、これによってこの処置は実質的な血管新生抑制効果を生じたことが示される図17A、右パネル。3G4の抗ガン活性の別の成分は、腫瘍血管損傷の誘導である。これは、同じコントロール研究に由来するHE染色腫瘍の代表的な画像を提供する、図17Bに例示される。コントロール腫瘍における血管は十分に灌流され、形態学的にインタクトであり、そして生存可能な分裂している腫瘍細胞によって囲まれる図17B、左パネル。対照的に、3G4処置された動物における血管は、分解している内皮細胞層を有することが頻繁に観察され、脱落した内皮細胞によって、そしておそらくは裸出された血管に誘引される宿主細胞によってブロックされる図17B、右パネル。3G4処置された腫瘍における代表的な血管によって、周囲の腫瘍細胞の前壊死性層によって示されたとおり、機能の損失が明確に示される図17B、右パネル。まとめると、3G4を用いる正所性のMDA-MB-231腫瘍の処置後の組織学的検査によって以下が示される:1腫瘍における約50の血管における血管内皮の分解;2腫瘍内皮細胞への白血球の結合および腫瘍間質への単核細胞の浸潤;3血小板凝集および赤血球による腫瘍血管の閉塞;43G4処置マウス対未処置マウス由来の腫瘍における微小血管密度の70低下;および5VTAに代表的な、腫瘍細胞の末梢辺縁の生存を伴う、腫瘍の中央壊死。従って、3G4抗体の一次抗腫瘍作用は、腫瘍脈管構造に対する効果を通じて発揮される。他の機構、詳細には腫瘍細胞自体に対する抗体依存性の細胞傷害性が、抗腫瘍効果に寄与する可能性が高い。これは重要であって、末梢の辺縁における腫瘍細胞を含む、さらに多くの腫瘍細胞の殺傷を可能にし得る。フォローアップ研究において、腫瘍増殖に対する3G4の効果は、同系マウスMethA線維肉腫、皮下異種腫瘍L540ヒトホジキンリンパ腫および正所性腫瘍ヒトMDA-MB-231乳ガンおよびヒトMDA-MB-435乳ガンを含む他のマウスモデルにおいて試験されている。3G4抗体を有するマウスの処置によって、それぞれ、これらの腫瘍の90、65および50および70の増殖遅延が生じた。小さい腫瘍0.1cm直径および十分樹立された腫瘍0.3cm直径、200mm3の両方とも同様に阻害された。抗PS処置は、MethA保有マウスの50およびMBA-MD-231腫瘍を有するマウスの30において長期の完全な緩和を誘導した。3G4は、免疫応答性のマウスにおいて最高の阻害性効果を有する。ヒト胸部腫瘍がマウスの乳腺脂肪パッドにおいて増殖されるヒト胸部腫瘍MDA-MB-231およびMDA-MB-435の正所性モデルは重要である。なぜなら、これらは、ヒトの胸部内で増殖するヒト胸部腫瘍の実際的かつ現実的なモデルであるからである。D.安全性プロフィール3G4抗体は、文献で記載される抗リン脂質抗体とは異なる。代表的には、抗リン脂質抗体は、凝固カスケードを妨害する病原性抗体とみなされる。それらは、インビトロにおいて凝固反応を阻害してインビボで血栓を生じる。対照的に3G4、9D2および同様の抗体は、病原性効果のない治療抗体である。1.凝固血清の非存在下と同じく血清の存在下で強力にPSコーティングプレートに結合する抗体を同定するためのスクリーニングを用いて、好ましくは所望の抗体が選択されるべきであるという本発明者らの認識から、3G4、9D2および同様の抗体の基部の重要な局面が得られる。この新規な展開によってPSタンパク質および血清タンパク質の複合体を認識する抗体を同定して排除する能力が得られる。なぜならこのような複合体は、抗リン脂質症候群および関連の病態の原因であるかまたはその重要な要因であると考えられるからである。インビトロにおける血液凝固の研究において、組織因子TissueFactorTF-誘導性凝固の弱い阻害が、高用量の3G4抗体を用いて観察された。それより低い用量を用いる他の研究では、3G4処置マウス由来のカルシウム再添加血清は、組織因子の存在下においてBBG3処置マウス由来のカルシウム再添加血漿と同じ速度で凝固した。またインビトロにおける細胞プラス組織因子への100μg/mlの3G4の添加は、プロプレックスproplexにおける凝固因子Xaの生成速度に影響しなかった外因系凝固経路。インビトロにおける高い抗体レベルを用いるTF誘導性凝固の弱い阻害にかかわらず、3G4抗体はインビボで試験されており、正常マウスでも腫瘍保有マウスでも血栓の合併症を生じない例えば、実施例XIを参照のこと。3G4抗体はまた、インビボにおいてサルで試験されており、有意な副作用は観察されていない。2.低い毒性または毒性のないことの他の指標3G4はマウスにおいて毒性を有さないか毒性が低いという最初の証拠は、3G4が毒性の証拠なしにマウスにおいてハイブリドーマとして増殖するという知見によってもたらされる。また、1mgの精製された3G4が腹腔内に注射された場合、毒性は観察されなかった。系統的なインビボ研究がここで行なわれており、ここでは3匹の8週齢のBALB/cマウスの群に100μgの精製した3G4または同位体マッチしたコントロールIgG3BBG3を2~3週間の間に週に3回、腹腔内注射した。毒性の生理学的兆候は観察されておらず、そして器官毒性も形態学的異常の組織病理学的兆候も、3G4処置されたマウスから取り出された主な器官の切片で検出されていない。以下のパラメーターを特に試験した。体重に関して、3G4処置したマウスはBBG3処置マウスと同じ速度で体重増加した。初期の研究において体重の低下は観察されなかった。毒性の身体的兆候、例えば、脱毛、食欲の低下などは観察されなかった。赤血球、血小板、白血球、絶対リンパ球カウントまたは絶対好中球カウントを含む血球カウントでは変化はない。骨髄細胞質を解析するために、3G4またはBBG3処置マウス6注射、100μg由来の骨髄のパラフィン切片を、総細胞質および細胞組成について試験した。処置動物における骨髄は本質的に完全に細胞性であった若齢の哺乳動物について予想されるとおり。赤血球、顆粒球、リンパ球性前駆体および巨核球が正常な数で存在した。まとめると、高用量の3G40.1mgを用いて2~3週間の間、週に3回処置した200匹を超えるマウスで、毒性の事例は観察されていない。2mgより多い程度の用量が与えられた場合でさえ、毒性の兆候は示されなかった。マウスは正常な肉体的兆候、骨髄細胞質、白血球カウント、組織学および凝固機能を保持している。3G4抗体はまた安全性研究においてサルに投与されており、副作用は観察されていない。血液クリアランス動態の研究はまたマウスで行なわれた。3G4を、BoltonHunter試薬を用いて放射ヨウ素標識して、マウスに静脈内注射した25g。血液のサンプルを、種々の時点後に尾静脈を介して取り出した。3G4の血液クリアランスは、マウスのマウスIgGに代表的であった。クリアランスのα相の半減期は3時間であって、β相の半減期は5日であった。分布の容積は正常であった100ml/kg。これらの研究によって3G4は、正常な宿主組織とは反応せず、加速されたクリアランスをもたらすことが示される。E.抗ウイルス効果3G4抗体はまた、有意な抗ウイルス効果を発揮する。実施例XIIIに示されるとおり、3G4を用いたRSV感染細胞の処置は、3SBを用いて観察される効果よりも優れていた。従って、これらの結果によって、文献における目立った抗PS抗体である3SBを上回る3G4抗体の別の利点が強調されるRoteら1993。3G4抗体はまた、インビトロ実施例XIIにおいてCMVを阻害するのに、そしてインビボにおいて実施例XXImCMVに感染されたマウスの生存を増強するのにおいて極めて有効であることが示される。それに加えて、3G4抗体は、ラッサ熱の感染因子であるPichindeウイルス感染を阻害することがさらに示される実施例XXIV。ウイルス感染後に示される本明細書の細胞表面PS露出、および3G4抗体がワクシニアウイルスに感染した細胞に結合する能力実施例XXIIIによって、3G4抗体が、広いスペクトルの抗ウイルス剤として大きい能力を有することが示される。実施例XIX3G4抗体、CDR配列およびキメラ従って3G4抗体は、血管新生阻害、抗腫瘍血管、および抗ウイルス剤の合わせた特性を保有する。細胞分裂、血管新生、腫瘍増殖およびウイルス性感染に対する3G4の阻害活性は、明白な毒性の欠失とともに考慮すれば、血管新生障害、ガン、糖尿病およびウイルス性感染の処置を含む、この抗体についての広範な治療指標を示す。3G4抗体と実質的に同じエピトープを認識する抗体は、例えば、免疫により、血管新生阻害、抗腫瘍血管および抗ウイルス治療の1つ以上における使用のために生成され得、そして抗体競合研究によって確認され得る。3G4抗体と実質的に同じエピトープに結合する抗体はまた、本明細書に提供される3G4抗体の配列の知識から生成され得る。本実施例によって3G4抗体の相補性決定領域CDRの配列およびその配列情報の用途が得られる。A.3G4抗体配列抗体の可変領域のもとの配列を、3G4抗体を生成するハイブリドーマからRACEによって得て、そしてその配列を確証した。3G4抗体CDR1-3の重鎖Vhの可変領域の核酸およびアミノ酸の配列は、それぞれ配列番号1および配列番号2によって提示される。配列番号1および配列番号2は、図18Aに示されるようにマウスのリーダー配列および定常鎖配列の一部を含む。リーダー配列は、配列番号2のアミノ酸1~19によって提示され、そして成熟タンパク質は図18Aにおける矢印によって示されるように始まる。十分な相補性決定領域の配列情報は、VSSを含む配列部分までの成熟タンパク質の配列によって含まれ、その後のアミノ酸は抗原結合には必須ではない。従って、核酸配列におけるBstEII部位は、機能的なマウス可変領域を調製するため、例えば、ヒト定常領域上への接合における使用のための便利な部位として用いられ得る図18A。実際には、3G4-2BVH配列は、LonzapEEベクターを用いてBstII部位のヒトγ1定常領域上に接合されている。得られた産物はマウスリーダー配列を含み、そのVHは、図18Aにおいて示される様式でヒトCH1配列に結合され、ここでASTLGPSVFPLAPSSKSTSG配列番号7は、ヒトCH1配列の第一の部分に相当する。3G4抗体CDR1-3の軽鎖Vκの可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3および配列番号4によって示される。配列番号3および配列番号4はここでも、配列番号18Bに示されるとおりマウスリーダー配列および定常鎖配列の一部を含む。このリーダー配列は、配列番号4のアミノ酸1~22であり、その成熟タンパク質は、図18Bにおける矢印によって示されるとおり始まる。TVFを含む配列部分までの成熟タンパク質の配列によって、十分な相補性決定領域の配列情報が含まれ、その後ろのアミノ酸は、抗原結合に必須ではない。従って、核酸配列におけるBbsI部位は、機能的なマウス可変領域を調製するため、例えば、ヒト定常領域上への接合における使用のための便利な部位として用いられ得る図18B。実際には、3G4-2BVL配列は、LonzapEEベクターを用いてBstEI部位のヒトκ定常領域上に接合されている。得られた産物はマウスリーダー配列を含み、そのVLは、図18Bにおいて示される様式でヒトCL1配列内に結合され、ここでIFPPSDEQLKSGTAS配列番号8は、ヒトκ定常領域配列の第一の部分に相当する。B.3G4キメラ抗体の生成および特徴づけマウス相補性決定領域およびヒト定常領域を含むキメラ構築物ch3G4を生成して、もとのマウス抗体と本質的に同じように挙動することが示された。マウス3G4抗体を、ヒトマウスキメラ抗体AvanirXenerexBiosciences,SanDiego,CAに変換した。マウスVHをクローニングして、Lonza2BVHベクターのBstEII部位のヒトγ1定常領域に接合した。マウスVKをクローニングして、Lonza2BVLベクターのBbsI部位のヒトK定常領域に接合した。この配列を確証した。全体的構築物をCHO細胞において発現させて、精製した。得られたch3G4は、リン脂質コーティングELISAプレートに対してマウス3G4が結合するのと少なくとも同じように結合する。リン脂質のパネルに対するキメラ3G4のインビトロ結合プロフィールを図21に示しており、ここでPS、PA、CL、PIおよびPGに対する結合は、同様に示される。この結合は抗原特異的である。なぜなら無関係の特異性のコントロール抗体とは結合が観察されなかったからである。特定の研究では、キメラ3G4対3G4抗体の見かけ上最大の結合が観察された;これは、二次抗体の優れた結合に起因し得る。インビボでは、ch3G4は、腫瘍血管内皮細胞に局在して、抗腫瘍効果を発揮する。マウスにおいて増殖しているMDA-MB-435ヒト乳ガン細胞におけるch3G4の抗腫瘍効果は、実施例XIに記載されて、図8Gに示される。キメラ抗体を用いるMDA-MB-435腫瘍を有するマウスの処置は、コントロールとは対照的に腫瘍増殖を効率的に遅延させた。ch3G4の局在化を、マウスで増殖するMDA-MB-435ヒト乳ガン細胞において試験した。マウスにビオチン化ch3G4または無関係の特異性のコントロールIgGを静脈内注射した。1時間後、マウスを放血させて、その腫瘍を取り出して凍結切片を切り出した。ビオチン化試薬を最初にストレプトアビジンCy3結合体とインキュベートして、PBS中で洗浄し、次いでMECA抗体とともに、続いてFITCタグ化二次抗体とともにインキュベートした。それぞれCy3の蛍光赤およびFITCの蛍光緑について適切なフィルターでとった単一の画像を、デジタルカメラで撮ってコンピューターに移した。黄色融合した緑および赤の蛍光の生成物を示す集束型converged画像を、Metaviewソフトウェアの補助によって重ね合わせた。この二重染色方法において、ビオチン化タンパク質および血管内皮を赤および緑で標識する。ビオチン化タンパク質を内皮に結合する場合、この集束型画像は黄色にみえる。図22に示されるとおり、ビオチン化ch3G4は、腫瘍血管内皮細胞に結合する。なぜなら染色パターンはMECA32のパターンに収斂するからである。実施例XXドセタキセルとの併用療法における3G4抗体本実施例は、3G4抗体および化学療薬ドセタキセルを用いる腫瘍処置のための併用療法に関する。これらの薬剤は、腫瘍脈管構造内皮細胞および腫瘍細胞区画を攻撃するように設計されて、毒性の低い相乗的な処置をもたらす。この結果によって、この併用療法は、処置効率を実際に有意に増強したことが示された。A.Fcドメイン媒介性抗腫瘍効果インビトロでの腫瘍細胞に対する阻害効果について3G4抗体を試験した。腫瘍細胞に対する直接の阻害効果は観察されなかった。従って、3G4抗体の抗腫瘍効果は、Fcドメイン媒介性の免疫エフェクター機能の増強、例えば、抗体媒介性食作用、ADCC、CDCおよびサイトカイン産生の刺激、またはこれらの機構の組み合わせの増強を含む可能性が高い。マクロファージによるPS陽性細胞の食作用に対する3G4の効果を評価した。蛍光腫瘍細胞をH2O2で処置してPS露出を誘導した。次いで、処置細胞および未処置の細胞を収集して3G4抗体またはコントロールの抗体BBGと接触させた。次いで、マウス骨髄マクロファージを添加して、このマクロファージが蛍光腫瘍細胞を食菌する能力を、蛍光顕微鏡を用いて解析した。3G4は、マクロファージによるPS陽性細胞の食作用を3倍を超えて増大し得ることが確認されている図23。この知見によって、3G4抗体のFcドメインが抗体の抗腫瘍効果に寄与するという本発明者らの推論が支持される。すなわち、Fcドメインは、宿主免疫エフェクター機能を活性化し、次いでこれが抗腫瘍効果を発揮する。従って3G4抗体は、NK細胞の溶解活性を増強してさらに有効なADCCをもたらす。B.ドセタキセルは、内皮細胞上のPS露出を誘導する。ドセタキセルの皮下濃度による内皮細胞上でのPS露出の誘導をFACS解析によってインビトロで試験した。ヒト臍静脈内皮細胞HUVECおよびヒト微小血管内皮細胞HUVECを10nMのドセタキセルで24時間処置して、FACSによって試験した。処置されたHUVECおよびHMVECの両方とも、未処置細胞に比べて3G4結合における有意な増大を示したそれぞれ、図24Aおよび図24B。48時間および72時間のドセタキセルインキュベーションをまた行なった。C.ドセタキセルは、腫瘍細胞上のPS露出を誘導する。臨床未満の濃度のドセタキセルによるPS露出のインビトロ誘導をまた、腫瘍細胞株のパネルを用いるFACS解析によって試験した。マウスルイス肺ガン腫3LL、マウス結腸ガンColo26およびヒト乳ガンMDA-MB-435細胞を10nMのドセタキセルを用いて24時間処置して、FACSで試験した。試験した全ての腫瘍細胞株は、未処置の細胞と比較して3G4結合の有意な増大を示したそれぞれ、図25A、図25Bおよび図25C。48時間および72時間のドセタキセルインキュベーションをまた行なった。マウス黒色腫B16およびマウス線維肉腫MethA腫瘍細胞株をさらに試験して、また未処置の細胞と比較して3G4結合における有意な増大が示された。ヒト乳ガンMDA-MB-231細胞を10nMのドセタキセルを用いて24時間処置して、キメラ3G4抗体ch3G4またはコントロールのヒトIgGのいずれかともにインキュベートしてFACSによって解析した。これらの結果によって、抗体結合における有意な増大が抗原特異的であることおよびキメラ抗体が親の3G4抗体のように挙動することが示される図26。D.3G4およびドセタキセルを用いた相乗的な腫瘍処置従って、本発明者らは、臨床濃度未満のドセタキセルを用いた内皮細胞および腫瘍細胞の処置が3G4結合を有意に増大することを示した。それらによってまた、3G4抗体が、表面上にPSが露出されている腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進することが示された。従って、ドセタキセルによって媒介される3G4結合の増大は腫瘍細胞の食作用および3G4抗体のFcドメインによって媒介される他の抗腫瘍効果、例えば、NK細胞の溶解活性を増強して、さらに有効なADCCをもたらす。他の研究によってまた、ドセタキセルを用いた乳ガン患者の処置は血清のIFN-γ、IL-2、IL-6およびGM-CSFサイトカインのレベルの増大、ならびにNKおよびLAK細胞の活性の増強をもたらすことが示されているTsavarisら、2002。従って、ドセタキセルとの3G4の組み合わせ治療の抗腫瘍効果を、ヒトMDA-MB-435乳ガンを保有するSCIDマウスにおける正所性モデルにおいて試験した。正所性MDA-MB-435ヒト乳ガンを保有するマウスを、腹腔内に3G4のみ100μg/1用量、ドセタキセルのみ10mg/kgまたは3G4をドセタキセルと組み合わせてそれぞれ100μg/1用量および10mg/kg用いて、3週間、週に3回投与して処置した。処置は腫瘍細胞移植後6日で開始した。これらの研究によって、3G4に加えたドセタキセルの併用療法は90の増殖阻害を生じたことが示された。3G4に加えたドセタキセルの増殖阻害は3G4単独p<0.005およびドセタキセル単独p<0.01よりも有意に優れていた。E.樹状細胞上のFcγRに対するアポトーシス腫瘍細胞の3G4標的化3G4に加えてドセタキセルで処置したマウス由来の腫瘍はまた、コントロールの腫瘍に比較して異常な量のリンパ球を含んだ。この現象は腫瘍細胞を崩壊させることによる免疫細胞の代表的な化学誘引に相当しているが、これはまた、免疫エフェクター細胞上のFcγRに対するFc結合を通じて媒介された3G4による免疫系の活性化を反映し得る。腫瘍内免疫細胞浸潤に対する3G4およびドセタキセル投与の効果を特徴付けるために、これらの浸潤に存在する細胞のタイプを、マクロファージ、抗中球、顆粒球、NK細胞および活性化リンパ球の特異的マーカーに対する抗体を用いる、腫瘍組織の凍結切片および/またはパラフィン切片の免疫染色によって同定することができるPharmingen,SanDiego,CA。この浸潤物の程度、表現型および活性化状態を等級付けしてもよい。IL-2およびINFを含む免疫細胞に浸潤することによるサイトカイン産生はまた、免疫組織化学的技術を介して解析され得る。血清サイトカインレベルは、ELISAによって評価され得、そして細胞内染色を用いて、サイトカイン産生を担う特定の細胞区画を同定することができる。従って、腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスに対する、浸潤する免疫細胞の効果は、体系的に評価することができる。前述のデータに照らして、本発明者らは、さらに樹状細胞上のFcγレセプターFcγRに対するアポトーシス腫瘍細胞の3G4媒介性標的化によって乳ガンの免疫療法の力価を増強する方法を企図する。有効な細胞性および体液性の免疫応答を誘導する効率的な抗原提示は、腫瘍ワクチンおよび免疫療法の発達に重要である。樹状細胞DCは、腫瘍関連抗原に対して細胞傷害性Tリンパ球をプライムする最も強力な抗原提示細胞APCである。樹状細胞DCによる腫瘍抗原提示の改善は、さらに強力な腫瘍ワクチンの開発をもたらすはずである。DCのFcγRレセプター媒介性の内面化による抗原提示は、液体相の抗原飲作用と比較して1,000倍まで増強され得る。アポトーシス腫瘍細胞ATCは、樹状細胞ロードのための抗原の優れた供給源である。なぜなら複数の腫瘍特異的抗原公知および未知の両方が、ナイーブなT細胞に対して効率的に提示され得、特定のエピトープのロックに起因する可能性が低い免疫系回避改変体の出現が生じるからである。動物研究では、ATCでパルスされたDCは、インビトロおよびインビボで強力な抗腫瘍免疫を生じることが示されている。しかし、最近のデータでは、ATC単独では、抗腫瘍免疫を活性化するためにいくらか効率が悪いことが実証されており、これはおそらくその効率の悪い取り込みおよびDC成熟を誘導する能力の欠如による。最近の研究ではまた、アポトーシス腫瘍細胞に対する抗腫瘍抗体の結合によって形成されたATC免疫複合体は、DC上のFcγRに対して標的化され得ることが実証された。ATC単独と比較して、ATC免疫複合体は、DCによってより効率的に内面化され、DC活性化および成熟を誘導するのにおいてより効率的であって、そしてさらに重要なことには、ATC免疫複合体はMHCIおよびMHCII制限抗原提示の両方を有意に増強し得、従って、強力な抗腫瘍TヘルパーおよびCTL免疫を誘導する。従って、本発明者らは、体液性および細胞性の抗腫瘍免疫の両方を増強する本発明の抗PS抗体を用いることを考えて、ATCベースのDC腫瘍ワクチンの有効性をブーストする。PSは、普遍的であって、アポトーシス腫瘍細胞の最も豊富な特異的マーカーであるので、本発明の抗体、詳細には3G4のパネルは、ATC上のPSに結合し得る。3G4-ATC複合体のFcγR媒介性内面化を通じて、3G4が300までアポトーシス腫瘍細胞のDC取り込みを増強し得ることを、本発明者らは既に実証している。従って、FcγRを通じて媒介されたDCによってATCの取り込みを増強することによって、3G4および同様の抗体は、MHCIおよびMHCII制限抗原提示の両方を大きく増強し得、強力な体液性および細胞性抗腫瘍免疫の両方を誘導し得、ATCベースのDC腫瘍ワクチンの有効性をブーストし得るということが判断されている。これは、インビボにおいて、Th1、CTLおよび抗体応答の誘導における、3G4-ATC免疫複合体をロードされたDCの有効性を確立することによって、およびインビボにおいて3G4-ATC免疫複合体をロードされたDCの免疫によって誘導された抗腫瘍免疫の力価を決定することによって、実証され得る。実施例XXI抗PS抗体は、インビボにおいてCMV感染を処置する実施例XIIに示されるインビトロのCMVに対する抗ウイルス効果に従い、本実施例は、CMVウイルスのマウスバージョン、mCMVを感染させたマウスの生存の増大が実証される。Balb/Cマウス6週齢、1群あたり5匹のマウスを、5×105pfuのmCMVRVG102を用いて腹腔内感染させた。このマウスを3G4抗体マウス1匹あたり1mgまたは上記のヒトマウスキメラ抗体ch3G4マウス1匹あたり1mgで1日目に腹腔内処置した。未処置のマウスをコントロールとして使用した。その後、マウス1匹あたり0.5mgの抗体またはキメラ抗体を用いて4日ごとに、26日までマウスを処置した。マウスを感染後90日間、生存についてモニターした。3G4抗体の親およびキメラ型の両方を用いた処置によって、mCMV感染マウスの生存の向上が得られた。3G4またはch3G4を用いて処置したマウスは、感染マウスのうち25しか生存しなかった、未処置のマウスと比較して、それぞれ100および80の生存を有した図27。実施例XXIIインビボにおいてPE結合ペプチド誘導体はCMV感染を処置する実施例XVIIに示されるCMVに対するインビトロの抗ウイルス効果に加えて、本実施例によって、デュラマイシンビオチン誘導体であるDLBがmCMVで感染されたマウスの生存を向上させたことが実証される。Balb/Cマウス1群あたり6週齢、マウス5匹を、5×105pfuのmCMVRVG102で腹腔内感染させた。これらのマウスを、マウス1匹あたり20μgのデュラマイシン誘導体DLBを用いて1日目に、そして4日ごとに腹腔内処置した。未処置のマウスをコントロールとして使用した。マウスを感染後90日間、生存についてモニターした。デュラマイシン-ビオチン誘導体であるDLBを用いた処置によって、mCMV感染マウスの生存が向上した。DLBで処置したマウスは、マウスのうち25しか感染から生存しなかった未処置のマウスと比較して、100の生存を有した図28。実施例XXIII抗PS抗体は、ウイルス感染した細胞に結合する本実施例によって、ウイルス感染が細胞表面でPS露出を誘導することおよび抗PS抗体がウイルス感染した細胞に結合することが示される。FACS解析において実証される細胞表面に対するキメラ3G4抗体の結合の増大によって示されるように、ワクシニアウイルスに感染した細胞はPS陽性になる。トリプシン処理されたワクシニアウイルスを2という高いm.o.iで用いてU937細胞を感染させた。要するに、ワクシニアウイルスを、等容積の0.25mg/mlのトリプシンを用いて37°Cで30分間処置した。このウイルスを0.5mlの総容積でU937細胞に添加した。1.5時間後、新鮮な培地を細胞に添加して、細胞をT25フラスコ中において37°Cで2日間インキュベートさせた。未感染の細胞をコントロールとして使用した。感染したU937細胞および未感染のU937細胞を、一次抗体を用い、コントロールとしてキメラ3G4抗体ch3G4またはヒトIgGHIgGのいずれかを用いて染色した。細胞を洗浄して、正常なマウス血清を用いてブロックし、次いで一次抗体を用いて氷上で45分間染色した。3回の洗浄後、1:400希釈のヤギ抗ヒトFITC結合体化二次抗体を用いて細胞を染色して、FACScanで解析した。FACS解析からの結果によって、未感染のU937細胞上で得られたシフト図29A、右緑ピークと比較して、ワクシニアウイルスで感染されたU-937細胞上にch3G4での有意なシフト図29B、右緑ピークが存在することが示される。従って本研究によって、ワクシニアウイルスを用いた細胞の感染が、細胞表面上でのPS露出をもたらすこと、および抗PS抗体3G4のキメラバージョンが、これらのウイルス感染した細胞に対して結合し得ることが示される。実施例XXIVPichindeウイルスに対する抗PS抗体の抗ウイルス効果CMVおよびRSVに対する抗ウイルス効果に加えて、本実施例によってさらに、抗PS抗体がインビトロでPichindeウイルス感染を阻害することが示される。Pichindeウイルスは新世界NewWorldアレナウイルスであって、ヒトでは非病原性であり、ラッサ熱の動物モデルにおいて用いられる。Vero細胞のコンフルエントな単層を、Pichindeウイルスを0.01pfu/細胞という低m.o.i.で用いた感染後、3G4抗体またはアイソタイプマッチングしたコントロール抗体であるGV39Gで処置した。要するに、細胞を1ウェルあたり1mlの総容積で、37°Cで90分間、ウイルスとともにインキュベートさせた。感染の間、プレートを30分ごとにおだやかにロッキングさせた。感染後、細胞上清を取り出して、DMEM/10FBS/pen-strepを各々のウェルに添加した1ウェルあたり2ml。2日目に、細胞を、トリプシンを用いて回収して、Biocoatチャンバスライドに固着させた。それらを固定して、ポリクローナルウサギ抗PIC血清、続いてビオチン結合体化ヤギ抗ウサギ二次二次抗体単独では、図30Cに示されるように染色を生じないを用いて染色した。100細胞の領域あたりの感染細胞の数をカウントした。3G4を用いて処置した細胞では、ウイルスは、ほぼ100個の細胞中約1個に達する、暗い赤に染まる単一の細胞に限定される図30A。これらはおそらく、CMVで見られるように、ウイルスによってもともと感染された細胞である実施例XII。しかし、コントロールのCV39G抗体で処置した細胞では、ウイルスは全ての細胞に伝播して感染した図30B。ウイルス複製の阻害のこのパターンは、3G4を用いてCMV感染ヒト線維芽細胞を処置した場合に観察されたパターンと類似である。従って、抗PS抗体である3G4は、図30Dにおいて定量されるように、細胞から細胞へのPichindeウイルスの伝播を効率的に妨げる。実施例XXVPE結合ペプチド誘導体を用いる腫瘍処置デュラマイシン誘導体の抗ウイルス効果に加えて、インビトロおよびインビボの両方で、本実施例は、腫瘍脈管構造に対するデュラマイシン誘導体の局在化および関連の抗腫瘍効果を実証する。A.デュラマイシンHuIgG結合体での腫瘍処置ヒトIgGHIgGを実施例XVに記載されるように最初に精製した。精製したHIgGを、SIABリンカーを用いてデュラマイシンに連結して、得られたD-SIABnHIgG結合体を精製した。マウス線維肉腫細胞株MethAを増殖させて、対数期に回収して、DPBSに再懸濁させた。約106個のMethA腫瘍細胞を6~8週齢のBALB/c雄性マウスの背中中央に皮下注射した。移植の5日後、マウスを2つの群に無作為に分離したn=15。10日目から、1つの群には腹腔内注射によって150μgのデュラマイシンHuIgG結合体を連続して2週間投与した。もう一方の群にはコントロールとして同じ量のHuIgGを投与した。腫瘍容積を週に2回測定して、式1/2ab2を用いて算出したここで、aは腫瘍の長軸であって、bは、腫瘍の短軸である。腫瘍が約1400mm3のサイズに達したとき、マウスを屠殺した。デュラマイシンHIgG結合体は、ヒトIgGコントロールと比較して、BALB/cマウスにおいて150μg/日の用量でMethA腫瘍増殖を阻害した図31。B.デュラマイシンHuIgG結合体は腫瘍脈管構造に局在する腫瘍サイズが500mm3に達したとき、上記と同じMethAマウス腫瘍モデルを用いて、100μgD-SIABnHIgGを含有する100μlPBSを、尾静脈を介して注射した。同じ量のヒトIgGをコントロールとして注射した。4時間後、マウスを屠殺して正常な生理食塩水を用いて5分間、1パラホルムアルデヒドを用いて10分間灌流させた。腫瘍および他の主な器官を切り取って液体窒素中で凍結させた。OCTに埋め込んだ後、組織を10μmの切片に凍結切片化してシラン処理したスライドにおいた。冷アセトン中での10分間の固定後に、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgGを用いてスライドを染色して、デュラマイシンHuIgGの体内分布を検出した。Meca32およびペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ラットIgGを用いて組織の血管構造を検出した。本研究によって、処置した動物においてデュラマイシンHIgG結合体が腫瘍血管脈管構造に局在することが示された。実施例XXVIデュラマイシン結合体の生体分布および特性本実施例は、インビトロにおける細胞不浸透性デュラマイシン誘導体の毒性の欠失、インビボで投与されたデュラマイシン誘導体の体内分布、およびデュラマイシン-抗体結合体がマクロファージによるアポトーシス細胞の食作用を増大する能力を実証する。A.デュラマイシン-ビオチン結合体は細胞毒性ではない本発明のデュラマイシン誘導体および結合体は、親のデュラマイシン分子の非特異的な毒性効果を最小にするように設計する。多くの実施例では、これは細胞不浸透性基に対するデュラマイシンの連結によって達成される実施例XV。ビオチン化デュラマイシン構築物DLBを実施例XVに記載の通り調製した。未改変のデュラマイシン化合物およびDLBを、MTTアッセイを用いてHUVEC上での細胞毒性効果について試験した。未改変のデュラマイシンは用量依存性の毒性を示したが、DLBは毒性ではなく、未処置のコントロールにマッチした図32。B.肺におけるマクロファージに対するデュラマイシン-ビオチン結合体の局在化ヒト乳ガン細胞株MDA-MB-435を増殖させて、対数期に回収して、DPBSに再懸濁した。約107個の細胞を、6~8週齢の雌性無胸腺ヌードマウスの乳房の脂肪パッドに注射した。100μgデュラマイシン-ビオチンを含む100μlPBSを尾静脈を介して注射した。4時間後、マウスを屠殺して正常な生理食塩水を用いて5分間、1パラホルムアルデヒドを用いて10分間灌流させた。心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、小腸、胸腺および脾臓を含む主な器官を切り取って液体窒素中で凍結させた。OCTに埋め込んだ後、組織を10μmの切片に凍結切片化してシラン処理したスライドにおいた。冷アセトン中での10分間の固定後に、Cy3標識したストレプトアビジンを用いてスライドを染色してデュラマイシン-ビオチン構築物の体内分布を検出した。Meca32およびFITC標識したヤギ抗ラットIgGを用いて組織の血管構造を検出した。MDA-MB-435腫瘍を保有するヌードマウスへのデュラマイシン-ビオチン結合体の静脈内注射によって、腫瘍細胞、尿細管および肺のマクロファージにおける薬物の沈着が得られた。肝臓に最小の沈着があり、脳、小腸、精巣には検出可能な分布はない。肺におけるマクロファージに対する局在は、本発明の抗ウイルスの実施形態において利用され得る。C.デュラマイシン-抗体結合体はアポトーシス細胞の食作用を増強するデュラマイシン-抗体結合体デュラマイシン-C44、DuC44がアポトーシス細胞の食作用を増大する能力を次に検討した。マクロファージを単離して、マウス骨髄から培養した。BMマクロファージの単離、培養および刺激のために用いられる培地は、2mMグルタミン、0.37w/vNaHCO3、10v/v熱不活性化されたFCSおよび0.5ng/mlマウスGM-CSFを含むDMEMであった。25ゲージの針を通じた完全培地のジェットを用いて、解剖した大腿骨から骨髄細胞を無菌的にフラッシュさせた。次いでこの細胞を完全培地1mlあたり約3×105個の細胞の密度に調節して、8ウェルチャンバスライド中の0.5mlアリコートに分配した。加湿チャンバ中において37°Cで、5CO2中で1時間細胞をインキュベートして、マクロファージを固着させかつ広げさせた。各々のウェルに5mlの暖めたPBSを添加することによって非固着細胞を取り出して、プレートを穏やかに叩くことによって非固着細胞を再懸濁して、このスライドを軽くたたいて非固着細胞を廃棄した。この洗浄を全部で3回行なった。細胞を7.5v/vCO2雰囲気下において37°Cで5日間維持した。細胞を用いるまで、完全培地を1日おきに交換した。以下の方法を用いて、蛍光細胞トレーサーを用いてHL-60標的細胞を標識した。1バイアル色素の含量を90μLのDMSOに溶解して、PBS中で10μMに希釈することによって、使用の直前に10mMCFDASEストック溶液を調製した。HL-60細胞ペレットを得るために遠心分離を用いて、上清を吸引した。細胞をCFDA/PBSに再懸濁して、37°Cで15分間インキュベートした。サンプルを遠心分離して上清を吸引した。細胞を培地に再懸濁してさらに30分間インキュベートした。細胞生存度および蛍光が95を超えることを確認した。この食作用アッセイにおいて、標識されたHL-60細胞をUV254nmに5分間露出して、37°Cで1時間インキュベートしてアポトーシスを誘導した。104個のアポトーシス性HL-60細胞をマクロファージとともに1時間インキュベートした。デュラマイシンC44結合体を10μg/mlの濃度で含んだ。同じ濃度のマウス抗体BBG3を陰性コントロールとして用いて、3G4抗体をまた比較のために含んだ。Hoechst33342を、最後の45分間に、10μg/mlの濃度で培地に添加した。スライドをPBSで3回洗浄して、15分間4パラホルムアルデヒド中で固定した。スライドをラット抗マウスCD11抗体CD11は、マクロファージマーカーであるで染色して、0.2ゼラチン中で1時間希釈して洗浄し、テキサスレッド標識ヤギ抗ラット二次抗体を用いて染色した。細胞を蛍光顕微鏡下で解析した。マクロファージはCD11マーカーに起因して赤い細胞として同定された。アポトーシス細胞を食菌したマクロファージは、標的細胞における蛍光トレーサーに起因して緑の細胞として同定される。赤および緑の細胞をカウントして、食作用を取り込みの食作用陽性の割合として定量する。この研究によって、デュラマイシン抗体結合体DuC44がマクロファージによるアポトーシス性HL-60細胞の食作用を増強したことが示される図33。従って、デュラマイシン部分は、アポトーシス細胞の表面に結合して、これによって結合体の突出する抗体部分がマクロファージによって認識されることが可能になる。従ってこのデュラマイシン-抗体結合体は、3G4抗体に類似して機能した。予想どおり、Fc領域を欠く3G4抗体のFab2フラグメントは、コントロールレベルを超える食作用を誘導しなかった。初期の研究では、デュラマイシン-ビオチン結合体がインビボにおいて肺投与後にマクロファージに局在することが示されたので、本研究において示されるアポトーシス細胞のマクロファージ媒介性食作用の刺激は、本発明の治療用途のために、例えば肺ウイルス感染を処置するのにおいて重要な意味を有する。本明細書に開示されかつ特許請求された全ての組成物および方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作製しかつ実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、この組成物および方法に対して、そして本明細書に記載されるその方法の工程または工程の順序においては、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、変異が適用され得ることが当業者には理解される。さらに詳細には、化学的におよび生理学的にその両方で関連する特定の因子が本明細書に記載される因子に交換されてもよいが、同じかまたは同様の結果が達成されるということが理解される。全ての同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲として規定されるとおり本発明の精神、範囲および概念のうちであるとみなされることが当業者には明白である。参考文献例示的な処置、または本明細書中に示される補足的な他の詳細を提供する程度に、以下の参考文献が、参考として本明細書中に特に援用される。"