"細胞培養培地および細胞を含む細胞培養物の連続的灌流培養による細胞の培養のための方法であって、前記細胞培養培地が前記細胞培養物に添加され、前記細胞培養物が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって循環され、結果として前記細胞培養物よりも低い細胞密度を有する液体の流出が生じ、かつ前記フィルタモジュール内の流れが交互接線流である方法。前記細胞培養培地が、式1:灌流量=SPR総細胞培養容積生存細胞密度1式中、前記灌流量はリットル/日で表され、SPRは比灌流量、すなわち前記細胞培養培地が、生存細胞/時間単位当たりで添加される培地の容積で表される前記細胞培養物に供給される速度であり、前記生存細胞密度は生存細胞/容積単位の数であるに従って計算される灌流量で添加される、請求項1に記載の方法。前記SPRが、0.01~0.3nL/細胞/日である、請求項2に記載の方法。バイオマスが少なくとも1回、前記細胞培養物から除去され、かつ追加の細胞培養培地が前記細胞培養物に添加される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記バイオマスの除去が、前記細胞が定常状態に達する直前または直後に開始される、請求項4に記載の方法。バイオマスの容積が、細胞培養/日の全容積の2~40で除去される、請求項4または5に記載の方法。前記交互接線流が、中空繊維を含むフィルタモジュールにわたって前記細胞培養物を循環させる1つのポンプを使用し、かつ、前記細胞培養より低い細胞密度を前記フィルタ分離前に有する液体を除去する別のポンプを使用することにより達成される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が、少なくとも80×106細胞/mlの生存細胞密度および少なくとも90の細胞生存率に培養される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。少なくとも5個の細胞の凝集体が、細胞の総量の最大でも5を構成する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が動物細胞、好ましくは、哺乳類細胞、または酵母細胞である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が哺乳類細胞である、請求項10に記載の方法。前記哺乳類細胞がPER.C6登録商標細胞である、請求項11に記載の方法。前記細胞が生物学的物質を産生する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。前記生物学的物質が、モノクローナル抗体、成長因子またはペプチドホルモン、酵素、遺伝子治療において使用されるウイルスベクターなどポリヌクレオチド、もしくはワクチンなど治療的または診断的タンパク質、好ましくは、モノクローナル抗体である、請求項13に記載の方法。前記生物学的物質がさらに下流処理で精製される、請求項13または14に記載の方法。[実施例1:生物製剤の製造のためのヒト細胞系PER.C6登録商標の方法最適化]<序論>多くの発現プラットフォームが現在、生物製剤の製造のために存在する。新しい製品の大部分は、哺乳類系を選択する必要があり、それは、これらの細胞が含有し、その他の細胞は欠いているグリコシル化機構によるところが大きい。しかし今日まで、これらの細胞の細胞量および結果として得られるこれらの細胞の生産性は、そのような製品を製造する機構を細胞が有した場合に対応する微生物系の10~100倍低い要因である。灌流培養構成が、生物製剤の製造を良好にさせる多くの特徴を有するヒト細胞系であるPER.C6登録商標細胞系のために開発された。灌流構成は培養ブロスのさまざまな成分の分離を含み、細胞が保持され、集菌が捕捉され、培地清浄化が起こる。PER.C6登録商標細胞系のスピンフィルタ、音響デバイス、および交互接線流ATFユニットを評価した。<材料と手法><細胞系および維持>:PER.C6登録商標細胞系をヒトIgGを産生する本試験において使用した。6mML-グルタミンジブコGibcoを補充した血清を含有しない市販の培地EX-CELL商標VPRO培地、JRHバイオサイエンス社Biosciences中に細胞を維持した。PER.C6登録商標細胞系は、ホスホグリセレートキナーゼプロモータを使用することによりアデノウイルスタイプ5ad5E1遺伝子で不死化したヒト胚細胞系である。<バイオリアクター構成>:1Lおよび4L作業量リアクターアプリコンApplikon、オランダ、およびB.ブラウンBraun、ドイツを本試験中に使用した。ブラウンBraunDCU3コントローラーB.ブラウンBraun、ドイツを使用し、規定設定点で方法を操作した。温度を36.5°C範囲35.5~37.5°Cで維持した。ヘッドスペースを通じた吸気組成物の自動調整および微孔性スパージャーによる一時的散布で50範囲40~60の空気飽和で溶解酸素濃度を制御した。pH設定点は7.1範囲6.7~7.5であり、ヘッドスペースを介しCO2の流れによって制御した。細胞を発酵槽において接種生存細胞密度範囲0.2~0.5106細胞/mLで接種した。灌流は1~3106細胞/mLの範囲の生存細胞密度で開始した。<細胞保持>:3種類のデバイスを使用してリアクター内で細胞を保持した。最初に10μmの細孔径を有するスピンフィルタGKD、デューレンDueren、ドイツを使用した。次に、BiosepAD1015細胞保持システムおよびコントローラーアプリセンスAppliSens、オランダを使用した。最後に、関連中空繊維膜モジュールを有するATF-4制御ユニットおよびハウジングリファインテクノロジーRefineTechnology、米国USAを評価した。使用された中空繊維フィルタはモデルCFP-2-E-8SIP0.2ミクロン、面積:4600cm2、マゼランインスツルメンツMagellaninstrumentsから得られたアマシャムバイオサイエンスAmershamBioscience、米国USAであった。一定の培養量を維持するためにレベルセンサ制御ループが実施中であった。<分析的手法>:バイオリアクターからの細胞計数をトリパンブルー排除法を使用して行った。生存細胞の数は以下の通り測定された。すなわち、トリパンブルーで染色した細胞の量をフックスローゼンタールFuchsRosenthal血球計算器に移した。血球計算器のチャンバを顕微鏡下に配置し、適切な数のボックスを計算した。生存細胞密度を以下の式:生存細胞密度×105細胞/ml=AB×E/3202式中、A=四角Aにおける非染色細胞の数B=四角Bにおける非染色細胞の数E=希釈係数を使用して計算した。UV280nmの吸収検出でHPLCを使用して分析的プロテインAカラムによって抗体濃度を測定し、実際の濃度をIgG1標準品の較正曲線に基づき測定した。<結果><灌流培養>上記の材料および手法で得られた結果は図1~図6に示されている。スピンフィルタ分離デバイスを使用したPER.C6登録商標クローンを産生するIgG1の2種類の連続的灌流の生存細胞密度×106細胞/ml対培養時間日。1LアプリコンApplikon発酵槽の攪拌速度設定は100~150rmpであった。灌流ランは1L作業量で行った。両方の灌流ランの比灌流量SPRは0.1~0.3nL/細胞/日であった。両方の場合に灌流ランはスピンフィルタの目詰まりにより終了しなければならなかった。細胞保持系として音響デバイスを備えた連続的灌流システムにおいてPER.C6登録商標を産生するIgG1の成長。1LアプリコンApplikon発酵槽の攪拌速度設定は100~150rmpであった。ラン/停止サイクルに使用された設定は前方300秒および後方4.5秒であった。ラン時にこれは300秒/3秒サイクル15日目に適合させた。灌流ランの比灌流量SPRは、0.1~0.3nL/細胞/日であった。細胞保持システムとしてATF-4ユニットを備えた連続的灌流システムにおけるPER.C6登録商標細胞を産生するIgG1の成長。実験は4LアプリコンApplikon発酵槽で行われた。攪拌速度の設定は125rpmであった。ATF-4では0.5~3作業量/日で操作された。SPRは0.03~0.08nL/細胞/日で設定された。差込図は培養の高い細胞密度を示し、凝集細胞を完全に欠いている。スピンフィルタ分離デバイスを使用したPER.C6登録商標クローンを産生するIgG1の2種類の連続的灌流発酵のIgG1対培養時間日の生産性。細胞保持システムとしての音響デバイスを備えた連続的灌流システムにおけるPER.C6商標細胞を産生するIgG1の生産性。細胞保持システムとしてのATFユニットを備えた連続的灌流システムにおけるPER.C6登録商標細胞を産生するIgG1の生産性。灌流方法を使用して培養されたPER.C6登録商標の細胞培養時間日対流L/日および比環流量nl/細胞/日でのSPR。実施例2に記載された手順を使用した生存細胞密度および細胞生存率。<概要>異なるタイプの灌流で得られたデータの要旨については表1を参照。ATFユニットを使用した連続的灌流実験は、非常に高い細胞密度および生成物濃度100×106細胞/mLおよび0.9g/L/日を達成する大きな可能性を示すが、PER.C6登録商標細胞の凝集は観察されなかったと結論づけることができる。[実施例2:灌流によるPER.C6登録商標細胞の培養]<機器>:B.ブラウンBraun発酵槽制御ユニットブラウンBraun、ドイツ、7LブラウンBraun管、および付随pH、溶解酸素DO、およびレベルセンサプローブブラウンBraun、ドイツを備えたヘッドプレート、ATF-4制御ユニット、および付随中空繊維膜モジュールリファインテクノロジーRefineTechnology、米国USA。<フィルタ>フィルタモデル:CFP-2-E-8SIPタイプ:0.2ミクロン面積:4600cm2アマシャムバイオサイエンスAmershamBioscience<作業量>設定点:4.1L範囲:3.8-4.7L<流出率>バイオマス除去はこの方法には適用されなかった。<材料>:EX-CELL商標VPRO培地JRHバイオサイエンスBioscience、米国USA、12Na2CO3中6mM最終濃度L-グルタミンジブコGibcoを使用してpHを制御する。<細胞系および培養条件>モデルIgGを発現するPER.C6登録商標細胞系を本試験で検討した。PER.C6登録商標細胞系は、網膜由来初代ヒト細胞から産生された。PER.C6登録商標細胞系は、完全なヒトモノクローナル抗体グリカンを含む参考文献1、参考文献2を産生することが可能である。エアレニマーErlenymerフラスコを110rpmおよび36.5°C下に攪拌して細胞を培養した。これらのフラスコのヘッドスペースを5CO2/空気の混合物を使用して制御した。参考文献1:ジョーンズJones,D.H.、バンベルケルvanBerkel,P.H.C.、ログテンベルクLogtenberg,T.、およびバウトBout,A.2002年PER.C6celllineforhumanantibodyproduction、Gen.Eng.News22、50-54頁。参考文献2:ジョーンズJones,D.ら、2003年、High-levelexpressionofrecombinantIgGinthehumancelllinePER.C6、Biotechnol.Prog.19、163-168頁。<発酵槽の操作>溶解酸素圧、pH、温度、および攪拌速度が下記の通り制御された発酵槽で細胞を培養した。<方法の説明>:接種生存細胞密度範囲0.2-0.5×106細胞/mlおよび設定点0.3×106細胞/mlの発酵槽で細胞を接種する。灌流は、2×106細胞/mlを上回る生存細胞密度または培養の5日時点のいずれかが最初に達成されると開始される。灌流量は、培養の細胞密度に依存し、使用される灌流量は以下の表に記載されている。流量および希釈率は、発酵槽内の細胞密度の増大に応じて調節される。本実施例からの実際のデータおよび結果とりわけ本実施例において使用された流量および比灌流量は、以下の表2および図7および図8に示されている。"