アッセイパネルを含む構成物であって、当該パネルが2つ以上の蛋白-蛋白相互作用についてのアッセイを含む構成物。試験化合物又は試験化合物類を分析する方法であって、当該方法が、アッセイパネルを構築する工程、ただし、当該パネルは2つ以上の蛋白-蛋白相互作用のアッセイを含む;当該パネル中の当該アッセイの活性に対する化合物又は化合物類の作用を試験する工程;当該アッセイの結果を利用して望ましい活性を有する化合物を同定する工程、を含む方法。化合物について安全性プロファイルを確立するための方法であって、当該方法が、当該化合物を1つ以上の蛋白-蛋白相互作用に対して試験する工程、当該化合物の各々について活性プロファイルを評価する工程;及び当該プロファイルを既知の安全性プロファイルを有する薬物のプロファイルと比較する工程、を含む方法。既知の薬物について新しい治療上の適応を同定するための方法であって、当該方法が、既知の薬局方から薬物を選択する工程;当該薬物を2つ以上の蛋白-蛋白相互作用に対して試験する工程;工程から得られた結果を利用して新しい活性を有する薬物を同定する工程、を含む方法。薬物毒性を予測するアッセイを確立するための方法であって、当該方法が、1つ以上のハイコンテントアッセイに対する1つ以上の毒性化合物の作用を試験する工程;及び当該試験の結果を利用して毒性を予測するアッセイを同定する工程、を含む方法。ハイコンテントアッセイパネルであって、当該アッセイパネルの少なくとも1つのメンバーが既知の毒物に反応するアッセイパネル。ハイコンテントアッセイパネルであって、当該アッセイパネルの少なくとも1つのメンバーが既知の薬物に反応するアッセイパネル。毒性化合物に反応するアッセイを利用して新規の化合物又はライブラリーをスクリーニングする、請求項3に記載の方法。薬物毒性の基礎にある経路を同定するための方法であって、当該方法が、1つ以上の蛋白-蛋白相互作用に対する1つ以上の毒性化合物の作用を試験する工程;及び当該試験の結果を利用して、毒性に関連した蛋白-蛋白相互作用を同定する工程、を含む方法。毒性化合物に反応する蛋白-蛋白相互作用がアッセイ中に使用される請求項7に記載の方法。請求項6に記載の方法であって、当該アッセイを利用して新規の化合物又はライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法。試験化合物をプロファイリングするための方法であって、当該方法が、細胞ベースのアッセイのパネルを構築する工程、ただし、当該パネルは2つ以上の蛋白-蛋白相互作用のアッセイを含む;当該パネルを当該化合物に接触させる工程;当該パネル中の蛋白-蛋白相互作用の量又は細胞内位置を測定する工程;工程の結果を利用して薬理学的プロファイルを構築する工程、を含む方法。アッセイパネルであって、当該アッセイパネルが2つ以上のハイコンテントアッセイで構成され、当該ハイコンテントアッセイの少なくとも1つが、細胞経路を変調させることが知られている薬剤の存在下で行われるアッセイパネル。蛋白-蛋白相互作用についてのアッセイであって、各相互作用の少なくとも1つのメンバーが表1に示されるリストから選択されているアッセイ。細胞又は細胞株のコレクションであって、当該細胞又は細胞株が第1の蛋白及び第2の蛋白を含み、当該第1の蛋白が合理的に分析されたレポーターの第1のフラグメントに操作可能に結合されており、第2の蛋白が合理的に分析されたリポーターの第2のフラグメントに操作可能に結合されているコレクション。本発明の課題及び効果薬物、薬物候補及び薬物リードの大規模な薬理学的プロファイリングのための方法を提供することが本発明の課題である。さらに、ゲノム全体に渡る規模での化合物の活性、特異性、能力、時間経過及び作用機序を評価する方法を提供することも本発明の課題である。また、生細胞の状況における化合物の選択性を測定できるようにすることも本発明の課題である。問題の細胞の生物学的状況における化合物のオフ経路作用の可能性、副作用又は毒性作用の検出を可能にすることも本発明の別の課題である。望ましい薬理学的プロファイルが得られるまで、反復方式でリード化合物のコレクション又はシリーズの薬理学的プロファイリングを行なうことにより、リード最適化を可能にすることが本発明の別の課題である。さらに、望ましくない作用又は毒性作用を有する薬物候補のふるい落としを可能にすることも本発明の課題である。さらに、新規の薬物候補のための前臨床の安全性プロファイルを確立することも本発明の課題である。さらに、臨床試験に先立って副作用、毒性作用、又は他のオフ経路作用を同定することにより、創薬プロセスの効率を改善することも本発明の課題である。さらに、臨床試験に先立って副作用、毒性作用、又は他のオフ経路作用を同定することにより、クラス中1位の薬物の安全性を改善することも本発明の課題である。さらに、予定された特性を有するデザイナードラッグの開発に適した方法を提供することも本発明の課題である。既知の薬物について新しい効能の同定を可能にすることが本発明の別の課題である。任意の生化学経路における任意のクラスの薬剤の活性を分析する方法を提供することが本発明の別の課題である。さらに、薬物毒性の基礎となる生化学経路の同定を可能にすることも本発明の課題である。さらに、広範囲の疾患において薬物の有効性の基礎となる生化学経路の同定を可能にすることも本発明の課題である。さらに、創薬と評価に有用なハイコンテント法、アッセイ及び構成物を提供することも本発明の課題である。薬理学的プロファイリングに適した蛋白-蛋白相互作用のパネルを提供することが本発明の別の課題である。本発明は、任意の問題の経路、遺伝子、遺伝子ライブラリー、薬物標的クラス、レポーター蛋白、検出モード、合成又は天然産物、化学物質、アッセイフォーマット、自動器機使用又は細胞のタイプに広く適用可能であるという利点を持つ。発明の要約本発明は、医薬上の発見のための上記の要件を満たすことを目指すものである。薬理学的に活性な薬剤の作用機序、選択性、及び副作用又はオフ経路作用を同定するために細胞ベースのアッセイを使用することができることを本発明は開示する。本発明は細胞ベースのアッセイ、特に蛋白-蛋白相互作用アッセイを用いた薬物分析及び薬理学的プロファイリングを実行するための一般的な戦略を提供するものである。さらに、本発明はこれらの目的を果たすために有用な広範な方法及び構成物を提供するものである。細胞応答は細胞内の区画中に存在する蛋白の複雑なネットワークによって媒介されている。細胞増殖、細胞死、化学走性、転移などはすべて蛋白-蛋白相互作用に関与する蛋白のレベルで制御されている。本発明の主題は、生化学ネットワーク上の化合物の作用の定量分析を可能にする方法である。本発明は、薬物クラス又は標的クラスにかかわらず任意の化合物の作用の分析を可能にする。本発明の新規の方法により以下のことが可能になる:特定の細胞応答の分子構造の、そのような細胞構造を可能にしている個々の蛋白-蛋白相互作用のレベルにおける、直接的な視覚化;以前には不可能であった方法による細胞のシグナル伝達ネットワーク上の薬物作用の直接的定量分析;及びリード化合物及びリード薬物のそれらの作用機序に無関係な、定量的かつ予測的な薬理学的プロファイルの作成。本発明の好ましい態様は、問題の特定の蛋白をコード化する遺伝子を使用するが、特性決定された完全長cDNAが好ましい。この方法は、しかしながら、部分的なcDNA又は蛋白ドメインも使用することができるので、完全長クローンに限定されるわけではない。蛋白-蛋白相互作用の測定を可能にするレポーター又はレポーターフラグメントのタグを付けたcDNAを、適当な発現ベクター中に挿入し、融合蛋白を問題の細胞中に発現させる。しかしながら、内在性の細胞遺伝子を、例えば非相同性組換えによってゲノムにレポーター又はレポーターフラグメントのタグを付けることにより使用することもできる。後者の場合、天然の蛋白が、天然の蛋白-蛋白複合体の検出を可能にする選別用レポータータグと共に発現される。上記の方法は、蛋白-蛋白相互作用を測定する方法及び/又は等価の経路標識のための、ハイコンテントアッセイ法を必要とする。好ましい態様では、蛋白相互作用は細胞内で測定される。そのような方法としては、FRET、BRET、2ハイブリッド法又は3ハイブリッド法、酵素サブユニット相補性法、及び蛋白フラグメント相補性法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。他の態様では、相互作用は組織切片、細胞ライセート又は細胞抽出液若しくは生物抽出液中で測定される。後者の場合、蛋白-蛋白複合体の測定のために広く多様な分析法を使用することができ、例えば、免疫組織化学的検査;ウエスタンブロット;免疫沈降及びそれに続く2次元ゲル電気泳動;質量分光法;リガンド結合法;量子ドット若しくは他のプローブ;又は特定の蛋白-蛋白複合体を定量する他の生化学的方法がある。このような方法は当業者に周知である。異なる蛋白-蛋白相互作用の測定に単一の技術を適用する必要はないことが強調されるべきである。任意の数及びタイプの定量的アッセイを本発明と共に組み合わせて使用することができる。酵母菌2ハイブリッド法は本発明と共に使用することができるが、Y2Hのいくつかの特徴により直接蛍光分析法よりも有用性が低い。第一に、Y2Hは酵母細胞のような細胞の核の中に、問題の蛋白の発現を必要とすることが多く、それはほとんどのヒトの蛋白については不自然な状況であり、受容体のようなヒトの膜蛋白には全く使用できない。第二に、酵母菌は創薬において関心が持たれるヒトの生化学経路を含んでおらず、そのため新規の薬物となる可能性のある標的蛋白を経路ベースで発見及び確認することができない。第三に、蛋白-蛋白相互作用を直接中断させる化学物質を除けば、Y2Hは哺乳動物の生化学経路を中断させる活性分子の薬理学的同定において役に立たない。酵素-フラグメント相補性法及び蛋白-フラグメント相補性法は本発明において好ましい態様である。これらの方法は、生細胞内の蛋白-蛋白複合体の定量化及び細胞内位置特定を可能にする。酵素フラグメント相補性法では、蛋白をβ‐ガラクトシダーゼの天然の又は変異体のアルファ/ベータサブユニットのような酵素サブユニットへの融合体として発現させる。PCAでは、蛋白を合成ポリペプチドフラグメントへの融合体として発現させるが、その場合、ポリペプチドフラグメント自体は、蛍光性又は発光性部分ではない;自然発生のものではない;及び、レポーターの断片化によって作られるものである。Michnickらは、PCAでは問題の任意のレポーター蛋白を使用することができることを教示しており、それには上記のレポーターのいずれもが含まれる。すなわち、PCAに適したレポーターとしては、それらに限定されるものではないが、多数の酵素、及び蛍光性、発光性又は燐光性の蛋白のいずれもが挙げられる。単量体酵素及び単量体蛍光性蛋白を含む小さな単量体蛋白がPCAには好ましく、これらは小さなフラグメントをもたらす。Michnickらによって確立された原理を使用していずれのレポーター蛋白も断片化することができるので、細胞型、標的、シグナル伝達プロセス及び選択された機器使用による特定の要求にアッセイを適合させることができる。最終的に、広範囲のレポーターフラグメントから選択できることにより、蛍光性、発光性、燐光性、又は他の検出可能なシグナルの構築、及びハイコンテント又はハイスループットアッセイフォーマットの選択が可能になる。先に示したように、PCA用の組換えポリペプチドフラグメントは個別に蛍光性又は発光性を示すものではない。PCAのこの特徴が、蛋白にGFP又は他の発光体のタグを付けたUS6518021のような、蛍光性分子又は発光体で蛋白にタグを付けることを含む他の発明との相違を示す。PCAフラグメントは発光体ではなく、個々の蛋白の再分布のモニタリングはできない。対照的に、PCAで測定されるのは2個の蛋白の間の複合体形成である。本発明は、分析用に選ばれるタイプの細胞、体液又は抽出液に制限されるものではない。細胞のタイプは、哺乳動物細胞、ヒト細胞、バクテリア、酵母菌、プラント、真菌又は他の任意の問題の細胞のタイプでもよい。上記細胞はまた、細胞株、又は肝細胞のような一次細胞でもよい。上記細胞は、無傷の組織若しくは動物の成分、又は体外移植片若しくは異種移植片のような全体のものでもよく、或いは、体液又は器官から単離したものでもよい。例えば、本発明をバクテリア中で使用して、重要な経路を遮断する抗菌剤を同定することができ、重要な経路を遮断する抗真菌剤を同定するために真菌中で使用することもできる。本発明は、哺乳動物又はヒトの細胞中で、疾患に関係した経路を遮断し、オフ経路作用又は副作用を持たない薬剤を同定するために使用することもできる。本発明は、癌、糖尿病、心血管疾患、炎症、神経組織変成疾患、及び人類を苦しめる他の慢性又は急性疾患を含む、問題の任意の疾患に対する創薬に合わせて使用することができる。本発明は任意の環境、状況又はシステム中の生細胞又は組織で使用することができる。これには培養細胞、培養組織、及び生きている生物体が含まれる。例えば、本発明は、ショウジョウバエ又はゼブラフィッシュのようなモデル生物体で使用することができる。本発明はヌードマウスに使用することもできる。例えば、PCAinsideのようなラベルが付けられた蛋白を発現させるヒト細胞をヌードマウスに異種移植片として移植し、薬物又は他の化合物をマウスに投与することができる。その後、細胞を移植組織から再抽出するか、又は、マウス全身を、Xenogenから提供されるような動物生体画像システムを使用して画像処理することができる。さらに、分析すべき蛋白-蛋白相互作用を表わす蛋白融合がそのゲノム中に存在するトランスジェニック動物に、本発明を使用することもできる。任意のタイプの化合物を、ここに提供される方法で分析することができる。そのような化合物としては、活性を試験する必要がある合成分子、天然生成物、組み合わせライブラリー、既知若しくは推定上の薬物、リガンド、抗体、ペプチド、小型干渉RNA又は任意の他の化学物質が含まれる。組み合わせライブラリースクリーニング又は他のハイスループットスクリーニングキャンペーンからのスクリーニングヒットを本発明と合わせて使用することもできる。本発明は、より望ましい特性を備えたそれらの化合物を、望ましい特性が劣るそれらの化合物と比較して同定するために使用することができる。従って、本発明は、予期しない属性、望ましくない属性、又は有毒な属性を有するリード化合物の最適化及び/又はふるい落としへの使用に適している。好ましい態様はハイコンテントアッセイフォーマットであるが、すべての場合ではないとしても多くの場合にハイスループットアッセイが使用できる。化学薬剤に反応して蛋白-蛋白複合体の量が増加又は減少する場合、正味の蛍光又は発光シグナルを定量することができる。薬物に反応して蛋白-蛋白複合体の細胞内位置がシフトする事象では、個々の細胞を画像化し、蛋白-蛋白複合体から発せられるシグナル及びその細胞内の位置を検出する。これらの事象の多くの例をここに提供する。方法及びレポーターによっては、異なる状況に、より適していることもあるであろう。PCAでは、レポーターの選択により蛋白-蛋白複合体の定量化及び位置測定が可能になる。特定のレポーターが、異なる細胞タイプ、及び異なる蛋白-蛋白複合体について、より最適度が高かったり低かったりするであろう。多くの場合、蛋白-蛋白複合体の量はその複合体中の個々の蛋白の量の増減の結果として増減するであろうことは当業者が認めるところであろう。同様に、蛋白-蛋白複合体の細胞内の位置は、その複合体中の個々の蛋白の細胞内の位置のシフトの結果として変化することもありうる。そのような場合、複合体又は複合体の個々の成分のいずれかを評価することができ、結果は同等なものになるであろう。個々の経路標識に関するハイコンテントアッセイは、問題の蛋白に操作によりリンクさせた緑色蛍光蛋白のような蛍光体又は発光体のタグを蛋白に付けるか;より新しい、SNAPタグ及びHaloタグを含む自己標識法によるか;又は、セルシグナリングテクノロジーズ社ベクトンディキンソン及び他の多くの供給元から提供される、蛋白特異抗体又は修飾特異抗体を使用して、細胞生物学の分野で周知の免疫蛍光法を用いることにより、構築することができる。このような方法及び試薬はここに提供される蛋白-蛋白相互作用と合わせて使用することができる。特に、表12にリストされたものを含む個々の蛋白を本発明の薬理学的プロファイリングのためのハイコンテントアッセイを構築するために使用してもよい。本発明はさらに、細胞内の変調可能な経路に対する試験化合物の作用を検出するための戦略及び方法を提供するものである。経路を変調させる戦略は、任意の細胞タイプ及び任意の測定可能なパラメーター又はアッセイフォーマットと合わせて薬理学的プロファイリングに適用することができる。試験化合物は基本となる条件下では重要な作用を持たないかもしれないが、それらの作用は試験化合物及び、それに次いで経路変調剤で細胞を処理することにより検出できる。この戦略により本発明の感度が改善される。例えば、ある例では、試験化合物は基本条件下で効果を示さないかもしれないが、経路が活性化又は抑制されるかいずれかの条件下では明白な効果を示すことがある。経路を変調する戦略の例を、ここではGPCR経路、サイトカイン経路及びDNA損傷応答経路について示す。任意の数の細胞経路を既知の変調剤によって活性化又は抑制することができ、それらは薬理学的プロファイリングの感度を改善するために使用することができる。ここに提供される方法及びアッセイは、アッセイフォーマットや小型化について柔軟に対応できるような、マルチウェルフォーマット、微量定量プレート、マルチスポットフォーマット、又はアレイで行ってもよい。アッセイフォーマット及び検出モードの選択は、分析するプロセスの生物学的状態及び複合体中の蛋白の機能によって決定される。いずれの場合でも、選ばれたレポーターによって産生されるシグナルの検出に適した任意の装置によって、本発明の対象である構成物を読み取ることができることに注目すべきである。発光性、蛍光性、又は生物発光性のシグナルは、蛍光マルチウェルプレートリーダー、蛍光活性化セルソーター及び、シグナルの空間的解析が可能な自動セルベース画像システムを含む、様々な自動及び又はハイスループット機器使用システムのいずれか1つを用いて容易に検出及び定量される。HCSを自動化するために、セロミクス社、アマシャム社、TTP社、Q3DM社、エボテック社、ユニバーサルイメージング社及びツァイス社によって開発された自動螢光画像システム及び自動顕微鏡検査システムを含む、様々な機器使用システムが開発されている。光退色後蛍光回復法及び経時的蛍光顕微鏡検査法も生細胞中の蛋白の移動性を研究するために使用されてきた。本発明はUS5989835及びUS6544790に記載されている方法と合わせて使用することもできる。発明の詳細な説明薬物のオン経路及びオフ経路作用の同定薬理学的プロファイリング全ての薬物は、生細胞中の蛋白に作用することにより影響を及ぼす。創薬の典型的なプロセスには、蛋白標的を選択し、問題の標的に対するインビトロのアッセイを確立することが含まれる。創薬の標的選択フェーズに続いて、その標的に対して望ましい作用を発揮する化合物の同定、スクリーニング又は開発が行われる。これは、化学薬品及び他の化合物のライブラリーのハイスループットスクリーニング;標的の結晶化及び、標的上の結合部位に適合するような化合物を設計するためのシリカ法又は湿式法;又はこれら及び類似の方法の組合わせのいずれかにより達成される。使用される方法にかかわらず、化合物には既知の標的、活性又は作用が常に存在する。しかしながら、ほとんどすべての場合、薬物及び薬物候補は生細胞と接触すると未知の作用を及ぼす。そのような未知の作用は、生細胞の生化学的環境を構築する何千もの蛋白の状況下において分子の特異性が不足している結果として起きている。場合によっては、これらの未知の作用が、その薬物が何百何千もの患者に投与されるまで見られなかった有害な生物学的結果又は毒性をもたらしうる。医薬品産業の中心的な課題はヒトにおいて安全かつ有効な薬物を開発することである。安全性と有効性の間のバランスを達成することは、臨床試験で薬物の75が脱落することで証明されるように、通常困難なことである。多くの場合、ある薬物は完全に安全であるが、それが意図される患者集団に対して評価しうるほどの利益を提供できるほど、特別の条件下で十分な有効性は持っていない。あるいは、ある薬物は効き目はあるが、長い期間にわたって多数の患者を研究するまで明らかにならないような長期的な副作用を有する。急性及び慢性の毒性が市場からの薬物の撤退につながることがあり、そのような例はトログリタゾン及び他の薬物を含めて多数ある。従って、医薬品産業は臨床試験に先立って、薬物の選択性及び副作用の可能性を推測する意図からかなりの研究開発費を費やしている。しかしながら、薬物選択性をプロファイリングする方法は現在のところ非常に限られている。そこで本発明者らは、ゲノム全体に渡る規模で薬物のオン経路及びオフ経路作用の迅速な同定が可能になるような方法を探究した。複合体を形成する細胞内蛋白の例細胞内の全ての蛋白は他の多数の蛋白と接触すると考えられる。さらに、細胞内には多くの経路が存在すると考えられており、それらは条件に応答するか又は特別の細胞表現型を機能させるために協力して働く蛋白の組織された集合を表わしている。図2は、蛋白-蛋白相互作用に関与する蛋白のクラスの例を提供するものである。これらの細胞内蛋白-蛋白相互作用のうちのあるものは構成性であり、すなわちそれらは外部刺激、環境条件又は他の変調因子に応答しない。応答するという表現により、ある動揺に反応して特別の蛋白-蛋白相互作用が増加、減少、又は細胞内分布若しくはパターンの変化を受けることを意味する。しかしながら、ほとんどではないとしても、多くの相互作用は生細胞中のある種の条件下で変調される。例えば、ある種の蛋白-蛋白相互作用は、アゴニスト、ホルモン若しくは生長因子が受容体に結合してシグナル伝達カスケードを誘導することによるか、又は細胞内の蛋白若しくは酵素を活性化する小分子により誘導される。他の相互作用は、例えば拮抗剤若しくは抗体が受容体に結合して、それによりシグナル伝達カスケードを遮断することによるか、経路にとって不可欠な蛋白をコード化する遺伝子を沈黙させるsiRNAにより、又は経路内の特別の蛋白を阻害する薬物により阻害されることもある。これらの例は、本発明の幅を例示するのが目的であって、本発明の実施について制限を加えるものではない。薬理学的プロファイリングのためのプロセス薬物分析プロセスの概略を図4に示す。工程1は、プロファイリングすべき化合物、薬物候補又は薬物の選択に関する。工程2は、試験すべき蛋白-蛋白相互作用の選択に関する。これらは既知又は新規の相互作用する蛋白でもよい。相互作用する蛋白は合理的に、例えば経路若しくは相互作用蛋白ペアの予備知識により、又は経験的に、同定又は選択することができる。例えば、相互作用蛋白は、ベイト対ライブラリースクリーニング又はペア式相互作用マッピングを含む1個又は複数の方法により同定することができる。さらに、無限の数の蛋白-蛋白相互作用アッセイを単純にランダムに構築することができ、任意の数の薬物又は化合物とのそれらの反応性に関して経験的に試験することができ、その結果を薬理学的プロファイルに組み入れることができる。薬理学的プロファイリングに使用できる蛋白-蛋白相互作用のタイプ、数又は同一性に実質的な制限はない。哺乳動物の細胞には何十万もの蛋白-蛋白相互作用が起きているものと思われる。しかしながら、あるものは構成性であり、他のあるものは余分なものであろう。構成性の相互作用、すなわち、薬物、アゴニスト、又は他の作用因子に応答しない相互作用は、薬理学的プロファイリングには役立たないであろう。幸運なことに、相互作用に関するアッセイを単純に構築し、ここで考察する多くのアッセイタイプのうちの1つを使用して、一連の薬物又は他の化合物に対する反応性を試験することにより、特定の蛋白-蛋白相互作用がプロファイリングに役立つかどうかを経験的に判断することができる。余分の相互作用とは、別の相互作用によって提供される情報と全く異ならない情報を提供する相互作用である。蛋白間の相互作用が次第にマッピングされて、ここで提供される方法に基づく完全な予測用アッセイのパネルを構築することが最終的に可能になるであろう。そのようなパネルによって、任意の化合物を試験して、生細胞中のすべての経路に対するその化合物の完全な活性スペクトルを確定し、また有害な効果を示唆する何らかのオフ経路活性を調べることが可能になるであろう。薬理学的プロファイリングの工程3は2個以上の蛋白-蛋白相互作用についてのアッセイを構築することに関する。そのようなアッセイを構築するのにふさわしい方法は広く普及しており、本発明の背景に詳細に述べてある。免疫捕捉法とともに2ハイブリッド法やFRET法を含むそのような方法は文献中に十分立証されており、相互作用する蛋白ペアが適切に選択されて、問題の化合物又は薬物によるシグナル強度又は位置の変化を検出し定量するのに十分なだけの感度がその方法にあれば、本発明に簡単に適合させることができる。フラグメント相補性アッセイの場合、アッセイは以下のスキームに従って構築される。調べようとするシグナル伝達ネットワーク用に、選択された蛋白-蛋白ペアの各メンバーを、適当なベクター中へ、PCAレポーター分子をコード化するレポーターフラグメントとのインフレームな遺伝子融合体としてクローニングし、適当な細胞株中にトランスフェクションされた際に、細胞の中で続いて発現されるコード化された蛋白が、選択された元のcDNA中にコード化されている蛋白のアミノ末端又はカルボキシ末端のどちらかに蛋白フラグメントを有するようにさせる。アッセイは一時的なトランスフェクション又は安定した細胞株若しくは感染体を使用して、例えば問題の蛋白を発現させるように設計されたレトロウイルス又はアデノウイルスを用いて、問題の相互作用の検出が可能になるように構築することができる。薬理学的プロファイリングの工程4では、各化合物又は薬物を各蛋白-蛋白相互作用に対して特定の時点及び薬物濃度にて試験する。各薬物結果を対照の値と比較する。工程5で、アッセイの結果を組み合わせて各化合物の薬理学的プロファイルを確立させる。結果は様々な方法で表示することができる。ここに提示した例では、本発明者らは薬理学的プロファイルを描くためにマトリックスディスプレイ及び又はヒストグラムを使用した。マトリックスの場合には、各スクリーンの結果を、赤色がシグナル強度又は位置の減少を表し緑色が増加を表すような色彩コードマトリックスで描くこともできる。赤色及び緑色の異なる濃淡を変化の強度を描くために使用することができる。このように、ディスプレイはマイクロアレイ実験のそれと同様である。経路分析に適したソフトウェアを使用して、薬理学的結果が上流及び下流での事象並びにそれらの事象に関連する薬物を示す図表に翻訳されている経路マップを作成することができる。適当な経路分析ソフトウェアはインジェニュイティシステムズ、GeneGo及び他の多くの供給元から発売されている。実験プロトコール本発明を大規模に適用するために、本発明者らはアポトーシス、細胞周期、DNA損傷反応、GPCRシグナル伝達、分子シャペロン相互作用、細胞骨格調節、プロテアソーム分解、有糸分裂誘発、炎症、及び核ホルモン受容体経路を含む重要な細胞プロセスを制御する経路について多数のアッセイを構築した。蛋白-蛋白複合体は、十分に特性決定された経路内の異なる階層的レベルでの相互作用を代表するように選択した。調べた経路の例、及び様々な標的についてのアッセイの例を、薬物、毒物及びリード化合物の予期された作用及び予期しない作用の例とともに、本発明の図7ないし15に表した。本発明者らはこの手法の普遍性を強調するために広範囲の経路、蛋白、薬物及び標的クラスを扱った。調査した特定の蛋白の詳細を以下の表1ないし3に示す。任意の蛋白相互作用について、その相互作用に対する動的なアッセイを構築することができさえすれば、本発明が使用できることに注目することが重要である。さらに、細胞ベースのアッセイのための我々の経路変調戦略を含む本発明の特別の要素は、細胞中の蛋白複合体の、又は個々の蛋白でも、任意の測定パラメーターに適用することができる。ヒトのシグナル伝達ネットワーク上の薬物作用を評価するために、本発明者らはヒト細胞株にハイコンテントアッセイを用いて薬物作用を分析した。このアッセイでは異なる条件下での特定のシグナル伝達の分岐点の活性を調べることが可能であり、活性は経路ネットワーク内の時間及び空間のレベルでモニターすることができる。この戦略を大規模に適用するために、本発明者らはアポトーシス、細胞周期、DNA損傷反応、GPCRシグナル伝達、分子シャペロン相互作用、細胞骨格調節、プロテアソーム分解、有糸分裂誘発、炎症、及び核ホルモン受容体経路を含む重要な細胞プロセスを制御する経路について多数のアッセイを構築した。複数の標的クラス及び経路を代表する多様なシグナル伝達分岐点の応答を分析することにより、本発明者らはオン経路及びオフ経路の薬物活性及び薬物選択性、メカニズムベースの毒性及び一般的な毒性、並びに薬物間の関連性を正確に示すことができた。PCAスクリーンは、相互作用する2個の蛋白に融合された場合にのみ折りたたまれて活性形態になるレポーター蛋白の相補性フラグメントを使用する。蛋白-蛋白複合体は、十分に特性決定された経路内の異なる階層的レベルに生じる既知の相互作用を代表するように選択した。この例のために、本発明者らはYFPの強い蛍光性の変異体のフラグメントに基づいてアッセイを操作した。この変異体は急速にに成熟し、ヒト細胞中に低レベルで発現される完全長の蛋白間で形成される複合体の可視化、定量化及び位置測定を可能にする。発現を最小限にするという目標は、すなわち外生の蛋白による内在性経路の動揺の可能性を最小限にすることを意味した。フラグメントの合成及び構築体の調製PCA用のレポーターフラグメントはオリゴヌクレオチド合成により作成された。最初に、ポリペプチドフラグメントYFP1及びYFP2をコード化するオリゴヌクレオチドを合成した。次に、PCR突然変異誘発を変異体フラグメントIFP1及びIFP2を産生させるために使用した。IFP1フラグメントはYFP1に対応し、IFP2フラグメントはYFP2に対応する。これらの突然変異は完全なYFP蛋白の蛍光強度を増加させることが示されている。以下に述べるような、問題の遺伝子を各レポーターフラグメントの5末端又は3末端のいずれかに融合させることができる配置をとる制限部位及びリンカー配列を組込むように、YFP1、YFP2、IFP1及びIFP2フラグメントをPCRにより増幅した。レポーターリンカーフラグメントカセットは、エプスタインバーウイルスの複製起点を組込むように修飾された哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングされた。oriPは、HEK293E細胞のようなEBNA1遺伝子を発現させる細胞株中でのこれらの修飾ベクターのエピゾーム複製を可能にする。さらに、これらのベクターはSV40起点も保持しており、SV40ラージT抗原を発現させる細胞株中でのエピゾーム発現が可能である。変異したレポーターフラグメントの完全性及び新しい複製起点は配列決定によって確認された。PCA融合構築体を、多様な範囲の細胞経路に関与することが知られている多数の蛋白について調製した。問題の各遺伝子の完全長をコードする配列を、配列が確認されている完全長cDNAからのPCRによって増幅した。得られたPCR生成物をカラム精製し、指向性のクローニングを可能にするように適当な制限酵素で切断し、フレキシブルな10アミノ酸ペプチド2をコードするリンカーによりYFP1、YFP2、IFP1又はIFP2の5末端又は3末端のいずれかにインフレーム融合させた。このフレキシブルリンカーにより、融合体の配向性/配置が確実に、レポーターフラグメントを隣接部に運ぶのに最適なものとなる。宿主株であるDH5alpha又はXL1BlueMR中の組換え体を、コロニーPCRによってスクリーニングし、正確なサイズのインサートを含んでいるクローンを、問題の遺伝子の存在と適当なレポーターフラグメントのインフレーム融合を確認するために最終配列決定にかけた。融合構築体のサブセットをプライマーウォーキングによる完全インサート配列決定用に選択した。DNAはQiagenMaxiPrepキットを使用して単離した。PCRは適当な遺伝子-特異的プライマーとレポーター-特異的プライマーを組み合わせることにより、適正な遺伝子融合体が適正なサイズで内部欠失のない状態で存在することを確認して、各融合構築体の完全性を評価するために使用した。上述の蛍光性蛋白のフラグメントはすべて、共通所有権下にある2003年12月1日出願の米国特許出願No10724178の対象であり、その出願内容を参照により本明細書にすべて含める。一過性トランスフェクションHEK293細胞を、10FBS、1ペニシリン及び1ストレプトマイシンを追加したMEMアルファ培地中で継代し、5CO2で平衡化した37°Cインキュベータ中で生育させた。トランスフェクションの約24時間前に、細胞を96ウェルのployDLysineコーテッドプレート中にマルチドロップ384ペリスタル型ポンプシステムを用いて7500細胞/ウェルの密度で接種した。最大で100ngの相補性YFP又はIFPフラグメント融合ベクターをFugene6を用いて製造元のプロトコールに従って共トランスフェクトした。この研究でスクリーニングして選択したPCAペア、並びに対応する遺伝子及びレポーターフラグメント情報を表2にリストした。24時間又は48時間の発現の後に、細胞を下記に述べるような薬物のパネルに対してスクリーニングした。安定細胞株いくつかの相互作用のために、安定細胞株を作成した。p50p65及びIkBap65については、HEK293細胞をYFP2p65融合ベクターを用いてトランスフェクトし、100μgmlハイグロマイシンBを使用して安定細胞株を選択した。続いて、選択された細胞株を、YFP1p50又はIκBαYFP1でトランスフェクトし、YFP1p50YFP2p65及びIκBαYFP1YFP2p65を発現させる安定細胞株を単離し、50μgmlハイグロマイシンB及び500μgmlゼオシンを用いた二重抗生剤選別を行った。b2ARBアレスチンについては、HEK293細胞をYFP1βアレスチン融合ベクターを用いてトランスフェクトし、1000μgmlゼオシンを使用して安定細胞株を選択した。続いて、選択された細胞株をベータ2ARYFP2融合ベクターでトランスフェクトし、YFP1ベータアレスチンベータ2ARYFP2を発現させる安定細胞株を単離し、200μgmlハイグロマイシンB及び500μgmlゼオシンを用いた二重抗生剤選別を行った。Akt1PDK1については、HEK293細胞をYFP1Akt1及びPDK1YFP2融合ベクターを用いて共トランスフェクトし、1000μgmlゼオシンを使用して安定細胞株を選択した。すべての細胞株において、蛍光シグナルは少なくとも25回の継代にわたって安定であった。薬物処理の約24時間前に、細胞を96ウェルのployDLysineコーテッドプレート中にマルチドロップ384ペリスタル型ポンプシステムを用いて接種した。薬物試験HEK293細胞は最大で100ngの相補性融合ベクターでFugene6を用いて製造元のプロトコールに従って共トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間又は48時間後に、細胞を以下に述べるようにデュプリケイトのウェル中で薬物に対してスクリーニングした。p50p65、betaArr2beta2AR及びAkt1Pdk1での薬物試験では、安定細胞株を薬物処理の24時間前に接種した。107個の異なる薬物を1つ以上の時点においてデュプリケイトで49個の別個のアッセイについて試験した。薬物濃度は公表されている細胞のIC50の約3倍になるように選択し、HEK293細胞において毒性が無いことを確実にするために試験した。液体を扱う工程はすべてバイオメックFXを使用して行なった。PCAペアを発現する細胞は、薬物を含む細胞培養培地中で30分、90分及び8時間、又はDNA損傷応答経路の場合には18時間インキュベートした。ある種の経路については、細胞を最初に薬物で処理し、その後、アゴニストで刺激して経路を誘導させた。このようにして、アゴニストに依存した経路を遮断する薬物を同定することができた。薬物処理の後、細胞を33μgmlヘキスト33342及び15μgmlテキサスレッド共役-小麦胚芽アグルチニン、で同時に染色し、2ホルムアルデヒドで10分間固定した。続いて細胞をHBSSですすぎ、画像収得の間は同じバッファー中で維持した。蛍光画像分析ロボットアームを備えたディスカバリー1自動蛍光画像処理機を用いて、細胞画像を得た。1ウェル当たり4個のオーバーラップしない細胞集団の画像を得るために以下のフィルターセットを使用した:励起フィルター48040nm、発光フィルター53550nm;励起フィルター36040nm、発光フィルター46530nm;励起フィルター56050nm、発光フィルター65040nm。各ウェルについて4個のスキャンが得られ、各スキャンは150300個の細胞を表わした。各波長に一定の露光時間を使用して、所定のアッセイのための全ての画像を得た。16ビットのグレイスケールTIFFフォーマットでの生の画像を、ImageJAPIライブラリーからのモジュールを使用して分析した。最初に、各蛍光チャンネルからの画像をImageJビルトインローリングボールアルゴリズムを使用して標準化した。PCAがそれぞれ特定の細胞内区画又は細胞小器官内にシグナルを発生させ、薬物処理が複合体の位置又はシグナル強度の変化をもららすことになるため、膜、核又は細胞質ゾルに局所化された蛍光シグナルを正確に計量するには異なるアルゴリズムが必要とされた。各アッセイを蛍光シグナルの細胞内位置によって分類し、各サンプル母集団中のシグナル強度の変化を4個の自動画像分析アルゴリズムのうちの1つを使用して定量した。アルゴリズム1:細胞全体を通じての蛍光の平均値の変化を、自動閾値処理されたヘキスト、テキサスレッド又はYFP画像に基づいてマスクを生成した後に定量した。閾値処理していないYFP画像から得られたヒストグラムを全体的なバックグラウンドを定義するために使用した。3個のマスクすべてをオーバーレイしたものが個々の粒子を規定した。YI中の陽性のピクセルはスキャン中のすべての陽性粒子の平均ピクセル強度を計算するためにサンプリングされた。アルゴリズム2:核に限定された蛍光の変化を測定するために、核マスク中に存在するユーザ定義のゲート値以上のピクセルをすべてYIからサンプリングし、平均核蛍光及び核蛍光総計を測定して、結果としてNucSum又はNucMeanを得た。アルゴリズム3:蛍光総計の母集団変化を測定するために、ユーザ定義のゲート値以上のピクセルをすべてYIからサンプリングし、平均蛍光総計及び蛍光総計を測定して、結果としてBulkSum又はBulkMeanを得た。アルゴリズム4:膜における蛍光の変化を測定するために、閾値処理したテキサスレッド画像に基づくマスクを使用して、膜領域中のピクセルをサンプリングした。マニュアルで確立されているゲート値以上の膜関連ピクセルをサンプリングして、平均膜蛍光を測定した。すべてのアルゴリズムについて、データは平均値を計算する前に全体的なバックグラウンドに対して補正した。各アッセイについて、画像の試験セットが作成された。各セットは、賦形剤のみで処理した細胞の画像及びシグネチャー化合物で処理した細胞の画像が含まれた。画像中の蛍光を各アルゴリズムで定量し、結果をその画像のマニュアルスコアと比較して、処理サンプルと対照の間の差を定量するために最も適したアルゴリズムを割り出した。各アッセイにおける各処理の効果を、賦形剤対照の結果と比較した。アルゴリズム1によって作成されたデータに対して、PPMは少なくとも8個のスキャンから各データポイントについてプールした。全サンプルについてPPMを計算するのに先立ち、グループの範囲外になる粒子を除外するためにアウトライアーフィルターを適用した。アルゴリズム24において、各サンプルのNucSum、BulkSum又はMemSumは、人為的蛍光を伴うスキャンを除外するために2SDフィルターを適用した後の薬物に対して少なくとも8個のスキャンからの平均値を表わす。薬物試験の結果はシグネチャー薬物について最低3回の別個の実験で繰り返され、反復実験間で一致を示した。マトリックス及びクラスタリングマトリックスにおいて、横列はそれぞれ特有の薬物を表わし、カラムはそれぞれ特定の時点におけるTNFalpha、CPT又はイソプロテレノールのような経路変調剤の非存在下又は存在下での特有のアッセイを表わす。各データポイントは対照に対するサンプルの比率の対数を取ることにより形成されている。すべての列及びカラムは同等の比重を持つ。ウォード階層クラスタリングアルゴリズム及びユークリッド距離測定法を処理のクラスタリングに使用した。表示の目的のために、マトリックス内の各データポイントは、アッセイ内の相対的な違いを例示するために色彩コード化してある。対照値に対する増加は緑色で表示され、減少は赤色で表示されている。それぞれの色はさらに2つのレベルに分けられる:レベル1、又はレベル2。レベル1はより明るい色調で表示され、レベル2はより暗い色調で表示される。結果本発明の範囲本発明者らは、本発明が薬理学的プロファイリング及び創薬のための普遍的な方法を提供するものであることを示した。この方法は問題の任意の試験化合物、薬物、毒物、薬物標的、経路又は細胞に適用することができる。広い範囲の蛋白及び経路について多数の例を図6ないし16に示す。本発明により薬物のオン経路及びオフ経路の作用の同定が可能になり、リード最適化及び選択的なふるい落としによって薬物候補の改良が可能になる。本発明は薬物リードの特性の評価、その特性の修飾、及び修飾されたリードの再試験に反復的な様式で適用することができる。この手法により、化合物の構造が特別のアッセイ結果及び薬理学的プロファイルに関連付けられた細胞構造-活性試験が可能であり、望ましい化学成分及び望ましくない化学成分の同定ができる。このように、生物系においてゲノム全体に渡る規模で化学的作用の検出を可能にするという点において、本発明は化学的ゲノミクスの一例と言える。本発明は細胞ベース又はインビトロのアッセイに使用することができるが、ここで使用する場合、細胞ベースのアッセイのほうが必要とする操作が少ない。薬物、毒物及びリード化合物のオン経路及びオフ経路作用図6は、GPCR経路における相互作用の例を示す。図7は、ユビキチンsumoプロテアソーム経路における相互作用及びそれらの経路上での薬物作用の例を示す。図8は、キナーゼシグナル伝達経路における相互作用及びそれらの経路上での薬物作用の例を示す。図9は、ヒートショックプロテイン経路における相互作用及びそれらの経路上での薬物作用の例を示す。図10は、核ホルモン受容体経路における相互作用及びそれらの経路上での薬物作用の例を示す。図11は、アポトーシス経路における相互作用及びそれらの経路上での薬物作用の例を示す。図12は、様々な経路上での薬物作用の別の例を示す。図13は、ヒストグラムで描いた薬理学的プロファイルを示す。図14は経路変調戦略をDNA損傷応答経路での結果を用いて例示している。図15は経路変調戦略をGPCR経路での結果を用いて例示している。これらの例は既知の薬物標的クラスを代表するものとして選択されている;これらの例、及び表1にリストされた相互作用は本発明の幅を例示するために提供されたものであり、本発明の範囲又は使用を制限することを意図したものではない。本発明は、任意の経路における任意の蛋白に適用することができる。蛋白相互作用及び薬物作用の例について以下で考察する。この戦略を用いると、薬物作用を薬物処理の数分又は数時間以内に見ることができ、短期的及び長期的作用の両方を測定することができる。図12は、翻訳後修飾、蛋白分解若しくは安定化、又は蛋白転座を含む既知のメカニズムによって変調される17個の既知の蛋白複合体についての代表的な画像を示す。示された薬物はそれぞれ、特定の処理時間における特定の複合体についてのシグナルの、適当な賦形剤対照と比較した場合の、増加、減少、又は細胞内位置のシフトのいずれかを引き起こした。様々な複合体の画像はそれぞれの複合体の主に膜、核及び細胞質での位置を示し、これらのアッセイのハイコンテント性及び自動顕微鏡検査法によるシグナルの細胞内局在性を解明する能力が強調されている。例えば、多くのキナーゼは、Hsp90及びCdc37のようなシャペロンと相互作用する。そのような相互作用の画像を図12に示す。HSPの薬理学的阻害剤は、クライアント蛋白の関与する多数の複合体の減量を引き起こした。例えば、Akt1Hsp90beta、Akt1p27、Cdc37Akt1及びAkt1Pdk1は全て、ゲルダナマイシン及び17AAGに対して感受性があり、HRasRaf1、Chk1Cdc25C、Cdc2Cdc25C;Cdc2Wee1;及びChk1p53も同様であった。Akt1複合体に対するゲルダナマイシン及び17AAGの作用の例を、図12、及び図9Bに示す。このように、生細胞を薬物で処理し、関心を寄せる経路中の蛋白複合体をモニターすることにより、標的に対する特異的な薬理学的作用と同様に標的間の物理的及び機能的な関連性を決定することができる。別の例では、beta2アドレナリン作動性受容体はベータアレスチンと相互作用し、続いてGPCRキナーゼによって受容体のリガンド誘導によるリン酸化が起きる。アゴニストの非存在下では、目視できるbetaArr2beta2AR複合体はなかった。アドレナリンアゴニストであるイソプロテレノールによる細胞処理は、数分以内に多数のbetaArr2beta2AR複合体の形成を引き起こした。図15中の蛍光顕微鏡写真は、クラスリン被覆ピットによる、アレスチンの受容体への結合及びそれに続く内在化の時間的経過と一致する斑点状の細胞質パターンを示している。逆アゴニストであるプロプラノロールで細胞を前処理すると、予想されるようなイソプロテレノール誘導による相互作用及びbetaArr2beta2ARの内在化が妨げられた。これらの結果は、この手法によってアゴニストとアンタゴニストの時間的な作用をそれらの既知の標的において直接検出することができることを強く示している。多くのGPCRがベータアレスチンに結合するので、これらの相互作用及び他の下流の相互作用もこの戦略を用いて調べることができる。以下の例で実証されるように、本発明の重要な特徴は経路の階層の異なるレベルで異なる薬物の作用を識別できることである。増殖細胞では、ホスファチジルイノシトール3キナーゼが細胞膜にPdk及びAktを補充する。Wortmannin及びLY294002はPI3Kの既知の阻害剤であり、Aktに対するホスホイノシチド膜受容体の合成を妨げ、それによりAktがホスファチジルイノシトール3依存性キナーゼによってリン酸化され活性化される場である膜へのAktの移動を妨げる。本発明者らは、Akt1とホスファチジルイノシトール3依存性キナーゼの間の複合体及びAkt1と、細胞周期調節において役割を果たすサイクリン依存性キナーゼ抑制剤であるp27の間の複合体を評価することにより、Aktが関与する経路上での薬物の作用を研究した。対照ウェルでは、Akt1Pdk1複合体は大部分が細胞膜に局在化したが、Akt1p27複合体は細胞核に集中した。WortmanninとLY294002は、膜から細胞質へのAk1tPdk1の迅速な再局在化とAkt1Pdk1複合体の全体量の減少をもたらしたが、Akt1p27には有意な効果を示さなかった表示せず。しかしながら、どちらの複合体もゲルダナマイシン及び17AAGに感受性を示した。これらの結果は、核の中のAkt1p27複合体のプールはAktシグナル伝達の初期段階に作用する薬物に感受性を示さないことを示唆している。Akt1Pdk1及びAkt1p27が別々の配置及び応答を示すことは、各アッセイがAktの全体的細胞内プールではなく特別のAkt複合体の生物学にのっとって、別個の細胞内プロセス及び細胞内区画での薬物の特有の作用の検出にとって重大な特徴を報告していることを例証している。上流で作用するキナーゼ抑制剤は下流での相互作用を調べることにより検出することができる。このことは図12D中に示され、そこではLY294002がCPTの存在下でp53p53複合体を誘導している。また、図8Dでは、2つの異なる非特異的キナーゼ抑制剤がHRas1Raf1複合体を縮小させている。これらの結果は両方とも、図3に図解されているネットワークプロファイリング戦略の有用性を証明するものであり、本発明によりオン経路作用と同様にオフ経路作用も検出することができることを示している。G蛋白共役受容体は、サイトカイン/成長因子受容体及び核ホルモン受容体と同様に、新薬の開発につながるような主要な標的クラスの蛋白と言える。核ホルモン受容体は、エストロゲンやテストステロンのようなステロイドの作用、レチノイド及びチアゾリジンジオンやフィブラートのような合成薬剤の作用を変調させる。核ホルモン受容体のアゴニストは、代謝疾患、糖尿病及び高脂血症の治療を含む様々な適用に向けて市販されている。図10Aは、これらの経路における相互作用、及び既知のアゴニストであるロシグリタゾンのその受容体標的であるPPARgammaへの作用のいくつかを図解している。このようなアッセイは任意の数の既知の受容体又はオーファン受容体を調べたり、試験化合物がこれらの相互作用を活性化するか抑制するかどうかを判断するために使用することができる。さらに、ロシグリタゾンのような既知のアゴニストを、図14Aに図解されている経路変調戦略と共に使用して、活性化されているこれらの経路を遮断する薬剤を同定することもできる。上記で考察したシャペロン、GPCR、核ホルモン及びキナーゼが介在する経路に加えて、図12は、動的なGTPアーゼ介在プロセス、細胞骨格、細胞周期、アポトーシス、DNA損傷応答経路及び核ホルモン受容体相互作用に関与する複合体の例を示す。これらのレポーター複合体によって検出されるようなこれらの経路に対する薬物の代表的な作用を、ここに記述する。エフェクター蛋白とのGTPアーゼ相互作用は重要な分子スイッチとして認識されている。図8D及び図13Aは、BAY117082を含む非選択的キナーゼ阻害剤に対して感受性を持っていた原型のGTPアーゼ:キナーゼエフェクター複合体を図解している。元はIKK阻害剤として同定されたBAY117082は、予想されたようにTNFalphaに応答して細胞質から核へp50p65が移動するのを遮断した。細胞骨格の形態を制御する経路に関して、LIMキナーゼ2はアクチンを解重合する因子コフィリンを不活性化する。CofilinLimk2複合体は、キナーゼ阻害剤インジルビン3モノキシムによってほぼ完全に除去された。研究した細胞周期蛋白にはCdc25C、Cdk4、サイクリンD1及びp53が含まれた。プロテアソーム阻害剤ALLNで処理すると、核の中にサイクリンD1Cdk4が徐々に蓄積される結果となり、これは26SプロテアソームによるサイクリンD1レベルの調節と一致している。イソプロテレノールはMnk1Erk2を誘導し、この結果はアドレナリンアゴニストに誘導されたMAPK活性に関する以前の報告と一致している。上に述べたように、LY294002はp53p53を増加させ、これはAktがMdm2をリン酸化して活性化し、p53のユビキチン化及び分解を増加させるという報告と一致している。最後に、リガンドにより活性化される転写因子の複合体、PPARgammaSRC1及びPPARgammaRXRalphaは、予測されたように、既知のPPARgammaアゴニストであるロシグリタゾンでの処理に反応して増加した。本発明者らはさらに、新規であるが、経路の構成についての公表された報告に一致する特定の薬物の興味深い作用を観察した。TNFalphaファミリーリガンドである蛋白サイトカインTRAILはBclxLBadを増加させた。また、プロテインキナーゼ阻害剤Goe6976はPAK4と細胞骨格蛋白コフィリンとの複合体を増加させた。酵母では、細胞が細胞周期のG2M期に進むと、Cdc42及びPAK相同体が活性化され、細胞骨格に変化が生じた。Goe6976は、チェックポイントキナーゼの強力な阻害剤であり、G2Mへの進行を促進する。従って、PAK4コフィリンのようなCdc42PAKより下流のプロセスに対してのGoe6976が介在する活性化は驚くべきことではない。本発明者らはまた、初めて転写因子及びプロリルイソメラーゼを含む核複合体の画像を明らかにしている。Pin1は、キナーゼJNKによりリン酸化及び活性化された後、Junに結合する。本発明者らは、クロフィブレートによる細胞処理の後、Pin1Jun複合体の強い抑制を観察した。PPARalphaアゴニストであるクロフィブレートは、PPARalphaとその転写の共調整因子との結合を増加させ、cJunの転写活性を低下させることが示され、これらの著者によりPPARgamma及びcJunの直接的相互作用が示唆されている。さらに、PPARgammaアゴニストはJNK経路の活性を抑制することが示されており、このことが本発明者らの観察したPin1Jun複合体の減少をもたらすものと思われる。要するに、広い範囲の標的クラス及び細胞のプロセスにおいて予期される薬物効果及び予期されない薬物効果の両方を、蛋白複合体及び薬物処理に対するその反応をモニタリングすることにより短期的及び/又は長期的な時点で検出することができた。化学的に関連性のある薬物は細胞アッセイパネル中で共通の活性を有していた。上に示した例は、蛋白複合体の空間的及び時間的な動力学を分析することにより、細胞の経路及びプロセスに対する薬物の個々の作用を測定することができることを例証している。本発明者らはこの手法を、6つの治療分野をターゲットとするか、又は細胞メカニズムの一般的な変調剤として機能する、107個の異なる薬物の薬理学的プロファイリングにも用いた。生理的な化合物用量を超えた際にしばしば観察される広範囲な標的外作用を回避するために、本発明者らは生理学的に妥当な薬物濃度に注目した。薬物を、細胞経路に対する早期の作用を捕らえるために30分から16時間に及ぶ複数の時点で試験した。例えば、いくつかの化合物は、時間経過とともにアッセイシグナルを一様に増加させ、他のあるものはシグナル強度の二相性の変化をもたらし、また、他の薬物処理の結果、時間経過とともにシグナル強度が低下することもある。すべての薬物/アッセイの結果の定量的データは、薬物及び個々のアッセイ時点の両方についてクラスター化された色彩コードマトリックスで表示されており、薬物クラスター系統図の拡大図を図17Bに示す。意外なことに、薬物が標的とする経路に関して報告しようとして意図的にアッセイを選択したわけではないという事実にもかかわらず、薬物は主に既知の構造-標的クラスにクラスター化した。この結果は、高度に枝分かれした細胞シグナル伝達ネットワーク内の蛋白複合体の動力学を評価することにより、細胞プロセス中で共有される薬物作用を解明できるかもしれないことを示唆している。報告上類似又は同等の細胞標的を持つ構造的に関連した薬物のグループについて、機能上のクラスターを作成した。これらには、プロテアソーム阻害剤、ALLN及びMG132;ベータ-アドレナリンGPCRアゴニスト、イソプロテレノール、クレンブテロール及びサルブタモール;HSP90阻害剤、17AAG及びゲルダナマイシン;並びにPPARgammaアゴニスト、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン及びトログリタゾンが含まれる。これらの例及び他の例において、観察されるクラスターを導いた薬理学的プロファイル中の類似性は、薬物グループ内で共有される構造的特徴に関係していた。毒性の基礎にあるメカニズムを研究し、かつ特定の毒性メカニズムに関連した薬理学的プロファイルを確立するために、既知の毒物をこの発明と共に使用することができる。その後、リード化合物及び他の検査薬を既知の毒物と比較して、試験化合物が同様の活性を有するかどうかを判定することができる。例えば、図16Aに示すように、塩化カドミウムは多数の経路に対して明らかな作用を示した。これらのうちのいくつかは、NFkappaBに対するカドミウムの作用のように、既知の又は予想されたものであり、これらのアッセイの中でカドミウムの予期された作用及び予期されなかった作用の両方を正確に示すことができた。図16Bに示すように、リード化合物のプロファイルをカドミウムのプロファイルと比較した。2個の特許リード化学物質はカドミウムと類似のプロファイルを示した。これらの化合物はその後、げっ歯動物に肝毒性をもたらすことが文書で証明された。本発明によるリード物質の薬理学的プロファイリングによって、動物試験の前にそれらの活性が同定され、前臨床試験にかかる時間と費用が節約されたであろう。薬物のいくつかの活性は一定の状況下では望ましいが、他の状況下では望ましくない。本発明はこれらの活性を同定するために使用することができる。図15Bは、腫瘍内科臨床用にキナーゼ抑制剤として元々設計された市販のリード化合物が、βアドレナリン作動性受容体に強力な作用を有したことを示す。この活性は意図した適用の観点からは望ましくないものであり、そのためこの化合物はふるい落とされた。その後の研究から、この化合物が確かに心臓毒性を有することが示され、それにより、本発明並びにここに提供される蛋白-蛋白相互作用及びそれらの使用方法の有用性が確認された。この結果はさらに、我々が経路変調戦略と呼ぶ本発明の重要な局面及び一般的な戦略を強調するものである。多くの細胞経路は、基本的な状態又は刺激されていない状態では活性が低いが、1つ以上のアゴニスト又は活性化剤により活性化することができる。最初に試験化合物で細胞を処理し、次にアゴニスト又は活性化剤で処理する場合、試験化合物の経路活性化を遮断する能力を測定することができる。これは図15Bで研究したリード化合物に当てはまる;すなわち、それはβアドレナリン作動性受容体を遮断し、イソプロテレノールの存在下でのみ作用は見られた。さらに、TNF依存性の経路を遮断する薬剤は、この薬剤で細胞を処理し、その後TNFで細胞を刺激することによりわかるであろう。経路変調戦略をさらに図14Bで例示し、そこでは細胞を試験化合物で処理した後にカンプトテシンで処理した。カンプトテシンは、一定期間にわたってDNA損傷を誘導し、図14Bの画像に示されるように、損傷応答経路中に様々な相互作用を誘導する。CPTの存在下における様々な化合物の作用の評価により、CPTの作用を遮断するか、又はCPTの作用を強める薬剤の検出が可能になった。これらの作用のうちのいくつかは状況に応じて望ましい時と望ましくない時があるであろう。例えば、チェックポイントキナーゼの抑制剤は、DNA損傷性薬剤と合わせて腫瘍内科臨床で使用するために開発中である。このような薬剤にとっては、CPTとの相乗効果が望ましく、それはこの戦略により検出することができる。マトリックス中に示されるように、タキソール及びテルフェナジンはこれらの経路の多くを活性化した。対照的に、ゲルダナマイシン、17AAG及びY27632はこれらの経路のいくつかにおいて逆の作用を示した。図14Bに示すように、テルフェナジンは既知の有効な抗癌剤であるパクリタキセルに見られたのと同様の様式でいくつかのDNA損傷応答経路を活性化した。このことから、テルフェナジンの潜在的な抗増殖活性の評価が促された。前立腺癌細胞株におけるテルフェナジンの研究から、ここで決定された薬理学的プロファイルに一致して、抗増殖性活性を有することが示された。従って、本発明による既知の薬物の薬理学的プロファイリングを使用して、ヒトの治療用に既知の薬物の潜在的な新規の用途、適応及び組合わせを迅速に同定することができるであろう。これは、既知の薬物に薬理学的プロファイリングを行ない、得られたプロファイルを既知の治療上の特性を持つ他の薬剤と比較することにより遂行される。試験薬剤が既知の/望ましいプロファイルを持った薬剤に類似のプロファイルを有する場合、その試験薬剤を機能アッセイで評価して、コンパレーター薬物と同じ機能を持つかどうかを判定することができる。いくつかの細胞経路は基礎状態においてオフであるが、経路のアゴニストで細胞を処理することによりオンに変えることができ、一方、他の細胞経路は基礎状態においてオンであっても拮抗剤又は阻害剤で処理することによりオフに変えることができる。例えば、基礎状態におけるAkt1Pdk1の強い細胞膜シグナルにより示されるように、血清の存在下で生育したHEK293細胞中では、Aktは細胞膜に集中し、Akt1Pdk1はオンである。例えば、問題の試験薬剤とともに、wortmannin又はLy294002のような拮抗剤又は阻害剤で、Akt1Pdk1を発現する細胞を処理することもできる。試験薬剤がアンタゴニスト又は阻害剤の作用を打ち消すことができれば、それはすなわちAkt1Pdk1シグナルを細胞膜状態に回復させるであろう。このように、本発明は別の薬剤とともに、問題の試験化合物で細胞を処理するためのものである。各経路及びアッセイについて経験的に決定される最適なプロトコールにより、問題の試験化合物を投与する前、後又は同時に追加的な薬剤を投与することができる。薬理学的プロファイリングのための経路変調戦略が、蛋白-蛋白相互作用の測定に限定されることなく、任意の個々の蛋白、又はその翻訳後修飾状態の量又は細胞内位置を含む、他の経路活性の測定に適用することができる本発明のユニークな構成要素であることは、当業者に十分理解されるであろう。プロテインキナーゼであるAkt1が、wortmannin又はLy294002に応答して、本発明者らがAkt1PDK1複合体について観察しているのと同様のパターンの細胞内再分布をとることは当業者に十分理解されるであろう。従って、Aktの細胞内位置及び再分布を測定することができるアッセイは、Akt1Pdk1複合体の細胞内位置及び再分布を測定するアッセイの代用として使用することができる。Aktの再分布に対するアッセイはBioImage社から市販されており、本発明と合わせて薬理学的プロファイリングに使用することもできる。同様に、NFkappaB複合体のp65サブユニットの再分布に対するアッセイは、本発明と合わせてp50p65複合体の測定の代用として使用することができ、実質的に同様の結果をもたらすであろう。このようなアッセイはBioImage社アッセイはGFPタグ付きのp65プロテインの発現に基づく、又はCellomics社アッセイはp65特異抗体を用いた免疫蛍光検査法に基づくのいずれかから入手可能である。最後の例として、ベータ-アレスチンの細胞内位置はベータ-アドレナリンアゴニスト及びアンタゴニストに応答して核内体にシフトする;これらのアッセイはTransFluorアッセイとして知られており、図15Aに示される受容体:アレスチン複合体の測定の代用として使用してもよい。本発明は、薬理学的プロファイリングのためにハイコンテントアッセイパネルを使用するためのものであり、そのようなパネルは蛋白複合体又は相互作用を対象としたハイコンテント又はハイスループットアッセイに加えて個々の蛋白の再分布に対するハイコンテントアッセイを含んでいてもよい。本発明者らの発明はさらに、遺伝子チップのようなこれまで利用されてきた薬理学的プロファイリング戦略の持ついくつかの限界に取り組むものである。本発明の特徴は、経路内の複数のポイントで短期的及び、より長期的な作用を捕らえることができるということである。観察したアッセイ動力学のいくつかは、特により長い時点ではアポトーシス又は細胞周期進行のような二次的又は機能的な細胞活動に対する反応であったが、より短い時点では化合物のより即時的な作用についての報告となる。複数の時点、及び経路階層内の複数のレベルでのシグナル伝達を調査することによって、問題の標的に直接関与するか又はそれに近接している変化を同定することができる。このような手法は、特別の蛋白の機能的生化学的役割を明確にし、ヒトの治療法を開発する際に最も有望な標的を同定するために必要である。有害作用を持つ可能性のある化合物の迅速な排除は同様に重要である。さらに、標的外活性の特定の生化学的性質を理解することにより、分子の望ましい又は望ましくない機能的属性に取り組むための化学構造の改良が可能になると考えられる。ここで述べる戦略は、その後の研究から排除するために化合物にフラグを立てるか、又は他の治療領域の開発に改めて向けるための有効な手段を提供するものである。以下の特許及び出版物及びそれに引用されている参考文献の内容のすべてを、個々の特許、特許出願又は刊行物がそれぞれ記載されている場合と同様の範囲で、あらゆる目的についての全ての内容を参照として本明細書に含める。US6372431CunninghametalUS6801859FriendetalUS6673554KauvaretalUS6270964MichnicketalUS6294330MichnicketalUS6428951MichnicketalUSPatentApplication20030108869MichnicketalUSPatentApplication20020064769MichnicketalUS6342345BlauetalUS5891646BaraketalUS6110693BaraketalUS6518021ThastrupetalUS5583217QuanteetalUS5516902QuanteetalUS5514561QuanteetalUS5338843QuanteetalAlessiDRCuendaACohenPDudleyDTandSaltielARPD098059isaspecificinhibitoroftheactivationofmitogenactivatedproteinkinasekinaseinvitroandinvivoJBiolChem2702748927494AndersonKECoadwellJStephensLRandHawkinsPTTranslocationofPDK1totheplasmamembraneisimportantinallowingPDK1toactivateproteinkinaseBCurrBiol8684691Angersetal2000Detectionofbeta2adrenergicreceptordimerizationinlivingcellsusingbioluminescenceresonanceenergytransferProcNatlAcadSciUSA9736843689ArlanderSJEapenAKVromanBTMcDonaldRJToftDOandKarnitzLMHsp90inhibitiondepletesChk1andsensitizestumorcellstoreplicationstressJBiolChem2785257252577BassoADSolitDBChiosisGGiriBTsichlisPandRosenNAktformsanintracellularcomplexwithheatshockprotein90andCdc37andisdestabilizedbyinhibitorsofHsp90functionJBiolChem2773985839866BouwmeesterTBauchARuffnerHAngrandPOBergaminiGCroughtonKCruciatCEberhardDGagneurJGhidelliSetalAphysicalandfunctionalmapofthehumanTNFalphaNFkappaBsignaltransductionpathwayNatCellBiol697105BrazilDPParkJandHemmingsBAPKBbindingproteinsGettinginontheAktCell111293303DaakaYLuttrellLMandLefkowitzRJSwitchingofthecouplingofthebeta2adrenergicreceptortodifferentGproteinsbyproteinkinaseANature3908891DaiKKobayashiRandBeachDPhysicalinteractionofmammalianCDC37withCDK4JBiolChem2712203022034deRuiterNDWolthuisRMvanDamHBurgeringBMandBosJLRasdependentregulationofcJunphosphorylationismediatedbytheRalguaninenucleotideexchangefactorRalpathwayMolCellBiol2084808488DempseyPWDoyleSEHeJQandChengGThesignalingadaptorsandpathwaysactivatedbyTNFsuperfamilyCytokineGrowthFactorRev14193209DiehlJAZindyFandSherrCJInhibitionofcyclinD1phosphorylationonthreonine286preventsitsrapiddegradationviatheubiquitinproteasomepathwayGenesDev11957972FryDWKrakerAJMcMichaelAAmbrosoLANelsonJMLeopoldWRConnorsRWandBridgesAJAspecificinhibitoroftheepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseScience26510931095GalarneauAPrimeauMTrudeauLEandMichnickSWAProteinfragmentComplementationAssaybasedonTEM1βlactamasefordetectionofproteinproteininteractionsNatBiotechnol20619622GardnerOSDewarBJEarpHSSametJMandGravesLMDependenceofperoxisomeproliferatoractivatedreceptorligandinducedmitogenactivatedproteinkinasesignalingonepidermalgrowthfactorreceptortransactivationJBiolChem2784626146269GiaeverGFlahertyPKummJProctorMNislowCJaramilloDFChuAMJordanMIArkinAPandDavisRWChemogenomicprofilingidentifyingthefunctionalinteractionsofsmallmoleculesinyeastProcNatlAcadSciUSA101793798GiaeverGShoemakerDDJonesTWLiangHWinzelerEAAstromoffAandDavisRWGenomicprofilingofdrugsensitivitiesviainducedhaploinsufficiencyNatGenet21278283GongLLiYNedeljkovicKurepaAandSarkarFHInactivationofNFkappaBbygenisteinismediatedviaAktsignalingpathwayinbreastcancercellsOncogene2247024709HongSLeeHYLeeYWandLeeHWApicidinahistonedeacetylaseinhibitorinhibitsproliferationoftumorcellsviainductionofp21WAF1Cip1andgelsolinCancerRes6060686074HankeJHGardnerJPDowRLChangelianPSBrissetteWHWeringerEJPollokBAandConnellyPADiscoveryofanovelpotentandSrcfamilyselectivetyrosinekinaseinhibitorStudyofLckandFynTdependentTcellactivationJBiolChem271695701HazraSXiongSWangJRippeRAKrishnaVChatterjeeKandTsukamotoHPeroxisomeproliferatoractivatedreceptorgammainducesaphenotypicswitchfromactivatedtoquiescenthepaticstellatecellsJBiolChem2791139211401HuEKimJBSarrafPandSpiegelmanBMInhibitionofadipogenesisthroughMAPkinasemediatedphosphorylationofPPARgammaScience27421002103HuangJZHHaggartySJSpringDRHwangHJinFSnyderMSchreiberSLFindingnewcomponentsofthetargetofrapamycinsignalingnetworkthroughchemicalgeneticsandproteomechipsProcNatlAcadSciUSA1011659416599HuhWKFalvoJVGerkeLCCarrollASHowsonRWWeissmanJSandOSheaEKGlobalanalysisofproteinlocalizationinbuddingyeastNature425686691IhmelsJFGBergmannSSarigOZivYBarkaiNRevealingmodularorganizationintheyeasttranscriptionalnetworkNatGenet31370377IrukayamaTomobeYMiyauchiTSakaiSKasuyaYOgataTTakanashiMIemitsuMSudoTGotoKandYamaguchiIEndothelin1inducedcardiachypertrophyisinhibitedbyactivationofperoxisomeproliferatoractivatedreceptoralphapartlyviablockadeofcJunNH2terminalkinasepathwayCirculation109904910ItoAKawaguchiYLaiCHKovacsJJHigashimotoYAppellaEandYaoTPMDM2HDAC1mediateddeacetylationofp53isrequiredforitsdegradationEmboJ2162366245KimuraYRutherfordSLMiyataYYaharaIFreemanBCYueLMorimotoRIandLindquistSCdc37isamolecularchaperonewithspecificfunctionsinsignaltransductionGenesDev1117751785KohnEAYooCJandEastmanATheproteinkinaseCinhibitorGo6976isapotentinhibitorofDNAdamageinducedSandG2cellcyclecheckpointsCancerRes633135KunathTGishGLickertHJonesNPawsonTandRossantJTransgenicRNAinterferenceinEScellderivedembryosrecapitulatesageneticnullphenotypeNatBiotechnol21559561LamphereLFioreFXuXBrizuelaLKeezerSSardetCDraettaGFandGyurisJInteractionbetweenCdc37andCdk4inhumancellsOncogene1419992004LiWZhuTandGuanKLTransformationpotentialofRasisoformscorrelateswithactivationofphosphatidylinositol3kinasebutnotERKJBiolChem2793739837406LiYandSarkarFHInhibitionofnuclearfactorkappaBactivationinPC3cellsbygenisteinismediatedviaAktsignalingpathwayClinCancerRes823692377LinFTChenWShenoySCongMExumSTandLefkowitzRJPhosphorylationofbetaarrestin2regulatesitsfunctionininternalizationofbetaadrenergicreceptorsBiochemistry411069210699LoselRandWehlingMNongenomicactionsofsteroidhormonesNatRevMolCellBiol44656LumPYACStepaniantsSBCavetGWolfMKButlerJSHinshawJCGarnierPPrestwichGDLeonardsonAGarrettEngelePRushCMBardMSchimmackGPhillipsJWRobertsCJShoemakerDDDiscoveringmodesofactionfortherapeuticcompoundsusingagenomewidescreenofyeastheterozygotesCell116121137LumPYArmourCDStepaniantsSBCavetGWolfMKButlerJSHinshawJCGarnierPPrestwichGDLeonardsonAetalDiscoveringmodesofactionfortherapeuticcompoundsusingagenomewidescreenofyeastheterozygotesCell116121137MacLeanMandPicardDCdc37goesbeyondHsp90andkinasesCellStressChaperones8114119MeiSHoADandMahlknechtURoleofhistonedeacetylaseinhibitorsinthetreatmentofcancerIntJOncol2515091519MichnickSWRemyICValoisFXValleeBelisleAGalarneauAandPelletierJNDetectionofProteinProteinInteractionsbyProteinFragmentComplementationStrategiesPartsAandBAVolumeofMethodsinEnzymology328208230MingXFViswambharanHBarandierCRuffieuxJKaibuchiKRusconiSandYangZRhoGTPaseRhokinasenegativelyregulatesendothelialnitricoxidesynthasephosphorylationthroughtheinhibitionofproteinkinaseBAktinhumanendothelialcellsMolCellBiol2284678477MitsiadesCSMitsiadesNandKoutsilierisMTheAktpathwaymoleculartargetsforanticancerdrugdevelopmentCurrCancerDrugTargets4235256MuhlenbeckFHaasESchwenzerRSchubertGGrellMSmithCScheurichPandWajantHTRAILApo2LactivatescJunNH2terminalkinaseviacaspasedependentandcaspaseindependentpathwaysJBiolChem2733309133098NagaiTIbataKParkESKubotaMMikoshibaKandMiyawakiAAvariantofyellowfluorescentproteinwithfastandefficientmaturationforcellbiologicalapplicationsNatBiotechnol208790NolteRTWiselyGBWestinSCobbJELambertMHKurokawaRRosenfeldMGWillsonTMGlassCKandMilburnMVLigandbindingandcoactivatorassemblyoftheperoxisomeproliferatoractivatedreceptorgammaNature395137143OchelHJSchulteTWNguyenPTrepelJandNeckersLThebenzoquinoneansamycingeldanamycinstimulatesproteolyticdegradationoffocaladhesionkinaseMolGenetMetab662430OgawaraYKishishitaSObataTIsazawaYSuzukiTTanakaKMasuyamaNandGotohYAktenhancesMdm2mediatedubiquitinationanddegradationofp53JBiolChem2772184321850ParkAandBaichwalVRSystematicmutationalanalysisofthedeathdomainofthetumornecrosisfactorreceptor1associatedproteinTRADDJBiolChem27198589862ParsonsABBRDingHLiZZhangCSheikhBBrownGWKanePMHughesTRBooneCIntegrationofchemicalgeneticandgeneticinteractiondatalinksbioactivecompoundstocellulartargetpathwaysNatBiotechnol226269PelletierJNCampbellValoisFXandMichnickSWOligomerizationdomaindirectedreassemblyofactivedihydrofolatereductasefromrationallydesignedfragmentsProcNatlAcadSciUSA951214112146PelletierJNRemyIandMichnickSWProteinFragmentComplementationAssaysaGeneralStrategyfortheinvivoDetectionofProteinProteinInteractionsJournalofBiomolecularTechniques103239PerdewGHWiegandHVandenHeuvelJPMitchellCandSinghSSA50kilodaltonproteinassociatedwithrafandpp60proteinkinasesisamammalianhomologofthecellcyclecontrolproteincdc37Biochemistry3636003607PerlmanZESlackMDFengYMitchisonTJWuLFandAltschulerSJMultidimensionaldrugprofilingbyautomatedmicroscopyScience30611941198PhelanMLandNockSGenerationofbioreagentsforproteinchipsProteomics321232134PicardDHeatshockprotein90achaperoneforfoldingandregulationCellMolLifeSci5916401648PruittKandDerCJRasandRhoregulationofthecellcycleandoncogenesisCancerLett171110RemyIWilsonIAandMichnickSWErythropoietinreceptoractivationbyaligandinducedconformationchangeScience283990993RemyIandMichnickSWVisualizationofbiochemicalnetworksinlivingcellsProcNatlAcadSciUSA9876787683RemyIandMichnickSWDynamicvisualizationofexpressedgenenetworksJCellPhysiol196419429RemyIandMichnickSWRegulationofapoptosisbytheFt1proteinanewmodulatorofproteinkinaseBAktMolCellBiol2414931504RemyIMontmarquetteAandMichnickSWPKBAktmodulatesTGFbetasignallingthroughadirectinteractionwithSmad3NatCellBiol6358365RemyIandMichnickSWClonalSelectionandInVivoQuantitationofProteinInteractionswithProteinFragmentComplementationAssaysProcNatlAcadSciUSA9653945399RemyIPelletierJNGalarneauAandMichnickSWProteinInteractionsandLibraryScreeningwithProteinFragmentComplementationStrategiesProteinproteininteractionsAmolecularcloningmanualEAGolemiseditorColdSpringHarborLaboratoryPressChapter25449475RichmanTJSawyerMMandJohnsonDITheCdc42pGTPaseisinvolvedinaG2MmorphogeneticcheckpointregulatingtheapicalisotropicswitchandnucleardivisioninyeastJBiolChem2741686116870RodriguezVicianaPSabatierCandMcCormickFSignalingspecificitybyRasfamilyGTPasesisdeterminedbythefullspectrumofeffectorstheyregulateMolCellBiol2449434954RossietalMonitoringproteinproteininteractionsinintacteukaryoticcellsbybetagalactosidasecomplementationProcNatlAcadSciUSA94840584101997andUS6342345Ruehretal1999CyclicAMPdependentproteinkinasebindingtoAkinaseanchoringproteinsinlivingcellsbyfluorescenceresonanceenergytransferofgreenfluorescentproteinfusionproteinsJBiolChem2743309233096SchmidJAetalDynamicsofNFkappaBandIkappaBalphastudiedwithgreenfluorescentproteinfusionproteinsJBiolChem2751703517042SemizarovDKroegerPandFesikSsiRNAmediatedgenesilencingaglobalgenomeviewNucleicAcidsRes3238363845ShoemakerDDandLinsleyPSRecentdevelopmentsinDNAmicroarraysCurrOpinMicrobiol5334337StancatoLFChowYHHutchisonKAPerdewGHJoveRandPrattWBRafexistsinanativeheterocomplexwithhsp90andp50thatcanbereconstitutedinacellfreesystemJBiolChem2682171121716SternbergSRBiomedicalimageprocessingIEEEComputer162234SubramaniamRDesveauxDSpicklerCMichnickSWandBrissonNDirectvisualizationofproteininteractionsinplantcellsNatBiotechnol19769772SumiTMatsumotoKTakaiYandNakamuraTCofilinphosphorylationandactincytoskeletaldynamicsregulatedbyrhoandCdc42activatedLIMkinase2JCellBiol14715191532TeruelTHernandezRBenitoMandLorenzoMRosiglitazoneandretinoicacidinduceuncouplingprotein1inap38mitogenactivatedproteinkinasedependentmannerinfetalprimarybrownadipocytesJBiolChem278263269ThevenodFFriedmannJMKatsenADandHauserIAUpregulationofmultidrugresistancePglycoproteinvianuclearfactorkappaBactivationprotectskidneyproximaltubulecellsfromcadmiumandreactiveoxygenspeciesinducedapoptosisJBiolChem27518871896VarleyCLStahlschmidtJLeeWCHolderJDiggleCSelbyPJTrejdosiewiczLKandSouthgateJRoleofPPARgammaandEGFRsignallingintheurothelialterminaldifferentiationprogrammeJCellSci11720292036VlahosCJMatterWFHuiKYandBrownRFAspecificinhibitorofphosphatidylinositol3kinase28phenyl4H1benzopyran4oneJBiolChem26952415248WardJHierarchicalgroupingtooptimizeanobjectivefunctionJournaloftheAmericanStatisticalAssociation58236244WestwickJKCoxADDerCJCobbMHHibiMKarinMandBrennerDAOncogenicRasactivatescJunviaaseparatepathwayfromtheactivationofextracellularsignalregulatedkinasesProcNatlAcadSciUSA9160306034WestwickJKLambertQTClarkGJSymonsMVanAelstLPestellRGandDerCJRacregulationoftransformationgeneexpressionandactinorganizationbymultiplePAKindependentpathwaysMolCellBiol1713241335WhiteMANicoletteCMindenAPolverinoAVanAelstLKarinMandWiglerMHMultipleRasfunctionscancontributetomammaliancelltransformationCell80533541WileySRSchooleyKSmolakPJDinWSHuangCPNichollJKSutherlandGRSmithTDRauchCSmithCAandetalIdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosisImmunity3673682WulfGMRyoAWulfGGLeeSWNiuTPetkovaVandLuKPPin1isoverexpressedinbreastcancerandcooperateswithRassignalinginincreasingthetranscriptionalactivityofcJuntowardscyclinD1EmboJ2034593472YokoyamaYTsuchidaSHatayamaIandSatoKLackofperoxisomalenzymeinducibilityinrathepaticpreneoplasticlesionsinducedbymutageniccarcinogenscontrastedexpressionofglutathioneStransferasePformandenoylCoAhydrataseCarcinogenesis14393398YuHWestMKeonBHBilterGKOwensSLamerdinJWestwickJKMeasuringdrugactioninthecellularcontextusingproteinfragmentcomplementationassaysASSAYandDrugDevelopmentTechnologies1811822ZabelUandBaeuerlePAPurifiedhumanIkappaBcanrapidlydissociatethecomplexoftheNFkappaBtranscriptionfactorwithitscognateDNACell61255265ZaccoloandTPozzan2000ImagingsignaltransductioninlivingcellswithGFPbasedprobesIUBMBLife49152000ZhangJFergusonSSBarakLSMenardLandCaronMGDynaminandbetaarrestinrevealdistinctmechanismsforGproteincoupledreceptorinternalizationJBiolChem2711830218305ここに開示した本発明の多くの形態は現時点での好ましい態様を構成するものであるが、他に多くのものが可能であり、また、好ましい態様及び他の可能な態様についてのさらに詳細な内容は限定的なものと解釈すべきではない。ここに使用される用語は限定するためではなく単に説明するためのものであり、多様な変更や多くの等価物が、請求されている本発明の趣旨又は範囲から外れることなく可能であると理解される。