Iセットドメインを修飾する方法であって、IgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIセットドメインに挿入およびまたは置換することを含む方法。構造特徴が、IgNAR可変ドメイン由来のループ領域と、ループ領域4のC末端ならびにIgNAR可変ドメイン由来のCおよびDβ鎖における溶媒露出面とからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。ループ領域がIgNAR可変ドメイン由来のループ領域4およびループ領域8からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。IセットドメインのCDR2ループの全体または一部分を除去する、請求項1に記載の方法。アミノ酸Lys32、Asp33、Thr34、Gly35、Tyr55、Glu57およびThr58またはその一部分と同等なIセットドメインのアミノ酸を修飾する、請求項1に記載の方法。修飾が、荷電または極性アミノ酸をこれらの位置に導入する、Iセットドメインの可溶性を改善する、あるいはその両方である、請求項5に記載の方法。IセットドメインがNCAM、VCAM、ICAM、Telokin、MADCAM1、TwitchinおよびTitinからなる群より選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。Iセットドメインに挿入されるIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴を含む、修飾Iセットドメイン。構造特徴が、IgNAR可変ドメイン由来のループ領域と、ループ領域4のC末端ならびにIgNAR可変ドメイン由来のCおよびDβ鎖における溶媒露出面とからなる群より選択される、請求項8に記載の修飾Iセットドメイン。ループ領域がIgNAR可変ドメイン由来のループ領域4およびループ領域8からなる群より選択される、請求項9に記載の修飾Iセットドメイン。IセットドメインのCDR2ループの全体または一部分を除去する、請求項8に記載の修飾Iセットドメイン。アミノ酸Lys32、Asp33、Thr34、Gly35、Tyr55、Glu57およびThr58またはその一部分と同等なIセットドメインのアミノ酸を修飾する、請求項8に記載の修飾Iセットドメイン。修飾が、荷電または極性アミノ酸をこれらの位置に導入する、Iセットドメインの可溶性を改善する、あるいはその両方である、請求項12に記載の修飾Iセットドメイン。IセットドメインがNCAM、VCAM、ICAM、Telokin、MADCAM1、TwitchinおよびTitinからなる群より選択される、請求項8に記載の修飾Iセットドメイン。請求項8に記載の修飾Iセットドメイン、ならびに薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。請求項8に記載の修飾Iセットドメインをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドライブラリー。大きなバクテリオファージのライブラリーがオオセザメ由来のタイプ2のVNARレパートリーに基づいて作製されており、これを使用して従来のCDR1ループと類似した骨格およびループ領域内に有意な可変性を含む幾つかのタイプ2VNARタンパク質が単離されている。しかしながら、最も有意な多様性は従来のCDR3ループと類似した延長ループ領域内に存在し、延長ループ領域は長さとアミノ酸組成の両方が変わる。タイプ2のVNARに関するさまざまなコンピュータモデル化構造が文献中で報告されてきている。このようなコンピュータモデル化は構造に対する重要な見識を与え得るが、最終的な構造は依然として結晶学的分析から決定されている。VNARの場合、結晶構造の解明が特に重要である。第1の態様では本発明は、40Åより良い分解能までIgNARの可変ドメインの原子座標を決定するための、X線を効果的に回析するタイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶であって、タイプ2のIgNARの可変ドメインが105~125のアミノ酸残基からなり、表1およびまたは図1に記載のアミノ酸配列を含む結晶を提供する。他の態様では本発明は、付録I、、またはの配位の全体または一部分±05Å未満のCα原子由来の二乗平均平方根偏差によって定義される構造を含む、タイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶を提供する。他の態様では本発明は、相同性モデル化の方法であって、IgSFドメインのアミノ酸配列図と図1に示す12Y1、12Y2、12A9または1A7のアミノ酸配列を一直線に並べて、アミノ酸配列の相同領域を適合させるステップ、付録I、、またはによって定義される12Y1、12Y2、12A9または1A7構造の対応する領域上の前記IgSFドメインの適合相同領域の構造をモデル化するステップ、および、前記適合相同領域の構造を実質的に保つ前記IgSFドメインの立体配座を決定するステップを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、タンパク質の構造を決定する方法であって、付録I、、またはの配位を与えること、および前記タンパク質の結晶単位セル中の配位を特定して、前記タンパク質の構造を与えること、または付録I、、またはの配位を処理することによって前記タンパク質のNMRスペクトルピークを割り当てることのいずれかを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、以下の付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録Iのデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成したIgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したIgSFドメインの原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むシステム、特にコンピュータシステムを提供する。他の態様では本発明は、コンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含むコンピュータ可読記憶媒体であって、12Y1、12Y2、12A9または1A7、あるいは12Y1、12Y2、12A9または1A7の異型の構造配位の全体または一部分によりデータが定義され、前記異型が、付録IのCαまたは骨格原子からの二乗平均平方根偏差が2Å未満、例えば15Åを超えないなど、好ましくは15Å未満、より好ましくは10Å未満、さらにより好ましくは074Å未満、さらにより好ましくは072Å未満、および最も好ましくは05Å未満である骨格原子を含む、コンピュータ可読記憶媒体を提供する。他の態様では本発明は、付録Iに従う12Y1、12Y2、12A9または1A7の構造配位の少なくとも一部分のフーリエ変換を含む第一組のコンピュータ可読データであって、未知の構造の分子または分子複合体のX線回析パターンを含む第二組の機械可読データと組合せ、前記第一組のデータおよび前記第二組のデータの使用に関する命令でプログラムされた機械を使用すると、第二組の機械可読データに対応する構造配位の少なくとも一部分を決定することができる、第一組のコンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含む、コンピュータ可読データ記憶媒体を提供する。他の態様では本発明は、付録Iに従い付録Iに記録される原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な付録Iに記録される12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録1のデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成した標的IgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読媒体を提供する。他の態様では本発明は、IgSFドメインに関する構造を作製するためおよびまたは合理的な薬剤設計を実施するためのデータを与える方法であって、以下の付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造、12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または12Y1、12Y2、12A9または1A7の複数の原子の配位を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録Iのデータに基づくドメインの相同性モデル化によって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したタンパク質の原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読データを含むリモートデバイスとの連絡を確立させること、および前記リモートデバイスから前記コンピュータ可読データを受信することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインの性質を変える方法であって、前記方法がβ鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内のIgNAR可変ドメインを修飾することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法によって生成される修飾IgNAR可変ドメインを含む結合成分を提供する。他の態様では本発明は、図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインを含む結合成分であって、β鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内でIgNAR可変ドメインが修飾されている結合成分を提供する。他の態様では本発明は、Iセットドメインを修飾する方法であって、前記方法がIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIセットドメインに挿入およびまたは置換することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、Iセットドメインを含む結合成分であって、IセットドメインがIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIセットドメインに挿入およびまたは置換すること、およびまたはIgNAR可変ドメインのループ領域4またはループ領域8と等しい領域に修飾を導入することによって修飾されている結合成分を提供する。他の態様では本発明は、Vセットドメインを修飾する方法であって、前記方法がIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をVセットドメインに挿入およびまたは置換することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、Vセットドメインを含む結合成分であって、VセットドメインがIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をVセットドメインに挿入およびまたは置換すること、およびまたはIgNAR可変ドメインのループ領域4またはループ領域8と等しい領域に修飾を導入することによって修飾されている結合成分を提供する。他の態様では本発明は、同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つがIgNAR可変ドメインである少なくとも2つのIgNARドメイン、同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるIセットドメインである少なくとも2つのIセットドメイン、または同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるVセットドメインである少なくとも2つのVセットドメインを含む、マルチマーを含む結合成分を提供する。他の態様では本発明は、診断試薬と結合した本発明による結合成分を提供する。他の態様では本発明は、固形支持体に固定されているかあるいはバイオセンサー表面と結合している、本発明による結合成分を提供する。他の態様では本発明は、本発明による結合成分をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の態様では本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。他の態様では本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞を企図する。他の態様では本発明は、本発明による結合成分を生成する方法であって、本発明による結合成分の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および場合によっては結合成分を回収することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、本発明による結合成分および薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。他の態様では本発明は、被験体の病状を治療する方法であって、本発明による結合成分を被験体に投与することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、標的分子に対する親和性を有する本発明による結合成分を選択する方法であって、標的分子に対する親和性を有する本発明による結合成分の発現に関して、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニングすることを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、本発明による結合成分をコードする複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーであって、ポリヌクレオチドがIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインにおいて1つまたは複数の修飾を含む、ポリヌクレオチドライブラリーを提供する。前に論じた全ての刊行物は、それらの全容が本明細書に組み込まれている。本明細書中に含まれている文書、作用、物質、デバイス、物品などの任意の考察は、単に本発明の文脈を与える目的のものである。これらの事項のいずれかまたは全てが従来技術の土台の一部分を形成する、あるいは本発明は本出願の各請求の優先日前に存在したので、本発明が関係する分野の共通の一般知識であったことは、当然のこととして解釈すべきではない。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、当技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。分子および生化学法ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NYandAusubeletal、ShortProtocolsinMolecularBiology4thEd、JohnWileySons、IncandthefullversionentitledCurrentProtocolsinMolecularBiologyを概略的に参照のことならびに化学法の標準的技法を使用する。本明細書を通じて、用語comprise、またはcomprisesまたはcomprisingなどの変形は、言及する要素、整数またはステップ、あるいは要素、整数またはステップの群の含有を示すが、任意の他の要素、整数またはステップ、あるいは要素、整数またはステップの群の排除は示さないことは理解されよう。本明細書で使用する疎水性残基または無極性残基によって、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを意味する。本明細書の極性残基によって、セリン、スレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびリシンを意味する。Plasmodiumfalciparumマラリア寄生虫の頂端膜抗原1を標的化する2つの密接に関連があるIgNAR可変ドメインを、我々は以前に同定している。12Y1ならびに12Y2で示すこれらのタンパク質は、CDR3配列と類似した天然に存在する領域および合成ループ領域と組合せた、元のオオセザメのレパートリーに由来するタイプ2のVNAR骨格足場の広範囲の混合物を含むライブラリーから単離された。我々は現在、12A9および1A7で示す2つの他のIgNAR可変ドメインを単離している。VNAR12A9は、Porphyromonasgingivalis由来のギンギパインKプロテアーゼに対するバイオパニングによって、オオセザメに由来する天然に存在するタイプ2のVNAR骨格足場の広範囲の混合物を含むライブラリーから単離された。このIgNARは完全に天然であり、CDR3類似ループ領域を含む。多くのIgNAR可変ドメインと同様に、ジスルフィド架橋はCDR1とCDR3類似ループ領域を連結および安定化させ、この場合残基Cys29とCys89を結びつける。VNAR1A7は抗AMA1マウスIgG5G8に特異的であり、12Y1および12Y2の単離に関して記載したのと同じ手順、すなわちファージディスプレイIgNARライブラリーのバイオパニングを使用して単離した。結合は1A7合成CDR3類似ループ領域中に見られるSYPモチーフを介する。従来のCDR3ループと類似した12Y1、12Y2および1A7ループ領域は合成の部類に入るが、それらの長さおよびアミノ酸組成は、天然に存在するIgNAR抗体に典型的である。12A9は天然に存在するサメ類のIgNARであり、従来のCDR3ループと類似した長さ13残基長のループ領域を有する。図1は、12Y1、12Y2、12A9、1A7ならびに12の天然に存在するタイプ2のVNAR7E22、7E23、7E51、7E54、7E56、7E58、7E68、7E77、7E80、7E87、7E91、7E93の配列アラインメントを示す。システイン残基の半分は23までの場合ループ領域4および8中に存在し、従来のCDR1およびCDR3ループと類似したループ間でジスルフィド架橋を形成する。12A9はループ領域4とループ領域8の両方中にシステイン残基を有する。12Y1、12Y2および1A7はループ領域4および8中にシステイン残基を含まない。表1は、図1中の16のタイプ2のVNAR配列およびNuttallによって報告されたタイプ2のVNAR配列のアミノ酸変異体を示す。従来のCDR1およびCDR3ループと類似したループ領域の外側に高い保存度の配列が存在することは、図1および表1から明らかである。我々は12Y1、12Y2、12A9および1A7の結晶を現在首尾よく作製しており、これらのタンパク質の構造を決定してきている。さらに我々は、これらの構造と一定範囲の知られている免疫分子、すなわち免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーを比較している。12Y1および12Y2のVNARは大腸菌中で発現させ、AMA1抗原の存在および不在下で結晶化試験に施した。おそらくAMA1タンパク質の本質的に柔軟なドメイン構造のために、抗原の存在下では結晶鉛は観察されなかった。対照的に、抗原の不在下で12Y1と12Y2の両方に関して良質の結晶を得た。12A9および1A7のVNARは大腸菌中で発現させ、結晶化試験に施した。成功条件を拡大し、12A9と1A7の両方に関して回析良質の結晶を得た。12Y1および12Y2結晶形に関して作製したデータセットは、鋳型として広範囲の免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質を使用する、標準的な分子置換技法による解決によって影響を受けなかった。我々はこれはこれらのタンパク質の特有の性質を示すものであり、したがって12Y1構造は2個の同形重原子誘導体ルテニウム水和物LAH、およびカリウムヘキサクロロレニウムPHRを用いて段階的に実行することによって最初から解明されたと考えた。しかしながら、最もおそらくはこの結晶形中の従来のCDR3ループと類似したループ領域の固有の柔軟性のために、この構造は不完全であり残基Phe88~Pro98を欠いていた。完全な12Y2構造は、モデルとして28Åの12Y1構造を使用した分子置換によって次いで解明された。12Y1の非対称単位は1個の分子を含むが、12Y2結晶の非対称単位は2個の分子を含みこの2個の12Y2モノマーの相対配置は、Cα原子と重なるために1762°の旋回および11Åの回転移動を必要とする。最終的な12Y2構造は218Åの分解能まで精製し、ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中には934の残基が存在し、充分に容認された領域または非容認領域中には残基は存在しなかった。回析データおよび精製の統計の詳細は表2中に示す。12Y1および12Y2の配位はそれぞれ付録Iおよびとして添付する。12A9および1A7の構造は分子置換によって決定した。12A9用の検索モデルは、CDR3ループを含まない12Y1構造であった。1A7用の検索モデルは、CDR3ループを含まない12Y1の二重ダイマー構造であった。最終的な12A9構造中では、884の残基がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中に存在し、充分に容認された領域または非容認領域中には1残基が存在した。最終的な1A7構造中では、909の残基がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中に存在し、充分に容認された領域または非容認領域中には鎖Cの2残基が存在した。回析データおよび精製の統計の詳細は表2中に示す。12A9および1A7の配位はそれぞれ付録Iおよびとして添付する。したがって、第1の態様では本発明は、40Åより良い分解能までIgNARの可変ドメインの原子座標を決定するための、X線を効果的に回析するタイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶であって、タイプ2のIgNARの可変ドメインが105~125のアミノ酸残基からなり、表1およびまたは図1に記載のアミノ酸配列を含む結晶を提供する。表1に記載のアミノ酸配列を含むという本明細書の言及は、表1に与えるコンセンサス配列との高度の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことは理解されよう。アミノ酸配列は表1中のコンセンサス配列と、好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、およびさらにより好ましくは少なくとも90の配列同一性を有する。アミノ酸配列は、完全に保存されている表1中のコンセンサス配列中の残基と、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも95の配列同一性を有する。図1に記載のアミノ酸配列を含むという本明細書の言及は、図1に示す配列と少なくとも80、より好ましくは少なくとも85、およびさらにより好ましくは少なくとも90の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことは理解されよう。誤解を避けるために、表1および図1に関して前に与えた配列同一性の数字は、表1中の可変領域および図1中の対応する可変領域は除外する。一実施形態では結晶は、a9726Å、b9726Åおよびc6523Åの単位セル寸法、および全寸法において5の単位セル可変性を有する空間群I4122を有する。他の実施形態では結晶は、a6528Å、b9205Åおよびc9822Åの単位セル寸法、および全寸法において5の単位セル可変性を有する空間群I212121を有する。他の実施形態では結晶は、a3827Å、b6832Åおよびc3951Åの単位セル寸法、および全寸法において5の単位セル可変性を有する空間群P21212を有する。他の実施形態では結晶は、a8050Å、b8866Åおよびc10175Åの単位セル寸法、および全寸法において5の単位セル可変性を有する空間群I212121を有する。結晶は30Åより良い分解能、より好ましくは25Åより良い分解能までX線を効果的に回析することが好ましい。他の態様では本発明は、付録I、、またはの配位の全体または一部分±05Å未満のCα原子由来の二乗平均平方根偏差によって定義される構造を含む、タイプ2のIgNARの可変ドメインの結晶を提供する。付録I、、および中に述べるIgNARドメイン構造はモノマー構造である。IgNAR可変ドメインに関して結晶学的にモノマーを観察したのは、今回が初めてである。付録I、、および中では、第3列が原子型を示し、第4列が残基型を示し、第5列が鎖の識別を示し、第6列が残基番号中に記載されたのと同様の原子番号を示し、第7、8および9列が問題の原子のX、Y、Z配位をそれぞれ示し、第10列が原子の占有率を示し、第11列が原子の温度因子を示し、最終列が原子型を示す。それぞれの付録は本質的に一貫した形式で示す。例えば、それぞれのアミノ酸残基の原子の配位は、骨格窒素原子が最初、次にCAで示すCα骨格炭素原子、次にタンパク質骨格の炭素および酸素、最後に側鎖残基となるように列挙する。異なる順序のこれらの原子、または異なる表示の側鎖残基を含み得る、代替ファイル形式のそれと一致する形式などを使用することができるか、あるいは当技術分野の他のものより好ましい可能性がある。しかしながら、異なるファイル形式を使用して付録の配位を表示または操作することは、本発明の範囲内にあることは明らかであろう。本明細書で論じるように我々は、これらのドメインの抗原結合または可溶性安定性に重要な12Y1、12Y2、12A9および1A7のIgNAR可変ドメインの構造特徴を同定してきている。これらの特徴をIgSFの他のメンバーのドメインに導入して、結合性を変える、あるいは可溶性およびまたは安定性を改善することができる。付録I中に示される情報を使用して、例えば修飾されたIgSFドメインの構造を比較して、IgNAR可変ドメインの構造とより密接に類似させることができる。タンパク質の構造類似性は、二乗平均平方根偏差によって通常表示または測定し、これは二組の原子間の空間内の位置の違いを測定する。二乗平均平方根偏差とは、平均からの偏差の二乗の相加平均の平方根を意味する。rmsdは、等しい原子間の距離をそれらの最適な重ね合わせの後に測定する。rmsdは全ての原子、残基骨格原子、主鎖原子のみ、側鎖原子のみあるいはより通常はCα原子のみに関して計算することができる。本発明の目的用に、以下に概略する方法のいずれかを使用して、これらのいずれかに関してrmsdを計算することができる。タンパク質の構造を比較する方法は、MethodsofEnzymology、vol115、pg397~420中で論じられている。rmsdを計算するのに必要な最小二乗法の代数がRossmanによって与えられてきているが、さらに迅速な方法がKabsch、HendricksonおよびMcLachanによって記載されてきている。幾つかのアルゴリズムは、Ferroによって記載されたのと同様に、1つの分子を他の分子に対して移動させる反復手順を使用する。他の方法、例えばKabschのアルゴリズムは、最適性を直接特定する。Cα原子およびrmsdはしたがって、LSQKAB、MNYFIT、MAPS、QUANTA、Insight、SybylRTM、Oおよび他の配位適合プログラムなどのプログラムを使用して計算することができると考えるのが普通である。例えばプログラムLSQKABおよびOでは、計算の目的で対にする2つのタンパク質中の残基を、ユーザーは定義することができる。あるいは、2つのタンパク質の配列アラインメントを作製することによって残基の対を決定することができる。したがって原子の配位をこのアラインメントに従い重ね合わせることができ、rmsd値を計算することができる。プログラムSequoiaは、相同タンパク質配列のアラインメント、および相同タンパク質の原子の配位の重ね合わせを実行する。ひとたびアラインメントをとらせた後、前に詳述したプログラムを使用してrmsdを計算することができる。同一、あるいは充分同一である配列用に、前に概略したように手動または自動でタンパク質の構造アラインメントを行うことができる。他の手法は配列を考慮せずに、タンパク質の原子座標の重ね合わせを生み出すと思われる。著しく異なる配位組を比較してCα原子のみのrmsd値を計算するとき、他の手法がさらに正常である。側鎖の動きを分析して全原子のrmsdを計算するとき、他の手法が特に有用であり、これはLSQKABおよび他のプログラムを使用して行うことができる。一斉方式で約05Åまで、好ましくは約03Åまで任意の方向に、構造の原子の原子配置を変えることによって、その構造特性と例えば分子構造系分析に関する有用性の両方の点で、付録Iまたはの構造と実質的に同じ構造が生じると思われる。当業者は、本発明の多くの適用例において、付録I、、またはの全配位を利用することは必要ではなく、それらの一部分のみを利用することが必要であることを理解していると思われる。用語一部分は、12Y1、12Y2、12A9または1A7構造中の隣接アミノ酸残基を表すことができるかあるいはできない、配位の部分集合を定義することを目的とする。本発明は、他のIgSFドメインの相同性モデル化用の手段も提供する。相同性モデル化によって、構造のX線結晶学データまたはコンピュータ支援denovo予測のいずれかに基づく、付録Iの配位データの操作に基づく、関連IgSFドメイン構造の予測を意味する。用語相同領域は、同一であるかあるいは類似の側鎖化学基を有する、2つの配列中のアミノ酸残基を記載する。相同領域中の同一および類似残基は、当業者によりそれぞれ不変型および保存型として時折記載される。一般に方法は、アミノ酸配列のアラインメントをとることによって、付録I、、またはのIgNARドメインのアミノ酸配列と修飾IgSFドメインのアミノ酸配列を比較することを含む。配列中のアミノ酸を次いで比較し、相同であるアミノ酸の群は1つにグループ分けする。この方法はポリペプチドの保存領域を検出し、アミノ酸の挿入または欠失を計算する。アミノ酸配列間の相同性は、市販のアルゴリズムを使用して測定することができる。プログラムBLAST、ギャップ化BLAST、BLASTN、PSIBLASTおよびBLAST2配列は、この目的のために当技術分野で広く使用されており、2つのアミノ酸配列の相同領域のアラインメントをとることができる。これらはデフォルトパラメータと共に使用して、モデル化する12Y1、12Y2、12A9または1A7タンパク質および他のIgSFドメインのアミノ酸配列間の相同性の程度を測定することができる。このような相同性モデル化は、当業者によく知られている技法である。これらの参照文献中に記載される技法、および当技術分野で一般に利用可能な他の相同性モデル化技法は、本発明を実施する際に使用することができる。したがって本発明は、相同性モデル化の方法であって、IgSFドメインのアミノ酸配列図と図1に示す12Y1、12Y2、12A9または1A9のアミノ酸配列を一直線に並べて、アミノ酸配列の相同領域を適合させるステップ、付録I、、またはによって定義される12Y1、12Y2、12A9または1A7構造の対応する領域上の前記IgSFドメインの適合相同領域の構造をモデル化するステップ、および、前記適合相同領域の構造を実質的に保つ前記IgSFドメインの立体配座を決定するステップを含む方法を提供する。ステップ~の1つまたは全ては、コンピュータモデル化によって実施することが好ましい。12Y1、12Y2、12A9または1A7構造をinsilicoで利用する、本明細書に記載する本発明の態様は、本発明の方法によって得られる修飾IgSFドメインのモデルに同様に適合させることができ、この適用例は本発明の他の態様を形成する。このようにして12Y1、12Y2、12A9または1A7の立体配座を決定した後、このような立体配座は、本明細書に記載する診断または治療用途用の修飾ドメインを合理的に設計する、コンピュータベースの方法において使用することができる。12Y1、12Y2、12A9または1A7の構造を使用して、他のIgNARドメインの結晶構造を解明することもでき、これらの他のドメインのX線回析データまたはNMR分光データが作製されてきており、構造を与えるために解釈を必要とする。これらの目的に使用することができる1つの方法は分子置換である。この方法では、未知のIgNARドメインの結晶構造は、本明細書で与える12Y1、12Y2、12A9または1A7の構造配位を使用して決定することができる。この方法は、最初からこのような情報を決定することを試みることより迅速かつ有効に、未知の結晶に関する正確な構造形を与えると思われる。分子置換を実施するための当技術分野で知られているコンピュータプログラムの例は、CNXまたはAMOREである。したがって、他の態様では本発明は、タンパク質の構造を決定するための方法であって、付録I、、またはの配位を与えること、および前記タンパク質の結晶単位セル中の配位を特定して、前記タンパク質の構造を与えること、または付録I、、またはの配位を処理することによって前記タンパク質のNMRスペクトルピークを割り当てることのいずれかを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、以下の付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録Iのデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成したIgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したIgSFドメインの原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むシステム、特にコンピュータシステムを提供する。例えばコンピュータシステムは、コンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含むコンピュータ可読データ記憶媒体、前記コンピュータ可読データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリー、および前記コンピュータ可読データを処理し、それによって構造を作製するおよびまたは合理的な薬剤設計を実施する、前記ワーキングメモリーおよび前記コンピュータ可読データ記憶媒体と結合した中央処理装置を含むことができる。コンピュータシステムは、前記構造を示すための前記中央処理装置と結合したディスプレイをさらに含むことができる。本発明は、付録Iによって与えられる出発データに基づき本明細書に記載する本発明の方法によって作製されている、修飾IgSFドメインの原子座標データを含むようなシステムも提供する。IgSFドメインの作用機構を分析するための構造の作製、およびまたは診断または治療目的のIgSFドメインの合理的設計の実施を含めた、幾つかの目的にこのようなデータは有用である。他の態様では本発明は、コンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含むコンピュータ可読記憶媒体であって、12Y1、12Y2、12A9または1A7、あるいは12Y1、12Y2、12A9または1A7の異型の構造配位の全体または一部分によりデータが定義され、前記異型が、付録IのCαまたは骨格原子からの二乗平均平方根偏差が2Å未満、例えば15Åを超えないなど、好ましくは15Å未満、より好ましくは10Å未満、さらにより好ましくは074Å未満、さらにより好ましくは072Å未満、および最も好ましくは05Å未満である骨格原子を含む、コンピュータ可読記憶媒体を提供する。本発明は、付録Iに従う12Y1、12Y2、12A9または1A7の構造配位の少なくとも一部分のフーリエ変換を含む第一組のコンピュータ可読データであって、未知の構造の分子または分子複合体のX線回析パターンを含む第二組の機械可読データと組合せ、前記第一組のデータおよび前記第二組のデータの使用に関する命令でプログラムされた機械を使用すると、第二組の機械可読データに対応する構造配位の少なくとも一部分を決定することができる、第一組のコンピュータ可読データをエンコードするデータ記憶材料を含む、コンピュータ可読データ記憶媒体も提供する。他の態様では本発明は、付録Iに従い付録Iに記録される原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7あるいは少なくとも選択したその配位の三次元構造を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な付録Iに記録される12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録1のデータに基づくIgSFドメインの相同性モデル化によって作成した標的IgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読媒体を提供する。このようなコンピュータ可読媒体を提供することによって、原子座標データに通常どおりアクセスして、IgSFドメインまたはその選択した配位をモデル化することができる。例えばRASMOLは、構造決定およびまたは合理的な薬剤設計用の原子座標データのアクセスおよび分析を可能にする、公に入手可能なコンピュータソフトウェアパッケージである。他方で、原子座標データから誘導可能な構造要因データは、例えばフーリエ電子密度マップの違いを計算するのに特に有用である。本発明の他の態様は、IgSFドメインに関する構造を作製するためおよびまたは合理的な薬剤設計を実施するためのデータを与える方法であって、以下の付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造、12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または12Y1、12Y2、12A9または1A7の複数の原子の配位を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録Iのデータに基づくドメインの相同性モデル化によって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したタンパク質の原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読データを含むリモートデバイスとの連絡を確立させること、および前記リモートデバイスから前記コンピュータ可読データを受信することを含む方法を提供する。本発明の他の態様は、IgSFドメインに関する構造を作製するためおよびまたは合理的な薬剤設計を実施するためのデータを与える方法であって、以下の付録Iに従う原子座標データであって、前記データが12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造、12Y1、12Y2、12A9または1A7の三次元構造の少なくとも1つのサブドメイン、または12Y1、12Y2、12A9または1A7の複数の原子の配位を定義するデータ、付録Iの原子座標データから誘導可能な12Y1、12Y2、12A9または1A7に関する構造要因データ、付録Iのデータに基づくドメインの相同性モデル化によって作成した修飾IgSFドメインの原子座標データ、付録Iのデータを参照することによりX線結晶学データまたはNMRデータを解釈することによって作成したタンパク質の原子座標データ、およびまたはの原子座標データから誘導可能な構造要因データの少なくとも1つを含むコンピュータ可読データを含むリモートデバイスとの連絡を確立させること、および前記リモートデバイスから前記コンピュータ可読データを受信することを含む方法を提供する。したがってリモートデバイスは、例えば本発明の前述の態様の1つであるコンピュータシステムまたはコンピュータ可読媒体を含むことができる。デバイスはコンピュータ可読データが受信される異なる国または管轄区に存在してよい。通信はインターネット、イントラネット、eメールなどを介したものであってよい。典型的には通信は電子化された性質のものであってよいが、通信経路の一部分または全体は光学式、例えば光ファイバーであってよい。さらに通信は、ラジオシグナルまたは衛星通信を介したものであってよい。12Y1、12Y2、12A9および1A7構造のフォールディング形態は、2つのβシートによって形成され対面でパッキングされB鎖とF鎖の間のジスルフィド結合によって連結したβサンドウィッチ構造によって確認される、特徴的な免疫グロブリンスーパーファミリーのフォールディングを示す。鎖間の特徴はCDR1およびCDR3ループと類似した2つのループ領域を含むターン、コイルおよびループである。構造は図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含む。本明細書で使用するループ領域は、1つまたは複数のβ鎖立体配座の間から延長するペプチド配列の一部分である。本明細書で使用するβ鎖領域は、延長型β鎖立体配座、すなわち少なくとも4個、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸を含むβ鎖を含む。ループ領域は典型的には延長型β鎖立体配座を含まないが、縮小型β鎖立体配座、すなわち4個未満のアミノ酸を含むβ鎖を含む可能性がある。NおよびC末端ループ領域以外に、ループ領域は反対方向に延長したβ鎖と結合する。ループ領域5は、縮小型β鎖立体配座を含むことが好ましい。我々はループ領域8が、縮小型または延長型であってよいβ鎖立体配座を含み得ることも見出しており、これらは以下でさらに詳細に論じる。他のループ領域はβ鎖立体配座を含まないことが好ましい。12Y1、12Y2、12A9および1A7骨格の詳細な分析は、幾つかの重要な特徴の中間フォールディングと類似した新規なフォールディング形態だけでなく、可変ドメイン中で見られる異なる構造特徴も示す。より詳細には構造は図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含み、ループ領域5は図3に記載のDおよびCで示す2個の縮小型β鎖領域、および5a、5bおよび5cで示す3個のループ領域を含む。同化したデータから表3は、タイプ2のVNARのさまざまなループおよびβ鎖領域中に存在するアミノ酸残基の数の減少を表す。ループ領域4は従来のCDR1ループと類似している。ループ領域8は従来のCDR3ループと類似している。ループ領域8は約5~30の範囲の可変数のアミノ酸を含み得るので、18というデフォルト値をそれに使用して、後の領域用の残基番号を配置する。したがって残基番号は、配列中に存在するアミノ酸残基の合計数とは必ずしも関係がない。それは18アミノ酸残基というデフォルト値を有するループ領域8に基づく。表3Aは、タイプ2のVNARのループ領域5中に存在するアミノ酸残基の数の減少を表す。ループ領域5はDおよびCで示す2個の縮小型β鎖領域、および5a、5bおよび5cで示す3個のループ領域を含む。VセットおよびIセットタンパク質の両方が第一鎖中に典型的な結合を有しており、これが鎖の第一部分とβサンドウィッチシートの一部分の水素結合、および第二部分と他のβシートの延長G鎖の水素結合を可能にする。第一鎖の結合は図4に示すVNARタンパク質中に見られる。それは充分に保存されたシスプロリン、可変ドメインの第一鎖結合中の最も典型的な残基で始まる。Vセットタンパク質と同様に、12Y1、12Y2、12A9および1A7も、C末端のG鎖およびC鎖中に隆起を有する。最も有意なことに12Y1、12Y2、12A9および1A7は、短いC鎖、およびVセットドメイン中と同様に1つの水素結合がC鎖ではなくD鎖と結合するように1つのβシートから他のβシートに不規則に変化する、非常に短いC鎖を有する点で、Iセットタンパク質と類似している。12Y2の鎖AおよびBと12Y1骨格は、密接に関係がある。構造情報が入手可能である12Y2の鎖Aと多様な可変および中間組のタンパク質の他の構造比較は、VNARは神経細胞接着分子およびTelokinなどのIセット分子と、最も密接に関係があることを示す。この類似性は、従来の抗体において分子の先端まで延長し免疫認識と関係があるCDR2ループによって結合した延長CおよびC鎖の不在によって大きく偏向する。対照的に、12Y2鎖のAと従来のT細胞受容体Vα、およびVH、VL、および単鎖ドメインVHH抗体の比較により、C、CおよびCDR領域を差し引いた主鎖周辺を基盤とする主な残基よりも一貫した構造同一性が低いことが示される。ラクダ科において見られる単鎖VHHドメインは、VNAR構造と類似していると予想することができるが、しかしながら、これらの単鎖ドメイン抗体は明らかに哺乳動物IgG様原種から生じており、可溶性、安定性、および延長CDR3の突然変異を首尾よく獲得している。VHHとVNARの間の低い構造相同性はそれらの非常に低い配列相同性と一致しており、溶媒溶解度および結合親和性を獲得する問題に対する相近進化の解決策となる。図8中には、3つの古典的に定義される抗体CDRまたは超可変ループ領域の相対位置を示す。配列アラインメントは、従来のCDR1およびCDR3領域に対応するループ領域4および8に限られるIgNAR抗体の可変性を示し、このことは我々の構造分析によって確認され、典型的なCDR2ループと類似したループ領域が欠けており、その底部のターンは抗原結合面から充分離れているようである。配列分析は、ループ領域4は長さが不変であり、多様性が限られる少数のループ要素であることも示唆する。この領域は残基28~33に限られ、抗体の軽鎖可変ドメインにおいて観察される標準構造2の形態に近い形態を有する。半分のシステインがVNARループ領域4中に存在する場合、それは位置29または32のみに見られる。この2つの残基の側鎖は延長型ループ領域8に対して外側および上側に延長し、理想的に位置してこの領域中に付随する半分のシステインと接触する。非常に多様なループ領域8に固有な非常に大きな形態の範囲を考慮すると、これらの安定したジスルフィド結合の制限にもかかわらず、ループ領域8によって明らかに広くさまざまな立体配座がとられる可能性がある。このような極端な多様性はVHH単鎖ドメイン抗体のCDR3ループに関しても観察されてきており、1つの抗原が非常にさまざまな免疫応答および著しく異なるループ形態を誘導する。12Y2のCDR3ループは2つの結晶形で存在し、鎖AおよびBに対応し、残基Phe86からGlu103に延長する。通常ではないが鎖Aのループ領域8は、柔軟性のあるループにより隔てられているPhe86Leu89、およびLeu98Glu103由来のβ鎖を有する明らかなβヘアピン鎖立体配座をとる。鎖Bに関しては、βヘアピンはβ鎖形成と関係がある残基Phe86Asp93、およびTyr96Glu103を有するループ領域8へとさらに延長する。構造的に、βヘアピンは主鎖の水素結合によって形成されるTyr87Phe100Tyr87Phe100Leu89Leu98Leu89Leu98、および、Asp93Tyr96。鎖Bのループ領域8に関する他のH結合はAsp93Tyr96Asp93Tyr96および、Leu91Tyr96である。したがって12Y2のループ領域8は、保存型βシート骨格上に20Åまで延長した最遠方地点で、位置94および96でのチロシン残基の塊状側鎖により先端形成され、免疫グロブリンフレームワークから外側および上側に延長する。このような延長型抗原結合パラトープは、しかしながら限られた数の抗体、例えばラクダ抗リゾチームVHHcAbLys3、およびHIVgp120結合の裂け目に深く貫通するヒト抗体b12のH3ループにおいて観察されてきている。12Y2の領域8の延長ループの長さとこれらの抗体の比較によって、12Y2のループ領域8は長さが長く、同様の方式で抗原と結合することができることが明らかになる。したがって、12Y2のループ領域8に基づく構造およびその延長βヘアピン構造は、例えば酵素活性部位、寄生虫コートタンパク質中の埋もれた裂け目および腔、あるいはウイルス中の裂け目に貫通するのに理想的なものとなる可能性があることは明らかである。AMA1抗原結合親和性を10倍まで独立に増大させた12Y2のループ領域8中の2つの突然変異を、我々は以前に同定した。理論によって制限されずに、これらの突然変異はおそらく、骨格の残り部分に対してヒンジ領域周辺のβヘアピンの柔軟性を増大させるように作用すると考えられる。例えば、3つの芳香族残基、CDR1のPhe29、ならびにループ領域8のTyr87およびPhe100は、CHπの相互作用の安定化と関係がある側鎖を有する。他の安定性は水素結合Tyr87Glu103に由来する。したがって、12Y2とAMA1標的の結合は堅いβヘアピンによっておそらく仲介され、ループ構造の底部における柔軟性によって仲介される抗原とのアクセスが増大する。対照的に、12Y1のループ領域8は結晶構造が解明されておらず、溶液中の類似のヒンジ様残基周辺でおそらく非常に柔軟性がある。12Y2の芳香族のループ領域8の残基は12Y1中のArg87およびPro98で置換され、ループ領域の安定性を低下させる、すなわちループ領域4のPhe29はここでGlu101Glu101と水素結合しており、ループ領域8のヒンジは支持されていない状態である。ここで我々は、異常なVNARCCD鎖形態の抗原認識に対する影響に話を向ける。VNARのCDR2ループは存在せず、分子の底部で短いβターンに置換されている。これは図12中に図によって示し、VNARのCDR2は典型的なヒト抗体のそれと一直線に並ぶ。このループの底部の位置は、低い配列変異性と組合せて、この領域は抗原との相互作用に対してほとんど影響がないことを強く示唆する。しかしながら従来のCおよびD鎖の消失は、延長した12Y2のループ領域8が従来のCDR2の不在下で開く大きな凹状ポケットと組合わさった、抗原結合に関する考えられる代替のモデルを示唆する。他の構造変異性も、CDR2の直前の残基Lys40~Glu46の範囲でC鎖ループの12Y1および12Y2構造において観察される。異なるサメ種由来のVNARの比較はこの領域中の有意な配列異質性を示し、これは分子の残り部分未満の淘汰圧下にあり構造塑性の影響をある程度受けやすい領域を表す可能性が最も高い。延長CDR2ループの欠如は、単離VNAR間の相互作用に対しても相当な影響がある。12Y1および12Y2は結晶学上2重対称のダイマーを形成し、これはループ領域4および8の下に連続的な8本鎖βシートを形成し、それぞれ従来のCDR1およびCDR3ループに対応する。異なる結晶形にもかかわらず、12Y1タンパク質と12Y2タンパク質の間で接触領域は充分保たれている。12Y2ダイマー形と12Y1ダイマー形の比較は、2重モノマー間の相互作用表面は連続的ではなく、3つの領域D鎖間の主鎖βシート相互作用表面、ループ領域4間の相互作用表面、およびループ領域8間の相互作用表面にさらに分けることができることを示す。12Y2中のループ領域8間の接触は広範囲であるが、ダイマーの配列は、より柔軟性があり著しく歪んだループ領域8にもかかわらず12Y1結晶中において保たれており、ループ領域8の立体配座が絶対に必要とされるわけではないことを示す。したがって、最も有意なダイマーの接触はループ領域4によって、および特に主鎖の相互作用が側鎖の変化と無関係なD鎖によっておそらく仲介される。1760Å2までの埋もれた表面積によって、12Y2ダイマーは真のタンパク質タンパク質相互作用部位であるようである、何故なら結晶中のこのような寸法の非特異的界面を発見する統計的確率は、1未満だからである。我々はこの立体配座は独立したIgNAR可変ドメインに関する一般的な現象であることを示唆する、何故なら我々は、他の組換えVNARにおいてこのようなダイマー種をさらに観察しているからである。VHVL抗体およびVαVβTCRなどのヘテロダイマー形の免疫受容体では、対のドメインが広範囲の疎水性界面で相互作用する。この非溶媒露出領域は、AGFCCのβ鎖上の残基の保存群と追加のCDR3の相互作用によって形成される。対照的に、多くのIgSF系細胞表面受容体は溶液中では単鎖ドメインであり、βサンドウィッチのこの面は一層の荷電性極性を呈する。我々は12Y2のVNAR、ラクダのVHH、TCRのVα、抗体のVH、およびNCAMおよびTelokinドメイン上のこの領域を比較している。ドメイン接触面間の疎水性領域はTCRおよび抗体ドメインに関してすぐに明らかであり、界面の中心の芳香族残基の周辺に集中している。例えばLeu45ArgおよびGly44Gluを突然変異させて一層の荷電性を与えることによって、VHHドメインの表面の性質を変える。しかしながら、ラクダ科におけるこれらの単鎖ドメイン抗体の発生からの比較的短い進化時間は、他の解決策、例えば、ループ領域8の一部分が引き継がれて以前のVL界面、例えば残基Asp121およびTyr120を部分的に含む、例示する抗体も採用されていることを意味する。これらのラクダ科への適合はネズミおよびヒト抗体の可変ドメインに直接移すことができるが、生成するタンパク質は予測不能な立体配座の変化により増大した溶解度を獲得することが多い。可溶性ヒト単鎖可変ドメインの単離も立体配座の摂動に依存する可能性があり、例えば保存残基Trp47の側鎖はVL界面上の腔にはじかれる。対照的にVNARに関しては、この面は荷電および極性残基Tyr37、Glu46、Lys82、Gln84、Arg101、およびLysl04によって占められている。残基Glu46、Lys82、およびLys104は特にタイプ2のVNAR中で充分保存されており、この場合側鎖間および隣接水分子との水素結合の形を有する荷電ポケットを形成する。中心のTyr37は免疫グロブリンスーパーファミリー中の芳香族種として充分保存されており、それならびに残基Gln84およびArg101は、骨格CDR3水素結合網Gln84Tyr87Arg101の形成にも関与している。これらの残基の組合せ効果は、それが結晶形の水分子によって囲まれるように高度の溶媒可溶性を示す、保存型の荷電ポケットを形成することである。Glu46、Lys82、およびLys104トリオの保存は安定性のある充分に確立された面を示唆する。同様の状況がNCAMにおいて観察され、この面は荷電残基Lys76およびGlu88によって占められており、Telokinに関しては、荷電および極性界面は水素結合の組合せによって保たれている。IgNAR可変ドメインに対する修飾結晶構造の分析は、例えば治療、診断およびバイオアレイ試薬としてのVNARタンパク質の可能性を明らかにしている。例えばVNARタンパク質は、その中でβヘアピン構造が延長して他の場合隠れている抗原部位に貫通することができるパラトープを形成する、裂け目に結合する抗体として作用する可能性を有する。さらに、これらのタンパク質は高度の安定性を有しており、それらの操作および実用用途の点で有意な利点を与える。したがって本発明は、図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインの性質を変える方法であって、前記方法がβ鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内のIgNAR可変ドメインを修飾することを含む方法を提供する。IgNAR可変ドメインの性質が変わるように、IgNAR可変ドメインを修飾する。ドメインのいずれかの特性または属性が非修飾ドメインの対応する性質と異なる場合、IgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインの性質が変わる。これらの性質には基質特異性、基質親和性、結合親和性、結合選択性、触媒活性、熱安定性、アルカリ安定性、pH活性概略、タンパク質分解に対する耐性、運動結合性、運動解離性、免疫原性、分泌能力、受容体を活性化する能力、疾患を治療する能力、可溶性、細胞毒性活性および酸化安定性があるが、これらだけには限られない。他に特定しない限り、IgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインの性質は、その性質が非修飾ドメインの対応する性質に対して少なくとも5、好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも20、さらにより好ましくは少なくとも50、および最も好ましくは少なくとも2倍の増大または低下を示すとき、変化していると考えられる。好ましい実施形態では、修飾IgNAR可変ドメイン、および付随する結合成分の可溶性を、対応する非修飾IgNAR可変ドメインに対して変える、好ましくは改善する。他の好ましい実施形態では、IgNAR可変ドメイン、および付随する結合成分の安定性を、対応する非修飾IgNAR可変ドメインに対して変える、好ましくは改善する。安定性の改変の例は、以下の性質熱安定性、アルカリ安定性、pH活性概略およびタンパク質分解に対する耐性の1つを変えることを含む。特に好ましい実施形態では、IgNAR可変ドメインの結合特性を対応する非修飾IgNAR可変ドメインに対して変える。結合特性の改変の例は、以下の性質基質特異性、基質親和性、触媒活性、運動結合性、運動解離性、結合親和性および結合選択性の1つを変えることを含む。他の好ましい実施形態では、非修飾IgNAR可変ドメインと比較して、修飾がIgNAR可変ドメインの性向を増大または低下させてホモダイマーを形成する。本発明は、本発明による方法により生成される修飾IgNAR可変ドメインを含む結合成分も提供する。本発明は、図2に記載のA、A、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含むIgNAR可変ドメインを含む結合成分であって、β鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内でIgNAR可変ドメインが修飾されている結合成分も提供する。非修飾β鎖領域およびループ領域は、表3に記載のアミノ酸残基番号を有することが好ましい。非修飾ループ領域5は、いずれも図3に記載のCおよびDで示す2個のβ鎖領域、および5a、5bおよび5cで示す3個のループ領域を含むことが好ましい。したがって好ましい実施形態では、IgNAR可変ドメインは図3に記載のA、A、B、C、C、D、D、E、FおよびGで示す10個のβ鎖領域、および図3に記載の1、2、3、4、5a、5b、5c、6、7、8および9で示す11個のループ領域を含む。ループ領域5a、5bおよび5c、ならびにβ鎖領域C、CおよびDは表3Aに記載のアミノ酸残基番号を有することが好ましい。好ましい実施形態では、修飾前にIgNAR可変ドメインを修飾する場合、ループ領域5bのCα痕跡は、表1中で定義する残基22、83および36のCα痕跡によって形成される平面より5Åを超えずに広がる。好ましい実施形態では、非修飾β鎖領域A、A、B、C、D、E、FおよびG、ならびにループ領域1、2、3、6、7および9のアミノ酸配列は、図1およびまたは表1に記載のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、IgNARはタイプ2またはタイプ3のIgNAR、好ましくはタイプ2である。IgNARはサメ類、好ましくはオオセザメに由来することが好ましい。他の好ましい実施形態では、非修飾IgNAR可変ドメインは図1に示す配列を有する。非修飾IgNARは12Y1、12Y2、12A9または1A7であることがより好ましい。適切な修飾には少なくとも1個のβ鎖領域またはループ領域の少なくとも1つの領域内の置換、挿入および欠失がある。欠失、挿入および置換の組合せを施して、IgNAR修飾可変ドメインを作製することができる。適切なヌクレオチド変化を本発明の核酸中に導入することによって、あるいは望ましいポリペプチドのinvitro合成によって、修飾体を調製することができる。このような突然変異は、例えばアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。アミノ酸配列突然変異体の設計では、突然変異部位の位置および突然変異の性質は、修飾する特性に依存すると思われる。突然変異部位は個別に、あるいは例えば保存アミノ酸選択基で最初に置換し、次いで得られた結果に応じてより多くの選択基で置換すること、標的残基を欠失させ、または位置特定する部位の近辺に他の残基を挿入することによって連続的に修飾することができる。保存置換基と同等であるがIgNAR可変ドメインの性質を変える修飾は、本発明の範囲内に含まれる。保存置換基の例は以下に与えるさらに、望むならば、非天然アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、本発明のポリペプチドへの置換基または付加基として導入することができる。このようなアミノ酸には、一般的なアミノ酸のD異性体、24ジアミノ酪酸、αアミノイソ酪酸、4アミノ酪酸、2アミノ酪酸、6アミノヘキサン酸、2アミノイソ酪酸、3アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、tブチルグリシン、tブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、βアラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβメチルアミノ酸、Cαメチルアミノ酸、Nαメチルアミノ酸など、および一般的なアミノ酸類似体があるが、これらだけには限られない。ポリペプチドの安定性および循環時間の増大、または免疫原性の低下などの利点を与えることができるIgNAR可変ドメインの化学的に修飾された誘導体も、本発明の範囲内に含まれる。誘導体化用の化学成分は水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコールプロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどから選択することができる。例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、知られている保護ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより合成中または後に特異的に修飾した本発明の可変ドメインも、本発明の範囲内に含まれる。IgNAR可変ドメインは分子内のランダムな位置、あるいは分子内の所定の位置で修飾することができ、1、2、3個あるいはそれより多くの結合化学成分を含むことができる。これらの修飾は、例えば本発明の修飾ドメインの安定性およびまたは生物活性を増大させるために働き得る。IgNAR可変ドメインは、CまたはN末端切断部を所有させることによって修飾することもできる。しかしながら、このような修飾の範囲は限られており、8個を超えない、好ましくは6個を超えない、およびより好ましくは4個を超えない残基を除去することが好ましい。N末端には切断部が存在しないことが好ましく、N末端またはC末端のいずれにも切断部が存在しないことがより好ましい。本発明の修飾ドメインは、天然タンパク質の生成および回収、組換えタンパク質の生成および回収、およびタンパク質の化学合成を含めた、さまざまな方法で生成することができる。一実施形態では、ポリペプチドを生成するのに有効な条件下でポリペプチドを発現することができる細胞を培養すること、およびポリペプチドを回収することによって、本発明の単離ポリペプチドを生成する。好ましい実施形態では、修飾は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸の挿入を含む。他の好ましい実施形態では、修飾は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個以上のアミノ酸の欠失を含む。他の好ましい実施形態では、修飾は1つのループ領域中の2個以上のシステイン残基の置換を含み、システイン残基は他のループ領域中の他のシステイン残基とのジスルフィド形成と関係がある。他の好ましい実施形態では、修飾は表1中に示す残基43の置換ではなく、あるいは残基43の2個以上の置換を含む。他の好ましい実施形態では、表1中に示す残基33、37、46、48、50、51、59、61、86、94、95、96、98、99および101よって定義される群中の1つまたは複数のアミノ酸残基に修飾を施す。好ましい実施形態では、IgNARのループ領域4またはループ領域8を修飾するとき、β鎖領域またはループ領域1~3、5~7または9の少なくとも1つも修飾する。他の好ましい実施形態では、β鎖領域C、D、EまたはFまたはループ領域5、6または7の少なくとも1つが修飾されている。他の好ましい実施形態では、β鎖領域CまたはDまたはループ領域5の少なくとも1つが修飾されている。他の好ましい実施形態では、ループ領域5が修飾されている。好ましい一実施形態では、修飾はループ領域8内の点突然変異を含む。例えば、残基Pro90およびまたはPhe100を置換して、ループ領域8の柔軟性を高めることができる。本発明の他の実施形態では、修飾はループ領域8の無作為化を含む。さらに他の実施形態では、修飾はループ領域8中へのアミノ酸の挿入を含む。さらに他の実施形態では、修飾はVセットまたはIセットドメイン由来のCDRループまたはその一部分をIgNAR可変ドメインに接合させることを含む。例えば抗体のCDR3ループは、ループ領域8の近辺のIgNAR可変ドメインに接合させることができる。接合は例えば、ループ領域8由来のアミノ酸と、抗体のCDR3ループまたはその一部分を構成するアミノ酸の置換を含むことができる。修飾はループ領域4由来のアミノ酸と、抗体のCDR1ループまたはその一部分を構成するアミノ酸の置換をさらに含むことができる。他の好ましい実施形態では、ループ領域8のN末端およびC末端におけるアミノ酸残基が、それぞれβ鎖立体配座をとることができるとき、ループ領域8はβ鎖立体配座をとることができないループの一部分中の少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または付加によって、好ましくは付加によって修飾する。他の好ましい実施形態では、ループ領域8のN末端およびC末端における2~10、好ましくは3~8個のアミノ酸残基はβ鎖立体配座をとることができる。他の好ましい実施形態では、ループ領域のCおよびまたはN末端における1つまたは複数のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して、好ましくは付加または置換して、CおよびまたはN末端でβ鎖立体配座をとることを容易にすることによって、ループ領域8を修飾する。他の好ましい実施形態では、ループ領域8を修飾して、2~10、好ましくは3~8個のアミノ酸残基長のCおよびまたはN末端でβ鎖立体配座をとることを容易にする。任意の所与の配列がβ鎖立体配座を形成することができるかどうかを、insilicoモデル化により予測することが可能であることは、当業者によって理解されるであろう。多くのコンピュータプログラムが利用可能であり、当業者に知られている。適切なプログラムの例は二次構造予測サーバー上、httpwwwpredictproteinorgでも見ることができる。一実施形態では修飾は、非修飾IgNAR可変ドメインと比較して、所定の標的分子の修飾IgNAR可変ドメインの結合特性、例えば親和性を増大または低下させる。リガンドと通常接触するか、あるいは我々が着手した研究から、リガンドとの相互作用に利用可能であり得るIgNAR可変ドメインの部分は、典型的にはIgNAR可変ドメインの溶媒露出領域である。特に、それらは一般に表面露出ループ、および特にIgNAR可変ドメインのループ領域8および4から構成されている。非修飾IgNAR可変ドメインは、1つまたは複数の修飾ループ領域を有していることが好ましい。特にこれは、IgNAR可変ドメインの1つまたは複数の溶媒露出ループと、IgSFの他のメンバーの可変ドメイン由来の1つまたは複数のループを置換することによって達成することができる。ループ領域4およびまたは8、またはその一部分は修飾される、好ましくは他の分子由来の対応するループ構造によって置換されることが好ましい。溶媒露出していないかつあるいは結合ループの一部分、例えばβ鎖領域を形成しないIgNAR可変ドメインの領域に、修飾を施すこともできる。他の好ましい実施形態では、非修飾IgNAR可変ドメインと比較して、修飾がIgNAR可変ドメインの性向を増大または低下させてホモダイマーを形成する。他の好ましい実施形態では、非修飾IgNAR可変ドメインと比較して、修飾がIgNAR可変ドメインの可溶性を増大させる。好ましい実施形態では、1つまたは複数の溶媒露出ループを修飾して可溶性を改善する。例えばジスルフィド結合形成システインを除去すること、およびまたは溶媒露出ループ内部由来のジスルフィド結合形成システインとアラニンまたはセリンなどのアミノ酸を置換することによって、可溶性を改善することができる。IgNAR可変ドメインが細胞内の状況で機能するように設計される、かつあるいはそれらの生成法が可溶形の発現を助長する場合、可溶性を改善するための修飾が望ましい可能性がある。結合特性の変化などの他の修飾を施すと同時かあるいはさらに前に、IgNAR可変ドメインの溶解特性を変えることが必要とされる可能性があることも、当業者には明らかであると思われる。IgNAR可変ドメインの安定性および可溶性などの物理化学的性質は、当技術分野で知られている広範囲の方法を使用して、定性的およびまたは定量的に決定することができる。結合成分の生物物理物理化学性を特徴付けするために、本発明において用途を見出すことができる方法には、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、質量分析、紫外線吸収分光法、蛍光分光法、円二色性分光法、等温滴定型熱量測定、示差走査熱量測定、分析限外濾過、動的光散乱、タンパク質分解、架橋、濁度測定、濾過遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光染色結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡法、およびELISAまたは他の結合アッセイによる凝集の検出がある。X線結晶学技法およびNMR分光法を利用する構造分析も用途を見出すことができる。タンパク質の安定性は、例えばフォールディング状態と非フォールディング状態の間の熱力学的平衡を測定することによって決定することができる。一実施形態では、安定性およびまたは可溶性は、ある明確な期間の後に可溶性タンパク質の量を測定することによって測定することができる。このようなアッセイでは、タンパク質は幾つかの極端な状態、例えば高温、低いpH、または変性剤の存在に曝すことができるか、あるいはできない。非フォールディングおよび凝集タンパク質がその機能を保つ、例えば所定の標的分子と結合することができるとは予想されないので、活性のある残留物の量は結合成分の安定性および可溶性の指標を与える。したがって、可溶性およびまたは安定性を評価する1つの方法は、結合成分を含む溶液を標的分子と結合するその能力に関してアッセイして、次いで溶液を1つまたは複数の明確な期間高温に曝し、次いで抗原の結合を再度アッセイすることである。あるいは、修飾IgNAR結合ドメインは原核細胞発現系において発現される可能性があり、タンパク質は示差遠心分離、ポリヒスチジンなどの結合タグを使用する親和性単離クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む一連の生化学的精製ステップによって細胞溶解物から単離される。修飾ポリペプチドの可溶性の改善の測定は、同等の量の発現非分画生成物で始めて、精製手順の最後に得た可溶性タンパク質の量と非修飾ポリペプチドを使用して得た量を比較することによって実施することができる。培養中の生成物の発現レベルは、SDS界面活性剤で溶解した細胞溶解物の均等な等分試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動後に、生成物のバンド強度を比較することによって標準化することができる。さらに、化学変性剤、熱、またはpHを使用してIgNAR可変ドメインを非フォールディング状態にすることができ、この移行は円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、NMR分光法、熱量測定、およびタンパク質分解だけには限られないが、これらを含めた方法を使用して調べることができる。当業者によって理解されるように、フォールディングおよび非フォールディングの移行の運動パラメータも、これらの技法および他の技法を使用して調べることができる。本発明のIgNAR可変ドメインの可溶性は、正確にフォールディングされた、モノマーポリペプチドの生成と関係があることが好ましい。修飾IgNAR可変ドメインの可溶性も、したがってHPLCまたはFPLCによって評価することができる。例えば、可溶性ドメインはHPLCまたはFPLCクロマトグラフ上で1つのピークを生み出し、一方で不溶性ドメインは複数のピークを生み出すと思われる。さらに、正確にフォールディングすることができる能力、整然とした結晶鉛および構造を形成することができる能力も、優れた可溶性を示すことが多い。加速安定性試験の一例として、IgNAR可変ドメインの等分試料を20°C、4°C、20°Cおよび37°Cなどの異なる温度で保存することができ、IgNAR可変ドメインの活性は異なる時間間隔でアッセイすることができる。例えば、12週間37°Cでの保存中の活性の首尾良い維持は、4°Cで12ヶ月の保存安定性とほぼ等しい。試験を実施して、保存バッファー中の異なる保護添加剤のタンパク質の安定性に対する影響を比較することもできる。このような添加剤は、グリセロール、ソルビトールなどの化合物、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質、またはタンパク質の貯蔵寿命を増大させるために使用することができる他の保護物質を含むことができる。IgNAR可変ドメインに基づくIgSFのメンバーの修飾本明細書に示す結果は、これらのドメインの抗原結合または可溶性安定性に重要であるIgNAR可変ドメインの構造特徴も確認する。これらの特徴をIgSFの他のメンバーのドメインに導入して結合性を変える、あるいは可溶性およびまたは安定性を改善することができる。したがって、他の態様では本発明は、IまたはVセットドメインを修飾する方法であって、前記方法がIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIまたはVセットドメインに挿入およびまたは置換することを含む方法を提供する。他の態様では本発明は、IまたはVセットドメインを含む結合成分であって、IまたはVセットドメインがIgNAR可変ドメイン由来の1つまたは複数の構造特徴をIまたはVセットドメインに置換または挿入することによって修飾されている結合成分を提供する。Iセットドメインによって、Chothiaに述べられそれに従うA、A、B、C、C、D、E、FおよびGで示す9個のβ鎖領域を含むドメインを意味する。代表的なIセットドメイン分子の例にはNCAM、VCAM、ICAM、Telokin、MADCAM1、TwitchinおよびTitinがある。Vセットドメインによって、Chothiaに述べられそれに従うA、A、B、C、C、C、D、E、FおよびGで示す10個のβ鎖領域を含むドメインを意味する。代表的なVセットドメイン分子の例には抗体、T細胞受容体、CTLA4、CD28、ICOS、CD2、CD4、Cd7、CD22、CD33、CD80、CD86、CD48およびCD58がある。IセットまたはVセットドメインは、ドメインの性質を変えるように修飾することが好ましい。一実施形態では、構造特徴はIgNAR可変ドメイン由来のループ領域である。例えば、IgNAR可変ドメイン由来のループ領域8およびまたはループ領域4を、IまたはVセットドメインに接合させることができる。接合は例えばIまたはVセットドメインの適切なアミノ酸を、表1で定義するアミノ酸86~103またはその一部分で置換することを含むことができる。他の実施形態では、方法はIまたはVセットドメインのCDR2ループの全体または一部分を除去することを含む。他の実施形態では構造特徴は、ループ領域4のC末端ならびにCおよびDβ鎖中のIgNAR可変ドメインの溶媒露出面である。方法は表1中に定義するアミノ酸32、33、34、35、55、57および58またはその一部分と等しいIまたはVセットドメインのアミノ酸を修飾することを含むことができる。方法はIgNAR可変ドメインの溶媒露出面またはその一部分を、IまたはVセットドメインに接合させることを含むことができる。接合はIまたはVセットドメインのアミノ酸と、IgNAR可変ドメインの溶媒露出面由来のアミノ酸を置換することを含むことができる。溶媒露出面のIまたはVセットドメインへの接合は、CDR2ループの全体または一部分の除去後に行うことが好ましい。修飾は荷電または極性アミノ酸をこれらの位置に導入することが好ましい。この修飾はIまたはVセットドメインの可溶性を改善することが好ましい。好ましい一実施形態では、VセットドメインはTCRVαまたはVβドメインであり、IgNAR可変ドメインの溶媒露出表面と等しいアミノ酸はGly30、Ser31、Phe32、Phe33、Phe62、Thr63、Ala64およびGln65である。好ましくは修飾は、荷電または極性アミノ酸をこれらの位置に導入することを含む。他の実施形態では、方法はTCRVαまたはVβドメインの1つまたは複数の残基を修飾することを含み、その1つまたは複数の残基はVαドメインとVβドメインの間の界面に位置する。好ましい実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸残基はSer31、Pro43、Leu89およびPhe106、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは修飾は、1つまたは複数の荷電アミノ酸をこれらの位置に導入することを含む。他の実施形態では、方法は抗体VHまたはVLドメインの1つまたは複数の残基を修飾することを含み、その1つまたは複数の残基はVHドメインとVLドメインの間の界面に位置する。好ましい実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸残基は、Ser31、Pro43、Leu89およびPhe106、ならびにこれらの組合せからなる群から選択されるTCRVαまたはVβドメインのアミノ酸と等しい。好ましくは修飾は、1つまたは複数の荷電アミノ酸をこれらの位置に導入することを含む。好ましい実施形態では、修飾はIまたはVセットドメインの可溶性を改善する。他の態様では本発明は、図2によって定義するIgNAR可変ドメインのループ領域4およびまたはループ領域8と等しいIまたはVセットドメインの領域に修飾を導入することを含む、IまたはVセットドメインを修飾する方法を提供する。他の態様では本発明は、本発明の方法によって生成される修飾Vセットドメインを提供する。マルチマー本発明は、同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つがIgNAR可変ドメインである少なくとも2つのIgNARドメイン、同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるIセットドメインである少なくとも2つのIセットドメイン、または同じであるかまたは異なってよく、少なくとも1つが本発明によるVセットドメインである少なくとも2つのVセットドメインを含む、マルチマーを含む結合成分も提供する。2つのドメインは、同じ供給源または異なる供給源に由来してよい。以下の記載は、IgNARドメインマルチマーを対象とする。しかしながら、IgNARドメインマルチマーに関して記載した多くの実施形態をIセットおよびVセットドメインマルチマーに同様に適用することができることは、当業者には明らかであると思われる。さらに、IgNAR可変ドメイン、IセットドメインおよびVセットドメインに関して本明細書に記載する本発明のさまざまな実施形態を、本発明のマルチマー実施形態中に存在するIgNAR可変ドメイン、IセットドメインおよびVセットドメインにそれぞれ同様に適用することは、当業者には明らかであると思われる。マルチマーは、2つのIgNAR可変ドメインを含むことが好ましい。好ましい実施形態では、1個または少なくとも2個のIgNARドメインは、図2に記載のA、Aapos、B、C、D、E、FおよびGで示す8個のβ鎖領域、および図2に記載の1~9で示す9個のループ領域を含む可変IgNARドメインである。好ましい実施形態では、少なくとも1つのIgNAR可変ドメインを、本明細書で前に記載した少なくとも1つのβ鎖またはループ領域内の少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失または付加によって修飾する。マルチマーが少なくとも2個のIgNAR可変ドメインを含む場合、その2個のドメインは、好ましくは少なくとも部分的には塩架橋によって、安定したホモダイマーを形成することが好ましい。したがって1つの好ましい実施形態は、安定したホモダイマーを形成する性向が増大するように、IgNAR可変ドメインの少なくとも1つが修飾されている実施形態である。他の好ましい実施形態では、少なくとも1つのIgNAR可変ドメインが修飾されて、非修飾IgNAR可変ドメインによって形成されるホモダイマーと比較して、形成されるホモダイマーの解離定数が増大している。2個のIgNAR可変ドメインは、安定したホモダイマーを形成する性向が増大するように修飾されていることが好ましい。これは、1つまたは2つの非修飾モノマーの以下の残基とシステイン残基残基57およびまたは61残基51および61または62のいずれか残基32およびまたは33残基99または残基59を置換することによって実施することが好ましい。我々は現在、完全なオオセザメのIgNARコード配列をクローニングしてきている。このコード配列は、1つのIgNARIセットドメインおよび5Cドメインを含む単ポリペプチド鎖をコードしている。成熟IgNAR抗体では、これらの鎖は、位置Cys430およびCys660において半システイン残基によって仲介されるダイマーを形成する。生成する2つのジスルフィド架橋は、定常ドメイン3に対するC末端および定常ドメイン4に対するN末端および定常ドメイン5に対するC末端に位置する。したがって他の実施形態では、マルチマーは少なくとも1つのIgNAR可変ドメインおよび少なくとも1つのIgNAR定常ドメインを含む。定常ドメインは、IgNARのC1定常ドメイン、すなわちIgNAR可変ドメインに性質が最も近い定常ドメインであることが好ましい。IgNAR可変ドメインとIgNAR定常ドメインの結合は結合親和性のレベルに対して影響がないことを、我々は見出している。これは、マルチマー化または結合親和性の消失を助長せずに、結合成分に物体を加えることが可能であることを意味する。したがって、このようなマルチマー構築体は市販のバイオセンサー試薬としての可能性を有する。マルチマーは治療試薬用の1つの好ましい設計体である、何故ならマルチマーは、好ましい薬物動態および生体分布性を与え得る、増大した親和力および低下した血中クリアランス速度を与える可能性を有するからである。IgNARドメインは、化学的または遺伝的にコードされたリンカーの使用を含めた、共有結合または非共有結合または結合の組合せによって結合させることができる。タンパク質ドメインを結合させるために使用するリンカーは、特に免疫グロブリンスーパーファミリー中のタンパク質に関して当技術分野でよく知られておりよく理解されている1401~10Pluckthun、A、およびPack、P1997Immunotechnology、3、83~105。したがって当業者は、任意の適切なヒンジまたは結合手段を使用して、少なくとも2つのIgNARドメインを結合させることができることを理解していると思われる。適切な化学結合の例には、ジマレイミドなどの適切な架橋剤を使用する2つのドメインの結合がある。あるいは2つのドメインは、それぞれCおよびN末端においてシステイン残基を与え、ジスルフィド結合を形成することによって結合させることができる。さらに2つのドメインは、GlyGlyGlyGlySerなどの単鎖GlySerリンカーを使用して結合させることができると思われる。当技術分野でよく知られている技法を使用して、ドメインを遺伝的に結合させることもできる。記載したこれらのリンカー戦略のいずれかから生成するマルチマーは、同じまたは異なる標的特異性を有し、したがって多価または多重特異性試薬を与える可能性がある。好ましい実施形態では、2つのIgNAR可変ドメインを接合させて、共有結合または非共有結合または結合の組合せによってヘテロダイマーを形成することができ、これによって2つの標的結合親和性を与えることができる。マルチマー中の2つ以上のIgNAR可変ドメインが同じ標的特異性を有する場合、マルチマーは多価であり、2つ以上の標的分子との結合に関して増大した親和力を有すると思われる。マルチマーの場合、IgNARドメインは互いに対して適切に配向されていなければならないことは、当業者によって理解されると思われる。第1のIgNARドメインは第2のIgNARドメインに対して適切にヒンジ状態であるか、あるいは結合していなければならない。マルチマーがIgNAR可変ドメインおよびIgNAR定常ドメインを含む場合、ドメインは互いに対して配向していることが好ましい、何故ならドメインは、それらが由来するそれぞれの原型タンパク質中に存在すると思われるからである。結合成分IgNAR可変ドメインを含む本発明の結合成分に関して、このような結合成分は、IgNAR可変ドメインの少なくとも1つの性質が変わるように修飾されているIgNAR可変ドメインを含む。このような結合成分は、適切なIgNAR可変ドメインが由来し得る完全長、野生型タンパク質を含まず、これらとは関係がないことは理解されよう。そうではなくて、このような結合成分は、それらの本来の環境から除去または単離されている可変ドメインを含むIgNARの一部分を含み、これらと関係がある。好ましい実施形態では、結合成分のIgNAR可変ドメインは、結合成分中のアミノ酸残基の合計分子量およびまたは数の、少なくとも25重量、好ましくは少なくとも40重量、より好ましくは少なくとも50重量、さらにより好ましくは少なくとも70重量、さらにより好ましくは少なくとも80重量、さらにより好ましくは少なくとも90重量、および最も好ましくは少なくとも95重量を占める。特に好ましい実施形態では、結合成分は本質的にCBDからなる。本発明の結合成分中に存在する結合ドメインのみが、修飾IgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインであることが好ましい。本発明の結合成分は、実質的に単離された形であってよい。タンパク質の意図する目的に干渉せずさらに実質的に単離されているとみなされる担体または希釈剤と、タンパク質を混合させることができることは理解されよう。本発明の結合成分は実質的に精製された形であってもよく、その場合結合成分は調製物中にタンパク質を一般に含み、その調製物中の90を超える、例えば95、98または99のタンパク質が本発明の結合成分である。本発明の結合成分は、例えば共有または非共有手段によって他の分子と結合することもできる。好ましい実施形態では、本発明の結合成分は、酵素、薬剤、脂質、糖類、核酸およびウイルスなどの分子と結合することができる。一態様では本発明は、診断試薬と結合した本発明の結合成分を提供する。この態様の好ましい実施形態では、診断試薬はストレプトアビジン、ビオチン、放射性同位体、色素マーカー、他のイメージング試薬およびこれらの組合せからなる群から選択される。他の態様では本発明は、固形支持体に固定されているかあるいはバイオセンサー表面と結合している、本発明の結合成分を提供する。一実施形態では結合成分は、他の物体の部位特異的結合用の溶媒露出システイン残基を含むことができる。本発明の結合成分は、典型的には共有または非共有手段によって他の分子と結合することができる。例えば結合成分は、他のポリペプチド配列と結合した融合タンパク質として生成することができる。融合パートナーは、多数の診断用途用または精製を助長するための酵素、検出可能な標識およびまたは親和性タグを含むことができる。融合パートナーは非制限的に、GFP、GST、チオレドキシンまたはヘキサヒスチジンであってよい。他の融合パートナーは、結合成分を特定の亜細胞位置に向けるか、あるいは結合成分を細胞外位置に向ける標的化配列、例えば分泌シグナルを含む。好ましい実施形態では、本発明の結合成分は、それらが由来するタンパク質の他の領域を含まない、すなわち任意の融合パートナーが、IセットまたはVセットドメインが由来するIgNARまたはタンパク質と異種である。異種配列は、生成する融合タンパク質が修飾IgNAR可変ドメイン、修飾Iセットドメインまたは修飾Vセットドメインの活性を保持するのを可能にする任意の配列であってよい。異種配列は例えば、Fc融合体などの免疫グロブリン融合体、またはタンパク質の安定性を増大させ、またはその精製を助ける可能性がある他の細胞リガンドとの融合体を含む。本発明の結合成分と結合することができる診断または治療物質には、薬理学的に活性がある物質、例えば毒素またはプロドラッグ、免疫調節物質など、核酸、例えば阻害核酸またはポリペプチドをコードする核酸など、PEGなどの結合成分のinvivoでの安定性または親油性挙動を増大させる分子、ならびに検出可能な標識、例えば放射活性化合物、色素、発色団、蛍光剤または他のイメージング試薬などがある。実質的に平らな表面またはビーズなどの固相に、結合成分を固定させることもできる。固相にポリペプチドを固定するための技法は、当技術分野で知られている。さらに、結合成分のライブラリーを使用する場合、固相に固定された結合成分のアレイを生成することができるS14~8およびその中に含まれる参照文献。本発明の他の実施形態では、骨格表面での提示用に結合成分の溶媒露出領域に挿入される他のポリペプチド配列を有するタンパク質骨格として、本発明の結合成分は機能する。このような骨格は例えば、立体配座に制約がある形式でペプチドを提示するための好都合な手段として働くことができる。これらの骨格を使用して、改変型結合特異性を有するIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインを生成することができ、当該の任意の標的分子に対する特異性を有する結合成分を生成およびまたはスクリーニングすることもできる。異種ポリペプチド配列は、1つまたは複数の溶媒露出領域、例えばIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインの1つまたは複数のループなどに挿入することができる。結合成分のIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインは、挿入される異種配列のタンパク質骨格として機能し、結合成分の表面上に異種配列を提示する。異種配列は、それらが挿入されるIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインのループの全体または一部分を置換することができるか、あるいは単に他の配列を形成することができる。複数の異種配列が、複数のループに挿入されることが好ましい。異種配列は、例えば他のIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインのループなどの溶媒露出領域に由来してよい。異種配列は他の分子に由来してもよく、あるいは部分的または完全に無作為化することができる。ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主本発明は、本発明によるIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、本発明による結合成分を生成する方法であって、結合成分の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および場合によってはIgNAR可変ドメインを回収することを含む方法も提供する。この態様の好ましい実施形態では、IgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬は非グリコシル化状態である。本発明のポリヌクレオチドはDNAまたはRNAを含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよい。本発明のポリヌクレオチドは、合成または修飾ヌクレオチドをその内部に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する幾つかの異なる型の修飾が当技術分野で知られている。これらはメチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の3およびまたは5端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加を含む。本発明の目的用に、本明細書に記載するポリヌクレオチドを当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾することができることは理解されよう。このような修飾を行って、本発明のポリヌクレオチドのinvivo活性または寿命を増大させることができる。本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクターに取り込ませることができる。ベクターを使用して、適合性のある宿主細胞中で核酸を複製することができる。好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞またはinvitro転写翻訳系の使用によりコード配列の発現をもたらすことができる制御配列と動作可能に連結している、すなわちベクターは発現ベクターである。用語動作可能に連結しているは、記載する要素がその意図する方式でそれらが機能することができる関係にあることを意味する。コード配列に動作可能に連結している調節配列は、制御配列と適合性がある条件下でコード配列の発現が得られるように連結させる。制御配列を例えば他の転写調節要素を加えることによって修飾して、制御配列によって誘導される転写のレベルを転写調節物質より応答性のあるレベルにすることができる。本発明のベクターを適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトして、本発明による結合成分の発現をもたらすことができる。この方法は、結合成分をコードするコード配列のベクターにより発現をもたらすための条件下において、発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養すること、および場合によっては発現した結合成分を回収することを含むことができる。ベクターは、例えば複製起点を備えるプラスミド、ファージミドまたはウイルスベクター、場合によっては前記ポリヌクレオチドの発現用のプロモーター、および場合によってはプロモーターの調節物質であってよい。ベクターは1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクターに関してはネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。ベクターを使用して、例えば宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換することができる。本発明のタンパク質をコードする配列と動作可能に連結した制御配列には、プロモーターエンハンサーおよび他の発現調節シグナルがある。これらの制御配列は、発現ベクターをその中で使用するために設計した宿主細胞と適合するように選択することができる。用語プロモーターは当技術分野ではよく知られており、最小プロモーターから上流要素およびエンハンサーを含むプロモーターまで大きさおよび複雑性の範囲がさまざまな核酸領域を含む。プロモーターは典型的には、原核生物または真核生物細胞中で機能性があるプロモーターから選択される。真核生物のプロモーターに関しては、それらは一般式に、あるいは代替的に組織特異式に機能するプロモーターであってよい。それらは特定の刺激に応答するプロモーターであってもよい。ウイルスプロモーター、例えばマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルスIEプロモーターを使用することもできる。細胞の寿命中に結合成分の発現のレベルを調節することができるように誘導性であることが、プロモーターに有利である可能性もある。誘導性は、プロモーターを使用して得られた発現のレベルを調節することができることを意味する。本発明の幾つかの実施形態では、異種配列を本発明のさまざまなドメインに挿入する。このような修飾は一般に、それぞれのドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドを操作することによって施す。これは、ドメインをコードする配列であって、ドメインの適切な領域への異種配列をコードするヌクレオチド配列の容易な挿入を可能にする1つまたは複数の独特な挿入部位を含む配列を含む、クローニングベクターを提供することによって都合よく実施することができる。それぞれの独特な挿入部位は、II型制限エンドヌクレアーゼによって認識され切断されるヌクレオチド配列であって、クローニングベクターが独特な挿入部位においてのみ制限エンドヌクレアーゼによって切断されるように、クローニングベクター中の他の場所には存在していないヌクレオチド配列を典型的には含む。これは、当業者によく知られている標準的技法を使用する切断ベクターとの連結による、適切な末端を有するヌクレオチド配列の容易な挿入を可能にする。挿入部位は工学処理されている、すなわちドメインが元来存在する配列に由来する場合、挿入部位はその元来の配列中には元来存在しないことが好ましい。本発明のベクターおよびポリヌクレオチドは、ベクターポリヌクレオチドを複製するおよびまたはポリヌクレオチドによってコードされる本発明による結合成分を発現させる目的で、宿主細胞に導入することができる。原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞を含めた、任意の適切な宿主細胞を使用することができる。適切な真核生物宿主細胞には、昆虫細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞および植物細胞がある。好ましい哺乳動物細胞は、CHO、COS、C127、3T3、HeLa、HEK293、NIH3T3、BHKおよびBowesメラノーマなどの動物細胞である。本発明のベクターポリヌクレオチドは、例えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションなどの当技術分野で知られている多数の技法のいずれかを使用して、適切な宿主細胞に導入することができる。本発明のベクターポリヌクレオチドを動物に投与する場合、幾つかの技法、例えばレトロウイルス、単純疱疹ウイルスおよびアデノウイルスなどの組換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注射および生物学的形質転換が当技術分野で知られている。本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、本発明のタンパク質を発現させることができる。本発明による結合成分の発現を可能にするのに適した条件下において、宿主細胞を培養する。結合成分の発現は、それらが連続的に生成されるように構成的であるか、あるいは初期発現に対する刺激を必要とする誘導的なものであってよい。誘導的発現の場合、例えば培養培地への誘導物質、例えばデキサメタソンまたはIPTGの添加によって必要とされると、タンパク質生成が開始される可能性があり、あるいは誘導的発現は熱誘導によって行うことができ、それによって抑制物質を変性させ、タンパク質合成を開始させることができる。本発明による結合成分は、酵素、化学およびまたは浸透圧溶解および物理的破壊を含めた当技術分野で知られているさまざまな技法によって宿主細胞から抽出することができる。無細胞翻訳系を使用して、本発明のペプチドを生成することもできる。原核生物および真核生物宿主と共に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook中に記載されている。結合成分のライブラリー本発明による結合成分は、IgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメイン中に異なる配列を有する複数の結合成分を含むライブラリーとして与えることができる。違いは1つまたは複数のループに存在することが好ましい。これらのライブラリーは、典型的にはスクリーニング法において使用して、当該の特定の標的分子に対する親和性などの、当該の活性を有する結合試薬を同定することができる。結合成分のライブラリーは、結合成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリーとして与えることが好都合である。ポリヌクレオチドは一般に突然変異させるかあるいは無作為化して、少なくとも1つのβ鎖またはループ領域内の1つまたは複数の位置で異なる、多数の異なる配列を生成させる。部位特定突然変異導入法などの当技術分野で知られているさまざまな技法を使用して、突然変異を導入することができる。M13などの一本鎖ファージを利用する方法からPCR系技法まで、部位特定突然変異導入法に関する幾つかの方法が当技術分野で知られているAcademicPress、ニューヨーク、1990を参照。他の技法は、市販のAlteredSitesIIinvitroMutagenesisSystemを使用することである。部位特定突然変異導入法に関する技法は前に記載している。複数のランダムに突然変異させた配列は、大腸菌mutD5などの細菌の突然変異菌株の使用および抗体過剰成熟系のBリンパ球の使用を含めた、さまざまなinvivo技法によってランダムに1つのヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列群に突然変異を導入することによって作製することができる。化学的突然変異誘発因子、およびイオン化またはUV照射、または突然変異塩基類似体の取り込みによって、invivoとinvitroの両方でランダムな突然変異を導入することもできる。例えば誤りがちのポリメラーゼを使用することによる重合中にinvitroにおいて遺伝子に、ランダムな突然変異を導入することもできる。IgNAR可変ドメインのループ領域中に存在する配列を変える突然変異導入技法を使用することが一般に好ましいが、望ましいかあるいは望ましくない可能性があるフレームワークの変化が生じる可能性もある。ループ領域を標的化するための1つの方法は、部分的または完全に突然変異無作為化された複数の比較的短いヌクレオチド配列を与え、IgNAR可変ドメイン中の特定の挿入部位にこれらの配列をクローニングすることである。他の手法は、複数のランダムな合成オリゴヌクレオチドを合成し、次いでそのオリゴヌクレオチドをIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインをコードする配列に挿入すること、およびまたはIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインをコードする配列とランダムな合成オリゴヌクレオチドを置換することである。2個以上のヌクレオチド前駆体を各ステップにおいて反応混合物に加えることによって縮重オリゴヌクレオチドを生成する適切な方法が、WO9727213中に記載されている。この方法の利点は、各ヌクレオチド位置を一定またはランダムに保つ程度を超えた完全な制御が存在することである。さらに、各コドンの第3の塩基においてC、GまたはTのみが考えられる場合、時期尚早な停止コドンが生成する可能性は著しく低下する、何故なら3個の停止コドンのうちの2個が、この位置にAを有するからである。オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野でよく知られている技法を使用して実施する。ライブラリーを指定し、市販のものを購入することもできる。合成法を実施して、全てまたは最も考えられる核酸長の組合せを作製することができ、したがって無作為化核酸のライブラリーを作製することができる。これらの無作為化配列は、それらが任意の融合パートナーを伴う無作為化ペプチドのインフレーム発現を可能にするように合成する。一実施形態では、ライブラリーは完全に無作為化されており、配列はいずれかの位置に優先せず、あるいはいずれかの位置に一定でもない。他の実施形態ではライブラリーは偏っている、すなわち部分的に無作為化されており、その中で配列中の幾つかの位置は一定に保たれているか、あるいは限られた数の考えられる変異体から選択される。したがって、幾つかの核酸またはアミノ酸位置は一定に保たれており、かつ幾つかの構造または化学特性は維持されると考えられる。無作為化オリゴヌクレオチドは、したがって適切な部位に挿入することができ、かつあるいはIgNAR可変ドメイン、IセットドメインまたはVセットドメインをコードする適切な配列を置換することができる。一般に配列のライブラリーは、構造的に異なるランダムな配列の群が示されるほど充分大きいと思われる。これによって形状および構造の大きなサブセットが示されることが確かになり、機能的相互作用の確率が最大になる。ライブラリーは少なくとも1000個の異なるヌクレオチド配列、より好ましくは少なくとも104、105または106個の異なる配列を含むことが好ましい。ライブラリーは104~1010個の異なる配列を含むことが好ましい。ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドの少なくとも5、10、15または20個のアミノ酸残基を、無作為化することが好ましい。典型的には、無作為化ヌクレオチド配列によってコードされる挿入ペプチドは少なくとも5、8、10または20個のアミノ酸を含む。ペプチドはさらに50、30または25個より少ないアミノ酸を含むことが好ましい。他の態様では本発明は、標的分子に対する親和性を有する本発明による結合成分を選択する方法であって、標的分子に対する親和性を有する結合成分の発現に関して、本発明のポリヌクレオチドのライブラリーをスクリーニングすることを含む方法を提供する。結合成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリーは、任意の適切な技法を使用してスクリーニングして、当該の活性を有する結合成分を同定することができる。例えば、当該の標的分子と結合する結合成分を同定するために、ポリヌクレオチドによってコードされる結合成分ポリペプチドの発現、およびポリペプチドと評価する標的分子の結合を可能にする条件下において、ポリヌクレオチドのライブラリーをインキュベートする。結合は典型的にはinvitroで、あるいは全細胞アッセイを使用して評価する。当該の活性を有する結合成分に関してライブラリーをスクリーニングするのに適した技法には、ファージディスプレイおよびリボソームディスプレイ、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターの使用、およびタンパク質バイオアレイによるinvivoの区画化スクリーニングがある。好ましい実施形態ではこの方法は、バクテリオファージ粒子の表面上に遺伝子IIIタンパク質融合体として、本発明のIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬を提示することを含む。他の好ましい実施形態では方法は、リボソームディスプレイ選択系において、本発明のIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬を提示することを含む。スクリーニングにおいて同定する結合成分の配列は、標準的なDNA塩基配列決定技法を使用して都合よく決定することができる。結合成分の診断治療用途本発明のスクリーニング法において同定した結合成分を含めた本発明の結合成分は、当該の標的分子に対するそれらの特異的な結合性のために診断治療の方法において使用することができる。このような使用は、抗体およびその断片に関して既に知られている多数の診断治療用途と類似していると思われる。例えば本発明の結合成分を使用して、生物サンプル中の当該の分子の存在または不在を検出することができる。診断目的用には、ディップスティック、マイクロタイタープレートまたはチップなどの固相に結合試薬を固定することが好都合である可能性がある。前に論じたように、本発明の結合成分は診断に使用するとき、典型的には検出可能な標識などの診断試薬と結合させてinvitroまたはinvivoでの結合事象の容易な検出を可能にする。適切な標識には、invivo検出およびまたは標的分子の位置特定用の放射性同位体、色素マーカー、または他のイメージング試薬がある。結合成分は治療に使用することもできる。例えば結合成分を使用して、細胞外受容体と結合するリガンドを標的化することができる。さらに、本発明の結合成分を抗体と同様の方法で使用して、結合成分が特異的に結合する腫瘍細胞上に特異的に存在する細胞表面分子との結合によって、腫瘍細胞などの当該の細胞に対して薬理学的に活性がある物質を標的化することができる。投与他の態様では本発明は、本発明によるIgNAR可変ドメインまたはマルチマー試薬、ならびに薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。他の態様では本発明は、被験体の病状を治療する方法であって、本発明による医薬組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明のスクリーニング法によって同定した結合成分を含めた本発明の結合成分は、好ましくはさまざまな要素と組合せて、本発明の組成物を生成することができる。好ましくは組成物を薬剤として許容可能な担体、アジュバントまたは希釈剤と組合せて、医薬組成物を生成する。適切な担体および希釈剤には、等張生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水がある。本発明の組成物は、直接注射によって投与することができる。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮投与用に配合することができる。典型的には、001~30mg体重1kg、好ましくは01~10mg体重1kg、より好ましくは01~1mg体重1kgの用量で、それぞれのタンパク質を投与することができる。結合成分をコードするポリヌクレオチドベクターは、裸の核酸構築体として直接投与することができる。ポリヌクレオチドベクターを裸の核酸として投与するとき、投与する核酸の量は典型的には1μg~10mg、好ましくは100μg~1mgの範囲であってよい。哺乳動物細胞による裸の核酸構築体の摂取は、幾つかの知られているトランスフェクション技法、例えばトランスフェクション物質の使用を含めた技法によって増大する。これらの物質の例には、カチオン性物質およびリポフェクタントおよびtransfectamがある。典型的には、核酸構築体をトランスフェクション物質と混合させて組成物を生成する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを薬剤として許容可能な担体または希釈剤と組合せて、医薬組成物を生成する。適切な担体および希釈剤には、等張生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水がある。組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮投与用に配合することができる。記載する投与経路および用量は単なる指針としてのみ考えられる、何故なら当業者は、任意の特定の患者および状態に関する最適な投与経路および用量を容易に決定することができるからである。前述の個々の項において言及する、本発明のさまざまな特徴および実施形態は、必要な変更を加えて適切に他の項に適用する。したがって、1つの項において示す特徴は、他の項において示す特徴と適切に組合せることができる。ここで本発明を、以下の非制限的な実施例においてさらに記載する。VNAR12Y1および12Y2タンパク質の発現記載されたのと同様に、組換えタンパク質12Y1および12Y2を、21残基のC末端デュアルオクタペプチドFLAGエピトープおよびリンカー領域とインフレームで大腸菌周辺質中に発現させた。簡単に言うと、大腸菌TG1開始培養物を2YT培地アンピシリングルコース中で一晩増殖させ、新たな2YT100μgmLのアンピシリングルコース中に1100に希釈し、次いでOD550nm02~04まで37°C200rpmで増殖させた。培養物は次いでIPTGを用いて誘導し、28°Cでさらに16時間増殖させ、遠心分離によって採取した。周辺質分画はMinskyの方法によって単離し、組換えタンパク質は抗FLAG抗体セファロースカラムを介した親和性クロマトグラフィーによって精製した。親和性カラムはTBS、pH74中で平衡状態にし、結合タンパク質はImmunoPure適度な溶出バッファーで溶出させた。溶出したタンパク質は002MのトリスpH75の2つの変形で透析し、3000Daのカットオフ膜での限外濾過によって濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィー、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびバイオセンサーによって純度および活性を分析した。VNAR1A7および12A9タンパク質の発現組換えタンパク質1A7および12A9を、前の実施例1に記載したのと全く同様に大腸菌周辺質中に発現させ、精製し分析した。VNAR12Y1および12Y2タンパク質の結晶化組換えタンパク質12Y2を、HamptonResearchの散在マトリクス結晶化スクリーニングキットを使用して2μlの懸滴中に設定した。プレートは25°Cでインキュベートした。最終的な結晶化条件は、01Mクエン酸ナトリウムpH4620vvイソプロパノール20PEG4000であった。回析良質の結晶を48時間後に得た。組換えタンパク質12Y1を、CartesianHoneyBeeロボットを使用して02μlの懸滴として設定した。プレートは25°Cでインキュベートした。13mgmlで12Y1タンパク質を使用して、成功条件を2μlの懸滴に拡大した。最終的な結晶化条件は、01MビストリスプロパンpH6545PPGP400であった。回析良質の結晶を7日後に得た。VNAR12A9および1A7タンパク質の結晶化組換えタンパク質12A9を、CartesianHoneyBeeロボットを使用して02μlの懸滴として設定した。プレートは25°Cでインキュベートした。成功条件を2μlの懸滴に拡大した。最終的な結晶化条件は、01MCHESpH9550PEG200であった。回析良質の結晶を40日後に得た。組換えタンパク質1A7を、CartesianHoneyBeeロボットを使用して02μlの懸滴として設定した。プレートは25°Cでインキュベートした。成功条件を2μlの懸滴に拡大した。最終的な結晶化条件は、01M酢酸pH4620PEPであった。回析良質の結晶を10日後に得た。12Y1および12Y2に関するデータ収集および構造決定全結晶からのX線回析データの収集は、単管集束光学装置を備えるRigakuHR3HBX線発生装置に取り付けた、RigakuRAXISIVおよびMar180画像プレート検出器を使用して内部で実施した。データは160°Cで収集し、結晶は他の凍結防止剤を必要としなかった。全てのデータ処理はDENZOSCALEPACKスイートを使用して実施した。回析データの統計は表2中に要約する。12Y1タンパク質に関する最初の重原子スクリーニングは、重原子スクリーニングM2キットルテニウム水和物2およびカリウムヘキサクロロレニウムを使用して、原型ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実施した。同形重原子誘導体は、08lの50mMLAHまたはPHR中に30分まで12Y1結晶を浸すことによって得た。重原子部位は統計的相分けプログラムSHARPを用いて同定および精製し、溶媒増大手順DMおよびSOLOMONを使用して相の不定性を解明した。SHARPにより生成した残差および異常差フーリエマップを調べて他の重原子ピークを位置特定し、それらはSHARPを使用する相精製および計算の後のサイクルに含まれていた。このサイクルを数回繰り返すことによって、他の位置を位置特定し相を282Åまで改善した。この結果はLuとReの両方の相指数を使用して得た。SHARPにより生成した電子密度マップにXtalViewを使用して、モデルを手作業で構築した。次いでこのモデルを、CNSおよびCCP4パッケージを使用して原型12Y1データに対して精製した。電子密度差マップ2m│FO│D│FC│およびm│FO││FC│を使用して、XtalViewプログラムにおいてモデルを改善した。モデル構築および精製中に、5のデータを交差確認用にフラグして精製の進行を調べた。電子密度マップによって、無秩序な状態であったCDR3類似ループ残基以外の全残基の明確な追跡が可能であった。水分子はm│FO││FO│マップにおいて≧2σピークでプログラムARPを用いて自動的に位置特定し、それらがH結合基準を満たす場合は保持し、精製後に2m│FO│D│FC│密度に戻した。標準的な精製における集束後、R因子の2を超えるさらなる改善を、CCP4REFMAC5中のTLS手順を用いて1つの異方性ドメインとして全タンパク質原子を精製することによって得た。振動テンソルは有意な異方性を示した。最終的なRおよびRfree値は、6~282Åの範囲の精製データに関してそれぞれ0166および0254であった。最終的な12Y1モデルは、100個のアミノ酸および97個の水分子を含む。12Y1モデルの残基のうち、845がCCP4PROCHECKによって作製されたラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中にあり、充分に容認された領域または非容認領域中には残基は存在しない。さらなる詳細は表2中に与える。12Y2の構造は、CCP4MOLREPを使用する分子置換によって決定した。検索モデルは、CDR3類似ループを含まない12Y1構造であった。2個の12Y2モノマーを、I212121空間群の非対称単位において同定した。XtalViewおよびREFMAC5を使用する精製を使用する反復モデル構築によって、延長CDR3類似ループを含むAおよびBモノマーの完全な追跡が可能であった。CDR3類似ループ領域中の電子密度を充分明確に定義した。観察した回析範囲の5を含む組に基づくRfree統計値を使用して、精製の進行を調べた。12Y1に関して記載したのと同様に、プログラムARPを用いて水分子を自動的に加えた。最終的な精製値は非対称単位中のTLS基としての個々にそれぞれの分子に関するTLSパラメータを含んでおり、1812~218Åの範囲の実験データに関してそれぞれ0176および0247のRおよびRfree値に収束した。12Y1に関しては、振動テンソルのみが有意であったが、異方性は低かった。最終的なモデルは、12Y2のAおよびB鎖の残基1~113および358個の水分子を含む。全体として934の残基がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中にあり、充分に容認された領域または非容認領域中には残基は存在しない。これは、12Y2モデルが非常に精製されたタンパク質構造と一致することを示す。さらなる詳細は表2中にある。12A9および1A7に関するデータ収集および構造決定1A7結晶に関するX線回析データの収集は、単管集束光学装置を備えるRigakuHR3HBX線発生装置に取り付けた、Mar180画像プレート検出器を使用して内部で実施した。12A9結晶に関するX線回析データは、日本国においてPhotonFactoryシンクロトロンBL5ビームラインで収集した。両方の結晶に関するデータは160°Cで収集し、結晶は他の凍結防止剤を必要としなかった。全てのデータ処理はDENZOSCALEPACKスイートを使用して実施した。回析データの統計は表2中に要約する。1A7および12A9の構造は、CCP4MOLREPを使用する分子置換によって決定した。1A7に関する検索モデルは、CDR3類似ループを含まない12Y1二重ダイマーであった。4つの1A7モノマーを、I212121空間群の非対称単位において同定した。XtalViewおよびREFMAC5を使用する精製を使用する反復モデル構築によって、CDR3類似ループを含むAおよびCモノマーの完全な追跡が可能であった。モノマーBおよびDのCDR3類似ループ領域中の電子密度は、充分明確には定義できなかった。AおよびB、ならびにCおよびD鎖は、12Y1および12Y2構造において観察されたのとほぼ同じ2つの二重ダイマーを形成する。12Y1および12Y2に関して記載したのと同様に、水分子を加え、精製の進行を調べた。最終的な精製値は非対称単位中のTLS基としての個々にそれぞれの分子に関するTLSパラメータを含んでおり、完全な216~27Åの範囲の実験データに関してそれぞれ0176および0265のRおよびRfree値に収束した。最終的なモデルは、1A7のAおよびC鎖の残基1~111、ならびにBおよびD鎖の残基1~88および99~111、ならびに489個の水分子を含む。全体として909の残基がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中にあり、充分に容認された領域または非容認領域中には2個の残基が存在する。1A7の完全鎖AおよびC、ならびに12Y2の鎖Aの重なりを図5a中に示す。さらなる詳細は表2中に与える。12A9に関する検索モデルは、CDR3類似ループを含まない12Y1構造であった。12A9の1分子を、P21212空間群の非対称単位において同定した。CDR3類似ループ中の電子密度は追跡可能であったが、しかしながら92~95領域は幾分拡散していた。最終的な精製値は分子全体に関するTLSパラメータを含んでおり、完全な395~21Åの範囲の実験データに関してそれぞれ0217および0280のRおよびRfree値に収束した。最終的なモデルは、12A9の残基1~108および140個の水分子を含む。全体として884の残基がラマチャンドランプロットの最も好ましい領域中にあり、充分に容認された領域中には1個の残基が存在する。さらなる詳細は表2中にある。結晶学上のダイマーの構造ダイマー間のモノマーの相対配置は、69°の旋回および043Åの回転移動として記載することができる。これは以下のように計算した。1個のモノマーのみから選択される対応するCα原子の最小二乗法の重ね合わせを使用して、12Y2ダイマーに12Y1ダイマーを重ね、したがって旋回の程度、および第一結晶形由来の残りのモノマー12Y1および12Y2に関する配位12Y1および12Y2に関する配位は、それぞれ付録IおよびIとして添付する。12A9および1A7に関する配位12A9および1A7に関する配位は、それぞれ付録IおよびIとして添付する。12Y2のループ領域に対する修飾12Y2のループ領域8は、その長さの相当な部分が延長し主鎖の水素結合によって安定化するβ鎖を有するβヘアピン鎖立体配座をとる。このβヘアピン鎖立体配座は、例えばTyr87Phe100Leu89Leu98Leu89Leu98の間で主鎖の水素結合によって保たれる。延長ループは免疫グロブリンフレームワークから外側および上側に延長し、例えば酵素活性部位、寄生虫コートタンパク質中の埋もれた裂け目および腔、あるいはウイルス中の裂け目に貫通するのに理想的な構造を作製する。以下の表は、12Y2のループ領域8の長さと、b12Igラクダ科VHH1MELおよびT細胞受容体1QRNなどの裂け目に結合する抗体由来の長鎖CDR3ループの長さの比較である。これらの数字は、12Y2のループ領域8は比較的長いことを示し、VNAR骨格はこのような長いCDR3様ループを示すのに理想的であることを示唆する。この分析は、ループ領域8に対する修飾が新規の診断または治療用結合成分の生成をもたらす可能性があることを示す。さらに、VNAR骨格の他の領域、特に12Y2骨格に対する修飾も、新規の診断または治療用結合成分の生成をもたらす可能性がある。修飾の例には以下のものがある1詳細に示すアミノ酸配列を有する延長CDR3ループの、ループ領域8近辺のVNAR骨格への接合例えば、配列RVGPYSWDDSPQDNYYMをループ領域8近辺の12Y2骨格に接合させて、抗HIV抗体b12に対応する延長ループを形成することができ、これによってHIVgp120と結合することができるIgNAR骨格を有する新規の結合成分を与えることができる。接合は例えば、12Y2のアミノ酸残基86~103とRVGPYSWDDSPQDNYYMの置換を含むことができる。他の例では、B型肝炎ウイルス由来の主要表面抗原の突出ループを表す配列CSKPSDSNCを、CDR3ループの代わりにVNAR骨格24G3に接合させることができる。したがって生成するIgNARを使用して、HBsAgループと他のHBVタンパク質の相互作用を評価することができると思われる。2詳細に示すアミノ酸配列を有するCDR1ループの、ループ領域4近辺のVNAR骨格への接合例えば、抗HIV抗体b12の配列GYRFSNFVIを、ループ領域4近辺の12Y2骨格に接合させることができ、前のに記載した抗HIV抗体b12のCDR3ループ接合部と組合せると、gpl20との結合親和性を増大させると思われる。接合は例えば、12Y2のアミノ酸残基28~33と配列GYRFSNFVIの置換を含むことができる。CDR1ループ接合が12Y2VNARの親和性および発現性を変えるかどうかを判定するために、12Y2の14M15クローンのN末端半分を、配列のライブラリーで置換した。これによって効果的に、固定CDR3と組合せたCDR1N末端フレームワーク変異体のライブラリーを生成した。88個のCDR1シャッフルVNARクローンを、AMA1抗原との結合に関してELISAによって分析した。19個のクローンがAM1に対する親和性を有しており、一方残りの69個は結合性を示さなかった。クローンは、陰性対照抗原に対する検出可能な親和性を有していなかった。これは、CDR1の配列および立体配座がIgNARの結合に必要不可欠であることを示す。図16は、高い親和性を有する5個のクローンおよび検出可能な親和性を有していない5個のクローンのELISA分析の結果を示す。相対的な発現レベルも与える。図17は、図16からのクローンのアミノ酸配列アラインメントを示す。最高親和性を有するクローンのうち、3個が類似したCDR1配列を有していたが、残りの2個は相当異なっていた。類似したクローンは共通のCDR1配列RDTSCAFSSTGを共有しており、N末端近辺のフレームワーク領域が異なる1~3個の残基を有していた。検出可能な抗原親和性を有していなかった5個のクローンの配列も、相当な変異を有していた。さらに、存在するIgNARタンパク質の量はクローン間で異なっていた。これは、CDR1の配列および立体配座がIgNARの発現レベルおよびタンパク質生成にも必要不可欠であることを示す。配列の違いは主にCDR1ループ領域に位置し、これはフレームワーク残基にある程度原因があり、親和性とタンパク質の発現レベルの両方に対して顕著な影響を有する。3ループ領域8中の特定残基の突然変異または挿入。例えば、残基Pro90およびまたはPhe100の突然変異によってループ領域8の柔軟性を増大させることができ、それによって改善された抗原結合性をもたらすことができる。100個の残基当たり平均1個のアミノ酸変化を含む12Y2変異体のランダムに作製したライブラリーを、AMA1抗原に対してスクリーニングした。2個の高親和性クローンをそれぞれ別個に単離し、野生型12Y2より10倍増大した親和性を示した。これらは14M15および14M8と示された。4長さおよびアミノ酸組成が異なるループ領域8全体の無作為化。これは実質的に、以下のさまざまな実施例中に記載する新しいサメ類ライブラリーの作製である。5長さおよびアミノ酸組成が異なるループ領域8全体の無作為化、および対型接合残基Gly84Glu103、またはGln84Gly102の組合せの取り込みによるループ領域フレームワーク接合部の改善。VNARライブラリーを、12または13残基のループ長およびGly84Glul03、またはGln84Glyl02のいずれかのフレームワーク残基の組合せを有するCDR3用の、新たな縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって拡大した。これらおよび他のCDR3組合せを使用して、2×108を超える要素の他のVNARライブラリーを構築した。以下の新たなプライマーオリゴヌクレオチドを使用したA0295、A0296、A0297およびA0298。IgNARドメインは、配列番号47~60で開示するプライマーの組合せを使用して仕上げた。6ループ領域8の先端の残基、例えば残基Pro90~Ser97、または他のこのような変異体の無作為化、および残基の取り込みまたは除去によるこのループの延長または縮小、ならびに無作為化残基の数および戦略の変更。ループ領域8の残基Leu98、Leu99修飾は同様の方法で行うことができる。例えばセット17個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97式71をコードする核酸による修飾をLeu98に施した。セット29個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97式91をコードする核酸による修飾をLeu98に施した。セット3チロシン環状アミノ酸傾向を有する8個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97およびLeu99に、式111121111をコードする核酸による修飾を施した。セット4主なチロシン環状アミノ酸傾向を有する10個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97およびLeu98に、式3431をコードする核酸による修飾を施した。セット5芳香族傾向を有しLeu98を有さない12個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97に、式3121212をコードする核酸による修飾を施す。セット6芳香族傾向を有しLeu98を有さない12個の無作為化残基によって置換されたLeu89~Ser97に、式12121212をコードする核酸による修飾を施す。1×108までの大きさの独立クローンの12Y2に基づくライブラリーを、等しい表示のこれら6個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して構築した。PlasmodiumfalciparumAMA1の異なる菌株、すなわちW2MEFおよびHB3、および原型抗原AMA13D7に対してライブラリーをスクリーニングした。図18は、異なる材料菌株に対して選別したKHライブラリーを示す。VNARの結合面を広げるために示す修飾本明細書に示す結果は、VNARのCDR2ループは存在せず、分子の底部で短いβターンによって置換されていることを示す。これは図12中に図式的に示し、この場合VNARのCDR2は典型的なヒト抗体のそれと一直線に並んでいる。このループの底部位置は、低い配列変異性と組合せて、この領域は抗原との相互作用に対してほとんど影響がないことを強く示唆する。しかしながら、従来のCおよびD鎖の消失は、従来のCDR2の不在下で開いた状態の大きな凹状ポケットと延長12Y2ループ領域8が組合わさった、抗原結合の考えられる他のモデルを示唆する。この凹状ポケットは、考えられる抗原結合面である。このポケットは、残基のループ領域8、ループ領域5およびCおよびDβ鎖を含む。これらの残基にはAsp33、Tyr37、Glu46、Ser48、Ser50、Ile51、Val59、Lys61、Phe86、Tyr94、Asn95、Tyr96、Leu98、Leu99およびArg101がある。この抗原結合表面は任意の抗体パラトープとは異なる、何故ならループ領域が互いに離れており、抗原接触残基がループ領域間にフレームワーク残基を含むことができるからである。この分析は、C、C、D鎖、ならびにループ領域5および8内の選択した残基の無作為化を使用して、ループとフレームワーク残基の組合せによって抗原と結合すると思われる鋏体分子ライブラリーを構築することができることを示唆する。適切な標的残基は単独、および組合せで以下のものである100個の残基当たり平均1個のアミノ酸変化を含む12Y2変異体のランダムに作製したライブラリーを、AMA1抗原に対してスクリーニングした。突然変異Pro90Leuおよび他の突然変異Thr39Serを取り込んでいた、高親和性クローンを単離した。このタンパク質は、ELISA参照、バイオセンサー参照、およびタンパク質バイオアレイによって14M15より2倍良い親和性を有していた。タンパク質の発現特性は不変であった参照。この突然変異は、β鎖領域Cに対してちょうどN末端のフレームワーク中の位置39に存在するおよび参照。これはフレームワーク領域の突然変異が、特にCDR2の近辺で親和性に対して有意な影響を有する可能性があることを示す。理論によって縛られずに、このことは、結合を増大させるほど充分にCDR立体配座を変える鎖のねじれに影響を与える可能性があると考えられる。サメ類からヒトドメインへのループ接合による治療物質または診断物質の作製IgNARおよびヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのIセットドメインの構造は、フレームワークループ領域接合部、鎖の射出角、およびループの配向の予測を可能にするほど充分相同性がある。VNARに関して発見した結合ループは、NCAM、ICAM、およびTelokinだけには限られないが、これらなどのヒトIセットの骨格に接合させることができる。これは、非ヒト供給源に由来する可変ループ領域のみを有する、ヒト結合ドメインIg様試薬を形成すると思われる。これらは裂け目に結合するヒトIg様試薬として非常に有用である可能性がある、何故ならこれらは、任意の知られている天然に存在する抗体と異なる抗原結合表面を有するからである。例えば以下の修飾を、NCAM、ICAMまたはTelokinなどのIセットフレームワーク分子に施すことができる112Y2由来の抗AMA1ループ領域8のIセット骨格への接合。212Y2由来の抗AMA1ループ領域4および8のIセット骨格への接合。312Y1由来の抗AMA1ループ領域8のIセット骨格への接合。412Y1由来の抗AMA1ループ領域4および8のIセット骨格への接合。5他のVNARループ領域8のIセット骨格への接合。6他のVNARループ領域4のIセット骨格への接合。7VNAR由来のループ領域4および8のIセット骨格への接合。8Iセット骨格と接合したループへのループ領域4~8のジスルフィド架橋の取り込み。9等しいループ、ループ領域4および8の無作為化によるIセット骨格のライブラリーの作製。10ループ領域4および8と等しいループの無作為化によるIセット骨格のライブラリーの作製、および細胞接着分子を標的化するウイルスを同定するための一組の可変性ウイルストラップとしての使用。NCAMおよびTelokinのクローニング神経細胞接着分子1は、神経細胞の接着を仲介する哺乳動物細胞表面の糖タンパク質である。細胞外ドメインは、5Igスーパーファミリードメイン次に2フィブロネクチンのタイプ3ドメインからなる参照。NCAMのドメイン1はIgスーパーファミリーのIセット内で分類され、グリコシル化または他の翻訳後修飾によって修飾されない。野生型ヒトNCAMドメイン1および野生型ヒトNCAMドメイン12のコード配列を、ヒトcDNAライブラリーから増幅し、大腸菌クローニング発現ベクターpGCにインフレームでクローニングした。A0657は、ドメイン1用の正方向5プライマーとして使用した。A0658は、ドメイン1用の逆方向3プライマーとして使用した。A0659は、ドメイン2用の逆方向プライマーとして使用した。A0979は、NCAMの二次延長プライマーとして使用した。クローンはDNA塩基配列決定によって確認した。野生型ドメイン1と野生型ドメイン12の両方が、FastProtein液状クロマトグラフィー参照およびSDSPAGEによって測定して、大腸菌周辺質空間に可溶性タンパク質として首尾良く発現された。整然とした立体配座へのフォールディングに関する証拠を与えるために結晶鉛を得た。ミオシン軽鎖キナーゼは、3個のN末端Ig様ドメイン、1個のカルモジュリン結合触媒ドメイン、および1個のC末端Ig様ドメインからなる参照。カルシウムカルモジュリンによる結合後のMLCKの活性化は、ミオシン軽鎖のN末端中の特定のセリンのリン酸化をもたらし、カルシウムシグナルの選択的な変換を可能にするカルモジュリンMLCKシグナル変換複合体の形成につながり、最終的に筋収縮を引き起こす。触媒ドメインの側面に位置するIg様ドメインは、MLCKとミオシンの結合を可能にする。内部プロモーターからのMLCKのC末端Ig様ドメインの独立した転写は、成熟タンパク質、Telokinの生成をもたらす。TelokinはIセットIgドメインであり、Ser12およびSer18にリン酸化部位を有する。Telokinは非リン酸化ミオシンと結合し、それによってMLCKによるリン酸化を妨げることによりMLCK活性を調節するようである。ヒトTelokinドメイン1のコード配列を、ヒトcDNAライブラリーから増幅し、大腸菌クローニング発現ベクターpGCにインフレームでクローニングした。A0678は、正方向5プライマーとして使用した。A0677は、逆方向3プライマーとして使用した。A0999は、TelokinのN末端二次延長プライマーとして使用した。DNA塩基配列決定により確認してクローン21J4は正確であった。Telokinのドメインが、FPLC参照およびSDSPAGEによって測定して、大腸菌周辺質空間に可溶性タンパク質として首尾良く発現された。モデル化およびループ接合非ヒト供給源に由来する可変ループ領域のみを有するヒト結合ドメインIg様試薬、すなわちサメ類のIgNAR抗体を生成するために、VNAR1A7由来のCDR3ループをNCAMのドメイン1およびTelokinのIセットドメインとのループ接合用にモデル化した。サメ類のVNAR、NCAMのドメイン1およびTelokinは、可変VNARCDR3ループの接合地点を評価するために、どの骨格構造相同性が最大であったかを決定するために調整した最小二乗値であった。これらのループは長さと配列の両方が異なり、NCAMのドメイン1およびTelokin骨格上のキメラとしてモデル化して、ヒト結合ドメインIg様試薬を生成した。さまざまなキメラを、VNARCDR3長の変異体および表5に記載の配列を有するModeller6v2を使用して、次いで設計および構築した。次いでそれぞれのモデルを、肉眼による検査によってヒト骨格およびVNARCDR3構造からの逸脱に関して、およびモデルの客観的値に従い潜在的な安定性に関して評価した。最適な値のモデルはNCAMモデル5、およびTelokinモデル3およびモデル5であった。NCAM1A7ループ接合最適なNCAMサメ類1A7のCDR3ループ接合は、オリゴヌクレオチドプライマーA0989を使用して重複PCRによって構築した。23B2で示す生成したクローンはDNA塩基配列決定によって確認した。タンパク質の発現および精製は、生成した組換えタンパク質は野生型より安定していたようであり、例えばSDSPAGEによりほとんど変性しなかったようであり参照、FPLCにより1つのピークが存在したようであった参照ことを示した。このタンパク質は結晶化試験に施すと幾つかの明確な結晶鉛を与え、それが安定性のある整然とした構造にフォールディングされていたことが示された。ELISAにおいて組換えタンパク質23B2は標的抗原と特異的に相互作用したが、陰性対照抗原とは相互作用しなかった参照。野生型NCAMドメイン1ではなく23B2の特異的結合はバイオセンサーによって確認した参照。Telokin1A7のループ接合最適なTelokinサメ類1A7のCDR3ループ接合は、オリゴヌクレオチドプライマーA1022およびA1023、ならびにプライマーA1024およびA1025を使用して重複PCRによって構築した。生成したクローンは24F4ならびに23C7で示し、DNA塩基配列決定によって確認した。タンパク質の発現および精製は、生成した組換えタンパク質は大腸菌周辺質空間に発現されたことを示した。組換えタンパク質のFPLCによる追跡およびSDSPAGE概略は、図26およびに示す。両方のループ接合モデル組換えタンパク質が標的抗原と特異的に相互作用したが、陰性対照抗原とは相互作用しなかった参照。野生型Telokinではなく24F4の特異的結合はバイオセンサーによって確認した参照。ヒトドメインからサメ類VNARへのループ接合による治療物質または診断物質の作製IgNARヒト免疫グロブリンスーパーファミリーのIセットドメインの構造は、フレームワークループ領域接合部、鎖の射出角、およびループの配向の予測を可能にするほど充分相同性がある。ICAM1などのIセットドメインは、ライノウイルスなどのウイルスの受容体として示されてきている。ライノウイルス結合に特異的なICAM1上の結合ループはVNAR骨格と接合させることができ、新規な結合成分を生成することができる。これはIセットドメインに基づく他のウイルス診断物質にさらに拡大することができる。例えば以下の修飾を、サメ類NARに施すことができる1ライノウイルス結合ICAM1VLRループの12Y2骨格への接合。2ライノウイルス結合ICAM1VLRループの12Y1骨格への接合。3ライノウイルス結合ICAM1VLRループのVNAR骨格への接合。4ライノウイルス結合ICAM1VLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。5狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループの12Y2骨格への接合。6狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループの12Y1骨格への接合。7狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループのVNAR骨格への接合。8狂犬病ウイルス結合NCAMVLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。9ウイルス結合IセットVLRループのVNAR骨格への接合。10ウイルス結合IセットVLRループのダイマーまたはマルチマーVNAR骨格への接合。VLRはVセットおよびIセットドメインの可変ループ領域であり、これらは、ドメインの骨格構造を害さずにβ鎖立体配座間で典型的に広がり、自然なアミノ酸変異を示すループ領域である。VLRは典型的にはCDRと呼ばれる領域を含む。サメ化による可溶性ヒト可変ドメインCDR2領域の作製Vセット免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質のCおよびC鎖によって作製されるCDR2ループは、免疫グロブリンの抗原結合および溶媒可溶性の維持において重要である。底部位置において等しいサメ類のドメインCDR2ループに関しては、ループ領域4のC末端およびCおよびDβ鎖中に溶媒露出群の残基がここで存在し、これは他の免疫グロブリンドメイン中ではCDR2ループによって覆われている。この溶媒露出面は主に12Y2の残基Lys32、Asp33、Thr34、Gly35、Tyr55、Glu57、Thr58からなる。残基Asp33Thr34Glu57によって形成される荷電および極性群は、特に重要であるようである。一例では、これらの残基をIセット可変ドメイン、例えば神経細胞接着分子に移して、1つのドメイン形式で発現されるとき、これらのタンパク質をさらに可溶性にすることができる。他の例ではこれらの残基を、CDR2ループが除去されているTCRおよび抗体などのVセットドメインに移して、超抗原刺激を避けることができる。例えば、以下の表を参照のことサメ化による可溶性ヒトTCRVHVL界面の作製単鎖ヒトTCRドメインを生成するための過去の試みは、低い可溶性および発現における難点のために最適状態でも問題があった。12Y1および12Y2のVNARとTCRαドメインの比較は、サメ類の構造を参照することによってヒトTCRが修飾され得る幾つかの態様を示す。サメ化によって我々は、TCRVαまたはVβドメインを別々に生成し指定突然変異によってその可溶性を増大させる機会を得る。表6は、TCR界面と12Y2およびラクダ科の可変ドメインの比較を示す。この分析は、以下の修飾を施してTCRドメインの可溶性を増大させることができることを示唆する1TCR界面中の残基Ser31はほとんど常にセリンまたはチロシンしたがって極性残基である。VNAR中では、それは荷電残基、あるいは50までの場合セリンである可能性がある。TCRドメインの残基31をAspに突然変異させることは、したがって可溶性を増大させることができる。2TCRドメイン界面中の重要な残基はPro43Leu89Phe106である。これはTCRVαおよびVβドメイン中の延長型疎水性群である。12Y2の残基Glu46、Lys82、Lys104により形成される荷電ポケットと類似した、荷電ポケットを形成するためのこれらの残基の突然変異は、したがって可溶性を増大させることができる。サメ化による可溶性抗体可変ドメインVHVL界面の作製単鎖抗体の可変ドメインを生成するための過去の試みは、可溶性および発現の問題と遭遇している。12Y1および12Y2のVNARと抗体VHおよびVLドメインの比較は、これらの個々のドメインをサメ類の構造を参照することにより修飾して、可溶性および発現レベルを改善することができる幾つかの態様を示す。例えば1前の実施例11中に記載した残基を使用する、単離した単鎖ドメインの可溶性を増大させるためのVHまたはVL界面の修飾。12Y2の残基Glu46、Lys82、Lys104により形成される荷電ポケットと類似した、荷電ポケットを形成するためのこれらの残基の突然変異は、したがって可溶性を増大させることができる。VNARダイマーの修飾12Y1および12Y2ダイマー形は、ループ領域下の連続的な8本鎖のβシートである。2重モノマー間の相互作用は、D鎖間およびループ領域8間の主鎖βシートの相互作用、ならびに側鎖相互作用および水仲介の接触を含む。これは、ダイマーの相互作用に関する有意な性向、および複合体形成におけるループ領域の非標準的な関与を示唆する。このダイマー形は、突然変異およびライブラリー選択に利用可能なループ領域8の残基およびダイマーのフレームワーク残基を有する1つの結合体として作用することができる。これは以下の修飾を施して、潜在的な診断または治療用途を有する結合成分を生成することができることを示唆する1VNARのD鎖中の位置Lys61およびGlu57におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。あるいは安定化は、D鎖中の位置Ile51およびLys61またはGly62のいずれかにおけるシステイン残基の導入によって実施することができる。2VNARのループ領域4中の位置Lys32およびAsp33におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。3位置Val59におけるシステイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。4VNAR領域のループ領域8中の位置Leu98およびまたはLeu99における、システイン残基の導入による組換えダイマーの安定化。5結合表面を形成するための12Y2のループ領域8およびβシート残基の無作為化。例えば、12Y2残基Asp26Glu30およびTyr87Glul03は、埋もれた残基であるが疎水性でなければならない。この場合残基Asp93Tyr96は、対称関連分子に由来する。6結合表面を形成するためのVNARおよびβシート残基のループ領域4および8の無作為化。ループ領域の配列がそれぞれの例に関して異なるであろうことは理解されよう。7同じ結合特異性の2つのコピーを表すための、ダイマーを使用することによるマルチマー化。82つの異なる結合特異性を表すための、ダイマーを使用することによるマルチマー化。VNARダイマーの修飾結晶ダイマーが天然形であり、連続的な8本鎖のβシートが生理的条件下において形成される場合、したがってさまざまな残基がダイマーの界面で対になる。したがって結晶構造中では、Leu99残基の側鎖は正しい方向、および適切な距離で隣接して、ジスルフィド架橋を形成する。この仮説を試験するために、二重12Y2突然変異体Pro90LeuおよびLeu99Cysを作製した。これらの突然変異体は標的抗原の本来の親和性を増大させ、結合を検出するのが容易になり、適度なダイマー化に適した位置に存在する。オリゴヌクレオチドプライマーを使用する重複PCRを使用して、DNAクローン21B5を構築した。これはDNA塩基配列決定によって正確であると確認した。生成したクローン21B5は、野生型と比較して、還元剤の不在下ではFPLCおよびSDSPAGEによりダイマー形として明らかに目に見える状態であったおよび参照。ELISAおよびバイオセンサーにより精製モノマーは固定AMA1と結合したおよび参照。精製ジスルフィド結合ダイマーは標的抗原とは結合せず、CDR3の重要性、およびこの新規のダイマー形はモノマータンパク質とは異なる抗原に対する界面を示すらしいことが実証される。ダイマー種は結晶化される可能性があり、安定しており、モノマーIgNAR形のそれとは異なる結合界面の基盤を形成する可能性がある。サメ類IgNARの原理に基づくヒトIセットドメインの設計、構築、およびスクリーニング。サメ類IgNAR抗体は構造上、TelokinおよびNCAMのドメイン1などのIセットドメイン免疫グロブリンに近い。詳細には、他の場合CDR2ループであるものは分子の底部に存在する。前述の構造、タンパク質工学処理、およびライブラリー選択の実験は、サメ類IgNAR抗体の構造から学習した原理は、ヒトIセット免疫グロブリンの結合レパートリーの作製に首尾良く適合させることができることを示唆する。このようなライブラリーは、CDR1およびCDR3類似領域中に可変性を主に含むと予想される。前述の実験は、NCAMおよびTelokinドメインのフレームワーク領域を標的化する下流工程の親和性成熟の戦略は、改変され増大した結合親和性および特異性をもたらす可能性があることも示した。サメ類IgNAR抗体およびNCAMのドメイン1およびTelokinをモデル化して、突然変異およびライブラリー無作為化の取り込みに最適なCDR骨格接合部残基を決定した。これは、長さと配列の両方が異なる無作為化CDRループの取り込みを可能にした。さらに、NCAMおよびTelokinのそれぞれの少なくとも1つの変異体において、ヒトCDR3骨格を首尾良いヒトサメ類モデル5のループ接合と同様に延長させて、NCAMまたはTelokin骨格の上に幾つかの残基が延長したCDR3ループを与えた。骨格接合部の同定後、NCAMのドメイン1とTelokinドメインの両方に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計してヒト骨格系ライブラリーを構築した。NCAMライブラリーのオリゴヌクレオチドプライマーA0980NCAMCDR1無作為化6ループA0981NCAMCDR1無作為化7ループA0982NCAMCDR3無作為化revcompl8ループA0987NCAMCDR3無作為化revcompl11ループA1018NCAMCDR3無作為化revcompl14ループA0988NCAMCDR3無作為化revcomplモデル5に基づく8ループ。TelokinライブラリーのオリゴヌクレオチドプライマーA1001TelokinCDR1無作為化7ループA1002TelokinCDR1無作為化9ループA1000TelokinCDR3無作為化revcompl6ループA1003TelokinCDR3無作為化revcompl9ループA1004TelokinCDR3無作為化revcompl12ループA1017TelokinCDR3無作為化revcomplモデル5に基づく9ループ。3個の分子ライブラリーを以下のように構築した前述の表からライブラリー番号1および2を集め、アミロイドaβペプチドおよび癌胎児性抗原に対するバクテリオファージディスプレイによって免疫性により選別した。図30は、アミロイドaβペプチドならびにCEAに対する選別の結果を示す。特に、抗原との結合ならびに個々のクローンの比較可能な発現レベルを示す。図31は、モノクローナル抗体5G8、AMA1、B型肝炎ウイルスE抗原、ab142ペプチド、癌胎児性抗原に対して選別したNCAMライブラリーおよびモノクローナル抗体5G8に対して選別したTelokinライブラリーからの溶出ファージの力価を示す。12Y2IgNARタンパク質の安定性。サメ類の血液は尿素が豊富である。したがってIgNARドメインは、このような刺激の強い化学物質を用いた処理に異常に耐性があるように進化してきていると仮定することができる。組換えIgNAR14M15を、8M尿素中での変性後にリフォールディングするその能力に関して試験した。固有の蛍光強度によって再生を測定した。尿素を除去した後に、IgNARドメインはその原型立体配座にリフォールディングした。完全IgNARコード配列、およびバイオセンサーによる分析用の可変および定常ドメイン試薬の生成。完全なオオセザメのIgNARコード配列を、サメ類cDNAからクローニングした。完全なDNAおよびアミノ酸配列は図33に与える。DNA配列は、1つのIgNARIセットドメインおよび5Cドメインを含む1本のポリペプチド鎖をコードしている参照。成熟IgNAR抗体中では、これらの鎖は位置Cys430およびCys660において半分システイン残基によって仲介されダイマーを形成する。生成する2つのジスルフィド架橋は定常ドメイン3に対するC末端および定常ドメイン4に対するN末端、および定常ドメイン5に対するC末端に位置する。採用した番号はタンパク質18H2に関するものであり可変ドメイン中での大きさの違いのために、残基番号はそれぞれのIgNARにおいて異なる。それぞれの定常ドメインは12kDaまでの分子量である。定常ドメイン1、2、および3をIgNAR可変ドメインに連続的に加えることによって、抗原に対して同じ親和性を有するがその分子量が異なる、一組の単鎖の一価タンパク質が生成する。例えば、12Y2可変ドメインをさまざまな番号の定常ドメインに加えることによって、標的抗原AMA1に対して同じ親和性を有するがさまざまな分子量を有する一組の分子が生成する。利用可能なさまざまなバイオセンサーのうち、多くは質量の違いに頼るものである。これらの試薬は、一親和性に対する質量の違いの影響を測定する理想的な試験系を与える。12Y2タンパク質と17T6タンパク質を、タンパク質の化学的性質およびバイオセンサーによって比較した~参照。17T6は適切な分子量の可溶性モノマータンパク質として生成されることを、結果は示す。質量を調節すると、それは親12Y2と同じ標的AMA1に対する結合親和性を有する。タイプ3のIgNARのモデル化。タイプ2のIgNAR可変ドメインの解明された構造体の1つは12A9である。この構造体は、ループ領域4と8の間にジスルフィド結合を有する。この特定のIgNARは、サメ類の胚中に見られるタイプ3のIgNARと、CDR3の長さおよびジスルフィド結合の位置が類似している。GenbankのAAM77190およびAAM77191を参照。1つのクラスとして、タイプ3のIgNAR可変ドメインは、CDR3と類似した一定の長さのループ領域、CDR1類似ループとCDR3類似ループを結ぶジスルフィド結合、および位置31の保存型トリプトファン残基によって特徴付けられる。図35は、12A9の結晶構造に基づくタイプ3のVNARのAAM77191のモデル化を示す。鋳型12A9と比較した4回のモデル化実施の結果を示す。図36は、12A9の構造に基づくVNARのタイプ3のCDR1およびCDR3類似領域のモデルを示す。このイソ型は限られた多様性、およびダークグレイで示す超可変性残基を有する。このモデル化は、低い配列の変異性にもかかわらず、保存型Phe96は幾つかの構造立体配座をとる可能性があり、この抗体の抗原結合範囲を劇的に増大させる可能性があることを示唆する。広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱せずに特定の実施形態に示したように、多数の変形およびまたは変更形態を本発明に施すことができることは、当業者によって理解されよう。したがって本発明の実施形態は、全ての点で例示的なものであり制限的なものではないと考えられる。[参考文献]