"異種糖タンパク質の製造方法であって、a異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸分子と、該異種糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む宿主細胞[ここにおいて、内在性OTase複合体を含むタンパク質をコードする内在性宿主細胞遺伝子が発現される]を準備し、b該異種糖タンパク質を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該異種糖タンパク質を産生させることを含む製造方法。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種Leishmaniasp.STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組合せである、請求項1記載の製造方法。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質である、請求項1記載の製造方法。該宿主細胞により産生された該異種糖タンパク質の少なくとも70が完全占拠N-グリコシル化部位を有する、請求項1記載の製造方法。該宿主細胞が、1以上の哺乳類またはヒト様N-グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項1記載の製造方法。該異種糖タンパク質が、エリスロポエチンEPO;サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球-コロニー刺激因子GCSF;顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子GM-CSF;凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体-Fc融合タンパク質;RAGE-Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子-2;骨髄前駆体抑制因子-1;オステオプロテジェリン;α-1-アンチトリプシン;α-フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL-2受容体アゴニストである、請求項1記載の製造方法。該異種タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV呼吸器性シンシチウムウイルス抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD417E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項1記載の製造方法。該宿主細胞が、ピチアパストリスPichiapastoris、ピチアフィンランディカPichiafinlandica、ピチアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピチアコクラメPichiakoclamae、ピチアメンブラネファシエンスPichiamembranaefaciens、ピチアオプンチエPichiaopuntiae、ピチアテルモトレランスPichiathermotolerans、ピチアサリクタリアPichiasalictaria、ピチアグエルクウムPichiaguercuum、ピチアピエペリPichiapijperi、ピチアスチプティスPichiastiptis、ピチアメタノリカPichiamethanolica、ピチアミヌタPichiaminutaオガタエアミヌタOgataeaminuta、ピチアリンドネリPichialindneri、ピチア属種Pichiasp.、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス属種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クライベロミセス属種Kluyveromycessp.、クライベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペルギルスニデュランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillusoryzae、トリコデルマレーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムルックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フザリウム属種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、ニューロスポラクラッサNeurosporacrassa、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項1記載の製造方法。該宿主細胞がピチアパストリスP.pastorisのoch1突然変異体である、請求項1記載の製造方法。糖タンパク質組成物における糖タンパク質上のN-グリコシル化部位の少なくとも70がN-グリカンで占拠されている、該糖タンパク質組成物の製造方法であって、a異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも1つの核酸分子と、該糖タンパク質をコードする核酸分子とを含む組換え宿主細胞[ここにおいて、内在性OTase複合体をコードする宿主細胞遺伝子が発現される]を準備し、b該糖タンパク質を発現させるための条件下、該組換え宿主細胞を培養して、該組成物における糖タンパク質上のN-グリコシル化部位の少なくとも70がN-グリカンで占拠されている該組成物を産生させることを含む製造方法。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種Leishmaniasp.STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質、STT3Dタンパク質またはそれらの組合せである、請求項10記載の製造方法。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質である、請求項10記載の製造方法。該異種糖タンパク質が、エリスロポエチンEPO;サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球-コロニー刺激因子GCSF;顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子GM-CSF;凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体-Fc融合タンパク質;RAGE-Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子-2;骨髄前駆体抑制因子-1;オステオプロテジェリン;α-1-アンチトリプシン;α-フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL-2受容体アゴニストである、請求項10記載の製造方法。該異種タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV呼吸器性シンシチウムウイルス抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD417E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項10記載の製造方法。該組換え宿主細胞が酵母または糸状菌宿主細胞である、請求項10記載の製造方法。a少なくとも1つの異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第1核酸分子と、b異種糖タンパク質をコードする第2核酸分子とを含む宿主細胞であって、該宿主細胞が、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼOTase複合体を含むタンパク質をコードする遺伝子を発現する、宿主細胞。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニア属種Leishmaniasp.STT3Aタンパク質、STT3Bタンパク質、STT3Cタンパク質またはSTT3Dタンパク質である、請求項16記載の製造方法。該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼがリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質である、請求項16記載の製造方法。該宿主細胞が、1以上の哺乳類またはヒト様N-グリカンを含む糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項16記載の宿主細胞。該異種糖タンパク質が、エリスロポエチンEPO;サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω;ならびに顆粒球-コロニー刺激因子GCSF;顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子GM-CSF;凝固因子、例えば因子VIII、因子IXおよびヒトプロテインC;アンチトロンビンIII;トロンビン;可溶性IgE受容体α鎖;免疫グロブリン、例えばIgG、IgGフラグメント、IgG融合体およびIgM;免疫接着物質および他のFc融合タンパク質、例えば可溶性TNF受容体-Fc融合タンパク質;RAGE-Fc融合タンパク質;インターロイキン;ウロキナーゼ;キマーゼ;尿素トリプシンインヒビター;IGF結合性タンパク質;上皮増殖因子;成長ホルモン放出因子;アネキシンV融合タンパク質;アンジオスタチン;血管内皮増殖因子-2;骨髄前駆体抑制因子-1;オステオプロテジェリン;α-1-アンチトリプシン;α-フェトプロテイン;DNアーゼII;ヒトプラスミノーゲンのクリングル3;グルコセレブロシダーゼ;TNF結合タンパク質1;濾胞刺激ホルモン;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4-Ig;膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド;グルカゴン様タンパク質1;またはIL-2受容体アゴニストである、請求項16記載の宿主細胞。該異種糖タンパク質が抗Her2抗体、抗RSV呼吸器性シンシチウムウイルス抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD417E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体または抗CD20抗体である、請求項16記載の宿主細胞。該宿主細胞が、ピチアパストリスPichiapastoris、ピチアフィンランディカPichiafinlandica、ピチアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピチアコクラメPichiakoclamae、ピチアメンブラネファシエンスPichiamembranaefaciens、ピチアオプンチエPichiaopuntiae、ピチアテルモトレランスPichiathermotolerans、ピチアサリクタリアPichiasalictaria、ピチアグエルクウムPichiaguercuum、ピチアピエペリPichiapijperi、ピチアスチプティスPichiastiptis、ピチアメタノリカPichiamethanolica、ピチアミヌタPichiaminutaオガタエアミヌタOgataeaminuta、ピチアリンドネリPichialindneri、ピチア属種Pichiasp.、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセス属種Saccharomycessp.、ハンゼヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クライベロミセス属種Kluyveromycessp.、クライベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、アスペルギルスニデュランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillusoryzae、トリコデルマレーゼイTrichodermareesei、クリソスポリウムルックノウエンスChrysosporiumlucknowense、フザリウム属種Fusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、ニューロスポラクラッサNeurosporacrassa、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項16記載の宿主細胞。複数の抗体と医薬上許容される担体とを含む糖タンパク質組成物であって、該組成物中の抗体分子の少なくとも70が、占拠された両方のN-グリコシル化部位を有し、該N-グリカンの約50~70モルがG0であり、該N-グリカンの15~25モルがG1であり、該N-グリカンの約5~15モルがMan5GlcNAc2コア構造を含む、糖タンパク質組成物。該抗体が、抗Her2抗体、抗RSV呼吸器性シンシチウムウイルス抗体、抗TNFα抗体、抗VEGF抗体、抗CD3受容体抗体、抗CD417E3抗体、抗CD25抗体、抗CD52抗体、抗CD33抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗EGF受容体抗体および抗CD20抗体からなる群から選択される抗体を含む、請求項23記載の組成物。組換えピチアパストリスPichiapastoris株YGLY14401の遺伝子型と同じ遺伝子型を有する組換えピチアパストリスPichiapastoris宿主細胞。N-およびO-グリコシル化パターンを有する抗RSV抗体と医薬上許容される担体とを含む抗体組成物を製造するための、組換えピチアパストリスPichiapastorisの使用。誘導または構成プロモーターに機能的に連結されたリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3DLmSTT3DオープンリーディングフレームORFをコードする発現カセットを含むプラスミドを以下のとおりに構築した。LmSTT3Dをコードするオープンリーディングフレーム配列番号12をピチアパストリスP.pastorisにおける最適発現のためにコドン最適化し、合成したGeneArtAG,Brandenburg,Germanyにより行われた。LmSTT3Dをコードするコドン最適化核酸分子をpGLY6287と命名し、それは、配列番号11に示されているヌクレオチド配列を有する。プラスミドpGLY6301図2は、ピチアパストリスP.pastorisにおけるURA6遺伝子座を標的化するロールインroll-in組込みプラスミドである。LmSTT3Dをコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける有効な発現のためにコドン最適化されたLmSTT3DORFをコードする核酸分子を含み、該核酸分子は、5’末端においては、誘導性ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーター配列配列番号23を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に機能的に連結されている。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeARR3ORFをコードする発現カセットを含み、ここで、該ORF配列番号32をコードする核酸分子は、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPRL10プロモーター配列配列番号25を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、URA6遺伝子座配列番号33を標的化するための核酸分子を含む。5’末端においてEcoRI部位に、そして3’末端においてFseI部位に隣接したコドン最適化LmSTT3DORFpGLY6287をコードするDNA断片を、EcoRIおよびFseIで消化されたプラスミドpGFI30t内にクローニングすることにより、プラスミドpGLY6301を構築した。プラスミドpGLY6294図3は、ピチアパストリスP.pastorisにおけるTRP1遺伝子座を、該遺伝子座の発現を破壊することなく標的化するKINKO組込みベクターである。KINKOKnock-InwithlittleorNoKnock-Out組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種DNAの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第20090124000号に記載されている。LmSTT3Dをコードする発現カセットは、LmSTT3DORFをコードする核酸分子を含み、該核酸分子は、5’末端においては、構成的ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーター配列配列番号26を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に機能的に連結されている。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ノウルセオスリシンNourseothricin耐性NATRORF[元々はpAG25EROSCARF,ScientificResearchandDevelopmentGmbH,Daimlerstrasse13a,D-61352BadHomburg,Germany由来;Goldsteinら,Yeast15:15411999を参照されたい]をコードする発現カセットを含み、ここで、該ORF配列番号34をコードする核酸分子は、5’末端においては、アシビアゴシピィAshbyagossypiiTEF1プロモーター配列配列番号86を有する核酸分子に、そして3’末端においては、アシビアゴシピィAshbyagossypiiTEF1終結配列配列番号87を有する核酸分子に機能的に連結されている。それらの2つの発現カセットは、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisALG3終結配列配列番号29を有する核酸分子に連結された、終止コドンで終わるTrp1pをコードするORFの5’領域からのヌクレオチド配列配列番号30を含む核酸分子に、そして他方の側では、TRP1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号31を含む核酸分子に隣接している。5’末端においてNotI部位に、そして3’末端においてPacI部位に隣接したコドン最適化LmSTT3DORFpGLY6287をコードするDNA断片を、NotIおよびFseIで消化されたプラスミドpGLY597内にクローニングすることにより、プラスミドpGLY6294を構築した。アシビアゴシピィAshbyagossypiiTEF1プロモーターPTEFおよびアシビアゴシピィAshbyagossypiiTEF1終結配列TTEFに機能的に連結されたノウルセオスリシンNourseothricin耐性ORFNATをコードする核酸分子を含む発現カセット。前記プラスミドは、以下の実施例に示されているとおりに、ピチアパストリスP.pastorisにおいて産生される糖タンパク質上のN-グリコシル化部位占拠を増加させるためにLmSTT3D発現カセットをピチアパストリスP.pastoris内に導入するために使用されうる。遺伝的に操作されたピチアパストリスPichiapastoris株YGLY13992は、組換えヒト抗Her2抗体を産生する株であり、ピチアパストリスPichiapastoris株YGLY14401は、組換えヒト抗RSV抗体を産生する株である。該株の構築は図1A~1Hに図示されている。簡潔に説明すると、以下のとおりに該株を構築した。株YGLY8316は、既に記載されている方法例えば、米国特許第7,449,308号、米国特許第7,479,389号、米国公開出願第20090124000号、公開PCT出願番号WO2009085135、NettおよびGerngross,Yeast20:12792003、Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:50222003、Hamiltonら,Science301:12442003を参照されたいを用いて野生型ピチアパストリスPichiapastoris株NRRL-Y11430から構築した。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法を用いて、pUC19プラスミドにおいて作製した。ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関して最適化されたヌクレオチド配列に関しては、天然ヌクレオチド配列をGENEOPTIMIZERソフトウェアGeneArt,Regensburg,Germanyにより解析し、その結果を用いて、ピチアパストリスP.pastoris発現に関してコドンが最適化されたヌクレオチド配列を得た。酵母株をエレクトロポレーションエレクトロポレーターBioRadの製造業者により推奨されている標準的な技術を用いるものにより形質転換した。プラスミドpGLY6図4は、URA5遺伝子座を標的化する組込みベクターである。それは、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeインベルターゼ遺伝子または転写単位ScSUC2;配列番号38を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号39を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号40を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY6を線状化し、該線状化プラスミドを野生型株NRRL-Y11430内に形質転換して、ScSUC2遺伝子がURA5遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY1-3を選択した。これはウラシルに対して栄養要求性である。プラスミドpGLY40図5は、OCH1遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位配列番号41を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、lacZ反復を含む核酸分子配列番号42に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、OCH1遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号43を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、OCH1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号44を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY40をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY1-3内に形質転換して、lacZ反復に隣接したURA5遺伝子がOCH1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY2-3を選択した。これはURA5に対して原栄養性である。株YGLY2-3を5-フルオロオロト酸5-FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子が喪失しlacZ反復だけがOCH1遺伝子座内に残存した幾つかの株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株YGLY4-3を選択した。プラスミドpGLY43a図6は、BMT2遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイラクティスK.lactisUDP-N-アセチルグルコサミンUDP-GlcNAc輸送体遺伝子または転写単位KlMNN2-2、配列番号45を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、lacZ反復を含む核酸分子に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、BMT2遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号46を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、BMT2遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号47を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY43aをSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY4-3内に形質転換して、lacZ反復に隣接したKlMNN2-2遺伝子およびURA5遺伝子がBMT2遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。BMT2遺伝子はMilleら,J.Biol.Chem.283:9724-97362008および米国特許第7,465,557号に開示されている。得られた株から株YGLY6-3を選択した。これはウラシルに対して原栄養性である。株YGLY6-3を5-FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子が喪失しlacZ反復だけが残存した株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株YGLY8-3を選択した。プラスミドpGLY48図7は、MNN4L1遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、UDP-GlcNAc輸送体配列番号48オープンリーディングフレームORFのマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーターを含む核酸分子配列番号26に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC終結配列を含む核酸分子配列番号24に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、lacZ反復に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisMNN4L1遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号49を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、MNN4L1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号50を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY48をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY8-3内に形質転換して、マウスUDP-GlcNAc輸送体およびURA5遺伝子をコードする発現カセットがMNN4L1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。MNN4L1遺伝子MNN4Bとも称されるは米国特許第7,259,007号に開示されている。得られた株から株YGLY10-3を選択し、ついで5-FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子が喪失しlacZ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株YGLY12-3を選択した。プラスミドpGLY45図8は、PNO1/MNN4遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、lacZ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、PNO1遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号51を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、MNN4遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号52を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY45をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY12-3内に形質転換して、lacZ反復に隣接したURA5遺伝子がPNO1/MNN4遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。PNO1遺伝子は米国特許第7,198,921号に開示されており、MNN4遺伝子MNN4Bとも称されるは米国特許第7,259,007号に開示されている。得られた株から株YGLY14-3を選択し、ついで5-FOAの存在下で対抗選択して、URA5遺伝子が喪失しlacZ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株YGLY16-3を選択した。プラスミドpGLY1430図9は、ADE1遺伝子座の発現を損なうことなくADE1遺伝子座を標的化するKINKO組込みベクターであり、1キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するピチアパストリスP.pastorisSEC12リーダーペプチド10にN末端において融合したヒトGlcNAcトランスフェラーゼI触媒ドメインNA、2UDP-GlcNAc輸送体のマウスホモログMmTr、3キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeSEC12リーダーペプチド8にN末端において融合したマウスマンノシダーゼIA触媒ドメインFB、および4ピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位をコードする4つの発現カセットを縦列配置で含有する。KINKOKnock-InwithlittleorNoKnock-Out組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種DNAの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第20090124000号に記載されている。NA10をコードする発現カセットは、SEC12リーダー10をコードする核酸分子配列番号54に5’末端において融合している、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたヒトGlcNAcトランスフェラーゼI触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号53を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。MmTrをコードする発現カセットは、UDP-GlcNAc輸送体ORFのマウスホモログをコードする核酸分子を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisSEC4プロモーターを含む核酸分子配列番号55に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisOCH1終結配列を含む核酸分子配列番号56に機能的に連結されている。FB8をコードする発現カセットは、SEC12-mリーダー8をコードする核酸分子配列番号58に5’末端において融合している、マウスマンノシダーゼIA触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号57を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGADPHプロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該URA5発現カセットは、lacZ反復を含む核酸分子に隣接したピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの4つの縦列カセットは、一方の側では、ADE1遺伝子の5’領域および完全ORFからのヌクレオチド配列配列番号59ならびにそれに続くピチアパストリスP.pastorisALG3終結配列配列番号29を含む核酸分子に、そして他方の側では、ADE1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号60を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY1430をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY16-3内に形質転換して、それらの4つの縦列発現カセットがADE1ORFの直後のADE1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY2798を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、今やウリジン、ヒスチジンおよびアデニンに対して原栄養性である。ついで該株を5-FOAの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株YGLY3794を選択した。これは、主としてガラクトースを末端とするN-グリカンを有する糖タンパク質を産生しうる。プラスミドpGLY582図10は、HIS1遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、1サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeUDP-グルコースエピメラーゼScGAL10、2キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeKRE2-sリーダーペプチド33にN末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼIhGalT触媒ドメイン、3lacZ反復に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位、および4キイロショウジョウバエD.melanogasterUDP-ガラクトース輸送体DmUGTをコードする4つの発現カセットを縦列配置で含有する。ScGAL10をコードする発現カセットは、ScGAL10ORFをコードする核酸分子配列番号61を含み、該ORFは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1プロモーターを含む核酸分子配列番号88に機能的に連結されており、3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1転写終結配列を含む核酸分子配列番号62に機能的に連結されている。キメラガラクトシルトランスフェラーゼIをコードする発現カセットは、KRE2-sリーダー33をコードする核酸分子配列番号64に5’末端において融合している、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたhGalT触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号63を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該URA5発現カセットは、lacZ反復を含む核酸分子に隣接したピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。DmUGTをコードする発現カセットは、DmUGTORFをコードする核酸分子配列番号65を含み、該ORFは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisOCH1プロモーターを含む核酸分子配列番号66に機能的に連結されており、3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisALG12転写終結配列を含む核酸分子配列番号67に機能的に連結されている。それらの4つの縦列カセットは、一方の側では、HIS1遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号68を含む核酸分子に、そして他方の側では、HIS1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号69を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY582を線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY3794内に形質転換して、それらの4つの縦列発現カセットがHIS1遺伝子座内に相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。株YGLY3853を選択した。これはヒスチジンに対して栄養要求性であり、ウリジンに対して原栄養性である。プラスミドpGLY167b図11は、ARG1遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、1キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeMNN2リーダーペプチド53にN末端において融合したキイロショウジョウバエD.melanogasterマンノシダーゼII触媒ドメインKD、2ピチアパストリスP.pastorisHIS1遺伝子または転写単位、および3キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeMNN2リーダーペプチド54にN末端において融合したラットN-アセチルグルコサミンGlcNAcトランスフェラーゼII触媒ドメインTCをコードする3つの発現カセットを縦列配置で含有する。KD53をコードする発現カセットは、MNN2リーダー53をコードする核酸分子配列番号71に5’末端において融合している、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたキイロショウジョウバエD.melanogasterマンノシダーゼII触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号70を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該HIS1発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisHIS1遺伝子または転写単位配列番号72を含む核酸分子を含む。TC54をコードする発現カセットは、MNN2リーダー54をコードする核酸分子配列番号74に5’末端において融合している、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたラットGlcNAcトランスフェラーゼII触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号73を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの3つの縦列カセットは、一方の側では、ARG1遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号75を含む核酸分子に、そして他方の側では、ARG1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号76を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY167bをSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY3853内に形質転換して、それらの3つの縦列発現カセットがARG1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY4754を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジンおよびヒスチジンに対して原栄養性である。ついで該株を5-FOAの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株YGLY4799を選択した。プラスミドpGLY3411図12は、lacZ反復に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該lacZ反復は、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT4遺伝子の5’ヌクレオチド配列配列番号77に、他方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT4遺伝子の3’ヌクレオチド配列配列番号78に隣接している。プラスミドpGLY3411を線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY4799内に形質転換して、該URA5発現カセットがBMT4遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY6903を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を5-FOAの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株YGLY7432およびYGLY7433を選択した。プラスミドpGLY3419図13は、lacZ反復lacZ反復に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位PpURA5を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該lacZ反復は、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT1遺伝子の5’ヌクレオチド配列配列番号79に、他方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT1遺伝子の3’ヌクレオチド配列配列番号80に隣接している。プラスミドpGLY3419を線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY7432およびYGLY7433内に形質転換して、該URA5発現カセットがBMT1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY7656およびYGLY7651を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を5-FOAの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株YGLY7930およびYGLY7940を選択した。プラスミドpGLY3421図14は、lacZ反復lacZ反復に隣接しているピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位PpURA5を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該lacZ反復は、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT3遺伝子の5’ヌクレオチド配列配列番号81に、他方の側では、ピチアパストリスP.pastorisBMT3遺伝子の3’ヌクレオチド配列配列番号82に隣接している。プラスミドpGLY3419を線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY7930およびYGLY7940内に形質転換して、該URA5発現カセットがBMT1遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY7965およびYGLY7961を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。プラスミドpGLY3673図15は、PRO1遺伝子座の発現を損なうことなくPRO1遺伝子座を標的化するKINKO組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeαMATpreシグナルペプチドにN末端において融合したティーレーセイT.reeseiα-1,2-マンノシダーゼ触媒ドメインaMATTrManをコードする発現カセットを含有する。aMATTrManをコードする発現カセットは、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeαMATpreシグナルペプチドをコードする核酸分子配列番号13に5’末端において融合したティーレーセイT.reesei触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号83を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーターを含む核酸分子配列番号23に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子配列番号24に機能的に連結されている。該カセットは、一方の側では、PRO1遺伝子の5’領域および完全ORFからのヌクレオチド配列配列番号89ならびにそれに続くピチアパストリスP.pastorisALG3終結配列を含む核酸分子に、そして他方の側では、PRO1遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号90を含む核酸分子に隣接している。該プラスミドはPpARG1遺伝子を含有する。プラスミドpGLY3673を株YGLY7965およびYGLY7961内に形質転換して幾つかの株を得、得られた株からYGLY78316およびYGLY8323を選択した。プラスミドpGLY6833図16は、ピチアパストリスP.pastorisにおけるTRP2遺伝子座を標的化する抗Her2抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールインroll-in組込みプラスミドである。抗Her2重鎖をコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ORFをコードする核酸分子配列番号15を含み、これは、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae接合因子プレシグナル配列配列番号14をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのN末端において、誘導性ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーター配列配列番号23を有する核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisCIT1転写終結配列配列番号85を有する核酸分子に融合している。抗Her2軽鎖をコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ORFをコードする核酸分子配列番号17を含み、これは、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae接合因子プレシグナル配列配列番号14をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのN末端において、誘導性ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーター配列配列番号23を有する核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisCIT1転写終結配列配列番号85を有する核酸分子に融合している。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ゼオシンORFをコードする発現カセットを含み、ここで、該ORFをコードする核酸分子配列番号35は、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeTEFプロモーター配列配列番号37を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、TRP2遺伝子座を標的化するための核酸分子配列番号91を含む。プラスミドpGLY6564図17は、ピチアパストリスP.pastorisにおけるTRP2遺伝子座を標的化する抗RSV抗体の軽鎖および重鎖をコードするロールインroll-in組込みプラスミドである。抗RSV重鎖をコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける有効な発現のためにコドン最適化された重鎖ORFをコードする核酸分子配列番号19を含み、これは、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae接合因子プレシグナル配列配列番号14をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのN末端において、誘導性ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーター配列配列番号23を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に融合している。抗RSV軽鎖をコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける有効な発現のためにコドン最適化された軽鎖ORFをコードする核酸分子配列番号21を含み、これは、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae接合因子プレシグナル配列配列番号14をコードする核酸分子に機能的に連結されており、そしてこれは、そのN末端において、誘導性ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーター配列配列番号23を有する核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisAOX1転写終結配列配列番号36を有する核酸分子に融合している。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、ゼオシンORFをコードする発現カセットを含み、ここで、該ORFをコードする核酸分子配列番号35は、5’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeTEFプロモーター配列配列番号37を有する核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列配列番号24を有する核酸分子に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、TRP2遺伝子座を標的化するための核酸分子配列番号91を含む。抗Her2抗体をコードするpGLY6833をYGLY8316内に形質転換することにより、株YGLY13992を作製した。得られた株から株YGLY13992を選択した。この株においては、抗Her2重鎖および軽鎖をコードする発現カセットはピチアパストリスPichiapastorisTRP2遺伝子座PpTRP2に標的化される。この株はLmSTT3D発現カセットを含まない。抗RSV抗体をコードするpGLY6564をYGLY8323内に形質転換することにより、株YGLY14401を作製した。得られた株から株YGLY14401を選択した。この株においては、抗RSV重鎖および軽鎖をコードする発現カセットはピチアパストリスPichiapastorisTRP2遺伝子座PpTRP2に標的化される。この株はLmSTT3D発現カセットを含まない。前記LmSTT3D発現/組込みプラスミドベクターでの本明細書に開示されている適当な株の形質転換は、実質的に以下のとおりに行った。適当なピチアパストリスPichiapastoris株を50mLのYPD培地[酵母エキス1、ペプトン2およびデキストロース2]内で約0.2~6のODまで一晩増殖させた。氷上で30分間のインキュベーションの後、2500~3000rpmで5分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌1Mソルビトール3回洗浄した後、0.5mL氷冷無菌1Mソルビトールに再懸濁させた。10μLの洗浄化DNA5~20μgおよび100μLの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で5分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、予め設定されたピチアパストリスPichiapastorisプロトコール2kV、25μF、200Ωに従いBio-RadGenePulserXcellにおいて行い、その直後に1mLのYPDS回収培地YPD培地1Mソルビトールを加えた。該形質転換細胞を室温24°Cで4時間~一晩で回収した後、該細胞を選択培地上でプレーティングした。ついで株YGLY13992およびYGLY14401のそれぞれを、前記のとおり、誘導性AOX1プロモーターの制御下でLmSTT3DをコードするpGLY6301、または構成的GAPDHプロモーターの制御下でLmSTT3DをコードするpGLY6294で形質転換して、実施例3に記載されている株を得た。LmSTT3DをコードするORFが誘導性PpAOX1プロモーターに機能的に連結された発現カセットを含む組込み/発現プラスミドpGLY6301、またはLmSTT3DをコードするORFが構成的PpGAPDHプロモーターに機能的に連結された発現カセットを含むpGLY6294を、それぞれSpeIまたはSfiIで線状化し、該線状化プラスミドをピチアパストリスPichiapastoris株YGLY13992またはYGLY14401内に形質転換して、表1に示されている株YGLY17351、YGLY17368、YGLY17319およびYGLY17354を得た。実施例2に記載されているのと実質的に同じ方法で形質転換を行った。URA6遺伝子座におけるpGLY6301のゲノム組込みを、プライマーPpURA6out/UP5’-CTGAGGAGTCAGATATCAGCTCAATCTCCAT-3’;配列番号1およびPucl9/LP5’-TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3’;配列番号2またはScARR3/UP5’-GGCAATAGTCGCGAGAATCCTTAAACCAT-3’;配列番号3およびPpURA6out/LP5-CTGGATGTTTGATGGGTTCAGTTTCAGCTGGA-3’;配列番号4を使用するコロニーPCRcPCRにより確認した。TRP1遺伝子座におけるpGLY6294のゲノム組込みを、プライマーPpTRP-5’out/UP5’-CCTCGTAAAGATCTGCGGTTTGCAAAGT-3’;配列番号5およびPpALG3TT/LP5’-CCTCCCACTGGAACCGATGATATGGAA-3’;配列番号6またはPpTEFTT/UP5’-GATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCA-3’;配列番号7およびPpTRP1-3’out/LP5’-CGTGTGTACCTTGAAACGTCAATGATACTTTGA-3’;配列番号8を使用するcPCRにより確認した。LmSTT3Dをコードする発現カセットの、該ゲノム内への組込みを、cPCRプライマーLmSTT3D/iUP5’-GCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTT-3’配列番号9およびLmSTT3D/iLP5’-CAACAGTAGAACCAGAAGCCTCGTAAGTACAG-3’配列番号10を用いて確認した。該PCR条件は、95°Cで2分間の1サイクル、95°Cで20秒間、55°Cで20秒間および72°Cで1分間の35サイクルならびにそれに続く72°Cで10分間の1サイクルであった。N-グリコシル化部位占拠分析のための抗体を製造するために、該株をSixfor発酵槽内で培養した。抗体製造のための形質転換株の細胞増殖条件は一般に以下のとおりであった。該形質転換酵母株のタンパク質発現を、1酵母エキス、2ペプトン、100mMリン酸カリウムバッファーpH6.0、1.34酵母窒素原礎培地、4×10-5ビオチンおよび1グリセロールからなる緩衝グリセロール-複合培地BMGYを含有する振とうフラスコ内で行った。タンパク質発現のための誘導培地は、BMGYにおけるグリセロールの代わりに1メタノールからなる緩衝メタノール-複合培地BMMYであった。メタノールにおけるPmtインヒビターPmti-3を、該誘導培地を加えた時点で18.3μMの最終濃度まで該増殖培地に加えた。細胞を集め、2,000rpmで5分間遠心分離した。SixFors発酵槽スクリーニング法は、表2に示されているパラメーターに従った。接種後の約18時間の時点で、350mLの培地A後記表3を参照されたい4グリセロールを含有するSixFors容器に、関心のある株を接種した。少用量100メタノール中の0.2mg/mLの0.3mLのPmti-35-[[3-1-フェニル-2-ヒドロキシエトキシ-4-2-フェニルエトキシ]フェニル]メチレン]-4-オキソ-2-チオキソ-3-チアゾリジン酢酸公開国際出願番号WO2007061631を参照されたいを接種物と共に加えた。約20時間の時点で、17mL50グリセロール溶液グリセロールフェッドバッチフィード、後記表4を参照されたいより大用量4mg/mLの0.3mLのPmti-3のボーラスを容器ごとに加えた。約26時間の時点で、溶存酸素DO濃度における正のスパイクにより示されるとおりグリセロールが消費され、メタノール供給後記表5を参照されたいを0.7mL/時間で連続的に開始した。同時に、別用量のPmti-30.3mLの4mg/mLストックを容器ごとに加えた。約48時間の時点で、別用量0.3mLの4mg/mLのPmti-3を容器ごとに加えた。接種の約60時間の時点で、培養を集め、加工した。抗Her2または抗RSV抗体上のN-グリカンの占拠を、以下のとおりに、キャピラリー電気泳動CEを用いて測定した。該抗体を細胞培養培地から回収し、プロテインAカラムクロマトグラフィーにより精製した。プロテインA精製サンプル100~200μgを約100μLまで濃縮し、ついでバッファーを、1SDSを含有する100mMTris-HClpH9.0と交換した。ついで該サンプルを、2μLの10kDa内部標準Beckmanにより提供されたものと共に、5μLのβ-メルカプトエタノールの添加により還元し、5分間沸騰させた。ついで約20μLの還元サンプルを、BeckmanCoulterにより推奨されている方法により、裸溶融bare-fusedシリカキャピラリー約70mm、50μmI.D.で分離した。図18はCE分析からの重鎖のN-グリコシル化部位占拠を示す。この図は、どちらの抗体に関しても、該抗体の発現が誘導されたのと同時にLmSTT3Dの発現が誘導された場合にLmSTT3Dが約99まで構成的に発現された場合、N-結合重鎖種の量が約80から約94に増加したことを示している。表7は、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼOST複合体の存在下でLmSTT3Dが過剰発現した宿主細胞から抗体が得られた組成物に関して、抗HER2および抗RSV抗体のN-グリコシル化部位占拠が増加したことを示している。N-グリコシル化部位占拠を測定するために、抗体を還元し、重鎖のN-グリカン占拠を測定した。この表は、一般に、試験された両方の抗体に関して、誘導プロモーターの制御下のLmSTT3Dの過剰発現が約82~83から約99へのN-グリコシル化部位占拠を増加を引き起こしたことを示しているLmSTT3Dの過剰発現の非存在下のN-グリコシル化部位占拠と比べて約19の増加。LmSTT3Dおよび該抗体の発現は同じ誘導プロモーターの制御下にあった。LmSTT3Dの過剰発現が構成的プロモーターの制御下にあった場合、試験された両方の抗体に関して、N-グリコシル化部位占拠の増加は約94まで増加したLmSTT3Dの過剰発現の非存在下のN-グリコシル化部位占拠と比べて約13の増加。表8は、内在性オリゴサッカリルトランスフェラーゼOST複合体の存在下でLmSTT3Dが過剰発現された宿主細胞から得られた完全抗体を含む組成物に関する、還元抗体調製物からの個々の重鎖のN-グリコシル化部位占拠の測定に基づくN-グリコシル化部位占拠を示している。式比率GHC2×100は、N-グリコシル化された重鎖の比率の測定に基づく完全占拠抗体の百分率の概算値または近似値を与える。Q-TOF分析用いた高速液体クロマトグラフィーHPLC系は、自動注入装置、カラム加熱区画ならびに210および280nmで検出するUV検出装置を備えたAgilent1200からなるものであった。この系で行った全てのLC-MS実験は1mL/分で行った。該流速はMS検出で分かれsplitなかった。質量分析は、Accurate-MassQ-TOFLC/MS6520Agilenttechnologyで正イオンモードで行った。二重ESI源の温度は350°Cに設定された。窒素気流速度はコーンに関しては13L/時間および350L/時間に設定され、ネブライザーは45psigに設定され、キャピラリーに4500ボルトが加えられた。質量校正およびタンパク質質量測定のために、API-TOF参照質量対処キットにより、922.009の参照質量をHP-0921から調製した。300~3000m/zのイオンスペクトル範囲のデータを得、AgilentMasshunterを使用して処理した。サンプル調製は以下のとおりに行った。完全抗体サンプル50μgを、50μLの25mMNH4HCO3pH7.8を使用して調製した。脱グリコシル化抗体に関しては、50μLのアリコートの完全抗体サンプルをPNGアーゼF10単位で37°Cで18時間処理した。還元抗体を、完全抗体または脱グリコシル化抗体のアリコートに1MDTTを10mMの最終濃度まで加えることにより調製し、37°Cで30分間インキュベートした。3μgの完全または脱グリコシル化抗体サンプルを、70°Cに維持されたPoroshell300SB-C3カラム2.1mm×75mm,5μmAgilentTechnologies上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で90溶媒A0.1HCOOH、5溶媒B0.1HCOOH中の90アセトニトリルで1分間洗浄した。ついで、26分にわたる5~100のBの勾配およびそれに続く100のBでの3分間の再生およびそれに続く5Bでの10分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。還元抗体に関しては、3μgのサンプルを、40°Cに維持されたPoroshell300SB-C3カラム2.1mm×75mm,5μmAgilentTechnologies上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で90溶媒A、5溶媒Bで3分間洗浄した。ついで、20分にわたる5~80のBの勾配およびそれに続く80のBでの7分間の再生およびそれに続く5Bでの10分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。図19はQ-TOF分析の結果を示す。ここでは、YGLY17351において産生された非還元抗Her2抗体のN-グリコシル化部位占拠を、CHO細胞において産生された商業的に入手可能な非還元抗Her2抗体HERCEPTINのN-グリコシル化部位占拠と比較した。この図は、株YGLY17351において産生された抗Her2が、CHO細胞において産生された抗Her2抗体のN-グリコシル化部位占拠と同様のN-グリコシル化部位占拠を有することを示している。この図は、抗体が株YGLY17351により産生された場合、ただ1つのN-グリコシル化部位が占拠された抗体の量が減少し、両方のN-グリコシル化部位が占拠された抗体の量が増加したことを示している。YGLY17351において産生された抗Her2抗体に関して示されている結果は、表8に示されている近似占拠と合致した。図20は、YGLY17351において産生された抗Her2抗体上のN-グリコシル化部位占拠のスケーラビリティを示す。N-グリカン占拠のスケーラビリティを評価するために、5mL~40Lの範囲のバイオリアクターにおいてYGLY17351を試験した。一般に、糖操作ピチアパストリスP.pastorisにおける糖タンパク質のN-グリコシル化部位占拠は、該糖タンパク質を製造するために用いた加工条件によって様々であることが観察されている。しかし、LmSTT3D過剰発現株は、バイオリアクターの規模および加工条件に無関係に、非常に一貫したN-グリコシル化部位占拠99を示した。したがって、本発明は、小規模条件下で増殖させた糖操作ピチアパストリスP.pastorisにおける糖タンパク質のN-グリコシル化部位占拠が大規模条件下での増殖の場合に維持される方法を提供する。図21および22は例示目的で記載されている。図21は、CHO細胞において産生された抗Her2抗体HERCEPTINの市販ロットのCEおよびQ-TOF分析の結果を示す。図22は、ある期間にわたってPNGアーゼで処理された後の、抗Her2抗体の同一市販ロットに関するCEおよびQ-TOF分析の結果を示す。該CEは非グリコシル化重鎖の増加を示し、該Q-TOFはPNGアーゼF処理後の非グリコシル化抗体の存在を示す図21と図22とを比較されたい。表9は、LmSTT3Dを過剰発現しない株と比較して、LmSTT3Dを過剰発現する株において産生された抗Her2および抗RSV抗体のN-グリカン組成を示す。この図は、LmSTT3D過剰発現株からの抗体のN-グリカンの質が、LmSTT3Dを過剰発現しない株からのものに匹敵することを証明している。抗体をSixFors0.5Lバイオリアクターから産生させ、プロテインA精製抗体からのN-グリカンを2AB標識で分析した。全体的には、LmSTT3Dの過剰発現は該抗体のN-グリカン組成に有意な影響を及ぼさないようであった。該グリコシル化組成は発酵条件の関数として変動しうる。したがって、ピチアパストリスPichiapastoris株において産生された抗体のグリコシル化組成は約50~70モルG0、15~25モルG1、4~12モルG2、5-17モルMan5、および3~15モルハイブリッドの範囲でありうる。表10は、CHO細胞において産生され商品名SYNAGISでパリビズマブpalivizumabとして販売されている抗RSV抗体の市販ロットの幾つかと比較された場合の、株YGLY14401において産生された抗RSV抗体のグリコシル化パターンの比較を示す。この実施例は、本発明が、組換え糖タンパク質のN-グリコシル化部位占拠が、CHO細胞のような哺乳類発現系において産生された組換え糖タンパク質のN-グリコシル化部位占拠に匹敵するピチアパストリスPichiapastorisにおける組換え糖タンパク質の製造を可能にすることを示している。リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Aタンパク質、リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Bタンパク質およびリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質は全て、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおけるSTT3遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制することが示されている異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの具体例であるNasebら,Molec.Biol.Cell19:3758-37682008。Nasebら同誌は更に、リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質がサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおけるWBP1、OST1、SWP1またはOST2遺伝子座の突然変異の致死表現型を抑制しうることを示した。HeseらGlycobiology19:160-1712009は、リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3A、STT3BおよびSTT3Dタンパク質がWBP1、OST2、SWP1およびOST2遺伝子座の突然変異を機能的に相補しうることを示唆するデータを記載している。他の単一サブユニット異種オリゴサッカリルトランスフェラーゼには、単一サブユニットジアルデジアGiardiaまたはキネトプラスチッドSTT3タンパク質、例えばセノルハブジティスエレガンスCaenorhabditiselegansSTT3タンパク質、トリパノソーマブルーセイTrypanosomabruceiSTT3タンパク質、トリパノソーマクルージTrypanosomacruziSTT3タンパク質およびトキソプラズマゴンヂToxoplasmagondiiSTT3タンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dタンパク質がサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeOTase複合体内に組込まれないとNasebra前掲らが教示しているのとは対照的に、CastroらProc.Natl.Acad.Sci.USA103:14756-147602006は、トリパノソーマクルージTrypanosomacruziSTT3タンパク質がサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeOTase複合体内に組込まれるらしいと教示している。この実施例においては、前実施例における宿主細胞と同様に構築された宿主細胞を、AOX1プロモーターに機能的に連結された、セノルハブジティスエレガンスCaenorhabditiselegans、トリパノソーマクルージTrypanosomacruziおよびリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3CからのSTT3タンパク質をコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターで形質転換した。ピチアパストリスPichiapastorisStt3pをコードする発現カセットを含有するベクターを該実験に含めた。表11に示すとおり、抗Her2抗体の発現を伴う種々のSTT3タンパク質の発現はN-グリコシル化部位占拠の増加をもたらさないようであった。しかし、種々のSTT3タンパク質は基質特異性を示しうる。例えば、リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3A、B、CおよびDタンパク質はグリコシル化のレベルでの基質特異性において異なっており、このことは、必須N-X-S/T結合部位に加えて、該基質の追加的特徴が特定の結合部位におけるN-結合グリコシル化に影響を及ぼしうることを示唆しているNasebra,前掲。表9に示されている結果は、抗Her2抗体を基質として使用したものである。抗体の各重鎖のCH2ドメインはN-結合グリコシル化のための単一部位を含有し、これは通常、アスパラギン残基297Asn-297に存在するKabatら,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,FifthEd.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,ΝIΗPublicationNo.91-3242。したがって、表9に示されている結果は、N-グリコシル化部位占拠が、使用されている個々の単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼの基質特異性により影響されうることを示唆している。シアル酸化N-グリカンを産生しうる株を以下のとおりに構築した。ヒトGM-CSFをコードするプラスミドベクター、およびリーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dをコードするプラスミドベクターで、該株をトランスフェクトした。該株の構築は図23A~23Dに図示されている。簡潔に説明すると、該株は、以下のとおりに構築した。プラスミドpGLY2456図24は、TRP2遺伝子座の発現を損なうことなくTRP2遺伝子座を標的化するKINKO組込みベクターであり、1マウスCMP-シアル酸輸送体mCMP-SiaTransp、2ヒトUDP-GlcNAc2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼhGNE、3ピチアパストリスPichiapastorisARG1遺伝子または転写単位、4ヒトCMP-シアル酸シンターゼhCSS、5ヒトN-アセチルノイラミナート-9-ホスファートシンターゼhSPS、6キメラ酵素をERまたはゴルジに標的化するサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeKRE2リーダーペプチド33にN末端において融合したマウスα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインmST6をコードする6つの発現カセット、およびピチアパストリスP.pastorisARG1遺伝子または転写単位を含有する。マウスCMP-シアル酸輸送体をコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたmCMPSiaTranspORFをコードする核酸分子配列番号92を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトUDP-GlcNAc2-エピメラーゼ/N-アセチルマンノサミンキナーゼをコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたhGNEORFをコードする核酸分子配列番号93を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ピチアパストリスP.pastorisARG1遺伝子をコードする発現カセットは配列番号94を含む。ヒトCMP-シアル酸シンターゼをコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたhCSSORFをコードする核酸分子配列番号95を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisGAPDHプロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトN-アセチルノイラミナート-9-ホスファートシンターゼをコードする発現カセットは、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたhSIAPSORFをコードする核酸分子配列番号96を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisPMA1転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。キメラマウスα-2,6-シアリルトランスフェラーゼをコードする発現カセットは、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeKRE2シグナルペプチドをコードする核酸分子に5’末端において融合している、ピチアパストリスP.pastorisにおける発現に関してコドン最適化されたmST6触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号97を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisTEF1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisTEF転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの6つの縦列カセットは、一方の側では、TRP2遺伝子の5’領域およびORFこれは終止コドンで終わるからのヌクレオチド配列配列番号98ならびにそれに続くピチアパストリスP.pastorisALG3終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、TRP2遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号99を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY2456をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY7961内に形質転換して、それらの6つの発現カセットがTRP2ORFの直後のTRP2遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY8146を選択した。ついで該株を5-FOAの存在下で対抗選択して、ウリジンに今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株YGLY9296を選択した。プラスミドpGLY5048図25は、STE13遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、1キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeαMATpreシグナルペプチドにN末端において融合したティーレーセイT.reeseiα-1,2-マンノシダーゼ触媒ドメインaMATTrMan、ならびに2ピチアパストリスP.pastorisURA5または転写単位をコードする発現カセットを含有する。aMATTrManをコードする発現カセットは、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeαMATpreシグナルペプチドをコードする核酸分子配列番号13に5’末端において融合している、ティーレーセイT.reesei触媒ドメインをコードする核酸分子配列番号83を含み、これは、5’末端においては、ピチアパストリスP.pastorisAOX1プロモーターを含む核酸分子に、そして3’末端においては、サッカロミセスセレビシエS.cerevisiaeCYC転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該URA5発現カセットは、lacZ反復を含む核酸分子に隣接したピチアパストリスP.pastorisURA5遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの2つの縦列カセットは、一方の側では、STE13遺伝子の5’領域からのヌクレオチド配列配列番号100を含む核酸分子に、そして他方の側では、STE13遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号101を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY5048をSfiIで線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY9296内に形質転換して、幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY9469を選択した。この株は、単一マンノースO-グリコシル化を有する糖タンパク質を産生しうる公開米国出願第20090170159号を参照されたい。プラスミドpGLY5019図26は、DAP2遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1プロモーターおよびアシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシンNourseothricin耐性NATR発現カセット[元々はpAG25EROSCARF,ScientificResearchandDevelopmentGmbH,Daimlerstrasse13a,D-61352BadHomburg,Germany由来;Goldsteinら,Yeast15:15411999を参照されたい]をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する。NATR発現カセット配列番号34は、アシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1プロモーターおよびアシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1終結配列に対して機能的に調節され、その全体は、一方の側では、ピチアパストリスP.pastorisDAP2遺伝子の5’ヌクレオチド配列配列番号102に隣接しており、他方の側では、ピチアパストリスP.pastorisDAP2遺伝子の3’ヌクレオチド配列配列番号103に隣接している。プラスミドpGLY5019を線状化し、該線状化プラスミドを株YGLY9469内に形質転換して、該NATR発現カセットがDAP遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株YGLY9797を選択した。プラスミドpGLY5085図27は、シアル酸化N-グリカンの産生に関与する第2セットの遺伝子をピチアパストリスP.pastoris内に導入するためのKINKOプラスミドである。該プラスミドは、ヒグロマイシン耐性HygRをコードする発現カセットでピチアパストリスP.pastorisARG1遺伝子が置換されていること、および該プラスミドがピチアパストリスP.pastorisTRP5遺伝子を標的化すること以外は、プラスミドYGLY2456に類似している。該HYGR耐性カセットは配列番号104である。HYGR発現カセット配列番号104は、アシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1プロモーターおよびアシビアゴシッピィAshbyagossypiiTEF1終結配列に対して機能的に調節されているGoldsteinら,Yeast15:15411999を参照されたい。それらの6つの縦列カセットは、一方の側では、TRP5遺伝子の5’領域およびORFこれは終止コドンで終わるからのヌクレオチド配列配列番号105ならびにそれに続くピチアパストリスP.pastorisALG3終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、TRP5遺伝子の3’領域からのヌクレオチド配列配列番号106を含む核酸分子に隣接している。プラスミドpGLY5085を株YGLY9797内に形質転換して幾つかの株を得、それらから株YGLY1200を選択した。プラスミドpGLY7240図28はピチアパストリスPichiapastorisTRP2遺伝子座PpTRP2を標的化し、該プラスミドは、Kex2切断部位を含有するリンカーを介してピチアパストリスPichiapastorisCWP1タンパク質に融合したヒトGM-CSFを含む融合タンパク質をコードしている。CWP1タンパク質は後期ゴルジにおいてKex2エンドプロテアーゼによりGM-CSFから除去されて、遊離GM-CSFが発酵上清中に分泌される。該ヒトGM-CSFは、配列番号108に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号108に示されているヌクレオチド配列によりコードされる。該融合タンパク質配列番号109は、配列番号110に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。CWP1シグナル配列はアミノ酸1-18であり、CWP1アミノ酸配列はアミノ酸19-289からのものであり、GGGSLVKRKex2リンカーのアミノ酸配列配列番号111はアミノ酸290-297からのものであり、GM-CSFアミノ酸配列はアミノ酸298-424からのものである。該融合タンパク質の発現はPpAOX1プロモーターおよびScCYC終結配列に機能的に連結されている。プラスミドpGLY7240を株YGLY12900内に形質転換して幾つかの株を得、それらから株YGLY15660を選択した。株YGLY15660をプラスミドpGLY6301[リーシュマニアメジャーLeishmaniamajorSTT3Dをコードしている]で形質転換して幾つかの株を得、それらから株YGLY16349を選択した。図29は、LmSTT3Dが非抗体糖タンパク質GM-CSFのN-グリカン占拠をも改善することを示している。GM-CSFは2つのN-結合部位を含有し、野生型ピチアPichiaにおいては、GM-CSF上の1つのN-結合部位が主にグリコシル化されている。GM-CSFのN-グリカン占拠に対するLmSTT3Dの影響を調べるために、GM-CSF産生株yGLY15560においてメタノール誘導性LmSTT3Dを過剰発現させた。Micro24バイオリアクターM24を使用してN-グリカン占拠を評価した。ウエスタンブロットおよび15SDS-PAGEを用いて、M24からの無細胞上清をN-グリカン占拠に関して分析した。GM-CSF特異的抗体で検出されたウエスタンブロットにおいて示されたとおり、大部分のGM-CSFレーン2~8は2つのN-結合部位でグリコシル化されており、一方、対照株yGLY15560、レーン9においては、GM-CSFは主に1つの部位でN-グリコシル化されており、わずかな部分が2つのN部位でN-グリコシル化されており又はグリコシル化されていない。総合すると、これは、LmSTT3Dが、複数のN-結合部位を含有する糖タンパク質のN-グリカン占拠を改善しうることを示している。図30は、それぞれyGLY15560AおよびyGLY16349Bから発現されたGM-CSFのQ-TOP分析を示す。この分析は、GM-CSFの大部分が、LmSTT3Dの存在下、2つのN-結合部位でグリコシル化されていることを証明している。非グリコシル化GM-CSFは検出されなかった。LC-ESI-TOFこの研究において用いた高速液体クロマトグラフィーHPLC系は、自動注入装置、カラム加熱区画ならびに210および280nmで検出するUV検出装置を備えたAgilent1200からなるものであった。この系で行った全てのLC-MS実験は1mL/分で行った。該流速はMS検出で分かれsplitなかった。質量分析は、Accurate-MassQ-TOFLC/MS6520Agilenttechnologyで正イオンモードで行った。二重ESI源の温度は350°Cに設定された。窒素気流速度はコーンに関しては13L/時間および350L/時間に設定され、ネブライザーは45psigに設定され、キャピラリーに4500ボルトが加えられた。質量校正およびタンパク質質量測定のために、API-TOF参照質量対処キットにより、922.009の参照質量をHP-0921から調製した。300~3000m/zのイオンスペクトル範囲のデータを得、AgilentMasshunterを使用して処理した。サンプル調製完全抗体サンプル50μgを、50μLの25mMNH4HCO3pH7.8を使用して調製した。脱グリコシル化抗体に関しては、50μLのアリコートの完全抗体サンプルをPNGアーゼF10単位で37°Cで18時間処理した。還元抗体を、完全抗体または脱グリコシル化抗体のアリコートに1MDTTを10mMの最終濃度まで加えることにより調製し、37°Cで30分間インキュベートした。3μgの完全または脱グリコシル化抗体サンプルを、70°Cに維持されたPoroshell300SB-C3カラム2.1mm×75mm,5μmAgilentTechnologies上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で90溶媒A0.1HCOOH、5溶媒B0.1HCOOH中の90アセトニトリルで1分間洗浄した。ついで、26分にわたる5~100のBの勾配およびそれに続く100のBでの3分間の再生およびそれに続く5Bでの10分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。還元抗体に関しては、3μgのサンプルを、40°Cに維持されたPoroshell300SB-C3カラム2.1mm×75mm,5μmAgilentTechnologies上にローディングした。まず、該タンパク質をカートリッジ上で90溶媒A、5溶媒Bで3分間洗浄した。ついで、20分にわたる5~80のBの勾配およびそれに続く80のBでの7分間の再生およびそれに続く5Bでの10分間の最終的平衡化時間により、溶出を行った。配列実施例1~4に開示されている株の幾つかを製造するために使用した配列を表12に示す。本発明は例示実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当技術分野における通常の技量を有し本明細書中の教示を利用する当業者はその範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲のみによって限定される。"