"コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないクロストリジウムヒストリチカムClostridiumhistolyticum由来のプロテアーゼNPからなる独立したA成分と、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したB成分とからなり、組織解離を行うには、解離を開始する前に、A成分をB成分に、それぞれ必要な量で添加する生成物。A成分として、組換え生産によって入手可能にしたものではない中性プロテアーゼを含む、請求項1に記載の生成物。中性プロテアーゼNPとコラゲナーゼとからなる生成物の製造方法であって、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なクロストリジウムヒストリチカム由来の中性プロテアーゼNPからなる独立したA成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したB成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整して混合することを特徴とする方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われることを特徴とする、請求項3に記載の方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われることを特徴とする、請求項3または4に記載の方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われることを特徴とする、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われることを特徴とする、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節されることを特徴とする、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれない精製中性プロテアーゼNPをそれぞれ選択された量で、組織解離のための又は細胞もしくは細胞集合体の、たとえば組織からの、単離のためのコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物に対する個別の添加物として使用する方法。中性プロテアーゼNPを明示された中性プロテアーゼ含量を持つ精製または部分精製コラゲナーゼと共に、両成分の量比を個別に調整して使用し、その際組換え生産によって製造されたものでない中性プロテアーゼを使用する、請求項9に記載の使用する方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が組織の量に応じて行われる、請求項9および10に記載の使用する方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が種、組織および組織の状態に応じて行われる、請求項9および10に記載の使用する方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵後の組織の状態に応じて行われる、請求項9および10に記載の使用する方法。貯蔵がペルフルオロ炭化水素を使った二層法によって行われる、請求項13に記載の使用する方法。コラゲナーゼと中性プロテアーゼの添加が貯蔵前または貯蔵後に行われ、中性プロテアーゼの量がそれに応じて調節される、請求項13および14に記載の使用する方法。本発明の目的は、細胞の収量、生存性および完全性に関して改善された単離結果が得られるような、組織解離用の生成物、その製造方法および使用を、利用できるようにすることである。この目的は、請求項1の特徴を持つ生成物、請求項3に記載の方法、および請求項9に記載の使用する方法によって達成される。本発明の生成物は、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれていないクロストリジウムヒストリチカム由来のプロテアーゼNPからなる独立したA成分aseparateAcomponentと、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したB成分とから構成され、組織解離を行うには、解離を開始する前に、A成分をB成分に、それぞれ必要な量で添加する。使用する中性プロテアーゼは、組換え生産によって入手可能にしたものではない。本発明の方法は、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれておらず、かつ組換え生産によって製造されたものではない、含量が明確なクロストリジウムヒストリチカム由来の中性プロテアーゼNPからなる独立したA成分を、精製もしくは部分精製コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物からなる独立したB成分に、組織解離の開始に先立って、両成分の量比を個別に調整anindividualdosageして混合することを特徴とする。本発明による使用方法は、単離結果が細胞の収量、生存性および完全性に関して改善されるように、コラゲナーゼ酵素調製物に含まれない精製中性プロテアーゼNPをそれぞれ選択された量で、組織解離のための又は細胞もしくは細胞集合体の、たとえば組織からの、単離のためのコラゲナーゼまたはコラゲナーゼ酵素調製物に対する個別の添加物として使用することを特徴とする。中性プロテアーゼNPを明示された中性プロテアーゼ含量を持つ精製または部分精製コラゲナーゼと共に、両成分の量比を個別に調整して使用し、その際組換え生産によって製造されたものでない中性プロテアーゼを使用するのが有利である。本発明の生成物ならびに本発明による組織解離への中性プロテアーゼの使用では、組織の細胞または細胞集合体を単離するために、中性プロテアーゼをコラゲナーゼ酵素調製物に個別に添加するか、またはコラゲナーゼもしくはコラゲナーゼIおよびIIに個別に添加することにより、コラゲナーゼ酵素調製物中に含まれていないクロストリジウムヒストリチカムの中性プロテアーゼNPを個別に使用するので、細胞の収量、生存性および完全性に関して単離結果の改善が達成される。クロストリジウムヒストリチカムの中性プロテアーゼが使用される。組織のタイプおよび/または状態に依存する個別性が、広く存在する。本方法では、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの添加が、組織の量に応じて、別々に行われる。中性プロテアーゼはコラゲナーゼ調製物中に含まれていないので、より高度な酵素安定性が達成される。これに加えて、製造者によって製造され、保存または貯蔵された、中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの混合物は、使用されない。中性プロテアーゼとコラゲナーゼは、組織解離を開始する直前に混合される。種、臓器の状態および臓器の位置に応じた消化による作用の証明は、特に有利である。驚いたことに、中性プロテアーゼの添加に変更を加えるだけで、島細胞換算収量、生存性、島細胞または島細胞集合体の完全性に関して、単離結果を有意に改善することができた。コラゲナーゼの添加が果たす役割は、それほど決定的ではない。というのも、コラゲナーゼは細胞にとって毒性が比較的低い酵素だからである。中性プロテアーゼ量の方が重要である。なぜなら、この酵素はその量が多すぎても少なすぎても、細胞を劣化させる作用を持ち、組織解離が不完全に終わるため、単離される島細胞および島細胞集合体の収量が低下するからである。中性プロテアーゼを個別に用量調整できるようにするには、他のタンパク質分解活性例えば中性プロテアーゼの活性を少量しか含んでいない精製または部分精製コラゲナーゼを使用することも重要である。本発明の好ましい実施態様は、従属クレームの対象である。ドナーに合わせた酵素の調節によるブタおよびヒト膵臓からの膵島単離の最適化膵組織からのランゲルハンス島の単離は、酵素的細胞分離の分野では、特別な位置を占めている。他の細胞タイプを他の組織から単離する場合とは異なり、膵島単離は、多細胞からなる細胞集合体、すなわち膵島を、もう一つの臓器、すなわち膵臓から、形態学的完全性を保って分離する試みを特徴とする。この目的は、適用する方法論に特別な要求を課すことになる。半自動消化濾過法は、大型動物の膵臓から膵島を単離するための標準的方法として確立されており、この方法では、膵臓の酵素消化と機械的解離とが併用される1。適当なコラーゲン分解酵素またはプロテアーゼ混合物の選択が、特有の課題になる。これらの混合物は、理想的には、この外分泌組織を最大限に解離すると共に、膵島組織の解離は最小限に抑えられることを保証すべきである。純粋でないコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物中に存在する多数の酵素のうち、クラスIおよびクラスIIのコラゲナーゼは、ラット2,3およびブタ4の膵臓から膵島を遊離させるのに不可欠であることが確認されている。純粋なコラゲナーゼはイヌ5およびラット2の膵組織を不十分にしか消化しないので、膵島を効率よく遊離させるには、ディスパーゼ6、中性プロテアーゼ2またはトリプシン4の形で、さらなるプロテアーゼが必要なようである。ブタ膵臓に関する我々自身の予備的知見でも、膵島遊離に対する非特異的中性プロテアーゼの正の相乗作用が裏付けられている。非特異的プロテアーゼの作用機序は、おそらく、プロテオグリカンのタンパク質分解によって、コラーゲン線維が遊離し、その結果、コラーゲン分解活性がその基質に容易に接近できるようになるというものだろう。また、非特異的プロテアーゼによるコラーゲン断片の加水分解の増強も議論されている2。過剰の中性プロテアーゼは、コラゲナーゼ自体のタンパク質分解を加速しうるが、プロテアーゼ感受性接着分子細胞接着分子CAMの分解により、膵島崩壊の一因にもなりうる。一方、膵島は、純粋なコラゲナーゼのタンパク質分解作用に対して、比較的耐性であるらしいことを、ラットで示すことができた2。ここに挙げた研究を評価する場合、中性プロテアーゼの破壊作用に対する膵島の感受性が種に依存し、コラーゲンマトリックスの特徴と細胞接着の形態学的分布パターンによって決まることを考慮しなければならない8,9。例えば、ブタの場合は、膵島周囲のコラーゲン含量が、今までに調べられたすべての種イヌ、ヒト、ラット、ウシのなかで最も低く、保護結合組織被膜の特徴が痕跡程度にしか存在しない10から12。一方、この種では、内分泌性膵細胞と外分泌性膵細胞の間に、最も多数の細胞接着が見いだされる8。したがって、活性プロファイルに関してコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物に求められる要件は、使用するドナー種に依存する。これらの重要な知見は、Roche社によるラットリベラーゼLiberaseRIO、イヌリベラーゼCO、ブタリベラーゼPIOおよびヒトリベラーゼHIOの膵臓から膵島を単離するための酵素混合物の開発と、その商業的利用につながった。これらの生成物は基本的に中性プロテアーゼの含量が異なっている。種依存的な相違の他に、当然、種内変動およびドナー間変動も存在する。ヒト膵臓ドナーの場合は、栄養状態、消費習慣および既往症などの因子の年齢依存的な特徴が、とりわけ、膵島単離後の収量に非常に大きな変動をもたらす。ブタの場合と同様に、とりわけドナーの年齢は、単離可能な膵島量に関して極めて重要な変数だというべきであり、そのため、25歳未満の若いドナーは、多くの場合、膵島単離を成功させるには適していないようである13から15。加齢に伴う変化、例えばしばしば膵臓の線維化17,18または膵脂肪変性19を伴う肥満度指数16の増加などは、ヒト膵臓からの膵島単離能を増大させる。これらの形態学的変化からは、老齢ドナーの膵臓でさえ、膵島の単離に適しているようにみえるが20、加齢に伴う膵島機能の低下も考慮すべきである15,21,22。したがって、若いドナーによるドナープールの拡大こそが、臨床的膵島移植の可能性を著しく増大させるだろう。ブタ膵臓については、若い膵臓からの膵島単離を実質的に妨げている成体と幼体との組織学的相違も指摘されている11,23,24。さらに、明確な育種系統でさえ、同じ年齢の個体間に、単離可能な膵島量に関して、有意差を認めうることが、最近の研究によって示されている25。上記の記載から、ドナー膵臓を処理する際には、さまざまなドナー因子の特徴を個別に考慮する必要があるという結論が導かれる。テーラーメードな単離方法には、特に、上述の組織学的結果を考慮して使用されるコラーゲン分解性プロテアーゼ混合物の修正が含まれる。利用可能な酵素または酵素混合物は、使用者にできるだけ高い融通性をもたらすと同時に、個別的配合の複雑さで使用者に過度の負担を強いないものでなければならない。純粋なクラスI/クラスIIコラゲナーゼ混合物例えばNordmark/ServaのNB-1コラゲナーゼの形で入手することができるを利用することにより、この要求を広範囲に満たすことができる。各ドナーの状態に応じてコラゲナーゼ濃度を調節すべきであり、中性プロテアーゼは、そのそれぞれに対して、個別に補わなければならない。以下、実施形態および実施例を挙げて、本発明を説明する。<実施例1>中性プロテアーゼ活性を調節すると、長時間冷蔵後のブタの島細胞単離が上手くいく。不足しているヒト臓器資源をできる限り節約するために、ブタで予備試験を行う。なかでも、我々は特に、コラゲナーゼおよび中性プロテアーゼの限界濃度の滴定法を見いだし、これを、まず成体>24ヶ月で評価する。最初はNB-1コラゲナーゼを限られた量しか利用できないので、ブタ膵島の単離はNB-8コラゲナーゼを使って行う。中性プロテアーゼ含量およびトリプシン含量が最も小さく、クロストリパイン含量も可能な限り低いことを特徴とするロットだけを使用する。ここでは、消化時間および可消化組織量が中性プロテアーゼの濃度と明確に相関することが、予備試験によって示される。各試験系列ごとに酵素濃度が一定であることを保証するために、コラゲナーゼ量を、使用する組織の量に合わせて調節する。これは、組織量とは無関係に500mgという一定量の酵素を使用すべきとされる普及したRoche社のリベラーゼプロトコールとは対照的である26。予備実験的に決定する必要がある3つのコラゲナーゼ濃度例えば4mg/g-臓器、6mg/gおよび8mg/gについて、中性プロテアーゼの最適量を、約0.2から0.6DMC-U/g-臓器の範囲で、繰り返し滴定する。消化時間、使用した組織と消化された組織との比、膵島収量、純度および平均膵島サイズが、関連する単離パラメータであると考えられる。最も有効な混合物を6つの臓器で試験する。そのようにして単離された膵島を、静的グルコース刺激法および膜完全性染色法によって生体外で、また糖尿病ヌードマウスバイオアッセイを使って生体内で、膵島の機能性および生存性を検討する品質検査に供する。最善と思われるNB-8コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの組合せを、NB-1コラゲナーゼを使った試験により、6つの臓器で同様に確認すべきである。実験的に収集された知見により、これらの反復最適化試験を若い約6月齢ドナーブタに適合させて、それらを、有望な酵素の組合せについて、回数を減らして繰り返すことができる。同じことが、NB-1コラゲナーゼを使ったヒト単離法に関する最適化試験にも当てはまる。年齢関連ドナー因子を実用面から考慮することにより、今までに得た経験を反映して、2つの年齢層、すなわち<25歳および≧25歳に、膵臓ドナーを分ける。中性プロテアーゼに関する上述の滴定スキームをヒト膵臓に適合させ、予備実験で決定した2つのコラゲナーゼ濃度例えば4mg/gおよび5mg/g-臓器に関して実施すべきである。最も有効であると思われるNB-1コラゲナーゼと中性プロテアーゼとの組合せを、各年齢層について、6つの臓器で試験し、単離された細胞を、生体外および生体内で品質検査に供する上記参照。個別の用量調整は、中性プロテアーゼを、中性プロテアーゼ含量が明確であってしかも少ない精製または部分精製コラゲナーゼと共に使用することによって可能になる。比活性は著しく不均一なので、酵素混合物の製造は、重量ではなく単位を基準にして行う。中性プロテアーゼ活性を調節すると、長時間冷蔵後のブタ島細胞の単離がうまくいく。背景:コラゲナーゼによる膵組織の酵素的解離は、島細胞単離法の決定的ステップである。膵コラーゲンにはタイプによって多様性がみられるため、専用の酵素混合物が製造されることになった。しかし、現時点で入手できる酵素混合物では、個々のドナー変数、例えば冷阻血時間などに応じて、個々の成分を用量調整することができない。本発明者らは、島細胞の遊離をより容易に成功させるために、中性プロテアーゼ活性の個別的調節を、酵素的膵臓消化の決定的因子として利用しうると考える。この仮説を証明するために、ブタの膵臓を長時間冷蔵6.5時間に供してから、中性プロテアーゼの量がごくわずかであることを特徴とするServaのNB-8コラゲナーゼを使って、解離を行った。方法:摘出後に、冷UW溶液に溶解したNB-8コラゲナーゼを膵管に注入することにより、もはや使用していない繁殖用動物の膵臓を膨張させた。最終的なコラーゲン分解活性は4FZ-U/g-膵組織だった。予備実験の後、新鮮調製膵臓n=5用または保存膵臓n=5用に、中性プロテアーゼServaを、0.6もしくは0.9DMC-U/gまたは0.14DMC-U/gに調節した。島細胞を消化-濾過法の変法によって単離し、フィコール-ジアトリゾ酸ナトリウムを使ってCobe2991で精製した。品質検査には、トリパンブルー排除試験と、静的グルコースインキュベーション2.8から20mMグルコースを含めた。さらに、テトラゾリウム化合物MTSを使用し、490nmでホルマザン生成を測定することにより、ミトコンドリア活性を評価し、タンパク質1mgあたりの任意単位AUとして表した。結果:長時間保存膵臓の総消化時間は、新鮮調製膵臓と比較して、かなり短くなった48±3対63±3、P<0.05。膵臓重量および消化された組織の量に関して相違はみられなかった。0.14または0.9DMC-U/gを使って単離された島細胞の精製後に、最終純度>95、膵島分割>95、および島細胞組織の回復73±9対72±16に関して、有意差はみられなかった。新鮮単離調製物と比較すると、長時間貯蔵後の島細胞収量はわずかに低かったが146,000±43,000IEQ対212,000±52,000IEQ,NS、有意差はなかった。品質検査では、0.14または0.6または0.9DMC-U/gによる消化後に、顕著な島細胞生存性99.9±1対99.4±0.3,NS、保存された細胞内インスリン含量1720±96μU/IEQ対1760±280μU/IEQ,NS、および同等なグルコース刺激指数1.7±0.2対1.5±0.1,NSが得られた。ミトコンドリア活性は、長時間貯蔵後に単離された島細胞0.85±0.06AU/mgと新鮮調製細胞0.90±0.11AU/mgとで、異ならなかった。結論:この研究は、個々のドナー変数に応じて酵素混合物の各単一成分を個別に用量調整することが、島細胞の遊離を促進するのに有効であることを、長時間保存したブタ膵臓のモデルを使って証明している。中性プロテアーゼ活性を個別に調節することは、温阻血、ドナー年齢および膵組織の脂肪性または線維性変性を考慮するのにも役立ちうる。<実施例2>ランゲルハンス島の単離に最適な中性プロテアーゼとコラゲナーゼとの比の決定目的:ランゲルハンス島の単離に使用する酵素混合物中の中性プロテアーゼ/コラゲナーゼ比NPCRの最適値の決定。ラットモデルで、さまざまなNPCRを持つServaコラゲナーゼ混合物を互いに比較すると共に、対照としてのリベラーゼおよびV型コラゲナーゼと比較する。背景:リベラーゼは、ヒト膵島の単離に現在広く使用されている酵素混合物である。リベラーゼの開発は、それが精製されていて、エンドトキシンを含まず、ロット間での酵素活性のばらつきをほとんど示さない点で、粗製コラゲナーゼと比較して決定的な改善であった。しかし、膵島移植の成果は進歩が速いので、市販される酵素混合物の構成および規格化をさらに改善する必要がある。例えば、発売されているリベラーゼのロットは、さまざまな酵素成分の生成物1グラムあたりの活性に関して、規格化されていない。したがって、製造者の分析証明書に示されているとおり、コラゲナーゼ活性、中性プロテアーゼ活性およびNPCRには、ロットごとにかなりのばらつきがある。そのため、膵島単離に最適なNPCRは分かっていない。また、膵臓ごとに、その構造、ドナーの年齢、阻血時間に応じて、NPCRを調節する必要がありうるとも考えられる。市販されている新しい酵素の一つは、中性プロテアーゼとは別個のバイアルに梱包されたServaコラゲナーゼである。これにより、製造者によって予め固定されていてロットごとに異なる比で単離を行うのではなくて、所定の比が得られるように、2つの成分を個別的に配合することができる。ラットモデルを使って、膵島単離に最適なNPCRを決定する。方法:膵島ドナーとして7群のルイスラットを使用する。各群は18匹のラットからなる。各群を次のように定める。第1群:中性プロテアーゼなしの純粋なServaコラゲナーゼNPCR=0w/wによる膵島単離。第2群:NPCRを3w/wにしたServaコラゲナーゼによる膵島単離。第3群:NPCRを6w/wにしたServaコラゲナーゼによる膵島単離。第4群:NPCRを12w/wにしたServaコラゲナーゼによる膵島単離。第5群:NPCRを24w/wにしたServaコラゲナーゼによる膵島単離。第6群:膵島単離をリベラーゼRIで行う。第7群:膵島単離をV型コラゲナーゼSigmaで行う。[実施例2A]新しい酵素調製物を使って評価した膵島単離における中性プロテアーゼの役割目的:膵島単離には数種類の酵素調製物を利用することができる。そのうちの一つは、成分コラゲナーゼと中性プロテアーゼが別々になっていて、膵島単離用に中性プロテアーゼ濃度を調節することができる、高度に精製された生成物である。この研究では、膵島単離における中性プロテアーゼの役割を評価する。方法:酵素タイプに応じて、規格化された膵島単離を行うために、スプレイグドーリーラットを7群各群18匹に分割した。I群では2mg/mlのXI型コラゲナーゼSigmaChemicalを使用し、II群では0.6mg/mlのリベラーゼRocheを使用し、III群からVII群では0.6mg/mlのNB1コラゲナーゼServaElectrophoreseを使用した。III群には純粋なNB1コラゲナーゼを使用した。IV、V、VIおよびVII群には、7.5、15、22および/または30μg/mlの濃度の中性プロテアーゼNPを加えた。結果を、膵島収量、アポトーシス細胞死検出ELISARocheおよびTUNEL染色、サイトカインIL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ分泌QuantikineM,RDsystem、インスリン分泌静的インキュベーション、および膵島の形態組織構造および免疫組織構造に関して評価した。結果:I群およびII群の場合、酵素溶液のエンドトキシン含量は、173122EU/mlおよび12011EU/mlだった。III群からVII群の場合、エンドトキシン含量は、NP濃度と共に、0.4EU/mlから58EU/mlまで徐々に増加したp<0.05。ラット1匹あたりの膵島換算IE収量は、I群および/またはII群の場合、1367522および1755110だった。III群からVII群の場合、ラット1匹あたりのIE収量は、NP濃度に応じて、ガウス分布に従い、V群では1712245と収量が高く、III群597277およびVII群905297では収量が低かったp=0.05。III群からVII群の場合、膵島の形態はNP濃度による影響を受け、NP含量が増加するにつれて、捕獲された膵島の数は減少し、断片化した膵島の数が増加した。NP濃度の増加は、膵島のα細胞リングの漸進的劣化を伴い、VII群ではI群およびII群に見られる劣化と同等だった。III群からVII群では、サイトカインIL-1β、IL-6、TNFα、IFNγの放出量は、I群およびII群よりも低かったが、NP濃度による影響は受けなかった。島細胞の壊死およびアポトーシスは、I群およびII群よりもIII群からVII群の方が、統計的に有意に少なかったが、NP濃度による影響は受けなかった。インスリン分泌の平均刺激指数は、I群の場合は2.96、II群の場合は5.17で、III群からVII群では5.25から5.43だった。結論:中性プロテアーゼは、膵島単離において、膵島収量を左右する決定的なコラゲナーゼへの添加物である。適切な中性プロテアーゼ濃度を持つServaコラゲナーゼは、膵島収量および膵島機能については、リベラーゼと同等であるが、細胞形態の改善をもたらす低い島細胞サイトカイン放出量およびアポトーシスと関係している。<実施例3>ブタ島細胞の単離に備えた二層法による長時間保存の成功背景:ブタ膵島細胞はとりわけ傷つきやすいため、長時間冷蔵後の膵臓からの単離は行われていなかった。ヒト島細胞の単離を成功させるために、冷蔵時に二層法TLMで膵組織に酸素を蓄積させる方法が、最近、開発された。今のところ、TLMによるブタ膵臓の長時間保存に関して、利用できるデータはない。そこで、6.5時間のTLM保存に供したブタ膵臓n=5からの島細胞単離の成功に関して、TLMの有効性を、新鮮調製膵臓n=5と比較して検討することを、この研究の目的とした。方法:摘出後直ちに、冷UW溶液に希釈したコラゲナーゼServaを膵組織1gあたり4mgの濃度で膵管に注入することにより、もはや使用していない繁殖用動物の膵臓を膨張させた。島細胞を消化-濾過法の変法によって単離し、フィコール-ジアトリゾ酸ナトリウムを使ってCobe2991で精製した。品質検査には、トリパンブルー排除試験と、静的グルコースインキュベーション2.8から20mMグルコースを含めた。さらに、テトラゾリウム化合物MTSを使用し、490nmでホルマザン生成を測定することにより、ミトコンドリア活性を評価し、タンパク質1mgあたりの任意単位AUとして表した。結果:精製後は、新鮮調製膵臓とTLM保存膵臓との間に、島細胞の最終純度>95、収量2440±580IEQ/g対1800±250IEQ/g、生存性99.4±0.3IEQ/g対100.0±0.0IEQ/gおよびグルコース刺激指数1.73±0.19対1.48±0.14,NSに有意差はみられなかった。TLM保存後の細胞内インスリン含量は新鮮調製物よりも高かった2250±110μU/IEQ対1760±280μU/IEQ,NS。新鮮単離島細胞と比較して、ミトコンドリア活性は、長時間貯蔵中も、TLMによって維持された0.96±0.15AU/mg対1.01±0.17AU/mg,NS。結論:この研究は、ブタ膵臓の長時間保存後に島細胞単離を成功させるのに、TLMが有効であることを証明している。<実施例4>二層法によるペルフルオロ炭化水素上での組織ブタ膵臓の貯蔵、中性プロテアーゼを個別に添加することによる組織解離。ペルフルオロ炭化水素は高い酸素結合能力を持っている。したがって、保存組織への酸素供給が改善され、代謝をより良く維持することができ、組織は数時間の貯蔵により良く耐える。細胞を単離するために、貯蔵前TLM前負荷または貯蔵後TLM後負荷に、消化酵素溶液を添加した。ここでも、4PZ-U/g-臓器という一定のコラゲナーゼ濃度に対して添加する中性プロテアーゼの量を変更できることが重要である。すなわち、前負荷には少量0.1DMC-U/g-臓器;貯蔵により、消化時間が長くなるためを、また後負荷には高量0.9DMC-U/g-臓器を使用する。中性プロテアーゼおよび貯蔵方法の変更による細胞単離結果の最適化。表1に記載のデータ:これらは島細胞換算収量、生存性、島細胞の完全性に関する詳細なデータである。これらのデータは、中性プロテアーゼの量を相応に調節すれば、島細胞換算収量、生存性、島細胞または島細胞集合体の完全性に関して達成できる結果が、貯蔵したか2=TLM-前負荷4PZ-U;0.1DMC-U;4=UW-前負荷4PZ-U;0.1DMC-U;3=TLM-後負荷4PZ-U;0.9DMC-U、貯蔵していないか6=非保存試料4PZ-U;0.9DMC-Uに関係なく、比較的良好であることを示している。"