"標的遺伝子をインビボで発現抑制できるiRNA二重鎖剤であって、aセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、を含むアンチセンス鎖、を含むiRNA二重鎖剤において、前記交互モチーフが二重鎖領域内にあり、組成物が必要に応じて1つ以上の突出部および/またはキャッピング基をさらに含む、iRNA二重鎖剤。前記アンチセンス鎖の5’炭素位置にホスフェートまたはホスフェート誘導体をさらに含む、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも1つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記化学修飾ヌクレオチドが、LNA、HNA、CeNA、2’-メトキシエチル、2’-OCH3、2’-O-アリル、2’-C-アリル、および2’-フルオロからなる群より選択される、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記化学修飾ヌクレオチドが2’-OCH3および2’-Fである、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記突出部が、長さが少なくとも2つのヌクレオチドであり、チミジンT、2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンTeo、2’-O-メトキシエチルアデノシンAeo、2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジンm5Ceo、およびそれらの組合せからなる群より選択され、必要に応じて、前記2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含み、該2つのヌクレオチドは同じであって異なっても差し支えない、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記突出部が、標的mRNAに対して不一致を形成し得るか、または標的mRNAと完全に相補性であり得る、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記二重鎖領域が、12~30の間のヌクレオチドの長さである、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。前記リガンドが前記センス鎖の3’末端に結合している、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii3’末端にある少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、iiリン酸化されている5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む、請求項1記載のiRNA二重鎖剤。少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも1つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記化学修飾ヌクレオチドが、LNA、HNA、CeNA、2’-メトキシエチル、2’-OCH3、2’-O-アリル、2’-C-アリル、および2’-フルオロからなる群より選択される、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記化学修飾ヌクレオチドが2’-OCH3および2’-Fである、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記突出部が、長さが少なくとも2つのヌクレオチドであり、チミジンT、2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンTeo、2’-O-メトキシエチルアデノシンAeo、2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジンm5Ceo、およびそれらの組合せからなる群より選択され、必要に応じて、前記2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含み、該2つのヌクレオチドは同じであって異なっても差し支えない、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記突出部が、標的mRNAに対して不一致を形成し得るか、または標的mRNAと完全に相補性であり得る、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記センス鎖および前記アンチセンス鎖がZ-X-Y構造を有する、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記二重鎖領域が、12~30の間のヌクレオチドの長さである、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。前記リガンドが前記センス鎖の3’末端に結合している、請求項10記載のiRNA二重鎖剤。式I’:に示された構造を有する化合物を含むiRNA二重鎖剤:式中:AおよびBの各々は、各存在毎に独立して、O、NRNまたはSであり;XおよびYの各々は、各存在毎に独立して、H、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ’ZO-ヌクレオシド、-PZ’ZO-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-PZ’ZO-R1-Q’-R2-OPZ’ZO-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-PZ’Z-式I、-PZ’Z-、または-Q-Rであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含み;Rは、L1であるか、または式II~V:に示された構造を有し;q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5Bおよびq5Cは、各存在毎に独立して、0~20を表し、式中、反復単位は同じであっても、異なってもよく;QおよびQ’は、各存在毎に独立して、存在しないか、-P7-Q7-R7p-T7-、または-T7-Q7-T7-B-T8-Q8-T8であり;P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T5A、T5B、T5C、T7、T7、T8、およびT8の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、NHCO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Bは、-CH2-NBL-CH2-であり;BLは、-TB-QB-TB-Rxであり;Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8、およびQBは、各存在毎に独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、SO、SO2、NRN、CR’=CR、C≡C、またはCOの1つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく;TBおよびTBの各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、OCOO、NHCO、NHCONH、NHCOO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Rx、親油性物質、ビタミン、ペプチド、炭水化物、エンドソーム溶解成分、ステロイド、テルペン、またはカチオン性脂質であり;R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、COO、CONH、NHCHRaCO、-CO-CHRa-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B、およびL5Cの各々は、各存在毎に独立して、炭水化物であり;R’およびRの各々は、各存在毎に独立して、H、C1~C6アルキル、OH、SH、またはNRN2であり;RNは、各存在毎に独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z、Z’、およびZの各々は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;pは、各存在毎に独立して、0~20である。前記iRNA二重鎖剤が、式VIに示された構造を少なくとも1つ含む、請求項19記載のiRNA二重鎖剤:式中:X6およびY6の各々は、独立して、H、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ’ZO-ヌクレオシド、-PZ’ZO-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、-PZ’ZO-R1-Q’-R2-OPZ’ZO-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-PZ’Z-式Iもしくは-PZ’Z-であり;Q6は、存在しないか、または-P6-Q6-R6v-T6-であり;P6およびT6の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、NHCO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Q6は、各存在毎に独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、SO、SO2、NRN、CR’=CR、C≡C、またはCOの1つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく;R6は、各存在毎に独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、COO、CONH、NHCHRaCO、-CO-CHRa-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;R’およびRの各々は、各存在毎に独立して、H、C1~C6アルキル、OH、SH、またはNRN2であり;RNは、各存在毎に独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z、Z’、およびZの各々は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;vは、各存在毎に独立して、0~20を表し;RLは、親油性物質またはカチオン性脂質である。RLが親油性物質である、請求項20記載のiRNA二重鎖剤。RLがコレステロールである、請求項20記載のiRNA二重鎖剤。RLが、である、請求項20記載のiRNA二重鎖剤。Rが、式V:の構造を有する、請求項19記載のiRNA二重鎖剤。Rが、である、請求項24記載のiRNA二重鎖剤。Rが、である、請求項24記載のiRNA二重鎖剤。前記化合物が、構造を有する、請求項19記載のiRNA二重鎖剤。前記化合物が、構造を有する、請求項19記載のiRNA二重鎖剤。前記化合物が、構造を有する、請求項19記載のiRNA二重鎖剤。aセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、を含むアンチセンス鎖、を含むiRNA二重鎖剤を投与することによって、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法。前記投与する工程が、筋肉内、気管支内、胸腔内、腹膜内、動脈内、リンパ管、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組合せを含む投与手段により行われる、請求項30記載の方法。対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法であって、前記対象に請求項1記載のiRNA二重鎖剤を皮下で送達し、よって、前記ポリヌクレオチドが該対象の特定の標的に送達される工程を含む方法。請求項1から29いずれか1項記載のiRNA二重鎖剤を単独でまたは薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物。インビボでの細胞への効率的な送達には、特異的ターゲティングおよび細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護が必要である。特異的ターゲティングを行う方法の1つは、iRNA二重鎖剤に標的部分を結合させることである。この標的部分は、要求される標的部位にiRNA二重鎖剤を標的にする上で役立つ。標的部分が送達を改善できる様式の1つは、受容体媒介エンドサイトーシス活性によるものである。この摂取機構は、膜構造の陥入による膜によって、または送達系の細胞膜による融合によって、包まれる区域の内部への、膜受容体に結合したiRNA二重鎖剤の移動を含む。このプロセスは、特異的リガンドの受容体への結合後に、細胞表面または膜受容体の活性化によって開始される。ガラクトース、マンノース、マンノース-6-リン酸などの糖、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質などのペプチドおよびタンパク質、ビタミンB12、インスリンおよび上皮成長因子EGFを認識するものを含む、多くの受容体媒介エンドサイトーシス系が公知であり、研究されてきた。アシアロ糖タンパク質受容体ASGP-Rは能力の高い受容体であり、これは、肝細胞上に非常に豊富にある。ASGP-Rは、D-GalよりもN-アセチル-D-ガラクトサミンGalNAcに50倍高い親和性を示す。以前の研究では、nM親和性を達成するために、多価が必要であるのに対し、糖の中での間隔も重要であることが示されてきた。ターゲティングリガンドの使用に関する成功がいくつかあるが、そのような成功は、常にインビボ条件に転換される訳ではない。これまでの成功にもかかわらず、上述したオリゴヌクレオチド治療剤のインビボ送達の欠点に対処した、より良く効く受容体特異的リガンド結合iRNA二重鎖剤およびその調製方法が明確に必要とされている。本発明は、この非常に重要な目的に向けられる。本発明は、iRNA二重鎖剤のインビボ送達に都合よい、少なくとも1つのリガンドに結合したRNA剤のための効果的なモチーフ、並びにインビボ治療に使用するのに適したiRNA組成物を提供する。1つの態様において、本発明は、少なくとも1つの炭水化物リガンド、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖に結合したiRNA二重鎖剤の効果的なモチーフを提供する。これらの炭水化物結合iRNA二重鎖剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、複数の、好ましくは2つまたは3つの炭水化物リガンドを含む。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、1つ以上のガラクトース部分を含む。別の実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、少なくとも1つの例えば、2つまたは3つ以上ラクトース分子ラクトースは、ガラクトースに結合したグルコースであるを含む。別の実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、少なくとも1つの例えば、2つまたは3つ以上N-アセチル-ガラクトサミンGalNAc、N-Ac-グルコサミンGluNAc、またはマンノース例えば、マンノース-6-リン酸を含む。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は少なくとも1つのマンノースリガンドを含む、このiRNA二重鎖剤はマクロファージを標的とする。1つの態様において、本発明は、炭水化物リガンドを含むiRNA二重鎖剤を特徴とし、炭水化物リガンドの存在により、iRNA二重鎖剤の肝臓への送達を増加させることができる。それゆえ、炭水化物リガンドを含むiRNA二重鎖剤は、肝臓において発現が望ましくない遺伝子を標的にするのに有用であり得る。例えば、炭水化物リガンドを含むiRNA二重鎖剤は、肝炎ウイルス例えば、C型肝炎、B型肝炎、A型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、F型肝炎、G型肝炎、またはH型肝炎による核酸発現を標的にできる。1つの態様において、本発明は、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを皮下で送達する方法をさらに提供する。本発明は、siRNAにおける二重鎖領域の交互モチーフをGalNAc3含有リガンドと組み合わせることによって得られた優れた結果に基づく。特に、そのsiRNAは、皮下または静脈内投与によって対象の標的部位に効果的に送達された。1つの態様において、本発明は、標的遺伝子をインビボで発現抑制できるiRNA二重鎖剤であって、aセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、を含むアンチセンス鎖、を含むiRNA二重鎖剤において、前記交互モチーフが二重鎖領域内にあり、組成物が必要に応じて1つ以上の突出部および/またはキャッピング基をさらに含む、iRNA二重鎖剤を提供する。1つの実施の形態において、本発明のiRNA二重鎖剤は、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、または少なくとも1つのメチルホスホネートヌクレオシド間結合をさらに含む。1つの実施の形態において、本発明のiRNA二重鎖剤は、LNA、HNA、CeNA、2’-メトキシエチル、2’-OCH3、2’-O-アリル、2’-C-アリル、および2’-フルオロからなる群より選択される化学修飾ヌクレオチドを含む。1つの実施の形態において、本発明のiRNA二重鎖剤は、チミジンT、2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジンTeo、2’-O-メトキシエチルアデノシンAeo、2’-O-メトキシエチル-5-メチルシチジンm5Ceo、およびそれらの組合せからなる群より選択される、長さで少なくとも2つのヌクレオチドを含む突出部を含み、必要に応じて、同じであって異なっても差し支えない前記2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含む。この突出部は、標的mRNAと不一致を形成できるか、または標的mRNAと完全に相補性であり得る。1つの実施の形態において、リガンドは、センス鎖の3’末端に結合される。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、末端二重鎖安定性の特異修飾DMTDSをさらに含む。末端二重鎖安定性の特異修飾DMTDSその上、本発明は、DMTDSおよびここに記載された別の要素を有するiRNA剤を含む。例えば、本発明は、ここに記載されたiRNA剤、例えば、反復性iRNA剤、非標準対合を有するiRNA剤、ここに記載された遺伝子、例えば、肝臓において活性である遺伝子を標的とするiRNA剤、ここに記載された構成または構造を有するiRNA剤、ここに記載された両親媒性送達薬剤に関連するiRNA、ここに記載された薬物送達モジュールに関連するiRNA、ここに記載されるように投与されるiRNA剤、またはDMTDSも包含する、ここに記載されるように配合されたiRNA剤を含む。iRNA剤は、アンチセンス鎖の二重鎖の5’末端の領域において、二重鎖が解離するまたは溶解する傾向を増す二重鎖結合の自由エネルギーを減少させることにより最適化できる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の5’末端の領域において二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を増加させるサブユニットを含ませることによって、行うことができる。このことは、この5’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を増加させるリガンドの結合によっても、行うことができる。理論により拘束することを意図するものではないが、その効果は、ヘリカーゼなどの酵素の効果を促進すること、例えば、アンチセンス鎖の5’末端の近傍でその酵素の効果を促進することのためであろう。本願の発明者等は、iRNA剤は、アンチセンス鎖の二重鎖の3’末端の領域における、二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させる二重鎖結合の自由エネルギーを増加させることにより、最適化できることも発見した。このことは、アンチセンス鎖の3’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させるサブユニットを含ませることによって、行うことができる。このことは、3’末端の領域における二重鎖の解離するまたは溶解する傾向を減少させるリガンドの結合によっても、行うことができる。前記二重鎖の5’末端の解離する傾向を増加させる修飾は、単独で、またはここに記載された他の修飾と組み合わせて、例えば、この二重鎖の3’末端の解離する傾向を減少させる修飾と組み合わせて、使用しても差し支えない。同様に、前記二重鎖の3’末端の解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、またはここに記載された他の修飾と組み合わせて、例えば、この二重鎖の5’末端の解離する傾向を増加させる修飾と組み合わせて、使用しても差し支えない。二重鎖のAS5’末端の安定性を減少させるサブユニット対は、解離または溶解を促進させるそれらの傾向に基づいて例えば、特定の対の結合または解離の自由エネルギーに基づいて、最も単純な手法は、個々の対の基準で対を調査することであるが、次の隣接する対または類似の分析を使用しても差し支えないランク付けすることができる。解離の促進に関して:A:Uが、G:Cよりも好ましく;G:Uが、G:Cよりも好ましく;I:Cが、G:Cよりも好ましくI=イノシン;不一致、例えば、非標準すなわち標準以外の対ここのどこかに記載されたようなが、標準A:T、A:U、G:C対よりも好ましく;普遍的塩基を含む対が、標準対よりも好ましい。一般的なdsiRNA剤は、以下のように図示することができる:S5’R1N1N2N3N4N5[N]N5N4N3N2N1R23’AS3’R3N1N2N3N4N5[N]N5N4N3N2N1R45’S:ASP1P2P3P4P5[N]P5P4P3P2P15’Sはセンス鎖を表し;ASはアンチセンス鎖を表し;R1は随意的なかつ好ましくはない5’センス鎖突出部を表し;R2は随意的な好ましい3’センス鎖突出部を表し;R3は随意的な好ましい3’アンチセンス鎖突出部を表し;R4は随意的なかつ好ましくはない5’アンチセンス鎖突出部を表し;Nはサブユニットを表し;[N]は、追加のサブユニット対が存在してもよいことを表し;Pxは、センスNxおよびアンチセンスNxの対を表す。突出部は、P図には示されていない。いくつかの実施の形態において、ここのどこかに記載されたように、3’AS突出部は領域Zに相当し、その二重鎖領域は領域Xに相当し、3’S鎖突出部は領域Yに相当するこの図は、ここのどこかに指針が提供されている最大または最小長さを暗示することを意図していない。二重鎖を形成する傾向を減少させる対は、AS鎖の5’末端での二重鎖における1つ以上の位置で使用されることが好ましい。末端対AS鎖に関しては最も5’末端の側はP1と示され、二重鎖のそれに続く対の位置AS鎖に関して3’方向に進むは、P2、P3、P4、P5などと示される。二重鎖の形成を調節するために修飾する好ましい領域は、P5からP1まで、より好ましくは、P4からP1まで、より好ましくはP3からP1までである。P1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置のいずれかでの修飾と共に、特に好ましい。列挙された領域の内の対の少なくとも1つ、より好ましくは2つ、3つ、4つ、または5つが、A:UG:UI:C不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対もしくは普遍的塩基を含む対の群から独立して選択されることが好ましい。好ましい実施の形態において、解離を促進する対を達成するために必要なサブユニットにおける変更はセンス鎖において行われるが、いくつかの実施の形態において、その変更は、アンチセンス鎖に行われる。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、解離を促進する対である。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、A:Uである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、G:Uである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、I:Cである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対である。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、普遍的塩基を含む対である。二重鎖のAS3’末端の安定性を増加させるサブユニット対は、安定性を促進させ、解離または溶解を阻害するそれらの傾向に基づいて例えば、特定の対の結合または解離の自由エネルギーに基づいて、最も単純な手法は、個々の対の基準で対を調査することであるが、次の隣接する対または類似の分析を使用しても差し支えないランク付けすることができる。二重鎖の安定性の促進に関して:G:Cが、A:Uよりも好ましく;ワトソンクリック塩基対A:T、A:U、G:Cが、非標準すなわち標準以外の対よりも好ましく;安定性を増加させる類似体が、ワトソンクリック塩基対A:T、A:U、G:Cよりも好ましく;2-アミノ-A:Uが、A:Uよりも好ましく;2-チオUまたは5Me-チオ-U:Aが、U:Aよりも好ましく;G-クランプ4つの水素結合を有するCの類似体:Gが、C:Gよりも好ましく;グアニジニウム-G-クランプ:Gが、C:Gよりも好ましく;シュードウリジン:Aが、U:Aよりも好ましく;結合を向上させる、糖修飾、例えば、2’修飾、例えば、2’F、ENA、またはLNAは、非修飾部分よりも好ましく、二重鎖の安定性を向上させるために一方または両方の鎖に存在し得る。二重鎖を形成する傾向を増加させる対が、AS鎖の3’末端で二重鎖の位置の1つ以上で使用されることが好ましい。末端対AS鎖に関しては最も3’末端の側はP1と示され、二重鎖のそれに続く対の位置AS鎖に関して5’方向に進むは、P2、P3、P4、P5などと示される。二重鎖の形成を調節するために修飾する好ましい領域は、P5からP1まで、より好ましくは、P4からP1まで、より好ましくはP3からP1までである。P1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置のいずれかでの修飾と共に、特に好ましい。列挙された領域の内の対の少なくとも1つ、より好ましくは2つ、3つ、4つ、または5つが、G:Cワトソンクリック塩基対A:T、A:U、G:Cよりも安定性を増加させる類似体を有する対2-アミノ-A:U2-チオUまたは5Me-チオ-U:AG-クランプ4つの水素結合を有するCの類似体:Gグアニジニウム-G-クランプ:Gシュードウリジン:A一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、2’修飾、例えば、2’F、ENA、またはLNAを有する対の群から独立して選択されることが好ましい。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、二重鎖の安定性を促進する対である。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、G:Cである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、ワトソンクリック塩基対よりも安定性を増加させる類似体を有する対である。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、2-アミノ-A:Uである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、2-チオUまたは5Me-チオ-U:Aである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、G-クランプ:Gである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、グアニジニウム-G-クランプ:Gである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、シュードウリジン:Aである。好ましい実施の形態において、P1からP4までの対の少なくとも2つまたは3つが、一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、2’修飾、例えば、2’F、ENA、またはLNAを有する対である。G-クランプおよびグアニジニウム-G-クランプが以下の文献に論じられている:HolmesandGaitTheSynthesisof2OMethylGClampContainingOligonucleotidesandTheirInhibitionoftheHIV1TatTARInteractionNucleosidesNucleotidesNucleicAcids22125912622003;HolmesetalStericinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1Tatdependenttransactivationinvitroandincellsbyoligonucleotidescontaining2OmethylGclampribonucleosideanaloguesNucleicAcidsResearch31275927682003;WildsetalStructuralbasisforrecognitionofguanosinebyasynthetictricycliccytosineanalogueGuanidiniumGclampHelveticaChimicaActa869669782003;RajeevetalHighAffinityPeptideNucleicAcidOligomersContainingTricyclicCytosineAnaloguesOrganicLetters4439543982002;AusinetalSynthesisofAminoandGuanidinoGClampPNAMonomersOrganicLetters4407340752002;MaieretalNucleaseresistanceofoligonucleotidescontainingthetricycliccytosineanaloguesphenoxazineand9phenoxazineandoriginsoftheirnucleaseresistancepropertiesBiochemistry41132372002;FlanaganetalAcytosineanalogthatconfersenhancedpotencytoantisenseoligonucleotidesProceedingsOfTheNationalAcademyOfSciencesOfTheUnitedStatesOfAmerica96351381999。二重鎖のAS5’末端の安定性を減少させると同時に、二重鎖のAS3’末端の安定性を増加させる先に論じたように、iRNA剤は、二重鎖のAS5’末端の安定性を減少させ、かつ二重鎖のAS3’末端の安定性を増加させるように修飾できる。このことは、二重鎖のAS5’末端における1つ以上の安定性減少修飾を、二重鎖のAS3’末端における1つ以上の安定性増加修飾を組み合わせることによって行うことができる。したがって、好ましい実施の形態は、P5からP1まで、より好ましくは、P4からP1まで、より好ましくはP3からP1までの修飾を含む。P1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置での修飾と共に、特に好ましい。二重鎖領域のAS5’末端の列挙された領域の内の対の少なくとも1つ、より好ましくは2つ、3つ、4つ、または5つが、A:UG:UI:C不一致対、例えば、非標準すなわち標準以外の対もしくは普遍的塩基を含む対、およびP5からP1まで、より好ましくは、P4からP1まで、より好ましくはP3からP1までにおける修飾の群から独立して選択されることが好ましい。P1での修飾が、単独で、または他の位置での修飾、例えば、今特定した位置での修飾と共に、特に好ましい。二重鎖領域のAS3’末端の列挙された領域の内の対の少なくとも1つ、より好ましくは2つ、3つ、4つ、または5つが、G:Cワトソンクリック塩基対A:T、A:U、G:Cよりも安定性を増加させる類似体を有する対2-アミノ-A:U2-チオUまたは5Me-チオ-U:AG-クランプ4つの水素結合を有するCの類似体:Gグアニジニウム-G-クランプ:Gシュードウリジン:A一方または両方のサブユニットが、結合を向上させる、糖修飾、例えば、2’修飾、例えば、2’F、ENA、またはLNAを有する対の群から独立して選択されることが好ましい。本発明は、DMTDSを有するiRNA剤を選択する方法および製造する方法も含む。例えば、iRNA剤として使用するための候補の配列について標的配列をスクリーニングする場合、ここに記載されたDMTDS特性を有する配列、または所望のレベルのDMTDSを提供するために、特にAS鎖に対して、好ましくはできるだけ少ない変更で、修飾できる配列を選択することができる。本発明は、候補のiRNA剤配列を提供すること、およびDMTDSiRNA剤を提供するためにP5からP1までの少なくとも1つのPおよび/またはP5からP1までの少なくとも1つのPを修飾することも含む。DMTDSiRNA剤は、ここに記載された任意の方法に、例えば、ここに開示された任意の遺伝子を発現抑制するために、ここに記載された任意の疾患を処置するために、ここに記載された任意の配合部に、また一般に、ここのどこかに記載された方法および組成物においておよび/またはそれらに関して、使用することができる。DMTDSiRNA剤は、ここに記載された他の修飾、例えば、標的薬剤の結合または安定性を向上させる修飾の含有、例えば、鎖間の二重鎖構造を形成するために自己解離する一本鎖突出部例えば、3’AS突出部および/または間3’S鎖突出部の含有またはヌクレアーゼ抵抗性モノマーの含有を含んで差し支えない。1つの態様において、本発明は、aセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフと、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i少なくとも2つの異なる化学修飾ヌクレオチドを有する交互モチーフ、を含むアンチセンス鎖、を含む前記iRNA二重鎖剤を投与することによって、対象における特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法を提供する。1つの実施の形態において、本発明のiRNA二重鎖剤の送達は、筋肉内、気管支内、胸腔内、腹膜内、動脈内、リンパ管、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組合せを含む投与手段により行われる。1つの態様において、本発明は、対象の特定の標的にポリヌクレオチドを送達する方法であって、対象に本発明のiRNA二重鎖剤を皮下で送達し、よって、そのポリヌクレオチドが対象の特定の標的に送達される工程を含む方法を提供する。1つの態様において、本発明は、先の請求項のiRNA二重鎖剤を単独でまたは薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。1つの態様において、iRNA二重鎖剤に炭水化物部分を結合させることにより、そのiRNA二重鎖剤の1つ以上の性質を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、iRNA二重鎖剤の修飾されたサブユニットに結合される。例えば、iRNA二重鎖剤の1つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物好ましくは環式担体と交換できる。そのサブユニットのリボース糖がそのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、ここでは、リボース置換修飾サブユニットRRMSと称される。環式担体は、炭素環式環系すなわち、全ての環原子は炭素原子である、または複素環式環系すなわち、1つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってよいであってよい。環式担体は、単環式環系であっても、または2つ以上の環、例えば、縮合環を含んでもよい。環式担体は、完全に飽和された環系であっても、1つ以上の二重結合を含有してもよい。1つの実施の形態において、リガンドは担体を介してポリヌクレオチドに結合される。その担体は、i少なくとも1つの骨格結合点、好ましくは2つの骨格結合点、およびii少なくとも1つのテザリング結合点を含む。ここに用いたような骨格結合点は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、担体をリボ核酸の骨格、例えば、リン酸、または修飾リン酸、例えば、硫黄含有骨格に組み込むのに利用でき、それに適した結合を称する。テザリング結合点TAPは、いくつかの実施の形態において、選択された部分に接続する環式担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子骨格結合点を提供する原子から区別されるを称する。その部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であって差し支えない。必要に応じて、選択された部分は、環式担体に、介在するテザーによって接続される。それゆえ、環式担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への含有またはテザリングに適した結合を提供する。1つの態様において、本発明は、式C1に示された構造を有する化合物を特徴とする。AおよびBの各々は、各存在毎に独立して、水素、保護基、必要に応じて置換された脂肪族、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコールPEG、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ1Z2-O-ヌクレオシド、または-PZ1Z2-O-オリゴヌクレオチドであり;式中、Z1およびZ2の各々は、各存在毎に独立して、O、S、Nアルキルまたは必要に応じて置換されたアルキルであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。J1およびJ2は、独立して、O、S、NRN、必要に応じて置換されたアルキル、OCONH、NHCOO、NHCO、OCO、COO、OCOO、NHCONH、NHCSNH、OCSNH、OPNRP2O、またはOPNRP2であり;は、環式基または非環式基であり;好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され;好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。好ましい実施の形態において、リガンドは、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖である。1つの実施の形態において、前記化合物は、式CIIに示されたピロリン環系であり、式中、Eは、存在しないか、またはCO、COO、CONH、CS、CSNH、SO、SO2、またはSO2NHであり;R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、およびR18の各々は、各存在毎に独立して、H、-CH2ORa、またはORbであり、RaおよびRbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコールPEG、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ1Z2-O-ヌクレオシド、-PZ1Z2-O-オリゴヌクレオチド、-PZ1O-リンカー-RL-O-ヌクレオシド、または-PZ1O-リンカー-RL-O-オリゴヌクレオチドであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。R30は、各存在毎に独立して、-リンカー-RLまたはR31であり;RLは、水素またはリガンドであり;R31は、-COCHNR322CH2hNR322であり;R32は、各存在毎に独立して、H、-RL、-リンカー-RLまたはR31であり;Z1は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;Z2は、各存在毎に独立して、O、S、Nアルキルまたは必要に応じて置換されたアルキルであり;hは、各存在毎に独立して、1~20である。ピロリン系クリック担体について、R11は-CH2ORaであり、R3はORbであり;またはR11は-CH2ORaであり、R9はORbであり;またはR11は-CH2ORaであり、R17はORbであり;またはR13は-CH2ORaであり、R11はORbであり;またはR13は-CH2ORaであり、R15はORbであり;またはR13は-CH2ORaであり、R17はORbである。ある実施の形態において、CH2ORaおよびORbは、ジェミナル置換されていてもよい。4-ヒドロキシプロリン系担体について、R11は-CH2ORaであり、R17はORbである。したがって、ピロリン系および4-ヒドロキシプロリン系化合物は、結合の回転がその特定の連結部の周りに限られている、例えば、環の存在から制限が生じている、連結部例えば、炭素-炭素結合を含有してもよい。それゆえ、CH2ORaおよびORbは、先に描写した対の何れにおいても、互いに対してシスまたはトランスであってもよい。したがって、全てのシス/トランス異性体が明白に含まれる。前記化合物は、1つ以上の不斉中心も含んでよく、それゆえ、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じるであろう。前記化合物のそのような異性形態の全てが明白に含まれる例えば、CH2ORaおよびORbを担持する中心は、両方とも、R配置を有し得;または両方とも、S配置を有し得;または一方の中心がR配置を有し得、他方の中心がS配置を有し得、またその逆も同様である。1つの実施の形態において、R11はCH2ORaであり、R9はORbである。1つの実施の形態において、Rbは固体担体である。1つの実施の形態において、式CIIの担体は、ホスホラミダイトである、すなわち、RaまたはRbの一方が-PO-アルキルNアルキル2、例えば、-POCH2CH2CNNi-プロピル2である。1つの実施の形態において、Rbが-PO-アルキルNアルキル2である。実施の形態において、前記化合物は、式CIIIに示されたリボース環系であり、式中、Xは、O、S、NRNまたはCRP2であり;Bは、各存在毎に独立して、水素、必要に応じて置換された天然または非天然のヌクレオ塩基、-リンカー-RLと結合した必要に応じて置換された天然のヌクレオ塩基、または-リンカー-RLと結合した必要に応じて置換された非天然のヌクレオ塩基であり;R1、R2、R3、R4およびR5の各々は、各存在毎に独立して、H、OR6、F、NRN2、または-J-リンカー-RLであり;Jは、存在しないか、O、S、NRN、OCONH、NHCOO、CONH、NHCO、NHSO、NHSO2、NHSO2NH、OCO、COO、OCOO、NHCONH、NHCSNH、、OCSNH、OPNRP2O、またはOPNRP2であり;R6は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコールPEG、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ1Z2-O-ヌクレオシド、-PZ1Z2-O-オリゴヌクレオチド、-PZ1Z2-式CIII、-PZ1O-リンカー-RL-O-ヌクレオシド、-PZ1O-リンカー-RL-O-オリゴヌクレオチド、または-PZ1O-リンカー-RL-O-式CIIIであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。RNは、各存在毎に独立して、H、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたヘテロアリールまたはアミノ保護基であり;RPは、各存在毎に独立して、H、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、または必要に応じて置換されたヘテロアリールであり;RLは、水素またはリガンドであり;Z1およびZ2の各々は、各存在毎に独立して、O、S、Nアルキルまたは必要に応じて置換されたアルキルである;但し、RLが少なくとも1つ存在するという条件で、さらにRLが少なくとも1つはリガンドであるという条件である。1つの実施の形態において、式CIの担体は、非環式基であり、非環式担体と称される。好ましい非環式担体は、以下の式CIVまたは式CVに示された構造を有し得る。1つの実施の形態において、前記化合物は、式CIVに示された構造を有する非環式担体であり、式中、Wは、存在しないか、O、SおよびNRNであり、式中、RNは、各存在毎に独立して、H、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたヘテロアリールまたはアミノ保護基であり;Eは、存在しないか、またはCO、COO、CONH、CS、CSNH、SO、SO2、またはSO2NHであり;RaおよびRbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコールPEG、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ1Z2-O-ヌクレオシド、-PZ1Z2-O-オリゴヌクレオチド、-PZ1O-リンカー-RL-O-ヌクレオシド、または-PZ1O-リンカー-RL-O-オリゴヌクレオチドであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。R30は、各存在毎に独立して、-リンカー-RLまたはR31であり;RLは、水素またはリガンドであり;R31は、-COCHNR322CH2hNR322であり;R32は、各存在毎に独立して、H、-RL、-リンカー-RLまたはR31であり;Z1は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;Z2は、各存在毎に独立して、O、S、Nアルキルまたは必要に応じて置換されたアルキルであり;hは、各存在毎に独立して、1~20であり;r、sおよびtの各々は、各存在毎に独立して、0、1、2または3である。rおよびsが異なる場合、第三炭素は、RまたはS配置のいずれであっても差し支えない。好ましい実施の形態において、xおよびyは1であり、zが0である例えば、担体はセリノールに基づく。非環式担体は、必要に応じて、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルにより置換されていて差し支えない。1つの実施の形態において、前記化合物は、式CVに示された構造を有する非環式担体であり、式中、Eは、存在しないか、またはCO、COO、CONH、CS、CSNH、SO、SO2、またはSO2NHであり;RaおよびRbの各々は、各存在毎に独立して、水素、ヒドロキシル保護基、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたシクロアルキル、必要に応じて置換されたアラルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコールPEG、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ1Z2-O-ヌクレオシド、-PZ1Z2-O-オリゴヌクレオチド、-PZ1Z2-式I、-PZ1O-リンカー-RL-O-ヌクレオシド、または-PZ1O-リンカー-RL-O-オリゴヌクレオチドであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。R30は、各存在毎に独立して、-リンカー-RLまたはR31であり;RLは、水素またはリガンドであり;R31は、-COCHNR322CH2hNR322であり;R32は、各存在毎に独立して、H、-RL、-リンカー-RLまたはR31であり;Z1は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;Z2は、各存在毎に独立して、O、S、Nアルキルまたは必要に応じて置換されたアルキルであり;hは、各存在毎に独立して、1~20であり;rおよびsの各々は、各存在毎に独立して、0、1、2または3である。ここに記載した環式担体に加え、RRMSは、その内容を全ての目的でここに引用する、同一出願人による係属中の、2004年8月10日に出願された米国特許出願第10/916185号、2004年9月21日に出願された米国特許出願第10/946873号、2004年11月9日に出願された米国特許出願第10/985426号、2007年8月3日に出願された米国特許出願第10/833934号、2005年4月27日に出願された米国特許出願第11/115989号、および2005年4月29日に出願された米国特許出願第11/119533号に記載された環式担体および非環式担体を含み得る。したがって、1つの態様において、本発明は、式Iに示された構造を有するモノマーを特徴とし、式中、AおよびBの各々は、各存在毎に独立して、O、NRNまたはSであり;RNは、各存在毎に独立して、HまたはC1~C6アルキルであり;XおよびYの各々は、各存在毎に独立して、水素、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ’ZO-ヌクレオシド、-PZ’ZO-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-PZ’ZO-リンカーOPZ’ZO-オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-PZ’Z-式I、-PZ’Z-、または-リンカー-Rであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。Rは、LGであるか、または以下:に示された構造を有し;LGは、各存在毎に独立して、リガンド、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり;Z’、Z、Z’およびZの各々は、各存在毎に独立して、OまたはSである。リンカーという用語は、化合物の2つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは、概して、直接の結合、または酸素や硫黄などの原子、NR8、CO、CONH、SO、SO2、SO2NHなどのユニット、または以下に限られないが、置換または未置換アルキル、置換または未置換アルケニル、置換または未置換アルキニル、1つ以上のメチレンが、O、S、SO、SO2、NR8、COにより割り込まれていても、終わらされても差し支えない、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール、置換または未置換アリール、置換または未置換へテロアリール、置換または未置換ヘテロシクリルなどの原子の鎖を含み、式中、R8は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。1つの実施の形態において、リンカーは、1~24の原子、好ましくは4~24の原子、好ましくは6~18の原子、より好ましくは8~18の原子、最も好ましくは8~16の原子である。1つの実施の形態において、リンカーは、-[P-Q-Rq-X-P’-Q’-R’q]q-T-であり、式中、P、R、T、P’、R’およびTの各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、NHCO、CH2、CH2NH、CH2O、NHCHRaCO、-CO-CHRa-NH-、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;QおよびQ’の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、-CH2n-、-CR1R2CH2n-、-CH2nCR1R2-、-CH2CH2OmCH2CH2-、または-CH2CH2OmCH2CH2NH-であり;Xは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;R1およびR2の各々は、各存在毎に独立して、H、CH3、OH、SHまたはNRN2であり;RNは、各存在毎に独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはベンジルであり;q、q’およびqの各々は、各存在毎に独立して、0~20であり、反復ユニットは、同じでも異なっても差し支えなく;nは、各存在毎に独立して、1~20であり;mは、各存在毎に独立して、0~50である。1つの実施の形態において、リンカーは、少なくとも1つの開裂可能な連結基を含む。ある実施の形態において、リンカーは分岐リンカーである。分岐リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってよいが、四価、五価または六価の原子、もしくは多価を示す基であってよい。ある実施の形態において、分岐点は、-N、-NQ-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-CONQ-C、-OCONQ-C、-NQCO-C、または-NQCOO-Cであり、式中、Qは、各存在毎に独立して、Hまたは必要に応じて置換されたアルキルである。他の実施の形態において、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。開裂可能な連結基開裂可能な連結基は、細胞の外では十分に安定であるが、標的細胞中に進入した際に、開裂されて、リンカーが一緒に保持している2つの部分を解放するものである。好ましい実施の形態において、開裂可能な連結基は、対象の血液中におけるよりも、標的細胞中で、または第1の標準状態例えば、細胞内状態を模倣するまたは表すように選択できるで、もしくは第2の標準状態例えば、血液中または血清中に見られる状態を模倣するまたは表すように選択できるで、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍速く開裂される。開裂可能な連結基は、開裂剤、例えば、pH、酸化還元電位または分解系分子の影響を受けやすい。一般に、開裂剤は、血清中または血液中よりも、細胞の内部でより高いレベルまたは活性で見つかるか、またはより優勢である。そのような分解系剤の例としては、例えば、酸化または還元酵素、もしくは還元によって酸化還元開裂可能な連結基を分解できる、細胞中に存在するメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質について選択された、または基質特異性を持たない酸化還元剤;エステラーゼ;酸性環境を作り出せるエンドソームまたは作用物質、例えば、5以下のpHを生じるもの;一般的な酸として機能することによって、酸性開裂可能な連結基を分解または加水分解できる酵素、ペプチダーゼ基質特異性であり得る、およびホスファターゼが挙げられる。ジスルフィド結合などの開裂可能な連結基は、pHの影響を受け得る。ヒトの血清のpHは7.4であるのに対し、平均的な細胞内pHは、わずかに低く、約7.1~7.3に及ぶ。エンドソームは、5.5~6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、5.0辺りのさらにより酸性のpHを有する。あるリンカーは、好ましいpHで開裂される開裂可能な連結基を有し、それによって、細胞内部のリガンドから、または細胞の所望の区画中に、陽イオン脂質を放出する。リンカーは、特定の酵素によって開裂可能である開裂可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる開裂可能な連結基のタイプは、標的とすべき細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーによって、陽イオン脂質に連結できる。肝臓細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富ではないタイプの細胞中よりも、肝臓細胞中において、より効率的に開裂される。エステラーゼが豊富な他の細胞のタイプとしては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。肝臓細胞および滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞のタイプを標的にする場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用できる。一般に、候補の開裂可能な連結基の適性は、分解剤または分解状態の、候補の連結基を開裂する能力を試験することによって評価することができる。血液中におけるまたは他の非標的組織と接触するときの、開裂に抵抗する能力についての候補の開裂可能な連結基を試験することも望ましいであろう。それゆえ、第1の条件が標的細胞中の開裂を示すように選択され、第2の条件が他の組織または生物学的流体、例えば、血液または血清中の開裂を示すように選択されている、第1と第2の条件の間での開裂に対する相対的な感受性を判定することができる。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または動物全体において行うことができる。無細胞条件または培養条件で初期評価を行い、動物全体におけるさらなる評価を確認することが有用であろう。好ましい実施の形態において、有用な候補の化合物は、血液または血清または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ状態と比べて、細胞中において少なくとも2、4、10または100倍速く開裂される。酸化還元開裂可能な連結基開裂可能な連結基の1つの部類は、還元または酸化の際に開裂される酸化還元開裂可能な連結基である。還元で開裂可能な連結基の例に、ジスルフィド連結基-S-S-がある。候補の開裂可能な連結基が、適切な還元で開裂可能な連結基であるか、または例えば、特定のiRNA部分および特定の標的薬剤に使用するのに適しているかを判定するために、ここに記載された方法に目を向けることができる。例えば、候補は、細胞中、例えば、標的細胞中に観察されるであろう開裂の速度を模倣する、当該技術分野に公知の試薬を使用して、ジチオトレイトールDTT、または他の還元剤と一緒のインキュベーションにより評価することができる。候補は、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価しても差し支えない。好ましい実施の形態において、候補の化合物は、血液中で多くとも10しか開裂されない。好ましい実施の形態において、有用な候補化合物は、血液または細胞外条件を模倣するように選択されたインビボ条件下と比べて、細胞中において少なくとも2、4、10または100倍速く分解される。候補化合物の開裂速度は、細胞内培地を模倣するように選択された条件下で、細胞外培地を模倣するように選択された条件と比べて、標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定できる。ホスフェート系開裂可能な連結基ホスフェート系開裂可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって開裂される。細胞中でリン酸基を開裂する作用物質の例には、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例には、-O-POORk-O-、-O-PSORk-O-、-O-PSSRk-O-、-S-POORk-O-、-O-POORk-S-、-S-POORk-S-、-O-PSORk-S-、-S-PSORk-O-、-O-PORk-O-、-O-PSRk-O-、-S-PORk-O-、-S-PSRk-O-、-S-PORk-S-、-O-PSRk-S-がある。好ましい実施の形態は、-O-POOH-O-、-O-PSOH-O-、-O-PSSH-O-、-S-POOH-O-、-O-POOH-S-、-S-POOH-S-、-O-PSOH-S-、-S-PSOH-O-、-O-POH-O-、-O-PSH-O-、-S-POH-O-、-S-PSH-O-、-S-POH-S-、-O-PSH-S-である。好ましい実施の形態は、-O-POOH-O-である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。酸開裂可能な連結基酸開裂可能な連結基は、酸性条件下で開裂される連結基である。好ましい実施の形態において、酸開裂可能な連結基は、約6.5以下のpH例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれ未満の酸性環境において、または一般酸として機能できる酵素などの作用物質によって、開裂される。細胞中で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pH細胞小器官は、酸開裂可能な連結基の開裂環境を提供できる。酸開裂可能な連結基の例としては、以下に限られないが、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸開裂可能な基は、一般式-C=NH-、COO、または-OCOを有し得る。好ましい実施の形態は、エステルの酸素に結合した炭素アルコキシ基がアリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルやt-ブチルなどの第三アルキル基である場合である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。エステル系連結基エステル系開裂可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により開裂される。エステル系開裂可能な連結基の例としては、以下に限られないが、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル開裂可能な連結基は、一般式-COO-または-OCO-を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。ペプチド系開裂基ペプチド系開裂可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により開裂される。ペプチド系開裂可能な連結基は、オリゴペプチド例えば、ジペプチド、トリペプチドなどおよびポリペプチドを生じるようにアミノ酸の間に形成されたペプチド結合である。ペプチド系開裂可能な基はアミド基-CONH-を含まない。アミド基は、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を生成するためにアミノ酸の間に形成される特別なタイプのアミド結合である。ペプチド系開裂可能な基は、概して、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生成するペプチド結合すなわち、アミド結合にかぎられ、アミド官能基全体を含むわけではない。ペプチド系開裂可能な連結基は、一般式-NHCHRACONHCHRBCO-を有し、式中RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価できる。ここに用いたように、炭水化物は、各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖ユニット直鎖、分岐鎖または環式であってよいから構成されたそれ自体が炭水化物である化合物;または各炭素原子に酸素、窒素または硫黄原子が結合している、少なくとも6つの炭素原子を有する1つ以上の単糖ユニット直鎖、分岐鎖または環式であってよいから構成された炭水化物部分をその一部として有する化合物を称する。代表的な炭水化物としては、糖単糖、二糖、三糖および約4~9の単糖ユニットを含有するオリゴ糖、およびデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖が挙げられる。特別な単糖としては、C5以上好ましくはC5~C8の糖が挙げられ;二糖および三糖としては、2つまたは3つの単糖ユニット好ましくはC5~C8を有する糖が挙げられる。単糖という用語は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、D-フシトール、L-フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、D-ガラクトサミニトール、N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース-6-リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、L-グリセロ-D-マンノース-ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース-6-リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロースおよびキシルロースの基を包含する。単糖は、D型であっても、L型であっても差し支えない。単糖は、さらに、デオキシ糖アルコール性ヒドロキシ基が水素で置換されている、アミノ糖アルコール性ヒドロキシ基がアミノ基で置換されている、チオ糖アルコール性ヒドロキシ基がチオールで置換されている、またはC=OがC=Sで置換されている、または環形態の環酸素が硫黄で置換されている、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖環炭素が窒素で置換されている、イミノ糖環酸素が窒素で置換されている、ホスファノ糖環酸素がリンで置換されている、ホスファ糖環炭素がリンで置換されている、C-置換単糖非末端炭素原子で水素が炭素で置換されている、不飽和単糖、アルジトールカルボニル基がCHOH基で置換されている、アルドン酸アルデヒド基がカルボキシ基で置換されている、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダン酸などであってよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換されても差し支えないことが理解される。二糖、三糖、および多糖という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、2-デオキシリボース、2-デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β-マルトース、マルトリオース、マンナン-オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α,α-トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロースなどの基を包含する。さらに、二糖、三糖、および多糖などは、さらに置換されても差し支えないことが理解される。二糖には、アミノ糖およびその誘導体、特に、C-4’位で誘導体化されたミカミノースまたはC-6’位で誘導体化された4デオキシ-3-アミノグルコースも含まれる。1つの実施の形態において、前記化合物は、式I’:に示された構造を有し、式中、AおよびBの各々は、各存在毎に独立して、O、NRNまたはSであり;XおよびYの各々は、各存在毎に独立して、H、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ’ZO-ヌクレオシド、-PZ’ZO-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-PZ’ZO-R1-Q’-R2-OPZ’ZO-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-PZ’Z-式I、-PZ’Z-、または-Q-Rであり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。Rは、L1であるか、または式II~V:に示された構造を有し;q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5Bおよびq5Cは、各存在毎に独立して、0~20を表し、式中、反復単位は同じであっても、異なってもよく;QおよびQ’は、各存在毎に独立して、存在しないか、-P7-Q7-R7p-T7-、または-T7-Q7-T7-B-T8-Q8-T8であり;P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T5A、T5B、T5C、T7、T7、T8、およびT8の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、NHCO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Bは、-CH2-NBL-CH2-であり;BLは、-TB-QB-TB-Rxであり;Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8、およびQBは、各存在毎に独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、SO、SO2、NRN、CR’=CR’、C≡C、またはCOの1つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく;TBおよびTBの各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、OCOO、NHCO、NHCONH、NHCOO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Rx、親油性物質例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン、ビタミン例えば、葉酸、ビタミンA、ビタミンE、ビオチン、ピリドキサール、ペプチド、炭水化物例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖、エンドソーム溶解成分、ステロイド例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、テルペン例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、またはカチオン性脂質であり;R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、COO、CONH、NHCHRaCO、-CO-CHRa-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B、およびL5Cの各々は、各存在毎に独立して、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり;R’およびRの各々は、各存在毎に独立して、H、C1~C6アルキル、OH、SH、またはNRN2であり;RNは、各存在毎に独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z、Z’、およびZの各々は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;pは、各存在毎に独立して、0~20である。いくつかの実施の形態において、式I’は構造を有する。いくつかの実施の形態において、式I’は構造を有する。いくつかの実施の形態において、式I’は構造を有する。いくつかの実施の形態において、式I’は構造を有する。いくつかの実施の形態において、式I’は構造を有する。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの好ましい実施の形態において、Rはである。いくつかの好ましい実施の形態において、Rはである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、構造を有する。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの実施の形態において、Rはである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは、構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、L2AおよびL2Bの両方とも同じである。いくつかの実施の形態において、L2AおよびL2Bの両方とも異なる。いくつかの好ましい実施の形態において、L3AおよびL3Bの両方とも同じである。いくつかの実施の形態において、L3AおよびL3Bの両方とも異なる。いくつかの好ましい実施の形態において、L4AおよびL4Bの両方とも同じである。いくつかの実施の形態において、L4AおよびL4Bの両方とも異なる。いくつかの好ましい実施の形態において、L5A、L5BおよびL5Cの全てが同じである。いくつかの実施の形態において、L5A、L5BおよびL5Cの内の2つが同じである。いくつかの実施の形態において、L5AおよびL5Bが同じである。いくつかの実施の形態において、L5AおよびL5Cが同じである。いくつかの実施の形態において、L5BおよびL5Cが同じである。別の態様において、本発明は、式Iの少なくとも1つのモノマーを含むiRNA二重鎖剤を特徴とする。いくつかの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、式Iの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのモノマー、より好ましくは、式Iの1つ、2つまたは3つのモノマー、より好ましくは、式Iの1つまたは2つのモノマー、さらにより好ましくは、式Iのたった1つのモノマーを含む。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーの全ては、二本鎖iRNA二重鎖剤の同じ鎖上にある。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、iRNA二重鎖剤の別個の鎖上にある。いくつかの実施の形態において、iRNA二重鎖剤における式Iの全てのモノマーは同じである。いくつかの実施の形態において、iRNA二重鎖剤における式Iのモノマーは全て異なる。いくつかの実施の形態において、iRNA二重鎖剤における式Iのいくつかのモノマーのみが同じである。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、iRNA二重鎖剤において互いに隣り合っている。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、iRNA二重鎖剤において互いに隣り合っていない。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、iRNA二重鎖剤の5’末端、3’末端、内部位置、3’末端と5’末端の両方、5’末端と内部位置の両方、3’末端と内部位置の両方、および3つの位置の全て5’末端と3’末端と内部位置にある。いくつかの好ましい実施の形態において、RXはコレステロールである。いくつかの好ましい実施の形態において、RXはリトコール酸である。いくつかの好ましい実施の形態において、RXはオレイルリトコール酸である。いくつかの好ましい実施の形態において、RXは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、BLは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、式中、YはOまたはSであり、nは3~6である。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、式中、YはOまたはSであり、nは3~6である。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、XはOまたはSである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iのモノマーは、式VIIのリンカーを通じてiRNA二重鎖剤に連結されており、RはOまたはSである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iは構造を有し、RはOHまたはNHCOOHである。いくつかの実施の形態において、iRNA二重鎖剤は、式Iのモノマーに加えて、式VIに示された構造を持つモノマーを有し、式中、X6およびY6の各々は、独立して、H、OH、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、-PZ’ZO-ヌクレオシド、-PZ’ZO-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、-PZ’ZO-R1-Q’-R2-OPZ’ZO-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-PZ’Z-式Iもしくは-PZ’Z-であり;式中、オリゴヌクレオチドは、aセンス鎖であり、i交互2’-フルオロ修飾と、ii少なくとも1つのリガンドと、を含むセンス鎖、およびbアンチセンス鎖であり、i交互2’-ハロゲン修飾と、ii5’炭素位置でリン酸化されている第1の5’末端アンチセンスヌクレオチドと、を含むアンチセンス鎖、を含む。Q6は、存在しないか、または-P6-Q6-R6v-T6-であり;P6およびT6の各々は、各存在毎に独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OCO、NHCO、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Q6は、各存在毎に独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、SO、SO2、NRN、CR’=CR’、C≡C、またはCOの1つ以上により割り込まれていても、終わらされても差し支えなく;R6は、各存在毎に独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、COO、CONH、NHCHRaCO、-CO-CHRa-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;R’およびRの各々は、各存在毎に独立して、H、C1~C6アルキル、OH、SH、またはNRN2であり;RNは、各存在毎に独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z、Z’、およびZの各々は、各存在毎に独立して、OまたはSであり;vは、各存在毎に独立して、0~20を表し;RLは、親油性物質例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン、ビタミン例えば、葉酸、ビタミンA、ビオチン、ピリドキサール、ペプチド、炭水化物例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖、エンドソーム溶解成分、ステロイド例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、テルペン例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、またはカチオン性脂質である。いくつかの実施の形態において、式Iの1つ以上、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのモノマーに加えて、式VIの1つ以上、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのモノマーが、前記iRNA二重鎖剤中に存在する。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iの1つのモノマーおよび式VIの1つのモノマーのみが、前記iRNA二重鎖剤中に存在する。いくつかの実施の形態において、RLはコレステロールである。いくつかの実施の形態において、RLはリトコール酸である。いくつかの実施の形態において、RLはオレイルリトコール酸である。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、式VIのモノマーと共有結合している。いくつかの好ましい実施の形態では、式Iのモノマーは、リン酸結合、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合を介して、式VIのモノマーと結合している。いくつかの好ましい実施の形態において、式Iのモノマーは、式VIのモノマーを介してiRNA二重鎖剤に結合される。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーは、iRNA二重鎖剤と式VIのモノマーとの間に介在している。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式IIのモノマーは互いに直接結合している。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式IIのモノマーは互いに直接結合していない。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式VIのモノマーは、二重鎖iRNA二重鎖剤の別個の鎖上にある。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式VIのモノマーは、iRNA二重鎖剤の反対の末端上にある。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式VIのモノマーは、iRNA二重鎖剤の同じ末端上にある。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーまたは式VIのモノマーの一方は内部位置にあるのに対し、他方は、iRNA二重鎖剤の末端位置にある。いくつかの実施の形態において、式Iのモノマーおよび式VIのモノマーは両方とも、iRNA二重鎖剤の内部位置にある。いくつかの好ましい実施の形態において、式VIのモノマーは構造を有する。いくつかの実施の形態において、本発明のiRNA二重鎖剤は、からなる群より選択され、式中、リガンドは、PK調節物質であり、X=OまたはSであり、Y=OまたはSであり、PEGは、分子量MW200~100,000の、ω-OHPEG、ω-アミノPEG、ω-メトキシPEG、ω-SHPEG、ω-プロパルギルPEG、ω-アジドPEG、およびω-リガンドPEGである。エンドソーム溶解成分二重層膜を容易には横切ることができない、巨大分子薬物および親水性薬物分子については、細胞のエンドソーム/リソソーム区画に閉じ込めることが、それらの作用部位に効果的に送達する上での最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くの手法や戦略が工夫されてきた。リポソーム製剤については、融合性脂質を製剤中に使用することが最も一般的な手法となっているSinghRSGoncalvesCetalOntheGeneDeliveryEfficaciesofpHSensitiveCationicLipidsviaEndosomalProtonationAChemicalBiologyInvestigationChemBiol11713723。プロトン化および/またはpH誘導性の立体構造変化を通じてpH感受性のエンドソーム溶解活性を示す他の成分としては、荷電したポリマーおよびペプチドが挙げられる。その例が、HoffmanASStaytonPSetalDesignofsmartpolymersthatcandirectintracellulardrugdeliveryPolymersAdvTechnol13992999;KakudoChakiTSetalTransferrinModifiedLiposomesEquippedwithapHSensitiveFusogenicPeptideAnArtificialVirallikeDeliverySystemBiochemistry43656185628;YessineMAandLerouxJCMembranedestabilizingpolyanionsinteractionwithlipidbilayersandendosomalescapeofbiomacromoleculesAdvDrugDelivRev569991021;OliveiraSvanRooyIetalFusogenicpeptidesenhanceendosomalescapeimprovingsiRNAinducedsilencingofoncogenesIntJPharm3312114に見出すことができる。これらは、リポソームまたはリポプレックスなどの、薬物送達系との関連で一般に使用されてきた。リポソーム製剤を用いる、葉酸受容体を介する送達については、例えば、pH感受性の融合性ペプチドがリポソームに組み込まれ、摂取の過程での薬物の放出を改善することによって活性を向上させることが示されているTurkMJReddyJAetalCharacterizationofanovelpHsensitivepeptidethatenhancesdrugreleasefromfolatetargetedliposomesatendosomalpHsBiochimBiophysActa15595668。ある実施の形態では、本発明のエンドソーム溶解成分は、pH依存性の膜活性および/または融合性を示すポリカチオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するよう設計された、タンパク質様の小さい鎖であってよい。ペプチド模倣体は、分子の特性を変化させるために既存のペプチドを修飾すること、もしくは自然ではないアミノ酸またはその類似体を用いてペプチド様分子を合成することによって生じるであろう。ある実施の形態では、これらは、ペプチドと比較して、安定性および/または生物学的活性が向上している。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、エンドソームpH例えば、pH5~6で活性のある立体構造をとる。活性のある立体構造とは、エンドソーム溶解成分が、エンドソームの溶解および/または本発明のモジュラー組成物、もしくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。化合物のライブラリーについては、溶血アッセイを用いて、中性pHに対するエンドソームpHでのそれらの示差的な膜活性についてスクリーニングしてもよい。この方法で単離される有望な候補は、本発明のモジュラー組成物の成分として使用してよい。本発明の組成物および方法で使用されるエンドソーム溶解成分を同定する方法は、化合物のライブラリーを提供する工程;血液細胞をライブラリーのメンバーと接触させる工程であって、接触が起こる培地のpHが制御される工程;これらの化合物が中性pH例えば、約pH7~8に対して、低いpH例えば、約pH5~6で血液細胞の示差溶解を誘導するか否かを判定する工程を含み得る。例示のエンドソーム溶解成分としては、GALAペプチドSubbaraoetalBiochemistry19872629642972、EALAペプチドVogeletalJAmChemSoc199611815811586、およびそれらの誘導体TurketalBiochemBiophysActa200215595668が挙げられる。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、pHの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基例えば、アミノ酸を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状または分岐状であってもよい。エンドソーム溶解成分の例示の一次配列としては、H2N-AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC-CO2H;H2N-AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC-CO2H;およびH2N-ALEALAEALEALAEA-CONH2が挙げられる。ある実施の形態では、複数のエンドソーム溶解成分を本発明のiRNA二重鎖剤に組み込んでもよい。いくつかの実施の形態では、これには、式Iのモノマーに加えて、複数の同じエンドソーム溶解成分をiRNA剤に組み込むことを伴う。他の実施の形態では、これには、式Iのモノマーに加えて、2つ以上の異なるエンドソーム溶解成分をiRNA二重鎖剤に組み込むことを伴う。これらのエンドソーム溶解成分は、例えば、エンドソームpHで立体構造を変化させることによって、エンドソームからの脱出を仲介し得る。ある実施の形態では、エンドソーム溶解成分は、中性pHでランダムコイル立体構造をとって存在し、エンドソームpHで両親媒性ヘリックスへと再編成してもよい。この立体構造転移の結果として、これらのペプチドがエンドソームの脂質膜に入り込み、エンドソームの内容物を細胞質へと漏れ出させ得る。立体構造転移はpH依存性であるので、エンドソーム溶解成分は、血液中pH約7.4を循環する間、ほとんどまたは全く融合活性を示すことができない。融合活性は、エンドソーム溶解成分による脂質膜の破壊を引き起こす活性と定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解成分によるエンドソーム膜の破壊であり、これは、エンドソームの溶解、または本発明のモジュラー組成物例えば、核酸の1つ以上の成分のエンドソームから細胞質への漏出および輸送をもたらす。本明細書に記載された溶血アッセイに加えて、適切なエンドソーム溶解成分は、当業者により、他の方法を用いて試験および同定することができる。例えば、pH環境に応答する例えば、pH環境によって電荷を変化させる化合物の能力を、常法によって例えば、細胞アッセイで試験することができる。ある実施の形態では、試験化合物を、細胞と混合するかまたは細胞と接触させ、例えば、エンドサイトーシスによって、細胞に試験化合物を取り込ませる。次いで、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製し、このエンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。対照細胞と比べた、接触させた細胞由来のエンドソーム画分の変化例えば、減少は、試験化合物が融合剤として機能できることを示す。あるいは、接触させた細胞と対照細胞を、例えば、顕微鏡法例えば、光学顕微鏡法または電子顕微鏡法で評価して、細胞内のエンドソーム個体群の違いを決定することができる。試験化合物および/またはエンドソームに標識付けて、例えば、エンドソームの漏出を定量化することができる。別のタイプのアッセイでは、本明細書に記載されたiRNA二重鎖剤を、1つ以上の試験融合剤または推定融合剤を用いて構築する。iRNA二重鎖剤は、可視化しやすいように標識付けることができる。一旦iRNA剤が細胞に取り込まれたら、エンドソームからの脱出を促進するエンドソーム溶解成分の能力を、エンドソーム調製物の調製によって、または細胞の細胞質中の標識iRNA二重鎖剤を可視化することができる顕微鏡技術によって評価することができる。ある他の実施の形態では、遺伝子発現の阻害、または任意の他の生理的パラメータを、エンドソーム脱出の代用マーカーとして使用してもよい。他の実施の形態において、円偏光二色性分光法を用いて、pH依存的な構造転移を示す化合物を同定することができる。2段階アッセイを実施することもできる。この2段階アッセイにおいては、第1のアッセイで、試験化合物だけでpHの変化に応答する能力を評価し、第2のアッセイで、試験化合物を含むモジュラー組成物がpHの変化に応答する能力を評価する。ペプチド本発明に使用するのに適したペプチドは、天然ペプチド、例えば、tatペプチドまたはアンテナペディアペプチド、合成ペプチド、またはペプチド模倣体であって差し支えない。さらに、ペプチドは、修飾ペプチドであって差し支えなく、例えば、ペプチドは、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびD-アミノ酸を含むこともできる。ペプチド模倣体ここではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれるは、天然ペプチドと類似の規定された3次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチドへの結合は、細胞による認識および吸収を高めることなどによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的分布に影響を及ぼし得る。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約5~50アミノ酸、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸であって差し支えない例えば、表1参照。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または例えば、主にTyr、Trp、またはPheからなる疎水性ペプチドであり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列MTSを含むことができる。例示の疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAPを有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAPも標的化部分であって差し支えない。このペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、送達ペプチドであり得る。例えば、HIVTatタンパク質由来の配列GRKKRRQRRRPPQおよびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質由来の配列RQIKIWFQNRRMKWKKは、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または1ビーズ1化合物OBOCコンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、DNAのランダムな配列によってコードすることができるLametalNature35482841991。脂質に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸RGD-ペプチド、またはRGD模倣体などの細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約5のアミノ酸~約40のアミノ酸の範囲に及び得る。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を増大させるために、構造的修飾を有することができる。下記の構造的修飾のいずれを利用しても差し支えない。RGDペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができるZitzmannetalCancerRes625139432002。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む、様々な他の組織の腫瘍への標的化を促進することができるAokietalCancerGeneTherapy87837872001。RGDペプチドは、脂質粒子の腎臓への標的化を促進することが好ましい。RGDペプチドは、線状または環状であって差し支えなく、かつ修飾する例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリコシル化されたRGDペプチドは、αvβ3を発現する腫瘍細胞を標的とすることができるHaubneretalJourNuclMed423263362001。増殖細胞に濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、RGDを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、IvJ3インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。このように、RGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D-アミノ酸を含むRGDペプチド、並びに合成RGD模倣体を使用することができる。RGDに加えて、Iv-J3インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。細胞透過ペプチドは、細胞、例えば、細菌細胞または真菌細胞などの微生物細胞、もしくはヒト細胞などの哺乳類細胞を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α-ヘリックス線状ペプチド例えば、LL-37もしくはセロピンP1、ジスルフィド結合含有ペプチド例えば、α-ディフェンシン、β-ディフェンシン、もしくはバクテネシン、または優勢なアミノ酸を1種または2種しか含有しないペプチド例えば、PR-39またはインドリシジンであり得る。細胞透過ペプチドは、核局在シグナルNLSを含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、HIV-1gp41の融合ペプチドドメインとSV40ラージT抗原のNLSとに由来する、MPGなどの、2つの部分からなる両親媒性ペプチドであり得るSimeonietalNuclAcidsRes31271727242003。iRNA二重鎖剤iRNA二重鎖剤は、標的遺伝子と十分に相同な領域を含み、かつヌクレオチドに関して、iRNA剤またはその断片がこの標的遺伝子の下方調節を仲介することができるほどの十分な長さであるべきである。説明しやすくするために、本明細書では、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語を、RNA剤の1つ以上のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書でのリボヌクレオチドまたはヌクレオチドという用語の用法は、修飾RNAまたはヌクレオチド代用物の場合、修飾ヌクレオチド、または1つ以上の位置での代用物置換部分も示すことができるということが理解されよう。したがって、iRNA二重鎖剤は、標的RNAに対して少なくとも部分的に、およびいくつかの実施の形態では、完全に、相補的な領域であるか、またはこのような領域を含む。iRNA二重鎖剤と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、その対応性は、iRNA二重鎖剤、またはその開裂産物が、例えば、標的RNA例えば、mRNAのRNAi開裂によって、配列特異的な発現抑制を導くことが可能となる程度に十分でなければならない。相補性、すなわち、標的鎖との相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖において、完全な相補性がたいてい望ましいが、いくつかの実施の形態は、特にアンチセンス鎖において、標的RNAに対して1つ以上の、または例えば、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ、もしくはそれより少ない不一致を含むことができる。特にアンチセンス鎖における不一致は、末端領域で最も許容され、かつ、存在する場合は、末端領域単数または複数において、例えば、5’末端および/または3’末端から6つ、5つ、4つ、または3つのヌクレオチド以内であり得る。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることのみである。本明細書の他の箇所で論じられるように、またその全体が参照により組み入れられる文献において、iRNA二重鎖剤は、たいてい、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む。iRNA二重鎖剤の一本鎖領域は、たいてい、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域またはヘアピン構造の領域例えば、2つの相補的な領域を繋ぐ領域は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、iRNA等に重鎖剤の1つ以上の3末端または5末端を安定化する修飾またはアンチセンスsiRNA剤がRISCに入るように有利に働く修飾も想定される。修飾としては、C3またはC6、C7、C12アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサC3、C6、C7、C12、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、特別なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬これらは、ホスホラミダイトとして生じ、DMT保護ヒドロキシル基を別に有して、RNA合成の最中に複数のカップリングを可能にするが挙げられる。iRNA二重鎖剤としては次のようなものが挙げられる:インターフェロン応答を誘発するのに十分な長さの分子これらは、DicerBernsteinetal2001Nature409363366によって開裂され、RISCRNAi-誘導発現抑制複合体内に入ることができる;およびインターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子これらの分子もDicerによって開裂され、および/またはRISC内に入ることができる、例えば、RISC内に入ることができる大きさの分子例えば、Dicer開裂産物に類似した分子。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子を、本明細書では、siRNA剤またはより短いiRNA二重鎖剤と呼ぶ。本明細書で使用されるsiRNA剤またはより短いiRNA二重鎖剤は、例えば、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘導しないぐらい十分に短い、例えば、60、50、40、または30未満のヌクレオチド対の二重鎖領域を有するRNA二重鎖剤例えば、二本鎖RNA剤または一本鎖剤を称する。siRNA剤、またはその開裂産物は、例えば、標的RNAに対してRNAiを誘導することによって、標的遺伝子を下方調節することができ、この場合、標的は内在性の標的RNAまたは病原体の標的RNAを含み得る。siRNA剤の各鎖の長さは、30、25、24、23、22、21、または20以下のヌクレオチドであって差し支えない。鎖の長さは、少なくとも19のヌクレオチドであってもよい。例えば、各鎖の長さは、21~25の間のヌクレオチドであることができる。siRNA剤は、17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対の二重鎖領域、および1つ以上の突出部、もしくは1つまたは2つの、2~3ヌクレオチドの3突出部を有してもよい。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤はヘアピンである。iRNA二重鎖剤におけるヘアーは、少なくとも17、18、19、29、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対またはそれと等しい二重鎖領域を有する。この二重鎖領域の長さは、200、100、または50以下であってよい。ある実施の形態において、二重鎖領域の長さの範囲は、12~30、17から23、19から23、および19から21のヌクレオチド対である。このヘアピンは、いくつかの実施の形態において3末端で、ある実施の形態において、ヘアピンのアンチセンス鎖で、一本鎖突出部または末端不対領域を有してもよい。いくつかの実施の形態において、突出部の長さは2~3のヌクレオチドである。二本鎖iRNA二重鎖剤のアンチセンス鎖の長さは、少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、または60のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。このアンチセンス鎖の長さは、200、100、または50ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、17から25、19から23、および19から21のヌクレオチドであってよい。二本鎖iRNA二重鎖剤のセンス鎖の長さは、少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、または60のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。このセンス鎖の長さは、200、100、または50ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、17から25、19から23、および19から21のヌクレオチドであってよい。二本鎖iRNA二重鎖剤の二本鎖部分の長さは、少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、または60のヌクレオチド、またはそれに等しくてもよい。この二本鎖部分の長さは、200、100、または50ヌクレオチド以下であってもよい。長さの範囲は、12~30、17から23、19から23、および19から21のヌクレオチド対であってよい。多くの実施の形態において、dsiRNA二重鎖剤は、内在性分子によって例えば、Dicerによって開裂されて、より小さいdsiRNA二重鎖剤例えば、siRNA剤を産生することができるくらいに十分大きい。二本鎖iRNA二重鎖剤のアンチセンス鎖とセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましいであろう。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ部類の修飾を有することもあれば、異なる修飾を有することもあり、例えば、場合によっては、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖を不活性化して、活性のあるsiRNA/タンパク質またはRISCの形成を妨げるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の5’-リン酸化を妨げる修飾によって例えば、5’-O-メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって行うことができるNykaenenetalATPrequirementsandsmallinterferingRNAstructureintheRNAinterferencepathwayCell107309321参照。例えば、単に5-OHをO-MeではなくHによって置換することなどの、リン酸化を妨げる他の修飾も使用しても差し支えない。あるいは、大きな嵩張る基を5’-ホスフェートに付加して、ホスホジエステル結合に変えてもよいが、ホスホジエステラーゼがこのような結合を開裂して、機能的なsiRNA5’末端を放出し得るので、これはあまり望ましくないであろう。アンチセンス鎖修飾としては、5’リン酸化、並びに本明細書で論じられた任意の他の5’修飾、特に、一本鎖iRNA分子に関する節において先に論じられた5’修飾が挙げられる。dsiRNA二重鎖剤が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、dsiRNA二重鎖剤は、突出部、例えば、1つまたは2つの5’突出部、または3’突出部、もしくは2~3ヌクレオチドの3’突出部を含有するように対形成した、センス鎖とアンチセンス鎖を含んでもよい。多くの実施の形態は、3’突出部を有する。あるsiRNA剤は、一本鎖突出部を有し、いくつかの実施の形態では、各末端に1つまたは2つまたは3つのヌクレオチドの長さの3’突出部を有する。突出部は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの2つの鎖が食い違っていることの結果として生じ得る。5’末端はリン酸化されていてもよい。いくつかの実施の形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で論じられたsiRNA剤の範囲において、15と30の間、または18、19、20、21、22、および23のヌクレオチド長である。siRNA剤は、長いdsiRNAから天然のDicerによって処理された産物と長さおよび構造が類似していることがあり得る。siRNA剤の2つの鎖が結合例えば、共有結合している実施の形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および3’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。dsiRNA二重鎖剤およびsiRNA剤を含む、本明細書に記載された単離されたiRNA二重鎖剤は、標的RNA、例えば、mRNA例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物の発現抑制を仲介することができる。便宜上、このようなmRNAを、本明細書では、発現抑制すべきmRNAとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。一般に、発現抑制すべきRNAは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、mRNA以外のRNA例えば、tRNA、およびウイルスRNAを標的とすることもできる。ここに用いたように、RNAiを仲介するという語句は、配列特異的な様式で、標的RNAを発現抑制する能力を称する。理論に束縛されることを望まないが、発現抑制では、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA例えば、21から23のヌクレオチドのsiRNA剤が使用されると考えられている。ここに用いたように、特異的にハイブリダイズ可能なまたは相補的なは、本発明の化合物と標的RNA分子の間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。非標的配列は、概して、少なくとも5つのヌクレオチドが異なっている。1つの実施の形態では、iRNA二重鎖剤は、iRNA二重鎖剤が標的mRNAによってコードされるタンパク質の産生を発現抑制するように、標的RNA、例えば、標的mRNAに対して十分に相補的である。別の実施の形態では、iRNA二重鎖剤は、標的RNAに対して厳密に相補的であり、例えば、標的RNAとiRNA二重鎖剤は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン-クリック塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。十分に相補的な標的RNAは、標的RNAに厳密に相補的な例えば、少なくとも10のヌクレオチドの内部領域を含むことができる。さらに、いくつかの実施の形態では、iRNA二重鎖剤は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に区別する。この場合、iRNA二重鎖剤は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある例えば、7ヌクレオチド以内の領域に見られる場合のみにRNAiを仲介する。ここに用いたように、オリゴヌクレオチドという用語は、例えば、100、200、300、または400未満のヌクレオチドの長さの核酸分子RNAまたはDNAを称する。本明細書で論じられるRNA剤としては、未修飾のRNA、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたRNA、およびヌクレオシド代用物のポリマーが挙げられる。未修飾のRNAは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在する、例えば、ヒトの体内に天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じである分子を称する。当技術分野では、稀であるかまたは通常とは異なるが、天然に存在するRNAを修飾RNAと呼ぶことが多く、例えば、LimbachetalSummarythemodifiednucleosidesofRNANucleicAcidsRes2221832196を参照されたい。典型的には転写後修飾の結果であることが明白なので修飾RNAと呼ばれることが多い、このような稀であるかまたは通常とは異なるRNAは、本明細書で使用される未修飾のRNAという用語の範囲内にある。修飾RNAは、1つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在するものと異なる、例えば、ヒトの体内に存在するものと異なる分子を称する。これらは修飾RNAと称されるが、当然、修飾されているのでRNAではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物とは、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子のことであり、この非リボリン酸構築物は、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸骨格の場合に見られるのと実質的に同様例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物であるように、塩基が正しい空間的関係性で提示されることを可能にする。上記の全ての例が本明細書で論じられる。以下の考察の大部分は、一本鎖分子について言及するものである。本発明の多くの実施の形態では、二本鎖iRNA二重鎖剤例えば、部分的二本鎖iRNA二重鎖剤が想定されている。したがって、以下に記載される一本鎖構造からできた二本鎖構造例えば、2つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成している場合、または分子内対形成によって二本鎖領域が形成されている場合例えば、ヘアピン構造は、本発明の範囲内にある。長さについては、本明細書の他の箇所で記載されている。核酸はサブユニットのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Oの修飾は、核酸内で繰り返される位置で生じる。修飾が核酸中のこれらの位置全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そうではない。一例として、修飾は、3’末端位置または5’末端位置でのみで生じ得、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチドでのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じ得る。修飾は、RNAの二本鎖領域でのみ生じても、またはRNAの一本鎖領域でのみ生じてもよい。例えば、非結合O位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端で生じてもよく、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチドでのみ生じても、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じてもよい。5’末端単数または複数をリン酸化することができる。いくつかの実施の形態では、例えば、安定性を高めるために、突出部に特定の塩基を含めるか、または一本鎖突出部例えば、5’突出部もしくは3’突出部、もしくはその両方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。いくつかの実施の形態では、3’突出部または5’突出部中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載される修飾を用いて、修飾する。修飾としては、例えば、リボース糖の2’OH基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド例えば、デオキシチミジンの使用、およびリン酸基での修飾例えば、ホスホロチオエート修飾が挙げられる。突出部が標的配列と相同である必要はない。修飾およびヌクレオチド代用物を以下で論じる。上記の式VIIに示す足場は、リボ核酸の一部を表す。塩基性成分は、リボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸ヌクレオチド間リンカーである。塩基が、天然の塩基、例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシンである場合、糖は、図示したように未修飾の2’ヒドロキシルリボース糖であり、W、X、Y、およびZは全てOであり、式VIIは、天然の未修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。未修飾のオリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴリボヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記RNA成分の1つ以上に対する化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴリボヌクレオチドをより安定にすることができる。修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下のうちの1つ以上を含むことができる:i非結合XおよびYリン酸酸素の一方もしくは両方、および/または結合WおよびZリン酸酸素の1つ以上の改変例えば、置換リン酸が末端位置にある場合、位置WまたはZの一方は、天然に存在するリボ核酸中ではさらなる元素にリン酸を結合しない。しかしながら、用語方を単純化するために、別記される場合を除き、核酸の5’末端のW位と核酸の3’末端の末端Z位とは、本明細書で使用される結合リン酸酸素という用語の範囲内にある;iiリボース糖の構成成分例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの改変例えば、置換;iiiリン酸部分括弧Iの、デホスホリンカーによる大規模な置換;iv天然に存在する塩基の修飾または置換;vリボース-リン酸骨格括弧IIの置換または修飾;viRNAの3’末端または5’末端の修飾例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、またはRNAの3’末端もしくは5’末端のいずれかへの、部分例えば、蛍光標識部分の結合。この文脈で使用される、置換、修飾、改変などの用語は、プロセス限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、対照リボ核酸または天然に存在するリボ核酸から始めて、それを、修飾リボ核酸を産生するように修飾しなければならないことを意味ものではなく、修飾とは、単に、天然に存在する分子との違いを意味するものである。いくつかの化学物質の実際の電子構造は、ただ1つの標準的な型すなわち、ルイス構造によって適切に表すことはできないことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、その代わりに、実際の構造は、集合的に共鳴型または共鳴構造として知られている、2つ以上の標準的な型のあるハイブリッドまたは加重平均であり得る。共鳴構造は、個別の化学物質ではなく、紙の上でのみ存在する。共鳴構造は、特定の化学物質に対する結合電子および非結合電子の配置または局在という点においてのみ相互に異なる。ある共鳴構造が他のものよりも高い程度でハイブリッドに寄与することが可能である。したがって、本発明の実施の形態についての記載および図示される説明は、特定の種に対する主要な共鳴型として当技術分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート非結合酸素の窒素による置換は、上記の図においてX=OおよびY=Nによって表されよう。具体的な修飾を以下に詳細に論じる。リン酸基リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、2つの非結合酸素原子すなわち、上記式1中のXおよびYに均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の1つを異なる置換基で置換することによって修飾しても差し支えない。RNAリン酸骨格に対するこの修飾の1つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態では、非荷電リンカーかまたは非対称の電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置換されている。XまたはYの一方のみが改変される状況とは異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対してさまざまな耐性を示す調製物が生じ得る。さらに、キラルリン酸基を含有するRNAのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のRNA種と比べてより低い可能性がある。したがって、理論に束縛されることを望まないが、ジアステレオマー混合物を産生することができないという点で、キラル中心を排除するXとYの両方に対する修飾例えば、ホスホロジチオエート形成が望ましいであろう。したがって、Xは、S、Se、B、C、H、N、またはORRはアルキルもしくはアリールであるのいずれか1つであり得る。したがって、Yは、S、Se、B、C、H、N、またはORRはアルキルもしくはアリールであるのいずれか1つであり得る。Xおよび/またはYを硫黄で置換することが可能である。リン酸リンカーは、結合酸素すなわち、上記式1中のWまたはZを、窒素架橋ホスホラロアミデート、硫黄架橋ホスホロチオエート、および炭素架橋メチレンホスホネートで置換することによって修飾することもできる。置換は、末端の酸素位置W3’または位置Z5’で生じ得る。Wを炭素で置換すること、またはZを窒素で置換することが可能である。候補となる薬剤を、以下に記載するように好適性について評価することができる。糖基修飾RNAは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、2’ヒドロキシル基OHは、多数の異なるオキシまたはデオキシ置換基で修飾または置換することができる。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルはもはや、2’アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化できないので、安定性の向上が予測される。2’アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、2’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが、いくつかの実施の形態に対して望ましい可能性がある。オキシ-2’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシOR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖;ポリエチレングリコールPEG、OCH2CH2OnCH2CH2OR;2’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって同じリボース糖の4’炭素に結合されているロックされた核酸LNA;O-AMINEAMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノおよびアミノアルコキシ、OCH2nAMINE例えば、AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノが挙げられる。メトキシエチル基MOEPEG誘導体である、OCH2CH2OCH3のみを含有するオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。デオキシ修飾としては、水素すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にdsのRNAの突出部に特に関連する;ハロ例えば、フルオロ;アミノ例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸;NHCH2CH2NHnCH2CH2-AMINEAMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、NHCORR=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖、シアノ;メルカプト;アルキル-チオ-アルキル;チオアルコキシ;並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルこれらは任意で、例えば、アミノ官能基で置換されていてもよいが挙げられる。ある実施の形態の他の置換基としては、2’-メトキシエチル、2’-OCH3、2’-O-アリル、2’-C-アリル、および2’-フルオロが挙げられる。糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する1つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾RNAは、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含んで差し支えない。修飾RNAは、C-1’にヌクレオ塩基を欠く無塩基糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、構成成分の糖原子の1つ以上における修飾をさらに含有することもできる。ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、2’修飾を、1つ以上のリン酸リンカー修飾例えば、ホスホロチオエートと組み合わせて使用することができる。いわゆるキメラオリゴヌクレオチドは、2つ以上の異なる修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。候補となる修飾を下記のように評価することができる。リン酸基の置換リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部上記式1中の括弧I参照で置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣物で置換することは、向上したヌクレアーゼ安定性を付与するはずであると考えられている。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態において、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施の形態では、置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれてもよい。候補となる修飾を下記のように評価することができる。リン酸骨格の置換リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物式1中の括弧II参照で置換されているオリゴヌクレオチド模倣足場を構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電された骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質例えば、ヌクレアーゼへの結合が減少すると考えられている。重ねて、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施の形態において、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸PNAというヌクレオシド代用物が挙げられる。ある実施の形態では、PNA代用物を使用してもよい。候補となる修飾を下記のように評価することができる。末端修飾オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の3’末端、5’末端、または両方の末端においてなされ得る。これらの修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の1つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素もしくはCy5色素または保護基例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルをベースにしたものに結合することができる。機能的分子実体は、リン酸基および/またはスペーサを介して糖に取り付けることが可能である。スペーサの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のC-3’もしくはC-5’のO基、N基、S基、もしくはC基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、スペーサは、ヌクレオチド代用物例えば、PNAの末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。これらのスペーサまたはリンカーとしては、例えば、-CH2n-、-CH2nN-、-CH2nO-、-CH2nS-、OCH2CH2OnCH2CH2OH例えば、n=3または6、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。スペーサ/リン酸-機能的分子実体-スペーサ/リン酸という配列が、iRNA二重鎖剤の2つの鎖の間に介在するとき、この配列は、ヘアピン型RNA剤中のヘアピンRNAループの代わりになり得る。3’末端は-OH基とすることができる。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分の結合は、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性を改善することができると考えられている。重ねて、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の改変を導入することが望ましいであろう。末端修飾の他の例としては、色素、挿入剤例えば、アクリジン、架橋剤例えば、プソラレン、マイトマイシンC、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリン、サッフィリン、多環式芳香族炭化水素例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、人工エンドヌクレアーゼ例えば、EDTA、親油性担体例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン、およびペプチド複合体例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG例えば、PEG40K、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン例えば、ビオチン、輸送/吸収促進物質例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸、合成リボヌクレアーゼ例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3錯体が挙げられる。末端修飾は、本明細書の他の箇所で論じられるように、活性を調節するため、または分解に対する耐性を調節するためを含む、多くの理由のために加えることができる。活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による5’末端の修飾が含まれる。例えば、ある実施の形態では、iRNA二重鎖剤、とりわけアンチセンス鎖は、5’リン酸化されているか、または5’プライム末端にホスホリル類似体を含む。5’リン酸修飾には、RISCを介した遺伝子発現抑制と適合可能なものが含まれる。好適な修飾としては、5’モノホスフェートHO2OP-O-5’;5’ジホスフェートHO2OP-O-PHOO-O-5’;5’トリホスフェートHO2OP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-グアノシンキャップ7-メチル化または非メチル化7m-G-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’-アデノシンキャップAppp、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造N-O-5’-HOOP-O-HOOP-O-PHOO-O-5’;5’モノチオホスフェートホスホロチオエート;HO2SP-O-5’;5’モノジチオホスフェートホスホロジチオエート;HOHSSP-O-5’、5’-ホスホロチオレートHO2OP-S-5’;酸素/硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ例えば、5’-α-チオトリホスフェート、5’-γ-チオトリホスフェートなど、5’-ホスホロアミデートHO2OP-NH-5’、HONH2OP-O-5’、5’-アルキルホスホネートR=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RPOHO-O-5’、OH2OP-5’-CH2、5’-アルキルエーテルホスホネートR=アルキルエーテル=メトキシメチルMeOCH2-、エトキシメチルなど、例えば、RPOHO-O-5’が含まれる。末端修飾は、分解に対する耐性を増大させるのに有用であり得る。末端修飾は、分布をモニタするためにも有用であり得るが、このような場合、付加すべき基としては、フルオロフォア例えば、フルオレセインまたはAlexa色素例えば、Alexa488が挙げられる。末端修飾は、摂取を増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾は、RNA剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾にはマイトマイシンCが含まれる。候補となる修飾を下記のように評価することができる。塩基アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、RNAに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するRNAを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成および天然のヌクレオ塩基例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、またはツベルシジンおよび上記の修飾のいずれか1つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基および汎用的な塩基のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、5-ハロウラシルおよび5-ハロシトシン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン、6-アゾウラシル、6-アゾシトシン、および6-アゾチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-2-アミノプロピルウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル、および他の8-置換アデニンならびにグアニン、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2置換プリン、N-6置換プリン、およびO-6置換プリン2-アミノプロピルアデニンを含む、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-3-アミノ-3-カルボキシプロピルウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、またはO-アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第3687808号明細書に開示されているもの、theConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineeringpages858859KroschwitzJIedJohnWileySons1990に開示されているもの、およびEnglischetalAngewandteChemieInternationalEdition199130613に開示されているものが挙げられる。一般に、塩基の変化は、安定性を促進するためには使用されないが、他の理由のために有用である可能性があり、例えば、いくつかのもの例えば、2,6-ジアミノプリンおよび2アミノプリンは蛍光性である。修飾塩基は、標的特異性を低下させることがあり得る。このことは、iRNA二重鎖剤の設計において考慮されるであろう。候補となる修飾を下記のように評価することができる。候補RNAの評価候補RNA剤例えば、修飾RNAを、そのRNA剤または修飾分子および対照分子を適当な条件に曝露し、選択された特性の存在について評価することによって、選択された特性について評価することができる。例えば、分解物質に対する耐性は、以下のように評価することができる。候補となる修飾RNAおよび対照分子、通常は未修飾形態を、分解的な条件、例えば、分解作用物質例えば、ヌクレアーゼを含む環境に曝露することができる。例えば、生物学的試料、例えば、治療的使用において遭遇し得る環境、例えば、血液または細胞画分例えば、無細胞ホモジネートまたは破砕された細胞と類似の生物学的試料を使用することができる。その後、候補および対照を、多数の手法のいずれによって、分解に対する耐性について評価しても差し支えない。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識もしくは酵素標識、または蛍光標識例えば、Cy3もしくはCy5を用いて、曝露の前に標識付けることができる。対照RNAおよび修飾RNAを、分解作用物質、および必要に応じて、対照例えば、不活化された例えば、熱不活化された分解作用物質とともにインキュベーションすることができる。その後、物理学的パラメータ例えば、修飾分子および対照分子のサイズを決定する。これらのパラメータを、物理学的方法によって例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって、その分子がそのもとの長さを維持していたかどうかを評価するために決定するか、または機能的に評価することができる。あるいは、ノーザンブロット分析を用いて、未標識の修飾分子の長さを検定することができる。機能的アッセイを用いて、候補薬剤を評価することもできる。機能的アッセイは、修飾によって、遺伝子発現を抑制する分子の能力が変化するか否かを決定するために、最初に、または前の非機能的アッセイ例えば、分解に対する耐性についてのアッセイの後で適用することができる。例えば、細胞例えば、マウスまたはヒトの細胞などの哺乳類細胞に、蛍光タンパク質例えば、GFPを発現するプラスミドと、その蛍光タンパク質をコードする転写物に相同な候補RNA剤を同時トランスフェクションすることができる例えば、国際公開第00/44914号パンフレット参照。例えば、GFPmRNAに相同な修飾dsiRNAは、トランスフェクションに候補dsiRNAを含めなかった対照細胞例えば、RNA剤が添加されなかった対照、および/または未修飾RNAが添加された対照と比較して、細胞の蛍光の減少についてモニタすることによって、GFP発現を阻害する能力について検定することができる。遺伝子発現に対する候補薬剤の効力は、修飾dsiRNA剤および未修飾dsiRNA剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価することができる。代わりの機能的アッセイにおいて、内在性マウス遺伝子例えば、c-mosなどの母性発現遺伝子に相同な候補dsiRNA剤を未成熟のマウス卵母細胞に注入して、インビボで遺伝子発現を阻害するiRNA剤の能力を評価することができる例えば、国際公開第01/36646号パンフレット参照。卵母細胞の表現型例えば、第II中期での停止を維持する能力を、RNA剤が発現を阻害する指標としてモニタすることができる。例えば、dsiRNA剤によるc-mosmRNAの開裂は、卵母細胞に中期での停止を抜け出させ、単為生殖的発生を開始させるであろうColledgeetalNature37065681994HashimotoetalNature37068711994。標的RNAレベルに対する修飾RNA剤の効果は、陰性対照と比較して、標的mRNAのレベルの減少について検定するためのノーザンブロット法によって、または標的タンパク質のレベルの減少につい検定するためのウエスタンブロット法によって確認することができる。対照としては、RNA剤が添加されない細胞、および/または未修飾RNAが添加される細胞が挙げられる。定義ハロという用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のうちの任意の基を称する。アルキルという用語は、表示された数の炭素原子を含み、必要に応じてN、O、またはSが挿入され得る、直鎖または分岐鎖であり得る飽和および不飽和の非芳香族炭化水素鎖これらは、プロピル、アリル、またはプロパルギルを含むが、これらに限定されないを称する。例えば、C1~C10は、この基がその中に1~10個含むの炭素原子を有し得ることを意味する。アルコキシという用語は、-O-アルキル基を称する。アルキレンという用語は、二価アルキルすなわち、-R-を称する。アルキレンジオキソという用語は、-O-R-O-式中、Rはアルキレンを表すという構造の二価種を称する。アミノアルキルという用語は、アミノで置換されたアルキルを称する。メルカプトという用語は、-SH基を称する。チオアルコキシという用語は、-S-アルキル基を称する。アリール基という用語は、各環の0個、1個、2個、3個、または4個の原子が、置換基によって置換され得る、6炭素の単環式または10炭素の二環式の芳香環系を称する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。アリールアルキルまたはアラルキルという用語は、アリールで置換されたアルキルを称する。アリールアルコキシという用語は、アリールで置換されたアルコキシを称する。本明細書で用いられるシクロアルキルという用語は、3から12個の炭素、例えば、3から8個の炭素、および例えば、3から6個の炭素を有する、飽和または部分飽和の環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、必要に応じて置換されていてもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールという用語は、単環式の場合には1~3個のヘテロ原子を、二環式の場合には1~6個のヘテロ原子を、または三環式の場合には1~9個のヘテロ原子を有する、5~8員の芳香族単環式環系、8~12員の芳香族二環式環系、または11~14員の芳香族三環式環系を称し、そのヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、1~3個、1~6個、または1~9個のN、O、またはSのヘテロ原子、そこで、各環の0個、1個、2個、3個、または4個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。ヘテロアリールアルキルという用語またはヘテロアラルキルという用語は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを称する。ヘテロアリールアルコキシという用語は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを称する。ヘテロシクリルという用語は、単環式の場合には1~3個のヘテロ原子を、二環式の場合には1~6個のヘテロ原子を、または三環式の場合には1~9個のヘテロ原子を有する、5~8員の非芳香族単環式環系、8~12員の非芳香族二環式環系、または11~14員の非芳香族三環式環系を称し、そのヘテロ原子は、O、N、またはSから選択され例えば、単環、二環、または三環の場合、炭素原子と、それぞれ、1~3個、1~6個、または1~9個のN、O、またはSのヘテロ原子、そこで、各環の0個、1個、2個、または3個の原子は、置換基により置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、トリゾリル、テトラゾリル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。オキソという用語は、炭素に結合した場合にはカルボニルを、窒素に結合した場合にはN-オキシドを、および硫黄に結合した場合にはスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。アシルという用語は、アルキルカルボニル置換基、シクロアルキカルボニル置換基、アリールカルボニル置換基、ヘテロシクリルカルボニル置換基、またはヘテロアリールカルボニル置換基を称し、これらはいずれも、置換基によってさらに置換されていてもよい。置換されたという用語は、所定の構造中の1つ以上の水素基と、以下に限られないが:ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルフォニル、アルキルスルフォニルアルキル、アリールスルフォニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族を含む、特定の置換基の基との置換を称する。置換基をさらに置換することができることが理解される。パリンドローム本発明のiRNA二重鎖剤は、2つ以上のRNA領域を標的とすることができる。例えば、iRNA二重鎖剤は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第1の配列と第2の配列を含むことができる。第1の配列は第1の標的RNA領域に相補的であることができ、第2の配列は第2の標的RNA領域に相補的であることができる。iRNA二重鎖剤の第1の配列と第2の配列が異なるRNA鎖上にあることができ、かつ第1の配列と第2の配列の間の不一致が、50未満、40未満、30未満、20未満、10未満、5未満、または1未満であり得る。iRNA二重鎖剤の第1の配列と第2の配列が同じRNA鎖上にあることができ、かつ関連する実施の形態では、iRNA二重鎖剤の50よりも多く、60よりも多く、70よりも多く、80よりも多く、90よりも多く、95よりも多く、または1よりも多くが、2分子の形態であることができる。iRNA二重鎖剤の第1の配列と第2の配列は、互いに完全に相補的であることができる。第1の標的RNA領域が第1の遺伝子によってコードされることができ、かつ第2の標的RNA領域が第2の遺伝子によってコードされることができ、または第1の標的RNA領域と第2の標的RNA領域が単一遺伝子由来のRNAの異なる領域であることができる。第1の配列と第2の配列は、少なくとも1つのヌクレオチド異なり得る。第1と第2の標的RNA領域は、遺伝子の第1と第2の配列変異体例えば、第1と第2の対立遺伝子によってコードされる転写物上にあることができる。これらの配列変異体は、例えば、突然変異、または多型であることができる。第1の標的RNA領域は、第2の標的RNA領域と比べて、ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失を含むことができ、または第2の標的RNA領域は、第1の標的領域の突然変異体または変異体であることができる。第1と第2の標的RNA領域は、ウイルスRNA領域またはヒトRNA領域を含むことができる。第1と第2の標的RNA領域は、オンコジーンの変異転写物上にあることもでき、または腫瘍抑制遺伝子転写物の異なる突然変異を含むこともできる。さらに、第1と第2の標的RNA領域は、遺伝子変異のホットスポットに対応することができる。本発明の組成物は、iRNA二重鎖剤分子の混合物を含むことができる。例えば、1つのiRNA二重鎖剤が、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第1の配列と第2の配列を含有することができ、さらに、第1の配列が第1の標的RNA領域に相補的であり、かつ第2の配列が第2の標的RNA領域に相補的である。その混合物は、ハイブリダイズするのに互いに十分に相補的な第3の配列と第4の配列を含む少なくとも1つの追加のiRNA二重鎖剤種を含むこともでき、この場合、第3の配列が第3の標的RNA領域に相補的であり、かつ第4の配列が第4の標的RNA領域に相補的である。さらに、第1または第2の配列が、第3または第4の配列に対して、互いにハイブリダイズできるのに十分に相補的であることができる。第1と第2の配列は同じまたは異なるRNA鎖上にあることができ、第3と第4の配列は同じまたは異なるRNA鎖上にあることができる。標的RNA領域は、ウイルスまたはヒトRNAの変異体配列であることができ、ある実施の形態では、標的RNA領域の少なくとも2つが、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物であることができる。標的RNA領域は、遺伝子のホットスポットに対応することができる。iRNA二重鎖剤組成物を作製する方法は、その領域が例えば、ヒトにおける高度の変異性または突然変異頻度を有する、標的遺伝子例えば、ウイルス遺伝子もしくはヒト遺伝子、またはオンコジーンもしくは腫瘍抑制遺伝子、例えば、p53のRNAの領域に関する情報を入手または提供することを含むことができる。さらに、その領域内の複数のRNA標的に関する情報を入手または提供することができ、その場合、各々のRNA標的が、遺伝子の異なる変異体または突然変異体例えば、p53248Qおよび/またはp53249Sをコードするコドンを含む領域に対応する。第1の配列が例えば、249Qをコードする複数の変異体RNA標的のうちの第1の標的と相補的であり、第2の配列が例えば、249Sをコードする複数の変異体RNA標的のうちの第2の標的と相補的であり、かつ第1と第2の配列がハイブリダイズするのに十分に相補的であり得るように、iRNA二重鎖剤を構築することができる。例えば、標的遺伝子中の共通の突然変異体を同定するために、配列分析を使用して、高度の変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定することができる。高度の変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、個体群由来の標的遺伝子についての遺伝子型情報を入手または提供することによって同定することができる。互いにハイブリダイズするのに十分に相補的な第1と第2の配列を有するiRNA二重鎖剤を提供することによって、標的遺伝子の発現を調節する例えば、下方調節または抑制することができる。さらに、第1の配列が第1の標的RNA領域に相補的であることができ、かつ第2の配列が第2の標的RNA領域に相補的であることができる。iRNA二重鎖剤は、第1の変異体RNA標的領域に相補的な第1の配列と第2の変異体RNA標的領域に相補的な第2の配列とを含むことができる。この第1と第2の変異体RNA標的領域は、標的遺伝子例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、またはオンコジーンの第1と第2の変異体または第1と第2の突然変異体に対応することができる。第1と第2の変異体標的RNA領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異体、突然変異体例えば、点突然変異体、または多型を含むことができる。第1と第2の変異体RNA標的領域は、遺伝子のホットスポットに対応することができる。複数のiRNA二重鎖剤例えば、パネルまたはバンクを提供することができる。他の実施の形態また別の実施の形態では、iRNA剤は、例えば、細胞に送達される外来のDNA鋳型から、インビボで細胞において産生される。例えば、DNA鋳型をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与米国特許第5328470号明細書によって、または定位注射例えば、ChenetalProcNatlAcadSciUSA9130543057参照によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリクスを含むことができる。例えば、DNA鋳型は、2つの転写ユニット、すなわち、iRNA二重鎖剤の上部の鎖を含む転写物を産生するものと、iRNA二重鎖剤の下部の鎖を含む転写物を産生するものとを含むことができる。鋳型が転写されると、iRNA二重鎖剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子発現抑制を仲介するsiRNA剤断片となる。生理学的効果本明細書に記載されるiRNA二重鎖剤は、治療上の毒性の決定が、iRNA二重鎖剤と、ヒト配列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計することができる。これらの方法により、iRNA二重鎖剤は、ヒト由来の核酸配列および少なくとも1種類の非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類例えば、齧歯類、反芻類、または霊長類由来の核酸配列に完全に相補的である配列からなることができる。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパンジー、アカゲザル、またはカニクイザルであることができる。iRNA二重鎖剤の配列は、非ヒト哺乳類およびヒトの相同遺伝子例えば、オンコジーンまたは腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であることができる。非ヒト哺乳類におけるiRNA二重鎖剤の毒性を決定することによって、ヒトにおけるiRNA二重鎖剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、iRNA二重鎖剤を、ヒトおよび2種類以上例えば、2種類または3種類またはそれより多くの非ヒト動物に対して相補的とすることができる。本明細書に記載された方法は、ヒトに対するiRNA二重鎖剤の任意の生理学的効果、例えば、任意の望ましくない効果例えば、毒性効果、または任意の有益な、もしくは所望の効果と相関させるために使用することができる。iRNA調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療剤またはiRNAを安定化させる薬剤、例えば、iRNAと複合体を形成してiRNPを形成するタンパク質と組み合わせて配合することができる。さらに他の薬剤としては、キレート化剤、例えば、EDTA例えば、Mg2などの二価陽イオンを除去するため、塩、NRase阻害剤例えば、RNasin登録商標などの広い特異性のNRase阻害剤などが挙げられる。送達経路iRNAを含む組成物は種々の経路で対象に送達することができる。例示的な経路としては、静脈内経路、局所経路、経直腸経路、経肛門経路、経膣経路、経鼻経路、経肺経路、および経眼経路が挙げられる。本発明のiRNA分子は、投与に適した医薬組成物中に組み入れることができる。このような組成物は、典型的には、1種類以上のiRNAと薬学的に許容される担体とを含む。ここに用いたように、薬学的に許容される担体という用語は、医薬品の投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張な吸収遅延剤などを含むことが意図されている。薬学的活性のある物質としてこのような媒体および薬剤を使用することは、当技術分野で周知である。従来の媒体および薬剤がいずれも活性化合物に適合しない場合を除き、組成物に従来の媒体および薬剤を使用することが考えられる。また、補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。本発明の組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるかによって、かつ処置すべき領域によって、多くの方法で投与され得る。投与は、局所経眼、経膣、経直腸、経鼻、経皮を含む、経口、または非経口であってよい。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋肉内注射、または髄腔内投与もしくは脳室内投与が挙げられる。投与の経路および部位は標的化を増大させるように選択してもよい。例えば、筋細胞を標的とする場合、対象となる筋肉に筋肉内注射することは、論理的な選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態のiRNAを投与することによって標的とし得る。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをiRNAでコーティングし、機械的にDNAを導入することによって標的とすることができる。投薬量1つの態様では、本発明は、対象例えば、ヒトの対象に、iRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤を投与する方法を特徴とする。本方法は、単位用量のiRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤、例えば、二本鎖siRNA剤であって、a二本鎖部分が19~25ヌクレオチドnt長、例えば、21~23ntであり、b標的RNA例えば、内在性標的RNAまたは病原体標的RNAに相補的であり、かつ必要に応じてc少なくとも1つの1~5ヌクレオチド長の3’突出部を含むものを投与することを含む。1つの実施の形態では、単位用量は、体重1kg当たり1.4mg未満、または体重1kg当たり10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、もしくは0.00001mg未満、および体重1kg当たり200ナノモル未満のRNA剤例えば、約4.4×1016コピー、または体重1kg当たり1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015ナノモル未満のRNA剤である。規定量は、疾患または障害、例えば、標的RNAに関連する疾患または障害を、処置または予防するのに有効な量であり得る。単位用量は、例えば、注射例えば、静脈内または筋肉内、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。いくつかの実施の形態では、投薬量は、体重1kgあたり2、1、または0.1mg未満であってもよい。いくつかの実施の形態では、単位用量は、1日に1回未満の頻度、例えば、2、4、8または30日毎よりも低い頻度で投与される。別の実施の形態では、単位用量は、頻繁には投与されない例えば、規則正しい頻度では投与されない。例えば、単位用量は、単回で投与されてもよい。1つの実施の形態では、有効用量が他の従来の治療モダリティで投与される。1つの実施の形態では、対象はウイルス感染症であり、モダリティは、iRNA二重鎖剤例えば、siRNA剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施の形態では、対象はアテローム性動脈硬化症であり、有効用量のiRNA二重鎖剤例えば、siRNA剤が、組み合わせて、例えば、外科的介入例えば、血管形成術の後に投与される。1つの実施の形態では、対象に、初回用量および1回以上の維持用量のiRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤例えば、前駆体、例えば、siRNA剤へ処理され得るより大きなiRNA二重鎖剤、もしくはiRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤、またはその前駆体をコードするDNAを投与する。維持用量は、通常、初回用量よりも少ない例えば、初回用量より半分未満。維持投与計画は、対象を、1日に体重1kg当たり0.01μgから1.4mgの範囲、例えば、1日に体重1kg当たり10、1、0.1、0.01、0.001、または0.00001mgの用量で処置することを含む。維持用量は、例えば、5、10、または30日毎に1回しか投与されない。さらに、処置投与計画は、ある期間に亘り継続するが、その期間は、特定の疾患の性質、その重症度、および患者の全体的な状態によって変わる。ある実施の形態では、投薬は、1日に1回以下、例えば、24、36、48時間、またはそれを上回る時間に1回以下、例えば、5または8日毎に1回以下しか送達されなくてもよい。処置後、患者を、状態の変化および疾患状態の症状の緩和について、モニタすることができる。患者が現在の投薬量レベルに対してはっきりと応答しない場合、化合物の投薬量を増大させてもよいし、または疾患状態の症状の緩和が認められる場合、疾患状態が取り除かれている場合、もしくは望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。有効用量は、特定の状況下で所望されるか、または適切と考えられるように、単回投与でまたは2回以上の投与で投与することができる。繰り返しの注入または頻繁な注入を容易にすることが望ましい場合には、送達装置例えば、ポンプ、半永久ステント例えば、静脈内、腹腔内、嚢内、もしくは関節内またはリザーバを埋め込むことが望ましいことがある。1つの実施の形態では、前記組成物は、複数のiRNA二重鎖剤種を含む。別の実施の形態では、iRNA二重鎖剤種は、天然に存在する標的配列に関して別のiRNA二重鎖剤種と重複せずかつ隣接しない配列を有する。別の実施の形態では、複数のiRNA二重鎖剤種は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。別の実施の形態では、iRNA二重鎖剤は対立遺伝子特異的である。本願の発明者等は、ここに記載されたiRNA二重鎖剤を、哺乳類、特に、非ヒト霊長類またはヒトなどの大型の哺乳類に様々な様式で投与できることを発見した。1つの実施の形態において、iRNA二重鎖剤例えば、siRNA剤の組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内例えば、ボーラスとしてまたは拡散注入として、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔内、舌下、経内視鏡、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、尿道、または経眼で行われる。投与は、対象者によって、または別の人例えば、医療提供者によって行われ得る。医薬品は、一定用量で、または定量を送達するディスペンサー中に提供され得る。選択される送達様式については、以下により詳細に論じる。本発明は、本明細書に記載されたiRNA二重鎖剤を直腸投与または直腸送達するための方法、組成物およびキットを提供する。したがって、本明細書に記載されたiRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤例えば、前駆体、例えば、siRNA剤へ処理され得るより大きなiRNA二重鎖剤、またはiRNA二重鎖剤、例えば、siRNA剤、またはそれらの前駆体をコードするDNA、例えば、本明細書に記載された治療的有効量のiRNA二重鎖剤、例えば、40未満のヌクレオチド、例えば、30未満のヌクレオチドの二本鎖領域を有し、1つまたは2つの1~3ヌクレオチドの一本鎖3’突出部を有するiRNA二重鎖剤は、直腸投与例えば、直腸から下部大腸または上部大腸に導入することができる。この手法は、炎症性障害、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えば、ポリープまたは大腸癌を治療する際に、特に有用である。1つの態様において、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、該細胞に本発明のiRNA二重鎖剤を提供する工程を含む方法を提供する。1つの実施の形態では、標的遺伝子は、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ遺伝子、ErbB遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNAp21遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL2遺伝子、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT1遺伝子、βカテニン遺伝子、cMET遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIα遺伝子、p73遺伝子の突然変異、p21WAF1/CIP1遺伝子の突然変異、p27KIP1遺伝子の突然変異、PPM1D遺伝子の突然変異、RAS遺伝子の突然変異、カベオリンI遺伝子の突然変異、MIBI遺伝子の突然変異、MTAI遺伝子の突然変異、M68遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびp53腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される。本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例はさらに制限するものとみなされるべきではない。本明細書の全体を通じて引用された、参考文献、係属特許出願、および公開特許は全て、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。実施例1.炭水化物複合体構成ブロック110および112の合成101の調製:ガラクトサミンペンタアセテート100を、周囲温度でジクロロエタン300mL中に採取した。そこに、TMSOTf44.55g、200.44ミリモルを添加し、この混合物を50°Cで90分間、水浴中で撹拌し、加熱を停止し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を暗色の粘性物質44.50g、定量的として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。1HNMRとMALDIで生成物の形成を確認した。MS:C14H19NO8の計算値329.11;実測値352.1MNa。102の調製:化合物10143.70g、133.56ミリモルとベンジルエステル41.71g、200.34ミリモルをジクロロエタン300mLに溶解させ、そこに分子ふるい50gを添加し、30分間撹拌した。そこにTMSOTf14.50g、66.78ミリモルを添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー勾配溶出:20~100の酢酸エチル/ヘキサンで精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体60.50g、86として得た。1HNMR、13CNMRMS:C26H35NO11の計算値537.22;実測値560.21MNa。103の調製:化合物10260.00g、111.68ミリモルを、メタノール/酢酸エチルの混合物に溶解させ、アルゴンで脱気した。Pd/C6.00g、10質量、Degussa、ウェットタイプを添加し、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄し、高真空下で一晩乾燥させて、生成物48.85g、98を得た。1HNMR、13CNMRMS:C19H29NO11の計算値447.17;実測値469.9MNa。104の調製:化合物10142.30g、128.43ミリモルとアジドエタノール26g、192.45ミリモルをジクロロエタン300mLに溶解させ、そこに分子ふるい50gを添加し、30分間撹拌した。そこにTMSOTf14.29g、64.21ミリモルを添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。これを、氷冷した重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー勾配溶出:20~100の酢酸エチル/ヘキサン、次いで5~10のメタノール/酢酸エチルで精製して、所要の化合物を淡褐色の粘着性の液体59.23g、91.00として得た。1HNMR、13CNMRMS:C20H32N4O11の計算値504.21;実測値527.1MNa。105の調製:化合物1049.33g、18.50ミリモルをTHF100mLに溶解させ、そこにPPh35.97g、22.2ミリモルを添加し、混合物を48時間撹拌した。出発材料が完全に消失したことをTLCで確認した。水1mL、55ミリモルを添加し、さらに24時間撹拌した。TFA2.85mL、23.12ミリモルとトルエン40mLを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと2回共蒸発させ2×40mL、高真空下で乾燥させた。これを同日中に次の反応に使用した。MS:C20H34N2O11の計算値478.22;実測値500.8MNa。107の調製:化合物106JOC20026.94g、14.73ミリモルとモノbocプロピルアミン10.26g、58.89ミリモルをDMF100mLに溶解させ、そこにHBTU17.26g、45.50ミリモルとDIEA15.36mL、88.14ミリモルを添加し、一晩撹拌した。反応混合物を氷と水の混合物中に入れ、ジクロロメタンで抽出し、重炭酸ナトリウム溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー酢酸エチル、次いで2~10のMeOH/DCMで精製して、生成物を白色の綿毛状の固体10.49g、76として得た。MS:C45H77N7O14の計算値939.55;実測値940.53MH。108の調製:化合物1072.40g、2.56ミリモルをジクロロメタン10mLに溶解させ、そこにTFA/DCMの混合物1:4、10mLを添加し、30分間撹拌した。反応を質量スペクトルでモニタした。100mLのトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと2回共蒸発させ2×100mL、高真空下で乾燥させて、化合物をそのTFA塩白色の粘性物質、2.47g、99として得た。これを、さらに精製することなく、次の反応に使用した。MS:C30H53N7O8の計算値639.40;実測値640.45MH。109の調製:GalNAc酸1034.00g、8.99ミリモルをDMF50mLに溶解させ、そこにHBTU3.75g、9.88ミリモル、HOBt1.34g、9.88ミリモル、およびDIEA5mL、3.2当量を添加し、3~4分間撹拌した。そこに1082.47g、2.50ミリモルのDMF溶液を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。TLCで確認し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、重炭酸ナトリウム溶液50mL、水100mLで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー酢酸エチル、次いで勾配溶出5~15のMeOH/DCMで精製して、生成物109を白色の固体4.20g、87として得た。MS:C87H134N10O38の計算値1926.89;実測値1949.5MNa。110の調製:GalNAc誘導体1097.50g、4.18ミリモルを、アルゴンで脱気したメタノール50mL中に入れた。Pd/C0.800g、10質量Degussaタイプ、ウェットタイプと数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で一晩水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。TFA0.465mL、5.22ミリモルを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと共蒸発させ2回、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をTFA塩淡黄色の固体、7.30g、99として得た。MS:C79H128N10O36の計算値1792.85;実測値1815.9MNa。111の調製:トリカルボン酸1062.17g、4.625ミリモルとアミン18.50ミリモル、先の反応からの粗製物をDMF100mLに溶解させた。そこにTBTU5.34g、16.63ミリモル、HOBt2.24g、16.59ミリモル、およびDIEA5.64mL、32.36ミリモルを添加し、反応混合物を24時間撹拌した。24時間撹拌した後、追加量のDIEA4mLを添加し、撹拌を続けた。48時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタンに溶解させ、1Mのリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー酢酸エチル、次いで3~15のMeOH/DCMで精製して、所要の化合物111を白色の固体5.80g、68として得た。MS:C81H125N7O41の計算値1851.79;実測値1874.20MNa。112の調製:GalNAc誘導体1115.75g、3.09ミリモルを、アルゴンで脱気したメタノール100mL中に入れた。Pd/C0.600g、10質量Degussa、ウェットタイプと数滴の酢酸を添加し、混合物をバルーン圧下で36時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、メタノールで洗浄した。TFA0.354mL、1.25当量とトルエン30mLを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと共蒸発させ2回、高真空下で一晩乾燥させて、化合物をTFA塩5.70g、粗製物として得た。MS:C81H125N7O41の計算値1717.75;実測値1740.5MNa。実施例2.炭水化物複合体118の合成115の調製:ヒドロキシプロリンアミン3.00g、7.15ミリモルとドデカン二酸モノメチルエステル1.748g、7.15ミリモルをDMF50mL中に一緒に入れた。そこにHBTU3.25g、8.56ミリモルとDIEA3.7mL、21.24ミリモルを添加し、反応物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、DCMで抽出した。重炭酸溶液、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー50酢酸エチル/ヘキサン、酢酸エチル、次いで5のMeOH/DCMで溶出で精製して、所要の化合物115を白色の固体4.30g、93として得た。MS:C39H51NO7の計算値645.37;実測値646.35MH。116の調製:化合物1154.25g、6.58ミリモルをTHF/DCM/水の混合物50mL、2:1:1に溶解させた。LiOH1.90g、45.2ミリモルを添加し、混合物を一晩撹拌した。TLCで確認し、酢酸を添加して、反応混合物を中和した。溶媒を除去し、残留物をDCMで抽出した。このDCM溶液にTEA過剰を添加し、溶液を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、所要の生成物116をそのTEA塩4.15g、86として得た。MS:C38H49NO7の計算値631.35;実測値630.34M-H。117の調製:化合物1161.30g、2.06ミリモルとHBTU0.821g、1.05当量をDMF30mL中に一緒に採取した。そこにDIEA1.07ml、3当量を添加し、混合物を3~4分間撹拌した。アミン1103.00g、1.58ミリモルの溶液、次いで1当量のDIEAを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。残留物をDCMに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで5~20のMeOH/DCMで溶出で精製して、生成物117を白色の固体3.35g、88として得た。MS:C117H175N11O42の計算値2406.19;実測値2429.10MNa。固体担体118の調製:化合物1173.30g、1.37モル、無水コハク酸0.274g、2当量、およびDMAP0.501g、3当量をDCMに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのTEA塩としてのオフホワイトの固体3.81gとして得た。MS:C121H179N11O45の計算値2506.21;実測値2529.20MNa。コハク酸塩2.20g、0.877ミリモルとHBTU0.334g、0.877ミリモルをDMF100mLに溶解させた。そこにDIEA0.457mL、2.62ミリモルを添加し、反応物を3~4分間旋回させた。そこにポリスチレン担体12.30gを添加し、混合物を24時間振盪させた。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で2時間乾燥させた。これを25のAc2O/Py混合物で30分間キャッピングした。同じ洗浄/乾燥手順を繰り返して、固体担体11813.10g、50.5モル/gの装填量を得た。実施例3.炭水化物複合体122の合成119の調製:Z-アミノカプロン酸2.19g、8.25ミリモルをDMF50mLに溶解させた。そこにHBTU3.13g、8.25ミリモルとDIEA7.19mL、5.00当量を添加し、混合物を数分間撹拌した。GalNAcアミン11210.10g、5.52ミリモルを50mLのDMFに溶解させ、前記混合物に添加し、48時間撹拌した。生成物の形成についてTLCとMALDIを確認した。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、NaHCO3溶液と水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィー酢酸エチルによる溶出、次いで5~15のMeOH/DCMの勾配溶出で精製して、所要の化合物113をオフホワイトの固体6.20g、57として得た。MS:C87H136N8O42の計算値1964.88;実測値1987.75MNa。120の調製:化合物1196.10g、3.10ミリモルをメタノール50mLに溶解させ、そこに1mLの酢酸を添加した。反応混合物を脱気し、そこにPd/C0.700g、10質量Degussa、ウェットタイプを添加し、バルーン圧下で36時間水素化した。反応混合物を小型のセライトパッドに通して濾過し、MeOHで洗浄した。そこに1.25当量のTFAとトルエン50mLを添加し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をトルエンと2回共蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させて、所要の化合物をオフホワイトの固体6.10g、定量的として得た。この化合物を、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。MS:C79H130N8O40の計算値1830.84;実測値1853.81MNa。121の調製:化合物1165.06g、6.90ミリモル、GalNAcアミン11210.55g、5.756ミリモル、TBTU2.44g、1.1当量、およびHOBt1.025g、1.1当量をDMF100mL中に一緒に採取した。そこにDIEA6mL、34.51ミリモルを添加し、混合物を48時間撹拌した。反応をTCLとMALDIでモニタした。溶媒を減圧下で除去した。残留物をDCMに溶解させ、重炭酸と水で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで3~10のMeOH/DCMで溶出で精製して、生成物121をオフホワイトの固体10.50g、79として得た。MS:C111H166N8O45の計算値2331.09;実測値2354.03MNa。122の調製:化合物1212.00g、0.857ミリモル、無水コハク酸0.186g、2当量、DMAP0.314g、3当量をDCM中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残渣を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのTEA塩として得る。コハク酸塩2.00g、0.857ミリモルとHBTU0.325g、0.857ミリモルをDMF100mLに溶解させる。そこにDIEA0.450mL、2.57ミリモルを添加し、反応物をを3~4分間旋回させる。そこにポリスチレン担体10.00gを添加し、混合物を24時間振盪させる。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体122を得る。実施例4.炭水化物複合体128の合成125の調製:アミン1232.75g、4.61ミリモルとヘキサン二酸モノエチル0.886g、5.09ミリモルをDMF50mLに溶解させた。そこにHBTU2.09g、5.51ミリモルとDIEA2.88mL、16.53ミリモルを添加し、反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、DCMで抽出し、重炭酸溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー50のEtOAc/ヘキサン、EtOAc、次いで5~10のMeOH/DCMで溶出で精製して、所要の生成物を綿毛状の白色の固体2.25g、65として得た。MS:C40H52N2O8S2の計算値752.32;実測値753.31MNa。126の調製:化合物1252.20g、2.97ミリモルをTHF/水の混合物20mL、2:1に溶解させた。LiOH0.187g、4.45ミリモルを添加し、混合物を4時間撹拌した。反応をTLCでモニタし、4時間後に冷却し、クエン酸を添加して、反応混合物の反応を停止させた。溶媒を除去し、残留物をDCMで抽出し、水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィーEtOAc、3~20のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物1260.750g、35をそのTEA塩として得た。MS:C38H48N2O8S2の計算値724.29;実測値723.28M-H。127の調製:化合物1261.008g、1.390ミリモル、1101.904g、1.007ミリモル、およびHBTU0.400g、1.054ミリモルをDMF20mLに溶解させた。そこにDIEA0.525mL、3当量を添加し、反応物を2日間撹拌した。反応混合物をTLCとMALDIでモニタした。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで3~15のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体1.90g、76として得た。MS:C117H174N12O43S2の計算値2499.12;実測値2522.12MNa。固体担体128の調製:化合物1272.00g、0.800ミリモル、無水コハク酸0.160g、2当量、DMAP0.300g、3当量をDCM中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのTEA塩として得る。化合物1272.00g、0.769ミリモルとHBTU0.290g、0.769ミリモルをDMF100mLに溶解させる。そこにDIEA0.500mL、3ミリモルを添加し、反応物を3~4分間旋回させる。そこにポリスチレン担体10.00gを添加し、混合物を24時間振盪させる。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体128を得る。実施例5.炭水化物複合体136の合成131の調製:マンノーストリクロロアセトイミデート12915.00g、20.24ミリモルとアジドアルコール4.25g、1.2当量をトルエンに溶解させ、2回共沸させた。残留物を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル30mLと分子ふるい10gを添加した。反応混合物を氷水浴中で冷却した。そこにTMSOTf0.5mL、0.1当量を添加し、混合物を10分間撹拌した。反応をTLCでモニタし、TEAで反応停止させた。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィー20~50のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物を無色の液体8.36g、55として得た。MS:C40H39N3O12の計算値753.25;実測値776.23MNa。132の調製:化合物1318.30g、11.01ミリモルを無水THF70mLに溶解させ、そこにPPh33.46g、1.2当量を添加し、混合物を周囲温度で2日間撹拌した。そこに水1mLを添加し、混合物をさらに24時間撹拌した。反応をTLCでモニタした。そこにトリフルロ酢酸1.06mL、1.25当量とトルエン50mLを添加した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をトルエンと2回共蒸発させ、高真空下で乾燥させた。これを、さらに精製することなく、そのまま次の反応に使用した。MS:C40H41NO12の計算値727.26;実測値750.23MNa。133の調製:トリカルボン酸11.05g、23.45ミリモルとアミン68.19g、94ミリモル、先の反応からの粗製物をDMF200mLに溶解させた。そこにTBTU27.09g、84ミリモル、HOBt11.34g、84ミリモル、およびDIEA28mL、160ミリモルを添加し、反応混合物を24時間撹拌した。24時間撹拌した後、追加量のDIEA28mLを添加し、撹拌を続けた。48時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタンに溶解させ、1Mのリン酸溶液、重炭酸ナトリウム溶液、および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー酢酸エチル、次いで3~15のMeOH/DCMで精製して、所要の化合物133を白色の固体41.95g、67として得た。MS:C141H146N4O44の計算値2598.93;実測値2621.89MNa。134の調製:化合物1333.05g、1.176ミリモルをDCM/MeOHの混合物に溶解させた。そこに50当量のギ酸アンモニウム、次いでの5のPd/C1.5g、50質量を添加し、周囲温度で8時間撹拌した。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、MeOH/DCMで洗浄し、溶媒を除去し、残留物を高真空下で一晩乾燥させて、化合物を白色の固体2.65g、92として得た。MS:C133H140N4O42の計算値2464.89;実測値2487.92MNa。135の調製:マンノースアミン2.076g、0.842ミリモル、1160.740g、1.00ミリモル、およびTBTU0.0.353g、1.1当量、およびHOBt0.149g、1.1当量をDMF30mLに溶解させた。そこにDIEA0.0.869mL、5当量を添加し、反応物を2日間撹拌した。反応混合物をTLCとMALDIでモニタした。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで2~4のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物を綿毛状のオフホワイトの固体1.48g、57.MS:C71H187N5O48の計算値3078.23;実測値3101.25MNa。固体担体136の調製:化合物1172.10g、0.681ミリモル、無水コハク酸0.136g、2当量、およびDMAP0.249g、3当量をDCMに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのTEA塩としてのオフホワイトの固体1.56gとして得た。MS:C175H191N5O51の計算値2506.21;3178.25;実測値3201.20MNa。コハク酸塩1.00g、0.305ミリモルとHBTU0.138g、1.2当量をDMF100mLに溶解させた。そこにDIEA0.50mL、過剰を添加し、反応物を3~4分間旋回させた。そこにポリスチレン担体6.05gを添加し、混合物を24時間振盪させた。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で2時間乾燥させた。これを25のAc2O/Py混合物で30分間キャッピングした。同じ洗浄/乾燥手順を繰り返して、固体担体1366.70g、42マイクロモル/g装填量を得た。実施例6.炭水化物複合体143の合成138の調製:マンノーストリクロロアセトイミデート12915.23g、20.55ミリモルと1374.36g、1.02当量をトルエンに溶解させ、2回共沸させた。残留物を高真空下で一晩乾燥させた。そこに無水ジエチルエーテル30mLと分子ふるい10gを添加した。反応混合物を氷水浴中で冷却した。そこにTMSOTf0.5mL、0.1当量を添加し、混合物を10分間撹拌した。反応をTLCでモニタし、TEAで反応停止させた。分子ふるいを濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をクロマトグラフィーヘキサン、15~25のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物を無色の液体14.52g、90として得た。MS:C46H42O12の計算値786.27;実測値809.25MNa。139の調製:マンノースベンジルエステル14.30g、18.17ミリモルを酢酸エチル100mLに溶解させ、そこに2滴の酢酸を添加した。脱気し、Pd/C1.50g、10質量Degussaウェットタイプを添加し、バルーン圧下で24時間水素化した。反応をTLCとMALDIでモニタした。これを小型のセライトパッドに通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を除去し、残留物を高真空下で乾燥させて、化合物を無色のオイル11.20g、90として得た。MS:C39H36O12の計算値696.22;実測値719.18MNa。141の調製:ヒドロキシプロリンアミン1403.82g、7.18ミリモル、1415.00g、7.18ミリモル、およびHBTU2.65g、7.18ミリモルをDMF50mLに溶解させた。そこにDIEA3.65mL、5当量を添加し、反応物を3時間撹拌した。反応混合物をTLCでモニタした。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、水と重炭酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。その後、これをクロマトグラフィーまず、酢酸エチル、次いで5~10のMeOH/EtOAcで精製して、所要の生成物を白色の固体4.08g、46として得た。MS:C71H74N2O16の計算値1210.50;実測値1233.40MNa。固体担体143の調製:化合物1412.00g、1.652ミリモル、無水コハク酸0.330g、2当量、DMAP0.604g、3当量をDCM中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのTEA塩142として得る。コハク酸塩2.00g、1.526ミリモルとHBTU0.578g、1.526ミリモルをDMF100mLに溶解させる。そこにDIEA1.32mL、5当量を添加し、反応物を3~4分間旋回させる。そこにポリスチレン担体10.00gを添加し、混合物を24時間振盪させる。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄し、これを無水酢酸でキャッピングして、固体担体143を得る。実施例7.炭水化物複合体152の合成146の調製:化合物14426.55g、64.06ミリモルと14510.00g、53.43ミリモルをDMF150mLに溶解させた。そこにHBTU24.12g、64ミリモルとDIEA46mL、5当量を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。TLCで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー20~50の酢酸エチル/ヘキサンで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体23.20g、74として得た。MS.C32H45N3O7のMW計算値:583.72、実測値584.73MH。147の調製:化合物1463.30g、5.65ミリモルを酢酸エチル/MeOHの混合物に溶解させ、Pd/C500mgを触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。MS.C16H33N3O3のMW計算値:315.25、実測値316.26MH。148の調製:化合物1475.65ミリモルとGalNAc酸1035.81g、12.99ミリモルをDMF80mLに溶解させた。そこにHBTU4.97g、13.10ミリモルとDIEA7.00mL,3当量を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、水とブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィーEtOAc、次いで3~10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体5.25g、79として得た。MS.C54H87N5O23のMW計算値:1173.58、実測値1196.60MNa。149の調製:二分岐のGalNAc誘導体1485.15g、4.40ミリモルを15mLの無水DCMに溶解させ、そこに3mLのアニソールと30mLのTFAを添加し、この反応混合物を周囲温度で2時間撹拌した。TLCで確認し、反応混合物にトルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。トルエンと2回共蒸発させ、残留物をDCMに溶解させ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗生成物を濾過カラム10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物を薄茶色の固体4.40g、91として得た。MS.C50H79N5O23のMW計算値:1117.52、実測値1140.62MNa。150の調製:二分岐のGalNAc酸1494.30g、3.84ミリモルとヒドロキシプロリンアミン1532.25g、1.1当量をDMF50mLに溶解させた。そこにHBTU1.46g、3.84ミリモルとDIEA3.3mLを添加し、反応混合物を3時間撹拌した。溶媒を除去し、残留物をDCMに溶解させ、水と重炭酸で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー3~10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物を白色の固体3.25g、52として得た。MS.C82H117N7O27のMW計算値:1631.80、実測値1654.45MNa。151の調製:化合物1503.30g、2.02ミリモル、無水コハク酸0.404g、2当量、DMAP0.740g、3当量をDCM30mL中に一緒に採取し、一晩撹拌する。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩をそのTEA塩151として得る。MS.C86H121N7O30のMW計算値:1731.82、実測値1753.87MNa。固体担体152の調製:コハク酸塩1512.02ミリモルとHBTU0.842g、1.1当量をDMF100mLに溶解させた。そこにDIEA1.50mL、過剰を添加し、反応物を3~4分間旋回させた。そこにポリスチレン担体28gを添加し、混合物を一晩振盪させた。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で2時間乾燥させた。これを25のAc2O/Py混合物で30分間キャッピングした。同じ洗浄/乾燥手順を繰り返して固体担体15230.10g、30マイクロモル/g装填量を得た。実施例8.炭水化物複合体161の合成155の調製:ヒドロキシプロリンアミン15310.00g、18.76ミリモルと1544.98g、18.76ミリモルをDMF100mLに溶解させた。そこにHBTU7.83g、20.64ミリモルとDIEA9.81mL、56.29ミリモルを添加し、反応物を2時間撹拌した。TLCで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー0~15のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体13.20g、90として得た。MS.C46H57N3O8のMW計算値:779.41、実測値780.42MH。156の調製:化合物15513.00g、16.66ミリモルを酢酸エチル/MeOHの混合物に溶解させ、少量のトリエチルアミンの存在下、Pd/C1.50gを触媒として用いて、バルーン圧下で一晩水素化した。小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した9.93g、92。MS.C38H51N3O6のMW計算値:645.38、実測値646.40MH。157の調製:化合物1569.90g、15.33ミリモルとジCbzリシン6.36g、15.33ミリモルをDMF100mLに溶解させた。そこにHBTU6.11g、15.33ミリモルとDIEA8mL、過剰を添加し、反応物を2時間撹拌した。TLCで確認し、混合物を氷冷水に添加し、エーテルと酢酸エチルの混合物で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィー0~10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体13.10g、83として得た。MS.C60H75N5O11のMW計算値:1041.55、実測値1042.57MH。158の調製:化合物15712.90g、12.37ミリモルを酢酸エチル/MeOHの混合物に溶解させ、Pd/C1.30gを触媒として用いて、バルーン圧下で水素化した。3時間後にTLCで確認し、小型のセライトパッドに通して濾過し、溶媒を除去し、この生成物を、さらに精製することなく、次の反応に使用した。MS.C44H63N5O7のMW計算値:773.47、実測値774.50MH。160の調製:化合物1582.32g、3ミリモルとグルコース酸1594.50g6.45ミリモルをDMF60mLに溶解させた。そこにHBTU2.44g、6.45ミリモルとDIEA3.36mL、3当量を添加し、反応物を2時間撹拌し、反応混合物を氷冷水中に入れ、EtOAc/DCMで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィーEtOAc、次いで0~10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体5.40g、85として得た。MS.C122H131N5O29のMW計算値:2129.89、実測値2152.90MNa。固体担体161の調製:化合物1605.20g、2.44ミリモル、無水コハク酸0.488g、2当量、およびDMAP0.894g、3当量をDCMに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのTEA塩としてのオフホワイトの固体として得た。MS:C126H135N5O32のMW計算値:2229.91、実測値2252.50MNa。コハク酸塩2.44ミリモルとHBTU0.925g、1.2当量をDMF200mLに溶解させた。そこにDIEA1.27mL、過剰を添加し、反応物を3~4分間旋回させた。そこにポリスチレン担体24gを添加し、混合物を24時間振盪させた。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で2時間乾燥させた。これを25のAc2O/Py混合物で30分間キャッピングした。同じ洗浄/乾燥手順を繰り返して、固体担体16127g、31マイクロモル/g装填量を得た。実施例9.炭水化物複合体165および166の合成163の調製:化合物1585.40g、6.97ミリモルとマンノース酸1399.96g14.30ミリモルをDMF100mLに溶解させた。そこにHBTU5.42g、14.30ミリモルとDIEA7.45mL、過剰を添加し、反応物を2時間撹拌し、反応混合物を氷冷水に注ぎ、EtOAc/DCMで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、粗生成物をクロマトグラフィーEtOAc、次いで2~10のMeOH/DCMで精製して、所要の生成物をオフホワイトの固体9.20g、62として得た。MS.C122H131N5O29のMW計算値:2129.89、実測値2152.65MNa。固体担体165の調製:化合物1633.20g、1.408ミリモル、無水コハク酸0.2835g、2当量、およびDMAP0.516g、3当量をDCMに溶解させ、一晩撹拌した。反応混合物をDCMで希釈し、水と冷えた希釈クエン酸溶液で洗浄した。DCM層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。残留物を小型のシリカゲルパッドに通して濾過して、コハク酸塩を、そのTEA塩としてのオフホワイトの固体として得た。MS:C126H135N5O32のMW計算値:2229.91、実測値2252.90MNa。コハク酸塩1.408ミリモルとHBTU0.640g、1.2当量をDMF200mLに溶解させた。そこにDIEA1.22mL、過剰を添加し、反応物を3~4分間旋回させた。そこにポリスチレン担体20gを添加し、混合物を24時間振盪させた。フリットに通して濾過し、DCM、10のMeOH/DCM、DCM、およびエーテルで洗浄した。固体担体を真空下で2時間乾燥させた。これを25のAc2O/Py混合物で30分間キャッピングした。同じ洗浄/乾燥手順を繰り返して、固体担体16123.2g、54.7マイクロモル/g装填量を得た。166の調製:化合物1634.01g、1.88ミリモルをDCM50mLに溶解させ、DIEA0.65mL、3.75ミリモルを添加した。この混合物にアミダイト試薬0.629mL、2.822ミリモルを添加し、反応混合物を15分間撹拌した。TLCで確認し、反応混合物を分液漏斗に移し、水と重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。粗生成物をクロマトグラフィー30~80のアセトン/DCMで精製して、生成物4.20g、96を得た。31PNMRCDCl3、400MHzδ=148.19、147.79、147.33。MS.C131H148N7O30PのMW計算値:2330.00、実測値2353.20MNa。実施例10.炭水化物複合体構成ブロックの合成171、172、173、および174の合成:構成ブロック171と172は、103の合成手順と同様の手順を用いて合成する。構成ブロック173と174は、105の合成手順と同様の手順を用いて合成する。180の合成:構成ブロック180は、110の合成手順と同様の手順を用いて合成する。構成ブロック188の合成:実施例11.炭水化物複合体の合成構成ブロック180をアミン183、185および188と結合させて、それぞれ、炭水化物複合体189、190および191を提供する。201の調製:マンノース10.00g、55.53ミリモルとデシノール100g、溶媒とCSA500mgを110°Cで、油浴で一晩撹拌した。デシノールの色は一晩で濃い茶色になった。デシノールの大部分を減圧下で完全蒸留した。残留物をDCMに溶解させ、TEAで中和した。この溶液を水で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物を小型のシリカゲルパッドによる濾過初めに酢酸エチル、次に10~15のMeOH/DCMで精製して、生成物7.52g、42を得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=5.90~5.75m,1H,5.02~4.85m,2H,4.00~3.30m,7H,2.10~1.94m,2H,1.60~1.49m,2H,1.41~1.20m,12H。203の調製:化合物2010.172g、0.541ミリモルをアルゴン雰囲気下で無水DCM10mLに溶解させた。そこにMSを添加し、反応物を氷浴中で冷却した。BF3Et2O10μlを反応混合物に撹拌しながら転化した。ガラクトーストリクロロアセトイミデート2021.00g.1.35ミリモルを15分かけて滴下して添加した。反応をTLCでモニタし、アクセプターがなくなった時点で、反応物をTEAで反応停止させ、DCMで希釈し、MSを濾過で除去し、乾燥させた。残留物をクロマトグラフィー勾配溶出10~40のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物を白色の綿毛状の固体0.550g、69として得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=7.95~7.20m,40H,5.90~5.50m,7H,5.35d,J=8.05Hz,1H,5.17d,J=8.06Hz,1H,4.98~4.81m,3H,4.65~4.09m,9H,3.81~3.42m,5H,3.20bs,1H,2.79bs,1H,2.01~1.88m,2H,1.30~0.92m,12H。13CNMRCDCl3、100MHzδ=166.28,166.20,165.88,165.76,165.66,165.64,165.40,139.34,134.04,133.82,133.71,133.66,133.42,133.30,130.21,129.99,129.86,129.70,129.59,129.28,129.03,129.00,128.94,128.77,128.73,128.63,128.61,128.54,128.47,128.44,114.37,102.74,102.68,98.81,85.27,72.43,71.96,71.37,71.31,71.01,70.30,70.26,70.05,68.31,68.23,67.41,66.11,62.63,62.08,33.96,29.65,29.58,29.53,29.58,29.08,26.20。MS.C84H82O24について計算された分子量、計算値1474.52、実測値1497.60MNa。204の調製:化合物2030.104g、0.07ミリモルをDCM/Py10mL、1:1とAc2O0.5mL、過剰とDMAP0.050gの混合物に溶解させ、反応物を一晩撹拌した。反応物をMeOHで反応停止し、溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー勾配溶出10~30のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物を白色の綿毛状の固体0.108g、99として得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=8.10~7.20m,40H,5.99dd,J=3.1,7.8Hz,2H,5.88~5.75m,2H,5.70dd,J=7.82,10.43Hz,1H,5.65~5.47m,2H,5.10~4.07m,13H,3.90~3.80m,1H,3.69~3.61m,1H,3.36~3.28m,1H,2.98~2.81m,1H,2.08s,3H,2.10~2.01m,4H,1.35s,3H,1.42~1.20m,12H。13CNMRCDCl3、100MHzδ=170.12,170.08,166.16,165.67,165.64,165.48,165.46,164.78,139.29,133.80,133.70,133.70,133.54,133.44,133.41,133.35,130.13,130.02,129.92,129.69,129.58,129.49,129.40,129.15,129.10,128.88,128.83,128.79,128.73,128.66,128.47,128.40,114.35,102.32,99.58,96.64,74.51,72.11,71.91,71.46,71.21,69.78,69.72,69.51,69.28,68.19,68.03,67.82,67.12,61.97,61.83,33.94,29.63,29.61,29.55,29.49,29.27,29.20,29.05,26.11,21.06,20.02。MS:C88H86O26について計算された分子量、計算値1558.54、実測値1581.8MNa。205の調製:化合物2051.36g、0.873ミリモルをジオキサン:水の混合物40mL、3:1に溶解させた。反応混合物に、ルチジン0.203mL、2当量、次いでOsO4溶液1mL。0.05Mのtブタノール溶液を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム0.774g、4当量を添加し、室温で4時間撹拌した。反応をTLCでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、DCM3回で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を全て除去し、残留物を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残留物をDMF20mLに溶解させ、そこにオキソン0.590g、1.05当量を添加し、周囲温度で3時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、2mLの1MのHClを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー勾配抽出0~40のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物を白色の固体1.08g、79として得た。1HNMRDMSO-d6、400MHzδ=11.96s,1H,8.00~7.23m,40H,5.85d,J=3.41Hz,1H,5.82d,J=3.17Hz,1H,5.79~5.63m,2H,5.56dd,J=8.00,10.01Hz,1H,5.41dd,J=8.00,10.01Hz,1H,5.25d,J=7.8Hz,1H,5.15d,J=7.8Hz,1H,4.90~4.35m,7H,4.10~3.55m,4H,3.30~3.20m,1H,2.96~2.87m,1H,2.18~2.10m,2H,1.96s,3H,2.01~1.95m,1H,1.51~1.39m,2H,1.27s,3H,1.20~1.01m,12H。13CNMRCDCl3、100MHzδ=178.68,178.48,170.26,170.16,166.25,165.78,165.73,165.70,165.54,165.53,164.83,133.85,133.75,133.60,133.49,130.18,130.08,128.85,129.61,129.52,129.44,129.20,129.13,128.91,128.89,128.81.128.78,128.71,128.51,128.45,102.34,99.67,96.65,74.60,72.17,71.94,71.49,71.21,69.82,69.79,69.59,69.37,68.22,68.11,67.81,67.20,64.55,61.99,61.85,60.59,44.06,33.96,30.79,29.39,29.31,29.24,29.20,29.17,29.08,26.08,24.85,24.79,22.20,21.24,21.11,20.07。MS:C87H84O28について計算された分子量、計算値1576.51、実測値1599.50MNa。206の調製:化合物2050.850g、0.539ミリモル、ヒドロキシプロリンアミン0.300g、0.563ミリモル、およびHBTU0.265g、0.698ミリモルをアルゴン雰囲気下でDMFに溶解させた。そこにDIEA0.281mL、3当量を添加し、周囲温度で3時間撹拌した。反応をTLCでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで勾配溶出3~10のMeOH/DCMで精製して、生成物を淡黄色の固体1.09g、96として得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=8.00~7.10m,53H,6.90~6.80m,4H,5.85d,J=3.41Hz,1H,5.82d,J=3.17Hz,1H,5.79~5.63m,2H,5.56dd,J=8.00,10.01Hz,1H,5.41dd,J=8.00,10.01Hz,1H,5.25d,J=7.8Hz,1H,5.15d,J=7.8Hz,1H,4.97d,J=4.15Hz,1H,4.90~4.80m,3H,4.70~4.30m,7H,4.20~4.00m,2H,3.95~3.85m,2H,3.70s,6H,3.69~3.50m,1H,3.30~3.20m,2H,2.96~2.87m,1H,2.18~2.10m,2H,1.96s,3H,2.01~1.95m,1H,1.51~1.39m,2H,1.27s,3H,1.20~1.01m,20H。13CNMRCDCl3,100MHzδ=171.87,170.85,169.46,169.04,165.25,165.21,165.09,164.95,164.48,164.53,162.29,158.09,157.97,145.08,135.87,135.73,134.04,133.74,133.56,129.60,129.18,129.06,128.91,128.84,128.81,128.75,128.67,128.63,128.52,128.41,127.77,127.58,113.19,113.09,102.30,99.60,96.60,85.10,75.68,71.48,70.02,69.81,68.99,68.58,66.55,61.86,6=54.96,45.74,38.27,36.32,35.76,35.46,34.15,30.74,28.69,26.20,25.34,26.20,25.34,24.15,20.48,19.54。MS:C119H122N2O32について計算された分子量、計算値2090.80、実測値2013.90MNa。長いアルキル鎖CPG207の調製:ヒドロキシ誘導体2060.550g、0.263ミリモルをDCM10mLに溶解させ、そこに無水コハク酸0.078g、3当量とDMAP0.128g、4当量を添加し、一晩撹拌した。TLCによって反応が完了したことが示された。反応混合物をDCM20mLで希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し2回、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。PPh30.90g、1.3当量、DMAP0.048g、1.5当量、および前工程からのコハク酸塩を、アセトニトリルとDCMの混合物6mLに溶解させた。上記の溶液にDTNP0.086g、1.05当量のDCM1mL溶液を添加した。混合物を3~4分間ゆっくりと振盪させた。長鎖アルキルアミン-CPGlcaaCPG、1.40g、133マイクロモル/gを混合物に添加し、2時間穏やかに振盪させた。CPGを濾過し、濾液が無色の状態である間、DCM、MeOH/DCM1:9の混合物、およびDCMで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したCPGを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、TEA1mLの存在下、ピリジン25中のAc2Oで15分間処理した。最後に、CPGを濾過し、DCM、DCM:MeOH9:1、次いでDCM、およびエーテルで洗浄した。CPG207を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りに装填量を測定した1.48g、装填量36マイクロモル/g。化合物217は、報告されている手順に従って合成したMartinCKarenPLaurenceVChemPharmBull200452965971。218の調製:1-デシノール0.300g、1.92ミリモルとトリクロロアセトイミデート2172.33g、1.2当量をアルゴン雰囲気下で無水DCM10mLに溶解させた。そこにMSを添加し、反応物を氷浴で冷却した。BF3Et2O30μlを反応混合物に撹拌しながら添加した。反応をTLCでモニタし、受容体が反応し終わったら、反応物をTEAで反応停止させ、DCMで希釈し、MSを濾過により除去し、乾燥させた。残留物をクロマトグラフィー勾配溶出10~40のEtOAc/ヘキサンにより精製して、化合物を白色の綿毛状の固体2.01g、86として得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=7.80~8.12m,10H,7.60~7.78m,4H,7.18~7.60m,21H,6.20~6.05m,2H,5.60~5.91m,5H,5.10~5.43m,3H,3.80~5.02m,7H,3.403.56m,1H,1.952.10m,4H,1.00~1.60m,11H。13CNMRCDCl3、100MHzδ=169.89,166.51,166.40,166.35,166.32,166.24,166.10,166.03,165.99,165.96,165.86,165.61,165.46,166.38,165.34,165.27,165.23,163.68,139.36,133.71,133.67,133.56,133.40,133.27,133.21,130.12,130.05,129.98,129.95,129.92,129.88,129.80,129.77,129.73,129.68,129.62,129.55,129.50,129.47,129.41,129.40,129.29,129.14,129.11,129.03,128.96,128.87,128.84,128.83,128.78,128.76,128.63,128.56,128.54,128.48,128.37,128.26,114.33,114.26,100.92,100.84,97.04,96.52,75.36,75.17,74.84,73.37,72.95,72.90,72.81,72.57,72.507,71.94,71.58,71.05,70.37,70.27,70.19,70.06,69.86,69.24,69.19,69.02,63.71,63.56,63.20,62.93,62.69,33.96,33.91,32.93,29.60,29.53,29.50,29.46,29.42,29.33,29.30,29.22,29.14,29.06,29.00。MS.C71H68O18について計算された分子量、計算値1208.44、実測値1231.4MNa。219の調製:化合物2187.26g、6ミリモルをジオキサン:水の混合物100mL、3:1に溶解させた。反応混合物に、ルチジン0.7mL、2当量を、次いでOsO4溶液5mL、0.05Mのtブタノール溶液を添加した。過ヨウ素酸ナトリウム5.11g、4当量を添加し、室温で4時間撹拌した。反応をTLCでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を水で希釈し、DCMで抽出し3回、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を全て除去し、残留物を次の反応に直接使用した。上記の反応からの残留物をDMF60mLに溶解させ、そこにオキソン3.86g、1.05当量を添加し、そして周囲温度で3時間撹拌した。出発材料が消費された時点で、10mLの1MのHClを添加し、酢酸エチルで希釈した。水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィー勾配溶出20~40のEtOAc/ヘキサンで精製して、化合物219を白色の固体5.50g、75として得た。1HNMRDMSO-d6、400MHzδ=12.00bs,1H,8.42~7.10m,35H,6.10~4.5m,13H,4.20~3.30m,3H,2.20~2.03m,3H,1.50~0.811H。13CNMRDMSO-d6、100MHzδ=174.55,174.51,169.13,165.59,165.52,165.39,165.27,165.24,165.14,164.99,164.88,164.75,164.70,164.66,164.60,164.54,164.50,162.92,165.59,165.51,165.39,165.27,165.24,165.14,164.99,164.88,164.75,164.70,164.60,164.54,164.50,133.80,133.71,133.58,133.42,133.29,133.15,129.88,129.42,129.36,129.29,129.23,129.20,129.12,129.07,129.05,129.03,128.91,128.88,128.72,128.59,128.48,128.38,99.96,99.29,99.22,95.96,95.64,95.22,93.10,75.61,74.86,74.57,74.37,74.15,73.59,73.14,72.58,71.46,71.15,70.48,70.31,70.09,69.97,69.00,68.87,68.22,67.81,63.65,62.49,60.73,59.76,43.01,33.68,33.62,32.54,28.84,28.82,28.61,28.55,28.47,28.40,25.47,25.21,24.52,24.43,20.45。MS.C70H66O20について計算された分子量、計算値1226.41、実測値1249.4MNa。220の調製:化合物2191.65g、1.37ミリモル、ヒドロキシプロリンアミン0.945g、1.3当量、およびHBTU0.623g、1.64ミリモルをアルゴン雰囲気下でDMFに溶解させた。そこにDIEA0.71mL、3当量を添加し、周囲温度で3時間撹拌した。反応をTLCでモニタし、出発材料が消費された時点で、混合物を氷水混合物中に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残留物をクロマトグラフィーまず酢酸エチル、次いで勾配溶出3~10のMeOH/EtOAcで精製して、生成物220を淡黄色の固体1.55g、65として得た。1HNMRDMSO-d6、400MHzδ=8.20~7.32m,35H,7.32~7.10m,9H,6.90~6.82m,4H,6.00~5.63m,4H,5.41~5.37m,1H,5.20~5.03m,2H,4.98d,J=4.15Hz,1H,4.90d,J=4.15Hz,1H,4.88~4.05m,9H,3.70s,6H,3.65~2.93m,10H,2.20~0.80m,22H。13CNMRDMSO-d6、100MHzδ=171.81,170.94,170.90,170.84,165.56,165.53,165.49,165.19,165.12,164.87,164.72,164.63,164.58,164.46,158.09,158.03,157.96,145.08,144.74,135.87,135.73,135.48,135.42,133.80,133.57,133.42,133.29,129.60,129.55,129.26,129.20,129.04,129.00,128.87,128.74,128.69,128.59,128.36,128.34,128.27,128.02,127.86,127.77,127.57,126.74,126.56,113.19,113.09,99.26,95.94,85.77,85.10,74.83,73.58,72.55,71.43,70.44,70.07,69.01,68.87,68.58,68.19,67.45,65.19,63.29,63.48,63.33,62.47,59.75,55.59,54.99,54.96,53.44,44.56,38.21,36.30,35.76,35.41,34.15,32.52,30.74,30.15,29.09,28.84,28.66,28.56,28.52,26.18,25.27,25.22,24.54,24.14.21.22,20.75,20.71,18.59,14.07,13.54。MS.C102H104N2O24について計算された分子量、計算値1740.70、実測値1263.7MNa。長いアルキル鎖CPG221の調製:ヒドロキシ誘導体2201.50g、0.862ミリモルをDCM20mLに溶解させ、そこに無水コハク酸0.174g、2当量とDMAP0.316g、3当量を添加し、一晩撹拌した。TLCによって反応が完了したことが示された。反応混合物をDCM20mLで希釈し、冷えた希釈クエン酸溶液と水で連続的に洗浄し2回、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、高真空下で乾燥させて、コハク酸塩を得た。前工程からのコハク酸塩とHBTU0.392g、1.2当量をDMF30mLに溶解させた。そこにDIEA0.450mLを添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で5分間撹拌した。長鎖アルキルアミン-CPGlcaaCPG、5.30g、133マイクロモル/gを混合物に添加し、2時間穏やかに振盪させた。CPGを濾過し、DMF、DCM/MeOHの混合物、およびDCMで連続的に洗浄し、乾燥させた。乾燥したCPGを別のフラスコに移し、穏やかに振盪させながら、TEA1mLの存在下、ピリジン25中のAc2Oで15分間処理した。最後に、CPGを濾過し、DCM、DCM:MeOH9:1、次いでDCM、およびエーテルで洗浄した。CPG221を真空下で一晩乾燥させ、報告されている通りに装填量を測定した5.62g、装填量:42マイクロモル/g。ヒドロキシ誘導体2200.200g、0.115ミリモルを無水DCM5mLに溶解させ、そこにDIEA0.80mLとクロロアミダイト試薬0.068mLを添加し、一晩撹拌した。反応をTLCでモニタし、溶媒を減圧下で除去し、TEAで中和したシリカゲルカラムに直接充填した。まず2:1EtOAc/ヘキサン、次いでEtOAcで溶出して、生成物0.150g、67を得た。1HNMRCDCl3、400MHzδ=7.10~8.12m,48H,6.85~6.75m,4H6.10t,J=10.19Hz,1H,5.80~5.60m,3H,5.33~5.20m,2H,5.00~4.06m,12H,3.77s,6H,3.90~3.05m,16H,2.80~1.0127H。31PCDCl3、161MHzδ=145.83,145.41,144.95。MS.C111H121N4O25について計算された分子量、計算値1940.81、実測値1963.80MNa。実施例12.RNA合成および二重鎖アニーリング1.オリゴヌクレオチド合成:オリゴヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot合成機またはABI394合成機で合成された。別記されない限り、市販の制御多孔質ガラス固体担体dTCPG、500Å、PrimeSynthesis社製と、標準的な保護基を有するRNAホスホラミダイト、すなわち、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2-イソブチリル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイトPierceNucleicAcidsTechnologies社製を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。2’-Fホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトは、Promega社から購入した。10のTHF/ANCv/v中、0.2Mの濃度で使用したグアノシンを除いて、ホスホラミダイトは全て、アセトニトリルCH3CN中、0.2Mの濃度で使用した。16分の連結/再利用時間を使用した。活性剤は、5-エチルチオテトラゾール0.75M、AmericanInternationalChemicals社製であり、PO-酸化については、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化については、2,6-ルチジン/ACN1:1v/v中のPADS2を使用した。リガンドが結合した鎖を、対応するリガンドを含有する固体担体を用いて合成した。例えば、配列の3’-末端での炭水化物部分/リガンド例えば、GalNAcについての導入は、対応する炭水化物固体担体を用いて合成を開始することによって行った。同様に、3’-末端のコレステロール部分は、コレステロール担体上で合成を開始することによって導入した。一般に、リガンド部分を、先の実施例に記載されたような最適なテザーを介してトランス-4-ヒドロキシプロリノールに連結させて、ヒドロキシプロリノール-リガンド部分を得た。その後、ヒドロキシプロリノール-リガンド部分を、コハク酸トリンカーを介して固体担体と連結させるか、または標準的なホスフィチル化条件によってホスホラミダイトに転化し、所望の炭水化物複合体構成ブロックを得た。詳細については実施例1~11を参照されたい。フルオロフォア標識siRNAを、対応するホスホラミダイトまたは固体担体BiosearchTechnologies社から購入から合成した。オレイルリトコール酸GalNAc3ポリマー担体は、38.6マイクロモル/グラムの装填量で自家生産した。マンノースMan3ポリマー担体も、42.0マイクロモル/グラムの装填量で自家生産した。所望の位置での、例えば、配列の5’-末端での、最適なリガンドの結合は、別記されない限り、標準的なホスホラミダイト連結条件下で、対応するホスホラミダイトを、成長中の鎖に連結させることによって行った。固体に結合したオリゴヌクレオチドに対する、5エチルチオ-1H-テトラゾール活性剤の存在下でのホスホラミダイトの0.1M無水CH3CN溶液の延長15分の連結。報告されている通りに1標準的なヨウ素水を用いて、または結合したオリゴヌクレオチドの10分の酸化待ち時間を伴う、tert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水10:87:3を用いた処理によって、ヌクレオチド間ホスファイトからホスフェートへの酸化を行なった。ホスホロチオエートは、DDTTAMChemicals社から購入、PADS、および/またはボーケージ試薬などの硫黄転移試薬を用いて、ホスファイトからホスホロチオエートへの酸化によって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、自家合成し、ジクロロメタン中、0.1Mの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの連結時間は、16分であった。3’-コレステロール-3’-炭水化物を含有するオリゴヌクレオチドの合成を、コレステロールホスホラミダイトの、所望の炭水化物を担持する固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホラミダイトへの連結によって行った。第2のリガンドを含むまたは含まないPEG化オリゴヌクレオチドを、対応するPEG-NHSエステルのアミノ結合配列への合成後結合によって得た。アミノリンカーを、対応するトランス-4-ヒドロキシプロリノールに基づくアミノリンカーまたは市販のアミノリンカーを用いて、配列中の所望の位置に導入した。例えば、3’-PEG-3’-GalNAc含有オリゴヌクレオチドの合成を、トランス-4-ヒドロキシプロリノールアミノリンカーホスホラミダイトの、所望のGalNAcを担持する固体担体への連結と、それに続くヌクレオシドホスホラミダイトへの連結によって行った。こうして得られたオリゴヌクレオチドを、配列の性質に応じて、重炭酸ナトリウム緩衝液中、pH7.5~9での、PEG-NHSエステルとの合成後結合に供した。2.脱保護Iヌクレオ塩基脱保護合成が完了した後、担体を100mlのガラスビンVWRに移した。オリゴヌクレオチドを、80mLのエタノールアンモニアの混合物[アンモニア:エタノール3:1]を用いて、55°Cで6.5時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から開裂した。ビンを氷上で短時間冷却し、その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい250mLのビンに入れた。CPGを2×40mL部のエタノール/水1:1v/vで洗浄した。その後、ロータリーエバポレーターroto-vapで混合物の容量を約30mLにまで減らした。その後、混合物をドライアイス上で凍結させ、真空下、SpeedVacで乾燥させた。3.脱保護II2’TBDMS基の除去乾燥した残留物を26mlのトリエチルアミンとトリエチルアミン三フッ化水素酸塩TEA3HFまたはピリジン-HFとDMSO3:4:6に再懸濁し、60°Cで90分間加熱して、2’位のtertブチルジメチルシリルTBDMS基を除去した。その後、反応を50mlの20mMの酢酸ナトリウムで停止させ、pHを6.5に合わせ、精製するまでフリーザーで保存した。4.分析精製する前に、オリゴヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィーHPLCで分析した。緩衝液とカラムの選択は、配列および/または結合されるリガンドの性質によって決まる。5.炭水化物が結合したオリゴヌクレオチドのPEG化アミノリンカーで官能化されたオリゴヌクレオチドを、pH7.5と9.0の間の重炭酸ナトリウム緩衝液中で、所望の分子量のPEGNHSエステルで処理した。反応の進行は、HPLCでモニタした。反応が完了した後、PEG化オリゴヌクレオチドをHPLCで精製し、MSで分析した。6.HPLC精製リガンドが結合したオリゴヌクレオチドを逆相分取HPLCで精製した。結合されていないオリゴヌクレオチドを、自家で充填したTSKゲルカラムでの陰イオン交換HPLCで精製した。緩衝液は、10のCH3CN中の20mMのリン酸ナトリウムpH8.5緩衝液Aと10のCH3CN、1MのNaBr中の20mMリン酸ナトリウムpH8.5緩衝液Bであった。全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥させた。約0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で150μlに希釈し、その後、CGEとLC/MS分析用の特殊なバイアルにピペットで分注した。化合物は、最終的に、LCESMSとCGEで分析した。7.siRNA調製siRNAの調製のために、等モル量のセンス鎖とアンチセンス鎖を1×PBS中、95°Cで5分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷ませた。二重鎖の完全性は、HPLC分析で確認した。実施例13:apoBsiRNAへの様々な化学修飾によるインビトロ発現抑制活性各修飾siRNAに関するIC50を、Lipofectamine登録商標RNAiMAXを使用した標準的なリバーストランスフェクションによってHep3B細胞において決定した。手短に言えば、ウェル当たり0.5μLのLipofectamineRNAiMaxカリフォルニア州、カールスバッド所在のInvitrogen社製、カタログ番号13778-150に加えた10μLのOpti-MENと共に、96ウェルプレートに、ウェル当たり5μLのsiRNA二重鎖剤に5μLのOpti-MENを加え、室温で15~20分間インキュベーションすることによって、リバーストランスフェクションを行った。インキュベーション後、次いで、12,000~15,000のHep3B細胞を含有する、抗生物質を含まない100μLの完全増殖培地を各ウェルに添加した。細胞を、溶解とbDNAQuantigeneによるApoBおよびGAPDHmRNAの解析の前に、5のCO2雰囲気において37°Cで24時間インキュベーションした。10nMから0.6pMに及ぶ7種類の異なるsiRNA濃度を、IC50を決定するために評価し、ApoBトランスフェクト細胞に関するApoB/GAPDHを、10nMのLucsiRNAをトランスフェクトした細胞に正規化した。実施例14:親ad-3698siRNAに対する様々なモチーフを有するコレステロール-GalNAc3結合apoBsiRNAのインビボ発現抑制活性C57/BL6マウス5匹/群、8~10週齢、マサチューセッツ州所在のCharlesRiverLaboratoriesにおけるApoB-Chol/GalNAc3siRNAの静脈内ボーラス投与を、10μl/gの用量容積で27G針を使用した少量尾静脈注射によって行った。一回100mg/kgの用量を投与し、48時間後にマウスを殺した。肝臓を採取し、液体窒素で瞬間冷凍し、その後、-80°Cで保存した。bDNA解析:6850Freezer/MillCryogenicGrinderSPEXCentriPrep,Inc社製を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を-80°Cで保存した。プロトコルに従って、分岐DNA技術をベースとしたQuantiGene1.0ReagentSystem米国、カリフォルニア州、フレモント所在のPanomicsを用いて、ApoBとGAPDHのmRNAレベルを検出した。10~20mgの凍結した肝臓の粉末を、1000ulの0.3ug/mlプロテイナーゼKEpicentre,MPRK092を含む組織/細胞溶解溶液Epicentre,MTC096H中、65°Cで40分間溶解させた。その後、10ulの溶解産物を90ulの溶解作用試薬2容積の水に1容積の溶解混合原液に添加し、マウスApoBおよびマウスGAPDHに特異的なプローブセットを含むPanomics捕捉プレート米国所在のPanomics上で、55°Cで一晩インキュベーションした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターVictor2-LightPerkinElmer社製で相対光単位RLUとして読み取った。肝臓溶解産物におけるApoBmRNA対GAPDHmRNAの比を、各処置群について平均化し、PBSで処置した対照群と比較した。結果:図2に示されるように、親AD-3698siRNAと比較して、コレステロール-GalNAc3が結合したsiRNAAD-27818を有する交互モチーフによる処置は、ApoB転写物レベルの低下PBS対照群に対して正規化したときに、より小さいApoB対GAPDH転写物比で示される、約65対約40をもたらし、コレステロール-GalNAc3が結合したsiRNAを有する交互モチーフが、優れたノックダウンを有することを示した。実施例15:マウスPK研究プロトコル:マウスに、静脈注射または皮下注射により10ul/gの用量容積時点当たりn=2で100mg/kgのsiRNA複合体を投与した。下記の表に示された各時点で、2匹のマウスを殺し、血液を、肝門静脈を通じて採血し、K2EDTA被覆管に採取し、反転により混合し、濡れた氷上に置いた。次いで、この動物を生理食塩水で潅流し、肝臓を採取し、液体窒素で瞬間凍結した。血液を、採血直後の遠心分離4°Cで10分間の2,000gにより血漿に処理した。血漿サンプルを赤血球から分離し、-80°Cで保存するために、エッペンドルフ登録商標チューブに分取した。6850Freezer/MillCryogenicGrinderSPEXCentriPrep,Inc社製を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を-80°Cで保存した。Attoprobeアッセイを使用して、肝臓組織1g当たりかつ血漿mL当たりのsiRNAの量を計量した。図3は、7日目までの持続性発現抑制に関するAD-27818のSCおよびIV投与について同様のレベルの発現抑制を示す。約65のApoBが、AD-27818GalNAc3のSC投与の96時間後に発現抑制する。実施例16:親AD-3698siRNAに対する、様々なモチーフを有するコレステロール-GalNAc3結合PTENsiRNAのインビボ発現抑制活性C57/BL6マウス5匹/群、8~10週齢、マサチューセッツ州所在のCharlesRiverLaboratoriesにおけるPTEN-Chol/GalNAc3siRNAの静脈内ボーラス投与を、10μl/gの用量容積で27G針を使用した少量尾静脈注射によって行った。マウスに一回100、75、50または25mg/kgの用量を静脈投与し、そのマウスを48時間後に殺した。肝臓を採取し、液体窒素で瞬間冷凍し、その後、-80°Cで保存した。bDNA解析:6850Freezer/MillCryogenicGrinderSPEXCentriPrep,Inc社製を用いて、凍結した肝臓をすり潰し、解析するまで粉末を-80°Cで保存した。プロトコルに従って、分岐DNA技術をベースとしたQuantiGene2.0ReagentSystem米国、カリフォルニア州、フレモント所在のPanomicsを用いて、PTENとGAPDHのmRNAレベルを検出した。10~20mgの凍結した肝臓の粉末を、1000ulの0.3ug/mlプロテイナーゼKEpicentre,MPRK092を含む組織/細胞溶解溶液Epicentre,MTC096H中に65°Cで40分間溶解させた。その後、10ulの溶解産物を90ulの溶解作用試薬2容積の水に1容積の溶解混合原液に添加し、マウスPTENおよびマウスGAPDHに特異的なプローブセットを含むPanomics捕捉プレート米国所在のPanomics上で、55°Cで一晩インキュベーションした。その後、プロトコルに従って、捕捉プレートにシグナルの増幅と検出のための処理を施し、化学発光を、マイクロプレートルミノメーターVictor2-LightPerkinElmer社製で相対光単位RLUとして読み取った。肝臓溶解産物におけるPTENmRNA対GAPDHmRNAの比を、各処置群について平均化し、PBSで処置した対照群と比較した。結果:図4に示されるように、コレステロール-GalNAc3が結合したPTENsiRNAを有する交互モチーフによる処置は、PTEN転写物レベルの低下PBS対照群に対して正規化したときに、より小さいPTEN対GAPDH転写物比で示されるをもたらし、コレステロール-GalNAc3が結合したsiRNAを有する交互モチーフが、優れたノックダウンを有することを示した。最良のPTEN-Chol/GalNAc3複合体は、最良の対応するApoB複合体と類似のインビボにおける有効性を示すことが分かり、その複合体と組み合わされたモチーフは配列に依存しないことを示唆している。"