対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を投与する段階;標識されたアミノ酸を、対象のタンパク質中に取り込ませる段階;異なる時点で対象から組織試料を採取する段階;および採取した組織試料を解析する段階であって、存在する同位体のレベルを測定する段階を含む、方法。解析する段階が、タンパク質の物理的特性に基づいてタンパク質を分離すること;および所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出することを含む、請求項1記載の方法。アミノ酸を15Nで標識し、かつさらに、組織試料を数日間にわたって採取する、請求項1記載の方法。投与する段階を、対象に組成物を食べさせることにより行う、請求項3記載の方法。組織試料を、毎日またはそれより長い間隔で採取する、請求項1記載の方法。物理的特性が、タンパク質サイズ、タンパク質形状、タンパク質サイズおよび形状の組み合わせ、ならびに等電点からなる群より選択される、請求項2記載の方法。標識されたアミノ酸を、対象における複数の異なるタンパク質中に取り込ませ、かつ、解析する段階が、対象の異なる組織において異なるタンパク質を追跡することを含む、請求項2記載の方法。解析する段階が、対象の多数の異なる組織において単一のタンパク質を追跡することをさらに含む、請求項1記載の方法。解析する段階が、第1のタイプの組織中に存在する同位体の、第2のタイプの組織に対する割合を測定することを含む、請求項1記載の方法。対象がマウスである、請求項2記載の方法。対象がヒトであり、かつ、採取する組織試料が血液試料である、請求項3記載の方法。解析する段階が、タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階;ならびに所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階を含む、請求項1記載の方法。単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し;かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項1記載の方法。以下の段階を含む、タンパク質代謝回転に対する薬物の影響を試験する方法:実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階;試験動物を、第1の群および第2の群に分ける段階:薬物を第1の群に投与するが、第2の群には薬物を投与しない段階;標識されたアミノ酸を、第1の群および第2の群における動物のタンパク質中に取り込ませる段階;第1の群および第2の群の動物から組織試料を採取する段階;第1の群および第2の群由来の組織試料を解析する段階であって、組織試料における同位体のレベルを測定する段階;ならびに薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する影響を測定するために、第1の群由来の試料における同位体のレベルを、第2の群の試料における同位体のレベルと比較する段階。第1の試験動物の群および第2の試験動物の群が、2匹またはそれより多い動物を各々含み、かつさらに、2またはそれより多い異なる時点で各群の動物から組織を採取する、請求項14記載の方法。試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、請求項14記載の方法。解析する段階が、タンパク質サイズに基づいてタンパク質を分離する段階;ならびに所与のサイズのタンパク質を質量分析に供し、同位体標識されたアミノ酸の同位体を検出する段階を含む、請求項14記載の方法。解析する段階が、タンパク質サイズ、または等電点を含むがそれに限定されないような他の物理的特性に基づいて、タンパク質を分離する段階;ならびに所与のサイズのタンパク質を、該タンパク質における同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する段階を含む、請求項14記載の方法。単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し;かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項14記載の方法。以下のための製剤の製造における、同位体標識されたアミノ酸の使用:対象に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される製剤を投与すること;標識されたアミノ酸を対象のタンパク質中に取り込ませること;異なる時点で対象から組織試料を採取すること;および存在する同位体のレベルを測定するために、採取した組織試料を解析すること。タンパク質が、タンパク質分離を可能にする異なる物理的特性を有し;かつタンパク質を、同位体標識されたアミノ酸の同位体が検出され得るように質量分析に供し得る、請求項20記載の使用。アミノ酸が15Nで標識されており、かつさらに、使用が組織試料を数日間にわたって採取することを可能にする、請求項20記載の使用。組成物が、経口で消費可能であることを特徴とする、請求項22記載の使用。組織試料が、毎日またはそれより長い間隔で採取され得ることを特徴とする、請求項20記載の使用。物理的特性がタンパク質サイズである、請求項21記載の使用。物理的特性がタンパク質サイズおよび形状である、請求項21記載の使用。物理的特性が等電点である、請求項20記載の使用。単離したタンパク質を、トリプシンなどの酵素での部分的タンパク質分解性分解に供し;かつ、該タンパク質分解性消化のペプチド断片を、該ペプチドにおける同位体標識の量およびパターンの測定のために質量分析法に供する、請求項20記載の使用。試験動物がマウスであり、かつ、アミノ酸が15Nで標識されている、請求項23記載の方法。発明の詳細な説明治療用の標的を同定するための本アッセイ方法論および同一物を使用する方法が記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイおよび方法に限定されず、従って当然変動してもよいことが、理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語法は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、かつ限定的であるようには意図されないこともまた、理解されるべきである。値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り下限の単位の十分の一までの各介在値もまた、具体的に開示されることが、理解される。任意の規定された値または規定された範囲における介在値と、任意の他の規定された値またはその規定された範囲における介在値との間の各々のより小さい範囲が、本発明内に包含される。規定された範囲における任意の具体的に除外された限界に応じて、これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれてもよく、または除外されてもよく、かつ、より小さい範囲にいずれかの限界が含まれるか、いずれも含まれないか、または両方とも含まれる各範囲もまた、本発明内に包含される。規定された範囲が、一つまたは両方の限界を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料が、次に記載される。本明細書において言及されるすべての刊行物は、該刊行物が引用されるものに関連して方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。本開示は、矛盾が存在する程度まで組み入れられる刊行物の任意の開示に取って代わることが、理解される。本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形である一つの、ある、およびそのは、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り、複数の指示対象を含むことが注目されなければならない。従って、例えば、標識への言及は、複数のそのような標識を含み、動物対象への言及は、1種または複数の、言及されたタイプの動物、および当業者に公知であるその同等物への言及を含む、などである。本明細書において議論される刊行物は、本出願の出願日より前の開示について単に提供されるだけである。本発明における何も、先行発明のために本発明がそのような刊行物に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。発明全般方法は、図1の流れ図に示すように、生物の食餌に同位体標識されたアミノ酸の補給物全体を導入する段階からなる。該同位体標識されたアミノ酸は、15N、13C、2H、または18Oを含むがそれらに限定されない、成分化学的構成要素の安定同位体を含有し得る。いくつかの態様において、飽和濃度の該同位体標識されたアミノ酸を、図1に示すマウスなどの試験対象に食べさせる。生物図1においてマウスとして示すが、ヒトを含む別の生き物であり得るの代謝が、最大パーセンテージの同位体標識例えば、15Nを新たに合成されるタンパク質中に取り込むことを確実にするのに十分な期間にわたって、給餌を継続する。あるいは、飽和濃度未満の同位体標識されたアミノ酸を試験対象に食べさせるが、食べさせる濃度は、十分な同位体標識例えば、15Nを新たに合成されるタンパク質中に取り込ませ、質量分析法または当技術分野において公知である他の方法による測定を可能にするのに十分である。飽和レベルは、対象におけるすべてのタンパク質の25、50、75、90、99、またはそれより多くであり得る。組織試料を、24、48、72、96時間毎を含む任意の間隔であり得る、異なる時点で採取する。異なる時に取得した組織試料を解析することにより、生物内の任意のタンパク質中への同位体の取り込みを測定する。試験対象は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、またはネコを含むがそれらに限定されない、任意の動物であり得る。マウスから取得した3種の異なるタイプの試料の例を、図2A、2B、および2Cに示す。タンパク質を試料から抽出し、ゲルを用いてタンパク質分離を行う。この標識方法論を質量分析と連結させて、インビボでのタンパク質代謝回転の速度を測定する。脳2A、肝臓2B、および血液2Cにおいて約2500個のタンパク質の代謝回転速度を測定でき、本開示を読んだ当業者は、本技術が20000個より多い異なるタンパク質についてタンパク質代謝回転速度を測定できることを理解するであろう。種々の態様において、本発明の方法は、単一の試料由来の、1、2、3、4、5、10、50、100、1000、2000、5000、10000、20000個、またはそれより多くのタンパク質を測定することができる。本方法論は、任意の生物において使用することができ、かつ、トランスジェニックマウスなどのインビボ疾患モデルと共に使用することができる。本発明は、プロテオーム動力学に対する生理活性薬物の作用を測定するのに有用である。投与前後のタンパク質代謝回転の速度を比較することにより、治療の標的とする作用および毒性作用を測定することが可能になる。方法はまた、新規の薬物標的を同定するために使用することができる。疾患モデルにおけるプロテオーム動力学の解析により、その調節不全が疾患をもたらすか、または疾患により引き起こされるタンパク質を同定することが可能になる。そのように、本明細書において開示される技術は、神経変性障害を含む多くの疾患において特徴となるプロテオーム動力学における変化を研究するための堅牢な方法論を提供する。方法は、疾患の活性、重症度、もしくは予後をモニタリングするため、または疾患を有する患者の管理のために使用することができる。疾患を有する患者におけるプロテオーム動力学の解析は、評定、処置、および医学的管理のための測定基準またはバイオマーカーを提供することができる。現在のプロテオーム技術は、定常状態のタンパク質濃度を測定できるだけであり、タンパク質動力学を測定することはできない。動力学の重要性は、発生および疾患の調査において決定的であるHellersteinMKNewstableisotopemassspectrometrictechniquesformeasuringfluxesthroughintactmetabolicpathwaysinmammaliansystemsintroductionofmovingpicturesintofunctionalgenomicsandbiochemicalphenotypingMetabEng685100。タンパク質代謝回転の測定についての大部分の以前の方法は、標的タンパク質の大規模な精製後に個々のタンパク質を測定できるだけであったNikolovENDinevaBBDabevaMDandNikolovTKTurnoverofribosomalproteinsinregeneratingratliverafterpartialhepatectomyIntJBiochem19159163;VerzijlNDeGrootJThorpeSRBankRAShawJNLyonsTJBijlsmaJWLafeberFPBaynesJWandTeKoppeleJMEffectofcollagenturnoverontheaccumulationofadvancedglycationendproductsJBiolChem2753902739031。多数のタンパク質の代謝回転を同時に測定するために以前に開示された方法は、単一のアミノ酸標識例えば、15Nリジン、13Cロイシン、2Hロイシンの投与に基づいている。これらの方法はすべて、部分的に、以前の方法で達成される同位体標識のはるかにより低い程度のために、本明細書において開示される方法と比較して測定される代謝回転速度の感度および精度を低下させる、技術的限界を有する。理論により束縛されること無く、タンパク質においてまたはタンパク質に由来するペプチドにおいて個々の標識されたアミノ酸で達成される同位体標識は、すべてのアミノ酸が同位体標識される時に達成されるものほど広範囲に及ばないため、新たに合成される標識されたタンパク質と以前より存在する標識されていないタンパク質との間の区別は、以前の方法でははるかにより難しい。本明細書に開示および説明される方法論は、何千もの個々のタンパク質の代謝回転を、個々のタンパク質の精製無しで同時に測定することを可能にする。薬物投与の間のプロテオーム動力学の測定は、プロテオームに対する薬物の作用を評定することを可能にすると考えられる。合成または分解における代償性変化のために、薬物の投与は、その標的タンパク質の全体的な濃度を動揺させない可能性がある。従って、タンパク質濃度をモニタリングする現在の方法は、プロテオーム恒常性に対する薬物の作用を評価することができない。本明細書に開示および説明される方法論の2番目の重要な特徴は、生きている動物において実施できることである。以前には、何百ものタンパク質についてのタンパク質動力学の多くの測定が、細胞培養において実施されてきた。しかしながら、本発明の方法論は、このアプローチを、複雑な生物およびより関連性のある疾患モデルへ広げる。本発明の方法の特定の態様を行うために、15N無機塩を使用して、スピルリナの培養用の培養液を作製する。図1の流れ図に示すように、乾燥した15N標識された藻類を使用して、マウスの食餌中のタンパク質を供給する。種々の態様において、15N、13C、2H、または18Oを含むがそれらに限定されない、1種または複数の同位体標識を使用することができる。いくつかの態様において、同位体標識は、1個または複数の異なるアミノ酸に取り込まれ、異なる同位体標識された組成物を作製することができる。いくつかの態様において、同位体標識された組成物は、摂食させることができ、例えば、固体もしくは液体形態において消費させることができ、試験対象中に注射または注入することができる。他の態様において、同位体標識された組成物は、移植可能な装置を介して送達することができる。種々の態様において、1種または複数の同位体標識された組成物は、同時にまたは連続的に送達することができ、かつ、1種または複数の以前に記載された送達の経路摂食、注入などを介して送達することができる。いくつかの態様において、同位体標識された組成物は、既知の量で試験対象に送達することができる。いくつかの例において、これは、試験対象から取得した試料における同位体標識の量を定めるために有用であり得る。相対的な量の解析、または同位体標識の有無を測定する場合など、いくつかの例においては、同位体標識の量は、既知である必要はない。図1に示す経時的に組織を採取する段階において示されるように、指定された時点で試料を取得する。組織試料は任意の時間に取得することができ、手頃な時間は、4日毎に1回である。取り出した組織試料を均質化し、1DSDSPAGEゲルにおいて分子量に従って分画する。ゲル内消化により、ペプチドをゲルから遊離させる。遊離したペプチドを、次に、LCMSMSにより解析する。標識されたペプチドの分子量における変化および相対的な集団を、プロテオーム全体にわたるバイオインフォマティクス解析において比較する。新たに合成されるタンパク質に関して解析から得られるデータを測定し、脳2A、肝臓2B、および血液2Cの各々について個々のタンパク質の結果を、図2A、2B、および2Cに示す。組織特異的タンパク質の各々のタイプについて列挙する。さらに、図2A、2B、および2Cの右端に、タンパク質の総数を示す。タンパク質代謝回転に対する薬物の作用の試験本発明のアッセイ方法論は、タンパク質代謝回転に対する薬物の作用を試験する方法において使用することができる。実質的に同一の試験動物の群に、複数の同位体標識されたアミノ酸から構成される組成物を食べさせる段階により、方法を行う。図1に示すように、動物に、有機塩および15N標識を含む、同位体標識された藻類食物源を食べさせてもよい。飽和濃度のアミノ酸を提供して、生物の代謝が、最大パーセンテージの同位体標識を新たに合成されるタンパク質中に取り込むことを確実にするために、十分な量の食物を動物に食べさせる。郡内の動物は、すべて実質的に同一であり、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物であってもよい。試験動物を、第1の群および第2の群に分ける。試験する薬学的に活性を有する薬物を第1の群に投与し、第2の群には薬物を投与しない。薬物は、給餌の前、間、または後に投与してもよい。一つの態様において、同位体標識された食物での給餌が開始する際に、薬物を投与する。同位体標識が、第1の群および第2の群の両方において動物のタンパク質中に取り込まれるように、十分な時間を経過させる。この期間は、数時間から数日、数週間、またはそれより長くまで変動し得る。一般に、給餌は、数日間にわたって継続すると考えられる。この時間中に、組織試料を動物から採取することができる。一つの態様において、組織試料のすべてを、動物のすべてから実質的に同一の時間に取得する。採取を2回またはそれより多い回数繰り返し、採取は実質的に同一の期間中に動物のすべてで行う。組織試料を採取した後、必要な場合は、それらを均質化し、解析に供してもよい。解析は、第1の群の試験動物および第2の群の試験動物の両方において試料組織中に存在する同位体のレベルを測定する段階を含む。解析を行って、試料中に存在する同位体のレベルを測定する。試料は、動物の各々の単一のタイプの組織由来であってもよいし、またはいくつかの異なるタイプの組織由来であってもよい。いったん解析が完了し、かつ特定の組織タイプにおける同位体のレベルを測定すると、第1の群の動物において測定した同位体レベルを、第2の群の動物における同位体レベルと比較する。この比較によって、もしあれば、試験薬物により引き起こされるタンパク質代謝回転に対する作用を測定することが可能になり、その作用を、組織の特定のタンパク質において見ることができる。定義プロテオームという用語は、ゲノム、細胞、組織、または生物により発現されるタンパク質のセット全体を指す。プロテオームとは、所与のタイプの細胞または生物において所与の時間に定義された条件の下で発現されるタンパク質のセットである。特定のタイプの組織の細胞についてのプロテオームが、同一の生物由来の異なるタイプの組織の細胞のプロテオームとは異なることを、当業者は理解するであろう。特に真核生物においてプロテオームがゲノムより大きく、生物において遺伝子が存在する際により多くのタンパク質が存在することを示すことを、当業者はまた理解するであろう。これは、遺伝子の選択的スプライシング、ならびに、グリコシル化およびリン酸化などの翻訳後修飾による。プロテオームが、ゲノムには欠如している少なくとも2種のレベルの複雑性を有することを、当業者は理解するであろう。ゲノムがヌクレオチドの配列に画定される時、プロテオームは、存在するタンパク質の配列の総数に限定され得ない。プロテオームの情報は、1プロテオームにおけるタンパク質の構造、および2タンパク質間の機能的相互作用の情報を必要とする。同位体標識という用語は、システムを通して試料物質の通過を追跡するための任意の技術を指す。物質は、その化学組成中に同位体を取り込むことにより標識される。同位体は、15N、または当業者により使用される他の同位体、例えば、13C、14C、40K、および水素同位体、ならびにそれらの組み合わせであってもよい。標識された同位体は、少なくとも2種の異なる方法において検出され得る。同位体は、異なる質量を有する。従って、異なる同位体、特に当業者により安定同位体と呼ばれるものの組成物内の存在は、質量分析法を用いて分離することができる。同位体を含有する分子はまた、同位体を含有しないものとは異なる振動モードを有する。従って、これらの異なる振動モードを、赤外分光分析を用いて検出することができる。安定同位体の他の特徴磁気スピンなどを、当技術分野において公知である方法により例えば、核磁気共鳴により検出することができる。データ解析提供されるデータは、質量シフトにおけるバーストを示し、食餌性藻類由来の局所的プールにおける15N標識されたアミノ酸の急速な増加を示す。最初の増加は、肝臓および血液におけるよりも脳において低く、食餌性アミノ酸の輸送を反映する。15N標識されたアミノ酸は、脳に到達する前に、血液に入り、かつ、消化管および肝臓を含む多数の組織を横切る。多数の組織を通る連続的な流動により、局所的脳プール中へ流入するより前に、局所的な代謝および異化過程を通して14N標識されたアミノ酸の導入が可能になる。従って、脳において、局所的脳プールの15N標識の最初のバーストは、上流組織と比較して低下している。質量シフトの2番目のより緩徐な相は、異化および代謝過程を通したアミノ酸の再循環に対応する。換言すると、内部タンパク質の分解により、15N標識されたアミノ酸の食餌による供給は常に希釈される。アミノ酸プールの完全な標識が達成され得る前に、14Nを含有するタンパク質の内部プールを、完全に枯渇させる必要がある。脳において、持続性の再循環相は、肝臓および血液と比較してより緩徐である。脳タンパク質が、肝臓および血液タンパク質と比較して相対的に長命であり、長期の再循環相をもたらすと仮定すると、この結果が期待される。このモデルを洗練するために、これらの種々の組織における遊離アミノ酸濃縮動態のさらなる解析を使用することができるであろう。定常状態のタンパク質レベルは、それら自体では、代謝回転速度を予測しない。タンパク質の静的レベルは、合成および分解速度の相対比により確立されるが、その寿命は、これらの速度の大きさにより決定される。この観念は、本発明者らのデータにより支持される。トリプシンペプチドのプロテオーム解析において、タンパク質の相対的な定常状態レベルは、そのタンパク質から期待されるペプチドの理論的な数に対する観察可能なペプチドの比により大雑把に概算することができる[ProteinAbundanceIndex]37。本発明者らのデータ内では、代謝回転速度とPAIとの間に有意な相関は無く図10Aおよび10B、同様の存在度を有するタンパク質が、広範な代謝回転速度を有し得ることを示唆する。本発明者らのデータは、タンパク質代謝回転が、組織、細胞小器官、およびタンパク質複合体のレベルで調節されていることを示唆する。代謝回転の速度は、一般に、血液および肝臓と比較して脳においてより遅い。脳におけるバルクタンパク質代謝回転の相対的に遅い速度が、以前に観察されている1821。本発明者らは、これが、単に脳に独自に発現している安定なタンパク質の存在のためだけではなく、3種の組織間で共有されているタンパク質が、脳においてより長い、すなわち2~5倍の半減期を有するためであることを示す。ラットにおいて、1グラムの肝臓当たりの器官特異的代謝速度が、脳の相当する量よりも5倍大きいと概算されていることは、興味深いことである38。該観察は、これらの2種の組織の代謝速度における差異が、主として、プロテオーム代謝回転に対するエネルギー関与における差異のためであり得ることを示唆する。本発明者らは、特定の細胞小器官に局在化するタンパク質の代謝回転速度中で、統計学的に有意な類似性を観察する。ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリアDNAによりコードされていようとまたは核DNAによりコードされていようと、図7に示すように同様の代謝回転速度を有する。ミトコンドリアタンパク質および核タンパク質は、細胞質タンパク質より長い半減期を有する傾向にあり、細胞質タンパク質は、次に、小胞体のタンパク質より安定である。いくつかの細胞小器官について、この協調的代謝回転は、分解の主要経路としての自食作用を反映する可能性がある。自食作用を通した単位としてのミトコンドリアの代謝回転マイトファジーは、細胞におけるミトコンドリア調節の主要な方法であることが公知である3940。ミトコンドリアタンパク質の寿命は、肝臓および脳の間で変動し、異なる組織特異的マイトファジー速度を示唆するものである。多くのタンパク質複合体について、構成サブユニットの代謝回転速度は、小さな範囲内に入る。脳および肝臓における20Sプロテアソームコア複合体は、狭い範囲の代謝回転速度を有する。多数の20Sサブタイプが、細胞および組織中に存在することが示唆されている41が、本発明者らのデータは、代替的なプロテアソーム組成物がまれであるか、または標準的なコア複合体と同一の寿命を有するかのいずれかであることを示唆する。リボソームおよびプロテアソームなどの、豊富な多タンパク質複合体の合成は、細胞にとって考慮すべきエネルギー投資に相当する。これらの複合体の協調的代謝回転は、オーファンサブユニットの存在を回避するための細胞によるエネルギー保存戦略に相当する可能性がある。例えば、タンパク質およびRNAリボソームサブユニット中の代謝回転の調節が、以前に確証された20。本発明者らは、Cop9シグナロソーム複合体CNSなどの少数の複合体について、広範な代謝回転速度を観察した。CNSは、特定の発生過程に関連するユビキチンプロテアソーム分解経路の調節された成分である42。変動するサブユニット組成および活性を有する別個のCNS集団が、同定されている43。本発明者らのデータは、これらの観察と一致して、別個の半減期を有する多数のCNS集団の存在を示唆する。培養したHeLa細胞の最近の解析は、約600個のタンパク質の代謝回転速度を測定することに成功した22。本発明者らは、これらのうち、約150個の相同なマウスタンパク質を、本発明者らのインビボデータセットにおいて少なくとも1種の組織について見出した。データの比較により、培養物における代謝回転速度とマウスにおける代謝回転速度との間にほとんど相関が無いことが明らかになる図10B。実際に、培養物において測定した代謝回転速度は、インビボの測定値よりも有意に速かった。この変動性は、形質転換された細胞株の継続的に増殖する性質のためである可能性がある。分化した細胞とは異なり、分裂する細胞株は、新たに生成する娘細胞に供給するために継続的なタンパク質産生を必要としている。肝細胞の増殖を通して起こる肝重の再生は、見かけのタンパク質半減期を低下させることが示された20。さらに、恐らくインビボでタンパク質代謝回転を調節する機構のいくつか例えば、自食作用、組織再生は培養物中に存在しないため、HeLa細胞における半減期の範囲は、対応するインビボでの測定値よりもはるかに広いように見られる。これらの結果は、インビボのプロテオーム恒常性のモデルとしての培養細胞株の限界を強調する。低い存在度のタンパク質の将来の動態解析は、確立されている精製技術を用いた組織ホモジェネートの分画により行うことができる。タンパク質代謝回転の測定を定量的プロテオーム戦略と組み合わせる将来の研究により、プロテオーム全体にわたる規模で絶対的なタンパク質分解速度を確立することが可能になるであろう。本研究は、標識された食餌を実験設計中に組み入れることができる任意のモデル生物および環境条件において、インビボのタンパク質代謝回転のプロテオーム全体にわたる解析を実施するために必要な方法論および理論的枠組みを提供する。該アプローチは、特に、タンパク質代謝回転が正常な機能に不可欠であり3233、かつミスフォールディングされたタンパク質凝集物の蓄積が神経変性疾患の主要な特性である4445脳において、プロテオーム恒常性と関心対象の生物学的表現型との間の関係を解析するために、一般に有用であると考えられる。分光測定法単離されたペプチドの配列およびタンパク質の同定は、MASCOTMatrixScienceLtdUKPerkinsDNetalProbabilitybasedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydataElectrophoresis2035513567またはSEQUEST商標UniversityofWashingtonSeattleWashなどの、タンデム質量分析法およびコンピューター支援データベース検索プログラムの組み合わせにより、決定することができるMcCormackALetalDirectAnalysisandIdentificationofProteinsinMixturesbyLCMSMSandDatabaseSearchingattheLowFemtomoleLevelAnalChem69767776;EngJKetalAnApproachtoCorrelateTandemMassSpectralDataofPeptideswithAminoAcidSequencesinaProteinDatabaseJAmerSocMassSpectrom5976989;米国特許第5538897号YatesIIIら。MASCOTおよびSEQUESTは両方とも、すべての公知のゲノム配列を利用し、すべての可能な理論的CIDスペクトルを計算し、かつ、マッチおよび配列同定のためにそれらを実験的CIDスペクトルと比較し、それらのすべては参照により本明細書に組み入れられる。以下の参照文献は、タンパク質の同定への質量分析技術の応用、特にプロテオーム解析に関連するものに関し、それらのすべては参照により本明細書に組み入れられる:IdekerTThorssonVRanishJAChristmasRBuhlerJEngJKBungarnerRGoodlettDRAebersoldRHoodLIntegratedgenomicandproteomicanalysesofasystematicallyperturbedmetabolicnetworkScienceMay4200129292934;GygiSPAebersoldRMassspectrometryandproteomicsCurrOpinChemBiolOctober2000448994;GygiSPRistBAebersoldRMeasuringgeneexpressionbyquantitativeproteomeanalysisCurrOpinBiotechnolAugust200011396401;GoodlettDRBruceJEAndersonGARistBPasaTolicLFiehnOSmithRDAebersoldRProteinidentificationwithasingleaccuratemassofacysteinecontainingpeptideandconstraineddatabasesearchingAnalChemMar1520007211128;およびGoodlettDRAebersoldRWattsJDQuantitativeinvitrokinasereactionasaguideforphosphoproteinanalysisbymassspectrometryRapidCommunMassSpectrom2000143448;ZhouHetalNatureBiotechnol19375378。以下の実施例は、本発明を作成および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されないし、かつ、下記の実験が行われたすべてまたは唯一の実験であることを表すようには意図されない。使用する数例えば、量、温度などに関しては正確性を確保する努力を行っているが、いくつかの実験誤差および偏差が占めるはずである。別の方法で示さない限り、部分は重量による部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、かつ圧力は大気圧または大気圧付近である。実施例1偏在的に15N標識された藻類の大規模産生長期の標識研究に必要な藻類を取得するために、本発明者らは、バブルリフト循環装置ベースの閉ループバイオリアクターを構築した。本発明者らは、唯一の窒素源として15N濃縮されたNaNO3を用いて、ほぼ均一な15N標識されたスピルリナを、1Lの培養液当たり3gの藻類の収率で生産した。スピルリナの質量スペクトル解析により、最終的な同位体濃縮は、>99515Nであることが示された。本発明者らの研究の全体に必要とされる標識された飼料を、約60Lのスピルリナ培養により供給した。藻類ペプチドおよびペプチド特異的な相対的同位体強度藻類の食餌の最大同位体濃縮を、4種の高い存在度のスピルリナタンパク質由来のペプチドを用いて測定した。天然t=0および15N濃縮されたt=無限大スピルリナタンパク質由来の同一のペプチドの同位体濃縮を、比較した。タンパク質の、Uniprotに列挙された名称、アクセッション番号、および分子量MWを含む、ペプチド特異的な情報を取得した。ペプチド特異的な質量/電荷mz、電荷状態z、およびアミノ酸配列を測定した。得られた期待値は、ペプチド配列を無作為に割り当てることができるProteinProspector検索エンジンにより割り当てられる確率であった。各ペプチドについて、濃縮されていないt=0および15N濃縮されたt=無限大スピルリナの、時点の15N取り込み測定値を取得した。藻類の食餌でのマウスの維持スピルリナベースの食餌を食べさせたマウスは、13週間の継続的な給餌の後にも亜慢性毒性を有さなかった24。本発明者らの食餌製剤は、刊行されているプロトコルと同様であった2123。全身の健康について毎日、および体重について少なくとも1週間に2回、マウスを検査した。体重は毎日変動したが、いずれのマウスも、藻類の食餌の前の体重の有意な分画>20を減らしたり増やしたりしなかった。ペプチド同定コンピュータースクリプトを利用して、データの計算解析を実施した。ペプチド、タンパク質、およびそれらの測定した動態パラメータを含むデータをすべて処理した。検出したペプチドおよびタンパク質についての相対的同位体強度標識時間経過を通してモニタリングしたペプチドおよびタンパク質の各々を、組織脳、肝臓、血液に従ってカテゴリー化した。ペプチドについて、Uniprotに列挙された名称、アクセッション番号、分子量MW、質量/電荷mz、電荷状態z、およびアミノ酸配列を割り当てた。列挙された液体クロマトグラフィーLC滞留時間でペプチドが見出され得る生データファイルを示すように、分画ファイル名称を与えた。期待値を、ペプチド配列を無作為に割り当てることができるProteinProspector検索エンジンにより割り当てられる確率として決定した。各ペプチドについて、時点の15N取り込み測定値を決定した。遅滞時間t0および集積速度k0は、時点により記載される指数関数的集積曲線を計算するために使用するフィッティングパラメータである。本研究において、本発明者らは、代謝回転が測定されなかったすなわち、0001日1より遅い代謝回転速度ペプチドと、後期の時点で観察されなかったペプチドとを区別しなかった。本発明者らは、二つの場合を識別するために、同一のタンパク質に属するペプチド間の類似性解析を頼りにした。ProteinProspectorリバースデータベース検索25において95より大きい信頼を有して割り当てられたペプチドのみを、その後の解析に使用した。後期の時点で収集した試料について、15N標識されたペプチドを以下に基づいて同定した:iゲルの分子量領域;ii0日試料において観察されるように期待されるLC滞留時間;およびiiiペプチドのMW、C、O、S、およびH原子の天然の同位体分布、ならびに00037~0995それぞれ、15Nの天然および藻類の存在度にわたる14N15N比に基づいて期待される質量分布。本発明者らは、4619個の脳ペプチド、7226個の肝臓ペプチド、および1968個の血液ペプチドについて、下記の表1に示すように、高い統計学的信頼を有して9時点すべてで、同定しかつ質量分布を数量化することができた。表1本研究において解析したペプチドおよびタンパク質の数★9時点すべてで検出したペプチドのみを、タンパク質解析に使用した。†規定された数のペプチドを解析しかつ平均化した、タンパク質の数。任意の所与の時点で2連の動物から得られたデータは、最小の変動を示した図4A、B、C、D、E、およびF。典型的な動態標識パターンの例として、脳由来のコフィリン1ペプチドNIILEEGKEILVGDVGQTVDDPYTTFVKの時間依存的質量増加を、図1Cに示す。15Nの取り込みの2種の独立したパラメータが、明白である。第1に、期待される標識されていない質量分布0日の外側にあたるペプチドピークの面積の画分において、時間依存的増加がある。第2に、標識された集団の質量中心図1C、矢印は、経時的に増加する。本発明者らは、完全に標識された試料に対する標識されていない試料の比に正規化したこれらの2種の測定値を、それぞれ標識された集団および質量シフトと呼ぶ。コフィリン1ペプチドについて、15N標識された集団は、標識の1日後に取得した試料において明らかに見える図1C。標識されたタンパク質集団は、最も早期の時点でも、天然の同位体分布から良好に分離され、天然および同位体質量分布のデコンボリューションの必要性を打ち消す。コフィリン1およびいくつかの他のペプチドについての、標識された集団および質量シフトのプロットを、図2Aおよび2Bの6個のグラフに示す。複数の動態傾向が、データにおいて明白である。第1に、質量シフトにおける増加は二相性であり、急速な最初のバースト、その後の長期の緩徐な相を有する。第2に、質量シフト動態は、同一の組織から抽出したペプチド間では類似しているが、3種の解析した組織間では異なる。具体的には、脳において、最初の急速な相は、肝臓および血液と比較してより低い振幅を有し、かつ第2の相は、より遅い速度を有する。第3に、標識された集団は、約1日の最初の遅滞相を有し、その後単一の指数関数的増加が続く。そして最後に、標識された集団の動態は、解析したペプチド間で高度に可変である。タンパク質代謝回転の計算歴史的に、トレーサー標識実験においてタンパク質代謝回転の動態を解釈するために、種々の単純化されたモデルが使用されている2628。これらのモデルは、観察される標識摂取の動態傾向を、アミノ酸およびタンパク質の理論的プールの動態流入および流出からなる反応機構と調和させようとする1726。本明細書において、本発明者らは、3プールモデル図1Bを利用して、観察される動態傾向図1Cにおけるコフィリン1ペプチドおよび図2にプロットされたペプチドにより例証されるを説明する。アミノ酸の全体的生物全体にわたるプールは、2種の供給源:外部の食餌および内部の代謝/異化により供給することができる。全体的プールは、タンパク質合成において使用される局所的組織全体にわたるプールのためにアミノ酸を提供する。アミノ酸は、全体的プールからシステムを出る排出されることができる。このモデルに従って、本発明者らの研究における標識された集団は、所与の時間で代謝回転しているタンパク質プールの分画を表し、かつ、標識された集団の質量シフトは、局所的アミノ酸プールにおける不安定な窒素の濃縮を反映する。質量シフトの程度は、起源の組織の特性であり、任意の個々のタンパク質の特徴ではない。逆に、標識された集団の動態は、ペプチドの代謝回転速度を表し、かつ、高度に可変であることが期待されるものである。遅滞期間の後、標識された集団は、指数関数的に増加する。この相を単一指数方程式に適合させることにより、ペプチド代謝回転の速度の測定が可能である。本発明者らのデータセットにおける大部分のタンパク質は、1個より多いペプチドにより表される。単一のタンパク質を網羅するペプチド間の代謝回転動態における変動性は、約025の典型的な変動係数を有し、かなり低かった図5Aおよび5B。単一のタンパク質に属し、かつ標識された集団の同様の動態プロファイルを有するペプチドを、各タンパク質について標識された集団の曲線を得るために平均化した。タンパク質平均値に関して09未満のピアソン相関を有するペプチドとして定義される外れ値は、除外した。血液から抽出した血清アルブミンについて示すように、平均化したタンパク質曲線を単一指数方程式に適合させ、各タンパク質についての代謝回転速度を測定した図6Aおよび6B。測定した代謝回転の速度は、0002日1から10日1の、4桁に及んだ。脳において、タンパク質は、より長い代謝回転時間を有したが、血液および肝臓タンパク質の分布は、より速い代謝回転速度の傾向があった図6Aおよび6B。脳ペプチドについての中央代謝回転速度は、それぞれ血液および肝臓タンパク質についての023および020日1と比較して、0075日1であった。従って、脳、肝臓、および血液におけるタンパク質の平均寿命は、それぞれ90、30、および35日である。脳に独自に発現しているタンパク質の多くは、遅い代謝回転の速度を有した。例えば、ミエリン鞘の豊富な構成要素であるミエリン塩基性タンパク質は、1年に至るまでの半減期を有した。さらに、3種の組織すべてに存在するタンパク質は、脳においてより長い代謝回転時間を示した図6~8。特に、ミトコンドリアタンパク質図6Bは、肝臓および血液と比較して脳において、はるかにより遅い代謝回転速度を有する傾向がある。代謝回転速度の関数への相関本発明者らは、次に、本発明者らの研究において動態解析したタンパク質の代謝回転速度と他の生物学的特性との間の統計学的に有意な相関を見出そうと努めた。本発明者らは、血液、肝臓、および脳におけるタンパク質に関連した遺伝子オントロジーGOタームのリスト30を作製し、その後、3~2log日1にわたり、かつ025log日1の間隔で05log日1により重複する代謝回転速度に従って、瓶中にタンパク質を分離した。各速度瓶におけるGOタームの相対普及率を、その瓶におけるGOタームに属する観察されるタンパク質の数と、無作為の機会により期待される数との間の比として計算した。濃縮の統計学的有意性を、フィッシャーの正確検定のp値を計算することにより判定した31。本発明者らは、p<0001の統計学的有意性で、1個または複数の速度瓶に濃縮された330個のGOタームを同定し、それらは、脳について108個のターム、肝臓について124個、および血液について98個を含んだ図7。多数のGOタームは、階層的様式において互いに関連し得る30。従って、同一の群の遺伝子は、多数の関連したGOタームの濃縮を引き起こし得る。この冗長性を打ち消すために、データにおいて重複する群のタンパク質30またはそれより多い重複により表されたGOタームを、経験的に指定されたクラスター中に群分けした。各クラスターについての瓶濃縮を、構成GOタームの各々について濃縮を平均化することにより判定した。分泌タンパク質アポリポタンパク質、カイロミクロン、補体因子、ならびに、シグナル伝達およびタンパク質フォールディングに関与するタンパク質例えば、シャペロンは、最速の代謝回転の速度を有する。本発明者らは、これらのタンパク質について、2~10時間の半減期を測定した。ヌクレオソームに含有されるタンパク質例えば、ヒストン、およびミエリン鞘の維持に関与するタンパク質は、1年に至るまでの測定した半減期を有し、最長の代謝回転速度を示した。細胞小器官に関連した異なるタンパク質は、同様の速度で代謝回転する。例えば、ミトコンドリアタンパク質は、一般に、長い半減期を示し、ERに常在する大部分のタンパク質は、6~10日の半減期を有した図7。図7は、特定の半減期を有するタンパク質について濃縮される機能的カテゴリーの網羅的リストではないことが、注目されるべきである。図7は、高い統計学的信頼度p<0001を有する濃縮の測定を可能にするのに十分な数の、本発明者らのデータセットにおけるタンパク質により表された、機能的カテゴリーに限定されている。タンパク質複合体サブユニットの代謝回転GOアノテーションを使用して、高度に不均一のタンパク質複合体例えば、微小管、ヌクレオソームなどを除外した、多タンパク質複合体に属するタンパク質をデータセットにおいて同定した。本発明者らは、≧5個のタンパク質サブユニットを含有する複合体を本発明者らのデータセットにおいて同定し、かつそれらの代謝回転速度の分布をプロットした図8。各複合体内に含有されるタンパク質、およびそれらのそれぞれの代謝回転速度を取得した。例外無く、脳および肝臓の両方において同定されたすべてのタンパク質複合体は、肝臓においてよりも脳においてより遅く代謝回転した。例えば、プロテアソームの12個のサブユニットを、脳および肝臓の両方において同定した。脳において観察されたサブユニットの平均半減期は8日であったが、肝臓におけるサブユニットの平均半減期は4日であった。プロテアソームのサブユニット間の半減期は同様であり、脳において13日のみの標準偏差を有した。ATP合成酵素およびリボソームなどの多くの大きく、豊富な複合体のサブユニットは、同様に狭い範囲の代謝回転速度を有する。参照文献前述は、単に本発明の原理を例証するに過ぎない。本明細書において明確に記載されるかまたは示されていないが、本発明の原理を具体化し、かつその精神および範囲内に含まれる種々の配置を、当業者が考案できるであろうことが、認識されると考えられる。その上、本明細書において列挙されるすべての実施例および条件付きの言い回しは、主に、本発明の原理、および当技術分野を促進するように本発明者らにより与えられる概念を読者が理解するのを手助けするように意図され、かつ、そのような具体的に列挙される実施例および条件に限定されるわけではないように解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面、および態様、ならびにそれらの具体例を列挙する、本明細書におけるすべての陳述は、それらの構造的および機能的同等物の両方を包含するように意図される。加えて、そのような同等物は、現在公知の同等物、および将来開発される同等物の両方、すなわち、構造にかかわらず同一の機能を果たす、開発される任意の要素を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書において示されかつ説明される例示的な態様に限定されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲により具体化される。