50塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む第一のPCRプライマーと、50塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む第二のPCRプライマーとを含む、ウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。40塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含む上記第一のPCRプライマーと、40塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含む上記第二のPCRプライマーとを含む、請求項1に記載のウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。上記第一のPCRプライマーは、配列番号1で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含み、上記第二のPCRプライマーは、配列番号2で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む、請求項1又は2に記載のウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーがいずれも、取りうる全プライマーの混合物としての縮重プライマーとして構成される、請求項1から3の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするTaqMan商標プローブをさらに含む、請求項1から4の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。上記TaqMan商標プローブは、配列番号3又は4で示す塩基配列を含む、請求項5に記載のウシ白血病ウイルスBLV検出用のキット。ウシ白血病ウイルスBLVの検出方法であって、請求項1~6に記載のウシ白血病ウイルス検出用のキットを用いて、ウシから取得した検査用サンプルにおけるBLV由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、検出方法。BLVは、世界中のウシに感染しており、乳牛産業に対する経済的な影響を強いている非特許文献16~20、24~26。BLVのenv遺伝子の遺伝学的多様性に関する最近の研究によれば、世界中の様々な場所のBLV分離株において遺伝的変異が示されている非特許文献24、27。さらに、上述のように、BLVは、感染後ただちに潜伏段階に入り、BLV抗原およびmRNAはウシにおいてほとんど発現されない。したがって、BLV抗原の量、BLVのmRNAの発現レベルなどによって、BLVの正確な検出および定量を行うことは困難である。したがって、BLVに誘導された白血病の発生の機序を理解し、BLV感染した動物の選別を実施するために、BLV感染したウシにおける疾患の過程の全体を通じたプロウイルス量の変化の詳細な評価が求められている。しかし、BLVの多様性に対応するプライマーは、BLVの高い変異率に大きく起因して、開発されていない。また、BLVプロウイルス用のリアルタイム定量的PCRは、臨床サンプル間のDNA配列のばらつきによって引き起こされる増幅効率の差異に大きく起因して、開発されていない。本発明は上述の問題を解決するためになされ、本発明の目的は、BLVの多様性に十分に対応する新たなBLV検出用キットおよびその利用を提供することである。さらに、本発明の他の目的は、ほぼすべてのBLVバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムPCR法を開発するために、上記キットを使用することである。上記課題を解決するために、本発明は、ウシ白血病ウイルス検出用のキットであって、50塩基以下からなり、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第一のPCRプライマーと、50塩基以下からなり、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第二のPCRプライマーとを含むものを提供する。また、第一のプライマーと第二のプライマーとは、縮重プライマーであることが好ましい。以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。1.BLV検出用キットキットの基本構成本発明に係るウシ白血病ウイルス検出用のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによって、BLV由来のDNA断片を選択的に増幅可能なものである。ここで、選択的に増幅可能とは、ウシ由来の検査サンプルに対して、当該キットを用いたPCRを行った場合に、BLV由来の断片が専ら増幅産物として得られるが、ウシ自身由来のDNA断片及びBLV以外のウイルス由来のDNA断片は増幅産物として相対的に少量しか得られない又はウシ自身由来のDNA断片及びBLV以外のウイルス由来のDNA断片はほぼ得られないことを指す。本発明に係るキットは、具体的には以下の1又は2の何れかに示す、第一のPCRプライマーと第二のPCRプライマーとのプライマーセットを含む。1配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む、50塩基以下のオリゴヌクレオチドである第一のPCRプライマーと、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む、50塩基以下のオリゴヌクレオチドである第二のPCRプライマーとの組合せ。なお、配列番号1で示す塩基配列は、表1中のprimerIDNo6で示す塩基配列に相当する。また、配列番号2で示す塩基配列は、表1中のprimerIDNo81で示す塩基配列に相当する。2配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含み、40塩基以下である第一のPCRプライマーと、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含み、40塩基以下である第二のPCRプライマーとの組合せ。なお、上記1又は2の何れの場合でも、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーの長さは35塩基以下であってもよく、30塩基以下であってもよい。第一のPCRプライマーは、好ましくは、配列番号1で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む。第二のPCRプライマーは、好ましくは、配列番号2で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む。第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーは、配列番号1又は2で規定されていない塩基配列を含みうる。例えば、第一のPCRプライマーが50塩基のオリゴヌクレオチドからなり、そのうち連続する20塩基のみが配列番号1で示されたものである場合は、残りの30塩基は配列番号1で規定されていないものである。このような場合でも、当業者であれば、公知になっている少なくとも一つのBLVの塩基配列を参照配列として、残りの30塩基を、当該参照配列にハイブリダイズする塩基配列として容易に決定することができる。また、本発明において、縮重塩基RrはAアデニン又はGグアニンを指す。縮重塩基YyはCシトシン又はTチミンを指す。縮重塩基WwはA又はTを指す。縮重塩基SsはG又はCを指す。縮重塩基KkはG又はTを指す。縮重塩基MmはA又はCを指す。縮重塩基DdはA又はG又はTを指す。縮重塩基Hhは、A又はC又はTを指す。縮重塩基NnはA又はC又はG又はTを指す。配列番号1で示す塩基配列、及び配列番号2で示す塩基配列は何れも上記した縮重塩基R、Y、W、S、K、M、D、H及びNの少なくとも一つを含む。そのため、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーはいずれも、いわゆる縮重プライマーでありうる。縮重プライマーは、少なくとも一つの塩基R、Y、W、S、K、M、D、H及びNの位置において異なる種類の複数の塩基が指定された複数種類のプライマーから構成される。より多種類のBLVを検出可能という観点では、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーは、取りうる全プライマーの混合物たる縮重プライマープライマーミックスである。ただし、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーはそれぞれ、上記縮重プライマープライマーミックスを構成するプライマーの一つであってもよい。上記第一のプライマー及び第二のプライマーは常法の核酸合成法に従って合成することができる。キットに含まれうるその他の構成物アッセイの特異性及び感度を増強するために、BLV検出用のキットはさらに、上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するTaqMan商標プローブを含んでいてもよい。上記TaqMan商標プローブは、例えば、配列番号3又は4に示す何れかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドでありえる。実施例において、CoCoMo-qPCRにおけるBLV-LTRのPCR産物を検出するためのTaqMan商標プローブとして、FAM-BLVプローブ5‘-FAM-CTCAGCTCTCGGTCC-NFQ-MGB-3’を用いた。さらに、他のTaqMan商標プローブ5‘-FAM-CTCAGCTCTCGGTC-NFQ-MGB-3’を、CoCoMo-qPCRのアンプリコンの検出に用いることもできる。しかし、感度の観点において、より長いプライマー前者が短いプライマーよりも好ましい。検査サンプル中に含まれる細胞数を定量化して、検査サンプル中のゲノムDNA量をノーマライズするために、BLV検出用のキットはさらに、シングルコピーの宿主遺伝子であるBoLA-DRA遺伝子の断片を特異的に増幅するPCRプライマーセットを含んでいてもよい。BLV検出用のキットはさらに、必要に応じて、1PCRに用いる各種試薬及び器具ポリメラーゼ、PCRバッファー、各dNTP、ピペット等、2PCRに供するDNAを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具試験管、バッファー等、3PCR増幅断片を解析するための各種試薬及び器具電気泳動ゲル材料、ピペット等、4検出キットの使用説明書、等の少なくとも1つを備えていてもよい。本発明に係るBLV検出用のキットは、BLVが存在するか否か、及び/又は、BLVの量BLVの定量を検出することができる。2.BLVの検出方法本発明に係るBLVの検出方法は、ウシ例えば、ウシは一頭でも複数頭でもよいから取得した検査用サンプルに対して、本発明に係るBLV検出用の上記キットを用いて、BLV由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む。より詳細には、本発明に係るBLVの検出方法は、以下の工程:aDNAを含有する検査用サンプルをウシから調製するサンプル調製工程、b上記検査用サンプルに対して、キットが含む第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅工程、c上記増幅工程で得られる増幅断片の有無、及び/又は当該増幅断片の量を検出する検出工程、を含む。以下、各工程を説明する。1調製工程調製工程は、検査対象となるウシからDNAを含有する試料を調製する工程である。DNAを含有する試料とは、例えば、ウシの血液、血液以外の体液、組織等である。なお、調製されたDNAを含有する試料には、DNAの他に、各種RNA、タンパク質、細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製し、ゲノムDNAを抽出してもよい。2増幅工程増幅工程は、上記試料に対して、本発明に係るキットが備える第一及び第二のプライマーのセットを用いたPCRを行う工程である。PCRは、PCR増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にBLVが含まれている場合には、そのLTRに対応する増幅断片が得られる。より具体的には、検査対象となるウシのゲノムDNAに組み込まれた、プロウイルス化したBLVのLTRに対応する増幅断片が得られる。特に限定されないが、好ましいPCRの条件例を以下に示す。なお、条件1~5は互いに組み合わせる事で相乗効果を奏する。1縮重プライマーとして用いる場合、第一のプライマーと第二のプライマーとの濃度比PCRの反応液中は、7:1~13:1が好ましく、8:1~12:1がより好ましく、9:1~11:1がさらに好ましく、10:1が特に好ましい。2PCRの反応液に含まれるゲノムDNAの終濃度は、1ng/μl~100ng/μlの範囲内が好ましく、1.5ng/μl~20ng/μlの範囲内がより好ましい。このとき、縮重プライマーとして用いられる第一のプライマーの終濃度は、400~600nMが好ましく、450~550nMがより好ましい。また、縮重プライマーとして用いられる第二のプライマーの終濃度は、40~60nMが好ましく、45~55nMがより好ましい。3PCRのサイクル数は、30回~100回程度が好ましく、60回~90回程度がより好ましく、80回~90回程度がさらに好ましい。4PCRのアニーリング温度は、55°C~70°Cが好ましく、55°C~65°Cがより好ましく、60°C程度がさらに好ましい。5PCRの反応液に含まれる塩化マグネシウムの濃度は、2.5mM~3.5mMが好ましく、2.8mM~3.2mMがより好ましく、約3mMがさらに好ましい。なお、本発明に係るキットがBoLA-DRA遺伝子の断片を特異的に増幅するPCRプライマーセットを含んでいる場合には、このPCRプライマーセットを用いたPCRも、第一及び第二のプライマーのセットと同一反応系で行うことができる。また、PCRによる増幅は、いわゆるリアルタイムPCRとして行うこともできる。3検出工程検出工程は、増幅工程で得られるPCR増幅断片の有無、及び/又は当該PCR増幅断片の量を検出する工程である。PCR増幅断片アンプリコンの有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりPCR増幅断片の有無、量、及びサイズを確認することができる。また、本発明のキットが、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するTaqManプローブを含む場合には、PCR増幅断片の有無及び量を蛍光シグナルで検出することができる。PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が存在する場合には、試料にBLVが存在すると判別することができる。また、PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が実質的に存在しない場合には、試料にBLVが存在していないと判別することができる。すなわち、検出工程を通じて、ウシがBLVを保有しているか否かの診断を行うことができる。実施例に示すように、このアッセイは、特異性が高く、高感度で、高定量性で、かつ再現性が高い、そして、従来確立されていたnestedPCRアッセイを用いてもネガティブであった沢山の試料においてBLVの検出ができた。このアッセイはまた、国際的なロケーションの範囲内からのウシにおけるBLVの検出に非常に効果的であった。後述する実施例、比較例などを参照して、以下に本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されない。[結果]BLVプロウイルスのコピー数決定用の絶対定量の原理BLVプロウイルスの絶対的なコピー数を決定するために、PCR増幅用の標的配列としてLTR領域を選択した図1におけるA。アッセイの設計において、2つのLTRが個々のBLVゲノムのそれぞれについて検出されることを考慮した以下の式を参照すればよい。また、ゲノムDNAの投入量を標準化するために、アッセイに、1コピーのBoLA-DRA遺伝子の平行した増幅を組み入れた図1におけるB。100000細胞ごとのプロウイルスのコピー数は、以下の式:BLVプロウイルス量=BLVプロウイルスのコピー数/二倍体細胞数×100000細胞=BLT-LTRのコピー数/2/BoLA-DRAのコピー数/2×100000細胞Aにしたがって算出された。すべてのBLV株を増幅させる能力を有しているプライマーセットを構築するためのCoCoMoアルゴリズムの使用すべてのBLVバリアントを増幅するために、複数のウイルス株を増幅可能なPCRプライマーを設計するために開発されたCoCoMoアルゴリズムを改変して用いて、BLVのLTRを標的化するプライマーを構築した。356のBLVヌクレオチド配列をGenBankから収集した2009年4月30日に。これらのBLV配列から、102のLTR配列をGenBankのannotaitionにしたがって選択した。上記LTR配列から、相同性を決定するために十分に大きい85の配列を選択し、当該配列を、Pajekグラフィックソフトウェアを用いた相同性に基づいて、主要なBLV-LTR群に指定した。これらの配列のうちの52をプライマー設計用に選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたCoCoMoアルゴリズムのBLV-LTR用に改変したバージョンにかけた。これらの配列をテンプレートとして用いて、49の候補プライマーTable.1を有している合計72のプライマーセット図2におけるBを設計した。BLV-LTR領域増幅用のプライマーセットおよびプローブの選択CoCoMoプライマーセットがBLVのLTR領域を増幅したか否かを判定するために、72の候補プライマーセット図2におけるBを用いたタッチダウンPCRを、BLV感染したBLSC-KU-17細胞から抽出されたゲノムDNAを用いて行った。図2におけるAに示されているように、BLVのLTR領域を巧く増幅した16組のプライマー1~6、9、15~17、20、21、24、33、43および46を同定した。16の選択されたプライマーの特異性を、増幅の融解曲線分析によって評価した。増幅には、BLVなしの正常なウシNs118に由来するBLSC-KU-17細胞およびPBMCから抽出されたゲノムDNAを、ネガティブコントロールとしての試薬のみとともに用いた。図2におけるCは、代表的な4つの融解曲線を示している。単一の融解温度を有している単一のPCR産物からなるアンプリコンは、単一のピークを示し、2以上の産物からなるアンプリコンは複数のピークを示した。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットID15を用いて生成されたアンプリコンは、BLSC-KU-17細胞によって単一の融解温度を有していた。これらのプライマーを用いて、BLVなしの正常なウシNs118から得られたゲノムDNA、または試薬のみのコントロールによってアンプリコンは生成されなかった。一方で、他のプライマーセット例えば、ID3、ID16およびID17は、BLVなしの正常なウシNs118から抽出されたゲノムDNAからか、または試薬のみにおいてか、ならびにBLSC-KU-17細胞から抽出されたゲノムDNAからアンプリコンを生成した。このため、BLV-LTR領域の検出にとって最良のペアであった図2におけるDCoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いた増幅の最適化を続けて行った。これらの最適化された条件下において、BLVに感染した56頭のウシおよびBLVなしの正常な3頭のウシから抽出されたゲノムDNAを用いた増幅融解曲線は、BLSC-KU-17細胞およびBLVなしの正常なウシNs118に見られたパターンと同じパターンを示したデータを示さず。BLVゲノムのLTR領域におけるCoCoMo6およびCoCoMo81と対応する位置の間にある変異性の低い領域図1から、BLV内部のTaqMan商標プローブを構築し、カルボキシフルオレセインFAM色素、無蛍光クエンチャーNFQおよび副溝結合剤MGBを用いて、プローブの融解温度を高めるために標識した。プローブをFAM-BLVと命名した。GenBankから入手した52のBLVのLTR配列に基づく、プライマーおよびプローブの領域と対応する配列のアラインメントを図3に示す。この比較に基づいて、52の配列のうちから、CoCoMo6プライマーと対応する8つの個々の配列、およびCoCoMo81プライマーと対応する4つの個々の配列が、整列され得た。このアラインメントによって、プローブ領域における配列は、BLVバリアントのアラインメントを可能にするほどに十分に保存されていたが、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーと対応する配列は、程度の低い類似性を示すことが証明された。BoLA-DRA遺伝子定量用のプライマーセットおよびプローブの構築PCRテンプレートとして使用されたゲノムDNAの標準化のために、BoLA-DRA遺伝子の定量用のプライマーおよびプローブを設計した図1。MR1のcDNAクローンDDJBNoD37956から配列を入手し、増幅用の標的としてBoLA-DRA遺伝子のエキソン4領域を選択した。増幅プライマーDRA643およびDRA734、ならびにBoLA-DRA内部のTaqMan商標プローブを、PrimerExpress30AppliedBiosystemsTokyoJapanを用いて設計した。プローブの融解温度を高めるためにVIC色素、NFQおよびMGBプローブを用いて、プローブを標識し、VIC-DRAと命名した。絶対定量的PCR用の標準曲線を作成するためのプラスミドDNAコピー数の定量BLVプロウイルスDNAおよび細胞性DNAの定量用の標準物質を得るために、BLVの全長LTRを含んでいるpBLV-LTR/SK、およびウシのDRA遺伝子の全長を含んでいるpBoLA-DRA/SKを、それぞれ103.1ng/μlpBLV-LTRconcおよび125.0ng/μlpBoLA-DRAconcにおいて調製した。これらのプラスミドのコピー数を段階希釈法によって算出した。各プラスミドを10倍に希釈し、標的DNAをネステッドPCRによって検出した。例えば、pBLV-LTRconcの10-11希釈において、PCR増幅は、PCR産物BLVのLTRが挙げられるをまったく検出できなかった。それから、10-11希釈において10回にわたってPCR反応を繰り返し、成功率は5/10と分かった。10のうち5のPCR溶液はLTR遺伝子を含有しておらず、fx=0=5/10として方程式に表されることをこの結果は示していた。標的遺伝子の平均コピー数λは、-loge5/10=0.231と算出され、2.31×1010/μlのpBLV-LTRconcについてのコピー数と一致していた。また、見積もられたコピー数の信頼性を確認するために、DNA質量に基づく試算のdraftコピー数を算出し、ほぼ同じ結果pBLV-LTRconcについて2.35×1010およびpBoLA-DRAconcについて2.85×1010を得た。BLV-CoCoMo-qPCRの最適化にとっての最後の手順標準曲線を作成するために、pBLV-LTRconcおよび125.0ng/μlpBoLA-DRAconcの以下の希釈物:0.1コピー/μl、1000コピー/μlおよび1000000コピー/μlを作った。500nMのCoCoMo6プライマー、50nMのCoCoMo81プライマー、150nMのFAM-BLVプローブ5’-FAM-CTCAGCTCTCGGTCC-NFQ-MGB-3’、および30ngのテンプレートDNAを含有している1×TaqManGeneExpressionMasterMixの総量20μlにおいて、BLV-LTRから得られた168bpのアンプリコンを増幅させた。50nMのDRA643プライマー5’-CCCAGAGACCACAGAGAATGC-3’、50nMのDRA734プライマー5’-CCCACCAGAGCCACAATCA-3’、150nMのVIC-DRAプローブ5’-VIC-TGTGTGCCCTGGGC-NFQ-MGB3’、および30ngのテンプレートDNAを含有している1×TaqManGeneExpressionMasterMixの総量20μlにおいて、BoLA-DRA領域の57bpのアンプリコンを増幅させた。以下のプログラムにしたがってABI7500FastRealtimePCRシステムを用いて、PCR増幅を行った:ウラシルDNAグリコシラーゼUDG酵素の2分にわたる50°Cにおける活性化、AmpliTaqGoldUltraPureUPの10分にわたる95°Cにおける活性化、および95°Cにおける15秒および60°Cにおける1分の85サイクル。BLV-LTRおよびBoLA-DRAについて得られたコピー数を用いて、式Aに示されるように、100000細胞ごとのBLVプロウイルス量を算出した。BLV-CoCoMo-qPCRの再現性BLVプロウイルスのコピー数決定用のBLV-CoCoMo-qPCRの、アッセイ内再現性およびアッセイ間再現性を、BLV感染した7頭のウシから得られた血液サンプルから抽出されたゲノムDNAの分取物を用いて評価したTable.2。アッセイ内信頼性の決定のために、アッセイを3回にわたって繰り返して、各サンプルからの3組のPCR増幅物を調べた。合計21の試験を行い、アッセイ内の変動係数CVは0~20.5平均8.6の範囲であった。アッセイ間信頼性の決定のために、各サンプルについて独立した3つの実験を行った。100000細胞ごとのBLVプロウイルスのコピー数についてのアッセイ間CVに関する値は、5.5~19.8平均12.7の範囲であった。これらの結果は、このアッセイが良好なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を有していることを明らかに証明している。種々のレトロウイルスを用いたBLV-CoCoMo-qPCRプライマーの特異性の評価BLV-CoCoMo-qPCRプライマーの特異性を、種々のレトロウイルス分子クローンおよび種々のプラスミドを用いて試験した。当該レトロウイルス分子クローンとしては、BLV、HTLV-1、ヒト免疫不全ウイルス1型HIV-1、サル免疫不全ウイルスSIV、マウス乳がんウイルスMMTV、モロニーマウス白血病ウイルスMMLVが挙げられる。当該プラスミドとしては、pUC18、pUC19、pBR322、およびpBluescriptIISKが挙げられる。リアルタイムPCRのために、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーを0.3ngの各プラスミドとともに使用し、産物を3アガロース電気泳動によって分析した。168bp長の単一のPCR産物は、7.9×1010/μg4.3×1010/μgのコピー数を有して図4におけるB、BLV感染性の分子クローンについてのみ観察された図4におけるA。アンプリコンは、他のプラスミドのいずれについても検出されなかった。これらの結果は、他のレトロウイルスのLTRを増幅させずに、BLV-CoCoMo-qPCRプライマーがBLVのLTRを特異的に増幅させることを強く示している。ネステッドPCRと比較された、BLV-CoCoMo-qPCRの感度の評価BLV-CoCoMo-qPCRの感度を決定するために、それぞれ0.7コピーのpBLV-LTR/SKを含有している20の溶液を、ネステッドPCR、ならびにCoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって増幅させた図5。ネステッドPCR増幅の3/10がポジティブであり、コピー数は0.36と見積もられた。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRについて、PCR増幅の5/10がポジティブであり、コピー数は0.69と見積もられた。この結果は、BLV-CoCoMo-qPCRの感度がネステッドPCRより1.9倍高いことを示していた。BLV-CoCoMo-qPCRおよび段階希釈-ネステッドPCRの比較段階希釈法は、標的遺伝子のコピー数を定量化するために有効である。段階希釈-ネステッドPCR、ならびにCoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって、1μgのゲノムDNAごとのBLVプロウイルスのコピー数を、BLV感染した5頭のウシについて算出した図6におけるA。両方の方法によって得られたBLVプロウイルスのコピー数を、回帰分析によって確認した。相関係数の平方R2は、0.8806であり図6におけるB、CoCoMoプライマーを用いたリアルタイムPCRによって得られたコピー数が、段階希釈-ネステッドPCRによって得られたコピー数と相関することを示していた。したがって、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRは、臨床サンプルからのBLVプロウイルスのコピー数を得るために使用され得ると考えられる。BLV-CoCoMo-qPCRおよびシンチチウム形成アッセイの相関BLVプロウイルスのコピー数がBLVによる感染能と相関しているか否かを調べるために、BLV-CoCoMo-qPCRおよびシンチチウム形成アッセイを、BLV感染した5頭のウシから得られたサンプルに対して行った。BLV感染した5頭のウシから得られた1×105のPBMCを、誘導因子CC81とともに3日にわたって共培養し、同じウシから得られた1×105の細胞とプロウイルスのコピー数を比較することによって、BLVの感染能を評価した図7におけるA。プロウイルスのコピー数は105細胞につき113~63098コピーの範囲であり、シンチチウムの数は105PBMCにつき36~12737の範囲であった。これらのサンプルについての回帰分析によって、プロウイルス量のレベルは、図7におけるBに示されているように、シンチチウムの数と正に相関していたR2=0.9658。BLV-CoCoMo-qPCRおよびネステッドPCRによる、異なる地域からの畜牛におけるBLVプロウイルスの検出縮重プライマーは高度に縮重している配列を検出可能なので、BLV-CoCoMo-qPCRは、既知および未知の両方の種々のBLV株を検出する潜在能を有している。上述の実験において、BLV-CoCoMo-qPCRの感度は、ネステッドPCRより優れていることを見出した。このため、BLV-CoCoMo-qPCRは、世界中の異なる地域からのウシにおけるBLVプロウイルスを検出し得るか否かを調べた。日本における1つの飼育場からの54頭のウシ、ペルーにおける2つの飼育場からの15頭のウシ、ボリビアにおける4つの飼育場からの60頭のウシ、チリにおける3つの飼育場からの32頭のウシ、およびアメリカにおける1つの飼育場からの5頭のウシを試験し、BLV-CoCoMo-qPCRによって得られた結果を、ネステッドPCRによって得られた結果と比較したTable.3。2つの方法によるBLVのLTRの増幅は、166頭のウシを3つのグループに分けた。第1グループのウシn=107は、両方の方法によってBLVのLTRについてポジティブであった日本における50頭、ペルーにおける7頭、ボリビアにおける27頭、チリにおける18頭、およびアメリカにおける5頭。第2グループのウシn=50は、両方の方法によってBLVのLTRについてネガティブであった日本における2頭、ペルーにおける7頭、ボリビアにおける28頭、およびチリにおける13頭。第3グループのウシn=9は、BLV-CoCoMo-qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであった日本における2頭、ペルーにおける1頭、ボリビアにおける5頭、およびチリにおける1頭。興味深いことに、BLV-CoCoMo-qPCRによってネガティブであったが、ネステッドPCRによってポジティブであったウシはいなかった。したがって、ネステッドPCR法およびBLV-CoCoMo-qPCR法は、試験したウシの94.6について同じ結果を示したが、5.4のウシについて、BLV-CoCoMo-qPCRのみがBLVプロウイルスを検出可能であった。これらの結果は、BLV-CoCoMo-qPCRの感度がネステッドPCRより高いことを明らかに示している。Table.3に示されているように、BLV-CoCoMo-qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであったいくつかのサンプルを検出した。これらのサンプルがBLVに感染していたことを確認し、これらのサンプルがネステッドPCRによって検出されなかった理由を調べるために、このグループから得られた9つのサンプル:ボリビアからのYA40、MO85、YA35、YA56およびME10、ペルーからのHY2、チリからのC336、ならびに日本からのNs27およびNs29のLTR領域を配列決定した。9つのサンプルのすべてにおいてBLV-LTR配列を検出可能であり図8、したがって、BLV-CoCoMo-qPCRの高い特異性を確認した。2/9のサンプルにおいて、ネステッドPCRにおけるLTRの増幅のために使用されたプライマーBLTR453にとってのアニーリング領域にミスマッチ配列を同定した。これは、ネステッドPCRがBLVプロウイルスを検出できなかった理由についての考えられる解釈である。疾患の進行およびBLVプロウイルス量の相関分析疾患の初期および後期におけるBLVプロウイルスの量における差異を特徴づけるために、EBLの進行の異なる段階において、BLV感染した268頭のウシについてBLVプロウイルスのコピー数を算出した。BLVポジティブの健常な163頭のウシ、PLにかかっているBLV感染した16頭のウシ、リンパ腫にかかっているBLV感染した89頭のウシ、およびBLVなしの正常な117頭のウシにおいて、BLV-CoCoMo-qPCRによってプロウイルス量を測定した図9。プロウイルス量は、無白血病段階と比べてPL段階において有意に増加しておりp=0.0052、リンパ腫段階においてさらに増加していたp=0.0052。BLVなしの正常な117頭のウシにおいてBLVは検出されなかった。したがって、BLVプロウイルスのコピー数は疾患の重篤度の増大にともなって増加することを証明できた。[考察]この研究において、われわれは、感染動物からのBLVプロウイルス量の定量にとっての非常に特異的かつ正確な高感度の方法の開発に成功したことを説明している。BLV-CoCoMo-qPCRシステムは、広い地理的由来日本、ペルー、ボリビア、チリおよびアメリカが挙げられるからの種々のBLV株を検出可能である。BLVのenv遺伝子の遺伝的な変異性についての初期の研究では、単離物のなかに極わずかな変異が同定されたが非特許文献28、制限断片長多型の分析および全長のBLVのenv遺伝子の分析に基づく最近の研究によって、少なくとも7つの異なるBLV遺伝子型が世界中に流布していることが明らかになっている非特許文献24、27、29。この新規な分類は、BLVの相違が世界中において拡大していることを示唆している。GenBankにおける合計356のBLV配列から、異なる52のBLVのLTRヌクレオチド配列を入手した。これは、多くのBLVバリアントが存在することを示しており、われわれの結果は、これらのバリアントのすべての検出がBLV-CoCoMo-qPCRを用いて可能であることを示唆している。したがって、CoCoMoアルゴリズムが複数のBLVバリアントに対応する縮重プライマーを設計するための有用なツールであることを、われわれは明らかに証明している。実際に、Tongetal非特許文献30は、コンセンサス-縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマーを用いたセミネステッドPCRまたはネステッドPCRのアッセイが、非常に特異的またはより広く包括的になり得、亜科または属のレベルを標的化可能であることを示した。この種の手法を用いると、CoCoMoプライマーの縮重度が高くなり過ぎ、これによって標的配列に対して特異的なプライマーの濃度およびアッセイの感度を低下させるリスクがある。BLV-CoCoMo-qPCRは非常に高感度であり、ネステッドPCR増幅に対して優れた結果を示していた図6ので、この問題はわれわれの研究では生じなかった。さらに、BLV-CoCoMo-qPCRシステムは、種々の地域からのBLV感染したウシにおけるウイルスの検出に非常に有効であったTable.3。TaqMan商標プローブは、感度および特異性を向上させるために使用され、高い縮重と関連する任意の欠点に対抗するために作用している。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーに対応する位置の間に配置されているBLVのTaqMan商標プローブの配列は、52のBLVバリアントのなかで完全に保存されていたことに注目することが重要である。また、ウシにおけるBLVにとってのELISA法および免疫拡散スクリーニング法は、非常に高感度であるが、PCRによる完全なプロウイルスの直接的な検出と異なり、BLVに対する抗原を検出することによって作用する非特許文献17。ELISA法および免疫拡散スクリーニング法は、高効率の偽陽性に陥り、また、BLV感染した母獣からの母性の抗体がアッセイを妨げ得るので、子ウシが感染しているか否かの決定に有効ではない。したがって、ウシにおけるBLV感染の確実な検出は、プロウイルスの検出のための高感度な方法を必要とする。この目的のために、BLV-CoCoMo-qPCRを開発した。CoCoMoプライマーを用いたBLV定量の高い特異性を確認するために、いくつかの手法を使用した。第1に、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーは、BLVに感染した細胞における融解曲線分析によって単一のピークを生じたが、未感染細胞または試薬のみのネガティブコントロールにおいて、産物を増幅しなかった。第2に、PCR増幅は、BLVポジティブのウシにおいて検出されたが、BLVネガティブの試験された120頭のウシのすべてにおいてネガティブであった。第3に、いくつかの非BLTのレトロウイルスLTRを含んでいる感染性分子のクローンは、われわれのシステムにおいて増幅されなかった。これまでの研究非特許文献31において、リアルタイムPCRを用いてBLVプロウイルスを定量するための方法が報告されている。この方法は、プロウイルスごとに1コピーのみ存在しているBLVのenvおよびpol遺伝子を標的にしており、プライマーのアニーリング領域は潜在的に変異を受け易かった。CoCoMo-qPCRのBLV-LTR標的は、プロウイルスごとに2コピー存在しており、われわれのアッセインの感度の向上に寄与している。実際に、Lewatel非特許文献31によって説明されているqPCR法を用いた場合、CoCoMo-qPCRによって容易に検出可能な濃度である18コピー/105細胞未満においてプロウイルスを検出できなかったデータを示さず。また、われわれの方法は、縮重プライマーの使用がBLV配列バリアント変異から生じるバリアントが挙げられるの検出を可能にするという利点を有している。また、BLV-CoCoMo-qPCRは正確であった。CoCoMoプライマーによるリアルタイムPCRを用いて得られたプロウイルスのコピー数は、段階希釈-ネステッドPCRの結果と密接に相関していた。細胞内のBLVプロウイルスを定量するためにBLV-CoCoMo-qPCRを使用することを目的にしていたので、単コピーの細胞性の遺伝子BoLA-DRAの平行した定量を実施した。この測定は、サンプル間の増幅効率における変動についての調整を可能にした。この方策を用いて、感染動物の診断にとって十分なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を実測した。アッセイのCV範囲は、HTLV-1プロウイルス量の定量について報告されている範囲8.2~31.4非特許文献32または49~55非特許文献33より顕著に良好な、0.0~20.5であった。われわれのアッセイの高い信頼性は、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の定量のための使用を可能にした。また、CoCoMo-qPCRの精度を配列決定分析によって確認した。BLVプロウイルスが、CoCoMo-qPCRによって検出され得たが、ネステッドPCRによって検出されなかった9つのサンプルを選択し、アンプリコンを配列決定した。この方策を用いて、9つのサンプルはBLVによって感染していたことを確認し、ネステッドPCRによってネガティブだったサンプルにおけるプロウイルスを検出するCoCoMo-qPCR法の能力を強調した。2/9のサンプルにおいて、ネステッドPCRプライマーにとってのアニーリング領域に配列ミスマッチを検出し、これによって、これらのサンプルにおけるネステッドPCRによるBLV検出の失敗の解釈を示唆している。シンチチウムアッセイは、存続可能なviableBLVウイルス粒子を検出するための通常の方法である非特許文献34。しかし、この方法は、時間のかかるしばしば困難な細胞培養を必要とし、低い感度を有している。われわれのアッセイを用いて得られたプロウイルスのコピー数がシンチチウム形成アッセイと相関するか否かを試験した。これは、われわれのアッセイがBLV感染の段階における診断に使用され得ることを示唆しているためである。シンチチウム形成は、BLV-CoCoMo-qPCRによって算出された通りの10000コピー/105細胞を超えるプロウイルス量と強く相関していた。BLV-CoCoMo-qPCRによって検出された低いプロウイルス量を有しているBLV感染したウシにおいて、シンチチウム形成はほとんど検出され得なかった。したがって、BLV-CoCoMo-qPCRは、低いウイルス量を有している動物におけるBLV感染のレベルを正確に決定可能であると考えられる。PLと呼ばれるBLV感染の前白血病段階は、複数の部位にプロウイルス挿入を有している感染した表面免疫グロブリンM陽性B細胞の増大によって特徴づけられる。一方で、特異な組込み部位は、顕性の白血病/リンパ腫の発症後におけるBLVに感染した個体に認められる悪性B細胞の悪性の指標である非特許文献13、23、35。このモデルにしたがえば、プロウイルス量は疾患の進行の間に増加するはずであるが、これは正式には証明されていなかった。BLV-CoCoMo-qPCRを用いて、われわれは、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の増加を検出し得た。この結果は、プロウイルス量が、疾患の進行を監視するための優れた指標であるが、BLV伝染を最小化するための隔離計画の実施にも有用もあり得ることを強く示唆している。また、プロウイルス実験によって、疾患の進行と相関する宿主因子または遺伝的背景が同定された。例えば、腫瘍関連c143抗原は、EBLにかかっているウシにおいて特異的にセリンリン酸化されていると同定された。そして、がん関連遺伝子例えば、p53および腫瘍壊死因子TNFは、EBLと関連している非特許文献35~41。また、プロウイルス量は、リンパ腫段階への進行に影響するマーカーを同定するための有用な手段であり得る。われわれのアッセイは、ワクチン接種の有効性を評価するために有用であり得、また、BLVに誘導されるリンパ腫に対する耐性または感受性とあらかじめ関連しているTNFおよびBoLA対立遺伝子を有しているBLV感染したウシにおけるプロウイルス量の変化を検出するために有用であり得る。最後に、われわれのアッセイはすべてのBLVバリアントを検出したので、CoCoMoアルゴリズムは、他のレトロウイルスHTLVおよびHIV-1が挙げられるのプロウイルス量を定量するための縮重プライマーの設計に有用なツールと考えられる。[結論]CoCoMoを用いて、既知または新規のBLVバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムPCR法を開発した。われわれの方法は、感染動物におけるBLVのLTR領域の検出のために、非常に特異的、高感度、定量的かつ再現可能である。上記方法は、種々の地理的位置からのウシにおけるBLVの検出に有効であり、以前に開発されたネステッドPCRより幅広いサンプルにおけるBLVを検出した。最後に、われわれは、プロウイルス量が疾患の進行の段階と非常に相関していることを初めて示している。[方法]臨床サンプル、細胞株およびDNA抽出物血液サンプルを、血清学的にBLVネガティブの正常な117頭のウシ、臨床的および血液学的に正常な163頭のBLV感染したウシ、PLにかかっている臨床的に正常な16頭のBLV感染したウシ、およびEBLにかかっている89頭のBLV感染したウシから入手した。これらのウシを日本において飼った。ボリビア、ペルー、チリおよび米国において飼われたさらなる116頭のウシを本研究に組み入れた。BLV感染したウシを、以前に確立された基準非特許文献42およびBLVプロウイルスのゲノムへの組込みにしたがって分類した。PBMCを、MiyasakaandTrnka非特許文献43の方法によって血液から分離した。BLV感染したBリンパ腫細胞株BLSC-KU-17非特許文献44を、10の熱非働化ウシ胎児血清FCSLifeTechnologiesJapanTokyoJapan、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったダルベッコ改変イーグル培地SigmaAldrichChemieGmbhSteinemGermanyにおいて維持した。マウス肉腫ウイルスによってがん化されたネコの細胞株CC81を、10の熱非働化FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地SigmaAldrichCoLtdAyrshireUKにおいて維持した。ゲノムDNAを、aDNAWizardGenomicDNApurificationKitPromegaMadisonWIによって全血、bHughesetal非特許文献45によって説明されている手法によってPBMC、およびc標準的な手法を用いてFTAelutecardsWhatmanTokyoJapan上にスポットした40μlの全血から抽出した。プライマーおよびプローブの設計個々のBLVのLTR配列のうち52のバリアントを、GenBankにおける356のBLV配列から選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたCoCoMoprimerdesignアルゴリズムhttpwwwgeneknotjpcocomoEndohDMizutaniTMorikawaSHamaguchiISakaiKTakizawaKOsaYAsakawaMKonYHayashiMCoCoMoPrimersawebserverfordesigningdegenerateprimersforvirusresearchSubmittedのBLV-LTR用に改変したバージョンにかけた。なお、LTRが公式に報告されていないBLV配列を利用するために、個々のBLVのLTR配列のうち52のバリアントを、公知のLTR配列に基づくBLASTプログラムおよびクラスター選択法を組み合わせることによって抽出した。さらに、CoCoMoprimerdesignアルゴリズムが使用される場合に、標的配列に多く見られる4塩基一致する2塩基-自由な1塩基-一致する1塩基が、一般的に検索される。しかし、ここでは多く見られる5塩基をBLVにおいて検索した。特異的なPCR産物を検出するために、PrimerExpresssoftwareversion20AppliedBiosystemsを用いて設計したプローブ配列とともに、TaqMan商標プローブシステムAppliedBiosystemsTokyoJapanを用いた。CoCoMoアルゴリズムについての詳細多くのウイルスは進化の間に変異しており、病原性および集団発生における変化を導き得る非特許文献1、2。分子技術特にポリメラーゼ連鎖反応PCRに基づくこれらの用途の開発は、ウイルス感染症の診断を激変させている非特許文献3、4。遺伝子のいくつかの起こり得る変異したバージョンの増幅を可能にする縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、cDNAクローニング用、および高い割合の変異に起因して変異性の高い配列の検出用に首尾よく使用されている非特許文献5。縮重プライマーは、未知の遺伝子の増幅だけでなく、類似しているが、同一ではない遺伝子の同時の増幅に有用である非特許文献6。縮重プライマーは、ウイルス検出に対する費用の大幅な削減および所要時間の大幅な短縮を可能にする。CoordinationofCommonMotifsCoCoMoアルゴリズムは、複数のウイルスの種を検出するために特に開発されているEndohDMizutaniTMorikawaSHamaguchiISakaiKTakizawaKOsaYAsakawaMKonYHayashiMCoCoMoPrimersawebserverfordesigningdegenerateprimersforvirusresearchsubmitted。このプログラムは、MAFFTを用いた複数のDNA配列のアラインメント非特許文献8に基づく、COnsensusDEgenerateHybridOligonucleotidePrimerCodeHop技術非特許文献7の拡張を利用している。CoCoMoは、標的配列から得られた複数のコドンを含んでいる多く見られるギャップテトラヌクレオチドモチーフGTNMを選択する。それから、CoCoMoは、データベースに基づく方法を用いて共通のGTNMの増幅可能な組を選択し、多く見られる増幅可能なGTNMのそれぞれの5’末端においてコンセンサスヌクレオチドを構築する。それから、コンセンサス縮重配列を、設計した縮重プライマーに結合させる。したがって、CoCoMoアルゴリズムは、高度に縮重した配列にとっての縮重プライマーの設計において有用である。プラスミドBLV由来の全長LTRを含んだpBLV-LTR/SKを得るために、プライマーLTR/XhoI5’-CCCGCTCGAGTGTATGAAAGATCATGCCGA-3’;1位~20位およびBLV-LTRR/BamHI5’-CGGGATCCTGTTTGCCGGTCTCTCCTGG-3’;510位~530位、およびKU-17細胞から抽出された、テンプレートとしてのゲノムDNAを用いたPCRを使用した。ウシDRA遺伝子の全長を含んだpBoLA-DRA/SKを生成するために、哺乳類の発現ベクターpCDM8非特許文献47から、XbaIを用いてMR1を消化した。それから、MR1配列を含んでいるXbaI-XbaI断片を、pBluescriptIISKStratageneにサブクローニングした。使用されたさらなるクローンは、BLV感染性クローンpBLV-IF非特許文献34;HTLV-1感染性クローンpK30非特許文献48;HIV-1感染性クローンpNL4-3非特許文献49;SIV感染性クローンSIVmac239/WT非特許文献50;ハイブリッドMMTVプロウイルスプラスミド非特許文献51;M-MLV感染性クローンpL-4非特許文献51;およびプラスミドpUC18TakaraBioIncTokyoJapan、pUC19TakaraBioIncおよびpBR322Promegaが挙げられるを含んでいた。段階希釈法によるコピー数の算出pBLV-LTR/SKおよびpBoLA-DRA/SKを、ScaIを用いて消化し、SephadexG50カラムGEHealthcareJapanTokyoJapanを用いて精製した。ゲノムDNAを、5mMのスペルミジンの存在下において24時間にわたってXhoIを用いて消化した。サンプルを、TE緩衝液1mMのエチレンジアミンテトラ酢酸EDTAを有している10mMのTris-HClpH8.0を用いて、氷上において10倍段階希釈物に希釈した。マイクロチューブに対するDNA吸着を避けるために、超滑面処理されたチューブBM4015PlatinumsuperpolypropyleneBMbioTokyoJapanを、標準曲線にとってのテンプレートの調製に使用した。直鎖化されたpBLV-LTR/SK、pBoLA-DRA/SKおよびゲノムDNAのために、限界希釈を実施した。プラスミドDNAからのBLV-LTR遺伝子およびBoLA-DRA遺伝子の検出を、CoCoMoプライマー6および8、またはプライマーDRA643およびDRA734をそれぞれ用いたリアルタイムPCRによって実施した。また、BLT-LTR遺伝子を、ネステッドPCRを用いてゲノムDNAにおいて検出した。増幅産物が検出不可能であった希釈点において、PCRを10回にわたって繰り返し、ネガティブな結果の頻度を算出したfx=0。標的遺伝子のコピー数を、ポアソン分布モデル:λ=-logefx=0λ=標的遺伝子の平均コピー数にしたがって算出した。BLV-LTR増幅用の候補CoCoMoプライマーセットにとってのPCR条件1.0ユニットのrTaq、0.2mMのdNTP、1.0mMのMgCl2、500nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにネステッドPCRによってゲノムDNAから増幅されている1:1000倍希釈したBLV-LTRアンプリコンを含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液TOYOBOTokyoJapanの20μl量において、タッチダウンPCR増幅を実施した。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラーBiometraGottingenGermanyを用いて以下のプログラムにしたがって実施した:10分における95°Cにおける開始の変性、95°Cにおける15秒、60°C~52°Cにおける10秒アニーリング温度は、3サイクルごとに0.2°Cだけ60°Cから52°Cまで段階的に低下させたおよび72°Cにおける10秒の、続く40サイクル。2アガロースゲル電気泳動のために5μlのPCR産物を使用し、増幅産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。PCR特異性を評価するための融解曲線分析500nMのCoCoMoプライマーのそれぞれ、3mMのMgCl2、および30ngのゲノムDNAを含有している、1×LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenIRocheDiagnosticsGmbHBaselSwitzerlandの総量20μlにおいて、PCR増幅を実施した。PCR増幅を、LightCycler20RocheDiagnosticsGmbHを用いて以下のプログラムにしたがって実施した:10分間にわたる95°Cにおける開始の変性、95°Cにおける15秒、65°Cにおける5秒および72°Cにおける9秒の、続く75サイクル。融解過程を、二本鎖化したDNAの検出用の、DNAと結合しているSYBRGreenI色素の蛍光によってモニターした。ネステッドPCRによるBLV-LTRの検出プライマーBLTRF-YR5’-TGTATGAAAGATCATGYCGRC-3’LTR1-21およびBLTRR5’-AATTGTTTGCCGGTCTCTC-3’LTR515-533を用いて、最初のPCRを実施した。250nMのBLTRF-YRプライマーおよびBLTRRプライマー、0.5ユニットのrTaqポリメラーゼ、0.2mMのdNTP、2.5mMのMgCl2、ならびに30ngのテンプレートDNAを含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液TOYOBOの総量20μlにおいて、増幅を実施した。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラーBiometraを用いて以下のプログラムにしたがって実施した:2分にわたる94°Cにおける開始の変性、94°Cにおける30秒、58°Cにおける30秒、および72°Cにおける30秒の、続く35サイクル、ならびに72°Cにおける5分の最後のサイクル。250nMの256プライマーおよび453プライマー以下を参照、0.5ユニットのrTaqポリメラーゼ、0.2mMのdNTP、2.5mMのMgCl2、ならびに1μlの1回目のPCR産物を含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液TOYOBOの総量20μlにおいて、第2組のPCRを実施した。第2のPCRに使用されたオリゴヌクレオチド配列は、2565’-GAGCTCTCTTGCTCCCGAGAC-3’、LTR256-276および4535’-GAAACAAACGCGGGTGCAAGCCAG-3’、LTR429-453であり、以前に説明されている非特許文献23。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラーBiometraを用いて以下のプログラムにしたがって実施した:2分にわたる94°Cにおける開始の変性、94°Cにおける30秒、58°Cにおける30秒、および72°Cにおける30秒の、続く35サイクル、ならびに72°Cにおける5分の最後のサイクル。2アガロースゲル電気泳動のために、5μlのPCR産物を使用し、PCR産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。BLV-LTR領域の増幅、クローニングおよびDNA配列決定BLV-CoCoMo-qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであったサンプルのヌクレオチド配列を分析するために、BLV感染したウシからのゲノムDNAを、MightyAmpDNApolymeraseVer2TAKARA、KODplusNeoTOYOBO、およびTaqManUniversalMasterMixIIシステムABを用いたPCRによる増幅にかけた。BLV-LTR特異的なオリゴヌクレオチドプライマーBLTR56F5’-AACGTCAGCTGCCAGAAA-3’、BLTR134F5’-AAAATCCACACCCTGAGCTG-3’、CoCoMo6、CoCoMo81、およびBLTR544R5’-ACCGAGCCCCCAATTGTTT-3’を、BLVプロウイルス配列のLTR領域を参照することによって設計した。PCR産物をTAクローニングによってpGEMTEasyベクターPromegaによってサブクローニングし、ヌクレオチド配列を、標準的な手法を用いたサイクル配列決定によって決定した。シンチチウム形成アッセイ以前に説明されている手法非特許文献15、22にしたがってアッセイを実施した。CC81細胞を、直径6cmのディッシュにおいて72時間にわたって成長させ、1×105のBLV感染したPBMCとともにRPMI1640培地においてインキュベートした。細胞を、MayGrunwald溶液において10分にわたって固定し、Giemsa溶液を用いて10分にわたって染色した。水を用いた洗浄後に、細胞を光学顕微鏡のもとに調べた。5を超える核を含んでいる細胞をシンチチウムとしてカウントした。統計分析R2101統計演算ソフトウェアを用いて、統計分析を実施した。複数の試験について、補正をともなった群のレベル間の対比較を算出するために、ペアt検定を使用した。0.05未満のP値を有意であるとみなした。回帰分析を用いて、段階希釈法およびBLV-CoCoMo-qPCR法の間、ならびにシンチチウムカウントおよびプロウイルスのコピー数の間における相関を調べた。Table本発明は、上述の実施形態および実施例の記載に限定されず、特許請求の範囲の範囲内において当業者によって変更され得る。異なる実施形態に開示されている技術的手段の適切な組合せに基づく実施形態は、本発明の技術的範囲に包含されている。