"-培養される真核細胞のサンプルを提供し;-前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し;及び-そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持することを含む真核細胞の培養方法において、前記細胞スキャフォールド材が、140~600のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70~300のアミノ酸残基の反復断片;スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70~120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によってはスパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100~160のアミノ酸残基のN末端断片を含む、スパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島由来の細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。-真核細胞のサンプルを提供し;-前記サンプルを細胞スキャフォールド材に適用し;-そこに適用された細胞を有する前記細胞スキャフォールド材を細胞培養に適した条件下に維持し;及び-前記細胞スキャフォールド材から細胞のサンプルを調製することを含む真核細胞の調製方法において、前記細胞スキャフォールド材が、140~600のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70~300のアミノ酸残基の反復断片;スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70~120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によってはスパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100~160のアミノ酸残基のN末端断片を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする方法。-真核細胞;及び-細胞スキャフォールド材の組合せにおいて、前記細胞スキャフォールド材が140~600のアミノ酸残基からなり、スパイダーシルクタンパク質の反復断片から誘導される70~300のアミノ酸残基の反復断片;スパイダーシルクタンパク質のC末端断片から誘導される70~120のアミノ酸残基のC末端断片;及び場合によってはスパイダーシルクタンパク質のN末端断片から誘導される100~160のアミノ酸残基のN末端断片を含むスパイダーシルクタンパク質のポリマーを含み、前記真核細胞が、幹細胞、及びベータ細胞を含むランゲルハンス島からの細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞であることを特徴とする組合せ。前記細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記細胞が胚性幹細胞である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記細胞が、神経前駆細胞、間葉系前駆細胞及び造血前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記細胞が、造血、神経、間葉系、乳房、内皮、上皮及び嗅覚の幹細胞からなる群から選択される、特に造血、神経及び間葉系幹細胞からなる群から選択される成体幹細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記細胞が、ランゲルハンス島由来の細胞、特にベータ細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記真核細胞が単一細胞として提供される、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のニューロスフェアとして提供される神経幹細胞である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記哺乳動物細胞が、少なくとも1のランゲルハンス島として提供されるベータ細胞である、請求項8に記載の方法又は組合せ。前記スパイダーシルクタンパク質が、式REPCT及びNTREPCTにより定められるタンパク質の群から選択され、ここで、NTは100~160のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるN末端断片であり、REPは70~300のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片は、LnL、LnAL、LnL、及びLnGLからなる群から選択され、ここで、nは2~10の整数であり、各個々のAセグメントは8~18のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、0~3のアミノ配列残基はAlaではなく、残りのアミノ酸残基はAlaであり;各個々のGセグメントは12~30のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、少なくとも40のアミノ酸残基はGlyであり;各個々のLセグメントは0~20のアミノ酸残基のリンカーアミノ酸配列であり;CTは70~120のアミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、該断片はスパイダーシルクタンパク質から誘導されるC末端断片である、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記スパイダーシルクタンパク質が細胞結合モチーフを含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。前記細胞結合モチーフが、少なくとも1のペプチド結合を介して、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分にカップリングしているオリゴペプチドである、請求項13に記載の方法又は組合せ。前記オリゴペプチドが、スパイダーシルクタンパク質の残りの部分のN末端にカップリングしている、請求項14に記載の方法又は組合せ。前記オリゴペプチドが、RGD、RGE、IKVAV、YIGSR、EPDIM及びNKDILからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14又は15に記載の方法又は組合せ。前記細胞スキャフォールド材が、フィルム、発泡体、繊維及び繊維メッシュからなる群から選択される物理的形態である、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法又は組合せ。実施例1組換えスパイダーシルクにおける造血及び間葉系幹細胞その直接の微小環境からの好ましくない影響に対して極めて敏感であることが知られている造血幹細胞と、種々の生物分解性の天然又は合成スキャフォールドに接着し、そこで増殖することが示されている間葉系幹細胞を、上述のように、4RepCTを含む組換えスパイダーシルクマトリックスで培養した。HSCを4RepCTの発泡体で培養し、Falcon1008プラスチック及びレトロネクチン被覆プレートで培養されたHSC:sと比較して、それらの分化能力及びそれらの表現型は維持されていた。MSCは、4RepCTで増殖させた場合のコントロールと比較して、類似した細胞数及び分化を示し、4RepCTのフィルム及び発泡体において増殖させた場合、中胚葉系列、例えば骨、軟骨及び脂肪細胞の細胞において分化能力を維持していた。材料と方法組換えスパイダーシルクタンパク質の発現組換えスパイダーシルクタンパク質4RepCTを、先に記載したようにして産生させた上掲。簡潔に述べると、4RepCT発現のために、ベクターと共に、大腸菌BL21細胞を、カナマイシンを含むLB培地中において、30°Cで、0.8-1のOD600になるまで増殖させ、イソプロピルβDチオガラクトピラノシドで誘導させ、さらに室温で3時間、インキュベートした。その後、細胞を収集し、リゾチームとDNアーゼIが補填された20mMのトリスHClに再懸濁させた。完全に溶解させた後、15000gで遠心分離した上清を、Niセファロースが充填されたカラムに充填した。300mMのイミダゾールを用い、結合したタンパク質を溶出させる前に、カラムを広範囲に洗浄した。標的タンパク質を含む画分をプールし、20mMのトリスHClで透析した。室温で1-2時間、1:1000のトロンビン:融合タンパク質の比率を用いたタンパク質切断により、4RepCTをタグから放出させた。放出されたHisTrxHisタグを除去するために、切断混合物を第2のNiセファロースカラムに充填し、フロースルーを収集した。タンパク質含有量を280nmでの吸光度で測定した。スキャフォールド調製精製した4RepCTタンパク質を、上掲のStarkらに記載されたようにして、繊維中に自己組織化させた。ついで、非組織培養処理されたファルコン皿での培養に使用する前に、繊維をより小さな小片に切断した。0.2-2.0mlのタンパク質溶液で、ファルコン1008皿を被覆し、空気乾燥させ、皿の底部に薄層の形成を可能にすることにより、フィルムを調製した。さらに、いくつかのファルコン1008皿を、タンパク質溶液を激しく攪拌した後に得られた発泡体で被覆し、24時間空気乾燥させ、皿の底部に3Dマトリックスを形成させた。137Cs源により送達される280Gyのγ線に暴露することにより、繊維、フィルムまたは発泡体を有する皿を滅菌した。造血幹細胞の単離及び培養健康なBalb/cマウスを殺し、大腿を取り除いた。骨髄細胞を、10mMのHEPESバッファーで緩衝されたハンクス平衡塩溶液を用い、大腿部から流した。BM細胞を、製造者の使用説明書に従い、系列細胞枯渇キットを用いた系列枯渇の後、又は直接使用し、3×105及び5×104細胞/皿にて、それぞれ、マウス幹細胞因子及びmIL3が補填された無血清DMEMHumGeneTher1121292141において培養した。表面抗原の測定4RepCTの存在下での培養の前後に、マウス骨髄細胞を、表現型分析のために収集した。簡潔に述べると、細胞を、0.5のウシ血清アルブミン、0.05のアジ化ナトリウム、及び0.45のグルコースを含むハンクス緩衝HEPES溶液で2回洗浄し、モノクローナル抗体の非特異的結合を防止するために、2の通常の熱失活マウス血清を含有する50μlのHBNに再懸濁させ、続いて、次の表面マーカー:ckit、sca1、CD4、CD8、CD11b及びB220に対して生じたMoAbsと共に、30分インキュベートした。細胞をHBNで2回洗浄し、死亡細胞をヨウ化プロピジウムに基づく分析から除去した。細胞サンプルをFACSCaliburフローサイトメーターを使用して測定し、10000のリストのモードイベントを収集し、Cellquestソフトウェアを使用して分析した。インビトロクローン原性前駆体アッセイ5×104のマウスBM細胞又は1×103の系列枯渇したBM細胞を、濃縮DMEMに入った0.8のメチルセルロース、1のBSA、0.3mg/mlのヒトトランスフェリン、0.1μmol/lの亜セレン酸ナトリウム、1mg/lのヌクレオシド、0.1mmol/lのβメルカプトエタノール、15μmol/lのリノール酸、15μmol/lのコレステロール、10μg/mlのインスリン、100U/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシンを含有する、1mlの無血清半固体状メチルセルロース培養培地にて、ファルコン1008のペトリ皿に配した。顆粒球/マクロファージコロニー形成を、10ng/mlのmIL3、100ng/mlのmSCF、及び20ng/mlのGMCSFを添加することにより刺激し、培養の810日目にスコア化した。赤芽球バースト形成細胞の成長は、100ng/mlのmSCF及び4U/mlのヒトエリスロポエチンにより誘発させ、810日後に計測したが、赤芽球コロニー形成単位の成長はhEPO単独で刺激し、2日後に計測した。巨核球前記細胞を、100ng/mlのmSCF、10ng/mlのmIL3m、及び10ng/mlのmTPOが補填された0.275の寒天培地にて刺激した。10日後にコロニーを乾燥させ、アセチルコリンエステラーゼポジティブ細胞に対して染色し、数え上げた。間葉系幹細胞の単離及び培養ヒトの間葉系幹細胞をLonzaから購入した。細胞を、54のDMEMLG、36のMCDB201、10のFCS、1mMのLグルタミン及び1のペニシリン/ストレプトマイシンBlood9826152625からなる完全培地1において培養した。細胞をトリプシン処理し、コンフルエンスが8090に達した時に継代培養し、培地を34日毎にリフレッシュした。マウスの間葉系幹細胞を、HHを用いて、Balb/cマウスの大腿をフラッシングすることにより得た。完全なBM細胞を、10のFCS、1mMのLグルタミン及び1のペニシリン/ストレプトマイシンが補填されたDMEMLGの存在下で培養した。付着細胞を継代培養し、1週間に1度継代した。培地を34日毎に変えた。分化アッセイ脂質生成分化について、MSC:sを、DMEMLG、10のFCS、1μMのデキサメタゾン、60μMのインドメタシン、500μMのイソブチルメチルキサンチン及び5μg/mlのインスリンからなる脂質生成培地の存在下、21日間培養し、オイルレッドOで染色した。骨原性分化について、MSC:sを、DMEMLG、10のFCS、100nMのデキサメタゾン、10mMのβグリセロホスファート及び0.2mMのアスコルビン酸からなる骨原性培地において、21日間維持した。リン酸カルシウム沈着物の存在を確認するために、細胞をアリザリンレッドSで染色した。軟骨形成分化について、2.5×105の細胞を15mlのポリプロピレンチューブに沈降させ、自発的に形成された3次元ペレットを、DMEMHG、100nMのデキサメタゾン、10ng/mlのTGFβ3、50μg/mlのアスコルビン酸、50mg/mlのITSプレミックスからなる軟骨形成培地において、21日間培養した。ペレット切片を組織学的研究のために調製し、軟骨形成系列の確認のためにアルシアンブルーで染色した。結果4RepCT繊維の存在下における幹細胞の増殖及び分化2回実施される3つの別々の実験において、4RepCTの小片の有無での、マウス骨髄細胞の増殖を研究した。結果を、100ng/mlのmSCF及び30ng/mlのmIL3が補填された無血清培地での、マウス骨髄細胞の増殖における、4RepCTの存在下で4日間培養した影響を示す、表3に提示する。計測された細胞は赤芽球コロニー形成単位;赤芽球バースト形成細胞;コロニー形成単位顆粒球/マクロファージ;及びコロニー形成単位巨核球である。コントロールウェルと比較して、4RepCT繊維の存在下で4日間の培養した後、細胞数と形成されたコロニーの量との間には、有意な差異は見いだされなかった。結果を、3回の別々の実験の平均±標準偏差として表す。全ての実験は2回実施した。11×105BM細胞当たりのコロニー2細胞×105SI:0日に対して比較される刺激指数値マウスMSC:sを、サブコンフルエンスになるまで培養培地で維持し、ついでトリプシン処理した。1×105のmMSCを、7日間、4RepCT繊維の1cm小片の有無において、6ウェルプレートにて培養し、ついでトリプシン処理し、計測した。コントロールウェルは7日後に、5.7倍の増殖を示したが、4RepCTの存在下で培養された細胞は、4.0倍増殖した。しかしながら、培養さらに維持された細胞だけをトリプシン処理し、繊維上で増殖させた細胞を全細胞計測に含めないと、各ウェルに存在する細胞の実際数の過小評価に至った。高密度コンフルエンス近傍での培養における接触阻害による、阻害シグナルの排出を防止するために、7日、14日及び21日後、繊維を培養皿から注意深く取り出し、PBSで洗浄し、培養培地のみを含有する新たなウェルに移動させた。よって、これらの培養皿で生じた細胞は全て単一源、すなわち組換えスパイダーシルク糸から誘導された。ヒトMSC:sを、mMSC:sと類似した条件下で、培養培地に維持した。繊維を1週間に1度、新たな培養皿に移した。培養の21日後、4RepCT繊維を取り出した。培養ウェルの表面を覆い、組換えスパイダーシルク糸から誘導された、残存するhMSC:sをトリプシン処理し、脂質生成、骨原性及び軟骨形成系列における、それらの分化能力についてテストした。全てのテストを3回実施した。4RepCT繊維から誘導された細胞は、4RepCTの不在下で培養された、同様の継代からのhMSC:sと比較して、それに匹敵する分化能力を示した。4RepCTコーティングされた組織培養皿における増殖及び分化マウス骨髄細胞を系列枯渇させ、mSCF及びmlL3を含有する無血清培地において、4RepCTの発泡体でコーティングされた培養皿にて培養した。培養の4日後、lin-/-BM細胞の増殖及びコロニー形成単位の数を、10μg/cm2の濃度で、組換えフィブロネクチン断片CH296でコーティングされたファルコン1008皿及び非組織培養処理された皿において培養された陰性細胞株列の培養物と比較した。インビトロ赤芽球バースト形成細胞;コロニー形成単位顆粒球/マクロファージ;及びコロニー形成単位巨核球の数について、結果を表4に示す。2回実施した実験の1つの結果を示す。11×105BM細胞当たりのコロニー2細胞×105SI:0日に対して比較される刺激指数値さらに、細胞表面マーカーの発現を、異なってコーティングされた皿における培養の前後で測定した。3回実施した実験の1つの結果を示す。データは絶対細胞数×105として表す。SI:0日に対して比較される刺激指数値1×105の老化したhMSC:sを、非組織培養処理された皿、組織培養処理された皿、組織培養処理された6ウェルプレート、及び4RepCTのフィルム又は発泡体でコーティングされた皿に配し、ほぼコンフルエントになるまで培養した。ついで、細胞を、コントロール培地、脂質生成分化培地又は骨原性分化培地において、21日間維持した。それぞれ脂質生成分化及び骨原性分化についての結果を、図6及び図7に提示する。皿のコーティングとは独立して、脂質生成培地の存在下で培養された細胞は、類似した程度の脂質生成分化性を示し、皿の表面上で等しく分割された複数の脂質小胞体を含む丸形細胞を有する。これに対し、老化したhMSC:sは、任意のコントロール条件下で培養した場合、骨原性分化培地で、通常の培地交換を行ったにもかかわらず、もはや骨原性系列に分化することができなかったが、興味深いことに、フィルム又は発泡体でコーティングされたプレートにおいては、ある程度のパッチ状アリザリンレッドS染色を示した。細胞を含有しない、4RepCTのフィルム又は発泡体でコーティングされたプレートは、何のポジティブアリザリンレッドS領域を示さなかったため、この染色は、4RepCTそれ自体の染色に原因するものではない。実施例2組換えスパイダーシルクにおけるヒト胚性幹細胞本実験は、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性を示す。材料及び方法標準的な6ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、3つのウェルはRGD4RepCTフィルムを含有し、残りの3つのウェルは空であった。細胞結合モチーフRGDを有する4RepCTフィルムを、本質的に実施例1に記載したようにして調製した。組織培養プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。実験の準備において、組織培養プレートを、クラスIIの微生物学的安全キャビネットにおいて、30分間、UV照射をした。ついで、各プレートにおける3つの空のウェルを、製造者のプロトコルのようにして、CELLstartTMCTSTMで被覆した。ヒト胚性幹細胞を、製造者のプロトコルのようにして、血清及びフィーダーフリーの培地STEMPROhESCSFM-ヒト胚性幹細胞培養培地を用い、CELLstartTMにおいて培養した。細胞を、製造者のプロトコルのようにして、STEMPROEZPassageTM-使い捨て幹細胞継代ツールを使用し、90コンフルエントなウェルから、1:6の比率で継代した。ウェルをPBSで洗浄し、培地を全てのウェルに配し、細胞を播種する前に、プレインキュベートした。継代64での細胞を、推奨する密度で全てのプレートの全てのウェルに播種し、播種後の細胞妨害がないようにケアした。全てのウェルを、製造者のプロトコルのようにして、STEMPROhESCSFMを用いて培養した。37°C、空気中に5のCO2、湿度95にて、標準的な培養インキュベーターでインキュベートを行った。細胞を毎日観察し、48時間毎に、100の培地を交換した。全ての培地は、摂食交換の2時間前に、インキュベーター条件に対して前平衡した。研究の終わりに、製造者のプロトコルのようにして、ウェルをSigma-Aldrich:アルカリホスファターゼ、白血球で染色した。結果細胞培養実験から選択された画像を、図8-12に提示する。全てのコントロールウェルは、使用したコントロール培養条件下でこのhESC系で予期されるであろう、特徴及び形態を示した。RGD4RepCTフィルムは、細胞の付着及び増殖に成功した。成長はコントロールウェルで見られるものよりも遅かったが、これは、新たなマトリックスに細胞が適応した結果であると考えられる。最初の細胞配置において、細胞は、マトリックスに対するある程度の付着性を示したが、非付着細胞は胚様体構造の外観をとり、このことは、hESC:sを、系列及び分化分析用にEB構造体を特異的に誘導するため、低付着性又は低クラスター性のプレートに配した場合に見られた。しかしながら、これらの細胞のEB様凝集体は、結局はマトリックスに付着し、これらの凝集塊から、細胞は成長し、拡大すると見られ、新規のマトリックスへの適合が示唆される。この研究の細胞は、常に成長し、摂食しており、拡大し続けることが予期される。さらに、細胞は継代及び増殖可能で、それらの多能性及び分化状態について評価可能であることも予期される。ポジティブアルカリホスファターゼ染色により、細胞が未だに未分化幹細胞の特徴を示すことが提示された。実施例3組換えスパイダーシルクにおけるマウス胚性幹細胞背景マウス胚性幹細胞は、フィーダー依存性、又はフィーダー独立性のいずれかとすることができる。mESCは、未分化を維持するために、培養培地に存在するLIFと共に培養する必要がある。それらの分化状態は、多能性細胞がAPを発現し、ポジティブ染色されるため、アルカリホスファターゼ活性染色により、又は1セットの分化マーカーの転写を測定することにより、決定することができる。手順継代17におけるフィーダー依存性mESCを解凍し、20の熱失活したES細胞認定FBS及び5×105単位/mlのLIFが補填されたグルタマックスを含有するDMEMにて、60mmのペトリ皿中のMEFの層に配した。2日後、細胞を収集し、ここの実施例に記載されたようにして調製した種々の4RepCTスキャフォールド、並びに12ウェルプレートのコントロールに播種した。分割比は1:7であった。培地を毎日交換し、細胞を2日毎、又は4日毎に分割させた。ゆっくりと増殖するため、スキャフォールドにおいて成長する細胞については、より長い分割期間を使用した。細胞が多能性を維持しているかどうかを評価するために、細胞を、4のパラホルムアルデヒドを用いて1分固定し、ついで、各継代の終わり、又は継代21のスキャフォールド上の細胞については3日後に、アルカリホスファターゼ活性ついて染色した。つまり、スキャフォールド上に維持されている細胞は、p21の終わりに、全体で443=11日培養されたが、ゼラチン又はMEF上で維持された細胞は、p21の終わりに、222=6日培養された。顕微鏡写真を反転顕微鏡にて撮った。結果ゼラチン上で成長したmESCは分化し始め、形態を失ったが、MEF上で成長した細胞は、3継代後でも、丸いコロニー形態及び幹細胞性を維持していた。mESCは、MEFと比較して、全てのスキャフォールドタイプにおけるコロニー数が少なかったことが示されていることから、MEFに対する結合性と比較して、発泡体及び繊維メッシュの双方への結合度合いの低さが提示された。スキャフォールド上で成長したコロニー数は、ゼラチン上で成長したコロニー数とほぼ同じであった。スキャフォールド材と結合すると、細胞は成長し、発泡体及び繊維メッシュにコロニーを形成するが、いくつかのコロニーは、MEFと比較してあまり滑らかでない形状を示す傾向にある。コロニーは、ゼラチン上のものと同じようにみえる。発泡体及び繊維メッシュを分割することなく、4日後、コロニーは非常に大きくなっており、部分的に分化し始めていた。第3の継代において、細胞を、3日間、それぞれのスキャフォールドにおいて増殖させた。コロニーは発泡体においてはAPポジティブ性を維持していたが、繊維メッシュでは分化の兆候を示した。4RepCTの発泡体において、コロニーは、RGD4RepCTの発泡体と比較して、より多く、より大きくなっていた。図13を参照し、それぞれの基質上の第3継代の3日目及び2日目に、AP活性について染色した。AP染色により、MEFにおけるmESCで見られたものと類似していることが示されたため、4RepCTの発泡体において成長する細胞は幹細胞性を維持していることが提示された。これに対し、繊維メッシュにおいて成長するmESCは、分化の兆候である弱い染色を示した。RGD4RepCTの発泡体におけるコロニーは小さいがAPポジティブであり、あまり増殖しないが、幹細胞性を維持していることが示された。継代なしに4日の培養後、発泡体及び繊維メッシュ上のコロニーに見られる分化は、コロニーが異常増殖し、あまりに大きくなった結果であるとすることができるが、細胞がそれらの多分化能を維持するために依存しているMEFにより分泌される因子を欠いているためでもあるとできる。このことは、MEFを含まないゼラチンに維持されている細胞も分化し始めるといった観察により裏付けられる。繊維メッシュにおいて、コロニーがまだ2日後のMEF上のコロニーに匹敵するサイズである時点で、細胞は3日後に分化し始めた。結論mESCは、4RepCT及びRGD4RepCTの発泡体及び繊維メッシュに結合し、増殖することが示されている。4日後、4RepCT及びRGD4RepCTの発泡体及び繊維メッシュにおけるmESCは、大きなコロニーである可能性のため、分化し始めた。しかしながら、これらの細胞が、新規に調製されたスキャフォールドに播種され、3日間培養された場合は、4RepCT及びRGD4RepCTの発泡体において、それらの幹細胞性を維持しており、コロニーの大きさは、2日後にMEFにおいて見られたものと類似していた。4RepCTの発泡体と比較して、RGD4RepCTの発泡体においては、ゆっくりとした成長が観察された。ゼラチンで2日間維持された細胞は分化し始め、MEF上のmESCも、大きなコロニーであるために、4日後に分化し始めるであろう。4RepCTの発泡体において、付着性、成長性及び幹細胞性の維持は、ゼラチンと比較して改善していた。mESCは通常、それらの幹細胞性を維持するために、MEFにより提供される因子に依存しているため、本結果は驚くべきことである。実施例4組換えスパイダーシルクにおける神経幹細胞材料及び方法スキャフォールドを含有するウェル及びポジティブコントロールウェルの調製4RepCT、IKVAV4RepCT及びRGD4RepCTを組換え的に生成させ、Hedhammarら,上掲の記載に類似させて精製した。得られたタンパク質溶液の一画分を、HedhammarらBiomacromolecules11953959に記載されたようにして、リポ多糖類から精製した。実施例1に記載したように、スキャフォールドの調製に使用する前に、タンパク質溶液を滅菌濾過した。半分のスキャフォールドを、リポ多糖類が枯渇したタンパク質溶液から作製した。細胞培養プレートに配する前に、2.8バール、蒸留水において、121°Cで15分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の6ウェル細胞培養プレートにおいて調製した。ポジティブコントロールとして、ポリLオルニチン及びフィブロネクチンでコーティングされたウェルを使用した。野生型4RepCTを有する6ウェルプレートの概略を、以下に付与する。さらに、類似のプレートを、野生型RepCTスキャフォールドを、それぞれIKVAV4RepCT及びRGD4RepCTから作製されるスキャフォールドと交換し、全体で9の実験用プレートを作製することにより調製した。コントロールプレートとして提供される第10番目の6ウェルプレートの2つのウェルを、以下のプロトコルを使用して調製した:-各ウェルに2mlのポリLオルニチン溶液を添加-37°Cで、細胞培養インキュベーターにおいて一晩インキュベート-吸入によりポリLオルニチン溶液を除去-細胞培養インキュベーターにおいて24時間インキュベート-PBS1xで2回洗浄プレートの残った4つのウェルは被覆しない、すなわち細胞を、ポリスチレンプラスチックの表面に直接播種した。例えば、コントロールプレートは概略的に以下のように表すことができる:上述した物質を、48時間未分化状態のNSCの培養に使用し、ここで細胞は星状細胞に分化した。さらに、神経幹細胞の特徴の詳細な研究のために、4RepCTフィルムを用いた一連の細胞培養プレートを、以下のようにして調製した:-各プレートの6つのウェルの5つに、4RepCTフィルムを持つ3つの6ウェルポリスチレンプレート。空のウェルと1つの付加的なウェルを、上述に従い、フィブロネクチン及びポリLオルニチンで被覆した。これらのプレートを、4896時間、未分化状態のNSC細胞を増殖させるのに使用され、その後、該細胞は星状細胞、オリゴデンドロサイト及びニューロンに分化する。-コントロールプレート:1つの6ウェルポリスチレンプレート。第1列を上述に従い、フィブロネクチン及びポリLオルニチンで被覆し、第2列をBSAで被覆し、第3列は被覆しないままにした。-4RepCTフィルムを有する7つの35mmポリスチレンプレートを、細胞死の率及び割合を特異的にかつ性格に分析するために調製した。溶液培地:N2培地DMEM:F12Lグルタミン1mlの50mg/mlトランスフェリン100μlの100μMプロゲステロン50μlの1Mプトレシン溶液30μlの500μM亜セレン酸ナトリウム1mlの12.5mg/mlインスリン5mlのPen/Strep溶液N2培地は、一次細胞の培養のための標準培地である。バッファー:ハンクス50mlの10×HBSS、1.85gのNaHCO3及び1.95gのddH2Oに溶解させたHEPES、pH7.2に調節。フィルター滅菌。使用液:ddH2OにポリLオルニチンが入ったもの。フィルター滅菌ddH2Oにフィブロネクチンが入ったもの。フィルター滅菌NaOH保管溶液:ddH2Oにプトレシンが入ったものEtOHにプロゲステロンが入ったものddH2Oに亜セレン酸ナトリウムが入ったものPBSにFGFが入ったもの0.02MのHClにインスリンが入ったもの。滅菌濾過DMEM:F12にトランスフェリンが入ったもの。滅菌濾過皮質神経幹細胞神経幹細胞を、妊娠したスプラーグドーリーE15.5ラットの胚の解離大脳皮質から得た。NSC:sを、N2サプリメントに富む、1ml/962mM2の無血清DMEM:F12培地において培養し、ポリLオルニチン/フィブロネクチンどコーティングされた細胞培養皿において増殖させた。80コンフルエンスに達するまで、10ng/mlのFGF2細胞を使用し、細胞を増殖状態で維持し、実験に使用する前に、2回継代した。第2継代後に、細胞を150000細胞/cm2で播種し、48時間培養した。細胞が未分化のままであるかを決定するために、ネスチンで染色した。NSCの分化を誘発させるために、FGF2を培養物から引き出し、新鮮な培地を、特定の組換え成長因子又は小分子と共に添加し、特異的な分化を誘発させた。星状細胞分化について、10ng/mlの組換えCNTFを添加した。CNTF及びインターロイキン6ファミリーの他の因子が、星状細胞の形態を有し、原型的星状細胞マーカーGFAPNature419934939に対してポジティブな細胞において、急速で効率的な皮質NSCの分化を誘発し、これらの細胞が機能的星状細胞であることが、カルシウムイメージング技術により、近年示されているMolCellNeurosciEpub14January2011。神経細胞分化について、0.51.0mMのバルプロ酸又は10ng/mlの組換えBMP4及び10ng/mlのWnt3aを、FGF2の引き出し後に投与した。VPAは、神経細胞マーカー抗体TuJ1に対してポジティブであり、神経細胞形態を有する、1030早期の、電気生理学的に無反応の細胞に、NSCの急速な分化を誘発する。VPA誘発性の分化した細胞の遺伝子発現分析により、それらが、阻害ニューロンへ分化プログラムを開始させることが示唆された。BMP4Wnt3aは、TuJ1を含む全てのパン神経細胞マーカーに対してポジティブであり、神経細胞形態を有する、1030成熟した、電気生理学的に活性な細胞に、NSCのゆっくりとした分化を誘発するPLoSOne5e13833。BMP4Wnt3a誘発された分化細胞の遺伝子発現及び生理学的分析により、それらが、興奮性ニューロンへの分化プログラムを開始させることが示唆された。また、BMP4Wnt3a処理により、VPAを使用して分化した細胞と比較して、神経細胞の成熟した表現型の一因である星状細胞分化の増加にも帰する。オリゴデンドロサイト分化について、50ng/mlの甲状腺ホルモンを添加した。T3は、47日以内に、最も原型的オリゴデンドロサイト特徴的タンパク質に対してポジティブであり、オリゴデンドロサイト形態を有する細胞に、高められた分化を誘発する。分化は他のプロトコルから得られたものより効果的ではないが、コントロール培養におけるオリゴデンドロサイトの数は非常に少ない、例えば<<1であることを記しておくべきである。免疫細胞化学免疫細胞化学について、培養物をPBSで1回洗浄し、20分間、10ホルマリンで固定した。次に、細胞を、PBS0.1のトリトンX100で、3×5分洗浄した。一次抗体を4°Cで一晩インキュベートした。次に、プレートをPBS0.1のトリトンX100で、6×5分洗浄し、二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。次の抗体:Sigmaのマウスモノクローナル抗平滑筋アクチン;DAKOのウサギポリクローナル抗グリア線維酸性タンパク質;CoVanceのマウスTuJ1、及びChemiconのラット抗MBP、続いて適切な種特異性アレキサ488及びアレキサ594コンジュゲート二次細胞を使用した。DAPIを含有するVectashieを使用し、核を可視化した。蛍光及び明視野画像をAxiovisionソフトウェアを具備する、ZeissAxioskop2motplusAxiocamMRmカメラを使用して獲得した。増殖アッセイ50μMの5エチニル2デオキシウリジンを添加した15分後に、10ホルマリンを使用して細胞を固定し、続いて、供給者の推奨に従い、免疫細胞化学を行った。細胞死アッセイスキャフォールドに付着した生存細胞と死亡細胞を区別するために、生存/死亡キットを使用した。製造者の推奨に従い、アッセイを始める前に、予め暖めておいたPBSで、プレートを2回すすいだ。アッセイにより、生細胞及び死亡細胞を同定することができた。結果繊維メッシュ、発泡体又はフィルムにおいて成長及び拡大した場合の、神経幹細胞の増殖性及び生存率、及び星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトへの分化の可能性における実験。特に示さないならば、全ての実験は3回実施した。48-72時間後、NSCは、発泡体及びフィルムにおいて、正常に増殖した。ウェルにおいて、プラスチックの一部をフィルム及び発泡体の隣に暴露させ、細胞はフィルム及び発泡体においてのみ成長した。形態はコントロール培養とは区別できなかった。ネスチンで染色した時、4RepCTにおけるNSCの外観は、ポリLオルニチン及びフィブロネクチンにおいて成長した細胞のものとは区別できなかった。フィブロネクチン及びポリLオルニチンでコーティングされた、シルクスキャフォールドを有するウェルにおいて、細胞は全てのプレートウェル上で成長しており、ウェルのプラスチック表面がコーティングされているので、このことは予期される。コントロールに対し、4RepCTフィルム上で成長したNSC間の細胞死亡及び増殖においては、48時間を超える任意の段階で、何の明らかで有意な差異は見られなかった。また、コントロールと比較して、4RepCTの発泡体状構造体上で成長したNSC間にも、何ら明らかな差異は見られなかった。BSAコーティングされたウェルにおいて、細胞は付着せず、予期したように、5日以内に死亡した。4RepCTのフィルム及び発泡体構造体上で増殖させた場合、NSCは、FGF2の存在下で、コントロール培養の幹細胞と、形態学的に区別できないままであった。それらは、生存可能であり、増殖し、及び未分化状態を維持しており、コントロールと比較して、何の有意な差異も検出されなかった。NSCが分化能力に関して多能性を維持しているかどうかをテストするために、種々の神経系列への分化をテストするための一連のプロトコルを、上述した方法の項に詳細に記載されたようにして適用した。4RepCTフィルム上で増殖させたNSCを、方法に記載したようにして、CNTFで処理した場合、それらは、原型型マーカータンパク質GFAPを発現する星状細胞の形態を有する細胞に、急速に効率的に分化し、コントロール培養と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった。4RepCTフィルム上で増殖させたNSCを、方法に記載したようにして、BMP4Wnt3aで処理した場合、それらは、原型型抗体TuJ1でポジティブ染色された神経細胞の形態を有する細胞に分化し、コントロール培養と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった。4RepCTフィルム上で増殖させたNSCを、方法に記載したようにして、VPAで処理した場合、それらは、原型型抗体TuJ1でポジティブ染色された神経細胞の形態を有する細胞に分化した。コントロール培養と比較して、増殖又は細胞死には、何の有意の差異はなかったが、分化においてわずかに効率性の低下が観察された。組換え成長因子が細胞内的に作用するのに対し、小分子VPAは基質に付着し分解するという事実のために、VPA媒介性分化が基質により影響を受けることは、以前から観察されている。それにもかかわらず、NSCのVPA媒介性神経細胞分化が、実際に4RepCTフィルムにおいて観察された。4RepCTフィルム上で増殖させたNSCを、方法に記載したようにして、T3で処理した場合、それらは、原型型マーカータンパク質MBPを発現するオリゴデンドロサイトの形態を有する細胞に効率的に分化し、コントロール培養と比較しても、効率性、増殖又は細胞死に何の有意の差異はなかった。MBP染色は、コントロール条件下で分化した細胞よりも、おそらくあまり成熟していない形態であることを示唆していると観察された。しかしながら、オリゴデンドロサイト成熟は複雑であり、このような観察には、決定的になる前に、注意深く拡張分析する必要があることを記しておくべきである。lps枯渇した又はしていない4RepCTタンパク質から作製されたスキャフォールド間での比較において、いずれの実験においても、形態、増殖、生存率、又は分化能力において、何の有意の差異も観察されなかった。さらに、IKVAV4RepCT又はRGD4RepCT上で成長したNSCにおいて、形態、増殖、又は生存率に、明らかな負の差異は見られなかった。実施例5スパイダーシルクスキャフォールドにおける、ランゲルハンス島と単一ベータ細胞、単独又は他の細胞との組合せ背景ランゲルハンス島の移植は、重度のI型糖尿病の、広範囲に適用可能な処置を見いだすための、最も前途有望なアプローチの一つである。残念ながら、現在利用可能な手順は、膵臓細胞の機能及び生存性が失われるための、低い効率性に悩んでいるTransplantation8617831788。成功率の低さは不完全に理解されているが、移植前、島の単離中、細胞を包囲する環境は破壊され、血管新生及び神経支配の喪失、細胞外マトリックスとの相互作用の変化に至る。このことは、制限された生存性及び機能の主要原因であることに暗示されているXenotransplantation14288297KilkennyandRocheleauMolEndocrinol22196205。外分泌部分とは異なり、膵臓の内分泌部分は、それらが所有する基底膜を生成しないが、むしろその周囲の環境に依存し、正しいニッチが重要であるかもしれないことを、再度示唆しているDiabetesObesMetab10Suppl4119127。島移植に対する他の主要な障害物は、ドナー不足によるベータ細胞の利用可能性が制限されることである。多くの他の細胞型と異なり、ベータ細胞は、それらを拡大させる試みにより脱分化に至るため、インビトロでの増殖は不可能であるTissueEng13589599。島及びベータ細胞にとって最適な環境の確立は、膵島及び島細胞の研究及び増殖、及び移植用の人工島/ベータ細胞キャリアの設計の双方にとって必要である。このことを実施するために、高度に多用途の生体材料が、スキャフォールドとして必要とされている。近年、生理学的条件下における組換えスパイダーシルクタンパク質生成の成功が、本発明の研究グループにより報告されている。タンパク質ポリマーは、3次元繊維メッシュ、発泡体又はフィルム等の、種々の物理的形態を採択可能な、強くて高度に多目的な物質を作成可能である。このようなスキャフォールドの安定性により、後続する移植のための、細胞の検索が可能になる。さらに、スキャフォールドは、例えばベータ細胞等、付着に適した特異的細胞結合モチーフで機能化させることができる。これらの特性により、天然の細胞環境を模倣したスキャフォールドを生成するための、優れた候補であるタンパク質が作製され、よってランゲルハンス島及び単離後の個々のベータ細胞に対する支持体が提供される。移植後、例えば適切な血管新生を用い、島を宿主環境において採択することが重要である。同時に、ネガティブな宿主免疫応答、例えば即時炎症反応は回避されるべきである。新規の毛細管の形成には内皮細胞が必要であり、もちろん、これらの細胞は血液との接触に対して容易に耐える。間葉系幹細胞は、内皮細胞における重要な成長因子の発現をアップレギュレートし、プロテアーゼを生成可能であり、よって新規の毛細管のための経路を作製することができる。ここに記載の実験により、機能化されたシルクのスキャフォールドを使用することで、個別化された島環境を組み立て可能であり、島細胞、内皮細胞及び間葉系幹細胞の付着性及び組合せ成長が可能になることが示される。実験材料組換えスパイダーシルクタンパク質、4RepCTを、実施例1に記載したようにして調製されたスキャフォールド構造体の形成において、本質的にHedhammarら上掲に記載したように調製した。RGD、IKVAV、及びYIGSR等、細胞外マトリックスに関連した種々の細胞結合モチーフの導入により、又はトリペプチドRGEの導入により修飾された変異体の形態、又は元来の形態4RepCTに、材料を使用した。他の変異体には、スピドロインN末端ドメイン及びC末端Hisタグが含まれ、NT4RepCTHisと命名されたタンパク質が生じるランゲルハンス島ヒト及びマウスの島からの細胞、例えばベータ細胞内皮細胞間葉系幹細胞実験方法細胞単離ヒトランゲルハンス島を、修正半自動消化濾過法を使用することにより、スエーデンのウプサラ大学の臨床免疫学部会にて単離し、その後、栄養補助剤及び10のヒト血清を含有する、CMRL1066培地で培養したDiabetes5723932401。齧歯動物ランゲルハンス島を、コラゲナーゼ処理された膵臓から単離し、連続した機械的振揺により消化させ、外分泌組織から分離し、その後、栄養補助剤及び10のFBSを含有する、RPMI1640培地で培養したDiabetes5422872293。単一細胞を、10ヶ月の肥満マウスの島、又はヒトドナーの島から調製した。アキュターゼ消化プロトコルに従い、単一細胞を単離した。簡潔に述べると、200の島をプールし、1×PBSで2回洗浄した。その後、1mlのアキュターゼを島に添加した。島アキュターゼ懸濁液を、ゆっくりと振揺させる2工程を伴い、37°Cで1015分インキュベートし、その後、島の単一細胞を1×PBSで2回洗浄し、ついで蒔き、種々の物理的形態であり、種々のペプチドモチーフを有する又は有さない、4RepCTスキャフォールドの種々の変異体において培養した。細胞培養4RepCTスキャフォールドと組合せたヒト島を、栄養補助剤と共に、CMRL1066において培養した。4RepCTスキャフォールドと組合せた単一の島細胞及び齧歯動物島を、補填されたRPMI1640培地において培養した。商業的に入手可能な、ヒト微小血管内皮細胞を得、よく知られている方式で、供給者の使用説明書に従い、培養物に維持した。商業的に入手可能な、骨髄から誘導されたヒト間葉系幹細胞を得、よく知られている方式で、供給者の使用説明書に従い、培養物に維持した。細胞培養プレートを、島用のコントロールとして使用した。組織培養処理されたプラスチックを、単一細胞の成長をコントロールするために使用した。付着アッセイ多数の島を、コントロールとして通常の培養プラスチック、及び4RepCTスキャフォールドの種々の変異体及び細胞結合モチーフに配した。特定の島培地を使用し、4RepCT及び島を5日間培養した。この期間、付着した島を毎日計測した。2日毎に培地交換を実施し、インスリン放出性を5日目に研究した。その後、4RepCTスキャフォールド内の島を、2週間まで培養し、その際に島の生存性を分析した。ヒトドナーからの島を使用する一実施態様においては、島を12週間培養した。島及び島細胞の機能及び生存性の評価個々の島及び島細胞の双方、ヒト及び齧歯動物の双方におけるシグナル伝達を、種々の4RepCTベースのスキャフォールドにおいて、種々の期間、種々の成長、機能及び生存促進条件下で、無傷の島又は島細胞を培養した後に研究した。島細胞の成長、機能及び生存性を、種々のシグナル伝達経路における特定の行程に対するバイオセンサー、及び種々の蛍光染料を用いてモニターした。いくつかの重要な事象をテストした:グルコース代謝、遊離のCa2の細胞質濃度、増殖、及びアポトーシス/壊死。例えば、ATP生成、エキソサイトーシス、及び刺激誘発性インスリン遺伝子転写についてテストすることもできる。インビボ移植島及び4RepCTの移植を、POBerggrenslaboratoryNatProtoc312781286SpeierらNatMed14574578において開発された方法に従い実施した。この方法では、生理学的及び糖尿病状態の双方にある生存生物体における、細胞の生存性、機能及び組込みを研究するための方法として、角膜を使用した。結果A島の培養野生型、又は種々の細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフの導入により修飾された変異体の双方の4RepCTの使用は、単離後の膵島の機能及び生存性を維持するための最適な環境を定める可能性がある。島を、ヒト膵臓及びマウス膵臓から単離した。島を、それらに特異的な媒体及び血清において、3時間~3日培養した。その後、4RepCTの種々の変異体上に配した、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSR。また、島をNT4RepCTHis上にも配した。図18A及び図18Bに示すように、島は、4RepCT変異体に自発的に付着した。空の培養プレートをコントロールとして使用した。これらの結果から、フィルム及び繊維と比較して、発泡体状のスキャフォールド構造体への優先的付着が観察された。よって、付着性及び機能の全てのテストを、発泡体状構造体において続けた。付着した島を5日目まで、播種後毎日計測した。島は、図20、図21AB及びn=1;実験を3回実施に示すように、島は種々の数で付着していた。また、種々のモチーフ間での比較を実施し、2、4及び5日目に、モチーフRGDを有する4RepCTについては、付着性にかなりの増加が見られた。さらに、コントロールと比較して、増加した方式で、島はNT4RepCTHisに付着した。4RepCTと接触した島をグルコースに暴露し、5日目にインスリン放出性を測定した。結果を図22AFに示す。インスリンは、4RepCTにおいて培養されたマウス島から放出された。また、NT4RepCTHisで培養された場合も、マウス島はインスリンを放出した。4RepCTで培養された場合、ヒト島は、グルコース刺激の後にインスリンを放出した。全ての島が発泡体状スキャフォールドに付着したわけではなく、よって2日目及び5日目における付着した島のインスリン放出機能を、別の実験でテストした、図22F。島によるグルコース刺激されたインスリン放出性は、ペプチドモチーフを有する又は有さない、4RepCTスキャフォールドでコーティングされたウェル、及びコントロールウェルにおける培養後と類似していた。これにより、4RepCTスキャフォールドで培養された島はそれらの機能を維持していることが示された。また、NT4RepCTHisで培養された島も機能を維持していた。最初の基底グルコースで測定されたインスリン放出性は、ペプチドモチーフを有する又は有さない4RepCTスキャフォールドでのいくつかのマウス実験においては高く、これは、これらの実験用島に間に高い変異性があり、スキャフォールドから洗い流すことが困難な、最初の培養培地に暴露された結果であると考えられる。刺激指数を各ウェルにおいて別々に測定したところ、スキャフォールド上のすべての島が、コントロールと等しく良好にインスリンを放出することにより、グルコースに対して応答することが示された。4RepCTスキャフォールドで培養されたヒト島は、細胞結合モチーフにかかわらず、低い基底インスリンレベルを示し、高度にグルコースに暴露した後に、満足のいく、刺激されたインスリン放出性を示した。遊離のCa2の細胞質濃度を、種々のモチーフを担持するスキャフォールドにおいて培養された島ついて測定した。島はグルコースに応答し、レシオメトリック画像分析により証明されるように、Ca2における増加が示された。コントロール島とスキャフォールドで培養された島の間には、何の差異も観察されなかった。島を2週間培養した。その後、島を計測し、生存率についてスキャンした。スキャフォールドにおける島の島形態は、2週間後も保存されていたが、コントロール島は、より不規則な形状により可視化されるような糖分解を示し、単一細胞に懸濁していた。壊死体を光学顕微鏡で分析した。さらなる壊死体がコントロール島に見られたが、4RepCTスキャフォールドで培養された、マウス及びヒトの双方の島は、無傷であり、生存していた。若いヒトドナーからの島を長期間培養し、5日後、4週間後及び12週間後のインスリン放出性、及び島様クラスターの形成についてテストした。RGDモチーフを有する発泡体状スキャフォールドにおける島は、4週間後、島様クラスターの形成の増加を示した。これらのクラスターは細胞に付着し、島と島様クラスターの間の細胞は、RGD4RepCTスキャフォールド構造体に沿って成長した。島と発泡体状構造体との間のこのような細胞成長は、YIGSRモチーフを有するスキャフォールドにおいても見られた。RGDを有するスキャフォールドに対する、インスリン放出性は経時的に増加し、YIGSRモチーフを有するスキャフォールドにおいて維持されており、これらの結果は、このような長期間の培養後、コントロール島と比較して、満足のいく機能を示す。染色により、島と島様クラスターに、インスリンポジティブ細胞が示された。Bベータ細胞単独の培養単一細胞を、肥満マウスの膵臓のランゲルハンス島、及びヒト島から単離した。単一細胞を配し、種々の4RepCT、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSRにおいて、37日間培養した。形態分析には、単一細胞が4RepCTの種々の変異体に、種々の方式で付着していることが示された。単一細胞の長期間培養を分析した。組織培養処理されたプラスチックをコントロールとして提供し、RGD等、導入された細胞結合モチーフを有する4RepCTの発泡体又はフィルムでコーティングされたウェルと比較した。全ての異なるウェルにおいて、図28に示すように、単一細胞は細胞クラスターを形成した。これらの細胞クラスターは形態が異なり、例えばコントロールにおいては散乱クラスター、例えばRGDモチーフを有する4RepCTにおいては丸型クラスターを示した。これらのクラスターを2週間後に計測し、ついでインスリン染色などの組織学的分析用に保存した。結果には、見いだされたこれら丸形クラスターの量は、RGDを有する4RepCTの発泡体において増加しており、これらの丸形クラスターは、図28Cに示すように、インスリンポジティブであることが示されている。これらの結果には、通常の細胞培養プラスチックにおいて培養された単一細胞と比較して、4RepCTが島のベータ細胞の機能を維持可能で、インスリンポジティブである丸形細胞クラスターの成長を高めることを示している。C他の細胞と組合せたベータ細胞の培養単一マウスベータ細胞、ヒト内皮細胞、及びヒト間葉系幹細胞を、導入されるモチーフ:なし、RGD、RGE、IKVAV及びYIGSRを有する、4RepCTの発泡体状スキャフォールドに、単独又は組合せて配し、培養した。間葉系幹細胞は、単独で培養された場合、スキャフォールド構造体に付着し、それに沿って成長した。単一ベータ細胞、内皮細胞、及び間葉系幹細胞は、発泡体状のスキャフォールドにおいて成長し、4RepCT及びRGD4RepCTにおいて、クラスター形成の増加を示した。ランゲルハンス島又は島細胞と組合せた、4RepCTスキャフォールドの移植は、生着支持を示すことが予期される。結論種々の4RepCTスキャフォールドを用いた島の培養により、細胞レベルでの糖尿病の潜在的処置方法の開発に関する、基本的研究が可能になる。種々の変異体を有する4RepCTスキャフォールドでの、島及び島単一細胞、例えばベータ細胞の培養は、インビトロにおけるそれらの機能の維持及び増加に役立つ。レシピエント自身の内皮細胞及び間葉系幹細胞を使用し、レシピエントに移植するならば、4RepCTスキャフォールドでのインスリン複合細胞集合体の培養は、インスリン生成装置としての可能性を有する。ProfBerggren研究所で近年開発された技術を使用し、マウスの目から前房に島と4RepCTとを一緒に移植することで、島の生着及び生存性が改善されることが予期される。ランゲルハンス島又は島細胞と組合せて、4RepCTスキャフォールドを移植することで、生着支持性を示すことが予期される。この実施例に記載された研究では、4RepCTスキャフォールドに基づき、移植可能な人工的インスリン生成装置の開発にとっての事前必要事項を実施した。実施例6組換えスパイダーシルクにおける内皮細胞血管の成長は、再生医療における組織工学に必須である。内皮細胞は血管成長の原因であり、このプロセスにより、ある種の状況において、例えば創傷治癒が誘発される。体内では、器官及び組織に応じて、多くの異なる種類の内皮細胞が存在する。組織に密接に接触して存在する内皮細胞は、微小血管内皮細胞として知られてる。実験材料商業的に入手可能な微小血管内皮細胞は、よく知られている方法で、供給者の使用説明書に従い、培養物から得られ、維持される。4RepCTタンパク質の種々の変異体ポリマーを含有する細胞スキャフォールド材を、実施例1に記載されたように、種々の物理的形態に調製した。4RepCTタンパク質を、任意の付加的な細胞結合モチーフを有さない未修飾の野生型形態、並びにペプチド細胞結合モチーフRGD、IKVAV又はYIGSRで修飾された形態で使用した。実験方法細胞を、種々のスキャフォールド材に添加し、研究した。細胞において、増殖アッセイ及びBD経路アッセイを含む、様々なアッセイを実施した。例えば、細胞機能アッセイ、アポトーシス及び壊死の生存/死亡アッセイ、及び組織学的アッセイを実施することも可能である。組織培養処理されたプラスチックプレートをコントロールとして使用した。結果結果を図31及び32に提示する。種々の4RepCTスキャフォールドと共に、培養物において、内皮細胞は付着し、成長した。培養の3日後、それらの形態を分析し、細胞量を計測した。形態分析には、細胞結合モチーフを有する又は有さない、種々の物理的形態の4RepCTスキャフォールド上の細胞は付着し、生存していることが示された。結論内皮細胞は生存可能であり、4RepCTスキャフォールドで成長可能で、そこで増殖能力を示した。実施例7組換えスパイダーシルクにおける線維芽細胞4RepCTから調製されたスキャフォールドが、一次線維芽細胞に依存して足場の成長を支持し、細胞が生存しており、物質に付着し、それらの主要機能の一つを維持しており、すなわちI型コラーゲンを分泌することを示す実験を実施した。4RepCTスキャフォールドでは、組織培養処理されたプラスチックと比較して、細胞成長を支持する能力の増加が示された。インテグリン結合モチーフRGDの導入により、この細胞の支持能力がさらに改善された。野生型4RepCTとRGD4RepCTにおける成長は、双方とも、血清タンパク質に無関係であることが示された。材料及び方法細胞培養新生児由来の一次ヒト皮膚線維芽細胞、HDFnを、5のウシ胎児血清、ペニシリン及びストレプトマイシンが補填された、ダルベッコの改変イーグル培地栄養混合物F12HAMにおいて培養した。平行実験において、、一次ヒト線維芽細胞を、25μg/mlのアスコルビン酸、及び5mMのLグルタミンが補填された無血清細胞培養培地PC1において培養した。3000細胞/cm2又は15000細胞/cm2の密度で、細胞を4RepCTスキャフォールドに播種した。全ての実験を、37°C、5のCO2、湿度95にて、継代8において実施した。細胞培養スキャフォールド精製後、付加的なN末端細胞結合モチーフRGD、IKVAV及びYIGSR、又はトリペプチドRGEを有する又は有さない、組換え的に発現した4RepCT上掲を、遠心濾過により濃縮し、実施例1の記載に従い、スキャフォールドを調製する前に滅菌濾過した。同様に、組換えNT4RepCTHisを調製した。2.8バール、蒸留水において、121°Cで15分、オートクレーブ処理することにより繊維を滅菌した。スキャフォールドを疎水性の96ウェル細胞培養プレート、又は細胞培養チャンバーガラススライドにおいて調製した。ネガティブコントロールとしてスキャフォールドを有さないウェル、ポジティブコントロールとして組織培養処理されたプレートを使用した。プレート及びチャンバースライドを、全速力のファンを用いた滅菌条件下、室温で一晩乾燥させた。スキャフォールドを滅菌PBSで2回洗浄し、細胞播種の前に、37°C、5のCO2で1時間、完全細胞培養培地でプレインキュベートした。アラマーブルーを用いた細胞列挙96ウェルプレートスキャフォールドにおいて成長した細胞を、アラマーブルー細胞生存率アッセイを用い、培養期間中、2日毎にモニターした。細胞培養培地で1:10に希釈されたアラマーブルーと共にインキュベートして4時間後、励起544/発光595での蛍光強度を、蛍光プレートリーダーを用い、培養物からの上清100μlにおいて測定した。5064000細胞/ウェルの範囲内の標準曲線を確立し、これにより、細胞数に対する蛍光強度の再計算が可能になった。各スキャフォールドタイプを6回分析した。細胞染色チャンバースライドにおけるスキャフォールド上で培養された細胞を、培養期間中、3日毎に、生存/死亡細胞、フィラメントアクチン又はI型コラーゲンについて染色した。共焦点顕微鏡、緑の蛍光:488nMで励起/500-530nMで検出、赤の蛍光:543nMで励起/620-660で検出の条件下で染色を視察し、Leica共焦点ソフトウェアで写真を撮った。生存/死亡染色:生存/死亡生存率アッセイを使用し、スキャフォールド上で成長する生存及び死亡細胞を可視化した。培養物を予め暖めておいたリン酸緩衝食塩水で2回洗浄し、カルセリンAM及びエチジウムホモダイマー1を用い、室温で30分染色した。フィラメントアクチン:スキャフォールドを2回洗浄し、細胞を4のパラホルムアルデヒドで固定し、PBSに0.1のトリトンX100が入ったもので透過処理し、PBSに1のウシ血清アルブミンが入ったものでブロックし、その後、AlexaFlour488ファロインジン、PBSに1のBSAが1:40で入ったもので染色した。核染色用にEthD1を使用した。スライドを蛍光搭載培地に搭載した。ビンクリン:スカフォールドを2回洗浄し、細胞を4のパラホルムアルデヒドで固定し、PBSに0.1のトリトンX100が入ったもので透過処理し、PBSに1のウシ血清アルブミンが入ったものでブロックし、その後、1のBSAに9.5μg/mlでマウス抗ヒトビンクリンが入ったもの、続いてAlexaFlour488ヤギ抗マウスIgGで、交差吸着したもの及びAlexaFlour594ファロインジン、PBSに1のBSAが1:40で入ったもので染色した。核染色用にDAPIを使用した。スライドを蛍光搭載培地に搭載した。I型コラーゲン:スキャフォールドを2回洗浄し、細胞を-20°Cでアセトンを用いて固定し、PBSに1のBSAが入ったものでブロックし、その後、1のBSAに3.5μg/mlでマウス抗I型コラーゲンが入ったもの、続いてAlexaFlour488ヤギ抗マウスIgGで、交差吸着したもので染色した。核染色用にEthD1を使用した。スライドを蛍光搭載培地に搭載した。アイソタイプのコントロールとして、マウスIgG1を使用した。分泌されたI型コラーゲンの定量的測定上清を、2日毎に培養物から収集し、1:10に希釈し、製造者の使用説明書に従い、I型プロコラーゲンCペプチドEIAキットを使用し、細胞培養培地への分泌中、I型プロコラーゲン分子から切断されたCペプチドについて分析した。Sunriseプレートリーダーを用いてOD450を測定し、Magellanソフトウエアを用いたデータ管理を使用して、オリジナルサンプルにおけるCペプチドの濃縮を達成した。pgCペプチド分泌/細胞に対して、データを再計算した。結果4RepCTから調製された細胞培養スキャフォールドフィルム、発泡体、繊維及び繊維メッシュスキャフォールドを、4RepCTタンパク質溶液から、成功裏に調製した。4RepCTスキャフォールドにおける線維芽細胞の成長培養の初位相後に、スキャフォールドウェルに存在する生存細胞の数が多いことによって示されるように、4RepCTスキャフォールドは、TCTと比較して、一次線維芽細胞の成長及び増殖を支持する能力が増加していることが提示された。しかしながら、初位相において、細胞は、TCTと比較して、スキャフォールド上で、幾分ゆっくりと成長しているように見えた。発泡体状スキャフォールドにおける生存細胞の数は、フィルム及び繊維ベースのスキャフォールドよりも一貫して少ない。しかしながら、発泡体状スキャフォールドの利用しやすいスキャフォールド領域は推定が困難であり、他のスキャフォールド型式に対する直接比較は不可能である。繊維又は繊維メッシュスキャフォールド下で4RepCTを添加することにより、支持能力はさらに増加した。また、我々は、線維芽細胞が、スキャフォールドにおいて高度な生存/死亡率を示すことを提示しており、ここでフィルムスキャフォールドはほとんど同一の成長パターン、細胞密度、及び細胞培養処理されたガラススライドに対する生存/死亡比率を示した。発泡体及び繊維ベースのスキャフォールドは、このアッセイで赤に染色されたため、生存細胞の形状は物質の形態に追随することを見せることができた。4RepCTスキャフォールドにおけるヒト線維芽細胞の無血清培養また、我々は、SFHDFが、培養物に血清が存在しなくても、4RepCTのフィルム状スキャフォールド上で成長可能であることを示した。これにより、材料と細胞の相互作用が、表面に非特異的に結合しする血清タンパク質に依存しないが、スキャフォールドそれ自体が、そこでの成長のために、細胞に適した表面を提供することを証明した。スキャフォールドに対する細胞の付着性周囲のマトリックスへ細胞が付着している間、フィラメントアクチンは、結合により媒介される、膜結合レセプターに結合している。細胞内フィラメントアクチンを染色することにより、細胞と基底物質との間の結合タンパク質を、間接的に可視化することができる。この方法を用いて、我々は、HDFnが、実際に繊維、繊維メッシュ、フィルム及び発泡体のスキャフォールドに、初期及び後期培養の双方で結合することを示すことができた。さらに、フィラメントアクチンと組合せてビンクリンを染色することで、無血清条件下、野生型フィルム、RGD、IKVAV、YIGSR及びNRCにおいてSFHDFを3時間培養した後に、限局的付着を検出することができた。これらの結果には種々の基質に対するインテグリン媒介性付着が示されている。4RepCTスキャフォールドにおいて成長する細胞によるI型コラーゲンの分泌全て異なる型式の4RepCT、すなわちフィルム、発泡体、繊維及び繊維メッシュのスキャフォールドにおいて増殖させる場合、細胞はI型コラーゲンを生成した。よって、細胞は、4RepCTスキャフォールド材におけるインビトロでの培養中、それらの重要な機能の一つを維持している。分泌されたコラーゲンのレベルは、培養の最初の5日間で、培養培地中で増加していた。しかしながら、細胞当たりに生成されたコラーゲンの量は、播種の2472時間後に最大に達し、TCTと比較して、任意の4RepCTスキャフォールドにおいて成長する細胞に対し、この時点では高くなっていた。コラーゲンの細胞内生成は、播種の1、4、7及び10日後、全てのスキャフォールド型で同じような程度であることが示された。4RepCTスキャフォールドにおける培養後の維持された線維芽細胞表現型4RepCTスキャフォールドでの培養後、線維芽細胞がそれらの表現型を維持していることを検証するために、培養の14日後に、スキャフォールドから細胞を収集し、I型コラーゲンの分泌を評価するためのTCT、又はI型コラーゲンの細胞内染色のためのガラスのいずれかに再播種した。このことを実施することで、線維芽細胞がI型コラーゲンを生成し、分泌しており、よって、4RepCTスキャフォールドにおける比較的長時間の培養後でさえ、それらの最も重要な機能の一つを失っていないことが示された。機能化された4RepCTスキャフォールドにおいて成長する線維芽細胞アラマーブルー生存率実験からの予備データには、4RepCTへのRGDの導入により、それぞれ3及び1日目から、フィルム及び繊維メッシュのスキャフォールドにおいて成長する、生存細胞の全数が増加していることが示されている。経時的に、すなわち7日目から、細胞数はTCTウェルに存在する細胞計測も超える。平行セットアップにおいては、無血清細胞培養システムを使用すると、血清の不在下でさえ、一次線維芽細胞の成長向上が、RGDを有さない4RepCTTと比較して、RGD4RepCTフィルムで達成されることが示された。よって、RGDの導入により、足場依存性細胞の成長を支持する、スキャフォールドの能力を、極めて改善することができ、その効果は、細胞培養培地に存在する血清成分に依存しない。また、結果には、RGDモチーフがスキャフォールド表面に、適切に暴露されることが示されている。実施例8組換えスパイダーシルクにおける角化細胞4RepCTから調製されたフィルム状スキャフォールドが、一次角化細胞の成長を支持し、細胞が物質に付着し、それらの特徴的形態を維持していることを示すために、実験を実施した。野生型4RepCT及び機能化された4RepCTの双方においる成長が、血清タンパク質に依存しないことが示された。材料と方法ヒトの皮膚から単離された角化細胞を、角化細胞の成長用に設計された無血清セットアップである、栄養補助剤を含有する角化細胞SFMにおいて培養した。伝統的には、細胞の収集後に、10のウシ胎児を不活性トリプシンに添加し、再播種時での結合を確実にした。現在のセットアップにおいて、この血清付加を伴う又は伴わない平行実験を実施した。先の実施例に記載されたように、4RepCTの野生型又は機能化されたフィルム状スキャフォールドにおいて、角化細胞を継代4で播種した。テストされる機能化には、一般的な細胞結合モチーフRGD及びIKVAVが含まれるが、一般的な細胞結合モチーフYIGSR、及び/又は角化細胞特異的モチーフEPDIM及びNKDILを含めることもできる。角化細胞特異的マーカーをさらに使用し、培養の終わりに表現型を確実に維持させ、分化状態、例えばケラチン、フィラグリン、Tob、G6K12、gp80及びMRP8を測定した。フィラメントアクチンと組合せてビンクリンの検出のための免疫蛍光染色を使用し、限局的付着性、すなわち、上述した実施例7に記載されたような、細胞と物質との間の実際の接触点を同定した。アポトーシスにおける影響を、EnzChekカスパーセ3アッセイを用いて評価する。上述した実施例7に記載されたようにして、生存細胞をアラマーブルーを用いて検出した。結果一次ヒト角化細胞を、細胞結合モチーフを有する又は有さない、4RepCTフィルムにおいて、4日間培養した。細胞は生存しており、1~4日間、細胞の数は増加した。それらは、全培養期間中、全ての物質において、角化細胞の特徴的形態を示した。野生型、RGD及びIKVAVフィルムにおいて、限局的付着が検出され、テストされた物質に対する、インテグリン媒介性付着が示された。結果は、播種前の血清付加とは無関係であり、よって、細胞は、厳密には無血清状態下で物質に結合した。実施例9組換えスパイダーシルクにおける一次肝細胞肝臓は固有の機能を有する必須器官である。現在、急性肝不全、例えば肝臓ベースの代謝疾患、及び慢性肝疾患のケースは、肝移植又は肝細胞治療により救済されている。残念なことに、現在の有用な肝細胞治療は、例えば多くの細胞が失われ、肝細胞移植中に生着しないため、最適ではない。肝細胞の宿主として提供され、それらを適所に維持するスキャフォールドにより、移植前に、これらの細胞を全生着させることができる。これにより、肝移植の新規な方法が開けた。実験材料齧歯動物の肝細胞を、連続した機械的振揺により、コラゲナーゼ処理された肝臓を消化して単離し、分離し、10のFBSが補填されたRPMI1640培地で培養した。先の実施例に記載された、組換えスパイダーシルクタンパク質4RepCTを、野生型、及び種々の細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフの導入により修飾された変異体の形態で使用し、実施例1に記載されたようにして調製された、スキャフォールド構造体の形態で、本質的に、Hedhammarら上掲に記載されたように調製した。細胞培養:4RepCTスキャフォールドと組合せた齧歯動物肝細胞を、補填されたRPMI1640培地において培養した。肝細胞の生存性の評価:細胞を、細胞外マトリックスに関連した細胞結合モチーフが導入された、繊維状及びフィルム状スキャフォールドに配した。細胞の形態及び生存性を、培養において、経時的に評価した。結果肝細胞は繊維状及びフィルム状スキャフォールドに付着した。また、肝細胞は、4RepCTを用いた培養において生存可能であった。実施例10組織工学用の組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールド実験では、4RepCTにより、インビボの脊髄損傷のアノックスを再生可能であることが予期される。播種された細胞を有さない4RepCTスキャフォールド、及びヒト神経細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた4RepCTスキャフォールドの双方を使用した。組織学的及び行動学的分析を使用し、結果を記載した。材料及び方法動物手術ラットの体重は、手術時、170200gであった。手術の30分前に、動物にアトロピンを注射した。Hypnormとドルミカムの混合物を用いて、ラットに麻酔をかけた。ラットの体温をモニターし、手術手順を通して38°Cに維持した。腰髄を部分的椎弓切除により外科的に暴露させ、脊髄損傷の前に、暴露した脊髄表面を数滴のキシロカインで処理した。コードの離断を、メスを用いて脊髄を切断することにより実施した。丁寧な視診により、外科医は、吻側及び尾側末端が完全に分離され、わずかに退縮したことを断言した。コードを病変させた後、リオプラント層を、傷を縫合する前に、硬膜置換として脊髄に配した。手術の前後に、3mlのリンガー/グルコースを、皮下的に2回注射した。手術後、4日間、1日2回、ラットにTemgesicを筋肉内注射した。膀胱を1日に2回、手動で空にし、尿路感染症の兆候が現れたら、Borgalを付与した。例えば、先の実施例に記載されたようにして調製された4RepCT繊維の23mmの長束を、損傷時又は損傷の1週間後に脊髄の間隙に配した。急性移植パラダイムにおいて、4RepCT繊維の束を、切断した脊髄の間隙に適合するように切断し、脊髄と同様の軸において、4RepCT繊維と共に、移植片に、脊髄の断端吻側及び尾側と接触するようにゆっくりと配した。その後、リオプラント硬膜置換を、4RepCT上に配した。4RepCT繊維のケースにおいて、束を損傷の1週間後に移植し、動物に麻酔をかけ、再び傷を開き、脊髄を暴露させた。コードの吻側及び尾側断端をトリミングした後、繊維の束を、間隙に適合するように切断し、脊髄と同じ軸に配し、繊維と移植片の吻側及び尾側の脊髄組織との間の接触を確認した。上述したようにして傷を閉じた。ヒトの未熟細胞の同時移植同様の実験において、上述したような4RepCT繊維の移植を、ヒト神経幹細胞及びヒトオリゴデンドロサイト前駆細胞の生着と組合せた。地方倫理委員会に承認されている手順に従い、中絶を依頼した女性に同意書を記入してもらった後、ヒトの所定の中絶から細胞を得た。所有権のある手順に従い、適切な細胞をインビトロ培養した後、成長因子を含有しない、最小量のDMEMF12に、100000500000細胞を懸濁させたものを、4RepCT繊維の束に注射し、ついで、先の項に記載されたようにして使用した。行動評価後肢の運動機能を研究するため、ラットをオープンフィールドで運動させ、少なくとも4分間観察した。後肢の機能、関節の動き、足の位置、荷重負荷、協調運動性、及びトウクリアランスを評価し、BassoBeattieBresnahanLocomotorRatingScaleJNeurotrauma12121BassoJNeurotrauma21395404を参照に従い、評価した。テストをビデオ記録し、処置に対する予備知識のない、少なくとも2人の独立した観察者は、各ラットを評価した。手術前、及び手術の1、2、6、12及び18週後に、動物を評価した。神経細胞成長の追跡順行的追跡を、製造者の記載に従い、1週間、頭頂葉皮質の複数の部位に、ビオチニル化デキストランアミンを注射することにより実施した。逆行性追跡を、病変の脊髄の3-5mm尾側に、フルオロゴールドを注射することにより実施した。BDAを損傷の脊髄尾側で可視化させることで、脊髄病変を通過するコルチコ脊髄下行アクソンが可視化され、フルオロゴールド標識されたニューロンを、下行赤核脊髄ニューロンの再成長の証拠として、脳幹の赤核についてスクリーニングした。形態分析病変の18週後、最後の行動評価をした後、ラットに致死量の静脈鎮静剤を付与し、100mlの無Ca2タイロード液、続いて400mlのリン酸で緩衝された4パラホルムアルデヒドを、上行大動脈を通してかん流させた。全脳幹と病変を含む4-5cmの脊柱を解剖し、同じ固定液において2時間、後固定させ、4°Cで少なくとも24時間、10のスクロース中に凍結保存した。ついで、脊髄を脊柱から丁寧に切断し、コード及び脳幹をTissueTekに包埋し、凍結し、クリオスタットにおいて10μmに薄片化し、ゼラチンコーティングされたスライドに搭載した。免疫組織化学分析について、次の一次抗体:ヒト特異的ウサギ抗熱ショックタンパク質27、ウサギ抗ネスチン、ウサギ抗βII型チューブリン、マウスモノクローナルヒト特異的抗グリア線維酸性タンパク質、ウサギ抗微小管結合タンパク質2を使用した。一次抗体を、0.3のトリトンX100を含有する0.1Mのリン酸緩衝液で希釈した。使用する二次抗体をCy3又はAlexa488にコンジュゲートさせた。室温で30分、1.5の通常のヤギ血清を用いて、切片を処理し、4°Cで一晩、一次抗体と共にインキュベートし、すすぎ、室温で、二次抗体と共に2時間インキュベートした。全ての切片を核マーカーHoechst33342を用いて対比染色し、DABCOにポリビニルアルコールが入ったものと共に搭載した。免疫標識された組織切片を、定量分析のために蛍光顕微鏡で研究し、マッキントッシュ用のOpenlabソフトウェア及びCCDカメラを使用して、画像を保存した。実施例11器官型培養におけるアクソンの再生を支持する組換えスパイダーシルクタンパク質スキャフォールドこの実験では、4RepCTスキャフォールドが、アクソンの再生を支持し、先導可能であることが示されるであろう。脊髄と脳幹の小片を、エクスビボ培養物に維持した。2つのこのような組織片に結合する4RepCTのスキャフォールドを適用することにより、再生アクソンにより、間隙に架橋する十分な支持体が提供されるであろう。実験には、インビボでの脊髄損傷において、ダメージを受けた組織のアクソン成長及び修復を支持する、4RepCTスキャフォールドの有用性が示されるであろう。脳幹及びコードの頸部の器官型培養物を調製した。脳と脊髄を、初期の出生前及び出生後のスプラーグドーリーラットから収集した。脳幹、及び脊髄の頸部を通過した矢状面における切片を、ビブラトームを使用して作製した。切断された組織を、37°C、5のCO2、加湿雰囲気にある、6ウェル組織培養プレートにおいて、1mlの血清ベース培地、25の熱失活ウマ血清、及び25のアール平衡塩溶液、1mMのLグルタミン及び0.5のdグルコースを含有する、50の基底イーグル培地中の膜上に配した。組織切片を714日間インキュベートし、培地を3日毎に取り替えた。損傷時、上頸髄の切片を剃刀刃で作製した。組織を反転顕微鏡で視察し、外殖片の2つの部分を完全に分離させた。先の実施例に記載されたようにして調製された4RepCT繊維の束を、組織片の間の間隙に配した。培養物をさらに14日間インキュベートし、リン酸で緩衝された4パラホルムアルデヒドに2時間浸漬して固定化し、4°Cで24時間、10のスクロース中に凍結保存した。免疫組織化学分析について、次の一次抗体:ヒト特異的ウサギ抗熱ショックタンパク質27、ウサギ抗ネスチン、ウサギ抗βII型チューブリン、マウスモノクローナルヒト特異的抗グリア線維酸性タンパク質、ウサギ抗微小管結合タンパク質2を使用した。一次抗体を、0.3のトリトンX100を含有する0.1Mのリン酸緩衝液で希釈した。使用する二次抗体をCy3又はAlexa488にコンジュゲートさせた。固定化された培地を、1.5の通常のヤギ血清を用いて、室温で30分処理し、4°Cで一晩、一次抗体と共にインキュベートし、すすぎ、室温で、二次抗体と共に2時間インキュベートした。全ての組織を核マーカーHoechst33342を用いて対比染色し、DABCOにポリビニルアルコールが入ったものと共に搭載した。免疫標識された組織切片を、定量分析のために蛍光顕微鏡で研究し、マッキントッシュ用のOpenlabソフトウェア及びCCDカメラを使用して、画像を保存した。結果では、4RepCTスキャフォールドにより、損傷を受けたアクソンの再生を先導可能であることが予期される。実施例12組換えスパイダーシルクに対するヒト胚性幹細胞本実験は、上述の実施例2として報告された研究で組み立てられた、組換えスパイダーシルク材料でのヒト胚性幹細胞の培養の可能性をさらに探究する。材料及び方法標準的な6ウェル組織培養プレートを調製した。プレートにおいて、3つのウェルは、次の4RepCT変異体:RGD4RepCT、RGE4RepCT、IKVAV4RepCT、YIGSR4RepCT及びNT4RepCTHisの一つを含んでおり、各プレートの残りの3つのウェルは空であった。NT4RepCTHis、及びペプチドモチーフを有する4RepCTの全てのフィルムを、本質的に実施例1に記載したようにして調製した。全体で15のプレートを実験に含めた。プレートをさらに使用するまで、室温で乾燥したままにした。実験の準備において、組織培養プレートを、クラスIIの微生物学的安全キャビネットにおいて、30分間、UV照射をした。ついで、各プレートにおける3つの空のウェルを、製造者のプロトコルに従って、CELLstartTMCTSTMで被覆した。ヒト胚性幹細胞を、製造者のプロトコルに従って、血清及びフィーダーフリーの培地STEMPROhESCSFM-ヒト胚性幹細胞培養培地を用い、CELLstartTMで培養した。細胞を、製造者のプロトコルに従って、STEMPROEZPassageTM-使い捨て幹細胞継代ツールを使用し、90コンフルエントなウェルから1:6の比率で継代した。ウェルをPBSで洗浄し、培地を全てのウェルに配し、細胞を播種する前に、プレインキュベートした。継代60での細胞を、推奨する密度で5つの6ウェルプレートの全てのウェルに播種し、播種後の細胞妨害がないようにケアした。全てのウェルを、製造者のプロトコルに従って、STEMPROhESCSFMを用いて培養した。37°C、空気中に5のCO2、湿度95において、標準的な培養インキュベーターでインキュベートを行った。細胞を毎日観察し、48時間毎に100の培地を交換した。全ての培地は、摂食交換の2時間前に、インキュベーター条件に対して前平衡化した。細胞を16日後、さらに6日後に、それぞれの変異体の残った2つの6ウェルプレートに継代した。これら2時点についての継代計画は、ヒト胚性幹細胞の単一細胞解離についてのRoslinCellabsにより確立された方法を含む。単位細胞解離は、製造者の使用説明書に従ってNatBiotechnol25681686、ROCKインヒビターを使用して1時間前処理したTrypLESelectを、製造者の使用説明書に従って使用して達成される。これにより、酵素的継代後の胚性幹細胞の成功裏の増殖に必須であることが示された。コントロール及び試行細胞を同じく処理し、全てを等価に播種した。本研究の第3継代の24時間後、製造者のプロトコルに従って、ウェルをSigmaAldrich:アルカリホスファターゼ、白血球で染色した。結果細胞培養実験から選択された画像を図48-52に提示する。種々の4RepCT間には、何の差異も観察されなかった。最初、細胞は、小さい程度の接着性を持つ非接着性の凝集塊クランプであった。増殖はコントロールウェルで見られるものよりもかなり遅かったが、これは、実施例2で見られるように、4RepCT変異体に細胞株が適応した結果であろう。しばしば、新規のマトリックス、又は実際には新規の培地組成物において再度樹立される前に、胚性幹細胞株が、移行又は遅延の相を通過する場合である。これらの胚様体構造は、最終的にはマトリックスに付着し、EB塊を形成し、細胞は増殖し、拡大することが見られ、実験の第1、第2及び第3継代の写真に示されるように、新規のマトリックスへの適合が示唆される。後続する継代も、改善された形態及び増殖を生じた。アルカリホスファターゼ染色により示されるように、驚くべきことに、細胞は、それぞれの4RepCT変異体での培養23日後も、未だに未分化幹細胞の特徴を示している。結論全てのコントロールウェルは、使用されたコントロール培養条件下でこのhESC系で予期されるであろう特徴及び形態を示した。細胞株は、全ての4RepCT変異体に対し、適合の兆候を示した。4RepCT変異体における第1継代では、最初の接着性、増殖性及び培養形態は乏しかった。しかしながら、後続する増殖及び継代では、全ての変異体のためのポジティブアルカリホスファターゼ染色を用い、コロニーが未分化細胞の形態的特徴を示す結果となった。4RepCT変異体でのhESC培養のこの研究には、驚くべきことに、変異体がhESCの培養を可能にし、それらが、例えば、形態、増殖特性、及びアルカリホスファターゼ染色に関し、細胞の幹細胞性の維持に適していることが示された。"