"配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。配列番号2で示されるCDRアミノ酸配、配列番号3で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号4で示されるCDRアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;ならびに配列番号6で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号7で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号8で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項2に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項3に記載の抗原結合タンパク質。配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号27、配列番号28および配列番号29からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項5に記載の抗原結合タンパク質。配列番号23で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号24で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号25で示されるCDRアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号27で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号28で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号29で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項6に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項7に記載の抗原結合タンパク質。配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号49、配列番号50および配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項9に記載の抗原結合タンパク質。配列番号45で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号46で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号47で示されるCDRアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号49で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号50で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号51で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項10に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項11に記載の抗原結合タンパク質。配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号35、配列番号36および配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項13に記載の抗原結合タンパク質。配列番号31で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号32で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号33で示されるCDRアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;ならびに配列番号35で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号36で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号37で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含んでなる、請求項14に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、請求項15に記載の抗原結合タンパク質。配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;ならびに/または配列番号12、配列番号7、配列番号8、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなる、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項17に記載の抗原結合タンパク質。配列番号10で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号11で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号12で示されるCDRアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;ならびに配列番号12で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号7で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号8で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域か、または配列番号18で示されるCDRアミノ酸配列、配列番号19で示されるCDRアミノ酸配列、および配列番号20で示されるCDRアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域かを含んでなる、請求項18に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる二量体の形成を阻害する、請求項19に記載の抗原結合タンパク質。配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。配列番号22で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号26で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。配列番号44で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号48で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号13で示されるアミノ酸配列および配列番号17で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号57で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。請求項1に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号38で示される核酸配列および配列番号39で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項27に記載の単離された核酸。配列番号59で示される核酸配列および配列番号60で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項27に記載の単離された核酸。請求項5に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号40で示される核酸配列および配列番号41で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項30に記載の単離された核酸。請求項9に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号52で示される核酸配列および配列番号53で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項32に記載の単離された核酸。配列番号61で示される核酸配列および配列番号62で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項32に記載の単離された核酸。請求項13に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号42で示される核酸配列および配列番号43で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項35に記載の単離された核酸。請求項26に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号42で示される核酸配列および配列番号58で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項37に記載の単離された核酸。請求項17に記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。配列番号54で示される核酸配列、配列番号55で示される核酸配列、および配列番号56で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項39に記載の単離された核酸。配列番号63で示される核酸配列、配列番号64で示される核酸配列、および配列番号65で示される核酸配列からなる群から選択される少なくとも1つの核酸を含んでなる、請求項39に記載の単離された核酸。請求項27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40および41のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、発現ベクター。請求項27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40および41のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。請求項27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40および41のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程、および抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなる、抗原結合タンパク質の生産方法。請求項1、5、9、13、17、21、22、23、24、25および26のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。被験体において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項1、5、9、13、17、21、22、23、24、25および26のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、前記被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。被験体において癌を治療する方法であって、a乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項22に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。c前記癌が配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項47に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項48に記載の方法。被験体において癌を治療する方法であって、a乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項24に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。c癌が配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項50に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項51に記載の方法。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療のための薬剤の製造における、請求項1、5、9、13、17、21、22、23、24、25および26のいずれか一項に記載の物質の使用。配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項54に記載の抗原結合タンパク質。配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合する、抗原結合タンパク質。前記抗原結合タンパク質がキメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項56に記載の抗原結合タンパク質。a請求項29、35および38のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1SV細胞である、請求項58に記載の方法。請求項58に記載の方法により生産された抗原結合タンパク質。a請求項29、35および38のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該発現ベクターは、IgG1Fcドメインアミノ酸残基とIgG3Fcドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラFcドメインをコードするFc核酸配列を含んでなる;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記Fc核酸配列が、配列番号40で示される核酸配列および配列番号42で示される核酸配列からなる群から選択される核酸にインフレームで融合されている、請求項61に記載の方法。請求項62に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。a請求項29、35および38のいずれか一項に記載の単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養する工程該発現ベクターはIgG1Fcドメインアミノ酸残基とIgG3Fcドメインアミノ酸残基の双方を有するキメラFcドメインをコードするFc核酸配列をさらに含んでなり、かつ、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記Fc核酸配列が、配列番号40で示される核酸配列および配列番号42で示される核酸配列からなる群から選択される核酸にインフレームで融合されている、請求項64に記載の方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1SV細胞である、請求項65に記載の方法。請求項64に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。被験体において前癌状態を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項1、5、9、13、17、21、22、23、24、25および26のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。被験体において前癌状態を治療する方法であって、a前癌状態を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項22に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。c前記癌が配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項69に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項69に記載の方法。被験体において前癌状態を治療する方法であって、a前癌状態を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項24に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。c前記癌が配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項72に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項73に記載の方法。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号23で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号24で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号25で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号27で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号28で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号29で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号31で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号32で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号33で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号35で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号37で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号45で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号46で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号47で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号49で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号50で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号51で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号15で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号19で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号20で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる、抗原結合タンパク質。医療に用いるための、請求項45に記載の医薬組成物。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療に用いるための、請求項45に記載の医薬組成物。哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項1、5、9、13、17、21、22、23、24、25および26のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、方法。前記哺乳類がヒトである、請求項84に記載の方法。前記癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項84または85に記載の方法。配列番号100で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466を有する重鎖配列と、配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238を有する軽鎖配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質。フコシル化グリカンを含んでなる、請求項87に記載の抗原結合タンパク質。前記フコシル化グリカンがG0、G2、G0F、G2F、G1、Man5、G1FおよびG1F’からなる群から選択される、請求項88に記載の抗原結合タンパク質。非フコシル化グリカンを含んでなる、請求項87に記載の抗原結合タンパク質。前記非フコシル化グリカンがG0、G2、G1およびMan5からなる群から選択される、請求項90に記載の抗原結合タンパク質。配列番号102で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466を有する重鎖配列と、配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238を有する軽鎖配列とを含んでなる、抗原結合タンパク質フコシル化グリカンを含んでなる、請求項92に記載の抗原結合タンパク質。前記フコシル化グリカンがG0、G2、G0F、G2F、G1、Man5、G1FおよびG1F’からなる群から選択される、請求項93に記載の抗原結合タンパク質。非フコシル化グリカンを含んでなる、請求項92に記載の抗原結合タンパク質。前記非フコシル化グリカンがG0、G2、G1およびMan5からなる群から選択される、請求項95に記載の抗原結合タンパク質。配列番号100で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466をコードする、単離された核酸。配列番号101で示される核酸配列を含んでなる、請求項97に記載の単離された核酸。配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238をコードする、単離された核酸。配列番号105で示される核酸配列を含んでなる、請求項99に記載の単離された核酸。配列番号102で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466をコードする、単離された核酸。配列番号103で示される核酸配列を含んでなる、請求項101に記載の単離された核酸。請求項97、98、99、100、101および102のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる、発現ベクター。請求項97、98、99、100、101および102のいずれか一項に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞前記α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が存在する、請求項104に記載の組換え宿主細胞。CHOK1細胞である、請求項105に記載の組換え宿主細胞。前記α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、請求項104に記載の組換え宿主細胞。CHOK1SV細胞である、請求項107に記載の組換え宿主細胞。請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質と薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。被験体において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。被験体において癌を治療する方法であって、a乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を被験体に投与し、それにより、被験体の癌が治療される工程を含んでなる、方法。c前記癌が配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項111に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項112に記載の方法。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療のための薬剤の製造における、請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の物質の使用。a請求項97または請求項98に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項97または請求項100に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が活性である;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1細胞である、請求項115に記載の方法。請求項115に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。a請求項97または請求項98に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項97または請求項100に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1SV細胞である、請求項118に記載の方法。請求項118に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。a請求項99または請求項100に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項101および請求項102に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が活性である;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1細胞である、請求項121に記載の方法。請求項121に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。a請求項99または請求項100に記載の単離された核酸を含んでなり、かつ、請求項101および請求項102に記載の単離された核酸を含んでなる発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞を培養する工程ここで、該組換え宿主細胞では、α-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている;およびb前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含んでなり、それにより、抗原結合タンパク質が生産される、抗原結合タンパク質の生産方法。前記組換え宿主細胞がCHOK1SV細胞である、請求項124に記載の方法。請求項124に記載の方法によって生産された抗原結合タンパク質。被験体において前癌状態を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。被験体において前癌状態を治療する方法であって、a前癌状態を有する被験体を特定する工程;およびb治療上有効な量の請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を前記被験体に投与し、それにより、被験体の前癌状態が治療される工程を含んでなる、方法。c流体を前記被験体に投与する工程をさらに含んでなる、請求項128に記載の方法。c前記癌が配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるタンパク質を発現することを判定する工程をさらに含んでなる、請求項128に記載の方法。前記タンパク質が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項130に記載の方法。医療に用いるための、請求項109に記載の医薬組成物。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫の治療に用いるための、請求項109に記載の医薬組成物。哺乳類において癌を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項87、88、89、90、91、92、93、94、95および96のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる、方法。前記哺乳類がヒトである、請求項134に記載の方法。前記癌が乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫から選択される、請求項134または135に記載の方法。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、皮膚癌、胃癌および黒色腫からなる群から選択される病態の治療において用いるための、請求項1~136のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。よって、HER3受容体を標的とする治療用抗体、およびこのような抗体で癌を治療する方法の必要がある。開示の概要本開示の一態様は、配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;および/または配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;および/または配列番号27、配列番号28および配列番号29からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;および/または配列番号49、配列番号50および配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;および/または配列番号35、配列番号36および配列番号37からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列と75を越える配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する重鎖可変領域;および/または配列番号12、配列番号7、配列番号8、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列と75以上の配列同一性を有する少なくとも1つのCDRを有する軽鎖可変領域を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号5で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号22で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号26で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号44で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号48で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号34で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号13で示されるアミノ酸配列および配列番号17で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列と、配列番号57で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列とを含んでなり、HER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号21のアミノ酸残基184~329を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合するHER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号21のアミノ酸残基330~495を含んでなるペプチド鎖ドメインに特異的に結合するHER3受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号3で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号23で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号24で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号25で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号27で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号28で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号29で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号31で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号32で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号33で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号35で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号36で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号37で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号45で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号46で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号47で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号49で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号50で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号51で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号15で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、HER3受容体に特異的に結合し、かつ、配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するCDRH1、配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するCDRH2、配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するCDRH3、配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するCDRL1、配列番号19で示されるアミノ酸配列を有するCDRL2、および配列番号20で示されるアミノ酸配列を有するCDRL3を含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示はまた、単離された核酸、発現ベクター、組換え宿主細胞、抗原結合タンパク質の生産方法、医薬組成物、癌を治療する方法、使用、および抗原結合タンパク質その総てが本開示のこれらの態様に関連するの生産方法も提供する。本開示の別の態様は、配列番号100で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466を有する重鎖配列と、配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号102で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466を有する重鎖配列と、配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238を有する軽鎖配列とを含んでなる抗原結合タンパク質である。本開示の別の態様は、配列番号100で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466をコードする単離された核酸である。本開示の別の態様は、配列番号104で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~238をコードする単離された核酸である。本開示の別の態様は、配列番号102で示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基20~466をコードする単離された核酸である。実施例11.概要マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10、キメラ1D9抗体およびキメラ15D5抗体に対して、全長ヒトHER3細胞外ドメインECDまたはそのサブドメインとの結合に関するBIACORE商標分析を行った。2.緒論本実施例の目的は、マウス1D9抗体、マウス15D5抗体、キメラ1D9抗体およびキメラ15D5抗体の親和性を測定することであった。3.方法3.1.実験プロトコール分析は、新しい各チップの調製前にシステムチェックで試験して合格したBIACORE商標2000装置SN33-0901-2420GEHealthcareを用いて行った。分析は総て、25°CでHBS-EPGEHealthcareBR-1006-69/5mMHEPES、150mMNaCl、3.4mMEDTA、0.005界面活性剤P20、pH7.4を実行バッファーとして用いて行った。マウスモノクローナル抗体は、第一級アミン化学法NHS/EDCで活性化GEHealthcareアミンカップリングキットBR-1000-50によってBIACORE商標CM5チップGEHEalthcareBR-1000-14に共有結合させたウサギ抗マウスRAMIgGGEHealthcareBR-1008-38を用いて分析した。キメラおよびヒト化競合因子モノクローナル抗体は、同様に結合させた抗ヒトFc特異的モノクローナルGEHealthcareBR-1008-39を用いて分析した。各チップはまた、捕捉試薬抗体が結合されて参照表面ででも調製した。動態解析のために、分析物の濃度を変えて複数サイクルの実行に関するセンサーグラムを取得した。1サイクルは、表面にモノクローナルを捕捉させ、バッファーを流して短時間安定化させた後、所定濃度の分析物ECDまたはサブドメインタンパク質を結合させることからなる。表面に結合させるために分析物を注入すると3~4分、曲線の関連部分が得られる。その後バッファーのみを流すと3~4分、解離データが記録できる。その後、このサイクルが終了し、捕捉キットに供給されている再生溶液抗ヒト捕捉用のRAMおよび3MMgCl2の弱酸性溶液を注入すると、捕捉された抗体/分析物が除去されるが、次のサイクルの別のモノクローナルの捕捉を行うこの捕捉抗体の能力には有意な影響を与えない。親和性分析の一般法は次の通りである。まず、チップを調製し、数種類のモノクローナル抗体濃度について捕捉された共鳴単位RUを調べた。その後、動態サイクル、すなわち、モノクローナル抗体をおよそ100RUのレベルまで捕捉させ、分析物タンパク質を結合させた後に解離させ、共有結合したタンパク質以外の総てのものを除去するように表面を再生させるということを行った。RAMチップは、捕捉キットに供給されている100mMグリシンpH1.7で再生し、抗ヒトチップは、捕捉キットに供給されている3MMgCl2で再生した。これらの一連のサイクルを6種類の異なる濃度の分析物タンパク質通常、256nM、128nM、64nM、32nM、16nMおよび8nMで行う。分析物タンパク質の前に数回のバッファーサイクルを行ってサイクルの一貫性を確認し、実験によっては、バッファーサイクルを二重参照[.]として用いる。用いた分析物は、ヒト全長HER3細胞外ドメインECD、ヒトHER3の細胞外部分の各サブドメインD1、D2、D3、D4または組合せHER3ドメインタンパク質D1-2およびD2-3であった。総てのヒトHER3ECD分析物を発現させ、標準的な技術を用いて調製した。動態実験サイクルでは、mock結合表面を参照とし、バッファーの人為要素を排除するために実行した特異的抗体-分析物RUデータから差し引いた。いくつかの実行では、動態曲線セットの各濃度に関して分析物を含有するサイクルデータからバッファーのみのサイクルを差し引くことによって二重参照を設定した。得られた曲線データに対し、BIAEVALUATION商標ソフトウエアv.3.2を用い、1:1ラングミュアモデルへのグローバルフィッティングを行う。3.2.薬物および材料本実施例で用いた試薬の一覧の一部は次の通りである。マウス1D9抗体4.77mg/mlマウス15D5抗体4.23mg/mlキメラ1D9抗体キメラ15D5抗体抗体は総て、リン酸緩衝生理食塩水pH7.0で処方および調製した。4.結果各相互作用に関してセンサーグラムを作製した。これらを用い、BIAEVALUATION商標ソフトウエアを用いた動態評価を行った。実行パラメーターおよび動態パラメーター総KDを含むを下記の表5および表6に示す。5.考察モノクローナルマウス1D9抗体およびマウス15D5抗体はヒトHER3細胞外ドメインに対して作製されたものである。マウス1D9抗体抗体は、全長ヒトHER3ECDおよびヒトHER3ECDのサブドメイン3に結合する。マウス15D5抗体は、全長ヒトHER3ECDおよびヒトHER3ECDのサブドメイン2に結合する。全長ヒトHER3ECDおよび選択ヒトHER3ECDサブドメインとの相互作用に関して、総ての抗体のナノモルおよびナノモル未満の親和性が確認された。マウス1D9抗体およびマウス15D5抗体の双方で同様の総親和性KDが見られ、マウス1D9抗体はより早い結合速度kaおよび解離速度kdを持っている。イムノアッセイおよび競合的免疫組織化学により、マウス15D5抗体は、ヒトHER3ECDのサブドメイン2、1-2および2-3に結合するが、サブドメイン1、3または4には結合しないことが示された。BIACORE商標分析は、これらのHER3ECD部分すなわち、ヒトHER3ECDのサブドメイン2、1-2および2-3の親和性が、全長ヒトHER3ECDサブドメイン1-4よりも増強されていることを示す。この効果は、サブドメイン2を含有する3種類のヒトHER3ECDタンパク質構築物D2、D1-2およびD2-3の総てで見られ、特定の理論に縛られることを望むものではないが、これは小さいサブドメインタンパク質にあるドメイン2内のエピトープの方がアクセシビリティーが大きいためではないかとと考えられる。さらに、特定の理論に縛られることを望むものではないが、構造上の問題が、マウス15D5抗体がHER3受容体の開放立体配座により大きな親和性を有する可能性を高くすると考えられる。この開放立体配座は、この受容体がヘレグリンリガンドと結合している時の状態であることが示されている。キメラ15D5抗体およびキメラ1D9抗体は、親マウス1D9抗体およびマウス15D5抗体と同等の親和性を保持している。実施例2X線結晶解析をinsilicoモデリングと組み合わせて、マウス1D9抗体およびその変異体の結合面を推定した。また、これらの解析により、マウス1D9抗体で見られた機能の中和への機構的洞察も得られ、合理的抗体成熟の助けとなった。ヒトHER3ECDのドメインIIIと結合したマウス1D9抗体由来Fabを含んでなる複合体の高分解能3.0Å構造が確定された。このため、ヒトHER3ECDのドメインIIIおよびマウス1D9抗体をCHO細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーならびにサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。マウス1D9抗体のFabフラグメントは、標準的方法を用いてパパイン切断により作製した。ヒトHER3ECDのドメインIIIと結合したマウス1D9抗体由来Fabを含んでなる複合体は、1:1.2モル比のマウス1D9抗体由来FabとヒトHER3ECDのドメインIIIを混合することによって作製した。次に、このタンパク質混合物を濃縮し、ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて結晶化した。アルゴンヌ国立研究所の先端光子源施設でX線回折データを取得した。回折データは、HKL2000ソフトウエアHKLResearch,Inc.を用いて指数付けとスケーリングを行った。構造はX-PLORプログラムにおける分子置換により決定した。作成された最初の分子置換解に対し、次に、CNSにおける分子動力学的精密化とWINCOOTプログラムによる再構築を複数回行った。次に、ヒトHER3ECDのドメインIIIと結合したマウス1D9由来Fabを含んでなる複合体の原子座標ファイルを作成し、得られた構造を解析した。この解析から、ヒトHER3ECDドメインIIIのドメインIII上のエピトープは、配列番号21のアミノ酸残基20~643を含んでなるフラグメントに見出せる配列番号66のIle346、Asn350、Gly351、Asp352、Pro353、Trp354、His355、Lys356、Ile357、Pro358およびAla359を含んでなることが分かった。表7参照。相互作用残基間の接触は表7および図55に記載されている。特定の理論に縛られることを望むものではないが、この高分解能結晶構造に基づけば、マウス1D9抗体FabフラグメントはヒトHER3ECDのドメインIIIと排他的に結合し、HER3ECDの開放立体配座内に存在するヘレグリン結合部位と部分的に重複するエピトープを覆っていると考えられる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、このマウス1D9抗体Fabは、閉鎖立体配座にある場合のHER3ECDと結合して、その受容体に二量体形成に必要な拡張型の立体配座を立体的に採らせないようにすることができる。マウス1D9抗体Fabは、1つには、ヒトHER3ECDのドメイン1に二量体形成に必要な立体配座を採らせないようにすることにより、その効果をもたらすと考えられる。さらに、特定の理論に縛られることを望むものではないが、ここに記載される構造的効果は、マウス1D9抗体およびその変異体によりもたらされるHER3活性の強力な阻害に寄与すると考えられる。実施例3開放立体配座にあるHER3ECDと結合したマウス15D5抗体の相互作用のこんピューター構造モデリングを、RosettaDockソフトウエアRosettaCommons.orgを実行した。このソフトウエアに採用されているアルゴリズムの第1段階では、剛体モンテカルロ検索、ならびに残基スケール相互作用ポテンシャルを用いた抗体表面に対する抗原の平行移動と回転を行う。アライメントスコアにより、抗原を抗体のCDRループに割り当てる。この低分解能検索の後に、主鎖依存性回転異性体パッキングアルゴリズムを用いて、タンパク質主鎖に明示的側鎖が付加される。その後、モンテカルロおよび最小化法により、側鎖の立体配座と剛体の位置を同時に最適化することによって、ドッキング立体配座空間の小領域において局部的最小値のセットを効率的に抽出する。この検索手順を種々のランダムな出発配向から繰り返して105通りの構造を作り出し、次に、これらをファンデルワールス相互作用、陰溶媒和モデルおよび配向依存性水素結合ポテンシャルによって支配されるエネルギー関数を用いてランク付けする。スコアカットオフを通過した上から1000のデコイを保持した。側鎖予測の分解能を高めるために、非結合型の回転異性体立体配座を回転異性体ライブラリーに含め、側鎖ねじれ角上の勾配に基づく最小化を用いた。この高分解能検索の終了時に最もスコアの良い200のデコイを、階層的クラスタリングアルゴリズムを用いたペアワイズ平方根偏差rmsdに基づいてクラスター化する。2.5Åクラスタリング閾値内の構造をセットと呼び、そのセット内の最もスコアの小さいデコイがクラスターを表す。結果として得られた、ヒトHER3ECDと結合したマウス15D5抗体のモデルは、この抗体が開放立体配座にあるHER3ECDと結合し、二量体形成アーム付近に立体障害を作り出すことを予測する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、これはマウス15D5抗体がHER3の二量体形成を遮断することを示唆する。実施例41.概要分子生物学的技術を用い、マウス1D9抗体およびマウス15D5抗体の一連のヒト化RR変異体を作製し、発現させた。次に、これらの抗体に、全長ヒトHER3細胞外ドメインECDとの結合に関するBIACORE商標分析を行った。2.緒論本実施の目的は、マウス1D9および15D5抗体のヒト化変異体の親和性を測定することであった。3.方法3.1.実験プロトコール3.2.BIACORE商標分析標準的な分子生物学的技術を用いて作製し、発現させたマウス1D9抗体およびマウス15D5抗体のヒト化変異体の結合親和性を測定するためにBIACORE商標分析を用いた。ヒト化変異体は、1D9H6L2RR抗体配列番号30および配列番号57を含んでなる、1D9H0L7RR抗体配列番号67および配列番号85を含んでなる、1D9H2L2RR抗体配列番号71および配列番号57を含んでなる、1D9H6L6RR抗体配列番号38および配列番号83を含んでなる、1D9H6L3RR抗体配列番号30および配列番号77を含んでなる、1D9H3L6RR抗体配列番号73および配列番号83を含んでなる、1D9H0L9RR抗体配列番号67および配列番号87を含んでなる、1D9H2L6RR抗体配列番号71および配列番号83を含んでなる、1D9H6L4RR抗体配列番号30および配列番号79を含んでなる、1D9H6L5RR抗体配列番号30および配列番号81を含んでなる、1D9H6L0RR抗体配列番号30および配列番号75を含んでなる、1D9H3L2RR抗体配列番号73および配列番号57を含んでなる、1D9H6L9RR抗体配列番号30および配列番号87を含んでなる、15D5H1L3抗体配列番号90および配列番号98を含んでなる、15D5H2L2抗体配列番号92および配列番号96を含んでなる、15D5H1L1抗体配列番号90および配列番号26を含んでなる、15D5H3L1抗体配列番号94および配列番号26を含んでなる、15D5H2L1抗体配列番号92および配列番号26を含んでなるならびに15D5H3L3抗体配列番号94および配列番号98を含んでなるであった。キメラ15D5抗体ch15D5もまた分析した。これらの抗体の結合動態をBIACORE商標3000を用いて評価した。供給されているカップリングバッファー9000RUを用いて固定化抗ヒトIgGFc特異的BIACORE商標GEHealthcareカタログ番号BR-1008-39モノクローナル抗体をコンジュゲートしたCM5バイオセンサーチップに抗体を捕捉させた。全長ヒトHER3ECD濃縮液を流速30μl/分で120秒間注入した。バイオセンサーチップは実施例1に記載にように再生した。BIACORE商標評価ソフトウエアを用い、1:1ラングミュアモデルへのデータのグローバルフィッティングにより、動態を測定した。分析操作はランニングバッファーとしてHBS-EPを用い、25°Cで行った。BIACORE商標分析法の基本工程の概略を以下に示す。1抗ヒトFc抗体の固定化9000-1000RU;25μg/ml、酢酸ナトリウムバッファー、pH5.0を使用;2目的抗体の捕捉400ng/ml;3分析物の捕捉抗体への結合例えば、HERECD512nM~16nM;4分析物の解離例えば、バッファー使用;5BIAcore動態測定サイクル工程:バッファー、512nMHER3ECD、256nMHER3ECD、128nMHER3ECD、64nMHER3ECD、32nMHER3ECDおよび16nMHER3ECD。バッファーサイクルおよび二重参照は実施例1に記載のように行った;および5BIACORE商標最適化バッファーによるバイオセンサーチップの再生。4.結果および考察下記の表8および表9は得られたデータを示し、親分子に対して作製された総てのヒト化抗体のうち、ヒト化1D9RR抗体H6L2およびヒト化15D5抗体H4L1が全長ヒトHER3ECDに対して最も高い親和性を有すると思われることを示す。実施例51.概要分子生物学的技術を用い、ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体を作製し、発現させた。次に、これらの抗体に、以下に示すように、全長ヒトHER3細胞外ドメインECD、全長ラットHER3細胞外ドメインECDおよび全長カニクイザルHER3細胞外ドメインECDとの結合に関するBIACORE商標分析を行った。2.緒論本実施の目的は、ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体の親和性を測定することであった。3.方法3.1.実験プロトコール3.2.BIACORE商標分析ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体の結合親和性を測定するためにBIACORE商標分析を用いた。約1300共鳴単位RUのレベルまで第一級アミンを結合させることによってAタンパク質をCM5チップに固定化した後、このチップにヒト化抗体を捕捉させた。総ての抗体を同等のレベル100~200RUで捕捉させた。次に、以下に示すように、全長ヒトHER3ECDをこのチップに50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nMおよび1.5625nMで流した。あるいは、全長ラットHER3ECDまたは全長カニクイザルECDをこのチップに10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nMおよび0.3125nMで流した。バッファーのみの注入を用いて、実施例1に示すように結合曲線の二重参照とした。この表面の再生は、10mMグリシンバッファーpH1.5を用いて行った。BIACORE商標評価ソフトウエアを用い、この結合データを1:1モデルに当てはめた。操作は、BIACORE商標T3000にて、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用い、25°Cで行った。4.結果および考察下記の表10および表11は、以下に示すように、ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体の、全長ヒトHER3細胞外ドメインECD、全長ラットHER3細胞外ドメインECDおよび全長カニクイザルHER3細胞外ドメインECDに対する結合に関して得られたデータを示す。ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標の特性決定によると、全長ヒトHER3ECDへの特異的結合が示される。交差種相同性推定に基づけば、ラットHER3ECDのドメインIIIおよびカニクイザルHER3ECDのドメインIIIは、ヒト化1D9抗体およびその変異体が結合するドメインIIIヒトHER3ECDエピトープと約95相同である。これは機能的交差反応の強い可能性を示唆する。このことと一致して、ヒト化1D9Fc障害抗体は、BIACORE商標分析により評価した場合に、全長カニクイザルHER3ECDおよび全長ラットHER3ECDと匹敵するレベルで交差反応することが見出された。上記の表10および表11参照。実施例61.概要本実施例は、1D9抗体例えば、マウス1D9抗体およびそのヒト化変異体および15D5抗体例えば、マウス15D5抗体およびそのヒト化変異体の、ヘレグリンにより誘導されるHER3のリン酸化を阻害し、下流AKTシグナル伝達を低下させ、ヘテロ二量体形成阻害剤として、活性化されたEGFRがHER3とヘテロ二量体を形成しないように働き、ヘレグリンにより誘導されるEGFR-HER3、HER2-HER3ならびにHER4-HER3ヘテロ二量体形成を妨げ、およびそれに続くHER3リン酸化を妨げる能力を証明する。2.緒論1D9抗体例えば、マウス1D9抗体およびそのヒト化変異体および15D5抗体例えば、マウス15D5抗体およびそのヒト化変異体の、ヘレグリンにより誘導されるHER3のリン酸化を阻害し、下流AKTシグナル伝達を低下させ、ヘテロ二量体形成阻害剤として、活性化されたEGFRがHER3とヘテロ二量体を形成しないように働き、ヘレグリンにより誘導されるEGFR-HER3、HER2-HER3ならびにHER4-HER3ヘテロ二量体形成を妨げ、およびそれに続くHER3リン酸化を妨げる能力を調べた。3.方法3.1.実験の予備事項これらの試験に用いたモデルは、内務省によって制定された動物管理のUKスタンダードに準拠する。3.2.実験プロトコール3.2.1癌細胞系統における、ヘレグリンにより誘導されるHER3受容体リン酸化の、抗HER3mAbによる阻害集密度およそ80のBxPC3、CHL-1、N87、SK-BR-3、BT-474またはMCF-7細胞を、トリプシンを用いて採取し、10FBS/培地で洗浄し、10FBS/培地に3~5×105細胞/mlで再懸濁させた。100μl/ウェルを96ウェル組織培養処理済み平底プレートに播種し、37°C、5CO2雰囲気中で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引し、血清不含培地と交換し、一晩インキュベートして血清飢餓状態とした。次に、血清不含培地でmAb原液を調製し、半対数連続希釈液を作製した。8点濃度曲線を得るために10μlのmAb原液を96ウェル細胞プレートに2反復で加え、37°Cで1時間インキュベートした。次に、10μlのHRGβ1を加えて終濃度30または100ng/mlとし、15分間インキュベートした。培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させ、氷上で30分間揺動した。溶解液はすぐに使用したか、または-80°Cで冷凍し、その後、氷上で解凍してヒトホスホ-ErbB3ELISARDSystemsカタログ番号DYC1769に用いた。ELISAは製造者のプロトコールに従って行った。データ分析は、GRAPHPAD商標PRISM商標ソフトウエアを用いて行った。3.2.2癌細胞系統における、ヘレグリンにより誘導されるAktリン酸化の、抗HER3mAbによる阻害集密度およそ80のBxPC3、CHL-1、N87、SK-BR-3またはBT-474細胞を、トリプシンを用いて採取し、10FBS/培地で洗浄し、10FBS/培地に3~5×105細胞/mlで再懸濁させた。100μl/ウェルを96ウェル組織培養処理済み平底プレートに播種し、37°C、5CO2雰囲気中で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引し、血清不含培地と交換し、一晩インキュベートして血清飢餓状態とした。翌日、血清不含培地でmAb原液を調製し、半対数連続希釈液を作製した。8点濃度曲線を得るために10μlのmAb原液を96ウェル細胞プレートに2反復で加え、37°Cで1時間インキュベートした。次に、10μlのHRGβ1を加えて終濃度30または100ng/mlとし、15分間インキュベートした。培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させ、氷上で30分間揺動した。溶解液はすぐに使用したか、または-80°Cで冷凍し、その後、氷上で解凍してヒト/マウス/ラットホスホ-AktS473チンパンジー特異的ELISARDSystemsカタログ番号DYC887Bに用いた。ELISAは製造者のプロトコールに従って行った。データ分析は、GRAPHPAD商標PRISM商標を用いて行った。3.2.3SK-BR-3乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子またはベータセルリンにより誘導されるHER3受容体リン酸化の、抗HER3mAbによる阻害SK-BR-3細胞を、ヘレグリンの代わりに上皮細胞増殖因子EGFまたはベータセルリンのいずれかを活性化リガンドとしてこと以外は、本実施例の第3.2.1節上記に、ヒトホスホ-ErbB3ELISARDSystemsカタログ番号DYC1769での使用に関して記載されているようにアッセイした。3.2.4HERファミリー受容体BACMAM商標を形質導入したCHO細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびHER3受容体リン酸化の阻害ヘレグリン-β1刺激後のEGFR、HER2およびHER4によるHER3受容体リン酸化の、抗HER3mAbにより媒介される阻害を調べるために、PerkinElmerALPHALISA商標アッセイ技術を用いてヘテロ二量体形成アッセイを開発した。試薬はPerkinElmerプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ホスホ-チロシン特異的マウスmAbP-Tyr-100CellSignalingTechnologyカタログ番号9411PBS単独処方物をALPHALISA商標アクセプタービーズPerkinElmerカタログ番号6772002とコンジュゲートさせた。1mgのアクセプタービーズを100μgの抗体と48時間コンジュゲートさせることにより、10:1結合重量比を用いた。抗体100μg当たり7.6μlの2mg/mlCHROMALINK商標ビオチン354SulfoNHS、SoluLinKカタログ番号B-1007-105を用いることにより、30:1モル比のビオチン:抗体を用いて、市販の抗ヒトHER3抗体RDSystemsMAB3481をビオチン化した。次に、96ウェルプレートにて、3×105細胞/mlのチャイニーズハムスター卵巣細胞にEGFRHER3、HER2HER3およびHER4HER3の特異的BACMAM商標対で一晩形質導入することにより、抗HER3mAbを評価した。翌日、抗HER3mAbを加え、37°Cで1時間インキュベートした。その後、ヘレグリン-β1を加えて終濃度100ng/mlとし、プレートを30分間インキュベートした。次に、培地を吸引し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する低温の溶解バッファーに細胞を溶解させた。溶解液を氷上で30分間揺動し、すぐに使用したか、または-80°Cで冷凍し、氷上で解凍してALPHALISA商標アッセイを行った。次に、2.5μlの溶解液を、384ウェルプレート中の、10μlの2.5nMビオチン化抗ヒトErbB3抗体RDSystemsMAB3481に加え、室温で1時間インキュベートした。その後、5μl/ウェルの50μg/mlホスホ-チロシン特異的マウスmAbP-Tyr-100CellSignalingTechnologyカタログ番号9411を加え、暗所で振盪しながら1時間インキュベートした。12.5μl/ウェルの80μg/mlストレプトアビジンコーティングドナービーズPerkinElmerカタログ番号6760002調製物を加え、さらに30分間インキュベートした。ENVISION商標2103マルチラベルプレートリーダーでプレートを読み取り、GRAPHPAD商標PRISM商標を用いてデータ分析を行った。3.3.薬物および材料ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体12.68mg/mlヒト化1D9アクリタマブ商標抗体7.45mg/mlヒト化1D9抗体1.88mg/mlヒト化1D9Fc障害抗体3.713mg/mlマウス1D9抗体M5.1D9.1F5;4.77mg/mlマウス15D5抗体3.19mg/mlマウスIgG1アイソタイプ対照抗体RDSystems500μg/mlカタログ番号MAB002マウスIgG2bアイソタイプ対照RDSystems500μg/mlカタログ番号MAB004ヒト抗マラリアmAbヒトアイソタイプ対照;5.74mg/mlヘレグリン-β1HRGβ1;1.88mg/ml3.4.データ分析本実施例で示されるデータは総て、最低2回の実験からの平均値を表す。抗体値を陽性対照ヘレグリン処置細胞値で割り、100を掛けてヘレグリン対照ホスホHER3に対するまたはヘレグリン対照ホスホAKT[.]に対するを計算した。上皮細胞増殖因子またはベータセルリン処置SK-BR-3細胞の場合には、上皮細胞増殖因子またはベータセルリン陽性対照処置細胞値を比較に用いた。個々の実験からのデータの平均をとり、GRAPHPAD商標PRISM商標分析ソフトウエアを用いてIC50値を計算した。4.結果4.2.1癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるHER3受容体リン酸化の、抗HER3抗体による阻害抗HER31D9および15D5抗体は、BxPC3図1、CHL-1図2、N87図3、SK-BR-3図4、BT-474図5、およびMCF-7図6癌細胞において、ヘレグリンにより誘導されるHER3リン酸化を阻害した。ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化アクリタマブ商標抗体を含め、総ての1D9抗体構築物が、表12に示されるように、2.5~40.6ng/mlの範囲のIC50値で強い阻害を示した。4.2.2癌細胞における、ヘレグリンにより誘導されるAktリン酸化の、抗HER3mAbによる阻害抗HER31D9抗体および15D5抗体は、BxPC3図7、CHL-1図8、N87図9、およびSK-BR-3図10癌細胞において、ヘレグリンにより誘導されるAKTリン酸化を低減した。AKTリン酸化のほとんどの強い阻害はBxPC3細胞で見られ、その場合、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体は、ヘレグリンにより誘導されるホスホ-AKT形成を2.6ng/mlのIC50値で阻害した表13。4.2.3SK-BR-3乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子およびベータセルリンにより誘導されるHER3受容体リン酸化の、抗HER3mAbによる阻害抗HER31D9抗体および15D5抗体は、SK-BR-3乳癌細胞における、上皮細胞増殖因子およびベータセルリンの双方により誘導されるHER3リン酸化を阻害した。1D9マウス構築物は、リガンドに誘導されるHER3受容体リン酸化を、活性化リガンドの使用とは無関係に、およそ3ng/mlのIC50値で阻害した表14。4.2.4HER3とEGFR、HER2またはHER4を組み合わせたBACMAM商標を形質導入したCHO細胞における、ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成およびHER3受容体リン酸化の阻害抗HER31D9抗体および15D5抗体は、示されるように、ヒトHER3受容体とEGFR、HER2またはHER4受容体とを同時形質導入したCHO細胞において、ヘレグリンにより誘導されるHER3リン酸化を阻害した。これらの抗体は、ヘレグリンにより誘導される、EGFR-HER3、HER2-HER3またはHER4-HER3ヘテロ二量体の形成を阻害することができた。IC50値を表15に示す。5.考察HER3受容体チロシンキナーゼはヒト上皮細胞増殖因子受容体ファミリーに属し、このファミリーはまたEGFRHER1、HER2およびHER4も含む。HER3は、ヘレグリンリガンドに結合するが、本質的にキナーゼ不活性型である。HER3は、その細胞内C末端ドメインにおいてチロシン残基のトランスリン酸化を可能とするためには、他のファミリーメンバーと二量体を形成しなければならない。続いて、活性化され、リン酸化されたHER3受容体から生じる下流シグナル伝達には、PI3K/AKT生存経路が含まれる。本実施例のデータは、抗HER31D9抗体および15D5抗体が、ヘレグリンにより誘導されるHER3受容体リン酸化を阻害することができることを示す。ヘレグリン刺激の前に癌細胞系統を1D9抗体で処置すると、ヘレグリンにより誘導されるHER3リン酸化の完全な阻害がもたらされた。図16は、種々の1D9抗体の、種々の癌細胞系統のHER3リン酸化阻害に関するIC50値を示す。下流のAKTリン酸化も、1D9抗体および15D5抗体処置により低減された。従って、1D9抗体および15D5抗体は、ヘレグリンにより誘導されるHER3リン酸化を阻害し、下流のAKTシグナル伝達を低下させる。上皮細胞増殖因子およびベータセルリンはEGFRのリガンドであり、EGFR-HER3ヘテロ二量体の形成を誘導することができる。SK-BR-3乳癌細胞は、これらのEGFRリガンドのいずれかで処置した場合、HER3リン酸化の誘導を示した。SK-BR-3細胞を1D9抗体または15D5抗体で処置すると、上皮細胞増殖因子またはベータセルリンにより誘導されるHER3リン酸化が阻害された図11および図12。このことは、これらの抗体がヘテロ二量体形成阻害剤として働き、活性化されたEGFRがHER3と二量体を形成しないようにすることができることを示唆する。1D9抗体および15D5抗体は、EGFR-HER3またはHER2-HER3またはHER4-HER3ヘレグリンにより誘導されるヘテロ二量体形成を特異的に阻害した。CHO細胞に、HER3と、ヘテロ二量体形成時にHER3をトランスでリン酸化することができる他のファミリーメンバーの1つだけを形質導入した。EGFRまたはHER2またはHER4が二量体形成パートナーとして用いられたかどうかにかかわらず、1D9抗体および15D5抗体は、ヘレグリンにより誘導されるHER3リン酸化を阻害した図13、図14および図15。このことは、1D9抗体および15D5抗体が、ヘレグリンにより誘導される、これらの他のファミリーメンバーとのヘテロ二量体形成を妨げ、HER3のリン酸化を妨げることを示唆する。実施例71.概要いくつかのinvitroアッセイで抗ヒトHER3抗体の特性決定を行った。これらには、これらのmAbの、全長HER3ECDおよび特定のHER3ドメインとの結合に関するアッセイ、これらのmAbの腫瘍細胞との結合に関するアッセイ、増殖アッセイ、浸潤アッセイ、インターナリゼーションアッセイ、およびこれらのmAbの交差種特異性マウスおよびカニクイザルに関するアッセイが含まれた。マウス1D9抗体、ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化アクリタマブ商標抗体を評価した。結果は、抗ヒトHER31D9抗体のマウス構築物およびヒト化構築物は双方とも、ヒトHER3ECD全長を認識し、そのHER3ECDのドメイン3に特異的に結合することを示した。これらのmAbは、ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞の増殖を用量依存的に阻害する。これらのmAbはまた、ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞の浸潤を阻害する。1D9抗体は、腫瘍細胞へのHER3受容体のインターナリゼーションを誘導する。これらのmAbはまた、マウスHER3と交差反応する。2.緒論本実施例では、抗ヒトHER3抗体に対して行ったinvitro特性決定をまとめる。本実施例は、マウス1D9抗体、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化アクリタマブ商標抗体に関するデータを含む。下記のアッセイ、すなわち、全長ヒトHER3ECDおよびドメイン結合、腫瘍細胞に対する結合、増殖、浸潤、インターナリゼーション、および交差特異性マウスから得られた結果を詳細に記載する。3.方法3.1HER3全長ECDおよびドメイン結合アッセイ目的:これらのアッセイの目的は、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化1D9アクリタマブ商標抗体が全長HER3細胞外ドメインに結合することを確認することであった。これらのアッセイのもう1つの目的は、これらのmAbがまたHER3ドメインIIIに特異的に結合することを確認することであった。HER3細胞外ドメインECDに対する抗HER3抗体の検出のために解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイDELFIAを用いた。DELFIA手順は次の通りであった:白色Maxisorp96ウェルプレートNunc437796を0.1M炭酸バッファーpH9.5中、4°Cで一晩、100μl/ウェルの1μg/mlHER-3ECD全長またはHER3ドメインI、II、IIIおよびIVでコーティングした。これらのプレートをTBS中のカゼインThermoScientific37532ロット番号JD121074でブロッキングした。無希釈ハイブリドーマ上清またはPerkinElmer4002-0010アッセイバッファーで10μg/mlまたは100μg/ml~0.01μg/mlに希釈した精製抗HER3抗体または最低3種類の希釈率のPK血清サンプル100μl/ウェルをプレートに加えた。これらのサンプルをプレートシェーカー上にて室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートした。100μl/ウェルの抗マウスEu抗体PEDELFIAAD-0124ロット326-949-A、1:1000=50ng/mlで使用またはEu標識抗ヒトIgG二次抗体Wallac1244-33050μg/ml、精製抗体には1:4,000希釈またはPK試験には1:2,000希釈で使用を用い、室温で1時間インキュベートした。各抗体インキュベーション工程の後、このプレートをBIOTEK商標プレート洗浄機にて、0.05ツィーン-20PerkinElmer4010-0010を含むトリスバッファーで4回洗浄した。100μl/ウェルのDELFIA増強溶液PerkinElmer1244-105を室温で5分間加えた。その後、このプレートをVICTOR商標1420プレートリーダーにて、ユウロピウム時間分解蛍光測定法TRFプロトコールを用いて読み取った。抗体結合を1ウェル当たりのユウロピウム総数として記録した。結果:図17は、マウス1D9抗体M5.1D9.1F5の、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIの双方に対する特異的結合を示す。図18は、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIの双方に対する特異的結合を示す。図19は、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体の、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに対する特異的結合を示す。図20は、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体の、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに対する特異的結合を示す。図21は、ヒト化1D9抗体の、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに対する特異的結合を示す。図17、図18、図19、図20および図21参照。結論:マウス1D9抗体M5.1D9.1F5は、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIの双方に特異的に結合する。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIの双方に特異的に結合する。ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体は、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに特異的に結合する。ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体は、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに特異的に結合する。ヒト化1D9抗体は、全長HER3ECDおよびHER3ドメインIIIに特異的に結合する。図17、図18、図19、図20および図21参照。3.2抗ヒトHER3抗体はフローサイトメトリーアッセイにおいてヒト癌細胞系統に結合する目的:HER3陽性細胞系統であることが知られているヒト癌細胞系統に対する抗ヒトHER3抗体の結合特性を決定すること。試薬:FACSバッファー:PBS、0.2BSA、0.1アジ化ナトリウム抗体:マウス1D9抗体M5.1D9.1F5ヒト化1D9抗体ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体PEヤギ抗マウスIgGHL-CaltagLaboratoriesM30004-4ヤギ抗ヒトIgGALEXAFLUOR647商標-InvitrogenA21445細胞系統:CHL1、BxPC3方法:HER3受容体に関して予めスクリーニングした細胞系統由来の5×106細胞を、フローサイトメトリーチューブに加えた。用量応答濃度の各供試抗体を適当なチューブに加えた。細胞および抗体を氷上で30分間インキュベートした。細胞を1mlの染色バッファーで1回洗浄した後、適当な二次抗体を適当なチューブに加えた。細胞を暗所、氷上で再び30分間インキュベートした後、FACSバッファーで洗浄し、再懸濁させた。細胞をFACSCANTO商標フローサイトメーターで分析した。データ分析:BDBiosciencesにより開発されたFACSDIVA商標ソフトウエアを用いて分析を行った。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。結果:各細胞系統に対する抗体結合のヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体のヒストグラムから右へシフトすることにより、ヒト化抗HER3mAbの特異的結合を示す。マウス1D9抗体M5.1D9.1F5は、MCF7ヒト乳癌細胞およびBxPC3ヒト膵臓腫瘍細胞で発現されるヒトHER3に結合する。図22参照。ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体は総て、CHL-1ヒト黒色腫細胞およびBxPC3ヒト膵臓腫瘍細胞上で発現されるヒトHER3に結合する。図23参照。結論:マウス1D9抗体M5.1D9.1F5は、MCF7ヒト乳癌細胞およびBxPC3ヒト膵臓腫瘍細胞により発現されるヒトHER3を認識した。図22参照。ヒト化1D9抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体は総て、CHL-1黒色腫およびBxPC3膵臓ヒト癌細胞系統上で発現されるヒトHER3を認識する。図23参照。3.3ヘレグリンにより誘導される腫瘍細胞増殖の、M5.1D9による阻害、ヘレグリンにより誘導される細胞増殖の阻害目的:MCF7またはBxPC3細胞系統のいずれかにおいて、任意の抗ヒトHER3抗体がヘレグリン-1βにより誘導される細胞増殖を阻害することができるかどうかを判定すること。試薬:完全培地:RPMI、10FBS、グルタミン細胞系統:MCF7BxPC3-ATCC抗体:マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10マウス1D9抗体M5.1D9.1F5マウス24H5抗体M5.24H5.C2ヒト化1D9抗体ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体CellTiter96非放射性細胞増殖アッセイMTT-PromegaG4000方法:MCF7またはBxPC3細胞系統のいずれか、それぞれ1×103または1×104細胞/ウェルを、平底96ウェルプレートの各ウェルの、10血清を含有する完全培地中に加え、37°Cで一晩インキュベートした。培地を除去して血清不含RPMIと交換した。スクリーニングする各抗体10μlを適当なウェルに4反復で加えた。抗体および細胞を37°Cで1時間インキュベートした。30ng/mlのヘレグリン-1βを各ウェルに加えた。ヒト化抗体実験では、p-HER3およびpAktアッセイで用いる条件に対する比較対照として100ng/mlヘレグリンを用いた。これらのプレートを37°Cで72時間インキュベートした。PromegaによるMTTキットを用いて増殖を測定し、これらのプレートをENVISION商標2103マルチラベルリーダーで分析し、マイクロソフトエクセル商標でデータを分析した。データを、抗体濃度に対するヘレグリンにより誘導される増殖のパーセンテージとしてグラフ化した。結果:MCF7細胞では、ヘレグリン-1βに応答した良好な増殖誘導が見られたおよそ40。しかしながら、BxPC3細胞での応答は限られたものであったおよそ10。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10およびマウス1D9抗体M5.1D9.1F5は双方とも、ヘレグリン-1βにより誘導されるMCF7細胞の増殖を阻害した。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10およびマウス1D9抗体M5.1D9.1F5は実際に、BxPC3増殖を細胞単独のレベルより低く阻害した。ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体は、BxPC3細胞において、マウス1D9抗体M5.1D9.1F5と同等の阻害効力を示した。図24、図25および図26参照。結論:マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10およびマウス1D9抗体M5.1D9.1F5は、MCF7およびBxPC3細胞増殖阻害能が匹敵するものであった。図24および図25。ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体は、BxPC3腫瘍細胞の増殖を阻害する。図26参照。3.4腫瘍細胞浸潤の阻害目的:本試験の目的は、任意の抗ヒトHER3抗体がヘレグリン刺激後に腫瘍細胞浸潤を阻害することができるかどうかを判定することであった。方法:HERファミリー発現に関して事前に特性決定を行ったヒト腫瘍細胞系統を浸潤アッセイに用いた。BXPC3細胞はHER-2と、程度は低いがHER3の双方を発現することが示された。BXPC3細胞浸潤に対するHER3抗体の効果は、TrevigenCULTREX商標細胞浸潤アッセイカタログ番号3455-096-Kを用いて判定した。簡単に述べると、BXPC3細胞を集密度60まで増殖させ、一晩、血清飢餓状態とした後、VERSENE商標キレート剤EDTAおよびトリプシンを用いて培養フラスコから取り出した。細胞をクエンチバッファーRPMI2BSAで洗浄し、トリパンプルー色素排除を用いて生存率を決定し、アッセイに用いるために、細胞をFBSまたはBSA含有RPMI培地に100万細胞/mlで懸濁させた。抗体を細胞とともに37°Cで1時間インキュベートした後、浸潤プレートの上のウェル列に加えた。下のウェル列にはRPMI培地10熱不活性化されていないFBSを入れた。しかしながら、下の一列のウェルにはランダムな移動を考慮するためにFBS不含のRPMIを入れた。移動した細胞をカルセイン-amで標識し、下のチャンバーをVICTOR商標IVプレートリーダーで読み取った。蛍光RFUは、移動した細胞の量を表す。各抗体のRFUをアイソタイプ対照抗体のRFUで割り、100を掛けて対照浸潤値を得た。結果:マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、キメラ1D9抗体およびキメラ15D5抗体は総て、BXPC3細胞の浸潤を40阻害した。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は細胞浸潤を30阻害した。マウス1D9抗体M5.1D9.1F5は、腫瘍細胞浸潤を20阻害した。図27参照。結論:マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、キメラ1D9抗体およびキメラ15D5抗体は、腫瘍細胞浸潤を阻害した。図27参照。3.5マウス1D9抗体のヒト腫瘍細胞への結合はHER3受容体のインターナリゼーションをひき起こす目的:任意の抗ヒトHER3抗体が結合時にHER3受容体のインターナリゼーションを引き起こすかどうかを判定すること。試薬:染色バッファー:PBS、0.2BSA、0.1アジ化ナトリウム抗体:IgG1対照-RDSystemsMAB002IgG2b対照-RDSystemsMAB004マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10-3.19mg/mlHz10-9.82mg/mlヒト化1D9抗体-1.88mg/ml二次抗体:PEヤギ抗マウスIgGHL-CaltagLaboratoriesM30004-4ヤギ抗ヒトIgGALEXAFLUOR647商標-InvitrogenA21445方法:100μlの5×106細胞/mlを、10μgの抗HER3抗体が入ったフローサイトメトリーチューブに加えた。各抗体を2反復で加えた。各抗体の1本のチューブを氷上でインキュベートし、他のチューブは37°Cでインキュベートした。2時間後、これらの細胞を1mlの染色バッファーで洗浄し、PE標識ヤギ抗マウス二次抗体で30分間、対比染色を行った。1mlの染色バッファーでさらに洗浄した後、これらの細胞をFACSCANTO商標サイトメーターで分析した。データ分析は、BDBiosciencesにより開発されたFACSDIVA商標ソフトウエアを用いて行った。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。結果:CHL-1細胞に対するHER3受容体のインターナリゼーションに関して、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10およびヒト化1D9抗体がスクリーニングされた。37°Cでインキュベートした後、これらの抗体は検出されなかったが、これはこの受容体が細胞表面には無かったことを示した。結論:マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10およびヒト化1D9抗体は、HER3受容体に結合した際にその受容体のインターナリゼーションを引き起こした。図28参照。3.6マウス1D9抗体はマウス腫瘍細胞上のマウスHER3と交差反応する目的:任意の抗ヒトHER3抗体がマウスHER3陽性細胞系統と交差反応するかどうかを判定すること。試薬:FACSバッファー:PBS、0.2BSA、0.1アジ化ナトリウム抗体:EGFR-Bioscience44783MHER2-BioscienceAHO1011HER3-Upstate05-471マウス15D5抗体マウス1D9抗体M5.1D9.1F5マウス24H5抗体M5.24H5.C2細胞系統:B16B16F10ZENON商標標識キット:マウスIgG1PE-InvitrogenZ25021マウスIgG1APC-InvitrogenZ25051マウスIgG2bAPC-InvitrogenZ25151方法:市販の抗ヒトEGFRおよびHER2抗体を準備した。供給者によりヒトHER3を認識することが示されている市販のHER3抗体を準備した。マウス15D5抗体、マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、マウス24H5抗体M5.24H5.C2抗体もまた準備した。これらの抗体を、ZENON商標標識キットInvitrogenを用いてPEまたはAPCのいずれかで標識した。5×106のB16またはB16F10マウス黒色腫細胞を、標識抗HER3抗体が入ったフローサイトメトリーチューブに加えた。細胞および抗体を暗所、氷上で30分間インキュベートし、FACSバッファーで洗浄し、再懸濁させた。次に、細胞をFACSCANTO商標フローサイトメーターで分析した。データ分析は、BDBiosciencesにより開発されたFACSDIVA商標ソフトウエアを用いて分析した。前方散乱と側方散乱を用いて細胞集団にゲートを設定し、蛍光強度のヒストグラムを作成した。結果:市販のEGFR、HER2およびHER3抗体はマウス細胞表面のこれらの受容体を認識しなかったデータは示されていない。マウス15D5抗体、マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、およびマウス24H5抗体M5.24H5.C2は総て、B16およびB16F10細胞表面のHER3を認識した。図29参照。結論:マウス15D5抗体、マウス1D9抗体M5.1D9.1F5、およびマウス24H5抗体M5.24H5.C2は、マウスHER3と交差反応する。図29参照。実施例81.概要ヒト癌のマウスモデルは、新しい抗癌薬のinvivo活性を実証するために前臨床状況で鋭意用いられている。本試験では、ヒト臨床試験に適用可能なさらなる開発のための取り組みを確立し、リード候補の優先順位を決定するために、マウス同一遺伝子型肺病巣形成モデルおよび数種のヒト異種移植モデルでマウス抗HER3モノクローナル抗体mAbを評価した。C57BL/6マウスにB16F10黒色腫細胞の単回のi.v.注射を行い、抗HER3mAb処置を伴うまたは伴わない肺における肺病巣形成を評価した。B16F10注射の3日後に50mg/kgi.p.および7日後と11日後に25mg/kgi.p.のマウス1D9抗体を投与したところ、試験の終了時、すなわち、B16F10注射の20日後に肺重量の有意な低下p<0.001が起こった。マウス15D5抗体はまた、肺において腫瘍細胞の病巣形成を阻害したがp<0.05、25および5mg/kgi.p.といった低用量計画の方が、50/25mg/kgの用量計画に比べて活性が高かった。マウス1D9mAbおよび15D5mAbは双方とも、続いて異種移植モデルでヒト腫瘍に対する活性を評価した。マウス抗HER3mAbは、CB-17SCIDマウスに移植した進行性HER3ヒト異種移植片の成長を遅延させた。週に2回、0.5~100mg/kgi.p.のマウス1D9抗体またはマウス15D5抗体で処置したところ、CHL-1黒色腫腫瘍増殖に用量依存的かつ統計学的に有意な低下が起こった≧5mg/kgでp<0.001。CB-17SCIDマウスにおける皮下移植後のBxPC3膵臓腫瘍増殖にも同様の活性が見られた≧5mg/kgでp<0.001。1D9抗体および15D5抗体は、CHL-1黒色腫異種移植モデルにおいて、5~50mg/kgの範囲の用量で、有意かつ用量依存的な抗腫瘍活性を保持していたp<0.001。さらに、ヒト化1D9RR抗体およびヒト化1D9RRアクリタマブ商標抗体は、5、25および50mg/kgの用量で有意かつ同等に強い活性を持っていたp<0.001。皮下および同所BxPC3異種移植モデルでは、50mg/kgのキメラ1D9抗体またはヒト化15D5抗体は、試験終了まで腫瘍増殖の有意な阻害を生じたがp<0.001、50mg/kgのヒト化1D9RR抗体は皮下BxPC3モデルにおける腫瘍増殖に対して、有意ではあるがp<0.001、一時的な効果を示した。増殖阻害の持続時間の違いは試験間の変動すなわち、移植されるBxPC3フラグメントの特徴によるものであると思われるが、やはり、遺伝的に操作されたmAbの腫瘍増殖に対する有効性が示された。最後に、NCI-N87胃モデルにおけるヒト化1D9RR抗体、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体、およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体の評価は、CHL-1黒色腫異種移植片に対して増強されたmAbの活性を示した。2.緒論本試験では、マウス親またはヒト化HER3モノクローナル抗体の、進行性HER3ヒト異種移植片、すなわち、CHL-1黒色腫、BxPC3膵臓腫瘍、およびNCI-N87胃腫瘍に対する抗腫瘍活性を評価した。マウス親抗HER3mAbの活性を評価するために、マウスB16F10黒色腫細胞を用いた同一遺伝子型肺病巣形成モデルを予備評価に含めた。3.方法3.1.実験の予備事項これらの試験に用いたモデルは、内務省によって制定された動物管理のUKスタンダードに準拠する。ヒト異種移植腫瘍モデル試験は、6~8週齢、体重およそ15~20グラムの雌CB-17SCIDマウスTaconic、Indiana、INで行った。マウスは試験開始時には10~12週齢であった。同一遺伝子型肺病巣形成モデル試験は、6~8週齢、体重およそ15~20gのC57Bl雌マウスで行った。マウスB16F10、およびヒトBxPC3、NCIN87およびCHL-1腫瘍細胞系統は細胞リポジトリから入手した。3.2.実験プロトコール3.2.1.マウスB16F10黒色腫同一遺伝子型モデルC57BL/6雌マウスに2×105のB16F10細胞をi.v.注射した。マウス抗HER3抗体またはアイソタイプ対照を腫瘍細胞注射の3日後に50または25mg/kgでi.p.投与し、その後、7日後と11日後に25または5mg/kgでi.p.投与した。注射3日後にジェムザール商標NDC0002-7502-01;ゲムシタビンをi.v.投与した。20日目に動物を安楽死させ、肺を摘出して湿重を測定した。3.2.2.ヒトCHL-1黒色腫異種移植モデルマトリゲル商標中、CHL-1細胞5×105~5×106を、CB-17SCIDマウスの大腿に皮下s.c.注射した。腫瘍異種移植片が平均体積80~120mm3に達したところで、マウスを治療群各群マウスn=6個体に無作為化し、抗HER3mAbまたはアイソタイプ対照を投与した。0.5~100mg/kgの用量を週に2回i.p.投与した。ビヒクル処置マウスを腫瘍増殖の対照群として用いた。毎週、腫瘍の幅Wおよび長さLを手動カリパスで測定し、下式:V=1/2L×W2を用いて腫瘍体積Vを計算した。アイソタイプ対照の平均腫瘍体積が1000mm3を越えた際に試験を終了した。3.2.3.ヒトBxPC3膵臓異種移植モデル:皮下および同所移植BxPC3細胞5×106/マウスを、ドナーとするCB-17SCIDマウスにs.c.投与した。腫瘍が800~1000mm3の体積に達した際にBxPC3担癌ドナーマウスを安楽死させ、その後、腫瘍を摘出し、3mm3の腫瘍断片に分けた。新しく摘出したBxPC3腫瘍断片をレシピエントマウスの大腿にs.c.移植した。同所モデルでは、断片をレシピエントマウスの膵臓に外科的に移植した。レシピエントマウスの腫瘍異種移植片が平均体積80~120mm3に達したところで、マウスを治療群各群マウスn=6個体に無作為化し、抗HER3mAbまたはアイソタイプ対照で処置した。0.5~100mg/kgの用量を週に2回i.p.投与皮下移植モデルまたはi.v.投与同所移植モデルした。ビヒクル処置マウスを腫瘍増殖の対照群として用いた。腫瘍体積を上記のように毎週、手動カリパスで測定した。同所モデルでは、腫瘍を超音波で測定し、VISUALSONICSVEVO商標770画像解析システムを用いて体積を求めた。3.2.4.ヒトNCI-N87胃異種移植モデルNCI-N87細胞をドナーマウスの右大腿に約1×106細胞/動物で移植した。ドナーマウスから腫瘍断片を採取し、10~12週齢のレシピエントマウスの大腿にs.c.移植した。腫瘍異種移植片が平均体積50~80mm3に達した際、または断片移植の29日後に、マウス抗HER3mAbによる処置を開始した。腫瘍異種移植片が平均体積80~1003mmに達した際、または移植の15日後に、遺伝的に操作した抗HER3mAbによる処置を開始した。腫瘍体積は上記のように手動カリパスで測定した。3.3.薬物および材料本試験に用いた抗HER3抗体およびアイソタイプ対照を下表に示す。また、本明細書に含まれる略称も示す。抗体は総て、投与用に、リン酸緩衝生理食塩水pH7.0で処方および調製した。3.4.データ分析対照群および処置群に関して、群平均値および平均値の標準誤差を求めた。データをグラフ化し、ヒト異種移植モデルではボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ANOVA、またはマウス同一遺伝子型モデルではダネットの事後検定を用いた一元配置Anovaを用いて分析したGRAPHPAD商標PRISM商標ソフトウエアv.5。4.結果4.1.マウス抗HER3mAbのinvivo有効性マウス1D9抗体およびマウス15D5抗体を、腫瘍細胞増殖に対する有効性を証明するためにマウス同一遺伝子型モデルおよび数種のヒト異種移植モデルで評価した。4.1.1.マウスB16F10黒色腫同一遺伝子型モデル抗HER3マウス1D9抗体による処置は、C57BL/6マウスの肺におけるB16F10腫瘍病巣形成を低下させた。50/25mg/kg群は、アイソタイプ対照群に比べて肺重量の有意な低下を示したp<0.01図30。また、マウス15D5抗体による処置も、25/5mg/kg群で、アイソタイプ対照に比べて、肺における腫瘍病巣形成の低下を示したp<0.05;図31。4.1.2.ヒトCHL-1黒色腫異種移植モデル抗HER3マウス1D9抗体またはマウス15D5抗体を5~100mg/kgi.p.の範囲の用量で週に2回投与したCB-17SCIDマウスは、それらの個々のアイソタイプ対照群に比べて、ヒトCHL-1腫瘍増殖に用量依存的かつ統計学的に有意な低下を示したp<0.001図32および図33。4.1.3.ヒトBxPC3膵臓異種移植モデルマウス1D9抗体を0.5~50mg/kgi.p.の用量で週に2回投与したCB-17SCIDマウスは、アイソタイプ対照群に比べて、BxPC3腫瘍増殖に有意な低下を示した≧5mg/kgでp<0.001図36。同様に、マウス15D5抗体による処置も、5~50mg/kg群で、アイソタイプ対照群に比べてBxPC3腫瘍増殖の低下をもたらしたp<0.001図35。4.1.4.ヒトNCI-N87胃異種移植モデルマウス1D9抗体を75または100mg/kgi.p.の用量で週に2回投与したCB-17SCIDマウスは、ビヒクル対照群に比べて、腫瘍体積に有意な低下を示したp<0.001図36。NCI-N87腫瘍増殖に対する、ビヒクルおよびアイソタイプ対照群に比べてのマウス15D5抗体の効果を図37に示す。4.2.キメラおよびヒト化抗HER3mAbのinvivo有効性ヒト化15D5抗体、キメラ1D9抗体、およびヒト化1D9RR抗体を作製し、評価した。種々のinvitroおよびinvivoモデルにおけるヒト化1D9RR抗体の活性に基づき、さらなる操作を用いて、IgG1mAbヒト化1D9RRアクリタマブ商標抗体またはCDCのみヒト化1D9RRポテリジェント商標抗体の抗体依存性細胞傷害性ADCCおよび補体依存性細胞傷害性CDC属性を増強した。以下にヒト異種移植モデルにおける種々の抗体の活性をまとめる。4.2.1.ヒトCHL-1異種移植モデルキメラ1D9抗体を5~50mg/kgi.p.で週に2回投与したCB-17SCIDマウスは、アイソタイプ対照群に比べて、CHL-1腫瘍増殖に用量依存的低下を示した。移植24日後の25および50mg/kg群における低下は統計学的に有意でありp<0.05、移植27日後には、総ての処置群で有意な低下が見られたp<0.001図38。同様の所見がヒト化15D5抗体処置群でも見られた図39。ヒト化H1D9RR抗体、ヒト化H1D9RRアクリタマブ商標抗体およびヒト化H1D9RRポテリジェント商標抗体を、CHL-1異種移植モデルにおいて5~50mg/kgの用量で評価した。ヒト化H1D9RR抗体、ヒト化H1D9RRアクリタマブ商標抗体およびヒト化H1D9RRポテリジェント商標抗体は、同等の活性特性を示した。総ての用量レベルで、移植29日後から34日後の試験終結まで、腫瘍増殖に有意な低下が見られたp<0.001図40、図41および図42。4.2.2.ヒトBxPC3異種移植モデル皮下および同所移植片皮下BxPC3移植後、ch1D9を0.5~50mg/kgi.p.で週に2回投与したCB-17SCIDマウスは、50mg/kg群p<0.001および5および0.5mg/kg群p<0.01において33日目から腫瘍増殖に統計学的に有意な、用量依存的低下を示した。50mg/kg群では36日目まで有意に低い腫瘍体積を維持したp<0.001図43。0.5~50mg/kgのh15D5による処置は、移植33日後および36日後に検出可能な50mg/kg群に腫瘍増殖遅延をもたらしたp<0.01図44。0.5~50mg/kgのヒト化1D9RR抗体で週に2回処置した後に、BxPC3腫瘍増殖に見られた低下の特徴を図45に示す。キメラ1D9抗体およびヒト化15D5抗体を、皮下移植よりも臨床転帰の予測性が高いと考えられるBxPC3の外科的同所移植モデルで評価した。週に2回、i.v.経路にて50mg/kgのキメラ1D9抗体またはヒト化15D5抗体で処置したところ、移植5週間後から7週間後にアイソタイプ対照に比べて有意な腫瘍増殖の遅延が生じたp<0.01図46。4.2.3.ヒトNCI-N87胃異種移植モデルヒト化H1D9RR抗体、ヒト化H1D9RRアクリタマブ商標抗体およびヒト化H1D9RRポテリジェント商標抗体の抗腫瘍活性をヒトNCI-N87胃モデルで評価した。CB-17SCIDマウスに週に2回、50mg/kgi.p.を投与した。50mg/kgで投与したヒト化H1D9RRアクリタマブ商標抗体は腫瘍体積の低下をもたらし、移植44日後に統計的有意性に達したp<0.05図47。5.考察ヒト癌のマウスモデルは、新しい抗癌薬のinvivo活性を実証するために前臨床状況で鋭意用いられている。本試験では、ヒト臨床試験に適用可能なさらなる開発のための取り組みを確立し、リード候補の優先順位を決定するために、マウス同一遺伝子型肺病巣形成モデルおよび数種のヒト異種移植モデルでマウス抗HER3モノクローナルmAbを評価した。マウス抗HER3mAbは、C57BL/6マウスの肺においてマウスB16F10腫瘍細胞病巣形成に有意な低下をもたらした。マウス1D9抗体の有効用量計画は50/25mg/kg、i.p.であったが、マウス15D5抗体では25/5mg/kg、i.p.計画の方が高用量レベルに比べて有効性が大きかった。両マウス抗HER3mAbとも、続いて異種移植モデルでヒト腫瘍に対する活性を評価した。マウス抗HER3mAbは、進行性HER3ヒト異種移植片において定着腫瘍の増殖を遅延させた。CHL-1黒色腫細胞移植後に5mg/kgを越える用量のマウス1D9抗体またはマウス15D5抗体で週に2回処置すると、腫瘍増殖に有意かつ用量依存的な低下が生じた。皮下BxPC3膵臓異種移植モデルでも同様の活性が見られた。1D9抗体および15D5抗体は、CHL-1黒色腫異種移植モデルにおいて、5mg/kg以上で用量依存的抗腫瘍活性を保持した。さらに、5mg/kgでのヒト化1D9RR抗体またはヒト化1D9RRアクリタマブ商標抗体による処置は、25mg/kg以上の用量に比べて、腫瘍増殖の遅延をもたらした。皮下および同所BxPC3異種移植モデルにおいて、50mg/kgのキメラ1D9抗体またはヒト化15D5抗体は、試験の終了まで有意な腫瘍増殖阻害を引き起こしたが、20mg/kgのヒト化1D9RR抗体は、皮下BxPC3モデルにおいて腫瘍増殖に有意な効果を示した。腫瘍増殖に対するこれらの抗体の有効性が実証された。最後に、NCI-N87胃モデルにおいてヒト化1D9RR抗体、ヒト化1D9RRアクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9RRポテリジェント商標抗体を評価したところ、CHL-1黒色腫異種移植片に対する活性に比べてmAb活性が増強される場合があることが示された。6.結論0.5~100mg/kgの範囲の濃度で週に2回投与されるマウス親および/またはヒト化HER3モノクローナル抗体による療法は、CHL-1黒色腫モデルおよびBxPC3膵臓ヒト異種移植モデルにおいて、定着したHER3ヒト腫瘍の増殖を遅延させることができた。実施例91.概要抗体依存性細胞傷害性ADCCアッセイならびに補体媒介細胞傷害性CDCアッセイの双方を用いて、野生型抗HER3抗体ならびにこれらの抗体の増強型の機能性を評価した。本実施例は、前記抗体の野生型および増強型の機能性を評価するために用いたinvitroアッセイを記載する。これらのアッセイでは、抗体の、その標的に結合し、その後、補体を付加する能力を評価するために種々のHER3発現標的細胞を、または抗体の機能的Fc領域を評価するためにエフェクター細胞を用いた。2.緒論これらの実施例は、増強されていない野生型抗体よりも抗HER3の機能性/効力が増強された増強型抗体を示す。3.方法3.1.実験の予備事項3.2.実験プロトコール3.2.1抗体依存性細胞傷害性精製されたヒト末梢血単核細胞を、これらのADCCアッセイにおいてエフェクター細胞として特性決定した。簡単に述べると、ナトリウムヘパリンを用いて採取したヒト全血を、密度勾配分離遠沈管UNI-MAX商標、AccurateSurgicalandScientific製を用いて精製した。その後、これらの精製末梢血単核細胞を洗浄し、フェノールレッド不含RMPI164010FBSに再懸濁させた1×107細胞/mlT:E比1:50。次に、HER3受容体陽性細胞HER3BACMAM商標形質導入HEK293MSRIIまたはCHL-1細胞にユウロピウムを添加して標的細胞として用いた。これらの形質導入細胞を高HER3発現細胞系統として用い、CHL-1細胞を低発現細胞系統として用いた。添加済み標的細胞をフェノールレッド不含RMPI164010FBSに8×105細胞/mlとなるように再懸濁させた。数種の抗HER3抗体25μl/ウェルを96ウェル丸底プレートに添加した。その後、この抗体含有プレートに、ユウロピウムを添加した標的細胞25μl/ウェルを加え、37°C、5CO2にて30分間インキュベートした。この30分のインキュベーション後に、100μl/ウェルのエフェクター細胞をプレートに加え、さらに2時間インキュベーターに戻した。特異的細胞溶解の測定は、実験プレートから25μl/ウェルの上清を取り出し、100μl/ウェルのDELFIA商標増強溶液が入った96ウェルmaxisorpプレートに移すことにより行った。室温で5分のインキュベーション後に、プレートをWallacVICTOR商標Vプレートリーダーにて時間分解蛍光を用いて読み取った。溶解した標的細胞から周囲の上清中へ放出されたユウロピウム細胞細胞傷害性を蛍光単位として測定した。値を特異的溶解に変換し、GRAPHPAD商標PRISM商標ソフトウエアを用い、抗体濃度に対する溶解としてプロットした。特異的細胞傷害性を計算するために用いた式は下記の通りである。対照ウェル:洗剤TRITONX商標の1溶液を最大放出ウェルに加えて細胞死とそれに続くユウロピウム放出を誘導した。自発的ユウロピウム放出のレベルを測定するために、いくつかの付加的対照ウェルに標的細胞を入れ、エフェクター細胞は含まなかった。形質導入:適当なBACMAM商標ウイルスヒトHER3、カニクイザルHER3またはラットHER3をHEK293MSRII細胞に多重感染度moi10024時間に8~15ウイルスv/vに相当で加えた。その後、形質導入細胞を組織培養フラスコからTrypLEを用いて取り出し、数回洗浄し、ユウロピウムを添加し、ADCCアッセイにおいて標的細胞として用いた。サル血液:密度勾配分離バッファーフィコール商標を、Ca2およびMg2不含PBSで10v/v希釈した後、サル末梢血リンパ球エフェクター細胞に対して密度勾配遠心分離を行った。ヒト血液はこれらの試験に対し、既定方針に従って用いた。サル血液は、既定プロトコールの下で得た。これらの試験に用いたモデルは、動物管理のUSスタンダードに準拠する。3.2.2補体依存性細胞傷害性これらの実験は、hHER3BACMAM商標形質導入HEK293MSRII細胞系統を標的として用いて行った。簡単に述べると、これらの細胞に、T175培養フラスコ中、37°C、5CO2にて約21時間形質導入を行ったmoi100。その後、フラスコから接着細胞を、TrypLEを用いて取り出し、数回洗浄した後に、96ウェルプレートに1×105細胞/50μl/ウェルで播種した。すぐに25μl/ウェルの抗ヒトHER3mAbを加え、37°C、5CO2にて30分間インキュベートした。このインキュベーション後、カルビオケム商標製のウサギ補体20μl/ウェル最終20を実験プレートに加え、37°C、5CO2にてさらに2時間インキュベートした。細胞生存率の評価は、マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合しながら各ウェルに100μlの細胞TITER-GLO商標を加えることによって行った。その後、このプレートの発光シグナルをWallacVICTOR商標Vプレートリーダーで読み取った生細胞はシグナルの増強を示す。3.3.薬物および材料ヒトHER3BACMAM商標サルカニクイザルHER3BACMAM商標フィコール商標GEHealthcare17-1440-02TRITONX-100商標SigmaT9284分離チューブAccurateSurgicalScientificUN-10ユウロピウムFluka20712896ウェル丸底プレートCostar379996ウェル平底プレートThermoScientific436110ヒト化1D9Fc障害抗体ヒト化1D9抗体ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体ヒト化1D91D9ポテリジェント商標抗体補体カルビオケム商標234400細胞TITERGLO商標PromegaG7571DELFIA商標増強溶液4001-00103.4.データ分析GRAPHPAD商標PRISM商標ソフトウエアを用いて、抗体濃度に対して特異的溶解をプロットし、EC50値を計算した。4.結果4.1ADCCアッセイヒト化1D9抗体HZ1D9またはH6L2と表記される場合もある、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化1D9アクリタマブ商標抗体を評価したヒトPBLADCCアッセイから得られた結果を図48および図49に示す。これらの結果は、標的細胞としてHER3BACMAM商標形質導入HEK293細胞およびエフェクター細胞としてヒト末梢血リンパ球を用いて得られたものである図48。この設定実験を、同時に、標的細胞集団としてCHL-1細胞同じヒトPBLエフェクター細胞を用いるを用いても行った図49。これらの結果は明らかに、野生型非増強抗体に比べて増強抗体では効力の増大と最大溶解の増大の双方が得られたことを示した。ヒト化1D9抗体HZ1D9またはH6L2と表記される場合もある、ヒト化1D9Fc障害抗体、ヒト化1D9ポテリジェント商標抗体およびヒト化1D9アクリタマブ商標抗体を評価したカニクイザルPBL末梢血リンパ球ADCCアッセイから得られた結果を図50~図53に示す。これらの結果は、標的細胞としてHER3BACMAM商標形質導入HEK293細胞およびエフェクター細胞としてカニクイザル末梢血リンパ球を用いて得られたものである図50および図51。この設定実験を、同時に、標的細胞集団としてCHL-1細胞同じカニクイザルPBLエフェクター細胞を用いるを用いても行った図52および図53。これらの結果は明らかに、野生型非増強抗体に比べて増強抗体では効力の増大と最大溶解の増大の双方が得られたことを示した。4.2CDCアッセイ図54に示される結果は、ヒトHER3形質導入HEK293標的細胞およびウサギ補体を用いたCDCアッセイから得られたものである。これらの結果は、ヒト化1D9抗体HZ1D9またはH6L2と表記される場合もある、およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体がそれぞれ同レベルの補体媒介標的細胞溶解をもたらしたことを示した。一方、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体は、補体媒介溶解に、これらの他の抗体で見られるものを越える、少なくとも10倍の向上を示した。ヒト化1D9Fc障害抗体は、測定可能な補体媒介溶解を示さなかった。5.考察本明細書に示される結果は、ヒト化1D9抗体の増強型例えば、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体が抗体依存性細胞傷害性アッセイならびに補体依存性細胞傷害性アッセイの双方で機能の向上を示したことを証明した。これは、高ADCCおよびCDCおよび低ADCCヒトHER3発現細胞系統ならびにカニクイザルHER3発現細胞ADCCの双方で証明された。ヒトエフェクター細胞データは、ADCC/CDC反応性を確保するために選択基準を用いなかったことから、ヒト集団において見られる得るものとして適切である。個々のヒトドナー間では違い特異的溶解の高低が見られるが、Fc増強抗体は、親野生型抗体よりも高い効力を一貫して示した。カニクイザルエフェクター細胞データにより、本発明者らは、毒性試験全般に用いられる実際のサルからのエフェクター細胞の特性決定を行うことができた。まとめると、ヒト化1D9アクリタマブ商標抗体およびヒト化1D9ポテリジェント商標抗体は双方とも、ADCCおよびADCC/CDC機能の改善それぞれを示した。実施例101.概要マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、ヒトHER3受容体のドメインII細胞外領域に結合するマウス抗HER3抗体である。この抗体は、冷凍物およびホルマリン固定パラフィン包埋FFPE物双方の癌性ヒト組織と十分に結合することが免疫組織化学により示されている。2.緒論HER3発現を評価するための比較診断薬として使用できるかどうか、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10のバリデーションを行った。この比較診断薬は、抗HER3モノクローナル抗体療法から臨床上利益を受け得る患者を特定する助けとして使用することができる。この比較mAbを用いれば、腫瘍を、腫瘍組織のHER3発現レベル、および/またはHER3受容体発現の強度に基づいてカテゴリーに分類することができる。本実施例では、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の特異性のバリデーションの助けとして使用される重要な実験のいくつかの概要を述べる。本実施例の実験では、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10抗体の、HER3および他のHERファミリーメンバー例えば、HER1、HER2およびHER4に対する免疫反応性および特異性を調べる。本実施例では、冷凍組織およびホルマリン固定パラフィ包埋組織に対する免疫組織化学;4つのHERファミリーメンバー例えば、HER1、HER2、HER3およびHER4の免疫細胞化学;免疫沈降;特異性を確認するための競合アッセイ;ならびに細胞溶解液および精製HER3細胞外ドメイン領域ウエスタンブロット法から得られた結果を記載する。3.方法3.1.実験の予備事項3.2.実験プロトコール3.2.1.HerファミリーメンバーのウエスタンブロットHEK293MSRII細胞にHER1、HER2、HER3またはHER4BACMAM商標を、37°C、5CO2にて22時間、多重感染度moi100で形質導入した。各細胞系統をバーセンを用いて採取た後、トリパンプルー排除染色を用いて細胞計数を行った。これらの細胞懸濁液を10mlのPBSで洗浄した後、3×107細胞を回収し、1mlのRIPA溶解溶液RIPA溶解原液:10ml1×RIPA溶解バッファーminihaltプロテアーゼ阻害剤1錠中に入れた。その後、この調製物を2分間ボルテックスにかけ、遠心分離し、上清細胞溶解液を4°Cで保存した。これらの細胞溶解液をLDSサンプルバッファーおよび還元剤と合わせた後、10分間70°Cに加熱した。室温まで冷却した後、これらの溶解液をQIASHREDDER商標中に入れ、2分間14,000rpmで回転させた。次に、これらの溶解液を4~12勾配Bis-Trisゲルの各レーンにのせ、電気泳動によりタンパク質を分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写した後、0.1Tween-20を含有するブロッキング溶液とともに一晩インキュベートした。HER1、HER2、HER3またはHER4ファミリーメンバーのいずれかに対する一次抗体を室温で5時間添加した。その後、IRコンジュゲート二次抗体とともに1時間インキュベートした。次に、これらのブロットを、LI-COR商標ODYSSEY商標画像解析装置を用いて可視化した。3.2.2.マウス15D5抗体を用いた免疫沈降3×107細胞/mlの懸濁液から上記のようにして調製した200μlの溶解液を10μgのマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10と合わせ、回転装置上、4°Cで一晩インキュベートした。次に、この抗原-抗体複合体を50μlの沈降不動A/Gタンパク質樹脂100μl樹脂スラリーと合わせ、回転装置上、室温で2時間、穏やかに混合しながらインキュベートした。免疫沈降物を、4°Cで5分間、5,000rpm~1,000xgで遠心分離することにより回収した。その後、このペレットを1mlRIPAバッファーで4回洗浄した。洗浄したペレットを20μlの1×LDSローディングバッファー100μlのRIPAバッファー、33μlのLDSサンプルバッファー4×、13.3μlの還元剤10×に再懸濁させ、サンプルを100°Cで5分間煮沸した。これらのサンプルを氷上で放冷した後、5,000rpm~1,000xgで1分間遠心分離した。次に、これらのサンプルをゲル0.4μg/レーンのHER3抗原、10μl/レーンのHERファミリーBACMAM商標形質導入HEK293MSRII溶解液および20μl/レーンのCHL-1細胞溶解液にのせ、200Vでおよそ50分間泳動させた。ゲルで分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写した後、得られたブロットを市販の抗HER3一次mAbRDSystemMAB3482、次いで、IRコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。その後、これらのブロットを、LI-COR商標ODYSSEY商標画像解析装置を用いて可視化した。3.2.3.Herファミリーメンバーの免疫細胞化学HEK293MSRII細胞にHer3BACMAM商標を、37°C、5CO2にて24時間、100moiで形質導入した。次に、TrypLEを用いて細胞を採取し、細胞を計数し、PBSを用いて洗浄した。その後、PBS中、0.5×106細胞/mlの懸濁液を調製し、この懸濁液100μlを、顕微鏡スライドを取り付けたサイトスピン漏斗に加えた。これらを500rpmで5分間回転させて、50,000細胞を含む細胞スポットを得た。スライドを生物実験用フード内で一晩乾燥させ、翌日、室温のアセトンで2分間固定した。2時間乾燥させた後、これらのスライドをサランラップで包み、免疫染色に用いるまで-20°Cで保存した。6枚のスライドを-20°Cの冷凍庫から取り出し、室温とし、風乾させた。乾燥したところで、各細胞スポットをPapペンでマークして、染色のために疎水性のバリアを形成した。スライドをTBSTTris緩衝生理食塩水0.05TWEEN-20商標中に入れて10分間水和させ、タンパク質ブロッキング溶液に30分間入れた。1μg/mlのマウス15D5抗体一次抗体としてをそのままスライドに室温で2時間適用した。スライドをTBSTで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス二次抗体をそのまま室温で2時間適用した。スライドをTBSTを用いて各5分間3回洗浄した後、DAB基質を2分間加えた。その後、スライドを水で各5分間3回すすぎ、ヘマトキシリン中に2分間置いた。次に、スライドを水で各5分間3回洗浄し、スライドを十分乾燥させた後、観察のためにカバーガラスをかけた。3.2.4.HER3の細胞外ドメインII領域を用いた競合アッセイHEK293MSRII細胞にHER3BACMAM商標を、37°C、5CO2にて24時間、100moiで形質導入した。このインキュベーション時間の後、TrypLEを用いて細胞を採取し、細胞計数を行った後、PBSを用いて細胞を洗浄した。これらの細胞をPBSに0.5×106細胞/mlとなるように再懸濁させ、100μlを、顕微鏡スライドを取り付けたサイトスピン漏斗に加えた。これらを500rpmで5分間回転させて、50,000細胞を含む細胞スポットを得た。スライドを生物実験用フード内で一晩乾燥させ、翌日、室温のアセトンで2分間固定した。2時間乾燥させた後、これらのスライドをサラン商標ラップで包み、免疫染色に用いるまで-20°Cで保存した。次に、2枚のスライドを冷凍庫から取り出し、室温まで温め、風乾させた。乾燥したところで、各細胞スポットをPapペンを用いて丸で囲み、染色のために疎水性のバリアを形成した。スライドをTBSTTris緩衝生理食塩水0.05TWEEN-20商標中に入れて10分間水和させ、タンパク質ブロッキング溶液に30分間入れた。1μg/mlの一次抗体、または1:1モル比の一次抗体とヒトHER3ドメインIIをそのままスライドに室温で2時間適用した。スライドをTBSTで3回洗浄し、HRPコンジュゲート抗マウス二次抗体をそのまま室温で1時間適用した。スライドをTBSTを用いて各5分間3回洗浄した後、DAB基質を5分間加えた。その後、スライドを水で各5分間3回洗浄し、スライドを十分乾燥させた後、観察のためにカバーガラスをかけた。3.2.5.HER3細胞外ドメインのウエスタンブロットHER3の4つの細胞外ドメインを、還元剤を含むLDSドデシル硫酸リチウムサンプルバッファーと合わせ、10分間70°Cに加熱した。室温まで冷却した後、溶解液を4~12勾配Bis-Trisゲルの各レーンにのせ、電気泳動によりタンパク質を分離した。分離されたタンパク質をニトロセルロースに転写することによりブロッティングしてブロットを形成し、このブロットを0.1Tween-20を含有するブロッキング溶液とともに一晩インキュベートした。次に、このブロットを希釈したマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10とともに室温で2時間インキュベートした。次に、このブロットをIRコンジュゲート二次抗体とともに1時間インキュベートした。その後、LI-COR商標ODYSSEY商標画像解析装置を用いてブロットを可視化した。3.2.6.冷凍組織およびFFPE組織の免疫組織化学ヒト乳癌組織16943a1d、16945a1o、22687a1p、23110a1kを、同じ摘出腫瘍からの冷凍サンプルおよびホルマリン固定パラフィン包埋FFPEサンプルの双方として保存した。HER3受容体発現の免疫組織化学的IHC評価のために、保存したヒト乳癌組織の切片を作製した。簡単に述べると、FFPE組織を6μmの切片とし、VARISTAIN商標GeminiES自動スライド染色装置を用い、十分なキシレン置換シリーズとアルコール段階を行うことにより、脱パラフィンと再水和を行った。種々の条件を比較するため、DECLOAKINGCHAMBER商標を用いていくつかの抗原賦活エピトープ賦活法を適用した。Tris-0.05TWEEN-20商標バッファーを用いた洗浄工程の後、組織をペルオキシダーゼブロックとともに5分間インキュベートし、その後、タンパク質ブロック溶液でブロッキングした。これらの組織切片に一次抗体を30~60分間適用した。洗浄する工程の後、二次抗体を30~60分間適用した。さらなる洗浄工程の後、DABジアミノベンジジンとともに5分間インキュベートした後に特異的免疫反応性を可視化した。その後、組織切片を水ですすぎ、1分間ヘマトキシリンで対比染色を行った。モノクローナル抗体染色は、DakoAutostainerSystemを用いて行った。冷凍組織を顕微鏡スライド上で6ミクロンの切片とし、室温で2時間乾燥させた。その後、スライド上の切片組織を室温で2分間、アセトンで固定し、乾燥させた。Tris-0.05TWEEN-20商標バッファーで洗浄した後、それらの組織をペルオキシダーゼブロックとともに5分間インキュベートし、タンパク質ブロック溶液を受容させた。FFPE組織に関して上記で概略を示したように染色を続けた。3.2.7.Multi-TumorTMAの免疫組織化学的評価標準的な手動または自動染色プロトコールを用いてスライドを染色した。腫瘍を切片化し、脱パラフィンを行った。切片を内因性のペルオキシダーゼおよび非特異的抗体結合ブロッキング溶液とともにインキュベートし、エピトープ賦活を行った後、一次抗体とともにインキュベートした。インキュベーションとインキュベーションの間には洗浄工程を行った。非特異的結合に対する標準的なブロッキング工程を行った。標準的な抗原賦活技術を行った。手動染色では、ABC商標HRPキットVectorLaboratories,Inc.を併用する二次ビオチン化抗体か、またはENVISION商標HRPコンジュゲートポリマーキットDakoNorthAmerica,Inc.および製造者の説明書に一致するジアミノベンジジン基質反応産物のいずれかを用いて結合を可視化した。自動染色可視化では、OMNIMAP商標HRPポリマー化学VentanaMedicalSystems,Inc.を用いて可視化を行った。適当であれば、標準的なヘマトキシリンまたはメチルグリーン核対比染色技術を用いて切片を対比染色した。3.3.薬物および材料HER1BACMAM商標vironsヒトHER2BACMAM商標vironsヒトHER3BACMAM商標vironsヒトHER4BACMAM商標vironsLDSサンプルバッファーInvitrogenNP0007QIASHREDDER商標Qiagen79656MINI-HALT商標プロテアーゼ阻害剤Rochediagnostics13535400ウエスタンブロックバッファーRocklandMB-070ニトロセルロース膜InvitrogenLC2000ウサギ抗ヒトErbB2ヒトHER2DakoA0485マウス抗ヒトEGFRヒトHER1DakoM3563クローンH11ヤギ抗マウスIR-DYE800商標抗体Rockland610-131-121ヤギ抗ウサギIR-DYE680商標抗体Li-CorOdyssey827-88367抗ヒトHER3モノクローナル抗体RDSystemMAB3482Tris緩衝生理食塩水DakoS1968ENVISION商標System-HRPDABキットDakoK4007マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H103.19mg/mlヒトHER3ドメインII競合に使用1.66mg/mlタンパク質ブロック溶液DakoX0909ロット10037797THERMOSHANDONEZDOUBLECYTOFUNNEL商標A78710005VWRSUPERFROSTPLUS商標48311-703TRYPLE商標SelectGibco12563-011RIPAバッファーSigmaR0278Multi-tumorhumanTissueMicroArrayTMAHu80357CAMB12-GSK-TMA-Origene4.結果4.1.1.4つのHERファミリーメンバーを発現した細胞溶解液のウエスタンブロット法によれば、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10がヒトHER3を選択的に認識し、ヒトHER1、ヒトHER2およびヒトHER4に対する交差反応性はほとんどないか、全くないことが示された。HER2およびHER1の発現を確認し、また比較するために、HER2に対する市販の抗体DakoおよびHER1に対する市販の抗体Dakoをこれらの溶解液で試験した。これらの結果によれば、ヒトHER2およびヒトHER1はHEK293細胞で行われた形質導入によって発現されたことが確認された。これらの結果はまた、抗HER2抗体Dakoとある程度の交差反応性を示した。4.1.2.ヒトHER3を形質導入したHEK293細胞およびCHL-1細胞を用いた免疫沈降実験では、高および低HER3発現細胞系統を検討する機会が得られた。これらの実験では、免疫沈降物中のヒトHER3の検出のためにマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10または市販の抗HER3抗体RDSystemsを用いた場合に、免疫反応性の類似のバンドパターンが示された。4.1.3.マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10を用いたヒトHER1、ヒトHER2、ヒトHER3およびヒトHER4BACMAM商標形質導入細胞の免疫組織化学分析では、ヒトHER3に対する強い免疫反応性が示され、他のHERファミリーメンバーとの免疫反応性はほとんどないか、全くなかった。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10はヒトHER3と優先的に結合する。4.1.4.マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10またはマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10を当モル濃度のヒトHER3ドメインIIECDと組み合わせて用いた場合の競合アッセイでは、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の免疫反応性が、ヒトHER3のドメインIIとともにプレインキュベーションを行うことにより完全に遮断されたことを示した。これらの結果により、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10がヒトHER3受容体の細胞外ドメインII領域に特異的に結合することが確認される。4.1.5.HER3細胞外ドメインのウエスタンブロット分析では、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の、ヒトHER3のドメインIIに対する特異性、およびこの抗体にはヒトHER3のドメインI、IIIおよびIVとの免疫反応性がないことが示された。4.1.6.冷凍物およびFFPE物の対応する癌性乳房組織n=4の免疫組織化学染色は、一致する染色パターンを示した。FFPE組織の構造的保全性は冷凍サンプルよりも保存状態が良いが、膜染色のパターンはこれら2種類の保存法で同様であった。図6は、これらの冷凍および固定乳房組織に見られる膜染色の1枚の代表的な写真を示す。4.1.7.腫瘍および代表的な正常組織を含むマルチ腫瘍アレイHu80357で、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10を用いてHER3の発現を評価した。示されている結腸、前立腺、乳房、子宮内膜、脳および皮膚腫瘍核の質的評価は総てヒトHER3の発現を示した。腎臓腫瘍1サンプルおよび肺癌1サンプルもヒトHER3の発現を示した。ヒトHER3の最も強い発現は黒色腫および前立腺腫瘍サンプルで見られた。黒色腫7サンプルおよび前立腺腫瘍7サンプルは、強いヒトHER3の発現を示した。乳癌8サンプルもヒトHER3の発現を示した。正常組織サンプルは、腫瘍サンプルよりも著しく低いシグナルを示したが、正常結腸3サンプルおよび正常乳房1サンプルはある程度のシグナルを示した。5.考察および要約本報告に記載されている実験は、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の感受性および特異性を実証する。本明細書に記載されるように、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、まず、ハイブリドーマパネルから、予備ELISAスクリーニングに基づき、HER3の細胞外領域に対するその特異性に関して選択された。HER3のさらなる特異性の決定は、ウエスタンブロット法およびBACMAM商標形質導入細胞を用いた免疫細胞化学によって行った。これらの実験では、ヒトHER3形質導入細胞は特異的免疫反応性を示したが、他のヒトHERファミリーメンバーを発現する細胞は反応性がほとんどないことを示した。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10を市販の抗体と組み合わせて免疫沈降アッセイでも用いたところ、HER3の特異的プルダウンを示した。さらに、ヒトHER3形質導入細胞のサイトスピン標本ならびにこれらの細胞冷凍標本に対して免疫細胞化学分析を行ったところ、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10がどのアッセイでもHER3を認識し、免疫組織化学アッセイにおいてHER3に結合できることが確認された。このマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10のヒトHER3受容体への結合は、この抗体をヒトHER3の細胞外ドメインII領域とともにプレインキュベートすることによって遮断することができたが、これにより、HER3のこの領域に対するその特異性が確認される。ホルマリン固定されかつパラフィン処理された、同様のバキュロウイルス形質導入細胞に対するマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10についても、さらなる免疫組織化学的プロトコールを開発したところ、細胞の調製法にかかわらず、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の、IHCによるHER3検出能が示された。本実施例に記載される実験で、乳腺癌の冷凍サンプルとFFPEサンプルの対応する対でヒトHER3の免疫反応性を実証することにより、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の挙動の、このクロスプラットフォーム的一貫性が確認される。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10により検出されるヒトHER3シグナルの存在量および相対的発現は、両検体調製法で同じであった。種々腫瘍タイプのパネルに対してマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10を用いる免疫組織化学的標的バリデーション試験は発現の違いを示したが、特定の腫瘍タイプ例えば、黒色腫、前立腺癌、乳癌内では、HER3のパターンおよび相対的存在量に一貫性が見られた。さらに、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、種々のプロトコールおよび染色系においてHER3の検出に成功を収めた。これらの所見は、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10が、プロトコールおよび検体の保存法に関わらず、腫瘍切片における免疫組織化学によりヒトHER3を一貫して正確に検出できることを示している。マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10はまた、種々のアッセイにおいてHER3の細胞外ドメインを特異的に検出する。本実施例ではまた、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10がこれらのアッセイにおいて変形形態であっても一貫して機能することも記載した。特に、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、組織切片において免疫組織化学によりヒトHER3を検出するのに高い程度の特異性および感受性を示した。さらに、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10は、同じサンプルにおいて異なるアッセイを用いて同レベルのヒトHER3を検出することができたマウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10シグナルとヒトHER3の存在量の間に正比例を示す。本実施例に記載された結果を考え合わせると、マウス15D5抗体M5.15D5.2A1.1H10の性能、特異性および一貫性が実証され、ヒトHER3診断アッセイ例えば、IHCアッセイにおける抗体試薬としてのその適性が裏付けられる。実施例11非公式配列表以下の下線は、抗体の可変重鎖および可変軽鎖部分のCDR配列、またはこれらのCDR配列をコードする核酸配列を示す。例えば、配列番号1では、フレームワークおよびCDRは、示されている配列の近位アミノ末端部分から遠位カルボキシ末端部分の順に、プレーンテキストのフレームワーク1、下線のCDR1、プレーンテキストのフレームワーク2、下線のCDR2、プレーンテキストのフレームワーク3、下線のCDR3およびプレーンテキストのフレームワーク4として表される。以下の斜体はシグナル配列を示す。1文字アミノ酸コードの記号の右側のアスタリスクは、左側のアミノ酸残基が可能性のあるN-グリコシル化部位であることを示す。この図式は例えば配列番号5、9、13、17、22、26、30、34、38~43、44、48、57などに用いられている。本明細書に開示される種々の抗体に関する詳細を示す表も提供する。下記表17参照。M5_15D5_2A1_1H10_VH配列番号1M5_15D5_2A1_1H10_CDRH1配列番号2M5_15D5_2A1_1H10_CDRH2配列番号3M5_15D5_2A1_1H10_CDRH3配列番号4M5_15D5_2A1_1H10_VL配列番号5M5_15D5_2A1_1H10_CDRL1配列番号6M5_15D5_2A1_1H10_CDRL2配列番号7M5_15D5_2A1_1H10_CDRL3配列番号8M5_22A5_1G6_1C10_VH配列番号9M5_22A5_1G6_1C10_CDRH1配列番号10M5_22A5_1G6_1C10_CDRH2配列番号11M5_22A5_1G6_1C10_CDRH3配列番号12M5_22A5_1G6_1C10_VL_LC1配列番号13M5_22A5_1G6_1C10_CDRL1_LC1配列番号14M5_22A5_1G6_1C10_CDRL2_LC1配列番号15M5_22A5_1G6_1C10_CDRL3_LC1配列番号16>M5_22A5_1G6_1C10_VL_LC2配列番号17M5_22A5_1G6_1C10_CDRL1_LC2配列番号18M5_22A5_1G6_1C10_CDRL2_LC2配列番号19M5_22A5_1G6_1C10_CDRL3_LC2配列番号20ヒトHER3アミノ酸配列配列番号21ヒト化_15D5_VHアミノ酸配列ヒト化15D5H4配列番号22ヒト化_15D5_CDRH1アミノ酸配列配列番号23ヒト化_15D5_CDRH2アミノ酸配列配列番号24ヒト化_15D5_CDRH3アミノ酸配列配列番号25ヒト化_15D5_VLアミノ酸配列ヒト化15D5L1配列番号26ヒト化_15D5_CDRL1アミノ酸配列配列番号27ヒト化_15D5_CDRL2アミノ酸配列配列番号28ヒト化_15D5_CDRL3アミノ酸配列配列番号29ヒト化_1D9_VHアミノ酸配列配列番号30ヒト化1D9H6ヒト化_1D9_CDRH1アミノ酸配列配列番号31ヒト化_1D9_CDRH2アミノ酸配列配列番号32ヒト化_1D9_CDRH3アミノ酸配列配列番号33ヒト化_1D9_VLアミノ酸配列配列番号34ヒト化1D9L2ヒト化_1D9_CDRL1アミノ酸配列配列番号35ヒト化_1D9_CDRL2アミノ酸配列配列番号36ヒト化_1D9_CDRL3アミノ酸配列配列番号37マウス15D5_VH核酸配列配列番号38マウス15D5_VL核酸配列配列番号39ヒト化_15D5_VH核酸配列細胞ヒト化15D5H4配列番号40ヒト化_15D5_VL核酸配列細胞ヒト化15D5L1配列番号41ヒト化_1D9_VH核酸配列細胞ヒト化1D9H6配列番号42ヒト化_1D9_VL核酸配列細胞ヒト化1D9L2配列番号43マウス_1D9_VHアミノ酸配列配列番号44M5.1D9.1F5VHマウス_1D9_CDRH1アミノ酸配列配列番号45マウス_1D9_CDRH2アミノ酸配列配列番号46マウス_1D9_CDRH3アミノ酸配列配列番号47マウス_1D9_VLアミノ酸配列配列番号48M5.1D9.1F5VLマウス_1D9_CDRL1アミノ酸配列配列番号49マウス_1D9_CDRL2アミノ酸配列配列番号50マウス_1D9_CDRL3アミノ酸配列配列番号51マウス_1D9_VH核酸配列配列番号52マウス_1D9_VL核酸配列配列番号53マウス_22A5_VH核酸配列配列番号54マウス_22A5_VL核酸配列配列番号55マウス_22A5_VL核酸配列配列番号56ヒト化_1D9_E_VLアミノ酸配列配列番号57ヒト化1D9EL2ヒト化_1D9_E_VL核酸配列細胞配列番号58マウス15D5_VH核酸配列細胞配列番号59マウス15D5_VL核酸配列細胞配列番号60マウス_1D9_VH核酸配列細胞配列番号61マウス_1D9_VL核酸配列細胞配列番号62マウス_22A5_VH核酸配列細胞配列番号63マウス_22A5_VL核酸配列細胞配列番号64マウス_22A5_VL核酸配列細胞配列番号65ヒトHER3細胞外ドメインw/oシグナル配列結晶構造に相当配列番号66ヒト化1D9H0VHアミノ酸配列配列番号67ヒト化1D9H0VH核酸配列配列番号68ヒト化1D9H1VHアミノ酸配列配列番号69ヒト化1D9H1VH核酸配列配列番号70ヒト化1D9H2VHアミノ酸配列配列番号71ヒト化1D9H2VH核酸配列配列番号72ヒト化1D9H3VHアミノ酸配列配列番号73ヒト化1D9H3VH核酸配列配列番号74ヒト化1D9L0VLアミノ酸配列配列番号75ヒト化1D9L0VL核酸配列配列番号76ヒト化1D9L3VLアミノ酸配列配列番号77ヒト化1D9L3VL核酸配列配列番号78ヒト化1D9L4VLアミノ酸配列配列番号79ヒト化1D9L4VL核酸配列配列番号80ヒト化1D9L5VLアミノ酸配列配列番号81ヒト化1D9L5VL核酸配列配列番号82ヒト化1D9L6VLアミノ酸配列配列番号83ヒト化1D9L6VL核酸配列配列番号84ヒト化1D9L7VLアミノ酸配列配列番号85ヒト化1D9L7VL核酸配列配列番号86ヒト化1D9L9VLアミノ酸配列配列番号87ヒト化1D9L9VL核酸配列配列番号89ヒト化15D5H1VHアミノ酸配列配列番号90ヒト化15D5H1VH核酸配列配列番号91ヒト化15D5H2VHアミノ酸配列配列番号92ヒト化15D5H2VH核酸配列配列番号93ヒト化15D5H3VHアミノ酸配列配列番号94ヒト化15D5H3VH核酸配列配列番号95ヒト化15D5L2VLアミノ酸配列配列番号96ヒト化15D5L2VL核酸配列配列番号97ヒト化15D5L3VLアミノ酸配列配列番号98ヒト化15D5L3VL核酸配列配列番号99ヒト化1D9H6全長重鎖アミノ酸配列FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系細胞においてヒト化1D9H6L2抗体を発現させるために使用、またFUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞においてヒト化1D9H6L2ポテリジェント商標抗体を発現させるために使用配列番号100ヒト化1D9H6全長重鎖核酸配列FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系においてヒト化1D9H6L2抗体を発現させるために使用、またFUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞においてヒト化1D9H6L2ポテリジェント商標抗体を発現させるために使用。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。配列番号101ヒト化1D9H6コンプリジェント商標FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系においてヒト化1D9H6L2コンプリジェント商標抗体を発現させるために使用またはアクリタマブ商標FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞において発現させる場合に、ヒト化1D9H6L2アクリタマブ商標抗体を発現させるために使用IgG1/IgG3アイソタイプキメラ全長重鎖アミノ酸配列配列番号102ヒト化1D9H6コンプリジェント商標FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系においてヒト化1D9H6L2コンプリジェント商標抗体を発現させるために使用またはアクリタマブ商標FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞において発現させる場合に、ヒト化1D9H6L2アクリタマブ商標抗体を発現させるために使用IgG1/IgG3アイソタイプキメラ全長重鎖核酸配列。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。配列番号103ヒト化1D9L2全長軽鎖アミノ酸配列ヒト化1D9H6L2抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系において配列番号100と同時発現させるために使用、ヒト化1D9H6L2ポテリジェント商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞において配列番号100と同時発現させるために使用、ヒト化1D9H6L2コンプリジェント商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系において配列番号102と同時発現させるために使用、またヒト化1D9H6L2アクリタマブ商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系において配列番号102と同時発現させるために使用配列番号104ヒト化1D9L2全長軽鎖核酸配列ヒト化1D9H6L2抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系において配列番号100と同時発現させるために使用、ヒト化1D9H6L2ポテリジェント商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系CHOK1SV細胞において配列番号100と同時発現させるために使用、ヒト化1D9H6L2コンプリジェント商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを有する非ポテリジェント商標系において配列番号102と同時発現させるために使用、またヒト化1D9H6L2アクリタマブ商標抗体を生産するために、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くポテリジェント商標系において配列番号102と同時発現させるために使用。MGWSCIILFLVATATGVHSシグナル配列をコードする部分は削除可能である。配列番号105本発明はここに十分に記載されるが、当業者には、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなくそれらに多くの変更および改変をなし得ることが自明である。"