"受託番号MTCC5184を有するビューベリア種真菌株であって、MTCC、ブタペスト条約の下で承認されている国際寄託機関に寄託されている真菌株。受託番号MTCC5184を有するビューベリア種に由来するプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼ等から選択される少なくとも1種の酵素を含む酵素の調製方法であって、a0.15~80の炭素供給源と、0.15~80の窒素供給源と、誘導物質とを含む培地においてビューベリア種MTCC5184を、5.0~9.0の範囲のpH、15~32°Cの間の範囲の温度、好気性条件下で、2~7日間の範囲の期間培養する工程を含み、ここで、前記炭素および窒素供給源は、場合により誘導物質であり、b工程aにおいて得られた培地を回収する工程と、c従来法によって液層中の酵素を分離/抽出する工程と、を含む方法。ビューベリア種を培養する工程が、液内条件または固体状発酵下で行われる、請求項2に記載の方法。前記炭素供給源が、糖、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースおよびアラビノース;グリセロール、マンニトールおよびソルビトールからなる群から選択される糖アルコール;デンプン、キシランおよびヘミセルロースからなる群から選択される多糖;オリーブオイル、ヒマワリ油、大豆油、ゴマ油、カラシ油、ヒマシ油、ココナッツオイル、ラッカセイ油、トリブチリンの群から選択されるオイルおよび脂肪、ならびにラッカセイミール、フスマ、米ぬか、ジャガイモ廃棄物、トウモロコシ粉、大豆ミール、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、乳製品、家禽、食肉および食品加工からなる群から選択される農業廃棄物、毛髪、羽毛のようなケラチンリッチ廃棄物、漁業に由来する廃棄物、酸性の膨潤したキチンおよびキチン含有廃棄物からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。前記窒素供給源が、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆ミール、マスタードシードケーキ、綿実ミール、ソヤトース、ソヤペプトン、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、羽毛、フィッシュミールおよび毛髪からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。前記酵素が、凍結乾燥、噴霧乾燥、塩析法または限外濾過によって濃縮される、請求項2に記載の方法。前記酵素組成物が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群から選択される無機塩を用いて部分精製され、濃縮される、請求項2に記載の方法。未精製形態、固定形態、細胞結合形態、純化形態、精製形態であり、噴霧乾燥、凍結乾燥、濾過、濃縮、純化および精製から選択される工程に付される、請求項2に記載の方法によって調製された酵素。前記酵素組成物が、真性コラーゲンに対して不活性である、請求項2に記載の方法によって調製された酵素。pH範囲5.5~12、30~70°Cの範囲の温度において活性であり、pH範囲3~11および最大50°Cの温度において安定である、請求項2に記載の方法によって調製されたプロテアーゼ。水混和性および水非混和性溶媒の両方において安定である、請求項9に記載のプロテアーゼ。フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される、請求項9に記載のプロテアーゼ。変性剤の存在下で安定であり、Hg、CuおよびCdから選択される有毒金属において活性である、請求項9に記載のプロテアーゼ。pH範囲4~9および温度範囲20~70°Cにおいて活性であり、pH範囲3~9において安定である、請求項2に記載の方法によって調製されるカルボヒドラーゼ。pH範囲4~9および20~60°Cの温度範囲において活性である、請求項2に記載の方法によって調製されたリパーゼ。皮革製造における前なめし操作、動物細胞培養、写真用フィルムからの銀の回収、ナノ粒子合成、有機溶媒におけるペプチド合成のための、および洗浄剤製剤における、請求項2に記載の方法によって調製された酵素の使用。しかし、ビューベリア種による、アミラーゼ、ケラチナーゼおよびキシラナーゼの単独またはアルカリプロテアーゼと組み合わせた製造に関する先行技術はない。バイオマス、未精製の、純化された、精製された形態または任意のこのような形態の中の酵素組成物のさらなる適用は、ビューベリア種からはこれまでに知られていない。したがって、本発明の主目的は、種々の分野において適用され得る酵素組成物を提供できるビューベリアの種を提供することである。本発明の別の目的は、以下の酵素:真菌供給源;ビューベリア種のこれまでに知られていない株に由来するプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼのうち少なくとも1種または複数を含む組成物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、本発明者らによって単離されたビューベリア属に属する真菌培養物を使用して、以下の酵素:プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼのうち少なくとも1種または複数を含有する酵素組成物の調製方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、広いpH範囲で活性および安定であり、短い発酵周期のアルカリプロテアーゼの調製方法を提供することである。本発明のなお別の目的は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼを単独または組み合わせて製造するための経済的な方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、動物組織培養物、分析ツール、医薬、分子生物学、皮革、洗浄剤、食品、繊維製品およびこのような同様の工業における前記酵素の適用/使用を提供することである。本明細書において、ビューベリアの新規種、すなわち、ビューベリアMTCC-5184を開示する。前記真菌供給源から調製された、それだけには限らないが、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも1種の酵素を含む組成物も開示する。前記酵素組成物の調製方法およびその適用使用も記載する。より詳しくは、本発明は、動物組織培養物、皮革、食品、洗浄剤およびその他の工業における適用の可能性を有する、広いpH範囲にわたって活性であり、安定であり、種々の洗浄剤、有機溶媒、変性剤などの存在下で安定である、アルカリプロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼに関する。したがって、本発明は、受託番号MTCC5184を有する真菌株ビューベリア種を提供し、ここで、前記株は、MTCC、ブタペスト条約の下で承認されている国際寄託機関に寄託されている。本発明はさらに、受託番号MTCC5184を有するビューベリア種に由来する、それだけには限らないが、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも1種の酵素を含む酵素の調製方法を提供し、前記方法は、[a]0.15~80の炭素供給源と、0.15~80の窒素供給源と誘導物質とを含む培地においてビューベリア種MTCC5184を、5.0~9.0の範囲のpHおよび15°C~32°Cの間の範囲の温度、好気性条件下で、2~7日間の範囲の期間培養することと;[b]ステップaで得られた培地を回収することと;[c]従来法によって液相中の酵素を分離/抽出すること、とを含む。本発明に従って、それだけには限らないが、真菌供給源、ビューベリア種のこれまでに知られていない株由来のプロテアーゼカルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも1種の酵素を含む組成物が、本明細書に開示されている。真菌株、ビューベリア種は、ウサギの糞から単離され、受託番号MTCC-5184MicrobialTypeCultureCollection、Chandigarh、Indiaを有する。ビューベリアの供給源は、土壌、昆虫、動物の糞、木の枝、海洋生物などである。培養物は、ウサギの糞から単離した。糞のペレットを、ペトリプレート中で清潔な湿った濾紙上に置いた。プレートを湿潤チャンバー中で維持し、室温で2~3週間インキュベートした。最初に、白色の真菌が増殖し、さらにインキュベートすると、小さい突起を示し、これが直立した柄に発達した。滅菌した先のとがったニードルで、これらの柄から胞子を注意深く持ち上げ、麦芽エキス、グルコース、酵母エキス、ペプトンMGYP寒天プレート上に広げた。単離されたコロニーを、MGYPプレート上で継代培養を反復することによって精製し、単一コロニーをMGYPスラントに移した。このように得られた単離物を、18SrDNAITS配列および形態的特徴を使用して特性決定し、ビューベリアフェリナと区別した。表1および表2における結果は、18SrDNAおよびITS配列の最初の10個のBLASTヒットを示す。18SrDNAおよびITS配列は、ビューベリアフェリナの種々の株と99の相同性を示した。図1は、その他の生物とのITS遺伝子の配列相同性を示す。18SrDNAおよびITS配列相同性によれば、本発明の単離物は、ビューベリアフェリナに対して98~100の相同性を示す。しかし、図2に示されるように、その形態においては、ビューベリアフェリナNCIM1314と比較して大きな相違がある。MTCC5184、ビューベリア種の新規株の18SrDNAおよびITS遺伝子配列は、それぞれ、受託番号FJ895305およびFJ895306でNCBI遺伝子バンクに寄託されている本発明の一実施形態では、組成物は、それだけには限らないが、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびリパーゼから選択される酵素を単独またはいずれかの組合せで含む。本発明の別の実施形態では、酵素組成物は、真性コラーゲンに対して不活性である。本発明のさらに別の実施形態では、本発明の酵素組成物は、バイオマス、未精製形態、精製形態、純化形態、細胞結合形態または固定形態から選択される形態であるが、それに制限されない。本発明のなお別の実施形態では、酵素組成物は、酵素組成物に一般に適用される物理的処理、例えば、乾燥、濾過、濃縮、純化などに対して安定である。本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、a.真菌株ビューベリアMTCC5184を、炭素供給源、窒素供給源および誘導物質を含む培地中、好気性条件下、5.0~9.0の範囲のpHおよび15°C~32°Cの範囲の温度で、2~7日の間の範囲の期間増殖させることと、b.培地を回収することと、c.従来法によって液相中の酵素を分離/抽出することとを含む、ビューベリア種を使用する酵素組成物の調製方法を提供する。本発明のなお別の実施形態では、生物を、180~220rpmで振盪しながら液内培養で増殖させる。さらに別の実施形態では、生物を、静置条件下で固体状発酵で増殖させる。本発明の別の実施形態では、炭素供給源は、単独またはそれらの組合せでの、糖、糖アルコール、多糖、オイル、脂肪、脂質、農産物/農業廃棄物などからなるが、それらに制限されない。糖として、グルコース、フルクトース、アラビノース、スクロース、ラクトースなどがある。糖アルコールとして、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどがある。多糖として、デンプン、キシランなどがあり、オイル/脂肪として、オリーブオイル、ヒマワリ油、大豆油、ゴマ油、カラシ油、ヒマシ油、ココナッツオイル、ラッカセイ油、トリブチリンなどがあり、農産物/農業廃棄物として、大豆粉、ジャガイモ廃棄物、トウモロコシ粉、大豆ミール、ラッカセイミール、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、フスマ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、米ぬかなど、カニ殻のようなキチン含有廃棄物などがある。本発明のなお別の実施形態では、窒素供給源は、場合により、有機または無機であり、単独またはそれらの組合せである。無機窒素供給源は、それだけには限らないが、リン酸水素二アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび尿素から選択される。本発明のさらに別の実施形態では、有機窒素供給源は、それだけには限らないが、ペプトン、トリプトン、ソヤトース、ソヤペプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、牛肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーおよび大豆粉、大豆カス、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、ラッカセイミールなどによって例示される窒素リッチマメ科基質、乳製品、家禽、食肉および食品加工からの廃棄物、毛髪、羽毛のようなケラチンリッチ廃棄物、漁業からの廃棄物およびその他の廃棄物から単独で、またはそれらの組合せで選択される。本発明のなお別の実施形態では、酵素を分離する従来法は、濾過、遠心分離または水もしくは希釈界面活性剤での抽出である。本発明のさらに別の実施形態では、誘導物質は、それだけには限らないが、ペプトン、トリプトン、ソヤトース、ソヤペプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、牛肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーおよび大豆粉、大豆カス、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、ラッカセイミールなどによって例示される窒素リッチマメ科基質、ホエーのような乳製品、フィッシュミールおよびニワトリの羽、羽毛粉などによって例示される家禽、食品加工、食肉および魚からの廃棄物、油糧種子ケーキとして例示される農業廃棄物および廃棄穀物穀類、フスマ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、米ぬか、オイル、脂肪のような炭水化物廃棄物、フレッシング、トリミングおよびクロムシェービングのような皮革廃棄物、爪、ひづめ、毛髪のようなケラチンリッチ基質から、単独で、またはそれらの組合せで選択される。本発明のさらなる実施形態では、誘導物質は、炭素の供給源であり得る。別の実施形態では、誘導物質は、リパーゼ、プロテアーゼおよびカルボヒドラーゼから選択される少なくとも1種の酵素を含む酵素組成物を製造する方法のための窒素の供給源であり得る。本発明の別の実施形態では、酵素の濃縮は、膜濾過によってか、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの塩の添加、エタノール、アセトンなどの有機溶媒の添加による塩析によって、または凍結乾燥もしくは噴霧乾燥のいずれかによって達成された。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のプロテアーゼは、3~11のpH範囲、好ましくは、pH7において安定であり、洗浄剤、変性剤、水混和性および水非混和性有機溶媒に対して安定であり、50°Cまで安定である。プロテアーゼは、5.5~12のpH範囲、キレート剤、金属イオンの存在下、30~70°Cの範囲の温度において、好ましくは、50°Cで活性である。本発明のなお別の実施形態では、粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼは、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン、エラスチン-オルシン、アゾカゼイン、アゾコールおよびゼラチンに対して活性を示す。本発明のさらに別の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、フェニルメチルスルホニルフルオリドPMSFによって阻害された。本発明の別の実施形態では、アミラーゼは、4~8のpH範囲において、好ましくは、pH6および20~70°Cの範囲の温度において、好ましくは、45°Cで活性である。本発明のさらに別の実施形態では、キシラナーゼは、4~9のpH範囲において、好ましくは、pH6および30~70°Cの温度範囲において、好ましくは、50°Cで活性である。本発明のなお別の実施形態では、リパーゼは、4~9のpH範囲において、好ましくは、pH7および20~60°Cの温度範囲において、好ましくは、50°Cで活性である。本発明の別の実施形態では、酵素組成物は、真性コラーゲンに対して不活性である。プロテアーゼ活性は、チロシン当量を単位として表した。反応混合物は、2mlの総容量中に、適宜希釈された酵素溶液の一定分量と、0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中、10mgのハマーステインカゼインとを含有していた。50°Cで10分間インキュベートした後、5トリクロロ酢酸濃塩酸で酸性化された3mlを添加することによって反応を終結させた。室温で30分間静置した後、形成された沈殿物を、WhatmanNo.l濾紙を通して濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を、280nmで測定した。生じたチロシンのマイクログラムを、予め較正した、チロシン濃度に対する280nmでの吸光度のグラフから算出し、単位は、アッセイ条件下で1分あたりに放出されたチロシンのμモルとして表した。キシラナーゼ活性は、50mMリン酸カリウムバッファーpH6中、1可溶性キシランを使用して測定した。1mlの総反応混合物は、適宜希釈された酵素0.5mlと、基質0.5mlとを含有しており、50°Cで30分間インキュベートした。遊離された還元糖は、ジニトロサリチル酸法P.Bernfeld1955年、Amylase:αβ、MethodsinEnzymology、第1巻、149頁によって測定した。キシラナーゼ活性は、アッセイ条件下で1分あたりに生じた還元等のμモルとしてキシロース当量として表した。アミラーゼ活性は、50mMリン酸カリウムバッファーpH6中、1可溶性デンプンを使用して測定した。1mlの総反応混合物は、適宜希釈された酵素0.5mlと、基質0.5mlとを含有しており、45°Cで30分間インキュベートした。遊離された還元糖は、ジニトロサリチル酸法P.Bernfeld1955年、Amylase:αβ、MethodsinEnzymology、第1巻、149頁によって測定した。アミラーゼ活性は、アッセイ条件下で1分あたりに生じた還元糖のμモルとしてグルコース当量として表した。リパーゼ活性は、2つの異なる方法によって測定した。a.基質としてp-ニトロフェノールパルミテートpNPPを使用する分光光度法アッセイ:一定に撹拌しながら、溶液B90mlの蒸留水中、0.1gのアラビアガムおよび0.4gTriton-X-1009mlに、溶液A10mlのプロパン-2-オール中、30mgpNPP1mlを滴加することによって基質溶液を新しく調製した。エマルジョンは2時間安定なままであった。アッセイ混合物は、0.9mlの基質と、0.1mlの50mMリン酸バッファーpH7と、0.1mlの適宜希釈された酵素とを含有していた。アッセイ混合物は、28°Cで20分間インキュベートし、2mlの2Na2CO3を添加することによって終結させた。放出されたp-ニトロフェノールの量を410nmで測定した。リパーゼ活性は、アッセイ条件下で1分間あたりに放出されるp-ニトロフェノールのμモルとして表されている。b.リパーゼの滴定分析。グラインダーミキサー中で10分間、20mlのオリーブオイルと、165mlの10アラビアガムと、15gの氷とを混合することによって基質を調製し、ガラスウール上で濾過し、4°Cで保存した。リパーゼアッセイのために、反応混合物は、2mlのリン酸バッファー50mM、pH7.0と、5mlの基質と、1mlの粗培養ブロスとを含有しており、50rpmで振盪しながら、50°Cで1時間インキュベートした。4mlのアセトン:エタノール1:1を添加することによって反応を終結させた。ブランクでは、アセトン:エタノールによって反応を終結させた後に酵素を加えた。10mMNaOHを用いて、放出された遊離脂肪酸を滴定した。リパーゼ活性は、アッセイ条件下で1分間あたりに放出された遊離脂肪酸のμモルとして表されている。本発明の酵素組成物は、食品、医薬品、皮革、繊維製品工業をはじめ、酵素ベースの組成物が必要であるあらゆる分野において用途がある。プロテアーゼは、農業、皮革、繊維製品、シルクの脱ガム、乳製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、肥料、または、植物、動物、ペプチド合成からの培地成分およびタンパク質加水分解物の調製において、分子生物学、化粧品、廃棄物処理などにおいて適用される。リパーゼは、農業、皮革、繊維製品、乳製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、肥料、化粧品、廃棄物処理、ポリマー合成などにおいて適用される。アミラーゼは、農業、皮革、繊維製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、培地成分の調製、廃棄物処理などにおいて適用される。キシラナーゼは、農業、紙パルプ、皮革、繊維製品、食品、飼料、医薬品、廃棄物処理、単細胞タンパク質、燃料、溶媒、または、オリゴサッカライドの合成や、大麻、ジュート、ラミー、亜麻などのような繊維の脱ガム、木の皮をはぐことなどにおいて適用される。伝統的に、ケラチナーゼは、羽毛粉、肥料および膠などの製造に使用されてきた。その適用範囲は、ゆっくりと広がっており、現在、洗浄剤製剤、化粧品、皮革、医薬および動物飼料などのその他の領域へと、ますます使用されるようになっている。より最近では、それらは、狂牛病の治療プリオンの分解、生分解性プラスチックおよび羽毛粉製造において適用されている。皮革製造における脱毛工程のために、軽度のエラスチン分解活性を有するが、コラーゲン分解性を欠くケラチナーゼの適用が検討されている。皮革製造における脱毛のような前なめし操作、動物細胞培養、写真用フィルムからの銀の回収およびナノ粒子合成、有機溶媒におけるペプチド合成および洗浄剤組成物のための、それだけには限らないが、ビューベリア種由来のプロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ、ケラチナーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも1種の酵素を含む酵素組成物の使用。このような洗浄剤組成物は、染み抜きをできる。脱毛工程の従来法は、高い有機窒素、生物学的酸素要求量BOD、化学的酸素要求量CODおよび全固形分TDSおよびpHの上昇を有する廃液の排出をもたらし、これは、土壌ならびに地下水を汚染し、従って、生態系に対して不可逆的損害を引き起こす。アルカリプロテアーゼを用いる脱毛は、廃水の量および汚染負荷量両方の大幅な減少をもたらす。さらに、特に、プロテアーゼと組み合わせたアミラーゼは、ビームハウスのベーチング操作において有用である米国特許第4,273,876号。本発明の酵素組成物は、種々の前なめし操作のために皮革工業にとって有用である。特に、本組成物は、前なめし操作単独において有用である。より詳しくは、本発明の酵素組成物は、本明細書に例示される皮革工業に、前なめし操作のための化学添加物を含まない選択肢を提供する。この環境への負担が小さい工程は、脱毛において石灰および硫化物を置き換え、その結果、廃液中のBOD、CODおよびTDSの低減をもたらすタンパク質分解酵素の使用を含む。これらの酵素は、6~8のpH範囲で皮革処理において使用できる。固体硫化物および水酸化カルシウムの使用によって毛髪自体が全体的に破壊される従来法とは異なり、酵素法は、上皮層の除去をもたらし、その結果、毛髪が解けるか、その毛根から取り除かれる。本発明を、実施例とともに、以下、本明細書に記載するが、それらは単に例示であり、いかなる形においても本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。[実施例1A]この実施例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミドCTAB法によるビューベリア種MTCC5184のゲノムDNAの単離を示す。DNAを単離するために、真菌を、その組成1リットルあたりのグラムが、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である麦芽エキスグルコース酵母エキスペプトンMGYP培地中、液体フラスコ中で増殖させた。増殖は、7日培養MGYPスラントから得た胞子を播種することによって開始させた。フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で48時間インキュベートした。内容物を8000rpmで15分間遠心分離し、繰り返し洗浄して、培地成分を除去した。3~5gの湿潤菌糸体を液体窒素中で粉砕し、続いて、8~10mlの、0.2のβ-メルカプトエタノールを含有するCTAB抽出バッファーpH8を添加し、その後、20μlのプロテイナーゼK20mg/mlを加え、65°Cで1時間インキュベートした。この後、20μlのリボヌクレアーゼA10mg/mlを添加し、さらに、65°Cで15分間インキュベートした。遠心分離8000rpm、10分後に回収した上清に、10mlのクロロホルム:イソアミルアルコール24:1を加えた。混合物を5分間振盪し、10,000rpm、4°Cで15分間遠心分離した。上清に、2容積のCTAB沈殿バッファーを加え、室温で1時間維持した。遠心分離後に回収したペレットを5mlの1.2MNaClに溶解し、5mlのクロロホルム:イソアミルアルコール24:1を加えた。水層に2容積の無水アルコールを加え、DNAを沈殿させた。DNAを巻き取って取り出し、70エタノールで洗浄し、5mlの0.1MのTrisエチレンジアミン四酢酸EDTAバッファーpH8.0に溶解し、保存した。分光光度計で260nmでサンプルの吸光度を測定することによってDNAの定量化を行い、純度を0.8アガロースゲル電気泳動で調べた。[実施例1B]この実施例は、18SrDNAおよび内部転写スペーサーITS遺伝子のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅を示す。真菌種の同定に使用したプライマーは、ユニバーサル真菌18SrDNAプライマーNS1-FGTAGTCATATGCTTGTCTC、NS8-RTCCGCAGGTTCACCTACGGA、ITS1-FTCCGTAGGTGAACCTGCGGおよびITS4-RTCCTCCGCTTATTGATATGCであった。ポリメラーゼ連鎖反応25μlは、ゲノムDNAを使用することによって18SrDNAおよびITS遺伝子を増幅するよう設定した。反応混合物は、通常、ゲノムDNA-0.70μl、10XPCRバッファー-2.50μl、0.2mMdNTP-2.5μl、フォワードおよびリバースプライマー10~20pモル-各1.25μl、蒸留水-16.60μlおよび1ユニットのTaqDNAポリメラーゼ-0.20μlを含有していた。18SrDNAおよびITS遺伝子増幅のためのPCR条件は、最初の変性95°Cで3分間、続いて、94°Cで1分間、57°Cで30秒間、72°Cで2分間の35サイクルおよび72°Cで10分間の最後の伸長とした。上記のPCR増幅産物5μlを使用して、1.0アガロースゲル上で増幅を調べた。[実施例1C]この実施例は、PCR増幅産物の精製を示す。20μlのPCR増幅産物に、12μ1の20PEG-NaClポリエチレングリコール-NaCl溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートした。次いで、12,000rpmで20分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを70エタノールで2回洗浄し、12,000rpmで20分間遠心分離することによって分離した。ペレットを乾燥させ、10μlの再蒸留水に溶解し、-20°Cで保存した。[実施例1D]この実施例は、精製PCR産物の配列決定を示す。配列決定反応は、AΒIPRISMBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionキットPerkinElmerAppliedBiosystemsDivision、FosterCity、CAを製造業者のプロトコールにしたがって使用したTaqDNAポリメラーゼを使用して実施した。このキットは、BigDyeTerminatorと呼ばれる異なる蛍光標識を有する4種のddNTPを含有する。20μlの配列決定反応において、2μlのPCR産物および3pmolの配列決定プライマーを使用した。配列決定プライマーは、配列決定用Whiteら、1990のNS1GTAGTCATATGCTTGTCTC、NS2GGCTGCTGGCACCAGACTTGC、NS3GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC、NS4CTTCCGTCAATTCCTTTAAG、NS5AACTTAAAGGAATTGACGGAAG、NS6GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC、NS7GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCおよびNS8TCCGCAGGTTCACCTACGGA、ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGおよびITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCであった。配列決定反応ミックスに対し、PerkinElmerサーマルサイクラー9700において25サイクル施した。各サイクルは、95°Cで10分、50°Cで5分および60°Cで4分からなっていた。DNA塩基配列決定は、ABI1500AutomatedSequencerで実施した。[実施例1E]この実施例は、上記の実施例で得られた18SrDNAおよびITS配列に基づくビューベリア種の新規株MTCC5184の同定および系統発生関係を示す。得られた配列は、小さい断片中にあり、従って、配列を重ね合わせることによって適宜アラインした。ビューベリア種の新規株の相同性パーセンテージおよび系統発生関係は、NCBIデータベース中の既存の配列を使用して行った。BLASTプログラムwww.ncbi.ncm.gov/blastを使用し、GenBankデータベースを用いてヌクレオチド配列を分析した。表1および表2中の結果は、それぞれ、NCBIデータベース中の18SrDNAおよびITS配列の最初の10個のBLASTヒットを示す。18SrDNAおよびITS配列は、ビューベリアフェリナの種々の株と99の相同性を示した。図1は、その他の生物とのITSの配列相同性を示す。18SrDNAおよびITS配列相同性によれば、本株は、ビューベリアフェリナに対して98~100の相同性を示す。しかし、図2に示されるように、その形態においては、ビューベリアフェリナBeauveriafelinaと比較して大きな相違がある。MTCC5184、ビューベリア種の新規株の18SrDNAおよびITS配列は、NCBI遺伝子バンクに、それぞれ、受託番号FJ895305およびFJ895306で寄託されている。[実施例2]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、グルコース-10;酵母エキス-3、マスタードシードケーキ-20を含有するリットルあたりのグラム培地中、振盪フラスコ中で実施した。種培養を調製するために7日培養のスラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。フラスコを28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で96時間インキュベートした。4日後の無細胞ブロスにおける活性は、12~15IU/mlであった。[実施例3]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。MGYP種培養を調製するために10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは:麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。種菌フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵を、誘導物質として2フィッシュミールを有する、グルコース、10;酵母エキス3を含有するリットルあたりのグラムグルコース酵母エキス培地中、振盪フラスコ中で実施し、28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で48時間インキュベートした。3日後の無細胞ブロスにおける活性は、9.9~10.6IU/mlの範囲であった。[実施例4]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるプロテアーゼの調製を示す。種培養を調製するために7日培養MGYPスラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。種菌フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。プロテアーゼ製造のための固体状発酵は、7mlの水と混合した、5gのフスマ;20mgの酵母エキス、1gの大豆ミールを含有する250mlフラスコ中で実施した。固体発酵培地に3mlの栄養種菌vegetativeinoculumを加え、十分に混合し、静置条件下、30°Cでインキュベートした。96時間インキュベートした後、半固体のカビの生えたコウジを50mlの0.1Tween-80を用い、200rpmで1時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、0.1T-80を用いてさらに2回の抽出を実施した。得られた酵素をアッセイし、96時間で450~570IU/大豆ミール1gの範囲の活性および75~95IU/乾燥固体1gが得られた。[実施例5]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるキシラナーゼの調製を示す。MGYP培地において種培養を調製するために10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成はリットルあたりのグラム、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。種菌フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、組成リットルあたりのグラムが、3種の異なる誘導物質、すなわち、3フスマ;1キシランおよび2トウモロコシの穂軸を含有する、グルコース、1.5;酵母エキス1.5;ペプトン5および牛肉エキス5であるMikami培地中、振盪フラスコ中で実施した。振盪フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で48時間インキュベートした。上記の誘導物質のすべてにおいて2日後の無細胞ブロスにおけるキシラナーゼ活性は、4~5.5IU/mlの間の範囲であった。[実施例6]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼの調製を示す。MGYP種培養を調製するために10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成はリットルあたりのグラム、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。これを28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、15mlの、その組成リットルあたりのグラムが、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5であるMikami培地と混合した9gフスマを含有する500mlフラスコ中で実施し、28°C、静止条件下で最大4日間インキュベートした。発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、100ml0.01Tween-80を用い、200rpmで1時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、50mlの0.01T-80を用いてさらに1回抽出を行った。3および4日目の最後でのキシラナーゼ活性は、それぞれ、62.33IU/gおよび96.54IU/gであった。[実施例7]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるアミラーゼの調製を示す。Mikami培地において種培養を調製するために10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5である。種菌フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー上で24時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、誘導物質として2トウモロコシデンプンを含有するMikami培地中、振盪フラスコ中で実施し、28°Cでロータリーシェーカー200rpm上でインキュベートした。4日後の無細胞ブロスにおける活性は、3.5~4.5IU/mlの範囲であった。[実施例8]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるリパーゼの調製を示す。種培養を調製するために7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。これを28°Cでロータリーシェーカー上で24時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、NaNO3-0.5;MgSO4-0.5;KCl-0.5;KH2PO4-2;酵母エキス-1;バクトペプトン-5;グルコース-10を含有するリットルあたりのグラムpH5.5に調整した培地中、振盪フラスコ中で実施した。1濃度の以下のオイルを、リパーゼ製造のための誘導物質として使用した。フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー上で4~5日間インキュベートした。無細胞ブロスにおける活性は、基質としてp-ニトロフェニルパルミテートを使用して求めた。アッセイプロトコールを示す。リパーゼ活性は、0.12~0.17IU/ml;ヒマシ油0.13IU/ml、ラッカセイオイル0.13IU/ml、ゴマ油0.17IU/ml、オリーブオイル0.12IU/mlの範囲であった。[実施例9]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるリパーゼの調製を示す。Mikami種培養を調製するために、7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、ペプトン-5;牛肉エキス-5;酵母エキス-1.5;グルコース-1.5である。これを28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して、振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、ペプトン-5;牛肉エキス-5;酵母エキス-1.5;グルコース-1.5を含有するリットルあたりのグラムMikami培地中、振盪フラスコ中で実施した。2濃度のオリーブオイルおよびトリブチリンをリパーゼ製造のための誘導物質として使用した。培地は、pH7に調整した。3~4日後の無細胞ブロスにおける活性は、滴定法によって求めた。オリーブオイルおよびトリブチリンにおけるリパーゼ活性は、3~5IU/mlの範囲であった。[実施例10]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるケラチナーゼの調製を示す。Mikami培地における種培養を調製するために、7日培養スラントから得られた胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5およびグルコース-1.5である。種菌フラスコを28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、2種の異なる誘導物質として2ニワトリ羽毛および2毛髪を含有するMikami培地中、振盪フラスコ中で実施した。振盪フラスコを、28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で72時間インキュベートした。ケラチナーゼ活性は、Bressollierら、AppliedEnvironmentalMicrobiology、第65巻6、2570~2576頁、1999年に従って求めた。酵素活性の1ユニットは、1分あたり595nmでの吸光度の1.0の増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。羽毛および毛髪について、3日後の無細胞ブロスにおけるケラチナーゼ活性は、それぞれ、0.26および0.30U/mlであった。[実施例11A]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株によるプレートアッセイを使用するリパーゼ活性の検出を示す。酵素のプレートアッセイは、グルコースリットルあたりのグラム:1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5、寒天-20および1トリブチリンからなる25mlのMikami培地を含有するディスポーザブルペトリプレートで実施した。種菌を調製するために7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用した。種菌培地の組成リットルあたりのグラムは、酵母エキス-3およびグルコース-10であった。48時間培養栄養種菌をプレートにスポット播種し、28°Cで72時間インキュベートした。トリブチリンの分解による、増殖する真菌コロニーの周囲のクリアランス領域が観察され、これは、生物によるリパーゼの分泌を示す図3。[実施例11B]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株によるプレートアッセイを使用するキチナーゼ活性の検出を示す。プレートアッセイは、25mlの、0.01酸性膨潤キチンを含有する2寒天中、ディスポーザブルペトリプレート中で実施した。7日培養スラントから得た胞子懸濁液を、その組成リットルあたりのグラムが酵母エキス-3、グルコース-10および酸性膨潤キチン-0.1である培地に播種し、180~200rpmで振盪しながら28°Cでインキュベートした。96時間後50μlの無細胞上清をプレート上にスポットし、37°Cで1時間インキュベートした。キチナーゼ活性の検出のために、プレートを、0.1ラニパルを用いて15分間満たし、続いて、蒸留水を用いて各30分間2回洗浄した。プレートを、UV光下で観察した。キチン分解によって、サンプルスポットの周囲のライトブルーの透明な領域が観察され、これは、真菌株によるキチナーゼの分泌を示す図4。[実施例12]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵によるアミラーゼおよびプロテアーゼの同時調製を示す。種培養を調製するために、7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5、ペプトン-5、牛肉エキス-5である。これを28°Cでロータリーシェーカー上で24時間インキュベートし、種菌の10v/vを使用して、実験フラスコに播種した。発酵は、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5、ペプトン-5、牛肉エキス-5、デンプン-20を含有するリットルあたりのグラムpH7に調整した培地中、振盪フラスコ中で実施した。フラスコを28°Cでロータリーシェーカー200rpm上でインキュベートした。6日後の無細胞ブロスにおけるアミラーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、6~7IU/mlおよび3.0~3.3IU/mlであった。[実施例13]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼおよびプロテアーゼの調製を示す。MGYP種培養を調製するために、10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス、3;酵母エキス、3;ペプトン、5およびグルコース10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、その組成が、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5である9mlのMikami培地と混合した9gフスマを含有する500mlフラスコ中で実施した。発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、100mlの0.01Tween-80を用い、200rpmで1時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、50mlの0.01T-80を用いてさらに1回の抽出を実施した。4日目の最後でのキシラナーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、116~134IU/gおよび50~62IU/gであった。[実施例14]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるリパーゼおよびプロテアーゼの調製を示す。固体状発酵は、1gのオリーブオイルおよびその組成リットルあたりのグラムが、NaNO3-0.5;MgSO4-0.5;KCl-0.5;KH2P04-2;酵母エキス-1;バクトペプトン-5である、pH5.5に調整した25mlの基礎塩培地と混合した10gのフスマを含有する培地中、250mlフラスコ中で実施した。7日培養スラントから得た胞子懸濁液1.75X106個胞子/mlの2ミリリットルを使用して、実験フラスコに播種し、静止条件下、28°Cでインキュベートした。発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、100mlの、0.1TritonX-100を含有する1NaClを用い、2時間振盪しながら抽出し、続いて、2重のモスリン布を通して濾過し、4°C、12000rpmで遠心分離した。無細胞ブロスにおける活性は、基質としてp-ニトロフェニルパルミテートを使用して求めた。5および7日後のリパーゼ活性は、それぞれ、0.8IU/gおよび5.115IU/gであった。5日後のプロテアーゼ活性は、45~48IU/gであった。[実施例15]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼの同時調製を示す。酵素製造のための固体状発酵は、グルコース-1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5からなるリットルあたりのグラム15mlのMikami培地と混合した、9gのフスマおよび3gのデンプンを含有する500mlフラスコ中で実施した。種培養を調製するために、10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。120時間インキュベートした後、半固体のカビの生えたコウジを、100mlの0.01Tween-80を用い、200rpmで1時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、50mlの0.01T-80を用いてさらに1回の抽出を実施した。5日目の最後での、フスマ1gあたりのキシラナーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、48~52IU、48~54IUおよび30~35IUであった。[実施例16]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する液内発酵による15~37°Cの温度範囲におけるプロテアーゼ製造を示す。MGYP種培養を調製するために、7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、pH6.5~7に調整した、グルコース-10;酵母エキス-3、マスタードシードケーキ-20を含有するリットルあたりのグラム培地中、振盪フラスコ中で実施した。フラスコを、15~37°Cの範囲の温度で、ロータリーシェーカー200rpm上で96時間インキュベートした。プロテアーゼ製造が15~32°Cの温度範囲で観察され、最高活性は、28°Cで観察された表3。[実施例17]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用するpH範囲5~9における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。MGYP種培養を調製するために、7日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、グルコース-10;酵母エキス-3、マスタードシードケーキ-20を含有するリットルあたりのグラム培地中、振盪フラスコ中で実施した。培地pHをpH5~9に変更した。振盪フラスコを28°Cでロータリーシェーカー200rpm上で96時間インキュベートした。プロテアーゼ製造が、pH範囲5~9において観察され、pH7で最高活性を有していた表4。[実施例18]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する、撹拌および通気の制御された条件下での機器を備えた発酵槽における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、グルコース-10;酵母エキス-3、マスタードシードケーキ-20を含有しリットルあたりのグラム、pH7に調整した培地中、4Lの作業容量を有する7.5LNewBruinswick発酵槽中で実施した。種菌は、MGYP培地中で2段階で発達させ、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10MGYPである。第1段階の種菌を調製するために、7日培養スラントから得られた胞子懸濁液を使用した。第1段階の種菌24時間は、50mlのMGYP培地を含有する250mlフラスコ中で発達させた。第2段階の種菌24時間は、250mlのMGYP培地を含有する1Lフラスコ中で発達された。7.5L発酵槽中の製造培地4Lは、基礎培地としてグルコース-酵母エキスGYEを含有していた。24時間増殖させた後、誘導物質として2の濃度のマスタードシードケーキを加えた。通気および撹拌機速度を、それぞれ、1分あたり3~4リットル1pmおよび350~400rpmで維持し、温度を26~28°Cで維持した。無細胞ブロスを綿上での重力濾過によって集めた。5日後の無細胞ブロスにおける活性は、12~15IU/mlであった。[実施例19]この実施例は、ビューベリア種MTCC5184株を使用する撹拌および通気の制御された条件下での機器を備えた発酵槽における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、pH7に調整し、グルコース-5;酵母エキス-3;マスタードシードケーキ-20および0.1Tween-80を含有するリットルあたりのグラム培地中、80Lの作業容量を有する100L発酵槽中で実施した。種菌は2段階で発達させた。第1段階種菌は、100mlのMGYP培地を含有する500mlエルレンマイヤーフラスコ中で発達させ、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である。7~10日培養MGYPスラントから得た胞子を播種し、フラスコを180~220rpmで振盪しながら24時間維持した。第2段階種菌は、1グルコースおよび0.3酵母エキスを含有し、pHを7に調整したGYE培地中、10Lの作業容量を有する14L発酵槽中で発達させた。発酵槽は、第1段階からの10v/v種菌を用いて播種した。通気および撹拌機速度は、それぞれ、0.5~0.6vvmおよび350~400rpmで維持し、温度は26~28°Cで維持した。種菌の増殖は、約12~24時間実施し、内容物を100L発酵槽に移した。100L発酵槽中の製造培地80Lは、グルコース-5;酵母エキス-3;Tween-80-0.1;マスタードシードケーキ-20からなっていたリットルあたりのグラム。発酵は、1分当たり60~80リットル1pmの通気を行って実施し、撹拌機速度は100~250rpmの間で調整した。発酵槽の温度は、最高収率を得るよう26°C~28°Cで維持した。発酵は3~4日間実施し、その間、pHは8~8.3に増大し、酵素は培地中に分泌された。真菌バイオマスを、遠心分離によって分離し、4日後の無細胞ブロスにおける活性は、12~15IU/mlであった。[実施例20]この実施例は、ビューベリアMTCC5184株を使用する固体状発酵によるアミラーゼの製造および限外濾過によるその濃縮を示す。MGYP種培養を調製するために、10日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成リットルあたりのグラムは、麦芽エキス-3;酵母エキス-3;ペプトン-5およびグルコース-10である。これを、28°Cでロータリーシェーカー上で48時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、10mlの10Tween80、その組成リットルあたりのグラムがグルコース-1.5;酵母エキス-1.5;ペプトン-5;牛肉エキス-5である10mlのMikami培地と混合した20gのフスマを含有する1000mlフラスコ中で実施し、静止条件下28°Cで、最大5日間インキュベートした。発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、150mlの0.01Tween-80を用い、200rpmで1時間振盪することによって抽出した。5日目の最後でのアミラーゼ活性は、50IU/gであった。このように製造されたアミラーゼを10,000rpmで遠心分離した。次いで、透明な上清を、Amicon膜濾過ユニットにおいて10,000ダルトンの分子量カットオフを有するPM-10メンブレン上で濃縮した。濾過後の回収は、95~98であった。[実施例21]実施例18において記載されるように製造した粗プロテアーゼを、添加剤として10および15マルトデキストリンを用い、150~160°Cの入口温度およびそれぞれ60~65°Cおよび70~80°Cの出口温度を用いて噴霧乾燥させ、70~80が回収された。噴霧乾燥されたプロテアーゼの安定性を、4°C~37°Cの範囲の温度で調べた。サンプルをバイアルに分配し、4°C、28°Cおよび37°Cで保存した。各温度でインキュベートした1バイアルを一定間隔で取り出し、残存活性を調べた。噴霧乾燥されたプロテアーゼは、試験したすべての温度で最大10ヶ月間301日間安定であり、90~95の活性を保持していた図5aおよび5b。[実施例22]この実施例は、ビューベリア種MTCC5184プロテアーゼの均一性への精製を示す。真菌を、実施例2に記載されるように2マスタードシードケーキを含有するグルコース-酵母エキス培地で4日間増殖させ、10,000rpmで10分間の遠心分離後に得られた透明な上清を、酵素の供給源として使用した。ブロスの分画硫酸アンモニウム沈殿を4°Cで実施し、透析された硫酸アンモニウム沈殿物40~70飽和を、50mMリン酸バッファーpH7.0で平衡化したジエチルアミノエチルセルロースDEAE-セルロースカラム2.5cm×25cmに載せた。吸着されない酵素は、50mMリン酸バッファーpH7.0を20ml/hの流速で用いて溶出した。プロテアーゼ活性を示す画分をプールし、speed-vaccによって濃縮し、-20°Cで保存した。精製に含まれる工程は、添付の表5に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素調製物の純度は、カチオン性ポリアクリルアミドゲル電気泳動PAGEで銀染色後にタンパク質バンドを、活性染色後にプロテアーゼバンドをX線フィルム上で可視化することによって調べた。カチオン性PAGEで銀染色後に1つだけのタンパク質バンドが見られ、これは、X線フィルム上での活性バンドと対応する図6。[実施例23]この実施例は、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー後に得られた非結合画分の純度を確認する。実施例12に記載されるように、プールされ、濃縮されたサンプルを、HPLCのTSKG2000SWプレパックドカラム7.5mm×600mmに適用し、50mMリン酸バッファー、pH7を、0.7ml/分の流速で用いて溶出したところ、40分の保持時間で単一のピークを示した。[実施例24]この実施例は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEおよびマトリックス支援レーザー脱離法イオン化飛行時間型MALDI-TOFによる精製プロテアーゼの分子量の決定を示す。SDS-PAGEの分子量マーカーは、炭酸脱水酵素29kDa、フマラーゼ48.5kDa、ウシ血清アルブミン66kDa、ホスホリラーゼb97.4kDaおよびβ-ガラクトシダーゼ116kDaからなっていた。SDS-PAGEによる酵素の分子量は、およそ29kDaであるとわかり、これは、炭酸脱水酵素の分子量に相当していた。精製プロテアーゼの分子量はまた、37-nm窒素レーザーを備えたVoyagerDE-STRAppliedBiosystemsを使用するMALDI-TOF質量分析を使用することによっても決定した。精製された酵素を、等容量のアセトニトリル中のシナピン酸と混合し、分析のために20μlの調製されたサンプルをMALDIプレート上においた。精製された酵素は、MALDI-TOFにおいて28.2kDaの分子量を示し、これは、SDS-PAGEによって得られた29kDaという分子量とほぼ同様であった図7。[実施例25]この実施例は、精製プロテアーゼのN末端配列の決定を示す。半乾燥エレクトロブロッティングユニットを使用して、精製された酵素をSDS-PAGEからポリビニリジエンジフルオリドメンブレンPVDFに電気泳動的に移した。タンパク質を3-シクロヘキシルアミノ1-プロパンスルホン酸CAPSバッファーpH-11中で移した。バンドを可視化するために、PVDFメンブレンをポンソーPonsueSを用いて染色した。PVDFメンブレン上のプロテアーゼバンドを含有する領域を切り出し、タンパク質N末端アミノ酸配列を、PerkinElmerシークエンサー、ProciseAppliedBiosystems、FosterCity、CA、USAでエドマン分解法によって調べた。プロテアーゼのN末端配列は、Ala-Met-Ala-Thr-Pro-His-Val-Ala-Pro-Lys-Val-Lys-Tyr-Gly-Val-Alaであるとわかった。この配列は、プロテアーゼのいずれとも100の相同性を示さなかった。ビューベリア種MTCC5184プロテアーゼのN末端配列中の16個のアミノ酸のうち10個のアミノ酸との最高の相同性は、スブチリシン様プロテアーゼに対して観察された。図8は、ビューベリア種の新規株由来のプロテアーゼのN末端アミノ酸の、その他のスブチリシン様プロテアーゼとの複数の配列アラインメントを示す。[実施例26]この実施例は、精製プロテアーゼの、その同定のためのゲル内トリプシン消化およびペプチドマスフィンガープリンティングPMFを示す。精製プロテアーゼを10SDS-PAGEに流し、クマシーブリリアントブルーCBBを用いて染色した。染色されたSDS-PAGEバンドを切り出し、400μlの50アセトニトリルを用いて各15分の3回バンドを洗浄し、CBB染色を除去した。スポットを100アセトニトリルを使用して、スポットが乳白色に変わるまで10~15分間脱水し、次いで、スピードバキュームを使用して乾燥させた。次いで、タンパク質バンドを100μlの10mMジチオトレイトール中、次いで、100μlの25mMヨードアセトアミド中に浸漬することによって還元し、アルカリ化した。次いで、このバンドを25mMの重炭酸アンモニウム溶液で洗浄し、配列決定等級のウシトリプシンSigma溶液を用いて消化した。タンパク質対トリプシンのモル比は、1:10で維持した。50アセトニトリルおよび5トリフルオロ酢酸TFAの混合物を用いて、一晩トリプシン消化した後のゲルからペプチドを抽出し、さらなる分析まで-20°Cで保存した。ペプチドを、0.1トリフルオロ酢酸TFAを含有する50アセトニトリルACN5μl中で再構成し、次いで、スポットし、96×2テフロンコーティングプレート上で風乾した。予めスポットしておいたペプチドスポット上にマトリックスとしてCHCAγ-シアノヒドロキシ桂皮酸を加えた。Voyager-DE-STRMALDI-TOF質量分析計を使用してペプチドマスフィンガープリンティングPMFを得た。800~4000Daの質量範囲でMALDIマススペクトルを記録した。トリプシン消化のペプチド質量相同性に基づいてMASCOTデータベースを使用することによってタンパク質を同定した。分析のために取られた67種の断片のうち、11の断片しか、ミクロスポルムカニス由来のスブチリシン様プロテアーゼ3前駆体と対応しない。[実施例27]この実施例は、ビューベリア種MTCC5184由来の精製プロテアーゼの等電点piの決定を示す。等電点電気泳動は、100mVで、pH8.0~10.0の範囲でアンフォラインを使用してガラス管中の10ポリアクリルアミドゲル中で16時間かけて行った。2種のゲルを流し込み、各管に100μgの精製プロテアーゼを加えた。ゲルをガラス管から取り出し、ゲルの一方を、各1cmの13の画分に切断し、もう一方を銀染色を用いて染色した。画分のプロテアーゼ活性およびpHを調べた。プロテアーゼの等電点は、9.31であるとわかった。[実施例28]この実施例は、ビューベリア種MTCC5184のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を示す。以下の阻害剤:フェニルメチルスルホニルフルオリドPMSF、エチレンジアミン四酢酸EDTA、ヨード酢酸、N-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトンTPCK、N-トシル-L-リシンクロロメチルケトンTLCK、ジメチルスルホキシドDMSOおよびベンズアミジンを調べた。300μgの精製プロテアーゼを、100mMTris-HClバッファーpH8.0中で各阻害剤とともに1時間プレインキュベートし、残存するプロテアーゼ活性を50°C、pH9.0で測定した。阻害剤を伴わないプロテアーゼは、コントロールとしての役割を果たした。プロテアーゼは、1mMPMSFによって完全に阻害され、このことは、それがセリンプロテアーゼであることを示した表6。[実施例29]この実施例は、ビューベリア種MTCC5184のプロテアーゼ活性に対する金属イオンの効果を示す。精製プロテアーゼを、種々の金属の1mMおよび10mM塩化物塩とともに28°Cで30分間インキュベートし、その後、残存する活性を調べた。Ca2の存在下でプロテアーゼ活性の活性化はなく、このことは、酵素がその活性にカルシウムイオンを必要としないことを示す表7。Cu2およびCo2は、プロテアーゼに対して阻害効果がなかったが、Cd2およびHg2は、10mM濃度で<40の阻害を示した。CdおよびHgは、1mM濃度で、3および10阻害をそれぞれ示した。[実施例30]この実施例は、PMSFによるプロテアーゼのセリン残基の修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。10mMリン酸バッファー、pH7.0中、10μΜのビューベリア種MTCC5184の精製プロテアーゼを、0.005~0.05mMPMSFとともに、28°Cで30分間インキュベートし、残存活性を調べた表8。PMSFを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。0.025mMPMSFで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するセリン残基の関与を示す。PMSFの濃度および時間に関する阻害速度論を図9に示す。[実施例31]この実施例は、ウッドワード試薬WRKによるプロテアーゼのアスパラギン酸残基の修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。10mMリン酸バッファー、pH7.0中、10μΜのビューベリア種MTCC5184の精製プロテアーゼを、1~10mMWRKとともに、28°Cで30分間インキュベートし、残存活性を調べた。WRKを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。9mMWRKで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するアスパラギン酸残基の関与を示す表9。[実施例32]この実施例は、N-ブロモスクシンイミドNBSを用いるトリプトファンの修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。10mMリン酸バッファー、pH7.0中、10μΜのビューベリア種MTCC5184の精製プロテアーゼを、0.01~0.1mMNBSとともに、28°Cで30分間インキュベートし、残存活性を調べた。NBSを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。0.06mMNBSで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するトリプトファン残基の関与を示す表10。[実施例33]この実施例は、PMSF、WRKおよびNBSによるビューベリア種MTCC5184プロテアーゼの阻害に対するカゼインによる基質保護の研究を示す。これは、1~10mgのカゼインとともに10μΜの精製プロテアーゼを、4°Cで5分間プレインキュベートし、続いて、10μΜPMSFまたは5mMWRKまたは10μΜNBSを用いて30分間処理することによって実施し、残存プロテアーゼ活性を調べた。カゼイン濃度を増大すると、両阻害剤による阻害が減少し、このことは、カゼインによる基質保護を示す表11。これは、プロテアーゼの活性部位でのセリン、アスパラギン酸およびトリプトファンの存在を示す。[実施例34]この実施例は、カゼイン、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミンに対する、ビューベリア種MTCC5184由来のプロテアーゼの活性の測定を示す。反応混合物は、2mlの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼ酵素の一定分量と、0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中の10mgの基質とを含有していた。50°Cで10分間インキュベートした後、3mlの5トリクロロ酢酸を添加すること濃塩酸を用いる酸性化によって反応を終結させた。室温で30分間静置した後、形成された沈殿物を、WhatmanNo.1濾紙を通して濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を、280nmで測定した。プロテアーゼは、上記の基質を種々の程度に分解できる表12。[実施例35]この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが活性であるpH範囲を示す。プロテアーゼの最適pHを決定するために、酵素を、5.5~12の範囲の異なるpHのバッファーで希釈し、アッセイした。以下のバッファーを使用した0.1M:クエン酸pH4および5クエン酸リン酸バッファーpH6、リン酸バッファーpH7、TrisHClバッファーpH8および炭酸重炭酸pH9および10、リン酸ナトリウム-NaOHpH11.0およびKCl-NaOHpH12.0。結果は、添付の表13に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、pH5.5から12の間で活性であるということが観察される。[実施例36]この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を決定するために、30~70°Cの範囲の温度で炭酸重炭酸バッファー0.1M、pH9を用いてプロテアーゼ活性を調べた。実験の結果は、添付の表14に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、30~70°Cの間で活性であるということが観察される。[実施例37]この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが安定であるpH範囲を示す。酵素の安定性に対するpHの影響を検討し、ここでは、酵素のpHは以下のバッファー:クエン酸-pH3、4および5;クエン酸リン酸バッファー-pH6;リン酸バッファー-pH7;TrisHClバッファー-pH8;炭酸重炭酸-pH9および10ならびにリン酸ナトリウム-NaOHpH11.0を用いて調整され、28°Cで1時間インキュベートした。インキュベートした後の酵素の残存活性を、50°C、pH9でアッセイした。結果は、表15に示され、ここでは、酵素がpH3~11の範囲で安定であり、pH7で最大の安定性を有することが観察される。[実施例38]この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが1時間安定である温度範囲を示す。温度安定性を調べるために、粗プロテアーゼを、4~70°Cの範囲の温度で、0.1Mリン酸カリウムバッファーpH7.0中で1時間インキュベートし、残存活性を50°C、pH9で測定した。結果は表16に示されており、ここでは、酵素が50°Cまで安定であることが観察される。[実施例39]前記プロテアーゼの安定性をまた、粗プロテアーゼを、炭酸重炭酸バッファーpH9.0中、50°Cで最大2時間インキュベートすることによって、50°Cで時間に関して調べた。一定分量を15分の一定間隔で取り出し、50°C、pH9で残存活性を推定した。結果は、表17に示されており、ここでは、50°Cでのプロテアーゼの半減期がおよそ2時間であるとわかった。[実施例40]この実施例は、アゾコールに対するビューベリア種MTCC5184由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、2.5mlの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量と、0.05MTrisHClバッファーpH8.0中の10mgのアゾコールとを含有していた。熱不活化酵素15分間煮沸することによるをブランクとしてとった。37°Cで10分間インキュベートした後、WhatmanNo.1濾紙を通して濾過することによって反応を終結させた。580nmで濾液の吸光度を測定した。酵素活性の1ユニットは、1分あたり580nmでの吸光度の1ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例2に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、4.31U/mlのアゾコール活性を有していた。20.7U/mlのカゼオノリティック活性を有する実施例22に記載される精製プロテアーゼは、1.84U/mlのアゾコールazocoll活性を示した。[実施例41]この実施例は、エラスチンオルシンに対する、ビューベリア種MTCC5184由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、3mlの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼ酵素の一定分量と、0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中、20mgのエラスチン-オルシンとを含有していた。熱不活化酵素15分間煮沸することによるをブランクとしてとった。50°Cで30分間インキュベートした後、2mlの0.7Mリン酸バッファーpH6を添加することによって反応を終結させた。内容物を遠心分離し、上清の吸光度を578nmで測定した。酵素活性の1ユニットは、1分で580nmでの吸光度の1ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例2に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、0.012U/mlの活性を示した。20.7U/mlのカゼオノリティック活性を有する実施例22に記載される精製プロテアーゼは、エラスチン-オルシンに対して0.011U/mlの活性を示した。[実施例42]この実施例は、アゾカゼインに対する、ビューベリア種MTCC5184由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、500μlの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量と、0.05M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中、1mgのアゾカゼインとを含有していた。熱不活化酵素15分間煮沸することによるをブランクとしてとった。50°Cで30分間インキュベートした後、500μlの10TCAを添加することによって反応を終結させた。氷上で15分間冷却した後、内容物を8000rpmで10分間遠心分離した。800μlの上清に、200μlの1.8MNaOHを加え、420nmで吸光度を測定した。酵素活性の1ユニットは、1分あたり420nmでの吸光度の1ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例2に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、16.05U/mlの活性を示した。[実施例43]この実施例は、N-α-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリドBAPNAに対する、ビューベリア種MTCC5184由来の精製プロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、500μlの総容量中に、0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中の、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量を含有していた。0.1M炭酸ナトリウムバッファーpH9.0中で調製された1.5mMBAPNA500μlを加え、50°Cで60分間インキュベートした。250μlの10酢酸を添加することによって反応を終結させた。410nmでの上清の吸光度を測定した。活性の1ユニットは、1分で410nmでの吸光度の1ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。20.7U/mlのカゼオノリティック活性を有する実施例22に記載されるように精製されたプロテアーゼは、0.018U/mlの活性を示した。[実施例44]この実施例は、NMITLI-1およびコラゲナーゼ-1基質を使用する蛍光研究によって、ビューベリア種MTCC5184由来のプロテアーゼの非コラゲナーゼ性を示す。最初に、NMITLI-1基質に対して粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼを用いて蛍光実験を行った。蛍光実験は、トリエタノールアミンバッファーTEApH8中、室温で実施した。通常、アッセイは、1.8μΜのNMITLI-1基質濃度12μM保存溶液の10μlを有する、290μlの100mMTEAバッファーpH8を含有していた。5μlの酵素サンプルを添加することによって反応を開始した。励起波長は、340nmとし、発光は、種々の時間間隔で425から625nmでスキャンした。AEDANS発色団の蛍光において3倍の増大があり、これは、酵素サンプルのタンパク質分解性を示す。NMITLI-IDabcylGabaArgProLeuGlyAlaAlaAlaLysValGabaCysLysNH2|AEDANSNMITLI-1基質に対する活性を示す粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼサンプルをまた、コラゲナーゼ基質-Iを用いてコラゲナーゼ活性についてスクリーニングした。蛍光実験は、トリエタノールアミンバッファーTEApH8中、室温で実施した。通常、アッセイは、1.6μMの基質。3MNaClの存在下で、プロテアーゼは最大2時間安定であり、初期活性の約75を保持した図13。[実施例53]この実施例は、前記株によって分泌されるキシラナーゼが活性であり、安定であるpH範囲を示す。キシラナーゼの最適pHを調べるために、酵素を以下のバッファー中に希釈し0.05M、50°Cで30分間アッセイした:クエン酸pH3、4および5クエン酸リン酸バッファーpH6、リン酸バッファーpH7、TrisHClバッファーpH8および炭酸重炭酸pH9。安定性研究のために、キシラナーゼを上記のバッファー中、室温で1時間プレインキュベートし、残存活性を50°C、pH6で30分間アッセイした。結果は、添付の表21に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、pH4から9の間で活性であり、3から9のpH範囲において安定であるということが観察される。[実施例54]この実施例は、前記株によって分泌されるキシラナーゼが活性である温度範囲を示す。キシラナーゼの最適温度を調べるために、酵素をpH6で、また30~70°Cの範囲の温度で推定した。実験の結果は、添付の表22に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は30~70°Cの間で活性であるということが観察される。[実施例55]この実施例は、前記株によって分泌されたアミラーゼが活性であり、安定であるpH範囲を示す。アミラーゼの最適pHを調べるために、酵素を以下のバッファー中に希釈し0.05M、50°Cで30分間アッセイした:クエン酸pH3、4および5クエン酸リン酸バッファーpH6、リン酸バッファーpH7、TrisHClバッファーpH8および炭酸重炭酸pH9。安定性研究のために、アミラーゼを、上記のバッファー中、室温で1時間プレインキュベートし、残存活性を50°C、pH6で30分間アッセイした。結果は、添付の表23に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、pH4から8の間で活性であり、3から9のpH範囲において安定であるということが観察される。[実施例56]この実施例は、前記株によって分泌されるアミラーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を調べるために、アミラーゼをpH6で、また20~70°Cの範囲の温度で推定した。実験の結果は、添付の表24に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、20~70°Cの温度範囲において活性であるということが観察される。[実施例57]この実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性であるpH範囲を示す。リパーゼの最適pHを調べるために、酵素を希釈し、滴定法によって50°C、4~9の範囲のpHでアッセイした。以下のバッファーを使用した:酢酸pH4および5クエン酸pH6、リン酸pH7、TrisHClpH8および炭酸重炭酸pH9。結果は.添付の表25に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、pH4から9の間で活性であるということが観察される。[実施例58]この実施例は、前記株によって分泌されるリパーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を調べるために、リパーゼ活性を、pH7で、また20~60°Cの範囲の温度で滴定法によって調べた。実験の結果は、添付の表26に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、20~60°Cの間で活性であるということが観察される。[実施例59]この実施例は、粗プロテアーゼおよび精製プロテアーゼならびにビューベリア種MTCC5184のバイオマス濾液を使用することによる、廃棄X線フィルムからの銀の回収および銀ナノ粒子の合成を示す。真菌を、組成リットルあたりのグラムが、麦芽エキス-3、酵母エキス-3、ペプトン-5、グルコース-10であるMGYPブロス中、28°C、200rpmで48時間、好気的に増殖させバイオマスを遠心分離によって回収し、続いて、蒸留水で十分に洗浄して、培地成分を除去した。10gの洗浄されたバイオマス湿潤重量を、100mlのMilli-Q脱イオン水とともに、28°C、200rpmでインキュベートした。2時間インキュベートした後、バイオマスをWhatmanNo.1濾紙上で濾過し、濾液を集めた。銀を回収し、銀ナノ粒子を合成するために、5gの、2cm×2cm片に切断した洗浄されたX線フィルムを、100mlの総容量で、粗プロテアーゼ、精製プロテアーゼおよびバイオマス濾液とともに、28°Cおよび200rpmでインキュベートした。銀含有タンパク質ゼラチン層の回収およびナノ粒子合成を、可視的にならびにUV-Vis分光法によって、最大48時間モニタリングした。ナノ粒子の存在とともに浄化されたフィルムの同時出現を伴うゼラチン層の完全な回収が、24時間内に観察された。銀ナノ粒子は、粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼによって、またバイオマス濾液によっても合成され得る。粗プロテアーゼは、混入物質として培地成分を含有し、精製プロテアーゼの使用は高価となるので、バイオマス濾液が好ましい。合成された銀ナノ粒子を、UV-可視分光法図15、透過型電子顕微鏡TEM、単一ナノ粒子フーリエ変換赤外分光法の回折パターンおよびX線回折によって特性決定した。[実施例60]この実施例は、細胞の分離のための動物組織培養における精製プロテアーゼの適用を示す。細胞を内皮細胞用基礎培地-2EBM-2上で増殖させた。48時間増殖させた後、プレートから培地をファルコンチューブ中に回収した。プレートの底の付着細胞を2mlの1mMEDTA溶液で洗浄し、続いて、4mlの1mMEDTA溶液中、200μgのプロテアーゼを加え、37°Cで2分間インキュベートした。細胞を洗い出し、ファルコンチューブ中に集め、2000rpmで2分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを1mlの新鮮培地中に再懸濁し、新しいペトリプレートに移した。顕微鏡観察によって、分離された細胞が示され、これは、プロテアーゼの作用によるものであった図16。[実施例61]この実施例は、洗浄剤製剤におけるプロテアーゼの適用を記載する。白い布片を血液中に浸し、風乾した。血痕のついた布を各0.5gの4等分に切断し、4つの異なるペトリプレート中で2ホルムアルデヒド中に2分間浸し、水ですすいで過剰のホルムアルデヒドを除去した。布片を30mlの反応混合物中に浸し、異なる条件下、28~30°Cで30分間インキュベートした:aコントロール水のみb洗浄剤のみc粗プロテアーゼ8.5U/mlのみおよびd洗浄剤粗プロテアーゼ8.5U/ml。布片を水道水で4回すすいだ。洗浄性能は、洗浄剤およびプロテアーゼが一緒に使用される場合に最高であった。血餅は、洗浄剤のみでは除去されなかったのに対し、プロテアーゼ単独では、血餅とともに血痕を除去できた図17。[実施例62]この実施例は、粗ビューベリアMTCC5184プロテアーゼを使用するヤギおよびヒツジ皮膚の脱毛工程を示す。実施例6Bに記載されるように製造したプロテアーゼを硫酸アンモニウム沈殿90飽和に付し、脱毛研究に使用した。湿潤塩漬けヤギおよびヒツジ皮膚を取り出し、6時間浸漬した。浸漬後、皮膚の重量を書きとめた。浸漬された重量に基づいて3プロテアーゼおよび10水のペーストを皮膚の内側に塗布し、5~10時間積み重ねた。対応する化学物質に基づく対照工程も、10石灰、3硫化物および15水のペーストを使用して実施した。次いで、コントロールおよび実験皮膚の両方を脱毛し、実験皮膚の脱毛有効性は、85~100の範囲であり、これは、化学物質に基づくプロセスと同様であった。生皮は清潔で、かすり傷がなかった。脱毛された生皮をクラスト皮に加工し、クラスト皮の品質も評価した。引張強度、引裂強度およびしぼ破裂強度によって評価されるような皮革の品質は、石灰および硫化物脱毛法によって得られたものに匹敵していた。汚染負荷量の低減もまた、コントロールおよび実験工程両方の種々の廃棄流を分析することによって評価した。結果は、脱毛にプロテアーゼが使用された場合に、CODおよび硫化物の大幅な低減を示し、0.69のBOD/COD比を有し、これは、廃水の分解性および処理性能が、化学的プロセスシステムの廃水と比較してかなり良好であるということを示す。[実施例63]この実施例は、粗ビューベリアMTCC5184プロテアーゼを使用するウシの皮の脱毛工程を示す。実施例6Bに記載されるように製造されたプロテアーゼを硫酸アンモニウム沈殿90飽和に付し、脱毛研究に使用した。湿潤塩漬けウシ皮を取り出し、8時間浸漬した。浸漬後、皮の重量を書きとめた。皮を、15水および4酵素を使用してドラム缶中で処理した。対応する化学物質に基づく対照工程も、150水、10石灰および3硫酸ナトリウムを使用して実施した。翌日、皮膚を脱毛し、脱毛有効性は、70~100の範囲であった。生皮は清潔でかすり傷がなかった。脱毛された生皮をクラスト皮に加工し、クラスト皮の品質も評価した。引張強度、引裂強度およびしぼ破裂強度によって評価されるような皮革の品質は、石灰および硫化物脱毛法によって得られたものに匹敵していた。汚染負荷量の低減もまた、コントロールおよび実験工程両方の種々の廃棄流を分析することによって評価した。結果は、脱毛にプロテアーゼが使用された場合に、CODおよび硫化物の大幅な低減を示し、0.72のBOD/COD比を有し、これは、廃水の分解性および処理性能が、化学的プロセスシステムの廃水と比較してかなり良好であるということを示す。本発明の主な利点は、以下のとおりである:真菌株は新規単離株である。本発明において記載される真菌株は、プロテアーゼを単独で、またアミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼを使って製造できる。本発明において記載される真菌株は、プロテアーゼアミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼを単独でまたは組み合わせて製造できる。酵素製造のために、液内発酵ならびに固体状発酵の両方とも使用できる。これらの酵素のカクテルは、皮革、繊維製品、洗浄剤および食品工業など、多数の工業的用途を有する。プロテアーゼは、皮革工業における前なめし操作におけるその適用についてすでに評価されている。粗プロテアーゼは、石灰および硫化物のような化学物質を全く添加する必要なく、動物皮膚/皮を脱毛できる。プロテアーゼは、内皮細胞を分離でき、動物細胞培養において使用できる。プロテアーゼは、ナノ粒子を合成できる。粗プロテアーゼ調製物は、広い基質特異性を有し、皮革および洗浄剤工業における適用に必要とされるようなアルブミン、ヘモグロビン、ゼラチン、ケラチンなど、種々のタンパク質を分解できる。プロテアーゼは、3~10の広いpH範囲にわたって、また、洗浄剤の存在下で安定性を有し、このために、洗浄剤および同類の工業におけるその適用にとって適した候補となる。プロテアーゼは、種々の水混和性および水非混和性溶媒の存在下で安定であり、このために、有機溶媒における種々の分子の酵素的合成にとって適したものとなる。"