"ヒトCD20に結合するヒト化抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、インビボで霊長類のB細胞を枯渇するのに有効な抗体であり、H鎖の可変領域VHに少なくとも一つの抗ヒトCD20抗体の配列番号12のCDR3配列および実質的なヒト重鎖サブグループIIIVHIIIのヒトコンセンサスフレームワークFR残基を含んでなる抗体。さらに配列番号10のH鎖CDR1配列および配列番号11のCDR2配列を含む、請求項1に記載の抗体。さらに配列番号4のL鎖CDR1配列、配列番号5のCDR2配列、配列番号6のCDR3配列、および実質的にヒトコンセンサスフレームワークFR残基であるヒト軽鎖κサブグループIVκIを含む、請求項2に記載の抗体。配列番号8のVH配列v16、図1Bに示すを含む、前記請求項に記載の抗体。配列番号2のVL配列v16、図1Aに示すを含む、請求項4に記載の抗体。VH領域がヒトIgG鎖定常領域に結合している、請求項3に記載の抗体。ヒトIgGがIgG1またはIgG3である、請求項6に記載の抗体。抗体が、それぞれ配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列[図6および図7に示す]を有する2H7.v16である、請求項1に記載の抗体。抗体が、それぞれ配列番号2および23の軽鎖および重鎖アミノ酸配列[図6および図8に示す]を有する2H7.v31である、請求項1に記載の抗体。H鎖にD56AとN100AおよびL鎖にS92Aのアミノ酸置換基を持つ[v.96]、請求項5に記載の抗体。さらにADCCおよび/またはCDC活性を向上するFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む、前記請求項のいずれかに記載の抗体。アミノ酸置換基が、S298A/E333A/K334Aである、請求項11に記載の抗体。抗体が配列番号23[図8に示す]の重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v31である、請求項12に記載の抗体。さらにCDC活性を減弱するFc領域に少なくとも一つのアミノ酸置換基を含む、請求項1ないし10のいずれかに記載の抗体。少なくとも置換基K322Aを含む、請求項14に記載の抗体。抗体が、リツキサンと比較して少なくとも10倍のADCC活性向上を有する2H7.v114または2H7.v115である、請求項1ないし10に記載の抗体。霊長類のB細胞がヒトおよびカニクイザルのものである、請求項1に記載の抗体。細胞障害性剤に結合している、前記請求項のいずれかに記載の抗体。細胞障害性剤が放射性同位体または毒素である、請求項18に記載の抗体。抗体がCHO細胞で生成される、前記請求項のいずれかに記載の抗体。前記請求項のいずれか一に記載の抗体をコードする単離した核酸。前記請求項のいずれかに記載の抗体をコードする発現ベクター。請求項21に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。前記請求項のいずれか一に記載の抗体を生成する、請求項23に記載の宿主細胞。CHO細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。前記請求項のいずれか一に記載の抗体の生成方法であって、請求項24に記載の抗体を生成する細胞を培養し、細胞培地から抗体を回収することを含む方法。請求項1に記載の抗体および担体を含んでなる組成物。抗体が2H7.v16であり、担体が薬剤的許容性のある担体である、請求項27に記載の組成物。容器およびそれに内包される前記請求項のいずれかに記載の抗体を含む組成物を含んでなる製造品。さらに、組成物が非ホジキンリンパ腫の治療に用いることが可能であることを示す梱包挿入物を含んでなる、請求項29に記載の製造品。インビボでB細胞にアポトーシスを引き起こす方法において、前記請求項のいずれかに記載の抗体をB細胞に作用させ、それによってB細胞を殺すことを含む方法。CD20陽性癌の治療方法において、前記請求項いずれかに記載のヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を癌患者に投与することを含む方法。CD20陽性癌がB細胞リンパ腫または白血病である、請求項32に記載の方法。CD20陽性癌が非ホジキンリンパ腫NHLまたは白血球優性ホジキン病LPHDである、請求項33に記載の方法。癌が慢性白血球性白血病またはSLLである、請求項32に記載の方法。抗体が、図および表に示すようなアミノ酸配列をそれぞれ持つ2H7.v16、v31、v96、v114、v115よりなる群から選択したものである、請求項34または35に記載の方法。抗体が、図6および図7にそれぞれ示す配列番号21および22の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を有する2H7.v16である、請求項34または35に記載の方法。抗体を275-375mg/m2の用量範囲で投与する、請求項33に記載の方法。さらに、少なくとも一つの化学療法剤を患者に投与することを含む、請求項32に記載の方法。癌が非ホジキンリンパ腫NHLであり、化学療法剤がドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンよりなる群から選択したものである、請求項39に記載の方法。自己免疫性疾患の治療方法において、前記請求項のいずれか一つのヒト化CD20結合抗体の治療的有効量を自己免疫性疾患患者に投与することを含む方法。自己免疫性疾患が、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスSLE、ウェゲナー肉芽種症、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病ITP、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発神経障害、筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、および糸球体腎炎よりなる群から選択したものである、請求項41に記載の方法。自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項42に記載の方法。さらに、患者に第二治療薬を投与することを含む、請求項43に記載の方法。第二治療薬が免疫抑制剤である、請求項44に記載の方法。免疫抑制剤がメトトレキセートである、請求項45に記載の方法。皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、ANCA血管炎下を含む再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血AIHA、第VIII因子欠損症、血友病A、自己免疫性好中球減少症、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病GVHD、IgM媒介、血栓性血小板減少性紫斑病TTP、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎HIV、閉塞性細気管支炎非移植性対NSIP、ギランバレー症候群、大血管血管炎、巨細胞高安動脈炎、中血管血管炎、川崎病、および結節性多発性動脈炎よりなる群から選択した自己免疫性疾患を治療する方法であって、治療的有効量のCD20結合抗体またはその機能的フラグメントを罹患患者に投与することを含んでなる方法。CD20結合抗体がリツキサン登録商標である、請求項47に記載の方法。カニクイザルのCD20の配列番号:のヌクレオチド配列図19に示すまたはこの配列の変性変異型を含んでなる単離した核酸。保存的なアミノ酸置換基を有する配列番号:図20に示すまたは配列番号:図20のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする配列を含んでなる単離した核酸。請求項50に記載の核酸を含んでなるベクター。発現コントロール配列に作用可能に結合している請求項49に記載の核酸を含む発現ベクターである、請求項51に記載のベクター。請求項50に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。カニクイザルのCD20のアミノ酸配列[配列番号、図20]を含む単離したポリペプチド。20mg/mLのヒト化2H7抗体、pH5.8の10mMヒスチジン硫酸塩、60mg/mlのショ糖、0.2mg/mlのポリソルベート20を含んでなる液状物。実施例12H7抗CD20マウスモノクローナル抗体のヒト化マウス抗ヒトCD20抗体の2H7ここではマウスをmとしてm2H7とも呼ぶのヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。マウス2H7抗体可変領域配列とマウスVとヒトCのキメラ2H7は開示されており、例えば米国特許第5846818号及び同第6204023号を参照のこと。2H7のCDR残基は、マウス2H7可変ドメインのアミノ酸配列米国特許第5846818号に開示を既知の抗体の配列と比較することにより同定されたKabat等Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest5版PublicHealthServiceNationalInstitutesofHealthBethesdaMD。軽鎖と重鎖のCDR領域は配列高頻度可変性上掲のKabat等に基づいて定まり、図1A及び図1Bにそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド表1を用いて、部位特異的突然変異誘発KunkelProcNatlAcadSci82488492を使用して、プラスミドpVX4に含まれるコンセンサス配列VkIVHIIIVLカッパサブグループI,VHサブグループIIIに対応する完全ヒトFabフレームワーク中に6つ全てのマウス2H7CDR領域を導入した図2。ファージミドpVX4図2を突然変異誘発並びに大腸菌中でのFの発現に使用した。pB0475の誘導体Cunningham等Science24313301336であるファージミドpb0720に基づいて、pVX4は、ヒト化コンセンサスκサブグループI軽鎖VLκICLとヒト化コンセンサスIII重鎖VHIIICH1抗IFNαインターフェロンα抗体をコードするDNA断片を含む。pVX4はまた共に別の過去に開示されたpUC119ベースのプラスミドpAK2Carter等ProcNatlAcadSciUSA894285から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャインダルガーノ配列を有している。独特のSpel制限部位をF軽鎖及び重鎖をコードするDNA間に導入した。抗IFNα重鎖及び軽鎖双方の最初の23のアミノ酸はStII分泌シグナル配列であるChang等Gene55189196。2H7のCDRスワップ型を構築するために、部位特異的突然変異誘発をpVX4のデオキシウリジン含有鋳型で実施した;抗IFNαの6つ全てのCDRがマウス2H7CDRに変化した。得られた分子をヒト化2H7型22H7v2又は2H7のCDRスワップ型と呼ぶ;これは図1A及び1Bに示されるコンセンサスヒトFR残基を有するm2H7CDR残基を有する。ヒト化2H7v2は更なるヒト化に用いた。表1はH及びL鎖においてマウス2H7m2H7CDRのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、CDRH1オリゴヌクレオチドを使用してm2H7のH鎖を再作製した。CDRH1、CDRH2及びCDRH3はH鎖CDR1、CDR2及びCDR3をそれぞれ意味する;同様に、CDRL1、CDRL2及びCDRL3はL鎖CDRのそれぞれを意味する。CDRH2における置換はCDRH2AとCDRH2Bの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。表1.pVX4のヒトフレームワーク中へのマウス2H7CDRのCDRスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。ヒト化コンストラクトとの比較のために、キメラ2H7FabマウスVL及びVHドメイン、及びヒトCL及びCH1ドメインを含むを発現するプラスミドを、2H7v2中にマウスフレームワーク残基を導入するために合成オリゴヌクレオチドを使用して部位特異的突然変異誘発上掲のKunkelによって構築した。2H7v68として知られているキメラFabを発現させるための得られたプラスミドコンストラクトの配列を図3に示す。Fabの各コード鎖は上にpVX4図2について記載された23のアミノ酸のStII分泌シグナル配列を有している。ヒトVkIVHIIIコンセンサスフレームワーク図1A及び1B及び過去のヒト化抗体Carter等ProcNatlAcadSciUSA8942854289とのマウス2H7フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって2H7v2Fabコンストラクト中に導入した。これらの変異により、CDRコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス2H7フレームワークに見出されたものに変化した。型3はVHR71V,N73Kを、型4はVHR71Vを、型5はVHR71V,N73K及びVLL46Pを、型6はVHR71V,N73K及びVLL46P,L47Wを含んでいた。m2H7抗体のヒト化及びキメラFab型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖DNAの調製のためにプラスミドを大腸菌株XL1ブルーStratageneSanDiegoCA中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法SequenaseUSBiochemicalCorpを使用して完全に配列決定した。プラスミドを、MM294の誘導体である大腸菌株16C9に形質転換し、5μg/mlのカルベニシリンを含むLBプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを37°Cで5-8時間、5mlのLB100μg/mlカルベニシリン中で成長させた。5mlの培養物を500mlのAP5100μg/mlカルベニシリンに添加して、37°Cで4Lの邪魔板振盪フラスコ中で16時間成長させた。AP5培地は1.5gのグルコース、11.0のHycaseSF、0.6gの酵母エキス保証付き、0.19gの無水MgSO4、1.07gのNH4Cl、3.73gのKCl、1.2gのNaCl、120mlの1Mトリエタノールアミン、pH7.4からなり、1Lの水に加えた後、0.1μmのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。細胞を、3000xgにて1Lの遠心分離瓶Nalgeneで遠心分離によって収集し、上清を除去した。1時間の凍結後、ペレットを25mlの非放射性10mMMES10mMEDTA、pH5.0バッファーA中に再懸濁させた。250μlの0.1MPMSFシグマを添加してタンパク質分解を阻止し、3.5mlの原液10mg/mlのニワトリの卵の白色リゾチームシグマを添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で1時間、穏やかに振盪した後、試料を40000xgで15分、遠心分離した。上清をバッファーAを用いて50mlにし、バッファーAで平衡にした2mlのDEAEカラムに充填した。ついで、バッファーAで平衡にしたプロテインGセファロースCL4Bファルマシアカラム0.5ml床容積に流通させた。カラムを10mlのバッファーAで洗浄し、1.25mlの1Mトリス、pH8.0に入れた3mlの0.3Mグリシン、pH3.0で溶出させた。ついで、Fをセントリコン30アミコンを使用してPBS中にバッファー交換し、0.5mlの最終容積まで濃縮した。全てのFのSDSPAGEゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。細胞ベースのELISA結合アッセイ以下に記載においては、キメラ2H7Fabを含むFabのCD20への結合は検出が難しかった。従って、2H7Fab型をアッセイと更なる突然変異誘発のために完全長IgG1抗体として再形態化した。完全長IgGの発現のためのプラスミドは、キメラ2H7v68FabのVL及びVHドメイン並びにヒト化Fab型2ないし6を、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたpRKベクターGorman等DNAProtEngTech2310中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各FabコンストラクトをEcoRV及びBlpIを用いて消化させてVL断片を切除し、これを、完全な軽鎖VLCLドメインの発現のためにプラスミドpDR1図4のEcoRV/BlpI部位にクローニングした。また、各FabコンストラクトをPvuII及びApaIで消化させてVH断片を切除し、これを、完全な重鎖VHCH1ヒンジCH2CH3ドメインの発現のためにプラスミドpDR2図5のPvuII/ApaI部位中にクローニングした。各IgG変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株293Graham等JGenVirol365974中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、293細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖DNAと、続いてpAdVAntageTMDNAPromegaMadisonWIを添加し、細胞を37°Cで一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し4日後に収集した。抗体を、プロテインAセファロースCL4Bを使用して培養上清から精製した後、バッファーを10mMコハク酸ナトリウム、140mMNaCl、pH6.0に交換し、セントリコン10アミコンを使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。CD20抗原に対する相対的結合親和性を測定するために、細胞ベースのELISAアッセイ法を開発した。ヒトBリンパ芽球腫WIL2S細胞ATCCCRL8885AmericanTypeCultureCollectionRockvilleMDを、加湿した5CO2インキュベーターにおいて、2mMのLグルタミン、20mMのHEPES、pH7.2及び10の熱不活化仔ウシ血清を補填したRPMI1640中で成長させた。細胞を、1FBS含有PBSアッセイバッファーで洗浄し、96ウェルの丸底プレートNuncRoskildeDenmark中で250-300000細胞/ウェルにて播種した。アッセイバッファー中、2倍の連続希釈標準15.6-1000ng/mlの2H7v68キメラIgGと3倍の連続希釈試料2.7-2000ng/mlをプレートに添加した。プレートを氷中に埋設し、45分間、インキュベートした。未結合抗体を除くために、ウェルに0.1mLのアッセイバッファーを添加した。プレートを遠心分離し、上清を除去した。細胞を0.2mLのアッセイバッファーでもう2回洗浄した。プレートに結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ヒトFc抗体JacksonImmunoResearchWestGrovePAをプレートに添加することによって検出した。45分のインキュベーション後、細胞を前に記載したようにして洗浄した。TMB基質3355テトラメチルベンジジン;KirkegaardPerryLaboratoriesGaithersburgMDをプレートに添加した。1Mのリン酸を加えて反応を停止させた。滴定曲線を4変数非線形回帰曲線フィッティングプログラムKaleidaGraphSynergysoftwareReadingPAを用いてフィッティングさせた。滴定曲線の中点の吸光度中央ODとその対応する標準濃度を決定した。ついで、この中央ODでの各変異体の濃度を決定し、標準の濃度を各変異体の濃度で割った。よって、値は、標準に対する各変異体の結合比である。相対親和性の標準偏差等価濃度は一般に実験値の/-10であった。表2に示されるように、CDRスワップ変異体v2の結合はキメラ2H7v68と比較すると極めて低減していた。しかしながら、型3ないし6は改善された結合性を示した。キメラ2H7のものに対する結合親和性を回復させるのに必要とされるかも知れない変異の最小数を決定するために、更なる変異及び変異の組み合わせを部位特異的突然変異誘発によって構築して、表3に示される変異体7から17を産生した。特に、これらはVH変異A49G、F67A、I69L、N73K、及びL78A;及びVL変異M4L、M33I、及びF71Yを含んでいた。型16及び17は、キメラ型の2倍内の、最良の相対的結合親和性を示し、2者間に有意差はなかった標準偏差=/-10。よって、変異の数を最小にするために、マウスフレームワーク残基に対してヒトフレームワーク残基の4の変異のみを有する型16を、更なる特徴付けのためのヒト化型として選択した。表2細胞ベースELISAを使用してキメラ2H7と比較したCD20に対するヒト化2H7IgG変異体の相対的結合親和性。相対的結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対するキメラ2H7の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat上掲のKabat等の番号付けに従ったCDRスワップ型に対するものである。表3ヒト化2H7型162H7v16における変異VHA49G、R71V、N73K及びVLL46Pの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。下線のコドンは示されたアミノ酸置換をコードする。VHR71V、N73K及びVLL46Pに対して、オリゴは、Fab鋳型での突然変異誘発に使用されたので、センス鎖として示される一方、VHA49Gに対して、オリゴは、pRKIgG重鎖鋳型と共に使用されたので、アンチセンス鎖として示される。型16のタンパク質配列は図6及び図7に示す。実施例22H7の抗原結合決定基パラトープCD20への結合における抗体の個々の側鎖の寄与を試験するために2H7v16又は2H7v17においてアラニン置換を行った。IgG変異体をpDR1及びpDR2ベクターから293細胞中で発現させ、精製し、上述の相対的結合親和性についてアッセイした。幾つかのアラニン置換は、WIL2S細胞上のCD20への相対結合性を有意に減少させた表4。表4.細胞ベースELISAWIL2S細胞を使用して測定したヒト化2H7v16のCDR領域におけるアラニン置換の効果。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7v16親の濃度として表す;よって、比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat上掲のKabat等の番号付けに従った2H7v16に対するものである。NBDは検出可能な結合がないことを意味する。型45の二つの数値は別の実験のものである。実施例32H7CDR領域内の更なる変異Alaスキャニングによって重要であると同定されたCDR位置での更なる残基の置換及び置換の組み合わせをまた試験した。幾つかの組み合わせた変異体、特にv96はv16よりもより強固に結合したようであった。表5.細胞ベースELISAWIL2S細胞を使用して測定したヒト化2H7v16のCDR領域における変異と非アラニン置換の組み合わせの効果。CD20に対する相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7v16親の濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す;比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat上掲のKabat等の番号付けに従った2H7v16に対するものである。実施例4フレームワークヒト化置換の部位における変異ヒト化の間に変化したフレームワーク位置の更なる残基の置換をまた2H7v16バックグラウンドで試験した。特に、マウス2H7親にもヒトコンセンサスフレームワークの何れにも見出されなかった選択的フレームワーク置換をVLP46及びVHG49、V71、及びK73において行った。これらの置換は一般的に相対的結合性の変化をあまりもたらさず表6、これらの位置のフレームワーク残基にある程度の自由度があることを示している。表6.フレームワーク置換の細胞ベースWIL2Sアッセイにおける相対結合性。IgG変異体は2H7v16バックグラウンドに対する変異で示す。相対結合性は、等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7v68キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す;比>1は変異体に対する高い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。可変ドメインのフレームワーク置換はKabat上掲のKabat等の番号付けに従った2H7v16に対するものである。標準コンパレーターとして2H7v16でアッセイされた変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。標準コンパレーターとして2H7v16でアッセイされた変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。実施例5亢進したエフェクター機能を持つヒト化2H7変異体2H7は補体依存性細胞傷害性CDCと抗体依存性細胞傷害性ADCCの双方を通してB細胞の溶解を媒介できるので、我々は、改善されたCDC及びADCC活性を持つヒト化2H7v16の変異体を産生しようとした。補体成分C1qへの向上した結合性を介してCDCを改善するために、他の抗体のFc領域内でのある種の残基の変異は記載されているIdusogie等JImmunol16625712575。活性化FcγレセプターへのIgG結合性の向上と阻害性FcγレセプターへのIgG結合性の向上によってADCCを改善するための変異もまた記載されているShields等JBiolChem27665916604Presta等BiochemSocTrans30487490。特に、記載されているようにして上掲のIdusogie等;上掲のShields等3の変異がCDC及びADCC活性の改善のために同定されている:S298A/E333A/K334Aここでは、三重Ala変異又は変異体とも呼ぶ;Fc領域の番号付けはEU番号付け法による;上掲のKabat等。2H7のCDC及びADCC活性を向上させるために、2H7Fcの三重Ala変異体を構築した。抗HER2抗体4d5のヒト化変異体は、変異S298A/E333A/K334Aで産生されており、4D5Fc110として知られているつまり、抗p185HER2IgG1S298A/E333A/K334A;上掲のShields等。プラスミドである抗体4D5Fc110をコードするp4D5Fc110上掲のShields等をApaIとHindIIIで消化させ、Fc断片変異S298A/E333A/K334Aを含むを2H7重鎖ベクターpDR2v16のApaI/HindIII部位に結合させ、pDR2v31を産生した。型31の完全H鎖のアミノ酸配列は図8に示す。L鎖はv16のものと同じである。IgG1抗体のFc領域の定常ドメインは与えられた種内にかなり保存されているが、対立遺伝子変異が存在しているLefranc及びLefrancThehumanIgGsubclassesmolecularanalysisofstructurefunctionandregulationpp4378FShakib編PergammonPressOxfordに概説。表7.CD20結合性に対するFc領域中の置換の効果。CD20への相対結合性は、フレームワーク置換の細胞ベースWIL2Sアッセイで測定した。Fc変異はEU番号付け法上掲のKabatにより、2H7v16親に対するものである。v31のFc領域の3つのAla変化の組み合わせはFc110と記載される。IgG変異体は2H7v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7v68キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。実施例6向上した安定性を持つヒト化2H7変異体治療用タンパク質としての開発のためには、好適な製剤バッファー中で、酸化、脱アミド化、又は生成物の品質に影響を及ぼしうる他のプロセスに対して安定なままである変異体を選択することが望ましい。2H7v16では、幾つかの残基が不安定性の可能な原因として同定された:VLM32及びVHM34、N100。従って、v16との比較でこれらの部位に変異を導入した。表8.細胞ベースWIL2SアッセイにおけるCD20に対する、安定性及び/又はエフェクター機能の向上のために設計された2H7変異体の相対結合性。IgG変異体は2H7v16バックグラウンドに対する変異で示される。相対結合性は等価な結合に必要とされる変異体の濃度に対する2H7v68キメラの濃度として表す;よって、比<1は変異体に対する弱い親和性を示す。相対的親和性の決定値における標準偏差は平均して/-10であった。可変ドメインにおけるフレームワーク置換はKabatの番号付けに従った2H7v16に対するものであり、Fc変異はEU番号付けによって示される上掲のKabat等。標準コンパレーターとして2H7v16で測定された変異体;相対値はキメラの値に対して正規化してある。更なるFc変異が過去に報告された変異Idusogie等Idusogie等Shields等に基づいてエフェクター機能を改変又は亢進するために安定性又は親和性亢進変異と組み合わせた。これらの変化には実施例5に記載したS298、E333A、K334ACDC活性の低減に対するK322A;ADCC活性を減少させるD265A;CDC活性を亢進するK326A又はK326W;及びFc領域にアロタイプ変化の効果を試験するE356D/M358Lが含まれる。これらの変異の何れもCD20結合親和性に有意な差異を生じなかった。標準コンパレーターとして2H7v16で測定された変異体;相対結合値はキメラの値に対して正規化してある。タンパク質の分解速度に対する安定性変異の効果を試験するために、2H7v16と2H7v73を10mMのヒスチジン、6のスクロース、0.02のポリソルベート20、pH5.8中12-14mg/mLで処方し、40°Cで16日間インキュベートした。ついで、インキュベートした試料につき、イオン交換クロマトグラフィーによって荷電変異体における変化を、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集と断片化を、細胞ベースWIL2Sアッセイでの試験によって相対結合性をアッセイした。結果図9は、加速された安定性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによる主ピークのフラクションの喪失について、2H7v73が2H7v16と比較して大なる安定性を有していることを示している。凝集、断片化又は結合親和性については有意差は見られなかった。実施例7WIL2S細胞上のCD20への抗体結合のスキャッチャード分析平衡解離定数Kdを、放射標識2H7IgGを使用してWIL2S細胞へ結合している2H7IgG変異体について定量した。IgG変異体はCHO細胞中で産生させた。リツキサン全実験での入手源はジェネンテック、SSanFranciscoCAとマウス2H7BDPharMingenSanDiegoCAをヒト化変異体との比較に使用した。マウス2H7抗体はまた例えばeBioscience及びCalbiochem共にSanDiegoCA、AccurateChemicalScientificCorp、Ancell、及びVinciBiochemから入手可能である。希釈は全て結合アッセイバッファー1ウシ血清アルブミン、25mMのHEPES、pH7.2、及び0.01のアジ化ナトリウムを含むDMEM培地で実施した。0.8nMの濃度の125I2H7v16ラクトペルオキシダーゼでヨウ素化のアリコート0.025mLをV底の96ウェルマイクロアッセイプレートのウェル中に分配し、非放射性抗体の連続希釈物0.05mLを加えて混合した。ついで、WIL2S細胞0.025mL中60000細胞を加えた。プレートをシールし、室温で24時間インキュベートした後、3500RPMで15分間遠心分離した。ついで、上清を吸引し、細胞ペレットを洗浄し遠心分離した。上清を再び吸引し、ペレットを1NのNaOHに溶解し、ガンマ計数のためチューブに移した。データを、プログラムLigandを使用するスキャッチャード分析に使用した。表9に示す結果は、ヒト化2H7変異体がマウス2H7と比較して類似のCD20結合親和性を、リツキサンと類似の結合親和性を有していたことを示している。2H7v31は上の表7に示した結合性に基づくとv16に非常に類似したKdを有していると予想される。表9.スキャッチャード分析による2H7変異体の均衡結合親和性実施例8補体依存性細胞傷害CDCアッセイ2H7IgG変異体について、本質的に開示されているIdusogie等JImmunol16441784184Idusogie等JImmunol16625712575CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2S細胞の補体依存性溶解を媒介するその能力をアッセイした。抗体を0.1mg/mL原液から1:3で連続希釈した。各希釈物の0.05mLのアリコートを、0.05mLの正常なヒト補体溶液QuidelSanDiegoCAを含んだ96ウェル組織培養プレートに加えた。この混合物に、0.05mL容積で50000WIL2S細胞を加えた。37°Cで2時間のインキュベーション後、0.05mLのアラマーブルー溶液AccumedInternationalWestlakeOHを加え、37°Cで更に18時間、インキュベーションを継続した。ついで、カバーをプレートから除去し、それを軌道振盪器で室温にて15分振盪した。相対蛍光単位RFUを530nm励起フィルター及び590nm発光フィルターを使用して読み取った。KaleidaGraphソフトウェアを使用して各抗体に対して濃度の関数としてRFUをフィッティングさせることによってEC50を計算した。結果表10は、ヒト化2H7抗体によるCDCの驚くべき改善を示しており、v73に対してはリツキサンと同様の相対作用強度で、v75に対してはリツキサンより3倍強く、v16に対してはリツキサンより3倍弱い。表10.リツキサンと比較した2H7抗体のCDC活性。>1の数はリツキサンより弱いCDC活性を示しており、<1の数はリツキサンより強い活性を示している。抗体は、によって示したものが一過性に産生された以外は、安定なCHO株から産生された。実施例9抗体依存性細胞性細胞傷害ADCCアッセイ2H7IgG変異体について、乳酸デヒドロゲナーゼLDH読み取りを使用して、本質的に開示されているShields等JBiolChem27665916604CD20発現リンパ芽球腫B細胞株のWIL2S細胞のナチュラルキラー細胞NK細胞溶解を媒介するその能力をアッセイした。NK細胞を、CD16としても知られているKoene等Blood9011091114FcγRIIIに対してアイソタイプであった正常なヒトドナーから得られた100mLのPBSリン酸緩衝生理食塩水で希釈した100mLのヘパリン処理血液から調製した。この実験では、NK細胞はCD16F158/V158に対してヘテロ接合性のヒトドナーからのものであった。希釈した血液を15mLのリンパ球分離培地ICNBiochemicalAuroraOhio上に層状にし2000RPMで20分間、遠心分離した。層間界面の白血球を4本の清浄な50mLチューブに分配し、それに15の仔ウシ血清を含むRPMI培地を満たした。チューブを1400RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットをMACSバッファー0.5BSA、2mMEDTA中に再懸濁させ、ビーズNK細胞単離キット,130046502を製造者のプロトコールMiltenyiBiotechに従って使用してNK細胞を精製した。NK細胞をMACSバッファーで2x106細胞/mLまで希釈した。アッセイ培地グリシンなしのF12/DMEM50:50、1mMのHEPESバッファー、pH7.2、ペニシリン/ストレプトマイシン100単位/mL;Gibco、グルタミン、及び1熱不活化仔ウシ血清中の抗体の連続希釈物0.05mLを、96ウェルの丸底組織培養プレートに加えた。WIL2S細胞をアッセイバッファーで4x105/mLの濃度まで希釈した。WIL2S細胞ウェル当たり0.05mLを96ウェルプレート中で希釈抗体と混合し、室温で30分間、インキュベートしてCD20への抗体の結合を可能にしたオプソニン作用。各ウェルに0.1mLのNK細胞を添加してADCC反応を開始させた。コントロールウェルでは、2のトリトンX100を添加した。ついで、プレートを37°Cで4時間インキュベートした。放出されたLDHのレベルを、細胞傷害性LDH検出キットキット番号1644793RocheDiagnosticsIndianapolisIndianaを製造者のプロトコールに従って使用して測定した。0.1mLのLDH展開液を各ウェルに加えた後、10秒間混合した。ついで、プレートをアルミフォイルで覆い、室温で15分暗室でインキュベートした。ついで、490nmでの光学密度を読み取り、コントロールウェル中で測定した全LDHで割ることによって溶解を計算するために使用した。溶解を抗体濃度の関数としてプロットし、4変数曲線フィッティングKaleidaGraphを用いてEC50濃度を決定した。結果は、ヒト化2H7抗体がADCCに活性があり、v31に対してはリツキサンの20倍強い相対作用強度で、v16に対してはリツキサンより5倍強く、v73に対してはリツキサンよりほぼ4倍強い。表11.n回の実験に基づいて2H7v16と比較したWIL2S細胞に対する2H7抗体のADCC活性。>1の値は2H7v16より低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す。更なるADCCアッセイを実施してリツキサンと2H7の組み合わせ変異体を比較した。これらのアッセイの結果は、2H7v114及び2H7v115がリツキサンと比較して>10倍の改善されたADCC作用強度を有することを示している表12。表12.n回の実験に基づいてリツキサンと比較したWIL2S細胞に対する2H7抗体のADCC活性>1の値はリツキサンより低い作用強度を示し、<1の値はより大なる強度を示す。実施例10カニクイザルにおけるパイロット試験での2H7変異体のインビボ効果CHO細胞の一過性トランスフェクションによって産生下2H7変異体を、そのインビボ活性を評価するために正常な雄カニクイザルにおいて試験した。C2B8リツキサンのような他の抗CD20抗体は、正常な霊長類においてB細胞を枯渇させる能力が証明されているReff等Blood83435445。一試験では、ヒト化2H7変異体を比較した。平行した試験では、リツキサンもまたカニクイザルにおいて試験された。4匹のサルを5つの用量群のそれぞれに使用した:1ビヒクル、20.05mg/kgのhu2H7v16、310mg/kgのhu2H7v16、40.05mg/kgのhu2H7v31、及び510mg/kgのhu2H7v31。抗体は、試験の1日目に一用量と8日目にもう一用量の全二用量に対して、0、0.2、又は20mg/mLの濃度で静脈内投与した。投薬の最初の日を1日目とし、その前の日を-1日と標記する;回復の最初の日各群2匹の動物に対しては11日と標記する。血液試料を-19、-12、1投薬前日、及び最初の投薬後6時間、24時間、及び72時間で収集した。更なる試料を8日目投薬前、10日目2動物/群の屠殺前、及び36日及び67日目回復動物に対してに採取した。末梢B細胞濃度を、CD3-/CD40細胞を計数するFACS法によって定量した。サル試料中における全リンパ球のCD3-CD40細胞の割合パーセントを次のゲーティング方法によって得た。前方散乱/側方散乱散乱図上にリンパ球集団をマークして領域1R1を決めた。R1での事象を使用して、CD40及びCD3マーカーに対して蛍光強度ドットプロットを表示した。蛍光的に標識した同位元素コントロールを用いて、CD40及びCD3陽性の各カットオフ点を決定した。結果は、2H7v16と2H7v31の双方が10mg/kg用量で完全な末梢B細胞枯渇を、また0.05mg/kg用量で部分的な末梢B細胞枯渇を生じさせることができたことを示している図11。投薬の最初の72時間の間に測定されたB細胞枯渇の時間経過と程度は二つの抗体に対して同様であった。回復動物の続く分析は、2H7v31で処置した動物が2H7v16を投薬したものと比較してB細胞の長い枯渇を示したことを示している。特に、10mg/kgの2H7v16で処置した回復動物は10日目と36日目の間のある時に実質的なB細胞回復を示した。しかしながら、10mg/kgの2H7v31で処置した回復動物では、36日目と67日目の間のある時にならないとB細胞は回復を示さなかった図11。これは、2H7v16と比較して2h7V31の場合に約一ヶ月完全な枯渇の期間が長くなることを示唆している。低又は高用量でサルの試験では毒性は観察されず、全体的な症状は正常であった。他の試験では、v16はこれらのサルで2週間あけて2用量を静脈内投与した後100mg/kgx2=1200mg/m2x2の最も高い用量まで耐容性が良好であった。2H7v16対リツキサンのカニクイザルにおけるデータは、CDC活性の5倍の減少が作用強度には悪影響を及ぼさないことを示唆している。強力なADCC活性を持つが減少したCDC活性の抗体は、大なるCDC活性を持つものよりも最初の注入反応に対して好ましい安全性状を有しうる。実施例11亢進したエフェクター機能を持つフコース欠損2H7変異体抗体正常なCHO及びHEK293細胞はIgGオリゴ糖に高度に97-98フコースを添加する。血清からのIgGがまた高度にフコシル化される。フコシル化適格性であるジヒドロ葉酸レダクターゼマイナスDHFR-CHO細胞株のDP12と、タンパク質フコシル化に欠損がある細胞株のLec13を用いてこの試験の抗体を産生した。CHO細胞株ProLec136aLec13を、イェシーバ大学のアルバートアインシュタイン医科カレッジのパメラスタンレー教授から取得した。親株はPro-プロリン栄養要求株及びGat-グリシン、アデノシン、チミジン栄養要求株である。CHODP12細胞株はCHOK1細胞株ATCC番号CCL61の誘導体であり、これはジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損であり、インスリンに対する要求は低い。細胞株は、Superfect法を使用してcDNAを形質移入した。形質移入した抗体を発現するLec13細胞の選択は、10の不活化FBS、10mMのHEPES、及び1Xのペニシリン/ストレプトマイシンを補填したLグルタミン、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含むMEMアルファ培地を含む成長培地中10μg/mlで、ピューロマイシン二塩酸塩を使用して実施した。CHO細胞を同様に、5のFBS、10mMのHEPES、2mMのLグルタミン、1XのGHTグリシン、ヒポキサンチン、チミジン、及び1Xのペニシリン/ストレプトマイシンを補填したNaHCO3を伴いグリシンを伴わない低グルコースDMEMを含むGHTなしのハムF12を含む成長培地で選択された。コロニーは2ないし3週間以内に形成され、増殖とタンパク質発現のためにプールした。細胞プールを、小バッチタンパク質発現のために3x106細胞/10cmプレートで最初に播種した。細胞は、それらが90-95の集密度まで成長したところで無血清培地に転換し、3-5日後に細胞の上清を収集し、FcIgG及び無傷IgGELISAで試験してタンパク質の発現レベルを推定した。10mg/Lの組換えヒトインスリン及び1mg/Lの微量元素を補填したPS24生産培地への転換の一日前に約8x106細胞/15cmプレートでLec13及びCHO細胞を播種した。Lec細胞及びDP12細胞は3-5日間、無血清生産培地に残したままとした。上清を収集し、150mlのコニカルチューブで遠心分離によって透明にし、細胞及び細胞片を除去した。プロテアーゼ阻害剤のPMSFとアプロチニンSigmaStLouisMOを添加し、上清を、プロテインGクロマトグラフィーAmershamPharmaciaBiotechPiscatawayNJを使用する即座の精製の前にMWCO30フィルターAmiconBeverlyMAを用いて撹拌細胞で5倍に濃縮した。全てのタンパク質を、Centripriep30濃縮器Amiconを使用してリン酸緩衝生理食塩水PBSにバッファー交換し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。タンパク質濃度はA280を使用して定量し、アミノ酸組成分析を使用して証明した。CHO細胞を、ヒト化2H7v16,2H7v31を発現するベクターでトランスフェクトし、記載されたようにして選択した。2H7v16抗体は野生型Fc領域を保持する一方、v.31実施例5、上の表7を参照は、3のアミノ酸変化がなされたS298A、E333A、K334AFc領域を有しており、FcγRIIIaレセプターに対して高い親和性を生じるShields等J.Biol.Chem.2769:6591-66042001。トランスフェクションと選択に続いて、個々の細胞コロニーを単離し、タンパク質の発現レベルの評価をし、最も高い発現体をネトトレキセートでの選択にかけて、プラスミドコピー数を増大させ、高レベルの抗体を産生した細胞を選択した。細胞を成長させ、7日の期間、無血清培地に移した後、培地を収集し、プロテインAカラムに充填し、標準的な方法を使用して抗体を溶出させた。抗体の最終濃度を、無傷の抗体を測定するElisaを使用して定量した。全てのタンパク質を、Centripriep30濃縮器Amiconを用いてリン酸緩衝生理食塩水PBSにバッファー交換し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分析した。アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法:N結合オリゴ糖は、PapacetalGlycobiology8445454の方法を使用して組換え糖タンパク質から放出された。簡単に説明すると、96ウェルPVDF裏打ちマイクロタイタープレートMilliporeBedfordMAを、ミリポアマルチスクリーン真空マニフォールドに真空を適用することによってPDVF膜を通して吸引した100μlメタノールで条件化した。条件化PVDF膜を3X250μl水で洗浄した。全ての洗浄工程間に、ウェルを、マニフォールドに穏やかな真空をかけることによって完全に液抜きした。膜を、6M塩酸グアニジン、360mMのトリス、2mMのEDTA、pH8.6からなる還元及びカルボキシメチル化バッファーRCMで洗浄した。糖タンパク質試料50μgを個々のウェルに適用し、穏やかな真空をかけてPVDF膜を通して再び吸引し、ウェルを2X50μlのRCMバッファーで洗浄した。固定化した試料を、各ウェルに50μlの0.1MジチオスレイトールDTT溶液に添加し、37°Cで1時間マイクロタイタープレートをインキュベートすることにより還元した。DTTを真空で除去し、ウェルを4x250μl水で洗浄した。システイン残基を、1MのNaOHで新しく調製しRCMバッファーで0.1Mまで希釈した50μlの0.1Mのヨード酢酸IAAを添加してカルボキシメチル化した。カルボキシメチル化は雰囲気温度で暗室にて30分間インキュベーションを行うことによって達成した。真空をプレートにかけてIAA溶液を除去し、ウェルを4x250μlの純水で洗浄した。PVDF膜を、100μlの1PVP360ポリビニルピロリドン、分子量360000Sigma溶液を添加し、雰囲気温度で1時間インキュベーションすることによりブロックした。PVP360溶液を穏やかな真空で除去し、ウェルを4x250μlの水で洗浄した。10mMトリスアセテート、pH8.4中25μlの25単位/ml溶液のPNGaseFNewEnglandBiolabsBeverlyMA消化液を各ウェルに加え、37°Cで3時間、消化を進めた。消化後、試料を500μlのエッペンドルフチューブに移し、各試料に2.5μlLの1.5M酢酸溶液を加えた。酸性化試料を雰囲気温度で3時間インキュベートし、オリゴ糖をグリコシルアミンからヒドロキシル形態に転換した。MALDITOF質量スペクトル分析の前に、放出されたオリゴ糖を、コンパクトな反応チューブUSBiochemicalClevelandOH中に充填したスラリー化された陽イオン交換樹脂水素形態のAG50WX8樹脂BioRadHerculesCAの0.7ml床を使用して脱塩した。ポジティブモードでの試料のMALDITOF質量スペクトル分析では、脱塩オリゴ糖0.5μlアリコートを、1mlのエタノール/10mM塩化ナトリウム1:1v/v中で2mgの25ジヒドロキシ安息香酸を0.1mgの5メトキシスリサイリック酸で溶解することによって調製した0.5μlの25ジヒドロキシ安息香酸マトリックスsDHBと共に染色なしの標的に適用した。試料/マトリックス混合物を真空乾燥した。ネガティブモードでの分析のために、脱塩N結合オリゴ糖0.5μlアリコートを、1:3v/vアセトニトリル/13.3mMクエン酸アンモニウムバッファー中で調製した0.5μlの246トリヒドロキシアセトフェノンマトリックスTHAPと共に染色なしの標的に適用した。試料/マトリックス混合物を真空乾燥した後、分析前に大気水分を吸収させた。放出されたオリゴ糖をPerSeptiveBioSystemsVoyagerDE質量分析計でのMALDITOFによって分析した。質量分析計を線形構成のポジティブ又はネガティブモードの何れかで遅延型抽出を使用して20kVで操作した。データは、信号雑音比を改善するためにデータ加算モード240スキャンで1300のレーザー出力を用いて獲得した。機器を標準オリゴ糖の混合物を用いて較正し、質量をあてがう前に19点のSavitskyGolayアルゴリズムを使用して平滑化した。質量スペクトルデータの積分をCaesar7.0データ解析ソフトパッケージSciBridgeSoftwareを使用して達成した。ナチュラルキラーNK細胞抗体依存性細胞傷害アッセイ。ADCCアッセイは実施例9に記載されたようにして実施した。標識細胞WIL2Sに対するNK比は1対4であり、アッセイを4時間実施し、毒性をラクトースデヒドロゲナーゼアッセイを使用して前のようにして測定した。標的細胞を、NK細胞の添加の前に30分間、示した抗体濃度でオプソニン化した。使用したリツキサン抗体はジェネンテックSSanFranciscoCAからのものであった。図12は代表的なADCCアッセイの結果を示す。結果は、低フコシル化抗体が、フコースの完全な補体を持つ抗体よりもより効果的にNK細胞標的細胞死滅を媒介することを示している。低フコシル化抗体2H7v31が標的細胞死滅の媒介に最も効果的である。この抗体は低濃度で効果的であり、他の抗体より高い濃度で、より大なる割合の標的細胞の死滅を媒介することができる。抗体の活性は次の通りである:Lec13誘導2H7v31>Lec13誘導2H7v16>Dp12誘導2H7v31>Dp12誘導2H7v16>又は=リツキサン。タンパク質及び糖鎖改変が相加的である。Lec13産生及びCHO産生IgGから天然IgGに見出された糖鎖の比較では、ガラクトシル化の度合いに有意な差異を示しておらず、よってこの結果はフコースの存在/不存在のみに帰する可能性がある。実施例12インビボでの亢進したADCCを示すフコース欠損2H7変異体抗体この実施例は、ヒトCDFcRγIIIとヒトCD20を発現するマウスにおける、DP12中で産生された正常なフコシル化対応物と比較した場合のLec13中で産生されたv16及びv31を含むフコース欠損ヒト化2H7変異体のインビボでのADCC活性を記載する。huCD20TghuCD16TgmCD16-/-マウスの産生ヒトCD20トランスジェニックマウスをヒトCD20BACDNAInvitrogenCarlsbadCAから産生した。ヒトCD20の発現のFACS分析に基づいてマウスをスクリーニングした。ついで、HuCD20TgマウスをhuCD16TgmCD16-/-マウスと交雑させて、huCD20TghuCD16TgmCD16-/-マウスを産生した。インビトロ処置2H7変異体又はリツキサンのそれぞれを10から100mg、腹腔内注射によって、huCD20TghuCD16TgmCD16-/-マウスに投与する。等量のアイソタイプの一致した抗体を動物のネガティブコントロール群に同様に適用する。マウスリンパ球の調製全血、脾臓、リンパ節及び骨髄からのマウスリンパ球を、CurrentProtocolsinImmunologyeditedbyJohnColiganAdaKruisbeekDavidMarguliesEthanShevachandWarrenStrober1994に記載された標準的なプロトコールに従って調製する。FACS分析50万の細胞を洗浄し、5μlの染色又はコントロール抗体を含む1BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水であるFACSバッファー100μlに再懸濁させる。アイソタイプコントロールを含む全ての染色抗体は、PharMingen,SanDiego,CAから取得する。ヒトCD20の発現を、FITC結合抗ヒトIgG1二次抗体と共にリツキサンで染色することによって評価する。FACS分析を、FACScan及びCellQuestBectonDickinsonImmunocytometrySystemsSanJoseCAを使用して実施する。全てのリンパ球は前方及び側方光散乱で定義される一方、全てのBリンパ球は細胞表面上のB220の発現で定義される。B細胞枯渇及び回復は、注入後の最初の週について毎日の基準でとその後の毎週基準で脾臓、リンパ節及び骨髄において末梢B細胞カウントを分析しhCD20B細胞をFACSによって分析することによって評価する。注入された2H7変異体抗体の血清レベルをモニターする。インビボアッセイでのこの結果は、野生型フコシル化に関してグリコシル化対応物に対するフコース欠損2H7変異体の増加したADCC活性及びB細胞枯渇に対するインビトロでの知見を確認する。実施例13アポトーシス活性リツキサンを含む抗CD20抗体は二次抗体又は化学的手段によって架橋されると、インビトロでアポトーシスを誘導することが示されているByrd等Blood99103843Pederson等Blood99131419。化学的に架橋すると、マウス2H7二量体はDaudi細胞のアポトーシスを誘導した。二次抗体での架橋はマウス2H7抗体でのアポトーシスを誘導した。これらの活性は、様々な作用機序がインビボでの細胞表面CD20に結合した抗CD20抗体の架橋を生じうるので、生理学的に関連していると考えられる。RhuMAb2H7v16[ヒト化2H7v16;RhuMAbは組換えヒトモノクローナル抗体の略である]及びリツキサンを、二次架橋抗体を用いてインビトロでのアポトーシスアッセイで比較した。CD20を発現するヒトBリンパ球細胞株であるRamos細胞CRL1596,ATCC,ManassasVAを用いて、アネキシンV染色とプロピジウムヨウ素色素排除アポトーシスアッセイキットMolecularProbesSeattleWAによって測定したアポトーシスを誘導する、抗CD20モノクローナル抗体rhuMAb2H7v16及びリツキシマブ対ネガティブコントロール抗体のトラスツズマブ2ヤギ抗ヒトFcPierceBiotechnologyRockfordILと共に含む96ウェルアッセイプレートBectonDickinsonPaloAltoCAに加えた。最終IgG濃度は100、10、1.0、0.1、0.01及び0.001nMであり、F2ヤギ抗ヒトFc抗体濃度は各試料抗体濃度の2倍に設定した。各希釈物は3組用意した。37°Cで24時間インキュベーションした後、細胞をPBSで2回洗浄した後、アネキシンV及びプロピジウムヨウ素で製造者の推奨に従って染色した。Ramos細胞の染色パターンをFACscanフローサイトメーターBectonDickinsonSanJoseCAを使用してフローサイトメトリーによって分析し、データを10秒間収集した。データをCellquestProソフトウェアBectonDickinsonを使用して減らした。1アネキシンV染色、2アネキシンV及びプロピジウムヨウ素二重染色に対して陽性であったRamos細胞と、3未染色生存細胞の数をカウントし、KaleidaGraphソフトウェアSynergySoftwareReadingPAを使用してプロットした。rhuMAb2H7v16及びリツキシマブは、無関係なIgG1コントロール抗体と比較して、抗ヒトFcで架橋された場合に、Ramos細胞のアポトーシスを誘導した図13-15。rhuMAb2H7のアポトーシス活性はリツキシマブのものより僅かに低かった。10nM濃度の架橋rhuMAb2H7、リツキシマブ、及びコントロールIgG1抗体の場合に、アネキシンV染色細胞の画分はそれぞれ18.5、16.5、2.5であり、二重に標識された細胞の画分は29、38、及び16であり、10秒当たりに計数した生存細胞数は5200、3100、及び8600であった。これらのインビトロのデータは、アポトーシスがインビボでのB細胞枯渇の一つの潜在的な機構であることを裏付けている。細胞表面CD20に結合したrhuMAb2H7又はリツキシマブのインビボでの架橋は免疫エフェクター細胞の表面上のFcγRを通して生じうる。実施例14腫瘍成長のインビボでの抑制RajiヒトB細胞のリンパ腫細胞株ATCCCCL86の成長を阻害するrhuMAb2H7v16の能力をBalb/cヌード胸腺欠損マウスで評価した。Raji細胞はCD20を発現し、ヌードマウスに成長し、転移性疾患を生じると報告されている;腫瘍成長はリツキサンによって阻害されるClynes等,NatureMedicine6,443-4462000。56匹の8-10週齢のBalb/cヌードマウスを、各群が8匹のマウスからなる7群A-Gに分けた。0日目に、各マウスは側部に5x106のRajiBリンパ腫細胞の皮下注射を受けた。0日目に始まって、各マウスは100uLのネガティブコントロール液PBS;リン酸緩衝生理食塩水、リツキサン又は2H7v16の何れかを受けた。投薬量は体重に依存し、薬剤送達は尾静脈を経る静脈内であった。A群のマウスはPBSを受けた。B-D群はリツキサンを、それぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kgで受けた。E-G群のマウスは2H7v16をそれぞれ5.0mg/kg、0.5mg/kg、及び0.05mg/kgで受けた。注射は6週間の間、毎週繰り返した。処置の間、毎週の間隔で、各マウスにつき、注射部位での明白な腫瘍の存在を検査し、存在した場合には腫瘍体積を測定し記録した。最終検査は8週目に行った処置なしの2週の間隔後。この試験の結果は、rhuMAb2H7v16とリツキサンの両方がヌードマウスにおいて皮下Raji細胞腫瘍成長の阻害に効果的であったことを示している図16-18。腫瘍成長は4週目に始まりPBSコントロール群で観察された。しかしながら、8週の試験の間、5mg/kg又は0.5mg/kgのリツキサン又は2H7v16で処置した群には腫瘍は観察されなかった。0.05mg/kgの低用量処置群では、2H7群の一匹の動物に、リツキサン群の一匹の動物に腫瘍が観察された図18。実施例15カニクイザルCD20のクローニングと抗体結合カニクイザルMacacafascicularisのCD20DNA配列を、カニクイザル脾臓cDNAライブラリーからCD20をコードするcDNAの単離の際に決定した。cDNA合成及びプラスミドクローニングのSUPERSCRIPTMプラスミド系カタログ番号18248013,InvitrogenCarlsbadCAを僅かに変更して用いてライブラリーを構築した。cDNAライブラリーを制限部位XhoI-及びNotIを使用してpRK5Eベクター中にライゲーションさせた。mRNAは脾臓組織CaliforniaRegionalResearchPrimateCenterDavisCAから単離された。CD20をコードするcDNAを増幅するプライマーはヒトCD20の非コード化配列に基づいて設計した。N末端領域プライマー5AGTTTTGAGAGCAAAATG3及びC末端領域プライマー5AAGCTATGAACACTAATG3を用い、ポリメラーゼ連鎖反応PCRによってカニクイザルCD20をコードするcDNAをクローニングした。PCR反応はPlatinumTaqDNAポリメラーゼ高フィデリティを使用して製造者の推奨に従ってGibcoRockvilleMD実施した。PCR産物をpCR21TOPOベクターInvitrogenにサブクローニングし、XL1ブルー大腸菌StratageneLaJollaCA中に形質転換した。結合したPCR産物を含むプラスミドDNAを個々のクローンから単離し、配列決定した。カニクイザルCD20のアミノ酸配列は図19に示す。図20はカニクイザル及びヒトCD20の比較を示す。カニクイザルCD20はヒトCD20と97.3類似で、8の差がある。細胞外ドメインはV157Aに一つの変化を含む一方、残りの7残基は細胞質又は膜貫通領域に見出すことができる。ヒトCD20に対する抗体について、CD20を発現するカニクイザル細胞に結合しFITC結合マウス2H7の結合を置換する能力をアッセイした。20ミリリットルの血液を2匹のカニクイザルから抜き取ってヘパリンナトリウム中に入れジェネンテックインクに直接送った。同じ日に、血液試料をプールし、40mlのリン酸緩衝生理食塩水を加えて1:1で希釈した。20mlの希釈した血液を50mlのコニカルチューブ中で4x20mlのFicollPaqueTMPlus上に層状に加え、Sorval7遠心分離器で30分間室温にて1300rpmで遠心分離した。PBMC層を単離し、PBSで洗浄した。赤血球を0.2NaCl溶液に溶解させ、等価容積の1.6のNaCl溶液で等張に回復させ、1000RPMで10分間、遠心分離した。PBMCペレットを、5仔ウシ血清FBSを含むRPMI1640に再懸濁させ、37°Cで1時間、10cmの組織培養皿に分配した。非付着性B及びT細胞集団を吸引により取り除き、遠心分離し、計数した。全体で2.4x107細胞が回収された。再懸濁させたPBMCを20の12x75mm培養チューブ中に分配した。各チューブは0.25mlの容積中に1x106細胞を含む。チューブを4組の5本のチューブに分けた。各組に、培地RPMI1640、5FBS、滴定量のコントロールヒトIgG1抗体、リツキサン、2H7v16、又は2H7v31の何れかを加えた。各抗体の最終濃度は30、10、3.3及び1.1nMであった。また、各チューブには20ulのフルオレッセインイソチオシアネートFITC結合抗ヒトCD20を入れた。細胞を穏やかに混合し、氷上で1時間インキュベートした後、非標識PBSで2回洗浄した。細胞表面染色をEpicXLMCLで分析し、得られた幾何学的平均値を、抗体濃度に対してプロットした。図21のデータは、2H7v16と2H7v31がカニクイザル細胞へのFITCマウス2H7の結合を競合的に排除したことを示している。更に、リツキサンもまたFITCマウス2H7の結合を排除し、よって、2H7とリツキサンの双方がCD20上の重複するエピトープに結合することを裏付けている。また、データは、2H7v16、2H7v.31及びリツキサンに対するIC50値が同様で、4-6nMの範囲に入ることを示している。実施例16中程度から重症の関節リウマチにおけるrhuMAb2H72H7v16のI/II相治験プロトコール概要安定した用量の併用メトトレキセートを受ける中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるPRO70769rhuMAb2H7の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式I/II相治験。目的この試験の主要な目的は中程度ないし重症の関節リウマチの患者におけるPRO70769rhuMAb2H7の増大静脈内IV用量の安全性と耐容性を評価することにある。研究計画これは、中程度ないし重症のRAの患者におけるMTXと組み合わせてのPRO70769の増大用量の安全性に関する無作為プラシーボ対照、多施設、盲式I/II期の研究者及び患者盲式治験である。治験は、用量増大相と多数の患者の登録を伴う第二相からなる。スポンサーは治療の指定には加わらなかった。現在はMTXでの治療には満足できない臨床応答を示す生物又は1ないし5の疾患改変抗リウマチ剤に失敗した中程度から重症のRAの患者が登録される。患者は試験への参加の前に少なくとも12週の間、毎週10-25mgの範囲でMTXを受け、試験薬PRO70769又はプラシーボの最初の用量を受ける前に少なくとも4週の間、安定した投薬を受けていることが必要である。患者はまた安定用量の経口コルチコステロイド毎日10mgまで又はプレドニゾン等価物と安定用量の非ステロイド系抗炎症薬NSAIDを受ける。患者は次の用量増大計画に従って図22を参照1日目と15日目に示された用量でPRO70769又はプラシーボ等価物の2回の静脈内注入を受ける。用量増大は、特定の基準に従って用量増大規則を参照、かつ内部の安全性データ審査委員会による安全性データの審査と各コホートで治療された最後の患者への第二の注入の72時間後の急性毒性の評価の後になされる。用量レベルが用量増大相の間、耐容性があると証明された場合には、用量増大相後に、40名の更なる患者32名は活性及び8名はプラシーボを、次の用量レベル:2x50mg、2x200mg、2x500mg、及び2x1000mgのそれぞれに無作為化する。およそ205名の患者を試験に登録する。B細胞のカウント数を得て、記録する試験評価のため、セクション4.5及びアペンディックスA1を参照。6ヶ月の効果評価を越えて48週の追跡試験期間にフローサイトメトリーを使用して、細胞カウント数を評価する。B細胞枯渇は用量制限毒性DLCとは考えられず、むしろPRO70769処置の期待される薬物動態学的結果である。任意のサブ試験において、血清及びRNA分析のための血液並びに尿試料を様々な時点で患者から得たセクション3.3.3を参照。これらの試料を用いて、中程度から重症のRAの患者におけるPRO70769治療への応答の予測となりうる生物マーカーを同定することができる。結果判定この研究の主要な結果判定法は中程度から重症のRAの患者におけるPRO70769の安全性と耐容性である。研究治療患者のコホートは次の増大計画に従って1日目と15日目に示した用量でPRO70769又はプラシーボの2回の静脈点滴を受ける。-10mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:4患者活性薬、1コントロール-50mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール-200mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール-500mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール-1000mgのPRO70769又はプラシーボ等価物:8患者活性薬、2コントロール効果PRO70769の効果をACR応答によって測定する。ACR20、ACR50及びACR70の応答を達成する患者の割合は治療群によって総括され、95の信頼区間が各群に対して生じる。これらの応答の成分とベースラインからのその変化は治療と往診によって総括される。結論上のデータは、その生物学的性質を維持し、亢進さえするヒト化CD20結合抗体、特にヒト化2H7抗体変異体を産生することに成功したことを証明している。本発明のヒト化2H7抗体はマウスドナー及びキメラ2H7抗体と同様の親和性でCD20に結合し、霊長類におけるB細胞死滅に効果的であり、B細胞枯渇を生じる。ある種の変異体は、NHLを治療するために現在使用されているキメラ抗CD20抗体よりも亢進されたADCCを示し、患者におけるより低用量の治療抗体の使用を支持する。また、マウスFR残基を持つキメラ抗体はそれに対する抗体応答を取り除くには完全なB細胞枯渇を達成するのに効果的な用量で投与されることが必要である場合があるところ、本ヒト化抗体は、特定の疾患及び患者に望ましいように、部分的な又は完全なB細胞枯渇を達成する用量で、異なった時間の間、投与することができる。また、これらの抗体は溶液中で安定性を示した。ヒト化2H7抗体のこれらの性質は、CD20陽性癌及び自己免疫疾患の治療における免疫療法剤としての使用にそれを理想的なものにする;これらの抗体は免疫原性であるとは予想されないし又はヒト患者において完全なマウス又はキメラ抗CD20抗体よりも免疫原性が少なくとも少ないであろう。文献特許、公開出願及び他の刊行物を含む本願において引用した文献は出典明示によりここに取り込む。本発明の実施には、特に示さない限り、当業者の技量内にある分子生物学の一般的技法等を用いる。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、MolecularCloningALaboratoryManualCurrentProtocolsinMolecularBiologyEssentialMolecularBiologyGeneExpressionTechnologyMethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGenesGeneTransferandExpressionRecombinantDNAMethodologyIIPCRAPracticalApproachOligonucleotideSynthesisCellCultureforBiochemistsGeneTransferVectorsforMammalianCellsMammalianCellBiotechnologyAnimalCellCultureCultureofAnimalCells2版FlowCytometryandSortingシリーズMethodsinEnzymologyWirthM及びHauserHImmunochemistryinPractice3rdeditionAJohnstoneRThorpeBlackwellScienceCambridgeMA1996TechniquesinImmunocytochemistryHandbookofExperimentalImmunologyCurrentProtocolsinImmunologyImmunoassayGodingMonoclonalAntibodiesPrinciplesandPracticeAcademicPressNewYorkEdHarlow及びDavidLaneAntibodiesAlaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNewYork1988AntibodyEngineering2版及びシリーズAnnualReviewofImmunologyシリーズAdvancesinImmunologyを参照のこと。"