"インフルエンザウイルスをベースとするワクチンの製造方法であって、aインフルエンザウイルスを永久ヒト羊膜細胞と接触させる工程、b前記永久ヒト羊膜細胞を培養する工程、c前記インフルエンザウイルスの発現を可能にする工程、及びd前記インフルエンザウイルスを前記培地から単離する工程、を含むことを特徴とする方法。インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法であって、aインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子を永久ヒト羊膜細胞と接触させる工程、b前記永久ヒト羊膜細胞を培養する工程、cインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子の複製、及び/又は前記インフルエンザウイルスタンパク質の発現を可能にする工程、及びd前記インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子及び/又は前記インフルエンザウイルスタンパク質を前記培地から単離する工程、を含むことを特徴とする方法。前記永久ヒト羊膜細胞が、前記インフルエンザウイルス又は前記インフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触する時点で、指数関数的増殖期及び静止増殖期にあるか、又はそれらの間にある、請求項1又は2に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。前記工程dの前記インフルエンザウイルスを前記培地から単離する工程が、密度勾配-分画遠心分離又はゾーン遠心分離で行われる、請求項1に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。前記工程dの前記インフルエンザウイルスタンパク質を前記培地から単離する工程が、電気泳動法又はクロマトグラフィー法を用いて行われる、請求項2に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。前記永久ヒト羊膜細胞が、前記アデノウイルス遺伝子産物E1A及びE1Bを発現する、請求項1~5のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。前記アデノウイルス遺伝子産物E1A及びE1Bが、前記ヒトアデノウイルス血清型5のヌクレオチド1~4344、505~3522又はヌクレオチド505~4079を含む、請求項4に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。前記永久ヒト羊膜細胞が、前記アデノウイルス遺伝子産物pIXを発現する、請求項1~7のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触させる前に、完全培地交換又は培地による1:2希釈を行う、請求項1~8のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。インフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子と接触させるとき、1×104U/細胞、1×105U/細胞、3×105U/細胞、5×105U/細胞又は1×106U/細胞のトリプシン濃度を添加する、請求項1~9のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。インフルエンザウイルスと接触させるとき、0.001~0.3の範囲のMOI値として記載されるウイルス量を使用する、請求項1~10のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法。インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト羊膜細胞の使用。前記永久ヒト羊膜細胞が前記アデノウイルス遺伝子産物E1A及びE1Bを発現する、請求項5に記載の使用。前記永久ヒト羊膜細胞が前記アデノウイルス遺伝子産物pIXを発現する、請求項5又は6に記載の使用。前記アデノウイルス遺伝子産物E1A及びE1Bが前記ヒトアデノウイルス血清型5のヌクレオチド1~4344、505~3522又はヌクレオチド505~4079を含む、請求項6に記載の使用。従って、本発明の課題は、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための、改善された永久ヒト細胞株を調製することである。この課題は、特許請求の範囲に記載される対象によって解決される。図は本発明を説明する。本明細書で使用するインフルエンザウイルスという用語は、ヒト及び動物に感染し得るオルソミクソウイルスOrthmyxovirenに属するものと理解される。ここで、A型、B型及びC型のインフルエンザウイルスは区別される。A型とB型のインフルエンザウイルスは1種類にまとめられている。C型インフルエンザウイルスは、7つのゲノムセグメントにより区別され、A型及びB型のインフルエンザウイルスには8つのゲノムセグメントがある。さらに、A型及びB型のインフルエンザウイルスは、それぞれヘマグルチニンHAとノイラミニダーゼNAをコードし、それに対してC型インフルエンザウイルスは、両方の特性を併せ持つ表面タンパク質であるヘマグルチニンエステラーゼ融合タンパク質HEFをコードする。A型インフルエンザウイルスは、さらに、ヘマグルチニンH1-H15分子とノイラミニダーゼN1-N9分子の配列に基づき亜型に細別される。本明細書で使用するインフルエンザウイルスタンパク質という用語は、インフルエンザウイルスのタンパク質又は誘導体と理解される。インフルエンザウイルスの誘導体は、通常、免疫化の目的で使用することができるインフルエンザウイルスのタンパク質又はその一部である。インフルエンザウイルスのタンパク質又は誘導体は、ウイルスエンベロープのタンパク質又はその一部を含む。特に、インフルエンザウイルスタンパク質は、A型インフルエンザタンパク質、B型インフルエンザタンパク質又はC型インフルエンザタンパク質、例えば、ヘマグルチニンHA、ノイラミニダーゼNA、核タンパク質NP、基質タンパク質M1及びM2、ポリメラーゼタンパク質PB1、PB2及びPA、ならびに非構造タンパク質NS1及びNS2、ならびにその一部を含む。インフルエンザウイルスタンパク質の一部は、A型インフルエンザタンパク質、B型インフルエンザタンパク質又はC型インフルエンザタンパク質の1種類以上のエピトープを含む。エピトープは、MHCクラスIIのクラスの結合モチーフを含み、MHCクラスIIの分子により抗原提示細胞の表面に発現されるペプチドであるCD4T細胞エピトープであってもよく、又はMHCクラスIのクラスの結合モチーフを含み、MHCクラスIの分子により抗原提示細胞の表面に発現されるペプチドであるCD8T細胞エピトープであってもよい。例えば、アルゴリズムモデル、MHC結合試験、インシリコ抗原同定法及びX線結晶構造解析法により、様々なMHC分子に結合できる抗原の同定が可能となる。本明細書で使用するワクチンという用語は、タンパク質、タンパク質サブユニット、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、死滅又は弱毒化させたウイルスこれはウイルス粒子全体又はウイルス粒子の一部であってもよい又はこれらの組み合わせを含む、生物学的又は遺伝子工学的に製造される抗原と理解される。抗原は、少なくとも1種類のエピトープ、例えば、T細胞エピトープ及び/又はB細胞エピトープを提示することができる。これらの抗原は、T細胞受容体又はB細胞受容体などの免疫学的受容体によって認識される。ワクチンは、投与後、特定のウイルスに関する免疫系を特異的に活性化する役割を果たす。ここで、免疫反応を惹起するウイルス又はその特異的抗原が存在する場合、免疫系の反応が利用される。これは、各疾患に対して長期間持続する防御を提供することができる抗体及び特殊なヘルパーT細胞の形成につながり、その防御はウイルスに応じて数年~生涯にわたり持続することができる。ワクチンには、生菌ワクチン又は死菌ワクチンが含まれる。生菌ワクチンは、例えば、疾患を引き起こすおそれがない、弱毒化された、まだ増殖能力のあるウイルスを含有する。それに対し、死菌ワクチンの場合、これらのウイルスは死滅されたか、又はそれはウイルス抗原の断片だけを含有する。ウイルスの不活化死滅は、例えば、化学物質、例えば、ホルムアルデヒド、β-プロピオラクトン及びソラレンにより行われる。その場合、ウイルスエンベロープは保持される。ウイルスの毒素の生物学的に不活性な成分トキソイドだけを含有するトキソイドワクチン例えば、破傷風-トキソイドもあり、これも同様に死菌ワクチンに挙げられる。特に、死菌ワクチンは、ウイルスエンベロープタンパク質の断片からなるスプリットワクチンであってもよい。ウイルスエンベロープの破壊又は分解は、例えば、界面活性剤又は強有機溶媒で行うことができる。ウイルスはさらに化学物質で不活化又は死滅させることもできる。さらに、死菌ワクチンには、ウイルスの特異的成分、例えば、ヘマグルチニンタンパク質及びノイラミニダーゼタンパク質からなるサブユニットワクチンも挙げられる。本明細書で使用されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンという用語は、インフルエンザに対する免疫化の目的で使用することができる、インフルエンザウイルスの全タンパク質、ペプチド又はその一部、及びこれらのタンパク質、ペプチド又はその一部をコードする核酸、及びインフルエンザウイルス粒子自体、組換えインフルエンザウイルスタンパク質インフルエンザエンベロープタンパク質を含む、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子VLP、VLP複合体、及び/又はその一部と理解される。本明細書で使用されるアジュバントという用語は、抗原の免疫原性を調整できる物質と理解される。アジュバントには、例えば、無機塩類、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム属Mycobakterien細胞壁調製物、特定のエマルション、モノホスホリル脂質A、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、クイルAQuilA、コレラ毒素Bのサブユニット、ポリホスファゼン及びその誘導体、免疫賦活複合体、サイトカインアジュバント、M59アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、特定の細菌外毒素、特定のオリゴヌクレオチド及びPLGがある。本明細書で使用される羊膜細胞という用語は、羊水中に存在し、羊水穿刺により得ることができる全ての細胞と理解される。それらは、羊膜又は羊水と接触している胎児組織に由来する。形態学的判断基準に基づいて区別される3種類の主要な羊膜細胞、即ち、線維芽細胞様細胞F細胞、類上皮細胞E細胞及び羊水細胞AmnioticFluidCells、AF細胞が記載されたHohnetal.,Pediat.Res.8:746-754,1974。AF細胞は優勢な種類の細胞である。本明細書で使用される永久細胞株という用語は、好適な培養条件で、細胞培養物中で永久的に増殖し続けることができるように遺伝子操作されている細胞と理解される。このような細胞は、不死化細胞とも称される。本明細書で使用される初代細胞という用語は、生物又は組織から直接採取することにより得られ、培養に供された細胞と理解される。初代細胞は、非常に限られた寿命しか有していない。本明細書で使用されるトランスフェクションという用語は、前述の1種類以上の核酸を細胞内に導入するのに適したあらゆる方法と理解される。例として、従来のリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、あらゆる種類のリポソーム系、及びこれらの方法の組み合わせを挙げることができる。本明細書で使用されるCAPという用語は、初代ヒト羊膜細胞をアデノウイルス遺伝子機能E1A及びE1Bで不死化することにより作製された永久ヒト羊膜細胞株と理解される。本明細書で使用されるCAP-Tという用語は、さらにSV40ラージT抗原の配列を含有する核酸分子が安定にトランスフェクションされたCAP細胞と理解される。本発明の対象は、以下の工程:iインフルエンザウイルスを永久ヒト細胞と接触させる工程、ii永久ヒト細胞を培養する工程、iiiインフルエンザウイルスの発現を可能にする工程、及びivインフルエンザウイルスを培地から単離する工程、を含む、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法に関する。本発明の方法では、細胞の増殖に適した条件で永久ヒト細胞を培養する例えば、温度、培地、pH値。例えば、温度、培地、pH値及び他の増殖パラメータに関する条件は当業者に周知であるか、又は通常の方法で決定することができる。培養物が所望の増殖密度に達した場合、細胞に感染させるためにインフルエンザウイルスを添加する。ウイルスは、細胞内で増殖するのに数日要する。この複製過程中に細胞の大部分は死滅し、ウイルスが培地中に放出される。ウイルス含有溶液は、例えば、遠心分離により、細胞残部から分離される。次いで、ウイルスを培地溶液から、例えば、クロマトグラフィーカラムで分離し、容積を減少させることができる。続いて、ウイルスを、例えば、化学プロセスにより不活化することができる。その後、ウイルスの分解を引き続き行うことができる。さらに精製及び濃縮工程を行った後、ウイルス株の抗原濃縮物が得られる。好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、インフルエンザウイルス株A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、ブタインフルエンザA/ブタH1N2Bakum/1832/00又はウマインフルエンザA/ウマ、A/Newmarket/1/93H3N8を使用する。他の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために使用されるインフルエンザウイルスを予め細胞に馴化させ、好ましくは、これは前述のインフルエンザウイルスである。好ましくは、このような馴化は4継代にわたり行われる。好ましくは、インフルエンザウイルスの馴化は、293SFMII培地又はPEM培地中で行われる。本発明の別の対象は、次の工程:iインフルエンザウイルスタンパク質をコードする核酸分子を永久ヒト細胞と接触させる工程、ii永久ヒト細胞を培養する工程、iiiインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子の複製及び/又はインフルエンザタンパク質の発現を可能にする工程、及びivインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子及び/又はインフルエンザウイルスタンパク質を培地から単離する工程、を含む、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造方法に関する。好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される永久ヒト細胞は永久ヒト羊膜細胞である。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞は、振盪フラスコ又はバイオリアクター、好ましくはSTRバイオリアクター又はWaveバイオリアクター内で培養される。永久ヒト細胞は、様々な培地中で、好ましくは293SFMII培地又はPEM培地中で培養することができる。さらに、培地にピルビン酸塩、グルタミン、グルコース及び他のアミノ酸を添加することができる。好ましくは、培地は4mM又は10mMピルビン酸塩及び他のアミノ酸を含有する。本発明の他の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞の出発細胞数は、振盪フラスコ内で培養する場合、5×105個/ml、より好ましくは8×105個/mlである。本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞培養物のpH値は、7.1~7.8の範囲、より好ましくは7.3~7.5の範囲、さらにより好ましくは7.3~7.5の範囲である。本発明の他の好ましい実施形態では、ヒト永久細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、完全培地交換又は培地による1:2希釈を行う。本発明の好ましい実施形態では、ヒト永久細胞にインフルエンザウイルスを感染させるために、1×104U/細胞、1×105U/細胞、3×105U/細胞、5×105U/細胞又は1×106U/細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に培地交換を行わない場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、1×104U/細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に培地で1:2希釈を行う場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、5×105U/細胞のトリプシン濃度を使用する。ヒト永久細胞に感染させる前に完全培地交換を行う場合、好ましくは、細胞にインフルエンザウイルスを感染させるとき、5×106U/細胞のトリプシン濃度を使用する。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、0.001~0.3の範囲のMOI感染多重度値として記載されるウイルス量を使用する。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞に感染させるために、MOI感染多重度値0.25、0.1、0.06、0.025又は0.0025として記載されるウイルスを使用する。好ましくは、感染の前に培地交換を行うことなく永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させる場合、MOI値0.25として記載されるウイルス量を使用し、感染の前に培地交換を行うことなくヒト永久細胞にインフルエンザウイルスA/Brisbane/59/2007を感染させる場合、MOI値0.1として記載されるウイルス量を使用する。好ましくは、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させる場合、MOI値0.1又は0.25として記載されるウイルス量を使用し、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスA/Brisbane/59/2007を感染させる場合、MOI値0.06又は0.25を使用し、感染の前に培地交換を行って永久ヒト細胞にインフルエンザウイルスB/Florida/4/2006を感染させる場合、MOI値0.1、0.025又は0.0025として記載されるウイルス量を使用する。好ましい実施形態では、振盪フラスコ内で培養する場合、感染時点での細胞数は1×106~6×106個/mlの範囲内にある。好ましくは、感染時点での細胞数は2.3×106個/ml、4.5×106個/ml又は5×106個/mlである。本発明の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は4.5×106個/mlであり、感染の前に培地交換は行わない。本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は2.3×106個/mlであり、感染の前に新鮮PEM培地で1:2希釈を行う。本発明の他の好ましい実施形態では、感染時点での細胞数は5×106個/mlであり、感染の前に完全培地交換を行う。本発明の特に好ましい実施形態では、永久ヒト細胞は1リットルのバイオリアクターSTRSartorius内にて、4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有するPEM培地中で培養され、ここで出発細胞数は5×105個/mlであり、約2.1×106個/mlの細胞数にMOI値0.025として記載されるウイルス量のインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換は行わない。好ましくは、最終濃度3×105U/mlのトリプシンの存在下で感染を行う。本発明の特に好ましい実施形態では、1リットルのバイオリアクターSTRSartorius内にてPEM培地中で永久ヒト細胞を培養し、ここで出発細胞数は8×105個/mlであり、MOI値0.025として記載されるウイルス量を使用してインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換を行う。好ましくは、最終濃度3×105U/mlのトリプシンの存在下で感染を行う。本発明の他の特に好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を、1リットルのWaveバイオリアクターWaveBiotechAG内にて、4mMグルタミン、4mMピルビン酸塩及び20mMグルコースを有するPEM培地中で培養し、ここで、出発細胞数は5×105個/mlであり、感染前の細胞数は2.1×106個/mlであり、MOI値0.025として記載されるウイルス量を使用してインフルエンザウイルスを感染させ、感染の前に培地交換を行わない。好ましくは、3×105U/mlの最終濃度のトリプシンの存在下で感染を行う。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を振盪フラスコ内にて4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有するPEM培地中で培養し、ここで、1×106U/細胞のトリプシン濃度の存在下でMOI値0.025として記載されるウイルス量を使用して細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、培地交換を行う。本発明の好ましい実施形態では、永久ヒト細胞を振盪フラスコ内にて4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有するPEM培地中で培養し、ここで、1×105U/細胞のトリプシン濃度の存在下でMOI値0.025として記載されるウイルス量を使用して細胞にインフルエンザウイルスを感染させる前に、1:1培地交換を行う。インフルエンザタンパク質及びインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子を製造する場合、培養されたヒト細胞に、インフルエンザタンパク質をコードする核酸分子をトランスフェクションし、続いて、公知の方法を使用して、インフルエンザウイルスタンパク質又はインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子を単離し、精製する。他の好ましい実施形態では、本発明の方法においてウイルス粒子による感染時点で又はインフルエンザウイルスタンパク質又はその一部をコードする核酸分子をトランスフェクションする時点で、ヒト細胞は中間指数関数的増殖期及び静止増殖期にあるか、又はそれらの間にある。時間に対する細胞数をプロットする典型的な増殖曲線は、シグモイド曲線を示す。それは、いわゆる誘導期から始まり、対数期又は指数関数期、及び静止期がそれに続く。ここで、中間指数関数的増殖期は、典型的な増殖曲線の第1の変曲点に対応し、変曲点とは、曲線の形状が凹状から凸状に、又は凸状から凹状に変化する増殖曲線上の点である。静止期は、増殖曲線がプラトーに達するとき、従って細胞数が一定になるときに始まる。本発明の方法で製造される、インフルエンザタンパク質をコードする核酸は、核酸免疫化のために、又はいわゆるDNAワクチンとして使用することができる。核酸免疫化の場合、免疫原性抗原、即ち、ヒトに免疫反応を惹起する抗原が接種される。これらの免疫原性抗原はDNA又はRNAによってコードされ、発現カセット又は発現ベクターとして存在するか、又はウイルスベクターに組み込まれており、遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。DNAワクチンは、様々な投与系に、例えば、DNA又はRNAとして、直線化された又は環状のプラスミド又は発現カセットの形態で存在することができ、ここで、これらは発現に必要な要素、例えば、プロモーター、ポリアデニル化部位、複製起点などを備えている。DNAを投与する場合、これらは、たいていの場合、アジュバントを有するもしくは有していない緩衝液中に、又はナノ粒子に結合した状態で、又はアジュバント含有化合物中に、又はウイルスもしくは細菌ベクターに組み込まれた状態で、存在している。DNAワクチンは、体液性免疫も細胞媒介性免疫も惹起する。DNAワクチンの利点は、抗原が天然型で発現し、従って免疫化の向上につながることである。DNAワクチンの他の利点は、弱毒化した生菌ワクチンとは対照的に、これらには感染性がなく、再度毒性を示すおそれがないことである。粒子に結合している、DNA又はRNA、プラスミド又は直線化されたDNAフラグメントの形態のDNAワクチンの投与は、注射により又は遺伝子銃を用いて行うことができる。この場合、注射用DNAワクチンは、例えば、食塩又は緩衝食塩溶液中に存在してもよい。本発明の方法で製造される、インフルエンザタンパク質をコードする核酸、インフルエンザタンパク質及びインフルエンザウイルスは、A型及び/又はB型及び/又はC型インフルエンザウイルスに対するワクチンとして使用することができる。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、インフルエンザに対する免疫化の目的で使用することができる、インフルエンザウイルスの全タンパク質、ペプチド又はその一部、及びこれらのタンパク質、ペプチド又はその一部をコードする核酸、及びインフルエンザウイルス粒子自体、組換えインフルエンザウイルスタンパク質インフルエンザエンベロープタンパク質を含む、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子VLP、VLP複合体、及び/又はその一部を含む。好ましくは、本発明の方法で製造されるインフルエンザタンパク質は、インフルエンザウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス株A/PR/8/34、A/Uruguay/716/2007、A/Brisbane/59/2007、B/Florida/4/2006、ブタインフルエンザA/ブタH1N2Bakum/1832/00又はウマインフルエンザA/ウマ、A/Newmarket/1/93H3N8のタンパク質又は誘導体である。本発明の方法で製造される、インフルエンザウイルスタンパク質又はその一部をコードする核酸の単離及び精製は、一般的な方法で行われ、当業者に公知である。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスタンパク質の単離及び精製は、当業者に公知の方法で行われる。タンパク質の精製処理は、まず、その由来に依存する。細胞内タンパク質と細胞外タンパク質は区別される。タンパク質が細胞体内にある場合、まず、例えば、剪断力又は浸透圧溶解Osmolyseによる細胞の分解が必要である。その後、例えば、細胞膜及び細胞壁などの不溶性材料の分離を、例えば、遠心分離により行う。遠心分離は、細胞内小器官及びタンパク質の分離に標準的に使用される。分離能力に関して有効な方法は、パルス電気泳動である。さらに、他の細胞成分を分離した後、大きさの異なるタンパク質、ペプチド及びアミノ酸を分離する必要もある。タンパク質の分離は、一次元もしくは二次元ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動で行うことができる。アミノ酸及びペプチドの領域では、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーIEC又は逆相クロマトグラフィーRPCなどのクロマトグラフィー法を使用する。脂質の存在及びプロテアーセの分離又は失活の必要性は精製に悪影響を及ぼす。細胞外基質中に存在するタンパク質が細胞から抽出されてはならないが、全ての不溶性成分を分離した後、非常に希薄な状態で、通常は細胞内タンパク質より明らかに少量で存在する。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルス粒子の単離及び精製には、当業者に周知の方法が使用される。これらの方法の例としては、密度勾配-分画遠心分離又はゾーン遠心分離がある。本発明の方法に使用される永久ヒト細胞は、初代ヒト細胞の不死化により生じる。初代ヒト細胞は、生物又は生物から採取した組織から直接採取することにより得られ、培養に供される。好ましくは、細胞形質転換因子を発現させることにより永久ヒト細胞株にうまく変化させることができるこのような初代ヒト細胞は、特に、羊膜細胞、胚性網膜細胞及び神経由来の胚性細胞である。細胞形質転換因子は、SV40Genbankアクセッション番号J02400のT抗原、HPVのE6及びE7遺伝子産物例えば、HPV16、Genbankアクセッション番号K02718ならびにヒトアデノウイルスのE1A及びE1B遺伝子産物例えば、ヒトアデノウイルス血清型5、Genbankアクセッション番号X02996であってもよい。ヒトアデノウイルスのE1の発現により不死化させるために、初代細胞にE1A及びE1B遺伝子産物の両方の核酸配列をトランスフェクションする。天然に存在するHPVにより発現する場合、E6及びE7はRNA転写により発現し得る。天然に存在するアデノウイルスのE1A及びE1Bの発現についても同様のことが言える。例えば、アデノウイルスE1遺伝子機能などの細胞形質転換因子により不死化又は形質転換が起こり、従って細胞が永続的に培養可能となる。細胞形質転換因子の発現は、相同プロモーター又は転写終結要素、例えば、アデノウイルスE1A遺伝子機能発現のための天然のE1Aプロモーター及び天然のE1Aポリアデニル化部位の制御下で行うことができる。これは、トランスフェクションに利用される核酸分子が、各ウイルスゲノム、例えば、E1A、E1Bなどの前述の遺伝子機能を有するアデノウイルスゲノムのフラグメントを含有することにより達成することができる。しかし、細胞形質転換因子の発現は、非相同の、天然には使用されるコード領域と一緒に存在しないプロモーター又は転写終結要素の制御下で行うこともできる。非相同プロモーターとしては、例えば、CMVサイトメガロウイルスプロモーターMakridesHrsg.,GeneTransferandExpressioninMammalianCells,Elsevier,Amsterdam,2003中のMakrides,9-26、EF-1αプロモーターKimetal.,Gene91:217-223,1990、CAGプロモーター第1イントロンを有する、ヒトサイトメガロウイルスの最初期エンハンサーと改変ニワトリβ-アクチンプロモーターとに由来するハイブリッドプロモーターNiwaetal.,Gene108:193-199,1991、ヒト又はマウスpgkホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターAdraetal.,Gene60:65-74,1987、RSVラウス肉腫ウイルスプロモーターMakrides,9-26:MakridesHrsg.,GeneTransferandExpressioninMammalianCells,Elsevier,Amsterdam,2003又はSV40シミアンウイルス40プロモーターMakrides,9-26:MakridesHrsg.,GeneTransferandExpressioninMammalianCells,Elsevier,Amsterdam,2003を使用することができる。ポリアデニル化部位としては、例えば、SV40ラージT抗原Genbankアクセッション番号J02400又はヒトG-CSF顆粒球コロニー刺激因子遺伝子MizushimaundNagata,Nucl.AcidsRes.18:5322,1990のポリアデニル化配列を使用することができる。初代ヒト細胞に、E1A及びE1Bをコードする核酸配列を含む核酸分子をトランスフェクションすることにより細胞を不死化する。初代ヒト細胞の不死化に使用される核酸分子は、好ましくはヒトアデノウイルス、特にヒトアデノウイルス血清型5に由来する、E1A及びE1B核酸配列を含む。好ましい実施形態では、不死化に使用される核酸分子は、E1A及びE1Bをコードする核酸配列の他に、アデノウイルスpIX遺伝子機能をコードする核酸配列も含む。ウイルス構造タンパク質であるpIXポリペプチドは、様々なウイルス及び細胞プロモーター、例えば、チミジンキナーゼプロモーター及びβ-グロブリンプロモーターなどに対して転写活性化因子として作用する。組換えポリペプチドをコードする配列が前述のプロモーターの1つの制御下にある場合、さらに細胞内で発現されるpIX-ポリペプチドの転写活性化作用により、本発明の産生細胞株において組換えポリペプチドの発現率を上昇させることができる。例示的配列は、Genbankアクセッション番号X02996にある。特に、核酸分子は、ヒトアデノウイルス血清型5のヌクレオチド1~4344、505~3522又はヌクレオチド505~4079を含む。好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、アデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド505~ヌクレオチド4079を含有する。他の特に好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、アデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド505~ヌクレオチド3522を含有する。他の特に好ましい実施形態では、初代細胞、特に羊膜細胞を不死化するための核酸分子は、HEK293細胞のアデノウイルスDNAに対応するアデノウイルス血清型5ヌクレオチド配列のヌクレオチド1~ヌクレオチド4344を含有するLouisetal.,Virology233:423-429,1997。さらに、不死化されたヒト細胞は、ウイルス複製因子を発現することができる。これらの複製因子は、トランスフェクションにより導入される核酸分子の複製起点ori、originofreplicationに結合し、それによりエピソーム核酸分子の複製を開始することができる。細胞中での核酸分子、特にプラスミドDNAのエピソーム複製により、移入された核酸分子のコピー数が著しく増加し、それによりこの分子でコードされる組換えポリペプチドの発現が上昇すると共に多数の細胞分裂にわたりそれが維持される。このようなウイルス複製因子には、例えば、シミアンウイルス40SV40のT抗原があり、これは、核酸分子、例えば、プラスミドDNA上のSV40複製起点SV40ori、originofreplicationと称される配列に結合した後、その複製を開始する。エプスタイン-バールEbstein-Barrウイルスタンパク質EBNA-1エプスタイン-バールウイルス核抗原-1は、ori-Pと称される複製開始点を認識し、ori-Pを有する核酸分子の染色体外複製を触媒する。シミアンウイルス40SV40のT抗原は、複製因子として複製を活性化するだけではなく、同様に幾つかのウイルス遺伝子及び細胞遺伝子の転写に対して活性化作用も有するBrady,JohnandKhoury,George,1985,MolecularandCellularBiology,Vol.5,No.6,p.1391to1399。本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞は、特に、不死化されたヒト羊膜細胞である。好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞は、SV40のラージT抗原又はエプスタイン-バールウイルスEBV核抗原-1EBNA-1を発現する。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト羊膜細胞は、SV40のラージT抗原又はエプスタイン-バールウイルスEBV核抗原-1EBNA-1を発現する。他の特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される不死化されたヒト細胞、特に羊膜細胞は、CAGプロモーター、RSVプロモーター又はCMVプロモーターの制御下でSV40のラージT抗原を発現する。本発明の方法に使用される永久ヒト羊膜細胞は、特に特許明細書、欧州特許第1230354号明細書及び欧州特許第1948789号明細書に記載されている。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される永久ヒト羊膜細胞は、CAP又はCAP-Tである。CAP細胞の場合、初代羊膜細胞に、マウスpgkプロモーター、Ad5配列のnt.505-3522全E1領域を含有する、SV40の3’スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナル、ならびにAd5のpIX領域nt.3485-4079を含有するプラスミドをトランスフェクションした。このプラスミドは、既に欧州特許第1948789号明細書に詳細に記載されている。CAP-T細胞を製造するために、SV40由来のイントロンとポリアデニル化部位が隣接したSV40のT抗原用発現カセットを含むプラスミドをCAP細胞にトランスフェクションした。さらに、プラスミドは、CAGプロモーターCMVエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーターとからなるハイブリッドプロモーターNiwaetal.,Gene108:193-199,1991、RSVプロモーターラウス肉腫ウイルス由来のプロモーターGenbankアクセッション番号DQ075935又はCMVプロモーターヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターSEQIDNO:5を含有することができる。安定な細胞株を作製するために、プラスミドは、ユビキチンプロモーターを有するブラストサイジン発現カセットpUB/Bsd、InvitrogenV512-20を含有する。さらに、本発明は、ヒト細胞、特に羊膜細胞を懸濁液中で増殖させることができる本発明の方法も提供する。さらに、本発明の方法では、ヒト細胞、特に羊膜細胞を血清非含有培地中で培養することができる。本発明の他の対象は、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンを製造するための永久ヒト細胞、特に羊膜細胞の使用である。好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスをベースにするワクチンの製造に使用される永久ヒト羊膜細胞はCAP細胞又はCAP-T細胞である。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、インフルエンザウイルス及び/又はインフルエンザウイルスタンパク質もしくはインフルエンザタンパク質をコードする核酸分子であってもよい。ワクチンは、注射器で非経口投与することができる。この場合、皮内、皮下又は筋肉内注射は区別される。皮内注射は噴射式注射器又はランセットで行うことができる。筋肉内注射は、上腕、上腿、又は臀筋に行うことができる。さらに、ワクチンは経口投与また経鼻投与することができる。ワクチンは、例えば、ヒト及び動物に投与することができる。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、能動免疫化でも受動免疫化でも、1種類以上のインフルエンザウイルスに対する耐性を付与することができる。能動免疫化の場合、ワクチンは、投与後、特定のウイルスに関してヒト及び動物の免疫系を特異的に活性化する役割を果たす。ここで、免疫反応を惹起するウイルス又はその特異的抗原が存在する場合、免疫系の反応が利用される。これにより抗体及び特殊なヘルパーT細胞が形成され、この後、それらはウイルスに応じて数年~生涯持続し得る、各疾患に対する長期間持続する防御を提供する。本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンは、例えば、生菌ワクチン又は死菌ワクチンであってもよい。生菌ワクチンは、例えば、疾患を引き起こすおそれがない弱毒化された、まだ増殖能力のあるウイルスを含有する。それに対して、死菌ワクチンの場合、これらのウイルスは死滅されたか、又はそれはウイルス抗原の断片だけを含有する。ウイルスの不活化死滅は、例えば、化学物質/物質の組み合わせ、例えば、ホルムアルデヒド、β-プロピオラクトン及びソラレンで行う。その場合、ウイルスエンベロープは保有されている。また、ウイルスの毒素の生物学的に不活性な成分トキソイドだけを含有するトキソイドワクチン例えば、破傷風トキソイドもあり、これも同様に死菌ワクチンに挙げられる。特に、死菌ワクチンは、ウイルスエンベロープタンパク質の断片からなるスプリットワクチンであってもよい。ウイルスエンベロープの破壊分解は、例えば、界面活性剤又は強有機溶媒で行うことができる。また、ウイルスをさらに化学物質で不活化死滅させることもできる。さらに、例えば、ヘマグルチニンタンパク質及びノイラミニダーゼタンパク質などのウイルスの特異的成分からなるサブユニットワクチンも死菌ワクチンに挙げられる。受動免疫化の場合、本発明の方法で製造されるインフルエンザウイルスをベースにするワクチンを宿主例えば、哺乳動物に投与し、惹起された抗血清を得、少なくとも1種類のインフルエンザウイルスに感染しているレシピエントに投与する。さらに、ワクチンは、投与するために、安定化剤、中和剤、担体、及び保存剤などの1種類以上の添加剤と混合される。これらの物質には、とりわけ、ホルムアルデヒド、チオメルサール、リン酸アルミニウム、アセトン、及びフェノールが挙げられる。さらに、ワクチンを、ワクチンの作用を増強するための補助剤と混合することができる。これらのいわゆるアジュバントは、できるだけそれ自体薬理学的作用を有していないものとし、特に、可溶化剤、エマルション又はそれらの混合物として使用される。アジュバントは、例えば、無機塩類、スクアレン混合物、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム属Mycobakterien細胞壁調製物、特定のエマルション、モノホスホリル脂質A、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、QuilA、コレラ毒素Bのサブユニット、ポリホスファゼン及びその誘導体、免疫賦活複合体、サイトカインアジュバント、MF59アジュバント、脂質アジュバント、粘膜アジュバント、特定の細菌外毒素、特定のオリゴヌクレオチド及びPLGである。以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものと解釈すべきではない。他の記載がない限り、例えば、Sambrooketal.,1989,Molecularcloning:ALaboratoryManual2.Auflage,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYorkに記載されているような、分子生物学の標準的方法を使用した。実施例1:PEM培地又は293SFMII培地中での永久羊膜細胞株CAP-1D5の培養実験永久羊膜細胞株CAP-1D5を、100mlの血清非含有293SFMII培地Invitrogen又はPEM培地Invitrogen中、37°C、8CO2及び100rpmで培養した。対照として、永久イヌ腎臓細胞株MDCK.SUS2マディンダービーイヌ腎臓、懸濁液中での増殖に馴化Lohretal.,Vaccine,2010,2838:6256-64を100ml振盪フラスコ内にて100mlの血清非含有SMIF8培地中で使用した。時点0=培養開始点及び各24時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにpH値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した生化学的マルチパラメータ解析システムLohretal.,Vaccine,2009,2737,4975-4982;Genzeletal.,ApplMicrobiolBiotechnol.,2010,882:461-75。293SFMII培地及びPEM培地中での永久羊膜細胞株CAP-1D5の生細胞数、ならびにMDCK.SUS2細胞は、培養開始時の培養物1ml当たり約2×105個から類似の推移を示し、168時間後に1ml当たり約2×106個の生細胞数に達した。MDCK.SUS2細胞の生細胞数は192時間以降1ml当たり9×105個に減少し、増殖曲線の開始後240時間まで一定のままであった。293SFMII培地中の永久羊膜細胞株CAP-1D5の生細胞数は、216時間の時点でようやく培養物1ml当たり2×105個の開始値に減少し、それに対してPEM培地中でのCAP-1D5細胞の生細胞数は、240時間まで安定して培養物1ml当たり約2.5×106個のままであり、312時間後にようやく2×105個の生細胞数の開始値に達した。293SFMII培地及びPEM培地中でのCAP-1D5細胞の生存率、ならびにMDCK.SUS2細胞の生存率は、増殖曲線の開始時及び168時間までは、80~90の間であった。PEM培地中でのCAP-1D5細胞の生存率は、240時間まで80のままであったが、その後減少し、312時間後にはさらに10を示した。293SFMII培地中でのCAP-1D5細胞の生存率は168時間後には既に徐々に減少し、216時間後には約10を示した。MDCK.SUS2細胞の生存率は、168時間後には減少し続け、240時間後には約45に達した。MDCK.SUS2細胞の培養物のpH値は、240時間にわたり比較的安定して7.7~7.6のままであった。それに対して、293SFMII培地及びPEM培地中でのCAP-1D5細胞の培養物のpH値開始時7.4は低下し続け、240時間後293SFMII培地又は312時間PEM培地後にはpH6.4になった。ラクトース濃度は、CAP-1D5細胞の各培養物の293SFMII培地及びPEM培地中で5mM未満の初期濃度から、240時間まで30~35mMに増加した。MDCK.SUS2細胞の培養物では、ラクトース濃度はあまり著しく増加しなかったが、240時間の時点で、CAP-1D5細胞の培養物と類似の値に達した。グルコース濃度は、293SFMII培地中及びPEM培地中でのCAP-1D5細胞の培養開始時点の20~25mMから、及びMDCK.SUS2細胞の培養物中でも10mM未満に減少したが、293SFMII培地中でのCAP-1D5細胞の培養物では最も著しい減少が認められた。293SFMII培地中とPEM培地中でのCAP-1D5細胞の培養物中のアンモニウム濃度の増加は、非常に類似した推移を示した<0.5から4~5mM。これと対照的に、MDCK.SUS2細胞の培養物中のアンモニウム濃度は、明らかに、より著しく増加した7mM。グルタミン濃度の減少は、293SFMII培地中及びPEM培地中のCAP-1D5細胞の培養物中で非常に類似した推移を示し、PEM培地中では最も著しい減少が認められた。MDCK.SUS2細胞の培養物は最も高いグルタミン酸濃度を有し、これは僅かしか上昇しなかった。グルタミン酸濃度は、PEM培地中でのCAP-1D5細胞の培養物中における培養の開始時には293SFMII培地中のものとは対照的に比較的高く、且つ上昇し続けた。MDCK.SUS2細胞の培養物中のピルビン酸塩濃度は、144時間以降、ゼロに減少した。それに対して、PEM培地又は293SFMII培地中のCAP-1D5細胞の培養物では、ピルビン酸塩は48時間後には既に消費した。従って、CAP-1D5細胞は、PEM培地中では293SFMII培地中よりも良好な増殖を示す。PEM培地中のCAP-1D5細胞は、最も著しいグルコース消費及び最も著しいラクトース生成を示す。192時間以降のグルコースの限界は、PEM培地中のCAP-1D5細胞の細胞数の急激な低下を説明することができる。PEM培地又は293SFMII培地中でのCAP-1D5細胞の培養物の培養条件を最適化するために、pH値の安定化、ピルビン酸塩及びグルタミンならびにグルコースの添加が重要な可能性がある。実施例2:非馴化ウイルスによるウイルス感染非馴化ウイルスによる感染実験では、羊膜細胞株CAP-1D5を55mlの血清非含有293SFMII培地Invitrogen及びPEM培地Invitrogen中、37°C、8CO2、100rpmで振盪フラスコ内にて培養した。対照として、イヌ腎臓細胞株MDCK.SUS2マディンダービーイヌ腎臓、懸濁液に馴化を使用した。それぞれ表1に記載した細胞密度に、ウイルスB/Florida/4/2006NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl又はA/PR/8/34H1N1RKI、Robert-Koch-Institutを、培地交換を行うことなく且つ5×106U/mLのトリプシンを添加して感染させた。産生したウイルス粒子の量をヘマグルチニンの滴定HA、標準的方法によるヘマグルチネーション試験により測定したlogHA単位/100μlで表す;表1Kalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。表1には同様にその時点での培地の各pH値も記載している。永久羊膜細胞株CAP-1D5では、PEM培地中で培養したとき、ウイルスB/Florida/4/2006B/Floridaを感染させた場合も、ウイルスA/PR/8/34を感染させた場合も、ウイルス粒子の産生を検出することはできなかった。293SFM培地中におけるA/PR/8/34H1N1の最大HA値は、MDCK.SUS2中で達成される最大HA値未満である。最大HAでのpH値は、CAP-1D5では全ての感染で同等であったがpH6.6、感染したMDCK.SUS2細胞pH7.7より明らかに低かった。従って、試験した条件では、永久羊膜細胞株CAP-1D5の感染はウイルスB/Floridaでしか起こらなかった。それに対して、永久イヌ腎臓細胞株MDCK.SUS2マディンダービーイヌ腎臓の場合、ウイルスA/PR/8/34H1N1に関してのみ感染を検出することができた。以下の実験では、ウイルスをCAP-1D5細胞に予め馴化させることにより、感染の向上、従ってウイルス収量の増加を達成できるかどうかを試験することを目的とした。実施例3:振盪フラスコ内でのPEM培地及び293SFMII培地中におけるCAP-1D5細胞へのウイルス馴化インフルエンザウイルスA/PR/8/34H1N1RKI、Robert-Koch-Institut、A/Uruguay/716/2007H3N2NYMCX-175C、NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl又はB/Florida/4/2006NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControlのウイルス馴化は、4継代にわたり、振盪フラスコ内にてPEM培地及び293SFMII培地中でCAP-1D5に感染させることにより行った。各感染の前に培地交換を行った。個々の継代中のウイルス収量は、ヘマグルチニンlogHA単位/100μlの滴定により、及び50組織培養感染量アッセイTCID50、ウイルス数/mlにより定量化したGenzelandReichl,Vaccineproduction-stateoftheartandfutureneedsinupstreamprocessinginMethodsinBiotechnology:AnimalCellBiotechnology-MethodsandProtocols;Eds.R.Poertner;HUMANAPressInc.,Totowa,NewJersey,2007,457-473;Kalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34H1N1及びA/Uruguay/716/2007H3N2を感染させると、PEM培地中でも293SFMII-培地中でも、4継代後にウイルス力価が明らかに上昇した。CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスB/Florida/4/2006を感染させると、293SFMII培地中で培養した場合も、PEM培地中で培養した場合も、第2継代でウイルス力価が明らかに上昇した。また、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34H1N1又はA/Uruguay/716/2007H3N2を感染させた場合、PEM培地中でも293SFMII培地中でも、HA値の滴定は同等の増加を示した。馴化中にウイルス力価が上昇する他に、どの継代でもウイルスの複製が速くなり、最終的に明らかにウイルス力価を上昇させることができた。一般的に、293SFMII培地では、PEM培地と比較してわずかに高いウイルス力価が達成される。実施例4:CAP-1D5細胞及びMDCK.SUS2細胞に馴化インフルエンザA/PR/8/34を感染させたときのMOI感染多重度依存性ここで、馴化インフルエンザウイルスA/PR/8/34H1N1;RKI、Robert-Koch-Institutで、3つの異なるMOI感染多重度値宿主細胞当たりのウイルス粒子数0.0025、0.025及び0.25でのMOI依存性を調べた。293SFMII培地又はPEM培地中の永久羊膜細胞CAP-1D5に、及びSMIF8培地中の永久イヌ腎臓細胞MDCK.SUS2に、振盪フラスコ内にて馴化インフルエンザウイルスA/PR/8/34を異なるMOIで感染させた。さらに感染時に培地交換を行い、それによりpH=約7.5のほぼ一定のpH値にした。続いて、96時間にわたり生細胞数を、144時間にわたりウイルス粒子の量logHA単位/100μlを、ヘマグルチネーション試験のヘマグルチニン滴定により標準的方法に従って測定した。293SFM培地中でのCAP-1D5細胞の培養物及びSMIF8培地中でのMDCK.SUS2細胞の培養物中の生細胞数の推移及び形成されたウイルス粒子の量の推移は、MOI値に対する依存性を示さなかった。ウイルス力価は、両方の培養物で2.5logHA単位/100μl超に上昇した。PEM培地中のCAP-1D5細胞の培養物は、3つのMOI値全てについて、ウイルス粒子量の減少約2.0logHA単位/100μlを示した。それに対応して、PEM培地中のCAP-1D5細胞の培養物の生細胞数は、48時間にわたり1×106個/mlで一定のままとなり、その後、1×104個/ml未満に減少した。それと対照的に、293SFM培地中のCAP-1D5細胞培養物及びMDCK.SUS2細胞培養物中の生細胞数は、一様に1×106個/mlから96時間後に1×104個/ml未満に減少した。全ての培養物で、MOIが0.0025の場合は、MOI値がそれより高い場合と比較して、logHA単位の上昇が時間的に遅延することにより、ウイルス複製が少し遅延することが明らかに確認できた。実施例5:感染A/PR/8/34馴化を行った場合の1Lのスケールでの培養CAP-1D5細胞を1リットルのバイオリアクター内にて、4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有するPEM培地中、85rpm、pH=7.2、及び純酸素の酸素分圧pO240で培養した。出発細胞数は5×105個/mLであった。114時間増殖させ、細胞数2.4×106個/mlとなった後、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34馴化:PEM中、第4継代、1.78×107ウイルス/mLを感染させた。このとき培地交換は行わなかったが、80mlのPEM培地ならびにグルタミン及びピルビン酸塩を最終濃度各2mMで添加した。MOI値は0.025であり、それにトリプシンを最終濃度1×105U/mlで添加した。240時間にわたり、各24時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにpH値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した。さらに、感染時点114時間以降、logHA単位/100μl及びTCID50値を測定したGenzelandReichl,Vaccineproduction-stateoftheartandfutureneedsinupstreamprocessinginMethodsinBiotechnology:AnimalCellBiotechnology-MethodsandProtocols;Eds.R.Poertner;HUMANAPressInc.,Totowa,NewJersey,2007,457-473;Kalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。CAP-1D5細胞の生細胞数は、まずインフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させる時点まで6×105個/mlから2.4×106個/mlに増加し、感染後は、多少減少した。CAP-1D5細胞の生存率は、全時間にわたり80~90であり、240時間後にようやく70に減少した。培養物中のピルビン酸塩濃度は72時間内にゼロに減少し、インフルエンザウイルスを感染させた場合、添加したピルビン酸塩の量も同様に10時間内に消費した。グルタミン酸塩濃度は、全時間にわたり約1mMから約1.8mMに上昇した。培養物のpH値は、観察時間中、7.1~7.4で僅かに変動した。達した最大のTCID50力価は、2.4×107ウイルス/mLであり、最大HA力価は2.2logHA単位/100μlであった。この増殖実験の結果から、ピルビン酸塩の添加により、グルコースの制限が起こらず、従って生細胞数が落ち込まないことが分かる。実施例6:50mlファルコン内でのPEM培地及び293SFMII培地中におけるCAP-1D5細胞へのウイルス馴化インフルエンザウイルスA/Brisbane/59/2007H1N1様HGR;IVR-148、NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl、B/Florida/4/2006NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl、ブタインフルエンザA/ブタH1N2Bakum/1832/00;IDTBiologika及びウマインフルエンザA/ウマ2H3N8;A/Newmarket/1/93;NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControlのウイルス馴化は、50mlファルコン容器内にてPEM培地及び293SFMII培地中でCAP-1D5に4継代にわたり感染させることにより行った。各感染の前に培地交換を行った。個々の継代中のウイルス収量をヘマグルチニン滴定logHA単位/100μlにより、及び50組織培養感染量アッセイTCID50、ウイルス数/mlにより定量化したGenzelandReichl,Vaccineproduction-stateoftheartandfutureneedsinupstreamprocessinginMethodsinBiotechnology:AnimalCellBiotechnology-MethodsandProtocols;Eds.R.Poertner;HUMANAPressInc.,Totowa,NewJersey,2007,457-473;Kalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/Brisbane/59/2007及びB/Florida/4/2006を感染させると、PEM培地中でも293SFMII培地中でも4継代後にウイルス力価が明らかに上昇したが、293SFMII培地中のウイルス力価の上昇の方が著しい。また、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/Brisbane/59/2007又はB/Florida/4/2006を感染させた場合、PEM培地でも293SFMII培地でも、HA値の滴定は同等の増加を示した。CAP-1D5細胞にブタインフルエンザウイルスを感染させた場合、PEM培地でも293SFMII培地でも、HA値の滴定が増加する。馴化中にウイルス力価が上昇する他に、各継代でウイルスの複製も速くなり、最終的にウイルス力価を明らかに上昇させることができた。一般的に、293SFMII培地では、PEM培地と比較してわずかに高いウイルス力価が達成される。実施例7:出発細胞数を増加した場合の永久羊膜細胞株CAP-1D5の培養実験永久羊膜細胞株CAP-1D5を、100mlのPEM培地Invitrogen中、37°C、8CO2及び185rpmで培養した。出発細胞数は、5×105個/ml又は8×105個/mlであった。さらに、出発細胞数を増加した調製物Ansaetzにピルビン酸塩を最終濃度4mM又は10mMで、及び他のアミノ酸を添加した。時点0=培養開始点及び各24時間の時間間隔で、生細胞数、死細胞数、細胞株の生存率、ならびにpH値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度生化学的マルチパラメータ解析システムを測定したLohretal.,Vaccine,2009,2736,4975-4982;Genzeletal.,ApplMicrobiolBiotechnol.,2010,882:461-75。培養開始時点の出発細胞数を、PEM培地中の永久羊膜細胞株CAP-1D5の培養物1ml当たり約5×105個から、培養物1ml当たり8×105個に増加することにより、90時間後に培養物1ml当たり1×106個の高収量を達成した。それにより、通常の感染時点培養開始点の約96時間後~120時間後で培養物1ml当たり5~6×106個の細胞数を達成した。培養物のpH値は、通常の感染時点培養開始点の約96時間後~120時間後では、どちらかと言えば臨界域の6.6~6.8であった。好ましくは、感染時のpH値は約7.2~7.4である。実施例8:トリプシン活性の変化及び培地交換又は培地による1:2希釈の実施のウイルス力価に対する影響この実験では、ウイルス感染時の様々なトリプシン濃度の使用及び培地交換又は培地での1:2希釈がウイルス力価にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的とした。永久羊膜細胞株CAP-1D5を、各4mMのピルビン酸塩及びグルタミンを有する100mlのPEM培地Invitrogen中、37°C、8CO2及び185rpmで、振盪フラスコ内にて培養した。培養開始時点で細胞株に、CAP-1D5細胞に馴化させたA/PR/8/34インフルエンザウイルスH1N1;RKI、Robert-Koch-Institutを感染させた。培養物中の細胞数は、感染前に培地交換を行わなかった場合、感染時点で4.5×106個/ml培養物であり、又は感染前にPEM培地で1:2希釈を行った場合、2.3×106個/ml培養物であり、感染前に完全培地交換を行った場合、5×106個/mlであった。さらに、培地交換を行わず、PEM培地で1:2希釈した培養物では、1×104U/細胞、3×105U/細胞及び5×105U/細胞のトリプシン濃度を使用した。完全培地交換を行った培養物では、1×104U/細胞、1×105U/細胞、5×105U/細胞及び1×106U/細胞のトリプシン濃度を使用したか又はトリプシンを使用しなかった。培地交換を行わなかった培養物の2.30logHAに対し、新鮮PEM培地で1:2希釈するとHAの上昇が早くなり24時間ではなく約12時間になり、且つHAの最大値が2.70logHAと高くなる。完全培地交換を行うと、3.0logHAを超える高いHA値になった。培地交換を行わない培養物とPEM培地で1:2希釈を行った培養物では、logHA値は、トリプシン濃度に依存せず非常に類似した推移を示す。完全培地交換を行った培養物では、トリプシン濃度が1×105U/細胞、5×105U/細胞及び1×106U/細胞の場合、logHA値の推移は非常に類似している。トリプシンを含まない培養物では、logHA値は約2logHA単位/100μlの値にしか達せず、1×104U/細胞のトリプシンを感染に使用した培養物では、logHA値は1logHA単位/100μl未満であった。実施例9:感染の前に培地交換を行った場合と行わなかった場合の、様々な馴化インフルエンザウイルス株をPEM培地中のCAP-1D5細胞に感染させたときのMOI感染多重度依存性本実験で、MOI値、即ち、感染に使用されるウイルス粒子数と感染されるCAP-1D5細胞数の数比と、ウイルス力価培養物100μl当たりのlogHA単位で表すとの依存性を調べた。このために、永久羊膜細胞株CAP-1D5を、各4mMのピルビン酸塩及びグルタミンを有する50mlのPEM培地Invitrogen中、37°C、8CO2及び185rpmで、振盪フラスコ内にて培養した。感染の前に培養物の培地交換を行わなかった場合と、培地交換を行った場合の両方についてMOI依存性を調べた。3つの異なる馴化インフルエンザ株:A/PR/8/34RKI、Robert-Koch-Institut、A/Brisbane/59/2007IVR-148、NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControl及びB/Florida/4/2006NIBSC、TheNationalInstituteforBiologicalStandardsandControlを使用した。感染は、50mL振盪フラスコ内で、接種時の細胞濃度4.9×106個/mL培地交換を行わなかった場合及び5.0×106個/mL培地交換を行った場合で行った。感染は、培地交換を行わなかった場合、MOI値0.25又は0.10A/Brisbaneインフルエンザウイルスの場合、0.025及び0.0025で、培地交換を行った場合、MOI値0.10又は0.06A/Brisbaneインフルエンザウイルスの場合、0.025及び0.0025で行った。トリプシン活性は、培地交換を行わなかった場合、1×104U/細胞であり、培地交換を行った場合、1×106U/細胞であった。続いて、144時間にわたり、ウイルス粒子の量logHA単位/100μlを測定したKalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。培地交換を行うと、ウイルス複製の結果が比較的一様になる。培地交換を行わずにンフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させた細胞の場合と、培地交換を行ってインフルエンザウイルスA/Brisbaneを感染させた細胞の場合だけ低いMOI依存性が認められた。培地交換を行った場合の方が、明らかに、より高いlogHA値を達成できる。pH値は、培地交換を行わなかった場合、一部臨界域の6.6~6.8であり、培地交換を行った場合、7.3~7.5である。実施例10:感染A/PR/8/34馴化を行った場合の1LのスケールのSTRバイオリアクター及びWaveバイオリアクター内での継続的培養一調製物B16では、CAP-1D5細胞を1リットルのバイオリアクターSTRSartorius内にて、4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有するPEM培地中、120rpm、pH=7.2、及び純酸素の酸素分圧pO240で培養した。出発細胞数は5×105個/mLであった。72.75時間増殖させ、細胞数が2.1×106個/mlとなった後、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34馴化:PEM中、第4継代、2.01×106ウイルス/mLを感染させた。その場合、培地交換は行わなかった。MOI値は0.025であり、それにトリプシンを最終濃度3×105U/mLで添加した。別の調製物B26では、CAP-1D5細胞を1リットルのバイオリアクターSTRSartorius内にて、PEM培地中、120rpm、pH=7.4~7.2及び純酸素の酸素分圧pO240で培養した。出発細胞数は8×105個/mLであった。92時間増殖させた後、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34馴化:PEM中、第4継代、3.75×106ウイルス/mLを感染させた。予め完全培地交換を行い、pH値を7.6に調整した。MOI値は0.025であり、それにトリプシンを最終濃度3×105U/mlで添加した。第3の調製物waveでは、CAP-1D5細胞を、1リットルのWaveバイオリアクターWaveBiotechAG内にて、4mMグルタミン、4mMピルビン酸塩及び20mMグルコースを有するPEM培地中、回転数Wippfrequenz13rpm、角度7°、pH=7.3~6.9、純酸素の酸素分圧pO240及びCO2分圧7.5で培養した。出発細胞数は5×105個/mLであった。72時間増殖させた後、CAP-1D5細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34馴化:PEM中、第4継代、1.87×106個/mlを感染させた。感染前の細胞数は2.1×106個/mlであった。この場合、培地交換は行わなかった。MOI値は0.025であり、それにトリプシンを最終濃度3×105U/mLで添加した。第4の調製物では、MDCK.SUS2細胞を1リットルのバイオリアクターSTRSartorius内にてAEM培地中で培養した。出発細胞数は5×105個/mLであった。118.25時間増殖させた後、MDCK.SUS2細胞にインフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させたLohretal.,Vaccine,2010,2838:6256-64。192時間にわたり、生細胞数及び死細胞数、ならびにpH値、培地中のグルコース、ラクトース、グルタミン、アンモニウム、グルタミン酸及びピルビン酸塩の濃度を測定した。さらに、感染時点以降、logHA単位/100μl及びTCID50値を測定したGenzelandReichl,Vaccineproduction-stateoftheartandfutureneedsinupstreamprocessinginMethodsinBiotechnology:AnimalCellBiotechnology-MethodsandProtocols;Eds.R.Poertner;HUMANAPressInc.,Totowa,NewJersey,2007,457-473;Kalbfussetal.,2008;Biologicals363:145-61。CAP-1D5細胞は、3つの全ての調製物で、MDCK.SUS2細胞と比較して、速く、高密度に増殖する。CAP-1D5細胞培養物中のウイルス力価は、logHA単位/100μlの値が最大で約2.5に達する。MDCK.SUS2細胞培養物のウイルス力価は、logHA単位/100μlの最大値が約3に達する。CAP-1D5細胞培養物中のウイルス力価は、MDCK.SUS2細胞培養物中のウイルス力価と比較して、明らかに早く上昇した。実施例11:感染前に完全培地交換又は1:1培地交換を行った場合の、振盪フラスコ内におけるPEM培地又は293SFMII培地中でのウイルス収量を増加させるための培養実験振盪フラスコ内で培養されるCAP-1D5細胞培養物中でのウイルス収量を最適化するために、CAP-1D5細胞を293SFMII培地Invitrogen及びPEM培地Invitrogen中で培養し、1:1培地交換又は完全培地交換を行った。永久羊膜細胞株CAP-1D5を、4mMグルタミン及び4mMピルビン酸塩を有する50mlのPEM培地中、37°C、8CO2及び100rpmで、100ml振盪フラスコ内にて培養した。細胞に馴化インフルエンザウイルスA/PR/8/34をMOI0.025で感染させる前に、培地交換を行った。1:1培地交換を行う場合、細胞の感染時に、トリプシンを1×105U/細胞の濃度で使用する。完全培地交換を行う場合、細胞の感染時に、トリプシンを1×106U/細胞の濃度で使用する。培地交換は、PEM培地でも、293SFMII培地でも行った。感染時の細胞濃度は、5×106個/mlであった。72時間にわたり、生細胞数、生存率、pH値、及び、標準的方法に従ったヘマグルチニンの滴定によるlogHA単位/100μlを測定したLohretal.,Vaccine,2009,2736,4975-4982;Genzeletal.,ApplMicrobiolBiotechnol.,2010,882:461-75。インフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物中では、1:1培地交換を行った細胞培養物と比較して、ウイルス力価が速く増加した。さらに、インフルエンザウイルスA/PR/8/34を感染させる前に完全培地交換を行った細胞培養物のウイルス力価は、1:1培地交換を行った細胞培養物と比較して、高い最大ウイルス力価に達した。感染前に完全培地交換を行った細胞培養物の生細胞数は、24時間後に5×106個/mlから急に減少し、48時間後にはさらに約2×104個/mlとなった。PEM培地を用い、感染前に1:1培地交換を行った細胞培養物では減少が最も隠微であり、このとき72時間後の生細胞数はまだ約7×105個/mlであった。pH値は、全ての細胞培養物中で、72時間の全時間にわたり7.6~7.2であった。"