以下の:修飾した生きたウシヘルペスウイルスBHV1;修飾した生きたパラインフルエンザウイルス3型PI3;修飾した生きたウシ呼吸器多核体ウイルスBRSV;アジュバント;少なくとも1種類の抗原;および獣医学的に許容される基剤、を含む免疫原性組成物。前記抗原が不活化されている、請求項1に記載の免疫原性組成物。前記アジュバントが、サポニン;サポニン含有水中油型エマルジョン;および/またはクイルA、アンフィジェンおよびコレステロールを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。前記抗原が、ウシウイルス性下痢症ウイルス1型BVDV1、ウシウイルス性下痢症ウイルス2型BVDV2、レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリッポティフォーサ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-プラジトゥノ、レプトスピライクテロヘモルハジア、レプトスピラインターロガンスポモナ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-ボビス、カンピロバクターフィタスから成る群から選択される少なくとも1種類の抗原を含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。上記ウシウイルス性下痢症ウイルス1型BVDV1が細胞変性または非細胞変性であり;上記ウシウイルス性下痢症ウイルス2型BVDV2が細胞変性または非細胞変性である、請求項4に記載の免疫原性組成物。以下の:aウシヘルペスウイルス1型;bウシウイルス性下痢症ウイルス1型;cウシウイルス性下痢症ウイルス2型;dパラインフルエンザウイルス3型PI3;eウシ呼吸器多核体ウイルスBRSV;fカンピロバクターフィタス;またはgレプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリッポティフォーサ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-プラジトゥノ、レプトスピライクテロヘモルハジア、レプトスピラインターロガンスポモナ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-ボビス、レプトスピラブラチスラバ、ネオスポラカニナム、トリコモナスフィタス、マイコプラズマボビス、ヘモフィルスソムナス、マンハイミアヘモリティカ、およびパスツレラムルトシダから成る群から選択される抗原、の少なくとも1つに対する免疫応答を対象となる動物に誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の請求項1に記載の組成物と、獣医学的に許容される基剤を投与するステップを含む前記方法。以下の:修飾した生きたウシヘルペスウイルスBHV1;修飾した生きたパラインフルエンザウイルス3型PI3;修飾した生きたウシ呼吸器多核体ウイルスBRSV;アジュバント;少なくとも1種類の抗原;および獣医学的に許容される基剤、を含むワクチン組成物。動物におけるBHV1から成る群から選択されるウイルスによって起こる流産の予防方法であって、治療に有効な量の請求項7に記載のワクチン組成物を上記動物に投与するステップを含む前記方法。前記動物が、乳牛、子牛、未経産雌牛、去勢した雄牛、去勢していない雄牛のいずれかである、請求項8に記載の方法。BVDV1型もしくは2型、BHV1、PI3、BRSVから成る群から選択されるウイルスの感染によって起こる動物の疾患または異常の治療または予防方法であって、治療に有効な量の請求項7に記載のワクチン組成物を上記動物に投与するステップを含む前記方法。レプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリッポティフォーサ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-プラジトゥノ、レプトスピライクテロヘモルハジア、レプトスピラインターロガンスポモナ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-ボビス、レプトスピラブラチスラバ、カンピロバクターフィタス、ネオスポラカニナム、トリコモナスフィタス、マイコプラズマボビス、ヘモフィルスソムナス、マンハイミアヘモリティカ、およびパスツレラムルトシダから成る群から選択される抗原の感染によって起こる動物の疾患または異常の治療または予防方法であって、治療に有効な量の請求項7に記載のワクチン組成物を上記動物に投与するステップを含む前記方法。対象となる動物の持続的な胎仔感染の予防方法であって、有効な量の請求項7に記載のワクチン組成物を上記動物に投与するステップを含む前記方法。以下の:修飾した生きたウシヘルペスウイルスBHV1;修飾した生きたパラインフルエンザウイルス3型PI3;修飾した生きたウシ呼吸器多核体ウイルスBRSV;細胞変性BVD2;BVD1;アジュバント;ならびにレプトスピラカニコーラ、レプトスピラグリッポティフォーサ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-プラジトゥノ、レプトスピライクテロヘモルハジアと、レプトスピラインターロガンスポモナ、レプトスピラボルグペテルセニイハージョ-ボビス、レプトスピラブラチスラバ、およびカンピロバクターフィタスから成る群から選択される少なくとも1種類の抗原;そして獣医学的に許容される基剤、を含むワクチン組成物。実施例1材料と方法動物-交配に適したBVDV血清陰性すなわち血清中和[SN]力価が1:2の56頭の乳牛を複数の供給源から取得し、研究期間中、研究用隔離施設で保管した。それぞれのウシは、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。ウシが耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、レプトスピラ症、カンピロバクター症ビブリオ症、クロストリジウムの感染に対する市販のワクチンをテスト用のウシに接種した。テスト用のウシを担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチン-テスト用ワクチンは、感染性ウシ鼻気管炎IBRパラインフルエンザ3PI3呼吸器多核体ウイルスRSVに対する修飾した多価の生ワクチンを乾燥させた形態のものであり、不活化した液体BVDVワクチンとアジュバントを用いて再び水和化するファイザー社、ニューヨーク、ニューヨーク州。BVDV成分は、免疫化のための最少量のBVDV1型および2型と、減菌アジュバントを含んでいた。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価GMTを計算することによって明らかにした。再水和化後、2mlのIBRPI3BRSVBVDVワクチンを筋肉内IM注射または皮下SC注射により投与した。乾燥させたIBRPI3RSVワクチンを減菌水で再構成したものをプラセボとして利用し、IM注射によって投与した。攻撃接種challengeウイルス-非細胞変性BVDV2型野生単離体94B5359株、ワイオミング大学、ワイオミング州獣医学研究所のHanaVanCampen博士から入手を攻撃接種剤として用いた。どのようなウイルスであるかは、SNアッセイと逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RTPCRによって確認した。RTPCR分析の結果は、p125タンパク質と5非翻訳領域に関してはBVDV2型ヌクレオチド配列が陽性であり、gp53とp80タンパク質に関してはBVDV1型の保存された配列が陰性であった。攻撃接種の直前と直後に行なった2回の滴定により、攻撃接種ウイルスの効力を示すGMTが1032TCID50mlであることが明らかになった。攻撃接種のための接種材料は、鼻腔内に4mlの用量を分割して与えた1つの外鼻孔に2mlずつ。血清学的アッセイ-ウシ細胞培養物におけるウイルス一定血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。ウイルスの単離-ウシ細胞培養物の中で、乳牛の末梢血、羊水、胎仔血液、胎仔組織からBVDVを攻撃接種後PCに単離することを試みた。BVDVに対して陽性の細胞培養物を、ヤギの抗BVDVポリクローナル抗体を用いた間接的な免疫蛍光により調べた。以前に報告されている免疫組織化学的方法を利用して胎仔組織からBVDVを単離することも試みたHainesDM、ClarkEG、DuboviEJ、VetPathol、第29巻、2732ページ、1992年。乳牛からの全血を頚静脈から5~10mlのサンプルとして採取し、ヘパリンを入れた試験管に入れ、ウイルスの単離に用いる軟層細胞を調製した。局所麻酔下で左脇腹を切開して子宮から吸引することにより、3~5mlの羊水サンプルを回収した。帝王切開または自然流産の後、目、脾臓、胸腺、脳の3つの切片脳幹/中脳、大脳、小脳をそれぞれの胎仔から無菌状態で回収した。均質化した胎仔組織からの上清を用いて細胞培養物の中でウイルスを単離することを試みた。免疫組織化学的評価を行なうため、胎仔組織をパラフィン中に埋包し、抗BVDVモノクローナル抗体を含む1:800と1:600の腹水希釈物を用いてテストを2回行なった。生物測定データの分析-攻撃接種後に保護されたことを証明するため、雌親と胎仔でのBVDV2型の感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種群T2とT3とプラセボ対照群T1で比較して明らかにする必要があった。フィッシャーの正確検定を利用し、1攻撃接種直後14日間の乳牛のウイルス血症、2羊水からのBVDV単離物、3自然流産または帝王切開した胎仔組織と胎仔血からのBVDV単離物、4BVDVが陽性である胎仔組織の免疫組織化学という事象を比較した。繰り返して測定した結果に対して混合線形モデルを用いることにより、血清中和力価を分析した。分散の分析から得られる最小自乗平均を利用し、幾何平均力価GMTを計算した。そのとき、攻撃接種を行なわなかった乳牛のSNデータは除外した。確率の値としてP≦005を利用し、統計的有意さを明らかにした。胎仔の保護に関する研究-テストした56頭の乳牛をランダムに3つのテスト群に割り当てた。それは、表1に示したIMプラセボ群T1、IMワクチン接種群T2、SCワクチン接種群T3である。ワクチンまたはプラセボを0日目と21日目に乳牛に接種した。どの場合にも、0日目の接種は首の左側に行ない、21日目の接種は首の右側に行なった。1日目から14日間にわたり、乳牛に酢酸メレンゲストロールを上に載せた餌を与えた。32日目、発情期に合わせてすべての乳牛にIMプロスタグランジンを注射したルタライズ、ファルマシアアップジョン社、カラマズー、ミシガン州。BVDVが陰性であることを確認した精子を用い、発情期を示した乳牛に人工授精を行なった。100日目、すなわち妊娠後約65日のとき、乳牛の妊娠状態を直腸触診によって調べた。105日目、妊娠が確認された23頭の乳牛を各テスト群からランダムに選択し対照7頭、IMワクチン接種8頭、SCワクチン接種8頭、近くの隔離施設中西部獣医学施設、オークランド、ネブラスカ州に入れて混じり合わせた。119日目、23頭のテスト用乳牛に有毒なBVDVを鼻腔内接種した。BVDVの単離と血清学的アッセイを目的として、血液サンプルを攻撃接種の日と攻撃接種後の8つの日、すなわち119日目、121日目、123日目、125日目、127日目、129日目、133日目、140日目、147日目PC0日目、2日目、4日目、6日目、8日目、10日目、14日目、21日目、28日目に回収した。147日目攻撃接種後28日目に左脇腹を切開し、羊水をそれぞれの乳牛から抽出した。297日目、すなわち子牛誕生予定日の約7~14日前、テスト用乳牛をネブラスカ大学の獣医学生体臨床医学サービス学部に属する施設に送って帝王切開した。手術の直前に血液サンプルをそれぞれの乳牛から回収してSNアッセイを行なった。300~301日目の帝王切開後、血液サンプルをそれぞれの胎仔から回収した。次に胎仔を安楽死させ、BVDVを単離するために組織を無菌状態で回収した。自然流産が起こったいくつかのケースでは、流産が検出されたときとその2週間後に血液サンプルを雌親から採取した。対となるその血液サンプルに対して血清学的テストを行ないネブラスカ大学獣医学診断センター、リンカーン、ネブラスカ州、流産した胎仔からのBVDVの単離ファイザー中央研究所、リンカーン、ネブラスカ州と胎仔組織の組織病理学的評価サスカトゥーン獣医学生体診断、サスカトゥーン、SK、カナダを行なった。結果ワクチンを2回投与した間の期間または投与直後に好ましくない事象は観察されなかった。乳牛はすべて、接種前0日目にはBVDV1型と2型に関して血清反応が陰性であった。これは、テスト用乳牛が研究開始時にはBVDVに対して免疫学的にナイーブであることを示している。BVDV1型に関するGMT値を表2に示してある。ワクチンを2回投与した後、接種した16頭の乳牛のうちの15頭がセロコンバージョンを起こした。乳牛61T3群は、BVDV1型のSN力価が、0日目に1:2、21日目に1:19、33日目と119日目に1:2であった。BVDV2型に対するGMT値を表3に示してある。接種したすべての乳牛乳牛61も含むは、2回目の接種後にセロコンバージョンを起こした。乳牛61は、BVDV2型のSN力価が、0日目に2、21日目に1:19、33日目に1:2048、119日目に1:431であった。交配のとき32日目~41日目、接種した乳牛は乳牛61を除き、BVDV1型のSN力価が1:64~1:13777の範囲であった。接種した乳牛は、交配時にBVDV2型のSN力価が1:64~1:6889の範囲であった。ワクチン接種後のIM群T2とSC群T3でのGMT値の違いは、攻撃接種前の2回の時期にも攻撃接種後にも統計的に有意ではなかった。プラセボ群T1のすべての乳牛は、攻撃接種のとき119日目までBVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性に留まった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。プラセボのすべての乳牛は、攻撃接種に血清反応した。これは、それぞれの乳牛で生存できる攻撃接種が起こったことを示している。プラセボ群は、BVDV1型に関し、既往性応答が起こったどちらのワクチン群よりもPCGMTが有意に小さかった表2、147日目。プラセボの乳牛は、BVDV2型に関しても、どちらのワクチン群よりもPCGMTが小さかったが、差は、IM接種群T2と比べたときだけ統計的に有意であった。3つのテスト群で23頭の乳牛が妊娠していることが確認されたため、攻撃接種を行ない、羊水穿刺を行なった表1。羊水穿刺147日目と帝王切開300~301日目の間に7頭の乳牛が流産した。4頭はT2群からの乳牛であり、3頭はT3群からの乳牛である。さらに、交配した3頭の乳牛1頭はT1プラセボ群からの乳牛、2頭はT3群からの乳牛が妊娠していないことが、帝王切開のときにわかった。これら3頭の乳牛に関しては、100日目交配後65日目に直腸触診によって妊娠していることを確認した。これは、その後に検出されない流産または胎仔の再吸収が起こったことを意味する。妊娠しなかったこれら3頭の乳牛からの胎仔組織は評価に使えなかったため、これらの乳牛は研究から除外した。259日目、プラセボ群T1の乳牛67が死んだため、その胎仔を取り出してBVDVを単離した。したがって研究の終了時に、攻撃接種を受けた23頭の乳牛のうちの12頭に対して帝王切開を行なった。帝王切開により得られた12頭の胎仔と流産した7頭の胎仔に加え、死んだ乳牛からの胎仔合計20頭をBVDVの単離に関して評価した。T2群からの乳牛38は、156日目に胎仔を流産した妊娠123日目、攻撃接種後37日目。対となる血清サンプルは評価しなかったが、この乳牛38は、攻撃接種後の末梢血と羊水からのBVDVの単離に関して陰性であった。胎仔は著しく自己分解していた。胎仔の組織病理学的評価と細菌学的評価により、絨毛膜と絨毛膜下の結合組織が化膿性炎症になっていることが明らかになった。ブドウ球菌スタフィロコッカスヒクスを肺、肝臓、胸膜液から単離した。BVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。これは、胎仔が攻撃接種によって感染しなかったことを示している。T3群からの3頭の乳牛番号21、27、40は、158日目または159日目に流産した妊娠125~127日目、攻撃接種後39日目または40日目。流産を観察していなかったため、回収した胎仔がどの乳牛からのものであるかを特定できなかった。そこで未知の胎仔1、2、3と名づけた。未知の胎仔1はミイラ化しており、組織学的に典型的なネオスポラ症の病変があった。未知の胎仔2は自己分解しており、化膿して壊死した多病巣性の胎盤炎と、炎症性滲出液に混じった多数の球菌が存在していた。スタフィロコッカスヒクスを肺、腎臓、肝臓、胃の内容物、胎盤組織から単離した。未知の胎仔3は浸軟して自己分解していた。ブドウ球菌属を肺、肝臓、腎臓、胃の内容物から単離した。3頭の未知の胎仔からのすべての組織で、BVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。3頭の雌親はすべて、攻撃接種後の末梢血からのBVDVの単離に関して陰性であった。乳牛21と40は、同様に羊水からのBVDVの単離に関して陰性であったが、乳牛27は、羊水サンプルがBVDVの単離に関して陽性であった。雌親からの対となる血清サンプルは評価しなかった。T2群からの乳牛45は、160日目に胎仔を流産した妊娠128日目、攻撃接種後40日目。胎仔が広範に自己分解していることが明らかであった。ブドウ球菌属を肺、肝臓、腎臓、胃の内容物、胎盤から単離した。多病巣性の血栓症と化膿性脈管炎を伴った胎盤炎が存在していた。胸膜液に関する血清学的アッセイの結果は、IBR、ウシウイルス性下痢症BVD、レプトスピラ症に関して陰性であった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。T2群からの乳牛66は、195日目に胎仔を流産した妊娠160日目、攻撃接種後76日目。胎盤の粘膜固有層の顕著な化膿性炎症が胎仔の表面から広がっていることが観察された。胃の内容物と胎盤からの大腸菌とプロテウス属Proteusvulgarisを培養した。対となる血清サンプルと胸膜液の血清学的結果は、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。T2群からの乳牛31は、295日目に胎仔を流産した妊娠262日目、攻撃接種後176日目。組織病理学的検査により、散在性壊死化膿性胎盤炎、絨毛膜上皮の壊死、強度の好中球性炎症が起こっていることが明らかになった。炎症の病巣からのグラム陰性球杆菌を培養した。対となる血清サンプルと胸膜液の血清学的結果は、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陰性の結果が得られた。攻撃接種後にT1プラセボ群の乳牛67から採取した末梢血サンプルと羊水において、陽性のBVDV単離物が得られた。すべての胎仔組織でBVDVの単離と免疫組織化学に関して陽性の結果が得られた。この乳牛からのすべての胎仔は、BVDVの単離と免疫組織化学に関して陽性であった。帝王切開によって得られた12頭の胎仔から回収した血液サンプルに関し、BVDV1型と2型に対するSN力価を調べた。プラセボの5頭の乳牛と接種した7頭の乳牛を帝王切開して得たどの胎仔も、BVDV1型と2型に関して血清反応は陽性でなかった。攻撃接種後のウイルス単離結果を表4に示してある。T1プラセボ群の7頭の乳牛はすべて、BVDVウイルス血症になっていた。これは血清学的結果を裏付けるものであり、接種していないそれぞれの乳牛で生き延びる攻撃接種が起こったことを示している。接種したT2群とT3群の合計16頭からの血液サンプルは、攻撃接種後の8つのサンプルのそれぞれにおいて、BVDVウイルス血症に関して陰性であった。接種したT2群とT3群におけるPCウイルス血症と対照におけるPCウイルス血症の差は、統計的に有意であったP≦00001。接種した12頭のうちの2頭125からの羊水はBVDVが陽性であったのに対し、T1プラセボ群の乳牛では7頭のうちの7頭が陽性であった。これは統計的な有意差であるP≦00001。接種したT3群の乳牛27と60からの羊水サンプルは陽性であった。乳牛27からの胎仔は、ウイルスの単離と免疫組織化学的方法によるとBVDVが陰性であった。接種した14頭のうちの1頭T3群の乳牛6071からの胎仔組織は、BVDVの単離に関して陽性であった。これをT1プラセボ群からの胎仔6頭中の6頭100でBVDVが単離されたことと比較すると、統計的有意差があるP≦00001。BVDVの単離結果は、それぞれの胎仔から評価した胎仔組織に関し、すべて陽性かすべて陰性のいずれかであった。免疫組織化学の結果は、接種したT2群とT3群合わせて14頭のうちの1頭T3群の乳牛6071からの胎仔組織においてBVDVが陽性であった。T1プラセボ群からの胎仔6頭中の6頭100に由来するすべての胎仔組織が、BVDV免疫組織化学に関して陽性であった。これは、接種群と比べて有意に大きな値であるP≦00001。BVDV免疫組織化学の結果は、それぞれの胎仔から評価した胎仔組織に関し、すべて陽性かすべて陰性のいずれかであった。表5に、BVDVの単離結果が陽性であった接種した2頭の乳牛に関するウイルス単離源と攻撃接種前のSN力価を示してある。血清学的データは、接種したT3群の乳牛27と60の両方が、接種に免疫応答したことを示している。乳牛27は、攻撃接種時のBVDV2型のSN力価がT3群のGMTよりも小さかったが、差は有意でなかった。筋肉内と皮下へのワクチン接種により、接種した14頭の乳牛のうちの13頭からの胎仔組織でBVDVの単離結果が陰性になったため、胎仔のBVDV2感染に関して全体として929で効果が得られた表4。これは、BVDV1を用いた胎仔攻撃接種に対する同じワクチンでの以前のテストにおける889という保護効果接種した18頭中の16頭がBVDVの単離に関して陰性であったに匹敵していた実施例2を参照のこと。どちらの研究でも、接種していないプラセボの乳牛で100の胎仔感染が起こった。これは、接種した乳牛が激しい免疫の攻撃接種を受けたことを示している。接種した2頭の乳牛乳牛27と60の羊水から攻撃接種ウイルスを単離した表5。その結果、どちらの乳牛も、攻撃接種後8回の時期のいずれでもウイルス血症に関して陰性であったにもかかわらず、BVDVの感染に関して陽性であると考えられた。特異性と感度が大きいウイルス単離法と免疫組織化学的方法では、乳牛27の流産した胎仔でBVDVを検出することはできなかった。そのためBVDV陰性として報告する必要があった。雌親の体内でBVDV感染プロセスによってこの胎仔が流産することはあり得た。結果を確認するため、2つの方法を利用して乳牛とその胎仔における保護を評価した乳牛では、ウイルス血症と、羊水からのウイルス単離、胎仔では、免疫組織化学と、組織培養物中でのウイルスの単離。最も控えめな結果を利用し、保護率を決定した。したがって接種した乳牛での保護率は、ウイルス血症に関して陰性である100ではなく、羊水からのウイルス単離に関して陰性である乳牛の割合の8751416であるとした。BVDVによる攻撃接種を行なう免疫研究に関し、接種していない対照で胎仔の感染が100になった攻撃接種に対して接種した場合に胎仔が100保護されたケースは報告されていない。妊娠した乳牛で評価することが一般的でない修飾した生ウイルスMLVワクチンでも、1回の研究における胎仔のBVDV1感染に対する保護率は83を超えなかった。CorteseVS、GroomsDL、EllisJ他、AmJVetRes、第59巻、14091413ページ、1998年。実施例2材料と方法動物-生殖年齢になった健康でBVDV血清反応陰性すなわち血清中和[SN]力価が1:2の59頭の乳牛と未経産雌牛を複数の供給源から取得し、研究期間中、ネブラスカにある研究用施設に隔離した。それぞれのウシは、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。ウシが耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、レプトスピラ症、カンピロバクター症ビブリオ症、クロストリジウムの感染に対する市販のワクチンをテスト用のウシに接種した。テスト用のウシを担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチン-テスト用ワクチンは、感染性ウシ鼻気管炎IBRパラインフルエンザ3PI3呼吸器多核体ウイルスRSVに対する修飾した多価の生ワクチンを乾燥させた形態のものであり、不活化した液体BVDVワクチンキャトルマスター/プレグシュア5、ファイザー社、ニューヨーク、ニューヨーク州を用いて再び水和化する。このBVDV成分を減菌アジュバントと混合した。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価GMTを計算することによって明らかにした。再水和化後、2mlのIBRPI3BRSVBVDVワクチンを筋肉内IM注射または皮下SC注射により投与した。乾燥させたIBRPI3RSVワクチンを減菌水で再構成したものをプラセボとして利用した。攻撃接種ウイルス-非細胞変性BVDV1型野生単離体816317株、コーネル大学、ニューヨーク州獣医学カレッジのEJDubovi博士から入手を攻撃接種剤として用いた。どのようなウイルスであるかは、SNアッセイと逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応RTPCRによって確認した。RTPCR分析の結果は、gp53およびp80タンパク質と5非翻訳領域に関してはBVDV1型ヌクレオチド配列が陽性であり、p125タンパク質に関してはBVDV2型の配列が陰性であった。攻撃接種の直前と直後に行なった2回の滴定により、攻撃接種ウイルスの効力を示すGMTが1043TCID50mlであることが明らかになった。攻撃接種のための接種は、鼻腔内に4mlの用量を分割して与えた1つの外鼻孔に2mlずつ。血清学的アッセイ-ウシ細胞培養物におけるウイルス一定血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。ウイルスの単離-ウシ細胞培養物の中で、乳牛の末梢血、羊水、胎仔組織からBVDVを攻撃接種後に単離することを試みた。BVDVに対して陽性の細胞培養物を、ヤギの抗BVDVポリクローナル抗体を用いた間接的な免疫蛍光により調べた。以前に報告されている免疫組織化学的方法を利用して胎仔組織からBVDVを単離することも試みたHainesDM、ClarkEG、DuboviEJ、VetPathol、第29巻、27~32ページ、1992年。乳牛からの全血を頚静脈から5~10mlのサンプルとして採取し、ヘパリンを入れた試験管に入れ、ウイルスの単離に用いる軟層細胞を調製した。局所麻酔下で左脇腹を切開して子宮から吸引することにより、3~5mlの羊水サンプルを回収した。帝王切開または自然流産の後、目、脳の3つの切片、脾臓、胸腺をそれぞれの胎仔から無菌状態で回収した。均質化した胎仔組織からの上清を用いて細胞培養物の中でウイルスを単離することを試みた。免疫組織化学的評価を行なうため、胎仔組織をパラフィン中に埋包し、抗BVDVモノクローナル抗体を含む1:800と1:600の腹水希釈物を用いてテストを2回行なった。生物測定データの分析-攻撃接種後に保護されたことを証明するため、雌親と胎仔でのBVDV2型の感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種群T2とT3とプラセボ対照群T1で比較して明らかにする必要があった。フィッシャーの正確検定を利用し、乳牛のウイルス血症、羊水からのBVDV単離物、胎仔組織、胎仔組織の免疫組織化学という事象を比較した。繰り返して測定した結果に対して混合線形モデルを用いることにより、血清中和力価を分析した。分散の分析から得られる最小自乗平均を利用し、幾何平均力価GMTを計算した。そのとき、攻撃接種を行なわなかった乳牛のSNデータは除外した。確率の値としてP≦005を利用し、統計的有意さを明らかにした。胎仔の保護に関する研究-テストした59頭の乳牛をランダムに3つのテスト群に割り当てた。それは、表6に示したIMプラセボ群T1、IM接種群T2、SC接種群T3である。ワクチンまたはプラセボを0日目と21日目に乳牛に接種した。どの場合にも、0日目の接種は首の左側に行ない、21日目の接種は首の右側に行なった。32日目、発情期に合わせてすべての乳牛にプロスタグランジンを筋肉内注射したルタライズ、ファルマシアアップジョン社、カラマズー、ミシガン州。BVDVが陰性であることを確認した精子を用い、発情期を示した乳牛に人工授精を行なった。96日目、すなわち妊娠後約60日目のとき、乳牛の妊娠状態を直腸触診によって調べた。103日目、妊娠が確認された30頭の乳牛を各テスト群からランダムに選択し、近くの隔離施設中西部獣医学施設、オークランド、ネブラスカ州に入れて混じり合わせた。117日目、30頭のテスト用乳牛に有毒なBVDVを鼻腔内接種した。BVDVの単離を目的として、血液サンプルを攻撃接種の日と攻撃接種後の8つの日、すなわち119日目、121日目、123日目、125日目、127日目、131日目、138日目、145日目に回収した。145日目攻撃接種後28日目に左脇腹を切開し、羊水をそれぞれの乳牛から抽出した。295日目、すなわち子牛誕生予定日の約7~14日前、テスト用乳牛をネブラスカ大学の獣医学生体臨床医学サービス学部に属する施設に送って帝王切開した。手術の直前に血液サンプルをそれぞれの乳牛から回収してSNアッセイを行なった。298~300日目の帝王切開後、血液サンプルをそれぞれの胎仔から回収した。次に胎仔を安楽死させ、BVDVを単離するために組織を無菌状態で回収した。自然流産が起こったケースでは、流産が検出されたときとその2週間後に血液サンプルを雌親から採取した。対となるその血液サンプルに対して血清学的テストを行ないネブラスカ大学獣医学診断センター、リンカーン、ネブラスカ州、流産した胎仔からのBVDVの単離ファイザー中央研究所、リンカーン、ネブラスカ州と胎仔組織の組織病理学的評価サスカトゥーン獣医学生体診断、サスカトゥーン、SK、カナダを行なった。結果胎仔保護テストで用いた30頭の乳牛の個々のSN値は、0日目にはBVDV1型と2型に関して陰性であった。これは、テスト用乳牛が研究開始時にはBVDVに対して免疫学的にナイーブであることを示している。GMT値表7と表8は、IMワクチン接種T2群とSCワクチン接種T3群の両方で、2回接種した後に血清反応が誘導されたことを示している。T2群とT3群のすべての乳牛は、2回目のワクチンを投与した後にBVDV1型とBVDV2型に対してセロコンバージョンを起こしたSN力価≧1:8。交配のとき34日目~37日目、BVDV1型のSN力価は1:27~1:2900の範囲であり、BVDV2型のSN力価は1:609~1:13777の範囲であった。ワクチン接種後、SC群でのGMT値は、攻撃接種前のそれぞれの時期におけるIM群での値よりもわずかに大きかった。しかし差は統計的に有意ではなかった。攻撃接種後28日目145日目、BVDV1型のGMT値表7は、IM接種T2群よりもSC接種T3群のほうが有利であることに関して統計的な有意差を示した。プラセボ群T1のすべての乳牛は、攻撃接種のとき117日目までBVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性に留まった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。プラセボの乳牛は、攻撃接種に血清反応したが、145日目のBVDV1型と2型に対するGMT応答では、既往性応答が起こったどちらのワクチン群よりもPCGMTが有意に小さかった表7と表8。羊水穿刺145日目と帝王切開298~300日目の間に2頭の乳牛が流産した。1頭はT1群からの乳牛であり、もう1頭はT3群からの乳牛である。さらに、交配した4頭の乳牛2頭はT1プラセボ群からの乳牛、1頭はT2群、1頭はT3群からの乳牛が妊娠していないことが、帝王切開のときにわかった。これら4頭の乳牛に関しては、96日目交配後60日目に直腸触診によって妊娠していることを確認した。これは、その後に検出されない流産または胎仔の再吸収が起こったことを意味する。妊娠しなかったこれら4頭の乳牛からの胎仔組織は評価に使えなかったため、これらの乳牛は研究から除外した。したがって研究の終了時に、攻撃接種を受けた30頭の乳牛のうちの24頭に対して帝王切開を行なった。帝王切開により得られた胎仔と流産した胎仔の合計26頭をBVDVの単離に関して評価した表6。T1プラセボ群からの乳牛1317は、238日目に胎仔を流産した妊娠201日目、攻撃接種後121日目。胎仔の組織病理学的評価と細菌学的評価によって肺炎と絨毛膜上皮の壊死が明らかになり、胃と胎盤からコリネバクテリウム属が単離された。乳牛からの対となる血清サンプルは、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。攻撃接種後6日目、8日目、10日目に回収した乳牛の末梢血、羊水、胎仔の脳、目、胸腺に関する細胞培養物において、BVDVの単離に関して陽性の結果が得られたが、胎仔の脾臓では陰性であった。胎仔の脳、目、胸腺、脾臓は、BVDVに関して免疫組織化学的に陽性であった。この場合のウイルス単離と血清学的証拠から、BVDVに感染した胎仔は、攻撃接種の結果としてウイルス血症になった雌親が流産したことが示唆される。T3ワクチン群からの乳牛1331は、249日目に胎仔を流産した妊娠212日目、攻撃接種後132日目。組織病理学的検査により、散在性化膿性肺炎になっていることが明らかになった。胃の内容物と肺に関する培養物が腸内細菌によって厚く覆われた。乳牛からの対となる血清サンプルは、IBR、BVD、レプトスピラ症が病因であることを示していなかった。攻撃接種後に9回回収した乳牛の末梢血、羊水、胎仔の脳、目、脾臓、胸腺に関する細胞培養物からBVDVを単離する試みは、すべて陰性であった。胎仔組織に関する免疫組織化学の結果は陰性であった。しかしプールした胎仔組織は、細胞培養物でのBVDV単離に関して陽性であった。この矛盾する結果は、胎仔組織が、BVD攻撃接種ウイルスが播かれている牧場との接触によって汚染されたか、BVDVを以前に単離した検死施設における媒介物によって汚染された可能性があることを示唆している。雌親の体内に攻撃接種後のウイルス血症がなく、陽性へのセロコンバージョン状態がなく、特定の胎仔器官でBVDVの単離が陰性であると、攻撃接種の結果としてこの胎仔がBVDVに感染することはなかったという結論が支持されることになる。帝王切開によって生まれたそれぞれの胎仔から回収した血液サンプルに関し、BVDV1型と2型に対するSM力価を調べた。T1プラセボ群からの帝王切開による7頭の胎仔のどれも、BVDV1型と2型に関して血清反応は陽性でなかった。T2接種群とT3接種群からの帝王切開による17頭の胎仔のうちの5頭は、BVDV1型に対する血清反応が陽性であった。4頭の胎仔は1型に対するSM力価が1:2~1:4であり、T2群の乳牛1421からの胎仔は、1型に対するSM力価が1:181であり、2型に対するSM力価が1:512であった。攻撃接種後にウイルスを単離した結果を表9に示してある。T1プラセボ群からの10頭の乳牛のうちの9頭は、BVDVウイルス血症になった。これは、生存できる攻撃接種が起こったことを示している。T2接種群とT3接種群の20頭のうちの19頭からの血液サンプルは、攻撃接種後の8つのサンプルそれぞれにおいて、BVDVウイルス血症に関して陰性であった。T2接種群の乳牛1421は、攻撃接種後6日目の123日目にBVDVに関して陽性であり、上記のように血清反応が陽性だがウイルス単離に関しては陰性の胎仔を産んだ。T2接種群とT3接種群における攻撃接種後のBVDVウイルス血症が5というのは、対照における90と比べて有意に少なかったP≦00001。接種群の18頭のうちの2頭111、すなわちT2の乳牛1301と1335からの胎仔組織は、BVDVの単離に関して陽性であった。これをT1プラセボ群の乳牛からの胎仔8頭のうちの8頭100でBVDVが単離されたことと比べると、統計的な有意差があるP≦00001。BVDVの単離結果は、T1群の乳牛1317を除き、評価した他のすべての胎仔組織でBVDV陽性またはBVDV陰性のどちらかであった。乳牛1317に関しては、4つの胎仔組織サンプルのうちの3つで陽性であった。接種群20頭のうちの2頭100からの羊水は、BVDVに関して陽性であった。それに対してT1プラセボ群の乳牛では、10頭のうちの10頭で陽性の結果であり、統計的な有意差があるP≦00001。T2接種群の乳牛1301と1335からの羊水サンプルが陽性であった。免疫組織化学の結果は、接種群の18頭のうちの2頭111、すなわちT2の乳牛1301と1335からの胎仔組織に関してBVDV陽性であった。接種したこれら乳牛からの胎仔組織はすべて、陽性であった。これは、細胞培養法を利用して羊水と胎仔組織からウイルスを単離しようと試みたときの同じ2頭のウシに関するBVDV単離結果に対応していた。T1プラセボ群の乳牛8頭のうちの8頭からの胎仔組織はすべて陽性であり、接種群の乳牛での頻度と比べて統計的に有意に多いP≦00001。BVDVの単離結果が陽性であった接種した3頭の乳牛に関する攻撃接種前の血清状態を表10に示してある。BVDVが陽性の胎仔を産んだ乳牛1301および1335と、ウイルス血症であった乳牛1421はすべて、ワクチン接種に免疫応答した。接種した乳牛からの胎仔18頭のうちの16頭889は、接種していない対照で胎仔を100感染させた攻撃接種に対して抵抗力があった。鼻腔内攻撃接種により、感染の天然経路を真似ただけでなく、野外で曝露するときに予想されるよりもはるかに多い量で攻撃接種を行なった。攻撃接種の効力は、実験的にBVDV1型ウイルス血症と胎仔の感染を確実に実現できることが以前の研究でわかっているレベルも超えていた。ウシウイルス性下痢症ウイルスに関する国際シンポジウム、50年の回顧のプロシーディングイサカ、ニューヨーク州、1996年の110~112ページに記載されているFickenM、JeevaraerathnamS、WanWelchSKらの選択した単離物によるBVDV胎仔感染。持続感染と免疫寛容な胎仔の感染と関係するバイオタイプであるという理由で、非細胞変性攻撃接種株を用いた。最新の動物治療法4、食肉動物実践編、フィラデルフィア、ペンシルヴェニア州、WBSaunders、1999年の286~291ページに記載されているCorteseVSのウシウイルス性下痢症ウイルスと粘膜疾患。血清学的データにより、IMとSCの両方の投与経路でワクチンの抗原性が確認された。接種したすべての乳牛は、両方のタイプのBVDVに対してセロコンバージョンした。攻撃接種に対する顕著な既往性応答表7と表8により、GMT力価の値が6ヶ月後に研究を終えるときまで維持された。ウイルスの単離に関して陽性であることと関係している接種した3頭の乳牛も、接種後にセロコンバージョンした表10。血清反応陽性の乳牛1301と1355を帝王切開して生まれた子牛は、BVDVに関して陽性であった。血清反応が陽性の乳牛またはその胎仔からのウイルス単離結果は、体液性抗体が保護と関係しているものの、それが唯一の決定要因ではないことを示唆している。細胞メカニズムまたは粘膜メカニズムも関与している可能性がある。実施例31クイルAを含む25アンフィジェン/コレステロールそれぞれ250mcgmlと、2アンフィジェン/Alゲルという2つのアジュバント製剤から調製したレプトスピラハージョ/レプトスピラポモナ混合ワクチン2mlを、16頭の家畜からなる2つのグループに3週間の間隔で2回皮下接種した。このワクチンは死んだレプトスピラで構成されており、レプトスピラから培養液を除去することで遊離した内毒素が少なくなっている。体温、注射部位の反応、全体的な健康所見を、2回の注射後に記録した。全身性の悪い効果は見られず、局所反応は最小限であったため、臨床的に許容可能であると判断した。対照として、別の16頭に生理食塩水を注射した。接種してから4週間後、5×106個のレプトスピラを用いて家畜の目と膣に3日連続で攻撃接種を行なった。それぞれの処理群の半分にはハージョを用い、半分にはポモナを用いて攻撃接種を行なった。ポモナを用いた対照のうちの2頭はある理由により研究から除いたため、その群には6頭が残った。尿を毎週回収し、腎臓サンプルを剖検によって回収し、攻撃接種の8週間後に、培養物、PCR、蛍光抗体顕微鏡法FAによって評価した。レプトスピラハージョを用いた攻撃接種の後、生き延びた生物が、接種していない対照のすべて88で尿培養物および/または腎臓培養物に検出された。それに対して接種したどの動物でも、陽性の培養物は得られなかった016。レプトスピラポモナを用いた攻撃接種の後、接種していない対照の6746が尿/腎臓培養物のレベルで感染していたが、接種したどの動物でも腎臓培養物または尿培養物が陽性になることはなかった016。レプトスピラ症は汚染された尿を通じて移るため、放尿を防いだり少なくしたりする能力が、ワクチンの効力に関する有効な指標である。どちらのワクチン組成物も、尿によるレプトスピラの放散を対照と比較して統計的に有意な程度に低下させた。データは、いずれかのアジュバントを用いて調製した二価のレプトスピラハージョ/レプトスピラポモナワクチンを接種することの実質的な利点を示している。これは、ホルマリンで殺した組み合わせバクテリンを接種することにより、家畜がレプトスピラの感染から保護されることを示している。実施例4材料と方法動物-BVDVとレプトスピラに関して血清反応陰性すなわちBVDV血清中和[SN]力価が1:2であり、レプトスピラの血清型ハージョとポモナの[MAT]力価が1:20である年齢が約7ヶ月の36頭の子牛を複数の供給源から取得し、研究期間中、ネブラスカの研究用隔離施設で保管した。それぞれの子牛は、それぞれの耳に1つずつ付けたタグによって特定した。子牛が耳のタグを紛失した場合には、新しいタグを取り付けた。研究を始める前に、クロストリジウム症とウシ呼吸器疾患に対する薬をテスト用のウシに接種したBVDウイルスは除く。テスト用の子牛を担当獣医の監督下に置いた。獣医は、臨床面からウシを毎日観察した。テスト用ワクチン-テスト用ワクチンは、ホルマリンで不活化したレプトスピラハージョボビスとレプトスピラポモナの一方または両方と、不活化したBVD1型と2型のウイルスを含む液体ワクチンであった。BVDV成分は、減菌アジュバントと混合した。BVDV免疫化抗原の効力は、ワクチン調製物で使用したバルク流体について8回行なった滴定の幾何平均力価GMTを計算することによって明らかにした。レプトスピラ免疫化抗原の効力は、ハムスター致死率モデルの手続きに従って決定した。実験用テストワクチンに含まれるアジュバントは、クイルAを含む25アンフィジェン/コレステロールそれぞれ250mcgmlだけ、あるいはそれに2水酸化アルミニウムを加えたものと;クイルAを含む25アンフィジェン/ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドDDAそれぞれ100mcgmlだけ、あるいは2水酸化アルミニウムを加えたもの、のいずれかを含んでいた。実験用テストワクチンは、皮下SC注射により5mlを投与した。一価レプトスピラハージョボビスバクテリンを、製造者の指示に従って陽性の対照として用いた。生理食塩水を含むプラセボワクチンを陰性の対照として用いた。攻撃接種細菌-レプトスピラボルグペテルセニイの血清型ハージョタイプであるハージョボビス株203国立動物疾患センター、エイムズ、アイオワ州を攻撃接種剤として利用した。レプトスピラハージョボビスという攻撃接種材料は、実験的にレプトスピラハージョボビスを感染させた家畜の尿から単離した初代継代培養生物として調製した。この攻撃接種材料を1日に1回、3日連続で投与した。攻撃接種を行なう日ごとに、レプトスピラハージョボビスを1mlに約25×106個含む合計2mlの攻撃接種材料を別々の3つの解剖学的部位に投与した。攻撃接種経路は、両方の目の結膜嚢それぞれ12mlと膣1mlへの滴注にした。血清学的アッセイ-ウシ細胞培養物におけるウイルス一定血清減少アッセイにより、BVDV1型と2型に関する血清中和力価を測定した。血清の系列希釈物を、50300TCID50の細胞変性BVDV1型5960株、あるいはほぼ同量の細胞変性BVDV2型125c株と混合した。レプトスピラハージョボビスとレプトスピラポモナに関する血清顕微鏡的凝集力価MATは、設備の整った獣医学診断センターコーネル大学、獣医学カレッジ、診断研究室で標準的な方法を利用して測定した。レプトスピラの単離-尿サンプルと腎臓組織ホモジェネート左右の腎臓をプールしたものにレプトスピラが存在しているかどうかを調べた。尿と腎臓の培養物にレプトスピラが存在しているかどうかを、標準的な手続きを利用して週に1回、8週間にわたって調べた。標準的なやり方でレプトスピラ蛍光抗体FA法を設備の整った獣医学診断センターコーネル大学、獣医学カレッジ、診断研究室で実施した。生物測定データの分析-攻撃接種後に保護されたことを証明するため、レプトスピラの感染事象が統計的に有意に減少したことを、接種した群表11T02、T03、T04、T05とプラセボ対照群T1で比較して明らかにする必要があった。腎臓移植と放尿に関するデータを処理法と時期に関してまとめた。それぞれの処理につき、腎臓でレプトスピラが検出された子牛の割合を比較した。それぞれの処理につき、尿でレプトスピラが検出された子牛の割合を比較した。フィッシャーの正確検定を利用してこのような分析を行なった。一般的な線形混合モデルを利用し、レプトスピラが尿に放出される期間も比較した。確率の値としてP≦005を利用し、統計的有意さを明らかにした。レプトスピラからの保護に関する研究-表11に示したように、テストした36頭の子牛をランダムに6つのテスト群に割り当てた。0日目と21日目に、T01~T05に割り当てたそれぞれの子牛に、適切な実験用テストワクチンまたはプラセボワクチン5mlを1回皮下投与した。0日目と28日目に、T06に割り当てたそれぞれの子牛に、陽性の対照となるワクチン2mlを1回皮下投与した。57~59日目に、すべての子牛に対し、すでに概略を説明したレプトスピラハージョボビス203株を用いて攻撃接種を行なった。0日目、21日目、35日目、56日目、84日目、111日目に血液サンプルをそれぞれの子牛から回収し、BVDV1型と2型の力価を測定した。1日目、56日目、70日目、77日目、84日目、91日目、98日目、105日目に尿サンプル約45mlをそれぞれの子牛から回収し、すでに説明したようにしてレプトスピラを単離した。112日目と113日目に子牛を安楽死させ、腎臓にレプトスピラが存在しているかどうかをすでに説明したようにして調べた。結果GMT値表12から、BVDVレプトスピラ混合ワクチンを受けたすべての子牛T02、T03、T04、T05において、ワクチンを2回投与した後に血清反応が誘導されたことがわかる。T02、T03、T04、T05の群に属するすべての子牛は、2回目のワクチンを投与した後にBVDV1型に対してセロコンバージョンしたSN力価≧1:8。T02、T04、T05の群に属するすべての子牛は、2回目のワクチンを投与した後に対してBVDV2型にセロコンバージョンしたSN力価≧1:8。プラセボ群T01または一価のレプトスピラハージョボビスワクチンを受けた群のすべての子牛は、BVDV1型と2型の両方に対して血清反応が陰性のままであった。これは、この研究が偶発的な曝露によって無効にならなかったことを示している。全体として、BVDVの血清学的データは、不活化したBVDV1型および2型と、不活化したレプトスピラハージョボビスおよびレプトスピラポモナとを4通りの異なるアジュバントの中に含む混合ワクチンが、家畜のBVDV疾患に対する保護応答を誘導できることを初めて示している。というのも、ウシBVDVSN力価が≧1:8であるというのは、BVDV疾患から保護されていることを示す、ということが従来から知られているからである。尿と腎臓におけるレプトスピラの結果表13から、BVDVレプトスピラ混合ワクチンを受けたすべての子牛T02、T03、T04、T05が、テストした8つの時期のすべての尿培養物CXについて陰性であり、剖検時112日目または113日目に採取した腎臓の培養物について陰性であったことがわかる表13、8列。一価レプトスピラワクチンを受けた子牛T06、陽性の対照は、レプトスピラの感染から同様に保護された。逆に、プラセボワクチンを受けた子牛T01、陰性の対照は、尿培養物表13、2列と腎臓培養物表13、8列での結果に基づくと感染していた。これは、攻撃接種に対するワクチンの研究が有効であったことを示している。全体として、レプトスピラハージョボビス単離のデータは、不活化したBVDV1型および2型と、不活化したレプトスピラハージョボビスおよびレプトスピラポモナとを4通りの異なるアジュバントの中に含む混合ワクチンが、家畜のBVDV疾患に対する保護応答を誘導できることを初めて示している。