ガストリン17のアミノ末端の9個のアミノ酸からなるペプチドを含む免疫原を含有する、グリシン延長ガストリン17により増殖が刺激される腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬剤組成物であり、ここで該免疫原は、ガストリン17およびグリシン延長ガストリン17の両方を中和するのに十分な抗ガストリン17抗体力価を誘導する、前記薬剤組成物。免疫原が免疫原性担体を含む、請求項1記載の薬剤組成物。腫瘍細胞が胃腸癌の細胞である、請求項1または2記載の薬剤組成物。腫瘍細胞が結腸直腸腺癌の細胞である、請求項1~3のいずれかの項記載の薬剤組成物。本実験は、本発明の免疫原がアミド化G17およびグリシン延長G17には結合するが、G34には結合しない抗血清を誘導することを実証する。ウサギの抗G17免疫により得た抗血清のガストリン特異性抗血清を100μgmlの濃度で固相に吸収させ、放射性同位体標識G17の濃度を固定し、非標識リガンドの濃度を増大させた競合結合測定法により置換率を求めた。図2および図3は、G17、G17-GlyおよびG34によるウサギ抗ヒトG17抗血清からの125IG17の置換率を示す。図2に示した試験に用いた抗血清は、G17DTにより免疫した動物から得たものであって、G17のN末端に特異的であった。図3の抗血清は、G17のC末端に特異的であった。G17は、両方の抗血清調製物から放射性標識G17を、50阻害濃度がウサギ抗ヒトG17DTについては3500pgml、ウサギ抗G17については800pgmlで、置換した。グリシン延長G17は、C末端特異的抗血清から放射性標識G17を置換しなかったが、N末端特異的抗血清からは置換した。これは、グリシン延長G17がN末端特異的抗血清には結合するが、C末端特異的抗血清には結合しないことを示している。G34は、C末端特異的抗血清からは放射性標識G17を置換したが、N末端特異的抗血清からは置換しなかった。これは、G17DT抗血清がG17およびグリシン延長G17に対しては特異性があるが、G34に対しては特異性がないことを示している。本実験は、DHDK12ラット大腸癌細胞がグリシン延長ガストリン17を産生し、抗G17抗血清がこの細胞により産生されるガストリン前駆体の濃度を低減させることを示す。ガストリン前駆体濃度のラジオイムノアッセイDHDK12細胞を、2mMグルタミンと10熱不活化ウシ胎児血清を加えたRPMI1640培地中でサブコンフルエンスまで増殖させた。細胞をCO25で37°Cの加湿条件でインキュベーションした。細胞を0025EDTAにより集め、遠心洗浄し、2×106の細胞を、無血清培地と1:1の比率で混合を入れたフラスコ中に接種した。細胞を0025EDTAで集め、洗浄し、1mlの滅菌蒸留水に再懸濁させ、沸騰湯浴中で加熱した。グリシン延長ガストリンの濃度を、文献記載の10921およびL2抗体を用いてラジオイムノアッセイにより測定した。DHDK12細胞性ガストリン前駆体の濃度DHDK12細胞はグリシン延長ガストリンを含有するが、アミド化G17を含有しないことが、表1に示すように、2つの別の実験で示された。表1:DHDK12細胞性ガストリン前駆体濃度━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━グリシン延長G17アミド化G17濃度濃度────────────────────────────────実験1312ND1実験2800ND1━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━腫瘍細胞抽出液は、1mlの滅菌水中で細胞を加熱することにより調製した。細胞抽出液を遠心分離により回収し、プロガストリンのグリシン延長ガストリンおよびアミド化G17の濃度を、それぞれ文献記載の10921およびL2抗体を用いて測定した。1ND-検出されずDHDK12細胞のガストリン前駆体濃度に及ぼすウサギ抗ラットG17:DT処置の効果セミコンフルエントsemiconfluentDHDK12細胞単層を前述のようにして無血清培地中で調製し、0025EDTAを用いて集めた。次いで、このフラスコにアフィニティー精製したウサギ抗ラットG17:DTおよびウサギ抗DTを、前者で3ngmlの抗原結合能を与えるに等しいタンパク質濃度で加えた。この細胞を4日間インキュベーションし、その後細胞抽出液を調製し、上述のRIAによりガストリン前駆体濃度について評価した。無血清培地中のDHDK12細胞性ガストリン前駆体の濃度に及ぼす、アフィニティー精製したウサギ抗ラットG17:DTおよびウサギ抗DT抗血清によるinvitro処置の効果を表2に示す。表2:ウサギ抗ラットG17:DT抗血清によるinvitro処置後のDHDK12細胞のガストリン前駆体濃度━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━処置グリシン延長G17アミド化G17濃度濃度───────────────────────────────────ウサギ抗G17:DT抗血清ND1ND1ウサギ抗DT抗血清670ND1━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━DHDK12細胞を無血清培地中で増殖させた。次いで、このフラスコにアフィニティー精製したウサギ抗ラットG17:DTおよびウサギ抗DTを、3ngmlのタンパク質濃度で加え、4日間インキュベーションした。細胞抽出液を遠心分離ににより回収し、プロガストリンのグリシン延長ガストリンおよびアミド化G17の濃度を、それぞれ文献記載の10921およびL2抗体を用いて測定した。1ND-検出されず表2から明らかなように、ウサギ抗ラットG17:DT抗血清はグリシン延長G17の濃度を67pgmlから検出されない程度にまで低下させた。また、DHDK12細胞は細胞性グリシン延長G17を発現するが、アミド化ガストリンは発現しないことが示された。ウサギ抗ラットG17:DTによるDHDK12細胞のinvitro処置は、対照のウサギ抗DT抗血清により処置された細胞に比べ、細胞性ガストリン前駆体の濃度を低下させた。従って、抗G17免疫により産生される抗体は、ガストリン翻訳の抑制の結果として、かかるペプチドを含む自己分泌増殖ループを妨げるかもしれない。以下の実験は、ラットG17DT免疫原によるラットの免疫が、invivoにおいてDHDK12腫瘍の増殖を著しく阻害することを実証するものである。実験動物6~10週令で体重340~430gの雄のBDIXラットを対で収容し、12時間明るくし12時間暗くするというサイクルで、温度25°C、湿度50に維持した。ラットは使用前に少なくとも7日間順応させた。免疫操作DTに結合させたラットG17またはDT成分のみを滅菌食塩水、pH73に1mgmlで溶解した。このコンジュゲートにアジュバントのノル-ムラミルジペプチドを、最終濃度が500μgmlとなるように添加した。この水溶液を1:1の比でオイルMontanideISA703AMSSeppicInc、パリ、フランスと混合し、ガラス製筒に入れる。この筒は3路のストップコックをコネクターとして有する第二の筒に接続しており、混合物をこの筒を通して100回強制的に移動させるストップコックにより垂直の剪断力を生じ、乳化を助けた。対照動物はDTペプチドのみを含有する同じエマルジョンを投与され、実験群はすべて体重を揃えた。エマルジョン200μlを実験動物の右側わき腹に皮下注射した。実験動物は21日間隔で免疫し、5回の免疫の後、腫瘍を植え付けた。腫瘍増殖の開始DHDK12細胞を25×107mlの濃度で09滅菌食塩水中に懸濁した。ラットを、Hypnorm、Hypnovelおよび滅菌蒸留水DT免疫原を用いた免疫ことを示すデータを図示する。DHDK12腫瘍はまた、抗G17免疫原で免疫したラットにおいて腫瘍重量が著しく減少した。図5は、DHDK12腫瘍の重量が、DT対照からの腫瘍に比べ565減少したことを示す。抗G17処置ラットにおける平均動物体重は実験期間中399gから452gに増加し、DT処置動物においては392gから447gに増加した。これは動物の成長速度はG17DT免疫原の投与に影響されないことを示す。この実験は、DHDK12腫瘍を植え付けた免疫ラットにおいて誘導される抗ラットG17抗体のレベルを示す。ラットG17DTで免疫されたラットの抗ラットG17抗体のレベル乳化したラットG17DT免疫原に対する抗体応答を測定するため、種々の時間にラットの尾部の血を取り、ELISA手法を用いて抗ラットG17DT抗体価を測定した。ラットG17BSAコンジュゲートをグリシン緩衝液中に2μgmlの濃度で調製し、96ウェルImmunlonUプレートにウェル当たり25μlを入れ、4°Cで一晩インキュベーションした。次いで、非吸収コンジュゲートを除き、ウェルを05Tween20および002NaN3を含有する09食塩水、pH73からなる緩衝液中で洗浄した。この緩衝液は洗浄と試薬の希釈に両方に用いた。試験血清は最初は1:100の希釈およびその後は10倍希釈で用いた。陽性対照は予め免疫した動物からのラット抗ラットG17抗血清であり、陰性対照は正常ラット血清および、DTで免疫したラットからの血清であった。これらは試験血清について記載したと同じ希釈で用いた。試験および対照血清は100μgmlで、25μlウェルのラットG17BSAの不在下または存在下で25μlの量でウェルに添加した。次いで、プレートを室温で60分間インキュベーションした。プレートを塩水緩衝液で洗浄し、次いで、ヤギ抗ラットIgビオチンを1500希釈でウェルに50μlウェルで添加し、室温で暗部において60分間インキュベーションした。プレートを塩水緩衝液で洗浄し、アビジンアルカリホスファターゼを1100で希釈してウェルに50μlウェルで添加し、室温、暗部で60分間インキュベーションした。塩水緩衝液で洗浄後、基質緩衝液中のpニトロフェニルホスフェート基質をウェルに50μlウェルで添加し、5分間の発色後、405nmでの吸光度を測定した。未処理血清と、ラットG17BSAと共にインキュベーションした血清との間の吸光度の差を比吸光度として算出した。遊離の抗ラットG17DT抗体レベルを測定し、血清の1100希釈で得られる比吸光度として表す。以下の実験は、G17での免疫により血清G17濃度は低下し、この低下は腫瘍の増殖の減少と関連があったことを示す。阻害RIAにより測定した免疫ラットにおけるG17濃度ウサギ抗G17抗血清をPBS中のタンパク質濃度10ng/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに塗被した。G17の濃度を増大させ、125IG17を10000CPMウェルの固定した濃度でインキュベーションすることにより標準曲線を作成した。遊離ガストリン、結合G17、遊離および結合抗G17抗体を含む未知のサンプルを250μlの量で調製した。新生ウシ血清125μl量および25ポリエチレングリコール3125μlを各血清試料に添加した。これらを1500rpmで30分間渦をつくらせ回転させた。上清を除去し、加熱し、遊離ガストリン試料とした。得られたペレットを05ウシ血清アルブミンを含む0002Mのベロナール緩衝液で5回洗浄し、250μlの水中で加熱することにより可溶化した。これは結合ガストリン含有物とした。各試料の3倍量を標識G17に添加し、阻害の度合いを測定した。次いで、ラット血清中のガストリン濃度を標準曲線から算出した。DT免疫ラットの遊離血清ガストリン濃度G17のカルボキシ末端に対して生じる抗血清を用いて測定は1140pgmlであり、ラットG17DT免疫群では685pgmlであった。これは全ガストリンにおいて40の減少に相当する。全血清ガストリン濃度は最終腫瘍重量に関連し、相関係数は統計的に有意であると認められた。抗体に結合した血清ガストリン濃度はDT免疫ラットでは0であり、ラットG17DT免疫ラットでは301~2537pgmlの範囲であった。CCKB/ガストリン受容体によりinvivoで増殖しているDHDK12ラット大腸腫瘍細胞は血清G17に応答した。これらの実験では、過剰な抗G17抗体を腫瘍攻撃の間測定した。全血清ガストリン濃度は40減少することが示され、治療の終わりには腫瘍重量と血清ガストリン濃度との間には有意な正の関係があることが示された。さらに、ラットG17DT免疫ラットでは抗体結合ガストリンが検出されたが、DT免疫ラットでは検出されなかった。このように、血清性ガストリンの中和は腫瘍増殖の減少に寄与した。この実験はG17に対する免疫がDHDK12腫瘍の組織学的外観に影響することを示す。ラット腫瘍の組織学的評価治療の終わりに、DHDK12腫瘍を10ホルマールカルシウムで固定し、パラフィン中に埋め込んだ。5μm部分を低温維持装置上で切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、腫瘍の病理要因を病理学者が独立に評価した。SeescanImageアナライザーを用いてブラインドマナーで画像分析を行い、生存腫瘍組織の面積を評価した。ガストリン受容体をウサギ抗CCKB/ガストリン受容体ポリクローナル抗血清を用いて検出した。断片を1500で希釈して40°Cで一晩インキュベーションした。結合は、イムノペルオキシダーゼを酵素トレーサーとし、ジアミノベンジデンを基質として用い、アビジン-ビオチン法により検出した。組織学的評価により、ラットG17DT免疫ラットからの腫瘍は、DT免疫ラットからの腫瘍に比べて、腫瘍のリーディングエッジ周りの生存腫瘍組織の縁がより小さく、また中央壊死の程度が大きいことが判明した。これは画像分析により定量化され、ラットG17DT処置ラットからの腫瘍においては生存細胞面積の平均割合は403であり、DT免疫ラットでは586であったDT免疫ラットからの腫瘍細胞の増殖は破裂状のパターンであることが示された。また、G17DT処置ラットからの腫瘍では、DT処置ラットに比べて結合組織が多かった。巣状壊死の部分はG17DT処置群においては生存腫瘍細胞内に存在し、またほとんどリンパ球からなるようにみえる炎症性浸潤物が増加していた。両方の処置群のラットからの腫瘍を抗GR抗血清で染色し、DT処置群およびG17DT処置群の両方に残る生存細胞がそのGR陽性を維持することが示された。G17DT免疫原での免疫は、断面積および重量測定の両者により示されるように、DHDK12ラット大腸腫瘍のinvivo増殖を低減させる。画像分析による生存腫瘍組織の定量的評価の外挿により、生存腫瘍組織の重量は68も減少したかもしれないことが示された。さらなる所見は、抗G17処置ラットにおける腫瘍組織内の壊死の中央領域、および主にリンパ球からなる腫瘍のある領域における炎症性浸潤物の存在であった。このような所見の1つの可能な説明は、抗体依存性の細胞障害性応答が抗G17免疫原により起こされることである。G17に対する免疫に適用されるこのような応答の機構は未解明である。抗G17免疫は、2つのトロフィック形態のガストリン、すなわちG17とグリシン延長G17の中和を可能とし、従って腫瘍内に細胞増殖抑制を引き起こすかもしれない。この組織学的所見は、抗G17免疫原処置ラットからの腫瘍は対照ラットからの腫瘍よりも増殖パターンとしてより遅い増殖を示すという理論の証明を提供し、繊維形成の程度および生存腫瘍組織の面積が前者のラットでは著しく減少した。興味深いことに、残存する生存腫瘍細胞はそのGRの発現を維持していることが示された。このことは、この腫瘍モデルでは、ガストリンホルモン感受性表現型はすべての細胞クローンによって発現されるかもしれないことを示し、抗G17免疫原の阻害から免れる結果となるガストリンホルモン非感受性クローンの生成はなかった。DHDK12細胞のCCKBガストリン受容体発現の免疫細胞化学的評価DHDK12細胞を1×106mlの濃度で懸濁し、その200μlを顕微鏡スライド上でサイトスピンcytospinを行うアルコール処理により透過性とする。この細胞をウサギ抗CCKBガストリン受容体抗血清とインキュベーションを行い、上記したようにして染色した。DHDK12細胞のCCKBガストリン受容体発現はヒトCCKBガストリン受容体から誘導体されたペプチド配列に対して生じた抗血清で評価した。DHDK12細胞は、高度のガストリン受容体発現を示す強いかつ特異的な膜性免疫活性を示した。対照のウサギ抗血清で処置した細胞は何ら特異的免疫反応性を示さなかった。引用文献