"インビトロで成長した多能性ヒト幹細胞の自己複製を可能にするための組成物であって、基材、完全な組換えラミニン-511LN-511又はラミニン-10を含み、動物タンパク質もフィーダー細胞も含まない、コーティング、及びフィーダー細胞を含まない既知組成培地を含む、組成物。前記培地が増殖因子を更に含む、請求項1に記載の組成物。前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項1に記載の組成物。前記コーティングが完全な組換えラミニン-511からなる、請求項1に記載の組成物。規定された人為的環境において新しい幹細胞系を生成するための方法であって、コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン-511LN-511又はラミニン-10を含み、タンパク質もフィーダー細胞も含まない、こと、ヒト幹細胞を該コーティング上にプレーティングすること、該ヒト幹細胞を、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び該ヒト幹細胞の増殖物から新しい幹細胞を得ることを含む、方法。前記新しい幹細胞が非分化である、請求項5に記載の方法。前記新しい幹細胞が均質である、請求項5に記載の方法。前記ヒト幹細胞が前記コーティング上に単層を形成する、請求項5に記載の方法。前記ヒト幹細胞が非分化胚性幹細胞である、請求項5に記載の方法。前記新しい幹細胞を収集すること、前記コーティングを含む第2の基材上に前記新しい幹細胞を再度プレーティングすること、前記新しい幹細胞をフィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び前記新しい幹細胞の増殖物から精製幹細胞を得ることを更に含む、請求項5に記載の方法。前記培地が増殖因子を更に含む、請求項5に記載の方法。前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項5に記載の方法。請求項5に記載の方法によって製造される新しいヒト幹細胞。自己複製する多能性ヒト幹細胞を維持するための方法であって、コーティングを含む基材を提供することであって、該コーティングは、完全な組換えラミニン-511LN-511又はラミニン-10を含み、動物タンパク質もフィーダー細胞も含まない、こと、ヒト幹細胞を前記コーティング上にプレーティングすること、該ヒト幹細胞を、フィーダー細胞を含まない既知組成培地に曝露すること、及び該幹細胞を定期的に収集し、再度プレーティングすることを含む、方法。前記培地が増殖因子を更に含む、請求項14に記載の方法。前記培地がヒトアルブミンを更に含む、請求項14に記載の方法。前記コーティングが完全な組換えラミニン-511からなる、請求項14に記載の方法。概要本開示は、細胞外マトリックスなどの組成物の開発、及びヒト幹細胞をインビトロで未分化状態で培養するためにそれを使用するプロセスを対象とする。ある種のラミニンは、未分化ヒト胚性幹細胞のインビトロでの成長growth及び増殖proliferationのための規定された適切な細胞外マトリックスを提供することが見いだされた。これは、フィーダー細胞及び/又は分化阻害剤がない。換言すれば、フィーダー細胞及び/又は分化阻害剤は、胚性幹細胞がラミニン細胞外マトリックス上で成長及び増殖するのに不要である。さらに、多能性ヒト胚性幹細胞を、組換えラミニン-10ラミニン-511で被覆されたプレート上でmTeSR1の類似物などの既知組成培地chemicallydefinedmedium中で培養すると、細胞は、増殖し、分化阻害剤の非存在下でもその多能性を維持できることが見いだされた。本明細書では既知組成chemicallydefinedという用語は、その成分すべてが既知である培地を指し、各成分の絶対的又は相対的量が既知であり、培地は、植物組織も動物組織も含まない。さらに、動物産物もフィーダー細胞も全く含まず、唯一の不明確な成分である純度96以上のヒトアルブミンのみを含む系が、自然なhES細胞微小環境であるヒト組換えラミニン-511上で種々のhES細胞系を培養することによって樹立された。hES細胞は、正常な核型で少なくとも4か月20継代自己複製し、その後、細胞は、全3種類の胚葉の細胞系譜を含む奇形腫を発生することができた。ラミニン-511上で小さい塊でプレーティングすると、hES細胞は単層で広がり、約97Oct-4陽性細胞を含む細胞均質性を維持した。hES細胞の接着は、α6β1インテグリンに依存した。均質な単層hES細胞培養物を使用すると、幹細胞の分化経路の設計条件がより制御可能になる。この異種もフィーダー細胞も含まない系は、細胞療法目的の細胞系譜の開発に有用であり得る。本開示のこれら及び他の非限定的特徴を以下により詳細に考察する。本特許又は出願ファイルは、少なくとも1つのカラー図面を含む。カラー図面単数又は複数を含むこの特許又は特許出願の複製は、請求次第、かつ必要な手数料の支払い次第、特許庁によって提供される。以下は、図面の簡単な記述である。これらは、本明細書に開示する例示的実施形態を説明するためのものであって、それを限定するものではない。詳細な説明ヒト幹細胞をインビトロで未分化状態で培養するための組成物及びプロセスを開示する。この点に関して、ヒト胚性幹細胞は、組換えラミニン-10ラミニン-511で被覆されたプレート上で培養すると、増殖し、その多能性を維持した。サイトカインの発現、細胞周期調節及び自己複製機序は、ヒトとマウスのES細胞では異なる。例えば、STAT3活性化は、マウスES細胞の自己複製に十分であるが、hES細胞の分化を防止することができない。したがって、マウスES細胞を用いて得られた結果をヒトES細胞に直接外挿することはできない。最近、フィーダーも異種も含まないhES細胞培養システムが報告された。それは、血しょうから精製されたヒトアルブミン、及び培養皿コーティングのためのヒトタンパク質混合物を含む。ヒトタンパク質細胞培養皿コーティングは、IVコラーゲン、ビメンチン、フィブロネクチン及びヒトラミニンを含むことが報告された。ヒトラミニンは、ヒト胎盤由来の分解タンパク質の混合物であることが示された。それは、幾つかのラミニンタイプの断片を含み、しばしば他のBMタンパク質及びフィブロネクチンも含む。したがって、これらのhES細胞状態は可変であり、化学的に明確であるとは考えられず、自己複製を与える基質の成分単数又は複数は不明である。本開示においては、本出願人らは、ヒト組換えLN-511単体が長期間の培養においてhES細胞の自己複製を支援することができるかどうか調べた。本出願人らは、ヒト胎児腎細胞HEK293において産生されたヒト組換えLN-511であらかじめ被覆された培養皿上でhES細胞系HS420、HS207及びHS40133を培養した。2つの異なる培地O3及びH3を使用した。O3培地は、唯一の動物由来の成分としてウシ血清アルブミンを含む、市販の既知組成mTeSR1培地の改変物であった。H3培地は、ヒト血清アルブミンを含む、異種を含まない既知組成TeSR1培地の改変物であった。使用したヒトアルブミンの潜在的なバッチ間のばらつきを抑制するために、本出願人らは12~14KDa透析膜を使用してタンパク質溶液を透析した。動物由来の成分を含まない細胞を継代するために、TrypLE商標Express酵素を使用した。対照細胞を、O3培地においてMatrigel上で、又は血清代替物質に基づく培地においてフィーダー細胞の層上で、培養した。本出願人らは、hESC細胞と種々のECMタンパク質の接着を試験した。LN-511は、基層に最大細胞接触面積を与えた。人工多能性幹iPS細胞系もLN-511上で自己複製した。接着は、hES細胞表面で最も豊富であることが示されたα6β1インテグリンに依存した。LN-511は、hES細胞において発現され、フィーダー依存性細胞培養及び初期胚におけるhES細胞環境の一部としてhES細胞接着、移動及び増殖の天然の基層とすることができた。多能性ヒト胚性幹細胞は、既知組成培地において組換えヒトラミニン-10ラミニン-511で被覆されたプレート上で培養すると、増殖し、その多能性を少なくとも105日間20継代維持することも見いだされた図1~3。Oct4、Sox2、Nanogなどの多能性マーカーの発現、及び増殖速度も安定なままであった。本明細書では自己複製という用語は、多数の細胞分裂サイクルを通過し、未分化すなわち多能性のままである幹細胞の能力を指す。多能性自体は、任意の細胞型に分化する幹細胞の能力を指す。増殖proliferationという用語は、幹細胞の分裂能力を指す。生存とは、分化型であろうと未分化であろうと、幹細胞の生存能力を指し、分裂又は分化するその能力を幹細胞が維持する必要はない。本開示を以下の非限定的な2組の実施例で更に説明するが、これらの実施例は単なる説明のためのものであって、本開示が、本明細書に列挙された材料、条件、プロセスパラメータなどに限定されるものではないことを理解されたい。別段の記載がないかぎり、割合はすべて重量単位である。I.第1の実験セットの方法細胞培養ヒト胚性幹細胞2つの系を使用した:HS420及びHS207、どちらもProf.Hovatta、KarolinskaUniversityHospitalHuddinge、KarolinskaInstitute、Swedenの好意で提供されたを、既知組成培地、すなわちmTeSR1の類似物において組換えラミニン-10ラミニン-511で被覆されたプレート上で培養した。幾つかの点を除いて、培地をLudwig,T.E.,Bergendahl,V.,Levenstein,M.E.,Yu,J.,ProbascoM.D.andThomsom,J.A.2006;Feeder-independentcultureofhumanembryonicstemcells;NatMethods8,637-646に記載のように調製した。第一に、組換えヒトFGFbasicRDSystemsをzbFGFの代わりに使用し、ウシ血清由来のアルブミンSIGMA-Aldrich、B4287をBSA画分Vの代わりに使用した。第二に、既製培地に添加されたInsulin-Transferrin-SeleniumSupplementInvitrogenを、論文に記載された方法の代わりに要素源として使用した。ヒト胚性幹細胞は、TrypLE商標ExpressGIBCOに曝露することによって4~6日間隔で塊状の継代であった。細胞を酵素に室温で2分間さらし、次いで培地で2回洗浄し、続いて静かにこすって収集した。細胞の大きい塊を軽いピペット操作によって破壊し、1:3継代した。Inzunzaa,J.,Gertow,K.,Stroemberg,M.,A.,Matilainen,E.,Blennow,E.,Skottman,H.,Wolbank,S.,Aehrlund-Richter,L.andHovatta,O.2005;DerivationofHumanEmbryonicStemCellLinesinSerumReplacementMediumUsingPostnatalHumanFibroblastsasFeederCells.StemCells2005;23:544-549に記載のように、対照ヒト胚性幹細胞を従来の培地においてヒト包皮線維芽細胞上で維持した。実体顕微鏡下でメスを使用してコロニーを8個の小片に切断することによって、細胞を機械的に継代した。機械的分割を6日間隔で実施した。非分化細胞を、形態によって判断して、各々更なる継代用に選択した。プレートコーティング96ウェル組織細胞培養プレートSarstedtを、終夜4°Cで以下の細胞外マトリックスタンパク質の無菌溶液で被覆した:ネズミラミニン-111Invitrogen、ヒト組換えラミニン-332、ヒト組換えラミニン-411Kortesmaa,J.,Yurchenco,P.,andTryggvason,K.2000;Production,purification,andinteractionswithintegrins.JBiolChem275,14853-14859,米国特許6,638,907、ヒト組換えラミニン-511Doi,M.,Thyboll,J.,Kortesmaa,J.,Jansson,K.,Iivanainen,A.,Parvardeh,M.,Timpl,R.,Hedin,U.,Swedenborg,J.,andTryggvason,K.2002;Production,purification,andmigration-promotingactivityonvascularendothelialcells.JBiolChem277,12741-12748;U.S.Patent6,933,273すべて、濃度30μg/ml5μg/mm2、増殖因子が欠乏したMatrigel商標1:30BDBiosciences、ウシのゼラチン1mg/mlSigma、0.1mg/mlポリ-D-リジンSigma。細胞接着アッセイ付着アッセイを[ExtracellularMatrixProtocols,2000に記載のように実施した。手短に述べると、上述したように細胞外マトリックスタンパク質で被覆し、1熱変性BSA溶液でブロックされたMaxiSorp96ウェルプレートNunc。未分化胚性細胞を細胞密度800細胞/mm2で細胞外マトリックス被覆プレート上で培養し、37°Cで1時間付着させた。非接着細胞を洗浄除去し、接着細胞を5グルタルアルデヒドによって20分間固定し、0.1クリスタルバイオレットによって染色した。RT-PCR:全RNAをAbsolutelyRNAMicroprepKitStratageneを使用して製造者の指示に従ってヒト試料から単離した。オリゴdT12~18プライマー及びSuperscriptII逆転写酵素Invitrogenを含む反応混合物20μl中の全RNA0.2μgを使用して、製造者の指示に従って、cDNAを合成した。可変のcDNA収率を補償するために、各PCR反応のcDNAの量を、ハウスキーピング遺伝子GADPHの発現レベルを標準として使用することによって較正した。20サイクルにおいて等量のGADPHPCR産物を生成するcDNA量データ示さずを後続のPCR反応に使用した。cDNAをヒト試料のための表1のプライマーを使用して増幅した。図示したGADPHPCRを含めて全PCR反応を30サイクル行い、20μlで標準条件下で1UのTaqDNAPolimeraseRecombinantInvitrogenを使用して実施した。PCR産物を臭化エチジウムを含む1.5アガロースゲル上で分析した。各RNA試料について、逆転写酵素なしのRT-PCRを実施して、ゲノムDNAが単離されないことを確認した。免疫蛍光:免疫蛍光では、胚性細胞を4パラホルムアルデヒドによって96ウェルプレートウェルに固定し、0.1Triton-Xによって透過処理し、0.1Tween-20SigmaPBS中の10ウシ胎児血清Invitrogenによって1時間ブロックした。一次抗体と一緒に室温で1.5時間インキュベートした。以下のヒト抗原に対する一次抗体を使用した:Oct4及びSox2どちらもRDSystems製。Alexa488及びAlexa546で標識された二次抗体Molecularprobes及びDAPIMolecularprobesと一緒に40分間インキュベートした。インキュベーション間に、試料を0.1Tween-20のPBS溶液で3から5回各10分間洗浄した。試料を蛍光封入剤Dakoに保存し、蛍光顕微鏡Leicaで観察した。第1の実験セットの結果A.ラミニン-511上で培養されたヒト胚性幹細胞は、既知組成培地においてフィーダーなしで増殖し、多能性のままである。ラミニン-511上では、ヒト胚性幹細胞は、既知組成培地において少なくとも105日間20継代多能性のままであることが判明した。形態:ラミニン-511上で培養されたヒト胚性幹細胞の形態は、Matrigel商標Bendall,S.,C.,Stewart,M.,H.,Menendez,P.,George,D.,Vijayaragavan,K.,Werbowetski-Ogilvie,T.,Ramos-Mejia,V.,Rouleau,A.,Yang,J.,Bosse’,M.,Lajoie,G.andBhatia,M.2007;IGFandFGFcooperativelyestablishtheregulatorystemcellnicheofpluripotenthumancellsinvitro.Nature,2007Aμg30;4487157:1015-21.又は細胞外マトリックス被覆プレートKlimanskaya,I.,Chung,Y.,Meisner,L.,Johnson,J.,West,M.,D.andLanza,R.2005;Humanembryonicstemcellsderivedwithoutfeedercells.Lancet.2005May7-13;3659471:1601-1603上で培養されたヒト胚性幹細胞のそれと極めて類似した。図1を参照されたい。しかし、上記2つのコーティングとは異なり、組換えヒトラミニン-511は、FDA要件に従って異種を含まない規定された非免疫原性化合物として製造することができ、続いて臨床に使用することができる。RT-PCRマーカー:多能性マーカーOct4及びNanogは、既知組成培地におけるラミニン-551上で105日間培養されたヒト胚性幹細胞によって、従来の培地におけるヒト線維芽細胞包皮上で培養された多能性胚性幹細胞と同程度に発現された。図2を参照されたい。免疫蛍光:ヒト胚性幹細胞は、従来の環境で成長した胚性幹細胞と同程度にOct4及びSox2のような多能性マーカーを発現した。図3を参照されたい。II.第2の実験セットの方法ヒトES細胞培養KarolinskaInstituteの本発明者らの研究室で最初に誘導されたHS207、HS420及びHS401のヒトES細胞は、LN-511被覆実験皿上で1既知組成O3培地mTeSR1培地の改変物及び2異種を含まない既知組成H3培地TeSR培地の改変物において37°C、5CO2で培養された。臨床等級の純度96以上のヒトアルブミンをOctapharmaAB、Stockholmから購入した。最初に、系の細胞を、無菌ナイフを使用して慎重にはがし取ることによって、フィーダー細胞層から小片でLN-511上に移した。ほんの数滴の新しい培地が添加された継代後の第1日を除いて、恒温器で1時間予熱した新しい培地を1日1回細胞に供給した。TrypLE商標ExpressGIBCOInvitrogenCorporation、Paisley、Scotlandに室温で1.5分間曝露することによって6~7日間で1回細胞を常法に従って継代した。次いで、それを皿上で培地で2回洗浄し、静かにこすり、ピペット操作によって単細胞懸濁液ではなく小片に破壊し、1:2又は1:3比多数の細胞が必要な場合は最高1:6比で培養した。同じ系の対照細胞をO3培地におけるMatrigel上で、及びヒト包皮線維芽細胞上で、培養した。実験皿を被覆した。使用前に、皿を恒温器で1時間予熱し、次いで予熱培地で2回慎重に洗浄した。O3培地mTeSR1の改変物の調製L-アスコルビン酸がないこと以外はLudwig,Nat.Methods3:637-6462006に記載のようにして、チアミン165mg及び還元型グルタチオン50mgを蒸留水500mlに添加することによってストックAを調製した。蒸留水をGIBCOInvitrogenCorporationから購入した。次いで、溶液をろ過し0.22μmフィルター、等分し、-20°Cで凍結させた。ストックBを、セレン、インスリン及びホロ-トランスフェリンないこと以外はLudwigに記載のとおりに調製した。次いで、フェノールレッド6μgを添加し、慎重に撹拌し、ろ過した。ストックBは、4°Cで最高2か月貯蔵することができた。トランスフォーミング増殖因子TGF-β1、ピペコリン酸、γ-アミノ酪酸GABA及びLiClのストックを調製し、Ludwigに記載のように貯蔵した。O3培地100mlを調製するために、D-MEM/F12培地にストックB20ml、TGF-β1ストック200μl、ピペコリン酸ストック13μl、GABAストック200μl、LiClストック200μl、MEM非必須アミノ酸溶液GIBCOInvitrogenCorporation1ml、200mML-グルタミン溶液GIBCOInvitrogenCorporation1ml及びインスリン-トランスフェリン-セレン補助剤GIBCOInvitrogenCorporation2mlを補充した。塩バランスを補償し、培地のpHを調節するために、NaCl145mg及びNaHCO356mgを添加した。次いで、溶液を徹底的に混合し、室温における培地のpHを10NNaOHを用いて7.4に調節した。溶液を0.22μmフィルターを使用してろ過し、次いで既知組成の脂質濃縮物GIBCOInvitrogenCorporation200μlを添加した。O3培地は、4°Cで最高1か月貯蔵することができた。使用前に、組換えヒトFGFbasicRDSystemsEuropeLTD、Abingdon、England96ng/ml及びアスコルビン酸SigmaAldrich40μg/mlを培地に補充した。H3培地TeSR1の改変物の調製O3培地の項で上述したように、ストックAを調製した。ヒトアルブミン溶液AlbuminativをOctapharmaAB、Stockholm、Swedenから購入した。溶液を12~14Kda透析膜SpectrumLaboratories,Inc.、RanchoDominguez、CAを使用して細胞培養リン酸緩衝食塩水PBSで3回各3時間透析し、続いてD-MEM/F12培地で1回透析した。光学濃度を測定して、溶液中のタンパク質の最終濃度を測定した。この場合、濃度に応じた適切な体積の透析ヒトアルブミン溶液を使用してストックBを混合して、上記O3培地のストックBの場合と同じ濃度のアルブミンを得た。微量元素及びフェノールレッドを添加し、水の代わりにD-MEM/F12を使用した。TGF-β1のストックを、ウシアルブミンの代わりに透析ヒトアルブミンを使用したこと以外はLudwigに記載のとおりに調製した。他のストックをすべて上述したように調製した。H3培地をO3の場合と同様に混合した。ただし、NaClは全く添加されなかった。使用前に、担体を含まない組換えヒトFGFbasicRDSystemsEuropeLTD、Abingdon、England96ng/ml及びアスコルビン酸SigmaAldrich40μg/mlを培地に補充した。ラミニン及び他のコーティング材料BioLamina、AB、Stockholmから入手可能なヒト組換えLN-511を、完全長ラミニンγ1、β1及びα5構築物を逐次的に移入したヒト胎児腎細胞HEK293;ATCCCRL-1573中で産生させた。タンパク質産生のために、HEK293細胞を、GlutaMaxI及び4.5g/lグルコースGIBCOInvitrogenCorporationを補充したダルベッコ変法イーグル培地DMEM中で最高6日間培養した。LN-511分子を抗FLAG基質Sigmaを使用して親和性精製し、次いで3~8図14及び4~15勾配SDS-PAGEを使用して還元及び非還元条件下で特性分析した。ポリフッ化ビニリデン膜上で鎖のSyproRubyBio-Radタンパク質染色及び免疫染色を使用して、タンパク質を可視化した。タンパク質を更に特徴づけるために、ラミニンα5、β1及びγ1鎖に対する抗体を使用したウエスタンブロット分析を実施した。調製物は、正しいサイズの全3本の鎖を含んだ。ヒト組換えラミニン-411は、LN-511と同様に産生された。他のECMタンパク質はすべて上述したように得られた。細胞接触面積測定MaxiSorp96ウェルプレートSarstedt、Numbrecht、Germanyを上述したようにECMタンパク質で被覆し、1熱変性BSA溶液によってブロックした。未分化ES細胞を分割して単細胞懸濁液とし、40μm無菌細胞篩によってろ過し、細胞密度700細胞/mm2でECM被覆プレート上にプレーティングし、37°Cで1時間付着させた。非接着細胞を洗浄除去し、接着細胞を5グルタルアルデヒドによって20分間固定し、洗浄し、0.1クリスタルバイオレットによって染色した。6~10個の無作為な場の写真を撮影し、VolocityイメージングソフトウェアImprovision、Waltham、MA、http://www.improvision.comを使用して13~93個の細胞の細胞接触面積を測定した。非拡散ヒトES細胞の細胞面積を測定するために、細胞をポリ-D-リジン上で20分間培養し、固定し、上述したように染色した。抗インテグリン抗体を使用した接着ブロッキングアッセイ接着ブロッキングアッセイを実施した。手短に述べると、プレートをLN-511で被覆し、1熱変性BSA溶液でブロックした。ES単細胞懸濁液を機能阻害抗インテグリン抗体供給業者によって推奨された濃度と一緒に30分間インキュベートし、LN-511被覆プレートにプレーティングし、37°Cで1時間付着させた。非接着細胞を除去し、残りの細胞を固定し、接着細胞を5グルタルアルデヒドによって20分間固定し、洗浄し、0.1クリスタルバイオレットによって染色した。1時間後、クリスタルバイオレットを細胞から10酢酸によって抽出し、570nmにおける光学濃度を測定することによって定量した。抗インテグリン抗体アッセイによって被覆された表面との細胞接着アッセイは、抗インテグリン特異抗体で被覆された表面に付着した細胞を保持するのに十分な量で発現されるインテグリン受容体を特定するように設計された。MaxiSorp96ウェルプレートNuncを精製抗インテグリン抗体を用いて濃度10μg/mlで4°Cで終夜被覆し、その後1BSA溶液で洗浄し、ブロックした。ES細胞を抗体被覆プレートにプレーティングし、37°Cで1時間付着させた。付着しない細胞を除去し、残りの細胞を固定し、染色し、上述したように定量した。エラーバーはSEMを示す。RT-PCR全RNAをAbsolutelyRNAMicroprepKitStratagene、LaJollaCA、www.stratagene.comを使用して製造者の指示に従って単離した。オリゴdT12~18プライマー及びSuperscriptII逆転写酵素GIBCOInvitrogenCorporationを含む反応混合物20μl中の全RNA0.2μgを使用して、製造者の指示に従って、cDNAを合成した。可変のcDNA収率を補償するために、各PCR反応のcDNAの量を、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGAPDHのハウスキーピング遺伝子の発現レベルを標準として使用することによって較正した。20サイクルにおいて等量のGAPDHPCR産物を生成するcDNA量データ示さずを後続のPCR反応に使用した。hES細胞の多能性又は分化の種々のマーカーの発現を分析するために、表2に記載のプライマーを使用してcDNAを増幅した。種々のラミニン鎖の発現を分析するために、プライマーを使用した。図示したGAPDHPCRを含めて全PCR反応を30サイクル行い、20μlで標準条件下で1UのTaqDNAPolimeraseRecombinantGIBCOInvitrogenCorporationを使用して実施した。PCR産物を臭化エチジウムを含む1.5アガロースゲル上で分析した。各RNA試料について、逆転写酵素なしのRT-PCRを実施して、ゲノムDNAが単離されないことを確認した。免疫蛍光免疫蛍光試験のために、ES細胞を培養し、8ウェルスライドチャンバーBDBiosciences又は96ウェルプレートウェルに4パラホルムアルデヒドによって固定し、0.1Triton-Xによって透過処理し、0.1Tween-20Sigma-Aldrich、St.Louis、MOを含むリン酸-食塩水緩衝剤PBS中の10ウシ胎児血清GIBCOInvitrogenCorporationによって1時間ブロックした。一次抗体と一緒に室温で1.5時間インキュベートした。二次抗体及び4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI、MolecularProbesと一緒に40分間インキュベートした。インキュベーション間に、試料を0.1Tween-20のPBS緩衝剤溶液で3から5回洗浄した。試料を蛍光封入剤Dako、Glostrup、Denmarkに保存し、蛍光顕微鏡Leica、Heerbrugg、Switzerlandで観察した。種々のmRNAのリアルタイムPCR定量全RNAを単離し、RT-PCRの項で上述したようにcDNAを合成した。実時間定量RT-PCRTaqmanアッセイを、AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystemAppliedBiosystems、FosterCity、CAを使用して実施した。対象とするmRNAのプライマー及びプローブを含むpre-developedgeneexpressionassaymixAppliedBiosystemsを使用して全反応を四つ組で実施した。各実験の追加の反応は、RNA入力を正規化するためのGAPDHのpre-developedgeneexpressionassaymixを含んだ。全データを7300SystemSDSSoftwarev1.4によって分析した。ウエスタンブロット及び濃度測定分析LN-511上で培養後、hES細胞を収集し、数え、遠心分離によってペレット化し、非還元SDS-PAGE試料緩衝剤と2000細胞/μlの等濃度に混合し、5回15秒間超音波処理した。勾配4~12ゲルをSDS電気泳動に使用し、タンパク質をPVDF膜に移した。膜を5乳のPBS溶液-0.1Tween緩衝剤で2時間ブロックした。0.1Tween緩衝剤を含む5乳のPBS溶液中のOct4及びSox2に対する一次抗体どちらもMillipore製を膜と一緒に4°Cで終夜インキュベートした。4回洗浄後、HRP複合化二次抗体の0.1Tween緩衝剤を含む5乳PBS溶液希釈1:1000を膜と一緒に室温で40分間インキュベートし、PBSで5回洗浄した。AmershamBiosciences製化学発光HRP-基材を可視化に使用した。フィルムを2,400dpiで走査し、ChemiImager5500プログラム1D-MultiLine濃度測定モードによって分析した。Matrigel上及びフィーダー細胞上で培養されたヒトES細胞を正の対照として使用した。FACS分析細胞をトリプシン/EDTAを用いて培養皿から除去し、解離させて単細胞懸濁液とし、氷冷FACS緩衝剤Hanks緩衝剤中2ウシ胎仔血清、0.1アジ化ナトリウムに再懸濁させた。SSEA-4、SSEA-1どちらもRDSystems、Minneapolis、MNUSA製、Tra1-60又はTra1-81どちらもMillipore、Billerica、MA製に対する一次抗体と一緒に氷上で1時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷FACS緩衝剤で3回洗浄した。その後、細胞をAlexaFluor抗マウス二次抗体GIBCOInvitrogenCorporationの1:400希釈を含むFACS緩衝剤中で30分間暗所でプローブし、4回洗浄した。対照細胞をマウス免疫グロブリン、続いて上述したように二次抗体と一緒にインキュベートした。細胞をFACSCaliburFlowCytometerBectonDickinson、SanJose、CAによって分析した。データをCellQuestソフトウェアBectonDickinsonによって分析した。Oct4発現の分析も実施した。核型分析細胞系の核型分析を標準Qバンディング技術を使用して継代20でLN-511上で実施した。細胞の試料をコルセミドKaryoMAX0.1μg/ml;GibcoInvitrogenCorporationを用いて最高4時間処理し、続いてTrypLE商標ExpressGibcoInvitrogenCorporationを用いて解離させた。細胞を遠心分離によってペレット化し、予熱した0.0375MKCl低張液に再懸濁させ、10分間インキュベートした。遠心分離後、細胞を固定液3:1メタノール:酢酸に再懸濁させた。中期拡散培養物spreadをガラス顕微鏡スライド上で調製し、トリプシンに短時間曝露してG-バンド染色し、4:1Gurr’s/Leishmann’s染料Sigma-AldrichCo.で染色した。最小10個の中期拡散培養物を分析し、追加の20個を数えた。奇形腫形成若い7週齢重症複合免疫不全SCIDマウスの精巣嚢下の約106個の細胞を移植して奇形腫形成実験を実施した。各細胞系当たり3匹の動物を使用した。奇形腫成長を触診によって毎週測定し、マウスを移植から8週間後に屠殺した。奇形腫を固定し、切片をヘマトキシリンとエオシンHE又はヘマトキシリン、エオシン及びPASHE-PASで染色した。全3つの胚性生殖系列層の組織成分の存在が、染色切片から分析して示された。動物実験はすべて、KarolinskaUniversityHospitalの感染のない動物施設で倫理委員会の承認に従って実施された。胚様体形成ES細胞を継代のために上述したようにLN-511被覆細胞培養皿から解離させ、小片に分解し、懸濁96ウェルプレートSarstedt中で培養した。これに使用した培地は、2mML-グルタミン、20ウシ胎仔血清GIBCOInvitrogenCorporation、0.1mMβ-メルカプトエタノールGIBCOInvitrogenCorporation及び1非必須アミノ酸GIBCOInvitrogenCorporationを補充したKnockoutDMEMGIBCOInvitrogenCorporationであった。懸濁状態で1週間後、胚様体をゼラチン被覆組織細胞培養96ウェルプレートSarstedtに移し、1週間培養し、次いで固定し、全3種類の胚性生殖系列層のマーカーに対する抗体平滑筋アクチン、ネスチン、MAP-2及びα-フェトプロテイン、全3種類の抗体はMillipore製であったで染色し、免疫蛍光の項で上述したように分析した。統計統計的有意性を不等分散のStudentの両側t検定によって判定した。第2の実験セットの結果A.LN-511との強力な接着は、ヒトES細胞と基層の大きい接触面積をもたらす。細胞の増殖は、その接着基層との細胞接触面積に大きく依存することが知られている。この考えは、種々のラミニン及び他のECMタンパク質とのマウスES細胞の接着、並びに種々のラミニン及び他のECMタンパク質上でのその増殖に関する本発明者らの以前の知見と一致する。種々のECMタンパク質とのヒトES細胞の接着性を比較するために、本出願人らは、LN-511、LN-332、LN-411、LN-111、Matrigel又はポリ-D-リジン基層上でヒトES細胞接着アッセイを実施した図4a及び4b。LN-511上で成長した接着ヒトES細胞の平均接触面積は、Matrigel上で培養された細胞より約1.6倍高く、LN-332上で培養された細胞より約1.2倍高かった図4b。試験した他のコーティング上の胚性幹細胞の拡散は、LN-511上のそれよりもかなり小さかった。B.HS207、HS420及びHS401細胞はLN-511を発現する。幾つかのヒトES細胞系の細胞は、ラミニンα5、β1及びγ1鎖を発現することが報告された。それがその系の独特の性質であるかどうかを解明するために、本出願人らは、HS207、HS420及びHS401の細胞から生ずるcDNAのRT-PCRを、種々のラミニン鎖に特異的なプライマーを使用して実施した。α1、α2及びβ2と一緒にα5、β1及びγ1ラミニン鎖の全3種類の転写物は容易に検出でき、LN-511が全3種類の系のhESC細胞において発現されることを示した図4c。興味深いことに、以前の報告と一致して、α3及びβ3ラミニン鎖の転写は記録されず、LN-332が胚性細胞において産生されなかったことを示唆している。C.LN-511との接触は、ヒトES細胞において高度に発現されるインテグリンα6β1に依存する。LN-511とのhES結合に強力に関与するインテグリン受容体を特定するために、本出願人らは接着ブロッキングアッセイを実施した。胚性細胞の単細胞懸濁液をLN-511被覆皿上で種々のインテグリン受容体に対する機能阻害抗体を含む培地中でインキュベートした。試験したすべてのインテグリンサブユニットのうち、α6及びβ1は、これらの条件下でLN-511との相互作用に関与する最も重要なものであった図5a。単細胞懸濁液はヒトES細胞に有利な状態ではないので、実験を3回繰り返して、同じ結果を得たデータ示さず。最近、α6β1は、hES細胞表面で最も豊富なインテグリンアイソフォームであることが示された。hES細胞表面のインテグリンサブユニット量の問題に更に対処するために、本出願人らは、抗インテグリン抗体をプラスチック表面に固定し、付着したhES細胞に結合し、それを保持することができる抗体を特定した。本出願人らは、β1インテグリンサブユニットに対する抗体が最強の接着を与えるものの、β2、β3及びβ4に対する抗体が、表面にはるかに弱く付着した細胞を保持することを見いだしたβ1に対する抗体との接着に比べてそれぞれ19、4及び4図5b。免疫蛍光染色によって、未分化Sox2陽性hES細胞におけるα6及びβ1インテグリンサブユニットの発現、及び細胞表面のそれらの共存が確認された図5c。D.ヒトES細胞は、異種を含まない既知組成培地におけるヒト組換えLN-511上で少なくとも4か月自己複製する。LN-511の自己複製支援能力を試験するために、本出願人らは、3種類のhES細胞系をO3及びH3培地で培養した。HS207、HS420及びHS401細胞系は、両方の培地で活発に増殖した。通常、細胞は、小塊で6~7日ごとに1:2又は1:3の比で継代されたが、多数の細胞が必要な場合は、1:6の比で継代することができた。細胞は、両方の培地で類似した増殖速度及び表現型を示した。図6aに示すように、LN-511上のヒトES細胞は、少なくともMatrigel上で成長した細胞と同じ安定した速度で増殖した。記述時点で、HS420、HS207及びHS401系は、O3培地においてそれぞれ28、27及び25継代であった培養5~6か月。核型は、20継代後の全3種類の系で正常であった図9。HS420及びHS207系は、それまで、H3においてそれぞれ29及び27継代増殖した5か月。免疫蛍光及びRT-PCR分析によれば、hES細胞は、Oct4、Nanog、Sox2などの多能性マーカーの高い発現レベルを維持した図6b及び6c。hES細胞を継代するときには、それらは、単細胞懸濁液としてではなく、小塊でプレーティングされた。興味深いことに、翌日既に細胞は表面に単層として拡散したごく薄い円板状。これは、LN-511被覆表面との親和性が細胞間接着に匹敵する、又はそれよりもさらに高いことを示唆している。通常、96ウェル培養プレート上にプレーティングされると、細胞は、まず、薄いコンフルエントな層を形成し、その後、細胞の上方に成長することによって細胞層を形成し始めた。LN-511上の単層とフィーダー又はMatrigel上で成長する細胞には差があり、細胞はより不均質であり、より高濃度のコロニー状で出現した。定性的にでも、安定な増殖速度を有するOct4及びSox2陽性細胞は、多能性を失い得る。特定の多能性マーカーの発現を定量するために、本出願人らは、LN-511上で培養されたhES細胞の試料を異なる時点で収集し、実時間定量RT-PCR及び定量ウエスタンブロット分析を使用して、主な多能性マーカーの発現レベルをMatrigel上又はフィーダー細胞層上で培養された細胞と比較した図6d及び6e。実時間定量RT-PCRによれば、両方の培地で培養されたhES細胞のOct4及びNanog発現レベルは、時間とともに低下せず、Matrigel上で培養された細胞よりも安定して高く、フィーダー細胞上で培養された細胞の発現レベルに匹敵した。ウエスタンブロットの定量は、Oct4及びSox2で類似した結果を示した。蛍光活性化細胞選別FACSによるLN-511上で培養された細胞の分析によれば、大多数の細胞は、多能性のマーカーOct-4、SSEA-4、TRA1-60及びTRA1-81を発現し、同時に、SSEA-1を微量しか発現しない図6f、図10。Matrigel上で培養されたヒトES細胞の同様の分析によって、わずかに少ないOct-4及びSSEA-4陽性細胞が明らかになった図11。LN-511、Matrigel及びフィーダー上のhES培養物における自発的分化レベルを評価するために、本出願人らは、分化マーカーPax6、Sox17及びSox7の発現レベルを比較した。実時間定量RT-PCRによって、20継代4か月後のLN-511培養物と4継代1か月後のMatrigel培養物における全3種類のマーカーの発現レベルが類似していることが明らかになった図12。LN-511が新しいhES細胞系の誘導に有用であり得るかどうかを試験するために、本出願人らは、3個の6日目の胚盤胞の内部細胞塊を単離し、それをLN-511上にプレーティングした。細胞は、コーティングに容易に付着し、hES細胞に典型的な増殖物outgrowthを生じた図13a。培養10日後、増殖物を小片に機械的に解離させ、その一部を免疫染色すると、多能性のマーカーNanog及びOct4の発現を示した図13b及び13c。実験は、倫理委員会の承認に従って実施された。E.ヒトES細胞は、LN-511上での培養4か月後にヒト胚の全3種類の生殖系列に分化することができる。O3培地においてLN-511上で15、20及び20継代培養されたHS207、HS420及びHS401細胞、並びにH3培地において23継代培養されたHS207細胞は、重症複合免疫不全マウスSCIDの精巣に移植後、奇形腫を形成した。染色切片の分析によって、細胞がヒト胚の全3種類の生殖系列の細胞に分化する能力が確認された図7a~7d。発生の可能性を更に調べるために、O3培地においてLN-511上で20継代後の全3種類のhES系の細胞を、胚様体の形成及びそれに続く全3種類の胚性胚葉のマーカーの免疫染色によってインビトロで調べた。染色によって、中胚葉平滑筋アクチン、外胚葉ネスチン及びMAP-2及び内胚葉α-フェトプロテインマーカーの発現が明らかになった図7e。これは、細胞の多能性の更なる証拠である。F.LN-511上の種々のヒトES細胞系自己複製LN-511が種々のhES系の自己複製を支援することができるかどうか判定するために、本出願人らは、O3又はmTeSR1培地におけるタンパク質上で培養された、十分に特徴づけられ、広く用いられるH1及びH9hES系を培養した。H1及びH9細胞の表現型及び増殖速度は、同じ条件下でHS207、HS420及びHS401細胞と類似した。免疫蛍光分析によれば、LN-511上の培養5継代1か月後、H1及びH9細胞は、Oct4、Nanog、Sox2などの多能性マーカーの発現を維持した図8。III.考察本試験によれば、LN-511は、異種を含まない環境における培養においてヒトES細胞の生存及び自己複製を支援する人工的微小環境を少なくとも20継代又は4か月提供した。重要なことには、細胞は、その長期のLN-511上の培養後に、ヒト胚の全3種類の生殖系列の細胞系譜を含む奇形腫を形成した。異種もフィーダーも含まない既知組成hES細胞培養システムが大いに必要とされるので、本明細書に記載のシステムは、その問題の解決策を提供することができる。LN-511は、このタンパク質がヒトES細胞の天然の起源である胚盤胞の内部細胞塊において検出されたので、ヒト胚における幹細胞の自然微小環境の一部である可能性がある。さらに、LN-511は、インビトロでフィーダー細胞上で培養されたヒト胚性幹細胞のコロニー中で発現される。さらに、ヒトES細胞はLN-511自体を発現し図4c、このタンパク質はES細胞の構築を促進する。これは、フィーダー細胞層上のその自己複製に極めて重要である。LN-511は、hES細胞の自然環境の一部であるので、ヒトES細胞をインビトロで自己複製するための生物学的に関連したコーティング基質を提供することができる。最近、hES細胞がLN-111、LN-332、LN-511などの幾つかの組換えヒトラミニン上で96時間多能性のままでいることが報告された。しかし、マウスES細胞を使用した以前の研究によれば、ES細胞自己複製に対する基質分子の能力を実証するために、細胞をより長く培養することが重要である。該研究では、マウスES細胞は、LN-511とLN-332の両方で少なくとも169日間生存し、増殖したが、LN-511上で培養されたマウスES細胞のみが生殖細胞系に適格なキメラマウスを生成することができた。hES細胞が、新しいLN-511被覆プレートに塊状で継代された後、単層を形成する傾向にあったことは興味深い。これは、LN-511が、通常、移動可能なヒトES細胞を与え、したがって可溶性栄養素及び増殖因子の移動が困難な高密度多層クラスターの形成を回避できることを示唆している。LN-511上で培養されたhES細胞に対する可溶性因子の利用能は、フィーダー又はMatrigel上で培養したときに過成長したES細胞コロニーの中央部で通常見られる自発的分化及び死亡を回避するのに役立ち得る。hES細胞の単層は、可溶性因子の同等の利用能によってより均質な分化細胞集団を生成することができるので、分化手順の開発にも有益であり得る。ヒトES細胞の集団はすべて、恐らくは自発的分化に帰因するある割合の分化細胞を含む。人工的微小環境は、それにコロニーを形成し、自己複製するために、非分化ヒトES細胞に競合の優位性を与えるべきである。本出願人らは、実験中にポジティブ選択を行わなかったが、それでも、本出願人らは、FACSを使用して、未分化ヒトES細胞の割合が実験全体を通して安定で高いことを示した図6f。本出願人らは、LN-511へのヒトES細胞の付着機序が、α6β1インテグリン受容体との結合にも大きく依存することを示した図5a。さらに、本出願人らは、β1インテグリンに対する抗体がβ2、β3又はβ4インテグリンよりも強力なヒトES細胞の付着を支援することを認めた。これは、細胞接着におけるβ1含有インテグリンの枢要な役割を強調するものである図5b。最近、α6β1は、hES細胞表面24で最も豊富なインテグリンアイソフォームであることが判明した。これらの観察に基づいて、本出願人らは、α6β1インテグリンを多量に発現するヒトES細胞が、素早く付着し、LN-511被覆表面に効率的に移動することができ、その結果LN-511被覆表面はそれらの自己複製を促進することを示唆する。したがって、LN-511の役割は、ヒトES細胞に表面との限局的な接着接触点を与え、その上の移動を可能にすることかもしれない。LN-511の発現が初期胚に限定されず、多数の成体組織の基底膜において見られるという事実は、この考えを支持するものである。時間的に、LN-511被覆実験プレート上のヒトES細胞自己複製で得られた本結果は、マウスEHS肉腫由来のMatrigel又はヒトフィーダー細胞上で得られたものと少なくとも同程度に良好である。しかし、ヒトLN-511コーティングの完全に既知組成の、異種を含まない組成物は、標準化された不変の科学的な将来の臨床応用の観点から、かなりの利点を有し得る。さらに、既知組成基層は、同じ目的でフィーダー細胞を使用するのと比較して主要な利点である。というのは、フィーダー細胞は、サイトカインなどの生理活性分子のその産生が変動し得るものであり、増殖因子及び他のタンパク質はほとんど未知であり、それらは、微生物及びウイルス混入のリスク、並びに結果におけるバッチ間のばらつきも引き起こし得る。したがって、この研究において記述されるLN-511に基づく異種もフィーダーも含まないヒトES細胞培養システムは、この問題の重要な解決策となり得る。大部分の国では、規制当局が、ヒト療法への使用が意図されたあらゆる試薬に厳格な規則を適用する。ヒト組換えLN-511は、ヒト細胞において産生される既知組成のタンパク質であるので、細胞療法用ヒト細胞の開発に適切なタンパク質を生産することができる製造手順を確立することが可能である。製造は、医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準GMPの実験室に容易に取り入れることができる。TeSR1培地は、Matrigelと併用するために処方された。それは、多数の増殖因子を極めて高濃度で含む。LN-511は、hES細胞のより良好な拡散及び主要な多能性マーカーの高い平均発現を与えたので、増殖因子、特にbFGFの用量を削減するために、培地組成を最適化する可能性を広げる。Matrigelとは異なり、LN-511は、バッチごとのコーティングで安定である規定された均質なタンパク質分子である。hES細胞をインビトロで培養する、より規定された環境の使用は、分化の分子機構を明らかにし、理解するのに役立ち、インビトロでのヒトES細胞の分化経路を設計するためのより制御可能な条件を提供することができる。特定の実施形態を記述したが、現在予期しない又はし得ない代替形態、改変形態、変更形態、改善形態及び実質的均等形態が本出願人ら又は他の当業者に生じ得る。したがって、提出された、さらに、補正され得る、添付の特許請求の範囲は、かかる代替形態、改変形態、変更形態、改善形態及び実質的均等形態すべてを包含するものとする。"