"アミノ酸配列X0X1X2X3を含み、ここでX0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、LもしくはKまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHである、単離されたペプチド。ペプチドがアミノ酸配列X1X0X1X2X3X4を含み、ここでX-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、LもしくはKまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである、請求項1記載のペプチド。ペプチドがNX1IK、NX1VK、NX1IR、NX1VR、NX1IHおよびNX1VHからなる群より選ばれるアミノ酸配列を含み、ここでX1はA、S、F、T、Yである、請求項1記載のペプチド。ペプチドがファミリー1のペプチド図1からなる群より選ばれる、請求項1記載のペプチド。ペプチドの少なくとも1のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項4記載のペプチド。ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項1記載のペプチド。ペプチドがDkk1とLRPの結合を阻害するが、Wnt9BとLRP6の結合を阻害しない、請求項1記載のペプチド。ペプチドがLRP6のE1βプロペラに結合する、請求項1記載のペプチド。ペプチドがLRP6のE1βプロペラのアミノ酸残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141およびN185の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11またはすべてと相互作用する、請求項8記載のペプチド。アミノ酸配列:X0X1X2X3を含み、ここでX0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHである、単離された環状ペプチド。環状ペプチドがアミノ酸配列X-1X0X1X2X3X4を含み、ここでX-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである、請求項10記載の環状ペプチド。環状ペプチドがNX1IK、NX1VK、NX1IR、NX1VR、X1IHおよびNX1VHからなる群のアミノ酸配列を含み、ここでX1はF、Y、L、A、RまたはSである、請求項10記載の環状ペプチド。ペプチドがファミリー2のペプチド図2からなる群より選ばれる、請求項10記載の環状ペプチド。ペプチドの少なくとも1のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される、請求項13記載の環状ペプチド。ペプチドがアミノ酸アナログを含む、請求項10記載の環状ペプチド。ペプチドがDkk1とLRPの結合を阻害するが、Wnt9BとLRP6の結合を阻害しない、請求項10記載の環状ペプチド。ペプチドがLRP6のE1βプロペラに結合する、請求項10記載の環状ペプチド。ペプチドがLRP6のE1βプロペラのアミノ酸残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141およびN185の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11またはすべてと相互作用する、請求項10記載の環状ペプチド。アミノ酸配列:X-1X0X1X2を含み、ここでX-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDまたはEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMである、単離されたペプチド。ペプチドがアミノ酸配列:X-2X-1X0X1X2X3を含み、ここでX-2はV、I、LまたはFであり;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDまたはEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである、請求項19記載のペプチド。ペプチドがファミリー3のペプチド図3からなる群より選ばれる、請求項19記載のペプチド。ファミリー4のペプチド図4からなる群より選ばれる、単離されたペプチド。試験化合物をLRP6またはその機能的等価物に接触させることと、Dkk1とLRP6との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とLRP6またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がDkk1とLRP6との相互作用を阻害することを示し、ここでペプチドリガンドがaファミリー1図1;bファミリー2図2;cファミリー3図3;およびdファミリー4図4のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、Dkk1とLRP6との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項23記載の方法。試験化合物をLRP5またはその機能的等価物に接触させることと、Dkk1とLRP5との相互作用を阻害するペプチドリガンドの存在下および不在下で、試験化合物とLRP5またはその機能的等価物との結合度を決定することを含み、ここでペプチドリガンドの存在下または不在下での結合度の変化は、試験化合物がDkk1とLRP5との相互作用を阻害することを示し、ここでペプチドリガンドがaファミリー1図1;bファミリー2図2;cファミリー3図3;およびdファミリー4図4のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む、Dkk1とLRP5との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法。ペプチドリガンドが検出可能な標識で標識される、請求項25記載の方法。一般的技術本発明の実施は、特に明記しない限り、当分野の範囲内である、分子生物学組換え技術を含む、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の一般的な技術を使用する。これらの技術は、MolecularCloningALaboratoryManual第2版OligonucleotideSynthesisAnimalCellCultureMethodsinEnzymologyCurrentProtocolsinMolecularBiologyPCRThePolymeraseChainReactionAPracticalGuidetoMolecularCloningなどの文献に詳細に説明されている。定義本発明の範囲内で用語アミノ酸とは、その最も広い意味で使用され、天然のLアミノ酸または残基を意味する。本明細書では天然のアミノ酸に一般的に使用される1文字および3文字の略号を使用するLehningerBiochemistry第2版pp7192を参照されたい。単離された核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、もともと核酸分子を含有する細胞に含まれる核酸分子を含むが、この核酸分子は、染色体外か、またはその天然の染色体位置とは違う染色体位置に存在する。本明細書で使用されるベクターという用語は、連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を指すと意図される。ベクターの一タイプはプラスミドであり、付加的なDNAセグメントがライゲートされうる円形の二本鎖DNAループを指す。ベクターの別のタイプは、ファージベクターである。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノムにライゲートさせうる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製できる例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター。他のベクター例えば、非エピソーム哺乳動物ベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、特定のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは組換え発現ベクターまたは単に組換えベクターと呼ぶ。一般に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、本明細書ではプラスミドとベクターは交換可能に使用されうる。本明細書で交換可能に使用されるポリヌクレオチドまたは核酸は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、DNAおよびRNAが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および/またはそれらのアナログ、またはDNAもしくはRNAポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの会合前または後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識を用いたコンジュゲートなどにより、合成後さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えばキャップcap、アナログとの天然のヌクレオチドの1または複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等および荷電連結ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリLリジン等を含むもの、インターカレーターintercalatorを有するもの例えばアクリジン、ソラレン等、キレート剤例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの例えばアルファアノマー核酸等、ならびにポリヌクレオチド類の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホネート基、ホスフェート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、または付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、または固体もしくは半固体担体にコンジュゲートされてもよい。5’および3’末端のOHはホスホリル化可能であり、または1~20の炭素原子を有する有機キャップ基部分またはアミンで置換することもできる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、当分野で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば2’Oメチル、2’Oアリル、2’フルオロまたは2’アジドリボース、炭素環式糖アナログ、アルファアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび例えばメチルリボシドなどの非塩基性ヌクレオシドアナログが含まれる。1または複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスフェートがPS、PS、NR2、PR、POR’、COまたはCH2と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのRおよびR’は独立して、Hか、またはエーテルO連結を含みうる置換もしくは未置換のアルキル、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルaraldylである。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。先の記述は、RNAおよびDNAを含む本明細書で引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは一般に、短く、一般に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約200未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドなる用語は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記記載はオリゴヌクレオチドと同等かつ十分に適用可能である。LRP6という用語は、本明細書では、特に明記しない限りは霊長類例えばヒトや齧歯類例えばマウスやラットなどの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然LRP6を指す。この用語は、完全長の未処理LRP6ならびに細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のLRP6を包含する。この用語はまた、例えばスプライスバリアントやアレルバリアントなどの天然のLRP6バリアントも含有する。例示的ヒトLRP6のアミノ酸配列がNCBI受託番号AAI43726、StrausbergRLらProcNatlAcadSciUSA991689916903ChenMらJBiolChem2843504035048に提供されている。LRP5という用語は、本明細書では、特に明記しない限りは霊長類例えばヒトや齧歯類例えばマウスやラットなどの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然LRP5を指す。この用語は、完全長の未処理LRP5ならびに細胞内のプロセシングから生じる任意の形態のLRP5を包含する。この用語はまた、例えばスプライスバリアントやアレルバリアントなどの天然のLRP5バリアントも含有する。例示的ヒトLRP5のアミノ酸配列がNCBI受託番号O75197、HeyPJらGene216103111に提供されている。本明細書で使用される治療および治療する治療しているなどの文法的変化形は、治療されている個体の自然な経過を改変するための臨床的介入を意味し、予防のためまたは臨床病理の経過で実施できる。治療の望ましい効果には、限定ではなく、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な任意の病的結果の軽減、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の寛解緩解または緩和、緩解およびまたは予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の化合物は疾患の発症または進行を遅らせるために用いられる。抗体および免疫グロブリンという用語は、最も広い意味で交換可能に使用され、モノクローナル抗体例えば全長または無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいての二重特異性抗体を含み、また特定の抗体断片本明細書で詳述を含みうる。抗体はヒト、ヒト化および/または親和性成熟でありうる。抗体断片は完全な抗体の一部分のみを含み、当該一部分は、完全なインタクトな抗体に存在する場合の当該一部分に通常関連する機能の少なくとも1つの、好ましくはその機能のほとんどまたはすべてを保持することが好ましい。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含むので、抗原結合能を保持する。別の実施態様では、抗体断片、例えばFc領域を含むものは、完全な抗体に存在する場合のFc領域に通常関連する生物学的な機能、例えばFcRn結合、抗体半減期の調節、ADCC機能および補体結合の少なくとも1つを保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似のインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるFc配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。本明細書で使用されるモノクローナル抗体という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、少量で存在しうる、自然に生じる可能性のある変異を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原に対する。さらに、異なる決定基エピトープに対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と違って、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。本明細書では、モノクローナル抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同性があり、鎖の残りの部分が、他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるキメラ抗体、ならびに所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む米国特許第4816567号およびMorrisonら、ProcNatlAcadSciUSA8168516855。非ヒト例えばマウス抗体のヒト化形とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種ドナー抗体の超可変領域の残基で置換されたヒト免疫グロブリンレシピエント抗体である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域FR残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の能力をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、典型的には2つの全可変ドメインを実質的に含み、ここで全てまたはほとんど全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全てまたはほとんど全てのFRがヒト免疫グロブリン配列である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域Fc、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含みうる。さらなる詳細は、JonesらNature321522525RiechmannらNature332323329およびPrestaCurrOpStructBiol2593596を参照されたい。また、以下のレビュー文献およびその引用文献も参照されたい:VaswaniおよびHamiltonAnnAllergyAsthmaImmunol1105115HarrisBiochemSocTransactions2310351038HurleおよびGrossCurrOpBiotech5428433。ヒト抗体は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、および/または本明細書中に開示のヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用してつくられたものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除く。親和性成熟抗体は、その1または複数のCDRに1または複数の変更を有する抗体であり、そのような変更をもたない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当分野において既知の方法で生産される。Marksらは、BioTechnology10779783で、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和性成熟を開示している。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダムな変異誘発が、BarbasらProcNatAcadSciUSA9138093813SchierらGene169147155YeltonらJImmunol15519942004JacksonらJImmunol15433109およびHawkinsらJMolBiol226889896に開示されている。疾患は、本発明の物質/分子または方法を用いた治療の恩恵を受ける任意の症状である。これには慢性および急性の疾患や疾病が含まれ、哺乳動物が当該疾患の素因を有するような病的状態も含まれる。本明細書で治療される疾患の非限定的な例は、Wntシグナルで活性化または阻害されるプロセスの疾患も含む。このようなプロセスの例として、様々な癌タイプにおける細胞増殖、細胞運命特定および幹細胞の自己再生や、発達プロセスなどが挙げられる。本発明の化合物は、例えば、Wntに媒介される骨や骨格系の疾患の治療に有用である。本発明の化合物を使用して治療可能な骨格または骨の疾患の例として、骨粗鬆症、変形性関節症、骨折および骨病変ならびに様々な形態の骨変性などが挙げられる。細胞増殖性疾患および増殖性疾患という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を指す。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。本明細書で用いられる腫瘍は、悪性または良性に関わらず全ての腫瘍形成細胞の成長および増殖、および全ての前癌性および癌性の細胞および組織を意味する。癌、癌性、細胞増殖性疾患、増殖性疾患および腫瘍なる用語は本明細書では相互排他的ではない。癌および癌性という用語は、典型的には、未制御の細胞成長/増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記述する。癌の例には、限定ではなく、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。このような癌の具体例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌livercancer、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌livercancer、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌hepaticcarcinomaおよび様々なタイプの頭部および頸部の癌が含まれる。有効な量とは、所望の治療または予防結果を得るのに必要な用量および時間での効果的な量を指す。本発明の物質/分子、アゴニストまたはアンタゴニストの治療的に有効な量は、個体の疾患ステージ、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力などの要因により変わりうる。治療に有効な量はまた、物質/分子、アゴニストまたはアンタゴニストの任意の毒性または有害な効果を治療的に有益な効果が上回るものである。予防的に有効な量とは、必要な用量および期間で所望の予防結果を得る効果的な量を意味する。典型的には、ただし必要ではないが、予防用量は疾患の初期のステージまたはその前の患者に用いるので、治療有効量よりも少ないであろう。本明細書で用いられる細胞傷害性剤という用語は、細胞の機能を阻害または阻止し、および/または細胞破壊をもたらす物質を指す。この用語は、放射性同位体例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32およびLuの放射性同位体、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイドビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロランブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター、核溶解性酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、小分子毒素または細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素などの毒素とそれらの断片および/またはバリアント、および以下に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞傷害性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は腫瘍細胞の破壊をもたらす。化合物と方法DickkopfDkkおよびWISE/スクレロスチンSOSTのタンパク質ファミリーは、その共受容体であるLRP5およびLRP6との結合を直接Wntと競うことで、Wnt/βカテニンシグナル経路を阻害する。本明細書では、DKK1とLRP5および/またはLRP6との相互作用を調節する化合物およびSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を調節する化合物を提供する。いくつかの実施態様では、化合物はDkk1およびSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を調節する。一実施態様では、化合物はDKK1とLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する。一実施態様では、化合物はSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する。一実施態様では、化合物はDkk1およびSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する。一実施態様では、化合物はLRP6との結合をDkk1と競う。一実施態様では、化合物はLRP6との結合をSOSTと競う。一実施態様では、化合物はLRP5との結合をDkk1と競う。一実施態様では、化合物はLRP5との結合をSOSTと競う。一実施態様では、化合物はLRP6のDkk1結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はLRP6のSOST結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はLRP5のDkk1結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はLRP5のSOST結合部位に結合する。一実施態様では、化合物はLRP6のE1βプロペラに結合する。一実施態様では、化合物はLRP5のE1βプロペラに結合する。一実施態様では、化合物はLRP6のE1βプロペラのアミノ酸残基R28、E51、D52、V70、S71、E73、L95、S96、D98、E115、R141およびN185の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11またはすべてと相互作用する。一実施態様では、化合物はLRP5のE1βプロペラのアミノ酸残基R28、E63、D64、V82、S83、E85、V108、S109、D111、E128、R154およびN198の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11またはすべてと相互作用する。Dkk1またはSOST結合領域に直接結合することにより、化合物は、Dkk1およびSOSTの結合と関連するWnt経路シグナル調節を標的化して行うことを可能にする。一実施態様では、化合物は、Dkk1のLRP5またはLRP6との結合に関連するWnt経路シグナルを調節する。一実施態様では、化合物は、SOSTのLRP5またはLRP6との結合に関連するWnt経路シグナルを調節する。一実施態様では、化合物は、セロトニン経路を調節することなく、Dkk1および/またはSOSTのLRP5またはLRP6との結合に関するWnt経路シグナルを調節する。いくつかの実施態様では、化合物は、Dkk1のLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害するが、WntのLRP5またはLRP6との相互作用は阻害しない。いくつかの実施態様では、化合物は、SOSTのLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害するが、WntのLRP5またはLRP6との相互作用は阻害しない。一実施態様では、WntはWnt3aである。一実施態様では、WntはWnt9bである。この選択的阻害は、Wntシグナル経路が阻害剤Dkk1またはSOSTに阻害されるのを阻止しながらも、Wnt分子による経路の刺激を可能にするのに役立つ。結果として、化合物は、Wnt経路と関連する骨成長および修復を促進するのに役立つ。いくつかの実施態様では、化合物は、例えば骨粗鬆症、リューマチ性関節炎、例えば多発性骨髄腫などの癌を含む数々の条件により生じうる骨分解または変性など、骨成長促進の恩恵を受けうる様々な骨格疾患の治療や、低骨密度または低骨強度と関連する骨折や他の骨疾患の治療に用いられる。本発明の一態様では、化合物はペプチドである。一実施態様では、化合物は直鎖状ペプチドである。一実施態様では、直鎖状ペプチドは3から100、3から50、3から30、3から20、3から10、3から9、3から8、3から7、3から6、3から5または3から4のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、直鎖状ペプチドは4から10、5から8、6から7のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、直鎖状ペプチドは3、4、5、6、7、8、9または10のアミノ酸長さを有する。別の実施態様では、化合物は環状ペプチドである。ある実施態様では、環状ペプチドは5から100、5から50、5から30、5から20、5から10、7から20、7から17、7から16、7から17、7から18、7から19または7から20のアミノ酸長さを有する。一実施態様では、環状ペプチドは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20のアミノ酸長さを有する。別の実施態様では、ペプチドは構築されたstructuredペプチドであるか、または標的との結合の不在下で明白なコンホメーションをとるペプチドアドプティブペプチドである。ペプチドがとるこのコンホメーションは、結合状態構造のペプチドのコンホメーションと似ている。いくつかの実施態様では、構築されたペプチドまたはアドプティブペプチドは、不定形のunstructuredペプチドと比べて高い治療効果がある。一実施態様では、構築されたペプチドまたはアドプティブペプチドは、不定形のペプチドと比べて、高い標的結合性、高い安定性および高いバイオアベイラビリティーといった特徴を1つまたは複数有する。一態様では、本発明は,アミノ酸配列:X0X1X2X3を含むファミリー1の直鎖状ペプチドを提供し、ここでX0はアスパラギンN残基である。ファミリー1のペプチドは、LRP6のE1βプロペラに結合する。いくつかの実施態様では、ファミリー1のペプチドはまた、LRP5に結合する。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はKである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はVであり;X3はK、RまたはHである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIであり;X3はKである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIであり;X3はRである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はVであり;X3はKである。一実施態様では、X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はVであり;X3はRまたはHである。別の実施態様では、ファミリー1の直鎖状ペプチドはさらにX0X1X2X3の両側に付加アミノ酸を含む。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列:X-1X0X1X2X3X4を含むファミリー1のペプチドを提供し、ここでX0はNである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はKであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列:X-1X0X1X2X3X4X5を含むファミリー1のペプチドを提供し、ここでX0はNである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はA、S、F、T、Y、L、KまたはRであり;X2はIまたはVであり;X3はKであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、ファミリー1のペプチドは、NX1IK、NX1VK、NX1IR、NX1VR、NX1IHおよびNX1VHからなる群より選ばれるペプチドを含み、ここでX1はA、S、F、T、Y、RまたはKである。例示的ファミリー1のペプチドを図1に示す。別の態様では、本発明はアミノ酸配列:X0X1X2X3を含むファミリー2の環状ペプチドを提供し、ここでX0はNである。ファミリー2のペプチドはLRP6のE1βプロペラに結合する。いくつかの実施態様では、ファミリー2のペプチドはまた、LRP5に結合する。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はKであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIであり;X3はKである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIであり;X3はRである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はVであり;X3はKである。一実施態様では、X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はVであり;X3はRである。別の実施態様では、ファミリー2の環状ペプチドはさらにX0X1X2X3の両側に付加アミノ酸残基を含む。一実施態様では、本発明はアミノ酸配列:X-1X0X1X2X3X4を含むファミリー2の環状ペプチドを提供し、ここでX0はNである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はKであり;X4はF、T、Y、LまたはVである。別の実施態様では、本発明はアミノ酸配列:X1X0X1X2X3X4X5を含むファミリー1のペプチドを提供し、ここでX0はNである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIであり;X3はK、RまたはHであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、X-1はP、S、CまたはGであり;X0はNであり;X1はF、Y、L、A、RまたはSであり;X2はIまたはVであり;X3はKであり;X4はF、T、Y、LまたはVであり;X5はF、T、Y、LまたはVである。一実施態様では、ファミリー2のペプチドはNX1IK、NX1VK、NX1IR、NX1VR、NX1IHおよびNX1VHからなる群より選ばれるペプチドを含み、ここでX1はF、Y、L、A、RまたはSである。例示的ファミリー2のペプチドを図2に示す。別の態様では、本発明はアミノ酸配列:X-1X0X1X2を含むファミリー3の直鎖状ペプチドを提供し、ここでX0はDまたはEであり、X2はMである。ファミリー3のペプチドはLRP5のE1βプロペラに結合する。いくつかの実施態様では、X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDまたはEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMである。一実施態様では、X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMである。一実施態様では、X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-1はFであり;X0はEであり;X1はIであり;X2はMであり;X3はWである。別の実施態様では、ファミリー3の直鎖状ペプチドはさらにX-1X0X1X2の両側に付加アミノ酸残基を含む。一実施態様では、ファミリー3の直鎖状ペプチドはアミノ酸配列:X-2X-1X0X1X2X3を含み、ここでX0はDまたはEであり、X2はMである。一実施態様では、X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDまたはEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-2はVであり;X-1はFであり;X0はEであり;X1はIであり;X2はMであり;X3はWである。別の実施態様では、本発明はアミノ酸配列:X-3X-2X-1X0X1X2X3,を含むファミリー3の直鎖状ペプチドを提供し、ここでX0はDまたはEであり、X2はMである。一実施態様では、X-3はH、F、NまたはQであり;X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDまたはEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-3はH、F、NまたはQであり;X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はDであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-3はH、F、NまたはQであり;X-2はV、I、LまたはF;X-1はW、L、Y、FまたはIであり;X0はEであり;X1はF、W、I、SまたはYであり;X2はMであり;X3はW、M、AまたはGである。一実施態様では、X-3はHであり;X-2はVであり;X-1はFであり;X0はEであり;X1はIであり;X2はMであり;X3はWである。例示的ファミリー3のペプチドを図3に示す。別の態様では、本発明はファミリー4の環状ペプチドを提供する。ファミリー4のペプチドはLRP5のE1βプロペラに結合する。いくつかの実施態様では、本発明は図4に示すファミリー4のペプチドを提供する。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドは100uM未満、50uM未満、20uM未満、10uM未満、5uM未満、1uM未満、0.5uM未満、0.1uM未満または0.01uM未満のKdで標的に結合する。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドは100uM未満、50uM未満、20uM未満、10uM未満、5uM未満、1uM未満、0.5uM未満、0.1uM未満または0.01uM未満のIC50で標的に結合する。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドはアミノ酸アナログを含む。いくつかの実施態様では、本発明のペプチドはファミリー1、ファミリー2、ファミリー3および/またはファミリー4のペプチドを含み、ここでペプチドの少なくとも1のアミノ酸がアミノ酸アナログで置換される。アミノ酸アナログ置換の具体例として、限定ではなく、GluおよびAspの2アミノアジピン酸Aad;GluおよびAspの2アミノピメリン酸Apm;Met、Leuおよび他の脂肪族アミノ酸の2アミノ酪酸Abu;Met、Leuおよび他の脂肪族アミノ酸の2アミノヘプタン酸Ahe;Glyの2アミノイソ酪酸Aib;Val、LeuおよびIleのシクロヘキシルアラニンCha;ArgおよびLysのホモアルギニンHar;Lys、Arg、およびHisの23ジアミノプロピオン酸Dap;Gly、Pro、およびAlaのNエチルグリシンEtGly;Gly、Pro、およびAlaのNエチルグリシンEtGly;Asn、およびGlnのNエチルアスパラギンEtAsn;LysのヒドロキシリジンHyl;LysのアロヒドロキシリジンAHyl;Pro、Ser、およびThrの3および4ヒドロキシプロリン3Hyp、4Hyp;Ile、Leu、およびValのアロイソロイシンAIle;Argの4アミジノフェニルアラニン;Gly、Pro、およびAlaのNメチルグリシンMeGly、サルコシン;IleのNメチルイソロイシンMeIle;Metおよび他の脂肪族アミノ酸のノルバリンNva;Metおよび他の脂肪族アミノ酸のノルロイシンNle;Lys、ArgおよびHisのオルニチンOrn;Thr、Asn、およびGlnのシトルリンCitおよびメチオニンスルホキシドMSO;およびPheのNメチルフェニルアラニンMePhe、トリメチルフェニルアラニン、ハロFClBrまたはIフェニルアラニンまたはトリフルオリルフェニルアラニンが含まれる。本発明の化合物のより具体的な例として、オリゴヌクレオチドアプタマーでもよい、限定ではなくポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体および抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびこのような抗体または断片のキメラまたはヒト化バージョンならびにヒト抗体および抗体断片を含む抗体が含まれる。あるいは、化合物は、例えばLRP5またはLRP6を識別するが付加的効果は与えないDkk1またはSOSTの変異型で、したがって野生型Dkk1またはSOSTの作用を競合的に阻害するような関連タンパク質でもよい。上述したように、化合物は、いくつかの実施態様では、Dkk1またはSOSTの作用を阻害するがWnt分子とLRP5またはLPR6との作用は阻害しない。本発明の付加的な化合物は、Dkk1とLRP5および/またはLRP6との相互作用またはSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する小分子を含む。小分子の例として、限定ではなく、ペプチド様分子および合成非ペプチジル有機または無機化合物が含まれる。これらの小分子は、本明細書で述べる任意の1または複数のスクリーニングアッセイおよび/または当業者に公知の任意の他のスクリーニング技術により同定できる。本明細書で記載のように、本発明の化合物はペプチドでよい。このようなペプチドを得る方法は当分野では公知であり、適当な標的抗原のバインダーを求めてペプチドライブラリーをスクリーニングすることを含む。一実施態様では、適当な標的抗原はLRP5またはLRP6またはそのDkk1またはSOST結合領域を含む一部分を含み、これは本明細書に詳述されている。例えば、適当な標的抗原はLRP6またはLRP5のE1βプロペラである。ペプチドライブラリーは当分野では周知であり、技術的方法に従って調製することも可能である。例えば、Clarkらの米国特許第6,121,416号を参照されたい。ファージコートタンパク質などの異種タンパク質成分に融合されたペプチドライブラリーは当分野では周知であり、例えばClarkらのsupraに記載されている。第1のペプチドバインダーのバリアントは、対象となる特徴例えば標的結合親和性の向上、薬物動態の向上、毒性の低下、治療指数の向上などを得ることにより、ペプチドの変異体をスクリーニングして産生されうる。変異誘発技術は当分野では周知である。さらに、系統的変異導入技術アラニンスキャニングに基づくものなどは、ペプチド内の個々のアミノ酸残基の構造的および/または機能的重要性を評価するのに特に有用でありうる。ベクター構築本明細書のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はまた、標準的な組換え技術を使用して得られうる。所望のポリヌクレオチド配列は適切なソース細胞から単離され配列決定されうる。抗体のソース細胞は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞を含みうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を用いて合成されうる。獲得後、免疫グロブリンをコードする配列は、宿主細胞内で異種ポリヌクレオチドを複製および発現可能な組換えベクターに挿入される。本発明の目的には、入手可能な、当分野で既知の多くのベクターが使用可能である。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞のサイズに主として依存する。各ベクターは、その機能異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、またはその両方と、それが存在する特定の宿主細胞との適合性により、異なるコンポーネントを含有する。ベクターのコンポーネントは一般に、限定ではなく、複製開始点特にベクターが原核細胞に挿入される場合、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合領域RBS、シグナル配列、異種核酸挿入および転写終結配列を含む。一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコンおよびコントロール配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的には大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンAmpおよびテトラサイクリンTet耐性のコード遺伝子を含むので、形質転換細胞の同定を容易にする。pBR322、その誘導体または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージもまた、微生物が外来性タンパク質発現に使用できるプロモーターを含みうるか、または含むように変更されうる。加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコンおよびコントロール配列を含むファージベクターを、これら宿主と関連して、形質転換ベクターとして使用できる。例えば、λGEMTM11などのバクテリオファージを、大腸菌LE392などの感受性の宿主細胞の形質転換に使用可能な組換えベクターの作製に利用できる。当業者が確認できる特定の状況の必要性に従って、構成または誘導プロモーターの何れかを本発明で使用することができる。様々な潜在的な宿主細胞に認識される多数のプロモーターがよく知られている。選択したプロモーターは、制限酵素消化によって供給源DNA由来のプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を選択したベクターに挿入することで、本明細書記載のポリペプチドをコードするシストロンDNAに作用可能に連結できる。ネイティブのプロモーター配列と多数の異種プロモーターはいずれも標的遺伝子の増幅および/または発現の指令に使用されうる。しかし、異種プロモーターのほうがネイティブの標的ポリペプチドプロモーターよりも一般に転写活性が高く発現標的遺伝子の収量も高いので、より好ましい。原核生物宿主との使用に適したプロモーターには、PhoAプロモーター、βガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファンtrpプロモーター系およびtacまたはtrcプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、細菌において機能的な他のプロモーター例えば、他の既知のバクテリアまたはファージプロモーターも同様に適している。そのヌクレオチド配列は公開されているので、当業者は、リンカーまたはアダプターを用いてそれらを標的の軽鎖および重鎖をコードするシストロンに作用可能にライゲートさせて任意必要な制限部位を供給できるSiebenlistらCell20269。ある実施態様では、組換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドが膜を越えて転位置するのを指示する分泌シグナル配列コンポーネントを含む。一般に、シグナル配列はベクターのコンポーネントであってよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドDNAの一部であってもよい。本発明の目的に選択されるシグナル配列は、宿主細胞に認識されプロセスされるすなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される配列であるべきである。異種ポリペプチド本来のシグナル配列を識別もプロセスもしない原核生物の宿主細胞に対しては、シグナル配列を例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンIISTIIリーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpAおよびMBPからなる群より選択される原核生物のシグナル配列で置換する。ポリペプチドを発現させるのに好適な原核生物の宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物などの古細菌および真正細菌が挙げられる。有用な細菌の例としてはエシェリキア属例えば、大腸菌、桿菌例えば、枯草菌、腸内細菌、シュードモナス種例えば、緑膿菌、ネズミチフス菌、セラチアマルセスカンス、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌属、根粒菌、ビトレオシラ、またはパラコッカスが挙げられる。好ましくは、グラム陰性細胞が使用される。好ましくは、宿主細胞は最少量のタンパク分解性酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤を細胞培養物中に望ましくは導入してもよい。ポリペプチド産生宿主細胞を上述した発現ベクターで形質転換または形質移入し、プロモーターの誘導、形質転換体の選抜または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するよう改変した一般的な栄養培地で培養する。形質移入とは、任意のコード配列が実際に発現されようとされまいと、発現ベクターが宿主細胞に取り込まれることを指す。数多くの形質移入法が当業者に知られており、例えばCaPO4沈殿法および電気穿孔法がある。成功裏の形質移入は、一般に、このベクターの作用の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合に認識される。形質転換とは、DNAを原核生物の宿主に導入し、そのDNAが染色体外要素としてまたは染色体組込み体により複製可能になることを意味する。形質転換は、用いる宿主細胞に応じて、かかる細胞に適切な標準的技術を用いて行う。一般に、かなりの細胞壁バリアを含む細菌細胞には塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が使用される。別の形質転換法は、ポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の技術として電気穿孔法が用いられる。本発明のポリペプチドを生産するために用いられる原核細胞は、選択した宿主細胞の培養に適切な当分野で既知の培地中で増殖させる。適切な培地の例としては、必要なサプリメントを補填したルリアブロスLBが挙げられる。好ましい実施態様では、培地はまた、発現ベクターの構成を基に選択した選択剤も含み、発現ベクターを含有する原核細胞の選択的な増殖を可能にしてよい。例えば、アンピシリンを培地に加えて、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を増殖する。炭素、窒素および無機リン酸供給源の他に、任意必要なサプリメントも適当な濃度で、単独でまたは複合窒素源などの他のサプリメントもしくは培地との混合物として導入し含めてもよい。培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトールおよびジチオスレイトールからなる群より選択される1または複数の還元剤を含んでもよい。原核宿主細胞を適切な温度で培養する。例えば、大腸菌増殖の好ましい温度は約20°Cから約39°C、より好ましくは約25°Cから約37°Cの範囲であり、さらに好ましくは約30°Cである。培地のpHは、主として宿主生物に依存して、約5から約9の範囲の任意のpHでよい。大腸菌には、pHは好ましくは約6.8から約7.4であり、より好ましくは約7.0である。発現ベクターに誘導プロモーターを用いる場合には、タンパク質発現はプロモーターの活性化に適切な条件下で誘導される。例えば、転写制御にPhoAプロモーターを用いる場合、形質転換された宿主細胞は誘導のためにリン酸制限培地で培養されうる。用いられるベクター構築物によっては、当分野で周知のように、様々な他の誘導物質を用いてもよい。微生物中に発現される本明細書記載のポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌されそこから回収されうる。タンパク質回収は典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理または溶解といった手段による微生物の破壊を伴う。細胞を破壊したら、細胞細片または全細胞を遠心分離または濾過によって取り除くことができる。タンパク質は、例えば樹脂アフィニティークロマトグラフィーでさらに精製してもよい。あるいは、タンパク質は培養培地に移行され、そこから単離されうる。細胞は培養物および培養物上清から濾過され濃縮されて除去され、産生されたタンパク質がさらに精製されうる。発現されたポリペプチドはさらに単離され、一般的に既知の方法、例えば免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカまたはDEAEなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を使用してのゲル濾過;疎水性アフィニティー樹脂、マトリックスに固定した適切な抗原を使用するリガンドアフィニティおよびウェスタンブロットアッセイを使用してさらに単離、同定できる。原核宿主細胞の他に、真核宿主細胞系もまた当分野で十分に確立されている。適切な宿主にはCHOなどの哺乳動物細胞株および以下に記載の昆虫細胞が含まれる。ポリペプチド精製産生されたポリペプチドを精製して、更なるアッセイおよび用途のための実質的に均質な調製物を得ることができる。当分野で既知の標準的なタンパク質精製法を用いることができる。以下の手順は適切な精製手順の例である:免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカまたはDEAEなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDSPAGE、硫酸アンモニウム沈殿および例えばセファデックスG-75を使用してのゲル濾過。本発明の候補物質/分子の化合物がDkk1のLRP5および/またはLRP6との結合およびSOSTのLRP5および/またはLRP6との結合を阻害する能力は、実施例セクションに記載の、インビトロまたはインビボアッセイで化合物の調節能力を試験することで決定されうる。薬学的組成物および投与様式様々な化合物ペプチドなどを含むが治療剤として使用されうる。一実施態様は、本発明の化合物を含有する薬学的組成物または医薬および治療的に不活性な担体、希釈剤または賦形剤ならびにこのような組成物や医薬を調製するために本発明の化合物を使用する方法を提供する。一例では、化合物は、室温および適切なpHで、所望の純度で、生理的に許容可能な担体、すなわちガレノスgalenical投与形態で使用する用量と濃度でレシピエントに無毒の担体と混合して処方されうる。製剤のpHは主として化合物の特定の用途と濃度によるが、好ましくは、約3から約8の範囲の任意の値である。一例では、化合物は酢酸バッファー中pH5で処方される。別の実施態様では、化合物は無菌である。化合物は、例えば個体または非結晶の組成物として、凍結乾燥組成物として、または水溶液として保存されうる。化合物は優良医療規範に則った様式で処方され、服用され、投与される。この場合に考慮すべき要素には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の患者、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に既知の他の要素が含まれる。適用のための薬学的組成物または製剤は、薬剤の投与方法により、様々な方法で包装されうる。一般に、流通品は、適切な形態で薬剤が入れられた容器を含む。適切な容器は当業者には公知であり、瓶プラスチックおよびガラス、小袋、アンプル、ビニール袋、金属製シリンダーなどの物品を含む。容器はまた、包装内容物の不注意な使用を避けるために不正開封防止部を含んでよい。加えて、容器にはその内容物を記載したラベルを取り付けてよい。ラベルはまた、適切な警告を含みうる。徐放性製剤が調製されうる。徐放性製剤の適切な例は、化合物を含有する疎水性固形ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは、例えば薄膜やマイクロカプセルなどの成形された物品の形をとる。徐放性製剤の例は、ポリエステル、ヒドロゲル例えば2ヒドロキシエチルメタクリレート、またはポリ、ポリ酪酸、Lグルタミン酸およびガンマエチルLグルタメートのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテート、LUPRONDEPOTTMなどの分解性乳酸‐グリコール酸コポリマー乳酸‐グリコール酸コポリマーとリュープロリド酢酸塩からなる注入可能な微粒子およびポリD3ヒドロキシ酪酸を含む。一例では、非経口的に投与される本発明の化合物の用量当たりの治療的に効果のある量は、化合物1日当たり患者体重の約0.01~100mg/kg、あるいは約0.1から20mg/kgの範囲であり、化合物の典型的な開始使用範囲は0.3から15mg/kg/日である。別の実施態様では、錠剤やカプセルなどの経口ユニットの投与形態は、本発明の化合物を好ましくは約5~100mg含有する。本発明の化合物は、経口、バッカル頬側や舌下を含む局所的、直腸内、膣内、経皮、非経口、皮下、腹腔内、肺内、皮内、くも膜下内および硬膜外および鼻腔内、および局所治療に所望の場合は病巣内投与を含む任意適切な方法で投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。本発明の化合物は、例えば錠剤、粉末、カプセル、溶液、分散液、懸濁液、シロップ、スプレー、座薬、ゲル、乳濁液、パッチなどの任意一般的な投与形態で投与されうる。このような組成物は、例えば希釈物、担体、pH調整剤、甘味料、バルク剤および他の活性剤などの一般的な薬剤調製成分を含有しうる。典型的な製剤は、本発明の化合物と担体または賦形剤を混合して調製される。適切な担体と賦形剤は当業者には公知であり、詳細は例えばAnselHowardCらAnsel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystemsPhiladelphiaLippincottWilliamsWilkins2004GennaroAlfonsoRらRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyPhiladelphiaLippincottWilliamsWilkins2000およびRoweRaymondCHandbookofPharmaceuticalExcipientsChicagoPharmaceuticalPress2005に記載されている。製剤はまた、1または複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存料、酸化防止剤、オペーク剤、滑走剤、加工補助剤、着色料、甘味料、芳香剤、香味剤、希釈剤および薬剤すなわち本発明の化合物またはその薬学的組成物の外観を整えるか、または薬学的製品すなわち医薬の製造を補助する他の既知の添加剤を含みうる。適切な経口剤形の一例は、約90~30mgの無水乳糖、約5~40mgのクロスカルメロースナトリウム、約5~30mgのポリビニルピロリドンPVPK30および約1~10mgのステアリン酸マグネシウムと調合された本発明の化合物を約25mg、50mg、100mg、250mgまたは500mg含有する錠剤である。粉末成分を最初に混合し、次いでPVP溶液と混合する。得られた組成物は、一般的な装置を用いて乾燥、粒化され、ステアリン酸マグネシウムと混合されて錠剤形に圧縮されうる。エアロゾル製剤の一例は、例えば5~400mgの本発明の化合物を、例えばホスフェートバッファーなどの適切なバッファー溶液中に、所望ならば例えば塩化ナトリウムなどの塩などの等張化剤tonicifierを加え、溶解させて調製されうる。溶液は例えば0.2ミクロンのフィルターを用いて濾過され、不純物と混入物が除去されうる。したがって、一実施形態は、化合物またはその立体異性体または薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を含む。別の実施態様は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともに化合物またはその立体異性体または薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を含む。本明細書の製剤はまた、必要に応じて、治療される特定の適応症のため、好ましくは互いに有害な影響を与えない相補的活性を有する2以上の活性化合物を含有してよい。あるいは、または加えて、組成物は、例えば細胞傷害性薬物、サイトカイン、化学療法薬または増殖阻害剤などの、組成物の機能を増強する薬物を含みうる。このような分子は、意図する目的に有効な量で、組み合わせて適切に存在する。スクリーニング法別の態様では、本発明はDkk1および/またはSOSTとLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する化合物のスクリーニング法を提供する。方法は好ましくは、ただし必要ではないが、特異的にLRP5および/またはLRP6に結合して、Dkk1および/またはSOSTがこれらの受容体に特異的に結合するのを阻害する化合物のスクリーニングを含む。本発明は、Dkk1とLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する化合物およびスクレロスチンとLRP5および/またはLRP6との相互作用を阻害する化合物を同定するための候補または試験化合物をスクリーニングする方法を包含する。一実施態様では、化合物はWntシグナルを阻害しない。スクリーニングアッセイは、LRP5および/またはLRP6に結合するか複合する、またはLRP5および/またはLRP6とDkk1および/またはSOSTとの相互作用を阻害する化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化合物ライブラリーの高効率なスクリーニングを可能にし、特に小分子薬剤候補の同定に適するアッセイを含む。アッセイは、当分野で特徴が明らかにされている。タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞アッセイを含む様々なフォーマットで実施可能である。一実施態様では、アッセイは、候補化合物とLRP5またはLRP6またはその等価物との相互作用に十分な時間および条件下でこれら2種類の組成物を接触させることが必要である。一実施態様では、候補化合物はLRP6のE1のβプロペラドメインと接触させられる。一実施態様では、候補化合物はLRP5のE1のβプロペラドメインと接触させられる。結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は反応混合物中で単離または検出されうる。特定の実施態様では、候補化合物は例えばマイクロタイタープレートなどの固相に共有結合または非共有結合で固定される。非共有結合は一般に、固体表面を物質/分子の溶液でコートし乾燥させて得られる。あるいは、固定される物質/分子の特異的な抗体例えばモノクローナル抗体などの固定化親和性分子を用いて物質/分子を固体表面に固定してもよい。アッセイは、検出可能な標識で標識されうる非固定化コンポーネントを固定化コンポーネント例えば固定されたコンポーネントを含有するコート面に付加することにより実施される。反応が完了すると、反応しなかったコンポーネントは例えば洗浄などにより除去され、固体表面に固定された複合体が検出される。当初の非固定化コンポーネントが検出可能な標識をもつ場合、表面に固定化された標識の検出は、複合が生じたことを示す。もとの非固定化コンポーネントが標識をもたないところでは、例えば固定化複合体に特異的に結合する標識抗体を使用して、複合が検出されうる。別の実施態様では、候補化合物とLRP5もしくはLRP6またはLRP6のE1のβプロペラドメインもしくはLRP5のE1のβプロペラドメインなどその機能的等価部分の間の相互作用は、タンパク質-タンパク質相互作用を検出する周知の方法によって検定されうる。このようなアッセイには、従来の手法、例えば、架橋結合、同時免疫沈降法および勾配またはクロマトカラムによる同時精製が含まれる。加えて、ChevrayおよびNathansProcNatlAcadSciUSA8957895793に開示のFieldsと共同研究者ら記述FieldsおよびSongNature340245246;ChienetalProcNatlAcadSciUSA8895789582の酵母ベースの遺伝システムを用いて、タンパク質-タンパク質相互作用をモニターできる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化因子は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前記文献記載の酵母発現系一般にツーハイブリッドシステムと呼ばれるは、この特性を生かして2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、βガラクトシダーゼに対する色素生産性基質を用いて検出される。ツーハイブリッド技術を用いた2つの特定のタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定する完全なキットMATCHMAKERTMは、Clontech社から購入できる。この系はまた、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、ならびにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張使用できる。本発明の別の態様は、Dkk1またはSOSTとLRP5またはLRP6標的分子の相互作用を試験化合物が阻害する能力をスクリーニングするのに本明細書のペプチドを使用することを含むアッセイを提供する。LRP5またはLRP6標的分子は、完全長のLRP5またはLRP6分子ならびにLRP6のE1のβプロペラドメインもしくはLRP5のE1のβプロペラドメインなどのその機能的等価部分を含む。一実施態様では、アッセイは、本発明のペプチド、例えばファミリー1、ファミリー2、ファミリー3またはファミリー4のペプチドから選ばれるペプチドの存在下または不在下で、試験化合物とLRP5またはLRP6標的分子を接触させることを含む。このペプチドはアッセイのコンテキストではペプチドリガンドと呼ばれる。試験化合物がLRP5またはLPR6標的分子との結合を競合したり、LRP5またはLPR6標的分子からペプチドリガンドを追い出す場合は、試験化合物はDkk1またはSOSTと標的分子との相互作用を阻害する化合物として選択される。選択された試験化合物はさらに、本明細書記載の当分野では周知のアッセイを使用して、骨成長促進能などの特異的な所望の特徴、ならびにWntリガンドとLRP5またはLPR6標的分子を結合させる効果について評価できる。試験化合物がペプチドリガンドとLRP5またはLPR6標的分子の結合を阻害する能力は、当分野では周知の技術により評価されうる。標的分子、ペプチドリガンドまたは試験化合物のいずれかをアッセイ相互作用のモニタリングを容易にするために検出可能な標識で標識してよい。このような標識は、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、磁気粒子、染料、金属粒子、酵素などを含む。このような標識の例として、限定ではなく、ビオチン、フルオレセイン、テキサスレッド、ルシファーイエローおよびローダミンが挙げられる。他の標識法は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼなどの酵素トレーサーを含む。このようなスクリーニングアッセイは、化合物ライブラリーの高効率なスクリーニングを可能にし、特に小分子薬剤候補の同定に適するアッセイを含む。意図される小分子は、合成有機または無機化合物を含む。アッセイは、当分野で特徴が明らかにされている、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイおよび細胞アッセイを含む様々なフォーマットで実施可能である。試験化合物は、例えばペプチド、ペプチドミメティック、ビニル性ペプトイドvinylogouspeptoidなどのペプトイド、ポリヌクレオチドまたは有機小分子などを含む任意のタイプの分子でよい。以下は本発明の方法と組成物の実施例である。上述の一般的な記載をふまえて、他の様々な実施態様が実施されうることを理解されたい。本明細書に引用される特許出願および公開を含むすべての文献は、その全体が参照として組み込まれる。実施例1材料と方法材料。高純度のWnt3a、Wnt9b、Dkk2、Dkk3およびDkk4を無担体タンパク質としてRDSystems社ミネソタ州ミネアポリスから入手し、結合および細胞アッセイに使用した。先述のように11、Dkk1、スクレロスチンおよびLRP6タンパク質をコードする遺伝子を、改変されたpAcGP67バキュロウイルスDNAトランスファーベクターBDPharmingenにクローニングし、Tni昆虫細胞ExpressionSystemsLLCカリフォルニア州ウッドランドでバキュロウイルスを発生させ細胞外で発現させた。タンパク質の発現および精製。先述のプロトコール11に従って、本研究で使用されるすべてのLRP6、Dkk1およびスクレロスチンタンパク質が発現され精製された。この後、純タンパク質は濃縮して10μMのストックとして-80°Cで保存できる。抗LRP6E1YW210.09Fabを、形質転換されたE.Coli34B8Stratageneを低濃度ホスフェートAP5培地で24時間30°Cで成長させて43発現させ、Gタンパク質アフィニティーカラムGEHealthcareで精製した44。Fab含有断片はさらにSP-セファロースカラムGEHealthcareを通過させて精製した。タンパク質濃度は280nmの吸光度で決定した。タンパク質複合体の結晶化。精製されたLRP6E1E2をYW210.09Fabと一晩インキュベートして安定な複合体を形成し、複合体をSuperdexS200ゲル濾過カラムGEHealthcareで精製した。複合体を含有する断片をプールし、8mg/mLまで濃縮し、10mMのトリスpH8、300mMのNaClおよび2.5のグリセロールを含有するバッファーに透析した。0.2Mのギ酸アンモニウムと20のPEG3350w/vの溶液から結晶が得られた。溶解構造中にLRP6E1しか観察できなかったので結晶を質量分析法で分析し、LRP6E2がArg335を超えて溶解していることが見いだされた。精製されたLRP6E1とDkk1ペプチドの複合体を0.1Mのチオシアン酸カリウムと30w/vのPEGMME2000、または0.2MのNaCl、0.1MのトリスpH8、25w/vのPEG3,350から結晶化した。付加ペプチドとLRP6E1の複合体の結晶化が、過剰な対象ペプチド1から2mMの最終濃度とLRP6E1の存在下でもとの共結晶Dkk1ペプチド含有をマイクロシードして得られた。播種された結晶は2つのもとのDkk1ペプチドの結晶化条件の一方または両方から2、3日で成長し、対象となるペプチドを含有することが見いだされた。データ収集と構造決定。回折データは単色X線ビーム12398.1eVを用いてAdvancedLightSourceALSのビームライン5.0.2で収集した。X線検出装置はADSCquantum-210CCD検出器であり、結晶から350mm離して設置した。あるいは、データは、スタンフォードシンクロトロン放射光研究所SSRL71またはAdvancedPhotonSouceAPS211DFで、または社内でRigakuX線発生装置007HFモデルをRigakuCCDカメラ007HF/Saturn944に連結して使用し収集した。データ収集に先立ち、結晶を25のグリセロール含有凍結保護溶液に移し、次いで液体窒素中で急速冷凍した。完全なデータセットを収集するため、単結晶にフレーム当たり1°の振動、トータルウェッジサイズは180°で回転法を適用した。次いでHKL2000プログラム45を使用してデータを指数付けし、積分し、スケーリングした。LRP6E1/Fab構造をPhaserプログラムCCP4英国デアスベリーを用いて分子置換MR法により解析した。マシューズ係数Matthews’coefficient計算の結果、非対称の各ユニットは1つのFab/E1複合体と54の溶媒からなることが示された。したがって、FabのN末端ドメイン、FabのC末端ドメインおよびE1のβプロペラドメインを含む3つのサブユニットの1セットを探すようにMR計算を行った。NおよびC末端ドメインは、Fabのエルボ角度を変数として別々に探した。FabサブユニットのサーチモデルはHGFA/Fab複合体の結晶構造から得た46。βプロペラドメインのサーチモデルはESyPred3Dウェブサーバーを介して生成した相同モデルであり47、LDL受容体の細胞外ドメイン構造48を相同モデルの鋳型として使用した。MRソリューションを使用して算出した差異電子密度マップにより、EFGドメイン構造が明らかになった。Fab複合体のLRP6E1ドメインをサーチモデルとして用いて、分子置換によりLRP6-ペプチド複合体の構造を決定した。電子密度にペプチドを手動で組み込んだ。手動での再構築はCOOTプログラム49を用いて行った。構造の精密化は、最尤標的機能、異方性の個々のB因子精密化を使用して、REFMAC550およびPHENIXプログラム51を用いて実施したペプチド複合体のみ。結合アッセイ。前述したように11、結合キネティクスは、OctetRed測定器ForteBioを使用してバイオレイヤー干渉法により測定した。ストレプトアビジンSAバイオセンサーに50mMのトリス、pH8、300mMのNaCl、5v/vのグリセロールおよび0.05w/vのトリトンX-100中ビオチン化したhLRP6をロードした。ロードされたバイオセンサーを同じバッファー中で洗ったあと、指示の回数会合と解離の測定を実施した。各相互作用のKdはOctetRedソフトウェアv6.3で定常状態解析を使用して決定された。報告された値はそれぞれ、異なる濃度の3またはそれ以上の実験の平均値であり、実験のカーブフィッティングは、相関係数の二乗R2が0.96を上回った。あるいは、親和性は蛍光偏光法FPにより決定された。フルオレセインで修飾されたペプチドプローブ30nMを、特定の標的-プローブの組み合わせの親和性に適切な濃度でLRP5またはLRP6E1ドメインと混合したおよそのKd。次いで競合試験剤タンパク質またはペプチドを加え、試験剤の濃度関数としてFPモニターを行った。阻害定数は、得られたカーブをカレイダグラフプログラムSynergySoftwareを使用して標準方程式にフィットさせて得た。ペプチドの親和性はまた、結合ペプチドを提示しているファージとの競合によって決定された競合ファージELISA。段階希釈した試験ペプチドを適切な不飽和濃度のファージと混合し、混合物を標的に曝露して均衡に到達させた。非結合材料を洗浄した後、抗M13抗体西洋わさびペルオキシダーゼHRPコンジュゲートとインキュベートし、適切な発色性HRP基質に曝露することにより結合ファージを検出した。最後に、ペプチドの親和性はまた、競合ELISAにより決定された。Maxi-SorbプレートNuncをストレプトアビジンまたはニュートラアビジンリン酸緩衝食塩水PBS中5μg/mL;一晩、4°Cでコートし、PBS中0.2のウシ血清アルブミンBSAでブロックした1時間、室温。ビオチン化E1結合ペプチドAc-GSLCSNRIKPDTHCSSKビオチン-amジスルフィドの溶液PBS中500nMを各ウェルに30分加え、次いでウェルをPBS含有0.05のTween-20で3回洗浄して過剰ペプチドを除去した。HisタグE1ドメインまたはFLAGタグE1E2タンパク質最終濃度5~10nMを段階希釈した試験ペプチドと15分プレインキュベートし、混合物をアッセイプレートのウェルに30分加えた。ウェルを洗浄し、次いでQiagenペンタHis-HRPコンジュゲートまたはシグマ抗FLAGM2HRPコンジュゲートPBS中1:2000希釈、0.2BSA、0.05Tween-20を30分加え、結合したLRP6をプローブした。洗浄後、TMB基質を加えたKirkegaardandPerryLaboratories。ウェルを1MのH3PO4でクエンチし、プレートを450nmで読んだ。カレイダグラフプログラムSynergySoftwareを使用して、得られたカーブを標準的な4つのパラメータ方程式にフィットさせて阻害定数を得た。光散乱実験。前述したとおり11、110μlのタンパク質または一晩均衡させたタンパク質複合体の一定分量をSEC-MALSOptilabRexに連結したQELSHPLCを用いたDawnHelios2、WyattTechnologiesで分析した。ファージディスプレイ。ファージディスプレイペプチドライブラリーおよそ2×1010の独自のメンバーを記載のとおり41構築し、LRP6E1E2、E1またはE3E4に対する、またはLRP5E1に対する溶液結合選択に4回かけた。ファージELISAでLRP6に結合した個々のファージクローンをDNA配列解析に供した。細胞内β/カテニンアッセイ。Wntシグナルをマウス線維芽細胞L細胞またはHEK293細胞で評価した。293細胞のルシフェラーゼリポーターアッセイを記載52のとおり実施した。マウス線維芽細胞L細胞イメージングアッセイを基本的に記載53のとおり実施した。細胞は指示どおりにWnt3a、Fz8CRD米国特許公開第20080299136号;54、LRP6またはDkk1、またはこれらのタンパク質の組み合わせで処理し、37°C、5CO2で6時間の後プロセスした。頭蓋冠骨モデル。前述のとおり52、55頭蓋冠を採取し培養する。頭蓋冠を0.1ウシ血清アルブミンと各100U/mlのペニシリンとストレプトマイシンを補充したBGJb培地の組織培養プレートで1日培養し、適切な濃度のペプチドまたはタンパク質で7日間処理する。骨は5のCO2を含む37oCの湿った大気中で培養する。マウスの頭蓋冠はμCT40SCANCOMedicalスイス、バッサードルフX線マイクロCTシステムで撮像する。マイクロCTスキャンはAnalyzeAnalyzeDirectIncアメリカ合衆国、カンザス州レネクサで分析する。あるいは、頭蓋冠を組織学的に染色し、石灰化領域を観察する。マウスを使用する実験はすべてGenentechInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeの指針に従って実施される。実施例2LRP6E1-YW210.09Fab複合体の構造。LRP6の第1のβプロペラとEGFドメインE1ドメインと抗LRP6抗体YW210.09国際公開第2011119661号のFabの複合体の結晶構造を分子置換により決定し、RとRフリーはそれぞれ0.175と0.220で1.9Åの分解能まで精密化した。結晶非対称単位は1つのLRP6E1ドメインと1つのYW210.09Fabからなる。解釈可能な電子密度でE1ドメインの残基Ala20からLys324の追跡ができた。Fab重鎖の残基Ser127からThr131を除いて、Fab重鎖と軽鎖はそれぞれ残基Asp1からGlu213およびGlu1からLys214を追跡できたすべてKabatの番号付け法を使用した56。LRP6E1ドメインはβプロペラモジュールと上皮増殖因子EGF様モジュールを備えるモジュラー構造内に構築される。βプロペラは、4本鎖の逆平行のβシートが放射状に配置されて形成されるブレード6枚からなり、N末端の端部は中心チャネルに面し、YWTDモチーフが各ブレードの2番目の鎖に局在する。LRP6E1のβプロペラ構造はLDLr構造と酷似しており57、配列一致性はわずか36にもかかわらず、245Cα原子と重ね合わせを行うとrmsdは0.83Åであった。保存残基のほとんどは、βプロペラの構造完全性に不可欠な、βシートを形成するYWTDコアモチーフの周りに集中した。これに対し、表面残基はこれらの受容体の機能的多様性からも考えられるように、非常に多様であった。LRP6はそのEGF様ドメインを使ってプロペラの第1および第6のブレードを固定するその機械的強度を維持するため。EGF様分子はβプロペラからC末端側に10残基のリンカーを経て伸長し、βプロペラの下側へと折り返し、第3と第4のブレードの間の表面に連結する。埋められた広大な1226Å2の総表面積および形状相補性スコアが0.74ということから示されるように、EGF様ドメインとβプロペラとの相互作用は広範である58。EGFモジュールの第1のβ鎖の残基Leu296、Leu298およびMet299はβプロペラの相補的くぼみに納まる疎水性コアを構成し、この疎水性コアはいくつかの直接的または水媒介の極性相互作用に囲まれている。これらの特徴はLDLr構造にも観察されている48、57。YW210.09Fabが識別するβプロペラ上心部は、しばしばタンパク質-タンパク質相互作用への関与が発見される領域である59。このパラトープは3つの重鎖CDRH1、H2、H3および2つの軽鎖CDRL1とL3を含むCDRの5つの残基からなる。抗体がβプロペラに結合すると総面積にして1691Å2が埋まり、形状相補性スコアは0.76である。酸性パッチがβプロペラのこの側の総表面積の約3分の1を占めるが、YW210エピトープとはめったに重複しない。抗体重鎖と軽鎖は別の領域を識別する。重鎖CDRが形成する直接接触が埋められた表面積の80を占めるうち、CDRH3が単独で50以上を占めている。このセグメントは17の残基からなり、このなかの残基His98からLys100cがβプロペラとの直接接触を形成する。重要なことに、抗体のAsn100はLRP6のAsn185と水素結合の対をなし、握手的相互作用を形成する図5。加えて、Val100bおよびLys100cを通る主鎖の異常なコンホメーションは、後方でLRP6のArg28と相互作用するカルボニル基と、前方で2個の水分子Wat1およびWat2を介して酸性パッチと相互作用する2つのNH基を位置決めする図5。Lys100cの側鎖もまた、LRP6のVal70とSer96主鎖カルボニルと水素結合して酸性パッチを部分的に中和する。LRP6のArg141が中間に固定されて、架橋する水Wat2、LRP6のAsn185およびYW210.09のAla100aと相互作用する。Arg141は2つの水素結合ネットワークを統合するようである。加えて、Val100bの側鎖はβプロペラの中心チャネルの疎水性のくぼみに連結する。したがって、短い一続きのYW210.09H3配列NAVKは、LRP6のβプロペラE1と極めて強い相互作用を呈する。他のCDRはβプロペラ上部の周囲に沿って残基と相互作用する。H1とH2は第5および第6のブレードと接触し、L1とL3は第6、第1および第2のブレードと接触する図6。結晶充填相互作用はYW210.09がLRP6のエピトープと接触する領域に直接関与しておらず、このことは、結晶構造が2個の分子が溶液中でどのように相互作用するかを反映するはずであることを示している。実施例3YW210.09H3ループ配列は、Dkks、スクレロスチンおよびwiseの中で保存されたNXIモチーフを表す。明白なCDRH3NAVKNモチーフとLRP6E1βプロペラとの相互作用は、報告されているラミニンとナイドジェンとの相互作用60と酷似している。いずれの場合も、重要な接触は、上述のAsnの握手と、分岐疎水性残基がβプロペラの中心チャネル上部に形成された疎水性のくぼみに入ることを通じて生じる。LDLrと違って、ナイドジェンとLRP6E1チャネルの中心は、付近のフェニルアラニンの側鎖またはPheシャッターにより所定位置に維持されているトリプトファン残基により溶媒から遮断されている60。この特徴により低分子量のリガンドに結合できるYWTDプロペラドメインが予測可能であることが提案されている60。ヒトDkk1の短い配列NAIKN;アミノ酸40から44はYW210.09のCDRH3ループ図7に見られるモチーフとほぼ一致する。このモチーフは、異種の、Dkk3を除く複数のDkkファミリーメンバーの中で厳密に保存されている。強力な保存は、Dkk1、2および4のこのセグメントが重要な機能を有することを示唆している。保存モチーフはDkk1のN末端付近の、無秩序であることが予測され、以前は機能的に重要であるとは同定されていなかった領域に見いだされる61。加えて、このモチーフはLRP5/6との相互作用を通じてWntシグナルを調節する別の2つのタンパク質、すなわちスクレロスチン32およびwise30に現れる図7A。スクレロスチンとwiseはシステインノットタンパク質のスーパーファミリーに属し62、この明白な折りたたみのヒールとも呼ばれる伸長したループ2の中にこのモチーフを提示する63、64。スクレロスチンの場合、ヒールは中和抗体の結合エピトープとして位置づけられており、この領域が機能的に重要であることを示唆している。スクレロスチンまたはwiseとLRP5またはLRP6との相互作用の詳細は報告されていない。実施例4Dkk1およびスクレロスチンのペプチドはLRP6βプロペラ上部に結合する。Dkk1およびSostの7残基のペプチドを標準的なFmoc手順で合成した。図7B。これらのペプチドは上述のNXIモチーフを含む。ペプチドのLRP6E1E2に対する親和性を競合ファージELISAにより決定した41。Dkk1ペプチドは比較的高い親和性で結合したが、スクレロスチンペプチドの結合は約10倍弱かったIC50はそれぞれ4μMおよび45μM。これらの値はラミニンペプチドのナイドジェンのβプロペラに対する親和性に匹敵する65。ペプチドとLRP6との相互作用の詳細を理解するため、LRP6E1βプロペラに結合したペプチドの高分解能の共結晶構造を決定した。構造を分子置換により決定し、Dkk1およびSostペプチドをそれぞれ1.9および1.5Å分解能まで精密化した図8。注目すべきは、ペプチドは、抗体ループと比較して結合状態のコンホメーションは酷似しており、いずれの場合も重要なアスパラギン側鎖が上述の握手的相互作用の位置にあることである。ペプチドイソロイシン残基は抗体ループのバリン側鎖が相互作用する疎水性ポケットを占める。抗体ループとDkk1ペプチドの全体的な比較は特に顕著であり、抗体残基Val99からLys100cLysβ炭素およびAsn100、Ala100aおよびVal100bの全側鎖も含む主鎖Cα-to-CαとDkk1ペプチドの等価な原子のアラインメントはコンホメーションが基本的に同一であることを示している26個の原子のRMSDは0.14Å。NXIコアモチーフに加えて、各ペプチドの塩基性側鎖は、配列内で相対的な位置が異なるにもかかわらずLRP6の酸性パッチと相互作用する。Dkk1ペプチドに関しては、リジンはイソロイシン残基に直続し、リジンのεアミノ基は、抗体ループのリジンアナログの相互作用と酷似した態様で小さい酸性の間隙を占める。Sostペプチドの場合、イソロイシンの後にはグリシンを挟んで塩基性アルギニン残基がある。これによりペプチド主鎖が再配向され、アルギニン側鎖はLRP6の酸性パッチのより周辺部に位置する。これらのペプチド構造は、LRP6E1との結合が、極めて明白なコアモチーフAsn側鎖とIle側鎖との相互作用と、様々な支持的接触が可能な周囲の面との相互作用の両方により駆動されることを示している。この後者の相互作用群は、付加的な親和性だけでなく特異性ももたらすと考えられる。例えば、ラミニン関連ペプチドは、ナイドジェンとの高親和性結合にAsnおよびVal残基を要し65、これらはLRP6複合体構造のNXIモチーフに見られる接触と酷似した接触を形成する60。しかし、ナイドジェンとの高親和性相互作用は、コアモチーフのAsnより2残基前に生じるAspからの付加的な接触を要する60、65。このAspはナイドジェンには存在するがLRP5またはLRP6には不在のArgの表面と塩橋を形成する。全体的に、Dkk1およびスクレロスチンペプチドの結合特性は、複数のWnt経路阻害剤に観察されるNXIモチーフ図7が、これらのタンパク質のLRP5およびLRP6との結合に重要であり、したがってこれらの阻害活性にも重要である、という見解と一致する。実施例5Wnt経路阻害剤とLRP6の個々のβプロペラとの相互作用のマッピング。異なるDkkおよびスクレロスチンと様々なLRP6ドメインとの相互作用をバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して測定した11。精製された受容体は、以下のように、単独のβプロペラEGF様ユニットE1、E2またはE4、2つのβプロペラE1E2またはE3E4または4つのβプロペラE1E4を含有した:ヒトLRP6:コンストラクトE1E4-LPR6のアミノ酸A20-Q1253;コンストラクトE1E2-LPR6のアミノ酸A20-E631;コンストラクトE3E4LPR6のアミノ酸E631-Q1253;コンストラクトE1-LPR6のアミノ酸A20-D325;コンストラクトE2-LPR6のアミノ酸D235-E631;コンストラクトE4-T933-Q1253。単独のLRP6βプロペラE3は発現できかった。ヒトLRP5:コンストラクトE1-LRP5のアミノ酸P33-R348Dkk1はLRP6のE1E2およびE3E4の両方の領域に結合できる11。この研究は、Dkk1およびDkk2のLRP6E1E2に対する高親和性結合それぞれ22および53nMを示すことで、その発見を展開させる。さらに、Dkk1およびDkk2はまた、E3E4にも結合したそれぞれ51および38nM。これに対し、高親和性の相互作用はDkk3およびDkk4では観察されなかった。Dkk3は試験したLRP6コンストラクトのいずれにも結合できず、これは最近の報告66とも一致した。Dkk4はLRP6E1E4およびE3E4との極めて弱い結合の証拠を示したが、興味深いことにE1E2には結合しなかった。Dkk1およびDkk2の個別のβプロペラとの結合をさらに分析すると、これらがそれぞれE1のみに高い親和性を有することが示される。E4との結合は検出されず、観察されたE3E4との相互作用はおそらくE3との高親和性相互作用によることが示唆された。E2との部分的結合は、Dkkの非常に高い濃度でのみ検出され、このことは非常に弱い結合または非特異的効果と一致した。スクレロスチンの結合も同様の方法でマッピングされた。スクレロスチンはE1E4、E1E2およびE1のみと結合し、E2との結合は極めて弱いかまたは非特異的である。Dkk1、Dkk2およびスクレロスチンがLRP6E1の同じ部位に結合するか評価するために、Dkk2またはスクレロスチンの結合を予めロードしたDkk1100nMの存在化で測定した。Dkk2の結合はわずかに阻害されたのみであり図8A、Dkk1およびDkk2の結合部位は実質的に重複しないことが示唆された。これに対し、スクレロスチンの結合はDkk1の存在化で非常に強力に阻害され図8B、これらの2種類の阻害剤の重複する結合部位が示唆された。この結論は、Dkk1およびスクレロスチンのNXIモチーフが類似の態様でLRP6E1と相互作用することを示す上記のペプチド相互作用研究と一致する。実施例6NXIモチーフはDkk1およびスクレロスチンとLRP6E1の結合に重要である。ペプチドおよびドメインマッピングの研究結果に基づき、Dkk1およびスクレロスチンとLRP6E1の結合は、各タンパク質に存在するNXIモチーフに主として媒介されると仮定された。この見解を検証すべく、モチーフの主要な接触残基を相互作用を妨害すると予測されるアミノ酸で置換したAsntoAla;またはIletoGlu。とりわけラミニンの類似残基の置換はナイドジェンとの結合に多大な影響を与え、親和性消失は3000から50000倍であった67。Dkk1のAsn40Alaの置換はLRP6E1E2に対し75倍の親和性消失をもたらし、Ile42Gluの置換では結合が大幅に阻止された>364倍の効果図9A。スクレロスチンの結合に対する置換の影響は明白ではあったが、さほど強力ではなく、Asn117AlaとIle119Gluの置換の親和性消失はそれぞれ14倍と19倍であった図9A。これらのデータは、特にDkk1に対するNXIモチーフの重要な役割と一致する。実施例7Dkk1のCRD2のアミノ酸置換はLRP6E3E4との結合を妨害する。Dkkタンパク質のC末端領域の重要な役割が提案されており、例えば、第1のシステインに富む領域CRD1のないヒトDkk1またはDkk2をコードするmRNAは、アフリカツノガエルの胚に注入されるとxWnt8シグナルを阻害できることが示されている61。しかし、今日まで、いかなるDkkファミリーメンバーも、相互作用パートナーとのいかなる複合体も、その完全なる構造はわかっていない。マウスのDkk2のCRD2の実験的構造がLRP5E3の相同性モデルにコンピューターでドッキングされている68。この複合体モデルに基づき、マウスのDkk1残基His210、Lys217またはArg242ヒトのDkk1残基204、211および236にそれぞれ対応がGluで置換されると結合が阻害されると予測され68、すべてのケースで、LRP6で形質移入された細胞との結合と、Dkk1のWnt3aシグナル阻害能の両方が妨害されることが見いだされた69。実施例5で記載のように、Dkk1は、LRP6のE1ドメインおよびおそらくはE3ドメインの両方に結合しうる。したがって、報告されたCRD2のアミノ酸置換を取り込んだヒトDkk1ではLRP6E3に対する親和性がかなり低く、E1との結合は影響を受けないのでは、と考えられた。この仮説をDkk1変異体H204EおよびK211Eを用いて検証し、結果は図9Bに示すとおりであった。実際、これらの変異はLRP6E3E4との結合は妨害したが、E1E2との結合は妨害しなかった。上述の結果と一致して、その逆がNXIモチーフ置換に当てはまった。興味深いことに、CRD2およびNXIモチーフのいずれの置換もDkk1のE1E4との結合に大きく影響した。まとめると、これは、Dkk1は独立してE1E4の2つの異なる部位に結合することができるか2:1の複合体;図10の絵3、または、Dkk1は互いに排他的な2つの部位に結合できるすなわち、代替的な1:1の複合体;図10の絵5および6ことを示す。第3の可能性として、1個のDkk1分子がE1およびE3の部位に同時に結合する図10の絵4が、変異体の2つのクラスと比較して野生型Dkk1が任意の結合活性効果を欠くのでこの可能性は薄いと考えられる。加えて、E1E2、Dkk1およびE3E4の三元複合体は形成されなかった11。2:1と1:1の結合モデルを区別するために、Dkk1バリアントとE1E4の複合体を光散乱検出と併せてサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。これらのデータは、Dkk1E1E4とLRP6E1E4複合体がすべて1:1のストイキオメトリを呈することを示す図10。全体的に、親和性測定および光散乱データは、2つの独立した、かつ互いに排他的な、Dkk1とLRP6間の結合様式の存在を示している。実施例8スクレロスチンはWntのサブセットしか調節しないが、Dkk1はWnt経路の広範な阻害剤として作用する。上述したように実施例5、スクレロスチンはLRP6E1とは結合するが、LRP6のE3E4領域とは相互作用しない。Wnt9bもE1E2領域とは結合するが、E3E4領域とは結合しない11。したがって、スクレロスチンは、Wnt9bのLRP6E1E4との結合を阻害する図11。これに対し、スクレロスチンは、Wnt3aのLRP6E1E4との結合を阻害できず図11、これはWnt3aがLRP6のE1E2領域とは結合しないがE3E4領域とは結合するという前述の観察と一致する11。Dkk1の場合は、おそらくは2つの明白な相互作用様式により実施例5~7、LRP6のE1E2断片およびE3E4断片の両方と高親和性結合できるので、より複雑である11。したがって、Dkk1はWnt3aおよびWnt9b両方のLRP6E1E4との結合を阻害する図11。精製タンパク質間の結合に及ぼす観察された効果が細胞シグナルに関連するかどうか検証するため、Dkk1およびスクレロスチンの活性をWnt依存性TOPbriteルシフェラーゼリポーターアッセイでさらに検証した52。リポーターで安定に形質移入された細胞が、Wnt1で一時的に形質移入された。Wnt形質移入細胞を精製Dkk1またはスクレロスチンバリアントで処理し、リポーター誘導効果を測定した図12。野生型Dkk1およびスクレロスチンでは、Wnt1依存性シグナルの強力な阻害が観察された。これは、LRP5/6のE1E2部分を通じて、Wnt1がWntシグナルの一クラスに属する、という先の観察と一致する11、52。Dkk1およびスクレロスチン変異体はLRP6との結合と一致する活性を示す図12。スクレロスチンIle119GluNXIモチーフは、Dkk1Ile42Gluと同様、Wnt1駆動シグナル阻害能が野生型よりも低い。これに対し、Dkk1Lys211GluCRD2は効果的にWnt1シグナルを阻害し、このことは、この変異体が維持しているE1E2との結合能と一致する図9B。まとめると、細胞アッセイの結合データとWntシグナルに対する効果は、保存NXIモチーフがDkk1およびスクレロスチンがE1E2との結合を通じてこれらのWntシグナルを阻害するのに機能的に関与することと、Dkk1CRD2とE3E4との相互作用がWntリガンドの異なるサブセットの阻害のみに重要であることを裏付ける。加えて、データは、Dkk1は2つの明白な結合様式で広域にWntシグナルを阻害するが、スクレロスチンはより選択的であることを示す。実施例9ヒト骨密度BMDの変異は、Wnt9bの結合に影響を与えることなく、Dkk1およびスクレロスチンのLRP6E1E2との結合を阻害する。Dkk1およびスクレロスチンとLRP6の第1のβプロペラとの相互作用を理解することで、LRP5の機能獲得型変異の機構が明らかになる。LRP5E1のこれらの単一アミノ酸置換により罹患個体の骨強度と厚みがかなり増す22~24。過去8年間で全部で9件のLRP5の機能獲得型変異7つの位置でが記述されている23。これらの7つのアミノ酸はそれぞれLRP5とLRP6の間で厳密に保存される。全体として、LRP5とLRP6のE1βプロペラはよく保存されており68の同一性、重要なことにはこれらの相互作用する上面はほぼ完全に一致する。構造的にもっとも驚くべきBMD変異は、Asn198とSerの置換であり24、Asn198は、Dkk1およびスクレロスチンに見られるNXIモチーフとの握手的相互作用に関わるLRP6Asn185に対応する実施例2および4。LRP6E1/Dkk1ペプチド複合体の表面でのBMD変異部位のマッピングにより、Asn185に加えて、LRP6残基のAsp98、Arg141およびAla201がペプチドと直接接触するか、または結合ポケットに近接することが明らかになった。したがって、これらの変異はDkk1およびスクレロスチンがLRP6E1と結合するのを阻害すると推測されうる。他の3つの変異部位は結合したペプチドから遠く離れているが、ペプチド結合ポケットの完全性に間接的に影響を及ぼすと考えることができる。LRP6残基のGly158は表面ループに存在し、Trp157のコンホメーションに影響すると考えることができる。Trp157のインドール環はBMD変異部位のArg141の隣にあり、ここで溶媒からArgの側鎖とペプチドAsnのカルボニル基の水素結合をスクリーニングしうる。Trp157のインドールはまた、Asn-Asnの握手を取り囲むポケットの壁のうち一つを形成する。Gly158ループに隣接して第2のインドール側鎖Trp183の側鎖があり、このインドールはAsn-Asnポケットの2番目の壁を形成する。別のBMD変異部位であるAla201は、Gly158とは反対側でTrp183の隣にある。Trp157またはTrp183の側鎖の配置が正しくなければNXIペプチドの結合が阻害されると考えられる。BMD部位のThr240およびAla229は、タンパク質表面から離れて隣接するβ鎖の末端付近に位置する。Thr240は、このクラスのプロペラタンパク質の特徴的なYWTD繰り返しのどれかに生じる。Thr240のヒドロキシル基の水素はAla229の主鎖アミドに結合し、いずれかの残基の置換によりタンパク質の不安定化が生じると考えることができる。加えて、Ala229は、リガンド結合部位底部を溶媒から遮断するのに重要だと思われる60Pheシャッター直下にある実施例3参照。BMD変異を担持するLRP5バリアントで形質移入された細胞は、スクレロスチンとの結合が減少し、Wnt10bまたはWnt6シグナルのスクレロスチン阻害に対し感受性が低い70。BMD置換の効果をさらに試験するために、これらのいくつかをLRP6E1E2に導入し、図13の結果を得た。LRP6E1E2のGly158Valは昆虫細胞で発現できなかった。この観察は哺乳動物細胞で観察された対応するLRP5変異体の非常に低い発現度と一致し70、この残基の置換で構造的不安定化が生じることが示される。試験した他のLRP6変異はすべて、Dkk1およびスクレロスチン両方のLRP6E1E2との結合を阻害する。Asn185のSerへの変異は、Dkk1およびスクレロスチンに対しそれぞれ183倍および59倍の親和性消失で有意に結合を阻害した。同様に、Arg141Metは、Dkk1およびスクレロスチンに対しそれぞれ29倍および31倍の親和性消失を誘導した。重要なことに、Wnt9bのLRP6バリアントとの結合には、影響はほとんどないか、まったくなかった。これらの結果は、BMD変異を原因とする機能獲得は、Wntリガンドの親和性獲得を原因とするのではなく、Wnt阻害剤の選択的な親和性消失に起因する、という見解を支持している。重要なことには、影響を受けたのはスクレロスチンとの結合のみならず70、Dkk1とそのE1相互作用部位との結合も阻害されることである。実施例10LRP5およびLRP6E1βプロペラは非常に特異的なペプチド識別モジュールである。LPR6βプロペラをプローブしファージディスプレイを用いてペプチド結合の特異性を検証した。直鎖状または環状ペプチドのナイーブライブラリーをLRP6E1E2またはE3E4、またはLRP5E1に対する溶液結合実験に用いた41。各標的を使用して結合選択を4回実施した。BSAとの結合と比べて特異的標的との結合は大幅な濃縮が観察され、LRP6E1E2とE3E4はそれぞれ1000倍と6000倍であった。同様の強力な濃縮がLRP5Eドメインに対する選択に観察された。個々のファージクローンについて、対象標的との結合および他のLRP6βプロペラコンストラクトとの結合をスクリーニングした。LRP6E1E2またはE3E4コンストラクトに対し選択されたファージは顕著に特異的であり、単離されたクローンはすべて、他のLRP6コンストラクトとの架橋結合なしにもとの標的にのみ結合した。加えて、E1E2に特異的なファージはE1ドメインにのみ結合し、E3E4に対し選択されたファージはE3に特異的であると考えられる。ペプチドの配列は、対象のクローンの配列決定により得られた。特に有望なクローンを使用して親和性成熟の二次ライブラリーを設計し、これらのライブラリーをさらに選択とスクリーニングに供した。LRP6E1ペプチド配列モチーフ図14は、Dkk1、スクレロスチンおよびwiseに見られるNXIモチーフと驚くほど一致している。直鎖状および環状ライブラリーのいずれにも厳密に保存されたAsnが存在するゼロ位置。2の位置には分岐疎水性残基が常にあり、非常に多くの場合Ileが存在する。特異的に結合するファージのこれら残基の強力な選択は、NXIモチーフのこれら2残基の重要性を裏付ける。直鎖状ライブラリー由来のペプチドは、-1の位置にターンを可能にするPro、Ser、CysまたはGlyなどの残基が好ましい。Serは1の位置にもっとも好ましく、Phe、Trp、TyrおよびLeuなどの疎水性残基がこれに続く。Dkk1配列に観察されるように、Lysは3の位置にもっとも好ましく、ArgとHisが2番目と3番目にもっとも一般的な残基である。最後に、4と5の位置には疎水性残基が好ましい。2つのシステイン間に長大な範囲のループ長を含んだ環状ライブラリーは、結合選択後、環状ペプチドを4種類のみもたらした。これらはCys残基と比べてループ長およびNXIモチーフの位置の両方が異なった。加えて、環の種類が異なると、保存AsnおよびIle残基に隣接する位置の残基の選択は異なる。例えば、3の位置のLysの選択はCNXIXC型の環では比較的緩い。他の場合は、例えばCXNXIKX4C型の環の下線をひいたLysはほぼ不変である。これらの結果はNXIモチーフの強力な特異性のみならず、異なる種類の環状ペプチドの明白なコンホメーション選択性およびおそらくは結合接触とも一致する。LRP5E1に結合するペプチドが上述のLRP6E1E2と同様にして得られた。LRP6と同様、LRP5は明白な直鎖状および環状のペプチドモチーフをもたらした図15。しかし、これらのモチーフはLRP6E1に結合するモチーフとは異なっていた。特に、これらのペプチドはNXIモチーフを含有しない。直鎖状ペプチドは代わりに保存された酸性の位置ゼロ位置を示し、疎水性のアミノ酸が2、3および-1の位置それぞれMet、TrpおよびPheにある。成熟クローンは-3のHisと-5のArgに対し非常に強い選択性を示す。3つの環状ペプチドファミリーのうち2つも保存された酸性残基を有するが、それらの配列パターンは直鎖状ファミリーのものとは異なる。実施例11ファージライブラリーの選択で同定されたペプチドの合成はそれらがLRP6E1と結合することを裏付ける。例示的ファミリー1と2のいくつかのペプチドを化学的に合成し、それらがファージ粒子のディスプレイのコンテキストの外側で標的LRP6E1に結合するかを評価した。一般に、これらの合成ペプチドは標的に対する結合能があった。例示的ファミリー1の直鎖状ペプチドの親和性はDkk1の7量体ペプチド低マイクロモルと同じ範囲内であり、例示的ファミリー2の環状ペプチドは低マイクロモルから中程度のナノモルの親和性を有した。これらのファージ由来のペプチドがどのようにLRP6E1を識別したかを理解するために、いくつかの共結晶構造を決定した図16。図示の構造中の4つのペプチドはすべてNXIモチーフを含有し、したがって、4つのペプチドはすべてDkk1およびスクレロスチンペプチドと同じ部位に結合し、各ペプチドのAsnおよびIle残基は上述した他の構造の同じ部位を占める。加えて、ペプチド構造はいくつかのユニークな特徴を示す。パートBに示すCX9C環状ペプチドは、N末端のアセチル基をLRP6表面上心部の第3の浅いポケットに配置する。このポケットはDkk1ペプチドに占められない。興味深いことに、このペプチドのいくつかの残基左下のLysの後ろの残基は電子密度で観察できず、結合状態で動的であることが示唆される。パートCとDの構造のペプチドは配列的に密に関連があり、違いは最後の2つの残基が逆になっていることのみである。この残基の逆転は、環のサイズをCX5CからCX4Cに縮小する付随的効果がある。2つのペプチドはタンパク質とわずかに異なる接触をし、特にLys側鎖の相互作用が異なるので、ペプチド親和性が影響を受ける。実施例12Dkk1ペプチドの最小結合配列の決定と最小化アナログの個別の残基の置換。Dkk1ペプチドの7残基すべてがLRP6E1との結合に必要であるか決定するために、いくつかの短いペプチドを合成した。これらのペプチドはN末端またはC末端の1または複数の残基が欠失していた。いずれかの末端から3残基を除去すると、結合は完全に阻止された。これらの欠失は、NXIモチーフの保存Asnまたは保存Ileのいずれかを除去するのに十分であった。このことは、これら両方の残基はLRP6部位との結合に重要であることを裏付ける。欠失数が少ないと、一般に結合は維持されるが、親和性は3倍以下の影響を受けた。図17AおよびB。置換の研究結果を図18に示す。ペプチドAc-NSIKGY-amのAsn残基の置換は、この残基がLRP6E1ドメインとの結合に重要であることを裏付けた。特に、通常の保存的置換Glnの結果、検出可能な結合は完全に消失した。S、IおよびK残基の置換は一般的により耐性があった。SerをAlaまたは塩基性残基のLys、Arg、HisまたはεεジメチルLysで置換すると親和性はわずかに向上したが、Orn、DabおよびDapなどの短い側鎖をもつ塩基性残基は側鎖の長さが減少するにつれて親和性が低下した。Ileの多くの疎水性置換は耐性があったが、Pheなどの長い側鎖をもつアミノ酸は耐性がなかった。LeuやMetの側鎖などの比較的長い側鎖はかなりの親和性消失をもたらした。Ileのβメチル基は、NvaがIle含有の親と同様の親和性で結合し、最小限の重要性しかもたないと考えられ、同様のパターンはValとAbuのアナログにも観察された。しかし、Ile残基を電荷を帯びた残基Gluで置換すると、結合が阻止された。最後に、Lys残基は様々な塩基性アミノ酸で置換可能であった。これらのうち、OrnおよびArgペプチドはLys親の親和性に近い親和性を維持したが、短い側鎖のアミノ酸DapおよびDabのペプチド親和性は減少した。Nαメチルアミノ酸の任意の位置で検証した置換S、IまたはKの結果、親和性が相当消失した結合は検出されなかった。実施例13疎水性ポケットのさらなる検証。NXIモチーフのIle位置での側鎖の選択を、例示的ファミリー1親ペプチドは図16Aに示すものと同じのペプチドのコンテキストで検証した。追加で、それぞれIle残基の代わりに異なる疎水性のアミノ酸を有する10個のペプチドを合成した表2;図19。シクロヘキシルグリシンChgの置換を除いて、各ペプチドはLRP6に結合した。非遺伝的にコードしたアミノ酸のノルバリンNvaを組み込んだペプチドは親Ileペプチドと等電位であった。加えて、3つのβメチル基を有するTleペプチドはこのようなメチル基を2つ有するValペプチドと等電位であった。これらの比較からも、LRP6E1は、親和性を減少させることなくペプチド側鎖に余剰なβメチル基を1つ収容またはこのような1つのメチル基を欠失しうることが推測できる。実施例14NXIモチーフを構築されたペプチド足場に転写。特異的な接触に必要な側鎖および溶液中明白かつ適切なコンホメーションの両方をもつペプチドは、標的タンパク質に高親和性を有すると考えられる。この見解をふまえて、LRP6に結合したリガンドの構造を、出版されているペプチド構造と比較した。NXIモチーフのAsnの周りの異常な主鎖のコンホメーションが、植物のプロテアーゼ阻害剤の1クラスと一致すると思われたBowman-Birk阻害剤;BBI。短いジスルフィド結合の阻害ペプチドを大きい天然の阻害剤から取ることができ、これらのペプチドのいくつかの構造が決定されている42。いくつかの残基を比較すると、NXIモチーフの主鎖のコンホメーションは、BBIペプチドの構造と密に重なった図20A。唯一重大な配列の違いは、LRP6との結合に必要なAsnに対するBBIループのLysトリプシン阻害のP1決定基であった。この1種類のアミノ酸を変えてBBI関連ペプチドを合成すると、LRP6親和性のペプチドが得られた22μM;図20B。とりわけ、このBBIミメティックは、LRP6の酸性パッチと相互作用するDkk1のLys残基の等価物をもたない。このことは、NXIモチーフがLRP6E1との結合に十分であることを示している。実施例15ジスルフィド結合以外のペプチド環化ストラテジー。先の実施例で記載のように、ペプチドの環化により標的タンパク質に対する親和性が向上しうる。加えて、場合によっては、環化により生物学的環境が安定し、またはその他にも生物学的効果の調節に使用するペプチドの特性が向上するかもしれない。このため所定のペプチドの様々な環化法を定義することは興味深い。LRP6に結合したDkk1のペプチド構造はこのようなストラテジーを示唆した図21A。結合したペプチドは、2番目Serと7番目Asnの残基の側鎖が互いに向けて突き出すように曲げられる。その距離は、Serの代わりのLys側鎖とAsnの代わりのAsp側鎖の間のアミド結合の形成により結合可能な距離である。標的の環状ペプチドが合成され、親Dkk1ペプチドと同等の親和性でLRP6に結合することが発見された図21B。実施例16NXIモチーフペプチドは、Wnt阻害剤とLRP6の結合を阻害するが、Wntの結合は阻害しない。Wntに刺激される骨成長の刺激や修復に向けた治療ストラテジーは、Wntリガンドによる正のシグナルを阻害することなく阻害剤の作用を排除すれば、もっとも効果的といえよう。阻害剤の結合とWntの結合がLRP5/6の明白なエピトープにより分離可能であることが、LRP6のBMD変異体アナログの実験で示唆された実施例9。タンパク質の変異誘発の結果を支持するために、ペプチドをアッセイし、様々なリガンドとLRP6の結合の阻害活性を測定した。3つの異なるペプチドが、Wnt9Bの結合に影響を与えることなく阻害剤Dkk1およびスクレロスチンとLRP6E1E2との結合を阻害した図22。このことは、低分子量のリガンドはBMD変異の効果を再現できることを示している。実施例17化合物はエクスビボ生体外の骨成長アッセイで試験可能である。ペプチドまたは他の薬剤が骨成長に有用な効果があるか評価するために、エクスビボの骨成長アッセイを使用した。このアッセイの前に、培地でマウス胎仔の頭蓋骨頭蓋冠を発生させる。発生中の骨は、例えば骨芽細胞などのいくつかの関連の細胞型を産生し、切開した頭蓋冠は、インビボの反応を潜在的に示す態様で、治療に反応するのに十分な複雑さを備える。加えて、頭蓋冠アッセイは動物の治療よりも簡便である。一般的に、前述したように、頭蓋冠はアッセイのために採取され半分に分割される実施例1を参照されたい52、55。ペプチドを標的アッセイの50倍濃度で水に溶かし、毎日新たに希釈してアッセイ培地にする。培地は7日間毎日交換する。この成長期間の終わりに、記載のとおり52、55、サンプルをプロセスし記載の分析に供する。組織学的染色アリザリンレッド/アルシアンブルーにより石灰化した部分が赤く染まる。文献1CleversH2006Cell127469802MacDonaldBTTamaiKHeX2009DevCell179263NusseR2008CellRes1852374PolakisP2007CurrOpinGenetDev1745515NusseRVarmusHE1982Cell31991096NusseRBrownAPapkoffJScamblerPShacklefordGら1991Cell642317RijsewijkFSchuermannMWagenaarEParrenPWeigelDNusseR1987Cell50649578BhanotPBrinkMSamosCHHsiehJCWangYら1996Nature382225309PinsonKIBrennanJMonkleySAveryBJSkarnesWC2000Nature407535810TamaiKSemenovMKatoYSpokonyRLiuCら2000Nature407530511BourhisETamCFrankeYBazanJFErnstJら2010JBiolChem2859172912NoordermeerJKlingensmithJPerrimonNNusseR1994Nature36780313TamaiKZengXLiuCZhangXHaradaYら2004MolCell131495614ZengXHuangHTamaiKZhangXHaradaYら2008Development1353677515ZengXTamaiKDobleBLiSHuangHら2005Nature438873716ManiARadhakrishnanJWangHManiMANelsonWilliamsCら2007Science31512788217CaricasoleACopaniACaraciFAronicaERozemullerAJら2004JNeurosci246021718DeFerrariGVPapassotiropoulosABiecheleTWavrantDeVriezeFAvilaMEら2007ProcNatlAcadSciUSA1049434919KinzlerKWNilbertMCVogelsteinBBryanTMLevyDBら1991Science25113667020NishishoINakamuraYMiyoshiYMikiYAndoHら1991Science253665921GongYSleeRBFukaiNRawadiGRomanRomanSら2001Cell1075132322BoydenLMMaoJBelskyJMitznerLFarhiAら2002NEnglJMed34615132123RickelsMRZhangXMummSWhyteMP2005JBoneMinerRes208788524WhyteMPReinusWHMummS2004NEnglJMed35020969著者回答925HoangBMoosMJrVukicevicSLuytenFP1996JBiolChem27126131726DannCEHsiehJCRattnerASharmaDNathansJLeahyDJ2001Nature412869027HsiehJCKodjabachianLRebbertMLRattnerASmallwoodPMら1999Nature398431628GlinkaAWuWDeliusHMonaghanAPBlumenstockCNiehrsC1998Nature3913576229SemenovMVTamaiKBrottBKKuhlMSokolSHeX2001CurrBiol119516130ItasakiNJonesCMMercurioSRoweADomingosPMら2003Development130429530531LiXZhangYKangHLiuWLiuPら2005JBiolChem28019883732SemenovMTamaiKHeX2005JBiolChem28026770533BaficoALiuGYanivAGazitAAaronsonSA2001NatCellBiol3683634BalemansWEbelingMPatelNVanHulEOlsonPら2001HumMolGenet105374335BalemansWPatelNEbelingMVanHulEWuytsWら2002JMedGenet3991736LiXLiuPLiuWMayePZhangJら2005NatGenet379455237RawadiG2008CurrDrugTargets95819038RouxS2010JointBoneSpine39BennettCNLongoKAWrightWSSuvaLJLaneTFら2005ProcNatlAcadSciUSA1023324940WalshNCGravalleseEM2010ImmunolRev2333011241TonikianRZhangYBooneCSidhuSS2007NatProtoc213688642BrauerABKellyGMcBrideJDCookeRMMatthewsSJLeatherbarrowRJ2001JMolBiol30679980743LeeCVLiangWCDennisMSEigenbrotCSidhuSSFuhG2004JMolBiol34010739344FellouseFAEsakiKBirtalanSRaptisDCancasciVJら2007JMolBiol3739244045OtwinowskiZaMW1997MethodsinEnzymology2763072646WuYEigenbrotCLiangWCStawickiSShiaSら2007ProcNatlAcadSciUSA10419784947LambertCLeonardNDeBolleXDepiereuxE2002Bioinformatics181250648RudenkoGHenryLHendersonKIchtchenkoKBrownMSら2002Science2982353849EmsleyPCowtanK2004ActaCrystallogrDBiolCrystallogr6021263250MurshudovGNVaginAADodsonEJ1997ActaCrystD532405551AdamsPDAfoninePVBunkocziGChenVBDavisIWら2010ActaCrystallogrDBiolCrystallogr662132152GongYBourhisEChiuCStawickiSDeAlmeidaVIら2010PLoSONE5e1268253HannoushRN2008PLoSOne3e349854DeAlmeidaVIMiaoLErnstJAKoeppenHPolakisPRubinfeldB2007CancerRes675371955MohammadKSChirgwinJMGuiseTA2008MethodsMolBiol455375056WuTTKabatEA1970JExpMed1322115057JeonHMengWTakagiJEckMJSpringerTABlacklowSC2001NatStructBiol849950458LawrenceMCColmanPM1993JMolBiol2349465059SpringerTA1998JMolBiol2838376260TakagiJYangYLiuJHWangJHSpringerTA2003Nature4249697461BrottBKSokolSY2002MolCellBiol2261001062McDonaldNQHendricksonWA1993Cell73421463LinternKBGuidatoSRoweASaldanhaJWItasakiN2009JBiolChem284231596864VeverkaVHenryAJSlocombePMVentomAMulloyBら2009JBiolChem2841089090065PoschlEFoxJWBlockDMayerUTimplR1994EMBOJ133741766NakamuraREHackamASGrowthFactors67PoschlEMayerUStetefeldJBaumgartnerRHolakTAら1996EMBOJ155154968ChenLWangKShaoYHuangJLiXら2008JBiolChem283233647069WangKZhangYLiXChenLWangHら2008JBiolChem28323371570SemenovMVHeX2006JBiolChem281382768471BourhisEら2011Structure1914331442"