式の化合物式中、iは、nが1である場合0、1、2もしくは3から、またはnが2である場合0、1、2、3もしくは4から、またはnが3である場合0、1、2、3、4もしくは5から選択される整数であり、jは0、1、2または3から選択される整数であり、kは0または1から選択される整数であり、同じかまたは異なっているnおよびnは0、1、2または4から選択される整数であり、ただし2≦nn≦4であり、ZはCH2、HC、N、NHまたはOであり、A環の利用可能な任意の位置にある各Riは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、CF3、COR、COOR、CONRRから選択され、C環の利用可能な任意の位置にある各Rjは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、COR、COOR、CONRRから選択され、Rkは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノから独立に選択され、Xは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから選択され、前記アルキルおよびまたはアリールは、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRで任意選択で置換されており、YはpNRaRb、OR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の単環式または二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、直鎖状または分岐状アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、ハロゲン、CN、NRR、CONRR、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルは、NRRまたはNRRで任意選択で置換されており、かつまたは前記単環式または二環式アリールは単環式5~7員複素環と任意選択で縮合しており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されている、sシクロアルキル、CN、Oアルキルで任意選択で置換されているアルキル、UStアルキルR、ハロゲン、CN、NRR、CONRR、CORの1つまたは複数で任意選択で置換されているアルキレンであるから選択されるか、あるいは、XとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、Hal、CN、NRR、Cアルキル、アルキル、シクロアルキル、複素環、COアルキル、アルキル複素環、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環はアルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択されるもしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。k1であり、Rkがハロゲンである、請求項1に記載の化合物。nが1であり、nが2である、請求項1または2に記載の化合物。Xが請求項1から3のいずれかに記載の通りであり、YがpNRaRb、OR、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは0、1、2または3から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、ハロゲン、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されている単環または二環であり、前記アルキルは、NRRまたはNRRで任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、rは0、1、2または3から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYがそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環が、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールはアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環はアルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、好ましくは、qが1、2または3であり、rが1、2または3である、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。n1であり、n2または3であり、Xが請求項1から4のいずれか一項に記載の通りであり、YがpNRaRb、または、OR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の単環式または二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは1、2または3であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されているから選択されるか、あるいは、XとYがそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個の窒素原子を含み、アルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択される、請求項1、2および4のいずれか一項に記載の化合物。n1であり、n2または3であり、Xが、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから選択され、前記アルキルおよびまたはアリールが、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRで任意選択で置換されており、YがpNRaRb、rアリールR、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールで置換されており、前記アリールがアルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されている飽和単環式5員複素環であるか、または窒素原子を含み、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールがハロゲン、COR、ORまたはNRRで任意選択で置換されている単環式6員複素環であり、qは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYがそれらが結合しているN原子と一緒になって前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個の窒素原子を含み、アルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合している、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の化合物。以下の式式中、iは0、1、2、3または4から選択される整数であり、jは0、1、2または3から選択される整数であり、A環の利用可能な任意の位置にある各Riは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、CF3、COR、COOR、CONRRから選択され、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択され、XはHであり、YはrアリールR、CN、NRR、CONRR、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、rは0~6から選択される整数であり、各TはHであり、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択される、pNRaRb、、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールで置換されており、前記アリールがアルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されている飽和単環式5員複素環であるか、または窒素原子を含み、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールがハロゲン、COR、ORまたはNRRで任意選択で置換されている単環式6員複素環でありqは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は任意選択で不飽和であり、かつまたは1つまたは複数の複素環またはアルキル複素環で任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個のヘテロ原子を含み、アルキルで任意選択で置換されているの化合物である、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸1ピペリジン4イルメチルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸2エチルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドアゼパン1イルメタノン9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド14ビピペリジニル1イルメタノン9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドNエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドメチルピペラジン1イルメタノンピペラジン1イルメタノンメタノンNメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNイルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロル水和物から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドアゼパン1イルメタノン14ビピペリジニル1イルメタノンNエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドメチルピペラジン1イルメタノンピペラジン1イルメタノンメタノンNメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロル水和物から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。式の対応する化合物の、ペプチドカップリングによる式の対応する化合物の通りに定義され、RはOHまたはハロゲンであり、XおよびYはそれぞれXおよびYと同じであるもしくはその前駆体またはアミノ保護基との反応ステップ、任意選択でその後にアルキル化または脱保護ステップを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。を除く、式の化合物。請求項1から9のいずれか一項に定義されている式の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩を、薬学的に許容される添加剤と一緒に含む医薬組成物。USPを阻害するために使用するための、請求項1から9のいずれか一項に定義されている式の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。USP7を阻害するための、請求項13に記載の使用のための化合物。癌および転移、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、免疫障害、骨関節疾患、骨粗鬆症、関節炎、炎症性障害、心血管疾患、ウイルス感染症および疾患、ならびにまたはウイルスの感染およびもしくは潜伏、細菌感染症および疾患を治療およびまたは予防するために使用するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩。前記ウイルス感染症および疾患が、単純ヘルペス1型または2型ウイルス感染症、A型肝炎、C型肝炎、SARSコロナウイルス感染症および疾患、エプスタインバーウイルス、ライノウイルス感染症および疾患、アデノウイルス感染症および疾患、灰白髄炎から選択される、請求項15に記載の使用のための化合物。請求項1から9のいずれか一項に記載の式の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩を、抗癌剤、神経作用剤、血栓溶解剤、抗酸化剤、抗感染剤、血圧降下剤、利尿剤、血栓溶解剤、免疫抑制剤、心血管治療薬、免疫調節剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤から選択される1つまたは複数の活性薬剤と一緒に含む組合せ。しかし、現在まで、特異的なUSP7小分子阻害剤は報告されていないようである。第1の目的によれば、本発明は、式の化合物式中、iは、nが1である場合0、1、2もしくは3から、またはnが2である場合0、1、2、3もしくは4から、またはnが3である場合0、1、2、3、4もしくは5から選択される整数であり、jは0、1、2または3から選択される整数であり、kは0または1から選択される整数であり、同じかまたは異なっているnおよびnは0、1、2または4から選択される整数であり、ただし2≦nn≦4であり、ZはCH2、HC、N、NHまたはOであり、A環の利用可能な任意の位置にある各Riは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、CF3、COR、COOR、CONRRから選択され、C環の利用可能な任意の位置にある各Rjは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、COR、COOR、CONRRから選択され、Rkは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノから独立に選択され、Xは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから選択され、前記アルキルおよびまたはアリールは、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRで任意選択で置換されており、YはpNRaRb、OR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の単環式または二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、直鎖状または分岐状アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、ハロゲン、CN、NRR、CONRR、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルは、NRRまたはNRRで任意選択で置換されており、かつまたは前記単環式または二環式アリールは単環式5~7員複素環と任意選択で縮合しており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されている、sシクロアルキル、CN、Oアルキルで任意選択で置換されているアルキル、UStアルキルR、ハロゲン、CN、NRR、CONRR、CORの1つまたは複数で任意選択で置換されているアルキレンであるから選択されるか、あるいは、XとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、Hal、CN、NRR、Cアルキル、アルキル、シクロアルキル、複素環、COアルキル、アルキル複素環、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環はアルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択されるもしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩に関する。本発明の式は以下の実施形態のいずれかまたはその組合せのいずれかを指す。特定の実施形態によれば、式は、HalがClであり、ij0であり、n1であり、n1であり、XがHまたはC1~2アルキルであり、Yが1つまたは2つのC1~C2アルキルで任意選択で置換されたフェニルであるか、またはn1であり、n2でありXがHであり、YがCNまたはCCH3で置換されたフェニルであるか、またはXとYが一緒になってメトキシフェニルまたはフルオロフェニルで置換されたピペラジニル環を形成しているか、またはXとYが一緒になってピペリジルで置換されたピペリジル環を形成しているか、またはXの1つがHであり、YがCOOEtで置換されたピペリジルである化合物を包含しない。具体的には、本発明の化合物は以下の式の化合物であってよい。具体的な化合物は式の化合物である。ここで、ij0であり、かつまたはXはH、CNで任意選択で置換されたアルキルから選択され、Yは上記定義通りであるか、あるいはXとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、Hal、CN、NRR、Cアルキル、アルキル、シクロアルキル、複素環、COアルキル、アルキル複素環、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環は、アルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合している。具体的にはA環はから選択される。好ましくは、nは0、1または2であり、nは3、2または1である。特に、式において、nは1であり、nは2である。より好ましくは、Aはである。一実施形態によれば、HalはF、BrまたはIである。他の実施形態によればXは上記の通り定義され、YはpNRaRb、OR、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは0、1、2または3から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、ハロゲン、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されている単環または二環であり、前記アルキルは、NRRまたはNRRで任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、rは0、1、2または3から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYがそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アリールまたはアルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールはアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環はアルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、好ましくは、qは1、2または3であり、rは1、2または3である。より具体的には、式においてn1であり、n2または3であり、Xは上記の通り定義され、YはpNRaRb、または、OR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されている、N、OまたはSから選択される1個、2個または3個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の単環式または二環式の複素環またはヘテロアリールであり、前記アリールは、アルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは1、2または3であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、rアリールR、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されているから選択されるか、あるいは、XとYがそれらが結合しているN原子と一緒になって、前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個の窒素原子を含み、アルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合しており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択される。より具体的には、式においてn1であり、n2または3であり、Xは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから選択され、前記アルキルおよびまたはアリールは、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRで任意選択で置換されており、YはpNRaRb、rアリールR、CN、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、rは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択される、、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールで置換されており、前記アリールがアルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されている飽和単環式5員複素環であるか、または窒素原子を含み、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールがハロゲン、COR、ORまたはNRRで任意選択で置換されている単環式6員複素環であり、qは0~6から選択される整数であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子を含む複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたはO、アルキル、シクロアルキル、複素環、アルキル複素環、COアルキル、アルキルアリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールは複素環と任意選択で縮合しており、かつまたは前記アリールはアルキルまたはCOアルキルで任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個の窒素原子を含み、アルキルで任意選択で置換されており、アリールと任意選択で縮合している。特に、本発明の化合物は以下の式式中、iは0、1、2、3または4から選択される整数であり、好ましくはi0であり、jは0、1、2または3から選択される整数であり、好ましくはj0であり、A環の利用可能な任意の位置にある各Riは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、CF3、COR、COOR、CONRRから選択され、C環の利用可能な任意の位置にある各Rjは、同じかまたは異なっており、ハロゲン、アルキル、アリール、アルキルアリール、OR、NRR、CN、COR、COOR、CONRRから選択され、XはHであり、YはrアリールR、CN、NRR、CONRR、COアルキルの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アルキルはNRRまたはNRRで置換されており、好ましくはそのアリールは、NRRで置換されたアルキルで置換されたフェニルであり、rは0~6から選択される整数であり、好ましくはrは0または1であり、各TはHであり、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって、N、OまたはSから選択されるさらに1個または2個のヘテロ原子を含んでよいN含有5~7員複素環を形成しており、前記複素環は、ハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されており、好ましくは、RとRはそれらが結合しているN原子と一緒になってハロゲン、アルキル、CN、CF3、OR、NRR、COR、COOR、CONRRの1つまたは複数で任意選択で置換されている5員複素環を形成しており、好ましくはRとRはそれらが結合しているN原子と一緒になって5員複素環を形成しており、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリールから独立に選択され、好ましくはそのアリールは、NRRで置換されているアルキルで置換されているフェニルであり、RとRは、それらが結合しているN原子と一緒になって5員複素環を形成している、pNRaRb、、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールで置換されており、前記アリールがアルキル、ハロゲン、OR、CORまたはNRRで任意選択で置換されている飽和単環式5員複素環であるか、または窒素原子を含み、アルキルアリール、OR、COR、O、CN、CF3、COR、NRR、CONRR、アリールの1つまたは複数で任意選択で置換されており、前記アリールが、ハロゲン、COR、ORまたはNRRで任意選択で置換されている単環式6員複素環でありqは0~6から選択される整数であり、好ましくは0、1または2であり、好ましくは1または2であり、同じかまたは異なっている各TはHまたはアルキルから独立に選択され、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリール、好ましくはアルキルから独立に選択され、好ましくは、はメチル、アルキルアリールで任意選択で置換されたピロリジンまたはピペリジンであり、アリールはハロゲン、COR、ORまたはNRR、好ましくはORまたはNRRで任意選択で置換されており、qは1または2であり、Tは同じかまたは異なっており、Hまたはアルキルから独立に選択され、同じかまたは異なっているRおよびRは、H、アルキル、アリール、アルキルアリール、好ましくはアルキルから独立に選択されるから選択されるか、あるいは、XとYはそれらが結合しているN原子と一緒になって前記N原子および任意選択でさらに1個または2個のヘテロ原子、好ましくはさらに1個の窒素を含む複素環、好ましくは6員または7員の複素環を形成しており、前記複素環は、任意選択で不飽和であり、かつまたは、1つまたは複数の複素環またはアルキル複素環で任意選択で置換されており、前記複素環は1個または2個のヘテロ原子、好ましくは窒素を含み、アルキルで任意選択で置換されており、好ましくは前記複素環は、任意選択でさらに1個の窒素を含み、任意選択で不飽和であり、かつまたは1つまたは複数の複素環、アルキル複素環で任意選択で置換されている6員複素環であり、前記複素環は1個または2個のヘテロ原子、好ましくは窒素を含み、アルキルで任意選択で置換されているの化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩であってよい。特定の実施形態によれば、式のこれらの化合物は9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸1ピペリジン4イルメチルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸2エチルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドアゼパン1イルメタノン9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド14ビピペリジニル1イルメタノン9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドNエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドメチルピペラジン1イルメタノンピペラジン1イルメタノンメタノンNメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNイルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロル水和物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。好ましくは、本発明は以下の化合物9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドアゼパン1イルメタノン14ビピペリジニル1イルメタノンNエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドメチルピペラジン1イルメタノンピペラジン1イルメタノンメタノンNメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロル水和物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩に関する。好ましくは、本発明は以下の化合物9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドアゼパン1イルメタノン14ビピペリジニル1イルメタノンNエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドメチルピペラジン1イルメタノンピペラジン1イルメタノンメタノンNメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロル水和物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩に関する。上記または以下で使用するようにアルキルは、その鎖の中に1~20個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状であってよい脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、その鎖の中に1~12個の炭素原子を有する。分岐状とは、メチル、エチルまたはプロピルなどの1つもしくは複数の低級アルキル基が直鎖状アルキル鎖と結合していることを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、nプロピル、iプロピル、nブチル、tブチル、nペンチル、3ペンチル、オクチル、ノニル、デシルが含まれる。本明細書で用いるシクロアルキルという用語は、1個の水素原子を取り外すことによって形成された3~10個の炭素原子の芳香族または非芳香族炭化水素の単環式、二環式もしくは多環式環を指す。例えばC5~C7シクロアルキルという表示は、5~7個の炭素原子を含むシクロアルキル基を指す。その例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル等ならびにそれらの縮合またはフェニル基との縮合によって形成される系が含まれる。アルケンは、その鎖の中に2~15個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状であってよい炭素炭素二重結合を含む脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は、その鎖の中に2~12個の炭素原子を有し、より好ましくはその鎖の中に約2~4個の炭素原子を有する。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、nブテニル、iブテニル、3メチルブタ2エニル、nペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルが含まれる。ハロゲン原子はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、好ましくはフッ素および塩素原子を指す。ペルハロゲノアルキルは、すべてのH原子がハロゲン原子で置き換えられている上記定義のアルキル基を指す。ポリハロゲノアルキルは、1個または複数のH原子がハロゲン原子で置き換えられている上記定義のアルキル基を指す。アリールは、6~14個の炭素原子、好ましくは6~10個の炭素原子の芳香族単環式または多環式炭化水素環系を意味する。アリール基の例には、フェニルまたはナフチルが含まれる。本明細書で用いる複素環または複素環式という用語は、その環の少なくとも1つのメンバーがヘテロ原子である飽和、部分不飽和もしくは不飽和非芳香族の安定な3~14員、好ましくは5~10員の単環式、二環式または多環式環を指す。一般に、ヘテロ原子には、これらに限定されないが、酸素、窒素、硫黄、セレンおよびリン原子が含まれる。好ましいヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄である。適切な複素環は、TheHandbookofChemistryandPhysics、第76版、CRCPress、Inc、1995~1996年、225~226頁にも開示されている。この開示を参照により本明細書に組み込む。好ましい非芳香族複素環には、これらに限定されないが、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリミジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニルならびにフェニル基との縮合によって得られるその縮合系が含まれる。本明細書で用いるヘテロアリールまたは芳香族複素環という用語は、5~14員、好ましくは5~10員の芳香族ヘテロ、単環式、二環式または多環式環を指す。その例には、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、124チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、イソオキサゾリル、ピリジルNオキシドならびにフェニル基との縮合によって得られるその縮合系が含まれる。アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環などは、2個の水素原子を取り外すことによって形成される対応するアルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、ヘテロシクレンなども指す。本明細書で用いる患者という用語は、本明細書で述べる1つもしくは複数の疾患および状態に苦しむ、またはそれに苦しむ可能性を有している飼育、愛玩または保存目的のための価値ある動物などの動物か、あるいは好ましくはヒトまたはヒトの子供を指す。本明細書で用いる治療有効量は、本明細書で述べる疾患および状態の症状を予防、軽減、排除、治療または制御するのに効果的である本発明の化合物の量を指す。制御するという用語は、本明細書で述べる疾患および状態の進行を遅延させる、中断させる、止めるまたは停止させる可能性があるすべてのプロセスを指すものとするが、疾患および状態の症状を完全にすべて排除することを必ずしも意味するものではなく、予防的治療を含むものとする。本明細書で用いる薬学的に許容されるという表現は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィットリスク比に相応している、過度の毒性、炎症、アレルギー反応または問題のある他の合併症を伴うことなくヒトや動物の組織と接触させるのに適した化合物、材料、添加剤、組成物または剤形を指す。本明細書で用いる薬学的に許容される塩は、その酸または塩基塩を作製することによって親化合物が改変されている開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機または有機酸から形成された親化合物の慣用的な非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そうした慣用的な非毒性の塩には、そのモノ、ジまたはトリ塩を含む塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導される塩および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸などの有機酸から調製される塩が含まれる。他の付加塩には、トロメタミン、メグルミン、エポラミン等のアンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛またはマグネシウムなどの金属塩が含まれる。本発明の薬学的に許容される塩は、慣用的な化学的手法で酸性または塩基性の部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そうした塩は、水もしくは有機溶媒またはその2つの混合液中で、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、RemingtonsPharmaceuticalSciences、第20版、MackPublishingCompany、Easton、PA、2000年に記載されている。この開示を参照により本明細書に組み込む。幾何異性体および立体異性体を有する一般式の化合物も本発明の一部である。他の目的によれば、本発明は、式の化合物を調製する方法にも関する。本発明の化合物は、当業者に周知のいくつかの方法で調製することができる。これらの化合物は、例えば以下で説明する方法または当業者に理解されるようなそれに対する変更形態を適用するかまたは適合させることによって合成することができる。適切な改変形態および置換形態は、容易に明らかであり周知であるか、または当業者は科学文献から容易に得ることができる。具体的には、そうした方法は、RCLarock、ComprehensiveOrganicTransformations、WileyVCHPublishers、1999年に記載されている。本発明の化合物は1個または複数の非対称的に置換された炭素原子を含むことができ、これを、光学的に活性な形態またはラセミ体で単離できることを理解されよう。したがって、特定の立体化学または異性体が具体的に示されていない限り、ある構造のすべてのキラル体、ジアステレオマー体、ラセミ体、異性体は対象とされるものとする。そうした光学的に活性な形態物の調製および単離の方法は当業者に周知である。例えば、立体異性体の混合物は、これらに限定されないが、ラセミ体の分割、順相、逆相およびキラルクロマトグラフィー、選択的な塩形成、再結晶化などを含む標準的な手法によるか、あるいはキラル出発原料からのキラル合成によるかまたは目的キラル中心の周到な合成によって分離することができる。さらに、本発明の方法はいくつかの位置異性体をもたらすことができ、これらはすべて本発明に包含される。位置異性体は一般にクロマトグラフィーによって単離される。本発明の化合物は様々な合成経路で調製することができる。試薬および出発原料は市販されているか、または当業者によって周知の手法により容易に合成される。別段の表示のない限り、すべての置換基は上記で定義した通りである。以下で説明する反応において、最終生成物においてそれが望ましい場合、反応におけるその望ましくない関与を回避するために、反応性官能基、例えばヒドロキシル、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基を保護することが必要になることがある。標準的技法にしたがって慣用的な保護基を使用することができる。例えばTWGreeneandPGMWutsinProtectiveGroupsinOrganicChemistry、第3版、JohnWileyandSons、1999年JFWMcOmieinProtectiveGroupsinOrganicChemistry、PlenumPress、1973年を参照されたい。いくつかの反応は塩基の存在下で実施することができる。この反応で使用する塩基の特性に特に制限はなく、それがその分子の他の部分に悪影響を及ぼさないという条件で、この種の反応で慣用的に使用される任意の塩基を同等に使用することができる。適切な塩基の例には水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、水素化ナトリウムおよび水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物メチルリチウムおよびブチルリチウムなどのアルキルリチウム化合物ならびにナトリウムメトキシドおよびナトリウムエトキシドなどのアルカリ金属アルコキシドが含まれる。通常、反応は適切な溶媒中で実施される。様々な溶媒を使用することができるが、ただし、反応または関係する試薬に対して悪影響を及ぼさないものとする。適切な溶媒の例にはヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンおよびキシレンなどの芳香族、脂肪族または脂環式炭化水素であってよい炭化水素ジメチルホルムアミドなどのアミドエタノールおよびメタノールなどのアルコールならびにジエチルエーテルおよびテトラヒドロフランなどのエーテルが含まれる。反応は広範囲の温度で実施することができる。一般に、反応を0°C~150°Cの温度で実施することが好都合であることが分かっている。反応に要する時間もいくつかの因子、特に反応温度および試薬の特性に応じて広い範囲にわたる。しかし、上記に概説した好ましい条件下で反応が行われれば、反応時間は通常3時間~20時間で十分である。そのようにして調製した化合物は、慣用的な手段で反応混合物から回収することができる。例えば、反応混合物から溶媒を留去するか、または必要であれば反応混合物から溶媒を留去した後、その残留物を水中に注ぎ、次いで水と非混和性の有機溶媒で抽出し、その抽出物から溶媒を留去して化合物を回収することができる。望むなら、追加的に生成物を再結晶化、再沈澱法または様々なクロマトグラフィー技術、特にカラムクロマトグラフィーもしくは分取薄層クロマトグラフィーなどの様々な周知の手法によりさらに精製することができる。本発明の式の化合物の調製方法は本発明の他の目的である。第1の態様によれば、式の本発明の化合物は、式の対応する化合物を、ペプチドカップリングによって、式の対応する化合物の通りに定義され、RはOHまたはハロゲンであり、XおよびYはそれぞれXおよびYと同じであるもしくはその前駆体またはアミノ保護基と反応させるステップ、任意選択でその後に場合によってそれぞれアルキル化または脱保護するステップによって得ることができる。前記式の化合物は、式の対応する化合物に定義の通りであるから官能化によって得ることができ、すなわちRk基を、ハロゲン化、還元、次いで脱水、求核付加、続く脱水を含むケト基の好都合な官能化により導入する。特にRkHalを導入するために、この官能化はハロゲン化ステップ、還元ステップ、続く脱水ステップを含む。本発明は、を除く、式の化合物の通りに定義されるにも関する。特定の実施形態によれば、式の化合物は以下の化合物である。式の化合物を、以下の2つの経路のどちらかにしたがって、化合物と、またはとをカップリングすることによって得ることができる。最初に、ケトンまたは置換ケトンと置換アニリンまたはの縮合を実施して三環式酸を得る。アミノテレフタル酸またはと対応するケトンまたはを適切な溶媒中で混合し、撹拌する。反応性に応じて混合物を加熱するか、または酸性条件を用いて触媒作用させることができる。経路の場合、反応をおよびの中間体エナミンの環化によって実施する。さらに、の官能化により化合物をハロゲン化アシルまたはカルボン酸として得る。の特性に応じて標準的な条件を用いてペプチドカップリングを実施する。アミンHNXYは市場から入手するか、または化合物とカップリングする前に古典的な方法を用いて調製することができる。NXYがジアミンである場合には代替のアプローチを用いた。このアプローチは、化合物をモノ保護したアミン前駆体とカップリングし、次いで脱保護し、ハライド誘導体またはアルデヒドなどの求電子試薬を用いた1段または連続2段のアルキル化するステップを含む。本明細書で用いる前駆体という用語は、基または官能基の存在およびまたは非存在によって表示化合物または所望化合物と異なる化合物を指す。そうした基または官能基は、当業者に公知の一般的な官能化反応により導入、転換するかつまたは取り除くことができる。官能化反応は、公知の方法を適用するかまたは適合させることによって実施することができる。当業者は上記反応を、以下の実施例で例示する方法を適用するかまたは適合させることによって実施することができる。さらに、本発明の方法は、式の化合物を単離する追加のステップも含むことができる。当業者はこれを、上記した回収方法などの公知の慣用的な手段のいずれかによって実施することができる。一般に、出発化合物、、、およびは、主にAldrichもしくはAcrosまたは他の典型的な化学品供給業者から市販品を入手するか、あるいは、公知の任意の方法または実施例で説明する方法を適用するかまたは適合させることによって得ることができる。他の目的によれば、本発明は、上記に定義した式の化合物もしくはその互変異性体およびまたはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される添加剤と一緒に含む医薬組成物にも関する。式の好ましい実施形態は、本発明の化合物に関して上記に定義した通りである。さらに他の目的によれば、本発明は、システインプロテアーゼを阻害するための本発明の式の化合物に関する。本発明の化合物は、それを必要とする患者におけるシステインプロテアーゼ、特にUSP、より具体的にはUSP7などの特異的な脱ユビキチン化酵素を阻害するのに有用である。本発明の化合物は、癌および転移、特に前立腺およびまたは結腸癌、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患、免疫障害、骨関節疾患、骨粗鬆症、関節炎、炎症性障害、心血管疾患、ウイルス感染症および疾患、ならびにまたはウイルスの感染およびもしくは潜伏、細菌感染症および疾患を治療およびまたは予防するために特に有用である。具体的には、前記ウイルス感染症および疾患は、単純ヘルペス1型または2型ウイルス感染症、A型肝炎、C型肝炎、SARSコロナウイルス感染症および疾患、エプスタインバーウイルス、ライノウイルス感染症および疾患、アデノウイルス感染症および疾患、灰白髄炎から選択される。一態様によれば、前記化合物は1つまたは複数のウイルスシステインプロテアーゼを阻害する。細菌システインプロテアーゼは、ストレプトパイン、クロストリパイン、ブドウ球菌システインプロテアーゼ、ジンジパインから選択することができる。本発明は、請求項1~8のいずれかに定義されている式の化合物もしくはその互変異性体およびまたは薬学的に許容されるその塩を抗癌剤、神経作用剤、血栓溶解剤、抗酸化剤、抗感染剤、血圧降下剤、利尿剤、血栓溶解剤、免疫抑制剤、心血管治療薬、免疫調節剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤から選択される1つまたは複数の活性剤と一緒に含む組合せにも関する。本発明は、それを必要とする患者に本発明の化合物を薬学的に許容される担体または添加剤と一緒に投与することを含む対応する治療方法にも関する。本明細書で述べる疾患および状態の治療を必要とする対象の特定は、十分に当業者の能力と知見の範囲内である。当技術分野の獣医または医師は、臨床試験、健康診断、病歴家族歴または生物学的および診断学的検査を用いることによって、そうした治療を必要とする対象を容易に特定することができる。担当診断医は当技術分野の専門家として、治療有効量を、慣用的な手法を用い、類似の状況下で得られた結果を観察することにより容易に決定することができる。治療有効量を決定する場合、担当診断医によって、これらに限定されないが対象の種そのサイズ、年齢および全体的な健康関係する具体的な疾患疾患の関与の度合いまたは重症度個々の対象の応答投与される具体的な化合物投与方法投与される製剤の生物学的利用能選択される投与レジメン併用薬の使用ならびに他の関連する状況を含む多くの因子が考慮される。所望の生物学的効果を達成するのに必要な式の化合物の量は、使用する化合物の化学的特性、その化合物の効力、疾患の種類、その患者が属する種、患者の病状、投与経路、選択された経路による化合物の生物学的利用能、投与される所要用量、送達およびレジメンに影響を及ぼすすべての因子を含む多くの因子によって変わることになる。薬学的にまたは薬学的に許容されるは、必要に応じて動物またはヒトに投与したとき、悪影響を及ぼさない、またはアレルギー性もしくは他の有害な反応をもたらさない分子的実体および組成物を指す。本明細書で用いる薬学的に許容される添加剤には、保存剤または抗酸化剤、フィラー、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などの任意の担体、賦形剤、補助剤またはビヒクルが含まれる。薬剤活性物質のためのそうした媒体や薬剤の使用は当業界で周知である。慣用的な任意の媒体または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用を考慮する。補助的活性成分を、適切な治療組合せとして組成物中に混ぜ込むこともできる。本発明の関連で、本明細書で用いる治療するまたは治療という用語は、そうした用語が適用される障害または状態、あるいはそうした障害または状態の1つもしくは複数の症状の進行を逆転させる、緩和するまたは抑制する、あるいはそれを予防することを意味する。治療有効量は、その病因に関与する活性システインプロテアーゼの阻害を必要とする病態を予防または治療するのに効果的な本発明による化合物医薬品の量を意味する。本発明によれば、患者またはそれを必要とする患者という用語は、活性システインプロテアーゼがその病因に関係している病態に罹患しているまたは罹患している可能性がある動物またはヒトを指すものとする。好ましくは、その患者はヒトである。大まかに言えば、本発明の化合物は、非経口投与用に01~10重量容積の化合物を含む生理緩衝水溶液で提供することができる。一般的な用量範囲は1日当たり1μgkg~01gkg体重であり、好ましい用量範囲は1日当たり001mgkg~100mgkg体重であり、またヒトの子供においてはその等価用量である。投与する薬物の好ましい投薬量は、疾患または障害の種類およびその進行度合い、具体的な患者の全体的健康状態、選択された化合物の相対的生物学的効能、化合物の処方、投与経路、選択された送達経路による化合物の薬物動態特性ならびに投与の速度およびスケジュールなどの変数に依存する可能性がある。本発明の化合物は単位用量形態で投与することもできる。この単位用量という表現は、活性化合物をそれ自体かまたは以下で説明するような薬学的に許容される組成物として含む物理的および化学的に安定な単位用量を維持しながら、患者に投与でき容易に取り扱い包装することができる単一用量を意味する。したがって、典型的な合計1日用量範囲は001~100mgkg体重である。一般的指針として言えば、ヒトのための単位用量は1日当たり1mg~3000mgの範囲である。好ましくは、単位用量範囲は1日に1~6回の投与で1~500mgであり、より好ましくは1日に1回10mg~500mgである。本明細書で提供する化合物は、1つまたは複数の薬学的に許容される添加剤と混合して医薬組成物に処方することができる。そうした単位用量組成物は、経口投与で、特に錠剤、単純なカプセル剤もしくは軟質ゲルカプセル剤の形態でまたは鼻腔内で、特に散剤、点鼻剤もしくはエアゾール剤の形態でまたは経皮で、例えば軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤もしくは噴霧剤または経皮パッチ剤で局所的に使用するために調製することができる。組成物は単位剤形で好都合に投与することができ、製薬技術分野で周知の方法のいずれか、例えばRemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy、第20版Gennaro、AR、EdLippincottWilliamsWilkinsPhiladelphia、PA、2000年に記載されている方法によって調製することができる。好ましい処方物には、本発明の化合物が経口または非経口投与用に処方されている医薬組成物が含まれる。経口投与用に、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似の性質の化合物微結晶性セルロースもしくはトラガカントゴムなどの結合剤デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤デンプンおよびセルロース誘導体などの崩壊剤ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミントもしくはサリチル酸メチルなどの香味剤のいずれか1つもしくは複数を含むことができる。カプセル剤は、任意選択で可塑剤とブレンドされたゼラチンブレンドで一般にできている硬カプセル剤または軟カプセル剤、ならびにデンプンカプセル剤の形態であってよい。さらに、投薬単位形態は、投薬単位の物理的形態を改変する他の様々な物質、例えば糖、セラックまたは腸溶性薬剤のコーティングを含むことができる。他の経口剤形のシロップ剤またはエリキシル剤は、甘味剤、保存剤、染料、着色剤および香味剤を含むことができる。さらに、活性化合物を、速溶性、放出調節型または持続放出型の製剤および処方物中に混ぜ込むことができる。ここで、そうした持続放出処方物は二峰性であることが好ましい。好ましい錠剤は、ラクトース、とうもろこしデンプン、ケイ酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクを任意の組合せで含む。非経口的投与用の液体製剤には、滅菌した水性または非水性の液剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。液体組成物は、結合剤、緩衝剤、保存剤、キレート剤、甘味剤、香味剤および着色剤なども含むことができる。非水性溶媒には、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの有機エステルが含まれる。水性担体には、アルコールと水の混合液、緩衝媒体および生理食塩水が含まれる。特に、生体適合性の生分解性ラクチドポリマー、ラクチドグリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーは活性化合物の放出を制御するための有用な添加剤であり得る。静脈内ビヒクルには、体液および栄養補給液、リンゲルデキストロースをベースとしたものなどの電解質補給液などを含むことができる。これらの活性化合物のための潜在的に有用な他の非経口送達系にはエチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システムおよびリポソームが含まれる。投与の代替的な方式には、乾燥粉末剤、エアゾール剤または滴下剤のような手段を含む吸入用の処方物が含まれる。それらは、例えばポリオキシエチレン9ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水性液剤であっても、点鼻剤の形態かまたは鼻腔内で施されるゲル剤として投与するための油性液剤であってもよい。口腔投与用の処方物は、例えばロゼンジ剤またはパスティール剤を含み、またスクロースまたはアカシアなどの香味ベースおよびグリココレートなどの他の添加剤も含むことができる。直腸投与に適した処方物は好ましくは、ココアバターなどの固体ベースの担体と一緒に単位用量坐剤として提供され、サリチル酸塩を含むこともできる。皮膚への局所施用のための処方物は好ましくは、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゲル剤、噴霧剤、エアゾール剤またはオイルの形態をとることが好ましい。使用できる担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコールまたはその組合せが含まれる。経皮投与に適した処方物は、離散型パッチとして提供することができ、ポリマーまたは接着剤中に溶解およびまたは分散させた親油性乳剤または緩衝水溶液であってよい。生理学的条件下での活性DUBのパネルによるUSP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害の非限定的例として、本発明を、以下の実施例および図面における説明により、さらに例示するが本発明はこれらに限定されるものではない。実験本発明の代表的な化合物は、以下の手順にしたがって合成することができる。基本分析手順NMRスペクトルを、BrukerまたはVarian分光計により、溶媒としてCDCl3またはDMSOd6を用いて1Hについて300または400MHzで、13Cについて75または100MHzで記録した。化学シフトを、内部TMSまたは重水素化溶媒シグナルを基準としてppmで示す。LCMS分析を用いて目的化合物を分析し精製した。LCMS分析は、WatersMicromass、BrukerEsquire3000またはAgilentlontrapXCTPlus質量分光計およびUVおよびまたはDAD検出を備えたWatersAlliance2790またはAgilent1100シリーズLCシステムを用いて実施した。カラムWatersXTerraMSC18、30×21mm、AtlantisT3C18、3μm、50mm×21mmまたはInertsilC8、250mm、46mm、5μm。流速08~12ml分、勾配a水10MeOH、ギ酸アンモニウム10mM~100MeOHまたはb95水アセトニトリル、01HCOOH~95アセトニトリル。UV検出190~400nm。すべての化合物は95を超える純度であった。基本手順1化合物の調製式の中間体の調製ステップ1縮合9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン3カルボン酸ジフェニルエーテル中の2アミノテレフタル酸の懸濁液にシクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cで10分加熱した。反応の完了をLCMSでモニターした。シクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cでさらに10分加熱した。LCMSにより完全な生成物の生成が示されるまで、上記工程を繰り返した。反応混合物を25°Cに冷却し、生成物をろ過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥して158gのを黄色固体として得た。1HNMRδ1327、1154、814~811、772~770、272、244、176~172。MSC14H13NO3の計算値24309、実測値2438。ステップ2ハロゲン化9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸オキシ塩化リン中の9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン3カルボン酸の懸濁液を100°Cで1h加熱した。反応の完了をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を25°Cに冷却し、過剰のオキシ塩化リンを真空下で除去した。残留物を氷と混合し、固体重炭酸ナトリウムでpHを4~5に調節した。得られた固体をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥して96gの化合物を白色固体として得た。1HNMRδ1337、844、819~816、809~807、306、296、199~189。MSC14H12ClNO2の計算値26106、実測値2618。ステップ3アミド形成複素環酸VIIの01MDMF溶液にトリエチルアミンを加え、次いで対応するアミンおよびカップリング剤を加えた。対応する混合物を20°Cで1~12h撹拌した。濃HClを加え、5分撹拌した後、混合物を真空下に置いた。粗製化合物を20mLのAcOEtで抽出し、10mLの05MNaHC03水溶液および10mLの水で洗浄した。有機相をMgSO4で脱水し、次いで真空下で蒸発させた。シリカゲルまたは分取LCMSを用いて精製して対応する純粋なアミドを得た。上記に開示した方法を適用するかまたは適合させて調製した化合物のいくつかの選択データを以下に示す9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸1ピペリジン4イルメチルアミド1HNMRδ877、847、817、804、736、718、709、707、704、338、332~329、321、306、298、279、228、194~184、169、166、163~153、128~114。MSC28H32ClN3Oの計算値46122、実測値46217。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド1HNMRδ872、843、816、802、729、718、354、332、306、298、246、189、174、097。MSC26H30ClN3Oの計算値43521、実測値43617。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド1HNMRδ875、845、817、804、337~328、306、298、244、232、19、168、139、083。MSC23H32ClN3Oの計算値40122、実測値40222。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド1HNMRδ869、844、818、804、341~328、306、298、259、252、19、098MSC21H26ClN3Oの計算値35918、実測値36019。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド1HNMRδ886、844、817、804、340~328、306、298、250~240、19、178~164。MSC21H26ClN3Oの計算値37118、実測値37217。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミド1HNMRδ88、844、817、803、338~326、306、298、246、190、168、095。MSC21H28ClN3Oの計算値37393、実測値37419。アゼパン1イルメタノン1HNMRδ817、785、76、361、335~328、305、298、189、176、160、153。MSC22H23ClN2Oの計算値34215、実測値34317。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド1HNMRδ884、845、817、804、338~328、306、298、236、219、19、171、14、083。MSC24H33ClN4Oの計算値42823、実測値42920。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド1HNMRδ876、844、817、802、733~716、347、338、334、333~328、306、299、242、212、190、177。MSC25H28ClN3Oの計算値42119、実測値42214。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸3プロピルアミド1HNMRδ882、845、817、804、338~328、306、298、236、214、19、171。MSC22H29ClN4Oの計算値40020、実測値40120。9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジノ3カルボキサミド1HNMRδ150、162、190、195、205、222、295、303、334、800、813、843、879。MSC21H26ClN3Oの計算値37118、実測値37195。9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HNMRδ171、185、250、297、305、337、366、454、728、809、818、852、936。MSC26H28ClN3Oの計算値43319、実測値43393。9クロロNフェニル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HNMRδ171、191、254、300、309、335、361、707、731、775、784、815、823、865。MSC25H26ClN3Oの計算値41918、実測値41994。9クロロNプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドRMN1HNMRδ099、121、140、157、170、190、208、228、272、282、295、305、330、803、815、844、880。MSC22H30ClN3Oの計算値39921、実測値40000。Nエチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ160、175、190、297、306、314、375、806、818、849、895。MSC22H28ClN3Oの計算値38519、実測値38596。9クロロNエチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ137、148、188、239、249、295、304、343、803、814、843、869。MSC21H26ClN3Oの計算値37118、実測値37195。メチルピペラジン1イルメタノン1HRMNδ108、142、163、178188、210、212、235、271、295、303、337、353、761、787、816。MSC25H33ClN4Oの計算値44023、実測値44102。ピペラジン1イルメタノン1HRMNδ140、168、183、188、211、216、251、255、276、296、304、335、365、762、788、817。MSC24H31ClN4Oの計算値42622、実測値42701。メタノン1HRMNδ163、189、298、305、334、359、761、787、818。MSC19H21ClN2Oの計算値32813、実測値32897。Nメチル9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ121、161、168、190、280、298、305、319、352、724、731、804、817、846、878。MSC27H30ClN3Oの計算値44721、実測値44798。9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ121、150、170、190、227、255、289、298、306、321、717、727、804、816、847、877。MSC29H34ClN3Oの計算値47524、実測値47601。9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ118、160、172、193、253273、297、306、322、720、805、817、848、878。MSC28H32ClN3Oの計算値46122、実測値46201。9クロロNペンタン2イル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ097、120、152、190、253、298、304、410、805、816、848、850。MSC23H32ClN3Oの計算値40122、実測値40196。9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ111、174、190283、250、285、299、307、318325、355、806、818、848、880。MSC21H26ClN3Oの計算値37118、実測値37192。9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ111、174、190283、250、285、299、307、318、325、355、806、818、848、880。MSC21H26ClN3Oの計算値37118、実測値37192。9クロロN22ジメチルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ094、189、229、234、296、305、326、801、816、843、877。MSC21H28ClN3Oの計算値37319、実測値37392。9クロロNイルプロピル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミド1HRMNδ184、255、267、280、296、305、339、357、709、799、809、844、886。MSC26H28ClN3Oの計算値43319、実測値43394。上記した方法を用いて以下の化合物も合成した9クロロNベンジル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドMSC26H28ClN3Oの計算値43319、実測値43391。9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドMSC28H32ClN3O2の計算値47722、実測値47799。9クロロNピペリジン4イルメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドMSC29H35ClN4Oの計算値49025、実測値49100。9クロロNメチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドMSC20H24ClN3Oの計算値35716、実測値35793。9クロロN5678テトラヒドロアクリジン3カルボキサミドMSC28H32ClN3O2の計算値47722、実測値47799。9クロロ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸アミドのクロルヒドラートMSC22H26ClN2O2HClの計算値35918、実測値36001。ペプシンカップリングによって式の化合物を得るために式の他の中間体化合物を合成した式の中間体の調製ステップ1縮合9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン2カルボン酸ジフェニルエーテル中のアミノ酸の懸濁液に、シクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cで10分加熱した。反応の完了をLCMSでモニターした。これは所望の生成物、中間体水和物を示したが、依然として出発原料は存在した。シクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cでさらに10分加熱した。LCMSが完全な生成物形成を示すまで上記工程を繰り返した。シクロヘキサノンの沸点155°Cであるため、過剰のシクロヘキサノンは低沸点の反応混合物をもたらした。最後に、過剰のシクロヘキサノンを減圧下で除去し、残留物を250°Cでさらに10分加熱した。LCMSは所望の生成物を示した。反応混合物を25°Cに冷却し、生成物をろ過し、ペンタンで洗浄し、真空下で乾燥して549mgを茶褐色固体として得た。粗生成物をさらに精製することなく使用した。1HNMRδ190~200、298~307、313~322、787、847、85713CNMRδ212および214、268、328、1235および1247、1274~1341、1427および1429、1598、1659ステップ2ハロゲン化9クロロ5678テトラヒドロアクリジン2カルボン酸POCl3中の粗製カルボン酸の懸濁液を100°Cで1h加熱した。反応をLCMSで追跡した。これにより、所望の生成物以外に出発原料は示されなかった。過剰のPOCl3を真空下で除去し、残留物を氷中に注ぎ、得られた水性残留物を摩砕し、固体NaHCO3でpHを4に調節し、得られた固体をろ過して、真空下で乾燥した後、127mgの生成物を得た。所望の生成物をリバースフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。90mgの純粋な所望生成物をベージュ色固体として得た。1HNMRδ190~200、298~307、313~322、787、847、85713CNMRδ212および214、268、328、1235および1247、1274~1341、1427および1429、1598、1659式の中間体の調製ステップ1酸化4ニトロイソフタル酸過マンガン酸カリウムを、温度計と還流冷却器を備えたフラスコ中で水に溶解した。4ニトロmキシレンを加えた。混合物を注意深く85°Cに加熱した。反応混合物を85°Cに保持するために冷却が必要であった。20分後、混合物を緩やかに3h還流させた。温かい混合物をセライトでろ過した。低温のろ液を濃硫酸で酸性化し、乳状の懸濁液を得た。EtOAcで抽出した。一緒にした有機層を脱水し、濃縮して白色固体を得た。溶離液としてEtOAcヘプタンAcOH10101を用いてフラッシュクロマトグラフィーで精製して2つの画分の白色固体を得た。ステップ2ニトロ還元4アミノイソフタル酸EtOH中のニトロイソフタル酸の溶液をHcubeに注入した。得られた溶液をLCMSで制御した。これにより所望の生成物への完全な転換が示された。ニトロソ副生物トレースを避けるため、得られたものを、上記した方法でもう一度HCubeに注入した。EtOHを真空下で除去し、083gの純粋な所望のアニリンを白色固体として得た。きれいなアニリンをさらに精製することなく縮合ステップで使用した。ステップ3縮合9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン4カルボン酸ジフェニルエーテル中の2アミノイソフタル酸の懸濁液にシクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cで10分加熱した。反応の完了をLCMSでモニターした。シクロヘキサノンを加え、反応混合物を250°Cでさらに10分加熱した。LCMSが完全な生成物形成を示すまで上記工程を繰り返した。6サイクル後、LCMSは反応の進行を示さなかった。そこで、シクロヘキサノンを真空下で完全に除去した。シクロヘキサノンの沸点155°Cであるため、過剰のシクロヘキサノンは低沸点の反応混合物をもたらした。過剰のシクロヘキサノンを減圧下で除去し、次いで15mLのシクロヘキサノンを残留物に加え、反応混合物を250°Cで10分加熱した。LCMSは所望の生成物への完全な転換を示した。反応混合物を25°Cに冷却し、生成物をろ過し、ペンタンで洗浄し、次いでMeOHで洗浄し、真空下で乾燥して純粋な所望生成物をベージュ色固体として得た。ステップ4ハロゲン化9クロロ5678テトラヒドロアクリジン4カルボン酸POCl3中の粗製カルボン酸の懸濁液を100°Cで1h加熱した。反応をLCMSで追跡した。これにより、所望の生成物への完全な転換が示された。反応物を室温に冷却し、過剰のPOCl3を真空下で除去した。残留物を氷中に注ぎ、固体NaHCO3でpHを4に調節した。水性混合物を摩砕し、終夜5°Cに置いた。得られた固体をろ過し、水で洗浄して濃い灰色の粉末を得た。迅速フラッシュクロマトグラフィーにより76mgの純粋な所望生成物を得た。1HNMRによりトレースまたはEtOAcが示されたので、生成物を高真空下で終夜乾燥し、120°C、周囲圧力で05h乾燥した。1HNMRδ185~195、293~302、303~310、801、820、875、133513CNMRδ222、274、341、1242、1261、1292~1302、1414、1481、1625、1671式の中間体の調製ステップ1縮合11オキソ67891011ヘキサヒドロ5Hシクロヘプタbキノリン3カルボン酸ジフェニルエーテル中の2アミノテレフタル酸の懸濁液に25°Cでシクロヘプタノンを加え、反応混合物を250°Cで15分加熱した。LCMSにより95の生成物形成が示された。反応混合物を23~25°Cに冷却し、ヘキサンを加え20分撹拌した。沈澱した固体をろ過し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥した。粗生成物をそのまま次のステップにもち込んだ。1HNMRδ1328、1161、814~816、773~7757、277~284、169~181、146。ステップ2ハロゲン化11クロロ78910テトラヒドロ6Hシクロヘプタbキノリン3カルボン酸化合物VIfをオキシ塩化リンに取り、95°Cで8h還流させた。反応をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を25°Cに冷却し、反応塊を砕氷でクエンチし、10NaHCO3溶液で塩基性化してpH4~5にした。水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して黄色固体を得た。1HNMRδ8456~8460、818~821、8104~8138、320~325、185~186、170~173。式の中間体の調製ステップ1ハロゲン化9ブロモ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸トルエン中の9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン3カルボン酸の懸濁液をオキシ臭化リンと一緒に100°Cで4h加熱した。反応の完了をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を25°Cに冷却し、固形の氷でクエンチし、固体重炭酸ナトリウムでpHを4~5に調節した。沈澱した固体をろ過し、水で洗浄し、真空下で乾燥して粗生成物を灰白色固体として得た。粗生成物を分取HPLCで精製して純粋なブロモ化合物を灰白色固体として得た。1HNMRδ844、819~816、808~811、307、297、189。ステップ2エステル化エチル9ブロモ5678テトラヒドロアクリジン3カルボキシレートトルエン中の9オキソ5678910ヘキサヒドロアクリジン3カルボン酸の懸濁液をオキシ臭化リンと一緒に100°Cで4h加熱した。反応の完了をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を25°Cに冷却しメタノールでクエンチし、反応混合物を真空下で濃縮し、粗生成物をシリカゲルカラムで精製した。生成物をクロロホルム中の2メタノールで溶出させた。画分を集め、濃縮して純粋な生成物を灰白色固体として得た。この化合物をそのまま次のステップにもち込んだ。1HNMRδ847~849、821~827、809~813、395、308、299、191。ステップ4メチル化エチル9メチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボキシレートDMEおよびTHFの中の9ブロモ5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸メチルエステルの溶液に炭酸カリウム、メチルボロン酸を加え、反応混合物をアルゴンで脱ガスした。テトラキスパラジウムを加え、反応混合物を90°Cで8h加熱した。反応の完了をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を25°Cに冷却し、酢酸エチルで希釈し、セライトでろ過した。ろ液を濃縮し、シリカゲルカラムで精製した。生成物をエーテル中の10酢酸エチルで溶出させた。画分を集め、濃縮して生成物を70の純度の灰白色固体として得た。生成物を分取HPLCでさらに精製した。1HNMRδ873、800~808、399、301~318、293、259、190~203。ステップ4けん化9メチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸THF水中の9メチル5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸メチルエステルの溶液に固体水酸化ナトリウムを加え、反応混合物を70°Cで3h加熱した。反応の完了をTLCでモニターした。完了したら反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した。水層を15N塩酸溶液でpH3~4に酸性化した。沈澱した生成物をろ過し、乾燥して純粋な生成物を灰白色固体として得た。化合物を分取HPLCで精製した。1HNMRδ869、857~860、826~829、332、301、285、194。ステップ4水素化5678テトラヒドロアクリジン3カルボン酸エタノール中の9クロロ5878テトラヒドロアクリジン3カルボン酸の溶液に50湿潤の10パラジウム炭素を加え、反応混合物を3kgで12h水素化した。反応の完了をTLCでモニターした。反応混合物をセライトでろ過し、エタノールで洗浄し、真空下で濃縮して粗生成物を得た。クロロホルム中の5メタノールを用いてシリカゲルクロマトグラフィーで精製して80mgの純粋な生成物を得た。1HNMRδ1315、843、809、791~798、2965~3072、1878~1972。代表的なシステインプロテアーゼUSP7タンパク質の生成および精製USP7をコードするcDNAを胎盤mRNAからのPCR増幅により得た。USP7cDNAをPCRでバキュロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。完全長野生型ヒトUSP7および触媒作用変異体を、InvitrogenからのBactoBacバキュロウイルス系を用いて製造業者の取扱説明書にしたがって、ヨトウガ細胞中、N末端でHisタグを付けた融合物として生成させた。pFastBacHTBUSP7を用いてDHIObac細胞を形質転換させ、青色白色セレクションをXgalIPTG寒天プレートで実施した。バクミドDNAをアルカリ溶解手順で調製した。バクミドミニプレップの完全性およびその向きを、ジェネリックプライマーおよび特異的プライマーを用いてPCRでチェックした。Sf9昆虫細胞をInsectXpress培地中、27°Cで培養し、GeneShuttle40を用いて対応するバクミドで形質移入させた。形質移入後72hでウイルスを上澄み中に回収した。ウイルスを、150cm2細胞培養フラスコ中で、50mlInsectXpress培地中の昆虫細胞を、形質移入されたSf9細胞の500μΙの上澄みで感染させて増幅させた。2回目の増幅に続いて、感染細胞を迅速SDS溶解法により回収し、100°Cで5分煮沸し、手短に超音波処理し、14000gで20分遠心分離にかけた。感染したSf9細胞での発現レベルを、感染していない細胞でのレベルと比較した。次いで融合タンパク質を、緩やかに揺らせながら4°Cで30分、TALONビーズと結合させた。ビーズを十分に洗浄し、結合タンパク質を250mMイミダゾールを含む洗浄緩衝液に溶出させた。溶出した画分を4~12NuPAGEゲルで分割した。高濃度の精製タンパク質を含む画分を透析し、一定分量に分け、液体窒素中で瞬間凍結させ、次いで80°Cで保存した。USP7活性アッセイUSP7を、USP緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を200μM~91nMの様々な濃度で試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。USP7についての基質濃度は300nMUbAMCであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は100pMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。USP5活性アッセイUSP5をUSP緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を異なる濃度200μM~91nMで試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。USP5についての基質濃度は300nMUbAMCであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は300pMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。USP8のクローニングおよび精製USP8をコードするcDNAを胎盤mRNAからのPCR増幅により得た。USP8cDNAをPCRでバキュロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。変異USP8をコードするcDNAを、変異原性PCRにより生成させた。対応するタンパク質は、残基786でのシステインのアラニンへの置換をコードする。配列を、読み取り枠全体を配列決定することによって確認した。USP8をコードするバクミドをDH10bac転位により生成させた。対応するバクミドを昆虫細胞に形質移入した。ウイルスを培養上澄みから回収し、2倍に増幅した。昆虫細胞を72時間感染させた。すべての細胞溶解物を収集し、溶解緩衝液に溶解させた。タンパク質を、金属親和性樹脂で親和性精製した。結合した物質を、洗浄緩衝液で十分に洗い、樹脂から250mMイミダゾール含有洗浄緩衝液に溶出させた。タンパク質を透析緩衝液中で透析させた。タンパク質精製物を4~12NuPAGEで分析した。USP8活性アッセイUSP8を、USP緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を異なる濃度200μM~91nMで試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。USP8についての基質濃度は300nMUbAMCであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は136nMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。UCHL1活性アッセイUCHL1を、USP緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を200μM~91nMの異なる濃度で試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。UCHL1についての基質濃度は300nMUbAMCであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は25nMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。UCHL3活性アッセイUCHL3を、USP緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を200μM~91nMの異なる濃度で試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。UCHL3についての基質濃度は300nMUbAMCであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は13pMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。カスパーゼ3活性アッセイカスパーゼ3を、カスパーゼ3緩衝液に希釈した。化合物ストックをDMSO中20°Cで保存した。化合物を200μM~91nMの異なる濃度で試験した。反応を黒色384ウェルプレートで2連で実施した。カスパーゼ3特異性アッセイのための基質濃度は250nMであった。特異性アッセイにおける酵素の濃度は16nMであった。特異性アッセイを一定の基質濃度で初期速度下で実施するために、濃度を決定した。化合物を25°Cで30分間、酵素でプレインキュベートした。反応を、アッセイ緩衝液に希釈した酵素を含むプレートに基質を加えて開始させた。反応物を37°Cで60分間インキュベートした。反応を、酢酸を加えて停止させた。Pherastar蛍光リーダーで読み取りを行った。λ発光380nmλ励起460nm。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめた。細胞生存率および増殖方法HCT116細胞生存率および増殖アッセイHCT116結腸癌細胞をATCCから入手し、10FBS、3mMグルタミンおよび1ペニシリンストレプトマイシンを含むMcCoys5A培地中で保持した。細胞を、5CO2を含む加湿環境下、37°Cでインキュベートした。細胞生存率を、96ウェル培養プレート水性非放射性細胞増殖アッセイ、Promega中でMTStechniqueを用いて製造業者の取扱説明書にしたがってアッセイした。MTS522Hテトラゾリウムは、代謝的に活性な細胞中で還元されて可溶性の細胞浸透性ホルマザンになるMTT誘導テトラゾリウムである。492nmでのその吸光度により検出されるホルマザンの量は、代謝的に活性な生存細胞の数に比例する。103個のHCT116細胞をウェルごとに播種した。24時間後、培地を取り替え、細胞を100μM~50nMの各化合物濃度で3連で処理した。化合物を100DMSOに希釈し、その最終濃度を細胞に対して05に保った。細胞を化合物で72時間インキュベートし、次いでMTSを2時間で添加してその生存率をアッセイした。492nmでの吸光度を96ウェル培養プレートから直接測定した。各化合物についてのGI50濃度を、S字形可変勾配当てはめを用いて算出した。値は、独立した3つの実験の平均値で表す。細胞溶解物において活性な脱ユビキチン化酵素のパネルによる化合物選択性の評価方法ユビキチンのC末端修飾したビニルスルホン誘導体、UbVSは、細胞中での活性DUBの直接可視化に明らかに有用である。脱ユビキチン化酵素のシステイン活性部位と共有結合するこの手段は、新規なユビキチンユビキチン様プロテアーゼを発見して特性評価し、正常細胞、ウイルス感染細胞および悪性細胞における活性脱ユビキチン化酵素をプロファイリングするための適用に成功している。この試験では、HAUbVSプローブを使用して細胞溶解物からのすべての脱ユビキチン化酵素の活性を直接可視化した。この手段を、本発明者らの小分子化合物の、生理学的条件で活性なすべての脱ユビキチン化酵素に対するUSP7についての活性特異性を評価するために用いた。誘導可能なUSP7shRNAHCT116細胞を用いてまたは用いずに予め4日間処理ならびにHEK293細胞を収集し、トリスpH74、50mMNaCl、150mMMgCl2、5mMEDTA、05mMDTT、2mMATP、2mMNP40、05およびグリセロール、10を含む非変性緩衝液を用いて氷上で溶解させた。サンプルを4°Cで1時間インキュベートし清澄化した。次いでタンパク質をBradford法で定量化した。天然細胞溶解物からのタンパク質25μgを、実施例14および実施例5の化合物またはNEMを用いて室温で2時間処理した。ラベリング緩衝液中のHAUbVSを添加してユビキチンラベリング反応を開始させ、室温で30分インキュベートした。次にサンプルを100°Cで10分間加熱し、手短に超音波処理した。これらをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分割し、ニトロセルロース膜に移し、USP7、HAおよびアクチンに対する抗体でプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたはHRPコンジュゲート抗ウサギ抗体を二次抗体として使用した。シグナルを、高感度ケミルミネッセンス法により試薬製造業者の取扱説明書にしたがって検出した。結果1USP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害結果を以下の表にまとめる2細胞生存率増殖の阻害結果を以下の表にまとめる3生理学的条件での活性DUBのパネルによるUSP7脱ユビキチン化活性の選択的阻害図1Aにまとめたように、ユビキチンのC末端修飾したビニルスルホン誘導体は、脱ユビキチン化酵素のシステイン活性部位と共有結合する。このラベリング、続く抗HA抗体での免疫ブロットによって、HCT116細胞溶解物からのすべての活性脱ユビキチン化酵素の識別が可能になる。さらに、活性USP7を、抗USP7抗体での免疫ブロット法に続いて観察される移動度シフトによって示されるように、このアッセイで特定した。DUBの活性形態に特異的なこのラベリングは、非特異的な方法でチオール反応性化合物によって阻害される。HAUbVSラベリングに続く活性DUBのパネルにおける活性USP7に対応するシグナルを局在化させるために、誘導可能なshRNAUSP7HCT116細胞系をドキシサイクリンで処理し、USP7shRNAの発現が可能になるようにした。興味深いことに、USP7サイレンシングに続いて1つのバンドだけが減少しており、これは、このバンドがHAUbVSUSP7に対応することを明らかに示している。この特異的な減少を示す定量化を図2Bに示す。ドキシサイクリン処理によって誘発されたUSP7サイレンシングを抗USP7抗体で確認した。小分子化合物を用いた試験を、HCT116細胞溶解物に対して固定用量の実施例14の化合物を用いてまず実施した。興味深いことに、HAUbVSUSP7に対応するサイズでの処理に続いて1つのバンドだけが減少していた。この特異的な減少を示す定量化を図3Bに示す。USP7活性に対するこの効果は、処理サンプルと未処理サンプルとの間で観察される移動度シフトで示されるように、抗USP7抗体で確認された。次にHCT116細胞を、異なる用量の実施例14および実施例5の化合物またはドキシサイクリンで処理してUSP7サイレンシングを誘発させた。ドキシサイクリンの存在で示されるようにHAUbVSUSP7タンパク質の局在化はUSP7の特異的サイレンシングによって促進された。このバンドが特定されたら、細胞溶解物を異なる用量の実施例14および実施例5の化合物で処理し、HAUbVSUSP7タンパク質レベルの特異的で用量依存的な減少が明らかに観察された。USP7活性に対するこの効果は、処理サンプルと未処理サンプルとの間で観察される移動度シフトで示されるように、抗USP7抗体で確認された。興味深いことに、こうした発見は、HEK293細胞から調製した細胞溶解物においても確認された。したがって、これらの結果は、この新規な化合物系統からの異なる化合物が、生理学的条件における活性DUBのパネルにより、USP7脱ユビキチン化活性を特異的で用量依存的に阻害することを実証している。4USP修飾因子の評価のためのUSP7およびUSP8基質としてのUb52の使用化合物26~38について、以下の手順にしたがってUSP7およびUSP8に対するインビトロアッセイを実施した。ユビキチンリボソームタンパク質融合物の調製ユビキチンとリボソームタンパク質L40との間の融合タンパク質をコードするcDNAを、独占所有のヒト胎盤ライブラリーを用いてヒトRNAから増幅させた。cDNAを、コードタンパク質のカルボキシル末端基に追加のflagタグを含む細菌発現ベクターにサブクローニングした。以下のプライマーを、GSTタグとインフレームで、ユビキチンL40をpGEX2Tに5cgtggatccatgcagatctttgtgaagaccctc3および5gcgaattctttatcgtcatcgtctttgtagtctttgaccttcttcttgggacg3をBamHIEcoRI制限酵素部位にサブクローニングするために使用した。組み換えタンパクの生成および精製のために、プラスミドpGEX2TUb52flagを大腸菌BL21に形質転換させ、100mgmlアンピシリンを含むLB培地中、37°Cで終夜成長させ、次いでLBampiへ1100に希釈した。細胞を、37°CでA60006~08に達するまでインキュベートした。01mMイソプロピルβDチオガラクトピラノシドで導入した後、培養物を30°Cで180分インキュベートした。4°C、7000×gで15分遠心分離にかけて細胞を収集した。細菌ペレットをNETNに溶解させ、手短に超音波処理した。14000×gで30分遠心分離にかけて不溶性物質を除去した。GSTUb52flagタンパク質をEverettRDら、EMBOJ16、1519~1530頁にしたがって精製した。手短に言えば、可溶性画分を、NETN緩衝液05ミルク中、4°Cで120分予め平衡化させたグルタチオンビーズでインキュベートした。通過画分を回収した。ビーズを十分に洗浄した。最終洗浄はトリスHClpH7620mMNaCl100mMMgCl212mMで実施した。溶出を、50mMトリスHClpH80、NaCl120mM中の20mM還元グルタチオンを用いて実施した。すべての画分を4~12NuPAGEで分割し、続いて01MDTTで処理し変性させ、クマシーブリリアントブルーで染色した。溶出液を、トリスHClpH7620mMNaCl50mMDTT05mM中、4°Cで終夜透析させた。均一時間分解蛍光発光測定法を用いた融合タンパク質のアッセイ本発明の実施例26~38により、均一媒体中での放射能移動によって放出された蛍光の時間分解測定をもとにしたアッセイでのGSTUb52Flagの使用の正当性の立証が可能になる。使用した試薬は以下の通りであるAntiflagKと称されるAntiflag抗体ユーロピウムクリプテート抱合体、08MKF、01ウシ血清アルブミン、トリスHCl25mMpH76中に02μMの溶液。抗GST抗体XL665抱合体、08MKF、01ウシ血清アルブミン、トリスHCl25mMpH76中に26μMの溶液。1475μMのGSTUb52Flag溶液および377μMのMBPUb52を、上記したストック溶液から50mMトリスHClpH76、EDTA05mM、ウシ血清アルブミン005、DTT5mM中へ調製。アッセイをマルチウェルアッセイプレートで実施する。プレートを、4°Cで終夜インキュベートした後、PHERAstar蛍光光度計で分析する。脱ユビキチン化タイプの酵素の活性のユビキチンリボソームタンパク質融合によるアッセイ試薬は以下のものを使用した50mMトリスHClpH76、ウシ血清アルブミン005、DTT5mM中に200pMのUSP7および400pMのUSP8の溶液。AntiflagK、08MKF、01ウシ血清アルブミン、トリスHCl25mMpH76中に02μMの溶液。抗GST抗体XL665抱合体、08MKF、01ウシ血清アルブミン、トリスHCl25mMpH76中に26μMの溶液。1475μMのGSTUb52flag溶液および377μMのMBPUb52を、上記ストック溶液からの50mMトリスHClpH76、EDTA05mM、ウシ血清アルブミン005、DTT5mM中への希釈により調製する。酵素反応を、GSTUb52flag溶液を5μlのUSP7溶液または5μlのUSP8と混合して実施する。この混合物を、マルチウェルアッセイプレートで、室温で1時間インキュベートする。5μlのAntiflagK溶液5μlの抗GSTXL665抗体の10μl混合物を、マルチウェルアッセイプレートの各ウェルに加える。4°Cで終夜インキュベートした後、PHERAstar蛍光光度計でプレートを読取る。シグナルの減少は、酵素活性の増大、すなわちGSTUb52Flag基質の切断と相関する。したがって用いたフォーマットは、ユビキチン特異的プロテアーゼなどの脱ユビキチン化タイプの酵素をアッセイする方法に十分に適しており、また、この酵素活性の修飾因子を決定するのにも適している。脱ユビキチン化タイプの酵素活性の修飾因子の決定脱ユビキチン化タイプの酵素の活性をアッセイするために上記したのと同じ手順を実施する。しかし、種々の反応混合物を、試験化合物26~38の存在下または非存在下、同じ酵素濃度でインキュベートする。データを対照に対するとして分析し、GraphPadを用いてパーセンテージ対化合物濃度の対数としてプロットした。データをS字形モデルに当てはめ、IC50を決定し以下の表に示した。