"血清、血漿または滑液中のII型コラーゲン断片のアッセイ方法であって、アミノ酸配列GPPGRDGAAG中に存在するC末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列GPPGRDGAAGVを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く抗体または免疫反応性抗体断片と反応性である、血清、血漿または滑液サンプル中のタンパク質断片の濃度の定量的測定を得るステップを含む、方法。アミノ酸配列GPPGRDGAAG中に存在するC末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列GPPGRDGAAGVを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く前記抗体または免疫反応性抗体断片と反応性であるタンパク質断片のサブセットが、前記測定から排除されない、請求項1に記載の方法。前記血清サンプル中に存在するタンパク質断片を前記抗体または免疫反応性抗体断片と接触させるステップと、前記抗体または免疫反応性抗体断片への前記断片の結合量を測定するステップとを含む、請求項1または2に記載の方法。前記抗体または免疫反応性抗体断片を、前記タンパク質断片と、前記抗体または免疫反応性抗体断片が特異的結合親和性を有する競合剤との両方に接触させる、請求項3に記載の方法。前記抗体が、HPACultureCollectionLogisticsOffice、HealthProtectionAgencyCultureCollections、CentreForEmergencyPreparednessandResponse、PortonDown、SalisburyWiltshire、SP40JG、UKに受託番号10091402として寄託されているNB44-3C1である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。HPACultureCollectionLogisticsOffice、HealthProtectionAgencyCultureCollections、CentreForEmergencyPreparednessandResponse、PortonDown、SalisburyWiltshire、SP40JG、UKに受託番号10091402として寄託されている細胞株により産生される、抗体NB44-3C1。検出可能な標識で標識された、請求項6に記載の抗体。前記標識がペルオキシダーゼ酵素標識である、請求項7に記載の抗体。較正曲線を生成するための標準試料、前記抗体に対して免疫学的に反応性のペプチド、発色反応に関与可能な発色性基質、発色反応の停止溶液、またはマルチウェルアッセイプレートのうちの1つまたは複数と一緒に、請求項6から8のいずれか一項に記載の抗体NB44-3C1を含む、イムノアッセイを実施するための試験キット。<抗体NB44-3C1の開発>免疫原性ペプチドを、標準的な操作手順に従って、キーホールリンペットヘモシアニンKLHにコンジュゲートした。簡潔に述べると、5mg/mlのシステイン含有ペプチドC-GGGRDGAAGおよびマレイミド活性化KLHを、コンジュゲート緩衝液中で混合し、室温で2時間インキュベートした。コンジュゲートした抗原を脱塩および透析によって精製し、EDTAおよびアジ化ナトリウムを除去した。6匹の8週齢Balb/Cマウスを、等体積のフロイント不完全アジュバントおよび免疫原KLH-C-GGGRDGAAGを含有するエマルジョン200μLで皮下免疫した。フロイント不完全アジュバントでの連続免疫は、3回の免疫については2週間毎に、その後は4週間毎に、マウス1匹当たり30μgの免疫原を用いて行った。2回目の免疫以降、マウスから採血した。各採血時に、血清力価を、ビオチン化した選択ペプチドBiotin-KPPGRDGAAGまたは除外ペプチドBiotin-KPPGRDGAAGVで被覆したストレプトアビジンプレートで、選択ペプチドPPGRDGAAG、除外ペプチドPPGRDGAAGV、およびネイティブ材料の自家製サンプルアレイデータ示さずに対して検出した。最も高い血清力価および良好なネイティブ反応性を有する2匹のマウスを、融合のために選択した。選択したマウスを1ヶ月間休息させ、その後100μLの0.9塩化ナトリウム溶液中50μgの免疫原で静脈内追加免疫した。3日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を単離した。融合ハイブリドーマを、標準手順に従って、SP2/0細胞LGCStandardsAB、Boras、Swedenを用いて行った。ハイブリドーマを、半固体培地法を使用して、35mmの細胞培養ペトリ皿中でクローニングした。皿から個々にピックアップした異なるハイブリドーマを、96ウェルプレートのウェルに移し、ここで、細胞を限界希釈によってクローニングした。クローンをELISAでスクリーニングした。簡潔に述べると、10ng/mlのビオチン標識した選択ペプチドおよび除外ペプチドを、10mMのPBS-BTBBSA、Tween-20およびブロニドックスを含む10mMのPBS中で、ストレプトアビジンプレート上に20°Cで30分間被覆した。標準的な洗浄緩衝液で5回洗浄した後、20μlの試験材料即ち、置換ペプチドまたは天然材料を、適切なウェルに添加した。洗浄せずに、1:100で開始した2倍希釈のクローン上清100μlを添加し、20°Cで2時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、マウスIgGに対するペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し[1:3000]JacksonImmunoResearch、EuropeLtd、UK、20°Cで1時間インキュベートした。洗浄後、100μlのテトラメチルベンジジンTMB3,3’,5,5-テトラメチルベンジジン、Kem-En-Tec、Roedovre、Denmarkを添加し、その15分後に100μlの停止溶液0.18M硫酸を添加した。比色アッセイを、605nmを参照として用いて、450nmで測定した。選択ペプチドを使用して、標的配列に対する抗体の結合を確認し、一方で除外ペプチドを使用して、標的配列を保有していない断片に対する抗体の任意の反応性を決定した。次いで、選択されたクローンを2回サブクローニングし、製造業者の使用説明書に従ってProtein-Gカラムを使用してモノクローナル抗体を精製した。2回のサブクローニングによって、細胞株NB44-3C1は、選択ペプチドおよび除外ペプチドを使用した所望の反応性プロフィールと、ヒトの血清、血漿および滑液中の断片に対する強い反応性とを有することが繰り返し実証され、最終的に、高度な生存能および抗体産生能を有した。<競合CIIMELISAの実施>CIIM競合ELISA手順は以下のとおりであった:96ウェルのストレプトアビジン被覆プレートを、4ng/mlので、20°C、300rpmで30分間被覆した。次いで、ウェルを標準的な洗浄緩衝液で5回洗浄した。標準試料の列を、10mMのPBS-BTBでの特異的ペプチドの事前希釈[2.5倍]によって準備した。サンプル即ち、ペプチド、ヒトの血清、血漿または滑液を同様に希釈した。標準試料およびサンプルを添加し[20μl/ウェル]、その後、20ng/mlのペルオキシダーゼ標識したNB44-3C1抗体を100μl/ウェル添加した。次いで、ウェルに覆いをし、4°C、300rpmで一晩18±1時間インキュベートした。次いで、ウェルを5回洗浄し、100μlのTMBと共に20°C、300rpmで15分間インキュベートし、その後、各ウェル中100μl/ウェルの停止溶液100μlを添加した。比色反応を、標準的な実験室プレートリーダーで、650nmの参照を用いて、450nmで測定した。データは、SoftMaxProv5.0プログラムで取得した。CIIMELISAにより、良好な技術的性能が示された;0.2~14.9ng/mlの定量範囲、<15のアッセイ間およびアッセイ内変動、およびほぼ100の希釈回復dilutionrecovery。<ヒトOA軟骨におけるCIIM断片の免疫局在>ヒトOA軟骨におけるCIIM断片の免疫局在を、異なる部位の関節軟骨でNB44-3C1モノクローナル抗体を使用して調査した。結果を図1および以下に示す。A陰性対照、上部領域から軟骨下骨まで、免疫原と予めインキュベートしたNB44-3C1倍率13.2×。B概観写真、上部領域から軟骨下骨までのNB44-3C1染色倍率13.2×。C領域表面が変則的な関節軟骨の上部領域倍率33×。D表面にびらんおよび線維化fibrillationのある上部領域倍率33×。E深い亀裂損傷のある中間領域倍率33×。F深部領域、石灰化した軟骨および軟骨下骨倍率33×。図1Bでは、NB44-3C1による強い染色単色で赤色~暗色が、組織切片の上部領域軟骨表面近傍および下部区画軟骨下骨近傍で観察される。図1Cは、より高倍率での上部領域での強い染色を実証している。図1Dおよび図1Eでは、強い染色が、上部領域および特に軟骨損傷の領域において観察される。最後に、図1Fは、軟骨下骨に対して近位の石灰化した軟骨中のNB44-3C1による強い染色を実証している。このように、CIIMは、OA軟骨における典型的な関節炎の特徴に免疫局在していることが示された。<関節リウマチ患者から得た血清サンプルにおける反応性II型コラーゲン断片の測定>実施例2に記載したモノクローナル抗体NB44-3C1を用いた競合CIIMELISAを使用して、CIIMを血清中で測定した。結果を図2に示す。血清サンプルは、抗炎症治療実線またはプラセボ破線による治療の前および4週間後に、関節リウマチ患者から得た。CIIM競合ELISAによるCIIM断片の分析まで、サンプルを-20°Cで保存した。4週間目に、プラセボ群と治療群との間の差異は、非常に有意であったp<0.05。<血清CIIMレベルとOA重篤度スコアとの相関>より広いCopenhagen地域の、21歳以上の合計159人の成人被験者を、以前に記載したように、CCBR調査に参加するよう勧誘した。この集団は、症状なしから一方または両方の膝の自己申告の疼痛までの範囲の、種々の程度のOA症状を有した。炎症性関節炎、磁気共鳴画像化MRI検査に対する何らかの禁忌、または以前の膝関節置換術がある被験者は、本調査から排除した。両方の膝のデジタルX線写真を、Synarc製のSynaFlexを使用して、全ての被験者から後側-前側の位置で同時に取得した。Kellgren-LawrenceKL指数を、それぞれ外側および内側の脛-大腿部関節について決定した。スコア0は膝OAの徴候がほとんど無いかまたは全く無いことを示し、最大スコア4は、進行性の膝OAを示す。被験者の膝の悪化のスコアを使用して、被験者を3つの下位群に分けた:OAなしKL0、中等度のOAKL1~2および重度のOA3~4。156人の被験者の血清サンプルを、-80°Cの保存から解凍し、CIIMレベルを測定した。他の3人の被験者の血清サンプルは、バイオバンクから欠落しているか空かのいずれかであった。本調査は、HelsinkiDeclarationIIおよびEuropeanGuidelinesforGoodClinicalPracticeに従って実施した。プロトコルは、DanishNationalCommitteeonBiomedicalResearchEthicsにより承認された承認番号KA2006-0054、DanishMinistryofInteriorandHealth。全ての参加者は、承認されたインフォームドコンセントの用紙にサインした。CIIMを、上記全ての血清サンプルで測定した。女性0.778ng/ml[CI95;0.693~0.907]、n=75と男性0.859ng/ml[CI95;0.757~0.939]、n=81との間に、血清CIIMレベルの有意なp=0.323差異は存在しなかった。被験者を、膝OAの程度に応じて、3つの群に下位分割した;OAなし、中等度のOAおよび重度のOA。OAなし群は有意に若く、いずれのOA群よりも有意に低いBMIを有していた。中等度のOA群と重度のOA群との間には、年齢およびBMIには有意な差異は存在しなかった。平均血清CIIMは、OAなしの個体0.712ng/ml、n=75と比較すると、中等度のOAを有する個体0.895ng/ml、n=62および重度のOAを有する個体1.039ng/ml、n=19において、有意に高かった図3。中等度のOAを有する個体と重度のOAを有する個体との間に有意な差異は存在しなかったが、重度のOAを有する個体では、血清CIIMレベルが上昇する傾向があった。<滑液中のCIIMレベル>CIIMELISAを使用して、滑液中のII型コラーゲン断片を検出した。51人のOA患者由来の滑液中で測定されたCIIMの平均レベルは0.850ng/mlであり、0.147から4.13ng/mlの範囲であった。<モノクローナル抗体と種々の被分析物との反応性>モノクローナル抗体3C1を、同じ免疫原即ち、KLH-C-GGGRDGAAGに対して生じた他の5種のモノクローナル抗体と比較した。全てが標的配列即ち、PPGRDAAGと反応性であったが、MAb3C1が、ヒト体液中に存在する被分析物に対する最良の相対的結合特性を提供した。特に、良好な反応性は、ヒト尿およびヒト血清中の被分析物に対して検出された。本明細書では、明示的にそうでないことが示されない限り、単語またはorは、条件の一方のみが満たされることを要求する演算子排他的なまたはexclusiveorとは異なり、提示された条件のいずれかまたは両方が満たされた場合に真の値を返す演算子の意味で使用される。単語含むcomprisingは、からなるconsistingofを意味するのではなく、含むincludingの意味で使用される。上で認識された全ての先行する教示は、本明細書により参照として組み込まれる。本明細書中の任意の先行の公開文書についての認識は、本明細書の日付においてオーストラリアまたは他の場所でその教示が共通の一般知識であったという容認または表明であると解釈すべきではない。"