"トリプトファン及び/又はインドール-3-乳酸をモナチンに変換することを含むモナチン製造方法であって、以下のステップ:トリプトファン又はインドール-3-乳酸を第一のポリペプチドと接触させ、上記第一のポリペプチドがトリプトファン又はインドール-3-乳酸をインドール-3-ピルビン酸塩に変換する、ここで、該第一のポリペプチドは、トリプトファンが上記第一のポリペプチドと接触するとき、トリプトファンアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.27、チロシン芳香族アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.5、トリプトファンデヒドロゲナーゼEC1.4.1.19、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼEC1.4.1.2、EC1.4.1.3、EC1.4.1.4、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼEC1.4.1.20、トリプトファン-フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼEC2.6.1.28、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.1、L-アミノ酸オキシダーゼEC1.4.3.2、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼEC1.4.99.1、D-アミノ酸オキシダーゼEC1.4.3.3、D-アミノ酸D-アラニンアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.21、又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれ、かつ、前記第一のポリペプチドは、インドール-3-乳酸が、上記第一のポリペプチドと接触するとき、インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.110、R-4-ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.222、3-4-ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素EC1.1.1.237、乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.27、EC1.1.1.28、EC1.1.2.3、3-イミダゾール-5-イル乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.111、及び乳酸塩オキシダーゼEC1.1.3.-又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる;インドール-3-ピルビン酸塩を第二のポリペプチド及びC3炭素源と接触させ、上記第二のポリペプチドがインドール-3-ピルビン酸塩及びC3炭素源を2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸に変換する、ここで、該第二のポリペプチドは、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩-リアーゼEC4.1.3.16、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩-リアーゼEC4.1.3.17又はそれらの組み合わせから選ばれる;及び2-ヒドロキシ2-インドール-3イルメチル-4-ケトグルタル酸を第三のポリペプチドと接触させ、上記第三のポリペプチドが2-ヒドロキシ2-インドール-3イルメチル-4-ケトグルタル酸をモナチンに変換する、ここで、該第三のポリペプチドは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.27、チロシン芳香族アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.5、トリプトファンデヒドロゲナーゼEC1.4.1.19、トリプトファン-フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼEC2.6.1.28、アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ2.6.1.1、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼEC1.4.1.2-4、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼEC1.4.1.20、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼEC1.4.99.1、D-アミノ酸D-アラニンアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.21、D-メチオニン-ピルベートアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.41、又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる;を含み、それよりモナチン又はその塩を製造する、前記方法。前記第一のポリペプチドはアミノ酸オキシダーゼEC1.4.3.3及びカタラーゼEC1.11.1.6を含み、かつ、前記第一のポリペプチドはトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換する、請求項1に記載の方法。前記アミノ酸オキシダーゼはトリプトファンオキシダーゼを含む、請求項2に記載の方法。前記C3炭素源はピルビン酸塩、フォスフォエノールピルビン酸塩、アラニン、セリン、システイン又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項1に記載の方法。前記第三のポリペプチドはリジンイプシロンアミノトランスフェラーゼを含む、及び2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸はさらにリジンと接触される、請求項1に記載の方法。前記第三のポリペプチドは還元的アミノ化活性を有する酵素及びNADPHを再生することができるポリペプチドを含む、請求項1に記載の方法。前記還元的アミノ化活性を有する前記酵素はグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、トリプトファンデヒドロゲナーゼ又はそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項6に記載の方法。前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、及び第三のポリペプチドの内の少なくとも1つは、精製されたポリペプチド、異種の組換え又は単離された核酸から発現されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチド、及び組換え細胞又は組換え細胞抽出物中のポリペプチド、及びそれらの組み合わせから選ばれる、請求項1に記載の方法。いくつかの態様の詳細な説明略号及び用語用語及び方法の以下の説明は本開示をよりよく示すために及び本開示の実施において当業者をガイドするために提供される。本明細書中で使用されるとき、含むcomprisingは含むincludingを意味し、及び単数形a若しくはan又はtheは文脈が明らかに別段のように規定しない限り、複数の言及を含む。例えば、タンパク質を含むcomprisingaproteinについての言及は1又は複数の上記タンパク質を含み、及び細胞を含むcomprisingthecellについての言及は1以上の細胞及び当業者に知られるその相当物についての言及を含む等。別段のように説明されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は本開示が属する分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に示されるものと同様の又は相当の方法及び材料は本開示の実施又は試験において使用されうるが、好適な方法及び材料は以下に示される。材料、方法及び実施例は例示的なものであるのみで、限定であるとは意図されない。本開示の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び請求項から明らかである。cDNA相補的DNA:内部の、非コードセグメントイントロン及び転写を決定する制御配列を欠く一片のDNA。cDNAは細胞から抽出されたメッセンジャーRNAから逆転写により研究室内で合成されうる。保存的置換:同様の生化学特性を有するアミノ酸残基についての1以上のアミノ酸置換例えば、2、5又は10残基。典型的には、保存的置換は生ずるポリペプチドの活性にほとんど~全く影響を有しない。例えば、理想的には、1以上の保存的置換を含むトリプトファンアミノトランスフェラーゼポリペプチドはトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を保持する。ポリペプチドは、例えば、位置特異的突然変異又はPCRの如き標準の手順を用いて、そのポリペプチドをコードする核酸を操作することにより1以上の保存的置換を含むよう作出されうる。置換変形体は、アミノ酸配列中の少なくとも1の残基が除去され、及び異なる残基がその場所に挿入されているものである。タンパク質において元のアミノ酸と置換されうる及び保存的置換とみなされるアミノ酸の例は:ser又はthrで置換されるala;gln、his又はlysで置換されるarg;glu、gln、lys、his、aspで置換されるasn;asn、glu又はglnで置換されるasp;ser又はalaで置換されるcys;asn、glu、lys、his、asp又はargで置換されるgln;asn、gln、lys又はaspで置換されるglu;proで置換されるgly;asn、lys、gln、arg、tyrで置換されるhis;leu、met、val、pheで置換されるile;ile、met、val、pheで置換されるleu;asn、glu、gln、his、argで置換されるlys;ile、leu、val、pheで置換されるmet;trp、tyr、met、ile又はleuで置換されるphe;thr、alaで置換されるser;ser又はalaで置換されるthr;phe、tyrで置換されるtrp;his、phe又はtrpで置換されるtyr;及びmet、ile、leuで置換されるvalを含む。保存的置換についてのさらなる情報は他の位置の中で、Ben-Bassatetal.,J.Bacteriol.169:751-7,1987、O’Reganetal.,Gene77;237-51,1989、Sahin-Tothetal.,ProteinSci.3:240-7,1994、Hochulietal.,Bio/Technology6:1321-5,1988、WO00/67796Curdetal.中に並びに遺伝学及び分子生物学の標準のテキスト中に見られうる。外因性の:上記用語外因性のは、核酸及び特定の細胞について本明細書中で使用されるとき、天然に見られるその特定の細胞に由来しない核酸をいう。したがって、非天然の核酸は、一旦その細胞に導入されたら、細胞について外因性であると考えられる。天然の核酸もまた特定の細胞について外因性でありうる。例えば、ヒトXの細胞から単離された染色体全体は、一旦その染色体がYの細胞に導入されたら、ヒトYの細胞について外因性の核酸である。機能的に相当な:相当な機能を有すること。酵素の文脈においては、機能的に相当な分子はその酵素の機能を保持する異なる分子を含む。例えば、機能的相当物は酵素配列における配列変化により提供されることができ、ここで、1以上の配列変化を有するペプチドが、それがその酵素活性を保持するように、変化されていないペプチドの機能を保持する。特定の例においては、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ機能的相当物はトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換する能力を保持する。配列変化の例は、非限定的に、保存的置換、欠失、突然変異、フレームシフト、及び挿入を含む。1の例においては、あるポリペプチドは抗体に結合し、及び機能的相当物は同じ抗体に結合するポリペプチドである。したがって、機能的相当物はポリペプチドと同じ結合特性を有する、及び上記ポリペプチドの代わりに試薬として使用されうるペプチドを含む。1の例においては、機能的相当物は結合配列が不連続であり、上記抗体が線状のエピトープに結合するポリペプチドを含む。したがって、上記ペプチド配列がMPELANDLGL配列ID番号:12のアミノ酸1~10である場合、機能的相当物は以下のように現れうる不連続なエピトープを含む=いくつかの介入するアミノ酸:NH2--MPELANDLGL-COOH。この例において、上記ポリペプチドの三次元構造が、それが配列ID番号:12のアミノ酸1~10に結合するモノクローナル抗体に結合しうるようなものである場合、上記ポリペプチドは配列ID番号:12のアミノ酸1~10に機能的に相当する。ハイブリダイゼーション:上記用語ハイブリダイゼーションは、本明細書中で使用されるとき、相補的な一重鎖DNA及び/又はRNAの二重鎖分子を形成する能力に基づいた、2の核酸分子のヌクレオチド配列における相補性についての試験方法をいう。核酸ハイブリダイゼーション技術は本開示の範囲内で単離された核酸を得るために使用されうる。簡単に述べると、配列ID番号:11中に示される配列といくらかのホモロジーを有する核酸は穏やかな~高い厳密さの条件下でのハイブリダイゼーションにより同様の核酸を同定するためにプローブとして使用されうる。一旦同定されたら、上記核酸はその後、それが本開示の範囲内であるかどうか決定するために精製され、シークエンスされ、及び分析されうる。ハイブリダイゼーションは、プローブにハイブリダイズする、それぞれDNA又はRNA配列を同定するためのサザン又はノザン分析によりなされうる。上記プローブはビオチン、ヂゴキシゲニン、ポリペプチド又は32Pの如き放射性同位体で標識されうる。分析されるべきDNA又はRNAは、Sambrooketal.,1989MolecularCloningsecondedition,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,NYの節7.39-7.52中に示されるものの如き本分野において周知の標準の技術を用いて、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動で分離され、ニトロセルロース、ナイロン又は他の好適な膜に移され、及びプローブとハイブリダイズされうる。典型的には、プローブは少なくとも長さ約20ヌクレオチドである。例えば、配列ID番号:11中に示される連続的な20ヌクレオチド配列に対応するプローブは同一の又は同様の核酸を同定するために使用されうる。さらに、20ヌクレオチドよりも長い又は短いプローブが使用されうる。本開示はまた少なくとも長さ約12塩基例えば、少なくとも長さ約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000又は5000塩基であり、及びハイブリダイゼーション条件下で配列ID番号:11中に示される配列を有する核酸のセンス又はアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列を提供する。上記ハイブリダイゼーション条件は穏やかな又は高くストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でありうる。本開示の目的のために、穏やかなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが25mMKPO4pH7.4、5×SSC、5×Denhart’s溶液、50μg/mL変性超音波処理サケ精子DNA、50フォルムアミド、10硫酸デキストラン、及び1~15ng/mLプローブ約5×107cpm/μgを含むハイブリダイゼーション溶液中で約42°Cで行われ、一方、洗浄は2×SSC及び0.1ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で約50°Cで行われることを意味する。高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが25mMKPO4pH7.4、5×SSC、5×Denhart’s溶液、50μg/mL変性超音波処理サケ精子DNA、50フォルムアミド、10硫酸デキストラン、及び1~15ng/mLプローブ約5×107cpm/μgを含むハイブリダイゼーション溶液中で約42°Cで行われ、一方、洗浄は0.2×SSC及び0.1ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で約65°Cで行われることを意味する。単離された:上記用語単離されたは、核酸について本明細書中で使用されるとき、それが、それが由来する生物の天然ゲノムにおいて一方は5’末端で及び一方は3’末端で直接的に連続している配列の両方と直接的には連続していない天然の核酸をいう。例えば、単離された核酸は、非限定的に、通常天然のゲノムにおいてその組換えDNA分子のすぐ両側に見られる核酸配列の1が除去される又は欠損することで提供される、いかなる長さの組換えDNA分子でもありうる。したがって、単離された核酸は、非限定的に、他の配列とは独立に分離した分子例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ処理により作出されるcDNA又はゲノムDNA断片として存在する組換えDNAに加えて、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス例えば、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルス内に又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA内に導入された組換えDNAをも含む。さらに、単離された核酸はハイブリッド又は融合核酸配列の一部である組換えDNA分子を含みうる。非天然の核酸配列は天然には見られず、及び天然のゲノムにおいて直接的に連続する配列を有しないので、上記用語単離されたは、核酸について本明細書中で使用されるとき、また非天然の核酸をも含む。例えば、遺伝子工学で作られた核酸の如き非天然の核酸は単離された核酸であると考えられる。遺伝子工学で作られた核酸は通常の分子クローニング又は化学的核酸合成技術を用いて作出されうる。単離された非天然の核酸は他の配列とは独立であり又はベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス例えば、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルス又は原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA内に導入されうる。さらに、非天然の核酸はハイブリッド又は融合核酸配列の一部である核酸分子を含みうる。例えば、cDNA若しくはゲノムライブラリー又はゲノムDNA制限酵素消化物を含むゲルスライス内の何百~何百万の他の核酸分子の中に存在する核酸は単離された核酸とは考えられないということは当業者に明らかであろう。核酸:上記用語核酸は、本明細書中で使用されるとき、RNA及び、非限定的に、cDNA、ゲノムDNA、及び合成例えば、化学的に合成されたDNAを含むDNAの両方を含む。核酸は二重鎖又は一重鎖でありうる。一重鎖であるとき、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖でありうる。さらに、核酸は環状又は直鎖状でありうる。有効に作用可能な状態で結合された:第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係でおかれるときはいつでも、第一の核酸配列は第二の核酸配列に有効に結合される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響する場合は、プロモーターはコード配列に有効に結合される。一般的に、有効に結合されたDNA配列は連続しており、及び、2のポリペプチドコード領域をつなげる必要がある場合は同じリーディングフレーム内にある。ペプチド改変:本開示は酵素及びその合成態様をも含む。さらに、所望の酵素活性を有するアナログ非ペプチド有機分子、誘導体開示されたペプチド配列で出発して得られた化学的に機能的にされたペプチド分子及び変形ホモログは本明細書中で示される方法中で利用されうる。本明細書中で開示されるペプチドは、天然の及びそうでない、L-及び/又はD-アミノ酸でありうるアミノ酸の配列を含む。ペプチドは改変されていないペプチドと本質的に同じ活性を有する、及び場合により他の所望の特性を有する誘導体を作出するためにさまざまな化学技術により改変されうる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシ末端又は側鎖のいずれでも、医薬として許容される陽イオンの塩の形態で提供され又はC1-C16エステルを形成するようエステル化され又はR1及びR2はそれぞれ独立にH若しくはC1-C16アルキルである式NR1R2のアミドに変換され又は5-若しくは6-員環の如きヘテロ環状環を形成するよう結合されうる。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端又は側鎖のいずれでも、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、トルエンスルフォン酸、マレイン酸、酒石酸及び他の有機塩の如き医薬として許容される酸添加塩の形態でありうる又はC1-C16アルキル若しくはヂアルキルアミノに改変され若しくはさらにアミドに変換されうる。ペプチド側鎖のヒドロキシル基はよく認識される技術を用いてC1-C16アルコキシに又はC1-C16エステルに変換されうる。ペプチド側鎖のフェニル及びフェノール環はF、Cl、Br又はIの如き1以上のハロゲン原子で又はC1-C16アルキル、C1-C16アルコキシ、カルボン酸及びそのエステル又は上記カルボン酸のアミドで置換されうる。ペプチド側鎖のメチレン基は同族のC2-C4アルキレンに延長されうる。チオールはアセトアミド基の如きいくつかのよく認識される保護基の1で保護されうる。当業者はまた構造に高められた安定性をもたらすコンフォメーションの拘束を選択する及び提供するために本開示のペプチドに環状構造を導入する方法をも認識するであろう。例えば、C-又はN-末端システインがペプチドに加えられることができ、そのため、酸化されたとき、上記ペプチドがヂスルフィド結合を含み、環状ペプチドを作出するであろう。他のペプチド環状化方法はチオエーテル及びカルボキシル-及びアミノ-末端アミド及びエステルの形成を含む。ペプチドミメティック及び器官ミメティック態様は、上記ペプチド及び器官ミメティックの化学組成の三次元配置がペプチド骨格及び構成成分アミノ酸側鎖の三次元配置を真似、検出可能な酵素活性を有する本開示のタンパク質の上記ペプチド及び器官ミメティックをもたらすことにより、また本開示の範囲内である。コンピュータモデリング適用のために、ファーマコフォアは生物学的活性のための構造的必要性の理想化された三次元定義である。ペプチド及び器官ミメティックはコンピュータ補助された薬物設計又はCADDを用いてそれぞれのファーマコフォアを近年のコンピュータモデリングソフトウェアとフィットさせるよう設計されうる。CADDにおいて使用される技術の記述については、Walters,Computer-AssistedModelingofDrugs,inKlegermanGroveseds.,PharmaceuticalBiotechnology,1993,InterpharmPress:BuffaloGrove,IL,pp.165-74及びCh.102inMunsoned.,PrinciplesofPharmacology,1995,ChapmanHallを参照のこと。上記技術を用いて調製されたミメティックもまた本開示の範囲内に含まれる。1の例においては、ミメティックは酵素又はその変形、断片若しくは融合により作出される酵素活性を真似る。プローブ及びプライマー:核酸プローブ及びプライマーは本明細書中に提供されるアミノ酸配列及び核酸配列に基づいて容易に調製されうる。プローブは検出可能な標識又はレポーター分子を含む単離された核酸を含む。例示的な標識は、非限定的に、放射活性同位体、リガンド、化学発光剤、及びポリペプチドを含む。標識化方法及びさまざまな目的に適切な標識の選択におけるガイダンスは、例えば、Sambrooketal.ed.,MolecularCloning:ALaboratoryManual2nded.,vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989及びAusubeletal.ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYorkwithperiodicupdates,1987中で議論される。プライマーは典型的に10以上のヌクレオチドを有する核酸分子例えば、約10ヌクレオチド~約100ヌクレオチドを有する核酸分子である。プライマーは核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的核酸鎖にアニーリングされ、プライマー及び上記標的核酸鎖の間でハイブリッドを形成し、及びその後、例えば、DNAポリメラーゼポリペプチドにより上記標的核酸鎖に沿って伸長されうる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応PCR又は本分野において知られる他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅のために使用されうる。プローブ及びプライマーの調製及び使用方法は、例えば、Sambrooketal.ed.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;Ausubeletal.ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYorkwithperiodicupdates,1987;及びInnisetal.eds.,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress:SanDiego,1990の如き引用文献中に示される。PCRプライマー対は、例えば、PrimerVersion0.5,コピーライト1991,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,Mass.の如きその目的のために意図されるコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列に由来しうる。当業者は、特定のプローブ又はプライマーの特異性は長さと共に増大するが、プローブ又はプライマーはサイズが全長配列~短くても5の連続したヌクレオチドの配列に及びうるということを理解するであろう。したがって、例えば、20の連続したヌクレオチドのプライマーは15ヌクレオチドのみの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニーリングしうる。したがって、より大きな特異性を得るために、例えば、10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450又はより多い連続したヌクレオチドを含む、プローブ及びプライマーが選択されうる。プロモーター:核酸の転写を方向付ける核酸制御配列の並び。プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメントの如き、転写開始部位の近辺の必須の核酸配列を含む。プロモーターは転写開始部位から何千塩基対もの位置にありうる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントを含みうる。精製された:上記用語精製されたは、本明細書中で使用されるとき、絶対的な精製度を必要としない;むしろ、それは比較の用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチド又は核酸の調製物は、問題のポリペプチド又は核酸、それぞれが、上記ポリペプチド又は核酸が生物内でその天然環境において存在するであろうよりは高濃度で存在するものでありうる。例えば、ポリペプチド調製物は、調製物中の上記ポリペプチド内容量が上記調製物中の総タンパク質内容量の少なくとも50、60、70、80、85、90、92、95、98又は99を示す場合、精製されたと考えられうる。組換え:組換え核酸は1それが発現される生物内で天然には起こらない配列又は22の、そうでなければ別々の、より短い配列の人工的な組み合わせにより作出される配列を有するものである。この人工的な組み合わせはしばしば化学合成により又はより通常には、核酸の単離されたセグメントの人工的な操作により、例えば、遺伝子工学技術により達成される。組換えはまた人工的に操作されているが、上記核酸が単離された生物中に見られる同じ制御配列及びコード領域を含む核酸分子を示すためにも使用される。配列同一性:アミノ酸配列間の類似性は、そうでなければ配列同一性といわれる、配列間の類似性の用語で表現される。配列同一性はしばしばパーセント同一性又は類似性又はホモロジーの用語で計測される;パーセントが高くなればなるほど、2の配列はより類似する。配列ID番号:12の如きペプチドのホモログ又は変形は標準の方法を用いて並べられたとき比較的高い程度の配列同一性を有する。比較のための配列の整合方法は本分野において周知である。さまざまなプログラム及び整合アルゴリズムが:SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970;PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444-8,1988;HigginsandSharp,Gene73:237-44,1988;HigginsandSharp,CABIOS5:151-3,1989;Corpetetal.,NucleicAcidsResearch16:10881-90,1988;及びAltschuletal.,NatureGenet.6:199-29,1994中に示される。TheNCBIBasicLocalAlignmentSearchToolBLAST商標Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn及びtblastxに関連した使用のために、theNationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,Bethesda,MDを含むいくつかの源から及びインターネット上で入手可能である。ペプチドの変形は典型的に、NCBIBlast2.0を用いて、ギャップblastpをデフォルトパラメーターに設定して、アミノ酸配列との全長整合にわたりカウントされる少なくとも50の配列同一性の所有により特徴付けられる。約30アミノ酸よりも大きなアミノ酸配列の比較のために、Blast2配列機能がデフォルトBLOSUM62マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して用いて使用されるギャップの存在はコスト11、及び残基ギャップ当たりはコスト1。約30アミノ酸よりも少ない短いペプチドを整合するとき、整合はBlast2配列機能を用いて、PAM30マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して使用して行われるオープンギャップ9、エクステンションギャップ1ペナルティー。引用配列にさらにより大きな類似性を有するタンパク質はこの方法により評価されたとき、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98又は少なくとも99配列同一性の如き、増大するパーセント同一性を示すであろう。全体より少ない配列が配列同一性について比較されるとき、ホモログ及び変形は典型的に10~20アミノ酸の短いウィンドウにわたり少なくとも80配列同一性を有するであろう、及び引用配列に対するそれらの類似性に因り少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95又は98の配列同一性を有しうる。上記短いウィンドウにわたる配列同一性の決定方法はtheNationalCenterforBiotechnologyInformationinBethesda,Marylandにより維持されるウェブサイトで示される。当業者は、これらの配列同一性の範囲はガイダンスのためにのみ提供されるということを理解するであろう;提供される範囲外にある非常に顕著なホモログが得られうることは全く可能である。同様の方法は核酸配列のパーセント配列同一性を決定するために使用されうる。特定の例においては、同族の配列はネイティブ配列に並べられ、及び適合の数は同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基が両方の配列に示される位置の数をカウントすることにより決定される。パーセント配列同一性は適合の数を同定された配列例えば、配列ID番号:11中に示される配列の長さで又は節に区切られた長さ例えば、同定された配列において示される配列からの100の連続したヌクレオチド又はアミノ酸残基で割り、続いて生ずる値に100を掛けることにより決定される。例えば、配列ID番号:11中に示される配列と並べられたとき1166の適合を有する核酸配列は配列ID番号:11中に示される配列に対して75.0パーセント同一であるすなわち、1166÷1554100=75.0。パーセント配列同一性値は小数第一位辺りまで概数にされるということに注意せよ。例えば、75.11、75.12、75.13、及び75.14は75.1に切り捨てられ、一方、75.15、75.16、75.17、75.18、及び75.19は75.2に繰り上げられる。また、長さの値は常に整数であろうということにも注意せよ。他の例において、以下の同定された配列からの20の連続したヌクレオチドと並ぶ20ヌクレオチド領域を含む標的配列はその同定された配列と75パーセント配列同一性を共有する領域を含むすなわち、15÷20100=75。特異的結合剤:本明細書中に示されるポリペプチドのいずれかに特異的に結合することができる剤。例は、非限定的に、ポリクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、及びFab、Fab’2、及びFv断片の如きモノクローナル抗体の断片及び上記ポリペプチドのエピトープに特異的に結合することができる他の剤を含む。本明細書中に提供されるポリペプチドに対する抗体又はその断片、変形又は融合は上記ポリペプチドを精製する又は同定するために使用されうる。本明細書中に提供されるアミノ酸及び核酸配列は、本明細書中に示されるポリペプチドを認識する特定の抗体に基づいた結合剤の作出を許容する。モノクローナル又はポリクローナル抗体はポリペプチド、ポリペプチドの一部又はその変形に作出されうる。場合により、ポリペプチド抗原上の1以上のエピトープに対して作出された抗体はそのポリペプチドを特異的に検出するであろう。すなわち、1の特定のポリペプチドに対して作出された抗体はその特定のポリペプチドを認識し及び結合しうる、及び他のポリペプチドを実質的に認識しない及び結合しないであろう。抗体が特定のポリペプチドに特異的に結合するという決定はいくつかの標準の免疫分析法のいずれか1によりなされる;例えば、ウェスタンブロッティング例えば、Sambrooketal.ed.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989を参照のこと。配列ID番号:12中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対してマウスにおいて作出される調製物の如きある抗体調製物はウェスタンブロッティングにより適切なポリペプチド例えば、配列ID番号:12中に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に検出するということを決定するために、全細胞タンパク質が細胞から抽出され、及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されうる。分離された全細胞タンパク質はその後膜例えば、ニトロセルロースに移され、及び上記抗体調製物は上記膜とインキュベートされうる。上記膜を洗浄し、非特異的に結合した抗体を除去した後、特異的に結合した抗体の存在は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルフォスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムの適用が免疫局在化したアルカリフォスファターゼにより濃い青色の化合物の生成をもたらすので、アルカリフォスファターゼの如きポリペプチドに結合された適切な二次抗体例えば、抗マウス抗体を用いて検出されうる。免疫原としての使用のために好適な実質的に純粋なポリペプチドはトランスフェクトされた細胞、形質転換された細胞又は野生型細胞から得られうる。最終調製物中のポリペプチド濃度はミリリットル当たり数マイクログラムの値に、例えば、Amiconfilter装置上の濃度により調節されうる。さらに、大きさが全長ポリペプチド~9程度のアミノ酸残基を有するポリペプチドに及ぶポリペプチドは免疫原として利用されうる。上記ポリペプチドは細胞培養物中に作出されうる、標準の方法を用いて化学的に合成されうる又は大きなポリペプチドを精製されうるより小さいポリペプチドに切断することにより得られうる。長さが9程度のアミノ酸残基を有するポリペプチドは、MHCクラスI又はMHCクラスII分子の如き主要組織適合遺伝子複合体MHC分子に関連して免疫系に提示されたとき免疫原性でありうる。したがって、本明細書中に開示されるアミノ酸配列の少なくとも9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350又はより多い連続したアミノ酸残基を有するポリペプチドが抗体を作出するための免疫原として使用されうる。本明細書中に開示されるポリペプチドのいずれかに対するモノクローナル抗体はKohlerMilsteinNature256:495-7,1975の古典的方法又はその誘導された方法にしたがってマウスハイブリドーマから調製されうる。本明細書中に開示されるいずれかのポリペプチドの不均一なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、改変されない又は免疫原性を高めるために改変されうる上記ポリペプチド又はその断片で好適な動物を免疫化することにより調製されうる。ウサギについての有効な免疫化プロトコルはVaitukaitisetal.J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-91,1971中に見られうる。抗体断片は抗体全体の代わりに使用されうる及び原核生物宿主細胞内で容易に発現されうる。抗体断片ともいわれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分を作出する及び使用する方法は周知であり、及びBetterHorowitzMethodsEnzymol.178:476-96,1989、Glockshuberetal.Biochemistry29:1362-7,1990、米国特許第5,648,237号ExpressionofFunctionalAntibodyFragments、米国特許第4,946,778号SinglePolypeptideChainBindingMolecules、米国特許第5,455,030号ImmunotherapyUsingSingleChainPolypeptideBindingMolecules、及び本明細書中に引用される引用文献中に示されるものを含む。形質転換された:形質転換された細胞は、核酸分子が、例えば、分子生物学的技術により導入されている細胞である。形質転換は、非限定的に、ウイルスベクターでのトランスフェクション、接合、プラスミドベクターでの形質転換、及びエレクトロポーレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン促進による裸DNAの導入を含む、核酸分子が上記細胞に導入されうる全ての技術を含む。変形、断片又は融合タンパク質:開示されたタンパク質はその変形、断片及び融合を含む。タンパク質例えば、配列ID番号:12、融合タンパク質又はタンパク質の断片若しくは変形をコードするDNA配列例えば、配列ID番号:11は上記タンパク質が真核細胞、細菌、昆虫、及び/又は植物中で発現されるよう遺伝子工学で作り変えられうる。発現を得るために、上記DNA配列は変化され及び他の制御配列に有効に結合されうる。上記制御配列及び上記タンパク質を含む最終生成物はベクターといわれる。このベクターは真核生物、細菌、昆虫、及び/又は植物細胞に導入されうる。一旦細胞内に入ったら、上記ベクターは上記タンパク質を生成させる。融合タンパク質は、そのタンパク質の所望の活性、例えば、トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換する能力を阻害しない他のアミノ酸配列につなげられた、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ又はその変形、多形、突然変異体若しくは断片、例えば、配列ID番号:12の如きタンパク質を含む。1の例において、上記他のアミノ酸配列は長さが多くて約10、12、15、20、25、30又は50アミノ酸である。当業者は、DNA配列がコードされたタンパク質の生物学的活性に影響することなく、多くの方法で変化されうることを理解するであろう。例えば、PCRはタンパク質をコードするDNA配列中に変形を作出するために使用されうる。上記変形体は上記タンパク質を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン優先又は発現を促進する他の配列変化のために最適化された変形体でありうる。ベクター:細胞内に導入され、それにより形質転換された細胞を作出する核酸分子。ベクターは、複製起点の如き、それが細胞内で複製することを許容する核酸配列を含みうる。ベクターはまた1以上の選択可能なマーカー遺伝子及び本分野において知られる他の遺伝的エレメントをも含みうる。生合成経路の概略図1~3及び11~13中に示されるように、多くの生合成経路はモナチン又はインドール-3-ピルビン酸塩若しくはMPの如きその中間体を生成するために使用されうる。それぞれの基質グルコース、トリプトファン、インドール-3-乳酸、インドール-3-ピルビン酸塩、及びMPのそれぞれの生成物トリプトファン、インドール-3-ピルビン酸塩、MP及びモナチンへの変換のために、いくつかの異なるポリペプチドが使用されうる。さらに、これらの反応はinvivo、invitroで又は非酵素的化学反応を含むinvitro反応の如き、invivo反応及びinvitro反応の組み合わせをとおして行われうる。それゆえ、図1~3及び11~13は例示であり、及び所望の生成物を得るために使用されうる複数の異なる経路を示す。グルコース~トリプトファン多くの生物はグルコースからトリプトファンを合成しうる。グルコース及び/又はトリプトファンからモナチン、MP、及び/又はインドール-3-ピルビン酸塩を生成するために必要な遺伝子単数又は複数を含む構築物単数又は複数は上記生物内にクローニングされうる。トリプトファンはモナチンに変換されうることが本明細書中で示される。他の例において、生物はトリプトファンを生成する又はトリプトファンを過剰生成するよう既知のポリペプチドを用いて遺伝子工学的に作り変えられる。例えば、米国特許第4,371,614号本明細書中に援用するは野生型トリプトファンオペロンを含むプラスミドで形質転換されたE.coli株を示す。米国特許第4,371,614号中に開示されるトリプトファンの最大タイターは約230ppmである。同様に、WO8701130本明細書中に援用するはトリプトファンを生成するよう遺伝子工学で作り変えられたE.coli株を示し、及びL-トリプトファンの増大する発酵生成を議論する。当業者は、グルコースからトリプトファンを生成することができる生物はまた、同様の結果で、グルコース又はフルクトース-6-リン酸塩に変換されうる他の炭素及びエネルギー源を利用することができることを認識するであろう。例示的な炭素及びエネルギー源は、非限定的に、スクロース、フルクトース、デンプン、セルロース又はグリセロールを含む。トリプトファン~インドール-3-ピルビン酸塩いくつかのポリペプチドはトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換するために使用されうる。例示的なポリペプチドは酵素クラスEC2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、及び2.6.1.21のメンバーを含む。これらのクラスはL-トリプトファン及び2-オキソグルタル酸塩をインドール-3-ピルビン酸塩及びL-グルタミン酸塩に変換するトリプトファンアミノトランスフェラーゼL-フェニルアラニン-2-オキソグルタル酸塩アミノトランスフェラーゼ、トリプトファントランスアミナーゼ、5-ヒドロキシトリプトファン-ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、L-トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、L-トリプトファントランスアミナーゼ、及びL-トリプトファン:2-オキソグルタル酸塩アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる;D-トリプトファン及び2-オキソ酸をインドール-3-ピルビン酸塩及びアミノ酸に変換するD-トリプトファンアミノトランスフェラーゼ;L-トリプトファン及びNADPをインドール-3-ピルビン酸塩及びNH3及びNADPHに変換するトリプトファンデヒドロゲナーゼNADP-L-トリプトファンデヒドロゲナーゼ、L-トリプトファンデヒドロゲナーゼ、L-Trp-デヒドロゲナーゼ、TDH及びL-トリプトファン:NADP酸化還元酵素脱アミノ化とも呼ばれる;D-アミノ酸及びFADをインドール-3-ピルビン酸塩及びNH3及びFADH2に変換するD-アミノ酸デヒドロゲナーゼ;L-トリプトファン及びフェニルピルビン酸塩をインドール-3-ピルビン酸塩及びL-フェニルアラニンに変換するトリプトファン-フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼL-トリプトファン-α-ケトイソカプロン酸塩アミノトランスフェラーゼ及びL-トリプトファン:フェニルピルビン酸塩アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる;L-アミノ酸及びH2O及びO2を2-オキソ酸及びNH3及びH2O2に変換するL-アミノ酸オキシダーゼオフィオ-アミノ-酸オキシダーゼ及びL-アミノ-酸:酸素酸化還元酵素脱アミノ化とも呼ばれる;D-アミノ酸及びH2O及びO2を2-オキソ酸及びNH3及びH2O2に変換するD-アミノ酸オキシダーゼオフィオ-アミノ-酸オキシダーゼ及びD-アミノ-酸:酸素酸化還元酵素脱アミノ化とも呼ばれる;及びL-トリプトファン及びH2O及びO2をインドール-3-ピルビン酸塩及びNH3及びH2O2に変換するトリプトファンオキシダーゼと呼ばれるペプチドを含む。これらのクラスはまたチロシン芳香族アミノトランスフェラーゼ、アルパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ、D-アミノ酸又はD-アラニンアミノトランスフェラーゼ、及び複数のアミノトランスフェラーゼ活性を有し、それらのいくつかはトリプトファン及び2-オキソ酸をインドール-3-ピルビン酸塩及びアミノ酸に変換しうる広範囲多基質アミノトランスフェラーゼをも含む。配列ID番号:11及び12中に示される新規アミノトランスフェラーゼを含む、上記活性を有するアミノトランスフェラーゼクラスの11のメンバーは以下の実施例1中に示される。それゆえ、この開示は配列ID番号:11及び12に対して少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも98又は少なくとも99配列同一性を有する単離された核酸及びタンパク質配列を提供する。アミノトランスフェラーゼ活性を保持する又はアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列ID番号:11及び12の断片及び融合もまた本開示に含まれる。例示的な断片は、非限定的に、配列ID番号11の少なくとも10、12、15、20、25、50、100、200、500又は1000の連続したヌクレオチド又は配列ID番号:12の少なくとも6、10、15、20、25、50、75、100、200、300又は350の連続したアミノ酸を含む。開示された配列及びその変形、断片、及び融合はベクターの一部でありうる。上記ベクターは宿主細胞を形質転換するために使用されることができ、それにより、トリプトファンからインドール-3-ピルビン酸塩を生成しうる、及びいくつかの例においてはさらにMP及び/又はモナチンを生成しうる組換え細胞を作出する。L-アミノ酸オキシダーゼ1.4.3.2は既知であり、及び配列はViperalebetinespP81375、OphiophagushannahspP81383、AgkistrodonrhodostomaspP81382、CrotalusatroxspP56742、Burkholderiacepacia、Arabidopsisthaliana、Caulobactercresentus、Chlamydomonasreinltardtii、Musmusculus、Pseudomonassyringae、及びRhodococcusstr.の如きいくつかの異なる源から単離されうる。さらに、トリプトファンオキシダーゼは文献中に示され、及び、例えば、Coprinussp.SF-1、根こぶ病を有する体菜白菜、Arabidopsisthaliana、及び哺乳類の肝臓から単離されうる。トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換しうるL-アミノ酸オキシダーゼクラスの1のメンバーは以下の実施例3、及び分子クローニングについての代替の源中で議論される。多くのD-アミノ酸オキシダーゼ遺伝子は分子クローニングについてのデータベースにおいて入手可能である。トリプトファンデヒドロゲナーゼは既知であり、及び、例えば、ホウレンソウ、Pisumsativum、Prosopisjuliflora、マメ、メスキート、小麦、トウモロコシ、トマト、タバコ、Chromobacteriumviolaceum、及びLactobacilliから単離されうる。多くのD-アミノ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列は既知である。図11~13中に示されるように、トリプトファンオキシダーゼの如きアミノ酸オキシダーゼがトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換するために使用される場合、カタラーゼが過酸化水素の存在を減少させる又は打ち消すために添加されうる。インドール-3-乳酸塩~インドール-3-ピルビン酸塩インドール-3-乳酸塩をインドール-3-ピルビン酸塩に変換する反応はポリペプチドの1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-又は1.1.1.111クラスのメンバーの如き、さまざまなポリペプチドにより触媒されうる。上記1.1.1.110クラスのポリペプチドはインドール乳酸塩デヒドロゲナーゼインドール乳酸:NAD酸化還元酵素とも呼ばれるを含む。上記1.1.1.27、1.1.1.28、及び1.1.2.3クラスは乳酸塩デヒドロゲナーゼ乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸塩:NAD酸化還元酵素とも呼ばれるを含む。上記1.1.1.222クラスはR-4-ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼD-芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼ、R-芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼ、及びR-3-4-ヒドロキシフェニル乳酸塩:NADP2-酸化還元酵素とも呼ばれるを含み、及び上記1.1.1.237クラスは3-4-ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素ヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素及び4-ヒドロキシフェニル乳酸塩:NAD酸化還元酵素とも呼ばれるを含む。上記1.1.3.-クラスは乳酸塩オキシダーゼを含み、及び上記1.1.1.111クラスは3-イミダゾール-5-イル乳酸塩デヒドロゲナーゼS-3-イミダゾール-5-イル乳酸塩:NADP酸化還元酵素とも呼ばれるを含む。これらのクラス内のポリペプチドのいくつかはインドール-3-乳酸からのインドール-3-ピルビン酸塩の生成を許容するようである。この変換の例は実施例2中に提供される。化学反応はまたインドール-3-乳酸をインドール-3-ピルビン酸塩に変換するために使用されうる。上記化学反応はいくつかの方法、例えば:B2触媒を用いた空気酸化ChinaChemicalReporter,v13,n28,p181,2002、希釈過マンガン酸塩及び過塩素酸塩又は金属触媒の存在下での過酸化水素を用いて達成されうる酸化段階を含む。インドール-3-ピルビン酸塩~2-ヒドロキシ2-インドール-3イルメチル-4-ケトグルタル酸MPいくつかの既知のポリペプチドはインドール-3-ピルビン酸塩をMPに変換するために使用されうる。例示的なポリペプチドクラスは4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17、及び4.1.2.-を含む。これらのクラスは2のカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼの如き炭素-炭素合成酵素/リアーゼを含む。ペプチドクラスEC4.1.3.-はインドール-3-ピルビン酸塩の如きオキソ酸基質を求電子剤として利用して炭素-炭素結合を形成する合成酵素/リアーゼであり、一方、EC4.1.2.-はベンズアルデヒドの如きアルデヒド基質を求電子剤として利用して炭素-炭素結合を形成する合成酵素/リアーゼである。例えば、EP1045-029中に示されるポリペプチドEC4.1.3.16、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸塩アルドラーゼ、2-オキソ-4-ヒドロキシグルタル酸塩アルドラーゼ又はKHGアルドラーゼとも呼ばれる4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩-リアーゼはグリオキシル酸及びピルビン酸塩を4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸に変換する、及びポリペプチド4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩アルドラーゼEC4.1.3.17、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩-リアーゼ又はProAアルドラーゼとも呼ばれるは2のピルビン酸塩の如き2のケト酸を縮合して4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩にする。これらのリアーゼを利用する反応は本明細書中に示される。図1~2及び11~13は3-炭素C3分子がインドール-3-ピルビン酸塩と結合されるこれらの反応の概略図を示す。EC4.1.2.-及び4.1.3.-の多くのメンバー、特にPLPを利用するポリペプチドはセリン、システイン、及びアラニンの如きアミノ酸又はその誘導体であるC3分子を利用しうる。EC4.1.2.-及び4.1.3.-の代表者により触媒されるアルドール縮合はピルビン酸塩又はピルビン酸塩の誘導体になるこの経路の3の炭素分子を必要とする。しかしながら、他の化合物はC3炭素源としてはたらき及びピルビン酸塩に変換されうる。アラニンは、上記に挙げられるものの多くを含む多くのPLPを利用するトランスアミナーゼによりアミノ基転移され、ピルビン酸塩を産出しうる。ピルビン酸塩及びアンモニアはO-メチル-L-セリン、O-ベンジル-L-セリン、S-メチルシステイン、S-ベンジルシステイン、S-アルキル-L-システイン、O-アシル-L-セリン、及び3-クロロ-L-アラニンの如き十分な脱離基を伴うL-セリン、L-システイン、及びセリン及びシステインの誘導体のトリプトファナーゼ又はβ-チロシナーゼにより触媒されるものの如きベータ-消去反応により得られうる。アスパラギン酸塩はトリプトファナーゼEC4.1.99.1及び/又はβ-チロシナーゼEC4.1.99.2、チロシン-フェノールリアーゼとも呼ばれるにより触媒されるものの如きPLP仲介ベータ-リアーゼ反応におけるピルビン酸塩の源としてはたらきうる。ベータ-リアーゼ反応の速度はMouratonetal.J.Biol.Chem.274:1320-5,1999により及び実施例8中に示されるように4.1.99.1-2ポリペプチド上で位置特異的突然変異を行うことにより増大されうる。これらの改変は上記ポリペプチドがヂカルボキシルアミノ酸基質を受けることを許容する。乳酸塩はまたピルビン酸塩の源としてはたらきうる、及び乳酸塩デヒドロゲナーゼ及び酸化共因子又は乳酸塩オキシダーゼ及び酸素の添加によりピルビン酸塩に酸化される。これらの反応の例は以下に示される。例えば、図2及び図11~13中に示されるように、ピルビン酸塩がC3分子として使用されるとき、ProAアルドラーゼはインドール-3-ピルビン酸塩と接触されうる。MPはまた実施例5中に提供されるアルドール縮合の如き化学反応を用いて作出されうる。MP~モナチンMPのモナチンへの変換は1以上の:トリプトファンアミノトランスフェラーゼ2.6.1.27、トリプトファンデヒドロゲナーゼ1.4.1.19、D-アミノ酸デヒドロゲナーゼ1.4.99.1、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ1.4.1.2-4、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼEC1.4.1.20、トリプトファン-フェニルピルビン酸塩トランスアミナーゼ2.6.1.28又はより一般的にはアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.1、チロシン芳香族アミノトランスフェラーゼ2.6.1.5、D-トリプトファンアミノトランスフェラーゼ又はD-アラニン2.6.1.21アミノトランスフェラーゼの如きアミノトランスフェラーゼファミリー2.6.1.-のメンバーにより触媒されうる図2。配列ID番号:11及び12中に示される上記クラスの新規メンバーを含む、アミノトランスフェラーゼクラスの11のメンバーは以下実施例1に示され、及びアミノトランスフェラーゼ及びデヒドロゲナーゼ酵素の活性を示す反応は実施例7中に提供される。この反応はまた化学反応を用いても行われうる。ケト酸MPのアミン化はアンモニア及びシアノボロヒドリドナトリウムを用いる還元的アミン化により行われる。図11~13はMPをモナチンに変換し、及びインドール-3-ピルビン酸塩又はトリプトファンからのモナチンの増大した収率を提供するために使用されうる追加のペプチドを示す。例えば、アスパラギン酸塩がアミノ供与体として使用される場合、アルパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼはアスパラギン酸塩をオキサロ酢酸に変換するために使用されうる図11。オキサロ酢酸塩はオキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼの如きデカルボキシラーゼによりピルビン酸塩及び二酸化炭素に変換される図11。さらに、リジンがアミノ供与体として使用される場合、リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼはリジンをアルリジンに変換するために使用されうる図12。アルリジンは自発的に1-ピペリデイン6-カルボキシレートに変換される図12。還元的アミン化反応を触媒することができるポリペプチド例えば、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼがMPをモナチンに変換するために使用される場合、蟻酸塩デヒドロゲナーゼの如き、NADPHを再生し及び/又は揮発性生成物を生成し図13うるポリペプチドが使用されうる。生合成経路の設計における追加の考慮どのポリペプチドがインドール-3-ピルビン酸塩、MP及び/又はモナチンを作出するために使用されるかに因り、共因子、基質、及び/又は追加のポリペプチドが生成物形成を高めるために生成細胞に提供されうる。過酸化水素の除去過酸化水素H2O2は、生成された場合、生成細胞に対して毒性でありうる及びポリペプチド又は生成された中間体を損傷しうる生成物である。上記に示されるL-アミノ酸オキシダーゼはH2O2を生成物として作出する。それゆえ、L-アミノ酸オキシダーゼが使用される場合、細胞又は生成物への可能性のある損害を減少させるために生ずるH2O2は除去され又はその値は減少されうる。カタラーゼは細胞においてH2O2の値を減少させるために使用されうる図11~13。生成細胞は、過酸化水素の水及び酸素ガスへの分解を触媒するカタラーゼEC1.11.1.6をコードする遺伝子又はcDNA配列を発現しうる。例えば、カタラーゼは生成細胞にトランスフェクトされたベクターから発現されうる。使用されうるカタラーゼの例は、非限定的に:tr|Q9EV50Staphylococcusxylosus、tr|Q9KBE8Bacillushalodurans、tr|Q9URJ7Candidaalbicans、tr|P77948Streptomycescoelicolor、tr|Q9RBJ5XanthomonascampestrisSwissProtAccessionNos.を含む。L-アミノ酸オキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ又はトリプトファンオキシダーゼを利用する生物触媒反応はまたカタラーゼポリペプチドをも含みうる。PLPピリドキサル-5’-フォスフェートアベイラビリティの調節図1中に示されるように、PLPは本明細書中に示される1以上の生合成段階において利用されうる。PLPの濃度は、PLPが反応の全体の効率に対する限界にならないように補充されうる。ビタミンB6PLPの前駆体の生合成経路はE.coliにおいて徹底的に研究されており、及びいくつかのタンパク質は結晶化されているLaberetal.,FEBSLetters,449:45-8,1999。2の遺伝子epd又はgapB及びserCは他の代謝経路において必要とされ、一方、3の遺伝子pdxA、pdxB、及びpdxJはピリドキサルフォスフェート生合成に独特である。E.coli経路における出発物質の1は1-デオキシ-D-キシルロース-5-フォスフェートDXPである。通常の2及び3の炭素中心代謝物からのこの前駆体の合成はポリペプチド1-デオキシ-D-キシルロース-5-フォスフェート合成酵素DSXにより触媒される。他の前駆体は4-炭素糖、D-エリスロース4-フォスフェートから形成されるスレオニン誘導体である。フォスフォ-4-ヒドロキシル-L-スレオニンHTPへの変換に必要とされる遺伝子はepd、pdxB、及びserCである。PLPの形成のための最後の反応はpdxA及びpdxJの遺伝子産物により触媒される、DXP及びHTPの間の複合体分子内縮合及び環閉鎖反応である。PLPがモナチンを生成するための発酵の間の制限的栄養物質になる場合、生成宿主細胞における1以上の経路遺伝子の増大した発現はモナチンの収率を増大させるために使用されうる。宿主生物はそのネイティブ経路遺伝子の複数のコピーを含みうる又は非ネイティブ経路遺伝子のコピーが生物ゲノム内に導入されうる。さらに、救助経路遺伝子の複数のコピーは宿主生物内にクローニングされうる。全ての生物において保存される1の救助経路はビタミンB6のさまざまな誘導体を活性PLP形に再生する。この経路に関連するポリペプチドはpdxKキナーゼ、pdxHオキシダーゼ、及びpdxYキナーゼである。1以上のこれらの遺伝子の過剰発現はPLPアベイラビリティを増大しうる。ビタミンB6値は宿主生物におけるネイティブ生合成経路遺伝子の代謝制御の消去又は抑制により上昇されうる。PLPは細菌Flavobacteriumsp.株238-7において前駆体スレオニン誘導体の生合成に関連するポリペプチドを抑制する。代謝制御から解放されたこの菌株はピリドキサル誘導体を過剰生成し、及び20mg/LまでのPLPを放出しうる。同様の様式でのモナチンを生成する宿主生物の遺伝子操作は生合成経路遺伝子の過剰発現を伴わずに、増大されたPLP生成を許容するであろう。アンモニウム利用トリプトファナーゼ反応はアンモニアをより入手可能にすることにより又は水の除去により合成方向インドールからのトリプトファンの生成に駆動されうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼにより触媒されるものの如き、還元的アミン化反応はまた過剰のアンモニウムにより駆動されうる。アンモニアは炭酸塩又はリン酸塩緩衝系において炭酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム塩として入手可能にされうる。アンモニアはまたピルビン酸アンモニア又は蟻酸アンモニアとしても提供されうる。あるいは、上記反応が、グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ又はトリプトファンデヒドロゲナーゼの如き、アンモニアを作出する反応とカップリングされる場合、アンモニアが補充されうる。アンモニアはフェノール又はインドール、ピルビン酸塩及びNH3に加水分解されるであろう、EC4.1.99.-の天然基質チロシン又はトリプトファンの添加により作出されうる。これはまた上記酵素にその好ましい基質を加水分解させることにより正常平衡量を超える合成生成物の増大した収率を許容する。生成物及び副生成物の除去反応がグルタミン酸塩を生成し、及び共基質2-オキソグルタル酸塩α-ケトグルタル酸塩を必要とするので、トリプトファンアミノトランスフェラーゼを介したトリプトファンのインドール-3-ピルビン酸塩への変換はインドール-3-ピルビン酸塩の生成速度に悪い影響を及ぼしうる。グルタミン酸塩はアミノトランスフェラーゼの阻害を引き起こしうる、及び上記反応は大量の共基質を消費するであろう。さらに、高いグルタミン酸塩濃度は下流の分離プロセスに有害である。ポリペプチドグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼGLDHはグルタミン酸塩を2-オキソグルタル酸塩に変換し、それによりトリプトファンアミノトランスフェラーゼにより触媒される反応における共基質を再生する。GLDHはまた好気性条件下で細胞のためのエネルギーATPを作出するために使用されうる還元当量NADH又はNADPHをも作出する。GLDHによるグルタミン酸塩の利用はまた副生成物形成を減少させる。さらに、上記反応は、細胞のための窒素源として又は図1中に示される最終段階のための還元的アミン化における基質としてはたらきうるアンモニアを生成する。それゆえ、GLDHポリペプチドを過剰発現する生成細胞は収率を増大させ及び媒体及び/又は分離プロセスのコストを減少させるために使用されうる。トリプトファンからモナチンへの経路において、適切な酵素クラスからのアミノトランスフェラーゼが使用される場合、段階3のアミノ供与体例えば、グルタミン酸塩又はアスパラギン酸塩は段階1に必要とされるアミノ受容体例えば、2-オキソ-グルタル酸塩又はオキサロ酢酸塩に戻されうる。1のトランスアミナーゼの基質が他のトランスアミナーゼの活性を競合的に阻害しない、この経路のための2の別々のトランスアミナーゼの利用はこの経路の効率を増大しうる。示される経路における多くの反応は可逆であり、及び、それゆえ、基質及び生成物の間の平衡に達するであろう。上記経路の収率はポリペプチドからの生成物の連続的な除去により増大されうる。例えば、透過酵素又は他の輸送タンパク質を用いたモナチンの発酵液への分泌又は基質の付随する再生を伴う生触媒反応器ストリームからのモナチンの選択的結晶化は反応収率を増大させるであろう。追加の酵素反応による又はアミノ供与基の置換による副生成物の除去は反応収率を増大させる他の方法である。いくつかの例は実施例13中に議論され、及び図11~13中に示される。理想的には、逆方向に反応するために使えない副生成物は、相変化蒸発により又は二酸化炭素の如き不反応性最終生成物への自発的変換により作出される。基質プールの調節インドールプールはトリプトファン前駆体の生成を増大させること及び/又はインドール-3-ピルビン酸塩及び又はトリプトファンに関する異化経路を変化させることにより調節されうる。例えば、インドール-3-ピルビン酸塩からのインドール-3-酢酸の生成は宿主細胞においてEC4.1.1.74をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより減少され又は消去されうる。トリプトファンからのインドールの生成は宿主細胞においてEC4.1.99.1をコードする遺伝子を機能的に欠失させることにより減少され又は消去されうる。あるいは、過剰のインドールは増大された量のEC4.1.99.1をコードする遺伝子と共にinvitro又はinvivoプロセスにおいて基質として利用されうるKawasakietal.,J.Ferm.andBioeng.,82:604-6,1996。遺伝子改変はD-エリスロース-4-フォスフェート及びコリスメートの如き中間体の値を増大させるためになされうる。トリプトファン生成はほとんどの生物において制御される。1の機構は経路におけるある酵素のフィードバック阻害を介する;トリプトファン値が増大すると、トリプトファン生成速度は減少する。したがって、トリプトファン中間体を介してモナチンを生成するよう遺伝子工学的に作り変えられた宿主細胞を用いるとき、トリプトファン濃度に感受性でない生物が使用されうる。例えば、さまざまなトリプトファンアナログによる成長阻害に耐性であるCatharanthusroseusの株は高濃度の5-メチルトリプトファンへの繰り返される暴露により選択されたSchallenbergandBerlin,ZNaturforsch34:541-5,1979。上記株の生ずるトリプトファン合成酵素活性は、おそらく遺伝子内の突然変異のために、生成物阻害によりあまり影響されなかった。同様に、モナチン生成に使用される宿主細胞は最適化されうる。トリプトファン生成は生成物阻害にあまり感受性でないポリペプチドを進化させるための方向付けられた進化の使用をとおして最適化されうる。例えば、スクリーニングは媒体中にトリプトファンを含まないが、高い値の代謝不可能なトリプトファンアナログを有するプレート上で行われうる。米国特許第5,756,345号;第4,742,007号;及び第4,371,614号は発酵生物においてトリプトファン生産性を増大させるために使用される方法を示す。トリプトファン生合成の最終段階はインドールへのセリンの添加である;それゆえ、セリンのアベイラビリティはトリプトファン生成を増大させるために増大されうる。発酵生物により生成されるモナチンの量は宿主生物により生成されるピルビン酸塩の量を増大させることにより増大されうる。TrichosporoncutaneumWangetal.,Lett.Appl.Microbiol.35:338-42及びTorulopsisglabrataLietal.,ApplMicrobiol.Biotechnol.57:451-9,2001の如きある酵母はピルビン酸塩を過剰生成し、及び本明細書中に開示される方法を実施するために使用されうる。さらに、E.coli株W1485lip2におけるものの如き、遺伝子改変はピルビン酸生成を促進するために生物になされうるKawasakietal.,J.Ferm.andBioeng.82:604-6,1996。キラリティの制御モナチンの味感プロファイルは分子の立体化学キラリティを制御することにより変化されうる。例えば、異なるモナチン異性体は異なる食物系のための濃度の異なる配合において所望されうる。キラリティはpH及びポリペプチドの組み合わせを介して制御されうる。モナチンのC-4位でのラセミ化上記の番号を付けられた分子を参照のことは、pHにおけるシフトにより又は共因子PLPとの反応により起こりうる、アルファ炭素の脱プロトン化及び再プロトン化により起こりうる。微生物においては、pHはラセミ化を引き起こすのに十分なほどシフトしないが、PLPは豊富である。ポリペプチドでキラリティを制御する方法はモナチン生成に利用される生合成経路に因る。モナチンが図2中に示される経路を用いて形成されるとき、以下のものが考えられうる。生触媒反応においては、炭素-2のキラリティはインドール-3-ピルビン酸塩をMPに変換する酵素により決定される。例えば、EC4.1.2.-、4.1.3.-からの複数の酵素はインドール-3-ピルビン酸塩をMPに変換しうる、したがって、所望の異性体を形成する酵素を選択することが可能である。あるいは、インドール-3-ピルビン酸塩をMPに変換する酵素のエナンチオ特異性は方向付けられた進化の使用をとおして改変されうる又は触媒抗体は所望の反応を触媒するよう遺伝子工学的に作り変えられうる。一旦MPが生成されたら酵素的に又は化学縮合により、アミノ基は本明細書中に示されるものの如きトランスアミナーゼを用いて立体特異的に添加されうる。炭素-4のR又はS配置はD-あるいはL-芳香酸アミノトランスフェラーゼが使用されるかどうかに因り生成されうる。ほとんどのアミノトランスフェラーゼはL-異性体に特異的である、しかしながら、D-トリプトファンアミノトランスフェラーゼはいくつかの植物において存在するKohibaandMito,Preceedingsofthe8thInternationalSymposiumonVitaminB6andCarbonylCatalysis,Osaka,Japan1990。さらに、D-アラニンアミノトランスフェラーゼ2.6.1.21、D-メチオニン-ピルビン酸塩アミノトランスフェラーゼ2.6.1.41並びにR-3-アミノ-2-メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ2.6.1.61及びS-3-アミノ-2-メチルプロパノエートアミノトランスフェラーゼ2.6.1.22の両方が同定されている。いくつかのアミノトランスフェラーゼはC2炭素での特定の配置でのみこの反応のための基質を受けうる。それゆえ、MPへの変換が立体特異的でない場合でさえも、最終生成物の立体化学はトランスアミナーゼの適切な選択をとおして制御されうる。上記反応は可逆であるので、反応しないMP所望されない異性体はその構成成分に再生されうる、及びMPのラセミ混合物が再形成されうる。基質の活性化フォスフォエノールピルビン酸塩PEPの如きリン酸化された基質は本明細書中に開示される反応において使用されうる。リン酸化された基質はよりエネルギー的に好まれうる、及びそれゆえ、反応速度及び/又は収率を増大させるために使用されうる。アルドール縮合において、リン酸基の添加は求核基質のエノール互変異性体を安定化させ、それをより反応性にさせる。他の反応においては、リン酸化された基質はしばしばよりよい脱離基を提供する。同様に、基質はCoA誘導体又はピロフォスフェート誘導体への変換により活性化されうる。実施例1トリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニング及び発現この実施例は、トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換するために使用されうるトリプトファンアミノトランスフェラーゼをクローニングするために使用された方法を示す。実験の概略アミノトランスフェラーゼをコードする11の遺伝子をE.coli内にクローニングした。これらの遺伝子はBacillussubtilisD-アラニンアミノトランスフェラーゼdat、Genbankアクセス番号Y14082.1bp28622-29470及びGenbankアクセス番号NP_388848.1、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、SinorhizobiummelilotiRhizobiummelilotiとも呼ばれるチロシンアミノトランスフェラーゼtatA、配列ID番号:1及び2、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Rhodobactersphaeroides株2.4.1チロシンアミノトランスフェラーゼホモロジーにより断定されるtatA、配列ID番号:3及び4、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、R.sphaeroides35053チロシンアミノトランスフェラーゼホモロジーにより断定される、配列ID番号:5及び6、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Leishmaniamajor広範囲基質アミノトランスフェラーゼbsat、L.mexicanaからのペプチド断片へのホモロジーにより断定される、配列ID番号:7及び8、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Bacillussubtilis芳香族アミノトランスフェラーゼaraT、ホモロジーにより断定される、配列ID番号:9及び10、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Lactobacillusamylovorus芳香族アミノトランスフェラーゼホモロジーにより断定されるaraT、配列ID番号:11及び12、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、R.sphaeroides35053多基質アミノトランスフェラーゼホモロジーにより断定される、配列ID番号:13及び14、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Rhodobactersphaeroides株2.4.1多基質アミノトランスフェラーゼホモロジーにより断定されるmsa、Genbankアクセス番号AAAB01000093.1、bp14743-16155及びGenbankアクセス番号ZP00005082.1、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、Escherichiacoliアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼaspC、Genbankアクセス番号AE000195.1bp2755-1565及びGenbankアクセス番号AAC74014.1、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列、及びE.coliチロシンアミノトランスフェラーゼtyrB、配列ID番号:31及び32、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列であった。上記遺伝子をクローニングし、発現し、及び商業的に入手可能な酵素と共に、トリプトファンからインドール-3-ピルビン酸塩への変換における活性について試験した。全ての11のクローンは活性を有した。所望の活性を有するポリペプチドを含みうる菌株の同定NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースにおけるどの遺伝子もトリプトファンアミノトランスフェラーゼとして指定されなかった。しかしながら、この酵素活性を有する生物は同定されている。L-トリプトファンアミノトランスフェラーゼTAT活性は細胞抽出物において又は以下の源からの精製タンパク質から計測されている:Festucaoctofloraからのリゾバクテリア単離物、マメミトコンドリア及び細胞質、ヒマワリクラウンゴール細胞、Rhizobiumleguminosarum生物型trifoli、Erwiniaherbicolapvカスミソウ、Pseudomonassyringaepv.savastanoi、Agrobacteriumtumefaciens、Azospirillumlipferumbrasilense、Enterobactercloacae、Enterobacteragglomerans、Bradyrhizobiumelkanii、Candidamaltosa、Azotobactervinelandii、ラット脳、ラット肝臓、Sinorhizobiummeliloti、PseudomonasfluorescensCHA0、Lactococcuslactis、Lactobacilluscasel、Lactobacillushelveticus、小麦種苗、大麦、Phaseolusaureus緑豆、Saccharomycesuvarumcarlsbergensis、Leishmaniasp.、トウモロコシ、トマトの苗条、マメ植物、タバコ、ブタ、Clostridiumsporogenes、及びStreptomycesgriseus。クローニングのためのゲノムDNAの単離S.melilotiATCC番号9930を25°C、pH7.2でTY培地中で生育させた。細胞を600nmOD600で1.85の光学濃度まで生育させ、及び2接種をゲノムDNA調製物に使用した。Qiagenゲノムチップ20/GキットValencia,CAをゲノムDNA単離に使用した。Bacillussubtilis6051ATCCをBeretoNutrientBrothDifco;Detroit,MT中で30°Cで生育させた。Qiagenゲノムチップ20/Gプロトコルを以下の変化を伴ってゲノムDNAを単離するために使用した:プロテイナーゼK及びリゾチームの濃度は二倍であり、及びインキュベーション時間は2~3倍に増大した。LeishmaniamajorATCC50122ゲノムDNAはTE緩衝液pH8.0、17ng/μL中にIDI,Inc.Quebec、Canadaにより補充された。Rhodobactersphaeroides2.4.1ProfessorSamKaplan,UniversityofTexas,Houstonにより提供された、R.sphaeroides35053ATCC番号、及びL.amylovorusゲノムDNAを標準のフェノール抽出により調製した。細胞を遅いログフェーズで回収し、TEN緩衝液10mMTris-HCl、pH7.5、1mMEDTA、100mMNaCl中に再懸濁し、及びmL細胞懸濁物当たり0.024mLラウリルサルコジンナトリウムの添加により溶解した。TE緩衝液10mMTris-HCl、pH7.5、1mMEDTAで飽和した等量のフェノールで少なくとも3回抽出した後、上記DNA溶液を9:1クロロフォルム:オクタノールで1回及びクロロフォルムで3回抽出した。上記DNAを0.1容量の3M酢酸ナトリウム、pH6.8及び2容量のエタノールの添加により沈殿させた。上記沈殿物を遠心分離により回収し、及び70エタノールで一回洗浄した。最後に、上記DNAを0.10mL蒸留水中に溶解した。EscherichiacoliゲノムDNAを株DH10BInvitrogenから単離し、及びQiagenGenomic-tip商標500/Gキットを用いて調製した。1.87のOD650までLB中で生育した30mLのこの株から、0.3mgの精製DNAが得られた。精製DNAを0.37μg/μLの濃度でQiagen溶離緩衝液EB中に溶解した。ポリメラーゼ鎖反応プロトコルプライマーをpET30Xa/LICベクターNovagen,Madison,WIについての融和性のオーバーハングと共に設計した。上記pETベクターはXa/LICサイトの5’側に12塩基の一重鎖オーバーハング及びXa/LICサイトの3’側に15塩基の一重鎖オーバーハングを有する。上記プラスミドはN-末端His及びS-タグ並びに場合によるC-末端His-タグを伴って、ライゲーション独立クローニングのために設計される。上記Xaプロテアーゼ認識部位IEGRは問題の遺伝子の開始コドンのすぐ前に位置するので、融合タンパク質のタグは除去されうる。プライマーを設計するとき、以下の配列を生物特異的配列の5’末端に加えた:前向きプライマー:5’GGTATTGAGGGTCGC配列ID番号:73;逆向きプライマー:5’AGAGGAGAGTTAGAGCC配列ID番号:74。Bacillussubtilisdatプライマー:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’配列ID番号:15及び16。SinorhizobiummelilotitatAプライマー:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC配列ID番号:17及び18。BacillussubtilisaraTプライマー:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG配列ID番号:19及び20。Rhodobactersphaeroidesmsa2.4.1.及び35053の両方:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG配列ID番号:21及び22。Leishmaniamajorbsat:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC配列ID番号:23及び24。LactobacillusamylovorusaraT:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA配列ID番号:25及び26。RhodobactersphaeroidestatA2.4.1及び35053株両方:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG配列ID番号:27及び28。EscherichiacoliaspC:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’配列ID番号:29及び30。EscherichiacolityrB:N末端:5’-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC及びC末端:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’配列ID番号:33及び34。S.melilotitatA由来の遺伝子を以下のPCRプロトコルを用いて増幅した。50μLの反応中に、0.1~0.5μg鋳型、1.5μMのそれぞれのプライマー、0.4mMのそれぞれのdNTP、3.5UのExpandHighFidelityPolymeraseRoche,Indianapolis,IN、及びMgを伴う1×Expand商標緩衝液を使用した。使用されたサーモサイクラープログラムは96°Cでの高温開始5分間、続いて以下の段階:94°Cで30秒間、55°Cで2分間、及び72°Cで2.5分間の29の繰返しを含んだ。29の繰返しの後、上記サンプルを72°Cで10分間維持し、及びその後4°Cで保存した。このPCRプロトコルは1199bpの生成物を生成した。R.sphaeroidesmsa及びtatA、L.amylovorusaraT、及びBacillusaraT由来の遺伝子配列を以下のPCRプロトコルを用いて増幅した。50μL反応中に、0.1~0.5μgの鋳型、1.5μMのそれぞれのプライマー、0.4mMのそれぞれのdNTP、3.5UExpandHighFidelity商標Polymerase、及びMgを伴う1×Expand商標緩衝液を添加した。使用されたサーモサイクラープログラムは96°Cでの高温開始5分間、続いて以下の段階:94°Cで30秒間、40~60°Cで1分45秒間勾配サーモサイクラー及び72°Cで2分15秒間の29の繰返しを含んだ。29の繰返し後、上記サンプルを72°Cで10分間維持し、及びその後4°Cで保存した。それぞれのR.sphaeroidesmsa遺伝子について、42°C及び48°Cのアニーリング温度は複数の生成物を生成したが、明らかなバンドは約1464bpであった。L.amylovorusaraTについて、42°C、48°C、及び56°Cのアニーリング温度は1173bpの強いバンドで単一の生成物を産出した。B.subtilisaraTについて、40°C、45°C、50°C、55°Cのアニーリング温度はゲノムDNA及びコロニーの両方から単一の強い生成物1173bpを生成した。L.majorbsatについて、55°Cのアニーリング温度は最もきれいな生成物1239bpを与えた。RhodobactertatA遺伝子について、50~55°Cのアニーリング温度は正しい大きさ1260bpのきれいな生成物を与えた。E.coli遺伝子及びB.subtilisdat遺伝子の両方について、55~60°Cのアニーリング温度を使用し、及び上記アニーリング時間を45秒間に短縮した。正しい大きさのきれいな生成物が得られたE.coli遺伝子について約1.3kb、dat遺伝子について850bp。クローニング上記PCR産物をQiagenゲル抽出キットValencia,CAを用いて0.8又は1TAE-アガロースゲルからゲル精製した。上記PCR産物をアガロースゲル上の標準に比較して定量し、及びその後LigationIndependentCloningNovagen,Madison,WIについての製造業者の推奨するプロトコルにしたがってT4DNAポリメラーゼで処理した。簡単に述べると、約0.2pmolの精製PCR産物をdGTPの存在下で1UT4DNAポリメラーゼで22°Cで30分間処理した。上記ポリメラーゼは上記PCR産物の3’末端から連続した塩基を除去する。ポリメラーゼがグアニン残基に出会うとき、上記酵素の5’~3’ポリメラーゼ活性はエキソヌクレアーゼ活性を妨げ、さらなる切除を効果的に妨げる。これはpETXa/LICベクターと融和性である一重鎖オーバーハングを作出する。上記ポリメラーゼは75°Cで20分間インキュベートすることにより不活性化される。上記ベクター及び処理された挿入物をNovagenにより推奨されるようにアニーリングした。約0.02pmolの処理された挿入物及び0.01pmolのベクターを22°Cで5分間インキュベートし、6.25mMEDTA最終濃度を添加し、及び22°Cでのインキュベーションを繰り返した。上記アニーリング反応1μLをNovaBlue商標singlesコンピテント細胞Novagen,Madison,WIに添加し、及び氷上で5分間インキュベートした。混合後、上記細胞を42°Cで30秒間の熱ショックにより形質転換した。上記細胞を氷上に2分間置き、及び250μLの室温のSOC中で37°Cで30分間225rpmで振騰しながら回復させた。細胞をカナマイシン25~50μg/mLを含むLBプレート上にまいた。プラスミドDNAをQiagenスピンミニプレップキットを用いて精製し、及びXhoI及びXbaIでの制限酵素消化により正しい挿入物についてスクリーニングした。正しい挿入物を有することがわかったプラスミドの配列をヂデオキシ鎖停止DNAシークエンシングにより実証した。配列ID番号:1~14及び31~32は組換えアミノトランスフェラーゼのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列を示し、Genbank配列からのどの変化も上記タンパク質配列においてサイレント又は作出された保存的置換であった。配列ID番号:11及び12は新規配列である。遺伝子発現及び分析配列分析により実証されたプラスミドDNAをE.coli発現宿主BLRDE3又はBL21DE3Novagen,Madison,WI内にサブクローニングした。培養物を生育させ、及び上記プラスミドをQiagenミニプレップキットを用いて単離し、及び同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。誘導はBLRDE3及びBL21DE3細胞内でL.amylovorusaraT、B.subtilisaraT、及びS.melilotitatAではじめに行った。タイムコース研究をカナマイシン30mg/Lを含むLB中で0.5~0.8のOD600まで生育させた培養物で行い、及び1mMIPTGイソプロピルチオガラクトシドで誘導し、及び誘導後0、1、2、及び4時間でサンプリングした。2.0mLからの細胞を10ドデシル硫酸ナトリウム、102-メルカプトエタノール、及び20グリセロールを含む0.10mL120mMTris-HCl、pH6.8中に再懸濁し、及び95°Cで10分間熱し、及び冷却し、及び0.10mLのH2Oで希釈した。これらの全細胞タンパク質サンプルの等分を4~5勾配ゲルを用いてSDS-PAGEにより分析した。2時間及び4時間誘導の間でも、BLRDE3及びBL21DE3細胞の間でも、発現されたタンパク質の量において顕著な差はなかった。細胞抽出物をまた0.25μLベンゾナーゼヌクレアーゼを含む0.25mLNovagenBugBuster商標試薬中に2mLの培養物からの細胞ペレットを懸濁し、室温で20分間穏やかに振騰しながらインキュベートし、及び細胞くずを除去するために16,000×gで遠心分離することにより、4時間サンプルから調製した。上記上清細胞抽出物を細胞可溶性タンパク質の分析のために4~15勾配ゲル上にロードした。3のクローン、L.amylovorusaraT配列ID番号:11及び12、B.subtilisaraT配列ID番号:9及び10、及びS.melilotitatA配列ID番号:1及び2は正しい大きさ約45kDaに対応する可溶性タンパク質を示した。B.subtilisaraT遺伝子産物は最も高い値で過剰発現され、及び/又は他の2の遺伝子産物よりも可溶性であった。続く発現方法において、陽性クローンからのプラスミドDNAを、この宿主のよりよい成長特性のために、BL21DE3内にサブクローニングした。誘導は50mg/Lでカナマイシンを含むLB中で生育させた培養物で1mMIPTGを用いて繰り返し、OD600が約0.8に達したとき誘導した。細胞を37°Cでの生育の4時間後に回収し、3000rpmで10分間4°C遠心分離し、TEGGP緩衝液Rochecompleteproteaseinhibitorcocktailを含む50mMTris-HClpH7.0、0.5mMEDTA、100mg/Lグルタチオン、5グリセロールで洗浄し、及び-80°Cエタノール中でフラッシュ凍結乾燥させた。サンプルを5μL/mLのproteaseinhibitorcocktailset3Calbiochem-NovabiochemCorp.,SanDiego,CA及び1μL/mLベンゾナーゼヌクレアーゼを含む5mL/g細胞湿重量のBugBuster商標Novagen試薬中に再懸濁した。サンプルを軌道シェーカー上で室温で20分間インキュベートした。不溶性細胞くずは16,000×gで20分間4°Cの遠心分離により除去した。細胞抽出物をSDS-PAGEにより分析し、及び以下のプロトコルを用いてインドール-ピルビン酸の生成を追うことによりトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性について分析した。1mL反応を50mMテトラホウ酸ナトリウムpH8.5、0.5mMEDTA、0.5mM砒酸ナトリウム、50μMピリドキサルフォスフェート、5mMα-ケトグルタル酸塩、及び5mML-トリプトファン中で行った。上記反応を細胞除去抽出物又は精製酵素の添加により開始し、及び30°Cで30分間インキュベートした。20TCA200μLを上記反応を停止させるために添加し、及び沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した。327nmでの吸収を計測し、及び分析緩衝液中に新しく調製したインドール-3-ピルビン酸塩の標準曲線と比較した。基質トリプトファンなしの又はpET30aのみで形質転換したクローンからの細胞除去抽出物を用いたコントロール反応もまた行った。細胞抽出物中のネイティブE.coliアミノトランスフェラーゼからのバックグラウンドのために、組換えタンパク質を製造業者のプロトコルNovagen,Madison,WIにしたがってHis-Bindカートリッヂを用いて精製した。溶離画分をPD-10AmershamBiosciences,Piscataway,NJカラム上で脱塩し、及び50mMTris,pH7.0中に溶離した。精製タンパク質をSDS-PAGEにより分析し、及びアミノトランスフェラーゼ活性について分析した。1mMIPTGでの37°C誘導4時間からの結果は、L.majorbsat、S.melilotitatA、E.coliaspC、及びR.shaeroidestatAクローンの両方は顕著な値のトリプトファンアミノトランスフェラーゼ活性を有することを示した。B.subtilisからのaraTタンパク質は過剰発現され、及び可溶性であったが、ほとんど酵素活性を示さなかった。L.amylovorusaraT遺伝子産物は細胞抽出物中では可溶性に見えたが、His-Bindカートリッヂを用いた精製は正しい分子量を有する少量のみのタンパク質をもたらした。msa遺伝子産物は不溶性であり、及びインクルージョンボディ形成を最小限にするためにさらなる発現実験が24°Cで行われた。10μM~1mMの間のIPTGのいくつかの濃度を可溶性タンパク質の量を最大限にするために使用した。表1は1分間当たり1ミリグラムタンパク質当たり形成されたインドール-3-ピルビン酸塩I3Pのマイクログラムで計測された特異的活性を列挙する。いくつかの場合、非常に少量の組換えタンパク質は上記分析の有効直線範囲を超える高い値の活性を示した。これらの場合には、>が特異的活性数の前についている。クローニングされた全ての組換えタンパク質を比較する並びは、araT、tatA、bsat、及びmsa配列の間に多くの高く保存された領域はないことを示す。最も高い活性の組換えタンパク質:RhodobactertatA遺伝子産物ホモログ、L.major広範囲基質アミノトランスフェラーゼ、及びSinorhizobiummelilotiチロシンアミノトランスフェラーゼの並びはいくつかの保存された領域を示した、しかしながら、それらはタンパク質値で約30~43のみ同一である。広範囲、D-特異的D-アラニンアミノトランスフェラーゼのアベイラビリティはモナチンの他の立体異性体の生成において有用でありうる。実施例2インドール-3-乳酸塩のインドール-3-ピルビン酸塩への変換図1及び3中に見られるように、インドール-3-乳酸はインドール-3-ピルビン酸塩を生成するために使用されうる。乳酸及びピルビン酸塩の間の変換は可逆反応であり、インドール-3-ピルビン酸塩及びインドール-3-乳酸塩の間の変換も同じである。インドール-乳酸塩の酸化は典型的に、インドール-3-ピルビン酸塩からの340nmでの高い量のバックグラウンドのために、続けられた。標準の分析混合物は0.1mL中に100mMリン酸カリウム、pH8.0、0.3mMNAD、7ユニットの乳酸塩デヒドロゲナーゼLDHSigma-L2395,StLouis,MO、及び2mM基質を含んだ。上記分析をMolecularDevicesSpectraMaxPlusプレートリーダーを用いてUV-透明マイクロタイタープレート中で二重で行った。ポリペプチド及び緩衝液を混合し、及びインドール-3-乳酸及びNADを含むウェル中に移し、及びそれぞれのウェルの340nmでの吸収を短い混合後9秒間隔で読んだ。反応を25°Cで5分間維持した。340nmでの吸収における増大はNADからのNADHの生成にしたがう。別々のネガティブコントロールをNADなしで及び基質なしで行った。LeuconostocmesenteroidesSigmaカタログ番号L2395からのD-LDHはBacillusstearothermophilusSigmaカタログ番号L5275からのL-LDHが示すよりもインドール-誘導基質でより活性を示すことがわかった。同様の方法をD-LDHポリペプチドの天然基質である、D-乳酸及びNAD又はNADH及びピルビン酸塩で利用した。ピルビン酸塩の還元についてのVmaxは乳酸塩の酸化についてのVmaxより100~1000倍高かった。D-LDHでのインドール-3-乳酸の酸化反応についてのVmaxは乳酸のそれの約5分の1であった。インドール-3-ピルビン酸塩の存在はまた0.5mMEDTA及び0.5mM砒酸ナトリウムを含む50mMホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて327エノール-ホウ酸塩誘導体での吸収における変化を追うことにより計測された。L及びD-LDHポリペプチドについてのネガティブコントロールと比較して、小さな、しかし繰り返されうる、吸収変化が観察された。さらに、広範囲特異性乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.27、EC1.1.1.28、及び/又はEC1.1.2.3に関連する活性を有する酵素はクローニングされ、及びインドール-3-乳酸からインドール-3-ピルビン酸塩を作出するために使用されうる。広範囲特異性デヒドロゲナーゼの源はE.coli、Neisseriagonorrhoeae、及びLactobacillusplantarumを含む。あるいは、インドール-3-ピルビン酸塩はインドール-3-乳酸塩を、インドール乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.110を含むClostridiumsporogenesからの細胞抽出物;又はインドール-3-ピルビン酸塩について活性を有することが知られるp-ヒドロキシフェニル乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.222を含むTrypanosomacruziepimastigotes細胞抽出物;又はイミダゾール-5-イル乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.111を含むPseudomonasacidovorans若しくはE.coli細胞抽出物;又はヒドロキシフェニルピルビン酸塩還元酵素EC1.1.1.237を含むColeusblumei;又はD-芳香族乳酸塩デヒドロゲナーゼEC1.1.1.222を含むCandidamaltosaと接触させることにより生成されうる。上記活性を示す引用文献は、Nowickietal.FEMSMicrobiolLett71:119-24,1992、JeanandDeMossCanadianJ.Microbiol.141968,CooteandHassallBiochem.J.111:237-9,1969、Corteseetal.C.R.SeancesSoc.Biol.Fil.162390-5,1968、PetersenandAlfermannZ.Naturforsch.C:Biosci.43501-4,1988、及びBhatnagaretal.J.GenMicrobiol135:353-60,1989を含む。さらに、Pseudomonassp.からのものの如き乳酸塩オキシダーゼGuetal.J.Mol.CatalysisB:Enzymatic:18:299-305,2002はインドール-3-乳酸のインドール-3-ピルビン酸塩への酸化のために利用されうる。実施例3L-アミノ酸オキシダーゼを利用したL-トリプトファンのインドール-3-ピルビン酸塩への変換この実施例は、実施例1中に示されるようにトリプトファンアミノトランスフェラーゼを用いることの代わりに、オキシダーゼEC1.4.3.2を介してトリプトファンをインドール-3-ピルビン酸塩に変換するために使用される方法を示す。L-アミノ酸オキシダーゼはCrotalusdurissusSigma,St.Louis,MO,カタログ番号A-2805から精製された。分子クローニングのためのL-アミノ酸オキシダーゼのアクセス番号は:CAD21325.1、AAL14831、NP_490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JB0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600、及びZ48565を含む。反応を総容積1mL中のマイクロ遠心分離管中で、37°Cで振騰しながら10分間インキュベートして行った。上記反応混合物は5mML-トリプトファン、100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.6、0.5mM砒酸ナトリウム、0.5mMEDTA、25mMテトラホウ酸ナトリウム、0.016mgカタラーゼ83U、SigmaC-3315、0.008mgFADSigma、及び0.005~0.125ユニットのL-アミノ酸オキシダーゼを含んだ。ネガティブコントロールはトリプトファン以外の全ての成分を含み、及びブランクはオキシダーゼ以外の全ての成分を含んだ。カタラーゼを酸化的脱アミノ化の間に形成される過酸化水素を除去するために使用した。テトラホウ酸ナトリウム及び砒酸ナトリウムを327nmで最大吸収を示すインドール-3-ピルビン酸塩のエノールホウ酸塩形を安定化するために使用した。インドール-3-ピルビン酸塩標準を反応混合物中に0.1~1mMの濃度で調製した。購入したL-アミノ酸オキシダーゼはmgタンパク質当たり1分間当たりに形成された540μgインドール-3-ピルビン酸塩の特異的活性を有した。これはトリプトファンアミノトランスフェラーゼ酵素の特異的活性と同じ次数の等級である。実施例4アルドラーゼでインドール-3-ピルビン酸塩を2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸に変換することこの例はアルドラーゼリアーゼを用いてインドール-3-ピルビン酸塩を2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸モナチン前駆体MPに変換するために使用されうる方法を示す図2。アルドール縮合はアルデヒド又はケトンのβ-炭素及び他のアルデヒド又はケトンのカルボニル炭素の間の炭素-炭素結合を形成する反応である。カルボアニオンは1の基質のカルボニル基の近隣の炭素上に形成され、及び第二の基質のカルボニル炭素求電子炭素を攻撃する求核剤としてはたらく。最も通常には、上記求電子基質はアルデヒドであり、そのためほとんどのアルドラーゼはEC4.1.2.-カテゴリーに入る。かなりしばしば、上記求核基質はピルビン酸塩である。アルドラーゼが2のケト-酸又は2のアルデヒドの間の縮合を触媒することは珍しい。しかしながら、2のカルボン酸の縮合を触媒するアルドラーゼは同定されている。例えば、EP1045-029はPseudomonas培養物EC4.1.3.16を用いたグリオキシル酸及びピルビン酸塩からのL-4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸の生成を示す。さらに、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩アルドラーゼ4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼ、EC4.1.3.17は2のケト酸の縮合を触媒しうる。それゆえ、同様のアルドラーゼポリペプチドがインドール-3-ピルビン酸塩とピルビン酸塩の縮合を触媒するために使用された。クローニング4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼProAアルドラーゼ、EC4.1.3.17及び4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸塩グルオキシル酸塩-リアーゼKHGアルドラーゼ、EC4.1.3.16は図2のアルドラーゼ反応に非常によく似た反応を触媒する。プライマーはpET30Xa/LICベクターNovagen,Madison,WIについての融和性のオーバーハングと共に設計された。これらのプライマーの設計は上記実施例1中に示される。以下のプライマーはpET30Xa/LICクローニングのために設計された:1.PseudomonasstramineaproA遺伝子Genbankアクセス番号:12964663バージョン:12964663及びComamonastestosteroniproA遺伝子配列ID番号:65-66、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’配列ID番号:55及び56。2.Sinorhizobiummeliloti1021SMc00502遺伝子proAと同族、Genbankアクセス番号:15074579及びCAC46344、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’配列ID番号:61及び62。3.Sphingomonassp.LB126fldZ遺伝子GenBankアクセス番号:7573247バージョン:7573247、推定されているアシルトランスフェラーゼをコードする前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’配列ID番号:57及び58。4.ArthrobacterkeyseripcmE遺伝子Genbankアクセス番号:AF331043バージョン:AF331043.1、オキサロシトラリンゴ酸塩アルドラーゼをコードする前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’配列ID番号:59及び60。5.YersiniapestisstrainCO92YPO0082遺伝子Genbankアクセス番号:15978115バージョン:15978115、可能性のあるトランスフェラーゼをコードする前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3’配列ID番号:63及び64。6.Bacillussubtiliskhg遺伝子Genbankアクセス番号Z99115.1GI:2634478、126711-127301及びCAB14127.1それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’配列ID番号:35及び36。7.E.colikhg遺伝子Genbankアクセス番号AE000279.11331-1972及びAAC74920.1、それぞれ核酸及びアミノ酸配列前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’配列ID番号:37及び38。8.S.melilotikhg遺伝子Genbankアクセス番号AL591792.1GI:15075850、65353-64673及びCAC47463.1、それぞれ核酸及びアミノ酸配列前向き5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’及び逆向き5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’配列ID番号:39及び40。上記1~2及び6~8中に示される生物からのゲノムDNAをQiagengenomic-tipプロトコルを用いて精製した。同様の技術を用いて、3~5中に示される生物からのゲノムDNAが精製されうる。PseudomonasstramineaATCC33636をNutrientBroth及びヒドロキシ安息香酸培地中で30°Cで生育させた。ComamonastestosteroniATCC49249をNutrientBroth及びヒドロキシ安息香酸培地中で26°Cで生育させた。Sphingomonassp.LB126FlemishInstituteforTechnologicalResearch、VITO、B-2400Mol、BelgiumをWattianetal.ResearchinMicrobiol.152:861-72,2001により示される方法にしたがって生育させた。ArthrobacterkeyseriGulfEcologyDivision,NationalHealthandEnvironmentalEffectsResearchLaboratory,U.S.EnvironmentalProtectionAgency,GulfBreeze,FL32561,USAをEatonJ.Bacteriol.183:3689-3703,2001により示されるプロトコルにしたがって生育させた。SinorhizobiummelilotiATCC51124をATCCTY培地及びヒドロキシ安息香酸培地中で26°Cで生育させた。Yersiniapestis株CO92ATCCをATCC培地739ウマ血液アガー中で26°Cで生育させた。Bacillussubtilis6051ATCCをBcretoNutrientBrothDifco;Detroit,MI中で30°Cで生育させた。E.coliゲノムDNAを実施例1中に示されるように株DH10BInvitrogenから単離した。実施例1中に示されるPCR、クローニング及びスクリーニングプロトコルをC.testosteroni及びS.melilotiproA配列、及びE.coli、B.subtilis、及びS.melilotikhg配列をクローニングするために使用した。同じ方法は上記に示される他の配列をクローニングするために使用されうる。陽性クローンをS-タグ及びT7ターミネータープライマーNovagen、及びIntegratedDNATechnologies,Inc.Coralville,IAからの内部プライマーでヂデオキシ鎖停止シークエンシングSeqwright,Houston,TXを用いてシークエンシングした。発現及び活性分析プラスミドDNA配列分析により実証されたを発現宿主BL21DE3Novagen内にサブクローニングした。上記培養物を50mg/Lカナマイシンを有するLB培地中で生育させ、プラスミドをQiagenスピンプラスミドミニプレップキットを用いて単離し、及び続いて同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。誘導実験を37°Cで50mg/Lカナマイシンを含むLB培地中で生育させたBL21DE3構築物で行った。タンパク質発現を、OD600が約0.6に達した後、0.1mMIPTGを用いて誘導した。上記細胞を30°Cで4時間生育させ、及び遠心分離により回収した。上記細胞をその後Bugbuster商標試薬Novagenを用いて溶解し、及びHis-タグ組換えタンパク質を上記実施例1に示されるようにHis-Bindカートリッヂを用いて精製した。精製タンパク質をPD-10ディスポーザブルカラム上で脱塩し、及び2mMMgCl2を有する50mMTris-HCl緩衝液、pH7.3中で溶離した。上記タンパク質を組換え融合タンパク質の予想されるMWで可溶性タンパク質の値を検出するために4~15勾配ゲル上でSDS-PAGEにより分析した。上記タンパク質をインドール-3-ピルビン酸塩及びピルビン酸ナトリウムを基質として用いて活性について分析した。上記分析混合物は1mL中に100mMTris-HClpH7-pH8.9、0-8mMMgCl2、3mMリン酸カリウムpH8、及び6mMのそれぞれの基質を含んだ。上記反応をさまざまな量のポリペプチド例えば、10~100μgを添加することにより開始し、及び25°C~37°Cで30分間インキュベートし、ろ過し、及びその後-80°Cで凍結した。proA遺伝子産物での活性結果C.testosteroniproA及びS.melilotiSMc00502遺伝子構築物の両方はIPTGで誘導されたとき高い値の発現を有した。上記組換えタンパク質は総タンパク質及び細胞抽出サンプルのSDS-PAGE分析により決定されるように、高く可溶性であった。C.testosteroni遺伝子産物を>95精製度まで精製した。S.meliloti遺伝子産物の収率はHis-Bindカートリッヂを用いたアフィニティ精製後非常に低かったので、細胞抽出物を酵素分析に使用した。両方の組換えアルドラーゼはインドール-3-ピルビン酸塩及びピルビン酸塩からのMPの形成を触媒した。二価マグネシウム及びリン酸カリウムの両方の存在は酵素活性に必要とされた。インドール-3-ピルビン酸塩、ピルビン酸塩又はリン酸カリウムが存在しないとき、生成物は明らかでなかった。また少量の生成物が酵素の不在下で形成された典型的に酵素が存在するときより1次数等級少ない。生成物ピークはインドール-3-ピルビン酸塩標準よりもわずかに遅く、逆相C18カラムから溶離し、このピークのマススペクトルは292.1の衝突誘導親イオン[MH]を示し、上記親イオンは生成物MPであると予測された。マススペクトル中に存在する主な娘断片はm/z=1581H-インドール-3-カルボアルデヒドカルボニウムイオン、1683-ブタ-1,3-ヂエニル-1H-インドールカルボニウムイオン、274292-H2O、256292-2H2O、238292-3H2O、228292-CH4O3、及び204ピルビン酸塩の損失でのものを含んだ。生成物はまた、279~280のλmax及び約290nmの小さなショルダーを有し、トリプトファンの如き他のインドール含有化合物のUVスペクトル特性を示した。C.testosteroniアルドラーゼにより生成されるMPの量は室温~37°Cの反応温度、基質の量、及びマグネシウムの量における増大と共に増大した。酵素の合成活性は増大するpHと共に減少し、観察される最高量生成物はpH7であった。トリプトファン標準に基づいて、20μgの精製タンパク質を用いた標準分析の下に生成されるMPの量は1mL反応当たり約10~40μgであった。S.meliloti及びC.testosteroniProAアルドラーゼコード配列の上記に示される他の遺伝子との高い程度のホモロジーのために、全ての上記組換え遺伝子産物はこの反応を触媒しうることが期待される。さらに、C.testosteroniの番号システムに基づいて59及び87位にスレオニンT、119にアルギニンR、120にアスパラギン酸D、及び31及び71にヒスチヂンHを有するアルドラーゼは同様の活性を有するであろうことが期待される。khg遺伝子産物の活性結果B.subtilis及びE.colikhg遺伝子構築物の両方はIPTGで誘導されたとき高い値のタンパク質発現を有し、一方、S.melilotikhgはより低い値の発現を有した。上記組換えタンパク質は、総タンパク質及び細胞抽出物のSDS-PAGE分析により判断されるように、高く可溶性であった。B.subtilis及びE.colikhg遺伝子産物を>95精製度まで精製した;S.meliloti遺伝子産物の収率はHis-Bindカートリッヂを用いたアフィニティ精製後それほど高くなかった。マグネシウム及びリン酸がこの酵素の活性に必要とされるという証拠はなかった。しかしながら、文献はリン酸ナトリウム緩衝液中で分析を行うことを報告し、及び酵素は伝えるところによれば二機能性であり、及び2-ケト-3-デオキシ-6-フォスフォグルコネートKDPGの如きリン酸化基質について活性を有する。上記酵素分析は上記に示されるように行われ、及びいくつかの場合、リン酸塩が省かれた。上記結果は、上記組換えKHGアルドラーゼはMPを生成したが、ProAアルドラーゼほど活性ではなかったことを示す。いくつかの場合、KHGにより生成されるMPの値はマグネシウム及びリン酸塩のみにより生成される量とほとんど同一であった。リン酸塩はKHG活性を増大するようには見えなかった。Bacillus酵素はSRM実施例10を参照のことにより決定されるように、最も高い活性、マグネシウム及びリン酸塩のみより約20~25高い活性を有した。Sinorhizobium酵素は最も少ない量の活性を有し、それは発現において注目される折りたたみ及び可溶性の問題に関連しうる。全ての3の酵素は活性部位グルタミン酸B.subtilis番号システム中の43位、及びピルビン酸塩とのShiff塩基形成に必要とされるリジン130位を有する;しかしながら、B.subtilis酵素は47位にアルギニンではなく、活性部位残基、スレオニンを含む。B.subtilisKHGはより小さく、及び活性部位スレオニンを有する他の酵素と共に、S.meliloti及びE.coli酵素とは区別されるクラスター中にあるように見える。活性部位における相違はB.subtilis酵素の増大された活性の理由でありうる。アルドラーゼ活性の改善触媒抗体は天然アルドラーゼと同じくらい有効であり、広い範囲の基質を受けうる、及び図2中に示される反応を触媒するために使用されうる。アルドラーゼはまた、例えば、リン酸塩必要性を除去するために及びエナンチオ選択性を逆にするためにDNAシャッフリング及びエラーしやすいPCRにより進化されるKDPGアルドラーゼ上記に示されるKHGと高く同族のについて以前に示されるように、方向付けられた進化により改善されうる。KDPGアルドラーゼポリペプチドは、供与基質ここでは、ピルビン酸塩について高く特異的であるが、受容基質すなわち、インドール-3-ピルビン酸塩については比較的柔軟であるので、生化学反応において有用であるKoellerWong,Nature409:239-9,2001。KHGアルドラーゼはピルビン酸塩のいくつかのカルボン酸との縮合について活性を有する。KHGアルドラーゼの哺乳類バージョンは、4-ヒドロキシ4-メチル2-オキソグルタル酸塩についてのより高い活性及び4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸塩の両方の立体異性体の受容を含んで、細菌バージョンより広い特異性を有すると考えられる。細菌の源はR異性体について10倍優先性を有するように見える。ゲノムデータベース中で入手可能な100近くのKHGホモログがあり、及びPseudomonas、Paracoccus、Providencia、Sinorhizobium、Morganella、E.coli、及び哺乳類組織において活性が示されている。これらの酵素はモナチン生成のために所望されるエナンチオ特異性を調整するための出発点として使用されうる。ピルビン酸塩及びケト酸である及び/又はインドールの如き嵩張る疎水性基を有する他の基質を利用するアルドラーゼはポリペプチドの特異性、速さ、及び選択性を調整するために進化されうる。本明細書中で示されるKHG及びProAアルドラーゼに加えて、これらの酵素の例は、非限定的に:KDPGアルドラーゼ及び関連するポリペプチドKDPH;Nocardioidesstからのトランスカルボキシベンザルピルビン酸塩ヒドラターゼ-アルドラーゼ;ピルビン酸塩及び2-カルボキシベンズアルデヒド芳香族環を含む基質を縮合する4-2-カルボキシフェニル-2-オキソブト-3-エノエートアルドラーゼ2’-カルボキシベンザルピルビン酸塩アルドラーゼ;またピルビン酸塩及び芳香族含有アルデヒドを基質として利用する、Pseudomonasputida及びSphingomonasaromaticivoransからのトランス-O-ヒドロキシベンジリデンピルビン酸塩ヒドラターゼ-アルドラーゼ;2-オキソ酸を基質として使用する及び生物Micrococcusdenitrificansにおいて存在すると考えられる、3-ヒドロキシアスパラギン酸塩アルドラーゼエリスロ-3-ヒドロキシ-L-アスパラギン酸塩グリオキシレートリアーゼ;ベンジル基を含む基質を利用する、ベンゾインアルドラーゼベンズアルデヒドリアーゼ;ヂヒドロネオプテリンアルドラーゼ;グリシンとベンズアルデヒドを縮合する、L-スレオ-3-フェニルセリンベンズアルデヒド-リアーゼフェニルセリンアルドラーゼ;4-ヒドロキシ-2-オキソ吉草酸塩アルドラーゼ;1,2-ヂヒドロキシベンジルピルビン酸塩アルドラーゼ;及び2-ヒドロキシベンザルピルビン酸塩アルドラーゼを含む。所望の活性を有するポリペプチドは以下の方法を用いて問題のクローンをスクリーニングすることにより選択されうる。トリプトファン栄養要求体を、発現カセット上に問題のクローンを有するベクターで形質転換し、及び少量のモナチン又はMPを含む培地上で生育させる。アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼ反応は可逆であるので、上記細胞はモナチンのラセミ混合物からトリプトファンを生成することができる。同様に、生物組換え及び野生型の両方はMP又はモナチンを炭素及びエネルギー源として利用する能力によりスクリーニングされうる。標的アルドラーゼの1の源はさまざまなPseudomonas及びリゾ細菌株の発現ライブラリーである。シュードモナスは芳香族分子の分解のための多くの普通でない異化経路を有し、及びそれらはまた多くのアルドラーゼを含む;一方、リゾ細菌はアルドラーゼを含み、植物の根圏中で生育することが知られ、及びモナチンの生合成経路の構築について示される多くの遺伝子を有する。実施例5モナチン前駆体の化学合成実施例4はインドール-3-ピルビン酸塩を2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸モナチン前駆体MPに変換するためにアルドラーゼを使用する方法を示した。この例はMPを化学的に合成する代替の方法を示す。MPは典型的なアルドール型縮合を用いることにより形成される図4。簡単に述べると、典型的なアルドール-型反応はLDAリチウムヂイソプロピルアミド、リチウムヘキサメチルヂシラザン又はブチルリチウムの如き強い塩基を用いたピルビン酸塩エステルのカルボアニオンの生成に関する。生成されたカルボアニオンはインドール-ピルビン酸塩と反応し、連結された生成物を形成する。インドール窒素を保護するために使用されうる保護基は、非限定的に:t-ブチルオキシカルボニルBoc、及びベンジルオキシカルボニルCbzを含む。カルボン酸についてのブロッキング基は、非限定的に、アルキルエステル例えば、メチル、エチル、ベンジルエステルを含む。上記保護基が使用されるとき、形成される生成物の立体化学を制御することは可能ではない。しかしながら、R2及び/又はR3がS-2-ブタノール、メタノール又はキラルアミンの如きキラル保護基である場合図4、これは他にまさり1のMPエナンチオマーの形成を好みうる。実施例6トリプトファン又はインドール-3-ピルビン酸塩のモナチンへの変換2の酵素、アミノトランスフェラーゼ及びアルドラーゼを利用するinvitroプロセスはトリプトファン及びピルビン酸塩からモナチンを生成した。第一の段階において、アルファ-ケトグルタル酸塩はインドール-3-ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩を生成するアミン転移反応においてトリプトファンからのアミノ基の受容体であった。アルドラーゼは、Mg2及びリン酸塩の存在下で、ピルビン酸塩がインドール-3-ピルビン酸塩と反応される第二の反応を触媒し、モナチンのアルファ-ケト誘導体MP、2-ヒドロキシ-2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸を生成した。第一の反応において形成されたグルタミン酸塩からのアミノ基の転移は所望の生成物、モナチンを生成した。上記生成物の精製及び特徴付けは、形成された異性体はS,S-モナチンであることを確立した。代替の基質、酵素、及び条件並びにこのプロセスになされた改善も示される。酵素Comamonastestosteroniからのアルドラーゼ、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-オキソグルタル酸塩ピルビン酸塩リアーゼProAアルドラーゼ、proA遺伝子EC4.1.3.17は実施例4中に示されるようにクローニングされ、発現され、及び精製された。B.subtilis、E.coli、及びS.melilotiからの4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸塩グリオキシル酸塩リアーゼKHGアルドラーゼEC4.1.3.16は実施例4中に示されるようにクローニングされ、発現され、及び精製された。モナチンを生成するためにアルドラーゼに関連して使用されるアミノトランスフェラーゼはE.coliaspC遺伝子によりコードされるL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ、E.colityrB遺伝子によりコードされるチロシンアミノトランスフェラーゼ、S.melilotiTatA酵素、L.majorbsat遺伝子によりコードされる広範囲基質アミノトランスフェラーゼ又はブタ心臓からのグルタミン-オキサロ酢酸トランスアミナーゼIIa型であった。非哺乳類タンパク質のクローニング、発現及び精製は実施例1中に示される。ブタ心臓からのグルタミン-オキサロ酢酸トランスアミナーゼIIa型はSigmaG7005から得られた。ProAアルドラーゼ及びL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼを用いる方法反応混合物は1リットル中に50mM酢酸アンモニウム、pH8.0、4mMMgCl2、3mMリン酸カリウム、0.05mMリン酸ピリドキサル、100mMピルビン酸塩アンモニウム、50mMトリプトファン、10mMアルファ-ケトグルタル酸塩、160mgの組換えC.testosteroniProAアルドラーゼ精製されていない細胞抽出物、~30アルドラーゼ、233mgの組換えE.coliL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ精製されていない細胞抽出物、~40アミノトランスフェラーゼを含んだ。酵素を除く全ての成分を共に混合し、及びトリプトファンが溶解されるまで30°Cでインキュベートした。上記酵素をその後添加し、及び上記反応溶液を30°Cでおだやかに振騰しながら100rpm3.5時間インキュベートした。酵素添加後0.5及び1時間に、固体トリプトファンの等分それぞれ50mmolesを上記反応に添加した。添加されたトリプトファンの全ては溶解しなかったが、濃度は50mM以上に維持された。3.5時間後、上記固体トリプトファンをろ過した。定義された量のトリプトファンを標準として用いたLC/MSによる上記反応混合物の分析は、上記溶液中のトリプトファン濃度は60.5mMであり、及びモナチン濃度は5.81mM1.05gであることを示した。以下の方法は最終生成物を精製するために使用された。透明な溶液の90パーセントをBioRadAG50W-X8樹脂225mL;1.7meq/mLの結合キャパシティのカラムにのせた。上記カラムを、280nmの吸収が画分をとおしてはじめの流分の<5になるまで水で洗浄し、300mL画分を集めた。上記カラムをその後1M酢酸アンモニウム、pH8.4で溶離し、4の300mL画分を集めた。全ての4の画分はモナチンを含み、及び微温水浴を伴うロト-エヴァポレーターを用いて105mLまで蒸発させた。容積が減少されるにつれて沈殿物が形成され、及び蒸発プロセスの過程にわたりろ過された。LC/MSによるカラム画分の分析は、トリプトファン及びモナチンの99がカラムに結合したことを示した。蒸発プロセスの間に形成された沈殿物は>97トリプトファン及び<2モナチンを含んだ。上清中のトリプトファン:生成物の割合は約2:1であった。上記上清7mlを、事前に0.5L1MNaOH、0.2L水、1.0Lの1.0M酢酸アンモニウム、pH8.0、及び0.5L水で洗浄することにより酢酸形に変換された100mLFastFlowDEAESepharoseAmershamBiosciencesカラムにのせた。上記上清を<2mL/分でロードし、及び上記カラムを280nmの吸収が~0になるまで3~4mL/分で水で洗浄した。モナチンは100mM酢酸アンモニウム、pH8.0で溶離し、4の100mL画分を集めた。上記画分の分析は、画分をとおした流分中のトリプトファン:モナチンの割合は85:15であり、及び溶離画分中の割合は7:93であることを示した。モナチンの280nmでの吸光係数がトリプトファンと同じであると仮定すると、溶離画分は0.146mmoleの生成物を含んだ。1L反応全体についての推定は、68の回復について、~2.4mmoles~710mgのモナチンを生成するであろう。DEAE-Sepharoseカラムからの溶離画分を<20mLまで蒸発させた。上記生成物の等分をさらに分析-スケールモナチン特徴付けについて実施例10中に示されるものと同じクロマトグラフィー条件を用いてC8調製済み逆相カラムへの適用により精製した。WatersFractionlynx商標ソフトウェアをm/z=293イオンの検出に基づいてモナチンの自動化された画分回収を引き起こすために使用した。モナチンに対応するプロトン化分子イオンを有するC8カラムからの画分を集め、乾燥するまで蒸発させ、及びその後少量の水中に溶解した。この画分を生成物の特徴付けのために使用した。生ずる生成物を以下の方法を用いて特徴付けた。UV/可視スペクトロスコピー酵素的に生成されたモナチンのUV/可視スペクトロスコピーの計測はCary100BioUV/可視スペクトロフォトメーターを用いて行われた。水中に溶解された精製生成物は、インドール含有化合物に典型的な特徴である、288nmのショルダーを伴う280nmの吸収最大値を示した。LC/MS分析invitro生化学反応に由来するモナチンについての混合物の分析を実施例10中に示されるように行った。invitro酵素的合成的混合物におけるモナチンの典型的なLC/MS分析は図5中に例示される。図5の下のパネルはm/z=293のモナチンのプロトン化分子イオンについての選択されたイオンクロマトグラムを例示する。混合物中におけるモナチンのこの同定は図6中に例示されるマススペクトルにより確証された。LC/MSによる精製生成物の分析は293の分子イオン及び280nmの吸収を有する単一のピークを示した。上記マススペクトルは図6中に示されるものと同一であった。MS/MS分析実施例10中に示されるように、LC/MS/MS娘イオン実験をまたモナチンについて行った。モナチンの娘イオンマススペクトルは図7中に例示される。図7中に標識化される全ての断片イオンの仮の構造割当てがなされた。これらはm/z=275293-H2O、257293-2×H2O、230275-COOH、212257-COOH、1683-ブタ-1,3-ヂエニル-1H-インドールカルボニウムイオン、1581H-インドール-3-カルボアルデヒドカルボニウムイオン、1443-エチル-1H-インドールカルボニウムイオン、1303-メチレン-1H-インドールカルボニウムイオン、及び118インドールカルボニウムイオンの断片イオンを含む。上記分子のインドール部分に由来する場合に予想されるように、これらの多くはMPについて得られるものと同じである実施例4。いくつかは、ケトンの代わりのアミノ基の存在のために、MPについて見られるものより1マス単位高い。高分解MS分析図8はAppliedBiosystems-PerkinElmerQ-Starhybridquadrupole/time-of-flightマススペクトロメーターを使用して精製モナチンについて得られたマススペクトルを例示する。トリプトファンを内部マス較正標準として用いたプロトン化モナチンについての計測されたマスは293.1144であった。本質的な組成であるC14H17N2O5に基づいた、プロトン化モナチンの計算されたマスは293.1137である。これは100万ppm当たり2部分未満のマス計測誤差であり、酵素的に生成されたモナチンの本質的な組成の確証を提供する。NMRスペクトロスコピーNMR実験をVarianInova500MHz器械上で行った。モナチンのサンプル~3mgを0.5mlのD2O中に溶解した。はじめに、溶媒D2Oを4.78ppmで内部リファレンスとして使用した。水についてのピークが大きかったので、1H-NMRを水についてのピークの抑制で行った。続いて、水のピークの広さのために、モナチンのC-2プロトンをリファレンスピークとして使用し、及び7.192ppmの公表された値で設定した。13C-NMRについて、数百スキャンのはじめのランは、上記サンプルが分配された時間内に十分な13Cスペクトルを得るには薄すぎることを示した。それゆえ、ヘテロ核多量子結合HMQC実験を行い、それは水素及びそれらが結合する炭素の相互関係を可能にし、及びまた上記炭素の化学シフトについての情報を提供した。1H及びHMQCデータの要約は表2及び3中に見られる。公表された値との比較により、上記NMRデータは、酵素的に生成されたモナチンはS,S、R,R又は両方の混合物のいずれかであることを示した。キラルLC/MS分析invitroで生成されたモナチンが1の異性体であり、及びR,R及びS,Sエナンチオマーの混合物でないことを確立するために、キラルLC/MS分析を実施例10中に示される器械を用いて行った。キラルLC分離を室温でChirobioticTAdvancedSeparationsTechnologyキラルクロマトグラフィーカラムを用いて行った。業者からの公開されたプロトコルに基づいた、分離及び検出をトリプトファンのR-D及びS-L異性体について最適化した。上記LC移動相はA0.05v/vトリフルオロ酢酸を含む水;B0.05v/vトリフルオロ酢酸を含むメタノールから成った。溶離は70A及び30Bでイソクラティックであった。流速は1.0mL/分であり、及びPDA吸収を200nm~400nmまでモニターした。トリプトファン及びモナチンのキラルLC/MS分析について使用される器械パラメーターはLC/MS分析について実施例10中に示されるものと同一である。領域m/z150~400についてのマススペクトルの収集を利用した。プロトン化分子イオンについての選択されたイオンクロマトグラムR-及びS-トリプトファンの両方について[MH]=205及びモナチンについて[MH]=293は混合物中でのこれらの分析物の直接的な同定を許容した。キラルクロマトグラフィーにより分離される及びMSによりモニターされる、R-及びS-トリプトファン及びモナチンのクロマトグラムは図9中に示される。モナチンのクロマトグラムにおける単一のピークは、上記化合物が、S-トリプトファンとほとんど同一のリテンション時間を有する、1の異性体であることを示す。偏光分析光回旋をRudolphAutopolIII偏光計測器上で計測した。モナチンを水中の14.6mg/mL溶液として調製した。S,Sモナチン塩形についての予想された特異的回旋[α]D20は水中の1g/mL溶液について-49.6であるVleggaaretal。観察された[α]D20は精製された、酵素的に生成されたモナチンについて-28.1であり、そのことはそれがS,S異性体であることを示した。改善試薬及び酵素濃度を含む反応条件を最適化し、及び10mg/mLの収率が以下の試薬混合物を用いて作出された:50mM酢酸アンモニウムpH8.3、2mMMgCl2、200mMピルビン酸塩ナトリウム又はアンモニウム塩、5mMアルファ-ケトグルタル酸塩ナトリウム塩、0.05mMリン酸ピリドキサル、酵素の添加後1mLの最終容積を達成するための脱気水、3mMリン酸カリウム、50μg/mLの組換えProAアルドラーゼ細胞抽出物;167μg/mLの総タンパク質濃度、E.coliaspC遺伝子によりコードされる1000μg/mLのL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼ細胞抽出物;2500μg/mLの総タンパク質濃度、及び>60mMの濃度を得るための固体トリプトファン飽和;いくらかは反応をとおして溶解されないままである。上記混合物を穏やかに攪拌しながら又は混合しながら30°Cで4時間インキュベートした。置換アルファ-ケトグルタル酸塩の濃度は1mMまで減少され、及び9mMアスパラギン酸塩で補充され、モナチンの相当収率を与える。オキサロ酢酸塩の如き、代替のアミノ酸受容体は第一段階において利用されうる。組換えL.major広範囲基質アミノトランスフェラーゼがE.coliL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼの代わりに使用されたとき、同様のモナチン収率が達成された。しかしながら、292の分子量を有する第二の同定されていない生成物主要生成物の3~10もまたLC-MS分析により検出された。E.colityrBをコードする酵素、S.melilotitatAをコードする酵素又はブタ心臓からのグルタミン-オキサロ酢酸トランスアミナーゼIIa型がアミノトランスフェラーゼとして添加されたとき、0.1~0.5mg/mLのモナチン濃度が生成された。インドール-3-ピルビン酸塩から反応を出発するとき、還元的アミン化がグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ及びNADHで最終段階のためになされうる実施例7中のように。B.subtilis、E.coli、及びS.melilotiからのKHGアルドラーゼはまた酵素的にモナチンを生成するためにE.coliL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼと共に使用された。以下の反応条件が使用された:50mMNH4-OAcpH8.3、2mMMgCl2、200mMピルビン酸塩、5mMグルタミン酸塩、0.05mMリン酸ピリドキサル、酵素添加後に0.5mLの最終容積を達成するための脱気水、3mMリン酸カリウム、20μg/mLの組換えB.subtilisKHGアルドラーゼ精製済み、細胞抽出物から精製されていないca.400μg/mLのE.coliL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼAspC、及び12mMインドール-3-ピルビン酸塩。上記反応を振騰しながら30°Cで30分間インキュベートした。B.subtilis酵素を用いて生成されたモナチンの量は80ng/mLであり、及びアルドラーゼの増量と共に増大された。インドール-3-ピルビン酸塩及びグルタミン酸塩が飽和量のトリプトファン及び5mMアルファ-ケトグルタル酸塩により置換された場合、モナチンの生成は360ng/mLまで増大された。反応を50mMTrispH8.3中で、飽和量のトリプトファンを伴って、30μg/mLの3のKHG酵素のそれぞれで繰り返し、及び検出を増大させるために1時間進行させた。Bacillus酵素は実施例4中のように最も高い活性を有し、約4000ng/mLのモナチンを生成した。E.coliKHGは3000ng/mLのモナチンを生成し、及びS.meliloti酵素は2300ng/mLを生成した。実施例7MP及びモナチンの間の内部変換モナチンを形成するためのMPのアミン化は実施例1及び6中に同定されるものの如きアミノトランスフェラーゼにより又はNADH若しくはNADPHの如き還元共因子を必要とするデヒドロゲナーゼにより触媒されうる。これらの反応は可逆であり、及びいずれかの方向で計測されうる。デヒドロゲナーゼ酵素を用いるとき、方向性はアンモニウム塩の濃度により主に制御されうる。デヒドロゲナーゼ活性モナチンの酸化的脱アミン化を、NADPがより発色性のNADPHに変換されるときの340nmの吸収における増大を追うことによりモニターした。モナチンは実施例6中に示されるように酵素的に生成され、及び精製された。典型的な分析混合物は0.2mL中に50mMTris-HCl、pH8.0~8.9、0.33mMNAD又はNADP、2~22ユニットのグルタミン酸塩デヒドロゲナーゼSigma、及び10~15mM基質を含んだ。分析をMolecularDevicesSpectraMaxPlusプレートリーダー上で、UV-透明マイクロタイタープレート中で二重で行った。酵素、緩衝液、及びNADPの混合物を基質を含むウェル中に移し、及び340nmの吸収における増大を短い混合後10秒間隔でモニターした。上記反応を25°Cで10分間インキュベートした。ネガティブコントロールを基質の添加なしで行い、及びグルタミン酸塩をポジティブコントロールとして利用した。ウシ肝臓からのIII型グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼSigmaG-7882はグルタミン酸塩のアルファ-ケトグルタル酸塩への変換速度の約100分の1の変換速度でモナチンのモナチン前駆体への変換を触媒した。アミン転移活性モナチンアミノトランスフェラーゼ分析をE.coliからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼAspC、E.coliからのチロシンアミノトランスフェラーゼTyrB、L.majorからの広範囲基質アミノトランスフェラーゼBSAT、及び実施例1中に示される2の商業的に入手可能なブタグルタミン酸塩-オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼで行った。オキサロ酢酸塩及びアルファ-ケトグルタル酸塩の両方はアミノ受容体として試験された。分析混合物は0.5mL中に50mMTris-HCl、pH8.0、0.05mMPLP、5mMアミノ受容体、5mMモナチン、及び25μgのアミノトランスフェラーゼを含んだ。上記分析を30°Cで30分間インキュベートし、及び上記反応を0.5mLイソプロピルアルコールの添加により停止させた。モナチンの損失をLC/MSによりモニターした実施例10。最も高い量の活性はL.majorBSATでオキサロ酢酸塩をアミノ受容体とした場合、続いて同じ酵素でアルファ-ケトグルタル酸塩をアミノ受容体とした場合で見られた。オキサロ酢酸塩での比較活性は:BSAT>AspC>ブタIIa型>ブタI型=TyrBであった。アルファ-ケトグルタル酸塩での比較活性は:BSAT>AspC>ブタI型>ブタIIa型>TyrBであった。実施例8トリプトファン及びピルビン酸塩以外のC3源からのモナチン生成上記実施例6中に示されるように、インドール-3-ピルビン酸塩又はトリプトファンはピルビン酸塩をC3分子として用いてモナチンに変換されうる。しかしながら、いくつかの場合、ピルビン酸塩は好ましい生の材料ではない場合もある。例えば、ピルビン酸塩は他のC3炭素源よりもより高価でありうる又は培地に添加される場合、発酵に悪い影響を及ぼしうる。アラニンは多くのPLP-酵素によりアミン転移され、ピルビン酸塩を生成しうる。トリプトファナーゼのような酵素はアミノトランスフェラーゼの如き他のPLP酵素よりも速い速度でベータ-消去反応を行う。このクラスからの酵素4.1.99.-は、O-メチル-L-セリン、O-ベンジル-L-セリン、S-メチルシステイン、S-ベンジルシステイン、S-アルキル-L-システイン、O-アシル-L-セリン、3-クロロ-L-アラニンの如き、よい脱離基を有するL-セリン、L-システイン、及びセリン及びシステインの誘導体の如きアミノ酸からアンモニア及びピルビン酸塩を生成しうる。EC4.1.99.-ポリペプチドを用いてモナチンを生成するプロセスはMouratouetal.J.Biol.Chem.274:1320-5,1999の方法にしたがって、β-チロシナーゼTPL又はトリプトファナーゼを突然変異させることにより改善されうる。Mouratouetal.は、天然には起こると報告されていない、β-チロシナーゼをヂカルボキシルアミノ酸β-リアーゼに変換する能力を示す。特異性における変化はバリンV283をアルギニンRに及びアルギニンR100をスレオニンTに変換することにより達成された。これらのアミノ酸変化は、リアーゼがアスパラギン酸塩の如き加水分解脱アミン化反応のためのヂカルボキシルアミノ酸を受けることを可能にする。それゆえ、アスパラギン酸塩はまた、続くアルドール縮合反応のためのピルビン酸塩源として使用されうる。さらに、細胞又は酵素反応は乳酸塩及び乳酸塩をピルビン酸塩に変換する酵素で補充されうる。この反応を触媒することができる酵素の例は乳酸塩デヒドロゲナーゼ及び乳酸塩オキシダーゼを含む。ゲノムDNAの単離トリプトファナーゼポリペプチドは、例えば、Mouratouetal.JBC274:1320-5,1999中で以前に報告されている。トリプトファナーゼポリペプチドをコードする遺伝子を単離するために、E.coliDH10BからのゲノムDNAを実施例1中に示されるようにPCRのための鋳型として使用した。チロシン-フェノールリアーゼについての遺伝子をC.freundiiATCCカタログ番号8090、DesignationATCC13316;NCTC9750から単離し、及びNutrientagarDifco0001及びnutrientbrothDifco0003上で37°Cで2.0のODになるまで生育させた。ゲノムDNAをQiagenGenomic-tip商標100/Gキットを用いて精製した。コード配列のPCR増幅プライマーを上記実施例1中に示されるように、pET30Xa/LICベクターNovagen,Madison,WIについての融和性のオーバーハングと共に設計した。E.colitna配列ID番号:41。pET30Xa/LICクローニングのためのN-末端プライマー:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAAAACTTTAAACATCT-3’配列ID番号:43。pET30Xa/LICクローニングのためのC-末端プライマー:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACTTCTTTAAGTTTTG-3’配列ID番号:44。C.freundiitpl配列ID番号:42。pET30Xa/LICクローニングのためのN-末端プライマー:5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAATTATCCGGCAGAACC-3’配列ID番号:45。pET30Xa/LICクローニングのためのC-末端プライマー:5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3’配列ID番号:46。EppendorfMastercycler商標Gradient5331ThermalCyclerを全てのPCR反応のために使用した。50μL中に0.5μg鋳型ゲノムDNA、1.0μMのそれぞれのプライマー、0.4mMのそれぞれのdNTP、3.5UExpandHighFidelityPolymeraseRoche、Mgを伴う1×Expandbuffer、及び5DMSO最終濃度を添加した。使用されるサーモサイクラーPCRプログラムは以下のとおりである:96°C高温開始5分間、94°C-30秒間、40~60°C-1分45秒間、72°C-2分15秒間;30回繰返し。最終ポリメライゼーション段階は7分間であり、及び上記サンプルをその後4°Cで貯蔵した。クローニング上記実施例1中に詳述されるクローニング及びポジティブクローン同定手順を適切なクローンを同定するために使用した。遺伝子発現及び活性分析配列分析により実証されたプラスミドDNAを発現宿主BL21DE3Novagen内にサブクローニングした。培養物を30mg/Lのカナマイシンを含むLB培地中で生育させ、プラスミドをQiagenミニプレップキットを用いて単離し、及び同一性を確認するために制限酵素消化により分析した。誘導実験をBL21DE3発現宿主で行い、上記構築物を50mg/Lカナマイシンを含むLB培地中で37°Cで生育させた。タンパク質発現を、上記培養物のOD600が約0.6に達した後、0.1mMIPTGを用いて誘導した。上記細胞を30°Cで4時間生育させ、及び遠心分離により回収した。上記細胞をその後5μL/mLのプロテアーゼインヒビターカクテルセットIIICalbiochem及び1μL/mLベンゾナーゼヌクレアーゼNovagenを含む5mL/g細胞湿重量のBugBuster商標Novagen試薬中に溶解し、及びHis-タグを付けた組換えタンパク質を上記実施例1中に示されるようにHis-Bindカートリッヂを用いて精製した。精製タンパク質をPD-10G25Sephadex,AmershamBiosciencesカラム上で脱塩し、及び100mMTris-Cl緩衝液、pH8.0中に溶離した。上記タンパク質を組換え融合タンパク質の予想されるMWでの可溶性タンパク質の値についてチェックするために4~15勾配ゲル上でSDS-PAGEにより分析した。突然変異ポリペプチドクラス4.1.99.-トリプトファナーゼ及びβ-チロシナーゼのいくつかのメンバーは改変なしにアスパラギン酸塩又は同様のアミノ酸でベータ-リアーゼ反応を行うであろう。しかしながら、上記クラスのいくつかのメンバーは上記基質の使用及び/又は生成物の作出を許容するために変異される必要がありうる。さらに、いくつかの場合、変換を行いうるポリペプチドは突然変異によりさらに最適化されうる。位置特異的突然変異をPLP-結合ポリペプチドの3D構造分析に基づいて行った。ポリペプチドの基質特異性を変化させる2の例は以下に示される。トリプトファナーゼの突然変異実施例1以下に提供される突然変異プロトコルはアミノ酸配列中に2のポイント突然変異を導入した。第一のポイント突然変異は103位のアルギニンRをスレオニンTに変え、及び第二のポイント突然変異は299位のバリンVをアルギニンRに変えたE.coli成熟タンパク質についての番号システム。突然変異実験をATGLaboratoriesEdenPrairie,MNにより行った。突然変異を遺伝子断片のPCRにより連続して導入し、及び断片の再配列もPCRにより達成された。アルギニンR103をスレオニンTに変換するためのプライマー:5’-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3’配列ID番号:47及び5’-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3’配列ID番号:48。バリンV299をアルギニンRに変換するためのプライマー:5’-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3’配列ID番号:49及び5’-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3’配列ID番号:50。突然変異をXbaI/HindIII及びSphIでの制限酵素消化によりスクリーニングし、及びシークエンシングにより実証した。チロシンフェノールリアーゼβ-チロシナーゼの突然変異実施例22のポイント突然変異をチロシンフェノールリアーゼアミノ酸配列に行った。これらの突然変異は100位のアルギニンRをスレオニンTに及び283位のバリンVをアルギニンRに変換したC.freundii成熟タンパク質配列において。R100T変換のためのプライマーは:5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’配列ID番号:51及び5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’配列ID番号:52であった。V283R変換のためのプライマーは:5’-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3’配列ID番号:53及び5’-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3’配列ID番号:54であった。上記に示される方法を使用し、及び上記クローンをKpnI/SacI消化、及びBstXI消化によりスクリーニングした。上記配列をヂデオキシ鎖停止シークエンシングにより実証した。組換えタンパク質を野生型酵素について上記に示されるように作出した。上記反応混合物は50mMTris-ClpH8.3、2mMMgCl2、200mMC3炭素源、5mMアルファ-ケトグルタル酸ナトリウム塩、0.05mMリン酸ピリドキサル、酵素添加後に0.5mLの最終容積を達成するための脱気水、3mMリン酸カリウムpH7.5、実施例4中のように調製される25μgの粗い組換えC.testosteroniProAアルドラーゼ、実施例1中で調製される500μgの粗いL-アスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼAspC、及び>60mMの濃度を得るための固体トリプトファン飽和;いくらかは反応をとおして溶解されないままであったから成った。上記反応混合物を混合しながら30°Cで30分間インキュベートした。セリン、アラニン、及びアスパラギン酸塩は3-炭素源として補充された。分析をベータ-消去及びベータ-リアーゼ反応を行うことができる精製された第二のPLP酵素トリプトファナーゼTNA、二重突然変異トリプトファナーゼ、β-チロシナーゼTPLあり及びなしで行った。結果は表4中に示される:3-炭素源としてアラニン及びセリンから生成されるモナチンはLC/MS/MS娘スキャン分析により実証され、及び実施例6中で生成される特徴付けられたモナチンと同一であった。アラニンは試験された最もよい代替物であり、及びAspC酵素によりアミノ転移された。生成されたモナチンの量は、第二の活性としてアミノ転移をすることができる、トリプトファナーゼの添加により増大された。炭素源としてセリンで生成されたモナチンの量は、アミノトランスフェラーゼに比較して5分の1量のトリプトファナーゼが添加されただけであるが、トリプトファナーゼ酵素の添加により2倍近くになった。AspCはある量のベータ-消去活性のみをすることができる。アスパラギン酸塩での結果は、アスパラギン酸塩に対するトリプトファナーゼ活性はβ-チロシナーゼについて以前に示唆されたのと同じ位置特異的突然変異で増大しないことを示す。突然変異体β-チロシナーゼはモナチンの生成についてより高い活性を有するであろうことが期待される。実施例9モナチンの化学合成インドール-3-ピルビン酸へのアラニンの添加はモナチンを生成し、及びこの反応はGrignard又は有機リチウム試薬で合成的に行われうる。例えば、カルボキシル及びアミノ基で適切にブロックされた3-クロロ-又は3-ブロモ-アラニンに無水条件下でマグネシウムを添加する。適切にブロックされたインドール-3-ピルビン酸塩がその後添加され、連結した生成物を形成し、続いて保護基が除去され、モナチンを形成する。特に有用な保護基は、容易に結合され及び除去されるTHPテトラヒドロピラニルエーテルを含む。実施例10モナチン及びMPの検出この実施例はモナチン又はその前駆体2-ヒドロキシ2-インドール-3-イルメチル-4-ケトグルタル酸の存在を検出するために使用される方法を示す。LC/MS分析invitro又はinvivo生化学反応に由来するモナチンのアルファ-ケト酸形モナチン前駆体、MP及びモナチンについての混合物の分析をクロマトグラフ及びMicromassQuattroUltimatriplequadrupoleマススペクトロメーターの間に直列に置かれたWaters996Photo-DiodeArrayPDA吸収モニターを有するWaters2690液体クトマトグラフを含む、Waters/Micromass液体クロマトグラフィー-タンデムマススペクトロメトリーLC/MS/MS器械を用いて行った。LC分離をSupelcoDiscoveryC18逆相クロマトグラフィーカラム、2.1mm×150mm又はXterraMSC8逆相クロマトグラフィーカラム、2.1mm×250mmを用いて室温で行った。LC移動相はA0.05v/vトリフルオロ酢酸を含む水及びB0.05v/vトリフルオロ酢酸を含むメタノールから成った。勾配溶離は5B~35B直線で0~9分、35B~90B直線で9~16分、90Bイソクラティックで16~20分、90B~5B直線で20~22分であり、ランの間に10分間の再平衡化時間を有した。上記流速は0.25mL/分であり、及びPDA吸収を200nm~400nmでモニターした。ESI-MSの全てのパラメーターは問題の分析物のプロトン化分子イオン[MH]の生成、及び特徴的な断片イオンの生成に基づいて最適化され及び選択された。以下の器械パラメーターをモナチンのLC/MS分析に使用した:Capillary:3.5kV;Cone:40V;Hex1:20V;Aperture:0V;Hex2:0V;Sourcetemperature:100°C;Dessolvationtemperature:350°C;Desolvationgas:500L/h;Conegas:50L/h;LowmassresolutionQ1:15.0;HighmassresolutionQ1:15.0;Ionenergy:0.2;Entrance:50V;CollisionEnergy:2;Exit:50V;LowmassresolutionQ2:15;HighmassresolutionQ2:15;IonenergyQ2:3.5;Multiplier:650。報告されたマス/チャージ率m/z及び分子マスについての不確定性は±0.01である。混合物中におけるモナチンのアルファ-ケト酸形MP及びモナチンのはじめの検出は領域m/z150~400についてのマススペクトルの収集を伴うLC/MSモニタリングにより達成された。プロトン化分子イオンMPについて[MH]=292、モナチンについて[MH]=293についての選択されたイオンクロマトグラムは混合物中におけるこれらの分析物の直接の同定を許容した。MS/MS分析LC/MS/MS娘イオン実験を以下のようにモナチンについて行った。娘イオン分析は問題の親イオン例えば、モナチンについてm/z=293の第一のマスアナライザーQ1からマススペクトロメーターの衝突セルへの伝達に関し、衝突セルではアルゴンが導入され、及び上記親を断片娘イオンに化学的に分離する。これらの断片イオンはその後第二のマスアナライザーQ2で検出され、及び上記親の構造割当てを確証するために使用されうる。以下の器械パラメーターをモナチンのLC/MS/MS分析に使用した:Capillary:3.5kV;Cone:40V;Hex1:20V;Aperture:0V;Hex2:0V;Sourcetemperature:100°C;Desolvationtemperature:350°C;Desolvationgas:500L/h;Conegas:50L/h;LowmassresolutionQ1:13.0;HighmassresolutionQ1:13.0;Ionenergy:0.2;Entrance:-5V;CollisionEnergy:14;Exit:1V;LowmassresolutionQ2:15;HighmassresolutionQ2:15;IonenergyQ2:3.5;Multiplier:650。モナチンのハイスループット決定invitro又はinvivo反応に由来するモナチンについての混合物のハイスループット分析<5分/サンプルを上記に示される器械、及びLC/MS/MSについて示される同じパラメーターを用いて行った。LC分離を0.3mL/分の流速で15水性MeOH、0.25酢酸中でイソクラティック溶離で室温でWatersXterraMSC82.1mm×50mmクロマトグラフィーを用いて行った。混合物中のモナチンの検出は選択反応モニタリングSRM-タンデムマススペクトロメトリーを用いて達成された。これはモナチンの検出のための感受性、選択性、及びスループットを最大限にするために、特定の衝突で誘導された親イオン[MH]=293.1の娘イオン例えば、m/z=168.1の断片イオン、3-ブタ-1,3-ヂエニル-1H-インドールカルボニウムイオンとして試しに割当てられた移行をモニタリングすることに関する。PDA吸収データをモナチン同一性のさらなる実証のために並行して集めた。実施例11細菌におけるモナチンの生成この実施例はE.coli細胞においてモナチンを生成するために使用される方法を示す。当業者は、同様の方法が他の細菌細胞においてモナチンを生成するために使用されうることを理解するであろう。さらに、モナチン合成経路図2における他の遺伝子を含むベクターが使用されうる。E.coli細胞における増大したトリプトファン生成のために使用されている最小限培地である、Trp-1グルコース培地Zemanetal.FoliaMicrobiol.35:200-4,1990を以下のように調製した。700mLのナノ単位で純粋な水に、以下の試薬を添加した:2gNH42SO4、13.6gKH2PO4、0.2gMgSO47H2O、0.01gCaCl22H2O、及び0.5mgFeSO47H2O。上記pHを7.0に調節し、容積を850mLに増大させ、及び培地をオートクレーブした。50グルコース溶液を別々に調製し、及びろ過滅菌した。40mLを基礎培地850mLに添加し、1L最終容積にした。10g/LのL-トリプトファン溶液を0.1Mリン酸ナトリウムpH7中に調製し、及びろ過滅菌した。10分の1の容積を以下に特定されるように典型的に培養物に添加した。10ピルビン酸ナトリウム溶液をまた調製し、及びろ過滅菌した。培養物リットル当たり10mL等分を典型的に使用した。アンピシリン100mg/mL、カナマイシン25mg/mL及びIPTG840mMのストックを調製し、ろ過滅菌し、及び使用するまで-20°Cで保存した。Tween20ポリオキシエチレン20-ソルビタン一ラウリン酸塩を0.2vol/vol最終濃度で利用した。アンピシリンを非致死濃度、典型的に1~10μg/mL最終濃度で使用した。実施例4中に示されるE.coliBL21DE3::C.testosteroniproA/pET30Xa/LICの新しいプレートを50μg/mLカナマイシンを含むLB培地上に調製した。一晩の培養物5mLを単一のコロニーから接種し、及びカナマイシンを含むLB培地中で30°Cで生育させた。典型的に、1~50の接種をtrp-1グルコース培地における誘導に使用した。新鮮な抗生物質を50mg/Lの最終濃度まで添加した。振騰フラスコを誘導前に37°Cで生育させた。細胞を、0.35~0.8のOD600が得られるまで1時間毎にサンプリングした。細胞をその後0.1mMIPTGで誘導し、及び上記温度を34°Cまで減少させた。サンプル1mlを誘導前に回収し0時点、及び5000×gで遠心分離した。上清をLC/MS分析のために-20°Cで凍結した。誘導4時間後、他の1mlサンプルを回収し、及び遠心分離して細胞ペレットから培養液を分離した。トリプトファン、ピルビン酸ナトリウム、アンピシリン、及びTweenを上記に示されるように添加した。上記細胞を誘導後48時間生育させ、及び他の1mlサンプルを取り、及び上記のように調製した。48時間目に、トリプトファン及びピルビン酸塩の他の等分を添加した。培養容積全体を約70時間の生育誘導後の後、4°C及び3500rpmで20分間遠心分離した。上清を注ぎ、及び培養液及び細胞の両方を-80°Cで凍結した。培養液画分をろ過し、及びLC/MSにより分析した。[MH]=293ピークの高さ及び領域を実施例10に示されるようにモニターした。培地のバックグラウンド値を差し引いた。またデータを600nmでの培養物の光学濃度で割った[MH]=293ピークの高さをプロットすることにより細胞の成長について正規化した。ピルビン酸塩、アンピシリン、及びTweenが誘導時ではなく、誘導4時間後に添加されたとき、より高い値のモナチンが生成された。PLP、追加のリン酸又は追加のMgCl2の如き他の添加物はモナチンの生成を増大させなかった。トリプトファンがインドール-3-ピルビン酸塩の代わりに利用されたとき、及びトリプトファンが接種時又は誘導時ではなく誘導後に添加されたとき、より高いタイターのモナチンが得られた。誘導前、及び誘導4時間後基質添加時、典型的に発酵培養液又は細胞抽出物中に検出可能な値のモナチンはなかった。ネガティブコントロールをpET30aベクターのみを有する細胞、並びにトリプトファン及びピルビン酸塩を添加されない培養物を利用して行った。親MSスキャンは、m1/z=293を有する化合物はより大きな分子に由来しないことを示し、及び娘スキャン実施例10中のように行われたはinvitroで作出されたモナチンと同様であった。Tween商標の効果を0、0.2vol/vol、及び0.6最終濃度のTween-20を利用することにより研究した。振騰フラスコにより生成された最も高い量のモナチンは0.2Tweenでのものであった。アンピシリン濃度を0~10μg/mLの間で変化させた。細胞培養液中のモナチンの量は0~1μg/mLの間で急激に2.5×増大し、及びアンピシリン濃度が1~10μg/mLに増大されたとき1.3×に増大した。典型的な結果を示すタイムコース実験は図10中に示される。値を細胞成長について正規化したときでさえ、細胞培養液中に分泌されたモナチンの量は増大した。トリプトファンのモル吸光係数を用いることにより、培養液中のモナチンの量は10μg/mL未満であると見積もられた。同じ実験をproA挿入物を有しないベクターを含む細胞で繰り返した。多くがネガティブであり、m/z=293のピーク高さは培地のみにおけるよりもこれらの培養物において少ないことを示した図10。数は、トリプトファン及びピルビン酸塩がないとき一貫して低く、モナチン生成はアルドラーゼ酵素により触媒される酵素反応の結果であることを示した。細菌細胞におけるモナチンのinvivo生成を800mL振騰フラスコ実験中で及び発酵器内で繰り返した。モナチンの250mLサンプル細胞なし培養液中を陰イオン交換クロマトグラフィー及び調製済み逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。このサンプルを蒸発させ、及び高分解マス分析にかけた実施例6中に示される。高分解MSは、生成された代謝物はモナチンであることを示した。invitro分析は、アミノトランスフェラーゼはアルドラーゼよりも高い値で存在することが必要であることを示し実施例6を参照のこと、それゆえ、E.coliからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼは生成されるモナチンの量を増大させるためにアルドラーゼ遺伝子と共に過剰発現された。プライマーは以下のように、aspC/pET30Xa/LICを有するオペロン内にC.testosteroniproAを導入するよう設計された:5’プライマー:ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT配列ID番号:67及び3’プライマー:CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC配列ID番号:68。クローニングのために、上記5’プライマーはBamHIサイトを含み、上記3’プライマーはSalIサイトを含む。PCRを実施例4中に示されるように行い、及びゲルを精製した。aspC/pET30Xa/LIC構築物をBamHI及びSalIで消化し、PCR産物も同様にした。消化物をQiagenスピンカラムを用いて精製した。proAPCR産物を製造業者の教示にしたがってRocheRapidDNALigationkitindianapolis,INを用いてベクターにつなげた。化学形質転換を実施例1中に示されるようにNovabluesSinglesNovagenを用いて行った。コロニーを50mg/Lカナマイシンを含むLB培地中で生育させ、及びプラスミドDNAをQiagenスピンミニプレップキットを用いて精製した。クローンを制限酵素消化分析によりスクリーニングし、及び配列をSeqwrightHouston,TXにより確認した。構築物をBLRDE3、BLRDE3pLysS、BL21DE3及びBL21DE3pLysSNovagen内にサブクローニングした。上記proA/pET30Xa/LIC構築物をまたBL21DE3pLysS内に導入した。上記に示される標準条件下のBLRDE3振騰フラスコサンプルの初期の比較は、第二の遺伝子aspCの添加は生成されるモナチンの量を7倍改善することを示した。生育を促進するために、BL21DE3由来宿主株を使用した。proAクローン及び2の遺伝子オペロンクローンを上記のようにTrp-1培地中で誘導し、pLysS宿主は培地に添加されたクロラムフェニコール34mg/Lをも有した。振騰フラスコ実験を0.2Tween-20及び1mg/Lアンピシリンの添加あり及びなしで行った。培養液中のモナチンの量をinvitro生成された精製モナチンを標準として用いて計算した。SRM分析を実施例10中に示されるように行った。細胞を0、生育の4時間、24時間、48時間、72時間、及び96時間にサンプリングした。結果は培養液中に生成された最大量について表5中に示される。ほとんどの場合、2の遺伝子構築物はproA構築物のみよりも高い値を与えた。漏りやすい細胞エンベロープを有するはずであるpLysS株は、これらの株は典型的により遅い速度で生育したが、より高い値の分泌モナチンを有した。Tween及びアンピシリンの添加は有益であった。実施例12酵母におけるモナチン生成この実施例は真核細胞においてモナチンを生成するために使用される方法を示す。当業者は、同様の方法が問題のどんな細胞においてもモナチンを生成するために使用されうることを理解するであろう。さらに、他の遺伝子が、この例において示されるものに加えて又はその代わりに使用されうる例えば、図2中に挙げられるもの。pESCYeastEpitopeTaggingVectorSystemStratagene,LaJolla,CAをSaccharomycescerevisiae内にE.coliaspC及びC.testosteroniproA遺伝子をクローニングする及び発現するために使用した。pESCベクターは、2の区別できる多様クローニング部位を伴って、反対の鎖上にGAL1及びGAL10プロモーターの両方を含み、2の遺伝子の同時発現を許容する。pESC-Hisベクターはまた宿主YPH500におけるヒスチヂン栄養要求性の相補のためにHis3遺伝子を含む。GAL1及びGAL10プロモーターはグルコースにより抑制され、及びガラクトースにより誘導される;Kozak配列は酵母における最適発現のために利用される。上記pESCプラスミドはシャトルベクターであり、はじめの構築物が選択のためにbla遺伝子を有するE.coli内で作出されることを許容する;しかしながら、菌のリボソーム結合部位は多様クローニング部位に存在しない。以下のプライマーをpESC-His内へのクローニングのために設計した制限部位は下線を引かれ、Kozak配列は太字である:aspCBamHI/SalI,GAL1:5’-両方の成熟タンパク質についての第二のコドンをKozak配列の導入のために芳香族アミノ酸からバリンに変化した。問題の遺伝子を、鋳型として実施例1及び実施例4中に示されるクローンからのpET30Xa/LICミニプレップDNAを用いて増幅した。PCRをEppendorfMasterサイクラー勾配サーモサイクラー及び50μL反応についての以下のプロトコルを用いて行った:1.0μL鋳型、1.0μMのそれぞれのプライマー、0.4mMのそれぞれのdNTP、3.5UExpandHighFidelityPolymeraseRoche,Indianapolis,IN、及びMgを含む1×Expand商標緩衝液。使用されたサーモサイクラープログラムは94°Cで5分間の高温開始、続いて以下の段階:94°Cで30秒間、50°Cで1分45秒間、及び72°Cで2分15秒間の29の繰返しから成った。29の繰返しの後、上記サンプルを72°Cで10分間維持し、及びその後4°Cで保存した。上記PCR産物を1TAE-アガロースゲル上での分離により精製し、続いてQIAquickGelExtractionKitQiagen,Valencia,CAを用いて回復させた。pESC-HisベクターDNA2.7μgをBamHI/SalIで消化し、及び上記のようにゲル精製した。aspCPCR産物をBamHI/SalIで消化し、及びQIAquickPCRPurificationColumnで精製した。ライゲーションを製造業者のプロトコルにしたがってRocheRapidDNALigationKitで行った。脱塩されたライゲーションを製造業者の教示にしたがって、パルスコントローラープラスを有するBioradGenePulserIIを用いて0.2cmBioraddisposableキュベット中の40μlのElectromaxDH10Bコンピテント細胞Invitrogen内にエレクトロポーレーションした。1mLのSOC培地中での1時間の回復後、形質転換体を100μg/mLアンピシリンを含むLB培地上にまいた。クローンについてのプラスミドDNA調製をQIAprepSpinMiniprepKitを用いて行った。プラスミドDNAを制限酵素消化によりスクリーニングし、及び上記ベクターについて設計されたプライマーを用いて実証のためにシークエンスしたSeqwright。aspC/pESC-HisクローンをEcoRI及びNotIで消化し、proAPCR産物も同様にした。DNAを上記のように精製し、及び上記のようにライゲーションした。上記2の遺伝子構築物をDH10B細胞内へ導入し、及び制限酵素消化及びDNAシークエンシングによりスクリーニングした。上記構築物をS.c.EasyComp商標TransformationKitInvitrogenを用いてS.cerevisiae株YPH500内に導入した。形質転換反応を2グルコースを含むSC-His最小限培地InvitrogenpYES2マニュアル上にまいた。個々の酵母コロニーを上記のPCRプライマーを用いてコロニーPCRによりproA及びaspC遺伝子の存在についてスクリーニングした。ペレット化した細胞2μlを1μlのチモラーゼを含む20μLのY-LysisBufferZymoResearch中に懸濁し、及び37°Cで10分間熱した。4μLのこの懸濁物をその後上記に示されるPCR反応混合物及びプログラムを用いて50μLPCR反応中に使用した。5mL培養物をSC-Hisグルコース上で30°C及び225rpmで一晩生育させた。上記細胞をガラクトースでの誘導前に遅延時間を最小限にするためにラフィノース上での生育に徐々に順応させた。約12時間の生育後、600nmでの吸収計測を取り、及び適切な容量の細胞をスピンダウンし、及び新しいSC-His培地中に0.4のODを与えるよう再懸濁した。以下の炭素源を連続して使用した:1ラフィノース1グルコース、0.5グルコース1.5ラフィノース、2ラフィノース、及び最後に誘導のために1ラフィノース2ガラクトース。誘導培地中での約16時間の生育後、50mL培養物を2の25mL培養物に分け、及び以下のものを2のうちの1にのみ添加した:最終濃度1g/LL-トリプトファン、5mMリン酸ナトリウムpH7.1、1g/Lピルビン酸ナトリウム、1mMMgCl2。非誘導培地からの、及びモナチン経路のための基質の添加前16時間培養物からの培養液及び細胞ペレットのサンプルをネガティブコントロールとして保存した。さらに、機能的なaspC遺伝子及び切りつめられたproA遺伝子のみを含む構築物を他のネガティブコントロールとして利用した。上記細胞を全部で誘導後69時間生育させた。臨時に、上記酵母細胞をより低いODで誘導し、及びトリプトファン及びピルビン酸塩の添加前に4時間のみ生育させた。しかしながら、これらのモナチン基質は生育を阻害するように見え、及びより高いODでの添加がより効果的であった。培養物からの細胞ペレットを、以前の実施例中に示されるようにプロテアーゼ阻害剤及びベンゾナーゼヌクレアーゼの添加を伴って、製造業者のプロトコルにしたがって細胞のグラム湿重量当たり5mLのYeastBuster商標50μlTHPNovagenで溶解した。上記培養液及び細胞抽出物をろ過し、及び実施例10中に示されるようにSRMにより分析した。この方法を用いて、モナチンは培養液サンプル中に検出されず、このことは、上記細胞はこれらの条件下でモナチンを分泌することができないことを示した。プロトン動力がこれらの条件下で不十分でありうる又は一般的なアミノ酸輸送体がトリプトファンで飽和されうる。タンパク質発現はSDS-PAGEを用いて変化の検出ができる値ではなかった。トリプトファン及びピルビン酸塩が培地に添加されたとき、モナチンは2の機能的な遺伝子を有する培養物の細胞抽出物において一過的に検出可能であった約60μg/mL。モナチンはネガティブコントロール細胞抽出物のいずれにおいても検出されなかった。モナチンについてのinvitro分析を実施例6中に示される最適化された分析を用いて4.4mg/mLの総タンパク質典型的にE.coli細胞抽出物について使用されるものの約2倍で二重で行った。他の分析を、いずれの酵素が細胞抽出物中で制限されているかを決定するために、32μg/mLC.testosteroniProAアルドラーゼ又は400μg/mLAspCアミノトランスフェラーゼのいずれかの添加を伴って行った。ネガティブコントロールを酵素の添加なし又はAspCアミノトランスフェラーゼのみの添加で行ったアルドール縮合が酵素なしである程度まで起こりうる。ポジティブコントロールを16μg/mLアルドラーゼ及び400μg/mLアミノトランスフェラーゼを用いて、部分的に純粋な酵素30~40で行った。invitro結果をSRMにより分析した。細胞抽出物の分析は、トリプトファンが、それが誘導後に培地へ添加されたとき、細胞内へ効果的に輸送され、追加のトリプトファンが添加されなかったものより2次数高い大きさのトリプトファン値をもたらしたことを示した。invitroモナチン分析についての結果は表6中に示される数字はng/mLを示す。生育培地に添加された基質あり及びなしの全長2遺伝子構築物細胞抽出物で陽性結果が得られた。これらの結果は、ポジティブコントロールに比較して、上記酵素は酵母中の総タンパク質の1に近い値で発現されたことを示す。切つめられたproAを有するaspC構築物の細胞抽出物がアルドラーゼと共に分析されたとき、生成されたモナチンの量は、細胞抽出物が単独で分析されたときより顕著に高く、及び組換えAspCアミノトランスフェラーゼは酵母総タンパク質の約1~2を含むことを示す。誘導されていない培養物の細胞抽出物は、細胞内の天然アミノトランスフェラーゼの存在のために、アルドラーゼと共に分析されたとき少量の活性を有した。AspCアミノトランスフェラーゼと共に分析されたとき、誘導されていない細胞からの抽出物の活性はAspCを有するネガティブコントロールにより生成されたモナチンの量まで増大したca.200ng/ml。対照的に、2遺伝子構築物細胞抽出物を分析したとき観察された活性は、アルドラーゼが添加されたときよりアミノトランスフェラーゼが補充されたとき増大した。両方の遺伝子が同じ値で発現されるべきであるので、このことは、実施例6中に示される結果と一致して、生成されたモナチンの量はアミノトランスフェラーゼの値がアルドラーゼのそれよりも高いとき最高に達することを示す。ピルビン酸塩及びトリプトファンの添加は細胞の成長を阻害するのみでなく、明らかにタンパク質発現をも阻害する。pESC-Trpプラスミドの添加はYPH500宿主細胞のトリプトファン栄養要求性について補正するために使用されることができ、成長、発現、及び分泌へのより少ない影響でトリプトファンを補充する方法を提供する。実施例13カップリングした反応を用いた酵素プロセスの改善理論的には、副反応又は基質若しくは中間体の分解が起こらない場合、図1中に例示される酵素反応から形成される生成物の最大量はそれぞれの反応の平衡定数、及びトリプトファン及びピルビン酸塩の濃度に直接的に比例する。トリプトファンは高く可溶性の基質ではなく、200mM超のピルビン酸塩の濃度は収率に悪い影響を及ぼすように見える実施例6を参照のこと。理想的には、モナチンの濃度は分離のコストを下げるために、基質について最大化される。逆反応が起こることを避けて、物理的な分離が、モナチンが反応混合物から除去されるように行われうる。生の材料及び触媒はその後再生されうる。いくつかの試薬及び中間体に対する大きさ、チャージ、及び疎水性におけるモナチンの類似性のために、物理的分離は、アフィニティクロマトグラフィー技術の如きモナチンについての高い量のアフィニティがない限り、困難であろう。しかしながら、モナチン反応は、系の平衡がモナチン生成に向かうようシフトするように他の反応にカップリングされうる。以下のものはトリプトファン又はインドール-3-ピルビン酸塩から得られるモナチンの収率を改善するためのプロセスの例である。オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼEC4.1.1.3を用いたカップリング反応図11は反応の例示である。トリプトファンオキシダーゼ及びカタラーゼはインドール-3-ピルビン酸塩生成の方向に反応を駆動するために利用される。カタラーゼは、過酸化水素が逆方向に反応するために又は酵素若しくは中間体を損傷するために利用できないように過剰に使用される。酸素はカタラーゼ反応の間に再生される。あるいは、インドール-3-ピルビン酸塩は基質として使用されうる。アスパラギン酸塩はMPのアミノ化のためのアミノ供与体として使用され、及びアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼが利用される。理想的には、アスパラギン酸塩がインドール-3-ピルビン酸塩を再アミノ化するために利用されないように、MP~モナチン反応に比較してトリプトファン/インドール-3-ピルビン酸塩反応について低い特異性を有するアミノトランスフェラーゼが使用される。Pseudomonassp.からのオキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼはオキサロ酢酸塩をピルビン酸塩及び二酸化炭素に変換するために添加されうる。CO2は揮発性であるので、それは酵素での反応のために利用可能ではなく、逆反応を減少させ又は妨げさえもする。この段階において生成されるピルビン酸塩はまたアルドール縮合反応において利用されうる。他のデカルボキシラーゼ酵素が使用されることができ、及びホモログがActinobacillusactinomycetemcomitans、Aquifexaeolicus、Archaeoglobusfulgidus、Azotobactervinelandii、Bacteroidesfragilis、いくつかのBordetella種、Campylobacterjejuni、Chlorobiumtepidum、Chloroflexusaurantiacus、Enterococcusfaecalis、Fusobacteriumnucleatum、Klebsiellapneumoniae、Legionellapneumophila、MagnetococcusMC-1、Mannheimiahaemolytica、MethylobacillusflagellatusKT、PasteurellamultocidaPm70、Petrotogamiotherma、Porphyromonasgingivalis、いくつかのPseudomonas種、いくつかのPyrococcus種、Rhodococcus、いくつかのSalmonella種、いくつかのStreptococcus種、Thermochromatiumtepidum、Thermotogamaritima、Treponemapallidum、及びいくつかのVibrio種において存在することが知られる。トリプトファンアミノトランスフェラーゼ分析をE.coliからのアスパラギン酸塩アミノトランスフェラーゼAspC、E.coliからのチロシンアミノトランスフェラーゼTyrB、L.majorからの広範囲基質アミノトランスフェラーゼBSAT、及び実施例1中に示される2の商業的に入手可能なブタグルタミン酸塩オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼで行った。オキサロ酢酸塩及びアルファ-ケトグルタル酸塩の両方をアミノ受容体として試験した。モナチンを用いた活性実施例7対トリプトファンを用いた活性の比率を、いずれの酵素がモナチンアミノトランスフェラーゼ反応について最も高い特異性を有するかを決定するために比較した。これらの結果は、モナチン反応対トリプトファン反応についての最も高い特異性を有する酵素はブタII-A型グルタミン酸塩-オキサロ酢酸塩アミノトランスフェラーゼ、GOATSigmaG7005であることを示した。この特異性は、いずれのアミノ受容体が利用されるかとは独立であった。それゆえ、この酵素はオキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼとのカップリング反応において使用された。インドール-3-ピルビン酸塩から出発する典型的な反応は最終濃度50mMTris-ClpH7.3、6mMインドール-3-ピルビン酸塩、6mMピルビン酸ナトリウム、6mMアスパラギン酸塩、0.05mMPLP、3mMリン酸カリウム、3mMMgCl2、25μg/mLアミノトランスフェラーゼ、50μg/mLC.testosteroniProAアルドラーゼ、及び3Units/mLのデカルボキシラーゼSigmaO4878を含んだ。上記反応を26°Cで1時間進めた。いくつかの場合、デカルボキシラーゼは除かれ又はアスパラギン酸塩はアルファ-ケトグルタル酸塩で置換されたネガティブコントロールとして。上記に示されるアミノトランスフェラーゼ酵素をまた初期の特異性実験を確認するためにGOATの代わりに試験した。サンプルをろ過し及び実施例10中に示されるようにLC/MSにより分析した。上記結果は、GOAT酵素はタンパク質mg当たり最も高い量のモナチンを生成し、副生成物として最も少ない量のトリプトファンを生成したことを示す。さらに、デカルボキシラーゼ酵素を添加したことから2~3倍の利点があった。E.coliAspC酵素はまた他のアミノトランスフェラーゼに比較して大量のモナチンを生成した。モナチン生成は:1インドール-ピルビン酸塩、ピルビン酸塩、及びアルパラギン酸塩の2mM添加30分毎~1時間毎を定期的に添加すること、2無気環境で又は脱気緩衝液で反応を行うこと、3反応を一晩進めること、及び4複数回凍結融解をされていない新たに調製したデカルボキシラーゼを用いることにより増大された。デカルボキシラーゼは12mM超のピルビン酸塩濃度により阻害された。4mM超のインドール-3-ピルビン酸塩濃度で、インドール-3-ピルビン酸塩での副反応が促進された。上記反応において使用されるインドール-3-ピルビン酸塩の量は、アルドラーゼの量がまた増大された場合、増大されうる。高い値のリン酸塩50mM及びアルパラギン酸塩50mMはデカルボキシラーゼ酵素に対して阻害的であることがわかった。添加されるデカルボキシラーゼ酵素の量は1時間反応におけるモナチン生成において減少なしに、0.5U/mLまで減少されうる。生成されるモナチンの量は、温度が26°Cから30°Cに及び30°Cから37°Cに増大されたとき、増大した;しかしながら、37°Cでは、インドール-3-ピルビン酸塩の副反応もまた促進された。生成されるモナチンの量はpHを7から7.3に増大することで増大し、及びpH7.3~8.3で比較的安定であった。トリプトファンで出発する典型的な反応は最終濃度50mMTris-ClpH7.3、20mMトリプトファン、6mMアスパラギン酸塩、6mMピルビン酸ナトリウム、0.05mMPLP、3mMリン酸カリウム、3mMMgCl2、25μg/mLアミノトランスフェラーゼ、50μg/mLC.testosteroniProAアルドラーゼ、4Units/mLのデカルボキシラーゼ、5~200mU/mLL-アミノ酸オキシダーゼSigmaA-2805、168U/mLカタラーゼSigmaC-3515、及び0.008mgFADを含んだ。反応を30°Cで30分間行った。デカルボキシラーゼの添加で改善が観察された。50mU/mLのオキシダーゼが使用されたとき、最大量のモナチンが生成された。改善は、インドール-3-ピルビン酸塩が基質として使用されたときに見られたものと同様であった。さらに、生成されたモナチンの量は1トリプトファン値が低かったすなわち、アミノトランスフェラーゼ酵素のKm未満、及びそれゆえ、活性部位においてMPと競合することができない、及び2オキシダーゼ対アルドラーゼ及びアミノトランスフェラーゼの比率が、インドール-3-ピルビン酸塩が蓄積できないような値に維持されたとき、増大した。インドール-3-ピルビン酸塩又はトリプトファンのいずれで出発しようと、1~2時間のインキュベーション時間での分析において生成されるモナチンの量は、同じ酵素比率を維持しながら2~4倍量の全ての酵素が使用されたとき、増大した。いずれかの基質を用いて、約1mg/mLのモナチンの濃度が達成された。インドール-ピルビン酸塩から出発した場合、生成されたトリプトファンの量は、典型的に生成物量の20未満であり、それはカップリング反応を利用することの利点を示す。中間体濃度及び副反応のさらなる最適化及び制御で、生産性及び収率は大いに改善されうる。リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼEC2.6.1.36を用いたカップリング反応リジンイプシロンアミノトランスフェラーゼL-リジン6-トランスアミナーゼは、Rhodococcus、Mycobacterium、Streptomyces、Nocardia、Flavobacterium、Candidautilis、及びStreptomycesを含むいくつかの生物において見られる。それはいくつかのベータ-ラクタム抗生物質の生成において第一段階として生物により利用されるRiusandDemain,J.Microbiol.Biotech.,7:95-100,1997。この酵素は、アルファ-ケトグルタル酸塩をアミノ受容体として利用して、リジンのC-6のPLP仲介アミノ転移により、リジンをL-2-アミノアヂピン酸塩6-セミアルデヒドアルリジンに変換する。アルリジンは不安定であり、及び自発的に分子内脱水を経験し、1-ピペリデイン6-カルボキシレート、環状分子を形成する。これは逆反応が起こることを効果的に阻害する。反応スキームは図12中に示される。代替の酵素、リジン-ピルビン酸塩6-トランスアミナーゼEC2.6.1.71もまた使用されうる。典型的な反応は1mL中に:50mMTris-HClpH7.3、20mMインドール-3-ピルビン酸塩、0.05mMPLP、6mMリン酸カリウムpH8、2~50mMピルビン酸ナトリウム、1.5mMMgCl2、50mMリジン、100μgアミノトランスフェラーゼリジンイプシロンアミノトランスフェラーゼLAT-101、BioCatalyticsPasadena,CA、及び200μgC.testosteroniProAアルドラーゼを含んだ。生成されたモナチンの量はピルビン酸塩濃度を増大することで増大した。これらの反応条件50mMピルビン酸塩でを用いた最大量は、オキサロ酢酸塩デカルボキシラーゼを用いたカップリング反応で観察されたものより10倍少なかった約0.1mg/mL。[MH]=293でのピークはモナチンについての予想された時間で溶離し、及びマススペクトルは他の酵素プロセスで観察されたものと同じいくつかの画分を含んだ。チャージ率293についての正しいマスでの第二のピークは実施例6中で生成されたS,Sモナチンについて典型的に観察されたものよりわずかに早く溶離し、及びモナチンの他の異性体の存在を示しうる。この酵素によりトリプトファンはほとんど生成されなかった。しかしながら、ピルビン酸塩についていくらかの活性が存在するようであるアラニンを副生成物として生成する。また、上記酵素は不安定であることが知られる。安定性を増大させる、ピルビン酸塩での活性を減少させる、及びMPでの活性を増大させるために、方向付けられた進化実験を行うことにより改善がなされうる。これらの反応はまた上記に示されるようにL-アミノ酸オキシダーゼ/カタラーゼにカップリングされうる。他のカップリング反応トリプトファン又はインドール-ピルビン酸塩からのモナチン収率を改善しうる他のカップリング反応は図13中に示される。蟻酸塩デヒドロゲナーゼEC1.2.1.2又は1.2.1.43は広く知られた酵素である。いくつかの蟻酸塩デヒドロゲナーゼはNADHを必要とし、一方、その他はNADPHを利用しうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼは以前の例において、アンモニウムを基礎とした緩衝液を用いて、モナチン前駆体及びモナチンの間の内部変換を触媒した。蟻酸アンモニウム及び蟻酸塩デヒドロゲナーゼの存在は共因子の再生のための効率のよい系であり、及び二酸化炭素の生成は逆反応の速度を減少させるための有効な方法であるBommariusetal.,Biocatalysis10:37,1994及びGalkinetal.Appl.Environ.Microbiol.63;4651-6,1997。さらに、大量の蟻酸アンモニウムが反応緩衝液中に溶解されうる。グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ反応又は同様の還元的アミノ化により生成されるモナチンの収率は蟻酸塩デヒドロゲナーゼ及び蟻酸アンモニウムの添加により改善されうる。他のプロセスはモナチン生成の方向に平衡を駆動するために使用されうる。例えば、アミノプロパンが米国特許第5,360,724号及び第5,300,437号により示されるものの如き、オメガ-アミノ酸アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.18でのMPからモナチンへの変換においてアミノ酸供与体として利用される場合、生ずる生成物の1は基質であるアミノプロパンよりも揮発性生成物である、アセトンでありうる。温度を、アセトンをすばやく消すために定期的に短時間上げ、それにより、平衡を緩和しうる。アセトンは47°Cの沸点を有し、その温度は短時間で使用される場合中間体を分解することはあまりない。アルファ-ケトグルタル酸塩について活性を有するほとんどのアミノトランスフェラーゼはまたモナチン前駆体について活性を有する。同様に、グリオキシル酸塩/芳香族酸アミノトランスフェラーゼEC2.6.1.60がアミノ供与体としてグリシンを伴って使用される場合、比較的不安定であり、及びグリシンに比較して非常に低い沸点を有するグリオキシル酸塩が生成される。実施例14組換え発現公に入手可能な酵素cDNA及びアミノ酸配列、及び配列ID番号:11及び12の如き、本明細書中に開示される酵素及び配列、並びにそれらの変形、多形、突然変異体、断片及び融合で、標準の研究室技術による、酵素の如きタンパク質の発現及び精製が可能である。当業者は、酵素及びその断片は問題のいかなる細胞又は生物においても組換えとして作出され、及び使用前に、例えば、配列ID番号:12及びその誘導体の生成前に精製されうることを理解するであろう。組換えタンパク質の生成方法は本分野で周知である。それゆえ、本開示の範囲は、酵素の如き、いかなるタンパク質又はその断片の組換え発現をも含む。例えば、Johnsonetal.の米国特許第5,342,764号;Pauschetal.の米国特許第5,846,819号;Fleeretal.の米国特許第5,876,969号及びSambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,Ch.17を参照のこと。簡単にいうと、タンパク質又はペプチドをコードする、部分的な、全長の又は変形cDNA配列は細菌又は真核生物発現ベクターの如き、発現ベクターにつなげられうる。タンパク質及び/又はペプチドはプロモーターを上記cDNA配列の上流に置くことにより生成されうる。プロモーターの例は、非限定的に、lac、trp、tac、trc、ファージラムダの主要なオペレーター及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、SV40の初期及び後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス及び類人猿のウイルス由来のプロモーター、3-フォスフォグリセレートキナーゼのプロモーター、酵母酸フォスファターゼのプロモーター、酵母アルファ-交配因子のプロモーター及びそれらの組み合わせを含む。無傷のネイティブタンパク質の生成に好適なベクターはpKC30ShimatakeandRosenberg,1981,Nature292:128、pKK177-3AmannandBrosius,1985,Gene40:183及びpET-3StudierandMoffatt,1986,J.Mol.Biol.189:113を含む。DNA配列は他のプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルス及び酵母人工染色体YACsの如き、他のクローニング媒体に移されうるBurkeetal.,1987,Science236:806-12。これらのベクターは、異種のcDNAの導入によりトランスジェニックにされる、体細胞及び、細菌、真菌TimberlakeandMarshall,1989,Science244:1313-7、無脊椎動物、植物GasserandFraley,1989,Science244:1293、及び哺乳類Purseletal.,1989,Science244:1281-8の如き単純な又は複雑な生物を含む、さまざまな宿主内へ導入されうる。哺乳類細胞における発現のために、cDNA配列はpSV2ベクター内プロモーターである、類人猿のウイルスSV40MulliganandBerg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072-6の如き、異種のプロモーターにつなげられ、及びサルCOS-1細胞Gluzman,1981,Cell23:175-82の如き、細胞内へ導入され、一過性の又は長期の発現を達成しうる。キメラ遺伝子構築物の安定な統合はネオマイシンSouthernandBerg,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:327-41及びマイコフェノール酸MulliganandBerg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072-6の如き生化学選択により哺乳類細胞において維持されうる。DNAのヒト又は他の哺乳類細胞の如き、真核生物内への移行は慣用の技術である。ベクターは、例えば、リン酸カルシウムGrahamandvanderEb,1973,Virology52:466、リン酸ストロンチウムBrashetal.,1987,Mol.CellBiol.7:2013での沈殿、エレクトロポーレーションNeumannetal.,1982,EMBOJ.1:841、リポフェクションFelgneretal.,1987,Proc.Natl.Acad.SciUSA84:7413、DEAEデキストランMcCuthanetal.,1968,J.Natl.CancerInst.41:351、マイクロインジェクションMuelleretal.,1987,Cell15:579、プロトプラスト融合Schafner,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2163-7又はペレットガンKleinetal.,1987,Nature327:70により、純粋なDNAとして受容細胞内に導入されるトランスフェクション。あるいは、上記cDNAは例えば、レトロウイルスBernsteinetal.,1985,Gen.Engrg.7:235、アデノウイルスAhmadetal.,1986,J.Virol.57:267又はヘルペスSpaeteetal.,1982,Cell30:295の如きウイルスベクターでの感染により導入されうる。我々の開示の原理が適用されうる多くの可能な態様の観点において、例示された態様は本開示の単なる特定の例であり、及び本開示の範囲についての限定として取られるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本開示の範囲は以下の請求項に一致する。我々はそれゆえ、我々の発明としてこれらの請求項の範囲及び本質の範囲内に入るもの全てを請求する。"