"生体適合性組織増加用組成物であって、当該組成物は架橋組換えゼラチン様蛋白質および架橋ヒアルロン酸を含み、組換えゼラチン様蛋白質はホモ三量体構造またはヘテロ三量体構造を有さず、組換えゼラチン様蛋白質とヒアルロン酸との質量比が60:40~5:95の範囲であり、インビボで、該組成物の分解時間が少なくとも1ヶ月である、上記生体適合性組織増加用組成物組換えゼラチン様蛋白質が、架橋前に少なくとも0.3ミリモル/gリシンおよび/またはヒドロキシリシン残基を含み、架橋後少なくとも0.15ミリモル/g遊離アミンを含む、請求項1に記載の組成物。組換えゼラチン様蛋白質がヒドロキシル化アミノ酸残基を含まない、請求項1または2に記載の組成物。組換えゼラチン様蛋白質が少なくとも1のRGDモチーフを含む、請求項1~3のいずれかに記載の組成物。組換えゼラチン様蛋白質対ヒアルロン酸の全質量比が少なくとも10:90である、請求項1~4のいずれかに記載の組成物。架橋組換えゼラチン様蛋白質画分が、ヒアルロン酸画分よりもインビボ分解時間が高い、請求項1~5のいずれかに記載の組成物。前記組成物が二相であり、一方相が架橋組換えゼラチン様蛋白質を含み、他相が架橋ヒアルロン酸を含む、請求項1~6のいずれかに記載の組成物。請求項1~7のいずれかに記載の組成物の製造法であって:aヒアルロン酸組成物を架橋してヒドロゲルを与えること;bゼラチンとゼラチン架橋剤とを含む溶液を得られたヒアルロン酸ヒドロゲルに加えること;cヒドロゲルとゼラチンおよびゼラチン架橋剤溶液とを混合すること;そしてd得られた混合物を架橋させ、二相ヒドロゲルを形成させることを含む前記方法。請求項1~7のいずれかに記載の組成物の皮膚充填剤としての使用。請求項1~7のいずれかに記載の組成物の限局性線維芽細胞誘引剤としての使用。請求項1~7のいずれかに記載の組成物の自己コラーゲン沈着を誘導するための使用。本発明の目的は、炎症やその他の望ましくない副作用のない充填作用の改良した寿命を与えることにより、現存製品の欠点を解消することにある。本発明は押出可能で生体適合性組織増加用組成物に関し、当該組成物は架橋組換えゼラチン様蛋白質および架橋ヒアルロン酸を含み、組換えゼラチン様蛋白質はホモ三量体構造またはヘテロ三量体構造を有さず、組換えゼラチン様蛋白質とヒアルロン酸との質量比が60:40~5:95の範囲であり、インビボで、組成物の分解時間が少なくとも1ヶ月である。一般的定義含むcomprisingという用語は、記載した部分、工程または成分の存在を特定すると解釈すべきであるが、一以上の追加の部分、工程または成分を排除しない。不定冠詞aやanにより要素への言及は、一つの若しくは一つのみの要素であることを明らかに要求する文脈でない限り、二以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞aやanは、通常、少なくとも一つを意味する。増加という用語は、本明細書中では、本発明の組成物を用いて組織を与える、供給する、増加する、または置き換えることにより、組織の損失または不存在により起因する少なくとも1種の症状、または欠陥の修復、減少、減退または軽減を意味するのに使用される。組織増加という用語は、本明細書中では、下記の皮膚組織増加;皺lines、folds、wrinkles、わずかな顔面くぼみ、口唇裂等の充填filling特に、顔面や首;老化または疾病による少しの奇形の矯正手、脚、指およびつま先を含む;会話のリハビリのための声帯声門の増殖;睡眠線sleeplinesおよび表情線expressionlinesの皮膚充填;老化による皮膚および皮下組織損失の置換;唇増加;目尻の皺および眼の周りの輪状溝orbitalgroove;胸部増加;顎増加;頬および鼻の増加;尿道周囲支持体periurethralsupportの増量剤、例えば、過剰吸引やその他の外傷による軟質組織、皮膚もしくは皮下組織のへこみの充填;アクネもしくは傷跡および外傷性皺の充填;鼻唇間線、鼻眉間線および口下線の充填等があるが、これらに限定されない。さらに、本発明は硬質組織増加にも向けることができる。硬質組織という用語は、骨、軟骨および靱帯を含むがこれらに限定されない。蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドという用語は、交換可能に使用され、アミノ酸類の鎖からなる分子に言及し、作用、サイズ、三次元構造や起源の特定のものへの言及ではない。本明細書中で使用するゼラチンおよびゼラチン様蛋白質という用語は、起源が、伝統的な方法による抽出または組み換えまたは生合成のいずれかのゼラチン、あるいはゼラチンの少なくとも一構造および/または機能的特性を有するいずれかの分子に言及する。この用語は、ゼラチン製品中に含まれる二種以上のポリペプチドからなる組成物、ならびにゼラチン材料に寄与する個々のポリペプチドの双方を包含する。したがって、本発明に関連して使用されるゼラチンという用語は、ゼラチンポリペプチドならびに個々のゼラチンポリペプチドを含む双方のゼラチンを包含する。ゼラチンを誘導できるポリペプチドは、コラーゲン、プロコラーゲンならびにコラーゲンの少なくとも一つの構造的および/または機能的特性を有するその他のポリペプチドのようなポリペプチドである。このようなポリペプチドはシングルコラーゲン鎖、またはコラーゲンホモ三量体もしくはヘテロ三量体、あるいはいずれかのフラグメント、誘導体、オリゴマー、ポリマー、あるいはそのサブユニットを含有でき、少なくとも一つのコラーゲン様ドメインGly-X-Y領域を含有できる。組換えゼラチン-様蛋白質という用語は、特に、天然で見出されていない人工配列、例えば、改変コラーゲン配列、例えば、天然コラーゲン配列から、削除、追加、置換、またはその他の変更により改変した配列であるものを意図する。このような配列は、例えば、適切な改変コラーゲンポリヌクレオチド構造等から得ることができる。明細書中で記載する架橋剤という用語は、架橋結合剤cross-linkerを含む組成物を意味する。本明細書で使用する架橋結合剤は、有機分子における分子内および分子間共有架橋を導入することができる反応性化学化合物を意味する。ヒドロゲルは、相当量の水を含むポリマー鎖のネットワークを意味する。用途に依存して、すなわち、活性剤の所望の放出プロフィールおよびヒドロゲルにかけられる機械的応力に依存して、幾つかのタイプのヒドロゲルを使用できる。例えば、40~60の水を含む非常に剛性で非弾性ヒドロゲル、60~85の水を含む弾性であるがなお剛性のヒドロゲル、および85~99の水を含有する軟質で非常に弾性のヒドロゲルである。ゲル強度はヒドロゲルを変形させるのに必要な力と定義され、いわゆる貯蔵弾性率G’単位パスカル:Paで表現される。ヒドロゲルのゲル強度は、レオメーターにより測定できる。ゲル強度は、ヒドロゲルが弾性的変形ばかりでなく、変形の結果として破壊もしくは再構成もあり得るので、変形の程度に依存する。したがって、ゲル強度の測定は、通常、ゲルの顕微鏡的組織の破壊のなくヒドロゲルを無傷に保つために小振動を用いる振動モードで行われる。押出可能は、塗布領域にデバイスからヒドロゲルを放出できると定義される。明らかに、押出可能であるために、材料は変形でき流動性でなければならない。適切な注射装置を使用して治療のために必要な患者にヒドロゲルを施用するとき、ヒドロゲルはいわゆる注射可能である。例えば、微細な針を具えた注射器またはアプリケーターチップを使用できる。小さな顔面皺を充填するのに20~30ゲージの針が有用である。インビボ分解時間は、生体内で組成物の少なくとも90が分解される時間である。したがって、埋め込み後に存在するものに比較して、少なくとも90の材料が最初の組成物としてもはや確認できない。インビボ分解時間は、組成物そのものの分解または個々の成分の分解のいずれかを意味する。ヒドロゲルは、それらの組成に関して区別し得るよく分離した2種のゲルから成るとき二相と呼ばれる。組み換えゼラチン様蛋白質/HAゲルの製造低バイオバーデンを確実にするために、総てのゲルおよび溶液を層流キャビネット中で調製した。溶液を0.2μmフィルターに通して濾過し、ガラス製品を使用前オートクレーブ中に入れた。ゲル1、2および3は架橋精製ヒアルロン酸HAゲルだった。ゲル1は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルBDDE、Flukaを使用して1水酸化ナトリウム中の10HA溶液Streptococcusequinussp.Fulka1351058由来のヒアルロン酸塩を架橋することにより得た。BDDEは、0.5μモルBDDE/gHAで使用した。ゲルを室温で24時間架橋した。1M塩酸を用いて中和させた後、ゲルを、pH7.4リン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液で2.6に稀釈し、48時間リン酸ナトリウム生理食塩水に対して透析した。最後に、ゲルを、ミクロナイザーを使用してつぶしたIKA、UltraturraxT25。ゲル2および3は、0.42μモルBDDE/gHAを使用して12HA溶液から出発することにより得た。ゲル2は微細化しなかったが、ゲル3は、調製後微細化した。組み換えゼラチン様蛋白質として、国際特許出願WO2008103041に記載された通りにして製造した組み換えゼラチンCBE3を使用した当該特許文献を参照として本明細書に含める。組み換えゼラチン様蛋白質/ヒアルロン酸RG/HA混合ゲルゲル4および5を得るために、精製CBE3溶液を、次のようにしてN-3-ジメチルアミノプロピル-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩EDCにより別々に架橋した。10CBE3溶液から出発して組み換えゼラチンゲルを調製し、2.0ミリモルEDC/RGによりpH4.7で架橋した。ゲル5について、より固いゲルを20CBE3溶液から出発して調製し、5.3μモルEDC/RGによりpH4.7で架橋した。双方のゲルを24時間架橋させ、続いて、粒子が2.5G注射針を通るに足る小ささまで微細化するまでつぶしたメタノール中で測定した粒径は200-250μm、MalvernMastersizer型。つぶしたRGゲルを24時間リン酸塩緩衝液に対して透析し、それぞれ2.0RGおよび6.7RGをもつRGゲルを得た。次いで、RG/HA混合ゲル4および5を、該RGゲルとHAゲル1をスパーテルを使用して3:7の容積比で均一混合することにより得た。先ず、ゲル1と同量のBDDEを用いて10HAゲルを調製することによりRG-HA混合ゲル6-8を調製した。24時間後、HAゲルのpHを、2.25ml1MHCl/10gHAゲルの添加により低下させた。次いで、2ml50EDC/10gゼラチン溶液を加えてある20RG溶液pH7.4を調製した。最終HA/ゼラチン比に応じて、6.01g、2.56g、または1.28gのいずれかを、12.25gHAゲルに加えた。UltraTurraxを使用して混合ゲルを均一にした。続いて、pHを、0.2ml0.5M硫酸の添加により低下させ、EDC架橋を開始した。30分間40°Cで架橋を進行させた。pH7.4リン酸塩緩衝液を用いて40mlにゲルを稀釈し、次いで、3日間pH7.4リン酸塩緩衝液に対して透析した。RG-HA混合ゲル9-11を、ゲル6-8と精製HAゲル3とを3:7の容積比で混合することにより得、表1に記載したように全ゼラチンおよびHA濃度に装填した。最終的に、総てのゲルを注射器に移し、冷凍試料を、ガンマー線7kGにより、ドライアイス上で冷凍を維持しながら殺菌した。ゼラチン、HA濃度、および各ゲルの質量比を表1にまとめた。MTS細胞毒性分析ヒドロゲルの細胞毒性を評価するためにMTS分析を行った。96-ウエルプレートにPK-84細胞ウエル当たり5,000細胞を接種した。24時間後、培地を上記調製したゲルの抽出物と置換した。抽出物は、37°C24時間細胞培養培地中でゲルを振とうすることにより調製した。次いで、抽出物の添加24時間後、ミトコンドリア基質MTS[3-4,5-ジメチルチアゾール-2-イル-5-3-カルボキシメトキシフェニル-2-4-スルホフェニル-2H-テトラゾリウム]を加えた。可溶性ホルマザン生成物の形成を光度計を使用して490nmで測定した。動物動物実験を体重250±10gの雄性AOラットHarlanNederland、Horst、オランダを用いて行った。規則的明暗サイクル、実験室不断食餌および酸性化水供給を行う標準的実験室条件下に収容した。総ての動物実験は動物実験地方委員会により承認された。インビボ実験手順イソフラン/N2O/O2麻酔下に動物を置き、その背部を剃毛し滅菌した。続いて、各ゲル100μlをラットの背部の異なる部位に皮下注射した。2週および4週後一般的麻酔下にゲルおよび周囲の組織を生体から分離し各時間当たりn=3、その後、ラットを頸椎脱臼により殺した。組織化学生体分離後、分離物を、2グルタルアルデヒド溶液中で固定し、プラスチック中に埋め込んだ。2μmの切片をトルイジンブルーを用いて染色し、光学顕微鏡により分析した。コラーゲン沈着の測定のため、2μm切片をピクロシリウス溶液を用いて染色したピクリン酸飽和水溶液中の0.1シリウスレッド、50°Cで24時間。続いて、当該切片を水道水で5分間洗浄し、マイヤーズヘマトキシリンで対比染色し、試薬等級エタノール中で脱水し、キシレン中で清澄化させ、樹脂状培地中に配置した。免疫組織化学-25°Cで分離物5μmの切片の切断し、アセトンを用いて固定した。その後、10ウサギ血清を用いて予備インキュベートし、続いて、それぞれ、マクロファージおよび巨大細胞の検出のためCD68SerotecLtd.,OxfordUKおよび血管の検出のためコラーゲンIVcat.no.ab6311-100に対して抗体を用いてインキュベートした。ゲル中にコラーゲンが沈着することを決定するために、コラーゲンIcat.no.ab6308-100およびコラーゲンIIIcat.no.ab6310-100、Abcamについて染色を行った。第1抗体を用いるインキュベート後、内因性ペルオキシダーゼ活性をH2O2処理により遮断し、それに続いて、適切な第2抗体DAKO、Glostrup、デンマークを用いてインキュベートした。次いで、スライドを3-アミノ-9-エチルカルバゾールAECで染色し、ヘマトキシリンで対比染色し、Kaisersグリセリンを用いて埋め込んだ。統計分析総てのデータを平均±SDとして表した。類似変動を推測する両側スチューデントt-検定を使用してデータを分析した。差異をp<0.05有意性で考慮した。結果明らかに、組み換えゼラチン様蛋白質のHAゲルへの付加は、組織内部成長主に線維芽細胞、血管新生、およびゲル内部のコラーゲン沈着、およびゲルの分解速度の程度に顕著な効果を示す。一般に組み換えゼラチン様蛋白質の付加はより強い組織内部成長、血管新生および自己コラーゲン沈着を誘引し、および分解速度を増加させる。これらの作用はゼラチン量の増加に伴って増加もする。ゲル9-11のような二相混合物は、ストロマ様組織内部成長、血管新生、およびコラーゲン沈着が、精製HAゲルと比較して非常に増加させるので利益のある挙動を示し、一方、4週後、わずかであるが分解を速めることが観察された。後者は、特に、持続させた皮膚充填目的に適している。"