"被検体の心機能不全により損傷した心臓組織を修復または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含む方法。前記心機能不全が心臓虚血/再かん流事象である、請求項1に記載の方法。前記虚血/再かん流による傷害が、心筋梗塞、心筋虚血、心筋再かん流、心内膜下虚血、高安動脈炎、心房細動、出血性脳卒中、人工心肺が使用される冠動脈バイパス形成などの心臓外科手術中に生じる虚血/再かん流事象、および移植のための臓器保存中に生じる虚血/再かん流事象からなる群から選択される虚血/再かん流事象後に生じるものである、請求項2に記載の方法。前記心機能不全が先天性心臓欠損である、請求項1に記載の方法。前記先天性心臓欠損が成形不全およびカントレル五徴からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後に投与する、請求項1に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後10分、15分、20分、25分、30分、1時間、2時間、6時間、12時間または24時間以内に投与する、請求項1に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の発生中に投与する、請求項1に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の前に投与する、請求項1に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の少なくとも1時間、2時間、6時間、12時間または24時間前に投与する、請求項9に記載の方法。50000~50000000個の心臓人工多能性幹細胞を前記被検体に投与する、請求項1に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を2回の等量の心筋内注射で投与する、請求項1に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を梗塞周囲領域に投与する、請求項1に記載の方法。前記心臓細胞を自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源から得る、請求項1に記載の方法。前記心臓細胞型が心臓線維芽細胞または心筋細胞である、請求項1に記載の方法。被検体の心機能不全による傷害を軽減させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含む方法。前記心機能不全が虚血、再かん流による傷害である、請求項16に記載の方法。前記虚血/再かん流による傷害が、心筋梗塞、心筋虚血、心筋再かん流、心内膜下虚血、高安動脈炎、心房細動、出血性脳卒中、人工心肺が使用される冠動脈バイパス形成などの心臓外科手術中に生じる虚血/再かん流事象、および移植のための臓器保存中に生じる虚血/再かん流事象からなる群から選択される虚血/再かん流事象後に生じる、請求項17に記載の方法。前記心機能不全が先天性心臓欠損である、請求項16に記載の方法。前記先天性心臓欠損が成形不全およびカントレル五徴からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後に投与する、請求項16に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後10分、15分、20分、25分、30分、1時間、2時間、6時間、12時間または24時間以内に投与する、請求項19に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の発生中に投与する、請求項16に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の前に投与する、請求項16に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の少なくとも1時間、2時間、6時間、12時間または24時間前に投与する、請求項24に記載の方法。50000~50000000個の心臓人工多能性幹細胞を前記被検体に投与する、請求項16に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を2回の等量の心筋内注射で投与する、請求項16に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を梗塞周囲領域に投与する、請求項16に記載の方法。前記心臓細胞を自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源から得る、請求項16に記載の方法。前記心臓細胞型が心臓線維芽細胞または心筋細胞である、請求項16に記載の方法。a1つ以上の幹細胞様因子を心臓細胞型に挿入する工程であって、前記幹細胞様因子がOct3/4、KlF4、Sox2、およびc-Myc、またはそのいずれかの組合せを含む工程、ならびにb前記心臓細胞型において前記幹細胞様因子を安定して発現する心臓人工多能性幹細胞を得る工程を含む、心臓人工多能性幹細胞を生成する方法。前記心臓細胞型を自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源から得る、請求項31に記載の方法。心臓細胞または心室細胞がH9c2心筋芽細胞である、請求項32に記載の方法。前記幹細胞様因子Oct3/4およびKlF4のcDNAを個別のベクターに独立して挿入する工程をさらに含む、請求項31に記載の方法。aKlF4-2Aの配列を単離する工程、b前記KlF4-2Aの配列を、Oct-3/4ベクターの同じ読み取り枠に挿入してOct-3/4-KlF4-2Aベクターを形成する工程、およびc前記Oct-3/4-KlF4-2Aベクターを、終止コドンを有するSox2cDNAに融合してOct-3/4-KlF4-2A-Sox2ベクターを形成する工程をさらに含む、請求項34に記載の方法。Oct-3/4-KlF4-2A-Sox2を取り出し、それをpCX-EGFPベクターに挿入する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。c-MyccDNAを前記ベクターに挿入する工程をさらに含む、請求項36に記載の方法。前記c-Mycが前記ベクター内のEGFP遺伝子と置き換えられる、請求項36に記載の方法。前記ベクターがpBS-2Aである、請求項34に記載の方法。前記幹細胞様因子がリポフェクトアミンを使用して心臓細胞または心室細胞に挿入される、請求項31に記載の方法。前記幹細胞様因子を安定して発現する前記心臓細胞または心室細胞をクローニングする工程をさらに含む、請求項31に記載の方法。安定したベクターを有する心臓細胞型を含み、前記ベクターがさらにOct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含む、心臓人工多能性幹細胞。前記KlF4、Sox2およびOct3/4の配列が、口蹄疫ウイルスの自己切断2A配列を介して操作可能に連結される、請求項42に記載の幹細胞。前記心臓細胞型が心臓線維芽細胞または心筋芽細胞である、請求項42に記載の幹細胞。前記心臓細胞型がH9c2心筋芽細胞である、請求項42に記載の幹細胞。前記心臓細胞型がヒト細胞またはげっ歯類細胞である、請求項42に記載の幹細胞。被検体の心機能不全による傷害後の梗塞の大きさを減少させる方法であって、前記被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含む方法。前記心機能不全が虚血/再かん流による傷害である請求項47に記載の方法。前記虚血/再かん流による傷害が、心筋梗塞、心筋虚血、心筋再かん流、心内膜下虚血、高安動脈炎、心房細動、出血性脳卒中、人工心肺が使用される冠動脈バイパス形成などの心臓外科手術中に生じる虚血/再かん流事象、および移植のための臓器保存中に生じる虚血/再かん流事象からなる群から選択される、請求項48に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後に投与する、請求項47に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の後10分、15分、20分、25分、30分、1時間、2時間、6時間、12時間または24時間以内に投与する、請求項50に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の発生中に投与する、請求項47に記載の方法。前記多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の前に投与する、請求項47に記載の方法。多能性幹細胞を前記心機能不全による傷害の少なくとも1時間、2時間、6時間、12時間または24時間前に投与する、請求項53に記載の方法。50000~50000000個の心臓人工多能性幹細胞を前記被検体に投与する、請求項47に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を2回の等量の心筋内注射で投与する、請求項47に記載の方法。前記心臓人工多能性幹細胞を梗塞周囲領域に投与する、請求項47に記載の方法。前記心臓細胞を自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源から得る、請求項47に記載の方法。前記心臓細胞型が心臓線維芽細胞または心筋細胞である、請求項47に記載の方法。V.詳細な説明本発明の化合物、組成物、物品、装置および/または方法を開示し、記載する前に、これらは他に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組み換えバイオ技術方法に限定されず、または他に明記しない限り具体的な試薬に限定されず、当然ながら変化し得るといったことが理解される。本明細書で使用される用語は具体的な実施形態を記載する目的に過ぎず、限定することを意図しない。A.定義本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形a、anおよびtheは、文脈上他に明記されない限り複数の指示対象を含む。それゆえ、例えば、apharmaceuticalcarrier薬学的担体への言及は、2つ以上のこのような担体の混合物などを含む。範囲は、本明細書において、約1つの具体的な値から、および/または約別の具体的な値まで、として表現されることができる。このような範囲を表現する場合、別の実施形態では、前記1つの具体的な値から、および/または前記別の具体的な値までを含む。同様に、各値が先行詞約を使用することにより近似値として表現される場合、その具体的な値が別の実施形態を形成することが理解されるだろう。さらに、各範囲それぞれの末端点は、他の末端点との関係における場合と、他の末端点から独立した場合の両方において意義を有することが理解されるだろう。また、多くの数字が本明細書に開示され、各値はまた、その値そのものに加えて、約その値として本明細書に開示されることが理解される。例えば、値10が開示される場合、それをもって約10も開示される。当業者であれば適宜理解されるように、ある値が開示される場合、その値以下、以上、および値間で可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値10が開示される場合、10以下ならびに10以上も開示される。本出願を通して、データが多くの様々なフォーマットで提供され、かつこのデータが末端点および開始点ならびにデータ点のいずれかの組合せの範囲を表すことも理解される。例えば、具体的なデータ点10および具体的なデータ点15が開示される場合、10と15より大きいこと、10と15以上であること、10と15未満であること、10と15以下であること、および10と15に等しいということが開示され、ならびに、10と15との間であるということも同様に開示されると考えられると理解される。以下の本明細書および特許請求の範囲において、多くの用語を参照し、これらは以下の意味を有すると定義されるものとする。任意のまたは任意では、続いて記載される事象または状況が発生する場合もあれば発生しない場合もあることを意味し、上記の事象または状況が発生する例および発生しない例が説明に含まれることを意味する。本出願を通して、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物のその全体の開示を、これに関連する最新技術をより完全に記載するために参照により本出願に組み込む。開示された参照文献はまた、参照を行う文において考察の対象となっている参照文献中の事項について、参照により本明細書に個々に、および具体的に組み込まれる。B.心機能障害から生じる損傷した心臓組織を減少させ、修復し、再生させる方法本明細書において、被検体の心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含む方法を開示する。心機能障害は、先天的心臓欠損および虚血/再かん流の事象などの多くの事象により生じ得ることが理解され、本明細書において検討される。それゆえ、例えば一態様において、心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、前記機能障害が虚血/再かん流の事象である方法を本明細書において開示する。本明細書において使用される虚血は、通常は血管の機能的狭窄または実際の閉塞による、部分的な血液の不足を指す。このような不足は、梗塞、つまり、もっとも一般的には血栓または塞栓によるその領域への循環の閉塞から生じる局所虚血による組織内の細胞死の領域を生じる。狭窄または閉塞を取り除き、血流を戻すと、再かん流が生じたこととなる。血流は戻るものの、再かん流は、細胞の膨化および壊死、アポトーシス、浮腫、出血、非再かん流現象および酸素フリーラジカルによる組織損傷などの、虚血エピソード後の血流回復の有害作用も生じさせ得る。従って、虚血/再かん流による傷害の軽減の1つの現れとしては、梗塞の大きさを軽減することがある。それに応じて、一態様において、本明細書において、被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含む、被検体の心機能障害による傷害後の梗塞の大きさを軽減する方法を開示する。虚血/再かん流による傷害の原因は多く知られていることが理解される。例えば、虚血/再かん流による傷害は、心筋梗塞、心筋虚血、心筋再かん流、心内膜下虚血、高安動脈炎、心房細動、出血性脳卒中動脈瘤および動静脈奇形から生じる脳卒中など、および一過性虚血発作、冠動脈バイパス形成など人工心肺を使用する心臓外科手術、および移植のための臓器保存などの、虚血再かん流事象から生じ得る。例として、そして一態様において、心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復し、または再生させる方法であって、被検体に心臓人工多能性幹細胞を投与することを含み、前記心機能障害が虚血再かん流による傷害であり、前記虚血/再かん流による傷害が、心筋虚血、心筋再かん流、心内膜下虚血、高安動脈炎、脳卒中、虚血性脳卒中、心房細動、出血性脳卒中、一過性虚血発作、冠動脈バイパス形成のような人工心肺を使用する心臓外科手術中に生じる虚血/再かん流事象、および移植のための臓器保存中に生じる虚血/再かん流事象からなる群から選択される虚血/再かん流事象の後に生じる方法を、本明細書において開示する。心機能障害はまた、損傷した心臓組織または補正的な修復を必要とする組織を生じる、被検体の先天的な欠損の結果であり得る。例えば、心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓組織由来の心臓人工多能性幹細胞を投与することを含み、前記心機能障害が例えば形成不全および/またはカントレル五徴などの先天的心臓欠損である方法を本明細書において開示する。処置および処置するとは、疾患、病態または障害を治癒し、改善し、安定させまたは予防する目的の、被検体の医療管理を意味する。この用語には、積極的処置、すなわち、疾患、病態または障害の改善に特に向けられた処置が含まれ、かつ原因処置、すなわち、関連疾患、病態または障害の原因の除去に向けられた処置も含まれる。さらに、この用語には、緩和処置、すなわち、疾患、病態または障害の治癒よりむしろ症状の緩和のために設計された処置、予防処置、すなわち、関連疾患、病態または障害の発症を最小限にし、または部分的もしくは完全に抑制することに向けられた処置、ならびに支持処置、すなわち、関連疾患、病態または障害の改善に向けられた別の特定の療法を補充するために使用される処置が含まれる。処置は、疾患、病態または障害を治癒し、改善し、安定させ、または予防することを意図とするが、実際に治癒、改善、安定化または予防を生じる必要はないことが理解される。処置は必ずしも疾患または状態の治癒や梗塞の完全な予防を指さず、例えば、虚血/再かん流による傷害の見通しの改善を含み得ることが理解され、本明細書において検討される。処置の効果を、本明細書に記載されるように、および、関与する疾患、病態または障害について適切であるとして当技術分野で知られているように、測定または評価することができる。このような測定および評価は、定性的および/または定量的な条件でなされ得る。それゆえ、例えば、疾患、病態もしくは障害の特徴もしくは特性、および/または、疾患、病態もしくは障害の症状を、任意の結果または任意の量に軽減することができる。本明細書において、疾患または状態の文脈において減少する減少させるまたは減少は、疾患または状態の原因、症状または影響の低下を指す。それゆえ、開示された方法において、減少するとは、梗塞の大きさを含むがそれだけに限定されない虚血/再かん流による傷害の量の10、20、30、40、50、60、70、80、90または100の低下を指すことができる。残念なことに、心機能障害は、例えば梗塞などの切迫した機能障害に気付いていない被検体に生じ得る。多くの場合、このような個人における最初の兆候は、虚血/再かん流事象などの機能障害それ自体である。このような個人において、潜在的な心臓組織の傷害を減少させる必要がある。従って、本明細書において、心機能障害後の心臓組織の損傷を減少させ、修復しまたは再生させるために使用され得る方法を開示することが検討される。例として、例えば虚血/再かん流事象などの心機能障害による心臓の損傷を減少させ、修復しかつ/または再生する方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来の心臓人工多能性幹細胞iPSを投与することを含み、前記iPSが心機能障害の傷害後24時間以内に投与される方法を開示する。心機能障害事象後にiPSを投与することが早いほど、傷害の可能性がより低くなり、続いて、例えば梗塞の大きさの低下など、損傷の潜在的な軽減がより大きくなることが理解される。従って、本明細書において、心臓人工多能性幹細胞を心機能障害事象または傷害後24時間、12時間、6時間、2時間、1時間、30分間、15分間、10分間、5分間以内に投与する方法を開示する。心臓人工多能性幹細胞iPSの投与は、心機能障害事象または傷害後5分~24時間の任意の時間でなされ得ることが理解される。機能障害が虚血/再かん流事象である場合、虚血および再かん流が生理学的に異なる事象であるだけでなく、必ずしも同時に起こるとはかぎらないないことが理解される。虚血は典型的には血栓または塞栓による一部への血流不足を指し、再かん流傷害は閉塞または狭窄が取り除かれたときに生じるところ、例えば虚血/再かん流事象の最中のように、心機能障害の発生中に心機能障害による傷害を軽減させることが可能であり、かつ望ましい。従って例えば、虚血中に、または別法として、虚血後であるが再かん流が生じる前に、または別法として、虚血後かつ再かん流発生時に、iPSを投与することができる。同様に、iPSを任意の心機能障害事象の発生中に投与することができる。従って、本明細書において、iPSを心機能障害事象の発生中に投与する方法を開示する。心機能障害の前にiPSを投与した個人において、心機能障害による心臓の損傷の軽減が生じることが理解され、本明細書において検討される。従って、心機能障害の危険性または既往歴を有する個人が、iPSを予防的に摂取することにより、将来の事象におけるさらなる損傷の危険を低下させることができることが理解され、本明細書において検討される。さらに、心筋梗塞のような虚血/再かん流事象などの多くの心機能障害は、認識した場合に被検体が迅速な処置を求めることを可能とし得る、実際の事象に先行する早期の前兆の症状を有することが理解される。将来の心機能障害事象により心臓組織の傷害が引き起こされる場合でも、iPSの予防的投与により、例えば梗塞の大きさを軽減するなど、心臓組織の傷害を軽減することができることが検討される。例えば、被検体の心臓組織の傷害を減少させる方法であって、それを必要とする被検体にiPSを投与することを含み、前記iPSが心機能障害事象の少なくとも30分前に投与される方法を本明細書において開示する。本明細書において、心機能障害事象の15分、30分、1時間、2時間、6時間、12時間、24時間、2日、3日、1週間または2週間前あるいはそれらの間の任意の時点でiPSが投与される方法を開示する。C.組成物開示された組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書において開示される方法で使用される組成物自体を開示する。これらのおよび他の材料が本明細書で開示され、かつこれらの材料の組合せ、部分集合、相互作用、群などが開示される一方で、これらの化合物の種々の個別的および集合的な組合せおよび並び替えの特定の参照がそれぞれ明確に開示されていない場合であっても、本明細書において、それぞれが特に検討され、記載されていることが理解される。例えば、具体的な幹細胞性因子例えば、Oct3/4、Klf4、Sox2およびc-Mycまたは心臓人工多能性幹細胞について開示考察され、かつ、幹細胞性因子例えば、Oct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含む多くの分子または心臓人工多能性幹細胞になされ得る多くの改変について考察される場合、特に断り書きが示されない限り、幹細胞性因子例えば、Oct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycまたは心臓人工多能性幹細胞のあらゆる全ての組合せおよび並び替えならびに可能な改変が特に検討される。従って、あるクラスの分子A、BおよびCが開示され、かつあるクラスの分子D、EおよびF、ならびに組合せの分子A-Dの例が開示される場合、それぞれが個々に引用されていない場合でも、それぞれが個別的および集合的に検討され、すなわちA-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-EおよびC-Fという組合せが検討され、開示される。同様に、これらの任意の部分集合または組合せについても開示される。従って、例えば、A-E、B-FおよびC-Eの部分群について検討され、開示される。この概念を、開示された組成物を作製し使用する方法の工程を含むがそれらに限定されない本出願の全ての側面に適用する。従って、実施され得る種々の追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれが、開示された方法のあらゆる特定の実施形態または各実施形態の組合せとともに実施され得ることが理解される。一態様において、本明細書において、心臓の人工多能性幹細胞iPSについて開示する。本明細書において考察および開示されるように、心臓人工多能性幹細胞は、幹細胞性因子が挿入され、それらを発現する、心臓細胞型由来の人工幹細胞である。幹細胞性因子は当技術分野で公知であり、Oct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含むがこれらに限定されない。従って、例えば本明細書において、安定したベクターが細胞内に挿入された心臓細胞型を含み、ベクターがさらにOct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含む、iPSについて開示する。幹細胞性因子を互いに操作可能に連結し得る。例えば本明細書において、幹細胞性因子であるOct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含むベクターを含み、これら幹細胞性因子が口蹄疫ウイルスの自己切断2A配列を介して操作可能に連結される、心臓人工多能性幹細胞について開示する。開示された心臓人工多能性幹細胞を本明細書に開示された方法のいずれかに使用することができる。例えば、本明細書において、被検体の心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来のiPSを投与することを含み、前記iPSがさらに幹細胞性因子であるOct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycを含むベクターを含む方法について開示する。本明細書において、心臓細胞型内に含有され幹細胞性因子を発現させるために使用するベクターは、細胞内で遺伝子を安定して発現させるのに適した任意のベクターであってよいことが検討される。例えば、ベクターはapBS-2Aベクターであってよい。本明細書に開示されたiPSを生成するために使用され得る心臓細胞型は、心筋芽細胞例えば、心筋細胞および心臓線維芽細胞を含むがそれらに限定されない任意の心臓細胞型であってよい。本明細書において開示されるiPSに使用され得る心筋芽細胞の例はH9c2心筋芽細胞である。さらに、筋細胞および線維芽細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、類人猿、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、モルモットおよびマウスを含むがそれらに限定されない任意の哺乳類動物種由来であってよい。細胞を被検体に送達する場合、心臓細胞型源が免疫学的に類似しているほど、免疫拒絶または移植片対宿主病の生じる可能性が低いことが理解される。それに応じて、本明細書において、心臓人工多能性幹細胞を形成するために最終的に誘導される心臓細胞型源が、自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源であってよいことが検討される。例えば、被検体の心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓細胞型由来のiPSを投与することを含み、前記心臓細胞型が自家、同種異系または同一遺伝子型の供給源から得られるものである方法を本明細書において開示する。本明細書において、記載の心臓人工多能性幹iPS細胞を作製する方法についても開示する。一態様において、iPSを作製する開示の方法は、幹細胞性因子を含むベクターを心臓細胞型に挿入することを含む。例えば、本明細書において、11つ以上の幹細胞様因子を心臓細胞型に挿入する工程であって、前記幹細胞様因子がOct3/4、KlF4、Sox2およびc-Mycまたはそのいずれかの組合せを含む工程、ならびに、2心臓細胞型内に幹細胞様因子を安定して発現する心臓人工多能性幹細胞を得る工程を含む、心臓人工多能性幹細胞を生成する方法を開示する。さらなる態様において、iPSを作製する開示の方法は、幹細胞様因子であるOct3/4およびKlF4のcDNAを別個のベクターに独立して挿入する工程を含むことができる。なおさらなる態様において、iPSを作製する開示の方法は、aKlF4-2A配列を単離する工程、bKlF4-2A配列を、Oct3/4ベクターの同じ読み取り枠に挿入してOct3/4-KlF4-2Aベクターを形成する工程、およびc終止コドンを有するSox2cDNAにOct3/4-KlF4-2Aベクターを融合させてOct3/4-KlF4-2A-Sox2ベクターを形成する工程を含むことができる。なおさらなる態様において、本明細書において、Oct3/4-KlF4-2A-Sox2を取り出し、pCX-EGFPベクターに挿入する工程をさらに含む、iPSを作製する方法を開示する。iPSを作製する方法は、なおさらにc-MyccDNAをベクターに挿入する工程を含み得る。c-Mycを他の幹細胞性因子に操作可能に連結させ操作可能に発現させる能力を保持するのに適したベクターの任意の位置に、c-Mycを挿入することができる。例えば、c-MycをpCX-EGFPベクターのEGFPと置き換えることができる。1.組成物の細胞への送達インビトロまたはインビボで核酸を細胞へ送達するために使用することができる多くの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物を、おもに2つのクラス、ウイルス系送達システムおよび非ウイルス系送達システムに分類することができる。例えば、核酸を、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの多くの直接送達システムを介して、または、細胞中もしくはカチオン性リポソームなどの担体中の遺伝物質の移送を介して、送達することができる。ウイルスベクター、化学形質移入体、または電気穿孔法およびDNAの直接拡散などの物理機械的方法を含む、形質移入の適切な手段が、例えばWolffJAetalScience24714651468およびWolffJANature352815818により記述されている。このような方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載の組成物および方法とともに使用するために容易に適合させることができる。特定の場合において、大きなDNA分子と特に機能するよう方法を修正する。さらにこれらの方法を、担体の標的特性を使用することにより、特定の疾患および細胞集団を標的とするために使用することができる。a核酸系送達システム導入ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために使用される任意の核酸構築物例えば、プラスミドであってよく、または遺伝子を送達するための一般的戦略の一部、例えば、組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部であってよいRametalCancerRes538388。本明細書で使用されるプラスミドまたはウイルスベクターは、開示された核酸、例えば本明細書に開示された幹細胞性因子Oct3/4、KlF4-2A、Sox2およびc-Mycをコードする遺伝子を、分解させることなく細胞内に輸送する物質であり、送達される細胞内で遺伝子の発現を生成するプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス、エイズウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のRNAウイルスであり、HIV骨格を有するこれらのウイルスを含む。さらに、ベクターとしての使用に適しているこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、MMLVを含み、ベクターとしてのMMLVの望ましい特性を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターより大きな遺伝的荷重すなわち導入遺伝子またはマーカー遺伝子を担持することができ、この理由で一般的に使用されるベクターである。しかし、非増殖細胞ではそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは相対的に安定であり、操作しやすく、力価が高く、エアロゾル製剤において送達することができ、非分裂細胞で形質移入することができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するための部位がいくつかあり、熱安定性であり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原により誘起される宿主生物の免疫反応を抑制するように遺伝子操作されたウイルスベクターである。この種の好ましいベクターはインターロイキン8または10をコードする領域を担持するだろう。本明細書において、心臓細胞型内に含まれ、幹細胞性因子を発現させる場合に使用されるベクターは、細胞内で遺伝子を安定して発現させるのに適した任意のベクターであってよいことが検討される。例えば、ベクターはapBS-2Aベクターであってよい。ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための化学的または物理的方法に比べ、より高い処理能力遺伝子を導入する能力を有し得る。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写産物、複製およびキャプシド形成に必要な逆位末端配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして遺伝子操作される場合、ウイルスは典型的に1つ以上の初期遺伝子が取り除かれ、遺伝子または遺伝子/プロモーターカセットが、前記取り除かれたウイルスDNAの場所においてウイルスゲノムに挿入される。この種の構築物は、約8kbまでの外来遺伝物質を担持することができる。取り除かれた初期遺伝子の必要な機能は、トランス的に初期遺伝子の遺伝産物を発現するよう遺伝子操作されている細胞株により通常は供給される。1レトロウイルスベクターレトロウイルスは、任意の種類、亜科、属または指向性を含むレトロウイルス科に属する動物ウイルスである。レトロウイルスは、本質的に、核酸カーゴを内部に包み込んだパッケージである。核酸カーゴは、パッケージングシグナルを担持し、これは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率よくパッケージされることを確実にする。パッケージシグナルに加え、ウイルスの複製および複製済みウイルスのパッケージングのために、多くの分子がシス的に必要とされる。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するgag、polおよびenv遺伝子を含有する。典型的には、gag、polおよびenv遺伝子が、標的細胞に移入させる外来性DNAによって置き換えられる遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的に、パッケージコートに組み込まれるためのパッケージングシグナル、gag転写単位の開始をシグナルする配列、逆転写のtRNAプライマーと結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要なエレメント、DNA合成中のRNA鎖のスイッチをガイドする末端反復配列、第2のDNA鎖合成のためのプライミング部位として作用する3’LTRの5’側にあるプリンリッチ配列、および宿主ゲノムに挿入するためにレトロウイルスのDNA状態の挿入を可能にするLTRの末端付近の特異的な配列を含有する。gag、polおよびenv遺伝子の除去により、約8kbの外来性配列が、ウイルスゲノムに挿入可能となり、逆転写され、複製時に新たなレトロウイルス粒子にパッケージされるようになる。この核酸量は、各転写産物の大きさに応じて、1つないしは多数の遺伝子を送達するのに十分な量である。挿入物内に、他の遺伝子とともに陽性または陰性の選択可能マーカーを含むことが好ましい。ほとんどのレトロウイルスベクターは複製機構およびパッケージタンパク質gag、polおよびenvが取り除かれているため、ベクターは典型的にパッケージング細胞株に入れることにより生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含有するがパッケージングシグナルを欠くレトロウイルスで形質移入または形質転換されている細胞株である。選択したDNAを担持するベクターがこれらの細胞株に形質移入される場合、当該ヘルパー細胞によりシス的に供給される機構により、目的の遺伝子を含有するベクターが複製され、新たなレトロウイルス粒子にパッケージされる。これらの機構のためのゲノムは、必要なシグナルが欠如しているためパッケージされない。2アデノウイルスベクター複製欠損アデノウイルスの構築について記述されているBerkneretalJVirology6112131220MassieetalMolCellBiol628722883HajAhmadetalJVirology57267274DavidsonetalJVirology6112261239ZhangGenerationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposomemediatedtransfectionandPCRanalysisBioTechniques15868872。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、最初の感染細胞内で複製できるが、新たな感染ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に広がり得る範囲が限定されることである。組み換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質組織および他の多くの組織部位に直接インビボ送達された後、効率的に遺伝子移入を達成できることが示されているMorsyJClinInvest9215801586KirshenbaumJClinInvest92381387RoesslerJClinInvest9210851092MoullierNatureGenetics4154159LaSalleScience259988990GomezFoixJBiolChem2672512925134RichHumanGeneTherapy4461476ZabnerNatureGenetics67583GuzmanCirculationResearch7312011207BoutHumanGeneTherapy5310ZabnerCell75207216CaillaudEurJNeuroscience512871291andRagotJGenVirology74501507。組み換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスの場合と同じように、ウイルスが受容体介在性エンドサイトーシスにより内在化することにより遺伝子形質導入を達成するChardonnetandDalesVirology40462477BrownandBurlinghamJVirology12386396SvenssonandPerssonJVirology55442449SethetalJVirol51650655SethetalMolCellBiol415281533VargaetalJVirology6560616070WickhametalCell73309319。ウイルスベクターは、E1遺伝子を取り除いたアデノウイルス系のものであってよく、これらのバイロンはヒト293細胞株などの細胞株で生成される。別の好ましい実施形態において、E1およびE3遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから取り除く。3アデノ随伴ウイルスベクター別の種類のウイルスベクターとして、アデノ随伴ウイルスAAV系のものがある。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができ、ヒトに非病原性であるため好ましいベクターである。AAV型のベクターは約4~5kbを輸送することができ、野生型AAVは染色体19に安定して挿入されることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含有するベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい実施形態は、カリフォルニア州サンフランシスコのアビゲンにより生成されたP4.1Cベクターであり、これは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子であるHSV-tkおよび/または緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有することができる。別の型のAAVウイルスにおいて、AAVは、異種遺伝子に操作可能に連結され細胞特異的発現を指向するプロモーターを含有する少なくとも1つのカセットに隣接する一対の逆位末端配列ITRを含有する。この文脈における異種とは、AAVまたはB19パルボウイルス由来でない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。典型的には、AAVおよびB19コード領域は削除されており、安全な非細胞毒性ベクターが生じる。AAVITRまたはその改変物は、感染力および部位特定的組み込みを付与するが細胞毒性は生じず、プロモーターは細胞特異的発現を指向する。このように開示されたベクターは、実質的に毒性を含むことなく、哺乳類動物の染色体に組み込むことができるDNA分子を提供する。ウイルスおよびレトロウイルス内の挿入された遺伝子は、通常、プロモーター、および/または所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるためのエンハンサーを含有する。プロモーターとは、一般に、転写開始部位に対して比較的固定された位置にある場合に機能する、DNAの1つまたは複数の配列である。プロモーターはRNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有し得る。4荷重が大きいウイルスベクター大きなヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学的実験により、ヘルペスウイルスの感染を許容する細胞において大きな異種DNA断片をクローン化し、増殖させ、樹立することができる手段が提供されているSunetalNaturegenetics833411994CotterandRobertsonCurrOpinMolTher56336441999。これらの大きなDNAウイルス単純ヘルペスウイルスHSVおよびエプスタインバーウイルスEBVは、150kbより大きいヒト異種DNAの断片を特定の細胞に送達する可能性を有する。EBV組み換え体は大きなDNA片をエピソームDNAとして感染B細胞に保持することができる。個々のクローンは、330kbまでのヒトゲノム挿入物を担持し、遺伝的に安定していると見られた。これらのエピソームの保持には、EBVに感染する間に構成的に発現する、特異的なEBV核タンパク質であるEBNA1を必要とする。さらに、これらのベクターを形質移入に使用することができ、この場合、多量のタンパク質を生体外で一過性に生成することができる。ヘルペスウイルスのアンプリコンシステムも、220kbより大きいDNA片をパッケージし、エピソームとしてDNAを安定して保持することができる細胞に感染させるために使用されている。他の有用なシステムとしては、例えば、複製および宿主限定非複製ワクシニアウイルスベクターがある。b非核酸系システム開示された組成物を種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物を、電気穿孔法を介して、またはリポフェクションを介して、あるいはリン酸カルシウム沈殿を介して送達することができる。選択される送達機構は、標的の細胞型、および、送達が起こるのが例えば生体内であるか生体外であるかということに部分的に依存するであろう。従って、組成物としては、開示されたベクターに加えて、例えばリポソーム、カチオン性リポソーム例えば、DOTMA、DOPE、DC-コレステロールまたはアニオン性リポソームなどの脂質が含まれ得る。リポソームはさらに所望の場合、特定の細胞を標的とすることを促進するタンパク質を含むことができる。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に求心性の血管に投与され、または呼吸器に吸入して気道の細胞を標的とすることができる。リポソームに関して、例えば、BrighametalAmJRespCellMolBiol195100FelgneretalProcNatlAcadSciUSA8474137417;米国特許第4897355号を参照のこと。さらに、化合物は、マクロファージなど特定の細胞型を標的とし得るマイクロカプセルの成分として、または、化合物の拡散または化合物の送達が特定の速度もしくは用量となるよう設計されているマイクロカプセルの成分として、投与されることができる。被検体の細胞への外因性DNAの投与および取込みすなわち、遺伝子形質導入または形質移入を含む上記の方法において、組成物の細胞への送達は種々の機構を介したものであり得る。一例として、送達は、リポフェクチン、リポフェクトアミンギブコ-BRL社、メリーランド州ゲーサーズバーグ、スーパーフェクトキアゲン社、ドイツ、ヒルデンおよびトランスフェクタムプロメガバイオテック社、ウィスコンシン州マディソンなどの市販のリポソーム製剤ならびに当技術分野で標準的な方法に従い開発された他のリポソームを使用した、リポソームを介したものであってよい。さらに、開示された核酸またはベクターを、ジェネトロニクス社カリフォルニア州サンディエゴから入手可能な技術である電気穿孔法により、ならびに超音波穿孔機イマルクスファーマシューティカルズ社、アリゾナ州ツーソンの手段により、インビボ送達することができる。従って、一態様において、被検体の心機能障害により損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓人工多能性幹細胞を投与することを含み、心臓人工多能性幹細胞が幹細胞性因子を含み、幹細胞様因子はリポフェクトアミンを使用して心臓細胞または心室細胞に挿入される方法を本明細書において開示する。材料は、溶液、懸濁液例えば、微粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれたもの中にあってよい。これらは抗体、受容体または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とすることができる。以下の参照は、腫瘍組織を特定のタンパク質の標的とするこの技術の使用の例であるSenteretalBioconjugateChem2447451BagshaweKDBrJCancer60275281BagshaweetalBrJCancer58700703SenteretalBioconjugateChem439BattellietalCancerImmunolImmunother35421425PieterszandMcKenzieImmunologReviews1295780andRoffleretalBiochemPharmacol4220622065。これらの技法は種々の他の特異的な細胞型に使用することができる。ステルス型リポソームその他抗体がコンジュゲートしたリポソームのようなビヒクル結腸癌に対する脂質介在型薬剤標的指向化を含む、細胞特異的リガンドを介したDNAの受容体介在型標的指向化、リンパ球により誘導される腫瘍標的化、およびインビボでマウス神経膠腫細胞に非常に特異的な治療用レトロウイルスの標的指向化。以下の参照は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的指向化するこの技術の使用の例であるHughesetalCancerResearch4962146220andLitzingerandHuangBiochimicaetBiophysicaActa1104179187。一般に、受容体は、構成的な、またはリガンド誘導された、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内でクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体を選別する酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームで分解されるかのいずれかとなる。内在化経路は、種々の機能、例えば栄養素の摂取、活性タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの制御に作用する。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価およびリガンド濃度に応じて複数の細胞内経路をたどる。受容体介在型エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構については概説されているBrownandGreeneDNAandCellBiology106399409。細胞に送達され、宿主細胞ゲノムに組み込まれる核酸は、典型的に組み込み配列を含有する。これらの配列は多くの場合、特にウイルス系システムを使用する場合、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込みシステムを、リポソームなどの非核酸系送達システムを使用して送達される核酸に取り入れ、その送達システムに含有される核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようにすることもできる。宿主ゲノムへの組み込みの他の一般的な技法には、例えば、宿主ゲノムとの相同組み換えを促進するよう設計されたシステムを含む。これらのシステムは、典型的には、発現される核酸と隣接する配列に依存し、この配列は宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有することによりベクター核酸と標的核酸との間の組み換えを生じさせ、送達された核酸の宿主ゲノムへの組み込みを引き起こす。これらのシステムおよび相同組み換えを促進するために必要な方法は、当業者に公知である。c生体内/生体外上記のように、組成物を薬学的に許容される担体中で投与することができ、当技術分野で公知の種々の機構により生体内および/または生体外で被検体の細胞に送達することができる例えば、ネイキッドDNAの摂取、リポソーム融合、遺伝子銃を介したDNAの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど。生体外の方法を使用する場合、細胞または組織を取り出し、当技術分野で公知の標準的なプロトコールに従い体外で保持する。組成物を、任意の遺伝子移入機構、例えば、リン酸カルシウム媒介型遺伝子送達、電気穿孔法、顕微注入またはプロテオリポソームを介して細胞に導入することができる。次いで、形質導入したこの細胞を例えば、薬学的に許容される担体中で注入し、またはその細胞型もしくは組織型における標準的な方法に従って、被検体にホモトピー的に移植して戻すことができる。被検体に種々の細胞を移植または注入する標準的な方法が知られている。2.相同性/同一性本明細書において開示される遺伝子およびタンパク質の既知の変異体および誘導体または生じ得る変異体および誘導体を定義する1つの方法は、特定の既知配列に対する相同性の観点から変異体および誘導体を定義することであることが理解される。特に、言及された配列に対して少なくとも70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99の相同性を有する、本明細書に開示されたこれらのおよび他の遺伝子ならびにタンパク質の変異体が開示される。当業者であれば、2つのタンパク質、または2つの核酸遺伝子などの相同性を決定する方法が容易に理解される。例えば、相同性は、相同性を最大レベルにするように上記2つの配列をアラインメントさせた後に算出することができる。相同性を算出する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより行うことができる。比較のための配列の最適アラインメントは、SmithandWatermanAdvApplMath2482の局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanandWunschJMolBiol48443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonandLipmanProcNatlAcadSciUSA852444の類似検索法により、これらのアルゴリズムGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、ウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ、ジェネティックスコンピュータグループ、575、ドクターサイエンス、ウィスコンシン州マディソンのコンピュータによる実施により、または目視により行うことができる。3.核酸本明細書において開示されている種々の分子は、核酸系であり、例えば、幹細胞性因子例えば、Oct3/4、Klf4、Sox2およびc-Mycおよび本明細書に開示される任意の他のタンパク質をコードする核酸、ならびに種々の機能的核酸などを含む。開示された核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的例が本明細書において考察される。例えば、ベクターが細胞内で発現する場合、発現したmRNAは典型的にA、C、GおよびUから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子を例えば外因性の送達を介して細胞または細胞環境に導入する場合、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を低下させるヌクレオチド類似体によりアンチセンス分子が構成されていることが有利であることが理解される。aヌクレオチドおよび関連分子ヌクレオオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドはリン酸部分および糖部分を介して連結されヌクレオシド間結合を生成し得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン-9-イルA、シトシン-1-イルC、グアニン-9-イルG、ウラシル-1-イルUおよびチミン-1-イルTであり得る。ヌクレオチドの糖部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は5価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定的例は、3’-AMP3’-アデノシン一リン酸または5’-GMP5’-グアノシン一リン酸である。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖またはリン酸部分のいずれかに、何らかの種類の修飾を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は、当技術分野において公知であり、例えば5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび2-アミノアデノシン、ならびに糖部分またはリン酸部分での修飾を含む。ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドに類似する機能特性を有するが、リン酸部分を含有しない分子であり、例えばペプチド核酸PNAなどである。ヌクレオチド代替物はワトソン-クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識する分子であるが、リン酸部分以外の部分を通して連結される。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に順応することができる。例えば、細胞摂取を高めるために、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に他の型の分子コンジュゲートを結合することも可能である。コンジュゲートはヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合することができる。このようなコンジュゲートはコレステロール部分などの脂質部分を含むがそれに限定されないLetsingeretalProcNatlAcadSciUSA19898665536556。ワトソン-クリックの相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代替物のワトソン-クリック面による少なくとも1つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代替物のワトソン-クリック面は、プリン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド代替物のC2、N1およびC6位、ならびに、ピリミジン系のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体もしくはヌクレオチド代替物のC2、N3およびC4位を含む。フーグスティーンの相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のフーグスティーン面上で生じる相互作用であり、これは二重DNAの主溝に顕在化する。フーグスティーン面はプリンヌクレオチドのN7位およびC6位の反応基NH2またはOを含む。b配列本明細書において、種々の配列が提供され、これらおよび他のものはジェンバンクで見つけることができる。当業者であれば、配列の不一致および違いを解決し、特定の配列に関する組成物および方法を他の関連配列に調節する方法を理解する。本明細書に開示され、当技術分野で公知の情報によって、任意の配列用のプライマーおよび/またはプローブを設計することができる。4.発現系細胞に送達される核酸は、典型的に発現制御システムを含有する。例えば、ウイルスおよびレトロウイルスシステムに挿入された遺伝子は、通常所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーターおよび/またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に対して比較的固定された位置にある場合に機能する、DNAの1つまたは複数の配列である。プロモーターはRNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有し得る。aウイルスプロモーターおよびエンハンサー哺乳類動物の宿主細胞においてベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40SV40、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから得ることができ、または異種哺乳類動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから得ることができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターはSV40の複製起点も含有するSV40制限断片として好都合に得られるFiersetalNature273113。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として好都合に得られるGreenwayPJetalGene18355360。当然ながら、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書において有用である。一般に、エンハンサーは、転写開始部位から様々な距離において機能し、転写単位に対して5’側または3’側LuskyMLetalMolCellBio31108のいずれにあってよいDNA配列を指す。さらに、エンハンサーはイントロン内BanerjiJLetalCell33729あるいはコード配列自体の中OsborneTFetalMolCellBio41293にあってもよい。通常、これらは10~300bpの長さであり、シスに機能する。エンハンサーは近くのプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。エンハンサーは多くの場合、転写の制御を媒介する応答エレメントも含有する。プロモーターもまた、転写の制御を媒介する応答エレメントを含有し得る。エンハンサーは多くの場合、遺伝子発現の制御を決定する。哺乳類動物の遺伝子グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質およびインスリン由来の多くのエンハンサー配列が今では知られているが、典型的には一般的な発現において真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するだろう。好ましい例は、複製起点の後ろ側のSV40エンハンサーbp100~270、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。プロモーターおよび/またはエンハンサーは、これらの機能をトリガーする光または特定の化学事象により、特異的に活性化させることができる。システムはテトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬により制御され得る。さらに、γ照射などの照射への曝露またはアルキル化化学療法薬によりウイルスベクター遺伝子発現を増強させる方法もある。特定の実施形態において、プロモーターおよび/またはエンハンサー領域は、転写されるべき転写単位の領域の発現を最大にするための構成的プロモーターおよび/またはエンハンサーとして作用することができる。特定の構築物において、プロモーターおよび/またはエンハンサー領域は、特定の時期においては特定の細胞型だけに発現するとしても、全ての真核細胞型において活性であり得る。この型の好ましいプロモーターは、CMVプロモーター650塩基である。他の好ましいプロモーターはSV40プロモーター、サイトメガロウイルス全長のプロモーターおよびレトロウイルスベクターLTRである。全ての特定の制御エレメントをクローン化することができ、メラノーマ細胞などの特定の細胞型に選択的に発現される構築発現ベクターに使用することができることが示されている。グリア原線維酸性タンパク質GFAPプロモーターは、グリア由来の細胞において遺伝子を選択的に発現させるために使用されている。真核宿主細胞酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞に使用される発現ベクターは、mRNA発現に影響し得る、転写終結に必要な配列も含有し得る。これらの領域は組織因子タンパク質をコードするmRNAの未翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。3’未翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写単位はポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の1つの利点は、転写単位がmRNAのように処理され輸送される可能性を高めることである。発現構築物のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に樹立されている。相同的ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物に使用されることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域はSV40初期ポリアデニル化シグナル由来であり、約400塩基から構成される。さらに、転写単位は、構築物由来の発現または構築物の安定性を改善させるために、他の標準的な配列を単独でまたは上記の配列と組み合わせて含有することが好ましい。bマーカーウイルスベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、また送達された後に発現しているかどうかを決定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態において、マーカーは選択可能なマーカーであり得る。哺乳類動物の細胞に適切な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼDHFR、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、ヒドロマイシンおよびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーを哺乳類動物の宿主細胞へ形質移入することが成功すれば、形質転換した哺乳類動物の宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合生存することができる。選択的方法の広く使用されている個別の分類には2つある。1つ目の分類は、細胞の代謝と、補充培地に依存せず増殖する能力を欠く突然変異細胞株の使用とに基づいたものである。この例の2つとして、CHODHFR-細胞およびマウスLTK-細胞がある。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素の添加なしに増殖する能力に欠けている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠損しており、欠如したヌクレオチドを補充培地において提供しない限り、生存することができない。培地を補充することの代替手段として、無傷のDHFRまたはTK遺伝子をこれら各遺伝子が欠如している細胞に導入し、それにより細胞の増殖必要条件を変更することである。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地で生存することができないだろう。2つ目の分類は、優性選択であり、これは任意の細胞型に使用され、突然変異細胞株の使用を必要としない選択スキームを表す。これらのスキームは典型的には宿主細胞の増殖を停止させる薬剤を使用する。新規の遺伝子を有する細胞は薬剤耐性を担持させるタンパク質を発現し、選択処理で生き残る。このような優性選択の例では、ネオマイシンSouthernPandBergPJMolecApplGenet1327、ミコフェノール酸MulliganRCandBergPScience2091422またはハイグロマイシンSugdenBetalMolCellBiol5410413の薬剤を使用する。この3つの例では、真核細胞による制御下において細菌遺伝子を使用し、それぞれ適切な薬剤G418もしくはネオマイシンジェネティシン、xgptミコフェノール酸、またはハイグロマイシンに対する耐性を担持させる。他にネオマイシン類似体G418およびピューロマイシンがある。5.医薬担体/医薬生成物の送達本明細書に記載のように、組成物は薬学的に許容される担体中においてインビボ投与することもできる。薬学的に許容されるとは、生物学的観点から、あるいは他の観点から、望ましくないものではない材料、すなわち、何らかの望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、それが含有されている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な相互作用をしたりすることなく、核酸またはベクターとともに被検体に投与され得る材料を意味する。担体は、当業者にはよく知られているように、活性成分の分解を最小限にし、被検体における有害な副作用を最小限にするよう選択されることは当然のことである。組成物は、経口、非経口例えば、静脈内、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経皮、体外、局所等による投与をすることができ、これは局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む。本明細書で使用される局所鼻腔内投与とは、1つまたは両方の鼻孔を通して鼻および鼻道に組成物を送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による送達、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を介した送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸器系の任意の領域例えば、肺に直接なされることができる。必要とされる組成物の正確な量は、被検体の動物種、年齢、体重および全般的な状態、処置されるアレルギー障害の重症度、使用される具体的な核酸またはベクター、その投与様式などに応じて各被検体により異なるだろう。従って、各組成物の正確な量を特定することは可能ではない。しかし、適切な量は、当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、ルーチン実験のみを使用して決定することができる。例えば、本明細書に開示された心臓人工多能性幹細胞を、組織損傷の部位、例えば梗塞周囲領域に非経口注射により投与することができる。それに応じて、本明細書において、被検体の損傷した心臓組織を減少させ、修復しかつ/または再生させ、または梗塞の大きさを減少させる方法であって、それを必要とする被検体に心臓人工多能性幹細胞iPSを投与することを含み、iPSを梗塞周囲領域に心筋内注射などの非経口注射を介して投与する方法を開示する。組成物の非経口投与が使用される場合は、一般的には注射である。注射剤を従来の形態において、すなわち液状の溶液もしくは懸濁液、注射前に液中で溶液もしくは懸濁液とすることに適した固体形態、または乳液として調製することができる。最近改良されている非経口投与の手法は、定用量が維持されるような徐放性システムまたは持続放出性システムの使用を含む。材料は溶液、懸濁液例えば、微粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれたものであってよい。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とし得る。以下の参照は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的指向化するこの技術の使用の例であるSenteretalBioconjugateChem2447451BagshaweKDBrJCancer60275281BagshaweetalBrJCancer58700703SenteretalBioconjugateChem439BattellietalCancerImmunolImmunother35421425PieterszandMcKenzieImmunologReviews1295780andRoffleretalBiochemPharmacol4220622065。ステルス型リポソーム、その他抗体がコンジュゲートしたリポソームなどのビヒクル結腸癌に対して薬剤を脂質媒介により標的指向化することを含む、細胞特異的リガンドを介したDNAの受容体介在型標的指向化、リンパ球誘導による腫瘍の標的化、およびインビボにおけるマウス神経膠腫細胞に対する非常に特異的な治療用レトロウイルス標的指向化。以下の参照は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的指向化するこの技術の使用の例であるHughesetalCancerResearch4962146220andLitzingerandHuangBiochimicaetBiophysicaActa1104179187。一般に、受容体は、構成的またはリガンド誘導性のエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリン被覆ピット内にクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に入り、受容体を選別する酸性化エンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームで分解されるかのいずれかとなる。内在化経路は、種々の機能、例えば栄養素の摂取、活性タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの制御に作用する。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの種類、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて、複数の細胞内経路をたどる。受容体介在型エンドサイトーシスの分子機構および細胞機構については概説されているBrownandGreeneDNAandCellBiology106399409。a薬学的に許容される担体組成物抗体を含むを、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療に使用することができる。適切な担体およびその配合物は、RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacyedARGennaroMackPublishingCompanyEastonPA1995に記載されている。典型的に、薬学的に許容される塩の適切な量を使用して、配合物を等張性とする。薬学的に許容される担体の例は、生理食塩水、リンゲル液およびブドウ糖溶液を含むが、それらに限定されない。溶液のpHは約5~約8が好ましく、約7~約7.5がより好ましい。さらなる担体は、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリクスなどの、持続放出性調製物を含み、このマトリクスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子のような成形物の形態である。例えば投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましくなり得ることは当業者であれば明らかであろう。医薬担体は当業者に知られている。これらは最も典型的には滅菌水、生理食塩水、および生理学的pHの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的な担体である。組成物を筋肉内投与または皮下投与することができる。他の化合物は当業者が使用する標準的な方法に従い投与される。医薬組成物は、選択の分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、表面活性剤などを含むことができる。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤など、1つ以上の活性成分を含むこともできる。医薬組成物は、局所処置が望ましいかあるいは全身処置が望ましいかということ、および処置される領域に応じて、多くの方法で投与され得る。投与は、局所投与眼、膣、直腸、鼻腔内を含む、経口投与、吸入による投与、または非経口投与であってよく、例えば、静脈内点滴、皮下、腹腔内あるいは筋肉内注射であってよい。開示された抗体を、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内または経皮投与することができる。非経口投与の製剤は、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液および乳液を含む。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール/水性溶液、乳液または懸濁液、ならびに生理食塩水および緩衝媒体を含む。非経口ベヒクルは塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、加乳酸リンゲル液または固定油を含む。静脈内ベヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤例えば、ブドウ糖リンゲル液系のものなどを含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなど、保存剤および他の添加物も存在し得る。局所投与の配合物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来型の医薬担体、水性、粉末もしく油性の基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合もある。経口投与の組成物は、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェまたは錠剤を含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合もある。組成物の中には、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として投与される可能性を有するものがあり、これらは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などの無機酸との反応、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などの有機酸との反応、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基との反応、およびモノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアミン、置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応により形成される。b治療用途組成物を投与するための有効な用量およびスケジュールは、経験的に決定することができ、このような決定は当業者の技量の範囲内である。組成物の投与のための用量の範囲は、症状/障害に作用する望ましい効果を得るために十分に大きいものである。用量は、有害な副作用、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー反応などを生じるほど大きいものであるべきではない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、あるいは他の薬剤が投与計画に含まれているか否かに応じて異なり、当業者により決定され得る。用量は、何らかの禁忌がある事象においては個々の医師が調節することができる。用量は変動することができ、1日または数日間にわたって、1日1回または複数回の投与を行うことができる。所与のクラスの医薬製品の適切な用量に関する手引きは文献中に見つけることができる。例えば、抗体の適切な用量選択の手引きは、抗体の治療用途についての文献、例えば、HandbookofMonoclonalAntibodiesFerroneetaledsNogesPublicationsParkRidgeNJch22andpp303357SmithetalAntibodiesinHumanDiagnosisandTherapyHaberetaledsRavenPressNewYorkpp365389に見つけることができる。心臓人工多能性幹細胞の典型的な用量は、上記の因子に応じて、50000~50000000個のiPSであり得る。例えば、投与用量は、細胞50000個、55000個、60000個、65000個、70000個、75000個、80000個、90000個、100000個、110000個、120000個、130000個、140000個、150000個、200000個、300000個、400000個、500000個、600000個、700000個、800000個、900000個、1000000個、10000000個または50000000個あるいはそれらの間の任意の量であってよい。従って、例えば、投与される細胞の量は細胞100000個~50000000個であってよい。投与される用量を1回または複数回の注射において適用することができることがさらに理解される。特に、被検体に、1、2、3、4、56、7、8、9または10回の注射を行って合計用量を送達し、それぞれの注射毎の細胞量を可算すると合計用量に達するように、それぞれの注射毎に送達される細胞量を適宜少なくする例について検討する。例えば、細胞50000個の用量が2回の注射で投与されるならば、細胞25000個の注射を2回することとなる。従って、例えば、被検体の心臓組織の損傷を減少させ、修復しかつ/または再生させる方法であって、それを必要とする被検体にiPSを投与することを含み、iPS50000個~500000個が被検体に投与される方法を開示する。さらに、被検体が2回の等量の注射例えば、2回の等量の心筋内注射でiPS50000個~500000個の用量を投与される方法を、本明細書において開示する。虚血/再かん流による傷害を処置し、抑制し、または予防するための、抗体などの開示された組成物の投与の後に、当該治療抗体の有効性について、当業者に公知の様々な方法で評価することができる。D.実施例以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される化合物、組成物、物質、デバイスおよび/または方法がどのように作製され、評価されるかについて、当業者が完全な開示および記載を得られるように提供されるものであって、純粋に例示を目的とし、開示を限定することを意図しない。数字例えば、量、温度などに関して正確性を確実にするよう努力がなされているが、いくらかの誤差および逸脱は考慮されるものとする。他に指示されない限り、部は重量部であり、温度は°Cで表されるかまたは雰囲気温度であり、圧力は大気圧であるかまたは大気圧付近である。1.実施例1これまで報告されてきた心筋細胞の分化は、マウスおよびヒトの線維芽細胞から生成されたiPS細胞からのものであった。本発明は、幹細胞様因子で形質移入した心臓細胞を利用した。以下の実施例は、iPS細胞を生成するためラットの心臓細胞を利用するが、本明細書における開示はヒトまたはげっ歯類の心臓細胞などの任意の他の心臓細胞および心室細胞とともに使用することができる。他の細胞の例として、市販のヒト初代心筋細胞またはヒト胎生細胞があり、例えばATCCバージニア州マナサスから入手できる細胞などがある。a細胞株の維持もともとはラット胎生心臓心室組織から単離されたものであるラット心筋芽H9c2細胞HescheleretalMorphologicalbiochemicalandelectrophysiologicalcharacterizationofaclonalcelllinefromratheartCircRes19916914761486KimesBrandtPropertiesofaclonalmusclecelllinefromratheartExpCellRes197698367381を、米国培養細胞系統保存機関ATCCから注文し、DMEM中で維持した。赤色蛍光タンパク質RFPを発現するH9c2細胞および未分化のマウスCGR8ES細胞を、以前報告されたようにSinglaetalFactorsReleasedfromEmbryonicStemCellsinhibitApoptosisinH9c2cellsthroughPl3kinaseAktbutnotERKpathwayAmJPhysiolHeartCircPhysiol295H907H913、ゼラチンプレート上で維持した。b形質導入したベクターおよびiPS細胞の生成Oct3/4、KlF4、Sox2およびc-MycをコードするcDNAを、ハイフィデリティDNAポリメラーゼおよびPCRプライマーOct3/45’-CACCATGGCTGGACACCTGGCTTC-3’および5’-GTTTGAATGCATGGGAGA-3’、Klf4:5’-ATGGCTGTCAGCGACGCTCT-3’および5’-AAAGTGCCTCTTCATGTGTAAG-3’、Sox2:5’-ATGTATAACATGATGGAGACG-3’およびTCACATGTGCGACAGGGGCAGTGT-3’、c-Myc:5’-TTCACCATGCCCCTCAACGTGAACTT-3’および5’-TTTATGCACCAGAGTTCG-3’を使用したPCRクローニングにより生成し、次いでベクターpCR2.1インビトロジェン、カリフォルニア州カースルバッドにクローン化した。KlF4、Sox2およびOct3/4のcDNA配列を、口蹄疫ウイルスの自己切断2A配列5’-AAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCA-3’を介して連結させた。2A配列を含有するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをベクターpBluscriptIISK-pBS、ストラタジーン、カリフォルニア州ラホーヤにライゲートし、さらなるクローニングに必要なベクターpBS-2Aを生成した。次に、Oct3/4およびKlF4のcDNAを独立してベクターpBS-2Aに挿入し、これによりpBS-Oct3/4-2AおよびpBS-KlF4-2Aを生成した。さらに、KlF4-2A配列を単離した後、pBS-Oct3/4-2Aの同じ読み取り枠に挿入し、pBS-Oct-3/4-2A-KlF4-2Aを形成した後、終止コドンを有するSox2cDNAの同じ読み取り枠にこれを融合させ、pBS-Oct-3/4-2A-KlF4-2A-Sox2を形成した。Oct3/4-2A-KlF4-2A-Sox2のcDNA断片をベクターから取り出し、発現ベクターpCX-EGFP日本国の岡部勝博士より入手のEcoRI部位にクローン化した。4つ目の遺伝子c-MYCのクローニングにおいては、Oct3/4-2A-KlF4-2A-Sox2-pCX-EGFPに存在するEGFPをc-MyccDNAと置き換えた。生成された最終生成物が、上述の4つの遺伝子を含有する発現ベクターであった。H9c2細胞を、10FBSを含有するDMEM中で、ウェル当たり細胞20000個の密度にて、6ウェルプレートで培養した。細胞を80の密集度に増殖させた後、製造者の使用説明書に従ってリポフェクトアミン2000インビトロジェンを使用して、Oct-3/4、Sox2、KlF4およびc-Mycを含有する発現プラスミドで形質導入させた。次の形質導入を3日目および5日目に行い、細胞を7日間インキュベーションし、培地を48時間毎に入れ替えた。iPS細胞に変換した形質導入済みH9c2細胞をトリプシン処理し、ゼラチン被覆プレートに入れ、上述のように幹細胞増殖培地で培養した。続いて、3週間後、これらの細胞はES細胞様コロニーを形成し始める。ES細胞様コロニーを抽出し、ES細胞培養培地およびマウス胚性線維芽MEF細胞から調製された馴化培地CM50:50中で、ゼラチン被覆プレートにおいてさらに培養した。さらに、iPSおよびH9c2細胞をRFP発現ベクターで形質移入し、安定したRFP細胞クローンを、抗生物質を用いて選択した。以前報告されたやり方SinglaSunTransforminggrowthfactorbeta2enhancesdifferentiationofcardiacmyocytesfromembryonicstemcellsBiochemBiophysResCommun2005332135141でウェスタンブロット法を実施し、H9c2細胞から生成された心臓iPS細胞内において形質導入した幹細胞性因子4Fの発現を検証した。つまり、iPSまたH9c2細胞対照を溶解し、遠心分離し、上清を単離した。タンパク質をSDS-Page10ポリアクリルアミドゲルで泳動し、PVDF膜上に移した。洗浄後、室温にて、一次抗体抗c-Myc、抗Sox2、抗Klf4および抗Oct3/4とインキュベーションし、続いてセイヨウワサビペルオキシターゼとコンジュゲートした二次抗体とインキュベーションした。インキュベーション後、増幅化学発光キットGEライフサイエンスを用いた反応をかなり進行させ、X線フィルムシグマコダックで撮影した。c多能性の決定生成したiPS細胞、ES細胞陽性対照またはH9c2細胞陰性細胞をPBSで5~7分間、2~3回洗浄した。洗浄後、細胞を、アルカリホスファターゼキットケミコンインターナショナル、米国を用いて製造者の具体的な推奨の通り染色した。次いで、細胞を明視野倒立顕微鏡により検査し、写真を鮮明に撮影した。免疫染色において、メタノール:アセトン7:3で20分間、-20°Cにて細胞を固定および透過処理し、ES細胞に存在する多能性マーカーであるOct-3/4に対する一次抗体とインキュベーションした。3回洗浄後、細胞を、AlexaFluor568がIgGにコンジュゲートされたものである二次抗体モレキュラープローブスとインキュベーションした。核を包埋媒体ベクターラボラトリーズ中に存在するDAPIで同定した。細胞をライカTSCSP2レーザー走査共焦点顕微鏡で検査した。次に、iPSまたはES細胞の標準的な懸滴法を使用して、胚様体EBを生成したが、これは、報告されたように3つ全ての胚層由来の細胞を含有するSinglaetalTransplantationofembryonicstemcellsintotheinfarctedmouseheartformationofmultiplecelltypesJMolCellCardiol200640195200WilesKellerMultiplehematopoieticlineagesdevelopfromembryonicstemcellsincultureDevelopment1991111259267。つまり、iPSまたはES細胞を、LIFの非存在下で、細胞2.5×104個/mlの濃度にて培養した。懸滴法を使用して、細胞600~750個を含有する細胞懸濁液30μlを細胞培養プレート内で2日間で懸滴に成長させた後、さらに2日間、プレートで懸濁培養した。次いで、各EBを抽出し、最大17日間、ゼラチン被覆プレート上に置いた。両群から生成されたEBを比較して多能性を決定し、かつ心筋細胞への分化に使用した。d梗塞発症マウスの心臓における細胞移植この試験で使用される動物プロトコールは、セントラルフロリダ大学の動物実験委員会で承認された。MIは報告されたように実施したSinglaetalTransplantationofembryonicstemcellsintotheinfarctedmouseheartformationofmultiplecelltypesJMolCellCardiol200640195200KumaretalDistinctmousecoronaryanatomyandmyocardialinfarctionconsequenttoligationCoronArteryDis2005164144。つまり、実験室でルーチン的に行われるように、雌雄8~10週齢C57BL/6マウスをイソフルランで麻酔し、左冠動脈下行枝を同定し、7-0縫合糸で結紮した。結紮後に変色を示した動物は梗塞発症動物と考え、細胞または媒体移植に使用した。結紮から数分以内に、梗塞周辺領域において、iPS細胞n=8、ES細胞n=8またはH9c2細胞n=8を、心筋内注射10μlそれぞれ、細胞25000個/注射、または細胞培養媒体n=8を含有するを2本行って移植した。2週間後、心臓機能を、論文に記載されているように心エコー検査を使用して決定しSinglaetalTransplantationofembryonicstemcellsintotheinfarctedmouseheartformationofmultiplecelltypesJMolCellCardiol200640195200WilesKellerMultiplehematopoieticlineagesdevelopfromembryonicstemcellsincultureDevelopment1991111259267KumaretalDistinctmousecoronaryanatomyandmyocardialinfarctionconsequenttoligationCoronArteryDis2005164144、ペントバルビタール80mg/kg、腹腔注射を使用した後に頸椎脱臼させることによって動物を屠殺した。心臓を単離し、緩衝ホルマリン液10中で固定し、さらなる分析を行った。e組織切片の調製および組織病理学検査以前に報告されているようにSinglaetalTransplantedembryonicstemcellsfollowingmousemyocardialinfarctioninhibitapoptosisandcardiacremodelingAmJPhysiolHeartCircPhysiol2007293H1308H1314、パラフィン包埋した心臓組織を5μmの厚さの切片にし、脱パラフィン化し、再水和化を行った。細胞形態および線維症を決定するため、次いで全ての心臓群からの切片をそれぞれヘマトキシリンエオジンおよびマッソントリクロームで染色した。心臓線維症おもに左心室LVに存在が観察され、imageJNIHプログラムを用いて、マッソントリクローム染色した切片における総青色領域/mm2を測定することによりこれを定量した。f分化した心筋の同定EBまたはEBのトリプシン化拍動領域の免疫染色を、以前に報告されているように行ったSinglaSunTransforminggrowthfactorbeta2enhancesdifferentiationofcardiacmyocytesfromembryonicstemcellsBiochemBiophysResCommun2005332135141。つまり、細胞を固定し、10正常ヤギ血清NGSでブロッキングした後、一次抗体、すなわち抗サルコメア心臓αアクチン1:100シグマまたはミオシン重鎖抗体MHC、MF-201:100ハイブリドーマテクノロジーズと室温RTにて1時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を二次抗体、すなわちヤギ抗マウスIgMまたはIgG1:75、インビトロジェンで処理した。最後に、切片をPBSで洗浄し、空気乾燥させ、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI;ベクターラボラトリーズを含有する退色防止ベクタシールド封入剤で封入し、全ての細胞核を染色した。H9c2細胞を陰性対照として使用し、ES細胞が陽性対照であった。切片を検査し、上記のように共焦点顕微鏡で撮影した。心臓切片を脱パラフィン化し、脱水し、10NGSとインキュベーションして非特異的結合をブロッキングした。手短に述べると、ドナー細胞、つまりiPS細胞、ES細胞またはH9c2細胞を検出するために、切片を一次抗体である抗RFPとインキュベーションした。心筋用に、一次抗体であるマウスmAb抗サルコメアαアクチンシグマで心臓切片を共標識した後、二次抗体である抗マウスもしくは抗ウサギAlexa568、またはFITCもしくはローダミンでコンジュゲートした抗マウスIgGM.O.Mキット、ベクターラボラトリーズとインキュベーションした。各染色の組には一次抗体または二次抗体を省略した対照切片を含ませた。切片を、DAPIを含有する退色防止剤で封入して全ての核を染色し、共焦点顕微鏡下において視覚化した。gアポトーシス心臓切片を脱パラフィン化し、脱水し、透過性とするために20分間室温にてプロテイナーゼKにさらした。市販のアポトーシス細胞死検出キットを米国、ロッシュアプライドサイエンスより入手した。心臓切片のアポトーシス核を検出するために、キットに備えられた小冊子に説明されている厳密な指示に従いアポトーシス染色を実施した。アポトーシスの量は、以前に報告されているように、6~8個の異なる心臓由来の1~2個の心臓切片内の赤いアポトーシス核を計数することにより決定したSinglaetalTransplantedembryonicstemcellsfollowingmousemyocardialinfarctioninhibitapoptosisandcardiacremodelingAmJPhysiolHeartCircPhysiol2007293H1308H1314。切片当たりのアポトーシス核の計数を、梗塞および境界帯域の4~6の無作為の選択された視野倍率20倍において、赤色染色されたTUNEL陽性核の合計を青色染色されたDAPI陽性核の合計で除することにより、陽性百分率に変換した。カスパーゼ3染色において、切片を、一次抗体である抗カスパーゼ3ウサギポリクローナル1:50希釈サンタクルーズバイオテクノロジーおよびセルシグナリングおよびサルコメア心臓αアクチンマウスモノクローナル抗体1:20;シグマで1時間、37°Cにて加湿チャンバー内で共標識した。3回の洗浄を行い、切片を抗ウサギAlexa635または抗マウスAlexa488二次抗体モレキュラープローブスとインキュベーションした。切片を、DAPIを含有する退色防止封入剤ベクターラボラトリーズで封入して核を染色した。切片を共焦点顕微鏡で検査した。カスパーゼ-3活性を、以前報告されたように、バイオビジョン比色アッセイを使用して行ったSinglaDKSinglaRDMcDonaldDEFactorsReleasedfromEmbryonicStemCellsinhibitApoptosisinH9c2cellsthroughPl3kinaseAktbutnotERKpathwayAmJPhysiolHeartCircPhysiol295H907H913FatmaSSelbyDESinglaRDSinglaDKFactorsReleasedFromEmbryonicStemCellsStimulateckitFlK1veProgenitorCellsandEnhanceNeovascularizationAntioxidRedoxSignal2010印刷版の前に電子版公開。各群のデータを平均±標準誤差として表した。一元配置ANOVAに続いてテューキー検定を行い、各群間の有意差p<0.05を評価した。2.実施例2:心臓iPS細胞を分析し、その多能性を決定した図1aおよびbは、H9c2細胞は長細いのに対し、4F発現ベクターを用いた形質導入後は、図1bに見られるように、これらの細胞は未形質導入のH9c2細胞図1aと比較して形態学的に異なって見えるようになることを示している。さらに、形質導入されたH9c2細胞の形態は、増殖中のマウスES細胞Singlaetalwnt3abutnotwnt11supportsselfrenewalofembryonicstemcellsBiochemBiophysResCommun2006345789795と類似していると見られた。形質導入後のH9c2細胞におけるクラスター形成の効率は0.008~0.01の間であった。続いて、増殖するクローンをモニターし、抽出し、MEF馴化培地を含有する細胞培養培地に維持した。生成したiPS細胞にこれらの4つの因子が存在するかを決定するためのウェスタンブロット分析のデータでは、図2に見られるように、iPS細胞がこれら4つの幹細胞性因子を発現していることを示すが、このような因子はH9c2細胞には存在しなかった。次に、生成したiPS細胞がアルカリホスファターゼおよびOct3/4などの多能性マーカーをも発現するかどうかを決定するために心臓iPS細胞を分析した。予測した通り、図3bおよびcに見られるように、iPS細胞は増殖細胞の100にアルカリホスファターゼを発現し、陽性対照として使用されたES細胞でも同様の発現が観察された。対照的に、図3aに見られるように、H9c2細胞はアルカリホスファターゼ染色について陰性であった。さらに、増殖するiPS細胞は未分化多能性マーカーOct3/4について陽性であり、これは図4a~dに見られるように陽性対照としてのES細胞と比較された。これらのデータは、生成したiPS細胞は再プログラムされ、多能性マーカーを発現し、ES細胞と同等であることを示唆する。3.実施例3:細胞培養のiPS細胞からの心筋細胞の分化ES細胞を用いて観察されるように、心臓iPS細胞が3つ全ての胚層由来の細胞を含有するEBを生成する可能性があるかを試験するため、EBを標準的な懸滴法を使用して生成した。iPS細胞から生成されたEBは、形態的、機能的に、ES細胞由来のEBと類似していたデータは示さず。次に、11日目の時点でEBが心筋細胞を生成する潜在的能力を決定した。iPS細胞から生成されたものでは自発的に拍動するEBが30観察され、それに比べてES細胞からのものでは27であり、両細胞型において同様な潜在的能力を有する心筋細胞が存在することが示唆されたデータは示さず。さらに、心臓特異的マーカーであるサルコメアαアクチンとリポータータンパク質RFPとの二重免疫標識を行い、心筋細胞の有無を決定した。iPS細胞またはES細胞から生成されたEBのいくつかは、心筋細胞の存在を実証するサルコメアαアクチンについて強く陽性であったサルコメアαアクチンは図5a、eおよびiに示し、レポータータンパク質RFPは図5b、fおよびjに示す。DAPIは全ての核を染色し図5c、gおよびk、合成画像により心筋細胞の分化を確認する図5d、hおよびl。次に拍動EBをトリプシン処理し、図6a~dに示されるようにサルコメアαアクチンで染色した。さらに、iPS-EBおよびES-EBにおいて、消化されたEBは別の心筋細胞特異的マーカーであるMHC抗体MF-20でも染色したが図7i~lおよびe~h、H9c2細胞はMF-20について陰性であった図7a~d。定量的データにより、心筋細胞の分化は、H9c2細胞では0であるのに比べ、iPS細胞およびES細胞から生成されたEBではどちらも25であったことが示唆された。それゆえ、心臓iPS細胞株は細胞培養において心筋細胞に分化する潜在的能力を有することが示唆された。4.実施例4:移植されたiPS細胞は心筋細胞に分化し、ギャップ結合を形成する抗RFPで染色した心臓切片より、C57BL/6マウスにおいて移植されたiPS細胞は心筋の梗塞周囲および梗塞領域に存在するが図9n、H9c2細胞移植された心臓には染色される細胞が存在しないことが実証された。次に、MIES細胞移植の心臓の抗RFP抗体染色は、心臓の梗塞周囲および梗塞領域に移植細胞がまばらに分布することを示した図9j。移植された細胞が心筋細胞に分化したかを確認するため、4つ全ての群をサルコメアαアクチン抗体で共標識し、移植された幹細胞が新たな心筋細胞に分化したことが示唆された図9i~p。しかし、H9c2細胞移植された群では、新たに生成された心筋細胞はほとんど認められなかった。定量的データにより、ES細胞移植された心臓では1.92±0.3の新たに形成された心筋細胞が存在していたのに対し、iPS細胞では2.37±0.3であったことが示された図10。iPS群およびES群の陽性分化心筋細胞の割合は、H9c2細胞群およびMI群と比べ有意に差があったp<0.05。しかし、iPS細胞群とES細胞群との間に統計的な差はなかった図10。次に、新たに生成された心筋細胞が天然の心筋との電気的カップリングを示すかを確認するため、心臓切片を、ドナーiPS細胞を検出するためにRFP、心筋細胞を検出するためにサルコメアαアクチン、およびギャップ結合を同定するためにコネキシン-43で、三重に免疫標識した。図11a~lは、新たに生成された心筋細胞がギャップ結合を形成し、電気的にカップリングし、心筋に組み込まれたことを示す。5.実施例5:移植されたiPS細胞はアポトーシスを抑制する移植されたiPS細胞の心臓アポトーシスに対する影響をTUNEL染色、カスパーゼ-3免疫染色、およびカスパーゼ-3活性により決定した。TUNEL染色のデータでは、MI群およびMIH9c2細胞群において広範囲に赤色のアポトーシス核が示されているのに対し図12aおよびd、MIiPS細胞群またはES細胞群では赤色のアポトーシス核の量が減少している図12gおよびj。DAPI染色した全ての核図12b、e、hおよびk、ならびに合成画像を図12c、f、iおよびlに見ることができる。定量的TUNELアポトーシス核により、MI群またはMIH9c2細胞群MI;1.2±0.1、MI±H9c2細胞;10.2アポトーシス核/切片、図13と比べ、移植されたiPS細胞がアポトーシス核を有意にP<0.05減少させた0.6±0.7ことが示された。さらに、移植されたES細胞はiPS細胞群と同様にアポトーシスを減少させた。TUNEL染色した心臓切片をカスパーゼ-3染色とも組み合わせて、細胞死がアポトーシス性のものであることを確認した。さらに、いくつかの切片では、3つ目の抗体でサルコメアαアクチンを共染色し、アポトーシスが心筋細胞で発生することを確認した。図14a~jにより、アポトーシス核がTUNELで染色され、カスパーゼ-3抗体で共標識され、さらにサルコメアαアクチンについて陽性であったことを確認し、アポトーシスが心筋細胞で発生することが示唆された。次に、アポトーシスの特質であると考えられるカスパーゼ-3活性を測定した。本データにより、iPS細胞またはES細胞移植後に、カスパーゼ-3活性はMIに比べ有意にP<0.05減少したが、H9c2細胞ではカスパーゼ-3活性の減少が見られないことが示された。さらに、カスパーゼ-3活性のデータはTUNELアポトーシス核染色によっても裏付けられており、心臓におけるアポトーシスが確認できる。6.実施例6:移植されたiPS細胞は線維症を抑制する移植されたiPS細胞またはES細胞が、有害な心臓リモデリングを抑制するか否かについて決定するために、組織学的検査を行った。幹細胞の有無に関わらず、移植された全てのマウス群の総間質性線維面積mm2を測定することにより、LVリモデリングを決定した。MI心臓およびH9c2細胞移植心臓が大きな線維面積を有するMI:0.94±0.03、およびMIH9c2細胞:0.9±07mm2のに比べ、iPS細胞およびES細胞を用いて移植を行った梗塞発症心臓から得られた心臓切片は線維症の有意なp<0.05減少を示しているMIiPS細胞:0.25±0.09、およびMIES細胞:0.21±0,05mm2。7.実施例7:奇形腫形成MI後にiPS細胞およびES細胞を用いて移植を行った全ての動物は、HE染色した切片を検査したところ、奇形腫形成のエビデンスを示さなかった図18。8.実施例8:移植されたiPS細胞は心臓機能を改善するLAD結紮後2週間の時点で行った心エコー検査により、左室内径短絡率について、MIES細胞群、MIH9c2細胞群、およびMI群MIES細胞;41±0.9、MIH9c2細胞;38±0.7、およびMI;31±0.9に比べ、iPS移植された心臓では有意な改善が示されたMIiPS細胞;45.4±0.7。さらに、ESおよびH9c2細胞の移植群は、MI心臓と比べ有意な差P<0.05があった。次に、左室収縮内径LVIDsが、MI群およびMIH9c2細胞群に比べ、MIiPS細胞群およびES細胞群で有意にP<0.05減少した。9.実施例9:考察本研究の目的は、ラット心臓iPS細胞を生成し、それらが梗塞発症心筋を修復し再生させる可能性を実証することであった。本研究は、4つの幹細胞性因子Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycを使用して、H9c2細胞もともとは胚性ラット心臓組織由来;HescheleretalMorphologicalbiochemicalandelectrophysiologicalcharacterizationofaclonalcelllinefromratheartCircRes19916914761486KimesBrandtPropertiesofaclonalmusclecelllinefromratheartExpCellRes197698367381から、ラット心臓iPS細胞の作製に初めて成功したものである。これらの心臓iPS細胞は、ES細胞と類似の特徴を数多く示し、それらの特徴には以下のものが含まれる;ES細胞様コロニーの形成、4つの幹細胞性因子の存在、アルカリホスファターゼおよびOct3/4の陽性染色、そしてEBを形成するという特性。心臓iPS細胞のデータは、ヒトの胚性細胞および成人線維芽細胞から生成したES細胞およびiPS細胞の未分化性の特徴により支持されるKumaretalEmbryonicstemcellsdifferentiationintocardiomyocytesandpotentialforheartrepairandregenerationCoronArteryDis200516111116ThomsonetalEmbryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocystsScience199828211451147ZhaoDaleyFromfibroblaststoiPScellsinducedpluripotencybydefinedfactorsJCellBiochem2008105949955。さらに、心臓由来H9c2細胞の再プログラミングの成功により、ヒト成人または新生児の単離された心筋細胞から心臓iPS細胞を生成する可能性が示された。また、インビトロおよびインビボでヒトまたはマウスのiPS細胞から心筋細胞を誘導したことについて得られていたデータは、4つの幹細胞性因子Oct3/4、Sox2、KlF4およびc-Mycを使用し、またはc-Mycを省略して、線維芽細胞から作製したiPS細胞に基づくものであるZhangetalFunctionalcardiomyocytesderivedfromhumaninducedpluripotentstemcellsCircRes2009104e30e41MartinezFernandezetaliPSprogrammedwithoutcMYCyieldproficientcardiogenesisforfunctionalheartchimerismCircRes2009105648656NarazakietalDirectedandsystematicdifferentiationofcardiovascularcellsfrommouseinducedpluripotentstemcellsCirculation2008118498506。本研究の目的は、ラット心臓iPS細胞が細胞培養において心筋に分化し、かつ移植後に梗塞発症マウスの心臓を修復し、再生させることができるかについて決定することであった。これに関しては、EBが発生し、iPS細胞由来の心筋が同調して拍動し、心筋細胞特異的マーカーであるサルコメアαアクチンおよびMHC抗体MF-20の染色が陽性であることが、確固として結論付けられた。このiPS由来の心筋細胞分化のデータを、既に確立されたES細胞の心筋生成モデルと比較し、確認したSinglaSunTransforminggrowthfactorbeta2enhancesdifferentiationofcardiacmyocytesfromembryonicstemcellsBiochemBiophysResCommun2005332135141。さらに、最近刊行された、細胞培養系におけるマウスおよびヒト線維芽iPS細胞由来の心筋細胞は、本研究で得られたデータとよく一致しており、心臓iPS細胞が心筋細胞に分化する能力を有することが強く示唆されるZhangetalFunctionalcardiomyocytesderivedfromhumaninducedpluripotentstemcellsCircRes2009104e30e41MartinezFernandezetaliPSprogrammedwithoutcMYCyieldproficientcardiogenesisforfunctionalheartchimerismCircRes2009105648656NarazakietalDirectedandsystematicdifferentiationofcardiovascularcellsfrommouseinducedpluripotentstemcellsCirculation2008118498506。しかしながら、ラット線維芽iPS細胞を生成してラット心臓iPS細胞と比較することが、いずれかの細胞が他の細胞型と比べて心血管細胞型に分化する上でより有利であるか否かを決定するためには依然として必要である。同様に、本研究は、組織特異的iPS細胞型からiPSを生成するという新たな道を切り開き、これは一般的な線維芽iPS細胞と対比される。組織特異的iPS細胞の生成が有利であるかについてさらなる研究が必要である。さらに、細胞が梗塞発症の心筋を再生する可能性を有するかを確認するために、移植された心臓iPS細胞のデータを証明するべきである。心臓iPS細胞は、梗塞発症の心筋に挿入されると多能性を失って本来の心筋中に植え付けられ、そこでは局所的な微小環境がこれらの細胞を心筋細胞に分化するよう誘導することを、上記データは強く示唆している。さらに、幹細胞移植試験においては、新たに分化した細胞が宿主心筋に組み込まれることができるかという懸念がある。上記データは、新たに形成された心筋細胞がコネキシン-43について陽性であり、電気的カップリングを示すことを示唆する。ヒト心筋細胞など患者に特異的な種々の成人細胞源からiPS細胞を容易に生成できるのであるから、心臓iPS細胞を使用したこれらの心臓再生データは重要である。さらに、移植された心臓iPS細胞の再生データは、ES細胞または線維芽iPS細胞を使用して梗塞発症の心臓において行われた試験と一致しているNelsonetalRepairofacutemyocardialinfarctionbyhumansternnessfactorsinducedpluripotentstemcellsCirculation2009120408416SinglaetalTransplantationofembryonicstemcellsintotheinfarctedmouseheartformationofmultiplecelltypesJMolCellCardiol200640195200BehfaretalStemcelldifferentiationrequiresaparacrinepathwayintheheartFASEBJ20021615581566。さらに、移植されたH9c2細胞は新たな心筋分化を示さなかった。これらのデータは、形質導入した心臓iPS細胞はH9c2細胞の元の特性を喪失しており、非形質導入H9c2細胞と比べて、梗塞発症の心臓を再生させるより優れた能力を有することを示唆する。移植されたESまたはiPS細胞は、免疫不全マウスに移植した後に奇形腫を形成する恐れがあり、これはES細胞の確立された特徴であるThomsonetalEmbryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocystsScience199828211451147ReubinoffetalEmbryonicstemcelllinesfromhumanblastocystssomaticdifferentiationinvitroNatBiotechnol200018399404。従って、奇形腫形成は、あらゆる器官においてES細胞またはiPS細胞の移植後の大きな制約となる。免疫不全マウスの梗塞発症の心筋に移植されたiPS細胞は腫瘍形成を示し、それに比べて免疫応答性マウスでは奇形腫形成が認められなかったことが最近報告されたNelsonetalRepairofacutemyocardialinfarctionbyhumanstemnessfactorsinducedpluripotentstemcellsCirculation2009120408416。本研究では、梗塞発症マウスの心臓に移植されたiPS細胞が、奇形腫形成のエビデンスを示すことなくうまく移植され、心筋細胞に分化し得ることが、確固として示されている。奇形腫形成の欠如の正確な理由は全く理解されていない。しかし、少ない数の心臓iPS細胞が移植されたため、細胞がMI後の心臓放出因子によりよくさらされ、これにより心臓細胞型に直接分化することに役立った可能性がある。対照的に、多数移植されたESまたはiPS細胞は、細胞クランプを形成し、これにより心臓細胞型分化よりむしろ幹細胞増殖を促進する内部幹細胞微小環境にこれら細胞がさらされ、奇形腫形成につながり得る。形質導入された癌原遺伝子であるc-Mycが、これらの心臓iPS細胞において奇形腫形成能を失ったかどうかを決定する他の指標はまだ知られていない。上記データは、少数のESまたはiPS細胞は奇形腫を形成しないことを示唆する過去に発表された研究と一致しているNelsonetalRepairofacutemyocardialinfarctionbyhumansternnessfactorsinducedpluripotentstemcellsCirculation2009120408416NussbaumetalTransplantationofundifferentiatedmurineembryonicstemcellsintheheartteratomaformationandimmuneresponseFASEBJ20072113451357SinglaEmbryonicStemCellsinCardiacRepairandRegenerationAntioxidRedoxSignal20091118571863。次に、MI対照に比べ、iPS細胞を移植された心臓において心臓機能の著しい改善が観察された。しかし、観察された機能改善は、新たに分化した心筋の数とあまり相関を示さない。これに関し、本研究を拡大して、移植されたiPS細胞が心筋アポトーシスおよび線維症を抑制するかどうかについて調べた。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、末期心不全へとつながるMIの進行に重要な役割を果たすことがすでに確立されているAnversaetalMyocytecelldeathandventricularremodelingCurrOpinNephrolHypertens19976169176。さらに、有害な心臓リモデリングには線維芽細胞増殖が関与し、これが死んだアポトーシス心筋と置き換わり、線維症の発症を引き起こし、最終的に心機能不全につながるAnversaetalMyocytecelldeathandventricularremodelingCurrOpinNephrolHypertens19976169176。本研究において、移植されたiPS細胞が梗塞発症の心臓の内因性心臓アポトーシスおよび線維症を著しく抑制することが示唆されている。本研究におけるアポトーシスおよび線維症の抑制は、これまでの幹細胞試験で観察された効果と類似しているようであるSinglaetalTransplantedembryonicstemcellsfollowingmousemyocardialinfarctioninhibitapoptosisandcardiacremodelingAmJPhysiolHeartCircPhysiol2007293H1308H1314WangetalCombiningpharmacologicalmobilizationwithintramyocardialdeliveryofbonemarrowcellsoverexpressingVEGFismoreeffectiveforcardiacrepairJMolCellCardiol200640736745WangetalChronicPreconditioningANovelApproachForCardiacProtectionAmJPhysiolHeartCircPhysiol2007292H2300H2305。このデータは、MIのアポトーシスおよび線維症の著しい減少は、梗塞発症の心臓における細胞移植が、自己分泌または傍分泌経路を介して有益な効果を発揮する一般的な現象であることを示唆する。それゆえ、移植されたiPS細胞も自己分泌または傍分泌因子を放出し、この因子はまだ未同定であるが、これがアポトーシスおよび線維症の抑制に主要な役割を果たすことが想定される。さらに、ES細胞またはMSCから放出される因子はアポトーシスを抑制するSinglaetalFactorsReleasedfromEmbryonicStemCellsinhibitApoptosisinH9c2cellsthroughPl3kinaseAktbutnotERKpathwayAmJPhysiolHeartCircPhysiol295H907H913GnecchietalParacrineactionaccountsformarkedprotectionofischemicheartbyAktmodifiedmesenchymalstemcellsNatMed200511367378GnecchietalEvidencesupportingparacrinehypothesisforAktmodifiedmesenchymalstemcellmediatedcardiacprotectionandfunctionalimprovementFASEBJ200620661669。しかし、この放出された因子は、報告されたように、特定の型の成長因子であるSinglaetalFactorsReleasedfromEmbryonicStemCellsinhibitApoptosisinH9c2cellsthroughPl3kinaseAktbutnotERKpathwayAmJPhysiolHeartCircPhysiol295H907H913GnecchietalParacrineactionaccountsformarkedprotectionofischemicheartbyAktmodifiedmesenchymalstemcellsNatMed200511367378GnecchietalEvidencesupportingparacrinehypothesisforAktmodifiedmesenchymalstemcellmediatedcardiacprotectionandfunctionalimprovementFASEBJ200620661669SinglaMcDonaldFactorsreleasedfromembryonicstemcellsinhibitapoptosisofH9c2cellsAmJPhysiolHeartCircPhysiol2007293H1590H1595。同様に、iPS細胞により放出される因子がES細胞またはMSCのものと同じであるか否かについて決定するためにはさらなる研究が必要である。全体として、本研究における心機能の改善は、新たな心筋細胞の形成ならびに有害な心臓リモデリングの抑制によるものであることが示唆される。結論として、ラットの心臓iPS細胞が多能性であり、細胞培養系において心筋細胞に分化することができ、梗塞発症の心筋を再生させることを、初めて報告する。これらの発見はさらに、梗塞発症の心臓に移植されたiPS細胞が、MIの2週間後、アポトーシスおよび線維症を抑制することを初めて提示する。移植されたiPS細胞の多因子的な効果が、新たな心筋の分化および心臓リモデリングの減少につながり、心機能改善に貢献する。"