哺乳動物由来の粘膜上皮細胞において、以下の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つを発現させる工程を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT、GLIS1前記粘膜上皮細胞が鼻粘膜上皮細胞である、請求項1に記載の方法。前記遺伝子が発現ベクターにより発現される、請求項1に記載の方法。前記発現ベクターが細胞質持続発現型RNAベクターである、請求項3に記載の方法。前記発現ベクターがセンダイウィルスベクターである、請求項3に記載の方法。前記遺伝子がOCT34、SOX2、KLF4及びcMYCである、請求項1に記載の方法。このような状況下、宿主細胞の採取に外科的処置を必要とせず、また、癌化の危険性の低い、iPS細胞の製造方法の開発が必要とされる。本発明者らは、外科的処置を必要としない試料採取法と遺伝毒性のないRNAウイルスベクターによる新たな手法を用いたiPS細胞を樹立することを目的して研究を進めた結果、被験者の鼻粘膜上皮を採取し、これらの細胞において初期化遺伝子を発現させることにより、外科的処置を必要せずにiPS細胞を作製することに成功した。また、本発明者らは、初期化遺伝子の発現に細胞質持続発現型RNAベクターを用いることにより、宿主である粘膜上皮細胞のゲノムDNAを無傷の状態に保ったまま初期化遺伝子を発現させ、これによって癌化リスクの低いiPS細胞を作製することに成功した。本発明は、これらの成功に基づくものである。すなわち、本発明は以下に関する。[1]哺乳動物由来の粘膜上皮細胞において、以下の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つを発現させる工程を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT、GLIS1[2]前記粘膜上皮細胞が鼻粘膜上皮細胞である、前記[1]に記載の方法。[3]前記遺伝子が発現ベクターにより発現される、前記[1]に記載の方法。[4]前記発現ベクターが細胞質持続発現型RNAベクターである、前記[3]に記載の方法。[5]前記発現ベクターがセンダイウィルスベクターである、前記[3]に記載の方法。[6]前記遺伝子がOCT34、SOX2、KLF4及びcMYCである、前記[1]に記載の方法。本発明の方法により、外科的処置を経ることなく、ドナー由来のiPS細胞を作製することができる。本発明の方法は、外科的処置を必要としないため、ドナーの負担が著しく低減される。このため、同一のドナーから、一回のサンプリングを行って、多くの粘膜上皮細胞を得ることが可能であり、ドナー1体からのiPS細胞の作製効率は従来法と比べても同等に有効である。また、粘膜は常に再生されているため、同一のドナーから、時期をずらして何回でも粘膜上皮細胞をサンプリングし、これを用いてiPS細胞を繰り返し作製することができる。さらに、本発明の方法では細胞質持続発現型RNAベクターを用いてもよく、この場合、初期化遺伝子は粘膜上皮細胞のゲノムDNAに取り込まれることがないため、作製されるiPS細胞は、従来の方法により作製されるiPS細胞と比較して、癌化するリスクが低く、再生医療に有用である。また、細胞質持続発現型RNAベクターを使用した場合、初期化遺伝子の発現が細胞質内に限定されるため、その発現は一過性のものとなり、iPS細胞誘導後には最終的に外来性の初期化遺伝子は除去されることになる。このため、本発明の方法により作製されたiPS細胞は、目的組織細胞に分化誘導を行う際に、外来性初期化遺伝子の発現による分化阻害を受けることがなく、この点からも、再生医療に非常に有用な材料であるといえる。本明細書においては、以下の略語を使用する。略語iPS細胞:inducedpluripotentstemcellsES細胞:EmbryonicstemcellsSeV:SendaiVirusMEF:mouseembryonicfibroblastSV40:SimianVacuolatingVirus40GFP:GreenFluorescentProteinMOI:MultiplicityofInfectionSNP:SingleNucleotidePolymorphism試薬SABM培地:SmallAirwayEpithelialCellsBasalMediumDMEM培地:DulbeccosModifiedEagleMediumDMEMF12培地:DulbeccosModifiedEagleMediumNutrientMixtureF12HAM11FBS:FetalBovineSerumKSR:KnockOutTMSerumReplacement遺伝子タンパクOCT34:OctamerbindingTranscriptionFactor34別名POUF5F1SOX2:SRYbox2SOX1SRYbox1KLF4:Krueppellikefactor4KLF2:Krueppellikefactor2KLF5:Krueppellikefactor5cMYC:cmyelocytomatosisviraloncogenenMYC:nmyelocytomatosisviraloncogenelMYC:lmyelocytomatosisviraloncogeneNANOG:NANOGhomeoboxhTERThumantelomerasereversetranscriptaseGLIS1GLISfamilyzincfinger1GDF3:Growthdifferentiationfactor3REX1:Reducedexpressiongene1DPPA2:Developmentalpluripotencyassociated2DPPA4:Developmentalpluripotencyassociated4GDPDH:Glyceraldehyde3phosphatedehydrogenaseSSEA3:Stagespecificembryonicantigen3SSEA4:Stagespecificembryonicantigen41.iPS細胞の作製方法本発明は、哺乳動物由来の粘膜上皮細胞において、少なくとも1つの初期化遺伝子を導入して発現させる工程を含む、人工多能性幹細胞の作製方法を提供する。初期化遺伝子初期化遺伝子の例としては、OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT、GLIS1が挙げられる。OCT34は、未分化状態のES細胞のマーカーとして報告される遺伝子であるNiwaHetalNatGenet243726。SOX2は、胚発生初期において発現する遺伝子であるが、神経幹細胞などにおいてもは発現が認められる遺伝子であるKamachiYetalTrendsGenet161827。本発明においては、SOX2遺伝子の代わりにSOX1遺伝子を用いることも可能であるYamanakaSCellApril3137pp1317。KLF4は、皮膚、胃、小腸及び骨格筋細胞内で発現していることが知られているGeimanDEetalNucleicAcidsRes28110613。本発明においては、KLF4遺伝子の代わりに、KLF2又はKLF5遺伝子を用いることも可能であるYamanakaSCellApril3137pp1317。cMYCは、種々の遺伝子の発現調節及びDNA複製に関与するDNA結合因子、即ち転写因子をコードする遺伝子であるが、MYC遺伝子の発現異常は、種々のがんとの関連性が示唆されているDominguezSolaDetalNature448pp445451。本発明においては、cMYC遺伝子の代わりに、nMYC又はlMYC遺伝子を用いることも可能であるYamanakaSCellApril3137pp1317BlellochRetalCellStemCell1pp245247。NANOGは、未分化状態のES細胞のマーカーであるNANOGタンパク質をコードする遺伝子であるChambersIetalCell11364355。LIN28は、タンパク質LIN28homologAをコードする遺伝子であり、当該タンパク質は、未分化状態のES細胞のマーカーとして知られているRichardsMetalStemCells225164。OCT34、SOX2、NANOG及びLIN28の4遺伝子を発現することにより、iPS細胞を誘導可能なことが報告されているYuJetalScience318pp19171920hTERTは、テロメラーゼタンパク質の活性サブユニットをコードする遺伝子であるKirkpatrickKLandMokbelKEurJSurgOncol2775460。SV40largeTは、ポリオーマウィルスSV40由来のヘキサマータンパク質をコードするガン原遺伝子であるAliSHandDeCaprioJASeminCancerBiol111523。hTERT及びSV40largeTの両遺伝子は、iPS細胞の誘導に寄与することが報告されているParkIHetalNature451pp141146。GLIS1は、GLIS1タンパク質をコードする遺伝子であり、GLIS1タンパク質は胚発達の特定段階において遺伝子発現のコントロールに重要な役割を果たすと考えられているKimYSetalJBiolChem2774188841896。皮膚線維芽細胞内でOCT34、SOX2、KLF4及びGLIS1を発現させることにより、iPS細胞を誘導可能なことが報告されているMaekawaMetalNatureJun8474pp2259OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT、GLIS1の各遺伝子は、イントロンを含むゲノム遺伝子、mRNA又はcDNAのいずれの形態にあってもよいが、好ましくはcDNAである。OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT、GLIS1の各遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIデータベースGenBankに下記のAccessionNumberで登録されている。一実施形態において、OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、cMYC、nMYC、lMYC、NANOG、LIN28、hTERT、SV40largeT又はGLIS1の各遺伝子は、上記表に記載のGenBankAccessionNumberに示されるポリヌクレオチドの塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換若しくは付加された変異体であり、かつ、各タンパク質OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、CMYC、NMYC、LMYC、NANOG、LIN28、HTERT、SV40LARGET若しくはGLIS1又はこれと同様の活性を有するタンパク質例えば、OCT34、SOX1、SOX2、KLF4、KLF2、KLF5、CMYC、NMYC、LMYC、NANOG、LIN28、HTERT、SV40LARGET又はGLIS1のタンパク質のアミノ酸配列と、0以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、991以上、992以上、993以上、994以上、995以上、996以上、997以上、998以上、又は999以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。粘膜上皮細胞本発明において、粘膜上皮細胞とは、粘膜層に含まれる上皮細胞を意味し、重層扁平上皮及び単層円柱上皮のいずれをも含み得る。粘膜上皮細胞の例としては、鼻粘膜、気管支粘膜、気管粘膜及び気道粘膜等に含まれる上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、粘膜上皮細胞は、鼻粘膜上皮細胞である。これら体表面に露出した粘膜に含まれる上皮細胞は、滅菌したブラシ又は綿棒等の適切な採取器具を用いて、個体から粘膜を採取し、その粘膜成分から公知の方法に従って単離することができる。例えば、滅菌したブラシ、セルスクレイパー又は綿棒により鼻腔、口腔、外耳道又は眼球表面より粘膜を採取し、ブラシ又は綿棒を適切な培養培地例えば、上皮細胞増殖因子EpithelialGrowthFactorを添加したSABM培地等に浸けてブラシ、セルスクレイパー又は綿棒に付着した細胞を回収する。回収した細胞を適切な培養ディッシュ例えば、コラーゲン、フィブロネクチン又はポリリジン等の接着分子でコーティングしたものであってもよい上で培養し、定期的に培養ディッシュを洗浄することにより、付着した細胞を粘膜上皮細胞として回収することができる。本発明において粘膜上皮細胞のドナーは、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはヒトである。遺伝子導入方法本発明において、初期化遺伝子を粘膜上皮細胞で発現させるには、当該遺伝子を適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターにより粘膜上皮細胞を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下のi~iiiを構成要素として含む。i哺乳動物由来の粘膜上皮細胞で転写可能なプロモーター;ii該プロモーターにinframeに結合した遺伝子;及びiiiRNA分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列各初期化遺伝子は、それぞれが個別の発現ベクターに組み込まれていてもよく、あるいは、複数が同一の発現ベクターに組み込まれ、それによって同時に発現されてもよい。哺乳動物由来の粘膜上皮細胞で転写可能なプロモーターの例としては、CMV、CAG、LTR、EF1α、SV40プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換された粘膜上皮細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、LacZ、GFPGreenFluorescenceProtein及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子HSVTK、ジフテリア毒素AフラグメントDTA等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換された粘膜上皮細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、前記マーカーに加えて発現ベクターがGFP等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、FACSFluorescenceActivatedCellSorter等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。粘膜上皮細胞への遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターの好ましい例としては、粘膜上皮細胞のゲノムDNAに取り込まれない発現ベクターが挙げられる。宿主細胞のゲノムDNAに取り込まれない発現ベクターを用いることにより、宿主細胞の癌化を回避することができるからである。また、リプログラミング完了後に、初期化遺伝子が残存することも併せて回避することができる。このような発現ベクターの例としては、プラスミドOkitaTetalScience322949953又は細胞質持続発現型RNAベクターが挙げられる。特に、細胞質持続発現型RNAベクターは、RNAウィルスベクターであるため、宿主細胞に対して強い感染力を有し、さらに、ゲノムDNAに取り込まれることがないため、宿主細胞の内在性遺伝子を破壊する恐れがないというメリットを有する。従って、宿主細胞を癌化させる危険性がないため、このような細胞質持続発現型RNAベクターを用いて誘導したiPS細胞は、再生医療に有用である。このような細胞質持続発現型RNAベクターの例としては、持続感染能を有するパラミクソウィルス由来のベクターが挙げられ、特に好ましくは、センダイウィルスベクターが挙げられる。iPS細胞の誘導を目的とした場合、複数の初期化遺伝子を同時に発現できる細胞質持続発現型RNAベクターが好ましい。このような条件を満たす細胞質持続発現型RNAベクターとしては、例えば、NishimuraKetalJBiolChemFeb1128647604771Epub2010Dec7、FusakiNetalProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85348362及びLiHOetalJVirol7465646569に報告されるベクターが挙げられる。あるいは、本発明の方法において、市販のベクター例えば、CytoTuneTM‐iPSDNAVECを用いてもよい。このような発現ベクターを、例えば、MOI=1~10、2~5、好ましくは3~4で粘膜上皮細胞に感染させることにより、当該粘膜上皮細胞内で初期化遺伝子を発現させることができる。粘膜上皮細胞のゲノムDNAへの初期化遺伝子の挿入の有無は、遺伝子導入後に粘膜上皮細胞のゲノムDNAについてSNPGenotyping解析を行い、ゲノムの欠損又は重複を解析することにより確認することができる。人工多能性幹細胞iPS細胞上記のように初期化遺伝子を導入した粘膜上皮細胞を、未分化状態の胚性幹細胞ES細胞と同様の条件下で培養することにより、最終的にリプログラミングされたiPS細胞を得ることができる。ES細胞の培養方法は公知であり、例えば、ヒト由来ES細胞の培養方法は、理研CDBヒト幹細胞研究支援室プロトコール、TakahashiKetalCellNov30131pp861872及びThomsonJAetalScienceNov6:282pp11451147に記載されている。具体的には、初期化遺伝子を導入した粘膜上皮細胞は、マウス胚性線維芽細胞MEF等のフィーダー細胞、LeukimeaInhibitoryFactorLIF若しくは塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF又はこれらの組み合わせの存在下で、適切な培養培地例えば、KSRを添加したDMEM培地中で維持培養し、iPS細胞へと誘導することができる。得られた細胞がiPS細胞としての特性を有するかどうかは、得られた細胞がES細胞と同様の生物学的特性を有することを検証することにより確認することができる。このような検証方法の例としては、顕微鏡を用いた細胞形態観察、幹細胞マーカー発現解析、遺伝子発現解析、メチル化解析、モデル動物への移植によるテラトーマ形成の観察等又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、幹細胞マーカー発現解析により、本発明の方法で得られた細胞がOCT34、SSEA4又はNANOG等の未分化ES細胞マーカーを発現しているかどうかを確認することができる。また、マイクロアレイを用いて得られた細胞の遺伝子発現パターンとES細胞の遺伝子発現パターンを解析し、両細胞の遺伝子発現パターンの相関性を分析することにより、得られた細胞が、ES細胞様の遺伝子発現パターンを示すかどうかを確認することができる。さらに、OCT34、SSEA4又はNANOG等の未分化ES細胞マーカー遺伝子のプロモーター領域のメチル化パターンをBisulfiteシーケンシングで解析することにより、得られた細胞のゲノムDNAが、ES細胞様の脱メチル化状態にあるかどうかを確認することができる。以上に挙げた方法により、本発明の方法により得られた細胞が、ES細胞と同様の生物学的特性を有することを検証することが可能である。また、本発明の方法により得られた細胞が、多分化能pluripotencyを有することを確認することも有用である。例えば、本発明の方法により得られた細胞を人工的に、複数種類の組織細胞へ分化誘導することにより、当該細胞の多分化能を検証することができる。例えば、上皮細胞、神経細胞、膵臓細胞、肝細胞、骨細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、上皮細胞、中皮細胞、造血幹細胞、血液細胞及び神経幹細胞から選択される組織細胞の2つ以上好ましくは3つ以上へ分化可能な場合には、本発明の方法に得られた細胞は、多分化能を有するものといえる。上記組織細胞への分化誘導の方法は、NishimuraYetalSTEMCELLS200624pp13811388及びFusakiNetalProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85348362を参照することができる。あるいは、本発明の方法により得られた細胞を、モデル動物に皮下移植し、テラトーマ形成の有無を観察することにより、当該細胞の多分化能を検証することができる。モデル動物の例としては、ヒトを除く哺乳動物が好ましく、特に免疫抑制された哺乳動物が好ましい。免疫抑制された哺乳動物の例としては、ヌードラット及びヌードマウスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。iPS細胞としての多分化能を確認するための方法は、公知であり、詳細については、例えば、TakahashiKetalNov30131pp861872に記載の方法を参照することができる。以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。[実施例1]鼻粘膜上皮細胞からのiPS細胞の樹立1.鼻粘膜上皮細胞の初代培養1培地の作製使用した培地は、以下の組成で調製した。2初代培養初代培養に用いた培地は、上記培地392mlにPenicillinStreptoMYCinSolutionStabilisedSIGMA800μlを加え、室温に戻して使用した。CytoSoftCytologyBrushMEDICALPACKAGINGを用いて、医師により鼻下甲介部位の鼻粘膜上皮細胞を採取した。60mmdishCorningにあらかじめ用意した室温の培地3mlに採取に使用したブラシを浸け、ブラシに付着した細胞を落とし、ピペッティングにより細胞塊をほぐした。この懸濁液をBiocoatCollagenICellwave35mmDishBDBiocoat1枚目にまき、さらに、細胞の回収率を上げるため、再度60mmdishに培地1mlを入れ、新たなBiocoatCollagenICellwave35mmDish2枚目にまいた。この工程をもう一度行い、細胞塊がほぐれているか顕微鏡で確認した後図2A:100倍率、37°C、5CO2で培養した。24時間後に観察し、細胞が接着していた場合、1枚目のBiocoatCollagenICellwave35mmDishから非接着細胞を回収し、新たなBiocoatCollagenICellwave35mmDish3枚目にまいた。その後、1枚目のDishに新たに培地を2ml加えた。この過程を48時間後に繰り返し、3枚目のDishから回収し、4枚目の新たなBiocoatCollagenICellwave35mmDishにまく。72時間後に2枚目、4枚目のDishの培地交換2mlを行った。以降、70~90confluent図2B:100倍率に達するまで中2日おきに培地交換を行った。細胞の増殖に応じて、適宜、培地添加量を増やした25以下:1ml5cm2、25~45:15ml5cm2、45以上:2ml5cm2。3鼻粘膜上皮細胞の継代タカラバイオ社製マニュアル正常ヒト細胞培養方法を参考とした。継代に使用する培地、試薬は室温に戻して使用した。細胞を培養したBiocoatCollagenICellwave35mmDishからSMBM培地をアスピレータにより吸引除去し、16mlのHEPESBufferedSolutionLonzaで細胞を洗浄し、HEPESBSSをアスピレータにより吸引除去した。続いて、064mlのTrypsinEDTA0025Trypsin001EDTALonzaを加え、Dish底面全体に行き渡らせ、顕微鏡で細胞の状態を観察しながら、細胞の約90が剥がれて丸くなるまで室温でトリプシン処理最大7分間を行った。この時、2分間隔で軽くDishを横と底面から叩いた。細胞が剥がれた後、128mlのTrypsinNutralizingsolutionLonzaを加え、剥がれた細胞を速やかに15ml用滅菌遠心チューブに移し、Dishを064mlのHEPESBSSで洗い、残りの細胞を遠心チューブに回収し、4°C、220gで5分間遠心した。上清を100~200μl程度残してアスピレータにより吸引除去し、タッピングにより細胞ペレットをほぐした。培地を加えて細胞を懸濁し、トリパンブルー染色トリパンブルー20μl細胞懸濁液20μl;2倍希釈によりBukerTurk型血球計数板で細胞数をカウントし、総細胞数生存率を算出した。細胞懸濁液を均一にし、70cells55mm2となるようCellCultureDish100mm×20mmCorningに播種し、37°C、5CO2のインキュベーターに移し均一に広げた後、培養を行った。以降、初代培養と同様70~90confluentに達するまで中2日おきに培地交換を行った。細胞の増殖に応じて、適宜、培地添加量を増やした25以下:1ml5cm2、25~45:15ml5cm2、45以上:2ml5cm2。4鼻粘膜上皮細胞の保存保存培地の調整極東凍結保存用培地FM1極東製薬工業株式会社とSABM培地を11で混和し、氷冷した。細胞を培養したCellCultureDish100mm×20mmから培地を吸引除去し、室温10mlのHEPESBSSで細胞を十分に洗浄し、吸引除去した。続いて、44mlのTrypsinEDTAを加え、Dish全体に行き渡らせ、細胞を顕微鏡で観察しながら、細胞の90が剥がれて丸くなるまでトリプシン処理最大7分間を行った。この時、2分間隔で軽くDishを横と底面から叩いた。細胞が剥がれた後、88mlのTNSを加え、剥がれた細胞を速やかに50ml用滅菌遠心チューブに移し、Dishを44mlのHEPESBSSで洗い、残りの細胞を遠心チューブに回収し、4°C、220gで5分間遠心した。上清を完全にアスピレータにより吸引除去し、保存培地FM1SABM培地1mlで泡立てないように懸濁した。この懸濁液20μlを氷冷していたトリパンブルー20μlに加え、BukerTurk型血球計算盤で簡単に細胞状態の確認を行った。氷冷していたセラムチューブCorningIncorporated2mlCORNINGに懸濁液を移し、セラムチューブをBICELLNIHONFREEZERに入れ、ディープフリーザー-80°Cに入れた。その後、BukerTurk型血球計算盤で細胞をカウントし、総細胞数、細胞生存率を算出し、翌日、出来るだけ迅速に液体窒素タンクに保存した。5凍結保存された鼻粘膜上皮細胞の起こし培地は室温に戻してから使用した。液体窒素タンクからセラムチューブを取り出し、浮きにさして37°Cの恒温槽に浮かべて振り、チューブ内の保存液が半解凍状態になった時にベンチ内に入れ、培地1mlを一滴ずつ加えた。セラムチューブ内の培地を50mlの遠心管に移し、培地10~20mlを一滴ずつゆっくり滴下し、4°C、220G、5分遠心した。上清を吸引除去したら培地1mlで懸濁し、20μl取ってトリパンブルーで2倍に希釈して血球計算板で生細胞数をカウントし、細胞数、細胞生存率を算出した。10mlの培地の入ったCellCultureDish100mm×20mmに70×104cells55mm2で細胞懸濁液をまき、37°C、5のCO2インキュベ内に移し、均一に広げた後、培養を開始した。5時間後に培地交換し、以降中2日おきに培地交換を行った。2.iPS細胞の樹立1使用試薬調整<MEFMouseembryonicfibroblast培養>解凍したFBSを56°C恒温槽で30分間温め、分注して-20°Cで保存した。解凍したFBSをDMEM培地500mlに加え、混和し、4°Cで保存した。PBS2mlをテルモシリンジ2mlにテルモカテラン針19G×112110×38mmで吸引し、MitomycinC2mgの入ったバイアルに注入し、混和した。テルモシリンジ5mlにテルモカテラン針090×70mmでDMSO5mlを吸引し、50mlチューブへ移し、そこへMEF用培地45ml添加し、よく懸濁し、氷冷した。400ml程度の超純水にGELATINTypeB500mgを加え、電子レンジで溶解した。超純水で500mlにメスアップし、オートクレーブにかけ、4°C保存した。<iPS培養>CaCl2147gに超純水10mlを加え、約1分ボルテックスし、1000rpm、1分で遠心した。その後、MillexGP33mmPES022μmSterile50pk日本ミリポアでろ過滅菌した。CollagenaseIV100mgをPBS10mlに加え、約1分ボルテックスし、1000rpm、1分で遠心した。その後、MillexGP33mmPES022μmSterile50pk日本ミリポアでろ過滅菌した。上記試薬を混和し、15mlずつ分注し、-20°C保存した。解凍後は4°C保存で1週間使用した。上記試薬を混和し、MillexGP33mmPES022μmSterile50pk日本ミリポアでろ過滅菌し、4°C保存した。上記試薬をフィルターシステムに入れ、ろ過滅菌し、4°C保存した。使用直前に01M2Mercaptoethanolを1μl培地1ml1000倍希釈で入れ、使用した。bFGF50μgにヒトES培地500μlを混和し、5μlずつ分注し、-20°C保存した。bFGF濃厚原液ストック25μlにDMEMF125mlを混和し、1mlずつ分注したものを4°Cで保存した。4週間以内に使用した。Acetamide059gを5ml程度のヒトES細胞用培地に溶解し、MillexGP33mmPES022μmSterile50pk日本ミリポアでろ過滅菌する。さらに、DMSO142ml、Propyleneglycol22mlを添加し、ヒトES培地で10mlにフィルアップしたものを適量ずつ分注し、-80°Cで保存した。数回の融解、凍結は可能。Y276325mgに超純水148mlを混和し、40μlずつ分注し、-20°C保存した。2フィーダー細胞MEFの準備MEFのマイトマイシンC処理workingstockの作成MEFは北山ラベスより購入した。1MEFを起こす15ml遠沈管にMEF用培地9mlを入れ、37°C恒温槽で温めておき、37°C恒温槽でMEFを半解凍した。温めた培地を遠沈管から1ml程度とり、MEFのチューブに添加し細胞を融解した後、遠沈管に素早く回収し、約170g、4°Cで5分間遠心後、上清を吸引し、MEF用培地5mlで懸濁した。細胞培養用10cmdishFalcon5枚にMEF用培地を各9ml入れ、細胞懸濁液を各1ml播種し、均一に広げた後、37°C、5CO2条件下で培養開始した。翌日、培地交換を行った。2継代PBSSIGMA、005Trypsin53mMEDTAsolutionInvitrogen、MEF用培地、1mgmlMitomycinCは37°C恒温槽で温めたものを使用した。コンフルエントになっているMEFの培養液を吸引し、PBS10mlで洗浄し、005TrypsinEDTAを3mldish添加した。37°C、5CO2条件下で5分間インキュベートした後、ディッシュを揺すって細胞を剥がし、細胞懸濁液を50ml遠沈管に回収した。さらに、MEF用培地を3mldish添加し、残りの細胞も遠沈管に回収し、約170g、4°Cで5分間遠心後、上清を吸引し、MEF用培地30ml6mldishで懸濁した。続いて、細胞培養用15cmdishFalcon15枚に、MEF用培地を各28ml入れ、細胞懸濁液をDishに各2ml播種した。均一に広げ、37°C、5CO2条件下で培養開始した。3MitomycinC処理コンフルエントになった細胞培養用15cmdish3枚から、培養液を15mlずつ遠沈管に回収し、遠沈管に1mgmlMitomycinCを900μl添加し、よく混和した後、再び2の細胞培養用15cmdishに15mlずつ戻した。これを培養ディッシュ15枚分、繰り返した。37°C、5CO2条件下で3時間インキュベートし、アスピレーターで培養液を吸引除去した後、DMEM25mldishでMEFを3回洗浄した。その後、MEF用培地25mlを入れ、37°C5CO2条件下で一晩培養した。4凍結保存PBSSIGMA、005Trypsin53mMEDTAsolutionInvitrogen、MEF用培地は37°C恒温槽で温めて使用した。また、10DMSOMEF用培地、凍結保存用cryogenicvialFalconは氷中で、BICELLNIHONFREEZERは4°Cで冷やして使用した。MEFの培養液を吸引し、PBS30mldishで洗浄し、005TrypsinEDTAを5mldish添加した。37°C、5CO2条件下で5分間インキュベートした後、ディッシュを揺すって細胞を剥がし、細胞懸濁液を50ml遠沈管に回収した。さらに、MEF用培地を5mldish添加し、残りの細胞も遠沈管に回収する工程を2回行った。よく混合後、50μl取ってBukerTurk型血球計算盤で細胞をカウントし、必要なMEFストック用培地量を算出した。その後、約170g、4°Cで5分間遠心後、上清を吸引し、ペレットをほぐすため軽くタッピングしたものにMEFストック用培地を必要量加え、ピペッティングした。この懸濁液を凍結保存用cryogenicvialに適量ずつ分注し、チューブをBICELLに入れ、容器ごと80°Cへ移し一晩置き、翌日に凍結保管場所に移した。iPS細胞の継代前日~当日に、必要量のMEFをゼラチンコートしたDish上に解凍し、フィーダー細胞として使用した。5MEFのMitomycinC処理workingstockの解凍MEF用培地は37°C恒温槽で温めて使用した。また、使用するDishにおいて01ゼラチン溶液を添加し5ml100mmDish、3ml60mmDish、1ml35mmDish、37°CのCO2インキュベーター内で30分以上静置し、使用直前にゼラチン溶液をアスピレーターで除去したものを使用した。15ml遠沈管にMEF用培地9mlを入れ、37°C恒温槽で温めておき、37°C恒温槽でMitomycinC済みMEFを半解凍した。温めた培地を遠沈管から1ml程度とり、MEFのチューブに添加し細胞を融解した後、遠沈管に素早く回収し、約170g、4°Cで5分間遠心後、上清を吸引し、適当な細胞濃度になるようMEF用培地を加え、懸濁した。適量MEF培地を入れた播種量培地=5ml60mmdish細胞培養用60mmdishFalconに細胞懸濁液を適宜播種し、均一に広げた後、37°C、5CO2条件下で培養開始した。翌日、培地交換を行った。本実施例では、以下の細胞濃度で使用した。遺伝子導入後の継代:15×105cells100mmdishコロニー単離:24‐wellpleteに47×104cellswell維持培養:40×105cells60mmdish3遺伝子導入1フィーダー細胞の準備細胞継代の前日予めゼラチンコートした培養ディッシュに15×105cells100mmdishになるようにMEFを播種し、翌日、MEF用培地を用いて培地交換を行った。2GFPによるSeV感染の確認遺伝子導入における条件検討およびSeV感染を確認するために鼻粘膜上皮細胞にGFPベクターを導入した。図3は、MOI3でSeV感染させた鼻粘膜上皮細胞の顕微鏡写真である100倍率。鼻粘膜上皮細胞を10×105cellsDishになるようにBiocoatCollagenICellwave35mmDishへ播種し、37oC、5CO2条件下で1晩培養した。翌日、-80°Cで保存されているCytoTuneTM‐iPSDNAVECのGFPベクター溶液のチューブ下端を37°C恒温槽で温めて半解凍後、速やかに氷中へ移した。SABM培地1mLの入った15mL遠心管に、ベクター溶液を適量加え、数回ピペッティングし、5分以内に用意した鼻粘膜上皮細胞の培地を吸引除去し、直ちにCytoTuneTM‐iPSSABM培地混液を1mlずつ静かに培養Dishそれぞれに添加し、全体によくなじませた。37°C、5CO2条件下で24時間培養後、SABM培地で培地交換を行った2mLDish。37°C、5CO2条件下でさらに5~6日間培養し、SABM培地を用いて毎日培地交換を行った。3初期化遺伝子の導入鼻粘膜上皮細胞を10×105cellsDishになるようにBiocoatCollagenICellwave35mmDishへ播種し、37°C、5CO2条件下で1晩培養した。翌日、‐80°Cで保存されているCytoTuneTM‐iPSDNAVECの各チューブ下端を順に37°C恒温槽で温めて半解凍後、速やかに氷中へ移した。SABM培地2mLの入った15mL遠心管に、そこに4種類のチューブOCT34、SOX2、KLF4、cMYCのベクター溶液を適量それぞれ加え106細胞に対しMOI3となる、数回ピペッティングし、5分以内に用意した鼻粘膜上皮細胞の培地を吸引除去し、用意したCytoTuneTM‐iPSSABM培地混液を1mlずつ静かに培養Dishそれぞれに添加し、全体によくなじませた。37°C、5CO2条件下で24時間培養後、SABM培地で培地交換を行った2mLDish。37°C、5CO2条件下でさらに5~6日間培養し、SABM培地を用いて毎日培地交換を行った。遺伝子導入の6~7日後、鼻粘膜上皮細胞の継代手順に従い、細胞を剥離回収した。細胞数を計測した後、予め用意したフィーダー細胞上に誘導した細胞を約10×105~20×105cells100mmdishになるよう重層し残りの細胞は、RT‐PCRによるSeVベクター検出の陽性コントロールに使用するため、凍結保存した、37oC、5CO2条件下で24時間培養後、ES細胞用培地4ngmlとなるようにbFGFも添加したに交換し、37oC、3CO2条件下で培養した。以降、同培地にて毎日培地交換を行った。4iPS細胞コロニーの単離1コロニーピックアップ用の培地調整コロニーの単離時に用いたES細胞用培地は以下の組成のものを用いた。2フィーダー細胞の準備コロニー継代の前日予めゼラチンコートした24‐wellpleteに47×104cellswellになるようにMEFを播種し、翌日、MEF用培地を用いて培地交換を行った。3コロニーピックアップコロニー培養Dishから培地を吸引除去し、PBSを10mldishで洗浄し、ES細胞用培地を5mldish加えた。続いて、P10ピペットマンを用いて顕微鏡下でコロニーをpickupし、予めES培地を20μlwell入れた96wellpleteに移した。この96wellpleteにES培地を180μlwell加え、20~30個程の細胞塊になるように顕微鏡下でピペッティングし、この細胞懸濁液をフィーダー処理済み24wellpleteに播種し、ES培地を300μlwell加えた。37°C、3CO2条件下で培養を始め、翌日、ES細胞用培地に交換し、以降同培地ROCK阻害剤不含にて毎日培地交換を行った。80~90confluentになった時点で6wellpleteに継代した。5iPS細胞の培養保存ヒト多能性幹細胞培養理研CDBヒト幹細胞研究支援室2008のプロトコールを参照した。1フィーダー細胞の準備予めゼラチンコートした60mmdishに40×105cells60mmdishになるようにMEFを播種し、翌日、MEF用培地を用いて培地交換を行った。2iPS細胞の維持培養継代コロニーが十分大きくなったヒトiPS細胞の培養Dishの培養液を吸引除去し、PBS培地の半量で1回洗浄し、解離液を400~500μl60mmdishで添加し、37°C条件下で5~7分程度インキュベートした。インキュベート後、MEF培地を1ml添加し、P1000のピペットマンにてコロニーを剥がしながら、適当な大きさに砕けるまで注意深くピペッティングし、細胞懸濁液を15ml遠沈管に回収した。再度、同じディッシュにES培地を35ml添加し、P1000のピペットマンにてピペッティングして回収し、先程の遠沈管と併せ計5ml程、4°C、約170g、3分間遠心後、上清を可能な限り吸引除去した。新しい培地5ml60mmdishに懸濁し、使用直前に培地を吸引したMEF培養ディッシュに細胞懸濁液を播種した。4ngmlとなるようにbFGFを添加し、37°C、3CO2条件下で培養開始し、以後、継代可能となるまで原則、毎日培地交換を行った。3iPS細胞の保存ガラス化法凍結保存液DAP213と凍結用保存バイアルは氷上で冷やしたものを使用した。コロニーが十分大きくなったヒトiPS細胞の培養Dishの培養液を吸引除去し、PBS培地の半量で1回洗浄し、解離液を400~500μl60mmdishで添加し、37°C条件下で5~7分程度インキュベートした。インキュベート後、MEF培地を1ml添加し、P1000のピペットマンにてコロニーを剥がしながら、適当な大きさに砕けるまで注意深くピペッティングし、細胞懸濁液を15ml遠沈管に回収した。再度、同じディッシュにES培地を35ml添加し、P1000のピペットマンにてピペッティングして回収し、先程の遠沈管と併せ計5ml程、4°C、約170g、3分間遠心後、上清を吸引除去した。再び遠心し170gに達したら止める、チューブ側面に残った培養上清を落とした後、上清を可能な限り除去し、氷上に置いた。凍結保存液を200μl凍結する細胞数に関わらず、凍結保存液の液量は200μlを細胞ペレットに加え、軽く1~2回ピペッティングして、凍結保存用チューブへ移し、すばやく蓋を閉めて、チューブの底部から23までを液化窒素に浸し、液化窒素中で十分に冷却し約1分程度、内部まで完全に凍結した。その後、凍結保存バイアルチューブは液体窒素に浸漬した状態のままを液化窒素タンクに移し保存した。4凍結保存iPS細胞の解凍15ml遠心チューブにES細胞用培地を9ml加え、37°Cの恒温槽で温めたものを用意し、細胞凍結チューブを凍結保管場所から出した後、すぐに液化窒素を入れた発泡スチロール容器に浮かべ、確実に保冷しながらクリーンベンチまで運んだ。凍結チューブを液化窒素から取り出し、37°Cに温めたES細胞用培地1mlを凍結チューブに加え、10回程ピペッティングを行い急速解凍し、細胞懸濁液を遠心チューブに移し、4°C、1000rpm170gで3分間遠心した。上清を可能な限り除き、適量の新しい培地5ml60mmdishに懸濁後、フィーダー細胞を播種しておいた培養Dishに5mlずつ移し、4ngmlとなるようにbFGFを添加し、37°C、3CO2条件下で培養を開始した。翌日、ヒトiPS細胞の細胞塊がDishに接着していることを確認後、培地交換を行った培地量5ml60mmdish。以後、継代可能となるまで原則、毎日培地交換を行った。[5]iPS細胞作製効率の計算得られたiPS細胞に対しギムザ染色あるいはクリスタルバイオレット染色を行った。以下の式に従って、iPS細胞の作製効率を求めた。作製効率=[染色されたコロニー数]×100[遺伝子導入に用いた細胞数]作製効率は、約008~01であった。MOI=4で10×105個の鼻粘膜上皮細胞にSeVを感染させた場合、作製効率は01図4A:ギムザ染色、0088、0079図4B左及び中央クリスタルバイオレット染色であり、MOI=3で10×105個の鼻粘膜上皮細胞にSeVを感染させた場合、作製効率は0075の作製効率であった図4B右クリスタルバイオレット染色。3.作製されたiPS細胞の評価1細胞形態観察樹立したiPS細胞の形態を顕微鏡を用いて観察し、写真撮影を行った。2SNPGenotyping解析[1]DNA抽出DNeasyBloodTissueKitQIAGEN、Cat:69504を用い、当該キットに添付のプロトコルに従って、凍結保存したiPS細胞及び回収したiPS細胞からDNAサンプルを抽出した。抽出後、NanoDropを用いてDNA濃度を測定し、抽出したDNAサンプルは-20°Cで保存した。[2]マイクロアレイHumanInfiniumHD610QuadBeadChipを用い、Invitrogen社のInfiniumHDAssaySuperManualEUC11294817Jプロトコールに従ってマイクロアレイ解析を行った。HumanInfiniumHD610QuadBeadChipにサンプルDNAを結合させ、IlluminaBeadScanで発光強度を測定した。データ解析はBeadStudioを用いて行った。3RTPCRによる幹細胞マーカー発現解析[1]RNA抽出RNeasyMiniKitQIAGENを用い、当該キットに添付のプロトコルに従って、凍結保存したiPS細胞及び回収したiPS細胞からRNAサンプルを抽出した。抽出後、NanoDropを用いてRNA濃度を測定し、抽出したRNAサンプルは-80°Cで保存した。[2]cDNA合成以下のMixtureを調製した。調製したMixtureを11μlずつ8連チューブにアプライし、抽出した各RNAを9μlずつ8連チューブに分注し、ゆっくり2~3回ピペッティングして混合し、サーマルサイクラーにセットし、以下の条件で反応させることにより、cDNAを調製した。42°C60min65°C10min25°C適宜[3]PCR反応上記で調製したcDNAを鋳型として、以下のプライマー及びPCR条件にてPCR反応を行った。ihOCT34Forward5’GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG3’配列番号15Reverse5’CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC3’配列番号16iihSOX2Forward5’GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG3’配列番号17Reverse5’TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG3’配列番号18iiihKLF4Forward5’ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC3’配列番号19Reverse5’TGATTGTAGTGCTTTCTGGCTGGGCTCC3’配列番号20ivhMYCForward5’GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC3’配列番号21Reverse5’TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG3’配列番号22vhNANOGForward5’CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC3’配列番号23Reverse5’CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC3’配列番号24vihGDF3Forward5’CTTATGCTACGTAAAGGAGCTGGG3’配列番号25Reverse5’GTGCCAACCCAGGTCCCGGAAGTT3’配列番号26viihREX1Forward5’CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT3’配列番号27Reverse5’GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA3’配列番号28viiihDPPA2Forward5’CCGTCCCCGCAATCTCCTTCCATC3’配列番号29Reverse5’ATGATGCCAACATGGCTCCCGGTG3’配列番号30ixhDPPA4Forward5’GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC3’配列番号31Reverse5’TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT3’配列番号32xhOCT34Forward5’CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG3’配列番号33Reverse5’AATGTATCGAAGGTGCTCAA3’配列番号34xihSOX2Forward5’ACAAGAGAAAAAACATGTATGG3’配列番号35Reverse5’ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG3’配列番号36xiihKLF4Forward5’ACAAGAGAAAAAACATGTATGG3’配列番号37Reverse5’CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC3’配列番号38xiiihMYCForward5’TAACTGACTAGCAGGCTTGTCGT3’配列番号39Reverse5’CCACATACAGTCCTGGATGATGATG3’配列番号40xivGAPDHForward5’CAGAACATCATCCCTGCCTCTAG3’配列番号41Reverse5’TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG3’配列番号42xvTransgeneおよびSeVゲノムの検出用プライマーCytoTuneTMiPSver10Forward5’GGATCACTAGGTGATATCGAGC3’配列番号43Reverse5’ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC3’配列番号44PCR条件条件1.使用したプライマーセット:hSOX2hKLF4hMYChNANOGhGDF395°C10min95°C30sec、56°C30sec、72°C60sec×35サイクル72°C7min4°C適宜条件2.使用したプライマーセット:hOCT34hSOX2hKLF4hMYCSeV95°C10min95°C30sec、54°C30sec、72°C60sec×35サイクル72°C7min4°C適宜条件3.使用したプライマーセット:hOCT34hDPPA2hDPPA495°C10min95°C30sec、56°C30sec、72°C60sec×40サイクル72°C7min4°C適宜条件4.使用したプライマーセット:hREX195°C10min95°C30sec、60°C30sec、72°C60sec×40サイクル72°C7min4°C適宜条件5.使用したプライマーセット:GAPDH95°C10min95°C30sec、60°C30sec、72°C60sec×35サイクル72°C7min4°C適宜RTPCRの増幅産物を2アガロースゲル電気泳動により分析した。4免疫染色による幹細胞マーカー発現解析CSTジャパン株式会社の免疫蛍光染色プロトコールメタノール透過処理に従って、iPS細胞の免疫染色を行った。一次抗体は、StemLite商標PluripotencykitCellSignalingCat:9656に含まれるものOCT4SOX2NANOGSSEA4TRA160TRA181を用いた。使用した二次抗体は、以下の通り。AntimouseIgGAlexaFluor488ConjugateHost;GoatAntirabbitIgGAlexaFluor568ConjugateHost;GoatAntimouseIgMAlexaFluor488ConjugateHost;GoatProlong登録商標GoldAntifadeReagentを用いて、蛍光強度を維持した。5遺伝子発現解析方法[1]RNA抽出上記項目3RTPCRによる幹細胞マーカー発現解析と同様に、iPS細胞、ES細胞及び鼻粘膜上皮細胞からRNAを抽出した。ES細胞は、筑波大学人間総合科学研究科の高崎真美助教よりRNA抽出用RLTバッファーに溶解した状態でご提供頂いた。[2]cRNA合成上記で抽出したRNAから、IlluminaTotalPrepRNAAmplificationkitIllumina、Cat:AM1L1791を用いてcRNAを合成した。[3]マイクロアレイ解析SentrixBeadChipArrayForGenExpressionHumanRef8V2BeadChipを用い、Invitrogen社のWholeGenomeGeneExpressionwithIntelliHybSealEUCRevB11226030Jプロトコールに従ってマイクロアレイ解析を行った。合成したビオチンラベルcRNAをBeadChipにハイブリダイズさせ、さらにCy3ストレプトアビジンで反応させた後BeadStation500X遺伝子解析システムを用いて蛍光強度を測定した。データ解析はイルミナ解析ソフトRを用いて行った。6メチル化解析[1]DNA抽出DNeasyBloodTissueKitQIAGEN、Cat:69504を用い、NeasyBloodTissueKitプロトコールに従って、iPS細胞、PS細胞、ES細胞及び鼻粘膜上皮細胞からゲノムDNAを抽出した。[2]Bisulfite処理EpiTectBisulfiteKitQIAGEN、Cat:59104を用いて、上記で抽出したゲノムDNAをBisulfite処理した。[3]Bisulfite処理後のPCR上記Bisulfite処理したゲノムDNAのNANOG遺伝子及びOCT34遺伝子をPCR増幅し、PCR産物をアガロース電気泳動により分離した。iNANOGの増幅AmpliTaqGold360MasterMixABI社及び以下のプライマーを用いて、NANOG遺伝子をPCR増幅した。プライマー:mehNANOGmehNANOGF1S5’TGGTTAGGTTGGTTTTAAATTTTTG3’配列番号45mehNANOGF1AS5’AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA3’配列番号46PCR反応条件は、以下の通り。95°C10min、[94°C30sec、568°C30sec、72°C1min]×45サイクル72°C10min25°C適宜iiOCT34の増幅PyromarkPCRKitQIAGEN及び以下のプライマーを用いて、OCT43遺伝子をPCR増幅した。プライマー:OCT43OCT43F5’ATTTGTTTTTTGGGTAGTTAAAGGTA3’配列番号47OCT43R5’CCAACTATCTTCATCTTAATAACATCCA3’配列番号48PCR反応条件は、以下の通り。95°C15minHotstart[94°C30sec、50°C30sec、72°C30sec]×45サイクル72°C10min25°C適宜[4]TAcloning上記でPCR増幅したNANOG遺伝子及びOCT43遺伝子をシークエンス解析するため、TOPOTACloningKitforSequencingInvitrogenを用い、それぞれTAクローニングした。NANOG遺伝子及びOCT43遺伝子をTAクローニングした各ベクターをそれぞれヒートショック法によりコンピテントセルDH5αCompetenthighTOYOBO、DNA903に導入し、形質転換及びミニカルチャーを行った。得られた形質転換体をLBAmpプレート上で一晩培養してコロニーを形成させた。[5]シークエンスする大腸菌の選択、PCR鋳型の調製コロニーPCR上記で形成させたコロニーに対し、コロニーPCRを行い、インサートチェックを行った。具体的には、複数個のコロニーをピックアップし、AmpliTaqGold360MasterMixキットABI及び当該キットに添付のプライマーM13Forwardprimer、M13Reverseprimerを用い、インサート配列部分のPCR増幅を行った。PCR反応条件は、以下の通り。95°C10min[94°C1min、55°C1min、72°C1min]×40サイクル72°C5min25°C適宜PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、インサートをチェックした。[6]シークエンス解析上記コロニーPCRにより得られたPCR産物インサートが確認されたものに対し、BigDyeTeminatorv11CycleSequencingkit、AmpliTaqGold360MasterMixキットABIに添付のプライマーM13Forwardprimer、M13Reverseprimer及びBigDyev11ABIを用いてシークエンス解析を行った。実験操作は、BigDyeTeminatorv11CycleSequencingkitのプロトコールに従って行った。シークエンス反応条件は、以下の通り。96°C1min[96°C10sec、50°C5sec、60°C4min]×25サイクル25°C適宜[7]メチル化解析ソフトウェアQUMAhttpqumacdbrikenjptopqumamainjhtmlを用いて、上記シークエンス解析の結果を比較し、NANOG遺伝子及びOCT43遺伝子のプロモーター領域のメチル化の状態を解析した。4.実験結果1細胞形態観察樹立したiPS細胞は、ヒトES細胞と酷似した細胞形態を有していた図5100倍率。2SNPGenotyping解析結果ランダムに抽出した7種類の細胞株について解析を行った。いずれの細胞株にも大きなゲノムの欠損は認められなかった。しかし、前記7株のうち2つの細胞株でゲノムの重複が認められた図6。図6において、赤丸で囲った部分が重複部位を示す。重複の認められた2株を除いた5つの細胞株iPSB2、iPSB3、iPS2B1、iPS3A2、iPS4B1について以下の3~6の評価実験を行った。3RTPCR結果ES細胞のマーカー遺伝子であるNANOG、OCT34、SOX2、KLF4、cMYC、GDF3、REX31、DPPA2、DPPA4がiPS細胞にも発現していることが確認された図7A。トランスジーンである4つの遺伝子OCT34、SOX2、KLF4、MYCとSeVベクター由来の遺伝子はSeVに感染後の鼻粘膜上皮細胞のみに発現がみられ、作製されたiPS細胞はSeVベクターフリーであることも確認された図7B。図7A及び図7Bにおいて、レーン1~9は、それぞれ鼻粘膜上皮細胞レーン1、SeV感染後の鼻粘膜上皮細胞レーン2、iPSB2レーン3、iPSB3レーン4、iPS2B1レーン5、iPS3A2レーン6、iPS4B1レーン7、ES細胞レーン8及び蒸留水DWレーン9に対応する。4免疫染色結果免疫染色を行った5株のiPS細胞iPSB2、iPSB3、iPS2B1、iPS3A2、iPS4B1の全てにおいて、6つの未分化マーカーNANOG、OCT4、SSEA3、SSEA4、Tra160、Tra181が発現していることが確認された図8。図8において、上段は蛍光染色画像赤:Alexa568、緑Alexa488、100倍率であり、下段は明視野画像100倍率である。上段の各蛍光染色画像と下段の各明視野画像は、それぞれ対応するiPSコロニーを示す。5遺伝子発現パターン結果樹立したiPS細胞と鼻粘膜上皮細胞の発現は相関がみられずr087又はr086、2つの遺伝子発現は異なる図9中央パネル。一方、樹立iPS細胞とES細胞の間には相関がみられr099、iPS細胞とES細胞の遺伝子発現パターンは類似する図9右パネル。また、樹立iPS細胞同士も類似の遺伝子発現パターンを示すr099:図9左パネル。観察された遺伝子発現パターンは、解析に用いた5株のiPS細胞iPSB2、iPSB3、iPS2B1、iPS3A2、iPS4B1の全てにおいて共通していた。6メチル化解析結果鼻粘膜上皮細胞ではNANOG遺伝子及びOCT34遺伝子のプロモーター領域にメチル化CpGが多く認められた図10。従って、体細胞である鼻粘膜上皮細胞では両遺伝子のプロモーター領域はメチル化された状態にあるといえる。これに対し、iPS細胞やES細胞ではNANOG遺伝子及びOCT34遺伝子のプロモーター領域に非メチル化CpGが多くみられる図10。従って、iPS細胞では、ES細胞と同様にNANOG遺伝子及びOCT34遺伝子のプロモーター領域が脱メチル化を起こしているといえる。図10において、黒丸領域は、メチル化CpGを示し、白丸領域は非メチル化CpG領域を示す。