"内胚葉細胞を肝細胞様細胞に分化誘導する、GSK-3阻害剤の使用方法。前記内胚葉細胞がヒト多能性幹hPS細胞に由来する、請求項1記載の使用方法。前記内胚葉細胞が誘導多能性幹細胞に由来する、請求項1記載の使用方法。前記内胚葉細胞が胚体内胚葉細胞である、請求項1~3のいずれか1項に記載の使用方法。前記内胚葉細胞が肝前駆体である、請求項1~4のいずれか1項に記載の使用方法。前記内胚葉細胞から肝細胞様細胞への分化がゼノフリー細胞を使用するゼノフリー状態の下で行われた、請求項1~5のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がWntシグナル経路を活性化させる、請求項1~6のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がHDAC阻害剤と共に使用される、請求項1~7のいずれか1項に記載の使用方法。前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムNaBである、請求項8に記載の使用方法。前記NaBの濃度が0.1mM~10mMであって、例えば0.05~5mMで好ましくは1mMで例えば1μM等である、請求項9に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤の濃度が0.01~50μM、0.1μM~10μM、例えば1~5μMである、請求項1~10のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤が、内胚葉細胞から肝前駆体への分化後に添加された、請求項1~11のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がGSK-3アルファ阻害剤又はGSK-3ベータ阻害剤である、請求項1~12のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤が以下のグループから選択される、請求項1~13のいずれか1項に記載の使用方法。グループ:BIO2’Z,3’E-6-ブロモインジルビンBromoindirubin-3’-オキシムoximeGSK3阻害剤IX;BIO-アセトキシムAcetoxime2’Z,3’E-6-ブロモインジルビンBromoindirubin-3’-アセトキシムacetoximeGSK3阻害剤X;5-メチルMethyl-1H-ピラゾールpyrazol-3-yl-2-フェニルキナゾリンphenylquinazolin-4-ylアミンamineGSK3阻害剤XIII;ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム錯体Pyridocarbazole-cyclopenadienylrutheniumcomplexGSK3阻害剤XV;TDZD-84-ベンジルBenzyl-2-メチルmethyl-1,2,4-チアジアゾリジンthiadiazolidine-3,5-ジオンdioneGSK3ベータ阻害剤I;2-チオThio3-ヨードベンジルiodobenzyl-5-1-ピリジルpyridyl-[1,3,4]-オキサジアゾールoxadiazoleGSK3ベータ阻害剤II;OTDZT2,4-ジベンジルDibenzyl-5-オキソチアジアゾリジンoxothiadiazolidine-3-チオンthioneGSK3ベータ阻害剤III;アルファalpha-4-ジブロモアセトフェノンDibromoacetophenoneGSK3ベータ阻害剤VII;AR-AO14418N-4-メトキシベンジルMethoxybenzyl-N’-5-ニトロnitro-1,3-チアゾールthiazol-2-ylウレアureaGSK-3ベータ阻害剤VIII;3-1-3-ヒドロキシプロピルHydroxypropyl-1H-ピロロpyrrolo[2,3-b]ピリジンpyridine-3-yl]-4-ピラジンpyrazin-2-yl-ピロールpyrrole-2,5-ジオンdioneGSK-3ベータ阻害剤XI;TWSI19ピロロピリミジンpyrrolopyrimidine化合物GSK3ベータ阻害剤XII;L803H-KEAPPAPPQSpP-NH2又はそれのミリストイル化フォームMyristoylatedformGSK3ベータ阻害剤XIII;2-クロロChloro-1-4,5-ジブロモdibromo-チオフェンthiophen-2-yl-エタノンethanoneGSK3ベータ阻害剤VI;アミノピリミジンAminopyrimidineCHIR99021;ケンパウロンKenpaullone9-ブロモBromo-7,12-ジヒドロdihydro-インドロindolo[3,2-d][1]ベンザゼピンbenzazepin-65H-オンone,SB2167633-2,4-ジクロロフェニルDichlorophenyl-4-1-メチルmethyl-1H-インドールindol-3-yl-1H-ピロールpyrrole-2,5-ジオンdione及びインジルビンlndirubin-3’-モノキシムmonoxime前記GSK‐3阻害剤がBIO2’Z,3’E-6-ブロモインジルビンBromoindirubin-3’-オキシムoximeGSK3阻害剤IXである、請求項1~14のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がケンパウロン9‐ブロモBromo‐7、12‐ジビトロ‐インドロ[3、2-d][1]ベンザゼピン-65H‐オンoneである、請求項1~15のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がSB2167633-2、4-ジクロロフェニルDichlorophenyl‐4‐1‐メチルmethyl-1H-インドロindol-3-yl-1H-ピロールpyrrole-ジオンdioneである、請求項1~16のいずれか1項に記載の使用方法。前記GSK-3阻害剤がインジルビンIndirubin‐3’‐モノキシムmonoximeである、請求項1~17のいずれか1項に記載の使用方法。GSK-3阻害剤を含む培養培地で培養している内胚葉を含む、前記肝細胞様細胞の準備方法。以下の培養表のいずれか一つに記載の、請求項19に記載の方法。表A表B表C表D表E表F表G以下を含む前記肝細胞様細胞の準備方法。a.GSK-3阻害剤を含む培養培地で培養している肝前駆体以下の培養表のいずれか1つに従った、請求項21に記載の方法。表H表I表J特定の肝細胞様細胞集団を増殖するための、請求項19~22のいずれか1項に記載の方法。ヒストンデアチラーゼHDAC阻害剤を含む1又はそれ以上の培養媒体である、請求項19~23のいずれか1項に記載の方法。前記ヒストンデアチラーゼHDAC阻害剤が酪酸ナトリウムNaBである、請求項24に記載の方法。GSK-3阻害剤を含む培地中の生体外で生成された肝細胞様細胞。GSK-3阻害剤なしの状態の下で取得された肝細胞様細胞と比較したとき、前記肝細胞様細胞が少なくともシトクロムP450活性の10以上の比、例えば13、例えば18、の酵素活性であることを示す、請求項26に記載の肝細胞様細胞。GSK3阻害剤及び生体外で生成された肝細胞様細胞を含む組成。ヒストンデアチラーゼ阻害剤をさらに含む請求項28に記載の組成。前記ヒストンデアチラーゼ阻害剤が酪酸ナトリウムNaBである、請求項29に記載の組成。少なくとも細胞の70が肝細胞様細胞である、生体外で生成されたヒト細胞の組成。細胞の少なくとも70、例えば75又は80、90、95が肝細胞様細胞である、請求項28~31のいずれか1項に記載の組成。生体外で生成された肝細胞様細胞がシトクロムP450活性を示す、請求項28~32のいずれか1項に記載の組成。GSK-3阻害剤の使用をまったくなしの状態の下で取得された肝細胞様細胞と比較して、前記肝細胞様細胞が、少なくともシトクロムP450活性の10以上の比、例えば13、例えば18の酵素活性を示す、請求項28~33のいずれか1項に記載の組成。前記酵素活性がシトクロムP4501Aによって測定された、請求項28~34のいずれか1項に記載の組成。前記肝細胞様細胞が肝細胞関連遺伝子の発現高進を示す、請求項28~35のいずれか1項に記載の組成。以下に挙げられたものから選択された肝細胞関連遺伝子である、請求項36に記載の組成:CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP7A1、MRP2。前記肝細胞様細胞がUGT活性を増加させることを示す請求項28~37のいずれか1項に記載の組成。本発明では、GSK阻害剤BIOGSK阻害剤IXを含むいくつかのWnt経路の調節剤は試験された。例Nejak-Bowenetal2008のような化学文献で開示され、その分野で良く知られているように、他のGSK-3阻害剤とシグナル伝達系signallingcascadeを果たす分子は、Wntシグナル経路の調節に関して類似する効果があることが示された。一般的な培養及び従来技術の例としては継続しているPCT/EP2004/005033、PCT/EP02/14895、PCT/EP2005/040582、PCT/EP2006/009697、PCT/EP2007/004940、PCT/EP208/059491の出願で開示されている。実施例の中で説明されているように、出発物質は胚体内又は胚体外分化系列への分化初期を経て由来するどんな多能性幹細胞からなっても良い。また、その出発物質は肝前駆体分化系列のどんな細胞でも良い。実施例1:フィーダー細胞上で維持されたヒト多能性幹細胞由来の肝細胞に関する出発物質全てのhPS細胞上記で定義されたようなは、この発明のための出発物質として用いることができる。以下の例のような特に肝細胞様細胞は、mEF細胞上で培養された生体外の未分化のヒト胚性幹細胞hESC由来であったHeinsetal2004,StemCells。この試験で用いられる細胞株は、hES細胞株SA002、SA121、SA181CellartisAB,Goeteborg,Swedenに限られずにでき、そして、Heinsetal.2004に記載のようにそれらを増殖させることができる。これらの細胞株はNIH幹細胞登録及びUK幹細胞バンク、ヨーロッパhESC登録でリストにされ、申請で利用可能である。hESCから取得されたhPSに加えて、hiPS誘導多能性幹細胞から取得されたhPS細胞発明は、この発明の実施例に関して肝細胞誘導が使われている。実施例2:GSK3阻害剤を使用するヒト多能性幹細胞からの肝細胞誘導肝細胞は図1のプロトコルによるhES細胞及びヒトhiPS細胞の両方に由来し、このプロトコルはヒト多能性幹細胞からヒト肝細胞様細胞への誘導の概要を提供する。最初の培地に加える前ID0~2日目に、その培養菌は二倍のPBSで徹底的に洗浄された。別の培地は、0日目ID0~1日目、2日目ID2~4日目、4日目と7~10日目の2、3日おきVH1、10~28日目の2、3日おきMMI又はMMIIに準備され、新たに加えられた。細胞は4日目で継代され、細胞濃度50,000-350,000cells/cm2例えば100,000-300,000cells/cm2、好ましくは200,000cells/cm2でリプレートreplateされる。分化初期IDステップ0~1日目RPMI16400.1PEST,1Glutamax1xB27100ng/mlアクチビンA1mMNaB2~3日目RPMI16400.1PEST1Glutamax1xB27100ng/mlアクチビンA0.5mMNaB肝前駆体ステップ3日目/-3.5μMGSK-3阻害剤例BIOVH14~9日目VitroHES1DMSO/-3.5μMGSK-3阻害剤例BIO成熟培地MMI10~30日目WMESQ-GA10001Glutamax0,1PEST10ng/mlOsM0.1μMDexM2ng/mlbFGF10ng/mlHGF0.5DMSO10mMニコチンアミドITS10μl/ml3ng/mlGlucagon/-1.5μMGSK-3阻害剤例BIO実施例3:実施例2及び図1に沿うが、成熟培地IMMIを成熟培地IIMMIIと入れ替える。成熟培地MMII10~30日目WMESQ-GA10001Glutamax0.1PEST10ng/mlOsM0.1μMDexM20ng/mlHGF0.5DMSO/-1.5μMGSK-3阻害剤例BIO実施例4:実施例2に沿うが、GSK3阻害剤を添加しない。実施例4はhESCがGSK3阻害剤なしで肝細胞様細胞に分化させられた制御プロトコルである。図2に沿うようにi~iv、図1のプロトコルの概要の変異体が試験された。分化の手順は以下の3段階であって、第一の分化初期段階の期間に、内胚葉細胞に類似する部分的に分化された細胞が形成され0~4日目、第二に部分的に分化された細胞が肝芽細胞/肝前駆体に分化され4~10日目、最後にその肝芽細胞は肝細胞様細胞に成熟させられる10~30日目。実施例4は図2iに図式的に描かれたように行われた。実施例5:実施例3に沿うが、GSK3阻害剤を添加しない。hESCsがGSK3阻害剤なしで肝細胞様細胞に分化させられる制御プロトコルとして含まれる。実施例5は図2iに図式的に描かれたように行われた。実施例6:図2iiで図式的に描かれた。実施例2に沿うが、3.5μMのGSK3阻害剤が3~10日目にのみ添加される。実施例7:図2iiで図式的に描かれた。実施例3に沿うが、3.5μMのGSK3阻害剤が3~10日目にのみ添加される。実施例8:図2iiiで図式的に描かれた。実施例2に沿うが、1.5μMのGSK3阻害剤が10~30日目にのみ添加される。実施例9:図2iiiで図式的に描かれた。実施例3に沿うが、1.5μMのGSK3阻害剤が10~30日目にのみ添加される。実施例10:図2ivで図式的に描かれた。実施例2に沿うが、3.5μMのGSK3阻害剤が3~10日目に添加され、10日目とプロトコルを通して1.5μMのGSK3阻害剤にかえられる。実施例11:図2ivで図式的に描かれた。実施例3に沿うが、3.5μMのGSK3阻害剤が3~10日目に添加され、10日目とプロトコルを通して1.5μMのGSK3阻害剤にかえられる。実施例12:フィーダーフリーのhES又はhiPS由来の肝細胞様細胞に関する培地及びサプリメント因子未分化hPS肝細胞様細胞の分化の開始前の細胞を洗浄する。第一の培地に添加する前の分化初期IDステップ0~2日目に、T150フラスコ中の未分化培養菌UDはPBS又はPRMI640で徹底的に2回洗浄される。その別の培地は常に0日目ID0~1日目、2日目、3日目、4日目ID2~4日目、4日目に準備され、新たに加えられた。次に、その細胞は新たにVH1培地の24ウェルプレートに表面を覆われたゼラチン-gelatine又はマトリゲルmatrigelにおよそ200,000cells/cm2の濃度で継代された。その成熟培地は7~10日目の毎第2日目又は第3日目及び10~28日目の毎第2日目又は第3日目のその時にかえられたBM2又はModII。実施例12には、この発明の制御として用いられ、図3Aに沿って行われるGSK3阻害剤BIOなしでの誘導が説明されている。分化初期IDステップ0~1日目RPMI16400.1PEST,1Glutamax1xB27100ng/mlアクチビンA1mMNaBID2~7日目RPMI16400.1PEST1xB27100ng/mlアクチビンA0.5mMNaB7日目にその細胞はTrypLEセレクトで継代される。その細胞は37°Cで3~7分間培養される。VH培地で希釈、洗浄され、300gで5分間回転させた。その後、その細胞は覆われた未使用のシャーレの上に播種された。VitroHES1ステップVH17~14日目VitroHESTMVH1DMSO成熟媒体BM2又は代わりにMMII実施例2で記載されたような14~28日目WMESQ-GA1000、1Glutamax0.1PEST10ng/mlOsM0.1μMDexM10ng/mlHGF0.5DMSO実施例13:図3Bに沿って行われる。実施例7に沿うが、1.4μMのGSK3阻害剤は14日目に添加される。実施例14:14日目に導入されるGSK3阻害剤及び7~9日目の間の分裂培地splitmediumで培養されたその細胞での誘導を記載している、図3Cに沿って行われる。分化初期IDステップ0~1日目RPMI16400.1PEST、1Glutamax1xB27100ng/mlアクチビンA1mMNaBID2~7日目RPMI16400.1PEST1xB27100ng/mlアクチビンA0.5mMNaB7日目にその細胞はTrypLEセレクトで継代される。その細胞は37°Cで4分間培養される。VH4培地で希釈、洗浄され、300gで5分間回転させたその後、その細胞は覆われた未使用のシャーレの上に播種された。分裂媒体SM7~9日目RPMIA0.1PEST1Glutamax10μl/ml100ng/mlaFGF5ng/mlbFGF50ng/mlBMP2200ng/mlBMP40.2FBSVitroHES1ステップVH19~14日目VitroHes1DMSO成熟媒体BM2又は代わりにMMII実施例2記載のように14~28日目WMESQ-GA1000、1Glutamax0.1PEST10ng/mlOsM0.1μMDexM2ng/mlbFGF10ng/mlHGF0.5DMSO10mMニコチンアミドnicotineamide10μg/mlITS3ng/mlグルカゴンGlucgon1.4μMBIO実施例15:GSK3阻害剤による肝細胞由来のhESCで培養されたmEF中のシトクロムP4501Aの誘導hESCsフィーダー細胞で培養されたhES細胞で培養されたMEFは実施例4、8、9に準じて肝細胞様細胞に分化され、そのため、成熟ステップ10~26日目の間の成熟培地I及びIIMMI及びMMIIそれぞれ実施例8及び9でのBIOの影響をBIOGSK3阻害剤実施例4なしにして比較している。第一の培地に添加する前ID0~2日目に、その培養菌はPBSで徹底的に2回洗浄された。別の培地が0日目DE0~1日目、2日目DE2~4日目、4日目及び7~10日目、他のすべての第3日目VH1、10~26日目、毎第2、第3の25日目MMI又はMMIIに準備され、新たに加えられた。別の培地の組成についての詳細な情報は、実施例4及び8、9を参照する。4日目に、その細胞は、次にhESC-HEPに分化される細胞の集密的な層を取得するために新しいシャーレに継代される。簡単にいうと、その細胞は酵素溶液Trypleセレクトで5~10分培養することによって培養ユニットから分離された。VitroHes培地は、酵素の効果を止める培養菌が添加された。その分離された細胞はチューブで移動され、300gで5分間遠心分離器にかけられる。その上澄みは処分され、VH1培地は次に単個細胞浮遊液に解離されたセルペレットを加えた。細胞がビルケルチャンバーBuerkerchamberで数えられ、1cm2あたり150,000から250,000個の細胞の細胞密度で培養ユニット例えば、24ウェルプレートに表面が覆われた0.1のゼラチンに播種された。16、18、20、21、25日目に、hESC-HEP培養菌は、0.1のペニシリンストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン及び25mMのヘペスHepesが補充されたフェノールレッドフリーウィリアムスE培地で、フェナセチン基質を最終濃度26μMに培養することによって、シトクロムP4501A活性に関して解析された。220μlに希釈された基質の体積volumeは24ウェルプレートの1ウェル毎に添加される。基質でhESC-HEP培養菌は翌朝まで培養される。16時間後、培地は集められそして続いて、10,000g、4°Cで20分間遠心分離される。サンプルは液体クロマトグラフィー質量分析LC-MSLCMSによってパラセタモール代謝物質の存在に関して分析され、p450シトクロム、Cyp1A2、1A1酵素によって生体内変換させられる。結果実施例8に従って1.5μMのBIOMMIBIOが補充された成熟培地Iで成熟させたhESC-HEPは、実施例4に従って培養制御より大きく拡張されたパラセタモールにフェナセチンを代謝できた図7A参照。それに加えて、1.5μMのBIOMMIIBIOの補充された成熟培地IIで培養されたhES-HEP実施例9は、Cyp1A活性に関するMMIBIO培養菌より、さらに良く行われる。この傾向は、16~18日目、20~21日目、25日目の全ての時点で実証されている。そのCyp1A活性は、BIOが取り扱われた2つのグループのときに増加し、GSK3阻害剤の存在する時間外の肝細胞様細胞の成熟を示している。そのCyp1A活性は、HepG2に類似するあるいはより大きいCYP1A2及びA1遺伝子発現水準を発見することによってサポートされる図7B参照。加えて、そのCYP1A2タンパク質はBIOの存在する中で成熟したhESC-HEP培養菌で発見された図7C参照。すなわち、GSK3阻害剤はhESC-HEP中のmRNA及びタンパク質水準の両方で、CYP1Aファミリーメンバーを機能的に発現させることを促す。CYP1A1は新生児の肝臓中で発現され、CYP1A2は新生児及び成人の肝臓中で発現されるとき、その結果は、肝細胞様細胞にhESCの分化及び成熟に重要な役割を果たすGSK3阻害剤を示す。実施例16:フィーダーフリー培養菌由来のPS細胞フィーダーフリー状態の下で培養されたhESCsはアクチビンAが補充された媒体で培養された。肝前駆体細胞とそれからよりいっそう成熟した肝細胞様細胞に分化させることによってその細胞はそれから肝細胞に誘導させられた。GSK3阻害剤ありとなしで培養された細胞は、それらの肝細胞の特性及び均一性に関して比較された。培養菌について詳しくは図3及び実施例12、13、14参照。この研究から、我々は、GSK3阻害剤BIOはその培養菌の分化、成熟、均一性に関して非常に重要であると結論を下すことができた。図4A及びBの結果を参照、代謝活性図4A及び肝細胞遺伝子マーカー発現図4Bの両方がGSK-3阻害剤にさらされた中でより高い水準であったため、その結果、フィーダー細胞上で最初に維持されたhPS由来のhESC-HEPsに匹敵した。BIOの取り扱いが、BIOの取り扱い上、ベータカテニンが細胞膜から核に移動が見られる図4Cに示されたWnt経路に影響している証拠は、Wnt経路のシグナルの役割と矛盾しない。実施例17:hiPS由来の肝細胞様細胞の誘導培養及び誘導は図3に沿って実施例12~14に記載されたように行われたが、フィーダーフリーhPS細胞をhiPS細胞と入れ替えた。未分化のhiPS細胞は部分的に分化された細胞への初期分化を促す媒体が補充されたアクチビンAで培養された。部分的に分化された細胞由来のhiPSは次に0.1のゼラチン又は0.016mMマトリゲルで表面を覆われたプレートに継代され、肝前駆体細胞に誘導され、そしてそのときBIO補助剤ありとなしの媒体で肝細胞様細胞に誘導された図3AB参照。この研究の結論は、BIOで補充された媒体で成熟したhiPS細胞はGSK-3阻害剤なしで成長した細胞と比較して、より成熟し、大きな反応をしたことである。これはQ-PCR免疫細胞化学及び活性検査によるその細胞の発現プロファイル分析によって結論付けられた図5。これらの結果は検証すると、我々がフィーダーフリーの方法で培養されたmEF及びhES上で培養された両方のhESに関して測定したことと一致する図4。そのhiPS細胞は密集するまでmEFs上で培養された。その細胞はPBS/で2回洗浄され、培地を含んでいるアクチビンAと共に取り扱われた図3a-b参照。その細胞は3日目中モルホロジーのような内胚葉endodermlikemorphologyに適応した。その細胞の大部分が部分的に分化させられたとき、その細胞は肝細胞様細胞図3A-B参照±BIOに細胞を誘導する因子が補充された媒体にさらされていた。別のマトリックス:ゼラチン及びマドリゲルは結果にほとんど影響を与えなかった。BIOはCYPsCYP1A2を含む成熟した肝細胞に関していくつかのマーカーを発現上昇させたという点で、その細胞に著しい影響を与えた。また、BIOと共に取り扱われたhESC-HEPSはより代謝活性させることも示した図5A。結果肝細胞様細胞プロトコルの成熟フェーズにおいてのBIOの結論:BIOなしの制御と比較してCYP1A活性を増加させた。BIOなしの制御と比べてCYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP7A1、MRP2、CD44、AFP、CK18、CK19活性のmRNAを増加させた。図3cのような肝細胞様細胞プロトコルの成熟段階の分裂培地splitmediumSM及びBIOの使用の結論。図5に結果の図が示されている。BIOなしの制御と比較してCYP1A及びCYP3A活性を増加させた。BIOなしの制御と比較してCD44、AFP、CK18、CK19、CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP7A1、アルブミンAlbumin,OATP2、A1AT、MRP2活性のmRNAを増加させた。実施例18:hES細胞由来の肝細胞の均質集団homogenouspopulationをもたらす、GSK3阻害剤BIOを使用する選択的な分化図2ii、iv3日目からBIO存在に沿って実施例6及び11に従って、肝細胞様細胞に分化したhESCで培養されたMEFは、3日目からBIOを扱った培養菌中の肝細胞様細胞の純化が実証された、図2i、iiiそれぞれ10~30日目から添加されたBIOとBIOなしに沿って実施例4及び8Dによって分化した肝細胞様細胞と比較された実施例6及び11。形態の観察は図8で図解されている。BIOのなし又は低い濃度1μMの培養菌は、図8A及びBで示されるように肝細胞様細胞は滅多に測定されない、高度に不均質の培養菌をもたらす。まず第一に、3日目の5μMのBIOの添加は劇的な細胞死をもたらした。しかしながら、4日目に生存細胞DE細胞及び/又は前方内胚葉細胞は新たなウェルに継代され、高度に純化され、そしてhESC-HEPの同質の培養菌は分化過程が進行したときに現れた図8C参照。BIOの中間濃度3.5μMは三日目実施例11から培養菌中で試験され、未処理の培養菌実施例9と比較して、hESC-HEPをより純化させる結果をもたらした。加えて、より少ない劇的な細胞死は3日目から5μMのBIOで成長させた培養菌と比較して計測された。したがって、分化末期段階にGSK-3阻害剤を添加することは、3日目に添加したとき見られた大量の細胞死をさけるために利点がある。さらに、細胞集団の純化の結果図8、純度表はまた、末期段階10日目で少なくともBIOの添加は最終純度をより良くすることを示す。データはDE細胞及び/前方内胚葉細胞の選択においてのGSK3阻害剤の役割、肝芽細胞及び次に肝細胞様細胞にさらに分化するための必須条件を示す。加えて、この段階でGSK3阻害剤は適格性のある内胚葉の肝細胞誘導に役立つ/を促してもよい。実施例19:HDAC阻害剤は肝細胞分化を誘導及び刺激するWntシグナルを増強する図9は成熟媒体例えば、HDAC阻害剤で補充されたMMI、GSK3阻害剤と一緒に酪酸ナトリウムNaB,1mM、21~25日目で1.4μMのBIOで分化したhESC-HEP培養菌肝細胞様細胞中の機能的なCYP1A活性のデータを実施例14に記載されたような下記のプロトコルで示している。mEF培養菌由来の細胞株SA002は出発物質として使われていた。それらのhESC-HEP培養菌は、培養菌を含むNaB中のCYP1A活性を増加させる成熟媒体のNaBなしの同様のhESC-HEP培養菌と比較された。データはHDAC阻害剤例えばNaBの転写を媒体にしたWntシグナルの強化や肝細胞分化への作用をするために果たす役割を示している。実施例20:肝細胞分化初期にGSK3阻害剤にさらすことはhESC-HEPの肝臓遺伝子発現プロファイルを改善する実施例9、図2、プロトコルiii3~10日目の間BIOなし又は実施例11、図2、プロトコルiv3~10日目の間3.5μMのBIOありに従って、hESC-HEPは細胞株mEF層上のSA002培養菌から生じた。21、24、26、28日目にキアゲンQiageneのRNA分離キットを使用することでRNAの合計が2つのhES-HEP培養菌から集められ、分離させられた。Taqmanプローブの使用によって、定量的逆転写酵素PCR、QrtPCR、は、以下の肝細胞マーカー遺伝子に対して行われる:フェーズI薬物代謝酵素;CYPシトクロムcytochromeP4503A4、3A7、2C9、フェーズII薬物代謝酵素GSTA1glutation-S-transferasA1、UGT2B7UDPグルクロノシルトランスフェラーゼglucuronosyltransferase2B7、フェーズIII、輸送体;MRP2多剤関連性タンパク質2、B胆汁酸トランスポーターそして一般的な肝細胞マーカー;A1ATアルファ-1-アンチトリプシン、ALBアルブミン、TATチロシンアミノトランスフェラーゼ。全データはハウスキーピング遺伝子CREBにノーマライズされた。Hep2培養菌由来のRNAは含まれ、そしてデータはHepG2の比として表される。BはHepG2細胞がその遺伝子を発現しないので例外である。したがって、B発現は、異なるソース由来のRNAを含むいわゆるキャリブレーターの比として代わりに表される。データは図10A~Dに表され、CYP3A7を除く全ての遺伝子はBIOが3~10日目から除かれた培養菌より、3日目からBIOにさらされたhESC-HEPのほうが高水準で発現されることを示している。CYP3A7に関しては、その反対が測定された。CYP3A7は出生前に主に発現される薬物代謝酵素であり、新生児及び成人の肝臓中のCYP3A4であるので出生前後、成人の両方のCyp3A5、CYP3Aファミリーメンバーの発現パターンは、初期の分化プロトコルでBIOは肝細胞分化の改良及びWntシグナルを刺激することによってhESC-HEP培養菌をより成熟させることに役立つための役割を果たすことを示している。培養菌にさらされたBIO中の肝細胞マーカーの改良された発現水準は、GSK-3阻害剤がhESCの肝細胞分化初期に重要であることの発見をサポートしている。実施例21:肝細胞分化初期の間にGSK-3阻害剤にさらされたhESC-HEPs中のUGT代謝活性の改良フィーダーフリーの状態実施例12~14参照で培養されたhESCs由来のhESC-HEPの代謝活性はいくつかのUDP-グルクロニルトランスフェラーゼUGTs多数の薬物代謝に関与する酵素の活性を試験することによって発生及び成熟の間のGSK-3阻害剤の効果を決定するために測定された。これらのUGTs活性はいくつかの基質を用いて試験された。すなわち、βエストラジオールUGT1A1、3-グルクロニド、1-ナフトールUGT1A6、プロポフォールUGT1A9、ナロキソンUGT2B7。また、非特異的な制御メチルウンベリフェロンには、hESC-HEPsが7日目までに原則実施例12にしたがって分化されたことが含まれた図12参照。この点で、細胞は3つのプロトコルの内1つで取り扱われた。3つのプロトコルはそれぞれ、プロトコル17日目から14日目のVH1培地、14日目から25日目のBM2成熟培地、14日目から25日目のBIOが限って存在する、プロトコル27日目から25日目のBM2培地、14日目から25日目のBIOが存在する、プロトコル37日目から14日目のMMI培地、14日目から25日目のMMII成熟培地であって、それぞれ、1.4μMの濃度で/-GSK3阻害剤このケースではBIOを用いる。明確な傾向は、発生の間でGSK-3阻害剤が取り扱われた細胞の活性をより向上させるUGTsのほとんどで、見られることができる。そしてこの傾向は3つの分化プロトコルの全てにわたってみられる。いくつかのUGTs例えば、UGT1A1については、増加の度合いは他のものよりはるかに大きいが、全体の傾向としては、細胞をGSK3阻害剤にさらすことによって、全ての好ましい分化方法に適したより成熟した、代謝活性な表現型となる。実施例22:より分化の末期段階でBIOを除くGSK-3阻害剤を使用しているWntシグナルの調節によってhESC-HEPs中の初期及び末期の段階の肝細胞マーカーの誘導hESC-HEPsは原則として実施例9、図2iiiの記載に由来しているが、代わりのBIOを除くGSK3阻害剤は以下に示すことに使われる。他のGSK3阻害剤は内胚葉から肝細胞マーカー遺伝子の発現を誘導するための肝細胞に分化する間、BIOと交互に用いられることができ、Wntシグナル経路を調節できる。その上、分化細胞は分化の末期10日目から段階に限りGSK-3阻害剤にさらされていた。GSK-3阻害剤に変わる3つは、BIOとともに、肝細胞マーカー発現SB216763、ケンパウロン及びインジルビン-3-Oを誘導する効果を判定するために試験され、そして、フェーズIとフェーズIIの酵素と肝細胞マーカーとに関する結果がまとめられた。ここでこの試験では、二つのネガティブコントロール分化の間にGSK-3阻害剤にさらされなかったhESC-HEPと、未分化のhESC細胞を行った。結果は図12AフェーズIのマーカー酵素及び図12BフェーズIIのマーカー酵素と肝細胞マーカーに示され、フェーズIの酵素で見ることができ、全てのGSK3の代用品はネガティブコントロールの水準を超えて遺伝子発現を誘導すると一般的に思われる。実際に、フェーズIの酵素と肝細胞マーカーのほとんどに関しては、ケンパウロンはBIOより発現の水準が高く誘導すると思われる。異なるマーカーと異なるGSK3阻害剤が比較されたとき、フェーズIIの酵素と肝細胞マーカーに関する結果は多少変動的ではあるが、試験された3つの代わりの組成はWntシグナル経路を調節し、肝細胞様細胞成熟を促すBIOに適した代用品として用いられることができることが再度一般的に表れる。ハウスキーピング遺伝子Creb転写調節因子の発現はさまざまなサンプルとプロトコルにわたって、違いがほとんどないことを示している。hESC-HEPSの代わりにhiPS細胞が用いられた場合に同等の結果が、図14で示され、もう一度BIOが他のGSK-3阻害剤によって代えられることができることの発見をサポートする。実施例23:分化中期と末期の段階の両方でBIOを除くGSK3阻害剤を用いるWntシグナルの調節による、hESC-HEPs中の初期及び末期段階の肝細胞マーカーの誘導hESC-HEPsは原則実施例11及び図2ivに記載されたように由来するが、代わりのBIOを除くGSK-3阻害剤は以下に示すことに使われる。他のGSK-3阻害剤は内胚葉から肝細胞マーカー遺伝子の発現を誘導するための肝細胞に分化する間、BIOと交互に用いられることができ、Wntシグナル経路を調節できる。分化の中期3~9日目及び末期10~23日目段階の間に、分化細胞はGSK-3阻害剤にさらされた。GSK-3阻害剤に変わる3つは、BIOとともに、肝細胞マーカー発現SB216763、ケンパウロン及びインジルビン-3-Oを誘導する効果を判定するために試験され、そして、フェーズIとフェーズIIの酵素と肝細胞マーカーとに関する結果がまとめられた。ここでこの試験では、二つのネガティブコントロール分化の間にGSK-3阻害剤にさらされなかったhESC-HEPと、未分化のhESC細胞を行った。分化の3~9日目の間、使用されたGSK-3阻害剤の濃度は以下のようであった。:BIO3.5μM、SB21676334nM、ケンパウロン0.23μM、インジルビン-3-O22nM。分化末期段階10日目から23日目について、濃度が以下にかえられた。:BIO1.5μM、SB2167632.5μM、ケンパウロン2.5μM、インジルビン-3-O2.5μM。結果は図13AフェーズIの酵素及び図13BフェーズIIの酵素に示され、フェーズIの酵素で見ることができ、GSK-3の代用品はネガティブコントロールの水準を超え、しばしばBIOの取り扱いで見られた水準を超える肝細胞マーカー遺伝子発現を誘導すると一般的に思われる。実際に、フェーズIの酵素、ケンパウロンのほとんどはBIOより高い発現の水準を誘導すると思われる。別のマーカーと別のGSK-3阻害剤が比較されたとき、フェーズIIの酵素と肝細胞マーカーに関する結果は多少変動的ではあるが、試験された3つの代わりの組成はWntシグナル経路を調節し、肝細胞様細胞成熟を促すBIOに適した代用品として用いられることができることが、再度一般的に表れる。また、GSK-3阻害剤は末期段階の間のみ調節を比較できることによって、中期及び末期段階で、Wntシグナルの調節をすることは明らかである。予期されたその結果他のもの以上の特定のマーカーの発現次第で、次に、一つの方法がその他のもの以上に望ましくてよい。ハウスキーピング遺伝子Creb転写調節因子の発現水準は、さまざまなサンプルとプロトコルにはここで、ほとんど違いが見られない。hESC-HEPSの代わりにhiPS細胞が用いられた場合に同等の結果が、図15で示され、もう一度BIOが他のGSK-3阻害剤によって代えられることができることの発見をサポートする。"