"あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、あらかじめ選択されたRNA標的に対する前記化合物の結合親和性を、RNA標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するよう修飾された少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;を含み、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、合成のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に対する前記化合物の結合親和性を、RNA標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含む、請求項1記載のオリゴマー性化合物。前記RNA標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断することができる、請求項1記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項2記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項2記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが4-12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項2記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが5-9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項6記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項2記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項8記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;を含み、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、合成のオリゴマー性化合物。修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されている少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含む、請求項10記載のオリゴマー性化合物。前記RNA標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断しうる、請求項10記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項11記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項11記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが4-12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項11記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが5-9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項15記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、かつ前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項11記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項17記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、少なくとも1つの2’-O-C1-20アルキル、2’-O-置換C1-20アルキルまたは2’-フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有し、前記アルキル上の置換が、アミノ、ヒドロキシまたはC1-10アルキルエーテル修飾である第1のセグメント;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;を含み、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。少なくとも1つの2’-O-C1-20アルキル、2’-O-置換C1-20アルキルまたは2’-フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第3のセグメントをさらに含み、ここで、前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはC1-10アルキルエーテルである、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが4-12個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが5-9個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも5個のサブユニットを有し、および前記第1のセグメントおよび第3のセグメントがそれぞれ少なくとも3個のサブユニットを有する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも7個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記RNA標的とハイブリダイズしたときに、二本鎖RNAse酵素を活性化して前記RNA標的を切断しうる、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントおよび前記第3のセグメントの前記リボフラノシルヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、2’-O-C1-20アルキル、2’-O-置換C1-20アルキルまたは2’-フルオロを有するように修飾されており、かつ前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはC1-10アルキルエーテルである、請求項22記載のオリゴマー性化合物。前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも2つが、ホスホロチオエート、3’-デオキシ-3’-チオ-ホスホロチオエート、5’-デオキシ-5’-チオ-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、5’-デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、5’-デオキシ-5’-アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、3’-デオキシ-3’-チオ-ホスホロチオエート、5’-デオキシ-5’-チオ-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、5’-デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、5’-デオキシ-5’-アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、3’-デオキシ-3’-チオ-ホスホロチオエート、5’-デオキシ-5’-チオ-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、5’-デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、5’-デオキシ-5’-アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第1のサブユニット、前記第2のサブユニットおよび前記第3のサブユニットの前記ヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、ホスホロチオエート結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項19記載のオリゴマー性化合物。前記第3のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項20記載のオリゴマー性化合物。配列中に少なくとも12個のリボフラノシルヌクレオシドを含み、あらかじめ選択されたRNAに特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており;前記化合物はギャップ部分が間に入った2つのウイング部分を有し;ウイング部分はそれぞれ少なくとも1つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含み、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており、前記ギャップ部分は、少なくとも4個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、ことを特徴とする化合物。前記ギャップ部分が少なくとも5個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項38記載のオリゴマー性化合物。複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;少なくとも4個の連続する2’-ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメント;および複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメント;を順に含み、オリゴマーのヌクレオシドサブユニットはホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、合成のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントが少なくとも5個の連続する2’-ヒドロキシルリボヌクレオチドサブユニットを有する、請求項40記載のオリゴマー性化合物。前記オリゴマーがあらかじめ選択されたRNAに特異的にハイブリダイズしうる、請求項40記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNAを特異的に切断する方法であって、前記RNAを、少なくとも12個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを前記あらかじめ選択されたRNAと特異的にハイブリダイズしうる配列で含むオリゴマー性化合物と接触させることを含み、前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており;前記化合物は、少なくとも1つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含む少なくとも1つのセグメントを有し、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており;前記化合物は、少なくとも4個の連続する2’-ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有するさらなるセグメントを有する、ことを特徴とする方法。前記さらなるセグメントが少なくとも5個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項43記載の方法。蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療する方法であって、生物を、リボ核酸の相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有する本発明のオリゴマー性化合物と接触させることを含み、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記標的RNAに対する前記化合物の親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており、複数のヌクレオシドサブユニットは連続する配列中に位置しており、かつ2’-ヒドロキシル-ペントフラノシル糖成分を有する、ことを特徴とする方法。薬学的に有効な量のオリゴマー性化合物を薬学的に許容しうる希釈剤または担体中に含む組成物であって、前記オリゴマー性化合物は、RNAの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を含み、オリゴマー性化合物の複数のヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記標的RNAに対する前記化合物の親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも1つを改良するように修飾されており;さらなる複数のヌクレオシドサブユニットが2’-ヒドロキシル-ペントフラノシル糖成分を有する、ことを特徴とする組成物。配列特異的標的RNAのインビトロ修飾の方法であって、dsRNase酵素および前記標的RNAを含む試験溶液を、前記標的RNAに特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、ここでヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性を改良するように修飾されており;および複数のヌクレオシドサブユニットは2’-ヒドロキシル-ペントフラノシル糖成分を有する、ことを特徴とする方法。生物においてハイブリダイゼーションおよびdsRNase酵素活性化を同時に促進する方法であって、生物を、標的RNAの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、ここで、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも1つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性;前記化合物の前記標的RNAに対する親和性または特異性;または前記化合物の電荷の改変;の少なくとも1つを改良するように修飾されており、複数のヌクレオシドサブユニットは2’-ヒドロキシ-ペントフラノシル糖成分を有することを特徴とする方法。あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;少なくとも1つの代用物ヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;連続する配列中に位置する少なくとも4個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含み、かつ2’-ヒドロキシル成分をそこに有する第2のセグメント;を含み、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする化合物。前記ヌクレオシドサブユニット代用物がペプチド核酸サブユニットである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。前記ヌクレオシドサブユニット代用物がモルホリノヌクレオシドサブユニットである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。前記ヌクレオシド代用物がシクロブチルヌクレオシドである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。前記ヌクレオシド代用物がピロリジンヌクレオシドである、請求項49記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、非リンヌクレオチド間結合により連結されており;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、を含む化合物。前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレン-ヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項54記載のオリゴマー性化合物。前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項54記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットがホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項54記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、少なくとも3個のヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、交互のリンおよび非リンヌクレオチド間結合により連結されており;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されている、を含む化合物。前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項58記載のオリゴマー性化合物。前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項58記載のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項58記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって;少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメント;前記第1のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、3’-デオキシ-3’-チオ-ホスホロチオエート、5’-デオキシ-5’-チオ-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、5’-デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、5’-デオキシ-5’-アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されており;および2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;前記第2のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、を含む化合物。少なくとも2つのヌクレオシドサブユニットの第3のセグメントを含み、前記第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、3’-デオキシ-3’-チオ-ホスホロチオエート、5’-デオキシ-5’-チオ-ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、5’-デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、5’-デオキシ-5’-アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項62記載のオリゴマー性化合物。前記第1のセグメントおよび第3のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-デオキシホスフィネート、3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項62記載のオリゴマー性化合物。あらかじめ選択されたRNA標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、DNAまたはRNA主要構築ブロックヌクレオシドではない少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;を含み、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されたヌクレオチド間結合により連結されている、ことを特徴とする化合物。前記第1のセグメントヌクレオシドサブユニットが、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの7-アルキル誘導体、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4-チオウラシル、2-チオウラシルおよびシトシン、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルアデニンおよびグアニン、および5-トリフルオロメチルウラシルおよびシトシンをその複素環塩基として有するヌクレオシドから選択される、請求項65記載の化合物。あらかじめ選択されたRNA標的と特異的にハイブリダイズすることができ、アデノシン、2’-デオキシアデノシン、グアノシン、2’-デオキシグアノシン、シチジン、2’-デオキシシチジン、ウリジンおよび2’-デオキシチミジンからなるヌクレオシド群を除く少なくとも1つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメント;を含む合成のオリゴマー性化合物であって、前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方はmRNAであり、および前記基質の前記鎖の他方は、複数の2’修飾ヌクレオシドサブユニットを含む第1のセグメントおよび2’-ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも4個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第2のセグメントを順に有する化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。前記化合物の前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記化合物の前記第1のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記化合物の前記第2のセグメントの前記サブユニットが、ホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項70記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記化合物の前記第2のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項70記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記化合物の前記第1のセグメントの前記サブユニットが、2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットである、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。A前記活性はNaClにより阻害され;B前記活性はMgを必要とし;およびD前記哺乳動物リボヌクレアーゼは、SDS-PAGEにより決定して約50から約80キロダルトンの見かけの分子量を有する、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記リボヌクレアーゼが核から単離される、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記リボヌクレアーゼが細胞質から単離される、請求項68記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。前記リボヌクレアーゼがヒト細胞または組織から単離しうる、請求項68記載の哺乳動物蛋白質。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖RNA基質であって、A前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも4個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、ここで前記中心部分は、前記デュープレックス中で互いに塩基対を形成しており;B前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にする化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有することを特徴とする基質。第1のオリゴヌクレオチドおよび第2のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖RNA基質であって、A前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも4個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、ここで前記中心部分は前記デュープレックス中において互いに塩基対を形成しており;B前記第1のオリゴヌクレオチドおよび前記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にし、かつデュープレックスの他方のオリゴヌクレオチドに対するそれらの親和性を増加させる化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有することを特徴とする基質。前記化学修飾がホスホロチオエート結合または2’-メトキシ修飾である、請求項78記載の二本鎖RNA基質。請求項78記載のdsRNA基質を含む親和性マトリックス。リボヌクレアーゼまたは非分解性RNA結合蛋白質を精製する方法であって、前記リボヌクレアーゼまたは非分解性RNA結合蛋白質を含む試料を請求項81記載の親和性マトリックスと接触させることを含む方法。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;およびホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも4個の連続する2’-ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメントを順に含む、合成のオリゴマー性化合物。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメントをさらに含み、前記第2のセグメントは、前記オリゴマー性化合物中で前記第1のセグメントと前記第3のセグメントとの間に位置している、請求項83記載の化合物。前記第2のセグメントがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する、請求項83記載の化合物。前記第2のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項83記載の化合物。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第1のセグメント;ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも4個の連続する2’-ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第2のセグメント;およびホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の2’-O-アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第3のセグメントを順に含む、合成のオリゴマー性化合物。前記第2のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項87記載の化合物。前記mRMAによりコードされる蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。前記mRNAまたは前記mRNAによりコードされる蛋白質の1つを同定するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。生物において、前記mRNAによりコードされる蛋白質に関連する異常な状態を診断するための、請求項68記載の前記リボヌクレアーゼの使用。二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方がmRNAであり、かつ前記鎖の他方が請求項1記載の化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。前記オリゴヌクレオチドの1つが配列番号8のヌクレオチド配列を有する、請求項78記載の二本鎖RNA基質。好ましい実施態様の詳細な説明理論に拘束されたくはないが、ここで、若干の化学修飾されたオリゴマー化合物の使用により、ヒト細胞を含めた真核生物細胞において、これら化合物と標的RNA鎖との予想外の相互作用に起因する若干の酵素活性を利用して、若干の酵素によって切断される二本鎖RNA様構造を形成することができると考えられる。従来、このような活性は、真核生物系において認識されても利用されてもいなかった。ここで、本発明のオリゴマー化合物は、それらが、標的とされたRNA部分を含む二本鎖構造を形成できる若干のRNAのような特徴を有し、そして引続き、この二本鎖構造は、細胞または試験溶液中において真核性dsRNアーゼ、すなわち、二本鎖RNアーゼ酵素によって分解されるということが見出された。T24ヒト膀胱癌細胞を代表的な真核生物細胞系として用いると、この活性は、核および細胞質両方の部分に同様のレベルで存在することが示された。本発明を詳しく説明するために本明細書中で与えられた若干の代表的な手順において、若干の他の既知のヌクレアーゼ活性と共通して、この活性は、RNA基質の切断後に5’リン酸基および3’ヒドロキシル基を脱離することが見出された。この5’リン酸基、3’ヒドロキシル末端の生成は、大腸菌のDNA:RNA二重らせんのRNA成分を切断するRNアーゼHIおよびII、高分子量二本鎖RNAの加水分解を触媒し且つセンス-アンチセンス二重らせんの分解を媒介するRNアーゼIII、およびRNアーゼIVを含めた、二本鎖核酸分子を認識するいくつかの他のヌクレアーゼと共通の特徴である。mRNA分解系の多数の成分は、原核生物と真核生物との間に保存されてきた。ここで、RNアーゼIIIがセンス-アンチセンスハイブリッドの分解を行って何等かの遺伝子の発現を調節している原核生物のように、ヒト細胞は、同様の役割を果たしうる活性を保存してきたことが見出された。治療上および診断上の使用を含めた他の使用に加えて、この活性によって、本発明の化合物は、どのようにヒト細胞が内因的に発現されたアンチセンス転写物を用いて遺伝子発現を調節するのか理解する場合に役立つ研究用試薬として用いることができる。診療室においてヒトに実験的に用いられまたは現在試験されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの大部分は、修飾オリゴデオキシヌクレオチドである。このようなオリゴデオキシヌクレオチドアンチセンス化合物とそれらの標的RNAとの間に形成されるヘテロ二本鎖は、この二重らせんのRNA鎖だけを切断する細胞内ヌクレアーゼRNアーゼHによって認識されることが示された。標的RNAのRNアーゼHに媒介される分解は有用な機序であることが判明したが、それには若干の制限がある。RNアーゼHは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して行われる構造的修飾に対して極めて感受性であるので、増加した親和性、増加したヌクレアーゼ耐性およびより大きい細胞透過性などの、治療的性質を向上させるように設計された修飾の大部分は、RNアーゼHによる切断を支持しないオリゴヌクレオチドをもたらした。アンチセンス作用の終結機序としてのRNアーゼHに対するもう一つの制限は、オリゴヌクレオチドがDNA様であるにちがいないということであり、そしてDNA様である場合、このようなオリゴヌクレオチドは、それらの標的RNAに対して本質的に低い親和性を有する。この低い親和性を免れるように設計された計画は、中心にある非修飾デオキシオリゴヌクレオチドの伸長部分ギャップと一緒に、5’および3’末端の高親和性化学修飾オリゴヌクレオチドの伸長部分ウィングから成るギャップマーオリゴヌクレオチドの設計を含む。DNAギャップマー、すなわち、オリゴデオキシヌクレオチドギャップマーは、それらの標的に対してオリゴデオキシヌクレオチドより有意に高い親和性を有するが、しかしながら、DNAギャップの寸法に依存して、RNアーゼHは影響されることが示された。RNアーゼHをRNA分解の終結機序として用いる場合、RNアーゼHの細胞内局在化および組織分布も考えるべきである。RNアーゼH活性は、主として、核に局在しているが、更に低いレベルで細胞質中において検出された。ある与えられたmRNAの大部分は細胞の細胞質中で見出されるので、終結機序として利用するのに理想的な活性は、核および細胞質両方において高レベルのものであると考えられる。RNアーゼH活性はまた、細胞系ごとにまたは組織間で極めて変化しやすいので、ある与えられた疾患状態は、標的組織が不十分なRNアーゼH活性を有するという理由だけで、RNA分解の充分な候補であるとはいえない。標的RNAを分解するための代わりの終結機序が大いに望まれていることは明らかである。他の使用の中で、現在認められている活性は、ここで、アンチセンス療法のためのRNアーゼHに対する代わりの終結機序として利用することができる。標的に対して高い親和性を有し、それによってDNA様オリゴヌクレオチドより高い力価を有するRNA様オリゴヌクレオチドを用いる場合、活性はヒト細胞中で発現されうることが見出された。細胞質および核両方での活性の存在は、本発明の化合物を用いて、核の前mRNAスプライシングから多数のRNAプロセッシング現象を阻害し且つ細胞質中の成熟転写物の分解へ輸送することを可能にする。本発明を詳しく説明し且つそれを他の既知のアンチセンス機序、例えば、RNアーゼHと比較するために、本発明の化合物によって引き起こされたdsRNアーゼ活性を、Ha-rasのコドン12に対して集中させることによって調べた。本明細書中にそのまま援用される、両方とも本出願と同一譲渡人の、出願第08297248号に該当する米国特許第5297248号およびその関連出願である1992年12月23日公開の国際公開第WO9222651号で記載のように、ras癌遺伝子は、原形質膜の内面に局在していて、しかもアミノ酸レベルで高度に保存され、高親和性および特異性でGTPを結合し、そしてGTPアーゼ活性を有することが示されている関連タンパク質をコードする遺伝子系列のメンバーである。ras遺伝子産物の細胞内機能はまだ知られていないが、それらの生化学的性質は、GTP結合性タンパク質すなわちGタンパク質として知られるシグナル伝達タンパク質のクラスとのそれらの有意の配列相同性と共に、ras遺伝子産物が、原形質膜を越える細胞外シグナル伝達に関連した基本的細胞調節機能において根本的な役割を果たしていることを示唆する。H-ras、K-rasおよびN-rasと称される3種類のras遺伝子は、哺乳動物ゲノム中で識別された。哺乳動物ras遺伝子は、それらのコーディング配列内の単一点突然変異似よって形質転換誘導性を獲得する。天然に存在するras癌遺伝子の突然変異は、コドン12,13および61に局在していた。ヒト腫瘍において見出される最も一般的に検出される活性化ras突然変異は、H-ras遺伝子のコドン12においてあり、ここにおいて、GGCからGTCへの塩基変化は、rasタンパク質産物のGTPアーゼ調節ドメインにおいてグリシン-バリン置換を引き起こす。この単一アミノ酸変化は、rasタンパク質機能の正常な制御を無効にして、それによって普通に調節される細胞タンパク質を継続して活性であるものに変換すると考えられる。このような正常rasタンパク質機能の脱調節は、正常から悪性の成長への形質転換の原因であると考えられる。例証する目的で、本発明の化合物をrasRNAに対して集中させるが、当然ながら、他のRNAの宿主も標的RNAとして適していることは理解される。したがって、本発明の化合物を用いて、細胞中に天然に存在する何等かの適当な標的RNAまたはインビトロの何等かの標的RNAの発現を調節することができる。例証する目的で用いられたras標的部位は、参考文献において確認された最もRNアーゼH感受性のオリゴヌクレオチド部位の一つである。ras癌遺伝子などの突然変異した遺伝子の選択的阻害は、mRNAのコード領域における調節化合物のハイブリッド形成を必要とする。これは、ポリソームによる化合物の置換を妨げるためのこのような化合物とrasmRNAとの高親和性相互作用かまたは、ある与えられた終結機序による標的mRNAの急速分解を必要とする。再度、理論に拘束されたくはないが、本発明のRNA様化合物は、本質的に高い親和性も有するし、細胞dsRNアーゼ活性も利用できる。本発明の目的により、標的RNA鎖に対して結合するおよびdsRNアーゼ酵素の基質である新規オリゴマー化合物を提供する。本発明のオリゴマー化合物には、オリゴリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオシドおよびそこに包含される結合したリボヌクレオチドサブユニットの直鎖状配列を有する他のオリゴマー化合物が含まれる。このような他のオリゴマー化合物は、PNAペプチド核酸セグメントおよび結合したリボヌクレオチドの間に形成されたキメラ構造を含むであろう。したがって、本明細書の目的のために、オリゴマー化合物という用語は、単独でかまたは組合わせで用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドという用語、更には、PNAセグメントおよび他の代理ヌクレオシド成分および結合したリボヌクレオシドセグメントの間に形成されたキメラ化合物を含めた他のオリゴマー化合物を含めることを意味する。本明細書および請求の範囲において用いられる通り、一つの意味において、オリゴマー化合物という用語は、オリゴリボヌクレオチドを示すのに用いられ、もう一つの意味においてオリゴリボヌクレオシドを示すのに、なおもう一つの意味においてオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドの混合物、そして他の場合において、上で識別されたPNAキメラ化合物などの指定された更に別のキメラ化合物を示すのに用いられる。本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、複数のヌクレオシドサブユニットから組立てられる。本発明の若干の好ましいオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドにおいて、それらヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つは、核酸の相補鎖に対するオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドの結合親和性を増加させる置換基を有する。更に、それらヌクレオシドサブユニットの少なくともいくつかは、2’-ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を含む。オリゴヌクレオチドが特に有用である細胞性使用では、そのオリゴヌクレオチドは、細胞の標的核酸とそれが相互作用するのに充分な期間細胞中に生存するために、ヌクレアーゼに対して適度に安定であるべきである。したがって、本発明の若干の実施態様において、特定のヌクレオシドサブユニットまたはヌクレオシド間結合を機能化するかまたは選択して、そのオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。しかしながら、研究用試薬としておよび診断薬としての本発明のオリゴマー化合物の使用のような非細胞性用途では、このようなヌクレアーゼ活性は必要ないかもしれない。相補的核酸に対する第一核酸の結合親和性の程度を測定する場合、その相補的核酸に対して結合する第一核酸の相対的能力は、特定のハイブリッド形成複合体の融解温度を決定することによって比較することができる。二本鎖ヌクレオチドの特徴的な物理的性質である融解温度Tmは、50のらせんハイブリッド形成した対コイルハイブリッド形成していない状態が存在する温度を示す。Tmは、UVスペクトルを用いてハイブリッド形成複合体の形成および破壊融解を確認することによって測定される。ハイブリッド形成中に起こる塩基スタッキングは、UV吸収の減少淡色性を伴う。結果として、UV吸収の減少は、より高いTmを示す。Tmが高いほど、鎖間結合の強度は大きい。本発明において、本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドの結合親和性は、これら化合物のヌクレオシドサブユニット中に置換基を包含することによって増加させうるということが判った。好ましい置換基は、2’置換基、すなわち、本発明の化合物のヌクレオシドサブユニットのペントフラノシル糖残基の2’位に位置する置換基である。現在好ましい置換基には、フルオロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、アリルオキシ、イミダゾリルアルコキシおよびポリエチレングリコールが含まれる。アルコキシ基およびアミノアルコキシ基は、概して、低級アルキル基、特に、C1-C9アルキルを含む。ポリエチレングリコールは、構造O-CH2-CH2n-O-アルキルを有する。特に好ましい置換基は、式-O-CH2-CH2n-O-アルキル式中、n=1およびアルキル=CH3を有するポリエチレングリコール置換基である。この修飾は、オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが示された。結合親和性を増加させる更に別の特に有用な2’-置換基は、2’-フルオロ基である。公表された研究SynthesisandBiophysicalStudiesof2dRIBOFModifiedOligonucleotides,ConferenceOnNucleicAcidTherapeutics,クリアウォーター,FL,1991年1月13日において、置換されたヌクレオシドサブユニットにつき1.6°Cの結合親和性の増加が、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット5個に2’-フルオロ置換基を有する15マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて報告された。オリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット11個が2’-フルオロ置換基を有した場合、結合親和性は、置換されたヌクレオシドサブユニットにつき1.8°Cまで増加した。この研究において、15マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、対応するホスホロチオエート類似体に誘導体化された。その15マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体と比較した場合、そのホスホロチオエート類似体は、15マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドの結合親和性の約66だけの結合親和性を有した。言い換えると、結合親和性は、オリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体に誘導体化した場合に失われた。しかしながら、2’-フルオロ置換基が15マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット11個に位置した場合、それら2’-置換基の結合親和性は、15マーオリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体に誘導体化することによって示される減少を十二分に克服した。この化合物、すなわち、2’-フルオロ置換基で置換された11個のヌクレオシドサブユニットを有する15マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおいて、その結合親和性は、置換基につき2.5°Cまで増加した。本発明の化合物のヌクレオシド構造サブユニットを製造する場合に用いるのに、これらヌクレオシドサブユニット中への包含に適した核塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンなどのプリンおよびピリミジン、更には、キサンチン;ヒポキサンチン;2-アミノアデニン;アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体;アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体;5-ハロウラシルおよびシトシン;5-プロピニルウラシルおよびシトシン;6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン;5-ウラシルプソイドウラシル;4-チオウラシル;8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン;5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン;7-メチルグアニンなどの他の合成および天然核塩基が含まれる。更に別のプリンおよびピリミジンには、米国特許第3687808号で開示されたもの、ConcisseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,858859頁,KroschwitzJI監修,JohnWileySons1990で開示されたものおよびEnglischら,AngewandteChemieInternationalEdition199130613で開示されたものが含まれる。これら核塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよび、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含めたN-2、N-6およびO-6置換プリンが含まれる。他の修飾ピリミジンおよびプリン塩基もまた、核酸の相補鎖に対するオリゴマー化合物の結合親和性を増加させると予想される。本発明による好ましいオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、好ましくは、約5~約50個のヌクレオシドサブユニットを含む。本発明の文脈中、これが、5~50個のヌクレオシドサブユニットを有する本明細書中前記の天然に存在しないオリゴマーを包含することは理解される。本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドが、約15~約25個のヌクレオシドサブユニットを含むことは更に好ましい。理解されるように、ヌクレオシドサブユニットは、オリゴリボヌクレオチド中のリン結合によっておよびオリゴリボヌクレオシド中の非リン結合によって隣接するサブユニットに対して適当に結合した核塩基および糖または糖代理物組合わせである。この文脈中において、ヌクレオシドサブユニットという用語は、ヌクレオシド単位またはヌクレオシドという用語と同じ意味に用いられる。本発明のオリゴリボヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、3’-または-5’デオキシ-3’-または-5’チオホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、3’-または-5’デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、3’-または-5’デオキシ-3’-または-5’アミノホスホルアミデート、ヒドロゲンホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルのリン結合を含めたリン結合によって連結されたヌクレオシドサブユニットを有する。他方、本発明のオリゴリボヌクレオシドは、カーボネート結合、カルバメート結合、シリル結合、硫黄結合、スルホネート結合、スルホンアミド結合、ホルムアセタール結合、チオホルムアセチル結合、オキシム結合、メチレンイミノ結合、メチレンメチルイミノ結合、メチレンヒドラゾ結合、メチレンジメチルヒドラゾ結合およびメチレンオキシメチルイミノ結合によって連結したヌクレオシドサブユニットを有する。本発明のオリゴマー化合物の全部の配列長さ全体の範囲内でdsRNAアーゼ応答を引き出すためには、3個を越えるが、好ましくは、4個、5個またはそれ以上の連続的に結合した2’-ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシドサブユニットのセグメントすなわち部分配列が存在するであろう。オリゴマー化合物の追加の部分配列すなわちセグメントが、2’-ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列の両側に位置するように、オリゴマー化合物中に2’-ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列を包含することは、現在のところ好ましい。このような構成において、2’-ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド配列は、中心またはギャップ領域またはセグメントとも称され、そして他のヌクレオシド部分配列すなわちセグメントは、フラキングまたはウィング領域またセグメントとも称される。例えば、ギャップ部分の両側にウィングが隣接している。他の構成も可能であり、本発明のオリゴマー化合物の3’末端かまたは5’末端に2’-ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列が存在することが含まれる。これら他の構成は、オープンギャップ付き構造と考えることができる、すなわち、そのギャップ部分はオリゴマー化合物の末端3’末端かまたは5’末端でオープンである。本発明によって用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、好都合に且つ常套で、周知の固相合成技術によって製造することができ、例えば、Oligonucleotidesythesisapracticalapproach,MJGait監修,IRLPress1984;OligonucleotideandAnaloguesAPracticalApproach,FEckstein監修,IRLPress1991特に、第1章、オリゴデオキシリボヌクレオチド合成の最新機械促進法、第2章、オリゴリボヌクレオチド合成、第3章、2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチド:合成および応用、第4章、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、第5章、オリゴヌクレオチドホスホロジチオエートの合成、第6章、オリゴ-2’-O-デオキシリボヌクレオシドメチルホスホネートの合成および第7章、修飾塩基を含有するオリゴデオキシヌクレオチドを参照されたい。他の特に有用な合成法、試薬、保護基および反応条件は、MartinP,HelvChimActa199578486504;BeaucageSLおよびIyerRP,Tetrahedron19924822232311、およびBeaucageSLおよびIyerRP,Tetrahedron19934961236194、またはそれらで論及された参考文献で記載されている。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドの合成用装置は、AppliedBiosystemsを含めたいくつかの販売業者によって販売されている。2’-O-メチルアミダイトおよび2’-O-ヒドロキシルアミダイトを含めた種々のアミダイト試薬も、商業的に入手可能である。このような合成のための他の手段はいずれも用いることができる。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、充分に当業者の技能の範囲内である。同様の技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを製造することも周知である。同様の技術並びに商業的に入手可能な修飾アミダイトおよび一定細孔ガラスCPG製品、例えば、ビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはプソラレンで修飾されたアミダイトおよび/またはCPGGlenResearch,スターリングVAから入手可能を用いて、蛍光標識された、ビオチニル化されたまたは他の複合したオリゴヌクレオチドを合成することも周知である。もう一つの実施態様において、本発明は、ヒトT24細胞および他の細胞系から単離可能な、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド:RNA二重らせん中のRNAを分解する哺乳動物リボヌクレアーゼに関する。そのリボヌクレアーゼは、本明細書中においてdsRNアーゼと称され、このdsは、二本鎖RNA基質に対するRNアーゼの特異性を示す。2’-メトキシ修飾糖残基を含有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、それらの細胞mRNA標的に対して高親和性で結合するが、得られた[DNA様]:[RNA]二重らせんは、T24細胞内の核溶解分解の基質ではない。実施例2で詳述されるように、Ha-RasmRNAのコドン12を標的とする2’-メトキシホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、2’-メトキシヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの中心のリボヌクレオチドの伸長部分で置換することによって修飾されて、2’-メトキシ/リボ/2’-メトキシキメラすなわち[ギャップマーオリゴヌクレオチドを形成し、ホスホロチオエート結合は分子全体で維持された。これらRNA様ギャップマーオリゴヌクレオチドは、それらの細胞mRNA標的に対して、完全な2’-メトキシオリゴデオキシヌクレオチドの親和性に匹敵する親和性で結合するが、[DNA様]:[RNA]二重らせんとは異なり、得られた[RNA様]:[RNA]二重らせんは、T24細胞内の核溶解分解の基質である。[アンチセンスRNA様ギャップマーオリゴヌクレオチド]:[Ha-RasmRNA]二重らせんの分解は、そのアンチセンス分子中に包含されたリボヌクレオチドの数に依存する。17塩基対9RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重らせんは、RNアーゼH切断の基質ではないが、T24細胞溶解産物中における本発明のdsRNアーゼによる切断の基質である。更に、T24細胞溶解産物で見られた切断部位は、二重らせんのRNA:RNA部分に局在しているが、二重らせんの2’-メトキシ:RNA部分では見られない。本発明のdsRNアーゼによる二重らせんの切断は、5’-リン酸末端および3’-ヒドロキシル末端を生じる。本発明の化合物は、診断薬、治療薬および研究用試薬並びにキットとして用いることができる。それらは、有効量の本発明の化合物を適当な薬学的に許容しうる希釈剤または担体に対して加えることによって医薬組成物で用いることができる。それらは、更に、望ましくないタンパク質生産を特徴とする疾患を有する生物を治療するのに用いることができる。その生物は、望ましくないタンパク質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリッド形成しうる配列を有する本発明の化合物と接触することができる。治療用組成物の製剤化およびそれらの引続きの投与は、当該技術の範囲内であると考えられる。概して、治療薬について、このような療法を必要とする患者は、本発明による化合物を、一般的には薬学的に許容しうる担体中で、患者の年齢および治療される疾患状態の重症度に応じて0.01μg~100g/kg体重の用量で投与される。更に、治療計画は、具体的な疾患の性状、その重症度および患者の全身状態に応じて異なるであろうし且つ1日1回~20年ごとに1回まで延長しうる期間継続してよい。処置後、その患者は、その状態の変化についておよび疾患状態の症状の軽減について監視される。化合物の投与量は、患者が現行の投薬レベルに対してほとんど応答しない場合に増加させることができるかまたは、疾患状態の症状の軽減が見られる場合若しくは疾患状態が消散した場合に減少させことができる。若干の場合、本発明の化合物を他の伝統的治療法と一緒に用いて患者を処置するのがより好ましいことがありうる。例えば、ウイルス疾患について処置されている患者は、本発明の化合物を既知の抗ウイルス薬と一緒に投与されうるし、またはアテローム性動脈硬化症の患者は、血管形成術後に本発明の化合物で処置されて、処置された動脈の再閉塞を防止することができる。成功した処置後、患者に維持療法を施して、疾患状態の再発を防止するのが望ましいことがあり、この場合、本発明の化合物は、0.01μg~100g/kg体重の維持用量で1日1回またはそれ以上~20年ごとに1回投与される。本発明の医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかに依っておよび処置される部位に依って、多数の方式で投与することができる。投与は、局所眼、腟、肛門、鼻腔内、経皮を含む、経口または非経口であってよい。非経口投与には、静脈内滴注、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、または包膜内若しくは室内投与が含まれる。局所投与用製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれうる。慣用的な医薬用担体、水性、粉末または油状基剤、粘稠化剤等も必要でありうるしまたは望ましいことがありうる。コーティングコンドーム、グローブ等も有用でありうる。経口投与用組成物には、散剤若しくは顆粒剤、水若しくは非水性基剤中の懸濁剤若しくは液剤、カプセル剤、サシェ剤または錠剤が含まれる。粘稠化剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望まれることがありうる。包膜内または室内投与用組成物には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水溶液が含まれうる。非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水溶液が含まれうる。投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依り、治療経過は、数日~数か月まで、または治癒が起こるまでまたは疾患状態の軽減が得られるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬物蓄積の測定値から算定することができる。当業者は、最適用量、投薬法および反復率を容易に決定することができる。最適投薬量は、個々の化合物の相対力価に依って異なることがありうるし、そして概して、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したEC50に基づいて算出することができる。概して、投薬量は、0.01μg~100g/kg体重であり、しかも1日、1週間、1か月若しくは1年に1回若しくはそれ以上、または2~20年ごとに1回でも与えられることができる。このような処置は、単細胞の原核生物および真核生物から多細胞の真核生物にいたる種々の生物で実施することができる。遺伝、代謝または細胞機構の基本的な部分としてDNA-RNA転写またはRNA-タンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、このような診断、治療および/または予防の処置に対して感受性である。細菌、酵母、原生動物、藻類、植物、および温血動物を含めた高等動物の形態などの見掛上多様な生物は、この方法で処置することができる。更に、多細胞真核生物の各々の細胞も、それらの細胞活性の不可欠な部分としてDNA-RNA転写およびRNA-タンパク質翻訳の両方を含むので、このような治療および/または診断を、このような細胞集団でも実施することができる。更に、真核細胞の多数の細胞小器官、例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体もまた、転写および翻訳機序を含む。それゆえ、単細胞、細胞集団または細胞小器官もまた、本発明の治療用または診断用化合物で処置されることが可能な生物の定義の範囲内に包含されうる。本明細書中で用いられる治療とは、疾患状態の根絶、生物、例えば、細菌、原生動物若しくは他の感染の致死、または異常な若しくは望ましくない細胞成長若しくは発現の抑制を含むことを意味する。本発明の文脈中、標的RNAとは、相補的核酸様化合物とハイブリッド形成しうる何等かのRNAを意味するものである。更に、本発明の文脈中、ハイブリッド形成とは、相補的核塩基間の水素結合を意味するものであり、ワトソンクリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる。本明細書中で用いられる相補的とは、二つの核塩基間の正確に対合する能力を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的核塩基である。本明細書中で用いられる相補的および特異的にハイブリッド形成しうるとは、ヌクレオシドサブユニットを含有する第一および第二核酸様オリゴマー間の正確な対合または配列相補性を意味する。例えば、第一核酸のある位置の核塩基が、第二核酸の同じ位置の核塩基と水素結合できる場合、その第一核酸および第二核酸は、その位置で互いに相補的であると考えられる。それら第一および第二核酸は、それぞれの分子中の充分に多数の対応する位置が、互いに水素結合できる核塩基で占められている場合、互いに相補的である。したがって、特異的にハイブリッド形成しうるおよび相補的は、本発明の化合物と標的RNA分子との間に安定且つ特異的な結合が生じるような充分な相補性の程度を示すのに用いられる用語である。本発明のオリゴマー化合物は、特異的にハイブリッド形成しうるその標的RNA配列に対して100相補的である必要はないということは理解される。オリゴマー化合物は、そのオリゴマー化合物の標的RNA分子に対する結合が、その標的RNAの正常な機能の妨げになって有用性を損なわせる場合に特異的にハイブリッド形成しうるし、そして特異的結合が望まれる条件下において、すなわち、インビボ検定若しくは治療的処置の場合またはインビトロ検定の場合の生理学的条件下において、それら検定が行われる条件下において、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるのに充分な相補性の程度が存在する。次の実施例および手順は、本発明を詳しく説明するが、発明を制限するためのものではない。本発明の説明において、実施例1は、本発明の若干の代表的なオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシド化合物の製造に有用である若干の市販ヌクレオシドアミダイトおよび他の追加のヌクレオシドアミダイトを確認する。実施例2~5は、本発明の他の代表的なオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシド化合物を製造する場合に用いるための更に別のヌクレオシドアミダイトの製造を詳しく説明する。実施例6は、本発明のオリゴリボヌクレオチド化合物の製造を詳しく説明する。実施例7は、本発明のオリゴリボヌクレオシド化合物の製造を詳しく説明する。実施例8~16は、若干のギャップマー、すなわち、ギャップおよびウィング構成を有する化合物を含めた本発明のキメラオリゴマー化合物の製造を詳しく説明する。実施例17~18は、本発明の化合物の若干の有用な態様を詳しく説明する。実施例19~28は、本発明の二本鎖リボヌクレアーゼdsRNアーゼの識別、特性決定および精製を詳しく説明する。実施例29は、本発明のdsRNアーゼ基質を包含するアフィニティーカラムを詳しく説明する。代表的な実施例において、ギャップマーのいくつか異なった種類を例示する。これらには、結合したヌクレオシドのギャップセグメントが、結合したヌクレオシドの5’および3’ウィングセグメント間に位置している第一型、およびギャップセグメントが、オリゴマー化合物の3’末端かまたは5’末端に位置している第二オープンエンド型が含まれる。全てのキメラオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドについての代表的な実施例において、特に断らない限り、2’-O-メチルヌクレオシドはウィングセグメントで用いられ、そして2’-OHヌクレオシドは、各々のオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドのギャップセグメントで用いられる。代表的な実施例のために、次の便法慣例を用いる。括弧、すなわち[]で示された構造は、ヌクレオシド省略形であるが、スラッシュマーク、すなわち/の後に示された構造は、ヌクレオシド、すなわち、オリゴリボヌクレオチドかまたはオリゴリボヌクレオシド化合物中でヌクレオシドを互いに結合している主鎖構造を連結するのに用いられるリンカーである。この用語法を用いて、ヌクレオシド間のリン結合に次の略語を用いる。ホスホジエステルにPO;ホスホロチオエートにPS;ホスホロジチオエートにP2S;ホスホロセレネートにPSe;メチルホスホネートにPMe;メチルホスホトリエステルにPOMe;ホスホルアミデートにPN;3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミデートに3’NPN;ホスフィネートにPI;アルキルホスホノチオエートにMePS;ボラノホスフェートにBPを用いる。ヌクレオシド間の非リン酸結合に用いられる略語は、メチレンメチルイミノのMMI;メチレンジメチルヒドラゾのMDH;ホルムアセタールのFA;チオホルムアセタールのTFA;エチレンオキシドのETOおよびメチレンカルボニルアミノのamide-3である。2’-OHは、非修飾リボ糖、すなわち、ペントリボフラノシル糖の略語として用いられる。修飾ヌクレオシドに用いられる略語は、ペントリボフラノシル残基の2’位の一般アルキル基の2’-O-アルキル、具体的なアルキルは、メチル、エチル、プロピルおよびメトキシエチルにそれぞれ、2’-O-Me、2’-O-Et、2’-O-Prおよび2’-O-EtOMeとして示され;ペントリボフラノシル残基の2’位のフルオロ残基の2’-F;例えば、米国特許第5459255号の開示によるプリン核塩基置換のModPurineまたは;そして例えば、米国特許第5484908号の開示によるピリミジン核塩基置換のModPyr;例えば、米国特許第5359044号の開示による糖代理物のSSである。実施例1オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシド合成用アミダイト2’-O-メチルヌクレオシドアミダイトおよび2’-OH2’-t-ブチルジメチルシリル誘導体として遮断されたヌクレオシドアミダイトは、GlenResearch,スターリング,VAから入手可能である。他の2’-O-アルキル置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5506351号、同第5466786号または同第5514786号で記載されているように製造される。シクロブチル糖代理化合物は、本明細書中に援用される米国特許第5359044号で記載されているように製造される。ピロリジン糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5519134号で記載されているように製造される。モルホリノ糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5142047号および同第5235033号、並びに他の関連特許開示で記載されているように製造される。N-2置換プリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5459255号で記載されているように製造される。3-デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5457191号で記載されているように製造される。5,6-置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5614617号で記載されているように製造される。5-プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5484908号で記載されているように製造される。実施例22’-O-メトキシエチルヌクレオシドアミダイト2’-O-エチル-O-メチル置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例2-a~2-hのようにまたは代わりに、MartinP,HelveticaChimicaActa199578486504の方法によって製造する。実施例2-a2,2’-アンヒドロ[1-β-D-アラビノフラノシル-5-メチルウリジン]5-メチルウリジンリボシルチミン,Yamasa,銚子,日本によって商業的に入手可能72.0g,0.279M、ジフェニルカーボネート90.0g,0.420Mおよび重炭酸ナトリウム2.0g,0.024Mを、DMF300mLに対して加えた。その混合物を撹拌しながら加熱して還流させ、発生した二酸化炭素ガスを制御方式で放出させた。1時間後、その薄黒い溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル2.5L中に撹拌しながら注いだ。その生成物はガムを形成した。エーテルを傾瀉し、そしてその残留物を最小量のメタノール約400mL中に溶解させた。その溶液を新たなエーテル2.5L中に注いで、堅いガムを生成した。エーテルを傾瀉し、そしてそのガムを真空オーブン1mmHgで60°C、24時間中で乾燥させて固体を与え、これを破砕して痰黄褐色粉末57g,85粗収率にした。NMRスペクトルは、フェノールをそのナトリウム塩として混入した約5構造と一致した。その材料をそのままで更に別の反応に用いたまたはそれを、カラムクロマトグラフィーによって、メタノールの酢酸エチル中の勾配10~25を用いて更に精製して、白色固体,mp222~4°Cを与えることができる。実施例2-b2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン2,2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン195g,0.81M、トリス2-メトキシエチルボレート231g,0.98Mおよび2-メトキシエタノール1.2Lを、2Lステンレス鋼製圧力容器に対して加え、そして160°Cで予熱された油浴中に入れた。155~160°Cで48時間加熱した後、その容器を開け、そして溶液を蒸発乾固させ、そしてMeOH200mLで研和した。その残留物を熱アセトン1L中に懸濁させた。不溶性塩を濾過し、アセトン150mLで洗浄し、そして濾液を蒸発させた。残留物280gをCH3CN600mL中に溶解させ、そして蒸発させた。シリカゲルカラム3kgを、0.5Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH20:5:3中で充填した。残留物をCH2Cl2250mL中に溶解させ、そしてカラム上に加える前にシリカ150gに吸収させた。その生成物を充填用溶媒で溶離して、160g63の生成物を与えた。追加の材料は、不純画分を再生することによって得られた。実施例2-c2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン2’-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン160g,0.506Mを、ピリジン250mLと一緒に共蒸発させ、そして乾燥した残留物をピリジン1.3L中に溶解させた。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート94.3g,0.278Mを加え、そしてその混合物を室温で1時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二アリコート94.3g,0.278Mを加え、そしてその反応を更に1時間撹拌した。次に、メタノール170mLを加えて、反応を停止させた。HPLCは、約70生成物の存在を示した。その溶媒を蒸発させ、そしてCH3CN200mLで研和した。その残留物をCHCl31.5L中に溶解させ、そして2×500mLの飽和NaHCO3および2×500mLの飽和NaClで抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。275gの残留物が得られた。その残留物を、0.5Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン5:5:1で充填され且つ溶離されるシリカゲルカラム3.5kg上で精製した。純粋画分を蒸発させて、164gの生成物を与えた。追加の約20gを不純画分から得て、183g57の全収量を与えた。実施例2-d3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン106g,0.167M、DMF/ピリジン562mLのDMFおよび188mLのピリジンから製造された3:1混合物750mLおよび無水酢酸24.38mL,0.258Mを一緒にし且つ室温で24時間撹拌した。その反応をtlcによって、MeOHの添加でtlc試料を最初に急冷することによって監視した。tlcによって判断される反応の完了時に、MeOH50mLを加え、そしてその混合物を35°Cで蒸発させた。その残留物をCHCl3800mL中に溶解させ、そして2×200mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200mLの飽和NaClで抽出した。水層を200mLのCHCl3で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ且つ蒸発させて、122gの残留物約90生成物を与えた。その残留物をシリカゲルカラム3.5kg上で精製し且つEtOAc/ヘキサン4:1を用いて溶離した。純生成物画分を蒸発させて、96g84を生成した。追加の1.5gは、後の画分から回収された。実施例2-e3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン96g,0.144MをCH3CN700mL中に溶解させることによって第一溶液を製造し、取っておいた。トリエチルアミン189mL,1.44Mを、トリアゾール90g,1.3MのCH3CN1L中溶液に対して加え、-5°Cまで冷却し、そしてオーバーヘッドスターラーを用いて0.5時間撹拌した。0~10°Cで維持されたその撹拌溶液に対して、POCl3を30分間にわたって滴加し、そして得られた混合物を更に2時間撹拌した。第一溶液を、その溶液に対して45分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を冷室内で一晩貯蔵した。その反応混合物から塩を濾過し、そしてその溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc1L中に溶解させ、そして不溶性固体を濾過によって除去した。その濾液を、1×300mLのNaHCO3および2×300mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ且つ蒸発させた。その残留物をEtOAcで研和して、標題化合物を与えた。実施例2-f2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン3’-O-アセチル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン103g,0.141Mのジオキサン500mLおよびNH4OH30mL中溶液を室温で2時間撹拌した。そのジオキサン溶液を蒸発させ、そして残留物をMeOH2×200mLと共沸させた。その残留物をMeOH300mL中に溶解させ、そして2リットルステンレス鋼製圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH400mLを加え、そしてその容器を100°Cまで2時間加熱したtlcは完全な転化を示した。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残留物をEtOAc500mL中に溶解させ且つ飽和NaCl200mLで1回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そしてその溶媒を蒸発させて、標題化合物85g95を与えた。実施例2-gN4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン85g,0.134MをDMF800mL中に溶解させ、そして無水安息香酸37.2g,0.165Mを撹拌しながら加えた。3時間撹拌した後、tlcは、反応が約95完了したことを示した。その溶媒を蒸発させ、そして残留物をMeOH200mLと共沸させた。その残留物をCHCl3700mL中に溶解させ、そして飽和NaHCO32×300mLおよび飽和NaCl2×300mLで抽出し、MgSO4上で乾燥させ且つ蒸発させて、残留物96gを与えた。その残留物を、シリカカラム1.5kg上において0.5Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン1:1を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を蒸発させて、標題化合物90g90を与えた。実施例2-hN4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン-3’-アミダイトN4-ベンゾイル-2’-O-メトキシエチル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン74g,0.10MをCH2Cl21L中に溶解させた。テトラゾールジイソプロピルアミン7.1gおよび2-シアノエトキシ-テトライソプロピルホスファイト40.5mL,0.123Mを、窒素雰囲気下において撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温で20時間撹拌したtlcは、反応が95完了したことを示した。その反応混合物を、飽和NaHCO31×300mLおよび飽和NaCl3×300mLで抽出した。水性洗浄物をCH2Cl2300mLで逆抽出し、そしてその抽出物を一緒にし、MgSO4上で乾燥させ且つ濃縮した。得られた残留物を、シリカカラム1.5kg上においてEtOAc\ヘキサン3:1を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を一緒にして、標題化合物90.6g87を与えた。実施例3長鎖、すなわちC20置換ヌクレオシドアミダイトの製造長鎖、例えば、C20置換基を2’位に有するヌクレオシドアミダイトの合成を、実施例3-a~3-cで示す。実施例3-a2,6-ジアミノ-9-2-O-オクタデシル-β-D-リボフラノシルプリンの合成DMF1L中の2,6-ジアミノ-9-β-D-リボフラノシルプリン50g,180ミリモルおよび水素化ナトリウム7gを加熱して2時間沸騰させた。ヨードオクタデカン100gを150°Cで加え、そしてその反応混合物をRTまで冷却させた。その反応混合物をRTで11日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。その生成物を5MeOH/CH2Cl2で溶離した。適当な画分を蒸発させて、生成物11gを生成した。1HNMRDMSO-d6δ0.84t,3,CH2;1.22m,32,O-CH2-CH2-CH216;1.86m,2,O-CH2-CH2;3.25m,2,O-CH2;3.93d,1,4’H;4.25m,1,3’H;4.38t,1,2’H;5.08d,1,3’-OH;5.48t,1,5’-OH;5.75s,2,6-NH2;5.84d,1,1’-H;6.8s,2,2-NH2;および7.95s,1,8-H。実施例3-b2’-O-オクタデシルグアノシンの合成0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液50mL,pH7.4、0.1Mトリス緩衝液1000mL,pH7.4およびDMSO1000mL中の2,6-ジアミノ-9-2-O-オクタデシル-β-D-リボフラノシルプリン10gを、RTにおいてアデノシンデアミナーゼ1.5gで処理した。3日目、5日目および7日目に、アデノシンデアミナーゼの追加のアリコートそれぞれ、500mg,880mgおよび200mgを加えた。その反応を合計9日間撹拌し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、生成物2gを生じた。分析用試料は、MeOHから再結晶された。1HNMRDMSO-d6δ0.84t,3,CH3,1.22[s,32,O-CH2-CH2-CH216],5.07m,2,3’-OHおよび5’-OH;5.78d,1,1’-H;6.43s,2,NH2,7.97s,1,8-Hおよび10.64s,1,NH2。C28H49N5O5の分析計算値:C,62.80;H,9.16;N,12.95。実測値:C,62.54;H,9.18;N,12.95。実施例3-cN2-イソブチリル-2’-O-オクタデシルグアノシンの合成ピリジン150mL中の2’-O-オクタデシルグアノシン1.9gを氷浴中で冷却し、そして塩化トリメチルシリル2g,5当量および塩化イソブチリル2g,5当量で処理した。その反応混合物を4時間撹拌し、その時間中にそれを室温まで暖めた。その溶液を冷却し、水を加え10mL、そして更に30分間撹拌した。濃水酸化アンモニウム10mLを加え、そしてその溶液を真空中で濃縮した。その残留物をシリカゲルクロマトグラフィー3MeOH/EtOAcで溶離されたによって精製して、生成物1.2gを生じた。1HNMRDMSO-d6δ0.85t,3,CH3,1.15m,38,O-CH2CH2CH216,CHCH32,2.77m,1,CHCH32,4.25m,2,2’-Hおよび3’-H;5.08t,1,5’-OH,5.12d,1,3’-OH,5.87d,1,1’-H,8.27s,1,8-H,11.68s,1,NH2および12.08s,1,NH2。C32H55N5O6の分析計算値:C,63.47;H,9.09;N,11.57。実測値:C,63.53;H,9.20;N,11.52。この生成物をオリゴリボヌクレオチド中に包含させる前に、それを、1994年2月3日公開の国際公開第WO9402501号で記載された手順にしたがって、N2-イソブチリル-5’-ジメトキシトリチル-2’-O-オクタデシルグアノシンに変換した後、ホスホルアミダイトに変換した。実施例42’-フルオロヌクレオシドアミダイト2’-フルオロ置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例4-a~4-dのようにまたは代わりに、Kawasakiら,JMedChem199336831841の方法によって製造する。実施例4-ai.N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニン。9-β-D-アラビノフラノシルアデニン1.07g,4.00ミリモルを、無水ピリジン20mLおよび無水ジメチルホルムアミド20mL中にアルゴン雰囲気下で溶解させた。その溶液を0°Cまで冷却し、そしてクロロトリメチルシラン3.88mL,30.6ミリモルを、その反応混合物に対してシリンジによって徐々に加えた。その反応混合物を0°Cで30分間撹拌した後、塩化ベンゾイル2.32mL,20ミリモルを徐々に加えた。その反応混合物を20°Cまで暖め且つ2時間撹拌した。その反応混合物を0°Cまで冷却した後、冷水8mLを加え、そしてその混合物を15分間撹拌した。濃水酸化アンモニウム8mLをその反応混合物に対して徐々に加えて、2Mのアンモニア最終濃度を与えた。冷反応混合物を30分間撹拌した後、その溶媒を真空60トル中において20°Cで蒸発させた後、真空1トル中において40°Cで蒸発させて油状物を与えた。この油状物をジエチルエーテル50mLで研和して固体を与え、これを濾過し且つジエチルエーテルで3回洗浄した。この粗製固体をメタノール100mL中において還流温度で3回研和し、そしてその溶媒を蒸発させて、N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを固体1.50g,100として生成した。ii.N6-ベンゾイル-9-[3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン。N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニン2.62g,7.06ミリモルを、無水ジメチルホルムアミド150mL中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、そしてp-トルエンスルホン酸一水和物1.32g,6.92ミリモルを加えた。この溶液を0°Cまで冷却し、そしてジヒドロピラン1.26mL,13.8ミリモルをシリンジによって加えた。その反応混合物を20°Cまで暖めた。5時間にわたって、合計10当量のジヒドロピランを、記載された方式で2当量ずつ加えた。その反応混合物を0°Cまで冷却し、飽和水性重炭酸ナトリウムをpH8まで徐々に加えた後、水を750mLの容量まで加えた。その水性混合物を塩化メチレン4×200mLで抽出し、そして有機相を一緒にし且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。その固体を濾過し、そして溶媒を真空60トル中において30°Cで蒸発させて少量の液体を与え、これを真空1トル中において40°Cで蒸発させて油状物を与えた。この油状物をp-キシレンと一緒に真空中において40°Cで共蒸発させて油状物を与え、これを塩化メチレン100mL中に溶解させた。ヘキサン200mLをその溶液に対して加え、そしてその低沸点溶媒を真空中において30°Cで蒸発させて、ヘキサン中に懸濁した白色固体を残した。この固体を濾過し且つヘキサン3×10mLで洗浄した後、シリカゲルおよび溶離剤として塩化メチレン-メタノール93:7を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。第一画分は標題化合物3を白色泡状物3.19g,83として生じ、そして第二画分は白色泡状物0.81gを与え、これを、N6-ベンゾイル-9-β-D-アラビノフラノシルアデニンの5’-モノテトラヒドロピラニル誘導体として特性決定した。iii.N6-ベンゾイル-9-[2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン。N6-ベンゾイル-9-[3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン2.65g,4.91ミリモルを無水ピリジン20mL中に溶解させ、そしてその溶媒を真空1mmHg中において40°Cで蒸発させた。得られた油状物を無水塩化メチレン130mL中にアルゴン下において溶解させ、無水ピリジン3.34mL,41.3ミリモルおよびN,N-ジメチルアミノピリジン1.95g,16.0ミリモルを加えた。その反応混合物を0°Cまで冷却し、そして無水トリフルオロメタンスルホン酸1.36mL,8.05ミリモルをシリンジによって徐々に加えた。その反応混合物を0°Cで1時間撹拌した後、それを冷飽和水性重炭酸ナトリウム140mL中に注いだ。その混合物を振とうし、そして有機相を分離し且つ0°Cで保持した。水性相を塩化メチレン2×140mLで抽出した。冷却した状態で絶えず保持された有機抽出物を一緒にし、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させた。その溶媒を真空60トル中において20°Cで蒸発させた後、真空1トル中において20°Cで蒸発させて、N6-ベンゾイル-9-[2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニンを粗製油状物として与え、これ以上精製しなかった。iv.N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン。粗製油状物としてのN6-ベンゾイル-9-[2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン4.9ミリモルを、無水テトラヒドロフラン120mL中に溶解させ、そしてこの溶液をアルゴン下において0°Cまで冷却した。水和物としてのフッ化テトラブチルアンモニウム12.8g,49.1ミリモルを無水テトラヒドロフラン50mL中に溶解させ、そしてこの容量の半分を、冷反応混合物に対してシリンジによって徐々に加えた。0°Cで1時間撹拌した後、試薬の残りを徐々に加えた。その反応混合物を0°Cで更に1時間撹拌した後、溶媒を真空60トル中において20°Cで蒸発させて油状物を与えた。この油状物を塩化メチレン250mL中に溶解させ、そしてブラインで3回洗浄した。有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。固体を濾過し、そして溶媒を蒸発させて油状物を与えた。この粗生成物を、半融ガラス漏斗中でシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製し、そして酢酸エチルを溶離剤として用いた。N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニンは、油状物2.03g,76として得られた。v.N6-ベンゾイル-9-2’-フルオロ-β-D-リボフラノシルアデニン。N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-3’,5’-ジ-O-テトラヒドロピラン-2-イル-β-D-アラビノフラノシル]アデニン1.31g,2.42ミリモルをメタノール60mL中に溶解させ、Dowex50Wx21004cm3,2.4ミリ当量をその反応混合物に対して加えた。その反応混合物を20°Cで1時間撹拌した後、0°Cまで冷却した。次に、トリエチルアミン5mLをその冷反応混合物に対して徐々にpH12まで加えた。樹脂を濾過し、そしてメタノール中30トリエチルアミンで、洗浄物がもはやUV吸収材料を含有しなくなるまで洗浄した。トルエン50mLをそれら洗浄物に対して加え、そして溶媒を真空60トル、続いて1トル中において24°Cで蒸発させて残留物を与えた。この残留物を塩化メチレン30mL中に部分溶解させ、そしてその溶媒を分液漏斗に移した。残留物の残りを熱60°C水中に溶解させ、そして溶媒を冷却した後、それも分液漏斗に加えた。二相系を抽出し、そして有機相を分離し且つ水3×100mLで抽出した。合わせた水性抽出物を真空60トル、続いて1トルHg中において40°Cで蒸発させて油状物を与え、これを無水ピリジン50mLと一緒に蒸発させた。この油状物を、更に、五酸化リンの存在下の真空1トルHg中において20°Cで一晩中乾燥させて、N6-ベンゾイル-9-2’-フルオロ-b-D-リボフラノシルアデニンを黄色泡状物1.08g,100として与え、これは少量の不純物を含んでいた。vi.N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-β-D-リボフラノシル]アデニン。少量の不純物を含有したN6-ベンゾイル-9-2’-フルオロ-b-D-リボフラノシルアデニン1.08g,2.89ミリモルを、無水ピリジン20mL中にアルゴン下で溶解させ、そして乾燥トリエチルアミン0.52mL,3.76ミリモルを加えた後、塩化4,4’-ジメトキシトリチル1.13g,3.32ミリモルを加えた。20°Cで4時間撹拌した後、その反応混合物を分液漏斗に移し、そしてジエチルエーテル40mLを加えて白色懸濁液を与えた。この混合物を水で3回洗浄し3×10mL、有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。トリエチルアミン1mLをその溶液に対して加え、そしてその溶媒を真空60トルHg中において20°Cで蒸発させて油状物を与え、これを、トリエチルアミン1mL含有トルエン20mLと一緒に蒸発させた。この粗生成物を、シリカゲルおよび酢酸エチル-トリエチルアミン99:1に続いて酢酸エチル-メタノール-トリエチルアミン80:19:1を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を二つの画分で与えた。それら画分を真空60トル、続いて1トルHg中において20°Cで蒸発させて泡状物を与え、これを、水酸化ナトリウムの存在下の真空1トルHg中において20°Cで更に乾燥させて、N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-β-D-リボフラノシル]アデニンを泡状物1.02g,52として与えた。vii.N6-ベンゾイル-[2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル]-アデノシン-3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダイト。N6-ベンゾイル-9-[2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-β-D-リボフラノシル]アデニン1.26g,1.89ミリモルを、無水ジクロロメタン13mL中にアルゴン下で溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン0.82mL,4.66ミリモルを加え、そしてその反応混合物を0°Cまで冷却した。クロロジイソプロピルアミノ-β-シアノエトキシホスフィン0.88mL,4.03ミリモルを、20°Cまで暖められ且つ3時間撹拌されたその反応混合物に対して加えた。酢酸エチル80mLおよびトリエチルアミン1mLを加え、そしてこの溶液をブライン3×25mLで洗浄した。有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。固体の濾過後、その溶媒を真空中において20°Cで蒸発させて油状物を与え、これを、シリカゲルおよび溶離剤としてヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン50:49:1を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。真空中において20°Cでの画分の蒸発は泡状物を与え、これを、水酸化ナトリウムの存在下の真空1トルHg中において20°Cで24時間更に乾燥させて、N6-ベンゾイル-[2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル]-アデノシン-3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダイトを泡状物1.05g,63として与えた。実施例4-b2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-ウリジン3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダイト。2,2’-シクロウリジンを、ジオキサン中70フッ化水素/ピリジンの溶液で120°Cにおいて10時間処理して、溶媒の除去後に、75収率の2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンを与える。5’-DMTおよび3’-シアノエトキシジイソプロピルホスルアミダイトで誘導体化されたヌクレオシドを、標準的な文献手順[Gait監修,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IRLPress,ワシントン,DC1984]によって、または実施例4-aの手順にしたがって得る。実施例4-c2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-シチジン-3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダイト。2’-デオキシ-2’-フルオロウリジン2.51g,10.3ミリモルを、CBReeseら,JChemSocPerkinTransI,11711176頁1982の方法により、無水酢酸3.1mL,32.7ミリモルを無水ピリジン26mL中において室温で用いるアセチル化によって、対応するシチジン類似体に変換した。その反応をメタノールで急冷し、溶媒を真空1トル中で蒸発させて油状物を与え、これをエタノールおよびトルエンと一緒に共蒸発させた。3’,5’-O-ジアセチル-2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンは、エタノールから結晶化して、無色結晶2.38g,81を与えた。N-4-1,2,4-トリアゾール-1-イル-3’,5’-O-ジアセチル-2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンは、3’,5’-O-ジアセチル-2’-デオキシ-2’-フルオロウリジン2.75g,9.61ミリモルと、1,2,4-トリアゾール5.97g,86.5ミリモル、オキシ塩化リン1.73mL,18.4ミリモルおよびトリエチルアミン11.5mL,82.7ミリモルとの無水アセトニトリル中において室温での反応によって70収率で得られた。90分後、その反応混合物を氷温まで冷却し、そしてトリエチルアミン7.98mL,56.9ミリモルを加えた後、水4.0mLを加えた。溶媒を真空1トル中で蒸発させて油状物を与え、これを塩化メチレン中に溶解させ、そして飽和水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。その水性相を塩化メチレンで2回抽出し2×100mL、そして有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒の蒸発は油状物を与え、これから、生成物N-4-1,2,4-トリアゾール-1-イル-3’,5’-O-ジアセチル-2’-デオキシ-2’-フルオロウリジンが、エタノールからの結晶化によって得られた。2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンは、濃水酸化アンモニウム4.26mL,81.2ミリモルをジオキサン中において室温で6時間用いる、保護されたトリアゾール-1-イル誘導体の処理によって与えられた。溶媒の蒸発後、その油状物をメタノール中の半飽和氷温でアンモニア中で16時間撹拌した。その溶媒を蒸発させ、そして2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンを酢酸エチル-メタノールv/v,75:25から結晶化させて、無色結晶1.24g,75を与えた。N-4-ベンゾイル-2’-デオキシ-2’-フルオロシチジンは、無水安息香酸を無水ジメチルホルムアミド中で用いる選択的ベンゾイル化によって製造された。VBhatら,NucleosidesNucleotides,8巻,179183頁1989。5’-O-4,4’-ジメトキシトリチル-3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-シアノエチルホスホルアミダイトは、実施例4-aにしたがって製造された。実施例4-di.9-3’,5’-[1,1,3,3-テトライソプロピルジシロクス-1,3-ジイル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン。グアノシンの3’および5’位を、Robinsら[CanJChem611911]の手順により、TPDS1,1,3,3-テトライソプロピルジシロクス-1,3-ジイル保護基の添加によって保護した。DMSO160mLおよび無水酢酸20mLの撹拌溶液に対して、TPDSグアノシン21g,0.040モルを加えた。その反応を室温で36時間撹拌した後、0°Cまで冷却した。冷エタノール400mL,95を加え、そしてその反応混合物をドライアイス/アセトン浴中で-78°Cまで更に冷却した。NaBH42.0g,1.32モル当量を加えた。その反応混合物を-2°Cまで暖め、30分間撹拌し、そして再度-78°Cまで冷却した。これを2回繰返した。NaBH4の添加を完了した後、その反応を0°Cで30分間、続いて室温で1時間撹拌した。その反応を酢酸エチル1L中にとり、そしてNaClの飽和溶液で2回洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥させ且つ減圧下で蒸発させた。その残留物をトルエンと一緒に2回共蒸発させ、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによってCH2Cl2-MeOH9:1を溶離剤として用いて精製した。純生成物6.02gは、適当なカラム画分から、これらの画分の蒸発の際に沈澱し、そして追加の生成物11.49gは、それら画分の蒸発時の残留物として得られた。ii.N2-イソブチリル-9-2’-O-イソブチリル-3’,5’-[1,1,3,3-テトライソプロピルジシロクス-1,3-ジイル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン。9-3’,5’-[1,1,3,3-テトライソプロピルジシロクス-1,3-ジイル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン6.5g,0.01248モルを、無水ピリジン156mL中にアルゴン下において溶解させた。DMAP9.15gを加えた。無水イソ酪酸6.12mLを徐々に加え、そしてその反応混合物を室温で一晩中撹拌した。その反応混合物を冷飽和NaHCO3156mL中に注ぎ且つ10分間撹拌した。その水溶液を酢酸エチル156mLで3回抽出した。有機相を飽和NaHCO3で3回洗浄し、そして蒸発乾固させた。その残留物をトルエンと一緒に共蒸発させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってCH2Cl2-アセトン85:15を用いて精製して、生成物5.67gを生成した。iii.N2-イソブチリル-9-2’-O-イソブチリル-β-D-アラビノフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-2’-イソブチリル-3’,5’-[1,1,3,3-テトライソプロピルジシロクス-1,3-ジイル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン9.83g,0.01476モルを、無水THF87.4mL中にアルゴン下の室温で溶解させた。THF中1MnBu4NF-29.52mL,2当量を加え、そしてその反応混合物を30分間撹拌した。その反応混合物を室温で蒸発させ、そしてその残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってEtOAc-MeOH85:15を用いて精製して、生成物4.98g80を生成した。iv.N2-イソブチリル-9-2’-O-イソブチリル-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-2’-イソブチリル-β-D-アラビノフラノシルグアニン4.9gを、無水1,4-ジオキサン98mL中にアルゴン下の室温で溶解させた。p-トルエンスルホン酸一水和物0.97gを加えた後、3,4-ジヒドロ-2H-ピランDHP,9.34mL,8.8当量を加えた。その反応混合物を2時間撹拌した後、0°Cまで冷却し、そして飽和NaHCO3125mLを加えて反応を急冷した。その反応混合物を125mLずつのCH2Cl2で3回抽出し、そして有機相をMgSO4上で乾燥させた。その有機相を蒸発させ、そして残留物を、最小量ではあるが、シロップではなくて透明液体を生じるのに充分な量のCH2Cl2中に溶解させた後、ヘキサンCH2Cl2の量の10倍中に滴下した。その沈澱を濾過して、生成物5.59g81.5を生成した。v.N2-イソブチリル-9-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-2’-イソブチリル-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン5.58gを、ピリジン-MeOH-H2O65:30:15,52mL中に室温で溶解させた。その溶液を0°Cまで冷却し、そして52mLのEtOH-MeOH95:5中2NNaOHを徐々に加えた後、0°Cで2時間撹拌した。氷酢酸をpH6まで加え、そして飽和NaHCO3をpH7まで加えた。その反応混合物を減圧下で蒸発させ、そして残留物をトルエンと一緒に共蒸発させた。次に、その残留物をEtOAc150mL中に溶解させ、そして飽和NaHCO3で3回洗浄した。有機相を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってEtOAc-MeOH95:5を溶離剤として用いて精製して、生成物3.85g78.3を生成した。vi.N2-イソブチリル-9-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-β-D-アラビノフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-β-D-アラビノフラノシルグアニン3.84gを、無水CH2Cl279mL、無水ピリジン5mLおよびDMAP2.93g中にアルゴン下の室温で溶解させた。その溶液を0°Cまで冷却し、そして無水トリフルオロメタンスルホン酸1.99mLを撹拌しながら徐々に加えた。その反応混合物を室温で1時間撹拌した後、100mLの飽和NaHCO3中に注いだ。水性相を冷CH2Cl2で3回抽出した。有機相をMgSO4上で乾燥させ、蒸発させ、そして無水MeCNと一緒に共蒸発させて、粗生成物を生成した。vii.N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-β-D-リボフラノシルグアニン。粗製N2-イソブチリル-9-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-2’-O-トリフルオロメチルスルホニル-β-D-アラビノフラノシルグアニンを、無水THF113mL中にアルゴン下の0°Cで溶解させた。THF中1MnBu4NF-ピリジンとの共蒸発によって乾燥された36.95mLを撹拌しながら加えた。1時間後、THF中nBu4NF-の追加のアリコート36.95mLを加えた。その反応混合物を0°Cで5時間撹拌し、そして-30°Cで一晩貯蔵した。その反応混合物を減圧下で蒸発させ、そして残留物をCH2Cl2160mL中に溶解させ且つ脱イオン水で5回抽出した。有機相をMgSO4上で乾燥させ且つ蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってEtOAc-MeOH95:5を用いて精製して、生成物5.25gを生成した。viii.N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-β-D-リボフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-3’,5’-ジ-O-[テトラヒドロピラン-2-イル]-β-D-リボフラノシルグアニン3.85gを、MeOH80mL中に室温で溶解させた。予め洗浄されたDowex50W樹脂12.32cm3を加え、そしてその反応混合物を室温で1時間撹拌した。樹脂を濾過し、そして濾液を蒸発乾固させた。その樹脂をピリジン-トリエチルアミン-H2O1:3:3で、濾液が透明になるまで洗浄した。この濾液を蒸発させて油状物を得た。両方の濾液からの残留物をH2O200mL中で一緒にし、そしてCH2Cl23×100mLで洗浄した。水性相を蒸発乾固させ、そして残留物を熱MeOHから再結晶させて、生成物0.299gを白色粉末として生成した。残りのMeOH溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、EtOH-MeOH4:1での溶離によって生成物0.783gを更に生成した。ix.N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-[4,4-ジメトキシトリチル]-β-D-リボフラノシルグアニン。N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-β-D-リボフラノシルグアニン1.09gを、ピリジン20mLおよびトリエチルアミン0.56mL中にアルゴン下の室温で溶解させた。塩化4,4’-ジメトキシトリチル1.20g,1.15モル当量を加え、そしてその反応混合物を室温で5時間撹拌した。その混合物を分液漏斗に移し、そしてジエチルエーテル100mLで抽出した。有機相を飽和NaHCO33×70mLで洗浄し、そして水性相をジエチルエーテルで3回逆抽出した。合わせた有機相をMgSO4上で乾燥させ、そしてトリエチルアミン4mLを加えて、その溶液を塩基性pHで維持した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってEtOAc-トリエチルアミン100:1に続いてEtOAc-MeOH-トリエチルアミン95:5:1を溶離剤として用いて精製して、生成物1.03gを生成した。x.N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-[4,4-ジメトキシトリチル]-グアノシン-3’-O-N,N-ジイソプロピル-β-D-シアノエチルホスホルアミダイト。N2-イソブチリル-9-2’-デオキシ-2’-フルオロ-5’-O-[4,4’-ジメトキシトリチル]-β-D-リボフラノシルグアニン0.587gを、無水CH2Cl231mLおよびジイソプロピルエチルアミン0.4mL中にアルゴン下の室温で溶解させた。その溶液を0°Cまで冷却し、そしてクロロジイソプロピルアミノ-β-シアノエトキシホスフィン0.42mLを徐々に加えた。その反応混合物を室温まで暖め且つ3.5時間撹拌した。CH2Cl2-トリエチルアミン100:1,35mLを加え、そしてその混合物を飽和NaHCO36mLで洗浄した。有機相をMgSO4上で乾燥させ且つ減圧下で蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、2カラム容量のヘキサン-EtOAc-トリエチルアミン75:25:1、続いてヘキサン-EtOAc-トリエチルアミン25:75:1、そして最後にEtOAc-トリエチルアミンを用いて精製した。生成物含有画分をプールし、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた油状物をMeCNと一緒に2回共蒸発させ且つ減圧下で乾燥させた。得られた白色固体をCH2Cl23mL中に溶解させ、そして撹拌されているヘキサン300mL中に滴下した。得られた沈澱を濾過し、そして減圧下で乾燥させて、生成物0.673g88を生成した。実施例5糖および塩基フラグメント上に置換を有するヌクレオシドアミダイトを、実施例5-a~5-kで示す。実施例5-a他のヌクレオシドアミダイトi.1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン2,2’-アンヒドロ-[1-β-D-アラビノフラノシル-5-メチルウリジン]71g,0.32ミリモル実施例2-aよりおよびジオキサン700mLを、2リットルステンレス鋼製ボンベ中に入れ、そしてHF/ピリジン100g,70を加えた。その混合物を120~125°Cで16時間加熱した後、氷浴中で冷却した。そのボンベを開け、そして混合物を3リットルの氷上に注いだ。この混合物に対して、炭酸水素ナトリウム300gおよび飽和重炭酸ナトリウム溶液400mLを注意深く加えた。その混合物を濾過し、そしてその濾過ケーキを水2×100mLおよびメタノール2×500mLで洗浄した。その水およびメタノール洗液を真空中で濃縮乾固させた。メタノール200mLおよび粗シリカゲル80gをその残留物に対して加え、そしてその混合物を真空中で濃縮乾固させた。得られた材料をシリカゲル上で濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、酢酸エチルおよびメタノールの勾配100:0~85:15を用いて精製した。生成物画分のプールおよび濃縮は、標題化合物36.9g51,2段階収率を与えた。この反応から更に単離されたのは、1-2-フェニル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン10.3gであった。この材料は、ボンベ反応が不純材料で行われる場合、上記アンヒドロ反応からのフェノールおよびそのナトリウム塩から形成される。アンヒドロ材料が精製されている場合、この生成物は形成されない。形成された1-2-フェニル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジンは、2’-フルオロ材料の場合と同様の反応条件を用いて、そのDMT/ホスホルアミダイトに変換された。ii.1-5-O-ジメトキシトリチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン31.15g,0.12モルをピリジン150mL中に懸濁させ、そして塩化ジメトキシトリチル44.62g,0.12モルを加えた。その混合物を密封フラスコ中で2時間撹拌した後、メタノール30mLを加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を飽和重炭酸塩溶液500mLと酢酸エチル3×500mLとに分配した。酢酸エチル部分をプールし且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮して粘稠な油状物にした。その油状物をジクロロメタン100mL中に溶解させ、シリカゲルカラムに対して加え、そして60/39/1~75/24/1まで増加する酢酸エチル:ヘキサン:トリエチルアミンで溶離した。生成物画分をプールし且つ真空中で濃縮して、標題化合物59.9g89を泡状物として与えた。iii.1-5-O-ジメトキシトリチル-2-フルオロ-3-O-N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエチルホスファイト-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1-5-O-ジメトキシトリチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン59.8g,0.106モルを、ジクロロメタンおよび2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト46.9mL,0.148モル中に溶解させ、そしてジイソプロピルアミンテトラゾリド5.46g,0.3当量を加えた。その混合物を16時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム1Lで洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン500mLで逆抽出した。合わせた有機層をブライン1Lで洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン100mLで逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約200mLの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン60/40/1を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル500ml中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで24時間乾燥させて、標題化合物68.2g84を与えた。1HNMR:CDCl3δ0.9-1.4m,14H,4xCH3,2xCH,2.3-2.4t,1H,CH2CN,2.6-2.7t,1H,CH2CN,3.3-3.8m,13H,2xCH3OAr,5’CH2,CH2OP,C-5CH3,4.2-4.3m,1H,4’,4.35-5.0m,1H,3’,4.9-5.2m,1H,2’,6.0-6.1dd,1H,1’,6.8-7.4m,13H,DMT,7.5-7.6d,1H,C-6,8.8bs,1H,NH。31PNMRCDCl3;151.468,151.609,151.790,151.904。iv.1-3’,5’-ジ-O-アセチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン実施例5-a-iの手順によって製造された1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン22.4g,92ミリモル,85純度を、ピリジン2×150mLと一緒に共沸させ、そしてピリジン250mL中に溶解させた。無水酢酸55mL,0.58モルを加え、そしてその混合物を16時間撹拌した。メタノール50mLを加え、そして撹拌を30分間続けた。その混合物を蒸発させてシロップにした。そのシロップを最小量のメタノール中に溶解させ、そしてシリカゲルカラム上に加えた。ヘキサン/酢酸エチル1:1を用いて生成物画分を溶離した。精製は、標題化合物19.0g74を与えた。実施例5-bi.4-トリアジン-1-3’,5’-ジ-O-アセチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1,2,4-トリアゾール106g,1.53モルをアセトニトリル150mL中に溶解させた後、トリエチルアミン257mL,1.84モルを溶解させた。その混合物を、氷浴を用いて0~10°Cに冷却した。POCl334.5mL,0.375モルを、添加用漏斗によって徐々に加え、そしてその混合物を更に45分間撹拌した。別のフラスコ中で、1-3’,5’-ジ-O-アセチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン56.9g,0.144モルをアセトニトリル150mL中に溶解させた。その1-3’,5’-ジ-O-アセチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン含有溶液を、トリアゾール溶液に対してカニューレによって徐々に加えた。氷浴を除去し、そしてその反応混合物を室温まで1時間暖めた。アセトニトリルを真空中で除去し、そして残留物を飽和重炭酸ナトリウム溶液400mLとジクロロメタン4×400mLとに分配した。有機層を一緒にし且つ真空中で濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル200mL中に溶解させ且つ固体の沈澱を開始させた。ヘキサン300mLを加え、そして更に固体を沈澱させた。その固体を濾過によって集め且つヘキサン2×200mLで洗浄し、そして真空中で乾燥させて63.5gを与え、これを、更に精製することなくそのまま用いた。ii.5-メチル-1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシルシトシン4-トリアジン-1-3’,5’-ジ-O-アセチル-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-チミン75.5g,0.198モルを、ステンレス鋼製ボンベ中のアンモニア400mL中に溶解させ、そして一晩密封した。そのボンベを冷却し且つ開け、そしてアンモニアを蒸発させた。メタノールを加えてその材料をフラスコに移し、そして約10容量のエチルエーテルを加えた。その混合物を10分間撹拌した後、濾過した。固体をエチルエーテルで洗浄し且つ乾燥させて、標題化合物51.7g86を与えた。iii.4-N-ベンゾイル-5-メチル-1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシルシトシン5-メチル-1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシルシトシン54.6g,0.21モルをピリジン700mL中に懸濁させ、そして無水安息香酸70g,0.309モルを加えた。その混合物を室温で48時間撹拌した。ピリジンを蒸発によって除去し、そしてメタノール800mLを加え、そしてその混合物を撹拌した。沈澱が形成され、これを濾過し、メタノール4×50mLで洗浄し、エーテル3×100mLで洗浄し、そして真空オーブン中において45°Cで乾燥させて、標題化合物40.5gを与えた。その濾液を真空中で濃縮し、そして飽和メタノール性アンモニアをボンベ中において室温で一晩用いて処理した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。再循環された出発物質を上記のように再度処理して、標題化合物を更に4.9g与え、合計45.4g61の標題化合物を与えた。iv.4-N-ベンゾイル-5-メチル-1-2-フルオロ-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシルシトシン4-N-ベンゾイル-5-メチル-1-2-フルオロ-β-D-エリトロペントフラノシル-シトシン45.3g,0.124モルを乾燥ピリジン250ml中に溶解させ、そして塩化ジメトキシトリチル46.4g,0.137モルを加えた。その反応混合物を室温で90分間撹拌し、そしてメタノール20mLを加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル2×1Lと飽和重炭酸ナトリウム1Lとに分配した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして真空中で蒸発させた。得られた油状物をジクロロメタン200mL中に溶解させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン50:50:1を用いて精製した。生成物画分をプールし、真空中で濃縮して乾燥させて、標題化合物63.6g76.6を与えた。v.4-N-ベンゾイル-5-メチル-1-2-フルオロ-3-O-N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエチルホスファイト-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシルシトシン4-N-ベンゾイル-5-メチル-1-2-フルオロ-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-シトシン61.8g,92.8ミリモルを、ジクロロメン300mL、2-シアノエチルN,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト40.9mL,0.130モルおよびジイソプロピルアミンテトラゾリド4.76g,0.3当量と一緒に室温で17時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム1Lで洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン500mLで逆抽出した。合わせた有機層をブライン1Lで洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン100mLで逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約200mLの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン60/40/1を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル500ml中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで24時間乾燥させて、標題化合物72.4g90を与えた。1HNMR:CDCl3δ1.17-1.3m,12H,4xCH3,1.5-1.6m,2H,2xCH,2.3-2.4t,1H,CH2CN,2.6-2.7t,1H,CH2CN,3.3-3.9m,13H,2xCH3OAr,5’CH2,CH2OP,C-5CH3,4.2-4.3m,1H,4’,4.3-4.7m,1H,3’,5.0-5.2m,1H,2’,6.0-6.2dd,1H,1’,6.8-6.9m,4H,DMT,7.2-7.6m,13H,DMT,Bz,7.82-7.86d,1H,C-6,8.2-8.3d,2H,Bz。31PNMRCDCl3;bs,151.706;bs,151.941。実施例5-ci.1-2,3-ジ-O-ブチルスズ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン5-メチルウリジン7.8g,30.2ミリモルおよび酸化ジブチルスズ7.7g,30.9ミリモルを、メタノール150mL中に懸濁させ且つ加熱して16時間還流させた。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そしてその固体をメタノール2×150mLで洗浄した。得られた固体を乾燥させて、標題化合物12.2g80.3を与えた。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。NMRは構造と一致した。ii.1-2-O-プロピル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1-2,3-ジ-O-ブチルスズ-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン5.0g,10.2ミリモルおよびヨードプロパン14.7g,72.3ミリモルを、DMF中において100°Cで2日間撹拌した。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そして濃縮した。残留するDMFをアセトニトリルと一緒に共蒸発させた。残留物を乾燥した後、2.40g78の標題化合物および3’-O-プロピル異性体を粗製混合物として得た。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。iii.1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン粗製混合物としての1-2-O-プロピル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジンおよび3’-O-プロピル異性体2.4g,8.4ミリモルを、ピリジン2×40mLと一緒に共蒸発させ、そしてピリジン60mL中に溶解させた。その溶液をアルゴン下の室温で15分間撹拌し、そして塩化ジメトキシトリチル4.27g,12.6ミリモルを加えた。その混合物をtlcによって定期的に検査し、そして3時間で完了した。メタノール10mLを加え、そしてその混合物を10分間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、初めから終わりまで用いられる1トリエチルアミンを含むヘキサン/酢酸エチル60:40を用いて精製した。適当な画分のプールおよび濃縮は、標題化合物1.32g26を与えた。iv.1-2-O-プロピル-3-O-N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエチルホスファイト-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン50.0g,86ミリモル、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト38mL,120ミリモルおよびジイソプロピルアミンテトラゾリド4.45g,25.8ミリモルをジクロロメタン500mL中に溶解させ且つ室温で40時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液2×400mLおよびブライン1×400mLで洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン40:60および1トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて43g67を与えた。v.1-2-O-プロピル-3-O-アセチル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン1-2-O-プロピル-5-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン10.0g,16.6ミリモルをピリジン50mL中に溶解させ、そして無水酢酸4.7ml,52.7ミリモルを加えた。その反応混合物を18時間撹拌し、そして過剰の無水酢酸をメタノール10mLで中和した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を酢酸エチル150mL中に溶解させた。その酢酸エチルを飽和NaHCO3150mLで洗浄し、そしてその飽和NaHCO3洗液を酢酸エチル50mLで逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、そして真空中で濃縮して、白色泡状物11.3gを生成した。粗収率は100を越え、そしてNMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。実施例5-di.1-2-O-プロピル-3-O-アセチル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-4-トリアゾロ-5-メチルピリミジントリアゾール10.5g,152ミリモルをアセトニトリル120mlおよびトリエチルアミン23mL中に無水条件下で撹拌しながら溶解させた。得られた溶液をドライアイスアセトン浴中で冷却し、そしてオキシ塩化リン3.9mL,41ミリモルを5分間にわたって徐々に加えた。その混合物は、更に10分間撹拌されて、生成物形成を示す希薄なスラリーになった。1-2-O-プロピル-3-O-アセチル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジン11.2g,165ミリモルをアセトニトリル150mL中に溶解させ、そして上記スラリーに対して加え、ドライアイスアセトン浴温度を維持した。その反応混合物を30分間撹拌した後、室温まで暖め且つ更に2時間撹拌した。その混合物を冷蔵庫中に0°Cで18時間置いた後、取出し、そして室温まで暖めた。その混合物の酢酸エチル/ヘキサン1:1中のtlcは、出発物質の完全な転化を示した。その反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチル300mL中に再溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液2×400mLおよびブライン400mLで抽出した。水性層を酢酸エチル200mLで逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして真空中で濃縮した。粗収量は11.3g95であった。NMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。ii.1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルシチジン1-2-O-プロピル-3-O-アセチル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-4-トリアゾロ-5-メチルピリミジン11.2g,16.1ミリモルを、ドライアイスアセトン温度の100mLボンベ中の液体アンモニア50ml中に溶解させた。そのボンベを室温まで18時間暖めた後、ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。ボンベ内容物をビーカーに移し、そしてメタノール50mLを加えた。その混合物を蒸発させてほぼ乾固させた。酢酸エチル300mLを加え、そして若干の固体を濾去した後、飽和重炭酸ナトリウム溶液2×250mLで洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、前に濾去された固体と一緒にし、そして真空中で濃縮して、10.1gの材料を与えた。粗収率は100を越え、そしてNMRは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。iii.1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルシチジン7.28g,10.1ミリモルおよび無水安息香酸4.5g,20ミリモルを、DMF60ml中に溶解させ且つ室温で18時間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル300mL中に再溶解させた。その酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液2×400mLで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン1:2および1トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて5.1g1-2-O-プロピルジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-5-メチルウリジンで開始する4段階で59を与えた。iv.1-2-O-プロピル-3-O-N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエチルホスファイト-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン1-2-O-プロピル-5-O-ジメトキシトリチル-β-D-エリトロペントフラノシル-4-N-ベンゾイル-5-メチルシチジン5.0g,7ミリモル、2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト3.6mL,11.3ミリモルおよびジイソプロピルアミノテトラゾリド0.42g,2.4ミリモルをジクロロメタン80mL中に溶解させ且つ室温で40時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液2×40mLおよびブライン1×40mLで洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル/ヘキサン40:60および1トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて7.3g98を与えた。実施例5-ei.2’-O-メチル-5-メチルウリジン方法1:粗製2,2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン10.0g,0.0416モル実施例2-aを、ステンレス鋼製ボンベ100mL容量中のメタノール80mL中に溶解させた。ホウ酸トリメチル5.6mL,0.049モルを加えた注記1。そのボンベを密封し且つ150°Cの油浴中に入れ、そこで約5atmの圧力を生じさせた。40時間後、そのボンベを氷中で冷却し、開け、そしてその内容物を減圧下で濃縮して、12gの黄褐色泡状物にした。その粗製物のNMRは、出発物質中の不純物を混入した生成物並びに微量のチミンおよび出発物質と一致した注記2。その粗生成物をそのまま次の工程で用いた。ホウ酸トリアルキルは、ボランの溶液例えば、THF中1Mを所望のアルコールに対して加え且つ得られた水素ガスを発生させることによって好都合に生成することができる。ヌクレオシドは、この点で、メタノールの酢酸エチル中の勾配0~10を用いるカラムクロマトグラフィーおよび生成物を無水エタノールから結晶化させることによって精製して、白色針状結晶,mp192~193°Cmp197-198°Cを与えることができる。この化合物の融点の文献基準は、EOotsuka,HInoue,1989年4月4日の特許公報第8985456号に包含されている。方法2:純2,2’-アンヒドロ-5-メチルウリジン1.0g,4.16ミリモルおよびホウ酸トリメチル0.56mL,4.9ミリモルを、ステンレス鋼製ボンベ100mL中のメタノール20mL中に溶解させた。そのボンベを150°Cの油浴中に入れた。80時間後、TLCは、反応が概ね完了したことを示した。その溶媒を除去して白色泡状物を生じた。NMRは、93:7の生成物対出発物質比率を示し、他の不純物は認められなかった。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル中のメタノール勾配0~10を用いて精製して、純粋な生成物850mg75およびまだ不純な生成物250mgを生じた。分析的に純粋な試料をNMR用に調製した。1HNMRDMSO-d6:δ1.79s,3H,5-CH3,3.35s,3H,OCH3,3.5-3.7m,2H,H-5’,3.7-3.9m,2H,H-3’,4’,4.15m,1H,H-2’,5.17m,2H,3’,5’-OH,5.87d,J=5Hz,1H,H-1’,7.80s,1H,H-6,11.37brs,1H,N-H。C11H16N2O6272.26の分析計算値:C,48.52;H,5.92;N,10.29。実測値:C,48.56;H,5.88;N,10.22。方法3:方法2に記載した方法と同じ、ただし、30mgの炭酸水素ナトリウムが反応に加えられ粗アンヒドロのナトリウム含量を一致させるため、そのため反応が完了するのに24時間かかった。塩化アンモニウム50mgが塩基を中和するために加えられ、溶液を乾固させた。粗生成物のNMRは3種の重要でないヌクレオシド不純物総計で約6を示した。同様のカラムを行った後、残渣をメタノール/酢酸エチルから再結晶すると、最初に850mg、続いて120mgの物質が得られ、両方ともなお2-3の未知のヌクレオシド不純物を含んでおり、85の収率であった。ii.5’-O-ジメトキシトリフェニルメチル-2’-O-メチル-5-メチルウリジン粗2’-O-メチル-5-メチルウリジン12gをピリジン2x50mLと共蒸発させ、乾燥ピリジン50mLに溶解した。塩化ジメトキシトリフェニルメチル18.1g,0.054モルを加え、フラスコに栓をして室温で45分間放置した。反応を停止させるためにメタノール10mLを加え、減圧下で溶液を濃縮すると油状物となった。残渣は酢酸エチル2x400mLおよび飽和炭酸水素ナトリウム溶液500mL間に分配させた。有機層を併せて乾燥し硫酸ナトリウム、濾過して濃縮すると黄色あわ状物を得た。あわ状物は塩化メチレン60mLに溶解し、シリカゲルカラムにのせ、酢酸エチル-ヘキサン-トリエチルアミン60:40:1で溶出した。生成物を含有している分画を集めて濃縮し、乾燥アセトニトリルと共蒸発させた2x50mL。得られた残渣は1mmHgで24時間乾燥すると、パリパリした白色あわ状物となった5-メチルウリジンからの3工程で60.4。実施例5-fi.2,3,5-トリ-O-ベンゾイル-2-チオ-5-メチルウリジン250mlの3頚丸底フラスコ中、1-O-アセチル-2,3,5-トリ-O-ベンゾイルリボース0.500g、1ミリモルおよび5-メチル-2-チオウラシル0.156g、1.1ミリモルを真空下で一夜乾燥させた。これらの成分は10mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、80°Cへ加熱した。この温かい溶液にN-O-ビストリメチルシリルアセトアミド0.509g、2.5ミリモルを加え、反応液は80°Cで1時間攪拌した。反応混合液を加熱装置から取り出して室温まで放置により冷却し、トリメチルシリルトリフレート0.334g、1.5ミリモルを滴加した。反応混合物は次に50°Cに加熱し、4時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル/ヘキサン1:1を使用するTLCにより検査すると、反応が完了していることが示された。溶液を室温まで冷却し、50mLのジクロロメタンおよび50mLの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水相をジクロロメタンで2回以上抽出し、有機層を併せ、硫酸マグネシウムで乾燥して濃縮すると淡黄色あわ状物を得た。このあわ状物はさらに精製することなく使用された。ii.2-チオ-5-メチルウリジン粗2,3,5-トリ-O-ベンゾイル-2-チオ-5-メチルウリジン20g、37ミリモルを500mLのメタノールに溶解した。この溶液にナトリウムメトキシド2.0g、37ミリモルを加え、反応液を2時間攪拌した。反応液を酢酸エチル/ヘキサン1:1および酢酸エチル/メタノール9:1を使用するTLCにより検査すると、反応が完了していることが示された。Dowex50H樹脂をpH試験紙で溶液が中性になるまで加え、樹脂を濾過した。樹脂は別のメタノール100mlで洗浄し、併せた濾液を濃縮すると、表題化合物8.5g84が淡黄色あわ状物として得られた。実施例5-g2’-O-メチル-5-メチル-2-チオウリジン攪拌した2-メチル-5-チオウリジン0.500g、1.8ミリモルのDMF10ml溶液に、酸化ジブチルスズ0.500g、2.0ミリモルヨウ化テトラブチルアンモニウム0.738g、2ミリモルおよびヨウ化メチル1.022g、7.2ミリモルを加える。反応フラスコを封じ、50°Cで16時間加熱する。混合物を冷却し、追加のヨウ化メチル1.022g、7.2ミリモルを加え、反応液をさらに16時間加熱する。この時間の終了時に反応混合物を室温まで冷却して塩化メチレンで希釈し、塩化メチレン/メタノールの濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な分画を集めて濃縮すると2’-O-メチル-5-メチル-2-チオウリジンが得られる。実施例5-h2’-O-プロピル-5-メチル-2-チオウリジン表題化合物はヨウ化メチルの代わりにヨウ化プロピル1.22g、7.2ミリモルを用いる実施例5-gの方法により製造される。実施例5-ii.2’-O-フタルイミドプロピル-5-メチル-2-チオウリジン表題化合物はヨウ化メチルの代わりにブロモ-プロピルフタルイミド0.67g、2.5ミリモルを用いる実施例5-gの方法により製造され、追加0.300gは2日目に加えられる。ii.5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-プロピルアミン-5-メチル-2-チオウリジン2’-O-フタルイミドプロピル-5-メチル-2-チオウリジン2.6g、3.6ミリモルを乾燥ピリジンに溶解し2度共蒸発させた。得られたあわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル1.8g、5.5ミリモル続いて4,4-ジメチルアミノピリジン0.050g、0.4ミリモルを加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。iii.5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-プロピルアミン-5-メチル-2S-トルオイル-2-チオウリジン5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-プロピルアミン-5-メチル-2-チオウリジン1g、1.6ミリモルをDMFに溶解し、0°Cに冷却した。この溶液に、トリエチルアミン0.300g、3ミリモル続いて塩化トルオイル0.300g、1.92ミリモルを5分以上かけて滴加した。反応液は放置して室温まで温めて一夜攪拌し、反応が完了したらメタノールで停止させて濃縮すると油状物が得られた。油状物は次に250mLの飽和炭酸水素ナトリウム/クロロホルム1:1溶液間に分配させた。水層を2回、75mLのクロロホルムで抽出し、有機層を乾燥して濃縮すると油状物が得られた。保護ヌクレオシドはヘキサン/酢酸エチル濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物はN-3トルオイルおよびS-2トルオイル化合物の混合物として集められた。この混合物はそのままフォスファイト化操作に使用された。iv.5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-プロピルアミン-3’-O-[N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスファイト]-5-メチル-2-S-トルオイル-2-チオウリジン5’-O-ジメトキシトリチル-2’-O-プロピルアミン-5-メチル-2S-トルオイル-2-チオウリジン16.01g、22ミリモルおよびジイソプロピルエチルアミン10mlのTHF200ml溶液に、0°Cでクロロ-β-シアノエトキシ-N,N-ジイソプロピルアミノホスフィン5.6ml、25ミリモルを加える。反応混合物は室温で20時間攪拌した。反応液は濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。1トリエチルアミンを常に含む酢酸エチル/ヘキサン濃度勾配で溶出し、適切な分画を集めて濃縮すると表題化合物が得られる。実施例5-ji.2’-O-アミノプロピル-5-メチル-2-チオウリジン500mlフラスコ中、2’-O-フタルイミドプロピル-5-メチル-2-チオウリジン5.0g、15.8ミリモルを100mlのメタノールに溶解する。ヒドラジン2.02g、63.2ミリモルを加え、混合物は攪拌しながら14時間加熱還流60-65°Cする。真空下、溶媒を蒸発させ、残渣はジクロロメタン150mlに溶解して等容量のNH4OHで2回抽出する。有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。NMRが生成物純度の検定に使用された。生成物はさらに精製することなく次の反応に使用された。ii.2’-O-トリフルオロアセチルアミノプロピル-5-メチル-2-チオウリジン2’-O-アミノプロピル-5-メチル-2-チオウリジンをMeOHに溶解し、5当量のトリエチルアミン続けて10当量のトリフルオロ酢酸エチルを加える。表題化合物が精製後に単離される。iii.2’-O-トリフルオロアセチルアミノプロピル-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-2-チオウリジン2’-O-トリフルオロアセチルアミノプロピル-5-メチル-2-チオウリジン2.5g、3.6ミリモルを乾燥ピリジンに溶解し、2度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル1.8g、5.5ミリモル続いて4,4-ジメチルアミノピリジン0.050g、0.4ミリモルを加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮すると油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。iv.2’-O-トリフルオロアセチルアミノプロピル-3’-O-[N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスファイト]-5’-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-2-チオウリジン実施例5-j-iiiの表題化合物を用い、実施例5-i-ivの方法により表題化合物が製造される。実施例5-ki.5’-O-ジメトキシトリチル-2-チオ-5-メチルウリジン2-チオ-5-メチルウリジン1g、3.6ミリモルを乾燥ピリジンに溶解し、2度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は25mLの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル1.8g、5.5ミリモル続いて4,4-ジメチルアミノピリジン0.050g、0.4ミリモルを加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に1mLのメタノールを加えた。溶液は75mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび50mLのクロロホルム間に分配させた。水層を2回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために0.5ピリジンを加えたメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。ii.5’-O-ジメトキシトリチル-3’-t-ブチルジメチルシリル-5-メチル-2-チオウリジン5’-O-ジメトキシトリチル-2-チオ-5-メチルウリジン1g、1.73ミリモルを乾燥DMFと2度共蒸発させて乾燥DMFに溶解し、イミダゾール0.141g、2.08ミリモル続いてt-ブチルジメチルシリルクロリド0.313g、2.08ミリモルを加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反応液は酢酸エチル/ヘキサン1:1を使用するTLCにより検査され、それは反応が完了していることを示した。次に反応混合物を5炭酸水素ナトリウム内に注ぎ、クロロホルムで3回抽出した。併せた有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると油状物となった。得られた油状物はメタノール/クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、2’および3’シリル保護ヌクレオシドが別々に単離された。iii.5’-O-ジメトキシトリチル-3’-t-ブチルジメチルシリル-2’-メタンスルホニル-5-メチル-2-チオウリジン5’-O-ジメトキシトリチル-3’-t-ブチルジメチルシリル-5-メチル-2-チオウリジン1.0g、1.45ミリモルをピリジンに溶解して0°Cに冷却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド0.183g、1.6ミリモルを滴加した。TLCにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物をメタノールで中和して濃縮すると油状物が得られた。表題化合物はそのまま続いての反応に使用される。iv.5’-ジメトキシトリチル-3’-t-ブチルジメチルシリル-2,2’-チオアンヒドロ-5-メチル-2-チオウリジン実施例5-k-iiiで得られたメシル化ヌクレオシドに5当量のナトリウムメトキシドを加え、チオアンヒドロ生成物の形成が完了するまで攪拌した。次に溶液をDowex50WH型で中和し、樹脂を濾過して除き、得られた溶液を濃縮すると表題化合物が得られた。v.2’-フルオロ-3’-t-ブチルジメチルシリル-5’-ジメトキシトリチル-5-メチル-2-チオウリジン実施例5-k-ivで得られたチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキサンに溶解した。この溶液に6当量のHF/ピリジン複合体を加え、TLCにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物は等容量の氷に注ぎ、中性になるまで炭酸カルシウムを加えた。固形物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。vi.2’-フルオロ-3’-O-[N,N-ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスファイト]-5’-ジメトキシトリチル-5-メチル-2-チオウリジン2’-フルオロ-3’-t-ブチルジメチルシリル-5’-ジメトキシトリチル-5-メチル-2-チオウリジンを実施例5-i-ivの方法により処理すると表題化合物が得られる。実施例6オリゴリボヌクレオチド合成無置換および置換ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチド本明細書においてPO結合オリゴリボヌクレオチドとも称されるは、ヨウ素での酸化による標準ホスホロアミダイト化学を使用する自動化DNAシンセサイザーAppliedBiosystemsモデル380Bにより合成された。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド本明細書においてPS結合オリゴリボヌクレオチドとも称されるは、ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチドの方法により合成されるが、但し、標準酸化ボトルはホスファイト結合の段階的硫黄化のために3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オンの0.2Mアセトニトリル溶液に置換されていた。硫黄化待ち工程は68秒に延長され、次にキャッピング工程が続いた。CPGカラムからの切断および55°Cでの濃水酸化アンモニウム中での脱保護18時間後、オリゴヌクレオチドは0.5MNaCl溶液から2.5容量のエタノールで2回沈澱させることにより精製された。分析ゲル電気泳動は20アクリルアミド、8M尿素、454mMトリス-ホウ酸緩衝液、pH7.0で行われた。オリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートはポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、完全長物質の80より大きいことが判断された。ホスフィネートオリゴリボヌクレオチド本明細書においてPI結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,508,270号に記載されているように製造される。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチド本明細書においてPMe結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第4,469,863号に記載されているように製造される。ホスホロアミダイトオリゴリボヌクレオチド本明細書においてPN結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,256,775号に記載されているように製造される。アルキルホスホノチオエートオリゴリボヌクレオチド本明細書においてMePS結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される公開されたPCT出願PCT/US94/00902およびPCT/US93/06976各々WO94/17093およびWO94/02499として公開に記載されているように製造される。3’-デオキシ-3’-アミノホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチド本明細書において3’NPN結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,476,925号に記載されているように製造される。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチド本明細書においてPOMe結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,023,243号に記載されているように製造される。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチド本明細書においてBP結合オリゴリボヌクレオチドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,130,302および5,177,198号に記載されているように製造される。実施例7-aオリゴリボヌクレオシド合成メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド本明細書においてMMI結合オリゴリボヌクレオシドとも記される、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド本明細書においてMDH結合オリゴリボヌクレオシドとも記される、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド本明細書においてamide-3結合オリゴリボヌクレオシドとも記されるおよびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド本明細書においてamide-4結合オリゴリボヌクレオシドとも記されるならびに例えば、MMIおよびPOまたはPS結合を交互に持つ混合主鎖化合物は本明細書において援用される米国特許第5,378,825、5,386,023、5,489,677号および公開されたPCT出願PCT/US92/04294およびPCT/US92/04305各々WO92/20822およびWO92/20823として公開に記載されているように製造される。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシド各々本明細書においてFAおよびTFAオリゴリボヌクレオシドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,264,562および5,264,564号に記載されているように製造される。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシド本明細書においてETO結合オリゴリボヌクレオシドとも記されるは本明細書において援用される米国特許第5,223,618号に記載されているように製造される。実施例7-bPNAペプチド核酸PNAそれ自体は既知であり、ペプチド核酸PNA:合成、特性および可能性のある応用、BioorganicMedicinalChemistry,1996,4,5-23、を参考とした任意の種々の方法に従って製造される。それらはまた、米国特許第5,539,083号1994年2月23日に出願された一連番号08/200,742に対応し、本出願と同じ譲受人に譲渡されているに従っても製造される。これらの参照文献は本明細書において援用される。実施例8キメラホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/PS[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/PSオリゴリボヌクレオチド2’-O-アルキルホスホロチオエートおよび2’-OHホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを持つキメラオリゴリボヌクレオチドは上記のようなAppliedBiosystems自動化DNAシンセサイザーモデル380Bを使用して合成された。オリゴリボヌクレオチドは自動化シンセサイザーおよびRNA部分のために5’-ジメトキシトリチル-2’-tert-ブチルジメチルシリル3’-O-ホスホロアミダイトおよび5’および3’ウイングのために5’-ジメトキシトリチル-2’-O-メチル-3’-O-ホスホロアミダイトを使用して合成された。環外アミン上の保護基は、rAおよびrGのためにはフェノキシアセチル、rCおよび2’-O-メチルAおよび2’-O-メチルCのためにはベンゾイル、および2’-O-メチルGのためにはイソブチリルであった。標準合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の送り込み後の待ち工程を600秒に延長し、RNAのために4回および2’-メチルのために2回反復するように修正した。完全に保護されたオリゴリボヌクレオチドは支持体から切断され、アンモニア/エタノール3:1中、室温で一夜かけてホスフェート基を脱保護し、凍結乾燥した。次に、すべての塩基を脱保護するために室温で24時間メタノール性アンモニアで処理し、試料は再び凍結乾燥した。ペレットは2’位を脱保護するためにTBAFの1MTHF溶液に室温で24時間再懸濁した。反応を1MTEAAで停止させ、ロートバックで試料を1/2の容量に減じた後、G25サイズ排除カラムで脱塩した。回収されたオリゴは収率が分光学的に、純度がキャピラリー電気泳動および質量分光計により分析された。実施例9キメラギャップマーオリゴリボヌクレオチドi.キメラのメチルホスフェートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/PMe[2’-OH]/PMe[-2’-O-Me]/PMeオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。ii.キメラホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/PN[2’-OH]/PN[-2’-O-Me]/PNオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。iii.キメラホスホロアミデートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/3’NPN[2’-OH]/3’NPN[-2’-O-Me]/3’NPNオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いると3’-デオキシ-3’-アミノホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。iv.キメラホスフィネートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/PI[2’-OH]/PI[-2’-O-Me]/PIオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスフィネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。v.キメラアルキルホスホノチオエートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/MePS[2’-OH]/MePS[-2’-O-Me]/MePSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホノチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。vi.キメラホスホロジチオエートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/P2S[2’-OH]/P2S[-2’-O-Me]/P2Sオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロジチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。vii.キメラホスホセレネートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/PSe[2’-OH]/PSe[-2’-O-Me]/PSeオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホセレネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。viii.キメラボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/BP[2’-OH]/BP[-2’-O-Me]/BPオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとボラノホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。ix.キメラメチルホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Me]/POMe[2’-OH]/POMe[-2’-O-Me]/POMeオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法において、実施例6のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスホトリエステル主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。実施例10キメラオリゴリボヌクレオシドi.キメラメチレンメチルイミノオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/MMI[2’-OH]/MMI[-2’-O-Me]/MMIオリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンメチルイミノ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。ii.キメラメチレンジメチルヒドラゾオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/MDH[2’-OH]/MDH[-2’-O-Me]/MDHオリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンジメチルヒドラゾ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。iii.キメラホルムアセタールオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/FA[2’-OH]/FA[-2’-O-Me]/FAオリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。iv.キメラチオホルムアセタールオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/TFA[2’-OH]/TFA[-2’-O-Me]/TFAオリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してチオホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。v.キメラエチレンオキシドオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/ETO[2’-OH]/ETO[-2’-O-Me]/ETOオリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してエチレンオキシド結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。vi.キメラメチレンカルボニルアミノオリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/amide-3[2’-OH]/amide-3[-2’-O-Me]/amide-3オリゴリボヌクレオシド実施例7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してamide-3結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。実施例11キメラオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシドi.メチレンメチルイミノ/ホスホロチオエートキメラ、例えば、[2’-O-Me]/PS[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つのウイングにメチレンメチルイミノ結合、および中心部ギャップおよび他のウイングにホスホロチオエート結合を持っている。ii.キメラメチルホスホネート/メチレンメチルイミノ/ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/PMe[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方の部分を持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つのウイングにメチレンメチルイミノ結合、中心部ギャップにホスホロチオエート結合、および他のウイングにメチルホスホネート結合を持っている。iii.キメラメチレンカルボニルアミノ/ホスホロチオエート/メチレンカルボニルアミノオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/amide-3[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/amide-3オリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は両方のウイングにメチレンカルボニルアミノ結合、および中心部ギャップにホスホロチオエート結合を持っている。iv.キメラメチレンカルボニルアミノ/ホスホロチオエート/メチレンメチルイミノオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド、例えば、[2’-O-Me]/amide-3[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/MMIオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つのウイングセグメントにメチレンカルボニルアミノ結合、中心部ギャップセグメントにホスホロチオエート結合、および他のウイングセグメントにメチレンメチルイミノ結合を持っている。v.メチレンメチルイミノ/ホスホジエステル/ホスホロチオエートキメラ、例えば、[2’-O-Me]/MMI-PO[2’-OH]/PS[-2’-O-Me]/MMI-POオリゴリボヌクレオチド/オリゴリボヌクレオシド実施例6および7の化学を用いた実施例8の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物はそのウイングセグメントにメチレンメチルイミノおよびホスホジエステル結合を交互に、およびその中心部ギャップセグメントにホスホロチオエート結合を持っている。実施例12キメラの末端ギャップ形成ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチドi.3’-末端ギャップ形成ホスホロチオエートキメラ、例えば、[2’-O-Me]/PS[2’-OH]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、その3’末端にオープンギャップセグメント、その5’末端にウイングセグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。ii.5’-末端ギャップ形成ホスホロチオエートキメラ、例えば、[2’-OH]/PS[2’-O-Me]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、その5’末端にオープンギャップセグメント、その3’末端にウイングセグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iii.3’-末端ギャップ形成ホスホロチオエートキメラ、例えば、[2’-F]/PS[2’-OH]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、その3’末端にオープンギャップ、その5’ウイングセグメントに2’-フルオロヌクレオシド、そのオープンギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。実施例13単一形主鎖結合および変異ヌクレオシドサブユニットを持つキメラオリゴリボヌクレオチドi.キメラ2’-O-エチルオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Et]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-Et]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-エチルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。ii.キメラ2’-O-プロピルオリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-Pr]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-Pr]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-プロピルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iii.[2’-O-F]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-F]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-フルオロヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iv.[2’-O-EtOMe]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-EtOMe]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-メトキシエチルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。v.[2’-O-EtOMe]/PS[2’-OH]/PS[2’-F]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、その5’ウイングセグメントに2’-O-メトキシエチルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシド、その3’ウイングセグメントに2’-フルオロヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。vi.[2’-O-EtOMe]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-Me]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、その5’ウイングセグメントに2’-O-メトキシエチルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシド、その3’ウイングセグメントに2’-O-メチルヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。実施例14変異主鎖結合および変異ヌクレオシドを持つキメラオリゴリボヌクレオチドi.[2’-O-Me]/PMe[2’-OH]/PS[2’-F]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例6の化学を用いる実施例8の方法で、その5’ウイングセグメントに2’-O-メチルヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシド、その3’ウイングセグメントに2’-O-フルオロヌクレオシド、ギャップセグメントおよび3’ウイングセグメント中にホスホロチオエート結合および5’ウイングセグメント中にメチルホスホネート結合を持つキメラ化合物が製造される。ii.[2’-O-Me]/PMe[2’-OH]/PS[2’-Pr]/PIオリゴリボヌクレオチド実施例6の化学を用いる実施例8の方法で、その5’ウイングセグメントに2’-O-メチルヌクレオシド、そのギャップに2’-OHヌクレオシド、その3’ウイングセグメントに2’-O-プロピルヌクレオシド、ギャップセグメント中にホスホロチオエート結合、5’ウイングセグメント中にメチルホスホネート結合および3’ウイングセグメント中にホスフィネート結合を持つキメラ化合物が製造される。実施例15代用物ヌクレオシドを含むキメラオリゴリボヌクレオチドi.モルホリノヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[モルホリノヌクレオシド代用物][2’-OH]/PS[モルホリノヌクレオシド代用物]オリゴリボヌクレオチド実施例7および実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,506,337号の教えにより製造されたモルホリノヌクレオシド、およびそのギャップセグメントにホスホロチオエート結合を通して連結された2’-OHヌクレオシドを持つキメラ化合物が製造される。ii.シクロブチルヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[シクロブチルヌクレオシド代用物]/PS[2’-OH]/PS[シクロブチルヌクレオシド代用物]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例7および実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,359,044号の教えにより製造されたシクロブチル代用物ヌクレオシド、およびそのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iii.ピロリジンヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[ピロリジンヌクレオシド代用物]/PS[2’-OH]/PS[ピロリジン糖]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例7および実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,519,135号の教えにより製造されたピロリジン代用物ヌクレオシド、およびそのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iv.3’-末端ギャップ形成PNAホスホロチオエートキメラ、例えば、PNA[2’-OH]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例7-bの化学を組み合わせた実施例8の方法により、ホスホロチオエート結合を持つ2’-OHヌクレオシドから形成されたその3’末端にオープンギャップおよび5’ウイングセグメントにPNA代用物を持つキメラ化合物が製造される。実施例16修飾された塩基を持つヌクレオシドを含むキメラオリゴリボヌクレオチドi.N-2修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾プリン]/PS[2’-OH]/PS[修飾プリン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,459,255号の教えにより製造された4,7,10,13-テトラアザヘキサデカ-1-イルグアノシンヌクレオシド、そのギャップに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。ii.C-5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾ピリミジン]/PS[2’-OH]/PS[修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,484,908号の教えにより製造された5-プロピニルピリミジンヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iii.N-2、C-6修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[修飾プリン]/PS[2’-OH]/PS[修飾プリン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに米国特許第5,459,255号の教えにより製造された6-ヒドロキシ-2-フルオロプリンヌクレオシド、そのギャップに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。iv.2’-O-アルキル、C-5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-プロピル修飾ピリミジン]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-プロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-プロピル-5-メチルシチジンヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。v.2’-O-アルキル、N-2、C-5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-プロピル修飾ピリミジン]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-プロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-プロピル-2-チオ-5-メチルウリジンヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。vi.2’-O-アミノアルキル、N-2、C-5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-アミノプロピル修飾ピリミジン]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-アミノプロピル修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-アミノプロピル-2-チオ-5-メチルウリジンヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。vii.2’-O-フルオロ、N-2、C-5修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、[2’-O-フルオロ修飾ピリミジン]/PS[2’-OH]/PS[2’-O-フルオロ修飾ピリミジン]/PSオリゴリボヌクレオチド実施例8の方法で、そのウイングセグメントに2’-O-フルオロ-2-チオ-5-メチルウリジンヌクレオシド、そのギャップセグメントに2’-OHヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。実施例17細胞培養およびras標的のノーザンブロット分析T24細胞は、10ウシ胎児血清および100単位/mlペニシリンを補給したマッコイ培地GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD中で単層として維持された。オリゴマー化合物で24時間処理された後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、標準プロトコールAusubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,1988,WileyandSons,NewYork,NYを参照されたいに従って全細胞RNAが単離された。Ha-rasmRNAの相対的存在量を定量するため、全RNA10μgがノーザンブロッティングによりBio-RadZetaプローブメンブレンBio-Rad,Hercules,CA上へ移され、UV架橋されたStratalinkerTM,Stratagene,LaJolla,CA。メンブレン結合RNAは32P標識0.9kbHa-rascDNAプローブOncogeneScience,Pasadena,CAへハイブリダイズされ、XARフィルムKodak,Rochester,N.Y.へ暴露された。Ha-ras信号の相対量は、同一のメンブレンをとり、ヒトグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼG3PDH,Coltech,PaloAlto,CAで探査した場合に得られた信号でHa-ras信号を規格化することにより決定された。ノーザンブロットからの信号はホスホイメージャーおよびimagequantソフトウェアーMolecularDynamics,Sunnyvale,CAを用いて定量された。実施例18細胞の化合物処理単層で増殖している細胞は15μg/mlの最大濃度を持つオリゴの200nM当たり5μg/mlの濃度でリポフェクチンGIBCO-BRLを含んでいるOpti-MEMGIBCO-BRL培地を加えた。培地が完全血清培地で置き換えられた場合はオリゴマー化合物を加え、37°Cで4時間インキュベートした。化合物の存在下で24時間後、細胞を採取してRNAを次の分析のために調製する。実施例19RNaseH分析RNaseH分析は活性化されたコドン12突然変異Ha-rasmRNAの塩基23から47に対応する17塩基オリゴリボヌクレオチドを用いて実施された。20mMトリス-Cl、pH7.5、100mMKCl、10mMMgCl2、1mMジチオスレイトールおよび100μlの最終容量に対して4単位のRNase阻害剤Pharmacia,Newark,NJを含む反応液中で、5’末端標識RNA20nMを100倍モル過剰の種々の試験オリゴリボヌクレオチドとインキュベートした。オリゴリボヌクレオチドは95°Cに5分間加熱することにより融解させ、90°C、2リットルの水浴中で室温まで徐々に冷却した。未変性ポリアクリルアミドゲル上、一本鎖末端標識センスRNAおよびアニール化二重鎖間の移動度におけるシフトにより二重鎖形成が確認された。得られた二重鎖は大腸菌RNaseHUSB,Cleveland,OHによる消化のための基質として試験された。RNaseHの1x10-9mg/ml溶液の1μlを二重鎖反応液10μlに加え、37°Cで30分間インキュベートし、変性装填緩衝液の添加により反応を停止させ、反応生成物は7M尿素を含む12ポリアクリルアミドゲルで分離し、XARフィルムKodakに暴露した。実施例20無細胞インビトロヌクレアーゼアッセイ無細胞T24抽出物実験で使用される二重鎖は上記のようにアニール化されたが、ただし、二重鎖形成後、反応物は1μlのRNaseTおよびA混合物AmbionRPAIIキット、Austin,TXを加えて37°Cで15分間インキュベートし、未変性12ポリアクリルアミドゲルで精製した。T24細胞核および細胞質分画は以前に記載されているように単離されたSzyf,M.,Bozoic,V.andTanigawa,G.,J.Biol.Chem.,1991,266,10027-10030。アニール化二重鎖10μlは3μgのT24細胞質抽出物と37°Cでインキュベートされた。反応はフェノール/クロロホルム抽出により停止し、担体として10μgのtRNAを添加してエタノール沈殿させた。ペレットは10μlの変性充填色素に再懸濁し、生成物を上記のように12ポリアクリルアミドゲルで分離した。分子量ラダーを発生させるため、32P標識17-塩基RNAを50mMNaCO3存在下pH=9.095°Cに10分間加熱することにより加水分解した。実施例215’および3’末端の決定非標識二重鎖を上記のようにT24抽出物で処理し、この反応液の半分を子ウシ小腸ホスファターゼCIP,Stratageneで処理し、半分は未処理のままで残した。ホスファターゼは95°Cに加熱することにより不活性化し、反応液をフェノール/クロロホルムで抽出し、担体としてグリコーゲンを添加してエタノール沈殿させた。沈殿物は次にT4ポリヌクレオチドキナーゼStratageneおよび32P-γ-ATPICN,Irvine,CAで処理した。試料は再びフェノール/クロロホルムで抽出してエタノール沈殿させ、生成物は12アクリルアミドゲルで分離し、XARフィルムに暴露することにより可視化した。切断二重鎖の3’末端は、二重鎖消化生成物とT4RNAリガーゼStratageneおよび32P-pCpICNとの反応により評価された。実施例22T24細胞中の標的RNAのキメラ2’-メトキシオリゴリボヌクレオチド媒介消化種々の2’-糖修飾を含んでいる、Ha-ras癌遺伝子のコドン12に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造活性分析はMoniaetal.,J.Biol.Chem.,1992,267,19954-19962およびMoniaetal.,J.Biol.Chem.,1993,268,14514-14522に報告されている。これらの報告において、2’-修飾オリゴヌクレオチドは非修飾2’-デオキシオリゴよりも高い親和性でRNAへハイブリダイズするけれども、それらはHa-ras遺伝子発現の阻害においては全く有効ではなかった。これらの2’-修飾オリゴで観察された活性の欠如は、まさにRNaseHによる分解の基質として働くことができる二重鎖を作ることができないことによっている。同様のプロトコールに従って、Ha-rasmRNAを標的とする17塩基2’-メトキシオリゴリボヌクレオチドの中心に連続したリボヌクレオチドが導入されて2’-メトキシ-2’-ヒドロキシ-2’-メトキシホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチドギャップ形成キメラ化合物が形成され、それは中心ギャップセグメント中のリボヌクレオチド含量を変化させたこれらの化合物ならびにそれらの塩基配列の表示は図1を参照されたい。それらの細胞標的にハイブリダイズした場合、生じた二重鎖は核酸分解の標的ではない二つの部分2’-メトキシウイングおよびRNA:RNA二重鎖を認識する新規リボヌクレアーゼ活性の標的であることが見いだされている一つの2’-ヒドロキシオリゴリボヌクレオチド部分から成っている。Ha-ras遺伝子のコドン12位に活性化G-Tトランスバージョン突然変異を含むT24膀胱癌細胞が使用された。この突然変異に特異的なギャップ形成キメラ化合物は培養で増殖しているT24細胞内へトランスフェクトされた。化合物と24時間インキュベーション後、細胞を採取し、全細胞質RNAが単離され、Ha-rasmRNAレベルについてのノーザンブロット分析が実施された。完全に修飾された2’-メトキシオリゴヌクレオチドは標的mRNAの核酸分解性切断を支援せず、従って試験された最も高い濃度でもHa-rasmRNAの定常状態レベルの減少を導かなかった図2AおよびB。ギャップにただ3つのみのリボヌクレオチドを持つRNAギャップマーオリゴヌクレオチドもまた標的RNAの核酸分解性切断を誘導できなかった図2Cおよび2D。しかしながら、ギャップに5、7および9のリボヌクレオチドを含むRNAギャップマーオリゴヌクレオチド、ならびに完全ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド分子でT24細胞を処理した場合はすべてHa-rasmRNAの定常状態レベルの用量依存性減少を示した図3B-3D。4つの不適正塩基を配列に含んでいる対照9RNAギャップマーオリゴヌクレオチドでT24細胞を処理すると、Ha-rasmRNAの用量依存性減少は示さず、標的RNAへのハイブリダイゼーションが活性に必須であることを示唆している図3E。RNAギャップマー化合物はHa-rasmRNAの定常状態レベルの用量依存性阻害を示した。RNAギャップマー化合物の能力はRNAギャップの大きさ、従ってインビボで形成されるRNA:RNA二重鎖の大きさに依存していた。3塩基RNAギャップマー化合物での細胞処理は標的の切断を起こさなかったが、一方、5、7および9塩基RNAギャップマー化合物ではHa-rasmRNAの減少が生じた図4。ギャップ中に3つのリボヌクレオチドを含むRNAギャップマーオリゴヌクレオチドは標的mRNAの減少を誘導できないという事実は、標的への結合および切断のために少なくとも4つのリボヌクレオチドの最小RNA:RNA二重鎖領域が活性には必要とされることを示唆している。興味あることに、リボヌクレオチドの代わりにギャップ中にデオキシヌクレオチドを含んでいるキメラDNAギャップマーオリゴヌクレオチドは、標的mRNAのRNaseH媒介分解の基質を形成するために同じ最小ギャップサイズ要求性を示しておりCrookeetal.,Annu.Rev.Pharmacol.,1996,36,107、RNaseおよびここに説明した二本鎖RNase活性は、それらの基質は明らかに異なっているけれどもいくつかの特性を共有しているであろうことを示唆している。図3Eに示されているように、4つの不適正塩基をその配列に含んでいる対照9RNAギャップマー化合物は予期されたように本質的にHa-rasmRNAを減少させなかった。完全ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド分子は5ギャップマーオリゴとほとんど同一の活性を持っていた図3D。このことは、2’-メトキシホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチドに比べてかなり安定であるので、インビボでの一本鎖リボヌクレアーゼによる不活性化により生じる完全オリゴリボヌクレオチドの安定性の相対的低下によるものであろう。Crookeet.al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937。T24細胞の種々のオリゴヌクレオチドおよび800nMまでの種々の濃度での処理が三重に行われ、Ha-rasmRNAレベルの定量は、非処理対照と比べた場合、600nMで5ギャップマーはHa-rasmRNAを51、7ギャップマーは49、9ギャップマーは77および完全リボヌクレオチドは38減少させる。このことは2’-メトキシウイングにより保護されたRNAギャップマーオリゴリボヌクレオチドはより強力な分子であることを示唆している。この実施例で示したように、T24ヒト膀胱癌細胞中のエンドリボヌクレアーゼ活性はキメラ二重鎖の内部RNA:オリゴリボヌクレオチド部分を認識し、標的mRNAレベルを減少させた。実施例23T24細胞抽出物中に存在する活性はインビトロで内部RNA:RNA部分内のギャップマーオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖の切断を誘導するT24細胞における二本鎖RNA切断活性をさらに特徴付けるため、T24細胞抽出物が調製され、インビトロにおいて9ギャップオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖を切断する能力が試験された。9ギャップ化合物:32P末端標識RNA二重鎖が3μgの細胞質抽出物と37°Cにて図4に示した種々の時間インキュベートされ、続いてフェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿および変性ゲルでの生成物の分離を行った。この二重鎖がT24抽出物に存在する活性による消化の基質であったことは、完全長末端標識RNAの消失および図4で矢印により示されているより小さい分子量の消化生成物の出現により示される。さらに、二重鎖の切断に対応する活性は、それが産生する切断生成物のサイズにより示されるように二重鎖のRNA:RNA部分に対する特異性を持っている32P末端標識RNAの物理地図を参照されたい、図4の最も右。9デオキシヌクレオチドギャップオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖のRNaseH切断および9リボヌクレオチドギャップオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖のT24細胞抽出物による切断は類似の消化生成物を生じるようである。このことは図4および5のゲルを比較することにより見ることができる。両方の活性はそれらの各々の二重鎖中の標的RNAの3’末端近くの好ましい切断部位を示し、そのことはそれらが結合ならびに機構的特性を共有しているであろうことを示唆している。ヒト臍帯静脈上皮細胞HUVEC、ヒト肺癌腫A549およびヒーラー細胞株から調製された細胞抽出物はすべてインビトロにおいて9RNAギャップマー:RNA標的二重鎖の切断を誘導できる活性を含んでいた。実施例24細胞生成物の細胞質および核分画の両方における標的RNAの切断ここで説明された二本鎖RNase活性の細胞分布がさらに評価された。核抽出物がT24細胞から調製され、9RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖を消化する能力が試験された。T24細胞から調製された核抽出物は標的二重鎖を分解でき、その活性は細胞質分画の活性と同レベルで核分画に存在することが観察された。分子の全体を通してホスホロチオエート結合を含むRNAギャップマーオリゴヌクレオチドが合成された。これにより一本鎖ヌクレアーゼへの安定性が増加するので、同様にdsRNaseによるアンチセンス鎖の切断を阻害することが推論される。従って、上記の活性がRNA二重鎖分子中の両方の鎖を切断できるかどうかを決定するため、2’メトキシヌクレオチド間のウイングにはホスホロチオエート結合を含んでいるが、ギャップ中の9のリボヌクレオチド間にはホスホジエステル結合を含む9RNAギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成された。この32P標識9RNAギャップマーホスホジエステル/ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る二重鎖が、T24抽出物中の二本鎖RNase活性の基質として試験された。活性はこの二重鎖のアンチセンス鎖ならびにセンス鎖を切断でき、消化生成物のパターンから切断が二重鎖のRNA:RNAホスホジエステル部分に再び制限されていることが示された。実施例25RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖はRNaseHの基質ではなかった実施例23に示した切断がRNaseHによるものではないかという可能性を排除するため、9ギャップマーオリゴリボヌクレオチドおよびその相補的5’32P標識RNAの17塩基対二重鎖を切断する大腸菌RNaseHの能力がインビトロで試験された。図5は二重鎖が形成され、一本鎖32P末端標識RNAの隣で非変性ゲルにより分析された場合、電気泳動移動度に予期されるシフトを示している。図5の最も右のパネルに観察されるように、9ギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖は、RNaseで処理された場合により低い分子量バンドは現れなかったのでRNaseH切断の基質ではなかった。しかしながら、予期されたように完全デオキシオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖は同一条件下でRNaseHにより切断され、それはこの酵素で処理されたレーンにより小さな分子種が出現したことから明らかであった図5、左パネル。9ギャップマーDNAオリゴヌクレオチドおよびその相補的RNAから成る二重鎖はRNaseH切断の基質であった。この特別な二重鎖中のRNaseH切断部位が二重鎖のDNA:RNA部分に局在化しているという事実は、RNAギャップマーオリゴリボヌクレオチド:RNA二重鎖はRNaseH消化の基質ではないことをさらに示している。9DNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖のRNaseH切断図5、左パネルおよびT24細胞抽出物による9RNAギャップマーオリゴヌクレオチド:RNA二重鎖の切断が同様の消化生成物を生じることに言及するのは興味を引かれることである図4参照。RNaseHおよびT24細胞抽出物の活性は各々の二重鎖に対して同一の好ましい切断部位を示した。さらに、この部位において、両方のオリゴヌクレオチドは有効性が大まかに一致していた。切断は各々のアンチセンス分子のDNAまたはRNAギャップの反対側領域における標的RNAの3’末端に制限されている。特定の理論に結び付けられるのを望んでいるわけではないが、すぐ前に記載した結果は、RNaseHおよび本発明のdsRNaseは結合ならびに機構的特性を共有しているらしいことを示唆している。しかしながら、c-RafmRNA上の4つの部位を標的とするDNAおよびRNAギャップマーオリゴヌクレオチドの分析は、RNaseHおよび本明細書に記載したdsRNase活性は明らかに異なった基質特異性を持っている。c-RafmRNAを標的としたRNA様ギャップマーオリゴヌクレオチドはmRNAの減少を誘導することはできなかったが、一方、同一の部位を標的としたRNaseH活性オリゴデオキシヌクレオチドは標的mRNAレベルを減少させることができた。T24細胞中の4つのc-RafRNAギャップマーにより誘導されない切断が考えられる配列特異性または切断によるものであったかどうかを決定するため、4つのc-RafRNA様ギャップマー、rasRNA様ギャップマーおよび対応するDNA様ギャップマーが32P標識標的オリゴリボヌクレオチドと前もってハイブリダイズされ、T24ホモジネートとインキュベートされた。rasRNA様ギャップマーはDNAギャップマーとほとんど同じくらい効率的にras標的化RNAの切断を支援した。しかしながら、c-Rafセグメントを標的としたRNA様ギャップマーのただ1つのみが切断を支援し、RNA様ギャップマーの切断速度は一致するDNA様ギャップマーよりもかなり遅かった。従って、RNaseと対照的に、dsRNaseは無視できない配列特異性を示した。実施例26ヌクレアーゼ活性は5’-リン酸および3’-ヒドロキル末端を発生させるインビトロにおいて二重鎖のヌクレアーゼ切断により残される5’末端の性質を決定するため、非標識二重鎖が前記のようにT24細胞抽出物とインキュベートされ、次に子ウシ小腸ホスファターゼで前処理して、またはしないでT4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[32P-γ-ATP]と反応させた。二重鎖生成物のホスファターゼ処理はポリヌクレオチドキナーゼとの反応間中の32P標識取り込みに必須であることが観察され、5’末端のリン酸基の存在を示している。二重鎖消化生成物とT4RNAリガーゼおよび32P-pCpとの反応により3’末端が評価された。T4RNAリガーゼは32P-pCpの結合に遊離3’-ヒドロキシル末端を必要とする。T4RNAリガーゼにより32P-pCpを取り込む二重鎖消化生成物の能力は3’-ヒドロキシル基の存在を示している。実施例27哺乳類組織からの二本鎖リボヌクレアーゼの精製および特徴付け哺乳類細胞培養細胞株以外のが二本鎖RNase活性を含んでいるかどうかを決定するため、およびそのようなリボヌクレアーゼが精製できるであろう供給源を提供するために、ラット肝臓ホモジネートからdsRNaseを同定および精製する努力をした。実施例27-adsRNase用の基質およびアッセイ予備的実験において、二本鎖RNase活性がラット肝臓ホモジネートに観察されたが、ホモジネートはまた高レベルの一本鎖RNaseも示し、そのことはdsRNaseによる切断後にオリゴリボヌクレオチドの切断が重なることになるためにdsRNase活性の分析を複雑化させる。この問題を解決するため、2つの追加の基質および非変性ゲルアッセイが使用された。センス鎖は8塩基ギャップ中にホスホジエステル結合を持ち、aホスホロチオエート結合の残基かまたはbホスホロチオエート結合の2’-メトキシヌクレオシドのフランクを持つオリゴリボヌクレオチドであった。両方の基質のアンチセンス鎖はホスホジエステルかまたはホスホロチオエート結合を持つ8塩基リボヌクレオチドギャップのどちら側にも2’-メトキシホスホロチオエートウイングを含んでいた表1。そのようなdsRNase基質はオリゴリボヌクレオチドよりもエキソヌクレアーゼ消化に対してより安定であり、ホスホロチオエート結合および2’-メトキシヌクレオシド両方を持つ基質は特に安定であった。ラット肝臓においては二本鎖RNase活性に比較して一本鎖RNaseが豊富であるので、これらの特色は重要であり、非変性アッセイの使用により支援されている。ボールド体残基はアンチセンス鎖中の2’-メトキシヌクレオチド残基を示している。ラット肝臓細胞質および核抽出物の両方が二重鎖基質の切断を誘導した。両方の抽出物が非変性ゲル電気泳動分析でより急速に移動するバンドを生じた。細胞質抽出物は核抽出物よりも活性であるようである。二本鎖RNase、RNaseV1Pharmacia,Piscataway,NJは基質を切断した;T24抽出物もまた基質を切断した。RNaseA非常に高い濃度である程度の切断が起こったを除いて、細菌または一本鎖RNaseは基質を切断しなかった。RNaseAによる切断は二本鎖RNaseの混入によるものか、または、ある条件下でRNaseAが二本鎖基質を切断できるのかどうかは不明である。実施例27-bラット肝臓細胞質および核抽出物からのdsRNaseの精製本明細書で同定された哺乳類dsRNaseを精製するため、0.5kgのラット肝臓を緩衝液X[10mMヘペスpH7.5、25mMKCl、0.15mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、1mMEDTA、2Mスクロース、10グリセロール;すべてSigmaChemicalCo.,St.Louis,MOからの試薬]中でホモジナイズし、BeckmanJ2-21M遠心機Beckman,Fullerton,CAを用い、10,000rpmで1.5時間遠心した。上清は40硫酸アンモニウムSigmaで沈殿させた。すべてのdsRNase活性が40硫酸アンモニウム沈殿に回収された。ペレットは緩衝液A[20mMヘペスpH6.5、5mMEDTA、1mMDTT、0.25mMフェニルメチルスルホニウムフルオリドPMSF、0.1MKCl、5グリセロール、0.1NP40、0.1トリトンX-100;すべての試薬はSigmaから]に再懸濁し、透析して硫酸アンモニウムを除いた。約40gの細胞質抽出物が0.5kgの肝臓から得られた。前の実施例で調製された粗核ペレットは緩衝液Y[20mMヘペスpH7.5、0.42MNaCl、1.5mMMgC12、0.2mMEDTA、0.5mMDTT、0.5mMPMSF、25グリセロール]に再懸濁されホモジナイズされた。ホモジネートはBeckmanJ2-21M遠心機Beckmanを用い、10,000rpmで1.5時間遠心した。上清は70硫酸アンモニウムSigmaで沈殿させた。ペレットは緩衝液Aに再懸濁し、透析した。すべてのdsRNase活性は70硫酸アンモニウム沈殿に回収された。約5gの核抽出物が0.5kgの肝臓から得られた。本発明のdsRNaseをさらに精製するために次にイオン交換カラムクロマトグラフィーが実施された。緩衝液A中の核および細胞質抽出物はFPLCのためにHi-TrapカラムPharmacia,Piscataway,NJにのせた。抽出物はNaClの直線濃度勾配により溶出して試料を集めた。試料の257nmでのUV吸収が決定された。試料は8,000gで10分間遠心し、緩衝液Aに再懸濁し、Ultrafree-15遠心フィルター装置Millipore,Bedford,MAで濃縮して活性を分析した。dsRNase活性は300-450mMNaClに対応する分画に溶出された。対照的に、核抽出物中のdsRNase活性は700-800mMNaClに溶出された。イオン交換カラムクロマトグラフィーからの分画は濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィーにかけられた。イオン交換カラムクロマトグラフィーからの活性試料を集め、TSKG-3000カラムTosoHaas,Mongomeryville,PAにのせて100mMNaCl含有緩衝液Aで溶出した。試料200から400μlを集め、それらの257nmでのUV吸収が決定された。試料はUltrafree-15遠心フィルター装置Millipore,Bedford,MAを用いて濃縮し、活性を分析した。図6はイオン交換カラムクロマトグラフィー後の濃縮活性分画およびサイズ排除クロマトグラフィーからの分画のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示している。最も高いdsRNase活性を持つ分画レーン4、図6は約50から約80キロダルトンの分子量範囲を持っており、約50キロダルトンのバンドはプリキャストゲルNovex,SanDiego,CAを使用して実施された12ポリアクリルアミドゲル電気泳動では増強されたように思われた。表2には核および細胞質肝臓抽出物からのdsRNase活性の精製および回収の要約が提供されている。1単位は前記の条件下37°Cにて15分間で10fMolのdsRNA二重鎖を消化するのに必要とされる試料の量として定義されている。肝臓核および細胞質からのdsRNase活性の精製は、異なった性質を持つ少なくとも2つのdsRNaseが二本鎖RNAを切断できることを示唆している。核dsRNaseはイオン交換カラムから細胞質dsRNaseよりも高いNaCl濃度で溶出された。しかしながら、両方ともMgを必要とし、オリゴリボヌクレオチドギャップ内のいくつかの部位を切断する。両方とも二重鎖基質を必要とし、二重鎖がホスホロチオエートまたはホスホロチオエート-2’-メトキシヌクレオシドウイングを持っている場合、オリゴリボヌクレオチドのセンスおよび2’-メトキシホスホロチオエートキメラのアンチセンス鎖から作り上げられている二重鎖中のオリゴリボヌクレオチドを切断できる。1再現性のあるおよび活性特異的アッセイを確立し、2いくつかの供給源を決定し、および3前記の方法を経て本発明のdsRNaseの十分な程度の精製を達成した後、dsRNaseは種々の方法によりさらに精製される。すべての場合において、本発明のdsRNaseはアセトニトリルまたはメタノール中で不安定であるので有機溶媒の使用は避けなければならず下記参照、本明細書に記載したアッセイは試料中の所望のdsRNaseの存在または不在を評価するために使用される。さらなる精製工程には以下の手段が含まれるが、それらに制限されるわけではない。いくつかの型のヘパリンカラムが種々のリボヌクレアーゼを精製するために使用されてきた。例えば、セファロースカラムはラナカテスベイアーナウシガエル卵母細胞からの配列特異的リボヌクレアーゼLiao,Nucl.AcidsRes.,1992,20,1371、アフリカツメガエル卵母細胞からのリボヌクレアーゼNittaetal.,Biol.Pharm.Bull.Jpn.1993,16,353、好熱性古細菌スルフォバススルファタリカスからのいくつかのリボヌクレアーゼFusietal.,Eur.J.Biochem.,1993,211,305、およびヒト脾臓からのリボヌクレアーゼYasudaet.al.,Eur.J.Biochem.,1990,191,523の精製に利用されている。疎水性相互作用クロマトグラフィーは強力なタンパク質精製手段であり、それは所望のタンパク質およびそれらのリガンド間の疎水性相互作用を増強するための強力な塩析塩に依存しているNarhietal.,Anal.Biochem.,1989,182,266。疎水性相互作用カラムHICは望まれない夾雑物を含むリボヌクレアーゼAを精製するために使用されたWuet.al.,MethodsinEnzymology,1996,270,127;Wetlauferetal.,J.Chromatography,1986,359,55。本発明のdsRNaseはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーKennedy,MethodsinEnzymology,l990,182,339によってもさらに精製されるであろう。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりトリパノソーマブルセイからエンド-およびエキソ-リボヌクレアーゼが精製されているGbenle,Exp.Parisitol.,1990,71,432;Gbenle,Mol.Biochem.Parasitol.,1985,15,37。RNAアフィニティーカラムもまた本発明のdsRNaseをさらに精製するために使用されるであろう。特に、市販品として入手可能な二本鎖RNAアフィニティーカラムPharmacia,Piscataway,NJが使用できる。もしくは、マトリックスが一つまたはそれ以上の本発明のdsRNase基質を含むようにカラムが調製される詳細は以下の実施例を参照されたい。本発明のdsRNaseの相対的配列特異性のため、後者の型のアフィニティーカラムが好適であろう。二本鎖アフィニティーマトリックスの両方の型のマトリックスの分解を防止するため、本発明のdsRNaseを含む試料はマトリックスの二本鎖RNA基質へ結合するdsRNaseの能力を著しく変化させずにdsRNaseの分解能力を制限するような様式で処理される。例えば、本発明のdsRNaseの分解活性は、例えばEDTAのような適当なキレート剤の添加により利用可能なMgを欠いた溶液中で、またはそのようなdsRNaseを含む試料に少なくとも300mMの最終濃度でNaClを添加することにより阻害される以下の副節を参照されたい。当業者は上記の手段ならびに本明細書には記載されていない他の手段は、本発明のdsRNaseの精製における最適な効率のために最適化される必要があることを認識するであろう。例えば、さらなる精製工程としての一つまたはそれ以上の前記手段の選択、およびそのような手段が応用される順序は処理されたdsRNaseの純度および比活性の程度に影響するであろう。しかしながら、所望のdsRNase活性に対するさらなる精製工程の影響を決定するために本明細書に記載したアッセイが当業者に容易にできるとするならば、そのような最適化は当業者に帰属すると信じられる。SDS-PAGEのような本分野で知られている他の技術は前記の精製手段にかけられた試料の純度を決定するために使用できる。実施例27-c精製された哺乳類dsRNaseの特徴付けdsRNase活性に対するいろいろな条件の影響が、イオン交換クロマトグラフィー後の活性分画を用いて評価された。dsRNase活性は約pH7から約pH10のトリスまたはリン酸緩衝液で示すことができた。dsRNase活性はアセトニトリルまたはメタノール溶液中では不安定であった。さらに、活性はNaClにより阻害された;10mMNaClで30、100mMNaClで>60、および300mMNaClで100。60°C、80°Cおよび100°Cで5分間の加熱はdsRNaseを不活性化した。最適活性は約37°Cから約42°Cの温度範囲で観察された。25°Cで、dsRNase活性は37°Cで観察された活性の約50であった。dsRNase活性は10、20および50mMEDTAで阻害されたが,5mMでは阻害されなかったのはMgの要求性と一致しており、多数回の凍結/融解に安定であった。実施例28精製されたラットdsRNaseを用いたdsRNase切断部位のさらなる特徴付け精製されたdsRNaseを用いて切断部位をより詳しく特徴付けた。エンドヌクレアーゼ切断後および操作中特に二重鎖の変性後に起こる一本鎖切断を最小にする必要があった。従って、最も安定な二重鎖基質、すなわち、二重鎖の両方の鎖が2’-メトキシヌクレオシドおよびホスホロチオエート結合から成る隣接領域を含む基質が使用された。実施例28-aオリゴヌクレオチドの32P標識センスオリゴヌクレオチドは[g32P]ATP、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、および標準法Ausubelet.al.,1989を用いて5’末端が32Pで標識された。標識オリゴヌクレオチドは12変性PAGEでの電気泳動により精製されたSambrooket.al.,1989。標識オリゴヌクレオチドの比活性は約5000cpm/fmolであった。実施例28-b二本鎖RNA消化アッセイオリゴヌクレオチド二重鎖は、10nMアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび105cpm32P標識センスオリゴヌクレオチドを含む30μLの反応緩衝液[20mMトリス-HClpH7.5、20mMKCl、10mMMgCl2、0.1mMDTT]中で調製された。反応液は90°Cに5分間加熱され、37°Cで2時間インキュベートされた。オリゴヌクレオチド二重鎖は総タンパク質濃度で75μgの未精製細胞質抽出物、60μgの未精製核抽出物、5μgのイオン交換精製細胞質分画、5μgのイオン交換精製核分画、または0.5μgのイオン交換およびゲル濾過精製核分画の未精製および半精製細胞抽出物とインキュベートした。消化反応液は37°Cで0-240分インキュベートした。インキュベーション後、各々の反応液の10μLをとり、変性ゲル充填緩衝液[5μL8M尿素、0.25キシレンシアノールFF、0.25ブロモフェノールブルー]の添加により反応を停止した。反応液は95°Cに5分間加熱し、12変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。残りの反応液は2μLの非変性ゲル充填緩衝液[グリセロール、0.25キシレンシアノールFF]で停止した。反応液は10°Cにて、44mMトリス-ホウ酸および1mMMgCl2を含む12非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルはMolecularDynamicsPhosphorimagerを用いて分析した。図7は非変性ゲルの結果を示している。レーン1は未処理32P標識センス鎖が非変性ゲル中で移動する位置を示しており、レーン2は0.02単位のRNaseV1で処理されたセンス鎖RNAを示している。残りのレーンでは、0.02レーン3および0.002レーン4単位のRNaseV1で、未精製核抽出物で0分レーン5または240分レーン6、未精製核抽出物でMg非存在下240分レーン7、未精製細胞質抽出物で240分レーン8、イオン交換精製細胞質抽出物でMg存在下レーン9または非存在下レーン10、およびイオン交換/ゲル濾過精製細胞質抽出物でMg存在下レーン9または非存在下レーン10の、dsRNase基質を処理した結果を示している。図8は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるdsRNase基質の消化生成物の分析結果を示している。レーン1は5x10-3単位のRNaseAで処理されたセンス鎖RNAを示しており、レーン2は0.02単位のRNaseV1で処理されたセンス鎖RNAを示している。残りのレーンは、0.02レーン3および0.002レーン4単位のRNaseV1で、未精製核抽出物で0分レーン5または240分レーン6、未精製細胞質抽出物で240分レーン7、イオン交換精製細胞質抽出物で240分レーン8、およびイオン交換/ゲル濾過精製細胞質抽出物で240分レーン9、処理されたdsRNase生成物を示している。レーン10は大きさを測るためのRNA塩基加水分解ラダーである。一本鎖基質のRNaseV1消化はほとんど分解を起こさなかったレーン2。二重鎖のRNaseV1消化はギャップ内のいくつかの部位での切断を反映している分解を生じたレーン3および4。レーン4-9において、ゲルの一番上のバンドは、変性後でさえもいくつかの二重鎖はアニール化されたまま残っていることを示しており、2’-メトキシヌクレオシドから成る二重鎖の非常に強い親和性を反映している。レーン6-9は、核および細胞質リボヌクレアーゼの両方が三重鎖基質をオリゴリボヌクレオチドギャップを持ついくつかの部位で切断したこと、および分解部位がRNaseV1の部位と異なっていたことを示している。レーン6-9における分解物の位置は、それらが2’-メトキシホスホロチオエート隣接領域ウイングであることと一致する。実施例29RNAアフィニティーカラムおよびリボヌクレアーゼを精製する方法核酸アフィニティーカラムを準備する技術は本分野では既知である例えば、Kadonaga,MethodsinEnzymology,1991,208,10を参照されたい。そのようなアフィニティーカラムは、非特異的かまたは特異的様式で基質を結合する所望の化合物のための核酸基質を含むマトリックスから成っている。DNA結合タンパク質の精製において最初に利用されたRNAアフィニティーカラムがRNA結合タンパク質およびリボヌクレアーゼを精製するためにも使用された例えば、Prokipcaketal.,J.Biol.Chem.,1994,269,9261;Dakeetal.,J.Biol.Chem.,1988,263,7691を参照されたい。本発明の一つまたはそれ以上のdsRNase基質を含むマトリックスは、多くの組織および細胞で優勢である一本鎖リボヌクレアーゼの作用に抵抗するdsRNA基質を提供するという利点を持っている。そのようなマトリックスはまた、適した保持体および保持体とdsRNase基質間の架橋を提供するリンカーも含んでいる。適した保持体には移植片ポリマーBayerおよびRappによる米国特許第4,908,405号;ポリアクリルアミドゲルFahyetal.,Nucl.AcidsRes.,1993,21,1819;ポリアクリルモルホライド、ポリスチレンおよび誘導体化ポリスチレン樹脂Syvanenetal.,Nucl.AcidsRes.,1988,16,11327;Itakuraによる米国特許第4,373,071および4,401,796号,アミノメチルスチレン樹脂を含むMillerおよびTs’Oによる米国特許第4,507,433号;N-ビニルピロリドンおよび酢酸ビニルのコポリマーSelingeretal.,TetrahedronLetts.,1973,31,2911;Selingeretal.,DieMakromolekulareChemie,1975,176,609;およびSelinger,DieMakromoleculareChemie,1975,176,1611;TEFLONTMLohrmannetal.,DNA,1984,3,122;Duncanetal.,Anal.Biochem.,1988,169,104;制御孔ガラスChowetal.,Anal.Biochem.,1988,175,63;アガロースKadonaga,MethodsEnzymol.,1991,208,10;Arndt-Jovinetal.,Eur.J.Biochem.,1975,54,411;Wuet.al.,Science,1987,238,1247;Blanketal.,NucleicAcidsRes.,1988,16,10283またはセルロースGoldkornetal.,Nucl.AcidsRes.,1986,14,9171;Albertsetal.,Meth.Enzymol.,1971,21,198またはそれらの誘導体、例えばDEAE-セルロースSchott,J.Chromatogr.,1975,115,461またはホスホセルロースSiddell,Eur.J.Biochem.,1978,92,621;Bunemannetal.,Nucl.AcidsRes.,1982,10,7163;Noyesetal.,Cell,1975,5,301;Bunemannetal.,Nucl.AcidsRes.,1982,10,7181のような多糖支持体;硫酸デキストランGingerasetal.,Nucl.AcidsRes.,1987,15,5373;ポリプロピレンMatsonetal.,Anal.Biochem.,1994,217,306;アガロースビーズKadonagaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1986,83,5889;ラテックス粒子Kawaguchietal.,NucleicAcidsRes.,1989,17,6229;ナイロンビーズVanNessetal.,Nucl.AcidsRes.,1991,19,3345;常磁性ビーズGabrielsonetal.,Nucl.AcidsRes.,1989,17,6253;Lund,etal.,Nucl.AcidsRes.,1988,16,10861;Dayetal.,Biochem.J.,1991,278,735;シリカゲルYashimaetal.,J.Chromatogr.,1992,603,111;シリカゲルの誘導体形、ポリテトラフルオロエチレンセルロースまたは金属オキサイドBuendiaによる米国特許第4,812,512号;および上記保持体の技術的に認識された均等物;マイクロタイタープレートDrmanacetal.,Science,l993,260,1649;米国特許第5,391,667号に記載されているようなN-ビニルピロリドン、他のN-ビニル-ラクタムモノマーおよび少なくとも一つのアミンまたは機能的に置き換え可能なアミンの架橋コポリマーが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好適な態様の一つの組においては、ポリスチレンまたは長鎖アルキルCPG制御孔ガラスビーズが用いられる。好適な態様の他の組においては、顕微鏡ガラススライドが用いられるFodoretal.,Science,1991,251,767;Maskosetal.,NucleicAcidsResearch,1992,20,1679;Guoetal.,1994,22,5456;Peaseetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91,5022。リンカーに関しては、種々の化学連結基または鎖が本発明のマトリックスに用いられるであろう。保持体およびdsRNase基質間に化学結合を形成できる任意の化学基または鎖が使用できるであろう。適したリンカーはオリゴヌクレオチド合成の種々の工程の間、化合物と反応性を示さないという望ましい特性を持っている。保持体およびdsRNase基質の化学組成がリンカーの選択に影響するであろうことを当業者は理解するであろう。多くの適したリンカーは片方または両方の末端に一級アミン基を持っているであろうし、一級アミンを種々の他の化学基へ結合するための多くの化学反応が本分野で知られている;しかしながら、他の末端反応性残基も知られており、本発明で使用されるであろう。適したリンカーには、保持体へジスルフィド結合を導入するための末端チオール基を持つリンカーDayetal.,Biochem.J.,1991,278,735;Zuckermannetal.,Nucl.AcidsRes.,15,5305;保持体へチオール-ブロモアセチル結合を導入するための末端ブロモアセチル基を持つリンカーFahyetal.,Nucl.AcldsRes.,1993,21,1819;オリゴヌクレオチドの活性化5’リン酸と反応できる末端アミノ基を持つリンカーTakedaetal.,TetrahedronLetts.,1983,24,245;Smithetal.,Nucl.AcidsRes.,1985,13,2399;Zarytovaetal.,Anal.Biochem.,1990,188,214;ポリエチレンイミンVanNessetal.,Nucl.AcidsRes.,1991,19,3345;アシル鎖Akashietal.,Chem.Lett.,1988,1093;Yashimaetal.,J.Chromatogr.,1992,603,111;ポリビニルアルコールSchott,J.Chromatogr.,1975,115,461;アルキル鎖Gossetal.,J.Chromatogr.,1990,508,279;アルキルアミン鎖Ponetal.,BioTechniques,1988,6,768;ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジン結合Kasheretal.,Mol.Cell.Biol.,1986,6,3117;Chodoshet.al.,Mol.Cell.Biol.,1986,6,4723;Fishelletal.,MethodsEnzymol.,1990,184,328;および上記リンカーの技術的に認識された均等物が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の好適な態様において、n-アミノアルキル鎖がリンカーである。適切なすなわち、センサーアレーおよび標的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの最適な程度および特異性を提供するリンカー長を決定する方法は本分野では既知である例えば、Dayetal.,Biochem.J.,1991,278,735を参照されたい。"