両親媒性膜活性ポリアミンを可逆的に修飾するための化合物であって、ジペプチドアミドベンジルカルボナートに共有結合している立体安定化剤または標的指向リガンドを含む、化合物。下記によって表される構造を有する、請求項1記載の化合物:式中、XはNH、O、またはCH2であり、YはNHまたはOであり、R1はCH2フェニル、CH2、CH2CH2、CHCH2CH3、CH3、であり、R2は水素、3NHCNH2、4N2、またはCH2CNH2であり、R4は非荷電であって、ポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み、R5は2、4、または6位にあって、CH2OCOZであり、ここでZはハロゲン化物、であり、かつ、R6は、R5が占有している位置を除き、2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、nCH3ここでn=0~4、2、またはハロゲン化物である。R4が立体安定化剤を含む、請求項2記載の化合物。立体安定化剤がポリエチレングリコールPEGである、請求項3記載の化合物。標的指向リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrリガンドを含む、請求項2記載の化合物。ASGPrリガンドが、ラクトース、ガラクトース、Nアセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなるリストより選択される、請求項5記載の化合物。XおよびYがNHであり、かつZがである、請求項1記載の化合物。R1がCH2フェニルである、請求項7記載の化合物。R2が3NHCNH2である、請求項7記載の化合物。下記を含む、インビボでRNA干渉RNAiポリヌクレオチドを細胞に送達するための送達ポリマー:式中、Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、M2はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤であり、yおよびzはそれぞれゼロ以上の整数であり、かつyzは、マスキング剤の非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、P上の一級アミンの50よりも大きい値を有する。立体安定化剤がPEGである、請求項10記載の送達ポリマー。標的指向リガンドがASGPrリガンドを含む、請求項10記載の送達ポリマー。ASGPrリガンドが、ラクトース、ガラクトース、Nアセチルガラクトサミン、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなるリストより選択される、請求項12記載の送達ポリマー。両親媒性膜活性ポリアミンが、ランダム、ブロック、または交互合成ポリマーからなるリストより選択される、請求項10記載の送達ポリマー。両親媒性膜活性ポリアミンがメリチンペプチドである、請求項10記載の送達ポリマー。ジペプチドアミドベンジルカルバマート連結が下記によって表される構造を有する、請求項10記載の送達ポリマー:式中、XはNH、O、またはCH2でありYはNHまたはOでありR1はCH2フェニル、CH2、CH2CH2、CHCH2CH3、CH3、であり;R2は水素、3NHCNH2、4N2、またはCH2CNH2であり、R4はM1の標的指向リガンドまたはM2の立体安定化剤を含み、かつポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。両親媒性膜活性ポリアミンがRNAiポリヌクレオチドにさらに共有結合している、請求項16記載の送達ポリマー。インビボでRNAiポリヌクレオチドを哺乳動物の細胞に送達する方法であって、RNAiポリヌクレオチドを哺乳動物に請求項10記載の送達ポリマーと同時投与する段階を含む、方法。RNAiポリヌクレオチドが送達ポリマーに共有結合している、請求項18記載の方法。細胞が肝実質細胞または肝臓癌細胞である、請求項18記載の方法。発明の詳細な説明記載するのは、両親媒性膜活性ポリアミンの可逆的修飾および阻害のために有用なマスキング剤ならびにジペプチドマスキング剤によるポリアミンの修飾によって生成した送達ポリマーである。ペプチダーゼ切断可能な連結は酵素非存在下での加水分解に安定で、電気的に中性であり、保存中およびインビボ循環中の長期DPC安定性を提供する。循環中の半減期が改善されるより長くなることで、腫瘍組織などの組織におけるリガンド仲介性蓄積に対する機会のウィンドウの拡大が促進される。ポリマーの送達は、RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達のために特に有用である。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、遺伝子発現の治療的阻害ノックダウンのために有用である。ジペプチドマスキング剤は以下の一般式を有する:RA1A2アミドベンジルカルボナート式中、Rは立体安定化剤または標的指向リガンドであり、A1はアミノ酸であり、A2はアミノ酸であり、かつカルボナートは活性化アミン反応性カルボナートである。Rは好ましくは非荷電である。マスキング剤カルボナートとポリマーアミンとの反応によりカルバマート連結が生じる。マスキング剤はジペプチドがインビボで内因性プロテアーゼにより切断され、したがってポリアミンから立体安定化剤または標的指向リガンドを切断するまで安定である。ジペプチドの後A2とアミドベンジルとの間の酵素的切断後、アミドベンジルカルバマートは自発的転移を起こし、その結果ポリマーアミンが再生する。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコールPEGである。肝送達のために好ましい標的指向リガンドはASGPrリガンドである。好ましいASGPrリガンドはNアセチルガラクトサミンNAGである。好ましいアミドベンジル基はpアミドベンジル基である。A1A2またはAAで表される、ジペプチドマスキング剤のジペプチドは、アミド結合を介して連結されたアミノ酸の二量体である。αおよびβアミノ酸を含むアミノ酸は生物学および化学において周知で、アミン基、カルボン酸基および異なるアミノ酸の間で変動する側鎖を含む分子である。好ましいアミノ酸は、一般式H2NCHRCOOHを有するαアミノ酸であり、ここでRは有機置換基である。好ましいαアミノ酸は非荷電の天然アミノ酸である。好ましいジペプチドにおいて、A1は疎水性アミノ酸であり、A2は非荷電親水性アミノ酸である。好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、またはシトルリンである。より好ましくは疎水性アミノ酸はフェニルアラニンまたはバリンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸はシトルリンである。ジペプチドが好ましいが、A1とRとの間にさらなるアミノ酸を挿入することも可能である。アミノ酸A1を脱離することによりジペプチドの代わりに1つのアミノ酸を用いることも可能である。本発明において用いる任意の天然アミノ酸は、本明細書においてそれらの一般的略称で呼ぶ。荷電アミノ酸を用いることもできるが、マスキング剤は非荷電であることが好ましい。好ましい態様において、両親媒性膜活性ポリアミンを本発明のジペプチドアミドベンジルカルボナートマスキング剤との反応により可逆的に修飾して、膜不活性送達ポリマーを得る。ジペプチドマスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、循環時間を延長し、特異的相互作用を増強し、毒性を阻害し、またはポリマーの電荷を変えることができる。本発明の可逆的にマスクしたポリマーは以下の構造を含む:式中:XはNH、O、またはCH2でありYはNHまたはOでありR1は好ましくはkフェニルkは1、2、3、4、5、6であり;k=1ではフェニルアラニン、CH2バリン、CH2CH2ロイシン、CHCH2CH3イソロイシン、CH3アラニン、2COOHグルタミン酸、またはであり;R2は好ましくは水素グリシン3NHCNH2シトルリン、4N2リジン2、kCNH2;kは1、2、3、4、5、6である、CH2CNH2アスパラギン、2CNH2グルタミン、CH2CNR1R2アスパラギン酸アミド、2CNR1R2グルタミン酸アミド、CH2COR1アスパラギン酸エステル、または2COR1グルタミン酸エステルであり、R1およびR2はアルキル基でありR4はポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み;かつポリアミンは両親媒性膜活性ポリアミンである。上記の構造はポリマーに連結された1つのジペプチドマスキング剤を示しているが、本発明の実施において、ポリマーアミンの50~90またはそれ以上がジペプチドマスキング剤によって修飾される。好ましい態様において、本発明の可逆的にマスクしたポリマーは以下の構造を含む:式中、R1、R2、R4およびポリアミンは前述のとおりである。本発明の可逆的にマスクしたポリマーは、本発明のジペプチドマスキング剤とポリマー上のアミンとの反応によって生成する。本発明のジペプチドマスキング剤は以下の構造を有する:式中:X、Y、R1、R2、およびR4は前述のとおりでありR5は2、4、または6位にあって、CH2OCOZであり、ここでZはハロゲン化物、R6は、R5が占有している位置を除き、2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、nCH3ここでn=0~4、2、またはハロゲン化物である。好ましい態様において、下記によって示すとおり、XはNHであり、YはNHであり、R4は非荷電であり、R5は4位にあり、かつR6は水素である:。もう一つの態様において、R4は:RsOY1であり、式中Rは水素、メチル、またはエチルであり;かつsは1~150の整数であり、かつY1は下記を含むリストから選択される:OY2NHC2C、ここでY2は3CNpCH2CH2pは1~20の整数である、およびO。標的指向リガンドはハプテン、ビタミン、抗体、モノクローナル抗体、および細胞表面受容体リガンドを含むリストから選択してもよい。標的指向リガンドはジペプチドに、PEGリンカーなどのリンカーを介して連結してもよい。本発明による使用に適した膜活性ポリマーの非限定例は、以前に米国特許出願公開第20080152661号、第20090023890号、第20080287630号、および第20110207799号に記載されている。適切な両親媒性膜活性ポリアミンは、メリチンペプチドなどの小ペプチドであってもよい。ポリマーアミンを本明細書に記載の酵素切断可能なリンカーを用いて可逆的に修飾した。修飾基を切断してアミンが再生する場合、アミンは可逆的に修飾されている。以下に示すとおり、マスキング剤の活性化カルボナートとポリマーアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化剤がポリマーに、ペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介して連結される:R1は標的指向リガンド保護基と共に、または保護基なしのいずれかまたはPEGを含み、R2は両親媒性膜活性ポリアミンであり、AAはジペプチド保護基と共に、または保護基なしのいずれかであり、かつZはアミン反応性カルボナートである。保護基をジペプチドマスキング剤の合成中に用いてもよい。存在する場合は、保護基を両親媒性膜活性ポリアミンの修飾前または修飾後に除去してもよい。十分なパーセンテージのポリマーアミンのジペプチドマスキング剤による可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を阻害する。また、ポリマーアミンのジペプチドマスキング剤による修飾は、好ましくはアミンの電荷を中和する。ジペプチドアミドベンジルカルバマート連結はプロテアーゼまたはペプチダーゼ切断に感受性である。プロテアーゼ存在下で、アニリド結合が切断されて中間体を生じ、これはただちに16脱離反応を起こして遊離ポリマーを放出する:上記反応スキームにおいて、AAはジペプチドであり、R1は標的指向リガンドまたは立体安定化剤を含み、かつR2は両親媒性膜活性ポリアミンである。重要なことに、遊離ポリマーは脱修飾され、したがって膜活性を復旧する。マスクした状態で、可逆的に修飾した膜活性ポリアミンは膜破壊活性を示さない。膜活性を阻害し、細胞標的指向機能を提供する、すなわち、可逆的にマスクした膜活性ポリマー送達ポリマーを生成するために、ポリアミン上のアミンの50よりも多く、55よりも多く、60よりも多く、65よりも多く、70よりも多く、75よりも多く、80よりも多く、または90よりも多くの、ジペプチドマスキング剤による可逆的修飾が必要とされうる。本発明は、生体活性物質を細胞内に送達する方法も提供する。より具体的には、本発明は、インビボでRNAiポリヌクレオチド哺乳動物細胞を送達するのに有用な化合物、組成物、および方法を目的とする。一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドを本発明の送達ポリマーに、生理的に不安定な共有結合を介して連結する。生理的に不安定な連結を用いることにより、ポリヌクレオチドをポリマーから切断して、細胞成分との機能的相互作用に参加するポリヌクレオチドを放出することができる。本発明は、以下の一般構造の結合体送達系を含む:式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、L1は生理的に不安定な連結であり、Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、かつM2はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤である。yおよびzはそれぞれ、いかなるマスキング剤も非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、yzがP上の一級アミンの50よりも大きい、60よりも大きい、70よりも大きい、80よりも大きい、または90よりも大きい値を有するとの条件で、ゼロ以上の整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。送達ポリマーM1yPM2zは膜活性ではない。P一級アミンのM1およびまたはM2の結合による可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化する。メリチンペプチドなどの、いくつかの小さい両親媒性膜活性ポリアミンは、3~5つという少数の一級アミンを含むことに留意される。アミンのあるパーセンテージの修飾は、ポリマーの集団におけるアミンのあるパーセンテージの修飾を反映することになる。M1およびM2の切断後、ポリアミンのアミンが再生され、それによりPはその非修飾の膜活性状態に戻る。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドをインビボで本発明の送達ポリマーと同時投与する。したがって、本発明は、以下の一般構造の組成物を含む:式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tは標的指向基であり、Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、M1はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された標的指向リガンドであり、かつM2はジペプチドアミドベンジルカルバマート連結を介してPに連結された立体安定化剤である。yおよびzはそれぞれ、いかなるマスキング剤も非存在下でのポリアミンP上のアミンの量により判定して、yzがP上の一級アミンの50よりも大きい、60よりも大きい、70よりも大きい、80よりも大きい、または90よりも大きい値を有するとの条件で、ゼロ以上の整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。送達ポリマーM1yPM2zは膜活性ではない。P一級アミンのM1およびまたはM2の結合による可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化する。メリチンペプチドなどの、いくつかの小さい両親媒性膜活性ポリアミンは、3~5つという少数の一級アミンを含むことに留意される。したがって、アミンのあるパーセンテージの修飾は、ポリマーの集団におけるアミンのあるパーセンテージの修飾を反映することになる。M1およびM2の切断後、ポリアミンのアミンが再生され、それによりPはその非修飾の膜活性状態に戻る。Nは、当技術分野において標準の方法を用いてTに共有結合により連結し、RNAiポリヌクレオチド標的指向基結合体を生成する。好ましい共有結合は生理的に不安定な結合である。NT。送達ポリマーおよびNTは別々に合成または製造する。TもNもP、M1またはM2に直接または間接的に共有結合していない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体とマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的または疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボでの肝送達に必要ではない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で共有することができる。これらは投与前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。肝実質細胞送達のために、RNAiポリヌクレオチドが送達ポリマーに共有結合を介して連結されているか、または送達ポリマーと同時投与するかのいずれにせよ、yはポリマーP上の一級アミンの50よりも大きく、最大100までの値を有する。したがって、zはゼロパーセント0以上であるが、ポリマーP上の一級アミンの50未満の値を有する。肝腫瘍細胞への送達のために、zはより大きくポリマーP上の一級アミンの最大100までの値を有していてもよい。好ましい態様において、腫瘍細胞への送達のために、zはポリアミンP上の一級アミンの50よりも大きい、60よりも大きい、70よりも大きい、80よりも大きい、または90よりも大きい値を有し、yはゼロである。膜活性ポリアミンは、原形質膜またはリソソームエンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。この膜活性はポリヌクレオチドの細胞送達のために必須の特徴である。しかし、膜活性は、ポリマーをインビボで投与すると毒性を引き起こす。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望ましくない生体内分布を引き起こす。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。マスキングは、記載したジペプチドマスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に結合して、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤は非特異的相互作用からポリマーを遮蔽し、血清相互作用を低減し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、循環時間を延長し、かつまたは細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害することは、マスキング剤の必須の特徴である。マスキング剤は非特異的相互作用からポリマーを遮蔽しうる血清相互作用を低減し、循環時間を延長する。膜活性ポリアミンは非修飾マスクしていない状態で膜活性であり、修飾マスクした状態で膜活性ではない不活化。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリマーの所望のレベルの修飾は、適切なポリマー活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリマーが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤がポリマーに連結されている。いかなるマスキング剤も非存在下でのポリマー上の一級アミンの量により判定して、マスキングはポリマーの集団上の一級アミン基の≧50、≧60、≧70、≧80または≧90の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。膜活性ポリアミンをマスキング剤に、過剰のマスキング剤存在下で結合することができる。過剰のマスキング剤を結合した送達ポリマーから除去した後に、送達ポリマーを投与してもよい。本明細書において用いられる立体安定化剤は、立体安定化剤を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー天然、合成、または非天然のいずれかである。立体安定化剤は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化剤は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化剤は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化剤はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化剤はポリエチレングリコールPEGまたはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1~500のエチレングリコールモノマー、または2~25のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85~20000ダルトンDa、約85~1000Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化剤は水溶液中で、立体安定化剤を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。標的指向リガンドは、それらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞または組織特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。明白にするために、本明細書において用いられる標的指向リガンドなる用語は、ジペプチドマスキング剤に結合している標的指向リガンドを示すために用い、標的指向基は、RNAiポリヌクレオチド標的指向基結合体においてRNAiポリヌクレオチドに連結している標的指向リガンドである。標的指向リガンドは分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向リガンドはそれらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。標的指向リガンドの細胞または細胞受容体への結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的指向リガンドは一価、二価、三価、四価、またはそれ以上の結合価を有しうる。標的指向リガンドは:細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、および細胞表面分子に親和性を有する抗体様物質を含む群より選択してもよい。好ましい標的指向リガンドは、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子に細胞および特定の細胞受容体を標的とさせるために、様々なリガンドが用いられてきた。細胞受容体リガンドは:炭水化物、グリカン、糖質ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、およびペプチドRGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではないを含む群より選択してもよい。肝実質細胞標的指向のために、好ましい標的指向リガンドはアシアロ糖タンパク質受容体ASGPrに親和性を有する糖質である。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるASGPrへのそれらの結合を通じて、インビボで分子に肝実質細胞を標的とさせるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向リガンドは、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的指向リガンドのASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。ASGPr標的指向リガンドは、ラクトース、ガラクトース、NアセチルガラクトサミンNAG、ガラクトサミン、Nホルミルガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、Nプロピオニルガラクトサミン、Nnブタノイルガラクトサミン、およびNイソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択してもよいIobstSTandDrickamerKJBC19962716686。ASGPr標的指向部分はモノマー例えば、1つのガラクトサミンを有するまたはマルチマー例えば、複数のガラクトサミンを有するの部分でありうる。一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向リガンドマスキング剤のポリアミン上の一級アミンの≧50、≧60、≧70、≧80、または≧90への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向リガンドマスキング剤およびPEGマスキング剤のポリマー上の一級アミンの≧50、≧60、≧70、≧80、または≧90への結合により可逆的にマスクする。ASGPr標的指向リガンドマスキング剤およびPEGマスキング剤の両方の場合、PEGのASGPr標的指向リガンドに対する比は約0~4:1、より好ましくは約05~2:1である。両親媒性amphipathic、または両親媒性amphiphilicポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性極性、水溶性および疎水性非極性、親油性、水不溶性基または部分の両方を有する。親水性基は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電アニオンもしくは負に荷電カチオンまたは両方両性イオンでありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる:炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。疎水性基は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。疎水性基は、好ましくは、炭素および水素原子のみを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む、非極性置換または非極性ヘテロ原子は許容されうる。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア親水性およびブタン疎水性を生じる。14ジアミノブタンが窒素炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア2×およびブタンである。しかし、14ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。本明細書において用いられる表面活性ポリマーは、水の表面張力およびまたは他の相との界面張力を低下させ、したがって、液体蒸気界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は通常は、物質の分子が両親媒性amphipathicまたは両親媒性amphiphilicであるという事実による。本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである:非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる:赤血球溶解溶血、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性は、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、HIVTATタンパク質由来のアルギニンを多く含むペプチド、アンテナペディアペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンを多く含む人工ペプチド、小さいグアニジニウムを多く含む人工ポリマ-などの化合物によって表される、細胞透過性ペプチドまたはポリマーと呼ばれるポリマーのクラスとは異なる。細胞透過性化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを必要とすることなく、また膜の完全性を妨害することなく、いくつかの分子を、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他の側へと膜を通過して輸送するようであるが、それらのメカニズムは不明である。ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜エンドソームまたはリソソームなどを破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。本発明の両親媒性膜活性ポリアミンコポリマーは、2つまたはそれ以上のモノマー種の共重合の産物である。一つの態様において、本発明の両親媒性膜活性ヘテロポリマーは以下の一般構造を有する:ab式中、Aは一級または二級アミン官能側基を含み、かつBは疎水性側基を含み、aおよびbは>0の整数である。ポリマーはランダム、ブロック、または交互であってもよい。追加のモノマーの組み込みが許容される。エンドソーム溶解性ポリマーは、溶解性酵素の存在などのエンドソーム特異的環境因子に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドなどの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、エンドソームにおいてそれらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。本発明の可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えられる。メリチンは、天然のハチ毒中にみられる小さい両親媒性膜活性ペプチドである。メリチンは生体原料から単離することもでき、または合成品であってもよい。合成ポリマーは人による化学的プロセスによって調合または製造され、天然の生体プロセスによって生成されるものではない。本明細書において用いられるメリチンは、例えば、以下の種の毒液中で見いだすことができるメリチンファミリーの天然ハチ毒ペプチドを含む:セイヨウミツバチApismellifera、トウヨウミツバチApiscerana、クロスズメバチの一種Vespulamaculifrons、スズメバチの一種Vespamagnifica、スズメバチの一種Vespavelutinanigrithorax、アシナガバチの一種PolistesspHQL2001、コミツバチApisflorae、オオミツバチApisdorsta、トウヨウミツバチApisceranacerana、アシナガバチPolisteshebraeus。本明細書において用いられるメリチンは、天然メリチンペプチドと同一、または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドを含む。具体的には、メリチンアミノ酸配列は表1に示すものを含む。合成メリチンペプチドは、天然のL型アミノ酸または鏡像異性のD型アミノ酸インベルソinversoを含むことができる。しかし、メリチンペプチドは基本的に全L型または全D型アミノ酸のいずれかを含むべきであるが、アミノまたはカルボキシ末端のいずれかに付属した反対の立体中心のアミノ酸を有していてもよい。メリチンアミノ酸配列は逆にすることもできるレベルソreverso。レベルソメリチンはL型アミノ酸またはD型アミノ酸レトロインベルソを有しうる。2つのメリチンペプチドを共有結合してメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、組織標的指向を増強する、またはインビボ循環を促進する、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合された、マスキング剤以外の修飾基を有しうる。連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤またはポリヌクレオチドをポリマーに接続することができる。不安定な連結は不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性およびまたは長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく;これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い熱力学的に、またはより速やかに分解される動力学的に共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期t12結合の半分が切断するのに要する時間によって議論される。したがって、不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換例えば、切断を起こすように選択される。本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。RNAi干渉標的化基結合体:標的化基は、RNAiポリヌクレオチドの3または5末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的化部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。一つの態様において、標的化基は疎水性基からなる。より具体的には、標的化基は、少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基からなる。ポリヌクレオチド標的化部分として用いる疎水性基は、本明細書において疎水性標的化部分と呼ぶ。適切な例示的疎水性基は、コレステロール、ジコレステロール、トコフェロール、ジトコフェロール、ジデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、ジドデシル、ジオクタデシル、イソプレノイド、およびコレアミドを含む群より選択されうる。6個以下の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的化部分として有効ではないが、8から18個の炭素原子を有する疎水性基は疎水性基のサイズ増大すなわち、炭素原子の数の増大に伴い漸増するポリヌクレオチド送達を提供する。疎水性標的化基のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、送達ポリマーの同時投与なしでは、RNAiポリヌクレオチドの効率的な機能的インビボ送達を提供しない。siRNAコレステロール結合体は、他の研究者らによりインビボでsiRNAsiRNAコレステロールを肝細胞に送達すると報告されているが、任意のさらなる送達媒体なしでは、高濃度のsiRNAが必要で、送達効果は悪い。本明細書に記載の送達ポリマーと組み合わせると、ポリヌクレオチドの送達は大幅に改善される。siRNAコレステロールを本発明の送達ポリマーと一緒に提供することにより、siRNAコレステロールの有効性は約100倍高まる。ポリヌクレオチド標的化部分として有用な疎水性基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、コレステロール、コレステロール誘導体、ステロール、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性標的化基は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。疎水性標的化基は、当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3または5末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、疎水性基はいずれの鎖に結合してもよい。もう一つの態様において、標的化基はガラクトースクラスターガラクトースクラスター標的化部分を含む。本明細書において用いられるガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびASGPrに対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC1炭素を通じて結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端Nアセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合するBaenzigerandFiete1980Cell22611620;Connollyetal1982JBiolChem257939945。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ポリマーと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。ガラクトースクラスターは、それぞれ中心の分枝点に連結している2~4つの、好ましくは3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである米国特許第5885968号;BiessenetalJMedChem1995Vol39p15381546。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG3スペーサー3つのエチレン単位である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3または5末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。好適なカラクトースクラスターは米国特許公開第20110207799号に記載されている。ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボースまたはリボースリン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボースリン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNAペプチド核酸、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5末端、3末端、または5および3両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。RNA干渉RNAiポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNAmRNA転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子または短い干渉RNAsiRNAおよびマイクロRNAmiRNAである。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNAdsRNA、短鎖ヘアピンRNAshRNA、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15~50塩基対、好ましくは21~25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ完全に相補的またはほぼ同じ部分的に相補的ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNAna3を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5ns3を有するセンス鎖で提供され、式中wは独立に5リン酸または5チオリン酸またはHであり、Z1は独立に2修飾ヌクレオシドであり、Z2は独立に2デオキシヌクレオシドまたは2フルオロ修飾ヌクレオシドであり、Z3は独立に2修飾ヌクレオシドであり、naは8~23であり、かつnsは8~25である。一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン:5na3を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5ns3を有するセンス鎖で提供され、式中Z1は2フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン:5na3を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5ns3を有するセンス鎖で提供され、式中Z3は2Oメチル修飾ヌクレオシド、2フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。一つの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは修飾パターン:5na3を有するアンチセンス鎖および修飾パターン5ns3を有するセンス鎖で提供され、式中Z1は2フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシヌクレオシドであり、Z3は2Oメチル修飾ヌクレオシド、2フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシヌクレオシドであり、かつ残りの置換基すべて、ならびに変数naおよびnsは前述の意味を有する。新規修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドの核酸配列におけるヌクレオシドは、53ホスホジエステルまたは53ホスホロチオアートのいずれかによって連結されうる。本明細書において用いられるアンチセンス鎖は、標的mRNAに相補的であり、siRNAがいったん巻き戻されるとmRNAに結合することになる、siRNA鎖である。新規修飾パターンを含む該siRNAのセンス鎖は、アンチセンス鎖に相補的である。原則として、RNAiポリヌクレオチドと、それが共有結合している標的指向部分または送達ポリマーとの間のヌクレアーゼ切断部位は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで少なくとも1つの2OHヌクレオチドを含む3または5オーバーハングによって導入することができる。最終活性siRNA種は、細胞内ヌクレアーゼ処理によって生成される。また、塩基対領域内の2OHヌクレオチドによって与えられた規定の切断部位の使用も可能である。これは、反対の鎖に相補的な少なくとも1つの2OHヌクレオチドを用いて、または少なくとも1つのミスマッチ2OHヌクレオチドもしくは少なくとも1つの2OHヌクレオチドを含むヘアピンバルジのいずれかの導入によって行うことができる。ポリヌクレオチドの送達ポリマーへの連結一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドを送達ポリマーに、生理的に不安定な結合またはリンカーを介して連結する。生理的に不安定なリンカーは、一定の生理的条件下にある場合に化学的変換例えば、切断を起こすように選択する例えば、細胞原形質の還元環境で切断されるジスルフィド結合。生理的に不安定な連結の切断による、ポリヌクレオチドのポリマーからの放出は、ポリヌクレオチドの適切な細胞成分との活性のための相互作用を促進する。ポリヌクレオチドポリマー結合体は、ポリヌクレオチドのポリマーへの共有結合によって生成する。ポリマーは、それが反応性基Aを含むように重合または修飾する。ポリヌクレオチドも、それが反応性基Bを含むように重合または修飾する。反応性基AおよびBは、当技術分野において公知の方法を用いて、それらを可逆的な共有結合を介して連結しうるように選択する。ポリヌクレオチドのポリマーへの結合は、過剰のポリマー存在下で実施することができる。ポリヌクレオチドおよびポリマーは結合中に反対の電荷のものでありうるため、過剰のポリマーの存在は結合体の凝集を低減または排除することができる。または、ポリカチオンなどの過剰の担体ポリマーを用いることもできる。過剰のポリマーを結合したポリマーから除去した後に、動物または細胞培養物に結合体を投与することができる。または、過剰のポリマーを動物または細胞培養物に結合体と同時投与することもできる。インビボ投与薬理学および毒性学において、投与経路は薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる道である。一般に、哺乳動物を治療するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内静脈内、動脈内、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液CSF、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される特性およびまたは物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および特性を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。これらの担体は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含んでいてもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含の両方によって確実にしうる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましいこともある。加えて、注射剤形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質の包含によって行いうる。一つの態様において、RNAiポリヌクレオチド標的化基結合体を、本発明の送達ポリマーと同時投与する。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチド結合体および送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド標的化基結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド標的化部分結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。治療効果RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。発明者らは、肝実質細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーターマーカー遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる治療のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される:<2、重度;2~5、中等度;および5~30軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1から2への上昇は有益であると考えることができる。6よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。肝臓は、その代謝例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝および循環タンパク質の分泌例えば、血友病における凝固因子における中心的役割を考慮すると、遺伝子療法の最も重要な標的組織の1つである。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、ポリヌクレオチドに基づく肝臓療法によって治療できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン阻害を通じて治療できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌肝実質細胞癌、HCCを含む、ウイルス感染症肝炎を含む、代謝障害高脂血症および糖尿病を含む、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性となることなく、特定の患者、組成物、および投与の様式に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変動しうる。選択する用量レベルは、用いる本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、用いている特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いる特定の組成物との組み合わせで用いる他の薬物、化合物およびまたは材料、治療中の患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存することになる。投与しようとする送達ポリマー、RNAiポリヌクレオチド標的指向基結合体または送達ポリマーRNAiポリヌクレオチド結合体の量用量は、経験的に決定することができる。発明者らは、動物体重1kgあたり01~10mgのsiRNAおよび動物体重1kgあたり15~60mgの送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示した。マウスにおける好ましい量は025~25mgkgのsiRNA結合体および10~40mgkgの送達ポリマーである。より好ましくは、約15~20mgkgの送達ポリマーを投与する。RNAiポリヌクレオチド結合体は典型的には高用量で毒性でないため、その量は容易に増やされる。本明細書において用いられるインビボとは、生物内部で起こるものを意味し、より具体的には、部分的または死滅したものに対して、生きている組織全体、哺乳動物などの生きている多細胞生物動物の中または上で行われるプロセスを意味する。本明細書において用いられる薬学的組成物は、本発明の結合体、薬学的担体または希釈剤、および製剤に必要な任意の他の媒質または物質を含む。本明細書において用いられる薬学的担体は、生理的に適合性の、任意の、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与例えば、注射または注入によるに適している。実施例1プロテアーゼペプチダーゼ切断可能なマスキング剤の合成NaHCO3水溶液中のアミノ酸のカップリングおよびシリル基脱保護を除き、すべての反応を新鮮無水溶媒を用いて無水条件で実施した。カラム精製は、明記した溶離剤を用いてシリカゲル上で行った。質量スペクトルMSはエレクトロスプレーイオン化を用いて得た。NAGおよびPEGの活性pニトロフェニルpアシルアミドベンジルカルボナート誘導体NAGLAAPABCPNPおよびPEGAAPABCPNPの調製において、発明者らはそれぞれPEGまたはNAG含有誘導体のNHSエステルを用いて、ジペプチドpアシルアミノベンジルアルコール前駆体のアミノ末端をアシル化した。以下の段階において、ベンジルのヒドロキシル基をpニトロフェニルカルボナートに変換し、続いてアミノ酸およびNAG部分から保護基を除去した。いくつかの適用において、パラニトロフェノールPNPカルボナートを特定のポリマーの修飾に用いた場合、ポリマー修飾の前の保護基。RはASGPrリガンド保護または未保護またはPEGを含み、かつA1およびA2はアミノ酸保護または未保護のいずれかである。合成はHA1A2PABA表1誘導体の調製から開始する。これらの付加物は、Dubowchikら2002によって記載された合成スキームをいくらかの改変と共に用いて得た。Fmoc保護アミノ酸、FmocA1OHを、ジシクロヘキシルカルボジイミドDCCおよびNヒドロキシククシンイミドNHSを用いての反応において、Nヒドロキシククシンイミドエステル、FmocA1NHSに変換することにより活性化した。これらの反応性NHSエステルを保護アミノ酸A2と、アミノ基を反応性に保つために加えたNaHCO3水溶液存在下でカップリングさせた。1eおよび1f表1の調製では、NHSエステルの代わりに市販のペンタフルオロフェニルエステルOPfpをカップリングのために用いた。Fmocジペプチド1a~hの合成aAAのNHSエステルをそれぞれのアミノ酸からNHSおよびDCCを用いて調製し、それ以上精製せずに用いた。条件:iNヒドロキシスクシンイミドNHS、NNジシクロヘキシルカルボジイミドDCC、0~20°C。FmocAlaNHSのために、DCC286mg、138mmolをDCM13mL中のFmocAlaOH412mg、132mmolおよびNHS160mg、138mmolの氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20°Cで16時間撹拌した。固体のジシクロヘキシル尿素DCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。FmocAsnNHSのために、DCC148mg、072mmolをDCM13mL中のFmocAsnOH298mg、068mmolおよびNHS83mg、072mmolのの氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20°Cで16時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。FmocGlyNHSのために、FmocGlyOH891mg、3mmolおよびNHS380mg、33mmolをTHF10mL中0°Cで5分間撹拌し、THF5mL中のDCC溶液650mg、315mmolで処理した。30分で冷却浴を取り除き、反応混合物を20°Cで10時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、THFで洗浄し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。生成物を秤量し、DMEに溶解して、02mM溶液を作成した。FmocGluNHSのために、DCC217mg、105mmolをTHF5mL中のFmocGluOH487mg、1mmolおよびNHS127mg、11mmolの氷冷溶液に加え、15分間撹拌し、次いで20°Cで10時間撹拌した。後処理をFmocGlyNHSについて記載したとおりに行った。FmocPheNHSのために、DCC1181g、572mmolをDCM50mL中のFmocPheOH211g、545mmolおよびNHS664mg、577mmolの氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20°Cで10時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。FmocValNHSのために、DCC227mg、11mmolをDCM13mL中のFmocValOH339mg、1mmolおよびNHS127mg、11mmolの氷冷溶液に加え、30分間撹拌し、次いで20°Cで16時間撹拌した。固体のDCUをろ去し、溶媒を減圧下で除去した。bアミノ酸、HAsnOHおよびHLysOHを、入手可能なFmoc保護誘導体から調製した。条件:iジメチルホルムアミドDMF中のトリエチルアミンEt3N。HAsnOHFmocAsnOH576mg、132mmolをDMF9mL中、Et3N37mL、264mmolと共に15時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより、40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。残渣をエーテル30mLで3回粉砕し、減圧下で乾燥した。収量271mg96。MS64363M145132MNa42952M12367MNa2153Ml1328MDMCP1。HLysOH。FmocLysOH4902g、765mmolをDMF100mL中、Et3N32mL、30当量、2294mmolと共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより、40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。残渣をエーテルで2回粉砕し、減圧下で乾燥した。収量31g97。MSネガティブモード4554533MCl4178M1。cFmocA1A2OHの合成A1=Gly、Glu、Asn、Phe、Ala、Val。A2=Gly、Lys、Cit、Asn、Lys2。条件:iHA2OH、NaHCO3、ジメトキシエタンDME、テトラヒドロフランTHFおよびH2Oの混合物。iiHA2OH、NaHCO3、DMETHFH2O。iiiHCitOH、NaHCO3、H2O中のTHF。FmocGlyGlyOH1aのために、グリシン75mg、1mmolおよびNaHCO3100mg、12mmolをH2O10mLおよびジメトキシエタンDME5mLに溶解した。DME中のFmocGlyNHS溶液5ml、1mmolを加えた。THF25mLを加え、混合物を超音波処理して均質にし、20時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEtOAcおよびH2O中5KHCO3溶液で処理した。生成物をEtOAcで4回抽出し、pH=3の食塩水で洗浄し、乾燥Na2SO4し、濃縮し、減圧下で乾燥した。収量321mg90。MS77502M2Na3774MNa3551M1。FmocGluGlyOH1bのために、グリシン75mg、1mmolおよびNaHCO384mg、1mmolをH2O2mL、THF4mLおよびDME5mLの混合物に溶解した。DME中のFmocGluNHS溶液5mL、1mmolを加え、10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、20mLの01MMES緩衝液pH=5を加え、続いてEtOAc25mLを加えた。反応混合物を氷上で撹拌し、KHSO4の5溶液でpH=5まで酸性化した。生成物をEtOAcで4回抽出し、pH=5の食塩水で洗浄し、乾燥Na2SO4し、濃縮し、減圧下で乾燥した。収量528mg96。MS567MNa562MNH45450M14271M2PhiPr。FmocAsnGlyOH1cをFmocAsnNHSおよびHGlyOHから1bについて前述したとおりに調製した。収率96。MS98742M15163MNa4944M14122MDMCP1。FmocPheLysOH1dをFmocPheNHSおよびHLysOHから1bについて前述したとおりに調製した。収率94。MS7885M1、2731MMMT1。FmocPheCitOH1eのために:iDME40mL中のFmocPheNHS496g、1026mmolをH2O40mLおよびTHF20mLの混合物中のLシトルリン180g、1026mmolおよびNaHCO3086g、1026mmolを含む溶液に加えた。反応混合物を15時間撹拌した。活性化からの残存DCCをろ過し、有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。残渣にH2O100mLおよびiPrOH10mLを加えた。懸濁液を5KHSO4でpH3まで酸性化し、生成物をEtOAc:iPrOH=9:1溶液3×、500mLで抽出し、食塩水:iPrOH=9:1の混合物2×、50mLで洗浄し、乾燥Na2SO4し、ろ過して濃縮し、オイルポンプで乾燥した。エーテルで粉砕して、純粋な生成物1eを得た。収量384g68。MS5456MNa5285MH2O3063MFmocH2O。iiTHF5mL中のFmocPheOPfp553mg、1mmolの溶液をH2O26mL中のHCitOH184mg、105mmolおよびNaHCO3882mg、105mmolの溶液に加えた。THF2mLを加えて溶液を均質にし、10時間撹拌した。THFをロータリーエバポレーターで除去し、残渣をH2O10mLおよびiPrOH1mLで希釈し、3HClでpH=1まで酸性化した。生成物をEtOAc:iPrOH=9:1溶液で5回抽出し、食塩水:iPrOH=9:1の混合物で洗浄し、乾燥Na2SO4し、減圧下で濃縮した。エーテルで粉砕して、313mgの純粋な生成物1eを得た57。FmocAlaCitOH1fをFmocAlaNHSおよびHCitOHから1eaについて前述したとおりに調製した。収率77。MS95982MNa93812M14914MNa4699M1。粗製FmocValCitOH1gをFmocValNHSおよびHCitOHから1bについて前述したとおりに調製した。最終精製をエーテルでの粉砕によって行った。全収率76。MS106032M3Na101572MNa5197MNa4979M1。FmocAlaAsnOH1hをFmocAlaNHSおよびHAsnOHから1bについて前述したとおりに調製した。収率95。MS5302MNa5082M14260MDMCP1。pアミノベンジルアルコールとのカップリング、FmocAAPABAおよびFmocAPABA2a~mの調製生成物1a~hをpアミノベンジルアルコールPABAと2エトキシ1エトキシカルボニル12ジヒドロキノリンEEDQ存在下でカップリングし、2a~hを生成した。PABAに1つのアミノ酸だけが結合している4つの代表的化合物3j~lも調製した。条件:iPABA、EEDQ、THFFmocGlyGlyPABA2aのために、DCM17mLおよびMeOH6mL中の1a318mg、09mmolおよびPABA220mg、18mmolの溶液をEEDQ444mg、18mmolと共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2Oで粉砕し、生成物をろ過して、減圧下で乾燥した。収量348mg84。FmocGluGlyPABA2bのために、DCM10mL中の1b524mg、096mmolおよびPABA142mg、155mmolの溶液をEEDQ357mg、144mmolと共に10時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量462mg74。FmocAsnGlyPABA2cを2aについて前述したとおりに調製した。収率64。MS6215M225993M1。FmocPheLysPABA2dを2bについて前述したとおりに調製した。収率70。FmocPheCitPABA2eのために、DCM150mLおよびMeOH50mL中の1e598g、1097mmolおよびPABA270g、2195mmolの溶液をEEDQ543g、2195mmolで処理し、15時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量614g86。MS6507M15273MPABA1。FmocAlaCitPABA2fのために、DCM45mLおよびMeOH15mL中の1f289g、617mmolおよびPABA152g、1234mmolの溶液をEEDQ305g、1234mmolで処理し、15時間撹拌した。後処理を2aについて前述したとおりに行った。収量456g74。MSES、ネガティブモード3074M263613499MFmoc16106084MHCl1。FmocValCitPABA2gを2bについて前述したとおりに調製した。98。FmocAlaAsnPABA2hを2aについて前述したとおりに調製した。収率59。MS6132M15314MDMCP14082M2051。FmocLys2PABA2iのために、FmocLys2OHHCl塩433mg、1mmolおよびPABA246mg、2mmolをDCM10mLおよびMeOH15mLに溶解し、5°Cに冷却し、EEDQ495mg、2mmolを加えた。冷却浴を取り除き、混合物を室温で10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2Oで粉砕し、粗生成物をろ過した。これをDCM2mLおよびMeOH1mLの混合物に再度溶解し、Et2O40mL中に滴下することにより再度沈澱させた。生成物をろ過し、減圧下で乾燥した。収量448mg83。FmocLeuPABA2jのために、DCM10mL中のFmocLeuOH353mg、1mmol、EEDQ495mg、2mmolおよびPABA222mg、18mmolの溶液を10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をEt2O40mLに溶解し、ドライアイス上で2時間冷却し、固体を遠心沈降により分離した。得られた粗製材料をカラムにより、CHCl3中のMeOH1~2の溶離剤勾配で精製した。収量444mg97。MS4594M1。FmocAsnPABA2kを2jについて記載したとおりに調製した。DCMの除去後、カラム精製の代わりの後処理において、残渣をEt2Oで粉砕し、0°Cまで冷却し、粗生成物をろ過した。この処理をもう一度繰り返し、続いて減圧下で乾燥した。収率77。MS5425M1。FmocCitPABA2lのために、DCM10mLおよびMeOH4mL中のFmocCitOH3457mg、087mmolおよびPABA214mg、174mmolの溶液をEEDQ430mg、174mmolで処理し、15時間撹拌した。固体生成物をエーテルで3回粉砕し、生成物をろ過して乾燥した。収量288mg67。MS5023M14855MH2O1263MFmocH2O11790M30611202M36531。生成物2mを異なるスキームを用いて調製した:HLys2PABA誘導体3のFmocPheNHSとのカップリング。条件:iDMF中、トリエチルアミンEt3N、10時間。iiFmocPheNHS、ジソプロピルエチルアミンDIEA、DMF。FmocPheLysPABA2mのために、FmocLys2PABA2i448mg、083mmolをDMF11mL中、Et3N35mLと共に10時間撹拌することにより、Fmoc脱保護した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去して、粗生成物3iを得た。この生成物をDMF7mLに溶解し、FmocPheNHS482mg、0996mmolと、続いてDIEA042mL、22mmolを加え、混合物を10時間撹拌した。溶媒およびDIEAをロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去して粗製2mを得、これをそれ以上精製せずに用いた。MS5494Ml。HAAPABA3a~h、mおよびHAPABA3j~lの調製条件:iDMF中、Et3N、10時間。Fmoc誘導体2a~h、j~lを3iについて前述したとおりにDMF中、Et3Nで処理し、続いて濃縮し、減圧下で乾燥した。粗生成物をDMFに溶解して01M溶液を作成し、それ以上精製せずに用いた。表1HAAPABA1~3の中間体プロテアーゼ切断可能なNAGマスキング試薬の調製NAGLAAPABCPNP表2、3の調製R1、R2およびR3が保護基であり、Lがガラクトサミン部分NAGとジペプチドAAとの間の連結である、NAGLAAPABCPNPの調製を、NAGLCO2H酸6、10a、b、13および17の調製から開始し、これらをNHSエステルに変換した後、HAAPABA2をアシル化するために用いた。塩基感受性ポリマーのために設計したカルボナート21a~fにおいて、保護基をポリマー修飾の間に除去しなければならなかった。このために、10a、b、13および17の調製において、GAL部分のAc保護基を不安定なトリエチルシリルTESおよびtertブチルジメチルシリルTBDMS基で置き換えた。これらの基は、塩基感受性PNPカルボナート部分を損なうことなく、H2O中70トリフルオロ酢酸TFA溶液を0°Cで用いて除去することができる。aR1=R2=R3=OAcであるNAGL1CO2H6の調製において、Z保護NAG4酢酸エステル4[3~5]をZ脱保護H2、PdC10、MeOH、CHCl320してNAGアミン5を得、これを次いで無水コハク酸でアシル化した無水コハク酸、Et3N、DCM、1時間。条件:iH2、PdC10、MeOH、CHCl3、3L3OtBu15の調製条件:iトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルTMSOTf、ジクロロエタンDCEii12ヒドロキシ4710トリオキサドデカン酸tブチルHOPEG4CO2tBu、SnCl4、ジクロロメタンDCM。条件:iHCO2H、10時間。iiEt3N、MeOH、H2O5:7:610時間。iiiDMF中TBDMSCl3当量、イミダゾール、10時間。エステルNAG3L3OtBu15のために、ガラクトサミンのペンタアセチル誘導体1410g、2564mmolをトルエンから2回蒸発させて乾燥した。得られた白色ガラスをDCE223mL中のTMSTf518mL、286mmolで処理し、60°Cで16時間撹拌した。反応混合物を0°Cに冷却し、TEA26mLで反応停止し、CHCl3300mLで希釈し、NaHCO3溶液および食塩水で2回洗浄した。分離した有機溶液をMgSO4で処理し、濃縮し、減圧下で乾燥した。粗製オキサゾリン誘導体をそれ以上精製せずに用いた。収量814g96。MS3681MK3522MNa3302M1。DCM270mL中のオキサゾリン誘導体528g、16mmol、12ヒドロキシ4710トリオキサドデカン酸tブチル512g、184mmolおよびCaSO420gの混合物を撹拌しながら、これにSnCl4084mL、084mmolを滴加した。溶液を16時間撹拌し、ろ過し、CHCl3250mLで希釈し、NaHCO3溶液および食塩水で2回洗浄した。生成物をMgSO4で乾燥して、濃縮した。粗生成物をカラムにより、酢酸エチル中のMeOH0~7の溶離剤勾配で精製した。収量483g50。MS6308MNa6255MNH46084M15526MtBu13302脱グリコシル化生成物。NAG3L3OH16のために、tertブチルエステル15199g、327mmolをニートのギ酸54mL中で16時間撹拌し、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、続いてトルエンを3回蒸発させた。生成物を減圧オイルポンプで2時間乾燥し、それ以上精製せずに用いた。収量177g98。MS3302脱グリコシル化生成物5904MK5746MNa5696MNH45526M1。NAGL3OH17R1=R3=OTBDMS、R2=OHのために、生成物16をO脱アセチル化し、8bの調製におけるとおりにTBDMSClで処理し、カラムにより、CHCl3中の3MeOH、05AcOHの溶離剤で精製した。収率18。MS12287M1、7967脱グリコシル化生成物。5つの得られた酸6、10a、b、13、17をすべて、NHSおよびDCCによる反応においてNHSエステル18a~eに変換したNHS、DCC、DCM、10時間。条件:iNHS、DCC、DXCM、10時間。NAGLNHS18a~eの調製のために、以下の18cについて記載した手順を用いた。生成物18cのために、DCM15mL中の10b614mg、0964mmolおよびNHS122mg、1061mmolの氷冷溶液をDCC219mg、1061mmolで処理し、氷上で30分間と20°Cで8時間撹拌した。反応混合物を0°Cに冷却し、DCUをろ去し、残渣を濃縮し、減圧下で乾燥した。粗生成物をDMFに溶解して005M溶液を作成し、それ以上精製せずに用いた。生成物18b~eを18aについて記載したとおりに調製した。c20a~lの生成、3a~hをヒドロキシル保護NAG誘導体18a~eのNHSエステルでアシル化しDIEA、DMF、5~10時間、19a~lを得た。次いで、生成物19a~lを5当量のビスカルボナート2COで処理し2CO、ジオキサンまたはDCM、40~50°C、15~24時間、Oアセチル保護PNPカルボナート誘導体20a~lを得た。生成物20a~eをペプチドの修飾のために直接用いた。アセチル基およびアミノ酸から保護基2PhiPr、DMCP、MMTは、修飾後、DPCのTFAおよびEt3Nによる連続処理中に除去した。条件:iDIEA、DMF、5~10時間。iiPNP2CO、ジオキサンまたはDCM、25~60°C、16~48時間。NAGLAAPABA19a~l生成物19aR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=GlyGlyのために、DMF中のNAGNHSエステル18a溶液005M0282mmolをDMF中の3aの01M溶液0282mmolおよびDIEA59μL、0338mmolで処理した。3時間で、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去し、Et2Oで粉砕し、カラムにより、溶離剤:EtOAc:CHCl3:MeOH=8:7:5~8:7:6の勾配で精製した。収量114mg53。MS7544M1。生成物19bR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=GluGlyを19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤EtOAc:CHCl3:MeOH=8:7:3で精製した。収率64。MS9445M1。生成物19cR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=AsnGlyのために、DMF215mL中の3c043mmolおよびDIEA83μL、0476mmolの溶液に、DMF215mL中の18a043mmolの溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をEt2Oで粉砕し、カラムにより、溶離剤CHCl3:アセトン:MeOH5:5:1で精製した。収量242mg62。MS9153MNa9106MNH48936M1。生成物19dR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=PheLysを19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中のMeOH5~6の溶離剤勾配で精製した。収率56。MS11879M1。生成物19eR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=PheCitのために、DMF3mL中の3e057mmolおよびDIEA119μL、0684mmolの溶液にDMF3mL中の18a057mmolの溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をCHCl3:MeOH5mLからEt2O45mL中に沈澱させ、それ以上精製せずに用いた。収量392mg73。MS9668MNa9447M19268MH2O8215MPABA16156MNAcGal14923MPABANAcGal1。生成物19fR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=AlaCitを19eについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに用いた。収率50。MS9932MNa9710M15396脱グリコシル化生成物。生成物19gR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=ValCitを19fについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率67:9989M1。生成物19hR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=GluGlyを19aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、DCM中のNH4OH3およびMeOH75溶液の溶離剤で精製した。収率15。MS10472M1、6157、4326脱グリコシル化生成物。生成物19iR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=PheCitを19eの調製について記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに用いた。収率50。MS10687MNa10473M16154脱グリコシル化生成物4325脱グリコシル化生成物。生成物19jR1=OTBDMSおよびOTES、R2=OH、R3=OTES、L=L1、AA=PheCitを、C3およびC6OTBDMSおよびOTES保護NAG誘導体の混合物としての3eおよび18bから、19eの調製について記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率76。MS10474M1、6158脱グリコシル化生成物。生成物19kR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L2、AA=PheCitを19eについて記載したとおりに調製し、それ以上精製せずに次の段階で用いた。収率67:12682M18359脱グリコシル化生成物。生成物19lR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L3、AA=PheCitを19eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中の5MeOH溶液の溶離剤で精製した。収率60。MS10640M16327脱グリコシル化生成物。NAGAAPABCPNP20a~l生成物20aR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=GlyGlyのために、ジオキサン5mL中の19a100mg、0132mmol、2CO202mg、0663mmolおよびDIEA007mL、0396mmolの懸濁液を暗所、40°Cで8時間撹拌した。さらに2CO121mg、0397mmolおよびDIEA004mL、0226mmolを加え、撹拌を40°Cでさらに8時間続けた。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH=7:8:3で精製した。収量84mg69。生成物20bR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=GluGlyのために、DCM10mL中の19b160mg、0169mmol、2CO258mg、0847mmolおよびDIEA009mL、0507mmolの溶液を暗所で10時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、生成物をカラムにより、溶離剤:CHCl3中5~6MeOH溶液で精製した。収量174mg92。生成物20cR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=AsnGlyのために、DCM5mL中の19c127mg、0142mmol、2CO216mg、0710mmolおよびDIEA74μL、0426mmolの溶液を暗所で16時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、生成物をカラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH7:22:08で精製した。収量1106mg74。MS10809MNa10587M1。生成物20dR1=R2=R3=OAc、L=L1、AAPheLysを20bについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH=9:7:1で精製した。収量76mg47。生成物20eR1=R2=R3=OAc、L=L1、AA=PheCitのために、ジオキサン17mL中の19e164mg、0173mmol、2CO528mg、173mmolおよびDIEA182μL、104mmolの溶液を暗所、60°Cで16時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留するDIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で2回連続して蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH8:15:05と、続いてCHCl3:MeOH7:1で精製した。収量85mg44。MS11320MNa11101M17808脱グリコシル化生成物。生成物20fR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=AlaCitを20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH=9:10:1で精製した。収量153mg36。生成物20gR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=ValCitを20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1で精製した。収率44。MS11645M1。生成物20hR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=GluGlyを20bについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH=8:7:1で精製した。収率77。生成物20iR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L1、AA=PheCitのために、ジオキサン7mL中の19i316mg、0297mmol、2CO913mg、297mmolおよびDIEA310μL、178mmolの溶液を暗所、65°Cで40時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留するDIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で2回連続して蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH8:15:05と、続いてCHCl3:MeOH92:08で精製した。収量297mg81。MS12467MNH412287M17976脱グリコシル化生成物4327脱グリコシル化生成物。生成物20jR1=OTBDMSおよびOTES、R2=OH、R3=OTES、L=L1、AA=PheCit、C3およびC6OTBDMSおよびOTES保護NAG誘導体の混合物としての生成物20jを20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1と、続いてCHCl3中10MeOHで精製した。収率50。MS12120M1、4800脱グリコシル化生成物。生成物20kR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L2、AA=PheCitを20eについて記載したとおりに調製し、カラムにより、CHCl3中のMeOH8~10の溶離剤勾配で精製した。収率85。生成物を次の段階で直接用いた。生成物20lR1=R3=OTBDMS、R2=OH、L=L3、AA=PheCitのために、ジオキサン8mL中の19l316mg、297mmol、2CO912mg、3mmolおよびDIEA031mL、178mmolの溶液を暗所、60°CのAr雰囲気下で48時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1で精製した。収量297mg81。NAGLAAPABCPNP21a~fR1=R2=R3=OH、20f~lの脱保護21a~fの生成。塩基感受性ポリアクリラートの修飾のために、NAGおよびジペプチドAA上の保護基を除去した後、20f~lをTFA:H2O=3:1の混合物で処理することによりポリマーに結合しTFAH2O=3:1、5°C、2~3時間、NAGジペプチドマスキング試薬21a~fを提供した。条件:TFAH2O=3:1、5°C、2~3時間生成物21aAA=AlaCit、L=L1のために、化合物20f150mg、0132mmolを氷冷TFA:H2O=3:1溶液2mL中で4時間撹拌し、撹拌中のEt2O20mL中に滴加した。沈澱を分離し、トルエンをロータリーエバポレーター30°Cで蒸発させて乾燥し、次いで減圧下で乾燥した。収量112mg94。MS9072M17044脱グリコシル化生成物。生成物21bAA=ValCit、L=L1のために、化合物20g305mg、026mmolを氷冷TFA:H2O=3:1溶液5mL中で1時間撹拌し、撹拌中のEt2O45mL中に滴加した。固体生成物を分離し、トルエンをロータリーエバポレーター30°Cで蒸発させて乾燥し、次いで減圧下で乾燥した。収量193mg79。MS9358M1、7327脱グリコシル化生成物。生成物21cAA=GluGly、L=L1を21bについて記載したとおりに調製した。収量55mg98。MS8655M1、6623脱グリコシル化生成物。生成物21dAA=PheCit、L=L1を21bについて記載したとおりに調製した。MS9837M1、7809脱グリコシル化生成物。生成物21eAA=PheCit、L=L2のために、化合物20kを21bについて記載した条件下、氷冷TFA:H2O=3:1溶液5mL中で15時間撹拌した。19kからの収率25。MS12039M1、10010脱グリコシル化生成物。生成物21fAA=PheCit、L=L3を20lから、21bについて記載した条件下、3時間の脱保護を用いて調製した。収率75。MS12039M1、10010脱グリコシル化生成物。表2中間体NAGLAAPABA19およびNAGLAAPABC20表3DPC調製のために用いた最終NAGLA1A2PABC20、21プロテアーゼ切断可能なPEGマスキング試薬の調製任意のHAAPABA3b、e、g、h、j、k~mのアミノ基をPEG酸のNHSエステルでアシル化しDIEA、DMF、5~10時間、22a~kを得た。次いで、生成物22a~kのヒドロキシル基をpニトロフェニルカルボナートに変換し2CO、ジオキサンまたはTHF、40~60°C、10時間、23a~kを得た。23a、d、gのために、AsnおよびGluから保護基を水性TFA処理によって除去しTFAH2O=3:1、5°C、2~3時間、所望の生成物24a~cを得た。23a、d、gを24a、d、gに変換することにより一貫性を保持することができるかまた、NAG版とPEG版との間の各文字についてアミノ酸の間に一貫性はあるかPEGnAAPABA22a~kの調製条件:iDIEA、DMF、5~10時間。生成物22an=11、AA=GluGly。DMF中の3bの01M溶液35mL、035mmolをPEG11NHSエステル240mg、035mmolおよびDIEA0061mL、035mmolと共に10時間撹拌した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤:CHCl3:MeOH:AcOH=38:2:1で精製した。収量274mg78MS10156MNH4、9987M1。生成物22bn=11、AA=PheCit。DMF3mL中の3e088mmolおよびDIEA167μL、096mmolの溶液に、DMF3mL中のPEG11NHSエステル080mmolの溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。粗生成物をCHCl3:MeOH5mLからEt2O45mL中に沈澱させ、カラムにより、CHCl3中のMeOH10~16の溶離剤勾配で精製した。収量420mg53。MS10159MH2O9988M19811MH2O。生成物22cn=11、AA=ValCit。生成物22fを、22aについて記載したとおりに、粗製3g300mg、05mmolの2gから得た、PEG11NHSエステル298mg、0435mmolおよびDIEA009mL、0522mmolから調製した。ロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプで濃縮した後、生成物をMeOH:DCM=1:1混合物6mLに懸濁し、超音波処理し、ろ過し、Et2O50mL中に沈澱させた。固体を分離し、この手順を再度繰り返した。残留する溶媒を減圧下で除去した。収量283mg60。MS9515M1。生成物22dn=11、AA=AlaAsn。DMF3mL中の3h056mmolおよびDIEA116μL、067mmolの溶液に、DMF3mL中のPEG11NHSエステル056mmolの溶液を加えた。混合物を16時間撹拌し、ろ過し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で除去した。残渣をCHCl3:MeOH=1:1混合物5mLに溶解し、冷却した0°CEt2O45mL中に沈澱させた。固体をカラムにより、DCM中のMeOH3~14の溶離剤勾配で精製した。収量261mg49。MS9837MNa9791MNH49618M19439MH2O1。生成物22en=11、AA=PheLys。生成物22eを22aについて記載したとおりに調製した。精製をHPLCカラムNucleodurC18、250×46、溶離剤ACNH2O01TFA、勾配15~30を用いて行った。MS9981M1。単離した生成物をDowex1×8樹脂により、溶離剤H2Oで脱塩した。収率40。生成物22fn=11、AA=Leu。生成物22fを22aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤:CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH=9:7:2:004で精製した。収率48。MS8249MNH4。生成物22gn=11、AA=Asn2CO、ジオキサンまたはTHF、40~60°C、10時間。生成物23an=11、AA=GluGlyのために、DCM15mL中の生成物22a274mg、0274mmolを暗所で2CO418mg、1372mmolおよびDIEA0143mL、0823mmolと共に15時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物をカラムにより、CHCl3中の4MeOH、02AcOHの溶離剤で精製した。収量260mg81。MS11807MNH4。生成物23bn=11、AA=PheCitのために、ジオキサン4mL中の22b419mg、042mmol、2CO766mg、252mmolおよびDIEA263μL、152mmolの溶液を暗所、50°Cで15時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留DIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で連続2回蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH45:5:05と、続いてCHCl3:MeOH9:1で精製した。収量390mg80。MS11812MNH4、11642M1。生成物23cn=11、AA=ValCitのために、14ジオキサン22mL中の22c273mg、0287mmol、2CO874mg、288mmolおよびDIEA03mL、172mmolの溶液を暗所、50°Cで24時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH=16:3:1と、続いてCHCl3中12~15のMeOHで精製した。収量163mg51。MS11160M1。生成物23dn=11、AA=AlaAsnを、23bの調製において記載したとおりに調製した。生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH9:2:1で精製した。収率77。MS11440MNH411273M1。生成物23en=11、AA=PheLys2を、23aについて記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤:CHCl3中の10MeOH、02AcOHで精製した。収率63。MS11631M1。生成物23fn=11、AA=Leuを、5当量の2COおよび3当量のDIEAだけを用い、熱を24時間適用して、23cについて記載したとおりに調製した。生成物をカラムにより、CHCl3中MeOH7~12の溶離剤勾配で精製した。収率75。MS972M1。生成物23gn=11、AA=Asnを、23fについて記載したとおりに調製し、粗生成物をそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS10734M18。生成物23hn=11、AA=Citのために、DCM4mL中の22h340mg、040mmol、2CO608mg、200mmolおよびDIEA208μL、120mmolの溶液を暗所、30°Cで15時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去した。残留DIEAを、DMFをロータリーエバポレーターにより40°Cオイルポンプ減圧下で連続2回蒸発させることにより除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH7:25:05と、続いてCHCl3中のMeOH8~14の勾配で精製した。収量390mg80。MS10343MNH410169M1]。生成物23in=23、AA=PheCitを、23bの調製において記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH45:5:05と、続いてCHCl3中のMeOH6~12の勾配で精製した。収率86。MS17114MNH416944M1。生成物23jPEG1000KAA=PheCitを、23bの調製において記載したとおりに調製し、カラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH45:5:05と、続いてCHCl3中のMeOH6~12の勾配で精製した。収率72。生成物23kn=23、AA=ValCitを、23bの調製において記載したとおりに調製し、生成物をHPLCで精製した。カラム:LunaPhenomenex5u、C8、100A。移動相:ACNH2OF3CO2H001、ACN勾配30~37、31分。収量:530mg48。MS16664MNa16442M1。PEGAAPABCPNP24a~c、AA脱保護条件:iTFAH2O=3:1、5°C、2~3時間。生成物24an=11、AA=GluGly。生成物23a250mg、0215mmolをCHCl3の3TFA溶液16mL中で35分間撹拌し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、減圧下で乾燥した。収量224mg100MS10626MNH410459M1。生成物24bn=11、AA=AlaAsnPABCPNP。化合物23dをTFA:DCM3:1の混合物中で15時間撹拌し、すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより20°Cで除去した。生成物をカラムにより、CHCl3中のMeOH6~12の溶離剤勾配で精製した。収率30。MS10667MNa、10620MNH410452M1。生成物24cn=11、AA=Asn。23g160mg、0143mmolを含む反応フラスコを0°Cまで冷却し、TFA:H2O9:1の冷混合物125mLを加えた。混合物を15時間撹拌し、冷H2O50mLで希釈した。撹拌を20°Cで20分間続けた。沈澱をろ過し、H2Oで洗浄した。すべての揮発性物質をロータリーエバポレーターにより40°Cで除去し、生成物をカラムにより、溶離剤CHCl3:EtOAc:MeOH:AcOH=45:35:12:002で精製した。収量43mg30。MS9740M1。表4DPC調製のために用いた最終PEGLA1A2PABC実施例2プロテアーゼ切断可能なマスキング剤のアミン含有ポリマーへの連結-pアシルアミドベンジルカルバマート連結の生成Aメリチンのプロテアーゼ切断可能なマスキング剤による修飾。1×mgのメリチンペプチドおよび10×mgのHEPES塩基を1~10mgmLペプチドで、2~6×mgのNAG含有プロテアーゼ切断可能基質のアミン反応性pニトロフェニルカルボナートまたはNヒドロキシスクシンイミドカルボナート誘導体の添加によりマスクした。次いで、動物への注入前に、溶液を室温RTで少なくとも1時間インキュベートした。Bポリアミンのプロテアーゼ切断可能なマスキング剤による修飾。pアシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化アミン反応性カルボナートをpH>8のH2O中で両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と反応させて、pアシルアミドベンジルカルバマートを得る。R1はASGPrリガンド保護または未保護のいずれかまたはPEGを含み、R2は両親媒性膜活性ポリアミンであり、AAはジペプチド保護または未保護のいずれかであり、かつZはアミン反応性カルボナートである。×mgのポリマーに等張グルコース中の12×mgのHEPES遊離塩基を加えた。緩衝化ポリマー溶液にDMF中の2×から16×mgの200mgmlジペプチドマスキング剤を加えた。いくつかの適用において、ポリマーを2×mgのジペプチドマスキング剤で修飾し、続いてsiRNAを結合した。次いで、ポリマーsiRNA結合体を6×から8×mgのジペプチドマスキング剤でさらに修飾した。実施例3siRNAsiRNAは以下の配列を有していた。第VII因子siRNA第VII因子siRNA霊長類ApoBsiRNA:Aha1siRNA:LucsiRNAEg5KSPEGFP小文字=2OCH3置換s=ホスホロチオエート連結ヌクレオチドの後のf=2F置換ヌクレオチドの前のd=2デオキシRNA合成を、AKTAOligopilot100GEHealthcare、Freiburg、Germanyおよび固体支持体としての多孔性ガラスCPGを用い、固相上で通常のホスホラミダイト化学により実施した。実施例4インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達DPCを前述のとおりに調製した。6~8週齡のマウスC57BL6またはICR系統、それぞれ約18~20gをHarlanSpragueDawleyIndianapolisINから入手した。マウスを注入前に少なくとも2日間ケージに収容した。給餌はHarlanTekladRodentDietHarlan、MadisonWIで適宜行った。DPCを本明細書に記載のとおりに合成した。結合体溶液04mLを尾静脈への点滴により注入した。組成物は生理的条件で可溶性かつ非凝集性であった。溶液を尾静脈への点滴により注入した。他の血管への注入、例えば、眼窩後注入も等しく有効であると予想される。WistarHanラット、175~200gをCharlesRiverWilmington、MAから入手した。ラットを注入前に少なくとも1週間ケージに収容した。ラットの注入量は典型的には1mlであった。特に記載がないかぎり、注入の48時間後に血清試料を採取し、およびまたは肝試料を採取した。血清ApoBレベルの定量マウスを4時間ラットの場合は16時間絶食させた後に顎下採血により血清を採取した。ラットの場合、血液を頚静脈から採取した。血清ApoBタンパク質レベルを、標準のサンドイッチELISA法によって定量した。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体BiodesignInternationalをそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。その後、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体Sigmaを適用してApoB抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチルベンジジンTMB、Sigma発色の吸光度をTecanSafire2Austria、Europeマイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。血漿第VII因子F7活性の測定動物からの血漿試料を、標準の手順に従い、血液9倍量マウスの場合は顎下採血により、またはラットの場合は頸静脈からを0109molLクエン酸ナトリウム抗凝固剤1倍量を含む微小遠沈管に採取することにより調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHENVIIキットHyphenBioMedAniara、Mason、OHを製造者の推奨に従って用い、色素産生法により測定した。発色の吸光度をTecanSafire2マイクロプレート読み取り器により405nmで測定した。実施例5ジペプチド切断可能マスキング剤で可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアクリラートポリアミンを用いての、インビボでのsiRNAの肝細胞への送達100mMのpH75HEPES緩衝液中のポリアクリラートAnt41658111を活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニルアルファメチルアルファトルエンSMPTPierceで05重量修飾し、続くsiRNAの結合のためのチオール反応性基を提供した。次いで、チオール反応性ポリマーを60mgmLHEPES塩基中で5mgmLに希釈した。この溶液に10mgmLの様々な記載の酵素切断可能なマスキング試薬を加えた。この量はポリマーアミン1に対しマスキング剤2のモル比であった。ポリマー修飾反応のために、ポリマーアミンのマスキング試薬に対する好ましいモル比は1:1から1:5である。より好ましい比は1:2から1:4である。より好ましい比は1:2である。1時間後、酢酸エステル保護チオール内因性齧歯類第VII因子siRNAポリマーに対し01から02重量当量をポリマー溶液に加えた。終夜インキュベートした後、無水マレイン酸のNアセチルガラクトサミン誘導体NAGCDM;表5を加えることにより、結合体をさらに修飾した。NAGCDMを25mgmLまで加え、30分から4時間インキュベートした。NAGCDMポリマー修飾のために、NAGCDMを氷酢酸の01水溶液から凍結乾燥した。乾燥したNAGCDMにポリマーの溶液を加えた。無水物を完全に溶解した後、動物に投与する前に溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。dNAGCDMのポリマーとの反応により下記を得た:式中、Rはポリマーであり、R1はASGPrリガンド例えば、Nアセチルガラクトサミンを含む。表5に示すとおり、第VII因子発現はジペプチド剤でマスクしたDPCで処置した動物では49~85低減した。表5PEGAApニトロフェニルカルバマートNAGCDMDPCで処置したマウスにおけるインビボでの第VII因子のノックダウンa動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmgb未処置対照に対して実施例6NAGPEGAApニトロフェニルカルバマートポリDPCを用いてのsiRNAのインビボ送達APEGプラスNAG修飾100mMのpH75HEPES緩衝液中のポリアクリラートAnt41658111をPierceからの活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニルアルファメチルアルファトルエンSMPTで05重量修飾した。チオール反応性ポリマーを60mgmLHEPES塩基中で5mgmLに希釈した。この溶液に10mgmLの様々なPEGAApニトロフェニルカルボナートマスキング試薬を加えた。1時間後、酢酸エステル保護チオール第VII因子siRNAをポリマー溶液に、ポリマーのsiRNAに対する比=5~10:1の範囲で加えた。終夜インキュベートした後、NAGAApニトロフェニルカルボナートマスキング試薬を40mgmLまで加えた。少なくとも30分であるが、4時間を超えない時間インキュベートした後、DPCを20gのICRマウスの尾静脈に注入した。注入の48時間後、血清の試料を採取し、fVIIのレベルを測定した。BNAG単独での修飾100mMのpH75HEPES緩衝液中のポリアクリラートANT41658111をPierceからの活性化ジスルフィド試薬のスクシンイミジルオキシカルボニルアルファメチルアルファトルエンSMPTで05重量修飾した。チオール反応性ポリマーを60mgmLHEPES塩基中で5mgmLに希釈した。酢酸エステル保護チオールsiRNA第VII因子をポリマー溶液に、ポリマーのsiRNAに対する比=5~10:1の範囲で加えた。終夜インキュベートした後、NAGAApニトロフェニルカルボナートマスキング試薬を50mgmLまで加えた。少なくとも30分であるが、4時間を超えない時間インキュベートした後、ポリマー結合siRNAを20gのICRマウスの尾静脈に注入した。注入の48時間後、血清の試料を採取し、fVIIのレベルを測定した。表6PEGNAGAApニトロフェニルカルバマートDPCで処置したマウスにおけるインビボでの第VII因子のノックダウンa動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmgb未処置対照に対してc重量当量実施例7NAGPEGAApニトロフェニルカルバマートポリDPCを用いてのsiRNAのインビボ送達両親媒性膜活性ポリポリアミンDW1360を10×重量当量のジペプチド切断可能マスキング剤で、ポリマー修飾中にマスキング剤が保護基を保持している以外はポリアクリラートAnt41658111について記載したとおりに修飾した。ポリマー修飾後、アミノ酸保護基をTFAにより除去し、NAG酢酸エステル保護基を30体積トリエチルアミン、50メタノールおよび20水の溶液存在下でのインキュベーションにより除去した。酢酸エステル脱保護溶液をロータリーエバポレーションにより除去した。マスクしたポリマーをマウスにコレステロールApoBsiRNA結合体と同時注入した。表7NAGAApニトロフェニルカルバマートポリおよびコレステロールApoBsiRNA結合体を同時注入したマウスにおけるインビボでのApoBのノックダウンa動物体重1kgあたりのポリマーまたはsiRNAのmgb未処置対照に対して実施例8マウスにおけるインビボでのメリチン送達ペプチドによるApoBsiRNA送達後の内因性ApoBレベルのノックダウン、酵素的に切断可能なマスキング剤メリチンを前述のとおり示した量の酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に修飾した。次いで、200~300μgのマスクしたメリチンを50~100μgのApoBsiRNAコレステロール結合体と同時注入した。ApoBレベルへの影響を前述のとおりに判定した。ペプチダーゼ切断可能なジペプチドアミドベンジルカルバマートで修飾したメリチンは有効なsiRNA送達ペプチドであった。D型メリチンペチドの酵素的に切断可能なマスキング剤と組み合わせての使用が好ましい。ペプチドマスキングはより安定であったため、同じレベルの標的遺伝子ノックダウンにはより多くのペプチドが必要とされるが、治療指数は変化または改善のいずれもしなかったCDMNAGによる同じペプチドのマスキングに比べて。表8第VII因子siRNAコレステロール結合体および示した酵素的に切断可能なマスキング剤で可逆的に阻害したGILメリチンD型SeqID25によって処置したマウスにおける正常な肝細胞中の第VII因子活性の阻害aマスキング反応において用いたメリチンアミンあたりのマスキング剤の量。実施例9プロテアーゼ切断可能なDPCによる腫瘍標的指向A標的遺伝子ノックダウン測定以下に示すすべての試験について、Aha1遺伝子転写物に特異的なsiRNA、標的遺伝子。高感度緑色蛍光タンパク質EGFPに対するsiRNAをオフターゲット対照として用いた。Aha1siRNAはヒトおよびマウス遺伝子の両方において100相同であるAha1の配列モティーフに相補的であった。したがって、Aha1siRNAのヒト異種移植片における宿主の細胞または腫瘍細胞のいずれかへの送達はmRNA切断および分解を引き起こす。マウスおよびヒトAha1遺伝子で異なる配列モティーフを用いて、細胞型の混合集団を含む組織試料中のヒトAha1およびマウスAha1mRNAレベルの両方の定量的測定を可能にするPCRプライマーを設計した。siRNA送達後24、48または72時間の時点で、いくらかの健常マウス肝組織が付着した腫瘍を採取し、全RNA単離のためにTriReagentInvitrogen中で処理した。次いで、ヒトおよびマウスAha1mRNAレベルの両方をqPCR検定により、内部参照遺伝子としてヒトCycAおよびマウスβアクチンを用いて測定した。模擬注入した動物、またはオフターゲット対照GFPsiRNAを注入したマウスからの動物におけるAha1mRNAレベルを100と考えた。結果は対照に対するAha1mRNAレベルのパーセントで表し、以下の表に示す。B正所性肝細胞癌HCC腫瘍モデルマウスHegG2、Hep3B、またはHuH7細胞肝細胞癌に2つの発現ベクター、pMIR85ヒト胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼSEAPベクターおよびpMIR3ネオマイシンカナマイシン耐性遺伝子ベクターを同時形質移入して、安定にSEAPを発現する細胞株を生じた。細胞を、10FBSおよび300ugmlG418を補足したDMEM中で培養し、回収し、計数し、マトリゲルBDBiosciences50体積と混合した。無胸腺ヌードマウスまたはScidベージュマウスを約3イソフルランで麻酔し、胸骨臥位で置いた。剣状突起のすぐ下で小さい1~2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり退縮させ、シリンジ針を左葉の真ん中に挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜のすぐ下約05cmに挿入した。細胞100000個を含む細胞マトリゲル混合物10μlをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針を肝臓内にしばらく15~20秒間挿入したままにして、確実に注入を完了した。SEAPHepG2細胞を無胸腺ヌードマウスに注入した。SEAPHep3BおよびSEAPHuH7細胞をScidベージュマウスに注入した。次いで、シリンジを肝臓からの針から除去し、綿棒を細胞の漏出または出血を防ぐために注入部位上に置いた。マトリゲル細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉をゆっくり腹部に戻し、腹壁を縫合した。腫瘍植え込み後、1週間に1回血清を採取し、SEAP検定にかけて腫瘍成長をモニターした。ほとんどの試験で、腫瘍測定値がSEAP値に基づき約4~8mmと推定される、移植の4~5週間後に腫瘍マウスを用いた。C結腸直腸転移腫瘍モデルHT29細胞を10FBSを補足したMcCoys5a培地中で培養し、回収し、計数し、マトリゲルBDBiosciences50体積と混合した。無胸腺ヌードマウスを約3イソフルランで麻酔し、胸骨臥位で置いた。剣状突起のすぐ下で小さい1~2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝左葉をゆっくり体外に出した。肝左葉をゆっくり退縮させ、シリンジ針を左葉の真ん中に挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜のすぐ下約05cmに挿入した。細胞約40000個を含む細胞マトリゲル混合物5μlをシリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針を肝臓内にしばらく15~20秒間挿入したままにして、確実に注入を完了した。次いで、シリンジを肝臓から除去し、綿棒を細胞の漏出または出血を防ぐために注入部位上に置いた。マトリゲル細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の除去後も消失しなかった。次いで、肝葉をゆっくり腹部に戻し、腹壁を縫合した。移植の4~5週間後に腫瘍マウスを用いた。実施例10HepG2SEAP正所性肝細胞癌HCCモデルにおけるPEG24ValCitDPC投与後のインビボでの標的遺伝子発現のノックダウン前述のとおり、2011062805Ant1291ポリマーDPCを18×重量過剰のPEG24PheCitマスキング剤またはPEG24ValCitマスキング剤または7×PEG550CDMのいずれかで修飾マスクした。前述のとおり、Aha1siRNARD09070またはGFPsiRNARD05814;オフターゲット対照をポリマーに結合した4:1の重量比。DPCを送達前にゲルろ過で精製せず、標的指向リガンドを加えなかった。動物ごとに等張グルコース200μl中のDPC結合体320μgポリマー重量を尾静脈注入により投与した群ごとにn=3。24時間後、等張グルコース200μl中のDPC結合体320μgポリマー重量の二回目の注入を動物に投与した。二回目の注入の48時間後、血清試料を採取して、肝酵素ALTおよびASTおよび血中尿素窒素BUNレベルを測定することにより毒性を評価し、続いて組織を採取し、qPCR分析を行った。Aha1siRNAを送達するためにPEG24ValCitAnt1291siRNADPCを用いることで、ヒト腫瘍細胞におけるAha1遺伝子の46ノックダウンを引き起こした表9。ヒトAha1ノックダウンレベルとは対照的に、マウスAha1はPEG24ValCitAnt1291siRNADPC投与に反応して70のノックダウンを示した表1。二置換無水マレイン酸マスキング剤PEG550CDMで作成した類似のDPCに比べて、内因性肝実質細胞Aha1ノックダウンは低減した。ALT、ASTおよびBUNレベルにより示されるとおり、PEG24ValCitDPCはよく耐容され、毒性を示さなかった表。表9無水マレイン酸修飾またはペプチド切断可能修飾Aha1siRNADPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン表10無水マレイン酸修飾またはペプチド切断可能修飾Aha1siRNADPC投与後の血液化学毒性マーカー実施例11二重特異性抗体bsAb標的指向DPC2011090701による標的遺伝子発現のノックダウン前述のとおり、Ant1291ポリマーを5×DigPheCitDigFCitマスキング剤で修飾した。次いで、siRNAを結合体に結合した。最後に、DigFCitAnt1291siRNA結合体を8×重量PEG12FCitでさらに修飾した。Aha1siRNARD09070またはGFPsiRNARD05814を4:1のポリマー:siRNA重量比で結合した。PEG12FCitDPCをSephadexG50スピンカラムで精製して、未結合の試薬を除去した。ヘパラン硫酸プロテオグリカングリピカン3GPC3、すなわちHepG2SEAP細胞で高度に発現されることが公知の細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびジゴキシゲニンDigに特異的な、細胞標的指向二重特異性抗体bsAbを作成した。対照として、タンパク質CD33骨髄由来造血幹細胞のマーカーおよびDigに特異的な二重特異性抗体を作成した。CD33はHepG2SEAP細胞によって発現されない。BsAbを修飾DPCと、推定1:1のモル比を提供するために125:1の重量比で複合体形成した。送達前に複合体をPBS中、少なくとも30分間形成した。DPCをHepG2SEAP腫瘍担持マウスに、bsAb標的指向剤と共に、またはbsAb標的指向剤なしのいずれかで投与した。各動物群ごとにn=3にDPC250μgポリマー重量の1回用量を投与した。DPCは200μlの滅菌PBS中でマウスの尾静脈に注入した。血清および組織試料を48時間後に採取し、前述のとおりに分析した。表11に示すとおり、bsAb標的指向DPCの1回用量250μgポリマー、625μgsiRNAは21~32の標的遺伝子ノックダウンを引き起こした。表11二重特異性抗体を用いてのペプチド切断可能マスキング剤修飾Aha1siRNADPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン実施例12二重特異性抗体bsAb標的指向DPCによる標的遺伝子発現のノックダウンDPCを、aPEG12FCitの代わりにPEG24FCitを用い、かつbDigPEG12NHSを用いてDigをポリマーに結合したこと以外は、前述のとおりに調製した。PEG24FCitDPCはPEG12FCitDPCよりも凝集が少なく、その大きさがより小さく、より均質であった。連結が不安定でないことに加えて、DigPEG12NHSはより長いPEGも含んでいた。DPCはbsAbとの複合体であり、動物に前述のとおりに注入した。血清および組織採取を注入の24時間後または48時間後のいずれかに行った。表12に示すとおり、DPCの1回用量250μgポリマー重量は、注入の24時間後に46~56のヒトAha1ノックダウンを引き起こした。表12PEG長が長いペプチド切断可能マスキング剤を用いて修飾したAha1siRNADPCによるHepG2肝腫瘍モデルにおけるAha1ノックダウン実施例13bsAb標的指向DPCによるヒト結腸直腸腺癌転移肝腫瘍組織へのDPCの標的指向Ant1291ポリマーを5×モル過剰のDigPEG12NHSおよび8×重量過剰のPEG24FCitで修飾した。Aha1siRNAまたはGFPsiRNAを修飾ポリマーに4:1のポリマー:siRNA重量比で結合した。DPCをSephadexG50スピンカラムで精製して、未結合の試薬を除去した。注入前に、DigDPCを滅菌PBS中、等モル量のIGF1RDigbsAbもしくはCD33DigbsAbと、またはbsAbなしで、少なくとも30分間複合体形成した。HT29腫瘍細胞ヒト結腸直腸腺癌;ATCC番号HTB38を含む動物にDPCを注入した。HT29細胞はインスリン様成長因子1受容体タンパク質IGF1Rを過剰発現し、IGF1RDig二重特異性抗体に結合し、これを内部に取り入れることができる。動物n=3にDPC320μgポリマー重量を投与した。24時間後に注入を繰り返した。血清および組織試料を2回目の投与の48時間後に採取した。腫瘍細胞におけるヒトAha1のノックダウンは26~38であった表13。CDMDPCに比べて、FCitDPCは低いオフターゲット肝Aha1ノックダウンを示した78~83に対して24~36。FCitDPCはCDMDPCに比べて肝蓄積の低減も示した。表13ジペプチド切断可能Aha1siRNADPCによるHT29結腸直腸腺癌転移肝腫瘍におけるAha1ノックダウン実施例14肝腫瘍における内因性Aha1のインビボでのノックダウン400μgのLau41648106を8×重量PEG12ValCitまたは16×PEG24PheCitで修飾した。100μgのAha1siRNAまたは100μgのEg5対照siRNAを、前述のとおり、修飾ポリマーに結合した。Hep3BSEAP腫瘍細胞を含む動物にDPCを注入した。血清および組織試料を注入の48時間後に採取した。腫瘍細胞におけるヒトAha1ノックダウンは26~38であった。表14ジペプチド切断可能Aha1siRNADPCによるHep3BSEAP肝腫瘍におけるAha1ノックダウン実施例15マスクしたポリマーのインビボでの循環および組織標的指向Lau24ABポリアクリラート100μgを50mMHEPESpH80緩衝液中、125IボールトンハンターBH試薬50μCiにより、室温で1時間処理した。標識ポリマーを2mlの水中SephadexQEAスピンカラムで精製した。標識ポリマーの溶液を4°Cで保存した。200gのラット1匹あたり約1mgの02μCiを有するポリマーを注入するために、非標識ポリマーに125I標識ポリマーを補足した。標識および非標識ポリマーの混合物約35匹の動物に対して計算をPEG24FCitまたはPEGCDMで前述のとおりに修飾した2mgmlポリアクリラート、14mgmlPEGCDM試薬、14mgmlNAGPEGCDM試薬、16mgmlPEG24FCit試薬。インキュベーション時間1時間。次いで、反応混合物を等張グルコースで希釈して、1mlの量の動物ごとの注入用量を得た。3匹群に注入した。所与の時間に動物から採血した01~02ml。試料中のポリマーの量をガンマ計数器で計数することにより求めた。図4に示すとおり、プロテアーゼ切断可能なマスキング剤で修飾したポリマーはpHに不安定な無水マレイン酸マスキング剤でマスクしたポリマーよりも排出が遅かった。循環時間の延長は非肝組織への標的指向のために有益である。実施例16両親媒性膜活性ポリマーの合成AポリiNBocエチルエトキシアクリラートおよびメタクリル酸プロピルのRAFT共重合:式中:Aはboc保護エチルエトキシアミノアクリラートでありBはメタクリル酸プロピルでありCはRAFT剤CPCPA4シアノ4ペンタン酸でありかつnおよびmは整数である。合成後のboc保護基の除去によりアミンモノマーを生じる。他の膜活性ポリマーのために、Aはbe保護beprotectedエチル、プロピル、またはブチルアミノアクリラートでありうる。Bは疎水性がより高い炭素原子10~24個、C18を示すアクリラート、疎水性がより低い炭素原子1~6個、C4を示すアクリラート、または疎水性がより低いアクリラートとより高いアクリラートとの組み合わせでありうる。アミンアクリラートC3メタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーおよびRAFT剤を秤量し、酢酸ブチル中に示した比率で加えた。AIBNアゾビスイソブチロニトリルを加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を80°Cの油浴中に15時間置いた。次いで、ポリマーをヘキサンで沈澱させ、DCMヘキサン溶媒系を用いてさらに分別沈澱させた下記参照。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーを酢酸中2MHCl7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を35kDaMWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜透析し、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。Ant41658111のためのモノマー合成22アゾビスAIBN、ラジカル開始剤、4シアノ4ペンタン酸CPCPA、RAFT剤および酢酸ブチルはSigmaAldrichから購入した。メタクリル酸プロピルモノマーAlfaAesarはろ過して阻害剤を除去した。撹拌子を入れた2Lの丸底フラスコ中、2エタノール211g、2029mmol、SigmaAldrichを350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lのフラスコ中、BOC無水物366g、1691mmolを660mLのジクロロメタンに溶解した。2Lの丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、BOC無水物溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2Lの分液漏斗中、生成物を10クエン酸、10K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各300mlで洗浄した。生成物のBOC保護2エタノールをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。撹拌子を入れ、アルゴンを流した、500mlの丸底フラスコ中、BOC保護2エタノール27836g、1358mmolと、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン355ml、2037mmolを加え、系をドライアイスアセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル121ml、1494mmolを10mlのジクロロメタンで希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10クエン酸、10K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOCアミノエチルエトキシアクリラートBAEEAをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションで蒸発させた。生成物を、直径75cmカラムを用い、29cmのシリカによるカラムクロマトグラフィで精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30酢酸エチルであった。Rf:030。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。BAEEAを収率74で得た。BAEEAをフリーザーに保存した。ポリマーAnt41658111:酢酸ブチル中のAIBN100mgmLおよびRAFT剤4シアノ4ペンタン酸CPCPA、100mgmLの溶液を調製した。モノマーのモル供給比は75BAEEA:25メタクリル酸プロピルCAS2210288ならびに0108CPCPARAFT剤および0016AIBN触媒合計000562molであった。BAEEA109g、421mmolA、メタクリル酸プロピル0180g、141mmolB、CPCPA溶液0170ml、000609mmolC、AIBN溶液0150ml、0000915mmol、および酢酸ブチル568mlを、撹拌子を入れた20mlのガラスバイアルに加えた。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジ針と出口としての第二の短いシリンジ針を用いて、溶液に窒素を1時間通気した。シリンジ針を除去し、系を油浴を用いて80°Cで15時間加熱した。溶液を室温まで戻し、50mlの遠沈管に移した後、ヘキサン1プロパノールTCI1358mmolと、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン2037mmolを加え、系をドライアイスアセトン浴中に置いた。塩化アクリロイル1494mmolを10mlのジクロロメタンで希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10クエン酸、10K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOCアミノプロピルアクリラートBAPAをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションで蒸発させた。生成物を、直径75cmカラムを用い、29cmのシリカによるカラムクロマトグラフィで精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30酢酸エチルであった。Rf:030。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。BAPAを収率74で得た。BAPAをフリーザーに保存した。ivNBocエチルエトキシアクリラートおよびメタクリル酸プロピルのランダム共重合。アミンアクリラートCnメタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーを秤量し、ジオキサン中に示した比率で加えた。AIBNアゾビスイソブチロニトリルを加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を60°Cの油浴中に3時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーをGPCで精製した。その後、ポリマーを酢酸中2MHCl7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を35kDaMWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜透析し、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。ポリマーLau41648106モノマーのモル供給比は80BAEEA:20メタクリル酸プロピルCAS2210288およびモノマーの合計モルに基づき3のAIBN触媒であった。BAEEA653g、252mmolA、メタクリル酸プロピル0808g、63mmolB、AIBN0155g、0945mmol、およびジオキサン345mlを、撹拌子を入れた50mlのガラスチューブに加えた。化合物AおよびBは実施例16Aiで前述したとおりに調製した。反応は三つ組で計画した。各溶液に長いピペットを用いて窒素を1時間通気した。ピペットを除去し、各チューブに注意深く栓をした。次いで、各溶液を油浴を用いて60°Cで3時間加熱した。各溶液を室温まで戻し、丸底中で混合した。粗製ポリマーを減圧下で乾燥した。MALSで得た分子量:55000PDI21;H1NMRで得たポリマー組成:アミンアルキル=74:26。GPC分別乾燥した粗製ポリマーを75ジクロロメタン、25テトラヒドロフラン、および02トリエチルアミン中、50mgmlで溶解した。次いで、ポリマーをJordiGelDVB104Å-500mm22mmカラムで、流速5ml分および注入10mlを用いて分別した。前半の分画を15~17分で回収し、後半の分画を17~19分で回収した。分画15~17:Mw138000PDI11;分画17~19:Mw64000PDI12。MALS分析約10mgのポリマーを05mLの898ジクロロメタン、10テトラヒドロフラン、02トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性PDIを、ShimadzuProminenceHPLCに接続したWyattHelosII多角光分散検出器により、Jordi5μ78×300MixedBedLSDVBカラムを用いて測定した。粗製ポリマー:MW:55000PDI21、分画15~17:MW138000PDI:11、分画17~19:MW64000PDI12精製したBOC保護ポリマーを酢酸中2MHCl7mlと05時間反応させてBOC保護基を除去し、アミンを生じた。15mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を凍結乾燥し、次いででDIH2Oに20mgmlの濃度で溶解した。ポリマー溶液を2~8°Cで保存した。v水溶性、両親媒性、膜活性ポリポリアミンターポリマーの合成Xmolアミン保護ビニルエーテル例えば、2ビニルオキシエチルフタルイミドを、乾燥器で乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン中に窒素雰囲気下で加える。この溶液に、Ymolの低級疎水性基例えば、プロピル、ブチルビニルエーテルおよび任意にZmolの高級疎水性基例えば、ドデシル、オクタデシルビニルエーテルを加える図1。溶液を50から78°Cの浴に入れ、2ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10molBF32を加え、反応を50から78°Cで2~3時間進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで14ジオキサンメタノール21に加える。フタルイミドに対して20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を05molLのHClに溶解し、15分間還流して、ポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温RTまで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することができる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光分散によるサイズ排除クロマトグラフィSECMALSを含む、標準の手順に従ってのカラムを用いて推定する。ポリマーDW1360アミンブチルオクタデシルポリターポリマーを、2ビニルオキシエチルフタルイミド5g、2302mmol、ブチルビニルエーテル0665g、658mmol、およびオクタデシルビニルエーテル0488g、164mmolモノマーから合成した。2ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む200mLの乾燥器で乾燥した丸底フラスコの無水ジクロロメタン36mL中に窒素雰囲気下で加えた。この溶液に、ブチルビニルエーテルおよびnオクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温RTで完全に溶解して、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ドライアイスをACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1:1溶液に加えることにより生成した50°Cの浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を生成させた。約15分間冷却した後、BF320058g、0411mmolを加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。反応を50°Cで3時間進行させた。メタノール中の1水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。次いで、ポリマーを30mLの14ジオキサンメタノール21に溶解した。この溶液にヒドラジン0147g、46mmolを加え、混合物を3時間加熱還流した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、次いで、得られた固体を20mLの05molLHClに加えて15分間還流し、20mLの蒸留水で希釈し、さらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、室温まで冷却し、分子量3500のセルロースチューブに移し、蒸留水に対して24時間2×20L透析し、凍結乾燥した。Bメリチンすべてのメリチンペプチドを、当技術分野において標準のペプチド合成技術を用いて作成した。適切なメリチンペプチドは全L型アミノ酸、全D型アミノ酸インベルソでありうる。LまたはD型とは独立に、メリチンペプチド配列を反転することができるレトロ。