"抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、中性pH条件下においてヒトFcRnに対する結合活性を有する抗原結合分子。低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、請求項1に記載の抗原結合分子。高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、請求項1に記載の抗原結合分子。低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項1または2に記載の抗原結合分子。高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項1または3に記載の抗原結合分子。前記FcRn結合ドメインがFc領域である、請求項1~5のいずれか一項に記載の抗原結合分子。更に、酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗原結合分子。少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、請求項7に記載の抗原結合分子。膜抗原又は可溶型抗原に結合することを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗原結合分子。抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗原結合分子。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、抗原結合ドメインに含まれる軽鎖または重鎖にヒト抗体由来のカルシウム結合モチーフが含まれる抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの軽鎖CDR1、CDR2およびまたはCDR3に含まれる、請求項11に記載の抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位およびまたは32位に含まれる、請求項12に記載の抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれる、請求項12または13に記載の抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれる、請求項12~14のいずれか一項に記載の抗原結合分子。抗原結合分子がIgA、またはヒトグリピカン3のいずれかである、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの重鎖CDR1、CDR2およびまたはCDR3に含まれる、請求項11に記載の抗原結合分子。カルシウム結合モチーフが重鎖CDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位、およびまたは101位に含まれる、請求項16に記載の抗原結合分子。抗原結合分子がIL6R、またはIL6のいずれかである、請求項17または18に記載の抗原結合分子。pH中性域の条件下でのFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインを含む、請求項11~19のいずれか一項に記載の抗原結合分子。前記FcRn結合ドメインがFc領域である、請求項20に記載の抗原結合分子。前記Fc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、および436のいずれかひとつ以上のアミノ酸が天然型Fc領域のアミノ酸と異なるFc領域である、請求項1~10、20または21のいずれか一項に記載の抗原結合分子。前記Fc領域のEUナンバリングで表されるアミノ酸であって;237位のアミノ酸がMet、248位のアミノ酸がIle、250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyr、254位のアミノ酸がThr、255位のアミノ酸がGlu、256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGln、257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、258位のアミノ酸がHis、265位のアミノ酸がAla、286位のアミノ酸がAlaまたはGlu、289位のアミノ酸がHis、297位のアミノ酸がAla、303位のアミノ酸がAla、305位のアミノ酸がAla、307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、311位のアミノ酸がAla、His、またはIle、312位のアミノ酸がAlaまたはHis、314位のアミノ酸がLysまたはArg、315位のアミノ酸がAla、AspまたはHis、317位のアミノ酸がAla、332位のアミノ酸がVal、334位のアミノ酸がLeu、360位のアミノ酸がHis、376位のアミノ酸がAla、380位のアミノ酸がAla、382位のアミノ酸がAla、384位のアミノ酸がAla、385位のアミノ酸がAspまたはHis、386位のアミノ酸がPro、387位のアミノ酸がGlu、389位のアミノ酸がAlaまたはSer、424位のアミノ酸がAla、428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、433位のアミノ酸がLys、434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、もしくは436位のアミノ酸がHis、Ile、Leu、Val、のいずれかひとつ以上の組合せである、請求項22に記載の抗原結合分子。抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、請求項1~23のいずれか一項に記載の抗原結合分子。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、中性pH条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性を付与する或いは高める工程を含む、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、酸性pH条件下における抗原結合活性を中性pH条件下における抗原結合活性よりも低下させる工程を含む、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項25~27のいずれか一項に記載の製造方法。抗原結合分子中のアミノ酸の改変が、抗原結合分子中の少なくとも1つ以上のアミノ酸をヒスチジンで置換する又は少なくとも1つのヒスチジンを挿入する改変である、請求項29に記載の製造方法。前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、請求項25~34のいずれか一項に記載の製造方法。前記抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、請求項25~35のいずれか一項に記載の製造方法。請求項1~24のいずれか一項に記載の抗原結合分子または請求項25~36のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。抗原の細胞内への取込みを促進させるために用いられる医薬組成物である、請求項37に記載の医薬組成物。血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物である、請求項37に記載の医薬組成物。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を含む、抗原の細胞内への取込み、または血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物。低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、請求項40に記載の医薬組成物。高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、請求項40に記載の医薬組成物。低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項40または41に記載の医薬組成物。高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項40または42に記載の医薬組成物。前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である請求項40~44のいずれか一項に記載の医薬組成物。更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、請求項40~45のいずれか一項に記載の医薬組成物。前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、請求項46に記載の医薬組成物。前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、請求項40~47のいずれか一項に記載の医薬組成物。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程。以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、請求項49~51のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、請求項49~51のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項49~52のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項49~51または53のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、請求項49~55のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、請求項49~56のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。請求項1~24のいずれか一項に記載の抗原結合分子または請求項25~36のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。請求項1~24のいずれか一項に記載の抗原結合分子または請求項25~36のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。請求項1~24のいずれか一項に記載の抗原結合分子または請求項25~36のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。請求項1~24のいずれか一項に記載の抗原結合分子または請求項25~36のいずれか一項に記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。前記低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、請求項62~65のいずれか一項に記載の方法。高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、請求項62~65のいずれか一項に記載の方法。低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、請求項62~66のいずれか一項に記載の方法。高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、請求項62~65または67のいずれか一項に記載の方法。前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である請求項62~69のいずれか一項に記載の方法。更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、請求項62~70のいずれか一項に記載の方法。前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、請求項71に記載の方法。前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、請求項62~72のいずれか一項に記載の方法。前記抗原結合分子が抗体である、請求項62~73のいずれか一項に記載の方法。本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、抗原結合分子により抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子により抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法、抗原の細胞内への取込みが促進された抗原結合分子、抗原への結合回数が増加した抗原結合分子、投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させることができる抗原結合分子、血漿中滞留性が改善された抗原結合分子、当該抗原結合分子を含む医薬組成物、およびそれらの製造方法を提供することにある。本発明者らは、抗原結合分子抗原結合能を有するポリペプチドなどの分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法について鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、血漿中と早期エンドソーム内におけるカルシウム濃度の差異に着目し、カルシウム依存性を示す抗原抗体反応を有する抗原結合分子を用いることで、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させうること、抗原結合分子が抗原に複数回結合することにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させうること、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させうること、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善しうることを見出した。すなわち本発明は、カルシウム依存性を示す抗原抗体反応を有する抗原結合分子により、抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子により抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善させる方法、抗原の細胞内への取込みが促進された抗原結合分子、抗原への結合回数が増加した抗原結合分子、その投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させることができる抗原結合分子、血漿中滞留性が改善された抗原結合分子、当該抗原結合分子を含む医薬組成物、およびそれらの製造方法などに関し、より具体的には、以下に関する。1抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、中性pH条件下においてヒトFcRnに対する結合活性を有する抗原結合分子。2低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、1に記載の抗原結合分子。3高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、1に記載の抗原結合分子。4低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、1または2に記載の抗原結合分子。5高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、1または3に記載の抗原結合分子。6前記FcRn結合ドメインがFc領域である、1~5のいずれかに記載の抗原結合分子。7更に、酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、1~6のいずれかに記載の抗原結合分子。8少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、7に記載の抗原結合分子。9膜抗原又は可溶型抗原に結合することを特徴とする、1~8のいずれかに記載の抗原結合分子。10抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、1~9のいずれかに記載の抗原結合分子。11抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低く、抗原結合ドメインに含まれる軽鎖または重鎖にヒト抗体由来のカルシウム結合モチーフが含まれる抗原結合分子。12カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの軽鎖CDR1、CDR2およびまたはCDR3に含まれる、11に記載の抗原結合分子。13カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位およびまたは32位に含まれる、12に記載の抗原結合分子。14カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれる、12または13に記載の抗原結合分子。15カルシウム結合モチーフが軽鎖CDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれる、12~14のいずれかに記載の抗原結合分子。16抗原結合分子がIgA、またはヒトグリピカン3のいずれかである、12~15のいずれかに記載の抗原結合分子。17カルシウム結合モチーフが抗原結合ドメインの重鎖CDR1、CDR2およびまたはCDR3に含まれる、11に記載の抗原結合分子。18カルシウム結合モチーフが重鎖CDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位、およびまたは101位に含まれる、16に記載の抗原結合分子。19抗原結合分子がIL6R、またはIL6のいずれかである、17または18に記載の抗原結合分子。20pH中性域の条件下でのFcRnに対する結合活性を有するFcRn結合ドメインを含む、11~19のいずれかに記載の抗原結合分子。21前記FcRn結合ドメインがFc領域である、20に記載の抗原結合分子。22前記Fc領域のアミノ酸配列のうち、EUナンバリングで表される248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、および436のいずれかひとつ以上のアミノ酸が天然型Fc領域のアミノ酸と異なるFc領域である、1~10、20または21のいずれかに記載の抗原結合分子。23前記Fc領域のEUナンバリングで表されるアミノ酸であって;237位のアミノ酸がMet、248位のアミノ酸がIle、250位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、252位のアミノ酸がPhe、Trp、またはTyr、254位のアミノ酸がThr、255位のアミノ酸がGlu、256位のアミノ酸がAsp、Glu、またはGln、257位のアミノ酸がAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、258位のアミノ酸がHis、265位のアミノ酸がAla、286位のアミノ酸がAlaまたはGlu、289位のアミノ酸がHis、297位のアミノ酸がAla、303位のアミノ酸がAla、305位のアミノ酸がAla、307位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、308位のアミノ酸がAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、309位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、311位のアミノ酸がAla、His、またはIle、312位のアミノ酸がAlaまたはHis、314位のアミノ酸がLysまたはArg、315位のアミノ酸がAla、AspまたはHis、317位のアミノ酸がAla、332位のアミノ酸がVal、334位のアミノ酸がLeu、360位のアミノ酸がHis、376位のアミノ酸がAla、380位のアミノ酸がAla、382位のアミノ酸がAla、384位のアミノ酸がAla、385位のアミノ酸がAspまたはHis、386位のアミノ酸がPro、387位のアミノ酸がGlu、389位のアミノ酸がAlaまたはSer、424位のアミノ酸がAla、428位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、433位のアミノ酸がLys、434位のアミノ酸がAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、もしくは436位のアミノ酸がHis、Ile、Leu、Val、のいずれかひとつ以上の組合せである、22に記載の抗原結合分子。24抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、1~23のいずれかに記載の抗原結合分子。25以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。26以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を製造する工程。27以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。28さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、中性pH条件下におけるヒトFcRnに対する結合活性を付与する或いは高める工程を含む、25~27のいずれかに記載の製造方法。29さらに、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、酸性pH条件下における抗原結合活性を中性pH条件下における抗原結合活性よりも低下させる工程を含む、25~27のいずれかに記載の製造方法。30低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、25~27のいずれかに記載の製造方法。31高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、25~27のいずれかに記載の製造方法。32低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、25~27のいずれかに記載の製造方法。33高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、25~27のいずれかに記載の製造方法。34抗原結合分子中のアミノ酸の改変が、抗原結合分子中の少なくとも1つ以上のアミノ酸をヒスチジンで置換する又は少なくとも1つのヒスチジンを挿入する改変である、29に記載の製造方法。35前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、25~34のいずれかに記載の製造方法。36前記抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、25~35のいずれかに記載の製造方法。371~24のいずれかに記載の抗原結合分子または25~36のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。38抗原の細胞内への取込みを促進させるために用いられる医薬組成物である、37に記載の医薬組成物。39血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物である、37に記載の医薬組成物。40抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を含む、抗原の細胞内への取込み、または血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物。41低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、40に記載の医薬組成物。42高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、40に記載の医薬組成物。43低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、40または41に記載の医薬組成物。44高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、40または42に記載の医薬組成物。45前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である40~44のいずれかに記載の医薬組成物。46更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、40~45のいずれかに記載の医薬組成物。47前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、請求項46に記載の医薬組成物。48前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、40~47のいずれかに記載の医薬組成物。49以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程。50以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程。51以下の工程~を含む、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、抗原に2回以上結合する機能、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及び優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。52低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、49~51のいずれかに記載のスクリーニング方法。53高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、49~51のいずれかに記載のスクリーニング方法。54低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、49~52のいずれかに記載のスクリーニング方法。55高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、49~51または53のいずれかに記載のスクリーニング方法。56前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、49~55のいずれかに記載のスクリーニング方法。57抗原結合分子が抗体であることを特徴とする、49~56のいずれかに記載のスクリーニング方法。581~24のいずれかに記載の抗原結合分子または25~36のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。591~24のいずれかに記載の抗原結合分子または25~36のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。601~24のいずれかに記載の抗原結合分子または25~36のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。611~24のいずれかに記載の抗原結合分子または25~36のいずれかに記載の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。62抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法。63抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を投与することにより、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法。64抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法。65抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを含む抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法。66前記低カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度01μM~30μMである、62~65のいずれかに記載の方法。67高カルシウム濃度がイオン化カルシウム濃度100μM~10mMである、62~66のいずれかに記載の方法。68低カルシウム濃度がエンドソーム内のイオン化カルシウム濃度である、62~67のいずれかに記載の方法。69高カルシウム濃度が血漿中のイオン化カルシウム濃度である、62~68のいずれかに記載の方法。70前記抗原結合分子に含まれるFcRn結合ドメインがFc領域である62~69のいずれかに記載の方法。71更に、前記抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性が、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い、62~70のいずれかに記載の方法。72前記抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを特徴とする、71に記載の方法。73前記抗原結合分子が結合する抗原がIL6R、IL6、IgA、ヒトグリピカン3、およびIgEからなる群から選択される抗原であることを特徴とする、62~72のいずれかに記載の方法。74前記抗原結合分子が抗体である、62~73のいずれかに記載の方法。また本発明は、本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む、本発明の方法に用いるためのキットに関する。また本発明は、本発明の抗原結合分子もしくは本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を有効成分として含有する、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込み促進剤、血漿中の抗原濃度の減少促進剤、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数増加剤、または抗原結合分子の血漿中滞留性改善剤に関する。また本発明は、本発明の抗原結合分子もしくは本発明の製造方法により製造された抗原結合分子の、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込み促進剤、血漿中の抗原濃度の減少促進剤、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数増加剤、または抗原結合分子の血漿中滞留性改善剤の製造における使用に関する。また本発明は、本発明の方法に使用するための、本発明の抗原結合分子または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子に関する。本発明によって、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子により抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法が提供された。抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みが促進されることで、抗原結合分子の投与により抗原の血漿中の抗原濃度の減少を促進させることが可能となるとともに、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善させることが可能となり、1分子の抗原結合分子により抗原への結合回数を増加させることが可能となり、invivoにおいて通常の抗原結合分子よりも優れた効果を発揮させることができる。本発明は、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、及び抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法を提供する。具体的には、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性本発明では結合能と記載する場合もあるが高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を用いることにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、及び抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法を提供する。アミノ酸本明細書において、たとえば、AlaA、LeuL、ArgR、LysK、AsnN、MetM、AspD、PheF、CysC、ProP、GlnQ、SerS、GluE、ThrT、GlyG、TrpW、HisH、TyrY、IleI、ValVと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。抗原本明細書において抗原は抗原結合ドメインが結合するエピトープを含む限りその構造は特定の構造に限定されない。別の意味では、抗原は無機物でもあり得るし有機物でもあり得るし、本発明が投与される生体にとって外来性の、または内在性のものでもあり得る。本発明の方法により薬物動態が改善された抗原結合分子が含む抗原結合ドメインが結合する抗原の例としては、例えば、受容体タンパク質膜結合型受容体、可溶型受容体や細胞表面マーカーなどの膜抗原、サイトカインなどの可溶型抗原、外来性生物にのみ存在するエピトープを含む抗原等が好適に挙げられる。抗原としては下記のような分子;17IA、41BB、4Dc、6ケトPGF1a、8イソPGF2a、8オキソdG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIAALK2、アクチビンRIBALK4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシンAddressins、アディポネクチン、ADPリボシルシクラーゼ1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK1、ALK7、アレルゲン、α1アンチキモトリプシン、α1アンチトリプシン、αシヌクレイン、αVβ1アンタゴニスト、アミニンaminin、アミリン、アミロイドβ、アミロイド免疫グロブリン重鎖可変領域、アミロイド免疫グロブリン軽鎖可変領域、アンドロゲン、ANG、アンジオテンシノーゲン、アンジオポエチンリガンド2、抗Id、アンチトロンビンIII、炭疽、APAF1、APE、APJ、アポA1、アポ血清アミロイドA、アポSAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミンArtemin、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ペプチド、心房性ナトリウム利尿ペプチドA、心房性ナトリウム利尿ペプチドB、心房性ナトリウム利尿ペプチドC、avb3インテグリン、Axl、B71、B72、B7H、BACE、BACE1、バチルスアントラシスBacillusanthracis防御抗原、Bad、BAFF、BAFFR、Bag1、BAK、Bax、BCA1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、bECGF、β2ミクログロブリン、βラクタマーゼ、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BLCAM、BLK、Bリンパ球刺激因子、BMP、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMPR、BMPRIA、BMPRIB、BMPRII、BMP、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子Bonederivedneurotrophicfactor、ウシ成長ホルモン、BPDE、BPDEDNA、BRK2、BTC、Bリンパ球細胞接着分子、C10、C1阻害因子、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a、CA125、CAD8、カドヘリン3、カルシトニン、cAMP、炭酸脱水酵素IX、癌胎児抗原、癌関連抗原carcinomaassociatedantigen、カルジオトロフィン1、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンCDPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンXZP、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1I309、CCL11エオタキシン、CCL12MCP5、CCL13MCP4、CCL14HCC1、CCL15HCC2、CCL16HCC4、CCL17TARC、CCL18PARC、CCL19ELC、CCL2MCP1、CCL20MIP3α、CCL21SLC、CCL22MDC、CCL23MPIF1、CCL24エオタキシン2、CCL25TECK、CCL26エオタキシン3、CCL27CTACK、CCL28MEC、CCL3M1P1α、CCL3LlLD78β、CCL4MIPlβ、CCL5RANTES、CCL6C10、CCL7MCP3、CCL8MCP2、CCL910MTP1γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受容体、CINC、CKb81、クローディン18、CLC、クロストリジウムボツリヌムClostridiumbotulinum毒素、クロストリジウムディフィシレClostridiumdifficile毒素、クロストリジウムパーフリンジェンスClostridiumperfringens毒素、cMet、CMV、CMVUL、CNTF、CNTN1、補体因子3、補体因子D、コルチコステロイド結合グロブリン、コロニー刺激因子1受容体、COX、CRet、CRG2、CRTH2、CT1、CTACK、CTGF、CTLA4、CX3CL1フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL、CXCL1Groα、CXCL10、CXCL11ITAC、CXCL12SDFlαβ、CXCL13BCA1、CXCL14BRAK、CXCL15ラングカインLungkine、CXCL16、CXCL16、CXCL2GroβCXCL3Groγ、CXCL3、CXCL4PF4、CXCL5ENA78、CXCL6GCP2、CXCL7NAP2、CXCL8IL8、CXCL9Mig、CXCLlOIP10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、シスタチンC、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DCSIGN、崩壊促進因子、デルタ様タンパク質Deltalikeproteinリガンド4、desIGF1、Dhh、DHICAオキシダーゼ、Dickkopf1、ジゴキシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、DK1、DNAM1、Dnase、Dpp、DPPIVCD26、Dtk、ECAD、EDA、EDAA1、EDAA2、EDAR、EGF、EGFR、EGF様ドメイン含有タンパク質7EGFlikedomaincontainingprotein7、エラスターゼ、エラスチン、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA78、エンドシアリンEndosialin、エンドセリン受容体、エンドトキシン、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン、エオタキシン2、エオタキシニeotaxini、EpCAM、エフリンB2EphB4、Epha2チロシンキナーゼ受容体、上皮増殖因子受容体、ErbB2受容体、ErbB3チロシンキナーゼ受容体、ERCC、エリスロポエチン、エリスロポエチン受容体、Eセレクチン、ET1、エクソダスExodus2、RSVのFタンパク質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcαR、FcイプシロンRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN1、フェリチン、FGF、FGF19、FGF2、FGF2受容体、FGF3、FGF8、酸性FGFFGFacidic、塩基性FGFFGFbasic、FGFR、FGFR3、フィブリン、線維芽細胞活性化タンパク質、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子10、フィブロネクチン、FL、FLIP、Flt3、FLT3リガンド、葉酸受容体、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、遊離型重鎖、遊離型軽鎖、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas6、GCP2、GCSF、GCSF、GCSF受容体、GD2、GD3、GDF、GDF1、GDF15、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、GDNF、ゲルゾリン、GFAP、GFCSF、GFRα1、GFRα2、GFRα3、GFβ1、gH外被糖タンパク質、GITR、グルカゴン、グルカゴン受容体、グルカゴン様ペプチド1受容体、Glut4、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII、糖タンパク質ホルモン受容体、糖タンパク質llbllla、グリピカン3、GMCSF、GMCSF受容体、gp130、gp140、gp72、顆粒球CSF、GROMGSA、成長ホルモン放出因子、GROβ、GROγ、ピロリ菌Hpylori、ハプテン、HBEGF、HCC、HCC1、HCMVgB外被糖タンパク質、HCMVUL、造血増殖因子Hemopoieticgrowthfactor、HepBgp120、ヘパラナーゼ、ヘパリン補因子II、肝細胞増殖因子hepaticgrowthfactor、バチルスアントラシス防御抗原、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、E型肝炎、ヘプシジン、Her1、Her2neu、Her3、Her4、単純ヘルペスウイルスgB糖タンパク質、HGF、HGFA、高分子量メラノーマ関連抗原Highmolecularweightmelanomaassociatedantigen、GP120等のHIV外被タンパク質、HIVMIBgp120V3ループ、HLA、HLADR、HM124、HMFGPEM、HMGB1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSVgD糖タンパク質、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子、ハンチンチン、HVEM、IAP、ICAM、ICAM1、ICAM3、ICE、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgA、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP、IGFR、IL、IL1、IL10、IL10受容体、IL11、IL11受容体、IL12、IL12受容体、IL13、IL13受容体、IL15、IL15受容体、IL16、IL16受容体、IL17、IL17受容体、IL18、IL18受容体、IL1α、IL1β、IL1受容体、IL2、IL2受容体、IL20、IL20受容体、IL21、IL21受容体、IL23、IL23受容体、IL2受容体、IL3、IL3受容体、IL31、IL31受容体、IL3受容体、IL4、IL4受容体、IL5、IL5受容体、IL6、IL6受容体、IL7、IL7受容体、IL8、IL8受容体、IL9、IL9受容体、免疫グロブリン免疫複合体、免疫グロブリン、INFα、INFα受容体、INFβ、INFβ受容体、INFγ、INFγ受容体、I型IFN、I型IFN受容体、インフルエンザ、インヒビン、インヒビンα、インヒビンβ、iNOS、インスリン、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インスリン様増殖因子2、インスリン様増殖因子結合タンパク質、インテグリン、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα4β1、インテグリンαVβ3、インテグリンαVβ6、インテグリンα4β7、インテグリンα5β1、インテグリンα5β3、インテグリンα5β6、インテグリンαδ、インテグリンαθ、インテグリンβ1、インテグリンβ2、インテグリンβ3、IP10、ITAC、JE、カリクレイン、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、カリスタチン、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子、ケラチノサイト増殖因子2、KGF、キラー免疫グロブリン様受容体、kitリガンド、Kitチロシンキナーゼ、ラミニン5、LAMP、LAPP、LAP、潜伏期関連ペプチド、潜在型TGF1、潜在型TGF1bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受容体、LECT2、レフティー、レプチン、黄体形成ホルモンleutinizinghormone、LewisY抗原、LewisY関連抗原、LFA1、LFA3、LFA3受容体、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、Lセレクチン、LTa、LTb、LTB4、LTBP1、肺サーファクタント、黄体形成ホルモン、リンホタクチン、リンホトキシンβ受容体、リゾスフィンゴ脂質受容体、Mac1、マクロファージCSF、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、マスピン、MCAM、MCK2、MCP、MCP1、MCP2、MCP3、MCP4、MCPI、MCSF、MDC、MDC、MDC、メグシンmegsin、Mer、METチロシンキナーゼ受容体ファミリー、メタロプロテアーゼ、膜糖タンパク質OX2、メソテリン、MGDF受容体、MGMT、MHC、微生物タンパク質microbialprotein、MIF、MIG、MIP、MIP1α、MIP1β、MIP3α、MIP3β、MIP4、MK、MMAC1、MMP、MMP1、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP2、MMP24、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、単球誘引タンパク質monocyteattractantprotein、単球コロニー阻害因子monocytecolonyinhibitoryfactor、マウスゴナドトロピン関連gonadotropinassociatedペプチド、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC16、MUC18、ムチン、ミュラー管抑制因子、Mug、MuSK、ミエリン関連糖タンパク質、骨髄前駆細胞阻害因子1、NAIP、ナノボディNanobody、NAP、NAP2、NCA90、NCAD、Nカドヘリン、NCAM、ネプリライシン、神経細胞接着分子、ニューロセルピンneroserpin、神経成長因子、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン4、ニューロトロフィン6、ニューロピリン1、ニュールツリン、NGFβ、NGFR、NKG20、Nメチオニルヒト成長ホルモン、nNOS、NO、NogoA、Nogo受容体、C型肝炎ウイルス由来の非構造タンパク質3型、NOS、Npn、NRG3、NT、NT3、NT4、NTN、OB、OGG1、オンコスタチンM、OP2、OPG、OPN、OSM、OSM受容体、骨誘導因子osteoinductivefactor、オステオポンチン、OX40L、OX40R、酸化型LDL、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、Pカドヘリン、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受容体、PDGFAA、PDGFAB、PDGFBB、PDGFD、PDK1、PECAM、PEDF、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤増殖因子、胎盤アルカリホスファターゼ、胎盤ラクトゲン、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子1、血小板増殖因子plateletgrowthfactor、plgR、PLP、異なるサイズのポリグリコール鎖polyglycolchain例えば、PEG20、PEG30、PEG40、PP14、プレカリクレイン、プリオンタンパク質、プロカルシトニン、プログラム細胞死タンパク質1、プロインスリン、プロラクチン、プロタンパク質転換酵素PC9、プロリラキシンprorelaxin、前立腺特異的膜抗原、プロテインA、プロテインC、プロテインD、プロテインS、プロテインZ、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、Pセレクチン糖タンパク質リガンド1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、リラキシン、リラキシンA鎖、リラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルスF、Ret、レチキュロンreticulon4、リウマチ因子、RLIP76、RPA2、RPK1、RSK、RSVFgp、S100、RON8、SCFKL、SCGF、スクレロスチンSclerostin、SDF1、SDF1α、SDF1β、セリンSERINE、血清アミロイドP、血清アルブミン、sFRP3、Shh、志賀様毒素II、SIGIRR、SK1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、スフィンゴシン一リン酸受容体1、ブドウ球菌のリポテイコ酸、Stat、STEAP、STEAPII、幹細胞因子、ストレプトキナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、シンデカン1、TACE、TACI、TAG72、TARC、TB、TCA3、T細胞受容体αβ、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、テネイシン、TERT、精巣PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGFα、TGFβ、TGFβ汎特異的TGFβPanSpecific、TGFβRII、TGFβRIIb、TGFβRIII、TGFβRl、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβ4、TGFβ5、TGFI、トロンビン、トロンボポエチン、胸腺間質性リンホプロテインThymicstromallymphoprotein受容体、胸腺Ck1、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、チロキシン結合グロブリン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子プロテアーゼインヒビター、組織因子タンパク質、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受容体I、TNF受容体II、TNFα、TNFβ、TNFβ2、TNFc、TNFRI、TNFRII、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、TNFRSF11A、TNFRSF11B、TNFRSF12、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、TNFRSF16、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF19L、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF22、TNFRSF25、TNFRSF26、TNFRSF3、TNFRSF4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF6B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRST23、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、TNFSF1A、TNFSF1B、TNFSF3、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFα、TNFβ、TNILI、毒性代謝産物toxicmetabolite、TP1、tPA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAILR1、TRAILR2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TGFαおよびTGFβ等のトランスフォーミング増殖因子、膜貫通型糖タンパク質NMB、トランスサイレチン、TRF、Trk、TROP2、トロホブラスト糖タンパク質、TSG、TSLP、腫瘍壊死因子、腫瘍関連抗原CA125、LewisY関連糖を示す腫瘍関連抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR1、ウロキナーゼ、VAP1、血管内皮増殖因子、バスピンvaspin、VCAM、VCAM1、VECAD、VEカドヘリン、VEカドヘリン2、VEFGR1、VEFGR2、VEGF受容体、VEGFR3、VEGI、VIM、ウイルス抗原、ビタミンB12受容体、ビトロネクチン受容体、VLA、VLA1、VLA4、VNRインテグリン、フォンヴィルブランド因子、WIF1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2SCMlβ、XCLlリンホタクチン、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81CD97CD98DDR1DKK1EREG、Hsp90IL17IL17R、IL20IL20R、酸化LDLPCSK9prekallikreinRONTMEM16F、SOD1ChromograninAChromograninB、tauVAP1、高分子キニノーゲン、IL31、IL31R、Nav11、Nav12、Nav13、Nav14、Nav15、Nav16、Nav17、Nav18、Nav19、EPCR、C1C1qC1rC1sC2C2aC2bC3C3aC3bC4C4aC4bC5C5aC5bC6C7C8C9factorBfactorDfactorHproperdin、sclerostin、fibrinogenfibrinprothrombinthrombin組織因子factorVfactorVafactorVIIfactorVIIafactorVIIIfactorVIIIafactorIXfactorIXafactorXfactorXafactorXIfactorXIafactorXIIfactorXIIafactorXIIIfactorXIIIaTFPIantithrombinIIIEPCRトロンボモデュリン、TAPItPAplasminogenplasminPAI1PAI2、GPC3、Syndecan1、Syndecan2、Syndecan3、Syndecan4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体のうち生体の体液中で細胞に係留されずに可溶型で存在する分子が例示され得る。抗原中に存在する抗原決定基を意味するエピトープは、本明細書において開示される抗原結合分子中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。よって、例えば、エピトープは、その構造によって定義され得る。また、当該エピトープを認識する抗原結合分子中の抗原に対する結合活性によっても当該エピトープが定義され得る。抗原がペプチド又はポリペプチドである場合には、エピトープを構成するアミノ酸残基によってエピトープを特定することも可能である。また、エピトープが糖鎖である場合には、特定の糖鎖構造によってエピトープを特定することも可能である。直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されたエピトープを含むエピトープである。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも3つ、および最も普通には少なくとも5つ、例えば約8ないし約10個、6ないし20個のアミノ酸が固有の配列において含まれる。立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されたエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ例えば、アミノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを規定する抗体により認識されないエピトープである。立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増大した数のアミノ酸を包含するかもしれない。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸およびまたはポリペプチド主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構造を決定する方法には、例えばX線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的なスピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば、EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology、第66巻、Morris編を参照。結合活性下記にIL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープに対する結合の確認方法が例示されるが、IL6R以外の抗原に対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子によるエピトープに対する結合の確認方法も下記の例示に準じて適宜実施され得る。例えば、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子が、IL6R分子中に存在する線状エピトープを認識することは、たとえば次のようにして確認することができる。上記の目的のためにIL6Rの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状のペプチドが合成される。当該ペプチドは、化学的に合成され得る。あるいは、IL6RのcDNA中の、細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列をコードする領域を利用して、遺伝子工学的手法により得られる。次に、細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドと、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子との結合活性が評価される。たとえば、固定化された線状ペプチドを抗原とするELISAによって、当該ペプチドに対する当該抗原結合分子の結合活性が評価され得る。あるいは、IL6R発現細胞に対する当該抗原結合分子の結合における、線状ペプチドによる阻害のレベルに基づいて、線状ペプチドに対する結合活性が明らかにされ得る。これらの試験によって、線状ペプチドに対する当該抗原結合分子の結合活性が明らかにされ得る。また、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子が立体構造エピトープを認識することは、次のようにして確認され得る。上記の目的のために、IL6Rを発現する細胞が調製される。IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子がIL6R発現細胞に接触した際に当該細胞に強く結合する一方で、当該抗原結合分子が固定化されたIL6Rの細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列からなる線状ペプチドに対して実質的に結合しないとき等が挙げられる。ここで、実質的に結合しないとは、ヒトIL6R発現細胞に対する結合活性の80以下、通常50以下、好ましくは30以下、特に好ましくは15以下の結合活性をいう。IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子のIL6R発現細胞に対する結合活性を測定する方法としては、例えば、AntibodiesALaboratoryManual記載の方法EdHarlowDavidLaneColdSpringHarborLaboratory359420が挙げられる。即ちIL6R発現細胞を抗原とするELISAやFACSfluorescenceactivatedcellsortingの原理によって評価され得る。ELISAフォーマットにおいて、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子のIL6R発現細胞に対する結合活性は、酵素反応によって生成するシグナルレベルを比較することによって定量的に評価される。すなわち、IL6R発現細胞を固定化したELISAプレートに被験ポリペプチド会合体を加え、細胞に結合した被験抗原結合分子が、被験抗原結合分子を認識する酵素標識抗体を利用して検出される。あるいはFACSにおいては、被験抗原結合分子の希釈系列を作成し、IL6R発現細胞に対する抗体結合力価titerを決定することにより、IL6R発現細胞に対する被験抗原結合分子の結合活性が比較され得る。緩衝液等に懸濁した細胞表面上に発現している抗原に対する被験抗原結合分子の結合は、フローサイトメーターによって検出することができる。フローサイトメーターとしては、例えば、次のような装置が知られている。FACSCantoTMIIFACSAriaTMFACSArrayTMFACSVantageTMSEFACSCaliburTMいずれもBDBiosciences社の商品名EPICSALTRAHyPerSortCytomicsFC500EPICSXLMCLADCEPICSXLADCCellLabQuantaCellLabQuantaSCいずれもBeckmanCoulter社の商品名例えば、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子の抗原に対する結合活性の好適な測定方法の一例として、次の方法が挙げられる。まず、IL6Rを発現する細胞と反応させた被験抗原結合分子を認識するFITC標識した二次抗体で染色する。被験抗原結合分子を適宜好適な緩衝液によって希釈することによって、当該抗原結合分子が所望の濃度に調製して用いられる。例えば、10μgmlから10ngmlまでの間のいずれかの濃度で使用され得る。次に、FACSCaliburBD社により蛍光強度と細胞数が測定される。当該細胞に対する抗体の結合量は、CELLQUESTSoftwareBD社を用いて解析することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometricMeanの値に反映される。すなわち、当該GeometricMeanの値を得ることにより、被験抗原結合分子の結合量によって表される被験抗原結合分子の結合活性が測定され得る。IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子が、ある抗原結合分子とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認され得る。抗原結合分子間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたIL6Rタンパク質が、候補となる競合抗原結合分子の存在下、または非存在下でプレインキュベートされた後に、被験抗原結合分子が添加される。ウェル中のIL6Rタンパク質に結合した被験抗原結合分子の量は、同じエピトープに対する結合に対して競合する候補となる競合抗原結合分子の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する競合抗原結合分子の親和性が大きくなればなる程、被験抗原結合分子のIL6Rタンパク質をコートしたウェルへの結合活性は低下する。IL6Rタンパク質を介してウェルに結合した被験抗原結合分子の量は、予め抗原結合分子を標識しておくことによって、容易に測定され得る。たとえば、ビオチン標識された抗原結合分子は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定される。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイは、特に競合ELISAアッセイといわれる。抗原結合分子は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識され得る。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。候補の競合抗原結合分子会合体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、競合抗原結合分子が、IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子の結合を少なくとも20、好ましくは少なくとも2050、さらに好ましくは少なくとも50ブロックできるならば、当該被験抗原結合分子は競合抗原結合分子と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープに対する結合に対して競合する抗原結合分子である。IL6Rに対する抗原結合ドメインを含む被験抗原結合分子が結合するエピトープの構造が同定されている場合には、被験抗原結合分子と対照抗原結合分子とがエピトープを共有することは、当該エピトープを構成するペプチドにアミノ酸変異を導入したペプチドに対する両者の抗原結合分子の結合活性を比較することによって評価され得る。こうした結合活性を測定する方法としては、例えば、前記のELISAフォーマットにおいて変異を導入した線状のペプチドに対する被験抗原結合分子及び対照抗原結合分子の結合活性を比較することによって測定され得る。ELISA以外の方法としては、カラムに結合した当該変異ペプチドに対する結合活性を、当該カラムに被検抗原結合分子と対照抗原結合分子を流下させた後に溶出液中に溶出される抗原結合分子を定量することによっても測定され得る。変異ペプチドを例えばGSTとの融合ペプチドとしてカラムに吸着させる方法は公知である。また、同定されたエピトープが立体エピトープの場合には、被験抗原結合分子と対照抗原結合分子とがエピトープを共有することは、次の方法で評価され得る。まず、IL6Rを発現する細胞とエピトープに変異が導入されたIL6Rを発現する細胞が調製される。これらの細胞がPBS等の適切な緩衝液に懸濁された細胞懸濁液に対して被験抗原結合分子と対照抗原結合分子が添加される。次いで、適宜緩衝液で洗浄された細胞懸濁液に対して、被験抗原結合分子と対照抗原結合分子を認識することができるFITC標識された抗体が添加される。標識抗体によって染色された細胞の蛍光強度と細胞数がFACSCaliburBD社によって測定される。被験抗原結合分子と対照抗原結合分子の濃度は好適な緩衝液によって適宜希釈することによって所望の濃度に調製して用いられる。例えば、10μgmlから10ngmlまでの間のいずれかの濃度で使用される。当該細胞に対する標識抗体の結合量は、CELLQUESTSoftwareBD社を用いて解析することにより得られた蛍光強度、すなわちGeometricMeanの値に反映される。すなわち、当該GeometricMeanの値を得ることにより、標識抗体の結合量によって表される被験抗原結合分子と対照抗原結合分子の結合活性を測定することができる。本方法において、例えば変異IL6R発現細胞に実質的に結合しないことは、以下の方法によって判断することができる。まず、変異IL6Rを発現する細胞に対して結合した被験抗原結合分子と対照抗原結合分子が、標識抗体で染色される。次いで細胞の蛍光強度が検出される。蛍光検出にフローサイトメトリーとしてFACSCaliburを用いた場合、得られた蛍光強度はCELLQUESTSoftwareを用いて解析され得る。ポリペプチド会合体存在下および非存在下でのGeometricMeanの値から、この比較値ΔGeoMeanを下記の計算式に基づいて算出することにより、抗原結合分子の結合による蛍光強度の増加割合を求めることができる。ΔGeoMean=GeoMeanポリペプチド会合体存在下/GeoMeanポリペプチド会合体非存在下解析によって得られる被験抗原結合分子の変異IL6R発現細胞に対する結合量が反映されたGeometricMean比較値変異IL6R分子ΔGeoMean値を、被験抗原結合分子のIL6R発現細胞に対する結合量が反映されたΔGeoMean比較値と比較する。この場合において、変異IL6R発現細胞及びIL6R発現細胞に対するΔGeoMean比較値を求める際に使用する被験抗原結合分子の濃度は互いに同一又は実質的に同一の濃度で調製されることが特に好ましい。予めIL6R中のエピトープを認識していることが確認された抗原結合分子が、対照抗原結合分子として利用される。被験抗原結合分子の変異IL6R発現細胞に対するΔGeoMean比較値が、被験抗原結合分子のIL6R発現細胞に対するΔGeoMean比較値の、少なくとも80、好ましくは50、更に好ましくは30、特に好ましくは15より小さければ、変異IL6R発現細胞に実質的に結合しないものとする。GeoMean値GeometricMeanを求める計算式は、CELLQUESTSoftwareUser’sGuideBDbiosciences社に記載されている。比較値を比較することによってそれが実質的に同視し得る程度であれば、被験抗原結合分子と対照抗原結合分子のエピトープは同一であると評価され得る。抗原結合ドメイン本明細書において、抗原結合ドメインは目的とする抗原に結合するかぎりどのような構造のドメインも使用され得る。そのようなドメインの例として、例えば、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュールWO2004044011、WO2005040229、細胞膜に発現する糖タンパク質であるfibronectin中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectinWO2002032925、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束bundleを構成するIgG結合ドメインをscaffoldとするAffibodyWO1995001937、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復ankyrinrepeat:ARの分子表面に露出する領域であるDARPinsDesignedAnkyrinRepeatproteinsWO2002020565、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリンneutrophilgelatinaseassociatedlipocalinNGAL等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等WO2003029462、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体variablelymphocytereceptorVLRのロイシン残基に富んだリピートleucinerichrepeatLRRモジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域WO2008016854が好適に挙げられる。本発明の抗原結合ドメインの好適な例として、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合ドメインが挙げられる。こうした抗原結合ドメインの例としては、scFvsinglechainFv、単鎖抗体singlechainantibody、Fv、scFv2singlechainFv2、FabまたはF2等が好適に挙げられる。本発明の抗原結合分子における抗原結合ドメインは、同一のエピトープに結合することができる。ここで同一のエピトープは、例えば、配列番号:15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在することができる。また、配列番号:15に記載のアミノ酸配列の20番目から365番目のアミノ酸からなるタンパク質中に存在することができる。あるいは、本発明の抗原結合分子における抗原結合ドメインは、互いに異なるエピトープに結合することができる。ここで異なるエピトープは、例えば、配列番号:15に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質中に存在することができる。また、配列番号:15に記載のアミノ酸配列の20番目から365番目のアミノ酸からなるタンパク質中に存在することができる。カルシウム結合モチーフ本発明の抗原結合分子における抗原結合ドメインは、カルシウム結合モチーフを含む。カルシウム結合モチーフは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い限り、抗原結合ドメインのいずれの位置にも含まれ得る。抗原結合ドメインが抗体の可変領域である場合は、カルシウム結合モチーフは可変領域の重鎖にも含まれ得るし、可変領域の軽鎖にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、重鎖および軽鎖の両方にも含まれ得る。非限定な別の一態様では、カルシウム結合モチーフは、可変領域のフレームワーク配列にも含まれ得るし、可変領域のCDR配列にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、フレームワーク配列とCDR配列の両方にも含まれ得る。本発明の非限定な一態様として、カルシウム結合モチーフは、カルシウムイオン濃度の条件によって抗原に対する抗原結合分子の結合活性を変化させるアミノ酸残基を含む。当該アミノ酸残基の例として、金属キレート作用を有するアミノ酸が好適に用いられる得る。金属キレート作用を有するアミノ酸の例として、例えばセリンSerS、スレオニンThrT、アスパラギンAsnN、グルタミンGlnQ、アスパラギン酸AspD、グルタミン酸GluE、ヒスチジンHisHおよびチロシンTyrY等が好適に挙げられる。低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い性質を有する既存の抗原結合ドメインに存在するカルシウム結合モチーフが、本発明のカルシウム結合モチーフとして適宜使用され得る。そのような既存の抗原結合ドメインの非限定な一例として、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗体の可変領域に含まれるカルシウム結合モチーフが好適に使用され得る。そのような抗体の非限定な例として配列番号:1および配列番号:2を含むIL6レセプター抗体および配列番号:25および配列番号:26を含むIL6抗体が挙げられる。また、複数個のカルシウムイオン結合部位を有し、分子進化上共通の起源から由来したと考えられるトロポニンC、カルモジュリン、パルブアルブミン、ミオシン軽鎖等が知られており、その結合モチーフも本発明のカルシウム結合モチーフとして使用され得る。本発明の抗原結合ドメインが抗体の可変領域である場合は、カルシウム結合モチーフは可変領域の重鎖にも含まれ得るし、可変領域の軽鎖にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、重鎖および軽鎖の両方にも含まれ得る。非限定な別の一態様では、カルシウム結合モチーフは、可変領域のフレームワーク配列にも含まれ得るし、可変領域のCDR配列にも含まれ得る。また、カルシウム結合モチーフは、フレームワーク配列とCDR配列の両方にも含まれ得る。これらのカルシウム結合モチーフが含まれるように重鎖または軽鎖のCDR1、CDR2およびまたはCDR3を設計することも可能である。例えば、本発明の非限定な一態様では、配列番号:41、配列番号:63、配列番号:64で表されるヒト抗体の軽鎖可変領域に含まれるカルシウム結合モチーフを、本発明の抗原結合分子の軽鎖可変領域に含まれるように設計することが可能である。そのようなカルシウム結合モチーフとしては、Kabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位およびまたは92位のいずれかひとつ以上のアミノ酸が、金属キレート作用を有するアミノ酸を含むカルシウム結合モチーフが挙げられる。そのようなカルシウム結合モチーフの非限定な一態様として、配列番号:41、配列番号:63、配列番号:64で表されるヒト抗体の軽鎖可変領域のKabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位およびまたは92位の5つのアミノ酸から選択される1~4のアミノ酸と同一のアミノ酸が、対応するKabatナンバリングのアミノ酸部位に含まれるカルシウム結合モチーフが好適に挙げられる。この場合において、軽鎖可変領域のKabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位およびまたは92位の5つのアミノ酸部位のうち、配列番号:41、配列番号:63、配列番号:64で表されるヒト抗体の軽鎖可変領域中の対応するアミノ酸部位に含まれるアミノ酸と非同一のアミノ酸であるアミノ酸部位には、金属キレート作用を有するアミノ酸が含まれることが好ましい。また、例えば、本発明の非限定な別の一態様では、配列番号:1で表される重鎖可変領域に含まれるカルシウム結合モチーフを、本発明の抗原結合分子の重鎖可変領域に含まれるように設計することも可能である。そのようなカルシウム結合モチーフとしては、Kabatナンバリングで表される95位、96位およびまたは100a位のアミノ酸が、金属キレート作用を有するアミノ酸を含むカルシウム結合モチーフが挙げられる。また、例えば、本発明の非限定な別の一態様では、配列番号:25で表される重鎖可変領域に含まれるカルシウム結合モチーフを、本発明の抗原結合分子の重鎖可変領域に含まれるように設計することも可能である。そのようなカルシウム結合モチーフとしては、Kabatナンバリングで表される95位およびまたは101位のアミノ酸が、金属キレート作用を有するアミノ酸を含むカルシウム結合モチーフが挙げられる。これらの金属キレート作用を有するアミノ酸として、例えばセリンSerS、スレオニンThrT、アスパラギンAsnN、グルタミンGlnQ、アスパラギン酸AspD、グルタミン酸GluE、ヒスチジンHisHおよびチロシンTyrY等が挙げられる。またカルシウムイオンの結合のためにこれらの位置のアミノ酸の主鎖のカルボニル基が関わっていてもよい。後述する実施例に記載されているように、カルシウム結合モチーフに含まれるアミノ酸を所望の抗原結合ドメインに移植することによって、驚くべきことに当該抗原結合ドメインにカルシウムイオン結合活性を付与することが可能であった。また、カドヘリンドメイン、カルモジュリンに含まれるEFハンド、ProteinkinaseCに含まれるC2ドメイン、血液凝固タンパク質FactorIXに含まれるGlaドメイン、アシアログライコプロテインレセプターやマンノース結合レセプターに含まれるC型レクチン、LDL受容体に含まれるAドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインおよびEGF様ドメインもまた適宜使用され得る。特異的特異的とは、一方の分子がその結合相手である一または複数の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態をいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。抗体本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラスアイソタイプが知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が含まれ得る。所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。以下に、IL6Rに結合する抗体抗IL6R抗体を作製する方法が例示される。IL6R以外の抗原に結合する抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。抗IL6R抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。抗IL6R抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞によって産生されるもの等が含まれる。本願発明のモノクローナル抗体には、ヒト化抗体やキメラ抗体が含まれる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって、例えば以下のように作製され得る。すなわち、IL6Rタンパク質を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗IL6R抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、配列番号:16にそのヌクレオチド配列が開示されたIL6R遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用される配列番号:15で表されるIL6Rタンパク質が取得され得る。すなわち、IL6Rをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のヒトIL6Rタンパク質が公知の方法で精製される。培養上清中から可溶型のIL6Rを取得するためには、例えば、MullbergらJImmunol15249584968によって記載されているような可溶型IL6Rである、配列番号:15で表されるIL6Rポリペプチド配列のうち、1から357番目のアミノ酸からなるタンパク質が、配列番号:15で表されるIL6Rタンパク質の代わりに発現される。また、精製した天然のIL6Rタンパク質もまた同様に感作抗原として使用され得る。哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として当該精製IL6Rタンパク質が使用できる。IL6Rの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、当該部分ペプチドはヒトIL6Rのアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、IL6R遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解酵素を用いてIL6Rタンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドとして用いるIL6Rペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。好ましい領域は配列番号:15のアミノ酸配列において20357番目のアミノ酸に相当するアミノ酸配列から任意の配列が選択され得る。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なくとも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8~50、好ましくは10~30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。また、IL6Rタンパク質の所望の部分ポリペプチドやペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecularCloning2ndedSambrookJetalMolecularCloning2nded9479581989ColdSpringHarborLabpressに記載されている。感作抗原として用いられるIL6Rの取得方法及びそれを用いた免疫方法は、WO2003000883、WO2004022754、WO2006006693等にも具体的に記載されている。当該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使用される。公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に投与によって投与されることにより免疫が実施される。具体的には、PBSPhosphateBufferedSalineや生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫することが望ましい場合もある。また、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法である。蛋白質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。-IL6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る-免疫抗原を精製する必要が無いDNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、IL6Rタンパク質を発現するDNAが免疫動物に投与される。IL6RをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与される。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA31などの市販の発現ベクターが好適に利用され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用され得る。たとえば、発現ベクターが吸着した金粒子が、genegunで免疫動物個体の細胞内に導入されることによってDNA免疫が行われる。さらに、IL6Rを認識する抗体の作製は国際公開WO2003104453に記載された方法を用いても作製され得る。このように哺乳動物が免疫され、血清中におけるIL6Rに結合する抗体力価の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用され得る。前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できるあるいはできない形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損以下HGPRT欠損と省略する、あるいはチミジンキナーゼ欠損以下TK欠損と省略するなどが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン感受性以下HAT感受性と省略するを有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン以下8AGと省略する、あるいは5ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2デオキシストレプタミン系抗生物質ゲンタマイシン類似体に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。このようなミエローマ細胞として、例えば、P3P3x63Ag8653JImmunol197912315481550、P3x63Ag8U1CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology19788117、NS1CEurJImmunol19766511519、MPC11Cell19768405415、SP20Nature1978276269270、FOJImmunolMethods198035121、S1945XX0BU1JExpMed1978148313323、R210Nature1979277131133等が好適に使用され得る。基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法MethodsEnzymol198173346等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコールPEG、センダイウイルスHVJ等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清FCS等の血清補液が好適に添加され得る。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37°C程度に加温されたPEG溶液例えば平均分子量1000から6000程度が通常30から60wvの濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細胞ハイブリドーマが形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去され得る。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液で培養することにより選択され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞非融合細胞が死滅するのに十分な時間通常、係る十分な時間は数日から数週間である上記HAT培養液を用いた培養が継続され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞非融合細胞が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施され得る。所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、IL6Rに結合するモノクローナル抗体は、細胞表面に発現したIL6Rに結合することができる。このようなモノクローナル抗体は、たとえば、FACSfluorescenceactivatedcellsortingによってスクリーニングされ得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面に対する抗体の結合を測定することを可能にするシステムである。FACSによって本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、まずIL6Rを発現する細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細胞は、IL6Rを強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主細胞として使用した形質転換されていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のIL6Rに対する抗体の結合活性が選択的に検出され得る。すなわち、宿主細胞に結合せず、IL6R強制発現細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、IL6Rモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが取得され得る。あるいは固定化したIL6R発現細胞に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評価され得る。たとえば、ELISAプレートのウェルにIL6R発現細胞が固定化される。ハイブリドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに好適なものである。当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコードされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例えば、Vandammeらによって既に確立されているEurJBiochem1990192767775。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。たとえば、抗IL6R抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗IL6R抗体の可変領域V領域をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。-グアニジン超遠心法Biochemistry1852945299-AGPC法AnalBiochem162156159抽出されたmRNAは、mRNAPurificationKitGEヘルスケアバイオサイエンス製等を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrepmRNAPurificationKitGEヘルスケアバイオサイエンス製などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMVReverseTranscriptaseFirststrandcDNASynthesisKit生化学工業社製等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMARTRACEcDNA増幅キットClontech製およびPCRを用いた5’RACE法ProcNatlAcadSciUSA8589989002、NucleicAcidsRes1729192932が適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入され得る。得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使った5’RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出されたRNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’RACEcDNAライブラリが得られる。5’RACEcDNAライブラリの合成にはSMARTRACEcDNA増幅キットなど市販のキットが適宜用いられる。得られた5’RACEcDNAライブラリを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列である。したがって、サブクラスは予めIsoStripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットロシュダイアグノスティックスなどの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3側のプライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5側のプライマーには、5’RACEcDNAライブラリ作製キットに付属するプライマーが利用される。こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、IL6Rに対する結合活性を指標として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえばIL6Rに対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のIL6Rに対する結合は、特異的であることがさらに好ましい。IL6Rに結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る;1ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL6R発現細胞に接触させる工程、2IL6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および3IL6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。抗体とIL6R発現細胞との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFACSなどの手法によって、抗体とIL6R発現細胞との結合が検出され得る。抗体の結合活性を評価するためにIL6R発現細胞の固定標本が適宜利用され得る。結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法も好適に用いられる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFvscFvを形成することができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。目的とする抗IL6R抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に1コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗IL6R抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域C領域をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス-ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト-ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域C領域をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。抗IL6Rモノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子が発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。例えば、シグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS配列番号:113を有するペプチドが使用され得るが、これ以外にも適したシグナル配列が付加される。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗IL6R抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。抗体遺伝子の発現のために、抗体重鎖H鎖および軽鎖L鎖をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターによって、同じ宿主細胞に同時に形質転換cotransfectされることによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子が発現され得る。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAが単一の発現ベクターに組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る国際公開WO1994011523を参照のこと。単離された抗体遺伝子を適当な宿主に導入することによって抗体を作製するための宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明の抗原結合ドメインを単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。1哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHKbabyhamsterkidney、Hela、Veroなど2両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など3昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5などあるいは植物細胞としては、ニコティアナタバカムNicotianatabacumなどのニコティアナNicotiana属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。-酵母:サッカロミセスセレビシエSaccharomycesserevisiaeなどのサッカロミセスSaccharomyces属、メタノール資化酵母PichiapastorisなどのPichia属-糸状菌:アスペスギルスニガーAspergillusnigerなどのアスペルギルスAspergillus属また、原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌Ecoli、枯草菌などの細菌細胞が適宜利用され得る。これらの細胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質転換された細胞をinvitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望の抗体が取得され得る。組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物も利用され得る。すなわち所望の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用され得る。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当該注入された胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得るBioTechnology12699702。本明細書において記載される抗原結合分子がヒトに投与される場合、当該会合体における抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。遺伝子組換え型抗体には、例えば、ヒト化Humanized抗体等が含まれる。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて適宜製造される。本明細書において記載される抗原結合分子における抗原結合ドメインを作製するために用いられる抗体の可変領域は、通常、4つのフレームワーク領域FRにはさまれた3つの相補性決定領域complementaritydeterminingregionCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。ヒト化抗体は、再構成reshapedヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlapExtensionPCRが公知である。OverlapExtensionPCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。最終的に3つのCDRと4つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5末端と3末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。当該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、当該組換え細胞を培養し、当該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、当該ヒト化抗体が当該培養細胞の培養物中に産生される欧州特許公開EP239400、国際公開WO1996002576参照。上記のように作製されたヒト化抗体の抗原に対する結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原に対する結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得るCancerRes53851856。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物国際公開WO1993012227、WO1992003918、WO1994002602、WO1994025585、WO1996034096、WO1996033735参照を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。さらに、ヒト抗体ライブラリを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体scFvとしてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である国際公開WO1992001047、WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236、WO1993019172、WO1995001438、WO1995015388参照。また、抗体遺伝子を取得する方法としてBernasconiらScience29821992202またはWO2008081008に記載のようなB細胞クローニングそれぞれの抗体のコード配列の同定およびクローニング、その単離、およびそれぞれの抗体特に、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の作製のための発現ベクター構築のための使用等の手法が、上記のほか適宜使用され得る。EUナンバリング本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定されるSequencesofProteinsofImmunologicalInterestNationalInstituteofHealthBethesdaMd1987年および1991年。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがい、定常領域のアミノ酸はKabatのアミノ酸位置に準じたEUナンバリングにしたがって表される。抗原の細胞内への取込みまたは細胞内への取込みの促進本発明において抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みとは、抗原がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることを意味する。また本発明において細胞内への取込みを促進するとは、血漿中において抗原と結合した抗原結合分子が細胞内に取り込まれる速度が促進されること、および/または、取り込まれた抗原が血漿中にリサイクルされる量が減少することを意味する。本発明における細胞内への取り込み速度の促進の程度は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、細胞内への取込み速度が促進されていればよい。したがって、本発明において、抗原結合分子により抗原の細胞内への取り込みが促進されたかどうかは、抗原の細胞内への取り込み速度が増大したかどうかで判断することが可能である。抗原の細胞内への取り込み速度は、例えば、ヒトFcRn発現細胞を含む培養液に抗原結合分子と抗原を添加し、抗原の培養液中濃度の減少を経時的に測定すること、あるいは、ヒトFcRn発現細胞内に取り込まれた抗原の量を経時的に測定すること、により算出することができる。本発明の抗原結合分子の抗原の細胞内への取込み速度を促進させる方法を利用することによって、例えば抗原結合分子を投与することによって、血漿中の抗原の消失速度を促進させることができる。したがって、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みが促進されたかどうかは、例えば、血漿中に存在する抗原の消失速度が加速されているかどうか、あるいは、抗原結合分子の投与によって血漿中の抗原濃度が低減されているかどうか、を測定することによっても確認することができる。即ち本発明の抗原結合分子の投与によって、血漿中の抗原濃度の減少を促進させることも可能である。1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数また、本発明における1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数とは、1分子の抗原結合分子が分解されて消失するまでの間に抗原へ結合することができる回数のことを意味する。本発明における1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させるとは、血漿中で抗原が抗原結合分子に結合し、抗原が結合した抗原結合分子が細胞内に取り込まれエンドソーム内で抗原を解離した後に、抗原結合分子が血漿中に戻ることを1サイクルとした時に、1分子の抗原結合分子が分解されて消失するまでの間に回すことができたこのサイクルの数を増加させることである。本発明においては、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、サイクル数が増えていればよい。したがって、サイクル数が増えたかどうかは、前述の細胞内への取込みを促進したか否か、あるいは、後述の血漿中滞留性の改善したか否かによって、判断することが可能である。血漿中滞留性の改善本発明において血漿中滞留性の改善は、薬物動態の向上、薬物動態の改善、優れた薬物動態、血漿中滞留性の向上、優れた血漿中滞留性または血漿中滞留性を長くすると言い換えることが可能であり、これらの語句は同じ意味で使用される。本発明において血漿中滞留性を改善するとは、抗原結合分子がヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌなどの動物に投与されてから、血漿中から消失するまで例えば、細胞内で分解される等して抗原結合分子が血漿中に戻ることが不可能な状態になるまでの時間が長くなることのみならず、抗原結合分子が投与されてから分解されて消失するまでの間に抗原に結合可能な状態例えば、抗原結合分子が抗原に結合していない状態で血漿中に滞留する時間が長くなることも含む。すなわち抗原に結合していない抗原結合分子抗原非結合型抗原結合分子が分解されて消失するまでの時間が長くなることを含む。抗原結合分子が血漿中に存在していても、その抗原結合分子にすでに抗原が結合している場合は、その抗原結合分子は新たな抗原に結合できない。そのため抗原結合分子が抗原に結合していない時間が長くなれば、新たな抗原に結合できる時間が長くなり新たな抗原に結合できる機会が多くなり、生体内で抗原が抗原結合分子に結合していない時間を減少させることができ、抗原が抗原結合分子に結合している時間を長くすることができる。抗原結合分子の投与により血漿中からの抗原の消失を加速することができれば、抗原非結合型抗原結合分子の血漿中濃度は増加し、また、抗原が抗原結合分子に結合している時間が長くなる。つまり、本発明における抗原結合分子の血漿中滞留性の改善とは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原非結合型抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原非結合型抗原結合分子と比較して、本発明の抗原非結合型抗原結合分子のいずれかの薬物動態パラメーターが改善血漿中半減期の増加、平均血漿中滞留時間の増加、血漿中クリアランスの低下のいずれかされる、あるいは、抗原結合分子投与後に抗原が抗原結合分子に結合している時間が延長される、あるいは、抗原結合分子による血漿中からの抗原の消失が加速されること、を含む。薬物動態パラメーターが改善されたか否かは、抗原結合分子あるいは抗原非結合型抗原結合分子の血漿中半減期、平均血漿中滞留時間、血漿中クリアランス等のいずれかのパラメーターファーマコキネティクス演習による理解南山堂を測定することにより判断することが可能である。例えば、抗原結合分子をマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ヒトなどに投与した場合、抗原結合分子あるいは抗原非結合型抗原結合分子の血漿中濃度を測定し、各パラメーターを算出し、血漿中半減期が長くなった又は平均血漿中滞留時間が長くなった場合等には、抗原結合分子の血漿中滞留性が改善したと言える。これらのパラメーターは当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、薬物動態解析ソフトWinNonlinPharsightを用いて、付属の手順書に従いNoncompartmental解析をすることによって適宜評価することができる。抗原非結合型抗原結合分子の血漿中濃度の測定は当業者公知の方法で実施することが可能であり、例えば、ClinPharmacol2008Apr4840617において測定されている方法を用いることができる。本発明において血漿中滞留性を改善するとは、抗原結合分子投与後に抗原が抗原結合分子に結合している時間が延長されたことも含む。抗原結合分子投与後に抗原が抗原結合分子に結合している時間が延長されたか否かは、抗原結合分子非結合型抗原遊離型抗原の血漿中濃度、あるいは総抗原濃度に対する抗原結合分子非結合型抗原濃度遊離型抗原濃度を測定し、当該濃度の割合が上昇してくるまでの時間により判断することが可能である。本発明において血漿中の抗原濃度の測定は、抗原結合分子非結合型抗原の血漿中濃度、あるいは総抗原濃度に対する抗原結合分子非結合型抗原濃度の割合を当業者公知の方法を用いて実施することが可能であり、例えば、PharmRes2006Jan2395103において測定されている方法を用いることができる。また、抗原が何らかの機能を生体内で示す場合、抗原が抗原の機能を中和する抗原結合分子アンタゴニスト分子と結合しているかどうかは、その抗原の機能が中和されているかどうかで評価することも可能である。抗原の機能が中和されているかどうかは、抗原の機能を反映する何らかの生体内のマーカーを測定することで評価することが可能である。抗原が抗原の機能を活性化する抗原結合分子アゴニスト分子と結合しているかどうかは、抗原の機能を反映する何らかの生体内のマーカーを測定することで評価することが可能である。抗原結合分子非結合型抗原の血漿中濃度の測定、総抗原濃度に対する抗原結合分子非結合型の抗原濃度の割合の測定、生体内マーカーの測定などの測定は特に限定されないが、抗原結合分子が投与されてから一定時間が経過した後に行われることが好ましい。本発明において抗原結合分子が投与されてから一定時間が経過した後とは、特に限定されず、投与された抗原結合分子の性質等により当業者が適時決定することが可能であり、例えば抗原結合分子を投与してから1日経過後、抗原結合分子を投与してから3日経過後、抗原結合分子を投与してから7日経過後、抗原結合分子を投与してから14日経過後、抗原結合分子を投与してから28日経過後などを挙げることができる。本発明においては、ヒトにおける血漿中滞留性が改善することが好ましい。ヒトでの血漿中滞留性を測定することが困難である場合には、マウス例えば、正常マウス、ヒト抗原発現トランスジェニックマウス、ヒトFcRn発現トランスジェニックマウス、等やサル例えば、カニクイザルなどでの血漿中滞留性をもとに、ヒトでの血漿中滞留性を予測することができる。細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離また、本発明は、細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離を促進させる方法として利用することも可能である。本発明において抗原が抗原結合分子から解離する箇所は細胞内であればいかなる箇所でもよいが、好ましくは早期エンドソーム内である。本発明において、細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離とは、細胞外で抗原結合分子に結合して細胞内に取り込まれた抗原全てが細胞内で抗原結合分子から解離する必要はなく、細胞内で抗原結合分子から解離する抗原の割合が、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前の抗原結合分子と比較して、細胞内で抗原結合分子から解離する抗原の割合がより高くなっていればよい。また、細胞外で抗原結合分子に結合した抗原の細胞内での抗原結合分子からの解離を促進させる方法は、抗原と結合した抗原結合分子の細胞内への取込みを促進させ、細胞内での抗原結合分子からの抗原の解離が促進されやすくなる性質を抗原結合分子に付与する方法ともいえる。抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の、抗原と結合していない状態での細胞外への放出また、本発明は、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の、抗原と結合していない状態での細胞外への放出を促進させる方法として利用することも可能である。本発明において、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の、抗原と結合していない状態での細胞外への放出とは、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子全てが抗原と結合していない状態で細胞外に放出される必要はなく、抗原と結合していない状態で細胞外に放出される抗原結合分子の割合が、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低くない抗原結合分子、あるいは、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる前と比較して、細胞外に放出される抗原結合分子の割合が高くなっていればよい。細胞外に放出された抗原結合分子は、抗原結合活性を維持していることが好ましい。また、抗原と結合した状態で細胞内に取り込まれた抗原結合分子の抗原と結合していない状態での細胞外への放出を促進させる方法は、抗原と結合した抗原結合分子の細胞内への取り込みを促進させ、抗原結合分子の抗原と結合していない状態での細胞外への放出が促進されやすくなる性質を抗原結合分子に付与する方法ともいえる。カルシウム濃度の条件本発明において、低カルシウム濃度条件下とは、通常、イオン化カルシウム濃度が01μM~30μMであることを意味する。好ましくは05μM~10μMであり、特に生体内の早期エンドソーム内でのイオン化カルシウム濃度に近い1μM~5μMであることが好ましい。また、本発明において、高カルシウム濃度条件下とは、通常、イオン化カルシウム濃度が、100μM~10mMを意味し、好ましくは200μM~5mM、特に生体内の血漿中血中でのイオン化カルシウム濃度に近い05mM~25mMが好ましい。従って、本発明において、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低いとは、抗原結合分子のイオン化カルシウム濃度01μM~30μMでの抗原結合活性が、イオン化カルシウム濃度100μM~10mMでの抗原結合活性より弱いことを意味する。好ましくは、抗原結合分子のイオン化カルシウム濃度05μM~10μMでの抗原結合活性が、イオン化カルシウム濃度200μM~5mMでの抗原結合活性より弱いことを意味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度における抗原結合活性が、生体内の血漿中のイオン化カルシウム濃度における抗原結合活性より弱いことを意味し、具体的には、抗原結合分子のイオン化カルシウム濃度1μM~5μMでの抗原結合活性が、イオン化カルシウム濃度05mM~25mMでの抗原結合活性より弱いことを意味する。さらに本発明において、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低いという表現は、抗原結合分子の高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも高いと表現することもできる。また抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低いという表現には、抗原結合分子中のアミノ酸配列を改変等することにより、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる、あるいは、抗原結合分子の高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも高くする場合も含まれる。つまり、本発明においては、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の比を大きくすればよい。例えば、後述のように、KD/KDの値を大きくするという態様が挙げられる。抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の比を大きくするためには、例えば、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低いものを選択する、あるいは、抗原結合分子中のアミノ酸配列を改変等することで低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を低くしてもよいし、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高いものを選択する、あるいは、抗原結合分子中のアミノ酸配列を改変等することで高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高くしてもよいし、又は、その両方でもよい。なお本発明においては、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低いを低カルシウム濃度条件下における抗原結合能が高カルシウム濃度条件下における抗原結合能よりも弱いと記載する場合もあり、また、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させるを低カルシウム濃度条件下における抗原結合能を高カルシウム濃度条件下における抗原結合能よりも弱くすると記載する場合もある。FcRn免疫グロブリンスーパーファミリーに属するFcγレセプターと異なり、FcRn、特にヒトFcRnは構造的には主要組織不適合性複合体MHCクラスIのポリペプチドに構造的に類似しクラスIのMHC分子と22から29の配列同一性を有するGhetieら,ImmunolToday18592598。FcRnは、可溶性βまたは軽鎖β2マイクログロブリンと複合体化された膜貫通αまたは重鎖よりなるヘテロダイマーとして発現される。MHCのように、FcRnのα鎖は3つの細胞外ドメインα1、α2、α3よりなり、短い細胞質ドメインはタンパク質を細胞表面に繋留する。α1およびα2ドメインが抗体のFc領域中のFcRn結合ドメインと相互作用するRaghavanらImmunity1303315。FcRnは、哺乳動物の母性胎盤または卵黄嚢で発現され、それは母親から胎児へのIgGの移動に関与する。加えてFcRnが発現するげっ歯類新生児の小腸では、FcRnが摂取された初乳または乳から母性IgGの刷子縁上皮を横切る移動に関与する。FcRnは多数の種にわたって多数の他の組織、並びに種々の内皮細胞系において発現している。それはヒト成人血管内皮、筋肉血管系、および肝臓洞様毛細血管でも発現される。FcRnは、IgGに結合し、それを血清にリサイクルすることによって、IgGの血漿中濃度を維持する役割を演じていると考えられている。FcRnのIgG分子への結合は、通常、厳格にpHに依存的であり、最適結合は70未満のpH酸性域において認められる。配列番号:17で表されたシグナル配列を含むポリペプチドを前駆体とするヒトFcRnは、生体内で配列番号:18にシグナル配列を含むそのポリペプチドが記載されているヒトβ2ミクログロブリンとの複合体を形成する。β2ミクログロブリンと複合体を形成している可溶型ヒトFcRnが通常の組換え発現手法を用いることによって製造される。このようなβ2ミクログロブリンと複合体を形成している可溶型ヒトFcRnに対する本発明のFcRn結合ドメインの結合活性が評価され得る。本発明において、特に記載のない場合は、ヒトFcRnは本発明のFcRn結合ドメインに結合し得る形態であるものを指し、例としてヒトFcRnとヒトβ2ミクログロブリンとの複合体が挙げられる。FcRn結合ドメイン本発明の抗原結合分子は、抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する。ヒトFcRn結合ドメインは、抗原結合分子が酸性pHおよび/または中性pHにおいてヒトFcRn結合活性を有していれば特に限定されず、また、直接または間接的にヒトFcRnに対して結合活性を有するドメインであってもよい。そのようなドメインとしては、例えば、直接的にヒトFcRnに対する結合活性を有するIgG型免疫グロブリンのFc領域、アルブミン、アルブミンdomain3、抗ヒトFcRn抗体、抗ヒトFcRnペプチド、抗ヒトFcRnScaffold分子等、あるいは間接的にヒトFcRnに対する結合活性を有するIgGやアルブミンに結合する分子等を挙げることができる。本発明においては、pH酸性域およびpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有するドメインが好ましい。当該ドメインは、あらかじめpH酸性域およびpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているドメインであればそのまま用いてもよい。当該ドメインがpH酸性域およびまたはpH中性域においてヒトFcRn結合活性がない若しくは弱い場合には、抗原結合分子中のアミノ酸を改変してヒトFcRn結合活性を得てもよいが、ヒトFcRn結合ドメイン中のアミノ酸を改変してpH酸性域およびまたはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性を得るのが好ましい。また、あらかじめpH酸性域およびまたはpH中性域においてヒトFcRn結合活性を有しているドメイン中のアミノ酸を改変して、ヒトFcRn結合活性を高めてもよい。ヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸改変は、アミノ酸改変前と改変後のpH酸性域およびまたはpH中性域におけるヒトFcRn結合活性を比較することによって目的の改変を見出すことができる。ヒトFcRn結合ドメインは、直接ヒトFcRnと結合する領域であることが好ましい。ヒトFcRn結合領域の好ましい例として、抗体のFc領域を挙げることができる。しかしながら、アルブミンやIgGなどのヒトFcRnとの結合活性を有するポリペプチドに結合可能な領域は、アルブミンやIgGなどを介して間接的にヒトFcRnと結合することが可能である。そのため、本発明におけるヒトFcRn結合領域は、アルブミンやIgGとの結合活性を有するポリペプチドに結合する領域であってもよい。特に、ヒトFcRn結合ドメインは、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性が高いほうが好ましく、予め中性pHにおけるヒトFcRn結合活性が高いヒトFcRn結合ドメインを選択しても良いし、抗原結合分子中のアミノ酸を改変して中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与しても良いし、あるいは中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を高めても良い。ヒトFcRnへの結合活性を測定する際のpH以外の条件は当業者が適宜選択することが可能であり、特に限定されない。例えば、WO2009125825に記載のようにMESバッファー、37°Cの条件において測定することが可能である。また、抗原結合分子のヒトFcRn結合活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、BiacoreGEHealthcareなどを用いて測定することが可能である。抗原結合分子とヒトFcRnの結合活性の測定は、抗原結合分子あるいはヒトFcRnを固定化したチップへ、それぞれヒトFcRnあるいは抗原結合分子をアナライトとして流すことで評価することが可能である。ここで、酸性pHにおけるヒトFcRnに対する結合活性とは、pH40~pH65でのヒトFcRn結合活性を意味する。好ましくはpH55~pH65でのヒトFcRn結合活性を意味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のpHに近いpH58~pH60でのヒトFcRn結合活性を意味する。また、中性pHにおけるヒトFcRnに対する結合活性とは、pH67~pH100でのヒトFcRn結合活性を意味する。好ましくは、pH70~pH80でのヒトFcRn結合活性を意味し、特に好ましくは、生体内の血漿中のpHに近いpH74でのヒトFcRn結合活性を意味する。抗原結合分子中のアミノ酸を改変して中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する、あるいは中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を高める場合、例えばヒトFcRn結合ドメインとしてIgG型免疫グロブリンのFc領域を用いる場合、ヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸を改変することにより、抗原結合分子に対し中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する、あるいは中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を高めることが可能である。改変のための好ましいIgG型免疫グロブリンのFc領域としては、例えばヒト天然型IgGIgG1IgG2IgG3IgG4のFc領域が挙げられる。他のアミノ酸への改変は、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性が付与される若しくはヒトFcRn結合活性が高められるかぎり、いかなる位置のアミノ酸が改変されていてもよい。抗原結合分子が、ヒトFcRn結合ドメインとしてヒトIgG1のFc領域を含んでいる場合、中性pHにおけるヒトFcRnへの結合がヒト天然型IgG1より強くなる改変が含まれていることが好ましい。そのような改変が可能なアミノ酸として、例えば、EUナンバリング221番目~225番目、227番目、228番目、230番目、232番目、233番目~241番目、243番目~252番目、254番目~260番目、262番目~272番目、274番目、276番目、278番目~289番目、291番目~312番目、315番目~320番目、324番目、325番目、327番目~339番目、341番目、343番目、345番目、360番目、362番目、370番目、375番目~378番目、380番目、382番目、385番目~387番目、389番目、396番目、414番目、416番目、423番目、424番目、426番目~438番目、440番目および442番目の位置のアミノ酸を挙げることができる。より具体的には、例えば表1に記載のようなアミノ酸の改変が挙げられる。これらの改変を使用することで、IgG型免疫グロブリンのFc領域の中性pHにおけるヒトFcRnへの結合活性を付与する、あるいは高める強くすることができる。また、pH酸性域におけるヒトFcRnへの結合活性をヒト天然型IgG1と比較して強くすることができる改変の例を表2に示した。これらの改変のうち、中性pHにおいてもヒトFcRnへの結合を強くすることが出来る改変を適宜選択し、本発明に使用することが可能である。FcRn結合ドメインのアミノ酸の改変またはアミノ酸改変とは、親FcRn結合ドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列に改変することを含む。親FcRn結合ドメインの修飾改変体がpH中性域においてヒトFcRnに結合することができる限り、いずれのFcRn結合ドメインも親FcRn結合ドメインとして使用され得る。また、既に改変が加えられたFcRn結合ドメインを親FcRn結合ドメインとしてさらなる改変が加えられたFcRn結合ドメインも本発明のFcRn結合ドメインとして好適に使用され得る。親FcRn結合ドメインとは、ポリペプチドそのもの、親FcRn結合ドメインを含む組成物、または親FcRn結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を意味し得る。親FcRn結合ドメインには、抗体の項で概説された組換えによって産生された公知のFc領域が含まれ得る。親FcRn結合ドメインの起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、親FcRn結合ドメインはまた、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され得る。好ましくは、親FcRn結合ドメインは、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を親FcRn結合ドメインとして適宜用いることができることを意味する。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブクラスのFc領域を、好ましくは親FcRn結合ドメインとして用いることができることを意味する。天然に存在するIgGの変異体または操作された型の例は、公知の文献CurrOpinBiotechnol2068591、CurrOpinImmunol20460470、ProteinEngDesSel23195202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、およびWO2006105338に記載されるがそれらに限定されない。改変の例としては一以上の変異、例えば、親FcRn結合ドメインのアミノ酸とは異なるアミノ酸残基に置換された変異、あるいは親FcRn結合ドメインのアミノ酸に対して一以上のアミノ酸残基の挿入または親FcRn結合ドメインのアミノ酸から一以上のアミノ酸の欠失等が含まれる。好ましくは、改変後のFcRn結合ドメインのアミノ酸配列には、天然に生じないFcRn結合ドメインの少なくとも部分を含むアミノ酸配列を含む。そのような変種は必然的に親FcRn結合ドメインと100未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態において、変種は親FcRn結合ドメインのアミノ酸配列と約75~100未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは約80~100未満、より好ましくは約85~100未満の、より好ましくは約90~100未満、最も好ましくは約95~100未満の同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。本発明の非限定の一態様において、親FcRn結合ドメインおよび本発明の改変されたFcRn結合ドメインの間には少なくとも1つのアミノ酸の差がある。親FcRn結合ドメインと改変FcRn結合ドメインのアミノ酸の違いは、特に前述のEUナンバリングで特定されるアミノ酸残基の位置の特定されたアミノ酸の違いによっても好適に特定可能である。また、pH酸性域におけるヒトFcRnへの結合を親ヒトIgGと比較して強くすることができる改変の例を表2に示した。これらの改変のうち、pH中性域においてもヒトFcRnへの結合を強くすることが出来る改変を適宜選択し、本発明に使用することが可能である。また、Fv4IgG1に対して酸性条件下でヒトFcRnへの結合を強くすることができる改変の組み合わせを表6-1および6-2に示した。特に好ましい親ヒトIgGのFc領域の改変アミノ酸として、例えばEUナンバリング237番目、238番目、239番目、248番目、250番目、252番目、254番目、255番目、256番目、257番目、258番目、265番目、270番目、286番目、289番目、297番目、298番目、303番目、305番目、307番目、308番目、309番目、311番目、312番目、314番目、315番目、317番目、325番目、332番目、334番目、360番目、376番目、380番目、382番目、384番目、385番目、386番目、387番目、389番目、424番目、428番目、433番目、434番目および436番目の位置のアミノ酸を挙げることができる。特に好ましい改変としては、例えば、親IgGのFc領域のEUナンバリング237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換、を挙げることができる。改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、1箇所のみのアミノ酸を改変してもよいし、2箇所以上のアミノ酸を改変してもよい。2箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えば表3に記載のような組合せが挙げられる。また、pH酸性域におけるヒトFcRnへの結合を親ヒトIgGと比較して強くすることができる改変の組合せを表4-1~4-5に示した。これらの改変のうち、pH中性域においてもヒトFcRnへの結合を強くすることが出来る改変の組合せを適宜選択し、本発明に使用することが可能である。さらに、Fv4IgG1に対して中性条件下でヒトFcRnへの結合を強くすることができる改変の組み合わせを表5-1および5-2に示した。これらのアミノ酸から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、抗原結合分子のpH中性域におけるヒトFcRn結合活性を高めることができる。表4-2は表4-1の続きの表である。表4-3は表4-2の続きの表である。表4-4は表4-3の続きの表である。表4-5は表4-4の続きの表である。表5-2は表5-1の続きの表である。表6-2は表6-1の続きの表である。これらのアミノ酸改変については、公知の技術を用いて適宜実施することが可能であり、例えばDrugMetabDispos2007Jan358694、IntImmunol2006Dec18175969、JBiolChem2001Mar22766591604、JBiolChem2007282170917、JImmunol2002169517180、JImmunol2009182766371、MolecularCellVol7867877April2001、NatBiotechnol1997Jul1563740、NatBiotechnol2005Oct2312838、ProcNatlAcadSciUSA2006Dec51031870914、EP2154157、US20070141052、WO2000042072、WO2002060919、WO2006020114、WO2006031370、WO2010033279、WO2006053301、WO2009086320においてヒト天然型IgG1のFc領域の改変が行われている。TheJournalofImmunology200918276637671によれば、pH酸性域におけるヒト天然型IgG1のヒトFcRn結合活性はKD17μMであり、pH中性域におけるヒト天然型IgG1はヒトFcRn結合活性をほとんど検出できていない。よって、本発明の方法に用いられる抗原結合分子の好ましい態様として、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD20μM以下で、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がヒト天然型IgG1以上である抗原結合分子を挙げることができる。より好ましい態様としては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD20μM以下で、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD40μM以下である抗原結合分子を挙げることができる。さらに好ましい態様としては、pH酸性域におけるヒトFcRn結合活性がKD05μM以下で、pH中性域におけるヒトFcRn結合活性がKD15μM以下である抗原結合分子を挙げることができる。即ち、抗原結合分子の酸性pH条件下における抗原結合活性を、中性pH条件下における抗原結合活性よりも低下させることが好ましい。なお、ここで示すKD値は、TheJournalofImmunology200918276637671に記載された方法抗原結合分子をチップに固定し、アナライトとしてヒトFcRnを流すで測定した時の値である。ヒトFcRn結合活性の値として、KD解離定数を用いることが可能であるが、ヒト天然型IgG1のヒトFcRn結合活性はpH中性域ではほとんど認められないため、KDとして算出することは困難である。pH74でのヒトFcRn結合活性がヒト天然型IgG1よりも高いかどうかを判断する方法として、Biacoreにおいて同じ濃度でアナライトを流した時の結合レスポンスの大小で判断する方法があげられる。すなわち、ヒト天然型IgG1を固定化したチップにヒトFcRnをpH74で流した時のレスポンスよりも、抗原結合分子を固定化したチップにヒトFcRnをpH74で流した時のレスポンスのほうが大きければ、その抗原結合分子のpH74でのヒトFcRn結合活性はヒト天然型IgG1よりも高いと判断することができる。pH70もまた、pH中性域として用いることができる。中性pHとしてpH70を用いることにより、ヒトFcRnとFcRn結合ドメインとの弱い相互作用を促進することができる。測定条件において使用される温度として、結合アフィニティーを、10°C~50°Cの任意の温度で評価してもよい。好ましくは、ヒトFcRn結合ドメインとヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために、15°C~40°Cの温度を使用する。より好ましくは、ヒトFcRn結合ドメインとヒトFcRnとの結合アフィニティーを決定するために、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、および35°Cのいずれか1つのような20°Cから35°Cまでの任意の温度を同様に使用する。実施例5に記載の25°Cという温度は、本発明の態様に関する一例である。好ましい態様において、ヒトFcRnとFcRn結合ドメインとの相互作用は、実施例5に記載の通りにpH70および25°Cで測定されうる。ヒトFcRnに対する抗原結合分子の結合アフィニティーは、実施例3に記載の通りにBiacoreによって測定されうる。より好ましい態様において、本発明の抗原結合分子は、pH70および25°Cで、天然型ヒトIgGより高いヒトFcRn結合活性を有する。より好ましい態様において、pH70および25°CでのヒトFcRn結合活性は、天然型ヒトIgGより28倍高いか、またはKD32μMより強い。より好ましい態様において、pH70および25°CでのヒトFcRn結合活性は、天然型ヒトIgGより38倍高いか、またはKD23μMより強い。天然型ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4は、好ましくはヒトFcRn結合活性または生体内における結合活性に関して抗原結合分子と比較する参照天然型ヒトIgG用途のための、天然型ヒトIgGとして用いられる。好ましくは、目的の抗原結合分子と同一の抗原結合ドメインおよびヒトFcRn結合ドメインとして天然型ヒトIgGFc領域を含む参照抗原結合分子を適宜用いることができる。より好ましくは、天然型ヒトIgG1は、ヒトFcRn結合活性または生体内における結合活性に関して抗原結合分子と比較する参照天然型ヒトIgG用途に用いられる。より具体的には、本発明に記載の血漿中の抗原消失活性に対して長期効果を有する抗原結合分子は、pH70および25°Cで、天然型ヒトIgG1より28倍~440倍高い範囲のFcRn結合活性を有するか、またはKDが30μMから02μMの範囲のFcRn結合活性を有する。血漿中での抗原消失活性に対する本発明の抗原結合分子の長期効果を評価する目的で、長期間の血漿中抗原濃度が、抗原結合分子の投与2日後、4日後、7日後、14日後、28日後、56日後、または84日後に血漿中の総抗原濃度または遊離抗原濃度および抗原/抗原結合分子モル比を測定することによって決定される。血漿中抗原濃度または抗原/抗原結合分子モル比の減少が本発明に記載の抗原結合分子によって達成されるか否かは、先に記載した1つまたは複数の任意の時点で減少を評価することによって決定されうる。さらにより具体的には、本発明に記載の血漿中の抗原消失活性に対して短期効果を有する抗原結合分子は、pH70および25°Cで、天然型ヒトIgGより440倍高いヒトFcRn結合活性を有するか、またはKDが02μMより強いFcRn結合活性を有する。血漿中の抗原消失活性に対する本発明の抗原結合分子の短期効果を評価する目的で、短期間の血漿中抗原濃度が、抗原結合分子の投与15分後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、12時間後、または24時間後に血漿中の総抗原濃度または遊離抗原濃度および抗原/抗原結合分子モル比を測定することによって決定される。本発明の方法は、標的抗原の種類によらない任意の抗原結合分子に適応可能である。例えば、抗原結合分子が膜抗原に結合する抗体の場合、生体内に投与した抗体は抗原に結合して、その後、抗体は抗原に結合したまま抗原と一緒にインターナライゼーションによって細胞内のエンドソームに取り込まれる。その後、抗体は抗原に結合したままライソソームへ移行し、抗体は抗原と一緒にライソソームにより分解される。インターナライゼーションを介した血漿中からの消失は抗原依存的な消失と呼ばれており、多くの抗体分子で報告されているDrugDiscovToday2006Jan11818。1分子のIgG抗体が2価で抗原に結合した場合、1分子の抗体が2分子の抗原に結合した状態でインターナライズされ、そのままライソソームで分解される。従って、通常の抗体の場合、1分子のIgG抗体が3分子以上の抗原に結合することは出来ない。例えば、中和活性を有する1分子のIgG抗体の場合、3分子以上の抗原を中和することはできない。IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い消失が遅いのは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているヒトFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているヒトFcRnに結合する。ヒトFcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進み、そこで分解されるが、ヒトFcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてヒトFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。また抗原結合分子が可溶型抗原に結合する抗体の場合、生体内に投与した抗体は抗原に結合し、その後、抗体は抗原に結合したまま細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込まれた抗体の多くはFcRnにより細胞外に放出されるが、このとき抗原に結合したまま細胞外に放出される為、再度、抗原に結合することはできない。従って、膜抗原に結合する抗体と同様、通常の抗体の場合、1分子のIgG抗体が3分子以上の抗原に結合することはできない。抗原に対して血漿中の高カルシウム濃度条件下においては強く結合し、エンドソーム内の低カルシウム濃度条件下において抗原から解離するカルシウム濃度依存的抗原結合抗体は、エンドソーム内で抗原から解離することが可能である。カルシウム濃度依存的抗原結合抗体は、抗原を解離した後に抗体がFcRnによって血漿中にリサイクルされると再び抗原に結合することが可能であるため、1つの抗体で複数の抗原に繰り返し結合することが可能となる。また、抗原結合分子に結合した抗原がエンドソーム内で解離することで血漿中にリサイクルされないため、抗原結合分子による抗原の細胞内への取り込みを促進し、抗原結合分子の投与により抗原の消失を促進し、血漿中の抗原濃度を低下させることが可能となる。抗原結合分子本発明は、抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する抗原結合分子であって、2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を提供する。本発明における抗原結合分子は、対象とする抗原への特異的な結合活性を有する抗原結合ドメインを有していれば特に限定されない。抗原結合ドメインの好ましい例として、抗体の抗原結合領域を有しているドメインを挙げることができる。抗体の抗原結合領域の例として、CDRや可変領域を挙げることができる。抗体の抗原結合領域がCDRである場合、全長抗体に含まれる6つのCDR全てを含んでいてもよいし、1つ若しくは2つ以上のCDRを含んでいてもよい。抗体の結合領域としてCDRを含む場合、含まれるCDRはアミノ酸の欠失、置換、付加及び/又は挿入などが行われていてもよく、又、CDRの一部分であってもよい。また本発明の方法が対象とする抗原結合分子としては、アンタゴニスト活性を有する抗原結合分子アンタゴニスト抗原結合分子、アゴニスト活性を有する抗原結合分子アゴニスト抗原結合分子、細胞傷害活性を有する分子などを挙げることができるが、好ましい態様として、アンタゴニスト抗原結合分子、特に受容体やサイトカインなどの抗原を認識するアンタゴニスト抗原結合分子を挙げることができる。本発明において対象となる抗原結合分子は特に限定されず、いかなる抗原結合分子でもよい。本発明で用いられる抗原結合分子は好ましくは、抗原結合活性抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する。本発明においては、特にヒトFcRnとの結合ドメインを含む抗原結合分子であることが好ましい。抗原結合ドメインとヒトFcRn結合ドメインを有する抗原結合分子の例として、抗体を挙げることができる。本発明の抗体の好ましい例として、IgG抗体を挙げることができる。抗体としてIgG抗体を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのアイソタイプサブクラスのIgGを用いることが可能である。また、本発明の抗原結合分子には抗体の定常領域が含まれていてもよく、定常領域部分にアミノ酸変異を導入しても良い。導入するアミノ酸変異は、例えば、Fcγレセプターへの結合を増大あるいは低減させたものProcNatlAcadSciUSA2006Mar14103400510等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、IgG2などの適切な定常領域を選択することによって、pH依存的な結合を変化させることも可能である。本発明が対象とする抗原結合分子が抗体の場合、抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えばキメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、二種特異性抗体、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片を含むポリペプチドなどであってもよい。キメラ抗体とは、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体である。キメラ抗体の具体的な例としては、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変V領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常C領域からなる抗体を挙げることができる。ヒト化抗体とは、再構成reshapedヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域CDRcomplementaritydeterminingregionをヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知であるKabatetalSequenceofProteinsofImmunologicalInterestNationalInstituteofHealthBethesdaMdChothiaetalNature342877。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である欧州特許出願公開番号EP125023号公報、WO9602576号公報参照。二重特異性抗体は、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいう。二種特異性抗体は2つ以上の異なる抗原を認識する抗体であってもよいし、同一抗原上の異なる2つ以上のエピトープを認識する抗体であってもよい。又、抗体断片を含むポリペプチドとしては、例えば、Fab断片、F2断片、scFvNatBiotechnol2005Sep23112636domainantibodyWO2004058821WO2003002609、scFvFcWO2005037989、dAbFc、Fc融合タンパク質等が挙げられる。Fc領域を含んでいる分子はFc領域をヒトFcRn結合ドメインとして用いることができる。また、これらの分子にヒトFcRn結合ドメインを融合させてもよい。さらに、本発明が適用できる抗原結合分子は、抗体様分子であってもよい。抗体様分子scaffold分子、ペプチド分子とは、ターゲット分子に結合することで機能を発揮するような分子でありCurrentOpinioninBiotechnology200617653658、CurrentOpinioninBiotechnology200718110、CurrentOpinioninStructuralBiology19977463469、ProteinScience2006151427、例えば、DARPinsWO2002020565、AffibodyWO1995001937、AvimerWO2004044011WO2005040229、AdnectinWO2002032925等が挙げられる。これら抗体様分子であっても、標的分子に対してカルシウム濃度依存的に結合し、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させ、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させ、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善させ、1つの抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させることが可能である。また抗原結合分子は、標的に結合するレセプタータンパク質にヒトFcRn結合ドメインが融合されたタンパク質であっても良く、例えば、TNFRFc融合タンパク、IL1RFc融合タンパク、VEGFRFc融合タンパク、CTLA4Fc融合タンパク等NatMed2003Jan94752、BioDrugs20062015160が挙げられる。これらレセプターヒトFcRn結合ドメイン融合タンパク質であっても標的分子に対してカルシウム濃度依存的に結合し、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させ、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させ、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善させ、1つの抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させることが可能である。また抗原結合分子は、標的に結合するが中和効果を有する人工リガンドタンパク質とヒトFcRn結合ドメインの融合タンパク質であっても良く、例えば、人工リガンドタンパク質としては、変異IL6EMBOJ1994Dec1513586370等が挙げられる。これら人工リガンド融合タンパク質であっても標的分子に対してカルシウム濃度依存的に結合し、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させ、抗原結合分子の投与により血漿中の抗原濃度の減少を促進させ、抗原結合分子の血漿中滞留性を改善させ、1つの抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させることが可能である。さらに、本発明の抗体は糖鎖が改変されていてもよい。糖鎖が改変された抗体の例としては、例えば、グリコシル化が修飾された抗体WO9954342など、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体WO0061739、WO0231140、WO2006067847、WO2006067913など、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体WO0279255などなどを挙げることができる。抗原への結合活性を測定する際のイオン化カルシウム濃度以外の条件は、当業者が適宜選択することが可能であり、特に限定されない。例えば、HEPESバッファー、37°Cの条件において測定することが可能である。例えば、BiacoreGEHealthcareなどを用いて測定することが可能である。抗原結合分子と抗原との結合活性の測定は、抗原が可溶型抗原である場合は、抗原結合分子を固定化したチップへ、抗原をアナライトとして流すことで可溶型抗原への結合活性を評価することが可能であり、抗原が膜型抗原である場合は、抗原を固定化したチップへ、抗原結合分子をアナライトとして流すことで膜型抗原への結合活性を評価することが可能である。本発明の抗原結合分子において、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも弱い限り、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の比は特に限定されないが、好ましくは抗原に対する低カルシウム濃度条件下におけるKDDissociationconstant:解離定数と高カルシウム濃度条件下におけるKDの比であるKD/KDの値が2以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が10以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が40以上である。KD/KDの値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。抗原結合活性の値として、抗原が可溶型抗原の場合はKD解離定数を用いることが可能であるが、抗原が膜型抗原の場合は見かけのKDApparentdissociationconstant:見かけの解離定数を用いることが可能である。KD解離定数、および、見かけのKD見かけの解離定数は、当業者公知の方法で測定することが可能であり、例えばBiacoreGEhealthcare、スキャッチャードプロット、フローサイトメーター等を用いることが可能である。また本発明の抗原結合分子において、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の比を示す他の指標として、例えば、解離速度定数であるkdDissociationrateconstant:解離速度定数を用いることも可能である。結合活性の比を示す指標としてKD解離定数の代わりにkd解離速度定数を用いる場合、抗原に対する低カルシウム濃度条件下におけるkd解離速度定数と高カルシウム濃度条件下におけるkd解離速度定数の比であるkdkdの値は、好ましくは2以上であり、さらに好ましくは5以上であり、さらに好ましくは10以上であり、より好ましくは30以上である。kdkdの値の上限は特に限定されず、当業者の技術常識において作製可能な限り、50、100、200等、いかなる値でもよい。抗原結合活性の値として、抗原が可溶型抗原の場合はkd解離速度定数を用いることが可能であり、抗原が膜型抗原の場合は見かけのkdApparentdissociationrateconstant:見かけの解離速度定数を用いることが可能である。kd解離速度定数、および、見かけのkd見かけの解離速度定数は、当業者公知の方法で測定することが可能であり、例えばBiacoreGEhealthcare、フローサイトメーター等を用いることが可能である。なお本発明において、異なるカルシウム濃度における抗原結合分子の抗原結合活性を測定する際は、カルシウム濃度以外の条件は同一とすることが好ましい。低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を得るために、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる弱くする方法カルシウム濃度依存的な抗原結合活性を付与する方法は特に限定されない。低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下した弱い抗原結合分子カルシウム濃度依存的結合を示す抗原結合分子は、例えば、invitroで提示した抗体ライブラリーから上述のような抗原へのカルシウム濃度依存的結合を指標にスクリーニングを行うことによって、直接取得することができる。それ以外の方法として、このような性質を有する抗原結合分子を直接取得する方法が挙げられる。例えば、動物マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス、ヒト免疫グロブリントランスジェニックラット、ヒト免疫グロブリントランスジェニックウサギ、ラマ、ラクダ等へ抗原を免疫して得られた抗体を抗原へのカルシウム濃度依存的結合を指標にスクリーニングを行い、目的の性質を有する抗体を直接取得してもよい。また、抗原結合分子中のアミノ酸配列にランダムな変異を導入し、上述の方法に従って、異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を測定し、改変前の抗原結合分子と比較して、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より、より低いものを選択してもよい。上述の方法等により抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性を高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低下させる弱くするKD/KDの値を大きくする場合、特に限定されないが、KD/KDの値がもとの抗体と比較して通常、2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上となっていることが好ましい。更に、本発明のカルシウム濃度依存的な抗原結合活性を付与する方法は、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を有する抗原結合分子に用いる、あるいは、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する或いは高める方法と組み合わせることで、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる機能、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、あるいは抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する機能を増強することが可能である。中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する或いは高める方法としては、例えば、上述のヒトFcRn結合ドメインのアミノ酸を改変する方法を挙げることができる。ここで、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性とは、pH67~pH100におけるヒトFcRnに対する結合活性を意味し、好ましいヒトFcRn結合活性として、pH70~pH80の間のヒトFcRn結合活性を挙げることができ、より好ましいヒトFcRn結合活性としてpH74におけるヒトFcRn結合活性を挙げることができる。また、更に、本発明のカルシウム濃度依存的な抗原結合活性を付与する方法は、pH依存的な抗原結合活性を有する抗原結合分子に用いる、或いは、pH依存的な抗原結合活性を付与する方法と組み合わせることで、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる機能、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、あるいは抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する機能を増強することが可能である。pH依存的な抗原結合活性を付与する方法としては、例えば、WO2009125825に記載の方法を挙げることができる。具体的には、例えば、本発明のカルシウム濃度依存的な抗原結合分子に、抗原結合分子の酸性pHにおける抗原結合活性を中性pHにおける抗原結合活性よりも低下させる弱くする方法を組合わせて用いることができる。ここで、酸性pHにおける抗原結合活性を中性pHにおける抗原結合活性よりも低下させるとは、抗原結合分子のpH40~pH65での抗原結合活性をpH67~pH100での抗原結合活性より弱くすることを意味する。好ましくは、抗原結合分子のpH55~pH65での抗原結合活性をpH70~pH80での抗原結合活性より弱くすることを意味し、特に好ましくは、抗原結合分子のpH58での抗原結合活性をpH74での抗原結合活性より弱くすることを意味する。本発明において酸性pHとは通常、pH40~pH65であり、好ましくはpH55~pH65であり、特に好ましくはpH58である。又、本発明において中性pHとは通常、pH67~pH100であり、好ましくは、pH70~pH80であり、特に好ましくはpH74である。また、抗原結合分子の酸性pHにおける抗原結合活性を中性pHにおける抗原結合活性よりも低下させるとは、抗原結合分子の中性での抗原結合活性を酸性でのpHにおける抗原結合活性よりも高くすると表現することもできる。つまり、本発明においては、抗原結合分子の酸性pHにおける抗原結合活性と中性pHにおける抗原結合活性の差を大きくすればよい例えば、後述のようにKD/KDの値を大きくすればよい。抗原結合分子の酸性pHにおける抗原結合活性と中性pHにおける抗原結合活性の差を大きくするためには、例えば、酸性pHにおける抗原結合活性を低くしてもよいし、中性pHにおける抗原結合活性を高くしてもよいし、又は、その両方でもよい。本発明において、酸性pHにおける抗原結合活性が中性pHにおける抗原結合活性よりも弱い限り、酸性pHにおける抗原結合活性と中性pHにおける抗原結合活性の差は特に限定されないが、好ましくは抗原に対するpH58でのKDとpH74でのKDDissociationconstant:解離定数の比であるKD/KDの値が2以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が10以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が40以上である。KD/KDの値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。また、酸性pHにおける抗原結合活性と中性pHにおける抗原結合活性の差を示す他の指標として、例えば、解離速度定数であるkdDissociationrateconstant:解離速度定数を用いることも可能である。結合活性の差を示す指標としてKD解離定数の代わりにkd解離速度定数を用いる場合、抗原に対するpH58でのkd解離速度定数とpH74でのkd解離速度定数の比であるkdkdの値は、好ましくは2以上であり、さらに好ましくは5以上であり、さらに好ましくは10以上であり、より好ましくは30以上である。kdkdの値の上限は特に限定されず、当業者の技術常識において作製可能な限り、50、100、200等、如何なる値でもよい。pH依存的な抗原結合活性を付与する方法は特に限定されず、例えば抗原結合分子中の少なくとも1つのアミノ酸をヒスチジンに置換する、又は抗原結合分子中に少なくとも1つのヒスチジンを挿入することによりpH58における抗原結合活性をpH74における抗原結合活性より弱くする方法を挙げることができる。抗体中のアミノ酸をヒスチジンで置換することによりpH依存性の抗原結合活性を抗体に付与できることは既に知られているFEBSLetter3098588。本発明では、抗原結合分子に対して、ヒスチジン変異置換又は挿入が導入される行われる位置は特に限定されず、変異又は挿入前と比較してpH58における抗原結合活性がpH74における抗原結合活性より弱くなるKD/KDの値が大きくなる限り、いかなる部位でもよい。例えば、抗原結合分子が抗体の場合には、抗体の可変領域などを挙げることができる。ヒスチジン変異又は挿入が導入される行われる数は当業者が適宜決定することができ、1箇所のみをヒスチジンで置換してもよいし、又は1箇所のみにヒスチジンを挿入してもよいし、2箇所以上の複数箇所をヒスチジンで置換してもよいし、又は2箇所以上の複数箇所にヒスチジンを挿入してもよい。又、ヒスチジン変異以外の変異ヒスチジン以外のアミノ酸への変異を同時に導入してもよい。さらに、ヒスチジン変異とヒスチジン挿入を同時に行ってもよい。ヒスチジンへの置換又はヒスチジンの挿入は当業者に公知のアラニンscanningのアラニンをヒスチジンに置き換えたヒスチジンscanningなどの方法によりランダムに行ってもよく、ヒスチジン変異又は挿入がランダムに導入された抗原結合分子ライブラリーの中から、変異前と比較してKD/KDの値が大きくなった抗原結合分子を選択してもよい。抗原結合分子に対し、少なくとも1つのアミノ酸をヒスチジンに置換する、又は抗原結合分子アミノ酸に少なくとも1つのヒスチジンを挿入する場合、特に限定されないが、ヒスチジン置換又は挿入後の抗原結合分子のpH74における抗原結合活性が、ヒスチジン置換又は挿入前の抗原結合分子のpH74における抗原結合活性と同等であることが好ましい。ここで、ヒスチジン置換又は挿入後の抗原結合分子のpH74における抗原結合活性が、ヒスチジン置換又は挿入前の抗原結合分子のpH74における抗原結合活性と同等であるとは、ヒスチジン置換又は挿入後の抗原結合分子が、ヒスチジン置換又は挿入前の抗原結合分子が有する抗原結合活性の10以上、好ましくは50以上、さらに好ましくは80以上、より好ましくは90以上を維持していることを言う。ヒスチジン置換又は挿入により抗原結合分子の抗原結合活性が低くなった場合には、抗原結合分子中の1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入などにより抗原結合活性をヒスチジン置換又は挿入前の抗原結合活性と同等にしてもよい。本発明においては、そのようなヒスチジン置換又は挿入後に1又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加及び/又は挿入を行うことにより結合活性が同等となった抗原結合分子も含まれる。また、抗原結合分子のpH58における抗原結合活性をpH74における抗原結合活性より弱くする他の方法として、抗原結合分子中のアミノ酸を非天然型アミノ酸に置換する方法、又は抗原結合分子中のアミノ酸に非天然型アミノ酸を挿入する方法を挙げることができる。非天然アミノ酸は人為的にpKaをコントロールすることができることが知られているAngewChemIntEd20054434、ChemSocRev2004Sep103342230、AminoAcids19991634579。従って、本発明においては上述のヒスチジンの代わりに非天然型アミノ酸を用いることも可能である。又、上述のヒスチジン置換及び/又は挿入と、非天然型アミノ酸の置換及び/又は挿入は、同時に行ってもよい。本発明で用いられる非天然型アミノ酸はいかなる非天然型アミノ酸でもよく、当業者に公知の非天然型アミノ酸等を用いることが可能である。さらに、抗原結合分子が抗体定常領域を含む物質である場合、抗原結合分子のpH58における抗原結合活性をpH74における抗原結合活性より弱くする他の方法として、抗原結合分子に含まれる抗体定常領域を改変する方法を挙げることができる。このような抗体定常領域の改変の具体例としては、例えばWO2009125825に記載の定常領域を置換する方法を挙げることが出来る。また、抗体定常領域の改変方法としては、例えば、定常領域のアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4を複数検討し、pH58における抗原結合活性が低下するpH58における解離速度が速くなるアイソタイプを選択する方法が挙げられる。さらに野生型アイソタイプのアミノ酸配列野生型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4アミノ酸配列にアミノ酸置換を導入することで、pH58における抗原結合活性を低下させるpH58における解離速度が速くする方法が挙げられる。アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4によって抗体定常領域のヒンジ領域の配列が大きく異なり、ヒンジ領域のアミノ酸配列の違いは抗原結合活性に大きく影響を与えるため、抗原やエピトープの種類によって適切なアイソタイプを選択することでpH58における抗原結合活性が低下するpH58における解離速度が速くなるアイソタイプを選択することが可能である。また、ヒンジ領域のアミノ酸配列の違いは抗原結合活性に大きく影響を与えることから、野生型アイソタイプのアミノ酸配列のアミノ酸置換箇所としては、ヒンジ領域が望ましいと考えられる。上述の方法等により、抗原結合物質のpH58における抗原結合活性をpH74における抗原結合活性より弱くするKD/KDの値を大きくする場合、特に限定されないが、KD/KDの値が、もとの抗体と比較して通常、2倍以上、好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上となっていることが好ましい。抗原結合分子さらに、本発明は2つの異なるカルシウム濃度条件下における抗原結合活性が異なり、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を提供する。本発明は好ましくはイオン化カルシウム濃度01μM~30μMの低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、イオン化カルシウム濃度100μM~10mMの高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子を提供する。より具体的には、生体内の早期エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度における抗原結合活性が、生体内の血漿中のイオン化カルシウム濃度における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子を挙げることができる。本発明の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子は、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下での抗原結合活性より低い限り、その結合活性の差は限定されず、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性がわずかでも低ければよい。本発明の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子の好ましい態様として、低カルシウム濃度条件下におけるKDと高カルシウム濃度条件下におけるKDの比であるKD/KDの値が2以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が10以上であり、さらに好ましくはKD/KDの値が40以上である。KD/KDの値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、400、1000、10000等、いかなる値でもよい。さらに本発明の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子の他の好ましい態様として、抗原に対する低カルシウム濃度条件下でのkdとpH74でのkdの比であるkd/kdの値が2以上であり、さらに好ましくはkd/kdの値が5以上であり、さらに好ましくはkd/kdの値が10以上であり、さらに好ましくはkd/kdの値が30以上である。kd/kdの値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、50、100、200等、いかなる値でもよい。本発明の抗原結合分子は、さらに、上述の中性pH条件下におけるヒトFcRn結合活性を有していても良い。当該中性pH条件下におけるヒトFcRn結合活性と、カルシウム濃度依存的な抗原結合活性とを組み合わせることで、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる機能、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、または抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する機能を増強することが可能である。また、本発明の抗原結合分子は、さらに、上述のpH依存的な抗原結合活性、すなわち酸性pH条件下における抗原結合活性が中性pH条件下における抗原結合活性よりも低いという抗原結合活性を有していても良い。当該pH依存的な抗原結合活性と、カルシウム濃度依存的な抗原結合活性とを組み合わせることで、抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる機能、抗原結合分子の投与による血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、または抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する機能を増強することが可能である。また、本発明の抗原結合分子は低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い限り、他にどのような性質を有していてもよく、例えばアゴニスト抗原結合分子やアンタゴニスト抗原結合分子などであってもよい。本発明の好ましい抗原結合分子の例としてアンタゴニスト抗原結合分子を挙げることができる。アンタゴニスト抗原結合分子は通常、リガンドアゴニストと受容体の結合を阻害し、受容体を介した細胞内へのシグナル伝達を阻害する抗原結合分子である。またpH依存的な抗原結合活性が付与された抗原結合分子は、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換され、又は少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていてもよい。また、本発明の抗原結合分子が結合する抗原は特に限定されず、いかなる抗原に結合してもよい。例えば、受容体蛋白質膜結合型受容体、可溶型受容体や細胞表面マーカーなどの膜抗原、サイトカインなどの可溶型抗原などを挙げることができる。その他の抗原の具体的な例としては、上述の通りである。スクリーニング方法本発明は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子をスクリーニングする方法を提供する。また、i抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、ii抗原に2回以上結合する機能、iii血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、およびiv優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。具体的には、本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;抗原を固定したカラムに高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを接触させる工程、前記工程でカラムに結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下でカラムから溶出する工程、前記工程で溶出された抗原結合分子を取得する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;抗原を固定したカラムに低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを通過させる工程、前記工程でカラムに結合せずに溶出した抗原結合分子を回収する工程、前記工程で回収された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で抗原結合活性が、前記工程で選択した基準より弱い抗原結合分子を取得する工程。なお、これらの工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は、上述のスクリーニング方法において、~あるいは~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含むスクリーニング方法を提供する。~あるいは~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。本発明のスクリーニング方法において、低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性は、イオン化カルシウム濃度が01μM~30μMの間の抗原結合活性であれば特に限定されないが、好ましいイオン化カルシウム濃度として、05μM~10μMの間の抗原結合活性を挙げることができる。より好ましいイオン化カルシウム濃度として、生体内の早期エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度が挙げられ、具体的には1μM~5μMにおける抗原結合活性を挙げることができる。また、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性は、イオン化カルシウム濃度が100μM~10mMの間の抗原結合活性であれば特に限定されないが、好ましいイオン化カルシウム濃度として200μM~5mMの間の抗原結合活性を挙げることができる。より好ましいイオン化カルシウム濃度として、生体内の血漿中でのイオン化カルシウム濃度を挙げることができ、具体的には05mM~25mMにおける抗原結合活性を挙げることができる。抗原結合分子の抗原結合活性は当業者に公知の方法により測定することが可能であり、イオン化カルシウム濃度以外の条件については当業者が適宜決定することが可能である。抗原結合分子の抗原結合活性は、KDDissociationconstant:解離定数、見かけのKDApparentdissociationconstant:見かけの解離定数、解離速度であるkdDissociationrate:解離速度定数、又は見かけのkd等として評価することが可能である。これらは当業者公知の方法で測定することが可能であり、例えばBiacore、スキャッチャードプロット、FACS等を用いることが可能である。本発明において、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より高い抗原結合分子を選択する工程は、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程と同じ意味である。高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より高い限り、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の差は特に限定されないが、好ましくは高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の2倍以上であり、さらに好ましくは10倍以上であり、より好ましくは40倍以上である。本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされる抗原結合分子はいかなる抗原結合分子でもよく、例えば上述の抗原結合分子をスクリーニングすることが可能である。例えば、天然の配列を有する抗原結合分子をスクリーニングしてもよいし、アミノ酸配列が置換された抗原結合分子をスクリーニングしてもよい。本発明のスクリーニング方法でスクリーニングされる抗原結合分子はどのように調製されてもよく、例えば、あらかじめ存在している抗体、あらかじめ存在しているライブラリーファージライブラリー等、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体又はライブラリー、これらの抗体やライブラリーにカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸や非天然アミノ酸変異を導入した抗体又はライブラリーカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸又は非天然アミノ酸の含有率を高くしたライブラリーや特定箇所にカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸又は非天然アミノ酸変異を導入したライブラリー等などを用いることが可能である。本発明のスクリーニング方法により、ヒト、マウス、サルなどの動物に投与した際に、i抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、ii抗原に2回以上結合する機能、iii血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及びiv優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得ることが可能である。従って、本発明のスクリーニング方法は、これらの機能のうち少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得る為のスクリーニング方法として利用することができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られるこれらの抗原結合分子は、患者への投与量や投与頻度を減らすことが可能であり、結果として総投与量を減らすことが可能となる為、医薬品として特に優れていると考えられる。従って、本発明のスクリーニング方法は、医薬組成物として用いる為の抗原結合分子のスクリーニング方法として利用することが可能である。抗原結合分子の製造方法本発明は、抗原結合分子の低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子の製造方法を提供する。また、i抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、ii抗原に2回以上結合する機能、iii血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、および、iv優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子の製造方法を提供する。具体的には、本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性を得る工程、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で解離した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。なお、~の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合しない抗原結合分子を選択する工程、前記工程で選択された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。なお、~の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。さらに、本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;抗原を固定したカラムに高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを接触させる工程、前記工程でカラムに結合した抗原結合分子を、低カルシウム濃度条件下でカラムから溶出する工程、前記工程で溶出された抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。なお、~の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;抗原を固定したカラムに低カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを通過させる工程、前記工程でカラムに結合せずに溶出した抗原結合分子を回収する工程、前記工程で回収された抗原結合分子を高カルシウム濃度条件下で抗原に結合させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。なお、~の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は上述の方法において、~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。さらに本発明は以下の工程~を含む抗原結合分子の製造方法を提供する;高カルシウム濃度条件下で抗原結合分子又は抗原結合分子ライブラリーを抗原に接触させる工程、前記工程で抗原に結合した抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得した抗原結合分子を低カルシウム濃度条件下に置く工程、前記工程で抗原結合活性が、前記工程で選択した基準より弱い抗原結合分子を取得する工程、前記工程で取得された抗原結合分子をコードする遺伝子を得る工程、前記工程で得られた遺伝子を用いて抗原結合分子を産生する工程。なお、~の工程は2回以上繰り返されてもよい。従って、本発明は、上述の方法において、~の工程を2回以上繰り返す工程をさらに含む方法を提供する。~の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。本発明の製造方法で用いられる抗原結合分子はどのように調製されてもよく、例えば、あらかじめ存在している抗体、あらかじめ存在しているライブラリーファージライブラリー等、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体又はライブラリー、ライブラリーにカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸や非天然アミノ酸変異を導入した抗体又はライブラリーカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸又は非天然アミノ酸の含有率を高くしたライブラリーや特定箇所にカルシウムをキレート可能なアミノ酸例えばアスパラギン酸やグルタミン酸又は非天然アミノ酸変異を導入したライブラリー等などを用いることが可能である。上述の製造方法において、低カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性は、イオン化カルシウム濃度が01μM~30μMの間の抗原結合活性であれば特に限定されないが、好ましいイオン化カルシウム濃度として、05μM~10μMの間の抗原結合活性を挙げることができる。より好ましいイオン化カルシウム濃度として、生体内の早期エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度が挙げられ、具体的には1μM~5μMにおける抗原結合活性を挙げることができる。また、高カルシウム濃度条件下における抗原結合分子の抗原結合活性は、イオン化カルシウム濃度が100μM~10mMの間の抗原結合活性であれば特に限定されないが、好ましいイオン化カルシウム濃度として200μM~5mMの間の抗原結合活性を挙げることができる。より好ましいイオン化カルシウム濃度として、生体内の血漿中でのイオン化カルシウム濃度を挙げることができ、具体的には05mM~25mMにおける抗原結合活性を挙げることができる。抗原結合分子の抗原結合活性は当業者に公知の方法により測定することが可能であり、イオン化カルシウム濃度以外の条件については当業者が適宜決定することが可能である。高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より高い抗原結合分子を選択する工程は、低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より低い抗原結合分子を選択する工程と同じ意味である。高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性より高い限り、高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性と低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の差は特に限定されないが、好ましくは高カルシウム濃度条件下における抗原結合活性が低カルシウム濃度条件下における抗原結合活性の2倍以上であり、さらに好ましくは10倍以上であり、より好ましくは40倍以上である。上述の製造方法において抗原と抗原結合分子の結合はいかなる状態で行われてもよく、特に限定されない。例えば、固定化された抗原結合分子に抗原を接触させることにより抗原結合分子と抗原を結合させてもよいし、固定化された抗原に抗原結合分子を接触させることにより抗原結合分子と抗原を結合させてもよい。又、溶液中で抗原結合分子と抗原を接触させることにより抗原結合分子と抗原を結合させてもよい。さらに本発明の製造方法は、上述の中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を有する抗原結合分子に用いることもできるし、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する或いは高める方法と組み合わせることもできる。本発明の製造方法に中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する或いは高める方法を組み合わせる場合には、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、中性pH条件下におけるヒトFcRn結合活性を付与する或いは高める工程を更に含んでもよい。また、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を有する抗原結合分子のヒトFcRn結合ドメインとしては、上述の中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を有するヒトFcRn結合ドメインを好ましい例として挙げることができる。従って、本発明の製造方法においては、予め中性pHにおけるヒトFcRn結合活性が高いヒトFcRn結合ドメインを有する抗原結合分子を選択する、およびまたは、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、中性pHにおけるヒトFcRn結合活性を付与する若しくは高める工程を更に含んでもよい。さらに本発明の製造方法は、上述のpH依存的な抗原結合活性を有する抗原結合分子に用いることもできるし、pH依存的な抗原結合活性を付与する方法WO2009125825と組み合わせることもできる。本発明の製造方法にpH依存的な抗原結合活性を付与する方法を組み合わせる場合には、予め酸性pH条件下における抗原結合活性が中性pH条件下における抗原結合活性よりも低い抗原結合分子を選択する、およびまたは、抗原結合分子中のアミノ酸を改変し、酸性pH条件下における抗原結合活性を中性pH条件下における抗原結合活性よりも低下させる工程を更に含んでもよい。また、pH依存的な抗原結合活性を有する抗原結合分子としては、抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換された又は少なくとも1つのヒスチジンが挿入された抗原結合分子を好ましい例として挙げることができる。従って、本発明の製造方法においては、抗原結合分子として少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換された又は少なくとも1つのヒスチジンが挿入された抗原結合分子を用いる、或いは、抗原結合分子の少なくとも1つのアミノ酸をヒスチジンに置換又は少なくとも1つのヒスチジンを挿入する工程を更に含んでもよい。なお、本発明の製造方法においてはヒスチジンの代わりに非天然アミノ酸を用いてもよい。従って、上述のヒスチジンを非天然アミノ酸と置き換えて本発明を理解することも可能である。本発明の製造方法により、ヒト、マウス、サルなどの動物に投与した際に、i抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、ii抗原に2回以上結合する機能、iii血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及びiv優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を製造することが可能である。従って、本発明の製造方法は、これらの機能のうち少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子を得る為の製造方法として利用することができる。また、これらの抗原結合分子は、患者への投与量や投与頻度を減らすことが可能であり、結果として総投与量を減らすことが可能となる為、医薬品として特に優れていると考えられる。従って、本発明の製造方法は、医薬組成物として用いる為の抗原結合分子の製造方法として利用することが可能である。本発明の製造方法において得られた遺伝子は、通常、適当なベクターへ担持挿入され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクターStratagene社製などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明の抗原結合分子を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内で抗原結合分子を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクタープロメガ社製、大腸菌であればpETベクターInvitrogen社製、培養細胞であればpME18SFL3ベクターGenBankAccessionNoAB009864、生物個体であればpME18SベクターMolCellBiol8466472などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができるCurrentprotocolsinMolecularBiologyeditAusubeletalPublishJohnWileySons.Section1141111。上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。抗原結合分子を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞例:ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、真菌細胞例:酵母、アスペルギルス、昆虫細胞例:ドロソフィラS2、スポドプテラSF9、動物細胞例:CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法CurrentprotocolsinMolecularBiologyeditAusubeletalPublishJohnWileySons.Section9199、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。宿主細胞の培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清FCS等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のpHは、約6~8とするのが好ましい。培養は、通常、約30~40°Cで約15~200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。宿主細胞において発現した抗原結合分子を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的の抗原結合分子に対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。一方、invivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における宿主とは、これらの動物、植物を包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができるVickiGlaserSPECTRUMBiotechnologyApplications。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。例えば、本発明の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むポリヌクレオチド断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗原結合分子を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される抗原結合分子を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに投与してもよいEbertetalBioTechnology12699702。また、本発明の抗原結合分子を産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗原結合分子を得ることができる。さらに、植物を本発明の抗原結合分子産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナタバカムNicotianatabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗原結合分子を得ることができるMaetalEurJImmunol241318。また、同様のバクテリアをウキクサLemnaminorに感染させ、クローン化した後にウキクサの細胞より所望の抗原結合分子を得ることができるCoxKMetalNatBiotechnol2006Dec2415911597。このようにして得られた抗原結合分子は、宿主細胞内または細胞外培地、乳汁などから単離し、実質的に純粋で均一な抗原結合分子として精製することができる。抗原結合分子の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて抗原結合分子を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられるStrategiesforProteinPurificationandCharacterizationALaboratoryCourseManualEdDanielRMarshaketalColdSpringHarborLaboratoryPress。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、HyperDPOROSSepharoseFF等が挙げられる。必要に応じ、抗原結合分子の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。医薬組成物また本発明は、本発明の抗原結合分子、本発明のスクリーニング方法により単離された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。本発明の抗原結合分子、本発明のスクリーニング方法により単離された抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子は、i抗原の細胞内への取込みを促進させる機能、ii抗原に2回以上結合する機能、iii血漿中の抗原濃度の減少を促進させる機能、及びiv優れた血漿中滞留性機能、から選ばれる少なくとも1つの機能を有する抗原結合分子であって、抗原結合分子の投与頻度を減らせることが期待されるので医薬組成物として有用である。また、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査診断のための薬剤を言う。本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬例えばDソルビトール、Dマンノース、Dマンニトール、塩化ナトリウムを含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコールエタノール等、ポリアルコールプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等、非イオン性界面活性剤ポリソルベート80TM、HCO50等を併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤例えば、塩酸プロカイン、安定剤例えば、ベンジルアルコール及びフェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗原結合分子を含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1kgあたり00001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0001~100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。また本発明の医薬組成物は、抗原の細胞内への取込みを促進させるため、または血漿中の抗原濃度の減少を促進させるために用いられる医薬組成物であることができる。また本発明は、本発明の抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を投与することにより、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、または血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法に関する。投与は、invivoあるいはinvitroのどちらで行われてもよい。投与対象としては、例えば非ヒト動物マウス、サルなど、あるいはヒトなどを挙げることができる。また本発明は、本発明の抗原結合分子、または本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を用いることにより、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法、または抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法に関する。なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾であるを受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。また本発明は、少なくとも本発明の抗原結合分子を含む、本発明の方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。また本発明は、本発明の抗原結合分子もしくは本発明の製造方法により製造された抗原結合分子を有効成分として含有する、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込み促進剤、血漿中の抗原濃度の減少促進剤、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数増加剤、または抗原結合分子の血漿中滞留性改善剤に関する。また本発明は、本発明の抗原結合分子もしくは本発明の製造方法により製造された抗原結合分子の、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込み促進剤、血漿中の抗原濃度の減少促進剤、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数増加剤、または抗原結合分子の血漿中滞留性改善剤の製造における使用に関する。また本発明は、抗原結合分子による抗原の細胞内への取込みを促進させる方法、血漿中の抗原濃度の減少を促進させる方法、1分子の抗原結合分子による抗原への結合回数を増加させる方法、または抗原結合分子の血漿中滞留性を改善する方法に使用するための、本発明の抗原結合分子もしくは本発明の製造方法により製造された抗原結合分子に関する。なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。実施例1カルシウム依存的抗原結合抗体の抗原消失加速効果のコンセプト1-1pH依存的結合抗体の抗原結合抗体による抗原消失加速効果WO2009125825に記載されているH54L28IgG1はヒト化抗IL6レセプター抗体であり、Fv4IgG1は、H54L28IgG1に対して可溶型ヒトIL6レセプターへpH依存的に結合する特性中性条件下において結合し、酸性条件下において解離するを付与したヒト化抗IL6レセプター抗体である。WO2009125825に記載されているマウスのinvivo試験において、H54L28IgG1と抗原である可溶型ヒトIL6レセプターの混合物を投与した群と比較して、Fv4IgG1と抗原である可溶型ヒトIL6レセプターの混合物を投与した群において、可溶型ヒトIL6レセプターの消失を大幅に加速できることが示された。通常の可溶型ヒトIL6レセプターに結合する抗体に結合した可溶型ヒトIL6レセプターは、抗体とともにFcRnによって血漿中にリサイクルされるのに対して、pH依存的に可溶型ヒトIL6レセプターに結合する抗体は、エンドソーム内の酸性条件下において抗体に結合した可溶型ヒトIL6レセプターを解離する。解離した可溶型ヒトIL6レセプターはライソソームによって分解されるため、可溶型ヒトIL6レセプターの消失を大幅に加速することが可能となり、さらにpH依存的に可溶型ヒトIL6レセプターに結合する抗体はFcRnによって血漿中にリサイクルされ、リサイクルされた抗体は再び可溶型ヒトIL6レセプターに結合することができ、これが繰り返されることによってひとつの抗体分子が複数回繰り返し可溶型ヒトIL6レセプターに結合することが可能となる図1。また、WO2009125825に記載されているとおり、通常のヒト化抗IL6レセプター抗体は、膜型ヒトIL6レセプターに結合後、ヒト化抗IL6レセプター抗体と膜型ヒトIL6レセプターの複合体の状態でインターナライズされ、その後ライソソームにて分解される。それに対して、pH依存的に結合するヒト化抗IL6レセプター抗体は、膜型ヒトIL6レセプターに結合しインターナライズされた後、エンドソーム内の酸性条件下において膜型ヒトIL6レセプターから解離することで血漿中にリサイクルされる。このようにリサイクルされた抗体は再び膜型ヒトIL6レセプターに結合することができ、これが繰り返されることによってひとつの抗体分子が複数回繰り返し膜型ヒトIL6レセプターに結合することが可能となる図2。1-2血漿中およびエンドソーム中におけるpHおよびカルシウム濃度図1および図2に示したpH依存的結合抗体による作用においては、血漿中とエンドソーム内の環境の違い、すなわちpHの違い血漿中:pH74、エンドソーム内:pH60を利用して、血漿中では抗原に強く結合させ、エンドソーム内では抗原から解離させることが重要である。血漿中とエンドソーム内でpH依存的結合抗体の抗原への結合能にこのような差異を作りだすためには、血漿中とエンドソーム内の環境の違いの大きさが重要である。pHの違いはすなわち水素イオン濃度の違いである。つまり、pH74の血漿中の水素イオン濃度は約40nMであり、pH60のエンドソーム内の水素イオン濃度は約1000nMであり、血漿中とエンドソーム内で因子水素イオンの濃度に約25倍の違いがある。図1および図2に示した作用をより容易に達成するため、あるいは、その作用を増強するためには、血漿中とエンドソーム内の水素イオン濃度の違いより、濃度の違いが大きい因子に依存する抗体を使用すれば良いと考えられた。血漿中とエンドソーム内で濃度の違いが大きい因子を探索した結果、カルシウムが見出された。血漿中のイオン化カルシウム濃度は1113mM程度であり、エンドソーム内のイオン化カルシウム濃度は3μM程度であり、血漿中とエンドソーム内で因子カルシウムの濃度に約400倍の違いがあり、その差は水素イオン濃度差よりも大きいことが見出された。すなわち、高カルシウム濃度条件下1113mMにおいて抗原に結合し、低カルシウム濃度条件下3μMにおいて抗原から解離するようなイオン化カルシウム濃度依存的結合抗体を用いることで、図1および図2に示した作用をより容易に達成できる、あるいは、その作用を増強することができると考えられた。また、WO2009125825において、ヒスチジンを導入することにより、pH74とpH60で性質が変化するpH依存的結合抗体を作製している。ヒスチジンは血漿中の中性条件下では中性電荷であるが、エンドソーム内の酸性条件下では正電荷を有する。このヒスチジンの電荷の変化を利用して、抗体と抗原の相互作用にpH依存性を付与することが可能である。一方で、図3に示すように、ヒスチジンを用いる場合、血漿中で抗原に結合し、エンドソーム内で抗原から解離するためには、抗体のヒスチジン残基は、抗原の正電荷のアミノ酸あるいは水素結合のドナーとなりうるアミノ酸と相互作用している必要があるため、目的の作用を発揮するためのpH依存的結合抗体が結合する抗原側のエピトープは正電荷のアミノ酸あるいは水素結合のドナーとなりうるアミノ酸を有する必要がある。一方、図4に示すように、カルシウム依存的結合抗体は、カルシウムイオンを介して抗原に結合すると考えられるため、抗原側のエピトープはカルシウムイオンをキレート可能な負電荷のアミノ酸あるいは水素結合アクセプターとなりうるアミノ酸であるため、ヒスチジンを導入して作製されたpH依存的結合体ではターゲットすることができないエピトープをターゲットすることが可能である。さらに、図5に示すように、カルシウム依存性とpH依存性を併せ持つ抗体を用いることで、幅広い性質を有するエピトープをターゲットすることが可能となると考えられる。実施例2ファージディスプレイ技術を用いたヒト抗体ライブラリーからのCa依存的結合抗体の取得2-1naiveヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの作製ヒトPBMCから作成したpolyARNAや、市販ヒトpolyARNAなどをtemplateとして、MethodsMolBiol200217887100に習い、ヒト抗体配列からなるFabドメインを提示する複数のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを構築した。2-2ビーズパンニングによるライブラリーからのCa依存的結合抗体断片の取得構築したヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからの最初の選抜は、抗原への結合能をもつ抗体断片のみを濃縮、もしくはCa依存的結合能を指標に濃縮させた。Ca依存的結合能をもつ抗体断片を濃縮させる場合には、Caイオン存在下で抗原と結合させた後、EDTAによりCaイオンをキレートすることによりファージの溶出を行った。抗原として、ビオチン標識したヒトIL6レセプターを用いた。上記のように構築したファージディスプレイ用phagemidを保持した大腸菌からファージ産生を行い、得られた培養液を25MNaCl10PEGにより沈殿させた後TBSにて希釈しファージライブラリー液とした。ファージライブラリー液にBSACaCl2を添加し、終濃度4BSAイオン化カルシウム濃度12mMとなるよう調製した。パンニングは、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法を参考としたJImmunolMethods2008Mar2033229、JImmunolMethods2001Jan1247191203、BiotechnolProg2002MarApr1821220、MolCellProteomics2003Feb2619。磁気ビーズにはNeutrAvidincoatedbeadsもしくはStreptavidincoatedbeadsを用いた。具体的には、調製したファージライブラリー液に250pmolのビオチン標識抗原を加え、室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングした磁気ビーズを加え、室温で15分間結合させた。ビーズを1mLの12mMCaCl2TBSにて1回洗浄した。その後、結合能を持つ抗体断片を濃縮する場合には、一般的な方法で溶出を行い、Ca依存的結合能を持つ抗体断片を濃縮する場合には、2mMEDTATBSにビーズを懸濁し、ファージを回収した。回収したファージ溶液に、対数増殖期となった大腸菌株TG110mLを添加し、37°C、1hr緩やかに攪拌培養を行うことにより感染させた。感染させた大腸菌を、225mmx225mmのプレートへプレーティングした。再度この大腸菌から培養を開始し、ファージの培養を行った。2回目以降のパンニングでは、Ca依存的結合能を指標に濃縮を行った。具体的には、調製したファージライブラリー液に40pmolのビオチン標識抗原を加え、室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングした磁気ビーズを加え、室温で15分間結合させた。ビーズを1mLの12mMCaCl2TBSTと12mMCaCl2TBSにて1回ずつ洗浄した。その後01mLの2mMEDTATBSを加えビーズを室温で懸濁し、即座にMagnetStandを用いビーズを分離し、ファージ溶液を回収した。回収したファージ溶液を、対数増殖期となった大腸菌株TG110mLに添加、37°C、1hr緩やかに攪拌培養を行うことにより感染させた。感染させた大腸菌を225mmx225mmのプレートへプレーティングした。再度この大腸菌から培養を開始し、上記と同様にファージの培養を行い、パンニングを2回繰り返した。2-3ファージELISAによる評価上記の方法により得られた大腸菌シングルコロニーから、MethodsMolBiol2002178133145に習い、ファージ含有培養上清を回収した。ファージ含有培養上清に終濃度4BSAカルシウムイオン濃度12mMとなるようBSA、CaCl2を加え、ELISAに供した。StreptaWell96マイクロタイタープレートをビオチン標識抗原を含むPBS100μLにて一晩コートした。PBSTにて洗浄し、抗原を除いた後、4BSATBS250μLにて1時間以上ブロッキングした。4BSATBSを除き、ここに調製した培養上清を加え37°Cで1時間静置しファージ提示抗体を結合させた。12mMCaCl2TBSTにて洗浄後、12mMCaCl2TBSもしくは1mMEDTATBSを加え37°Cで30分間静置しインキュベートした。12mMCaCl2TBSTにて洗浄後、4BSAイオン化カルシウム濃度12mMとしたTBSにて希釈したHRP結合抗M13抗体を1時間インキュベートさせた。12mMCaCl2TBSTにて洗浄後、TMBsinglesolutionで検出し、硫酸の添加により反応を停止した後、450nmの吸光度を測定した。Ca依存的結合能があると判断した抗体断片に対し、特異的なプライマーを用いて塩基配列解析を行った。2-4抗体の発現と精製ファージELISAにより、Ca依存的結合能があると判断されたクローンについて、動物細胞発現用プラスミドへの導入を行った。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenをFreeStyle293ExpressionMedium培地へ懸濁し、133×106個mLの細胞密度で6wellplateの各ウェルへ3mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター37度、8CO290rpmで4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出したProteinScience1995424112423。実施例3取得された抗体のヒトIL6レセプターに対するCa依存的結合能の評価実施例2で取得された抗体6RL9IgG1重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:2、6RK12IgG1重鎖配列番号:66、軽鎖配列番号:67及び、FH4IgG1重鎖配列番号:3、軽鎖配列番号:4を、BiacoreT100GEHealthcareを用いてpH74でヒトインターロイキン6レセプター結合活性が評価された。ランニングバッファーとして3μMもしくは2mMCaCl2を含有する005SurfactantP2010mmollACES150mmollNaClpH74もしくはpH60を用いて測定を行った。SensorchipCM4上にアミノカップリング法で組換え型プロテインAThermoScientificを適当量固定化した後、抗体を結合させた。アナライトとして適切な濃度のhIL6Rをインジェクトし、センサーチップ上の抗体と相互作用させた。その後、10mmolLGlycineHClをインジェクトし、センサーチップを再生した。測定は37°Cで行った。測定した結果、得られたセンサーグラムを図6に示した。これらの結果から、6RL9IgG1、6RK12IgG1およびFH4IgG1抗体はいずれも、Ca2濃度が3μMの条件下では、Ca2濃度が2mMの条件下の場合と比べて、hIL6Rに対する結合が弱いことが明らかに示された。これらの抗体の中から、Ca依存性を有する抗体として6RL9IgG1重鎖配列番号:1、軽鎖配列番号:2、及び、FH4IgG1重鎖配列番号:3、軽鎖配列番号:4をさらに反応速度論解析を行った。Ca依存性を有さない抗体として、WO2009125825に記載されているH54L28IgG1重鎖配列番号:5、軽鎖配列番号:6を用いた。高カルシウムイオン濃度として、2mMを使用し、低カルシウムイオン濃度の条件として3μMを使用した。抗原はヒトIL6レセプターIL6Rを用いた。SensorchipCM4上にアミンカップリング法でproteinAを適当量固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。ランニングバッファーには10mmolLACES、150mmolLNaCl、005Tween20、2mmolLCaCl2、pH74もしくは10mmolLACES、150mmolLNaCl、005Tween20、3μmolLCaCl2、pH74の2種類を用いた。測定は全て37°Cで実施し、IL6Rの希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。H54L28IgG1に関しては、IL6R希釈液とブランクであるランニングバッファーを流速20μLminで3分間インジェクトし、センサーチップ上にキャプチャーさせた抗体にIL6Rを相互作用させた。その後流速20μLminで10分間ランニングバッファーを流しIL6Rの解離を観察した後、10mmolLGlycineHClpH15を流速30μLminで30秒間インジェクトし、センサーチップを再生した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数ka、および解離速度定数kdを算出し、その値をもとに各抗体のヒトIL6レセプターに対する解離定数KDを算出した。各パラメーターの算出にはBiacoreT100EvaluationSoftwareを用いた。FH4IgG1、6RL9IgG1に関しては、IL6R希釈液とブランクであるランニングバッファーを流速5μLminで15分間インジェクトし、センサーチップ上にキャプチャーさせた抗体にIL6Rを相互作用させた。その後、10mmolLGlycineHClpH15を流速30μLminで30秒間インジェクトし、センサーチップを再生した。測定で得られたセンサーグラムに対してsteadystateaffinitymodelを使って解離定数KDを算出した。各パラメーターの算出にはBiacoreT100EvaluationSoftwareを用いた。この方法により求めた2mMCaCl2存在下における各抗体とIL6Rとの解離定数KDを表7に示す。H54L28IgG1ではCa濃度の違いによるIL6Rに対する結合の違いは観察されなかったが、FH4IgG1、6RL9IgG1では低濃度のCa条件下では結合の著しい減弱が観察された図7、8、9。H54L28IgG1については2mMCa濃度存在下と同様の方法で、Ca濃度が3μMの条件下でのKDを算出することができる。FH4IgG1、6RL9IgG1についてはCa濃度が3μMの場合は、ほぼIL6Rに対する結合が観察されなかったため、上記の方法によるKDの算出は困難であるが、下記の式1を用いることでKDを予測することが可能である。式1上記式1中の各項目の意味を示す;Req定常状態結合レベルSteadystatebindinglevelsRmaxアナライトの表面結合能AnalytebindingcapacityofthesurfaceRI試料中の容積屈折率寄与BulkrefractiveindexcontributioninthesampleCアナライト濃度AnalyteconcentrationKD平衡解離定数Equilibriumdissociationconstantこの式1を用いて、Ca濃度が3μmolLの場合の予測される各抗体とIL6Rとの解離定数KDを概算した結果を表8に示す。上記表8中、Req、Rmax、RI、Cは測定結果を基に仮定された値である。この結果から、FH4IgG1、6RL9IgG1は、2mMCaCl2から3μMCaCl2にすることで、IL6Rに対するKDがそれぞれ約60倍、約120倍上昇60倍、120倍以上アフィニティーが低減すると予測された。表9にH54L28IgG1、FH4IgG1、6RL9IgG1の3種類の抗体の2mMCaCl2存在下および3μMCaCl2存在下におけるKD値、および、KD値のCa依存性についてまとめた。実施例4取得された抗体へのカルシウムイオン結合評価次に、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価を行うために、示差走査型熱量測定による熱変性中間温度の評価を行った。熱変性中間温度は安定性の指標であり、カルシウムイオンが結合してタンパク質が安定化すると、熱変性中間温度はカルシウムイオンが結合していない場合に比べて高くなることを利用して、抗体へのカルシウムイオンの結合の評価を行った。精製した抗体を20mMTrisHCl150mMNaCl2mMCaCl2pH74、または20mMTrisHCl150mMNaCl3μMCaCl2pH74の溶液に対して透析を行った。タンパク質溶液を透析に用いた溶液で01mgmLに調製し、20°Cから115°Cまで240°Chrの昇温速度でDSC測定を行った。得られたDSCの変性曲線を元に各抗体のFabドメインの熱変性中間温度Tm値を算出し表10に示した。表10の結果からカルシウム依存的結合能を示すFH4および6RL9はカルシウムイオンの濃度によりFabのTm値が変動し、カルシウム依存的結合能を示さないH54L28はTm値が変動しないことが示された。FH4および6RL9で示されたFabのTm値の変動は、これらの抗体にカルシウムイオンが結合し、Fab部分が安定化したことを示している。これにより、FH4および6RL9はカルシウムイオンが結合し、一方でH54L28はカルシウムイオンが結合していないことが示された。実施例5ノーマルマウスを用いたCa依存性結合抗体の抗原の血漿中滞留性への影響評価5-1ノーマルマウスを用いたinvivo試験ノーマルマウスC57BL6Jmouse、CharlesRiverJapanにhsIL6R可溶型ヒトIL6レセプター:参考例1にて作製を単独投与もしくはhsIL6Rおよび抗ヒトIL6レセプター抗体を同時投与した後のhsIL6Rおよび抗ヒトIL6レセプター抗体の体内動態を評価した。hsIL6R溶液、もしくは、hsIL6Rと抗ヒトIL6レセプター抗体の混合溶液を尾静脈に10mLkgで単回投与した。抗ヒトIL6レセプター抗体としては、上述のH54L28IgG1、6RL9IgG1、FH4IgG1を使用した。混合溶液中のhsIL6R濃度は全て5μgmLであるが、抗ヒトIL6レセプター抗体濃度は抗体毎に異なり、H54L28IgG1は01mgmL、6RL9IgG1およびFH4IgG1は10mgmL、このとき、hsIL6Rに対して抗ヒトIL6レセプター抗体は十分量過剰に存在することから、hsIL6Rは大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後15分間、7時間、1日間、2日間、4日間、7日間、14日間、21日間、28日間で採血を行った。採取した血液は直ちに4°C、12000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。5-2ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトIL6レセプター抗体濃度測定マウス血漿中の抗ヒトIL6レセプター抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAntiHumanIgGF2FragmentofAntibodyをNuncImmunoPlateMaxiSoupに分注し、4°Cで1晩静置しAntiHumanIgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として064、032、016、008、004、002、001μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、AntiHumanIgG固相化プレートに分注して25°Cで1時間インキュベーションした。その後BiotinylatedAntihumanIL6RAntibodyRDを25°Cで1時間反応させ、さらにStreptavidinPolyHRP80を25°Cで05時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54L28IgG1、6RL9IgG1、FH4IgG1の血漿中抗体濃度推移を図10に示した。5-3電気化学発光法による血漿中hsIL6R濃度測定マウスの血漿中hsIL6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、625、3125pgmLに調整したhsIL6R検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFOTAGNHSEsterMesoScaleDiscoveryでルテニウム化したMonoclonalAntihumanIL6RAntibodyRDおよびBiotinylatedAntihumanIL6RAntibodyRDおよびトシリズマブ重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:14溶液を混合し4°Cで1晩反応させた。その際のAssaybufferには10mMEDTAが含まれており、サンプル中のFreeCa濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL6Rが6RL9IgG1もしくはFH4IgG1から解離し、添加したトシリズマブと結合した状態とすることを目的とした。その後、MA400PRStreptavidinPlateMesoScaleDiscoveryに分注した。さらに25°Cで1時間反応させ洗浄後、ReadBufferT517180に記載されているように、IgG1に対してアミノ酸置換を導入することによって中性条件下pH74においてマウスFcRnに対する結合が認められるようになった抗体をマウスに投与した場合、抗体の血漿中滞留性が悪化することが報告されている。また、JImmunol2009182766371やJBiolChem2007Jan19282170917やJImmunol2002Nov1169517180に記載されているように、IgG1に対してアミノ酸置換を導入することによって酸性条件下pH60におけるヒトFcRnの結合が向上するが、同時に中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合が認められるようになった抗体をカニクイザルに投与した場合、抗体の血漿中滞留性は改善することは無く、血漿中滞留性に変化が認められなかったことが報告されている。そのため、抗体の機能を向上させる抗体工学技術においては、中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合を増加させることなく酸性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増加させることで抗体の血漿中滞留性を改善させることにのみ注力されており、これまでにIgG抗体のFc領域にアミノ酸置換を導入し、中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合を増加させることの利点は報告されていない。Ca依存的に抗原に結合する抗体は、可溶型の抗原の消失を加速させ、ひとつの抗体分子が複数回繰り返し可溶型の抗原に結合する効果を有することから、極めて有用である。この抗原消失加速効果をさらに向上させる方法として、FcRnへの中性条件下pH74における結合を増強する方法を検証した。6-2中性条件下におけるFcRnへの結合を有するCa依存的ヒトIL6レセプター結合抗体の調製カルシウム依存的抗原結合能を有するFH4IgG1と6RL9IgG1、および、コントロールとしてカルシウム依存的抗原結合能を有さないH54L28IgG1に対して、中性条件下pH74におけるFcRnに対する結合を増加させるアミノ酸変異を導入した。アミノ酸変異の導入はPCRを用いた当業者公知の方法を用いて行った。具体的にはIgG1の重鎖定常領域に対して、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける434番目をAsnからTrpに置換したFH4N434W重鎖配列番号:7、軽鎖配列番号:8と6RL9N434W重鎖配列番号:9、軽鎖配列番号:10とH54L28N434W重鎖配列番号:11、軽鎖配列番号:12を作製した。アミノ酸置換の導入方法としては、QuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitStratageneを用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的の発現ベクターを作成した。抗体の発現、精製、濃度測定は実施例2に記載の方法で実施した。実施例7ノーマルマウスを用いたCa依存性結合抗体の消失加速効果の評価7-1ノーマルマウスを用いたinvivo試験ノーマルマウスC57BL6Jmouse、CharlesRiverJapanにhsIL6R可溶型ヒトIL6レセプター:参考例1にて作製を単独投与もしくはhsIL6Rおよび抗ヒトIL6レセプター抗体を同時投与した後のhsIL6Rおよび抗ヒトIL6レセプター抗体の体内動態を評価した。hsIL6R溶液、もしくは、hsIL6Rと抗ヒトIL6レセプター抗体の混合溶液を尾静脈に10mLkgで単回投与した。抗ヒトIL6レセプター抗体としては、上述のH54L28N434W、6RL9N434W、FH4N434Wを使用した。混合溶液中のhsIL6R濃度は全て5μgmLであるが、抗ヒトIL6レセプター抗体濃度は抗体毎に異なり、H54L28N434Wは0042mgmL、6RL9N434Wは055mgmL、FH4N434Wは1mgmLとした。このとき、hsIL6Rに対して抗ヒトIL6レセプター抗体は十分量過剰に存在することから、hsIL6Rは大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後15分間、7時間、1日間、2日間、4日間、7日間、14日間、21日間、28日間で採血を行った。採取した血液は直ちに4°C、12000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。7-2ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトIL6レセプター抗体濃度測定マウス血漿中の抗ヒトIL6レセプター抗体濃度は実施例6と同様のELISA法にて測定した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるH54L28N434W、6RL9N434W、FH4N434Wの血漿中抗体濃度推移を図12に示した。7-3電気化学発光法による血漿中hsIL6R濃度測定マウスの血漿中hsIL6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、625、3125pgmLに調整したhsIL6R検量線試料および50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、SULFOTAGNHSEsterMesoScaleDiscoveryでルテニウム化したMonoclonalAntihumanIL6RAntibodyRDおよびBiotinylatedAntihumanIL6RAntibodyRDを混合し4°Cで1晩反応させた。その際のAssaybufferには10mMEDTAが含まれており、サンプル中のFreeCa濃度を低下させ、サンプル中のほぼ全てのhsIL6Rが6RL9N434WもしくはFH4N434Wから解離し、free体として存在する状態とすることを目的とした。その後、MA400PRStreptavidinPlateMesoScaleDiscoveryに分注した。さらに25°Cで1時間反応させ洗浄後、ReadBufferT424112423。8-36RL9抗体からのFabフラグメントの精製分子量分画サイズ10000MWCOの限外ろ過膜を用いて6RL9抗体が21mgmLまで濃縮された。LCystein4mM、EDTA5mM、20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH65を用いて5mgmLによって希釈された25mLの当該抗体の試料が調製された。0125mgのPapainRocheAppliedScienceを加えて攪拌された当該試料が35°Cにて2時間静置された。静置後、プロテアーゼインヒビターカクテルミニ、EDTAフリーRocheAppliedScience1錠を溶かした10mLの25mMMES緩衝液pH6をさらに当該試料に加え、氷中に静置することによって、Papainによるプロテアーゼ反応が停止された。次に、当該試料が、下流に1mLサイズのProteinA担体カラムHiTrapMabSelectSureGEHealthcareがタンデムにつながれた25mMMES緩衝液pH6で平衡化された1mLサイズの陽イオン交換カラムHiTrapSPHPGEHealthcareに添加された。同緩衝液中NaCl濃度を300mMまで直線的に上げて溶出をおこなうことで6RL9抗体のFabフラグメントの精製画分が得られた。次に、得られた精製画分が5000MWCOの限外ろ過膜により08mL程度まで濃縮された。50mMNaClを含む100mMHEPES緩衝液pH8で平衡化されたゲルろ過カラムSuperdex20010300GLGEHealthcareに濃縮液が添加された。結晶化用の精製6RL9抗体のFabフラグメントが同緩衝液を用いてカラムから溶出された。なお、上記のすべてのカラム操作は6から75°Cの低温下にて実施された。8-46RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶化予め一般的な条件設定で6RL9Fabフラグメントの種結晶が得られた。つぎに5mMとなるようにCaCl2が加えられた精製6RL9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜を用いて12mgmLに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として2029のPEG4000を含む100mMHEPES緩衝液pH75が用いられた。カバーグラス上で08μlのリザーバー溶液および08μlの前記濃縮試料の混合液に対して、29PEG4000および5mMCaCl2を含む100mMHEPES緩衝液pH75中で破砕された前記種結晶が10010000倍に希釈された希釈系列の溶液02μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20°Cに2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線回折データが測定された。8-56RL9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶化精製6RL9抗体のFabフラグメントが5000MWCOの限外ろ過膜を用いて15mgmlに濃縮された。つぎに、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって、前記のように濃縮された試料の結晶化が実施された。リザーバー溶液として1825のPEG4000を含む100mMHEPES緩衝液pH75が用いられた。カバーグラス上で08μlのリザーバー溶液および08μlの前記濃縮試料の混合液に対して、25PEG4000を含む100mMHEPES緩衝液pH75中で破砕されたCa存在下で得られた6RL9抗体のFabフラグメントの結晶が10010000倍に希釈された希釈系列の溶液02μlを加えることによって結晶化ドロップが調製された。当該結晶化ドロップを20°Cに2日から3日静置することによって得られた薄い板状の結晶のX線回折データが測定された。8-66RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶のX線回折データの測定35PEG4000および5mMCaCl2を含む100mMHEPES緩衝液pH75の溶液に浸された6RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL17Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に178°Cの窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDディテクタQuantum315rADSCを用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理がプログラムXia2CCP4SoftwareSuite、XDSPackageWalfgangKabschならびにScalaCCP4SoftwareSuiteによって行われた。最終的に分解能22Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=4547Å、b=7986Å、c=11625Å、α=90°、β=90°、γ=90°であった。8-76RL9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶のX線回折データの測定35PEG4000を含む100mMHEPES緩衝液pH75の溶液に浸された6RL9抗体のFabフラグメントのCa非存在下で得られた単結晶一つを、微小なナイロンループ付きのピンを用いて外液ごとすくいとることによって、当該単結晶が液体窒素中で凍結された。高エネルギー加速器研究機構の放射光施設フォトンファクトリーのビームラインBL5Aを用いて、前記の凍結結晶のX線回折データが測定された。なお、測定中は常に178°Cの窒素気流中に凍結結晶を置くことで凍結状態が維持された。ビームラインに備え付けられたCCDディテクタQuantum210rADSCを用い、結晶を1°ずつ回転させながらトータル180枚の回折画像が収集された。格子定数の決定、回折斑点の指数付け、および回折データの処理がプログラムXia2CCP4SoftwareSuite、XDSPackageWalfgangKabschならびにScalaCCP4SoftwareSuiteによって行われた。最終的に分解能23Åまでの回折強度データが得られた。本結晶は、空間群P212121に属し、格子定数a=4540Å、b=7963Å、c=11607Å、α=90°、β=90°、γ=90°であり、Ca存在下の結晶と同型であった。8-86RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造解析プログラムPhaserCCP4SoftwareSuiteを用いた分子置換法によって、6RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造が決定された。得られた結晶格子の大きさと6RL9抗体のFabフラグメントの分子量から、非対称単位中の分子数が一個であると予想された。一次配列上の相同性をもとにPDBcode1ZA6の構造座標から取り出されたA鎖112220番およびB鎖116218番のアミノ酸残基部分が、CLおよびCH1領域の探索用モデル分子とされた。次にPDBcode1ZA6の構造座標から取り出されたB鎖1115番のアミノ酸残基部分が、VH領域の探索用モデル分子とされた。最後にPDBcode2A9Mの構造座標から取り出された軽鎖3147番のアミノ酸残基が、VL領域の探索用モデル分子とされた。この順番にしたがい各探索用モデル分子の結晶格子内での向きと位置を回転関数および並進関数から決定することによって、6RL9抗体のFabフラグメントの初期構造モデルが得られた。当該初期構造モデルに対してVH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化をおこなうことにより、2530Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は469、FreeR値は486となった。さらにプログラムRefmac5CCP4SoftwareSuiteを用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2FoFc、FoFcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正を繰り返しプログラムCootPaulEmsley上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2FoFc、FoFcを係数とする電子密度マップをもとにCaイオンおよび水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5CCP4SoftwareSuiteを用いて精密化がおこなわれた。分解能2522Åの21020個の反射データを用いることによって、最終的に3440原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は200、FreeR値は279となった。8-96RL9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶のX線回折データの測定6RL9抗体のFabフラグメントのCa非存在下での結晶の構造は、同型であるCa存在下結晶の構造を使って決定された。6RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶の構造座標から水分子とCaイオン分子がのぞかれ、VH、VL、CH1、CLの各ドメインを動かす剛体精密化がおこなわれた。2530Åの反射データに対する結晶学的信頼度因子R値は303、FreeR値は317となった。さらにプログラムRefmac5CCP4SoftwareSuiteを用いた構造精密化と、実験的に決定された構造因子Foとモデルから計算された構造因子Fcおよび位相を用い計算された2FoFc、FoFcを係数とする電子密度マップを参照しながらモデル修正を繰り返しプログラムCootPaulEmsley上でおこなうことによってモデルの精密化がおこなわれた。最後に2FoFc、FoFcを係数とする電子密度マップをもとに水分子をモデルに組み込むことによって、プログラムRefmac5CCP4SoftwareSuiteを用いて精密化がおこなわれた。分解能2523Åの18357個の反射データを用いることによって、最終的に3351原子のモデルに対する結晶学的信頼度因子R値は209、FreeR値は277となった。8-106RL9抗体のFabフラグメントのCa存在または非存在下での結晶のX線回析データの比較6RL9抗体のFabフラグメントのCa存在下での結晶およびCa非存在下での結晶の構造を比較すると、重鎖CDR3に大きな変化がみられた。X線結晶構造解析で決定された6RL9抗体のFabフラグメントの重鎖CDR3の構造を図14に示した。具体的には、Ca存在下での6RL9抗体のFabフラグメントの結晶では、重鎖CDR3ループ部分の中心部分にカルシウムイオンが存在していた。カルシウムイオンは、重鎖CDR3の95位、96位および100a位Kabatナンバリングと相互作用していると考えられた。Ca存在下では、抗原との結合に重要である重鎖CDR3ループがカルシウムと結合することによって安定化し、抗原との結合に最適な構造となっていることが考えられた。抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合する例はこれまでに報告されておらず、抗体の重鎖CDR3にカルシウムが結合した構造は新規な構造である。重鎖CDR3は抗原との結合に最も重要であることが知られており、重鎖CDR3の構造維持にカルシウムイオンが必要となっている本実施例で見出されたモチーフは、抗原への結合にカルシウムイオンが重要な役割を果たしていると考えられる。すなわち、本モチーフを有する抗体はカルシウムイオン依存的に抗原に対する結合を有する可能性が極めて高いと考えられ、例えば本モチーフを有する合成ライブラリーを作製することができれば、そのようなライブラリーから効率的にカルシウム依存的結合抗体を取得することが可能であると考えられた。実施例9ファージディスプレイ技術を用いたヒト抗体ライブラリーからのCa依存的にIL6に結合する抗体の取得9-1ナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの作製ヒトPBMCから作成したポリARNAや、市販されているヒトポリARNAなどを鋳型として当業者に公知な方法にしたがい、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリーが構築された。9-2ビーズパンニングによるライブラリーからのCa依存的に抗原に結合する抗体断片の取得構築されたナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからの最初の選抜は、抗原IL6への結合能をもつ抗体断片のみの濃縮によって実施された。抗原としてビオチン標識されたIL6が用いられた。構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生が行われた。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に25MNaCl10PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリー液が得られた。次に、ファージライブラリー液に終濃度4BSAおよび12mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が添加された。パンニング方法として、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法が参照されたJImmunolMethods33229、JImmunolMethods247191203、BiotechnolProg1821220、MolCellProteomics2619。磁気ビーズとして、NeutrAvidincoatedbeadsSeraMagSpeedBeadsNeutrAvidincoatedもしくはStreptavidincoatedbeadsDynabeadsM280Streptavidinが用いられた。具体的には、調製されたファージライブラリー液に250pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、当該ファージライブラリー液を室温にて60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温にて15分間結合させた。ビーズは12mMCaCl2TBST12mMCaCl2を含むTBSTにて3回洗浄された後、1mLの12mMCaCl2TBS12mMCaCl2を含むTBSにてさらに2回洗浄された。その後、05mLの1mgmLのトリプシンが加えられたビーズは室温で15分懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液が、対数増殖期OD600が0405となった10mLの大腸菌株TG1に添加された。37°Cで1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は、225mmx225mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによって、ファージライブラリー液が調製された。2回目以降のパンニングでは、Ca依存的結合能を指標にファージの濃縮が行われた。具体的には、調製したファージライブラリー液に40pmolのビオチン標識抗原を加えることによって、ファージライブラリーを室温で60分間抗原と接触させた。BSAでブロッキングされた磁気ビーズが加えられ、抗原とファージとの複合体を磁気ビーズと室温で15分間結合させた。ビーズは1mLの12mMCaCl2TBSTと12mMCaCl2TBSにて洗浄された。その後01mLの2mMEDTATBSが加えられたビーズは室温で懸濁された後、即座に磁気スタンドを用いてビーズが分離され、ファージ溶液が回収された。回収されたファージ溶液に100mgmLのトリプシン5μLを加えることによって、Fabを提示しないファージのpIIIタンパク質ヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質が切断され、Fabを提示しないファージの大腸菌に対する感染能を失わせた。トリプシン処理されたファージ溶液から回収されたファージが、対数増殖期OD600が0407となった10mLの大腸菌株TG1に添加された。37°Cで1時間緩やかに上記大腸菌の攪拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。感染させた大腸菌は225mmx225mmのプレートへ播種された。次に、播種された大腸菌の培養液からファージを回収することによってファージライブラリー液が回収された。Ca依存的結合能を指標とするパンニングが3回繰り返された。9-3ファージELISAによる評価上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法MethodsMolBiol178133145に習い、ファージ含有培養上清が回収された。終濃度4BSAおよび12mMカルシウムイオン濃度となるようにBSAおよびCaCl2が加えられたファージを含有する培養上清が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell96マイクロタイタープレートRocheがビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。当該プレートの各ウェルをPBSTにて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウェルが1時間以上250μLの4BSATBSにてブロッキングされた。4BSATBSが除かれた各ウェルに調製された培養上清が加えられた当該プレートを37°Cで1時間静置することによって、ファージを提示する抗体を各ウェルに存在する抗原に結合させた。12mMCaCl2TBSTにて洗浄された各ウェルに、12mMCaCl2TBSもしくは1mMEDTATBSが加えられ、当該プレートは37°Cで30分間静置しインキュベートされた。12mMCaCl2TBSTにて洗浄された後に、終濃度4のBSAおよび12mMのイオン化カルシウム濃度としたTBSによって希釈されたHRP結合抗M13抗体AmershamPharmaciaBiotechが各ウェルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。12mMCaCl2TBSTにて洗浄後、TMBsingle溶液ZYMEDが添加された各ウェル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450nmの吸光度によって当該発色が測定された。単離された96クローンを用いてファージELISAを行うことによって、IL6に対するCa依存的な結合能を有する6KC4185抗体、6LC4115抗体および6LC4216抗体が得られた。上記のファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断される抗体断片を鋳型として特異的なプライマーによって増幅された遺伝子の塩基配列解析が行われた。6KC4185抗体の重鎖可変領域の配列を配列番号:25に、および軽鎖可変領域の配列を配列番号:26に記載した。6KC4185抗体の重鎖可変領域配列番号:25をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によってIgG1由来配列をコードするポリヌクレオチド配列番号:65と連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれ、配列番号:27で表される重鎖を発現するベクターが構築された。6KC4185抗体の軽鎖可変領域配列番号:26をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域配列番号:28をコードするポリヌクレオチドと連結された配列番号:29で表された配列をコードするDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。同様の方法で、6LC4115抗体重鎖配列番号68、軽鎖配列番号69および6LC4216抗体重鎖配列番号70、軽鎖配列番号71が細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。9-4抗体の発現と精製ファージELISAの結果、Ca依存的な抗原に対する結合能があると判断されたクローンが、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenがFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenに懸濁され、133x106細胞mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター37度、8CO2、90rpm中で4日間培養が行われた。rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出されたProteinScience424112423。9-5カルシウム依存的抗IL6抗体の結合評価取得された抗体を、BiacoreT100GEHealthcareを用いてpH74でヒトインターロイキン6結合活性解離定数KDに関して評価した。ランニングバッファーとして3μMもしくは12mMCaCl2を含有する005Tween2010mmollACES150mmollNaClpH74を用いて測定を行った。SensorchipCM5上にアミノカップリング法で組換え型プロテインAGThermoScientificを適当量固定化した後、抗体を結合させた。アナライトとして適切な濃度のhIL6ヒトインターロイキン6、鎌倉テクノサイエンスをインジェクトし、センサーチップ上の抗体と相互作用させた。その後、10mmolLGlycineHClをインジェクトし、センサーチップを再生した。測定は37°Cで行った。測定の結果、得られたセンサーグラムを図15に示した。これらの結果から、6LC4115IgG1および6LC4216IgG1、6KC4185IgG1抗体はCa2濃度が3μMの条件下では、Ca2濃度が12mMの条件下の場合と比べて、hIL6に対する結合が弱いことが明らかに示された。上記の結果は、カルシウム依存的な抗原結合という性質が実施例3に示されたIL6RだけでなくIL6でも示されたことから、他の抗原に対しても適応可能であることが示している。実施例106KC4185抗体のカルシウムイオン結合評価10-16KC4185抗体のカルシウムイオン結合評価ヒト抗体ライブラリーから取得されたカルシウム依存的抗原結合抗体6KC4185抗体がカルシウムと結合するか評価された。イオン化カルシウム濃度が異なる条件で、測定されるTm値が変動するか否かが実施例4に記載された方法で評価された。6KC4185抗体のFabドメインのTm値を表11に示した。表11に示されているように、6KC4185抗体のFabドメインのTm値はカルシウムイオンの濃度によって変動していることから、6KC4185抗体がカルシウムと結合することが明らかになった。10-26KC4185抗体のカルシウムイオン結合部位の同定実施例10の10-1で6KC4185抗体はカルシウムイオンと結合することが示されたが、6KC4185は後述されるhVk52配列のようなカルシウム結合モチーフを持たない。そこで、カルシウムイオンが6KC4185抗体のどの残基とカルシウムイオンが結合しているか同定するために、6KC4185抗体のCDRに存在するAspD残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAlaA残基に置換した改変重鎖6H111配列番号:30、6H112配列番号:31、6H113配列番号:32、6H114配列番号:33、6H115配列番号:34および改変軽鎖6L15配列番号:35および6L16配列番号:36が作製された。改変抗体遺伝子を含む発現ベクターが導入された動物細胞の培養液から、改変抗体が実施例2に記載された方法にしたがって精製された。精製された改変抗体のカルシウム結合が、実施例4に記載された方法にしたがって測定された。測定された結果を表12に示した。表12に示されているように、6KC4185抗体の重鎖CDR3の95位または101位KabatナンバリングをAla残基に置換することによって6KC4185抗体のカルシウム結合能が失われることから、この残基がカルシウムとの結合に重要であると考えられる。6KC4185抗体の改変抗体のカルシウム結合性から明らかになった6KC4185抗体の重鎖CDR3のループ付け根付近に存在するカルシウム結合モチーフも、本発明の抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメインにおけるカルシウム結合モチーフとして使用され得ることが明らかとなった。本モチーフは実施例8で見出されたモチーフと同様に重鎖CDR3のカルシウム結合モチーフであることから、同様に例えば本モチーフを有する合成ライブラリーを作製することができれば、そのようなライブラリーから効率的にカルシウム依存的結合抗体を取得することが可能であると考えられた。実施例11カルシウムイオンに結合するヒト生殖細胞系列配列の探索11-1ヒト生殖細胞系列配列の取得ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体でカルシウムイオンが結合するものはこれまで報告されていない。そこで、ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かを判定するため、HumanFetalSpreenPolyRNAClontechから調製されたcDNAを鋳型としてヒト生殖細胞系列配列を含む抗体の生殖細胞系列の配列がクローニングされた。クローニングされたDNA断片は動物細胞発現ベクターに挿入された。得られた発現ベクターの塩基配列が、を当業者公知の方法で決定し、その配列番号を表13に示した。配列番号:37Vk1、配列番号:38Vk2、配列番号:39Vk3、配列番号:40Vk4ならびに配列番号:41Vk5をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域配列番号:28をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。また、配列番号:42Vk1、配列番号:43Vk2、配列番号:44Vk3、配列番号:45Vk4ならびに配列番号:46Vk5をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によってIgG1のC末端2アミノ酸が欠失したポリペプチド配列番号:65をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。11-2抗体の発現と精製取得された5種類のヒト生殖細胞系列配列を含むDNA断片が挿入された動物細胞発現ベクターが動物細胞へ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenがFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenに懸濁され、133x106細胞mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター37度、8CO2、90rpm中で4日間培養が行われた。rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出されたProteinScience424112423。11-3ヒト生殖細胞系列配列を含む抗体のカルシウムイオン結合活性の評価精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。精製された抗体が20mMTrisHCl、150mMNaCl、2mMCaCl2pH74または20mMTrisHCl、150mMNaCl3μMCaCl2pH74の溶液を外液とする透析Easy、TOMY処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ01mgmLに調製された抗体溶液を被験物質として、20°Cから115°Cまで240°Chrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度Tm値を表14に示した。その結果、hVk1、hVk2、hVk3、hVk4配列を含む抗体のFabドメインのTm値は、当該Fabドメインを含む溶液中のカルシウムイオンの濃度によらず変動しなかった。一方で、hVk5配列を含む抗体のFabドメインのTm値は、当該Fabドメインを含む抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度によって変動したことから、hVk5配列がカルシウムイオンと結合することが示された。実施例12ヒトVk5hVk5配列の評価12-1hVk5配列Kabatデータベース中には、hVk5配列としてhVk52配列のみが登録されている。以下では、hVk5とhVk52は同義で扱われる。12-2糖鎖非付加型hVk52配列の構築、発現および精製hVk52配列は20位Kabatナンバリングのアミノ酸にN型糖鎖が付加する配列を有する。タンパク質に付加する糖鎖にはヘテロジェニティーが存在するため、物質の均一性の観点から糖鎖は付加されないほうが望ましい。そこで、20位KabatナンバリングのAsnN残基がThrT残基に置換された改変体hVk52L65配列番号:47が作製された。アミノ酸の置換はQuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitStratageneを用いる当業者公知の方法で行われた。改変体hVk52L65をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体hVk52L65のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてCIMH配列番号:48が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例2で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現したhVk52L65およびCIMHを含む抗体が、実施例2で記載した方法で精製された。12-3糖鎖非付加型hVk52配列を含む抗体の物性評価取得された改変配列hVk52L65を含む抗体が、改変に供されたもとのhVk52配列を含む抗体よりも、そのヘテロジェニティーが減少しているか否かが、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析された。イオン交換クロマトグラフィーの方法を表15に示した。分析の結果、図16に示したように糖鎖付加部位が改変されたhVk52L65は、元のhVk52配列よりもヘテロジェニティーが減少していることが示された。次に、ヘテロジェニティーが減少したhVk52L65配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが、実施例4に記載された方法を用いて評価された。その結果、表16に示したように、糖鎖付加部位が改変されたhVk52L65を含む抗体のFabドメインのTm値も、抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度の変化によって変動した。すなわち、糖鎖付加部位が改変されたhVk52L65を含む抗体のFabドメインにカルシウムイオンが結合することが示された。実施例13hVk52配列のCDR配列を含む抗体分子に対するカルシウムイオンの結合活性の評価13-1hVk52配列のCDR配列を含む改変抗体の作製、発現および精製hVk52L65配列はヒトVk52配列のフレームワークに存在する糖鎖付加部位のアミノ酸が改変された配列である。実施例12で糖鎖付加部位を改変してもカルシウムイオンが結合することが示されたが、フレームワーク配列は生殖細胞系列の配列であることが免疫原性の観点から一般的には望ましい。そこで、抗体のフレームワーク配列を、当該抗体に対するカルシウムイオンの結合活性を維持しながら、糖鎖が付加されない生殖細胞系列配列のフレームワーク配列に置換することが可能であるか否かが検討された。化学合成されたhVk52配列のフレームワーク配列がhVk1、hVk2、hVk3およびhVk4配列に改変された配列それぞれCaVk1配列番号:49、CaVk2配列番号:50、CaVk3配列番号:51、CaVk4配列番号:52をコードするポリヌクレオチドが、PCR法によって天然型Kappa鎖の定常領域配列番号:28をコードするポリヌクレオチドと連結されたDNA断片が、動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体の配列は当業者公知の方法で確認された。上記のように作製された各プラスミドは、CIMH配列番号:48をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミドと共に実施例2で記載された方法で動物細胞に導入された。上記のように導入された動物細胞の培養液から、発現した所望の抗体分子が精製された。13-2hVk52配列のCDR配列を含む改変抗体のカルシウムイオン結合活性の評価hVk52配列以外の生殖細胞系列配列hVk1、hVk2、hVk3、hVk4のフレームワーク配列およびhVK52配列のCDR配列を含む改変抗体に、カルシウムイオンが結合するか否かが実施例4に記載された方法によって評価された。評価された結果を表17に示した。各改変抗体のFabドメインのTm値は、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度の変化によって変動することが示された。よって、hVk52配列のフレームワーク配列以外のフレームワーク配列を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。すなわち、hVk52配列のCDR配列が有するモチーフがカルシウムイオンとの結合に重要であることが示され、フレームワーク配列は任意のフレームワークであってもよいことが確認された。さらに、hVk52配列以外の生殖細胞系列配列hVk1、hVk2、hVk3、hVk4のフレームワーク配列およびhVK52配列のCDR配列を含むように改変された各抗体のFabドメインの熱安定性の指標である熱変性温度Tm値は、改変に供されたもとのhVk52配列を含む抗体のFabドメインのTm値よりも増加することが明らかになった。この結果から、hVk1、hVk2、hVk3、hVk4のフレームワーク配列およびhVk52配列のCDR配列を含む抗体はカルシウムイオンと結合する性質を有する上に、熱安定性の観点でも優れた分子であることが見出された。実施例14ヒト生殖細胞系列hVk52配列に存在するカルシウムイオン結合部位の同定14-1hVk52配列のCDR配列中の変異部位の設計実施例13に記載されているように、hVk52配列のCDR部分が他の生殖細胞系列のフレームワーク配列に導入された軽鎖を含む抗体もカルシウムイオンと結合することが示された。この結果からhVk52に存在するカルシウムイオン結合部位はCDRの中に存在することが示唆された。カルシウムイオンと結合する、すなわち、カルシウムイオンをキレートするアミノ酸として、負電荷のアミノ酸もしくは水素結合のアクセプターとなりうるアミノ酸が挙げられる。そこで、hVk52配列のCDR配列中に存在するAspD残基またはGluE残基がAlaA残基に置換された変異hVk52配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが評価された。14-2hVk52配列のAla置換体の作製ならびに抗体の発現および精製hVk52配列のCDR配列中に存在するAspおよびまたはGlu残基がAla残基に改変された軽鎖を含む抗体分子が作製された。実施例12で記載されるように、糖鎖が付加されない改変体hVk52L65はカルシウムイオン結合を維持していたことから、カルシウムイオン結合性という観点ではhVk52配列と同等と考えられる。本実施例ではhVk52L65をテンプレート配列としてアミノ酸置換が行われた。作製された改変体を表18に示した。アミノ酸の置換はQuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitStratagene、PCRまたはInfusionAdvantagePCRcloningkitTAKARA等の当業者公知の方法によって行われ、アミノ酸が置換された改変軽鎖の発現ベクターが構築された。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。作製された改変軽鎖の発現ベクターを重鎖CIMH配列番号:48の発現ベクターと共に、ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株Invitrogen、またはFreeStyle293細胞Invitrogenに一過性に導入することによって、抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProteinASepharoseTMFastFlowGEヘルスケアを用いて当業者公知の方法で、抗体が精製された。精製された抗体溶液の280nmでの吸光度が、分光光度計を用いて測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出されたProteinScience424112423。14-3hVk52配列のAla置換体を含む抗体のカルシウムイオン結合活性評価得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが判定された。具体的には、精製された抗体が20mMTrisHCl、150mMNaCl、2mMCaCl2pH75または20mMTrisHCl、150mMNaClpH75の溶液表19ではカルシウムイオン濃度0μMと表記を外液とする透析Easy、TOMY処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ01mgmLに調製された抗体溶液を被験物質として、20°Cから115°Cまで240°Chrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度Tm値が表19に示されている。hVk52配列のCDR配列中に存在するAspまたはGlu残基をカルシウムイオンの結合もしくはキレートに関与できないAla残基に置換することによって、抗体溶液のカルシウムイオン濃度の変化によってそのFabドメインのTm値が変動しない抗体が存在した。Ala置換によってTm値が変動しない置換部位32位および92位Kabatナンバリングはカルシウムイオンと抗体の結合に特に重要であることが示された。実施例15カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列を含む抗体のカルシウムイオン結合活性の評価15-1カルシウムイオン結合モチーフを有するhVk1配列の作製ならびに抗体の発現および精製実施例14で記載されたAla置換体のカルシウムの結合活性の結果から、hVk52配列のCDR配列の中でAspやGlu残基がカルシウム結合に重要であることが示された。そこで、30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの残基のみを他の生殖細胞系列の可変領域配列に導入してもカルシウムイオンと結合できるか否かが評価された。具体的には、ヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの残基がhVk52配列の30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの残基に置換された改変体LfVk1Ca配列番号:61が作製された。すなわち、hVk52配列中のこれらの5残基のみが導入されたhVk1配列を含む抗体がカルシウムと結合できるか否かが判定された。改変体の作製は実施例2と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1Caおよび軽鎖hVk1配列を含むLfVk1配列番号:62を、重鎖CIMH配列番号:48と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例14と同様の方法で実施された。15-2カルシウムイオン結合モチーフを有するヒトhVk1配列を含む抗体のカルシウムイオン結合活性の評価上記のように得られた精製抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例4に記載された方法で判定された。その結果を表20に示した。hVk1配列を有するLfVk1を含む抗体のFabドメインのTm値は抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によっては変動しない一方で、LfVk1Caを含む抗体配列の、Tm値は、抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1°C以上変化したことから、LfVk1Caを含む抗体がカルシウムと結合することが示された。上記の結果から、カルシウムイオンの結合には、hVk52のCDR配列がすべて必要ではなく、LfVk1Ca配列を構築する際に導入された残基のみでも十分であることが示された。15-3分解抑制型LfVk1_Ca配列の構築、発現および精製実施例15の15-2でヒト生殖細胞系配列であるhVk1配列の30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの残基がhVk52配列の30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの残基に置換された改変体LfVk1_Ca配列番号:61が作製され、カルシウムイオンが結合することが示された。そこで、LfVk1_Ca配列を含むCa依存性抗体Ca結合抗体が考えられるが、新規配列であるLfVk1_Ca配列の医薬品としての保存安定性は不明であることから、その医薬品としての応用可能性は不明である。そこで、LfVk1_Caの熱加速試験により安定性を評価した。LfVk1_CaをL鎖に有する抗体を20mMHistidineHCl、150mMNaCl、pH60の溶液に一晩4°Cの条件で透析された。透析された抗体は05mgmLに調製され、5°Cまたは50°Cで3日間保存された。保存後の各抗体を実施例12に記載された方法でイオン交換クロマトグラフィーが行われた。その結果、図17に示すように、LfVk1_Caは50°Cで3日間保存で著しく分解することが確認された。LfVk1_Ca配列は、30位、31位および32位KabatナンバリングにAspが存在し、酸性条件下で分解することが報告されているAspAsp配列がCDR1配列中に存在するJPharmBiomedAnal472330ため、30位、31位および32位Kabatナンバリングが分解箇所である可能性が考えられた。そこで、LfVk1_Caの分解を回避するため、分解する可能性がある3か所のAspD残基がAlaA残基に置換された改変体LfVk1Ca1配列番号:72、LfVk1Ca2配列番号:73およびLfVk1Ca3配列番号:74が作製された。アミノ酸の置換はQuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitStratageneを用いる当業者公知の方法で行われた。改変体をコードするDNAが動物発現用ベクターに組み込まれた。作製された改変体のDNAが組み込まれた動物発現用ベクターは、重鎖としてGCH配列番号:102が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例14で記載した方法で共に動物細胞中に導入された。導入された動物細胞中で発現した抗体が、実施例14で記載した方法で精製された。15-4分解抑制型LfVk1_Ca配列を含む抗体の安定性評価実施例15の15-3で取得された抗体が、改変に供されたもとのLfVk1Ca配列を含む抗体よりも、pH60溶液中での分解が抑制されているか否かが熱加速後の各抗体のヘテロジェニティーの比較によって評価された。上述と同様に抗体は5°Cまたは50°Cで3日間保存された。保存後の各抗体を実施例12に記載された方法でイオン交換クロマトグラフィーが行われた。分析の結果、図17に示されるように30番目Kabatナンバリング部位が改変されたLfVk1Ca1は、元のLfVk1Ca配列よりもヘテロジェニティーが少なく、熱加速による分解が著しく抑制されていることが示された。すなわち、LfVk1Ca配列中の30位に存在するAspD残基が分解することが示され、そしてAsp残基の分解はアミノ酸改変によって回避できることが示された。15-5軽鎖30位Asp残基分解抑制型LfVk1Ca配列の作製ならびに抗体の発現および精製実施例15の15-4で記載されたAla置換体の分解抑制の結果から、LfVk1Ca配列のCDR配列の中で30位KabatナンバリングのAspD残基が酸性条件で分解し、30位Kabatナンバリングを他のアミノ酸15-4では、AlaA残基に置換されたに置換することで分解が抑制できることが示された。そこで、30位Kabatナンバリングの残基をカルシウムイオンがキレートできる残基の一つであるSerS残基に置換した配列LfVk1Ca6とよぶ。配列番号:75としても、カルシウム結合能を維持しつつ、分解が抑制されるか否かが評価された。改変体の作製は実施例14と同様に行われた。得られた軽鎖改変体LfVk1Ca6および軽鎖LfVk1Ca配列を、重鎖GCH配列番号:102と共に発現させた。抗体の発現および精製は実施例14と同様の方法で実施された。15-6軽鎖30位Asp残基分解抑制型LfVk1Ca配列の評価上記のように得られた精製抗体の酸性条件下における保存安定性が実施例15の15-4に記載された方法で判定された。その結果、図18に示すように、LfVk1Ca6配列を含む抗体は、元のLfVk1Ca配列を含む抗体よりも分解が抑制されていることが示された。さらに、LfVk1Ca配列を含む抗体およびLfVk1Ca6配列を含む抗体がカルシウムイオンと結合するか否かが実施例15に記載された方法で判定された。その結果を表21に示す。LfVk1Ca配列を含む抗体および分解抑制型であるLfVk1Ca6配列を含む抗体のFabドメインのTm値は、それぞれ抗体溶液中のカルシウムの濃度の変化によって1°C以上変化した。以上の結果から、安定性を考慮に入れると、30位はAsp以外のカルシウムイオンと相互作用が可能なアミノ酸Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Tyr等であって、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングの配列の全てあるいは一部がhVk52のアミノ酸、あるいは、カルシウムと相互作用可能なアミノ酸Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、His、Tyr等であることが、抗体へのカルシウムイオンの結合に重要であることが示された。例えばこのようなモチーフを有する合成ライブラリーを作製することができれば、そのようなライブラリーから効率的にカルシウム依存的結合抗体を取得することが可能であると考えられた。実施例16NMRによるカルシウムイオン結合モチーフを有するヒトhVk1配列を含む抗体のカルシウムイオン結合活性の評価16-1抗体の発現と精製NMR測定に用いるために発現させたLfVk1Caを含む抗体とLfVk1を含む抗体が精製された。具体的には、LfVk1Caを含む抗体は重鎖配列番号:13と軽鎖配列番号:61をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。また、LfVk1を含む抗体は重鎖配列番号:13と軽鎖配列番号:62をそれぞれ発現させることが出来るように調製された動物発現用プラスミドが動物細胞に一過的に導入された。最終細胞密度1x106細胞mLとなるようにFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenへ懸濁された100mLのヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株Invitrogenの細胞懸濁液に、標識アミノ酸が加えられた。具体的には、AspGluGlnAsn標識体についてはLAsparticacid13C415N10mg、LGlutamicacid13C515N25mg、LGlutamine13C515N260mg、LAsparagine13C415N2H2O25mg、βchloroLalanine6mgを10mLの水に懸濁した溶液を022μmフィルターでろ過した液を加えた。Leu標識体については、LLeucine15N30mg、βchloroLalanine6mgを10mLの水に懸濁した溶液を022μmフィルターでろ過した液を加えた。リポフェクション法により調製されたプラスミドが細胞に導入された。プラスミドが導入された細胞はCO2インキュベーター37°C、8CO2、90rpm中で5日間培養された。rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いた当業者公知の方法にしたがって、上記のように得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いて測定値から抗体濃度が算出されたProteinScience424112423。16-2Fabフラグメントの調製分子量分画サイズ30000MWCOの限外ろ過膜を用いて、各種抗体が82118mgmLまで濃縮された。LCystein1mM、EDTA2mM、50mM酢酸125mMトリス緩衝液pH68を用いて8mgmLに希釈された当該抗体の試料が調製された。各抗体に対して1240量のPapainRocheAppliedScienceを加えて攪拌された当該試料が37°Cにて1時間静置された。静置後、それぞれ下流に1mLサイズのProteinA担体カラムHiTrapMabSelectSureGEHealthcareがタンデムにつながれた50mM酢酸125mMトリス緩衝液pH68で平衡化されたGlyGlyTyrArgSigmaペプチドを結合した1mLサイズのHiTrapNHSactivatedHPGEHealthcareに添加された。上流のGlyGlyTyrArgペプチドによって活性化Papainを除去するとともに、下流のProteinA担体カラムでFcフラグメントおよび未消化抗体を除去することでFabフラグメントの精製画分が得られた。Fab画分に含まれる不活性Papainが活性化するのを防ぐために、Fab画分にはシステインプロテアーゼ阻害剤E64Sigmaを10μM添加した。なお、上記のすべてのカラム操作は20から25°Cの室温下にて実施された。16-3LfVk1Ca抗体およびLfVk1抗体のFabフラグメントのNMR試料調製抗体溶液をMWCO5000の限外濾過器VivaspinSartoriusを用いて05mLまで遠心により濃縮した。次に上記限外濾過器にダイアフィルトレーションカップを設置して、NMR用緩衝液:5mMdBisTris20mMNaCl0001NaN352H2OpH70NaOH、HClを用いてpHを調製したへ緩衝液置換ダイアフィルトレーションカップに上記緩衝液を5mL足して05mLまで遠心濃縮することを3回繰り返したを行い、最後に025mLまで濃縮した。最後に、NMR緩衝液で限外濾過器を洗いこみ、濃縮液とあわせて抗体溶液をLfVk1Ca抗体については420μL、LfVk1抗体については270μLとした。この段階で再度、pHを確認し、必要に応じてNaOH、HClによりpH70に調整した。UV測定器NanodropThermoFisherScientificを用いて280nmにおける吸光度を測定し、280nmにおけるモル吸光係数を70000M1cm1としてFabフラグメントを定量した。Leu標識LfVk1Ca抗体、Leu標識LfVk1抗体は012mM、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1Ca抗体、Asp、Glu、Asn、Gln標識LfVk1抗体は024mMとなった。これらの試料の内、LfVk1Ca抗体については、直径5mmのNMR試料管shigemiに、LfVk1抗体については直径5mmの水溶液用対称形ミクロ試料管shigemiにパスツールピペットを用いて充填した。LfVk1Ca抗体のCa2滴定実験においては、抗体溶液に、抗体に対して、Ca2が1、2、5、10、20モル等量となるよう、CaCl2溶液を順次、添加した。添加に用いたCaCl2溶液にはNMRバッファーに溶解した10、20、50、100mMCaCl2溶液を準備した。シリンジ部分を既製品から延長した特注マイクロシリンジITOにより、添加容量が310μLの範囲となるように、CaCl2溶液の必要量を直接、NMR試料管に充填された抗体溶液に添加し、試料管をボルテックスミキサーにより攪拌後、手動遠心器Shimadzuにより遠心分離した。16-4LfVk1Ca抗体およびLfVk1Ca抗体のFabフラグメントのアミド基シグナルを観測するためのNMR測定NMR測定には、TCICryoProbeを設置したNMR分光器DRX750BrukerBiospinを用いた。設定温度を307KGasFlow535Lhとした。アミド基シグナルを観測するためのNMR測定には1H15NHSQCを用いた。測定法としては、15N展開期にα炭素とカルボニル炭素の同時13Cデカップリング、および溶媒水シグナル消去のための3919パルストレインを伴う1H15NFHSQCを用い、それを制御するパルスプログラムには、メーカーBrukerBiospinにより標準として準備されているものを用いた。NMRの測定条件は以下の通りとした。スペクトル幅12019Hz1976Hz、データポイント数2048128。データ処理にはTopspin30BrukerBiospinを用いた。データ処理条件は以下の通りとした。f2、f1共に、ウィンドウ関数としてshiftedSineを乗じ、2倍のデータポイント数となるようにゼロフィリングを行った後に、フーリエ変換を行った。シグナルの化学シフトはNMR解析ソフトウェアSparkyUCSFを用いて算出した。16-5主鎖アミド基のNMRシグナルの帰属これまでにトシリズマブ重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:14のFabフラグメントの主鎖アミド基のNMRシグナルの内、80が帰属されたデータ未公開。LfVk1Ca抗体のFabフラグメントのアミノ酸配列は、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の一部、および軽鎖73、83番のアミノ酸残基およびを除き、トシリズマブとFabフラグメントのアミノ酸配列と同じである。両抗体でアミノ酸配列が同じ部分については、そのNMRシグナルが同一の化学シフトを有する、あるいはそれらが近いため、トシリズマブの帰属情報を移行することが可能であった。Leu標識試料については、軽鎖11、、、、、、125、135、136、154、175、179、181、201、重鎖18、46、64、71、81、83、114、144、147、165、176、181、184、195が帰属を移行することが可能であった。上記、括弧が付いていない番号はトシリズマブと同一の化学シフトであるため、帰属が移行できた残基番号、括弧が付いた番号は、トシリズマブと近い化学シフトを有しており、それ以外に近い化学シフトを有するシグナルがないため、帰属が可能であった残基番号であった。一方、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料については、LfVk1Ca抗体とLfVk1抗体のスペクトルを比較し、4個のシグナルがLfVk1Caで新たに観測されていた。これは、この両抗体間でAsp、Glu、Asn、Gln残基の内、Ca2結合モチーフとして導入した配列の異なる軽鎖Asp30、31、32、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基由来であると分類できた。16-6Ca2のLfVk1Ca抗体上の結合部位の同定LfVk1Ca抗体のFabフラグメントのCa2未添加状態と、20モル等量添加の1H15NHSQCスペクトルを比較して、化学シフトが変化しているシグナルを抽出した。その結果、Leu標識試料からは、軽鎖Leu33が結合に関与しており、それ以外のLeu残基は結合に関与していないことが分かった。また、Asp、Glu、Asn、Gln標識試料からは、軽鎖Asp30、31、32、92、Glu50の5残基の内のいずれか4残基が結合に関与し、それ以外のAsp、Glu、Asn、Gln残基の内の1残基を除くすべてが結合に関与していないことが明らかとなった。以上のことから、Ca2結合モチーフとして導入されたアミノ酸配列の内、少なくとも軽鎖CDR1、これに加えて軽鎖CDR2、CDR3の両方もしくはいずれかのアミノ酸がCa2結合に関与していると同定された。このことは実施例15において確認された30位、31位、32位、50位および92位Kabatナンバリングのうち4つがhVk52配列のアミノ酸であることがカルシウムイオンの結合に重要であった結果と一致している。16-7滴定実験におけるCa2解離定数の算出Ca2濃度がLfVk1Ca抗体のFabフラグメントに対して、0、1、2、5、10、20モル等量の時の1H15NHSQCスペクトルを利用した。結合部位として同定された軽鎖Leu33のシグナルの1Hまたは15N化学シフトを縦軸に、上記Ca2のモル等量を横軸にプロットし、グラフ作成ソフトウェアGnuplotを用いて以下の式2で示される関数のフィッティングを行った。式2fs×105a×24×x×a205t×05a×24×x×a205式2で表される関数において、s、tはそれぞれCa2非結合時の化学シフトppm、Ca2飽和結合時の推定化学シフトppm、aは抗体Fabフラグメント濃度M、Kdは解離定数、xは抗体Fabフラグメントに対して添加したCa2のモル等量を示している。フィッティングの際には、stKdをフィッティングパラメータとした。その結果、1H化学シフトからはKd71×105M、15N化学シフトからは、Kd59×105Mとして見積もられた。実施例17hVk52バリアント配列のカルシウム結合評価Vk52配列番号:41のほかにVk52に分類されるVk52バリアント1配列番号:63およびVk52バリアント2配列番号:64が得られた。これらのバリアントについてもカルシウム結合評価が行われた。Vk52、Vk52バリアント1およびVk52バリアント2のDNA断片がそれぞれ動物細胞用発現ベクターに組み込まれた。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定された。Vk52、Vk52バリアント1およびVk52バリアント2のDNA断片がそれぞれ組み込まれた動物細胞用発現ベクターは、重鎖としてCIMH配列番号:48が発現するように組み込まれた動物発現用のベクターと、実施例13で記載された方法で共に動物細胞中に導入され、抗体が精製された。精製された抗体のカルシウムイオン結合活性が評価された。精製された抗体が20mMTrisHCl、150mMNaCl、2mMCaCl2pH75または20mMTrisHCl、150mMNaClpH75の溶液表22ではカルシウムイオン濃度0mMと表記を外液とする透析Easy、TOMY処理に供された。透析に用いられた溶液を用いておよそ01mgmLに調製された抗体溶液を被験物質として、20°Cから115°Cまで240°Chrの昇温速度でDSC測定が行われた。得られたDSCの変性曲線にもとづいて算出された各抗体のFabドメインの熱変性中間温度Tm値が表22に示されている。その結果、Vk52、Vk52バリアント1およびVk52バリアント2の配列を含む抗体のFabドメインのTm値は、当該Fabドメインを含む抗体溶液中のカルシウムイオンの濃度によって変動したことから、Vk52に分類される配列を持つ抗体はカルシウムイオンと結合することが示された。実施例18カルシウム依存的にヒトCD4に結合する抗体18-1可溶型ヒトCD4の調製可溶型ヒトCD4は以下のように調製された。膜貫通領域を欠損したヒトCD4のアミノ酸配列にMycタグを付加した配列配列番号:76をコードするDNA配列が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。作製された組み換えヒトCD4の配列は当業者公知の方法で確認された。18-2可溶型ヒトCD4に結合する抗体の発現と精製TNX355IgG1重鎖配列番号:77、軽鎖配列番号:78およびQ425重鎖配列番号:79、軽鎖配列番号:80は抗ヒトCD4抗体である。さらにQ425L9重鎖配列番号:81、軽鎖配列番号:82はQ425のL鎖改変体である。TNX355IgG1重鎖配列番号:77、軽鎖配列番号:78、Q425重鎖配列番号:79、軽鎖配列番号:80およびQ425L9重鎖配列番号:81、軽鎖配列番号:82のアミノ酸をコードするDNA配列が、動物細胞発現用プラスミドへ導入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenがFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenに懸濁され、133x106細胞mLの細胞密度で6ウェルプレートの各ウェルへ3mLずつ蒔きこまれた。調製されたプラスミドは、リポフェクション法によって細胞へ導入された。CO2インキュベーター37°C、8CO2、90rpm中で4日間培養が行われた。rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法を用いて、上記で得られた培養上清から抗体が精製された。分光光度計を用いて精製された抗体溶液の280nmでの吸光度が測定された。PACE法により算出された吸光係数を用いることによって、得られた測定値から抗体濃度が算出されたProteinScience424112423。18-3取得された抗体のヒトCD4に対するカルシウム依存的結合能評価取得された抗体の可溶型ヒトCD4に対するカルシウム依存的結合能がBiacoreT100GEHealthcareを用いて評価された。高カルシウムイオン濃度として、12mMを使用し、低カルシウムイオン濃度の条件として3μMを使用した。抗原は可溶型ヒトCD418-1で調製したを用いた。SensorchipCM4GEHealthcare上にアミンカップリング法でproteinGInvitrogenを適当量固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。ランニングバッファーには12mmolLCaCl2または3μmolLCaCl2を含む10mmolLACES、150mmolLNaCl、005Tween20、12mmolLCaCl2、pH74またはpH60を用いた。測定は全て37°Cで実施し、ヒトCD4の希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。抗体のセンサーグラムを図19に示した。図19に示したようにTNX355IgG1抗体はランニングバッファーの条件が変化してもセンサーグラムの形状は変化しなかったことから、TNX355IgG1はヒトCD4に対してカルシウム依存的に結合活性を示さない通常の抗体であることが確認された。一方で、Q425抗体およびQ425L9抗体はいずれもカルシウムイオン濃度が3μM低カルシウムイオン濃度のときの抗原結合量はカルシウムイオン濃度が12mM高カルシウムイオン濃度のときの抗原結合量よりも少なく、Ca依存的結合能が示された。特にQ425L9抗体は、カルシウムイオン濃度が3μMとなると、200nMのアナライト可溶性ヒトCD4で測定した場合でも全く結合相が観測できなかった。すなわち、Q425抗体およびQ425L9抗体はヒトCD4に対してカルシウム依存的に結合活性を示すカルシウム依存的結合であることが確認された。実施例19ノーマルマウスを用いたCa依存性結合抗体の抗原の血漿中滞留性への影響評価19-1ノーマルマウスを用いたinvivo試験実施例18で調製されたQ425およびQ425L9はカルシウム依存的に可溶型ヒトCD4に結合する抗体であった。しかし、これまでにカルシウム依存的に抗原と結合する性質を有する抗体と抗原を同時に投与した場合に、カルシウム依存的に抗原と結合する性質が無い抗体と抗原を同時に投与した場合よりも抗原の消失を加速させる性質を持っていることは実施例5および実施例6で示したようにIL6Rで明らかになっているが、他の抗原でも抗原の消失を加速させる性質を持っているかは不明である。そこで、ノーマルマウスC57BL6Jmouse、CharlesRiverJapanに可溶型ヒトCD4実施例18で調製を単独投与もしくは可溶型ヒトCD4および抗ヒトCD4抗体を同時投与した後の可溶型ヒトCD4および抗ヒトCD4抗体の体内動態を評価した。可溶型ヒトCD4溶液、もしくは、可溶型ヒトCD4および抗ヒトCD4抗体の混合溶液を尾静脈に10mLkgで単回投与した。抗ヒトCD4抗体としては、上述のTNX355IgG1、Q425IgG1、Q425L9IgG1を使用した。混合溶液中の可溶型ヒトCD4濃度は全て50μgmLであるが、抗ヒトCD4抗体濃度は抗体毎に異なり、TNX355IgG1は0264mgmL、Q425IgG1は0197mgmL、およびQ425L9IgG1は2594mgmL、このとき、可溶型ヒトCD4に対して抗ヒトCD4抗体は十分量過剰に存在することから、可溶型ヒトCD4は大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後可溶型ヒトCD4を単独投与した群は、2分間、5分間、15分間、30分間、1時間、2時間で採血を行った。可溶型ヒトCD4およびカルシウム依存的抗原結合能が無いTNX355IgG1を同時投与した群は、投与後5分間、2時間、7時間、1日間、3日間、7日間、14日間、28日間で採血を行った。可溶型ヒトCD4およびカルシウム依存的抗原結合能を有するQ425IgG1およびQ425L9IgG1を同時投与した群は、投与後5分間、30分間、2時間、7時間、1日間、3日間、8日間、14日間、28日間で採血を行った。採取した血液は直ちに4°C、12000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。19-2ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトCD4抗体濃度測定マウス血漿中の抗ヒトCD4抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAntiHumanIgGF2FragmentofAntibodyをNuncImmunoPlateMaxiSoupに分注し、4°Cで1晩静置しAntiHumanIgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として064、032、016、008、004、002、001μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、AntiHumanIgG固相化プレートに分注して25°Cで1時間incubationした。その後BiotinylatedAntihumanIL6RAntibodyRDを25°Cで1時間反応させ、さらにStreptavidinPolyHRP80StereospecificDetectionTechnologiesを25°Cで05時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateBioFXLaboratoriesを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるTNX355IgG1、Q425IgG1およびQ425L9IgG1の血漿中抗体濃度推移を図20に示した。19-3電気化学発光法による血漿中可溶型ヒトCD4濃度測定マウスの血漿中可溶型ヒトCD4濃度はELISA法にて測定した。sCD4単独投与の群Q425、Q425L9と同時投与した群については、TNXをNuncImmunoPlateMaxiSoupNalgenuncInternationalに分注し、4°Cで1晩静置しTNX固相化プレートを作成した。血漿中濃度として10、5、25、125、0625、03125、0156μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を10mMEDTA入りのBufferで調製し、TNX固相化プレートに分注して25°Cで3時間incubationした。その後AnticmycHRPMiltenyiBiotechを25°Cで1時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateBioFXLaboratoriesを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。TNXと同時投与した群については、Q425をNuncImmunoPlateMaxiSoupに分注し、4°Cで1晩静置しQ425固相化プレートを作成した。血漿中濃度として20、10、5、25、125、0625、03125μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を2mMCa2入りのBufferで調製し、TNX固相化プレートに分注して25°Cで3時間incubationした。その後AnticmycHRPを25°Cで1時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中可溶型ヒトCD4濃度推移を図21に示した。結果、可溶型ヒトCD4単独は非常に早い消失を示したのに対して、可溶型ヒトCD4とCa依存的な結合が無い通常の抗体であるTNX355IgG1を同時に投与した場合は、可溶型ヒトCD4の消失を大幅に遅くした。それに対して、可溶型ヒトCD4とCa依存的な結合を有するQ425IgG1あるいはQ425L9IgG1を同時に投与した場合は、可溶型ヒトCD4の消失を大幅に加速した。TNX355IgG1を同時に投与した場合と比較して、Q425IgG1あるいはQ425L9IgG1を同時に投与した場合は、可溶型ヒトCD4の消失を促進することが出来た。これよりカルシウム依存的結合抗体が血漿中からの抗原の消失を達成できることがIL6RのみならずヒトCD4においても確認された。実施例20カルシウム依存的にヒトIgAに結合する抗体20-1ヒトIgAhIgAの調製抗原であるヒトIgAの組み換えヒトIgA以下hIgAは以下のように調製した。HIgA1配列番号:83とL配列番号:14とを含むhIgAを発現させて、当業者公知の方法によってイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。20-2ヒトIgAに結合する抗体の発現と精製GA1IgG1重鎖配列番号:84、軽鎖配列番号:85、GA2IgG1重鎖配列番号:86、軽鎖配列番号:87、GA3IgG1重鎖配列番号:88、軽鎖配列番号:89およびGA4IgG1重鎖配列番号:90、軽鎖配列番号:91はヒトIgAに結合する抗体である。さらに、実施例6および実施例7と同様に、血漿中からの抗原hIgAの消失をさらに増大させるために、GA2IgG1に対してマウスFcRnに対するpH74における結合を増強するためにN434Wのアミノ酸置換を導入したGA2N434W重鎖配列番号:92、軽鎖配列番号:87を作製した。GA1IgG1重鎖配列番号:84、軽鎖配列番号:85、GA2IgG1重鎖配列番号:86、軽鎖配列番号:87、GA3IgG1重鎖配列番号:88、軽鎖配列番号:89、GA4IgG1重鎖配列番号:90、軽鎖配列番号:91およびGA2N434W重鎖配列番号:92、軽鎖配列番号:87をコードするDNA配列が動物発現用プラスミドに当該業者公知の方法で組み込まれた。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenをFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenへ懸濁し、133x106個mLの細胞密度で6wellplateの各ウェルへ3mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター37°C、8CO290rpmで4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出したProteinScience1995424112423。20-3取得された抗体のヒトIgAに対するCa依存的結合能評価取得された抗体を、BiacoreT200GEHealthcareを用いてヒトIgA結合活性解離定数KDに関して評価した。ランニングバッファーとして3μMもしくは12mMCaCl2を含有する005tween2020mmollACES150mmollNaClpH74およびpH58、01μMもしくは10mMCaCl2を含有する005tween2020mmollACES150mmollNaCl、pH80を用いて測定を行った。SensorchipCM5上にアミノカップリング法で組換え型プロテインAGThermoScientificを適当量固定化した後、抗体を結合させた。アナライトとして適切な濃度のhIgA20-1に記載をインジェクトし、センサーチップ上の抗体と相互作用させた。その後、10mmolLGlycineHClpH15をインジェクトし、センサーチップを再生した。測定を37°Cで行った。測定結果をBiacoreT200EvaluationSoftwareGEHealthcareを用い、カーブフィッティングによる解析および平衡値解析により、解離定数KDを算出した。その結果を表23に示す。また、得られたセンサーグラムを図22に示した。GA2IgG1、GA3IgG1、GA4IgG1はCa2濃度が12mMにおいてはヒトIgAに強く結合するが、Ca2濃度が3μMにおいてはヒトIgAに弱く結合することが明らかに示された。実施例21ノーマルマウスを用いたCa依存性ヒトIgA結合抗体の抗原の血漿中滞留性への影響評価21-1ノーマルマウスを用いたinvivo試験ノーマルマウスC57BL6Jmouse、CharlesRiverJapanにヒトIgAヒトIgA:実施例20にて作製を単独投与もしくはヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体を同時投与した後のヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体の体内動態を評価した。ヒトIgA溶液80μgmL、もしくは、ヒトIgAおよび抗ヒトIgA抗体の混合溶液を尾静脈に10mLkgで単回投与した。抗ヒトIgA抗体としては、上述のGA1IgG1、GA2IgG1、GA3IgG1およびGA2N434Wを使用した。混合溶液中のヒトIgA濃度は全て80μgmLであるが、抗ヒトIgA抗体濃度は各抗体のhIgAへのアフィニティーに応じて抗体毎に異なり、GA1IgG1は100mgmL、GA2IgG1は289mgmL、GA3IgG1は538mgmL、GA2N434Wは1mgmLとした。このとき、ヒトIgAに対して抗ヒトIgA抗体は十分量過剰に存在することから、ヒトIgAは大部分が抗体に結合していると考えられる。投与後5分間、7時間、1日間、2日間、3日間、7日間で採血を行った。採取した血液は直ちに4°C、12000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。21-2ELISA法によるノーマルマウス血漿中の抗ヒトIgA抗体濃度測定マウス血漿中の抗ヒトIgA抗体濃度はELISA法にて測定した。まずAntiHumanIgGF2FragmentofAntibodyをNuncImmunoPlateMaxiSoupNalgenuncInternationalに分注し、4°Cで1晩静置しAntiHumanIgG固相化プレートを作成した。血漿中濃度として05、025、0125、00625、003125、001563、007813μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、AntiHumanIgG固相化プレートに分注して25°Cで1時間インキュベーションした。その後GoatAntiHumanIgGBiotinConjugateSouthernBiotechnologyAssociatsIncを25°Cで1時間反応させ、さらにStreptavidinPolyHRP80StereospecificDetectionTechnologiesを25°Cで1時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateBioFXLaboratoriesを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおけるGA1IgG1、GA2IgG1、GA3IgG1およびGA2N434Wの血漿中抗体濃度推移を図23に示した。21-3ELISA法による血漿中ヒトIgA濃度測定マウスの血漿中ヒトIgA濃度はELISA法にて測定した。まずGoatantiHumanIgAAntibodyBETHYLをNuncImmunoPlateMaxiSoupNalgenuncInternationalに分注し、4°Cで1晩静置しAntiHumanIgA固相化プレートを作成した。血漿中濃度として04、02、01、005、0025、00125、000625μgmLに調整したヒトIgA検量線試料および100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、これら検量線試料および血漿測定試料100μLに500ngmLのhsIL6Rを200μL加え、室温で1時間静置した。その後AntiHumanIgA固相化プレートに分注しさらに室温で1時間静置した。その後BiotinylatedAntihumanIL6RAntibodyRDを室温で1時間反応させ、さらにStreptavidinPolyHRP80StereospecificDetectionTechnologiesを室温で1時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateBioFXLaboratoriesを基質として用い発色反応を行い、1NSulfuricacidShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のノーマルマウスにおける血漿中ヒトIgA濃度推移を図24に示した。結果、ヒトIgA単独の消失に対して、ヒトIgAとCa依存的な結合が弱い依存性の度合いが小さい抗体であるGA1IgG1を同時に投与した場合は、ヒトIgAの消失を遅くした。それに対して、ヒトIgAと100倍以上のCa依存的な結合を有するGA2IgG1を同時に投与した場合は、ヒトIgAの消失を大幅に加速した。図23に示された血漿中抗体濃度、図24に示された血漿中ヒトIgA濃度および表23に示された各抗体のKD値から、血漿中に存在する非結合型のヒトIgA濃度を求めた。その結果を図25に示した。図25に示されたようにGA1IgG1投与群の非結合型の抗原ヒトIgAの濃度と比較して、GA2IgG1またはGA3IgG1投与群の非結合型の抗原ヒトIgAの濃度は低いことから、カルシウム依存的結合抗体を抗原の消失を加速することによって、非結合型の抗原ヒトIgAを低下できることが示された。さらに、pH74におけるFcRn結合を増強したGA2N434Wは抗原の消失をGA2IgG1よりも早め、投与7時間後には検出限界以下となった。以上からカルシウム依存的結合抗体が、pHまたはカルシウム依存的に結合しない通常の抗体と比較して、血漿中からの抗原の消失を加速可能であることが確認され、この現象は実施例5で示されたヒトIL6Rや実施例19で示されたヒトCD4だけでなくヒトIgAでも起こることが明らかになった。また、実施例6および実施例7のヒトIL6Rと同様に、カルシウム依存的結合抗体に対してpH74におけるFcRn結合を増強することによってさらに抗原の消失を加速できることがヒトIgAにおいても確認された。参考実施例31に示すとおり、pH依存的にヒトIL6受容体に結合するFv4IgG1は、非pH依存的にヒトIL6受容体に結合するH54L28IgG1と比較してヒトIL6受容体の消失を加速することが出来ているものの、ヒトIL6受容体単独より消失を加速することはできていない。ヒトIL6受容体単独より消失を加速するためには、中性領域のおけるFcRnへの結合を増強したFv4IgG1v1あるいはFv4IgG1v2を用いる必要がある。一方、驚くことに、Ca依存的にヒトIgAに結合するGA2IgG1は、中性領域のおけるFcRnに対する結合を増強していない天然型IgG1の定常領域を含むにも関わらず、ヒトIgAの消失をヒトIgA単独より加速することが見出された。このようなことがGA2IgG1において起こる理由として以下のメカニズムが考えられた。ヒトIL6受容体の単量体抗原の場合、2価の抗体に対して抗原が2つ結合し、抗原抗体3分子からなる抗原抗体複合体を形成する。一方、ヒトIgAが二量体抗原であり、抗体も2価であることから、両者の抗原抗体複合体は、抗原抗体4分子以上からなる抗原抗体複合体免疫複合体を形成すると考えられる。多量体抗原に対する天然IgG1型通常抗体が大きな免疫複合体を形成する場合、その免疫複合体はFcgR、FcRn、補体レセプター等に対して多価のFc領域を介してavidityで結合することが可能であるため、これらのレセプターを発現する細胞に取り込まれるのに対して、pHCa依存性を有さない単量体抗原に対する通常抗体は、天然IgG1型のレセプターに対する親和性が十分ではないため細胞に取り込まれる効率が低い。本来FcRnは細胞内に取り込まれた抗体をエンドソームから血漿中にリサイクルする役目を持っているが、このようなFcRnに対して多価で結合可能な大きな免疫複合体は、FcRnを介してエンドソームからライソソームに移行し分解されることが知られている。すなわち、図26に示すように、多量体抗原に対して大きな免疫複合体を形成する通常抗体は、その抗原の消失を加速することは可能だが、エンドソーム内でも抗原が抗体から解離することが無いことから、抗原と同時に抗体も消失してしまうため、抗体1分子あたりの抗原を消失させる効率は悪い。すなわち、pHCa依存性を有さない単量体抗原に対する通常抗体は抗原の消失を加速することは可能だが、その効率は悪いと考えられる。これに対して、多量体抗原に対する天然型IgG1の定常領域を含むpHCa依存性抗体が大きな免疫複合体を形成する場合は、図27に示すように、その免疫複合体はFcgR、FcRn、補体レセプター等に対して多価のFc領域を介してavidityで結合し、これらのレセプターを発現する細胞に取り込まれる。その後、エンドソーム内で抗原がpHCa依存性抗体から解離することで、免疫複合体の形成が解消される。抗原はFcRnに結合することができないため、ライソソームに移行し分解されるのに対して、抗体は免疫複合体を形成していないためFcRnによって血漿中にリサイクルされると考えられる。すなわち、多量体抗原に対する天然IgG1型の定常領域を含むpHCa依存性抗体が大きな免疫複合体を形成して、avidityでFcgR、FcRn、補体レセプター等に結合することが出来れば、抗原の消失のみを選択的に大幅に加速することが出来ると考えられる。そのようなことがヒトIgAに対するGA2IgG1においても起こっていると考えられた。参考実施例31に示すような天然型IgG1に対してアミノ酸置換で中性領域におけるFcRnの結合を増強する方法を用いることなく、多量体抗原の消失を大幅に加速する方法として有用であると考えられた。このような作用を発揮するためには、抗原抗体が大きな免疫複合体を形成し、IgG1でもavidityでFcgRFcRnに強く結合する必要があると考えられる。抗原が二量体以上の抗原であれば、大きな免疫複合体を形成し、avidityで上述のレセプターに結合するようなpHCa依存性抗体をスクリーニングすることが出来れば、アミノ酸置換することなく天然型IgG1の定常領域を用いることで効率的に抗原の消失を加速することが可能である。また、一般には抗原と抗体が大きな免疫複合体を形成するためには、抗原が多量体抗原例えばIgAIgE等のimmunoglobulinやTNFCD154等のTNFスーパーファミリーである必要があると考えられるが、単量体抗原であってもその単量体抗原に存在する2つ以上のエピトープを認識する適切な2種類以上のpHCa依存性抗体の混合物を用いることでも大きな免疫複合体を形成することが可能であると考えられる。また、単量体抗原に存在する2つ以上のエピトープを認識する適切なmultispecificpHCa依存性抗体例えば、図28に示すようなエピトープAを認識する右腕とエピトープBを認識する左腕を含む天然型IgGの定常領域を含むbispecific抗体を用いることでも大きな免疫複合体を形成することが可能であると考えられる。すなわち、単量体抗原に対しても、適切なpHCa依存性抗体をスクリーニングすることができれば、天然型IgG1の定常領域を含む抗体の混合物やmultispecificな天然型IgG1の定常領域を含む抗体を用いることで、そのアミノ酸が置換された変異型IgG1を用いることなく効率的に抗原の消失を加速することも可能であると考えられる実施例22カルシウム依存的にヒトグリピカン3に結合する抗体22-1ヒトグリピカン3GPC3の調製抗原として用いる組み換えヒトグリピカン3以下GPC3を以下のように調製した。ヒトグリピカン3の膜貫通領域を含まないアミノ酸配列に6残基のヒスチジンが連結した配列配列番号:93を発現するプラスミドが定常的に導入されているCHO細胞を培養し、培養上清を回収した。得られた培養上清を、イオン交換クロマトグラフィー精製後、Hisタグを用いたアフィニティー精製およびゲルろ過クロマトグラフィー精製を行って、GPC3を得た。22-2ヒトGPC3に結合する抗体の発現と精製抗ヒトグリピカン3抗体である、CSCM01005重鎖配列:94、軽鎖配列:95、CSCM01009重鎖配列:96、軽鎖配列:97、CSCM01015重鎖配列:98、軽鎖配列:99、CSCM01023重鎖配列:100、軽鎖配列:101およびGCIgG1重鎖配列:102、軽鎖配列:103がそれぞれ動物発現用プラスミドへ挿入された。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株InvitrogenをFreeStyle293ExpressionMedium培地Invitrogenへ懸濁し、133x106個mLの細胞密度で6wellplateの各ウェルへ3mLずつ蒔きこみ、リポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター37°C、8CO290rpmで4日間培養を行い、得られた培養上清から、rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出したProteinScience1995424112423。なお、GCIgG1抗体については、GCIgG1抗体が定常的に発現するCHO細胞培養上清から同様の方法で抗体を精製し、濃度を算出した。22-3取得された抗体のヒトGPC3に対するCa依存的結合能評価取得された抗体が以下の手順でELISAに供された。StreptaWell96マイクロタイタープレートRocheがビオチン標識抗原を含む100μLのPBSにて一晩コートされた。該当プレートの各ウェルをACESbuffer10mMACES150mMNaCl100mMCaCl2005Tween20pH74にて洗浄することによって抗原が除かれた後、当該ウェルが2BSAを含むACESBuffer250μLにて1時間以上ブロッキングされた。2BSAを含むACESBufferが除かれた各ウェルに、あらかじめ10μgmLから4倍ずつ希釈を行った精製IgG各100μLが加えられた当該プレートを一時間静置することによって、IgGを各ウェルに存在する抗原に結合させた。ACESBufferにて洗浄された各ウェルに、10mMACES150mMNaCl12mMCaCl2pH74、10mMACES150mMNaCl3μMCaCl2pH74、10mMACES150mMNaCl12mMCaCl2pH58もしくは10mMACES150mMNaCl3μMCaCl2pH58が加えられ、当該プレートは37°Cで30分間静置しインキュベートされた。ACESBufferにて洗浄された後に、2BSAを含むACESBufferによって希釈されたHRP結合抗ヒトIgG抗体BIOSOURCEが各ウェルに添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。ACESBufferにて洗浄後、TMBsingle溶液ZYMEDが添加された各ウェル中の溶液の発色反応が、硫酸の添加により停止された後、450nmの吸光度によって当該発色が測定された。測定された結果を図29に示した。GCIgG1ではカルシウムイオンの濃度に依らず吸光度が同じであるのに対して、CSCM01005、CSCM01009、CSCM01015およびCSCM01023は12mMカルシウムイオン濃度高カルシウムイオン濃度における吸光度と比較して、3μMカルシウムイオン濃度低カルシウムイオン濃度における吸光度は、顕著に低い結果となった。この結果から、CSCM01005、CSCM01009、CSCM01015およびCSCM01023はカルシウムイオンの濃度によって抗原との結合が変化する性質を有することが示され、ヒトグリピカン3に対してもカルシウム依存的抗体が取得できることが示された。これらのカルシウム依存的抗ヒトグリピカン3抗体は、通常の抗ヒトグリピカン3抗体と比較して、上述の実施例におけるヒトIL6R、ヒトCD4、ヒトIgAと同様に、ヒトグリピカン3の消失を加速することが出来ると考えられた。さらにこれらのカルシウム依存的抗ヒト抗グリピカン3抗体に対して、pH74におけるFcRnに対する結合を増強することにより、さらにヒトグリピカン3の消失を加速することが出来ると考えられた。実施例23カルシウム依存的にIgEに結合する抗体23-1ビオチン化ヒトIgEの調製抗原であるヒトIgEは以下のように調製された。IgEH配列番号:104、C末端にビオチン付加配列が連結されているおよびL配列番号:14をコードするDNA配列を挿入した動物細胞発現ベクターを作製し、当該発現ベクターおよびFreeStyle293Invitrogenを用いて培養上清中にビオチン付加配列がC末端に結合した全長のヒトIgE蛋白質を発現させた。得られた培養上清からイオン交換クロマトグラフィー、アビジンを用いたアフィニティー精製さらにゲルろ過クロマトグラフィー精製を行い、ビオチン化ヒトIgEを得た。23-2ヒトIgEに結合する抗体の発現と精製GEB0100重鎖配列番号:105、軽鎖配列番号:106、GEB0220重鎖配列番号:107、軽鎖配列番号:108、GEB0230重鎖配列番号:109、軽鎖配列番号:110およびXolair重鎖配列番号:111、軽鎖配列番号:112はヒトIgEに結合する抗体である。GEB0100重鎖配列番号:105、軽鎖配列番号:106、GEB0220重鎖配列番号:107、軽鎖配列番号:108、GEB0230重鎖配列番号:109、軽鎖配列番号:110およびXolair一般名Omalizumab重鎖配列番号:111、軽鎖配列番号:112がそれぞれ動物発現用プラスミドに当該業者公知の方法で組み込まれた。抗体の発現は以下の方法を用いて行った。ヒト胎児腎細胞由来FreeStyle293F株Invitrogenへリポフェクション法により調製したプラスミドを細胞へ導入した。CO2インキュベーター37°C、8CO290rpmで4から7日間培養を行い、得られた培養上清から、rProteinASepharoseTMFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定した。得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出したProteinScience1995424112423。23-3取得された抗体のヒトIgEに対するCa依存的結合能の評価取得された抗体のヒトIgEに対するCa依存的結合能の評価はELISA法を用いて行われた。具体的には、NUNCイムノ384ウェルプレートマキシソープThermofisherscientific社製464718に1μgmLのGoatantirabbitIgGFcpolyclonalantibodyBethyllaboratory社製A120111Aまたは1μgmLのGoatantihumanIgGFcpolyclonalantibodyICNbiomedicals社製55071を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、溶液を取り除き、20に希釈したBlockingOne試薬ナカライテスク社製0395395を50μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、溶液を取り除き、12mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で希釈した精製抗体を40μL加えた。4°Cで一晩インキュベートした後、12mMの塩化カルシウムと005wvのTween20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、12mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で500ngmLに希釈したビオチン化ヒトIgE23-1で作製を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、12mMの塩化カルシウムと005wvのTween20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、2mMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液pH74または3μMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液pH74を80μL加え、ただちに溶液を取り除いた後、再び2mMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液pH74または3μMの塩化カルシウムを含むACES緩衝溶液pH74を80μL加えた。37°Cで1時間インキュベートした後、12mMの塩化カルシウムと005wvのTween20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、12mMの塩化カルシウムを含むトリス緩衝溶液で25ngmLに希釈したHRP標識ストレプトアビジンThermofisherscientific社製21132を40μL加えた。室温で1時間インキュベートした後、12mMの塩化カルシウムと005wvのTween20を含むトリス緩衝溶液80μLで3回洗浄し、発色基質KPL社製506606ABTSperoxidasesubstratesystem1componentを40μL加える。室温で15分または30分インキュベートした後、405nmの吸光度を測定したMoleculardevices社製SpectraMaxPlus384。測定結果を図30に示した。Xolairではカルシウムイオンの濃度に依らず吸光度が同じであるのに対して、GEB0100、GEB0220およびGEB0230は2mMカルシウムイオン濃度高カルシウムイオン濃度における吸光度と比較して、3μMカルシウムイオン濃度低カルシウムイオン濃度における吸光度は、顕著に低い結果となった。この結果から、GEB0100、GEB0220およびGEB0230はカルシウムイオンの濃度によって抗原との結合が変化する性質を有することが示された。上記の現象は、ヒトIgEに対してもカルシウム依存的抗体が取得できることを示している。これらのカルシウム依存的抗ヒトIgE抗体は、Xolairなどの通常の抗ヒトIgE抗体と比較して、上述の実施例におけるヒトIL6R、ヒトCD4、ヒトIgAと同様に、ヒトIgEの消失を加速することが出来ると考えられた。さらにこれらのカルシウム依存的抗ヒトIgE抗体に対して、pH74におけるFcRnに対する結合を増強することにより、さらにヒトIgEの消失を加速することが出来ると考えられた。参考例1可溶型ヒトIL6レセプターhsIL6Rの調製抗原であるヒトIL6レセプターの組み換えヒトIL6レセプターは以下のように調製した。JImmunol15249584968で報告されているN末端側1番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL6レセプター以下、hsIL6RのCHO定常発現株を当業者公知の方法で構築し、培養し、hsIL6Rを発現させた。得られた培養上清から、BlueSepharose6FFカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーの2工程によりhsIL6Rを精製した。最終工程においてメインピークとして溶出した画分を最終精製品とした。参考例2ヒトFcRnの調製FcRnは、FcRnとβ2ミクログロブリンとの複合体である。公表されているヒトFcRn遺伝子配列に基づいてオリゴDNAプライマーを調製したJExpMed1994Dec1180237781。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNAHumanPlacentaMarathonReadycDNAClontechを用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域Met1~Leu290を含有する細胞外ドメインをコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。同様に、公表されているヒトβ2ミクログロブリン遺伝子配列ProcNatlAcadSciUSA991689916903に基づいてオリゴDNAプライマーを調製した。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNAHumanPlacentaMarathonReadycDNAClontechを用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域Met1~Met119を含有するタンパク質全体をコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。可溶型ヒトFcRnを以下の手順により発現させた。ヒトFcRn配列番号:17およびβ2ミクログロブリン配列番号:18を発現させるために構築したプラスミドを、PEIPolyscienceを用いたリポフェクション法によって、ヒト胎児腎癌由来細胞株HEK293HInvitrogenの細胞に導入した。得られた培養上清を回収して、IgGSepharose6FastFlowAmershamBiosciencesを用いて精製した後にHiTrapQHPGEHealthcareJImmunol2002Nov1169517180を用いることによってFcRnをさらに精製した。参考例3pH依存的抗原結合抗体の抗原消失加速効果の向上検討invivo試験3-1中性条件下におけるFcRnへの結合を有するpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体の調製VH3IgG1配列番号:19とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1に対して、中性条件下pH74におけるFcRnに対する結合を増加させる変異を導入した。具体的にはIgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける252番目をMetからTyrに、254番目をSerからThrに、256番目をThrからGluに置換したVH3IgG1v1配列番号:21、および、IgG1の重鎖定常領域に対して、EUナンバリングにおける434番目をAsnからTrpに置換したVH3IgG1v2配列番号:22を調製した。アミノ酸置換の導入は、QuikChangeSiteDirectedMutagenesisKitStratageneまたはInFusionHDCloningKitを用いて、添付説明書記載の方法で変異体を作製し、得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。H54配列番号:5とL28配列番号:6とを含むH54L28IgG1、VH3IgG1配列番号:19とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1、VH3IgG1v1配列番号:21とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1v1、および、VH3IgG1v2配列番号:22とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1v2の発現及び精製は、以下の方法を用いて行われた。製造元の提供するプロトコールに記載のようにFreestyleHEK293により、またはHEK293H株により抗体を発現させた。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株Invitrogenを、10ウシ胎仔血清Invitrogenを含むDMEM培地Invitrogenへ懸濁し、5~6×105個mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ直径10cmCORNINGの各ディッシュへ10mLずつ蒔きこみCO2インキュベーター37°C、5CO2内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHOSSFMIIInvitrogen培地69mLを添加した。調製したプラスミドをlipofection法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離約2000g、5分間、室温して細胞を除去し、さらに022μmフィルターMILLEXGVMilliporeを通して滅菌して培養上清を得た。得られた培養上清にrProteinASepharoseFastFlowAmershamBiosciencesを用いて当業者公知の方法で精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸光度を測定した。得られた値からProteinScience1995424112423に記された方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した。当業者公知の方法によって発現させて精製した。3-2ヒトFcRnトランスジェニックマウスおよび正常マウスを用いたinvivo試験ヒトFcRnトランスジェニックマウスB6mFcRnhFcRnTg系統276マウス、JacksonLaboratories、MethodsMolBiol201060293104および正常マウスC57BL6Jマウス、CharlesRiverJapanにhsIL6R可溶型ヒトIL6受容体:参考例1にて調製を単独投与もしくはhsIL6Rおよび抗ヒトIL6受容体抗体を同時投与した後のhsIL6Rおよび抗ヒトIL6受容体抗体の生体内における動態を評価した。hsIL6R溶液もしくはhsIL6Rおよび抗ヒトIL6受容体抗体の混合溶液それぞれ5μgmL、01mgmLを尾静脈に10mLkgで単回投与した。このとき、hsIL6Rに対して抗ヒトIL6受容体抗体は十分量過剰に存在することから、hsIL6Rはほぼ全て抗体に結合していると考えられる。投与15分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、7日後、14日後、21日後、28日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4°C、15000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。抗ヒトIL6受容体抗体としては、ヒトFcRnトランスジェニックマウスには上述のH54L28IgG1、Fv4IgG1、および、Fv4IgG1v2、正常マウスには上述のH54L28IgG1、Fv4IgG1、Fv4IgG1v1、および、Fv4IgG1v2を使用した。3-3血漿中抗ヒトIL6受容体抗体濃度のELISA法による測定マウス血漿中の抗ヒトIL6受容体抗体濃度はELISA法にて測定した。まず抗ヒトIgGF2抗体断片をNuncImmunoPlateMaxiSorpに分注し、4°Cで一晩静置し抗ヒトIgG固相化プレートを調製した。血漿中濃度として08、04、02、01、005、0025、00125μgmLの検量線試料と100倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製し、これら検量線試料および血漿測定試料100μLに20ngmLのhsIL6Rを200μL加え、室温で1時間静置した。その後抗ヒトIgG固相化プレートに分注しさらに室温で1時間静置した。その後ビオチン化抗ヒトIL6R抗体RDを室温で1時間反応させ、さらにStreptavidinPolyHRP80を室温で1時間反応させ、TMBOneComponentHRPMicrowellSubstrateを基質として用い発色反応を行い、1N硫酸ShowaChemicalで反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。この方法で測定した静脈内投与後のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中抗体濃度推移を図31に、正常マウスにおける血漿中抗体濃度推移を図33に示した。3-4電気化学発光法による血漿中hsIL6R濃度測定マウスの血漿中hsIL6R濃度は電気化学発光法にて測定した。2000、1000、500、250、125、625、および3125pgmLの濃度に調整したhsIL6R検量線試料ならびに50倍以上希釈したマウス血漿測定試料を調製した。試料を、SULFOTAGNHSEsterMesoScaleDiscoveryでルテニウム化したモノクローナル抗ヒトIL6R抗体RD、ビオチン化抗ヒトIL6R抗体RD、およびWTIgG1溶液と混合し、37°Cで一晩反応させた。その際の抗ヒトIL6受容体抗体として、H配列番号:13とL配列番号:14とを含むWTIgG1の終濃度は試料に含まれる抗ヒトIL6受容体抗体濃度より過剰の333μgmLであり、試料中のほぼ全てのhsIL6RをWTIgG1と結合した状態にすることを目的とした。その後、MA400PRStreptavidinPlateMesoScaleDiscoveryに分注した。さらに室温で1時間反応させ洗浄後、ReadBufferT樹脂に添加することで血漿中に存在する全てのIgG型抗体マウスIgG、抗ヒトIL6受容体抗体および抗ヒトIL6受容体抗体可溶型ヒトIL6受容体複合体をプロテインAに吸着させた。その後、高速遠心機でスピンダウンし、パス溶液を回収した。パス溶液にはプロテインAに結合した抗ヒトIL6受容体抗体可溶型ヒトIL6受容体複合体は含まれないため、パス溶液中のhsIL6R濃度を測定することによって、血漿中の遊離hsIL6R濃度を測定可能である。次にパス溶液を、SULFOTAGNHSEsterMesoScaleDiscoveryでルテニウム化したモノクローナル抗ヒトIL6R抗体RDおよびビオチン化抗ヒトIL6R抗体RDと混合し室温で1時間反応させた。その後、MA400PRStreptavidinPlateMesoScaleDiscoveryに分注した。さらに室温で1時間反応させ洗浄後、ReadBufferT766371。Fv4IgG1、および、Fv4IgG1に対してこのアミノ酸置換を導入したFv4IgG1v2のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおけるinvivo試験の結果を比較した。図31に示したとおり、両者の抗体血漿中滞留性はほぼ同等であったが、図32に示すとおり、中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合が増加したFv4IgG1v2と同時に投与したhsIL6Rのほうが、Fv4IgG1と同時に投与したhsIL6Rと比較して、hsIL6Rの消失が早くなっていることが確認された。中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合を付与することによって4日後の血漿中hsIL6R濃度は約4倍低減できることが見出された。ヒトFcRnとマウスFcRnのホモロジーからEUナンバリングにおける434番目のAsnからTrpへの置換は、中性条件下pH74におけるマウスFcRnへの結合も増加させると考えられる。また、EUナンバリングにおける252番目をMetからTyrに、254番目をSerからThrに、256番目をThrからGluに置換することによって、中性条件下pH74におけるマウスFcRnに対する結合が増加することが報告されているJImmunol2002169517180。Fv4IgG1、および、Fv4IgG1に対してこれらのアミノ酸置換をそれぞれ導入したFv4IgG1v1とFv4IgG1v2の正常マウスにおけるinvivo試験の結果を比較した。図33に示したとおり、Fv4IgG1と比較して、中性条件下pH74におけるマウスFcRnへの結合も増加させたFv4IgG1v1とFv4IgG1v2の血漿中滞留性は若干低下した1日後の血漿中抗体濃度がそれぞれ約15倍および約19倍低下。図34に示すとおり、中性条件下pH74におけるマウスFcRnに対する結合が増加したFv4IgG1v1あるいはFv4IgG1v2と同時に投与したhsIL6Rのほうが、Fv4IgG1と同時に投与したhsIL6Rと比較して、hsIL6Rの消失が著しく早くなっていることが確認された。中性条件下pH74におけるマウスFcRnに対する結合を付与することによって、Fv4IgG1v1とFv4IgG1v2は1日後の血漿中hsIL6R濃度はそれぞれ約32倍および約80倍低減できることが見出された。中性条件下pH74におけるマウスFcRnに対する結合を付与することによって、上述のように抗体の血漿中濃度も若干低下したが、それを大幅に上回る血漿中hsIL6R濃度低減効果を示すことが見出された。さらにhsIL6R単独の投与群と比較しても、Fv4IgG1v1あるいはFv4IgG1v2と同時に投与したhsIL6RのほうがhsIL6Rの消失が早くなっていることが見出された。図34に示すとおり、hsIL6R単独と比較して、Fv4IgG1v1またはFv4IgG1v2と同時にhsIL6Rを投与することにより1日後の血漿中hsIL6R濃度はそれぞれ約4倍および約11倍低減できることが見出された。これはすなわち、pH依存的に可溶型IL6受容体に結合し、さらに中性条件下pH74におけるマウスFcRnに対する結合を付与した抗体の投与によって、可溶型IL6受容体の消失を抗体により加速できたことを意味する。すなわち、このような抗体を生体内に投与することによって、生体内で血漿中の抗原濃度を低減することが可能となる。図35に示すとおり、H54L28IgG1は投与7日後まで遊離hsIL6R濃度が検出されたが、Fv4IgG1は投与後1日以降は遊離hsIL6Rが検出されず、Fv4IgG1v1またはFv4IgG1v2は投与後7時間以降は遊離hsIL6Rが検出されなかった。すなわち、hsIL6Rに対してpH依存的結合を有するFv4IgG1は、H54L28IgG1と比較して低い遊離hsIL6R濃度を示したことから、hsIL6Rに対してpH依存的結合を付与することでより高いhsIL6Rの中和効果を発揮し、さらにFv4IgG1に対してpH74においてFcRnへの結合を増加させたFv4IgG1v1およびFv4IgG1v2は、さらに低い遊離hsIL6R濃度を示したことから、pH74においてFcRnへの結合を増加させることでさらに高いhsIL6Rの中和効果を発揮することが可能であることが確認された。H54L28IgG1のような通常の中和抗体は、抗体を投与すると結合する抗原のクリアランスを低下させ、抗原はより血漿中に長く滞留する。抗体投与によってその作用を中和したい抗原の血漿中滞留性が長くなることは好ましくない。抗原に対する結合にpH依存性中性条件下で結合し、酸性条件下で解離するを付与することで、抗原の血漿中滞留性を短くすることが出来る。今回、さらに中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合を付与することで、抗原の血漿中滞留性をさらに短くすることができた。さらに、pH依存的に抗原に結合し中性条件下pH74におけるFcRnに対する結合を付与した抗体を投与することによって、抗原単独のクリアランスよりもクリアランスを増大させることが可能であることが示された。これまでに抗体投与により抗原単独のクリアランスよりもクリアランスを増大させる方法は知られておらず、本検討で見出された方法は、抗体投与によって血漿中から抗原を消失させる方法として極めて有用である。また、本検討により初めて中性条件下pH74におけるFcRnに対する結合を増加させることの利点が見出された。また、中性条件下pH74におけるFcRnに対する結合を増加させる異なるアミノ酸置換を有するFv4IgG1v1とFv4IgG1v2の両方において同様の効果が認められたことから、アミノ酸置換の種類によらず、中性条件下pH74におけるヒトFcRnに対する結合を増加させるアミノ酸置換であれば、抗原の消失を加速する効果があると考えられる。すなわち、JBiolChem2007282170917に報告されているEUナンバリング257番目のProをIleに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング311番目のGlnをIleに置換するアミノ酸置換、JImmunol2009182766371に報告されているEUナンバリング434番目のAsnをAla、TyrもしくはTrpに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング252番目のMetをTyrに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング307番目のThrをGlnに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング308番目のValをProに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング250番目のThrをGlnに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング428番目のMetをLeuに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング378番目のAlaをValに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング436番目のTyrをIleに置換するアミノ酸置換、JBiolChem2006Aug182812351424に報告されているEUナンバリング252番目のMetをTyrに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、EUナンバリング256番目のThrをGluに置換するアミノ酸置換、NatBiotechnol2005Oct2312838に報告されている433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、434番目のAsnをPheに置換するアミノ酸置換、436番目のTyrをHisに置換するアミノ酸置換等、および、これらのアミノ酸置換の組み合わせを用いることによって、投与より血漿中から抗原を消失させる抗体分子を作製可能であると考えられる。参考例4ヒトFcRnへの結合活性の評価Biacoreを用いた抗体とFcRnの相互作用を評価する測定系として、JImmunol2009182766371に記されたセンサーチップへ抗体を固定化しヒトFcRnをアナライトとする系が報告されている。この目的のために、ヒトFcRnを参考例4に記載のように調製した。本系を用いて、Fv4IgG1、Fv4IgG1v1およびFv4IgG1v2のpH60およびpH74におけるヒトFcRnへの結合活性解離定数KDの評価を行った。被験物質である抗体は、SeriesSセンサーチップCM5に直接固定化して試験に供した。センサーチップへの抗体の固定化は、ランニングバッファーとして50mmolLリン酸ナトリウム150mmolLNaCl005SurfactantP20pH60を用い、アミンカップリングキットを使用してメーカーのマニュアルに従って固定化量500RUを目指して実施した。ランニングバッファーとして、50mmolLリン酸ナトリウム150mmolLNaCl005SurfactantP20pH60、あるいは50mmolLリン酸ナトリウム150mmolLNaCl005SurfactantP20pH74を使用し、作成したセンサーチップを使用して測定を実施した。測定は全て25°Cで行った。ヒトFcRn希釈液とランニングバッファー参照溶液としてとを流速5μLminで10分間インジェクトし、センサーチップ上の抗体にヒトFcRnを相互作用させた。その後流速5μLminで1分間ランニングバッファーを流しFcRnを解離を観察した後、20mmolLTrisHCl150mmolLNaClpH81を流速30μLminで15秒間インジェクトを2回繰り返してセンサーチップを再生した。測定結果の解析はBiacoreT100EvaluationSoftwareVer201で行った。少なくとも6つの異なる濃度のFcRnの測定結果より定常状態アフィニティー法steadystateaffinitymethodにより解析して解離定数KDを算出した。Fv4IgG1、Fv4IgG1v1およびFv4IgG1v2のpH60およびpH74におけるヒトFcRnへの結合活性解離定数KDの結果を以下の表24に示した。Fv4IgG1のpH74におけるヒトFcRnへの結合は非常に弱く、KD値を算出することはできなかったNA。それに対して、Fv4IgG1v1とFv4IgG1v2はpH74におけるヒトFcRnへの結合が認められ、KD値はそれぞれ3655μMと1103μMと算出された。また、pH60におけるヒトFcRnへのKD値はそれぞれ199μMと032μMと011μMと算出された。図31に示したように、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて、Fv4IgG1と比較して、Fv4IgG1v2にすることによってhsIL6Rの消失が加速されたことから、ヒトIgG1を改変して最低でもpH74におけるヒトFcRnへの結合を1103μMよりも強くすることで、抗原の消失を加速できると考えられる。また、JImmunol2002169517180に示されているようにヒトIgG1はマウスFcRnに対してヒトFcRnよりも10倍程度強く結合することから、Fv4IgG1v1とFv4IgG1v2においてもpH74におけるマウスFcRnへの結合はヒトFcRに対する結合よりも10倍程度強いと予想される。図34に示した正常マウスにおけるFv4IgG1v1とFv4IgG1v2のhsIL6Rの消失加速は、図32に示したヒトFcRnトランスジェニックマウスにおけるFv4IgG1v2のhsIL6Rの消失加速よりも大きいことから、pH74におけるFcRnへの結合の強さに応じて、hsIL6Rの消失加速が大きくなると考えられる。参考例5中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強したpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体の調製5-1Fv4IgG1の重鎖定常領域改変体の作製ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける、pH依存的ヒトIL6受容体結合抗体の抗原消失効果を更に増大させるため、Fv4IgG1に対して、中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強するための様々な改変を導入した。具体的には、表25-1および25-2に記載のアミノ酸改変をFv4IgG1の重鎖定常領域に導入することで、各種変異体を作製した変異箇所のアミノ酸番号はEUナンバリングによる。なお、アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。表25-2は表25-1の続きの表である。調製した重鎖とL配列番号:14とを含む変異体を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した。5-2ヒトFcRnに対する結合評価BiacoreT100を用いて、ヒトFcRnと抗体との速度論的解析を行った。この目的のために、ヒトFcRnを参考例2に記載のように調製した。センサーチップCM4上にアミンカップリング法でプロテインLを適当量固定化し、そこへ目的の抗体を捕捉させた。次に、FcRn希釈液とランニングバッファー参照溶液としてとをインジェクトし、センサーチップ上に捕捉させた抗体にヒトFcRnを相互作用させた。ランニングバッファーには50mmolLリン酸ナトリウム、150mmolLNaCl、005Tween20、pH70を用い、FcRnの希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。チップの再生には10mmolLグリシンHClpH15を用いた。測定は全て25°Cで実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数ka、および解離速度定数kdを算出し、その値をもとに各抗体のヒトFcRnに対するKDを算出した。各パラメーターの算出にはBiacoreT100EvaluationSoftwareを用いた。Biacoreによる中性条件下pH70でのヒトFcRnへの結合評価の結果を、表6-1および6-2に記載した。ここで、天然型IgG1は結合が非常に弱く、KDは算出不可能であったため、表6-1にNDと表記した。参考例6中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強したpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体のinvivo試験参考例4で調製した中性条件下でのヒトFcRnへの結合能を付与した重鎖を用いて、中性条件下でのヒトFcRnへの結合能を有するpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体を作製し、生体内での抗原消失効果の検証を行った。具体的には、VH3IgG1とVL3CKとを含むFv4IgG1、VH3IgG1v2とVL3CKとを含むFv4IgG1v2、VH3IgG1F14とVL3CKとを含むFv4IgG1F14、VH3IgG1F20とVL3CKとを含むFv4IgG1F20、VH3IgG1F21とVL3CKとを含むFv4IgG1F21、VH3IgG1F25とVL3CKとを含むFv4IgG1F25、VH3IgG1F29とVL3CKとを含むFv4IgG1F29、VH3IgG1F35とVL3CKとを含むFv4IgG1F35、VH3IgG1F48とVL3CKとを含むFv4IgG1F48、VH3IgG1F93とVL3CKとを含むFv4IgG1F93、VH3IgG1F94とVL3CKとを含むFv4IgG1F94を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した。調製したpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体について、ヒトFcRnトランスジェニックマウスB6mFcRnhFcRnTg系統276マウス、JacksonLaboratories、MethodsMolBiol201060293104を用いたinvivo試験を、参考例3の方法と同様に実施した。得られた静脈内投与後のヒトFcRnトランスジェニックマウスにおける血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度推移を図36に示した。試験の結果、中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強させたpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体はいずれも、中性条件下におけるヒトFcRnへの結合能をほとんど持たないFv4IgG1と比較して、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が低く推移することが示された。中でも、特に顕著な効果を示したものとして例を挙げると、Fv4IgG1F14と同時に投与された可溶型ヒトIL6受容体の1日後の血漿中濃度は、Fv4IgG1と同時に投与されたそれと比較して、約54倍低下することが示された。また、Fv4IgG1F21と同時に投与された可溶型ヒトIL6受容体の7時間後の血漿中濃度は、Fv4IgG1と同時に投与されたそれと比較して、約24倍低下することが示された。更には、Fv4IgG1F25と同時に投与された可溶型ヒトIL6受容体の7時間後の血漿中濃度は、検出限界156ngmL以下であり、Fv4IgG1と同時に投与されたそれと比較して、200倍以上もの顕著な抗原濃度の低下が可能であると考えられた。これらのことから、抗原消失効果を増強させることを目的として、pH依存的抗原結合抗体に対して中性条件下でのヒトFcRnへの結合を増強させることは非常に有効であることが示された。また、抗原消失効果を増強させるために導入される、中性条件下でのヒトFcRnへの結合を増強させるアミノ酸改変の種類は表6-1、表6-2に記載の改変を含めて特に限定されず、どのような改変を導入しても、生体内において抗原消失効果を増強することが可能であると考えられる。更に、Fv4IgG1F14、Fv4IgG1F21、Fv4IgG1F25、Fv4IgG1F48の4種のpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体と同時に投与した可溶型ヒトIL6受容体は、可溶型ヒトIL6受容体の単独投与群と比較しても、より低い血漿中濃度推移を示した。このようなpH依存的ヒトIL6受容体結合抗体を、血漿中の可溶型ヒトIL6受容体濃度が一定濃度を維持している状態定常状態にある生体内に投与することで、血漿中の可溶型ヒトIL6受容体濃度を定常状態における血漿中濃度よりも、より低く維持することが可能である。すなわち、このような抗体を生体内に投与することによって、生体内で血漿中の抗原濃度を低減することが可能となる。参考例7低用量001mgkgにおけるFv4IgG1F14の有効性の検証参考例6で調製したFv4IgG1F14を用いて、低用量001mgkgにおけるinvivo試験を参考例6の方法と同様に行い、参考例6で得られたFv4IgG1およびFv4IgG1F14の1mgkg投与時の結果と比較した結果を図37および38に示した。その結果、Fv4IgG1F14の001mgkg投与群の血漿中抗体濃度は、1mgkg投与群に比較して100倍程度低いにも関わらず図38、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度推移はほぼ同等であることが示された図37。また、Fv4IgG1F14の001mgkg投与群の7時間後の血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度は、Fv4IgG1の1mgkg投与群のそれと比較して、約3倍低下させることが示された。更に、Fv4IgG1F14は、いずれの用量での投与群においても、可溶型ヒトIL6受容体単独投与群と比較して、より低い血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度推移を示した図37。このことから、Fv4IgG1に対して中性条件下でのヒトFcRnへの結合を増強させたFv4IgG1F14は、Fv4IgG1の100分の1の投与量であっても、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度を効果的に低下させることが示された。つまり、pH依存的抗原結合抗体に対し、中性条件下でのFcRnへの結合能を増強させることで、より低い投与量であっても効果的に抗原を消失させることが可能になると考えられる。参考例8正常マウスを用いた定常状態モデルによるinvivo試験8-1中性条件下におけるマウスFcRnへの結合評価参考例5で調製した、VH3IgG1配列番号:19とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1、VH3IgG1v2配列番号:22とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1v2、VH3IgG1F20配列番号:23とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1F20、について、以下の方法により中性条件下pH74におけるマウスFcRnへの結合評価を実施した。BiacoreT100を用いて、マウスFcRnと抗体との速度論的解析を行った。センサーチップCM4上にアミンカップリング法でプロテインLを適当量固定化し、そこへ目的の抗体を捕捉させた。次に、FcRn希釈液とランニングバッファー参照溶液としてとをインジェクトし、センサーチップ上に捕捉させた抗体にマウスFcRnを相互作用させた。ランニングバッファーには50mmolLリン酸ナトリウム、150mmolLNaCl、005Tween20、pH74を用い、FcRnの希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。チップの再生には10mmolLグリシンHClpH15を用いた。測定は全て25°Cで実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数ka、および解離速度定数kdを算出し、その値をもとに各抗体のマウスFcRnに対するKDを算出した。各パラメーターの算出にはBiacoreT100EvaluationSoftwareを用いた。結果を表26pH74におけるマウスFcRnアフィニティーに示した。ここで、定常領域が、天然型IgG1であるVH3LIgG1表26におけるIgG1は、マウスFcRnに対する結合が非常に弱く、KDは算出不可能であったため、表26にはNDと表記した。測定の結果、中性条件下におけるヒトFcRnへの結合を増強したこれらの改変体は、マウスFcRnに対しても同様に、中性条件下における結合が増強していることが示された。8-2血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度を定常状態とした正常マウスにおけるinvivo試験実施例3および参考例5で調製した、H54L28IgG1、Fv4IgG1、Fv4IgG1v2およびFv4IgG1F20を用いて、下記の方法でinvivo試験を行った。正常マウスC57BL6Jマウス、CharlesRiverJapanの背部皮下に可溶型ヒトIL6受容体を充填した注入ポンプを埋め込むことで、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が定常状態に維持される動物モデルを作製した。その動物モデルに対して、抗ヒトIL6受容体抗体を投与し、投与後の可溶型ヒトIL6受容体の生体内における動態を評価した。可溶型ヒトIL6受容体に対する中和抗体の産生を抑制するために、モノクローナル抗マウスCD4抗体を尾静脈に20mgkgで単回投与した。その後、928μgmLの可溶型ヒトIL6受容体を充填した注入ポンプをマウス背部皮下に埋め込んだ。注入ポンプ埋め込み3日後に、抗ヒトIL6受容体抗体を尾静脈に1mgkgで単回投与した。抗ヒトIL6受容体抗体を投与した15分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、7日後、14日後、21日後、28日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4°C、15000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、アッセイを実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。8-3血漿中抗ヒトIL6受容体抗体濃度のELISA法による測定参考例3と同様の方法で実施した。8-4電気化学発光法による血漿中hsIL6R濃度測定実施例5と同様の方法で実施した。図39に示した通り、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が約40ngmLにおいて定常状態を維持している正常マウスhsIL6R群に対して、可溶型ヒトIL6受容体の中和抗体であるH54L28IgG1を投与すると、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が650ngmL投与前の15倍まで上昇した。一方で、H54L28IgG1にpH依存的抗原結合能を付与したFv4IgG1の投与群においては、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が70ngmL程度を維持していた。このことから、通常の中和抗体であるH54L28IgG1の投与によって引き起こされる血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度の上昇は、pH依存的結合能を付与することにより、10分の1程度にまで抑制できることが示された。更に、pH依存的ヒトIL6受容体結合抗体に対して、中性条件下でのFcRnへの結合を増強させる改変を導入したFvIgG1v2およびFvIgG1F20の投与により、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度を定常状態の10分の1以下にまで低下した状態を維持することが可能であることが示された。ここで、FvIgG1v2は、投与から14日後における血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が約2ngmLであり、投与前の20分の1にまで低下させることが可能であった。また、FvIgG1F20は、投与から7時間後、1日後、2日後、4日後の血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度は、検出限界156ngmL以下であり、投与前の25分の1以下にまで低下させていることが示された。以上のことから、血漿中の抗原濃度が定常状態を維持している動物モデルに対して、pH依存的抗原結合能と中性条件下でのFcRnへの結合能を併せ持つ抗体を投与することにより、血漿中の抗原の消失速度を増加させ、血漿中抗原濃度を顕著に低下させることが可能であることが示された。通常の抗体は、H54L28IgG1のように、標的抗原に対して結合することで、その作用を中和することしか出来ず、更に悪いことに血漿中の抗原濃度の上昇が起こってしまう。一方、pH依存的抗原結合能と中性条件下でのFcRnへの結合能を併せ持つ抗体は、標的抗原を中和するだけでなく、血漿中の標的抗原の濃度を低下させることが可能であることが見出された。抗原を血漿中から除去することによって、中和以上の高い効果を有することが期待できる。また、中和だけでは不十分な標的抗原に対しても、効果を示すことが可能となると考えられる。参考例9抗原消失を増強するのに必要なpH中性域におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーの閾値の同定、および抗原消失とpH中性域におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーとの関係9-1invivo試験のための抗体調製pH中性域におけるFcRnに対する結合が増加したVH3IgG1配列番号:19とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1のFc変異体を作製した。具体的には、VH3M73配列番号:24およびVH3IgG1v1配列番号:21を調製した。アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。H54配列番号:5とL28配列番号:6とを含むH54L28IgG1、VH3IgG1配列番号:19とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1、VH3M73配列番号:24とVL3CK配列番号:20とを含むFv4M73、VH3IgG1v1配列番号:21とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1v1、およびVH3IgG1v2配列番号:22とVL3CK配列番号:20とを含むFv4IgG1v2を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した。9-2pH中性条件下におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーの評価VH3IgG1配列番号:19とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1、VH3M73配列番号:24とL配列番号:14とを含むVH3LM73、VH3IgG1v1配列番号:21とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1v1、およびVH3IgG1v2配列番号:22とL配列番号:14とを含むVH3LIgG1v2は、その全てを参考例3に記載の通りに調製し、中性pHpH70におけるヒトFcRn結合に関して評価した。ヒトFcRnに対するVH3LIgG1v1およびVH3LIgG1v2の結合活性を、参考例5に記載の方法を用いて測定した。ヒトFcRnに対するVH3LIgG1およびVH3LM73の結合活性が低いために、実施例5に記載の方法ではヒトFcRnに対する結合活性を測定することができず、ゆえに、これらの抗体を以下に記載する方法によって評価した。抗体とヒトFcRnとの結合の動態をBiacoreT100GEHealthcareを用いて解析した。センサーチップCM4GEHealthcare上にアミンカップリング法で適当量のプロテインLACTIGENを固定化し、チップに目的の抗体を捕捉させた。次に、希釈したFcRn溶液とランニングバッファー参照溶液としてとをインジェクトして、センサーチップ上に捕捉させた抗体にヒトFcRnを相互作用させた。ランニングバッファーとして、50mmollリン酸ナトリウム、150mmollNaCl、005Tween20、pH70を用いた。FcRnを各バッファーを用いて希釈した。チップを10mmollグリシンHClpH15を用いて再生した。測定は25°Cで行った。各抗体のKDMを、センサーグラムの結合および解離相を同時に適合させて、実行中の組における全ての曲線を一括で適合させるBiacoreT100EvaluationSoftwareGEHealthcareを用いてセンサーグラムデータから導いた。センサーグラムを、BiacoreT100EvaluationSoftwareによって提供された1:1結合モデルであるラングミュア結合モデルに適合させた。結合相互作用のいくつかについては、平衡に基づくアプローチを用い、アナライト濃度の対数に対して平衡結合レスポンスであるReqをプロットし、非線形回帰分析によりKDを導いた。中性条件下pH70におけるヒトFcRn結合についてのBiacoreによる結果を表27に示す。9-3ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276を用いた同時投与モデルにおける抗体の抗原消失効果のinvivo試験同時投与モデルを用いた抗体のinvivo試験を参考例3に記載した通りに行った。本試験において用いた抗ヒトIL6受容体抗体は、先に記載したH54L28IgG1、Fv4IgG1、Fv4M73、Fv4IgG1v1、およびFv4IgG1v2である。この試験において用いたマウスはヒトFcRnトランスジェニックマウスB6mFcRnhFcRnTg系統276マウス、JacksonLaboratoriesMethodsMolBiol60293104である。図40に示すように、H54L28IgG1、Fv4IgG1、Fv4M73、Fv4IgG1v1、およびFv4IgG1v2の薬物動態は同等であり、これらの抗体は試験のあいだ類似の血漿中濃度を維持した。血漿中hsIL6濃度推移を図41に示した。Fv4IgG1と共に投与したhsIL6Rと比較して、Fv4IgG1v2と共に投与したhsIL6Rは、クリアランスの増大を示したが、Fv4M73およびFv4IgG1v1と共に投与したhsIL6Rはクリアランスの低下を示した。M73、v1およびv2の全てのFc変異体が、ヒトFcRnに対してpH中性条件下pH70において結合アフィニティーが増大しているが、hsIL6Rクリアランスの増大を示したのはFv4IgG1v2のみであり、Fv4M73およびFv4IgG1v1は増大を示さなかった。このことは、抗原のクリアランスを増大させるためには、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーがKD32μMであるかまたは天然型ヒトIgG1ヒトFcRnに対する結合アフィニティーはKD88μMより28倍高いIgG1v1と比べて、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーが、それより少なくとも高い必要があることを示している。図42は、pH70におけるヒトFcRnに対するFc変異体の結合アフィニティーと、hsIL6RおよびFc変異体を同時投与した1日後の血漿中hsIL6R濃度との関係を示す。本実施例および参考例6に記載のFc変異体Fv4IgG1、Fv4M73、Fv4IgG1v1、Fv4IgG1v2、Fv4IgG1F14、Fv4IgG1F20、Fv4IgG1F21、Fv4IgG1F25、Fv4IgG1F29、Fv4IgG1F35、Fv4IgG1F48、Fv4IgG1F93、およびFv4IgG1F94をプロットしている。pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーを増大させると、抗原のクリアランスを反映する血漿中hsIL6R濃度は、最初に増加した後、急激に低下した。このことは、天然型ヒトIgG1と比較して抗原クリアランスを増大させるためには、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーが、好ましくはKD23μM図42の曲線に当てはめて得た値より強い必要があることを示している。ヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーがKD88μM~KD23μMである場合、むしろ抗原クリアランスは低下すると考えられるより高いhsIL6R濃度。言い換えれば、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーは、抗原の消失を増強するためには、好ましくは天然型ヒトIgG1より38倍高い必要があり、そうでなければ抗原クリアランスは低下すると考えられる。図43は、pH70におけるヒトFcRnに対するFc変異体の結合アフィニティーと、hsIL6RおよびFc変異体を同時投与した1日後の血漿中抗体濃度との関係を示す。本実施例および参考例6に記載のFc変異体Fv4IgG1、Fv4M73、Fv4IgG1v1、Fv4IgG1v2、Fv4IgG1F14、Fv4IgG1F20、Fv4IgG1F21、Fv4IgG1F25、Fv4IgG1F29、Fv4IgG1F35、Fv4IgG1F48、Fv4IgG1F93、およびFv4IgG1F94をプロットしている。pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーを増大させると、抗体の薬物動態クリアランスを反映する血漿中抗体濃度は最初維持されるが、その後急激に低下する。このことは、天然型ヒトIgG1ヒトFcRnに対する結合アフィニティーはKD88μMと類似した抗体の薬物動態を維持するためには、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体のアフィニティーが、KD02μM図43の曲線に当てはめて得た値より弱い必要があることを示している。ヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーがKD02μMより強い場合、抗体のクリアランスは増大したすなわち、血漿からのより急速な抗体の消失。言い換えれば、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーは、天然型ヒトIgG1と類似した抗体薬物動態を示すためには、天然型ヒトIgG1と比べて440倍以内の高さとする必要があり、そうでなければ血漿からの抗体の急速な消失が生じると考えられる。図42および43の双方を考慮すると、天然型ヒトIgG1と類似した抗体薬物動態を維持しながらIgG1と比較して抗原クリアランスを増大させるすなわち、血漿中抗原濃度を減少させるためには、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーが、23μMから02μMである必要があるか、または言い換えればpH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーが、天然型ヒトIgG1より38倍から440倍高い範囲である必要がある。長期間の抗体消失活性を有するIgG1と類似した薬物動態であるそのような抗体は、長期間作用性により、慢性疾患などのより長い投与間隔を必要とする抗体治療にとって有益となると考えられる。一方、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーをKD02μMより強く増大させることにより、または言い換えれば天然型ヒトIgG1と比較してpH70でのヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーを440倍より高く増大させることにより、抗体は天然型ヒトIgG1より速やかに血漿から消失するものの、抗原クリアランスを短期間でのかなりの程度のものに増強すると考えられる。抗原濃度の急速で大きな減少を誘導できるそのような抗体は、その即効性により、疾患関連抗原を血漿中から除去する必要がある急性疾患などの抗体治療にとって有益となると考えられる。抗体1分子につき血漿から消失される抗原の量は、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大した抗体Fc変異体を投与することにより抗原消失効率を評価する場合に重要な要因となる。抗体1分子あたりの抗原消失効率を評価するために、本実施例および参考例6に記載のinvivo試験の各時点で以下の計算を行った。A値:各時点での抗原のモル濃度B値:各時点での抗体のモル濃度C値:抗体モル濃度あたりの抗原モル濃度抗原/抗体モル比C=AB各抗体についてのC値抗原/抗体モル比の推移を図44に記載した。C値がより小さいことは、抗体1分子あたりの抗原消失効率がより高いことを示すが、C値がより大きいことは、抗体1分子あたりの抗原消失効率がより低いことを示す。IgG1と比較してC値がより小さければ、Fc変異体によってより高い抗原消失効率が得られたことを示すが、IgG1と比較してC値がより大きければ、Fc変異体が抗原消失効率に関して負の効果を有することを示す。Fv4M73およびFv4IgG1v1を除く全てのFc変異体が、Fv4IgG1と比較して抗原消失効率の増大を示した。Fv4M73およびFv4IgG1v1は、抗原消失効率に対して負の影響を示し、これは図42と一致した。図45は、pH70におけるヒトFcRnに対するFc変異体の結合アフィニティーと、hsIL6RおよびFc変異体を同時投与した1日後のC値抗原/抗体モル比との関係を示す。本実施例および参考例6に記載のFc変異体Fv4IgG1、Fv4M73、Fv4IgG1v1、Fv4IgG1v2、Fv4IgG1F14、Fv4IgG1F20、Fv4IgG1F21、Fv4IgG1F25、Fv4IgG1F29、Fv4IgG1F35、Fv4IgG1F48、Fv4IgG1F93、およびFv4IgG1F94をプロットしている。これは、天然型ヒトIgG1と比較してより高い抗原消失効率を達成するためには、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体のアフィニティーがKD30μM図45の曲線に当てはめて得た値より強い必要があることを示している。言い換えれば、pH70におけるヒトFcRnに対する抗体の結合アフィニティーは、天然型ヒトIgG1と比較してより高い抗原消失効率を達成するためには、天然型ヒトIgG1より少なくとも29倍高い必要がある。結論としては、FcRnに対してpH70でKD30μMから02μMの結合アフィニティーを有する抗体変異体の群、または言い換えればFcRnに対してpH70で天然型ヒトIgG1より29倍から440倍高い範囲の結合アフィニティーを有する抗体変異体の群は、IgG1と類似した抗体薬物動態を有するが、増大した血漿中抗体消失能を有する。よって、そのような抗体は、IgG1と比較して増大した抗原消失効率を示す。IgG1と類似した薬物動態により、血漿から抗原を長期間消失させることが可能であり長期間作用性の抗原消失、ゆえに長い投与間隔が可能となり、このことは慢性疾患に関する抗体治療物質にとって好ましいと考えられる。FcRnに対してpH70でKD02μMより強い結合アフィニティーを有する抗体変異体の群、または言い換えればFcRnに対してpH70で天然型ヒトIgG1より440倍高い結合アフィニティーを有する抗体変異体の群は、急速な抗体クリアランス短期間の抗体消失を有する。それにもかかわらず、そのような抗体は抗原のさらにより急速なクリアランスを可能にすることから即効性の抗原消失、よって、そのような抗体はまた、IgG1と比較して増大した抗原消失効率を示す。参考例8に示すように、正常マウスにおけるFv4IgG1F20は、血漿からの抗原の大幅な消失を非常に短期間で誘導するが、抗原消失効果は持続しない。そのようなプロファイルは、疾患関連抗原を非常に短期間で迅速かつ大幅に血漿から枯渇させる必要がある急性疾患の場合に好ましいと考えられる。参考例10ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276を用いた定常状態注入モデルによるFv4IgG1F14のinvivo試験ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276を用いた下記の定常状態注入モデルによるFv4IgG1F14のinvivo試験を行った。試験群は対照群抗体なし、1mgkgの用量でのFv4IgG1、ならびに1mgkg、02mgkg、および001mgkgの用量でのFv4IgG1F14からなる。ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276B6mFcRnhFcRnTg系統276マウスB6mFcRnhFCRNTg276B6CgFcgrt<tm1Dcr>Tg276Dcr、JacksonLaboratoriesMethodsMolBiol60293104の背部皮下に、可溶型ヒトIL6受容体を充填した注入ポンプMINIOSMOTICPUMPMODEL2004;alzetを埋め込むことで、血漿中可溶型ヒトIL6受容体濃度が一定に維持されるモデル動物を作製した。モデル動物に抗ヒトIL6受容体抗体を投与し、投与後の可溶型ヒトIL6受容体の生体内における動態を評価した。可溶型ヒトIL6受容体に対する中和抗体の産生を抑制するために、注入ポンプを埋め込む前と、抗体を尾静脈に投与した14日後に、モノクローナル抗マウスCD4抗体RDを20mgkgで投与した。次に、928μgmlの可溶型ヒトIL6受容体を充填した注入ポンプをマウスの背部皮下に埋め込んだ。注入ポンプ埋め込み3日後に、抗ヒトIL6受容体抗体H54L28IgG1およびH54L28IgG1F14を尾静脈に1mgkgで単回投与した。抗ヒトIL6受容体抗体を投与した15分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、7日後、14日後、21日後、および28日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4°C、15000rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで20°C以下に設定された冷凍庫に保存した。マウス血漿中のhsIL6R濃度は電気化学発光にて測定した。2000、1000、500、250、125、625、および3125pgmlの濃度に調整したhsIL6R検量線試料ならびに50倍以上希釈したマウス血漿試料を調製した。試料を、SULFOTAGNHSEsterMesoScaleDiscoveryでルテニウム化したモノクローナル抗ヒトIL6R抗体RD、ビオチン化抗ヒトIL6R抗体RD、およびWTIgG1溶液と混合し、37°Cで一晩反応させた。抗ヒトIL6受容体抗体として、トシリズマブ重鎖配列番号:13、軽鎖配列番号:14とを含むWTIgG1の終濃度は、試料に含まれる抗ヒトIL6受容体抗体濃度より過剰の333μgmlであり、試料中のほぼ全てのhsIL6R分子がWTIgG1と結合した状態にすることを目的とした。その後、試料をMA400PRStreptavidinPlateMesoScaleDiscoveryに分注し、室温で1時間反応させて洗浄を行った。ReadBufferT×4MesoScaleDiscoveryを分注し、直ちにSectorPR400ReaderMesoScaleDiscoveryで測定を行った。hsIL6R濃度は検量線のレスポンスから解析ソフトウェアSOFTmaxPROMolecularDevicesを用いて算出した。図46は、抗体投与後の血漿中hsIL6R濃度の時間プロファイルを示す。抗体を投与していないベースラインのhsIL6Rレベルと比較して、1mgkgFv4IgG1の投与により、血漿中hsIL6R濃度が数倍増加した。他方、1mgkgのFv4IgG1F14の投与により、Fv4IgG1群およびベースライン群と比較した場合に血漿中濃度の有意な減少が生じた。2日目に、血漿中hsIL6R濃度は検出されず血漿中hsIL6R濃度の定量限界はこの測定系において156ngmLである、これは14日目まで持続した。H54L28IgG1F14は、H54L28IgG1と比較して血漿中hsIL6R濃度の減少を示したが、減少の程度は小さかった。減少の程度は、hsIL6Rに対するpH依存的結合特性をFv4可変領域に有する場合ではかなり大きかった。このことは、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーを増大させることは血漿中抗原濃度を減少させるために有効であるが、pH依存的抗原結合とpH中性域におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーの増大とを組み合わせると、抗原消失が有意に増大することを示している。より低用量のFv4IgG1F14を用いた試験は、1mgkgの1100である001mgkgでさえも、血漿中抗原濃度をベースラインよりも減少させて、分子が血漿から抗原を枯渇させる効率が有意であることを示している。参考例11同時投与モデルにおけるヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276および系統32の比較これまでのinvivo試験は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276JacksonLaboratoriesを用いて行っていた。ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276と異なるトランスジェニック系統である系統32との差を比較するために、本発明者らは、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32B6mFcRnhFcRnTg系統32マウス32Dcr、JacksonLaboratoriesMethodsMolBiol60293104を用いてH54L28IgG1、Fv4IgG1、およびFv4IgG1v2の同時投与試験を行った。試験方法は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32をヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276の代わりに用いたこと以外は、参考例3の試験方法と同じであった。図47は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276および系統32の双方における血漿中hsIL6R濃度推移を示す。H54L28IgG1、Fv4IgG1、およびFv4IgG1v2は、類似の血漿中hsIL6R濃度時間プロファイルを示した。いずれのマウスにおいても、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーを増大させると、血漿からの抗原消失が同程度に増強されたFv4IgG1とFv4IgG1v2とを比較。図48は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統276および系統32の双方における血漿中抗体濃度推移を示す。H54L28IgG1、Fv4IgG1、およびFv4IgG1v2は、類似の血漿中抗体濃度時間プロファイルを示した。結論としては、系統276と系統32のあいだに有意差は観察されず、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーを増大させるFc変異体は、血漿中抗原濃度の消失の増強に関して、ヒトFcRnを発現する2つの異なるトランスジェニックマウス系統において有効であった。参考例12中性pHにおけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大した様々な抗体Fc変異体の作製12-1Fc変異体の作製抗原消失プロファイルをさらに改善するために、pH中性域におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーを増大させることを目的として、様々な変異をFv4IgG1に導入した。具体的には、表15に示されるアミノ酸変異をFv4IgG1の重鎖定常領域に導入してFc変異体を作製した変異部位のアミノ酸番号は、EUナンバリングに従って記載する。アミノ酸置換の導入は参考例3に記載の当業者公知の方法に従って実施した。調製された重鎖とL配列番号:14とを各々含むさらなる変異体IgG1F100からIgG1F1052を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した。12-2ヒトFcRn結合の評価抗体とヒトFcRnとの結合の動態を、IgG1v1、IgG1v2、およびIgG1F2からIgG1F1052については参考例5に記載した通りに、またはIgG1およびM73については参考例9に記載した通りに解析した。中性条件下pH70におけるヒトFcRn結合についてのBiacoreによる結果を表28-1から28-21に示す。表28-2は、表28-1の続きの表である。表28-3は、表28-2の続きの表である。表28-4は、表28-3の続きの表である。表28-5は、表28-4の続きの表である。表28-6は、表28-5の続きの表である。表28-7は、表28-6の続きの表である。表28-8は、表28-7の続きの表である。表28-9は、表28-8の続きの表である。表28-10は、表28-9の続きの表である。表28-11は、表28-10の続きの表である。表28-12は、表28-11の続きの表である。表28-13は、表28-12の続きの表である。表28-14は、表28-13の続きの表である。表28-15は、表28-14の続きの表である。表28-16は、表28-15の続きの表である。表28-17は、表28-16の続きの表である。表28-18は、表28-17の続きの表である。表28-19は、表28-18の続きの表である。表28-20は、表28-19の続きの表である。表28-21は、表28-20の続きの表である。参考例13ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32を用いた定常状態注入モデルによる様々なFc変異体抗体のinvivo試験参考例12において作製したFc変異体を、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32を用いた定常状態注入モデルにおいて血漿中抗原消失能に関して試験した。定常状態注入モデルinvivo試験は、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32を系統276の代わりに用い、モノクローナル抗マウスCD4抗体を2回注入ポンプを埋め込む前と、抗体を投与した14日後または3回注入ポンプを埋め込む前と、抗体を投与した10日後および20日後投与したこと以外は、実施例1に記載した通りに行った。表28-1から28-21に記載のFc変異体から選択した、以下に記載の抗体Fc変異体を、参考例3に記載の当業者公知の方法によって発現させて精製した:VH3IgG1とVL3CKとを含むFv4IgG1;VH3IgG1F11とVL3CKとを含むFv4IgG1F11;VH3IgG1F14とVL3CKとを含むFv4IgG1F14;VH3IgG1F39とVL3CKとを含むFv4IgG1F39;VH3IgG1F48とVL3CKとを含むFv4IgG1F48;VH3IgG1F140とVL3CKとを含むFv4IgG1F140;VH3IgG1F157とVL3CKとを含むFv4IgG1F157;VH3IgG1F194とVL3CKとを含むFv4IgG1F194;VH3IgG1F196とVL3CKとを含むFv4IgG1F196;VH3IgG1F198とVL3CKとを含むFv4IgG1F198;VH3IgG1F262とVL3CKとを含むFv4IgG1F262;VH3IgG1F264とVL3CKとを含むFv4IgG1F264;VH3IgG1F393とVL3CKとを含むFv4IgG1F393;VH3IgG1F434とVL3CKとを含むFv4IgG1F424;およびVH3IgG1F447とVL3CKとを含むFv4IgG1F447。これらの抗体を、ヒトFcRnトランスジェニックマウス系統32に1mgkgの用量で投与した。図49は、マウスにおける血漿中hsIL6R濃度推移を示す。Fv4IgG1と比較して、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大したFc変異体は全て、血漿中hsIL6R濃度の減少を示し、ゆえに血漿からの抗原の消失を増大させた。抗原濃度減少の程度および持続はFc変異体間で異なったものの、全ての変異体が一致してIgG1と比較して血漿中hsIL6R濃度を減少させた。これは、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大することにより、血漿からの抗原の消失が一般に増大することを示している。図50は、マウスにおける血漿中抗体濃度推移を示す。抗体の薬物動態はFc変異体間で異なった。参考例9に記載したように、抗体1分子につき血漿から消失される抗原の量は、pH70におけるヒトFcRnに対する結合アフィニティーが増大した抗体Fc変異体を投与することにより抗原消失効率を評価する場合に重要な要因となる。ゆえに、各抗体についてのC値抗原/抗体モル比の推移を図51に記載した。図52は、pH70におけるヒトFcRnに対するFc変異体の結合アフィニティーと、抗体投与1日後のC値抗原/抗体モル比との関係を示す。これは、この試験において試験した全ての抗体Fc変異体がFv4IgG1と比較して小さいC値を有することを示している。本試験において試験した全てのFc変異体が、ヒトFcRnに対してpH70でKD30μMより強い結合アフィニティーを有することから、それらは天然型ヒトIgG1と比較して高い抗原消失効率を達成した。これは参考例9で得られた結果と一致した図42。図53は、本試験において試験したFc変異体において、F11、F39、F48、およびF264のFc変異体を有する抗体が、IgG1と類似した薬物動態を示したことを示す。この試験はヒトFcRnトランスジェニックマウスを用いて行われていることから、これらのFc変異体はヒトにおいてもIgG1と類似した長い半減期を有すると予想される。図54は、天然型ヒトIgG1と類似した薬物動態を有する抗体F11、F39、F48、およびF264を投与したマウスにおける血漿中hsIL6R濃度推移を示す。これらの変異体は、IgG1と比較して血漿中hsIL6R濃度を約10倍低減させた。その上、これらの抗体は、ベースラインhsIL6R濃度抗体なしの濃度より下までhsIL6R濃度を減少させた。したがって、これらの抗体は、血漿からの抗原の長期消失を可能にし、ゆえに、慢性疾患のための抗体治療にとって好ましい長い投与間隔を可能にすると考えられる。図55および56はそれぞれ、IgG1、ならびにFc変異体F157、F196、およびF262についての血漿中抗体濃度および血漿中hsIL6R濃度推移を示す。驚くべきことに、F157およびF262の抗体薬物動態は、天然型IgG1と比較して有意に速い血漿からのクリアランスを示したが、F157およびF262は血漿からの大幅かつ持続的なhsIL6R消失を示した。具体的には、F157での血漿中hsIL6R濃度は、1日目から28日目14日目を除くまで検出限界156ngmlより下であり、F262での血漿中hsIL6R濃度は14日目から28日目まで検出限界156ngmlより下であった。一方、F157と比較して抗体のクリアランスがより遅いF196に関しては、抗原濃度は14日目で増加し始め、28日目にベースラインに戻った。本試験において試験したFc変異体の中で、F157およびF262は、血漿中hsIL6R濃度を28日目の時点で156mgmlより下に減少させることができた唯一のFc変異体であった。抗体は天然型ヒトIgG1と比較して非常に急速に血漿から消失したことから、F157およびF262においてそのような持続的な長期効果が得られたことは、抗体の薬物動態からは予想外のことである。特に、F157での血漿中抗体濃度は、21日目では検出されなかった。それにもかかわらず、血漿中hsIL6R濃度は、21日目および28日目の時点で検出限界の156ngmlより低いレベルまで減少し続けた。本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、この予想外の効果は、抗体がFcRn結合型として血管内皮細胞表面に存在するためであると考えられる。これらの抗体は血漿中で低濃度を示したが、これらの抗体はなおもFcRn結合型血漿中抗体濃度として測定することができないとして血管コンパートメントに存在している。これらのFcRn結合抗体はなおも血漿中の抗原に結合し、抗原/抗体複合体がFcRnによって取り込まれた後、抗原はエンドソーム内で遊離してライソソームによって分解されるが、抗体はFcRn結合型として細胞表面に戻されてリサイクルされる。このように、これらのFcRn結合抗体は抗原の消失に寄与する。このことにより、抗体濃度が血漿中で低くなった後でさえもこれらの抗体が抗原消失能を維持している理由が説明される。"