"7,10-ジヒドロキシ8E-オクタデセン酸7,10-dihydroxy-8E-octadecenoicacid、DODをヘキサンと混合する段階と、前記混合物を熱処理する段階と、を含むフラン脂肪酸の製造方法。前記7,10-ジヒドロキシ8E-オクタデセン酸が、オレイン酸及びオレイン酸を含む植物性油の少なくともいずれかを基質として利用して、緑膿菌Pseudomonasaeruginosa微生物によって生産されることを特徴とする請求項1に記載のフラン脂肪酸の製造方法。前記植物性油が、オリーブ油、紅花油、大豆油、トウモロコシ油、ゴマ油、エゴマ油、ブドウ種子油、唐辛子種油、キャノーラ油、ヒマワリ種子油、甜瓜油、菜種油及び米糠油で構成された群から選ばれたことを特徴とする請求項2に記載のフラン脂肪酸の製造方法。前記微生物が、緑膿菌PR3PseudomonasaeruginosaPR3,NRRLstrainB-18602であることを特徴とする請求項2に記載のフラン脂肪酸の製造方法。前記7,10-ジヒドロキシ8E-オクタデセン酸10mgあたり10μlから1,000μlのヘキサンを混合することを特徴とする請求項1に記載のフラン脂肪酸の製造方法。前記熱処理が、30°Cから150°Cで1時間から150時間で行うことを特徴とする請求項1に記載のフラン脂肪酸の製造方法。7,10-ジヒドロキシ8E-オクタデセン酸7,10-dihydroxy-8E-octadecenoicacid、DODをヘキサンで熱処理することにより製造される7,10-エポキシ-オクタデカ-7,9-ジエン酸7,10-epoxy-octadeca-7,9-dienoicacid。請求項7に記載の7,10-エポキシ-オクタデカ-7,9-ジエン酸を含む抗酸化剤。以下、実施例に基づいて、本発明を更に詳細に説明することにする。これらの実施例は、単に本発明を例示するものであるため、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されるものと解釈されない。実験材料オリーブ油extravirgingradeは、国内市場で購入した。ヘプタデカン酸Heptadecanoicacid.、C17:0は、Nu-ChekPrepElysianMN、USAから購入した。トリメチルシリルイミダゾールtrimethylsilylimidazole、TMSIとピリジンpyridine、1:4、v/vとの混合物は、SupelcoBellefonte、PA.USAから購入した。薄層プリコートされたKieselgel60F254プレートは、EMScienceCherryHill、NJ、USAから入手した。シリカゲル、DavisilTM、grade635、60-100mesh、60A、99及び他の化学剤は、特に言及しない限り、Sigma-AldrichSt.Louis、MO、USAから購入した。他の全ての化学剤は、試薬級で追加の精製なしに使用された。実施例1.DODの製造DOD7,10-dihydroxy-8E-octadecenoicacidは、本発明者の以前の報告書21に基づいて製造した。簡単に説明すると、オリーブ油1、v/vを振とう培養機で28°C、200rpmで好気性に培養されたPseudomonasaeruginosaPR3NRRLstrainB-18602の24時間培養物に基質として添加した後、72時間の間追加培養した。同量のエチルアセテートで前記培養物を抽出して得られたDOD粗抽出物crudeDODextractを精製するために、シリカゲルカラム1.5cmI.D×30cmを使用している。分画は、ヘキサンとエチルアセテートの様々な比率で、2倍カラム容量の溶媒混合物で行われた。実施例2.熱処理によるDODからEODAの生産熱処理によるDODの転換は、10mgDODと、溶媒として500μlヘキサンを含む4mlのガラスバイアルで行われた。前記混合物を90°Cで24時間加熱ブロックheatblock;Barnstead/ThermolyneType176000Dri-Bathで反応させた。前記の処理後、窒素フラッシングnitrogenflushingを利用して溶媒を除去し、反応生成物をクロロホルムとメタノール1:1、v/vとの混合物に溶かした。時間によるtime-coursed生成物の分析のために、10mgのDODを含むバイアルを90°Cで熱処理し、提示された時間後に回収した。実施例3.反応生成物の分析反応生成物は、TLCで解析され、内部標準internalstandardであるヘプタデカン酸heptadecanoicacidでGC分析して定量された。TLC分析は、溶媒システムtoluene:1,4dioxane:aceticacid.、79:14:7、v/v/vで行い、スポットspotsを50硫酸sulfuricacidでプレートに噴射し、95°Cで10分間熱処理することにより可視化した。GC分析のために、室温で5分間ジアゾメタンdiazomethaneにメチル化されたサンプルを炎イオン化検出器flame-ionizationdetectorと毛細管カラムcapillarycolumn、SPB-1TM、15mx0.32mmi.d.、0.25μmthickness、SupelcoInc.、Bellefonte、PA、USAを装備されたガスクロマトグラフィーACME6100SeriesGasChromatographySystem;YounlinCo.、Koreaで分析した。GCは、100°Cで150°Cまで20°C/min、150°Cで200°Cまで5°C/min、及び200°Cで210°Cまで0.5°C/minの温度勾配で行った後、300°Cで10分間維持することにより進行した。インジェクターとディテクターの温度は、それぞれ270及び280°Cに設定した。精製された目的生成物の化学的構造は、GC/MS、NMR、FTIRで決定された。電子衝撃質量分析Electron-impactEImassspectraは、HewlettPackard5972SeriesMassSelectiveDetectorと繋がっているHewlettPackard5890GCAvondale、PA、USAを得た。コラム排出口は、イオンソースに直接繋がっている。分離は、70°Cから130°Cまで20°C/min、170°Cで1分間保持、及び250°Cまで5°C/minの温度勾配に続き、15分間保持することで、メチルシリコーンカラムmethylsiliconecolumn、30m×0.25mmi.d.、膜厚:0.25μmで行われた。1H-NMR及び13C-NMRspectraは、それぞれ400及び100MHzの周波数で動作する、Varian-500spectrometerBillerica、MA、USAを用いて、重水素化されたクロロホルムdeuteratedchloroformで測定された。精製された生成物のFTIR分析は、PerkinElmerInfraredFourierTransformModel1750spectrometerPerkinElmer、Oakbrook、IL、USAのKBr上のフィルムで行われた。抗酸化活性は、以前の研究によってDPPH2,2-Diphenyl-1-picryhydrazylを用いて分析された22。簡単に説明すると、96ウェルプレートで50μlのサンプル溶液を含むDMSOに200μlの200μMDPPHラジカル溶液を添加した。L-アスコルビン酸及びα-トコフェロールが対照群として使用された。37°Cで反応30分後、515nmで吸光度を測定した。DPPHフリーラジカル消去能は、次の式を用いて計算した:DPPHフリーラジカル消去能=[1-Asample-Ablank/Acontrol-Ablank]x100。DMSOは、対照群として使用された。実験結果1.主生成物の製造と分離90°Cで24時間、ヘキサンでDODの熱処理で得られた一つの主生成物を含んでいる幾つかの混合物は、TLCRf=7.2、図1のBとGCpeakretentiontime=8.2-8.4min、図1のAで分析された。これらの生成物は、シリカゲルカラムを用いて精製された。ターゲット化合物unknownは、ヘキサン:エチルアセテート8:2、v/vの分画から得られた。白色の結晶質-類似粉末whitecrystal-likepowderを持つ精製した生成物は、GC図2のAにより96以上の純度を持つ、単一の主なピークとして確認され、TLC分析図2のBで、1つの主なスポットとして示された。実験結果2.構造決定精製したターゲットの生成物の構造決定のために、GC/MS、FTIR及びNMRが使用された。メチル化された生成物の電子衝撃質量分析electron-impactGC/MSspectrumとそれに伴う構造は、図3に示した。精製された生成物の質量分析は、フラグメントグラムfragmentogramで6つの主要ピークとして示された。フラン環の両側面でβ切断から95m/zでフラン断片を獲得し、193m/z及び209m/zで強いピークintensepeakを示すイオンは、それぞれメチル及びメチル化されたカルボキシル末端の方向にフラノイド環furanoidringのβ切断beta-cleavageによって形成された。メトキシ基の消失の証拠は、277m/zで示された。このようなGC/MS分析のパターンは、化学的に合成された9,12-エポキシ-オクタデカ-9,11-ジエン酸9,12-epoxy-octadeca-9,11-dienoicacidの場合と非常に類似している23。9,12-エポキシ-オクタデカ-9,11-ジエン酸は、7,10-EODAとは全く異なる物質であるが、7,10-EODAに比べて、カルボキシル基から離れているフラン環の位置が、2つの炭素分だけ更に遠くに存在する物質である。前記GC-MS分析で得られたスペクトラムを用いて、目標生成物の構造を推定した結果、図3に示すような構造が導出された。つまり、7番炭素と10番炭素との間で酸素原子で接続されたエポキシ構造を含んでおり、7~8番炭素間と9~10番炭素間に2つの二重結合を持つ形でフラン脂肪酸の構造をしていると推定した。GC-MSスペクトラムのフラグメントパターンが、推定された構造と正確に一致していることが分かる。フラン脂肪酸の場合、自然界で、主に魚から少量発見されているが、ほとんどフラン環にメチル基を1つ又は2つ持っている形態で示されている。側鎖の長さは、多様に示されており、人の血液中にも少量含まれていることが知られている。しかしながら、メチル基を持たない形は、自然界ではほとんど知られていないため、リノール酸をリポキシゲナーゼで処理する場合、中間生成物として少量生産され得ると報告されている。また、この場合に生成されるフラン脂肪酸の構造は、本発明で確認されたものとはフラン環の位置が異なって示されている。つまり、10番炭素と13番炭素との間でエポキシ構造をしている。以上の結果から、本発明により製造された新たなフラン脂肪酸は、まだ学界に報告されていない新たな物質であることを確認することができた。したがって、新たな生成物の推定の構造を検証するために、NMRとFTIRを用いて構造解析を実施した。FTIR分析は、1710carbonyl、780outofplaneδCH、1250inplaneδCH、及び1567C=C、furanで幾つかの特徴的なピークcharacteristicabsorptionscm-1を示した図4。全体のピークのパターンは、合成フラン分子に対する他の研究者らのデータと非常に類似している24。NMR分析で精製した生成物の確認された構造を検証した。共鳴信号ppmとそれに伴う分子指定molecularassignmentsは、次の通りである。1H-NMR400MHz、CDCl3:2.342H、CH2COOH、5.842H、furan、2.574H、2xCH2-furan、0.893H、CH3、1.28-1.6118H、9-CH2-、及び13C-NMR100MHz、CDCl3は、104.81、105.02、154.09及び154.81それぞれC7、C8、C9、及びC10で、フラン環、14.11C18で、-CH3、及び178.64C1のカルボキシル炭素carboxylcarbonの存在が確認された。他の炭素は、33.78C2、24.45C3、27.22C4、29.71C5、33.78C6、31.87C11、29.35C12、27.84C13、28.58C14、29.24C15、31.94C16、及び22.67C17にあった。GC-MS、FTIR及びNMR解析から得たデータは、精製した生成物が、分子量が294GC/MS分析により分子量を確認である7,10-epoxy-octadeca-7,9-dienoicacidであることを確認した図5。前記の構造に基づいて、これらの化合物を7,10-EODAと命名した。置換基のないフラン脂肪酸の化学的合成は、一部の異性質体C18フランを含む脂肪酸が、複雑な段階と複数の触媒を用いてフランから化学的に合成されるということが、LieKenJie等によって最初に報告された24。また、Alaizなどは、9,12-epoxy-octadeca-9,11-dienoicacidの化学的触媒で複数の化学的段階を経てリシノル酸recinoleicacidから合成されることを報告した25。しかしながら、本発明では、化学的触媒は、使用されなかった。代わりに、単一の熱処理段階でDODから新規なフラン脂肪酸を製造するのに十分であった。これは、熱処理により、DODから新規なフラン脂肪酸が単一の段階one-stepで混合され得ることを初めて発見したものである。本発明者は、データベース検索NISTMSSearch2.0andCambridgeSoftChemOfficever.5によって、EODAが新たに合成されたフラン脂肪酸であることを確認し、他のF-acidと比較して、本発明の化合物についての情報がないことを確認した。実験結果3.時間による生成物と抗酸化活性実施例2の方法で反応温度を変化させながら反応温度に応じて生成されるEODA量を図6に示した。図6に示されるように、反応温度が高いほど、反応時間が長くなるほど、EODAの生産量が増加すると示されているが、最大の生成効率は、80程度を示した。最大の生成効率を得るためには、反応温度が85°C以上を維持し、反応時間も48時間程度を保持しなければならないことがわかった。したがって、7,10-EODAの時間による生成は、90°Cで96時間の間研究された。図7に示されているように、7,10-EODAの生成は、時間に比例して48時間まで増加し、その後の上昇が止まった。これらの条件下で、最大の生成収率は、82を示した。フラン脂肪酸が抗酸化活性を含むと報告されているため、7,10-EODAの抗酸化活性をラジカル消去活性で示すDPPH分析を利用して確認し、DODと比較した図8。7,10-EODAのラジカル消去活性は、濃度-依存的に増加して試験された最高濃度100μg/mlで23を示した一方、DODは、いずれの活性も認められなかった。前記の活性がα-トコフェロール又はアスコルビン酸と比較して相対的に低かったが、7,10-EODAは、濃度-依存的に明白なラジカル消去活性を示した。これらの結果は、F-acidが抗酸化活性を示すという以前の推定を確認した。フラン脂肪酸は、ヒドロキシルラジカルの強力なスカベンジャーであり、一重項酸素singletoxygenによって誘導される赤血球の溶血erythrocytehemolysisを阻害し、サケのフォスファチジルコリンのsn1の位置のみで発見される26。食品由来のF-acidは、哺乳動物の組織や血液、特にリン脂質に供給されるが、部分的に多価不飽和脂肪酸PolyUnsaturatedFattyAcid;PUFAを取り替える27。このようなF-acidの生化学的、生物学的研究に基づいて、F-acidが、ヒトを含む哺乳動物で決定的に重要な抗酸化物質として作用できると思うのは当然なことである。このため、F-acidの低コスト-高効率生産のための簡便な方法の新たな発見は、意味がある。纏めると、本発明は、ジヒドロキシ脂肪酸の前駆体から7,10-EODAを生産する簡便な方法を提示する。ペルオキシルラジカルによる攻撃、少量であることによる自然のフラン脂肪酸を精製する際の難しさ、及び複雑で高コストの化学的合成の短点を考慮する場合、本発明は、費用-効率的な方法で大規模に生物学的活性のF-acidを生産するための有用な情報を提供する。"