"医薬として使用できる組換え体ヒトFSHの製造方法であって,aヒトFSHα鎖cDNAをEF-1αプロモーター及びその第1イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターと,ヒトFSHβ鎖cDNAをEF-1αプロモーター及びその第1イントロンの下流に組み込んでなる発現ベクターをそれぞれ構築するステップと,bそれらの発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトして組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞を作成するステップと,c該細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトFSHを培養液中に分泌させるステップと,d該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと,e上記ステップdで得た培養上清を,50~250mMの塩を含むpH5~6.5に調整した緩衝液により平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに結合させ,次いで300~900mMの塩を含むpH5~6.5に調整した緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,f上記ステップeで回収された該画分を,pH7.8~8.2の緩衝液により平衡化した色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに吸着させ,次いで1.8~2.2Mの塩を含むpH7.8~8.2の緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,g上記ステップfで回収された該画分を,2.3~2.7Mの塩を含むpH7.8~8.2に調整した緩衝液により平衡化したフェニルセファロースカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSHを該カラムに吸着させ,次いで1.2~1.8Mの塩を含むpH7.8~8.2に調整した緩衝液により組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,h上記ステップgで回収された該画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップとを,この順で含んでなるものである製造方法であり,且つ該製造方法により得られる組換え体ヒトFSHが,そのまま医薬として使用できる純度を有し,比活性が14000~18000IU/mgであるものである製造方法。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,弱陽イオン交換体である請求項1の製造方法。該弱陽イオン交換体が,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである,請求項2の製造方法。該弱陽イオン交換体が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである,請求項2又は3の製造方法。該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である請求項1ないし4の何れかの製造方法。該そのまま医薬として使用できる純度が,該組換え体ヒトFSHをRP-HPLC分析したときα鎖のピーク及びβ鎖のピーク以外のピークが面積比で約1にとどまるものである,請求項1ないし5の何れかの製造方法。該比活性が,ラット卵巣重量増加法により測定されたものである,請求項1ないし6の何れかの製造方法。上記の背景の下,本発明は,組換え体ヒトFSH産生細胞の培養液中から,組換え体ヒトFSHを,有機溶媒の使用を排した工程のみを用いて,そのまま医薬として使用できる高い純度にまで,高収率で精製する方法を提供することである。本発明者らは,無血清培地中で培養した組換え体ヒトFSH産生細胞の培養液の培養上清中に含まれる組換え体ヒトFSHを,陽イオン交換カラムクロマトグラフィー,色素アフィニティーカラムクロマトグラフィー,疎水性カラムクロマトグラフィー,及びゲルろ過カラムクロマトグラフィーの組み合わせにより精製することによって,極めて純度の高い組換え体ヒトFSHを,極めて高い効率で精製することができることを見出した。本発明は,これらの知見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。すなわち,本発明は以下を提供する。1.組換え体ヒトFSHの製造方法であって,a組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して組換え体ヒトFSHを培養液中に分泌させるステップと,b該培養液から該細胞を除去することにより培養上清を調製するステップと,c上記ステップbで得た培養上清を,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,d上記ステップcで回収された該画分を,色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,e上記ステップdで回収された該画分を,疎水性カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップと,f上記ステップeで回収された該画分を,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに付して組換え体ヒトFSH活性画分を回収するステップとを,この順で含んでなるものである,製造方法。2.陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのイオン交換体が,弱陽イオン交換体である上記1.の製造方法。3.該弱陽イオン交換体が,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つものである,上記2の製造方法。4.該弱陽イオン交換体が,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を備えたものである,上記項2又は3の製造方法。5.該色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーの色素がブルートリアジン色素である上記1ないし4の何れかの製造方法。本発明によれば,血清を使用しない細胞培養で組換え体ヒトFSHを製造することができるため,血清の使用に由来するウイルスやプリオンによる汚染のおそれのない組換え体ヒトFSHを製造することができる。このため本発明により得られる組換え体ヒトFSHは,これらの汚染因子による感染のリスクを完全に排除した,安全な不妊治療薬としてヒトの体内に投与することができる。また,本発明によれば,組換え体ヒトFSHを,有機溶媒を使用することなく精製できるため,有機溶媒との接触による組換え体ヒトFSHの変性のおそれが除かれ,更には,精製工程において生じる廃液中に有機溶媒が含まれないため環境面において好ましく,また廃液中の有機溶媒を処理するための設備が不要となり,経済面においても好ましい。本発明において,組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞というときは,ヒトFSHの2つのサブユニットαサブユニットとβサブユニットをコードする遺伝子が発現又は強発現するように,人為的な操作を加えた哺乳動物細胞のことをいう。このとき強発現させる該遺伝子は,該遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換させることにより該哺乳動物細胞内に導入するのが一般的であるが,これに限らず,内在性の遺伝子を強発現できるように人為的に改変したものでもよい。内在性の遺伝子を強発現できるように人為的に改変する手段としては,内在性の遺伝子の上流に存在するプロモーターを,強力な遺伝子発現を誘導するプロモーターに置き換える方法が挙げられるが,これに限られない。また,該哺乳動物細胞について特に限定はないが,ヒト,マウス,ハムスター由来の細胞が好ましく,特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のCHO細胞が好ましい。本発明において,組換え体ヒトFSHというときは,上記の組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞を培養したときに,培地中に分泌されるヒトFSHのことをいう。本発明において,組換え体ヒトFSH産生哺乳動物細胞の培養のための無血清培地としては,例えば:アミノ酸3~700mg/L,ビタミン類0.001~50mg/L,単糖類0.3~10g/L,無機塩0.1~10000mg/L,微量元素0.001~0.1mg/L,ヌクレオシド0.1~50mg/L,脂肪酸0.001~10mg/L,ビオチン0.01~1mg/L,ヒドロコルチゾン0.1~20μg/L,インシュリン0.1~20mg/L,ビタミンB120.1~10mg/L,プトレッシン0.01~1mg/L,ピルビン酸ナトリウム10~500mg/L,及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により,チミジン,ヒポキサンチン,慣用のpH指示薬および抗生物質を添加してもよい。また無血清培地として,DMEM/F12培地DMEMとF12の混合培地を基本培地として用いてもよく,これら各培地は当業者に周知である。更にまた無血清培地として,炭酸水素ナトリウム,L-グルタミン,D-グルコース,インスリン,ナトリウムセレナイト,ジアミノブタン,ヒドロコルチゾン,硫酸鉄,アスパラギン,アスパラギン酸,セリン及びポリビニルアルコールを含むものである,DMEMHGHAM改良型R5培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地,例えば,CDoptiCHO,CHOSSFMIIまたはCDCHOインビトロジェン社,ISCHOVまたはISCHOVGSアーバイン社,EXCELL302またはEXCELL305JRH社等を基本培地として使用してもよい。組換え体ヒトFSH精製のための各クロマトグラフィーは,状況に応じて,タンパク質の非特異的吸着を防止するため,非イオン性界面活性剤の存在下で行うことができる。非イオン性界面活性剤としては,特に限定はないが,好ましくはポリソルベート系界面活性剤が,更に好ましくはポリソルベート80が用いられる。非イオン性界面活性剤の濃度は,好ましくは0005~0015,より好ましくは001である。ヒトFSH精製は,室温又は低温環境で行うことができるが,好ましくは低温環境で,特に1~10°Cで行われる。精製の第一クロマトグラフィー工程においては,塩を添加したリン酸緩衝液により平衡化させた陽イオン交換カラムに,組換え体ヒトFSHを結合させる。このときのリン酸緩衝液のpHは5~65に調製しておくことが好ましく,55~60付近に調製しておくことが更に好ましい。また,このときリン酸緩衝液に添加する塩としては,特に限定はないが,好ましくは塩化ナトリウムであり,その濃度は50~250mMが好ましい。組換え体ヒトFSHを結合させた陽イオン交換カラムを洗浄した後,塩濃度を上昇させたリン酸緩衝液により組換え体ヒトFSHを溶出させる。このときのリン酸緩衝液のpHは55~65に調製しておくことが好ましく,60付近に調製しておくことが更に好ましい。また,このときリン酸緩衝液に添加する塩としては,特に限定はないが,好ましくは塩化ナトリウムであり,その濃度は300~900mMが好ましく,400~800mMが更に好ましい。また,陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに用いるイオン交換体について特に限定はないが,弱陽イオン交換体が好ましく,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ弱陽イオン交換体が更に好ましい。例えば,フェニル基,アミド結合及びカルボキシル基を備え疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ弱陽イオン交換体として,CaptoMMCGEヘルスケア社等を使用することができる。精製の第二工程における,色素アフィニティークロマトグラフィーは,ヒトFSHが,特定の色素に対して強い親和性を示すことを利用して,夾雑物を除去するためのものである。ブルートリアジン色素が好適に利用されるが,その他のトリアジン色素も適当である。特に好ましいのは,色素CibacronTMBlueF3GAをSepharose6FastFlowマトリックスに共有結合で固定した,BlueSepharose6FFFastFlowGEヘルスケア社である。色素アフィニティークロマトグラフィーカラムを中性付近,好ましくはpH78~82に,緩衝液で平衡化し,これに第一工程の溶出画分を供する。その際,第一工程の溶出画分は,予め緩衝液で,pHを中性付近,好ましくはpH78~82に調整する。溶出は塩濃度を上昇させることにより行うことができる。溶出に用いる塩としては,特に限定はないが,好ましくは塩化カリウムであり,その濃度は好ましくは18~22mol/L,特に好ましくは約2mol/Lである。精製の第三工程における,疎水性クロマトグラフィーは,夾雑蛋白質等を除去するためのものである。疎水性クロマトグラフィー交換樹脂としては,特に限定はないが,PhenylSepharoseが好適に利用できる。疎水性クロマトグラフィーに供されるヒトFSH含有画分は,塩濃度を調整しておく必要がある。このとき用いられる塩は,特に限定は無いが,好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。その濃度は,塩化ナトリウムイオン濃度換算で,好ましくは25~35mol/Lに,更に好ましくは,28~32mol/Lである。カラムは,塩を添加した緩衝液でpHを中性付近,好ましくはpH78~82に,更に好ましくは約8に調整しておく。このとき添加する塩としては,特に限定はないが,好ましくは塩化ナトリウムであり,その濃度は,好ましくは2~3mol/L,更に好ましくは,23~27mol/L,特に好ましくは約25mol/Lである。溶出は塩濃度を低下させることにより行うことができる。溶出に用いる塩としては,特に限定はないが,好ましくは塩化ナトリウムであり,その濃度は好ましくは12~18mol/L,更に好ましくは約14~16mol/Lである。精製の第四工程における,ゲルろ過カラムクロマトグラフィーは,エンドトトキシン等の低分子の不純物,ヒトFSHの多量体,分解物等を除去するためのものであり,これにより,実質的に純粋なヒトFSHが得られる。以下,実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが,本発明が実施例に限定されることは意図しない。ヒトFSH発現用ベクターの構築pEFmycnucベクターインビトロジェン社を,KpnIとNcoIで消化し,EF1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCIneoインビトロジェン社を,BglIIおよびEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に,T4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して,pEneoベクターを構築した図1-1及び図1-2。pEneoベクターを,SfiIおよびBstXIで消化し,ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1kbpの領域を切除した図2-1。pcDNA31Hygroインビトロジェン社を鋳型にしてプライマーHygSfiおよびプライマーHygBstX5’AACCATCGTGATGGGTGCTATTCCTTTGC3’;配列番号2を用いて,PCR反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した図2-2。増幅したハイグロマイシン遺伝子を,SfiIおよびBstXIで消化し,上記のpEneoベクターに挿入して,pEhygrベクターを構築した図2-3。ヒト胎盤cDNAライブラリーを鋳型にして,プライマーHCGAF5ATCCTGCAAAAAGCCCAGAG3;配列番号3およびプライマーHCGARを用いて一次PCR反応を行った。さらに得られたPCR産物を鋳型に,一次反応プラーマーHCGAFよりやや3’側下流の位置の配列を持つプライマーHCGAORFF5GCGAATTCGCCACCATGGATTACTACAGAA3;配列番号5,および一次反応プラーマーHCGARよりやや5’側上流の位置の配列を持つプライマーHCGAORFR5GCGAATTCTTAAGATTTGTGATAAT3配列番号6を用いて二次PCR反応を行いヒトFSHα鎖のcDNAを増幅した。また,同様に,ヒト脳下垂体cDNAライブラリーを鋳型にして,1次プラーマーFSHF5GACCACAGGTGAGTCTTGGC3;配列番号7およびFSHR5TGGTCCTTCAGGACAAGGGT3;配列番号8と2次プライマーFSHF25GCGAATTCGCCACCATGAAGACACTCCAGT3配列番号9及びFSHR2を用いて,PCR反応によりヒトFSHβ鎖のcDNAを増幅した。ヒトFSHα鎖の1次PCR反応は,ヒト胎盤cDNAライブラリー100ngを鋳型に,95°C/10秒,55°C/10秒,72°C/10秒を1サイクルとして40サイクルさせた。2次PCR反応は,1次PCR反応の反応液1μLを鋳型に,95°C/10秒,60°C/10,72°C/10秒を1サイクルとして30サイクル反応させた。また,ヒトFSHβ鎖の1次PCR反応は,ヒト脳下垂体cDNAライブラリー10ngを鋳型に,98°C/2秒,60°C/10,72°C/10秒を1サイクルとして40サイクル反応させた。2次PCR反応は,1次PCR反応の反応液1μLを鋳型に,98°C/2秒,60°C/10,72°C/10秒を1サイクルとして30サイクル反応させた。増幅させたヒトFSHα鎖cDNAを,EcoRIで切断した後,EcoRIで消化したpBluescriptIISKpBSStratagene社のEcoRIサイトへ挿入した。得られたプラスミドDNAをXbaIとEcoRVで消化し,ヒトFSHα鎖cDNAを切り出し,これをXbaIとSmalで消化したpEneoベクターに挿入し,ヒトFSHα鎖発現用ベクターpEneohCGαとした図3。増幅させたヒトFSHβ鎖cDNAを,EcoRIおよびNotIで切断した後,EcoRIとNotIで消化したpBluescriptIISKに挿入した。得られたプラスミドDNAを,EcoRIで消化し,T4DNAポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に,NotIで消化し,ヒトFSHβ鎖cDNAを切り出した。pEhygrベクターをXbaIで消化し,T4DNAポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に,NotIで消化した。このpEhygrベクターに,ヒトFSHβ鎖cDNAを挿入し,ヒトFSHβ鎖発現用ベクターpEhygrとした図4。ヒトFSH発現用組換え細胞の作成CHO細胞CHOK1:AmericanTypeCultureCollectionより購入に,Lipofectamine2000lnvitrogen社を用いて,前記発現用ベクターpEneoおよびpEhygrを下記の方法でトランスフェクトした。すなわち,予めトランスフェクション前日にコンフルエントに近い細胞密度となるように35cm培養皿にCHOK1細胞を播種し,一晩5炭酸ガス通気下37°Cで培養した。翌日,PBSで2回洗浄した後,血清を含まないDMEMF12培地インビトジェン社1mLに交換した。OptiMEMI培地インビトロジェン社で20倍に希釈したLipofectamine2000溶液とプラスミドDNA溶液pEneo132μg/mLpEhygr66μg/mLの等量混液を200μL添加し,37°C5時間トランスフェクションした。トランスフェクション後,5FCSを含むDMEM/F12DMEMF12/5FCS培地に交換して5炭酸ガス通気下37°Cで2日間培養した。その後,06mg/mlG418および04mg/mlハイグロマイシンBを含むDMEMF125FCS培地に交換して5炭酸ガス通気下37°Cで選択培養を行った。選択培地中で増殖する細胞を数代継代し,組換え体細胞を得た。次に,限界希釈法にて96穴プレートに1穴あたり1個以下の細胞が播種される条件で組換え体細胞を播種し,10日間ほど培養し,単一コロニーを形成させた。単一コロニーを形成した穴の培養上清を採取しELISAにてFSH発現量を調べ,ヒトFSHの高発現株を選択した。選択した細胞株を,無血清浮遊細胞へ馴化させるため,L-グルタミンを4mM,ヒポキサンチンを10mg/L,チミジンを4mg/L,G418を120mg/L,ハイグロマイシンBを80mg/L添加した市販の無血清培地EXCELL302培地JRH社で細胞の増殖が安定するまで維代培養を行った。更に,培地をISCHOVGS培地に切り換えて,細胞の増殖速度が安定するまで培養を継続し,これを10DMSOを添加したISCHOVGS培地に懸濁させて液体窒素中に保存し,種細胞とした。ヒトFSH発現用組換え細胞の培養前記種細胞を融解し,2×105個/mLの濃度に希釈して,まずISCHOVGS培地で3日間培養した。次いで,ISCHOVGS培地と,L-グルタミンを8mM,ヒポキサンチンを10mg/L,チミジンを4mg/L,G418を012mg/mL及びハイグロマイシンBを80mgL添加したCDoptiCHOCD培地インビトロジェン社を1:1の比率で混合した培地で細胞濃度を2×105個/mLに希釈して4日間,更にCD培地で細胞濃度を2×105個/mLに希釈し4日間,37°Cで5C02存在の下に静置培養し,拡大培養を行った。細胞数を計測し,細胞濃度が5×105個/mLとなるようにCD培地で希釈し,5Lの細胞液を,培養器に移して3日間振とう培養した。更に,培養器に新鮮なCD培地20Lを添加して,3日間振とう培養した。このときの培養条件は,攪拌速度60rpm,pH72,溶存酸素70,温度37°C,上面通気空気500mL/分,液内通気C0250mL/分,液内通気0250mL/分とした。次に,上記の培養器の細胞培養液を2×105個/mLとなるようにG418及びハイグロマイシンBを含まないCD培地で希釈し,このうち250Lの細胞液を,250L容培養器に移して7日間振とう培養した。このときの培養条件は,攪拌速度120rpm,pH72,溶存酸素70,温度37°C,上面通気空気10L/分,液内通気空気250mL/分,液内通気C022500mL/分,液内通気022500mL/分とした。培養中は毎日サンプリングを行い,細胞数,生存率,グルコース濃度,乳酸濃度,ヒトFSHの発現量を測定した。上記細胞の培養は3回繰り返し行ったロット番号1~3。いずれの場合も,生細胞密度は,培養6~7日目にかけて,ほぼ1×107個/mL以上にまで達し,高密度な細胞培養が実現できたことがわかった図5。細胞から培地中に分泌されたヒトFSHの濃度をELISA法により測定したところ,その濃度は,細胞増殖曲線にやや時間的遅れを示しながら上昇し,培養7日目には,おおよそ8~10mg/Lに達した図6。細胞培養液を回収し,ゼータプラスTMフィルターカートリッジ90MZ03M3M社を用いて細胞を除去し,更に022μmフィルターでろ過して,培養上清を得た。ヒトFSHの精製方法回収した培養上清に,6NHClを添加して,培養上清のpHを55に調整し,沈殿物をフィルターろ過して除去した。この培養上清を,カラム体積の4倍量の50mMリン酸ナトリウム/100mMNaClpH55溶液で平衡化した,疎水性相互作用および水素結合に基づく選択性を併せ持つ陽イオン交換カラムであるCaptoMMCカラムカラム体積;約10L,ベット高:約20cmに,150cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積の4倍量の50mMリン酸ナトリウム/100mMNaClpH55溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積の5倍量の50mMリン酸ナトリウム/400mMNaClpH60溶液で吸着蛋白質を溶出した。次いで,ウイルス不活化工程として,上記のCaptoMMCカラム溶出画分に,最終濃度が各々03および1となるようにトリ-n-ブチルリン酸TNBPおよびTween80を添加して,室温で6時間静置した。上記のウイルス不活化処理をしたCaptoMMCカラム溶出画分に,体積で約40量の250mMTrisHClpH85を加え,導電率を約2.6S/mに調製した。この溶液を,カラム体積4倍量の50mMTrisHCl/300mMNaClpH80溶液で平衡化した色素カラムであるBluesepharose6FFカラムカラム体積:約6L,ベット高:約20cmに,60cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積4倍量の50mMTrisHCl/500mMKClpH80溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積5倍量の50mMTrisHCl/2MKCl/001Tween80pH80溶液で吸着蛋白質を溶出した。次いで,上記Bluesepharose6FFカラム溶出画分に,4MNaCl溶液を等量添加し塩濃度を調製した。この溶液を,カラム体積4倍量の50mMTrisHCl/2MNaClpH80溶液で平衡化したPhenylsepharoseHPカラムカラム体積:約6L,ベット高:約20cmに,60cm/時の線流速で負荷し,吸着させた。引き続き同流速で,カラム体積4倍量の50mMTrisHCl,25MNaClpH80溶液でカラムを洗浄した後,カラム体積5倍量の50mMTrisHCl,16MNaClpH80溶液で吸着蛋白質を溶出した。次いで,上記PhenylsepharoseHPカラム溶出画分を,バイオマックス5膜5kDaカットオフ,ミリポア社で順次濃縮した。この濃縮液を,20mMリン酸ナトリウム/133mMNaCl/001Tween80pH74溶液で平衡化したSuperdexpeptide75pgカラム体積:約48L,ベット高:約60cmに,149cm/時の線流速で負荷し,280nmの吸光度ピーク図7を,精製ヒトFSHとして分離,回収した。各精製ステップにおけるヒトFSHの回収率を,表1に示した。ここで,工程FSH回収率とは,各々の工程において,負荷したヒトFSH量に対する,回収したヒトFSH量の比率のことをいい,通算FSH回収率とは,精製工程に供したスタート時点におけるヒトFSH量に対する,各行程において回収したヒトFSH量の比率のことをいう。精製第一工程である陽イオンカラムクラマトグラフィーに供したヒトFSHの量は22561mgであったが,最終的に10435mgのヒトFSHを回収することができ,回収率は439に達した。このことから,上記の精製方法により,高収率で大量の組換えヒトFSHが精製できることがわかった。精製ヒトFSHの分析上記精製ヒトFSHを非還元非加熱条件でSDSPAGE電気泳動をした。ゲルをクマジー染色した結果,分子量約45kDaに単一バンドのみが認められた図8。このバンドは抗ヒトFSH抗体を用いたウェスタンブロッティングで染色され,ヒトFSHのものであったデータは示さず。また,上記精製ヒトFSHを,RP-HPLC分析したところ,α鎖に由来するピーク3,β鎖に由来するピーク1以外に,面積比約1のピーク2を認めるものの,高純度に精製されたヒトFSHであることがわかった図9。なお,ピーク2は,N末端アミノ酸配列解析とアミノ酸組成分析から,α鎖に由来するペプチド鎖であることがわかった。また,上記精製ヒトFSHを,等電点電気泳動で分析したところ,pI35~55の間に複数のバンドを認めた図10。これは,既報の組換えFSHの等電点電気泳動パターンと同様であったLoumayeEHumanReprodUpdate48628811998。ラット卵巣重量増加法により,上記精製ヒトFSHの比活性を測定したところ,14000~18000IU/mgであった。この値は,既に日本国内で医薬品として販売されている組換えヒトFSH製剤の比活性と同等かそれ以上であった。ELISA法によるヒトFSHの定量EIA用96ウェルマイクロタイタープレートヌンク社の各ウェルに,005MNaHCO3溶液で1μg/mLに希釈した抗ヒトFSHαサブユニット抗体LeincoTechnologies社100μLを添加し室温で2時間以上静置して吸着させた。次いで,各ウェルを,005Tween20を含むPBSPBSTで3回洗浄したのち,各ウェルに,05BSA及び005Tween20を含むPBSPBSBTで適度に希釈した検体またはヒトFSHスタンダードシグマ社を,100μL添加して室温で2時間以上静置した。次いで,各ウェルを,PBSTで3回洗浄したのち,各ウェルに,PBSBTで1000倍希釈したPO標識抗ヒトFSHβ鎖抗体LeincoTechnologies社を100μL添加して室温で2時間以上静置した。次いで,各ウェルを,PBSTで3回洗浄したのち,各ウェルに,基質溶液を100μLずつ添加し,室温で酵素反応を行った。上記基質溶液として,0025Mクエン酸と005MNa2HPO4を混合してpH50に調整した緩衝液に,オルトフェニレンジアミンOPDを04mg/mLおよびH2O2を0008含むように添加したものを用いた。次いで,各ウェルに,2NH2SO4を100μLずつ添加して反応を停止させた後,各ウェルの492nmにおける吸光度を,96ウェル用プレートリーダーで測定した。RP-HPLC法によるヒトFSHの分析高速液体クロマトグラフィーはLC20ASystemSPD20AVUVVISDetector島津製作所を用いて実施した。TSKgelOctadecyl4PW46mm径X150mm長,東ソー社を,0.1トリフルオロ酢酸を含む4アセトニトリル溶液で平衡化した。これにサンプルを負荷し,アセトニトリル濃度を直線的に4から18に上昇させて溶出した。検出は214nmの吸光度を測定した。ラット卵巣重量増加法によるヒトFSHの活性測定ヒトFSHの活性測定はラット卵巣重量増加法で行ったSteelmanSEndocrinology5366046161953。体重約45~65gの雌性SDラット日本チャールスリバーを,入荷後3日間飼育して馴化させた。ラットに,試料希釈液を用いて02mLに希釈した被験試料又はヒトFSHスタンダードを,1日目の午後,2日目の午前,正午,午後,3日目の午前および午後の計6回皮下投与した。5日目に,ラットの卵巣を摘出し,重量を測定した。ヒトFSHスタンダードには,FirstinternationalstandardforFolliculeStimulatingHormoneRecombinantHumanforBioassayNIBSCcode92642WHOを用いた。また,試料希釈液は,hCG製剤10000IU,日本薬局方3アンプルに,1アンプルにつき添付溶解液2mLを加えて溶解し5000IU/mL,得られた溶液40mLとウシ血清アルブミン30gを,適量のリン酸塩緩衝液pH71に加えて溶解した後,上記緩衝液で全量250mLに調整,これを,022μmメンブレンフィルターでろ過して調製した。1群5匹のラットに,希釈倍率を変えた4種類の被験試料を投与し力価の推定を行った後,本試験を行った。本試験は,卵巣質量が95~105mgになると推定される希釈倍率のものを高濃度群,高濃度群の15~2倍の希釈倍率のものを低濃度群とし,1群10匹で,2-2用量検定法により,ヒトFSHの活性を測定した。"