中間精製およびポリッシングの工程を少なくとも包含する、バイオリアクターにおいて生成されたタンパク質混合物からの抗体の精製のための方法であって、前記中間精製およびポリッシング工程は、連続的なインラインの、分離混合物をフロースルー画分として生成するアニオン交換クロマトグラフィーAEXと、それに続く、精製抗体調製物をフロースルー画分として生成する疎水性相互作用クロマトグラフィーHICとを含み、前記精製抗体調製物は、少なくとも1つのさらなる精製工程に供される、方法。アニオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーが、連続的に連結された2つの別個のデバイスにおいて行われる、請求項1に記載の方法。前記連続的なインラインのAEXおよびHICが、単一ユニット操作として行われる、請求項1に記載の方法。HIC前の前記分離混合物に、適量のリオトロピック塩が補充される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。HIC前の前記分離混合物に、適量の硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウムおよび塩化ナトリウムが補充される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。アニオン交換クロマトグラフィー部分および疎水性相互作用クロマトグラフィー部分の両方を連続的に連結して含む請求項1~5のいずれか一項に記載の方法において使用され得る単一操作ユニットであって、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の出口は、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー部分の入口に連結されており、前記ユニットは、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分の上流端に入口を含みかつ前記疎水性相互作用クロマトグラフィー部分の下流端において出口を含み、前記ユニットはまた、前記アニオン交換クロマトグラフィー部分と前記疎水性相互作用クロマトグラフィー部分との間にも入口を含む、単一操作ユニット。[実施例][材料および方法]全ての試験を、ヒト細胞株PERC6のクローンP419によって産生されたIgG1を用いて実施した。培養を、化学的に規定された培地を使用して流加バッチで実施し、その後、細胞を、ZetaPlus10M02P、ZetaPlus60ZA05およびSterAssurePSA020全てCuno3Mからの三段デプス濾過フィルター列によって除去した。この清澄化した採取物は、7.5g/LのIgGを含有するものであり、2~8°Cで保存した。まず、標準的なプロテインAクロマトグラフィーによる最初の精製を、MabSelectGEを使用し、標準的な手順清澄化採取物を負荷し、まず20mMTris150mMNaClで洗浄し、次にpH5.5の緩衝液で洗浄し、緩衝液pH3.0を用いて溶出させるを用いて実施した。次の精製のための最適化緩衝液条件を見出すために、2番目の洗浄および溶出は、100mMアセタート緩衝液または100mMシトラート緩衝液を用いて実施した。MabSelect溶出後、溶出ピークを回収し、1時間にわたってpH3.5に維持した。その後、導電率を5.0mSに設定するために、試料を2MTrispH9.0を使用してpH7.4に中和し、脱塩水を用いて希釈し、そして0.22μmで濾過した。こうして得られた材料は、アセタートTris緩衝液またはシトラートTris緩衝液中の予備精製したIgGであった。この材料を用いて、次の3つの一連の試験を実施した。1.フロースルー様式でのAEXクロマトグラフィーに最適な条件を確立する試験1。2.フロースルー様式でHI-クロマトグラフィーを使用して最適条件を確立する試験2。3.最適化されたAEX条件およびHIC条件の両方を1つの単一ユニット操作試験において組み合わせる実施例1。HCPは、多クローン性抗PERC6HCPを用いてELIZAによって測定した。単量体IgGおよび凝集体の濃度は、標準的な手順に従って、サイズ排除クロマトグラフィーHP-SECによって測定した。[試験1][フロースルー様式でのアニオン交換クロマトグラフィーに最適な条件を確立する]フロースルー様式でのAEXクロマトグラフィーを、上述のアセタートTris緩衝液またはシトラートTris緩衝液中の予備精製したIgGを使用して実施した。以下のAEX媒体を試験した:MustangQコイン0.35mLPall、SartobindQカプセル1mL、ChromaSorbカプセル0.08mLMillipore全て膜吸着体、およびPoros50HQ樹脂appliedBiosystems1mL充填床を使用した充填床カラム。全てのAEX媒体を、40床体積/時間でAKTAエクスプローラーを使用して、フロースルーで実施した。コンディショニングおよび洗浄緩衝液は、100mMアセタートTrispH7.4アセタート緩衝液中の生成物試験用または100mMシトラートTrispH7.4シトラート緩衝液中の生成物試験用を用いた。各AEX媒体上に負荷した生成物の量は、1.5g/mL膜またはカラム床体積であった。HCPを、クロマトグラフィー工程の前後で測定した。HCP除去は、AEXクロマトグラフィー性能として最も重要であると考えられる。HCPの対数減少値は、前述のアニオン交換体について、それぞれ1.9、1.7、1.8および2.1であった全て単独試験。シトラートマトリックスを使用すると、全てのAEX媒体の性能が著しく劣り、MustangQ、ChromasorbおよびPoros50HQについては、それぞれ1.2、0.2および1.3というHCP対数減少値を結果としてもたらした。これらの結果は、試験した全てのAEXクロマトグラフィー媒体が、アセタート緩衝液を使用してHCPを実質的に除去するのに適していることを示し、これらの条件下においてほぼ同じHCP対数減少値を示した。[試験2][フロースルー様式で疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して最適条件を確立する]HIC工程について、次の4種の樹脂を試験した:PhenylSepharoseFFlowsubGE、ToyopearlPPG600Tosoh、Toyopearlフェニル600Tosoh、Toyopearlブチル600Tosoh。これらの試験については、予備精製したIgGは、100mMアセタートTris緩衝液pH7.4、導電率5.0mS中のものであった。さらに、MabSelect予備精製IgG含有材料を、凝集体の量をおよそ20に増加させるために、40分間pH4および50°Cでインキュベートした。コンディショニングおよび洗浄には、100mMアセタートTris緩衝液pH7.4、導電率5.0mS緩衝液Aを、特定の体積パーセントの緩衝液Bとインライン混合して使用した。緩衝液Bは、100mMアセタートTris緩衝液pH7.4中に2M硫酸アンモニウムを含有したものであった。全ての樹脂を、緩衝液Bとの体積ベースでのインライン混合を生成物負荷の間に使用して試験した。負荷物/緩衝液Aおよび緩衝液Bについてのいくつかのパーセント比を、各樹脂について試験した。カラム体積は全て1mLであり、流量は100mL/時間であり、負荷物中のIgGの量は0.29g/Lであり、100mLを負荷した。負荷物およびフロースルー物の両方をサンプリングし、分析した。Toyopearlフェニル600、Toyopearlブチル600の両方は、0Bですでに、凝集体ばかりでなくIgGの大部分と結合した。したがって、これらの樹脂が、適用した条件下でのP419IgGを使用したフロースルー様式での凝集体除去に適していないと結論づけた。PhenylSepharoseFFlowsub示さず、ToyopearlPPG600表1参照の両方が、硫酸アンモニウム含有緩衝液Bの特定の比率でのインライン混合を使用したフロースルーにおいて良好な凝集体除去をもたらした。[実施例1]1つの単一ユニット操作における最適化したAEX条件およびHIC条件でのIgGの精製。AEXユニットおよびHICユニットを、図1の図に示されるように、連続的にインライン連結した。AEXには、MustangQコインを使用し、HICには、3mLのToyopearlPPG600樹脂を含有するカラムを使用した。生成物負荷前の樹脂コンディショニングには、100mMアセタートTris緩衝液pH7.4、導電率5.0mSを使用した緩衝液A。同時に、緩衝液Bを、22の体積比でインライン混合した。緩衝液Bは、100mMアセタートTris緩衝液pH7.4中に2M硫酸アンモニウムを含有したものであった。予備精製したIgGの負荷は、緩衝液Aのポンプ輸送を停止している間に、IgGを緩衝液Aと同様の流量でポンプ輸送することによって開始した。4.37gのIgGを含有する362mLの量を負荷した。負荷の完了後、このシステムから全ての生成物を回収するために、ポンプを緩衝液Aに戻した。その後、緩衝液Bのインライン混合を停止することによってHICユニットをストリッピングした、したがって100緩衝液A別個に回収されるを使用する。全試験の間、HICを通る流量は、185mL/時間であった。合計時間コンディショニング、洗浄およびストリッピングを含むは、3.5時間であった。負荷物およびフロースルー物の両方を、IgG凝集体比、DNA含有量、HCP含有量およびタンパク質生成物含有量A280について分析した。HCP減少は、>log2.3であったフロースルー中のHCPの量はLoD未満であった。凝集体の量は、負荷物中5.8、フロースルー物中1.2であった。A280に基づく全生成物回収率は、ストリッピングなしでは86.7であり、ストリッピングを含むと90.1であった。[使用した略語]A280280nmでの光吸収AEXアニオン交換クロマトグラフィーBHK細胞ベビーハムスター腎臓細胞CHO細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞EBA膨張床吸着HCP宿主細胞タンパク質HIC疎水性相互作用クロマトグラフィーHPLC高圧液体クロマトグラフィーIgG免疫グロブリンGLoD検出限界TFF接線流濾過Trisトリスヒドロキシメチルメチルアミン