"CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3からなるCDRを有するヒト化抗体重鎖であって、前記CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3がそれぞれ配列番号4、5および6の配列を含んでなる、ヒト化抗体重鎖。配列番号10、11、12、13、85または87からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなる、請求項1に記載のヒト化抗体重鎖。配列番号21、22、23、24、89または91からなる群から選択される完全配列を含んでなる、請求項1または2に記載のヒト化抗体重鎖。CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなるCDRを有するヒト化抗体軽鎖であって、前記CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3がそれぞれ配列番号7、8および9の配列を含んでなる、ヒト化抗体軽鎖。配列番号14、15、16、17、18、19、20、86または88からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなることを特徴とする、請求項4に記載のヒト化抗体軽鎖。配列番号25、26、27、28、29、30、31、90または92からなる群から選択される完全配列を含んでなることを特徴とする、請求項4または5に記載のヒト化抗体軽鎖。ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片であって、前記ヒト化抗体が、重鎖および軽鎖を含んでなり、前記重鎖が、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3からなるCDRを有し、前記軽鎖が、CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなるCDRを有し、前記CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3が、それぞれ配列番号4、5および6の配列を含んでなり、前記CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3が、それぞれ配列番号7、8および9の配列を含んでなる、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。配列番号10、11、12、13、83、85または87からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号14、15、16、17、18、19、20、84、86または88からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項7に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。配列番号21、22、23、24、89または91からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号25、26、27、28、29、30、31、90または92からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなる、請求項7または8に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。以下からなる群から選択される、請求項7に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片:-配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号16の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号22の配列の重鎖および配列番号27の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号17の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号22の配列の重鎖および配列番号28の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号18の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号22の配列の重鎖および配列番号29の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号19の配列の軽鎖可変領域を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号22の配列の重鎖および配列番号30の配列の軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号23の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号15の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号23の配列の重鎖および配列番号26の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号10の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号21の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号10の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号21の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号22の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号23の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号13の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号24の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号15の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号26の配列の軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号16の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号27の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号17の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号28の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号18の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号29の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号19の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号30の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号20の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片;-配列番号91の配列の重鎖および配列番号31の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。以下の核酸から選択される、単離された核酸分子:a請求項1、2、または3のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;b請求項4、5または6のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;c請求項7~10のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;da、bまたはcに記載の核酸に相補的な核酸;e配列番号38~41、49~52、93または95の核酸配列を含んでなる重鎖の3つのCDRの少なくとも1つと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも18ヌクレオチドの核酸;およびf配列番号42~48、53~59、94または96の核酸配列を含んでなる軽鎖の3つのCDRの少なくとも1つと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも18ヌクレオチドの核酸。-ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列であって、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号32のCDR-H1ヌクレオチド配列、配列番号33のCDR-H2ヌクレオチド配列および配列番号34のCDR-H3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列;-ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列列であって、前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号35または60のCDR-L1ヌクレオチド配列、配列番号36または61のCDR-L2ヌクレオチド配列および配列番号37または62のCDR-L3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列;および-ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列をコードする核酸配列であって、i前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号32のCDR-H1ヌクレオチド配列、配列番号33のCDR-H2ヌクレオチド配列および配列番号34のCDR-H3ヌクレオチド配列を含んでなり、ii前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号35または60のCDR-L1ヌクレオチド配列、配列番号36または61のCDR-L2ヌクレオチド配列および配列番号37または62のCDR-L3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含んでなる、請求項11に記載の単離された核酸分子。請求項11または12に記載の核酸で構成される、ベクター。請求項13に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。請求項14に記載のベクターで形質転換された細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。以下の工程を含んでなる、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の産生方法:-請求項14に記載の宿主細胞の培地および前記宿主細胞に適した培養条件で培養する工程、および-産生された前記抗体またはその機能的断片の1つを前記培養培地または前記培養細胞から回収する工程。薬物として使用するための、請求項7~10のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片。請求項1~3に記載のヒト化抗体重鎖および/または請求項4~6に記載のヒト化抗体軽鎖からなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。請求項7~10および17のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片からなる化合物を活性成分として含んでなる、請求項18に記載の組成物。同時、別個または拡張使用のための組合せ物としてCXCR4に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を更に含んでなる、請求項18または19に記載の組成物。同時、別個または拡張使用のための組合せ物または接合物として細胞毒性薬剤/細胞分裂阻害剤、細胞毒および/またはラジオアイソトープを更に含んでなる、請求項18~20のいずれか一項に記載の組成物。薬物として使用するための、請求項18~21のいずれか一項に記載の組成物。がんを予防または治療するための、請求項1~3のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および/または請求項4~6のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および/または請求項7~10もしくは17のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および/または請求項18~22のいずれか一項に記載の組成物。前記がんが、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌から選択されるがんである、請求項23に記載のヒト化抗体重鎖および/または軽鎖および/またはヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および/または組成物。対象においてCXCR4を発現する腫瘍の存在および/または位置をインビトロで検出する方法であって、a前記対象由来のサンプルを、請求項1~3のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および/または請求項4~6のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および/または請求項7~10もしくは17のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片に接触させ、かつb前記抗体と前記サンプルの結合を検出することを含んでなる、方法。少なくとも1つの請求項1~3のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および/または請求項4~6のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および/または請求項7~10もしくは17のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キット。第1の態様によれば、本発明の主題は、本発明に係るヒト化抗体の作製および選択プロセスである。第1の態様によれば、本発明は、リガンド依存性およびリガンド非依存性のCXCR4活性化の両方を阻害できる抗CXCR4ヒト化抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、の選択プロセスであって、以下の工程を含んでなるプロセスに関する:i作製されたヒト化抗体をスクリーニングし、CXCR4に特異的に結合でき且つCXCR4活性化を調節できる抗体を選択する工程;ii工程iの選択された抗体を試験し、CXCR4ホモ二量体のコンホメーション変化を誘導できる抗体を選択する工程;およびその後iii工程iiの選択された抗体を試験し、CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導できる抗体を選択する工程。調節するという表現は、増加または阻害と理解されなければならない。好ましくは、本発明の選択された抗体は、CXCR4活性化を阻害しなければならない。上記で説明したように、CXCR4二量体コンホメーション変化の誘導は、そのような抗体がより大きな患者集団に実質的利益を提供するので、本発明の主要な態様である。抗体の作製は、例えば骨髄腫細胞と選択された骨髄腫細胞に適合する免疫化したマウスまたは他の種の脾臓細胞との融合物によって分泌されたマウス抗体のシークエンシングされたCDRからデザインされた組換えヒト化抗体から、当業者に公知の任意の方法により実現することができるKohlerMilstein1975Nature256495497。免疫化した動物としては、ヒト免疫グロブリン座を有して直接ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスが含まれ得る。別の可能な実施形態は、ファージディスプレイ技術を用いてライブラリーをスクリーニングすることにある。スクリーニング工程iは、当業者に公知の任意の方法またはプロセスによって実現することができる。非限定的な例として、ELISA、BIAcore、免疫組織化学、FACS分析および機能的スクリーニングを挙げることができる。好ましいプロセスは、CXCR4形質転換体に対しておよび産生された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識できることを確認するために少なくとも1つの腫瘍細胞系に対してFACS分析によりスクリーニングすることにある。このプロセスは以下の実施例でより正確に説明する。CXCR4活性化を調節するという表現は、後述するマウス抗体についての実施例4、5、7および11、キメラ抗体についての実施例16、17および19、ならびにヒト化抗体についての実施例27、24および28に記載されている活性の少なくとも1つを調節することが意図され、好ましくは、-特にヒト野生型CXCR4受容体を安定的に発現するCHO-Kl膜等の形質転換真核細胞膜上での競合による、細胞膜の受容体CXCR4上でのリガンドSDF-1の特異的結合実施例4、16、27参照;-特に野生型CXCR4受容体膜を安定且つ構成的に発現するNIH-3T3細胞等の形質転換真核細胞膜上での、細胞膜の受容体CXCR4上でのGTPγSの特異的結合実施例5、17、24参照;-CXCR4により仲介されるcAMP産生の阻害実施例7参照;および-CXCR4受容体により仲介される細胞内カルシウムストアの動員実施例11、19、28参照を調節することが意図される。より好ましくは、これらの活性の少なくとも1つのこの調節は活性の阻害である。本発明のプロセスの選択工程iiおよびiiiの好ましい実施形態では、前記工程iiおよびiiiは、それぞれCXCR4-RLuc/CXCR4-YFPおよびCXCR4-Rluc/CXCR2-YFPを発現する細胞のBRET分析によって抗体を評価することならびにBRETシグナルの少なくとも40、好ましくは45、50、55、最も好ましくは60を阻害できる抗体を選択することにある。BRET法は、タンパク質二量体化を示すことが知られている技術である[AngersetalPNAS200097368489]。本プロセスの工程iiおよびiiiで使用されるBRET法は当業者に周知であり、以下の実施例で詳細に説明する。より具体的には、BRET生物発光共鳴エネルギー移動は、生物発光ドナーウミシイタケルシフェラーゼRlucと蛍光アクセプターであるGFP緑色蛍光タンパク質またはYFP黄色蛍光タンパク質の変異体との間で起こる非放射性のエネルギー移動である。本発明では、EYFP高感度黄色蛍光タンパク質を用いた。移動効果はドナーとアクセプターの配向および距離に依存する。そして、2つの分子が接近1~10nmしている場合にのみ、エネルギー移動が起こり得る。この特性を用いて、タンパク質-タンパク質相互作用アッセイを作製する。実際に、2つのパートナー間の相互作用を調べるために、第1のパートナーをウミシイタケルシフェラーゼに、第2のパートナーをGFPの黄色変異体に遺伝的に融合させる。融合タンパク質は、必ずではないが一般的に、哺乳動物細胞中で発現させる。Rlucはその膜透過性基質セレンテラジンの存在下で青色光を発する。GFP変異体がRlucから10nmよりも近い場合、エネルギー移動が起こり得、追加の黄色シグナルを検出することができる。BRETシグナルは、アクセプターによって発せられた光とドナーによって発せられた光の比として測定される。したがって、2つの融合タンパク質が接近するか、コンホメーション変化によってRlucとGFP変異体が近づくと、BRETシグナルが増加する。好ましい実施形態にBRET分析がある場合、当業者に公知の任意の方法を用いて、CXCR4二量体のコンホメーション変化を測定することができる。限定されるものではないが、以下の技術を挙げることができる:FRET蛍光共鳴エネルギー移動、HTRF均一時間分解蛍光HomogenousTimeresolvedFluorescence、FLIM蛍光寿命画像顕微法またはSW-FCCS単波長蛍光相互相関分光。共免疫沈降、Alphascreen、化学的架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ELISAまたはファーウェスタンブロッティング法等のその他の古典的技術も用いることができる。本発明に係るプロセスの特定の態様によれば、工程iiは、CXCR4-RLuc/CXCR4-YFPの両方を発現する細胞のBRET分析により抗体を評価することおよびBRETシグナルの少なくとも40を阻害できる抗体を選択することにある。本発明に係るプロセスの別の特定の態様によれば、工程iiiは、CXCR4-RLuc/CXCR2-YFPの両方を発現する細胞のBRET分析により抗体を評価することおよびBRETシグナルの少なくとも40を阻害できる抗体を選択することにある。第2の態様によれば、本発明の主題は、前記プロセスによって得られる、単離されたヒト化抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、である。前記ヒト化抗体、またはその前記断片もしくは誘導体の1つは、ヒトCXCR4に特異的に結合することができ、また、必要に応じて、好ましくはそれに加えて、そのリガンドの自然な結合を阻害することができ、前記ヒト化抗体は、CXCR4二量体のコンホメーション変化を誘導することもできる。機能的断片および誘導体という表現は、本明細書において以下で詳細に定義される。ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわちそれらは天然環境にはなく、天然供給源から精製によって単離または獲得することができたものであるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得たものであり、したがって、続けて更に説明されるように、非天然アミノ酸を含んでもよいと理解されなければならない。より具体的には、本発明の別の態様によれば、抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つが記載され、前記ヒト化抗体は、配列番号4~9のアミノ酸配列を含んでなるCDRから選択され、IMGTに従って定義される、少なくとも1つの相補性決定領域CDRを含んでなることを特徴とする。第2の態様によれば、本発明は、配列番号4、5、6、7、8もしくは9の配列のCDRから選択される少なくとも1つのCDRまたはIMGTによる定義で配列が配列番号4、5、6、7、8もしくは9の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する少なくとも1つのCDRを含んでなる単離されたヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。抗体の機能的断片とは、特に、元の抗体と同じCXCR4に対する特異性を有する抗体断片、例えば断片Fv、scFvsc=単鎖、Fab、FAb’2、Fab’、scFv-Fcもしくは二重特異性抗体diabodyまたは半減期が延長された任意の断片を意味する。そのような機能的断片は、本明細書において以下で更に詳細に説明される。抗体の誘導化合物または誘導体とは、特に、ペプチドスキャフォールドとそのCXCR4認識能を保存するための元の抗体のCDRの少なくとも1つとで構成される結合タンパク質を意味する。そのような誘導化合物は当業者に周知であり、本明細書において以下で更に詳細に説明される。本発明の別の実施形態では、誘導化合物または誘導体は、元の抗体の少なくとも2、好ましくは少なくとも3、より好ましくは4、更により好ましくは5、最も好ましくは6個のCDRを含んでなり得る。より好ましくは、本発明は、遺伝的組換えまたは化学合成によって得られる、本発明に係るヒト化抗体、その誘導化合物またはその機能的断片を含んでなる。好ましい実施形態では、本発明に係るヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。モノクローナル抗体とは、ほぼ均一な抗体集団から生じた抗体を意味すると理解される。より具体的には、集団の個々の抗体は、最小限の割合で見出すことのできる少数の可能な天然の変異を除き、同一である。換言すると、モノクローナル抗体は、単細胞クローン例えば、ハイブリドーマ、均一な抗体をコードするDNA分子でトランスフェクトされた真核宿主細胞、均一な抗体をコードするDNA分子でトランスフェクトされた原核宿主細胞等の増殖により生じる均一抗体からなり、一般的に、ただ1つのクラスおよびサブクラスの重鎖ならびに1種類だけの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。更に、種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体標品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の1つのエピトープに対するものである。ここで、本発明は天然型のヒト化抗体に関するものではなく、すなわち天然環境から取られるものではなく天然供給源から精製によって単離または獲得されるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得られるものであり、したがって後述するように非天然アミノ酸を有してよいと理解されなければならない。より具体的には、本発明の好ましい実施形態によれば、ヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、配列番号4、5もしくは6のアミノ酸配列のCDRから選択される少なくとも1つのCDRまたは配列が配列番号4、5もしくは6の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する少なくとも1つのCDRを含んでなる重鎖を含んでなること;あるいは配列番号7、8もしくは9のアミノ酸配列のCDRから選択される少なくとも1つのCDRまたは配列が配列番号7、8もしくは9の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する少なくとも1つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。好ましい様式では、本発明のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つは、以下の3つのCDR、それぞれCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3、を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする:-CDR-H1は、配列番号4の配列または配列番号4と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなり;-CDR-H2は、配列番号5の配列または配列番号5と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなり;-CDR-H3は、配列番号6の配列または配列番号6と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなる。特定の実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つは、配列番号4の配列のCDR-H1、配列番号5の配列のCDR-H2、および配列番号6の配列のCDR-H3を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。更により好ましくは、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つは、以下の3つのCDR、それぞれCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする:-CDR-L1は、配列番号7の配列または配列番号7の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなり;-CDR-L2は、配列番号8の配列または配列番号8の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなり;-CDR-L3は、配列番号9の配列または配列番号9の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列を含んでなる。特定の実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つは、配列番号7の配列のCDR-L1、配列番号8の配列のCDR-L2、および配列番号9の配列のCDR-L3を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。本明細書中、ポリペプチド、ポリペプチド配列、ペプチドおよび抗体化合物にまたはその配列に結合しているタンパク質という用語は同義である。ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、天然環境から取られるものではなく天然供給源から精製によって単離または獲得されるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得られるものであり、したがって後述するように非天然アミノ酸を有してよいと理解されなければならない。IMGTの固有なナンバリングは、抗原受容体、鎖型、または種に関わらず可変ドメインを比較するために定義されたものである[LefrancMPImmunologyToday18509LefrancMPTheImmunologist7132136LefrancMPPommieCRuizMGiudicelliVFoulquierETruongLThouveninContetVandLefrancDevCompImmunol275577]。IMGTの固有なナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置になる:例えばシステイン231st-CYS、トリプトファン41CONSERVED-TRP、疎水性アミノ酸89、システイン1042nd-CYS、フェニルアラニンまたはトリプトファン118J-PHEまたはJ-TRPである。IMGTの固有なナンバリングは、フレームワーク領域FR1-IMGT:1~26位、FR2-IMGT:39~55位、FR3-IMGT:66~104位およびFR4-IMGT:118~128位および相補性決定領域:CDR1-IMGT:27~38、CDR2-IMGT:56~65およびCDR3-IMGT:105~117の標準化された境界を与える。ギャップは非占有位置を表すので、CDR-IMGT長かぎ括弧中に示されドットで区切られる。例えば[8.8.13]は重要な情報となる。IMGTの固有なナンバリングは、IMGTColliersdePerlesと呼ばれる2Dグラフィック表示[RuizMandLefrancMPImmunogenetics53857883KaasQandLefrancMPCurrentBioinformatics22130およびIMGT/3Dstructure-DBの3次元構造KaasQRuizMandLefrancMPTcellreceptorandMHCstructuraldataNuclAcidsRes32D208D210]に用いられる。3つの重鎖CDRおよび3つの軽鎖CDRが存在する。本明細書において、CDRという用語は、状況に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の1つまたはこれらの領域の複数もしくは全部を指すために使用される。本発明において、核酸またはアミノ酸の2つの配列間の同一性パーセンテージとは、最適なアラインメント後に得られる、比較される2つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは完全に統計的であり、2つの配列の間の差はその全長に渡ってランダムに分布される。2つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来、それらの最適なアラインメント後に配列を比較することによって行われ、前記比較は、セグメントによってまたはアラインメントウィンドウを用いて行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業での比較の他に、SmithandWatermanAdAppMath2482の局所相同性アルゴリズムを用いて、NeddlemanandWunschJMolBiol48443の局所相同性アルゴリズムを用いて、PearsonandLipmanProcNatlAcadSciUSA852444の類似性サーチ法を用いてまたはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェアWisconsinGeneticsSoftwarePackageGeneticsComputerGroup575ScienceDrMadisonWIのGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA、または比較ソフトウェアBLASTNRもしくはBLASTPを用いて行うことができる。2つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、2つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較される核酸またはアミノ酸配列は、2つの配列間での最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加または欠失を有し得る。同一性パーセンテージは、2つの配列間で、好ましくは2つの完全配列間で、アミノ酸ヌクレオチドまたは残基が同一の箇所の数を決定し、この同一箇所の数をアラインメントウィンドウ中の箇所の総数で割り、その結果に100を掛けて2つの配列間の同一性パーセンテージを得ることにより計算される。例えば、サイトhttpwwwncbinlmnihgovgorfbl2htmlで利用可能なBLASTプログラムBLAST2SequenecsTatusovaetalBlast2sequencesanewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequencesFEMSMicrobiol1999Lett174247250をデフォルトのパラメーター特にパラメーター、オープンギャップペナルティ:5、エクステンションギャップペナルティ:2について;選択されるマトリックスは、例えばプログラムによって提案されるBLOSUM62マトリックスで使用することができ、このプログラムにより、比較する2つの配列間の同一性パーセンテージが直接計算される。参照アミノ酸配列と少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例として、参照配列、特定の修飾、特に少なくとも1つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、切断または伸張を含むものが含まれる。1または複数の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換は、置換されるアミノ酸が同等なequivalentアミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、同等なアミノ酸という表現は、構造的アミノ酸の1つを置換でき、対応する抗体および後述する具体例の生物学的活性を変化させないと考えられる、任意のアミノ酸を指すものとする。同等なアミノ酸は、それらで置換されるアミノ酸とそれらの構造的相同性に基づいてまたは生成されるであろう種々の抗体間の生物学的活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。非限定的な例として、対応する修飾抗体の生物学的活性を大きく変えずに行うことができると考えられる、可能性のある置換を以下の表1にまとめる。同じ条件下で逆置換が当然可能である。当該技術分野の現在の状況では、6つのCDR中の最大の可変性長さおよび組成は3つの重鎖CDR、より具体的にはこの重鎖のCDR-H3に見られることが当業者に知られている。したがって、本発明の抗体の、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つの、好ましい特徴的なCDRが重鎖の3つのCDRとなることは明らかであろう。本発明の別の実施形態では、以下の3つのCDRを含んでなる重鎖:配列番号4の配列または配列番号4の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-H1;配列番号5の配列または配列番号5の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-H2;配列番号6の配列または配列番号6の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-H3;および以下の3つのCDRを含んでなる軽鎖:配列番号7の配列または配列番号7の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-L1;配列番号8の配列または配列番号8の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-L2;配列番号9の配列または配列番号9の配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性を有する配列のCDR-L3;を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片が開示される。本発明の別の態様は、上記ヒト化抗体の機能的断片に関する。当業者に明らかなように、機能的断片は必ず、結合断片、すなわち元の抗体と同じ標的に結合できる断片である。更に、機能的断片は、元の抗体の機能を保持している。特に、本発明の機能的断片はCXCR4の活性化を調節することができる。より好ましくは、本発明に係る機能的断片はCXCR4の活性化を阻害することができる。一実施形態では、CXCR4活性化はリガンド依存的であり、別の実施形態では、前記CXCR4活性化はリガンド非依存的である。好ましい実施形態では、本発明の機能的断片は、CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体の活性を調節することにある元の抗体の機能を保持している。好ましくは、前記機能的断片は、CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体の活性を阻害する能力を保持している。より具体的には、本発明は、前記機能的断片が、断片Fv、Fab、Fab’2、Fab’、scFv、scFv-Fcおよび二重特異性抗体;またはペグ化断片等の半減期が延長された任意の断片から選択されることを特徴とする、抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。本発明に係る抗体のそのような機能的断片は、例えば、断片Fv、scFvsc=単鎖、Fab、FAb’2、Fab’、scFv-Fcまたは二重特異性抗体、あるいはポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールの付加ペグ化ペグ化断片はFv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、FAb’2-PEGおよびFab’-PEGと呼ばれる等の化学修飾によりまたはリポソーム、マイクロスフェアもしくはPLGA中への組込みにより半減期が延長された任意の断片からなり、前記断片は、特にそれが由来する抗体の一般的様式の活性を一部であれ発揮できる本発明のヒト化抗体の特徴的CDRの少なくとも1つを有する。好ましくは、前記機能的断片は、それらが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変部の部分的配列を含んでなるか含み、前記部分的配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な親和性、好ましくはそれが由来する抗体の親和性の1/10に少なくとも等しい親和性、より好ましくは少なくとも1/10の親和性を保持するのに十分である。そのような機能的断片は、それが由来する抗体の配列の少なくとも5個のアミノ酸、好ましくは6、7、8、10、15、25、50または100個の連続アミノ酸含む。好ましくは、これらの機能的断片の種類は、それらが得られた抗体と同じ結合特異性を通常有するFv、scFv、Fab、FAb’2、FAb’、scFv-Fcまたは二重特異性抗体である。本発明によれば、本発明の抗体の断片は、ペプシンもしくはパパインを含む酵素消化等の方法によりおよび/または化学的還元によるジスルフィドブリッジの切断により、上記の抗体から得ることができる。抗体断片は更に、当業者に公知の組換え遺伝子技術によりまたは例えばアプライドバイオシステムズ社から販売されているような自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成等によっても得ることができる。より具体的には、本発明は、本明細書中でiHZ515H7、Hz515H7またはhz515H7MabおよびiiHZ515H7-2、Hz515H7-2またはhz515H7-2Mabと呼ばれるマウス515H7Mabの種々のヒト化抗体バリアントまたはiii前記抗体バリアントの軽鎖および/または重鎖の任意の組合せに関する。更に分かりやすいように、本発明のヒト化バリアント型ともいうhz515H7およびhz515H7-2のCDRに対応する種々のアミノ酸配列を以下の表2aに要約する。本発明のヒト化型hz515H7の種々のバリアントの可変ドメインおよび全長配列に対応する種々のアミノ酸配列を表2bに要約する。本発明のヒト化型hz515H7-2の可変ドメインおよび全長配列に対応する種々のアミノ酸配列を表2cに要約する。不明瞭さを避けるための例として、VH1という表現は、VHバリアント1、VHVar1、VHvar1という表現とほぼ同じである。コンセンサス配列の入手は実施例22に記載されている。本発明の更に別の具体的態様は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれラムダまたはカッパ領域およびガンマ-1、ガンマ-2またはガンマ-4領域であることを特徴とするヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。本発明は、2008年6月25日付でFrenchcollectionformicroorganismculturesCNCM、パスツール研究所、フランス、パリに番号I-4019で寄託されたモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Balb/C免疫化マウス脾細胞とミエローマSp2/O-Ag14系の細胞との融合により得られた。ここで515H7で参照するマウスモノクローナル抗体は、2008年6月25日に番号I-4019でCNCMに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるものである。本発明は更にキメラ抗体に関する。キメラ抗体は、特定の種の抗体に由来する天然の可変領域軽鎖および重鎖と前記特定の種と異種の種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域との組合せを含むものである。これらの抗体、またはそのキメラ断片は、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒトモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列特にマウスと、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えDNAをクローニングすることによって作製することができる。そのような組換え遺伝子の1つにコードされる本発明に係るキメラ抗体は、例えば、マウス-ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスDNAに由来する可変領域によって決まり、アイソタイプはヒトDNAに由来する定常領域によって決まる。キメラ抗体の作製方法についてはVerhoeynetal.BioEssays8741988を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、配列番号83から選択される配列の可変領域を含んでなるキメラ抗体重鎖c515H7VHと呼ぶに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号84の配列の可変領域を含んでなるキメラ抗体軽鎖c515H7VLと呼ぶに関する。好ましい特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、配列番号83のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列および配列番号84のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなる。本明細書において、ヒト化抗体とは、少なくとも1つの重鎖または1つの軽鎖を含んでなる抗体であって、前記重鎖または軽鎖が、非ヒト起源の抗体に由来するCDR領域を含み、抗体分子の残りの部分がヒト起源である例えば、前記残りの部分は1種類または複数種類のヒト抗体に由来し得るものを指す。ヒト化抗体という表現により、本発明は、ヒト化鎖が1つだけで2つめがキメラまたはマウス鎖である抗体を含んでなる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は2つのヒト化鎖を含んでなり、すなわち重鎖および軽鎖の両方がヒト化されている。本発明のヒト化抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって作製することができる例えば、文献SingeretalJImmun150284428571992;MountainetalBiotechnolGenetEngRev1011421992およびBebbingtonetalBioTechnology101691751992に記載されている技術。そのようなヒト化抗体は、インビトロでの診断またはインビボでの予防的および/もしくは治療的処置を含む方法におけるその使用に好ましい。当業者に知られるその他のヒト化技術、例えばPDL社によって欧州特許第0451216号、同第0682040号、同第0939127号、同第0566647号または米国特許第5,530,101号、同第6,180,370号、同第5,585,089号および同第5,693,761号に記載されているCDRグラフト化技術等。米国特許第5,639,641号または同第6,054,297号、同第5,886,152号および同第5,877,293号も挙げることができる。本発明は、上記のマウス抗体515H7から生じたヒト化抗体に関する。好ましい様式では、ヒト化抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域は、それぞれ、ラムダまたはカッパおよびガンマ-1、ガンマ-2またはガンマ-4領域である。より具体的には、本発明は、iヒト抗体重鎖の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびii異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するCDRに相同なCDRを含んでなるヒト化抗体重鎖に関し、前記CDRは、配列番号4、5および6の配列をそれぞれ含んでなるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3からなる。言い換えると、本発明は、配列番号4、5および6の配列をそれぞれ含んでなるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3からなるCDRを有するヒト化抗体重鎖に関する。当業者には、抗体515H7のヒト化に異なる生殖系列を選択できることは明らかであり、それにより、異なる型のヒト化515H7が得られる。より具体的には、好ましい非限定的実施形態では、j遺伝子には同じ生殖系列を保存する一方でv遺伝子をコードする配列に異なる生殖系列を用いることができる。本発明では、使用できる生殖系列は以下の2つの補完的基準に基づいて選択される:-各CDRのアミノ酸の長さはマウスCDRと生殖系列中の同等物との間で同一でなければならない;および-アミノ酸中の生殖系列配列は元のマウス配列と少なくとも70の同一性を有さなければならない。不明瞭さを避けるために、ここで本発明は同じ抗体515H7の2つの好ましい非限定的ヒト化型バージョンともいうを包含することに注意されたい。Hz515H7ともいう最初の1つは、重鎖については生殖系列IGHV3-4904配列番号77およびIGHJ401配列番号81、軽鎖については生殖系列IGKV4-101配列番号78およびIGKJ101配列番号82で得られたヒト化抗体からなる。Hz515H7-2ともいう2つめは、重鎖については生殖系列IGHV3-7301配列番号79およびIGHJ401配列番号81、軽鎖については生殖系列IGKV2D-4001配列番号80およびIGKJ101配列番号82で得られたヒト化抗体からなる。別の実施形態では、本発明は配列番号10、11、12、13、85または87からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号10、11、12または13からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7重鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号85の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2重鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2重鎖に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、H35S、V48L、R50F、A61D、D76NおよびA81Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号87の配列のヒト化抗体H515H7-2重鎖可変領域に関する。更に別の実施形態では、本発明は、配列番号21、22、23、24、89または91からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。更に別の実施形態では、本発明は、配列番号21、22、23または24からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号89の完全配列を含んでなるヒト化抗体H515H7-2重鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号91の完全配列を含んでなるヒト化抗体H515H7-2重鎖に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、H35S、V48L、R50F、A61D、D76NおよびA81Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号91の配列のヒト化抗体H515H7-2重鎖に関する。より具体的には、本発明は、iヒト抗体軽鎖の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびii異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するCDRに相同なCDR、を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関し、前記CDRは、配列番号7、8および9の配列をそれぞれ含んでなるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなる。言い換えると、本発明は、配列番号7、8および9をそれぞれ含んでなるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなるCDRを有するヒト化抗体軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号14、15、16、17、18、19、20、86または88からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号14、15、16、17、18、19または20からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号86の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号88の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2軽鎖に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Yおよび/またはV89Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号88の配列のヒト化抗体H515H7-2軽鎖可変領域に関する。更に別の実施形態では、本発明は、配列番号25、26、27、28、29、30、31、90または92からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号25、26、27、28、29、30または31からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体H515H7軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号90の完全配列を含んでなるヒト化抗体H515H7-2軽鎖に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号92の完全配列を含んでなるヒト化抗体H515H7-2軽鎖に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、L9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Yおよび/またはV89Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号92の配列のヒト化抗体H515H7-2軽鎖に関する。より具体的には、本発明は、iヒト抗体の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびii異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するCDRに相同なCDRを各々が有する重鎖および軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関し、ここで、前記CDRは、配列番号4、5および6の配列をそれぞれ含んでなる重鎖のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3ならびに配列番号7、8および9の配列をそれぞれ含んでなる軽鎖のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなる。言い換えると、本発明は、配列番号4、5および6の配列をそれぞれ含んでなるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3からなるCDRを有する重鎖および配列番号7、8および9の配列をそれぞれ含んでなるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3からなるCDRを有する軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号10、11、12、13、83、85または87からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号14、15、16、17、18、19、20、84、86または88からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号10、11、12または13からなる群から選択される重鎖可変領域および配列番号14、15、16、17、18、19または20からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号85の配列の重鎖可変領域および配列番号86の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号85の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号86の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、H35S、V48L、R50F、A61D、D76NおよびA81Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号87の配列の重鎖可変領域ならびにD40A、L43Q、Y59A、A61D、S69T、G74EおよびD76Yからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。更に別の実施形態では、本発明は、キメラ軽鎖と組み合わされたヒト化重鎖を含んでなるヒト化抗体に関する。更に別の実施形態では、本発明は、ヒト化軽鎖と組み合わされたキメラ重鎖を含んでなるヒト化抗体に関する。より具体的には、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号14、15、16、17、18、19、20、86または88からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号15の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL1T59AE61Dまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号16の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL2またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号17の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL2.1またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号18の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL2.2またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号19の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL2.3またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号20の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7VL3またはその誘導化合物または機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号86の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号83の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体c515H7VH/Hz515H7-2VL1またはその由来化合もしくはは機能的断片に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号10、11、12、13、85または87からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号10の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1/c515H7VLまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76N/c515H7VLまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76N/c515H7VLまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号13の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH2/c515H7VLまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号85の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号84の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/c515H7VLまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。更に別の実施形態では、本発明は、配列番号21、22、23、24、89または91からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号25、26、27、28、29、30、31、90または92からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号21、22、23または24からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号25、26、27、28、29、30または31からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体H515H7に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号89の配列の重鎖および配列番号90の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、H35S、V48L、R50F、A61D、D76NおよびA81Lからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号91の配列の重鎖ならびにD40A、L43Q、Y59A、A61D、S69T、G74EおよびD76Yからなる群から選択される1または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体H515H7-2に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号16の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号22の配列の重鎖および配列番号27の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号17の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号22の配列の重鎖および配列番号28の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号18の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号22の配列の重鎖および配列番号29の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号19の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号22の配列の重鎖および配列番号30の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76NVL2.3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76NVL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号23の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76NVL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号15の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76NVL1T59AE61D、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号23の配列の重鎖および配列番号26の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76NVL1T59AE61D、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号10の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号21の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号10の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号11の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76N/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号12の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76N/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号13の配列の重鎖可変領域および配列番号88の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH2/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号21の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号22の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1D76N/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号23の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH1V48LD76N/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号24の配列の重鎖および配列番号92の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7VH2/Hz515H7-2VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号14の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号15の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VLlT59AE61D、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号16の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号17の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号18の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号19の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号87の配列の重鎖可変領域および配列番号20の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号25の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VLl、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号26の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VLlT59AE61D、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号27の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号28の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.1、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号29の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.2、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号30の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL2.3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号91の配列の重鎖および配列番号31の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Hz515H7-2VH1/Hz515H7VL3、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。上記で例示したVH/VLの組合せは限定するものではないと理解されなければならない。当業者であれば、当然、過度な負担なしに且つ発明的能力を用いることなく、本明細書に開示されている全てのVHおよびVLを再編成することができる。したがって、当業者であれば、本願に開示されている全てのVHおよびVLの全組合せに対応する全てのヒト化抗体を得ることができる。本発明の新規な態様は、以下の核酸全ての縮重遺伝暗号を含むから選択されることを特徴とする単離された核酸に関する:a本発明に係るヒト化抗体重鎖をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;b本発明に係るヒト化抗体軽鎖をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;c本発明に係るヒト化抗体をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA;da、bまたはcに記載の核酸に相補的な核酸;e配列番号38~41、49~52、93または95の核酸配列を含んでなる少なくとも1つの重鎖と、好ましくはIMGTまたはKabatのCDRのナンバリングによるその3つのCDRの少なくとも1つと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも18ヌクレオチドの核酸;f配列番号42~48、53~59、94または96の核酸配列を含んでなる少なくとも1つの軽鎖と、好ましくはIMGTまたはKabatのCDRのナンバリングによるその3つのCDRの少なくとも1つと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも18ヌクレオチドの核酸。本発明は更に、ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号32のCDR-H1ヌクレオチド配列;配列番号33のCDR-H2ヌクレオチド配列;および配列番号34のCDR-H3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子に関する。本発明は更に、ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号35または60のCDR-L1ヌクレオチド配列;配列番号36または61のCDR-L2ヌクレオチド配列;および配列番号37または62のCDR-L3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子に関する。本発明は更に、ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号32のCDR-H1ヌクレオチド配列;配列番号33のCDR-H2ヌクレオチド配列;および配列番号34のCDR-H3ヌクレオチド配列を含んでなり;前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号35または60のCDR-L1ヌクレオチド配列;配列番号36または61のCDR-L2ヌクレオチド配列;および配列番号37または62のCDR-L3ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子に関する。本発明の抗体Hz515H7のCDRに対応する最適化されたヌクレオチド配列を以下の表3aに要約する。本発明のヒト化抗体Hz515H7の種々のバリアントの可変ドメインおよび全長配列に対応する種々の最適化されたヌクレオチド配列を表3bに要約する。本発明のヒト化バージョンhz515H7-2の可変ドメインおよび全長配列に対応する種々の最適化されたヌクレオチド配列を表3cに要約する。最適化された配列という表現は、興味のあるタンパク質本明細書では抗体の可変ドメインの構成的アミノ酸をコードするコドンが、専用の細胞型本明細書では哺乳動物細胞における翻訳機構によってよりよく認識されるように最適化されていることを意味する。この点に関し、最適化された配列によってコードされる所定のタンパク質のアミノ酸配列は最適化されていない配列によってコードされるものと同じであるが、ヌクレオチド配列は異なる。最適化には、G/C含量の適合および安定なRNA二次構造の防止も含まれる例としては、Kimetal1997Gene199293301を参照されたい。例えば、マウスCDR-H1のヌクレオチド配列配列番号71が最適化され、ヒト化CDR-H1のヌクレオチド配列配列番号32に対応し、コドンggg、actおよびgatそれぞれ残基Gly、ThrおよびAspをコードするがそれぞれggc、accおよびgacやはりそれぞれ残基Gly、ThrおよびAspをコードするで置換されている。CDR-H2およびCDR-H3それぞれ配列番号72および73に関して、これらも最適化され、それぞれ配列番号33および34の最適化されたCDRに対応する。軽鎖の3つのCDRそれぞれ配列番号74、75および76についても同様であり、VL1、VL2およびVL3それぞれ配列番号35、36および37ならびにVL2.1、VL2.2およびVL2.3それぞれ配列番号60、61および62に対応する2つの最適化されたヒト化型がある。元のCDR、すなわちマウスの最適化されていない配列を以下の表4に要約する。本明細書中で同義で使用されている、核酸、核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列という用語は修飾されていてもよく、核酸の断片または領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含んでもよく、二本鎖DNA、一本鎖DNA、または前記DNAの転写産物のいずれかであるヌクレオチドの正確な配列を意味する。本発明は天然の染色体環境中すなわち天然状態のヌクレオチド配列に関するものではないことをここで記載しておく。本発明の配列は、単離および/または精製されたものであり、すなわち、これらは、例えばコピーによって、直接または間接的にサンプリングされ、その環境が少なくとも部分的に変更されたものである。例えば宿主細胞を用いた組換え遺伝子技術によって得られたまたは化学合成によって得られた単離された核酸もここで述べておく。好ましい配列と最適なアラインメント後に少なくとも80、好ましくは85、90、95および98の同一性パーセンテージを示す核酸配列とは、参照核酸配列に関して、特定の修飾、例えば特に欠失、切断、伸張、キメラ融合、および/または置換特に点でのを示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは、遺伝暗号の縮重、あるいは、好ましくは高ストリンジェントな条件化で、特に以下に記載する条件化で、参照配列と特異的にハイブリダイズすると思われる相補的配列に関連する。高ストリンジェントな条件化でのハイブリダイゼーションとは、2つの相補的DNA断片間でハイブリダイゼーションが維持されるように温度およびイオン強度に関連する条件が選択されることを意味する。純粋な例として、上記のポリヌクレオチド断片を定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェントな条件は好ましくは以下の通りである。DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションは2工程で行われる:15×SSC1×SSCは0.15MNaCl0.015Mクエン酸ナトリウムの溶液に相当、50ホルムアミド、7ドデシル硫酸ナトリウムSDS、10×デンハルト液、5硫酸デキストランおよび1サケ精子DNAを含むリン酸バッファー20mM、pH7.5中、42°Cで3時間のプレハイブリダイゼーション;2プローブの長さに応じた温度すなわち、長さが100ヌクレオチドを超えるプローブでは42°Cで20時間の一次ハイブリダイゼーション、続いて、2×SSC2SDS中、20°Cで20分間のウォッシュを2回、0.1×SSC0.1SDS中、20°Cで20分間のウォッシュを1回。最後のウォッシュを、長さが100ヌクレオチドを超えるプローブでは60°Cで30分間、0.1×SSC0.1SDS中で行う。当業者は、既定のサイズのポリヌクレオチドについての上記の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を、Sambrooketalに記載されている手順に従って、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。本発明は更に、本発明に記載の核酸を含んでなるベクターに関する。本発明は、特に、そのようなヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび/または発現ベクターに関する。本発明のベクターは、好ましくは、所定の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現および/または分泌を可能にするエレメントを含む。したがって、ベクターは、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルならびに好適な転写制御領域を含まなければならない。これは、宿主細胞中に安定に維持することができなければならず、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特別なシグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、使用される宿主細胞に応じて当業者によって選択および最適化される。そのために、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター中に挿入してもよく、選択された宿主の組込みベクターであってもよい。そのようなベクターは、当業者により通常用いられる方法によって調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショックまたは化学的方法等の標準的方法によって好適な宿主中に導入することができる。ベクターは、例えばプラスミドまたはウイルス起源のベクターである。これらは、本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するために宿主細胞の形質転換に使用される。本発明は更に、本発明に記載のベクターで形質転換されたまたはこれを含んでなる宿主細胞を含んでなる。宿主細胞は、原核または真核系、例えば細菌細胞、更に例えば酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞から選択することができる。昆虫または植物細胞を用いることもできる。本発明は更に、本発明に係る形質転換細胞を有するヒト以外の動物に関する。本発明の別の態様は、以下の工程を含んでなることを特徴とする、本発明に係る抗体、またはその機能的断片の1つ、を産生する方法に関する:a本発明に係る宿主細胞の培地および宿主細胞に適した培養条件で培養する工程;およびbこのようにして産生された前記抗体、またはその機能的断片の1つ、を培養培地または前記培養細胞からを回収する工程。本発明に係る形質転換細胞は、本発明に係る組換えポリペプチドの製造方法に有用である。本発明は更に、ベクターおよび/または本発明に係るベクターによって形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え型の本発明に係るポリペプチドの製造方法を含んでなる。好ましくは、本発明に係るベクターで形質転換された細胞は、上記ポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能にする条件下で培養される。既に述べたように、宿主細胞は原核または真核系から選択することができる。特に、そのような原核または真核系における分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することが可能である。したがって、そのような配列を有する本発明に係るベクターを、分泌される組換えタンパク質の産生に有利に使用することができる。実際、これらの目的の組換えタンパク質の精製は、これらが宿主細胞中よりも細胞培養の上清中に存在することで容易になる。本発明のポリペプチドは化学合成によって製造することもできる。そのような製造方法の1つも本発明の対象である。化学合成法、例えば固相技術特にStewardetal1984SolidphasepeptidessynthesisPierceChemCompanyRockford1112nded参照または部分的固相partialsolid-phase技術、断片の縮合によるまたは従来の溶液中での合成による化学合成法は当業者に公知である。本発明は更に、化学合成によって得られ且つ対応する非天然アミノ酸を含むことができるポリペプチドを含んでなる。本発明は更に、本発明の方法によって得られると思われる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなる。更に別の態様によれば、本発明は、更にヒトケモカインファミリー受容体に特異的に結合でき且つ/またはそのような受容体のシグナル伝達を特異的に阻害できることを特徴とする前述の抗体に関する。新規な実施形態によれば、本発明は、例えばVEGFR、VEGF、EGFR、IGF-1R、HER2neu、HGF、cMET、FGF、テトラスパニン、インテグリン、CXCR4本発明の抗体以外、すなわち別のエピトープを標的とする、CXCR7またはCXCR2等の腫瘍の発症に関与する受容体と相互作用できる第2のモチーフを含んでなるという意味で二重特異性である抗体からなる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。二重特異性または二機能性抗体は、同じ分子中に2つの異なる可変領域が組み合わされた第2世代のモノクローナル抗体であるHollingerandBohlen1999Cancerandmetastasisrev18411419。新たなエフェクター機能をリクルートする能力または腫瘍細胞表面上の複数の分子を標的とする能力に関して、診断領域および治療領域の両方においてその有用性が実証されている。そのような抗体は、化学的方法GlennieMJetal1987JImmunol13923672375;ReppRetal1995JHemat377382または体細胞法somaticmethodStaerzUDandBevanMJ1986PNAS8314531457;SureshMRetal1986MethodEnzymol121210228によって得ることができ、更に、好ましくは、ヘテロ二量体化させることにより求める抗体の精製を容易にすることが可能な遺伝子操作技術によっても得ることができるMerchandetal1998NatureBiotech16677681。これらの二重特異性抗体は、完全wholeIgG、二重特異性Fab’2、Fab’PEG、二特異性抗体diabodyまたは二重特異性scFvとして、更には標的とする各抗原について2つの結合部位が存在する四価の二重特異性抗体Parketal2000MolImmunol37112330または前述したその断片として構築してもよい。二重特異性抗体の製造および投与が2つの特異的抗体の産生より安価である場合の経済的利点に加えて、このような二重特異性抗体の使用には、治療の毒性を低減するという利点がある。実際、二重特異性抗体の使用により、循環抗体の全量を減らすことができ、したがって起こり得る毒性を低減することができる。本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は2価または4価の抗体である。最後に、本発明は、薬物として使用するための上記の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。本発明は更に、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の1つ、からなる化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、前記抗体に補形剤および/または薬学的に許容されるキャリアが添加される。本発明は更に、CXCR4に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を同時、別個、または拡張使用のための組合せ物として更に含んでなることを特徴とする組成物に関する。更に別の実施形態では、本発明は更に、IGF-IR、EGFR、HER2/neu、cMET、VEGFRもしくはVEGF等の受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害できる化合物または当業者に公知の任意の他の抗腫瘍化合物から選択される少なくとも1つの第2の抗腫瘍化合物を含んでなる上記の医薬組成物に関する。本発明の第2の好ましい態様によれば、前記第2の化合物は、前記受容体によって促進される増殖および/または抗アポトーシスおよび/または血管形成および/または播種性転移metastaticdissemination誘導活性を阻害できる単離された抗体である抗EGFR、抗IGF-IR、抗HER2/neu、抗cMET、VEGFR、VEGF等またはその機能的断片および誘導化合物から選択することができる。リツキシマブ、イブリツモマブまたはトシツモマブ等の抗CD20抗体;ゲムツズマブまたはリンツズマブ等の抗CD33抗体;エピラツズマブ等の抗CD22抗体;アレムツズマブ等の抗CD52抗体;エドレコロマブ、Ch17-1AまたはIGN-101等の抗EpCAM抗体;ザクチンXactin等の抗CTP21または16抗体;131I-CotaraTNT-1等の抗DNA-Ag抗体;ペムツモマブまたはR1150等の抗MUC1抗体;ABX-MA1等の抗MUC18抗体;ミツモマブ等の抗GD3抗体;CeaVacまたはラベツズマブ等の抗ECA抗体;OvaRex等の抗CA125抗体;アポリズマブ等の抗HLA-DR抗体;MDX-010等の抗CTLA4抗体;MDX-070、111In90Y-J591、177LuJ591、J591-DM1等の抗PSMA抗体;IGN311等の抗ルイスY抗体;AS1405、90YmuBC1等の抗血管形成抗体;TRAILR1mAbまたはTRAILR2mAb等の抗Trail-R1抗体を好適なものとして挙げられる。本発明の補足的な別の実施形態は、同時、別個、または拡張使用のための組合せ物または併用剤として細胞毒性薬剤/細胞分裂阻害剤を更に含んでなる上記組成物からなる。同時使用とは、組成物の両化合物を単一の製剤に含めて投与することを意味する。別個使用とは、組成物の両化合物を異なる製剤に含めて同時に投与することを意味する。拡張使用とは、組成物の両化合物を異なる製剤にそれぞれ含めて逐次投与することを意味する。一般的に、本発明に係る組成物は、がんの治療の有効性をかなり上昇させる。言い換えると、細胞毒性薬剤の投与により、本発明の抗体の治療効果は予想されるよりも大きく増大する。したがって、本発明の組成物によって得られるもう1つの大きなの利点は、使用する活性成分の有効量がより少なくなる可能性、したがって、副作用、特に細胞毒性薬剤の影響が現れるリスクを回避または低減することが可能になる可能性に関する。更に、この組成物は、予想される治療効果をより迅速に達成することを可能にする。治療的抗がん剤または細胞毒性薬剤とは、患者に投与された時に患者におけるがんの発症が治療または予防される物質を意味する。そのような薬剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬および免疫調節剤が含まれる。そのような薬剤は、例えばVIDALのCytotoxicの見出しの下で腫瘍学および血液学に関連する化合物に費やされたページに挙げられており、この文献に参照により引用されている細胞毒性化合物を好ましい細胞毒性薬剤として本明細書に引用する。アルキル化剤とは、細胞中の任意の分子、好ましくは核酸例えばDNA、に共有結合できるまたはこれをアルキル化できる任意の物質を指す。そのようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、クロルハイドレート、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウムまたはエストラムスチン等のナイトロジェンマスタード;シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホスファミドまたはイホスファミド等のオキサザホスホリン;チオテパ、トリエチレンアミンまたはアルテトラミンaltetramine等のアジリジンまたはエチレン-イミン;カルムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチンまたはロムスチン等のニトロソウレア;ブスルファン、トレオスルファンまたはインプロスルファン等のアルキルスルホナート;ダカルバジン等のトリアゼン;またはシスプラチン、オキサリプラチンもしくはカルボプラチン等の白金錯体が含まれる。代謝拮抗剤とは、特定の活性、一般にDNA合成、を妨げることにより成長および/または細胞代謝をブロックする物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、5-フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、6-メルカプトプリン6-MP、6-チオグアニン6-TG、クロロデソキシアデノシン、5-アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシンおよびペントスタチンが含まれる。抗腫瘍抗生物質とは、DNA、RNAおよび/またはタンパク質の合成を防止または阻害できる化合物を意味する。そのような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンバルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンC、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが含まれる。有糸分裂阻害剤は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を防止する。一般的に、微小管阻害剤またはタキソイド、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルが有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン等のビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。クロマチン阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼIおよびII等のクロマチンを形作るタンパク質の正常な機能を阻害する物質である。そのような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼIには、カンプトテシンおよびその誘導体、例えばイリノテカンまたはトポテカン;トポイソメラーゼIIには、エトポシド、リン酸エチポシドおよびテニポシドが含まれる。抗血管形成剤とは、血管の成長を阻害する任意の薬物、化合物、物質または薬剤である。抗血管形成剤の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、CGS-27023A、ハロフジノン、COL-3、ネオバスタット、BMS-275291、サリドマイド、CDC501、DMXAA、L-651582、スクアラミン、エンドスタチン、SU5416、SU6668、インターフェロン-α、EMD121974、インターロイキン-12、IM862、アンジオスタチンおよびビタキシンvitaxinが含まれる。抗エストロゲン薬またはエストロゲンアンタゴニストとは、エストロゲンの作用を低減、拮抗または阻害する任意の物質を指す。そのような薬剤の例としてはタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イオドキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられる。抗アンドロゲン薬またはアンドロゲンアンタゴニストとは、アンドロゲンの作用を低減、拮抗または阻害する任意の物質を指す。抗アンドロゲン薬の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スプリロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリドおよびシミチジンが含まれる。免疫調節剤とは免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、インターフェロン、インターロイキン、例えばアルデスロイキン、OCT-43、デニロイキンジフチトクスまたはインターロイキン-2、腫瘍壊死因子、例えばタソネルミン、または他の種類の免疫調節剤、例えばレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリI:Cまたはレバミソールと5-フルオロウラシルの組合せが含まれる。更なる詳細について、当業者は、FrenchAssociationofTherapeuticChemistryTeachersによって刊行されたTherapeuticchemistryvol6AntitumordrugsandperspectivesinthetreatmentofcancerTECandDOCedition2003[フランス語]というタイトルのマニュアルを参照することができる。特に好ましい実施形態では、組合せ物としての本発明の前記組成物は、同時使用のために前記細胞毒性薬剤が前記抗体に化学的に結合していることを特徴とする。特に好ましい実施形態では、前記組成物は、前記細胞毒性薬剤/細胞分裂阻害剤が、紡錘体阻害剤または安定化剤、好ましくはビノレルビンおよび/またはビンフルニンおよび/またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。前記細胞毒性薬剤と本発明に係る抗体との間の結合を容易にするために、結合させる2つの化合物の間にポリアルキレングリコールのポリエチレングリコールまたはアミノ酸等のスペーサー分子を導入してもよく、あるいは、別の実施形態では、前記抗体と反応できる機能が導入された前記細胞毒性薬剤の活性誘導体を用いてもよい。これらの結合技術は当業者に周知であり、本明細書中で更に詳細な説明はしない。その他のEGFR阻害剤としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体C225および抗EGFR22Mabインクローンシステムズ社ImCloneSystemsIncorporated、ABX-EGFアブジェニックス社Abgenix/セルジェネシス社CellGenesys、EMD-7200メルクKgaA社MerckKgaAまたは化合物ZD-1834、ZD-1838およびZD-1839アストラゼネカ社、PKI-166ノバルティス社、PKI-166/CGP-75166ノバルティス社、PTK787ノバルティス社、CP701セファロン社Cephalon、フルノミドflunomideファルマシア社/スゲン社Sugen、CI-1033ワーナーランバートパークデービス社WarnerLambertParkeDavis、CI-1033/PD183,805ワーナーランバートパークデービス社、CL-387,785ワイエス-アイエルスト社Wyeth-Ayerst、BBR-1611ベーリンガーマンハイムGMBH社/ロシュ社、ナアミジンAブリストルボードマイヤーズスクイブ社Bristol-boardMyersSquibb、RC-3940-IIファルマシア社、BIBX-1382ベーリンガーインゲルハイム社、OLX-103メルクアンドカンパニー、VRCTC-310ベンテクリサーチ社VentechResearch、EGF融合毒素セラゲン社SeragenInc.、DAB-389セラゲン社/リルガンド社Lilgand、ZM-252808王立癌研究所ImperialCancerResearchFund、RG-50864INSERM、LFM-A12パーカーヒューズセンターがんParkerHughesCenterCancer、WHI-P97パーカーヒューズセンターがん、GW-282974グラクソ社、KT-8391協和発酵またはEGFRワクチンヨークメディカル社/免疫分子センターCentroofImmunologiaMolecularが含まれる。本発明の別の態様は、前記抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片、の少なくとも1つが細胞毒素および/またはラジオアイソトープと組み合わされているまたはコンジュゲートしていることを特徴とする組成物に関する。好ましくは、前記毒素または前記ラジオアイソトープは腫瘍細胞の成長または増殖を防止することができ、特に前記腫瘍細胞を完全に不活化することができる。更に、好ましくは、前記毒素は、腸内細菌毒素、特にシュードモナス外毒素Aである。治療抗体と組み合わせるのに好ましいラジオアイソトープは、ガンマ線を発するラジオアイソトープ、好ましくはヨウ素131、イットリウム90、金199、パラジウム100、銅67、ビスマス217およびアンチモン211である。アルファ線およびベータ線を発するラジオアイソトープも治療に用いることができる。本発明の少なくとも1つの抗体またはその機能的断片と組み合わされた毒素またはラジオアイソトープとは、特に2つの化合物間の共有結合により、前記毒素または前記ラジオアイソトープをその少なくとも1つの抗体に結合させることを可能にする任意の手段を指し、結合分子が導入されてもよく、されなくてもよい。コンジュゲートの要素の全部または一部の化学的共有結合、静電結合、または非共有結合を可能にする薬剤の例としては、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より具体的にはEDC1-エチル-3-[3-ジメチル-アミノプロピル]-カルボジイミド-ヒドロクロリド、ジマレイミド、ジチオビス-ニトロ安息香酸DTNB、N-スクシンイミジルS-アセチルチオ-アセタートSATA、紫外UV線と反応する1または複数の基を有する、1または複数のフェニルアシド基を有する架橋剤、最も好ましくはN-[-4アジドサリチルアミノブチル]-3’-2’-ピリジルジチオ-プロピオンアミドAPDP、N-スクシンイミド-イル32-ピリジルジチオプロピオナートSPDPおよび6-ヒドラジノ-ニコチンアミドHYNICが含まれる。もう1つの結合形態は、特にラジオアイソトープの場合、二官能性イオンキレート化剤の使用からなり得る。そのようなキレーターの例としては、免疫グロブリンと金属、特に放射性金属を結合させるために開発されたEDTAエチレンジアミン四酢酸またはDTPAジエチレントリアミン五酢酸に由来するキレーターが含まれる。したがって、DTPAおよびその誘導体は、リガンド-金属錯体の安定性および剛性rigidityを増大させるように種々の基によって炭素鎖上で置換され得るKrejcareketal1977;Brechbieletal1991;Gansow1991;米国特許第4,831,175号。例えば、DTPAジエチレントリアミン五酢酸およびその誘導体は、遊離形態または金蔵イオンとの錯体形態で薬物および生物学において長い間広く使用されており、がん治療のためのラジオ-イムノコンジュゲートを開発するための抗体等の治療または診断目的のタンパク質とカップリングし得る金属イオンと安定なキレートを形成する注目すべき特徴を示すMeasesetal1984;Gansowetal1990。また好ましくは、前記コンジュゲートを形成する本発明の前記少なくとも1つの抗体は、その機能的断片、特に構成要素Fcを失った断片、例えばscFv断片から選択される。本発明は更に、がんの予防または治療を目的とする薬物を製造するための組成物の使用を含んでなる。本発明は更に、腫瘍細胞の成長を阻害する薬物を製造するための、本発明に係る、好ましくはヒト化された、抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および/または組成物の使用に関する。広義には、本発明は、がんを予防または治療する薬物を製造するための、好ましくはヒト化された、抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および/または組成物の使用に関する。予防および/または治療され得る好ましいがんには、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌または任意のその他のがんが含まれる。本発明は更に、細胞中のCXCR4活性を調節するための薬物を製造するための、前述した抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および/または組成物の使用に関する。本発明の別の態様は、CXCR4発現レベルに関連する疾患の、好ましくはインビトロでの、診断方法における上記抗体の使用に関する。好ましくは、前記診断方法における前記CXCR4タンパク質関連疾患はがんである。したがって、本発明の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、生体サンプル中のCXCR4タンパク質をインビトロで検出および/または定量化する方法、特に、がんのようなこのタンパク質の異常発現に関連する疾患の診断方法において使用でき、前記方法は以下の工程を含んでなる:a生体サンプルを本発明に係る抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に接触させる工程;b形成されるであろう抗原-抗体複合体を示す工程。したがって、本発明は更に、以下の構成要素を含んでなる、上記方法を実施するためのキットまたは付属物を含んでなる:a本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体;b必要に応じて、免疫学的反応に好ましい培地mediumを構成するための試薬;c必要に応じて、免疫学的反応によって生成する抗原-抗体複合体を明らかにする試薬。一般的に、本発明は、CXCR4の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはCXCR4の発現に関連する発がん性障害の発症についての予後をインビトロで決定するための、それぞれ配列番号4、5および6の配列のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の3つのCDRを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号7、8および9の配列のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の3つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片の使用に関する。本態様に関して、本発明は、特に、CXCR4の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはCXCR4の発現に関連する発がん性障害の発症についての予後をインビトロで決定するための、本発明に係るヒト化抗体重鎖および/またはヒト化抗体軽鎖および/またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片、の使用に関する。別の態様によれば、本発明は、対象におけるCXCR4発現腫瘍の存在および/または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、aそれぞれ配列番号4、5および6の配列のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の3つのCDRを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号7、8、9の配列のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の3つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつb前記抗体とサンプルの結合を検出することを含んでなる、方法に関する。特に、本発明は、対象におけるCXCR4発現腫瘍の存在および/または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、a本発明に係るヒト化抗体重鎖および/またはヒト化抗体軽鎖および/またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつb前記抗体とサンプルの結合を検出することを含んでなる、方法に関する。非限定的例として、そのような検出は、FACSまたは当業者に公知のその他の任意の技術によってなされ得る。別の態様によれば、本発明は、対象のCXCR4発現腫瘍におけるCXCR4発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、a’それぞれ配列番号4、5および6の配列のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の3つのCDRを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号7、8、9の配列のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の3つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつb’前記サンプルにおけるCXCR4への抗体結合レベルを定量化することを含んでなる方法に関する。特に、本発明は、対象由来のCXCR4発現腫瘍におけるCXCR4発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、a’本発明に係るヒト化抗体重鎖および/またはヒト化抗体軽鎖および/またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつb’前記サンプル中におけるCXCR4への抗体結合レベルを定量化することを含んでなる方法に関する。好ましい実施形態では、CXCR4発現レベルは免疫組織化学IHCによって測定される。別の態様によれば、本発明は、CXCR4発現腫瘍をインビトロで診断する方法または対象におけるCXCR4発現腫瘍の発症についての予後をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、i本発明に従って、特に本発明のヒト化抗体を用いて、CXCR4の発現レベルを決定する工程;およびii工程iの発現レベルを正常組織由来のCXCR4の参照発現レベルと比較する工程、を含んでなる方法に関する。別の態様によれば、本発明は、対象の腫瘍のCXCR4の状態をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、1本発明に従って、特に本発明のヒト化抗体を用いて、CXCR4の発現レベルを決定する工程;2前記腫瘍をCXCR4発現レベルについてスコア化する工程;および3前記スコア化を対照サンプルから得られたものと比較する工程、を含んでなる方法に関する。別の態様によれば、本発明は、発がん性障害が抗CXCR4抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する方法であって、前記方法が、a本発明に従って対象の腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定する工程;およびb状態がCXCR4であった場合、発がん性傷害が抗CXCR4抗体またはその断片または誘導体を用いた治療に感受性であることを決定する工程を含んでなる方法に関する。別の態様によれば、本発明はCXCR4アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび/または同定する方法であって、aCXCR4を発現している細胞を選択する工程;bそれぞれ配列番号4、5および6の配列のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の3つのCDRを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号7、8、9の配列のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の3つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片と前記細胞をインキュベートする工程;c抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、とCXCR4との結合を阻害する能力について、被験分子を評価する工程;およびd前記阻害が可能な分子を選択する工程を含んでなる方法に関する。この態様によれば、本発明は特に、CXCR4アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび/または同定する方法であって、aCXCR4を発現している細胞を選択する工程;b本発明に係るヒト化抗体重鎖および/またはヒト化抗体軽鎖および/またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片と前記細胞をインキュベートする工程;c抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、とCXCR4との間の結合を阻害する能力について、被験細胞を評価する工程;およびd前記阻害が可能な分子を選択する工程を含んでなる方法に関する。別の態様によれば、本発明は、それぞれ配列番号4、5および6の配列のCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3の3つのCDRを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号7、8、9の配列のCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3の3つのCDRを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片を少なくとも含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キットに関する。この態様によれば、本発明は特に、少なくとも1つの本発明に係るヒト化抗体重鎖および/またはヒト化抗体軽鎖および/またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キットに関する。別の態様によれば、本発明は、腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定するための本発明に係るキットであって、前記キットが、i前記抗CXCR4抗体とCXCR4との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬;およびiiCXCR4発現レベルをスコア化するのに有用な陽性および陰性対照サンプルを更に含んでなるキットに関する。好ましくは、抗体またはその機能的断片は、支持体、特にタンパク質チップ上に固定化することができる。そのようなタンパク質チップの1つは本発明の対象である。好ましくは、タンパク質チップは、生体サンプル中のCXCR4を検出および/または定量化するために必要なキットまたは付属物中で使用することができる。本発明において生体サンプルbiologicalsampleという用語は、生きている生物から採取したサンプル特に、哺乳動物、特にヒトから採取した血液、組織、臓器等のサンプルまたはかかるCXCR4タンパク質の1つを含むと思われる任意のサンプル例えば、必要に応じて形質転換された、細胞サンプルに関するということを述べておく必要がある。前記抗体、またはその機能的断片は、検出可能および/または定量化可能なシグナルを得るためのイムノコンジュゲートまたは標識抗体の形態であり得る。本発明の標識抗体、またはその機能的もしくは断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α-D-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素またはグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素とあるいはビオチン、ジゴキシゲニンまたは5-ブロモ-デオキシウリジン等の分子と組み合わせることができる抗体コンジュゲートイムノコンジュゲートが含まれる。蛍光標識、特にフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、緑色蛍光タンパク質GFP、ダンシル、ウンベリフェロン等も、本発明の抗体またはその機能的断片と組み合わせることができる。そのようなコンジュゲートにおいて、本発明の抗体またはその機能的断片は当業者に公知の方法によって調製することができる。それらは、酵素または蛍光標識と、ポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸EDTAまたはジエチレントリアミン五酢酸DPTA等のスペーサー基または連結基を介して直接結合させてもよく、治療のためのコンジュゲートについて上記で述べたような結合剤の存在下で結合させてもよい。フルオレセイン標識を有するコンジュゲートはイソチオシアナートとの反応によって調製することができる。その他のコンジュゲートとして更に、化学発光標識、例えばルミノールおよびジオキセタン、生物発光標識、例えばルシフェラーゼおよびルシフェリン、または放射性標識、例えばヨウ素123、ヨウ素125、ヨウ素126、ヨウ素133、臭素77、テクネチウム99m、インジウム111、インジウム113m、ガリウム67、ガリウム68、ルテニウム95、ルテニウム97、ルテニウム103、ルテニウム105、水銀107、水銀203、レニウム99m、レニウム101、レニウム105、スカンジウム47、テルル121m、テルル122m、テルル125m、ツリウム165、ツリウム167、ツリウム168、フッ素18、イットリウム199およびヨウ素131が含まれ得る。直接または前述したEDTAもしくはDTPA等のキレート化剤を介してラジオアイソトープと抗体を結合させるための当業者に公知の従来の方法を診断用ラジオアイソトープに用いることができる。そこで、クロラミン-T法[HunterWMandGreenwoodFCNature194495]による[I125]Naでの標識;Crockfordetal米国特許第4,424,200号に記載されているテクネチウム99mでの標識またはHnatowich米国特許第4,479,930号に記載されているDTPAを介した結合を挙げておくべきであろう。バイオマーカーとしての本発明の抗体の使用も開示される。方法は、CXCR4の発現に関連する種々の過剰増殖発がん性障害hyperproliferativeoncogenicdisorder、限定されるものではないが例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、腎癌、膠芽腫、甲状腺癌、横紋筋肉腫、またはCXCR4の発現に関連する任意のその他のがんを検出または診断するために用いられ得る。当業者に理解されるように、特定の障害に関連する抗体発現レベルは予め存在する状態の性質および/または重症度に応じて異なる。当業者に公知の従来の方法のいずれかにおける本発明の抗体の投与例えば局所、非経口、筋肉内等は、サンプル中の異形成細胞を検出する非常に有用な方法であって、CXCR4の発現に関連するまたは仲介される過剰増殖障害の治療を受けている患者の治療計画を臨床医がモニタリングすることを可能にする方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、CXCR4の発現に関連する発がん性障害をインビボでイメージングするための医薬組成物であって、インビボでCXCR4に結合する標識された上記モノクローナル抗体またはその断片と薬学的に許容されるキャリアとを含んでなる医薬組成物に関する。本発明の抗体またはその機能的断片もしくは誘導体は、CXCR4の発現に関連する種々の病態の検出、診断、およびステージ分類を含む種々の医学的目的または研究目的に有用であろう。ステージの決定は、潜在的な予後的価値prognosticvalueがあり、最適な治療法をデザインする基準を提供する[SimpsonetalJClinOncology182059]。一般的に、例えば乳癌の病理学的ステージ分類は臨床的ステージ分類よりも正確な予後が分かるため好ましい。しかし、臨床的ステージ分類は、病理学的評価のための組織を得る侵襲的手技に依存しないので、病理学的ステージ分類と同程度に正確であるなら、臨床的ステージ分類が好ましい。好適な標識または他の適切な検出可能な生体分子もしくは化学物質と共に使用される場合、本発明の抗体はインビトロおよびインビボでの診断および予後予測への応用に特に有用である。イムノアッセイで使用するための標識は一般に当業者に公知であり、酵素、ラジオアイソトープ、ならびに蛍光性、発光性および発色性の物質、例えば着色された粒子、例えばコロイド金またはラテックスビーズが含まれる。好適なイムノアッセイには酵素結合免疫吸着検定法ELISAが含まれる。様々な種類の標識および本発明の抗体に標識をコンジュゲートする方法が当業者に周知であり、例えば以下に記載するものがある。本明細書において、CXCR4の発現に関連する発がん性障害oncogenicdisorderという用語は、障害に罹患している対象における高レベルまたは異常に低いレベルのCXCR4異常の存在が障害の病態生理であるか障害の悪化に寄与する因子であることが示されているまたは疑われている疾患および他の障害を含むことが意図される。あるいは、そのような障害は、例えば、障害に罹患している対象の冒された細胞または組織の細胞表面上におけるCXCR4レベルの増加によって示され得る。CXCR4レベルの増加は、例えば、本発明の抗体515H7またはhz515H7を用いて検出され得る。更に、比較的自律的な成長を示す細胞を指し、それらは細胞増殖制御の有意な消失を特徴とする異常な成長の表現型を示す。あるいは、細胞は、正常レベルのCXCR4を発現し得るが、異常な増殖によって特徴付けられる。特定の実施形態では、CXCR4に関連する場合の増加した発現とは、RNA発現またはタンパク質発現による測定で対照と比べて統計的に有意な発現の増加を示すタンパク質または遺伝子発現レベルを指す。より具体的には、CXCR4の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはCXCR4の発現に関連する発がん性障害、例えばCXCR4の発現に関連するがんの発症についての予後をインビトロで決定するための、前述の本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体の使用が考えられる。本発明に係る別の広い態様は、対象におけるCXCR4の発現に関連する病的状態への感受性または病的過剰増殖発がん性障害を診断する方法であって、サンプル中のCXCR4を有する細胞の有無を決定することおよび前記CXCR4を有する細胞の有無に基づいて病的状態または状的状態への感受性を診断することを含んでなる方法に関する。本発明の抗体の診断における使用は、原発性腫瘍、がん転移、がん幹細胞を含んでなる。抗体は、検出可能且つ/または定量可能なシグナルが得られるようなイムノコンジュゲートの形態または標識抗体の形態で存在し得る。より具体的には、本発明に係る好ましい主題は、対象においてCXCR4を発現する腫瘍の存在および/または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、a本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体に対象由来のサンプルを接触させ。かつb前記抗体とサンプルとの結合を検出することを含んでなる方法である。この主題の別の態様は、臨床試験中、より具体的にはCXCR4受容体のダウンレギュレーションおよびまたは分解が被験化合物の作用機序の一部である時の、CXCR4標的療法に対する応答としてのCXCR4発現の追跡である。当業者に明らかなように、本発明の抗体の結合の検出は種々のアッセイにより示され得る。アッセイを行うための任意の手段を本発明と共に用いることができるが、例としてFACS、ELISAまたはIHCを挙げることができる。本明細書において、サンプルという用語は、新生物細胞を含むまたは含むと思われる結腸、胃、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、皮膚、甲状腺、リンパ節、骨髄または他の臓器もしくは組織の細胞等の新生物細胞を含むまたは含み得る、任意の生体液、細胞、組織、臓器、またはその一部を意味することが意図される。この用語は、個体中に存在するサンプルおよび個体から得られたまたは個体に由来するサンプルを含む。例えば、サンプルは、生検によって得られた検体の組織切片または組織培養に入れたもしくは適応させた細胞であり得る。サンプルは更に、細胞成分画分もしくは抽出物、または粗もしくは実質的に純粋な核酸分子もしくはタンパク質標品であり得る。臨床サンプルは、対象から得られ且つ例えばCXCR4発現レベルを決定または検出する診断検査またはモニタリング検査等の本発明の方法に有用である様々な種類のサンプルを包含することが意図される。この定義は、外科的切除によって得られた固体組織サンプル、病理標本、保存サンプル、または生検標本、組織培養またはそれに由来する細胞およびその子孫、ならびにこれらの供給源のいずれかから調製された切片またはスメアを包含する。非限定的な例として、結腸、胃、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、皮膚、甲状腺、リンパ節、骨髄等から得られたサンプルが挙げられる。この定義はまた、生体起源の液体サンプルを包含し、その中に懸濁されている細胞もしくは細胞断片または液体培地およびその溶質のいずれかを指し得る。本発明に係る別の態様は、対象から得られたCXCR4発現腫瘍におけるCXCR4発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、a’本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体に対象から得られたサンプルを接触させ、かつb’前記サンプルにおけるCXCR4への抗体結合レベルを定量化することを含んでなる方法に関する。当業者に明らかなように、CXCR4への抗体結合レベルは、いくつかの方法で、例えば種々のアッセイによって、定量化され得る。アッセイを行うための任意の手段を本発明と一緒に用いることができるが、好ましい方法は、ELISA法に基づくか、免疫蛍光法によるか、免疫組織化学またはラジオイムノアッセイRIA技術または同等の技術による、免疫酵素的方法を利用する。好ましくは、生体サンプルは生体液、例えば血清、全血、細胞、組織サンプルまたはヒト起源の生検試料で形成される。サンプルは、例えば、CXCR4の発現に関連する病的過剰増殖発がん性障害の存在について好都合にアッセイすることができる生検された組織を含み得る。被験サンプル中に存在するCXCR4の量が決定されたら、その結果を、CXCR4の発現に関連する過剰増殖発がん性障害を有さない個体から被験サンプルと同様にして得た対照サンプルのものと比較することができる。CXCR4レベルが被験サンプルで有意に上昇している場合、それが由来する対象が前記疾患を有するまたは発症する可能性が高くなっていると結論付けることができる。本発明は、より具体的には、対象におけるCXCR4発現腫瘍をインビトロで診断する方法またはCXCR4発現腫瘍の発症についての予後をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、i上記CXCR4の発現レベルを決定する工程;およびii工程iの発現レベルを正常組織またはCXCR4を発現しない組織のCXCR4参照発現レベルと比較する工程、を含んでなる方法に関する。本願において、疾患を診断するとは、例えば、CXCR4の発現に関連するまたは仲介される病的過剰増殖発がん性障害の存在を診断または検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、およびCXCR4の発現に関連する障害を示す細胞またはサンプルを同定または検出することを含むことが意図される。本願において、予後prognosisとは、疾患から回復する可能性または推定される疾患の発症もしくは転帰outcomeの予測を意味する。例えば、対象から得られたサンプルが本発明の抗体を用いた染色に陽性であった場合、その対象の予後は、サンプルがCXCR4染色に陰性であった場合よりも良い。サンプルは、以下で更に詳細に説明されるように適切なスケールに基づいてCXCR4発現レベルについてスコア化され得る。しかし、本発明の別の態様は更に、その作用機序の1つとしてCXCR4の分解を誘導する治療化合物のためにCXCR4発現をモニタリングすることに関する。その場合、細胞膜上でのCXCR4発現の追跡が臨床試験およびテーラーメイド治療中の処置の有効性を評価する重要なツールとなり得る。CXCR4発現レベルは、好ましくは、参照レベルまたは参照発現レベルともいう対照の細胞またはサンプルにおけるレベルに関連して比較または測定される。参照レベル、参照発現レベル、対照レベルおよび対照は本明細書で同義で使用されている。大まかに言うと、対照レベルは、疾患またはがんを一般的に有さない比較可能な対照細胞で測定される別個のベースラインレベルを意味する。これは同じ個体から得られてもよく、病気サンプルもしくは被験サンプルを得た個体と同じ疾患を有さないまたは正常な別の個体から得られてもよい。本発明の文脈で、参照レベルという用語は、患者のがん細胞を含むサンプルにおけるCXCR4の発現の試験レベルを評価するために用いられる、CXCR4の発現の対照レベルを指す。例えば、患者の生体サンプルにおけるCXCR4レベルがCXCR4の参照レベルより高い場合、細胞はCXCR4の発現が高レベルまたは過剰であると見なされる。参照レベルは複数の方法によって決定することができる。したがって、発現レベルは、CXCR4発現細胞の数に依存せずにCXCR4を有する細胞またはCXCR4発現レベルを定義し得る。したがって、各患者の参照レベルは、本明細書に記載の参照レベルを決定するための方法のいずれかによって決定することができるCXCR4の参照比によって定めることができる。例えば、対照は、種々の形態を取り得る所定の値であり得る。それは中央値または平均値等の単一のカットオフ値であり得る。参照レベルは、全ての患者に個々に等しく適用可能な単一の数値であってもよく、具体的な患者小集団に応じて異なってもよい。したがって、例えば、同じがんに対して年長の男性の参照レベルが若い男性と異なることがあり、同じがんに対して女性の参照レベルが男性と異なることがあり得る。あるいは、参照レベルは、試験する新生物細胞の組織と同じ組織から得た非発がん性がん細胞におけるCXCR4発現レベルを測定することによって決定されてもよい。また、参照レベルは、患者の新生物細胞におけるCXCR4と同じ患者の非腫瘍細胞におけるCXCR4レベルとの特定の比率であり得る。参照レベルはまた、腫瘍細胞をシミュレートするようにマニピュレートされ得るまたは参照レベルを正確に決定する発現レベルが得られる任意のその他の様式でマニピュレートされ得るインビトロ培養細胞のCXCR4レベルであり得る。一方、参照レベルは、CXCR4レベルが上昇していない群中およびCXCR4レベルが上昇している群中等、同等な群に基づいて確立されてもよい。比較可能な群の別の例は、特定の疾患、状態または症状を有する群および疾患のない群である。所定の値は、例えば、被験集団を、低リスク群、中リスク群、高リスク群等の群に、あるいは第1四分位または第1五分位が最もリスクの低いもしくはCXCR4の量が最も多い個体となり、第4四分位または第5五分位が最もリスクが高いもしくはCXCR4の量が最も少ない個体となる四分位または五分位に均等または不均等に分けられるように調整され得る。参照レベルはまた、同じがんを有する患者の集団におけるCXCR4レベルの比較によっても決定され得る。これは、例えば、患者の全コホートがグラフィカルに表され、第1軸がCXCR4レベルを表し、第2軸がコホート中で腫瘍細胞が所定のレベルのCXCR4を発現する患者の数を表す、ヒストグラム分析によって達成され得る。CXCR4が同じまたは同様なレベルのコホートの亜集団集団を特定することにより、2以上の別個の患者群を決定することができる。次いで、これらの別個の群が最も良く区別されるレベルに基づいて参照レベルを決定することができる。参照レベルは、1つがCXCR4である2種以上のマーカーのレベルを表してもよい。2種以上のマーカーは例えば各マーカーレベルの値の比率によって表され得る。同様に、健康と思われる集団は、CXCR4の発現に関連する状態を有することが知られている集団とは異なる正常範囲を有する。したがって、選択される所定の値は、個体が分類されるカテゴリーを考慮したものであり得る。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者による日常的な実験によって選択することができる。上昇増加とは、選択された対照と比べて高いことを意味する。通常、対照は、適切な年齢範囲の健康で正常と思われる個体に基づく。また、本発明に係る対照は、所定の値に加えて、実験材料と並行して試験される材料のサンプルであり得ると理解される。例としては、同じ対象から同時に得られた組織または細胞、例えば対象から得られた1つの生検試料の一部または1つの細胞サンプルの一部が含まれる。CXCR4仲介疾患の患者の臨床診断またはモニタリングでは、正常対象または非がん組織から得た対応する生検サンプルにおけるレベルと比較したCXCR4発現細胞の検出またはCXCR4レベルの増加により、一般的に、CXCR4仲介障害を有するまたは有することが疑われる患者が示される。上記に基づいて、本発明は、組織サンプルにおけるCXCR4発現レベルを検出することを含んでなり、その存在ががんへの感受性susceptibilityを示し、CXCR4発現の程度が感受性の程度に相関する、がんへの感受性を予測する方法を提供する。したがって、具体的な実施形態では、乳房組織、卵巣組織、前立腺組織、膵臓組織、皮膚組織、食道組織、肺組織、頭頸部組織、膀胱組織、結腸直腸組織、骨肉腫組織、神経芽細胞腫組織、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、腎臓組織、膠芽腫組織、甲状腺組織、横紋筋肉腫組織、またはCXCR4を発現する細胞が疑われる任意の他の組織におけるCXCR4の発現が検査され、サンプル中のCXCR4の存在により、がん感受性または組織特異的腫瘍の出現もしくは存在の兆候が示される。腫瘍の攻撃性を評価する方法も提供される。一実施形態では、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察する方法が、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるCXCR4のレベルを決定すること、そのようにして決定されたレベルを、同じ個体から異なる時点に採った同等な組織サンプルにおいて発現されるCXCR4のレベルと比較することを含んでなり、腫瘍サンプルにおける経時的なCXCR4発現の程度からがんの進行についての情報が得られる。更に別の実施形態では、本願は、対象に適した治療プロトコールを決定する方法を提供する。本発明に係るCXCR4の有無またはCXCR4レベルの変化は、対象が再発性、進行性、または持続性のCXCR4に関連するがんを有しやすいことを示し得る。したがって、CXCR4を発現する細胞数の増加または種々の組織もしくは細胞に存在するCXCR4濃度の変化を測定することにより、CXCR4に関連する悪性腫瘍を改善するための特定の治療計画が有効であるかどうかを決定することができる。本発明の別の主題は、CXCR4の発現に関連する発がん性障害のインビボでのイメージング法である。例えば、そのような方法は、発がん性障害の症状を呈する患者に用いることができる。例えば患者のCXCR4発現レベルが増加している場合、患者はがん性障害に罹りやすい。また、この方法は、CXCR4によって仲介されるがんを過去に診断された患者における進行および/または治療への反応をモニタリングするのに有用であり得る。上記目的に基づいて、本発明は、好ましくは標識された、特に放射性標識された、本発明に係る抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体、を含んでなるインビボイメージング試薬および医学的イメージングにおけるその使用を提供する。したがって、本発明に係る一般的な方法は、前述の標識されたモノクローナル抗体等のイメージング有効量のイメージング試薬および薬学的に有効なキャリアを患者に投与し、その後、サンプル中に存在するCXCR4に薬剤が結合した後に薬剤を検出することによって作用する。特定の実施形態では、方法は、ターゲティング部分および活性部分を含んでなるイメージング有効量のイメージング剤を投与することによって作用する。イメージング剤は、ヒト等の哺乳動物における診断使用に有効な量で投与され、その後、イメージング剤の局在および蓄積が検出される。イメージング剤の局在および蓄積は、放射性核種のイメージング、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、陽電子放射断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、X線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出によって検出され得る。標的化された抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術を用いた診断は、受容体発現レベルに関するinsitu情報を提供するので、そのような治療に必要な受容体発現レベルに基づいて治療に感受性である患者を選択することを可能にする。モノクローナル抗体を用いた免疫療法では、ヒト化抗Her2モノクローナル抗体トラスツズマブが出現して乳癌におけるHer2過剰発現の決定が現在臨床的に重要であるトラスツズマブを用いた治療と同様に、治療に対する反応は標的受容体発現レベルに依存する。トラスツズマブはHer2過剰発現がん細胞を特異的にターゲティングすることによって作用するので、トラスツズマブを用いた治療にはHer2過剰発現を示すことが必須である。Her2の正確な検査は、高価で潜在的に毒性であるトラスツズマブ治療を非過剰発現腫瘍患者に与えないことおよびトラスツズマブの恩恵を受け得る全患者が適切な治療を受けるようにすることを目的としている。Her2を過剰発現した患者の選択に関するトラスツズマブを用いた教示で、モノクローナル抗体を用いた治療法を用いる時に受容体の発現レベルを決定することおよび治療用のモノクローナル抗体と同時に患者の選択に用いることができるモノクローナル抗体を開発することの利点が示された。したがって、本発明は、対象の腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、1上記CXCR4の発現レベルを決定する工程、2前記腫瘍をCXCR4発現についてスコア化する工程、および3前記スコア化を対照サンプルから得られたものと比較する工程、を含んでなる方法に関する。本発明の意味におけるCXCR4状態とは、免疫組織化学IHC、蛍光insituハイブリダイゼーションFISH、染色体insituハイブリダイゼーションCISH、遺伝子チップまたは当業者に公知のその他の方法等の任意の方法によって測定されるCXCR4遺伝子発現レベルの決定に基づいたCXCR4陽性[CXCR4]、CXCR4陰性[CXCR4-]クラスへの腫瘍の分類に関する。好ましい実施形態では、診断のための抗体は、組織サンプルがホルマリン固定、Glyco-fixx固定、パラフィン包埋および/または凍結された時に標的受容体に結合できなければならない。より具体的には、CXCR4発現レベルは免疫組織化学IHCによって測定される。例えば、サンプルは抗体染色のレベル0~3のスケールでCXCR4発現レベルについてスコア化され得、ここで、半定量的な4段階の強度増加で0は陰性、1~3は陽性の染色を表す。各陽性スコアはスコア0陰性と比べて再発および致死性の疾患のリスクの有意な低下に関連し得るので、スコア1~3は陽性として記録することができるが、陽性スコア間の強度増加は更なるリスク低下を示し得る。CXCR4の予後的価値を評価するために任意の従来のハザード分析法が用いられ得る。代表的な分析法としては、打切り例存在下での生存または時間と事象のデータをモデル化するためのセミパラメトリックな方法であるコックス比例分析HosmerandLemeshow1999;Cox1972が含まれる。他の生存分析、例えば生命表またはカプランマイヤー法と異なり、コックスはモデルに予測変数共変数を含めることができる。従来の分析法、例えばコックスを用いて、原発性腫瘍におけるCXCR4発現状態と疾患再発の発生までの時間無症候生存時間または転移疾患までの時間または疾患による死亡までの時間全生存時間のいずれかとの相関に関する仮説を調べることが可能であり得る。コックス比例分析は、コックス比例ハザード分析としても知られる。この方法は、患者生存時間に対する腫瘍マーカーの予後的価値を試験するための標準的方法である。多変量モードで用いた時、複数の共変数の影響が並行して試験され、その結果、独立した予後的価値を有する個々の共変数、すなわち最も有用なマーカーを同定することができる。腫瘍の陽性または陰性のCXCR4状態、[CXCR4またはCXCR4-ともいう]という用語はそれぞれスコア0またはスコア1~3を指す。サンプルは乳癌の診断またはモニタリング中にスコア化され得る。最も簡単な形態では、スコア化は、免疫組織化学によるサンプルの視覚検査によって判定されるカテゴリー的な陰性または陽性であり得る。より定量的なスコア化では、染色強度およびサンプル採取された染色陽性細胞の割合の2つのパラメーターを判定する。これら2つのパラメーターに基づいて、陽性染色の増加が反映されるように数値が割り当てられ得る。AllredetalAllredHarveyetal1998は、これを達成する方法の1つを記載しており、その方法では、0陰性~3のスケールで両パラメーターをスコア化し、個々のパラメーターのスコアを全体スコアへと集計する。これにより、可能なスコアが0、2、3、4、5、6、7または8であるスケールが得られるAllredのスケールではスコア1は可能でないことに注意されたい。それより幾分簡単なスコア化方法では、核染色の強度および染色された核を示す細胞の割合をまとめて0~3の複合スケールにする。いずれのスコア化方法も、細胞核中の活性化されたStat5の染色の強度および割合のスコア化に適用され得る。本明細書で使用される腫瘍の陽性または陰性のCXCR4状態という用語は、簡略化したスケールでそれぞれスコア0または1~3に対応するCXCR4の発現レベルを指す。一般的に、本発明に係る試験またはアッセイの結果は、種々のフォーマットのいずれで示されてもよい。結果は定性的な様式で示されてもよい。例えば、試験報告で、特定のポリペプチドが検出されたかどうかだけが、おそらくは検出限界と共に、示されてよい。結果は、半定量的様式で示されてもよい。例えば、種々の範囲が定義され得、この範囲に、ある程度の定量的情報を与えるスコア例えば1~3が割り当てられてよい。そのようなスコアは、種々のファクター、例えばCXCR4が検出される細胞の数、シグナルの強度CXCR4の発現レベルまたはCXCR4を有する細胞を示し得る等を反映し得る。結果は、定量的様式、例えばポリペプチドCXCR4が検出される細胞のパーセンテージやタンパク質濃度等として示されてもよい。当業者に理解されるように、試験によって得られる結果の種類は、ポリペプチドの検出に関連する試験の技術的限界および生物学的意義に応じて変わり得る。例えば、特定のポリペプチドの場合、完全に定性的な結果例えば特定の検出レベルでポリペプチドが検出されるかどうかによって意義のある情報が得られる。より定量的な結果例えば、正常レベルに対する被験サンプル中のポリペプチド発現レベルの比率が必要な場合もある。より好ましい実施形態では、CXCR4発現レベルのスコア化は、反応生成物の強度および陽性細胞のパーセンテージの評価に基づいて0~3に段階評価される。更に分かり易いように、これらのパラメーターを以下の表5に要約する。浸潤腫瘍の完全に膜の周囲における反応性のみを考慮すべきであり、これは見た目がチキンワイヤーに似ていることが多かった。今回の指針では、IHCでCXCR4のボーダーライン2以上のスコアとしてスコア化されたサンプルは、CXCR4と見なす必要があり、更なる評価が必要である。もしも、限定されるものではないが、対照が予想された通りでない場合、サンプルのほとんどにアーチファクトの影響がある場合、および正常な乳管内部対照のサンプルが膜における強い陽性を示す過剰な抗原検出を示唆する場合、IHC分析を不適とし、繰り返すか、FISCHまたは任意の他の方法で試験すべきである。本発明に係る方法のより好ましい実施形態では、前記スコア化は、染色の強度および陽性細胞のパーセンテージの2つのパラメーターに基づく適切なスケールの使用を含んでなる。好ましい実施形態では、本発明に係る方法の適切なスケールは、腫瘍細胞の膜反応性membranousreactivityなしが0にスコア化され、10を超える腫瘍細胞での強く完全な反応性が3にスコア化される、0~3のスケールである。より具体的には、前述のように、前記適切なスケールは、腫瘍細胞の膜反応性なしが0にスコア化され;10を超える腫瘍細胞におけるかすかに知覚可能な膜反応性が1にスコア化され、10を超える腫瘍細胞における弱~中程度の完全な膜反応性が2にスコア化され;10を超える腫瘍細胞における強力で完全な反応性が3にスコア化される、0~3のスケールである。本発明の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが2のCXCR4である。本発明の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが3のCXCR4である。本発明の別の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが2または3のCXCR4である。本発明によれば、本発明は更に、発がん性障害が抗CXCR4抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する方法であって、前記方法が、a前述したように対象の腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定する工程およびb状態がCXCR4であった場合に、発がん性障害が抗CXCR4抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する工程、を含んでなる方法に関する。本発明の別の態様によれば、本発明の抗体を含んでなる、そのような診断または予後予測方法に有用なキットも考えられる。便利なように、パッケージ化された所定量の試薬の組合せと診断アッセイを実施するための説明書、例えばキットも本発明の範囲内である。キットは、例えばELISAまたはウェスタンブロットでCXCR4をインビトロで検出および定量化するための抗体を含む。本発明の抗体は、例えばELISAまたはウェスタンブロットにおいてCXCR4をインビトロで検出および定量化するためのキット中に提供され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素に要求される基質および補因子例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆物質を含む。更に、安定化剤、バッファー例えばブロックバッファーまたは溶解バッファー等のその他の添加剤も含まれ得る。そのようなキットは、バイアル、チューブ等の1または複数の容器containerを収納するように区画化された収納容器receptacleを含んでなってもよく、そのような容器に本発明の別個の構成要素が収容される。例えば、1つの容器には、不溶性または一部可溶性のキャリアに結合した第1の抗体が含まれ得る。第2の容器には、凍結乾燥された形態または溶液の形態で、可溶性で検出可能な標識された第2の抗体が含まれ得る。収納容器は、凍結乾燥形態または溶液形態の検出可能な標識された第3の抗体を収容する第3の容器を含んでもよい。このような性質のキットは、本発明のサンドイッチアッセイにおいて使用することができる。ラベルまたは添付文書により、組成物の説明および意図されるインビトロまたは診断で使用するための指示が提供され得る。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液濃度が得られるように大きく異なってよい。特に、試薬は、溶解されて適切な濃度の試薬溶液を提供する補形剤を含む、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。本発明の更に別の態様によれば、本明細書中に詳述されているモノクローナル抗体またはその結合断片は、検出可能な部分で標識されて提供され、前述の抗原を有する細胞を診断または同定するための例えばキット中にパッケージ化されて使用されてよい。そのような標識の非限定的な例としては、フルオレセインイソチオシアネート等のフルオロフォア;発色団、放射性核種、または酵素が含まれる。そのような標識された抗体または結合断片は、例えば、抗原の組織学的局在、ELISA、セルソーティング、ならびにCXCR4およびこの抗原を有する細胞を検出または定量化するその他の免疫学的技術に用いられ得る。アポトーシスアッセイ、細胞からのCXCR4の精製または免疫沈降のための陽性対照として有用なキットも提供される。CXCR4を単離および精製するために、キットは、ビーズ例えばセファロースビーズにカップリングした本明細書に記載の抗体またはその抗体結合断片を含んでよい。CXCR4をインビトロ例えばELISAまたはウェスタンブロットで検出および定量化するための抗体を含むキットが提供され得る。製造物と共に、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含んでなる。容器は、少なくとも1つの本発明の抗CXCR4抗体またはその結合断片を含んでなる組成物を収容する。例えば希釈剤およびバッファー、対照抗体を含む更なる容器を含めてもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明および意図されるインビトロまたは診断での使用のための指示を提供し得る。より具体的には、本発明は、当業者に公知の任意の方法により腫瘍のCXCR4状態を決定するためのキットに関する。好ましい実施形態では、実施例に記載されるように、本発明は、IHCの方法により腫瘍のCXCR4状態を決定するためのキットに関する。特定の実施形態では、本発明は、前述した少なくとも1つの抗CXCR4抗体またはその機能的断片もしくは誘導体を含んでなるキットにあり、前記抗体は好ましくは標識されている。例えば前述の標識の使用を初めとする任意の標識方法が当業者によって用いられ得ると理解されなければならない。好ましい実施形態では、対象におけるCXCR4発現腫瘍の存在および/または位置をインビトロで検出するのに有用な本発明に係るキットは、前記抗CXCR4抗体とCXCR4との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬を更に含んでなる。別の好ましい実施形態では、CXCR4発現腫瘍におけるCXCR4発現レベルをインビトロで決定するのに有用な本発明のキットは、前記標識抗体とCXCR4との間の結合レベルを定量化するのに有用な試薬を更に含んでなる。更に別の実施形態では、腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定するのに有用な本発明に係るキットは、i前記標識抗体とCXCR4との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬;およびiiCXCR4発現レベルをスコア化するのに有用な陽性および陰性対照サンプルを更に含んでなる。腫瘍のCXCR4状態をインビトロで決定するための前記キットは、マウス抗体に特異的なポリクローナル抗体を更に含んでなってよく、好ましくはマウス抗体に特異的な前記ポリクローナル抗体は標識されている。本発明は更に、CXCR4を発現または過剰発現する細胞へと生物学的活性化合物を特異的にターゲティングするための薬物の製造における本発明に係る抗体の使用に関する。本明細書において、生物学的活性化合物とは、細胞活性、特に成長、増殖、転写および遺伝子翻訳を調節、特に阻害できる任意の化合物である。本発明は更に、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明に係る抗体またはその機能的断片で構成されるインビボ診断試薬および医学的イメージングにおける、特にCXCR4の細胞発現または過剰発現に関連するがんを検出するための、その使用に関する。本発明は更に、薬物として用いられる、本発明に係る組合せ物としての組成物または抗CXCR4/毒素コンジュゲートもしくはラジオアイソトープに関する。好ましくは、組合せ物としての前記組成物または前記コンジュゲートに補形剤および/または薬学的賦形剤が添加される。本明細書において、薬学的賦形剤pharmaceuticalvehicleとは、二次的な反応を生じさせずに、例えば活性化合物の投与を容易にするか、生物中でのその寿命および/または有効性を増加させるか、溶液中での溶解性を上昇させるか、保存性を高める、医薬組成物に入れられる化合物または化合物の組合せを意味する。そのような薬学的キャリアは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与経路に応じて当業者により適応される。好ましくは、そのような化合物は、全身経路によって、特に静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明に係る抗体で構成される組成物は、等間隔で時間を空けて複数回に分けて投与される。それらの投与経路、投薬スケジュールおよび最適な生薬形態は、患者に適した治療を確立する時に一般的に考慮される基準、例えば患者の年齢または体重、全身状態の重症度、治療に対する許容度および副作用歴等に基づいて決定することができる。したがって、本発明は、CXCR4を発現または過剰発現する細胞に生物学的活性化合物を特異的にターゲティングするための薬物製造における抗体、またはその機能的断片の1つ、の使用に関する。既に示されているように、本発明に係るCXCR4Mabは、がんの治療において強力な活性を有するので、がんを治療するためのCXCR4アンタゴニスト抗腫瘍薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。これらのアッセイの最初の工程では、CXCR4発現細胞を本発明の抗体とインキュベートし、その後、抗体結合を阻害する能力について分子を評価することができる。この種のアッセイに用いられる細胞はトランスフェクトされた細胞系、例えばCHO-CXCR4、NIH3T3-CXCR4、またはCXCR4でトランスフェクトされたヒト細胞系、例えばU373-MAGI-CXCR4、CXCR4を発現するヒト細胞系、例えばNALM6または初代細胞、例えばPBMCであり得る。CXCR4発現細胞上での抗体結合を阻害するCXCR4のアンタゴニストをスクリーニングするために用いられる方法は、ZhaoQetalに記載されている細胞ベースの競合的酵素結合免疫吸着検定法ELISAまたはJuarezJetalに記載されているような蛍光標示式細胞分取FACSを用いたプロトコールであり得る。したがって、本発明の特定の態様によれば、aCXCR4を発現する細胞を選択する工程;b前記細胞を、本発明の抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、とインキュベートする工程;c抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の1つ、とCXCR4との結合を阻害する能力について、被験分子を評価する工程;およびd前記阻害が可能な分子を選択する工程を含んでなる、CXCR4アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび/または同定する方法が考えられる。実施例および上記にレジェンドを示した図を用いた説明中で本発明のその他の特徴および利点が更に明らかになる。実施例1:癌細胞におけるCXCR4およびCXCR2の発現-Q-PCR分析:リアルタイムRT-PCRを用いて、種々のがん細胞系におけるCXCR4およびCXCR2の相対的発現を定量化した。RNeasyMiniまたはMidiProtocolキアゲン社、フランスを用いて種々の細胞系からRNAサンプルを抽出した。次いで、Experion自動電気泳動システムBIO-RAD社、フランスを用いてRNAサンプルを制御し、良好な品質/完全性であることを示した。iScriptcDNASynthesisキットBIO-RAD社、フランスを用いて1μgの各RNAサンプルをcDNA鋳型に変換した。CXCR2にはTaqManプローブ、CXCR4にはSYBERGreenを用いて、qPCRによりcDNAレベルを定量化した。サンプルを比較するためには標準化が必要であるので、内部参照RPL0を含めた。TaqManプローブCXCR2に使用は5’FAMレポーター標識および3’TAMRA消光基を有する。50°Cで2分間および95°Cで10分間加熱することによりPCR酵素を活性化した。5μlのcDNA鋳型1/20希釈、1×qPCRMastermixTaqManUniversalPCRMasterMix、アプライドバイオシステムズ社、米国ニュージャージー州ブランチバーグ、50~900nMの各プライマー、および50~100nMのプローブを含む合計体積50μlのPCRミックス中において95°Cで15秒間および62°Cで1分間を40または45サイクル行う2工程の手順を用いた。全ての反応はiCycle機BIO-RAD社を用いて行った。Q-PCRはサイクル閾値Ctを決定することができる。Ct値が小さいほど、被験遺伝子の発現が多い。ヒトリボソームタンパク質である大きなP0用のプライマーおよびプローブには、フォワードプライマー:5’-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3’配列番号63;リバースプライマー:5’-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’配列番号64;プローブ:5-FAM-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-TAMRA-3’配列番号65を用いた。ヒトCXCR4ケモカイン受容体4用のプライマーには、フォワードプライマー:5’-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3’配列番号66;リバースプライマー:5’-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3’配列番号67を用いた。ヒトCXCR2ケモカイン受容体2用のプライマーおよびプローブには、フォワードプライマー:5’-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3’配列番号68;リバースプライマー:5’-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3’配列番号69;プローブ:5’-FAM-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-TAMRA-3’配列番号70を用いた。本発明者らの比較実験では、2つの遺伝子[被験遺伝子CXCR4およびCXCR2およびRPL0]の発現を、被験細胞系および参照細胞系の2つの異なるサンプルで定量化した。参照細胞系は、定量化する遺伝子の発現が最も少ない細胞系に相当する。遺伝子発現の比較計算は以下の式を用いてなされた:相対遺伝子発現=1E遺伝子-ΔCt1/1ERPL0-ΔCt2E遺伝子=定量化する遺伝子のプライマー/プローブを用いたPCR効率ERPL0=RPL0プライマー/プローブを用いたPCR効率Ct=閾値サイクルΔCt1=Ct遺伝子被験細胞系-Ct遺伝子参照細胞系ΔCt2=CtRPL0被験細胞系-CtRPL0参照細胞系一連のPCRそれぞれについて、相対的な遺伝子定量値を計算し、がん細胞系を、その発現レベルを考慮して、最も多い群から陰性の群へと分類した。全データを図1Aおよび1Bに示す。CXCR2の場合のDU145およびU-87MGを除いて、試験した全てのがん細胞系がCXCR4図1AおよびCXCR2図1Bを発現していた。-FACS分析:MDA-MB-231、PC3およびU937がん細胞系に透過処理を行い、その後、10μg/mLの抗CXCR4モノクローナル抗体[44717RDシステムズ社対そのアイソタイプ対照IgG2bシグマ社]または10μg/mLの抗CXCR2モノクローナル抗体抗h-CXCR2、クローン48311、RDシステムズ社、Mab331対そのアイソタイプ対照IgG2aのいずれかとインキュベートした。次いで、1BSA/PBS/0.01NaN3で細胞を洗浄した。次に、Alexa標識された二次抗体を細胞に添加し、4°Cで20分間インキュベートした。その後、細胞を再度2回洗浄した。2回目の洗浄後、FACS分析を行った。これらの結合実験の結果を図2に示す。MDA-MB-231、PC3、U937等の腫瘍細胞はCXCR4およびCXCR2タンパク質の両方を発現していた。実施例2:ヒトCXCR4に対するモノクローナル抗体Mabの作製CXCR4に対するモノクローナル抗体を作製するために、組換えNIH3T3-CXCR4細胞ならびに/またはCXCR4の細胞外のN末端およびループに相当するペプチドでBalb/cマウスを免疫化した。最初の免疫化後に6~16週齢のマウスを、フロイント完全アジュバント中で抗原を用いて皮下s.c.に一度免疫化し、その後、フロイント不完全アジュバント中で抗原を用いて皮下に2~6回免疫化を行った。眼窩後出血によって免疫応答をモニタリングした。ELISAで血清をスクリーニングし後述、抗CXCR4抗体の力価が高いマウスを融合に用いた。屠殺して脾臓を取り出す2日前にマウスの静脈内に抗原の追加免疫を行った。-ELISA抗CXCR4抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化したマウスから得られた血清をELISAで調べた。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、5μg等量ペプチド/mLでBSAにコンジュゲートされた精製[1-41]N末端ペプチドでコーティングし、100μL/ウェル、4°Cで一晩インキュベートした後、250μL/ウェルの0.5ゼラチンを含むPBSでブロッキングした。CXCR4免疫化マウスの血漿希釈物を各ウェルに添加し、37°Cで2時間インキュベートした。プレートをPBSで洗浄した後、HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG抗体ジャクソンラボラトリーズ社と37°Cで1時間インキュベートした。洗浄後、TMB基質でプレートを発色させ、100μL/ウェルの1MH2SO4を添加することで5分後に反応を停止させた。最も大きな力価の抗CXCR4抗体を作ったマウスを抗体作製に用いた。-CXCR4に対するMabを産生するハイブリドーマの作製最も力価が大きい抗CXCR4抗体を作ったBalb/cマウスから単離したマウス脾細胞を、PEGを用いてマウス骨髄腫細胞系Sp2/0と融合させた。細胞を約1×105/ウェルでマイクロタイタープレートにプレーティングした後、ultraculturemedium2mML-グルタミン1mMピルビン酸ナトリウム1×HATを含む選択培地中で2週間インキュベートした。次いで、抗CXCR4モノクローナルIgG抗体についてELISAでウェルをスクリーニングした。次いで、抗体を分泌するハイブリドーマを、限界希釈により少なくとも2回サブクローニングし、インビトロで培養して抗体を作製し、更に分析した。実施例3:抗CXCR4Mab515H7の結合特異性およびがん細胞系認識のFACSによる特徴解析本実験では、抗CXCR4Mab515H7のヒトCXCR4への特異的結合をFACS分析によって調べた。NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4トランスフェクト細胞、MDA-MB-231、HelaおよびU937がん細胞系を、10μg/mLのモノクローナル抗体515H7と一緒にインキュベートした。次いで、1BSA/PBS/0.01NaN3で細胞を洗浄した。次に、Alexa標識二次抗体を細胞に添加し、4°Cで20分間インキュベートした。次いで、細胞を再度2回洗浄した。2回目の洗浄後、FACS分析を行った。これらの結合実験の結果を以下の表6に示す。表は、抗CXCR4Mab515H7がヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系に特異的に結合したが、元のNIH3T3細胞上では認識がなかったこと[FACSで得られた平均蛍光強度MFI]を示している。このMabは、ヒトがん細胞系、例えばMDA-MB-231乳癌細胞、U937前骨髄球がん細胞およびHela子宮頸癌細胞も認識することができた。抗CXCR4Mab515H7は、NIH3T3-hCXCR4形質移入体を認識したが、元のNIH3T3野生型細胞は認識しなかった。Mab515H7はがん細胞系も認識することができた。実施例4:ヒトCXCR4受容体を安定的に発現するCHO-K1膜における[125I]SDF-1と抗CXCR4Mab515H7の競合結合このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトCXCR4受容体への放射標識[125I]SDF-1の結合に515H7Mabが競合する能力を評価することができる。ヒトCXCR4受容体の全コード配列参照配列NM_003467を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブCHO-K1細胞ATCCCCL-61をトランスフェクションすることにより、ヒトCXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。完全培養培地[5ウシ胎児血清FCSおよび500μg/mlのジェネテシンを添加したDMEM-Ham’sF12]中で細胞を増殖させた。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中でCHO/CXCR4細胞を機械的に破砕した後、遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。[125I]SDF-1比活性:1500Ci/mmolの結合は、SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜30μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、pH7.4、CaCl21mM、MgCl25mM、NaCl150mM、BSA1]中で、評価する化合物SDF-1またはmAb、放射性リガンド1nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。25°Cで1時間後に結合平衡に達した。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。10μMの非標識SDF-1存在下で非特異的結合を推定した。非標識SDF-1は、[125I]SDF-1結合を用量依存的に阻害し、pKi値IC50=特異的[125I]SDF-1結合を50阻害するリガンド濃度は7.75±0.27nMn=4であった図3A。同じ実験条件下で、515H7100nMは、[125I]SDF-1結合と効率的に競合した[125I]SDF-1の阻害率:64±3図3B。実施例5:抗CXCR4Mab515H7による、野生型CXCR4受容体を発現する細胞膜における[35S]GTPγS結合の調節この機能的アッセイでは、野生型ヒトCXCR4受容体を介したGタンパク質の活性化ならびにCXCR4リガンドおよび515H7Mabによるその調節をモニタリングすることができる。CHO-K1についての上記実施例と同様にして、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するNIH-3T3細胞を得た。完全培養培地[10FCS、1L-グルタミン、2μ重炭酸ナトリウムを添加したEMEM]中でHeLaヒト子宮頸癌細胞を増殖させた。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中で機械的に破砕し、更に遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で[35S]GTPγS結合を行った。SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて[35S]GTPγS比活性:1000Ci/mmolの取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜10μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、GDP3μΜ、MgCl2l0mM、NaCl100mM、EDTA1mM、pH=7.4]中で、評価する化合物SDF-1または興味のあるMab、[35S]GTPγS0.2~0.4nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。結合反応は、25°Cで1時間行った。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。チェンプルソフの等式:KB=[アンタゴニスト濃度]/{EC50’/EC50-1}式中、EC50およびEC50’はそれぞれmAb非存在下および存在下でのSDF-1の効力であるを用いてアンタゴニストの効力potencyを計算した。SDF-1は、CXCR4受容体によるGタンパク質活性化により、[35S]GTPγS結合の用量依存的増加を誘導した。[35S]GTPγS結合の最大刺激は、HeLaおよびNIH3T3/CXCR4細胞膜で、基底の[35S]GTPγS結合に対してそれぞれ167および320である。SDF-1の効力は、どちらの細胞系でも同様であり、41.3±9.7nMに相当した図4。これらの実験条件下で、NIH3T3/CXCR4細胞中で決定された515H7Mabのアンタゴニストとしての効力は15nMであった。HeLa細胞でも同様なアンタゴニストの効果が観察された図5。実施例6:CXCR4と種々の相互作用パートナーとの会合:生物発光共鳴エネルギー移動BRET法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対する515H7Mabの影響この機能的アッセイでは、CXCR4受容体へのSDF-1および/または515H7Mabの結合によって誘導されるCXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン2シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。従来の分子生物学的技術を用いて、調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET実験を行う2日前に、対応するBRETパートナーをコードする発現ベクターでHEK293細胞を一時的にトランスフェクトした:CXCR4ホモ二量体化の研究には[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]、CXCR4とCXCR2のヘテロ二量体化の研究には[CXCR4/RlucCXCR2:YFP]、CXCR4に仲介されるβアレスチン2のリクルートの研究には[CXCR4/Rlucβ-arr2:YFP]。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を5CO2、37°Cで培養した。次いで、1ウェル当たり200μlのDMEMを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。BRET実験直前に、DMEMを除き、すぐに細胞をPBSで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のPBS中で37°Cにて10分間細胞をインキュベートし、その後、300nMのSDF-1とまたはSDF-1なしで、5μMのセレンテラジンHを添加して最終体積を50μlにした。37°Cで更に10分間インキュベートした後、485nmおよび530nmでの発光取得light-emissionacquisitionを、MithrasLB940マルチラベルリーダーベルトールド社を用いて開始した1s/波長/ウェルで、室温にて15回反復。BRET比の計算は以前に記載されているように行ったAngersetal2000:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ実験条件下でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞での発光530nm/発光485nm。この等式を簡単にすることにより、BRET比が、Rlucに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比530/485nmによって補正された、2つのBRETパートナーが存在する時に得られる比530/485nmに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリBRET単位mBUで表す:mBUはBRET比に1000を掛けたものに相当する。SDF1300nMは、CXCR4受容体に融合したアダプタータンパク質とアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約20増加させた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図6A。興味深いことに、SDF1300nMは、CXCR2およびCXCR4に融合したアダプタータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約24減少させた。このことは、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図6B。この後者の場合、SDF-1によって活性化されるCXCR4/CXCR2のコンホメーションはBRETエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、515H7Mabは、SDF-1によって誘導されるCXCR4ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができSDF-1によって誘導されるBRETの増加を69阻害、図6A、また、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体形成のコンホメーション変化も調節することができた515H7は、SDF-1によって誘導されるBRETの減少を90阻害、図6B。515H7Mabは更に、単独で、CXCR4/CXCR4およびCXCR2/CXCR4の空間的近接をそれぞれ調節することができた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対する515H7Mabの影響を示している図6Aおよび6B。SDF-1300nMによるCXCR4活性化により、233のBRETシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた図6C。このリクルートは515H7Mabによって一部阻害され約95、図6C、シグナル伝達に対するMab515H7の影響が示された。実施例7:CXCR4によって仲介されるcAMP産生の阻害この機能的アッセイは、阻害性Gi/oタンパク質を介してアデニル酸シクラーゼレベルでCXCR4受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。cAMPLANCE法パーキンエルマー社を供給業者に説明されているように用いた。簡潔に述べると、前述したように、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するNIH3T3細胞を得、増殖させた。トリプシンを含まない薬剤ベルセンVerseneを用いて細胞を回収し、AlexaFluor結合抗cAMPMab100倍希釈および化合物フォルスコリン、SDF-1および/または515H7Mabを含む溶液中に106細胞/mlの濃度で再懸濁した。室温で30分間インキュベートした後、ユウロピウム-ストレプトアビジン1/125希釈複合体およびビオチン-cAMP1/125希釈複合体を含む検出液detectionmixを添加した。室温で1時間インキュベートした後、得られたFRETシグナルを、MithrasLB940ベルトールド社マルチラベルリーダーで測定した。データは、任意の蛍光値としてまたはFKの影響を引いた後のSDF-1応答に対する相対刺激として表される。フォルスコリンFKは、NIH3T3/CXCR4細胞中で約0.3μMの効力でcAMP産生を用量依存的に刺激した図7A。SDF-1共存在下では、CXCR4受容体による阻害性Gi/oタンパク質の活性化の結果として細胞内cAMPレベルが減少した。SDF-1の効力は、5.0±3.1nMであった図7A。515H7Mabは、フォルスコリンに刺激されるSDF-1100nMの効果を80超効率的に阻害した図7B。実施例8:Mab515H7による、構成的活性型変異体Asn119SerCXCR4受容体を発現する細胞膜での[35S]GTPγS結合の調節この機能的アッセイでは、構成的活性型変異体CAMAsn119SerCXCR4受容体を介したGタンパク質活性化をモニタリングすることができるZhangetal2002参照。この高感度アッセイでは、CXCR4リガンドをその固有の活性に基づいて識別することができる部分アゴニスト、サイレントアンタゴニストまたはインバースアゴニスト。Zhangらによって以前に報告されているように、AMD3100またはT140等のCXCR4リガンドは、CAMCXCR4受容体でそれぞれ部分アゴニストおよびインバースアゴニストとして振る舞う。サイレントアンタゴニストの同定は、このクラスの分子が活性状態および不活性状態の両方のCXCR4に対して同様な親和性を示さなければならないため、困難であり得るWurchetal1999。従来の分子生物学的技術を用いてCXCR4受容体のコード配列中にAsn119Serの変異を導入したQuickChange部位特異的変異誘発キット、ストラタジーン社、米国。上記実施例と同様にして、CAMCXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中で機械的に破砕し、更に遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、[35S]GTPγS結合を行った。[35S]GTPγS比活性:1000Ci/mmolの取込みは、SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜10μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、GDP3μΜ、MgCl210mM、NaCl100mM、EDTA1mM、pH7.4]中で、評価する化合物SDF-1またはmAb、[35S]GTPγS0.2~0.4nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。結合反応は25°Cで1時間行った。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社で放射線数を測定した。SDF-1100nMは、[35S]GTPγS結合を130刺激した。インバースアゴニストT140は、基底の[35S]GTPγS結合およびSDF-1刺激[35S]GTPγS結合の両方を阻害したそれぞれ-17および-159。対照的に、515H7Mabは、CAMCXCR4でサイレントアンタゴニストとして振る舞い、基底の[35S]GTPγS結合は変化させなかった図8が、SDF-1誘導[35S]GTPγS結合は阻害した図8。実施例9:SDF-1によって誘導されるU937細胞遊走に対する抗CXCR4Mab515H7の影響遊走プロセスに対する抗CXCR4モノクローナル抗体515H7の阻害効果を評価するために、2FCSを添加したRPMI1640培地中の100000個のU-937細胞を遊走チャンバーの上側チャンバー24ウェルプレート、細孔径8μmにプレーティングし、ウェルの下部にSDF-1が存在するものと存在しないもの、上側チャンバー中にはMab515H7が存在するものと存在しないものを用意した。この試験では、マウスIgG2bをアイソタイプ対照として導入した。プレーティングの2時間後に遊走細胞を数える。図9に示す結果から、予想された通り、SDF-1がU-937細胞遊走の有意な増加を誘導できることが示された。細胞をIgG2bアイソタイプ対照とインキュベートした時には影響は観察されなかった。一方、515H7Mabとインキュベートした細胞では、80を超える、SDF-1誘導U937細胞遊走の有意且つ再現可能な減少が観察された。実施例10:抗CXCR4Mab515H7による、Nod/ScidマウスにおけるMDA-MB-231異種移植腫瘍成長の阻害これらの実験の目的は、抗CXCR4Mab515H7がNod/SCIDマウスにおけるMDB-MB-231異種移植片の成長を阻害する能力を評価することである。ECACCから入手したMDA-MB-231細胞をDMEM培地インビトロジェン社、英国スコットランド、10FCSシグマ社、米国メリーランド州セントルイスでルーチンに培養した。細胞が対数増殖期になるように、移植の48時間前に細胞を分割した。PBS中の1000万個のMDA-MB-231細胞を7週齢のNod/Scidマウスチャールスリバー社、フランスに移植した。移植の5日後に、腫瘍は測定可能であり34mm3<V3<40mm3、腫瘍のサイズが同等なマウス6頭の群にマウスを分けた。マウス1頭当たり2mgの負荷量のMab515H7でマウスを腹腔内i.p.治療した。その後、0.5mg/用量dose/マウスのMab515H7を週2回、週3回、マウスに注射した。対照群としてPBS群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週2回測定し、式:π/6×長さ×幅×高さによって計算した。マンホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。これらの実験で、治療期間中に死亡は観察されなかった。PBS群と比べて、0.5mg/用量の515H7で、D7とD39の間に腫瘍成長の有意な阻害がありp≦0.002、Mab515H7では治療5週間後の平均腫瘍体積がPBSに対して50減少していた図10。実施例11:CXCR4受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激によるCXCR4受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。上記実施例と同様にして、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。MDA-MB-231ヒト乳腺癌およびU937ヒト白血病細胞を、完全培養培地、それぞれ[10FCSを添加したDMEM]および[10FCS、20mMHEPES、1非必須アミノ酸溶液、1ピルビン酸ナトリウム、1L-グルタミン、4.5g/lグルコースを添加したRPMI1640]中で増殖させた。全ての種類の細胞を、100,000細胞/ウェルの密度で黒色96MWプレートの適切な培養培地中にプレーティングした。実験を行う前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素Fluo-4NoWash、インビトロジェン社、米国を含むローディングバッファー[HBSS1×、HEPES20mM、プロベニシド酸25mM]を37°Cで30分間、その後25°Cで30分間ローディングした。各ウェルに直接注入することでSDF-1による刺激を行った。拮抗作用の実験では、SDF-1の少なくとも10分前に10μlのMab溶液をローディングバッファ-に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーMithrasLB940ベルトールド社を用いて動的蛍光測定を行った:励起485nm、発光535nm、励起エネルギー10000任意単位。SDF-1注入の前20秒間にわたり、1秒毎に0.1秒間、各ウェルの蛍光を記録した基底シグナル。次いで、20μlのSDF-1を注入し、続いて、2分間にわたってデータを記録した。各実験条件は2連でinduplicate行った。基底の蛍光および細胞を含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正する。SDF-1100nMによって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表した。SDF1100nMは組換えCHO/CXCR4において細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導したが、ナイーブCHO-K1細胞では蛍光シグナルが検出されなかった。最大強度は基底の蛍光に対して160超にまで達し、SDF-1刺激後約30秒で観察された。MDA-MB-231およびU-937の両方で、SDF-1100nMによる最大蛍光強度は低め基底に対して130~140であるが、同様な動的曲線kineticcurveが観察された図11A、11B、11C。515H7抗体133nMは、調べた3つの細胞系の全てにおいて、SDF-1100nMによって誘導されるカルシウムシグナルを強力且つほとんど完全に阻害した。実施例12:U937マウス生存モデルにおける抗CXCR4Mab515H7の活性ATCCから得たU937細胞をRPMI1640培地、10FCS、1L-グルタミン中で培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の2日前に細胞を分けた。1000万個のU937細胞を雌のNOD/SCIDマウスに腹腔内注射した。移植の2日後、マウスを、2mgの515H7Mab/マウスの負荷量で、次いで1mgの抗体/マウスで週2回、皮下s.c.処置した。PBSを注射されたマウスとマウスIgGアイソタイプ対照を投与されたマウスの間で生存率に差が観察されないことが以前の研究で示されているので、対照マウスにはPBSを注射した。マウスの生存は毎日モニタリングした。図12の結果は、515H7Mabで処置されたマウスで劇的且つ有意に寿命が増加し、515H7MabではT/Cが約280であることを示している図12。実施例13:抗CXCR4Mab515H7による、Nod/ScidマウスにおけるT細胞KARPAS299異種移植腫瘍成長の阻害本実験の目的は、抗CXCR4Mab515H7がNod/ScidマウスにおけるKARPAS299異種移植片の成長を阻害する能力を評価することである。ECACCから得たKARPAS299細胞を、RPMI培地、1L-Gluおよび10FCSシグマ社、米国メリーランド州セントルイス中でルーチンに培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の48時間前に細胞を分けた。PBS中の500万個のKARPAS299細胞を7週齢のNod/Scidマウスチャールスリバー社、フランスに移植した。移植の5日後、腫瘍は測定可能であり32mm3<V3<49mm3、腫瘍のサイズが同等なマウス6頭の群にマウスを分けた。マウス1頭当たり2mgの負荷量のMab515H7でマウスを腹腔内i.p.処置した。その後、1mg/用量dose/マウスのMab515H7を週2回、マウスに注射した。対照群としてPBS群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週2回測定し、式:π/6×長さ×幅×高さによって計算した。マンホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。これらの実験で、処置期間中に死亡は観察されなかった。PBS群と比べて、1mg/用量の515H7MabではD7とD33の間に腫瘍成長の有意な阻害がありp≦0.002、処置5週間後の平均腫瘍体積がMab515H7ではPBSに対して63減少していた図13。実施例14:抗CXCR4キメラMabc515H7の産生マウス515H7Mabのキメラ形態をデザインした:これは、ヒトのCκおよびIgG1定常ドメインに遺伝的に融合させた目的のマウス抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインに相当する。HEK293/EBNAシステムとpCEP4発現ベクターインビトロジェン社、米国を用いた一過性のトランスフェクションによって組換えMabを産生した。515H7Mab軽鎖および重鎖の可変ドメインに対応する全ヌクレオチド配列を網羅的遺伝子合成ジーンクラスト社Genecust、ルクセンブルクによって合成した。これらを、ヒトIgG1免疫グロブリンの軽鎖Cκまたは重鎖CH1-ヒンジ-CH2-CH3のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するpCEPベクターインビトロジェン社、米国にサブクローニングした。全てのクロニーング工程は、実験マニュアルSambrookandRussel2001に記載されているように従来の分子生物学的技術に従っておよび供給業者の取扱説明書に従って行った。各遺伝子コンストラクトを、BigDyeterminatorcyclesequencingkitアプライドバイオシステムズ社、米国を用いたヌクレオチドシークエンシングで完全に検証し、3100GeneticAnalyzerアプライドバイオシステムズ社、米国を用いて分析した。懸濁液に適応させたHEK293EBNA細胞インビトロジェン社、米国を、オービタルシェーカーを用いて、6mMのグルタミンを添加した50mlの無血清培地Excell293SAFCバイオサイエンス社を入れた250mlフラスコ中でルーチンに成長させた回転速度110rpm。終濃度1mg/mlで水中に混合して調製した25kDaの線状ポリエチレンイミンPEIポリサイエンス社PolysciencesおよびプラスミドDNA重鎖と軽鎖のプラスミド比1:1で終濃度1.25μg/mlを用いて、2.106細胞/mlで一過性のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの4時間後、等体積の新鮮な培養培地で培養液を希釈して最終細胞密度を106細胞/mlとした。細胞生存率およびMab産生に基づいて培養プロセスをモニタリングした。典型的には、培養は4~5日間維持した。プロテインA樹脂GEヘルスケア社、米国を用いた従来のクロマトグラフィー法でMabを精製した。Mabは機能的評価に適したレベルで産生された。産生レベルは一般に、精製Mabで6~15mg/lである。実施例15:抗CXCR4キメラMabc515H7の結合特異性およびがん細胞系認識のFACS分析による特徴解析本実験では、ヒトCXCR4への抗CXCR4キメラMabc515H7の特異的結合をFACS分析によって調べた。NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4トランスフェクト細胞およびMDA-MB-231がん細胞系を、10μg/mLのモノクローナル抗体c515H7と一緒にインキュベートした。次いで、1BSA/PBS/0.01NaN3で細胞を洗浄した。次に、Alexa標識二次抗体を細胞に添加し、4°Cで20分間インキュベートした。次いで、細胞を再度2回洗浄した。2回目の洗浄後、FACS分析を行った。これらの結合実験の結果を以下の表7に示す。表は、抗CXCR4キメラMabc515H7がヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系に特異的に結合し、ヒトがん細胞系、例えばMDA-MB-231乳癌細胞も認識すること[FACSで得られた平均蛍光強度MFI]を示している。実施例16:ヒトCXCR4受容体を安定的に発現するCHO-K1膜における抗CXCR4マウスMabm515H7およびキメラMabc515H7と[125I]SDF-1の競合結合このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトCXCR4受容体への放射標識[125I]SDF-1の結合に対してマウスMabm515H7およびキメラMabc515H7が競合する能力を評価することができる。ヒトCXCR4受容体の全コード配列参照配列NM_003467を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブCHO-K1細胞ATCCCCL-61をトランスフェクションすることにより、ヒトCXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。完全培養培地[5ウシ胎児血清FCSおよび500μg/mlのジェネテシンを添加したDMEM-Ham’sF12]中で細胞を増殖させた。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中でCHO/CXCR4細胞を機械的に破砕した後、遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて[125I]SDF-1比活性:1500Ci/mmolの結合を行った。簡潔に述べると、細胞膜30μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、pH7.4、CaCl21mM、MgCl25mM、NaCl150mM、BSA1]中で、評価する化合物SDF-1またはmAb、放射性リガンド1nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。25°Cで1時間後に結合平衡に達した。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。10μMの非標識SDF-1存在下で非特異的NS結合を推定した。抗CXCR4Mab100nMは、[125I]SDF-1結合と効率的に競合し、競合効果[125I]SDF-1の阻害率は以下の順番であった:m515H762±10およびc515H755±4図14。実施例17:抗CXCR4マウスMabm515H7およびキメラMabc515H7による、野生型CXCR4受容体を発現する細胞膜における[35S]GTPγS結合の調節この機能的アッセイでは、野生型ヒトCXCR4受容体を介したGタンパク質の活性化ならびに抗CXCR4マウスMabm515H7およびキメラMabc515H7によるその調節をモニタリングすることができる。CHO-K1についての上記実施例と同様にして、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するNIH-3T3細胞を得た。完全培養培地[10FCS、1L-グルタミン、2μM重炭酸ナトリウムを添加したEMEM]中でHeLaヒト子宮頸癌細胞を増殖させた。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中で機械的に破砕し、更に遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、[35S]GTPγS結合を行った。SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて[35S]GTPγS比活性:1000Ci/mmolの取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜10μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、GDP3μΜ、MgCl2l0mM、NaCl100mM、EDTA1mM、pH=7.4]中で、評価する化合物SDF-1および興味のあるMab、[35S]GTPγS0.2~0.4nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。結合反応は25°Cで1時間行った。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。各MabについてIC50を計算した。これらの実験条件下で、NIH3T3/CXCR4細胞中で決定されたm515H7Mabおよびc515H7MabのIC50はそれぞれ1.9nMおよび1.5nMであった図15。同じ実験条件でHeLa細胞を用いて決定されたm515H7Mabおよびc515H7MabのIC50はそれぞれ0.2nMおよび0.6nMであった図16。実施例18:CXCR4と種々の相互作用パートナーとの会合:生物発光共鳴エネルギー移動BRET法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対するマウスMabm515H7およびキメラMab515H7の影響この機能的アッセイでは、CXCR4受容体へのSDF-1ならびに/またはm515H7マウスMabおよびc515H7キメラMabの結合によって誘導されるCXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン2シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を用いて、対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET実験を行う2日前に、対応するBRETパートナーをコードする発現ベクターでHEK293細胞を一時的にトランスフェクトした:CXCR4ホモ二量体化の研究には[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]、CXCR4とCXCR2のヘテロ二量体化の研究には[CXCR4-RlucCXCR2-YFP]、CXCR4に仲介されるβアレスチン2のリクルートの研究には[CXCR4-Rlucβ-arr2-YFP]。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を5CO2、37°Cで培養した。次いで、1ウェル当たり200μlのDMEMを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。BRET実験直前に、DMEMを除き、すぐに細胞をPBSで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のPBS中で37°Cにて15分間細胞をインキュベートし、その後、100nMのSDF-1とまたはSDF-1なしで、5μMのセレンテラジンHを添加して最終体積を50μlにした。37°Cで5分間インキュベートし、ホモおよびヘテロ二量体でのみ室温で更に20分間インキュベートした後、485nmおよび530nmでの発光取得light-emissionacquisitionを、MithrasLB940マルチラベルリーダーベルトールド社を用いて開始した1s/波長/ウェルで、室温にて15回反復。BRET比の計算は以前に記載されているように行ったAngersetal2000:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ実験条件下でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞での発光530nm/発光485nm。この等式を簡単にすることにより、BRET比が、Rlucに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比530/485nmによって補正された、2つのBRETパートナーが存在する時に得られる比530/485nmに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリBRET単位mBUで表す:mBUはBRET比に1000を掛けたものに相当する。SDF1100nMは、CXCR4受容体に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約10増加させた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図17A。興味深いことに、SDF1100nMは、CXCR4およびCXCR2に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約17減少させた。このことは、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図17B。この後者の場合、SDF-1によって活性化されるCXCR4/CXCR2のコンホメーションはBRETエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、m515H7Mabおよびc515H7Mabは、SDF-1によって誘導されるCXCR4ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができc515H7は、SDF-1によって誘導されるBRETの増加を96阻害。図17A、また、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体形成のコンホメーション変化も調節することができたc515H7は、SDF-1によって誘導されるBRETの減少を98阻害。図17B。m515H7Mabおよびc515H7Mabは更に、それらだけで、CXCR4/CXCR4およびCXCR2/CXCR4の空間的近接をそれぞれ調節することができた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対するこれらのMabの影響を示している図17Aおよび17B。SDF-1100nMによるCXCR4活性化により、400のBRETシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた図17C。このリクルートはc515H7Mabによって一部阻害され約93、図17C、シグナル伝達に対するこれらのMabの影響を示している。実施例19:CXCR4受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激によるCXCR4受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。上記実施例に記載したように、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。U937ヒト白血病細胞を、完全培養培地、それぞれ[10FCSを添加したDMEM]および[10FCS、20mMHEPES、1非必須アミノ酸溶液、1ピルビン酸ナトリウム、1L-グルタミン、4.5g/lグルコースを添加したRPMI1640]中で増殖させた。全ての種類の細胞を、100,000細胞/ウェルの密度で黒色96MWプレートの適切な培養培地中にプレーティングした。実験を行う前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素Fluo-4NoWash、インビトロジェン社、米国を含むローディングバッファー[HBSS1×、HEPES20mM、プロベニシド酸25mM]を37°Cで30分間、その後25°Cで30分間ローディングした。各ウェルに直接注入することでSDF-1による刺激を行った。拮抗作用の実験では、SDF-1の少なくとも10分前に10μlのMab溶液をローディングバッファ-に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーMithrasLB940ベルトールド社を用いて動的蛍光測定を行った:励起485nm、発光535nm、励起エネルギー10000任意単位。SDF-1注入の前20秒間にわたり、1秒毎に0.1秒間、各ウェルの蛍光を記録した基底シグナル。次いで、20μlのSDF-1を注入し、続いて、2分間にわたってデータを記録した。各実験条件は2連でinduplicate行った。基底の蛍光および細胞を含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正した。SDF-1100nMによって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表した。SDF1100nMは組換えCHO/CXCR4において細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導したが、ナイーブCHO-K1細胞では蛍光シグナルが検出されなかった。最大強度は基底の蛍光に対して140超にまで達し、SDF-1刺激後約40秒で観察された。U-937細胞でも同様な動的曲線kineticcurveが観察された図18A、18B。キメラ抗体c515H7133nMは、調べた両方の細胞系において、SDF-1100nMによって誘導されるカルシウムシグナルを強力且つほとんど完全に阻害した。実施例20:SDF-1によって誘導されるU937細胞遊走に対する抗CXCR4マウスMabm515H7およびキメラMabC515H7の影響遊走プロセスに対する抗CXCR4Mabm515H7およびc515H7の阻害効果を評価するために、2FCSを添加したRPMI1640培地中100000個のU-937細胞を遊走チャンバーの上側チャンバー24ウェルプレート、細孔径8μmにプレーティングし、ウェルの下部にSDF-1が存在するものと存在しないもの、上側チャンバー中にMabc515H7およびm515H7が存在するものと存在しないものを用意した。この試験では、マウスIgG2bをアイソタイプ対照として導入した。プレーティングの2時間後に遊走細胞を数えた。図19に示す結果から、予想されたように、SDF-1がU-937細胞遊走の有意な増加を誘導できることが示された。細胞をIgG2アイソタイプ対照とインキュベートした時には影響が観察されなかった。一方、c515H7Mabおよびm515H7Mabとインキュベートした細胞では、SDF-1誘導U937細胞遊走の有意且つ再現可能な減少が観察され、この減少はc515H7MabおよびM515H7Mabでは約80を超えた。実施例21:U937マウス生存モデルにおける抗CXCR4キメラMabc515H7の活性ATCCから得たU937細胞をRPMI1640培地、10FCS、1L-グルタミン中で培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の2日前に細胞を分けた。1000万個のU937細胞を雌のNOD/SCIDマウスに腹腔内i.p.注射した。移植の2日後、マウスを、2mgのc515H7Mab/マウスの負荷量で、次いで1mgの抗体/マウスで週2回、皮下s.c.処置した。PBSを注射されたマウスとマウスIgGアイソタイプ対照を投与されたマウスの間で生存率に差が観察されないことが以前の研究で示されているので、対照マウスにはPBSを注射した。マウスの生存は毎日モニタリングした。図20に示す結果は、c515H7Mabで処置されたマウスで劇的且つ有意に寿命が増加し、T/Cが約180であることを示している。実施例22:抗CXCR4マウス抗体515H7のヒト化一般的手順CDR移植の包括的規則を適用して515H7抗CXCR4抗体のヒト化を行った。IMGTの固有なナンバリングスキームならびにMIGTのライブラリーおよびツールLefranc1997wwwimgtorgを応用して、CDRおよびフレームワークFR領域の免疫遺伝学的分析および決定を行った。SDF-1に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力について、操作されたengineered抗体の機能的活性を生物発光共鳴エネルギー移動BRETアッセイで試験することにより、ヒト化プロセスの効率を評価した。このアッセイでは、CXCR4をルシフェラーゼでタグ化し、βアレスチンをYFPでタグ化した。SDF-1に仲介されるCXCR4へのβアレスチンのリクルートはCXCR4のシグナル伝達における重要な工程である。ヒトCXCR4で安定にトランスフェクトされたNIH3T3細胞系を用いて515H7のヒト化バリアントの結合も決定した。ビオチン化マウス抗体との競合アッセイを用いて結合活性を評価した。第2の試みとして、RAMOS細胞へのビオチン化SDF-1の結合を阻害する能力について、ヒト化抗体を評価した。RAMOS細胞は、CXCR4を多く発現し、CXCR7およびSDF-1の発現が少ないので選択された。これらのアッセイを用いて、抗CXCR4抗体の組換えヒト化バージョンの特徴解析を行った。可変ドメインをヒトIgG1/k定常ドメインと構成し、哺乳動物用発現ベクターpCEPにクローニングした。組換えIgG1/κ由来抗体をHEK293細胞中で一時的に発現させた。発現培養上清をろ過し、プロテインAセファロースを用いて抗体を精製した。精製抗体をPBSバッファー中に再度懸濁し、ELISAで抗体濃度を求めた。515H7可変ドメインのヒト化CDR移植に好適なヒト生殖系列を選択するために、マウスの515H7VH配列との相同性が最も高いヒト生殖系列遺伝子を同定した。IMGTのデータベースおよびツールを利用して、マウス515H7VHCDRのヒトアクセプター配列としてヒトIGHV3-4904生殖系列遺伝子およびヒトIGHJ401J生殖系列遺伝子を選択した。ヒトV遺伝子IGHV3-4904は、マウス515H7重鎖可変ドメインのV遺伝子に80.27の相同性を有する。ヒトJ遺伝子IGHJ401Jの相同性は87.50である。選択されたヒト生殖系列遺伝子とマウス抗体515H7のVHドメインは、19残基異なる。元の抗体のVHドメインと生殖系列配列とのアラインメントを図21に示す。軽鎖可変ドメインに関しては、ヒト生殖系列遺伝子IGKV4-101およびIGKJ101を選択した図22。ヒトV遺伝子IGKV4-101との相同性は79.12である。軽鎖の515H7J遺伝子はヒトJ遺伝子IGKJ101に対して84.85の相同性を有する。翻訳されたヒト生殖系列遺伝子IGHV3-4904およびIGKV4-101のアミノ酸配列を用いて、結晶化のなされている相同な抗体を同定した。重鎖では、RCSBProteinDataBankのアクセッション番号1MAMの抗体をモデルとして選び、軽鎖では、抗体1SBSを選んだ。コンピュータープログラムDSvisualを用いて2つのドメインを構築し、ヒト化抗体515H7のモデルとして用いた。元の抗体と対応するヒト生殖系列配列との間で異なる各残基の位置に基づいて、ヒトとマウスの配列間で異なる各残基に優先順位priorityrankorderを付与した図21および22。これらの優先度を用いて、各ヒト化可変ドメインの3つの異なるバリアントを作出し、それぞれVH1、VH2およびVH3と命名した。最初の一連の実験で、本発明者らは、3つの最初のヒト化バリアントを構築し、その抗CXCR4結合活性を分析した。VHバリアント1VH1をマウスVLと組み合わせ、これらのコンストラクトを、ビオチン化した元のマウス515H7抗体の結合を阻害する能力について評価した。全てのコンストラクトで、マウス抗体との競合能は同程度であった図23A~C。このことは、最もヒトに近いVHバリアントがそれほどヒトに近くないバリアントと同じ結合能力を有することを示している。そこで、VH1を、VLの3つの異なるバリアントと組み合わせた図23D~F。VH1とVL3の組合せだけが、ビオチン化マウス抗体と競合する能力の低下を示し、一方、フレームワーク中に逆変位を有さない最もヒトに近いバリアントVH1VL1はキメラ抗体と同じ交差ブロック活性を示した。このバリアントVH1VL1を更に、SDF-1に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力についてBRETアッセイで調べた図24。元の抗体の交差ブロックにより決定された望ましい受容体結合活性にも関わらず、コンストラクトVH1VL1はβアレスチンのリクルートの弱い阻害しか示さなかった。この強力な阻害活性の欠如のため、マウス残基でヒトフレームワーク残基を置換する必要がある。VH1に1つの逆変異を入れた。以下の残基を置換した:V48L、E61D、D76NおよびA81Lアミノ酸一次配列に基づいたナンバリング。バリアントVH1のこれらの逆変異1つの変異体をバリアントVL1と組み合わせた。これらのうち、逆変異D76Nでのみ、BRETアッセイによる評価で、シグナル伝達の阻害が増加した図25B。このコンストラクトの活性を上昇させ、更に他の残基の重要性を評価するために、VH1について種々の二重逆変異の変異体を構築した。こららのコンストラクトの阻害活性はわずかに向上した平均約45~50の阻害が、十分ではなかった図25C。次に、逆変異が1つの変異体D76Nを3つの異なるVLバリアントと組み合わせた図25D。コンストラクトhz515H7VHD76NVL2は、キメラ抗体と同じ範囲である平均88.2の活性を示した。バリアントVL1ドメイン中に一重および二重逆変異を構築し、コンストラクトhz515H7VH1D76NVL2の活性と比較した図26。調べた組合せのいずれも、このコンストラクトと同様なまたはこれより優れた活性を有さなかった。hz515H7VH1D76NVL2のフレームワーク中のヒト残基のパーセンテージを計算した:180残基中14個の非ヒト残基を含み、これは92.2の<germinalityindex>に等しい。比較として、市販のヒト化抗体ベバシズマブおよびトラスツズマブはその可変ドメイン中にそれぞれ30および14個の非ヒト残基を含む。SDF-1に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する効果が最も強かった、最も良い4つのヒト化型を、ビオチン化SDF-1の結合を阻害する能力についても試験した図27A。SDF-1結合とβアレスチンリクルートの阻害は密接に相関していた。この相関は、SDF-1結合の阻害がシグナル伝達阻害の主要な機構である可能性が最も高いことを示している。hz515H7VH1D76NVL2バリアントを更にヒト化するために、図26で評価した二重および三重変異体で得られた情報を用いて、更に3つのバリアントをデザインした。バリアントVL2.1、VL2.2およびVL2.3VL2-1、VL2-2およびVL2-3とも呼ぶ中でそれぞれ更に4および5個の残基をヒト化した。これらは残基D9、P49、D66、S69、S83、L84;V89に相当する。VL2と比較したこれら3つのバリアントのアラインメントを図28に示す。これらのVL2バリアントがSDF-1によって仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力を評価した。ヒト化hz515H7VH1D76NVL2、VL2.1、VL2.2およびVL2.3バリアントはキメラ抗体c515H7と同様な活性を示した図26。515H7-2可変ドメインのヒト化別のヒト化型を作製するために、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方についてCDR移植に別の好適なヒト生殖系列を選択した。これらの両方について、マウス配列との相同性のパーセンテージに関してだけでなく、それらがそれぞれマウス515H7のVLおよびVHと同じCDR長を有するように、生殖系列を選択した。IMGTのデータベースおよびツールを用いて、ヒトIGHV3-7301生殖系列遺伝子およびヒトIGHJ401J生殖系列遺伝子を、マウス515H7VHCDRのヒトアクセプター配列として選択した。ヒトV遺伝子IGHV3-7301は、マウス515H7重鎖可変ドメインのV遺伝子に対して79を超える相同性を有する。ヒトJ遺伝子IGHJ401Jに対する相同性は87.50である。軽鎖可変ドメインに関して、ヒト生殖系列遺伝子IGKV2D-4001およびIGKJ101を選択した。ヒトV遺伝子IGKV2D-4001との相同性は70を超える。軽鎖の515H7のJ遺伝子はヒトJ遺伝子IGKJ101に対して84.85の相同性を有する。元の抗体と対応するヒト生殖系列の配列間で異なる各残基の位置および当業者の知識に基づいて、逆変異する残基として複数の重要な残基を特定した。重鎖に関して、これらの残基はH35S、V48L、R50F、A61D、D76Nおよび/またはA81Lである表2cの配列番号86および90参照。軽鎖に関して、これらの残基はL9S、I21M、D40A、L43Q、Y59A、A61D、D66A、S69T、G74E、D76Yおよび/またはV89Lである表2cの配列番号85および89参照。実施例23:抗CXCR4ヒト化Mab515H7の結合特異性およびがん細胞系認識のFACS分析による特徴解析この実験では、抗CXCR4ヒト化Mab515H7のヒトCXCR4への特異的結合をFACS分析により調べた。NIH3T3、NIH3T3-hCXCR4トランスフェクト細胞およびRamos、U934がん細胞系を、0~10μg/mLのヒト化Mab515H7hz515H7VH1D76NVL2[=hz515H7VL2]、hz515H7VH1D76NVL2.1[=hz515H7VL2.1]、hz515H7VH1D76NVL2.2[=hz515H7VL2.2]およびhz515H7VH1D76NVL2.3[=hz515H7VL2.3]と一緒に、4°C、暗黒下、100μlのFacsバッファー中で20分間インキュベートした。Facsバッファーで3回洗浄した後、細胞を二次抗体のヤギ抗ヒトAlexa4881/500希釈と一緒に、4°C、暗黒化で20分間インキュベートした。Facsバッファーで3回洗浄した後、各ウェルにヨウ化プロピジウムを添加し、生細胞のみをFacsで分析した。各条件について蛍光強度の平均値を評価するために少なくとも5000個の生細胞を評価した。これらの結合実験の結果を図29A~29Cに示す。これらは、抗CXCR4ヒト化Mabhz515H7が、ヒトCXCR4-NIH3T3トランスフェクト細胞系に特異的に結合すること図29A元のNIH3T3細胞ではMFI=2.2ならびにヒトがん細胞系、例えばU937図29BおよびRamos図29Cも認識すること[FACSで得られた平均蛍光強度MFI]を示している。実施例24:抗CXCR4ヒト化Mab515H7による、野生型CXCR4受容体を発現する細胞膜における[35S]GTPγS結合の調節この機能的アッセイでは、野生型ヒトCXCR4受容体を介したGタンパク質の活性化および抗CXCR4ヒト化Mab515H7によるその調節をモニタリングすることができる。CHO-K1細胞についての上記実施例と同様にして、野生型CXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するNIH-3T3細胞を得た。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中で機械的に破砕し、更に遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、[35S]GTPγS結合を行った。SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて[35S]GTPγS比活性:1000Ci/mmolの取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜10μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、GDP3μΜ、MgCl2l0mM、NaCl100mM、EDTA1mM、pH=7.4]中で、評価する化合物SDF-1および興味のあるMab、[35S]GTPγS0.2~0.4nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。結合反応は25°Cで1時間行った。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。各MabについてIC50を計算した。これらの実験条件下で、NIH3T3/CXCR4細胞中で決定されたヒト化hz515H7MabのIC50は、hz515H7VH1D76NVL2Mabが3.86nM図30A、hz515H7VH1D76NVL2-1Mabが4.05nM図30B、hz515H7VH1D76NVL2-2Mabが5.19nM図30C、hz515H7VH1D76NVL2-3Mabが8.5nM図30Dであった。hz515H7Mabは、SDF-1100nMによって刺激される[35S]GTPγS結合も阻害することができ、阻害率は、hz515H7VH1D76NVL2Mabが86、hz515H7VH1D76NVL2-1Mabが69、hz515H7VH1D76NVL2-2Mabが66、hz515H7VH1D76NVL2-3Mabが58図31であった。実施例25:CXCR4と種々の相互作用パートナーとの会合:生物発光共鳴エネルギー移動BRET法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対するヒト化Mab515H7の影響この機能的アッセイでは、CXCR4受容体へのSDF-1および/または515H7ヒト化Mabの結合によって誘導されるCXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン2シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。従来の分子生物学的技術を用いて、調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを対応する色素ウミシイタケルシフェラーゼRlucおよび黄色蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質として構築した。BRET実験を行う2日前に、対応するBRETパートナーをコードする発現ベクターでHEK293細胞を一時的にトランスフェクトした:CXCR4ホモ二量体化の研究には[CXCR4/RlucCXCR4/YFP]、CXCR4とCXCR2のヘテロ二量体化の研究には[CXCR4-RlucCXCR2-YFP]、CXCR4に仲介されるβアレスチン2のリクルートの研究には[CXCR4-Rlucβ-arr2-YFP]。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色96MWプレートの完全培養培地[10FBSを添加したDMEM]中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を5CO2、37°Cで培養した。次いで、1ウェル当たり200μlのDMEMを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。BRET実験直前に、DMEMを除き、すぐに細胞をPBSで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のPBS中で37°Cにて15分間細胞をインキュベートし、その後、100nMのSDF-1とまたはSDF-1なしで、5μMのセレンテラジンHを添加して最終体積を50μlにした。37°Cで5分間インキュベートし、ホモおよびヘテロ二量体でのみ更に室温で20分間インキュベートした後、MithrasLB940マルチラベルリーダーベルトールド社を用いて485nmおよび530nmでの発光取得を開始した1s/波長/ウェルで、室温にて15回反復。BRET比の計算は以前に記載されているように行ったAngersetal2000:[発光530nm-発光485nm×Cf]/発光485nm、式中、Cf=同じ実験条件下でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞の発光530nm/発光485nm。この等式を簡単にすることにより、BRET比が、Rlucに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比530/485nmによって補正された、2つのBRETパートナーが存在する時に得られる比530/485nmに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリBRET単位mBUで表す:mBUはBRET比に1000を掛けたものに相当する。SDF1100nMは、CXCR4受容体に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約12増加させた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図32A。興味深いことに、SDF1100nMは、CXCR4およびCXCR2に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるBRETシグナルを約16減少させた。このことは、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる図32B。この後者の場合、SDF-1によって活性化されるCXCR4/CXCR2のコンホメーションはBRETエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、515H7ヒト化Mabは、SDF-1によって誘導されるCXCR4ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができ、SDF-1によって誘導されるBRET増加の阻害率は、hz515H7VH1D76N-VL2Mabが約88、hz515H7VH1D76N-VL2.1Mabが65、hz515H7VH1D76N-VL2.2Mabが33、hz515H7VH1D76N-VL2.3Mabが21であり図32A、また、CXCR2/CXCR4ヘテロ二量体では、SDF-1によって誘導されるBRET減少の阻害率は、hz515H7VH1D76N-VL2Mabが約100、hz515H7VH1D76N-VL2.1Mab、hz515H7VH1D76N-VL2.2Mabおよびhz515H7VH1D76N-VL2.3Mabが50であった図32B。515H7ヒト化Mabは更に、それらだけで、それぞれCXCR4/CXCR4およびCXCR2/CXCR4の空間的近接を調節することができた。このことは、CXCR4/CXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対するこれらのMabの影響を示している図32Aおよび32B。SDF-1100nMによるCXCR4活性化により、390のBRETシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた図32C。このリクルートは515H7ヒト化Mabによって一部阻害され、阻害はhz515H7VH1D76N-VL2Mabで約94、hz515H7VH1D76N-VL2.1Mabで81、hz515H7VH1D76N-VL2.2Mabで82、hz515H7VH1D76N-VL2.3Mabで71であり図32C、シグナル伝達に対するこれらのMabの影響を示している。実施例26:免疫組織化学的研究IHC切片を脱パラフィンし、再水和し、熱処理によるエピトープ賦活化heat-inducedepitoperetrievalのために予め98°Cに温めたpH8のEDTA中に7分間置いた。トリス緩衝食塩水-0.05tween20TBS-Tダコ社、S3006で3回洗浄した後、5分間ペルオキシダーゼブロッキング試薬ダコ社、K4007を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片をTBS-Tで洗浄し、ブロッキング試薬UltraVblock-TA-125UB-ラブビジョン社LabVision中で5分間インキュベートした後、抗CXCR-4マウスモノクローナル抗体50μg/ml、クローン515H7、ピエールファーブル社PierreFabreまたは対照としてのマウスIgG1/κ50μg/ml、X0931、ダコ社と4°Cで一晩インキュベートした。切片をTBS-Tで洗浄し、EnvisionDualLinkと室温で1時間インキュベートした。褐色反応産物の発色にジアミノベンジジンを用いたダコ社、K3468。スライドを対比染色のためにヘマトキシリンに4分間浸しダコ社、S3309、PBSで洗浄した後、Faramount封入剤およびカバースリップ中にマウントした。この免疫組織化学的方法では、褐色反応産物が細胞膜の陽性染色に関連し、褐色反応産物の欠如が陰性染色および細胞膜が可視化されないことに関連する。抗CXCR4マウスモノクローナル抗体、クローン515H7により、様々な種類の腫瘍の細胞膜が異なるように染色された。515H7の抗腫瘍活性が示された2つの異種移植モデル、RAMOSおよびKARPAS299で行った染色を図33および34に示した。図33および34に示されているように、得られた染色は固定依存的である。実際、膜染色は組織をホルマリン固定した場合の方が弱く図34aおよび34c、Glyo-fixxホルマリンの代替物を用いた場合に膜染色が有意に増加した図33aおよび33c。実施例27:ヒトCXCR4受容体を安定的に発現するCHO-K1膜における[125I]SDF-1と抗CXCR4ヒト化Mab515H7の競合結合このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトCXCR4受容体への放射標識[125I]SDF-1の結合に対してヒト化Mab515H7が競合する能力を評価することができる。ヒトCXCR4受容体の全コード配列参照配列NM_003467を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブCHO-K1細胞ATCCCCL-61をトランスフェクションすることにより、ヒトCXCR4受容体を安定的且つ構成的に発現するCHO-K1細胞を得た。完全培養培地[5ウシ胎児血清FCSおよび500μg/mlのジェネテシンを添加したDMEM-Ham’sF12]中で細胞を増殖させた。溶解バッファー[Hepes20mM、pH7.4、NaCl150mM]中でCHO/CXCR4細胞を機械的に破砕した後、遠心10000g、15分間して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。[125I]SDF-1の結合比活性:1500Ci/mmolは、SPA法シンチレーション近接アッセイ、GEヘルスケア社を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜30μg/ウェルを、結合バッファー[Hepes20mM、pH7.4、CaCl21mM、MgCl25mM、NaCl150mM、BSA1]中で、評価する化合物SDF-1またはmAb、放射性リガンド1nMおよび最後にSPA-WGA-PVTビーズ7.3mg/ウェルと一緒にインキュベートした。25°Cで1時間後に結合平衡に達した。遠心[1000gで10分間]後、シンチレーションカウンターTopCount、パーキンエルマー社を用いて放射線数を測定した。10μMの非標識SDF-1存在下で非特異的NS結合を推定した。抗CXCR4Mabは、[125I]SDF-1結合と効率的に競合し、競合効果[125I]SDF-1の阻害率は以下の順番であった:hz515H7VH1D76NVL277、hz515H7VH1D76NVL2.168、hz515H7VH1D76NVL2.261およびhz515H7VH1D76NVL2.349図35A。Hz515H7Mabは[125I]SDF-1結合を用量依存的に阻害し、IC50は、hz515H7VH1D76NVL2Mabが1.44nM図35B、hz515H7VH1D76NVL2.1Mabが6.69nM図35C、hz515H7VH1D76NVL2.2Mabが5.91nMであった図35D。実施例28:CXCR4受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激によるCXCR4受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。完全培養培地[10FCS、20mMHEPES、1非必須アミノ酸溶液、1ピルビン酸ナトリウム、1L-グルタミン、4.5g/1グルコースを添加したRPMI1640]中でU937ヒト白血病細胞を増殖させた。細胞を100,000細胞/ウェルの密度で黒色96MWプレートの適切な培養培地中にプレーティングし、実験を行う前に一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素Fluo-4NoWash、インビトロジェン社、米国を含むローディングバッファー[HBSS1×、HEPES20mM、プロベニシド酸25mM]を37°Cで30分間、その後25°Cで30分間ローディングした。各ウェルへの直接注入によりSDF-1による刺激を行った。拮抗作用の実験では、SDF-1の少なくとも10分前に10μlのMab溶液をローディングバッファ-に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーMithrasLB940ベルトールド社を用いて動的蛍光測定を行った:励起485nm、発光535nm、励起エネルギー10000任意単位。SDF-1注入の前20秒間にわたり、1秒毎に0.1秒間、各ウェルの蛍光を記録した基底シグナル。次いで、20μlのSDF-1を注入し、続いて、2分間にわたってデータを記録した。各実験条件は2連でinduplicate行った。基底の蛍光および細胞含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正する。SDF-1に100nMよって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表す。SDF1100nMはU937細胞中で細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導した。最大強度は基底の蛍光に対して340を超え、SDF-1による刺激後約40秒で観察された。hz515H7VH1D76NVL2Mab133nMは、U937細胞系においてSDF-1100nMによって誘導されるカルシウムシグナルを一部阻害した図36、前記Mabはレジェンド中でhz515H7VL2とだけ記載されている。実施例29:SDF-1によって誘導されるU937細胞遊走に対する抗CXCR4ヒト化Mabhz515H7の影響遊走プロセスに対する抗CXCR4ヒト化Mabhz515H7VH1D76NVL2hz515H7と呼ぶの阻害効果を評価するために、2FBSを含むRPMI1640培地中、37°C、5CO2で、10μg/mlの抗体と共にU937細胞を40分間インキュベートした。合計5×104個の細胞を上側のtranswellチャンバーコーニング社、米国マサチューセッツ州ローウェルに入れた。下側チャンバーには、2FBSを含む培地に含めてSDF-1100ng/mlを添加した。細胞播種の2時間後にtranswellチャンバーから上側チャンバーに遊走した細胞数を数えることにより、U937細胞の遊走を測定した。ATPの定量化に基づいて培養液中の生細胞数を測定するCellTiter-Glo登録商標LuminescentCellViabilityAssayを用いて遊走した細胞を計数した。図37Aに示した結果から、予想された通り、SDF-1がU-937細胞遊走の有意な増加を誘導できることが実証された。細胞をIgG1アイソタイプ対照とインキュベートした時には影響は観察されなかった。一方、図37Aは、10μg/mlのhz515H7VH1D76NVL2MabによるSDF1誘導U937細胞遊走の阻害を示している。結果は3連intriplicateで行った3つの独立した実験の平均±SDを表している。図37Bは、SDF-1誘導細胞遊走に対する様々な量のhz515H7VH1D76NVL2Mabの効果を示す図である。結果は4つの独立した実験の平均±SEMを表しているIC50=4.5310-3μg/ml±2.210-3。実施例30:hz515H7VH1D76NVL2を用いた免疫組織化学的研究IHC切片を脱パラフィンし、再水和し、熱処理によるエピトープ賦活化heat-inducedepitoperetrievalのために予め98°Cに温めたpH8のEDTA中に7分間置いた。トリス緩衝食塩水-0.05tween20TBS-Tダコ社、S3006で3回洗浄した後、5分間ペルオキシダーゼブロッキング試薬ダコ社、K4007を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片をTBS-Tで洗浄し、ブロッキング試薬UltraVblock-TA-125UB-ラブビジョン社中で5分間インキュベートした後、ビオチン化されたヒト化抗CXCR4抗体50μg/ml、hz515H7VH1D76NVL2、ピエールファーブル社またはアイソタイプ対照としてのビオチン化されたヒトIgG150μg/ml、BP078、バインディングサイト社TheBindingSiteと4°Cで一晩インキュベートした。切片をTBS-Tで洗浄し、ストレプトアビジンHRPと室温で1時間インキュベートした。褐色反応産物の発色にジアミノベンジジンダコ社、K3468を用いた。スライドを対比染色のためにヘマトキシリンに4分間浸しダコ社、S3309、PBSで洗浄した後、Faramount封入剤およびカバースリップ中にマウントした。この免疫組織化学的方法では、褐色反応産物が細胞膜の陽性染色に関連し、褐色反応産物の欠如が陰性染色および細胞膜が可視化されないことに関連する。ビオチン化抗CXCR4ヒト化抗体515H7VH1D76NVL2により、様々な種類の腫瘍の細胞膜が異なるように染色される。図38および39に、マウスを515H7で処置した時に抗腫瘍活性が示された2つの異種移植モデルRAMOSおよびKARPAS299で行った染色を示した。図38および39に示されているように、得られた染色は固定依存的である。実際、膜染色は組織をホルマリンで固定した場合の方が弱く図39aおよび39c、一方、Glyo-fixxホルマリンの代替物を用いた場合に膜染色が有意に増加した図38aおよび38c。実施例31:ScidマウスにおけるB細胞Ramos異種移植腫瘍成長に対するキメラ515H7c515H7、ヒト化型hz515H7VH1D76NVL2およびhz515H7VH1D76NVL2.1Mabの影響ATCCから入手したRamos細胞をRPMI1640培地、10FCSおよび2mML-Gluシグマ社、米国メリーランド州セントルイス中でルーチンに培養した。細胞が対数増殖期になるように、移植の48時間前に細胞を分けた。7週齢の雌SCIDマウスチャールスリバー社、フランスにPBS中1000万個のRamos細胞を皮下sc.移植した。移植の5日後、腫瘍は測定可能であり平均100mm3、腫瘍のサイズが同等なマウス6頭の群にマウスを分けた。マウス1頭当たり2mgの負荷量のMabc515H7、hz515H7VH1D76NVL2またはhz515H7VH1D76NVL2.1でマウスを腹腔内i.p.処置した。その後、1mg/用量/マウスのMabc515H7、hz515H7VH1D76NVL2またはhz515H7VH1D76NVL2.1を週2回マウスに注射した。対照群としてPBS群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週2回測定し、式:π/6×長さ×幅×高さによって計算した。マンホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。これらの実験で、処置期間中に死亡は観察されなかった。PBS群と比べて、1mg/用量のc515H7Mab図40、hz515H7VH1D76NVL2Mab図41およびhz515H7VH1D76NVL2.1図42で、D11とD54の間に腫瘍成長の有意な阻害があり、c515H7Mabおよびhz515H7Mabでは、処置されたマウスでPBS群と比べて処置4週間後の平均腫瘍体積が92減少していた。"