"TNFR2Tumornecrosisfactorreceptortype2タンパク質または該TNFR2の細胞外領域を含む断片が、IL21RInterleukin-21receptorタンパク質または該IL21Rの細胞外領域を含む断片に連結されている、融合タンパク質。配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1記載の融合タンパク質。200~250個のアミノ酸からなることを特徴とする、請求項1記載の融合タンパク質。TNFR2の細胞外領域を含む断片が、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1記載の融合タンパク質。TNFR2の細胞外領域を含む断片が、配列番号2で表されるアミノ酸配列のN末端から23~179番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項1記載の融合タンパク質。IL21Rの細胞外領域を含む断片が、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1記載の融合タンパク質。IL21Rの細胞外領域を含む断片が、配列番号3で表されるアミノ酸配列のN末端から21~231番目のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項1記載の融合タンパク質。請求項7記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。請求項8記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。請求項9記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換させて調製した形質転換体。請求項1記載の融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防及び治療用組成物。自己免疫疾患が、悪性貧血、1型糖尿病、自己免疫性関節炎、ループス、多発性硬化症、反応性関節炎、及び皮膚筋炎からなる群から選択される、請求項11記載の組成物。自己免疫疾患が自己免疫性関節炎である、請求項12記載の組成物。薬学的に有効な量の請求項1~請求項7のいずれか一項記載の融合タンパク質を、自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患治療方法。薬学的に有効な量の請求項1~請求項7のいずれか一項記載の融合タンパク質を、個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患予防方法。自己免疫疾患予防及び治療に用いるための請求項1~請求項7のいずれか一項記載の融合タンパク質。本発明の目的は、TNF-αとIL-21に対して二重拮抗剤の役割をする、TNFR2-IL21R融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防及び治療用組成物を提供することである。前記の目的を達成するために、本発明は、TNFR2タンパク質またはTNFR2の細胞外領域を含む断片とIL21Rタンパク質またはIL21Rの細胞外領域を含む断片が連結された融合タンパク質を提供する。また、本発明は、TNFR2-IL21R融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、TNFR2-IL21R融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。また、本発明は、TNFR2-IL21R融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。また、本発明は、TNFR2-IL21R融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防及び治療用組成物を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTNFR2-IL21R融合タンパク質を自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患の治療方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTNFR2-IL21R融合タンパク質を個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患の予防方法を提供する。同時に、本発明は、自己免疫疾患の予防及び治療用医薬に用いるための本発明による融合タンパク質を提供する。本発明は、自己免疫疾患の一つである関節リウマチの病因として知られたTNF-αとIL-21に対して、拮抗作用をするTNFR2-IL21R融合タンパク質を有効成分として含む組成物として、TNFR2-FcとIL21R-FcよりTNFR2-IL21R融合タンパク質が炎症性サイトカインの分泌を抑制して、抗炎症性サイトカインの生成を増加させて、破骨細胞の分化を防ぐのに顕著な効能を示すだけでなく、CIA関節炎誘発マウスモデルで関節浸潤、炎症及び軟骨破壊を緩和させる効果を示して、免疫抑制細胞であるTreg細胞の発現を増加させて関節リウマチの治療効果を示すので、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質は、自己免疫疾患の予防及び治療効果を有する組成物の有効成分として有用に使用することができる。以下、本発明を詳しく説明する。本発明は、TNFR2タンパク質またはTNFR2の細胞外領域を含む断片とIL21Rタンパク質またはIL21Rの細胞外領域を含む断片が連結された融合タンパク質を提供する。前記TNFR2-IL21R融合タンパク質において、TNFR2の細胞外領域を含む断片は配列番号2のアミノ酸の23番~179番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、IL21Rの細胞外領域を含む断片は、配列番号3のアミノ酸の21番~231番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、前記融合タンパク質は配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21R融合タンパク質は、200~250個のアミノ酸からなるものが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質に含まれるFcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはCH2とCH3不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、TNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル-及びアミノ-末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質は、少なくとも2つの等価な抗体重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。このような二つのFc重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質のTNFR2、IL21R部分は、少なくとも2つの等価なTNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメイン領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。本発明のTNFR2-IL21Rの融合タンパク質は、下記の工程を含む方法によって製造されることが好ましいが、これに限定されない:1DNAライブラリーを鋳型にして、IL21Rプライマーを用いてPCR重合酵素連鎖反応を遂行する工程;2DNAライブラリーを鋳型にして、TNFR2プライマーを用いてPCRを遂行する工程;3工程1と工程2のPCR産物を鋳型にして、TNFR2-IL21Rの融合遺伝子をコードするプライマーを用いてPCRを遂行する工程;4工程4のPCR産物を制限酵素で切断する工程;5pYK-602-HIS-Fc発現ベクターを制限酵素で切断する工程;6工程4と工程5の制限酵素で切断したプラスミドをライゲーションする工程;7工程6のライゲーション反応が完了したTNFR2-IL21R融合タンパク質を形質転換する工程;8工程7の形質転換後、LBプレートに接種する工程;9工程8の生成されたコロニーを用いたPCRを遂行する工程;10工程9で確認されたTNFR2-IL21Rの融合タンパク質を293E細胞にトランスフェクションさせる工程;11工程10の293E細胞で発現したTNFR2-IL21R融合タンパク質を細胞培養液から精製する工程;12工程11の精製されたTNFR2-IL21R融合タンパク質の細胞毒性を除去する工程;及び13工程12の精製されたTNFR2-IL21R融合タンパク質の結合能力を確認する工程。本発明の製造方法において、ベクターの製造はDNAライブラリーからPCRを用いて遂行することが好ましく、DNAライブラリーは、肝臓、胎盤、膵臓及び肝組織で製造されたものを用いることが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21Rの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、TNFR2-IL21Rの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、pYK602-HIS-Fcが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21Rの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に形質転換させた形質転換体を提供する。形質転換体は、E.coilのDH5αであることが好ましいが、これに限定されない。本発明の具体的な実施例で、pYK602-HIS-Fc発現ベクターにIL21RとTNFR2をサブクローニングするために、PCRを行なってIL21R遺伝子と、TNFR2遺伝子を増幅した。増幅されたそれぞれのPCR産物をpYK602-HIS-Fc発現ベクターにライゲーションして、TNFR2-Fc及びIL21R-Fcを構築した図1及び図3参照。構築したTNFR2-FcとIL21R-Fcを293E細胞にトランスフェクションさせた後、生成されるタンパク質と、これを精製したタンパク質IL-21単一拮抗剤をウエスタンブロットを用いて確認した図2及び図4参照。また、DNAライブラリー混合腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合を鋳型にしてIL21RとTNFR2遺伝子をPCRを行なって増幅させた。IL21RとTNFR2の融合された遺伝子を増幅するためのプライマーを製作した後図5参照、増幅された産物を鋳型にして、TNFR2-IL21R融合タンパク質TNF-αおよびIL-21二重拮抗剤をコードする遺伝子をPCRを用いて増幅した。増幅されたPCR産物をpYK602-HIS-Fc発現ベクターにライゲーション反応を通じて、TNFR2-IL21R融合タンパク質発現ベクターを構築した図6及び図7参照。併せて、TNFR2-IL21R融合タンパク質のリガンド中の一つであるTNF-αとの結合力を調べるために、結合程度を確認する実験を行なって、TNFR2-IL21R融合タンパク質がTNF-αとIL-21に対して高い結合力を有していることを確認した図8参照。また、本発明は、TNFR2-IL21R融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患の予防及び治療用組成物を提供する。前記TNFR2-IL21R融合タンパク質において、TNFR2の細胞外領域を含む断片は、配列番号2のアミノ酸の23番~179番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、IL21Rの細胞外領域を含む断片は配列番号3のアミノ酸の21番~231番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、前記融合タンパク質は配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21R融合タンパク質は、200~250個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質に含まれるFcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはCH2とCH3不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、TNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル-及びアミノ-末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質は、2当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのFc重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質のTNFR2、IL21R部分はまた、2当量以上のTNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいが、これに限定されない。本発明の具体的な実施態様において、Th17細胞に<実施例>を通じて構築されたTNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した結果、炎症性サイトカインであるIL-21、IL-17及びRORc転写因子の発現がTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した後、TNFR2-Fc、IL21R-Fcと比較した時、その発現がすべて顕著に減少することを確認することができた図9参照。また、Th17細胞から分泌される炎症性サイトカインは、TNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時、TNFR2-Fc、IL21R-Fcを処理した時に比較して顕著に減少することを確認することができた図9参照。また、TNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質をそれぞれ処理した後、抗炎症性サイトカインであるIL-10のタンパク質分泌量をELISA法を用いて測定した結果、FoxP3の発現とIL-10タンパク質の分泌量がTNFR2-Fc、IL21R-Fcに比較して、TNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時さらに増加することを確認することができた図10参照。併せて、TNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した後、破骨細胞分化の分化が抑制されることをTRAP染色とカテプシンKの発現増加を通じて確認することができた図11参照。また、本発明の具体的な実施例で、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質の生体内関節炎治療効果を確認するために、CIA関節炎誘発マウスモデルを製造して、マウスモデルに本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与した結果、関節炎治療効果が観察され図12参照、これは具体的に関節浸潤、炎症及び軟骨破壊が緩和されて図13参照、炎症因子の発現が減少するだけでなく図14参照、前記関節炎誘発マウスを製造するために投与されたCII特異的IgG2aの生成が減少する効果を示した図15参照。このような、関節炎の治療または緩和効果は、関節炎治療剤に用いているエンブレルと類似かまたは、優れていることを観察することができた。同時に、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与したCIA関節炎誘発マウスで、免疫反応に関与する脾臓組織を採取してTh17とTreg細胞の発現を観察した時、炎症因子を発現するTh17CD4IL-17細胞の発現が減少した一方、自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるTregCD4CD25Foxp3細胞の発現が増加することを観察することができた図16参照。したがって、TNFR2-IL21R融合タンパク質は、炎症性サイトカインIL-17の生成を減少させ、このような効果はTNFR2-FとIL21R-Fc単一タンパク質と比較してより顕著で、抗炎症性サイトカインであるIL-10の生成もまた、TNFR2-FとIL21R-Fcよりさらに増加させる効果を示すのみならず、CIA関節炎誘発マウスモデルで関節リウマチの緩和または治療効果を示すので、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を自己免疫疾患予防及び治療用組成物の有効成分として有用に使用することができる。本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質の治療的に有効な量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などによって変化し得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性をともに考慮して適正量に決定されなければならない。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用され得る量を推定することも可能である。有効量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、HardmanandLimbird,eds.,GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics,10thed.2001年,PergamonPress;及びE.W.Martined.,RemingtonsPharmaceuticalSciences,18thed.1990年,MackPublishingCo.に記述されている。本発明の薬学組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、TNFR2-IL21R融合タンパク質の生体内送達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、MerckIndex,13thed.,MerckCo.Inc.に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びそれらの成分の中で1成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法で、またはRemingtonsPharmaceuticalScienceMackPublishingCompany,EastonPA,18th,1990年に開示されている方法を用いて、各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の組成物に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を0.0001~10重量で、好ましくは0.001~1重量を含む。本発明による組成物は目的とする方法によって、非経口投与例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、0.001~100mg/kgであり、好ましくは0.01~10mg/kgであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。また、本発明は、薬学的に有効な量のTNFR2-IL21R融合タンパク質を自己免疫疾患にかかった個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患治療方法を提供する。また、本発明は、薬学的に有効な量のTNFR2-IL21R融合タンパク質を個体に投与する工程を含む、自己免疫疾患予防方法を提供する。前記TNFR2-IL21R融合タンパク質において、TNFR2の細胞外領域を含む断片は、配列番号2のアミノ酸の23番~179番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、IL21Rの細胞外領域を含む断片は、配列番号3のアミノ酸の21番~231番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21R融合タンパク質は、200~250個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質に含まれるFcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはCH2とCH3不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、TNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル-及びアミノ-末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質は、2当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのFc重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質のTNFR2、IL21R部分は、2当量以上のTNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいが、これに限定されない。本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質は、炎症性サイトカインIL-17の生成を減少させ、TNFR2-FとIL21R-Fcと比較した時、より有意に減少させることを確認することができ、抗炎症性サイトカインであるIL-10の生成をTNFR2-FcとIL21R-Fcよりさらに増加させ、また破骨細胞の分化を抑制する効能がTNFR2-FcとIL21R-Fcより効果的なので、自己免疫疾患の治療方法として有用に使用することができる。本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質の治療的に有効な量は、多くの要素、例えば投与方法、目的部位、患者の状態などによって変化し得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性及び効率性をともに考慮して適正量に決定されなければならない。動物実験を通じて決定された有効量からヒトに使用する量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮するこのような事項は、例えば、HardmanandLimbird,eds.,GoodmanandGilmansThePharmacologicalBasisofTherapeutics,10thed.2001年、PergamonPress;及びE.W.Martined.,RemingtonsPharmaceuticalSciences,18thed.1990年,MackPublishingCo.に記述されている。本発明の薬学組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、TNFR2-IL21R融合タンパク質の生体内送達に相応しいものなら特別に制限されず、例えば、MerckIndex,13thed.,MerckCo.Inc.に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びそれらの成分の中で1成分以上を混合して用いることができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法で、またはRemingtonsPharmaceuticalScienceMackPublishingCompany,EastonPA,18th,1990年に開示されている方法を用いて、各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の組成物に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を0.0001~10重量で、好ましくは0.001~1重量を含む。組成物は目的とする方法によって、非経口投与例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用するか、経口投与することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日投与量は、0.001~100mg/kgであり、好ましくは0.01~10mg/kgであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。同時に、本発明は、自己免疫疾患予防及び治療用医薬として用いるための本発明による融合タンパク質を提供する。前記TNFR2-IL21R融合タンパク質において、TNFR2の細胞外領域を含む断片は、配列番号2のアミノ酸の23番~179番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、IL21Rの細胞外領域を含む断片は、配列番号3のアミノ酸の21番~231番を含むポリペプチドであることが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有することが好ましいが、これに限定されない。また、TNFR2-IL21R融合タンパク質は、200~250個のアミノ酸からなることが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、抗体の重鎖の不変領域ドメインに由来した断片を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質に含まれるFcドメインは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMからなる群から選択されることが好ましく、より好ましくはCH2とCH3不変ドメイン全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。また、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質は、TNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインのカルボキシル-及びアミノ-末端に抗体の重鎖の不変領域ドメイン領域全体または一部を含むことが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質は、2当量以上の抗体の重鎖の不変領域ドメインを有する形態を含むことを特徴とすることが好ましいが、これに限定されない。このような二つのFc重鎖は、ジスルフィド結合または他の共有結合で連結されたものが好ましいが、これに限定されない。TNFR2-IL21R融合タンパク質のTNFR2、IL21R部分は、2当量以上のTNFR2、IL21Rの細胞外水溶性ドメインの領域を有する形態を含むことが好ましいが、これに限定されない。前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、ループス、重症筋無力症、強直性脊柱炎、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、潰瘍性大腸カタル、クローン病、心臓弁膜症、多発性硬化症、全身性強皮症、自己免疫性肝炎からなる群から選択されるいずれか一つであることが好ましく、関節リウマチであることがさらに好ましいがこれに限定されない。以下、本発明を実施例、実験例及び製造例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例、実験例及び製造例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例に限定されるのではない。<実施例1>IL21R-Fcの製造<1-1>IL21R-Fcの発現ベクター製造IL21R-Fc発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合DNAライブラリー21CFrontierHumanGENEBank韓国生命工学研究院から購入。CloneID:hMU007690,plateNo.IRAH-24-A10,ベクター:pOTB7.を鋳型に用いて、IL21R遺伝子を発現させるための制限酵素SfiI配列を含む正方向プライマー配列番号4:5-agggggccgtgggggcccccgacctcgtctgctacac-3及び逆方向プライマー配列番号5:5-tagcggccgacgcggccaattcctttaactcctctgact-3を用いて、遺伝子を下記の条件で増幅した後、SfiI制限酵素で処理した後、pYK602-HIS-Fcベクターにサブクローニングした。PCR条件は、全体反応液が50μlの時、鋳型は100ngになるように入れ、pfuポリメラーゼゼノテック、韓国2.5unit、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ10pmole/50μl入れて、残りの量を蒸留水で満たして総50μlの反応液を調製した後、94°Cで2分後、94°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで1分を30サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、72°Cで10分間反応させてPCR産物を得た。増幅されたPCR産物及びベクターを、それぞれSfiI制限酵素で切断して37°Cで4時間反応させた後、ゲル精製用キットQIAGEN,28706,米国を用いて精製した。増幅されたPCR産物とベクターの割合を3150μg:150μgにして、1μlT4DNAリガーゼSDL01-R40k,Solgent,韓国と2μl10×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を20μlにして16°Cで16時間ライゲーションを行なった。ライゲーションしたプラスミドをE.coliDH5αに形質転換した後、アンピシリンを含んだLBプレートに撤いたspreading後、37°C培養器で16時間培養させた。コロニー生成後コロニーを10μlアンピシリンを含んだLB培地に広げた後、コロニーPCR方法を用いて、その中の4~5μlをPCR鋳型にして、PCRを行なって、IL21R遺伝子がpYK602-HIS-Fc発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。<1-2>IL21R-Fcの発現及び精製293E細胞を、DMEM500mlにFBSを50ml添加した培地を用いて、150mmプレートに70~80の面積を占める程度に細胞を植えた後、IL21R-Fc20μgとPEI40μgを1:2の割合で混合して常温で20分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。16~20時間経過後、血清が含まれていないDMEM培地20mlと交換して、細胞の上澄み液を2~3日に一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、5000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して精製する前まで4°Cで保管した。20個の150mmプレートから3日、5日、7日、9日目に集めた上澄み液総1lを精製した。上澄み液全体を0.22μmtop-filterPR02890Millipore,米国を用いてフィルターした後、5mlカラムにパッキングされている500μlのプロテインAビーズ17-1279-03,GEhealthcare,Swedenに結合させた。Peri-startポンプを用いて0.9ml/分で4°Cで一晩中結合させた後、100ml以上のPBSでカラムを洗浄して、0.1Mグリシン塩酸G7126,Sigma,米国を用いて6個の分画に分けて溶離し、1MトリスT-1503-5KG.Sigma.米国pH9.0で中和させた。その次に、IL21R-Fcを定量して、IL21R-Fcの発現がある分画を2~3個集めてアミコンウルトラUFC805024,Millipore,米国を用いて濃縮した後、PBS70011,Gibco,米国で10回程度バッファーを交換した。その結果、図2に示されるように培養上澄み液1lからIL21R-Fcを740ng/μlで総1.0mgを得た。<実施例2>TNFR2-Fcの製造<2-1>TNFR2-Fcの発現ベクター製造TNFR2-Fc発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合DNAライブラリー21CFrontierHumanGENEBank韓国生命工学研究院から購入。CloneID:hMU013725,plateNo.IRAU-86-H09,ベクター:pDNR-LIBを鋳型に用いて、TNFR2遺伝子を発現させるための制限酵素SfiI配列を含む正方向プライマー配列番号6:5-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3及び逆方向プライマー配列番号7:5-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3を用いて遺伝子を下記の条件で増幅した後、SfiI制限酵素で処理した後、pYK602-HIS-Fcベクターにサブクローニングした。PCR条件は、全体反応液が50μlの時、鋳型は100ngになるように入れて、pfuポリメラーゼゼノテック、韓国2.5unit、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ10pmole/50μlを入れて、残りを蒸留水で満たして総50μlの反応液を調製した後、94°Cで2分、94°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分の30サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、72°Cで10分間反応させてPCR産物を得た。増幅されたPCR産物及びベクターを、それぞれSfiI制限酵素で切断して37°Cで4時間反応させた後、ゲル精製キットを用いて精製した。増幅されたPCR産物とベクターの割合を3150μg:150μgにして、1μlT4DNAリガーゼと2μl10×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を20μlにして16°Cで16時間ライゲーションを行なった。ライゲーションしたプラスミドをE.coliDH5αに形質転換した後アンピシリンを含んだLBプレートに撤いた後、37°Cの培養器で16時間培養させた。コロニー生成後、コロニーを10μlアンピシリンを含んだLB培地に広げた後、コロニーPCR方法を用いて、その中の4~5μlをPCR鋳型にして、PCRを行なって、TNFR2遺伝子がpYK602-HIS-Fc発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。<2-2>TNFR2-Fcの発現及び精製293E細胞を、DMEM500mlにFBSを50ml添加した培地を用いて、150mmプレートに70~80の面積を占める程度に細胞を植えた後、TNFR2-Fc20μgとPEI40μgを1:2の割合で混合して常温で20分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。16~20時間経過後、血清を含まないDMEM培地20mlと交換して、細胞の上澄み液は2~3日に一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、5000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して、精製する前まで4°Cで保管した。20個の150mmプレートから3日、5日、7日、9日目に集めた上澄み液総1lを精製した。全体上澄み液を0.22μmtop-filterを用いてフィルターした後、5mlカラムにパッキングされている500μlのプロテインAビーズに結合させた。Peri-startポンプを用いて0.9ml/分で4°Cで一晩中結合させた後、100ml以上のPBSでカラムを洗浄して0.1Mグリシン塩酸を用いて6個の分画に分けて溶離して、1MトリスpH9.0で中和させた。その次に、精製したタンパク質を定量してTNFR2-Fcの発現がある分画を2~3個集めてアミコンウルトラを用いて濃縮した後、PBS70011,Gibco,米国で10回程度バッファーを交換した。その結果、図4に示されるように培養上澄み液総1lからTNFR2-Fcを1mg/mlで精製されたタンパク質1.5mgを得た。<実施例3>TNFR2-IL21R融合タンパク質の製造<3-1>TNFR2-IL21R融合タンパク質の発現ベクター製造TNFR2-IL21R融合タンパク質の発現ベクターを製造するために、腎臓、胎盤、膵臓及び肝臓の混合DNAライブラリーを鋳型に用いて、TNFR2を発現させるための制限酵素SfiI配列を含む正方向プライマー及び逆方向プライマー配列番号8:5-tagcggccgacgcggccaacgtgcagactgcatccatgc-3を用いてTNFR2遺伝子を増幅して、IL21R遺伝子を増幅させるために正方向プライマーと逆方向プライマーを下記の条件で増幅した後、二つのPCR産物を1:1の割合で混合し、総100ngで鋳型として、三種類のプライマーを用いてPCRしてTNFR2-IL21R融合タンパク質をpYK602-HIS-Fcベクターにサブクローニングした。使用したPCR条件は、全体反応液が50μlの時、鋳型は100ngになるように入れて、pfuポリメラーゼゼノテック、韓国2.5unit、正方向と逆方向プライマーをそれぞれ10pmole/50μl入れて、残りを蒸留水で満たして総50μlの反応液を調製した後、94°Cで2分後、94°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで1分の30サイクル反復して遺伝子を増幅させた後、72°Cで10分間反応させてPCR産物を得た。増幅されたそれぞれのPCR産物を、SfiI制限酵素で切断して37°Cで4時間反応させた後、ゲル精製キットを用いて精製した。増幅されたPCR産物とベクターの割合を3150μg:150μgにして、1μlT4DNAリガーゼと2μl10×リガーゼバッファーを混合した後、総反応液を20μlにして16°Cで16時間ライゲーションを行なった。ライゲーションされたプラスミドをE.coliDH5αに形質転換した後、アンピシリンを含んだLBプレートに撤いた後、37°Cの培養器で16時間培養させた。コロニー生成後、コロニーを10μlアンピシリンを含んだLB培地に広げた後、コロニーPCR法を用いて、その中の4~5μlをPCR鋳型にして、PCRを行なって、TNFR2-IL21R融合タンパク質をコードする遺伝子がpYK602-HIS-Fc発現ベクターにサブクローニングされることを確認した。<3-2>TNFR2-IL21R融合タンパク質の発現及び精製293E細胞をDMEM500mlにFBSを50ml添加した培地を用いて、150mmプレートに70~80の面積を占める程度に細胞を植えた後、TNFR2-IL2R融合タンパク質20μgとPEI40μgを1:2の割合で混合して常温で20分程度反応させた後、細胞に滴下してトランスフェクションさせた。16~20時間経過後、血清を含まないDMEM培地20mlと交換して、細胞の上澄み液を2~3日ごとに一回ずつ集めた。上澄み液を得た後、5000rpmで10分間遠心分離した後、上澄み液のみを新しいビンに移して精製する前まで4°Cで保管した。10個の150mmプレートから3日、5日、7日目に集めた上澄み液総600mlを精製した。上澄み液全体を0.22μmtop-filterを用いてフィルターした後、5mlカラムにパッキングされている500μlのプロテインAビーズに結合させた。Peri-startポンプを用いて0.9ml/分で4°Cで一晩中結合させた後、100ml以上のPBSでカラムを洗浄して0.1Mグリシン塩酸を用いて6個の分画に分けて溶離して、1MトリスpH9.0で中和させた。その次に、精製したタンパク質を定量してTNFR2-IL21R融合タンパク質の発現がある分画を2~3個集めてアミコンウルトラを用いて濃縮した後、PBS70011,Gibco,米国で10回程度バッファーを交換した。その結果、図7に示されるようにTNFR2-IL21R融合タンパク質を380μg/mlで、総1mgを得た図7。<実験例1>TNFR2-IL21R融合タンパク質とリガンドの結合力測定<実施例>で製造したTNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質とそのリガンドであるTNF-αと結合して拮抗作用するかどうかを調べるために、結合力を測定する実験を行なった。ELISAプレート439454,Nunc,Denmarkを用いてウェル当り100ngのTNF-αC001-1MG,enzynomics,韓国でコーティングをした。コーティングは、4°Cで一晩中行なった。コーティングが完了したELISAプレートに、PBS200μlに4スキムミルク232100,Difco,Franceを入れた溶液を入れて、非特異的な反応を抑制するために常温でおおよそ1時間ブロッキングバッファー[PBS中、4スキムミルク]でブロッキングさせた。ブロッキングが終わったあと、ELISAプレートからブロッキングバッファーを除去して、それぞれの精製された融合タンパク質を1のスキムミルクをPBSに混合した溶液100μlに100nMで準備した後、それを1/4の希釈濃度で段階希釈をした後、常温でおおよそ2時間反応させた。その次に、200μlPBSでプレートを5回洗浄して2μlの2次抗体である抗ヒトFc-HRP31413,Thermo,米国を1スキムミルクを含有した4mlのPBSに混合した後、ELISAプレートに一ウェル当り200μlずつ入れた後、常温で1時間反応させた。反応後、ELISAプレートの2次抗体を除去した後、200μlのPBSで5回洗浄し、ウェル当り10μlの過酸化水素溶液H2O2,H1009-100ML,Sigma,米国と10mlのPCバッファー[5.1gクエン酸モノハイドレート、7.3gリン酸ナトリウムpH5.0/l]、そしてOPD錠剤P8787-100TAB,Sigma,米国1個を混合して総100μlに調製した反応液を入れた。反応液を入れた後、常温の暗い状態で10分間反応させた後、発色を確認して、反応を中断させるSTOPバッファーを一ウェル当り50μlずつ入れて反応を終了させ、ELISAリーダーで490nmの波長でKdの値を測定した。その結果、図8に示されるように、TNF-αリガンドはTNFR2-IL21R融合タンパク質と低いKd値を示すことから、高い結合力を確認することができた図8。<実験例2>TNFR2-IL21R融合タンパク質の炎症性サイトカイン抑制測定<2-1>末梢血液単核細胞分離健康な人からヘパリン処理された注射器を用いて血液を採取した後、PBSと1:1の割合で希釈した。フィコールFicollAmerchamBiosciences,Burkinghamshire,英国と希釈した血液の割合が1:4になるようにして、フィコール層に混じらないように血液を浮かべた後、2000rpm、20°Cの条件で30分間遠心分離して軟膜層から末梢血単核細胞PBMCを分離した。分離した細胞をPBSで洗浄した後、10牛胎児血清Gibco,Burlingame,CA,米国を含んだ細胞培養液RPMI1640GibcoBRLに1×106細胞/mlで希釈した。<2-2>Th17細胞培養実験例<2-1>に記載した末梢血単核細胞を10牛胎児血清を含んだ細胞培養液RPMI1640で5×105細胞/500μlの細胞で48ウェルプレートNalgeNuncInternational,IL,米国に分注し、これら細胞にTNF-αとIL-21に対するTNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を10μg/mlの濃度で処理して1時間培養した。1時間後、細胞をピペットを用いて底に付いた細胞を取り離して、抗-CD3BDPharmingen,SanDiego,CA,米国が0.3μg/mlでコーティングされた48ウェルプレートに移して、末梢血液単核細胞をTh17細胞に分化誘導させるためにIL-6RDSystems,Minneapolis,MN,米国20ng/ml、IL-23RDSystems10ng/ml及びIL-1βRDSystems5ng/mlを処理して、37°C、5CO2環境の培養器で72時間培養した。72時間培養の間、培地交換及び追加刺激はしなかった。<2-3>RT-PCR実施例<2-2>の72時間培養した細胞から総RNAをRNAzol-BMolecularResearchCenter,Cincinnati,OH,米国を用いて抽出した。総2μgのRNAにランダムプライマーGenotech,Daejeon,韓国1μlを加えて、70°Cで5分間放置した後、すぐ氷に入れて急冷させて、4μlの5×M-MULVバッファー、1μlの10mMdNTP、0.5μlリボヌクレアーゼ阻害剤Takara,Shiga,日本と混合した後、総反応液が19μlになるように蒸留水9.5μlを加えた。25°Cで5分間反応後、1μlの逆転写酵素M-MULVTakara,Shiga,日本を処理して25°Cで5分、42°Cで60分、72°Cで10分間反応させてcDNAを得た。このように生成されたcDNA産物を鋳型にして、逆転写重合酵素連鎖反応RT-PCRを施行した。RT-PCRのための反応化合物は、一サンプル当り総25μlになるようにし、溶液の組成は10×反応バッファー2.5μl、0.5mMのdNTP2.5μl、Taq0.3μlTakara,shinga,日本及びターゲット正方向と逆方向プライマーそれぞれ2μlとcDNA1μl及び14.7μlの蒸留水を含む。増幅のために、Dual-bayThermalcyclersystemMJResearchを用いた。陰性対照群に抽出したcDNAの代わりに蒸留水を用いて、PCR産物が観察されないことを通じてPCR汚染がないことを確認した。IL-21は、94°Cで3分変性過程を経た後、94°Cで30秒、56°Cで30秒、72°Cで30秒間の反応を30回反復した後、伸長のために72°Cで7分間反応を行った。IL-17増幅条件は、94°Cで3分の変性過程を経た後、94°Cで1分、56°Cで1分、72°Cで1分間の反応を30回反復した後、72°Cで7分間反応を行った。RORcとβアクチンは、94°Cで3分間の変性過程を経た後、94°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒間の反応をそれぞれ30回、26回反復した。重合酵素反応によって得られた増幅産物は、臭化エチジウムを含んだ1.5アガロースゲルに電気泳動させた後、Gel-Doc2000Bio-radLaboratories,Hercules,CAで画像を得て、Quantity-OneBio-radプログラムを用いて増幅産物を濃度計測法で定量した。この値をβアクチンとの比率に換算して各細胞群間のmRNA発現程度を比較した。用いたプライマー配列は下記のとおりである:IL-21;5-CTTACCTGGCAAGACCAGTATGA-3配列番号9;5-GTAGAAGGCAGGGTCTTCGTAAT-3配列番号10;IL-17;5-TGAAGTGCTGTCTGGAGCAG-3配列番号11;5-TCCTCAGAATCATCCATGTC-3配列番号12;RORc;5-AGTCGGAAGGCAAGATCAGA-3配列番号13;5-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3配列番号14;βアクチン;5-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3配列番号15;5-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3配列番号16。増幅産物をβアクチン発現の割合によって換算して各mRNAの発現程度を比較した。その結果、Th17細胞の分化条件では、炎症性サイトカインであるIL-17及びIL-21Th17細胞の分化過程で発現されると報告された特定転写因子であるRORcのmRNA発現が高かった。しかし、同一条件のTh17細胞にTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した場合、IL-17、IL-21及びRORc遺伝子の発現が顕著に抑制されることを観察することができた図9。<2-4>TNFR2-IL21R融合タンパク質のIL-17生成減少測定TNFR2-IL21R融合タンパク質によってIL-17タンパク質の生成が減少するかどうかを確認するために、実験例<2-3>で培養したTNFR2-IL21R融合タンパク質が処理されたTh17細胞の上澄み液で、炎症性サイトカインIL-17タンパク質の量をELISA法を用いて測定した。サンドイッチELISA用96ウェルプレートに、IL-10RDSystems抗体を2μg/mlで1ウェルに100μl入れて常温で2時間反応させた後、1牛血清アルブミンBSAを0.05PBST[PBS中0.05ツイーン20]に混合したブロッキングバッファー200μlを添加して室温で2時間反応させた。標準試料に用いるヒト組換えIL-10RDSystemsは、各5,000~78.125pg/mlの濃度で段階希釈して準備した。標準試料とともに測定する実験例<3-1>の細胞培養上澄み液を100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させた。反応後、0.05PBST300μlで4回洗浄して、ビオチンが結合された抗-ヒトIL-10RDSystemsを200ng/mlの濃度に希釈して、100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させた。反応後、PBSTで4回洗浄して、エクストラアビジンアルカリフォスファターゼ接合体Sigma,Louis,MO,米国を1:2,000に希釈して、100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させて、PBSTで洗浄後、フォスファートジナトリウム塩ヘキサハイドレートPhosphateDisodiumsaltHexahydrate,PNPP/DEA溶液を1mg/ml濃度で100μl添加して反応させた。反応後、0.2NNaOH100μlを入れて反応を止めて、405nm波長で吸光度を測定した。その結果、図9に示されるように、Th17細胞が分化刺激条件の下で炎症性サイトカインであるIL-17タンパク質の生成物が増加するが、本発明のTNFR2-IL21R融合タンパク質を10μg/mlを処理した場合、TNFR2-Fc、IL21R-Fcを処理した群に比較してIL-17の生成がより効果的に減少することを確認した図9。<実験例3>TNFR2-IL21R融合タンパク質のFoxP3発現及びIL-10生成増加測定<3-1>TNFR2-IL21R融合タンパク質のFoxP3発現測定TNFR2-IL21R融合タンパク質が、Th17細胞反応を抑制するのと同時に自己抗原に対する均衡を維持して自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるTregの作用に相乗効果を誘導することができるかどうかを調べるために、Treg細胞で生成される転写因子であるFoxP3の発現をフローサイトメトリー法を用いて測定した。実験例<2-2>に記載した方法で分化が誘導されたTh17細胞に、TNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を10μg/ml処理して、1時間培養した後、前記と同一な細胞刺激によって細胞を3日間培養して、PMA25ng/ml、イオノマイシンIonomycine250ng/mlとゴルジストップGolgistopBDPharmingen,SanDiego,CA,米国を5時間前処理した。細胞を集めてペリジニン葉緑素タンパク質が融合されたヒトCD4に対する抗体PeridininchlorophyllproteinPerCP-anti-humanCD4,Bioscience,SanDiego,CA,米国及びアロピコシアニンが融合されたヒトCD25に対する抗体allophycocyaninAPC-抗-ヒトCD25e-Bioscience,SanDiego,CA,米国抗体を20μl/1×106細胞で処理して、4°C暗所で30分間反応させた後、FACSバッファー[0.002アジ化ナトリウム、0.2BSAinPBS]で洗浄した。浸透性バッファー1mlを処理して30分間反応させた。浸透性バッファーで細胞を洗浄した後、ヒトFoxP3に対するフルオレセイン抗体Fluoresceinisothiocanate-anti-humanFoxP3,e-Bioscience,SanDiego,CA,米国を20μl/1×106細胞に処理して、4°C、暗所で30分間反応させた。浸透性バッファーで細胞を洗浄した後、上澄み液を捨ててFACSバッファーを入れてフローサイトメトリー機FACSCalibur,BectonDickinson,SanDiego,CA,米国で分析した。その結果、図10に示されるように、Tregの代表的転写因子であるFoxP3の発現は、TNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時、TNFR2-FcやIL21R-Fcに比較してより効果的にFoxP3の発現を増加することを確認することができた図10。<3-2>TNFR2-IL21R融合タンパク質のIL-10生成増加測定TNFR2-IL21R融合タンパク質が、Th17細胞反応を抑制するのと同時に自己抗原に対する均衡を維持して自己免疫から保護する役割をする免疫抑制細胞であるTregの作用に相乗効果を誘導することができるかどうかを調べるために、Treg細胞で生成される抗炎症性サイトカインIL-10タンパク質をELISA法を用いて測定した。サンドイッチELISA用96ウェルプレートに、IL-10RDSystems抗体を2μg/mlで1ウェルに100μl入れて常温で2時間反応させた後、1牛血清アルブミンBSAを0.05PBSTに混合したブロッキングバッファー200μlを添加して室温で2時間反応させた。標準試料に用いるヒト組換えIL-10RDSystemsは、各5,000~78.125pg/ml濃度に段階希釈して準備した。標準試料とともに測定する実験例<3-1>の細胞培養上澄み液を100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させた。反応後、0.05PBST300μlで4回洗浄して、ビオチンが結合された抗ヒトIL-10RDSystemsを200ng/mlの濃度に希釈して、100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させた。反応後、PBSTで4回洗浄して、エクストラアビジンアルカリフォスファターゼ接合体Sigma,Louis,MO,米国を1:2,000に希釈して100μl/ウェルずつ入れて室温で2時間反応させて、PBSTで洗浄後、フォスファートジナトリウム塩ヘキサハイドレートPNPP/DEA溶液を1mg/ml濃度で100μl添加して反応させた。反応後、0.2NNaOH100μlを入れて反応を止めて、405nm波長で吸光度を測定した。その結果、図10に示されるように、Th17細胞分化条件にTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時、TNFR2-Fc、IL21R-Fcを処理したものに比較して、IL-10の生成が統計的に有意にさらに増加することを確認した図10。<実験例4>TNFR2-IL21R融合タンパク質の破骨細胞分化減少測定<4-1>破骨細胞培養健康な人からヘパリン処理された注射器を用いて血液を採取した後、PBSと1:1の割合で希釈した。フィコールと希釈した血液の割合が1:4になるようにして、フィコール層に混じらないように血液を浮かべた後、2000rpm、20°Cの条件で30分間遠心分離して軟膜層から末梢血単核細胞PBMCを分離した。分離した細胞をPBSで洗浄した後、10牛胎児血清を含んだαMEMInvitrogen、Burlingame,CA,米国に混合して、24ウェルプレートに5×105細胞/500μlで分注して37°C、5CO2環境の培養器で2時間培養した。2時間後プレート底に付かない細胞を除去して、PBSで洗浄した後、新しい10αMEM細胞培養液を500μl入れて組換えヒト大食細胞コロニー刺激因子recombinanthumanmacrophage/monocytecolony-formingfactor,M-CSFRDSystems,Minneapolis,MN,米国100ng/mlで細胞を刺激して3日間培養した。3日後、PBS洗浄後、培地を新しい10αMEM培養液に交換して、rhM-CSF25ng/ml及び核因子カッパーBリガンドの受容体活性剤receptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand,RANKLPeprotech,London,UK30ng/mlで刺激して、TNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を条件によってそれぞれ10μg/ml処理して培養した。3日ごとに培養液を交換して前記刺激条件によって処理した。細胞分化状態を観察して刺激回数を決定した。<4-2>破骨細胞染色前記の分化された細胞に、TNF-αとIL-21に対するTNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した後、前記方法で破骨細胞分化を誘導した。分化された破骨細胞を、10ホルマリンを入れて10分間反応させて固定し、それら細胞をPBSで3回洗浄して、TRAPTartrate-resistantacidphosphatase染色KitSigma,Louis,MO,米国を通じて、分化された破骨細胞を調査した。あらかじめ加温しておいた37°Cの滅菌した蒸留水45mlにキット内のfastGarmetGBCBasr溶液500μlと亜硝酸ナトリウム溶液500μlをよく混合した。この混合溶液に、ナフトールAS-BIフォスファート溶液500μl、アセテート溶液2ml、酒石酸塩溶液1mlを順に入れた後、よく混合して固定した細胞に200μlずつ入れて、37°Cで30分間染色反応を実施した後、染色程度を観察して反応時間を調節した。TRAP陽性赤紫色で核が3個以上の多核細胞を破骨細胞とみなし、これを光学顕微鏡で計測した。実験は、3回以上施行し4群ウェルに分けて実験し、結果を平均値±標準偏差で示した。その結果、図11に示されるように、M-CSF及びRANKLの刺激で破骨細胞の分化が活発に起きたことを観察することができ、このような分化はTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時、TNFR2-FcとIL21R-Fcを処理したものに比較してより効果的に分化を抑制することを確認することができた図11。<4-3>カテプシンCathepsinKの発現測定前記の分化された細胞にTNFR2-Fc、IL21R-Fc及びTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した細胞からRNAを得て、実験例<2-3>に記載したRT-PCR方法を用いてcDNAを合成した後、カテプシンKの発現を測定した。その結果、図11に示されるように、M-CSF及びRANKLの刺激で発現したカテプシンKがTNFR2-IL21R融合タンパク質を処理した時、TNFR2-FcとIL21R-Fcを処理したものに比較してより効果的に発現が減少することを確認することができた図11。<実験例5>TNFR2-IL21R融合タンパク質のCIA関節炎誘発マウスの関節炎治療効果確認本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質の関節炎治療効果を確認するために、コラーゲン誘導による関節炎CIAcollageninducedArthritisマウスモデルにTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与して治療効果を確認した。具体的に、CIA誘導をさせるために、6週齢の雄DBA/1Jマウスオリエントバイオに、completeFreundsadjuvantCFAと同量で混合したII型コラーゲンCII100μgを尾に注射して、1回免疫化反応を行なった。6匹ずつ、各実験群に分けた後、7日後からIL21R/TNFR2-FcTNFR2-IL21R融合タンパク質50μg、エンブレル100μgをそれぞれ腹腔内注射I.P.方法で週3回ずつ3週間総9回注入した。1回免疫化反応を開始点にして観察者三人が毎週3回ずつ関節炎症の重症度を評価した。関節炎評価は、Rosoliniecなどによる平均関節炎指数meanarthriticindexに基づいて下記の尺度によって付けた点数を合わせて4で割った平均値を得て、再び各マウスから3人の観察者が得た数値を合算して割った平均値を用いる。発生率は、一足を25にして腫れた足の数を点数化した:0点:むくみや腫脹がない;1点:足または足首関節に限った軽いむくみと発赤;2点:足首関節から中足骨にかけた軽いむくみと発赤;3点:足首関節から中足骨にかけた中程度のむくみと発赤;及び4点:足首から足全体にかけてむくみと発赤がある場合。その結果、図12に示されるように本発明による精製されたTNFR2-IL21R融合タンパク質をCIA関節炎誘発マウスモデルに投与した後、臨床スコアと発生率を観察した時、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与した群で優れた関節炎治療効果を示すことを確認することができ、このような効果は関節炎治療剤に使用されるエンブレルを投与した陽性対照群と比較してより優れていた図12。<実験例6>免疫組織化学染色法を通じたTNFR2-IL21R融合タンパク質のCIA関節炎誘発マウスの関節炎緩和効果確認前記<実験例5>で用いたCIA関節炎誘発マウスに、TNFR2-IL21R融合タンパク質及びエンブレルを投与した実験群マウスの関節を採取して、免疫組織化学染色法を用いて関節浸潤、炎症及び軟骨の破壊程度を確認した。具体的に、免疫組織化学染色法を行なうために、まず前記TNFR2-IL21R融合タンパク質及びエンブレルをそれぞれ投与したCIA関節炎誘発マウスの関節を採取して、10中性緩衝ホルマリンで固定させて、EDTAを用いて骨を脱灰させた。続いてパラフィンに包埋して関節組織を7μmの厚さの切片に作ってスライドに付着した。基本染色を進行する前にキシレンを用いた脱パラフィン過程を経て、エチルアルコールを高濃度から低濃度まで含水させ、染色過程はヘマトキシリンとエオジン染色を進行した。また、軟骨に含まれたプロテオグリカンを感知することができるサフラニンOとトルイジンブルー法を用いて炎症と軟骨組織の破壊程度を測定した。その結果、図13に示されるようにCIA関節炎誘発マウスモデルにTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与した時、何も投与しないCIA関節炎マウスモデルと比較して、細胞の浸潤が減少していることを観察することができ、サフラニンO及びトルイジンブルー法を通じて炎症及び軟骨の破壊も緩和されることを観察することができた図13。<実験例7>免疫組織化学染色法を通じたTNFR2-IL21R融合タンパク質のCIA関節炎誘発マウスの炎症減少効果確認前記<実験例5>で用いたCIA関節炎誘発マウスに、TNFR2-IL21R融合タンパク質及びエンブレルを投与した実験群マウスの関節を採取して、免疫組織化学染色法を用いて炎症因子の発現を観察した。まず、前記TNFR2-IL21R融合タンパク質及びエンブレルを投与したCIA関節炎誘発マウスの関節を採取して、10中性緩衝ホルマリンで固定させて、EDTAを用いて骨を脱灰させた。続いてパラフィンに包埋して関節組織を7μmの厚さの切片に作ってスライドに付着した。基本染色を進行する前に、キシレンを用いた脱パラフィン過程を経てエチルアルコールを高濃度から低濃度まで含水させた。免疫化学染色法用いて炎症性サイトカインであるIL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6とRANKReceptoractivatorofnuclearfactor-κB、VEGFVascularendothelialgrowthfactorを染色して光学顕微鏡で観察した。その結果、図14に示されるように、CIA関節炎誘発マウスと比較して、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与した群で、炎症性サイトカインであるIL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6の発現が減少することを観察することができ、新生血管生成の主要因子であるVEGF及び破骨細胞分化を示す因子であるRANKの発現はほとんど観察されなかった。このようなTNFR2-IL21R融合タンパク質を投与した群で観察される炎症性サイトカイン、VEGF、RANKの発現様相は、エンブレルを投与した群と類似で、これを通じて本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質が関節炎の治療に有用できることを確認することができた図14。<実験例8>CIA関節炎誘発マウスのCII特異的IgG2a生成量測定前記<実験例5>で用いたCIA関節炎誘発マウスはII型コラーゲンCIIを1回投与して免疫化した。その後、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を週3回ずつ3週間、総9回にわたって注入した。このように注入する過程によって、血液の中でCIIの含量の変化を測定した。DABマウスにcompleteFreundsadjuvantCFAと同量で混合したII型コラーゲンCII100μgを尾に注射した後、1週間後、本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を3週にわたって総9回注入した。その過程中、TNFR2-IL21R融合タンパク質を注入する前0回、一回目注入後、六回目注入後、及び最後の注入後から6時間~12時間以内に、マウスの目から血液を採血して血清を獲得した。CII-specificIgG2aの量を測定するため、CII抗体を1:1,000に希釈して96ウェルプレートにコーティングして2時間反応させた。コーティングバッファーを除去した後、IgGブロッキングバッファーをウェル当り200μlずつ入れて、常温で1時間反応させた。その後、実験群及び対照群の血清を希釈して50μlずつ入れて常温で1時間反応させた。IgGウォシングバッファーで5回洗浄した後、抗マウスIgGHRPを1:75,000に希釈してウェル当り50μlずつ入れて常温で1時間反応させた。反応後、IgGウォシングバッファーで5回洗浄した後、TMB基質溶液と反応させた後、色変化を1NH2SO4を用いて停止させた後、ELISAリーダー機を用いて450nm波長でO.Dを測定した。その結果、図15に示されるようにどのようなFc融合タンパク質も注入されないCIA関節炎誘発マウスでは、時間によるCII-特異的IgG2aの量に変化が観察されなかったが、TNFR2-IL21R融合タンパク質を注入した群では、注入回数が増加するほどCII-特異的IgG2aの量が減少することを観察することができた。また、エンブレル注入群でも1次注入後の測定されたO.D値が注入前と比較して若干増加したように観察されるが、エンブレル追加注入後は生成が減少する傾向を示した図15。<実験例9>CIA関節炎誘発マウスの脾臓のTh17及びTreg細胞発現量測定本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を注入したCIA関節炎誘発マウスのTh17とTreg細胞発現に及ぼす影響を確認するために、前記<実験例5>で用いたマウスの脾臓組織を採取して、Th17CD4IL-17である細胞及びTregCD4CD25Foxp3である細胞を共焦点染色を通じて観察した。具体的に、前記<実験例5>CIA関節炎誘発マウスの脾臓を採取して、OCT化合物で包埋させた後、液化窒素を用いて急速冷凍させた組織を冷凍切片機を用いて7μm厚さでスライドに付着した。スライドに付着した切片をアセトンで固定後、10正常ヤギ血清で30分間非特異的反応を遮断させた。TregマーカーであるCD4、CD25、Foxp3の染色は、それぞれPE-標識された抗-CD4抗体、アロピコシアニンAllophycocyanin-標識された抗-CD25抗体Biolegend、FITC-標識された抗-Foxp3Ab抗体を用いて行ない、Th17マーカーであるCD4、IL-17はビオチニル化抗-CD4抗体BDBiosciences、PE-標識された抗-IL-17抗体を用いた。前記抗体をPBSpH7.5に1:100の比率で希釈した後、前記スライドに付着した組織と4°Cでひと晩反応させて、翌日バイオチニル化抗-CD4抗体を用いた組織には追加でストレプトアビジンcy-3を常温で2時間反応させた。PBSを用いて3回洗浄した後、染色された組織を共焦点顕微鏡LSM510Meta.Zeiss,Gottingen,Germanyを用いて観察した。その結果、図16に示されるように、CIA関節炎誘発マウスに本発明によるTNFR2-IL21R融合タンパク質を注入したマウスの脾臓組織で、Foxp3である細胞の数が、何も注入されていないCIA関節炎マウスに比較して増加することを観察することができたが、一方、CD4IL-17であるTh17の発現の場合、TNFR2-IL21R融合タンパク質またはエンブレルを注入した群で、何も注入されていないCIA関節炎マウスに比較して発現が減少したことを観察することができた図16。下記では、本発明の組成物のための製造例を提示する。<製造例1>薬学的製剤の製造<1-1>散剤の製造TNFR2-IL21R融合タンパク質2g乳糖1g前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。<1-2>錠剤の製造TNFR2-IL21R融合タンパク質100mgとうもろこし澱粉100mg乳糖100mgステアリン酸マグネシウム2mg前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。<1-3>カプセル剤の製造TNFR2-IL21R融合タンパク質100mgとうもろこし澱粉100mg乳糖100mgステアリン酸マグネシウム2mg前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。<1-4>丸薬の製造TNFR2-IL21R融合タンパク質1g乳糖1.5gグリセリン1gキシリトール0.5g前記の成分を混合した後、通常の方法によって1丸薬当り4gになるように製造した。<1-5>顆粒の製造TNFR2-IL21R融合タンパク質150mg台も抽出物50mgブドウ糖200mg澱粉600mg前記の成分を混合した後、30エチルアルコール100mgを添加して60°Cで乾燥して顆粒を形成した後、包に充填した。"