"選択された配列を捕捉および増幅する方法であって、a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団および表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を含む基質を得ることであって、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団のメンバーは、前記基質上で空間的にアドレス指定されていないものであることと、b前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーを、前記第1のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム配列を含有する領域を含む選択オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、c前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の前記第1のメンバーを伸長させて、前記ゲノム配列に相補的な配列を含む支持体結合選択プライマーを生成することと、d前記支持体結合選択プライマーを、前記ゲノム配列を含む核酸断片とハイブリダイズさせることと、e前記支持体結合選択プライマーを伸長させて、前記ゲノム配列に隣接する配列を含有する伸長産物を生成することと、f前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団の伸長されていないメンバーを使用して、前記基質上で前記伸長産物を増幅して、PCR産物を生成することと、を含む方法。前記核酸断片は、5’末端アダプターを含むアダプターをライゲートしたゲノム断片であり、前記伸長は、その3’末端に前記アダプターに相補的な配列を含む伸長産物を生成し、前記表面結合オリゴヌクレオチドの前記第2の集団のメンバーは、前記ブリッジPCRの間に前記アダプターに相補的な前記配列とハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。前記5’末端アダプターは、前記ゲノム断片にライゲートされた末端に配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項2に記載の方法。前記方法は、ステップeとfの間に、前記伸長産物の前記3’末端上にアダプターをライゲートすることを含み、前記表面結合オリゴヌクレオチドの前記第2の集団のメンバーは、前記増幅の間に前記アダプターとハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。前記アダプターは、前記核酸断片にライゲートされた末端に配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項4に記載の方法。前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団は、i.表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団のメンバーを、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団の前記メンバーとハイブリダイズする領域および前記核酸断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、ii.前記表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団の前記メンバーを伸長させて、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を生成することと、によって作製される、請求項1に記載の方法。前記選択オリゴヌクレオチドは、前記第1のメンバーとハイブリダイズする前記領域と前記ゲノム配列を含有する前記領域との間に配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項1に記載の方法。前記PCR産物の第1の鎖を配列決定して、前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記PCR産物の第2の鎖を配列決定して、前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項1に記載の方法。断片化されたゲノムを生成するために哺乳動物のゲノムを断片化することと、任意で、前記断片化されたゲノムにアダプターを付加することと、前記基質に前記断片化されたゲノムを適用することと、を含む、請求項1に記載の方法。前記断片化は、物理的に、化学的に、または制限酵素を使用して行われる、請求項10に記載の方法。前記断片化は、超音波処理または剪断によって行われる、請求項11に記載の方法。前記ハイブリッド形成は、複数の異なる個体からの複数の断片化されたゲノムを調製することと、プールを生成するために前記複数の断片化されたゲノムをプールすることと、前記断片化されたゲノムのプールを前記基質に適用することと、前記異なる個体の前記ゲノム配列に隣接する配列を含むPCR産物を得ることと、によって行われる、請求項10に記載の方法。前記PCR産物の少なくとも前記第1の鎖を配列決定して、前記異なる個体の前記ゲノム配列に隣接する前記配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得ることをさらに含む、請求項13に記載の方法。プールすることの前に、異なるアダプターが、前記異なる個体からの前記断片化されたゲノムにライゲートされ、前記アダプターは、前記PCR産物が配列決定された後に、前記アダプターをライゲートしたゲノム断片の源が同定されることを可能にするバーコード配列を含む、請求項13に記載の方法。第1のバーコード配列を含む第1のアダプターを使用して、第1の対象からの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートして、第1の産物を生成することと、第2のバーコード配列を含む第2のアダプターを使用して、第2の対象からの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートして、第2の産物を生成することと、前記第1および第2の産物を組み合わせて、混合鋳型を生成することと、前記混合鋳型を使用して請求項1の方法を行って、各々が前記バーコード配列を含有する第1および第2のPCR産物を提供することと、を含む、請求項15に記載の方法。前記混合された鋳型は、少なくとも1,000の対象からの断片化されたゲノムDNAを含む、請求項16に記載の方法。i.前記核酸断片を、配列決定プライマーのための部位および前記第2の表面結合オリゴヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を含有するアダプターにライゲートすることと、ii.前記アダプターをライゲートした断片を、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーとハイブリダイズさせることと、iii.前記アダプターをライゲートした断片がハイブリダイズされた前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の前記第1のメンバーを伸長させることと、iv.前記伸長産物の前記アダプターを含有する末端を、第2の支持体結合ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによってブリッジを生成し、ブリッジPCRを促進することと、を含む、請求項1に記載の方法。前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団は、前記核酸断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団にライゲートして、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を生成することによって作製される、請求項1に記載の方法。前記増幅は、ブリッジPCRによるものである、請求項1に記載の方法。前記核酸断片は、ゲノム断片またはcDNAである、請求項1に記載の方法。a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団および表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を含む基質であって、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団は、前記基質上で空間的にアドレス指定されていない、基質と、b前記第1の集団の第1のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム配列を含有する領域を含有する選択オリゴヌクレオチドと、cアダプターと、e請求項1に記載の方法を行うための指示と、を備える、システム。定義本明細書で特に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術および科学的用語は、本発明が属する技術の当業者に一般に理解されるのと同様の意味を持つ。本明細書に説明されるものと類似、または同等のあらゆる方法および材料は、本発明の実践または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を説明する。本明細書において言及される全ての特許および刊行物そのような特許および刊行物に開示される全ての配列を含むは、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。別途指定のない限り、それぞれ、核酸は、左から右に5’から3’方向に記載され、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ方向に記載される。本明細書に提供される見出しは、本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。したがって、下記に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより完全に定義される。別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有するものとする。Singleton,etal.,DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,2DED.,JohnWileyandSons,NewYork1994、およびHaleMarkham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y.1991は、本明細書において使用される用語の多くの一般的な意味を当業者に提供する。さらに、明確性のため、および参照しやすいように、特定の用語を以下に定義する。本明細書で使用される場合のサンプルという用語は、必ずしもというわけではないが典型的には液体形態の、1つ以上の対象となる分析物を含有する材料または材料の混合物に関連する。本明細書において使用される核酸サンプルは、それらが配列を含有する複数の異なる分子を含有するという点において複雑であり得る。哺乳動物例えば、マウスまたはヒト由来のmRNAから作製される断片化されたゲノムDNAおよびcDNAは、複雑なサンプルの種類である。複雑なサンプルは、104、105、106、または107より多くの異なる核酸分子を有し得る。DNA標的は、ゲノムDNA、cDNARNA由来、または人工DNA構築物等の任意の源から生じてもよい。核酸を含有する任意のサンプル、例えば、組織培養細胞から作製されたゲノムDNA、組織のサンプル、またはFPETサンプルが、本明細書において用いられ得る。ヌクレオチドという用語は、既知のプリン塩基およびピリジン塩基のみならず、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むことが企図される。そのような修飾は、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環を含む。さらに、ヌクレオチドという用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含有し、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく他の糖類も同様に含有し得る部分を含む。修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは、例えば、ヒドロキシル基の1つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で置換され、エーテル、アミン等として官能基化される、糖部分上の修飾も含む。核酸およびポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる、任意の長さ、例えば約2塩基超、約10塩基超、約100塩基超、約500塩基超、1000塩基超、約10,000塩基まで、またはそれ以上の長さのポリマーについて説明するために本明細書において交換可能に使用され、酵素的にまたは合成的に生成することができ例えば、米国特許第5,948,902号およびその中で引用される参考文献に記載されるようなPNA、2つの天然に発生する核酸のハイブリダイゼーションと同様の配列特異的な様式で天然に発生する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソンクリック塩基対形成相互作用に関与することができる。天然に発生するヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミンそれぞれ、G、C、A、およびTを含む。核酸サンプルという用語は、本明細書で使用される場合、核酸を含有するサンプルを表す。標的ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、研究中の対象となるポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、対象となり、かつ研究中である1つ以上の配列を含有する。本明細書で使用される場合のオリゴヌクレオチドという用語は、約2~200ヌクレオチド長、500ヌクレオチド長までのヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。オリゴヌクレオチドは、合成によるものであってもよいか、または酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態において、30~150ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体すなわち、オリゴリボヌクレオチドであってもよいまたはデオキシリボヌクレオチド単量体を含有してもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、10~20、11~30、31~40、41~50、51-60、61~70、71~80、80~100、100~150、または150~200ヌクレオチド長であってもよい。ハイブリダイゼーションという用語は、当該技術分野で既知であるように、核酸の鎖が塩基対合によって相補鎖に結合するプロセスを指す。2つの配列が、中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸は、参照核酸配列に対して選択的にハイブリダイズ可能であると考えられる。中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、既知である例えば、Ausubel,etal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,WileySons1995およびSambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,2001ColdSpringHarbor,N.Y.を参照のこと。高ストリンジェンシー条件の一例は、50ホルムアミド、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5SDS、および100ug/ml変性キャリアDNA中、約42°Cでのハイブリダイゼーション、それに続く2×SSCおよび0.5SDS中、室温での2回の洗浄、ならびに0.1×SSCおよび0.5SDS中、42°Cでのさらなる2回の洗浄を含む。二重鎖または二重鎖のという用語は、本明細書で使用される場合、塩基対合した、すなわち、一緒にハイブリダイズした、2つの相補的なポリヌクレオチドを説明する。本明細書で使用される場合の増幅するという用語は、標的核酸を鋳型として使用して標的核酸の1つ以上のコピーを作製することを指す。決定する、測定する、評価するevaluating、評価するassessing、アッセイする、および分析するという用語は、任意の形態の測定を指して本明細書において交換可能に使用され、ある要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的決定および/または定性的決定の両方を含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。~の存在を評価するは、存在する何かの量を決定すること、およびそれが存在するかしないかを決定することを含む。使用するという用語は、その従来の意味を有し、そのため、目的を達成するために方法または組成物を用いること、例えば、使用可能にすることを意味する。例えば、ファイルを作成するためにプログラムが使用される場合、ファイルを作成するためにプログラムが実行され、該ファイルは、通常、プログラムの出力である。別の例において、コンピュータファイルが使用される場合、目的を達成するために、コンピュータファイルがアクセスされ、読み取られ、ファイルに格納された情報が利用される。同様に、特有の識別子、例えば、バーコードが使用される場合、例えば、特有の識別子と関連付けられたオブジェクトまたはファイルを特定するために特有の識別子が読み取られる。本明細書で使用される場合、Tmという用語は、二重鎖の半分がハイブリダイズされた状態に留まり、二重鎖の半分が一本鎖へと解離する、オリゴヌクレオチド二重鎖の溶融温度を指す。オリゴヌクレオチド二重鎖のTmは、経験的に決定されてもよいか、または以下の式を用いて予測されてもよい:Tm=81.516.6log10[Na]0.41画分GC60/N、式中、Nは鎖の長さであり、[Na]は1M未満である。SambrookandRussell2001;MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarborN.Y.,ch.10を参照のこと。オリゴヌクレオチド二重鎖のTmを予測するための他の式が存在し、ある式は、所与の条件または条件のセットに大体適切であり得る。溶液中に遊離するという用語は、本明細書で使用される場合、別の分子に結合または係留されていないポリヌクレオチド等の分子を説明する。変性させるという用語は、本明細書で使用される場合、核酸二重鎖が2つの一本鎖に分離することを指す。ゲノム配列という用語は、本明細書で使用される場合、ゲノム中に生じる配列を指す。RNAはゲノムから転写されるため、この用語は、生物の核ゲノム中に存在する配列、およびそのようなゲノムから転写されたRNA例えば、mRNAのcDNAコピーに存在する配列も包含する。ゲノム断片という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ヒト、サル、ラット、魚もしくは昆虫、または植物のゲノム等の、動物または植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は、アダプターがライゲートされていてもまたはいなくてもよい。ゲノム断片は、アダプターがライゲートされていてもよいかその場合、分子の少なくとも5’末端に、断片の一末端または両末端にライゲートされたアダプターを有する、またはアダプターがライゲートされていなくてもよい。特定の場合において、本明細書に記載される方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、参照ゲノム領域、すなわち、既知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えばNCBIのGenbankデータベースまたは他のデータベースなどにその配列が登録されている染色体領域を使用して設計されてもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有するサンプルを使用するアッセイに用いられてもよく、テストゲノムは、オリゴヌクレオチドのための結合部位を含有する。ライゲートするという用語は、本明細書で使用される場合、第1のDNA分子の5’末端の末端ヌクレオチドが、第2のDNA分子の3’末端の末端ヌクレオチドに酵素的に触媒されて結合することを指す。アダプターという用語は、二本鎖および一本鎖の分子を指す。複数は、少なくとも2つのメンバーを含む。特定の場合において、複数は、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも100、少なくとも10,000、少なくとも100,000、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、または少なくとも109、またはそれ以上のメンバーを有してもよい。2つの核酸が相補的である場合、核酸のうちの一方の各塩基が他方の核酸中の対応するヌクレオチドと塩基対合する。相補的および完全に相補的という用語は、本明細書において同義的に使用される。プライマー結合部位は、プライマーが、オリゴヌクレオチドまたはその相補鎖中でハイブリダイズする部位を指す。分離するという用語は、本明細書で使用される場合、2つの要素の物理的分離例えば、サイズまたは親和性による等、および一方の要素が分解され、他方が未変化のまま残ることを指す。配列決定という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも10個の連続するヌクレオチドの同一性例えば、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、もしくは少なくとも200個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの同一性が得られる方法を指す。空間的にアドレス指定されていないオリゴヌクレオチドの表面結合集団を含有する基質の文脈において、空間的にアドレス指定されていないという用語は、互いに特定の順序または位置にない、すなわち、互いにランダムな位置にあるかまたはランダムに散在する異なるオリゴヌクレオチド分子を含有する表面を含む基質を指す。そのような基質は、平面状である必要はなく、特定の場合においてビーズの形態であってもよい。空間的にまたは光学的にアドレス指定された単一オリゴヌクレオチドの集団を含有する基質例えば、マイクロアレイおよびコードされたビーズ等は、この定義によって除外される。表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団が空間的にアドレス指定されていない、表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団および表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を含む基質は、基質全体にランダムに分布された異なるオリゴヌクレオチドの少なくとも2つの集団を含有する基質を指す。基質は、例えば、平面状またはビーズの形態であってもよい。アダプターをライゲートしたという用語は、本明細書で使用される場合、アダプターにライゲートされた核酸を指す。アダプターは、核酸分子の5’末端または3’末端にライゲートすることができる。伸長するという用語は、本明細書で使用される場合、ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの付加によるプライマーの伸長を指す。核酸にアニールされたプライマーが伸長されると、核酸が伸長反応のための鋳型としての役割を果たす。ブリッジPCRという用語は、固相ポリメラーゼ連鎖反応を指し、反応中に伸長されるプライマーがそれらの5’末端によって基質に係留される。増幅中、係留されたプライマー間に増幅産物がブリッジを形成する。ブリッジPCRまたクラスターPCRと称されてもよいは、Illumina社のSolexaプラットフォームにおいて使用される。ブリッジPCRおよびIllumina社のSolexaプラットフォームは、様々な刊行物、例えば、GudmundssonetalNat.Genet.200941:1122-6、OutetalHum.Mutat.200930:1703-12、およびTurnerNat.Methods20096:315-6、米国特許第7,115,400号、ならびに出願公開番号US20080160580号およびUS20080286795号に一般的に記載される。バーコード配列という用語は、本明細書で使用される場合、反応におけるポリヌクレオチドの源を同定および/または追跡するために使用される特有のヌクレオチドの配列を指す。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの5′末端または3’末端にあり得る。バーコード配列は、サイズおよび組成において大きく異なってもよく、以下の参考文献は、特定の実施形態に適切なバーコード配列のセットを選択するための目安を提供する:Brenner,米国特許第5,635,400号、Brenneretal,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-16702000、Shoemakeretal,NatureGenetics,14:450-4561996、Morrisetal,欧州特許公開第0799897A1号、Wallace,米国特許第5,981,179号等。特定の実施形態において、バーコード配列は、4~36ヌクレオチド、または6~30ヌクレオチド、または8~20ヌクレオチドの範囲の長さを有し得る。本明細書を通して他の用語の定義が記載される可能性がある。本発明の例示的実施形態の詳細な説明主題の方法の特定の特徴を、断片の基質へのハイブリダイゼーション前にアダプターが断片にライゲートされる実施形態を例示する図1を参照して説明する。代替の実施形態において、アダプターは、プロトコルの後半に加えられてもよい。本方法は、概して、互いに空間的に散在する異なる配列の少なくとも2つの表面結合オリゴヌクレオチドを含有する基質を得ることを含む。そのような基質は、現在のところIllumina社のSolexa配列決定技術に用いられており、様々な参考文献、例えば、米国特許第7,115,400号、ならびに公開番号第US20080160580号および第US20080286795号に記載されるこれらは、そのような開示のために、参照により組み込まれる。以下に記載する実施形態のうちのいくつかは、ゲノムの断片を単離するための方法の使用について説明し得る。これらの実施形態は、他の種類の配列、例えば、cDNAまたは合成DNAに、容易に適合させることができる。特定の実施形態において、表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーが、a配列決定プライマー部位を第1のメンバーおよび領域とハイブリダイズする領域、ならびにb標的ゲノム配列を含有する領域を含有する選択オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。第1の集団の十分な数のオリゴヌクレオチドが選択オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされていない状態を保ち、プロトコルの後半で行われるブリッジPCRステップに使用されるべく利用可能であるように、このステップで使用される選択オリゴヌクレオチドの量を最適化することができる。表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーは、標的ゲノム配列に相補的な配列を含有する支持体結合選択プライマーを含有する二重鎖を生成するために伸長される。伸長された支持体結合選択プライマーを残すために、選択オリゴヌクレオチドが変性によって除去される。次いで、伸長された支持体結合選択プライマーを、標的ゲノム配列、標的ゲノム配列に隣接する配列、および鎖の一方または両方の5’末端にアダプター配列を含有する、アダプターをライゲートしたゲノム断片化学的に、物理的に、または酵素を使用してゲノムDNAを断片化し、次いで、得られた断片の末端にアダプターをライゲートすることによって作製することができるとハイブリダイズさせる。ゲノム内のゲノム配列に隣接する配列と、アダプターをライゲートしたゲノム断片のアダプターの配列とを含有する産物を生成するために、支持体結合選択プライマーを伸長させる。いくつかの実施形態において、アダプターをライゲートしたゲノム断片のアダプターを、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団とハイブリダイズさせてもよい。しかしながら、特定の場合において、増幅前に、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団が、a第2のメンバーとハイブリダイズする領域およびアダプター配列を含有する含有する領域を含有する修飾オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされてもよい。このステップで使用される修飾オリゴヌクレオチドの量は、十分な数の産物分子がハイブリダイズするように最適化することができる。表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団の第2のメンバーは、アダプター配列に相補的な配列を含有する支持体結合アダプタープライマーを含有する二重鎖を生成するために伸長されてもよい。支持体結合アダプタープライマーを残すために、修飾オリゴヌクレオチドが変性によって除去される。次いで、ブリッジPCRによって産物を増幅することができる。図1bに例示するように、PCR産物を生成するために、第1の伸長されていない表面結合オリゴヌクレオチドおよび第2の表面結合オリゴヌクレオチドによって産物を増幅する。特定の場合において、ゲノム断片は、5’末端アダプターを含むアダプターをライゲートしたゲノム断片である。これらの場合、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーが、アダプターの補体とハイブリダイズする。代替の実施形態において、アダプターが伸長産物上にライゲートされてもよく、それによって表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団とハイブリダイズするアダプターを伸長産物の3’末端上に配置する。他の実施形態において、a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の伸長されていないメンバーと、bi.表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーを、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーとハイブリダイズする領域およびアダプターに相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、ならびにii.伸長産物の5’末端とハイブリダイズする支持体結合プライマーを生成するために、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーを伸長させることによって作製される支持体結合プライマーと、を使用して増幅が行われる。いくつかの実施形態において、ゲノム断片は、5’末端アダプターを含むアダプターをライゲートしたゲノム断片であり、伸長することによって、その3’末端上に、アダプターに相補的な配列を含む伸長産物を生成し、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーは、ブリッジPCRの間にアダプターに相補的な配列とハイブリダイズする。この実施形態において、5’末端アダプターは、ゲノム断片にライゲートされた末端に配列決定プライマーのための結合部位を含む。他の実施形態において、本方法は、ステップeとfの間に、伸長産物の3’末端上にアダプターをライゲートすることを含み、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーは、ブリッジPCRの間にアダプターとハイブリダイズする。これらの実施形態において、アダプターは、ゲノム断片にライゲートされた末端に配列決定プライマーのための結合部位を含む。いくつかの実施形態において、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団は、i.表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団のメンバーを、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることと、ii.表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を生成するために、表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団のメンバーを伸長させることによって作製される。いくつかの実施形態において、前記表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を生成するために、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団が、前記核酸断片の配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドを、表面結合オリゴヌクレオチドの最初の第2の集団にライゲートすることによって作製されてもよい。このライゲーションは、ライゲートされた2つのオリゴヌクレオチド間にブリッジを形成するスプリントオリゴヌクレオチドによって促進され得る。換言すると、修飾オリゴヌクレオチドは、支持体結合アダプタープライマーを作製するために、ブリッジを形成するオリゴヌクレオチドを使用して元となる固体支持体オリゴヌクレオチドの修飾を誘導する、ライゲーションに基づくプロセスによって導入されてもよい。同様に、支持体結合アダプタープライマーは、標的修飾に必要なプライマー伸長を作製するための同様のブリッジを形成するオリゴヌクレオチドを使用して作製することができる。いくつかの場合において、選択オリゴヌクレオチドは、前記第1のメンバーとハイブリダイズする前記領域と前記ゲノム配列を含有する前記領域との間に、配列決定プライマーのための結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ゲノム配列に隣接する配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、PCR産物の第1の鎖を配列決定することをさらに含んでもよい。この方法は、ゲノム配列に隣接する配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、PCR産物の第2の鎖を配列決定することをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、本発明は、断片化されたゲノムを生成するために哺乳動物のゲノムを断片化することと、任意で、断片化されたゲノムにアダプターを付加すること、および断片化されたゲノムを基質に適用することとを含んでもよい。断片化は、物理的に、化学的に、または制限酵素を使用して行われる。断片化は、例えば、超音波処理または剪断によって行われる。特定の場合において、複数の異なる個体から複数の断片化されたゲノムを調製し、複数の断片化されたゲノムをプールしてプールを生成し、断片化されたゲノムのプールを基質に適用し、異なる個体のゲノム配列に隣接する配列を含むPCR産物を得ることによって、ハイブリッド形成が行われてもよい。これらの実施形態は、異なる個体のゲノム配列に隣接する配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、PCR産物の少なくとも第1の鎖を配列決定することをさらに含んでもよい。特定の場合において、プールする前に、異なるアダプターが、異なる個体からの断片化されたゲノムにライゲートされ、アダプターは、PCR産物が配列決定された後に、アダプターをライゲートしたゲノム断片の源が同定されることを可能にするバーコード配列を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第1の産物を生成するために、第1のバーコード配列を含む第1のアダプターを使用して、第1の対象からの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートすることと、第2の産物を生成するために、第2のバーコード配列を含む第2のアダプターを使用して、第2の対象からの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートすることと、混合鋳型を生成するために第1および第2の産物を組み合わせることと、各々がバーコード配列を含有する第1および第2のPCR産物を提供するために、混合鋳型を使用して請求項1に記載の方法を行うこととを含む。混合鋳型は、いくつかの場合において、少なくとも1,000の対象からの断片化されたゲノムDNAを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、i.ゲノム断片を、配列決定プライマーのための部位および第2の表面結合オリゴヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を含有するアダプターにライゲートすることと、ii.アダプターをライゲートしたゲノム断片を、表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーとハイブリダイズさせることと、iii.アダプターをライゲートした断片がハイブリダイズされた表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の第1のメンバーを伸長させることと、iv.伸長産物のアダプターを含有する末端を第2の支持体結合ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、それによってブリッジを生成し、ブリッジPCRを促進することと、を含んでもよい。また、システムも提供される。特定の場合において、システムは、a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団および表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を含む基質であって、表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団は、基質上で空間的にアドレス指定されていない、基質と、b第1の集団の第1のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム配列を含有する領域を含有する選択オリゴヌクレオチドと、cアダプターと、e請求項1に記載に記載の方法を行うための指示と、を備えてもよい。標的ゲノム配列に隣接する配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、例えば、Illumina社のSolexaプラットフォーム、または別の固相配列決定法を使用して、PCR産物を配列決定してもよい。特定の実施形態において、本方法は、標的ゲノム配列に隣接する配列の源を可能にするバーコード配列を用いることができる。これらの実施形態において、アダプターをライゲートしたゲノム断片のアダプターは、PCR産物が配列決定された後に、アダプターをライゲートしたゲノム断片の源が同定されることを可能にするバーコード配列を含有してもよい。特定の実施形態において、この方法は、第1の産物を生成するために、第1のバーコード配列を含む第1のアダプターを使用して、第1の対象対象は、第1の対象のプールに含まれてもよいからの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートすることと、第2の産物を生成するために、第2のバーコード配列を含む第2のアダプターを使用して、第2の対象対象は、第2の対象のプールに含まれてもよいからの断片化されたゲノムDNAにアダプターをライゲートすることと、混合鋳型を生成するために第1および第2の産物を組み合わせることと、各々がバーコード配列を含有する第1および第2のPCR産物を提供するために、混合鋳型を使用して前述の方法を行うこととを含む。上記方法において、使用されるアダプターは、同じ配列を有し、かつ表面結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする部分と、バーコード配列を含有する異なるヌクレオチド配列を有する部分とを有する。選択された配列を増幅する第2の方法が提供される。この方法の原則は、前述の方法の原則と同様であるが、但し、a支持体結合選択プライマーとハイブリダイズされるゲノム断片はアダプターにライゲートされておらず、bアダプターは、支持体結合選択プライマーが伸長された後である。アダプターライゲーション、産物は、前述のようにブリッジPCR反応に用いられてもよい。前述の代替の実施形態におけるように、a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団の伸長されていないメンバーと、bi.表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーを、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーとハイブリダイズする領域およびアダプターの配列に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること、ならびにii.支持体結合プライマーを生成するために表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団のメンバーを伸長させることによって作製される支持体結合プライマーと、を使用して増幅が行われる。前述の方法と同様に、ゲノム配列に隣接する配列のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、PCR産物が配列決定されてもよい。代替の実施形態において、ゲノム断片は、配列決定プライマー結合部位だけではなく、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団と同じ配列も含有するアダプターにライゲートされてもよい。示されるように、伸長された表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団通常、高温で、すなわち、少なくとも90°Cで行われるを、アダプターをライゲートした断片とハイブリダイズさせて伸長させると、伸長産物は、表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団通常、低温で、例えば、60°C未満、例えば、55°C未満で行われるとハイブリダイズする配列を含有し、それによって第1および第2の表面結合オリゴヌクレオチドを使用してゲノム断片の増幅を促進する。この方法を図14に例示する。特定の実施形態において、第1の集団のオリゴヌクレオチドは、基質に適用される選択オリゴヌクレオチドの量に対して少なくとも5X、10X、20X、50X、または100X、500X、1,000X、2000X、10,000X、50,000Xモル過剰で存在する。一実施形態において、モル過剰は、5X~50,000Xモル過剰、例えば、100X~5,000Xモル過剰の範囲内であってもよい。特定の実施形態において、基質は、各々が、表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団のメンバーとハイブリダイズする領域領域は、異なる選択オリゴヌクレオチドにおいて同じヌクレオチド配列を有するおよびゲノム配列を含有する領域を含む、複数の異なる選択オリゴヌクレオチドと接触してもよい。選択オリゴヌクレオチドの各々のゲノム配列が異なるため、基質上でいくつかのゲノム領域を捕捉、増幅、および配列決定することができる。キット前述のように主題の方法を実践するためのキットも本開示によって提供される。特定の実施形態において、主題のキットは、a表面結合オリゴヌクレオチドの第1の集団および表面結合オリゴヌクレオチドの第2の集団を含む基質であって、表面結合オリゴヌクレオチドの第1および第2の集団は、基質上で空間的にアドレス指定されていない、基質と、b第1の集団の第1のメンバーとハイブリダイズする領域およびゲノム配列を含有する領域を含有する選択オリゴヌクレオチドと、を備えてもよい。またキットは、本方法において用いられてもよい前述および後述の他の試薬、例えば、アダプター、リガーゼ、ハイブリダイゼーションバッファー等を含んでもよい。前述の構成要素に加えて、標題のキットは、典型的には、主題の方法を実践するためにキットの構成要素を使用するための指示をさらに含む。主題の方法を実践するための指示は、通常、好適な記録媒体上に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチック等の基板上に印刷されてもよい。そのため、指示は、キットの容器またはその構成要素等の表示内に添付文書としてすなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに関連付けられてキット内に存在してもよい。他の実施形態において、指示は、例えば、CD-ROM、ディスケット等の好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の指示はキット内に存在せず、例えば、インターネットを介して、遠隔ソースから指示を得るための手段が提供される。この実施例の一例は、指示を閲覧することができるおよび/またはそこから指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、この指示を得るための手段が、好適な基板上に記録される。他の必要な構成要素は、シーケンサー上に既に実装された従来のプログラムに対する変更を実施するための関連するコンピュータプログラムおよび/またはコンピュータスクリプトを含む。指示に加えて、キットは、1つ以上の対照分析物混合物、例えば、キットをテストする際に使用するための2つ以上の対照分析物も含むことができる。本発明をさらに例示するために、以下の特定の例が、本発明を例示するために提供されるのであって、決してその範囲を限定するものであると見なされるべきではないという理解とともに提供される。全ての図、例、詳細な説明、およびオリゴヌクレオチド配列を含む、2010年9月24日に出願された米国仮特許出願第61/386,390号および2011年5月11日に出願された第61/485,062号の開示は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。標的DNAの配列決定を行うための新規アプローチを以下に提示する。本方法は、標的DNA捕捉デバイスとしての役割を果たすように、固相支持体上で汎用プライマー菌叢すなわち、ランダムに分布された少なくとも2つのプライマーを含有する菌叢を修飾し、サンプルを大幅に操作することなく、捕捉されたDNAの直接的な配列決定を可能にすることに基づく。本方法は、関連する流体プラットフォームを用いて、標的DNAの捕捉と配列決定実験のシームレスな統合を可能にする。このアプローチは、その配列決定の可能性を維持しながら、固相支持体上でDNA捕捉基質としての役割を果たす普遍的プライマー菌叢を使用する。本方法は、配列決定のための鋳型として未処理の天然DNAを使用することができる。この方法を使用した配列決定は、必ずしも研究施設に依存するわけではない。さらに、サンプル処理の間に導入されるあらゆるバイアスが回避され、他の方法と比較してより少ない時間および低コストで実質的により小さなサンプルを分析することができる。本方法は、一本鎖および二本鎖の鋳型を分析するために使用することができる。一本鎖DNA鋳型を分析する能力は、病理学アーカイブからのホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを使用するいくつかの配列決定用途にとって重要であり得る。同様に、一本鎖DNA鋳型による配列決定を可能にすることにより、本方法は、複雑な核酸抽出ステップ、およびDNAの二本鎖編成を保存するように設計された高価な断片化機器を必要としない。むしろ、廉価かつ効率的な溶解および加熱による断片化によってサンプルを調製することができる。単純な捕捉配列決定アッセイは、ヒトゲノムDNAに限定されず、細菌およびウイルスのDNAおよびRNA等の他の核酸基質も分析することができる。トランスクリプトーム、非翻訳領域、およびmiRNAも、捕捉および配列決定することができる。また、ヌクレオチド配列の捕捉および配列決定、他の遺伝子特性およびエピジェネティックな特性DNAメチル化、大きなゲノムの再編成、および遺伝子発現等も調べることができる。本方法は、集団から合成DNAを選択するためにも用いることができる。一般的に、配列決定は、DNAサンプルが、配列決定システム上での分析を促進するように構造的に修飾されるプロセスとして見なされてきた。以下に記載する方法は、配列決定システムを修飾するため、サンプルを修飾して大規模に調製する必要がない。合成DNAを使用して汎用プライマー菌叢を官能基化することにより、未処理サンプルの標的遺伝子のオリゴヌクレオチドライブラリーを直接的にアッセイすることができる。非特異的捕捉を減少させるために、ブリッジ構造の形成において用いられる配列を提供する特異的DNA構成要素を経時的に導入すると、プライマー菌叢自体が修飾される。あらゆる種類のシーケンサーのための配列決定用ライブラリーの調製は、特異的二本鎖アダプター配列をDNA鋳型に付加することに依存する。捕捉オリゴヌクレオチドが固体支持体上に固定化されたアダプターとしての役割を果たしたため、アッセイのためのライブラリーの調製は、単一アダプターの付加を必要とするだけであった。これによって、サンプル処理が実質的に短縮され、クローン増幅またはゲル電気泳動に基づくサイズ分別が不要となる。特定の場合において、固体支持体上で捕捉された鋳型に第2のアダプターが付加されてもよい。本方法の特定の実施形態は、配列決定用の鋳型としての粗DNAの使用を可能にする。ハイスループットな再配列決定を行うためのいくつかの現在の方法は、標的DNAを捕捉することおよび配列決定することを別個の方法として含む。これは、特定の場合において、以下を含む複数の問題を引き起こす可能性がある:i大幅な労働集約的および時間集約的なDNA材料の操作、ii複雑な実験プロトコルに伴う誤差、iii選択および分子増幅プロセスによって生じるバイアス、ならびにiv大量の出発材料の必要性。以下に記載する方法は、事前のサンプル操作をほとんどまたは全く伴わず、完全に自動化可能であり、拡張性が高いため、これらの問題のうちの多くの源を排除すると考えられる。概念実証として、アッセイは再現性があり、ゲノムの特異的領域を捕捉および配列決定するために使用することができることを示すために、ヒトゲノム中の10個の癌遺伝子の全てのエクソンが配列決定された。このアッセイ技術は、Illumina社のGenomeAnalyzerを用いて証明したが、このアプローチは、固相支持体を使用するいずれのシーケンサーにも広く適用可能であることに留意されたい。以下に記載する方法それらの原則のうちのいくつかを図1に例示するは、任意の標的DNA配列を効率的に捕捉するために使用することができ、捕捉されたゲノム断片の直接的な配列決定を可能にする。単純な加熱による断片化ステップによってゲノムDNAサンプルを配列決定のために調製することができ、アッセイ全体を完全に自動化して固体支持体上で行うことが可能である。捕捉およびその後の反応は、流体システムによって媒介することができる。追加の実施形態は、断片化DNAを鋳型として使用すること、および流体システムを使用して、捕捉されたDNA断片に配列決定アダプターを付加することにより、固体支持体上での配列決定のためにDNA断片の調製を可能にする方法を提供する。概念実証として、Illumina社の次世代DNAシーケンサーを使用してこれらのアプローチを開発した。プライマー菌叢の修飾およびヒトゲノム中の366ヶ所の標的部位を使用した、統合された捕捉および配列決定調製反応の結果を提示する。25分間の加熱による断片化を除いて、全てのステップをIllumina社のフローセルの固相支持体上で行うことができる。以下に記載するデータは、アッセイのロバスト性、ならびに捕捉基質としての普遍的プライマー菌叢および流体システムの適用性を証明するものである。本方法がロバストに作用することを可能にする、プライマー菌叢の修飾の特有のパラメータを同定した。複雑な真核生物のゲノムに加えて、本方法は、真菌および他の微生物のゲノム、ウイルスのDNAおよびRNA、異なる源のトランスクリプトーム、ならびに合成DNAを捕捉するためにも適用できる。さらに、流体システムの固体支持体上に固定化された未変性のプライマー菌叢をプログラミングして、特異的な用途を実行するという概念を導入して立証した。材料および方法ゲノムDNAサンプルCoriellInstituteからNA18507のゲノムDNAを得た。結腸直腸癌患者から新鮮な冷凍組織サンプルを得た。StanfordCancerCenterからインフォームドコンセントとともに患者材料を得、試験はStanfordUniversitySchoolofMedicineの治験審査委員会IRBによって承認された。冷凍組織片を調製し、ヘマトキシリンエオシン染色を行い、病理学的検査により各サンプルの腫瘍組成を決定した。細胞組成がそれぞれ90腫瘍であるかまたは純粋に正常である領域から腫瘍組織および正常組織を代表するサンプルを切除した。E.Z.N.ASQDNA/RNAProteinKitOmegaBio-Tek、Norcross,GAを使用してゲノムDNAを抽出した。SNP6.0アレイAffymetrix、SantaClara,CAを使用してサンプルを分析するために、DNAの調製、アレイハイブリダイゼーション、および走査のための標準プロトコルを使用した。GenotypingConsoleソフトウェアおよびBirdseedV2アルゴリズムAffymetrixを使用してデータ分析を行った。SNPコールの品質を評価するために、試験サンプルと合わせて13個の追加のマイクロアレイデータセットを分析した。P値の閾値0.01を用いてSNP6.0アレイデータをフィルタリングした。標的選択およびコンピュータによるOS-Seqオリゴヌクレオチドの設計CCDSBuildRelease20090902、NCBIのヒトゲノムBuild37hg19、およびdbSNPBuildID131を多型参照データセットとして使用した。遺伝子選択のために、GeneRankerアノテーションデータベースを使用して、重要性によって優先順位をつけた344個の癌遺伝子を選択した。オリゴヌクレオチドの標的特異的配列を検索するために、候補遺伝子のためのエクソンの定義をCCDSから採択した。標的エクソン500bp未満のほとんどにおいて、40-mer標的特異的配列が、エクソン境界の5’末端の10塩基外側にあった図3a。個々のプライマープローブを使用してエクソンの両方の鎖を標的とした。OS-Seq-366は、エクソンの隣接領域のみを覆っていた。OS-Seq-11kアッセイにおいて、エクソン領域全体が覆われるまで標的特異的配列をタイリングすることにより、500bpよりも大きいエクソンを処理した図3b。OS-Seq-11kのオンターゲット特異性を向上させるために、Repbaseを使用して反復性の高い配列を標的とするオリゴヌクレオチド配列を同定し、排除した。オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドの合成には2つのストラテジーを適用した。OS-Seq-366の場合、366個の101-merオリゴヌクレオチドを設計し図5a、次いでカラム合成を行ったStanfordGenomeTechnologyCenter、Stanford,CA図4a。オリゴヌクレオチドを定量化し、等モル濃度でプールした。OS-Seq-11kの場合、インサイツのマイクロアレイ合成LCSciences、Houstonアプローチを使用して、11,742個の前駆体オリゴヌクレオチドを合成した図5b。標的特異的オリゴヌクレオチドの配列を下の表2に示す。マイクロアレイ合成を行ったオリゴヌクレオチドの増幅前駆体80-merオリゴヌクレオチドの3つの25μlサブプールを使用した587、638、および415nM図5b。PCRアプローチを用いて前駆体である低濃度オリゴヌクレオチドを増幅した図4b。アレイ合成オリゴヌクレオチドのサブプールを10fM/オリゴに希釈し、PCR増幅のための鋳型として使用した。標準的な反応条件でTaqDNAポリメラーゼNEBおよびdNTP1mMdATP、1mMdCTP、1mMcGTP、500nMdTTP、および500nMdUTPを使用してPCRを行った。95°Cで30分間変性させた後、20回の増幅サイクル95°Cで30秒、55°Cで30秒、68°Cで30秒を行った。増幅プライマー1は、3’末端にウラシルを含有し、増幅プライマー2には追加の機能配列を組み込んだ図5b。増幅したオリゴヌクレオチドを精製して余分なプライマーを除去しFermentas、次いで、0.1U/μlのUracil-DNAExcisionMixEpicentre、Madison,WIを使用して37°Cで45分間処理して普遍的増幅プライマー部位を剥離し、オリゴヌクレオチドの成熟101-merコード鎖を切断した。プライマープローブ固定化の間に標的特異的部位を正確に伸長させるために、オリゴヌクレオチドの5’末端は、機能的であり、かつ遊離していなければならない。熱ショックによる酵素の不活性化65°C、10分の後、オリゴヌクレオチド調製物を精製したFermentas。最後に、3つのオリゴヌクレオチドのサブプールを定量化し、各サブプールが等モル濃度の単一プールを作製した。フローセルプライマー菌叢の修飾によるOS-Seqプライマープローブの合成Illumina社のGenomeAnalyzerIIxIllumina、SanDiegoシステムにおいて、固相支持体すなわち、フローセルは、ポリアクリルアミド層上に極めて高密度でランダムに固定化された2つのプライマーCおよびDを有する。OS-Seq実験のために、Illumina社のClusterStationを使用してDプライマーのサブセットを特異的に修飾した。NGSプライマー修飾の前に、133nMオリゴヌクレオチドのプールを95°Cで5分間熱変性させた。熱ショック95°Cで5分間を用いてOS-Seqオリゴヌクレオチドのコード鎖を遊離させた。第2の鎖はフローセル上で不活性であり、ハイブリダイゼーション後に洗浄されたため、さらなる鎖の精製は必要なかった。変性オリゴヌクレオチドを4xハイブリダイゼーションバッファー20xSSC、0.2Tween-20で希釈した。得られた100nMオリゴヌクレオチドをフローセル修飾実験に使用した。30μlのオリゴヌクレオチド混合物をフローセルの各レーンに分注した。温度勾配18分間で96°Cから40°Cの間に、オリゴヌクレオチドは、固定化プライマーDに特異的にアニールした。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドを鋳型としてDプライマーを伸長させるためにDNAポリメラーゼを使用した。伸長後、元のオリゴヌクレオチド鋳型を伸長させたDプライマーから変性させ、固相支持体から洗浄した。伸長、洗浄、および変性ステップには標準的なIllumina社のv4試薬を使用した。プライマーDの修飾によって、プライマープローブの固定化がもたらされた。配列決定用ライブラリーの調製OS-Seq配列決定用ライブラリーの調製において用いられるゲノムDNA断片化、末端修復、A-テーリング、アダプターライゲーション、およびPCRの概略的スキームを図2に要約する。NA18507からのゲノムDNA1μgおよび瞬間冷凍した直腸結腸癌サンプルを出発材料として使用した。CovarisE210RCovaris、Woburn,MAを使用してゲノムDNAを断片化し、平均断片サイズ500bpを得たデューティサイクル5、強度3、200サイクル/バースト、および80秒。0.25UのKlenowLargeFragmentNewEnglandBiolabs、Ipswich,MA、7.5UのT4DNAポリメラーゼNEB、400μMの各dNTPNEB、25UのT4ポリヌクレオチドキナーゼNEB、およびATPNEBを含むT4DNAリガーゼバッファーを50μlの反応体積で45分間室温で使用して、ランダムに断片化したDNAを末端修復した。末端修復後、3.2UのTaqDNAポリメラーゼNEB、100μMdATPInvitrogen、および1.5mMMgCl2を含むTaqバッファーを80ulの反応で15分間72°Cで使用して、鋳型DNAの3’末端にアデニンを付加した。アダプターライゲーションの前に、PCRPurificationKitFermentasを使用して反応物を精製した。OS-Seqのためのインデックスシステムを開発した。配列決定用ライブラリーアダプターは、任意選択的な6塩基インデックス配列、配列決定プライマー1部位、およびプライマーCのハイブリダイゼーションのための12-mer配列を含有する上の表2、図5c。設計した16個のインデックスアダプターを設計した。StanfordGenomeTechnologyCenterでアダプターオリゴヌクレオチドを合成した。ライゲーションの前に、温度勾配が下降する間にアダプターオリゴヌクレオチドをアニールした。NA18507の標的再配列決定のために、AACCTGタグを有するシングルプレックス用アダプターおよびマルチプレックス用アダプターの両方を使用した。マッチする正常腫瘍サンプルをインデックスするために、正常組織にはTGCTAAバーコードを使用し、腫瘍サンプルはAGGTCAでタグ化した。2,000UのT4DNAリガーゼNEBおよびT4DNAリガーゼバッファーを室温で1時間使用して、T-オーバーハングを有する二本鎖DNAアダプターをA-テーリングした鋳型にライゲートした。アダプターライゲーションの後、PCRPurificationKitFermentasを使用して反応物を精製し、PCRを使用してライブラリーを増幅した。1UのPhusionHotStartDNAPolymeraseFinnzymes、Finland、1μMライブラリー増幅プライマー付録の表1、PhusionHFバッファー、および200μMの各dNTPNEBの50ulの反応物を調製した。反応物を98°Cで30秒間変性させた。その後、22回のPCRサイクルを行い98°Cで10秒、65°Cで30秒、および72°Cで30秒、続いて、72°Cで7分および4°Cで行った。その後、PCRPurificationKitFermentasを使用してPCR反応物を精製し、定量化した。マルチプレックス化したライブラリーを等しい濃度でプールした。プライマープローブを使用した標的の捕捉OS-Seqプライマープローブを使用してフローセル上で標的を捕捉した図1bおよび下のオリゴヌクレオチド配列。30ulのゲノム配列決定用ライブラリー30~42ng/ulをフローセルに注入した。配列決定用ライブラリーをフローセル内で65°Cで20時間インキュベートすることによって、標的DNAをプライマープローブとハイブリダイズさせた。ゲノムDNAライブラリーのハイブリダイゼーションおよびその後の伸長の間、フローセルを65°Cで一定に保った。Illumina社のClusterStationを使用してプライマープローブのハイブリダイゼーションおよび伸長ステップを実行した。プライマープローブへのハイブリダイゼーションの前に、22.5μlの配列決定用ライブラリー40~56.6ng/μlを95°Cで5分間変性させた。熱ショックの後、4xハイブリダイゼーションバッファーを使用してゲノムDNAライブラリーを合計体積30μlに希釈した。配列決定用ライブラリーの最終DNA濃度は、30~41.7ng/μlの範囲であった。配列決定用ライブラリーの濃度が高いことに起因して、ハイブリダイゼーション体積は最小限に保たれた。したがって、再現性のある低体積のハイブリダイゼーションを可能にするために、専用のClusterStationプログラムを開発した。Illumina社のv4試薬を使用して以下の伸長、洗浄、および変性ステップを行った。フローセル処理および配列決定標的の捕捉後、フローセルの温度を30分間40°Cまで下げ、捕捉されたゲノムDNAライブラリー断片の3’末端にある12塩基をプライマーCとハイブリダイズさせた図1bおよび下のオリゴヌクレオチド配列。ブリッジ形成において、DNAポリメラーゼを使用してライブラリー断片およびプライマーCを伸長させ、捕捉されたDNA断片を完成させ、複製した。その後、ブリッジPCRを実行し、クローン的に増幅された配列決定用クラスターを作製した。標準版の4つの配列決定試薬およびレシピIlluminaを使用して、Illumina社のGenomeAnalyzerIIx上で40×40OS-Seq-366または60×60OS-Seq-11kのペアエンドサイクルを用いてサンプルを配列決定した。SCS2.8およびRTA2.8ソフトウェアIlluminaを使用して画像解析およびベースコールを行った。配列解析およびバリアントの検出Burrows-WheelerAlignerBWA19を使用して、配列リードをヒトゲノム版のNCBIのHumanGenomeBuild37-hg19とアラインした。アライメント後、オンターゲットのリードリード1は、プライマープローブの5’末端の1kb以内にあると定義された。オフターゲットのリードは、プライマープローブの5’末端の1kb外側にアライメントするとして、または関連付けられたプライマープローブの位置から異なる染色体上のマッピングとして定義される。インデックスしたレーンの逆多重化のために、perlスクリプトを使用して、ベースコールファイルを使用する7塩基タグのインデックスを作成した。このインデックスファイルおよび別のperlスクリプトを使用して、組み合わせたベースコールファイル更なる処理のための別個のfastqファイルを作成できるようにまたはアラインされたファイルのいずれかを逆多重化した。バリアントコールのためのあらゆる合成プライマープローブ配列を排除するために、メートペア上のインサートのサイズによるフィルタリングを適用した。インサートのサイズは、対になった配列リードのアライメントを比較することによって決定した。バリアントコールために、抽出された配列は、[40リード1の長さ]よりも大きなインサートサイズを有する必要があった。インサートのサイズによるフィルタリング後、SAMtoolsおよびBCFtoolsを使用してバリアントコールを行った。マッピング品質閾値50でSAMtoolsmpileupを使用して、ヒトゲノムhg19に対する配列のpileupを行った。BCFtoolsviewを使用して塩基位置の遺伝子型を決定し、SAMtoolsパッケージ内に提供されるバリアントフィルタperlスクリプトvcfutils.plを使用してデータをフィルタリングした。vcfutilsvarFilterの条件は、i10以上のカバレッジ、ii鎖バイアスフィルタの除去OS-Seqは、鎖特異的捕捉法であるため、iiiスクリプトに基準位置および非基準位置の両方を出力するよう強制することである。基準コールおよび非基準コールをAffymetrixSNP6.0アレイデータとの比較に用いた。遺伝子型を決定した位置をフィルタリングし、50を超えるPhred様品質スコアを得た。BEDtoolsintersectBedを使用して、各プライマープローブの標的領域、およびプローブがそれらの標的内で重複する組み合わせを定義した。バリアントの比較抽出したバリアントの品質評価のために、NA18507データのバリアントコールを、完全ゲノム配列解析3から同定されたバリアントのコールおよびHapmap遺伝子型決定データwww.hapmap.orgと比較した。perlスクリプトを使用してOS-SeqデータとAffymetrixSNP6.0アレイデータの比較を行った。SNPのアノテーションにはdbSNP131を使用した。さらなるオリゴヌクレオチド配列0オリゴヌクレオチドOS-Seqオリゴヌクレオチド:5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’汎用捕捉オリゴヌクレオチド、N=特有の40-mer配列、配列番号37Ad_top_FC_capture_A_tail:5’-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’配列番号38Ad_bot_FC_capture_A_tail:5’-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’配列番号39フローセルプライマーC:5’-PS-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3’U=2-デオキシウリジン配列番号40フローセルプライマーD:5’-PS-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGoxoAT-3’,Goxo=8-オキソグアニン配列番号41配列決定プライマー1:5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’配列番号42配列決定プライマー2:5’-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’配列番号431フローセルの修飾アニール3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’OS-Seqオリゴヌクレオチド配列番号44FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’フローセルプライマーD配列番号45伸長3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’OS-Seqオリゴヌクレオチド配列番号46FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’プライマープローブ配列番号47変性FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’プライマープローブ配列番号482ライブラリーの調製断片化、末端修復5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ゲノムDNA3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ゲノムDNAA-テーリング5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA-3’A-テーリング後のゲノムDNA3’-ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’A-テーリング後のゲノムDNAアダプターライゲーションOS-Seqdsアダプター5’-GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’Ad_bot_FC_capture_A_tail配列番号493’-TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’Ad_top_FC_capture_A_tail配列番号50OS-SeqdsAdライブラリーこれはOS-Seq-アダプターライブラリーの構造であるN=断片化によって定義されるランダムなゲノムDNA配列5’-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’配列番号513’-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’配列番号52ライブラリーPCROS-Seqアダプターライブラリー増幅Ad_top_FC_capture_A_tail、単一プライマーPCRを使用してアダプターライブラリーを増幅する5’-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’Ad_top_FC_capture_A_tail配列番号533’-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’OS-Seqライブラリー断片配列番号545’-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’OS-Seqライブラリー断片配列番号553’-TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’Ad_top_FC_capture_A_tail配列番号565’-CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’増幅したOS-Seqライブラリー断片配列番号573’-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’増幅したOS-Seqライブラリー断片配列番号583捕捉アニールOS-SeqアダプターライブラリーのアニーリングN=40-mer特異的捕捉部位3’-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAgenomicdna配列番号59NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’増幅したOS-Seqライブラリー断片配列番号60FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’プライマープローブ配列番号61伸長OS-Seq捕捉3’-GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAgenomicdna配列番号62NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC-5’増幅したOS-Seqライブラリー断片配列番号63FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’捕捉されたDNA配列番号64変性OS-SeqライブラリーFC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’捕捉されたDNA配列番号654アダプターの完成40CでのハイブリダイゼーションOS-Seq_ライブラリーOS-SeqアダプターとOligo-Cの間には12-merの相同性が存在するFC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG-3’捕捉されたDNA配列番号663’-CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FCオリゴC配列番号67伸長FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’完成したDNA配列番号683’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC完成したDNA配列番号69変性FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’完成したDNA配列番号703’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC完成したDNA配列番号715クラスターの作製アニールFC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’完成したDNA配列番号723’-CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FCオリゴC配列番号73FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3’配列番号74オリゴD3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC完成したDNA配列番号75伸長FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’完成したDNA配列番号763’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FC完成したDNA配列番号77変性FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’クラスター化されたDNA配列番号783’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FCクラスター化されたDNA配列番号796配列決定FC-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’クラスター化されたDNA配列番号803’-<----TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACA-5’配列決定プライマー1配列番号815’-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT---->配列決定プライマー2配列番号823’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACTTGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgenomicdnaTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA-FCクラスター化されたDNA配列番号83結果この項では、標的再配列決定アプローチに見られる限界の多くを解決する、オリゴヌクレオチド選択的配列決定OS-Seqと称される標的再配列決定のための新規アプローチについて記載する。他の方法とは概念的に異なり、OS-Seqは、ゲノム標的の捕捉と配列決定の両方がIllumina社のフローセル等の図1aNGS固相支持体上で行われる統合化アプローチである。OS-Seqの調製のために、ゲノムDNAから単一アダプター配列決定用ライブラリーを調製し、標的特異的オリゴヌクレオチドを合成してフローセル上のプライマープローブを構築するために使用する。次いで、フローセル上の固定化プライマープローブを使用して、単一アダプターゲノムDNAライブラリーから単一分子標的を捕捉する。OS-Seqの処理は3つのステップを伴う:Illumina社の配列決定システムを、標的特異的プライマープローブを含むように修飾し、単一アダプターライブラリーから標的を捕捉し、固定化された断片を配列決定のために完成させる図1b。捕捉基質を調製するために、既存のプライマー菌叢のサブセットを標的特異的プライマープローブになるように修飾することにより、Illumina社のフローセルを分子的に再設計する。これらのプライマープローブを作製するために、オリゴヌクレオチドの複雑なプールの3’普遍的配列をフローセル上でその補体とハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼ伸長反応を使用して固定化プライマーを伸長させる。ランダムに配置された標的特異的プライマープローブのセットが得られ、フローセル表面上に固定される。65°Cの高温インキュベーションの間に、プライマープローブは、単一アダプターゲノムDNAライブラリー内の標的相補的配列に特異的にハイブリダイズする:ハイブリダイゼーション後、次いで、プライマープローブは、別のDNAポリメラーゼ伸長反応のためのプライマーとして機能する。伸長ステップは、標的配列を効率的に捕捉する。伸長後、変性ステップを行い、次いで、40°Cの低温ハイブリダイゼーションにより配列決定用ライブラリーアダプターをフローセル上でその補体に安定化させ、ブリッジ構造を作製する。第3のDNAポリメラーゼ伸長反応により、3’末端に追加の配列を組み込み、固相増幅が可能な2つの分子を作製する。OS-Seqに特異的な3つのステップの後、捕捉された分子をブリッジ増幅し、処理し、Illumina社のNGSシステムからの標準的な配列決定プロトコルを使用して配列決定する。OS-Seqにおける分子生物学的ステップの詳細な説明は、上記に示され、Illumina社のOS-Seq用ClusterStationプログラムはそれに応じて変更される。原理の実証の証拠として、2つの捕捉アッセイを開発した。最初に、10個の癌遺伝子のエクソンに隣接する366個のOS-SeqプライマープローブOS-Seq-366を設計した図3。このアッセイは、OS-Seqの方法をテストすることを企図するものであって、決定的なエクソンカバレッジをテストすることを企図するものではなかった。カラムに基づく方法を使用してOS-Seq-366オリゴヌクレオチドを合成した。次に、拡張性を証明するために、344個の癌遺伝子のエクソンを捕捉するための11,742個のプライマープローブを設計および合成したOS-Seq-11k。これらのプライマープローブは、エクソンカバレッジの向上のために、反復を避けて大きなエクソンにわたってタイリングした。OS-Seq-11kのハイスループットな産生のために、プログラム可能なマイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドを合成した。これらのアレイ合成オリゴヌクレオチドは、処理のためおよびOS-Seqに十分な材料を得るために増幅を必要とする図4。処理後、OS-Seqオリゴヌクレオチドは、標的領域の5’末端に相補的な標的特異的40-merを含有する図5。また、これらのオリゴヌクレオチドは、ペアエンド配列決定プライマーのアニーリングおよびフローセル上の固定化プライマー菌叢へのハイブリダイゼーションに必要な配列を含有する。OS-Seq-366およびOS-Seq11kアッセイの捕捉性能を評価するために、以前に配列決定されたヨルバ人の個体由来のDNAを調製したNA18507。全ての標的アッセイに対してペアエンド配列決定を行った。第1のリードリード1は標的ゲノムDNAに由来し、第2のリードリード2は合成標的特異的プライマープローブに由来する図1a。GAIIxでの実行において、単一レーン上でOS-Seq-366を実行した。我々のインデックススキームに基づいて、OS-Seq-11kの各サンプルを1.3レーンの均等物上で実行した。サンプルをタグ化するために、特有のバーコード配列図5cを有するアダプターを使用してインデックススキームを開発した。バーコードは、リード1の最初の7個の塩基に由来する。全体で、適切なバーコードを含有するOS-Seq-366リードの87.6およびOS-Seq-11kリードの91.3をヒトゲノム基準にマッピングした表1。それと比較して、以前に報告されたハイブリッド選択方法を使用して得られたリードの58をヒトゲノム基準にマッピングすることができた。各プライマープローブの全体的なカバレッジを評価するために、プライマープローブの3’末端から1kb以内に属するリード1のデータに由来するリードの数を決定した。OS-Seqプライマープローブは、鎖特異的であり、DNA標的の5’末端のみを捕捉する図6。一例として、OS-Seq-366における全てのプライマープローブのカバレッジプロファイルの中央値図1aは、プライマープローブから1kb下流までどのように配列が捕捉されるかを例示している。概して、より小さいインサートのサイズに向かってバイアスが検出され、OS-Seq-366では、標的リードの50がプライマープローブから283塩基以内にマッピングされた。両方のアッセイにおいて、1kb間隔を超えるリードおよび1.7kbまで離れた追加のリードを同定した。1kbを超える配列リードは、任意の所与のプライマープローブからの捕捉分布の末端を表し、OS-Seq-366およびOS-Seq-11kの両方とも全体の配列データの0.15未満であった。また、カバレッジ分布の特徴は、ライブラリー作製の間に導入された断片サイズと相関しており、ブリッジ形成および固相PCRに固有のサイズの制約によるものであることも観察された図6。また、より高いモル濃度の単一アダプターライブラリーを導入すること、追加のレーンを配列決定すること、またはより長いリードを使用することにより、標的に沿ったカバレッジを増加させることができる。オンターゲットのリードは、プライマープローブの1kb以内にマッピングするリード1配列であると定義された。これらのオンターゲットカバレッジ基準を用いると、OS-Seq-366内の40塩基リードの86.9およびOS-Seq-11k内の53塩基リードの93.3がオンターゲットであった表1。コンピュータによるプライマープローブの設計を改良しようとする試みを考慮すると、OS-Seq-11kは特異性の向上を示した。具体的には、OS-Seq-11kのコンピュータによるプライマープローブ選択には、反復マスキングフィルタが使用され、より少ないオフターゲットのリードをもたらす結果となった。比較すると、公開されたハイブリッド選択方法において、76塩基リードの89および36塩基リードの50がプローブの近位にマッピングされ、方法間での同様のオンターゲット特異性が示唆され、より長いリードに向かって移動するようにそれを傾斜させることにより、OS-Seqのオンターゲット特異性を向上させることができる。OS-Seqのエクソン上での特異性も、公開されたハイブリッド選択方法と同様であった。OS-Seq-11Kを使用して、リードの42.7がエクソン内にマッピングされたことが観察され表1、ハイブリッド選択捕捉技術では、エクソンにマッピングされたのはリードの42であると報告された。典型的な遺伝子カバレッジプロファイルの一例として、KRAS遺伝子に関する捕捉配列データを図1cに示す。エクソン標的は、オフターゲット隣接領域と比較して高い倍数のカバレッジで配列決定される。以前に述べたように、OS-Seq-366は、エクソンに隣接するように設計されており、より大きな領域にわたってタイリングされていない。エクソンの平均倍数カバレッジを表1に、カバレッジクラスの詳細な内訳すなわち、10X、20Xを表2に示す。全体として、OS-Seq-366内のエクソン塩基の83.9が少なくとも1つのリードでカバーされており、残りの部分は、このパイロットアッセイでは意図的に標的としなかった。同様に、OS-Seq-11kで分析した3つのサンプル間では、エクソン塩基の94~95.6が少なくとも1つのリードでカバーされた。OS-Seq-366の設計に優るプライマープローブの設計の改善により、具体的には、OS-Seq-11kの設計は、500塩基よりも大きなエクソンにわたってプライマープローブをタイリングしたことにより、OS-Seq-366と比較して、OS-Seq-11kアッセイは、エクソン上での配列カバレッジの増加を示したリード1のデータをその関連付けられたプライマープローブによりビニングし、その標的とアラインするリードを数えることによって、アッセイの標的選択均一性についても評価した。観察された捕捉収率に基づいてOS-Seqプライマープローブをソートし、OS-Seq-366およびOS-Seq-11k内の分布を図1dにオーバーレイ方式で表した。OS-Seq-366では、プライマープローブの100が1つの配列リードの最少収量を有し、プライマープローブの89.6の収量が10倍の範囲内であったことが観察された観察された。同様に、OS-Seq-11kの場合、プライマープローブの95.7が1つの配列リードの最少収量を有し、プライマープローブの54が10倍の範囲内に収率を有していた。OS-Seq-366オリゴヌクレオチドをカラム合成し、プーリング前に別々に定量化することで、プライマープローブ構築ステップにおいて各標的特異的配列が確実に等モル濃度になるようにした。OS-Seq-11kのプライマープローブ収量におけるより高い分散は、プライマープローブ作製のために使用されたマイクロアレイ合成オリゴヌクレオチドのPCRの間に導入された増幅バイアスによる可能性が最も高い。OS-Seq-11kアッセイからの個々のプライマープローブの配列収量を比較することにより、OS-Seqの技術的再現性を評価した図7。マルチプレックスライブラリーNA18507、正常および腫瘍をプールし、2つの独立したIllumina社のGAIIxのレーン上で捕捉および配列決定を行った。各個々のプライマープローブの配列収量を技術的複製間で比較し、相関係数を算出した:R2=0.986。生物学的再現性の評価では、2つの異なるマルチプレックス配列決定用ライブラリーを同じレーン内で実行した。生物学的複製の相関係数は、R2=0.90であった。OS-Seqの高い再現性は、NGSシステムを使用した固有の自動化、単一の反応体積で捕捉および配列決定ステップを行う能力、ならびに捕捉後にPCRを適用しなくてもよいことに関連する可能性が高い。OS-Seq-366およびOS-Seq-11kアッセイのバリアントコーリング性能を評価するために、完全ゲノム配列決定分析を受けたヨルバ人の個体NA18507について標的配列決定分析を行った。いずれかのOS-Seqアッセイを用いたSNVコーリングのために、遺伝子型品質スコアが50を超え、最低10Xカバレッジのオンターゲット位置のみを分析した表1。OS-Seq-366およびOS-Seq-11kデータでは、合計でそれぞれ191kbおよび1,541kbがこれらの基準を満たした。これらの高品質な標的位置から、OS-Seq-336から105個のSNV、OS-Seq-11kから985個のSNVをコールした表1。公開されたNA18507のSNV、およびこれらの同じ高品質領域で生じることが報告された他のSNPを抽出した。比較すると、OS-Seq-366の97およびOS-Seq-11kの95.7が、以前に報告されていた表1。OS-Seq-366およびOS-Seq-11kについて、バリアント検出の感度は、報告されたSNPに基づいて、それぞれ0.97および0.95であった下の表3。OS-Seq-11kの分析を、マッチする正常‐直腸結腸癌ペアに由来するゲノムDNAにも適用した。NA18507の分析と同じ品質基準およびカバレッジ基準を用いて、正常サンプルから同定された871個のSNVを同定し、腫瘍から727個を同定した表4。比較のために、AffymetrixSNP6.0アレイを用いて2つのサンプルの遺伝子型を決定した。以前の分析によれば、AffymetrixSNP6.0アレイおよびBirdseedアルゴリズムを使用した遺伝子型決定の正確性は高く、SNPの良好な平均コール率は99.47であり、コールされたSNPは、他のプラットフォームからのHapMap遺伝子型と99.74の一致を有する。OS-SeqSNVをAffymetrixSNPと比較すると、正常サンプルで99.8、腫瘍サンプルで99.5の高い一致が観察された。正常組織バリアントをフィルタリングし、カバレッジが40よりも大きい新規癌特異的バリアントを考慮することにより、SMAD4S144の明らかな病原性ナンセンス変位を同定および確認した。この遺伝子は、直腸結腸癌において頻繁に突然変異することが多い、大腸癌ドライバー遺伝子である。OS-Seq-366およびOS-Seq-11kアッセイにおける個々のプライマープローブの捕捉効率を調べ、各プライマープローブの性能を評価した。OS-Seqの特有の特徴は、ペアエンドを用いて配列決定した場合に、捕捉されたゲノム配列をそれらのプライマープローブとマッチさせることができることである。リード1は、捕捉された標的の3’末端に由来し、リード2はOS-Seqプライマープローブ合成配列から始まる。よって、リード1は、常に捕捉されたゲノムDNA配列を表し、リード2は、個別のプライマープローブのための分子バーコードとして機能的役割を果たす。これにより、標的化を媒介した正確なOS-Seqプライマープローブの同定が可能となり、個別のプライマープローブの性能の評価を促進する。例えば、プライマープローブのGC含量と標的配列の収量との間に強い関係が観察されたデータは図示せず。極度に低いGC含量20未満または高いGC含量>70は、プライマープローブのその標的配列捕捉の不良の増加と関連していた図8。捕捉性能を直接的に評価する能力は、有用なプライマープローブの品質管理手段であると考えられる。OS-Seq技術は、合理的かつ拡張性の高い標的再配列決定のために開発された。配列決定前に標的を濃縮する従来の捕捉方法から離れ、OS-Seqは、NGSシステムの固相支持体上のハイブリダイゼーションおよび選択を介して、標的DNAの捕捉および配列決定を統合する。原理の実証試験は、OS-Seqアッセイが、良好な均一性および高い特異性を伴って、効率的かつ再現性よく標的ゲノム領域を捕捉することを示している。NA18507参照ゲノムのバリアント解析によって、SNVの決定のための高い特異性および低い偽発見率が証明された。マッチする結腸直腸腫瘍サンプルと正常サンプルの標的再配列決定により、癌ゲノムのハイスループットな遺伝子解析に対するOS-Seqの適応性が証明された。OS-Seq技術により、専用の標的再配列決定アッセイを作製することができる。プライマープローブオリゴヌクレオチドの設計および生成は、比較的単純であり、標的領域は、平衡の取れたGCおよび非反復配列を使用して単純に選択することができる。専用の複雑なオリゴヌクレオチドライブラリーをまとめて作製するために、プログラム可能なマイクロアレイ合成源を使用することができる。同様に、より小さな標的遺伝子セットのための専用アッセイを作製するために、従来のオリゴヌクレオチド合成方法が使用されてもよい。我々の最も大規模な標的アッセイは、344個の遺伝子のエクソンおよび隣接する配列を網羅したが、OS-Seqは、より多くの標的含量まで大幅にスケールアップすることができると考える。OS-Seq-366データから、フローセル内のハイブリダイゼーション混合物の標的断片と比較して、2,000倍を超える過剰なプライマープローブが存在すると推定した。20時間のハイブリダイゼーションの間に、ライブラリー内の全ての潜在的な標的の4.9が配列決定のために捕捉されたことが推定される。クラスター形成を犠牲にすることなく、オリゴヌクレオチドの濃度を少なくとも10倍増加させることができ、配列決定用ライブラリーの濃度を5倍増加させることができることデータは図示せずも調べた。OS-Seqサンプルの調製は単純である:1日で完了可能であり、容易に自動化される図9。労働に関しては、OS-Seqを使用することは、ショットガン配列決定実験を実行することに好ましく匹敵する。捕捉中は、残存するアダプターがフローセルとハイブリダイズしていないため、OS-Seqライブラリーは、物理的分離方法による限定されたサイズの精製の必要性なく、様々なサイズのDNA断片を用いることができる。ゲノムDNA断片の5’末端に単一アダプターを付加するだけでよい。単一アダプターの設計も、分子バーコードの導入を伴うインデックスに容易に役立つ。この特徴は、配列決定アッセイの単純なサンプル多重化を可能にし、多くの潜在的用途を有する。例えば、マッチする正常腫瘍分析は、バイアスを減少させることができる同じ捕捉反応において行われる。個別化医療における関心の増加を考慮すると、ヒトゲノム再配列決定の迅速かつ単純なアプローチを開発する明らかな必要性がある。これには、癌ゲノムに見られる生殖系列バリアントおよび体細胞突然変異の分析が含まれる。候補遺伝子のハイスループットな分析、および臨床的に使用可能な標的領域の同定を可能にすることにより、OS-Seqは、標的再配列決定のための実践的かつ効率的なアプローチとして、翻訳試験および臨床診断に特に有用である。上記方法にはIllumina社のGenomeAnalyzerを使用した。しかしながら、このシステムは、いずれの平行配列決定プラットフォームにも広く適用可能であると考えられる。"