"Brd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量を対象に投与するステップを含んでなる、対象において白血病または関連障害を治療する方法。前記作用物質が、式I~XXIIのいずれかの化合物、または本明細書で開示されるいずれかの化合物、またはその誘導体である、請求項1に記載の方法。前記白血病が、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群である、請求項1に記載の方法。細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるステップとを含んでなる、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる方法。細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導するステップとを含んでなる、白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導する方法。前記細胞が対象中にある、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。前記細胞が、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。Brd4を阻害する作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップと、それによって対象において急性骨髄性白血病を治療するステップとを含んでなる、対象において急性骨髄性白血病を治療する方法。前記作用物質が、小型化合物または阻害性核酸分子である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記小型化合物が、JQ1またはその誘導体である、請求項8に記載の方法。前記阻害性核酸分子が、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸分子である、請求項8に記載の方法。前記対象が哺乳類である、請求項8に記載の方法。前記哺乳類がヒト患者である、請求項12に記載の方法。前記ヒト患者が成人である、請求項13に記載の方法。前記ヒト患者が小児である、請求項13に記載の方法。対象中で白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる、請求項8に記載の方法。治療効果のある賦形剤中に、Brd4を阻害する作用物質またはその誘導体の治療的有効量を含んでなる医薬組成物。Brd4を阻害する作用物質の治療的有効量と、請求項8に記載の方法で使用される化合物投与のための書面による指示を含んでなる、白血病を治療するためのキット。白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、前記細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなり、前記マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大が、前記細胞が前記作用物質に対して応答性であることを示す、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法。対象の白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、前記細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなり、前記マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大が、その作用物質を含む治療計画を前記対象のために選択すべきであることを示す、白血病を有すると同定された対象のために、治療計画を選択する方法。白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、前記細胞中のmycの発現または生物学的活性を検出するステップを含んでなり、mycの発現または生物学的活性の低下が、前記細胞が前記作用物質に応答性であることを示す、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法。白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、mycの発現または生物学的活性を検出するステップを含んでなり、mycの発現または生物学的活性の低下が、前記作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきことを示す、前記対象のために治療計画を選択する方法。本発明は、白血病および関連障害例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群を検出して治療するための組成物、方法、およびキットを提供する。一態様では、本発明は、概して、Brd4を阻害する作用物質例えば、Brd4、JQ1を標的とする阻害性核酸またはその誘導体の有効量を対象に投与するステップを伴う、対象において、白血病または関連障害例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群を治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるステップを伴う、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導するステップを含んでなる、白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、Brd4を阻害する作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップと、それによって対象において急性骨髄性白血病を治療するステップを伴う、対象において急性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、治療効果のある賦形剤中に、Brd4を阻害する作用物質またはその誘導体の治療的有効量を含有する、医薬組成物を提供する。さらに別の態様では、本発明は、Brd4を阻害する作用物質の治療的有効量と、請求項8に記載の方法で使用される化合物投与のための書面による指示を包含する、白血病を治療するためのキットを提供する。さらに別の態様では、本発明は白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを伴う、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。さらに別の態様では、本発明は、対象の白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを伴う、白血病を有すると同定された対象のために、治療計画を選択する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきであることを示す。さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でmycの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、mycの発現低下は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、mycの発現を検出するステップを含んでなる、対象のために治療計画を選択する方法を提供し、mycの発現低下は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきことを示す。本明細書に記述される本発明の上記態様または任意のその他の態様のいずれかの様々な実施形態では、作用物質は、小型化合物例えば、JQ1またはその誘導体または阻害性核酸分子例えば、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸分子である。上記態様の別の実施形態では、対象は哺乳類例えば、ヒト患者である。別の実施形態では、対象は成体哺乳類例えば、成人患者である。別の実施形態では、対象は幼若哺乳類例えば、小児患者である。上の態様の別の実施形態では、方法は、対象において、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる。上記態様のいずれかの様々な実施形態において、作用物質は本明細書に記載される式I~XXIIのいずれかのまたは任意のその他の式の化合物である。上記態様の特定の実施形態では、細胞は対象中にある。上記態様の別の実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害である。上記態様の別の実施形態では、白血病細胞は急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する。別の態様では、本発明は、概して、Brd4を阻害する作用物質例えば、Brd4、JQ1を標的とする阻害性核酸またはその誘導体の有効量を対象に投与するステップを含んでなる、対象において、白血病または関連障害例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群を治療する方法を提供する。別の態様では、本発明は、細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させるステップを含んでなる、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、細胞をBrd4を阻害する作用物質またはその誘導体の有効量に接触させるステップと、それによって白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導するステップを含んでなる、白血病細胞中で細胞死または最終分化を誘導する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、Brd4を阻害する作用物質の有効量をそれを必要とする対象に投与するステップと、それによって対象において急性骨髄性白血病を治療するステップを含んでなる、対象において急性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、治療効果のある賦形剤中に、Brd4を阻害する作用物質またはその誘導体の治療的有効量を含んでなる、医薬組成物を提供する。さらに別の態様では、本発明は、Brd4を阻害する作用物質の治療的有効量と、請求項8に記載の方法で使用される化合物投与のための書面による指示を含んでなる、白血病を治療するためのキットを提供する。さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。さらに別の態様では、本発明は、対象の白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でマクロファージ特異的分化マーカーの発現を検出するステップを含んでなる、白血病を有すると同定された対象のために治療計画を選択する方法を提供し、マクロファージ特異的分化マーカーの発現増大は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきであることを示す。さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、細胞中でmycの発現を検出するステップを含んでなる、白血病細胞の臨床応答性を検出する方法を提供し、mycの発現低下は、細胞が作用物質に対して応答性であることを示す。さらに別の態様では、本発明は、白血病細胞をBrd4阻害性作用物質またはその誘導体に接触させるステップと、mycの発現を検出するステップを含んでなる、対象のために治療計画を選択する方法を提供し、mycの発現低下は、その作用物質を含む治療計画を対象のために選択すべきことを示す。上記態様のいずれかの、または本明細書に記述されるあらゆるその他の本発明の態様の様々な実施形態において、作用物質は、小型化合物例えば、JQ1またはその誘導体または阻害性核酸分子例えば、siRNA、shRNAまたはアンチセンス核酸分子である。上記態様の別の実施形態では、対象は哺乳類例えば、ヒト患者である。上の態様の別の実施形態では、方法は、対象において、白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる。上記態様のいずれかの様々な実施形態において、作用物質は、式I~XXIIのいずれかの、または本明細書に記載される任意のその他の式の化合物である。上記態様の特定の実施形態では、細胞は対象中にある。上記態様の別の実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害である。上記態様の別の実施形態では、白血病細胞は急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症または骨髄増殖性障害に由来する。本発明のその他の利点および新規な特徴は、添付図と併せて検討することで、以下の本発明の様々な非限定的実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。本明細書および参照によって援用する文献が、矛盾するおよび/または一貫性のない開示を含む場合は、本明細書が優先するものとする。本発明によって規定される組成物および物品は、下に提供される実施例との関連で、分離されており、さもなければ製造されている。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白になるであろう。本発明は、白血病および関連障害例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群を治療するのに有用な組成物および方法を特徴とする。本発明は、Brd4を阻害する作用物質が、急性骨髄性白血病の成長または進行を阻害するのに有用であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。この阻害は、Myc活性の抑制を伴い得る。これらの知見はまた、がんにおける直接薬理学的介入に対する、エピジェネティックな脆弱性を明らかにする発見プラットフォームとしてのRNAiスクリーニングの効用を強調する。下で詳細に報告するように、Brd4阻害が白血病の治療に有用であるという発見は、異常なクロマチンと関連付けられている高悪性度造血器腫瘍である急性骨髄性白血病AMLにおいて、エピジェネティックな脆弱性をプローブする、不偏アプローチを使用して得られた。遺伝的に定義された白血病における公知のクロマチン調節因子を標的にする、カスタマイズされたshRNAライブラリーをスクリーニングすることで、AML疾患維持の重要な必要条件として、ブロモドメイン含有タンパク質Brd4が同定された。shRNAまたは小分子阻害剤JQ1を使用するBrd4抑制は、生体外および生体内で、最終骨髄性分化と白血病幹細胞LSC排除が付随して起きる、頑強な抗白血病効果をもたらす。これらの効果は、Myc発現の維持と異常な自己再生の促進における、Brd4の要求事項に起因する。ブロモドメイン含有タンパク質遺伝子制御は、基本的に、可逆的な高分子の非共有結合アセンブリーによって支配される。RNAポリメラーゼへの信号伝達は、クロマチンの翻訳後修飾状態を解釈できるアセンブリー要素によって空間的に制御される、より高次のタンパク質複合体を必要とする。エピジェネティックなリーダーは、ヒストンタンパク質またはDNAの共有結合修飾を認識する、1つまたは複数の進化的に保存されたエフェクターモジュールをそれぞれが保有する、構造的に多様なタンパク質である。ヒストン尾部上のリジン残基Kacのε-N-アセチル化は、オープンクロマチン構造および転写活性化と関連付けられているMarushigeProcNatlAcadSciUSA73,3937-3941,1976。アセチルリジンのコンテクスト特異的分子認識は、主にブロモドメインによって媒介される。ブロモドメイン含有タンパク質は、転写因子複合体TAF1、PCAF、Gcn5、およびCBPの構成要素、およびエピジェネティックメモリーの決定因子として、生物学的にかなり興味深いDeyetal.,MolBiolCell20,4899-4909,2009。合計で57の多様なブロモドメインを含有する、41個のヒトタンパク質がある。大きな配列多様性にも関わらず、全てのブロモドメインは、基質特異性を決定する多様なループ領域ZAおよびBCループによって結合する、4本のαらせんαZ、αA、αB、αCの左巻きの束を含んでなる、保存された折り畳みを共有する。ペプチド性基質との共結晶構造は、アセチルリジンが中心疎水性窩によって認識され、ほとんどのブロモドメイン中に存在するアスパラギン残基との水素結合によってアンカーされることを示したOwen,D.J.etal.ThestructuralbasisfortherecognitionofacetylatedhistoneH4bythebromodomainofhistoneacetyltransferasegcn5p.EmboJ19,6141-6149,2000。ブロモドメインおよびエキストラ末端BETファミリーBRD2、BRD3、BRD4、およびBRDTは、高レベルの配列保存を呈示する2つのN末端ブロモドメインを含んでなる共通ドメイン構造と、より多岐にわたるC-末端動員ドメインとを共有するZengetal.、FEBSLett513、124-128、2002。本発明は、ヒトブロモドメインタンパク質を阻害するのに有用な組成物および方法を特徴とする。発明の化合物本発明は、BETファミリーメンバー例えばBRD2、BRD3、BRD4の第1のブロモドメインのapo結晶構造の結合ポケット中に結合する化合物例えば、JQ1、および本明細書で記述される式の化合物を提供する。理論による拘束は望まないが、これらの化合物は、特に、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害または骨髄異形成症候群をはじめとするが、これに限定されるものではない白血病を抑制するのに効果的であってもよい。1つのアプローチでは、白血病および関連障害の治療に有用な化合物は、ブロモドメイン構造結合ポケットに結合することが予測される化合物を同定する、分子ドッキングプログラムを使用して選択される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、BETファミリーメンバー例えばBRD2、BRD3、BRD4、BRDTの生物学的活性を少なくとも10、25、50、75、または100妨げ、阻害し、または妨害し、または低下させて、および/または例えばブロモドメインapo結合ポケット中の結合部位に結合することにより、このようなタンパク質の細胞内局在化を妨害し得る。特定の実施形態では、本発明の化合物は、約1000ダルトン未満、800未満、600未満、500未満、400未満、または、約300ダルトン未満の分子量を有する小分子である。本発明の化合物の例としては、BETファミリーメンバーの第1のブロモドメイン例えばBRD4以下、BRD41と称される;PDBID2OSSのapo結晶構造の結合ポケットに結合する、JQ1およびその他の化合物が挙げられる。JQ1は、新規チエノ-トリアゾロ-1,4-ジアゼピンである。本発明は、このような化合物の薬学的に許容可能な塩をさらに提供する。特定の実施形態では、本発明の化合物は、約1000ダルトン未満、800未満、600未満、500未満、400未満、または、約300ダルトン未満の分子量を有する小分子である。本発明の化合物の例としては、BETファミリーメンバーの第1のブロモドメイン例えばBRD4以下、BRD41と称される;PDBID2OSSのapo結晶構造の結合ポケットに結合する、JQ1およびその他の化合物が挙げられる。JQ1は、新規チエノ-トリアゾロ-1,4-ジアゼピンである。本発明は、このような化合物の薬学的に許容可能な塩をさらに提供する。一態様では、本化合物は、式I、式中、XはNまたはCR5であり;R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または-COO-R3であり;環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;R1は-CH2n-L式中、nは0~3であり、LはHである、-COO-R3、-CO-R3、-CO-NR3R4、-SO2-R3、-SO2-NR3R4、NR3R4、NR4COR3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;R2はH、D重水素、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり;各R3は独立して、iH、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;iiヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;iiiO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、-C1~C8アルキル、-C2~C8アルケニルまたは-C2~C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、-C3~C12シクロアルキル、置換-C3~C12シクロアルキル、-C3~C12シクロアルケニル、または置換-C3~C12シクロアルケニル;およびivNH2、N=CR4R6からなる群から選択され;各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4~10員環を形成し;R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4~10員環を形成し;mは0、1、2、または3であるが;ただしa環Aがチエニルであり、XがNであり、Rがフェニルまたは置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは1であり、Lは-CO-NR3R4であるであれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;b環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは1であり、Lは-CO-NR3R4であるであり、R3でR4の一方がHであれば、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく;c環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは1であり、Lは-COO-R3であるであれば、次にR3はメチルでもエチルでもない化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、LはH、-COO-R3、-CO-NR3R4、-SO2-R3、-SO2-NR3R4、NR3R4、NR4COR3または任意選択的に置換されるアリールである。特定の実施形態では、各R3は独立して、H;O、S、またはNから選択される0、1、2、または3個のヘテロ原子を含有する-C1~C8アルキル;またはNH2、N=CR4R6からなる群から選択される。特定の実施形態では、R2はH、D、ハロゲンまたはメチルである。特定の実施形態では、RBは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、またはアルコキシである。特定の実施形態では、RBはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、COOH、COOMe、COOEt、またはCOOCH2OCOCH3である。特定の実施形態では、環Aは5または6員環アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、環Aはチオフラニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリジジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリニルである。特定の実施形態では、環Aはフェニルまたはチエニルである。特定の実施形態では、mは1または2であり、RAの少なくとも1つの存在はメチルである。特定の実施形態では、各RAは独立して、H、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒にアリールを形成し得る。別の態様では、本化合物は、式II、式中、XはNまたはCR5であり;R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または-COO-R3であり;各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;R’1はH、-COO-R3、-CO-R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;各R3は独立して、iH、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール;iiヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;iiiO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、-C1~C8アルキル、-C2~C8アルケニルまたは-C2~C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、-C3~C12シクロアルキル、置換-C3~C12シクロアルキル、-C3~C12シクロアルケニル、または置換-C3~C12シクロアルケニルからなる群から選択され;mは0、1、2、または3であるが;ただしR’1が-COO-R3であり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、RBがメチルであれば、次にR3はメチルでもエチルでもない化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、Rは、それぞれが任意選択的に置換される、フェニルまたはピリジルである。特定の実施形態では、Rはp-Cl-フェニル、o-Cl-フェニル、m-Cl-フェニル、p-F-フェニル、o-F-フェニル、m-F-フェニルまたはピリジニルである。特定の実施形態では、R’1は-COO-R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;R3はO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子を含有して任意選択的に置換されていてもよい、-C1~C8アルキルである。特定の実施形態では、R’1は-COO-R3であり、R3はメチル、エチル、プロピル、i-プロピル、ブチル、sec-ブチル、またはt-ブチルであり;またはR’1はHまたは任意選択的に置換されるフェニルである。特定の実施形態では、RBはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、COOH、COOMe、COOEt、COOCH2OCOCH3である。特定の実施形態では、RBはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、COOH、COOMe、COOEt、またはCOOCH2OCOCH3である。特定の実施形態では、各RAは独立して、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールを形成し得る。特定の実施形態では、各RAはメチルである。別の態様では、本化合物は、式III、式中、XはNまたはCR5であり;R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または-COO-R3であり;環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;Rは、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;各R3は独立して、iH、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;iiヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;iiiO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、-C1~C8アルキル、-C2~C8アルケニルまたは-C2~C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、-C3~C12シクロアルキル、置換-C3~C12シクロアルキル、-C3~C12シクロアルケニル、または置換-C3~C12シクロアルケニル;およびivNH2、N=CR4R6からなる群から選択され;各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4~10員環を形成し;R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4~10員環を形成し;mは0、1、2、または3であるが;ただしa環Aがチエニルであり、XがNであり、Rがフェニルまたは置換フェニルであり、RBがメチルであれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;b環Aがチエニルであり、XがNであり、Rが置換フェニルであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R3およびR4の一方がHであれば、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでない、そして化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、Rはそれぞれが任意選択的に置換される、アリールまたはヘテロアリールである。特定の実施形態では、Rは、それぞれが任意選択的に置換される、フェニルまたはピリジルである。特定の実施形態では、Rはp-Cl-フェニル、o-Cl-フェニル、m-Cl-フェニル、p-F-フェニル、o-F-フェニル、m-F-フェニルまたはピリジニルである。特定の実施形態では、R3はH、NH2、またはN=CR4R6である。特定の実施形態では、各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールである。特定の実施形態では、R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールである。別の態様では、本化合物は、式IV、式中、XはNまたはCR5であり;R5は、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;RBは、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、ヒドロキシラルキル、アミノアルキル、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、または-COO-R3であり;環Aはアリールまたはヘテロアリールであり;各RAは独立して、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒に融合アリールまたはヘテロアリール基を形成し得て;R1は-CH2n-L式中、nは0~3であり、LはHである、-COO-R3、-CO-R3、-CO-NR3R4、-SO2-R3、-SO2-NR3R4、NR3R4、NR4COR3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであり;R2はH、D、ハロゲン、または任意選択的に置換されるアルキルであり;各R3は独立して、iH、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール;iiヘテロシクロアルキルまたは置換ヘテロシクロアルキル;iiiO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、-C1~C8アルキル、-C2~C8アルケニルまたは-C2~C8アルキニル;それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、-C3~C12シクロアルキル、置換-C3~C12シクロアルキル、-C3~C12シクロアルケニル、または置換-C3~C12シクロアルケニル;およびivNH2、N=CR4R6からなる群から選択され;各R4は独立して、それぞれが任意選択的に置換される、H、アルキル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒になって4~10員環を形成し;R6は、それぞれが任意選択的に置換される、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり;またはR4およびR6はそれにそれらが付着する炭素原子と一緒になって4~10員環を形成し;mは0、1、2、または3であるが;ただしa環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは0であり、Lは-CO-NR3R4であるであれば、次にR3およびR4はそれにそれらが付着する窒素原子と一緒にならずモルホリノ環を形成せず;b環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは0であり、Lは-CO-NR3R4であるであれば、R3およびR4の一方はHであり、次にR3およびR4の他方はメチル、ヒドロキシエチル、アルコキシ、フェニル、置換フェニル、ピリジルまたは置換ピリジルでなく;c環Aがチエニルであり、XがNであり、R2がHであり、RBがメチルであり、R1が-CH2n-L式中、nは0であり、Lは-COO-R3であるであれば、次にR3はメチルでもエチルでもない化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、R1は-CH2n-L式中、nは0~3であり、Lは-COO-R3、任意選択的に置換されるアリール、または任意選択的に置換されるヘテロアリールであるであり;R3はO、S、またはNから選択される、0、1、2、または3個のヘテロ原子を含有して任意選択的に置換されていてもよい、-C1~C8アルキルである。特定の実施形態では、nは1または2であり、Lはアルキルまたは-COO-R3であり、R3はメチル、エチル、プロピル、i-プロピル、ブチル、sec-ブチル、またはt-ブチルであり;またはnは1または2であり、LはHまたは任意選択的に置換されるフェニルである。特定の実施形態では、R2はHまたはメチルである。特定の実施形態では、RBはメチル、エチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、COOH、COOMe、COOEt、COOCH2OCOCH3である。特定の実施形態では、環Aはフェニル、ナフチル、ビフェニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ピリジル、フラニル、インドリル、ピリミジニル、ピリジジニル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チエニル、チアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、または5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリニルである。特定の実施形態では、各RAは独立して、任意選択的に置換されるアルキルであり、または任意の2つのRAはそれにそれぞれが付着する原子と一緒にアリールを形成し得る。本発明の方法はまた、式V~XXIIの化合物、および本明細書に記載される任意の化合物に関する。別の態様では、化合物は、式、によって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、化合物は-JQ1、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の態様では、化合物は、式、またはによって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の態様では、化合物は、式、またはによって表される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の態様では、化合物は、式、によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の態様では、化合物は、式、によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の態様では、化合物は、以下の構造、によって表される化合物のいずれか1つ、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、本発明の化合物は、の構造の1つによって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物であり得る。一実施形態では、化合物は、構造によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の実施形態では、化合物は、構造によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。別の実施形態では、化合物は、構造によって表され、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。特定の実施形態では、本発明の化合物は、本明細書に示される任意の化合物の逆のキラリティーを有し得る。特定の実施形態では、本化合物は、式V、VI、またはVIIによって表される化合物、式中、R、R1、およびR2およびRBは式I中と同じ意味を有し;YはO、N、S、またはCR5であり、R5は式I中と同じ意味を有し;nは0または1であり;式VII中の破線の円は芳香族または非芳香族環を示す、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。式I~IVおよびVIまたは本明細書の任意の式のいずれかの特定の実施形態では、R6は、下の表Aで示されるアルデヒドの非カルボニル部分に相当するすなわち式R6CHOのアルデヒドでは、R6はアルデヒドの非カルボニル部分である。特定の実施形態では、R4およびR6は、組み合わさって、表Aで示されるケトンの非カルボニル部分に相当するすなわち式R6COR4のケトンでは、R4およびR6はケトンの非カルボニル部分である。一実施形態では、化合物は、式、によって表され、またはその塩、溶媒和化合物、または水和物である。特定の実施形態では、化合物はラセミJQ1であり;特定の実施形態では、化合物は-JQ1である。特定の実施形態では、化合物は、およびからなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和化合物または水和物である。化合物の追加的な例としては、式、のいずれかに記載の化合物が挙げられる。式IX~XXII中では、RおよびR’は、例えば、それぞれが任意選択的に置換されていてもよい、H、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、-C1~C8アルキル、-C2~C8アルケニル、-C2~C8アルキニル、-C3~C12シクロアルキル、置換-C3~C12シクロアルキル、-C3~C12シクロアルケニル、または置換-C3~C12シクロアルケニルであり得る。式XIV中では、Xは、本明細書に記載されるようなアリール基のための任意の置換基であり得る。本発明の化合物は、そのいくつかが当該技術分野で公知の多様な方法によって調製し得る。例えば、下で提供される化学物質の例は、化合物JQ1ラセミ体としておよび鏡像異性体-JQ1および--JQ1スキームS1およびS2を参照されたいを調製するための合成スキームを提供する。式I~VIIIの多様な化合物は、適切な出発原料の置換により、類似法によって調製し得る。例えば、JQ1から出発して、下のスキーム1に示されるようにして、類似アミンを調製し得る。スキーム1スキーム1に示されるように、JQ1のt-ブチルエステルの加水分解は、カルボン酸を与え、それはジフェニルリン酸アジドDPPAで処理されて、クルチウス転位条件にさらされてCbz保護アミンを提供し、次にそれは脱保護されてアミンをもたらす。例えば還元的アミノ化による引き続くアミン基の合成は第二級アミンをもたらし、それをらにアルキル化して三級アミンを提供し得る。スキーム2スキーム2は、例えば、例えば式Iの環Aを異なる芳香族環で置換することでその中で融合環コアが修飾される、式Iの本発明の化合物のさらなる実施例の合成を示す。例えば後述のスキームS1中のアミノジアリールケトンS2に代えて適切な官能性を有するアミノジアリールケトンを使用することで、多様な融合環コアおよび/または付属アリール基式Iの基Rに対応するを有する新しい化合物を提供する。このようなアミノジアリールケトンは市販され、またはそのいくつかが当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得る。スキーム3は、さらなる本発明の化合物を調製するための追加的な例示的合成スキームを提供する。スキーム3スキーム3で示されるように、融合二環式前駆体この化合物の合成については後述のスキームS1を参照されたいを部分RDAM=ジメチルアミノメチレン保護基で官能化し、次にヒドラジドとの反応によって合成して、三環式融合コアを形成する。置換基Rxは、適切なヒドラジドの選択によって変化させ得る。本明細書に記載される方法によって調製し得る本発明の化合物の追加的な実施例としては、以下が挙げられる。アミドアミドは、例えば対応するカルボン酸またはエステルの調製と、それに続く標準条件を使用した適切なアミンでのアミド化によって、調製し得る。特定の実施形態では、アミドは、末端末端窒素含有環例えばピリジル、ピペリジル、ピペラジニル、イミダゾリルN-メチル-イミダゾリルを含む、モルホリニルなどとの二炭素リンカーを提供する。例示的なアミド構造としては、が挙げられる。アミド部分と末端窒素含有環の間の二炭素リンカーの使用が好ましい。逆方向アミド第二級アミンボロン酸特定の実施形態では、少なくとも1つのキラル中心を有する化合物が、ラセミ形態で存在する。特定の実施形態では、少なくとも1つのキラル中心を有する化合物が、鏡像異性的に濃縮され、すなわち少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、99、99または100の鏡像体過剰率e.e.を有する。特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載される化合物-JQ1S-tert-ブチル2-4-4-クロロフェニル-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾール[4,3-a][1,4]ジアゼパム-6-イルアセテートと同一の絶対配置を有する。本明細書で開示される式のいずれかの特定の実施形態では、化合物は以下の構造によって表されない。式中、R’1はC1~C4アルキルであり;R’2は水素、ハロゲン、またはハロゲン原子またはヒドロキシル基で任意選択的に置換されるC1~C4アルキルであり;R’3はハロゲン原子、任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニル、C1~C4アルキル、C1~C4アルコキシ、またはシアノ;-NR5-CH2m-R6式中、R5は水素原子またはC1~C4アルキルであり、mは0~4の整数であり、R6は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルである;または-NR7-CO--CH2n-R8式中、R7は水素原子またはC1~C4アルキルであり、nは0~2の整数であり、R8は任意選択的にハロゲン原子によって置換されるフェニルまたはピリジルであるであり;R’4は-CH2a-CO-NH-R9式中、aは1~4の整数であり、R9は、C1~C4アルキルである;C1~C4ヒドロキシアルキル;C1~C4アルコキシ;または任意選択的にC1~C4アルキル、C1~C4アルコキシ、アミノまたはヒドロキシル基または-CH2b-COOR10式中、bは1~4の整数であり、R10はC1~C4アルキルであるによって置換されるフェニルまたはピリジルである。薬学的に許容可能な塩という用語はまた、本明細書で開示される化合物例えばJQ1、式I~XXIIの化合物または本明細書で記述される任意のその他の化合物から調製されて、カルボン酸官能基などの酸性官能基、および薬学的に許容可能な無機または有機塩基を有する塩を指す。適切な塩基としては、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物;カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物;アルミニウムおよび亜鉛などのその他の金属の水酸化物;アンモニア、および非置換またはヒドロキシ置換モノ-、ジ-、またはトリアルキルアミンなどの有機アミン;ジシクロヘキシルアミン;トリブチルアミン;ピリジン;N-メチル,N-エチルアミン;ジエチルアミン;トリエチルアミン;モノ-、ビス-、またはトリス-2-ヒドロキシエチル-アミン、2-ヒドロキシ-tert-ブチルアミン、またはトリス-ヒドロキシメチルメチルアミンなどのモノ-、ビス-、またはトリス-2-ヒドロキシ-低級アルキルアミン、N,N-ジメチル-N-2-ヒドロキシエチル-アミンなどのN、N,-ジ-低級アルキル-N-ヒドロキシ低級アルキル-アミン、またはトリ-2-ヒドロキシエチルアミン;N-メチル-D-グルカミン;およびアルギニン、リジンなどのアミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。薬学的に許容できる塩という用語は、本明細書で開示される化合物または本明細書で記述される任意のその他の化合物から調製されて、アミノ官能基などの塩基性官能基、および薬学的に許容可能な無機または有機酸を有する塩も指す。適切な酸としては、硫酸水素、クエン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、硝酸、リン酸、イソニコチン酸、乳酸、サリチル酸、酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ベシル酸、フマル酸、グルコン酸、グルカロン酸、糖酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびp-トルエンスルホン酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。Brd4を阻害する小型化合物に加えて、本発明は、Brd4の発現または生物学的活性を阻害する、その他の作用物質をさらに提供する。阻害性核酸本発明は、Brd4の発現または活性を阻害する阻害性核酸分子と、白血病例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性骨髄性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性障害、脊髄形成異常症を治療するためのこのような作用物質の使用とをさらに提供する。このようなオリゴヌクレオチドとしては、Brd4をコードする核酸分子例えば、アンチセンス分子、siRNA、shRNAに結合する一本鎖および二本鎖核酸分子例えば、DNA、RNA、およびそのアナログ、ならびにBrd4に直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子例えば、アプタマーが挙げられる。リボザイム本発明のアンチセンスBrd4配列を含む触媒RNA分子またはリボザイムを使用して、生体内でBrd4核酸分子の発現を阻害し得る。アンチセンスRNA内へのリボザイム配列の包含は、それらにRNA切断活性を与え、したがってコンストラクトの活性を増大させる。標的RNA特異的リボザイムのデザインおよび使用は、そのそれぞれを参照によって援用する、Haseloffetal.,Nature1988;334:585-591および米国特許出願公開第2003/0003469A1号明細書に記載される。したがって、本発明はまた、8~19個の連続核酸塩基を有するアンチセンスRNAを結合アーム中に含む、触媒RNA分子を特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、触媒核酸分子は、ハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフに形成される。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossietal.,AidsResearchandHumanRetroviruses1992;8:183によって記載される。ヘアピンモチーフの例は、1988年9月20日に出願された米国特許出願第07/247,100号明細書の一部継続出願である、1989年9月20日に出願されたHampeletal.,RNACatalystforCleavingSpecificRNASequences、HampelandTritz,Biochemistry1989;28:4929、およびHampeletal.,NucleicAcidsResearch1990;18:299に記載される。これらの特異的モチーフは本発明を制限するものではなく、当業者は、本発明の酵素核酸分子で重要なのは、それが標的遺伝子RNA領域の1つまたは複数に相補的な特異的基質結合部位を有し、また基質結合部位内または周囲に、分子にRNA切断活性を与えるヌクレオチド配列を有することだけであると認識する。小型ヘアピンRNAは、任意選択の3’UU-オーバーハングがあるステムループ構造からなる。変動してもよいが、ステムは、21~31bp望ましくは25~29bpの範囲であり得て、ループは4~30bp望ましくは4~23bpの範囲であり得る。細胞内におけるshRNAの発現のためには、ポリメラーゼIIIH1-RNAまたはU6プロモーターのどちらかを含有するプラスミドベクター、ステムループRNAインサートのためのクローニング部位、および4-5チミジン転写終結シグナルを用い得る。ポリメラーゼIIIプロモーターは、概して明確に定義された開始および終結部位を有し、それらの転写物にはポリA尾部が欠如している。これらのプロモーターの終結シグナルはポリチミジントラクトによって規定され、転写物は、典型的に第2のウリジンの後で切断される。この位置での切断からは、発現されるshRNA中の3’UUオーバーハングが生じ、それは合成siRNA中の3’オーバーハングと類似する。哺乳類細胞内でshRNAを発現する追加的な方法は、上で引用した参考文献に記載される。siRNA短い21~25ヌクレオチドの二本鎖RNAは、下方制御遺伝子発現に効果的である参照によって本明細書に援用するZamoreetal.,Cell101:25-33;Elbashiretal.,Nature2001;411:494-498。哺乳類におけるsirNAアプローチの治療有効性は、McCaffreyetal.Nature2002;418:38-39によって生体内で実証された。標的遺伝子の配列を前提として、siRNAは、遺伝子を不活性化するようにデザインされてもよい。このようなsiRNAは、例えば、罹患組織に直接投与し、または全身投与し得る。Brd4遺伝子の核酸配列を使用して、小型干渉RNAsiRNAをデザインし得る。21~25ヌクレオチドのsiRNAは、例えば血管疾患または障害を治療する治療薬として使用してもよい。本発明の阻害性核酸分子は、Brd4発現のRNA干渉RNAi媒介ノックダウンのための二本鎖RNAとして用いられてもよい。一実施形態では、Brd4発現が、造血細胞または白血病細胞内で低減される。RNAiは、関心のある特定タンパク質の細胞発現を低下させる方法である。Tuschl,Chembiochem2001;2:239-245;Sharp,GenesDevel.2000;15:485-490;HutvagnerandZamore,Curr.Opin.Genet.Devel.2002;12:225-232;およびHannon,Nature2002;418:244-251でレビューされる。dsRNAの形質移入による、またはプラスミドベースの発現系を使用したsiRNA発現を通じた、siRNAの細胞内への導入は、哺乳類細胞において機能喪失表現型を作り出すために、ますます盛んに用いられるようになっている。本発明の一実施形態では、本発明の核酸塩基オリゴマーの8~19個の連続核酸塩基を含む、二本鎖RNAdsRNA分子が作成される。dsRNAは、二重鎖化した2本の個別のRNA鎖、または自己二重鎖化した単一RNA鎖小型ヘアピンshRNAであり得る。典型的に、dsRNAは約21または22塩基対であるが、所望ならばより短くまたはより長くあってもよい最大29核酸塩基まで。dsRNAは、標準的な技術例えば、化学合成または生体外転写を使用して作成し得る。例えば、AmbionAustin,TXおよびEpicentreMadison,WIからのキットが利用できる。dsRNAを哺乳類細胞内で発現させる方法は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、Brummelkampetal.,Science2002;296:550-553;Paddisonetal.,GenesDevel.2002;16:948-958;Pauletal.,NatureBiotechnol.2002;20:505-508;Suietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002;99:5515-5520;Yuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002;99:6047-6052;Miyagishietal.,NatureBiotechnol.2002;20:497-500;およびLeeetal.,NatureBiotechnol.2002;20:500-505に記載される。小型ヘアピンRNAshRNAは、ステムループ構造を有するRNA配列を含んでなる。ステムループ構造は、主に一本鎖ヌクレオチドである領域ループ部分によって片側が連結する、二本鎖または二重鎖ステム部分を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチド領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。ヘアピンという用語はまた、本明細書でステムループ構造を指すために使用される。このような構造は、当該技術分野で周知であり、用語は、当該技術分野におけるその公知の意味で、一貫して使用される。当該技術分野で公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を要求しない。したがってステムは、1つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含み得る。代案としては、塩基対合は正確であり得て、すなわちいかなるミスマッチも含まない。複数ステムループ構造は、例えば、核酸リンカー、miRNAフランキング配列、その他の分子、またはその組み合わせなどのリンカーを通じて、互いに連結し得る。本明細書の用法では、小型ヘアピンRNAという用語は、前駆型miRNAプレmiRNAを形成する、従来型ステムループshRNAを含む。範囲がいくらか変動してもよいが、従来のステムループshRNAは、19~29bpの範囲にわたるステムと、4~30bpの範囲にわたるループを含んでなり得る。shRNAは、micro-RNA包埋shRNAmiRNAベースのshRNAもまた含み、その中ではmiRNA二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖が既存のまたは天然miRNA内にまたは修飾または合成デザインされたmiRNA内に組み込まれる。場合によっては前駆体miRNA分子は、2つ以上のステムループ構造を含みえる。MicroRNAは、約22ヌクレオチド長の内因性にコードされたRNA分子であり、概して高度に組織または発達段階特異的な様式で発現され、転写後に標的遺伝子を調節する。200個を超える別個のmiRNAが、植物および動物で同定されている。これらの小型調節RNAは、1標的mRNA翻訳を阻止することで、および2RNA干渉RNAi、すなわちmRNAの切断および分解を通じて、の2つの支配的な作用様式で、重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、miRNAは、低分子干渉RNAsiRNAに類似して機能する。したがって、既存のmiRNA遺伝子の特徴に基づいて、人工miRNAをデザインし発現させ得る。この点において、短いヘアピンRNAをデザインして、内在性miRNAを模倣させ得る。多数のmiRNA中間体は、制限なしに、miR-15a、-16、-19b、-20、-23a、-27b、-29a、-30b、-30c、-104、-132s、-181、-191、-223の主鎖デザインを含んでなるmiRNAをはじめとする、shRNAまたはshRNAmirのモデルとして使用し得る米国特許公開2005/0075492第号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、shRNA分子は、ヒトmiR-30配列に基づいてデザインされ、pri-miR-30のステム配列を無関係の塩基対合配列で置換することで再設計して、人工shRNAを発現できるようにする。Siolasetal.,2005,Nat.Biotech.23:227-231;Silvaetal.,2005,Nat.Genet.37:1281-1288;Zengetal.2002,Molec.Cell9:1327-1333。miR-30の天然ステム配列を長さ約16~約29ヌクレオチド、特に長さ約19~29ヌクレオチドのステム配列で置換し得る。ループ配列は、長さが約4~約23ヌクレオチドになるように改変し得る。一実施形態では、shRNA分子のステムは、長さが約22ヌクレオチドである。別の実施形態では、ステムは、長さが約29ヌクレオチドである。したがって、本発明は、合成的に生成されたshRNA、ならびに天然に見られるmicroRNAmiRNA分子を使用して実施し得て、再構築して短いヘアピンRNAの合成サイレンシングとして機能させ得る。shRNAはDNAベクターから発現して、持続性のサイレンシングおよびほとんどあらゆる細胞型への高収率の送達を提供し得る。いくつかの実施形態では、ベクターはウィルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルスおよび鳥類ウイルスベクターをはじめとするレトロウイルスが挙げられ、安定した単一コピーゲノムの組み込みができるようにするベクターを含む。レトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来するレトロウィルスとしては、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系を形質導入して、産生細胞系を形成し得る。形質移入し得るパッケージング細胞の例としては、その内容全体を参照によって本明細書に援用するMiller,HumanGeneTherapy1:5-141990に記載されるような、PE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GPE-86、GPenvAm12、およびDAN細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。ベクターは、当該技術分野で公知の任意の手段を通じて、パッケージング細胞に形質導入し得る。産生細胞系は、DNA複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、感染性レトロウィルスベクター粒子を産出する。次にこのようなレトロウィルスベクター粒子を用いて、生体外または生体内のどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、DNA複製タンパク質を発現する。本質的に、細胞内に核酸コンストラクトを導入する任意の方法を用い得る。核酸を導入する物理的方法としては、コンストラクト含有溶液の注入、コンストラクトによって被覆された粒子による衝撃、細胞または組織サンプルまたは生物の核酸溶液への浸漬、またはコンストラクト存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウィルス粒子内にパッケージされたウィルス性コンストラクトを使用して、細胞内への発現コンストラクトの効率的な導入と、コードされたshRNAの転写の双方を達成し得る。脂質媒介キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介輸送などの核酸を細胞に導入する、その他の当該技術分野で公知の方法を使用し得る。したがってshRNAをコードする核酸コンストラクトを以下の機能の1つまたは複数を果たす構成要素と共に導入し得る:細胞によるRNA取り込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定化する、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増大する。細胞内発現のために、例えば、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターのどちらかを含んでなるプラスミドベクターなどのDNAベクターを用い得る。内在性miRNAの発現はRNAポリメラーゼIIPolIIプロモーターによって制御され、場合によっては、shRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと比較して、PolIIプロモーターによって最も効率的に駆動されるDickinsetal.,2005,Nat.Genet.39:914-921。いくつかの実施形態では、shRNAの発現は、制限なしに、RNAポリメラーゼタイプIIプロモーターをはじめとする、誘導性プロモーターまたは条件的発現系によって制御され得る。本発明の文脈で有用なプロモーターの例は、TRE-tightをはじめとするテトラサイクリン誘導性プロモーター、IPTG誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子系、および逆テトラサイクリントランス活性化因子rtTA系である。構成的プロモーターもまた使用し得て、細胞特異的または組織特異的プロモーターについても同様である。多数のプロモーターは遍在性であり、それらは任意の細胞および組織型で発現される。特定の実施形態は、生体外および生体内研究における最も効果的な条件的遺伝子発現系の1つである、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用する。誘導性shRNAの説明については、国際特許出願PCT/US2003/030901国際公開第2004-029219A2号パンフレットおよびFewelletal.,2006,DrugDiscoveryToday11:975-982を参照されたい。小型ヘアピンRNAshRNAは、ステムループ構造を有するRNA配列を含んでなる。ステムループ構造は、主に一本鎖ヌクレオチドである領域ループ部分によって片側が連結する、二本鎖または二重鎖ステム部分を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチド領域を含む、二次構造を有する核酸を指す。ヘアピンという用語はまた、本明細書でステムループ構造を指すのに使用される。このような構造は、当該技術分野で周知であり、用語は、当該技術分野におけるその公知の意味で、一貫して使用される。当該技術分野で公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を要求しない。したがってステムは、1つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含み得る。代案としては、塩基対合は正確であり得て、すなわちいかなるミスマッチも含まない。複数ステムループ構造は、例えば、核酸リンカー、miRNAフランキング配列、その他の分子、またはその組み合わせなどのリンカーを通じて、互いに連結し得る。本明細書の用法では、小型ヘアピンRNAという用語は、前駆型miRNAプレmiRNAを形成する、従来型ステムループshRNAを含む。範囲がいくらか変動してもよいが、従来のステムループshRNAは、19~29bpの範囲にわたるステムと、4~30bpの範囲にわたるループを含んでなり得る。shRNAは、micro-RNA包埋shRNAmiRNAベースのshRNAもまた含み、その中ではmiRNA二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャー鎖が既存のまたは天然miRNA内にまたは修飾または合成デザインmiRNA内に組み込まれる。場合によっては前駆体miRNA分子は、2つ以上のステムループ構造を含み得る。MicroRNAは、約22ヌクレオチド長の内因性にコードされたRNA分子であり、概して高度に組織または発達段階特異的な様式で発現され、転写後に標的遺伝子を調節する。200個を超える別個のmiRNAが、植物および動物で同定されている。これらの小型調節RNAは、2つの支配的な作用様式で、すなわち、1標的mRNAの翻訳を抑制することにより、および2RNA干渉RNAi、すなわちmRNAの切断および分解を通じて、重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、miRNAは、低分子干渉RNAsiRNAに類似して機能する。したがって、既存のmiRNA遺伝子の特徴に基づいて、人工miRNAをデザインし発現し得る。この点において、短いヘアピンRNAをデザインして、内在性miRNAを模倣し得る。多数のmiRNA中間体は、制限なしに、miR-15a、-16、-19b、-20、-23a、-27b、-29a、-30b、-30c、-104、-132s、-181、-191、-223の主鎖デザインを含んでなるmiRNAをはじめとする、shRNAまたはshRNAmirのモデルとして使用し得る米国特許公開2005/0075492第号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態では、shRNA分子は、ヒトmiR-30配列に基づいてデザインされ、pri-miR-30のステム配列を無関係の塩基対合配列で置換することで再設計して、人工shRNAを発現できるようにする。Siolasetal.,2005,Nat.Biotech.23:227-231;Silvaetal.,2005,Nat.Genet.37:1281-1288;Zengetal.2002,Molec.Cell9:1327-1333。miR-30の天然ステム配列を長さ約16~約29ヌクレオチド、特に長さ約19~29ヌクレオチドのステム配列で置換し得る。ループ配列は、長さが約4~約23ヌクレオチドになるように改変し得る。一実施形態では、shRNA分子のステムは、長さが約22ヌクレオチドである。別の実施形態では、ステムは、長さが約29ヌクレオチドである。したがって、本発明は、合成的に生成されたshRNA、ならびに天然に見られるmicroRNAmiRNA分子を使用して実施し得て、再構築して短いヘアピンRNAの合成サイレンシングとして機能させ得る。shRNAはDNAベクターから発現して、持続性のサイレンシングおよびほとんどあらゆる細胞型への高収率の送達を提供し得る。いくつかの実施形態では、ベクターはウィルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルスおよび鳥類ウイルスベクターをはじめとするレトロウイルスが挙げられ、安定した単一コピーゲノムの組み込みができるようにするベクターを含む。レトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来するレトロウィルスとしては、モロニーマウス白血病ウィルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウィルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞系を形質導入して、産生細胞系を形成し得る。形質移入し得るパッケージング細胞の例としては、その内容全体を参照によって本明細書に援用するMiller,HumanGeneTherapy1:5-141990に記載されるような、PE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GPE-86、GPenvAm12、およびDAN細胞系が挙げられるが、これに限定されるものではない。ベクターは、当該技術分野で公知の任意の手段を通じて、パッケージング細胞に形質導入し得る。産生細胞系は、DNA複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、感染性レトロウィルスベクター粒子を産出した。次にこのようなレトロウィルスベクター粒子を用いて、生体外または生体内のどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。形質導入された真核生物細胞は、DNA複製タンパク質を発現する。本質的に、細胞内に核酸コンストラクトを導入する任意の方法を用い得る。核酸を導入する物理的方法としては、コンストラクト含有溶液の注入、コンストラクトによって被覆された粒子による衝撃、細胞または組織サンプルまたは生物の核酸溶液への浸漬、またはコンストラクト存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウィルス粒子内にパッケージされたウィルス性コンストラクトを使用して、細胞内への発現コンストラクトの効率的な導入と、コードされたshRNAの転写の双方を達成し得る。脂質媒介キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介輸送などの核酸を細胞に導入する、その他の当該技術分野で公知の方法を使用し得る。したがってshRNAをコードする核酸コンストラクトを以下の機能の1つまたは複数を果たす構成要素と共に導入し得る:細胞によるRNA取り込みを高める、二重鎖のアニーリングを促進する、アニールした鎖を安定化する、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増大する。細胞内発現のために、例えば、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターのどちらかを含んでなるプラスミドベクターなどのDNAベクターを用い得る。内在性miRNAの発現はRNAポリメラーゼIIPolIIプロモーターによって制御され、場合によっては、shRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと比較して、PolIIプロモーターによって最も効率的に駆動されるDickinsetal.,2005,Nat.Genet.39:914-921。いくつかの実施形態では、shRNAの発現は、制限なしに、RNAポリメラーゼタイプIIプロモーターをはじめとする、誘導性プロモーターまたは条件的発現系によって制御され得る。本発明の文脈で有用なプロモーターの例は、TRE-tightをはじめとするテトラサイクリン誘導性プロモーター、IPTG誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化因子系、および逆テトラサイクリントランス活性化因子rtTA系である。構成的プロモーターもまた使用し得て、細胞特異的または組織特異的プロモーターについても同様である。多数のプロモーターは遍在性であり、それらは任意の細胞および組織型で発現される。特定の実施形態は、生体外および生体内研究における最も効果的な条件的遺伝子発現系の1つである、テトラサイクリン応答性プロモーターを使用する。誘導性shRNAの説明については、国際特許出願PCT/US2003/030901国際公開第2004-029219A2号パンフレットおよびFewelletal.,2006,DrugDiscoveryToday11:975-982を参照されたい。核酸塩基オリゴマーの送達裸の阻害性核酸分子、またはそのアナログは、哺乳類細胞に入って、例えばBrd4などの関心のある遺伝子発現を抑制することができる。それでもなお、オリゴヌクレオチドまたはその他の核酸塩基オリゴマーの細胞への送達を助ける製剤を利用するのが、望ましいことがある。例えば、それぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第5,656,611号明細書、米国特許第5,753,613号明細書、米国特許第5,785,992号明細書、米国特許第6,120,798号明細書、米国特許第6,221,959、米国特許第6,346,613号明細書、および米国特許第6,353,055号明細書を参照されたい。治療薬別の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、薬理効果を有することが発見された作用物質例えばJQ1または本明細書に記述される式の化合物は、薬剤として、または合理的薬物設計による既存化合物の構造的修飾の情報として有用である。治療用途では、本明細書で開示される方法を使用して同定された組成物または作用物質は、例えば生理的食塩水などの薬理的に許容可能な緩衝液中に配合して、全身投与してもよい。好ましい投与経路としては、例えば、患者中で連続的な持続性薬剤レベルを提供する、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮内注射が挙げられる。ヒト患者またはその他の動物の治療は、生理学的に許容可能なキャリア中の本明細書で同定された治療薬の治療的有効量を使用して実施される。適切なキャリアおよびそれらの処方については、例えばRemington’sPharmaceuticalSciencesbyE.W.Martinに記載される。投与される治療薬の量は、投与様式、患者の年齢と体重、および白血病例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害の臨床症状次第で変動する。一般に、量は、白血病と関連付けられているその他の疾患の治療で使用されるその他の作用物質で使用される量の範囲内であるが、場合によっては、化合物の特異性増大のためにより少ない量が必要とされる。化合物は、当業者に知られている方法による測定で、または細胞増殖または生存度を測定するアッセイを使用した測定で、がん細胞の増殖、成長または生存を低下させる投与量で投与される。医薬組成物の処方白血病治療のための化合物投与は、その他の構成要素と組み合わさって、白血病細胞の増殖または生存を低下させるのに効果的な治療薬濃度をもたらす、あらゆる適切な手段によってもよい。化合物は、任意の適切なキャリア物質中に任意の適切な量で含有されてもよく、通常、組成物総重量の1~95重量の量で存在する。組成物は、非経口例えば皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与経路に適した剤形で提供されてもよい。医薬組成物は、従来の製薬慣行に従って調合してもよい例えば、Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy20thed.,ed.A.R.Gennaro,LippincottWilliamsWilkins,2000およびEncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,eds.J.SwarbrickandJ.C.Boylan,1988-1999,MarcelDekker,NewYorkを参照されたい。特定の一実施形態では、本発明の作用物質は、対象に直接、全身投与される。ヒト投与量は、最初に、マウスで使用される化合物量の外挿によって決定し得て、当業者は認識するように、これは動物モデルと比較してヒトのための投与量を変更する、技術分野におけるルーチンである。一実施形態では、本発明の作用物質は、50mg/kgで経口または全身投与される。特定の他の実施形態では、投与量が、約1μg化合物/Kg体重~約5000mg化合物/Kg体重;または約5mg/Kg体重~約4000mg/Kg体重または約10mg/Kg体重~約3000mg/Kg体重;または約50mg/Kg体重~約2000mg/Kg体重;または約100mg/Kg体重~約1000mg/Kg体重;または約150mg/Kg体重~約500mg/Kg体重の間で変動してもよいことが予期される。別の実施形態では、この用量は、約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、または5000mg/Kg体重であってもよい。別の実施形態では、用量は、約5mg化合物/Kg体重~約100mg化合物/Kg体重の範囲内であってもよいことが想定される。別の実施形態では、用量は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/Kg体重であってもよい。もちろん、この投与量は、このような治療プロトコルで慣例的に行われるように、初期臨床試験の結果と特定患者のニーズに応じて、上向きまたは下向きに調節してもよい。本発明に従った医薬組成物は、投与時に実質的に即座に、または投与後の任意の所定時間または期間に、活性化合物を放出するように調合してもよい。後者の種類の組成物は、一般に放出制御製剤として知られ、以下が挙げられるi体内で長期にわたり実質的に定濃度の薬剤をもたらす製剤;ii所定の遅延時間後に、体内で長期にわたり実質的に定濃度の薬剤をもたらす製剤;iii活性物質の血漿レベルのゆらぎ鋸歯状動態パターンと関連付けられている望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内で比較的一定した効果的レベルを保つことで、所定期間中に作用を維持する製剤;iv例えば、胸線に隣接しまたは接触する、放出制御組成物の空間配置によって、作用を局在化させる製剤;v用量が例えば1週間または2週間毎に投与されるような、便利な投与ができるようにする製剤;およびvi急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病を標的とする製剤。いくつの用途では、放出制御製剤は、日中に血漿レベルを治療レベルに保つための頻繁な投与に対する必要性をなくす。放出速度が、問題になっている化合物の代謝率を補って余りある、放出制御を得るために、いくつかのストラテジーを追究し得る。一例では、放出制御は、例えば、様々な種類の放出制御組成物およびコーティングを含む、様々な処方パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療薬は、適切な賦形剤と共に医薬組成物に調合され、それは投与時に、治療薬を制御された様式で放出する。実施例としては、一単位または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油剤、懸濁液、エマルション、マイクロカプセル、微小球、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。非経口組成物医薬組成物は、投薬形態または製剤での注射、輸液または移植皮下、静脈内に、筋肉内、腹腔内、などによって、または従来の無毒の薬学的に許容可能なキャリアおよびアジュバントを含有する適切な送達デバイスまたはインプラントを介して、非経口的に投与してもよい。このような組成物の処方および調製は、製剤処方当業者に周知である。処方は、前出のRemington:TheScienceandPracticeofPharmacyにある。非経口用の組成物は、単位用量形態例えば単回投与アンプルで、またはその中に適切な保存料が添加されても良い、数回の用量を含有するバイアルで提供されてもよい下記参照。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、輸液用器具、または埋め込み用送達デバイスの形態であってもよく、またはそれは、使用前に水または別の適切なビヒクルで戻される乾燥粉末として提示されてもよい。白血病細胞の成長、増殖または生存を低下させる活性薬剤の他に、組成物は、適切な非経口的に許容可能なキャリアおよび/または賦形剤を含むこともできる。活性治療薬は、放出制御のために、微小球、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれてもよい。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、pH調節剤、浸透圧調節剤、および/または分散剤を含んでもよい。上述の通り、本発明に従った医薬組成物は、無菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するために、適切な治療薬を非経口的に許容可能な液体ビヒクルに溶解または懸濁する。用いてもよい許容可能ビヒクルおよび溶剤は、水、適量の塩酸または水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液の添加によって適切なpHに調節された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル液、および等張の塩化ナトリウム溶液とデキストロース溶液である。水性製剤は、1つまたは複数の保存料例えばメチル、エチルまたはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエートもまた含有してもよい。場合によっては、化合物の1つが難溶性またはわずかに水溶性であれば、溶解促進剤または可溶化剤を添加し得て、または溶媒に10~60w/wのプロピレングリコールなどを含めることもできる。放出制御非経口組成物放出制御非経口組成物は、水性懸濁液、微小球、マイクロカプセル、磁性微小球、油剤、油懸濁液、またはエマルションの形態であってもよい。代案としては、活性薬剤は、生体適合性キャリア、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または輸液用器具に組み込まれてもよい。微小球および/またはマイクロカプセル調製品で使用するための材料は、例えばポリガラクチン、ポリ-イソブチルシアノアクリレート、ポリ2-ヒドロキシエチル-L-グルタミン、およびポリ乳酸などの生分解性/生体内分解性のポリマーである。放出制御非経口製剤を処方する際に使用してもよい生体適合性キャリアは、炭水化物例えばデキストラン、タンパク質例えばアルブミン、リポタンパク、または抗体である。インプラントで使用するための材料は、非生分解性例えばポリジメチルシロキサン、または生分解性例えばポリカプロラクタム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸またはポリオルトエステルまたはその組み合わせであり得る。経口使用のための固体剤形経口使用のための製剤としては、無毒の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物中の活性成分を含有する錠剤が挙げられる。このような製剤は、当業者に知られている。賦形剤は例えば、不活性希釈剤または増量剤例えばスクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン類、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム;顆粒化剤および崩壊剤例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸;結合剤例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール;および平滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、または滑石であってもよい。その他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色剤、着香剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。錠剤は、未被覆であってもよく、またはそれらは公知の技術によって被覆されて、任意選択的に、胃腸管内における崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたり持続性作用を提供する。コーティングは、例えば放出制御製剤を達成するために所定のパターンで活性薬剤を放出するように適合されてもよく、またはそれは胃通過後まで、活性薬剤を放出しないように適合されてもよい腸溶コーティング。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレート共重合体、ポリエチレングリコールおよび/またはポリビニルピロリドンベース、または腸溶コーティング例えばメタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸メチルセルロースヒドロキシプロピル、ポリビニルアセテートフタレート、シェラック、および/またはエチルセルロースベースであってもよい。さらに、例えばモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料もまた用いてもよい。固体錠剤組成物は、望まれない化学変化例えば活性治療剤の放出前の化学分解から組成物を保護するように適合されたコーティングを含んでもよい。コーティングは、前出のEncyclopediaofPharmaceuticalTechnologyに記載されている様式と同じようにして、固体剤形上に塗布してもよい。少なくとも2つの治療薬を錠剤中で一緒に混合してもよく、または分割してもよい。一例では、第2の治療薬のかなりの部分が第1の治療薬の放出前に放出されるように、第1の活性治療薬が錠剤内部に、第2の活性治療薬が外側に含有される。経口使用のための製剤は、チュアブル錠として、または活性成分が不活性固体希釈剤例えばジャガイモデンプン、乳糖、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が、例えば、落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油などの水または油媒質と混合される、軟質ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。粉末および顆粒は、錠剤およびカプセルについて上述された成分を使用して、例えばミキサー、流動床装置または噴霧乾燥装置を使用して、従来の様式で調製してもよい。放出制御経口投薬形態経口使用のための放出制御組成物は、例えば、活性物質の溶出および/または拡散を制御することで、活性治療薬を放出するように構築されてもよい。溶出または拡散放出制御は、錠剤、カプセル、ペレットの適切なコーティングによって、または化合物の顆粒製剤によって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって達成し得る。放出制御コーティングとしては、上述の1つまたは複数のコーティング物質および/または、例えば、シェラック、蜜蝋、グリコワックス、水素化ヒマシ油、カルナウバ蝋、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリン、エチルセルロース、アクリル樹脂、dl-ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メタクリル酸メチル、2-ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートハイドロゲル、1,3ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および/またはポリエチレングリコールが挙げられる。放出制御マトリックス製剤中では、マトリックス材は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバ蝋およびステアリルアルコール、カルボポル934、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル-メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および/またはハロゲン化フルオロカーボンもまた含んでもよい。1つまたは複数の治療用化合物を含有する放出制御組成物はまた、浮揚性錠剤またはカプセルすなわち、経口投与時に、一定時間胃内容物上部に浮遊する錠剤またはカプセルの形態であってもよい。化合物の浮揚性錠剤処方は、化合物と賦形剤の混合物をヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの20~75w/wの親水コロイドと共に顆粒化することで調製し得る。次に得られた顆粒を錠剤に圧縮し得る。胃液との接触時に、錠剤はその表面周辺に、実質的に不透水性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは、1未満の密度の維持に荷担し、それによって錠剤が胃液中で浮揚性のままであるようにする。併用療法任意選択的に、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害をはじめとするがこれに限定されるものではない白血病を治療するための治療薬が、単独で投与され、または当業者に知られており、Remington’sPharmaceuticalSciencesbyE.W.Martinに記載されるがんを治療するためのその他の標準治療法と組み合わせて投与される。所望ならば、本発明の作用物質例えば、本明細書に記述される式の化合物であるJQ1、およびその誘導体が、がん治療に有用な任意の従来の化学療法薬と組み合わせて投与される。キットまたは医薬品システム本組成物は、白血病例えば、急性骨髄性白血病AML、慢性リンパ球性白血病CLL、急性リンパ球性白血病ALL、慢性骨髄性白血病CML、慢性骨髄単核白血病CMML、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄形成異常症、および骨髄増殖性障害の治療で使用するためのキットまたは医薬品システムに組み立ててもよい。本発明のこの態様に従ったキットまたは医薬品システムは、その中に、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの1つまたは複数の収容手段を厳重に密封して有する、箱、カートン、筒などの運搬手段を含んでなる。本発明のキットまたは医薬品システムは、本発明の作用物質を使用するための付属使用説明もまた含んでなってもよい。治療法治療法は、家庭、医院、診療所、病院の外来、または病院など、がん治療法が実施される任意の場所で提供されてもよい。治療は、一般に、医師が治療法の効果を綿密に観察し、必要なあらゆる調節をし得るように、病院で開始される。治療法の持続期間は、治療されるがんの種類、患者の年齢および病状、患者の疾患の病期およびタイプ、および患者の身体が治療にどのように応答するかに左右される。薬剤投与は、異なる間隔例えば、毎日、毎週、または毎月で実施してもよい。治療法は、患者の身体が健康な新しい細胞を構築して、その強度を取り戻す機会があるように、休息期間を含む間欠的周期で与えられてもよい。上述したように、所望ならば、Brd4を標的とする阻害性核酸分子である本発明の化合物例えば、JQ1による治療は、増殖性疾患治療のための治療法例えば、放射線療法、外科手術、または化学療法と組み合わせてもよい。本発明の実施は、特に断りのない限り、十分に当業者の技量の範囲内である、従来の組換え技術をはじめとする分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学技術を用いる。このような技術は、MolecularCloning:ALaboratoryManual,secondeditionSambrook,1989;OligonucleotideSynthesisGait,1984;AnimalCellCultureFreshney,1987;MethodsinEnzymologyHandbookofExperimentalImmunologyWeir,1996;GeneTransferVectorsforMammalianCellsMillerandCalos,1987;CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubel,1987;PCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullis,1994;CurrentProtocolsinImmunologyColigan,1991などの文献で詳しく説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用でき、したがって本発明の作成および実施で検討し得る。以下の節で、特定の実施形態のために特に有用な技術を考察する。以下の実施例は、当業者に、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作成して使用する方法の完全な開示と説明を提供するために提示され、発明者らが彼らの発明と見なす範囲を制限することは意図されない。I.化学物質実施例-合成および調製法本発明の化合物は、本明細書の説明を考慮して、本明細書に記載される方法によって、および/または当業者に知られている方法に従って、合成し得る。スキームS1.ラセミブロモドメイン阻害剤±-JQ1の合成2-アミノ-4,5-ジメチルチオフェン-3-イル4-クロロフェニルメタノンS2上に示すスキームに従って、化合物JQ1を調製した。23°Cのエタノール20ml、0.35M中の4-クロロベンゾイルアセトニトリルS11.24g、6.9mmol、1等量、2-ブタノン0.62ml、6.9mmol、1.00等量、およびモルホリン0.60ml、6.9mmol、1.00等量の溶液に、イオウ220mg、6.9mmol、1.00等量を固体として添加した21。次に混合物を70°Cに加熱した。12時間後、反応混合物を23°Cに冷却し、鹹水100ml中に注いだ。水層を酢酸エチル3×50mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水50mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、40グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、S21.28g、70を黄色固体として得た。S-tert-ブチル-3-{[9H-フルオレン-9-イルメトキシ]カルボニル}アミノ-4-{[3-4-クロロベンゾイル-4,5-ジメチルチオフェン-2-イル]アミノ}-4-オキソブタノエートS3N,N-ジメチルホルムアミド1.5ml、1.0M中の9-フルオレニルメトキシカルボニル-アスパラギン酸β-tert-ブチルエステル[Fmoc-AspOt-Bu-OH]864mg、2.1mmol、2.10等量の溶液に、2-6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスファートHCTU827mg、2.0mmol、2.00等量、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン0.72ml、4.0mmol、4.00等量を逐次添加した。次に混合物を23°Cで5分間撹拌した。次にS2266mg、1.0mmol、1等量を固体として添加した。反応混合物を23°Cで撹拌した。16時間後、酢酸エチル20mlおよび鹹水20mlを添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル2×20mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水30mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、40グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、S3625mg、90を褐色油として得た。S-tert-ブチル3-アミノ-4-3-4-クロロベンゾイル-4,5-ジメチルチオフェン-2-イルアミノ-4-オキソブタノエートS423°CのDMF溶液4.0ml、0.22M中の20ピペリジンに、化合物S3560mg、0.85mmol、1等量を溶解した。30分後、酢酸エチル20mlおよび鹹水20mlを反応混合物に添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル2×20mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水3×25mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、24グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、遊離アミンS4370mg、90を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は75に下がったAS-Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCにより測定された。S-tert-ブチル2-5-4-クロロフェニル-6,7-ジメチル-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-チエノ[2,3-e][1,4]ジアゼパム-3-イルアセテートS5アミノケトンS4280mg、0.63mmolを10酢酸エタノール溶液21ml、0.03Mに溶解した。反応混合物を85°Cに加熱した。30分後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、12グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、化合物S5241mg、95を白色固体として得た。S5のエナンチオマ純度は67であったAS-Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCにより測定された。tert-ブチル2-5-4-クロロフェニル-6,7-ジメチル-2-チオキソ-2,3-ジヒドロ-1H-チエノ[2,3-e][1,4]ジアゼパム-3-イルアセテートS6ジグリム1.25ml、0.4M中のS5210mg、0.5mmol、1等量溶液に、五硫化リン222mg、1.0mmol、2.00等量、炭酸水素ナトリウム168mg、2.0mmol、4.00等量を逐次添加した。反応混合物を90°Cに加熱した。16時間後、鹹水20mlおよび酢酸エチル35mlを添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル3×30mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水2x15mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、24グラムシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、回収されたS573mg、34と共に、S6141mg、65を褐色固体として得た。tert-ブチル2-4-4-クロロフェニル-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾール[4,3-a][1,4]ジアゼパム-6-イルアセテート[±JQ1]0°CのTHF2.6ml、0.14M中のS6158mg、0.36mmol、1等量溶液に、ヒドラジン0.015ml、0.45mmol、1.25等量を添加した。反応混合物を23°Cに加温して、23°Cで1時間撹拌した。全ての溶剤を減圧下で除去した。得られたヒドラジンを精製なしで直接使用した。次にヒドラジンをオルト酢酸トリメチルとトルエンの2:3混合物6ml、0.06Mに溶解した。反応混合物を120°Cに加熱した。2時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、4gのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、JQ1140mg、2段階で85を白色固体として得た。反応条件は、不斉中心をさらにエピマー化して、ラセミ体JQ1がもたらされた。AS-Hカラムを用いて、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCにより測定された。スキームS2.鏡像異性的に濃縮された-JQ1の合成S-tert-ブチル-3-{[9H-フルオレン-9-イルメトキシ]カルボニル}アミノ-4-{[3-4-クロロベンゾイル-4,5-ジメチルチオフェン-2-イル]アミノ}-4-オキソブタノエートS3N,N-ジメチルホルムアミド1.0ml、1.0M中の9-フルオレニルメトキシカルボニル-アスパラギン酸β-tert-ブチルエステル[Fmoc-AspOt-Bu-OH]411mg、1.00mmol、1.0等量溶液に、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシルトリピロリジノホスホニウムPyBOP494mg、0.95mmol、0.95等量、N,N-ジイソプロピルエチルアミン0.50ml、2.8mmol、2.75等量を逐次した。次に混合物を23°Cで5分間撹拌した。次にS2266mg、1.0mmol、1等量を固体として添加した。反応混合物を23°Cで撹拌した。4時間後、酢酸エチル20mlおよび鹹水20mlを添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル2×20mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、40グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、S3452mg,72を褐色油として得た。S-tert-ブチル3-アミノ-4-3-4-クロロベンゾイル-4,5-ジメチルチオフェン-2-イルアミノ-4-オキソブタノエートS423°CのDMF溶液2.2ml、0.22M中の20ピペリジンに、化合物S3310mg、0.47mmol、1等量を溶解した。30分後、酢酸エチル20mlおよび鹹水20mlを反応混合物に添加した。2層が分離し、水層を酢酸エチル2×20mlで抽出した。合わせた有機層を鹹水3×25mlで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、24グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、遊離アミンS4184mg、90を黄色固体として得た。エナンチオマ純度は、91であった。AS-Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCによりチェックした。S-tert-ブチル2-5-4-クロロフェニル-6,7-ジメチル-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-チエノ[2,3-e][1,4]ジアゼパム-3-イルアセテートS5アミノケトンS4184mg、0.42mmolをトルエン10ml、0.04Mに溶解した。シリカゲル300mgを添加して、反応混合物を90°Cに加熱した。3時間後、反応混合物を23°Cに冷却した。シリカゲルを濾過して、酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashRFsystem、12グラムのシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンによって精製し、化合物S5168mg、95を白色固体として得た。エナンチオマ純度は90であったAS-Hカラムを使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCにより測定された。S-tert-ブチル2-4-4-クロロフェニル-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾール[4,3-a][1,4]ジアゼパム-6-イルアセテート[JQ1]-78°CのTHF1.8ml、0.15M中のS5114mg、0.27mmol、1等量溶液に、カリウムtert-ブトキシドTHF中の1.0M溶液、0.3ml、0.30mmol、1.10等量を添加した。反応混合物を-10°Cに加温して、23°Cで30分間撹拌した。反応混合物を-78°Cに冷却した。クロロリン酸ジエチル0.047ml、0.32mmol、1.20等量を反応混合物に添加した22。得られた混合物を-10°Cで45分間加温した。酢酸ヒドラジド30mg、0.40mmol、1.50等量を反応混合物に添加した。反応混合物を23°Cで撹拌した。1時間後、90°Cに加熱された反応混合物に、1-ブタノール2.25mlを添加した。1時間後、全ての溶剤を減圧下で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーCombiflashsystem、4gシリカゲル、勾配0~100酢酸エチル-ヘキサンで精製し、-JQ1114mg、92を白色固体として90のエナンチオマ純度で得たAS-Hカラム、85ヘキサン-メタノール、210nm、tRR-鏡像異性体=1.59分、tRS-鏡像異性体=3.67分を使用して、Berger超臨界流体クロマトグラフィーSFCによって測定した。キラル分取HPLCOD-Hカラムを使用したAgilent高圧液体クロマトグラフィーによって生成物をさらに精製し、99ee以上でS鏡像異性体を得た。1HNMR600MHz,CDCl3,25°Cδ7.39d,J=8.4Hz,2H,7.31d,J=8.4Hz,2H,4.54t,J=6.6MHz,1H,3.54-3.52m,2H,2.66s,3H,2.39s,3H,1.67s,3H,1.48s,9H.13CNMR150MHz,CDCl3,25°Cδ171.0,163.8,155.7,150.0,136.9,131.1,130.9,130.6,130.3,128.9,81.2,54.1,38.1,28.4,14.6,13.5,12.1.HRMSESI計算値C21H24ClN2O3S[MH]:457.1460,実測値457.1451m/z.TLCEtOAc、Rf:0.32UV[α]22D=75c0.5、CHCl3Fmoc-D-AspOt-Bu-OHを出発原料として用いて、同様にして--JQ1を合成し、キラル分取HPLCOD-Hカラムを使用したAgilent高圧液体クロマトグラフィーによってさらに精製して、99eeを超えるR鏡像異性体を得た。[α]22D=-72c0.5、CHCl3追加的な化合物の合成スキームS3で図示されるようにして、追加的な本発明の化合物を調製した。スキームS3.ヒドラジン誘導体の合成スキームS3で示されるようにして、-JQ1のt-ブチルエステル1を切断して遊離酸2をもたらし、それをヒドラジンと結合してヒドラジド3をもたらした。4-ヒドロキシベンズアルデヒドとの反応は、ヒドラゾン4を生じた。ヒドラジド3およびヒドラゾン4のどちらも、少なくとも1つの生物学的アッセイで活性を示した。ヒドラジド3と多様なカルボニル含有化合物との反応によって、化合物のライブラリーを調製した上の表A参照。例えばアッセイ開発のためのプローブとして使用するために、追加的な化合物を調製した。例示的な合成を下のスキームS4に示す。スキームS4.プローブとして有用な誘導体の合成追加的な化合物を下の表で示すようにして調製した。各化合物のスペクトルデータは、割り当てられた構造に一致した。生物学的活性および処理法実施例1:Brd4は、急性骨髄性白血病細胞の増殖のために、決定的かつ特異的に必要とされる。急性骨髄性白血病AMLの維持に必要なエピジェネティックな経路を体系的に探索するために、shRNAスクリーニングを行った。このためには、243個の公知のクロマチン調節因子を標的とする、特定用途向けshRNAライブラリーを構築した。このライブラリーは、エピジェネティックなマークの大部分のwriter、reader、およびeraserを含んだ図1A。この1,095個のshRNA遺伝子あたり3~6個のライブラリーは、負の選択RNAiスクリーニング向けに最適化させたベクターであるTRMPV中で構築した。一次スクリーニングでは、MLL-AF9およびNrasG12D融合遺伝子を含む確立されたTet-OnコンピテントAMLマウスモデル細胞系に、ライブラリーを1つのプールとして形質導入したZuberetal.,NatBiotechnol2011;29:79-83。薬剤選択に続いて、ドキシサイクリンdoxの添加によってshRNA発現を誘導した。ゲノムDNAから増幅されたshRNAguide鎖の大規模シークエンシングを使用して、14日間の培養後のライブラリー表現の変化をモニターした図1Bおよび2A~2D。2つの独立した複製のそれぞれで、177個のshRNAが、20倍を超える消耗を呈示し、それをスコア付基準として使用した。必須遺伝子Rpa1、Rpa3、Pcna、Polr2bを標的とする8つの陽性対照shRNAの全てで、ならびに2つの公知のMLL-AF9補助因子Men1およびPsip1を標的とするいくつかのshRNAで、正のスコアを得た。一次スクリーニングでスコア付基準を達成した少なくとも2つの独立したshRNAを有する遺伝子には、独立したMLL-AF9/NrasG12DAML系およびベクターシステムを使用して、詳細な一つずつの検証を行った図3A追加的な詳細については、国際公開第2010/111712号パンフレットを参照されたい。一次スクリーニングおよび検証段階の双方で、転写因子Brd4を標的とするshRNAは、最も強く消耗した1つである。全体的に、Brd4は、このshRNAスクリーニングの実験条件に対する最も応答性の遺伝子として同定された図1Bおよび3B。Brd4は、アセチル化ヒストンに結合して転写に影響を及ぼす、ブロモドメイン含有タンパク質のBETファミリー構成員である。BRD4はまた、稀な形態の扁平上皮がんにおいて、染色体転座を介して突然変異するプロトオンコジーンでもある。白血病におけるBrd4の役割については、記載されていない。小分子BETブロモドメイン阻害剤の最近の進歩Filippakopoulosetal.,Nature2010;468:1067-73は、上述のshRNAスクリーニングにおける最も応答性の高い遺伝子としてのBrd4の同定と相俟って、Brd4がAML療法の新規薬剤標的であることを示唆した。5つの独立したBrd4shRNAが、ノックダウン効率と成長阻害の間の密接な対応を示し、標的化効果が示唆される図6Aおよび6B。Brd4抑制が白血病細胞の細胞周期停止およびアポトーシスをもたらしたのに対し、不死化マウス胎児繊維芽細胞MEFにおける同等のノックダウンは、細胞毒性のない控えめな細胞周期阻害のみをもたらした図4A-4D。Brd4ノックダウンはまた、非形質転換G1E赤芽球細胞の成長に影響を及ぼせなかった図4E。これに加えて、BRD4を標的にするshRNAはまた、2つのMLL-AF9ヒトAML系において細胞周期停止を誘導するのに十分であった図5A~5D。総合して、これらの結果は、Brd4が、MLL-AF9AMLにおいて重要な必要条件であることを示唆した。実施例2:急性骨髄性白血病AML細胞増殖は、ブロモドメインタンパク質阻害剤JQ1によって特異的にブロックされる。Brd4の第1のブロモドメインに対する最も高い親和性がある、BETブロモドメインのファーストインクラス小分子阻害剤Filippakopoulosetal.,2010である、JQ1の効果を多様な白血病細胞型に対して試験した。マウスMLL融合白血病細胞の増殖は、これらの異なる細胞型の増殖に対するBrd4-shRNAの相対的影響に合致して、線維芽細胞およびG1E図6Bと比較して、マイクロモル以下のJQ1濃度に対して著しく感受性であった。成人および小児の原発性白血病サンプルなど、一連の確立されたヒト白血病細胞系におけるJQ1の成長阻害効果もまた試験した。多様な遺伝子サブタイプにわたり、13/14のAML細胞系図6Cおよび7Aおよび12/15の原発性AML図8および9において、JQ1IC50<500nMの広範な成長抑制活性が観察された。これに加えて、3/3の試験された原発性MLL再構成型小児白血病は、JQ1図9Aおよび9Bに高度に感受性であったのに対し、その他の試験された非AML白血病および固形腫瘍細胞系は、化合物に対して最小の感受性しか示さなかった図6Cおよび7B。全ての試験されたAML系で、JQ1処理は、shRNA媒介Brd4ノックダウン後に見られた効果と同様に、細胞周期停止およびアポトーシスを普遍的に引き起こした図6D、6E、8A~8D、9A~9C、10A~10C。総合して、これらのデータは、Brd4がAMLの生体外成長にとって重要であり、それはブロモドメイン阻害剤JQ1を使用して、効果的に標的にし得ることを示す。実施例3:生体内の白血病の進行は、Brd4の抑制によって阻害される。生体内のAMLの進行に対するBrd4の妥当性を調査した。マウス中の確立されたAMLにおいてBrd4を阻害するために、Tet-OnコンピテントMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞を抗Brd4shRNA含有または対照shRNA含有TRMPVコンストラクトで形質導入した。次にこれらの細胞をあらかじめ亜致死的に照射された二次受容マウスに移植した。生物発光イメージングによって確認された疾患発症に続いて、ドキシサイクリンdox投与によってshRNA発現を誘導した図11A~11F。引き続くモニタリングは、Brd4の抑制が白血病の進行に著しい遅延をもたらし、著しい延命効果を提供したことを明らかにした図12A~12C。TRMPVベクター中のshRNA発現と連動するdsRedレポーターZuberetal.,NatBiotechnol2011;29:79-83を活用して、フローサイトメトリー分析は、対照と比較して、Brd4-shRNA陽性細胞が末期白血病負荷内で消耗したことを確認した。このデータは、試験マウスにおける致死性が、Brd4-shRNA陰性細胞成長の帰結であったことを示す図12Dおよび12E。総合して、これらのデータは、Brd4のRNAi媒介抑制が、生体内で白血病拡大を阻害することを示す。実施例4:JQ1処理は、生体内で確立されたAMLを阻害する。JQ1が、AML中で単一作用物質活性を有するかどうかを試験するために、MLL-AF9/NrasG12D白血病細胞を移植したマウスを毎日注射されるJQ150mg/kgまたはビヒクルのどちらかで処理した。JQ1投与は、疾患進行の著しい遅延と、顕著に伸びた生存期間図12F~12Hをもたらした。JQ1はまた、そのどちらも従来の化学療法に対して非感受性であることが知られているZuberetal.,GenesDev2009;23:877-89MLL-AF9/NrasG12DおよびAML1-ETO9a/NrasG12D/p53-/-AMLモデル図12I、13A~13E、および14A~14Cで見られるように、確立された疾患状況において単一作用物質活性を示した。先の知見Filippakopoulosetal.,Nature2010;468:1067-73と一致して、JQ1処理はマウスで良好に耐えられて、正常な造血にはたとえあったとしても極わずかな影響しか及ぼさなかった図15、16、17A、および17B。これらの知見は、JQ1が生体内で単一作用物質として、強力かつ白血病特異的な効果を有することを実証する。実施例5:shRNAまたはJQ1によるBrd4阻害は、幹細胞の白血病細胞可能性を低下させ、それらの分化を誘導する。AMLは、最終骨髄分化完了の不能と結びついた、拡大された自己再生能力によって特徴付けられる。したがって、Brd4の存在が、白血病細胞の分化状態に影響を及ぼすかどうかを次に考察した。Brd4shRNA発現およびJQ1処理のどちらも、MLL-AF9/NrasG12D白血病細胞の形態を骨髄単核芽球から、マクロファージ様外観を有する細胞に改変させた図18Aおよび18B。shRNAまたはJQ1処理のどちらかによるBrd4阻害時に、マクロファージ機能に関与する遺伝子と、骨髄性分化マーカーであるMac-1とが上方制御された。Brd4阻害は、そのレベルがMLL再構成型白血病における白血病幹細胞LSC頻度と相関する、c-kitを下方制御した図18Cおよび18D。これに加えて、JQ1処理は、程度は様々であるが、試験された原発性白血病サンプルの大部分において、成熟表現型の形態学的徴候を誘導した図8および9。Brd4の抑制が、LSC区画を根絶するかどうかをさらに検証するために、Brd4-shRNAおよびJQ1処理白血病細胞から得られた発現マイクロアレイ上で、遺伝子セット濃縮分析GSEAを行ったSubramanianetal.,ProcNatlAcadSciUSA2005;102:15545-50。GSEAは、Brd4阻害に続くマクロファージ特異的遺伝子発現の著しい上方制御図18Eおよび18Fと、非自己再生型白血病細胞サブセットからLSCを識別することが先に示されている、遺伝子発現シグネチャーの全体的損失図18Gおよび18HSomervailleetal.,CellStemCell2009;4:129-40とを明らかにした。図18Iは、RT-qPCRの結果を示すグラフを含む。遺伝子発現変化の同様のプロフィールは、JQ1処置ヒトAML細胞系THP-1で見られた図19。重要なことには、これらのアッセイにおける、shRNAを介したBrd4ノックダウンと、薬理学的BETブロモドメイン阻害の間の強力な表現型の類似点は、Brd4がJQ1の標的であることを確立する。したがって、これらの結果は、Brd4が白血病幹細胞集団の維持と、それらの最終分化の防止に必須であることを明らかにする。実施例6:マウスおよびヒト白血病細胞内で、JQ1は、白血病幹細胞自己再生と関連付けられている経路であるMyc経路を抑制する。Myc経路は白血病幹細胞自己再生と関連付けられており、MycはBrd4の下流標的であるように見えるので、Mycレベルに対するBrd4阻害の効果を調べた。マウスMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞において、shRNAまたはJQ1処理を介したBrd4阻害は、MycmRNAレベルおよびMycタンパク質レベルに劇的な低下をもたらし;対照的に、Brd4阻害は、MEFまたはG1E細胞には最小の効果しか及ぼさなかった図20A~20C、21A、および21B。MycmRNAレベルの下方制御はJQ1曝露の60分間以内に起き、Cd74などのマクロファージ分化に関連した遺伝子発現増大に定性的に先行する図20D。直接転写調節をさらに支持するために、クロマチン免疫沈降法実験によって、JQ1への曝露に続いて排除される、Mycプロモーターの約2キロベース上流の局所的Brd4占有領域が同定された図20E。予期されたように、shRNAによるまたはJQ1によるBrd4阻害のRNAiまたはJQ1が誘導する抑制は、Myc標的遺伝子発現の全体的低下もまたもたらした図21Cおよび22Kimetal.,Cell2010;143:313-24;およびSchuhmacheretal.,NucleicAcidsRes2001;29:397-406もまた参照されたい。著しいことに、JQ1処理は、検査された広範囲のマウスおよびヒト白血病細胞系でMyc下方制御を引き起こし図20A~20C、図23Aおよび23B、JQ1がMyc経路を白血病サブタイプの範囲に抑える手段を提供することを示唆する。図21Dは、Myc下流標的遺伝子発現の変化を評価するGSEAプロットを含む。実施例7:Brd4は、Myc非依存性経路を通じて細胞生存を調節する。次に、実験を行って、Myc活性の抑制を介して、JQ1処理の抗増殖効果が生じるかどうかをさらに評価した。ここでは、MyccDNAがレトロウイルスプロモーターから異所性に発現されるように、MLL-AF9/NrasG12D白血病培養を作成し、JQ1誘導性転写抑制に対して完全に抵抗性である、わずかであるが構成的なMyc過剰発現をもたらした図20F、24A、および24B。特に、異所性Mycは、JQ1、Brd4shRNA誘導性細胞周期停止、およびマクロファージ分化に対して、ほぼ完全な抵抗性を与えた図20G、20H、および25A~D。さらに、全体的発現プロファイリングは、JQ1誘導性転写変化の大部分が、事実上Myc下方制御の二次効果であることを明らかにした図26A~26C。Mycそれ自体のshRNAノックダウンもまた、Brd4阻害と似ている成長停止および骨髄性分化のパターン引き起こし図27A~D、JQ1誘導性効果の重要媒介物としてのMycをさらに支持する。重要なことには、異所性Myc発現はJQ1誘導性細胞死を阻止できず、細胞生存の調節における、Brd4の追加的なMyc非依存性役割が示唆された図24Cおよび24D。これらの知見は、Myc活性化を保ち、白血病における未分化細胞状態を維持する上で、Brd4が重要な役割を有することを示す。エピジェネティックな調節因子を標的にする不偏スクリーニングアプローチをとることにより、AML疾患の維持に必要な決定的因子としてBrd4を同定した。Brd4は、AML図28Aおよび28Bにおいて、明白に突然変異したり過剰発現されたりしてはいないので、Brd4阻害に対する白血病細胞の強い感受性は、単にこの疾患の遺伝的または転写特性解析を通じては、明らかにならない。これに加えて、本明細書に記載される結果は、ブロモドメイン阻害剤JQ1が、異なるAMLのコンテクストにおいて幅広い活性を有することを実証し、その効果をBrd4-shRNAによって誘導される効果と比較することで、Brd4が、JQ1の抗白血病活性の妥当な標的であるという証拠を提供する。JQ1は、齧歯類における半減期が約1時間の頑強な抗白血病分子である図29。このような効果はまた、生体内でBrd4shRNAについても観察され、がんを標的とする新規薬剤を明らかにする上でのRNAiスクリーニングの効用を明白に強調する。アセチルリジン結合領域の競合的阻害剤として、JQ1は、Brd4が、転写活性化を促進するヒストンアセチル化標識を読み取る能力に干渉するFilippakopoulosetal.,2010。白血病細胞に適用されると、JQ1は自己再生を支持する転写回路に干渉し;それにより、JQ1は白血病幹細胞LSCの最終分化を誘導する。Mybは、MLL-AF9誘導性転写プログラムの中心的な媒介物であり、異常な自己再生状態に重要であるので、Mybの阻害が疾患を根絶するのに十分であるZuberetal.,提出済み。興味深いことに、Brd4の遺伝的または薬理学的阻害に続いて生じた遺伝子発現の変化は、MLL-AF9またはMybの抑制時に観察されたものと顕著に類似している図30A~30C。しかし、JQ1処理は、MLL-AF9の確立された直接標的であるHoxa7、Hoxa9、またはMeis1の発現に影響を与えない。これはBrd4阻害が、MLL-AF9の全体機能を中和しないが、その代わりに例えばMycの阻害を介して、その他の下流標的の大きなサブセットを抑制することを示す。総合して、MLL-AF9、Myb、およびBrd4は、悪性自己再生に必須の共通転写回路内で機能的に交差するようである。このプログラムの重要な作動体は、魅力的な治療標的として検証されているが、従来の薬理学的阻害を受け入れにくい腫瘍性タンパク質MycZuberetal.,提出済みである。上述の例は、Brd4を標的にすることが、白血病コンテクストに対する選択性を持って、Mycの発現を根絶して、自己再生を制限し、それにより全身性Myc阻害に潜在的に付随する造血毒性を回避することを間違いなく実証する。その結果、RNAiノックダウンまたはJQ1処理を介したBrd4阻害は、エピジェネティックな機構の直接調節を通じて、マウスおよびヒト白血病に関連した捕らえにくい発がん経路を安全化するための特異的かつ効果的ストラテジーを規定する。本明細書の上の実施例で報告された結果は、以下の材料と方法を使用して得られた。プラスミド条件的RNAi実験のために、先に記載されているTRMPV-NeoベクターまたはTtTMPV-Neoベクターのどちらかから、shRNAを発現させたZuberetal.,NatBiotechnol2011;29:79-83。スクリーニング検証のために、PuroR導入遺伝子をNeoRカセットで置換することにより、LMP3をベースとして作成されたLMNMSCV-miR30-PGK-NeoR-IRES-GFPに、shRNAをクローンした。Mycレスキュー実験のためには、野生型マウスMyccDNAをMSCV-PGK-Puro-IRES-GFPMSCV-PIGにサブクローニングしたHemannetal.,NatGenet2003;33:396-400。プールされた負の選択RNAiスクリーニング先に記載されたようにしてZuberetal.,2011、miR30適応BIOPREDsi予測を使用して、243個のクロマチン調節マウス遺伝子を標的にする特定用途向けshRNAライブラリーをデザインしHueskenetal.,NatureBiotechnology2005;23:995-10016個のshRNA/遺伝子、PCR-クローニングによって、55kの特定用途向けアレイAgilentTechnologies,Lexington,MA上で、オリゴヌクレオチドのプールを構築した。配列検証に続いて、1095個のshRNA3~6個/遺伝子をいくつかの陽性および陰性対照shRNAと一緒に、等濃度で1つのプールに合わせた。単一レトロウイルス組み込みを優勢にもたらし、計算された>500個の細胞数あたり1個のshRNAに相当する感染時に総計3千万個の細胞、2の形質導入効率条件を使用して、このプールをTRMPV-Neoにサブクローニングし、Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞に形質導入した。1mg/mlのG418Invitrogen,Carlsbad,CAを使用して、形質導入された細胞を5日間にわたり選択し;各継代培養時に>2千万個の細胞を維持して、実験全体を通じてライブラリー表現を保った。薬剤選択に続いてT0サンプルが得られ複製あた約2千万個の細胞、引き続いて0.5mg/mlのG418および1μg/mlのドキシサイクリン添加の下で細胞を培養し、shRNAの発現を誘導した。14日後=12回の継代培養、T14に、FACSAriaIIBDBiosciences,Sparks,MDを使用して、各複製について約1.5千万個のshRNA発現dsRed/Venus細胞をソートした。PhaseLockチューブ5prime,Gaithersburg,MDを使用して、2回のフェノール抽出と、それに続くイソプロパノール沈殿によって、T0およびT14サンプルからゲノムDNAを単離した。先に記載されたようにして、shRNAガイド鎖のPCR増幅によって、大規模シークエンシングテンプレートライブラリーを作成したZuberetal.,2011。Illumina登録商標ゲノム分析器SanDiego,CA上で、8pMの最終濃度で、ライブラリーを分析し;ガイド鎖内へ逆方向読み取りするプライマーを使用して、18個のntを配列決定したmiR30EcoRISeq、TAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA。実験的サンプル中のshRNA消耗を検出するための十分なベースラインを提供するために、T0サンプル中のshRNAあたり>500の読み取り得ることが望ましく、プールされたプラスミド調製品に固有の、またはPCRバイアスによって導入された、shRNA表現の格差を代償するために、それはサンプルあたり>1千万の読み取りを必要とした。これらの条件で、1072全部の97個のshRNAについての>500の読み取りのT0ベースラインを得た。カスタマイズされたGalaxyプラットフォームを使用して、配列プロセッシングを実施したTayloretal.,CurrProtocBioinformaticsChapter10,Unit1052007。各shRNAおよび条件について、レーンあたりライブラリー特異的読み取り総数に対して、マッチング読み取り数を正規化し、さらなる分析のためにデータベースにインポートした。細胞培養全てのマウスMLL白血病細胞系は、末期症状の受容マウスから得られた骨髄に由来し、10ウシ胎仔血清FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシン添加RPMI1640内で培養された。MLL-AF9単独、MLL-AF9/NrasG12D、Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D、およびMLL-ENL/FLT3ITD細胞培養は、先に記載されているようにして誘導されたZuber.etal.,GenesDev2009;23:877-89およびZuberetal.,2011。Tet-On不死化MEF培養については先に記載されているZuberetal.,2011。G1E細胞は、MitchellWeissUniversityofPennsylvaniaによって親切にも提供された。MEF細胞は、10FBSおよび1グルタミン添加DMEM中で培養したGIBCO登録商標,Carlsbad,CA。G1E細胞は15FBS、2U/mlエリスロポエチンSigma-Adrich、および10キットリガンド条件培地添加IMDM中で培養した。全ヒト白血病細胞系はRPMI1640/10FBS内で培養したが、KASUMI-1細胞のみ20FBS内で培養した。NOMO-1およびMOLM-13は、DSMZから購入された。KASUMI-1、HL-60、およびIMR-90は、ATCCから得られた。K-562およびTHP-1は、MartinCarrollUniversityofPennsylvaniaによって親切にも提供された。U2OS、HeLa、およびJurkatは、CSHL組織培養サービスによって提供された。ウエスタンブロットBrd4ウエスタンブロットでは、30μgのホールセル溶解産物RIPA抽出物25mMのTrispH7.6、150mMのNaCl,1のNP-40、1のデオキシコール酸ナトリウム、0.1のSDSを各レーンに装入した。Mycウエスタンブロットでは、細胞をLaemmli緩衝液に直接溶解した。およそ50,000個の細胞相当量を各レーンに装入した。SDS-PAGE電気泳動によってタンパク質抽出物を分離して、ブロッティングのためにニトロセルロースに転写した。増殖アッセイ72時間にわたる生存細胞数の増大を計数することで、増殖アッセイを実施した。ヨウ化プロピジウムPIを含めることで、死細胞を排除した。前方/側方散乱/PI細胞を使用して、生存細胞のみをゲーティングして、GuavaEasycyteMillipore,Billerica,MA上で細胞濃度の測定を実施した。式、を使用して増殖速度を計算した。ln細胞濃度72h/細胞濃度0h/72。相対増殖速度は、DMSO処理細胞の速度を正規化することで計算した。メイグリュンワルドギムザサイトスピン染色MLL-AF9/NrasG12D白血病細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理してTRMPVshRNAを誘導し、または100nMのJQ1で2日間処理した。50,000個の細胞を100μlのFACS緩衝液5FBS、PBS中の0.05NaN3中に再懸濁し、ShandonCytospin2Centrifugeを使用して500rpmで5分間、スライドガラス上にサイトスピンした。製造会社のプロトコルに従って、メイグリュンワルドSigma-Aldrich、019K4368およびギムザSigma-Aldrich、010M4338染色を実施した。40倍の対物レンズでZeissObserverMicroscopeを使用して、画像を収集した。BrdU細胞周期分析およびアネキシンVフローサイトメトリー製造業者のプロトコルに従ってBD、APCBrdUFlowKit、552598、BrdU組み込みアッセイを実施し、細胞はBrdUで30分間パルスされた。DNA含量測定のために、細胞を7-AADまたはDAPIで共染色した。全ての条件的shRNA実験で、分析は、shRNA/dsRed細胞集団上でゲートした。製造会社のプロトコルBDBiosciences、APCアネキシンV、550475に従って、アポトーシスのアネキシンV染色を実施した。図4eでは、生細胞FSC/SCCおよびdsRed/shRNA集団上で、アネキシンVゲーティングを実施して、shRNA効果の明瞭な読み取りを確保した。このゲーティング法は、初期アポトーシス細胞アネキシンV、DAPI-を選択的に視覚化し、したがって一見するとプロット中に蓄積した死細胞アネキシンV、DAPIが欠如している。全分析は、Flowjoソフトウェアを使用して実施した。ヒトAML細胞系におけるshRNA実験ヒトshRNAをTRMPV-Neoベクターにクローンし、THP-1およびMOLM-13細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、MSCV-RIEPプラスミドrtTA-ires-EcoR-PGK-Puroを使用して、Ecotropic受容体およびrtTA3を発現するよう修飾した。細胞は、400μg/mlのG418によって1週間にわたり選択された。細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理して、shRNA発現を誘導した。FACSを使用したdsRed/shRNA細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。BrdU細胞周期分析は、上述したように実施した。成人原発性白血病サンプル分析図8原発性白血病細胞は、診断時n=10または再発時n=2にAMLがある、12人の未治療患者の末梢血PBまたは骨髄BM吸引サンプルから得られた。診断は、French-American-BritishFABCooperativeStudyGroupDelhommeauetal.,NEnglJMed2009;360:2289-301;およびLeyetal.,NEnglJMed2010;363:2424-33、および世界保健機関WHOZuberetal.,NatBiotechnol2011;29:79-83によって提供される基準に従って確立した。Ficollを使用して単核細胞MNCを調製し、使用時まで液体窒素内で保存した。いずれの場合にも、献血またはBM穿刺に先だって、インフォームドコンセントを得た。研究はMedicalUniversityofViennaのInstitutionalReviewBoardEthicsCommitteeによって認可された。HL60およびMOLM13細胞系を対照として含めたGermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,DSMZ,Braunschweig,Germany。解凍後、AML細胞の生存度は、トリパンブルー排除による評価で、70~99の範囲であった。原発性細胞解凍MNC、5-10×104細胞/ウェルおよび細胞系1~5×104細胞/ウェルを、JQ110~5,000nM不在または存在下で、37°C5CO2で48時間にわたり、10ウシ胎仔血清FCS、Pasching添加RPMI1640培地PAAlaboratories,Pasching,Austria中で、96ウェルマイクロタイタープレートTPP,Trasadingen,Switzerland内で培養した。選択実験では、以下の増殖誘導サイトカインカクテルの存在または不在下において、原発性AML細胞をJQ1と共に培養した:100ng/mlの組換えヒトrhG-CSFAmgen,ThousandOaks,CA、100ng/mlのrhSCFPeprotech,RockyHill,NJ、および100ng/mlのrhIL-3Novartis,Vienna,Austria。48時間後、0.5μCi3Hチミジンを添加した16時間。次に細胞をFiltermate196ハーベスターPackardBioscience,Meriden,CT内のフィルター膜上に収集した。フィルターを風乾し、β-counterTop-CountNXT,PackardBioscience内で結合放射能を測定した。全実験は、三連で実施した。増殖は、対照のパーセント対照培地内に維持された細胞として計算し、JQ1の阻害効果はIC50値として表した。7/12人の患者で、サイトスピンスライドのライトギムザ染色によって、薬剤曝露細胞を分化の形態学的徴候について分析した。小児原発性白血病サンプル分析図9施設内審査委員会認可プロトコルの下で、新たに診断された急性白血病がある小児から診断骨髄サンプルを収集した。Helsinkiプロトコルに従って、インフォームドコンセントを得た。収集時に、Ficoll-PaquePLUSGEHealthcare,Piscataway,NJを使用して密度遠心分離によって、原発性白血病胞を濃縮し、引き続いて液体窒素内で保存した。冷凍保存細胞のバイアルを解凍し、培地に再懸濁して、生白血病細胞を密度遠心分離によって濃縮した。細胞を20ウシ胎仔血清補給培地中に維持した。全白血病細胞を5CO2内で37°Cで培養した。原発性白血病サンプルを96ウェルプレート内で72時間にわたり、一連の用量範囲のJQ1およびビヒクル対照で処理した。アネキシン結合アッセイでは、細胞を収集してアネキシンV-PEおよび7-AADBDPharmingen,SanDiego,CAで染色し、FACSCalibur上で読み取って、FlowJoソフトウェアTreeStar,Inc.,Ashland,ORで分析した。WST-1アッセイでは、WST-1試薬RocheDiagnostics,Manheim,Germanyを培養液1:10希釈に添加し、Bio-Radモデル680マイクロプレートリーダーBioRadLaboratories,Hercules,CAを使用して、吸光度を450nmで測定した。WST-1アッセイは三連で実施した。原発性白血病サンプルを96ウェルプレート内で48時間にわたり、250nMのJQ1およびビヒクル対照で処理した。サイトスピンを24時間および48時間のベースラインで調製し、ライトギムザ溶液Sigma-Aldrich,St.Louis,MOで染色した。NikonEclipseE600顕微鏡システムを使用して、画像を得た。骨髄の組織学的分析パラフィン包埋切片をヘマトキシリンエオジンHEで染色した。NIS-ElementsF2.30ソフトウェアを使用して、2560×1920の解像度で、NikonDigitalSightカメラ付きNikonEclipse80i顕微鏡上で写真を撮影した。AdobePhotoshopCS2を使用して、画像をサイズ変更し、解像度を300ピクセル/インチに設定して、自動コントラストを適用し、アンシャープマスクを使用して画像の明確さを改善した。正常造血のFACS評価図17ヒトshRNAをTRMPV-Neoベクターにクローンし、THP-1およびMOLM-13細胞のレトロウイルス形質導入がそれに続き、MSCV-RIEPプラスミドrtTA-ires-EcoR-PGK-Puroを使用して、Ecotropic受容体およびrtTA3を発現するよう修飾した。細胞は、400μg/mlのG418によって1週間にわたり選択された。細胞を1μg/mlのドキシサイクリンで処理して、shRNA発現を誘導した。FACSを使用したdsRed/shRNA細胞の相対変化を使用して、成長阻害をモニターした。BrdU細胞周期分析は、上述したように実施した。発現マイクロアレイCSHLmicroarraysharedresourceによって、マイクロアレイが実施された。RNeasy登録商標MiniKitQIAGEN,Germantown,MD、74104を使用して、107個の細胞からRNAを単離した。Agilent2100Bioanalyzer,RNA6000PicoSeriesIIChipsAgilent,PaloAlto,CA,USA上で、RNAの質を評価した。RINスコアによって、サンプルを評価した2.0以上は合格。修正Eberwine技術によってRNAを増幅し、次にAmbion登録商標WT発現キットAmbion,Austin,TXを使用して、aRNAをcDNAに転換した。Agilent2100BioanalyzerRNA6000NanoSeriesIIChipsAgilent,PaloAlto,CA,USAを使用して、3’バイアスについて評価されたaRNAおよびcDNAの粒度分布を全サンプルで実施した。次にAffymetrix登録商標GeneChipWT末端標識キットAffymetrix,SantaClara,CAを使用して、cDNAを断片化して末端をビオチンで標識した。次にハイブリダイゼーションのためにサンプルを調製し、ハイブリダイズして洗浄し、マウス遺伝子ST1.0GeneChipsAffymetrix,SantaClara,CA上で製造会社の使用説明書に従ってスキャンした。AffymetrixExpressionConsoleQC測定基準を使用して、画像データを通過させた。RベースBioconductor中のAffymetrixおよびLimmaパッケージによって、生データを処理した。図25に示されるヒートマップは、GenePatternソフトウェアを使用して作成されたYokoyamaetal.,CancerCell2008;14:36-46。簡単に述べると、RMA処理マイクロアレイデータをlog2基準に変換した。次に選択された遺伝子リストを列正規化し、GenePattern上のHeatmapImageモジュールを通じて実行した。遺伝子セット濃縮分析GSEA分析GSEAv2.07ソフトウェアBroadInstitute,Cambridge,MAを使用して、1000個の表現型置換で、遺伝子セット濃縮分析Subramanianetal.,ProcNatlAcadSciUSA2005;102:15545-50を実施した。白血病幹細胞およびMyc遺伝子セットは、示される出版物Kimetal.,Cell2010;143:313-24、Schuhmacheretal.,NucleicAcidsRes2001;29:397-406、およびSomervailleetal,CellStemCell2009;4:129-40から得られた。マクロファージ発生遺伝子セットは、Ingenuity登録商標PathwayAnalysisIPAソフトウェアIngenuity,RedwoodCity,CAから得られた。Mybシグネチャー遺伝子セットshMybMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞中のトップ500下方制御遺伝子およびMLL-AF9シグネチャー遺伝子セットMLL-AF9Tet-OFFMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞中のトップ500下方制御遺伝子は、Lowe/Vakoc研究所からの未発表研究からのマイクロアレイデータから得られたZuberetal.,提出済み。図19では、ヒトマイクロアレイデータ上でGSEAを実施するために、bioDBNetdbWalkモジュールhttp://biodbnet.abcc.ncifcrf.gov/db/dbWalk.phpを使用して、または手動でNCBIデータベースを使用して、最初にマウス遺伝子セットをヒト遺伝子名に転換した。GSEA技法および解釈の詳細な説明は、http://www.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.htmlに提供される。手短に言えば、NormalizedEnrichmentScoreNESが、遺伝子のランク付けリストの上部または下部で、遺伝子セットが大きな比率を占める程度を提供する。FalseDiscoveryRateq値FDRq値は、所与のNESがある遺伝子セットが、偽陽性検出に相当する推定確率である。一般に、ほとんどの発現データセットにおける首尾一貫性の欠如、および分析される比較的少数の遺伝子セットを考えると、25のFDRカットオフが適切である。クロマチン免疫沈降法ChIPアッセイを正確に記載される通りにFilippakopoulosetal.実施した。逐次EGSPierce/ホルムアルデヒドで、架橋を実施したNicodemeetal.,Nature2010;468:1119-23。全ての結果は、ABI7900HT上でSYBRgreenABIを使用して実施されたqPCRによって、定量化した。各IPシグナルを入力標準曲線希釈シリーズIP/入力に対して参照し、出発細胞数の差とプライマー増幅効率について正規化した。RT-qPCRTrizol登録商標試薬Invitrogen,Carlsbad,CAを使用して、RNAを調製した。qScriptcDNASuperMixQuantaBiosciences,Gaithersburg,MD、101414-106を使用して、cDNA合成を実施した。SybrgreenABI,Carlsbad,CA、4364344によりABI7900HT上で、定量的PCRqPCR分析を実施した。全てのシグナルは、デルタCt法を使用して定量化した。全てのシグナルは、GAPDHのレベルに対して正規化した。プライマーマウスRT-qPCRプライマー5’から3’方向に記載Bim:CCTGCTTTGCTCTCTCCATTTTおよびCCCCACCCCAGACACAAGTABrd4:CCATGGACATGAGCACAATCおよびTGGAGAACATCAATCGGACACcl4:CCCGAGCAACACCATGAAGおよびCCACGAGCAAGAGGAGAGAGACd74:CCAACGCGACCTCATCTCTAAおよびAGGGCGGTTGCCCAGTAGapdh:TTCACCACCATGGAGAAGGCおよびCCCTTTTGGCTCCACCCTHoxa7:AGTTCAGGACCCGACAGGAAおよびCAGGTAGCGGTTGAAATGGAAHoxa9:CCGAAAACAATGCCGAGAAおよびCCGGGTTATTGGGATCGATItgax:CCAGGTTGCCCAGTGAGAAおよびCTCAGATGGGCGGGTTCAMmp9:CATTCGCGTGGATAAGGAGTおよびTCACACGCCAGAAGAATTTGMyc:GCCGATCAGCTGGAGATGAおよびGTCGTCAGGATCGCAGATGAAGヒトRT-qPCRプライマー5’から3’方向に記載BIM:CACCGTGTCCATTACAGCAGおよびCTAAAATGCAGGAGGCCAAGBRD4:CCCCTCGTGGTGGTGAAGおよびGCTCGCTGCGGATGATGGAPDH:CCTGACCTGCCGTCTAGAAAおよびCTCCGACGCCTGCTTCACMYC:AGGGATCGCGCTGAGTATAAおよびTGCCTCTCGCTGGAATTACTマウスMycChIPプライマー5’から3’方向に記載Myc-3.8kb:TGTGGCTTTCCTGTCCTTTTおよびAGGGGACATCCCCATTTTACMyc-2.2kb:ATTCATTTTCCCCATCCACAおよびTTGCAAAGAGGGGGAGTAGAMyc-1.9kb:ACAAATCCGAGAGCCACAACおよびAACACCAAGAGCCACCAATCMyc-1.8kb:GGTGGCTCTTGGTGTTTGAGおよびTCGAGCTCATTGCACAATTCMyc-1.7kb:CAACTTTGAACAATGAGCACCTおよびCTCTCACTGCTACCCGGTTTMyc-1.5kb:CGAGGAGTCCGGAATAAGAAおよびTCTTTTGCTCTGTGCATTGGMyc-1kb:GCCTCTTGTGAAAACCGACTおよびCCGGTCTACACCCCATACACMyc1kb:TGGAATCCTGAGGTCTTTGGおよびCAGAAATGCACCAAGCTGAAMyc1.5kb:CCCTCCCCTTTTATTTCGAGおよびGCTTTTCTTTCCGATTGCTGMyc3.7kb:TGCTTTGGGTGTGTCTGAAGおよびCTCCCAGAAAGGCAGAACAG抗体ウエスタンブロット法で使用した抗Brd4抗体はGerdBlobelから贈与され、ChIPで使用した抗Brd4抗体はSigmaHPA015055から購入された。抗Myc抗体は、Epitomics1472-1から購入された。FACSで使用される抗体:APC抗マウスCD117/ckitBiolegend105811、APC抗マウスCD11bBiolegend101211、PacificBlue抗マウスCD45.2Biolegend109820、マウス造血系eFluor登録商標450cocktailebioscience88-7772-72、APC抗マウスCD45R/B220Biolegend103212、APC抗マウスTER-119/ErythroidCellsBiolegend116212、APC抗マウスLy-6G/Gr-1ebioscience17-5931、PE-Cy7抗マウスCD117/ckitebioscience25-1171-82、およびAPC抗マウスSca-1ebioscience17-5981-81。抗β-アクチンHRP抗体は、SigmaA3854から購入された。抗Brd4抗体はGerdBlobelから贈与された。抗Myc抗体Epitomics,Burlingame,CA、1472-1。FACSで使用された抗体、APC抗マウスCD117/ckit105811、APC抗マウスCD11b101211、およびPacificBlue抗マウスCD45.2109820は、BiolegendSanDiego、CAから購入された。抗β-アクチンHRP抗体は、SigmaA3854から購入された。動物実験生体内条件的RNAi実験では、Tet-OnMLL-AF9/NrasG12D白血病細胞をTRMPV-shRNAコンストラクトで形質導入した。亜致死的に5.5Gy照射されたB6/SJLCD45.1受容マウスへの1×106個の細胞の尾静脈注射によって、白血病細胞を移植した。全身生物発光イメージングのために、マウスに50mg/kgD-ルシフェリンGoldbio,St.Louis,MOを腹腔内注射し、10分後に、IVIS登録商標スペクトルシステムCaliperLifeSciences,Waltham,MAを使用して分析した。LivingImagesoftwareCaliperLifeSciencesを使用して、マウスの体躯と四肢をカバーする関心のある長方形領域を標準化して、定量化を実施した。shRNA誘導では、飲料水2スクロース添加2mg/ml;Sigma-Aldrich,St.Louis,MOおよび飼料625mg/kg、HarlanLaboratories,Indianapolis,INの双方の中のドキシサイクリンで動物を処理した。JQ1処理の試行では、ボルテックス下で、102-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンSigma-Aldrichキャリアを滴下添加して、DMSO中の100mg/mlのJQ1の原液を20倍希釈し、5mg/mlの最終濃度を得た。MLL-AF9/NrasG12D白血病細胞を移植したマウスに、新鮮に調製したキャリア希釈JQ1100mg/kgまたは400μlのキャリア5DMSO含有を毎日腹腔内注射IPした。マイクロアレイ分析AffymetrixST1.0GeneChipsを使用して、発現マイクロアレイを実施した。GSEAv2.07ソフトウェアを使用して、1000の表現型置換により経路分析を実施したSubramanianetal.。その他の実施形態前述の説明から、本明細書に記載される発明に変更および修正を加えて、様々な用途と条件に適合させてもよいことは明らかである。このような実施形態もまた、以下の請求項の範囲内である。本明細書の任意の変数の定義における要素一覧の列挙は、任意の単一要素または列挙された要素の組み合わせとしての変数の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単一実施形態としての、または任意のその他の実施形態またはその部分と組み合わさった、その実施形態を含む。本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、あらゆる目的のために特許および刊行物がそれぞれが具体的に独立して個々に援用されたかのように、参照によって本明細書に援用する。"