"ヒトIL13に対する単離された特異的結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメイン及びヒト抗体VLドメインから構成され、かつCDRのセット、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体抗原結合部位を含み、ここで当該VHドメインが、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、当該VLドメインがLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、当該CDRのセットが、以下の:BAK278D6のCDRのセット、ここでHCDR1は配列番号1のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号3のアミノ酸配列を有し、LCDR1は配列番号4のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、LCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を有する;BAK278D6のCDRのセットと比較して1又は2のアミノ酸置換を含むCDRセット、及び表1の個々のクローンについて示されるCDRの各セット、からなる群から選択されるCDRセットからなる、前記メンバー。前記1又は2の置換が、カバトの標準的番号付けを使用して、CDR内の以下の残基:HCDR1中の31、32、34HCDR2中の52、52A、53、54、56、58、60、61、62、64、65HCDR3中の96、97、98、99、101LCDR1中の26、27、28、30、31LCDR2中の56LCDR3中の95A、97の1又は2の位置にある、請求項1に記載の単離された特異的結合メンバー。前記1又は2の置換が、下記の位置:置換の位置以下からなる群から選択される置換残基HCDR1中の31:Q、D、L、G、及びEHCDR1中の32:THCDR1中の34:V、I、及びFHCDR2中の52:D、N、A、R、G、及びEHCDR2中の52AD、G、T、P、N、及びYHCDR2中の53:D、L、A、P、T、S、I、及びRHCDR2中の54:S、T、D、G、K、及びIHCDR2中の56:T、E、Q、L、Y、N、V、A、M、及びGHCDR2中の58:I、L、Q、S、M、H、D、及びKHCDR2中の60:RHCDR2中の61:RHCDR2中の62:K及びGHCDR2中の64:RHCDR2中の65:KHCDR3中の96:R及びDHCDR3中の97:N、D、T、及びPHCDR3中の98:RHCDR3中の99:S、A、I、R、P、及びKHCDR3中の101:YLCDR1中の26:D、SLCDR1中の27:I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H、及びGLCDR1中の28:VLCDR1中の30:GLCDR1中の31:RLCDR2中の56:TLCDR3中の95A:NLCDR3中の97:Iで、各位置についての可能な置換残基の同定された群の中からなされる、請求項2に記載の単離された特異的結合メンバー。BAK278D6のCDRセットと比較して、HCDR3の残基99とLCDR1の残基27で2の置換が存在する、請求項3に記載の単離された特異的結合メンバー。S、A、I、R、P及びKからなる群から選択されるHCDR3の残基99での置換、及び又は、I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H及びGからなる群から選択されるLCDR1残基27での置換を有する、請求項4に記載の単離された特異的結合メンバー。HCDR3の残基99にてNがSに置換され及び又はLCDR1の残基27にてNがIに置換される前記BAK278D6のCDRセットを含む、請求項4に記載の単離された特異的結合メンバー。前記VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3が生殖細胞系列フレームワーク内にあり、及び/又はVLドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3が生殖細胞系列フレームワーク内にある、請求項1~6のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。前記VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3が生殖細胞系列フレームワークVH1DP14内にある、請求項7に記載の単離された特異的結合メンバー。前記VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3が生殖細胞系フレームワークVLvλ3h内にある、請求項7又は請求項8の単離された特異的結合メンバー。130位のアルギニンがグルタミンにより置換されているヒトIL13変種に結合する、請求項1~9のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。非ヒト霊長類IL13に結合する、請求項1~10のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。前記非ヒト霊長類IL13が、アカゲザル又はカニクイザルである、請求項11に記載の単離された特異的結合メンバー。BAK502G9VHドメインを含む、請求項8~12のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。BAK502G9VLドメインを含む、請求項8~13のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。BAK502G9VHドメインとBAK502G9VLドメインにより形成されるIL13抗原結合部位の親和性と同等か又はそれより優れた親和性でIL13に結合する、請求項1~14のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーであって、ここで特異的結合メンバーの親和性と抗原結合部位の親和性は同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。ヒトIL13を中和する、請求項1~15のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。BAK502G9VHドメインとBAK502G9VLドメインにより形成されるIL13抗原結合部位の力価と同等か又はそれより優れた力価でヒトIL13を中和する、請求項16の特異的結合メンバーであって、ここで当該特異的結合メンバーの力価と当該抗原結合部位の力価は同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。scFv抗体分子を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。抗体定常領域を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。全抗体を含む、請求項19の特異的結合メンバー。前記全抗体がIgG4である、請求項20の特異的結合メンバー。請求項1~21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VHドメイン。請求項1~21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VLドメイン。請求項1~23のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー、抗体VHドメイン又はVLドメインと、少なくとも1つの追加の成分とを含む組成物。医薬として許容される賦形剤、溶媒、又は担体を含む、請求項24の組成物。請求項1~23のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー又は特異的結合メンバーの抗体VHドメイン若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。請求項26の核酸でインビトロで形質転換された宿主細胞。請求項27の宿主細胞を、特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生のための条件下で培養することを含む、該特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生方法。特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを単離及び/又は精製することをさらに含む、請求項28の方法。特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に中に調製することをさらに含む、請求項28又は請求項29の方法。ヒトIL13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを産生する方法であって、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む親VHドメイン[ここで親VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3はBAK278D6のHCDRのセットであるか、又はBAK502G9のHCDRのセットであるのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、親VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを提供し、場合によりこうして提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せて1つ以上のVH/VL組合せを得て;そして親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメイン又はVH/VL組合せを試験して、ヒトIL13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを同定する、ことを含む、前記方法。前記親VHドメインアミノ酸配列は配列番号13と配列番号15からなる群から選択される、請求項31の方法。前記1以上のVLドメインは、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む親VLドメイン[ここで親VLドメインのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3はBAK278D6のLCDRのセットであるか、又はBAK502G9のLCDRのセットであるのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、その各々が親VLドメインのアミノ酸配列変種である1つ以上のVLドメインを産生することにより提供される、請求項31又は請求項32に記載の方法。前記親VLドメインアミノ酸配列が、配列番号14と配列番号16からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。ヒトIL13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを産生する方法であって、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む親VHドメイン[ここで親VHドメインのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3は、BAK167A11のHCDRのセットであるか、BAK615E3のHCDRのセットであるか、BAK582F7のHCDRのセットであるか、又はBAK612B5のHCDRのセットであるのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、親VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを提供し、場合によりこうして提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せて1つ以上のVH/VL組合せを得て;そして親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメイン又はVH/VL組合せを試験して、ヒトIL13に特異的な抗体の抗原結合ドメインを同定する、ことを含む、前記方法。親VHドメインアミノ酸配列は配列番号55と配列番号33からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。前記1つ以上のVLドメインが、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む親VLドメイン[ここで親VLドメインのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3は、BAK167A11のLCDRのセットであるか、BAK615E3のLCDRのセットであるか、BAK582F7のLCDRのセットであるか、又はBAK612B5のLCDRのセットであるのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、その各々が親VLドメインのアミノ酸配列変種である1つ以上のVLドメインを産生することにより提供される、請求項35又は請求項36に記載の方法。前記親VLドメインアミノ酸配列は、配列番号24と配列番号34からなる群から選択される、請求項37に記載の方法。前記親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメインアミノ酸配列がCDR突然変異誘発により提供される、請求項31~34のいずれか1項に記載の方法。親VHドメインのアミノ酸配列変種である該VHドメインアミノ酸配列がCDR突然変異誘発により提供される、請求項35~38のいずれか1項に記載の方法。IgG、scFv、又はFab抗体分子内に抗体の抗原結合部位をさらに提供することを含む、請求項31~40のいずれか1項に記載の方法。ヒトIL13に結合する特異的結合メンバーを産生する方法であって、VHドメインをコードする出発核酸又はそれぞれがVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し;該出発核酸又は出発レパートリーを、HCDR1又はHCDR1、HCDR2又はHCDR2、及び/又はHCDR3又はHCDR3をコードするか又はこの変異により産生されるドナー核酸と組合せて、該ドナー核酸を出発核酸又は出発レパートリー中のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域中に挿入し、そしてVHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し;該生成物レパートリーの核酸を発現させて生成物VHドメインを産生させ;場合により、該生成物VHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せ;ヒトIL13に特異的な特異的結合メンバーを選択し;そして該特異的結合メンバー又はこれをコードする核酸を回収する、ことを含む前記方法。前記ドナー核酸は該HCDR1及び/又はHCDR2の変異により産生される、請求項42に記載の方法。ドナー核酸はHCDR3の変異により産生される、請求項42に記載の方法。HCDR3又はHCDR3のアミノ酸配列をコードする核酸の変異によりドナー核酸を提供することを含む、請求項44に記載の方法。核酸のランダム変異により前記ドナー核酸を提供することを含む、請求項42に記載の方法。回収された特異的結合メンバー内に含まれる生成物VHドメインを抗体定常領域に結合させることを含む、請求項42~46のいずれか1項に記載の方法。生成物VHドメインとVLドメインとを含むIgG、scFv又はFab抗体を提供することを含む、請求項42~46のいずれか1項に記載の方法。ヒトIL13に結合する抗体の抗原結合ドメイン又は特異的結合メンバーを、ヒトIL13を中和する能力について試験することをさらに含む、請求項31~48のいずれか1項に記載の方法。ヒトIL13に結合しかつ中和する抗体断片を含む特異的結合メンバーが得られる、請求項49に記載の方法。前記抗体断片がscFv抗体分子である、請求項50に記載の方法。前記抗体断片がFab抗体分子である、請求項50の方法。全抗体中に抗体断片のVHドメイン及び/又はVLドメインを提供することをさらに含む、請求項51又は請求項52に記載の方法。IL13に結合する特異的結合メンバー、抗体の抗原結合部位、又はIL13に結合する抗体の抗原結合部位若しくは特異的結合メンバーの抗体のVH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に調製することをさらに含む、請求項31~53のいずれか1項に記載の方法。ヒトIL13に結合する特異的結合メンバーをIL13又はIL13の断片に結合させることをさらに含む、請求項31~54のいずれか1項に記載の方法。請求項1~21のいずれか1項に記載のIL13に結合する特異的結合メンバーを、ヒトIL13又はヒトIL13の断片に結合させることを含む方法。前記結合がインビトロで起きる、請求項55又は請求項56の方法。IL13又はIL13の断片への特異的結合メンバーの結合量を測定することを含む、請求項55~57のいずれか1項に記載の方法。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における前記特異的結合メンバーの使用をさらに含む、請求項31~58のいずれか1項に記載の方法。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における、請求項1~21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの使用。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療方法であって、請求項1~21のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーを、当該疾患又は障害を有するか又は発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインから構成され、そしてCDRのセット、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体の抗原結合ドメイン部位を含む、ヒトIL13の単離された特異的結合メンバーであって、ここで当該VHドメインはHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、当該VLドメインはLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、ここでHCDR1は、以下の式:HX1HX2GHX3Sを有するアミノ酸配列であり、HCDR2は、以下の式:WIHX4HX5HX6HX7GHX8THX9YHX10HX11HX12FHX13HX14を有するアミノ酸配列であり、HCDR3は、以下の式:DHX15HX16HX17HX18WARWHX19FHX20Lを有するアミノ酸配列であり、LCDR1は、以下の式:GGLX1LX2LX3GLX4LX5LVHを有するアミノ酸配列であり、LCDR2は、以下の式:DDGDRPLX6を有するアミノ酸配列であり、LCDR3は、以下の式:QVWDTGSLX7PVLX8を有するアミノ酸配列である、前記メンバー。HX1は、D及びNからなる群から選択され、HX2は、Yであり、HX3は、Lであり、HX4は、S及びGからなる群から選択され、HX5は、T及びAからなる群から選択され、HX6は、Nであり、HX7は、N及びIからなる群から選択され、HX8は、でDあり、HX9は、N、D、及びKからなる群から選択され、HX10は、Gであり、HX12は、E及びGからなる群から選択され、HX13は、Qであり、HX19は、Fであり、LX1は、N及びSからなる群から選択され、LX2は、N、Y、T、S、及びIからなる群から選択され、LX6はS、であり、LX7はDである、請求項62の単離された特異的結合メンバー。HX1は、N及びDからなる群から選択され、HX2は、Yであり、HX3は、Lであり、HX4は、S及びGからなる群から選択され、HX5は、A及びTからなる群から選択され、HX6は、Nであり、HX7は、Nであり、HX8は、D及びGからなる群から選択され、HX9は、I、S、N、及びDからなる群から選択され、HX11は、Qであり、HX12は、E及びKであり、HX14は、Gであり、HX15は、Sであり、HX16は、S及びNからなる群から選択され、HX17は、Sであり、HX18は、S及びNからなる群から選択され、HX19は、Fであり、HX20は、Dであり、LX1は、N及びDからなる群から選択され、LX2は、Iであり、LX8はVである、請求項62の単離された特異的結合メンバー。HX7は、N、S、T、D、G、及びKからなる群から選択され、HX8は、D、T、E、Q、L、Y、N、V、A、Mからなる群から選択され、HX9は、N、I、L、Q、S、M、及びHからなる群から選択され、HX10は、Gであり、HX11は、Qであり、HX12は、Fであり、HX13は、Qであり、HX14は、Gであり、HX15は、Sであり、HX16は、N及びSからなる群から選択され、HX17は、Sであり、HX18は、N及びSからなる群から選択され、HX19は、Fであり、HX20は、Dであり、LX1は、NでありLX2は、N及びIからなる群から選択され、LX3は、Iであり、LX4は、Sであり、LX5は、Kであり、LX6は、Sであり、LX7は、Dであり、そしてLX8は、Vである、請求項62に記載の単離された特異的結合メンバー。HX1は、N、Q、及びDからなる群から選択され、HX3は、L、V、及びIからなる群から選択され、HX4は、S、N、A、及びRからなる群から選択され、HX5は、A、D、T、G、N、及びYからなる群から選択され、HX6は、N、A、P、S、D、及びIからなる群から選択され、HX7は、N、T、D、及びGからなる群から選択され、HX8は、D、Q、Y、及びNからなる群から選択され、HX9は、N、Q、S、及びIからなる群から選択される、請求項65に記載の単離された特異的結合メンバー。ヒトIL13を中和する、請求項62~66のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。BAK502G9VHドメインとBAK502G9VLドメインにより形成されるIL13抗原結合部位の力価と同等か又はそれより優れた力価でヒトIL13を中和する、請求項67の特異的結合メンバーであって、ここで特異的結合メンバーの力価と抗原結合部位の力価が同じ条件下で測定されることを特徴とする、前記メンバー。scFv抗体分子を含む請求項62~68のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。抗体定常領域を含む請求項62~68のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー。全抗体を含む、請求項70に記載の特異的結合メンバー。前記全抗体がIgG4である、請求項71に記載の特異的結合メンバー。130位のアルギニンがグルタミンにより置換されている、ヒトIL13変種に結合する請求項62~72のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。非ヒト霊長類IL13に結合する、請求項62~72のいずれか1項に記載の単離された特異的結合メンバー。前記非ヒト霊長類IL13はアカゲザル又はカニクイザルである、請求項74に記載の単離された特異的結合メンバー。請求項62~75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VHドメイン。請求項62~75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの単離された抗体VLドメイン。請求項62~77のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー、抗体VHドメイン又はVLドメイン、及び少なくとも1つの追加の成分を含む組成物。医薬として許容される賦形剤、溶媒、又は担体を含む、請求項78の組成物。請求項62~77のいずれか1項に記載の特異的結合メンバー又は特異的結合メンバーの抗体VHドメイン若しくはVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。請求項80に記載の核酸でインビトロにおいて形質転換された宿主細胞。特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生方法であって、請求項81の宿主細胞を前記特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVLドメインの産生のための条件下で培養することを含む前記方法。前記特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを単離及び又は精製することをさらに含む、請求項82に記載の方法。特異的結合メンバー又は抗体VH若しくはVL可変ドメインを、少なくとも1つの追加の成分を含む組成物に剤形することをさらに含む、請求項82又は請求項83に記載の方法。ヒトIL13に結合する特異的結合メンバーを、IL13又はIL13の断片に結合させることをさらに含む、請求項82~84のいずれか1項に記載の方法。請求項62~75のいずれか1項に記載のIL13に結合する特異的結合メンバーを、ヒトIL13又はヒトIL13の断片に結合させることを含む方法。前記結合はインビトロで起きる、請求項85又は請求項86に記載の方法。IL13又はIL13の断片への特異的結合メンバーの結合量を測定することを含む、請求項85~87のいずれか1項に記載の方法。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための薬剤の製造における特異的結合メンバーの使用をさらに含む、請求項82~84のいずれか1項に記載の方法。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療のための医薬の製造における、請求項62~75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーの使用。喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、及びホジキンリンパ腫からなる群から選択される疾患又は障害の治療方法であって、請求項62~75のいずれか1項に記載の特異的結合メンバーを当該疾患又は障害を有するか又は発症するリスクのある患者に投与することを含む、前記方法。本発明の種々の態様と実施態様において、添付の特許請求の範囲の主題が提供される。本発明は、IL13、特にヒト及び/又は霊長類のIL13及び/又はIL13の変種、並びにマウスIL13に対する特異的結合メンバーを提供する。本発明の好適な実施態様は抗体分子であり、全抗体又は抗体断片でもよい。抗体VHとVLドメインのように、抗体の抗原結合領域が提供される。VHとVLドメイン内で、相補性決定領域が提供され、これは、異なるフレームワーク領域内に提供されて、場合に応じてVH又はVLドメインを形成する。抗原結合部位は、抗体VHドメイン及び/又はVLドメインからなることもある。抗原結合部位は、フィブロネクチン又はチトクロームBなどの非抗体タンパク質骨格上のCDRの整列により提供される115116。タンパク質内の新規結合部位を作成するための骨格は、Nygrenら116に詳細に総説される。抗体模倣物のタンパク質骨格はWO/0034784に開示されており、発明者らは、少なくとも1のランダム化ループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質を記載する。1つ以上のCDRを入れ込むための適当な骨格は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意のドメインメンバーにより提供される。本発明の好適な実施態様は、本明細書においてBAK278D6系統と呼ぶものである。これは以下のようにBAK278D6の6つのCDR配列のセット:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3について定義される。1の態様では、本発明はヒトIL13に対する特異的結合メンバーであって、ヒト抗体VHドメイン及びヒト抗体VLドメインから構成され、かつCDRのセットを含む抗体抗原結合部位を含む、上記特異的結合メンバーを提供し、ここで当該VHドメインがHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、並びに当該VLドメインはLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含むここで、当該HCDR1は配列番号1のアミノ酸配列を有し、当該HCDR2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、当該HCDR3は配列番号3のアミノ酸配列を有し、当該LCDR1は配列番号4のアミノ酸配列を有し、当該LCDR2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、当該LCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を有するか;或いは、CDRのセットが、上記CDRのセットHCDR1は配列番号1のアミノ酸配列を有し、HCDR2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、HCDR3は配列番号3のアミノ酸配列を有し、LCDR1は配列番号4のアミノ酸配列を有し、LCDR2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、そしてLCDR3は配列番号6のアミノ酸配列を有すると比較して1つ又は2つのアミノ酸置換を含む。HCDR1が配列番号1のアミノ酸配列を有し、HCDR2が配列番号2のアミノ酸配列を有し、HCDR3が配列番号3のアミノ酸配列を有し、LCDR1が配列番号4のアミノ酸配列を有し、LCDR2が配列番号5のアミノ酸配列を有し、LCDR3が配列番号6のアミノ酸配列を有するCDRのセットは、本明細書においてBAK278D6のCDRセットと呼ぶ。BAK278D6のCDRセット内のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3は、BAK278D6のHCDRセットと呼び、BAK278D6のCDRセット内のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3は、BAK278D6のLCDRセットと呼ぶ。BAK278D6のCDRセット、BAK278D6のHCDRセット、又はBAK278D6のLCDRセット、或いはそれらの中の1又は2個の置換を有するCDRのセットは、BAK278D6系統であると言われる。前記のように、ある態様において本発明は、ヒト抗体VHドメインとヒト抗体VLドメインで構成され、かつCDRのセットを含む抗体の抗原結合部位を含む、ヒトIL13に対する特異的結合メンバーを提供し、ここで当該CDRのセットは、BAK278D6のCDRセット、又はBAK278D6のCDRセットと比較して1つ又は2つの置換を含むCDRのセットである。好適な実施態様において1つ又は2つの置換は、カバトの標準的番号付け107を使用して、VH及び/又はVLドメインのCDR内の以下の残基の1つ又は2つにある。HCDR1中の31、32、34HCDR2中の52、52A、53、54、56、58、60、61、62、64、65HCDR3中の96、97、98、99、101LCDR1中の26、27、28、30、31LCDR2中の56LCDR3中の95A、97。好適な実施態様は、BAK278D6のCDRセットと比較して、HCDR3残基99とLCDR1残基27にて2つの置換を有する。これらの実施態様のうち好適な実施態様は、HCDR3残基99でNがSに置換され、LCDR1残基27でNがIに置換される。さらに好適な実施態様は、S、A、I、R、P及びKからなる群から選ばれるHCDR3残基99での置換と、I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H及びGからなる群から選ばれるLCDR1残基27での置換とを有する。好適な実施態様において1つ又は2つの置換が、以下の可能な置換残基の特定された基:置換の位置以下からなる群から選択される置換残基HCDR1中の31:Q、D、L、G、EHCDR1中の32:THCDR1中の34:V、I、FHCDR2中の52:D、N、A、R、G、EHCDR2中の52A:D、G、T、P、N、YHCDR2中の53:D、L、A、P、T、S、I、RHCDR2中の54:S、T、D、G、K、IHCDR2中の56:T、E、Q、L、Y、N、V、A、M、GHCDR2中の58:I、L、Q、S、M、H、D、KHCDR2中の60:RHCDR2中の61:RHCDR2中の62:K、GHCDR2中の64:RHCDR2中の65:KHCDR3中の96:R、DHCDR3中の97:N、D、T、PHCDR3中の98:RHCDR3中の99:S、A、I、R、P、KHCDR3中の101:YLCDR1中の26:D、SLCDR1中の27:I、L、M、C、V、K、Y、F、R、T、S、A、H、GLCDR1中の28:VLCDR1中の30:GLCDR1中の31:RLCDR2中の56:TLCDR3中の95A:NLCDR3中の97:Iに従って、BAK278D6のCDRセット内の上記残基の1つ又は2つでなされる:好適な実施態様は、HCDR3の残基99でNがSに置換され、LCDR1の残基27でNがIに置換されたBAK278D6のCDRセットを有する。こうして定義されたCDRのセットは以下の通りである:HCDR1配列番号7;HCDR2配列番号8、HCDR3配列番号9;LCDR1配列番号10、LCDR2配列番号11、LCDR3配列番号12。このCDRのセットは本明細書においてBAK502G9のCDRのセットと呼ぶ。さらなる好適な実施態様は、CDR内に1つ又は2つの置換を有するBAK278D6のCDRセットを有するが、ただし、HCDR3の残基99のNのSによる置換とLCDR1の残基27のNのIによる置換の対は含まれない。他の好適な実施態様は以下の通りである:BAK1166G2:HCDR1配列番号67、HCDR2配列番号68、HCDR3配列番号69、LCDR1配列番号70、LCDR2配列番号71、LCDR3配列番号72。BAK1167F2:HCDR1配列番号61、HCDR2配列番号62、HCDR3配列番号63、LCDR1配列番号64、LCDR2配列番号65、LCDR3配列番号66。BAK1184C8:HCDR1配列番号73、HCDR2配列番号74、HCDR3配列番号75、LCDR1配列番号76、LCDR2配列番号77、LCDR3配列番号78。BAK1185E1:HCDR1配列番号79、HCDR2配列番号80、HCDR3配列番号81、LCDR1配列番号82、LCDR2配列番号83、LCDR3配列番号84。BAK1167F4:HCDR1配列番号85、HCDR2配列番号86、HCDR3配列番号87、LCDR1配列番号88、LCDR2配列番号89、LCDR3配列番号90。BAK1111D10:HCDR1配列番号91、HCDR2配列番号92、HCDR3配列番号93、LCDR1配列番号94、LCDR2配列番号95、LCDR3配列番号96。BAK1183H4:HCDR1配列番号97、HCDR2配列番号98、HCDR3配列番号99、LCDR1配列番号100、LCDR2配列番号101、LCDR3配列番号102。BAK1185F8:HCDR1配列番号103、HCDR2配列番号104、HCDR3配列番号105、LCDR1配列番号106、LCDR2配列番号107、LCDR3配列番号108。これらのすべては、重鎖CDR1とCDR2のランダム化によりBAK502G9から得られ、従ってBAK502G9系統である。任意のクローンのCDRのセットを含むVHドメインを表1に示す。別に、表1に示すクローンのCDRのセットを含むVLドメインも本発明により表1に示される。好ましくはかかるVHドメインはかかるVLドメインと対になっており、最も好ましくはVHとVLドメインの対は、表1に示すクローンと同じである。さらに本発明により、CDRのセットが、1つ又は2つのアミノ酸置換を有する表1に示す任意のクローンのものに対応する、CDRのセットを含むVHドメインが提供される。さらに本発明により、CDRのセットが、1つ又は2つのアミノ酸置換を有する表1に示す任意のクローンのものに対応する、CDRのセットを含むVLドメインが提供される。VH及び/又はVLドメインを含む抗体の抗原結合ドメインを含む特異的結合メンバーもまた、本発明により提供される。本発明者は、BAK278D6系統を、IL13に対するヒト抗体の抗原結合ドメインを提供する系統であるとして同定し、これは特に価値がある。この系統内で、BAK502G9が特に有用であると特定される。BAK278D6とBAK502G9のCDRのセットは、すでに上記で同定されている。構造/性質活性相関に多変量データ解析技術を適用するコンピューター化学の進歩に従って94、抗体の統計的活性性質相関、パターン認識と分類のような公知の数学的方法を使用して、抗体の定量的活性性質相関を得ることができる95~100。抗体の性質は、抗体配列の経験的及び理論的モデル、機能的及び3次元構造から得ることができ、これらの性質は単独及び組合せで考慮することができる。VHドメインとVLドメインからなる抗体の抗原結合部位が、ポリペプチドの6つのループから、そして3つが重鎖可変ドメインからにより形成される。既知の原子構造の抗体の分析により、抗体結合部位の配列と3次元構造の関係が明らかにされた101102。これらの関係は、VHドメイン中の第3の領域を除くと、結合部位ループは少数の主鎖コンフォメーションの1つを有することを示唆する。特定のループで形成される標準構造は、ループとフレームワーク領域の両方でそのサイズといくつかの残基の存在により決定されることが証明された101102。配列構造相関のこの研究は、既知の配列の抗体の残基の予測に使用することができるが、未知の3次元構造については予測できず、これはそのCDRループの3次元構造を維持し、従って結合特異性を維持するのに重要である。これらの予測は、リード最適化実験からの出力についての予測の比較により支持することができる。構造アプローチでは、自由に入手できるか又は市販のパッケージを使用して抗体分子103についてモデルを作成することができる。例えばインサイトII105又はディープビュー106のようなタンパク質の視覚化と分析ソフトウェアパッケージを使用して、CDR中の各位置の可能な置換を評価することができる。次にこの情報を使用して、活性への影響が最小であるか又は有益な置換が作成される。本発明者は、そのCDRのセットを表1に示すクローンのパネルの配列データを分析した。この分析は、scFv変種の記載のセットからのCDR中の記載のアミノ酸の変化の2成分の組合せは、少なくとも親scFvBAK278D6の出発力価を有するscFv変種を与えるという仮説を検定した。全てのscFv変種は、改良された親和性について選別され、そしてより高い力価を示すことが確認されている。観察されたアミノ酸の変化は、TF1アッセイにおいてscFvBAK278D6の出発力価の44nMに対してのその作用が、好ましいか、好ましくないか、又はどちらでもない。任意の2つのアミノ酸の変化の間で関連は観察されず、任意の2つの選択されたアミノ酸の変化の間に正又は負の相乗作用が無いことが確認された。かかる2つの組合せが仮説を満足する4つのシナリオと、仮説が有効ではない3つのシナリオがある。関連は観察されなかったため、相乗作用的アミノ酸の変化は考慮していない。仮説は以下の場合A1:変異1が好ましく、かつ変異2が好ましいA2:変異1が好ましく、かつ変異2がどちらでもないA3:変異1がどちらでもなく、かつ変異2がどちらでもないA4:変異1が好ましく、かつ変異2が好ましくないに有効である:。仮説は以下の場合:B1:変異1が好ましくなく、かつ変異2がどちらでもないB2:変異1が好ましくなく、かつ変異2が好ましくないB3:変異1が好ましく、かつ変異2が好ましくないに有効ではない。A4が可能であるためには、変異1は、力価についての変異2の負の作用を相殺できるほど極めて好ましいものでなければならない。かかる極めて好ましい変異は、選択に使用される変化のライブラリーには存在しないため、これは変種のパネルについて選択され、従ってそこにしばしば現れるであろう。相乗作用は排除することができるため、かかる変異は任意の種類の配列で有効であり、従って異なるscFv変種中に再出現するはずである。かかる高頻度のアミノ酸変化の例は、軽鎖CDR1の変化Asn27Ileの変化である。しかしこの変異自体は、力価に対してわずかに2倍の作用しか有さない。それ自体でこれは極めて好ましい変異ではないため、A4に示すシナリオは不可能であろう。これは、1つ以上のさらなる変異とともに軽鎖CDR1のAsn27Ile変化を有する記載のIL13結合クローンセット中の各クローンは、1本鎖の軽鎖CDR1Asn27Ile変異を有する変種と少なくとも同等の力価であることを示唆する。他の変異はどちらでもないか又は正であるが、負若しくは有害な作用は無い。さらなる例は、重鎖CDR3のAsn99Serである。この単一のアミノ酸変化を有するクローンは観察されていないため、かかるクローンの力価は、以下の理論により約12.0nMであると推定されている:BAK278D6力価は44nMである。VLCDR1N27IVHCDR3N99Sの変化は、力価8nMのBAK502G9を与え、すなわち5.5倍の改良である。BAK278D6力価は44nMである。VLCDR1N27Iの変化は、力価23nMのBAK531E2を与え、すなわち1.9倍の改良である。BAK278D6力価は44nMである。VHCDR3N99Sの変化は、力価12.2nMの可能なクローンを与え、すなわち2.9倍の改良である。重鎖CDR3Asn99Serと軽鎖CDR1Asn27Ileとの2成分の組合せは、力価が8nMのscFvBAK0502G9を与える。相乗作用が除外されているため、BAK502G9中の重鎖CDR3Asn99Serの変化の寄与は付加的である。従って1つ以上のさらなる変異とともに重鎖CDR3のAsn99Ser変化を有するIL13結合クローンの記載のセット中のすべてのクローンは、n=1~2について許容アッセイウィンドウ2.5倍内で少なくとも12nM又はそれ以上の力価を有するであろう。すなわち本発明者は、優先的に選択される極めて好ましいアミノ酸の変化は観察されないと考えている。上記したように、主にscFv変種の表1中に示した2つの変化を詳細に分析した。1つ以上のさらなる変異とともにこれらの変異のいずれかを有する表1のscFv変種は、親BAK278D6中のこれらの2つの単一のアミノ酸変化の任意の1つを含有するクローンのように少なくとも改善していた。従ってシナリオA4を可能にするであろう極めて好ましいアミノ酸変化がこのパネル中に存在するという証拠は無い。この観察結果により本発明者は、このscFv変種のセットには好ましくない変異は存在しないと結論した。これは、シナリオA4及びB1~B3が関係なく、この仮説が有効であることを意味する。従ってすでに記載したように本発明は、定義されたCDRのセット、特にBAK278D6のCDRセットと、BAK278D6系統のCDRセットを、CDRのセット内の1つ又は2つの置換とともに含む特異的結合メンバーを提供する。関連するCDRのセットが、抗体フレームワーク領域内又は他のタンパク質骨格に提供される115116。好ましくは抗体フレームワーク領域が使用され、これらが使用される場合、これらは好ましくは生殖細胞系であり、さらに好ましくは重鎖の抗体フレームワーク領域は、VH1ファミリー由来のDP14でもよい。軽鎖の好適なフレームワーク領域はλ33Hでもよい。BAK502G9のCDRセットでは、抗体フレームワーク領域が、VHFR1については配列番号27、VHFR2については配列番号28、VHFR3については配列番号29、軽鎖FR1については配列番号30、軽鎖FR2については配列番号31、軽鎖FR3については配列番号32であることが好ましい。極めて好適な実施態様において、配列番号15のアミノ酸配列を有するVHドメインが提供され、これはBAK502G9VHドメインと呼ぶ。さらに極めて好適な実施態様において、配列番号16のアミノ酸配列を有するVLドメインが提供され、これはBAK502G9VLドメインと呼ぶ。本発明で提供される極めて好適な抗体の抗原結合部位は、BAK502G9VHドメイン配列番号15と、BAK502G9VLドメイン配列番号16で構成される。この抗体の抗原結合部位は、本明細書の別のところでさらに考察されるように、任意の所望の抗体分子フォーマット、例えばscFv、Fab、IgG、IgG4、dAbなどの中に提供されうる。さらに極めて好適な実施態様において本発明は、BAK502G9VHドメイン配列番号15とBAK502G9VLドメイン配列番号16とを含むIgG4抗体分子を提供する。これを本明細書においてBAK502G9IgG4と呼ぶ。抗体VHドメイン内にBAK502G9のHCDRセット及び/又は抗体VLドメイン内にBAK502G9のLCDRセットを含む他の抗体分子のように、BAK502G9VHドメイン及び/又はBAK502G9VLドメインを含むIgG4若しくは他の抗体分子が本発明により提供される。本明細書で使用される及び/又はは、他のものを含むか又は含まない2つの特定の特徴又は成分のそれぞれの具体的な開示であると理解されることをここで指摘することが便利である。例えばA及び/又はBは、それぞれが個々に記載されるように、A、B、及びAとB、のそれぞれの具体的な開示であると理解されたい。前記したように本発明は、ヒトIL13に結合し、かつBAK502G9VHドメイン及び/又はBAK502G9VLドメインを含む、特異的結合メンバーを提供する。一般に、VHドメインはVLドメインと対になって抗体の抗原結合部位を提供するが、後述のように、抗原に結合するためにVHドメイン単独が使用されることがある。ある好適な実施態様においてBAK502G9VHドメインはBAK502G9VLドメインと対になり、その結果、BAK502G9VHとVLドメインの両方を含む抗体の抗原結合部位が形成される。他の実施態様においてBAK502G9VHはBAK502G9VL以外のVLドメインと対になる。軽鎖の無差別結合は当該分野において確立されている。同様に、単独で又はVLドメインと組合せて特異的結合メンバーとして使用されるVHドメイン中に、BAK278D6系統の任意のHCDRセットを提供することができる。例えば表1に示すように、BAK278D6系統の抗体のHCDRセットを有するVHドメインが提供され、かかるVHドメインがVLドメインと対になると、例えば表1に示すBAK278D6系統の抗体のLCDRセットを有するVLドメインが提供される。HCDRセットとLCDRセットとの対形成を表1に示し、表1に示すようにCDRのセットを含む抗体の抗原結合部位を提供する。VH及び/又はVLドメインのフレームワーク領域は生殖細胞系フレームワークでもよい。重鎖ドメインのフレームワーク領域はVH1ファミリーから選択され、好適なVH1フレームワークはDP14フレームワークである。軽鎖のフレームワーク領域はλ3ファミリーから選択され、好適なかかるフレームワークはλ33Hである。BAK502G9VH又はVLドメインから1つ以上のCDRが取られ、適当なフレームワークに取り込まれる。これは本明細書でさらに説明される。BAK502G9HCDRの1、2、及び3は、それぞれ配列番号7、8、及び9に示される。BAK502G9LCDRの1、2、及び3は、それぞれ配列番号10、11、及び12に示される。他のBAK278D6系統のCDRについても、表1に示すCDRのセットと同じことが適用される。本発明のさらなる実施態様は、VH及び/又はVLドメインを含む特異的結合メンバー、又は167A11として示される抗体分子、及びその誘導体615E3、BAK582F7、及びBAK612B5のVH及び/又はVLドメインのCDRを含む抗原結合部位に関する。これらはヒトIL13を認識する。VHCDR3ランダム化からの167A11の誘導体は、力価の高いscFv分子である。167A11系統は、他の分子について本明細書に開示されたように本発明の任意の態様及び実施態様で使用され、例えば改良された力価を有する抗原結合部位の変異と選択方法に使用される。本明細書にそのアミノ酸配列が記載され、IL13に対する特異的結合メンバーに使用することができるものを含む、本発明のVH及びVLドメイン並びにCDRの変種は、配列改変又は変異法及びスクリーニングにより得ることができる。かかる方法もまた、本発明により提供される。その配列が本明細書に具体的に開示されるVH及びVLドメインの任意の可変ドメインアミノ酸配列変種は、記載のように本発明に従って利用される。具体的な変種は1つ以上のアミノ酸配列改変を含み、約20未満の改変、約15未満の改変、約10未満の改変、又は約5未満の改変、4、3、2、或いは1の改変を含む。改変は、1つ以上のフレームワーク領域及び/又は1つ以上のCDR中に作成される。本発明のさらなる態様において、抗原に結合することについて、任意の特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーここで、両方が抗原に結合する、本明細書に開示のVH及び/又はVLドメイン、又は本明細書に開示のHCDR3、又はこれらの任意の変種が提供される。結合メンバー間の競合はインビトロで、例えばELISAを使用して、及び/又は他の非標識結合メンバーの存在下で検出できる1の結合メンバーに対して特異的なレポーター分子を標識することにより、容易に測定でき、同じエピトープ若しくは重複するエピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にする。すなわち本発明のさらなる態様は、IL13への結合について、BAK502G9抗体分子、特にBAK502G9scFv及び/又はIgG4と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む特異的結合メンバーを提供する。さらなる態様において本発明は、IL13への結合について、抗体の抗原結合部位と競合するヒト抗体の抗原結合部位を含む特異的結合メンバーであって、抗体の抗原結合部位はVHドメインとVLドメインから構成され、かつVH及びVLドメインはBAK278D6系統のCDRセットを含む、上記特異的結合メンバーを提供する。IL13に対する抗体であり、IL13への結合についてBAK502G9抗体分子、BAK502G9のCDRセットを有する抗体分子、又はBAK278D6のCDRセットを有する抗体分子と競合する抗体を得るために、種々の方法が当該分野で利用できる。さらなる態様において本発明は、抗原に結合することができる1つ以上の特異的結合メンバーを得るための方法であって、本発明の特異的結合メンバーのライブラリーと該抗原とを接触させ、該抗原に結合することができるライブラリーの1つ以上の特異的結合メンバーを選択することを含む方法を提供する。ライブラリーはバクテリオファージ粒子の表面上に表示され、各粒子はその表面に表示される抗体VH可変ドメイン、及び場合によって存在するなら表示されるVLドメインをコードする核酸を含有する。抗原に結合することができ、バクテリオファージ粒子上に表示される特異的結合メンバーの選択後に、該選択された特異的結合メンバーを表示するバクテリオファージ粒子から核酸が採取される。かかる核酸は、該選択された特異的結合メンバーを表示するバクテリオファージ粒子から採取される核酸の配列を有する核酸から発現させることによる、特異的結合メンバー又は抗体VH可変ドメインの以後の産生に使用される。該選択された特異的結合メンバーの抗体VH可変ドメインのアミノ酸配列を有する抗体VH可変ドメインは、かかるVHドメインを含む特異的結合メンバーのように、単離された型で提供される。さらにIL13に結合する能力、またIL13への結合についてBAK502G9と競合する能力もまた試験される。さらに後述されるように、IL13を中和する能力が試験される。本発明の特異的結合メンバーは、BAK502G9抗体分子の親和性で、又はそれより強い親和性でIL13に結合する。本発明の特異的結合メンバーは、BAK502G9抗体分子の力価で、又はそれより優れた力価でIL13を中和する。本発明の特異的結合メンバーは、BAK502G9抗体分子の力価で、又はそれより優れた力価で、天然に存在するIL13を中和する。異なる特異的結合メンバーの結合親和性と中和力価は、適切な条件下で比較することができる。本発明の抗体は、既存の市販のげっ歯類抗ヒトIL13抗体、すなわちJES105A2、BB13、及びクローン321166に対して、多くの利点を有する。本発明の抗体の力価を、市販のJES10A2及びBB13と比較した。クローン321166は以前の実験で、既知の市販の抗体より著しく力価が低いことが明らかだったため、評価しなかった。げっ歯動物の市販のIL13抗体は、免疫原性応答を誘導する可能性が高く、従って体内からより速くクリアランスされるため、この抗体のヒトでの効力と使用は限定されるようである。非ヒト霊長類での本発明の抗体の動力学的解析は、これらの抗体が他の既知のヒト又はヒト化抗体と同等のクリアランス速度を有することを示唆する。本発明の種々の実施態様で提供される抗体は、非ヒト霊長類IL13及びカニクイザルIL13を含むを認識する。非ヒト霊長類で抗体の効力と安全性プロフィールを測定することは、ヒトでの抗体の安全性、薬物動態、及び薬力学的プロフィールを予測する手段を提供するため、極めて有用である。さらに本発明の種々の実施態様の抗体はさらに、喘息に関連するヒトIL13変種を認識する。変種IL13との交差反応性は、本発明の抗体及び本発明の抗体を含む組成物を、野生型と変種IL13を用いる患者の治療に使用することを可能にする。本発明の好適な実施態様は、BAK502G9VHドメインとBAK502G9VLドメインにより形成されるIL13抗原結合部位の力価と同等か又はこれより優れた力価で、天然に存在するIL13を中和する抗体を含む。例えば本発明者は、BAK502G9、1167F2、及び1183H4のような代表的クローンが、既知の市販の抗体より天然に存在するIL13に対してはるかに強力であることを示した。抗体配列以外に本発明の特異的結合メンバーは、他のアミノ酸を含み、例えばペプチド又はポリペプチドを形成するか、又は抗原に結合する能力以外に他の機能的特徴を分子に付与する。本発明の特異的結合メンバーは、検出できる標識物を有するか、又は毒素若しくは標的化成分若しくは酵素に、結合してもよい。さらなる態様において本発明は、本発明の特異的結合メンバー、VHドメイン及び/又はVLドメインをコードする配列を含む単離された核酸と、本発明の特異的結合メンバー、VHドメイン及び/又はVLドメインを調製する方法とを提供する。本発明の特異的結合メンバーは、本発明の特異的結合メンバーの有効量を患者に投与することを含む、ヒト又は動物の体の治療又は診断法、例えばヒト患者の疾患又は障害の治療法で使用される。本発明で治療される症状には、IL13が関与する任意の症状、特に喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、慢性閉塞性肺疾患、硬皮症、炎症性腸疾患、及びホジキンリンパ腫がある。さらに本発明の抗体はまた、IL13介在免疫抑制を阻害する6465ため、腫瘍やウイルス感染症を治療するのに使用される。本発明のさらなる態様は、本明細書に開示のVH可変ドメイン及び/又はVL可変ドメインをコードする、一般に単離された核酸を提供する。本発明の別の態様は、本明細書に開示のVHCDR又はVLCDR配列、特に配列番号7、8及び9から選択されるVHCDR、又は配列番号10、11及び12から選択されるVLCDR、最も好ましくはBAK502G9VHCDR3をコードする、一般に単離された核酸を提供する。BAK502G9のCDRセットをコードする核酸、BAK502G9のHCDRセットをコードする核酸、及びBAK502G9のLCDRセットをコードする核酸もまた、BAK278D6系統の個々のCDR、HCDR、LCDR、及びCDR、HCDR、LCDRのセットをコードする核酸のように、本発明により提供される。さらなる態様は、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を提供する。さらなる態様は、コード核酸からの発現を引き起こすことを含む、抗体VH可変ドメインの産生法を提供する。かかる方法は、該抗体VH可変ドメインの産生のための条件下で宿主細胞を培養することを含む。VL可変ドメイン、及びVH及び/又はVLドメインを含む特異的結合メンバーの産生のための類似の方法は、本発明のさらなる態様として提供される。産生法は、生成物の単離及び/又は精製工程を含有してもよい。産生法は、生成物を少なくとも1つの追加の成分、例えば薬剤学的に許容される賦形剤、を含む組成物中に製剤化することを含む。本発明のこれら及び他の態様は、以下に詳述される。用語特異的結合メンバー特異的結合メンバーは、互いに結合特異性を有する分子対のメンバーを説明する。特異的結合対のメンバーは、天然に得られるか、又はすべて若しくは一部が合成されるものでもよい。分子対の1つのメンバーはその表面又は空洞に、分子対の他のメンバーの特定の空間的及び極性構成に特異的に結合し、従ってこれに相補的な領域を有する。すなわち対のメンバーは、互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合対のタイプの例は、抗原抗体、ビオチンアビジン、ホルモンホルモン受容体、受容体リガンド、酵素基質である。本発明は、抗原抗体型の反応に関する。抗体分子抗体分子は、天然の又は部分的若しくは完全に合成された免疫グロブリンを記載する。この用語はまた、抗体結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を包含する。抗原結合ドメインを含む抗体断片は、Fab、scFv、Fv、dAb、Fdのような分子、及びダイアボディである。モノクローナル抗体及び他の抗体を取り、組換えDNA技術を使用して、元々の抗体の特異性を保持する他の自己抗体又はキメラ分子を産生することは可能である。かかる技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域フレームワーク領域に導入することを含む。例えばEPA184187、GB2188638A又はEPA239400、及び多くの以後の文献を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の抗体は遺伝的変異又は他の変化を受け、これは産生される抗体の結合特異性を変化させることも変化させないこともある。抗体は多くの方法で修飾することができるため、用語抗体分子は、必要な特異性を有する抗体の抗原結合ドメインを鵜鵜する特異的結合メンバー又は物質を包含するものと理解されたい。すなわちこの用語は、天然の又は完全に若しくは部分的に合成された免疫グロブリン結合ドメインを含むポリペプチドを含む、抗体断片及び誘導体を包含する。従って、他のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現は、EPA0120694及びEPA0125023、及び多くの以後の文献に記載されている。抗体工学の分野で利用できるさらなる方法が、ヒト及びヒト化抗体を単離することを可能にした。例えばヒトハイブリドーマはKontermannらが記載したように作成することができる107。特異的結合メンバーを作成するための別の確立された技術であるファージディスプレイ法が、Kontermannら107やWO92/01047のような多くの刊行物で詳述されている。マウス免疫系の他の成分を無傷のまま残して、マウス抗体遺伝子が不活性化されヒト抗体で機能的に置換されたトランスジェニックマウスを、ヒト抗原に対するヒト抗体を単離するために使用することができる108。例えばKnappikら、JMolBiol296、5786、又はKrebsら、JImmunolMeth25420016784に記載されているように、適当な発現ベクター内で合成され組み立てられたオリゴヌクレオチドを使用して作成された遺伝子から発現させて、合成抗体分子を作成してもよい。全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たすことができることが示されている。結合断片の例は、VL、VH、CL、及びCH1ドメインからなるFab断片;VHとCH1ドメインからなるFd断片;1本鎖抗体のVLとVHドメインからなるFv断片;VHドメインからなるdAb断片、McCaffertyらNature348552554;単離されたCDR領域;2つの連結したFab断片を含む2価断片であるF2断片;1本鎖Fv分子、ここでVHドメインとVLドメインは、2つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーにより結合される;二重特異的1本鎖Fvダイマー、及びダイアボディ、遺伝子融合により構築される多価又は多重特異的断片。Fv、scFv、又はダイアボディ分子は、VHドメインとVLドメインとを連結するジスルフィド結合の取り込みにより安定化される。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニボディを作成することもできる。二重特異的抗体が使用される場合、これらは従来の二重特異的抗体でもよく、これらは種々の方法で製造することができ、例えば化学的に又はハイブリッドハイブリドーマから調製されるか、又は上記の任意の二重特異的抗体断片でもよい。二重特異的抗体の例にはBiTE技術のものがあり、これは、異なる特異性を有する2つの抗体の結合ドメインを使用することができ、短い柔軟性のあるペプチドを介して連結される。これは、短い1本鎖ポリペプチド上で2つの抗体を組合せる。ダイアボディとscFvは可変ドメインのみを使用してFc領域無しで構築することができ、抗イディオタイプ反応の影響を低減する可能性がある。二重特異的全抗体に対して二重特異的ダイアボディはまた、容易に構築することができ大腸菌中で発現できるため、特に有用である。適切な結合特異性のダイアボディは、ライブラリーからファージディスプレイを使用して容易に選択することができる。例えばIL13に対する特異性を用いて、ダイアボディの1つのアームを一定に維持するなら、他のアームが変化したライブラリーを作成することができ、適切な特異性の抗体を選択することができる。二重特異的全抗体は、ノブズインツウホールズ法により作成してもよい。抗原結合ドメイン抗原結合ドメインは、抗原の一部又はすべてに特異的に結合しかつこれに相補的な領域を含む抗体分子の一部を説明する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合し、この部分はエピトープと呼ばれる。1つ以上の抗体可変ドメインにより抗原結合ドメインが提供される。好ましくは抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖可変領域とを含む。特異的特異的は、特異的結合対の1つのメンバーがその特異的結合対以外の分子に顕著な結合を示さない状況指すために使用される。この用語はまた、例えば抗原結合ドメインが、多くの抗原に運搬される特定のエピトープに特異的な場合にも適用され、この場合抗原結合ドメインを有する特異的結合メンバーは、エピトープを有する種々の抗原に結合することができる。含む含むは、一般に含むと言う意味、すなわち1つ以上の特徴又は要素の存在を許容するという意味で使用される。単離された単離されたは、本発明の特異的結合メンバー又はかかる結合メンバーをコードする核酸が、一般に本発明に従っている状態を意味する。単離されたメンバー及び単離された核酸は、そうした調製が、インビトロ又はインビボで行われる組換えDNA技術によル場合、それらが元々関連している物質、例えば天然環境、又は当該メンバー及び核酸が調製される環境例えば、細胞培養において見られる他のポリペプチド又は核酸が存在しないか、又は実質的に存在しない状況である。メンバーと核酸は、希釈剤又はアジュバントを用いて剤形され、さらに実用のため単離されており、例えばメンバーは、イムノアッセイで使用されるマイクロタイタープレートを被覆するために使用されるなら、通常ゼラチン又は他の担体と混合されるか、又は診断又は治療で使用される時、医薬として許容される担体又は希釈剤と混合されるであろう。特異的結合メンバーは、天然状態で又は異種真核細胞細胞系によってグリコシル化されることもあるし、又はグリコシル化されないこともある。天然IL13天然IL13は一般に、IL13タンパク質又はその断片が存在する状態を意味する。天然IL13は、コードする核酸を組換え技術を使用してあらかじめ導入することなく、細胞により自然に産生されるIL13タンパク質を意味する。すなわち天然に存在するIL13は、例えばCD4T細胞により天然に産生されるか、及び/又は哺乳動物から単離されうる。組換えIL13組換えIL13は、IL13タンパク質又はその断片が生じる状態を意味する。組換えIL13は、異種宿主中で組換えDNAにより産生されるIL13タンパク質又はその断片を意味する。組換えIL13は、天然IL13とはグリコシル化の点で異なる。原核生物の細菌発現系により発現される組換えタンパク質はグリコシル化されず、一方真核生物系で発現されるものはグリコシル化される。しかし昆虫細胞中で発現されるタンパク質は、哺乳動物細胞で発現されるタンパク質とはグリコシル化が異なる。実質的に記載されたようにとは、本発明の関連するCDR又はVH若しくはVLドメインが、配列が本明細書に記載された特定の領域と同一であるか又は極めて類似していることを意味する。極めて類似しているとは、1~5、好ましくは1~4、例えば1~3又は1若しくは2、或いは3若しくは4個のアミノ酸置換が、CDR及び/又はVH若しくはVLドメイン中に作成されていると考える。本発明のCDR又はCDRのセットを運搬するための構造は一般に、抗体重鎖又は軽鎖配列又はその十分な部分であり、その中にはCDR又はCDRセットが、再構成免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然VH及び/又はVL抗体の可変ドメインのCDR又はCDRセットに対応する位置に位置している。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、KabatEAら、免疫学的興味のあるタンパク質の配列、第4版、米国保健社会福祉省、1987、及びこの更新版に記載されており、現在はインターネットで利用できる。CDRはまた、フィブロネクチン又はチトクロームBのような他の骨格により保持される115116。好ましくは、実質的に本明細書に記載のCDRアミノ酸配列は、ヒト可変ドメイン又はその実質的な部分の中のCDRとして保持される。実質的に本明細書に記載されるHCDR3配列は本発明の好適な実施態様であり、これらの各々は、ヒト重鎖可変ドメイン又はその実質的な部分にHCDR3として保持されることが好ましい。本発明で使用される可変ドメインは、任意の生殖細胞系列又は再構成ヒト可変ドメインから得られるか、又は既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインでもよい。本発明のCDR配列は、組換えDNA技術を使用してCDRが欠如した可変ドメインのレパートリーに導入してもよい。例えばMarksらは、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法であって、当該可変ドメイン内で、可変ドメイン領域の5’末端に向けられるか又はこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトVH遺伝子の第3のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用して、CDR3を欠如するVH可変ドメインのレパートリーを提供する方法を記載する。Marksらはさらに、このレパートリーがいかに特定の抗体のCDR3と組合わされるかを説明する。類似の方法を使用して本発明のCDR3由来配列を、CDR3が欠如したVH又はVLドメインのレパートリーとシャッフリングし、シャッフリングした完全なVH又はVLドメインは同種のVL又はVHドメインと一緒になり、本発明の特異的結合メンバーを提供する。次にレパートリーは、適当な宿主系、例えばWO92/01047又は以後の多くの文献、ペプチドとタンパク質のファージディスプレイ:実験室マニュアル、サンジエゴ:アカデミックプレスに記載のファージディスプレイ系で表示され、その結果特異的結合メンバーが選択される。レパートリーは、104以上の個々のメンバー、例えば106~108又は1010のメンバーからなる。他の適当な宿主系は、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、リボゾームディスプレイなどである。リボゾームディスプレイの総説については、LoweDとJermutusL2004CurrPharmBiotech51727、及びWO9201047を参照されたい。類似のシャフリング又はコンビナトリアル法がまた、Stemmerにより開示され、彼らは、βラクタマーゼに関連してこの技術を説明するが、このアプローチが抗体の作成に使用されることを観察している。別の方法は、1つ以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して本発明のCDR由来配列を有する新規VH又はVL領域を作成して、全可変ドメイン内に変異を作成することである。かかる方法は、Gramらにより記載され、彼らはエラーの多いPCRを使用した。好適な実施態様において、HCDR及び/又はLCDRのセット内に1つ又は2つのアミノ酸置換が作成される。使用される別の方法は、VH又はVL遺伝子のCDR領域に突然変異誘発を誘発誘発することである。かかる方法はBarbasら及びSchierらにより開示されている。上記のすべての技術は当該分野で公知であり、本発明の一部を構成するものではない。当業者はかかる技術を使用して、当該分野のルーチン的方法を使用して本発明の特異的結合メンバーを提供することができるであろう。本発明のさらなる態様は、IL13抗原に特異的な抗体の抗原結合ドメインを得る方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のVHドメインのアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換又は挿入により、VHドメインのアミノ酸配列変種であるVHドメインを提供し、場合によりこうして提供されたVHドメインを1つ以上のVLドメインと組合せ、そしてVHドメイン又はVH/VL組合せを試験して、特異的結合メンバー、又はIL13抗原に特異的なかつ場合により1つ以上の好適な性質、好ましくはIL13活性を中和する能力を有する抗体の抗原結合ドメインを同定することを含む。該VLドメインは、実質的に本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する。本明細書に開示のVLドメインの1つ以上の配列変種を1つ以上のVHドメインと組合せる類似の方法が使用される。好適な実施態様においてBAK502G9VHドメインは変異を受けて、1つ以上のVHドメインアミノ酸配列変種、及び/又はBAK502G9VLを提供する。本発明のさらなる態様は、IL13抗原に特異的な特異的結合メンバーを調製する方法であって、当該方法が以下の:置換されるCDR3を含むか又はCDR3をコードする領域が欠如したVHドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供し;該レパートリーを、VHCDR3について実質的に本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組合せて、該ドナー核酸をレパートリー中のCDR3領域中に挿入し、そしてVHドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供し;該生成物レパートリーの核酸を発現させ;IL13に特異的な特異的結合メンバーを選択し;そして該特異的結合メンバー又はこれをコードする核酸を回収する、ことを含む方法を提供する。再度、類似の方法であって、当該方法において本発明のVLCDR3が、置換されるCDR3を含むか又はCDR3をコードする領域を欠如するVLドメインをコードする核酸のレパートリーと組合わされる、前記方法が使用される。同様に、1つ以上の、又はすべての3つのCDRがVH又はVLドメインのレパートリー中に移植され、これは次に、特異的結合メンバー又はIL13に特異的な特異的結合メンバーについてスクリーニングされる。好適な実施態様において1つ以上のBAK502G9HCDR1、HCDR2配列番号8、及びHCDR3、又はBAK502G9のHCDRセットが使用され、及び/又は1つ以上のBAK502G9LCDR1、LCDR2、又はBAK502G9のLCDRセットが使用される。免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、その介在フレームワーク領域とともに少なくとも3つのCDR領域を含む。好ましくはこの部分はまた、第1及び第4のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約50を含み、この50は第1のフレームワーク領域のC末端の50と第4のフレームワーク領域のN末端の50である。可変ドメインの実質的な部分のN末端又はC末端の追加の残基は、通常は天然に存在する可変ドメイン領域に結合していないものでもよい。例えば組換えDNA技術により作成された本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニング又は他の操作工程を容易にするために導入されたリンカーによりコードされるN末端又はC末端残基の導入をもたらしうる。他の操作工程は、本発明の種々のドメインをさらなるタンパク質配列例えば免疫グロブリン重鎖、例えばダイアボディの産生における他の可変ドメイン、又は本明細書中のいたるところでより詳細に記載されるタンパク質標識に繋げるために、リンカーの導入を含む。本発明の好適な態様において一対のVHとVLドメインを含む特異的結合メンバーが好ましいが、VH又はVLドメイン配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは本発明の他の態様を構成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にVHドメインが特異的に標的抗原に結合できることは公知である。いずれかの単一の特異的結合ドメインの場合、これらのドメインは、IL13に結合できる2ドメイン特異的結合メンバーを形成することができる相補的なドメインをスクリーニングするのに使用される。これは、WO92/01047に開示されているように、いわゆる階層的な2重コンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング法により行われる。ここで、鎖をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させるためにH又はL鎖クローンを含む個々のコロニーが使用され、そして得られた2鎖特異的結合メンバーが、文献に記載のようなファージディスプレイ法に従って選択される。この方法はまた、Marksらにも開示されている。本発明の特異的結合メンバーはさらに、抗体定常領域又はその一部を含む。例えばVLドメインがそのC末端で、ヒトCκ又はCλ鎖、好ましくはCλ鎖、を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合される。同様にVHドメインに基づく特異的結合メンバーはそのC末端で、任意の抗体イソタイプから得られる免疫グロブリン重鎖のすべて又は一部に結合される。IgG4は補体に結合せず、エフェクター機能を生成しないため好ましい。これらの性質を有し可変領域を安定化させる合成又は他の定常領域変種はまた、本発明の実施態様での使用に好適である。本発明の特異的結合メンバーは、検出可能な又は機能的標識物で標識してもよい。検出可能な標識物には、放射線標識があり、これらは、抗体イメージングの分野で公知の一般的化学を使用して、本発明の抗体に結合される。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識を含む。標識はさらにビオチンなどの化学成分を含み、これは特異的な同種の検出できる成分への結合を介して検出される。本発明の特異的結合メンバーは、ヒト又は動物対象の診断又は治療法で使用できるように設計される。従って本発明のさらなる態様は、提供された特異的結合メンバーの投与を含む治療法、かかる特異的結合メンバーを含む医薬組成物、及び投与される医薬の製造におけるかかる特異的結合メンバーの使用を提供する。治療効果を与えるために抗IL13抗体が使用される臨床的適応症には、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、繊維症、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、硬皮症、及びホジキンリンパ腫がある。すでに説明したように、抗IL13治療はこれらのすべての疾患に有効である。抗IL13治療は、経口、注射、吸入、又は局所的に投与される。投与経路は、治療の物理化学的特性、疾患についての特殊な考慮事項、又は効力を最適化し副作用を最小にするための要件により決定することができる。抗IL13治療は、診療の場での使用に限定されない。すなわち、針を使用しない器具を使用する皮下注射も好適である。併用療法を使用して、特に抗IL13特異的結合メンバーを1つ以上の他の薬剤と組合せて、大きな相乗作用を得ることができる。本発明の特異的結合メンバーは、短期又は長期作用性ベータアゴニスト、コルチコステロイド、クロモグリク酸、ロイコトリエンアンタゴニスト、メチルキサンチンとその誘導体、IL4インヒビター、ムスカリン受容体アンタゴニスト、IgEインヒビター、ヒスタミンインヒビター、IL5インヒビター、エオタキシン/CCR3インヒビター、PDE4インヒビター、TGFベータアンタゴニスト、インターフェロンガンマ、ペルフェニドン、化学療法剤、及び免疫治療剤と組合せて提供してもよい。1つ以上の短期又は長期作用性ベータアゴニスト、コルチコステロイド、クロモグリク酸、ロイコトリエンアンタゴニスト、キサンチン、IgEインヒビター、IL4インヒビター、IL5インヒビター、エオタキシン/CCR3インヒビター、PDE4インヒビターとの併用療法は、喘息の治療に使用される。本発明の抗体はまた、コルチコステロイド、代謝拮抗物質、TGFβとその下流のシグナル伝達経路のアンタゴニストと組合せて、繊維症の治療に使用することもできる。これらの抗体とPDE4インヒビター、キサンチンとその誘導体、ムスカリン受容体アンタゴニスト、短い及び長いベータアンタゴニストとの併用療法は、慢性閉塞性肺疾患を治療するのに有用である。同様の組合せが、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、硬皮症、及びホジキンリンパ腫の治療のための抗IL13の使用に適用される。本発明において提供された組成物は、個人に投与される。投与は好ましくは治療有効量で行われ、これは患者に利益を示すのに充分な量である。かかる利益は、少なくとも1つの症状の少なくとも改善である。投与される実際の量、投与の速度と経時変化は、治療される疾患の性質と重症度に依存する。治療処方は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。抗体の適切な用量は当該分野で公知である;LedermannJAら、IntJCancer47659664BagshaweKDらAntibodyImmunoconjugatesandRadipharmaceuticals4915922を参照されたい。正確な用量は、例えば抗体が診断用であるか又は治療用であるか、治療される部位の大きさと位置、抗体の正確な性質、及び検出可能な標識又は抗体に結合される他の分子の性質などの多くの因子に依存する。典型的な抗体用量は、全身性応用には100μg~1gの範囲であり、局所的適用には1μg~1mgである。典型的には抗体は全抗体であり、好ましくはIgG4アイソタイプである。これは、成人患者の単回治療の投与量であり、子供と幼児は比例して調整され、また抗体フォーマットについては分子量に比例して調整される。治療は医師の判断により、毎日、週に2回、週に1回、又は月に1回の間隔で繰り返される。本発明の好適な実施態様において、治療は定期的であり、投与間の期間は約2週間又はそれ以上、好ましくは約3週間又はそれ以上、さらに好ましくは約4週間又はそれ以上、又は月に約1回である。本発明の特異的結合メンバーは、通常医薬組成物の形で投与され、これは特異的結合メンバー以外に少なくとも1つの成分を含む。すなわち本発明の及び本発明で使用される医薬組成物は、活性成分以外に、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、又は当業者に公知の他の物質を含む。かかる物質は非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨害してはならない。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し、これは経口又は注射でもよい。経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末又は液体形態、又は液剤型でもよい。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含む。液体の医薬組成物は一般に、液体担体、例えば水、石油、動物若しくは植物油、ミネラル油又は合成油を含む。生理食塩水、デキストロース、又は他の糖溶液又はグリコールを含有してもよい。静脈内注射又は患部への注射用に、活性成分は、発熱性物質を含まず、適当なpH、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形である。当業者は、例えば注射用塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸加リンゲル液のような等張溶媒を使用して、適当な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び/又は他の添加剤が含まれる。組成物は、単独で又は他の治療とともに、治療される症状に応じて同時に若しくは逐次的に投与される。本発明の特異的結合メンバーは、分子の物理化学的性質やデリバリー経路に応じて液体又は固体型で調製される。製剤は、賦形剤、又は賦形剤の組合せ、例えば:糖、アミノ酸、及び界面活性剤を含有してもよい。液体製剤は、広範囲の抗体濃度とpHを含む。固体製剤は、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥、又は超臨界液技術による乾燥により製造してもよい。抗IL13の製剤は、目的のデリバリー経路に依存する:例えば肺デリバリー用の製剤は、吸入により肺深部までの浸透を確実にする物性を有する粒子からなる;局所的製剤は、薬剤が作用部位に留まる時間を延長する粘度改変物質を含む。本発明は、本明細書に記載のようにIL13への特異的結合メンバーの結合を引き起こすか又はこれを可能にする方法を提供する。上記したようにかかる結合は、インビボで例えば特異的結合メンバー若しくは特異的結合メンバーをコードする核酸の投与後に起きるか、又はインビトロで例えばELISA、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、親和性クロマトグラフィー、又は細胞ベースのアッセイで起きる。IL13への特異的結合メンバーの結合量は測定できる。定量は試験試料中の抗原の量に関連し、これは診断的に関心が高い。本発明の任意の態様又は実施態様の特異的結合メンバー又は抗体分子を含むキットはまた、本発明の態様として提供される。本発明のキットにおいて特異的結合メンバー又は抗体分子は標識されて、試料中での反応性の測定を可能にする。キットの成分は一般に無菌であり、密封バイアル又は他の容器に入れられる。キットは、診断分析又は抗体分子が有用な他の方法で使用される。キットは、方法、例えば本発明の方法中の成分の使用についての説明書を含有してもよい。かかる方法を補助するか又は実施することを可能にする付属の材料を、本発明のキット内に含めてもよい。試料中の抗体の反応性は、任意の適切な手段により測定される。放射免疫定量法は1つの可能性である。放射能標識した抗原が非標識抗原と混合され、抗体に結合させられる。結合抗原は非結合抗原から物理的に分離され、抗体に結合した放射活性抗原の量が測定される。試験試料中により多くの抗原が存在するなら、抗原に結合する放射活性抗原は少なくなる。レポーター分子に結合した抗原又は類似体を使用して、非放射活性抗原による競合的結合アッセイを使用してもよい。レポーター分子は、スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を有する蛍光色素、蛍光体又はレーザー色素でもよい。適当な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びテキサスレッドがある。適当な発色性色素にはジアミノベンジジンがある。他のレポーターには、巨大分子コロイド粒子又は粒状物質、及び検出できるシグナルを視覚的に観察するか、電子的に検出するか、又は他の方法で記録することを直接又は間接に可能にする生物学的若しくは化学的に活性な物質がある。分子は、例えば発色するか若しくは色を変化させるか、又は電気的性質の変化を引き起こす反応を触媒する酵素でもよい。これらは、エネルギー状態の電子的遷移により特徴的なスペクトル吸収又は発光が起きるように、分子が励起可能なものでもよい。これらには、バイオセンサーとともに使用される化学物質がある。ビオチン/アビジン又はビオチン/ストレプトアビジン及びアルカリホスファターゼ検出系を使用してもよい。個々の抗体レポーター結合体により生成されるシグナルを使用して、試料中の関連する抗体結合の定量可能な絶対若しくは相対データを得てもよい。本発明はまた、競合的アッセイにおける抗原レベルを測定するための上記の特異的結合メンバーの使用を提供し、すなわち競合的アッセイにおいて本発明により提供される特異的結合メンバーを使用して試料中の抗原レベルを測定する方法が提供される。これは、結合抗原を非結合抗原から分離する必要が無い場合でありうる。結合により物理的又は光学的変化が起きるように、レポーター分子を特異的結合メンバーに連結することは、1つの可能性である。レポーター分子は、検出可能な、好ましくは測定可能なシグナルを直接又は間接に生成する。レポーター分子の結合は、直接又は間接に、共有結合的又は非共有結合的でもよい。ペプチド結合を介する結合は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果でもよい。本発明はまた、例えばバイオセンサー系で本発明の特異的結合メンバーを使用して、直接に抗原のレベルを測定することを提供する。結合を測定するモードは本発明の特徴ではなく、当業者はその好みと一般的知識に従って適当なモードを選択することができる。上記したように種々の態様と実施態様において本発明は、IL13への結合について、本明細書で定義される特異的結合メンバーと競合する特異的結合メンバーを包含する。結合メンバー間の競合は、例えば特異的レポーター分子をある結合メンバーに標識し、これは非標識結合メンバーの存在下で検出することができ、同じエピトープ又は重複エピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能にすることにより、インビトロで容易に測定することができる。競合は、例えばIL13をプレートに固定化し、第1の標識結合メンバーを1つ以上の非標識結合メンバーとともにプレートに加えるELISAを使用して測定してもよい。標識結合メンバーと競合する非標識結合メンバーの存在は、標識結合メンバーが出すシグナルの低下により観察される。競合を試験するには抗原のペプチド断片が使用され、特に目的のエピトープを含むペプチドが使用される。エピトープ配列いずれかの末端の1つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用してもよい。かかるペプチドは、特定の配列から基本的になる。本発明の特異的結合メンバーは、その抗原への結合が、与えられる配列を有するか又は含むペプチドにより阻害されるようなものである。これを試験するには、いずれかの配列1つ以上のアミノ酸を有するペプチドを使用してもよい。特異的ペプチドに結合する特異的結合メンバーは、例えばペプチドとのパニングによりファージディスプレイライブラリーから単離される。本発明はさらに、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸はDNA及び/又はRNAを含む。好適な態様において本発明は、上記した本発明のCDR又はCDRセット又はVHドメイン若しくはVLドメイン、又は抗体の抗原結合部位又は抗体分子、例えばscFv若しくはIgG4をコードする核酸を提供する。本発明はまた、上記の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写若しくは発現カセットの形態の構築体を提供する。本発明はまた、上記の1つ以上の構築体を含む組換え宿主細胞を提供する。提供される上記のCDR又はCDRセット又はVHドメイン若しくはVLドメイン、又は抗体の抗原結合部位又は抗体分子、例えばscFv若しくはIgG4をコードする核酸自体は、コードされる生成物の産生法のように本発明の態様を構成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより便利に行われる。発現による産生後に、VH若しくはVLドメイン又は特異的結合メンバーは、任意の適当な方法を使用して単離及び/又は精製され、次に適宜使用される。本発明の特異的結合メンバー、VH及び/又はVLドメイン、及びコードする核酸分子とベクターは、例えばその自然の環境から単離及び/又は精製されて、実質的に純粋な又は均一な型で、又は核酸の場合は、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸又は遺伝子を含まないか又は実質的に含まずに提供される。本発明の核酸はDNA又はRNAを含み、完全に又は部分的に合成される。本明細書のヌクレオチド配列への参照は、特定の配列を有するDNA分子を包含し、特定の配列を有するRNA分子を包含する。種々の異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングと発現のための系は公知である。適当な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、及びバキュロウイルス系、及びトランスジェニック植物と動物がある。異種ポリペプチドの発現のために当該分野で利用できる哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎細胞、NS0マウス黒色腫細胞、YB2/0ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎細胞、ヒト胚網膜細胞、及び他の多くの細胞がある。一般的な好適な細菌宿主は大腸菌である。原核細胞中の抗体及び抗体断片の発現は、当該分野で確立されている。総説については、PluckthunABioTechnology9545551を参照されたい。培養真核細胞中の発現もまた、特異的結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に公知である。例えばChaddHEとChamowSM110CurrentOpinioninBiotechnology12188194AndersenDCとKrummenLCurrentOpinioninBiotechnology13117LarrickJWとThomasDWCurrentOpinioninBiotechnology12411418を参照のこと。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び適宜他の配列を含む適切な制御配列を含む適当なベクターを選択し構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、例えば適切なものとしてファージ、又はファジミドでもよい。さらなる詳細については、例えば分子クローニング:実験室マニュアル、第3版、SambrookとRussell2001コールドスプリングハーバーラボラトリープレスを参照されたい。核酸の操作のための多くの公知の技術及びプロトコールは、分子生物学の現代のプロトコール、第2版、Ausubelら編、ジョンワイリーアンドサンズ、1988、分子生物学の簡単なプロトコール:分子生物学の現代のプロトコールからの方法の概要、Ausubelら編、ジョンワイリーアンドサンズ、第4版、1999に詳述されている。SambrookらとAusubelらの開示内容は、本明細書中に援用される。すなわち本発明のさらなる態様は、本明細書に開示の核酸を含有する宿主細胞を提供する。かかる宿主細胞はインビトロでも培養細胞でもよい。かかる宿主細胞はインビボでもよい。宿主細胞のインビボの存在は、本発明の特異的結合メンバーのイントラボディ又は細胞内抗体としての細胞内発現を可能にする。イントラボディは、遺伝子治療で使用される112。さらに別の態様は、かかる核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は任意の利用可能な方法を使用してもよい。真核細胞については適当な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン、電気穿孔法、リポソーム介在トランスフェクション、及びレトロウイルス若しくは他のウイルスを使用する導入がある。宿主細胞、特に真核細胞への核酸の導入は、ウイルス又はプラスミドベースの系を使用する。プラスミド系はエピソームで維持されるか、又は宿主細胞中に若しくは人工的染色体に取り込まれる110111。取り込みは、単一又は複数の遺伝子座での1つ以上のコピーのランダム又は標的化組み込みである。細菌細胞については適当な技術には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションがある。導入の後に、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を含有することにより、核酸からの発現を引き起こすか又はこれを可能にする。ある実施態様において本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。組み込みは、標準的技術に従ってゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより促進される。本発明はまた、上記の特異的結合メンバー又はポリペプチドを発現するために、発現系で上記の構築体を使用することを含む方法を提供する。本発明の態様及び実施態様を、以下の実験を参照して例示する。実施例1抗IL13scFvの単離scFv抗体レパートリー20人のドナーの脾臓リンパ球から得られ、ファジミドベクターにクローン化した大きな1本鎖Fvヒト抗体ライブラリーを、選択に使用した66。scFvの選択基本的に67に記載されるとおりに、組換え細菌由来のヒト又はネズミIL13についての一連の繰り返し選択サイクルによりファージディスプレイライブラリーからIL13を認識するscFvを単離した。簡単に説明すると、ライブラリーを用いてインキュベーション後、常磁性ビーズにあらかじめ結合させた固定化抗原と結合ファージとを磁性分離により回収し、非結合ファージを洗い流した。次に結合ファージをVaughanら67が記載したように回収し、選択プロセスを繰り返した。異なる固体表面及び捕捉法を、異なるラウンドの選択で使用して非特異結合を低下させた。抗原をビーズM270カルボン酸に共有結合させたか、又は製造業者のプロトコールに従ってビオチン化により修飾し、その後ストレプトアビジン被覆ビーズM280により2次捕捉した。Vaughanら67とOsbournら70が記載したように、選択ラウンドの出力からのクローンの代表的な一部をDNA配列決定した。IL13依存性細胞増殖アッセイにおいて、IL13を精製scFv調製物として中和する能力について、固有クローンを評価した。リボソームディスプレイライブラリーを作成し、基本的にHanesら113に記載されるとおりに、組換え細菌由来のヒト又はネズミIL13を特異的に認識するscFvについてスクリーニングした。まず初期選択からのBAK278D6リードクローンをリボソームディスプレイフォーマットに変換し、この鋳型をグリコシル化ライブラリー作成のための使用した。DNAレベルでは、mRNAへの効率的な転写のために5’末端にT7プロモーターを付加した。mRNAレベルでは、構築体は原核細胞リボゾーム結合部位を含有した。1本鎖の3’末端で停止コドンを除去し、gIIIの部分を、スペーサーとして作用するように付加した113。抗体相補性決定領域の突然変異誘発によりリボソームディスプレイライブラリーを作成し、ここでPCR反応は非プルーフリーディングTaqポリメラーゼを用いて行った。親和性ベースの選択を行い、ライブラリーとインキュベーション後、ビオチン化ヒトIL13をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズM280により捕捉し、結合した3成分複合体を磁性分離により回収し、結合しない複合体を洗い流した。結合性scFvをコードするmRNAを、Hanesら113が記載したようにRTPCRにより回収し、選択する間に存在するビオチン化ヒトIL13の低い濃度を用いて選択プロセスを繰り返した。誤りが出やすいPCRはまた、ライブラリーサイズをさらに拡大するために使用した。選択操作において、3種の間違い頻度のプロトコールに記載のように、標準的PCR反応後に1000bp毎に2.0、3.5、及び7.2の変異を使用した。最初の誤りを起こしやすいPCR反応を、100nMで開始される第1ラウンドの選択の前に行った。誤りを起こしやすいPCRの以後のラウンドは、10nMのビオチン化ヒトIL13で第3ラウンドの選択前に行った。上記したように、選択ラウンドの出力からのクローンの代表的な一部を、Vaughanら67とOsbournら70が記載したようにDNA配列決定にかけた。IL13依存性細胞増殖アッセイにおいて、IL13を精製scFv調製物として中和する能力について、固有クローンを評価した。実施例2IL13依存性TF1細胞増殖アッセイにおける抗IL13scFvの中和力価ヒト及びネズミIL13生物活性に対する精製scFv調製物の中和力価を、TF1細胞増殖アッセイを使用して評価した。精製scFv調製物は、WO01/66754の実施例3に記載のように調製した。精製scFv調製物のタンパク質濃度は、BCA法を使用して測定した。TF1は、赤白血病患者から樹立したヒト前骨髄性細胞株である68。TF1細胞株は生存と増殖について因子依存性である。この点でTF1細胞はヒト又はネズミIL13に応答し69、ヒトGMCSFを含有する培地中で維持された。IL13依存性増殖の阻害は、分裂細胞の新たに合成されたDNA中へのトリチウム化チミジンの取り込みの低下を測定することにより決定された。TF1細胞アッセイプロトコールTF1細胞を、アールアンドディーシステムズから得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、5胎児牛血清と1ピルビン酸ナトリウムとを含有するグルタマックスIを有するRPMI1640を含んだ。各アッセイの前に、300×gで5分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞をアッセイ培地に再懸濁した。この操作を、1mlのアッセイ培地中105細胞の最終濃度で再懸濁された細胞を用いて2回繰り返した。抗体の試験溶液をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL13に無関係の抗体を陰性対照として使用した。組換細菌由来のヒト又はネズミIL13を、96ウェルアッセイプレート中で100μl/ウェルの総量中の適切な試験抗体と混合した時50ng/mlの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用したIL13の濃度を、最終アッセイ濃度で約80の最大増殖応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で30分間インキュベートした。次に100μlの再懸濁細胞を各アッセイ点に加えて、総アッセイ容量200μl/ウェルを得た。アッセイプレートを37°Cで5CO2下で72時間インキュベートした。次に25μlのトリチウム化チミジンを各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに4時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート上で採取した。パッカードトップカウントマイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズムソフトウェアを使用してデータを解析した。結果ヒトとネズミ抗原との交互の選択サイクルにもかかわらず、交差反応性の中和抗体は得られなかった。選択により、2つの明確な抗ヒト及び1つの抗ネズミIL13中和scFvが得られた。BAK278D6とBAK167A11はヒトIL13を認識し、BAK209B11はネズミIL13を認識した。scFvとしてのBAK278D6とBAK167A11は、それぞれ44nMと111nMのIC50で、25ng/mlヒトIL13を中和した。scFvとしてのBAK209B11は、185nMのIC50で25ng/mlネズミIL13を中和した。実施例3IL13依存性TF1細胞増殖アッセイにおける親クローンの重鎖CDR3の標的化最適化からのリードクローンの中和力価Osbournら70は、重鎖CDR3中の残基の標的化突然変異誘発が、抗体の親和性を顕著に改善することを証明した。scFvレパートリーについて選択は実施例1に記載のように行い、ここでBAK278D6とBAK167A11の重鎖CDR3内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例2に記載のようにDNA配列決定とTF1細胞増殖アッセイにおけるscFvとして測定した中和力価により同定した。結果両方の系統で力価の大きな上昇が達成された。BAK167A11系統からの最も高力価のクローンはBAK615E3、BAK612B5、及びBAK582F7であり、これらはTF1細胞増殖アッセイにおいて25ng/mlのヒトIL13に対して、scFvとしてそれぞれ3nM、6.6nM、6.65nMのIC50を有した。BAK278D6系統では、最も高力価のクローンはBAK502G9であり、これはTF1細胞増殖アッセイにおいてscFvとして25ng/mlのヒトIL13に対して8nMのIC50を有した。実施例4TF1因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息と関連する非ヒト霊長類IL13とIL13変種に対するBAK167A11とBAK278D6系統の中和力価BAK167A11とBAK278D6ヒトIL13中和系統のいずれも、ネズミ交差反応性はなかった。従って本発明者は、さらなる最適化と臨床的進展のために選択した系統について以下の基準を決定した:好ましくは非ヒト霊長類IL13と交差反応性であること、IL13の変種を認識すること。この変種は、遺伝的に喘息と他のアレルギー性疾患に関連している37384171。交差反応性は、表面プラズモン共鳴分析により、精製scFv調製物が非ヒト霊長類IL13とIL13変種とに結合する能力により測定した。機能活性は、TF1細胞増殖アッセイを使用して測定した。野生型、変種、及び非ヒト霊長類IL13の産生野生型ヒトIL13のcDNAをインビトロゲンから得て、部位特異的突然変異誘発クイックチェンジキットにより修飾して、変種IL13をコードするcDNAを得た。アカゲザルとカニクイザルIL13のコード配列を、ヒトIL13配列に基づく縮重プライマーを使用してゲノムDNA鋳型のPCRにより得た。非ヒト霊長類配列は互いに同じであるが、ヒトIL13とは7つのアミノ酸が異なった。次に、バキュロウイルス発現系を使用して、組換え野生型、変種、及び非ヒト霊長類IL13を発現させた。発現構築体は、発現されたタンパク質にカルボキシル末端親和性タグを付与し、これは昆虫細胞調整培地からほぼ均一になるまで精製することを可能にした。ビアコアを使用する定性的結合アッセイ非ヒト霊長類、変種及び野生型IL13に対する精製scFv調製物の結合親和性を、Karlssonら72が記載したようにビアコア2000バイオセンサーを使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約200Ruの表面密度で、アミンカップリングキットを使用してIL13をCM5センサーチップに結合させ、そして試験scFvの3の濃度約350nM、175nM、及び88nMを含むHHB緩衝液をセンサーチプ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをビーアイエー評価3.1ソフトウェアを使用して評価して、相対結合データを得た。TF1アッセイプロトコールこのアッセイは以下の修飾を加えて基本的に実施例2に記載されたように行った:非ヒト霊長類IL13、ヒト変種IL13、及び野生型ヒトIL13を、それぞれ50ng/ml、25ng/ml、及び25ng/mlの濃度で使用した。結果ビアコア結合アッセイデータは、BAK167A11系統ではなくBAK278D6が、さらなる治療薬開発に必要な交差反応性プロフィールを有することを示唆した。この知見は、BAK278D6とBAK502G9がTF1細胞増殖アッセイでほぼ同等の力価でヒトIL13、ヒトIL13変種、及び非ヒト霊長類IL13を中和できることを示すバイオアッセイデータにより支持された。これに対して、BAK615E3は、TF1細胞増殖アッセイにおいて、その親BAK167A11に対するヒトIL13に対して有意に高い力価を有したが、いずれのクローンもビアコア結合アッセイで非ヒト霊長類又は変種IL13に結合しなかった。BAK278D6とBAK502G9のフレームワーク領域の生殖細胞系列化得られたBAK278D6VHとVLのアミノ酸配列を、VBASEデータ73中の既知のヒト生殖細胞系列の配列と配列比較し、配列類似性により最も近い生殖細胞系列を同定した。BAK278D6のVHドメイン及びその誘導体に最も近い生殖細胞系列は、VH1ファミリーメンバーであるDP14として同定された。BAK278D6VHは、DP14生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で、9つの変化を有する。BAK278D6のVLの最も近い生殖細胞系列は、Vλ33hとして同定された。BAK278D6VLドメインは、生殖細胞系列に対してフレームワーク領域内で5つの変化を有する。BAK278D6とその誘導体のフレームワーク領域を部位特異的突然変異誘発クイックチェンジキットにより生殖細胞系列に戻して、未変性のヒト抗体と完全に一致させた。実施例5ヒトIL13依存性TF1細胞増殖アッセイにおけるBAK502G9の重鎖CDR1と重鎖CDR2配列の標的化最適化からのリードクローンの中和力価BAK502G9配列を使用して鋳型として生殖細胞系列化フレームワーク領域を用いて、第2相の最適化を行った。選択は基本的に実施例1に記載のように行い、ここでBAK502G9の重鎖CDR1又は重鎖CDR2内の残基は突然変異誘発によりランダム化してあった。選択出力からの固有クローンを、実施例2に記載のようにDNA配列決定とTF1細胞増殖アッセイにおいて精製scFv調製物として測定した中和力価により同定した。Persicらが記載した方法を若干改変して、全ヒトIgG4抗体としての再発現を可能にするために、最も高力価のscFvクローンにベクターを構築した。ベクター中にoriP断片を含めて、HEKEBNA293細胞との使用を容易にし、エピソーム複製を可能にした。VH可変ドメインを、発現ベクターpEU8.1の分泌リーダー配列とヒトガンマ4定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローニングした。VL可変ドメインを、発現ベクターpEU4.1の分泌リーダー配列とヒトラムダ定常ドメインとの間のポリリンカー中にクローン化した。プロテインA親和性クロマトグラフィーにより、重鎖と軽鎖とを発現する構築体を用いてコトランスフェクトしたEBNA293細胞からの調整培地から、全抗体を精製した。精製した抗体分画を無菌ろ過し、4°Cでリン酸緩衝化生理食塩水中に保存し、その後評価した。タンパク質濃度は、BCA法を使用して280nmの吸光度を測定することにより測定した。実施例2に記載のTF1増殖アッセイにおいて、再フォーマット化ヒトIgG4全抗体を市販の抗ヒトIL13抗体と比較した。結果図5に示すように、市販の抗体BB13は、ヒトIL13に対して市販のJES105A2より有意に高力価であることが示された。BAK502G9由来の8つのクローン、すなわちBAK1111D10、BAK1166G02、BAK1167F02、BAK1167F04、BAK1183H4、BAK1184C8、BAK1185E1、BAK1185F8は、scFvとして市販の抗体に対して改善された力価を示した。これらの改善は、全抗体ヒトIgG4に変換された際に維持された。これらのVH及びVLドメインは、それぞれ及びこれらの請求項に係る物の各ペアにおいて、本発明の態様又は実施態様を表し、それは、これらの1以上を含むIL13に対する特異的結合メンバー、BAK502G9系統クローンからの1つ以上のCDRを含む特異的結合メンバー、好ましくはBAK502G9系統のHCDRセットを含むVHドメイン、及び/又はBAK502G9系統のLCDRセットを含むVLドメインと同様である。これらは、本明細書に開示のように本発明の任意のかつすべての態様で使用されうる。全抗体としてのBAK502G9の誘導体は、244pM~283pMの範囲のIC50を有した。全抗体IgG4としてのBAK502G9は、384pMのIC50を有した。要約すると、BAK502G9の重鎖CDR1又はCDR2を標的化することにより、力価の大きな改善が得られるであろう。ANOVA後にダネット後検定解析ソフトウェアにより、BB13に対する統計的比較を行った。さらなる特徴解析BAK278D6系統由来の選択された抗ヒト抗体をさらに特徴解析して、その特異性を測定した。これらには、BAK502G9とその誘導体であるBAK1167F2及びBAK1183H4があり、これらは、BAK502G9のそれぞれ重鎖CDR1と重鎖CDR2に対する修飾を有するクローンの代表例である。実施例6TF1因子依存性細胞増殖アッセイにおける喘息に関連する非ヒト霊長類IL13とIL13変種に対するBAK502G9の重鎖CDR1と重鎖CDR2の標的化最適化からのリードクローンの中和力価抗ヒトIL13抗体の交差反応性を、実施例4に記載のように非ヒト霊長類IL13及びIL13変種介在TF1細胞増殖を阻害する能力により測定した。結果最適化した抗ヒトIL13抗体BAK1167F2とBAK1183H4は、その親BAK502G9の特異性を維持した。野生型IL13に対する力価の上昇は、実質的に同等の力価で非ヒト霊長類IL13及びIL13変種を中和する能力に反映された。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL13に対するBAK502G9のIC50は、それぞれ1.4nM、1.9nM、及び2.0nMであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL13に対するBAK1167F2のIC50は、それぞれ1.0nM、1.1nM、及び1.3nMであった。ヒト、ヒト変種、及び非ヒト霊長類IL13に対するBAK1183H4のIC50は、それぞれ0.9nM、1.0nM、及び1.6nMであった。これらのクローンは治療的用途に適していた。実施例7HDLM2細胞増殖アッセイにおける未変性のヒトIL13に対するリード抗ヒトIL13抗体の中和力価ヒトIL13配列は4つのNグリコシル化部位候補を有する。本発明者は、細菌又はバキュロウイルス発現系で発現される組換えIL13を中和するBAK278D6とその誘導体の能力を証明した。哺乳動物系で知られている多くのプロセシングイベントは昆虫でも起きる証拠があるが、タンパク質グリコシル化、特にNグリコシル化において大きな差がある74。本発明者は、BAK278D6誘導体がヒト細胞から放出された未変性のIL13を中和する能力を調べた。Drexlerら75は、HDLM2細胞をホジキン病患者から単離した。Skinniderら76は、HDLM2細胞増殖が一部はIL13の自己分泌及びパラ分泌性放出に依存性であることを証明した。リード抗ヒトIL13抗体を、未変性のIL13の放出により仲介されるHDLM2細胞増殖を阻害する能力について評価した。HDLM2細胞アッセイプロトコールHDLM2細胞をドイツ微生物と細胞培養物保管施設から得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地は、20胎児牛血清を含有するグルタマックスIを有するRPMI1640で構成された。各アッセイの前に、細胞を300×gで5分間遠心分離してペレット化し、培地を吸引して除去し、細胞を新鮮な培地に再懸濁した。この操作を3回繰り返し、細胞を最終的に1mlのアッセイ培地中2×105細胞の最終濃度で再懸濁した。50μlの再懸濁細胞を96ウェルアッセイプレートの各アッセイ点に加えた。抗体の試験溶液をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL13に反応しない無関係のアアイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。ウェル当たり総量50μlの適切な試験抗体を細胞に加え、各アッセイ点は総アッセイ容量100μl/ウェルを与えた。アッセイプレートを37°Cで5CO2下で72時間インキュベートした。次に25μlのトリチウム化チミジンを各アッセイ点に加え、アッセイプレートをインキュベーター中にさらに4時間戻した。セルハーベスターを使用して細胞をグラスファイバーフィルタープレート上で採取した。パッカードトップカウントマイクロタイタープレート液体シンチレーションカウンターを使用して、チミジン取り込みを測定した。グラフパッドプリズムソフトウェアを使用してデータを解析した。結果図7に示すように、BAK502G9、及びその誘導体であるBAK1183H4とBAK1167F2は、他のバイオアッセイで観察されたものと同様の相対的力価で、細胞増殖の用量依存性阻害を引き起こすことができた。ヒトIgG4としてのBAK502G9、BAK1183H4、BAK1167F2のIC50は、それぞれ4.6nM、3.5nM、及び1.1nMであった。市販の抗体JES105A2とBB13のIC50は、それぞれ10.7nMと16.7nMであった。実施例8疾患関連初代細胞におけるIL13依存性応答に対するリード抗ヒトIL13抗体の中和力価初代細胞及び気道疾患により関連のある読み出し情報を使用して、2次バイオアッセイを行った。これらは、正常ヒト肺繊維芽細胞からのエオタキシン放出、ヒト臍帯静脈内皮細胞の表面上における血管細胞接着分子1の上方制御であった。両方のIL13依存性応答が、喘息症状の特徴である好酸球のリクルート92に寄与した。NHLFアッセイプロトコールIL13は、肺繊維芽細胞からエオタキシン放出を引き起こすことが示されている777879。NHLFからの因子依存性エオタキシン放出をELISAにより測定した。NHLFはバイオウィッタカーから得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地はFGM2であった。抗体の試験溶液をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL13に反応しない無関係の抗体を陰性対照として使用した。次に、組換え細菌由来のヒトIL13を、200μlの総量中の適切な試験抗体と混合した際に10ng/mlの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用されるIL13の濃度を、約80の最大応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で30分間インキュベートした。次に96ウェルアッセイプレート中でウェル当たり1×104細胞の密度であらかじめ撒いておいたNHLFにアッセイ試料を加えた。アッセイプレートを37°Cで5CO2下で16~24時間インキュベートした。アッセイプレートを300×gで5分間遠心分離して、剥がれた細胞をペレット化した。上清中のエオタキシンレベルを、製造業者により提供された試薬と方法とを使用して、ELISAを用いて測定した。グラフパッドプリズムソフトウェアを使用してデータを解析した。結果BAK278D6系統クローンは、NHLFからのIL13依存性エオタキシン放出を阻害することができた。相対的力価は、TF1細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった。BAK502G9、BAK1183H4、BAK1167F2は、10ng/mlのヒトIL13に対してIC50がそれぞれ207pM、118pM、及び69pMであった。市販の抗体であるJES105A2とBB13はIC50がそれぞれ623pMと219pMであった。HUVECアッセイプロトコールIL13は、HUVECの細胞表面上のVCAM1の発現を上昇させることが証明されている8081。因子依存性VCAM1発現を、時間分解蛍光読み出しを使用してVCAM1受容体細胞発現のアップレギュレーションの検出により測定した。HUVECをバイオウィッタカーから得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイ培地はEGM2であった。抗体の試験溶液をアッセイ培地で所望の濃度まで希釈した。IL13に反応しない無関係の抗体を陰性対照として使用した。次に、組換え細菌由来のヒトIL13を、200μlの総量中の適切な試験抗体と混合した際に10ng/mlの最終濃度になるように加えた。このアッセイで使用したIL13の濃度を、約80の最大応答を与えた用量として選択した。すべての試料を室温で30分間インキュベートした。次に96ウェルアッセイプレート中でウェル当たり4×104細胞の密度であらかじめ撒いてあったHUVECにアッセイ試料を加えた。アッセイプレートを37°Cで5CO2下で16~20時間インキュベートした。次にアッセイ培地を吸引して除去し、ブロッキング溶液ミルク粉末を含有するPBSで置換した。アッセイプレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルをPBSTTweenで3回洗浄後、100μl中に1:500希釈のビオチン化抗VCAM1抗体を各ウェルに加えた。アッセイプレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルをデルフィア洗浄緩衝液で3回洗浄後、100μlのユーロピウム標識ストレプトアビジン又は抗ネズミIgG1洗浄緩衝液で1:1000希釈を各ウェルに加えた。次にアッセイプレートを室温で1時間インキュベートした。ウェルをデルフィア洗浄緩衝液で7回洗浄した。最後に100μlの増強溶液を各ウェルに加え、ワラック1420ビクター2プレートリーダーを使用して、蛍光強度を測定した。グラフパッドプリズムソフトウェアを使用してデータを解析した。結果BAK502G9、BAK1183H4、BAK1167F2の全抗体ヒトIgG4としての典型的なデータを図9に示す。相対的力価はTF1細胞増殖アッセイで観察されたものと同様であった。BAK502G9、BAK1183H4、及びBAK1167F2のIC50は、10ng/mlのヒトIL13に対してそれぞれ235pM、58pM、及び55pMであった。実施例9IL1βとIL4依存性VCAM1アップレギュレーションに対する抗IL13抗体の中和力価BAK278D6系統のクローンの特異性をHUVECバイオアッセイを修飾して評価した。IL13とともにIL4とIL1βの両方が、HUVECの細胞表面上のVCAM1の発現をアップレギュレートすることが証明されている8081。HUVECアッセイプロトコールアッセイは、以下の変更を加えて基本的に実施例5に記載したように行った。ヒトIL13の代わりに組換えヒトIL1βとIL4をそれぞれ0.5ng/mlと1ng/mlで使用し、最大応答の約80を与える用量であった。結果BAK278D6系統からの評価したクローンのいずれも、ヒトIL1βとIL4に応答してVCAM1アップレギュレーションを中和せず、従ってIL13に対する特異性を示さなかった。IL4はIL13と最も密接に関連し、アミノ酸レベルで30の配列同一性を共有する82。実施例10ネズミIL13依存性ネズミB9細胞増殖アッセイにおけるヒトIgG4としてのBAK209B11の中和力価実施例1に記載したようにscFvとして抗ネズミIL13中和クローンとして同定されたBAK209B11を、実施例5に記載したように全抗体ヒトIgG4として再フォーマット化し、その力価をネズミIL13依存性B9細胞増殖アッセイにおいて評価した。B9はネズミB細胞ハイブリドーマ細胞株である83。B9は生存と増殖について因子依存性である。この点でB9細胞はネズミIL13に応答し、ヒトIL6を含有する培地中で維持される。ネズミIL13依存性増殖の阻害を、分裂細胞の新たに合成されたDNAへのトリチウム化チミジンの取り込みの低下を測定することにより測定した。B9細胞アッセイプロトコールB9細胞は、動物細胞培養物のヨーロッパコレクションから得て、提供されたプロトコールに従って維持した。アッセイは以下の変更を加えて基本的に実施例2でTF1アッセイについて記載したように行った。アッセイ培地は、5胎児牛血清と50μM2メルカプトエタノールとを含有するグルタマックスIを含むRPMI1640で構成された。組換え細菌由来のネズミIL13は、ヒトIL13を最終濃度1ng/mlで置換した。結果ヒトIgG4としてのBAK209B11は、B9アッセイにおいて1ng/mlのネズミIL13を776pMのIC50で中和した。従ってBAK209B11は、疾患のネズミモデルにおいてIL13の役割を研究するための有用な手段である。これは明らかに実施例12で証明され、これは急性肺炎症のネズミモデルでBAK209B11の効力を証明している。実施例11ビアコア分析による抗IL13抗体の親和性測定ヒトIgG4としての、BAK502G9、BAK1167F2、及びBAK1183H4のヒトIL13に対する親和性とBAK209B11のネズミIL13に対する親和性を、基本的に72に記載のようにビアコア2000バイオセンサーを使用する表面プラズモン共鳴測定により測定した。簡単に説明すると、約500Ruの表面密度で、アミン結合キットビアコアを使用して、抗体をセンサーチップに結合させ、そしてHB緩衝液中にIL13を連続希釈50nM~0.78nMした液を、センサーチップ表面を通過させた。得られたセンサーグラムをBIA評価3.1ソフトウェアを使用して評価して、動力学データを得た。結果BAK502G9、BAK1167F2、及びBAK1183H4のIgG4は、それぞれ178pM、136pM及び81pMのKdの高親和性でヒトIL13に結合し、細胞に基づいたアッセイにおける相対効力に一致した。BAK209B11はネズミIL13に5.1nMの親和性で結合した。実施例12急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルにおけるBAK209B11の効力急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルBAK209B11VH配列番号25;VL配列番号26、つまり抗ネズミIL-13中和ヒトIgG4抗体の効力は、急性アレルギー性肺炎において調べられた。このモデルは、基本的にRiffoVasquezら84に記載されたように行い、その終点において、気管支肺胞洗浄液IL13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールメスのBalb/cマウス、英国を抗ネズミIL13抗体BAK209B11又はアアイソタイプ一致対照抗体で処理した。0日と7日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒を含有する生理食塩水中の10μgのオボアルブミンの腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。14、15、及び16日目にマウスにオボアルブミンで抗原刺激した。オボアルブミンは、滅菌生理食塩水中に1に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、1時間の間隔で分わけた20分間の一連の3回の暴露でデビルビスウルトラネブ2000ネブライザーを使用してエアゾル化した。BAK209B11又は無関係のヒトIgG4を、最初の抗原刺激の1日前と以後の各抗原刺激の2時間前に静脈内投与した。このモデルは、17日目に最後の抗原刺激の24時間後に終了した。血液とBALを採取した。総IgEについて血清を測定した。3回一定量の生理食塩水を注射することによりBALを得て試料をプールした。BAL細胞から総白血球と白血球百分率を得た。結果感作マウスのオボアルブミン抗原刺激は、非感作であるが抗原刺激した動物よりも、総BAL細胞動員の有意な上昇を引き起こした。当該リクルートはBAK209B11により用量依存性に阻害された;有意な阻害は、36μg以上のBAK209B11で見られたが、対照抗体ではみられなかった。同様の作用が好酸球と好中球についてみられ、BAK209B11の最小用量36μgで細胞流入の有意な阻害が見られた。この阻害は対照抗体では見られなかった。リンパ球は抗原刺激された際に、感作マウスでは誘導されたが、非感作マウスでは誘導されなかった。この誘導はBAK209B11により用量依存性に阻害され、36μgのBAK209B11により最大の阻害が見られた。対照抗体は何の作用もなかった。非感作動物と比較した時、感作動物では単球/マクロファージは誘導されなかったが、バックグランドレベルは36μg以上のBAK209B11により抑制され、対照抗体では抑制されなかった。血清IgEレベルは、抗原刺激後の非感作動物と比較すると感作動物では有意に上昇した。この上昇は、36μgのBAK209B11を用いる処理後に低下したが、対照抗体によっては低下しなかった。要約するとネズミIL13中和抗体であるBAK209B11の全身性投与は、炎症性細胞流入を阻害し、アレルギー性炎症のネズミモデルでオボアルブミンによる感作と以後の抗原刺激により引き起こされる血清IgEレベルのアップレギュレーションを阻害した。実施例13~20は予測である。実施例13急性肺炎症のロイドネズミモデルにおけるBAK209B11の効力急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルネズミIL13中和抗体であるBAK209B11の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第2のネズミモデルで研究した。このモデルは、基本的にMcMillanら85が記載したように行い、その終点でBAL及び肺組織IL13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールメスのBalb/Cマウスに種々の用量の抗ネズミIL13抗体BAK209B11又はアイソタイプ一致対照抗体を以下のように投与した。0日と12日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒3を含有する生理食塩水中10μgのオボアルブミンの腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。19、20、21、22、23、及び24日目にマウスにオボアルブミンを20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザーを使用してエアゾル化した。18、19、20、21、22、23、及び24日目にマウスに種々の腹腔内用量の抗ネズミIL13抗体であるBAK209B11muIgG1又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。0日と25日目にメタコリン抗原刺激を増加し、意識下体積変動を追跡して、気道機能を評価した。個々のマウスについて0日と25日目にメタコリン用量応答曲線の4パラメータ非固定カーブフィッティングから、PC50を推定した。このモデルは、25日目に最後の抗原刺激の24時間後に終了した。血液、血清、BAL、及び肺組織を採取した。結果0日と25日に個々の動物の肺機能を評価し、PC50値を計算して定量した。個々の気道過剰応答を、25日目のlogPC50の0日からの変化により測定した。このlogPC50の変化量は試験の1次終点であった;PC50データは終点ANOVAの必要性のためにlog変換した。個々の変化を群内で平均して、群平均のlogPC50の変化量を得た。感作マウスのオボアルブミン抗原刺激は、非感作の抗原刺激マウスと比較して有意なAHRを引き起こした。BAK209B11はAHRの明確で用量依存性の低下を引き起こしたが、対照抗体は何の作用も無かった。実施例14急性肺炎症のゲラードネズミモデルにおけるBAK209B11の効力急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル抗ネズミIL13中和ヒトIgG4抗体であるBAK209B11の効果を、急性アレルギー性肺炎症の第3のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にHumblesら86が記載したように行い、その終点でBAL及び肺組織IL13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールメスのBalb/Cマウスに種々の用量の抗ネズミIL13抗体BAK209B11又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。0、7、及び14日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒3を含有する生理食塩水中10μgのオボアルブミンの腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。21、22、23、及び24日目にマウスにオボアルブミンを20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5に希釈した後、噴霧した。すべての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザーを使用してエアゾル化した。このモデルは、25日目に抗原刺激の24時間後に終了した。血液、血清、BAL、及び肺組織を採取した。実施例15肺炎症のロイド慢性モデルにおけるBAK209B11の効力慢性アレルギー性肺炎症のネズミモデル抗ネズミIL13中和ヒトIgG4抗体であるBAK209B11の効果を、慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら87が記載したように行い、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールメスのBalb/Cマウスに種々の用量の抗ネズミIL13抗体BAK209B11又はアイソタイプ一致対照抗体を投与した。0、及び11日目に各群のマウスを、0.2mlの溶媒3を含有する生理食塩水中10μgのオボアルブミンの腹腔内注射により感作した。別の対照群の非感作マウスには、等量の溶媒を投与した。18、19、20、21、22、23、28、30、32、35、37、39、42、44、46、49、及び51日目にマウスをオボアルブミンで20分間抗原刺激した。オボアルブミンは、生理食塩水中に5に希釈した後、噴霧した。全ての吸入抗原刺激物は、プレキシグラス暴露チャンバー中で投与した。Ovaを、デビルビスウルトラネブ2000ネブライザーを使用してエアゾル化した。このモデルは、52日目に抗原刺激の24時間後に終了した。血液、血清、BAL、及び肺組織を採取した。実施例16ネズミ空気嚢airpouchモデルに投与した外来性ヒトIL13に対する抗ヒトIL13抗体の効力ヒトIL13の炎症促進作用に対する抗ヒトIL13抗体の効果を、基本的なネズミモデルで調べた。このモデルは基本的にEdwardsら93が記載したように行い、その終点で空気嚢への細胞浸潤により解析した。モデルプロトコール0日目に2.5mlの無菌空気を皮下注射して、メスのBalb/cマウスの背中に空気嚢を作成した。3日目にさらに2.5mlの無菌空気を用いて空気嚢を再度膨らませた。6日目に0.75CMC中の2μgのhuIL13を直接嚢内に注入した。24時間後マウスを屠殺し、空気嚢を1mlのヘパリン化食塩水で洗浄した。抗体処理は、嚢内でhuIL13を用いて又は全身で行った。結果溶媒、腹腔内処理マウスに対して抗原刺激後24時間では、空気嚢に注射したヒトIL13は総白血球と好酸球の浸潤の有意な上昇を引き起こした。局所投与されたBAK502G9は、0.75CMC中2μgのhuIL13により誘導された空気嚢への総白血球と好酸球浸潤とを有意にかつ用量依存性に阻害した。全身性に投与したBAK209B11もまた、0.75CMC中2μgのhuIL13により発生した空気嚢への総白血球と好酸球浸潤とを有意にかつ用量依存性に阻害した。実施例17肺アレルギー性炎症モデルにおける抗ヒトIL13抗体の効力を評価するためのヒトIL13ノックイン/ネズミIL13ノックアウトトランスジェニックマウスの作成本発明者は、遺伝子ターゲティングにより、ネズミではなくヒトIL13を発現するマウスを作成した。マウスIL13遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでヒトIL13遺伝子の関連部分で置換されている。このマウス種は、内因性IL13プロモーターとIL13pAテイルが変化していないため、野生型マウスと同じ刺激に応答してマウスIL13ではなくヒトIL13を発現する。ヒトIL13はマウスIL13受容体に結合しこれを介してシグナル伝達して、マウスIL13受容体に結合するマウスIL13により引き起こされるシグナル伝達と同じ生理学的結果を生成できることが証明されている。例えば外因性ヒトIL13は、ネズミ空気嚢への炎症性細胞のリクルートを引き起こした。これらのトランスジェニック動物は、樹立された疾患のネズミモデルで非ネズミ交差反応性抗ヒトIL13抗体を評価することを可能にする。このマウスは、急性アレルギー性気道炎症モデルや慢性アレルギー性気道炎症モデルで使用されており、アレルギー性気道疾患における抗ヒトIL13抗体の薬理を評価することを可能にする。実施例18急性肺炎症におけるhuIL13トランスジェニックロイドネズミモデルにおける抗ヒトIL13抗体の効力急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル抗ヒトIL13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にMcMillanら85が記載したようにかつ実施例13に記載したように行った。このモデルは、その終点でBAL及び肺組織IL13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールこのモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL13抗体を投与した以外は実施例13と同じである。実施例19急性肺炎症におけるhuIL13トランスジェニックゲラードネズミモデルにおける抗ヒトIL13抗体の効力急性アレルギー性肺炎症のネズミモデル抗ヒトIL13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して急性アレルギー性肺炎症の別のネズミモデルで調べた。このモデルは、基本的にHumblesら86が記載したようにかつ実施例14に記載したように行った。このモデルは、その終点でBAL及び肺組織IL13の上昇、肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールこのモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL13抗体を投与した以外は実施例14と同じである。実施例20肺炎症におけるhuIL13トランスジェニックロイドネズミモデルにおける抗ヒトIL13抗体の効力抗ヒトIL13中和ヒトIgG4抗体の効果を、実施例17で作成したトランスジェニックマウスを使用して慢性アレルギー性肺炎症のモデルで調べた。このモデルは、基本的にTemelkovskiら87が記載したようにかつ実施例15に記載したように行った。このモデルは、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。モデルプロトコールこのモデルのプロトコールは、BAK209B11の代わりに抗ヒトIL13抗体を投与した以外は実施例15と同じである。実施例21アスカリススウムアレルギー性カニクイザルにおける抗ヒトIL13抗体の薬物動態と薬力学502G9の薬物動態と薬力学を、10mg/kgの単回静脈内大量投与後の4匹のアレルギー性であるが非抗原刺激カニクイザル霊長類で評価した。実験は29日間行った。血清薬剤濃度曲線の幾何平均から抗体の薬物動態パラメータを決定し、これを以下の表4に示す。同じ試験で、ヒトIgEELISAキット、米国を使用して血清IgE濃度も追跡した。結果血清IgE濃度はBAK502G9の10mg/kgの単回静脈内大量投与後に、100対照レベルから、投与の4日間後と5日間後に対照値の66±10まで有意に低下した。血清IgE濃度の低下は、22日目までに対照レベルの88±8まで回復した。再度これらのデータは、各動物の血清IgE濃度を投与前レベルに対して標準化し、次に試験した4匹の動物からの曲線を平均して得られた。2匹のオスのサルは比較的低い投与前総血清IgEを有した。これらのIgEレベルは、BAK502G9による治療後の傾向を示唆するようには変化しなかった。2匹のメスのサルは比較的高い投与前総血清IgEを有した。これらのIgEレベルは、BAK502G9による治療後に低下し、7日目に最大60まで低下し、投与後28日目までにほぼ投与前レベルまで回復した。これらのデータはBAK502G9が、IgEの比較的高い循環IgEを有する動物の血清IgE濃度を低下させることを示す。実施例22皮膚アレルギーのカニクイザルモデルにおける抗ヒIL13抗体の効力抗ヒトIL13中和ヒトIgG4抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、ヒトIL13とアスカリススウム抗原とをカニクイザルに皮内注射することにより行った。24~96時間後、皮膚生検試料と血清試料とを取った。このモデルを、その終点で皮膚への細胞浸潤により解析した。実施例23肺アレルギーのカニクイザルモデルにおける抗ヒトIL13抗体の効力抗ヒトIL13中和ヒトIgG4抗体の効果を、急性アレルギー性肺炎症の霊長類モデルで調べた。このモデルは、アスカリススウムアレルギー性カニクイザル霊長類に霧状にしたアスカリススウム抗原を暴露し、こうしてアレルギー反応を生成させることにより行った。このアレルギーは、その終点で肺とBALへの細胞浸潤、血清IgEレベルの上昇、及び気道過剰応答により解析される。さらにフローサイトメトリー法を使用して薬力学をエクスビボで評価した。CD23は高親和性IgE受容体であり、ヒト末梢血の単核細胞上で発現することができる。CD23発現は、CD23を発現する細胞の数と各細胞がどれだけ多くのCD23を発現するかという点で、IL13とIL4の両方により誘導することができる。IL13介在応答は、抗ヒトIL13抗体により阻害されうる。この2相試験に参加させるための動物を、霧状にした抗原抽出物の抗原刺激後のあらかじめ樹立したAHRに基づいて選択した。第I相気道機能は、1日目と11日目に静脈内ヒスタミン抗原刺激中に評価した。PC30の30の上昇を引き起こすのに必要なヒスタミン用量を、各ヒスタミン用量応答曲線から決定した。9日目と10日目に動物に、RLの40上昇と動的コンプライアンスの35の低下を引き起こすことがすでに証明されている霧状にした抗原の個々に調整した用量で抗原刺激した。このモデルでは従来、第1回より第2回のアレルゲン投与より、より大きいRLが観察され、これは抗原プライミングである。2回の抗原刺激は、1日目に比較して11日目にヒスタミン用量応答曲線下の面積の上昇と、PC30、BAL、並びに好酸球の低下により測定されるように、AHRを引き起こした。AHR症状を示す動物を選択して第II相に入れた。第II相は、すべての動物に1日目、5日目、及び9日目に30mg/kgのBAK502G9を注入した以外は、第I相と全く同様に行った。BAK502G9の効果は、個々の動物について第II相で見られた変化を第I相で見られた変化と比較して評価した。血液、血清、BAL、及び肺組織を採取した。血清IgEレベルはELISAにより追跡した。BAK502G9処理したカニクイザルの血清は、IL13により誘導されるヒト末梢血単核細胞上のCD23の発現を阻害することが証明された。この阻害の大きさは、PKELISAにより予測された血清BAK502G9レベルと一致した。結果RLAUCにより測定すると、BAK502G9はAHRを有意に阻害した。PC30により測定するとAHRに対するBAK502G9の阻害作用が観察されたが、統計的有意性には達しなかった。BAK502G9はまた、抗原プライミングとBAL炎症とを有意に阻害した。BAK502G9は、BALへの総細胞と好酸球流入とを有意に阻害したが、マクロファージ、リンパ球又は肥満細胞の流入は阻害しなかった。実施例24ヒトIL13をマウス肺に投与する際に、発症する喘息症状に対する抗ヒトIL13抗体の効力気道過剰応答のネズミモデルマウス肺へのヒトIL13の投与後の気道過剰応答の発症に対する抗ヒトIL13中和抗体BAK502G9の効力を調べた。このモデルは、ネズミIL13の代わりにヒトIL13を使用した以外は基本的にYangら119により記載されたように行った。モデルプロトコール症状を出現させるために、48時間の間隔でオスのBalb/cマウスを2用量のヒトIL13に暴露した。簡単に説明するとマウスを、100μlのサファン溶液の静脈内注射により麻酔した。マウスに22ゲージのカテーテル針を挿管し、ここからヒト組換えIL13に溶解した25μg又は溶媒対照を点滴注入した。IL13の最後の投与の24時間後にメタコリン抗原刺激を上昇させて、意識下プレスチモグラフィーを追跡して、気道機能を評価した。メタコリン用量応答曲線の4パラメータ非固定曲線適合から、PC200を測定した。各IL13投与の24時間前に、腹腔内注射により抗体処理を行った。結果投薬経験の無い野生型マウスへヒトIL13を気管内注入することは、PC200メタコリン濃度により測定すると、対照動物に対して有意な気道過剰応答がもたらされた。全身に投与されたBAK502G9はAHRの出現を有意に阻害し、一方ゼロ対照抗体は何の作用もなかった。実施例25ヒトB細胞からのヒトIL13依存性IgE放出に対するヒトIgG4としてのBAK502G9の中和力価B細胞スイッチングアッセイプロトコールIL13は、インビトロでヒトB細胞中のIgE合成を誘導することが証明されている120。ヒトB細胞からの因子依存性IgE放出をELISAにより測定した。ヒトIgG4としてのBAK502G9の中和力価を、ヒトB細胞からのIL13依存性IgE放出に対して評価した。1.077g/Lの密度勾配遠心分離によりヒトバフィーコートから末梢血単核細胞を精製した。B細胞はB細胞単離キットIIを用いて製造業者が記載する試薬と方法とを使用してPBMCから精製した。アッセイ培地は、10胎児牛血清と20μg/mlヒトトランスフェリンを含むイスコブ改変ダルベッコー培地で構成された。精製後、B細胞をアッセイ培地に最終濃度106/mlで再懸濁した。50μlの再懸濁細胞を96ウェルアッセイプレートの各アッセイ点に加えた。50μlの4μg/ml抗CD40抗体EA5を適宜アッセイウェルに加えた。抗体の試験溶液をアッセイ培地中に所望の濃度に希釈した。IL13と反応しない無関係な抗体を陰性対照として使用した。50μl/ウェルの適切な試験抗体を細胞に加えた。次に、組換え細菌由来のヒトIL13を加えて最終濃度30ng/mlにして総アッセイ容量200μl/ウェルを得た。アッセイで使用したIL13の濃度を最大応答を得るように選択した。アッセイプレートを37°Cで5CO2下で14日間インキュベートした。上清中のIgEレベルを、製造業者、ベチルラボラトリーズが提供する試薬とプロトコールを使用してELISAにより測定した。グラフパッドプリズムソフトウェアを使用してデータを解析した。結果図24に示すように、BAK502G9は、ヒトB細胞によるヒトIL13依存性IgE産生を阻害することができた。ヒトIgG4としてのBAK502G9は、30ng/mlのヒトIL13に対して1.8nMのIC50を有した。実施例26初代ヒト気管支平滑筋細胞におけるヒスタミン誘導Ca2シグナル伝達のIL13介在強化に対するBAK502G9の効力IL13は、気道平滑筋の収縮を直接調節することが示されている121,122。細胞内カルシウム動員は平滑筋収縮の必須要件である。最近の研究は平滑筋収縮性を改変するIL13の能力が、一部は収縮性アゴニスト誘導Ca2シグナル伝達の調節により仲介されることを証明した123,124。収縮性アゴニストであるヒスタミンに対する初代ヒト気管支平滑筋細胞シグナル伝達応答のIL13介在改変に対する、IgG4としてフォーマット化した抗ヒトIL13抗体であるBAK502G9の効力を、Ca2シグナル伝達アッセイで調べた。BSMCCa2シグナル伝達アッセイプロトコールヒト初代BSMC、平滑筋増殖培地2と平滑筋基礎培地をバイオウィッタカーから得た。BSMCは、販売業者の薦めに従ってSmGM2中で維持した。BSMCを96ウェルマイクロタイター細胞培養プレートに2×104細胞/ウェルで撒き、24時間付着させ、次に再供給し、さらに24時間インキュベートした。Ca2シグナル伝達実験の前に、BSMCを最終濃度50ng/mlのIL13で抗体有り又は無しで刺激し、18~24時間インキュベートした。BAK502G9とイソタイプ一致した無関係の対照モノクローナル抗体CAT0001を、最終濃度10μg/mlで評価した。ヒスタミンに応答した細胞にCa2濃度を、Ca2感受性色素Fluo4と96ウェル蛍光イメージングプレートリーダーを用いる標準方法を使用して測定した。ヒスタミンに応答したCa2シグナル伝達応答の曲線下の面積を、各前処理結合体について測定した。グラフパッドプリズムウィンドウズ登録商標用バージョン4GraphPadSoftwareを使用してデータ解析を行った。結果IL13を用いるBSMCのプレインキュベーションは、ヒスタミンに応答したCa2シグナル伝達を有意に増強した。IL13によるBAK502G9のプレインキュベーションはヒスタミンに応答したCa2シグナル伝達の強化を有意に阻害したは阻害しなかった。実施例27ヒトIL13依存性PBMCCD23発現アッセイにおける抗IL13抗体の中和力価代表的IL13抗体の力価をヒトILー13依存性末梢血単核細胞CD23発現アッセイで評価した。CD23の細胞表面発現を上昇させることにより、PBMCはIL13とIL4の両方に反応する120。CD23はIgEについての低親和性受容体であり、種々の炎症性細胞で発現される。ヒトIL13依存性CD23発現アップレギュレーションの阻害を、PBMCへの蛍光標識CD23モノクローナル抗体の結合の低下をフローサイトメトリーにより計測することにより測定した。アッセイプロトコール輸血サービスからヒト血液を得て、40分間のデキストランT500沈降により赤血球を取り除いた。次に白血球と血小板リッチな画分を、3mlの64と5mlの80と1部の10×PBSであるの不連続パーコル勾配上で20分間1137gで遠心することにより分離した。64層の上部からPBMCを採取し、アッセイ緩衝液RPMI1640、10FCS、200IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、2mMLグルタミンに再懸濁した。アッセイは、2×106細胞、±80pM組換えヒトIL13又は21pM組換えヒトIL4、±BAK502G9又は無関係のIgG4を最終容量500mcl中に含有する24ウェルプレート中で行った。細胞を37°Cで48時間培養した後採取し、CD23PEで4°Cで20分間染色した。最後に、細胞をフローサイトメーター上で読んだ。CD23発現を、CD23スコアにより測定した;CD23陽性細胞のパーセントに染色の明るさを掛けた。刺激物質の無いCD23スコアを引き、データをIL13単独に対する応答のパーセントとして示した。データは、4~6人の個々のドナーからの細胞を使用して各点を三重測定で行い、4~6回の異なる実験から得られた平均±SEMとして表した。結果PBMCと80pMのIL13又は21pMのIL4との48時間のインキュベーションにより、明らかにCD23が発現された。BAK502G9は用量依存性にIL13誘導CD23発現を阻害し、幾何平均は120.2pMであった。これに対してBAK502G9は、21.4pMのIL4により誘導されるCD23発現は阻害できなかった。無関係のIgG4は、PBMC上のIL13又はIL4依存性CD23発現を阻害しなかった。80pMのIL13と21.4pMのIL4によるPBMCの同時刺激は、付加的CD23発現を引き起こした。BAK502G9は、CD23発現レベルをIL4刺激単独で見られるレベルまで低下させた。実施例28ヒトIL13依存性好酸球形態変化アッセイにおけるヒトIL13抗体の中和力価本試験の目的は、IL13125126、TNFα127、TGFβ1128のような喘息患者の肺に存在する因子で刺激後に、NHLFから放出されるメディエーターにより誘導される好酸球形態変化に対するIL13抗体の効果を評価することであった。IL13はTNFα129又はTGFβ1130と相乗作用して、エオタキシン1を産生するように繊維芽細胞を誘導し、次にこれは直接好酸球を化学誘引するように作用することができる。白血球形態変化応答は細胞骨格の再配置により仲介され、微小循環から炎症部位への白血球遊走プロセスに必須である。NHLFによるIL13依存性形態変化誘導因子放出の阻害は、ELISAによりエオタキシン1分泌の低下とフローサイトメトリーにより好酸球の形態変化を減少を測定することにより測定した。アッセイプロトコールNHLF細胞を、培地単独又は刺激物質9.6nMのIL13、285.7pMのTNFα及び160pMのTGFβ1を含有する培地とともに、BAK502G9の非存在下又は存在下で同時培養した。次に細胞を37°Cでさらに48時間培養後、得られた調整培地を吸引し、80°Cで保存した。調整培地中のエオタキシン1の濃度は、アールアンドディーシステムズヂュオセットELISA系を使用して評価した。輸血サービスからヒト血液を得て、40分間のデキストランT500沈降により赤血球を枯渇させた。次に白血球と血小板リッチな画分を、3mlの64と5mlの80と1部の10×PBSであるの不連続パーコル勾配上の20分間の1137gの遠心により分離した。64:80界面から顆粒球を採取し、洗浄し、アッセイ緩衝液PBS、1mMCaCl2、1mMMgCl2、10mMヘペス、10mMDグルコース、0.1シグマBSA、pH7.3に再懸濁した。アッセイはFACSチューブ中で5×105細胞、±3nM組換えヒトエオタキシン1又は調整培地を用いて、最終容量400μlで行った。細胞を37°C°Cで8.5分間インキュベート後、4°Cに移し、固定剤、ビーディーバイオサネンスで固定し、最後にフローサイトメーターで読んだ。好酸球をそのFL2自己蛍光により同定し、前進スキャターパラメータを読んだ。好酸球FSCはエオタキシン1と調整培地の両方に応答して変化し、形態変化が測定された。チューブを高流速でサンプリングし、1000の好酸球イベント後又は1分後に採取を停止した。形態変化を、形態変化緩衝液単独により引き起こされたFSCのパーセントとして計算した。データは、4回の異なる実験から得られた平均ブランク形態変化±SEMとして表した。各実験では、個々のバフィーコートからの細胞を使用して各点について二重測定で行った。結果NHLF細胞を9.6nMのIL13、285.7pMのTNFα及び160pMのTGFβ1で同時刺激し48時間培養すると、9.6nMのエオタキシン1を培地中に分泌した。これに対して維持培地のみで培養したNHLF細胞は、培地中に0.1nMのエオタキシン1を分泌したのみである。IL13/TNFα/TGFβ1で同時刺激したNHLF細胞エオタキシン1産生は、BAK502G9によりIC50が32.4nMで用量依存性に阻害されたため、このエオタキシン1産生はIL13依存性であった。本試験のこの部分の主目的は、好酸球形態変化を調べることであった。3nM好酸球に応答した好酸球形態変化の大きさは122.2±2.1であった。エオタキシン1誘導形態変化は、100nMの抗好酸球抗体CAT213により完全に阻害され、平均形態変化は101.0±1.0であった。9.6nMのIL13、285.7pMのTNFα及び160pMのTGFβ1で同時刺激し48時間培養したNHLF細胞から得られた培地は、明らかな好酸球形態変化を誘導した。これに対してNHLF維持培地単独中で48時間培養したNHLFからの培地は好酸球形態変化を誘導しなかった。NHLF培養前の同時刺激培地への抗IL13抗体BAK502G9の添加は好酸球形態変化の用量依存性阻害を引き起こし、幾何平均IC50は1:16希釈で測定すると16.8nMであった。NHLF細胞とともに培養していない刺激物質の、好酸球と好中球形態変化を誘導する能力も調べた。9.6nMのIL13、285.7pMのTNFα及び160pMのTGFβ1は、明らかな好酸球形態変化を誘導しなかった。これは、刺激物質とのNHLF細胞培養の間に発生する調整培地の好酸球形態変化能は、いずれかの刺激物質単独のせいでも又は組合せのせいでもないことを示唆する。実施例29ヒトIL13上の抗IL13抗体のマッピング代表的なIL13抗体BAK502G9のエピトープマッピングを、分子的アプローチと標準的ペプチド切断を使用して行った。分子的アプローチヒトIL13配列の一部がネズミ配列で置換されたIL13キメラを作成した。これらのキメラは、特定のエピトープの同定を助けるために代表的IL13抗体との結合試験で使用した。IL13キメラの2つのパネルを作成した。第1のパネルは9つのキメラを含み、エピトープの全体的位置を捜すために使用した。第2のパネルは10個のキメラを含有し、エピトープを細かくマッピングするために使用した。PCRを使用してキメラIL13配列を組み立て、ゲートウェイエントリーベクター中にクローン化し、次にこれをデスティネーションベクターpDEST8と組換えを行った。これらの発現ベクターを使用して、化学処理によるDH10Bacのコンピテント大腸菌を形質転換して、バキュロウイルスシャトルベクター中へのタグ付きキメラIL13の部位特異的転位を可能にした。組換えバクミドDNAを各IL13キメラについて単離し、セルフェクチン試薬を使用してSf9昆虫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に組換えバキュロウイルスを採取し、Sf9昆虫細胞によりさらに2回継代した。昆虫の2000~500mlの培養上清をアフィニティカラムで精製し、溶出した物質を16mlから1mlに濃縮し、最後の仕上げと緩衝液交換のためにサイズ排除スーパーデックス200HR10/300GLカラムにロードした。ビオチン化ヒトIL13、ストレプトアビジンアントフィオシアネート及びユーロピウム標識BAK502G9を使用する同種競合アッセイを開発した。このアッセイは以下の通りである:EuBAK502G9はビオチン化ヒトIL13に結合し、次に複合体がストレプトアビジンAPC結合体により認識され、閃光が適用されると、エネルギーがAPC標識物から近傍のユーロピウムに転移し、時間分解蛍光を測定することができる。非標識ヒトIL13とキメラ構築体により、この結合の競合が導入される。この競合を定量して、IL13抗体に対するIL13変異体の相対的親和性を計算することにより、結合を変化させる変異を同定することが可能になる。結果BAK502G9への結合について、キメラ構築体IL13へリックスDはビオチン化ヒトIL13に対する最も弱い競合物質であり、IL13分子内のへリックスDがBAK502G9エピトープ結合に関与していることを示す。親配列の残基40、41、及び33、34がそれぞれ変化している40、41と33、34変異体について活性の低下が見られ、BAK502G9の認識におけるヘリックスAの関与の可能性を示している。ループ3はヒト分子と比較してこの変異体中のアミノ酸の数が減少しており、タンパク質の全体構造を変化させる可能性があるため、このループの活性低下は無視した。キメラIL13分子がBAK502G9結合について競合する能力の他の低下は、かかるアミノ酸の変化には重要であると考えられなかった。次にへリックスD中のより標的化された変異のセットを試験した。得られた結果は表6に示し、以下の通りである:結果は、キメラ構築体116117TK、123KA、及び127RAは、少なくともBAK502G9への結合について競合することができることを示す。競合アッセイでの有効性の低下のためにBAK502G9へ結合するとされている他の残基には、へリックスD残基124Qと120121SYがある。58L位のロイシンの変異はまた結合性を低下させ、3D構造の分析はこの残基がヘリックスDに対して集まり、BAK502G9により直接接触されるか又はヘリックスDの整列に影響を与えることを明らかにした。これらの実験は、ヘリックスD内の残基がIL13へのBAK502G9の結合に決定的に重要であることを証明する。特に123位のリジンと127位のアルギニンは、このいずれかの変異がBAK502G9への結合を無くさせるため、この結合にとって決定的に重要である。エピトープ切断またBAK502G9のエピトープマッピングを標準的ペプチド切断法を使用して行った。ここでIgGは固相に固定化され、IL13リガンドを捕捉するようにされる。形成された複合体は次に、特異的タンパク質分解的消化を受け、この間アクセス可能なペプチド結合が切断されるが、IgG:リガンド界面により防御されるものは無傷のままである。すなわちエピトープを含有するペプチドはIgGに結合する。次にこれが脱着され、採取され、質量スペクトルにより同定される。2つの相補的技術が使用され、最初の方法はサイファージェンプロテインチップリーダーMALDITOF質量スペクトル計を使用し、ここではIgGを質量スペクトル計チップに共有結合させることができ、次にインサイチュで消化と抽出を行うことができる。第2の技術は、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合したビオチン化BAK502G9を使用し、これは、タンデム質量スペクトル法により配列確認のための充分なペプチドの採取を可能にした。2つの方法は絶対的な詳細とスケールが異なるが、基本的に同じ段階を含んだ。MALDTOFmsアプローチは、PBS中1~2mg/mlのIgGを4°Cで一晩結合させた遊離の1級アミン基に共有結合するカルボニルジイミダゾールで活性化した専用のmsチップを使用する。次にチップを室温で1時間エタノールアミン溶液でブロックし、次にPBS又はHBS適当な界面活性剤を用いて充分に洗浄した。次に1ピコモルアリコートのIL13をPBS又はHBS中でチップに適用し、化学的に固定化したIgGに室温で2時間結合させた。次に、界面活性剤有り及び無しのPBS又はHBSでさらに洗浄して、非特異的に結合したIL13を除去した。PBS又はHBS中200~3.1μg/mlの範囲のトリプシン溶液をIgG:リガンド複合体に適用し、室温で30分消化を進行させ、次にPBS又はHBS界面活性剤で、PBS又はHBSで、そして最後に水でチップを洗浄した。適当なMALDTOFmsマトリックスを適用後、チップを直接質量スペクトル計に入れて分析した。ビーズベースのアプローチは、NHSビオチン化合物を使用して、IgGのビオチン化で出発した。次に、ゲルろ過を使用して、非結合ビオチンと反応の副産物を除去した。次にビオチン化IgGをニュートラアビジン被覆アガロースビーズに結合させ、ここでIgG捕捉を最大にするようにした。次にIgG被覆ビーズの一定量を濃縮スピンカラムに入れ、ダルベッコーPBS0.05Tween20で洗浄し、次にダルベッコーPBS0.05Tween20に再懸濁した。次にIL13のパルスを再懸濁IgGビーズに適用し、さらに10分結合を進行させ、次に液相を遠心分離して除去し、ビーズをダルベッコーPBS0.05Tween20で洗浄し、次にダルベッコーPBS0.05Teen20に再懸濁した。次にビーズ:IgG:リガンド複合体をトリプシン又はキモトリプシンとともに室温又は37°Cでインキュベートしてタンパク質分解に付した。次にビーズを再度ダルベッコーPBS0.05Tween20で洗浄し、次にさらに界面活性剤の無いダルベッコーPBSで洗浄した。次にビーズを水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸混合物に再懸濁し、上清を回収した。次にこれを、MALDITOFms又は逆相HPLC質量スペクトル断片化により、種々分析した。得られる断片パターンをヒトIL13配列及びBAK502G9IgGの別の重鎖と軽鎖配列に一致するようにした。実験工程の間、多くの対照を使用して、同定されたペプチドがIgG捕捉IL13から特異的に得られたものであり、BAK502G9の生成物又は非特異的に結合したIL13消化の生成物ではないことを証明した。結果この実験シリーズは一貫して、各消化について単一のIL13特異的ペプチドを与えた。LCQイオン捕捉装置からのデータは、トリプシン断片が3258Daのモノアイソトピック質量を有し、キモトリプシン断片が3937Daのモノアイソトピック断片を有することを明らかにした。ヒトIL13の適切なinsilico消化に対するこれらの質量の検索は、分子のC末端部分の関連ペプチドとの密接な一致を与えた。トリプシンペプチド質量の一致:3258Da1000ppmの許容誤差で、3258Daは106位のアスパラギン酸から132位のC末端アスパラギンまでの配列に一致する。この許容誤差では他の一致は無い。この領域を、以下のヒトIL13の前駆体型の配列上で太字で強調する。キモトリプシンペプチド質量の一致:3937Da1000ppmの許容誤差で、3937Daは99位のセリンから132位のC末端アスパラギンまでの配列に一致する。この領域を、以下のヒトIL13の前駆体型の配列上で太字で強調する。これらの一致の両方とも、抗体:リガンド複合体のタンパク質分解の間、BAK502G9IgGがIL13分子のC末端部分を保持することを示す。両方のペプチドの本体は、ms/msによりうまく確認され、いずれもBAK502G9との有意な配列類似物を示さなかった。Y又はBイオンを同定するように調整したms/ms断片地図は、トリプシンペプチドの1電荷状態の104の可能なイオンうちの26に一致し、キモトリプシンペプチドの128の可能なイオンのうちの19に一致した。すべての電荷状態を調べると、トリプシン断片の27アミノ酸残基のうちの23とキモトリプシン断片の33残基のうちの29の同定を示す。これは同一性を確認するのに充分である。全体としての実験配列は、ヒトIL13上のBAK502G9エピトープの一部が、27個のC末端アミノ酸残基内に存在することを同定した。これらの知見は、前記で詳述した分子的アプローチの知見を確証する。第I相でAHRを示す21匹の動物と抗原プライミング症状を有する追加の動物を第II相の試験に進めた。AUCとPC30で測定されたように、必ずしもすべての動物がAHRをもってはいない。第I相でAHRを示し、そのAHRを第I相と第II相で評価した動物のみをAHRの結果に含めた。インスタットを使用して統計的検定を行った。検定は両側スチューデントt検定を、終点は数0を含むという帰無仮説に対して行った;p<0.05、p<0.01。データは算術平均±SEMとして示す。a5匹の動物は第I相でAHRを示さなかったため、AUC解析から除外した。第II相の気道機能データ採取における技術的失敗のために、さらに3匹の動物を除外した。b3匹の動物は第II相の気道機能データ採取における技術的失敗のためにPC30解析から除外した。抗原プライミング症状を有する追加の動物は第I相においてPC30AHRを示さなかったため除外した。c第I相の気道機能データ採取における技術的失敗のために、2匹の動物を抗原プライミング解析から除外した。d試験の開始時の顕著なBAL炎症のために1匹の動物をBAL解析から除外した。"