"人工多能性幹細胞を調製するための方法であって、下記ステップを含む方法。ステップ1:少なくとも1種の幹細胞多能性因子を体細胞に導入するステップステップ2:ステップ1で幹細胞多能性因子が導入された体細胞を、リチウム塩が添加された培地を用いて培養するステップステップ3:人工多能性幹細胞クローンの同定及び特徴付けを行うステップ人工多能性幹細胞の生成及び産生効率を示すために体細胞にレポーター遺伝子を導入するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。レポーター遺伝子はOct4-GFP又はNanog-GFP、好ましくはOct4-GFPである、請求項2に記載の方法。ステップ1において、幹細胞多能性因子は、Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28及びEsrrbからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。ステップ1において、幹細胞多能性因子は、Oct4、Sox2、Klf4及びc-Mycであるか、又はOct4、Sox2及びKlf4である、請求項4に記載の方法。ステップ2において、リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ-リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1に記載の方法。ステップ2においてリチウム塩は塩化リチウムである、請求項1に記載の方法。ステップ2において、リチウム塩の濃度は0.1mM~40mM、好ましくは0.5mM~20mM、より好ましくは5mM~10mM、最も好ましくは10mMである、請求項1に記載の方法。ステップ2において、培地はmES培地又はKSR培地であり、mES培地は、15ウシ胎児血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、及びβ-メルカプトエタノールが添加されたDMEMであり、KSR培地は、15血清代替物、1000U/mL白血病抑制因子、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、及びβ-メルカプトエタノールが添加されたKnockoutDMEMである、請求項1に記載の方法。ステップ2は、Oct4、Sox2、Klf4及びc-Mycの4因子又はOct4、Sox2及びKlf4の3因子がステップ1で導入されたマウス胎仔線維芽細胞を、2日目にトリプシン処理し、フィーダー細胞上に播種し、mES培地を用いて培養し、3日目に、リチウム塩が添加されたmES培地に培地を交換し、6日目に、リチウム塩が添加されたKSR培地に培地を交換し、8日目にKSR培地に培地を交換し、その後、優れた幹細胞様形態を有するコロニー又はOct4-GFP陽性コロニーを選択して継代培養に使用することをさらに含む、請求項1に記載の方法。体細胞は哺乳動物の体細胞である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル又はヒトから選択される、請求項11に記載の方法。人工多能性幹細胞を調製するための培地であって、リチウム塩をさらに含む培地。リチウム塩は、塩化リチウム、炭酸リチウム、酢酸リチウム、臭化リチウム、アスパラギン酸リチウム、γ-リノレン酸リチウム、ヘパリンリチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、及びリチウムイオンを含有する他の化学物質からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項13に記載の培地。リチウム塩は塩化リチウムである、請求項13に記載の培地。リチウム塩の濃度は0.1mM~40mM、好ましくは0.5mM~20mM、より好ましくは5mM~10mM、最も好ましくは10mMである、請求項13に記載の培地。リチウム塩が添加されたmES培地又はリチウム塩が添加されたKSR培地である、請求項13に記載の培地。以下の実施例は、本発明者らが行った標準的な実験操作を例示するために提供される。以下の実施例は例示的なものにすぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは理解されるべきである。本発明において使用される技術の概要:本明細書に記載の各物質は、特に断らない限り、Invitrogenから市販されているものである。レトロウイルスの作製及びiPS細胞の生成のための実験手順:製造業者のプロトコールに従い、FugeneHDRocheを用いて、マウスOct4、Sox2、Klf4及びc-MycのcDNAを含むpMXsレトロウイルスベクターAddgeneから購入をplat-E細胞にトランスフェクトすることによって、レトロウイルスを得た。48時間後、ウイルスを含有する上清を回収し、濾過した。濾過した上清に8mg/Lのポリブレンを添加し、次いで、マウス胎仔線維芽細胞を感染させるために使用した。ウイルスを含有する上清を添加する日を0日目として数える。ウイルスに感染した線維芽細胞をmES培地中で培養し、感染14日目~18日目4因子感染実験又は感染20日目~24日目3因子感染実験に、Oct-GFPの発現及び幹細胞の典型的な形態に基づいてiPSコロニーを採取した。再プログラム化効率の測定のための実験手順:再プログラム化効率の算定は、主として、Oct-GFP陽性細胞を計数することによって行う。例えば、1.フローサイトメトリーを用いて、4因子に10~12日間又は3因子に14~16日間感染させた細胞培養物中のOct-GFP陽性細胞の割合を測定する。あるいは、2.蛍光顕微鏡を用いてウェル中のOct-GFP陽性コロニーを直接計数する。iPS細胞の特徴付けのための実験手順:幹細胞マーカータンパク質のアルカリホスファターゼ染色、蛍光染色、多能性遺伝子の発現、ウイルス遺伝子のサイレンシング、奇形腫形成、キメラ形成及びジャームライントランスミッションの確認を行う[19、20]。実施例1:リチウム塩が添加された幹細胞培地は4因子誘導iPS細胞の形成を促進できる。a.Oct4、Sox2、Klf4又はc-Mycを有する同体積のウイルスを混合し、6ウェルプレートの1つのウェル中の合計180,000個のOG2マウス胎仔線維芽細胞に添加し、37°C、5CO2で、10ウシ胎児血清が添加されたDMEM培地中で細胞を培養した。ウイルス感染の日を0日目として数えた。2日目に、細胞をトリプシン処理し、mES培地に再懸濁し、次いで、放射線照射したマウス胎仔線維芽細胞フィーダーを予め播種した96ウェルプレートに5,000個/ウェルの密度で細胞を播種した。種々の濃度のLiCl0.6mM、1.2mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM及び40mMが添加されたmES培地を3日目から使用した。6日目に、種々の濃度のLiCl0.6mM、1.2mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM及び40mMが添加されたKSR培地に培地を交換した。8日目に、培地を再びKSR培地に交換した。プロセス全体を図1に示す。b.ステップaの方法を用いて、8日目からOct-GFP陽性コロニーを観察し、倒立型蛍光顕微鏡で毎日計数し、蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。図2Aは、10日目の96ウェルプレートのウェルの代表的な画像であり、未処理のウェルよりも10mMLiClで処理したウェルの方が多くのGFP陽性コロニーが存在した。図2Bは、Oct-GFP陽性コロニーの統計学的データを示す。8日目に、対照ウェルではGFP陽性コロニーがほとんど観察されなかったのに対し、10mMLiClで処理したウェルでは約10個のGFP陽性コロニーが観察された。10日目に、10mMLiClで処理したウェルでは約20個のGFP陽性コロニーが観察され、誘導効率は対照ウェルの誘導効率の5~6倍であった。図2Cは、種々の濃度のLiCl0.6mM、1.2mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM及び40mMでの処理後に生成した陽性コロニーの数を示す。顕著な用量効果が観察され、LiClの最も有効な用量は10mMであった。c.ステップaの方法を用いて、12日目に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによりOct-GFP陽性細胞の割合を測定した。図3Aは、代表的なFACSプロットである。図3Bは、3回の独立した実験の統計学的データを示す。これらのデータは、4因子を用いて再プログラム化を誘導した場合、10mMLiClで処理したウェルの誘導効率は、処理無しのウェルの誘導効率に比べて5~6倍に増加したことを示している。実施例2:リチウム塩が添加された幹細胞培地は3因子誘導iPS細胞の形成を促進できる。a.Oct4、Sox2又はKlf4を有する同体積のウイルスを混合し、6ウェルプレートの1つのウェル中の合計180,000個のOG2マウス胎仔線維芽細胞に添加し、37°C、5CO2で、10ウシ胎児血清が添加されたDMEM培地中で細胞を培養した。ウイルス感染の日を0日目として数えた。2日目に、細胞をトリプシン処理し、mES培地に再懸濁し、放射線照射したマウス胎仔線維芽細胞フィーダーを予め播種した96ウェルプレートに5,000個/ウェルの密度で細胞を播種した。種々の濃度のLiCl0.6mM、1.2mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM及び40mMが添加されたmES培地を3日目から使用した。6日目に、種々の濃度のLiCl0.6mM、1.2mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM及び40mMが添加されたKSR培地に培地を交換した。8日目に、培地を再びKSR培地に交換した。プロセス全体を図1に示す。b.ステップaの方法を用いて、12日目からOct-GFP陽性コロニーを観察し、倒立型蛍光顕微鏡で毎日計数し、蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。図4Aに示されるように、14日目に、対照群と比較して、5mM又は10mMのLiClで処理したウェルでのiPS細胞の誘導効率は有意に向上しており、10mMのLiClで処理したウェルでのiPS細胞の誘導効率は約7倍に増加していた。c.ステップaの方法を用いて、16日目に細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによりOct-GFP陽性細胞の割合を測定した。図4Bに示されるように、対照群でのOct-GFP陽性細胞の割合はわずか0.24であったのに対し、実験群では、10mMのLiClで処理したOct-GFP陽性細胞の割合が14.5に達し、約60倍に増加していた。実施例3:リチウム塩の添加によって得られるiPS細胞株は多能性を有する。a.上述のように、マウス胎仔線維芽細胞をOct4、Sox2、Klf4及びc-Mycの4因子又はOct4、Sox2及びKlf4の3因子に感染させ、LiClが添加された幹細胞培地中で培養した。感染14日目4因子の場合又は感染20日目3因子の場合に、形態及び蛍光発現に基づいて代表的なコロニーを選び出し、これらのコロニーを用いて、継代培養により同種のiPS細胞株を生成させた。b.樹立されたiPS細胞株を形態の観点から観察し、染色して幹細胞に特異的なタンパク質を検出した。図5に示されるように、iPS細胞は、胚性幹細胞に類似した特徴的な形態を有し、Oct-GFPを強く発現し、かつアルカリホスファターゼAP染色が陽性であった。幹細胞に特異的なタンパク質に対する抗体を用いてiPS細胞の免疫蛍光染色を行った。結果は、iPS細胞が幹細胞に特異的なタンパク質Nanog及びSSEA-1を発現したことを示していた。c.iPS細胞からRNAを抽出する前に、差次接着法を用いてフィーダー細胞を除去した。製造業者のプロトコールに従い、トリゾールTrizolInvitrogen試薬を用いて全RNAを抽出した。プライムスクリプトPrimeScript商標キットTakaraco.を用いて逆転写を行った。ジャンプスタートJumpStart商標タックレディミックスTaqReadyMix商標キットSigmaco.及びMx3000PサーマルサイクラーABIco.を用いてリアルタイムPCRを行った。製造業者のプロトコールに従って一般的なPCR条件を使用した。iPSに特異的な遺伝子を同定するためのプライマーを表1に列挙した。図6Aに示されるように、本発明の方法により得られたiPS細胞は、内在性Oct4、内在性Sox2、Nanog及びRex1を含む多能性因子を高レベルで発現し、それらの発現レベルは胚性幹細胞株E14での発現レベルに匹敵していた。これに反して、これらの因子の発現は、元のマウス胎仔線維芽細胞では検出不可能であった。他方、図6Bに示されるように、本発明の方法により得られたiPS細胞はウイルス遺伝子をかなり上手くサイレンシングできた。これは、細胞が完全に幹細胞に再プログラム化されたことを示している。d.リチウム塩の添加により得られたマウス4因子誘導iPS細胞をトリプシン処理し、iPS細胞約1×106個をmES培地200μlに再懸濁し、NOD-SCIDマウスの大腿内の筋肉に注入した。4~5週間後、マウスを屠殺し、奇形腫をパラフィンに包埋し、薄片に切り、HE染色して解析した。図7に示されるように、3種の胚葉に由来する組織が、iPS細胞から形成された奇形腫の切片中に存在した。それらの組織には、外胚葉に相当する表皮様組織、中胚葉に相当する筋肉及び軟骨様組織、及び内胚葉に相当する消化管の管腔様組織が含まれる。したがって、マウス胚性幹細胞と同様に、リチウム塩の添加により得られたマウス4因子誘導iPS細胞は多能性であり、3種の胚葉の異なるタイプの細胞をもたらした。e.リチウム塩の添加により得られたマウス4因子誘導iPS細胞をICRマウスの胚盤胞に注入し、胚盤胞中のマウス胚性幹細胞と混合した。次いで、正常に発達させるために、偽妊娠している雌ICRマウスの子宮に胚盤胞を移植した。仔マウスの毛色を観察して、キメラが形成されたかどうかを判断した。キメラが検出された場合、それらのキメラを白色ICRマウスと交配し、子孫動物の毛色を観察して、ジャームライントランスミッションが起こったかどうかを判断した。図8に示されるように、3因子iPS細胞及び4因子iPS細胞はいずれもキメラマウスを作り出すことができた。また、4因子iPS細胞により生成されたキメラマウスの子孫に黒色マウスが現れた。これらの結果から、リチウム塩の添加により得られたiPS細胞が実際に生殖細胞系列をもたらすことが確認された。このことは、これらの細胞が多能性を有し、胚性幹細胞に非常に類似していることを示している。要するに、本発明のリチウム塩添加培地を使用することによって、iPS細胞を効率的に生成させることが可能となる。リチウム塩で処理した実験群の誘導効率は、対照群の誘導効率の5~6倍4因子誘導アッセイ及び約60倍3因子誘導アッセイに増加することがフローサイトメトリー解析の結果により実証されている。また、再プログラム化時間は、iPS誘導の間にリチウム塩を添加することによって短縮できる。リチウム塩で処理した実験群では感染8日目にOct4-GFP陽性コロニーが検出されるのに対して、対照群では10日目までOct4-GFP陽性コロニーは見られない。リチウム塩を用いて誘導されるiPS細胞は優れた多能性を有する。4因子又は3因子が形質導入されたiPSクローンはキメラマウスを形成することができ、4因子iPS細胞を用いて生成させたキメラマウスにおいてジャームライントランスミッション及び子孫の誕生が観察されている。本発明は効率的なiPS細胞誘導方法を提供する。本発明の方法は、iPS細胞の基礎研究及び臨床応用を実質的に促進する可能性がある。上述の内容は、本発明の好ましい例にすぎず、本発明の権利の範囲を限定するものでないことは明らかである。したがって、本発明の特許請求の範囲に従って行われる同等の変更もまた本発明の範囲に包含される。参考文献:1.Evans,M.J.andM.H.Kaufman,Establishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryos.Nature,1981.2925819:p.154-6.2.Thomson,J.A.,etal.,Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science,1998.2825391:p.1145-7.3.Takahashi,K.andS.Yamanaka,Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell,2006.1264:p.663-76.4.Meissner,A.,M.Wernig,andR.Jaenisch,Directreprogrammingofgeneticallyunmodifiedfibroblastsintopluripotentstemcells.NatBiotechnol,2007.2510:p.1177-81.5.Okita,K.,T.Ichisaka,andS.Yamanaka,Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.Nature,2007.4487151:p.313-7.6.Wernig,M.,etal.,InvitroreprogrammingoffibroblastsintoapluripotentES-cell-likestate.Nature,2007.4487151:p.318-24.7.Park,I.H.,etal.,Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors.Nature,2008.4517175:p.141-6.8.Yu,J.,etal.,Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science,2007.3185858:p.1917-20.9.Zhao,X.Y.,etal.,iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature,2009.4617260:p.86-90.10.Nakagawa,M.,etal.,GenerationofinducedpluripotentstemcellswithoutMycfrommouseandhumanfibroblasts.NatBiotechnol,2008.261:p.101-6.11.Li,Y.,etal.,GenerationofiPSCsfrommousefibroblastswithasinglegene,Oct4,andsmallmolecules.CellRes,2010.12.Stadtfeld,M.,etal.,Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science,2008.3225903:p.945-9.13.Zhou,H.,etal.,Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.CellStemCell,2009.45:p.381-4.14.Esteban,M.A.,etal.,VitaminCenhancesthegenerationofmouseandhumaninducedpluripotentstemcells.CellStemCell,2010.61:p.71-9.15.Ichida,J.K.,etal.,Asmall-moleculeinhibitoroftgf-Betasignalingreplacessox2inreprogrammingbyinducingnanog.CellStemCell,2009.55:p.491-503.16.Shi,Y.,etal.,InductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicfibroblastsbyOct4andKlf4withsmall-moleculecompounds.CellStemCell,2008.35:p.568-74.17.Maherali,N.andK.Hochedlinger,TgfbetasignalinhibitioncooperatesintheinductionofiPSCsandreplacesSox2andcMyc.CurrBiol,2009.1920:p.1718-23.18.Mali,P.,etal.,Butyrategreatlyenhancesderivationofhumaninducedpluripotentstemcellsbypromotingepigeneticremodelingandtheexpressionofpluripotency-associatedgenes.StemCells,2010.284:p.713-20.19.Yamanaka,S.,Strategiesandnewdevelopmentsinthegenerationofpatient-specificpluripotentstemcells.CellStemCell,2007.11:p.39-49.20.Evans,M.J.,etal.,TheabilityofEKcellstoformchimerasafterselectionofclonesinG418andsomeobservationsontheintegrationofretroviralvectorproviralDNAintoEKcells.ColdSpringHarbSympQuantBiol,1985.50:p.685-9."