"減少した量の高マンノースグリカンを有する糖タンパク質組成物を酵母又は糸状菌の宿主細胞において作製する方法であって、前記糖タンパク質上のa-マンノシダーゼ抵抗性グリカンの存在を減少させるか又は排除することを含む前記方法。糖タンパク質上のa-マンノシダーゼ抵抗性グリカンを減少させるか又は排除する工程が、N-グリカンのβ-マンノシル化に関与している遺伝子の破壊、欠失、又は変異を通して宿主細胞を修飾することを含む、請求項1に記載の方法。遺伝子が、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントをコードする、請求項2に記載の方法。a-マンノシダーゼ抵抗性グリカンが、b-マンノース残基、分枝高マンノース残基、又はa-1,4マンノース残基を含む、請求項3に記載の方法。宿主細胞が、ピキアパストリスPichiapastoris、ピキアフィンランジカPichiafinlandica、ピキアトレハロフィラPichiatrehalophila、ピキアコクラメPichiakoclamae、ピキアメンブラネファシエンスPichiamembranaefaciens、ピキアメタノリカPichiamethanolica、ピキアミニュータPichiaminutaオガテアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリPichialindneri、ピキアオプンチエPichiaopuntiae、ピキアサーモトレランスPichiathermotolerans、ピキサリクタリアPichisalictaria、ピキアグエルカムPichiaguercum、ピキアピジペリPichiapijperi、ピキアスチプチスPichiastiptisピキアsp.、サッカロミセスカステリーSaccharomycescastellii、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロミセスクルイベリSaccharomyceskluyveri、サッカロミセスsp.、ハンセヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセスKluyveromycessp.、クルイベロミセスラクチスKluyveromyceslactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、カンジダsp.、アスペルギルスフミガツスAspergillusfumigatus、アスペルギルスニヅランスAspergillusnidulans、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アスペルギルスオリゼAspergillusoryzae、トリコデルマリーセイTrichodermareesei、クリソスポリウムルックノウェンスChrysosporiumlucknowense、フザリウムFusariumsp.、フザリウムグラミネウムFusariumgramineum、フザリウムベネナツムFusariumvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens、及びニューロスポラクラッサNeurosporacrassa:からなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法方法。宿主細胞が、アルファ-1,6-マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする機能的な遺伝子産物の欠失をさらに含む、請求項2に記載の方法。宿主細胞が、マンノシルホスフェートmannosylphosphateトランスフェラーゼ活性をコードする機能的な遺伝子産物の欠失をさらに含む、請求項2に記載の方法。請求項1から7のいずれか一項に記載の方法により作製された宿主細胞。請求項8に記載の方法により作製された糖タンパク質組成物。糖タンパク質がN結合型グリカン又はO結合型グリカンのいずれかを含む、請求項9に記載の糖タンパク質組成物。a配列番号:1;b配列番号:1の縮重バリアントである核酸分子;c少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:1との同一性を有する核酸配列;d配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、e少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:2との同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;f配列番号:1とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸配列;及びg少なくとも60連続ヌクレオチド長である、aからfのいずれか1つの断片を含む核酸配列:を含む、又はからなる、単離された核酸配列。a配列番号:3;b配列番号:3の縮重バリアントである核酸分子;c少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:3との同一性を有する核酸配列;d配列番号:4のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、e少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:4との同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;f配列番号:2とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸配列;及びg少なくとも60連続ヌクレオチド長である、aからfのいずれか1つの断片を含む核酸配列:を含む、又はからなる、単離された核酸配列。a配列番号:5;b配列番号:5の縮重バリアントである核酸分子;c少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:5との同一性を有する核酸配列;d配列番号:6のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、e少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:6との同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;f配列番号:5とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸配列;及びg少なくとも60連続ヌクレオチド長である、aからfのいずれか1つの断片を含む核酸配列:を含む、又はからなる、単離された核酸配列。a配列番号:7;b配列番号:7の縮重バリアントである核酸分子;c少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:7との同一性を有する核酸配列;d配列番号:8のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列、e少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の配列番号:8との同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;f配列番号:7とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸配列;及びg少なくとも60連続ヌクレオチド長である、aからfのいずれか1つの断片を含む核酸配列:を含む、又はからなる、単離された核酸配列。請求項11から14いずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。核酸配列が、β-マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、請求項15に記載のベクター。配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントからなる群より選択される核酸配列の機能的な遺伝子産物の発現が減少するよう修飾されていることを特徴とする、修飾された酵母又は糸状菌の宿主細胞。配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントからなる群より選択される1つ以上の核酸配列に破壊、欠失、又は変異を含む、請求項17に記載の修飾された宿主細胞。請求項11、12、13、又は14に記載の単離されたポリペプチドと選択的に結合する、単離された抗体又はこの抗原結合断片もしくは誘導体。従って、必要とされているのは、治療用糖タンパク質の作製のための、糖タンパク質上の不要のマンノース残基を除去する方法である。従って、本発明は、糖タンパク質上のa-マンノシダーゼ抵抗性グリカンの存在を減少させるか又は排除することを含む、減少した量の高マンノースグリカンを有する糖タンパク質組成物を酵母又は糸状菌の宿主細胞において作製する方法を提供する。ある種の実施態様において、糖タンパク質上のa-マンノシダーゼ抵抗性グリカンの減少又は排除は、N-グリカンのマンノシル化に関与している遺伝子の破壊、欠失、又は変異を通して宿主細胞を修飾することにより達成される。このような遺伝子には、例えば、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントとして本明細書に記載された遺伝子配列が含まれる。ある種の実施態様において、a-マンノシダーゼ抵抗性グリカンには、b-マンノース残基、分枝高マンノース残基、又はa-1,4マンノース残基が含まれ得る。本発明の宿主細胞は、好ましくは、酵母及び/又は糸状菌を起原とするものである。本発明において有用な宿主細胞には、以下の科、属、及び種が含まれ得る:ピキアパストリス、ピキアフィンランジカfinlandica、ピキアトレハロフィラtrehalophila、ピキアコクラメkoclamae、ピキアメンブラネファシエンスmembranaefaciens、ピキアメタノリカmethanolica、ピキアミニュータminutaオガテアミニュータOgataeaminuta、ピキアリンドネリlindneri、ピキアオプンチエopuntiae、ピキアサーモトレランスthermotolerans、ピキサリクタリアPichisalictaria、ピキアグエルカムguercum、ピキアピジペリpijperi、ピキアスチプチスstiptis、ピキアsp.、サッカロミセスカステリーSaccharomycescastellii、サッカロミセスセレビシエcerevisiae、サッカロミセスクルイベリkluyveri、サッカロミセスsp.、ハンセヌラポリモルファHansenulapolymorpha、クルイベロミセスKluyveromycessp.、クルイベロミセスラクチスlactis、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、カンジダsp.、アスペルギルスフミガツスAspergillusfumigatus、アスペルギルスニヅランスnidulans、アスペルギルスニガーniger、アスペルギルスオリゼoryzae、トリコデルマリーセイTrichodermareesei、クリソスポリウムルックノウェンスChrysosporiumlucknowense、フザリウムFusariumsp.、フザリウムグラミネウムgramineum、フザリウムベネナツムvenenatum、フィスコミトレラパテンスPhyscomitrellapatens、及びニューロスポラクラッサNeurosporacrassa。ある種の実施態様において、本発明の宿主細胞は、OCH1のようなアルファ-1,6-マンノシルトランスフェラーゼ活性をコードする機能的な遺伝子の欠失を含み得る。この他の実施態様において、本発明の宿主細胞は、PNO及びMNN4Bのような、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子をさらに含み得る。本発明は、本発明の方法により作製され得る、減少した量の、a-マンノシダーゼに対して不応性の高マンノースグリカン構造を有する糖タンパク質組成物も提供する。このような糖タンパク質組成物は、N結合型グリカン及び/又はO結合型グリカンのいずれかを含み得る。本発明は、さらに、a-マンノシダーゼ抵抗性グリカンの産生に関与する単離された核酸配列を提供する。これらの単離された核酸配列には、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントとして本明細書に記載された配列が含まれる。上記配列との構造的な類似性を示すこの他の核酸配列も、本発明に含まれる。これらには、例えば、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7の縮重バリアントが含まれ、これらとの高レベルのヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列も含まれ得る。従って、本発明に含まれる核酸分子には、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7の配列との少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の同一性を有する核酸配列が含まれ、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7により産生されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列;配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8により産生されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとの少なくとも72、75、80又は85、90、95、98、99、99.9の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列;並びに配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7として記載された核酸配列のうちの1つ以上とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸配列も含まれるであろう。本発明は、少なくとも60連続ヌクレオチド長である、上記核酸配列のいずれかの断片を含む核酸配列も含む。さらにこの他の実施態様において、本発明は、修飾された酵母又は糸状菌の宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7からなる群より選択される1つ以上の核酸配列の機能的な遺伝子産物の発現が減少するよう修飾されていることを特徴とし得る。ある種の実施態様において、修飾された宿主細胞は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7からなる群より選択される1つ以上の核酸配列に破壊、欠失、又は変異を含む。この他の実施態様において、修飾された宿主細胞は、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、又はこれらのバリアントからなる群より選択される核酸の機能的な遺伝子産物の発現の細胞阻害剤を含む。本発明にとって有用な発現の細胞阻害剤には、例えば、アンチセンスDNA及び低分子干渉RNAが含まれる。この他の実施態様において、本発明は、減少した量の高マンノースグリカンを有し、a-マンノシダーゼ抵抗性グリカン、例えばβ-マンノシル残基の減少した存在を含む糖タンパク質組成物を発現することができる修飾された酵母又は糸状菌の宿主細胞を含み得る。タチナタマメマンノシダーゼ及びa-1,2マンノシダーゼによるN-グリカンの消化標準的なN結合型オリゴ糖20mgを、100mlのHPLCグレード水で再構成した。この一部10mlを、0.6mlシリコン処理チューブに添加した。試料を蒸発乾固させた。試料に、タチナタマメマンノシダーゼ0.03U又はトリコデルマリーセイreseei由来のa-1,2マンノシダーゼ0.03mU、DrContrerasR,UnitofFundamentalandAppliedMolecularBiology,DepartmentofMolecularBiology,GhentUniversity,Ghent,Belgiumからの寄贈と共に、10mlの50mM酢酸アンモニウムを添加した。試料を、37°Cで、16から24時間、酵素と共にインキュベートした。次いで、試料を蒸発乾固させた。試料を10mlの水で再構成した。この後、試料を、MALDI-TOFMSにより分析した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析グリカンの分子量を、遅延引き出しを使用して、ボイジャーVoyagerDEPROリニアlinearMALDI-TOFAppliedBiosciences質量分析計を使用して決定した。各ウェルからの乾燥グリカンを、15uLの水に溶解させ、0.5uLをステンレスのサンプルプレート上にスポットし、0.5uLのS-DHBマトリックス9mg/mLのジヒドロキシ安息香酸、lmg/mLの5-メトキシサリチル酸を含む1:1水/アセトニトリル0.1TFAと混合し、乾燥させた。イオンは、4nsのパルス時間でパルス状の窒素レーザー337nmを照射することにより発生された。装置を、125nsの遅延時間及び20kVの加速電圧で、遅延引き出しモードで作動させた。グリッド電圧は93.00であり、ガイドワイヤ電圧は0.10であり、内部圧力は5×10-7トル未満であり、低質量ゲートlowmassgateは875Daであった。スペクトルは100から200のレーザーパルスの和から作製され、2GHzデジタイザーにより取得された。Man5GlcΝAc2オリゴ糖を外部分子量標準として使用した。全てのスペクトルが、ポジティブイオンモードで装置により作製された。スペクトルの推定質量精度massaccuracyは、0.5であった。ピキアパストリス由来のAMR2遺伝子の同定及び配列分析リジン及びグルタミン酸がリッチな反復配列を含有するサッカロミセスセレビシエMNN4遺伝子ジェンバンクGenbank登録P36044のC末端部分を、P.パストリスゲノム配列IntegratedGenomics,Chicago,ILに対してブラスト検索blastするためのプローブとして使用した。類似したリジン及びグルタミン酸がリッチなリピートを有するタンパク質をコードするORFを含むいくつかのDΝA断片が同定された。このうちの1つのORFは、S.セレビシエMnn4pに構造的に類似している、推定N末端膜貫通ドメイン並びにリジン及びグルタミン酸がリッチなC末端尾部を含む644アミノ酸のタンパク質をコードすることが見出された。変異型の対立遺伝子を保持している株の表現型分析に基づき、この遺伝子をAMR2アルファ-マンノシダーゼ抵抗性と命名した。この後のP.パストリスゲノム配列のブラスト検索は、さらに3つのAMR2と密接に関連した遺伝子の存在を明らかにした。YAS137株におけるAMR2遺伝子の欠失P.パストリスYAS137株Dochl,Dpnol,Dmnn4b米国出願第11/020,808号を、AMR2遺伝子ノックアウト実験のための宿主として使用した。YAS137は、外側の鎖を含まない無電荷のN-グリカンを産生する図2A。a-l,2-マンノシダーゼ図2B及びa-1,2/a-1,3/a-1,6活性を有するタチナタマメマンノシダーゼにより消化されると、株YAS137から精製されたN-グリカンの有意な割合が、Man5GlcΝAc2に変換され得る。しかしながら、20ものN-グリカンが、これらのa-マンノシダーゼに対して不応性である図3。amr2欠失対立遺伝子amr2::KanRをPCRオーバーラップ法により作成した図4。プライマーPBS1-2-C3配列番号:95’-TAATAGTGGAGAAA-CTTGCAAAGG-3’とPBS2-KO2配列番号:105’-GTGCTACCTAAAT-CGTATGTGTCGTTGAAGCTTCCCAATGATAGC-3’との対、及びプライマーPBS1-2-KO3配列番号:115’-CTCCCTATAGTGAGTCGTATTCATATGAT-GGGTGTTTGCTCACTC-3’とPBS1-2-KO4配列番号:125’-CTTGG-TTCAACGCAGCACTTTG-AC-3’との対を、ゲノムDNAからAMR2遺伝子の5’及び3’隣接領域を増幅するために使用したゲノムDNAはNRRL-Y11430株から単離された。プライマーPR29配列番号:135’-CACATACGATTTAG-GTGACAC-3’とPR32配列番号:145’-AATACGACTCACTATAGG-GAG-3’との対を、ベクターpUG6GoldsteinandMcCusker,1999からKanG418耐性マーカーを増幅するために使用した。この後、1回目のPCR反応からの3つの産物全てを用いた第2の反応において、プライマーPBS1-2-C3及びPBS1-2-KO4を使用し、オーバーラップ産物を作製した。得られた融合PCR産物を、YAS137株を形質転換するために使用した。形質転換のためのDNAは、0.3Mの最終濃度で酢酸ナトリウムを添加することにより調製した。次いで、100パーセント氷冷エタノールを、70の最終濃度でDNA試料に添加した。DNAを遠心分離12000g×10分によりペレット化し、70氷冷エタノールにより2回洗浄した。DNAを乾燥させ、次いで、50mlの10mMトリス、pH8.0に再懸濁させた。YAS137は、およそ2から6のO.D.になるまで、BMGY緩衝最小グリセロール:100mMリン酸カリウム、pH6.0;1.34酵母ニトロゲンベースyeastnitrogenbase;4×10-5ビオチン;1グリセロールにおいて酵母培養物を増幅することにより調製した。1Mソルビトールで3回洗浄し、およそ1から2mlの1Mソルビトールに再懸濁させることにより、酵母をエレクトロコンピテントelectrocompetentにした。DNA1から2mgを50mlのコンピテント酵母と混合し、1分間、氷上でインキュベートした。次いで、以下のパラメータを使用して、BTXエレクトロセルマニピュレーターElectrocellManipulator600により、酵母を電気穿孔した:1.5kV、129オーム、及び25mF。1ミリリットルのYPDS1酵母抽出物、2ペプトン、2デキストロース、1Mソルビトールを、電気穿孔された細胞に添加した。この後、形質転換された酵母を、選択寒天プレート上に播種した。形質転換体を、200mg/mlのG418硫酸塩、GIBCO商標を含有するYPD培地上で選択した。欠失対立遺伝子amr2::KanRの適切な組み込みを、PCRにより確認した。ノックアウトのスクリーニングは、ノックアウト構築物の5’部分及び3’部分両方のPCR増幅により実施した。PBS1-C5配列番号155’-TTTTCCTCA-AGCCTTCAAA-GACAG-3’およびPTEF配列番号165’-AGCTGCGCA-CGTCAAGACTGTCAA-GG-3’プライマーをノックアウト構築物の5’部分をスクリーニングするために使用し、PBS1-2-C2配列番号175’-TACCGATACATAC-GTAGCCAACAC-3’およびKAN10配列番号185’-TCGCTATACTGCTG-TCGATTCGATAC-3’プライマーをノックアウト構築物の3’部分をスクリーニングするために使用した。プライマーPTEF及びKAN10は、薬物耐性マーカー配列の5’及び3’末端にそれぞれアニーリングし;PBS1-C5及びPBS1-2-C2は、ノックアウト構築物において使用されたDNAの5’及び3’領域に隣接するゲノム内の配列に対して相補的であるため、両方のスクリーニングにおけるPCR産物の観察は、AMR2遺伝子のノックアウトの成功の指標となる。新たなDoch1,Dpno1,Dmnn4b,Damr2株を、PBP130と名付けた。PCR増幅エッペンドルフマスターサイクラーEppendorfMastercyclerを全てのPCR反応のため使用した。PCR反応は、鋳型DNA、125mMdNTP、各0.2mMの順方向プライマー及び逆方向プライマー、ExTaqポリメラーゼ緩衝液TakaraBioInc.、並びにExTaqポリメラーゼTakaraBioInc.を含有していた。予測されたAMR2遺伝子の5’側、予測されたAMR2遺伝子の3’側のDNA断片、及び薬物耐性マーカーを、94°C2分の初期変性工程、98°C10秒、52°C10秒、72°C2分の30サイクル、72°C10分の最終伸長工程により増幅した。PCR試料をアガロースゲル電気泳動により分離し、キアゲンQiagenのゲル抽出キットGelExtractionKitを使用して、DNAバンドを抽出し、精製した。全てのDNA精製を、10mMトリス、pH8.0で溶出した。検索及び整列化NCBIにおいて完全及び不完全な真菌ゲノムに由来する配列を入手するためBLAST検索を実施し、発明の詳細に記述されたようなAMR2ホモログを同定した。図5に示される整列化は、MegalignプログラムDNAStar及びClustalWアルゴリズムを使用して構築された。P.パストリスにおけるa-マンノシダーゼ抵抗性N-グリカンの決定YAS137及びPBP130のN結合型グリカンを、メタノールにより誘導可能なAOX1プロモーターの調節下で発現されたHisタグ化レポータータンパク質の分泌により分析した。レポータータンパク質K3は、単一のN結合型グリコシル化部位を含有する。簡単に説明すると、BMGYを含有する振とうフラスコに、YAS-130の新鮮な培養物を接種し、およそ20のO.D.になるまで培養した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットをBMMY緩衝最小メタノール:1グリセロールの代わりに0.5メタノールを含む以外はBMGYと同一により洗浄した。細胞ペレットを、元のBMGY培養物の1/5の容量でBMMYに再懸濁させ、24時間、振とう機に置いた。遠心分離によりバイオマスをペレット化し、培養培地を新鮮なチューブに移すことにより、分泌されたタンパク質を採集した。次いで、Hisタグ化K3タンパク質を、Ni-アフィニティーカラム上で精製し、PNGaseChoiら、2003により消化した。Man10及びMan11/12の分析α-マンノシダーゼ消化に対して不応性のグリカンの構造分析は、コアマンノースオリゴ糖に結合した少なくとも1つのb1,2-マンノシル残基を開示した。構造Iは、この鎖に決定的に連結され得、高マンノース構造の不可欠な部分である可能性が高い分枝5の上に示された提唱されたb-マンノシル残基13を示している。以下のグリカン構造構造I上の残基は、付加的な数13、14、15を任意に追加して、ZieglerらZiegler,F.D.,J.Cavanagh,C.Lubowski,R.B.Trimble,1999,Glycobiology9:497-505による論文に基づき番号付けされた。構造I9......[Mana1-2]Mana1-66\Mana1-64/\......Mana1-37\32115Manbβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc[Mana]-[Mana1-6]12/\/Mana1-351413118/...[Mana1-2]Manb1-2Manαa1-2Mana1-23つの試料からのデータを、b-マンノシル残基の存在について分析した。試料1:man10-これは、man9/10混合物として記載された最初の試料であった。試料2:man11-これは、推定された50man11、15man12を有するP4画分63から66からのman11/man12混合物として記載された第2の調製物であった。試料3:man10_digest-これは、最初のman11/man12混合物が、man9又はman10へとトリムバックtrimbackするため、a-1,2-マンノシダーゼにより処理された、第3の調製物であった。コアman8/man9混合物を含有する第4の試料も調査した。試料をD2Oから凍結乾燥させ、200uL又は500uLのD2Oに再溶解させた。NMRデータは、25Cで、バリアンイノバVarianInova600MHz及び800MHz分光計で収集された。バリアンライブラリーグラジエントCOSY、TOCSY、NOESY、グラジエントHSQC及びHMBCからの標準実験を、特徴決定のため使用した。b-マンノシル残基の証拠:3つの試料は、全て、b-アノマーと一致するNMRシグナルを有する。3つのスペクトル特性が、この主張を支持する:化学シフト、H1-H2スカラーカップリング、及び分子内NOE測定。プロトン化学シフト。a-マンノシル残基のアノマープロトンの化学シフト値は、典型的には5.0ppm超であり、b-マンノシル残基は、一般的に5.0ppm未満である。a-マンノシル残基3、4、及び12のような例外が存在し、従って、これは単独ではアノマー配置を立証しない。4つの試料のプロトン1Dスペクトルのアノマー領域を示す分析は、11に1-2結合したb-マンノシル残基に対応する2つのピーク13及び13tを明らかにした。ここで、13tは末端残基であり、13はa-マンノシル残基14によりさらに置換されていると思われる。5ppm未満の化学シフト領域にコア残基3及び4並びに残基12のみを示すZieglerら、において見出された高マンノース構造からのNMRデータと、これらのスペクトルを比較することができる。Trinelら、JBC1999及びNitzら、JBC2002に報告されたデータに精密に対応する、残基13からの別個のH1、H2、H3、H4、及びH5シグナルを示す2DTOCSYデータから、付加的な化学シフトが抽出された。末端残基13tからのシグナルは、よく分離されていないが、類似したシフトを有する表1参照。2DTOCSYプロトン-プロトン相関マップは、b-Man13残基に属するクロスピークcrosspeaksを示したデータは示されていない。b-マンノシル残基の化学シフト及び文献の値を、表1に列挙する。a-マンノシル残基の化学シフトは、一般に、同一の次数を有するが、H2の値は典型的にはおよそ0.1ppm低く、H3はおよそ0.1ppm高く、H5はおよそ0.2ppm高い。Trinel,P.-A.,Y.Plancke,P.Gerold,T.Jouault,F.Delplace,R.T.Schwarz,G.Strecker,andD.Poulain,1999,J.Biol.Chem.274:30520-30526Nitze.M,C.-C.Ling,A.Otter,J.E.Cutler,D.R.Bundle,2002,J.Biol.Chem.,277:3440-3446NOEクロスピークb-アノマープロトンは、ピラノース環のH3及びH5と同一の面上にあり、約2.4オングストローム離れているが、a-アノマープロトンは、反対面上にあり、H3又はH5のいずれかから4オングストロームにより近い。従って、b-アノマーにおいてはH1とH3及びH5との間の強いNOEシグナルが予想される。これは、スペクトルが、空間相互作用を通して生じ、高度に距離依存性であるNOEクロスピークを示す、NOESYデータ示されていないに明白に示されている。4.895ppmにおける水平線は、b-man13残基のH1に対応する示されていないデータ。上パネルにおけるTOCSY実験により決定されるように、垂直線は、これらのピークの特定の共鳴への割り当てを確認する。強いピークH3及びH5は、H1とH3又はH5との間の残基内NOEによるものであり、これは、b-アノマーの割り当てを確認する示されていないデータ。H1-H2スカラー結合ピークの分裂共鳴の分裂及び多重線構造を生じさせるプロトンスカラー結合の大きさは、関与しているプロトンの相対的な方向と関係がある。従って、これは、アノマー配置の指標となり得る。a-マンノシル残基におけるH1-H2スカラー結合は、約1.5Hzであり、b-アノマーは<1Hzである。極めて狭い線を有するスペクトルにおいて、a-アノマーの分裂は見ることができるが、b-アノマーは小さすぎるため、シグナルが一重線のように見える。これらのデータにおいて、線幅は最適ではなく、従って、いずれのピークのセットも一重線のように見える。しかしながら、2DTOCSYデータは示されていないにおけるピークのパターン及び強度も、結合の大きさにも依存する。TOCSYスペクトルからのある領域は、どこで水平線がH1シグナルに対応するか、及びクロスピークがそれぞれの残基内の他のプロトンに由来することを示している。第1に、b-Man残基3、13、13tに連結されたH2領域のピークは、a-Manピーク例えば、4より低い強度である。強度は、シグナル転移の効率、従って、結合定数のサイズのおよこの指標である。a-アノマーは、H1からH3まで、時にはH4までの付加的なクロスピークも示しており-これは、H1及びH2との間のスカラー結合が、H2を超えてシグナルを転移させるほどに十分に大きいことを意味している。他方、b-アノマーは、H1-H2クロスピークのみを示す;これは、カップリングが小さく、シグナルの転移が極めて非効率的であり、環内の他のプロトンに継続しないためである。13、13t、及び3についてのパターンは同一であるが、この他のマンノシル残基とは明白に異なっている。b-マンノシル13tの結合位置の証拠。H1及びH2の化学シフトの変化。公知の高マンノース構造について、H1及びH2プロトン化学シフトを、標準的な文献の値と比較することは、構造に到達するために一般的に十分である。この場合、変則のシグナルのため、結合を確立するために、より多くの努力を要した。しかしながら、Man8/9スペクトルについて示されたような、コア構造に割り当てられ得るいくつかのピークが存在した。Man8/9及びMan9/10のスペクトル示されていないデータを比較すると、b-マンノシル残基として上に記載された新たなシグナル13及び13tを含む多くの差異が存在する。試料Man9/10及びMan11/12のスペクトルを比較すると、9に類似している末端a-マンノシル残基が戻っていた。これは、Man9/10スペクトルの中の6、12と表示されたピークが、もう1つのa-マンノースとの置換によりシフトすると予想されるため、末端6である可能性が高いことを示唆するであろう。これは、マンノシダーゼにより消化された試料、Man10-digestにおいて元の位置に戻る。Man11及びMan10-digest試料からの炭素-プロトン相関データ示されていないHSQC、HMBCスペクトルは、この残基が1-6結合で接続されていることを確認する。14と表示されたシグナルは、典型的なMan9構造に見られるような、置換されたマンノシル残基7ではなく、13に結合したa-マンノシル残基であることが提唱される。これは、下記のNOEデータに基づく。しかしながら、アノマープロトンの化学シフトを説明するためには、これはおそらくさらに置換されている。NOEデータの分析。結合部位を決定するための第一のデータは、空間的に近いプロトンを示すNOEスペクトルからである。従って、残基内NOEクロスピークに加えて、残基間クロスピークを観察することもでき、これは一般的に結合位置を示す。Man1-2結合の場合、同一残基内のH1及びH2との間、グリコシド結合した残基のH1とH2との間にクロスピークが観察され、しばしば、グリコシド結合した残基のH1とH1との間にも観察される。man10試料のNOESY及びTOCSYスペクトルからの領域を分析したデータは示されていない。上パネルにおいて、ピークは、同定されたマンノシル残基のH1とH2との間の相関を表す。中央パネルにおいて、11と表示されたシグナルは、この割り当てと一致して、マンノシル残基8のH1とH2との間のNOE相関ボックスを示す。残基13及び13tのアノマープロトンからのNOEクロスピークを調査した場合、マンノシル残基11のH2との相関が存在する。これは、b-マンノシル残基を、コアオリゴ糖の1-3分枝に連結する。下パネルは、13tのH1と11のH1との間のさらなる強いNOE相関を示しており、やはりb1-2結合と一致している。この構造的な断片は、マンノシル残基11のH2の異常な化学シフトによってさらに支持される;この値は、b-manにより2-置換されたa-マンノシル残基についての4.26ppmという化学シフトを示している、TrimbleらTrimble,R.B.,C.Lubowski,C.HauerIII,R.Stack,L.McNaughton,T.Gemmill,andS.AnandKumar,2004,Glycobiology14:265-274からのデータと一致している。さらに、プロトン-炭素相関データHSQC及びHMBCスペクトル、示されていないは、マンノシル11例えば、8及び5ものC2の炭素化学シフトがグリコシド結合内の炭素に特徴的な高い値およそ82から84ppmにあることを示している。少なくとも1つのb-マンノシル残基がコアマンノースオリゴ糖と1-2結合していることが示され得ると結論付けられる。b-マンノシル残基のための複数の結合部位が存在するかもしれず、これら自体が置換されているかもしれない。参考文献"