ペプチドを結合するための方法であって、i1以上の工程で、ペプチドを、前記ペプチドを構成しているアミノ酸残基の何れとも接触可能ではない1以上の官能基または潜在的な官能基latentfunctionalgroupsを具備する第1化合物と、前記第1化合物を前記ペプチドへと導入することを触媒する能力を有するトランスグルタミナーゼの存在下で反応させて、機能化ペプチドを形成する工程と;ii任意に、前記潜在的な官能基を活性化させる工程と;iii1以上の工程で、前記機能化ペプチドを、前記ペプチドを構成しているアミノ酸残基における接触可能な官能基と反応せず、かつ前記第1化合物中の前記官能基と反応する能力を有する1以上の官能基を具備する第2化合物と反応させて、前記機能化ペプチドと前記第2化合物との間に共有結合を形成する工程を備えた方法。請求項1に記載の方法であって、以下の式で表されるGln残基含有ペプチドを、1以上の工程において、以下の式で表される窒素含有求核試薬と、トランスグルタミナーゼの存在下で反応させて、以下の式のアミノ基転移ペプチドtransaminatedpeptideを形成し、任意に、Xに具備された前記潜在的な官能基を活性化し、前記アミノ基転移ペプチドを、以下の式の第2化合物と更に反応させて、以下の式の結合型ペプチドを形成し、式中のDは、結合または酸素を表し;Rは、リンカーまたは結合を表し;Xは、ペプチドPCNH2を構成しているアミノ酸残基に接触可能ではない官能基又は潜在的な官能基を具備しているラジカルを表し;Yは、Xに存在する官能基と反応し、かつペプチドPCNH2における接触可能な官能基と反応しない1以上の官能基を具備しているラジカルを表し;Eは、リンカーまたは結合を表し;Aは、XおよびYに具備された官能基の間の反応によって形成される成分を表し;並びにZは、前記ペプチドに結合される成分である、方法。請求項2に記載の方法であって、式中のAがオキシムヒドラゾンフェニルヒドラゾンセミカルバゾントリアゾールまたはイソオキサゾリジン成分を表す方法。請求項2~3の何れか1項に記載の方法であって、式中のXに具備される官能基又は潜在的な官能基が、ケトアルデヒドNHNH2OCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHCC6H4NHNH2CNHNH2ONH2CONH2NHCONH2NHCONH2アルキンアジドまたはニトリルオキシドから選択されるか又はそれらへと活性化されえる方法。請求項2~4の何れか1項に記載の方法であって、式中のYに存在する官能基がケトアルデヒドNHNH2OCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHCC6H4NHNH2CNHNH2ONH2CONH2NHCONH2NHCONH2アルキンアジドまたはニトリルオキシドのなかから選択される方法。請求項2~5の何れか1項に記載の方法であって、式中のXがケトまたはアルデヒド誘導体から選択されるか又はそれらへと活性化されえるものであり、YがNHNH2OCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNH2NHCNHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHNHCNHNH2NHCC6H4NHNH2CNHNH2ONH2CONH2NHCONH2およびNHCONH2から選択される方法。請求項6に記載の方法であって、式中のXに具備された潜在的な基が、以下のものから選択される方法:式中のR9は、HC16アルキルアリールおよびヘテロアリールから選択される。請求項2~5の何れか1項に記載の方法であって、式中のXおよびYの各々が、アルキンおよびトリアゾールからなる群の又はアルキンおよびニトリルオキシドからなる群の異なるメンバーを表す方法。請求項2~6の何れか1項に記載の方法であって、前記窒素含有求核試薬が、4フェニルエタノン4フェニルエタノンN2アミノアセトアミド14フェニルエタノン13フェニルエタノン14ビスブタン3オキサペンタン15ジオキシアミン18ジアミノキシ36ジオキサオクタン13ビスプロパン2ol111ビス369トリオキサウンデカン13ジアミノ2プロパノール12ビスエタンおよび13ビスプロパンから選択される方法。請求項2~9の何れか1項に記載の方法であって、式中のZが、1以上のPEGまたはmPEGラジカル及びそのアミノ誘導体;直鎖状、分枝状および/または環状のC122アルキルC222アルケニルC222アルキニルC122ヘテロアルキルC222ヘテロアルケニルC222ヘテロアルキニルここで1以上の単素環式芳香族化合物ビラジカルまたは複素環式化合物ビラジカルが挿入されてもよく、ここで前記C1C22またはC2C22ラジカルはヒドロキシルハロゲンカルボキシルヘテロアリールおよびアリールから選択される1以上の置換基で任意に置換されてもよく、ここで前記アリールまたはヘテロアリールはヒドロキシルハロゲンおよびカルボキシルから選択される1以上の置換基で任意にさらに置換されてもよい;ステロイドラジカル脂質ラジカルポリサッカライドラジカルデキストランポリアミドラジカルポリアミノ酸ラジカルPVPラジカルPVAラジカルポリポリエチレン無水マレイン酸ポリマーシバクロン染料またはシバクロンブルー3GAを具備する方法。請求項10に記載の方法であって、式中のZは、10kDaおよび40kDaの付近の間の分子量を有する1以上のPEGまたはmPEGラジカルを具備する方法。請求項11に記載の方法であって、式中のZは、10kDa20kDa40kDaまたは40kDaの付近の分子量を有する1以上のPEGまたはmPEGラジカルを表す方法。請求項10に記載の方法であって、式中のZは、1以上のC1020アルキルを具備する方法。請求項8に記載の方法であって、式中のZは、1以上のC15アルキルC17アルキルシバクロンブルー3GAまたは以下の式のラジカルを具備する方法:。請求項1~14の何れか1項に記載の方法であって、前記酵素が、Streptomycesmobaraenese、Streptomyceslydicus又はモルモットの肝臓から単離されたトランスグルタミナーゼである方法。請求項2~15の何れか1項に記載の方法であって、式中のPは、インシュリン、グルカゴン様ペプチド1、グルカゴン様ペプチド2、成長ホルモン、サイトカイン、TFF、メラノコルチンレセプターモディファイヤーおよびVII因子化合物から選択されるペプチドを表す方法。請求項16に記載の方法であって、式中のPは、成長ホルモンを表す方法。請求項1~17の何れか1項に記載の方法によって取得可能な結合型ペプチド。以下の式で表される化合物、並びに、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ、および溶媒和物:式中のPCNHは、水素をGlnの側鎖におけるNH2から除去することによって取得されるペプチドラジカルを表し;Dは、結合または酸素を表し;Rは、リンカーまたは結合を表し;Eは、リンカーまたは結合を表し;Aは、オキシムヒドラゾンフェニルヒドラゾンセミカルバゾントリアゾールまたはイソオキサゾリジン成分を表し;およびZは、PEGまたはmPEGラジカル及びそのアミノ誘導体;直鎖状、分枝状および/または環状のC122アルキルC222アルケニルC222アルキニルC122ヘテロアルキルC222ヘテロアルケニルC222ヘテロアルキニルここで1以上の単素環式芳香族化合物ビラジカルまたは複素環式化合物ビラジカルが挿入されてもよく、ここで前記C1C22またはC2C22ラジカルはヒドロキシルハロゲンカルボキシルヘテロアリールおよびアリールから選択される1以上の置換基で任意に置換されてもよく、ここで前記アリールまたはヘテロアリールはヒドロキシルハロゲンおよびカルボキシルから選択される1以上の置換基で任意にさらに置換されてもよい;ステロイドラジカル脂質ラジカルポリサッカライドラジカルデキストランポリアミドラジカルポリアミノ酸ラジカルPVPラジカルPVAラジカルポリポリエチレン無水マレイン酸ポリマーシバクロン染料またはシバクロンブルー3GAのなかから選択される。請求項19に記載の化合物であって、前記ペプチドラジカルはヒト成長ホルモンに由来し、Aはオキシムまたはトリアゾール成分を表し、ZはC1020アルキルC15アルキル、10kDa付近から40kDa付近の分子量を有するmPEG、10kDa付近の分子量を有するmPEG、20kDa付近の分子量を有するmPEG、30kDa付近の分子量を有するmPEG、または40kDa付近の分子量を有するmPEGを表す化合物。請求項20に記載の化合物であって、前記化合物がhGH中のポジション141で結合される化合物。Nε1412イルブタノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGHNε1412ピペリジン4イルエチルオキシイミノエチルhGHNε141イルアミノカルボニルオキシプロパ2イルオキシブチリルアミノブチルオキシイミノエチルhGHNε141イルオキシカルボニルアミノヘキサノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGHNε141イルオキシブチリルアミノブチルオキシイミノエチルhGHNε141イルオキシブチリルアミノブチルオキシイミノエチルhGHおよびNε141イルオキシプロパノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGH;並びに、その薬学的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグから選択される請求項19に記載の化合物であって、上記のmPEGイルおよびmPEGイルが、それぞれ106未満の多分散性指標を有するmPEGイルおよびmPEGイルを指すことを意図する、化合物。請求項19~21の何れか1項に記載の化合物を含む薬学的組成物。請求項19~21の何れか1項に記載の化合物の治療における使用。成長ホルモン分泌不全症ターナー症候群プラーダーヴィリ症候群ヌーナン症候群ダウン症候群慢性腎臓病、若年性関節リウマチ嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染症HIVHALS小児在胎齢が短く誕生した小さい小児SGASGAを除く極低出生体重VLBWで誕生した小児における低身長骨格形成異常低軟骨形成症軟骨形成不全症特発性低身長ISS成人におけるGHD脛骨腓骨大腿骨上腕骨橈骨尺骨鎖骨中手骨中足骨および指などの長骨における、又は、それらの骨折頭蓋骨手の基部および足の基部などの海綿状骨における、又は、それらの骨折手膝または肩部などにおける腱または靭帯の手術後の患者伸延骨形成を有している又は経験している患者臀部または円板の置換メニスカスの修復脊椎固定または膝臀部肩部肘手関節または下顎などのプロテーゼ固定の後の患者釘、スクリューおよびプレートなどの骨接合材料が固定された患者癒着不能または変形癒合の骨折を有する患者脛骨または第一足指からなどのオステアトミアosteatomia後の患者移植物の移植後の患者外傷または関節炎が原因の膝の関節軟骨変性ターナー症候群の患者のオステオポローシス男性のオステオポローシス慢性透析の成人患者APCDAPCDにおける栄養不良関連性心臓血管疾患APCDにおけるカヘキシーの反転APCDにおけるガンAPCDにおける慢性閉塞性abstractive肺疾患APCDにおけるHIVAPCDを伴う高齢者APCDにおける慢性肝疾患APCDにおける疲労症候群クローン病肝機能の障害HIV感染症を伴う男性短小腸症候群中心性肥満HIV関連性リポジストロフィ症候群男性の不妊症主要な待機手術後の患者アルコール薬の解毒または神経学的な外傷加齢虚弱な高齢者骨関節炎外傷性に傷害された軟骨勃起不全線維筋痛記憶障害うつ病外傷性の脳傷害くも膜下出血非常に低い出生時体重代謝症候群糖質コルチコイドミオパシーまたは小児の糖質コルチコイド治療による低身長の治療の方法であって、成長ホルモンも、筋肉組織神経組織または傷のヒーリングの促進;損傷を受けた組織の血流の促進または改善;或いは損傷を受けた組織における感染率の減少のために使用されており、効果的な量の治療的に効果的な量の請求項19~21の何れか1項に記載の化合物を、それを必要とする患者に投与することを備えた方法。請求項19~21の何れか1項に記載の化合物の、以下の疾患の治療に使用される医薬の製造における使用:成長ホルモン分泌不全症ターナー症候群プラーダーヴィリ症候群ヌーナン症候群ダウン症候群慢性腎臓病、若年性関節リウマチ嚢胞性線維症、HAART治療を受けている小児におけるHIV感染症HIVHALS小児在胎齢が短く誕生した小さい小児SGASGAを除く極低出生体重VLBWで誕生した小児における低身長骨格形成異常低軟骨形成症軟骨形成不全症特発性低身長ISS成人におけるGHD脛骨腓骨大腿骨上腕骨橈骨尺骨鎖骨中手骨中足骨および指などの長骨における、又は、それらの骨折頭蓋骨手の基部および足の基部などの海綿状骨における、又は、それらの骨折手膝または肩部などにおける腱または靭帯の手術後の患者伸延骨形成を有している又は経験している患者臀部または円板の置換メニスカスの修復脊椎固定または膝臀部肩部肘手関節または下顎などのプロテーゼ固定の後の患者釘、スクリューおよびプレートなどの骨接合材料が固定された患者癒着不能または変形癒合の骨折を有する患者脛骨または第一足指からなどのオステアトミアosteatomia後の患者移植物の移植後の患者外傷または関節炎が原因の膝の関節軟骨変性ターナー症候群の患者のオステオポローシス男性のオステオポローシス慢性透析の成人患者APCDAPCDにおける栄養不良関連性心臓血管疾患APCDにおけるカヘキシーの反転APCDにおけるガンAPCDにおける慢性閉塞性abstractive肺疾患APCDにおけるHIVAPCDを伴う高齢者APCDにおける慢性肝疾患APCDにおける疲労症候群クローン病肝機能の障害HIV感染症を伴う男性短小腸症候群中心性肥満HIV関連性リポジストロフィ症候群男性の不妊症主要な待機手術後の患者アルコール薬の解毒または神経学的な外傷加齢虚弱な高齢者骨関節炎外傷性に傷害された軟骨勃起不全線維筋痛記憶障害うつ病外傷性の脳傷害くも膜下出血非常に低い出生時体重代謝症候群糖質コルチコイドミオパシーまたは小児の糖質コルチコイド治療による低身長であって、成長ホルモンも、筋肉組織、神経組織または傷のヒーリングの促進;損傷を受けた組織の血流の促進または改善;或いは損傷を受けた組織における感染率の減少のために使用されている疾患。結合されるペプチド例えば、水などの適切な溶媒に溶解されるを、5~1000倍過剰の第1化合物上記で議論したとおりと混合し、トランスグルタミナーゼが添加される。適切なトランスグルタミナーゼは、例えば、Streptomycesmobaraenese、Streptomyceslyticus又はモルモットの肝臓から単離されたものである。添加すべきトランスグルタミナーゼの量は、反応の所望の速度rateに依存する。より多くの酵素を添加すれば、反応はより速く進行する。温度は、周囲温度ambientであるか又は約40°Cまで若干上昇してもよい。前記反応が所望のポイント即ち、結合されるべきペプチドの所望の画分が機能化されるポイントに達したとき、第2化合物上記で議論したとおりが添加されて結合型ペプチドが生じる。結合型ペプチドは、引続いて精製されてもよい例えば、カラム技術によって。また、1以上の付加的な精製工程を、反応シークエンスの早期に含ませてもよい例えば、過剰な第1化合物を除去するため又は前記酵素を除去するため。第2工程において、温度を、反応速度を増加させるために上昇させてもよいというのも、この工程は、酵素活性に依存しないからである。典型的な反応条件は、文献Biochem3513072130801996BioconjugateChem115025092000andBioconjugateChem127017101991中に見出すことができる。略語TGaseUS5156956に記載のStreptoverticilliummobaraenaeからの又はWO9606931A1に記載のStreptomycesLydicusからの微生物のトランスグルタミナーゼ。分析方法:MaldiTof質量分析。分子量は、AutoflexMaldiTof機器を用いて決定された。サンプルは、サンドイッチ法にしたがって調製された。マトリックス1は、1mlのアセトン中に10mgのアルファシアノ4ヒドロキシ桂皮酸を含有する溶液であった。マトリックス2は、水で希釈した50アセトニトリル1ml中に10mgのアルファシアノ4ヒドロキシ桂皮酸を含有する溶液であった。サンプルは、ターゲット上で順次、1μlマトリックス1を適用し、空気乾燥し、1μl3トリフルオロ酢酸を適用し、1μlサンプルを適用し、1μlマトリックス2を適用し、空気乾燥し、フラッシングflushingすることによってターゲットプレートを水で洗浄し、そして最後に空気乾燥することによって調製された。スペクトルは、20レーザー出力および標準方法を用いて、320kDa範囲に関して取得されたこれは機器から供給される。RPHPLCRPHPLC分析を、Waters996ダイオードアレイ検出器を備えたWaters2690SeparationModule上で実施した。AVydac218TP5446mmx250mm5μmC18シリカカラムを使用し、検出をUVで214nm、254nm、280nmおよび301nmで行った。前記カラムを、01トリフルオロ酢酸H2Oで平衡化し、01トリフルオロ酢酸H2Oに対して0から90アセトニトリルのグラジエントで、50min、42 ゚C、05mlminの流速で溶出した。LCMSLCMS分析を、2つのPerkinElmerシリーズ200マイクロポンプ、PerkinElmerシリーズ200オートサンプラー、アプライドバイオシステム785AUV検出器およびSedex75蒸発光散乱検出器EvaporativeLightscatteringdetectorを備えるPESciexAPI100質量分析計で実施した。WatersXterra30mmx50mm5μC18シリカカラムを、15mlminで室温で溶出した。それを5アセトニトリル01トリフルオロ酢酸H2Oで平衡化し、5アセトニトリル01トリフルオロ酢酸H2Oで10min、そして90アセトニトリル01トリフルオロ酢酸H2Oまでのリニアグラジエントで7min溶出した。検出を、UV検出器で214nm及び蒸発光散乱で行った。カラム溶出液のフラクションを、PESciexAPI100質量分析計のイオンスプレーインターフェースに導入した。質量範囲300~2000amuを、試験の間2秒毎にスキャンした。エドマンシークエンシングアミノ酸配列を、AppliedBiosystemモデル494タンパク質シークエンサーを用いた自動化エドマン分解で、基本的に製造者によって記載されたとおりに決定した。通常、50pmolのペプチドを、分析に使用した。PEG化PEGylatedまたは脂肪酸誘導体化fattyacidderivatizedアミノ酸残基は、ブランクのエドマンサイクルを提示する。タンパク質の定量タンパク質濃度を、UV分光光度計を用いて280nmでの吸収を測定することで見積もった。16170M÷1cm÷1のモル吸光係数を使用した。量を、ボリュームvolumesおよび濃度から計算した。誘導体化部位の決定に関する酵素的なペプチドマッピングペプチドマッピングを、還元された又はアルキル化されたタンパク質のAspN消化を用いて行った。最初に、タンパク質を標準の手順にしたがいDTTおよびヨードアセトアミドで処理した。アルキル化された産物を、HPLCを用いて精製した。引き続いて、アルキル化された精製産物を、酵素:基質の比率を1100でエンドプロテアーゼAspNで一晩消化した。消化物を、C18カラムおよび標準のトリフルオロ酢酸アセトニトリル緩衝系を用いて、HPLC分離した。結果的に生じたペプチドマップを、未誘導体化hGHのものと比較した。そして、異なる保持時間を有するフラクションを、収集し、Malditof質量分析を用いてさらに分析した。SDSpageSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を、NuPAGE412BisTrisゲルを用いて実施した。ゲルを、銀染色またはクーマシー染色した。そして妥当な場合には、MMKurfurstAnalBiochem2002442481992による記載のとおりにPEGに関してヨウ化バリウムで染色した。hGHのmPEGとの又は親油性成分lipophilicmoietyとの結合に関する図解IhGHヒト成長ホルモンIINε141hGHIIINε141hGHIVNε1412ブタノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGHVNε1412ピペリジン4イルエチルオキシイミノエチルhGH。例1hGHのトランスアミノ化でのNε141hGHの生成hGHを、リン酸緩衝液に溶解した。この溶液を、リン酸緩衝液の溶液と混合した。最終的に、リン酸緩衝液に溶解したTGaseの溶液を添加し、上記のボリュームをリン酸緩衝液の添加によって10mlへと調整し、これによって13ジアミノプロパン2オールの濃度02Mを得た。組合わされた混合物を、4時間37 ゚Cでインキュベーションした。温度を室温に下げ、Nエチルマレイミドを終濃度の1mMまで添加した。さらに1時間後、混合物を10ボリュームのトリス緩衝液で希釈した。例2Nε141hGHのイオン交換クロマトグラフィー例1で生成した溶液を、緩衝液Aで前平衡化したMonoQ10100GLカラムに適用した。それを次に2mlminの流速で緩衝液B50mMtris2MNaClpH85の3から6のグラジエントで溶出した。フラクションを280nmでのUV吸収に基づいて収集した。そして、MaldiTof分析を選択したフラクションで行った。MaldiTof質量分析法による予想mwを提示している最大ピークに対応するフラクションをプールした。例3Nε141hGHのキャラクタリゼーション例2で収集されたプールのペプチドマッピングは次の事項を提示した。その事項とは、AspN断片AA130146が、グルタミン残基の側鎖中にアミノアルコールの付加に対応する73amuの質量増加を提示したことである。これは本来のhGHのものと比較した際に、HPLCマップ中で保持時間が変化した唯一のペプチドであった。この断片は、2つのグルタミン残基を含有する。前記ペプチドをエドマンシークエンシングに供試した。そしてGln137は予測された産物で発見されたが、Gln141はブランクのエドマンサイクルを提示した。誘導体化はGln141で選択的に発生したと結論された。例4N4mPEGylブチルアミド式中のmPEGylは、多分散性であり、約20kDaの分子量を有するの合成工程12ブチルイソインドール13ジオン商業的に利用可能なNフタルイミドおよびNBocヒドロキシルアミンの混合物に、アセトニトリルを引続いて18ジアザビシクロ540ウンデ7エンを添加した。前記反応混合物を、室温で30min、次に50 ゚Cで2日間撹拌した。それを水および1N塩酸の混合物で希釈した。それを酢酸エチルで抽出した。有機物相organicphaseをブライン50mlで洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。粗製品crudeproductを、ヘプタン酢酸エチル10から01のグラジエントを溶出液として用いて、シリカ60g上でクロマトグラフィーで精製し、208gの2ブチルイソインドール13ジオンを生成した。工程2:Nカルバミン酸tertブチルエステルヒドラジン水和物を、エタノール中の2ブチルイソインドール13ジオンの溶液に添加した。反応混合物を、80 ゚Cで65h撹拌した。溶媒を、減圧下invacuoで除去した。残渣をトルエンに溶解し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、1N塩酸中に懸濁した。沈殿物を、濾過で除去し、水で洗浄した。濾過物および洗浄液体washliquidsを、混合し、炭酸カリウムで塩基性とした。溶液を、ジクロロメタンで抽出した。有機物層を、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、039gのNカルバミン酸tertブチルエステルを生成した。炭酸カリウムを水相に添加した、これをジクロロメタンで抽出した。これらの混合した有機物層を、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を減圧下で除去して、別の039gのNカルバミン酸tertブチルエステルを得た。工程3:Nブタノリアミドブトキシカルバミン酸tertブチルエステル商業的に利用可能なmPEG2000ylブタン酸のNヒドロキシスクシンイミドエステルを、ジクロロメタンに溶解した。Nカルバミン酸tertブチルエステルを添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ジエチルエーテルを、沈殿が得られるまで添加した。沈殿を、濾過で分離した。物質を減圧下で乾燥して、239gのNブタノリアミドbutanolyaminoブトキシカルバミン酸tertブチルエステルを産出した。工程4N4ブタノリアミドトリフルオロ酢酸を、ジクロロメタン中のNブタノリアミノブトキシカルバミン酸tertブチルエステルの溶液に添加した。反応混合物を、30min撹拌した。ジエチルエーテルを添加した。形成された沈殿を、濾過で単離した。それをジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥し、196gのN4ブタノリアミドbutanolyamideを得た。例5Nε141hGHの酸化でのNε141hGHの生成487mgのを含有している例2からのプールしたフラクションの緩衝液を、アミコンウルトラ15限外濾過装置を用いて、15mMトリエタノールアミンpH85緩衝液に対して4回交換した。最終的に溶液は、2mlまで濃縮された。これに2mllの100mMメチオニン溶液15mMトリエタノールアミン緩衝液pH85中に存在が添加された。最終的に、04mlの25mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、そして混合物を30min室温でインキュベーションした。次にそれを氷上で冷却し、16mlの氷冷したNNジメチルホルムアミドを添加した。例6Nε141hGHのN4mPEGylブチルアミドのオキシム化OximationでのNε1412ブタノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGH式中のmPEGylは、多分散性であり、約20kDaの分子量を有するの生成380mgのN4mPEGylブチルアミドbutyramideを、4mlの水に溶解し、pHを1N塩酸で60に調整した。例5から結果的に生じた混合物を、次に穏やかに撹拌しながらゆっくりと添加し、反応を室温で72h進行させた。例7Nε1412ブタノイルアミノブチルオキシイミノエチルhGHのイオン交換クロマトグラフィー式中のmPEGylは、多分散性であり、約20kDaの分子量を有する例6で結果的に得られた溶液を、緩衝液Aで前平衡化したMonoQ10100GLカラムに適用した。次にそれを緩衝液Aにおいて0から7の緩衝液Bのグラジエントで流速05mlminで1120min以上溶出した。フラクションを280nmでのUV吸収に基づいて収集し、MaldiTof分析を選択したフラクションで行った。MaldiTof質量分析によって予想されたmwを提示している最大ピークに対応するフラクションをプールした。MaldiTof分析は、mPEGの多分散特性と一致して43130Da付近を中心とするブロードなピークを呈した。SDSpageは、60kDaの見かけの分子量を有する単一バンドを示した。前記バンドは銀およびヨウ化バリウムの双方で染色されたので、PEG誘導化タンパク質であることが確認された。これらの分析的結果によって、分離された産物化合物がhGHのモノペグ化誘導体monopegylatedderivativeであることが確認された。例814エチルピペリジン1イルヘキサデカン1オンの合成工程142エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステルトシルクロライドを、商業的に利用可能な4ピペリジン1カルボサイクリックエステルtertブチルエステルおよびトリエチルアミンをジクロロメタン中に含む溶液に添加した。反応混合物を、室温で16h撹拌した。それを酢酸エチルで希釈し、硫化水素sodiumhydrogensulphateの10水溶液で洗浄した。水相を、酢酸エチルで抽出した。組合せた有機物層organiclayersを、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、酢酸エチルヘプタンを最初に12を次に11を溶出液として用いて、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーで精製し、604gの42エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステルを生成した。1HNMRδ105145155250265405735780。工程242エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステル0 ゚Cで、水素化ナトリウムを鉱物油中に含む60懸濁物を、NヒドロキシフタルイミドをNNジメチルホルムアミド中に含む溶液に添加した。反応混合物を、0 ゚Cで45分間撹拌した。42エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステルをNNジメチルホルムアミド中に含む溶液およびヨウ化テトラブチルアンモニウムを、逐次添加した。反応混合物を、60 ゚Cで2日間処理し、室温に冷却した。水を慎重に添加した。反応混合物を、酢酸エチルで希釈し、硫化水素の10水溶液で洗浄した。水相を、酢酸エチルで抽出した。組合わせた有機物層organiclayersを、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、酢酸エチルヘプタン11を溶出液として用いて、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーで精製し、436gの42エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステルを生成した。1HNMRδ115150175275410430780。工程32エトキシイソインドール13ジオントリフルオロ酢酸を、ジクロロメタン中の42エチルピペリジン1カルボン酸tertブチルエステルの溶液に添加した。反応混合物を、室温で50min撹拌した。溶媒を、減圧下で除去した。残渣をジクロロメタンに溶解し、溶媒を減圧下で除去した。後者の手順を2回繰り返して、646gの粗製のトリフルオロ酢酸塩の2エトキシイソインドール13ジオンを生成した。MSmz275M11HNMRδ130165190290330420790830865。工程422ピペリジン4イルエトキシイソインドール13ジオン0 ゚Cで、13エチルカルボジイミドハイドロクロライドを、NNジメチルホルムアミドおよびジクロロメタン中のパルミン酸palmicacidおよび34ジヒドロ3ヒドロキシ4オキソ123ベンゾトリアゾールの溶液に添加した。反応混合物を、0 ゚Cで20min撹拌した。NNジメチルホルムアミドおよびエチルジイソプロピルアミン中のトリフルオロ酢酸塩の2エトキシイソインドール13ジオンの溶液を、連続的に添加した。反応混合物を、室温にまで暖めている間に16h撹拌した。それを酢酸エチルで希釈し、硫化水素sodiumhydrogensulphateの10水溶液で洗浄した。水相を、酢酸エチルで抽出した。組合わせた有機物層organiclayersを、水と炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液との混合物で洗浄し、硫酸マグネシウムに対して乾燥させた。粗製品を、酢酸エチルヘプタン11を溶出液として用いて、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーで精製し、152gの22ピペリジン4イルエトキシイソインドール13ジオンを生成した。MSmz513M11HNMRδ090110125145165180230295385420440790。工程5ヒドラジン水和物を、エタノール中の22ピペリジン4イルエトキシイソインドール13ジオンの溶液に添加した。反応混合物を熱して75min還流refluxし、室温に冷却した。形成された沈殿を、濾過で除去した。濾過物の溶媒を、減圧下で除去した。粗製品を、ジクロロメタンメタノール25アンモニア水の混合物を溶出液として用いて、シリカ上でフラッシュクロマトグラフィーで精製し、800mgの14エチルピペリジン1イルヘキサデカン1オンを生成した。MSmz383M11HNMRδ0801251601701652708t2H260305380460。例9ZGlnGlyのアミノ基転移での42ベンジルオキシカルボニルアミノブチリルアミノ酢酸の生成30mgZGlnGlyを、リン酸緩衝液に溶解した。これに、リン酸緩衝液の溶液を添加した。最終的に、リン酸緩衝液に溶解したTGaseの溶液を添加し、組合わせた混合物を4時間、37 ゚Cでインキュベーションした。温度を室温に下げ、Nエチルマレイミドを終濃度の1mMまで添加した。更に1時間後、混合物を10ボリュームの水で希釈した。産物を、この溶液から半調製的semipreparativeなHPLCを7μmC18シリカを充填した25mmx250mmカラム上で1回onerun行って単離した。前記カラムを、01トリフルオロ酢酸H2O中に10から30アセトニトリルを含有する溶液のグラジエントで、10mlmin、40 ゚Cの温度で、50minで溶出した。主要なピークに対応するフラクションを含有しているペプチドを、収集し、30mlに約3ボリュームのH2Oで希釈し、凍結乾燥した。得られた最終的な産物の特徴を調べたところ、RPHPLCで産物は1275minの保持時間を有しており、LCMSで19minの保持時間のものが4115amuのMHに対応する質量ピークを有していた、この結果は予想された構造と一致していた。例1042ベンジルオキシカルボニルアミノブチリルアミノ酢酸の酸化での2ベンジルオキシカルボニルアミノ4ブチリルアミノ酢酸の生成08mgの42ベンジルオキシカルボニルアミノブチリルアミノ酢酸を、4mlの15mMトリエタノールアミン緩衝剤pH85に溶解した。これに1mlの173mMメチオニン溶液水に溶解を添加した。最終的に、05mlの24mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、そして混合物を10min、0 ゚Cでインキュベーションした。例112ベンジルオキシカルボニルアミノ4ブチリルアミノ酢酸のオキシム化でのエトキシイミノエチルカルバモイルブチリルアミノ酢酸の生成2mgの14エチルピペリジン1イルヘキサデカン1オンを、3mlのNNジメチルホルムアミドに溶解し、溶液を氷上で冷却した。053mlの本溶液に、例10からの138mlの反応混合物を添加し、混合物を0 ゚Cで一晩反応させた。RPHPLCによって、新しい産物の形成が確認された。それをRPHPLCにより分析用スケールで単離し、MaldiTOF質量分析に供し、予測された構造と一致したMH7447amuに相当するピークが出現した。例12Nε141hGHの酸化でのNε141hGHの生成5mgのNε141hGHを、05mlの15mMトリエタノールアミン緩衝剤pH85に溶解した。これに013mlの173mMメチオニン溶液水に溶解を添加した。最終的に、006mlの24mM過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、そして混合物を10min、0 ゚Cでインキュベーションした。例13Nε141hGHの14エチルピペリジン1イルヘキサデカン1オンでのオキシム化によるNε1412ピペリジン4イルエチルオキシイミノエチルhGHの生成2mgの14エチルピペリジン1イルヘキサデカン1オンを、3mlのNNジメチルホルムアミドに溶解し、溶液を氷上で冷却した。例12からの014mlの反応混合物を添加し、混合物を0 ゚Cで一晩反応させた。例14Nε1412ピペリジン4イルエチルオキシイミノエチルhGHのキャラクタリゼーション例13からの粗製の反応混合物のアリコートを、RPHPLCにより分析用スケールanalyticalscaleで分画し、MaldiTOF質量分析を前記フラクションで行った。産物の構造から予想される予想分子量を呈している前記フラクションを、ペプチドマッピングに供した。前記マップは次の事項を示した。その事項とは、AspN断片AA130146が、グルタミン残基の側鎖中に2ピペリジン4イルエチルオキシイミノエチルの付加に対応する407amuの質量増加を提示したことである。これは本来のhGHのものと比較した際に、HPLCマップ中で保持時間が変化した唯一のペプチドであった。この断片は、2つのグルタミン残基を含有する。前記ペプチドをエドマンシークエンシングに供試した。そしてGln137は予測された産物で発見されたが、Gln141はブランクのエドマンサイクルを提示した。誘導体化はGln141で選択的に発生したことが結論づけられた。