"重鎖及び軽鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含み、軽鎖の可変ドメインが、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号7に示される配列を含む、上記ヒト化アゴニスト抗体。重鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列VH1-31-46JH4配列番号52由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。重鎖の可変ドメインの25、37、41、48、71、73、及び76位の少なくとも1つの残基がドナー残基である、請求項2に記載のヒト化抗体。配列番号30、配列番号38、又は配列番号40に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項3に記載のヒト化抗体。重鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインは、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含み、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列VH1-21-eJH4配列番号54由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。配列番号46に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項5に記載のヒト化抗体。重鎖の可変ドメインの25、37、41、48、71、76、及び78位の少なくとも1つの残基がドナー残基である、請求項5に記載のヒト化抗体。配列番号42、又は配列番号44に示される重鎖可変ドメイン配列を有する、請求項7に記載のヒト化抗体。軽鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号6又は配列番号7に示される配列を含み、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列VK12-11L23JK4配列番号48由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。軽鎖の可変ドメインの1、2、3、4、47、60、及び70位の少なくとも1つの残基がドナー残基である、請求項9に記載のヒト化抗体。配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22又は配列番号24に示される軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項10に記載のヒト化抗体。軽鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号6又は配列番号7に示される配列を含み、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団配列VK36-1-1A27JK4配列番号50由来である、上記ヒト化アゴニスト抗体。軽鎖の可変ドメインの2、47、58、70、71、及び85位の少なくとも1つの残基がドナー残基である、請求項12に記載のヒト化抗体。配列番号26、又は配列番号28に示される軽鎖可変ドメイン配列を有する、請求項13に記載のヒト化抗体。配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46からなる群から選択される配列を含む重鎖、並びに配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、及び配列番号28からなる群から選択される配列を含む軽鎖を有する、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体。全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、又はFab、修飾されたFab’、Fab’、Fab’2、Fv、VH、VL、若しくはscFv断片などのこの断片からなる群から選択される、請求項1から15までのいずれか一項に記載のアゴニスト抗体分子。軽鎖の可変ドメインが、請求項15に記載の抗体の軽鎖可変ドメインと少なくとも80の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが、請求項15に記載の抗体の重鎖可変ドメインと少なくとも80の同一性又は類似性を有する配列を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体。5nM未満の単離されたヒトPD-1例えばヒト細胞外ドメインに対する結合親和性を有するヒト化アゴニスト抗体。請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖単数又は複数及び/又は軽鎖単数又は複数をコードする単離されたDNA配列。請求項19に記載の1又は複数のDNA配列を含むクローニングベクター又は発現ベクター。請求項20に記載の1又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。請求項21に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗体を単離することを含む、請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法。請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体を、1又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。他の有効成分をさらに含む、請求項23に記載の医薬組成物。免疫障害の治療又は予防において使用するための、請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項23又は請求項24に記載の医薬組成物。免疫障害の治療又は予防するための薬剤の製造における、請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体の使用。したがって患者の治療に適した改善されたアゴニスト抗PD-1抗体、特にPD1-PDL1又はPD1-PDL2相互作用をブロックしないものが当該技術分野では依然として必要である。本発明者らは、現在、例えばT細胞応答を低下させることにより、免疫障害の治療又は予防での使用に適した高親和性アゴニスト抗PD-1抗体を同定した。被験者へのPD-1特異的抗体の投与により治療することができる免疫障害の非限定例には、限定されないが、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、クローン病、全身性紅斑性狼瘡、I型糖尿病、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、過剰増殖性免疫障害hyperproliferativeimmunedisorder、癌、及び感染症が含まれる。ヒト化抗体が由来する親マウス抗体ハイブリドーマは、本明細書ではクローン19と呼ばれる。クローン19に由来するクローン化組換え抗体は、抗体CA051_00949と本明細書で呼ばれ、本明細書で949とも呼ばれる。抗体可変ドメインにおける残基は、通常、Kabatらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Kabatら、1987、免疫学的関心のあるタンパク質の配列SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、米国保健社会福祉省USDepartmentofHealthandHumanServices、NIH、USA以後、Kabatら前述に記載されている。特に明記しない場合は、この番号付けシステムが本明細書において使用される。Kabat残基表記法は、アミノ酸残基の線形番号付けと必ずしも直接対応しない。実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても相補性決定領域CDRであっても、構造成分の短縮又はそこへの挿入に対応して、厳密なKabat番号付けの場合よりも少ない又は多いアミノ酸を含んでもよい。残基の正しいKabat番号付けは、抗体の配列の相同性の残基を標準的なKabat番号付け配列とアラインメントすることにより、所定の抗体について決定してもよい。重鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムに従って、残基31~35CDR-H1、残基50~65CDR-H2及び残基95~102CDR-H3に位置している。しかしながら、ChothiaChothia,C.及びLesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-9171987によると、CDR-H1に同等なループは残基26から残基32に伸びる。故に特に指示のない限り本明細書で使用するときCDR-H1とは、Kabat番号付けシステム及びChothiaの位相的ループ定義の組合せにより記載された残基26~35を指すことが意図される。軽鎖可変ドメインのCDRは、Kabat番号付けシステムに従うと、残基24~34CDR-L1、残基50~56CDR-L2、及び残基89~97CDR-L3に位置される。本明細書で使用するとき、用語アゴニスト抗体は、PD-1の生物学的シグナル伝達活性を刺激し、細胞内ドメインへのホスファターゼ動員、並びに従ってT又はB細胞受容体シグナル伝達及び活性化に関連した表現型特性の不活化をもたらすことができる抗体を表す。本発明に使用するための抗体は、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。融合タンパク質、例えばPD-1-Fc融合タンパク質、又はポリペプチド活性化T細胞などのを組換え的に又は自然に発現する細胞を含むPD-1ポリペプチド/タンパク質は、PD-1を特異的に認識する抗体を産生するのに用いることができる。PD-1ポリペプチドは、成熟なポリペプチド又は生物学的に活性なこの断片若しくは誘導体であってもよい。適切にはPD-1ポリペプチドは、成熟なヒトポリペプチド又はこの細胞外ドメイン若しくは断片である。細胞外ドメインは、典型的には、PD-1タンパク質のアミノ酸21~170SWISSPROTエントリーQ15116を含む。PD-1ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当該技術分野において周知な方法によって調製されてもよく、又は天然の生物学的供給源から回収されてもよい。本出願では、用語ポリペプチドには、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が含まれる。これらは、他に明記されていなければ、相互交換して用いられる。PD-1ポリペプチドは、ある場合には、例えばアフィニティータグに融合された融合タンパク質などの巨大タンパク質の一部であってもよい。PD-1ポリペプチドに対して生じた抗体は、動物の免疫付与が必要な場合は、周知であり日常的なプロトコルを用いて動物に、好ましくは非ヒト動物に該ポリペプチドを投与することによって得ることができ、例えば、HandbookofExperimentalImmunology,D.M.Weir編,Vol4,BlackwellScientificPublishers,Oxford,England,1986を参照されたい。多数の温血動物、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタを免疫してもよい。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが、一般的には最も適切である。モノクローナル抗体は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって調製されてもよく、例えば、ハイブリドーマ技術KohlerMilstein,1975,Nature,256:495-497、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術Kozborら,1983,ImmunologyToday,4:72、及びEBVハイブリドーマ技術Coleら,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,77-96頁,AlanRLiss,Inc.,1985が挙げられる。また、本発明に使用するための抗体は、例えば、Babcook,J.ら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA9315:7843-78481;WO92/02551;WO2004/051268及び国際特許出願番号WO2004/106377によって報告されている方法によって、特異的抗体を産生するために選択される単一のリンパ球から生じさせた免疫グロブリン可変領域cDNAをクローニングし、発現させることによる単一のリンパ球抗体法を用いて生じさせてもよい。抗体のスクリーニングは、ヒトPD-1への結合を測定するアッセイ、及び/又はPD1活性にアゴニスト作用を及ぼす能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。特に、結合アッセイの例としては、プレートに固相化されたヒトPD-1及びヒトFcの融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に結合した抗PD-1抗体を検出するためのコンジュゲートされた二次抗体を使用するELISAが挙げられる。適切なアゴニスト作用及びリガンドブロッキングアッセイの例は、本明細書の実施例に記載されている。ヒト化抗体CDRグラフト抗体を含むは、非ヒト種由来の1又は複数の相補性決定領域CDRとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である例えば、US5,585,089;WO91/09967を参照されたい。CDR全体ではなくCDRの特異性決定残基を移すことが単に必要なだけであり得ることは理解されよう例えば、Kashmiriら,2005,Methods,36,25-34を参照されたい。ヒト化抗体は、場合により、CDRに由来する非ヒト種由来の1又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。本発明は、ヒトPD-1に特異性を有するアゴニストヒト化抗体を提供する。アゴニストマウス抗PD-1抗体クローン19は、PCT/IB2009/06940未公開に記載されており、この抗体の可変領域及びCDRの配列が図1に提供されている。特にこの抗体のCDRは、図1c、配列番号1~6に提供されている。クローン19由来のCDRL3配列番号6の改善されたバージョンは、図2a配列番号7に提供され、潜在的な脱アミド化部位が修飾されている。したがって、一実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖を含む、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体であって、重鎖の可変ドメインが、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含み、並びに軽鎖の可変ドメインが、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号7に示される配列を含む、上記ヒト化アゴニスト抗体を提供する。本明細書中で使用するとき、用語ヒト化抗体分子とは、重鎖及び/又は軽鎖が、アクセプター抗体例えば、ヒト抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされたドナー抗体例えば、マウスモノクローナル抗体由来の1又は複数のCDR所望により、1又は複数の修飾されたCDRを含むを含む抗体分子を指す。概説については、Vaughanら,NatureBiotechnology,16,535-539,1998を参照されたい。一実施形態では、移されている全CDRというよりはむしろ、本明細書において上記されたいずれか1つのCDR由来の特異性決定残基のほんの1又は複数が、ヒト抗体フレームワークに移されている例えば、Kashmiriら,2005,Methods,36,25-34を参照されたい。一実施形態では、本明細書において上記された1つ又は複数のCDR由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。別の一実施形態では、本明細書において上記された各々のCDR由来の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移されている。CDR又は特異性決定残基をグラフトした場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、CDRが誘導されるドナー抗体のクラス/タイプを考慮して使用されてもよく、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域が含まれる。適切には、本発明に係るヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域、並びに、図1c又は図2cに示される1若しくは複数のCDRを含む可変ドメインを有する。このようにして、一実施形態では、ヒトPD-1に結合するアゴニストヒト化抗体が提供され、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーCDRを含む。本発明において用いることができるヒトフレームワークの例としては、KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及びPOMが挙げられるKabatら、上述。例えば、KOL及びNEWMは重鎖に使用することができ、REIは軽鎖に使用することができ、並びにEU、LAY及びPOMは重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよい;http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/で利用可能である。本発明に係るヒト化抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、所望により、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。本発明のヒト化抗体の重鎖についてこのように適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団のVH1配列1-31-46、並びにJH4配列番号52由来である。したがって、一例では、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、重鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団のVH1配列1-31-46、並びにJH4由来である、上記抗体が提供される。ヒトJH4の配列は、以下の通りである:YFDYWGQGTLVTVS配列番号56。YFDYモチーフはCDR-H3の一部であり、フレームワーク4の一部ではないRavetch,JV.ら,1981,Cell,27,583-591。本発明のヒト化抗体の重鎖に関する別の適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団VH1配列1-21-e、及びJH4由来である配列番号54。したがって、一例では、CDR-H1について配列番号1に示される配列、CDR-H2について配列番号2に示される配列、及びCDR-H3について配列番号3に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、重鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団VH1配列1-21-e、及びJH4、例えば配列番号46を参照されたい由来である、上記アゴニストヒト化抗体が提供される。ヒトJH4の配列は、以下の通りである:YFDYWGQGTLVTVS配列番号56。YFDYモチーフはCDR-H3の一部であり、フレームワーク4の一部ではないRavetch,JV.ら,1981,Cell,27,583-591。一例では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号46に示される配列を含む。本発明のヒト化抗体の軽鎖について適切なフレームワーク領域は、ヒト生殖系列下位集団のVK1配列2-1-1L23、並びにJK4配列番号48由来である。したがって、一例では、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号6又は配列番号7に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、軽鎖フレームワーク領域は、ヒト下位集団の配列2-1-1L23、並びにJK4由来である、上記抗体が提供される。JK4配列は、以下の通りである:LTFGGGTKVEIK配列番号57。LTモチーフはCDR-L3の一部であり、フレームワーク4の一部ではないHieter,PA.ら,1982,J.Biol.Chem.,257,1516-1522。本発明のヒト化抗体の軽鎖に関する別の適切なフレームワーク領域は、ヒト下位集団VK3配列6-1-1A27、及びJK4由来である配列番号50。したがって、一例では、CDR-L1について配列番号4に示される配列、CDR-L2について配列番号5に示される配列、及びCDR-L3について配列番号6又は配列番号7に示される配列を含むアゴニストヒト化抗体であって、軽鎖フレームワーク領域が、ヒト下位集団VK3配列6-1-1A27、及びJK4由来である、上記アゴニストヒト化抗体が提供される。ヒトJK4の配列は、以下の通りである:LTFGGGTKVEIK配列番号57。LTモチーフはCDR-L3の一部であり、フレームワーク4の一部ではないHieter,PA.ら,1982,J.Biol.Chem.,257,1516-1522。また、本発明のヒト化抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同じ配列を正確に有している必要はない。例えば、稀な残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプについてより出現することが多い残基に変化されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域において選択された残基は、ドナー抗体と同じ位置で見られる残基に対応するように変化されてもよいReichmannら,1998,Nature,332,323-324を参照されたい。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限に止めておくべきである。変化が必要とされ得るアクセプターフレームワーク領域において残基を選択するためのプロトコルは、WO91/09967に記載されている。適切には、本発明のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖がヒトVH1配列1-31-46、並びにJH4を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、3つのドナーCDR配列番号1、2及び3に加えて、25位、37位、41位、48位、71位、73位及び76位のうちの少なくとも1つにドナー残基を含むKabatら上述による。したがって、一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの25位、37位、41位、48位、71位、73位及び76位のそれぞれの残基がドナー残基であるCDRグラフト抗体が提供され、例えば配列番号30に示される配列を参照されたい。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの25、37、41、及び48位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号38に示される配列を参照されたい。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの25位の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号40に示される配列を参照されたい。適切には、本発明のヒト化抗体分子では、アクセプター重鎖がヒトVH1配列1-21-e、及びJH4を有する場合、重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、3つのドナーCDR配列番号1、2、及び3に加えて、25、37、41、48、71、76、及び78位の少なくとも1つにドナー残基を含むKabatら上述による。したがって、一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの25、37、41、48、71、76、及び78位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号42に示される配列を参照されたい。一例では、少なくとも、重鎖の可変ドメインの25、37、41、及び48位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号44に示される配列を参照されたい。適切には、本発明によるヒト化抗体分子では、アクセプター軽鎖がヒト下位集団VK1配列2-1-1L23、及びJK4を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、3つのドナーCDR配列番号4、5、及び6又は7に加えて、1、2、3、4、47、60、及び70位の少なくとも1つにドナー残基を含む。したがって、一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの1、2、3、4、47、60、及び70位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号10を参照されたい。一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの1、2、3、及び4位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号18又は配列番号20を参照されたい。一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの1、2、及び3位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば配列番号22又は配列番号24を参照されたい。適切には、本発明によるヒト化抗体分子では、アクセプター軽鎖がヒト下位集団VK3配列6-1-1A27、及びJK4を有する場合、軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、3つのドナーCDR配列番号4、5、及び6又は7に加えて、2、47、58、70、71、及び85位の少なくとも1つにドナー残基を含む。したがって、一例では、少なくとも、軽鎖の可変ドメインの2、47、58、70、71、及び85位の各々の残基がドナー残基である、ヒト化抗体が提供される例えば、配列番号26又は配列番号28を参照されたい。ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、CDRが本来誘導されている抗体由来の残基である。ドナー残基は、ヒトアクセプターフレームワーク由来の適切な残基に置換されてもよいアクセプター残基。ドナー残基を各フレームワークに置換するための適切なヒトアクセプター残基は、以下に挙げられる。本発明の抗体分子は、適切には、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を含む。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46からなる群から選択される配列を含む重鎖、並びに配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、及び配列番号28からなる群から選択される配列を含む軽鎖を有する、ヒトPD-1に結合するヒト化アゴニスト抗体を提供する。PD-1に結合し、PD-1活性にアゴニスト作用を及ぼす抗体の能力が著しく変更されなければ、本発明によって提供されるCDR又は他の配列例えば、可変ドメインに対して、1又は複数のアミノ酸の置換、付加及び/又は欠失がなされてもよいことは理解されよう。アミノ酸の置換、付加及び/又は欠失のいずれによる影響も、例えば、本明細書、特に実施例に記載されている方法を用いて、当業者によって容易に試験され、PD-1結合及びPD-1アゴニスト作用を決定することができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、又は配列番号46のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも60の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、又は配列番号46のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも70、80、90、95又は98の同一性又は類似性を有する配列を含む。同一性とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。類似性とは、本明細書中で使用するとき、整列された配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似したタイプであることを指す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンで置換されてもよい。多くの場合、互いに置換され得る他のアミノ酸には、限定されないが、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン芳香族側鎖を有するアミノ酸;リシン、アルギニン及びヒスチジン塩基性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン酸及びグルタミン酸酸性側鎖を有するアミノ酸;アスパラギン及びグルタミンアミド側鎖を有するアミノ酸;並びにシステイン及びメチオニン硫黄含有側鎖を有するアミノ酸が含まれる。同一性及び類似性の程度は容易に計算することができるComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.編,OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.編,AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.,及びGriffin,H.G.編,HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987,SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.及びDevereux,J.編,MStocktonPress,NewYork,1991,NCBIから入手可能なBLAST商標softwareAltschul,S.F.ら,1990,J.Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.States,D.J.1993,NatureGenet.3:266-272.Madden,T.L.ら,1996,Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.ら,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402;Zhang,J.Madden,T.L.1997,GenomeRes.7:649-656。別の実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、又は配列番号28のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも60の同一性又は類似性を有する配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、又は配列番号28のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも70、80、90、95又は98の同一性又は類似性を有する配列を含む。本発明の別の実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、又は配列番号46のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも60の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、又は配列番号28のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも60の同一性又は類似性を有する配列を含む。適切には、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、配列番号30、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、又は配列番号46のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも70、80、90、95、又は98の同一性又は類似性を有する配列を含み、軽鎖の可変ドメインは、配列番号10、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、又は配列番号28のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも70、80、90、95、又は98の同一性又は類似性を有する配列を含む。本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はその断片を含んでもよく、限定されないが、Fab、修飾されたFab、Fab’、修飾されたFab’、Fab’2、Fv、単一ドメイン抗体例えば、VH又はVL又はVHH、scFv、二価、三価若しくは四価抗体、ビス-scFv、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい例えば、Holliger及びHudson、2005、NatureBiotech.239:1126-1136;Adair及びLawson,2005,DrugDesignReviews-Online23,209-217を参照されたい。これらの抗体断片を作製し、産生する方法は、当該技術分野において周知である例えば、Vermaら,1998,JournalofImmunologicalMethods,216,165-181を参照されたい。本発明に使用するための他の抗体断片には、国際特許出願WO2005/003169、WO2005/003170及びWO2005/003171に記載されたFab及びFab’断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含んでもよく、又は単一特異的であってもよい例えば、WO92/22853及びWO05/113605を参照されたい。一実施形態では、本開示による抗体は、免疫グロブリン部分、例えばFab又はFab’断片、及びこれに直接的又は間接的に連結された1つ又は2つの単一ドメイン抗体dAb例えばWO2009/040562に記載されたようなを含むPD-1結合抗体融合タンパク質として提供される。一実施形態では、融合タンパク質は、場合によりジスルフィド結合により連結された2つのドメイン抗体例えば可変重鎖VH及び可変軽鎖VLペアリングのようなを含む。一実施形態では、融合タンパク質のFab又はFab’エレメントは、単一ドメイン抗体又は抗体複数と同一又は類似の特異性を有する。一実施形態では、Fab又はFab’は、単一ドメイン抗体又は抗体複数とは異なる特異性を有し、すなわち融合タンパク質は多価である。一実施形態では、本発明による多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有し、例えばこのVH/VLペアはアルブミン結合部位を提供する。本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択されてもよい。例えば、定常領域ドメインは、ヒトIgA、IgD、IgE、IgG又はIgMドメインであってもよい。特に、ヒトIgG定常領域ドメインが用いられてもよく、特に、抗体分子が治療用であり、抗体エフェクター機能が要求される場合、IgG1及びIgG3アイソタイプであってもよい。或いは、IgG2及びIgG4アイソタイプは、抗体分子が治療目的であり、抗体エフェクター機能が要求されない場合、例えば、単にPD-1活性にアゴニスト作用を及ぼすために用いられてもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体も使用され得ることは承認されよう。例えば、241位のセリンが、Angalら,MolecularImmunology,1993,301,105-108に報告されるようにプロリンに変更されているIgG4分子を用いてもよい。また、抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことは当業者に理解されよう。これらの修飾のタイプ及び範囲は、多くの場合、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存する。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含んでもよい。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因した、カルボキシ末端の塩基性残基例えば、リシン又はアルギニンの喪失であるHarris,RJ.JournalofChromatography705:129-134,1995に記載される通りである。したがって、図8a、配列番号36に示される抗体重鎖のC末端リシンは欠乏していてもよい。一実施形態では、抗体の重鎖はCH1ドメインを含み、抗体の軽鎖はCLドメインのカッパ又はラムダのいずれかを含む。生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び/又は塩基性官能基を含み、それにより、分子に正味の正電荷又は負電荷を与える。全体の観察された電荷量は、実在物の絶対アミノ酸配列、3D構造における荷電基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点pIは、特定の分子又はその溶媒接触表面が正味の電荷を担持しないpHである。一例では、本発明のPD-1抗体及び断片は、適切な等電点を有するように操作されてもよい。これは、より強固な特性、特に、適切な溶解性及び/又は安定性プロフィール及び/又は改善された精製特性を有する抗体及び/又は断片をもたらすことができる。このようにして、一態様では、本発明は、初めに特定された抗体949の等電点とは異なる等電点を有するように操作されたヒト化PD-1抗体を提供する。例えば、抗体は、アミノ酸残基の置換、例えば、1又は複数の塩基性アミノ酸残基で酸性アミノ酸残基を置換することによって操作されてもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基が導入されてもよく、又は酸性アミノ酸残基が除去され得る。或いは、分子が容認されない高いpI値を有する場合、酸性アミノ酸残基は、必要に応じてpIを下げるように導入されてもよい。pIを操作する場合、抗体又は断片の所望の活性を保持するように注意すべきであることは重要である。このようにして、一実施形態では、操作された抗体又は断片は、修飾されていない抗体又は断片と同じ又は実質的に同じ活性を有する。ExPASYhttp://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及びhttp://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.htmlなどのプログラムを用いて、抗体又は断片の等電点を予測してもよい。本発明の抗体分子は、適切には、高い結合親和性、特にナノモル濃度を有する。親和性は、単離された天然の若しくは組換えPD-1又は適切な融合タンパク質/ポリペプチドを用いて、本明細書の実施例に記載されているBIAcoreを含む当該技術分野において既知の任意の適切な方法を用いて測定されてもよい。一例では、親和性は、本明細書の実施例に記載されている組換えヒトPD-1細胞外ドメインを用いて測定される。一例では、用いられる組換えヒトPD-1細胞外ドメインは、単量体である。適切には、本発明の抗体分子は、単離されたヒトPD-1に対する結合親和性が約6nM又はそれより良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約5nM又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約4nM又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明の抗体分子は、結合親和性が約3nM又はそれよりも良好である。一実施形態では、本発明は、結合親和性が約5nM又はそれよりも良好であるヒト化抗体を提供する。本発明によって提供される抗体の親和性は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いて変更されてもよいことは理解されよう。したがって、本発明はまた、PD-1に対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子の改変体に関する。このような改変体は、多数の親和性成熟プロトコルによって得ることができ、CDRの突然変異Yangら,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995、チェーンシャッフリングMarksら,Bio/Technology,10,779-783,1992、大腸菌E.coliの突然変異誘発株の使用Lowら,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996、DNAシャッフリングPattenら,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997、ファージディスプレイThompsonら,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996、及びセクシャルPCRCrameriら,Nature,391,288-291,1998が挙げられる。Vaughanら上述は、親和性成熟のこれらの方法を検討している。一実施形態では、本発明の抗体分子は、ヒトPD-1活性にアゴニスト作用を及ぼす。PD-1にアゴニスト作用を及ぼす抗体の能力を決定するのに適したアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、PD-1とそのリガンドPD-1Lの相互作用をブロックしない。抗体がそのリガンドPD-1LとのPD-1相互作用をブロックするかどうかを決定するのに適したアッセイは、本明細書の例に記載されているFreeman,Gordonら2000JExpMed1921027;Butte,Mannishら,2007Immunity2712007。所望により、本発明に使用するための抗体は、1又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされてもよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に結合できる単一部分を形成するように連結された2以上のこのような分子を含んでもよいことは承認されよう。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望まれる場合、これは、抗体断片を直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する、標準的な化学的又は組換えDNAの手法によって調製されてもよい。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は当該技術分野において周知であるHellstromら,ControlledDrugDelivery,第2版Robinsonら編,1987,623-53頁;Thorpeら,1982,Immunol.Rev.,62:119-58、及びDubowchikら,1999,PharmacologyandTherapeutics,83,67-123を参照されたい。具体的な化学的手法には、例えば、WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及びWO03031581に記載の手法が含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、WO86/01533及びEP0392745に記載されるような組換えDNA手法を用いて達成することができる。エフェクター分子なる用語は、本明細書中で使用するとき、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成の又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばDNA、RNA及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物又はNMR若しくはESR分光法によって検出できる化合物などのレポーター基を含む。エフェクター分子の例には、細胞毒素、又は細胞にとって有害例えば致死的である任意の薬物を含む細胞毒性剤が含まれてもよい。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。また、エフェクター分子には、限定されないが、代謝拮抗剤例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン、アルキル化剤例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチンBSNU及びロムスチンCCNU、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、並びにシス-ジクロロジアミン白金IIDDPシスプラチン、アントラサイクリン例えば、ダウノルビシン以前はダウノマイシン及びドキソルビシン、抗生物質例えば、ダクチノマイシン以前はアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシンAMC、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン、及び有糸分裂阻害剤例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチンが含まれる。他のエフェクター分子は、111In及び90Y、Lu177、ビスマス213、カリホルニウム252、イリジウム192及びタングステン188/レニウム188などのキレートされた放射性核種;又は、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼI阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得る。他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。対象となる酵素には、限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、或いはリンホカイン、インターロイキン-1IL-1、インターロイキン-2IL-2、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、神経成長因子NGF、又は他の増殖因子などの生物反応修飾因子、及び免疫グロブリンが挙げられる。他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属陽電子放出トモグラフィーにおける使用のため及び非放射性常磁性金属イオンを含む。診断としての使用のための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンに関しては、米国特許第4,741,900号全体を参照されたい。適切な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族はストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンを含み、適切な発光物質はルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射性核種は、125I、131I、111In及び99Tcを含む。別の例において、エフェクター分子は、インビボにおける抗体の半減期の増加及び/又は抗体の免疫原性の減少及び/又は上皮バリアを越える免疫系への抗体の送達を強化できる。この型のエフェクター分子の適切な例は、WO05/117984に記載されたような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物を含む。エフェクター分子がポリマーである場合、一般に、合成の又は天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐又は非分岐の多糖類、例えば、ホモ又はヘテロの多糖類であってよい。上記の合成ポリマーに存在してもよい特定の任意の置換基は、1又は複数のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基を含む。合成ポリマーの具体例には、場合により置換された直鎖又は分岐鎖のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール又はその誘導体、特に、場合により置換されたポリエチレングリコール、例えばメトキシポリエチレングリコール及びその誘導体が挙げられる。具体的な天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体を含む。誘導体は、本明細書中で使用するとき、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されてもよい。このような基の残基が、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、時には生成物の一部を形成することは理解されよう。ポリマーのサイズは、所望に応じて変更可能であるが、一般には、平均分子量が500Daから50000Da、例えば5000から40000Da、例えば20000から40000Daの範囲となる。ポリマーサイズは、特に、生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある種の組織に局在する能力又は循環半減期を延長させる能力に基づいて選択できる総説としては、Chapman,2002,AdvancedDrugDeliveryReviews,54,531-545を参照されたい。したがって、例えば、生成物を腫瘍の治療に使用するために循環から離れて組織に浸透させようとする場合、分子量の小さいポリマー、例えば約5000Daの分子量のポリマーの使用が有利である場合がある。生成物が循環に残存する場合の適用に関しては、分子量のより大きいポリマー、例えば20000Daから40000Daの範囲の分子量を有するポリマーの使用が有利である場合がある。適したポリマーは、ポリエチレングリコール、或いは特にメトキシポリエチレングリコールなどの、特に約15000Daから約40000Daの範囲の分子量のポリアルキレンポリマー又はその誘導体を含む。一例では、本発明において使用するための抗体は、ポリエチレングリコールPEG部位に結合される。特定の一例では、抗体は抗体断片であり、PEG分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して結合されてもよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生してもよく、又は組換えDNA法を用いて断片中に操作してもよい例えば、US5,219,996、US5,667,425、WO98/25971、WO2008/038024を参照されたい。一例において、本発明の抗体分子は修飾されたFab断片であり、修飾は抗体分子の重鎖のC末端への、エフェクター分子の結合を可能にする、1又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合できる1又は複数のシステイン残基を含む、修飾されたヒンジ領域を形成する。2以上のPEG分子を結合するために複数の部位が使用できる。適切には、PEG分子は、抗体断片に位置した少なくとも1つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾された抗体断片に結合した各ポリマーは、断片に位置したシステイン残基のイオウ原子に共有結合されてもよい。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、又は、特にイオウ-炭素の結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が使用されてもよい。上記のように、活性化ポリマーが、ポリマーによって修飾された抗体断片の調製において、出発物質として用いることができる。活性化ポリマーは、α-ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどの、チオール反応基を含む任意のポリマーであってもよい。このような出発物質は、市販で例えば、Nektar、以前はShearwaterPolymersInc.,Huntsville,AL,USAから得ることができる、又は市販の出発物質から、従来の化学的手法を用いて調製することができる。特定のPEG分子は、20Kメトキシ-PEG-アミンNektar、以前はShearwater,RappPolymere及びSunBioから入手可能及びM-PEG-SPANektar、以前はShearwaterから入手可能を含む。一実施形態では、抗体は、例えば、EP0948544又はEP1090037に開示されている方法に従って、PEG化された、すなわちPEGポリエチレングリコールが共有結合した、修飾されたFab断片又はdiFabである[PolyethyleneglycolChemistry,BiotechnicalandBiomedicalApplications,1992,J.MiltonHarris編、PlenumPress,NewYork,PolyethyleneglycolChemistryandBiologicalApplications1997、J.MiltonHarris及びS.Zalipsky編、AmericanChemicalSociety、WashingtonDC及びBioconjugationProteinCouplingTechniquesfortheBiomedicalSciences,1998,M.Aslam及びA.Dent,GrovePublishers、NewYork;Chapman、A.2002、AdvancedDrugDeliveryReviews2002、54:531-545も参照されたい]。一例では、PEGは、ヒンジ領域においてシステインに結合する。一例では、PEG修飾されたFab断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合でき、リシン残基上の各アミン基は、約20,000Daの分子量を有するメトキシポリエチレングリコールポリマーに結合できる。したがって、Fab断片に結合したPEGの全分子量は約40,000Daであってもよい。特定のPEG分子は、PEG2MAL40KNektar社、以前のShearwater社から入手可能としても知られている、N,N’-ビスメトキシポリエチレングリコールMW20,000修飾リシンの2-[3-N-マレイミドプロピオンアミド]エチルアミドを含む。PEGリンカーの代替供給源には、GL2-400MA2以下の構造中、mは5及びGL2-400MAmは2を供給するNOF社が含まれ、nは約450である:すなわち各PEGは約20,000Daである。以下のタイプのさらなる代替PEGエフェクター分子:は、DrReddy、NOF社及びJenkem社から入手可能である。一実施形態では、鎖中のアミノ酸226又はアミノ酸226の前後、例えば重鎖のアミノ酸226連続した番号付けによるで、システインアミノ酸残基を通じて付加される、ペグ化される例えば本明細書に記載されたPEGにより抗体が提供される。また、本発明は、本発明の抗体分子の重鎖単数又は複数及び/又は軽鎖単数又は複数をコードする単離されたDNA配列を提供する。適切には、DNA配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のDNA配列は、例えば、化学的方法によって作製された合成DNA、cDNA、ゲノムDNA又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。本発明の抗体分子をコードするDNA配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードするDNA配列は、所望に応じて決定されたDNA配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成されてもよい。アクセプターのフレームワーク配列をコードするDNAは、当業者に広く利用可能であり、それらの知られたアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするDNA配列を調製しもよい。所望のDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応PCR技法を必要に応じて使用することができる。適切なDNA配列の例は図2~12、特に配列番号11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、及び47に提供される。本発明はまた、本発明の1又は複数のDNA配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、提供されるのは、本発明の抗体をコードする1又は複数のDNA配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターである。適切には、クローニングベクター又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする2つのDNA配列、並びに適切なシグナル配列を含む。一例では、ベクターは、重鎖と軽鎖の遺伝子間配列を含むWO03/048208を参照されたい。ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、CurrentProtocolsinMolecularBiology、1999、F.M.Ausubel編,WileyInterscience,NewYork及びColdSpringHarborPublishingにより作成されたマニアティスのマニュアルManiatisManualを参照する。また、本発明の抗体をコードする1又は複数のDNA配列を含む1又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞/ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするDNA配列を発現させるために用いられてもよい。細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用することができ、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系もまた使用することができる。適切な哺乳動物宿主細胞には、CHO、骨髄腫又はハイブリドーマの細胞が含まれる。また、本発明は、本発明の抗体分子をコードするDNAからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養するステップ、及びこの抗体分子を単離するステップを含む、本発明に係る抗体分子を産生するための方法を提供する。抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする配列だけが宿主細胞にトランスフェクトの使用に必要とされる場合には、重鎖又は軽鎖のポリペプチドだけを含んでもよい。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の作製について、細胞系に、2つのベクターである軽鎖ポリペプチドをコードする第1ベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第2ベクターをトランスフェクトしてもよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含むベクターである単一のベクターを用いることができる。本開示に係る抗体及び断片は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。このようにして、抗体及び/又は断片の特性は、市販用加工に最適であり、貢献するものである。本発明の抗体は病態の治療及び/又は予防に有用であるため、本発明はまた、本発明の抗体分子を、1又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物又は診断用組成物を提供する。したがって、薬剤を製造するための本発明の抗体の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常は含む、無菌の医薬組成物の一部として通常は供給されることになる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含んでもよい。また、本発明は、本発明の抗体分子を、1又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に添加又は混合すること含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製する方法を提供する。この抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物における唯一の有効成分であってもよく、又は他の抗体成分、例えば、抗TNF抗体、抗IL-1β抗体、抗T細胞抗体、抗IFNγ抗体又は抗LPS抗体、或いはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の有効成分を伴ってもよい。さらなる実施形態では、本開示に係る抗体、断片又は組成物は、さらなる医薬として活性のある作用物質、例えば、コルチコステロイド例えばプロピオン酸フルチカゾン及び/又はベータ-2-作動薬例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはフォルモテロール又は細胞成長及び増殖の阻害剤例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、或いは選択的にCD28及び/又はCD40阻害剤と組み合わせて使用される。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。医薬組成物は、適切には、治療有効量の本発明の抗体を含む。用語治療有効量とは、本明細書中で使用するとき、標的となる疾患若しくは状態を治療、改善又は予防するために、或いは検出可能な治療効果又は予防効果を示すために必要とされる治療薬の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかにおいて、初期に推定することができる。また、動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることができる。続いて、このような情報は、ヒトにおける有用な投薬量及び投与経路を決定するために用いることができる。ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ単数又は複数、治療に対する反応感受性及び耐性/応答に依存する。この量は、日常の実験によって決定でき、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、0.01mg/kg~50mg/kg、例えば0.1mg/kg~20mg/kgである。好都合には、医薬組成物は、1用量あたり所定量の本発明の活性剤を含む単位剤形で存在してもよい。組成物は、患者に個別に投与してもよく、又は他の薬物、薬剤若しくはホルモンと組み合わせて例えば、同時に、連続して又は別々に投与されてもよい。本発明の抗体分子を投与する場合の投薬量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されるか又は現状を治療するために使用されているかどうかに依存する。投薬の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子の半減期が短い例えば、2~10時間場合、1日に1回又は複数回の投薬が必要とされ得る。或いは、抗体分子の半減期が長い例えば2~15日場合、1日に1回、1週間に1回、若しくはさらに1又は2か月に1回の投薬だけが必要とされ得る。薬学的に許容される担体は、それ自体は組成物を摂取する個体に対して有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性があってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子などの大型の緩慢に代謝される巨大分子であってよい。薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩が使用できる。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含んでもよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はpH緩衝物質などの補助物質がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液などに処方可能にする。投与の好ましい形態は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射用又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルにおいて懸濁液、溶液又は乳剤の形態を取ってよく、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び/又は分散剤などの製剤助剤を含んでもよい。或いは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌の液体により再構成するために、乾燥形態であってもよい。一度処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療されるべき対象は動物であり得る。しかしながら、1又は複数の実施形態では、組成物はヒト対象に投与するために適合される。適切には、本開示に係る製剤において、最終製剤のpHは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のpHが7である場合、8~9又はそれを超えるpIが適切であり得るためである。望ましくは理論に束縛されずに、これは、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤を提供することができ、例えば、抗体又は断片が溶液中に留まると考えられる。一実施形態では、4.0~7.0の範囲のpHの医薬製剤は、1~200mg/mLの本開示による抗体、1~100mMの緩衝液、0.001~1の界面活性剤、a10~500mMの安定剤、b10~500mMの安定剤及び5~500mMの等張化剤、又はc5~500mMの等張化剤を含む。例えば約pH6の製剤は、1~50mg/mLの抗体、20mML-ヒスタジンhistadineHCl、240mMトレハロース、及び0.02ポリソルベート20を含んでもよい。或いは約pH5.5の製剤は、1~50mg/mLの抗体、20mMクエン酸塩緩衝液、240mMスクロース、20mMアルギニン及び0.02ポリソルベート20を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮的例えば、WO98/20734を参照されたい、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸の経路を含む、任意の数の経路によって投与できる。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物の投与のために使用できる。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液のどちらかとして、注射可能に調製できる。注射前の、液体媒体中における溶液用又は懸濁液用に適した固体形態にもまた調製できる。組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内によって達成され、又は組織の間質腔に送達される。組成物はまた、病変内に投与され得る。投薬処置は、単回投薬スケジュール又は複数回投薬スケジュールであってもよい。組成物中の有効成分が抗体分子であることは承認されよう。そのため、消化管における分解を受けやすい。このようにして、組成物が消化管を使用する経路によって投与されるべきである場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から一度吸収されたら抗体を放出する薬物を含む必要がある。薬学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの製薬科学Remington’sPharmaceuticalSciencesMackPublishingCompany,N.J.1991において利用可能である。一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、高圧ガスを含む計量エアロゾル、又は高圧ガスを伴わない吸入可能な溶液が挙げられる。活性物質を含む、本開示に係る吸入可能な粉末は、上記の活性物質だけからなっているか、又は上記の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物からなっていてもよい。これらの吸入可能な粉末は、単糖例えば、グルコース又はアラビノース、二糖例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース、オリゴ糖及び多糖例えば、デキストラン、多価アルコール例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、塩例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、又はこれら同士の混合物を含んでもよい。単糖又は二糖が適切には使用され、それは、ラクトース又はグルコースの使用、特に、限定されないが、それらの水和物の形態である。肺における沈着用の粒子は、10ミクロン未満の粒径を必要とし、例えば、1~9ミクロン、例えば0.1~5μm、特に1~5μmである。有効成分例えば、抗体又は断片の粒径は、最も重要である。吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができる噴射ガスは当該技術分野において知られている。適切な噴射ガスは、炭化水素、例えばn-プロパン、n-ブタン又はイソブタン、ハロ炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び/又はフッ素化誘導体の中から選択される。上記の噴射ガスは、単独で又はそれらの混合物で使用されてもよい。特に適切な噴射ガスは、TG11、TG12、TG134a及びTG227の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、TG134a1,1,1,2-テトラフルオロエタン及びTG2271,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン、及びそれらの混合物が特に適している。また、噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、表面活性剤界面活性剤、抗酸化剤、潤滑剤、及びpHを調整するための手段を含んでもよい。これらの全ての成分は当該技術分野において知られている。本発明に係る噴射ガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最大5重量の活性物質を含んでもよい。本発明に係るエアロゾルは、例えば、0.002~5重量、0.01~3重量、0.015~2重量、0.1~2重量、0.5~2重量、又は0.5~1重量の有効成分を含む。或いは、肺への局所投与はまた、溶液製剤又は懸濁製剤の投与によって、例えば、噴霧器などのデバイス、例えば、圧縮器に接続された噴霧器例えば、PariRespiratoryEquipment,Inc.,Richmond,Va.により製造されたPariMaster登録商標圧縮器に接続されたPariLC-JetPlus登録商標噴霧器を用いるものであってもよい。本発明の抗体は、溶媒に分散されて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達させることができる。適切な生理溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬理学的に許容される溶媒、又は緩衝液に懸濁することができる。当該技術分野において知られている緩衝液には、水1mlあたり、0.05mg~0.15mgのエデト酸2ナトリウム、8.0mg~9.0mgのNaCl、0.15mg~0.25mgのポリソルベート、0.25mg~0.30mgの無水クエン酸、及び0.45mg~0.55mgのクエン酸ナトリウムが含まれていてもよく、それにより、約4.0~5.0のpHを達成する。懸濁液は、例えば、凍結乾燥させた抗体を使用することができる。また、治療用の懸濁液又は溶液製剤は、1又は複数の賦形剤を含んでもよい。賦形剤は当該技術分野において周知であり、緩衝液例えば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば、血清アルブミン、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液をリポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、無菌的な製造プロセスを用いて、実質的に無菌形態で提供される。これは、処方に使用される緩衝溶媒/溶液のろ過、該無菌の緩衝溶媒溶液への抗体の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の分注による製造及び滅菌を含んでもよい。本開示にかかる噴霧可能な製剤は、例えば、アルミホイルに包まれた単一投薬量単位例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアルとして提供されてもよい。各バイアルは、ある体積、例えば2mlの溶媒/溶液緩衝液中の単位用量を含む。本明細書に開示される抗体は、噴霧を介した送達に適していてもよい。また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与されてもよいことが予測される。これを達成するために、適切なDNA成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするDNA配列が患者に導入され、その結果、抗体鎖がDNA配列から発現され、インサイチュで集積される。また、本発明は、炎症性疾患、例えば急性又は慢性炎症性疾患の調節に使用するための抗体分子又はそれを含む組成物を提供する。適切には、抗体分子又はそれを含む組成物は、炎症過程を減少させる、又は炎症過程を妨げるために使用され得る。一実施形態では、活性化T細胞、特に、不適切な炎症性免疫応答に関与した活性化T細胞、例えば、このような応答の近辺/位置に動員される活性化T細胞のインビボでの減少がもたらされる。活性化T細胞の減少は、本明細書で用いられる場合、処置前又は処置なしと比較して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、又はそれを超える減少であってもよい。好都合には、本発明に係る抗体、断片又は組成物による処置により、患者のT細胞不活性化T細胞の一般レベルを減少させずに、活性化T細胞のレベルを減少させることができる。これは、より少ない副作用をもたらし、おそらくは患者におけるT細胞減少を妨げることができる。また、本発明は、免疫障害の治療又は予防において使用するための本発明の抗体分子を提供する。免疫障害は、例えば、感染ウイルス、細菌、真菌、及び寄生、感染と関連した内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、COPD、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、I型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫介在性炎症性障害、狼瘡例えば全身性紅斑性狼瘡、及びギランバレー症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、IgA腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、サルコイドーシス、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵臓炎、外傷外科、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、心筋梗塞などの虚血性疾患及びアテローム性動脈硬化症を含む心臓疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、並びに低塩酸症、又は母子間免疫寛容の欠如に関連した不妊症からなる群から選択されてもよい。一実施形態では、本発明による抗体は、アレルギー、COPD、自己免疫疾患、又は関節リウマチの治療に使用される。また、本発明は、疼痛、特に炎症と関連している疼痛の治療又は予防に使用するための、本発明に係る抗体分子を提供する。さらに、本発明は、免疫障害の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供し、特に、免疫障害は関節リウマチ、喘息又はCOPDである。さらに、本発明は、本明細書に記載されている1又は複数の医学的兆候の治療又は予防のための薬剤の製造における、本発明に係る抗体分子、断片又は組成物の使用を提供する。本発明の抗体分子、断片又は組成物は、任意の治療に利用されてもよく、この場合、ヒト又は動物の生体におけるPD-1の効果を増加させることが望まれる。一実施形態では、本発明の抗体分子又はそれを含む組成物は、例えば、本明細書に記載される炎症性疾患を制御するために使用される。また、本発明は、免疫障害に罹患しているか又はその危険性があるヒト又は動物対象を治療するための方法であって、有効量の本発明の抗体分子、又はそれを含む組成物を該対象に投与することを含む上記方法を提供する。一実施形態では、抗体特に、本発明に係る抗体又は断片を精製するための方法であって、不純物がカラムに保持され、抗体が溶出するように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを行うステップを含む上記方法が提供される。該方法に使用するための適切なイオン交換樹脂には、Q.FF樹脂GE-Healthcare社により供給が含まれる。このステップは、例えば、pHが約8で行われてもよい。該方法は、例えば、4.5など約4~5のpHで実行される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、CaptoS樹脂又はSPセファロースFFGE-Healthcare社により供給などの樹脂を用いてもよい。抗体又は断片は、次いで塩化ナトリウムなどのイオン食塩水を、例えば200mMの濃度で用いて、樹脂から溶出することができる。故にクロマトグラフィーステップ単数又は複数は、必要に応じて1又は複数の洗浄ステップを含み得る。また、精製方法は、透析ろ過ステップなどの1又は複数のろ過ステップをさらに含んでもよい。このようにして、一実施形態では、精製された抗PD-1抗体又は断片、例えば、実質的に精製された形態であり、特に、内毒素及び/又は宿主細胞のタンパク質若しくはDNAを含まないか、又は実質的に含まない、ヒト化抗体又は断片、特に本発明に係る抗体又は断片が提供される。上記で使用される精製された形態は、少なくとも90の純度を指すものとし、例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99w/w又はそれを超えて純粋である。内毒素が実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物1mgあたりの内毒素含量が1EU未満であることを指すものとし、例えば、生成物1mgあたり0.5又は0.1EUである。宿主細胞のタンパク質又はDNAが実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物1mgあたり宿主細胞タンパク質及び/又はDNA含量が400μg未満であるであることを指すものとし、例えば、必要に応じて、1mgあたり100μg未満、特に1mgあたり20μgである。また、本発明の抗体分子は診断、例えば、PD-1に関与する疾患状態のインビボでの診断及び画像化に使用されてもよい。本明細書との関連で含むことcomprisingは、含むことincludingを意味するものとする。この場合、本発明の技術的に適切な実施形態を組み合わせてもよい。実施形態は、本明細書において、ある種の特徴/要素を含むものとして記載されている。また、本開示は、上記特徴/要素からなるか又は本質的に上記特徴/要素からなる実施形態を区別するように広げる。本発明は、添付の図面について言及する以下の実施例においてのみ、例示としてさらに説明される:実施例図1は、詳細にはa抗体949の軽鎖V領域配列番号8b抗体949の重鎖V領域配列番号9c抗体949のCDRH1配列番号1、CDRH2配列番号2、CDRH3配列番号3、CDRL1配列番号4、CDRL2配列番号5、CDRL3配列番号6を示す。図2a修飾されたCDRL3修飾された脱アミド化部位b949VK1gL1V領域配列番号10c949VK1gL1V領域DNA配列番号11dシグナル配列を有する949VK1gL1V領域配列番号12eシグナル配列を有する949VK1gL1V領域DNA配列番号13f949VK1gL1軽鎖V定常配列番号14図3a949VK1gL1軽鎖V定常DNA配列番号15bシグナル配列を有する949VK1gL1軽鎖V定常配列番号16cシグナル配列を有する949VK1gL1軽鎖V定常DNA配列番号17d949VK1gL9V領域配列番号18図4a949VK1gL9V領域DNA配列番号19b949VK1gL11V領域配列番号20c949VK1gL11V領域DNA配列番号21d949VK1gL12V領域配列番号22e949VK1gL12V領域DNA配列番号23f949VK1gL14V領域配列番号24図5a949VK1gL14V領域DNA配列番号25b949VK3gL1V領域配列番号26c949VK3gL1V領域DNA配列番号27d949VK3gL11V領域配列番号28e949VK3gL11V領域DNA配列番号29f949gH1aV領域配列番号30図6a949gH1aV領域DNA配列番号31bシグナル配列を有する949gH1aV領域配列番号32cシグナル配列DNAを有する949gH1aV領域配列番号33d949gH1aV領域及び定常領域配列番号34図7a949gH1aV領域及び定常領域DNA配列番号35図8aシグナル配列を有する949gH1aV領域及び定常領域配列番号36図9aシグナル配列DNAを有する949gH1aV領域及び定常領域配列番号37図10a949gH8aV領域b949gH8aV領域DNAc949gH20aV領域d949gH20aV領域DNAe949gH1bV領域f949gH1bV領域図11a949gH8bV領域b949gH8bV領域DNAc949gH20bV領域d949gH20bV領域DNAeヒトVK12-1-1L23JK4アクセプターフレームワークfヒトVK12-1-1L23JK4アクセプターフレームワークDNA図12aヒトVK36-1-1A27JK4アクセプターフレームワークbヒトVK36-1-1A27JK4アクセプターフレームワークDNAcヒトVH11-31-46JH4アクセプターフレームワークdヒトVH11-31-46JH4アクセプターフレームワークDNAeヒトVH11-21-eJH4アクセプターフレームワークfヒトVH11-21-eJH4アクセプターフレームワークDNA図13は、抗体949によるヒトCD4T細胞増殖の阻害を示す。CD4T細胞は、負の選択によりヒトPBMCから精製され、及び抗CD3プラス対照BSA又は抗PD-1抗体/組換えPD-L2で被覆されたDynalbeadsと共に培養された。増殖y軸は、6日目に3H-チミジン取り込みにより測定された。バーは、最大応答抗CD3/BSAのを表し、4つの異なるドナー培養物の平均/-S.E.M.である。図14は、抗体949を用いたリガンドブロッキングアッセイ。PD-1発現HEK293細胞は、精製されたキメラ949若しくはヒト化949、又はアイソタイプマッチされた陽性及び陰性対照と共にプレインキュベートされ、この後組換えPD-L2と共にインキュベートされた。抗体949によるPD-1に対するPD-L2のブロッキングは、抗マウスIgGHLPEコンジュゲート抗体と結合しているPD-L2を明らかにして評価された。括弧内の数字は、プレインキュベーション段階中に添加されたヒト化949の計算された濃度μg/mLを表す。図15は、抗体949によるヒトPD-1/CD28/TCRζSEAPレポーター細胞系からのSEAPの刺激。抗体の希釈物は、レポーター細胞と共にインキュベートされ、放出されたSEAPが決定された。データは、発光量比foldinductionシグナル/バックグラウンドシグナルとしてプロットされた。図16は、カニクイザル及びアカゲザル由来のPD-1との949キメラ移植片及びヒト化移植片の交差反応性。空ベクターd、又はヒトa、カニクイザルb若しくはアカゲザルc由来のPD-1をトランスフェクトされたHEK293細胞への949移植片の結合は、フローサイトメトリーにより測定された。データは、PD-1抗体結合蛍光の幾何平均として表される。図17は、マウスに関する軽鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化軽鎖のアラインメントを示す。CDRは、ボールド体であり、下線が付されている。ドナー残基は、ボールド体であり、イタリック体であり、反転表示されている。図18は、マウスに関する重鎖、アクセプターフレームワーク、及びヒト化重鎖のアラインメントを示す。CDRは、ボールド体であり、下線を付されている。ドナー残基はボールド体、イタリック体であり、強調表示されている。図19は、949gH1a重鎖V定常-huIgG4PデルタLys配列番号58を示す。図20は、949gH1a重鎖V定常-huIgG4PデルタLys、下線を付されたエクソン配列番号59。図21は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する949gH1a重鎖V定常-huIgG4PデルタLys配列番号60。図22は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する949gH1a重鎖V定常-huIgG4PデルタLys、下線を付されたエクソン配列番号61。図23は、949gH1a重鎖V定常-huIgG1デルタLys配列番号62。図24は、949gH1a重鎖V定常-huIgG1デルタLys、下線を付されたエクソン配列番号63。図25は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する949gH1a重鎖V定常-huIgG1デルタLys配列番号64。図26は、下線を付され、イタリック体にされたシグナル配列を有する949gH1a重鎖V定常-huIgG1デルタLys下線を付されたエクソン配列番号65。例1抗PD-1抗体クローン19の作製方法抗体クローン19の作製は、国際出願PCT/IB2009/006940未公開に既に記載されている。1.1骨髄腫細胞系融合には、ドイツ微生物細胞培養コレクションDSMZGmbH、ブラウンシュバイクからの骨髄腫細胞系SP2/0-Ag14を用いた。この細胞系は、BALB/c脾臓細胞と骨髄腫細胞系P3x63Ag8のハイブリッドである。該細胞は、免疫グロブリン鎖を合成又は分泌せず、20μg/mlで8-アザグアニンに耐性であり、HATヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地で増殖しないとされている。SP2/0細胞は、標準増殖培地10FCSを含むにおいて組織培養フラスコ中で常に維持する。HGPRT陽性復帰突然変異体の実施を回避するために、凍結SP2/0細胞の新たなアリコートを2週間後に用いた。骨髄腫細胞は、全てのマイコプラズマ試験において陰性であることが示された。1.2免疫付与及びスクリーニング用の抗原組換えタンパク質PD-1Fcを、CD28Fcの産生について記載された方法EvansらNatImmunol.6,271-92005を用いて調製し、0.01MHEPES、150mMNaCl、pH7.4中で5.1mg/mlに濃縮した。還元及び非還元条件下で行った抗原のSDS-PAGE分析は、タンパク質の純度が>95であることを証明した。1.3免疫付与5匹のマウス約8週齢を、60日間にわたる免疫付与プロトコルを用いて腹腔内腔を介して免疫した。免疫付与のために、免疫原のミョウバン沈降物を調製した。ミョウバン沈降物は、追加免疫ごとに新たに調製した。マウスは、50μgタンパク質で免疫し、25μgタンパク質で追加免疫した。3匹のマウスを融合に使用した。1.4細胞の一般的処理細胞は、層流システム、滅菌材料、及び滅菌溶液を用いて滅菌条件下で処理した。細胞は、5二酸化炭素を含有する湿潤雰囲気中で37°Cでインキュベートした。ハイブリドーマ細胞の培養のために、補助剤2-メルカプトエタノール、L-グルタミン、グルタマックス、HT、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質/抗真菌剤溶液供給者により推奨された濃度での、及びFCSを含むDMEMを異なる濃度10、15又は20で含有する完全増殖培地CGMを使用した。1.5脾臓細胞の調製及び細胞融合3匹の免疫したマウスをCO2中で窒息させた後、脾臓を無菌的に除去した。プールした脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞及び骨髄腫細胞をDMEMで数回洗浄し、1ml50w/vPEG3550の存在下で2回融合した脾臓細胞対SP2/0比2.5:1及び2.4:1。産生されたハイブリドーマを、20FCS及びアミノプテリンを含有するCGMHAT培地で再懸濁した。各融合の細胞懸濁液140Cl/ウェルを、20FCSを含むCGM中に支持細胞として140Cl/ウェルの腹腔滲出細胞を含有する、8つの96ウェル組織培養平底プレートCorning-Costar社にプレートアウトした。プレートは10日間インキュベートした。この期間中、細胞にHAT培地を2回供給した。脾臓細胞調製物のアリコート約8×106脾臓細胞を、24ウェルプレートのウェルで10日間培養し、細胞培養上清はELISAでの陽性対照として用いた。1.6スクリーニングアッセイELISAを、細胞培養上清中のIgGのスクリーニングに用いた。96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートGreiner社、カタログ番号655061を、0.5M炭酸塩/重炭酸塩緩衝液、pH9.6中、50μl/ウェルのPD-1Fc抗原5μg/mlで被覆した。湿室で4°C、一晩インキュベーション後、プレートを、0.01トリトンX-100洗浄緩衝液を含有するトリス緩衝液食塩水TBS、50mMトリス、pH7.8、500mM塩化ナトリウムで洗浄し、振とう機で室温RT、1時間、TBSブロッキング緩衝液中200μl/ウェルの2FCSでブロックした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、100μl細胞培養上清を適切なウェルに添加した。SP2/0骨髄腫細胞からの細胞培養上清は、陰性対照として使用した。陽性対照としては、脾臓細胞培養からの細胞培養上清を使用した。プレートはRTで1時間、振とう機でインキュベートし、この後数回洗浄した。結合抗体の検出のために、プレートを、ブロッキング緩衝液中、アルカリホスファターゼにコンジュゲートした50μl/ウェルのヤギ抗マウスIgGFab特異的1:5000と共に、振とう機で、RT、1時間インキュベートし、この後、数回洗浄し、150μl/ウェルの基質緩衝液5ジエタノールアミン中2mM4-ニトロフェニルリン酸0.5mMMgCl2、pH9.8を添加した。光学密度ODは、12チャンネルDynexOpsysMRマイクロプレートリーダーで405nmで推定した。OD405nmの平均プレート値より2倍高いOD405nmを有するウェルを、陽性として選択した。1.7安定な抗体産生株の選択陽性IgG産生培養物からの細胞を48ウェルプレートのウェルに移し、数日間培養した細胞の増殖特性に応じて。特異的バインダーを選択するために、予め被覆した抗原なしでPD-1FcについてELISAを行った。ELISA陽性ウェルからの細胞を、凍結培地90FCS、10DMSOで凍結した。該細胞のアリコートを、さらなる特徴付け用に細胞培養上清を作製するため、さらに培養した。1.8限界希釈クローニング陽性ウェルを同定するとすぐに、非産生細胞による異常増殖のリスクを減少させるために、ハイブリドーマ細胞をクローニングした1次クローニング。抗体が本当に単クローンであることを確実にするために、ハイブリドーマを再びクローニングした2次クローニング。限界希釈の方法を、両方のクローニング手順に用いた。IgG産生細胞は、1ウェルあたり1~3細胞の密度でフィーダー細胞を含有する1つの96ウェルプレートに分配した。8~10日後増殖特性に応じて、単クローン性増殖の検出のため、全てのプレートを顕微鏡下で視覚的に検査した。このようなウェルからの培養上清を、上記スクリーニングアッセイを用いて特異的免疫グロブリン含量についてスクリーニングした。増殖特性及びELISAシグナルに関して適切なクローンを選択し、24ウェルプレートのウェルに移し、数日間培養した。スクリーニングアッセイを行った。この手順を2~3回繰り返した。2次クローニング手順又は凍結保存のための培養に適切なサブクローンを、それぞれ選択した。この手順は、クローン19として知られる抗PD-1抗体の産生をもたらした。1.9抗体の調製及びアイソタイピングハイブリドーマ上清を調製し、滅菌したアジドフリーPBSに希釈した。モノクローナル抗体の精製したストックを、IsoStripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットSantaCruz社;sc-24958を用いてPBS中1μg/mlでアイソタイピングした。クローン19は、アイソタイプIgG1κであることを見出した。1.10クローン19の配列決定クローン19をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定し、図1に提供する。この抗体を抗体CA051_00949と命名したしばしば949と省略される。例2抗体949の特徴付け及び選択2.1抗体選択の理論的根拠PD-1を通じて阻害シグナルをT細胞に伝達することができる治療試薬を作製するために、アゴニスト抗PD-1モノクローナル抗体を選択した。この抗体で膜近位エピトープを標的化することは、この抗体がPD-1に対する内因性リガンドPD-L1又はPD-L2の結合をブロックしないことを確実にするであろう。したがって、該アゴニスト抗体はPD-1を通じて伝達されるリガンドからのいずれの天然の阻害シグナルにも付加して作用することになり、及び該シグナルを増強することができる。この抗体のヒト化バージョンは、不適切なレベルのT又はBリンパ球活性化を伴う広範なヒト疾患において潜在的な治療有用性を有するであろう。2.2ヒトCD4T細胞で抗体949により誘導されたPD-1アゴニスト作用の分析抗体949親可変領域、マウスIgG1がPD-1を通じたシグナル伝達を誘導することができることを実証するために、T細胞受容体TCR誘導活性化シグナルを阻害する該抗体の能力について試験した。これは、949をTCR活性化抗CD3抗体と共にDynalbeadsに共有結合させて達成した。ビーズは、次いで初代ヒトCD4T細胞の培養物に添加し、結果として得られた増殖を、6日後に3H-チミジン取り込みにより測定した。トシル活性化4.5μmDynalbeadsM450;Invitrogen社を0.1M滅菌リン酸緩衝液pH7.5中で洗浄し、1×107ビーズあたり2μgの抗ヒトCD3クローンOKT3を、連続反転混合により8時間、37°Cでロードした。ビーズを次いで洗浄して非コンジュゲート抗CD3を除去し、アリコートを、連続反転混合により19時間、37°C、1×107ビーズあたり3μgのBSA、非アゴニスト対照抗PD-1抗体、949又は組換えヒトPD-L2.mFcで二次被覆した。ビーズをこの後洗浄し、0.2Mトリス/0.1BSApH8.5中で3時間インキュベートして遊離トシル基を不活化し、この後洗浄し、PBS/0.1BSA/2mMEDTApH7.4にビーズを再懸濁した。ビーズセットの均等な抗CD3及び抗体/リガンド被覆は、ビーズの蛍光色素標識アイソタイプ特異的抗体による染色、及びフローサイトメトリーによる分析により確認した。ヒトT細胞増殖試験のため、新鮮なヘパリン添加血液を、RPMIにより1:1希釈し、リンパ球を密度勾配分離FicollHypaqueにより分離した。CD4T細胞は、MACSCD4T細胞分離キットII;MiltenyiBiotec社を用いた陰性選択により全PBMCから精製した。1×105ヒトCD4T細胞/ウェルを、96ウェル丸底プレート中で被覆ビーズと共に1:1比で培養し、37°C/5CO2/100湿度で6日間インキュベートした。増殖は、6日後に、培養の最後の6時間に0.5μCi/ウェルの3H-チミジンを添加して測定した。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、取り込まれた3H-チミジンをβシンチレーション計数により測定した。2.3結果図13の結果は、抗CD3プラス抗PD-1抗体又はBSA対照被覆ビーズの存在下で測定したヒトCD4T細胞による6日目の増殖応答を示す。データは、最大応答抗CD3プラスBSA対照のパーセンテージとして表され、4つの異なるドナー応答の平均である。CD4T細胞増殖は抗体949により阻害され、その結果、観察された平均増殖は最大値のわずか51.6であった。CD4T細胞増殖の類似の阻害は、PD-1シグナル伝達の陽性対照として利用した組換えヒトPD-L2で見られた。比較では、非アゴニスト抗PD-1mAbを使用し、該mAbは、本アッセイにおいてCD4T細胞増殖に対する期待されたような効果を示さなかった。これは、抗体949がPD-1を通じたアゴニストシグナル伝達を誘導することができ、ヒトCD4T細胞応答の阻害をもたらすことを証明するものである。例3抗体CA051_00949のヒト化抗体CA051_00949は、マウス抗体V領域由来の相補性決定領域CDR、図1cをヒト生殖系列抗体V領域フレームワークにグラフトしてヒト化した。抗体の活性を回復するために、マウスV領域由来のいくつかのフレームワーク残基もヒト化配列に保持された。これらの残基は、Adairら1991ヒト化抗体HumanisedantibodiesWO91/09967により概説されたプロトコルを用いて選択した。マウス抗体ドナーV領域配列とヒト生殖系列抗体アクセプターV領域配列とのアラインメントは、設計されたヒト化配列と共に図17及び18に示される。ドナーからアクセプター配列にグラフトされたCDRは、合体されたChothia/Kabat定義が使用されるCDR-H1を例外としてAdairら1991ヒト化抗体HumanisedantibodiesWO91/09967を参照されたい、KabatKabatら,免疫学的対象のタンパク質の配列Sequenceofproteinsofimmunologicalinterest1987.BethesdaMD,NationalInstitutesofHealth,USによって定義されている。抗体949の重鎖CDRは、ヒトV領域VH11-31-46プラスJH4J領域VBASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/にグラフトした。重鎖フレームワーク残基は、ドナー残基フェニルアラニンF25、メチオニンM37、ヒスチジンH41、イソロイシンI48、バリンV71、リシンK73、及びスレオニンT76がそれぞれ保持された、残基25、37、41、48、71、73、及び76Kabat番号付けを例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基を、グルタミン酸E1と置換して均一な産物の発現及び精製を得た。抗体及び抗体断片のN末端におけるグルタミンのピログルタミン酸への転換は広く報告されている。得られたヒト化配列は、949gH1aと命名した。もう1つのヒト化重鎖配列、949gH1bは、CDRをヒトV領域VH11-21-eプラスJH4J領域VBASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/にグラフトして作製した。重鎖フレームワーク残基は、ドナー残基フェニルアラニンF25、メチオニンM37、ヒスチジンH41、イソロイシンI48、バリンV71、スレオニンT76及びバリンV78がそれぞれ保持された、残基25、37、41、48、71、76、及び78Kabat番号付けを例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒトフレームワークの1位のグルタミン残基を、グルタミン酸E1と置換して均一な産物の発現及び精製を得た。ヒトV領域VK12-1-1L23JK4J領域VBASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/は、軽鎖CDRのアクセプターとして選択された。軽鎖フレームワーク残基は、ドナー残基グルタミン酸E1、アスパラギンN2、バリンV3、ロイシンL4、トリプトファンW47、アスパラギン酸D60、及びセリンS70がそれぞれ保持された、残基1、2、3、4、47、60、及び70Kabat番号付けを例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。得られたヒト化配列は、949VK1gL1と命名した。もう1つのヒト化軽鎖配列、949VK3gL1は、CDRをヒトV領域VK36-1-1A27プラスJK4J領域VBASE、http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/にグラフトして作製した。軽鎖フレームワーク残基は、ドナー残基アスパラギンN2、トリプトファンW47、バリンV58、セリンS70、チロシンY71、及びスレオニンT85がそれぞれ保持された、残基2、47、58、70、71、及び85Kabat番号付けを例外として、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒト化949VK1gL1、949VK3gL1、949gH1a、及び949gH1b軽鎖並びに重鎖V領域配列をコードする遺伝子は、EntelechonGmbHによる自動化合成アプローチにより設計し、構築した。ヒト化重鎖及び軽鎖のいくつかの異なる改変体は、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により該遺伝子を修飾して作製し、CDRL3については、場合により脱アミド化部位を修飾した図2a。ヒト化949軽鎖V領域遺伝子配列は、UCB-Celltechヒト軽鎖発現ベクターpKH10.1にクローニングされ、このベクターはヒトカッパ鎖定常領域Km3アロタイプをコードするDNAを含有する。ヒト化949重鎖V領域遺伝子配列は、ヒンジ安定化突然変異S241Pを有するヒトガンマ-4重鎖定常領域Angalら、MolImmunol.1993、301:105-8をコードするDNAを含有する、UCB-Celltechヒトガンマ-4重鎖発現ベクターpVhγ4PFLにクローニングし、及びC末端リシン残基のコドンが除去されている、ヒトガンマ-4P重鎖ベクターの一バージョン、pVhγ4PデルタLysにもクローニングした。ヒト化949重鎖V領域遺伝子配列はまた、C末端リシン残基が除去されたヒトガンマ-1重鎖定常領域をコードするDNAを含有する、UCB-Celltechヒトガンマ-1重鎖発現ベクターpVhγ1デルタLysにもクローニングした。HEK293懸濁細胞への軽鎖及び重鎖ベクターの一過性コトランスフェクションは、293フェクチン12347-019Invitrogen社を用いて達成し、ヒト化された組換え949抗体の発現をもたらした。ヒト化重鎖及び軽鎖のいくつかの異なる改変体は、抗体949由来の図1cのCDR、及び2a修飾された脱アミド化部位を有するクローン19由来のCDRL3、及び使用されるフレームワークに応じて以下に列挙された1又は複数のドナー残基を含めることにより作製した。配列は、図2~11並びに図17及び18に提供されている。3.1ヒト化のためのAb949残基例4例3で作製されたヒト化抗体の特徴付け4.1親和性結合親和性測定アッセイフォーマットは、固定化された抗ヒトFcによる949又はこのヒト化バージョンの捕捉、及びこの後の、捕捉表面でのヒトPD-1の滴定を含んだ。BIABiamolecularInteractionAnalysisはBIAcore3000BIAcoreABを用いて行われた。AffinipureFab’2断片、ヤギ抗ヒトIgG、Fc断片特異的JacksonImmunoResearchは、約6000反応単位RUの捕捉レベルまでアミンカップリング化学を介してCM5センサーチップ上に固相化された。ブランク表面は、この手法からFc断片を除いて、同様の方法により調製された。HBS-EP緩衝液10mMHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005サーファクタントP20、BIAcoreABは、泳動緩衝液として使用され、流速は10μl/分であった。約1μg/mLで949IgGの10μl注入は、固相化された抗ヒトIgG-Fcによる約200RUの捕捉のために用いられた。ヒトPD-1は、流速を30μL/分にして、種々の濃度50nM以下の捕捉された949又はヒト化改変体全体で滴定された。表面は、流速を10μL/分にして、40μMHClの10μL注入、続く5mMNaOHの5μL注入によって再生された。バックグラウンド除去結合曲線は、標準的な手法に従って、BIAevaluationソフトウェアバージョン3.2を用いて分析された。動態パラメータは適合アルゴリズムから測定された。949及びこの様々なヒト化バージョンについてのデータが、表1に示される。1つ、VK1gL11gH1aを除く、試験した全てのグラフトについて、PD-1に対する親和性は949親抗体に比べて改善された。キメラは、ヒトIgG4定常ドメインを有する949可変領域を含有した。4.2抗体949及び949のヒト化バージョンのリガンドブロッキング活性の分析PD-1リガンド結合アッセイを行って、抗体949キメラヒトIgG4親V領域、及び949のヒト化一過性クローンがリガンド結合をブロックする能力を有するかどうかを決定した。このアッセイでは、PD-1発現HEK細胞を、精製された又は一過性に発現された抗体上清と共に30分間インキュベートし、この後、組換えヒトPD-L2.mFc融合タンパク質と共にインキュベートした。細胞発現PD-1へのPD-L2.mFcの結合は、次いで、PEコンジュゲート抗マウスIgGHL抗体を用いて明らかにした。方法HEK293細胞には、5μgヒトPD-1DNA及び293フェクチンInvitrogen社を、6ウェルプレートで一晩、5×106/ウェルで培養して一過性にトランスフェクトした。翌日、PD-1発現HEK293細胞を、96ウェルU-プレートに50μL中1×106/ウェルで添加し、50μLのヒトIgG4対照10μg/mL、若しくは精製されたキメラ94910、3.3又は1.1μg/mL、若しくは対照抗PD-1抗体10、3.3又は1.1μg/mL、又は150μLの無希釈のヒト化949一過性上清のどちらかと共に、氷上で30分間プレインキュベートした。組換えヒトPD-L2.mFc融合タンパク質を、氷上でさらに30分間、0.3μg/mL最終濃度で細胞に添加した。HEK細胞を、FACS緩衝液中で2回洗浄した。フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスHLIgGを1/200希釈し、ウェルあたり50μLで細胞ペレットに添加した。細胞は、30分間、氷上でインキュベートした。細胞を、FACS緩衝液中で2回洗浄し、直ちにフローサイトメーターに取り込んだ。結果図14のデータは、対照IgG4又は抗PD-1抗体のどちらかで予めブロックした場合の、PD-1トランスフェクトHEK細胞へのPD-L2.mFc結合を示す。対照IgG4は、幾何平均蛍光強度の増加により示されるように、細胞へのPD-L2の結合を阻害しなかった。精製されたキメラ949抗体は、1から10μg/mLの間の濃度ではPD-1発現細胞へのPD-L2結合を阻害しなかった。既知のリガンドブロッキング特性を有する対照抗PD-1抗体は、試験濃度でPD-1発現細胞へのPD-L2結合をブロックし、リガンドブロッキングがこのアッセイフォーマットで検出され得ることを確認した。抗体949の全てのヒト化バージョンも、細胞で発現されたPD-1へのPD-L2結合を阻害しなかった。4.3抗体949及びこのヒト化バージョンの機能的活性の分析レポーター遺伝子アッセイは、ヒトPD-1の細胞外リガンド結合ドメイン及び膜貫通ドメイン、並びにヒトCD28シグナル伝達ドメイン及びヒトTCRζ細胞内ドメインを含むキメラ受容体を安定に発現するJurkat細胞系を用いて開発した。これらの細胞は、NFκB依存性プロモーターの制御下のレポーター遺伝子を有し、組換えヒトPD-リガンド1又は2で刺激されると、該細胞は分泌性アルカリホスファターゼSEAPを産生する。これは、このレポーターアッセイがPD-1アゴニスト作用を検出できることを証明している。アッセイは、親マウス抗体949の機能アゴニスト活性を様々なヒト化構築物と比較するのに使用した。ヒトPD-1/CD28/TCRζキメラ構築物は、国際出願WO2007/060406に記載された方法により作製した。Jurkat細胞には、SEAPレポーターベクターでヒトPD-1/CD28/TCRζキメラを安定にトランスフェクトした。細胞を大量に調製し、使用されるまで液体窒素中で貯蔵した。細胞を解凍し、384ウェルあたり30,000細胞を含有する培地の15μLアリコートで分注した。抗体/構築物は、NM6培地において4×最終濃度で調製し、5μL容量を添加してウェルを複製した。18時間のインキュベーション後、4μLの上清を、添付文書に記載されているようにSEAP活性についてアッセイしたClontech社、GreatEscape商標SEAP。活性は、発光量比バックグラウンドシグナルで除したシグナルとして計算した。図15のデータは、JurkatヒトPD-1/CD28/TCRζSEAPレポーター細胞系からの、SEAPの抗体949刺激放出を示す。対照ヒト抗体、CAN-1は、SEAPの放出を刺激しなかった。最初のCA949構築物、cLcH、及び構築物VK1gL12gH8bは、アッセイにおいて類似の滴定を生じた。表2は、試験した全てのヒト化構築物が、このアッセイにおいてSEAP応答を引き起こしたことを示しており、該構築物が、ヒト化後にアゴニスト機能を維持していることを証明している。4.4HEK293ヒト、カニクイザル、及びアカゲザルPD-1に結合している949キメラ移植片及び949ヒト化移植片のフローサイトメトリー分析抗体949のヒト化移植片が、ヒト以外の霊長類PD-1との交差反応性を維持したことを確認するために、フローサイトメトリーアッセイを、完全長ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルPD-1をコードするDNAを一過性にトランスフェクトしたHEK293懸濁細胞で実施した。HEK293細胞には、5μgDNA及び293フェクチンInvitrogen社を、6ウェルプレートで一晩、5×106/ウェルで培養して一過性にトランスフェクトした。翌日、ヒト、カニクイザル、又はアカゲザルPD-1発現HEK293細胞を、0.2BSAw/vPBS0.09アジ化ナトリウムに再懸濁し、所定濃度の949キメラ移植片、949ヒト化移植片、949キメラ精製抗体、又は対照抗体と共に、4°Cで1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、二次抗体-1:1000FITCFab2ヤギ抗ヒトFc特異的109-006-098Jackson社と共に、4°Cで1時間インキュベートした。分析は、FACSCaliburBectonDickinson社で行った。結果は図16に示される。結果は、i全ての移植片は、PD-1発現細胞に特異的に結合する図16a、d、ii移植片は全て、オリジナル配列図16aに等しいヒトPD-1結合を保持する、並びにiii移植片は全て、カニクイザル図16b及びアカゲザル図16c由来のPD-1と交差反応する、ことを示している。本発明は単なる例示として記載され、決して限定的にする意図はなく、詳細の変更が以下の特許請求の範囲内でなし得ることは当然理解されよう。本発明の各実施形態の好ましい特徴は、変更すべきところは変更した他の実施形態それぞれについても同様である。限定するものではないが、本明細書に引用した特許及び特許出願を含む全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、具体的に且つ個別に、完全に説明されたように本明細書中に参照により援用されることを示唆したかのように、本明細書中に参照により援用される。"