"ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。前記抗体は、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害するか、またはb30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記抗体が、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害し、かつb30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記抗体は、a配列番号19~23、69、および71~73からなる群から選択される参照VH配列と少なくとも90同一のVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択される参照VL配列と少なくとも90同一のVL配列と、を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記VHおよびVL配列は、前記参照VHおよびVL配列と少なくとも95同一である、請求項4に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記VHおよびVL配列は、前記参照VHおよびVL配列と少なくとも99同一である、請求項5に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。a配列番号19~23、69、および71~73からなる群から選択されるVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択されるVL配列と、を含む、請求項6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号19および配列番号24を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号20および配列番号25を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号21および配列番号26を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号21および配列番号27を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号22および配列番号28を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号23および配列番号29を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号23および配列番号30を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号69および配列番号70を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号71および配列番号26を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号71および配列番号27を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号72および配列番号26を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号72および配列番号27を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号73および配列番号26を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。配列番号73および配列番号27を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRへの第2の抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記第2の抗体が、配列番号21の重鎖可変領域と、配列番号26もしくは27の軽鎖可変領域と、を含み、第1の抗体または抗原結合フラグメントが、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、またはc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメント。2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される抗体と、同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、またはc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、ならびにn配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、ならびにn配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。aa配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、請求項27に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号15または配列番号16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号15または16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、請求項30に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、請求項32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである、請求項1~33のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。全長抗体である、請求項1~34のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。抗原結合フラグメントである、請求項1~33のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単鎖FvもしくはscFv、ジスルフィド結合型Fv、V-NARドメイン、IgNar、細胞内抗体、IgGΔCH2、ミニボディminibody、Fab’3、テトラボディtetrabody、トリアボディtriabody、ダイアボディdiabody、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、scFv2、またはscFv-Fcを含む、請求項1~36のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。請求項1~37のいずれか一項に記載のVHおよびVL配列を含む、ポリペプチド。前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、実質的に同様の結合親和性で、ヒトEGFRおよびマカクEGFRの両方に結合する、請求項1~38のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。約1.0~約10nMのKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する、請求項39に記載の抗体またはポリペプチド。約1.0nMまたはそれよりも優れたKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する、請求項40に記載の抗体またはポリペプチド。前記結合親和性は、フローサイトメトリー、Biacore、または放射免疫測定によって測定される、請求項39~41のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを生成する、単離細胞。請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、a請求項43に記載の細胞を培養することと、b前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法。前記細胞は、真核細胞である、請求項44に記載の方法。式A-L-Cを有する免疫抱合体であって、式中、Aは、請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、Lは、リンカーであり、Cは、細胞毒性剤であり、前記リンカーLが、AをCに結合する、免疫抱合体。前記リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される、請求項46に記載の免疫抱合体。前記リンカーは、非開裂可能リンカーである、請求項47に記載の免疫抱合体。前記リンカーは、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオペンタノエートSPP、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDBまたはN-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオ-2-スルホブタノエートスルホ-SPDB、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCC、N-スルホスクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートスルホSMCC、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、およびN-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドからなる群から選択される、請求項48に記載の免疫抱合体。前記リンカーは、N-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドである、請求項49に記載の免疫抱合体。前記細胞毒性剤は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC-1065、CC-1065類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または前記剤のプロドラッグからなる群から選択される、請求項46~50のいずれか一項に記載の免疫抱合体。前記細胞毒性剤は、マイタンシノイドである、請求項51に記載の免疫抱合体。前記細胞毒性剤は、N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1またはN2’-デアセチル-N2-4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル-マイタンシンDM4である、請求項52に記載の免疫抱合体。請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。第2の抗癌剤をさらに含む、請求項54に記載の薬学的組成物。標識化された、請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、診断試薬。前記標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される、請求項56に記載の診断試薬。請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、を含む、キット。EGFRを発現する細胞の成長を阻害する方法であって、対象に、前記細胞を、請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは請求項54または55に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。前記細胞は、腫瘍細胞である、請求項59に記載の方法。癌を有する患者を治療するための方法であって、対象に、請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは請求項54または55に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。前記対象に第2の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項61に記載の方法。前記第2の抗癌剤は、化学療法剤である、請求項62に記載の方法。細胞増殖性障害を治療するための方法であって、前記対象に、請求項1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、請求項46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは請求項54または55に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。前記細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚ヘック病、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される、請求項64に記載の方法。配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも90同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。前記配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも95同一である、請求項66に記載の単離ポリヌクレオチド。前記配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも99同一である、請求項67に記載の単離ポリヌクレオチド。配列番号44~50および81と少なくとも90同一である配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と少なくとも95同一である配列を含む、請求項69に記載の単離ポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と少なくとも99同一である配列を含む、請求項70に記載の単離ポリヌクレオチド。配列番号39~58および77~84からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。請求項66~72のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。請求項73に記載のベクターを含む、宿主細胞。前記免疫抱合体は、EGFR陽性の腫瘍細胞を排除することができるが、3.3nMの濃度で、ヒト初代ケラチノサイトの成長を40以下阻害するのみである、請求項46に記載の免疫抱合体。式A-L-Cを有する免疫抱合体であって、式中、Aは、配列番号21の重鎖可変領域と、配列番号26もしくは27の軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lは、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCCリンカーであり、Cは、細胞毒性剤N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1である、免疫抱合体。本発明は、概して、EGFRに結合する、抗体、その抗原結合フラグメント、ポリペプチド、および免疫抱合体に関する。本発明はまた、悪性腫瘍等の疾患の診断および治療のための、このようなEGFR結合分子の使用方法に関する。したがって、一実施形態において、本発明は、ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、ならびにc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも1つの特徴を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、抗体は、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、ならびにc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも2つの特徴を有する。別の実施形態において、ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害し、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらし、c60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。一実施形態において、本発明は、a配列番号19~23および69~73からなる群から選択される参照VH配列と少なくとも90同一のVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択される参照VL配列と少なくとも90同一のVL配列と、を含む、抗体を提供する。別の実施形態において、VHおよびVL配列は、参照VHおよびVL配列と少なくとも95同一である。別の実施形態において、VHおよびVL配列は、参照VHおよびVL配列と、少なくとも99同一である。一実施形態において、本発明は、a配列番号19~23および69~73からなる群から選択されるVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択されるVL配列と、を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号19および配列番号24を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号20および配列番号25を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号21および配列番号26を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号21および配列番号27を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号22および配列番号28を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号23および配列番号29を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号23および配列番号30を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号69および配列番号70を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号71および配列番号26を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号71および配列番号27を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号72および配列番号26を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号72および配列番号27を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号73および配列番号26を含む。別の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号73および配列番号27を含む。一実施形態において、本発明は、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本発明は、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される抗体と同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明は、a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、ならびにn配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明は、ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、ならびにn配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本発明は、ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一のCDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。一実施形態において、本発明は、ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、本抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号15または16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号15または16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。一実施形態において、本発明は、ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、本抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態において、本抗体は、a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む。一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、全長抗体である。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合フラグメントである。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単鎖FvもしくはscFv、ジスルフィド結合型Fv、V-NARドメイン、IgNar、細胞内抗体、IgGΔCH2、ミニボディminibody、Fab’3、テトラボディtetrabody、トリアボディtriabody、ダイアボディdiabody、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、scFv2、またはscFv-Fcを含む。本発明はまた、本明細書に記載のVHおよびVL配列を含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明は、実質的に同様の結合親和性で、ヒトEGFRおよびマカクEGFRの両方に結合する、抗体またはポリペプチドを提供する。一実施形態において、抗体またはポリペプチドは、約1.0~約10nMのKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する。別の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、約1.0nMまたはそれよりも優れたKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する。別の実施形態において、結合親和性は、フローサイトメトリー、Biacore、または放射免疫測定によって測定される。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを生成する、単離細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、a抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを発現する細胞を培養することと、b前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法を提供する。一実施形態において、細胞は真核細胞である。一実施形態において、本発明は、式A-L-Cを有する免疫抱合体であって、式中、Aは、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、Lは、リンカーであり、Cは、細胞毒性剤であり、前記リンカーLは、AをCに結合する、免疫抱合対を提供する。別の実施形態において、リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される。別の実施形態において、リンカーは、非開裂可能リンカーである。別の実施形態において、リンカーは、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオペンタノエートSPP、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDBまたはN-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオ-2-スルホブタノエートスルホ-SPDB、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCC、N-スルホスクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートスルホSMCC、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、およびN-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドからなる群から選択される。さらなる実施形態において、リンカーは、N-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドである。別の実施形態において、免疫抱合体は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC-1065、CC-1065類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、またはこの薬剤のプロドラッグからなる群から選択される、細胞毒性剤を含む。別の実施形態において、細胞毒性剤は、マイタンシノイドである。さらなる実施形態において、細胞毒性剤は、N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1またはN2’-デアセチル-N2-4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル-マイタンシンDM4である。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは本明細書に記載の免疫抱合体、ならびに薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。別の実施形態において、薬学的組成物は、第2の抗癌剤を含む。一実施形態において、本発明は、標識化された、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチド、または免疫抱合体を含む、診断試薬を提供する。一実施形態において、標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される。一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ポリペプチド、または免疫抱合体を含む、キットを提供する。一実施形態において、本発明は、EGFRを発現する細胞の成長を阻害するための方法であって、その細胞を、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物と、接触させることを含む、方法を提供する。別の実施形態において、細胞は、腫瘍細胞である。一実施形態において、本発明は、新生物を有する患者を治療する方法であって、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。別の実施形態において、新生物は、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、眼、頭頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系からなる群から選択される。別の実施形態において、本方法は、第2の抗癌剤を対象に投与することを含む。さらなる実施形態において、第2の抗癌剤は、化学療法剤である。一実施形態において、本発明は、患者における細胞増殖性障害を治療するための方法であって、本明細書に記載の免疫抱合体または薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法を提供する。別の実施形態において、細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚ヘック病、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される。一実施形態において、本発明は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも90同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも95同一である。別の実施形態において、配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも99同一である。一実施形態において、本発明は、配列番号44~50および81と、少なくとも90同一の配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と、少なくとも95同一である配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と、少なくとも99同一である配列を含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号39~58および77~84からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のベクターを含む、宿主細胞を提供する。本発明は、EGFRシグナル伝達を部分的に阻害し、初代ケラチノサイトを含む、EGFR陽性正常上皮細胞には影響を及ぼさないが、EGFRを過剰発現する腫瘍細胞には高く細胞毒性である、新しいクラスのEGFR結合分子を提供する。さらに、抗EGFR抗体の免疫抱合体は、抗体の抗腫瘍効果を強化する。I.定義本発明の理解を促すために、多数の用語および語句を以下に定義する。本明細書に使用される際、上皮成長因子受容体またはEGFRとは、成熟チロシンキナーゼ細胞表面受容体を指す。用語可溶性EGFRまたはsEGFRは、EGFRの細胞外のリガンド結合ドメインを含む、EGFRの部分を指す。より具体的には、sEGFRは、成熟EGFRのアミノ酸1~619を含むUllrichetal.,HumanEpidermalGrowthFactorcDNASequenceandAberrantExpressionoftheAmplifiedGeneinA-431EpidermoidCarcinomaCells,Nature,Vol.309,418-251986。語句EGFR媒介性癌は、EGFRが正常な対応する上皮組織内よりも高いレベルまで異常に活性化される、上皮腫瘍によって特徴付けられる癌を指す。これらのより高いレベルのEGFR活性は、多数の種類の癌において、腫瘍成長を促進する。このような癌には、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。EGFRの異常活性化は、受容体の過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の活性化、受容体リガンドの過剰発現、および/またはEGFR活性の調節因子の損失によって生じる可能性がある。用語抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を通じて、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組み合わせを認識し、それに特異的に結合する、免疫グロブリン分子を意味する。本明細書に使用される際、用語抗体は、抗体が、所望の生物学的活性を呈する限り、抗体の抗原決定部分を含む、少なくとも2つの無傷の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む、任意の他の修飾された免疫グロブリンから生成される、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、その抗体フラグメント例えば、Fab、Fab’、Fab’2、およびFvフラグメント、単鎖FvscFv突然変異体、二重特異性抗体等の多特異性抗体を包含する。抗体は、いずれの5つの主要なクラスの免疫グロブリン、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMのもの、または、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと称される、それらの重-軽鎖定常ドメインの同一性に基づいて、それらのサブクラスアイソタイプ例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2のものであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なった周知のサブユニット構造、および3次元構造を有する。抗体は、裸であるか、または毒素、放射性同位体等の他の分子に抱合されてもよい。遮断抗体または拮抗抗体は、EGFR等、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または減少させるものである。いくつかの実施形態において、遮断抗体または拮抗抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。生物学的活性は、10、20、30、50、70、80、90、95、または100さえも減少される。抗体に関して本明細書に使用される際、語句EGFR活性化を阻害する能力は、EGFRへの結合が、ヒトEGFR活性化および受容体の活性化の際に生じるヒトEGFRの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことを意図する。細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、またはマウス腫瘍モデル実施例を参照されたいのいずれかを使用して判定される、EGFRの生物学的活性の1つ以上の指標を測定することにより、EGFRの活性化を阻害する、抗体の能力を評価することができる。用語抗EGFR抗体またはEGFRに結合する抗体は、EGFRを標的とすることにおいて、診断および/または治療剤として有用であるために十分な親和性で、EGFRに結合する能力を有する抗体を指す。いくつかの抗EGFR抗体が、当該技術分野で既知である。例えば、セツキシマブ抗体225および528抗体は、米国特許第4,943,533号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。無関係の非EGFRタンパク質への抗EGFR抗体の結合範囲は、例えば、放射免疫測定RIAによって測定した場合、EGFRへの抗体の結合の約10未満であり得る。特定の実施形態において、EGFRに結合する抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、または0.1nM以下の解離定数Kdを有する。本明細書に使用される際、用語上皮毒性は、上皮の異常性または機能障害を指し、EGFR阻害剤の投与によって癌の治療を施される患者において、他の症状の中でもとりわけ、皮膚発疹、下痢、角膜菲薄化、毛髪萎縮もしくは脱毛、毛包の異形成、変性、壊死、もしくは炎症、毛包間の表皮異形成、または損傷後の治癒の失敗もしくは治癒の遅れから選択される、1つ以上の症状または病状によって現れ得る。一実施形態において、上皮毒性は、座瘡様または大型丘疹等の皮膚毒性として現れる。用語抗体フラグメントは、無傷の抗体の一部分を指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab’、Fab’2、およびFvフラグメント、抗体フラグメントから形成される、線形抗体、単鎖抗体、および多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基またはエピトープの高く特異的な認識および結合に関与する、均一性の抗体集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。用語モノクローナル抗体は、無傷および全長の両方であるモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、単鎖scFv突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに、抗原認識部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。さらに、モノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、およびトランスジェニック動物を含む、任意の多数の手段で作製されたこのような抗体を指す。用語ヒト化抗体は、特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、または最小非ヒト例えば、マウス配列を含むそれらのフラグメントである、非ヒト例えば、マウス抗体の形態を指す。典型的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域CDRの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、非ヒト種例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターのCDRの残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリンであるJonesetal.,1986,Nature,321:522-525、Riechmannetal.,1988,Nature,332:323-327、Verhoeyenetal.,1988,Science,239:1534-1536。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域FR残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、および/または能力を精錬および最適化するために、Fvフレームワーク領域および/または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにおけるさらなる残基の置換によって、さらに修飾されてもよい。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDR領域のうち全てまたは実質的に全てを含む、少なくとも1つ、典型的には2つ、または3つの可変ドメインのうち、実質的に全てを含むことになるが、一方で、実質的に全てのFR領域は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメインFcの少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第5,225,539号に記載される。抗体の可変領域は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体の軽鎖の可変領域または抗体の重鎖の可変領域を指す。重鎖または軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても既知の3つの相補性決定領域CDRによって接続される、4つのフレームワーク領域FRから構成される。各鎖内のCDRは、もう一方の鎖のCDRとともに、FRによって近接して結合され、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。CDRの決定には、少なくとも2つの技法が存在する:1種間の配列可変性に基づくアプローチすなわち、Kabatetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,1991,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMd.、および2抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチAl-lazikanietal1997J.Molec.Biol.273:927-948。さらに、CDRを決定するために、これらの2つのアプローチの組み合わせが、しばしば、当該技術分野において使用される。Kabatの番号付けシステムは、一般的に、可変ドメインおおよそ軽鎖の残基1~107および重鎖の残基1~113内の残基を参照する場合に使用される例えば、Kabatetal.,SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991。Kabatのようなアミノ酸位置の番号付けとは、Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991における、抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用することにより、実際の直線アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはCDRの短縮化、またはそこへの挿入に対応する、少数または追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後ろに単一のアミノ酸挿入物Kabatによると残基52a、および重鎖FR残基82の後ろに挿入された残基例えば、Kabatによると残基82a、82b、および82c等を含んでもよい。残基のKabat番号付けは、所定の抗体に対して、抗体の配列の相同性領域における、標準的なKabat番号付けを行った配列との配列比較によって、決定することができる。Chothiaは、代わりに、構造的ループの位置について言及するChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-9171987。Kabat番号付け慣例を使用して番号付けした場合、ChothiaのCDR-H1ループの末端は、ループの長さに応じてH32~H34間で変化するこれは、Kabat番号付けスキームが、H35AおよびH35Bに挿入を行うためであり、35Aも35Bも存在しない場合、ループは32で終了し、35Aのみが存在する場合、ループは33で終了し、35Aおよび35Bの両方が存在する場合、ループは34で終了する。AbM超可変領域は、KabatのCDRとChothiaの構造的ループとの間の中間を表し、OxfordMolecular’sAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用される。用語ヒト抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して製造される、ヒトによって生成される抗体、またはヒトによって生成される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、無傷もしくは全長抗体、そのフラグメント、ならびに/またはマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体等、少なくとも1つのヒト重鎖および/または軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。用語キメラ抗体は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が、2つ以上の種に由来する、抗体を指す。典型的に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および能力を有する哺乳動物例えば、マウス、ラット、ウサギ等の1つの種に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で、定常領域は、その種での免疫反応を誘発することを避けるために、別のもの通常、ヒトに由来する抗体における配列と相同である。用語エピトープまたは抗原決定基は、本明細書に互換的に使用され、特定の抗体によって認識および特異的に結合される能力のある抗原の部分を指す。抗原が、ポリペプチドの場合、エピトープは、連続するアミノ酸、およびタンパク質の3次折り畳みによって並置される、不連続のアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質の変性時に保持されるが、一方で3次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に、タンパク質の変性時に失われる。エピトープは、典型的に、固有の空間配座に、少なくとも3個、より一般的には少なくとも5または8~10個のアミノ酸を含む。結合親和性とは、一般的に、分子例えば、抗体の単一の結合部位と、その結合パートナー例えば、抗原との間の非共有相互作用の総合計の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書において使用される際、結合親和性は、結合ペアのメンバー例えば、抗体と抗原間の1:1の相互作用を反映する、内在性の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、概して、解離定数Kdによって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般的に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向にあるが、一方で、高親和性抗体は、一般的に、より速く抗原に結合し、より長く結合された状態に留まる傾向にある。結合親和性を測定する種々の方法が、当該技術分野で既知であり、そのうちの任意のものを、本発明の目的に使用することができる。特定の例示的な実施形態を、以下に記載する。結合親和性に関して本明細書に使用される際のまたはそれよりも優れたとは、分子とその結合パートナーとの間のより強い結合を指す。本明細書に使用される際のまたはそれよりも優れたとは、より小さい数のKd値によって表される、より強い結合を指す。例えば、抗原に対する親和性が、0.6nMまたはそれよりも優れたである抗体は、その抗原に対する抗体の親和性が、0.6nM未満、すなわち、0.59nM、0.58nM、0.57nM等、または0.6nM未満の任意の数値である。特異的に結合するとは、一般的に、抗体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、およびその結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間にいくらかの相補性をもたらすこと、を意味する。この定義に従って、抗体は、それが、その抗原結合ドメインを介して、あるエピトープに、無作為の無関係なエピトープに結合する場合よりも容易に結合する場合、そのエピトープに特異的に結合すると言われる。用語特異性は、ある抗体があるエピトープに結合する相対的な親和性を規定して、本明細書に使用される。例えば、抗体Aは、所定のエピトープに対して、抗体Bよりも高い特異性を有すると見なすことができるか、または抗体Aは、関連するエピトープDに対して有するものよりも、高い特異性でエピトープCに結合すると言われ得る。優先的に結合するとは、抗体が、関連、類似、相同、または相似エピトープへの結合よりも容易に、あるエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所定のエピトープに優先的に結合する抗体は、このような抗体が、関連エピトープと交差反応し得る場合であっても、関連エピトープよりも、そのエピトープに結合する可能性が高い。抗体は、それが、ある程度エピトープへの参照抗体の結合を妨害する程度まで、そのエピトープに優先的に結合する場合、所定のエピトープへの参照抗体の結合を、競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイによって判定することができる。抗体は、所定のエピトープへの参照抗体の結合を、少なくとも90、少なくとも80、少なくとも70、少なくとも60、または少なくとも50、競合的に阻害すると言われ得る。本明細書に使用される際、語句実質的に類似または実質的に同じとは、当業者が、2つの値の間の差異を、前記値例えば、Kd値によって測定される生物学的特徴の範囲内に、生物学的および/または統計学的有意性がほとんどないか、またはないと見なすような、2つの数値一般的に、一方は本発明の抗体と関連し、もう一方は、参照/比較抗体と関連する間の十分に高い程度の類似性を意味する。前記2つの値の間の差異は、参照/比較抗体の値の関数として、約50未満、約40未満、約30未満、約20未満、または約10未満であってもよい。2つの実質的に類似する結合親和性の間の差異は、概して、参照/比較抗体の値の関数として約10未満である。本明細書に使用される際、リガンド非依存的結合は、EGFRとのリガンド相互作用の非存在下で、ヒトEGFR上のエピトープに結合する、EGFR結合剤の能力を表す。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然に見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、もはや天然に見られる形態ではない程度まで精製されているものが含まれる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。本明細書に使用される際、実質的に純粋とは、少なくとも50純粋すなわち、汚染物質を含まない、少なくとも90純粋、少なくとも95純粋、少なくとも98純粋、または少なくとも99純粋な物質を指す。本明細書に使用される用語免疫抱合体または抱合体は、細胞結合剤すなわち、抗EGFR抗体もしくはそのフラグメントに結合され、一般式、C-L-Aによって定義され、式中、C=細胞毒素、L=リンカー、およびA=細胞結合剤または抗EGFR抗体もしくは抗体フラグメントである、化合物またはその誘導体を指す。免疫抱合体はまた、逆の順序の一般式、A-L-Cによって定義されてもよい。リンカーは、安定した共有結合方式で、通常、マイタンシノイド等の薬物である、化合物を、抗EGFR抗体またはそのフラグメント等の細胞結合剤に、結合する能力のある任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が、活性に留まる条件下において、酸誘発性開裂、光誘発性開裂、ペプチダーゼ誘発性開裂、エステラーゼ誘発性開裂、およびジスルフィド結合開裂の影響を受けやすいか、または実質的に抵抗性であり得る。好適なリンカーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。リンカーにはまた、本明細書に記載、および当該技術分野で既知の、荷電リンカーおよびその親水性形態が含まれる。用語癌および癌性は、細胞の集団が、制御されない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍および新生物は、前癌性病変を含む、良性非癌性または悪性癌性のいずれかの過剰な細胞の成長または増殖からもたらされる、1つ以上の細胞を指す。治療および/または予防可能な癌または腫瘍原性疾患には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭頸部、神経系中枢および末梢、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖器系の新生物が挙げられる。用語癌細胞、腫瘍細胞、および文法上の同等物は、腫瘍細胞集団の大部分を構成する非腫瘍原性細胞および腫瘍原性幹細胞癌幹細胞の両方を含む、腫瘍または前癌性病変に由来する細胞の全集団を指す。本明細書に使用される際、単に、再生および分化する能力を欠くような腫瘍細胞を指している場合の用語腫瘍細胞は、そのような腫瘍細胞を癌幹細胞から区別するために、用語非腫瘍原性によって修飾されるであろう。用語対象は、具体的な治療の受容者となる、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類等を含むがこれらに限定されない、任意の動物例えば、哺乳動物を指す。典型的に、対象および患者は、ヒト対象を指して、本明細書に互換的に使用される。1つ以上のさらなる治療剤との組み合わせ投与には、同時併用および任意の順序での連続投与が含まれる。用語薬学的製剤は、活性成分の生物学的活性を有効にすることができるような形態にあり、製剤が投与されるであろう対象に対して許容できないほど毒性である追加の構成成分を含有しない、調製物を指す。製剤は、滅菌であり得る。本明細書に開示される、抗体の有効量は、具体的に提示される目的を実行するのに十分な量である。有効量は、提示される目的に関して、経験に基づいて、通常の方法で、決定することができる。用語治療有効量は、対象または哺乳動物において、疾患または障害を治療するのに有効な抗体または他の薬物の量を指す。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞数の減少、腫瘍寸法の縮小、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害すなわち、ある程度までの遅延、もしくは停止、腫瘍転移の阻害すなわち、ある程度までの遅延、もしくは停止、腫瘍成長のある程度までの阻害、ならびに/または1つ以上の癌関連症状のある程度までの緩和を行うことができる。本明細書における治療の定義を参照されたい。その薬物が、既存の癌細胞の成長の予防および/または殺傷を行うことができる限り、それは、細胞増殖抑制および/または細胞毒性であってもよい。予防的有効量は、必要な容量および期間で、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。必ずしもそうではないが、典型的には、予防的投与は、疾患の初期段階の前またはその時点で使用されるため、予防的有効量は、治療有効量を下回ることになる。本明細書に使用される際の用語標識は、標識化抗体を生成するために、抗体に直接的または間接的に抱合される、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であり得る例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識か、あるいは酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。化学療法剤は、作用機構に関わらず、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤には、例えば、CD20の拮抗薬、例えば、リツキシマブおよびシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレジニソンpredinisone、フルダラビン、エトポシド、メトトレキサート、レナリドマイド、クロラムブシル、ベンタムスチンbentamustine、および/またはこのような化学療法剤の修飾版が含まれる。治療するまたは治療または治療することまたは軽減または軽減すること等の用語は、1診断される病態または障害の症状の治癒、遅延、緩和、および/または進行の停止を行う治療的処置、ならびに2標的とされる診断される病態または障害の発達を予防および/または遅延する予防的prophylacticまたは予防的preventative処置の両方を指す。したがって、治療を必要とするものには、既に障害を有するもの、障害を有する傾向にあるもの、および障害が予防されるであろうもの、が含まれる。特定の実施形態において、対象は、患者が、癌細胞の数の減少もしくは完全な不在、腫瘍寸法の縮小、癌細胞の末梢器官への浸潤の阻害もしくは不在、例えば、軟組織および骨内への癌の拡散、腫瘍転移の阻害もしくは不在、腫瘍成長の阻害もしくは不在、特定の癌に関連する1つ以上の症状の緩和、罹患率および死亡率の減少、生活の質の向上、腫瘍の腫瘍原性、腫瘍原性頻度、もしくは腫瘍原性能力の減少、腫瘍内の癌幹細胞の数もしくは頻度の減少、腫瘍原性細胞から非腫瘍原性状態への分化、または何らかの効果の組み合わせのうち、1つ以上を示す場合、本発明の方法による癌の治療に成功する。本明細書に互換的に使用されるポリヌクレオチドまたは核酸は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAもしくはRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体等の、修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との抱合等、重合後にさらに修飾されてもよい。他の種類の修飾には、例えば、cap、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合でのもの例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバメート等、および荷電結合でのもの例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸等、例えば、タンパク質例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等等のペンダント部分を含むもの、インターカレーターでのもの例えば、アクリジン、ソラレン等、キレート剤でのもの例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等、アルキル化剤を含むもの、修飾結合例えば、αアノマー核酸等、ならびにポリヌクレオチド複数を含むの非修飾形態が含まれる。さらに、通常、糖に存在するヒドロキシル基のうちの任意のものを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、または活性化してさらなるヌクレオチドへのさらなる結合を調製することができ、あるいは固体支持体に抱合することができる。5’および3’末端OHを、リン酸化するか、または1~20個の炭素原子のアミンもしくは有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導され得る。ポリヌクレオチドはまた、例えば、2’-O-メチル-、2’-O-アリル、2’-フルオロ-、または2’-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、アラビノース、キシロース、もしくはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシド等の無塩基ヌクレオシド類似体を含む、一般的に当該技術分野で既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含んでもよい。1つ以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置き換えられてもよい。これらの代替の結合基には、リン酸がPOSチオエート、PSSジチオエート、ONR2アミダート、POR、POOR’、CO、またはCH2ホルムアセタールによって置き換えられる実施形態が含まれるが、これらに限定されず、式中、RまたはR’は、独立して、H、あるいは任意でエーテル--O--結合を含む置換もしくは非置換アルキル1~20C、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチドにおける全ての結合が、同一である必要はない。前述の説明は、RNAおよびDNAを含む、本明細書に参照される全てのポリヌクレオチドに適用される。用語ベクターは、宿主細胞中の目的の1つ以上の遺伝子複数を含むまたは配列複数を含むを、送達および場合によっては発現する能力のある構築物を意味する。ベクターの例には、限定されないが、ウイルスベクター、裸のDNAもしくはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、もしくはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するDNAもしくはRNA発現ベクター、リポソームおよび生成細胞等の真核細胞内に封入されるDNAもしくはRNA発現ベクターが挙げられる。用語ポリペプチドペプチド、およびタンパク質は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して、本明細書に互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化成分との抱合等の任意の他の操作もしくは修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、1つ以上のアミノ酸の類似体例えば、非天然のアミノ酸等を含む、ならびに当該技術分野で既知の他の修飾を含む、ポリペプチドもこの定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているため、特定の実施形態において、ポリペプチドが、単鎖または連鎖として生じ得ることが理解される。2つ以上の核酸またはポリペプチドとの関連において、用語同一またはパーセント同一性は、いずれのアミノ酸置換も配列同一性の一部とは見なさずに、最大一致について比較および配列比較必要であればギャップを導入するした際、同じであるか、または特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、2つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列の配列比較を得るために使用可能な種々のアルゴリズムおよびソフトウェアが、当該技術分野で既知である。配列比較アルゴリズムの1つのこのような非限定的な例は、Karlinetal,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268に記載され、Karlinetal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877において修正され、NBLASTおよびXBLASTプログラムAltschuletal.,1991,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402に組み込まれるアルゴリズムである。特定の実施形態において、GappedBLASTは、Altschuletal.,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402に記載のように使用することができる。BLAST-2、WU-BLAST-2Altschuletal.,1996,MethodsinEnzymology,266:460-480、ALIGN、ALIGN-2Genentech,SouthSanFrancisco,California、またはMegalignDNASTARは、配列を配列比較するために使用可能な、公的に利用可能な追加のソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、GCGソフトウェアのGAPプログラムを使用して、判定することができる例えば、NWSgapdna.CMPマトリックス、およびギャップ加重40、50、60、70、または90、および長さ加重1、2、3、4、5、または6を使用して。特定の代替的な実施形態において、NeedlemanおよびWunschJ.Mol.Biol.48:444-4531970のアルゴリズムを組み込むGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を判定することができる例えば、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックス、およびギャップ加重16、14、12、10、8、6、または4、および長さ加重1、2、3、4、5を使用して。あるいは、特定の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、MyersおよびMillerCABIOS,4:11-171989のアルゴリズムを使用して判定される。例えば、パーセント同一性は、ALIGNプログラムバージョン2.0を使用して、ならびに残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4でPAM120を使用して、判定することができる。特定のソフトウェアによる最大配列比較に適切なパラメーターは、当業者によって決定することができる。特定の実施形態においては、配列比較ソフトウェアの初期設定パラメーターを使用する。特定の実施形態において、第1のアミノ酸配列の、第2の配列アミノ酸に対するパーセント同一性Xは、100×Y/Zとして計算し、式中、Yは、第1の配列と第2の配列の配列比較において、完全な一致としてスコアされた目視検査または特定の配列比較プログラムによって配列比較した場合アミノ酸残基の数であり、Zは、第2の配列の総残基数である。第1の配列の長さが、第2の配列よりも長い場合、第1の配列の第2の配列に対するパーセント同一性は、第2の配列の第1の配列に対するパーセント同一性よりも長くなる。非限定的な例として、任意の具体的なポリヌクレオチドが、参照配列に対して特定の割合の配列同一性例えば、少なくとも80同一である、少なくとも85同一である、少なくとも90同一である、およびいくつかの実施形態において、少なくとも95、96、97、98、または99同一であるを有するかどうかは、特定の実施形態において、BestfitプログラムWisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix登録商標,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711を使用して、判定することができる。Bestfitは、SmithandWaterman,AdvancesinAppliedMathematics2:4824891981の部分相同性アルゴリズムを使用して、2つの配列間の最良の相同性セグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列比較プログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列に95同一であるかどうかを判定する場合、パラメーターは、同一性が参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、相同性におけるギャップが参照配列におけるヌクレオチドの総数の最大5まで許容されるように、設定する。いくつかの実施形態において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは、実質的に同一である、すなわち、それらは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定される、最大一致について比較および配列比較した際、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、およびいくつかの実施形態においては、少なくとも95、96、97、98、99のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する。同一性は、少なくとも約10、約20、約40~60個、またはその間の任意の整数値の残基長の配列の領域にわたって存在し得、60~80個の残基よりも長い領域、例えば、少なくとも約90~100個の残基にわたってもよく、いくつかの実施形態においては、配列は、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域等、比較される配列の全長にわたって、実質的に同一である。保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するもう1つのアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、非荷電極性側鎖例えば、グリシン、アルパラギン、グルタミン、セリン、テオロニン、チロシン、システイン、非極性側鎖例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、β分枝側鎖例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン、ならびに芳香族側鎖例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが含まれる。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、抗原複数を含む、すなわち、ポリペプチドまたは抗体が結合するEGFRへの、アミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の結合を無効にするわけではない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を識別する方法は、当該技術分野で周知である例えば、Brummelletal.,Biochem.32:1180-11871993、Kobayashietal.ProteinEng.1210:879-8841999、およびBurksetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:.412-4171997を参照されたい。本開示および特許請求の範囲で使用される際、単数形のa1つの、an1つの、およびtheには、内容によりそうでない旨が明確に示されない限り、複数形が含まれる。実施形態が、含むという言葉を伴って本明細書に記載される、いかなる場合も、別の~からなるおよび/または本質的に~からなるに関して記載される類似の実施形態もまた、提供される。本明細書においてAおよび/またはB等の語句に使用される、用語および/またはは、AおよびB、AまたはB、A、ならびにBのいずれをも含むように意図される。同様に、A、B、および/またはC等の語句に使用される、用語および/またはは、次の実施形態のそれぞれを包含するように意図する:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A単独;B単独;ならびにC単独。II.EGFR結合剤腫瘍は、しばしば、種々のリガンドリガンドに結合する成長因子受容体を過剰発現し、無制限の腫瘍成長を促進する。このような成長因子受容体の1つの例は、上皮成長因子受容体EGFRタンパク質ファミリーである。上皮成長因子受容体EGFRタンパク質ファミリーを通じたシグナル伝達は、リガンドの結合によって誘発される、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に依存する。この受容体ファミリーは、4つの膜結合タンパク質EGFR、HER2/neu、HER3、およびHER4から構成される。これらのタンパク質の過剰発現は、乳房、結腸、卵巣、子宮内膜、胃、膵臓、前立腺、および唾液腺の癌を含むがこれらに限定されない、多数の種類の癌における予後の不良と関連している。多数の団体が、腫瘍成長を阻害するために、EGFRタンパク質ファミリー例えば、HER2/neuまたはEGFRの個々のメンバーを標的とする戦略を開発してきたが、これらの形態の癌を最終的に治療することが証明された治療法はない。本発明によって、ヒトEGFRに特異的に結合する新規薬剤例えば、抗体を提供する。これらの新規薬剤は、EGFRのシグナル伝達を部分的に阻害し、初代ケラチノサイトを含む、EGFR陽性正常上皮細胞に影響を及ぼさない。しかしながら、これらの薬剤は、EGFRを過剰発現する腫瘍細胞に、高く細胞毒性である。したがって、本発明は、ヒトEGFRに特異的に結合する薬剤を提供する。これらの薬剤は、本明細書にEGFR結合剤として称される。特定の実施形態において、EGFR結合剤は、抗体、免疫抱合体、またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、EGFR結合剤は、ヒト化抗体である。特定の実施形態において、EGFR結合剤は、次の効果の1つ以上を有する。腫瘍細胞の増殖の阻害、腫瘍における癌幹細胞の頻度を減少させることによる腫瘍の腫瘍原性の減少、腫瘍成長の阻害、生存率の増加、腫瘍細胞の細胞死の誘発、非腫瘍原性状態への腫瘍原性細胞の分化、または腫瘍細胞の転移の予防。いくつかの実施形態において、EGFR結合剤は、腫瘍体積を縮小する能力がある。EGFR結合剤が、腫瘍体積を縮小させる能力は、例えば、対照対象の平均腫瘍体積で除した治療対象の平均腫瘍体積である、T/C値を測定することによって評価することができる。いくつかの実施形態において、EGFR結合剤での治療は、約55未満、約50未満、約45未満、約40未満、約35未満、約30未満、約25未満、約20未満、約15未満、約10未満、または約5未満のT/C値をもたらす。特定の実施形態において、ヒトEGFRに特異的に結合する免疫抱合体または他の薬剤は、細胞毒性剤を介して、細胞死を誘発する。例えば、特定の実施形態において、ヒトEGFR抗体に対する抗体を、タンパク質内部移行によって、EGFRを過剰発現する腫瘍細胞において活性化されたマイタンシノイドと抱合する。特定の代替的な実施形態において、薬剤または抗体は、抱合されない。特定の実施形態において、EGFR結合剤は、腫瘍成長を阻害する能力がある。特定の実施形態において、EGFR結合剤は、インビボで例えば、異種移植片マウスモデルにおいて、および/または癌を有するヒトにおいて腫瘍の成長を阻害する能力がある。EGFR結合剤には、EGFR抗体であるEGFR-6、EGFR-7、およびEGFR-12、ならびにそれらのフラグメント、変異体、および誘導体が含まれる。EGFR結合剤はまた、抗体EGFR-6、EGFR-7、およびEGFR-12と同じEGFRエピトープに特異的に結合するEGFR結合剤を含む。EGFR結合剤はまた、抗体EGFR-6、EGFR-7、およびEGFR-12を競合的に阻害するEGFR結合剤を含む。EGFR結合剤はまた、EGFR-6、EGFR-7、およびEGFR-12の重鎖および軽鎖CDR配列を含む、EGFR結合剤を含む。マウスおよびヒト化両方のEGFR-7およびEGFR-12のCDR配列を、以下の表1および2に記載する。EGFR結合分子は、CDRあたり最大4つすなわち、0、1、2、3、または4つの保存的アミノ酸置換を有する、EGFR-6、EGFR-7、およびEGFR-12のCDRを含む、EGFRに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントであってもよい。ポリペプチドは、本明細書に記載の個々の可変軽鎖または可変重鎖の1つ以上を含み得る。抗体およびポリペプチドはまた、可変軽鎖および可変重鎖の両方を含んでもよい。マウスおよびヒト化EGFR-7およびEGFR-12抗体の可変軽鎖および可変重鎖の配列を、以下の表3および4に提供する。さらに、a配列番号19~23、69、および71~76と、少なくとも約90の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号24~30および70と、少なくとも約90の配列同一性を有するポリペプチド、を含むポリペプチドもまた提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号19~30および69~76と、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号19~23、69、および71~76と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号24~30、および70の配列と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号19~23、69、および71~76、のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号24~30および70のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドもまた、提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体であり、および/またはポリペプチドは、EGFRに特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、EGFRに特異的に結合する、マウス、キメラ、またはヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号19~30および69~76と、ある割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号19~30および69~76とは異なる。a配列番号31、32、および36と少なくとも約90の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号33~35、37、および38と少なくとも約90の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドもまた、提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号31~38と、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号31、32、および36と、少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチドならびに/またはb配列番号33~35、37、および38と、少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号31~32、および36のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号33~35、37、および38のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体であり、および/またはポリペプチドは、EGFRに特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、EGFRに特異的に結合するヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号31~38と特定の割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号31~38とは異なる。特定の実施形態において、EGFR抗体は、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331EGFR-6、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332EGFR-7、および2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333EGFR-12からなる群から選択される、ハイブリドーマから生成される抗体である。特定の実施形態において、抗体は、PTA-11331、PTA-11332、およびPTA-11333からなる群から選択される、ハイブリドーマから生成される抗体のVH-CDRおよびVL-CDRを含む。モノクローナル抗体は、KohlerandMilstein1975Nature256:495に記載のもの等、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法を使用してマウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物に、上述のように免疫付与し、リンパ球による抗体の生成を誘発し、それが免疫抗原に特異的に結合することになる。リンパ球はまた、インビトロで免疫付与することもできる。免疫付与の後に、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、好適な骨髄腫細胞系と融合して、次に未融合のリンパ球および骨髄腫細胞とは別に選択されるハイブリドーマ細胞を形成する。免疫沈降、免疫ブロット、またはインビトロ結合アッセイ例えば、放射免疫測定RIA、酵素結合免疫吸着測定法ELISAによって測定される、選択された抗原に特異的に向けられるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、次いで、標準的な方法を使用したインビトロ培養Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,1986、または動物における腹水腫瘍としてインビボでのいずれかで、繁殖させることができる。モノクローナル抗体は、次いで、ポリクローナル抗体について上述のように、培養培地または腹水から精製することができる。あるいは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第4,816,567号に記載のように、組み換えDNA方法を使用して製造することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅する、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、RT-PCRによって単離し、それらの配列を、従来の手順を使用して判定する。重鎖および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを、次に、好適な発現ベクターにクローニングし、それを、そうしなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない、例えば、大腸菌細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞にトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。また、所望の種の組み換えモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、McCaffertyetal.,1990,Nature,348:552-554、Clacksonetal.,1991,Nature,352:624-628、およびMarksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597に記載のように、所望の種のCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド複数を含むを、組み換えDNA技術を使用する多数の異なる方法でさらに修飾し、代替の抗体を生成してもよい。いくつかの実施形態において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインは、1キメラ抗体を生成するために、例えば、ヒト抗体の領域で、または2融合抗体を生成するために、非免疫グロブリンポリペプチドで、置換することができる。いくつかの実施形態において、定常領域を切断または除去して、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成する。可変領域の部位特異的または高密度な突然変異生成を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。いくつかの実施形態において、ヒトEGFRに対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態において、このような抗体は、ヒト対象に投与する場合、抗原性およびHAMAヒト抗マウス抗体反応を減少させるために、治療的に使用される。ヒト化抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して生成することができる。特定の代替的な実施形態において、EGFRに対する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して、直接的に調製することができる。標的抗原に対する抗体を生成する、インビトロで免疫付与したか、または免疫付与した個体から単離した不死化ヒトBリンパ球を生成することができる例えば、Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.771985、Boemeretal.,1991,J.Immunol.,1471:86-95、および米国特許第5,750,373号を参照されたい。また、ヒト抗体は、例えば、Vaughanetal.,1996,Nat.Biotech.,14:309-314、Sheetsetal.,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,95:6157-6162、HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381、およびMarksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581に記載のように、ファージライブラリーがヒト抗体を発現する場合、ファージライブラリーから選択されてもよい。抗体ファージライブラリーの生成および使用の技術はまた、米国特許第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号、同第6,593,081号、同第6,300,064号、同第6,653,068号、同第6,706,484号、および同第7,264,963号、ならびにRotheetal.,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるに記載される。親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略Marksetal.,1992,Bio/Technology10:779-783、参照によりその全体が組み込まれるが、当該技術分野で既知であり、高い親和性のヒト抗体を生成するために採用することができる。ヒト化抗体はまた、内因性免疫グロブリン生成の非存在下において、免疫付与時にヒト抗体の全範囲を生成する能力がある、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を含む、トランスジェニックマウスにおいて製造することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、および同第5,661,016号に記載される。本発明はまた、EGFRを特異的に認識する、二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを、特異的に認識および結合する能力のある抗体である。異なるエピトープは、例えば、両方の抗体が、EGFR、ならびに例えば、1T細胞受容体例えばCD3もしくはFc受容体例えば、CD64、CD32、CD16等の白血球上のエフェクター分子、または2以下に詳細に記載される細胞毒性剤、を特異的に認識し、それに結合することができるように、同じ分子例えば、同じEGFR内、または異なる分子上にあってもよい。例示的な二重特異性抗体は、2つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも1つは、本発明のポリペプチドに由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原アームは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞防御機構に焦点をあてるために、T細胞受容体分子例えば、CD2、CD3、CD28、もしくはB7、またはIgGのFc受容体等、白血球上の誘発分子に結合するアームと結合される。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する、直接的な細胞毒性剤として使用することもできる。これらの抗体は、抗原結合アーム、およびEOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETA等の細胞毒性剤または放射性核種キレート剤に結合するアームを有する。二重特性抗体を製造する技術は、当該技術分野において一般的であるMillsteinetal.,1983,Nature305:537-539、Brennanetal.,1985,Science229:81、Sureshetal,1986,MethodsinEnzymol.121:120、Trauneckeretal.,1991,EMBOJ.10:3655-3659、Shalabyetal.,1992,J.Exp.Med.175:217-225、Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.148:1547-1553、Gruberetal.,1994,J.Immunol.152:5368、および米国特許第5,731,168号。二価以上を有する抗体もまた想定される。例えば、三重特異性抗体が調製可能であるTuttetal.,J.Immunol.147:601991。したがって、特定の実施形態において、EGFRに対する抗体は、多重特異性である。特定の実施形態において、例えば、腫瘍浸潤を増加させるための抗体フラグメントを提供する。抗体フラグメントの生成のための種々の技術が、既知である。従来的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解を介してもたらされる例えば、Morimotoetal.,1993,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117、Brennanetal.,1985,Science,229:81。特定の実施形態において、抗体フラグメントは、組み換えで生成される。Fab、Fv、およびscFv抗体フラグメントは、全て、大腸菌または他の宿主細胞内に発現し、そこから分泌し得、したがって、これらのフラグメントの大量生成を可能にする。このような抗体フラグメントはまた、上述の抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載のような線形抗体であってもよく、単一特異性または二重特異性であり得る。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者には明らかであろう。本発明に従って、技術は、EGFRに特異的な単鎖抗体の生成に適合させることができる米国特許第4,946,778号を参照されたい。さらに、方法は、所望のEGFR特異性を有するモノクローナルFabフラグメント、またはその誘導体、フラグメント、類似体、もしくは相同体の迅速で効果的な識別を可能にするように、Fab発現ライブラリーの構築に適合させることができるHuse,etal.,Science246:1275-12811989。抗体フラグメントは、a抗体分子のペプシン消化によって生成されるFab’2フラグメント、bFab’2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生成されるFabフラグメント、cパパインおよび還元剤での抗体分子の処理によって生成されるFabフラグメント、ならびにdFvフラグメントを含むがこれらに限定されない、当該技術分野における技術によって生成することができる。特に抗体フラグメントの場合においては、抗体を、その血清半減期を増加させるために修飾することが、さらに望ましい可能性がある。これは、例えば、抗体フラグメントへのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みによって、抗体フラグメント内の適切な領域の突然変異によって、または末端もしくは中央のいずれかにおいて抗体フラグメントに融合されるペプチドタグに、エピトープを組み込むこと例えば、DNAもしくはペプチド合成によって、達成することができる。ヘテロ抱合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は、2つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫細胞を不要な細胞に標的化するために提案された米国特許第4,676,980号。抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学において既知の方法を使用して、インビトロで調製可能であることが、企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築することができる。この目的に好適な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチリミデートが挙げられる。本発明の目的のために、修飾された抗体が、抗体とヒトEGFRのポリペプチドとの会合を提供する、任意の種類の可変領域を含み得ることを理解されたい。この点において、可変領域は、所望の腫瘍関連抗原に対する体液性応答の増加および免疫グロブリンの生成を誘発し得る、任意の種類の哺乳動物を含むか、またはそれに由来し得る。このようにして、修飾された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類例えば、カニクイザル、マカク等、またはオオカミ由来のものであり得る。いくつかの実施形態において、修飾された免疫グロブリンの可変領域および定常領域の両方は、ヒトのものである。他の実施形態において、通常、非ヒト源に由来する適合性抗体の可変領域は、分子の結合特性の改善または免疫原性の減少のために、操作または特別に調整することができる。この点に関して、本発明に有用な可変領域は、ヒト化され得るか、またはそうでなければ、取り込まれたアミノ酸配列の包含を通じて、改変され得る。特定の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、1つ以上のCDRの少なくとも部分的な置き換えによって、ならびに必要であれば部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列変更によって、改変される。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはサブクラスでさえある抗体に由来してもよいが、CDRが、異なるクラスの抗体に由来し、場合によっては、異なる種の抗体に由来するであろうことが想定される。一方の可変ドメインの抗原結合能力をもう一方へ移行するために、必ずしも全てのCDRを、ドナーの可変領域由来の全CDRで置き換える必要はない。むしろ、いくつかの場合においては、抗原結合部位の活性を維持するために必要な残基を移行するだけでよい。米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、および同第5,693,762号に記載の説明を考慮すると、日常的な実験を行うことによって、または試行錯誤による実験によってのいずれかで、免疫原性が減少した機能的抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内にあるであろう。可変領域の改変に関わらず、当業者は、本発明の修飾された抗体が、定常領域ドメインのうちの1つ以上の少なくともごく一部が、削除されているか、またはそうでなければ、生来または未改変の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合に、増加した腫瘍局在または減少した血清半減期等、所望の生化学的特徴を提供するために改変されている、抗体例えば、全長抗体またはその免疫反応性フラグメントを含むであろうことを理解するであろう。いくつかの実施形態において、修飾された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含むであろう。本発明に適合性のある定常領域に対する修飾は、1つ以上のドメインにおける、1つ以上のアミノ酸の追加、削除、または置換を含む。すなわち、本明細書に開示される、修飾された抗体は、3つの重鎖定常ドメインCH1、CH2、もしくはCH3の1つ以上、および/または軽鎖定常ドメインCLへの改変または修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、1つ以上のドメインが、部分的または完全に削除されている、修飾された定常領域が企図される。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、CH2ドメイン全体が除去されている、ドメイン削除構築物または変異体を含むΔCH2構築物。いくつかの実施形態において、削除された定常領域ドメインは、通常、定常領域の不在によってもたらされる、何らかの分子の柔軟性を与える短いアミノ酸スペーサー例えば、10個の残基によって置き換えられる。それらの構造に加えて、定常領域が、いくつかのエフェクター機能を媒介することは、当該技術分野で既知である。例えば、抗体への補体のC1構成成分の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関与する可能性がある。さらに、抗体は、抗体のFc領域上のFc受容体部位が、細胞のFc受容体FcRに結合した状態で、Fc領域を介して細胞に結合する。IgGγ受容体、IgEη受容体、IgAα受容体、およびIgMμ受容体を含む、異なるクラスの抗体に特異的な、多数のFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体コーティング粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、またはADCCと称される、炎症性媒介物質の放出、胎盤通過、ならびに免疫グロブリン生成の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的反応を引き起こす。特定の実施形態において、EGFR結合抗体は、次に、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす、改変されたエフェクター機能を提供する。例えば、定常領域ドメインの削除または不活性化点突然変異もしくは他の手段を通じては、循環している修飾された抗体のFc受容体結合を減少させ、それによって、腫瘍局在化を増加させ得る。他の事例において、本発明と一致する定常領域の修飾は、補体結合を緩和し、したがって、血清半減期および抱合された細胞毒素の非特異的な会合を減少させ得る。定常領域のさらなる他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体の柔軟性の増加のために、局在化の強化を可能にする、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除することができる。同様に、本発明による定常領域への修飾は、十分に当業者の範囲内にある周知の生化学または分子工学技術を使用して、容易に行うことができる。特定の実施形態において、抗体であるEGFR結合剤は、1つ以上のエフェクター機能を有しない。例えば、いくつかの実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞毒性ADCC活性、および/または補体依存性細胞毒性CDC活性を有しない。特定の実施形態において、抗体は、Fc受容体および/または補体因子に結合しない。特定の実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有しない。特定の実施形態において、修飾された抗体を、それぞれの修飾された抗体のヒンジ領域に、CH3ドメインを直接的に融合するように操作することができることに留意されたい。他の構造においては、ヒンジ領域と修飾されたCH2および/またはCH3ドメインとの間に、ペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合がある。例えば、適合性構築物は、CH2ドメインが、削除され、残りのCH3ドメイン修飾または非修飾が、5~20個のアミノ酸スペーサーでヒンジ領域に結合される場合に、発現され得る。例えば、定常ドメインの調節エレメントが開放およびアクセス可能なままであり、ヒンジ領域が、柔軟なままであることを確保するために、このようなスペーサーを追加することができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、いくつかの事例において、免疫原性であり、構築物に対する不要な免疫反応をもたらすことを証明し得ることに留意されたい。したがって、特定の実施形態において、構築物に追加されるいずれのスペーサーも、修飾された抗体の所望の生物学的品質を維持するために、比較的非免疫原性であり得るか、または纏めて削除することさえ可能である。全定常領域ドメインの削除に加えて、本発明の抗体が数個または単一のみのアミノ酸の部分的な削除または置換によって提供され得ることが、理解されるであろう。例えば、CH2ドメインの選択された範囲内の単一のアミノ酸の突然変異は、Fc結合を実質的に減少させ、それによって腫瘍局在化を増加させるのに十分であり得る。同様に、エフェクター機能例えば、補体CLQ結合が調節されるように制御する、1つ以上の定常領域ドメインの一部を、単純に削除することが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的な削除は、抗体の選択された特徴血清半減期を改善しながら、対象の定常領域ドメインと関連する他の所望の機能を、無傷に保つことができる。さらに、上に示されるように、開示される抗体の定常領域は、結果として得られる構築物のプロファイルを強化する、1つ以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じて、修飾されてもよい。この点において、修飾された抗体の構造および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位例えば、Fc結合によって提供される活性を破壊することが可能な場合がある。特定の実施形態は、エフェクター機能の減少もしくは増加等、所望の特徴を強化するか、または、さらなる細胞毒素もしくは炭水化物の結合を提供するために、1つ以上のアミノ酸を定常領域に追加することを含んでもよい。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。本発明は、本明細書に記載のキメラ、ヒト化、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同である、変異体および同等物を、さらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つ以上アミノ酸の置換アミノ酸を含み得る。例えば、保存的置換は、1つのアミノ酸と、同じ一般クラス内の別のアミノ酸との置換、例えば、1つの酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸、1つの塩基性アミノ酸と別の1つの塩基性アミノ酸、または1つの中性アミノ酸の別の中性アミノ酸による、置換を指す。保存的アミノ酸置換により意図されるものは、当該技術分野で周知である。本発明のポリペプチドは、ヒトEGFRに対する抗体、またはそのフラグメントを含む、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。本発明のいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能の著しい影響なしに、変更され得ることは、当該技術分野において理解されるであろう。したがって、本発明は、実質的な活性を示すか、またはEGFRタンパク質に対する抗体もしくはそのフラグメントの領域を含む、ポリペプチドの変異体をさらに含む。このような突然変異には、削除、挿入、反転、反復、および型置換が含まれる。ポリペプチドおよび類似体は、通常はタンパク質の一部ではない、追加の化学部分を含むように、さらに修飾されてもよい。その誘導された部分は、タンパク質の可溶性、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。この部分はまた、タンパク質等のいずれの望ましい副作用も減少または排除し得る。この部分についての概要は、REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,20thed.,MackPublishingCo.,Easton,PA2000に見出すことができる。本明細書に記載の単離されたポリペプチドは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって。生成することができる。このような方法は、直接的タンパク質合成方法から、単離されたポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築すること、および好適な形質転換宿主に、これらの配列を発現することまでの範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、DNA配列は、目的の野生型タンパク質をコードする、DNA配列を単離または合成することよって、組み換え技術を使用して構築される。任意で、配列は、その機能的類似体を提供するために、部位特異的な突然変異生成によって、突然変異生成され得る。例えば、Zoelleretal.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:5662-50661984および米国特許第4,588,585号を参照されたい。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学合成によって構築されるであろう。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列、および目的の組み換えポリペプチドが中で生成されるであろう宿主細胞に好ましいコドンを選択することに基づいて、設計され得る。目的の単離されたポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列の合成に、標準的な方法を適用することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、DNAオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで連結させることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的に、相補的構築のために、5’または3’のオーバーハングを含む。いったん構築されると合成、部位特異的な突然変異生成、または別の方法によって、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、発現ベクター内に挿入され、所望の宿主細胞内でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に操作可能に接続され得る。適正な構築は、ヌクレオチドの配列決定、制限酵素マッピング、および好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって、確認することができる。当該技術分野で周知のように、宿主において、高い発現レベルのトランスフェクト遺伝子を得るためには、その遺伝子は、選択された発現宿主において機能的である、転写および翻訳発現制御配列に、操作可能に結合される必要がある。特定の実施形態において、組み換え発現ベクターを使用して、ヒトEGFRに対する抗体またはそのフラグメントをコードするDNAを増幅および発現させる。組み換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する、好適な転写または翻訳調節エレメントに操作可能に結合された、抗EGFR抗体またはそのフラグメントのポリペプチド鎖をコードする、合成またはcDNA由来のDNAフラグメントを有する、複製可能なDNA構築物である。転写単位は、一般的に、以下に詳細に記載されるように、1遺伝子発現に調節的な役割を有する遺伝エレメント1つまたは複数例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、2mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、ならびに3適切な転写および翻訳の開始および終了配列の集合を含む。このような調節エレメントは、転写を制御するために、操作者の配列を含む。通常、複製の起点によって与えられる宿主内での複製能力、および形質転換細胞の認識を促進するための選択遺伝子が、さらに組み込まれてもよい。DNA領域は、それらが、互いに機能的に関連する場合、操作可能に結合されている。例えば、シグナルペプチドのDNA分泌リーダーは、それが、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、ポリペプチドのDNAに操作可能に結合される、プロモーターは、それが、配列の転写を制御する場合、コード配列に操作可能に結合される、または、リボソーム結合部位は、それが、翻訳を可能にするように位置付けられる場合、コーディング配列の操作可能に結合される。酵母発現系における使用を対象とした構造エレメントには、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にする、リーダー配列を含まれる。あるいは、組み換えタンパク質が、リーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、それは、N末端メチオニン残基を含んでもよい。この残基は、任意で、続いて発現された組み換えタンパク質から実質的に開裂されて、最終生成物を提供することができる。発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主/ベクターの組み合わせが採用可能である。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、既知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9、およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、より広宿主域のプラスミド、例えば、M13および繊維状単鎖DNAファージ等、が含まれる。EGFR結合ポリペプチドまたは抗体もしくは抗原として使用するためのEGFRタンパク質の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下における、原核生物、酵母、昆虫またはより高度な真核細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または桿菌が挙げられる。より高度な真核細胞には、以下に記載の哺乳動物由来の樹立細胞系が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、採用可能である。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Pouwelsetal.CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985によって記載され、その関連する開示は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体生成を含む、タンパク質生成の方法に関する追加の情報は、米国特許公開第2008/0187954号、米国特許第6,413,746号および同第6,660,501号、ならびに国際公開第WO04009823号に見出すことができ、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系もまた、組み換えタンパク質の発現に有利に採用される。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質が、概して、正しく折り畳まれ、適切に修飾され、完全に機能的であるため、実行可能である。好適な哺乳動物宿主細胞系の例には、GluzmanCell23:175,1981によって記載されるサル腎臓細胞のCOS-7系、ならびに、例えば、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣CHO、HeLa、およびBHK細胞系を含む、適切なベクターを発現する能力のある他の細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製の原型、発現される遺伝子に結合した好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5’または3’が両側に隣接する非転写配列、ならびに5’または3’翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容部位、ならびに転写集結配列を含むことができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生成のためのバキュロウイルス系を、LuckowandSummers,Bio/Technology6:471988によって検討した。形質転換宿主によって生成されるタンパク質は、任意の好適な方法に従って精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー例えば、イオン交換、親和性およびサイジングカラムクロマトグラフィー、遠心分離、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコーティング配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ等の親和性標識をタンパク質に結合させ、適切な親和性カラムの通過による容易な精製を可能にすることができる。単離タンパク質はまた、タンパク分解、核磁気共鳴およびx線結晶学等の技術を使用して、物理的に特徴付けることができる。例えば、培養培地内に組み換えタンパク質を分泌する系からの上清は、まず、市販で利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMilliporePelliconの限外濾過装置を使用して、濃縮することができる。濃縮ステップに続いて、濃縮物を、好適な精製マトリックスに適用することができる。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダント型ジエチルアミノメチルDEAE基を有するマトリックスまたは基質を採用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に広く採用される、他の種類のものであってもよい。あるいは、カチオン交換ステップが採用されてもよい。好適なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む、種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、EGFR結合剤をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC培地、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを採用する、1つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィーRP-HPLCステップを採用することができる。前述の精製ステップのいくつかまたは全てはまた、均一性の組み換えタンパク質を提供するために、種々の組み合わせで採用されてもよい。細菌培地で生成された組み換えタンパク質を、細胞ペレットからの初期抽出、続いて、1回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって、単離することができる。高速液体クロマトグラフィーHPLCを、最終精製ステップに採用することができる。組み換えタンパク質の発現に採用された微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来方法によって破壊することができる。抗体または他のタンパク質の精製のための、当該技術分野で既知の方法にはまた、例えば、米国特許公開第2008/0312425号、同第2008/0177048号、同第2009/0187005号に記載されるものであり、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、EGFR結合剤は、抗体ではないポリペプチドである。タンパク質標的に高い親和性で結合する、非抗体ポリペプチドの識別および生成のための種々の方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-3042007、Hosseetal.,ProteinScience,15:14-272006、Gilletal.,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-6582006、Nygren,FEBSJ.,275:2668-762008、およびSkerra,FEBSJ.,275:2677-832008を参照されたく、そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、ファージディスプレイ技術が、EGFR結合ポリペプチドの識別/生成に使用されている。特定の実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質A、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択される種類のタンパク質の足場を含む。いくつかの実施形態において、本薬剤は、非タンパク質分子である。特定の実施形態において、本薬剤は、小分子である。非タンパク質EGFR結合剤の識別に有用なコンビナトリアルケミストリーライブラリーおよび技術は、当業者に既知である。例えば、Kennedyetal.,J.Comb.Chem,10:345-3542008、Dolleetal,J.Comb.Chem.,9:855-9022007、およびBhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-4042001を参照されたく、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる特定の実施形態において、本薬剤は、炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、またはプロテオグリカンである。特定の実施形態において、本薬剤は、核酸アプタマーである。アプタマーは、別の分子に結合するそれらの能力に基づいて例えば、無作為または突然変異したプールから選択された、ポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、DNAポリヌクレオチドを含む。特定の代替的な実施形態において、アプタマーは、RNAポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、アプタマーは、1つ以上の修飾された核酸残基を含む。タンパク質への結合のために核酸アプタマーを生成およびスクリーニングする方法は、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第5,270,163号、同第5,683,867号、同第5,763,595号、同第6,344,321号、同第7,368,236号、同第5,582,981号、同第5,756,291号、同第5,840,867号、同第7,312,325号、同第7,329,742号、国際特許公開第WO02/077262号、同第WO03/070984号、米国特許出願第2005/0239134号、同第2005/0124565号、同第2008/0227735号を参照されたく、そのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。III.免疫抱合体本発明はまた、薬物またはプロドラッグに結合または抱合された、本明細書に開示される抗EGFR抗体、抗体フラグメント、およびそれらの機能的同等物を含む、抱合体本明細書において、免疫抱合体とも称されるを対象とする。好適な薬物またはプロドラッグは、当該技術分野で既知である。薬物またはプロドラッグは、細胞毒性剤であってもよい。本発明の細胞毒性抱合体において使用される細胞毒性剤は、細胞死をもたらす、細胞死を誘発する、または何らかの方法で細胞の生存率を減少させる、任意の化合物であり得、例えば、マイタンシノイドおよびマイタンシノイド類似体が含まれる。他の好適な細胞毒性剤は、例えば、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC-1065およびCC-1065類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、エンジイン、例えば、カリケアマイシン、アウリスタチンを含むドラスタチンおよびドラスタチン類似体、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ならびにモルホリノドキソルビシンである。このような抱合体は、抗体または機能的同等物への薬物またはプロドラッグの結合のために、結合基を使用して、調製することができる。好適な結合基は、当該技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸性不安定性基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定性基、およびエステラーゼ不安定性基が挙げられる。薬物またはプロドラッグは、例えば、ジスルフィド結合を通じて、抗EGFR抗体またはそのフラグメントに結合され得る。リンカー分子または架橋剤は、抗EGFR抗体またはそのフラグメントと反応し得る、反応化学基を含む。細胞結合剤との反応のための反応化学基は、N-スクシンイミジルエステルおよびN-スルホスクシンイミジルエステルであり得る。さらに、リンカー分子は、反応性化学基を備え、それは、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る、ジチオピリジル基であってもよい。リンカー分子には、例えば、N-スクシンイミジル3-2-ピリジルジチオプロピオネートSPDP例えば、Carlssonetal.,Biochem.J.,173:723-7371978を参照されたい、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDB例えば、米国特許第4,563,304号、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオ2-スルホブタノエートスルホ-SPDB米国公開第20090274713号を参照されたい、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオペンタノエートSPP例えば、CAS登録番号341498-08-6号を参照されたい、2-イミノチオラン、またはアセチルスクシン無水物が挙げられる。例えば、抗体または細胞結合剤は、架橋試薬で修飾することができ、このようにしてもたらされる遊離または保護チオール基を含む抗体または細胞結合剤は、次に、ジスルフィドまたはチオールを含むマイタンシノイドと反応して、抱合体を生成する。抱合体は、HPLC、サイズ排除、吸収、イオン交換および親和性捕捉、透析、または接線流濾過を含むが、これらに限定されない、クロマトグラフィーによって精製することができる。本発明の別の態様において、抗EGFR抗体は、免疫抱合体の有効性、可溶性、または効果を強化する際、ジスルフィド結合およびポリエチレングリコールスペーサーを介して細胞毒性薬物に結合する。このような開裂可能親水性リンカーは、国際公開第WO2009/0134976号に記載される。このリンカー設計の追加の利点は、抗体-薬物抱合体の、所望の高モノマー比および最小凝集である。この態様において、2~8の狭い範囲の薬物負荷で、ポリエチレングリコールスペーサーCH2CH2On=1-14を有するジスルフィド基-S-S-を介して結合された、細胞結合剤と薬物との抱合体が、特に企図され、癌細胞に対して比較的極めて強力な生物学的活性を示し、所望の生化学的特性である、高い抱合収率および高いモノマー比を、最小のタンパク質凝集とともに有することが示される。この態様において、式Iの抗EGFR抗体薬物抱合体または式I’の抱合体が、特に企図される。CB-[Xl--CH2-CH2O-n-Y-D]mI[D-Y--CH2-CH2O-n-Xl]m-CBI’式中、CBは、抗EGFR抗体またはフラグメントを表し、Dは、薬物を表し、Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し、Yは、ジスルフィド結合を介して薬物に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環単位を表し、lは、0または1であり、mは、2~8の整数であり、nは、1~24の整数である。いくつかの実施形態において、mは、2~6の整数である。いくつかの実施形態において、mは、3~5の整数である。いくつかの実施形態において、nは、2~8の整数である。あるいは、例えば、米国特許第6,441,163号および同第7,368,565号に開示されるように、薬物を、まず、修飾して、細胞結合剤との反応に好適な反応性エステルを導入してもよい。活性化されたリンカー部分を含むこれらの薬物と、細胞結合剤との反応は、細胞結合剤薬物抱合体を生成する別の方法を提供する。マイタンシノイドはまた、例えば、米国特許第6,716,821号に記載のように、PEG結合基を使用して、抗EGFR抗体またはフラグメントに結合されてもよい。これらのPEG非開裂可能結合基は、水および非水性溶媒の両方に可溶性であり、1つ以上の細胞毒性剤を、細胞結合剤に結合するために使用することができる。例示的なPEG結合基には、リンカーの両末端で、1つの末端でスルフヒドリルまたはジスルフィド基、もう1つの末端で活性エステルを通じて、細胞毒性剤および細胞結合剤と反応する、ヘテロ二官能性PEGリンカーが挙げられる。PEG結合基を使用する、細胞毒性抱合体の合成の一般的な例として、再度、米国特許第6,716,821号へ参照がなされ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。合成は、反応性PEG部分を有する1つ以上の細胞毒性剤と、細胞結合剤との反応で壊死し、結果として、細胞結合剤のアミノ酸残基による、各反応性PEG部分の末端の活性エステルの変位をもたらし、PEG結合基を通じて細胞結合剤に共有結合された、1つ以上の細胞毒性剤を含む細胞毒性抱合体を生成する。あるいは、細胞結合は、二官能性PEG架橋剤で修飾し、反応性ジスルフィド部分ピリジルジスルフィド等を導入してもよく、それを、次にチオール含有マイタンシノイドで処理して抱合体を得ることができる。別の方法において、細胞結合は、二官能性PEG架橋剤で修飾して、チオール部分を導入してもよく、それを、次に反応性ジスルフィド含有マイタンシノイドピリジルスルフィド等で処理して、抱合体を得ることができる。非開裂型結合を有する抗体-マイタンシノイド抱合体もまた、調製可能である。このような架橋剤は、当該技術分野において記載され例えば、米国公開第20050169933号を参照されたい、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCCが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体を、文献に記載のように、スクシンイミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、スルホ-SMCC、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルMBS、スルホ-MBS、またはスクシンイミジル-ヨード酢酸等の架橋試薬で修飾し、1~10個の反応基を導入するYoshitakeetal,Eur.J.Biochem.,101:395-3991979、Hashidaetal,J.AppliedBiochem.,56-631984、およびLiuetal,Biochem.,18:690-6971979。修飾された抗体を、次に、チオール含有マイタンシノイド誘導体と反応させ、抱合体を生成する。抱合体を、SephadexG25カラムを通じたゲル濾過、または透析もしくは接線流濾過によって、精製することができる。修飾された抗体を、チオール含有マイタンシノイド1~2モル当量/マレイミド基で処理し、抗体-マイタンシノイド抱合体を、SephadexG-25カラムを通じたゲル濾過、セラミックヒドロキシアパタイトカラム上のクロマトグラフィー、透析もしくは接線流濾過、またはそれらの方法の組み合わせによって、精製する。典型的に、1個の抗体につき1~10個のマイタンシノイドが、結合される。1つの方法は、スクシンイミジル4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCCで抗体を修飾してマレイミド基を導入し、続いて、修飾された抗体をチオール含有マイタンシノイドと反応させて、チオエーテル結合抱合体を得ることである。また、1個の抗体分子につき、1~10個の薬物分子を有する抱合体が生じる。抗体、抗体フラグメント、および他のタンパク質のマイタンシノイド抱合体は、同じ方法で作製される。本発明の別の態様において、EGFR抗体は、PEGスペーサーの仲介を通じた非開裂可能結合を介して、薬物に結合される。薬物と抗EGFR抗体またはフラグメントとの間のリンカーを形成する、親水性PEG鎖を有する好適な架橋試薬もまた、当該技術分野で周知であるか、または市販入手可能である例えば、QuantaBiodesign,パウエル,オハイオ州から。好適なPEG含有架橋剤はまた、当業者に既知の標準的な合成化学技術を使用して、市販入手可能なPEG自体から合成することができる。薬物を、米国特許公開第20090274713号およびWO2009/0134976に詳細に記載される方法によって、二官能性PEG含有架橋剤と反応させて、次の式、Z-Xl--CH2-CH2-O-n-Yp-Dの化合物を得ることができ、それを、次に細胞結合剤と反応させて、抱合体を得ることができる。あるいは、細胞結合は、二官能性PEG架橋剤で修飾して、チオール反応基マレイミドまたはハロアセトアミド等を導入してもよく、それを、次にチオール含有マイタンシノイドで処理して、抱合体を得ることができる。別の方法において、細胞結合は、二官能性PEG架橋剤で修飾して、チオール部分を導入してもよく、それを、次にチオール反応性マイタンシノイドマレイミドまたはハロアセトアミドを有するマイタンシノイド等で処理して、抱合体を得ることができる。したがって、本発明の別の態様は、式IIまたは式II’の抗EGFR抗体薬物抱合体であり、CB-[Xl--CH2-CH2-O-n-Yp-D]mII[D-Yp--CH2-CH2-O-n-Xl]m-CBII’式中、CBは、抗EGFR抗体またはフラグメントを表し、Dは、薬物を表し、Xは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し、Yは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素-炭素結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して、薬物に結合された、脂肪族、芳香族、または複素環の単位を表し、lは、0または1であり、pは、0または1であり、mは、2~15の整数であり、nは、1~2000の整数である。いくつかの実施形態において、mは、2~8の整数である。いくつかの実施形態において、nは、1~24の整数である。いくつかの実施形態において、mは、2~6の整数である。いくつかの実施形態において、mは、3~5の整数である。いくつかの実施形態において、nは、2~8の整数である。好適なPEG含有リンカーの例には、抗EGFR抗体またはそのフラグメントとの反応のためのN-スクシンイミジルエステルまたはN-スルホスクシンイミジルエステル部分、ならびに化合物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチル系部分を有するリンカーが挙げられる。PEGスペーサーは、本明細書に記載の方法によって、当業者に既知の任意の架橋剤に組み込むことができる。本明細書に開示される多数のリンカーは、米国特許公開第20050169933号および同第20090274713号、ならびにWO2009/0134976号に詳細に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、約2~約8個の薬物分子薬物負荷、例えば、マイタンシノイドが、抗EGFR抗体またはそのフラグメントに結合され、抱合体の抗腫瘍効果が、同じ細胞結合剤に結合した、より少数またはより多数の薬物と比較した際、より一層有効である、態様を含む。薬物負荷とは、本明細書に使用される際、細胞結合剤例えば、抗EGFR抗体またはそのフラグメントに結合し得る薬物分子例えば、マイタンシノイドの数を指す。一態様において、細胞結合剤に結合し得る薬物分子の数は、平均して約2~約8個例えば、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1である。N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1およびN2’-デアセチル-N2’-4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチルマイタンシンDM4もまた、使用可能である。抗EGFR抗体またはそのフラグメントを、二官能性架橋試薬を抗EGFR抗体またはそのフラグメントと反応させ、それによって、リンカー分子の抗EGFR抗体またはそのフラグメントへの共有結合をもたらすことにより、修飾することができる。本明細書に使用される際、二官能性架橋試薬は、細胞結合剤を、本明細書に記載の薬物等の薬物に共有結合する、任意の化学部分である。別の方法において、結合部分の一部は、薬物によって提供される。この態様において、薬物は、細胞結合剤を薬物に結合するために使用される、より大きなリンカー分子の一部である、結合部分を含む。例えば、マイタンシノイドDM1を形成するために、マイタンシンのC-3ヒドロキシル基の側鎖は、遊離スルフヒドリル基SHを有するように修飾される。このマイタンシンのチオール化形態は、修飾された細胞結合剤と反応して、抱合体を形成することができる。したがって、最後のリンカーは、2つの構成成分から構築され、1つは架橋試薬によって提供されるが、もう1つはDM1由来の側鎖によって提供される。薬物分子はまた、血清アルブミン等の中間担体分子を通じて、抗体分子に結合されてもよい。本明細書に使用される際、細胞結合剤に結合したまたは抗EGFR抗体またはフラグメントに結合したという表現は、好適な結合基またはその前駆体を介して、細胞結合剤である抗EGFR抗体またはフラグメントに結合した少なくとも1つの薬物誘導体を含む、抱合体分子を指す。1つの結合基は、SMCCである。特定の実施形態において、本発明において有用な細胞毒性剤は、マイタンシノイドおよびマイタンシノイド類似体である。好適なマイタンシノイドの例には、マイタンシノールのエステルおよびマイタンシノール類似体が挙げられる。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体のように、微小管形成を阻害し、哺乳動物細胞に高く毒性である、あらゆる薬物が含まれる。好適なマイタンシノールエステルの例には、修飾された芳香環を有するもの、および他の位置に修飾を有するものが挙げられる。このような好適なマイタンシノイドは、米国特許第4,424,219号、同第4,256,746号、同第4,294,757号、同第4,307,016号、同第4,313,946号、同第4,315,929号、同第4,331,598号、同第4,361,650号、同第4,362,663号、同第4,364,866号、同第4,450,254号、同第4,322,348号、同第4,371,533号、同第5,208,020号、同第5,416,064号、同第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号、同第6,333,410号、同第7,276,497号、および同第7,473,796号に開示される。ある実施形態において、本発明の免疫抱合体は、チオール含有マイタンシノイドDM1、正式名称N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンを、細胞毒性剤として利用する。DM1は、次の構造式IIIによって表される。別の実施形態において、本発明の抱合体は、チオール含有マイタンシノイドN2’-デアセチル-N2’4-メチル-4-メルカプト-1-オキソペンチル-マイタンシン例えば、DM4を、細胞毒性剤として利用する。DM4は、次の構造式IVによって表される。立体障害チオール結合を含む、別のマイタンシノイドは、N2’-デアセチル-N-2’4-メルカプト-1-オキソペンチル-マイタンシンDM3と称されるは、次の構造式Vによって表される。米国特許第5,208,020号および同第7,276,497号に教示されるマイタンシノイドのそれぞれもまた、本発明の抱合体に使用することができる。この点に関して、米国特許第5,208,020号および同第7,276,697号の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイド上の多くの位置が、結合部分に化学的に結合するための位置として機能する。例えば、ヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシで修飾されたC-15位、およびヒドロキシ基を有するC-20位は、全て有用であることが予想される。いくつかの実施形態において、C-3位は、結合部分に化学的に結合するための位置として機能し、いくつかの具体的な実施形態においては、マイタンシノールのC-3位は、結合部分に化学的に結合するための位置として機能する。いくつかの抱合体の構造的表示を、以下に示す。このような抗体-マイタンシノイド抱合体の生成のための複数の記述は、米国特許第6,333,410号、同第6,441,163号、同第6,716,821号、および同第7,368,565号に提供され、そのそれぞれが、全体として本明細書に組み込まれる。一般的に、水性緩衝液中の抗体の溶液は、反応基を保有するジスルフィド部分を有する、モル過剰マイタンシノイドとともにインキュベートすることができる。反応混合物を、過剰アミンエタノールアミンタウリン等の添加によって、反応停止させることができる。マイタンシノイド-抗体抱合体は、次に、ゲル濾過によって精製することができる。1個の抗体分子あたりのマイタンシノイド分子の数は、252nmおよび280nmにおける吸光度比を、分光光度的に測定することによって、判定することができる。平均のマイタンシノイド分子/抗体数は、例えば、1~10個または2~5個であり得る。アントラサイクリン化合物、ならびにその誘導体、中間体、または修飾形態もまた、抗EGFR免疫抱合体の調製に使用することができる。例えば、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、ドキソルビシン中間体、および修飾ドキソルビシンを、抗EGFR抱合体に使用することができる。例示的な化合物は、WO2010/009124号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような化合物には、例えば、次の式の化合物が含まれ、式中、R1は、水素原子、ヒドロキシ、またはメトキシ基であり、R2は、C1-Csアルコキシ基、またはその薬学的に許容される塩である。抗体とマイタンシノイドまたは他の薬物との抱合体を、インビトロで種々の望ましくない細胞系の増殖を抑制するそれらの能力について、評価することができる。例えば、NCI-H226、NCI-H292、およびNCI-H322M等の細胞系は、これらの化合物の細胞毒性の評価に、容易に使用可能である。評価する細胞を化合物に4~5日間曝露し、細胞の生存率を、既知の方法による直接アッセイで測定することができる。IC50値は、次に、アッセイの結果から計算することができる。免疫抱合体は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によると、細胞内に内部移行され得る。免疫抱合体は、したがって、それが、EGFR発現細胞によって、取り込まれるか、または内部移行される際に、治療効果を発揮することができる。いくつかの具体的な実施形態において、免疫抱合体は、開裂可能リンカーによって細胞毒性剤に結合された、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを含み、細胞毒性剤は、EGFR発現細胞によって内部移行される際に、抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドから開裂される。いくつかの実施形態において、免疫抱合体は、腫瘍体積を縮小する能力がある。例えば、いくつかの実施形態において、免疫抱合体での治療は、約50未満、約45未満、約40未満、約35未満、約30未満、約25未満、約20未満、約15未満、約10未満、または約5未満のT/C値をもたらす。別の態様において、本発明のsiRNA分子は、薬物の代わりに本発明の抗体に結合し得る。siRNAは、オリゴヌクレオチドの修飾に広く使用される方法によって、本発明の抗体に結合され得る例えば、米国特許公開第20050107325号および同第20070213292号を参照されたい。したがって、その3’または5’-ホスホラミダイト形態にあるsiRNAを、ヒドロキシ官能性を有する架橋剤の1つの末端と反応させて、siRNAと架橋剤との間にエステル結合をもたらすことができる。siRNAホスホラミダイトと、末端アミノ基を有する架橋剤との類似反応により、アミンを通じて、siRNAへの架橋剤の結合をもたらす。あるいは、siRNAを、標準的な化学的方法によって、誘導し、チオール基を導入してもよい。修飾して活性ジスルフィドまたはマレイミド部分を導入した抗体と、このチオール含有siRNAを反応させ、開裂可能または非開裂可能抱合体を生成することができる。この方法によって、1~20個のsiRNA分子を、抗体に結合することができる。III.ポリヌクレオチド特定の実施形態において、本発明は、EGFRに特異的に結合するポリペプチド、またはこのようなポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、ヒトEGFRに対する抗体をコードするか、またはこのような抗体のフラグメントをコードする、核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNAの形態であり得る。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれ、二本鎖または単鎖であり得、単鎖の場合は、コード鎖または非コードアンチセンス鎖であり得る。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されている。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。本発明は、配列番号1~38および69~76からなる群から選択される配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。本発明は、以下の表7~9に示されるものから選択される配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。さらに、配列番号39~58、77~84と少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、少なくとも約98、または少なくとも約99の配列同一性を有するポリヌクレオチドもまた提供する。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号39~43、51、54、56、77~80、もしくは82~84と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに/またはb配列番号44~50、52、53、55、57、58、81と少なくとも約95の配列同一性を有するポリペプチド、を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、a配列番号39~43、51、54、56、77~80、もしくは82~84のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および/またはb配列番号44~50、52、53、55、57、58、81のアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合された成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そのリーダー配列が、宿主細胞によって開裂されて、ポリペプチドの成熟形態を形成し得る。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質にさらなる5’アミノ酸残基を加えたプロタンパク質をコードすることが可能である。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパク質であり、タンパク質の不活性形態である。いったんプロ配列が開裂されると、活性な成熟タンパク質が残る。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に融合された、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、またはマーカー配列は、哺乳動物宿主例えば、COS-7細胞が使用される場合は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のヘマグルチニンHAタグであってもよい。本発明は、さらに、例えば、フラグメント、類似体、および誘導体をコードする、本明細書に上述のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、または両方における改変を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド変異体は、静的置換、追加、または削除をもたらす改変を含むが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの縮退のため、‘静的置換によって生成される。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化するヒトmRNAのコドンを、大腸菌等の細菌宿主に好ましいものに変更するために、生成される。本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクターおよび細胞もまた、提供する。IV.使用方法および薬学的組成物本発明のEGFR結合剤抗体、免疫抱合体、およびポリペプチドを含むは、癌の治療等、治療的な治療法を含むが、これに限定されない、種々の適用に有用である。特定の実施形態において、本薬剤は、腫瘍成長の阻害、分化の誘発、腫瘍体積の縮小、および/または腫瘍の腫瘍原性の減少に有用である。使用方法は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボ法であってもよい。特定の実施形態において、EGFR結合剤もしくは抗体もしくは免疫抱合体、またはポリペプチドは、それが結合するヒトEGFRに拮抗性ではない。一態様において、本発明の抗EGFR抗体および免疫抱合体は、生物学的試料中のEGFRの存在を検出することに有用である。本明細書に使用される際、用語検出は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織を含む。一態様において、本発明は、生物学的試料中のEGFRの存在を検出する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、EGFRへの抗EGFR抗体の結合を可能にする条件下で、生物学的試料を抗EGFR抗体と接触させること、および抗EGFR抗体とEGFRとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。一態様において、本発明は、EGFRの発現の増加と関連する障害の診断方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、試験細胞を抗EGFR抗体と接触させること、EGFRへの抗EGFR抗体の結合を検出することによって、試験細胞によるEGFRの発現レベルを判定すること定量的または定性的のいずれかで、ならびに、試験細胞によるEGFRの発現レベルを、対照細胞例えば、試験細胞と同じ組織に由来する正常細胞、またはこのような正常細胞に匹敵するレベルでEGFRを発現する細胞によるEGFRの発現レベルと比較することを含み、対照細胞と比較した際、試験細胞によるEGFRの高い発現レベルは、EGFRの発現の増加と関連する障害の存在を示す。特定の実施形態において、試験細胞は、EGFRの発現の増加と関連する障害を有する疑いのある個体から得られる。特定の実施形態において、障害は、癌または腫瘍等、細胞増殖性障害である。特定の実施形態において、上述のもの等、診断または検出の方法は、細胞表面上、またはその表面上にEGFRを発現する細胞から得られた膜標本内に、発現されるEGFRへの抗EGFR抗体の結合を検出することを含む。特定の実施形態において、本方法は、EGFRへの抗EGFR抗体の結合を可能にする条件下で、細胞を抗EGFR抗体と接触させること、および細胞表面上で、抗EGFR抗体とEGFRとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。細胞の表面上に発現されるEGFRへの抗EGFR抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、FACSアッセイである。特定の他の方法が、EGFRへの抗EGFR抗体の結合を検出するために使用可能である。このような方法には、当該技術分野で周知の抗原結合アッセイ、例えば、ウェスタンブロット、放射免疫測定、ELISA酵素結合免疫吸着測定法、サンドイッチ免疫測定、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫測定、タンパク質A免疫測定、および免疫組織化学IHCが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗EGFR抗体は、標識化される。標識には、直接的に検出される標識または部分蛍光、発色団、電子密度、および放射性標識等、ならびに例えば、酵素反応または分子間相互作用を通じて、間接的に検出される、酵素またはリガンド等の部分が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗EGFR抗体は、不溶性マトリックス上に固定化される。固定化は、溶液中で遊離したままである任意のEGFRから抗EGFR抗体を分離することを伴う。これは、通常、アッセイ手順の前に、不水溶性マトリックスもしくは表面への吸着により抗EGFR抗体を不溶性にすることBennichetal.、米国特許第3,720,760号、または共有結合例えば、グルタルアルデヒド架橋、または例えば免疫沈降によって抗EGFR抗体とEGFRとの複合体の形成後に抗EGFR抗体を不溶性にすること、のいずれかによって、達成される。診断または検出のいずれの上述の実施形態も、抗EGFR抗体の代わりにか、またはそれに加えて、本発明の免疫抱合体を使用して実行することができる。特定の実施形態において、EGFR結合剤または拮抗薬例えば、抗EGFR抗体で治療される疾患は、癌である。特定の実施形態において、癌は、EGFR結合剤例えば、抗体が結合する、EGFRを発現する細胞によって特徴付けられる。さらなる態様において、本発明は、EGFRが発現される、特に、EGFRが、異常発現例えば、過剰発現される、膀胱、脳、頭頸部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、皮膚、および腎臓の癌を含む、細胞増殖疾患を治療するための改善された方法であって、本発明の抗EGFR結合剤の治療有効量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法を対象とする。別の実施形態において、抗体は、ヒト化される。本発明の抗EGFR結合剤によって治療することができる細胞増殖障害の例には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭頸部、神経系中枢および末梢、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系内に位置する新生物が含まれるが、これらに限定されない。同様に、他の細胞増殖障害もまた、本発明の抗EGFR結合剤によって治療することができる。このような細胞増殖障害の例には、上記の器官系に位置する、副腎皮質過形成クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚ヘック病、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、さらに、本明細書に記載の抗体または他の薬剤を使用して、腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、細胞を、インビトロで、EGFR結合剤例えば、抗体と接触させることを含む。例えば、EGFRを発現する不死化細胞系または癌細胞系を、抗体または他の薬剤を添加した培地中で培養し、腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料等の患者試料から単離し、EGFR結合剤を添加した培地中で培養し、腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、腫瘍または腫瘍細胞を、インビボで、EGFR結合剤例えば、抗体と接触させることを含む。特定の実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞をEGFR結合剤と接触させることは、動物モデルにおいて行われる。例えば、EGFR結合剤を、免疫無防備状態のマウス例えば、NOD/SCIDマウスにおいて成長させた1つ以上のEGFRを発現する異種移植片に投与して、腫瘍成長を阻害する。いくつかの実施形態において、癌幹細胞を、例えば、組織生検、胸水、または血液試料等の患者試料から単離し、免疫無防備状態のマウスに注射し、次いで、それにEGFR結合剤を投与して、腫瘍細胞成長を阻害する。いくつかの実施形態において、EGFR結合剤を、同時、または腫瘍原性細胞の導入直後に動物に投与し、腫瘍成長を防止する。いくつかの実施形態において、EGFR結合剤を、腫瘍原性細胞が、指定寸法まで成長した後に、治療として投与する。特定の実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、EGFR結合剤の治療有効量を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、対象は、腫瘍を有するか、腫瘍を除去されている。特定の実施形態において、腫瘍は、EGFR結合剤または抗体が結合する、EGFRを発現する。さらに、本発明は、対象における腫瘍の腫瘍原性を減少させる方法であって、EGFR結合剤の治療有効量を、対象に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、癌幹細胞を含む。特定の実施形態において、腫瘍中の癌幹細胞の頻度は、本薬剤の投与によって減少する。本発明は、さらに、腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞に分化させる方法であって、腫瘍原性細胞を、EGFR結合剤と接触させること例えば、EGFR結合剤を、腫瘍原性細胞を含む腫瘍を有するか、またはそのような腫瘍を除去した対象に、投与することによってを含む、方法を提供する。腫瘍細胞を含むがこれに限定されない細胞の分化を誘発するための、本明細書に記載のEGFR結合剤、ポリペプチド、または抗体の使用もまた、提供する。例えば、細胞を、本明細書に記載のEGFR結合剤例えば、抗EGFR抗体の有効量と接触させることを含む、細胞の分化を誘発させる方法が、想定される。EGFR結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍内の細胞に分化を誘発させる方法もまた、提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、膵臓腫瘍である。特定の他の実施形態において、腫瘍は、結腸腫瘍である。いくつかの実施形態において、治療方法は、EGFR結合剤、ポリペプチド、または抗体の治療有効量を、対象に投与することを含む。本発明は、さらに、本明細書に記載のEGFR結合剤のうち1つ以上を含む、薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルをさらに含む。これらの薬学的組成物は、ヒト患者において腫瘍成長の阻害および癌の治療における使用を見出す。特定の実施形態において、保管および使用のために、製剤を、精製された本発明の抗体または薬剤と、薬学的に許容されるビヒクル例えば、担体、賦形剤とを合わせることによって調製するRemington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEditionMackPublishing,2000。好適な薬学的に許容されるビヒクルには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等の非毒性緩衝剤;塩化ナトリウム等の塩;アスコルビン酸およびメチオニンを含む、酸化防止剤;保存剤例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール;低分子量ポリペプチド例えば、約10個未満のアミノ酸残基;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アルパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸;単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリン等の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖類;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属複合体例えば、Zn-タンパク質複合体;ならびに、TWEENまたはポリエチレングリコールPEG等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物は、局所または全身治療のいずれかのためのあらゆる手段で、投与することができる。投与は、経皮貼付、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐薬、液体、および粉末等の、局所例えば、膣および直腸送達を含む、粘膜へ、肺例えば、噴霧器によるものを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入または吹送によって、すなわち、気管内、鼻腔内、表皮、および経皮;経口;または静脈内、心房内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射または注入を含む、非経口;または頭蓋内例えば、髄腔内もしくは脳室内の投与であり得る。本発明の抗体または免疫抱合体は、薬学的複合製剤中、または併用療法としての投与レジメンにおいて、抗癌特性を有する第2の化合物と合わせることができる。薬学的複合製剤または投与レジメンの第2の化合物は、互いに悪影響を与えることのないように、ADCの組み合わせに対して相補的な活性を有し得る。EGFR結合剤および第2の抗癌剤を含む薬学的組成物もまた、提供される。疾患の治療について、本発明の抗体または薬剤の適切な用量は、全てが治療する医師の判断で、治療される疾患の種類、疾患の重症度および過程、疾患の反応性、抗体または薬剤が治療的もしくは予防的目的で投与されるのか、以前の治療法、患者の病歴等に依存する。抗体または薬剤は、1回または数日から数ヶ月続く一連の治療にわたって、あるいは治癒がもたらされるか、または疾患状態の減少例えば、腫瘍寸法の縮小が達成されるまで、投与され得る。最適な投与スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定から計算することができ、個々の抗体または薬剤の相対的な強度によって変化することになる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法、および反復率を、容易に決定することができる。特定の実施形態において、投与量は、体重1kgあたり0.01μg~100mgであり、1日1回以上、週1回以上、月1回以上、または年1回以上で与えることができる。特定の実施形態において、抗体または他のEGFR結合剤を、2週間に1回、または3週間に1回与える。特定の実施形態において、抗体または他のEGFR結合剤の投与量は、体重1kgあたり約0.1mg~約20mgである。治療する医師は、投与の反復率を、測定された体液および組織中の薬物の滞留時間および濃度に基づいて、推定することができる。併用療法は、相乗作用を提供し、相乗的であることを証明し得る、すなわち、活性成分が一緒に使用された場合に達成される効果が、化合物を別々に使用することからもたらされる効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、1組み合わせた単位用量形態で、同時に共製剤化および投与もしくは送達される、2別個の製剤として、交互または並行して送達される、または3何らかの他のレジメンによる場合に、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば、別個の注射器で別々の注射によって、連続的に投与または送達される場合に、達成され得る。一般的に、交互療法の際、各活性成分の有効用量は、連続的に、すなわち、順に投与されるが、一方で、併用療法においては、2つ以上の活性成分の有効量は、一緒に投与される。VI.EGFR結合剤を含むキット本発明は、本明細書に記載の抗体、免疫抱合体、または他の薬剤を含み、本明細書に記載の方法を実行するために使用可能である、キットを提供する。特定の実施形態において、キットは、1つ以上の容器中に、少なくとも1つの精製されたEGFRに対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、キットは、対照、アッセイを行うための指示書、ならびに結果の分析および提示に必要な任意のソフトウェアを全て含む、検出アッセイの実行に必要および/または十分な構成要素の全てを含む。当業者は、開示される本発明の抗体、免疫抱合体、または他の薬剤を、当該技術分野で周知の確立されたキット形式に、容易に組み込むことができることを、容易に認識するであろう。EGFR結合剤例えば、EGFR結合抗体、ならびに第2の抗癌剤を含むキットを、さらに提供する。特定の実施形態において、第2の抗癌剤は、化学療法剤例えば、リツキシマブである。本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示目的のみであり、それを踏まえた種々の修正または変更が当業者に提示され、本出願の精神および範囲内に含まれるであろうことを、理解されたい。実施例1マウスEGFR抗体の生成マウス抗EGFR抗体を生成するために、CA922JapaneseCollectionofResearchBioresourcesJCRB,新宿区,日本およびHSC4JCRB,新宿区,日本等の頭頸部扁平上皮癌細胞系を、Balb/c雌性マウスCharlesRiverLaboratory,ウィルミントン,マサチューセッツ州に、マウス1匹あたり5×106個の細胞の用量で、2週間に1回で5回皮下注射した。ハイブリドーマ生成のために屠殺する3日前に、免疫付与したマウスに、もう一用量の抗原を腹腔内注射で与えた。マウスの脾臓を、標準的な動物プロトコルに従って収集し、2つの滅菌したフロスト付き顕微鏡用スライド間で潰し、RPMI-1640培地において単一細胞懸濁液を得た。赤血球をACK溶解緩衝液で溶解した後、脾臓細胞を、続いて、マウス骨髄腫P3X63Ag8.653細胞P3細胞J.F.Kearneyetal.1979,JImmunol,123:1548-1550と、P3細胞1:脾臓細胞3の比率で混合した。脾臓細胞とP3細胞の混合物を洗浄し、融合培地0.3Mマンニトール/D-ソルビトール、0.1mMCaCl2、0.5mMMgCl2、および1mg/mlBSA中において、室温で3分間、プロナーゼで処理した。反応を、FBSウシ胎児血清、Invitrogenの添加によって停止し、続いて細胞を洗浄し、2mlの低温融合培地に再懸濁し、BTXECM2001電気融合機HarvardApparatusで融合した。融合細胞を、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジンHATSigmaAldrichを含有するRPMI-1640選択培地に穏やかに添加し、37°Cで20分間インキュベートし、続いて平底96ウェルプレートに、200μl/ウェルで播種した。次に、プレートを、5CO2インキュベーターで、ハイブリドーマのクローンが抗体スクリーニングの準備が整うまで、37°Cでインキュベートした。J.LangoneandH.VunakisEds.,MethodsinEnzymology,Vol.121,ImmunochemicalTechniques,PartI;AcademicPress,Florida、およびE.HarlowandD.LaneAntibodies:ALaboratoryManual;1988;ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,NYに記載のもの等を含む、免疫付与およびハイブリドーマの他の技術もまた使用可能である。マウスハイブリドーマのスクリーニングおよび選択ハイブリドーマのスクリーニングは、未処理またはEGFRDSystemsで処理済みのいずれかの免疫付与細胞を用いて、フローサイトメトリー結合アッセイを使用して行った。EGFとのインキュベーションは、細胞表面上のEGFRのレベルを下方調節するため、EGFR特異的ハイブリドーマ上清は、未処理細胞にのみ反応し、EGF処理した細胞には反応しないであろう。スクリーニングのための細胞は、まず、無血清培地で一晩培養し、2つの部分に分割した。一方の部分の細胞を未処理のまま残し、もう一方の部分を37°Cで、3時間EGFで処理した。EGF処理細胞を、CellTrace商標近赤外DDAO-SEInvitrogenで標識化し、1:1の比率で未処理細胞と混合し、ハイブリドーマ上清とともに、氷上で2時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、FITC-標識化抗マウスIgGJacksonImmunoresearchとともにインキュベートし、洗浄し、ホルマリンで固定し、FACScaliburBDBioscienceを使用して分析した。EGFR特異的ハイブリドーマを拡大し、上清を、可溶性組み換えヒトEGFR細胞外ドメインRELIATechを抗原として使用して、ELISAによって再スクリーニングした。陽性ハイブリドーマを、ヒトEGFR発現A431表皮癌腫細胞系ATCCおよびサルEGFR発現Vero細胞系アフリカミドリザル腎臓上皮細胞系ATCCを用いて、フローサイトメトリー結合アッセイを使用して再スクリーニングした。手短に述べれば、ハイブリドーマ上清を、A431細胞およびDDAO標識化Vero細胞とともに、氷上で1時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、PE抱合型ヤギ抗マウスIgG抗体JacksonImmunoresearchとともに、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、続いてFACS緩衝液で洗浄し、ホルマリン中に固定し、FACSCaliburフローサイトメーターBDBiosciencesを使用して分析した。ヒトおよびサル両方の抗原に反応する陽性ハイブリドーマのクローンを、EGFR過剰発現HCC827細胞ATCCの基底増殖を阻害する能力について試験した。手短に述べれば、指数成長期のHCC827細胞を、10FBSを含有する100μlの完全培地において、2000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種した。100μlのハイブリドーマ上清を、細胞に添加し、混合物を、加湿5CO2インキュベーターにおいて、37°Cで5日間インキュベートした。細胞増殖のレベルを、比色分析WST-8アッセイDojindoMolecularTechnologies,Rockville,MDを使用して判定した。WST-8は、生存細胞中の脱水素酵素によって、組織培養培地中に可溶である橙色のホルマザン生成物に還元され、生成されたホルマザンの量は、生存細胞数に直接的に正比例する。WST-8の最終体積の10を、各ウェルに添加し、プレートを、37°Cでさらに2~4時間インキュベートした。プレートを、次に、SpectraMaxM2プレートリーダーMolecularDevices,サニーヴェール,カリフォルニア州で、450nmA450における吸光度を測定することによって分析した培地を伴うウェルおよびWST-8のみの、バックグラウンドA450吸光度を、全ての値から差し引いた。各処理済み試料の値を、未処理細胞を有するウェルの平均値で除すことによって、生存率を計算した生存率=A450処理済み試料-A450バックグラウンド/A450未処理試料-A450バックグラウンド。結果を、生存率0が細胞を有さないウェルの値を示し、1が、いずれの抗EGFR抗体も有さない、血清含有培地における細胞増殖のレベルを示すように、正規化した。少なくとも50のHCC827細胞成長を阻害したハイブリドーマのクローンを、限界希釈法によって、サブクローニングした。フローサイトメトリーにより親細胞と同じ反応性を示した、各ハイブリドーマから1つのサブクローンを、その後の分析のために選択した。安定したサブクローンを培養し、抗体を、市販のアイソタイプ化試薬Rocheを使用して、アイソタイプ化した。抗体の精製抗体を、例えば、タンパク質AまたはGクロマトグラフィーHiTrapProteinAまたはGHP、1mL、AmershamBiosciences等の標準的な方法を使用して、ハイブリドーマのサブクローン上清から精製した。手短に述べれば、上清を、1/10体積の1Mトリス/HCl緩衝液、pH8.0の添加によって、クロマトグラフィー用に調製した。pH調節した上清を、0.22μmのフィルター膜を通じて濾過し、結合緩衝液PBS、pH7.3で平衡化したカラムに充填した。カラムを、280nmで吸光を伴わずに安定したベースラインが得られるまで、結合緩衝液で洗浄した。抗体を、pH2.8の0.15MNaCl含有0.1M酢酸緩衝液で、0.5mL/分の流速を使用して溶出した。おおよそ0.25mLの分画を収集し、1/10体積の1Mトリス/HCl、pH8.0の添加によって中和した。ピーク分画複数を含むを、1倍PBSに対して一晩で2回透析し、0.2μmのフィルター膜を通じた濾過によって、滅菌した。精製した抗体を、A280での吸光度により定量化した。タンパク質A精製分画を、マウス抗体に対する第四級アンモニウムQクロマトグラフィーとともに、イオン交換クロマトグラフィーIEXを使用して、さらに洗練した。手短に述べれば、タンパク質A精製由来の試料を、結合緩衝液10mMトリス、10mM塩化ナトリウム、pH8.0に、緩衝液交換し、0.22μmのフィルターを通じて濾過した。調製した試料を、次に、120cm/時間の流速で、結合緩衝液で平衡化したQ高速樹脂GELifesciences上に充填した。カラム寸法は、試料中、全てのMAbに結合するのに十分な能力を有するように選択した。続いて、カラムを、280nmで吸光を伴わずに安定したベースラインが得られるまで、結合緩衝液で洗浄した。勾配を20カラム体積CV中10mMから開始し、500mMまでの塩化ナトリウムによって、抗体を溶出した。ピーク分画を、280nmA280での吸光度測定に基づいて収集した。モノマーの割合を、SWXLガードカラム6.0×40mmを有するTSKゲルG3000SWXL7.8×300mmTosohBioscience,モンゴメリービレ,ペンシルバニア州上で、AgilentHPLC1100システムAgilent,サンタクララ,カリフォルニア州を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーSECで評価した。95を超えるモノマー含量を有する分画をプールし、TFFシステムを使用して、PBSpH7.4に緩衝液交換し、0.2μmのフィルター膜を通じて濾過することにより滅菌した。精製した抗体のIgG濃度を、1.47の減衰係数を使用して、A280によって判定した。セラミックヒドロキシアパタイトCHT等の代替方法もまた、良好な選択性を有する抗体の洗練に使用可能である。IEXクロマトグラフィーに対して記載されるものと類似のプロトコルを用いて、40μmの粒子寸法を有するCHTタイプII樹脂Bio-RadLaboratoriesを使用した。CHTに対する結合緩衝液は、20mMリン酸ナトリウム、pH7.0に相当し、抗体を、20~160mMの勾配のリン酸ナトリウムで、20CVにわたって溶出した。実施例2ヒトおよびサルのEGFR抗原に対する結合親和性ヒトおよびサルの抗原に対するEGFR抗体の結合親和性を判定するために、MDA-MB468ATCCおよびA431ATCC、ならびにVeroサル腎臓細胞系ATCC等のEGFR発現ヒト腫瘍細胞系を、フローサイトメトリー結合アッセイに使用した。手短に述べれば、細胞を、4°Cで1時間、種々の濃度のEGFR抗体とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、4°Cで1時間、PE抱合型二次抗体JacksonImmunoresearchとともにインキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ホルマリン中に固定し、FACSarrayBDBioscienceで分析した。これらの抗体の結合親和性を判定するために、幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットした。用量反応曲線を、非線形回帰によって生成し、各抗体の見掛けの解離定数Kdに対応する、曲線のEC50値をGraphPadPrismv4GraphPadソフトウェアを使用して計算した。本発明のEGFR抗体、ならびに陽性対照抗体であるセツキシマブおよびパニツムマブは、ヒト腫瘍細胞およびサルVero細胞の両方に、強く特異的な結合を示した。図1に示される表は、ヒトEGFRおよびサルEGFRに対する各抗体のKdを記載する。本発明のEGFR抗体は、ヒトおよびサルの両方の抗原に対して、同様に強力な結合親和性を示した。実施例3リガンド誘発EGFR活性化の阻害EGFRのリガンド結合は、EGFRのリン酸化に続いて、下流シグナル伝達経路の活性化を誘発する。リガンド誘発EGFR活性化における抗EGFR抗体の効果を調査するために、MDA-MB468腫瘍細胞系およびヒト初代成熟ケラチノサイトを使用して、ウェスタンブロット分析を行った。手短に述べれば、細胞を、1e6細胞/ウェルで、6ウェルプレートに播種し、通常培地で一晩培養した。細胞を洗浄し、37°Cで2時間、0.1BSAを含有する無血清培地で飢餓状態にした。10μg/mlの抗体を細胞に添加し、混合物を、37°Cで3時間インキュベートした。50ng/mlのEGFRDSystemsを混合物に添加し、15分間、37°Cでインキュベートした。次に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中に溶解した。タンパク質溶解物を、SDS-PAGEにおいて分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を5BSAでブロッキングし、抗ホスホチロシン抗体クローン4G10、Milliporeとともに、4°Cで一晩インキュベートした。膜を洗浄し、HRP抱合型抗マウス抗体JacksonImmunoresearchとともに、室温で1時間インキュベートし、再度洗浄した。ECL化学発光強化システムGEHealthcareを使用して、シグナルを検出した。各列に等量のタンパク質が充填されることを確実にするために、膜を剥がし、抗-β-チューブリン抗体SigmaAldrichで再プローブした。図2に示されるように、EGF刺激は、MDA-MB468細胞およびヒト初代ケラチノサイトの両方において、強いEGFRのリン酸化をもたらした。セツキシマブおよびパニツムマブでの細胞の処理は、EGF誘発EGFRリン酸化を強く阻害したが、一方で、本発明のEGFR抗体は、EGFRの活性化を完全には阻害しなかった。抗KTIKunitzトリプシン阻害剤抗体ATCCから入手したハイブリドーマにより生成を、陰性対照として使用した。実施例4EGFR抗体の作動活性EGFRリガンドの非存在下におけるEGFRシグナル伝達に対する本発明のEGFR抗体の効果を調査するために、MDA-MB468腫瘍細胞を、実施例5に記載の無血清培地において飢餓状態にした。細胞を、続いて、10μg/mlのEGFR抗体とともに、37°Cで3時間インキュベートした。陽性対照である未処理細胞を、50ng/mlのEGFとともに、37°Cで15分間インキュベートした。タンパク質溶解物を調製し、実施例5に記載のように、ウェスタンブロットを使用して分析した。代表的な結果を、図3に示す。EGF処理は、MDA-MB468細胞において、強いEGFRのリン酸化を明らかに誘発したが、一方で、本発明のEGFR抗体は、リガンドの非存在下において、EGFRシグナル伝達に影響を及ぼさなかった。実施例5リガンド結合の競合EGFRシグナル伝達阻害の1つの機構は、リガンド結合の封鎖である。EGFR抗体が、EGFRへのリガンド結合を阻害するかどうかを試験するために、A431細胞へのビオチン化EGFRリガンドの結合を、抗EGFR抗体の存在下において、フローサイトメトリーによって測定した。TGFαのビオチン化は、製造業者の説明書に従って、EZ-linkMicroSulfo-NHS-LC-ビオチン化キットPierce,Rockland,ILを使用して、行った。ビオチン化EGFは、Invitrogenから入手した。競合アッセイの前に、ビオチン化リガンドの結合曲線を確立した。種々の濃度の抗EGFR抗体を、EC50濃度EGFおよびTGFaに対して、それぞれ1.8nMおよび10nMで、ビオチン化リガンドと事前に混合し、混合物を、細胞とともに、氷上で30分間インキュベートした。続いて、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、ストレプトアビジン-APC抱合体JacksonImmunoresearchとともに、氷上で15分間インキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、FlowJoプログラムTreeStarを使用して、FACSCaliburBDBioscienceで分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットした。図4に示されるように、陰性対照抗体である抗KTI抗体は、リガンド結合に影響を及ぼさなかったが、一方で、全ての抗EGFR抗体は、次のEC50表10で、リガンド結合に競合した。本発明のEGFR抗体は、セツキシマブと類似のEC50で、TGFaおよびEGF結合を妨害した図4および表10。この結果は、リガンド誘発EGFRシグナル伝達実施例3、およびヒト初代ケラチノサイトを含む、正常上皮細胞の成長実施例6に対する、セツキシマブおよび本発明のEGFR抗体の差動的な効果を説明することはできない。実施例6ヒト初代ケラチノサイトおよび正常上皮細胞系の成長阻害アッセイヒトの皮膚の正常上皮基底細胞、消化管、および他の器官は、生理的にEGFRを発現する。これらの組織におけるEGFRシグナル伝達は、上皮細胞の成長に重要である。セツキシマブおよびパニツムマブ、ならびにエルロチニブおよびゲフィチニブ等の小型チロシンキナーゼ阻害剤によるEGFRシグナル伝達経路の破壊は、著しい皮膚毒性をもたらす。皮膚および他の上皮細胞における潜在毒性を模倣するために、ヒト初代ケラチノサイトInvitrogenおよび非腫瘍原性乳房上皮細胞系であるMCF10AATCCを使用する増殖アッセイを確立した。このアッセイにおいて、細胞を、製造業者により推奨される、1ウェルあたり1,500~2,000細胞でEGFRリガンド含有培地に播種し、抗EGFR抗体とともに、37°Cで5日間インキュベートした。ケラチノサイトアッセイ図5において、細胞を、1nMEGFの存在下で、種々の濃度の抗体とともに成長させた。一方で、MCF10A細胞アッセイ図6においては、細胞を、10nMEGFの存在下で、固定濃度10μg/mlの抗体とともに成長させた。細胞増殖のレベルを、実施例1に記載のように、比色分析WST-8アッセイDojindoMolecularTechnologies,ロックビル,メリーランド州を使用して判定した。生存率を計算した。各処理済み試料の値を、未処理細胞を有するウェルの平均値で除すことによって、生存率を計算した生存率=A450処理済み試料-A450バックグラウンド/A450未処理試料-A450バックグラウンド。結果を、0が、EGFの非存在下における細胞増殖のレベルを示し、1が、いずれの抗EGFR抗体処理も有さない、EGFの存在下における細胞増殖のレベルを示すように、正規化した。ヒト初代ケラチノサイト、ならびにMCF10A細胞への抗EGFR抗体の結合を、増殖アッセイを行う前に確認した。ケラチノサイト増殖アッセイの代表的な結果を、図5に示す。毒性プロファイルから予想されるように、セツキシマブおよびパニツムマブは、セツキシマブについては40、パニツムマブについては78の最大阻害を伴って、用量依存的様式でケラチノサイトの増殖を強く阻害した。驚くべきことに、本発明のEGFR抗体は、陰性対照であるキメラKTI抗体と同様に、ケラチノサイトに対する影響をほとんど有さなかったか、または全く有さなかった。この結果は、MCF10A増殖アッセイにおいて確認した図6。セツキシマブおよびパニツムマブは、MCF10A細胞増殖を強く阻害したが、一方で本発明のEGFR抗体は、MCF10A細胞成長に対する影響をほとんど有さなかったか、または全く有さなかった。これらのデータは、本発明のEGFR抗体が、EGFRを発現する正常上皮細胞に対して、セツキシマブおよびパニツムマブよりも毒性が低いことを示唆する。実施例7HCC827およびNCI-H292細胞系の基底増殖の阻害腫瘍細胞の基底増殖の阻害における、抗EGFR抗体の能力を判定するために、EGFRを発現するHCC827ATCCおよびNCI-H292ATCC肺腫瘍細胞系を用いた増殖アッセイを確立した。細胞を、10FBSを含有する通常成長培地に1ウェルあたり2,000細胞で播種し、37°Cで5日間、種々の濃度の抗EGFR抗体の存在下において、成長させた。細胞増殖のレベルを、比色分析WST-8アッセイを使用して判定した。OD結果を、生存率1が、抗EGFR抗体なしの通常成長培地で成長した細胞を表し、0が、細胞なしのウェルの値を表すように、正規化した。図7Aおよび7Bは、それぞれ、HCC827およびNCI-H292細胞を用いた、代表的な増殖アッセイ結果を示す。HCC827細胞系図7Aにおいては、セツキシマブは、用量依存的様式で、腫瘍細胞の成長を強く阻害した。EGFRを発現する正常上皮細胞には無害であるにも関わらず、本発明の抗EGFR抗体は、セツキシマブと同様か、またはそれよりも優れた阻害活性を示した。表11は、各抗体のEC50および最大阻害を示す。NCI-H292細胞系図7Bにおいては、セツキシマブおよびパニツムマブは、用量依存的様式で、基底細胞増殖を強く阻害した。本発明のEGFR抗体もまた、最大増殖阻害が、セツキシマブおよびパニツムマブであり、この細胞系において著しく活性であった。表12は、各抗体のEC50および最大阻害を示す。これらのデータは、本発明のEGFR抗体が、EGFR過剰発現細胞において、セツキシマブおよびパニツムマブと同様に活性でありながらも、正常上皮細胞の成長には影響を及ぼさないことを強く主張する。実施例8抗EGFR抗体結合競合抗EGFR抗体の結合エピトープを区別するために、フローサイトメトリーを使用して、抗体結合競合アッセイを行った。この実験において、0.3nMビオチン化528図8A、0.2nMビオチン化セツキシマブ図8B、および0.2nMビオチン化EGFR-7抗体図8CのMDA-MB468細胞への結合を、種々の濃度の競合する抗体の存在下において、測定した。手短に述べれば、ビオチン化抗体を、種々の濃度の競合する抗体と、事前混合した。抗体混合物を、次に、細胞とともに、氷上で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン-アレクサ488抱合体とともに、氷上で1時間インキュベートした。洗浄後、細胞を固定し、FACScaliburで分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットし、100が、他の抗体の非存在下におけるビオチン化抗体の最大結合を表し、0が、ビオチン化抗体の非存在下におけるバックグラウンド染色を表すように、正規化した。図8に示されるように、全てのEGFR抗体は、互いに競合する。セツキシマブおよびパニツムマブは、裸の528抗体と同程度の強さで528抗体結合と競合したが、一方で本発明のEGFR抗体は、528抗体と競合する能力が、わずかに低かった図8A。全てのEGFR抗体は、類似の様式で、セツキシマブおよびEGFR-7ビオチン化抗体の結合と、競合した図8Bおよび8C。実施例9EGFR抗体のVLおよびVH領域のクローニングおよび配列決定EGFR抗体全細胞RNAを、製造業者のプロトコルに従って、RNeasyキットQIAgenを使用して、5×106細胞のEGFRハイブリドーマから調製した。cDNAを、続いて、SuperScriptIIcDNA合成キットInvitrogenを使用して、全RNAから合成した。ハイブリドーマ細胞由来のcDNAにおける、1回目の縮重PCR反応のための手順は、Wangetal.2000JImmunolMethods.233:167-77およびCoetal.1992JImmunol.148:1149-54に記載の方法に基づいたものであった。VH配列を、次の縮重プライマーを使用して、PCRによって増幅した。EcoMH1CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC配列番号59、EcoMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG配列番号60、およびBamIgG1GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC配列番号61。VL配列を、次の縮重プライマーを使用して、PCRによって増幅した。SacIMKGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA配列番号62およびHindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC配列番号85。混合基は、次のように定義する。N=GATC、S=GC、Y=CT、M=AC、R=AG、W=AT。PCR反応混合物を、次に、1低融点アガロース上に流し、300~400bpのバンドを切除し、ZymoDNAミニカラムを使用して精製し、配列決定のため、AgencourtBiosciencesに送った。それぞれの5’および3’PCRプライマーを配列決定プライマーとして使用して、両方向から可変領域cDNAを生成した。VHおよびVL領域のアミノ酸配列を、DNA配列決定の結果から、予想した。VLおよびVHのcDNA配列をクローニングするために使用した縮重プライマーは、5’末端配列を変化させるため、完全な配列を検証するために、さらなる配列決定の努力が必要であった。抗体配列が由来する、マウスの生殖細胞系配列について、NCBIIgBlastサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/を検索するために、予備cDNA配列を使用した。PCRプライマーを、次いで、この新しいPCR反応が、PCRプライマーによって変化されていない完全な可変領域cDNA配列をもたらすように、マウス抗体の生殖細胞系結合型リーダー配列とアニーリングするように設計した。PCR反応、バンド精製、および配列決定を、上述のように行った。配列確認のための質量決定可変領域のcDNA配列情報を、生殖細胞系の定常領域配列と合わせ、全長抗体cDNA配列を得た。次に、重鎖および軽鎖の分子量を計算し、マウスEGFR抗体のLC/MS分析によって得られた分子量と比較した。分子量測定値は、EGFR-7およびEGFR-12両方の軽鎖および重鎖のcDNA配列と一致する。EGFR-7変異体の複合CDR配列多数のマウス抗EGFRハイブリドーマに配列決定を行い、EGFR-7とほぼ同一の軽鎖および重鎖可変領域配列を有する抗体を発現するが、いくつかのCDRアミノ酸置換を、特に重鎖CDR2に有することが見出された図9。マウスEGFR-7のこれらのCDR変異体は、機能的に同一であることが見出されたため、それらは、EGFR-7のCDRのものの配列の柔軟性に、いくらかの構造的見識を提供する。軽鎖CDR2および3、ならびに重鎖CDR1は、変異体のそれぞれにおいて同一であるが、一方で単一の残基置換が、軽鎖CDR1および重鎖CDR3において低頻度で見られた。明らかに緊密な配列保存を有するCDRのものとは対照的に、EGFR-7の変異体は、重鎖CDR2に、4つ程度のアミノ酸置換を頻繁に含んだ。EGFR-7のこれらの配列変異体は、5つの緊密に保存されたCDRのものは、EGFR結合の構造的基礎を提供し得るが、一方で重鎖CDR2は、親和性成熟の際に体細胞突然変異ホットスポットをもたらす、いくらかの配列柔軟性を有することを示唆する。表4は、ヒト化について上述のCDR変異体とともに、EGFR-7変異体に基づいて列挙される、複合CDR配列を提供する。これらの複合CDRのものに由来するヒト化抗体は、EGFR-7の機能的特性を維持することが予想される。実施例10抗体のヒト化EGFR-7およびEGFR-12抗体を、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Roguskaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,913:969-9731994およびRoguskaetal.,ProteinEng.910:895-9041996等、前述の表面再構成方法に従って、ヒト化した。表面再構成は、一般的に、軽鎖および重鎖両方における可変領域フレームワーク表面残基の識別、ならびにそれらをヒトの同等物で置き換えることを伴う。マウスCDRのものは、表面再構成した抗体において保持される。EGFR-7およびEGFR-12抗体の例示的なCDRは、表13に示されるように定義される。CDRのものに分類されるリジンを抱合する影響についての懸念を最小化するために、マウスEGFR-7抗体の軽鎖CDR1中のリジン24を、軽鎖CDR1の両形態が得られるように、アルギニンでヒト化形態1.0斜体で示されるに置き換えた。同様に、マウスEGFR-12抗体の軽鎖CDR1中のリジン27および31を、それぞれ、グルタミンおよびアルギニンで、ヒト化形態1.0斜体で示されるに置き換えた。アルギニンの代わりにグルタミンでのリジン27を置き換えるのは、グルタミンが、この位置で、ヒト生殖細胞系配列に確保されるためである。表面再構成に採用されるAbM重鎖CDR2の定義に加えて、この表は、EGFR-7およびEGFR-12抗体のマウスおよびヒトの両方の形態に対する、例示的なKabat定義された重鎖CDR2のものを提供する。下線の配列は、表面再構成のためのCDRと見なされなかったKabat重鎖CDR2の位置を示す。表面残基位置を、30以上の相対的なアクセス可能性を有する任意の位置として定義したPedersenJ.T.et.Al,J.Mol.Biol.1994;235:959-973。計算した表面残基を、次に、ヒト生殖細胞系表面配列と配列比較し、最も相同であるヒト表面配列を識別した。EGFR-7抗体の軽鎖可変ドメインの置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系配列は、IGKV1-1201であったが、一方でIGKV1-1601を、EGFR-12抗体のVLの置き換え表面として使用した。EGFR-7およびEGFR-12抗体の重鎖可変ドメインの置き換え表面として使用したヒト生殖細胞系配列は、それぞれ、IGHV1-6902およびIGHV1-6908であった。EGFR-7およびEGFR-12抗体の特定のフレームワーク表面残基の変化を、それぞれ、図10および11に提供する。両方の抗体の表面再構成した軽鎖は、好ましい形態にCDR1リジン置換複数を含むを含んだため、表面再構成形態v1.01はまた、マウスのリジン複数を含むがCDR-L1に保持された状態で得られた。最後に、マウスEGFR-7およびその変異体の重鎖フレームワーク2は、不対システイン残基をもたらす体細胞W47C突然変異を含んだ。この理由のために、EGFR-7重鎖W47生殖細胞系の復帰突然変異体形態v1.11もまた、試験した。図12は、EGFR-7およびEGFR-12抗体の軽鎖および重鎖両方の可変ドメインの表面再構成した配列の、それらのマウス対応物との配列比較を示す。可変ドメインの表面再構成によるヒト化に加えて、EGFR-7抗体はまた、例えば、Jonesetal.,Nature321:604-6081986およびVerhoeyenetal.,Science239:1534-15361988等に記載の相補性決定領域CDR移植技術に従って、ヒト化した。CDR移植方法は、自然に進化したマウス抗体由来のCDRを、ヒト抗体のFvフレームワーク領域FRに移植することから構成される。プロセスの主要なステップは、適切なヒトアクセプターフレームワークを選択することであった。Kabatの番号付けスキームおよびKabatのCDR定義を、EGFR-7抗体のCDR移植に使用した。CDR移植のためのEGFR-7抗体の例示的なCDRは、表15に示されるように定義される。マウスEGFR-7抗体と最も高い相同性を有するヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列を、Lefranc,NucleicAcidsRes.29:207-2092001に記載のように、InternationalImMunoGeneTicsinformationsystem登録商標IMGThttp://imgt.cines.fr/の相互作用ツールV-QUESTを通じて、識別した。EGFR-7抗体のVLおよびVHドメインのアクセプターフレームワークとして使用したヒト生殖細胞系配列は、それぞれ、IGKV1-3301およびIGHV1-4603であった。CDRのものに分類されるリジンを抱合する影響についての懸念を最小化するために、マウスEGFR-7抗体の軽鎖CDR1におけるリジン24を、CDR移植の際に、アルギニンで置き換えた表6。特定のフレームワーク残基の変化、ならびにEGFR-7抗体のCDR移植におけるCDR-L1の置換を、図13に提供し、EGFR-7抗体の可変ドメインのCDR移植した配列と、そのマウスの対応物との配列比較を、図14に図示する。ヒト化EGFR抗体の組み換え発現huEGFR-7およびhuEGFR-12の可変領域配列を、コドン最適化し、BlueHeronBiotechnologyによって合成した。配列は、単鎖の哺乳動物発現プラスミド内のそれぞれの定常配列とのインフレームクローニングのために、制限酵素部位が両側に隣接している。軽鎖可変領域を、pAbKZeoプラスミド中のEcoRIおよびBsiWI部位にクローニングした。重鎖可変領域を、pAbG1Neoプラスミド中のHindIIIおよびApa1部位にクローニングした。これらのプラスミドは、一過的または安定いずれかの哺乳動物細胞のトランスフェクションにおいて、組み換え抗体を発現するために使用した。HEK293T細胞において組み換え抗体を発現するための一過的トランスフェクションを、修正したPEI手順を使用して行ったDurocher,Y.etal.,NucleicAcidsRes.30:E92002。上清を、マウス抗体について上述した標準的な手順を使用して、タンパク質Aおよびポリッシングクロマトグラフィーステップによって精製した。実施例11マウス抗EGFR抗体とヒト化抗EGFR抗体との間の結合競合ヒト化抗EGFR抗体の結合を試験するために、抗体競合アッセイを、実施例8に記載のように行った。muEGFR-6およびmuEGFR-7抗体は、互いに競合し合うため図8C、この実験は、EGFR-6図15AまたはEGFR-7図15Bのマウスまたはヒト化抗体が、MDA-MB468細胞へのビオチン化muEGFR-7抗体の結合と競合する能力を試験する。手短に述べれば、1nMのビオチン化muEGFR-7抗体を、種々の濃度の競合する抗体と事前混合した。抗体混合物を、次に、標的細胞とともに、氷上で1時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン-APC抱合体とともに、氷上でさらに1時間インキュベートし、洗浄し、固定して、フローサイトメーターを使用して分析した。幾何平均蛍光強度を、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットし、100が、他の抗体の非存在下におけるビオチン化抗体の最大結合を表し、0が、ビオチン化抗体の非存在下におけるバックグラウンド染色を表すように、正規化した。図15Aに示されるように、muEGFR-6およびhuEGFR-6両方の抗体は、類似のEC50muEGFR-6について8.13nMおよびhuEGFR-6について11.09nMで、muEGFR7の結合と競合する。図15Bは、muEGFR-7、hu-EGFR-7、およびhuEGFR-7R抗体もまた、類似のEC50muEGFR7について3.54nM、huEGFR-7Rについて3.35nM、およびhuEGFR-7について4.12nMで、muEGFR-7抗体結合と競合することを示す。これらの結果は、ヒト化が、本発明の抗体の結合に影響を及ぼさないことを示す。ヒト化抗EGFR抗体の抗腫瘍活性本発明のヒト化抗体の抗腫瘍活性を試験するために、H292腫瘍細胞成長阻害アッセイを、実施例7に記載のように行った。図16に示されるように、EGFR-6およびEGFR-7のマウスおよびヒト化抗体は、表16に含まれるEC50で、H292腫瘍細胞成長に効力を有した。全てのヒト化抗体が、マウス対応物の抗腫瘍活性を維持し、これらの抗体の生物学的活性に影響を及ぼさないことは明らかである。実施例12huEGFR抗体の抗体依存性細胞毒性ADCC活性乳酸脱水素酵素LDH放出アッセイを使用して、新たに単離したヒトナチュラルキラーNK細胞をエフェクター細胞として用いて、腫瘍細胞系の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性ADCCを測定したShieldsRL,JBiolChem.20012769:6591-604。NK細胞を、まず、NK細胞単離キットII130-091-152、MiltenyiBiotec,オーバーン,カリフォルニア州の修正したプロトコルを使用して、正常ドナーのヒト末梢血から単離したResearchBloodComponents,Inc.,ブライトン,マサチューセッツ州。末梢血を、1倍PBSで2倍希釈した。25mLの希釈した血液を、50mLの円錐管中で、25mLのFicollPaque上に注意深く重ね、400gで45分間、室温で遠心分離した。末梢血の単核細胞PBMCを、界面から収集し、新しい50mLの円錐管に移し、1倍PBSで1回洗浄した。PBMCを計数し、2.5×107細胞/100μlの濃度において、MACS緩衝液1倍PBS、0.5BSA、2mMEDTAで再懸濁し、続いて、1/4倍体積のNK細胞ビオチン-抗体カクテルを、細胞懸濁液に添加した。NK細胞ビオチン-抗体カクテルは、NK細胞を除いてリンパ球に結合し、NK細胞の陰性選択をもたらす、ビオチン化した抗体を含有する。混合物を、4°Cで10分間インキュベートし、次いで、3/5倍体積のMACS緩衝液および2/5体積のビオチン化抗体に結合するであろうNK細胞MicroBeadカクテルを、添加した。細胞-抗体混合物を、4°Cでさらに15分間インキュベートした。次に、細胞を50mLのMACS緩衝液で1回洗浄し、3mLのMACS緩衝液中に再懸濁した。NK細胞を、自動MACS分離器MiltenyiBiotecを使用して、陰性分画として分離した。結果として得られたNK細胞を、一晩、30mLの完全RPMI培地5ウシ胎児血清、1ペニシリン-ストレプトマイシン、1mMHEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、1100XMEM非必須アミノ酸溶液を補充したRPMI-1640に蒔いた。後続のアッセイおよび全ての希釈は、RHBP培地20mMHEPES、pH7.4、0.1BSA、および1ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地において行った。RHBP培地中の種々の濃度の抗体を、50μL/ウェルで、丸底96ウェルプレート中に2通りにアリコートした。標的細胞この実験においては、A431細胞系を、106細胞/mLで、RHBP培地に再懸濁し、100μL/ウェルで、抗体希釈物を有する各ウェルに添加した。標的細胞および抗体希釈物を含有するプレートを、室温で30分間インキュベートした。次いで、NK細胞を、50μL/ウェルで、標的細胞を含有するウェルに添加した。典型的な比率は、1個の標的細胞対3~4個のNK細胞であった。次の対照を、各実験のために準備した。NK細胞単独、標的細胞単独自発的LDH放出、NK細胞と標的細胞抗体非依存性LDH放出、10TritonX-100を有する標的細胞最大LDH放出。混合物を、細胞溶解を可能にするために、37°Cで4時間インキュベートした。プレートを、1200rpmで10分間遠心分離し、100μLの上清を、新しい平底96ウェルプレートに注意深く移した。細胞毒性検出キットRoche1644793からのLDH反応混合物100μL/ウェルを、各ウェルに添加し、室温で5~30分間インキュベートした。試料の光学密度ODを、490nmOD490で測定した。各試料の特異的溶解パーセントを、次の式を使用して判定した。特異的溶解パーセント=試験値-自発的放出/最大放出-自発的放出×100。図17は、huEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体の代表的なADCC活性を、chKTI抗体のものと比較して示す。huEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体は、最大特異的殺滅がおおよそ20、ならびにhuEGFR6およびhuEGFR-7RのEC50が、それぞれ22ng/mlおよび17ng/mlに達し、用量依存的に、NK細胞媒介性の標的細胞殺滅を誘発した。対照的に、標的細胞に結合しなかったchKTI抗体は、ADCCの媒介に失敗した。実施例13huEGFR-7R-SMCC-DM1の調製スクシンイミジル4-N-マレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレートSMCC、PierceBiotechnology,Incリンカーを、ジメチルアセトアミドDMA中に溶解した。huEGFR抗体を、5mg/mLの抗体を、50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA、pH6.5中において、10モル過剰のSMCCとともに、インキュベートすることによって、SMCCで修飾して、抗体にマレイミドを導入した。周辺温度でおおよそ100分後、反応混合物を、同じリン酸カリウム緩衝液で平衡化したHADEX登録商標G25カラムを使用して精製した。分画を有する抗体をプールし、後続のステップに使用した。SMCC修飾した抗体を、マレイミドリンカーに対して、1.7のモル過剰で、10mMのDM1溶液と反応させた。反応物を、周辺温度下で、おおよそ18時間攪拌した。抱合反応混合物を、pH6.5の1倍PBSで平衡化したHADEX商標G25ゲル濾過カラムを通じて濾過した。huEGFR抗体-SMCC-DM1抱合体を、次いで、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1スクロース、pH5.5を含有する緩衝液中に、透析した。1個の抗体分子あたりの結合したDM1分子の数を、既に報告された抗体およびDM1の減衰係数を使用して、判定したLiuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-86231996。抱合反応後に存在する遊離マイタンシノイドの割合は、20~50μgの抱合体を、100mMの酢酸アンモニウム緩衝液、pH7.0中、25アセトニトリル中で平衡化したHiSepカラムに注入し、アセトニトリル中に溶出することによって判定した。全遊離マイタンシノイド種のピーク面積勾配において溶出し、既知の標準物との溶出時間の比較によって識別を、波長252nmに設定した吸光度検出器を使用して測定し、結合マイタンシノイドカラムのフロースルー分画における抱合体ピーク中に溶出に関連するピーク面積と比較して、全遊離マイタンシノイド種の割合を計算した。1個のhuEGFR抗体につき3.5~4個のDM1分子を有する抱合体を、1未満が未抱合マイタンシノイドとして存在する状態で、得た。huEGFR-7R-SPDB-DM4の調製例示的なN-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDBリンカーを、エタノール中に溶解した。huEGFR抗体を、8mg/mLで、5.5~5倍のモル過剰SPDBリンカーとともに、50mMNaCl、2mMEDTA、および3エタノールを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5中で、おおよそ2時間室温でインキュベートした。SPDB修飾した抗体を、pH6.5のPBS中で2倍に希釈し、ジメチルアセトアミドDMA中のDM4の濃溶液15~30mMの添加によって、1.5倍のモル過剰マイタンシノイドDM4で修飾した。室温で一晩インキュベートした後、抱合した抗体を、10mMヒスチジン、250mMグリシン、1スクロース、pH5.5で平衡化したHADEX商標G25F上のクロマトグラフィーによって精製した。1個の抗体分子あたりの結合したDM4分子の数を、既に報告した、抗体およびマイタンシノイドの減衰係数を使用して判定したWiddisonWCetal.JMedChem,49:4392-44082006。全遊離マイタンシノイド種の割合を、上述のように判定した。1個のhuEGFR抗体につき3.5~4個のDM4分子を有する抱合体を、1未満が未抱合マイタンシノイドとして存在する状態で、得た。実施例14マイタンシノイド抱合体の結合親和性huEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体のマイタンシノイド抱合体の結合親和性を、実施例2に記載のように、MDA-MB468細胞を使用して、裸の抗体のものと比較した。huEGFR-6抗体および抱合体の結合曲線から計算したKd図18Aは、裸のhuEGFR-6抗体については0.81nMであり、huEGFR-6-SMCC-DM1抱合体については1.18nMであった。huEGFR-7R抗体および抱合体の結合曲線から計算したKd図18Bは、裸のhuEGFR-7R抗体については0.67nMであり、huEGFR-7R-SMCC-DM1抱合体については0.83nMであった。このデータは、DM抱合が、huEGFR抗原に対するhuEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体の結合親和性を著しく改変しないことを示す。実施例15腫瘍細胞に対するインビトロ細胞毒性アッセイEGFR抗体マイタンシノイド抱合体が腫瘍細胞成長を阻害する能力を、インビトロ細胞毒性アッセイを使用して測定した。手短に述べれば、標的細胞を、1ウェルあたり1,500~3,000個の細胞で、10FBSを含有する100μLの完全RPMI培地に蒔いた。抱合体を、5倍連続希釈を使用して、完全RPMI培地中に希釈し、1ウェルあたり100μLを添加した。最終濃度は、典型的に、3×10-8M~8×10-14Mの範囲であった。細胞を、加湿5CO2インキュベーターにおいて、37°Cで5日間インキュベートした。残存細胞の生存率を、比色分析WST-8アッセイを使用して判定し、450nmでの吸光度A450を、多重ウェルプレートリーダーにおいて測定した。各処理試料の値を、未処理対照の平均値で除すことによって、生存率を計算した。生存率を、各処理について、片対数プロットで、抗体-抱合体の濃度に対してプロットした。本発明の裸の抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体のインビトロ細胞毒性を、chKTIおよびchKTI-SMCC-DM1等の非特異性抗体およびその対応するマイタンシノイド抱合体の活性と比較した。典型的な細胞毒性アッセイから得られた結果を、図19および20に示す。図19Aにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイドの抱合体の活性を、FaDu細胞系において試験した。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの裸の抗体は、それぞれ、40および55のH292細胞成長を阻害したが、一方で、chKTI抗体は活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のEGFR抗体の活性を、さらに強化した。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの両方のSMCC-DM1抱合体が、それぞれ、0.22nMおよび0.06nMのEC50で、標的細胞を完全に破壊した。対照chKTI-SMCC-DM1抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、EC50はかなり低かった0.59μM。図19Bにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、H292細胞系において試験した。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの裸の抗体は、60~70のH292細胞成長を阻害したが、一方で、chKTI抗体は、活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のEGFR抗体の活性を、さらに強化した。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの両方のSMCC-DM1抱合体が、それぞれ、0.16nMおよび0.03nMのEC50で、標的細胞を完全に破壊した。対照chKTI-SMCC-DM1抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、EC50はかなり低かった38.51nM。図20Aにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、H226細胞系において、セツキシマブと比較した。セツキシマブ、huEGFR-6、huEGFR-7Rの裸の抗体、ならびにchKTI対照抗体は、抗増殖活性を有さなかった。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの両方の抗体のマイタンシノイド抱合体は、それぞれ、0.68nMおよび0.14nMのEC50で、標的細胞を完全に排除したが、一方で、対照chKTI-SMCC-DM1抱合体は、標的細胞の殺滅に失敗した。図20Bにおいて、本発明の裸の抗体およびマイタンシノイド抱合体の活性を、SCC-4細胞系において、セツキシマブと比較した。セツキシマブ、huEGFR-6、およびhuEGFR-7Rの裸の抗体は、最大阻害がおおよそ30で、用量依存性の成長阻害を示したが、一方で、chKTI抗体は、活性を有さなかった。マイタンシノイド抱合は、本発明のEGFR抗体の活性を、さらに強化する。huEGFR-6およびhuEGFR-7Rの両方のSMCC-DM1抱合体は、それぞれ、0.07nMおよび0.03nMのEC50で、標的細胞を完全に排除した。対照chKTI-SMCC-DM1抱合体もまた、標的細胞を殺滅したが、EC50はかなり低かった17.62nM。要約すると、これらの結果は、マイタンシノイド抱合が、本発明のEGFR抗体の抗腫瘍活性を、劇的に強化することを示す。実施例16huEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体、ならびにマイタンシノイド抱合体を比較したインビボ効果研究huEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体の、裸の抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体の活性を、EGFR発現H292NSCLC非小細胞肺癌図21およびFaDuSCCHN頭頸部の扁平上皮細胞癌腫図22の腫瘍異種移植片モデルにおいて試験した。1×107個の腫瘍細胞を、SCIDマウスに皮下注射した。腫瘍がおおよそ100mm3の平均体積に達したときに、動物を、腫瘍体積によって治療群に無作為化し、指定用量の裸の抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体を1回注入した。各治療群の平均腫瘍体積を、腫瘍細胞接種後の時間に対してプロットする図21および22。表17および18は、完全寛解CR触知可能な腫瘍がないを有するマウスの数、および対照群の腫瘍体積が、所定の寸法に達した際に、各治療群の腫瘍体積の平均を対照群の平均腫瘍体積で除したものに相当する、腫瘍成長阻害率T/Cを示す。42未満のT/C値を有する治療を、活性であると見なし、一方で、12未満のT/C値を有する治療を、高く活性であると見なす。本発明の裸の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体は、非常に活性であり、それらは、H292およびFaDuの両方の腫瘍異種移植片の成長を、有意に遅延させた図21および22。H292腫瘍異種移植片研究図21および表17において、3mg/kg程度のhuEGFR-6-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-SMCC-DM1抱合体で治療した全てのマウスは、完全寛解を示した。10mg/kgでのhuEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体でさえも、高く活性であった。FaDu腫瘍異種移植片研究においては図22および表18、10mg/kgのhuEGFR-6およびhuEGFR-7R抗体は、高く活性であり、抗体-マイタンシノイド抱合体は、いくつかのマウスにおいて、完全寛解を伴って、なおもさらに活性であった。huEGFR-7R-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-PEG-MAL-DM1を比較したインビボ効果研究裸の抗体、huEGFR-7R-SMCC-DM1抱合体、およびhuEGFR-7R-PEG-MAL-DM1抱合体の活性を、EGFR発現H292NSCLC非小細胞肺癌図25、HSC2SCCHN頭頸部の扁平上皮細胞癌腫図26およびFaDuSCCHN図27腫瘍異種移植片モデルにおいて、試験した。実験およびデータ分析は、上述のように行った。H292NSCLC腫瘍異種移植片研究図25および表19において、試験品目の全てが、3mg/kgの単回投与で、高く活性であった。huEGFR-7R-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-PEG-MAL-DM1の両方の抱合体で治療した全てのマウスが、完全寛解を示したが、一方で、huEGFR-7R抗体で治療したマウスは、一匹も完全寛解を有さなかった。HSC2SCCHN腫瘍異種移植片研究においては図26および表20、huEGFR-7R-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-PEG-MAL-DM1の両方の抱合体が、8のT/Cを有して高く活性であったが、一方で、huEGFR-7R抗体は、5mg/kgの単回投与で、ほとんど活性ではなかった。FaDuSCCHN腫瘍異種移植片研究においては図27および表21、huEGFR-7R-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-PEG-MAL-DM1の両方の抱合体は、それぞれ、15および28のT/Cを有して、活性であった。huEGFR-7R抗体治療は、いくらかの腫瘍成長阻害を示したが、それは、著しく活性ではなかった。結論として、これらの結果は、本発明の裸の抗体は、NSCLCおよびSCCHN腫瘍の成長の阻害に効力を有し、マイタンシノイドとの抱合が、抗腫瘍活性をさらに強化することを示す。実施例17ヒト初代ケラチノサイトにおけるインビトロ細胞毒性アッセイEGFRシグナル伝達は、ヒト初代ケラチノサイト増殖に重要な役割を果たす。小分子チロシンキナーゼ阻害剤またはセツキシマブ等の拮抗性抗EGFR抗体によるEGFRシグナル伝達の阻害は、ケラチノサイト培養において、成長の停止およびアポトーシスをもたらすStolletal.,Oncogene16,1493-14991998。ケラチノサイトのアポトーシスは、診療施設において抗EGFR療法によりもたらされる皮膚毒性の原因となる機構の1つであると考えられる。皮膚毒性の可能性を試験するために、本発明のEGFR抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体を、ヒト初代ケラチノサイトを使用して、インビトロ細胞毒性アッセイにおいて試験した。手短に述べれば、ヒト初代ケラチノサイトInvitrogenを、1ウェルあたり1,500~3,000個の細胞で、製造業者に推奨される、100μLのEGFを含有する培地に蒔いた。試験品目を、5倍連続希釈を使用して、EGF含有培地中で希釈し、1ウェルにつき100μLを添加した。最終濃度は、典型的に、3×10-8M~8×10-14Mの範囲であった。細胞を、加湿5CO2インキュベーターにおいて、37°Cで5日間インキュベートした。残存細胞の生存率を、比色分析WST-8アッセイを使用して判定し、450nmでの吸光度A450を、多重ウェルプレートリーダーにおいて測定した。各処理試料の値を、未処理対照の平均値で除すことによって、生存率を計算した。生存率を、各処理について、片対数プロットで、抗体-抱合体の濃度に対してプロットした。同じ実験において、ヒト初代ケラチノサイト図23AならびにH292腫瘍細胞図23Bに対する、huEGFR-7Rの裸の抗体およびhuEGFR-7R-SMCC-DM1抱合体のインビトロ細胞毒性を、非特異性抗体chKTI、chKTI-SMCC-DM1抱合体、非拮抗性抗体huML66、およびその対応するマイタンシノイド抱合体の活性と比較した。H292細胞系図23Bにおいては、huML66抗体は活性を有さなかったが、一方で、huEGFR-7R抗体は、細胞成長を最大55まで阻害した。huML66およびhuEGFR-7Rのマイタンシノイド抱合体が、最良の活性を有し、それらは、0.05~0.07nMのEC50で、腫瘍細胞成長を完全に阻害した。ヒト初代ケラチノサイト図23Aにおいて、chKTIおよびhuML66抗体は、ケラチノサイト増殖に対して影響を有さなかった。しかしながら、huML66-SMCC-DM1は、0.55nMのEC50で、ケラチノサイトの殺滅に非常に効力があった。huEGFR-7Rの裸の抗体は、ケラチノサイトにほとんど影響を有さなかった。驚くべきことに、huEGFR-7R-SMCC-DM1抱合体は、huML66-SMCC-DM1抱合体と比較して、ケラチノサイトに対して、毒性がはるかに低かった。3.3nMの濃度で、huEGFR-7Rの裸の抗体およびその対応する抱合体は、ケラチノサイトの成長を40未満で阻害しただけであった。要約すると、本発明の抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体は、腫瘍細胞の排除には非常に効力がありながらも、ヒト初代ケラチノサイト細胞の成長にはほとんど影響を有しない。実施例18ヒト初代ケラチノサイトによるケモカイン/サイトカイン生成主にケラチノサイトから構成される皮膚上皮は、樹枝状細胞、メラニン細胞、およびTリンパ球、ならびに単球が散在しており、宿主防御に高く関与している。身体的、化学的、または免疫特異的損傷は、異なる白血球の亜集団を引き付けて活性化し、炎症反応を誘発する、ケモカインおよびサイトカインの発現の増加によって特徴付けられる、表皮反応を容易に引き起こす。TNFαは、ヒトケラチノサイトに、CCL5/RANTES、CXCL10/IFNγ誘発性タンパク質10、およびCXCL8/IL-8を含む、多数のケモカインおよびサイトカインを発現させる。CCL5は、T細胞、単球、ならびに好中球を引き付ける。CXCL10は、1型T細胞の移動を誘発する。CXCL8は、好中球動員ならびに上皮および内皮細胞の増殖に活性な化学誘引物質である。EGFRシグナル伝達は、恒常性の維持および上皮組織の修復を支配する。EGFRの活性化は、ケラチノサイトの増殖、移動、および制御された分化をもたらす。TNFαに反応して、ケラチノサイトは、EGFRシグナル伝達を活性化するEGFRリガンドを生成する。ケラチノサイトにおける強化されたEGFR活性化は、CXCL8発現を増加させ、CCL5およびCXCL10の発現を減少させる。対照的に、EGFRシグナル伝達の障害は、逆のパターンをもたらす。選択的EGFRチロシンキナーゼ阻害剤の皮膚への適用は、表皮CCL5およびCXCL10レベルの増加、ならびに皮膚中により多くの単球/マクロファージおよびT細胞を伴う、より重度の接触過敏性反応をもたらす。これらの発見は、EGFRシグナル伝達が、ケラチノサイトにおけるケモカインの発現に影響を及ぼすことにより、皮膚炎症を調節することを示唆するPastore,J.Immunol.,174:5047-50562005。現在では、EGFR療法の際に診療施設おいて現れた皮膚毒性は、皮膚におけるアポトーシスおよび持続した炎症によってもたらされると見られている。ヒト初代ケラチノサイトによるケモカイン/サイトカイン生成を調節することにおける、本発明の抗体および抗体-マイタンシノイド抱合体の効果を、次のインビトロアッセイにおいて試験した。1×105個のヒト初代ケラチノサイト/ウェルInvitrogenを、まず、6ウェルプレートに蒔いた。細胞を、一晩飢餓状態にし、次いで、EGF含有培地において、100ng/mlのTNFαおよび10μg/mlの試験抗体で、14時間培養した。培養上清中のCCL5、CXCL10、およびCXCL8を、製造業者のプロトコルに従って、RDシステムのELISAキットを使用して測定した。図24に示されるように、セツキシマブは、CXCL8の発現を減少させ、CXCL10およびCCL5の生成を増加させた。対照的に、本発明の裸の抗体は、chKTI対照と比較すると、これらのケモカイン/サイトカインの発現に、影響を有さないか、またはほとんど有さなかった。驚くべきことに、本発明のEGFR抗体のマイタンシノイド抱合体もまた、ケラチノサイトに対して影響を有さないか、またはほとんど有さなかった。要約すると、実施例17および18に示された結果は、本発明の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体の両方が、インビトロにおいて、ヒト初代ケラチノサイトに対して最小の影響を有し、したがって、ヒトの皮膚に対する毒性がより低い傾向にあることを強く示唆する。ケラチノサイトへの影響とは対照的に、本発明の抗体および抗体マイタンシノイド抱合体は、実施例7、12、15、および16に示されるように、インビトロおよびインビボにおいて、EGFR陽性腫瘍細胞の殺滅には非常に効力が高い。要約すると、本発明の抗体および抗体細胞毒性剤抱合体は、正常細胞に対して、腫瘍細胞に対するものとは異なる効果を有する、独自のクラスの抗EGFR分子である。実施例19エピトープのマッピングヒトEGFRは、細胞外リガンド結合領域、単一の膜貫通領域、および非触媒調節領域が両側に隣接した細胞質チロシンキナーゼドメインを有する、大型1186個の残基のモノマー糖タンパク質である。ヒトEGFR残基1~618の細胞外ドメインECDは、本明細書においてドメインIアミノ酸1~165、ドメインIIアミノ酸166~309、ドメインIIIアミノ酸310~481、およびドメインIVアミノ酸482~618と称される、4つのサブドメイン図28を含む。これらのドメインはまた、L1、CR1、L2、およびCR2とも称され、LおよびCRは、それぞれ、大型LargeおよびシステインリッチCys-richの頭字語である。本発明のhuEGFR-7Rのエピトープを、切断型およびキメラのヒト/マウスEGFR分子を操作することによって、ヒトEGFRECDドメインIIIにおいて、主に、アミノ酸460~480を含む規定領域にマッピングする。EGFR変異体のクローニングおよび発現全長ヒトEGFRECDアミノ酸1~618は、Fc融合タンパク質huEGFR-Fcとして発現される。タンパク質配列を、コドン最適化し、合成し、pmuFc2ANL哺乳動物発現ベクターにおいて、BlueHeronBiotechnologiesによって、マウスIgG2Aヒンジ、CH2、およびCH3領域を用いて、インフレームでクローニングした。本発明の抗体は、EGFRに結合するセツキシマブと競合し図8B、セツキシマブがドメインIIIに排他的に結合するため、本発明の抗体のエピトープもまた、ドメインIII内に位置し、セツキシマブのものと重なり得る。エピトープをさらに識別するために、全ドメインIIIアミノ酸310~481に加えて、ドメインIVアミノ酸482~501からの20個の余剰残基を含む、セツキシマブの結合に必要とされることが示唆される、切断したヒトEGFRのFc融合huEGFRdIII-Fcを、huEGFR-Fcと同様に構築した。さらに、アミノ酸310~501を含む切断したマウスEGFRmuEGFRdIII-Fc、およびアミノ酸460~481をコードするヌクレオチド配列が、ヒトEGFRの配列で置き換えられたマウスEGFRアミノ酸310~501を含むキメラ形態のchEGFRdIII-Fcもまた、同様に、Fc融合タンパク質として発現されるように構築した図29。chEGFRdIII-Fc構築物は、残基460、461、467、468、471、473、474、および478~480を含む、10個のアミノ酸のそれらのヒト対応物への突然変異から構成される。EGFRECDFcタグ化タンパク質の全ては、HEK293T細胞の一過性トランスフェクションを解して発現され、タンパク質A親和性クロマトグラフィーを使用して、トランスフェクトされた細胞の上清から精製される。種々のEGFRECD-Fc構築物への抗体結合huEGFR-7Rを、上述の種々のEGFR-Fc構築物への結合について、ELISAフォーマットで試験した。図30に示されるように、huEGFR-7R抗体は、ヒトEGFRhuEGFR-FcおよびヒトEGFRドメインIIIhuEGFRdIII-Fcの両方に、類似の親和性で結合する。図30はまた、huEGFR-7R抗体が、ヒト受容体との高い配列相同性にも関わらずドメインIIIにおいて88の配列同一性、事実上マウスEGFRドメインIIImuEGFRdIII-Fcを認識しないことを示す。さらに、huEGFR-7R抗体は、位置460、461、467、468、471、473、474、および478~480における10個のアミノ酸がそれらのヒト対応物に突然変異された、主としてマウスEGFRドメインIII配列を含む、ヒト/マウスEGFRキメラchEGFRdIII-Fcに結合する図30。これらのデータは、huEGFR-7R抗体が、ヒトEGFRのドメインIIIに排他的に結合し、結合エピトープは、大部分がアミノ酸位置460~480内に限定されることを示す。huEGFRの別の切断形態への結合親和性を比較すると、chEGFRdIII-FcへのhuEGFR-7R抗体の結合親和性に、huEGFRおよびhuEGFRdIIIと比較して、おおよそ2倍の減少が存在することが明らかであり、huEGFR-7R抗体のエピトープが、位置460~480以外のさらなるアミノ酸残基から構成されることを示唆する。このデータは、muEGFR-7抗体の結合結果で確認した図32。同時に、huEGFR-6図31、muEGFR-6図33、muEGFR-12図34、およびmuEGFR-13図35抗体等、独自の生物学的活性をEGFR-7抗体と共有する、本発明の他の抗EGFR抗体は、EGFR-7抗体と同様の結合特性を示す。それらは、ヒトEGFRドメインIIIhuEGFRdIII-Fcに結合するが、マウスEGFRドメインIIImuEGFRdIII-Fcには結合せず、重要なことに、それらは、全て、huEGFRdIII-Fcよりも低い親和性でchEGFRdIII-Fcに結合する。これらのデータは、本発明の抗体によって認識されるエピトープが、位置460~480のアミノ酸残基に加えて、ドメインIII内の他の残基を構成することを示唆する。対照的に、セツキシマブは、chEGFRdIII、ならびに野生型ヒトEGFRおよびhuEGFRdIIIに、類似の親和性で結合し図36、セツキシマブ結合エピトープが、位置460~480のアミノ酸残基に限定されることを示唆する。要約すると、本発明のhuEGFR-7R抗体、ならびに他の抗EGFR抗体は、huEGFR細胞外ドメインのドメインIIIに排他的に結合する。さらに、キメラEGFRの構築を通じて、本発明の抗体によって認識されるエピトープが、huEGFRドメインIIIのC末端に向かって移動され、大部分がセツキシマブ結合部位と重なるが同一ではなく、さらなる重要アミノ酸から構成される可能性が高いことが確認された。特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を十分に明らかにするため、当業者の範囲内の知識を適用することによって、必要以上の実験を伴わずに、様々な適用のためにこのような特定の実施形態を、本発明の一般概念を逸脱することなく、容易に修正および/または適合することができるであろう。したがって、このような適合および修正は、本明細書に提示される教示および指導に基づき、開示される実施形態の同等物の意義および範囲の中に含まれることが意図される。本明細書における表現または用語は、限定ではなく説明を目的とするものであり、したがって、本明細書の用語または表現は、当業者によって、教示および指導を考慮して解釈されることを理解されたい。本発明の幅および範囲は、上述の例示的な実施形態のいかなるものによっても制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるものとする。項目1ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、ならびにc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも1つの特徴を有する、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目2前記抗体は、前記抗体は、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、ならびにc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、からなる群から選択される、少なくとも2つの特徴を有する、項目1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目3ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80のEGFおよびTGFαを阻害し、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらし、c60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目4前記抗体は、a配列番号19~23、69、および71~73からなる群から選択される参照VH配列と少なくとも90同一のVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択される参照VL配列と少なくとも90同一のVL配列と、を含む、項目1~3のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目5前記VHおよびVL配列は、前記参照VHおよびVL配列と少なくとも95同一である、項目4に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目6前記VHおよびVL配列は、前記参照VHおよびVL配列と少なくとも99同一である、項目5に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目7a配列番号19~23、69、および71~73からなる群から選択されるVH配列と、b配列番号24~30および70からなる群から選択されるVL配列と、を含む、項目6に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目8配列番号19および配列番号24を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目9配列番号20および配列番号25を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目10配列番号21および配列番号26を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目11配列番号21および配列番号27を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目12配列番号22および配列番号28を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目13配列番号23および配列番号29を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目14配列番号23および配列番号30を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目15配列番号69および配列番号70を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目16配列番号71および配列番号26を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目17配列番号71および配列番号27を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目18配列番号72および配列番号26を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目19配列番号72および配列番号27を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目20配列番号73および配列番号26を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目21配列番号73および配列番号27を含む、項目7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目22ヒトEGFRへの第2の抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記第2の抗体が、配列番号21の重鎖可変領域と、配列番号26もしくは27の軽鎖可変領域と、を含み、第1の抗体または抗原結合フラグメントが、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、またはc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目232010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託されたATCC寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される、ハイブリドーマによって生成される、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目242010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択される抗体と、同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目25ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11331、2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11332、および2010年10月6日にATCCに寄託された寄託指定番号PTA-11333からなる群から選択され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a10nM以上の濃度で、A431細胞に結合する少なくとも80の上皮成長因子EGFおよび形質転換成長因子TGFαを阻害する、b30nM以上で、H292およびHCC827腫瘍細胞増殖の少なくとも50の阻害をもたらす、またはc60nM以下で、20を上回ってケラチノサイトおよびMCF-10A上皮細胞の増殖を阻害しない、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目26a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、n配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される抗体と、同じEGFRエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目27ヒトEGFRへの参照抗体の結合を競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、a配列番号19のVHポリペプチドおよび配列番号24のVLポリペプチドを含む抗体、b配列番号20のVHポリペプチドおよび配列番号25のVLポリペプチドを含む抗体、c配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、d配列番号21のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、e配列番号22のVHポリペプチドおよび配列番号28のVLポリペプチドを含む抗体、f配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号29のVLポリペプチドを含む抗体、g配列番号23のVHポリペプチドおよび配列番号30のVLポリペプチドを含む抗体、h配列番号69のVHポリペプチドおよび配列番号70のVLポリペプチドを含む抗体、i配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、j配列番号71のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、k配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、l配列番号72のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、m配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号26のVLポリペプチドを含む抗体、ならびにn配列番号73のVHポリペプチドおよび配列番号27のVLポリペプチドを含む抗体、からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目28ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目29aa配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号2、4、6、63、または64の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3または5の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号10、13、または14の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目27に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目30ヒトEGFRに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号15または配列番号16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目31a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号7、8、または9の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号15または16の参照軽鎖CDR1配列、配列番号17の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号18の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目30に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目32ヒトEGFRに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、a1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b1、2、または3つの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖CDR2配列、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。項目33a配列番号1の参照重鎖CDR1配列、配列番号65、66、または67の参照重鎖CDR2配列、および配列番号3の参照重鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域と、b配列番号68または13の参照軽鎖CDR1配列、配列番号11の参照軽鎖配列CDR2、および配列番号12の参照軽鎖CDR3配列とそれぞれ同一である、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域と、を含む、項目32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目34前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、マウス、非ヒト、ヒト化、キメラ、表面再構成、またはヒトのものである、項目1~33のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目35全長抗体である、項目1~34のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目36抗原結合フラグメントである、項目1~33のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目37前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’2、Fd、単鎖FvもしくはscFv、ジスルフィド結合型Fv、V-NARドメイン、IgNar、細胞内抗体、IgGΔCH2、ミニボディminibody、Fab’3、テトラボディtetrabody、トリアボディtriabody、ダイアボディdiabody、単一ドメイン抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、scFv2、またはscFv-Fcを含む、項目1~36のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。項目38項目1~37のいずれか一項に記載のVHおよびVL配列を含む、ポリペプチド。項目39前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、実質的に同様の結合親和性で、ヒトEGFRおよびマカクEGFRの両方に結合する、項目1~38のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。項目40約1.0~約10nMのKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する、項目39に記載の抗体またはポリペプチド。項目41約1.0nMまたはそれよりも優れたKdで、ヒトEGFRおよびマカクEGFRに結合する、項目40に記載の抗体またはポリペプチド。項目42前記結合親和性は、フローサイトメトリー、Biacore、または放射免疫測定によって測定される、項目39~41のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。項目43項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを生成する、単離細胞。項目44項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドを製造する方法であって、a項目43に記載の細胞を培養することと、b前記抗体、その抗原結合フラグメント、またはポリペプチドを、前記培養された細胞から単離することと、を含む、方法。項目45前記細胞は、真核細胞である、項目44に記載の方法。項目46式A-L-Cを有する免疫抱合体であって、式中、Aは、項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチドであり、Lは、リンカーであり、Cは、細胞毒性剤であり、前記リンカーLが、AをCに結合する、免疫抱合体。項目47前記リンカーは、開裂可能リンカー、非開裂可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群から選択される、項目46に記載の免疫抱合体。項目48前記リンカーは、非開裂可能リンカーである、項目47に記載の免疫抱合体。項目49前記リンカーは、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオペンタノエートSPP、N-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオブタノエートSPDBまたはN-スクシンイミジル4-2-ピリジルジチオ-2-スルホブタノエートスルホ-SPDB、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCC、N-スルホスクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートスルホSMCC、N-スクシンイミジル-4-ヨードアセチル-アミノベンゾエートSIAB、およびN-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドからなる群から選択される、項目48に記載の免疫抱合体。項目50前記リンカーは、N-スクシンイミジル-[N-マレイミドプロピオンアミド-テトラエチレングリコール]エステルNHS-PEG4-マレイミドである、項目49に記載の免疫抱合体。項目51前記細胞毒性剤は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、CC-1065、CC-1065類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体、または前記剤のプロドラッグからなる群から選択される、項目46~50のいずれか一項に記載の免疫抱合体。項目52前記細胞毒性剤は、マイタンシノイドである、項目51に記載の免疫抱合体。項目53前記細胞毒性剤は、N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1またはN2’-デアセチル-N2-4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル-マイタンシンDM4である、項目52に記載の免疫抱合体。項目54項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。項目55第2の抗癌剤をさらに含む、項目54に記載の薬学的組成物。項目56標識化された、項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、診断試薬。項目57前記標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、および金属イオンからなる群から選択される、項目56に記載の診断試薬。項目58項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、あるいは項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、を含む、キット。項目59EGFRを発現する細胞の成長を阻害する方法であって、対象に、前記細胞を、項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目54または55に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。項目60前記細胞は、腫瘍細胞である、項目59に記載の方法。項目61癌を有する患者を治療するための方法であって、対象に、項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目54または55に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。項目62前記対象に第2の抗癌剤を投与することをさらに含む、項目61に記載の方法。項目63前記第2の抗癌剤は、化学療法剤である、項目62に記載の方法。項目64細胞増殖性障害を治療するための方法であって、前記対象に、項目1~42のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはポリペプチド、項目46~53のいずれか一項に記載の免疫抱合体、あるいは項目54または55に記載の薬学的組成物の治療有効量を、前記患者に投与することを含む、方法。項目65前記細胞増殖性障害は、副腎皮質過形成クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮肥厚ヘック病、皮脂腺過形成、代償性肝臓肥大、および新形成以外の任意の他の細胞増殖疾患からなる群から選択される、項目64に記載の方法。項目66配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも90同一のポリペプチドをコードする配列を含む、単離ポリヌクレオチド。項目67前記配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも95同一である、項目66に記載の単離ポリヌクレオチド。項目68前記配列は、配列番号39~43、77~80、および82~84からなる群から選択される配列と、少なくとも99同一である、項目67に記載の単離ポリヌクレオチド。項目69配列番号44~50および81と少なくとも90同一である配列を含む、前記単離ポリヌクレオチド。項目70前記ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と少なくとも95同一である配列を含む、項目69に記載の単離ポリヌクレオチド。項目71前記ポリヌクレオチドは、配列番号44~50および81と少なくとも99同一である配列を含む、項目70に記載の単離ポリヌクレオチド。項目72配列番号39~58および77~84からなる群から選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。項目73項目66~72のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。項目74項目73に記載のベクターを含む、宿主細胞。項目75前記免疫抱合体は、EGFR陽性の腫瘍細胞を排除することができるが、3.3nMの濃度で、ヒト初代ケラチノサイトの成長を40以下阻害するのみである、項目46に記載の免疫抱合体。項目76式A-L-Cを有する免疫抱合体であって、式中、Aは、配列番号21の重鎖可変領域と、配列番号26もしくは27の軽鎖可変領域と、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Lは、N-スクシンイミジル4-マレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレートSMCCリンカーであり、Cは、細胞毒性剤N2’-デアセチル-N2’-3-メルカプト-1-オキソプロピル-マイタンシンDM1である、免疫抱合体。"