"目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、a組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌を提供すること、b組換えOrf11/GrlA核酸分子によってコードされた組換えOrf11/GrlAポリペプチドを発現すること、c目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でA/E病原菌を成長させて、組換えOrf11/GrlA核酸分子を含まないA/E病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、を含む方法。前記目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件が、III型抗原の分泌に好ましい条件であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、20-100mMのNaHCO3が添加された最小培地を含む細胞培養倍地中でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。前記最小培地に、5-10mMのMgSO4、0.1-1.5のグルコース及び0.05から0.5カサミノ酸がさらに添加されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、2-10のCO2の存在中における、37°Cの温度でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、600nmで0.7-0.8の吸光度ODまでA/E病原菌を培養することを含む請求項2に記載の方法。前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、20-100mMのNaHCO3、5-10mMのMgSO4、0.1-1.5のグルコース及び0.05-0.5のカザミノ酸が添加された最小培地を含む細胞培養培地中でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌の細胞培養上清を単離することをさらに含む請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。組換えOrf11/GrlA核酸分子が、異種の又は非相同のものheterologousであることを特徴とする請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。組換えOrf11/GrlA核酸分子が、異種の又は非相同のものでないことを特徴とする請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。前記組換えOrf11/GrlA核酸分子が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumに由来することを特徴とする請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記組換えOrf11/GrlA核酸分子が、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号85にハイブリダイズすることを特徴とする請求項1~10に記載の方法。前記組換えOrf11/GrlAポリペプチドが、配列番号86であるか、又は、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号86にハイブリダイズする核酸分子によってコードされていることを特徴とする請求項1~10に記載の方法。前記組換えOrf11/GrlAポリペプチドが、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号56をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされることを特徴とする請求項1~10に記載の方法。前記目的のポリペプチドが分泌ポリペプチドであることを特徴とする請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。前記目的のポリペプチドがIII型抗原であることを特徴とする請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。目的のポリペプチドが、配列番号24~43、73~75を含むポリペプチド、Tir、EspA、EspB、EspD、EspF、EspG、EspH、及び、Mapポリペプチドを含む群から1つ以上選択されることを特徴とする請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。A/E病原菌が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentium細胞であることを特徴とする請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌。前記A/E病原菌が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumであることを特徴とする請求項19に記載のA/E病原菌。目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、a組換えOrf11/GrlA核酸分子をA/E病原菌に導入すること、b組換えOrf11/GrlA核酸分子によってコードされる組換えOrf11/GrlAポリペプチドを発現すること、c目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でA/E病原菌を成長させて、組換えOrf11/GrlA核酸分子を含まないA/E病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、を含む方法。本発明は、部分的には、A/E病原体の幾つかの新規な共通のcommon分泌タンパク質の同定に基づく。本発明は、一つの態様において、ポリペプチド又はそれらの断片若しくは変異体を含む組成物、或いは、そのようなポリペプチドを含む細胞培養上清但し、該実質的に純粋なポリペプチドは、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むを提供する。本発明はまた、核酸分子を含む組成物但し、該核酸分子は、配列番号1~21若しくは60~72の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む;及び、配列番号22~43又はそれらの断片の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組成物をも提供する。前記組成物は、更に生理学的に許容し得る担体を含んでもよく、又は、更に生理学的に許容し得るアジュバントを含んでもよい。前記組成物はまた、EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀毒素1、志賀毒素2、又は、イニチミンのようなポリペプチド又は核酸分子を含んでいてもよい。前記ポリペプチド又は核酸分子は、実質的に純粋で有り得る。本発明はまた、別の態様において、細菌又はそれらの調製物但し、該細菌は、nleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG、nleH、又は、それらの相同体ホモログのような遺伝子における変異を含むか、或いは、配列番号1~21又は60~72と実質的に同一なヌクレオチド配列の細菌ゲノムにおける変異を含むを提供する。ある実施形態において、前記細菌は、腸管出血性大腸菌EHEC;例えば、EHECO157:H7又はEHECO157:NM、腸管病原性大腸菌EPEC;例えば、EPECO127:H6、又は、サイトロバクターローデンティウムのようなA/E病原体で有り得る。ある実施形態において、前記変異は病原性を減弱させるものであってもよく、或いは、配列番号1~21又は60~72から成る群より選択される配列と実質的に同一なA/E病原体ゲノムヌクレオチド配列中に生じるものであってもよい。前記細菌は、アジュバントと組み合わせた組成物として提供されてもよい。ある実施形態においては、前記細菌は生存していてもよい。ある実施形態においては、前記細菌は死滅していてもよい。投与様式は、経口又は非経口的で有り得る。本発明はまた、別の態様において、試料の用意;並びに、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なヌクレオチド配列;配列番号22~43、59又は73~84から選択される配列と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;又は、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの検出但し、該ヌクレオチド配列又は該アミノ酸配列の存在は、試料中、例えば、卵、糞便、血液又は腸におけるA/E病原体の存在を示しているによる、試料中のA/E病原体の存在を検出する方法を提供する。前記検出は、配列番号1~21又は60~72から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの一部から成る群より選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と実質的に同一のプローブ又はプライマーと前記ヌクレオチド配列との接触を含んでいてもよく、或いは、配列番号22~43、59若しくは73~84、又は、それらの断片若しくは変異体から成る群より選択される配列と特異的に結合する抗体と前記アミノ酸配列との接触を含んでいてもよい。本発明はまた、別の態様において、A/E病原体感染若しくは感染リスクのある動物を同定し、及び;該動物に有効量の組成物但し、該組成物は、配列番号22~43、59又は73~8443の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド;配列番号22~43、59又は73~84から選択される配列と実質的に同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;1‐21又は60‐72の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子;或いは、そのようなポリペプチドを含む細胞培養上清を含むを投与することによる、A/E病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を惹起する方法、或いは、動物例えば、ヒト;ヒツジヒツジの対象、ヤギ、ウシウシの対象などのような反芻動物;又は、任意の他の動物、例えばブタ、ウサギ、家禽例えば、アヒル、ニワトリ、シチメンチョウなどにおけるA/E病原体のコロニー形成又は脱粒を減少させる方法を提供する。本発明はまた、別の態様において、A/E病原体を用意し;及び、A/E病原体におけるnleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG若しくはnleH又はそれらの相同体のような遺伝子を変異させるか、又は、A/E病原体のゲノムのヌクレオチド配列但し、該ヌクレオチド配列は配列番号1~21又は60~72から選択されるの1又はそれ以上を変異させることによって病原性を減少させるような、A/E病原体の病原性を減少させる方法を提供する。本発明はまた、別の態様において、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド;配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;又は、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子、を含むシステム系例えば、EHEC、EPEC若しくはC.ローデンティウム細胞のような細胞、動物モデル、又は、試験管内のシステム系を用意し;被検化合物を用意し;並びに、該被検化合物が、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌、又は、生物学的活性を調節するか否かを決定することによる、A/E病原体の病原性を減少させる化合物のスクリーニング方法を提供する但し、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌又は生物学的活性における変化例えば減少は、該A/E病原体の病原性を減少させる化合物を示す。本発明はまた、別の態様において、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド;配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体から成る群より選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;又は、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子、を含む組換え細胞を用意し;該ポリペプチドの発現及び/又は分泌が許容される条件下で該組換え細胞を増殖させ、及び、任意的に該ポリペプチドを単離することによる、A/E病原体病原性因子を産生する方法を提供する。ある実施形態においては、前記ポリペプチドは、前記細胞から分泌されてもよい。本発明はまた、別の態様において、A/E病原体感染を有する又はそのリスクのある哺乳動物を同定し;及び、該哺乳動物に治療上有効量の該A/E病原体病原性を減少させる化合物を投与する事但し、該化合物は、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つと実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの前記発現又は分泌を抑制するによる、A/E病原体感染を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態において、前記化合物は、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つと実質的に同一なヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス核酸分子であってもよく、或いは、siRNAであってもよい。本発明はまた、別の態様において、配列番号22~43、59又は73~84の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換え型ポリペプチド、又は、単離された核酸分子、及び/又は、そのようなヌクレオチド配列を含むベクター;並びに、宿主細胞例えば、そのようなベクターを含む、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又は、サイトロバクターローデンティウムのようなA/E病原体を提供する。別の態様において、本発明はまた、A/E病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を惹起させる、又は、動物においてA/E病原体のコロニー形成若しくは脱粒を減少させる医薬品の調製における、本発明に従った、該組成物、細菌、ポリペプチド、又は、該核酸分子の使用を、提供する。別の態様において、本発明はまた、試料中のA/E病原体を検出する試薬、及び、試料中の該A/E病原体の検出に関する使用説明の添付文書とを含むキットを提供する。前記試薬は、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、と実質的に同一なプローブ又はプライマーを含んでもよく、或いは、配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群より選択される配列に特異的に結合する抗体を含んでもよい。A/E病原体は、例えば、動物例えば、哺乳動物―例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコなど、又は、トリ―例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどの腸表面に結合する病原性の大腸菌病原であり、及び、接着/破壊A/E病変と呼ばれる特徴的な組織学的病変を誘発する8。一般的に、A/E病原体感染は、下痢、大腸炎、溶血性尿毒症候群のような腎臓疾病をもたらし得る。しかしながら、A/E病原体の感染は、必ずしも疾患症状が明白である必要はない;A/E病原体に感染した宿主哺乳動物は、該病原体のキャリアであって健康で疾病から免れたままでもよい。それゆえ、A/E病原体に感染する又は感染リスクのある哺乳動物は、例えば、必ずしも疾病症状が明白ではない家禽動物例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル若しくは反芻動物例えばウシ、ヒツジ、ヤギなどのような農業動物又は他の農業動物例えばブタなどの動物、並びに、A/E病原体感染の結果として重篤な腸内疾病に感受性のあるヒトを含む。模範的なA/E病原体には、腸管出血性大腸菌EHEC志賀毒素産生大腸菌STEC又はベロ毒素産生大腸菌VTECとしても知られており、例えば、EHEC血清型0157例えば、EHECO157:H7、それらのゲノム配列はアクセッション番号AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC002695又はNC002655において記載されている、又は、0158、05、08、018、026、045、048、052、055、075、076、078、084、91、0103、0104、0111、0113、0114、0116、0118、0119、0121、0125、028、0145、0146、0163、0165;腸管病原性大腸菌EPEC;並びに、マウス例えば、サイトロバクターローデンティウム;ウサギ例えば、O15:H‐のようなRDEC‐1系統;ブタ;ヒツジ;イヌ;及び、他の哺乳動物に感染する病原性大腸菌、を含むがこれらに限定されるものではない。A/E病原体の多くの系統は、例えば、AmericanTypeCultureCollectionATCCマナサス、バージニア州、米国を通して、商業的に利用できる。A/E病原体は、例えば、セフィキシム及びテルライトtelluriteを添加されたソルビトールマッコンキー寒天上への直接プレーティング、又は、該培地へのプレーティングに続く免疫磁気濃縮によって、感染個体から単離されてもよい72、107、108。タンパク質、ペプチド、又は、ポリペプチドは、2又はそれ以上の任意のアミノ酸鎖であり、翻訳後修飾例えば、糖鎖形成又はリン酸化に関わりなく、天然又は非天然のアミノ酸又はアミノ酸類似体を含む。本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド、ペプチド、又は、タンパク質には、異常な連鎖結合、クロスリンク及びエンドキャップ、非ペプチジル結合、又は、代替修飾基を有するペプチド又はタンパク質を含む。そのような修飾ペプチドも、本発明の範囲内にある。用語修飾基は、前記ペプチド性構造体に直接的に付着する例えば、共有結合によって、並びに、前記ペプチド性構造体に間接的に付着する例えば、安定的な非共有結合性会合によって、又は、前記コアのペプチド性構造体に隣接していてもよい付加的アミノ酸残基又はそれらの模倣体mimetic、類似体若しくは誘導体への共有結合性結合によって構造体を含むことを意図している。例えば、前記修飾基は、前記ペプチド性構造体のアミノ末端若しくはカルボキシ末端に、又は、前記コア領域に隣接したペプチド性若しくはペプチド模倣性領域に、結合し得る。或いは、前記修飾基は、ペプチド性構造体の少なくとも一つのアミノ酸残基の側鎖に、又は、前記コア領域に隣接したペプチド性若しくはペプチド模倣性領域に例えば、リジル残基のεアミノ基を介して、アスパラギン酸残基若しくはグルタミン酸残基のカルボキシル基を介して、チロシル残基、セリン残基若しくはスレオニン残基のヒドロキシ基を介して、又は、アミノ酸側鎖上の他の好適な反応基を介して、結合されてもよい。前記ペプチド性構造体へ共有結合された修飾基は、化学構造連結例えば、アミド、アルキルアミノ、カルバミン酸、又は、尿素結合のための当業者に周知された方法に従って、付着され得る。用語核酸又は核酸分子は、RNAプラス及びマイナス鎖、並びに、cDNA、ゲノムDNA、及び、合成例えば化学合成されたDNAを含むDNAを包含する。前記核酸は、二本鎖又は一本鎖で有り得る。一本鎖である場合、前記核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖で有り得る。核酸分子は、2又はそれ以上の共有結合されたヌクレオチド天然又は非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体若しくは誘導体を含むの任意の鎖で有り得る。RNAは、2又はそれ以上の共有結合された、天然又は修飾されたリボヌクレオチドを意味する。本用語の範囲内に含まれる修飾RNAの一例は、ホスホロチオネートRNAである。DNAは、2又はそれ以上の共有結合された、天然又は修飾されたデオキシリボヌクレオチドを意味する。cDNAは、相補的DNA、又は、RNA依存性DNAポリメラーゼ逆転写酵素の作用によりRNA鋳型から産生されたコピーDNAを意味する。それゆえ、cDNAクローンは、クローニングベクターに保有された目的のRNA分子に相補的な二重鎖DNA配列を意味する。相補的とは、二つの核酸、例えばDNA又はRNA、が該二つの核酸間で二重鎖領域を産生するためのワトソン‐クリック塩基対形成を成し得るのに十分な数のヌクレオチドを含む。それゆえ、DNA又はRNAの一方の鎖におけるアデニンは、反対側の相補的DNA鎖におけるチミンと、又は、反対側の相補的RNA鎖におけるウラシルと対をなす。核酸分子における各ヌクレオチドが、二重鎖を形成するために、反対側の相補鎖中のヌクレオチドと、対応したmatchedワトソン‐クリック塩基対を形成する必要がないことが理解されよう。核酸分子は、高ストリンジェントな条件下で第二の核酸分子とハイブリダイズするのであれば、もう一方の核酸分子と相補的である。本書で使用する場合、細胞培養上清とは、一般に、配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む1又はそれ以上のポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分を、細胞培養倍地中に分泌し得る培養中の細菌又は他の生物体例えば酵母又は細胞例えば昆虫細胞由来の上清を指す。ある実施形態において、前記細胞培養上清は、実質的に純粋すなわち実質的に細菌の細胞又はそれらの細胞の可溶化液からフリーである。ある実施形態において、前記細胞培養上清は、EspA、EspB、EspD、Tir、インチミン、志賀毒素1若しくは2、又は、EspPポリペプチド、或いは、それらの断片又は凝集体の1又はそれ以上を含み得る。前記細菌は、A/E病原体―例えば、EHEC、EPEC又はサイトロバクターローデンティウム該A/E病原体は、ある実施形態においては、本書に記載されたタンパク質を優先的に発現又は分泌するように修飾又は変異させられていてもよいであってよく、或いは、幾つかの他の細菌―例えば、非病原性細菌、例としてHB101のような非病原性大腸菌又は非A/E病原体該他の細菌は、例えば組換え又は他の技術によって、本書に記載されたタンパク質例えば、配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分の1又はそれ以上を、細胞培養培地中に分泌するように修飾又は変異させられているであってもよい。幾つかの実施形態においては、前記細菌は、EHEC又はEPECではない。幾つかの実施形態において、前記細菌がA/E病原体である場合には、ポリペプチド例えば、EspA、EspB、EspD、Tir、イニチミン、志賀毒素1若しくは2又はEspPを発現又は分泌する能力を損なうような修飾を更に施してもよい但し、該ポリペプチドは、修飾がなされていない状態で正常に分泌される。幾つかの実施形態において、前記他の生物体例えば酵母又は細胞例えば昆虫細胞、例えば組換え又は他の技術によって、本書に記載されたタンパク質例えば、配列番号22~43の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分の1又はそれ以上を、細胞培養倍地中に分泌するように修飾又は変異させられている。天然において化合物に付随する成分から、該化合物が分離された場合に、該化合物は実質的に純粋又は単離されている。典型的には、試料中の全物質の、重量において、少なくとも10、20、30、40、50若しくは60、又は、より一般的には、少なくとも70、75、80、85、90、95若しくは99である場合、化合物は実質的に純粋である。それゆえ、例えば、化学的に合成された又は組換え技術により産生されたポリペプチドは、一般に、該ポリペプチドが天然において会合する成分から実質的にフリーであろう。ポリペプチドが、遠心分離、沈殿、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、HPLC等のような物理的な技術により該ポリペプチドの天然会合成分から分離された場合、該ポリペプチドはまた一般に実質的に純粋であろう。核酸分子が、本発明におけるDNAが由来する生物の天然ゲノムにおいて、該核酸分子が通常近接しているコード配列と、すぐ近接すなわち共有結合性に連結していない場合、該核酸分子は一般に実質的に純粋又は単離されているであろう。それゆえ、単離された遺伝子又は核酸分子とは、ゲノム配列中におけるように該遺伝子又は核酸分子に通常現実に隣接する核酸分子によって隣接されていない、及び/又は、cDNA又はRNAライブラリ中におけるように他の転写された配列から完全に又は部分的に精製された遺伝子又は核酸分子を意味することを意図する。例えば、本発明の単離された核酸は、該核酸が天然において存在する前記複合体細胞環境に関して、実質的に単離されていてもよい。幾つかの場合、前記単離された物質は、組成物例えば、他の物質を含む粗製抽出物、緩衝液系、又は、混合試薬の一部を形成するであろう。他の場合には、前記物質は、例えば、PAGE又はHPLCのようなカラムクロマトグラフィによって決定されるような本質的な均一性へと精製されてもよい。したがって、前記用語は、例えば、自律複製プラスミド若しくはウイルスのようなベクターに、又は、原核生物若しくは真核生物のゲノムDNA内に組み込まれた;或いは、他の配列から独立した別個の分子例えば、PCR又は制限酵素処理によって産生されたcDNA又はゲノムDNA断片として存在する、組換え核酸を含む。付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え核酸をも含む。好ましくは、単離された核酸は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも凡そ50、80、又は、90モルを基礎としてを含む。それゆえ、単離された遺伝子又は核酸分子は、化学的に又は組み換え法により合成された遺伝子又は核酸分子を含み得る。ベクターに含有された組換えDNAは、本書で使用する場合、単離されたの定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種性の宿主細胞中に組換えDNA分子、並びに、溶液中に部分的に又は実質的に精製されたDNA分子を含む。本発明のDNA分子の生体内及び試験管内RNA転写物も、単離された核酸分子に包含される。そのような単離された核酸分子は、前記コードされたポリペプチドの製造において、相同配列を単離するためのプローブとして例えば、他の哺乳動物種から、遺伝子地図のために例えば、染色体との切片上ハイブリッド形成法によって、又は、ノーザンブロット解析によるような組織例えば、末梢血のようなヒト組織における遺伝子発現の検出のために、有用である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源からの抽出によって;ポリペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現によって;又は、化学合成によって、獲得され得る。純度は、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、HPLCなどのような適切な方法の何れかを用いて測定し得る。実質的に純粋な細胞例えば細菌細胞調製物は、所望の変異遺伝子型を有しない、又は、所望のポリペプチドを十分な量で発現若しくは分泌しない混入細胞が、該調製物における全細胞数の10、20、30、40、50、60、70、80又は90より少なく構成される細胞の調製物である。本発明の種々の遺伝子及び核酸配列は、組換え型配列であってもよい。用語組換えは何かが組み換えられていることを意味するが、核酸コンストラクトに言及する場合、該用語は、組み合わされた又は分子生物学的技術の方法によって産生された核酸配列から成る分子を意味する。タンパク質又はポリペプチドに言及する場合に用語組換えは、分子生物学的技術の方法によって産生された組換え核酸コンストラクトを用いて発現させられたタンパク質又はポリペプチド分子を意味する。遺伝的組成物に言及する場合に用語組換えは、その親のゲノムに無い新しい組み合わせの対立遺伝子を伴った配偶子又は子孫を意味する。組換え核酸コンストラクトは、天然において連結しない又は天然とは異なる位置に連結された核酸配列に、連結された又は連結するように操作されたヌクレオチド配列を含んでもよい。それゆえ、組換えの場合の核酸コンストラクトは、該核酸分子が遺伝子工学を用いて操作された、すなわちヒトの介入による核酸コンストラクトを意味する。組換え核酸コンストラクトは、例えば、形質転換により宿主細胞中に導入されてもよい。そのような組換え核酸コンストラクトは、それと同じ宿主細胞の種又は異なる宿主細胞の種由来の配列を含み、該配列は単離され該宿主種の細胞に再導入される。組換え核酸コンストラクト配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果として、又は、引き続く組換え及び/又は修復イベントの結果の何れかにより、該宿主細胞ゲノムに組み込まれることになってもよい。本書で使用される場合、核酸又はタンパク質に対して異種の又は非相同のheterologousとは、天然に見出される位置とは異なる位置になるように人的介入によって操作された分子を言う。例えば、ある種からの核酸配列がもう一つの種のゲノム中に導入されてよく、或いは、あるゲノム座位からの核酸配列が同じ種のもう一つのゲノム座位若しくは染色体外座位に移動されてもよい。異種の又は非相同のタンパク質は、例えば、天然にはそのタンパク質を発現しない単一細胞中で、異種の又は非相同のコード配列から発現されたタンパク質又は組換え型遺伝子から発現されたタンパク質を含む。実質的に同一のsubstantiallyidentical配列は、本書で検討されたような1又はそれ以上の保存的な置換によって、或いは、アミノ酸又は核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列位置における1又はそれ以上の非保存的置換、欠失又は挿入によって、のみ基準配列と異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列である。そのような配列は、例えば、AlignProgram96又はFASTAを用いて比較のために使用された配列と、アミノ酸又はヌクレオチドレベルで、10から99の任意の整数、又はより一般的には、少なくとも10、20、30、40、50、55若しくは60、又は、少なくとも65、75、80、85、90若しくは95、又は、96、97、98若しくは99と同程度、同一であり得る。ポリペプチドについては、前記比較配列の長さは、少なくとも2、5、10若しくは15アミノ酸、又は、少なくとも20、25若しくは30アミノ酸であってよい。別の実施形態においては、前記比較配列の長さは、少なくとも35、40若しくは50アミノ酸、又は、60、80若しくは100アミノ酸以上であってよい。核酸分子については、前記比較配列の長さは、少なくとも5、10、15、20若しくは25ヌクレオチド、又は、少なくとも30、40若しくは50ヌクレオチドであってよい。別の実施形態においては、前記比較配列の長さは、少なくとも60、70、80若しくは90ヌクレオチド、又は、100、200若しくは500ヌクレオチド以上であってよい。配列同一性は、公的に入手可能な配列解析ソフトウェア例えば、ウィスコンシン大学生物工学センターGeneticsComputerGroupのSequenceAnalysisSoftwarePackage、国立医学図書館から入手可能なBLASTソフトウェア、又は、本書に記載されたようなを用いて、容易に測定され得る。有用なソフトウェアの例には、プログラムPileupandPrettyBoxを含む。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、置換及び他の修飾に対し、相同性の度合いを割り当てることにより、似た配列を対応させる。或いは、又は、更に、二つの核酸配列が高い厳密性条件下でハイブリッド形成する場合、それらは実質的に同一であってもよい。ある実施形態において、高い厳密性条件は、例えば、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、少なくとも500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリッド形成に匹敵するハイブリッド形成を許容する条件である。これらは、高い厳密性でのノーザンブロット法又はサザンブロット法のための典型的条件である。ハイブリッド形成は、凡そ20から30分間、又は、凡そ2から6時間、又は、凡そ10から15時間にわたって、或いは、24時間又はそれ以上にわたって、行われる。高厳密性PCR、DNAシークエンス、一本鎖高次構造多型解析、及び、切片上ハイブリッド形成法のような分子生物学者によって日常的に行われている多数の技術の成功も、高厳密性のハイブリッド形成に依存している。ノーザンブロット法及びサザンブロット法とは対照的に、これらの技術は、通常、相対的に短いプローブで行われる例えば、通常、PCR又はシークエンスのためには凡そ16ヌクレオチド若しくはそれより長く、及び、切片上ハイブリッド形成法のためには凡そ40ヌクレオチド若しくはそれより長い。これらの技術で用いられる前記高厳密性条件は、分子生物学分野の当業者に周知されている61。実質的に同一な配列は、例えば、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列、或いは、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列であってよい。幾つかの実施形態において、実質的に同一な配列は、例えば、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と相補的な又はハイブリッド形成するヌクレオチド配列であってもよい。幾つかの実施形態において、実質的に同一な配列は、A/E病原体由来のものであってもよい。プローブ又はプライマーは、相補的な配列標的を含む2番目のDNA又はRNA分子と塩基対形成basepairし得る限定された配列の一本鎖DNA又はRNA分子である。生じたハイブリッド分子の安定性は、生じた塩基対形成の程度範囲に依存し、そして、プローブと標的分子との間の相補性の程度、及び、ハイブリッド形成条件の厳密度のようなパラメータに影響される。ハイブリッド形成厳密性の度合いは、その温度、塩濃度、ホルムアミドのような有機分子の濃度などのパラメータに影響され、当業者既知の方法により決定される。本書に記載された前記核酸配列に対して特異的なプローブ若しくはプライマー又はそれらの一部は、その目的、その条件、及び、使用されるのがプローブかプライマーかに依存して、長さにおいて異なり、少なくとも8ヌクレオチドから500ヌクレオチドの間の任意の整数によって示される値を取ってよい。例えば、プローブ又はプライマーは、少なくとも8、10、15、20若しくは25ヌクレオチド長であってよく、又は、少なくとも30、40、50又は60ヌクレオチド長であってよく、又は、100、200、500若しくは1000ヌクレオチド長以上であってよい。本書に記載された前記核酸配列に対して特異的なプローブ若しくはプライマーは、本書に記載された前記核酸配列と、例えばAlignprogram96を用いて、10から99の任意の整数、又は、より一般的には、少なくとも10、20、30、40、50、55若しくは60、又は、少なくとも65、75、80、85、90若しくは95、又は、96、97、98若しくは99程度、同一であり得る。プローブ又はプライマーは、当業者既知の方法により、放射能又は非放射能の何れかにより、検出可能なように標識され得る。プローブ又はプライマーは、核酸シークエンス、ポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅、一本鎖高次構造上多型SSCP解析、制限酵素断片多型RFLP解析、サザンブロット法、ノーザンブロット法、切片上ハイブリッド形成法、電気泳動移動度シフト解析EMSA、及び、当業者既知の他の方法のような、核酸ハイブリッド形成法を含む方法のために使用し得る。プローブ又はプライマーは、ゲノムDNA若しくはcDNAに例えば増幅による、又はクローン化DNAセグメントに由来してよく、或いは、化学的に合成されてもよい。変異は、生物体のDNA配列すなわちゲノムにおいて、その親の菌株と比較した場合の、任意の変化を含む。前記変化は、自発的に生じてもいいし、又は、前記生物体を、変異原性化学薬品、エネルギー、放射線、組換え技術、交配、若しくはDNAを改変するために使用される任意の他の技術のような変異原性刺激に曝露することによって生じてもいい。変異は、本書に記載された任意のヌクレオチド配列における変化を含んでよく、又は、本書に記載された任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における変化を含んでよい。変異は、前記変異の結果として、その親の菌株と比較した際に、前記変異体細胞のその病原性レベルが少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100まで減少した場合、病原性の減弱を含んでよい。病原性の減弱は、ポリペプチド例えば、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現において、その親の菌株と比較した際に、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100の減少によって測定されてもよい。A/E病原体の病原性は、本書に記載された又は当業者に知られているように測定されてよい。病原性の減弱は、ポリペプチド例えば、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの前記生物学的活性において、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100の減少によって測定されてもよい。調節又は調節するは、減少又は増加の何れかの変化を意味する。増加又は減少は、対照又は参照の試料又は化合物と比較された場合、10と90の間の任意の整数値の、又は30と60の間の任意の整数値の変化であってよく、或いは、100以上の変化であってよい。被検化合物は、任意の天然の又は人工的に誘導された化合物である。被検化合物は、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機物分子、及び、核酸分子を含むがこれらに限定されない。被検化合物は、本書に記載された任意の前記ポリペプチド又は前記核酸分子のような既知化合物と、例えば、病原性を干渉することによって、又は、該既知化合物によって誘発される任意の生物学的応答を干渉することによって、競合し得る。一般的に、被検化合物は、参照化合物と比較された場合、10と200の間の任意の値、又は、500以上の調節を示し得る。例えば、被検化合物は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の10から200の整数値での調節、又は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の30から150の整数値での調節、又は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の60から100の整数値での調節、又は、任意の陽性若しくは陰性の100以上の整数値での調節を示してもよい。負のモジュレーターである化合物は、通常、既知化合物に関する修飾を減少させるであろうし、正のモジュレーターである化合物は、通常、既知化合物に関する修飾を増加させるであろう。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は、哺乳類若しくは昆虫ウイルス、又は人工染色体に由来するDNA分子であり、それらの中に核酸分子例えば、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列が挿入されてよい。ベクターは1又はそれ以上の独特の制限酵素部位を含んでよく、或いは、前記クローン化された配列が複製可能なように限定された宿主又は媒体生物体の中で自律増殖可能であってもよい。ベクターはDNA発現ベクターすなわち組換え型ポリペプチドの合成を指揮し得る任意の自律的エレメントであってよく、そして、それゆえ、宿主細胞中でポリペプチド例えば、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現させるために使用してもよい。DNA発現ベクターは、細菌のプラスミド及びファージ、並びに、哺乳類及び昆虫のプラスミド及びウイルスを含む。ベクターは、ベクターによる前記宿主細胞のゲノム中に導入された任意の修飾が、該宿主細胞のゲノムの一部になるように、前記宿主細胞のゲノム中に組み込み可能であってもよい。ベクターは、前記宿主細胞のゲノム中に組み込み不可能であって、そして、そのため、プラスミドのように自律複製単位として残ってもよい。抗体は、抗体が抗原例えば、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識し結合した場合、抗原に特異的に結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識し結合することはない。そのような抗体は、前記抗原に対する親和性例えば、試料中のもう一つの参照分子に対する該抗体の親和性よりも少なくとも10、100、1000又は10000倍大きいを有する。試料は、A/E病原体感染動物或いは本発明の1又はそれ以上の前記ポリペプチド若しくは核酸分子又はそれらの免疫原性断片を投与された動物から単離された試料のような、対象から単離された任意の器官、組織、細胞若しくは細胞抽出物であり得る。例えば、試料は、患者ヒト又は動物、被検対象又は実験動物から得られた、組織例えば組織診又は剖検からの、細胞、血液、血清、乳、尿、便、唾液、糞便、卵、哺乳類細胞培養若しくは培地、又は、任意の他の検体、或いは、それらの任意の抽出物を含み得るがこれらに限定されない。試料は、正常な又は形質転換された細胞によって細胞培養中に産生された産物例えば、組換えDNA又は単クローン抗体技術によるを含んでよいがこれらに限定されない。試料は、実験条件下で創出された細胞又は株化細胞該細胞は、対象から直接的に単離されていないであってもよい。試料は、無細胞の、人工由来の、又は、合成されたものでも有り得る。前記試料は、A/E病原体由来の遺伝子、ゲノム、ポリペプチド、核酸分子の存在を検出するために、又は、A/E病原体由来の遺伝子における変異を検出するために、又は、A/E病原体由来の遺伝子若しくはポリペプチドの発現レベルを検出するために、又は、A/E病原体由来の遺伝子若しくはポリペプチドの生物学的機能を決定するために、当業者既知及び/又は本書に記載された方法を用いて、分析されてよい。例えば、試料由来PCR産物のシークエンス、一本鎖高次構造多型SSCP解析若しくは制限酵素断片長多型RFLP解析のような方法が、遺伝子における変異を検出するために使用し得;ELISA若しくはウエスタンブロット法はポリペプチドのレベルを測定するために使用し得;ノーザンブロット法は、mRNAを測定するために使用し得;又は、PCRは、核酸分子のレベルを測定するために使用し得る。免疫応答は、以下の1又はそれ以上の哺乳類における応答:組成物又はワクチン投与後の、該組成物又はワクチン中の前記抗原に特異的に方向付けられた抗体、B細胞、T細胞ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、γδT細胞を含むの誘導、を含むがこれらに限定されない。組成物又はワクチンへの免疫応答は、それゆえ一般に、目的の該組成物又はワクチンへの宿主哺乳類の細胞性の及び/又は抗体‐仲介性応答における発達を含む。通常、前記免疫応答は、A/E病原体による感染の予防又は減少をもたらすであろう;該A/E病原体によるコロニー形成に対する腸の抵抗性;又は、該A/E病原体の脱粒における減少。ポリペプチド又は核酸分子の免疫原性断片は、免疫応答を誘発するアミノ酸又はヌクレオチド配列を意味する。したがって、免疫原性断片は、本書に記載された任意の配列の任意の部分、又は、それらと実質的に同一の配列であって、1又はそれ以上のエピトープT細胞又はB細胞のような特異的免疫系細胞によって認識される前記部位を含有するもの、を含んでよいがこれらに限定されない。例えば、免疫原性断片は、本書に記載された任意の1又はそれ以上の配列に由来する、6と60の間の、又は、60以上の任意の値のアミノ酸長のペプチド、例えば、10と20の間の任意の値のアミノ酸長の、又は、20と40の間の任意の値のアミノ酸長のペプチド、を含んでよいがこれらに限定されない。そのような断片は、エピトープマッピング法、又は抗原性若しくは疎水性親水性指標プロットのような当業者既知の標準的方法、例えば、OxfordMolecularGroupのOmigaバージョン10プログラムを用いて、同定されてよい参照、例えば、米国特許第4,708,87176、77、81、92、73。本発明者らは、A/E病原体表2の幾つかの新規な共通のcommon分泌タンパク質を、陽性LEEレギュレーター包括的レギュレーターLEEの活性化因子、又は、GrlAを用いて同定した該GrlAは、分泌を有意に増加させるために使用され得、そしてプロテオミクスに基づくアプローチを用いた前記LEEコードTTSSを介した分泌タンパク質の機能的スクリーニングを可能とさせた。これらの新規タンパク質は、Nle非LEEコードエフェクターA~Hと名付けられ、LEE含有病原体において存在し、そして、大腸菌の非病原性系統、及び、前記LEE以外の3つの病原性島PAIs該PAIsは、A/E病原体において存在し且つ前記LEEと共進化した3、8によってコードされる非LEE病原体では存在していない。これらのタンパク質の同定は、ある場合には、以前には機能未知であったORFsに機能を割り当てることを可能にした。典型的なタンパク質、NleAp54は、C.ローデンティウム、EPEC及びEHECを含むA/E病原体におけるIII型エフェクターであり、且つ、病原性において決定的役割を果たす。NleAは、前記EHECゲノム内のLEEとは別のファージ関連病原性島内にコードされている。前記LEEコードTTSSは、NleAの宿主細胞内への転位置を方向付ける宿主細胞においてNleAはゴルジ体に局在化する。NleAは、LEE含有病原体において存在し、そして、非病原性系統大腸菌及び非LEE病原体では存在していない。本発明のある実施形態において、これらのポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子、又は、それらの一部は、A/E病原体感染に対するワクチン、薬物療法、診断、又は、薬物スクリーニング手段として、或いは、試薬として、有用で有り得る。ポリペプチド及び被検化合物本発明に従った化合物は、例えば、配列番号1~56、59~84、並びに、それらの断片、類似体及び変異体として記載された前記ポリペプチド及び核酸分子を含むがこれらに限定されない。本発明に従った化合物はまた、前記orf11/grlA、nleA、nleB、nleB2、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG、nleHnleH1及び/又はnleH2遺伝子、或いは、それらの相同体ホモログの産物を含む。本発明に従った化合物はまた、例えば、番号Z0985NleB2、Z0986NleC、Z0990NleD、Z6020NleF、Z6024NleA、Z4328NleB、Z4329NleE、Z6025NleG相同体、Z6021NleH1、Z0989NleH2、Z2076、Z2149、Z2150、Z2151、Z2337、Z2338、Z2339、Z2560、Z2976又はL0043Orf11/GrlAAccession番号AF071034、配列番号85及び86のような前記EHECゲノム配列例えばAE005174、並びに、それらの断片、類似体及び変異体として記載された前記ポリペプチド及び核酸分子を含む。化合物は、例えば、本書に記載されたポリペプチドの任意の位置におけるアミノ酸残基を、他の保存されたアミノ酸残基すなわち同様の物理的、生物学的又は化学的性質を有する残基で、置換、欠失又は挿入することにより、並びに、例えば、該化合物が病原性を減弱させる能力についてスクリーニングすることにより、調製され得る。本発明のある実施形態において、本発明の化合物は、本書に記載された前記ポリペプチド、例えば、配列番号22~43、59又は73~84に特異的に結合する抗体を含む。生物学的に等価なポリペプチドを得るために、幾つかの修飾及び変化がポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させずに該ペプチドの構造の中で成され得ることが、当業者に周知されている。本発明の一つの態様において、前記本発明のポリペプチドはまた、生物学的に等価なペプチド、又は、本発明の前記ポリペプチドの配列の一部が保存されたアミノ酸置換によって異なる、若しくは、生物学的機能例えば病原性に影響しない非保存的置換によって異なる変異体に及ぶ。本書で使用される場合、用語保存されたアミノ酸置換は、前記ペプチドの所与の位置におけるあるアミノ酸の別のアミノ酸への置換であって、重要な機能の実質的欠損無しに成され得る置換を意味する。そのような変化の作成において、同様のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似度―例えば、それらのサイズ、電荷、疎水性及び親水性などに基づいて成し得、そして、そのような置換が前記ペプチド機能に及ぼすそれらの効果についてルーチンの試験により調べられてもよい。本書で使用される場合、用語アミノ酸は、天然タンパク質において一般に見出されるL‐アミノ酸、D‐アミノ酸、及び、それらが修飾された際のアミノ酸を意味する。従って、本発明のアミノ酸は、例えば、2‐アミノアジピン酸;3‐アミノアジピン酸;β-アラニン;β-アミノプロピオン酸;2-アミノ酪酸;4-アミノ酪酸;ピペリジン酸;6-アミノカプロン酸;2-アミノヘプタン酸;2-アミノイソ酪酸;3-アミノイソ酪酸;2-アミノピメリン酸;2,4-ジアミノ酪酸;デスモシン;2,2’-ジアミノピメリン酸;2,3-ジアミノプロピオン酸;N-エチルグリシン;N-エチルアスパラギン;ヒドロキシリシン;アロ-ヒドロキシリシン;3-ヒドロキシプロリン;4-ヒドロキシプロリン;イソデスモシン;アロ-イソロイシン;N-メチルグリシン;サルコシン;N-メチルイソロイシン;6-N-メチルリシン;N-メチルバリン;ノルバリン;ノルロイシン;及び、オルニチンを含む。幾つかの実施形態において、保存されたアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の親水性値例えば、プラス若しくはマイナス2.0、又は、プラス若しくはマイナス1.5、又は、プラス若しくはマイナス1.0、又は、プラス若しくはマイナス0.5の値以内を有する別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されてよい。但し、以下のものは、アミノ酸残基への割り当てがTyr又はProのような凡そ-1.6の疎水性親水性指標詳細は米国特許第4,554,101に記載されており、参照により本書に組み込まれるを有するアミノ酸残基であってよい:Arg;Lys;Asp;Glu;Ser;Asn;Gln;Gly;Pro;Thr;Ala;His;Cys;Met;Val;Leu;Ile;Tyr;Phe及び、Trp。別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の疎水性親水性指標例えば、プラス若しくはマイナス2.0、又は、プラス若しくはマイナス1.5、又は、プラス若しくはマイナス1.0、又は、プラス若しくはマイナス0.5の値以内を有する別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されてよい。そのような実施形態において、各アミノ酸残基は、疎水性親水性指標を、その疎水性及び荷電特性に基づいて、以下の通りに割り当てられてよい:Ile;Val;Leu;Phe;Cys;Met;Ala;Gly;Thr;Ser;Trp;Tyr;Pro;His;Glu;Gln;Asp;Asn;Lys及び、Arg。別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、公的に入手可能な類似度マトリックスファミリー60、70、102、103、94、104、86を用いて成されてもよい。PAMマトリックスは、進化モデル由来の計算に基づいているのに対し、Blosumマトリックスは整列化内部の高度に保存されたブロックに由来する計算を使用する。PAM又はBlosumマトリックスの何れかにおいてゼロ以上の類似度スコアは、保存的なアミノ酸置換をつくるのに使用されてよい。別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同じクラスの別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されもよい但し、アミノ酸が以下のように無極性、酸、塩基、中性及び無極性に分類される:Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met;酸:Asp、Glu;塩基:Lys、Arg、His;中性:Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。保存的なアミノ酸変化には、L‐アミノ酸の保存的置換だけでなく、対応するD‐アミノ酸による、保存的なD‐アミノ酸による、又は、天然の、遺伝的にコードされていない形式のアミノ酸によるL‐アミノ酸の置換を含み得る。天然の遺伝的にコードされていないアミノ酸は、β-アラニン、3-アミノ-プロピオン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ-酪酸、N-メチルグリシンサルコシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、2-ナプチルアラニン、ピリジルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボキシリキス酸、β-2-チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、N-アセチルリシン、2-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、2,4,-ジアミノ酪酸、p-アミノフェニルアラニン、N-メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、ε-アミノヘキサン酸、δ-アミノ吉草酸、又は、2,3-ジアミノ酪酸を含む。別の実施形態において、保存的なアミノ酸変化は、親水性若しくは疎水性、サイズ若しくは容量、又は、電荷の考慮に基づいた塩基の変化を含む。アミノ酸は、一般に、そのアミノ酸側鎖の性質に主に依存して、疎水性又は親水性として特徴付けられ得る。アイゼンバーグEisenbergらの標準化されたコンセンサス疎水性スケール71に基づいて、疎水性アミノ酸は、ゼロよりも大きな疎水性を示し、そして、親水性アミノ酸はゼロよりも小さな疎水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸はGly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met及びTrpを含み、そして、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸はThr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser及びLysを含む。遺伝的にコードされていない疎水性アミノ酸はt‐ブチルアラニンを含む一方、遺伝的にコードされていない親水性アミノ酸はシトルリン及びホモシステインを含む。疎水性又は親水性アミノ酸は、さらに、その側鎖の特性に基づいて再分割され得る。例えば、芳香族アミノ酸は、少なくとも一つの芳香族又は芳香族複素環を含む一つの側鎖を有する疎水性アミノ酸である但し、該芳香族又は芳香族複素環は、-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、二酸化窒素、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-COR、-COOH、-COOR、-CONH2、-CONHR、-CONRRなどのような1又はそれ以上の置換基を含んでよく、ここで、Rは、独立して、C1-C6アルキル、置換されたC1-C6アルキル、C1-C6アルケニル、置換されたC1-C6アルケニル、C1-C6アルキニル、C1-C6アルキニル、C5-C20アリール、置換されたC5-C20アリール、C6-C26アルカリル、置換されたC6-C26アルカリル、5-20員へテロアリール、置換された5-20員へテロアリール、6-26員アルケテロアリール、又は、置換された6-26員アルケテロアリールである。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸はPhe、Tyr及びTrpを含む一方、遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸はフェニルグリシン、2-ナプチルアラニン、β-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンを含む。無極性アミノ酸は、生理的pHで無荷電であり且つ二つの原子により共有されている電子対が一般的に該二つの原子の各々により等しく保持されている結合複数を有する側鎖即ち該側鎖は極性が無いを伴う疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸はGly、Leu、Val、Ile、Ala及びMetを含む一方、遺伝的にコードされていない無極性アミノ酸はシクロヘキシルアラニンを含む。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸か否かにより、更に再分割され得る。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸はAla、Leu、Val及びIleを含む一方、遺伝的にコードされていない脂肪族アミノ酸はノルロイシンを含む。極性アミノ酸は、生理的pHで無荷電であるが二つの原子により共有されている電子対が該原子の一つによってより接近して保持されている一つの結合を有する側鎖を伴う疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸はSer、Thr、Asn及びGlnを含む一方、遺伝的にコードされていない極性アミノ酸はシトルリン、N‐アセチルリジン及びメチオニンスルホキシドを含む。酸性アミノ酸は、7より低いpKa値の側鎖を伴う親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失のために生理的pHにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、Asp及びGluを含む。塩基性アミノ酸は、7より高いpKa値の側鎖を伴う親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合のため、生理的pHにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸はArg、Lys及びHisを含む一方、遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸は非環状アミノ酸オルニチン、2,3,‐ジアミノプロピオン酸、2,4‐ジアミノ酪酸及びホモアルギニンを含む。上記分類が絶対的なものではなく、一つのアミノ酸が一つ以上のカテゴリーに分類されてもよいことは、当業者に認識されるであろう。さらに、アミノ酸は、特定のアッセイにより又は以前に同定されたアミノ酸との比較により、既知の挙動及び/又は特徴的な化学的、物理的若しくは生物学的性質に基づいて分類され得る。アミノ酸はまた、アミノ酸様側鎖を有する二機能性成分を含み得る。保存的変化はまた、例えば、アミノ酸の機能的側鎖の反応による、非誘導体化残基に対して化学的誘導体化部分の置換を含み得る。それゆえ、これらの置換は、その遊離型freeのアミノ基が、アミン塩酸塩、p‐トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t‐ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又は、ホルミル基へ誘導体化された化合物を含み得る。同様に、遊離freeのカルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル、若しくは、他の型のエステル、又は、ヒドラジドを形成するように誘導体化され得、そして、側鎖は、遊離のヒドロキシル基に対してはO‐アシル若しくはO‐アルキル誘導体を、又は、ヒスチジンのイミダゾール窒素に対してはN‐im‐ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。ペプチド類似体もまた、例えば、メチル化によって、エチルアミン、エタノールアミン若しくはエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるC末端アミノ酸のアミド化、又は、アミノ酸側鎖のアシル化若しくはメチル化リジンのεアミノ基のアシル化のようなによって、化学的に変化させられたアミノ酸を含む。ペプチド類似体は、置換されたアミド例えば、‐CO‐NRの基、ここで、RはC1‐C6アルキル、C1‐C6アルケニル、C1‐C6アルキニル、置換されたC1‐C6アルキル、置換されたC1‐C6アルケニル、又は、置換されたC1‐C6アルキニル、又は、アミド結合のアイソスター例えば、‐CH2NH‐、‐CH2S、‐CH2CH2‐、‐CH=CH‐シス及びトランス、‐COCH2‐、‐CHOHCH2‐、又は、‐CH2SO‐によるペプチド内のアミド結合の置換をも含み得る。前記化合物は、同種重合体又はヘテロ重合体を形成するために、例えば、重合又は抱合によって、共有結合性に結合され得る。スペーサ及びリンカー典型的には、生理的条件下で無電荷なアミノ酸のような中性低分子から構成されるものが、使用され得る。結合は、多数の方法により達成され得る。例えば、システイン残基がペプチド終端に付加され、そして、複数ペプチドが管理された酸化により共有結合され得る。あるいは、ジスルフィド/アミド形成剤、又は、チオエーテル/アミド形成剤のようなヘテロ二機能性薬剤が、使用され得る。前記化合物はまた、もう一つの化合物該もう一つの化合物は、例えば免疫原性応答を調節し得ると結合され得る。前記化合物はまた、例えば、環状部分を有することによって、制約されconstrained得る。ペプチド又はペプチド類似体は、標準的化学技法により、例えば、溶液又は固相合成方法論を用いた自動化合成により、合成し得る。自動化ペプチド合成装置は、商業的に入手可能であり、且つ、当業者によく使用されている。ペプチド及びペプチド類似体はまた、例えば、Sambrookら110又はAusubelら111において記載されているような標準的な技術を用いた組換えDNA技術を用いて調製し得る。通常、候補化合物は、天然物又は合成若しくは半合成抽出物の両者の大規模ライブラリ、或いは、当業者既知の方法に従った化学的ライブラリから同定され得る。創薬及び薬剤開発の分野の専門家には、本発明の前記方法にとって、被検抽出物又は化合物の正確な供給源が重要でないことは理解されるであろう。したがって、実質的に、幾つかの化学的抽出物又は化合物がいくらでも、本書に記載された模範的な方法を用いてスクリーニングされ得る。そのような抽出物又は化合物の例には、植物に、真菌に、原核生物に若しくは動物に基づく抽出物、発酵ブロス、及び、合成化合物、並びに、現存する化合物の修飾を含むがこれらに限定されない。また多数の方法が、多数の化合物糖類、脂質、ペプチド及び核酸に基づく化合物を含むがこれらに限定されないのランダムな又は方向付けられた合成例えば、半合成又は全合成を発生させるのに利用可能である。合成化合物ライブラリは、商業的に入手可能である。或いは、細菌の、真菌の、植物の、及び、動物の抽出物の形の天然化合物ライブラリが、多くの供給源Biotics、Xenova、HarborBranchOceanographicInstitute、及び、PharmaMarマサチューセッツ州、米国を含むから、商業的に入手可能である。さらに、必要に応じて、天然及び合成的に産生された例えば、A/E病原体ポリペプチドのライブラリが、当業者既知の方法、例えば、標準的抽出及び分画法に従い、産生される。なおそのうえ、必要に応じて、任意のライブラリ又は化合物が、標準的な化学的、物理的又は生化学的方法を用いて容易に修飾される。粗製抽出物が病原性を調節することが見出された場合、該陽性リード抽出物の更なる分画が、該観察された効果の原因である化学的成分を単離するのに必要である。そのため、その抽出、分画及び精製プロセスのゴールは、病原性修飾特性を有する前記粗製抽出物内の化学的実体の慎重な特徴付け及び同定である。本書に記載された化合物の混合物における活性検出のための同様のアッセイが、その活性成分の精製及びその誘導体の試験に使用し得る。そのような不均一な抽出物の分画及び精製の方法は、当業者において既知である。必要であらば、処置において有用な薬剤であることが示された化合物は、当業者に知られた方法に従って、化学的に修飾される。治療上の、予防的な、診断の、又は、他の価値のあるものとして同定された化合物は、A/E病原体感染のサイトロバクター若しくはウシのモデル、又は、A/E病原体感染の任意の他の動物モデルを用いて、引き続いて分析されてもよい。ワクチンワクチンは、所望の免疫応答を惹起する物質を含む組成物である。ワクチンは、例えば、A/E病原体又はその成分のような感染性物質の除去を可能にする免疫系のメモリーB及びT細胞を、選択、活性化、又は、拡大してもよい。ある実施形態において、ワクチンは、アジュバントのような好適な担体を含む該アジュバントとは、非特異的様式で特異的抗原又は抗原群に対する免疫応答を増加させる物質であり、任意の所与のワクチン用量における該抗原量の減少、又は、所望の免疫応答を生起させるのに必要とされる用量の頻度の減少を可能とする。所望の免疫応答は、A/E病原体の脱粒感染動物、例えば哺乳動物の糞便における存在又はA/E病原体によるコロニー形成感染動物、例えば哺乳動物の腸における存在に対する完全な又は部分的な防御を含む。例えば、所望の免疫応答は、非ワクチン接種動物と比較した時に、ワクチン接種動物におけるA/E病原体の脱粒又はA/E病原体のコロニー形成に対する防御が、10から100までの間の任意の値、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100を含んでよい。本発明に従ったワクチンは、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、又は、それらの免疫原性断片を含んでもよく、また、当業者に周知の又は本書に記載された投与様式を用いて投与されてよい。本発明の幾つかの実施形態において、前記ワクチンは、生存しているA/E病原体、殺傷されたA/E病原体、又は、それらの成分を含んでもよい。生存しているA/E病原体は、経口ワクチンの形状で投与されてもよいが、該A/E病原体の病原性には影響するがその免疫応答の誘発には影響しない非可逆的遺伝的改変を含んでよい。生ワクチンは、接種された動物、例えば哺乳動物の腸内でコロニー形成可能であってもよい。幾つかの実施形態において、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、又は、それらの免疫原性断片、又は、本書に記載された変異させられた細菌例えば減弱された細菌が、家禽、例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどに、該家禽における免疫応答を惹起例えば抗体産生するように、投与されてもよい。本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子又はそれらの免疫原性断片に対し免疫応答を示すそのような家禽から得られた卵又はその生産物は、動物、例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジなどに、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子又はそれらの免疫原性断片に対し該動物における免疫応答を惹起するように投与されてもよい。家禽における抗体産生方法及びそのような抗体の投与方法は、例えば、1998年5月12日に発行された米国特許5,750,113Cook、2004年5月4日に発行された米国特許6,730,822Ivarieら、及び、本書で引用された出版物113‐117において、記載されている。本発明に従った前記ワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、組換え型又は精製されたEspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀毒素1若しくは2及び/又はイニチミンのような抗原の添加によって更に補充されてもよい。EspA、Tir、EspB、及び、イニチミンのようなEHECO157:H7タンパク質の組換え生産及び使用が、記載されているPCT公報第WO97/40063;PCT公報第WO99/24576;51。細胞培養A/E病原体は、当業者に周知された又は本書に記載された任意の方法に従って、育てられてよい。例えば、A/E病原体は、まず、LuriaBertaniLB培地中で、凡そ8から48時間、又は、凡そ12から24時間増殖させ、それから、凡そ1:5から1:100例えば1:67、又は、凡そ1:5から1:25、又は、凡そ1:10で、20‐100mMNaHCO2若しくはNaHCO3、又は、凡そ30‐50mM若しくは凡そ44mMNaHCO2若しくはNaHCO3;4‐20mMMgSO4若しくは凡そ5‐10mM;又は、凡そ0.8mMから8mMMgSO4、0.1から1.5グルコース、又は、凡そ0.2から1若しくは凡そ0.4グルコース及び0.05から0.5カサミノ酸、又は、凡そ0.07から0.2若しくは凡そ0.1カサミノ酸を添加されたM-9最少培地中に、希釈されてもよい。培養は、一般に、凡そ37°Cで、任意的には2‐10CO2、又は、任意的には5CO2に維持し、凡そ600nmの光学濃度が0.7から0.8まで増殖させる。それから全細胞を適当な手段、例えば、精密濾過法又は遠心分離により除去し、その上清を例えば、100倍のように10‐1000倍又はそれ以上に、透析及び限外濾過などを用いて濃縮する。総タンパク質量は、当業者既知の方法により容易に決定される。細胞培養上清は、野生型又は変異体A/E病原体を含む任意のA/E病原体、例えば本書に記載された又は当業者既知のEHEC、の培養を用いて産生されてよい。一般に、前記A/E病原体は、III型抗原分泌を助ける条件下で、好適な培地中で培養される米国特許第6,136,554及び6,165,74351、74。付加的遺伝子の単離及び同定本書に記載された前記ヌクレオチド及びアミノ酸配列、例えば配列番号1~56又は59~84、に基づいて、付加的遺伝子の単離及び同定が標準的技術を用いて成し得る。任意のA/E病原体が、そのような遺伝子の供給源として役立ち得る。ある実施形態においては、本書に記載された前記核酸配列は、何れかのDNA鎖配列に基づいたプローブ又はプライマー変性オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含むを設計するために用いてもよい。それから、前記プローブ又はプライマーは、標準的増幅法又はハイブリッド形成法を用いて、他のA/E病原体からの遺伝子に対するゲノムの又はcDNAライブラリをスクリーニングするのに用いてもよい。ある実施形態においては、本書に記載された前記アミノ酸配列は、A/E病原体からのポリペプチドのスクリーニングに使用される抗体又はその他の試薬を作成するために使用され得る但し、A/E病原体は、これらの抗体に結合する。ある実施形態においては、結合パートナーは、エピトープ配列例えば、FLAG又は2HAで、本発明の前記ポリペプチド例えば、配列番号22~43、59又は73~84と実質的に同一な配列を標識化しtagging、そして、それを本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む適当なベクターでトランスフェクションすること又は内因性細菌III型の送達の何れかにより宿主細胞に送達し、続いて免疫沈降及びその結合パートナーの同定を行うことによって、同定されてもよい。HeLa細胞が、そのFLAG又は2HA融合を発現する系統で感染させられ、溶解され、そして、抗FLAG又は抗2HA抗体で免疫沈降されてもよい。結合パートナーは、質量分析で同定されてもよい。本発明のポリペプチドが十分量産生されない場合、そのような方法はその結合パートナーを同定するための標識化されたtaggedタンパク質を送達しなくともよい。補完的なアプローチの一部として、本発明の各ポリペプチドは、哺乳類の形質移入ベクター中に、例えば2HA、GFP及び/又はFLAGと融合されてクローン化されてもよい。形質移入後、HeLa細胞は溶解され、そして、標識化されたポリペプチドが免疫沈降されてもよい。前記結合パートナーは、SDSPAGEに続く質量分析によって、同定されてもよい。ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、標識化され、過剰産生され、そして、同定標的化合物を同定及び/又は確認するためのアフィニティーカラム及び免疫沈降に使用されてもよい。FLAG、HA、及び/又は、Hisで標識されたタンパク質は、細胞抽出物から宿主細胞因子を取り出すアフィニティーカラムなどのために使用され得、そして、任意のヒットしたものは、標準的な結合実験、飽和曲線、及び、本書に記載された又は当業者既知の他の方法によって、確証されてよい。ある実施形態において、細菌ツーハイブリッドシステムをタンパク質間相互作用を調べるために使用してもよい。本書に記載された前記核酸配列又はそれと実質的に同一な配列は、ツーハイブリッドシステムのpBTベイトプラスミドにクローン化され得、そして、5x106個の独立クローンである商業的に入手可能なマウス脾臓ライブラリがベイトに対する標的ライブラリとして使用されてよい。可能性のあるヒットしたものについては、偽陽性該偽陽性は、クローンベイト変異体及びレポーター遺伝子をクローンバイトと独立に活性化するライブラリ標的クローンから生じるを減少させるために前記プラスミドを回収し再形質転換することによって更に特徴付けられてよい。再現性のあるヒットしたものは、本書に記載されたように更に調べられてもよい。ある実施形態において、GrlAを発現するA/E病原体系統、例えばクローン化されたGrlAを発現するEHECO157系統は、A/EIII型分泌プロテオームのプロテオミクス解析例えば、その上清の2次元ゲル解析を用いるのために使用されてもよい。さらに、完全A/E病原体例えばEHECアレイは、GrlAによって制御される遺伝子を限定するために使用されてもよい。病原性は、本書に記載された又は当業者に周知されているように調べられてもよい。一旦、コード配列が同定されると、それらは標準的クローニング技術を用いて単離され、そして、任意の適当なベクター又はレプリコン例えばポリペプチド産生のためのに挿入され得る。そのようなベクター及びレプリコンには、バクテリオファージX大腸菌、pBR322大腸菌、pACYC177大腸菌、pKT230グラム陰性細菌、pGVI106グラム陰性細菌、pLAFRlグラム陰性細菌、pME290非大腸菌グラム陰性細菌、pHV14、pBD9バシラス、pIJ61放線菌類、pUC6放線菌類、YIp5酵母類、Ycpl9酵母類、又は、ウシ乳頭腫ウイルス哺乳類細胞が、含まれるがこれらに限定されるものではない。一般的には、本発明の前記ポリペプチドは、適当なベクターにより形質転換又は形質移入された任意の適当な宿主細胞中で、産生されてよい69。前記形質転換又は形質移入の方法及び前記発現媒体の選択は、選択された宿主システムに依存するであろう。広範な種類の発現系が使用されてよく、そして、使用される正確な宿主細胞は本発明に対して決定的なものではない。例えば、本発明に従ったポリペプチドは、原核生物の宿主例えば、大腸菌又は真核生物の宿主例えば、出芽酵母、昆虫細胞例えばSf21細胞、又は、哺乳類細胞例えばNIH3T3、HeLa若しくはCOS細胞において、産生され得る。そのような細胞は、広範囲な供給源例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関ATCC、マナサス、バージニア州から入手可能である。ポリペプチド産生のための細菌発現系には、大腸菌pET発現系Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州及びpGEX発現系ファルマシアを含む。アッセイポリペプチド、核酸分子及び低分子を含む候補化合物は、本書に記載された又は当業者既知の種々の技術を用いて、スクリーニング及び試験され得る。本発明の任意の前記ポリペプチド又は核酸分子の発現量を減少させる化合物は、例えば、A/E病原体感染に対する治療において、有用で有り得る。スクリーニングアッセイは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして本発明に従った任意の適当な核酸断片を用いた標準的ノーザンブロット解析による遺伝子発現測定但し、前記候補化合物存在下での前記遺伝子発現レベルが前記候補化合物非存在下での前記遺伝子発現レベルと比較された場合のによって行われてよい。代わりに、又は、さらに、候補化合物の前記効果は、例えば、免疫沈降又はウエスタンブロット法のアプローチを用いて、前記ポリペプチドの発現又は分泌レベルで判定されてもよい。他のアッセイは、以下の通りに行われてよいIII型分泌の確認、及び、宿主細胞内への転位置translocation候補化合物のどれが分泌に関しTTSSを要求するかを決定するために、各遺伝子又はそれらの一部は、その末端をFLAGに融合させてもよく、そして、WT及びTTSS変異体例えば、本書に記載された又は当業者に周知されているようなWTEHEC及びその同質遺伝子のescNIII型変異体からの上清が収集されてもよい。分泌を決定するための別の方法は、前記変異体系統における分泌産物のロスについての上清検査、又は、前記タンパク質に対する抗体産生及びWTとIII型上清のウエスタン分析、を含む。目的の前記タンパク質がTTSS成分でないことを確認するために、III型誘導条件下で増殖させた前記候補化合物の各々からの上清をIII型分泌について検討してもよい。前記LEETTSSは、二つのクラスのタンパク質を分泌する:トランスロコンEspA、B、及び、D細菌の細胞表面に集合させられている、及び、エフェクター宿主細胞中に直接的に転位置させられている。候補化合物は、それらがエフェクター又は輸送体translocatorsであるか否かを判定するために調べられてもよい。例えば、EHEC又は他のA/E病原体におけるFLAGタグをつけた推定上のエフェクターは、培養HeLa上皮細胞を感染させるために使用され、抗FLAG抗体で染色後に免疫蛍光顕微鏡観察により調べられてもよい。そのような可視化は、通常宿主細胞中への細菌の送達を実証し、そして、しばしば前記エフェクターがその標的としている細胞小器官を指し示す例えば膜へのTir、ゴルジへのNleA。種々の細胞区画に対する抗体は、その局在性を確認するために使用され得る。前記可視化を補完するため、感染させたHeLa細胞は既知の分画方法30を用いてサイトゾル、不溶性、及び、膜画分に分画され、どの細胞画分がエフェクターの標的なのかを限定するために抗FLAG抗体を用いたウエスタン分析を行い得る。対照として、細胞は、TTSS欠損系統において発現されるタグ付加エフェクターで感染させられてもよい。前記膜画分を標的としているのであれば、高濃度の塩又はアルカリ性pHの処理が、それが内在性膜タンパク質であるか否かを決定するのに使用され得る。前記候補化合物が低レベルで発現しており且つ免疫蛍光法による転位置ないし移行translocationの検出が困難な場合、アデニル酸シクラーゼ、その活性化のために哺乳類の細胞質の補助因子を必要とするカルモジュリン酵素87、の遺伝的融合が作成され得る。台形成pedestalformation及び取り込みにおける効果アクチン凝縮condensation及び台形成がA/E病原体の特徴であるとすると、候補化合物は、アクチン蓄積及び台形成について、例えば、培養HeLa上皮細胞において、スクリーニングされ得る。EPEC及びEHEC浸潤invasionは容易に測定されるもう一つの細胞培養表現型であり、そして、培養上皮細胞との相互作用及び宿主細胞骨格を変化させる能力の徴候を与えるIII型変異体は浸潤、Tir及びインチミン欠損系統もまた浸潤しない。種々の候補化合物の浸潤レベルが、wt及びIII型変異体A/E病原体において、例えば、WT及びTTSS変異体EHECをHeLa細胞においてゲンタマイシン保護アッセイprotectionassayを用いて、比較されてもよい。さらに、EPEC及びEHECがIII型依存様式で宿主のPI3キナーゼ活性を抑制することによって培養マクロファージにおける食作用を抑制するので、候補化合物が培養マクロファージの食作用を遮断する能力を試験し得るCelliJMOlivierandBBFinlay2001EnteropathogenicEscherichiacolimediatesantiphagocytosisthroughtheinhibitionofPI3kinasedependentpathwaysEmboJ20124558。もし任意の候補化合物が食作用の抑制をできなくさせるのであれば、PI3キナーゼ抑制について第二のアッセイを行い得る。極性化した上皮性単層polarizedepithelialmonolayersにおける効果接合部の完全性は下痢において鍵となる役割を担う。台形成に加えて、A/E病原体は、極性化した上皮細胞polarizedepithelialmonolayersにおける他のLEEIII型効果、微絨毛の喪失微絨毛消失及び単層貫通transmonolayer電気抵抗の喪失密着結合の測定を含む、を及ぼす。Caco‐2細胞の極性化したヒト腸単層を用いて、高分解能走査型電子顕微鏡観察が、WTA/E病原体例えばWTEHEC、TTSS変異体A/E病原体例えばEHECescN、及び、前記候補化合物の各々で感染させた単層について行われてよい。単層は、種々の時間感染させられ、洗浄され、そして、標準的技術を用いたSEM66で処理され、そして、感染後の極性化したCaco‐2細胞の電気抵抗の喪失についてスクリーニングされ得る。自然免疫及び炎症における効果病原体に共通して急速に出現したテーマは、自然免疫及び炎症反応を抑制するその能力である。そのような効果は、EHEC及びEPECのようなA/E病原体に関して報告されており、そして、これらのアッセイがWT及びTTSS変異体A/E病原体株において候補化合物を試験するために用いられてもよい。例えば、EHECは、HeLa細胞において、NF‐κβの抑制を引き起こし、その結果Il‐8、Il‐6及びIl‐1αのような幾つかのサイトカインの抑制をもたらし80、また、このプロセスは前記LEETTSSを必要とする。候補化合物は、これらの因子の抑制について、例えば、HeLa細胞の感染後に、RT‐PCRリアルタイムPCR及び商業的に利用可能なELISAアッセイのような標準的方法を用いて、アッセイされてよい。局在性情報に基づいた機能研究表現型アッセイに加えて、候補化合物は、宿主細胞における局在に基づいてアッセイされてもよい。例えば、候補化合物がゴルジに局在化されているのであれば、ゴルジの機能に影響するかを判定するためのアッセイ糖鎖形成を検討する生化学的研究及び該候補化合物を発現する酵母における機能的ゴルジアッセイを含むを行い得る。前記候補化合物がミトコンドリアに局在化されているのであれば、アポトーシス及び他のミトコンドリア機能についてのアッセイを利用し得る。前記候補化合物が小胞体に局在化されているのであれば、タンパク合成及び分泌のアッセイを計画し得る。核へのターゲティングが起こているのであれば、転写研究を行ってもよい。病原性における役割競合的指標CIは、微量な病原性因子の役割、並びに、二つの病原性因子が同一の病原性経路に属するかどうかを決定するのに広範に使用されている63。簡潔には、異なる抗生物質耐性で特徴付けられる二つの菌株が、動物に同時感染させられ、適当なインキュベーション時間の後、細菌が回収され、該二つの菌株の比が決定される。値が1は、等しい病原性を示している。同定された化合物が病原性への影響を有しているのであれば、WTに比較されてそのCIが決定されてもよい。CIはまた、前記候補化合物が属する病原性経路がどれかを決定するために使用されてもよい。例えば、CIは、二つの病原性因子の変異体の比較を、WTに対する各々の変異体を比較するのに加えて、行ってもよい。単一の変異体と二重変異体とを比較した場合に、CI比が1は、それらが同じ病原性経路に属していることを示し、一方、1以外の値はそれらが異なる病原性経路にあることを示している。顕微鏡観察の研究顕微鏡観察技術がA/E病原体疾患を特徴付けるために使用されてもよいA/E病変形成を確認するためにrEPECを感染させたウサギからの遠位回腸のパイエル板におけるリンパ濾胞を検討するための透過型電子顕微鏡TEM及び走査型電子顕微鏡SEM63、マウスの絨毛内への送達を示すための共焦点顕微鏡観察、及び、感染マウスにおける疾患プロセスの組織学的解析を含む。これらの技術は、候補化合物を適当な動物モデル、例えば、前記候補配列中に変異を含む種々のサイトロバクター菌株で感染させたマウスにおいて、アッセイするために使用されてよい。各候補化合物についての包括的な研究が、この系で病状悪化又は病状の欠如を追跡するために行われてもよい。さらに、腸の表面におけるこれら変異体のコロニー形成レベルが決定されてもよい。抗生物質で特徴付けられた菌株が、動物を感染させるために使用され、続いて腸の組織が回収されてもよい。組織はホモジナイズされ、細菌は選択プレート上でプレート計数により定量化されてよい。A/E病原体感染、例えばサイトロバクター感染の主要な特徴は、広範な炎症である。細胞の炎症事象は、候補化合物における種々の変異体について、共焦点顕微鏡観察により、追跡されてもよい。組織を抗体又はレクチンで標識した後に共焦点顕微鏡で観察することにより、変異体によって感染部位に集められる前記炎症細胞が、該変異体の親株との比較で明らかにされてもよい。幾つかの生得的応答因子に対する抗体が入手可能であり、そして、生得的応答因子及びマクロファージ、好中球、iNOS産生細胞、樹状細胞などのような細胞を検討して、感染の際の前記変異体の表現型を分析するために用いられてもよい。組織学的研究染色された組織の組織学的研究が行われてもよい。例えば、REPEC及び候補化合物において欠失のある菌株で感染させられたウサギのヘマトキシリン及びエオシン染色の回腸切片は、その炎症及び組織損傷を比較しA/E病原体感染を特徴付けるために調べられてもよい58。同様の染色が、マウスにおいて、候補化合物を欠いたサイトロバクター菌株でなされてもよい。ギムザ及びトルイジンブルーO一般的な形態学のために、過ヨウ素酸シッフ炭水化物を染色し、腸の粘液層及び杯状細胞を調べることが可能、グラム染色、クロロ酢酸エステラーゼ炎症細胞の染色、及び、カスパーゼアッセイアポトーシスのためにを含む、利用可能な幾つかの他の組織学的染色により、サイトロバクター及び同質遺伝子的変異体と関連した炎症を更に規定してよい。細菌及び哺乳動物細胞抗原に対する抗体の利用を、免疫組織化学は許容する。抗体本発明の化合物は、標準的な調製技術45又は当業者既知の技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を調製するのに使用し得る。例えば、本発明のポリペプチドのコード配列は、ウサギの免疫化に必要な程度に精製されてよい。低い親和性又は抗血清の特異性といった潜在的な問題を最小化するために、2又は3のポリペプチドコンストラクトが各タンパク質から産生されてよく、そして、各コンストラクトは少なくとも2羽のウサギに注射される。抗血清は連続した注射により高められてよく、好ましくは、少なくとも3回のブースター注射を含む。最初の免疫化はフロイント完全アジュバントで、そして、引き続く免疫化はフロイント不完全アジュバントで行われてよい。抗体価は、前記精製タンパク質を用いたウエスタンブロット及び免疫沈降解析によりモニターされてよい。免疫血清は、CNBrセファロース結合タンパク質を用いて、アフィニティー精製されてよい。抗血清の特異性は、無関係のタンパク質のパネルを用いて測定されてよい。代わりに、又は、更に、本発明のポリペプチドの相対的に独特な免疫原性領域に対応するペプチドが生成され、そして、導入されたC末端リジンを介して鍵穴カサガイヘモシアニンKLHへ結合されてもよい。これらのペプチドに対する抗血清は、BSAと抱合したペプチドでアフィニティー精製されてよく、そして、特異性は、ELISA及びウエスタンブロットペプチド抱合体を用いウエスタンブロットと免疫沈降によるにより試験される。或いは、本発明の前記ポリペプチドの何れかと特異的に結合する単クローン抗体が、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製される91、90、89、78。一旦産生されたら、単クローン抗体は、特異的認識についてウエスタンブロット又は免疫沈降によりテストされてよい。本発明の前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体は有用で有ると判断される;そのような抗体は、例えば免疫測定法において使用されてよい。或いは、単クローン抗体は、上記の本発明の前記ポリペプチド及びファージディスプレイライブラリ112を用いて調製されてもよい。幾つかの実施形態において、抗体は、高頻度の荷電残基のような判定基準によって、免疫原性が有りそうに思われるポリペプチド断片を用いて産生されてもよい。抗体は、例えば、一つの種からの抗原結合領域及びもう一つの種からのFc部分を含むキメラ抗体を用いることによって、又は、適切な種のハイブリドーマから産生された抗体を用いることによって、有害な宿主免疫応答を最小限にするように仕立てられ得る。幾つかの実施形態において、本書に記載された前記ポリペプチドの何れかに対する抗体は、A/E病原体による感染を治療又は予防するのに使用してもよい。動物モデル化合物は、A/E病原体感染の種々の動物モデルにおいて迅速にスクリーニングされ得る。サイトロバクターマウス感染モデルは天然疾病モデルであり、そして、成体ウシのEHEC脱粒モデルは天然の非疾病運搬モデルウシは病気にならないが、EHECはその常在菌叢の一部ではないである。サイトロバクターモデルについて、変異体は、本書に記載されたようにマウスにおける病原性に関してスクリーニングされ得る。ノックアウトKO/変異体マウスは、感染における候補配列の役割を調べるために使用されてもよい。幾つものKOマウス株が開発されており、それは、iNOS20、T及びB細胞106、Tlr-4の役割の明確化、及び、一定範囲の宿主感受性の確立54、並びに、Nckを含む。ウシのモデルについては、前記EHEC変異体は、一年子のウシにおいてスクリーニングされ得る。例えば、PCT公報第WO02/053181を参照されたい。簡潔には、108CFUの変異体又はWTO157が、経口胃挿管を介してウシに送達される。接種14日後に、糞便の脱粒を選択的プレーティングによりモニターし、そして、コロニーは、mutiplexPCR、脱粒レベル、及び、EHECが集中している肛門周囲の領域の組織学的及び顕微鏡での解析により検証する97。もう一つのモデルは、ウシの腸ループintestinalloopモデルである該モデルにおいては、腸ループにEHECが注入され、そして種々の時点で、組織学的及び顕微鏡的な検討、並びに、プレーティングによる接着性細菌の定量化がなされる。RDEC‐1感染の天然ウサギ感染モデルが以下の通りに行われてよい:オーバーナイトで培養された細菌を遠心分離により収集し、そして、1mlのリン酸緩衝食塩水に再懸濁する。ニュージーランド白色ウサギ体重1.0から1.6kgを一晩囲い込みfasted、それから、5mlの2.5無菌炭酸水素ナトリウムと1mlのRDEC‐1若しくは候補配列変異体菌株2:‐5x1010を口腔胃管orogastrictubesを用いてその胃内に播種する。次の日に各ウサギに同じ用量の細菌を播種する。各々のウサギの体重が毎日量られ、そして細菌の糞便の脱粒が直腸塗布により便ペレットから収集される。直腸塗布を、ナリジクス酸含有マッコンキーMacConkeyプレートの表面の2分の1に渡って転がす。5つの便ペレット又は同量の液体便を各々のウサギから収集し、そして、3mlリン酸緩衝食塩水に再懸濁し、そして各々の便懸濁液0.1mlをナリジクス酸含有マッコンキープレート上にプレーティングする。前記ナリジクス酸耐性コロニーの増殖は以下のようにスコアーリングする:0、無増殖;1、広い間隔のコロニー;2、密接な間隔のコロニー;3、集密的に増殖したコロニー。ケタミンと過量のフェノバルビタールナトリウムの静脈内注射によって絶命させた後、即座に組織を摘出する。腸組織における細菌コロニー形成量は以下の通りにアッセイした:盲腸を除く前記腸のセグメント10cmは、その近位及び遠位末端で二重に結紮され、二重結紮部分の間で切開されdissected、それから、10ml氷冷リン酸緩衝食塩水で流す。盲腸からの粘稠性内容物1グラムに9mlのリン酸緩衝食塩水を加える。得られたリン酸緩衝食塩水懸濁液は、希釈され、そして、ナリジクス酸含有マッコンキープレート上にプレーティングする。組織試料を9mm直径コルク穿孔器を用いて摘出し、リン酸緩衝食塩水で3回洗浄し、2mlの氷冷リン酸緩衝食塩水を、そして、ホモジナイザでホモジナイズし、それから、段階希釈試料をマッコンキープレート上にプレーティングする。平方センチメートル当たりの各組織に接着した細菌の数は以下の通りに計算する:CFU/cm2=前記細菌数/プレート×希釈因子×2ml/‐0.452。治療及び診断本書に記載された前記ポリペプチド及び核酸分子は、例えば、ワクチン若しくは治療用の組成物の調製、又は、病原性が減弱されたA/E病原体の構築のために、治療に使用されてもよい。そのようなA/E病原体は、例えば、本書に記載された核酸配列に基づくプライマーを設計すること、及び、sacB遺伝子に基づく対立形質交換技術29を用いることにより、本書に記載されたように構築されてよい。前記ポリペプチド及び核酸分子は、単独で使用、或いは、互いに、又は、EspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀毒素1、志賀毒素2、又は、インチミン分子のような他の適切な分子と、組み合わせて使用されてもよい。幾つかの実施形態において、本書に記載された前記核酸分子は、アンチセンス技術において使用されてもよい。核酸に関連して本書でアンチセンスという場合、核酸分子、例えば、nleA、nleB、nleC、nleD、nleE又はnleF遺伝子のような遺伝子の有意鎖に相補的な、或いは、配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を意味する。幾つかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、その相補遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベルを、一つの細胞中で両者が発現されている際に、低下させられる核酸分子である。幾つかの実施形態において、前記ポリペプチドレベルは、その相補的アンチセンス核酸分子がなくその遺伝子のみが発現している細胞中の前記ポリペプチドレベルと比較した場合に、少なくとも10から少なくとも25の任意の整数まで、又は、少なくとも25から少なくとも50の任意の整数まで、又は、少なくとも50から少なくとも75の任意の整数まで、又は、少なくとも75から100の任意の整数まで、低下させられる。幾つかの実施形態において、RNA干渉RNAi技術すなわち転写後遺伝子サイレンシング形式を用いて、興味のある遺伝子又は翻訳若しくは非翻訳領域の発現が、抑制又は阻止されてもよい。RNAiは、機能的ノックアウトすなわち興味のある遺伝子又は翻訳若しくは非翻訳領域の発現が減少するようなシステム前記コード産物全体の減少がもたらされるを創生するのに用いられてもよい。そういうものとして、RNAiは、興味のある核酸又はその断片若しくは変異体を標的にし、次に、それがコードする産物の発現及び活性レベルを減少させるために実行されてもよい。そのようなシステムは、前記産物の機能研究だけでなくA/E病原体感染の治療のためにも使用されてよい。RNAiは、例えば、発行された米国特許出願20020173478Gewirtz;2002年11月21日に発行及び20020132788ルイスら;2002年11月7日に発行79、67に記載されている。RNAiを行うための試薬及びキットが、例えば、AmbionIncAustin、テキサス、米国及びNewEnglandBiolabsIncBeverly、マサチューセッツ州、米国からのものが商業的に入手可能である。幾つかのシステムにおけるRNAiのための初期物質は、標的核酸に対応する二本鎖RNAdsRNA分子であると考えられている。前記二本鎖RNAは、そして、21‐23ヌクレオチド長の低分子干渉RNAssiRNAs各々2ヌクレオチドが3’突出した19-21bpの二本鎖へと切断されると考えられている。この最初の切断過程に影響すると考えられている酵素は、Dicerダイサーと呼ばれ、RnaseIIIファミリーの二本鎖RNA特異的RNA分解酵素のRnaseIIIファミリーの一員として分類されている。或いは、RNAiは、細胞内への直接的な導入を介して、又は、そのようなsiRNA若しくはsiRNA様分子の適当な前駆物質例えばベクター等を細胞内に導入することによる細胞内での生成を介して、効果が発揮されてよい。siRNAは、それから、RNA誘導サイレンシング複合体RISCを形成するために他の細胞内成分と会合してもよい。そのようにして形成されたRISCは、引き続いて、そのsiRNA成分と興味のある転写物標的転写物との間の相同性による塩基対形成相互作用を介して、該標的転写物を標的とし、該siRNAの3’末端から凡そ12ヌクレオチドの該標的転写物の切断をもたらす。そうして、前記標的mRNAは切断され、そして、該標的mRNAがコードするタンパク質産物レベルが減少させられる。RNAiは、適切に試験管内合成されたsiRNA又はsiRNA様分子を細胞内に導入することによって、効果が発揮されてよい。RNAiは、例えば、化学的に合成されたRNAを用いて行われてよく64、それに適したRNA分子は既知の方法を用いて化学的に合成されてよい。或いは、適当な発現ベクターがそのようなRNAを試験管内又は生体内で転写させるために使用されてもよい。センス及びアンチセンス鎖同じベクター上又は別のベクター上に存在する配列によりコードされるの試験管内転写は、例えば、T7RNAポリメラーゼを用いて行われてもよく、この場合、該ベクターは適当なコード配列がT7プロモータに作動可能なように連結されたものを含んでよい。前記試験管内転写されたRNAは、具体的には例えば大腸菌RNaseIIIを用いて、RNAiに適したサイズへと試験管内で加工されてもよい。RNA二本鎖該二本鎖は、興味のある標的細胞内に導入されるを形成するために組み合わされてもよい。低分子ヘアピン型RNAsshRNAsを発現する他のベクターが使用されてもよく、shRNAsはsiRNA様分子へと加工され得る。ベクターに基づく多様な方法が当業者に周知されている65、93、95、98、99、105、109。そのようなベクターを試験管内で又は生体内で例えば、遺伝子治療細胞に導入する多様な方法が、当業者に周知されている。したがって、一つの実施形態においては、配列番号22~43の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現が、該ポリペプチド若しくはその断片をコードする核酸分子又はそれらと相同的な核酸分子に対応するsiRNA又はsiRNA様分子を細胞内に導入するか又は細胞内で産生させることによって抑制されてもよい。種々の実施形態において、そのような方法は、細胞内へのsiRNA又はsiRNA様分子の直接投与、或いは上述の前記ベクターに基づく方法の使用を必要としてもよい。一つの実施形態において、前記siRNA又はsiRNA様分子は、凡そ30ヌクレオチド長より短い。一つの更なる実施形態において、前記siRNA又はsiRNA様分子は、凡そ21‐23ヌクレオチド長である。一つの実施形態において、siRNA又はsiRNA様分子は、19‐21bpの二本鎖部分を含み、各鎖は3’突出の2ヌクレオチドを有する。複数の実施形態において、前記siRNA又はsiRNA様分子は、前記ポリペプチド又はその断片若しくは変異体又は変異体の断片をコードする核酸と実質的に同一である。そのような変異体は、配列番号22~43によってコードされるポリペプチドの前記活性を有するタンパク質をコードし得る。複数の実施形態において、前記siRNA又はsiRNA様分子のセンス鎖は、配列番号1~21又はそれらの断片と実質的に同一であるRNAは、そのDNA配列のT残基の代わりにUを有する。幾つかの実施形態において、本発明の前記ポリペプチドに対して産生される抗体は、A/E病原体による感染に対する治療に使用されてもよい。幾つかの実施形態において、本発明の前記ポリペプチド及び核酸分子は、試料中のA/E病原体の存在を検出するのに使用されてもよい。前記核酸分子は、プローブ又はプライマー例えば、試料中のA/E病原体の前記DNAとハイブリッド形成し得るを設計するのに使用されてもよく、又は、試料中のA/E病原体の前記DNAを増幅する例えばポリメラーゼ連鎖反応法を用いてのに使用されてもよい。前記ポリペプチドは、例えば、A/E病原体によって発現されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するのに使用され得る。そのようなプローブ又はプライマー又は抗体は、検出可能な程度に標識されてもよい。検出可能な程度に標識されるとは、分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、遺伝子若しくはその断片、又は、cDNA分子、の存在を、標識して同定するための方法を意味する。検出可能な程度に標識化する分子に関する方法は、当該技術分野で周知されており、放射性標識化例えば32P又は35Sのような同位元素での及び酵素標識化のような非放射性標識化例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを用いて、化学発光標識、蛍光標識例えば、フルオレセンを用いて、生物発光標識、又は、前記プローブ付着したリガンドの抗体検出を含むがこれらに限定されない。間接的方法により検出可能な程度に標識化された分子、例えば、一番目の成分ビオチンなどと結合した分子、該一番目の成分は次に観察又はアッセイされてよい二番目の成分フルオレセン標識ストレプトアビジンなどと結合する、も本定義に含まれる。標識には、ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼ、及び、エクオリンも含む。医薬及び獣医学組成物、薬用量、並びに、投与化合物には、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、並びに、本発明の方法を用いて同定された化合物を含む。本発明に従う化合物は、単独で又は他の化合物例えば、核酸分子、小分子、ポリペプチド、ペプチド又はペプチド類似体と併用して、リポソーム、アジュバント又は任意の医薬的に許容し得る担体の存在下で、哺乳動物例えば、ヒト、ウシ、ヒツジなどへの投与に適した形状で、提供され得る。必要であれば、本発明に従った化合物での治療は、A/E病原体感染の、より伝統的な及び現存する治療と組み合わせてもよい。通常の薬務が、A/E病原体によって感染した対象に前記化合物を投与するのに適した製剤又は組成物を提供するために使用されてよい。任意の適切な投与経路、例えば、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼の、脳室内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル又は経口投与が使用されてよい。製剤は、液体溶液又は懸濁液;錠剤又はカプセル;粉末、点鼻薬又はエアロゾルの形状でよい。製剤を製造するための方法は、当該技術分野で周知されている57。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水若しくは生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜起源の油、又は、水素付加ナフタレンを含んでよい。生体適合性、生分解性ラクチドlactide高分子ラクチド/グリコリドlactideglycolide共重合体、又は、ポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレン共重合体は、前記化合物の徐放性放出のために使用されてよい。調節性化合物のための他の潜在的に有用な非経口的送達系は、エチレン‐ビニル酢酸塩共重合体粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入システム、及び、リポソームを含む。吸入用の製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含んでよく、又は、水溶液例えば、ポリオキシエチレン‐9‐ラウリルエーテル、グリココール酸及びデオキシコール酸を含むであってもよく、点鼻薬の形状で若しくはゲルとして投与されるための油性溶液であってもよい。治療用の又は予防用の組成物のためには、前記化合物は、A/E病原体感染を止めるか遅らせるのに十分な量で個体に投与される。本発明に従った化合物の有効量effectiveamountは、治療的有効量又は予防的有効量を含む。治療的有効量therapeuticallyeffectiveamountとは、A/E病原体によるコロニー形成又はA/E病原体の脱粒の減少のような所望の治療上の効果を達成するために必要な投薬複数及び期間における有効な量を言う。化合物の治療的有効量は、対象の病状、年齢、性及び体重、並びに、対象において所望の応答を惹起させる該化合物の能力のような要因に従って異なってよい。投与計画は、最適な治療上の応答が実現されるように調整されてよい。治療的有効量は、前記化合物の任意の有毒又は有害な効果が、治療的に有利な効果によって上回られるような量でもある。予防的有効量prophylacticallyeffectiveamountとは、A/E病原体によるコロニー形成の阻害のような所望の予防上の効果を達成するために必要な投薬複数及び期間における有効な量を言う。典型的には、予防的投薬は、予防的有効量が治療的有効量より少なくてよいように、疾病の前か又は早い段階で、対象において使用される。化合物の治療的又は予防的効果量の好ましい範囲は、0.1nM‐0.1M、0.1nM‐0.05M、0.05nM‐15μM又は0.01nM‐10μMの任意の数であってよい。薬用量の値は軽減されるべき状態の重症度とともに異なってよいことが、注意されるべきである。任意の特定の対象に対して、特有の投与計画が、個体の必要性及び前記組成物投与を投与又は監督する人の専門的判断に従い、時間経過につれて、調整されてよい。本書で説明される薬用量範囲は、臨床医によって選択されてよい薬用量範囲の模範的なものであってこれを限定するものではない。前記組成物における活性化合物の量は、個体の病状、年齢、性及び体重などの要因に従って異なってよい。投与計画は、最適な治療上の応答を実現するために調整されてよい。例えば、単独の巨丸剤が投与されてよく、幾つかに分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、又は、治療上の状況の緊急性によって示される場合には投与量は比例的に減少又は増加させられてもよい。投与の容易性且つ薬用量の均一性のために、単位用量形式で非経口的組成物を製剤化するのも有利であってよい。ワクチン製剤の場合、有効量の本発明の化合物は、単独で若しくは他の化合物と併用して、免疫応答を誘発する1又はそれ以上の免疫学的アジュバントと共に、提供され得る。本発明に従ったアジュバントは、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジンavridine、水酸化アルミニウムのような水性アジュバント、キトサンベースアジュバント、サポニン、油、アンフィゲンAmphigen登録商標、LPSリポ多糖、細菌細胞壁抽出物、細菌DNA、細菌複合体、合成オリゴヌクレオチド、及び、それらの組み合わせを含んでよい100。前記アジュバントは、マイコバクテリウムphleiM.phlei細胞壁抽出物MCWE米国特許第4,744,984、M.phleiDNAM-DNA、又は、放線菌細胞壁複合体MCCを含んでいてもよい。乳化剤は、天然及び合成の乳化剤を含む。合成乳化剤は、陰イオン性剤例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩、すなわち、金属性セッケン、及び、硫酸ラウリルナトリウムのような有機スルホン酸、陽イオン性剤例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、及び、非イオン性剤例えば、モノステアリン酸グリセリルのようなグリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル及びエーテル、並びに、モノパルミチン酸ソルビタン及びそれらのポリオキシエチレン誘導体例としてモノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンのようなソルビタン脂肪酸エステルを含む。天然乳化剤は、アカシア、ゼラチン、レシチン及びコレステロールを含む。他の好適なアジュバントは、単一の油、油複数の混合物、水中油エマルジョン例えば、EMULSIGEN商標、EMULSIGENPLUS商標又はVSA3、又は、非水中油エマルジョン例えば、油エマルジョン、油中水エマルジョン、又は、水中油中水エマルジョンのような油を含む。前記油は、ミネラルオイル、野菜油、又は、動物油であってよい。好適な動物油は、例えば、タラ肝油、オヒョウ油、ニシンmenhaden油、オレンジラッフィー油、又は、サメ肝油を含むが、これらの全ては商業的に入手可能である。好適な野菜油は、アブラナ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油又はダイズ油を含むがこれらに制限されない。或いは、いくつかの脂肪族窒素性塩基aliphaticnitrogenousbasesの多くがワクチン製剤と共にアジュバントとして使用されてもよい。例えば、既知の免疫原性アジュバントは、アミン、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン及びチオウロニウムを含む75。特異的アジュバント化合物は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドDDA米国特許第5,951,98888、59、85、68、84、82、83、及び、N,N‐ジオクタデシル‐N,N‐ビス2‐ヒドロキシエチルプロパンジアミンアブリジンavridine米国特許第4,310,550、米国特許第5,151,26762を含む。本発明に従うアジュバントは、例えば、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含んでもよい。ワクチン組成物は、標準的技術混合、超音波処理及び微小流動化microfluidationを含むがこれらに限定されないを用いて調製されてよい。前記アジュバントは、前記ワクチンの凡そ10から50v/v、又は凡そ20から40v/v、又は凡そ20から30、又は凡そ35v/v、或いは、これらの範囲内の任意の値で含まれてよい。前記化合物は、免疫原性を高めるために、ウシ血清アルブミン又は鍵穴カサガイヘモシアニンのような担体分子と会合されていてもよい。通常、本発明の化合物は、実質的な毒性を引き起こすこと無しに使用されるべきである。本発明の化合物の毒性は、標準的技術を用いて、例えば、細胞培養又は実験動物において試験し且つ治療係数すなわち、そのLD50その集団の50にとって致死的な用量とそのLD100その集団の100にとって致死的な用量との間の比を決定することにより、判定され得る。しかしながら、幾つかの場合において、重篤な病的状態では、実質的に過剰な前記組成物が投与されてもよい。なお、本発明は、以下の好ましい実施形態を含む。形態1配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。形態2配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。形態3配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。形態4配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む細胞培養上清を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。形態5前記ポリペプチドが、前記組成物中に存在する前記細胞のタンパク質の20を構成することを特徴とする形態4に記載の組成物。形態6さらにEspA、EspB、EspD、EspP、Tir、志賀毒素1、志賀毒素2、又は、インチミンポリペプチドを含むことを特徴とする形態1~5の何れか一項に記載の組成物。形態7さらにアジュバントを含むことを特徴とする形態1~6の何れか一項に記載の組成物。形態8細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、配列番号1~21又は60~72と実質的に同一なヌクレオチド配列の該細菌ゲノムにおける変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。形態9細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、nleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG若しくはnleH、又は、それらの相同体と実質的に同一な遺伝子における変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。形態10前記細菌が、A/E病原体であることを特徴とする形態8又は9に記載の細菌。形態11前記細菌が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又は、サイトロバクターローデンティウムであることを特徴とする形態8~10の何れか一項に記載の細菌。形態12前記EHECが、EHECO157:H7、又は、EHECO157:NMであることを特徴とする形態11に記載の細菌。形態13前記EPECが、EPECO127:H6であることを特徴とする形態11に記載の細菌。形態14前記変異が、病原性を減弱させることを特徴とする形態8~13の何れか一項に記載の細菌。形態15形態8~14の何れか一項に記載の前記細菌を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。形態16前記細菌が生きていることを特徴とする形態15に記載の組成物。形態17前記細菌が経口投与されることを特徴とする形態16に記載の組成物。形態18前記細菌が死滅していることを特徴とする形態15に記載の組成物。形態19前記細菌が非経口投与されることを特徴とする形態18に記載の組成物。形態20さらにアジュバントを含むことを特徴とする形態15~19の何れか一項に記載の組成物。形態21前記アジュバントが、水中油型エマルジョン、又は、非水中油型エマルジョンであることを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態22前記アジュバントが、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態23前記アジュバントが、乳化剤、ムラミルジペプチド、水性剤、キトサンベース剤、サポニン、油、リポ多糖LPS、細菌細胞壁抽出物、細菌DNA、細菌複合体、合成オリゴヌクレオチド、及び、脂肪族窒素性塩基aliphaticnitrogenousbaseから成る群より選択される1又はそれ以上の薬剤を含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態24前記乳化剤が、1又はそれ以上の天然乳化剤、合成乳化剤、陰イオン性乳化剤、陽イオン性乳化剤、及び非イオン性剤から成る群より選択されることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態25前記天然乳化剤が、1又はそれ以上のアカシア、ゼラチン、レシチン、及び、コレステロールから成る群より選択されることを特徴とする形態24に記載の組成物。形態26前記陰イオン性乳化剤が、ラウリン酸のカリウム塩、オレイン酸のカリウム塩、ラウリン酸のナトリウム塩、オレイン酸のナトリウム塩、ラウリン酸のアンモニウム塩、オレイン酸のアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のアルミニウム塩、金属性セッケン、及び、有機スルホン酸塩から成る群の1又はそれ以上より選択されることを特徴とする形態24に記載の組成物。形態27前記有機スルホン酸塩が、硫酸ラウリルナトリウムであることを特徴とする形態26に記載の組成物。形態28前記陽イオン性乳化剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする形態24に記載の組成物。形態29前記合成乳化剤が、1又はそれ以上のグリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル、ポリオキシエチレングリコールエーテル、及びソルビタン脂肪酸エステルから成る群より選択されることを特徴とする形態24に記載の組成物。形態30前記グリセリルエステルが、モノステアリン酸グリセリルであることを特徴とする形態28に記載の組成物。形態31前記ソルビタン脂肪酸エステルが、モノパルミチン酸ソルビタン、及び、それらのポリオキシエチレン誘導体から成る群の1又はそれ以上より選択されることを特徴とする形態28に記載の組成物。形態32前記ポリオキシエチレン誘導体が、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンであることを特徴とする形態31に記載の組成物。形態33前記水性剤が、水酸化アルミニウムであることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態34前記油が、1又はそれ以上のミネラルオイル、野菜油、及び動物油から成る群より選択されることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態35前記野菜油が、1又はそれ以上のアブラナ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、及びダイズ油から成る群より選択されることを特徴とする形態34に記載の組成物。形態36前記動物油が、1又はそれ以上のタラ肝油、オヒョウ油、ニシンmenhaden油、オレンジラッフィー油、及びサメ肝油から成る群より選択されることを特徴とする形態34に記載の組成物。形態37前記アジュバントが、油成分を含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態38前記油成分が、1又はそれ以上の単一の油、及び油複数の混合物から成る群より選択されることを特徴とする形態37に記載の組成物。形態39前記非水中油型エマルジョンが、1又はそれ以上の油エマルジョン、油中水型エマルジョン、及び水中油中水型エマルジョンから成る群より選択されることを特徴とする形態21に記載の組成物。形態40前記水中油型エマルジョンが、EMULSIGEN商標、又はEMULSIGENPLUS商標であることを特徴とする形態21に記載の組成物。形態41前記油が、アンフィゲンAmphigen登録商標であることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態42前記アジュバントが、放線菌の細胞壁抽出物を含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態43前記アジュバントが、放線菌のDNAを含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態44前記アジュバントが、放線菌の細胞壁複合体を含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態45前記脂肪族窒素性塩基aliphaticnitrogenousbasesが、1又はそれ以上の、アミン、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン、及び、チオウロニウムから成る群より選択されることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態46前記脂肪族窒素性塩基が、N,N‐ジオクタデシル‐N,N‐ビス2‐ヒドロキシエチルプロパンジアミンであることを特徴とする形態23に記載の組成物。形態47前記アジュバントが、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする形態7又は20に記載の組成物。形態48前記アジュバントが、20から40v/vの濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする形態21~47の何れか一項に記載の組成物。形態49試料中のA/E病原体の存在を検出する方法であって、a試料を用意し、そして、b配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の1又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子の存在を検出するか、又は、c配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の1又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出するか、又は、d配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の1又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を検出することを含み、該核酸分子又は該ポリペプチドの存在が、該試料中におけるA/E病原体の存在を示すことを特徴とする方法。形態50前記試料が、糞便又は血液であることを特徴とする形態49に記載の方法。形態51前記検出が、a配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群から選択されるヌクレオチド配列、或いは、b配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と実質的に同一なプローブ又はプライマーと、前記ヌクレオチド配列との接触を含むことを特徴とする形態49又は50に記載の方法。形態52前記検出が、前記アミノ酸配列と、配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群より選択される配列と特異的に結合する抗体との接触を含むことを特徴とする形態49又は50に記載の方法。形態53A/E病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を動物において惹起する方法であって、形態1~7又は15~48の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態8~14の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物に免疫応答を惹起させることを特徴とする方法。形態54動物において、A/E病原体のコロニー形成colonizationを減少させる方法であって、形態1~7又は15~48の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態8‐14の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるA/E病原体のコロニー形成を減少させることを特徴とする方法。形態55動物において、A/E病原体の脱粒sheddingを減少させる方法であって、形態1~7又は15~48の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態8‐14の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるA/E病原体の脱粒を減少させることを特徴とする方法。形態56前記動物が、反芻動物であることを特徴とする形態53~55の何れか一項に記載の方法。形態57前記反芻動物が、ウシ又はヒツジ被検体であることを特徴とする形態56に記載の方法。形態58前記動物が、ヒトであることを特徴とする形態53~55の何れか一項に記載の方法。形態59A/E病原体による感染を治療又は予防する方法であって、aA/E病原体感染を有するか、又はそのリスクのある哺乳動物を同定すること;及び、b該哺乳動物に有効量の該A/E病原体病原性を減少させる化合物を投与すること但し、該化合物は、配列番号22~43、59若しくは73~84の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現、分泌又は生物学的活性を抑制するを含む方法。形態60前記化合物が、配列番号1~21、59若しくは73~84の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス核酸分子であることを特徴とする形態59に記載の方法。形態61前記化合物が、siRNAであることを特徴とする形態59に記載の方法。形態62A/E病原体の病原性を減少させる方法であって、A/E病原体におけるnleA、nleB、nleC、nleD、nleE、nleF、nleG及びnleHから成る群より選択される遺伝子又はそれらの相同体遺伝子の1又はそれ以上を変異させるか、或いは、A/E病原体のゲノムのヌクレオチド配列但し、該ヌクレオチド配列は配列番号1‐21又は60‐72から選択されるの1又はそれ以上を変異させることを含み、それによって病原性を減少させることを特徴とする方法。形態63A/E病原体の病原性を減少させる化合物のスクリーニング方法であって、a以下のi~iiiの何れかを含むシステム系を用意すること:i配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子ii配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子iii配列番号22~43、59若しくは73~84又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドb被検化合物を用意すること;並びに、c該被検化合物が、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌、又は、生物学的活性を調節するか否かを決定すること但し、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌又は生物学的活性における変化は、前記A/E病原体の病原性を減少させる化合物を示すを含むことを特徴とする方法。形態64前記システムが、細胞であることを特徴とする形態63に記載の方法。形態65前記細胞が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又は、サイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumであることを特徴とする形態63又は64に記載の方法。形態66前記システムが、試験管内のシステムであることを特徴とする形態63に記載の方法。形態67A/E病原体ポリペプチドを産生する方法であって、a以下のi又はiiを含む組換え細胞を用意すること、並びに、i配列番号1~21又は60~72と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子ii配列番号22~43、59又は73~84と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子b該ポリペプチドの分泌が許容される条件下で該組換え細胞を増殖させることを含むことを特徴とする方法。形態68前記ポリペプチドの分泌が許容される条件下で前記組換え型細胞を増殖させることを更に含むことを特徴とする形態67に記載の方法。形態69前記ポリペプチドが前記細胞から分泌されることを特徴とする形態67又は68に記載の方法。形態70前記ポリペプチドの単離を更に含むことを特徴とする形態67~69の何れか一項に記載の方法。形態71前記A/E病原体が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又は、サイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumであることを特徴とする形態49~70の何れか一項に記載の方法。形態72前記EHECが、EHECO157:H7、又は、EHECO157:NMであることを特徴とする形態71に記載の方法。形態73前記EPECが、EPECO127:H6であることを特徴とする形態71に記載の方法。形態74配列番号22~43、59又は73~84の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む組換え型ポリペプチド。形態75配列番号1~21又は60~72の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。形態76形態75に記載の前記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。形態77前記ベクターが、A/E病原体のゲノム中に組み込み可能であることを特徴とする形態76に記載のベクター。形態78前記ベクターが、A/E病原体のゲノム中に組み込み不能であることを特徴とする形態76に記載のベクター。形態79形態76~78の何れか一項に記載の前記ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。形態80前記宿主細胞が、A/E病原体であることを特徴とする形態79に記載の宿主細胞。形態81前記A/E病原体が、腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又は、サイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumであることを特徴とする形態80に記載の宿主細胞。形態82A/E病原体若しくはその成分に対する免疫応答を惹起するための、又は、動物におけるA/E病原体の脱粒若しくはコロニー形成を減少させるための、又は、A/E病原体による感染を治療若しくは予防するための、薬物調製における、形態1~7若しくは15~48の何れか一項に記載の前記組成物、形態8~14の何れか一項に記載の前記細菌、形態74に記載の前記ポリペプチド、又は、形態75に記載の前記核酸分子の使用。形態83試料中のA/E病原体を検出する試薬、及び試料中の該A/E病原体の検出に関する使用説明の添付文書と、を含むキット。形態84前記試薬が、a配列番号1~21若しくは60~72又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群より選択されるヌクレオチド配列、或いは、b配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と実質的に同一なプローブ又はプライマーを含むことを特徴とする形態83に記載のキット。形態85前記試薬が、配列番号22~43、59、73~84又はそれらの断片若しくは変異体の1又はそれ以上から成る群より選択される配列に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする形態83に記載のキット。形態101目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、a組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌を提供すること、b組換えOrf11/GrlA核酸分子によってコードされた組換えOrf11/GrlAポリペプチドを発現すること、c目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でA/E病原菌を成長させて、組換えOrf11/GrlA核酸分子を含まないA/E病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、を含む方法。形態102前記目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件が、III型抗原の分泌に好ましい条件であることを特徴とする形態101に記載の方法。形態103前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、20-100mMのNaHCO3が添加された最小培地を含む細胞培養倍地中でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする形態102に記載の方法。形態104前記最小培地に、5-10mMのMgSO4、0.1-1.5のグルコース及び0.05から0.5カサミノ酸がさらに添加されていることを特徴とする形態102に記載の方法。形態105前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、2-10のCO2の存在中における、37°Cの温度でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする形態102に記載の方法。形態106前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、600nmで0.7-0.8の吸光度ODまでA/E病原菌を培養することを含む形態102に記載の方法。形態107前記III型抗原の分泌に好ましい条件が、20-100mMのNaHCO3、5-10mMのMgSO4、0.1-1.5のグルコース及び0.05-0.5のカザミノ酸が添加された最小培地を含む細胞培養培地中でのA/E病原菌の培養を含むことを特徴とする形態102に記載の方法。形態108組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌の細胞培養上清を単離することをさらに含む形態101~107のいずれか一項に記載の方法。形態109組換えOrf11/GrlA核酸分子が、異種の又は非相同のものheterologousであることを特徴とする形態101~108のいずれか一項に記載の方法。形態110組換えOrf11/GrlA核酸分子が、異種の又は非相同のものでないことを特徴とする形態101~108のいずれか一項に記載の方法。形態111前記組換えOrf11/GrlA核酸分子が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumに由来することを特徴とする形態101~110のいずれか一項に記載の方法。形態112組換えOrf11/GrlA核酸分子が、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号85にハイブリダイズすることを特徴とする形態101~110に記載の方法。形態113前記組換えOrf11/GrlAポリペプチドが、配列番号86であるか、又は、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号86にハイブリダイズする核酸分子によってコードされていることを特徴とする形態101~110に記載の方法。形態114前記組換えOrf11/GrlAポリペプチドが、0.5MNaHPO4、pH7.2、7SDS、1mMEDTA及び1BSAフラクションVを含む緩衝液中で温度65°Cで、又は、48ホルムアミド、4.8xSSC、0.2MTris-Cl、pH7.6、1xデンハート液、10デキストラン硫酸及び0.1SDSを緩衝液中で温度42°Cで、配列番号56をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされることを特徴とする形態101~110に記載の方法。形態115前記目的のポリペプチドが分泌ポリペプチドであることを特徴とする形態101~114のいずれか一項に記載の方法。形態116前記目的のポリペプチドがIII型抗原であることを特徴とする形態101~114のいずれか一項に記載の方法。形態117目的のポリペプチドが、配列番号24~43、73~75を含むポリペプチド、Tir、EspA、EspB、EspD、EspF、EspG、EspH、及び、Mapポリペプチドを含む群から1つ以上選択されることを特徴とする形態101~114のいずれか一項に記載の方法。形態118A/E病原菌が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC、又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentium細胞であることを特徴とする形態101~117のいずれか一項に記載の方法。形態119組換えOrf11/GrlA核酸分子を含むA/E病原菌。形態120前記A/E病原菌が腸管出血性大腸菌EHEC、腸管病原性大腸菌EPEC又はサイトロバクターローデンティウムCitrobacterrodentiumであることを特徴とする形態119に記載のA/E病原菌。形態121目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、a組換えOrf11/GrlA核酸分子をA/E病原菌に導入すること、b組換えOrf11/GrlA核酸分子によってコードされる組換えOrf11/GrlAポリペプチドを発現すること、c目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でA/E病原菌を成長させて、組換えOrf11/GrlA核酸分子を含まないA/E病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、を含む方法。以下の実施例は本発明の実施形態を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。[実施例1]変異体の作製用いた細菌の菌株は以下のとおりである:EHECO157:H7株86//2432、EHECEDL933野生型大腸菌O127:H7単離株;3;EHECescN-47、野生型EPECE2348/69野生型大腸菌O127:H6単離株;50、サイトロバクターローデンティウムCrodentiumDBS100ATCC51459;53、REPEC0103:K-:H285/15052、大腸菌HB101。用いたプラスミドは以下のとおりである:PCR及びインバースPCRを行うために、校正ELONGASE増幅システムを日常的に用いてPCRによる誤差を最小限にした。PCR産物は、インビトロジェンのTOPOTAクローニングキットを用い、pCR2.1-TOPO又はpCRII-TOPOの何れかにクローン化した。DNAの塩基配列は、Taqダイターミネータ法と自動化373ADNAシークエンサーアプライドバイオシステムズを用いて決定した。日常的なクローニング、形質転換、及び感染操作を行うために、細菌は、適当な抗生物質を添加したLB寒天培地、又はLBブロス液体培地にて37°Cで生育させた。種々の抗生物質を以下の濃度で使用した、アンピシリン100μg/ml、カルベニシリン100μg/ml、カナマイシン50μg/ml、及びクロラムフェニコール30μg/ml。LEE遺伝子発現及びIII型タンパク質分泌は、ダルベッコ変法イーグル培地DMEMにて生育させて行った。sacB遺伝子に基づく対立遺伝子変換14及びラムダRed組換え酵素系を用いて変異体を作製した。通常、それぞれの遺伝子の内部配列の75以上を欠失させて当該遺伝子の機能を確実に破壊した。ler遺伝子はラムダRed組換え酵素系により、また、ler、orf11/grlA及びcesT遺伝子はsacB遺伝子に基づく対立遺伝子変換法により変異を導入した。ler/orf11二重変異体もまたsacBに基づく方法で作製した。tir及びescD変異体の作製についてはすでに報告した20、56。これらの変異体はインフレームの欠失変異体であり、NheI、BamHI又はSalIの何れかの制限酵素切断部位が以下の欠失部位に導入されたものである。これらの変異体は複数のPCR反応により検証された。Δtir、Δler及びΔorf11変異体は、それぞれの遺伝子をプラスミドで供給することにより相補性試験を行った。これらすべての変異体は補完され、両方の対立遺伝子変換法で作製された変異体は下流の遺伝子機能に影響を及ぼさず、従って非極性であることが確認された。EHEC-pNleA-HAを作製するため、nleA遺伝子を校正ELONGASE増幅システムインビトロジェン及び以下のプライマーを用いて増幅した:Z6024F:5AGATCTGAAGGAGATATTATGAACATTCAACCGACCATAC配列番号44;Z6024R:5CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG配列番号45PCR産物は、TOPOTAクローニングキットインビトロジェンを用いてクローン化し、DNA塩基配列はTaqダイターミネータ法と自動化373ADNAシークエンサーアプライドバイオシステムズを用いて検証した。該産物は、次に、サイトロバクターローデンティウムEspGプロモータからタンパク発現を駆動するように操作され、発現されたタンパク質のC末端にインフルエンザヘマグルチニンHAを付加したpACYC由来のプラスミドpCRespG-2HA/BglIIにサブクローン化した。このプラスミド構築物は、続いてエレクトロポレーション法により野生型EHEC及びEHECescN-に導入した。EHECのナリジキシン酸耐性株におけるnleA遺伝子の欠失変異体は、sacB遺伝子に基づく対立遺伝子変換法により作製した29。nleA遺伝子に隣接する2つのDNA断片を、EHEC染色体DNAを鋳型として用い、PCRにより増幅した。断片Aは、プライマーNT10:5CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG配列番号46と、プライマーNT11:5AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC配列番号47とを用いてPCR増幅し、1.3kbの産物を産生した。断片Bは、プライマーNT12:5AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG配列番号48と、プライマーNT13:5CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC配列番号49とを用いてPCR増幅し、1.3kbの産物を産生した。断片A及びBは続いてPstIにより1時間消化し、その後酵素を65°Cで20分間熱不活化した。各消化断片およそ50ngをT4DNAリガーゼにより室温で1時間連結した。連結反応液を1/10に希釈し、その1μlを、プライマーNT10とNT13とを用いるPCRに添加した。生じた2.3kbのPCR産物は続いてSacIとKpnIで消化し、pRE11214の対応部位と連結し、DH5αλpirに形質転換してpNT225を作製した。pNT225は、野生型EHECとの接合においてドナー株として働く接合性株SM10λpirに形質転換した。ナリジキシン酸及びクロラムフェニコール耐性エキソ接合体は、LB寒天培地で選択した。続いてこのエキソ接合体を5w/vスクロースを含み、且つNaClを含まないLB寒天培地にプレーティングした。生じたコロニーはクロラムフェニコールに対する感受性によりスクリーニングし、続いてPCRによりnleA遺伝子を欠失し、プラスミド配列を失った単離物を同定した。nleA遺伝子を欠失した1つの変異体を単離し、以下の実験に使用した。サイトロバクターローデンティウムのnleA欠失変異体は、PCRによりnleA遺伝子の内部欠失を有する自殺ベクターを、pRE11814を用いて作製することにより生成した。以下のプライマーを用いた:del1F5GGTACCACCACACAGAATAATCdel1R5CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTTdel2F5GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGGdel2R5GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT。作製したプラスミドはエレクトロポレーション法によりサイトロバクターローデンティウムへ導入し、抗生物質耐性部分二倍体株を創生した。第二の組み換え段階においてプラスミド配列を失った変異体株は上述した方法により選択した。抗生物質感受性、且つスクロース耐性コロニーは、欠失領域に隣接するプライマーを用いたPCRにより適切な組み換えが起こっていることを検証した。NleAタンパク質が存在しないことを、ポリクローナル抗NleA抗血清を用いた細胞全体ライセート溶菌液のウェスタンブロッティングにより確認した。総タンパク質及び分泌タンパク質の解析/プロテオミクス分泌タンパク質は既述のようにして調製した51。C.ローデンティウム株は、4mlのルリアブロスLBの入ったシェーカー中で37°Cにて一晩増殖させた。培養液は1/50に希釈して、組織培養インキュベーター5CO2で一晩あらかじめ保温しておいた4mlのダルベッコ変法イーグル培地DMEMに継代し、同じインキュベーター内で6時間静置して生育させ、LEE遺伝子の発現を誘導した。培養液は、13000rpmで10分間の遠心分離を2回行って細菌を除去した。培地中に分泌されたタンパク質を濃縮するために、上清を10トリクロロ酢酸TCAで沈殿させた。細菌のペレットは2倍濃度のSDS-PAGE用緩衝液に溶解し、総細菌タンパク質と名づけた。上清から沈殿させた分泌タンパク質もまた2倍濃度のSDS-PAGE用緩衝液に溶解し、残存TCAを1μlの飽和Tris溶液を用いて中和した。細菌ペレット及び分泌タンパク質を再懸濁するために用いた緩衝液の容量は培養液の濁度について標準化し、試料負荷量を均一にした。分泌タンパク質は、12又は17SDS-PAGEで分析し、0.1クーマシーブルーG250で染色した。ウェスタンブロット解析は、総タンパク質又は分泌タンパク質を10SDS-PAGEで分離した後、ニトロセルロース膜バイオラッド上に移行させた。抗体は、ヒスチジンタグを付加したサイトロバクターTirに対するラットのポリクローナル抗体、及びEPECEspBに対するマウスのモノクローナル抗体を用い、標準的なECLウェスタンブロッティングプロトコルアマシャムライフサイエンスに従った。野生型EHEC及びEHECCVD451は、LB培養液中にて一晩生育させた。続いて培養液を、44mMのNaHCO3、8mMのMgSO4、0.4グルコース及び0.1カザミノ酸を含むM-9最小培地で100倍に希釈し、37°C、5炭酸ガス中にて静置してOD600が0.6から0.8になるまで増殖させた。分泌タンパク質は、培養液を8000gで30分間遠心分離して回収し、ペレットから上清を分離した。上清は、0.45ミクロンのフィルターを通してろ過し、タンパク質濃度をBCAアッセイ法シグマ社にて決定した。電気泳動用のタンパク質は1/9容量の100TCAを加えて、氷上、45~120分間沈殿させ、続いて17600gで30分間遠心分離することにより調製した。沈殿は100冷アセトンでリンスし、1×レムリー緩衝液一次元SDS-PAGEゲル又は二次元ゲルのための2Dサンプルバッファー8M尿素、2Mチオウレア、4CHAPS、20mMトリス、0.002ブロモフェノールブルーに溶解した。二次元ゲルのためには、DTTを6mg/ml、サンプル負荷前にIPGバッファーpH3~10、アマシャムバイオサイエンスを0.5添加した。18cmのイモービラインドライストリップpH3~10、アマシャムバイオサイエンスは、サンプル中で20°C、一晩再水和された。その後、サンプルは15°Cにて65000Vh泳動フォーカスした。泳動後、ストリップ条片を10mg/mlのDTTを添加したEB中、15分間平衡化し、続いて25mg/mlヨードアセタミドで15分間平衡化したEBは、50mMのTris、6M尿素、30グリセリン、2SDS、pH8.8である。平衡化したストリップを、0.002ブロモフェノールブルーを添加したSDS-PAGE泳動バッファーで調製した0.5アガローズを用いて大型SDS-PAGEゲル12又は14アクリルアミドの上に封着し、色素の先端がゲルを流れきるまで泳動した。ゲルはSyproRubyを用いて使用説明書BioRadに従って染色し、紫外線ライトボックス上で、又はナノフロー液体クロマトグラフィーシステムを備えたLCQDecaイオントラップ質量分析計によるMS/MSにより視覚化した。紫外線ライトボックス上で視覚化されたゲルに対して、目的のスポットを手動で切り取った。タンパク質のゲル内消化は、InvestigatorProGestロボットにより記述された方法23で実施した。高濃度でタンパク質が存在するサンプルは、FAMOSオートサンプラーを備えたナノフロー液体クロマトグラフィーシステム及びLCQDecaイオントラップ質量分析計24からなるLC-MSシステムにより分析した。逆相PicoFritカラムPFC7515PP185は、ペプチド分離のために使用し、カラムからの溶出液を直接質量分析装置に噴霧注入した。200nL/分の流速で、総データ採取時間はサンプル当たりほぼ45分であった。低濃度でタンパク質が存在するサンプルは、ナノスプレーイオン源を備えたAPIQSTARPulsarハイブリッドMS/MS質量分析計アプライドバイオシステムズ/MDSSCIEX、コンコード、カナダ12で分析した。分析に先立って、サンプルはZipTipsミリポア、ビルリカ、MAで精製及び濃縮した。このAPIQSTARPulsarは、デノボペプチドシーケンシングにも用いた。測定されたスペクトルは、Mascot又はSonar検索エンジンを用いてNCBIデータベースに対して検索を行った。cat転写融合体の構築とCATアッセイサイトロバクターler遺伝子LEE1及びtir遺伝子LEE5のプロモーター及び全ての上流制御要素を有するPCR断片は、BamHI及びHindIIIで消化され、プロモーターを持たないcat遺伝子を含むプラスミドpKK232-8にクローン化された。クローン化された断片にわたる位置はここに示される。異なるサイトロバクター株におけるこれらの融合物によって示されるCAT活性は、既述の方法21、22により決定した。サンプルは、上述したようにDMEM中で増殖する細菌培養液から異なる時刻に回収した。配列解析とバイオインフォマティクス手段DNA及びタンパク質の配列解析、並びにBLASTN、TBLASTN及びBLASTPによる相同性検索は、NCBIウェブサイトから入手可能なプログラムを用いて行った。使用したデータベースは、NCBIサイト、サンガーゲノムセンター、及びSwissProtからのものを含む。LEEPAI及びEHECゲノム中のプロファージの位置は、IslandPathプログラム13によって作成されたデータより入手した。サザンブロット解析サザンブロット解析のためのゲノムDNAサンプルは、DNeasyTissueキットキアゲン社を用いて調製した。プローブは、pNleA-HAをSalIとBglII酵素で消化することにより500塩基対の断片を取得し、BrightStarPsoralenBiotinNonisotopicLabelingKitを用いて標識した。それぞれ5μgのゲノムDNAサンプルは、25ユニットのBamHI、EcoRI、及びPstIで一晩消化した。このサンプルを1アガロースゲル電気泳動により分離し、受動的なわずかにアルカリ性の下方溶出流によってBrightStarPlusナイロン膜アンビオン社に一晩移行させた。DNAは、当該膜を紫外線に2分間露光し、続いて80°Cでベーキングすることにより膜に架橋した。膜は、10mlのULTRAhybUltrasensitiveHybridizationBuffer中で42°C、30分間洗浄してプレハイブリダイズした。続いて、上記で調製したプローブ10μlを同バッファー中のプレハイブリダイゼーション膜に添加し、プローブと膜とを42°Cで一晩ハイブリダイズさせた。膜は室温にて、厳密性の低い洗浄バッファーアンビオン中で5分間2回洗浄し、厳密性の高い洗浄バッファーアンビオン中で15分間2回洗浄した。ハイブリダイズしたプローブは、BrightStarBioDetectNonisotopicDetectionKitとコダックフィルムへの露光により検出した。抗NleA抗血清の調製nleA遺伝子のコード部分は、EHECゲノムDNAから増幅し、ヒスチジンタグ付き発現ベクターpET28a、ノバジェンにクローン化した。用いたプライマーは次のとおりである:5TTCCATATGAACATTCAACCGACC配列番号54及び5GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC配列番号54。このプラスミドBL21λDE3に導入し、吸光度A600が0.8まで生育させ、0.5mMIPTGを添加して20°Cにて16時間発現を誘導した。ヒスチジンタグ付加タンパク質は、Ni-NTAカラムにより取扱説明書に従って精製した。NleAタンパク質を含有する画分をプールし、トロンビンを添加し500:1、そしてタンパク質を20mMトリスpH8.2、50mMのNaClに対して一晩透析した。次の日、タンパク質をモノQFPLCカラムに負荷し、カラムを50~500mMのNaClの直線的な濃度勾配で展開した。NleAタンパク質を含有する画分をプールした。この段階の後、タンパク質は90以上の純度であった。精製したタンパク質により、2匹のSDラットを一匹当たり300μgのタンパク質とフロイントの完全アジュバントシグマ社を用いて免疫し、生成した抗血清を、活性化した免疫担体Affi-Gel15を用いて取扱説明書バイオラッドに従ってアフィニティー精製した。免疫蛍光実験のため、抗血清はHeLa細胞及びEHEC.NleAから調製したアセトンパウダーへの吸着により、45に記載されたようにさらに精製した。抗血清の特異性は、野生型EHEC及びEHEC.NleAからの細胞抽出液のウェスタンブロットにより確認した。イムノブロット解析ウェスタンブロット解析のためのサンプルは、SDS-PAGE9~12ポリアクリルアミドで分離した。タンパク質をニトロセルロースへ移行させ、イムノブロットを、0.1ツイーン20と5脱脂乾燥乳NFDMを含むTBSバッファー、pH7.2TBSTで4°Cにて一晩ブロックした。そしてその後、1NFDMを含むTBST中、室温にて1時間、第一抗体とインキュベートした。膜をTBSTで6回洗浄した後、1:5000に希釈したワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスHL抗体と共に、室温で1時間インキュベートした。膜はその後上述したように洗浄した。抗原-抗体複合体は、活性化化学発光検出キットenhancedchemiluminescencedetectionkitアマシャムを用い、続いてコダックフィルムパーキンエルマーに露光することによって視覚化した。以下の第一抗体を用いた:抗HA.11Covance、抗DnaKStressgen、抗EHECTir、抗NleA本研究、抗カルネキシンStressgen、抗カルレティキュリンアフィニティーバイオリージェンツ、抗チューブリンシグマ。免疫蛍光法HeLa細胞を24ウェル組織培養プレートにてカバーガラス上で生育させ、OD約0.4の一晩静置培養液EHEC1μlで6時間感染させた。感染後6時間に細胞をCa2及びMg2含有PBSで3回洗浄し、2.5パラホルムアルデヒドを含むPBS中、室温にて15分間固定した。細胞を、0.1サポニンを含むPBSで透過処理し、5ヤギ血清又は5BSAを含むPBS0.1サポニンでブロックし、ブロッキング溶液で希釈した以下の第一抗体と共に室温にて1時間インキュベートした:抗EHECTir、1:1000;抗大腸菌O157ディフコ、1:200;アフィニティー精製ラットポリクローナル抗NleA本研究、1:100;抗マンノシダーゼIIマリアン、ファークハー博士USCDから提供、1:1000。PBS/サポニンにて3回洗浄後、細胞を二次抗体Alexa-488又は-568結合抗マウス、ウサギ、ラット1:400で、室温にて30分間インキュベートし、PBS/サポニンで3回、PBSで1回洗浄し、モビオールDABCOを用いてスライドガラス上にのせた。重合したアクチンを可視化するために、Alexa-488-結合ファロイジンを1:100希釈にて第二抗体と共にインキュベートした。表示した場合には、細胞を5μg/mlのブレフェルディンAベーリンガーマンハイムで固定前に30分間インキュベートした。画像は、ZeissAxioskop顕微鏡を用いて検出し、EmpixDVC1300デジタルカメラで取り込み、ノーザンエクリプスイメージングソフトウェアを用いて解析するか、又はLasersharpソフトウェアを用いてバイオラッドラジアンスプラス共焦点顕微鏡で検出した。感染宿主細胞の分画それぞれのサンプルごとに、100mmシャーレ2枚に密集したHeLa細胞を、初期感染効率MOI1:10にて野生型EHEC-pNleA-HA又はEHECescN-pNleA-HAに感染させた。感染6時間後に細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、既述の方法30、49にて生化学的に分画した。簡単に説明すると、細胞を300μlの完全プロテアーゼ阻害剤カクテルロッシュを添加した均一化バッファー3mMイミダゾール、250mMスクロース、0.5mMのEDTA、pH7.4に再懸濁し、22ゲージの注射針を通して機械的に破壊した。ホモジネートを低速3000gで15分間、4°Cにて遠心分離し、非破壊細胞、細菌、核及び細胞骨格成分低速ペレットを沈殿させた。上清を、TL100遠心分離機ベックマンのTLS55ローターを用いて4°Cで20分間高速超遠心分離41000gを行い、宿主膜ペレットと細胞質上清に分離した。ペレットは300μlの1×レムリーバッファーに再懸濁し、上清は5×の保存液を用いて1×レムリーバッファーに調製した。すべての画分の等容量をSDS-PAGE9ポリアクリルアミドで分離し、ニトロセルロースに移行させ、ウェスタンブロット解析した。膜に相互作用したNleAの抽出実験のため、100mmシャーレ2枚分の感染したHeLa細胞をそれぞれの抽出条件ごとに上述と同様に分画した。高速ペレット宿主膜画分は300μlの以下の抽出バッファーの1つに再懸濁した:10mMトリス、5mM塩化マグネシウム、pH7.4;10mMトリス、5mM塩化マグネシウム、1M塩化ナトリウム、pH7.4;0.2MNaHCO3、5mM塩化マグネシウム、pH11.4;10mMトリス、5mM塩化マグネシウム、1TritonX-100、pH7.4。抽出は、氷上にて30秒間、5秒ごとにサンプルをピペット吸入及び排出することによって行い、サンプルは100000gで30分間再遠心分離した。ペレット不溶性画分は1×レムリーバッファーに再懸濁し、上清可溶性画分は、10トルクロロ酢酸で氷上30分間沈殿させ100アセトンで洗浄し、300μlの1×レムリーバッファーに再懸濁した。等量をSDS-PAGE9ポリアクリルアミドで分離し、ニトロセルロースへ移行させ、ウェウスタンブロッティングで解析した。マウスでのC.ローデンティウム感染解析5週齢のC3H/Hejマウスジャクソンラボラトリーと非近交系のNIHスイスマウスは、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会及び実験動物の使用に関するカナダ会議によって作成されたガイドラインに従ってブリティッシュコロンビア大学動物施設に収容した。野性型C.ローデンティウム及びnleA欠失変異体をLB培地中シェーカーにて200rpm一晩増殖させ、100μlの培養液を用いて経口的胃管栄養法によりマウスに感染させた。接種菌液は段階的希釈及びプレーティングにより力価を測定し、両方のグループにおいて4×108cfu/マウスとなるように計算した。C.ローデンティウムに感受性の高いC3H/Hejマウスの感染については、感染実験の期間中毎日感染したマウスの生存を評価した。マウスが瀕死の状態になったときは直ちに屠殺した。NIHスイスマウスを用いた細菌病原性アッセイのために、感染後10日目に動物を屠殺した。結腸の過形成を計測するために、肛門の端から始まって遠位結腸の最初の4cmを回収し、糞便のペレットを取り除いた後で秤量した。細菌のコロニー形成をアッセイするために結腸組織及び糞便ペレットをPBS中ポリトロン組織ホモジナイザーを用いて均質化し、マッコンキー寒天培地ディフコラボラトリー上にプレーティングする前に段階的に希釈した。結腸組織と糞便ペレットは併せて屠殺時のマウス結腸における全細菌負担を決定した。マッコンキー寒天培地はグラム陰性細菌に対して選択的であり、その上でC.ローデンティウムの形成するコロニーは、高度に特徴的かつ同定可能な大腸菌とは異なる形態を示す26。組織学的な解析のために、感染マウス結腸の最後の0.5cmを10中性緩衝化ホルマリンで固定し、処理し、3μm切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。組織学的解析は、ブリティッシュコロンビア大学病理学実験医学教室における形態学的サービスによって行われた。実施例2LEE遺伝子発現調節解析LEE遺伝子座の如何なる遺伝子が、C.ローデンティウムのLEE遺伝子発現を制御しているのかを調べるために、LEE4遺伝子及びLEE5Tir遺伝子にそれぞれコードされているEspB及びTirタンパク質発現のための種々のLEE変異体を解析した。DMEM培地で増殖した細菌の細胞ライセート全体を、抗Tir及び抗EspB抗血清を用いたウェスタンブロットにより解析した。その結果、Δler株ではTir及びEspBタンパク質の何れも産生されなかったことからLEE発現におけるLerのきわめて重要な役割が確認された。予想されるように、Δtir及びΔespB株ではそれぞれTir及びEspBタンパク質は産生しなかった。ΔcesT株ではTirタンパク質は検出されず、この結果は、Tirタンパク質の安定性と分泌のためのシャペロンとしてのCesTタンパク質の役割18、19から妥当である。意外にも、別のLEEコードタンパク質であるOrf11もまたTir及びEspBの発現に要求された。ΔOrf11株におけるTir及びEspBの発現は、サイトロバクターorf11遺伝子のみを有するプラスミドによって相補された図8。orf11遺伝子は、A/E病原体の間で高度に保存され、EHEC及びEPECのorf11遺伝子は共にサイトロバクターΔOrf11株を相補した図8。このことは、Orf11タンパク質がA/E病原体におけるLEE遺伝子発現の正の制御における機能的な等価物であることを示す。配列解析の結果、Orf11/GrlAは、腸内細菌科のcai及びfixオペロンの転写活性因子であるCaiF15に対して23の同一性を示し、性質不明のサルモネラ菌産物16で、std海馬采オペロン下流に位置する1つの遺伝子によってコードされる推定されたアミノ酸配列と37の同一性を示した図7。このサルモネラ菌ホモログは、図の中でSGHサルモネラGrlAホモログとして示される。3つのタンパク質はすべてDNA結合タンパク質に特徴的な予測されたヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを含む。LEE遺伝子発現の調節におけるOrf11及びLer遺伝子の階層性と取り組むために、サイトロバクターローデンティウムにおいてler及びorf11遺伝子の二重変異体を作製した。ΔlerΔorf11株におけるTir及びEspBの発現は、Lerをトランスに発現させることによって部分的に回復するが、同様に発現されたOrf11はそのような効果を持たなかった図8。このことは、Orf11遺伝子が調節カスケードにおけるLer遺伝子の上流で作用することを示す。プライマー伸長解析は、サイトロバクターlerプロモーターがEPEClerのそれと同様であり、その発現がΔorf11株において減少することを示すことによって、この調節的階層を確認した。ler遺伝子の発現調節におけるOrf11の役割は、LEE1Ler又はLEE5Tirオペロンの調節領域とcatレポーター遺伝子との転写融合物pLEE1-CAT又はpLEE5-CATの活性を、ダルベッコ改変最小培地DMEM中で6時間増殖させたサイトロバクターの野生型、Δler及びΔOrf11株においてモニターすることによりさらに証明された。LEE1-cat融合物の活性はΔOrf11株において減少し、LEE5-cat融合物の活性はΔler及びΔOrf11株において劇的に減少した。これらの結果は、Orf11がLer発現の新規な正の調節因子であり、続いてLerが他のLEEオペロンの発現を促進することを示す。Orf11は、調節カスケードにおいてLerの上流で作用するから、GrlALEE-活性化因子の包括的調節因子と名づけられた。実施例3LEE遺伝子座にコード化されたTTSSにより分泌されるエフェクターの同定A/E病原体は組織培養液又は最小培地中に種々のタンパク質を分泌するが、それらは主にEspA、EspB及びEspDなどの輸送体である。DMEMで増殖した細菌培養液の上清からTCA沈殿によって分泌タンパク質を濃縮し、12SDS-PAGE、続いてクーマシーブルー染色により分析した。orf11/grla遺伝子を含むプラスミドをもったサイトロバクターローデンティウムは、野生株に比べて少なくとも300以上のEspA、EspB、及びEspDを分泌した。サイトロバクターLEEによってコードされるエフェクターを規定するために、TTS及び宿主細胞接着に関与しない種々のLEE遺伝子座にコードされたタンパク質をそのカルボキシ末端にて二重ヘマグルチニン2HAエピトープと結合させ、野生型及び変異体C.ローデンティウムにおけるそれらの分泌を解析した。Tir、EspG、EspF、EspH、及びMapのみがC.ローデンティウムにおいてLEEにコードされたTTSSによって分泌された。このことは、LEE遺伝子座が5つのエフェクターのみをコードすることを示唆する。これまで認められなかった54kダルトンのタンパク質p54が、Tirを過剰分泌する1つの変異体においてクーマシー染色により容易に検出された。このことは、これがLEE意外にコードされる新規な推定エフェクターを意味することを示唆する。p54を同定し、さらなるエフェクターがC.ローデンティウムのLEE領域外でコードされているか否かを決定するために、GrlAがLEE遺伝子発現及び/又はIII型分泌を促進する能力を利用して、grlAプラスミドを、エフェクターは分泌するが輸送体を分泌しない変異体に導入した。GrlAの過剰発現は、これらの変異体におけるTirの分泌を大いに促進400以上もしたが輸送体は発現しなかった。少なくとも6種類の更なる分泌タンパク質が認められ、LEEにコードされたTTSSが種々の付加的な非LEEコードタンパク質を分泌することを示した。これらのタンパク質を同定するために、分泌タンパク質を2次元ゲルで分析した。いくつかのLEEコードエフェクターRspF、EspH及びMapは、推定される塩基性pI値、例えば、EspFの極端なpI値11.00を有することから、これらの分泌タンパク質は、最初に酸性pH3~10及び塩基性pH6~11グラジエントの両方のImmobilineDryStripsで泳動し、続いて12及び14のそれぞれのSDS-PAGEで分離した。ゲルをSyproRubyで染色し、選択したタンパク質のスポットを手作業で切り出し、質量分析及びdenovoペプチドシークエンシングにより解析した。この解析により、LEEにコードされたTir、EspF、EspG、EspH、及びMapはIII型分泌機構により分泌されることが確認された。[表2]C.ローデンティウムのLEEコード化TTSSによって分泌されるエフェクター及び推定エフェクターLEE遺伝子座にコードされた5つのエフェクターに加え、LEE遺伝子座にコードされていない7つのエフェクターと思われる分泌タンパク質を同定した。LEE以外にコードされたこれらの分泌タンパク質は、従って、LEEコード化分泌タンパク質/エフェクターEspから区別するために、NleAp54、NleB、NleC、NleD、NleE、NleF、及びNleGQQENAPSSI/LQTR;配列番号59非LEEコード化エフェクターと称する表2。同定された7つのタンパク質の中で、NleGだけがC.ローデンティウムに独特のものであり、他の6つのタンパク質はEHECO157における高度に保存されたホモログを有する表2。EHECのホモログは、ゲノム中の3つの異なる領域に密集する遺伝子にコードされ、それぞれの領域は少なくともC.ローデンティウムが分泌するタンパク質と相同性を示す2つのタンパク質をコードしている表2。NleA及びNleFのホモログをコードしている遺伝子Z6024及びZ6020は、プロファージCP-933Pを相互作用するEHECのOアイランド71に局在する。同様に、NleB及びNleEホモログをコードする遺伝子Z4328及びZ4329はOアイランド122に局在し、NleC及びNleDホモログをコードする遺伝子Z0986及びZ0990はOアイランド36に局在する表2、図9。さらに、Z4328Oアイランド122は、Oアイランド36のZ0986の次に局在する1つの遺伝子であるZ0985に強い相同性を有する。6つの新規EHEエフェクター遺伝子のすべてのホモログは、そのゲノム塩基配列が決定されたEPECにおいても存在し同様に構成されている。EPEC遺伝子と89の塩基配列同一性を示したZ6024を除き、他の5つのEHEC遺伝子はEPECにおけるそれらのホモログと95以上の同一性を示した。さらに、これらのエフェクターのいくつかは、他の病原性細菌においても高度に保存されている。NleD/Z0990は、P.syringaepv.tomatoのIII型エフェクターであるHopPtoHと類似性を有する41、42。NleE/Z4329は、ウサギEPECREPECのRorfD及びS.flexneriのOrf212と有意な相同性を有し8、33、一方、NleB/Z4328はREPECのRorfE、及び2つの仮想S.typhimuriumタンパク質と強い相同性を有する。Z4328及びZ4329の遺伝子は、EHECでは隣接して局在し、これはREPECにおけるrorfD及びrorfE遺伝子の配置と同様である8。しかしながら、rorfD及びrorfE遺伝子はREPECではLEEの隣に局在するが、EHECにおけるそれらの対応遺伝子はLEEから遠く離れた1つの領域O-アイランド122に存在する。Z4328及びZ4329を有するEHECのO-アイランド122は、2つの細胞毒素と共に、S.entericaにおける重要なPhoP/PhoQ調節病原性因子であるPagCのホモログをコードする遺伝子もまた含む3、43。これらの新規エフェクターをコードするEHECの3つのO-アイランドは、PAIsの特徴であるジヌクレオチド偏向と低GC含量を有する。さらに、それらはプロファージと関連しているか、又は可動挿入配列によって隣接されており、非病原性大腸菌のゲノムには存在しない。このことは、これらの遺伝子の水平伝達を意味する。まとめると、以上のことはこれらのアイランド及び新規に同定されたサイトロバクター及びEHECの病原性エフェクターの重要性を示唆する。これらの菌は互いに分岐したため、細菌染色体におけるPAIsの異なる位置にもかかわらず、関連する病原体は驚くべきことに保存された一連のPAIsを維持することも示唆する。[実施例4]NleAの同定III型分泌機構は一般的に接触依存性であると思われているが、所定のインビトロ培養条件において、EHECは液体培養液中で増殖する間にIII型エフェクターを細胞外培地に分泌させることができる28、51。野生型EHECwt及びIII型分泌変異体escN-から培養上清を調製し、III型分泌誘導条件において増殖させた。分泌タンパク質のSDS-PAGEによる解析によって、野生型及びescN-サンプルの両方からの分泌タンパク質に共通の1つの大量の高分子量タンパク質、及び野生型サンプルに特有の種々の他の大量のタンパク質が見出された図10A。これらの分泌タンパク質は、2次元ゲル電気泳動によって分離され、大量の分離されたタンパク質のスポットはゲルから切り出され、質量分析法により分析された図10B、表1。スポット番号1は野生型及びescN-培養上清の両方に存在し、EspPと同定された。EspPは、EHECのプラスミドにコードされ、III型分泌とは独立して自動輸送機構によって分泌される1つのタンパク質である25。4つの主要なスポット番号2、3、4、5は野生型の上清に特有である。これらのうちの3つは、LEE内の既知のIII型分泌タンパク質として同定され:Tirスポット番号2、EspBスポット番号4及びEspAスポット番号5である図10B、表1。スポット番号3はEHECゲノム内のLee領域外の翻訳領域にコードされる推定分子量が48kダルトンのタンパク質として同定された図10C。このタンパク質はNleA非LEEコード化エフェクターAと称する。[実施例5]nleAを含む遺伝子座の特徴づけnleA遺伝子はO-アイランドにコードされている。O-アイランドとは、EHECゲノムの1つの領域であって、非病原性大腸菌K-12株には存在しない領域である3。大腸菌K12株バックボーンに保存された最後の遺伝子YciEとファージの構造タンパク質をコードする遺伝子の間の領域は、いくつかの推定トランスポザーゼ転移酵素と1つの推定部位特異的組換え酵素断片を有した図11A。この領域をPAIsを同定するためのプログラムであるアイランドパスで解析した結果、この領域内の全ての翻訳領域ORFは、ジヌクレオチド偏向とEHECゲノムの平均とは異なるGC含量を有することが分かった。この領域内の10個のORFは、EHECゲノムの平均値よりも少なくとも1標準偏差低いGC含量を有し、一方、6個のORFの2つはEHECゲノムの平均値よりも少なくとも1標準偏差高いGC含量を有した。これらの結果をまとめると、nleA遺伝子はPAIを含む水平伝達遺伝子群に局在していることが示唆される。この領域内のいくつかの他のORFは病原性における役割を示唆する特徴を有し、これらは推定シャペロンZ2565及び他の病原体のIII型分泌タンパク質との相同性を有する2つのタンパク質Z6021、Z6020を含む。nleA遺伝子の性質と分布をさらに調べるために、nleAプローブを調製し、A/E病原体及び非病原性大腸菌株からのゲノムDNAパネルを用いてサザンブロットを行った。図11Bに示したように、nleA遺伝子は調べた全てのA/E病原体に存在したが、非病原性大腸菌には存在しなかった。現在進行中のEPECゲノムシクエンシング解析によれば、nleA遺伝子はEPECゲノムのファージ挿入部位に近接して存在することが分かった。nleA遺伝子はインチミン陽性、非O157EHEC株O84:H4のプロファージ内にも存在するが、非病原性大腸菌株、LEEを含まない尿路感染性大腸菌には存在しない。nleA遺伝子は、サルモネラ種や赤痢菌種のような他のTTSSを含む病原体にも存在しない。従って、nleA遺伝子は、A/E病原体に特異的に獲得され維持されていると思われる。C.ローデンティウム、EPEC、EHEC及びO84:H4のnleA遺伝子配列の複数配列整列マルチプルシークエンスアライメントによれば、これら4種類のA/E病原体において高度な配列保存性が分かった図11C。[実施例6]NleAはLEEにコードされるIII型分泌機構により分泌される現在報告されているLEEにコードされたTTSSのEHEC及びEPECエフェクターは、LEE内において、分泌装置そのものをコードする遺伝子に近接してコードされている。NleAの分泌がLEEにコードされたTTSSに依存的かどうかを決定するために、NleAのエピトープ付加物を、野生型EHEC、及びIII型分泌を欠損するescN-EHEC株でプラスミドから発現させた。図12Aに示したように、HA付加NleAは野生型及びescN-EHEC株で同程度のレベルで発現されたけれども、当該タンパク質はNleA-HAで形質転換された野生型細菌によってのみ細胞外培地に分泌された。非分泌型細菌タンパク質であるDnaKは分泌タンパク質サンプルにおいて非分泌タンパク質の不存在のための対照として用いた図12B。Tirは非形質転換及びNleA-HAで形質転換された野生株で分泌されたが、escN-株では分泌されず、予想されたTTSS表現形が検証された。同様の結果は、野生型EPEC及びEPECのいくつかのIII型分泌変異体におけるエピトープ付加NleAの発現について得られ、NleAがEPECのTTSSによってもまた分泌されることが示された。[実施例7]NleAは宿主細胞内に移行するEHECがIII型分泌誘導条件下で増殖するとき、2種類のタンパク質が細胞外の培養液へ分泌される。NleAが輸送体であるか、又は移行エフェクターであるかを決定するために、欠失変異体株を作製してNleA非存在下におけるIII型分泌及び移行を調べた。野生型及びΔnleA変異体EHEC株からの分泌タンパク質プロフィールを解析した。野生型のサンプルは、ΔnleAから分泌されたタンパク質には存在しない約50kDaの多量のタンパク質を含んでいた図13A。NleAに対する抗血清を用いて行ったウェスタンブロット解析は、50kDaのNleAタンパク質が野生型分泌タンパク質には存在するがΔnleAサンプルに存在しないことを示した図13B。しかしながら、NleAの存在又は不存在の他は野生型及びΔnleA株の分泌タンパク質プロフィールは同一であった図13A。このように、NleAは他のIII型分泌エフェクターの分泌には必要ではない。NleAが他のIII型エフェクターの宿主細胞への移行に必要かどうかを調べるために、HeLa細胞を野生型EHEC及びEHECΔnleAで感染させ、Tirの移行及び機能を感染細胞の免疫蛍光染色法によりモニターした。野生型EHEC及びΔnleA変異体による台座形成を調べるために、感染細胞を抗EHEC及び抗Tir抗体による免疫蛍光法に供し、ファロイジンを用いて糸状のアクチンを可視化した。その結果、EHECΔnleAは野生型EHECと同等のレベルでHeLa細胞に接着することを示した。免疫蛍光染色法により、Tirは宿主細胞内に移行し、野生型及びΔnleAEHEC株の両方の感染細菌下に集中することが分かった。機能的なTir移行を確認すために、感染細胞を蛍光ファロイジンで染色し、接着した細菌の下で台座形成に関与する重合したアクチンを視覚化した。アクチンの台座は、野生型又はΔnleAEHECの何れで感染した細胞にも顕著であり、このことは他のIII型エフェクターの移行及び機能がNleA非存在下において進行しうることを示す。これらの結果は、NleAが台座形成に必要でないことも示す。NleAが他のエフェクターの分泌と移行に役割を果たさないと思われたので、NleAが自分自身を移行させるかどうかを調べた。HeLa細胞を、野生型又はHA付加NleAを発現するescN-EHECで6時間感染させ、細胞成分分画と抗HA抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。図14Aに示したように、NleAは宿主細胞に移行し、そこで宿主細胞の膜画分と相互作用した。NleAの移行は、HA付加NleAを発現するIII型分泌変異体で細胞が感染する間は観察されず、NleAの移行と宿主膜との相互作用はTTSS依存的であることを示す。それぞれの画分に特異的なタンパク質に対する抗体で画分のウェスタンブロットを行ったところ、画分の相互汚染がないことが確認された。宿主細胞の膜内臓タンパク質であるカルネキシンは、宿主細胞質画分には存在せず、宿主細胞の細胞質タンパク質であるチューブリンは宿主膜画分には存在しなかった。非分泌型細菌タンパク質であるDnaKは、低速ペレットにのみ存在し、宿主膜及び細胞質画分への細菌汚染のないことを示した。NleA及びDnaKは、EHECの接着がIII型依存的であるため、III型変異感染細胞の低速ペレットには存在しなかった。EHECの接着がIII型依存的であるためIII型変異体感染サンプルにおける人為的なNleAの不存在を抑えるために、NleAを発現し送達する同様の実験を野生型及びIII型変異体EPECによってもまた行った。何故なら、EPECのHeLa細胞への接着はIII型分泌とは独立しているからである。NleAは野生型EPEC感染した細胞の膜画分には存在したが、III型変異EPEC株では存在しなかった。NleA及びDnaKのいずれも野生型及びIII型変異EPEC感染細胞の両方の低速ペレット画分に存在した。NleAと宿主細胞膜との相互作用の性質を調べるため、HA付加NleAを含む宿主細胞膜画分を氷上で種々の条件下に抽出し、可溶性及び不溶性膜画分を得るために再遠心した図14B。これらの画分は、HA付加NleAを検出するため抗HA抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。高塩濃度1M塩化ナトリウム又はアルカリ性pH0.2MのNa2CO3、pH11.4処理によって、それぞれ静電的又は親水性相互作用を介して膜と表面的に相互作用していたタンパク質は除かれた。NleAと宿主細胞膜との相互作用は、膜内在性タンパク質であるカルネキシンのように図14B中央パネルこれらの処理による破壊に抵抗を示した図14Bトップパネル。反対に、表在性膜タンパク質であるカルレティキュリンの大部分は、高塩濃度及びアルカリ性pH処理の両方の処理の間に膜画分から抽出された図14B、下のパネル。カルネキシンのような膜内在性タンパク質を可溶化する図14B、中央パネル非イオン性界面活性剤TritonX-100による膜画分の処理は、ほぼ完全にNleAを可溶化し、HA付加NleAタンパク質の不溶性画分から可溶性画分への移動を起こした図14B、上部パネル。これらの結果は、NleAが宿主細胞へ移行し、そこで膜内在性タンパク質のようにふるまうことが示された。実際、種々の膜貫通ドメイン推測プログラムによるNleAタンパク質の配列解析は、その配列内に1つ又は2つの推定膜貫通ドメインの存在を予想する図11C。[実施例8]NleAは宿主のゴルジ体へ局在する宿主細胞内におけるNleAの細胞内局在性について次に決定した。HeLa細胞を野生型EHEC又はEHECΔnleAで感染させ、NleA及びマンノシダーゼIIに対する抗体で免疫蛍光法を行った。いくつかのサンプルは固定する前に30分間ブレフェルディンAで処理した。NleA及びマンノシダーゼIIによる二重染色を行った。HeLa細胞は、GFP-NleA融合タンパク質をコードする発現構築物で形質転換し、マンノシダーゼIIに対する抗体で免疫蛍光法を行った。野生型EHECで感染させたHeLa細胞の抗NleA抗体による免疫蛍光染色は、核周囲の染色パターンを示し、これはEHECΔnleAで感染させた細胞や非感染細胞には見られなかった。このパターンは、後期エンドソーム、リソソーム、小胞体ERミトコンドリア又は核に対するマーカーで得られた染色とは似ていなかった。しかし、非常によく似た染色パターンが、細胞を抗NleA抗体とマンノシダーゼIIを含むゴルジ体のマーカーに対する抗体で共染色したときに観察され、2つのタンパク質は広範に共存した。NleAのゴルジ体への局在を確認するために、固定前の感染細胞を、ゴルジ体の構造を破壊するカビの代謝産物であるブレフェルディンA27と共にインキュベートし、免疫蛍光染色した。ブレフェルディンAはマンノシダーゼII及びNleA染色の両者の拡散を引き起こし、ゴルジ体局在タンパク質であることが推定された。NleAは種々の他のゴルジ体マーカーと共存することが観察され、ゴルジ体への局在は、また、HA及びFLAGエピトープタグを用いた抗タグ抗体で染色されたエピトープタグ付加NleAを調べた実験でも認められた。NleAのゴルジ局在が他の細菌ファクターを必要とするか、又はNleAの固有的な性質であるのかを決定するために、細胞をGFP-NleA融合タンパク質をコードする発現構築物で形質転換した。形質転換されたNleAGFPもまたゴルジに局在し、マンノシダーゼII染色部位と重なった。このように、我々の実験はNleAがゴルジに局在することを示した。形質転換されたNleA-GFP融合タンパク質がゴルジに局在するという知見は、NleAタンパク質がゴルジ標的化情報を含み、この目的地へ到着するための他の細菌ファクターを必要としないことを示唆する。細菌によって送達されるNleAもまたゴルジ局在性である。[実施例9]NleAは病原性に必須であるA/E病原体における高度な配列保存性図11Cは、NleAが感染における類似した役割を果たしていることを示唆する。C.ローデンティウムはマウスの天然の病原体であり53、A/E病原性の研究のモデルシステムとして用いられてきた。感受性系統では、C.ローデンティウム感染は致死性であり、典型的には感染後6~10日の間に感染したマウスの死亡を引き起こす。より耐性を有するマウス系統は、C.ローデンティウム感染によって死亡しないが、コロニー形成を起こし、腸管炎症や結腸の過形成を引き起こす54。病原性におけるNleAの役割を調べるために、我々はnleA欠失C.ローデンティウム株を作製し、全細菌抽出物をNleA抗血清でウェスタンブロッティングしてNleAの不存在を検証した図16A。マウスを等量数の野生型又はΔnleA細菌で経口的胃管栄養法により感染させた。C.ローデンティウム感受性C3H/Hejマウスでは、NleAは病原性にとって絶対的に要求された。野生型C.ローデンティウムに感染した全てのC3H/Hejマウスは感染後6~10日の間に死亡したn=9が、ΔnleA感染マウスn=13は、軟便等の緩和な疾患症状を示したがそれでも体重は増加し感染期間中活発であり、不確定期間生存した図16B。さらに、ΔnleA感染マウスは野生型C.ローデンティウムによる後の暴露に抵抗性を示したn=5、図16B。このように、ΔnleA株は感受性マウスにおいて非病原性である一方、宿主に対し十分に保護免疫を刺激する作用を示した。C3H/Hejマウスとは反対に、C.ローデンティウム感染は非近交系のNIHスイスマウスに対して致死性ではない。これらのマウスにおいて、大腸におけるC.ローデンティウムのコロニー形成は腸管炎症、結腸の過形成及び緩和な下痢症状に導く。NIHスイスマウスを野生型又はΔnleA株で感染させ、感染後10日目に屠殺した。ΔnleA株に感染したマウスは、10日目の結腸におけるC.ローデンティウム力価が平均して20倍低かった図16C。感染したNIHスイスマウス結腸の組織学的解析は、マウスを野生型又はΔnleA株で感染させ、それらを感染後10日目に屠殺することにより行った。感染マウス結腸の最後の0.5cmを10中性緩衝化ホルマリンで固定し、処理し、3μm切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。すべてのマウスの組織切片を観察し、5倍及び63倍の対物レンズで写真撮影した。感染したマウスの肛門の端から取得した生検の組織学的解析の結果、多くの細菌が野生型感染組織に認められたが、ΔnleA感染サンプルの細菌数は、わずかであった。野生型C.ローデンティウムに感染した全ての動物は、結腸過形成の病理学的徴候を示したが、全てのΔnleA感染マウスは過形成の徴候を示さなかった。野生型感染サンプルは激しい炎症を示し、腸管内腔がもはやはっきりせず、増大した上皮に適応するため外部の筋肉層が見かけ上拡張している程度まで過形成していた。反対に、ΔnleA感染サンプルでは、比較的正常な組織像を示した。腸管炎症と過形成の相対的程度は、マウスの2つのグループにおける屠殺時の結腸重量違いでも明らかである図16D。野生型感染マウスは、ΔnleA感染よりも大きな脾臓を有することが脾臓重量に反映されている図16D。このように、疾患のマウスモデルにおける病原性に対してNleAの著しい効果が示された。感受性マウスにおいて、C.ローデンティウムの機能的NleAの存在は10日以内の致死的な感染を引き起こした。NleA欠失株に感染したマウスはほとんど症状を示さず、不確定に感染から生き残った。C.ローデンティウムの感染が致死性でないより耐性のマウス系統では、NleAは結腸の過形成の進展に必要であり、感染後10日目において宿主腸管内のnleA変異体の数はより少なかった。これらの研究は、C.ローデンティウムにおけるNleAの明確な効果を示す。HeLa細胞のEHEC感染から得られた結果は、インビトロにおいてNleAは細菌の宿主細胞への接着又は他のエフェクターの移行に影響せず、NleAが細菌接着を増強するよりも宿主クリアランスへの抵抗性レベルで作用し手いるかもしれないことを示唆した。さらに、ΔnleA感染マウスのその後の野生型C.ローデンティウムへの暴露は、nleA変異体株がコロニーを形成し、宿主免疫を刺激するために十分な程度宿主と相互作用するという証拠を提供する。これは、C.ローデンティウムのIII型変異体が宿主にコロニー形成せず、引き続く暴露から保護しないこととは対照的である。従って、nleA変異体株は弱毒化ワクチン株として使用できるであろう。[引用文献]下記の刊行物は引例により組み込まれる。1NataroJPandKaperJBDiarrheagenicEscherichiacoliClinMicrobiolRev111422012FrankelGPhillipsADRosenshineIDouganGKaperJBandKnuttonSEnteropathogenicandenterohaemorrhagicEscherichiacolimoresubversiveelementsMolMicrobiol309119213PernaNTPlunkettG3rdBurlandVMauBGlasnerJDRoseDJMayhewGFEvansPSGregorJKirkpatrickHAPosfaiGHackettJKlinkSBoutinAShaoYMillerLGrotbeckEJDavisNWLimADimalantaETPotamousisKDApodacaJAnantharamanTSLinJYenGSchwartzDCWelchRAandBlattnerFRGenomesequenceofenterohaemorrhagicEscherichiacoliO157H7Nature4095295334ElliottSJWainwrightLAMcDanielTKJarvisKGDengYKLaiLCMcNamaraBPDonnenbergMSandKaperJBThecompletesequenceofthelocusofenterocyteeffacementfromenteropathogenicEscherichiacoliE234869MolMicrobiol28145PernaNTMayhewGFPosfaiGElliottSDonnenbergMSKaperJBandBlattnerFRMolecularevolutionofapathogenicityislandfromenterohemorrhagicEscherichiacoliO157H7InfectImmun66381038176ZhuCAginTSElliottSJJohnsonLAThateTEKaperJBandBoedekerECCompletenucleotidesequenceandanalysisofthelocusofenterocyteEffacementfromrabbitdiarrheagenicEscherichiacoliRDEC1InfectImmun69210721157DengWLiYVallanceBAandFinlayBBLocusofenterocyteeffacementfromCitrobacterrodentiumsequenceanalysisandevidenceforhorizontaltransferamongattachingandeffacingpathogensInfectImmun69632363358TauschekMStrugnellRAandRobinsBrowneRMCharacterizationandevidenceofmobilizationoftheLEEpathogenicityislandofrabbitspecificstrainsofenteropathogenicEscherichiacoliMolMicrobiol44153315509HackerJandKaperJBPathogenicityislandsandtheevolutionofmicrobesAnnuRevMicrobiol5464167910GRCornelisJCellBiol15840111SGruenheidBBFinlayNature42277512IChernushevichALobodaBThomsonJMassSpectrom3684913HsiaoWWanIJonesSJandBrinkmanFSIslandPathaidingdetectionofgenomicislandsinprokaryotesBioinformatics1941842014EdwardsRAKellerLHandSchifferliDMImprovedallelicexchangevectorsandtheirusetoanalyze987PfimbriageneexpressionGene20714915715VSperandioJLMelliesWNguyenSShinJBKaperProCNatlAcadSciUSA961519616JLMelliesSJElliottVSperandioMSDonnenbergJBKaperMolMicrobiol3329617KADatsenkoBLWannerProCNatlAcadSciUSA97664018AAbeetalMolMicrobiol33116219SJElliottetalMolMicrobiol33117620VallanceBADengWDeGradoMChanCJacobsonKandFinlayBBModulationofinduciblenitricoxidesynthaseexpressionbytheattachingandeffacingbacterialpathogencitrobacterrodentiumininfectedmicEInfectImmun706424643521VHBustamanteFJSantanaECalvaJLPuenteMolMicrobiol3966422JLPuenteDBieberSWRamerWMurrayGKSchoolnikMolMicrobiol208723THouthaeveHGausepohlMMannKAshmanFEBSLett3769124ZZieglerAnalChem74489A25BrunderWSchmidtHandKarchHEspPanovelextracellularserineproteaseofenterohaemorrhagicEscherichiacoliO157H7cleaveshumancoagulationfactorVMolMicrobiol2476777826BuchetANasserWEichlerKandMandrandBerthelotMAPositivecoregulationoftheEscherichiacolicarnitinepathwaycaiandfixoperonsbyCRPandtheCaiFactivatorMolMicrobiol3456257527ChardinPandMcCormickFBrefeldinAtheadvantageofbeinguncompetitivECell9715315528DeVinneyRSteinMReinscheidDAbeARuschkowskiSandFinlayBBEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157H7producesTirwhichistranslocatedtothehostcellmembranebutisnottyrosinephosphorylatedInfectImmun672389239829DonnenbergMSandKaperJBConstructionofaneaedeletionmutantofenteropathogenicEscherichiacolibyusingapositiveselectionsuicidevectorInfectImmun594310431730GauthierAdeGradoMandFinlayBBMechanicalfractionationrevealsstructuralrequirementsforenteropathogenicEscherichiacoliTirinsertionintohostmembranesInfectImmun684344434831GoosneyDLDeVinneyRandFinlayBBRecruitmentofcytoskeletalandsignalingproteinstoenteropathogenicandenterohemorrhagicEscherichiacolipedestalsInfectImmun693315332232GriffinPMOstroffSMTauxeRVGreeneKDWellsJGLewisJHandBlakePAIllnessesassociatedwithEscherichiacoliO157H7infectionsAbroadclinicalspectrumAnnInternMed10970571233CBuchrieseretalMolMicrobiol3876034GalanJESalmonellainteractionswithhostcellstypeIIIsecretionatworkAnnuRevCellDevBiol17538635KennyBDeVinneyRSteinMReinscheidDJFreyEAandFinlayBBEnteropathogenicEcolitransfersitsreceptorforintimateadherenceintomammaliancellsCell9151152036ElliottSJKrejanyEOMelliesJLRobinsBrowneRMSasakawaCandKaperJBEspGanoveltypeIIIsystemsecretedproteinfromenteropathogenicEscherichiacoliwithsimilaritiestoVirAofShigellaflexneriInfectImmun694027403337KennyBandJepsonMTargetingofanenteropathogenicEscherichiacolieffectorproteintohostmitochondriaCellMicrobiol257959038McNamaraBPKoutsourisAOConnellCBNougayredeJPDonnenbergMSandHechtGTranslocatedEspFproteinfromenteropathogenicEscherichiacolidisruptshostintestinalbarrierfunctionJClinInvest10762162939OMarchesetalInfectImmun68217140TuXNisanIYonaCHanskiEandRosenshineIEspHanewcytoskeletonmodulatingeffectorofenterohaemorrhagicandenteropathogenicEscherichiacoliMolMicrobiol4759560641DSGuttmanetalScience295172242TPetnickiOcwiejaetalProCNatlAcadSciUSA99765243SIMillerAMKukralJJMekalanosProCNatlAcadSciUSA86505444GruenheidSDeVinneyRBladtFGoosneyDGelkopSGishGDPawsonTandFinlayBBEnteropathogenicEcoliTirbindsNcktoinitiateactinpedestalformationinhostcellsNatCellBiol385685945HarlowEandLaneDAntibodiesalaboratorymanualColdSpringHarborNYColdSpringHarborLaboratory46HueckCJTypeIIIproteinsecretionsystemsinbacterialpathogensofanimalsandplantsMicrobiolMolBiolRev6237943347JarvisKGandKaperJBSecretionofextracellularproteinsbyenterohemorrhagicEscherichiacoliviaaputativetypeIIIsecretionsystemInfectImmun644826482948KennyBEllisSLeardADWarawaJMellorHandJepsonMACoordinateregulationofdistincthostcellsignallingpathwaysbymultifunctionalenteropathogenicEscherichiacolieffectormoleculesMolMicrobiol441095110749KnodlerLAVallanceBAHenselMJackelDFinlayBBandSteeleMortimerOSalmonellatypeIIIeffectorsPipBandPipB2aretargetedtodetergentresistantmicrodomainsoninternalhostcellmembranesMolMicrobiol4968570450LevineMMBergquistEJNalinDRWatermanDHHornickRBYoungCRandSotmanSEscherichiacolistrainsthatcausediarrhoeabutdonotproduceheatlabileorheatstableenterotoxinsandarenoninvasiveLancet11119112251LiYFreyEMackenzieAMandFinlayBBHumanresponsetoEscherichiacoliO157H7infectionantibodiestosecretedvirulencefactorsInfectImmun685090509552PeetersJEGeeromsRandOrskovFBiotypeserotypeandpathogenicityofattachingandeffacingenteropathogenicEscherichiacolistrainsisolatedfromdiarrheiccommercialrabbitsInfectImmun561442144853SchauerDBandFalkowSTheeaegeneofCitrobacterfreundiibiotype4280isnecessaryforcolonizationintransmissiblemurinecolonichyperplasiaInfectImmun614654466154VallanceBADengWJacobsonKandFinlayBBHostsusceptibilitytotheattachingandeffacingbacterialpathogenCitrobacterrodentiumInfectImmun713443345355YoshidaSKatayamaEKuwaeAMimuroHSuzukiTandSasakawaCShigelladeliveraneffectorproteintotriggerhostmicrotubuledestabilizationwhichpromotesRac1activityandefficientbacterialinternalizationEmboJ212923293556DengWVallanceBALiYPuenteJLandFinlayBBCitrobacterrodentiumtranslocatedintiminreceptorisanessentialvirulencefactorneededforactincondensationintestinalcolonizationandcolonichyperplasiainmicEMolMicrobiol489511557RemingtonsPharmaceuticalSciencesedAGennaro1995MackPublishingCompanyEastonPa58AbeAUHeczkoRHegeleandBFinlay1998TwoenteropathogenicEscherichiacolitypeIIIsecretedproteinsEspAandEspBarevirulencefactorsJournalofExperimentalMedicine1881907191659AdvDrugDelivRev516318760AltschulSF1991AminoacidsubstitutionmatricesfromaninformationtheoreticperspectiveJournalofMolecularBiology21955566561AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkNY199862BabiuketalVirology159576663BeuzonCRandDWHolden2001UseofmixedinfectionswithSalmonellastrainstostudyvirulencegenesandtheirinteractionsinvivoMicrobesInfect313455264BrownDetalTechNotes93565BrummelkampTRetalScience29655055366CanilCIRosenshineSRuschkowskiMSDonnenbergJBKaperandBBFinlay1993EnteropathogenicEscherichiacolidecreasesthetransepithelialelectricalresistanceofpolarizedepithelialmonolayersInfectImmun6127556267CaplenNJetalProcNatlAcadSciUSA989746974768ClinExpImmunol7825626269CloningVectorsALaboratoryManualMODayhoff345352NationalBiomedicalResearchFoundationWashington71Eisenbergetal97299973EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiologyVol66HumanaPressTotowaNJ74FeyetalEmergInfectDisVolume675GallDImmunology1136938676GeysenetalProcNatlAcadSciUSA813998400277GeysenetalMolecImmunol2370971578HammerlingetalInMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomasElsevierNY198179HammondSMetalNatureRevGen211011980HaufNandTChakraborty2003SuppressionofNFkappaBactivationandproinflammatorycytokineexpressionbyShigatoxinproducingEscherichiacoliJImmunol17020748281HoppetalProcNatlAcadSciUSA783824382882Immunology5824525083IntArchAllergyApplImmunol6820120884JImmunolMethods9715916485JControlledRelease712313286KarlinSandAltschulSF1990MethodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemesProcNatlAcadSciUSA872264226887KnodlerLAJCelliWDHardtBAVallanceCYipandBBFinlay2002SalmonellaeffectorswithinasinglepathogenicityislandaredifferentiallyexpressedandtranslocatedbyseparatetypeIIIsecretionsystemsMolMicrobiol43108910388KodakLaboratoryChemicalsBulletin561589KohleretalEurJImmunol6292197690KohleretalEurJImmunol6511197691KohleretalNature256495197592KyteetalJMolBioL15710513293LeeNSetalNatureBiotechnol2050050594MSJohnsonandJPOverington1993AStructuralBasisofSequenceComparisonsAnevaluationofscoringmethodologiesJournalofMolecularBiology23371673895MiyagishiMandTairaKNatureBiotechnol2049750096MyersandMillerCABIOS19894111797NaylorSWJCLowTEBesserAMahajanGJGunnMCPearceIJMcKendrickDGSmithandDLGally2003LymphoidfollicledensemucosaattheterminalrectumistheprincipalsiteofcolonizationofenterohemorrhagicEscherichiacoliO157H7inthebovinehostInfectImmun7115051298PaddisonPJetalGenesDev1694895899PaulCPetalNatureBiotechnol20505508100SchijnsetalCurrOpiImmunol12456101SharpPAGenesDev15485490102StatesDJGishWAltschulSF1991ImprovedSensitivityofNucleicAcidDatabaseSearchUsingApplicationSpecificScoringMatricesMethodsAcompaniontoMethodsinEnzymology36677103StevenHenikoffandJorjaGHenikoff1992AminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocksProcNatlAcadSciUSA891091510919104StevenHenikoffandJorjaGHenikoff1993PerformanceEvaluationofAminoAcidSubstitutionMatricesProteinsStructureFunctionandGenetics174961105SuiGetalProcNatlAcadSciUSA9955155520106VallanceBAWDengLAKnodlerandBBFinlay2002MicelackingTandBlymphocytesdeveloptransientcolitisandcrypthyperplasiayetsufferimpairedbacterialclearanceduringCitrobacterrodentiuminfectionInfectImmun70207081107VanDonkersgoedetalCanVetJ40332108VanDonkersgoedetalCanVetJ42714109YuJYetalProcNatlAcadSciUSA9960476052110SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989111AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySons1994112VaughanetalNatureBiotech143093141996113LarssonAetalChickenantibodiestakingadvantageofevolutionareviewPoultSci1993Oct72180712114AlymovaIVKodihalliSGovorkovaEAFangetBGerdilCWebsterRGImmunogenicityandprotectiveefficacyinmiceofinfluenzaBvirusvaccinesgrowninmammaliancellsorembryonatedchickeneggsJVirol1998May7244727115OFarrellyCBrantonDWankeCAOralingestionofeggyolkimmunoglobulinfromhensimmunizedwithanenterotoxigenicEscherichiacolistrainpreventsdiarrheainrabbitschallengedwiththesamestrainInfectImmun1992Jul6025937116RomitoMViljoenGJDuPlessisDHElicitingantigenspecificeggyolkIgYwithnakedDNABiotechniques2001Sep316706726745117YokoyamaHUmedaKPeraltaRCHashiTIcatloFCJrKurokiMIkemoriYKodamaYOralpassiveimmunizationagainstexperimentalsalmonellosisinmiceusingchickeneggyolkantibodiesspecificforSalmonellaenteritidisandStyphimuriumVaccine1998Feb1638893他の実施形態本発明の種々の実施形態が本書において開示されているが、当業者が共有する一般的な知識に従って、本発明の範囲内において改変及び修飾が多くなされてもよい。そのような修飾は、実質的に同じ方法において同じ結果を達成するために、既知の等価な形態との置換を含む。本書で使用される場合、受入番号Accessionnumbersは、ヌクレオチド配列に関しては、GenBank、ヨーロッパ分子生物学研究室EMBL、日本DNAデータバンクDDBJ、若しくは、ゲノム配列データベースGSDBを含み、並びに、ポリペプチド配列に関しては、タンパク質情報資源PIR、SWISSPROT、タンパク質研究財団PRF、及び、タンパク質データバンクPDB解析された構造からの配列、及び、GenBank、EMBL、DDBJ若しくはRefSeqにおけるヌクレオチド配列からのアノテートされた翻訳領域からの翻訳を含む、複数のデータベースからの受入番号を含む。数字の範囲は、範囲を限定された包括的な数である。本明細書においては、単語含んでいるcomprisingは、言い回しを含むがこれらに限定されないincludingbutnotlimitedtoと実質的に等価な、制限の無い用語として使用され、また、単語含むcomprisesも一致する意味を有する。本書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であるとの承認として解釈されるべきではない。各個別刊行物が、本書に参照により組み込まれるべく且つ本書で十分にかのように説明されるべく、具体的且つ個々に指し示された場合、全ての刊行物は参照により本書に組み込まれる。本発明は、本書の前に記載され、そして、実施例及び図面に対して参照されるような、実質的な全ての実施形態及び変形形態を含む。"