以下を特徴とする、捕獲薬物抗体とトレーサー薬物抗体とを含む二重抗原架橋イムノアッセイ法を用いて試料中の薬物抗体に対する抗体を免疫学的に測定するための方法;i捕獲薬物抗体が、固相に結合される抗体部位が異なる少なくとも2つの該薬物抗体を含む該薬物抗体の混合物であり;およびiiトレーサー薬物抗体が、検出可能な標識に結合される抗体部位が異なる少なくとも2つの該薬物抗体を含む該薬物抗体の混合物である。その結合パートナーに対する薬物抗体の結合が、N末端およびまたはεアミノ基、異なるリジンのεアミノ基、薬物抗体のアミノ酸骨格のカルボキシ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、およびまたはフェノール官能基、ならびにまたは薬物抗体の糖鎖構造の糖アルコール基による化学結合によって行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。トレーサー薬物抗体混合物が、その結合パートナーに対してアミノ基および糖鎖構造によって結合された薬物抗体を含むことを特徴とする、請求項1または2記載の方法。捕獲薬物抗体混合物が、その結合パートナーに対してアミノ基および糖鎖構造によって結合された薬物抗体を含むことを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。捕獲薬物抗体の固相に対する結合が受動吸着によって行われることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。捕獲薬物抗体対トレーサー薬物抗体の比が1:10~50:1であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。アミノ結合薬物抗体対炭水化物結合薬物抗体の比率がそのような混合物において1:10~10:1であることを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。捕獲薬物抗体が、特異的結合対を通して固定されることを特徴とする、請求項1~4および6~7のいずれか一項記載の方法。捕獲薬物抗体がビオチンに結合され、固定が、固定されたアビジンまたはストレプトアビジンを通して行われることを特徴とする、請求項8記載の方法。トレーサー薬物抗体が、特異的結合対を通して検出可能な標識に結合されることを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項記載の方法。トレーサー薬物抗体がジゴキシゲニンに結合され、検出可能な標識に対する連結が、ジゴキシゲニンに対する抗体を通して行われることを特徴とする、請求項10記載の方法。発明の詳細な説明本発明に係る薬物抗体という用語は、個体の試料が投与後に薬物抗体を含むことが疑われるように、個体に投与することができる抗体を示す。本発明に従って行われる1つのアッセイ法において、薬物抗体、捕獲薬物抗体、およびトレーサー薬物抗体は、同じ抗体分子、たとえば同じ発現ベクターによって組換えによって産生され、同じアミノ酸配列を含む分子を含む。薬物抗体は、腫瘍遺伝子疾患のような様々な疾患の処置のために広く用いられている。そのような抗体は、たとえばLeveneAPetalJournaloftheRoyalSocietyofMedicine98146152において記述されている。そのような抗体は、たとえばCD20、CD22、HLADR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、LevisY抗原、IL6受容体、またはIGF1受容体に対する抗体である。治療抗体はまた、GronerBetalCurrMolMed4539547;およびHarrisMLancetOncol5292302によって記述される。例示的な抗体は、IL6受容体に対する抗体である。そのような抗体は、たとえばMiharaetalClinImmunol98319326;NishimotoNetalBlood10626272632、臨床試験第NCT00046774号、またはWO2004096274によって記述されている。例示的な抗体は、IGF1受容体に対する抗体である。そのような抗体は、たとえば、WO2004087756またはWO2005005635において記述されている。抗薬物抗体は、薬物抗体の可変領域、定常領域、または糖構造のような、薬物抗体の任意の領域に対して向けられる抗体である。そのような抗薬物抗体は、患者の免疫原性反応として抗体治療の際に起こる可能性がある4349を参照されたい。モノクローナル抗体は、タンパク質として多くの反応性側鎖を含有する。抗体のそのような反応性の化学基は、たとえばアミノ基、チオール基、カルボン酸基および糖アルコール基である。本発明に係るイムノアッセイ法の固相支持体は当技術分野において広く記述されている423を参照されたい。異なるイムノアッセイ法の原理は、たとえばHageDSinAnalChem71294R304Rによって記述されている。LuBetalAnalyst12129R32Rは、イムノアッセイ法において用いるための抗体の方向性の固定を報告している。アビジンビオチン媒介イムノアッセイ法は、たとえばWilchekMandBayerEAMethodsEnzymol184467469によって報告されている。モノクローナル抗体およびその定常ドメインは、タンパク質として、表面、タンパク質、PEG、セルロースもしくはポリスチロールのようなポリマー、酵素、または結合パートナーのメンバーのような、結合パートナーとカップリングするための多くの反応性側鎖を含有する。抗体の化学反応基は、たとえばアミノ基、チオール基、カルボン酸基、および糖アルコール基である。そのような抗体は、たとえばAslamMandDentABioconjugationMacMillanRefLtd1998pp50100によって記述されている。タンパク質の最も一般的な反応性基の1つは、アミノ酸リジンの脂肪族εアミンである。一般的に、ほぼ全ての抗体が、豊富なリジンを含有する。リジンアミンは、pH80より上で妥当に良好な求核性を有し、したがって、多数の試薬と容易かつきれいに反応して安定な結合を形成する。抗体における他の一般的な反応基は、硫黄含有アミノ酸シスチンおよびその還元産物システインからのチオール残基である。システインは、アミンより求核性が高く、一般的にタンパク質における最も反応性の高い官能基である遊離のチオール基を含有する。チオールは一般的に、中性pHで反応性であり、したがってアミンの存在下で選択的に他の分子とカップリングすることができる。遊離のスルフヒドリル基は、比較的反応性であることから、これらの基を有するタンパク質は、しばしばジスルフィド基またはジスルフィド結合としてのその酸化型でそれらと共に存在する。免疫グロブリンMはジスルフィド連結五量体の例であるが、免疫グロブリンGのサブユニットは内部ジスルフィド架橋によって結合される。そのようなタンパク質において、反応性の遊離のチオールを生成するためには、ジチオスレイトールのような試薬によるジスルフィド結合の還元が必要である。しかし、この方法はまた、これらの抗体における鎖の連結を分解して、鎖を適切に折り畳ませる再構築が可能でない可能性がある。シスチンおよびシステインのほかに、いくつかのタンパク質はまた、チオエーテル連結において硫黄を含有するアミノ酸メチオニンを有する。メチオニンの選択的改変は一般的に行うことが難しく、一般的に薬物および他の分子を抗体に付着させる方法としてほとんど用いられない。文献は、反応性のアミノ基によって多数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供するために、Traut試薬、スクシニミジルアセテート、およびスルホスクシニミジル63プロピオンアミドヘキサノエートのようないくつかのチオール化クロスリンク試薬を用いることを報告している。生体結合化学は、化学的または生物学的手段によって、他の生体分子、低分子、およびポリマーに生体分子を連結させることである。これには、抗体およびその断片、核酸およびその類似体、ならびにリポソーム成分の、互いの、または有用な特性を付加する任意の分子基との結合が含まれる。これらの分子基には、放射性核種、薬物、毒素、酵素、金属キレート、蛍光体、ハプテン、およびその他が含まれる。抗体におけるもう1つの一般的な反応基は、カルボン酸である。タンパク質は、C末端部分およびアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖内でカルボン酸基を含有する。水中でのカルボン酸の比較的低い反応性のために、通常、タンパク質および他の生体分子を選択的に改変するためにこれらの基を用いることは難しい。これを行う場合、水溶性のカルボジイミドを用いることによって、カルボン酸基を通常、反応性のエステルに変換し、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンのような求核試薬に反応させる。アミン含有試薬は、タンパク質上の他のアミンの存在下で活性化カルボン酸と選択的に反応するためには、弱い塩基性でなければならない。タンパク質のクロスリンクは、pHが80より上昇した場合に起こりうる。過ヨウ素酸ナトリウムは、炭水化物部分内の糖のアルコール部分をアルデヒドに酸化するために用いることができる。それぞれのアルデヒド基は、カルボン酸に関して記述されるように、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンと反応することができる。炭水化物部分は、抗体の結晶可能な断片領域において主に見いだされることから、抗原結合部位から離れた炭水化物の部位特異的改変を通して結合を行うことができる。アミン反応性試薬は、リジンおよびタンパク質のαアミノ基と主に反応する。反応性のエステル、特にNヒドロキシシクシニミドエステルはアミン基の改変のために最も一般的に用いられる試薬である。水性環境における反応に関して最適なpHはpH80~90である。イソチオシアネートは、アミン改変試薬であり、タンパク質とチオウレア結合を形成する。それらは、水溶液においてタンパク質アミンと反応する。アルデヒドは、脂肪族および芳香族アミン、ヒドラジン、およびヒドラジドと軽度の水性条件で反応して、イミン中間体を形成する。シッフ塩基を、軽度または強い還元剤によって選択的に還元させて、安定なアルキルアミン結合を誘導することができる。アミンを改変するために用いられている他の試薬は、酸無水物である。たとえば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物は、2つのアミン反応性のアンヒドリド基を含有する二官能キレート物質である。これは、タンパク質のN末端およびεアミン基と反応して、アミド連結を形成することができる。アンヒドリド環は開環して、配位錯体において金属に堅固に結合することができる多価の金属キレート形成アームを作製する。チオール反応性試薬は、タンパク質上のチオール基にカップリングしてチオエーテルカップリング産物を形成する試薬である。これらの試薬は、わずかに酸性から中性pHで急速に反応し、したがってアミン基の存在下で選択的に反応させることができる。ハロアセチル誘導体、たとえばヨードアセトアミドはチオエーテル結合を形成して、チオール改変のための試薬である。抗体において、反応は、内因性に存在するか、または抗体の様々な部分でシスチンのジスルフィドの還元に起因するシステイン基で起こる。さらに有用な試薬はマレイミドである。チオール反応性試薬とマレイミドとの反応はヨードアセトアミドと本質的に同じである。マレイミドは、わずかに酸性から中性pHで急速に反応する。アミン、ヒドラジド、およびヒドラジンはアルデヒドであり、カルボン酸反応性試薬である。アミン、ヒドラジド、およびヒドラジンは、水溶性カルボジイミドによるカルボキシル基の活性化後、タンパク質のカルボン酸とカップリングすることができる。アミン含有試薬は、それがリジンのより塩基性の高いεアミンの存在下でカルボジイミド活性化タンパク質と選択的に反応して、安定なアミド結合を形成するように、弱塩基性でなければならない。アミン、ヒドラジド、およびヒドラジンはまた、抗体上の炭水化物残基の過ヨウ素酸塩酸化によって抗体上に生成されうるアルデヒド基と反応することができる。このシナリオにおいて、シッフ塩基中間体が形成され、これをシアノホウ化水素ナトリウムまたはホウ化水素ナトリウム水溶性還元剤による中間体の還元を通して、アルキルアミンに還元することができる。試料という用語には、生物またはこれまで生きていた生物からの任意の量の物質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。そのような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が含まれるがこれらに限定されるわけではない。そのような物質には、臨床でのルーチンで最も広く用いられる試料源である個体からの全血、血清、または血漿が含まれるがこれらに限定されるわけではない。固相という用語は、非液体物質を意味し、これには、ポリマー、金属、ガラス、およびセラミックのような材料で作製された粒子;シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルのようなゲル物質;ポリマー、金属、ガラス、およびまたはセラミック製であってもよいキャピラリー;ゼオライトおよび他の多孔性物質;電極;マイクロタイタープレート;固体小片;ならびにキュベット、チューブ、または他の分光光度計試料容器が含まれる。アッセイの固相成分は、固相がその表面上で、捕獲薬物抗体と相互作用することが意図される少なくとも1つの部分を含むという点において、アッセイが接触する可能性がある不活性な固体表面とは区別される。固相は、チューブ、小片、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートのような静止成分であってもよく、またはビーズおよび微粒子のような非静止成分であってもよい。微粒子はまた、均一なアッセイフォーマットに関する固相として用いることができる。タンパク質および他の物質を非共有的または共有的に付着させる多様な微粒子を用いてもよい。そのような粒子には、ポリスチレンおよびポリのようなポリマー粒子;金ナノ粒子および金コロイドのような金粒子;ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子のようなセラミック粒子が含まれる。たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、MartinCRetalAnalyticalChemistryNewsFeaturesMay11998322A327Aを参照されたい。色素原、酵素、NMR活性基または金属粒子、ハプテン、たとえばジゴキシゲニンは、検出可能な標識の例である。検出可能な標識はまた、光活性化可能なクロスリンク基、たとえばアジドまたはアジリン基となりうる。エレクトロケモルミネッセンスによって検出可能な金属キレートもまた、好ましいシグナル放出基であり、ルテニウムキレート、たとえばルテニウム32キレートは特に好ましい。適したルテニウム標識基は、たとえばEP0580979、WO9005301、WO9011511、およびWO9214138において記述されている。本発明は、捕獲薬物抗体が、固相に結合する抗体部位が異なる薬物抗体の少なくとも2つを含む薬物抗体の混合物であり、トレーサー薬物抗体が、検出可能な標識に結合される抗体部位が異なる薬物抗体の少なくとも2つを含む薬物抗体の混合物である、捕獲薬物抗体とトレーサー薬物抗体とを含む二重抗原架橋イムノアッセイを用いて試料における薬物抗体に対する抗体の免疫学的測定のための方法を提供する。本発明に係る方法において有用な捕獲薬物抗体は、固相に結合される。結合は好ましくはN末端およびまたはεアミノ基、異なるリジンのεアミノ基、薬物抗体のアミノ酸骨格のカルボキシ、スルフヒドリル、ヒドロキシル、およびまたはフェノール官能基、ならびにまたは薬物抗体の糖鎖構造の糖アルコール基を通しての化学結合によって行われる。本発明に従う方法において有用な捕獲抗体は、固相に結合された少なくとも2つの薬物抗体が、それらが固相に結合される部位が異なる、固相に結合した少なくとも2つの薬物抗体の混合物である。たとえば、固相に結合された少なくとも2つの薬物抗体の混合物は、アミノ酸骨格のアミノ酸を通して固相に結合された薬物抗体と、薬物抗体の糖鎖構造の糖アルコール基を通して固相に結合された薬物抗体とを含んでもよい。同様に、たとえば、固相に結合された少なくとも2つの薬物抗体の混合物は、そのアミノ酸骨格の異なるアミノ酸残基を通して固相に結合された薬物抗体を含んでもよい。異なるアミノ酸残基という表現は、たとえばリジンとアスパラギン酸、もしくはチロシンとグルタミン酸のような異なる種類の2つのアミノ酸、または薬物抗体のアミノ酸骨格の2つの数が異なるアミノ酸残基のいずれかを指す。後者の場合は、アミノ酸は同じ種類または異なる種類となりうる。抗体部位が異なるおよび部位という表現は、部位の種類の差、たとえばアミノ酸もしくは糖アルコール基の差、または薬物抗体が固相に結合されるアミノ酸骨格のアミノ酸の数の差を指す。同じことが本発明に従う方法において有用なトレーサー薬物抗体についても当てはまる。以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載の技法に改変を行うことができ、それらも本発明の趣旨に含まれると理解される。実施例1Dビオチノイルアミノカプロン酸Nヒドロキシスクシニミドエステルによる抗体mABIL6Rのビオチニル化IL6受容体に対する抗体を、緩衝液、pH85に対して透析した。次に、溶液をタンパク質濃度10mgmlに調節した。Dビオチノイルアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルをDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。60分後、Lリジンを加えることによって反応を停止させた。過剰量の標識試薬を、150mMNaCl、pH75を添加した25mMKPO4に対する透析によって除去した。実施例2無水シトラコニン酸による処置後のDビオチノイルアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルによるmABIL6Rのビオチニル化mABIL6Rを100mMKPO4、pH84に対して透析した。次に、溶液をタンパク質濃度20mgmlに調節した。無水シトラコニン酸をDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。120分後、反応を100mMKPO4、pH84によって平衡にしたSephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって停止させた。抗体溶液をタンパク質濃度約4mgmlに調節した。Dビオチノイルアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルをDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。Lリジンを加えることによって反応を60分後に停止させた。余剰の標識試薬を200mM酢酸ナトリウム緩衝液pH50に対して透析することによって除去した。SephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって、抗体溶液を150mMNaCl、pH72を添加した25mMKPO4に移した。実施例3ビオチンヒドラジドによるmABIL6Rのビオチニル化mABIL6Rを100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55に対して透析した、次に、溶液をタンパク質濃度20mgmlに調節した。過ヨウ素酸ナトリウムを100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55に溶解して、最終濃度10mMとなるように抗体溶液に加えた。反応を、100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55によって平衡にしたSephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって30分後に停止させた。抗体溶液をタンパク質濃度約5mgmlとなるように加えた。ビオチンヒドラジドをDMSOに溶解して、モル比1:50で抗体溶液に加えた。ホウ化水素ナトリウムを最終濃度15mMとなるように加えることによって、120分後に反応を停止させた。30分後、抗体溶液を150mMNaCl、pH72を添加した25mMKPO4に対して透析した。実施例4ジゴキシゲニン3Oメチルカルボニルεアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルによるmABIL6Rのジゴキシゲニル化mABIL6Rをジゴキシゲニル化緩衝液に対して透析した。次に、溶液をタンパク質濃度10mgmlに調節した。ジゴキシゲニン3Oメチルカルボニルεアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルをDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。60分後、Lリジンを加えることによって反応を停止させた。余剰の標識試薬を、150mMNaCl、pH75を添加した25mMKPO4に対する透析によって除去した。実施例5無水シトラコニン酸による処置後のジゴキシゲニン3Oメチルカルボニルεアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルによるmABIL6Rのジゴキシゲニル化mABIL6Rを100mMKPO4、pH84に対して透析した。次に、溶液をタンパク質濃度20mgmlに調節した。無水シトラコニン酸をDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。100mMKPO4、pH84によって平衡にしたSephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって、120分後に反応を停止させた。抗体溶液を、タンパク質濃度約4mgmlに調節した。ジゴキシゲニン3Oメチルカルボニルεアミノカプロン酸NヒドロキシスクシニミドエステルをDMSOに溶解して、モル比1:5で抗体溶液に加えた。Lリジンを加えることによって、反応を60分後に停止させた。200mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH50に対して透析することにより、余剰の標識試薬を除去した。抗体溶液をSephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって25mMKPO4および150mMNaCl、pH72を有する緩衝液に移した。実施例6ジゴキシゲニンXヒドラジドによるmABIL6Rのジゴキシゲニル化mABIL6Rを100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55に対して透析した。次に、溶液をタンパク質濃度20mgmlに調節した。過ヨウ素酸ナトリウムを100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55に溶解して、最終濃度10mMとなるように抗体溶液に加えた。反応を、100mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH55によって平衡にしたSephadexG25を有するカラムにおけるクロマトグラフィーによって30分後に停止させた。抗体溶液をタンパク質濃度約5mgmlに調節した。ジゴキシゲニンXヒドラジドをDMSOに溶解して、モル比1:50で抗体溶液に加えた。ホウ化水素ナトリウムを最終濃度15mMとなるように加えることによって、120分後に反応を停止させた。30分後、抗体溶液を150mMNaCl、pH72を添加した25mMKPO4に対して透析した。実施例7mABIL6Rに対する抗体を検出するための架橋ELISAビオチニル化mABIL6Rを第一段階においてストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートのウェルに結合させた。万能緩衝液によって洗浄することにより、非結合抗体を除去した。次に、試料および参照標準物質をウェルにおいてインキュベートした。抗mABIL6R抗体を固定mABIL6Rに結合させた。未結合の物質を洗浄して除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーション後に、結合した抗mABIL6R抗体をジゴキシゲニル化mABIL6Rによって検出した。抗体酵素結合体は、ABTS基質の色反応を触媒した。シグナルをELISAリーダーによって405nmで測定した。各血清試料の吸光度の値を3個ずつ決定した。架橋ELISAの異なる5つの変化型を行った:-変化型1実施例1および4の結合体を用いる-変化型2実施例2および5の結合体を用いる-変化型3実施例3および6の結合体を用いる-変化型4実施例1および3の混合結合体と実施例4および6の混合結合体を用いる-変化型5実施例1~3の混合結合体と実施例4~6の混合結合体を用いる異なるELISA変化型において得られた参照標準シグナルおよび曲線を表1および図2~6に示す。異なるELISA変化型における参照標準シグナル異なる標準曲線を有する試料分析を表2に示す。血清試料の分析表1に示すように、結合体は全て抗mABIL6R抗体の検出のために用いることができる。同じウサギポリクローナル抗mABIL6R抗体を用いると、全てのアッセイ変化型に関する参照標準曲線は非常に類似である。実施例8固相で固定するためのストレプトアビジンビオチン相互作用を用いる抗mABIGF1R抗体の検出のための架橋ELISAIGF1Rに対するビオチニル化抗体を第一段階においてストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートのウェルに結合させた。非結合抗体を万能緩衝液による洗浄によって除去した。次に、試料および参照物質をウェルにおいてインキュベートした。抗mABIGF1R抗体を固定mABIGF1Rに結合させた。未結合の物質を洗浄した後、結合した抗mABIGF1R抗体を、ジゴキシゲニル化mABIGF1Rの後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションによって検出した。抗体酵素結合体は、ABTS基質の発色反応を触媒した。シグナルをELISAリーダーによって波長405nmで測定した。各血清試料の吸光度の値を3個ずつ決定した。架橋ELISAの異なる3つの変化型を行った:-変化型1実施例1および4に従って作製された結合体を用いる-変化型2実施例2および5に従って作製された結合体を用いる-変化型3実施例1および2に従って作製された混合結合体と実施例4および5に従って作製された混合結合体を用いるビオチニル化およびジゴキシゲニル化mABIGF1Rの試薬変種は全て、mABIL6Rに関して先に記述したとおりに合成した。異なるELISA変化型において得られた参照標準シグナルを表3に示す。異なるELISA変化型における参照標準シグナル異なる標準曲線を有する試料分析を表4に示す。血清試料の分析表3は、抗mABIGF1R抗体を検出するために、全ての結合体を用いることができることを示している。同じウサギポリクローナル抗mABIGF1R抗体を用いると、全てのアッセイ変化型に関する参照標準は非常に類似である。実施例9固相で結合するための受動吸着を用いて抗mABIGF1R抗体を検出するための架橋ELISAマイクロタイタープレート、Nuncに炭酸緩衝液においてmABIGF1Rを室温で1時間コーティングした。PBSTween20によって3回洗浄した後、MTPのウェル全てをPBS3BSAによって室温で1時間ブロックした後、再度洗浄した。次に、試料および参照標準物質をインキュベートした。抗mABIGF1R抗体を固定mABIGF1Rに結合させた。未結合の物質を洗浄後、結合した抗mABIGF1R抗体を、ジゴキシゲニル化mABIGF1Rの後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートすることによって検出した。抗体酵素結合体は、ABTS基質の発色反応を触媒した。シグナルをELISAリーダーによって波長405nmで測定した。それぞれの血清試料の吸光度を3個ずつ決定した。架橋ELISAの異なる3つの変化型を行った:-変化型1実施例4に従って作製された結合体を用いる-変化型2実施例5に従って作製された結合体を用いる-変化型3実施例4および5に従って作製された混合結合体を用いるジゴキシゲニル化mABIGF1Rの試薬変種は全て、mABIL6Rに関して先に記述したように合成した。異なるELISA変化型における参照標準シグナルを表5および図7に示す。参照標準シグナル表5は、固相上のmABIGF1Rに結合させるために受動吸着を用いる本発明に従う架橋アッセイを、抗mABIGF1R抗体を検出するために行うことができることを示す。同じウサギポリクローナル抗mABIGF1R抗体を用いると、3つのアッセイ変化型全ての参照標準値は非常に類似である。