"トランスジェニック微生物であって:aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;b6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;c目的の非天然生産物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子と;を含み、目的の非天然生産物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも1つの酵素反応を含み;aおよびbの協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし;そしてcを含み、aおよびbを欠いているか、または協調的調節様式でaおよびbを過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物におけるcの発現によって生産される目的生産物の量が増加している;上記トランスジェニック微生物。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子および6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が:aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、第1のプロモーターに作動可能に連結させ、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、第2のプロモーターに作動可能に連結させる手段であって、ここで第1のプロモーターが、第2のプロモーターと比較すると、同等または減少した活性を有する、該手段;bグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、多コピーで発現させ、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、多コピーで発現させる手段であって、ここでグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数が、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等であるかまたは減少する、該手段;cグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性を、マルチザイムとして6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性に連結させる手段;およびda、bおよびcに記載された手段の任意の組合せ;からなる群から選択される手段によって達成される、請求項1に記載のトランスジェニック微生物。a、bおよびcの遺伝子に加えて、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子が発現する、請求項1に記載のトランスジェニック微生物。目的の非天然生産物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルからなる群から選択される、請求項1に記載のトランスジェニック微生物。目的の非天然生産物が、オメガ-3脂肪酸およびオメガ-6脂肪酸からなる群から選択され;そしてcの少なくとも1つの異種遺伝子が、デルタ-12デサチュラーゼ、デルタ-6デサチュラーゼ、デルタ-8デサチュラーゼ、デルタ-5デサチュラーゼ、デルタ-17デサチュラーゼ、デルタ-15デサチュラーゼ、デルタ-9デサチュラーゼ、デルタ-4デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼ、C20/22エロンガーゼおよびデルタ-9エロンガーゼからなる群から選択される、請求項4に記載のトランスジェニック微生物。微生物が、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類からなる群から選択される、請求項1に記載のトランスジェニック微生物。酵母が、油性酵母である、請求項6に記載のトランスジェニック微生物。トランスジェニック油性酵母であって:aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;b6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;c目的の非天然生産物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子であって、目的の生産物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも1つのキノン由来化合物、少なくとも1つのカロテノイドおよび少なくとも1つのステロールからなる群から選択される、該異種遺伝子と;を含み、aおよびbの協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし;そしてcを含み、aおよびbを欠いているか、または協調的調節様式でaおよびbを過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母におけるcの発現によって生産される目的生産物の量が増加している;トランスジェニック油性酵母。油性酵母が、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaである、請求項8に記載のトランスジェニック油性酵母。前記少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、ガンマ-リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ-ガンマ-リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ-6ドコサペンタエン酸、アルファ-リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ-3ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、請求項8または9に記載のトランスジェニック油性酵母。cを含み、aおよびbを欠いているか、または協調的調節様式でaおよびbを過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産される総脂質含量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量および少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸量に加えて、総脂質含量が増加している、請求項10に記載のトランスジェニック油性酵母。少なくとも1つのカロテノイドが、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β-クリプトキサンチン、α-カロテン、β-カロテン、β、ψ-カロテン、δ-カロテン、ε-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、γ-カロテン、ψ-カロテン、4-ケト-γ-カロテン、ζ-カロテン、α-クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、7,8-ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β-イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、4-ケト-ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン-β-ジグルコシド、ゼアキサンチン、CC30カロテノイドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載のトランスジェニック油性酵母。少なくとも1つのキノン由来化合物が、ユビキノン、ビタミンK化合物およびビタミンE化合物ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載のトランスジェニック油性酵母。少なくとも1つのステロール化合物が、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、7-デヒドロコレステロールプロビタミンD3およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項8に記載のトランスジェニック油性酵母。目的の非天然生産物の生産のための方法であって:aトランスジェニック微生物を備えるステップであって:iグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;ii6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と;iii目的の非天然生産物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子と;を含み、iおよびiiが協調的調節様式で過剰発現され、iおよびiiを欠いているか、または協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生産が増加している、該ステップと;b発酵性炭素源の存在下でステップaのトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生産物の生産をiiiの発現によりもたらすステップと;c場合によって、目的の非天然生産物を回収するステップと;を含む、上記方法。第1の実施形態では、本発明は、トランスジェニック微生物であって、aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、b6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、c目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子とを含み、目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも1つの酵素反応を含み、aおよびbの協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし、cを含み、かつaおよびbを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生成物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物におけるcの発現によって生成される目的生成物の量が増加している、トランスジェニック微生物に関する。さらに、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が、aG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子が、第1のプロモーターに作動可能に連結し、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子が、第2のプロモーターに作動可能に連結し、第1のプロモーターの活性が、第2のプロモーターと比較すると、同等または減少していること、bG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子が、多重コピーで発現し、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子が、多重コピーで発現し、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数が、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少していること、cG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性が、マルチザイムmultizymeとして6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性に連結していること、およびda、bおよびcに述べられた手段の任意の組合せ、からなる群から選択される手段によって達成される。第2の実施形態では、本発明は、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子が、a、bおよびcの遺伝子に加えて発現する、上記トランスジェニック微生物に関する。第3の実施形態では、本発明は、目的の非天然生成物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルからなる群から選択される上記トランスジェニック微生物に関する。第4の実施形態では、本発明は、a目的の非天然生成物が、オメガ-3脂肪酸およびオメガ-6脂肪酸からなる群から選択され、かつbcの少なくとも1つの異種遺伝子が、デルタ-12デサチュラーゼ、デルタ-6デサチュラーゼ、デルタ-8デサチュラーゼ、デルタ-5デサチュラーゼ、デルタ-17デサチュラーゼ、デルタ-15デサチュラーゼ、デルタ-9デサチュラーゼ、デルタ-4デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼ、C20/22エロンガーゼおよびデルタ-9エロンガーゼからなる群から選択される、上記トランスジェニック微生物に関する。第5の実施形態では、本発明は、前記トランスジェニック微生物が、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類からなる群から選択されるトランスジェニック微生物に関する。より具体的には、好ましいトランスジェニック微生物は油性酵母である。第6の実施形態では、本発明は、トランスジェニック油性酵母であって、aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、b6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、c目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子であって、目的の生成物が、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも1つのキノン誘導体化合物、少なくとも1つのカロテノイドおよび少なくとも1つのステロールからなる群から選択される異種遺伝子とを含み、aおよびbの協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし、cを含み、かつaおよびbを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生成物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母におけるcの発現によって生成される目的生成物の量が増加している、トランスジェニック油性酵母に関する。より具体的には、本発明のトランスジェニック油性酵母はヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaである。第7の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、ガンマ-リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ-ガンマ-リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ-6ドコサペンタエン酸、アルファ-リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ-3ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。第8の実施形態では、本発明は、cを含み、かつaおよびbを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生成される総脂質含量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量および少なくとも1つの多価不飽和脂肪酸量に加えて、総脂質含量が増加している、上記トランスジェニック油性酵母に関する。第9の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのカロテノイドが、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリンcapsorubrin、β-クリプトキサンチン、α-カロテン、β-カロテン、β,ψ-カロテン、δ-カロテン、ε-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、γ-カロテン、ψ-カロテン、4-ケト-γ-カロテン、ζ-カロテン、α-クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、7,8-ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β-イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、4-ケト-ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン-β-ジグルコシド、ゼアキサンチン、C30カロテノイド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。第10の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのキノン誘導体化合物が、ユビキノン、ビタミンK化合物およびビタミンE化合物、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、上記トランスジェニック油性酵母に関する。第11の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのステロール化合物が、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、7-デヒドロコレステロールプロビタミンD3およびそれらの組合せからなる群から選択される、トランスジェニック油性酵母に関する。第12の実施形態では、本発明は、目的の非天然生成物の生成のための方法であって、aトランスジェニック微生物を提供するステップであって、iグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、ii6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子と、iii目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子とを含み、iおよびiiが協調的調節様式で過剰発現され、iおよびiiを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生成が増加している、ステップと、b発酵性炭素源の存在下でステップaのトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生成物をiiiの発現により生成させるステップと、c場合によって、目的の非天然生成物を回収するステップとを含む方法に関する。生物学的寄託以下の生物学的材料は、米国培養細胞系統保存機関AmericanTypeCultureCollectionATCC,10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209に寄託されており、以下の名称、登録番号および寄託日を有する。上に記載された生物学的材料は、BudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposesofPatentProcedureの条項下で寄託された。記載の寄託物は指定の国際寄託機関に少なくとも30年間維持され、それを開示する特許の交付時に一般に利用可能となる。寄託物の利用可能性は、政府行為により交付された特許権の適用外で、本発明を実施するためのライセンスを構成しない。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305Uは、米国特許出願公開第2008-0254191号明細書に記載の方法論に従って、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4128から誘導した。本明細書で引用されたすべての特許文献および非特許文献の開示は、それらの内容全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。本開示では、以下の略語を使用する。翻訳領域はORFと略す。ポリメラーゼ連鎖反応はPCRと略す。米国培養細胞系統保存機関はATCCと略す。ペントースリン酸経路はPP経路と略す。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸は、NADPまたはその還元型ではNADPHと略す。グルコース-6-リン酸はG-6-Pと略す。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼはG6PDHと略す。6-ホスホグルコノラクトナーゼは6PGLと略す。6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼは6PGDHと略す。多価不飽和脂肪酸はPUFAと略す。トリアシルグリセロールはTAGと略す。総脂肪酸はTFAと略す。脂肪酸メチルエステルはFAMEと略す。乾燥細胞重量はDCWと略す。本明細書で使用する用語発明または本発明は、限定することを意図するものではなく、特許請求の範囲に定義されたかまたは本明細書に記載された任意の発明に一般に適用するものである。用語ペントースリン酸経路[PP経路]、ホスホグルコン酸経路およびヘキソース一リン酸側路は、2つの別個の段階で起こるサイトゾル過程を指す。非酸化段階は、ヌクレオチドおよび核酸を構築するための基質へのリボース-5-リン酸の変換を担っている。次の化学反応:グルコース-6-リン酸2NADPH2O→リブロース-5-リン酸2NADPH2HCO2で要約することができる酸化段階は、細胞内の還元的生合成反応のためのNADPH還元当量を生成する役目をする。より具体的には、表1および図1に前述したとおり、酸化段階で起こる反応は、脱水素、加水分解および酸化的脱炭酸を含む。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸[NADP]およびその還元型NADPHは、CAS登録番号53-59-8を有する補因子ペアである。NADPは、還元剤としてNADPHを必要とする同化反応に使用される。動物では、PP経路の酸化段階は、細胞NADPHの主要な供給源であり、必要なNADPHの約60を生成する。NADPHは、シトクロムP450による水酸化例えば芳香族化合物、ステロイド、アルコールの水酸化ならびに種々の生合成反応例えば脂肪酸鎖伸長ならびに脂質、コレステロールおよびイソプレノイドの合成に還元当量を提供する。加えて、NADPHは、活性酸素種の毒性に対する防御に関与する酸化還元のための還元当量を提供する。用語グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PD]は、脱水素を介してグルコース-6-リン酸[G-6-P]の6-ホスホグルコノラクトンへの変換を触媒する酵素[E.C.1.1.1.49]を指す。用語6-ホスホグルコノラクトンは、CAS登録番号2641-81-8を有する化合物を指す。これらのホスホグルコノラクトンは分子内変換を通してデルタ型またはガンマ型のいずれかになる。用語6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]は、加水分解によりデルタ-6-ホスホグルコノラクトンの6-ホスホグルコン酸への変換を触媒する酵素を指す[E.C.3.1.1.31]。用語6-ホスホグルコン酸は、CAS登録番号921-62-0を有する化合物を指す。用語6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ[6PGDH]は、酸化的脱炭酸を介して、NADPHおよび二酸化炭素と共に、6-ホスホグルコン酸のリブロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素を指す[E.C.1.1.1.44]。用語G6PDおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現は、ほぼ同量のG6PDHおよび6PGLの活性が、PP経路を通るバランスのとれたフラックスを維持するために、細胞内で共発現するか、またはG6PDH活性が6PGL活性より少ないように共発現することを意味する。これにより、6PGL活性が6-ホスホグルコノラクトンのデルタ型[δ-6-PG-L]の加水分解を加速し、それ故、ガンマ型[γ-6-PG-L]への変換が防止されて、高濃度のδ-6-P-G-Lの蓄積が防止されることが保証される。用語多重コピーでの発現は、遺伝子コピー数が2以上であることを意味する。用語マルチザイムまたは融合タンパク質は、少なくとも2つの独立して分離可能な酵素活性を有し、第1の酵素活性が第2の酵素活性に連結していることが好ましい単一ポリペプチドを指す米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書。少なくとも2つの独立して分離可能な酵素活性間の連結または結合は、最小で1つのポリペプチド結合から構成されるが、プロリンもしくはグリシンなどの1つのアミノ酸残基または少なくとも1つのプロリンまたはグリシンのアミノ酸残基を含むポリペプチドから構成されることもある。さらに、米国特許出願公開第2008-0254191-A1号明細書は、その明細書中の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号7からなる群から選択されるいくつかの好ましいリンカーについて記載している。用語目的の非天然生成物は、野生型微生物内で天然には生成されない任意の生成物を指す。典型的には、目的の生成物である異種タンパク質の発現を可能にするために、宿主微生物へ適切な異種遺伝子を導入する組換え手段によって、目的の非天然生成物は生成される。本明細書における本発明の目的のためには、目的の非天然生成物の生合成は、還元当量としてNADPHを利用する少なくとも1つの酵素反応を必要とする。好ましい目的の非天然生成物の非限定例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルが挙げられる。用語目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子は、それが導入される宿主微生物とは異なる起源に由来する遺伝子を指す。異種遺伝子は、宿主微生物における目的の非天然生成物の生成を促進する。一部の場合では、中間段階または経路中間体をまったく経ずに、所望する目的の生成物への基質の直接変換を触媒する単一の異種遺伝子のみが、目的の生成物の生成を可能にするために必要となり得る。あるいは、所望する目的の非天然生成物を生成するための一連の反応が起こるように、新しい生合成経路をコードする一連の遺伝子を微生物へ導入することが望ましい場合もある。用語油性は、エネルギー源をオイルの形態で貯蔵する傾向がある生物を指すWeete,In:FungalLipidBiochemistry,2ndEd.,Plenum,1980。一般に、油性微生物の細胞オイル含量はシグモイド曲線に従い、脂質濃度は、後期対数増殖期または初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次いで、後期定常期および死滅期の間に徐々に減少するYongmanitchaiandWard,Appl.Environ.Microbiol.,57:419-251991。油性微生物が乾燥細胞重量の約25を超えてオイルを蓄積することはまれではない。用語油性酵母は、オイルを生成することができる酵母と分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、決してこれらに限定されるものではないが、次の属、すなわちヤロウィアYarrowia、カンジダCandida、ロドトルラRhodotorula、ロドスポリジウムRhodosporidium、クリプトコックスCryptococcus、トリコスポロンTrichosporonおよびリポマイセスLipomycesが挙げられる。用語ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、核酸配列、核酸断片および単離核酸断片は、本明細書において互換的に使用する。これらの用語はヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変のヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAのポリマーとすることができる。DNAポリマーの形態にあるポリヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはそれらの混合物の1つまたは複数のセグメントから構成することができる。ヌクレオチド通常、5’-一リン酸形態で見出されるは、次の一文字名により表す。アデニル酸またはデオキシアデニル酸それぞれRNAまたはDNAに対応に対してはA、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対してはC、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対してはG、ウリジル酸に対してU、デオキシチミジル酸に対してはT、プリンAまたはGに対してはR、ピリミジンCまたはTに対してはY、GまたはTに対してはK、AまたはCまたはTに対してはH、イノシンに対してはI、任意のヌクレオチドに対してはNである。一本鎖形態の核酸断片が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で別の核酸断片にアニールすることができる場合、核酸断片は、cDNA、ゲノムDNAまたはRNA分子などの別の核酸断片にハイブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、参照によって本明細書に組み込むSambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989の特に第11章および表11.1に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片遠縁の生物からの相同配列などから高度に類似した断片機能性酵素を再現する、近縁の生物からの遺伝子などまでスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の1セットは、6×SSC、0.5SDS、室温で15分間に始まり、次いで2×SSC、0.5SDS、45°Cで30分間を反復し、さらに0.2×SSC、0.5SDS、50°Cで30分間を2回反復する一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましいセットは、より高温を使用するが、その洗浄は、最後の2回の0.2×SSC、0.5SDS、30分間洗浄の温度を60°Cに上昇させることを除いて上記のものと同じである。高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、最後の2回に0.1×SSC、0.1SDS、65°Cの洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のさらなるセットとして、例えば、0.1×SSC、0.1SDS、65°Cでのハイブリダイゼーションおよび2×SSC、0.1SDS、次いで0.1×SSC、0.1SDSでの洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能となるけれども、ハイブリダイゼーションには、2つの核酸が相補的配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、それらの配列を有する核酸ハイブリッドの熱融解点[TmまたはTm]の値は高くなる。Tmの高さに対応する、核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性は、RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNAの順序で低下する。長さが100超のヌクレオチドのハイブリッドについては、Tmの計算式が誘導されているSambrookら、前出、9.50-9.51を参照のこと。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定するSambrookら、前出、11.7-11.8を参照のこと。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約20ヌクレオチドであり、最も好ましくは、その長さは少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに、当業者ならば、温度および洗浄液塩濃度は、プローブの長さなどの要因に応じて必要なときに調整することができることを認識されよう。アミノ酸またはヌクレオチド配列の実質的な部分とは、当業者による配列のマニュアル評価またはBasicLocalAlignmentSearchTool[BLAST]Altschul,S.F.,etal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101993などのアルゴリズムを使用する、コンピュータによる自動配列比較および同定のいずれかによって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、10以上の連続したアミノ酸配列または30以上のヌクレオチド配列が、既知のタンパク質または遺伝子に相同なものとしてポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、20~30の連続したヌクレオチドを含む、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークのinsituハイブリダイゼーションなど、遺伝子同定例えばサザンハイブリダイゼーションおよび単離の配列依存的方法に使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、12~15塩基の短いオリゴヌクレオチドを、PCRの増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定および/または単離するのに十分な配列を含む。本明細書に報告された配列の利益を受ける当業者は、本明細書に記載の方法論に基づいて、当業者に周知の目的のために本開示の配列の全部または実質的な部分を今や使用することができる。用語相補的は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用する。例えば、DNAに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。用語相同性および相同は互換的に使用する。これらは、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現の媒介または特定の表現型の生成に対する遺伝子断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未改変断片に比較して、得られる核酸断片の機能特性が実質的に変化しない、1つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の改変を指す。さらに、当業者は、相同な核酸配列はまた、0.5×SSC、0.1SDS、60°Cなどの中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例示した配列またはその配列と機能的に同等である、本明細書に開示のヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片をスクリーニングするように調整することができる。用語選択的にハイブリダイズするは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも顕著に検出できる程度例えばバックグラウンドの少なくとも2倍に、指定の核酸標的配列に核酸配列がハイブリダイズすることおよび非標的核酸が実質的に除外されることへの言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的には、互いに少なくとも約80の配列同一性または90の配列同一性、最大100の配列同一性すなわち、完全に相補的を有する。用語ストリンジェントな条件またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なることになる。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに100相補的な標的配列を同定することができる相同プロービング。あるいは、ストリンジェンシー条件は、低度の類似性を検出するように、配列中のミスマッチを幾分許容するように調整することができる非相同プロービング。一般に、プローブの長さは、約1000ヌクレオチド未満、場合によっては500ヌクレオチド未満である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH7.0~8.3において、約1.5M未満のNaイオン、典型的には約0.01~1.0MのNaイオン濃度または他の塩であり、温度が、短いプローブ例えば10~50ヌクレオチドについては少なくとも約30°C、長いプローブ例えば50を超えるヌクレオチドについては少なくとも約60°Cであるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。代表的な低ストリンジェンシー条件は、30~35ホルムアミド、1MNaCl、1SDSドデシル硫酸ナトリウム緩衝液を用いた37°Cでのハイブリダイゼーションおよび1×~2×SSC20×SSC=3.0MNaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウムによる50~55°Cでの洗浄を含む。代表的な中程度ストリンジェンシー条件は、40~45ホルムアミド、1MNaCl、1SDSを用いた37°Cでのハイブリダイゼーションおよび0.5×~1×SSCによる55~60°Cでの洗浄を含む。代表的な高ストリンジェンシー条件は、50ホルムアミド、1MNaCl、1SDSを用いた37°Cでのハイブリダイゼーションおよび0.1×SSCによる60~65°Cでの洗浄を含む。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の働きによるものであり、重要な要因は最終洗浄液のイオン強度および温度である。DNA-DNAハイブリッドについては、Tmは、Meinkothetal.,Anal.Biochem.,138:267-2841984の式、Tm=81.5°C16.6logM0.41GC-0.61form-500/Lから近似することができ、式中、Mは一価カチオンのモル濃度、GCはDNA中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセント、formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセント、Lは塩基対中のハイブリッドの長さである。Tmは、相補的な標的配列の50が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする規定のイオン強度およびpHの下で温度である。Tmは、1のミスマッチ当たり約1°C低下するので、Tm、すなわちハイブリダイゼーションおよび/または洗浄の条件を、所望の同一性を有する配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、≧90超の同一性を有する配列を探す場合、Tmを10°C低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHにおける、特定の配列とその相補配列とのTmよりも約5°C低いように選択する。しかしながら、厳密にストリンジェントな条件では、Tmよりも1、2、3または4°C低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件では、Tmよりも6、7、8、9または10°C低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件では、Tmよりも11、12、13、14、15または20°C低いハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を利用することができる。式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の組成物ならびに所望のTmを使用すると、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄の溶液のストリンジェンシーにおける変更を当然記述できることを当業者ならば理解されよう。所望のミスマッチ程度が45°C水溶液または32°Cホルムアミド溶液未満のTmをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにSSC濃度を増加させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,Elsevier,NewYork1993およびCurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2,Ausubeletal.,Eds.,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork1995に見出される。ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄の条件は、少なくとも10、30、60、90、120または240分間適用することができる。用語パーセント同一性は、配列の比較により決定される、2つ以上のポリペプチド配列間または2つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。パーセント同一性は、場合によっては、比較配列間のマッチのパーセントにより決定されるポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列関連度も意味する。パーセント同一性およびパーセント類似性は、これらに限定されないが、1ComputationalMolecularBiologyLesk,A.M.,Ed.OxfordUniversity:NY1988;2Biocomputing:InformaticsandGenomeProjectsSmith,D.W.,Ed.Academic:NY1993;3ComputerAnalysisofSequenceData,PartIGriffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.Humania:NJ1994;4SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinje,G.,Ed.Academic1987;および5SequenceAnalysisPrimerGribskov,M.andDevereux,J.,Eds.Stockton:NY1991に記載のものを含む、公知の方法によって容易に計算することができる。パーセント同一性を決定する好ましい方法は、試験配列間に最良のマッチを与えるように設計されている。パーセント同一性およびパーセント類似性を決定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス計算スイートDNASTARInc.,Madison,WIのMegAlign商標プログラムを使用して実施することができる。配列の多重アライメントは、アライメントのClustalV法およびアライメントのClustalW法HigginsandSharp,CABIOS,5:151-1531989;Higgins,D.G.etal.,Comput.Appl.Biosci.,8:189-1911992に記載を含む数種類のアルゴリズムを包含し、LASERGENEバイオインフォマティクス計算スイートDNASTARInc.のMegAlign商標バージョン8.0.2プログラムの中にあるアライメントのClustal法を使用して実施する。いずれかのClustalプログラムを使用して配列アライメントをした後、プログラム中の配列距離表を見ることにより、パーセント同一性を得ることができる。アライメントのBLASTN法は、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較するための国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformation[NCBI]により提供されるアルゴリズムであり、一方、アライメントのBLASTP法は、デフォルトパラメーターを使用して、タンパク質配列を比較するためのNCBIにより提供されるアルゴリズムである。同一または類似の機能または活性を有する他種由来のポリペプチドを同定する際に、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者は十分理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書に記載の方法および宿主細胞において単離した、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に報告したアミノ酸配列に対して少なくとも約70~85同一のポリペプチドをコードし、一方、より好ましい核酸断片は、少なくとも約85~95同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上記のとおりであるが、パーセント同一性の有用な例としては、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99などの50~100間の任意の整数パーセントが挙げられる。さらに、この単離したヌクレオチド断片のいずれの全長相補物もまたは部分的相補物も目的のものである。適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも50アミノ酸、好ましくは少なくとも100アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも200アミノ酸、最も好ましくは少なくとも250アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。用語コドン縮重は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号における性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が示すコドンバイアスについて十分承知している。したがって、宿主細胞における発現の改善を目的として遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが好ましい。合成遺伝子は、当業者に公知の手順を使用して、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチドビルディングブロックをアニールし、次いで連結して遺伝子セグメントを形成した後、酵素的に組み立てて全遺伝子を構築する。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のための遺伝子を構築することができる。当業者は、宿主が好むコドンの方向へコドン使用をバイアスすると、遺伝子発現が成功する可能性が高まることを認識している。好ましいコドンは、配列情報が利用可能である、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて決定することができる。例えば、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaのコドン使用プロフィールは米国特許第7,125,672号明細書に提供されている。遺伝子は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、コード領域のみを指すことも、またはコード配列の前5’非コード配列およびコード配列の後3’非コード配列に調節配列を含むこともある。天然遺伝子は、それ自体の調節配列を有する、天然に見出される遺伝子を指す。キメラ遺伝子は、天然では一緒に見出されることがない制御配列およびコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。内在性遺伝子は、生物ゲノム内のその天然位置にある天然遺伝子を指す。外来遺伝子は、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。導入遺伝子は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。コドン最適化遺伝子は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計された、そのコドン使用頻度を有する遺伝子である。コード配列は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。適切な調節配列は、コード配列の上流5’非コード配列、内部または下流3’非コード配列に位置し、転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、5’非翻訳リーダー配列例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンの間、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を挙げることができる。プロモーターは、コード配列または機能RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対して3’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来することも、または天然に見出される様々なプロモーターに由来した様々なエレメントから構成されていることも、または合成DNAセグメントまで含むこともある。異なる組織もしくは細胞型において、または異なる発生段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが遺伝子の発現を指示し得ることを当業者は理解している。ほぼ常に大部分の細胞型で遺伝子の発現を誘導するプロモーターは、一般に、構成的プロモーターと呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全には画定されていないので、様々な長さのDNA断片が同一のプロモーター作用を示す可能性があることもまた認識されている。用語3’非コード配列および転写ターミネーターは、コード配列の下流に位置するDNA配列を指す。これには、mRNAプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化認識配列およびその他の調節配列をコードする配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。3’領域は、転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすことができる。RNA転写物は、RNAポリメラーゼが触媒するDNA配列の転写により生じる生成物を指す。RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、その転写物は転写一次産物と呼ばれ、または転写一次産物の転写後プロセシングから生じたRNA配列である場合は、成熟RNAと呼ばれる。メッセンジャーRNAまたはmRNAは、イントロンがなく、かつ細胞がタンパク質に翻訳することができるRNAを指す。cDNAは、mRNAに相補的で、それに由来する二本鎖DNAを指す。センスRNAは、mRNAを含み、その故細胞がタンパク質に翻訳することができるRNA転写物を指す。アンチセンスRNAは、標的転写一次産物またはmRNAの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現を阻止するRNA転写物を指す米国特許第5,107,065号明細書;国際公開第99/28508号パンフレット。用語作動可能に連結されるは、一方の機能が他方の機能に影響を及ぼすように、単一核酸断片上で核酸配列が結合していることを指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を及ぶすことができる場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で調節配列に作動可能に連結することができる。用語組換え体は、例えば化学合成により、または遺伝子工学技術を用いる核酸の単離セグメントの操作により、さもなければ別々の2つの配列を人為的に組合せたものを指す。本明細書で使用する用語発現は、核酸断片に由来したセンスmRNAまたはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。したがって、本明細書で使用する用語発現は、機能性最終生成物例えばmRNAまたはタンパク質[前駆体または成熟のいずれか]の生成を指す。形質転換は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物への核酸分子の移入を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドである場合も、または宿主生物のゲノムへ組み込まれる場合もある。トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物は、形質転換手順により核酸断片を含有する細胞または生物を指す。トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物はまた、組換え、形質転換または形質転換体細胞または生物と呼ばれる。用語プラスミドおよびベクターは、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖DNA断片の形態をとる染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたは任意の供給源に由来する一本鎖もしくは二本鎖のDNAもしくはRNAの線状もしくは環状のヌクレオチド配列とすることができ、そこでは、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組換えされて、細胞に発現カセットを導入することができるユニークな構築物になっている。用語発現カセットは、外来遺伝子を含有し、かつ外来宿主においてその遺伝子の発現を増強させることができるエレメントを、外来遺伝子に加えて有するDNAの断片を指す。一般に、発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列ならびに選択された遺伝子生成物の発現に必要とされる、コード配列の前5’非コード配列および後3’非コード配列の調節配列を含むことになる。したがって、発現カセットは、典型的には、1プロモーター配列、2コード配列、すなわち翻訳領域[ORF]、および33’非翻訳領域、すなわち真核生物では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは、通常、クローニングおよび形質転換を容易にするためにベクター内に含まれる。それぞれの宿主に対して適正な調節配列を使用する限り、様々な発現カセットを、細菌、酵母、植物および哺乳類の細胞を含む様々な生物に形質転換することができる。用語組換えコンストラクト、発現コンストラクトおよびコンストラクトは、本明細書において互換的に使用する。組換えコンストラクトは、例えば天然に一緒に見出すことはない調節配列およびコード配列などの核酸断片の人為的な組合せを含む。例えば、組換えコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列を含むことも、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むこともある。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することも、またはベクターと共に使用することもできる。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者には周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本明細書に記載の任意の単離核酸断片を含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントを十分承知している。当業者はまた、独立した異なる形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらしJonesetal.,EMBOJ.,4:2411-24181985;DeAlmeidaetal.,Mol.Gen.Genetics,218:78-861989、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す株または系統を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。用語配列分析ソフトウェアは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは市販のものでも、または独立に開発されたものでもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、これらに限定されないが、1GCGプログラムスイートWisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WI、2BLASTP、BLASTN、BLASTXAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101990、3DNASTARDNASTAR,Inc.Madison,WI、4SequencherGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI、および5Smith-Watermanアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムW.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.]1994,MeetingDate1992,111-20.Editors:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NYが挙げられる。本記載内では、配列分析ソフトウェアを解析に使用する場合は常に、特に指示がない限り、分析結果は、参照プログラムのデフォルト値に基づくものである。本明細書で使用するデフォルト値は、ソフトウェアを最初に初期化したときに、初めにロードされる値またはパラメーターの任意のセットを意味する。本明細書で使用する標準の組換えDNAおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989これ以降Maniatis、Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1984、およびAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,Hoboken,NJ1987により記載されている。ペントースリン酸経路の酸化分岐は、上述のとおり、3つの酵素、すなわちグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]、6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]および6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ[6PGDH]を含む。しかしながら、G6PDHはPP経路の律速酵素であり、NADPによりアロステリック的に促進されるその結果、低濃度のNADPは解糖系にG-6-Pを振り向けるが、高濃度のNADPはPP経路にG-6-Pを振り向ける。PP経路の酵素、特にG6PDHは詳細に研究されている。これは、G6PDH欠損が、世界中で4億を超える人々に存在し、アフリカ、地中海およびアジアの系統の人々が最大の有病率を示す世界で最も一般的なヒト酵素欠損症である結果である。具体的には、G6PDH欠損は、いくつかの原因、最も一般的には感染または特定の医薬品または化学物質への曝露に呼応した、異常に低レベルのG6PDHおよび非免疫性溶血性貧血を特徴とするX連鎖劣性遺伝病である。1998年の時点で、いずれも完全に不活性というわけではないが、欠陥のあるG6PD遺伝子によりコードされた、ほぼ100種の異なる形態のG6PD酵素分子が知られていた---このことはG6PDがヒトにおいて不可欠であることを示唆する。部分的および全体的なゲノム配列が利用可能であるため、G6PDH、6PGLおよび6PGDHをコードする数多くの遺伝子配列が公的に利用可能である。例えば、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaのG6PDH、6PGLおよび6PGDHのタンパク質に対して高い相同性を有するG6PDH、6PGLおよび6PGDHの配列を、それぞれ表3、4および5に示す。当技術分野で周知のとおり、これらの配列から、配列分析ソフトウェアを使用して、同種または他種のG6PDH、6PGLおよび/または6PGDHのホモログをそれぞれ容易に探索することができる。一般に、このようなコンピュータソフトウェアは、種々の置換、欠失およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。表3、表4または表5の任意のG6PDH、6PGLおよび/または6PGDHのタンパク質を核酸またはタンパク質の配列データベースに対して比較し、それによって好ましい生物内の類似の公知配列を同定するために、低複雑性フィルターlowcomplexityfilterおよび以下のパラメーター:期待値Expectvalue=10およびマトリックス=Blosum62を用いるBLATPアライメント法Altschul,etal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-34021997などのソフトウェアアルゴリズムを使用することはよく知られている。公知配列のデータベースの中を検索するためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表3、表4および表5にそれぞれ記載されている配列など、G6PDH、6PGLおよび/または6PGDHの公的に利用可能な配列に対して比較的低いパーセント同一性を有するホモログの単離に特に適している。G6PDH、6PGLおよび/または6PGDHの公的に利用可能な配列に対して少なくとも約70~85同一であるG6PDH、6PGLおよび/または6PGDHのホモログの単離は比較的容易であると予測できる。さらに、少なくとも約85~90同一であるそれらの配列は、単離に特に適しており、少なくとも約90~95同一である配列は、最も容易に単離されよう。一部のG6PDHホモログは、G6PDH酵素にユニークなモチーフの使用によっても単離されている。例えば、G6PDHがNADP結合モチーフを有することは周知であるLevy,H.,etal.,Arch.Biochem.Biophys.,326:145-1511996。保存ドメインのこれらの領域は、特定の位置に高度に保存された1組のアミノ酸に対応し、G6PDHタンパク質の構造、安定性または活性にとって不可欠なG6PDHタンパク質の領域を表している可能性が高い。モチーフは、タンパク質ホモログファミリーのアライメントされた配列が高度に保存されていることにより同定される。ユニークなサインとしてのモチーフにより、新しく決定された配列を有するタンパク質が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するものか否かを決定することができる。これらのモチーフは、新規G6PDH遺伝子を迅速に同定するための診断ツールとして有用である。あるいは、G6PDH、6PGLおよび/または6PGDHの公的に利用可能な配列またはそれらのモチーフをホモログ同定用のハイブリダイゼーション試薬とすることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素としては、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると推測される試料および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、典型的には、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列にハイブリダイズ可能である。プローブ長は5塩基から数万塩基まで変動し得るが、典型的には、約15塩基~約30塩基のプローブ長が適している。プローブ分子の一部のみが、検出すべき核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイズした領域にある塩基の特定の分画が適切な相補的塩基と対を形成しない結果となりながらも、ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間で起こる。ハイブリダイゼーション法は周知である。典型的には、プローブおよび試料を、核酸ハイブリダイゼーションが可能となる条件下で混合しなければならない。これには、適切な濃度および温度の条件下で、無機塩または有機塩の存在においてプローブと試料を接触させるステップが含まれる。プローブと試料核酸の間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起こるのに十分長い時間、プローブと試料核酸を接触させていなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定される。プローブまたは標的の濃度が高いほど、必要とするハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短縮される。場合によっては、塩酸グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムまたはトリフルオロ酢酸セシウムなどのカオトロピック剤を添加してもよい。所望により、ハイブリダイゼーション混合物に、ホルムアミドを典型的には30~50v/v[容積単位]で添加することができる。種々のハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。典型的には、これらの溶液は、約20~60容積、好ましくは30容積の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約30~50v/vのホルムアミド、約0.15~1Mの塩化ナトリウム、約0.05~0.1Mの緩衝液例えば、クエン酸ナトリウム、Tris-HCl、PIPESまたはHEPESpHは約6~9の範囲、約0.05~0.2の界面活性剤例えばドデシル硫酸ナトリウム、または0.5~20mMの間のEDTA、FICOLLPharmaciaInc.約300~500kdal、ポリビニルピロリドン約250~500kdalおよび血清アルブミンを使用する。さらに、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約0.1~5mg/mLの非標識キャリア核酸、子ウシ胸腺DNAもしくはサケ精子DNAなどの断片化核DNAまたは酵母RNA、および場合によっては、約0.5~2wt/vol[重量/容積]のグリシンが含まれる。極性の水溶性剤または膨潤剤例えばポリエチレングリコール、アニオン性ポリマー例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートおよびアニオン性糖ポリマー硫酸デキストランなどを含む容積排除剤volumeexclusionagentなどの他の添加物を含めてもよい。核酸ハイブリダイゼーションは様々なアッセイ形式に適応可能である。最も適したものの1つはサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能となる。サンドイッチ型アッセイの主要構成要素は固体担体である。固体担体は、非標識で配列の一部に相補的である固定化核酸プローブを吸着または共有結合させている。本明細書または公開文献に記載されているG6PDH、6PGLおよび/もしくは6PGDHの任意の核酸断片または同定された任意のホモログを使用して、同種または他種からホモログタンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存プロトコールを使用するホモログ遺伝子の単離は当技術分野で周知である。配列依存プロトコールの例としては、これらに限定されないが、1核酸ハイブリダイゼーション法、2ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]米国特許第4,683,202号明細書、リガーゼ連鎖反応[LCR]Tabor,S.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:10741985または鎖置換増幅[SDA]Walker,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:3921992などの核酸増幅技術の種々の使用により例示されるDNAおよびRNA増幅法、ならびに3相補性によるライブラリー構築およびスクリーニングの方法が挙げられる。例えばG6PDH、6PGLおよび/または6PGDHの公的に利用可能な遺伝子またはそれらのモチーフに類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、それらの公的に利用可能な核酸断片の全部または一部をDNAハイブリダイゼーションプローブとして使用し、周知の方法によって所望の任意の生物からのライブラリーをスクリーニングすることにより直接単離することができよう。公的に利用可能な核酸配列に基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で公知の方法により設計および合成することができる上記Maniatis。さらに、配列全体を直接使用して、ランダムプライマーDNA標識化、ニックトランスレーション法もしくは末端標識化手法などの当業者に公知の方法によるDNAプローブ合成または利用可能なinvitro転写システムを使用するRNAプローブ合成を行うことができる。さらに、特定のプライマーを設計および使用して、公的に利用可能な配列またはそれらのモチーフの一部または全長を増幅することができる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識するか、または増幅反応の後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下で全長DNA断片を単離するためのプローブとして使用することができる。まさに議論した周知の方法のいずれかに基づいて、選択した好ましい任意の生物において、G6PDH、6PGLおよび/または6PGDHの遺伝子ホモログを同定および/または単離することが可能であろう。複雑な分子がより小さな単位から合成される、細胞内の大部分の同化過程は、アデノシン三リン酸[ATP]またはNADPHのいずれかによりエネルギーを供給される。NADPHに関しては、PP経路の酸化段階が細胞におけるNADPHの主要な供給源であり、必要なNADPHの約60が生成される。したがって、G6PDH、6PGLおよび6PGDHにより触媒される反応は、細胞NADPHを生成するそれらの能力のために細胞の代謝において重要な役割を果たす。次いで、この分子は数多くの同化経路に還元当量を提供する。本発明は、NADPHの細胞内アベイラビリティを増加させ、それによって、この補因子をその生合成経路において必要とする非天然生成物の生成を増加させることに関する。より具体的には、目的の非天然生成物を生成するための方法であって、aトランスジェニック微生物を提供するステップであって、iグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]をコードする少なくとも1つの遺伝子と、ii6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]をコードする少なくとも1つの遺伝子と、iii目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子とを含み、目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸[NADPH]を必要とする少なくとも1つの酵素反応を含み、iおよびiiが協調的調節様式で過剰発現され、iおよびiiを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されるNADPH量と比較すると、NADPH量の生成が増加している、ステップと、b発酵性炭素源の存在下でステップaのトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生成物をiiiの発現により生成させるステップと、c場合によって、目的の非天然生成物を回収するステップとを含む方法を本明細書に記載する。より具体的には、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子を、協調的調節様式で過剰発現させるが、これは、a第2のプロモーターに比較すると、第1のプロモーターの活性が同等または低下している[すなわち、第1のプロモーターと第2のプロモーターが互いに同じかまたは異なっている]、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子の第1のプロモーターへの作動可能な連結および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の第2のプロモーターへの作動可能な連結、bG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数が、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少している、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子の多重コピーでの発現および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の多重コピーでの発現、cマルチザイムの作製による、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性の6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性への連結、およびda、bおよびcに述べられた手段の任意の組合せ、からなる群から選択される手段によって達成することができる。少なくとも1つのNADPH依存性反応を含む生合成ルートが過剰発現すると、NADPレベルが劇的に増加し、そのため、G6PDHが刺激されてNADPHがさらに生成することになる。上記の方法に関する一部の実施形態では、6PGDHをさらに発現させることにより、NADPHの細胞アベイラビリティのさらなる増加を得ることができる。少なくとも1つのNADPH依存性反応を有する目的の非天然生成物はいずれも、本発明のトランスジェニック微生物および/または方法を使用して生成することができる。NADPH依存性反応を有する非天然生成物の例としては、これらに限定されないが、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、キノインquinoine、スチルベン、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルが挙げられる。より具体的には、脂質合成では、NADPHは脂肪酸生合成に必要である。例えば具体的には、多価不飽和脂肪酸であるリノール酸[LA、18:2ω-6]の1分子の合成には、次の反応:9アセチルCoA8ATP16NADPH2NADH→LA8ADP16NADP2NADで示されるとおり、少なくとも16分子のNADPHが必要である。したがって、脂質合成はNADPHの細胞アベイラビリティに依存する。用語脂肪酸は、より長鎖およびより短鎖の酸が両方とも知られているが、鎖長が約C12~C22の範囲にある長鎖脂肪酸アルカン酸を指す。主な鎖長はC16からC22の間である。脂肪酸の構造はX:Yの単純な表記法で表し、ここで、Xは、特定の脂肪酸における炭素[C]原子の総数、Yは二重結合の数である。飽和脂肪酸対不飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸対多価不飽和脂肪酸[PUFA]およびオメガ-6脂肪酸[n-6]対オメガ-3脂肪酸[n-3]の間の差異に関するさらなる詳細は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第7,238,482号明細書に提供されている。米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書の表3には、オメガ-3およびオメガ-6PUFAとそれらの前駆体の化学名および一般名、ならびに一般に使用される略語について詳細にまとめられている。しかしながら、PUFA例の一部として、これらに限定されないが、リノール酸[LA、18:2ω-6]、ガンマ-リノレン酸[GLA、18:3ω-6]、エイコサジエン酸[EDA、20:2ω-6]、ジホモ-ガンマ-リノレン酸[GLA、20:3ω-6]、アラキドン酸[ARA、20:4ω-6]、ドコサテトラエン酸[DTA、22:4ω-6]、ドコサペンタエン酸[DPAn-6、22:5ω-6]、アルファ-リノレン酸[ALA、18:3ω-3]、ステアリドン酸[STA、18:4ω-3]、エイコサトリエン酸[ETA、20:3ω-3]、エイコサテトラエン酸[ETrA、20:4ω-3]、エイコサペンタエン酸[EPA、20:5ω-3]、ドコサペンタエン酸[DPAn-3、22:5ω-3]およびドコサヘキサエン酸[DHA、22:6ω-3]が挙げられる。NADPHが必要となるPUFA生合成のさらなる例として、グルコースからのEPA生合成を次の化学方程式:グルコース2ADP4NAD→2アセチルCoA2ATP4NADH2CO2式110アセチルCoA9ATP18NADPH5NADH→EPA9ADP18NADP5NAD式2によって示すことができる。コレステロール合成では、還元反応にNADPHが必要なため、1モルのコレステロール合成に複数モルのNADPHが必要となる。したがって、ステロール生合成はNADPHの細胞アベイラビリティに依存する。ステロール化合物の例としては、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、7-デヒドロコレステロールプロビタミンD3およびそれらの組合せが挙げられる。同様に、イソプレノイド生合成では、還元反応の電子供与体としてNADPHが必要となる。例えば、イソプレンの前駆体であるメバロン酸へのHMG-CoAの変換に2モルのNADPHが必要となる。また、他のイソプレノイドへのイソプレンのさらなる変換には、還元/不飽和化ステップでNADPHがさらに必要となる。用語イソプレノイド化合物は、イソプレン2-メチルブタ-1,3-ジエン;CH2=CCH3CH=CH2から形式的に誘導される化合物、すなわちその骨格が分子内に反復して存在することが全般的に認められる化合物を指す。これらの化合物は、イソペンテニルピロリン酸で始まるイソプレノイド経路を介して生合成的に生成するもので、イソプレン単位のヘッドトゥーテール縮合により形成し、長さが例えば5、10、15、20、30、または40炭素であり得る分子がもたらされる。したがって、例えばテルペン、テルペノイド、カロテノイド、キノン誘導体化合物、ドリコールおよびスクアレンがイソプレノイド化合物として挙げられるが、これらの化合物すべてについてその生合成は、NADPHの細胞アベイラビリティに依存する。本明細書で使用する用語カロテノイドは、イソプレンから形式的に誘導される共役ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスを指す。このクラスの分子は、トリテルペン[C30ジアポカルテノイドdiapocarotenoid]およびテトラテルペン[C40カロテノイド]ならびにそれらの酸素化誘導体から構成され、典型的には、これらの分子は強い光吸収特性を有し、長さがC200を超える場合もある。長さが、例えばC35、C50、C60、C70およびC80である他のカロテノイド化合物が知られている。用語カロテノイドには、カロテンおよびキサントフィルの両方が含まれ得る。カロテンは、炭化水素カロテノイド例えばフィトエン、β-カロテンおよびリコペンを指す。対照的に、用語キサントフィルは、1つまたは複数の酸素原子を、ヒドロキシ-、メトキシ-、オキソ-、エポキシ-、カルボキシ-またはアルデヒドの官能基形態で含有するC40カロテノイドを指す。キサントフィルはカロテンより極性であり、この特性により、脂肪および脂質へのその溶解性が劇的に低下する。したがって、カロテノイドの適切な例として、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチンすなわち3,3’-ジヒドロキシ-β、β-カロテン-4,4’-ジオン、カンタキサンチンすなわちβ,β-カロテン-4,4’-ジオン、カプソルブリンcapsorubrin、β-クリプトキサンチン、α-カロテン、β,ψ-カロテン、δ-カロテン、ε-カロテン、β-カロテンケト-γ-カロテン、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、γ-カロテン、ψ-カロテン、ζ-カロテン、ゼアキサンチン、アドニルビン、テトラヒドロキシ-β、β’-カロテン-4,4’-ジオン、テトラヒドロキシ-β、β’-カロテン-4-オン、カロキサンチン、エリスロキサンチン、ノストキサンチン、フレキシキサンチン、3-ヒドロキシ-γ-カロテン、3-ヒドロキシ-4-ケト-γ-カロテン、バクテリオルビキサンチンbacteriorubixanthin、バクテリオルビキサンチナールbacteriorubixanthinal、ルテイン、4-ケト-γ-カロテン、α-クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、7,8-ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β-イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、4-ケト-ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、4-ケト-トルレン、3-ヒドロキシ-4-ケト-トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン-β-ジグルコシドおよびそれらの組合せが挙げられる。用語少なくとも1つのキノン誘導体化合物は、酸化還元活性のあるキノン環構造を有する化合物を指し、CoQ系列すなわち、Q6、Q7、Q8、Q9およびQ10のキノン、ビタミンK化合物、ビタミンE化合物およびそれらの組合せを含む。例えば、補酵素Q10[CoQ10]という用語は、ユビキノン10としても知られる2,3-ジメトキシ-ジメチル-6-デカプレニル-1,4-ベンゾキノンCAS登録番号303-98-0を指す。CoQ10のベンゾキノン部分はチロシンから合成されるが、イソプレン側鎖はメバロン酸経路を介してアセチルCoAから合成される。したがって、CoQ10などのCoQの生合成はNADPHを必要とする。ビタミンK化合物には、例えばメナキノンまたはフィロキノンが含まれるが、一方ビタミンE化合物には、例えばトコフェロール、トコトリエノールまたはα-トコフェロールが含まれる。リスベラトロール生合成では、芳香族前駆体チロシンの生成のためにNADPHが必要となる。したがって、リスベラトロール[3,4’,5-トリヒドロキシスチルベン]生合成はNADPHの細胞アベイラビリティに依存する。当業者ならば、少なくとも1つのNADPH依存性反応を有する、他の目的生成物の例を容易に考え出すことができよう。本例は、限定することを意図するものではなく、代替生成物もまた考えられることは明白である。目的の非天然生成物を生成するように操作することができる任意の微生物を本発明の実施に使用することができる。そのような微生物の例としては、これらに限定されないが、種々の細菌、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類が挙げられる。これらの微生物は、本明細書に記載のG6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現に先だって、目的の非天然生成物の生合成を可能にする少なくとも1つの異種遺伝子を含むことを特徴とする。あるいは、まずG6PDHおよび6PGLの過剰発現を協調的に調節し、次いで少なくとも1つの異種遺伝子を導入して、結果として目的の非天然生成物の生合成を可能にするように微生物を操作できること、または同じ最終結果を達成するためにこれらの形質転換を同時に実施できることを理解されたい。時として、目的の生成物が親油性の場合には、油性生物が好まれることがある。油性生物は、オイルの合成および蓄積が天然に可能であり、通常、乾燥細胞重量の約25超をオイルとして蓄積することができる。種々の藻類、コケ、菌類、酵母、ストラメノパイルおよび植物が本来油性として分類される。油性酵母がより好ましく、油性酵母として典型的に同定される属としては、これらに限定されないが、ヤロウィア属Yarrowia、カンジダ属Candida、ロドトルラ属Rhodotorula、ロドスポリジウム属Rhodosporidium、クリプトコックス属Cryptococcus、トリコスポロン属Trichosporonおよびリポマイセス属Lipomycesが挙げられる。より具体的には、例示のオイル合成酵母として、ロドスポリジウムトルロイデスRhodosporidiumtoruloides、リポマイセススターケイLipomycesstarkeyii、L.リポフェラスL.lipoferus、カンジダレブカウフィCandinarevkaufi、C.プルケリマC.pulcherrima、C.トロピカリスC.tropicalis、C.ユチリスC.utilis、トリコスポロンプランスTrochosporonpullans、T.クタネウムT.cutaneum、ロドトルラグルチヌスRhodotorulaglutinus、R.グラミニスR.graminisおよびヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica以前はカンジダリポリティカとして分類されたが挙げられる。最も好ましい油性酵母はヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaであり、ATCC76982、ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944および/またはLGAMS71PapanikolaouS.,andAggelisG.,Bioresour.Technol.,821:43-92002として指定されるY.リポリティカY.lipolytica株が最も好ましい。代替実施形態では、非油性生物、例えばサッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeなどの酵母は、油性になるように遺伝子改変することができる国際公開第2006/102342号パンフレット。したがって、例えば、デサチュラーゼすなわち、デルタ-12デサチュラーゼ、デルタ-6デサチュラーゼ、デルタ-8デサチュラーゼ、デルタ-5デサチュラーゼ、デルタ-17デサチュラーゼ、デルタ-15デサチュラーゼ、デルタ-9デサチュラーゼ、デルタ-4デサチュラーゼ遺伝子およびエロンガーゼすなわち、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼ、C20/22エロンガーゼおよびデルタ-9エロンガーゼ遺伝子の適切な組合せを導入することにより、数多くの微生物が長鎖PUFAを生成するように遺伝子操作されてきた。例えば、サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeDyer,J.M.etal.,Appl.Eniv.Microbiol.,59:224-2302002;Domergue,F.etal.,Eur.J.Biochem.,269:4105-41132002;米国特許第6,136,574号明細書;米国特許出願公開第2006-0051847-A1号明細書、海洋シアノバクテリウムシネココッカスcyanobacteriumSynechococcus種Yu,R.,etal.,Lipids,3510:1061-10642006、メチロトローフ酵母ピチアパストリスKajikawa,M.etal.,PlantMolBiol.,543:335-522004およびコケのニセツリガネゴケPhyscomitrellapatensKaewsuwan,S.,etal.,Bioresour.Technol.,10111:4081-40882010に関する研究を参照されたい。さらに、それらの内容全体が参照によって本明細書に組込まれる以下の参考文献:米国特許第7,238,482号明細書;米国特許第7,465,564号明細書;米国特許第7,588,931号明細書;米国特許出願公開第2006-0115881-A1号明細書;米国特許第7,550,286号明細書;米国特許第2009-0093543-A1号明細書;米国特許第2010-0317-072A1号明細書に記載のとおり、PUFA生成のために、油性酵母株であるヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの操作に向けて莫大な努力がなされてきた。PUFA生合成のために操作された上記の組換え生物のそれぞれにおいて、G6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現により、NADPH量の増加がもたらされ、それによって、生成されるPUFA量の増加が可能になる協調的調節様式ではG6PDHおよび6PGLを過剰発現していない、同様に操作された組換え生物と比較してと予測されよう。微生物が油性酵母であり、目的の非天然生成物がPUFAである一部の実施形態では、G6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現が、総脂質含量の増加もPUFA生成の増加に加えてもたらす。代替実施形態では、目的の代替非天然生成物を生成する様々な目的のために微生物を操作することができる。例えば、野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaは、補酵素Q9およびエルゴステロールを天然に生成することができるが、天然ではカロテン生成性ではなく、リスベラトロールを通常生成しない。国際公開第2008/073367号パンフレットおよび国際公開第2009/126890号パンフレットは、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするcrtE、フィトエンシンターゼをコードするcrtB、フィトエンデサチュラーゼをコードするcrtI、リコペンシクラーゼをコードするcrtY、カロテノイドヒドロキシラーゼをコードするcrtZおよび/またはカロテノイドケトラーゼをコードするcrtWなどのカロテノイド生合成経路遺伝子の導入によるY.リポリティカY.lipolyticaにおける一連のカロテノイドの生成について記載している。米国特許出願公開第2009/0142322-A1号明細書および国際公開第2007/120423号パンフレットは、補酵素Q10を生成するデカプレニルピロリン酸シンターゼをコードするddsA、ビタミンK化合物を生成するためのMenF、MenD、MenC、MenE、MenB、MenA、UbiEおよび/またはMenGのポリペプチドをコードする遺伝子およびビタミンE化合物を生成するためのtyrA、pdslhppd、VTEl、HPT1VTE2、VTE3、VTE4および/またはGGHのポリペプチドをコードする遺伝子などの異種キノン生合成経路遺伝子の導入によるY.リポリティカY.lipolyticaにおける種々のキノン誘導体化合物の生成について記載している。国際公開第2008/130372号パンフレットは、スクアレンシンターゼをコードするERG9/SQS1およびスクアレンエポキシダーゼをコードするERGlの導入によるY.リポリティカY.lipolyticaにおけるステロールの生成について記載している。また、国際公開第2006/125000号パンフレットは、リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子の導入によるY.リポリティカY.lipolyticaにおけるリスベラトロールの生成について記載している。非天然生成物の生成のために操作された組換え生物のそれぞれにおいて、協調的調節様式ではG6PDHおよび6PGLを過剰発現していない、同様に操作された組換え生物と比較して、G6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現により、NADPH量の増加がもたらされ、それによって、非天然生成物すなわち、PUFA、カロテノイド、キノン誘導体化合物、ビタミンK化合物、ビタミンE化合物、ステロイド、リスベラトロールの量の増加が可能になると予測されよう。当業者は、目的の様々な非天然生成物を生成するように操作された他のトランスジェニック微生物についても十分承知しており、非天然生成物の生成をもたらす生合成反応の少なくとも1つがNADPH依存的である場合には、これらはいずれも本明細書に開示の使用に適している。別の態様では、本発明は、トランスジェニック微生物であって、aグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]をコードする少なくとも1つの遺伝子と、b6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]をコードする少なくとも1つの遺伝子と、c目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子とを含み、目的の非天然生成物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸[NADPH]を必要とする少なくとも1つの酵素反応を含み、cを含み、aおよびbを欠いているかまたは協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生成されたNADPH量および目的生成物量と比較すると、aおよびbの協調的に調節された過剰発現が、NADPH量の増加をもたらし、NADPH量の増加が、トランスジェニック微生物におけるcの発現により生成される目的生成物量の増加をもたらす、トランスジェニック微生物に関する。好ましい実施形態では、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が、aG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子が、第1のプロモーターに作動可能に連結し、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子が、第2のプロモーターに作動可能に連結し、第1のプロモーターの活性が、第2のプロモーターと比較すると、同等または減少していること、bG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子が、多重コピーで発現し、かつ6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子が、多重コピーで発現し、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数が、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等または減少していること、cG6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性が、マルチザイムとして6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の酵素活性に連結していること、およびda、bおよびcに述べられた手段の任意の組合せ、からなる群から選択される手段によって達成される。一部の実施形態では、トランスジェニック微生物は、a、bおよびcの遺伝子に加えて、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子も発現する。PP経路遺伝子をコードする少なくとも1つの翻訳領域[ORF]を含む組換えコンストラクトを作製し、目的の非天然生成物をコードする少なくとも1つの異種遺伝子を含む宿主微生物に導入することが必要である。当業者は、1DNA分子、プラスミドなどの高分子の構築、操作および単離のための特定の条件および手順、2組換えDNA断片および組換え発現コンストラクトの生成、および3クローンのスクリーニングおよび単離を記載する標準資料教材について承知している。Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989;Maligaetal.,MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarbor,NY1995;Birrenetal.,GenomeAnalysis:DetectingGenes,v.1,ColdSpringHarbor,NY1998;Birrenetal.,GenomeAnalysis:AnalyzingDNA,v.2,ColdSpringHarbor:NY1998;PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,Clark,ed.Springer:NY1997を参照されたい。一般に、コンストラクトに含まれる配列の選択は、所望の発現生成物、宿主細胞の性質および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案手段に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功裡に行うためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントについて承知している。しかしながら、典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子、選択可能マーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列の転写および翻訳を指示する配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域5’すなわちプロモーター、および転写終結を制御するDNA断片の領域3’すなわちターミネーターを含む。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来する場合が最も好ましい。所望の宿主細胞における異種遺伝子またはその一部の発現を促進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、よく知られている。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、3’UTRおよび/または5’UTR領域、ならびにタンパク質および/またはRNA安定化エレメントを含むことができる。このようなエレメントはそれらの強度および特異性において異なっていてもよい。実際、選択された宿主細胞におけるこれらの遺伝子の発現を指示できる任意のプロモーター、すなわち天然、合成またはキメラのいずれのプロモーターも適している。宿主細胞における発現は、誘導様式または構成的様式で起こすことができる。誘導発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された調節可能プロモーターの活性を誘導することにより起こる。構成的発現は、目的の遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用により起こる。当業者は、当業者に周知の手段を使用して、第2のプロモーターに比較して第1のプロモーターの活性強度を容易に識別することができよう。宿主微生物が例えば酵母である場合、酵母細胞で機能する転写および翻訳の領域が、具体的には宿主種から得られる。例えば、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaで使用する好ましい転写開始制御領域については、国際公開第2006/052870号パンフレットおよび米国特許出願公開第2009-009-3543-A1号明細書を参照されたい。構成的転写または誘導転写のいずれが望ましいか、目的のORFを発現する際のプロモーターの効率、構築の容易さ等に応じて任意の数の調節配列を使用することができる。転写終結コドン、すなわち終結領域をコードする3’非コード配列は、組換えコンストラクトに備えられていなければならず、開始領域が得られた遺伝子の3’領域に由来してもまたは異なる遺伝子に由来してもよい。多数の終結領域が公知であり、それらが由来した属および種と同じでも異なっていても使用される場合には、様々な宿主において申し分なく機能する。終結領域は、何らかの特定の性質のためではなく便宜上で選択されることが多い。終結領域はまた、好ましい宿主にとって天然の種々の遺伝子に由来してもよい。酵母で使用するための具体的に有用な終結領域は、酵母遺伝子、具体的にはサッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、カンジダ属Candida、ヤロウィア属Yarrowiaまたはクリベロミセス属Kluyveromycesに由来する。γ-インターフェロンおよびα-2インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の3’-領域も酵母において機能することが知られている。当業者は、入手可能な情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する3’-領域配列を設計し合成することができるので、3’-領域は合成することも可能である。終結領域は不必要な場合もあるが、極めて好ましいものである。ベクターは、上記の調節エレメントに加えて、選択可能マーカーおよび/またはスコラブルscorableマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は抗生物質抵抗性遺伝子であることが好ましく、その結果、抗生物質により細胞を処置すると、非形質転換細胞は増殖阻害を受けるかまたは死滅し、形質転換細胞は阻害を受けずに増殖する。酵母形質転換体の選択については、カナマイシン、ヒグロマイシンおよびアミノグリコシドG418に対する抵抗性を有する、酵母において機能する任意のマーカーが有用であり、またウラシル、リジン、ヒスチジンまたはロイシンの欠損培地上で増殖する能力は特に有用である。クローニングベクターに遺伝子を挿入するのみでは、所望の速度、濃度、量等でのその発現は保証されない。高い発現速度の必要性に応じて、多くの特殊化した発現ベクターが、転写、RNA安定性、翻訳、タンパク質の安定性および局在、酸素制限ならびに宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝エレメントを操作することにより作製されている。操作される特徴の一部として、関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローン化された遺伝子のコピー数、遺伝子がプラスミドに保持されるか宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、合成される外来タンパク質の最終的な細胞局在、宿主生物におけるタンパク質の翻訳および正確なフォールディングの効率、宿主細胞内のクローン化された遺伝子のmRNAおよびタンパク質の固有の安定性、ならびに宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近い頻度でのクローン化された遺伝子内のコドン使用が挙げられる。これらのそれぞれは、PP経路遺伝子の発現をさらに最適化するために、本明細書に記載の方法および宿主細胞において使用することができる。具体的には、協調的に調節された過剰発現には、本発明では、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子を必要とする。これを達成できる方法の1つは、G6PDHをコードする遺伝子を第1のプロモーターに作動可能に連結し、6PGLをコードする遺伝子を第2のプロモーターに作動可能に連結し、第1のプロモーターの活性が、第2のプロモーターと比較すると、同等または減少していることを保証することによるものである。一部の場合には、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは同じである。これにより、細胞における6PGLおよびG6PDHの活性量を同様にすることができ、その結果PP経路を通るバランスのとれたフラックスが維持される。当業者ならば承知しているように、種々のプロモーターの活性を比較するために様々な方法が利用可能である。このタイプの比較は、各プロモーターの強度を容易に判定するのに有用である。こうして、レポーター遺伝子すなわちβ-グルクロニダーゼGUSをコードする大腸菌E.coli遺伝子の発現に基づいてプロモーター活性を間接的に定量することが有用となる可能性があり、そこでは各発現コンストラクトのGUS活性を組織化学的および/または蛍光定量的アッセイによって測定することができるJefferson,R.A.PlantMol.Biol.Reporter5:387-4051987。代替実施形態では、より定量的な手段を使用して、プロモーター活性を定量することが時として有用となり得る。適切な方法の1つは、リアルタイムPCRの使用であるリアルタイムPCRの適用についての一般的総説に関しては、Ginzinger,D.J.,ExperimentalHematology,30:503-5122002を参照されたい。リアルタイムPCRは、蛍光レポーターの検出および定量に基づいている。このシグナルは反応におけるPCR生成物の量に正比例して増加する。各サイクルで蛍光発光量を記録することにより、PCR生成物量の最初の顕著な増加が標的テンプレートの初期量に相関する対数期の間のPCR反応をモニターすることが可能である。アンプリコンを定量的に検出するために、1蛍光プローブの使用、または2DNA結合剤例えばSYBR-greenI、臭化エチジウムの使用の2つの一般方法がある。相対的な遺伝子発現比較については、内部基準例えば、染色体にコードされた16SrRNA遺伝子として内在性の対照を使用することが必要であり、それによって、各リアルタイムPCR反応に加えられた総DNA量の差を標準化することが可能になる。リアルタイムPCRのための特定の方法については当技術分野で詳細に文書化されている。例えば、リアルタイムPCR特集号Methods,254:383-4812001を参照されたい。リアルタイムPCR反応に続いて、蛍光強度の記録を使用して、1絶対標準法invitro翻訳RNAcRNAなどの既知量の標準を使用する、2相対標準法既知量の標的核酸を各ランのアッセイデザインに含む、または3遺伝子発現の相対的な定量のための比較CT法ΔΔCT標的配列の相対量を選ばれたリファレンス値のいずれかと比較し、その結果をリファレンス値に対するものとして示すによりテンプレート量を定量する。比較CT法では、標的とノーマライザーのCT値間の差、すなわち、ΔCT=CT標的-CTノーマライザーを最初に決定する必要がある。この値を定量すべき試料それぞれについて計算し、各比較がなされるリファレンスとして1つの試料を選択しなければならない。比較ΔΔCT計算には、各試料のΔCTとベースラインのΔCTの間の差を見出すステップと、次いで、これらの値を式2-ΔΔCTにより絶対値に変換するステップとが含まれる。本明細書における本発明を限定するものとは考えられないが、国際公開第2006/2006/052870号パンフレットは、比較条件下で、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaにおける7つの異なるプロモーター活性を直接比較する手段の例を提供している。プロモーター、PP経路ORFおよびターミネーターを含む少なくとも1つのキメラ遺伝子を含む組換えコンストラクトを作製した後、そのコンストラクトを、宿主微生物において自律複製可能なプラスミドベクターに配置するか、または宿主微生物ゲノムに直接組み込む。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム内でランダムに起こすことができるか、または宿主遺伝子座との組換えを目的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同領域を含有するコンストラクトを使用することにより標的を設定することができる。コンストラクトの標的を内在性遺伝子座にする場合、転写および翻訳の制御領域の全部または一部を内在性遺伝子座から得ることができる。2つ以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現する場合、ベクターの選択手段はそれぞれ異なっていてもよく、各ベクターは、安定な発現を維持しかつコンストラクト間のエレメントの再集合を防止するために他のコンストラクトとの相同性を有するべきではない。すべての導入遺伝子が、所望の生成物の合成を実現するのに必要なレベルで発現するように、導入コンストラクトの制御領域、選択手段および増殖方法を実験的に決定することにより賢明に選択することができる。目的遺伝子を含むコンストラクトは、任意の標準手法により宿主細胞に導入することができる。これらの手法には、酢酸リチウム形質転換MethodsinEnzymology,194:186-1871991などの形質転換、プロトプラスト融合、遺伝子銃衝撃biolisticimpact、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、真空濾過、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する他の任意の方法が含まれる。便宜上、例えば発現カセット中のDNA配列を取り込む任意の方法により操作された宿主微生物を、本明細書では、形質転換または組換え体と呼ぶ。形質転換宿主は、発現コンストラクトの少なくとも1つのコピーを有し、遺伝子がゲノムに組み込まれ、増幅されるか否か、または複数のコピー数を有する染色体外エレメント上に存在するか否かに応じて、2つ以上有することがある。G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現を達成するための代替手段が、遺伝子が多重コピーで発現する場合に存在する。具体的には、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数が、6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子のコピー数に比較して同等または減少している場合に、細胞における6PGLおよびG6PDHの活性量を同様にすることができ、その結果PP経路を通るバランスのとれたフラックスが維持される。あるいは、当業者は、G6PDHをコードする少なくとも1つの遺伝子および6PGLをコードする少なくとも1つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現を、両酵素を含むマルチザイムを作製することによっても保証することができる。国際公開第2008/124048号パンフレットは、少なくとも2つの独立して分離可能な酵素活性を、マルチザイムまたは融合タンパク質として単一ポリペプチドの中に連結する手段を教示している。それぞれが独立して分離可能な酵素活性を有する2つ以上のポリペプチド間の適切な結合または連結もまた、そのパンフレットに含まれており、したがって、G6PDH-6PGLマルチザイムの作製は容易であろう。このアプローチはまた、細胞における6PGLおよびG6PDHの活性量を同様にして、PP経路を通るバランスのとれたフラックスを維持することを保証するのに適していよう。形質転換宿主微生物は、導入コンストラクト上に含有されるマーカーに対する選択により同定することができる。あるいは、多くの形質転換手法が多くのDNA分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時形質転換することができる。典型的には、形質転換宿主は、選択培地上で増殖する能力に対して選択され、選択培地は、抗生物質が組み込まれている場合も、または栄養素もしくは増殖因子など非形質転換宿主の増殖に必要な要素が欠損している場合もある。導入マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を与える場合も、または必須な増殖因子または酵素をコードしている場合もあり、そのため、形質転換宿主で発現すると、選択培地上での増殖が可能になる。発現したマーカータンパク質を直接的または間接的に検出することができると、形質転換宿主の選択も可能になる。マーカータンパク質は、単独でまたは別のタンパク質との融合物として発現させることができる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的にまたは抗体を使用する蛍光標識細胞ソーティングまたはパニングなどの手法により選択することができる。選択された宿主または発現コンストラクトにかかわらず、独立した異なる形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすのでJonesetal.,EMBOJ.,4:2411-24181985;DeAlmeidaetal.,Mol.Gen.Genetics,218:78-861989、所望の発現レベル、調節およびパターンを示す株または系統を得るためには複数の形質転換体をスクリーニングしなければならない。このようなスクリーニングは、DNAブロットのサザン解析Southern,J.Mol.Biol.,98:5031975、mRNA発現のノザン解析Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,6181-2:133-1451993およびタンパク質発現のウェスタン解析および/もしくはElisa解析、または表現型解析により達成することができる。あるいは、G6PDHおよび6PGLの発現レベルが操作されているトランスジェニック微生物で生成される目的の非天然生成物の量を単に定量し、この量を、G6PDHおよび6PGLの発現レベルが操作されていないトランスジェニック微生物で生成される目的の非天然生成物の量と比較すれば、細胞における目的の非天然生成物の量の増加が観察されるか否かに基づいて、G6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現が達成されているか否かを容易に判定することができよう。特定のアッセイでは、目的の生成物を合成して判定することになる。トランスジェニック微生物は、目的の少なくとも1つの非天然生成物の生成を最適化する条件下で増殖させる。一般に、培地条件は、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、様々なミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、pH、バイオマス生産段階の期間、オイル蓄積段階の期間、ならびに細胞収集の時期および方法を改変することにより最適化することができる。例えば、油性酵母ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaは、酵母抽出物-ペプトン-デキストロースブロス[YPD]などの複合培地、合成最少培地、または増殖に必要な成分が欠損し、所望の発現カセットの選択を引き出す合成最少培地例えば、YeastNitrogenBaseDIFCOLaboratories,Detroit,MIの中で一般に増殖させる。本明細書に記載の方法およびトランスジェニック生物のための発酵培地は、米国特許第7,238,482号明細書および米国特許出願公開第2009-0325265-A1号明細書の教示のとおり、適切な炭素源を含有しなければならない。適切な炭素源は、多種多様な糖例えばグルコースを包含し、フルクトース、グリセロールおよび/または脂肪酸が好ましい。グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトースおよび/または10~22の間の炭素を含有する脂肪酸が最も好ましい。例えば、発酵性炭素源は、グルコースを転化スクロースおよび/またはフルクトースと組み合わせて使用する場合に、転化スクロースすなわち、スクロースの加水分解から生じる等量のフルクトースおよびグルコースを含む混合物、グルコース、フルクトースおよびこれらの組合せからなる群から選択することができる。窒素は、無機例えばNH42SO4または有機例えば尿素またはグルタミン酸の供給源から補充することができる。適切な炭素源および窒素源に加えて、発酵培地はまた、油性宿主の増殖および目的の非天然生成物の生成に必要な酵素経路の促進に適する、当業者に公知の適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ビタミンおよびその他の成分を含有しなければならない。好ましい増殖培地は、YeastNitrogenBaseDIFCOLaboratories,Detroit,MIなどの一般の商業的調製培地である。他の合成defined増殖培地または合成synthetic増殖培地も使用することができ、形質転換宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知である。発酵に適したpH範囲は、典型的には、約pH4.0~pH8.0の間であり、その中では初期増殖条件の範囲としてpH5.5~pH7.5が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で行うことができ、その中では微好気条件が好ましい。当業者はまた、生成しようとする目的の特定生成物に応じた、トランスジェニック微生物を培養する適切な手段に精通していよう。例えば、代謝期は増殖と脂肪の合成/保存との間でバランスを取らなければならないため、油性酵母細胞における高レベルのPUFAの蓄積には、典型的には、二段階工程が必要である。したがって、最も好ましくは、二段階発酵工程が油性酵母例えばヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaにおけるPUFAの生成に必要である。このアプローチは米国特許第7,238,482号明細書に記載されており、種々の適切な発酵工程設計すなわちバッチ、フェドバッチおよび連続および増殖中の検討がある。本発明を以下の実施例の中でさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方、例示としてのみ示されることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特性を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正をなして、様々な使用および条件にそれを適合させることができる。特に指示がない限り、参照された米国特許および特許出願はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる。一般的方法実施例で使用する標準の組換えDNAおよび分子クローニングの手法は、当技術分野で周知であり、1Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989Maniatis;2T.J.Silhavy,M.L.Bennan,andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1984;および3Ausubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,Hoboken,NJ1987に記載されている。微生物培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適した手法は、ManualofMethodsforGeneralBacteriologyPhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,Eds,AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.1994;またはThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded.,SinauerAssociates:Sunderland,MA1989の記載に見出すことができる。微生物細胞の増殖および維持に使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、特に指示がない限り、AldrichChemicalsMilwaukee,WI,DIFCOLaboratoriesDetroit,MI,NewEnglandBiolabs,Inc.Beverly,MA,GIBCO/BRLGaithersburg,MD,またはSigmaChemicalCompanySt.Louis,MOから入手した。大腸菌E.coli株は、典型的には、LuriaBertani[LB]プレート上で37°Cにて増殖させた。特に指示がない限り、PCR増幅は、PCR緩衝液10mMKCl、10mMNH42SO4、20mMTris-HClpH8.75、2mMMgSO4、0.1トリトンX-100を含有、100μg/mLのBSA最終濃度、200μMの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、10pmoleの各プライマー、1μlのPfuDNAポリメラーゼStratagene,SanDiego,CAおよび1μl容量中の20~100ngのテンプレートDNAを含む50μlの全容積で行なった。増幅は以下のように実施した。95°Cで1分間の最初の変性、次いで95°Cで30秒間の変性を30サイクル、55°Cで1分間のアニーリング、および72°Cで1分間の伸長。72°Cで10分間の最終伸長サイクルを実施した後、4°Cで反応を停止した。一般的な分子クローニングは標準的方法Sambrookら、上記に従って実施した。DNA配列は、ベクターおよび挿入断片に特異的なプライマーの組合せを使用する染料ターミネーター技術米国特許第5,366,860号明細書;欧州特許第272,007号明細書を使用して、ABIの自動シークエンサー上に生成した。配列編集をSequencherGeneCodesCorporation,AnnArbor,MIで実施した。すべての配列は、両方向で少なくとも2倍のカバレッジを示す。本明細書において特に指示がない限り、遺伝子配列の比較はDNASTARソフトウェアDNASTARInc.,Madison,WIを使用して行った。略語の意味は以下のとおりである。secは秒を意味し、minは分を意味し、hは時間を意味し、dは日を意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、μMはマイクロモル濃度を意味し、mMはミリモル濃度を意味し、Mはモル濃度意味し、mmolはミリモルを意味し、μmoleはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、ngはナノグラムを意味し、Uは単位を意味し、bpは塩基対を意味し、kBはキロベースを意味する。発現カセットの命名法発現カセットの構造はX::Y::Zの単純な表記法により表され、ここでXはプロモーター断片を記述し、Yは遺伝子断片を記述し、Zはターミネーター断片を記述し、これらはすべて互いに作動可能に連結されている。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの形質転換および培養ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362株は米国培養細胞系統保存機関Rockville,MDから購入した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica株は、下記の処方に従った数種の培地中で28~30°Cにて定期的に増殖させた。高グルコース培地[HGM]1リットル当たり:80グルコース、2.58gのKH2PO4および5.36gのK2HPO4、pH7.5調整の必要なし。合成デキストロース培地[SD]1リットル当たり:6.7gの硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有YeastNitrogenbaseおよび20gのグルコース。発酵培地[FM]1リットル当たり:6.70g/lの硫酸アンモニウム含有、アミノ酸非含有Yeastnitrogenbase、6.00gのKH2PO4、2.00gのK2HPO4、1.50gのMgSO47H2O、1.5mg/Lのチアミン-HCl、20gのグルコースおよび5.00gの酵母抽出物BBL。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2009-0093543-A1号明細書に記載のように、Y.リポリティカY.lipolyticaの形質転換を実施した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305U株の生成Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現を介して総脂質に比較してEPAを生成するY4305U株は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第2008-0254191号明細書の一般的方法に記載のように生成した。手短かに言えば、Y4305U株は、Y2224株野生型ヤロウィアYarrowiaATCC20362株のUra3遺伝子の自律突然変異からの5-フルオロオロチン酸[FOA]抵抗性変異体、Y4001株17のEDA生成、Leu-表現型、Y4001U1株Leu-およびUra-、Y4036株18のDGLA生成、Leu-表現型、Y4036U株Leu-およびUra-、Y4070株12のARA生成、Ura-表現型、Y4086株14のEPA生成、Y4086U1株Ura3-、Y4128株37のEPA生成、2007年8月23日に米国培養細胞系統保存機関に寄託、名称ATCCPTA-8614、Y4128U3株Ura-、Y4217株42のEPA生成、Y4217U2株Ura-、Y4259株46.5のEPA生成、Y4259U2株Ura-、Y4305株総TFAに対して53.2のEPA生成の構築を通して、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362から誘導した。Y4305株の完全な脂質プロフィールは以下のとおりであった。16:02.8、16:10.7、18:01.3、18:14.9、18:217.6、ALA2.3、EDA3.4、DGLA2.0、ARA0.6、ETA1.7およびEPA53.2。総脂質乾燥細胞重量[DCW]は27.5であった。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較したY4305株の最終遺伝子型は、SCP2-YALI0E01298g、YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-、未知の1-、未知の3-、未知の8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12S::Lip2、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex203コピー、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::E389D9eS::OCT、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip12コピー、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、EXP1::EgD5S::ACO、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::YlCPT1::ACO、GPD::YlCPT1::ACOであったここで、FmD12は、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliformeΔ12デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,504,259号明細書]であり;FmD12Sは、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliformeに由来する、コドン最適化Δ12デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,504,259号明細書]であり;ME3Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpinaに由来するコドン最適化C16/18エロンガーゼ遺伝子[米国特許第7,470,532号明細書]であり;EgD9eは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisのΔ9エロンガーゼ遺伝子[米国特許第7,645,604号明細書]であり;EgD9eSは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisに由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子[米国特許第7,645,604号明細書]であり;E389D9eSは、ユートレプチエラEutreptiella種CCMP389に由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子[米国特許第7,645,604号明細書]であり;EgD8Mは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilis[米国特許第7,256,033号明細書]に由来する合成突然変異体Δ8デサチュラーゼ[米国特許第7,709,239号明細書]であり;EgD5は、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisのΔ5デサチュラーゼ[米国特許第7,678,560号明細書]であり;EgD5Sは、ユーグレナグラシリスEuglenagracilisに由来するコドン最適化Δ5デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,678,560号明細書]であり;RD5Sは、ペリディニウムPeridinium種CCMP626に由来するコドン最適化Δ5デサチュラーゼ[米国特許第7,695,950号明細書]であり;PaD17は、ピチウムアファニデルマツムPythiumaphanidermatumのΔ17デサチュラーゼ[米国特許第7,556,949号明細書]であり;PaD17Sは、ピチウムアファニデルマツムPythiumaphanidermatumに由来するコドン最適化Δ17デサチュラーゼ[米国特許第7,556,949号明細書]であり;YlCPT1はヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaのジアシルグリセロールコリンホスホトランスフラーゼ遺伝子[国際公開第2006/052870号パンフレット]である。続いて、Y4305株のUra3遺伝子を破壊して米国特許出願公開第2008-0254191号明細書の一般的方法に記載のように、Ura3突然変異遺伝子をY4305株のUra3遺伝子に組み込んだ。形質転換体の選択およびFAMEの分析の後に、MM5-FOAプレート上で増殖させた場合、形質転換体1、6および7がそれぞれ総脂質の37.6、37.3および36.5のEPAを生成することが明らかとなった。これら3株を、それぞれY4305U1株、Y4305U2株およびY4305U3株と命名し、まとめてY4305U株とした。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの脂肪酸分析脂肪酸分析のために、細胞を遠心分離により集め、Bligh,E.G.Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-9171959に記載のように脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステル[FAME]をナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル転移反応により調製しRoughan,G.,andNishidaI.,ArchBiochemBiophys.,2761:38-461990、次いで、30m×0.25mm内径のHP-INNOWAXHewlett-Packardカラムを装着したHewlett-Packard6890GCで分析した。オーブン温度は、3.5°C/分で170°C25分間保持から185°Cであった。直接の塩基エステル転移反応のために、ヤロウィアYarrowia培養物3mLを採取し、蒸留水で1回洗浄し、真空下、Speed-Vacで5~10分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド1のものを100μlを試料に添加し、次いで試料を20分間攪拌振盪した。1MNaClを3滴およびヘキサンを400μl添加した後、試料を攪拌回転した。上層を取り出し、上記のようにGCにより分析した。G6PDH、6PGLおよび6PGDHをコードするヤロウィアYarrowia遺伝子グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]をコードするヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica遺伝子は、配列番号1として本明細書に示されており、GenBank登録番号XM_504275に対応する。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaORFYALI0E22649pとしてそこにアノテートされている1497bp配列は、uniprot|P11412サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeYNL241cZWF1グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼに類似している。さらに、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaG6PDHをコードする498アミノ酸のタンパク質配列配列番号2を使用して、国立バイオテクノロジー情報センター[NCBI]BLASTP2.2.22BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.,etal.,NucleicAcidsRes.,25:3389-34021997;Altschul,S.F.,etal.,FEBSJ.,272:5101-51092005検索を、BLASTnrデータベースすべての非重複性のGenBankCDS翻訳、ProteinDataBank[PDB]タンパク質配列データベース、SWISS-PROTタンパク質配列データベース、ProteinInformationResource[PIR]タンパク質配列データベースおよびProteinResearchFoundation[PRF]タンパク質配列データベースを含み、全ゲノムショットガン[WGS]プロジェクトからの環境試料を除く内の類似性を有する配列を同定するために行った。配列番号2が最大類似性を有する配列をまとめたBLASTP比較の結果を、同一性、類似性および期待値に従って報告する。同一性は、2つのタンパク質間で同一のアミノ酸のパーセントとして定義される。類似性は、2つのタンパク質間で同一または保存のアミノ酸のパーセントとして定義される。期待値は、このサイズのデータベース検索においてまったく偶然に期待されるマッチの数を特定し、所与のスコアを用いてマッチの統計的有意性を評価する。多くのタンパク質が、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaG6PDH配列番号2と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質をグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼと具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表3に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表3のタンパク質は、配列番号2に対して2e-132より大きいe-値を有していた。G6PDHは、探索されたすべての生物および細胞型で見出され、かなりの配列保存が観察されることに留意されたい。G6PDHをコードするサッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeのZWF1遺伝子を最初に単離して特徴づけしたNogae,I.およびM.JohnstonGene,96:161-1691990は、コードされたタンパク質が、ショウジョウバエ、ヒトおよびラットの酵素からのG6PDH配列に対して約60の類似性があることを認めた。6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]をコードするヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica遺伝子は、配列番号3として本明細書に示されており、GenBank登録番号XM_503830に対応する。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaORFYALI0E11671pとしてそこにアノテートされている747bp配列は、uniprot|P38858サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeYHR163wSOL3の可能性のある6-ホスホグルコノラクトナーゼに類似している。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica6PGL配列番号4をコードする248アミノ酸のタンパク質配列を、Y.リポリティカY.lipolyticaG6PDHタンパク質について上記した方法と同様に、nrデータベースに対するNCBIBLASTP2.2.22検索のクエリーとして使用した。多くのタンパク質が、配列番号4と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質を6-ホスホグルコノラクトナーゼと具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表4に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表4のタンパク質は、配列番号4に対して1e-40より大きいe-値を有していた。同様に、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ[6PGDH]をコードするヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica遺伝子は、配列番号5として本明細書に示されており、GenBank登録番号XM_500938に対応する。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaORFYALI0B15598pとしてそこにアノテートされている1470bp配列は、uniprot|P38720サッカロミセスセレビシアSaccharomycescerevisiaeYHR183wGND16-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼに高度に類似している。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolytica6PGDH配列番号6をコードする489アミノ酸のタンパク質配列を、Y.リポリティカY.lipolyticaG6PDHおよび6PGLのタンパク質について上記した方法と同様に、nrデータベースに対するNCBIBLASTP2.2.22検索のクエリーとして使用した。多くのタンパク質が、配列番号6と有意な類似性を共有するとして同定された。タンパク質を6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼと具体的に同定したアノテーションを有するヒットの要約の一部を表5に示すが、これは本明細書の開示を限定するものと見なすべきではない。表5のタンパク質は、配列番号6に対して0.0より大きいe-値を有していた。実施例1ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY2107U株におけるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼG6PDHの過剰発現本実施例では、強力な天然ヤロウィアYarrowiaプロモーターの制御下で、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]をコードするヤロウィアYarrowia遺伝子の過剰発現を可能にするプラスミドpZWF-MOD1図2A;配列番号7の構築について記載する。過剰発現プラスミドを用いて、PUFAを生成するY.リポリティカY.lipolyticaY2107U株の形質転換を行い、細胞増殖および脂質合成に対する過剰発現の効果を判定し、比較した。具体的には、G6PDHの過剰発現は細胞増殖の低下をもたらした。ヤロウィアYarrowiaG6PDHを含むプラスミドpZWF-MOD1の構築ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaG6PDHORFは、5’-末端配列番号10のヌクレオチド85~524近傍にイントロンを含有していた。G6PDHをコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号1として示す。プライマーYZWF-F1配列番号8およびYZWF-R配列番号9を、G6PDHをコードするヤロウィアYarrowia遺伝子のコード領域を増幅するために設計した。プライマーYZWF-F1は、翻訳開始ATGコドンの後に挿入された6つの塩基GGATCCBamHI部位の形成を含有している。ゲノムDNAおよびcDNAの両方を2つの別個のPCR増幅一般的方法においてテンプレートとして使用し、440bpイントロン配列番号12含有および非含有G6PDHコード領域を得た。増幅DNA断片をBamHIおよびNotIで消化し、BamHIおよびNotIで消化したpZUF-MOD1配列番号13;図2Bにライゲートした。プラスミドpZUF-MOD1は、以前に、米国特許第7,192,762号明細書の実施例5に記載されている。図2BのMCR-Stuffer断片は、pDNR-LIBClonTech,PaloAlto,CAの一部から増幅された253bpstufferDNA断片に相当する。この断片を、強力なヤロウィアYarrowiaFBAINプロモーター米国特許第7,202,356号明細書;配列番号14に作動可能に連結した。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌E.coliTOP10コンピテント細胞を形質転換した。何回かの試みにもかかわらず、増幅cDNA断片を含有するライゲーション混合物ではコロニーは得られなかった。コロニーは、増幅ゲノムDNA断片で容易に得られた。これらのコロニーに由来するDNAを、QiagenMiniprepキットで精製し、プラスミドの同一性を制限酵素マッピングにより確認した。キメラFBAIN::G6PDH::Pex20遺伝子を含む得られたプラスミドをpZWF-MOD1図2A;配列番号7と命名した。ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY2107U株におけるG6PDH過剰発現の効果Y2107U1株およびY2107U2株をまとめて指し、Δ6デサチュラーゼ/Δ6エロンガーゼ経路の発現を介した2段階増殖の後に総脂質の約16のEPAを生成するY.リポリティカY.lipolyticaY2107U株は、参照によって本明細書に組込まれる米国特許第7,192,762号明細書の実施例4に記載のように生成した。手短かに言えば、Y2107U株は、M4株8のDGLA生成、Y2047株11のARA生成、Y2048株11のEPA生成、Y2060株13のEPA生成、Y2072株15のEPA生成、Y2072U1株14のEPA生成およびY2089株18のEPA生成の構築を通して、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362から誘導した。野生型ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaATCC20362と比較したY2107U株の最終遺伝子型は、FBAIN::EL1S:Pex20、GPDIN::EL1S::Lip2、GPAT::EL1S::Pex20、GPAT::EL1S::XPR、TEF::EL2S::XPR、TEF::Δ6S::Lip1、FBAIN::Δ6S::Lip1、FBA::F.Δ12::Lip2、TEF::F.Δ12::Pex16、FBAIN::M.Δ12::Pex20、FBAIN::MAΔ5::Pex20、TEF::MAΔ5::Lip1、TEF::HΔ5S::Pex16、TEF::I.Δ5S::Pex20、GPAT::I.Δ5S::Pex20、TEF::Δ17S::Pex20、FBAIN::Δ17S::Lip2、FBAINm::Δ17S::Pex16、TEF::rELO2S::Pex202コピーであった。略語は下記のとおりである。EL1Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpinaに由来するコドン最適化エロンガーゼ1遺伝子GenBank登録番号AX464731であり;EL2Sは、スラウストキトリウムオウレウムThraustochytriumaureumに由来するコドン最適化エロンガーゼ遺伝子[米国特許第6,677,145号明細書]であり;Δ6Sは、モルティエラアルピナMortierellaalpinaに由来するコドン最適化Δ6デサチュラーゼ遺伝子GenBank登録番号AF465281であり;F.Δ12は、フザリウムモニリフォルメFusariummoniliformeのΔ12デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,504,259号明細書]であり;M.Δ12は、モルティエライサベリナMortierellaisabellinaのΔ12デサチュラーゼ遺伝子GenBank登録番号AF417245であり;MAΔ5は、モルティエラアルピナMortierellaalpinaのΔ5デサチュラーゼ遺伝子GenBank登録番号AF067654であり;HΔ5Sは、ヒトHomosapiensに由来するコドン最適化Δ5デサチュラーゼ遺伝子GenBank登録番号NP_037534であり;I.Δ5Sは、イソクリシスガルバナIsochrysisgalbanaに由来するコドン最適化Δ5デサチュラーゼ遺伝子国際公開第2002/081668号パンフレットであり;Δ17Sは、S.ジクリナS.diclinaに由来するコドン最適化Δ17デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,125,672号明細書]であり;rELO2Sは、ラットに由来するコドン最適化rELO2C16/18エロンガーゼ遺伝子GenBank登録番号AB071986である。プラスミドpZWF-MOD1配列番号7および対照プラスミドpZUF-MOD1配列番号13を使用して、Y2107U株を形質転換した。形質転換体を、250rpmで30°Cにて2日間、25mLのSD培地中で増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により集め、HGM培地中に再懸濁した。250rpmで30°Cにて、さらに5日間、培養物を増殖させた。乾燥細胞重量測定のために、各培養物の10mLを3750rpmで5分間遠心分離した。各細胞ペレットを水10mL中に再懸濁し、再び遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、あらかじめ秤量したアルミニウム皿に移して、80°Cで一晩乾燥させ、秤量して細胞培養物10mLの乾燥細胞重量[DCW]を決定した。脂質測定のために、細胞を遠心分離により集め、脂質を抽出して、FAMEをエステル転移反応により調製し、次いで、Hewlett-Packard6890GCで一般的方法に記載のように分析した。キメラFBAIN::MCR-Stuffer::Pex20遺伝子を含む3つのpZUF-MOD1形質転換体およびキメラFBAIN::G6PDH::Pex20遺伝子を含む9つのpZWF-MOD1形質転換体について、DCW、細胞の総脂質含量[TFADCW]およびTFAの重量パーセントとしてのEPA濃度[EPATFA]を、太字で強調したそれぞれの平均と共に、下記の表6に示す。より具体的には、本明細書の用語総脂肪酸[TFA]は、例えばバイオマスまたはオイルのこともある所与の試料において、塩基エステル転移反応法当技術分野で公知により脂肪酸メチルエステル[FAME]に誘導することができる、すべての細胞脂肪酸の合計を指す。したがって、総脂肪酸は、中性脂質分画ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール[TAG]を含むおよび遊離脂肪酸以外の極性脂質分画ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンの分画を含むに由来する脂肪酸を含む。細胞の総脂質含量という用語は、DCWのパーセントとしてのTFAの尺度であるが、DCWのパーセントとしてのFAMEの尺度[FAMEDCW]で総脂質含量を近似することができる。こうして、総脂質含量[TFADCW]は、例えばDCW100ミリグラム当たりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。総脂質中の脂肪酸濃度は、TFAの重量パーセント[TFA]、例えばTFA100ミリグラム当たりの所与の脂肪酸のミリグラムとして本明細書では表現する。本明細書の開示に特に記載がない限り、総脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントに言及する場合、TFAとしての脂肪酸濃度に等しい例えば、総脂質のEPAは、EPATFAに等しい。一部の場合には、細胞の所与の脂肪酸含量を、乾燥細胞重量[DCW]の重量パーセントとして表現することが有用である。したがって、例えば、エイコサペンタエン酸DCWは、次の式:[エイコサペンタエン酸TFATFADCW]/100によって決定されよう。しかしながら、乾燥細胞重量[DCW]の重量パーセントとしての細胞の所与の脂肪酸含量は、次の式:[エイコサペンタエン酸TFAFAMEDCW]/100で近似することができる。上記の表6に示した結果より、pZWF-MOD1を保持し、キメラFBAIN::G6PDH::Pex20遺伝子を発現する細胞の平均DCWは、対照のわずか約半分であることが実証された。これにより、G6PDHを過剰発現する細胞の増殖は良好ではないことが示された。具体的には、一部のコロニーのDCWが10未満であった。DCWが対照の50を超えるコロニーについては、対照の値と比較すると、総脂質およびEPAの含量がわずかに増加していた。上記の結果および細胞が良好に増殖できなかった細胞表現型の観察に基づいて、極めて強力なプロモーター制御下でのG6PD単独の過剰発現は、ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaの増殖を阻害する、許容できない量の6-ホスホグルコノラクトンをもたらすと結論した。実施例2グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]および6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]の協調的に調節された過剰発現のためのプラスミドpZKLY-PP2の構築本実施例では、協調的調節様式で、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]および6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]をコードするヤロウィアYarrowia遺伝子を過剰発現させるためのプラスミドpZKLY-PP2図3A;配列番号15の構築について記載する。具体的には、弱い天然ヤロウィアYarrowiaプロモーターをG6PDの発現を誘導するために選択し、一方強力な天然ヤロウィアYarrowiaプロモーターを6PGLに作動可能に連結した。この戦略は、6-ホスホグルコノラクトンの6-ホスホグルコン酸への迅速な変換を保証し、それによって毒性レベルの6-ホスホグルコノラクトンの蓄積を回避するように設計したものである。G6PDHおよび6PGLの過剰発現のためのプラスミドpZKLY-PP2の構築プラスミドpZKLY-PP2の構築には、最初に、ヤロウィアYarrowiaの6PGLおよびG6PDH遺伝子を個々に増幅させ、個々それぞれの遺伝子を適切なヤロウィアYarrowiaプロモーターにライゲートして、個々の発現カセットを作製する必要があった。次いで、協調的に調節された過剰発現のためのプラスミドpZKLY-PP2を2つの発現カセットから組み立てた。具体的には、PCRプライマーのYL961配列番号16およびYL962配列番号17を使用して、Y.リポリティカY.lipolyticaゲノムDNAからヤロウィアYarrowia6PGL遺伝子を増幅した一般的方法。プライマーYL961は、翻訳開始ATGコドンの後に挿入された3つの塩基GCTを含有した。6PGLを含む752bpのNcoI/NotI断片およびヤロウィアYarrowiaFBAプロモーター米国特許第7,202,356号明細書;配列番号18を含む533bpのPmeI/NcoI断片を、PmeI/NotIで消化したpZKLYプラスミド配列番号25と一緒にライゲートして、pZKLY-6PGL配列番号19;図3Bを生成した。同様に、プライマーYL959配列番号20およびYL960配列番号21を使用して、ゲノムDNAからヤロウィアYarrowiaG6PDHをPCRにより増幅した一般的方法。プライマーYL959は、第4のヌクレオチドAがGに変化して、クローニング目的のためのNcoI部位を生成するように、G6PDHコード領域内で1塩基対突然変異を誘起させた。したがって、G6PDHの増幅されたコード領域は、野生型酵素に対して変化したアミノ酸を含有し、第2アミノ酸のThrがAlaに変化していた。このPCR生成物を、NcoI/EcoRVで消化して496bp断片を生成し、またはEcoRV/NotIで消化して1.4kB断片を生成した。次いで、G6PDHがヤロウィアYarrowiaGPMプロモーター米国特許第7,259,255号明細書;配列番号24に作動可能に連結するように、これら2つの断片をpDMW224-S2配列番号22のNcoI/NotI部位に一緒にライゲートして、pGPM-G6PD配列番号23;図4を生成した。次いで、GPM::G6PDを含む2.8kB断片を、SwaI/BsiWI制限酵素を用いる消化によりpGPM-G6PDから切り取った。次いで、この単離した断片を、pZKLY-6PGL配列番号19;図3BのSwaI/BsiWI部位にクローニングして、pZKLY-PP2を生成した。したがって、プラスミドpZKLY-PP2図3Aは以下の構成要素を含有した。実施例3ヤロウィアリポリティカYarrowialipolyticaY4305U株におけるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ[G6PDH]および6-ホスホグルコノラクトナーゼ[6PGL]の協調的に調節された過剰発現は、総脂質の蓄積を増加させる。本実施例では、プラスミドpZKLY-PP2による、PUFAを生成するY.リポリティカY.lipolyticaY4305U株の形質転換ならびに細胞増殖および脂質合成に対するG6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現の効果について記載する。具体的には、形質転換細胞において、G6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現は、DCWのパーセントとしての総脂質量の増加およびTFAのパーセントとしてのPUFA量の増加をもたらした。Y.リポリティカY.lipolyticaY4305U株一般的方法をpZKLY-PP2配列番号15;実施例2の8.5kBのAscI/SphI断片により、一般的方法に従い形質転換した。形質転換体をウラシルが欠損するSD培地プレート上で選択した。3つのpZKLY-PP2形質転換体をPP12株、PP13株およびPP14株と命名した。脂質分析のために、pZKLY-PP2形質転換体およびY4305細胞対照を比較的油性の条件下で増殖させた。最初に、125mLフラスコに入れたSD培地25mL中で、約0.1のOD600から出発して48時間、各株の培養物を増殖させた。50mL円錐管において、4300rpmで5分間遠心分離して細胞を収集した。上清を廃棄して細胞をHGM25mL中に再懸濁し、新たな125mLフラスコに移した。細胞を30°Cでさらに120時間、通気培養した。HGM培養細胞1mLを13,000rpmで1分間遠心分離して集め、総脂質を抽出して、エステル転移反応により脂肪酸メチルエステルFAMEを調製した後、Hewlett-Packard6890GC一般的方法で分析した。乾燥細胞重量[DCW]、総脂質含量[TFADCW]、総脂肪酸の重量パーセントとして表現する所与の脂肪酸の濃度[TFA]および乾燥細胞重量のパーセントとしての所与の脂肪酸の含量[DCW]を以下の表8に示す。具体的には、脂肪酸は18:0ステアリン酸、18:1オレイン酸、18:2リノール酸;ω-6、エイコサテトラエン酸[ETA;20:4ω-3]およびエイコサペンタエン酸[EPA;20:5ω-3]と同定された。Y.リポリティカY.lipolyticaY4305UのpZKLY-PP2形質転換体すなわちPP12、PP13およびPP14ならびにY4305対照株の三つ組み試料の平均脂肪酸組成は、灰色で強調し平均を付けて示した。表8の結果より、Y4305Uにおける、PP経路酵素のG6PDHおよび6PGLの過剰発現は、Y4305対照株とパーセント比較すると、総脂質含量[TFADCW]を約12増加させることが示された。さらに、EPA生産性[EPADCW]およびETAEPA生産性[ETAEPADCW]が形質転換株において約6~7増加した。EPATFAとして測定されるEPAタイターは、PP12株、PP13株およびPP14株において、わずかに減少した。Y.リポリティカY.lipolyticaY4305UのpZKLY-PP2形質転換体PP12、PP13およびPP14について、代替培地で増殖させた場合も評価した。各株を、125mLフラスコに入れたFM培地25mL中において250rpmで30°Cにて48時間増殖させた。BeckmanGS-6R遠心分離機で3600rpmにて各培養物5mLを遠心分離した後、125mLフラスコに入れたHGM培地25mL中に細胞を再懸濁し、250rpmで30°Cにて5日間増殖させた。各培養物から遠心分離により細胞を収集して、総脂質を抽出し、エステル転移反応によりFAMEを調製した後、Hewlett-Packard6890GCで分析した。表8に記載のものと同様な数量化を使用して、表9に結果を示す。表9の結果より、Y4305Uにおける、PP経路酵素のG6PDHおよび6PGLの協調的に調節された過剰発現は、総脂質含量[TFADCW]、EPA生産性[EPADCW]およびETAEPA生産性[ETAEPADCW]ならびにEPAタイター[EPATFA]を増加させた。この効果はG6PDHによりもたらされた細胞NADPHアベイラビリティの増加に起因する。"