C4‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチドであって:a配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリペプチド;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、若しくは5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;c配列番号1、3、若しくは5、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;d配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体;並びにeC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するa、b、c、又はdのポリペプチドの断片、から選択されるペプチド。配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99又は100の配列同一性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。低ストリンジェンシー条件下で、低~中ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、若しくは5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1又は2に記載のポリペプチド。配列番号1、3、若しくは5、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1~3のいずれか1項に記載のポリペプチド。配列番号2、4か、又は6を含んで成るか又は配列番号2、4か、又は6から成る、請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。配列番号2、4、若しくは6の成熟ポリペプチドを含んで成るか又は配列番号2、4、若しくは6の成熟ポリペプチドから成る、請求項1~4のいずれか1項に記載のポリペプチド。配列番号2の成熟ポリペプチドが、配列番号2の第62~397又は69~397アミノ酸であり;配列番号4の成熟ポリペプチドが、配列番号4の第18~418アミノ酸であり;そして配列番号6の成熟ポリペプチドが、配列番号6の第69~397アミノ酸である、請求項6に記載のポリペプチド。E.コリNRRLB‐50400に含まれるプラスミドpAaC4T737に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか;E.コリNRRLB‐50388に含まれるプラスミドpAaC4t521に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるか、又はE.コリNRRLB50401に含まれるプラスミドpAaMAT737に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項1~7のいずれか1項に記載のポリペプチド。請求項1~8のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。請求項1~8のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。発現宿主内でそのポリペプチドの産生を指示する1若しくは複数例えば、2個、数個の制御配列に作用可能に連結された請求項10に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構築物又は発現ベクター。そのポリペプチドの産生を指示する1若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された請求項10のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞。C4‐ジカルボン酸輸送体をコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドが:a配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するC4‐ジカルボン酸輸送体をコードするか;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、若しくは5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするか;あるいはc配列番号1、3、若しくは5、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有し、当該宿主細胞が、異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、同じ条件下で培養された場合により大量のC4‐ジカルボン酸を産生することができる宿主細胞。異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、請求項13に記載の宿主細胞。リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項13又は14に記載の宿主細胞。ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第3の異種ポリヌクレオチドをさらに含んで成る、請求項13~15のいずれか1項に記載の宿主細胞。宿主細胞が、糸状菌宿主細胞である、請求項13~16のいずれか1項に記載の宿主細胞。宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、請求項17に記載の糸状菌宿主細胞。宿主細胞が、アスペルギルスオリゼ宿主細胞である、請求項17に記載の糸状菌宿主細胞。C4‐ジカルボン酸が、リンゴ酸である、請求項13~19のいずれか1項に記載の宿主細胞。C4‐ジカルボン酸の製造方法であって:aC4‐ジカルボン酸を産生するのに好適な条件下、培地中で請求項13~20のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養し;そしてbC4‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。C4‐ジカルボン酸の産生を増大する方法であって:a請求項1~8のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に形質転換し;bC4‐ジカルボン酸を産生するのに好適な条件下、培地中で形質転換宿主細胞を培養し;そしてcC4‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。緩衝液及び基質として使用した化学物質は、少なくとも試薬等級の市販品であった。真菌株アスペルギルスアクレアツスをC4‐ジカルボン酸輸送体タンパク質遺伝子c4t737、c4t521、及びmat737の供給源として使用した。アスペルギルスオリゼNRRL3488又はATCC56747を、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の供給源として、並びにC4‐ジカルボン酸の産生のために使用した。培地YEG培地は、1リットルあたり、20gのグルコース、5gの酵母抽出物、及び脱イオン水から構成された。COVEプレートは、1Mのショ糖、2のCOVE塩類溶液、10mMのアセトアミド、15mMのCsCl、及び25g/lのノーブル寒天から構成された。COVE塩類溶液は、1リットルあたり、26gのKCl、26gのMgSO47H2O、76gのKH2PO4、50mlのCOVE微量元素溶液、及び脱イオン水から構成された。COVE微量元素溶液は、1リットルあたり、0.04gのNa2B4O710H2O、0.04gのCuSO45H2O、1.2gのFeSO47H2O、0.7gのMnSO4H2O、0.8gのNa2MoO22H2O、10gのZnSO47H2O、及び脱イオン水から構成された。種培地は、1リットルあたり、40gグルコース、6gのバクトペプトン、750mgのKH2PO4、750mgのK2HPO4、100mgのMgSO47H2O、100mgのCaCl2H2O、5mgのFeSO47H2O、5mgのNaCl、及び脱イオン水から構成された。種培地Bは、1リットルあたり、30gのグルコース、3gのバクトペプトン、560mgのKH2PO4、560mgのK2HPO4、925mgのNaH2PO4H2O、820mgのNa2HPO4、75mgのMgSO47H2O、75mgのCaCl2H2O、0.75mlの1000×MicronutrientSolution、及び脱イオン水から構成された。酸産生培地Cは、1リットルあたり、100gのグルコース、80gのCaCO3、6gのバクトペプトン、150mgのKH2PO4、150mgのK2HPO4、100mgのMgSO47H2O、100mgのCaCl2H2O、1mlの1000×MicronutrientSolution、及び脱イオン水から構成された。発酵槽バッチ培地は、1リットルあたり、120gのグルコース、120gのCaCO3、9gのバクトペプトン、150mgのKH2PO4、150mgのK2HPO4、100mgのMgSO7H2O、100mgのCaCl22H2O、5mgのFeSO47H2O、5mgのNaCl、5mLのPluronicL61、及び脱イオン水から構成された。1000×MicronutrientSolutionは、1リットルあたり、5gのNaCl、5gのFeSO47H2O、1gのクエン酸、及び脱イオン水から構成された。PDAプレートは、39g/lのポテトデキストロース寒天から構成された。2×YTampプレートは、1リットルあたり、16gのトリプトン、10gの酵母抽出物、5gのNaCl、100mgのアンピシリン、15gのバクト寒天、及び脱イオン水から構成された。実施例1:アスペルギルスアクレアツスC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターpSaMF35の構築アスペルギルスアクレアツスからのゲノムDNAを、次のとおり単離した。2x106個の胞子を振盪フラスコ内の100mlのYEG培地に植え付け、そしてそのフラスコを160rpmで振盪しながら34°Cにて一晩インキュベートした。菌糸を、MIRACLOTH登録商標CalbiochemSanDiegoCAUSAを敷いた漏斗を使用した濾過によって集菌し、およそ2gの菌糸を、回収し、そして液体窒素中で冷凍した。冷凍菌糸を、MIRACLOTH登録商標の中に包みながら、ハンマーですばや粉砕することによって破壊した。次に、破壊した菌糸を、10mlの1×溶解バッファー100mMのEDTA、10mMのTrispH8.0、1Triton登録商標X‐100、0.5MのGuanidine‐HCl、200mMのNaCl及び3μlのRNアーゼAQIAGENIncValenciaCAUSA、100mg/mlの入った50ml容ポリプロピレン製コニカル遠沈管に移した。その遠沈管をゆるやかにボルテックスすることで混合し、そして室温にて5分間インキュベートし、その後、150μlのProteinaseKQIAGENIncValenciaCAUSA;20mg/mlを加えた。その遠沈管を、転倒撹拌によって混合し、50°Cにて1時間インキュベートした。次に、その遠沈管を7240×gにて20分間遠心分離した。次に、上清を、前平衡化QIAGEN‐チップ100QIAGENIncValenciaCAUSAに加え、そして残りのDNA抽出ステップを製造業者の取扱説明書に従って実施した。DNAを、100μlのTEバッファー10mMのTris塩基、1mMのEDTA、pH8.0中に再懸濁した。1194bpのC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子c4t737を、次に示したプライマー069698と069699を使用することでアスペルギルスアクレアツスのゲノムDNAから増幅した。プライマー069698:5’‐GTGATAGAACATCGTCCATAATGCTCGGGCAACACT‐3’配列番号7プライマー069699:5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTCCGATACATCCTCGT‐3’配列番号8PCR反応は、5μlの10×反応バッファーStratageneLaJollaCAUSA、1μlのA.アクレアツスのゲノムDNA鋳型105ng/μl、1μlのプライマー069698100ng/μl、1μlのプライマー069699100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、40.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのHerculase登録商標HotStartDNApolymeraseStratageneLaJollaCAUSAから構成された。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、60°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間を10サイクル;そしてそれぞれ95°Cにて10秒間、60°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間1サイクルごとに10秒追加を20サイクル、をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificIncWestburyNewYorkUSAによりインキュベートした。次に、PCR産物を、MinElute登録商標PCRPurificationKitQIAGENIncValenciaCAUSAを使用して精製した。プラスミドpShTh60図1;2010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号も参照を、SexAIとPacIで消化し、TBEバッファー10.8g/LのTris塩基、5.5g/Lのホウ酸、2mMのEDTA、pH8.0中の0.8のアガロースゲル電気泳動法によって分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQIAGENIncValenciaCAUSAを使用して精製した。次に、前記精製したPCR産物を、2μlの5×バッファーClontech、MountainViewCA、USA、2.4μlの精製PCR産物33ng/μl、1.5μlの消化及びゲル精製pShTh60132ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び3.1μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応キットClontech、MountainViewCA、USAを使用して消化したpShTh60断片内に挿入した。反応物は、37°Cにて15分間、50°Cにて15分間インキュベートし、氷上に5分間置き、そして40μlのTEバッファー10mMのTris塩基、1mMのEDTA、pH8.0で希釈して、pSaMF35図2を得た。pSaMF35を含む先の連結反応の反応物の2.5μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen、SanDiegoCA、USA内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を釣り出し、そしてDNA配列決定にかけてc4t737遺伝子がベクター内に組み込まれたことを確認した。アスペルギルスアクレアツスc4t737遺伝子のヌクレオチド配列配列番号1と推定アミノ酸配列配列番号2を図3に示す。そのコード配列は、終止コドンを含め1194bpである。コードしている予測タンパク質は、44.3kDaの予測分子量と6.93の等電点pHを有する397個のアミノ酸である。前記その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。。SignalPプログラムNielsenetal1997ProteinEngineering1016を使用して、61残基のシグナルペプチドは予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、37.3kDaの予測分子量と6.52の等電点pHを有する336個のアミノ酸を含んでいる。InterProScanプログラムEuropeanBioinformaticsInstituteを使用して、68個の残基のシグナルペプチドは予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、36.5kDaの予測分子量と6.52の等電点pHを有する329個のアミノ酸を含んでいる。実施例2:アスペルギルスオリゼNRRL3488SaMF35内への発現ベクター断片の形質転換pSaMF35のとアスペルギルスオリゼNRRL3488のプロトプラスト調製と形質転換を、約2x107個の胞子を100mlのYEG培地中に植え付け、そしてそのフラスコを140rpm、27°Cにて16~18時間インキュベートすることによって実施した。菌糸を、培養物をMIRACLOTH登録商標CalbiochemSanDiegoCAUSAを敷いた無菌の漏斗に注ぎ入れ、50mlの0.7MKClですすぐことで集菌した。洗浄した菌糸を、1mlの濾過滅菌した0.7MKClあたり、5mgのGLUCANEX商標NovozymesASBagsvaerdDenmark及び0.5mgキチナーゼSigmaChemicalCoStLouisMOUSAから構成された20mlのプロトプラスト化溶液の入った125ml容フラスコ中に再懸濁し、そして80rpmで混合しながら34°Cにて30分間インキュベートした。プロトプラスト化溶液を、MIRACLOTH登録商標を敷いた無菌の漏斗に注ぎ入れ、そして50mlのSTCバッファー1Mのソルビトール‐10mMのTrisHClpH6.5‐10mMのCaCl2ですすいだ。流れ出たものを2本の50ml容ポリプロピレン製チューブ内に回収した。そのチューブを1300×g、室温にて10分間遠心分離した。上清を捨て、そしてプロトプラストペレットを20mlのSTCバッファーで再懸濁した。プロトプラストを、ペレットを室温にて20mlのSTCバッファーで再懸濁し、そして1300×gにて10分間遠心分離することを2ラウンド行うことによって洗浄した。最終的なペレットを、2mlのSTCバッファーで再懸濁した。プロトプラストを、10μlのサンプルを取り出し、そして血球計VWR、WestChesterPA、USAでそれらをカウントすることによってカウントした。体積を、STCバッファーで調整し、1mlあたり2×107個のプロトプラスト濃度を得た。プラスミドpSaMF35を、PmeIでの制限消化によって形質転換のために調製した。4977bpの発現カセットを、QIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用してTBEバッファー中の0.8アガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そして精製した。2つの形質転換反応物を調製した。各反応として、プロトプラスト調製物の100μlの溶液を、12ml容ポリプロピレン製チューブに移し、そこに5μgの線状化pSaMF35、250μlのPEG溶液60w/vのポリエチレングリコールPEG、10mMのTris6.5、10mMのCaClを加え、続いて緩やかに混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。各形質転換体を9mlのSTCバッファーで希釈し、続いて3mlの別々の3つのアリコートをCOVEプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、34°Cにて7~10日間インキュベートした。20個のSaMF35形質転換体を、個々のCOVEプレートに移し、34°Cにて5日間インキュベートした。胞子ストックを、0.1のTWEEN登録商標80中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれグリセロールストック800μlの胞子ストック、200μlの0.1TWEEN登録商標80を調製することによって保存し、そして80°Cにて冷凍した。実施例3:pSaMF35の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF35の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生実施例2に記載のそれぞれのpSaMF35形質転換体と、対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488からの胞子を、個々のPDAプレート上で平板培養し、そして34°Cにて5~7日間胞子を形成させた。胞子を0.1のTWEEN登録商標80中に回収し、そして血球計を使用してカウントした。種培養を、100mlの種培地Bを含む250ml容フラスコ内に調製し、300μlの胞子懸濁液を接種した。種培養物を、200rpmで振盪しながら30°Cにて約17時間培養した。酸産生培養物を、50mlの酸産生培地Cと3mlの17時間種培養物を含む250ml容バッフルなしフラスコ内に調製した。培養物を、200rpmで振盪しながら30°Cにて2~10日間インキュベートした。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化は、1200SeriesBinaryLCSystemと1200SeriesDiodeArrayDetectorDADAgilentTechnologies、SantaClaraCAUSAを使用したReversePhaseHighPressureLiquidChromatographyRP‐HPLCによって実施した。逆相分離を、Aqua5μC18125Å205×4.6mmのIDカラムとAQC184x3.0mmのSecurityGuardCartridgePhenomenexIncTorranceCAUSAを使用して実施した。移動相は、10のメタノールHPLC等級と90の145mMホスファートpH1.5バッファーから成っていた。全培養物サンプルは取り出し、次に、850mlの64mMリン酸緩衝液と150mlのメタノールpH1.65から構成されたHPLCRunningBufferで1:10に希釈した。次に、サンプルを、25mmの0.45ミクロンポリエーテルスルホン膜WhatmanFlorhamParkNJUSAを通して濾過し、そして1.5mlの濾液を酸性分析のためにHPLCバイアル中に入れた。振盪フラスコ培養物の残量を、3層の寒冷紗を通して濾過し、そして10倍量の二重蒸留した滅菌水で3回をすすいで、不溶性CaCO3を取り除いた。細胞ペレットを、寒冷紗から回収し、15ml容培養試験管中に入れ、-20°Cにて保存した。RP‐HPLCを、25°Cのカラム温度と11分のランタイムを用いて0.7ml/分の流量等張にて10μlの注入体積を使用して実施した。検出は、360nmにて40nmのバンド幅を基準に用い、210nmにて8nmのバンド幅に設定した。ボイド時間を3.8分に決定した。49.2~3.93mMの範囲の濃度を有する連続的に希釈したリンゴ酸標準の複数回の注入を実施することによって、リンゴ酸について逆相法の定量性能を決定した。複数回の注入の相対標準偏差RSDは≦5であった。リンゴ酸はR2≧0.9999を示す。pSaMF35を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体は、3日間の振盪フラスコ培養後にアスペルギルスオリゼNRRL3488対照を2倍超上回るリンゴ酸産生の改善を示した。実施例3B:pSaMF35の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF35の発酵実施例2に記載のアスペルギルスオリゼpSaMF35形質転換体と、対照形質転換体であるアスペルギルスオリゼShTh10402010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号を参照を調製し、そして以下の実施例7に記載のとおり発酵させた。発酵中のリンゴ酸の定量化を先に記載したように実施した。アスペルギルスオリゼpSaMF35形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルスオリゼShTh1040形質転換体に匹敵しているので、先に記載のShTh1040とNRRL3488の比較を根拠に、アスペルギルスオリゼpSaMF35形質転換体はアスペルギルスオリゼーNRRL3488対照過剰発現C4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いているより優れていることを示唆している。実施例4:アスペルギルスアクレアツスC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターpSaMF36の構築1257bpのC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子c4t521を、以下に示したプライマー069700と069701を使用して単離されたアスペルギルスアクレアツスゲノムDNA実施例1から増幅した。プライマー069700:5’‐TGTGATAGAACATCGTCCATAATGCACGACCACAGC‐3’配列番号9プライマー069701:5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA‐3’配列番号10PCR反応物は、10μlの5×反応バッファー、1μlのA.アクレアツスゲノムDNA鋳型105ng/μl、1μlのプライマー069700100ng/μl、1μlのプライマー069701100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、35.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのPhusion商標HotStartHigh‐FidelityDNAポリメラーゼFinnzymesIncMassachusettsUSAから構成された。増幅反応物を、98°Cにて30秒間を1サイクル;それぞれ98°Cにて10秒間、60°Cにて30秒間、及び72°Cにて1分間を30サイクル;そして72°Cにて10分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標によりインキュベートした。PCR産物を、DpnIで1時間消化し、すべてのプラスミドDNA鋳型を分解した。プラスミドpShTh60図1を、SexAIとPacIで消化し、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用して精製した。次に、先の精製したPCR産物を、2μlの5×バッファー、3μlの精製したPCR産物26ng/μl、1.5μlのゲル精製したSexAI及びPacI消化、ゲル精製pShTh60132ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び2.5μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応キットを使用して消化したpShTh60断片内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、50°Cにて15分間インキュベートし、5分間氷上に置き、そして40μlのTEバッファーで希釈して、pSaMF36図4を得た。先のの連結反応物の2.5μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞に形質転換した。形質転換体を2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を釣り出し、そしてDNA配列決定にかけて、mat521遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。アスペルギルスアクレアツスc4t521遺伝子のヌクレオチド配列配列番号3と推定アミノ酸配列配列番号4を図5に示す。コード配列は、終止コドンを含めて1257bpである。コードしている予測タンパク質は、46.8kDaの予測分子量と6.36の等電点pHを有する418個のアミノ酸である。その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。SignalPプログラムNielsenetal1997ProteinEngineering1016を使用して、17残基のシグナルペプチドを予測した。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、44.9kDaの予測分子量と6.89の等電点pHを有する401個のアミノ酸を含んでいる。実施例5:アスペルギルスオリゼNRRL3488内へのpSaMF36の発現ベクター断片の形質転換SaMF36プロトプラスト調製とアスペルギルスオリゼNRRL3488の形質転換を、実施例2に記載のとおり実施した。プラスミドpSaMF36を、PmeIでの制限消化によって形質転換のために調製した。5040bpの発現カセットを、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用して精製した。2つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、100μlのプロトプラスト調製物を12ml容ポリプロピレン製チューブに移し、そこに5μgの線状化pSaMF36と250μlのPEG溶液60w/vのポリエチレングリコールPEG、10mMのTris6.5、10mMのCaClを加え、続いて緩やかに混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。各形質転換体を9mlのSTCバッファーで希釈し、続いて3mlの別々の3つのアリコートをCOVEプレート上で平板培養した。次に、各プレートを34°Cにて7~10日間インキュベートした。20個のSaMF36形質転換体を、個々のCOVEプレートに移し、そして34°Cにて5日間インキュベートした。胞子ストックを、0.1のTWEEN登録商標80中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック800μlの胞子ストック、200μlの0.1のTWEEN登録商標80を調製することによって保存し、-80°Cにて冷凍した。実施例6:pSaMF36SaMF36の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生実施例5に記載のそれぞれのpSaMF36形質転換体と、対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488からの胞子を、実施例3に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。表1には、3日間の振盪フラスコ培養後の、対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488のリンゴ酸産生と比較した、形質転換体であるアスペルギルスオリゼSaMF36‐3及びアスペルギルスオリゼSaMF36‐4のリンゴ酸力価の相対的増加が示されている。アスペルギルスオリゼSaMF36‐3及びアスペルギルスオリゼSaMF36‐4は、アスペルギルスオリゼNRRL3488と比較して、それぞれ2.1倍及び2.3倍のリンゴ酸力価の増大を生じた。実施例7:pSaMF36の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF36の発酵実施例5に記載のアスペルギルスオリゼpSaMF36形質転換体と対照形質転換体であるアスペルギルスオリゼShTh10402010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号を参照を、34°Cにて約7日間PDAプレート上で培養した。0.2のTWEEN登録商標80を含む5~6mlの体積の無菌50mMリン酸ナトリウムバッファーpH6.8を、それぞれ平板培養に加え、そして胞子を、白金耳で掻き取ることによって懸濁した。各懸濁液をピペットによって50ml容コニカルチューブに移した。各チューブに関して、25mlの無菌リン酸ナトリウム緩衝液50mM、pH6.8を、75mlの種培地の入った500ml容バッフルなしフラスコに加え、次にそこに2mlの胞子懸濁液を植え付けた。次に、そのフラスコを180rpm、34°Cにて約24時間インキュベートした。1タンクあたりに必要とされる144mlの種菌を供給するために、種フラスコを組み合わせた。1.8リットルの発酵槽バッチ培地を含む3リットル容発酵槽に、アスペルギルスオリゼpSaMF36形質転換体又はアスペルギルスオリゼShTh1040形質転換体のいずれかの組み合わせ種フラスコからの種培養ブロス144ml8を導入することによって、個別に植え付けをした。この実施例だけに関しては、発酵槽バッチ培地中のグルコース濃度を、60g/Lまで減らし、そして給餌開始が1日遅れた。発酵槽を、34°C±0.1°Cに平衡化し、500rpmで撹拌した。流入気流を1v/v/mで維持した。20のグルコース流を、発酵約43時間で開始し、約7.3g/時間の速度で投与した。無菌CaCO3約100gを5日又は6日目周りで加えて、6~7の範囲に発酵pHを保った。サンプルを毎日抜き取り、そして実施例3に記載のリンゴ酸産生について分析した。発酵を7又は8日間で終了した。発酵におけるリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。アスペルギルスオリゼpSaMF36形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルスオリゼShTh1040に匹敵しているので、先に記載したShTh1040とNRRL3488の比較を根拠に、アスペルギルスオリゼpSaMF36形質転換体がアスペルギルスオリゼNRRL3488過剰発現C4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いているよりリンゴ酸産生に優れていることを示唆している。実施例8:アスペルギルスオリゼリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングと発現ベクターpSaMF21の構築プラスミドpSaMF21を、NAD依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh3遺伝子配列DOGAN:AO0907010000132010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号に記載のアスペルギルスオリゼーからの1430bpの断片を含むように構築した。アスペルギルスオリゼNRRL3488リンゴ酸デヒドロゲナーゼmdh3遺伝子のヌクレオチド配列配列番号11と推定アミノ酸配列配列番号12を図6に示す。終止コドンを含めて1430bpのゲノムコード配列は、35kDaの予測質量を有する330個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。コード配列は、57bp14~70bp、70bp103~172bp、74bp284~357bp、68bp446~513bp、58bp892~949bp、48bp1035~1082bp、及び62bp1228~1289bpの7つのイントロンが割り込んでいる。mdh3遺伝子のコード領域のGC含有量は50.3である。簡単に言えば、プラスミドを、SexAIとPacIでの制限消化によるpShTh60図1の線形化によって構築した。消化したベクターを、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用して精製した。mdh3遺伝子を、プライマー067522と067525を使用してpShTh712010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号から増幅した。プライマー067522:5’‐AGAACATCGTCCATAATGGTCAAAGCTGGTGAGTTA‐3’配列番号13プライマー067525:5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTTTGGTGGTGGGTTCT‐3’配列番号14PCR反応物は、5μlの10×反応バッファー、1μlのpShTh71鋳型87ng/μl、1μlのプライマー067522100ng/μl、1μlのプライマー067525100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、45.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのHerculase登録商標HotStartDNAポリメラーゼStratageneLaJollaCAUSAから構成された。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、58°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間を10サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、50°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間1サイクルごとに10秒追加を20サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標によりインキュベートした。PCR反応物を、DpnIでの制限消化に1時間晒して、すべてのプラスミドDNA鋳型を分解した。次に、PCR産物を、MinElute登録商標PCRPurificationKitQIAGENIncValenciaCAUSAを使用して精製した。精製したPCR産物を、2μlの5×バッファー、0.5μlの精製したPCR産物110ng/μl、1.7μlのゲル精製したSexAIとPacIで制限消化したpShTh60図1;78ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び4.8μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応を使用してベクター内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、続いて50°Cにて15分間インキュベートし、その後それを氷上に5分間置き、そして40μlのTEバッファーで希釈して、pSaMF21図7を得た。連結反応物の2μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen、SanDiegoCA、USAに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、DNA配列決定にかけて、mdh3遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれことを確認した。実施例9:アスペルギルスオリゼピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングと発現ベクターpRyan1の構築プラスミドpRyan1を、2010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号に記載のアスペルギルスオリゼーからの2つの終止コドンを含めて3646bpの断片であるピルビン酸カルボキシラーゼpyc遺伝子配列DOGAN:AO090023000801を含むように構築した。アスペルギルスオリゼピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列配列番号15と推定アミノ酸配列配列番号16を、図8Aと8Bに示す。アスペルギルスオリゼNRRL3488とATCC56747ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は共に、同じヌクレオチド配列を有する。1つの終止コドンを含む3643bpのゲノムコード配列は、131kDaの予測質量で1193個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。コード配列には、61bp3475~3535bpの1つのイントロンが割り込んでいる。遺伝子のコード領域のGC含有量は57.1である。簡単に言えば、プラスミドを、SexAIとPacIでの制限消化によるpShTh60図1の線形化によって構築した。消化したベクターを、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用して精製した。pyc遺伝子を、アスペルギルスオリゼNRRL3488ゲノムDNAから以下に示したプライマー066549と067388を使用して増幅した。プライマー066549:5’‐TAGAACATCGTCCATAATGGCGGCTCCGTTTCGTCA‐3’配列番号17プライマー067388:5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTACGCTTTGACGATCT‐3’配列番号18PCR反応物は、5μlの10×反応バッファー、1μlのアスペルギルスオリゼNRRL3488ゲノムDNA110ng/μl、1μlのプライマー066549100ng/μl、1μlのプライマー067388100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、45.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのHerculase登録商標HotStartDNAポリメラーゼから構成された。増幅反応を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、58°Cにて30秒間、及び72°Cにて3.5分間を10サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、58°Cにて30秒間、及び72°Cにて3.5分間1サイクルごとに10秒追加を20サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標によりインキュベートした。次に、PCR産物を、MinElute登録商標PCRPurificationKitを使用して精製した。精製したPCR産物を、2μlの5×バッファー、1μlのPCR産物144ng/μl、2μlのゲル精製したSexAIとPacIで制限消化したpShTh60図1;78ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び4μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応を使用してベクター内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、続いて50°Cにて15分間インキュベートし、その後それを氷上に5分間置き、40μlのTEバッファーで希釈して、pRYAN1図9を得た。連結反応物の2μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、DNA配列決定にかけて、pycの遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。第1308ヌクレオチドを、CからTに変更したが、タンパク質配列に影響しなかった。実施例10:アスペルギルスオリゼNRRL3488内へのpSaMF36、pSaMF21、及びpRyan1の発現ベクター断片の形質転換SaMF3603ベクターpSaMF36実施例4、pSaMF21実施例8、及びpRyan1実施例9を、形質転換のためにPmeIを用いて37°Cにて4時間消化することによって調製した。消化したベクターを、0.8のアガロースTBEゲルにより分離し、5040bpのバンドをpSaMF36のために切り出し、5213bpのバンドをpSaMF21のために切り出し、そして7429bpのバンドをpRyan1のために切り出した。発現カセットを含むバンドを、製造業者の取扱説明書に従ってMacherey‐NagelNucleospin登録商標ExtractIIKitDijrenGermanyを使用してそれぞれ精製した。3つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、100μlのプロトプラスト調製物実施例2を12ml容ポリプロピレン製チューブに移した。これに、等モル当量且つ250μlのポリエチレングリコールPEG溶液60w/vのポリエチレングリコールPEG、10mMのTris6.5、10mMのCaCl中、合計5マイクログラムの、ampマーカー不含、線状化pShTh104、pSaMF21、及びpRyan1を加え、続いて緩やかに混合し、そして、37°Cにて30分間インキュベートした。各形質転換を、9mlのSTCバッファーで希釈し、続いて3mlの別々の3つのアリコートをCOVEプレート上で平板培養した。次に、各プレートを34°Cにて7~10日間インキュベートした。得られた形質転換体を、個々のCOVEプレートに移し、34°Cにて5日間インキュベートした。胞子ストックを、0.1のTWEEN登録商標80中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれ800μlの胞子ストック、200μlの0.1TWEEN登録商標80のグリセロールストックを調製することによって保存し、-80°Cにて冷凍した。実施例11:pSaMF36、pSaMF21、及びpRyan1の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF3603の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生実施例10に記載のそれぞれのアスペルギルスオリゼ三重形質転換体SaMF3603と、対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488からの胞子を、実施例3に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。pSaMF36、pSaMF21、及びpRyan1を含有するアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF3603は、アスペルギルスオリゼNRRL3488対照株を2.55倍超上回るリンゴ酸産生の改善を示した。実施例12:pSaMF36、pSaMF21、及びpRyan1の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF3603の発酵実施例10に記載のアスペルギルスオリゼ三重形質転換体SaMF3603及び対照形質転換体アスペルギルスオリゼSaMF21032010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号を参照を、実施例7に記載のとおり調製し、そして発酵させた。発酵におけるリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。アスペルギルスオリゼ三重形質転換体SaMF3603の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF2103に匹敵しているので、以前に記載した比較を根拠に、アスペルギルスオリゼ三重形質転換体SaMF3603は、アスペルギルスオリゼpSaMF36単独形質転換体及びアスペルギルスオリゼNRRL3488対照の両方より優れていることが示唆された。実施例13:アスペルギルスアクレアツスC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと発現ベクターpSaMF38の構築1194bpのC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子mat737を、pAaMAT737図10;DNA2.0、MenloParkCA、USA内に合成によって構築した。mat737遺伝子を、プライマー069698と069699実施例1を使用してpAaMAT737から増幅した。PCR反応物は、10μlの5×反応バッファー、1μlのpAaMAT737鋳型20ng/μl、1μlのプライマー069698100ng/μl、1μlのプライマー069699100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、35.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのPhusion登録商標HotStartHigh‐FidelityDNAポリメラーゼから構成された。増幅反応物を、98°Cにて30秒間を1サイクル;それぞれ98°Cにて10秒間、65°Cにて30秒間、及び72°Cにて1分間を30サイクル;72°Cにて10分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標によりインキュベートした。PCR反応物を、DpnIを用いて1時間消化し、すべてのプラスミドDNA鋳型を分解した。PCR産物を、MinElute登録商標PCRPurificationKitを使用して精製した。プラスミドpShTh60図1を、SexAIとPacIで消化し、TBEバッファー10.8g/LのTris塩基、5.5g/Lのホウ酸、2mMのEDTA、pH8.0中の0.8のアガロースゲル電気泳動法で分離し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitを使用して精製した。先の精製したPCR産物を、2μlの5×バッファー、0.5μlの精製したPCR産物187ng/μl、1.5μlの消化及びゲル精製したpShTh60132ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び5μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応キットを使用して消化したpShTh60断片内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、50°Cにて15分間インキュベートし、5分間氷上に置き、そして40μlのTEバッファー10mMのTris塩基、1mMのEDTA、pH8.0で希釈して、pSaMF38図11を得た。pSaMF38を含む先の連結反応物の2.5μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、DNA配列決定にかけて、mat737遺伝子がベクター内に組み込まれたことを確認した。mat737遺伝子のヌクレオチド配列配列番号5と推定アミノ酸配列配列番号6を図12に示す。コード配列は、終止コドンを含めて1194bpである。コードしている予測タンパク質は、44.3kDaの予測分子量と7.32の等電点pHを有する397個のアミノ酸である。その遺伝子はイントロンを全く含んでいない。InterProScanプログラムEuropeanBioinformaticsInstituteを使用して、68残基のシグナルペプチドが予測された。このプログラムに基づいて、予測成熟タンパク質は、36.6kDaの予測分子量と6.52の等電点pHを有する329個のアミノ酸を含んでいる。実施例14:アスペルギルスオリゼNRRL3488内への発現ベクター断片pSaMF38の形質転換SaMF38アスペルギルスオリゼNRRL3488のプロトプラスト調製及び形質転換を、実施例2に記載のとおり実施した。プラスミドpSaMF38を、形質転換のためにPmeIで制限消化することによって調製した。4977bpの発現カセットを、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法により消化したベクターから分離し、そしてMacherey‐NagelNucleospinExtractIIKitを使用して精製した。2つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、100μlのプロトプラスト調製物を、12ml容ポリプロピレン製チューブに移し、それに5μgの線状化pSaMF38と250μlのPEG溶液60w/vのポリエチレングリコールPEG、10mMのTris6.5、10mMのCaClを加え、続いて緩やかに混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。各形質転換を、9mlのSTCバッファーで希釈し、続いて3mlの別々の3つのアリコートをCOVEプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、34°Cにて7~10日間インキュベートした。20個のSaMF38形質転換体を、個々のCOVEプレートに移し、34°Cにて5日間インキュベートした。胞子ストックを、0.1のTWEEN登録商標80中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック800μlの胞子ストック、200μlの0.1TWEEN登録商標80を調製することによって保存し、-80°Cにて冷凍した。実施例15:pSaMF38の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF38の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生実施例14に記載のアスペルギルスオリゼpSaMF38形質転換体と、対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488からの胞子を、実施例3に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。アスペルギルスオリゼpSaMF38形質転換体は、アスペルギルスオリゼNRRL3488対照株を1.8倍超上回るリンゴ酸産生における改善を示した。実施例16:アスペルギルスアクレアツスC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子のクローニングと選択的プロモーター制御下の発現ベクターpSaMF41の構築以下の実施例は、アスペルギルスアクレアツスC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子が選択的gpdプロモーターを使用して駆動できることを実証する。1257bpのC4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子c4t521を、以下に示したプライマー0611384と069701を使用してpSaMF36前掲から増幅した。プライマー0611384:5’‐CCAACAGACACATCTAAACAATGCACGACCACAGCA‐3’配列番号21プライマー069701:5’‐GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA‐3’配列番号22PCR反応物は、5μlの10×反応バッファー、1μlのpSaMF36鋳型50ng/μl、1μlのプライマー0611384100ng/μl、1μlのプライマー069701100ng/μl、1μlのdNTP混合物10mM、40.5μlの脱イオン水、及び0.5μlのHerculase登録商標HotStartDNAポリメラーゼStratageneLaJollaCAUSAから構成された。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、60°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間を10サイクル;それぞれ95°Cにて10秒間、60°Cにて30秒間、及び72°Cにて1.5分間1サイクルごとに10秒追加を20サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標によりインキュベートした。PCR反応物を、DpnIを用いて1時間制限消化にかけて、すべてのプラスミドDNA鋳型を分解した。次に、PCR産物を、MinElute登録商標PCRPurificationKitQIAGENIncを使用して精製した。次に、精製したPCR産物を、5×がバッファー2μl、0.6μlの精製したPCR産物127ng/μl、1.75μlのゲル精製しHindIIIとPacIで制限消化しpShTh108114ng/μl、1μlのIn‐Fusion商標酵素、及び4.65μlの脱イオン水から構成されたIn‐Fusion商標Advantage反応を使用してgpdプロモーターを含むベクターpShTh108内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、次に50°Cにて15分間インキュベートし、次に氷上に5分間置き、そして40μlのTEバッファーで希釈して、pSaMF41を得た。連結反応物の2.5μlのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってONESHOT登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体を、DNA配列決定にかけて、c4t521遺伝子が首尾よくベクター内に組み込まれたことを確認した。アスペルギルスアクレアツスc4t521遺伝子のヌクレオチド配列配列番号3と推定アミノ酸配列配列番号4を図5に示す。そのコード配列は、終止コドンを含めて1257bpであり、実施例4のpgkプロモーターと比較してgpdプロモーターによって駆動される。実施例17:アスペルギルスオリゼNRRL3488への発現ベクター断片pSaMF41の形質転換SaMF41アスペルギルスオリゼ3488のプロトプラスト調製と形質転換を、実施例2に記載のとおり実施した。プラスミドpSaMF41を、形質転換のためにPmeIを用いて制限消化することによる線形化によって調製した。5025bpの発現カセットを、TBEバッファー中の0.8のアガロースゲル電気泳動法によって消化したベクターから分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル分離にMachereyNagelNucleospin登録商標ExtractIIKitを使用して精製した。2つの形質転換反応物を調製した。各形質転換反応として、100μlのプロトプラスト調製物を12ml容ポリプロピレン製チューブに移した。これに5μgの線状化pSaMF41と250μlのPEG溶液60w/vのポリエチレングリコールPEG、10mMのTris6.5、10mMのCaClを加え、続いて緩やかに混合し、そして37°Cにて30分間インキュベートした。各形質転換体を、9mlのSTCバッファーで希釈し、続いて3mlの別々の3つのアリコートをCOVEプレート上で平板培養した。次に、各プレートを、34°Cにて7~10日間インキュベートした。SaMF41形質転換体を、個々のCOVEプレートに移し、そして34°Cにて5日間インキュベートした。胞子ストックを、0.1のTWEEN登録商標80中に胞子を回収することによって調製した。培養物を、それぞれのグリセロールストック800μlの胞子ストック、200μlの0.1TWEEN登録商標80を調製することによって保存し、-80°Cにて冷凍した。実施例18:pSaMF41の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF41の振盪フラスコ培養におけるリンゴ酸の産生実施例17に記載のそれぞれのpSaMF41形質転換体SaMF41、実施例5に記載のpSaMF36形質転換体SaMF36、及び対照としてのアスペルギルスオリゼNRRL3488からの胞子を、実施例3に記載のとおり調製した。振盪フラスコ培養形質転換体のリンゴ酸の定量化を、実施例3に記載のとおり実施した。gpdプロモーターによって駆動されるアスペルギルスアクレアツスc4t521遺伝子配列番号3を含むアスペルギルスオリゼSaMF41形質転換体は、pgkプロモーターによって駆動されるアスペルギルスアクレアツスc4t521の遺伝子配列番号3を含むアスペルギルスオリゼSaMF36形質転換体に匹敵するリンゴ酸産生を示し、さらに、c4t521遺伝子を欠いているアスペルギルスオリゼNRRL3488対照と比較して約2倍のリンゴ酸力価の増大を示した。実施例19:pSaMF41の発現ベクター断片を含むアスペルギルスオリゼ形質転換体SaMF41の発酵実施例18に記載のアスペルギルスオリゼpSaMF41形質転換体と対照形質転換体であるアスペルギルスオリゼShTh10402010年8月27日に出願されたPCT出願第PCT/US10/47002号を参照を、実施例7に記載のとおり調製し、そして発酵させた。発酵におけるリンゴ酸の定量化を、先に記載したように実施した。アスペルギルスオリゼpSaMF41形質転換体の相対リンゴ酸力価は、アスペルギルスオリゼShTh1040形質転換体に匹敵しているので、先に記載したShTh1040とNRRL3488との比較を根拠に、アスペルギルスオリゼpSaMF41形質転換体は、過剰発現C4‐ジカルボン酸輸送体遺伝子を欠いているアスペルギルスオリゼーNRRL3488対照より優れていることが示唆された。生物学的材料の寄託以下の生物学的材料は、ブダペスト条約の条項に従い、theAgriculturalResearchServicePatentCultureCollectionNorthernRegionalResearchCenter1815UniversityStreetPeoriaILUSAに寄託され、以下の受入番号を付与された:これらの株は、本出願の係属中は、その権利を有すると外国の特許法で認められる人への菌株のアクセスを可能にする条件下で寄託されている。寄託物は、寄託された菌株の実質的に純粋な培養物である。寄託物は、本出願の写し又はその所産物が出願される国における外国特許法の必要性に応じて入手できる。しかし寄託物の入手可能性は、政府により認可される特許権を逸脱して、本発明を実施する権利を与えるものではないことを理解すべきである。本発明は、以下の付番された段落によりさらに説明される:[1]以下のものから選択されるC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド:a配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリペプチド;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、若しくは5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;c配列番号1、3、若しくは5、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;d配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体;並びにeC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するa、b、c、又はdのポリペプチドの断片。[2]以下のものから選択されるC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド:a配列番号2又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも75、例えば、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリペプチド;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;c配列番号1又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも75、例えば、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;d配列番号2又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体、並びにeC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するa、b、c、又はdのポリペプチドの断片。[3]以下のものから選択されるC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド:a配列番号4又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリペプチド;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号3、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;c配列番号3又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;d配列番号4又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体、並びにeC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するa、b、c、又はdのポリペプチドの断片。[4]以下のものから選択されるC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有する単離されたポリペプチド:a配列番号6又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリペプチド;b低ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;c配列番号5又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99、又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;d配列番号6又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体、並びにeC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するa、b、c、又はdのポリペプチドの断片。[5]配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99又は100の配列同一性を有する、段落[1]~[4]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[6]低ストリンジェンシー条件下で、低~中ストリンジェンシー条件下で、中ストリンジェンシー条件下で、中~高ストリンジェンシー条件下で、高ストリンジェンシー条件下で、又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号1、3、若しくは5、その成熟ポリペプチドコード配列、又は前記配列の完全長相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、段落[1]~[5]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[7]配列番号1、3、若しくは5、又はその成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも65、例えば、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも91、少なくとも92、少なくとも93、少なくとも94、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99又は100の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、段落[1]~[6]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[8]配列番号2、4か、又は6を含んで成るか又はそれから成る、段落[1]~[7]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[9]配列番号2、4、若しくは6の成熟ポリペプチドを含んで成るか又はそれから成る、段落[1]~[7]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[10]配列番号2の成熟ポリペプチドが、配列番号2の第62~397又は69~397アミノ酸である、段落[9]に記載のポリペプチド。[11]配列番号4の成熟ポリペプチドが、配列番号4の第18~418アミノ酸である、段落[9]に記載のポリペプチド。[12]配列番号6の成熟ポリペプチドが、配列番号6の第69~397アミノ酸である、段落[9]に記載のポリペプチド。[13]配列番号2、4、若しくは6の断片であって、ここで、前記断片がC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有している、段落[1]~[7]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[14]配列番号2、4、若しくは6、又はその成熟ポリペプチド配列の1若しくは複数例えば、2個、数個のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入を含んで成る変異体である、段落[1]~[7]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[15]E.コリNRRLB‐50400に含まれるプラスミドpAaC4T737に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落[1]~[13]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[16]E.コリNRRLB‐50388に含まれるプラスミドpAaC4t521に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落[1]~[13]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[17]E.コリNRRLB50401に含まれるプラスミドpAaMAT737に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、段落[1]~[13]のいずれか1項に記載のポリペプチド。[18]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んで成る組成物。[19]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。[20]発現宿主内でそのポリペプチドの産生を指示する1若しくは複数例えば、2個、数個の制御配列に作用可能に連結された段落[19]に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構築物又は発現ベクター。[21]そのポリペプチドの産生を指示する1若しくは複数の制御配列に作用可能に連結された段落[19]のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞。[22]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって:a前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、その野生型では前記ポリペプチドを産生する細胞を培養し;そしてb前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。[23]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって、a前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、段落[21]に記載の組換え宿主細胞を培養し;そしてb前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。[24]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換されたトランスジェニック植物、植物の部分又は植物細胞。[25]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって:a前記ポリペプチドの産生を促進する条件下で、段落[24]に記載のトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し;そしてb前記ポリペプチドを回収すること、を含んで成る方法。[26]親細胞の突然変異体の製造方法であって:段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを不活性化し、そしてそれが、親細胞ほどポリペプチドを産生しない突然変異体をもたらすことを含んで成る方法。[27]段落[26]に記載の方法によって作出される突然変異細胞。[28]天然又は異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んで成る、段落[27]に記載の突然変異細胞。[29]タンパク質の製造方法であって:a前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落[27]又は[28]に記載の突然変異細胞を培養し;そしてb前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。[30]段落[19]に記載のポリヌクレオチドの部分配列を含んで成る二本鎖阻害性RNAdsRNA分子であって、ここで、前記dsRNAが場合によりsiRNA分子又はmiRNA分子である分子。[31]長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又はそれを超える二本鎖ヌクレオチドである、段落[30]に記載の二本鎖阻害性RNAdsRNA分子。[32]細胞におけるC4‐ジカルボン酸輸送体活性を有するポリペプチド発現の阻害方法であって、段落[30]又は[31]に記載の二本鎖RNAdsRNA分子を前記細胞に投与するか又は前記細胞で発現させることを含んで成る方法。[33]段落[31]又は[32]に記載の方法によって作出される細胞。[34]天然又は異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んで成る、段落[33]に記載の細胞。[35]タンパク質の製造方法であって:a前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落[33]又は[34]に記載の細胞を培養し;そしてb前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。[36]配列番号2の第1~61又は1~68アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。[37]配列番号4の第1~17アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。[38]配列番号6の第1~68アミノ酸を含んで成るか又はそれから成るシグナルペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。[39]段落[36]~[38]のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドに作用可能に連結されたタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る核酸構築物又は発現ベクターであって、ここで、前記遺伝子がシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって外来性である核酸構築物又は発現ベクター。[40]段落[39]に記載の核酸構築物又は発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。[41]タンパク質の製造方法であって:a前記タンパク質の産生を促進する条件下で、段落[40]に記載の組換え宿主細胞を培養し;そしてb前記タンパク質を回収すること、を含んで成る方法。[42]C4‐ジカルボン酸の製造方法であって:a培地中で、段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞を培養し;そしてbC4‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。[43]C4‐ジカルボン酸産生を増やす方法であって:a段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを宿主細胞内に形質転換し;b培地中で形質転換生物体を培養し;そしてcC4‐ジカルボン酸を回収すること、を含んで成る方法。[44]異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性であるプロモーターに作用可能に連結されている、段落[42]又は[43]に記載の方法。[45]宿主細胞が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチド例えば、配列番号11の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれかをさらに含んで成る、段落[42]~[44]のいずれか1項に記載の方法。[46]第2の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落[45]に記載の方法。[47]宿主細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第3のポリヌクレオチド例えば、配列番号15の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれかをさらに含んで成る、段落[42]~[46]のいずれか1項に記載の方法。[48]第3の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落[47]に記載の方法。[49]宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、段落[42]~[48]のいずれか1項に記載の方法。[50]糸状菌宿主細胞が、アクレモニウムAcremonium、アスペルギルスAspergillus、アウレオバシジウムAureobasidium、ビヤーカンデラBjerkandera、セリポリオプシスCeriporiopsis、クリソスポリウムChrysosporium、コプリヌスCoprinus、コリオルスCoriolus、クリプトコッカスCryptococcus、フィリバシジウムFilibasidium、フザリウムFusarium、フミコーラHumicola、マグナポルテMagnaporthe、ムコールMucor、ミセリオフトラMyceliophthora、ネオカリマスティクスNeocallimastix、ノイロスポラNeurospora、ペシロミセスPaecilomyces、ペニシリウムPenicillium、フェネロケテPhanerochaete、フレビアPhlebia、ピロミセスPiromyces、プレロータスPleurotus、リゾープスRhizopus、シゾフィルムSchizophyllum、タラロミセスTalaromyces、サーモアスクスThermoascus、チエラビアThielavia、トリポクラジウムTolypocladium、トラメテスTrametes、又はトリコデルマTrichodermaから選択される、段落[49]に記載の方法。[51]宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、段落[50]に記載の方法。[52]宿主細胞が、アスペルギルスオリゼ宿主細胞である、段落[50]に記載の方法。[53]培地が発酵培地である、段落[42]~[52]のいずれか1項に記載の方法。[54]C4‐ジカルボン酸が、約10g/L超、例えば、約25g/L超、50g/L超、75g/L超、100g/L超、125g/L超、150g/L超、160g/L超、170g/L超、180g/L超、190g/L超、200g/L超、210g/L超、225g/L超、250g/L超、275g/L超、300g/L超、325g/L超、350g/L超、400g/L超、又は500g/L超;あるいは、例えば、約10g/L超~約500g/L超、約50g/L超~約350g/L超、約100g/L超~約300g/L超、約150g/L超~約250g/L超、約175g/L超~約225g/L超、又は約190g/L超~約210g/L超の力価である、段落[42]~[53]のいずれか1項に記載の方法。[55]C4‐ジカルボン酸のレベルが、同じ条件下で培養された場合に、C4‐ジカルボン酸輸送体をコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも25、例えば、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも300、又は500増強される、段落[42]~[54]のいずれか1項に記載の方法。[56]C4‐ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、及びフマル酸から選択される、段落[42]~[55]のいずれか1項に記載の方法。[57]C4‐ジカルボン酸がリンゴ酸である、段落[56]に記載の方法。[58]段落[1]~[17]のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含んで成る宿主細胞であって、ここで、同じ条件下で培養された場合に、異種ポリヌクレオチドなしの宿主細胞と比較して、高いレベルでC4‐ジカルボン酸を分泌できる宿主細胞。[59]異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落[58]に記載の宿主細胞。[60]リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする第2の異種ポリヌクレオチド例えば、配列番号11の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれかをさらに含んで成る、段落[57]又は[58]に記載の宿主細胞。[61]第2の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落[60]に記載の宿主細胞。[62]ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする第3の異種ポリヌクレオチド例えば、配列番号15の成熟ポリペプチドコード配列又は記載されたその態様のいずれかをさらに含んで成る、[58]~[61]のいずれか1項に記載の宿主細胞。[62]第3の異種ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにとって外来性のプロモーターに作用可能に連結されている、段落[62]に記載の宿主細胞。[63]宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、段落[58]~[62]のいずれか1項に記載の宿主細胞。[64]宿主細胞が、アクレモニウムAcremonium、アスペルギルスAspergillus、アウレオバシジウムAureobasidium、ビヤーカンデラBjerkandera、セリポリオプシスCeriporiopsis、クリソスポリウムChrysosporium、コプリヌスCoprinus、コリオルスCoriolus、クリプトコッカスCryptococcus、フィリバシジウムFilibasidium、フザリウムFusarium、フミコーラHumicola、マグナポルテMagnaporthe、ムコールMucor、ミセリオフトラMyceliophthora、ネオカリマスティクスNeocallimastix、ノイロスポラNeurospora、ペシロミセスPaecilomyces、ペニシリウムPenicillium、フェネロケテPhanerochaete、フレビアPhlebia、ピロミセスPiromyces、プレロータスPleurotus、リゾープスRhizopus、シゾフィルムSchizophyllum、タラロミセスTalaromyces、サーモアスクスThermoascus、チエラビアThielavia、トリポクラジウムTolypocladium、トラメテスTrametes、又はトリコデルマTrichodermaから選択される、段落[63]に記載の糸状菌宿主細胞。[65]宿主細胞が、アスペルギルス宿主細胞である、段落[64]に記載の糸状菌宿主細胞。[66]宿主細胞が、アスペルギルスオリゼ宿主細胞である、段落[64]に記載の糸状菌宿主細胞。[67]細胞が、1時間あたり約0.1g/L超、例えば、1時間あたり約0.2g/L超、1時間あたり0.5g/L超、1時間あたり0.6g/L超、1時間あたり0.7g/L超、1時間あたり0.8g/L超、1時間あたり0.9g/L超、1時間あたり1.0g/L超、1時間あたり1.1g/L超、1時間あたり1.2g/L超、1時間あたり1.3g/L超、1時間あたり1.5g/L超、1時間あたり1.75g/L超、1時間あたり2.0g/L超、1時間あたり2.25g/L超、1時間あたり2.5g/L超、又は1時間あたり3.0g/L超;あるいは、1時間あたり約0.1g/L超~1時間あたり約2.0g/L超、例えば、1時間あたり約0.3g/L超~1時間あたり約1.7g/L超、1時間あたり約0.5g/L超~1時間あたり約1.5g/L超、1時間あたり約0.7g/L超~1時間あたり約1.3g/L超、1時間あたり約0.8g/L超~1時間あたり約1.2g/L超、又は1時間あたり約0.9g/L超~1時間あたり約1.1g/L超のC4‐ジカルボン酸の容積生産性が可能である、段落[58]~[66]のいずれか1項に記載の宿主細胞。[68]宿主細胞が、同じ条件下で培養された場合に、第1の異種ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、少なくとも25、例えば、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも300、又は500高いレベルのC4‐ジカルボン酸を分泌できる、段落[58]~[67]のいずれか1項に記載の宿主細胞。[69]C4‐ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸、マロン酸、及びフマル酸から選択される、段落[58]~[68]のいずれか1項に記載の宿主細胞。[70]C4‐ジカルボン酸がリンゴ酸である、段落[69]に記載の宿主細胞。本明細書の具体的な態様は本発明のいくつかの態様の例であることを企図しており、本明細書に記載し特許請求される発明の範囲は、決してこれらの態様に限定されるものではない。すべての同等の態様は、本発明の範囲内にあると考えられる。実際、本明細書に示し説明した本発明の種々の変更態様は、前記説明から当業者には明らかであろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲内であると企図される。不一致がある場合は、定義を含む本開示が優先するものとする。