"以下の工程を含む、光を生成する方法:aオキシダントを提供する工程;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつR2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である;c1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程;d1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程;e反応混合物を形成するために、酵素複合体を、1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程;ならびにf反応混合物に光を生成させる工程。前記オキシダントが、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレート、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。前記オキシダントが、過酸化水素、ならびに過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムである、請求項2に記載の方法。AまたはBのうちの少なくとも1つがである、請求項1に記載の方法。AおよびBがともにである、請求項1に記載の方法。R1が、1~2の炭素原子を含むアルキルまたは1~2の炭素原子を含むトリフルオアルキルtrifluoalkylである、請求項1に記載の方法。Tが以下である、請求項1に記載の方法:式中、R3、R4およびR5は、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチルtrifluomethyl、トリフルロエチルtrifluroethyl、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1~20の炭素原子を含むアルコキシ、6~14の炭素原子を含むアリール、6~14の炭素原子を含むアリールオキシ、2~21の炭素原子を含むエステル、3~30の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3~30の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2~21の炭素原子を含むアルキルアミド、7~15の炭素原子を含むアリールアミド、2~21の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7~15の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6~14の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3~60の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18~42の炭素原子を含むトリアリールシリル、7~32の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1~20の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールスルホニル、2~20の炭素原子を含むアルキルチオおよび6~14の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、かつXは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。OR2が、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニド、または以下である、請求項1に記載の方法:式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖である。R2が、である、請求項8に記載の方法。R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、Z基の酵素的切断に際してこの原子はNuc基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって1,2-ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつ、Zは酵素的切断可能基であり;式中、Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;Lは、1~4の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-CH2m-O-CH2n、-CH2m-S-CH2n-、または-CH2m-NR6-CH2n-からなる群から選択され、式中、mおよびnは0~3であり、かつmnは2または3であり、式中、R6は、1~10の炭素原子を含むアルキルであり、かつ、連結基は、1~24の炭素原子を含むアルキル、2~24の炭素原子を含むアルケニル、1~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6~10の炭素を含むアリール、1~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾール、もしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ;Nucは酸素原子または硫黄原子であり;かつZは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシルdiacylglycerosyl、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシルglucosiduransyl、またはであり、式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖である、請求項1に記載の方法。Zがである、請求項10に記載の方法。前記酵素部分が加水分解酵素を含む、請求項1に記載の方法。前記加水分解酵素が、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはノイラミニダーゼである、請求項12に記載の方法。前記酵素部分が酵素である、請求項13に記載の方法。1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が酵素の存在を示し、かつ放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる、工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。前記酵素部分が、抗原に結合可能な第1の抗体と、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗体である、請求項13に記載の方法。前記第1の抗体が、酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項16に記載の方法。前記第1の抗体が、標識に共有結合で連結され、前記酵素が、標識に非共有結合可能な分子に共有結合で連結される、請求項17に記載の方法。前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、前記分子がアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinである、請求項18に記載の方法。前記標識がハプテンであり、前記分子が、ハプテンに結合可能な抗体である、請求項18に記載の方法。a抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;b抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程;c酵素複合体を形成するためにサンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させる工程;ならびにd1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が抗原の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。前記酵素部分が、抗原と、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗原である、請求項13に記載の方法。前記抗原が酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項23に記載の方法。前記抗原が標識に共有結合で連結され、かつ前記酵素が、標識に非共有結合可能な分子に共有結合で連結される、請求項24に記載の方法。前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、かつ前記分子がアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinである、請求項25に記載の方法。前記標識がハプテンであり、前記分子がハプテンに結合可能な抗体である、請求項25に記載の方法。a抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;b抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;c酵素複合体を形成するためにサンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させる工程;ならびにd1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。前記酵素部分が、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結オリゴヌクレオチドである、請求項13に記載の方法。前記オリゴヌクレオチドが酵素に共有結合または非共有結合で連結される、請求項30に記載の方法。前記オリゴヌクレオチドが標識に共有結合で連結され、かつ前記酵素が、標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結される、請求項31に記載の方法。前記標識がビオチンまたはビオチン誘導体であり、かつ前記分子がアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinである、請求項32に記載の方法。前記標識がハプテンであり、かつ前記分子が、ハプテンに結合可能な抗体である、請求項32に記載の方法。a核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;b核酸を固相へ固定化する工程、c酵素複合体を形成するために、固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させる工程;ならびにd1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が核酸の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる、工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。任意の未結合の酵素連結オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含む、請求項35に記載の方法。前記反応混合物が促進剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記促進剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項37に記載の方法。前記促進剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項38に記載の方法。前記アクセプター色素がフルオレセインである、請求項39に記載の方法。前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリ[ビニルベンジル塩化ベンジルジメチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリブチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム]、またはそれらの組み合わせである、請求項38に記載の方法。前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムおよびポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせである、請求項38に記載の方法。前記エノールエーテルが、である、請求項1に記載の方法。以下の工程を含む、サンプル中の酵素の存在または量を決定するアッセイ方法:aオキシダントを提供する工程;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつR2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である;c1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程;d1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;e反応混合物を形成するために、サンプルを、1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程;ならびにf1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が酵素の存在を示し、かつ放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる、工程。以下の工程を含む、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法:aオキシダントを提供する工程;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつR2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である;c1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程;d抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;e抗原に結合可能な第1の抗体と、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗体を提供する工程;f抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程;g酵素複合体を形成するため、サンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させる工程;h反応混合物を形成するため、酵素複合体を、1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程;ならびにi1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が抗原の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程。以下の工程を含む、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法:aオキシダントを提供する工程;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、R2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である;c1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせる工程;d抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;e抗原と、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結抗原を提供する工程;f抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程;g酵素複合体を形成するために、サンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させる工程;h反応混合物を形成するために、酵素複合体を、1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程;ならびにi1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、放射された光の量を、サンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる、工程。以下の工程を含む、サンプル中の核酸の存在および/または量を決定するアッセイ方法:aオキシダントを提供する工程;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、ならびにR2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である;c1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成するために、水溶液、オキシダント、およびエノールエーテルを組み合わせる工程;d核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程;e核酸を固相へ固定化する工程;f核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、1,2-ジオキセタン酵素基質が分解して光を生成するように該基質を切断可能な酵素とを含む、酵素連結オリゴヌクレオチドを提供する工程;g酵素複合体を形成するために、固定化され酵素が連結したオリゴヌクレオチドを接触させる工程;h反応混合物を形成するために、酵素複合体を、1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させる工程;ならびにi1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出する工程であって、光の放射が核酸の存在を示し、かつ放射された光の量を、サンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる、工程。以下を含む、サンプル中の検体の存在または量を検出するためのキット:aオキシダント、ならびにb以下の構造を有するエノールエーテル:式中、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基、または光促進基により置換されてもよく、かつ、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり、かつR2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基である。前記オキシダントが、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレート、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項48に記載のキット。前記オキシダントが、過酸化水素、または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムである、請求項49に記載のキット。AまたはBの少なくとも1つがである、請求項48に記載のキット。AおよびBが、ともにである、請求項48に記載のキット。R1が、1~2の炭素原子を含むアルキルまたは1~2の炭素原子を含むトリフルオアルキルtrifluoalkylである、請求項48に記載のキット。Tが以下である、請求項48に記載のキット:式中、R3、R4、およびR5は、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチルtrifluomethyl、トリフルロエチルtrifluroethyl、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1~20の炭素原子を含むアルコキシ、6~14の炭素原子を含むアリール、6~14の炭素原子を含むアリールオキシ、2~21の炭素原子を含むエステル、3~30の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3~30の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2~21の炭素原子を含むアルキルアミド、7~15の炭素原子を含むアリールアミド、2~21の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7~15の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6~14の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3~60の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18~42の炭素原子を含むトリアリールシリル、7~32の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1~20の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールスルホニル、2~20の炭素原子を含むアルキルチオおよび6~14の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、かつXは、硫黄原子、酸素原子、または窒素原子である。OR2が、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニド、またはであり、式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖である、請求項48に記載のキット。R2が、である、請求項55に記載のキット。R2がE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、Z基の酵素的切断に際してこの原子はNuc基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって1,2-ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;かつZは酵素的に切断可能な基であり;式中、Eは、カルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;Lは、1~4の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-CH2m-O-CH2n、-CH2m-S-CH2n-、または-CH2m-NR6-CH2n-からなる群から選択され、式中、mおよびnは0~3であり、かつmnは2または3であり、式中、R6は、1~10の炭素原子を含むアルキルであり、かつ連結基は、1~24の炭素原子を含むアルキル、2~24の炭素原子を含むアルケニル、1~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6~10の炭素を含むアリール、1~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ;Nucは酸素原子または硫黄原子であり;かつZは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシルdiacylglycerosyl、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシルglucosiduransyl、またはであり、式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖である、請求項48に記載のキット。Zが、である、請求項57に記載のキット。促進剤をさらに含む、請求項48のキット。前記促進剤が、ポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項59に記載のキット。前記促進剤がアクセプター色素をさらに含む、請求項60に記載のキット。前記アクセプター色素がフルオレセインである、請求項61に記載のキット。前記ポリマー性第四級アンモニウム塩が、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリ[ビニルベンジル塩化ベンジルジメチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリブチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム]、またはそれらの組み合わせである、請求項60に記載のキット。前記ポリマー性第四級ホスホニウム塩が、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムおよびポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムを含むコポリマー;またはそれらの組み合わせである、請求項60に記載のキット。前記エノールエーテルが、である、請求項48に記載のキット。以下の工程を含む、1,第1の態様において、本発明は、光を生成する方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程と;c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;d1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程と;e酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;f反応混合物が光を生成することを可能にする工程とを含む方法を提供する。オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。エノールエーテル[1]において、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され得、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つであり、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリールまたは5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり得、Tは、光を放射できるアリール環またはヘテロアリール環であり得、R2は、酵素部分によって切断可能でありT上で酸素アニオンを産出する結合を含む酵素切断可能基であり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテルは、である少なくとも1つのAまたはBを有することができ、一方他の実施形態において、AおよびBはともにである。いくつかの実施形態において、R1は1~2の炭素原子を含むアルキルまたは1~2の炭素原子を含むトリフルオアルキルtrifluoalkylであり得る。いくつかの実施形態において、Tはであり、R3、R4およびR5は、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチルtrifluomethyl、トリフルロエチルtrifluroethyl、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1~20の炭素原子を含むアルコキシ、6~14の炭素原子を含むアリール、6~14の炭素原子を含むアリールオキシ、2~21の炭素原子を含むエステル、3~30の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3~30の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2~21の炭素原子を含むアルキルアミド、7~15の炭素原子を含むアリールアミド、2~21の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7~15の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6~14の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3~60の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18~42の炭素原子を含むトリアリールシリル、7~32の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1~20の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールスルホニル、2~20の炭素原子を含むアルキルチオおよび6~14の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され、Xは硫黄原子、酸素原子または窒素原子である。いくつかの実施形態において、OR2は、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニドまたは式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖であるであり得る。いくつかの実施形態において、R2は、であり得る。いくつかの実施形態において、R2はE-L-Nuc-Zであり得、そこでR2はE-L-Nuc-Zであり、式中、Eは求電子性原子を含む基であり、Z基の酵素的切断に際してこの原子はNuc基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって1,2-ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;Zは酵素的切断可能基であり;式中、Eはカルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり;Lは、1~4の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-CH2m-O-CH2n、-CH2m-S-CH2n-または-CH2m-NR6-CH2n-からなる群から選択され、式中、mおよびnは0~3であり、mnは2または3であり、式中、R6は1~10の炭素原子を含むアルキルであり、連結基は、1~24の炭素原子を含むアルキル、2~24の炭素原子を含むアルケニル、1~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6~10の炭素を含むアリール、1~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ;Nucは酸素原子または硫黄原子であり;Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシルdiacylglycerosyl、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシルglucosiduransylまたはであり、式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖である。これらのいくつかにおいて、Zは、である。酵素部分は加水分解酵素を含むことができる。いくつかの実施形態において、加水分解酵素はアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼであり得る。いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素であり得る。いくつかの実施形態において、方法は、1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された任意の光を検出し、光の放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、酵素部分は、抗原に結合可能な第1の抗体および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗体であり得る。実施形態のいくつかにおいて、第1の抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、第1の抗体は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。いくつかの実施形態において、方法は、a抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;b抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程と;cサンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と;d1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が抗原の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、酵素部分は、抗原および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗原であり得る。いくつかの実施形態において、抗原は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態において、抗原は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。いくつかの実施形態において、方法は、a抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;b抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程と;cサンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と;d1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、酵素部分は、核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結オリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。これらのいくつかにおいて、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。他において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。いくつかの実施形態において、方法は、a核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;b核酸を固相へ固定化する工程と、c固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と;d1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、任意の未結合の酵素連結オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、反応混合物は促進剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。これらのいくつかにおいて、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらのいくつかの中で、アクセプター色素はフルオレセインであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリ[ビニルベンジル塩化ベンジルジメチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリブチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム]またはそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムおよびポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、であり得る。他の態様において、本発明は、サンプル中の酵素の存在または量を決定するアッセイ方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b構造[1]を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と;c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;d1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;eサンプルを1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;f1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる工程とを含む方法を提供する。他の態様において、本発明は、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b構造[1]を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と;c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;d抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;e抗原に結合可能な第1の抗体および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗体を提供する工程と;f抗原に結合可能な第2の抗体を含む固相を提供する工程と;gサンプルおよび酵素連結抗体を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と;h酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;i1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が抗原の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程とを含む方法を提供する。他の態様において、本発明は、サンプル中の抗原の存在または量を決定するアッセイ方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b構造[1]を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と;c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;d抗原を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;e抗原および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結抗原を提供する工程と;f抗原に結合可能な抗体を含む固相を提供する工程と;gサンプルおよび酵素連結抗原を固相と接触させて酵素複合体を形成する工程と;h酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;i1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、放射された光の量をサンプル中に存在する抗原の量に相関させることができる工程と含む方法を提供する。他の態様において、本発明は、サンプル中の核酸の存在または量を決定するアッセイ方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b構造[1]を有し、上記のような置換基を有するエノールエーテルを提供する工程と;c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;d核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;e核酸を固相へ固定化する工程と;f核酸にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む酵素連結オリゴヌクレオチドを提供する工程と;g固定化され、酵素が連結したオリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と;h酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;i1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とを含むアッセイ方法を提供する。他の態様において、本発明は、サンプル中の検体の存在および/または量を検出するためのキットを提供する。キットはオキシダントおよび構造[1]を有し上記のような置換基を有するエノールエーテルを含む。エノールエーテルの様々な実施形態は構造[1]およびその置換基を有し、オキシダントも上記され、本発明のキットおよび方法に等しく適用可能である。いくつかの実施形態において、キットは促進剤も含み得る。いくつかの実施形態において、促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。これらのいくつかにおいて、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらのいくつかにおいて、アクセプター色素はフルオレセインであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリ[ビニルベンジル塩化ベンジルジメチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリブチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム]またはそれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムおよびポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、構造[1]を有するエノールエーテルは上で示されるようなエノールエーテル[2]~[18]のいずれか1であり得る。他の態様において、本発明は、1,2-ジオキセタン酵素基質を作製する方法であって、aオキシダントを提供する工程と;b以下の構造を有するエノールエーテルを提供する工程と:c水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程とを含む方法を提供する。本発明を詳細に記載する前に、本発明は本明細書において開示される実施形態に限定されていないことを理解されたい。さらに、方法およびキットは、様々な工程または構成要素を含むという用語で記載される含むが、これらに限定されないという意味として解釈されるが、方法およびキットは、さらに様々な工程および構成要素からも本質的になるまたはなることができ、かかる用語は閉じたメンバーの群を本質的に定義すると解釈されるべきである。最終的に、本明細書および添付の請求項中で使用される、単数形a、anおよびtheは、文脈が明確に指示しない限り複数の指示物を含むことが指示される。定義アクセプター色素は、光を放射する他の分子からエネルギー特に光を受け取ることができ、同様に、検出可能なエネルギーこの場合もやはり好ましくは光を放射することができる分子を指す。検体は、分析手順において決定される物質または化学物質の組成を指す。本明細書において使用される時、この用語は、抗原または抗体を含むが、これらに限定されない。抗原は、抗体が結合できる物質を指す。抗体は、血液または他の脊椎動物の体液中に見出され、外来物を同定し中和するために免疫系によって使用されるガンマグロブリンタンパク質を指す。本明細書において使用される時、この用語は、抗原を結合することができる任意のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体またはその断片を含むが、これらに限定されない。促進剤とは、1,2-ジオキセタン酵素基質の酵素的切断およびその後の分解からもたらされる特異的な光エネルギー生産を増加させ、観察されたこの光産生が促進剤のない状態で観察されたものを超える、水溶性物質を指す。酵素は化学物質反応を触媒するタンパク質を指す。ハプテンは、大きなキャリアータンパク質等に付加された場合のみに免疫反応を誘発できる低分子を指す。加水分解酵素またはヒドロラーゼは、化学物質結合の加水分解を触媒し、酵素のEC番号分類においてEC3として分類される酵素を指す。核酸はDNA、RNAまたはその断片を指す。オリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーを指す。本明細書において使用される時、この用語は、2~1000の核酸を含む核酸ポリマーを含むが、これらに限定されない。オキシダントは、容易に酸素原子を移す化学化合物、または酸化還元化学物質反応において電子を獲得する物質である。本明細書において使用される時、用語は、酸化薬剤または酸化剤という用語と互換的に使用される。本発明は、insituで、水性または他の条件において化学発光酵素基質を生成する、および/または光を生成するためにこの基質を使用する方法を提供する。光の生成を使用して、サンプル中の酵素、抗原または核酸の存在を決定することができる。これらの方法は、組み合わせた場合に水溶液中で1,2-ジオキセタン酵素基質を形成する、安定化したエノールエーテルおよびオキシダントに関する。本発明は、サンプル中の検体の存在および/または量の検出のためのキットも提供する。キットは、組み合わせた場合に水溶液中で1,2-ジオキセタン酵素基質を形成する、安定化したエノールエーテルおよびオキシダントを含む。これらの方法およびキットは、当技術分野で認められているアッセイにおいて有益である。一態様から見ると、本発明は光を生成する方法を提供する。方法はオキシダントを提供する工程と;構造を有するエノールエーテルを提供する工程と:水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する工程と;1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体を提供する工程と;酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する工程と;反応混合物が光を生成することを可能にする工程とを含む。これらの方法の1つの工程において、オキシダントが提供される。このオキシダントは、エノールエーテル[1]をその対応する1,2-ジオキセタン酵素基質に転換することができるものであるだろう。いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。オキシダントは溶液または粉末として提供され得る。オキシダントが複数の構成要素を含む場合には、これらの構成要素の1つまたは複数しかしすべてでないは、エノールエーテルの有無にかかわらず組み合わせることができる。これらの方法の他の工程において、エノールエーテル[1]が提供される。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、直鎖アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルキル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキルおよびポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択されるAおよびBを有することができ、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つである。電子活性基の例は以下のものを含む。F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1~20の炭素原子を含むアルコキシ、6~14の炭素原子を含むアリール、6~14の炭素原子を含むアリールオキシ、2~21の炭素原子を含むエステル、3~30の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3~30の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2~21の炭素原子を含むアルキルアミド、7~15の炭素原子を含むアリールアミド、2~21の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7~15の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6~14の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3~60の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18~42の炭素原子を含むトリアリールシリル、7~32の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1~20の炭素を含むアルキルアミドスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールスルホニル、2~20の炭素原子を含むアルキルチオおよび6~14の炭素原子を含むアリールチオ。可溶化基の例は以下のものを含む。カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基;ポリエトキシn基[-O-CH2-CH2-n]式中、n=1~30、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする;ポリ[-O-CH2-n]式中、n=1~30、カルボン酸基、マロン酸基、ヒドロキシル基、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基およびアンモニウム基を末端とする。光促進基の例は以下のものを含む。アルキルアンモニウム基、アルキルホスホニウム基、アルキルスルホニウム基;アルキルアリールアンモニウム基、アルキルアリールホスホニウム基およびアルキルアリールスルホニウム基;またはアリールアンモニウム基、アリールホスホニウム基およびアリールスルホニウム基;およびポリアルキルアンモニウム基、ポリアルキルホスホニウム基、ポリアルキルスルホニウム基;ポリアルキルアリールアンモニウム基、ポリアルキルアリールホスホニウム基およびポリアルキルアリールスルホニウム基;またはポリアリールアンモニウム基、ポリアリールホスホニウム基およびポリアリールスルホニウム基等のカチオン性モイエティまたはポリカチオン性モイエティ。いくつかの実施形態において、AおよびBは、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキルおよび4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニルからなる群から独立して選択され得、そのいずれかは、非置換であってもよいか、あるいは1つまたは複数の電子活性基、可溶化基または光促進基により置換されてもよく、AおよびBがシクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルをともに形成する場合には、シクロアルキル、シクロアルケニル、ポリシクロアルキルまたはポリシクロアルケニルの炭素原子のうちの1つは、エノールエーテルの二重結合を形成する2つの炭素原子のうちの1つである。いくつかの実施形態において、AまたはBのうちの少なくとも1つはであり得る。他の実施形態において、AおよびBは、ともにであり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり得るR1を有するだろう。これらのいくつかにおいて、R1は、1~20の炭素原子を含むアルキル、6~14の炭素原子を含むアリール、7~15の炭素原子を含むアラルキル、4~20の炭素原子を含むヘテロアリール、または5~20の炭素を含むヘテロアラルキルであり得る。これらのいくつかにおいて、R1は1~2の炭素原子を含むアルキルまたは1~2の炭素原子を含むトリフルオアルキルtrifluoalkylであり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、光を放射できるヘテロアリール環を含むが、これらに限定されない、アリール環化合物または縮合多環式化合物であり得るTを有する。光の産生を妨害せず、付加されているジオキセタン環の4-炭素原子の原子価を満たすように、Tが選択される。Tは、対応するジオキセタン分解断片がエネルギーを吸収し、励起状態を形成し、その励起状態から断片が光学的に検出可能なエネルギーを放射して基底状態に戻ることを可能にする光を放射する蛍光団を形成する多数の蛍光発色団基のいずれかを示す。Tはまた、酵素によって切断可能な結合を含む酵素切断可能基により置換されて、ジオキセタン環に結合された電子豊富なモイエティ例えば酸素アニオン、硫黄アニオンまたは窒素アニオンを、直接または後続するpHの調整のいずれかによって産出する。いくつかの実施形態において、Tはアリールフェニル等であり得、それは電子活性基、可溶化基または光促進基により置換され得る。いくつかの実施形態において、Tは、酵素によって切断した場合に縮合多環モイエティを電子豊富にし、次にジオキセタン化合物を光の放射のために分解可能にする結合を含む、酵素的に切断可能な不安定な環置換基を有する縮合多環含有蛍光団モイエティであり得る。その残基がこの蛍光団モイエティの形成に使用できる縮合多環化合物の中には、9~約30の環炭素原子を含有する縮合多環芳香族炭化水素環の蛍光化合物が含まれ、例えばナフタレン:ペンタレン、アズレン、ヘプタレン、as-インダセン、s-インダセン、ビフェニレン、ペリレン、アセナフチレン、フェナントレン、アントラセン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセンおよび同種のものに加えて、1つまたは複数の非不安定置換基例えば、1~20の炭素原子を有する分岐状アルキル基または直鎖アルキル基例えばメチル、n-ブチルまたはデシルが包含される、1~7の炭素原子を有する分岐状ヘテロアルキル基または直鎖ヘテロアルキル基例えばメトキシ、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルが包含される;1または2つの環を有するアリール基例えばフェニル;1または2つの環を有するヘテロアリール基例えばピロリルまたはピラゾリル;3~7の炭素原子を有するシクロアルキル基環状で、例えばシクロヘキシルが包含される;3~6の炭素原子を有するヘテロシクロアルキル基環状で、例えばジオキサンが包含される;1または2つの環を有するアラルキル基例えばベンジル;1または2つの環を有するアルカリール基例えばトリル;電子吸引基1~7の炭素原子を有するペルフルオロアルキル基等、例えばトリフルオロメチルが包含される;ハロゲン;CO2H、ZCO2H、SO3H、NO2、ZNO2、CNまたはZCN式中、Zは1~7の炭素原子を有する分岐状アルキル基または直鎖アルキル基であり、例えばメチル基、または1もしくは2つの環を有するアリール基例えばフェニルが包含される;電子供与基例えば分岐状または直鎖のC1-C7アルコキシ基、例えばメトキシまたはエトキシ:1または2つの環を有するアラルコキシ基例えばフェノキシ;分岐状または直鎖のC1-C7アルコキシ基例えばメトキシまたはエトキシ;1または2つの環を有するアラルコキシ基例えばフェノキシ;分岐状または直鎖のC1-C7ヒドロキシアルキル基例えばヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル;1または2つの環を有するヒドロキシアリール基例えばヒドロキシフェニル;分岐状または直鎖のC1-C7アルキルエステル基例えばアセテート;1または2つの環を有するアリールエステル基例えばベンゾアート;または1または2つの環を有するヘテロアリール基例えばベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾールまたはベンゾトリアゾールにより置換されたその誘導体が包含される。さらに、Tによって示される蛍光団モイエティの縮合多環部分は、縮合多環芳香族複素環の蛍光化合物、例えば、ベンゾ[b]チオフェン、ナフト[2,3-b]チオフェン、チアントレン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチン、キノリン、イソキノリン、フェナントリジン、フェナジン、フェノキサジン、フェノチアジン、フェナントロリン、プリン、4H-キノリジン、フタラジン、ナフチリジン、インドール、インドリジン、クロマン、イソクロマン、インドリン、イソインドリン、および同種のものの残基でもあり得、前述の非不安定置換基の1つまたは複数により非置換または置換され、9~約30の環原子を含有し、包括的には、その大部分は炭素原子である。いくつかの実施形態において、Tは式中、R3、R4およびR5は、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチルtrifluomethyl、トリフルロエチルtrifluroethyl、直鎖アルキル、分岐状アルキル、直鎖アルケニル、分岐状アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、ポリシクロアルキル、ポリシクロアルケニル、ポリシクロヘテロアルキル、ポリシクロヘテロアルケニル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、エステル、トリアルキルアンモニウム、トリアルキルホスホニウム、アルキルアミド、アリールアミド、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、トリアルキルシリル、トリアリールシリル、アルキルアリールシリル、アルキルアミドスルホニル、アリールアミドスルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルチオおよびアリールチオからなる群から独立して選択されるであり得る。これらのいくつかにおいて、R3、R4およびR5は、H、F、Cl、Br、I、シアノ、ニトロ、スルホネート、サルフェート、トリフルオメチルtrifluomethyl、トリフルロエチルtrifluroethyl、1~20の炭素原子を含む直鎖アルキル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルキル、2~20の炭素原子を含む直鎖アルケニル、3~20の炭素原子を含む分岐状アルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロアルケニル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルキル、3~20の炭素原子を含むシクロヘテロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロアルケニル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルキル、4~60の炭素原子を含むポリシクロヘテロアルケニル、1~20の炭素原子を含むアルコキシ、6~14の炭素原子を含むアリール、6~14の炭素原子を含むアリールオキシ、2~21の炭素原子を含むエステル、3~30の炭素原子を含むトリアルキルアンモニウム、3~30の炭素原子を含むトリアルキルホスホニウム、2~21の炭素原子を含むアルキルアミド、7~15の炭素原子を含むアリールアミド、2~21の炭素原子を含むアルキルカルバモイル、7~15の炭素原子を含むアリールカルバモイル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホンアミド、6~14の炭素原子を含むアリールスルホンアミド、3~60の炭素原子を含むトリアルキルシリル、18~42の炭素原子を含むトリアリールシリル、7~32の炭素原子を含むアルキルアリールシリル、1~20の炭素原子を含むアルキルアミドスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールアミドスルホニル、1~20の炭素原子を含むアルキルスルホニル、6~14の炭素原子を含むアリールスルホニル、2~20の炭素原子を含むアルキルチオおよび6~14の炭素原子を含むアリールチオからなる群から独立して選択され得るであり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、ホスフェート、アセテート、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセリド、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-フルクトフラノシド、β-D-グルクロニドまたは式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖であるである、OR2を有することができる。これらのいくつかにおいて、R2はである。R2酵素的に切断可能な置換基は、一般式式中、Mはカチオンアルカリ金属例えばナトリウムまたはカリウム、アンモニウム、またはC1-7アルキル、アラルキルもしくは芳香族第四級アンモニウムカチオン、D3が各々アルキル例えばメチルまたはエチル、アラルキル、例えばベンジルであり得るかまたは複素環システム例えばピリジニウムの一部を形成するNDR34、および特にジナトリウム塩等を示すによって示されるリン酸エステル基を含み得る。かかる第四級アンモニウムカチオンは、ポリマー性骨格にそれらの四級化基の1つを通して連結させることもでき、すなわち式中、nは1を越えるか、またはポリ第四級アンモニウム塩すなわちイオネンポリマーの一部であり得るである。いくつかの実施形態において、R2はE-L-Nuc-Z式中、Eは求電子性原子を含む基であり、Z基の酵素的切断に際してこの原子はNuc基の電子対によって攻撃され、近接性補助によって1,2-ジオキセタン酵素基質アニオンを放出し;Lは連結基であり;Nucは求核原子であり;Zは酵素的切断可能基であり;式中、Eはカルボキシル、カルボニル、脱離基によって置換されたメチレン、ホスフェート、カルボネート、キサンテート、サルファイト、スルホネート、亜硫酸水素塩または二硫化物であり得;Lは、1~4の炭素原子を含むメチレンもしくはポリメチレン、-CH2m-O-CH2n、-CH2m-S-CH2n-または-CH2m-NR6-CH2n-からなる群から選択され得、式中、mおよびnは0~3であり、mnは2または3であり、式中、R6は1~10の炭素原子を含むアルキルであり、連結基は、1~24の炭素原子を含むアルキル、2~24の炭素原子を含むアルケニル、1~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルキル、2~24の炭素原子を含み、1~24の炭素原子を含むアシルオキシにより一置換もしくは二置換されたアルケニル、6~10の炭素を含むアリール、1~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルキル、または2~24の炭素原子を含み、フェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、1~4の炭素原子を含むアルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾールもしくはカルバミルにより置換されたアルケニルによって置換することができ;Nucは酸素原子または硫黄原子であり得;Zは、ホスホリル、アセチル、1-ホスホ-2,3-ジアシルグリセロシルdiacylglycerosyl、アデノシントリホスホリル、アデノシンジホスホリル、アデノシンモノホスホリル、アデノシル、α-D-ガラクトシル、β-D-ガラクトシル、α-D-グルコシル、β-D-グルコシル、α-D-マンノシル、β-D-マンノシル、β-フルクトフラノシル、β-D-グルコシドウランシルglucosiduransylまたはであり得、式中、B1、B2およびB3は各々独立してHまたは1~4の炭素原子のアルキル分岐状または直鎖であるであり得る。いくつかの実施形態において、Zはであり得る。いくつかの実施形態において、エノールエーテル[1]は、であり得る。これらの方法の他の工程において、水溶液、オキシダントおよびエノールエーテルを組み合わせて1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液を形成する。水溶液は水、1つもしくは複数の緩衝液構成要素、1つもしくは複数の有機溶媒、1つもしくは複数の着色剤、1つもしくは複数の防腐剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。1,2-ジオキセタン酵素基質の提供に必要な水溶液中のオキシダントおよびエノールエーテルの濃度の決定は、診断技術分野における当業者の技術内である。これらの方法の他の工程において、1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素部分を含む酵素複合体が提供される。酵素部分は、酵素、酵素連結抗体、酵素連結抗原または酵素連結オリゴヌクレオチドであり得る。酵素部分は、1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。いくつかの実施形態において、酵素は加水分解酵素であり得る。加水分解酵素は、エステル結合を切断しEC3.1として分類される酵素または糖結合を切断しEC3.2として分類される酵素を含み、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼまたはノイラミニダーゼを含むが、これらに限定されない。酵素、抗原または核酸を含む疑いのあるサンプルがアッセイされる。サンプルは生物学的または非生物学的な起源であり得る。サンプルが生物学的起源である場合、それは血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液、粘液、精液、組織、組織抽出物、細胞培養培地、細胞、細胞抽出物、および同種のものであり得る。いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素であり得る。これらの実施形態において、サンプル中の酵素は酵素複合体を含む。酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。いくつかの実施形態において、光の放射が検出され、かかる放射が酵素の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する酵素の量に相関させることができる。いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結抗体であり得る。酵素連結抗体は、抗原に結合可能な第1の抗体、および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素連結抗体、抗原、および抗原に結合可能で固相上に固定化された第2の抗体は、酵素複合体を構成する。酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。いくつかの実施形態において、抗原を含む疑いのあるサンプルを、第1の抗体および酵素を含む酵素連結抗体ならびに第2の抗体を含む固相と接触させ、そこで両方の抗体は抗原を結合することができ、1,2-ジオキセタン酵素基質を切断しその結果基質が分解されて光を生成できる酵素複合体を提供する。サンプル、酵素連結抗体および固相は任意の順序で組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗体を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行することができる。第1の抗体、第2の抗体または両方はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。第2の抗体は、診断技術分野において公知の技法によって、固相に対する抗体の非共有結合または共有結的な付加によって固相上に固定化することができる。第1の抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、第1の抗体は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結される。いくつかの実施形態において、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。ビオチン誘導体は置換を有するビオチン分子である。ビオチン構造の一部が欠損しているビオチン分子もビオチン誘導体と判断される。ビオチン誘導体は置換された合成ビオチンに加えて天然に存在するビオチンも含む。いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結抗原であり得る。酵素連結抗原は、抗原、および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素複合体は、抗原を結合できる抗体を含む固相に結合された酵素連結抗原を含む。酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。いくつかの実施形態において、抗原を含む疑いのあるサンプルは、酵素連結抗原、および抗原に結合できる抗体を含む固相と接触させることができる。サンプル、酵素連結抗原および固相は任意の順序で組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗原を酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄工程を実行することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらの固相が作製される材料は診断技術分野において公知である。抗体は、固相に対する抗体の非共有結合または共有結的な付加によって固相に固定化することができる。抗体は酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、抗原は標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態において、上記のように、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、酵素部分は酵素連結オリゴヌクレオチドである。酵素連結オリゴヌクレオチドは、特定の核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド、および1,2-ジオキセタン酵素基質を切断できる酵素を含む。これらの実施形態において、酵素複合体は、核酸を含む固相にハイブリダイズされた酵素連結オリゴヌクレオチドを含む。酵素複合体を1,2-ジオキセタン酵素基質と接触させて反応混合物を形成し、反応混合物が光を生成することを可能にする。いくつかの実施形態において、方法は、核酸を含む疑いのあるサンプルを提供する工程と;核酸を固相上へ固定化する工程と;固定化された核酸および酵素連結オリゴヌクレオチドを接触させて酵素複合体を形成する工程と;1,2-ジオキセタン酵素基質の水溶液の添加後に反応混合物から放射された光を検出し、光の放射が核酸の存在を示し、放射された光の量をサンプル中に存在する核酸の量に相関させることができる工程とをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、酵素複合体の洗浄によって、任意の未結合の酵素連結抗体オリゴヌクレオチドを酵素複合体から除去する工程をさらに含み得る。これは、酵素複合体の構成要素と適合性のある緩衝液の添加および除去によって実行することができる。かかる緩衝液は診断技術分野において周知である。固相の追加の洗浄を実行することができる。固相は、ビーズ、試験管、マルチウェルプレート、マイクロアレイ、ゲル、膜、微粒子、ナノ結晶、量子ドットおよび同種のものであり得る。これらが作製される材料は診断技術分野において公知である。オリゴヌクレオチドは酵素に共有結合または非共有結合で連結され得る。非共有結合で連結される場合、オリゴヌクレオチドは標識に共有結合で連結され、酵素は標識に非共有結合できる分子に共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態において、上記のように、標識はビオチンまたはビオチン誘導体であり、分子はアビジンまたはストレプアビジンstrepavidinであり得る。いくつかの実施形態において、標識はハプテンであり、分子はハプテンに結合可能な抗体であり得る。ハプテンとしてのジゴキシゲニンの使用および分子としての抗ジゴキシゲニンは、診断技術分野において公知である。この方法の他の工程において、サンプルを1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液と接触させて反応混合物を形成する。いくつかの実施形態において、サンプルは1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液に添加することができ、一方他の実施形態において1,2-ジオキセタン酵素基質を含む水溶液をサンプルに添加することができる。いくつかの実施形態において、反応混合物は促進剤をさらに含み得る。促進剤はCTAB臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび他のミセル形成物質を含み得る。促進剤はポリマー性第四級アンモニウム塩、ポリマー性第四級ホスホニウム塩またはそれらの組み合わせを含み得る。ポリマー性第四級アンモニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム、ポリ[ビニルベンジル塩化ベンジルジメチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリブチルアンモニウム]、ポリ[ビニル塩化ベンジルトリペンチルアンモニウム]またはそれらの組み合わせであり得る。ポリマー性第四級ホスホニウム塩は、ポリ塩化ビニルベンジルトリメチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウム、ポリ塩化ビニルベンジルトリブチルホスホニウムおよびポリ塩化ビニルベンジルトリオクチルホスホニウムを含むコポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、促進剤はアクセプター色素をさらに含み得る。これらの実施形態の中で、アクセプター色素は蛍光色素であり得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、蛍光色素はフルオレセインであり得る。これらの方法の他の工程において、反応混合物が光を生成することを可能にする。いくつかの実施形態において、光は肉眼により観察されるか、またはX線フィルムもしくは生成された光を検出および測定できる装置を使用して測定され得る。生成された光を検出および測定できる装置は、ルミノメーター、フィルムを用いるカメラ、または電荷結合カメラを含むが、これらに限定されない。他の態様から見ると、本発明は、オキシダントおよび構造[1]を有するエノールエーテル両者は上で定義されるを含むサンプル中の検体の存在または量を検出するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、オキシダントは、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、過酸化水素、モリブデン酸ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸塩および過酸化水素、アリールエンドペルオキシド、過酸化カルシウムペルオキシハイドレートならびにそれらの組み合わせから選択することができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、オキシダントは、過酸化水素または過酸化水素およびモリブデン酸ナトリウムであり得る。いくつかの実施形態において、キットは上記のような促進剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは上記のようなアクセプター色素をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、その構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。以下の実施例は、本発明を説明するが限定しないことを意図する。実施例1エノールエーテルホスフェートの一般的合成a.エノールエーテルトリエステルホスフェートの合成A、B、R1およびR6は、発明を実施するための形態において定義された通りである。オキシ塩化リン1.5当量を、ピリジン0.7ml/mmoleフェノールエノールエーテル、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥したに、アルゴン雰囲気下の0°Cで徐々に添加する。少量の白色煙が指摘されるが、沈殿は形成されない。このPOCl3溶液に、無水THF3ml/mmoleフェノールエノールエーテル中のフェノールエノールエーテル30mmole、1当量の溶液を、90分間にわたって滴下漏斗を介して添加する。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成される。余剰体積のTHFを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加する。懸濁物を0°Cで15分間および室温で3時間撹拌する。次いで反応混合物を冷却して0°Cに戻し、3-ヒドロキシプロピオニトリル3.95当量を注射器を介して細い流れで徐々に添加する。0°Cで5分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出するが、混合物は室温で一晩撹拌する。沈殿物を濾過によって除去し、ヘキサン中のEtOAcでリンスする。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。粗製産物に飽和NaHCO3溶液13ml/mmoleフェノールエノールエーテルを添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解する。水溶液をヘキサン中の60EtOAcにより3回抽出する。合わせた有機溶液を水およびブラインで連続して洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、回転蒸発装置によって濃縮する。粘着性の粗製産物をヘキサン中の5のEtOAcにより3回粉砕する加熱し、室温次いで0°Cまで冷却する。TLCにより、残存するピリジンの大部分ならびに微量の未反応出発フェノールエノールエーテルおよびわずかなビス-アリールモノ-シアノエチルホスフェートトリエステル副産物が粉砕によって除去されることが示される。次いで、産物を一定の重さのゴムまで真空下でポンプで減圧する。b.エノールエーテルホスフェートの合成A、B、R1およびR6は発明を実施するための形態において定義された通りである。無水MeOH3ml/mmoleトリエステルホスフェート中のホスフェートトリエステルエノールエーテル28mmole、1当量の溶液に、MeOH溶液中の4.37MNaOMe2当量を、アルゴン雰囲気下の0°Cで、注射器を介して細い流れで添加する。混合物を0°Cで数分間撹拌し、次いで室温まで温める。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成される。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れる。濃厚な懸濁物を一晩撹拌する。反応混合物を回転蒸発装置に置いてMeOH体積の約2分の1を除去し、残存する懸濁物に1.5水/アセトン7ml/mmoleトリエステルホスフェートを添加する。追加体積のアセトン7ml/mmolトリエステルホスフェートを添加して大部分の粉末を濾過器に移す。濾過ケーキを冷アセトン2ml/mmoleトリエステルホスフェートでリンスし、真空デシケーター中で乾燥するまでポンプで減圧して、白色紛体を得た。粗製粉末を水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェート中に溶解し、ブフナー漏斗上で溶液を濾過することによってさらに精製する。追加体積の水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェートを使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾過する。次いで合わせた濾液をフリーザーボトルに移し、追加体積の水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェートを使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液をアセトン13ml/mmoleトリエステルホスフェートに添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出する。追加体積のアセトン1.4ml/mmoleトリエステルホスフェートを添加してより容易な濾過のために懸濁物を希釈する。30分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収する。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し、一定の重さの白色紛体まで真空デシケーター中で乾燥する。実施例2AMPPDエノールエーテルホスフェートの合成AMPPDエノールエーテルフェノールの合成は米国特許第5,177,241号中で報告される。b.AMPPDエノールエーテルトリエステルホスフェートの合成オキシ塩化リン1.5当量を、ピリジン0.7ml/mmoleフェノールエノールエーテル、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥したに、アルゴン雰囲気下の0°Cで徐々に添加する。沈殿物は形成されない。このPOCl3溶液に、無水THF3ml/mmoleフェノールエノールエーテル中のAMPDDエノールエーテルフェノール30mmole、1当量の溶液を、90分間にわたって滴下漏斗を介して添加する。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成される。余剰体積のTHFを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加する。懸濁物を0°Cで15分間および室温で3時間撹拌する。次いで反応混合物を冷却して0°Cに戻し、3-ヒドロキシプロピオニトリル3.95当量を注射器を介して細い流れで徐々に添加する。0°Cで5分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出するが、混合物を室温で一晩撹拌する。沈殿物を濾過によって除去し、ヘキサン中のEtOAcでリンスする。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。粗製産物に飽和NaHCO3溶液13ml/mmoleフェノールエノールエーテルを添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解する。水溶液をヘキサン中の60EtOAcにより3回抽出する。合わせた有機溶液を水およびブラインで連続して洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、回転蒸発装置によって濃縮する。粘着性の粗製産物をヘキサン中の5のEtOAcにより3回粉砕する加熱し、室温次いで0°Cまで冷却する。TLCにより、残存するピリジンの大部分ならびに微量の未反応出発エノールエーテルフェノールおよびわずかなビス-アリールモノ-シアノエチルホスフェートトリエステル副産物が粉砕によって除去されることが示される。次いで、産物を一定の重さのゴムまで真空下でポンプで減圧する。c.AMPPDエノールエーテルホスフェートの合成無水MeOH3ml/mmoleトリエステルホスフェート中のAMPPDエノールエーテルトリエステルホスフェート28mmole、1当量の溶液に、MeOH溶液中の4.37MNaOMe2当量を、アルゴン雰囲気下の0°Cで、注射器を介して細い流れで添加する。混合物を0°Cで数分間撹拌し、次いで室温まで温める。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成される。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れる。濃厚な懸濁物を一晩撹拌する。反応混合物を回転蒸発装置に置いてMeOH体積の約2分の1を除去し、残存する懸濁物に1.5水/アセトン7ml/mmoleトリエステルホスフェートを添加する。追加体積のアセトン7ml/mmolトリエステルホスフェートを添加して大部分の粉末を濾過器に移す。濾過ケーキを冷アセトン2ml/mmoleトリエステルホスフェートでリンスし、真空デシケーター中で乾燥するまでポンプで減圧して、白色紛体を得た。粗製粉末を水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェート中に溶解し、ブフナー漏斗上で溶液を濾過することによってさらに精製する。追加体積の水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェートを使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾過する。次いで合わせた濾液をフリーザーボトルに移し、追加体積の水0.35ml/mmoleトリエステルホスフェートを使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液をアセトン13ml/mmoleトリエステルホスフェートに添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出する。追加体積のアセトン1.4ml/mmoleトリエステルホスフェートを添加してより容易な濾過のために懸濁物を希釈する。30分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収する。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し、一定の重さの白色紛体まで真空デシケーター中で乾燥する。実施例3ADP-StarエノールエーテルホスフェートおよびADP-Star登録商標の合成ホスホン酸合成は米国特許第5,582,980号、カラム5、行18~62中で報告される。c.ADP-Starメトキシエノールエーテルの合成140mlの無水THF中のジエチル1-メトキシ-1-4-クロロ-3-メトキシフェニルメタンホスホナート21.1g、65.4mmole、1.1当量の溶液を、アルゴン雰囲気下で-78°Cまで冷却し、滴下漏斗を介してヘキサン中の41mlのn-ブチルリチウム1.6M、65.4mmole、1.1当量により20分間以上の間処理した。もたらされたオレンジ色の反応混合物を-78°Cで15分間撹拌し、次いで粉末の2-アダマンタノン8.93g、59.5mmoleを1ポーションで添加した。反応混合物を-78°Cで40分間撹し、次いで室温まで加温し、最終的に激しいブタンの発生について注意しながら1.5時間加熱還流した。反応混合物を冷却して室温に戻し、この温度で一晩維持した。翌朝、反応混合物中の揮発性物質を回転蒸発によって除去した。次いで残留物をヘキサン中の飽和NaHCO3溶液と5のEtOAcとの間で分配した。水溶液をヘキサン中の5EtOAcにより3回抽出した合計300ml。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、シリカゲルプラグに通過させた。濾液の濃縮後に、黄色油を得た。粗製産物を30mlのMeOH中で結晶化した。20mlのMeOH中での第2の再結晶後に、11.99gのわずかに黄色の固体63.2を得た。合わせた母液をシリカゲルクロマトグラフィーヘキサン中の0~4のEtOAcによってさらに精製し、8mlのMeOH中で2回結晶化し、わずかに黄色の固体として産物の第2の収穫物を1.74g9.2得た。d.ADP-Starエノールエーテルフェノールの合成NaHミネラルオイル中で60、1.63g、40.8mmole、1.3当量をヘキサンで3回3×15mlリンスし、もたらされた湿ったNaH粉末にアルゴン気流を乾燥するまで送風し、真空下で5分間の短い間ポンプで減圧した。無水DMF35ml中の粉末NaHの懸濁物に、EtSH3.1ml、42.3mmole、1.35当量を、アルゴン雰囲気下で0°Cで10分間にわたって注射器を介して1滴ずつ添加した。激しいガスの発生が添加の間に直ちに起こり、もたらされた清澄なナトリウムエチルチオラート溶液を0°Cで5分間および室温で25分間撹拌した。溶液を冷却して0°Cに戻し、ナトリウムエチルチオラート溶液を固体のADP-Starメトキシエノールエーテル10g、31.4mmoleの1ポーションで処理した。懸濁物を120~125°Cで加熱還流し、加熱の間に均一混合物が生じ、後に還流の間に濁ってきた。2時間の還流後に、TLCにより反応の完了が示された。反応混合物を冷却して室温に戻し、飽和NaHCO3溶液でクエンチした。水溶液をヘキサン中の20EtOAcにより3回抽出した合計150ml。合わせた有機溶液をブラインで洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、粗いシリカゲルプラグ40~140メッシュに通過させた。濾液を回転蒸発によって濃縮して穏やかな悪臭のある白色紛体を得た。粗製産物を粉砕によって精製した。30mlのヘキサンと共に加熱し、続いて冷却し一晩冷蔵庫中に保存し、濾過した後に、白色の固体として8.78gの産物91.8を得た。e.ADP-Starエノールエーテルトリエステルホスフェートの合成オキシ塩化リン4.2ml、46.3mmole、1.5当量を、ピリジン22ml、塩基性酸化アルミニウムの上で一晩乾燥したに、アルゴン雰囲気下の0°Cで徐々に添加する。少量の白色煙が指摘されるが、沈殿は形成されなかった。このPOCl3溶液に、94mlの無水THF中のADP-Starエノールエステルフェノール9.41g、30.87mmoleの溶液を、90分間にわたって滴下漏斗を介して添加した。白色ピリジン塩酸塩沈殿が添加の間に形成された。余剰の10mlのTHFを使用して保存ボトルおよび滴下漏斗をリンスし、反応混合物に添加した。懸濁物を0°Cで15分間および室温で2時間40分撹拌した。次いで反応混合物を冷却して0°Cに戻し、3-ヒドロキシプロピオニトリル8.3ml、122mmole、フェノールに基づいて3.95当量を注射器を介して細い流れで徐々に添加した。0°Cで5分間の撹拌後に、さらに多くの白色沈殿物が途中で析出したが、混合物を室温で一晩~15.5時間撹拌した。沈殿物を濾過によって除去し、60mlのヘキサン中のEtOAcでリンスした。合わせた濾液を減圧下で濃縮して、淡黄色油を得た。粗製産物を400mlの飽和NaHCO3溶液に添加し、次いで適切な水を添加して任意の存在する塩を溶解した。水溶液をヘキサン中の60EtOAcにより3回抽出した合計400ml。合わせた有機溶液を水およびブラインで洗浄し各々150ml、無水Na2SO4の上で乾燥し、回転蒸発によって濃縮する。粘着性の粗製産物を各々40mlのヘキサン中の5のEtOAcにより3回粉砕した加熱し、室温次いで0°Cまで冷却する。TLCにより、残存するピリジンの大部分、微量の未反応出発材料ADP-Starエノールエーテルフェノールおよびわずかなビス-アリールモノ-シアノエチルホスフェートトリエステル副産物がこれらの粉砕によって除去されることが示された。次いで産物は一定の重さまで真空下でポンプで減圧され、13.4g92の淡黄色のゴムとして得られた。f.ADP-Starエノールエーテルホスフェートの合成85mlの無水MeOH中のADP-Starエノールエーテルトリエステルホスフェート13.83g、28.2mmoleの溶液に、MeOH溶液12.9ml、56.3mmole、2当量中の4.37MNaOMeを、アルゴン雰囲気下の0°Cで、注射器を介して細い流れで添加した。混合物を0°Cで2分間撹拌し、次いで室温まで温めた。大量の沈殿が室温での撹拌の間に形成された。フラスコを時々軽く叩いて、撹拌溶液の中へ沈着する固体を戻し入れた。濃厚な懸濁物を17.5時間撹拌した。アセトニトリル/NaHCO3勾配を使用する解析HPLCモニタリングは、8.3分で所望される産物;13.6分で不完全な反応中間体モノ-シアノエチルモノ-アリールホスフェートジエステル;16.9分で副産物ビス-アリールホスフェートジエステル、および19.6分でADP-Starフェノールエノールエーテルを示した。反応混合物を回転蒸発装置に置いて約45mlのMeOHを除去し、残存する懸濁物に3mlの水および次いで200mlのアセトンを添加した。溶液をブフナー漏斗で濾過した。追加の10mlの水を使用して保存容器および濾過漏斗をリンスし、濾液に添加した。次いで合わせた濾液を1リットルの凍結乾燥器用のボトルに移し、追加の10mlの水を使用して濾過フラスコをリンスし、溶液に添加する。合わせた水溶液を360mlのアセトンに添加した場合、重い沈殿物が溶液から析出した。追加の40mlのアセトンを添加して後のより容易な濾過のために懸濁物を希釈した。30分間ベンチ上で懸濁物を放置し、次いで白色沈殿物を濾過によって回収した。濾過ケーキをアセトンで複数回洗浄し合計200ml、10.07gの白色紛体83.9の一定の重さで産物の第1の収穫物として得られるまで、真空デシケーター中で乾燥させた。1HNMR400MHz,D2O:δ7.42br.s,1H,7.38d,J=8.2Hz,1H,6.96d,J=8.2Hz,1H,3.35s,3H,3.08br.s,1H,2.57br.s,1H,1.68-1.98m,12H.濾液を冷蔵庫中で冷却している間に、より多くの沈殿物が溶液中で析出した。産物の追加の第2の収穫物1.388g11.6を濾過によって得た。そのプロトンNMRスペクトルは第1の収穫産物のものと同一であった。両方の収穫物からの産物の解析HPLCピークの積分は99.4よりも大きかった。g.ADP-Star登録商標の合成ADP-Star登録商標は、米国特許第5,582,980号中で報告されるCDP-Star登録商標の合成に従って、化合物55~6カラムの手技において5-クロロ-2-アダマンタノンの代わりに2-アダマンタノンを置き換えることによって合成される。すべての他の工程はCDP-Star登録商標について報告されたものと同一である。基質のために使用することができるエノールエーテルホスフェートの他の例は以下のものを含むが、これらに限定されない。米国特許第6,355,441号内で引用されるベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートおよびアナログ。3-ホスホリルオキシフェニルメトキシメチレントリシクロ[7.3.1.02,7]トリデカ-2,7-エン、ジナトリウム塩。米国特許第6,461,876号。[3-ホスホリルオキシフェニル2,2,2-トリフルオロエトキシメチレン]トリシクロ[7.3.1.02,7]トリデカ-2,7-エン、ジナトリウム塩。米国特許第6,461,876号。3-ホスホリルオキシ-4-クロロフェニルメトキシメチレントリシクロ[7.3.1.02,7]トリデカ-2,7-エン、ジナトリウム塩。米国特許第6,461,876号。[4-メトキシ-4-3-ホスホリルオキシフェニル]スピロ[1,2-ジオキセタン-3,13-8-n-プロピルトリシクロ[7.3.1,02,7]トリデカ-2,7-エン]、ジナトリウム塩。米国特許第6,461,876号。3-ホスホリルオキシフェニルメトキシメチレンアダマンタン-4,5-エン、ジナトリウム塩。米国特許第6,461,876号。実施例4相間移動触媒作用によるエノールエーテル配糖体の一般的合成1NNaOH溶液およびCH2Cl2の混合物中のフェノールエノールエーテル1当量およびPTC触媒、Bu4NBr1.05当量の強く撹拌した二相性混合物に、CH2Cl2中のペルアシルグリコシルブロミド1.5当量の溶液を室温で細い流れで添加した。混合物を60分間撹拌した。飽和NaHCO3溶液を反応に添加し、この溶液をCH2Cl2により3回抽出した。合わせたCH2Cl2溶液を水で洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、保護されたグリコシルエノールエーテルを得た。ペルアシルグリコシルエノールエーテル1当量を1:1のTHF/MeOH中で溶解し、0°Cで1NNaOHを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。完全な脱保護に際して、反応物を固体のNaHCO3により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、逆相クロマトグラフィーによって精製する。ペルアシルブロモグリコシドの例は以下の通りである。α-D-グルコピラノシルブロミド,2,3,4,6-テトラアセテートCAS572-09-8;α-D-ガラクトピラノシルブロミド,2,3,4,6-テトラアセテートCAS3068-32-4;α-D-グルコピランウロン酸,1-ブロモ-1-デオキシ-メチルエステル,2,3,4-トリアセテートCAS21085-72-3。実施例5相間移動触媒作用によるグルコン-Starエノールエーテルテトラアセテートの合成a.グルコン-Starエノールエーテルテトラアセテートの合成1NNaOH20mlおよび14mlのCH2Cl2中のCDP-Starエノールエーテルフェノール1.02g、3mmoleおよびPTC触媒、テトラブチルアンモニウムブロミド1.02g、3.15mmoleの強く撹拌した混合物に、6mlのCH2Cl2中のα-D-グルコピラノシルブロミド,2,3,4,6-テトラアセテート2.47g、6mmoleを室温で添加した。出発材料がほとんど残っていないことがtlcによって示されまで、反応物を30分間撹拌した。反応を飽和NaHCO3溶液でクエンチした。水層をCH2Cl2により3回抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥した。4滴のトリエチルアミンを溶液に添加し、溶液を短いシリカゲルカラムに通過させ、100mlの40EtOAc/ヘキサンにより溶出して、オレンジ色のゴムを得た。4°Cで一晩の保存後に、粗製産物を少量のCH2Cl2中で溶解し、シリカゲルによりクロマトグラフィ分離し、20~50EtOAC/ヘキサンにより溶出した。カップリングした産物を含む画分を回収し濃縮して、淡黄色のゴム2.31g、>100を得た。b.グルコン-Starエノールエーテルの合成粗製グルコン-Starエノールエーテルテトラアセテート-1.5gの理論的収量、3mmolの溶液に、15滴のMeOH中の4.37MNaOMeを室温でピペットによって添加した。混合物を一晩撹拌し、アセテート加水分解は最小であった。追加の30滴のMeOH中の4.37MNaOMeを添加し、混合物は黄色からオレンジへ変わり、加水分解は4時間後に完全であることがTLCによって示された。塩化アンモニウム1gを添加して反応をクエンチし、溶液を1時間撹拌した。塩化メチレンを添加して産物を沈殿させ、5MeOH/CH2Cl2を、これ以上沈殿物が析出しなくなるまで添加した。沈殿物を濾過によって回収し、5MeOH/CH2Cl2で洗浄した。粗製ゴムをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、30EtOAc/ヘキサンにより最初に溶出してCDP-Starエノールエーテルフェノールを回収し、次いで5~10MeOH/CH2Cl2によりカラムをフラッシングして、淡黄色の泡1.18g、79としてGlucon-Starエノールエーテルを得た。実施例6Schmidtグリコシド化によるエノールエーテルグリコシドの一般的合成CH2Cl26ml/当量フェノール中のペルアシルグリコシルトリクロロアセトイミダート1.2~1.5当量の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下の室温で、固体のフェノールエノールエーテル1当量を1ポーションで添加した。混合物を-23°Cまで冷却し、CH2Cl20.6ml/当量フェノール中でBF3OEt20.2当量の溶液により10分間にわたって徐々に処理した。反応混合物はBF3OEt2添加の間に濁ってき、1.5時間にわたって0°Cまで徐々に暖められた。反応物をEt3N5当量のBF3OEt2によりクエンチし、0°Cで10分間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3溶液とCH2Cl2との間で分配し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、ペルアシル化グリコシルエノールエーテルを泡として回収した。ペルアシルグリコシルエノールエーテル1当量を1:1のTHF/MeOH中で溶解し、0°Cで1NNaOHを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。完全な脱保護に際して、反応物を固体のNaHCO3により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、逆相クロマトグラフィーによって精製する。ペルアシルグリコシルトリクロロアセトイミダート合成は、R.R.Schmidt,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,1994,50:21による総説、およびその中で引用された参照文献中で報告されている。実施例7Schmidtグリコシド化によるグルクロノシルエノールエーテル合成a.ペルアシルグルクロノシルAMPPDエノールエーテルの合成CH2Cl224ml/当量中のペルアシルグルクロノシルトリクロロアセトイミダート1.2当量の溶液に、アルゴン雰囲気下の室温で、固体のフェノールエノールエーテル1当量を添加する。混合物を-25°Cまで冷却し、三フッ化ホウ素エーテラート0.2当量のCH2Cl2溶液を10分間にわたって徐々に添加して処理する。もたらされた濁った混合物は-23°C~-20°C1時間、-20°C~-10°C30分間および-10°C~5°C30分間の温度勾配で撹拌する。反応を5°Cで15分間Et3Nによりクエンチし、続いて飽和NaHCO3溶液を添加する。混合物をCH2Cl2により抽出し、水で洗浄し、無水Na2SO4の上で乾燥し、少量のEt3Nを有機溶液に添加する。回転蒸発およびシリカゲルクロマトグラフィー後に粗製産物を得る。b.グルクロノシルAMPPDエノールエーテルの合成ペルアシルグルクロノシルAMPPDエノールエーテル1当量を1:1のTHF/MeOH中で溶解し、0°Cで1NNaOHを添加することによって脱保護し、次いで反応物を室温まで暖める。脱保護の完了に際して、反応物を固体のNaHCO3により中和し、回転蒸発によって溶媒を取り除き、次いで逆相クロマトグラフィーによって精製する。実施例8水溶液中でのエノールエーテルのジオキセタンへの転換2つのエノールエーテルホスフェートは、水性の塩基性条件における酸化によって、それらの対応する1,2-ジオキセタンアルカリフォスファターゼ基質に成功裏に転換された。1,2-ジオキセタンおよびAMPPD登録商標およびADP-Starをエノールエーテル前駆体から生成し、続いてアルカリホスファターゼ検出アッセイおよびIL-6のELISA酵素結合免疫吸着アッセイにおいて使用した。モデル酸化条件およびジオキセタン形成の実証は以下に詳述する。a.AMPPDエノールエーテルホスフェートのAMPPD登録商標への酸化図1中で図示される反応スキームにおいて示されるように、AMPPDエノールエーテルホスフェートAMPPD-EEは、アルカリpHでNa2MoO4/H2O2の酸化システムを使用して、水溶液中で1,2-ジオキセタン基質AMPPD登録商標へ効率的に酸化された。これについて使用された試薬は以下のとおりであった。AMP緩衝液:0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.5。AMPPD登録商標LifeTechnologies、AMP緩衝液中で1mg/mlAMPPD-EE、AMP緩衝液2.5mM中で1mg/mL2.3mM。H2O2ストック:水中で103M50溶液から、Aldrich。Na2MoO4ストック:4.8mg/mLAldrich、~20mM。10μLのAMPPD-EE0.23mM、40μLのAMP緩衝液、40μLのH2O2ストック1Mおよび20μLのNa2MoO4ストック3.6mMを組み合わせ、37°Cで1時間、次いで55°Cで10分間反応させた。HPLCによりこの反応の進行を追跡した。出発材料AMPPD-EEの溶出ピークのHPLCトレースを対照トレースとして図2中で示す。所望される1,2-ジオキセタンAMPPD登録商標の溶出ピークのHPLCトレースを図3中に示す。図4および図5のHPLCトレースは、AMPPD-EE8.1分の所望されるジオキセタン基質AMPPD登録商標7.3分への酸化の進行を示す。反応から1時間10分で明らかに1つの産物AMPPD登録商標が得られた。b.ADP-StarエノールエーテルホスフェートのADP-Star登録商標への酸化アルカリpHでNa2MoO4/H2O2による、ADP-StarエノールエーテルホスフェートADP-EEのADP-Star登録商標ADPへの酸化は、図6中で示される反応スキームに従って行った。使用された試薬は以下のとおりであった。AMP緩衝液:0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.5。0.1MNa2MoO4Aldrich。ADP-EE-Oストック:50μLの0.1MNa2MoO4ストックと組み合わせた2mLのAMP緩衝液の中の10mgのADP-EE2.5mMNa2MoO4と11.7mMADP-EE。H2O2ストック:水中の103M50溶液から、Aldrich。100μLのADP-EE-Oストックを40μLのH2O2ストックと組み合わせ、混合物を1時間55°Cで反応させる。この時の後に、反応混合物を0.5mLのAMP緩衝液により希釈して、結果として1mg/mL2.3mMの1,2-ジオキセタンおよび0.5mMNa2MoO4を含む溶液を得た。この溶液はADP-EE酸化混合物と称される。ADPEEのADP-Star登録商標への酸化は、もたらされたジオキセタンのアルカリホスファターゼによる活性化およびTurnerルミノメーターでの光放射の測定によって実証された。以下の試薬をこれについて使用した。0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液、pH9.5AMP緩衝液、CDP-Star登録商標CDP、LifeTechnologies:AMP緩衝液中で6.2mg/mL12.5mM、ADP-Star登録商標ADP、LifeTechnologies:0.1MAMP緩衝液中で1mg/mL2.2mM、ADP-EE酸化混合物:0.1MAMP緩衝液中で1mg/mL2.3mM、TBQ:10×SapphireII商標化学発光促進剤LifeTechnologies、およびアルカリホスファターゼストックAP:8ng/mL17.4mg/mLの濃縮物から。10μLのADPまたはADP-EE酸化混合物それぞれ、0.22mMまたは0.23mM、10μLのTBQ、80μLのAMP緩衝液および10μLのAPを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで25分間連続的に測定した。1.6μLのCDP0.2mM、10μLのTBQ、80μLのAMP緩衝液および10μLのAPを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで25分間連続的に測定した。図7は、ADP-Star光放射曲線ADP-Starジオキセタン対照およびADP-Starエノールエーテルホスフェート酸化の2つの産物については、商業的に入手可能なCDP-Star登録商標ジオキセタン対照よりも高い光放射を示したことを示す。実施例9試薬の熱安定性Na2MoO4の存在下において、水溶液AMPPD登録商標、AMPPDエノールエーテルホスフェートAMPPD-EEおよびAMPPD-EEの熱安定性を検討した。図8および図10中で示されるように、AMPPD登録商標の熱による半減期は40°Cで~40日であり、半減期は55°Cで~10日へ低下する。比較において、図9および図10中で示されるように、AMPPDエノールエーテルホスフェートは4か月以上にわたって40°Cで実質的には熱分解を示さず、5か月以上にわたって55°Cで最小の熱分解を示した。Na2MoO4の存在下におけるAMPPD-EEの40°Cでの熱安定性も検討したところ、図11中で示されるように、Na2MoO4の存在下におけるAMPPDエノールエーテルホスフェートの熱分解は観察されなかった。エノールエーテルホスフェート熱安定性評価に加えて、Na2MoO4、H2O2および尿素H2O2商業的応用における一般のH2O2代替物についての報告された熱安定性を検討した。表A中で示されるように、モリブデン酸ナトリウムおよび過酸化水素は有意な熱分解を示さなかった。表A酸化試薬熱安定性の評価insituで生成されたジオキセタンAMPPD登録商標およびADP-Star登録商標の安定性は、製造されたジオキセタンに類似する安定性を有することが予想される。insituで生成されたジオキセタンは、通常の制限例えば6か月の間の4°Cで保存で将来の使用のために保存することができる。実施例10エノールエーテル基質による化学発光アッセイデザイン-方法Ainsitu1,2-ジオキセタン基質形成をアッセイデザインへ応用するために、複数の方法においてinsitu基質形成を援用することが可能である。例えば、第1の工程として酵素活性または酵素標識が1,2-ジオキセタン基質前駆体エノールエーテルフェノラートを生成し、次いで第2の工程において、1,2-ジオキセタンへinsitu酸化され、それは形成に際して分解されて化学発光シグナルリードアウトを生じることにより検出シグナルが生成されるような、アッセイを実行することができる方法A。この方法において、酸化工程をストップ溶液として見なすことができる。あるいは、1,2-ジオキセタン前駆体の1,2-ジオキセタンへのinsitu酸化が第1の工程であり、酵素活性または酵素標識が第2の工程として1,2-ジオキセタンフェノラートを生成するような、アッセイを実行することができる方法B。第1の工程が酸化であり、続いて酵素検出がある、第2のアッセイ方法方法Bは、セクションIVアルカリホスファターゼ活性に対するNa2MoO4およびH2O2のクエンチング効果の可能性中で記載される。方法A酵素活性化に続いて酸化:11,2-ジオキセタン基質のエノールエーテル前駆体の酵素活性化例えばエノールエーテルフェノラートを産出するAMP緩衝液中でアルカリフォスファターゼによって。2エノールエーテルフェノラートの酸化例えば緩衝液pH10中でH2O2/Na2MoO4によって。方法Aを図12中で示す。この方法において、酵素活性化に後続して基質に対するinsitu酸化が起こり、これはエンドポイントアッセイリードアウトに適合させることができ、そこで累積シグナルは酵素活性後に測定される。基質への酸化工程はアッセイ停止溶液としても機能する。使用した試薬:AMP緩衝液:0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.8。TBQ:10×SapphireII商標化学発光促進剤LifeTechnologies、AP:8、1.6、0.32、0.064ng/mLのアルカリホスファターゼストック17.4mg/mLの濃縮物から作製された、AMPPD-EE:AMP緩衝液中で1mg/mL2.5mM、H2O2ストック:水中の103M50溶液から作製、Aldrich、Na2MoO4ストック:0.5MNa2MoO4Aldrich、ホスフェート:2MK2HPO4pH9.6および対照:10μLのAMPPD登録商標0.21mM、10μLのTBQ、80μLのAMP緩衝液および10μLのAP様々な濃度でを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで30分間連続的に測定した。insituAMPPD-EEの酸化:10μLのAMPPD-EE0.21mM10μLのTBQ[10μLのAP様々な濃度で10μLのAMP緩衝液、37°Cで、1時間]、[8.5μLのNa2MoO435mM50μLのホスフェート25μLのH2O2ストック0.63M、30秒超音波処理、37°Cで]、90分間、~5分間読み取るグロー。方法Aを使用して、AMPPDエノールエーテルホスフェートAMPPD-EEは、1アルカリホスファターゼ希釈範囲にわたってによって脱リン酸化され10μLのAMPPD-EE0.21mM10μLのTBQ[10μLのAP様々な濃度で10μLのAMP緩衝液、37°Cで、1時間]、2AMPPD登録商標へinsituで酸化され[8.5μLのNa2MoO435mM50μLのホスフェート25μLのH2O2ストック0.63M、30秒超音波処理、37°Cで]、3insituAMPPD登録商標vs.AMPPD登録商標対照からの光放射が比較された90分間にわたって、5分間ごとに読み取る。図13および図14中で示されるように、アルカリホスファターゼ希釈曲線について非常に類似した直線状化学発光リードアウトが、insituAMPPD登録商標および対照AMPPD登録商標から生成された。実施例11アルカリホスファターゼ活性に対するNa2MoO4およびH2O2のクエンチング効果の可能性方法Bのinsituジオキセタン生成によるアッセイ条件を開発する前に、酸化システムからの試薬がアルカリホスファターゼ活性に悪影響を及ぼすかどうか調べた。実験結果から、過酸化水素はアルカリホスファターゼ活性に影響を与えないが、モリブデン酸ナトリウムはアルカリホスファターゼ活性を有意にクエンチし、最大85光が減少することが示された図15を参照。1mM未満までモリブデン酸ナトリウムの濃度を低下させることは、大部分のアルカリホスファターゼ活性を回復する図16を参照。これらの結果に基づいて、方法Bのinsituジオキセタン生成は、はるかに低いモリブデン酸ナトリウム濃度を酸化システムのために使用して開発された。一重項酸素生成/反応系からの任意のクエンチング効果は酵素に特異的であり得、任意の酵素/検出基質ペアについて評価されなくてはならない。例えば、Na2MoO4クエンチングはアルカリホスファターゼ酵素および/または関連する酵素ファミリーに特異的であり得、他の加水分解酵素についてはクエンチング効果を示さないかもしれない。使用した試薬:AMP緩衝液:0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.8、AMPPD登録商標:AMP緩衝液中で1mg/mLのAMPPDLifeTechnologiesTBQ:10×SapphireII商標化学発光促進剤LifeTechnologiesから、AP:アルカリホスファターゼストック、40ng/mL17.4mg/mLの濃縮物から、H2O2ストック:水中の103M50溶液から、Aldrich、Na2MoO4ストック:0.5MAldrich、実験条件:対照:10μLのAMPPD登録商標2.3mM、10μLのTBQ、120μLのAMP緩衝液および10μLのAP40ng/mLを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで30分間連続的に測定した。試験:10μLのAMPPD登録商標2.3mM、10μLのTBQ、80μLのAMP緩衝液、25μLのH2O2ストック10および10μLのAP40ng/mLを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで30分間連続的に測定した。10μLのAMPPD登録商標2.3mM、10μLのTBQ、115μLのAMP緩衝液、様々な量のNa2MoO4ストックおよび10μLのAP40ng/mLを組み合わせ、混合物からの発光を37°Cで30分間連続的に測定した。実施例12エノールエーテル基質による化学発光アッセイデザイン-方法Bアッセイにおけるinsituジオキセタン基質生成の援用に対する代替のアプローチは、第1の工程中でエノールエーテルホスフェートを酸化するものであり、それはアッセイウェル中で行うか、または別々の容器中で行いそこから基質をアッセイウェルへ添加する。insituジオキセタン基質の酵素活性化例えばアルカリフォスファターゼに基づくアッセイにおける脱リン酸化はこの工程に後続し、化学発光のリードアウトを行う。方法Bをキネティックモードのアッセイのために使用して、アッセイシグナルが生成されるにつれて測定することこができる。このワークフローの融通性が必要なならば、使用者がアッセイの第1の工程insituジオキセタン生成を先立って行うことも方法Bでは可能である。方法B酸化に続いて酵素活性化:11,2-ジオキセタン基質のエノールエーテル前駆体の酸化例えば緩衝液pH10中のH2O2/Na2MoO4により1,2-ジオキセタン基質を産出する。2insitu生成1,2-ジオキセタン基質の酵素活性化例えばAMP緩衝液中のアルカリフォスファターゼにより1,2-ジオキセタンフェノラートを産出する。方法Bを図17中に示す。この方法において、AMPPDエノールエーテルホスフェートをAMPPD登録商標へinsituで酸化し、アルカリホスファターゼ希釈範囲にわたってによって脱リン酸化し、insituAMPPD登録商標vs.AMPPD登録商標対照からの光放射を比較した。この場合もやはり、アルカリホスファターゼ希釈曲線について非常に類似した直線状化学発光リードアウトが、insituAMPPD登録商標および対照AMPPD登録商標から生成された図18および図19を参照。使用される実験条件を以下に記載する。0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液、pH9.8AMP緩衝液中の200μLの5mg/ml9mMのAMPPD-EE5μLの0.1MNa2MoO41.8mM75μLの10H2O20.8Mを組み合わせること、および1時間55°Cで混合物をインキュベーションすることによって、AMPPDエノールエーテルをAMPPD登録商標へ酸化した。AMP緩衝液を1mLの最終的な体積まで添加して、~1mg/mL2.5mMおよび0.5mMNa2MoO4の濃度で酸化AMPPD-EEAMPPD-EE-Oを含む溶液を生じた。AMPP-EE-Oの発光特性をAMPPD登録商標のものと比較した。アッセイのために使用した試薬:AMP緩衝液:0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.8、AMPPD:AMP緩衝液中で1mg/mL2.3mMのAMPPDLifeTechnologies、AMPPD-EE-O:AMP緩衝液中で約1mg/mL2.5mM、TBQ:10×SapphireII商標化学発光促進剤LifeTechnologies、AP:40、8、1.6、0.32、0.064ng/mLの濃度のアルカリホスファターゼ17.4mg/mLの濃縮物から作製された。Luminoskan測定三重で測定:20μL0.46mMのAMPPD、10μLのTBQ、60μLのAMP緩衝液および10μLのAP4、0.8、0.16、0.032、0.0064ng/mLを組み合わせ、混合物からの発光を室温で2時間連続的に測定した。20μLのAMPPD-EE-O0.5mM、10μLのTBQ、60μLのAMPの緩衝液および10μLのAP4、0.8、0.16、0.032、0.0064ng/mLを組み合わせ、混合物からの発光を室温で2時間連続的に測定した。方法Bも使用して、以前に論じられたように、ADP-StarエノールエーテルホスフェートからのADP-Star登録商標のinsitu生成を評価する。insituADP-Star登録商標および対照ADP-Starからの光放射曲線は、図7中で示されるように、重ねることができる。以下に記載するように、ADP-Starエノールエーテルホスフェート可溶性を提供する方法Bの修飾を行った。使用した試薬:溶液A:12.5mMNa2MoO4と共に、30アセトニトリル/70炭酸ナトリウム溶液中の23.3mMADP-Star-EE。溶液B:10H2O2。炭酸ナトリウム溶液:10リットルの水中の32gmの重炭酸ナトリウム12gmの炭酸ナトリウム1mLの溶液Aおよび0.7mlの溶液Bを組み合わせ、55°Cで15分間加熱して色が消えるまで、13.7mMinsituADP-Starストック溶液を生成した。試験:1.7mLのinsituADP-Starストック溶液を、56.3mLの0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液pH9.5および1mg/mLのSapphireII商標化学発光促進剤LifeTechnologiesと組み合わせて、0.4mMinsituADP-Starおよび1mg/mlのSapphireII商標を含む溶液の生成した。insitu生成ADP-Starの性能は、アルカリホスファターゼ希釈曲線中のジオキセタン対照CSPD、ADP-StarおよびCDP-Starと比較して、対照ジオキセタンに類似していた図20および図21を参照。2つの異なるアッセイ/基質生成方法方法Aおよび方法Bを使用する、insitu生成AMPPDおよび対照AMPPDと類似した酵素希釈曲線の生成は、insituジオキセタン基質生成の原理が酵素アッセイ適用に容易に適合できることを実証する。同等の結果は、方法Bを使用するinsituADP-Starおよび対照ジオキセタン、CSPD登録商標LifeTechnologies、ADP-Star登録商標ならびにCDP-Star登録商標について得られた。これらの基質生成およびアッセイデザイン原理はアルカリホスファターゼ基質およびアッセイにより実証されたが、他の加水分解酵素β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-グルコシダーゼおよびノイラミニダーゼについてジオキセタン基質およびアッセイに一般的に適合させることができる。実施例13エノールエーテル基質によるモデル組換えヒトインターロイキン6rhIL-6のELISA1.insituAMPPD検出によるrhIL-6のELISAモデルの組換えrhIL-6検出ELISAをinsituAMPPDおよび対照AMPPD登録商標で同時に実行して、イムノアッセイにおけるinsituAMPPDの性能を評価した。実験により、insituで生成されたAMPPDは等しいモル量の基質を使用するアッセイにおいて対照AMPPD登録商標と同様に動作し、エノールエーテルホスフェートの100の転換が想定されることが示された図22を参照。ELISAインキュベーション工程の間にinsituAMPPDを調製することができ、アッセイに余分な時間を加えず、ELISAアッセイ自体と比べてあまり不便ではなかった。全体的なアッセイ感受性およびダイナミックレンジは、CDP-Star登録商標CDPにより検出された内部rhIL-6のELISAに十分匹敵していた。rhIL-6ELISAプレート調製96ウェルマイクロタイタープレート:1.捕捉抗体2mg/mLの抗ヒトIL-6によりELISAプレートを一晩コートする。2.プレートウェルを洗浄する。3.300μL/ウェルのブロッキング緩衝液1×PBS/0.02ツイーン20/1BSAによりプレートをブロックする。4.プレートウェルを洗浄する。rhIL-6アッセイ:5.100μLのサンプルまたはスタンダード3000pg/μL~0.0003pg/mLのrhIL-6、1:6希釈でをウェルへ添加し、室温で30分間インキュベーションする。6.プレートウェルを洗浄する。7.100μLの12.5ng/mlビオチン化検出抗IL6抗体RDSystemsを添加し、室温で15分間インキュベーションする。プレートウェルを洗浄する。8.100μLのアルカリフォスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンJacksonLaboratoriesを1:40,000希釈で添加する。9.プレートウェルを洗浄する。10.各々のウェルへ100μlの基質溶液を添加し、室温で30分間インキュベーションする。11.ルミノメーターを使用して25°Cの温度で30分間で各々のウェルのRLUを測定する。AMPPDのinsituジオキセタン調製:溶液Aを以下の溶液を組み合わせることによって調製して12.7mMのAMPPDエノールエーテルホスフェートのストック溶液を得た。5mg/mLのAMPPDエノールエーテルホスフェート実施例2から;分子量394。2mLの0.1Mアミノメチルプロパノール緩衝液、pH9.8AMP緩衝液。50μLの0.1MNa2MoO4。工程1-溶液Bの作製100μLの溶液A38μLの10H2O29.2mMAMPPD登録商標分子量426を作製する55°Cで1時間溶液を加熱するO2バブルが出て、透明に色変化これは溶液Bである。化学発光促進剤もこの工程で添加することができる。工程22.54mM-2.54mMAMPPDの溶液Cの作製138μLの溶液B9.2mMAMPPD登録商標を有する、insituで生成362μLの0.1MAMP緩衝液pH9.8これは2.54mMAMPPD登録商標の溶液Cである。工程24mM-4mMAMPPDの溶液Cの作製138μLの溶液B9.2mMAMPPD登録商標を有する、insituで生成された149.4μLの0.1MAMP緩衝液pH9.8これは4mMAMPPD登録商標の溶液Cである。工程30.25mM-0.25mMAMPPDの溶液Dの作製1mLの溶液C2.54mMAMPPD登録商標1mLの10×SapphireIILifeTechnologies8mLの0.1MAMP緩衝液pH9.8これは0.25mMAMPPD登録商標の溶液Dである。100μLの溶液Dのを各々のウェルへ添加する。工程30.4mM-0.4mMAMPPDの溶液Dの作製1mlの溶液C4mMAMPPD登録商標1mlの10×SapphireIILifeTechnologies8mlの0.1MAMP緩衝液pH9.8これは0.4mMAMPPD登録商標の溶液Dである。100μLの溶液Dを各々のウェルへ添加する。スタンダードアッセイ検出は0.4mM1,2-ジオキセタンおよび1mg/mlの促進剤をを用いるので、これは比較アッセイ条件を設定する。実験の他のセットにおいて、insituAMPPDを生成する酸化時間は多様であり、次いで基質性能を対照AMPPD登録商標と共にrhIL-6のELISAによって評価した。時間経過実験は、30分までに大部分のAMPPDエノールエーテルホスフェートがinsituAMPPDに転換されるようであることを示した。15分間のinsitu生成AMPPDvs.60分間のinsitu生成AMPPDを使用するイムノアッセイ性能感受性およびダイナミックレンジにおける低下はほとんどなかった。30分間のinsitu生成AMPPDvs.60分間のinsitu生成AMPPDにより検出シグナルRLUにおける差異もほとんどなかった。AMPPDエノールエーテルホスフェートのinsituAMPPDへのある程度の転換が、T0結果によって示されるようにアッセイの間に起こる図23を参照。2.insituADP-Star検出によるrhIL-6検出ELISAベンチマークテストの実験により、insituADP-Starの光放射RLUでおよびシグナル対ノイズS:Nを、対照ジオキセタンCSPD登録商標、ADP-Star登録商標およびCDP-Star登録商標と比較した。最大光放射はジオキセタン基質に応じて変動し、CSPD登録商標は30分間でグローに到達し、CDP-Star登録商標は45分間でグローに到達し、ADP-Star登録商標は60分間でグローに到達する図24および図25を参照。モデルのrhIL-6ELISAを、insituADP-Starおよび対照ジオキセタンCSPD登録商標、ADP-Star登録商標およびCDP-Star登録商標と同時に実行し、イムノアッセイにおけるinsituADP-Starの性能を評価した。実験により、insitu生成ADP-Starは対照ジオキセタン基質と同等に実行されることが示された。アッセイ感受性IL-6の検出下限、S/Nおよびダイナミックレンジは、insitu生成ADP-Starを含むすべての基質について類似していた図26を参照。上記の溶液調製工程A~Dのうちの1つまたは複数の排除は、応用開発において所望され得る。溶液構成要素の修飾も特定の応用において所望され得る。溶液構成要素の修飾の一例は、アッセイ条件への緩衝液による希釈前に、酸化工程において存在する促進剤を用いた検出溶液の調製によって実証された。修飾したinsituジオキセタン調製を使用して、アルカリホスファターゼ検出曲線から、ADP-Star登録商標対照赤色および淡青色の放射曲線と比較して、insituADP-Star紺色および黄色の光放射曲線は類似した感受性であることが示される図27を参照。実際は、insituADP-Star検出溶液は、対照と比較して、放射最大への到達に際してより安定した光放射を与える。加えて、修飾したinsituADP-Starジオキセタン調製は、IL-6ELISAについて対照ジオキセタンに匹敵するイムノアッセイ検出感度を与える図28および図29を参照。促進剤溶液中のinsitu生成ADP-Star:a酸化はAMPの緩衝液中の11.7mMADP-Starエノールエーテルホスフェート実施例3からおよび10mg/mlのSapphireIILifeTechnologiesNa2MoO4で実行した。酸化後に、溶液はAMP緩衝液により1×へ希釈する。最終的な溶液濃度は以下の通りである。0.58mMinsitu生成ADP-Star/0.5mg/mlSapphireII。b酸化はAMP緩衝液中の4mMADP-Starエノールエーテルホスフェート実施例3からおよび10mg/mlのSapphireNa2MoO4で実行した。酸化後に、溶液はAMP緩衝液により1×へ希釈した。最終的に、0.4mMinsitu生成ADP-Star/1mg/mlSapphireII。添付の図面に関して本発明の具体的な実施形態を記載してきたが、本発明はそれらの正確な実施形態に限定されず、当業者であれば、添付の請求項によって定義されるような本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明中で様々な変更および修正を行えることを認識すべきである。"