"DBHおよびHとは異なるJAK/STAT阻害剤の薬学的に効果的な量を投与することによって、軟骨の分解を伴う疾患の発症の進行または可能性を阻害する方法。疾患が変形性関節症である、請求項1に記載の方法。疾患が慢性関節リウマチである、請求項1に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がJAK-3阻害剤である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がWHI-P131である、請求項4に記載の方法。DBHおよびHとは異なるJAK/STAT阻害剤の薬学的に効果的な量を投与することによって、細胞における軟骨分解酵素の発現を調節する方法。細胞がインビトロで阻害剤と接触する、請求項6に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がJAK-3阻害剤である、請求項6に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がWHI-P131である、請求項6に記載の方法。DBHまたはHとは異なるJAK/STAT阻害剤の薬学的に効果的な量を投与することによって、軟骨細胞における前炎症性因子の発現を調節する方法。細胞をインビトロで阻害剤と接触させる、請求項10に記載の方法。前炎症性因子が、iNOS、COX-2またはNF-6Bからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がJAK-3阻害剤である、請求項10~12のいずれか一項に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がWHI-P131である、請求項13に記載の方法。DBHまたはHとは異なるJAK/STAT阻害剤の薬学的に効果的な量を投与することによって、軟骨細胞における前炎症性サイトカインの発現を調節する方法。細胞がインビトロで阻害剤と接触する、請求項15に記載の方法。前炎症性サイトカインが、IL-6、TNF-αまたはIL-1からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がJAK-3阻害剤である、請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。JAK/STAT阻害剤がWHI-P131である、請求項18に記載の方法。DBHまたはHの薬学的に効果的な量を投与することによって、OAまたはPKC媒介炎症とは異なるJAK/STAT媒介の疾患または障害を処置する方法。前記JAK/STAT媒介の疾患または障害が、T細胞により媒介される疾患または障害、2型の疾患または障害、マスト細胞により媒介される疾患または障害、Bリンパ腫細胞の疾患または障害、および骨髄性の疾患または障害からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。軟骨の分解を伴う疾患または障害を処置するために有用な化合物を検出するためのアッセイであって、aJAK3を候補化合物と接触させること、およびbJAK3活性の低下を検出することを含む方法。実施例1:ヒト関節軟骨細胞培養物の調製OAなどの退行性軟骨の疾患または障害に関連した細胞病理学を研究するために、ヒト軟骨の細胞ヒト軟骨細胞培養物を調製した。正常なヒト関節軟骨の薄片を剖検の48時間以内に30歳の白人男性の膝から得たNationalDiseaseResearchInterchangeNDRI、Philadelphia、PA。関節の軟骨細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM;GIBCO/BRL、Gaithersburg、MD中で37°Cで一晩の酵素消化0.1クロストリジウムヒストリチクムClostridiumhistolyticumコラゲナーゼ;Worthington、Freehold、NJによって軟骨のすりつぶした薄片から遊離させた。不完全な消化物を、DMEM中で0.25コラゲナーゼおよび0.05トリプシンを使用してさらに3時間消化した。軟骨細胞をプラスチック容器に単層で播種し、そしてDMEM、10ウシ胎児血清FBS;HyClone、Logan、UT、100U/mlペニシリンpenおよび100μg/mlストレプトマイシンstrepの存在下、37°Cおよび8CO2において、3日毎に培地交換を行いながらコンフルエンスになるまで培養した。コンフルエンスに達したとき、第1継代の軟骨培養をトリプシン処理によって集め、細胞株HC30-0198と名付けて、将来の使用のために、DMEM、pen/strep、40FBS、および10ジメチルスルホキシドの存在下で液体窒素中に保存した。実施例2:正常なヒト関節軟骨細胞におけるJAK3の発現ヒト軟骨細胞におけるJAK3の発現を明らかにするために、JAK3特異的プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRを、単層で培養された正常な成人ヒト軟骨細胞から単離された総RNAに対して行った。正常な成人のヒト関節軟骨細胞を、上記の実施例1に教示されているように軟骨の薄片から単離して培養した。凍結された軟骨細胞の細胞株HC30-0198を解凍し、上記に記載されるように単層で培養して第2継代、コンフルエンス後5日目まで培養した。総RNAを、製造者が指示するプロトコールに従ってQiagenRneasy登録商標キットQIAGEN、Valencia、CAを使用してコンフルエンス後5日目のヒト関節軟骨細胞から抽出した。JAK3プライマーを発表されたヒトJAK3遺伝子およびcDNA配列それぞれ、GenBankアクセション番号U70065および同U090607から設計した。JAK3遺伝子に特異的な3つのDNAプライマーは、ヒトJAK3遺伝子のエキソン18およびエキソン19を標的とした表I。第1鎖cDNAを、JK3-2プライマー、総RNA、ならびにReady-To-Go登録商標You-Primeの第1鎖ビーズおよび方法AmershamPharmaciaBiotech、Piscataway、NJを使用して作製した。cDNA産物8μlを、10μlのPCR用10X緩衝液、2.4μlの25mMのMgCl2、0.5μlのホットスタートを使用するTaqポリメラーゼBoehringerMannheim、Indianapolis、IN、73μlの水、およびそれぞれ3μlの10μMのJK3-1プライマーおよびJK3-3プライマーを使用する100μlの反応液で増幅した。ホットスタートPCRプロトコールは、94°Cで5分間の最初の変性その後、Taqポリメラーゼが添加される、その後、94°Cで30秒間の変性;56°Cで30秒間のアニーリング;72°Cで30秒間の伸長から構成された。変性、アニーリング、および伸長を40サイクル行い、その後、72°Cで5分間の最後の伸長を行った。RT-PCRにより、254塩基対のDNA産物が得られ、これを、QIAquick商標ゲル抽出キットQIAGEN、Valencia、CAを使用して、2SeaKem登録商標GTG登録商標アガロースゲルFMCBioProducts、Rockland、MEでの電気泳動によって精製した。RT-PCR産物の配列決定を、JK3-3プライマーおよびAmpliCycle登録商標の配列決定試薬およびプロトコールPerkinElmer、FosterCity、CAを使用して行った。109ヌクレオチドのDNA配列が、RT-PCR産物の一方の鎖のサイクル配列決定反応から得られ、うち106個のヌクレオチドは、GenBankのヒトJAK3のcDNA配列アクセション番号U09067に対して100の同一性を示した図1。3つのヌクレオチド不一致は、RT-PCRにより生じた配列決定テンプレートおよびDNA配列決定ゲルの品質が最適ではなかったことに起因した。実施例3:ヒト変形性関節症の軟骨に由来する関節軟骨細胞におけるJAK3の発現ヒト変形性関節症の軟骨に由来する関節軟骨細胞におけるJAK3の発現を、上記の実施例2の正常なヒト軟骨細胞において見出されるJAK3の発現と比較するために、JAK3特異的プライマーを使用するRT-PCRを、成人のヒト変形性関節症の軟骨から直接単離された総RNAに対して行った。全膝置換を受けている47歳の白人女性の右膝に由来する変形性関節症の関節軟骨の薄片をNDRIから得た。軟骨を、集めた直後に液体窒素中に素早く凍結した。無傷の軟骨の2グラム~4グラムの総量を、SPEXミルSPEXCertiPrep,Inc.、Metuchen、NJを使用して液体窒素の存在下で粉末化した。総RNAを、粉末化した軟骨から、Reno他1977によって記載されるTRIspin法を使用して単離した。RT-PCRを、実施例2に記載されるように、JK-1、JK-2、およびJK-3のプライマーを使用して総RNAサンプルに対して行った。RT-PCRにより、254塩基対のDNA産物が得られ、続いてこれを、QIAquickゲル抽出キットQIAGEN、Valencia、CAを使用して2SeaKem登録商標GTG登録商標アガロースゲルFMCBioProducts、Rockland、MEから精製した。RT-PCR産物の配列決定を、製造者が指示するプロトコールに従って、JK3-3プライマーおよびABIプリズムダイターミネーターサイクルシーケンシングレディー反応キットPEAppliedBiosystems、Foster、CAを使用して行った。DNA配列を、ABIPRISM登録商標377DNA配列決定装置PEAppliedBiosystems、FosterCity、CAを使用して決定した。214bpの配列が決定された。配列決定された214個のヌクレオチドのうち、197個のヌクレオチドは、GenBankのヒトJAK3のcDNA配列アクセション番号U09067に対して100の同一性を示した図2。残る17個のヌクレオチド不一致は、配列決定テンプレートの品質が最適ではなかったことに起因した。実施例4:ヒト軟骨細胞cDNAライブラリーからのJAK3cDNAの単離JAK3がヒト軟骨細胞で活発に発現していることをさらに明らかにするために、JAK3をヒト軟骨細胞のcDNAライブラリーから単離した。この分野で知られている技術を使用して、アルギン酸塩中で培養されたヒト関節軟骨細胞から単離された総RNAを使用して、cDNAライブラリーを作製したcDNAライブラリーの構築はStratageneLaJolla、CAによって商業的に行われた。cDNAライブラリーを、十分に確立されたプロトコールSambrook他1989、およびStratageneLaJolla、CAの推奨されるプロトコールに従って力価測定して、スクリーニングした。JAK3のDNAプローブを使用して、軟骨細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングした。cDNAライブラリー/フィルターのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、1Xプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション溶液GIBCO/BRL、Gaithersburg、MDを65°Cで使用して行った。JAK3のDNAプローブを用いた15時間のハイブリダイゼーションを行った後、ブロットの洗浄を、順次、2XSSC/0.1SDSで2回室温で15分/洗浄、そして1XSSC/0.1SDSで2回65°Cで30分/洗浄行った。ブロットを空気乾燥して、放射能シグナルを、KodakX-Omat商標ARXARオートラジオグラフィーフィルムEastmanKodak、Rochester、NYを使用して可視化した。二連のフィルターで陽性であったプラークを選択して、1mlの滅菌SM緩衝液0.05MのTrispH7.5、0.1MのNaCl、0.008MのMgSO4、0.01ゼラチンに入れ、ボルテックスして、4°Cで一晩インキュベーションした。一次スクリーニングから得られた14個の陽性プラークを、200μlの細菌株XL-1BlueMRF’Stratagene、LaJolla、CAへの1×102希釈物の10μlを使用して再置床し、上記のようにJAK3のDNAプローブを用いてスクリーニングした。二次スクリーニングから得られた陽性プラークを選択して、上記のようにSM緩衝液に入れた。二次スクリーニングから得られた2個の陽性ファージクローンを、i実施例2に記載されるようなPCR反応においてJK3-1プライマーおよびJK3-3プライマーを使用するJAK3同一性の確認、およびiiT7プライマーおよびT3プライマーStratagene、LaJolla、CAを使用するクローン化されたcDNA挿入物のサイズの確認に基づくDNA配列分析のために選択した。ホットスタートPCRプロトコールは、93°Cで5分間の最初の変性その後、Taqポリメラーゼが添加される、その後、93°Cで1分間の変性;55°Cで1分間のアニーリング;75°Cで45秒間の伸長から構成された。変性、アニーリング、および伸長を40サイクル行い、その後、75°Cで7分間の最後の伸長を行った。PCR産物のサイズは、1SeaKem登録商標GTG登録商標アガロースゲルFMCBioProducts、Rockland、MEにおいて可視化された。JAK3の最長のcDNA挿入物を含有する2つのラムダZAP登録商標IIファージクローンのPCR産物を同定した後、JAK3のcDNA挿入物をそれぞれ、製造者が指示するプロトコールに従ってExAssist商標干渉耐性ヘルパーファージStratagene、LaJolla、CAを使用してSOLR大腸菌株にサブクローン化した。数個の細菌コロニーを単離して、プラスミドDNAを、QIAprepスピンミニプレップキットQiagen、Valencia、CAを使用してこれらのクローンから精製した。2つのサブクローンのそれぞれに由来する一方のDNA鎖のDNA配列分析により、それぞれのサブクローンから得られた約2000ヌクレオチドの配列が発表されたJAK3のcDNA配列GenBankアクセション番号U09607と同一であることが明らかにされた。これらのサブクローンの1つから決定されたDNA配列が図3として示される。実施例2、3、および4の結果により、JAK3の発現が、ヒト変形性関節症の軟骨と同様に、正常なヒト軟骨に由来する培養された関節軟骨細胞において最初に確認される。実施例5:ヒト関節軟骨細胞におけるJAK3発現のノーザンブロット分析凍結された軟骨細胞の細胞株HC30-0198実施例1に記載されるように調製された正常なヒト関節軟骨細胞を解凍して、単層で培養し第2継代、コンフルエンス後5日目まで培養した。試験培養物をリン酸塩緩衝化生理的食塩水PBSで洗浄し、その後、12ng/mlの組換えヒトインターロイキン-1βrhIL-1βRDSystems、Minneapolis、MNを1抗生物質溶液を含有する無血清DMEM中で24時間にわたって、または21抗生物質溶液を含有する無血清DMEMのみコントロールのいずれかを加えた。単層培養物に由来する総RNAを、製造者が指示するプロトコールに従ってTRIzol試薬GIBCO/BRL、Gaithersburg、MDを使用して24時間の培養の後に集めた。上記のそれぞれのサンプルから得られた総RNAの10μgを2.2Mホルムアルデヒド/1.2アガロースゲルで分離し、そして製造者が指示するプロトコールに従ってTURBOBLOTTER商標SchleicherSchuell、Keene、NHシステムを使用して穏和なアルカリ転写によってナイロン支持メンブランSchleicherSchuell、Keene、NHに転写した。ノーザンブロット上のRNAを、Stratalinker登録商標1800UV架橋装置Stratagene、LaJolla、CAを使用することによってメンブランに固定した。JAK3の109塩基対のヒトcDNAがRT-PCRによって得られた上記の実施例2を参照のこと。このcDNAを、製造者が指示するプロトコールに従ってReady-To-GoDNA標識ビーズ-dCTP;AmershamPharmaciaBiotech、Piscataway、NJを使用して[α-32P]dCTPNewEnglandNuclear、Boston、MAで標識し、そしてCHROMASPIN商標TE-30カラムClontech、PaloAlto、CAを使用して精製し、ノーザンブロット分析用のプローブとして使用した。ノーザンブロットのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、2Xプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション溶液GIBCO/BRL、Gaithersburg、MDおよびホルムアミドの1:1希釈物を使用して42°Cで行った。JAK3のDNAプローブを使用して15時間のハイブリダイゼーションを行った後、ブロットの洗浄を、順次、2XSSC/0.1SDSで2回室温で15分/洗浄、そして0.5XSSC/0.1SDSで2回65°Cで30分/洗浄行った。ブロットを空気乾燥して、放射能シグナルを、FujifilmBAS-1500ホスホルイメージャーFujiMedicalSystems、USA、Stamford、CTを使用して可視化した。ノーザンブロット分析の蛍光像を図4として示す。その結果は、JAK3のmRNAが正常な成人の培養された関節軟骨細胞において発現していること、およびrhIL-1βは、rhIL-1βで刺激されなかった正常な成人関節軟骨細胞で見出されたJAK3のmRNAレベルから増大させることも低下させることもないことを明らかにしている。さらに、ノーザンブロットにより、2つの分子量のJAK3種が単層培養のヒト関節軟骨細胞によって発現していることが明らかにされるおよそ4.2kbおよび2.2kbの長さ。正常な成人の培養されたヒト関節軟骨細胞によって発現するJAK3のmRNAの優勢な形態は2.2kbの形態である。大きい方の形態4.2kbは、リンパ系系統の正常なヒト血液細胞に見出される形態とサイズが一致しており、軟骨細胞において発現する総JAK3のmRNAの小さい画分を表す。実施例6:JAK3のDBHによる阻害OAなどの退行性関節疾患に対して効果的な治療薬であるDBHがJAK3を阻害するように機能することを明らかにするために、チロシンキナーゼの酵素連結免疫吸着アッセイELISAを行った。Nunc免疫プレートのMaxisorp平底捕獲プレートNalgeNuncInternational、Rochester、NYを、コーティング緩衝液10mMリン酸塩pH7.20.02のNaN3で2μg/mlに希釈された抗ホスホチロシンPY54MAb抗体TransductionLabs、Lexington、KYの80μl/ウエルでコーティングし、4°Cで一晩吸着させた。プレートを洗浄しすべての洗浄は、TBST25mMのTris/HClpH8.0、150mMのNaCl0.05ツイーン-20を用いて4回である、その後、200μl/ウエルのブロッキング緩衝液TBST1BSAを加えた。プレートを密閉し、37°Cで60分間または4°Cで一晩インキュベーションして、再び洗浄した。キナーゼ反応を、丸底プレートCorning、Corning、NYにおいてビオチン化ペプチド基質を用いて50μlの容量で行った。キナーゼ反応混合物は、20μlの50μMのGAS1ビオチン化ペプチドLCビオチン-EGPWLEEEEEAYGWMDF-アミド、キナーゼ緩衝液中の0μM~1250μMのATP、2Xキナーゼ緩衝液50mMのイミダゾール/HCl、2mMのDTT、0.2mMのEDTA、0.030のBrij-35、pH6.8中の10μlの50mMのMgCl2、水0.2プルロニック-104および3ジメチルスルホキシドDMSOを含有する中の10μlの0μM~50μMのDBH、および10μlのJAK3酵素キナーゼ緩衝液で希釈を含有した。キナーゼ緩衝液を希釈剤として使用してホスホペプチドの標準曲線0nM~10nMもまた試験した。キナーゼ反応を37°Cで30分間行い、その後、15μl/ウエルの0.125MのEDTApH6.8を加えることによって停止させた。停止させた溶液のウエルあたり50μlのアリコートを、抗体をコーティングした捕捉プレートに移し、密閉して、37°Cで60分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、その後、Genzyme希釈緩衝液で1/5希釈されたSA-HRP試薬Genzyme、Cambridge、MAの80μl/ウエルを加えた。プレートを密閉して、37°Cで60分間再びインキュベーションした。プレートを洗浄し、その後、室温で予め平衡化したテトラメチルベンジジンTMB基質溶液KirkegaardPerryLaboratories、Gaithersburg、MDの100μl/ウエルを加えて、約5分間反応させた。反応を1NのH2SO4溶液の100μl/ウエルで停止させた。サンプルをA450-A620で読み取った。この実験の結果図6として示されるにより、DBHがJAK3の強い阻害剤であり、記録された阻害定数Kiが286±16nMであることが明らかにされる。実施例7:DBHおよびその変化体はJAK3を特異的に阻害する様々な細胞成分に対するDBHおよびその変化体の特徴的な阻害をさらに調べるために、ポリGlu,Tyr4:1のELISAを行った。ヒメニアルジシンH、DBH海産海綿動物の抽出物として:ChipmanおよびFaulkner1997を参照のこと、および合成DBHの3つの変化体DBHの遊離塩基形態DBH-2FB、DBHのトリフルオロ酢酸塩形態DBH-2S、およびDBHのメタンスルホン酸塩形態DBH1をDMSOに溶解して、ZAP-7070kDaのζ会合ポリペプチドタンパク質チロシンキナーゼ、BTKブルートン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ、JAK3Janusキナーゼ3タンパク質チロシンキナーゼ、LCKリンパ様T細胞タンパク質チロシンキナーゼ、およびIGFRインスリン様増殖因子受容体タンパク質チロシンキナーゼを阻害する効力について試験した。MaxisorbマイクロタイタープレートNalgeNuncInternational、Rochester、NYを、リン酸塩緩衝化生理的食塩水PBS、0.02アジ化ナトリウムに溶解した、1mg/mlのポリGlu,Tyr4:1Sigma、St.Louis、MOでコーティングした。アッセイの当日に、マイクロタイタープレートを、Skatronプレート洗浄機SkatronInstruments、Sterling、VAを使用してTBS-ツイーン25mMのTrispH8.0、150mMのNaCl、0.05ツイーン20で4回洗浄した。200μlの滅菌ブロッキング緩衝液PBS、0.02アジ化ナトリウムにおける3BSAを各ウエルに加え、マイクロタイタープレートを37°Cで1時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を除き、プレートを洗浄して、様々な濃度の阻害剤を20μlの容量でウエルに加えた。その後、60μlの適切な基質ミックスを加えた。基質ミックスを表2に記載されるように調製した。基質ミックスを加えた後、20μlの試験タンパク質チロシンキナーゼ1Xアッセイ緩衝液においてを加えた。キナーゼ反応液を37°Cで30分間インキュベーションし、その後、Skatronプレート洗浄機で洗浄した。100μlのビオチン化PT-66抗ホスホチロシンモノクローナル抗体Sigma、St.Louis、MO0.5BSA、無菌ろ過TBSにおいて1:4000希釈を各ウエルに加え、37°Cでさらに30分間インキュベーションした。プレートを洗浄して、0.5BSA-無菌ろ過TBSで1:32,000に希釈されたストレプトアビジン-HRP結合体ICNPharmaceuticals、CostaMesa、CAの100μlを各ウエルに加え、最後に37°Cで30分間インキュベーションした。プレートを洗浄して、100μlのテトラメチルベンジジンTMB基質溶液KirkegaardPerryLaboratories、Gaithersburg、MDを室温で15分間かけて加え、その後、100μlの停止試薬1Mリン酸を加えた。その後、サンプルをプレート読み取り装置において450nmで読み取った。4ロットの海産物抽出物H979-1、979-4、979-5、979-6として示されるおよび2ロットの海産物抽出物DBH5025-11および5025-12と呼ぶは、JAK3の特異的な低マイクロモル濃度の阻害を示し、ec-50値50阻害に対する有効濃度が2.6μM~10.7μM979のロット物および23.4μM~34.4μM5025のロット物の範囲にあった図7。ZAP-70、LCK、BTK、およびIGFRの阻害は弱く、ec-50値は数百マイクロモル濃度から非阻害まで変化したデータ示さず。試験された合成DBHの3つの形態もまたJAK3の阻害を示し、ec-50値は11.60μM~53.99μMの範囲であった図8A。DBH-2FBは、DBHの2つの塩形態と比較したときに、より大きなJAK3の阻害すなわち、11.60μMを示した。DBH-2FBはまた、ZAP-70、LCK、BTK、およびIGFRに対するec-50値が1971μMから非阻害まで変化するJAK3の選択的阻害剤であることが示される図8B。これらの結果は、DBHおよびその様々な誘導体がJAK3に特異的な阻害剤であることを明らかにしている。実施例8:OAに関連したmRNAのDBHおよびその変化体によるダウンレギュレーションDBHによるJAK3阻害の下流の影響を調べるために、ノーザンブロットアッセイを行い、OAに関連した様々な分子の定常状態のmRNAレベルにおける変化を検出した。凍結したヒト関節軟骨細胞の細胞株HC30-0198実施例1に記載を解凍して、コンフルエンス後1日目~5日目まで上記に記載されるようにT150組織培養フラスコCorningCostar、Cambridge、MAにおいて単層で培養した。試験培養物をPBSで洗浄して、5μMのDBH合成をその遊離塩基形態またはトリフルオロ酢酸塩形態で含有する10mlの無血清DMEMを用いて2時間プレインキュベーションした。その後、5μMのDBH、4ng/mlの組換えヒトインターロイキン-1βrhIL-1β;2ng/mlの最終濃度RDSystems、Minneapolis、MNおよび2抗生物質溶液1の最終濃度を含有する無血清DMEMのさらなる10mlを24時間かけて加えた。2つのコントロール培養物を並行して処理した:DBHを含まない培養物rhIL-1β単独と、DBHもrhIL-1βも含まない培養物。単層培養物に由来する総RNAを、製造者が指示するプロトコールに従ってTRIzol試薬GIBCO/BRL、Gaithersburg、MDを使用して集めた。それぞれの試験サンプルから得られた総RNAの10μgを2.2Mホルムアルデヒド/1.2アガロースゲルで分離し、そして製造者が支持するプロトコールに従ってTURBOBLOTTER商標システムSchleicherSchuell、Kneene、NHを使用して穏和なアルカリ転写によってナイロン支持メンブランSchleicherSchuell、Kneene、NHに転写した。総RNAを、Stratalinker登録商標1800UV架橋装置Stratagene、LaJolla、CAを使用してメンブランに固定した。ストロメライシン-1MMP3、コラゲナーゼ1MMP1、シクロオキシゲナーゼIICOX2、NF-κBp65、腫瘍壊死因子-αTNF-α、およびインターロイキン-6IL-6に対するヒトDNAプローブを、製造者が指示するプロトコールに従ってReady-To-GoDNA標識ビーズ-dCTPAmershamPharmaciaBiotech、Piscataway、NJを使用して[α-32P]dCTPNewEnglandNuclear、Boston、MAで標識した。放射性プローブを、CHROMASPIN商標TE-30カラムClontech、PaloAlto、CAを使用して、取り込まれなかった[α-32P]dCTPから分離し、そして精製されたプローブをノーザンブロットハイブリダイゼーション実験のために使用した。放射性プローブを用いたノーザンブロットのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、製造者が指示するプロトコールに従ってExpressHyb商標ハイブリダイゼーション溶液Clontech、PaloAlto、CAを使用して行った。ブロットの洗浄を、順次、2XSSC/0.05SDSで2回室温で15分/洗浄、そして0.1XSSC/0.1SDSで2回65°Cで30分/洗浄行った。ブロットを空気乾燥して、放射性シグナルを、FujifilmBAS-1500ホスホルイメージャーFuji、Stamford、CTを使用して、可視化して定量化した。RNA負荷量の正規化を、ノーザンブロットを臭化エチジウムで染色することによって行った。5μlの10mg/ml臭化エチジウムSigma、St.Louis、MOを50mlの1XMOPS溶液MESA緩衝液:Sigma、St.Louis、MOに加え、室温で7分かけて間染色した。ブロットを1XMOPS緩衝液で30分間3回洗浄した。臭化エチジウム染色パターンをFujifilmLAS-1000インテリジェントダークボックスFujiMedicalSystems,USA、Stamford、CTで可視化した。ノーザンブロット実験の結果図9Aおよび図9Bに示すにより、5μMのJAK3阻害剤DBHは、変形性関節炎の病理学に関連していることが知られているか、またはその関連が考えられるmRNA、すなわち、ストロメライシンMMP3、コラゲナーゼ1MMP1、シクロオキシゲナーゼIICOX2、NF-κBp65、腫瘍壊死因子-αTNF-α、およびインターロイキン-6IL-6のIL-1β誘導されるアップレギュレーションを様々な程度で阻害することができたことが明らかにされる。DBHの遊離塩基形態が、いくつかのmRNAに対して、DBHのトリフルオロ酢酸塩形態よりも大きな程度でrhIL-1β誘導のmRNAを阻害するという予想外の観測結果は注目される図9A。この観測結果は、実施例7のチロシンキナーゼアッセイで得られたデータと一致している。実施例9:ウシ軟骨細胞におけるIL-1α誘導されるアグリカナーゼ活性のDBHによる阻害JAK3特異的阻害剤としてのDBHの細胞作用を明らかにするために、DBHおよびその変化体の阻害を、IL-1α誘導される35S標識プロテオグリカンのウシ軟骨細胞における放出によって測定した培養された初代ウシ軟骨細胞および軟骨外稙片におけるIL-1α誘導されるプロテオグリカンの放出は、アグリカナーゼとして知られている酵素によってアグリカンが切断されるためであることが十分に明らかにされている。初代ウシ関節軟骨細胞を、30分間37°Cの1mg/mlヒアルロニダーゼBoehringerMannheim、Indianapolis、IN処理を使用し、その後、30分間37°Cの2mg/mlコラゲナーゼPBoehringerMannheim、Indianapolis、INおよび2.5mg/mlトリプシンGIBCO/BRL、Gaithersburg、MDの処理を使用して子ウシ膝関節の切開した関節軟骨から単離した。酵素溶液を、血清を含まない1:1のダルベッコ改変必須培地/ハムF-12DMEM/F12において調製して、0.22μmのMillex登録商標-GVフィルターMilliporeS.A.、Molsheim、フランスでろ過滅菌した。3回目の一晩の消化37°Cで0.5mg/mlのコラゲナーゼPをBellco攪拌フラスコにおいて行った。ウシ軟骨細胞を、酵素を中和するために10ウシ胎児血清FBSを補充した等容量のDMEM/F12を加えることによって回収して、70μmのナイロン製Falcon登録商標細胞ストレイナーBecktonDickinson、FranklinLakes、NJでろ過し、室温において1000Xgで10分間遠心分離した。軟骨細胞を、0.5mlの1:1のDMEM/F12、10FBS、1抗生物質溶液ペニシリン、ストレプトマイシン、フンギゾンGIBCO/BRL、Gaithersburg、MDを使用して、Costar登録商標24ウエル組織培養プレートCorning、Corning、NYに8×104細胞/ウエルで播種して、37°C、8CO2でインキュベーションした。細胞を、DMEM/F1210FBS、1抗生物質溶液を3日毎に再度与えながら28日間培養した。プロテオグリカンの代謝的標識を、22日目に、血清を含まないDMEM/F12、1抗生物質溶液において10μCiの35SulfateAmersham、ArlingtonHeights、ILを用いて48時間行った。遊離の35Sulfateを24日目に除き、軟骨細胞をPBSで洗浄して、DMEM/F1210血清、1抗生物質溶液を再び与えた。軟骨細胞をさらに2日間培養して、DMEM/F1210FBS、1抗生物質溶液を26日目に再び与え、そして27日目にPBSで洗浄した。PBSで洗浄した後、軟骨細胞を、1さらなる補充物なし、または25μMのDBHDBH1、DBH-2S、またはDBH-FBのいずれかとしてのいずれかを含む無血清DMEM/F12、1抗生物質溶液の0.5mlで処理した。2時間後、rhIL-1αを、rhIL-1αなしのコントロールの場合を除き1ng/mlの最終濃度になるまで培養物に加えた。28日目に、0.5mlの培地を取り出し、シンチレーション用ミニバイアルに入れた。4mlのシンチレーション液を加えて、培地中の放射能をシンチレーション計数によって定量した。細胞層をPBSで洗浄して、0.5mlの1Xトリプシン-EDTAで集め、そして上記のようにシンチレーション計数によって定量した。すべてのサンプルは三連で培養された。データは、下記のように測定し、そして表した:1.バックグラウンド割合c=培地中に放出された非IL-1誘導による放射能量を表す総放射能培地細胞層の割合=[IL-1αなし、DBHなしのコントロールの培地中の総CPM/IL-1αなし、DBHなしのコントロールの培地中の総CPMIL-1αなし、DBHなしのコントロールの細胞層における総CPM]2.培地中へのIL-1αによる35S標識プロテオグリカンの放出aバックグラウンド=非IL-1誘導の放出による試験サンプルの培地中のカウント=バックグラウンド割合c[試験サンプル培地中の総CPM試験サンプル細胞層における総CPM]bIL-1αにより放出されたCPM=培地中の総CPM-バックグラウンドcIL-1αによる放出=[IL-1αにより放出されたCPM/IL-1αにより放出されたCPM細胞層における総CPM]1003.DBH存在下でのIL-1αによる放出={DBH培地サンプルにおける総CPM-バックグラウンド/[DBH培地サンプルにおける総CPM-バックグラウンドDBH細胞層サンプルにおける総CPM]}1004.DBHによる阻害=[1-DBH存在下でのIL-1αによる放出/IL-1αによる放出]100合成DBHの3つの形態すなわち、DBH1、DBH-2S、またはDBH-FBはIL-1α誘導による35S標識プロテオグリカンの放出の阻害を様々な程度で示したそれぞれ、約50、約40、および100図10。再度ではあるが、DBHの遊離塩基形態は、阻害剤として、DBHのそれ以外の2つの形態の結果を劇的に上回る結果をもたらした。実施例10:OAに関連したmRNAの化合物WHI-P131によるダウンレギュレーションDBHおよびその関連する化合物が、JAK3に特異的な阻害剤として機能することによって効果的なOA治療薬として機能することを明らかにするために、そして一般にはOA関連化合物の阻害剤として、したがって新規な種類のOA治療薬としてのJAK3阻害剤の有効性を確認するために、よく知られているJAK3特異的阻害剤である4-4’-ヒドロキシフェニル-アミノ-6,7-ジメトキシキナゾリンこれはまたこの分野ではWHI-P131として呼ばれれているによる様々なOA関連mRNAの阻害を評価した。正常なヒト関節軟骨細胞を、実施例1に記載されるように軟骨の薄片から単離して培養した。mRNA阻害実験を、JAK3特異的阻害剤のWHI-P1314-4’-ヒドロキシフェニル-アミノ-6,7-ジメトキシキナゾリンA.G.Scientific、SanDiego、CAから購入をDBHの代わりに使用したことを除いて実施例8に記載されるプロトコールと同じように行った。DMSOに溶解したWHI-P131の2つの濃度33.6μMおよび168μMを調べた。ノーザンブロット実験の結果図11に示すにより、JAK3特異的阻害剤であるWHI-P131の33.6μMおよび168μMの処理はともに、変形性関節炎の病理学に関連することが知られているか、またはそのような関連が考えられるmRNA、すなわち、ストロメライシン-1MMP3、コラゲナーゼMMP1、シクロオキシゲナーゼIICOX2およびNF-κBp65のIL-1β誘導によるアップレギュレーションを阻害することが明らかにされる。本発明では、分子生物学の分野で十分に知られている様々な技術がそのまま参考により組み込まれる。このような技術には、下記の刊行物に記載される様々な技術これらに限定されないが含まれる:Old,R.W.S.B.Primrose、PrinciplesofGeneManipulation:AnIntroductionToGeneticEngineering第3版、1985年、BlackwellScientificPublications、Boston。StudiesinMicrobiology;第2巻:409頁ISBN0-632-01318-4。Sambrook,J.他編、MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版、1989年、ColdSpringHarborLaboratoryPress、NY、第1巻~第3巻ISBN0-87969-309-6。Winnacker,E.L.、FromGenesToClones:IntroductionToGeneTechnology1987年、VCHPublishers、NYHorstIbelgauftsにより翻訳、634頁ISBN0-89573-614-4。参考文献本明細書中において言及された刊行物は,それぞれ参考により組み込まれる。"