"活性な3‐HP発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、外来性PPC遺伝子;外来性PYC遺伝子;外来性AAT遺伝子;外来性ADC遺伝子;外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び外来性3‐HPDH遺伝子、から選択される1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を含む、細胞。外来性PYC遺伝子を含む、請求項1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記PYC遺伝子が、配列番号2、3、4、5、6、7、8から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項2に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記PYC遺伝子が、配列番号1のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項2又は3に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。外来性AAT遺伝子を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記AAT遺伝子が、配列番号14、15、及び16から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項5に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記AAT遺伝子が、配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項5又は6に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。外来性ADC遺伝子を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記ADC遺伝子が、配列番号17、18、133、135、137、及び139から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記ADC遺伝子が、配列番号130、131、132、134、136、及び138から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項8又は9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。外来性BAAT遺伝子又は外来性gabT遺伝子を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号20、21、22、23、及び24から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項11に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19、140、141、及び142から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項11又は12に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記BAAT遺伝子又はgabTが、gabT遺伝子でもあるBAAT遺伝子である、請求項11~13のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。外来性3‐HPDH遺伝子を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26、27、28、29、30、31、32、33、34、及び129から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項15に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25、143、144、及び343から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項15又は16に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。3‐HPDH遺伝子が、HIBADH遺伝子でもある、請求項15~17のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。3‐HPDH遺伝子が、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、請求項15~18のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。外来性PPC遺伝子を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記PPC遺伝子が、配列番号10、11、及び12から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項20に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記PPC遺伝子が、配列番号9のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項20又は21に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、請求項1~22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、請求項1~22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記酵母細胞が、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、請求項24に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記酵母細胞が、I.オリエンタリス、C.ランビカ、及びS.ブルデリから選択される、請求項24に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD、及びPCK遺伝子から選択される天然遺伝子の1若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、請求項1~26のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記1若しくは複数の欠失又は破壊が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子の挿入に起因する、請求項27に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子が、1若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、請求項1~28のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、75g/L以上の3‐HPを含む培地中、4未満のpHで増殖できる、請求項1~29のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、3‐HP耐性酵母細胞である、請求項1~30のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、突然変異及び/又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い3‐HP耐性を有するように、突然変異及び/又は選択を受ける、請求項1~31のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び/又は選択を受ける、請求項32に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記細胞が、乳酸又は3‐HPの存在下で選択を受ける、請求項32又は33に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。前記選択が、ケモスタット選択である、請求項34に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。以下:i少なくとも1種類の炭素源を含む培地の存在下、請求項1~35のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し;そしてii培養物から3‐HPを単離すること、を含む3‐HPの生産方法。前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選択される、請求項36に記載の方法。前記培地が、5未満のpH、例えば、約1.5~約4.5、約2.0~約4.0、又は約2.0~約3.5の範囲内である、請求項36又は37に記載の方法。詳細な説明以下の本発明の説明は、本発明の様々な実施形態を例示することを意図したにすぎない。そのため、議論した具体的な改変は、本発明の範囲に対する制限と解釈されるものではない。様々な同等物、変更、及び改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであろうから、係る同等の実施形態が、本明細書中に含まれるべきことも理解されている。本明細書中に引用されたすべての引用文献は、参照によりその全体を本明細書中に援用する。略語3‐HP、3‐ヒドロキシプロピオン酸;3‐HPA、3‐ヒドロキシプロピオンアルデヒド;3‐HPDH、3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ;AAM、アラニン2,3アミノムターゼ;AAT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;ACC、アセチル‐CoAカルボキシラーゼ;ADC、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼ;AKG、α‐ケトグルタル酸;ALD、アルデヒドデヒドロゲナーゼ;BAAT、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ;BCKA、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ;bp、塩基対;CYB2、L‐‐乳酸シトクロムcオキシドレダクターゼ;CYC、イソ‐2‐シトクロムc;EMS、エタンスルホン酸メチル;ENO、エノラーゼ;gabT、4‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ;GAPDH、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ3;GPD、グリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼ;GPP、グリセロール3‐リン酸ホスファターゼ;HIBADH、3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ;IPDA、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ;KGD、α‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ;LDH、乳酸デヒドロゲナーゼ;MAE、リンゴ酸酵素;OAA、オキサロ酢酸;PCK、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ;PDC、ピルビン酸デカルボキシラーゼ;PDH、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ;PEP、ホスホエノールピルビン酸;PGK、ホスホグリセリン酸キナーゼ;PPC、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ;PYC、ピルビン酸カルボキシラーゼ;RKI、リボース5‐リン酸ケトールイソメラーゼ;TAL、トランスアルドラーゼ;TEF1、翻訳延長因子‐1;TEF2、翻訳延長因子‐2;TKL、トランスケトラーゼ;XDH、キシリトールデヒドロゲナーゼ;XR、キシロースレダクターゼ;YP、酵母抽出物/ペプトン。説明3‐HP生産用の遺伝子組み換え酵母細胞、これらを酵母細胞の作製方法、及び3‐HPを生産するためのこれらの細胞の使用方法を、本明細書中に規定する。本明細書中で使用される3‐HPとしては、塩及び酸形態の3‐ヒドロキシプロピオン酸が挙げられる。多くの3‐HP発酵経路が当該技術分野で知られている例えば、米国特許第6,852,517号;同第7,309,597号;米国特許出願公開第2001/0021978号;同第2008/0199926号;WO02/42418;及びWO10/031083を参照のこと、これらの文献を参照により本明細書中に援用する。ホスホエノールピルビン酸PEP、ピルバート、オキサロ酢酸OAA、アスパラタート、β‐アラニン、マロン酸セミアルデヒド、リンゴ酸、マロニル‐CoA、アセチル‐CoA、アラニン、ラクタート、ラクチル‐CoA、アクリロイル‐CoA、グリセロール、3‐ヒドロキシプロピオンアルデヒド3‐HPA、β‐アラニル‐CoA、3‐HP‐CoA、及びグリセラートを含めた一連の中間体を経て、3‐HP発酵経路は作動する。いくつかの公知の3‐HP発酵経路に関する総説を、図1に説明する。本明細書中に開示されるように、多様な種からの酵母細胞の一群を、3‐HP耐性について試験した。3‐HP耐性を示した細胞を、異なった濃度の3‐HPを含む培地中でそれらの増殖速度及びグルコース消費量に基づいてさらに評価した。これらの実験に基づいて、3‐HP生産のための1群の理想的な宿主細胞を特定した。次に、これらの宿主細胞を、活性な3‐HP発酵経路を含むように遺伝子組み換えし、そして、低pH条件下で3‐HPを産生する遺伝子組み換え酵母細胞を得た。PEP、ピルバート、及び/又はグリセロールから3‐HPへの少なくとも1種類の活性な3‐HP発酵経路を持つ遺伝子組み換え酵母細胞を、特定の実施形態で本明細書中に規定する。本明細書中で使用される活性な3‐HP発酵経路を持つ酵母細胞は、3‐HP発酵経路の各反応を触媒するのに必要とされる活性な酵素を産生するので、そのため、少なくとも1種類の発酵性糖の存在する発酵条件下で培養されると、計測可能な収量で3‐HPを産生することができる。活性な3‐HP発酵経路を持つ酵母細胞は、1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子を含んでいる。本明細書中で使用される3‐HP経路遺伝子は、3‐HP発酵経路に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列のコード領域を指す。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、PEP若しくはピルバートからOAA、アスパラタート、β‐アラニン、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体を経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、米国特許出願公開第2010/0021978号、図1を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、ピルビン酸カルボキシラーゼPYC、PEPカルボキシラーゼPPC、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAAT、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼgabT、3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH、3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼHIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。3‐HP発酵経路遺伝子はさらに、好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたPEPカルボキシキナーゼPCK遺伝子を含んでいてもよい一般に、天然のPCK遺伝子は、好ましくはOAAからPEPへの逆の反応を触媒するポリペプチドを産生する。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、PEP若しくはピルバートから、OAA、そしてリンゴ酸中間体を経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、米国特許出願公開第2010/0021978号、図4を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、PPC、PYC、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。3‐HP発酵経路遺伝子はまた、好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたPCK遺伝子を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、PEP若しくはピルバートから、OAA、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体を経て活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、米国特許出願公開第2010/0021978号、図1を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、PPC、PYC、2‐ケト酸デカルボキシラーゼ、α‐ケトグルタル酸AKGデカルボキシラーゼKGD、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼBCKA、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼIPDA、3‐HPDH、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。3‐HP発酵経路遺伝子はまた、好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたPCK遺伝子を含んでもよい。さらに、3‐HP発酵経路遺伝子は、OAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように改変されたPDC遺伝子及び/又はベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、PEP若しくはピルバートから、OAA、マロニル‐CoA、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体該マロン酸セミアルデヒド中間体は任意であるを経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、米国特許出願公開第2010/0021978号、図2を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、PPC、PYC、OAAギ酸リアーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDH、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。3‐HP発酵経路遺伝子はまた、好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたPCK遺伝子を含んでもよい。さらに、3‐HP発酵経路遺伝子は、OAAからマロニルCoAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように2‐ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を改変することによって得られるOAAデヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、アセチル‐CoA、マロニル‐CoA、及びマロン酸セミアルデヒド中間体マロン酸セミアルデヒド中間体は任意であるを経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、WO02/042418、図44を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼPDH、アセチル‐CoAカルボキシラーゼACC、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDH、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、アラニン、β‐アラニン、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、3‐HP‐CoA、そしてマロン酸セミアルデヒド中間体β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、3‐HP‐CoA、及びマロン酸セミアルデヒド中間体は任意であるを経る活性な3‐HP発酵経路を持つβ‐アラニンは、マロン酸セミアルデヒド中間体を経て、又はβ‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、そして3‐HP‐CoA中間体を経て3‐HPに転換される例えば、米国特許第7,309,597号、図1を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン2,3アミノムターゼ、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、BAAT、3‐HPDH、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、ピルバートから、ラクタート、ラクチル‐CoA、アクリロイル‐CoA、そして3‐HP‐CoA中間体を経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、WO02/042418、図1を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、LDH、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、ラクチル‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、及び3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、グリセロールから3‐HPA中間体を経る活性な3‐HP発酵経路を持つ例えば、米国特許第6,852,517号を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、グリセロールデヒドラターゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、PEP若しくはピルバートから、OAA、アスパラタート、β‐アラニン、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、3‐HP‐CoA、そしてアラニン中間体OAA、アスパラタート、及びアラニン中間体は任意であるを経る活性な3‐HP発酵経路を持つPEP又はピルバートは、OAAとアスパラタートを経て、又はアラニンを経てβ‐アラニンへと転換されるWO02/042418、図54、米国特許第7,309,597号、図1を参照のこと。これらの実施形態において、酵母細胞は、PPC、PYC、AAT、ADC、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びAAM遺伝子のうちの1若しくは複数を含む一連の3‐HP発酵経路遺伝子を含む。3‐HP発酵経路遺伝子はまた、好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するポリペプチドを産生するように改変されたPCK遺伝子を含んでもよい。本明細書中に規定する酵母細胞における3‐HP発酵経路遺伝子は、内在性であっても、外来性であってもよい。例えば、遺伝子、プロモーター、及びターミネータ配列など遺伝子成分に関して本明細書中で使用される内在性とは、その遺伝子成分が天然型の特定の酵母細胞のゲノム内の特定の位置に存在していることを意味する。遺伝子成分に関して本明細書中で使用される外来性とは、その遺伝子成分が天然型の特定の酵母細胞のゲノム内の特定の位置に存在していないことを意味する。酵母細胞に関して本明細書中で使用される天然とは、特定の酵母種の野生型酵母細胞を指す。代謝経路に関して本明細書中で使用される天然とは、天然酵母細胞内に存在し、且つ、活性な代謝経路を指す。外来性遺伝子成分には、天然又は非天然のいずれかの配列があり得る。天然配列を持つ外来性遺伝子成分は、機能に影響しない個人ごとの突然変異は別として天然の細胞のゲノム内に存在している遺伝子成分と同一の配列を含むすなわち、外来性遺伝子成分は内在性遺伝子成分と同一である。しかしながら、外来性成分は、内在性成分に比べて宿主細胞ゲノム内の別の場所に存在している。例えば、内在性PYC遺伝子と同一の外来性PYC遺伝子は、酵母細胞内に挿入されるが、非天然増加した数のPYC遺伝子コピーを持つ改変細胞をもたらす。非天然配列を持つ外来性遺伝子成分は、天然細胞のゲノム内には見られない配列を含む。例えば、特定の種からの外来性PYC遺伝子が、別の種の酵母細胞内に挿入されてもよい。外来遺伝子は、好ましくは機能的な様式で宿主細胞ゲノム内に組み込まれるが、それは、宿主細胞内で活性タンパク質を産生することができることを意味している。しかしながら、特定の実施形態において、外来遺伝子は、宿主細胞質内で安定して維持されるベクターの一部として細胞内に導入され得る。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、1若しくは複数の外来性3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定の実施形態において、本明細書中に開示された遺伝子組み換え酵母細胞は、1種類の外来遺伝子を含む。他の実施形態において、酵母細胞は、複数の外来遺伝子を含む。これらの実施形態において、酵母細胞は、1種類の外来遺伝子の複数のコピー、及び/又は別々の外来遺伝子の2コピー以上を含んでもよい。複数の外来遺伝子を含む酵母細胞は、いろいろな外来遺伝子を含んでもよい。例えば、これらの酵母細胞は、1~20個の外来遺伝子を含んでもよい、そして、特定の好ましい実施形態において、それらは1~7個の外来遺伝子を含んでもよい。外来遺伝子の複数のコピーは、それらが互いに隣接するように、1つの遺伝子座に組み込まれてもよい。あるいは、それらは宿主細胞のゲノム内の数個の遺伝子座に組み込まれてもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、1若しくは複数の内在性3‐HP発酵経路遺伝子を含む。特定のこれらの実施形態において、細胞は、これらの内在性遺伝子のうちの1若しくは複数を過剰発現するように操作されてもよく、そしてそれは、改変細胞が少なくともいくつかの条件下で天然の細胞より高いレベルで内在性遺伝子を発現することを意味している。特定のこれらの実施形態において、過剰発現される内在性遺伝子は、1若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結され得る。例えば、1若しくは複数の天然又は非天然の外来性強力プロモーターが、それらが1若しくは複数の内在性3‐HP経路遺伝子に作動可能なように連結されるように細胞内に導入されてもよい。本明細書中に規定する改変酵母細胞における3‐HP発酵経路遺伝子は、例えば、プロモーター又はターミネータなどの1若しくは複数の調節要素に作動可能なように連結されてもよい。本明細書中に使用されるプロモーターという用語は、その遺伝子の転写の開始を制御する、ある遺伝子一般に、約1~1000塩基対bpの範囲内、好ましくは約1~500bpの範囲内の翻訳開始コドンの上流すなわち、5’に位置する非翻訳配列を指す。本明細書中で使用されるターミネータという用語は、その遺伝子の転写の終わりを制御する、ある遺伝子一般に、約1~1000bpの範囲内、好ましくは約1~500bpの範囲内、特に約1~100bpの範囲内の翻訳終止コドンの下流すなわち、3’に位置した非翻訳配列を指す。プロモーター又はターミネータは、その遺伝子の関連するゲノム内のその位置が、場合によって、そのプロモーター又はターミネータの転写調節機能を果たすような位置であれば、ある遺伝子に作動可能なように連結されている。好適なプロモーター及びターミネータは、例えば、WO99/14335、WO00/71738、WO02/42471、WO03/102201、WO03/102152、及びWO03/049525に記載されているそれらの全体を参照により本明細書中に援用する。本明細書中に規定する細胞の3‐HP発酵経路遺伝子に連結された調節要素は、内在性であっても、外来性であってもよい。例えば、外来性3‐HP発酵経路遺伝子は、それが内在性プロモーター及び/又はターミネータの転写調節下にあるように、酵母細胞内に挿入されてもよい。あるいは、外来性3‐HP発酵経路遺伝子は、1若しくは複数の外来性調節要素に連結されてもよい。例えば、外来遺伝子は、1若しくは複数の外来性調節要素を含む遺伝子発現構築物の一部として細胞内に導入されてもよい。特定の実施形態において、外来性調節要素又は少なくとも外来性調節要素の機能部分が、天然配列を含んでもよい。他の実施形態において、外来性調節要素は、非天然配列を含んでもよい。これらの実施形態において、外来性調節要素は、天然調節要素に対して比較的高度な配列同一性を有する配列を含んでもよい。例えば、外来遺伝子は、天然プロモーター又はターミネータに対して少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、又は少なくとも90の配列同一性を有する外来プロモーター又はターミネータに連結されてもよい。ヌクレオチド又はアミノ酸配列の配列同一性のパーセンテージは、例えば、既定のパラメーターを用いたBLASTNationalCenterforBiologicalInformationBasicLocalAlignmentSearchToolバージョン2.2.1ソフトウェアを使用などの当該技術分野で公知の方法によって計算できる。例えば、既定のパラメーターを用いたBLASTバージョン2.2.1アルゴリズムを使用して、少なくとも90の同一性スコアを持つ配列は、少なくとも90の配列同一性を有すると考えられる。BLASTソフトウェアは、NCBIBethesdaMarylandから入手可能である。特定の態様において、本明細書中に規定する細胞の3‐HP発酵経路遺伝子に連結された調節要素例えば、プロモーターは、経路遺伝子にとって外来のものであってもよい。経路遺伝子にとって外来のものである調節要素は、その天然の形態では該遺伝子に連結されていない調節要素である。経路遺伝子と酵母細胞とのその関係によって、当業者は、経路遺伝子にとって外来のものである調節要素が内在性であっても、外来性であってもよいことを理解できる。場合によっては、内在性3‐HP発酵経路遺伝子は、経路遺伝子にとって外来のものである調節要素例えば、プロモーターに作動可能なように連結される。他の例では、外来性3‐HP発酵経路遺伝子は、経路遺伝子にとって外来のものである外来性調節要素例えば、プロモーターに作動可能なように連結される。複数の外来遺伝子が宿主細胞内に挿入されているそれらの実施形態において、各外来遺伝子は、異なった調節要素の制御下にあっても、又は2個以上の外来遺伝子が同じ調節要素の制御下にあってもよい。例えば、第1の外来遺伝子が第1の調節要素に連結される場合、第2の外来遺伝子は、第1の調節要素に連結されていても、又はそれが第2の調節要素に連結されていてもよい。第1及び第2の調節要素は、同一であっても、高度な配列同一性を共有していても、又はそれらは完全に無関係であってもよい。本明細書中に規定する酵母細胞の1若しくは複数の3‐HP発酵経路遺伝子に連結され得るプロモーターの例としては、これだけに限定されるものではないが、PDC1、ホスホグリセリン酸キナーゼPGK、キシロースレダクターゼXR、キシリトールデヒドロゲナーゼXDH、L‐‐乳酸シトクロムcオキシドレダクターゼCYB2、翻訳延長因子‐1TEF1、翻訳延長因子‐2TEF2、エノラーゼENO1、グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼGAPDH、及びオロチジン5’‐リン酸デカルボキシラーゼURA3遺伝子のプロモーターが挙げられる。これらの例において、3‐HP発酵経路遺伝子は、PDC1、PGK、XR、XDH、CYB2、TEF1、TEF2、ENO1、GAPDH、又はURA3遺伝子の内在性又は外来性プロモーターに連結され得る。プロモーターが外来性である場合、それらは、PDC1、PGK、XR、XDH、CYB2、TEF1、TEF2、ENO1、GAPDH、又はURA3遺伝子の天然プロモーターと同一であるか、又は高い配列同一性すなわち、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、又は少なくとも約99を共有し得る。本明細書中に規定する酵母細胞の1若しくは複数の3‐HP発酵経路遺伝子に連結され得るターミネータの例としては、これだけに限定されるものではないが、PDC1、XR、XDH、トランスアルドラーゼTAL、トランスケトラーゼTKL、リボース5‐リン酸ケトールイソメラーゼRKI、CYB2、若しくはイソ‐2‐シトクロムcCYC遺伝子又はガラクトースファミリーの遺伝子のターミネータ特にGAL10ターミネータが挙げられる。これらの例において、3‐HP発酵経路遺伝子は、PDC1、XR、XDH、TAL、TKL、RKI、CYB2、若しくはCYC遺伝子又はガラクトースファミリー遺伝子の内在性又は外来性ターミネータに連結され得る。ターミネータが外来性である場合、それらは、PDC1、XR、XDH、TAL、TKL、RKI、CYB2、CYC遺伝子又はガラクトースファミリー遺伝子の天然ターミネータと同一であるか、又は高い配列同一性すなわち、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、又は少なくとも約99を共有し得る。特定の実施形態において、3‐HP発酵経路遺伝子は、宿主細胞にとって固有の天然GAL10遺伝子の機能部分を含むターミネータ、又は天然GAL10ターミネータと少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、又は少なくとも95の配列同一性を共有する配列に連結される。外来遺伝子は、当該技術分野で公知ないずれかの方法によって酵母宿主細胞内に挿入され得る。好ましい実施形態において、遺伝子は、宿主細胞ゲノム内に組み込まれる。外来遺伝子は、標的化又はランダムな様式でゲノム内に組み込まれ得る。それらの実施形態において、遺伝子が標的化様式で組み込まれた場合、それは、特定の遺伝子の遺伝子座に組み込まれることができ、外来遺伝子の組み込みは天然遺伝子の欠失又は破壊と対にされる。例えば、外来性3‐HP経路遺伝子の導入は、他の発酵産物経路に関与する酵素をコードする1若しくは複数の遺伝子の欠失又は破壊と対にされ得る。あるいは、外来遺伝子は、遺伝子に相当しないゲノムの一部に組み込まれてもよい。標的組み込み及び/又は欠失は、組み込み構築物を利用してもよい。本明細書中で使用される構築物という用語は、宿主細胞を形質転換するのに使用されるDNA配列を指す。構築物は、例えば、環状プラスミド又はベクター、環状プラスミド又はベクターの一部分例えば、制限酵素消化産物など、線状プラスミド又はベクター、あるいは鋳型としてプラスミド又はゲノムDNAを使用した調製したPCR産物である。外来性構築物で酵母細胞を形質転換する方法は、例えば、WO99/14335、WO00/71738、WO02/42471、WO03/102201、WO03/102152、及びWO03/049525に記載されている。組み込み構築物は、挿入部位標的からの2つのクローン標的DNA配列を使用することで組み立てることができる。2つの標的DNA配列は、天然宿主ゲノム内で隣接していても、隣接していなくてもよい。これに関連して、隣接していないとは、天然ゲノム内で互いに直に隣接していないが、その代わりに、欠失されるべき領域によってDNA配列が切り離されていることを意味する。本明細書中で使用される隣接配列は、天然ゲノム内で互い直に隣接している。標的組み込みが標的遺伝子の欠失又は破壊と対にされる場合、組み込み構築物はまた、欠失構築物と呼ばれることもある。欠失構築物において、標的配列の1つには、標的遺伝子の5’からプロモーターまでの領域、プロモータ領域の全部若しくは一部、標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部、又はそのうちのいくつかの組み合わせを含み得る。他の標的配列は、標的遺伝子の3’からターミネータまでの領域、ターミネータ領域の全部若しくは一部、及び/又は標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部を含み得る。標的組み込みが天然遺伝子の欠失又は破壊と対にされない場合、標的配列は、介在配列の挿入が天然遺伝子発現を中断しないように選択される。組み込み又は欠失構築物は、宿主細胞のゲノム内に天然に現れた場合に、2つの標的配列が相互の関連で同方向に向けられるように調製される。組み込み又は欠失構築物が宿主細胞内に外来遺伝子を導入するのに使用される場合、遺伝子発現カセットが、外来遺伝子の発現を可能にするように2つの標的遺伝子配列の間の構築物内にクローン化される。遺伝子発現カセットは、外来遺伝子を含んでいて、さらに外来遺伝子に作動可能なように連結された1若しくは複数の調節配列、例えば、プロモーター又はターミネータなどを含み得る。遺伝子発現カセットを含まない欠失構築物もまた、構築できる。そうした構築物は、外来遺伝子の挿入なしで遺伝子配列を欠失又は破壊するように設計されている。組み込み又は欠失構築物は、2つの標的遺伝子配列の間の構築物内にクローン化された1若しくは複数の選択マーカーカセットを含み得る。選択マーカーカセットは、形質転換体の選択を可能にする少なくとも1種類の選択マーカー遺伝子を含んでいる。選択マーカー遺伝子とは、選択培養培地中での形質転換細胞の生存及び/又は成長に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子なので、そのため、細胞に対して選択圧を加えるのに使用できる。成功した形質転換体は、選択マーカー遺伝子を含んでおり、そしてそれが、うまく形質転換された細胞に選択の基礎を規定する少なくとも1つの特徴を与える。典型的な選択マーカー遺伝子は、a抗生物質又は他の毒素に対する耐性例えば、ブレオマイシン若しくはゼオマイシン例えば、ストレプトアロテイカスヒンダスタヌスStreptoalloteichushindustanusble遺伝子、例えば、G418若しくはカナマイシンなどのアミノグルコシド例えば、トランスポゾンTn903からのカナマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン例えば、E.コリからのアミノグルコシド抗生物質耐性遺伝子耐性を与えるか、b細胞の栄養要求性欠乏例えば、ロイシン例えば、K.マルキシアヌスKmarxianusLEU2遺伝子、ウラシル例えば、K.マルキシアヌス、S.セレビシエ、又はI.オリエンタリスURA3遺伝子、又はトリプトファン例えば、K.マルキシアヌス、S.セレビシエ、又はI.オリエンタリスTRP遺伝子の欠乏を補うか、c単純培地から入手できない重要な栄養素を細胞が合成できるようにするか、あるいはd特定の炭素源で細胞が成長する能力を与える例えば、α‐ガラクトシダーゼメリビアーゼ酵素をコードし、単一炭素源としてのメリビオースにより成長する能力を与えるS.セレビシエからのMEL5遺伝子タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーとしては、URA3遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子、MEL5遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。別の好ましい選択マーカーは、L‐乳酸:フェリシトクロムcオキシドレダクターゼCYB2遺伝子カセットであるが、但し、宿主細胞が天然にそうした遺伝子を欠いているか、又は単数若しくは複数のその天然CYB2遺伝子が最初に欠失又は破壊されるものとする。選択マーカー遺伝子は、宿主細胞内で作動可能である1若しくは複数のプロモーター及び/又はターミネータ配列に作動可能なように連結される。特定の実施形態において、これらのプロモーター及び/又はターミネータ配列は、選択マーカーカセットに含まれている外来性プロモーター及び/又はターミネータ配列である。好適なプロモーター及びターミネータは、本明細書中に記載されているとおりである。組み込み又は欠失構築物は、宿主細胞を形質転換するのに使用される。形質転換は、例えば、エレクトロポレーション及び/又は化学的形質転換例えば、塩化カルシウム、酢酸リチウムベースのもの、などの方法を使用することで達成され得る。選択マーカーの存在又は不存在に基づく選択又はスクリーニングは、成功した形質転換体を特定するために実施されてもよい。成功した形質転換体において、標的部位の遺伝子座における相同組み換え事象は、標的部位配列の破壊又は欠失をもたらす。構築物が欠失又は破壊のために天然遺伝子を標的とする場合、天然標的遺伝子、そのプロモーター、及び/又はそのターミネータの全部若しくは一部がこの組み換え事象中に欠失され得る。発現カセット、選択マーカーカセット、及び組み込み構築物の標的配列の間のその他の遺伝物質が、標的配列に相当する遺伝子座において宿主ゲノム内に挿入される。PCR又はサザン解析による分析を、所望の挿入/欠失がおこなわれたことを確認するために実施できる。いくつかの実施形態において、細胞の形質転換は、単独の構築物又はPCR産物よりむしろ、2個以上の構築物、PCR産物、又はその組み合わせからのDNAを使用することで実施され得る。これらの実施形態において、1つの組み込み断片の3’末端は、別の組み込み断片の5’末端に重なっている。一例において、一方の構築物は、標的配列の遺伝子座からの第1の配列及びマーカー遺伝子カセットの無機能性部分を含むが、もう片方のものは、標的配列の遺伝子座からの第2の配列及びマーカー遺伝子カセットの第2の無機能性部分を含む。マーカー遺伝子カセットの部分は、それらが完全なカセットを形成するように組み合わせられるように選択される。細胞は、これらのピースで同時に形質転換され、そして完全で、機能的なマーカー又は構造的な遺伝子カセットの形成をもたらす。成功した形質転換体は、選択マーカーによって与えられた特徴に基づいて選択される。別の例において、選択マーカーは、1つの断片上に常駐するが、標的配列は別々の断片上に存在しているので、組み込み断片は着目の部位において高確率の組み込みがある。他の実施形態において、3つの直鎖DNAからの形質転換が、外来性遺伝物質を組み込むために使用できる。これらの実施形態において、一方の断片が、5’末端において第2の断片に、そして、3’末端において第3の断片に重なる。組み込み又は欠失構築物は、選択マーカー遺伝子又はその調節要素のいくつか若しくはすべてがその後の相同組み換え事象の結果として自然に欠失されるように設計されてもよい。これを達成する簡便な方法は、選択マーカー遺伝子及び/又は調節要素が反復配列に隣接するように構築物を設計することである。反復配列は、宿主細胞にとって天然又は非天然の、そして構築物上では互いに同方向又は逆方向を向いている同一のDNA配列である。反復配列は、有利なことには、長さ約50~1500bpであり、そして、何かをコードする必要もない。反復配列の包含は、相同組み換え事象の発生を可能にし、そしてそれが、選択マーカー遺伝子及び一方の反復配列の欠失をもたらす。相同組み換えは比較的低い頻度でしか起こらないので、いくつかの細胞で自然発生的な相同組み換えが起こるのを可能にさせるには、非選択的培地における数ラウンドの間、形質転換体を培養することが必要とされることもある。選択マーカー遺伝子が自然に欠失された細胞は、それらの選択マーカー遺伝子によって与えられた選択特徴の喪失に基づいて選択又はスクリーニングできる。ある場合には、リコンビナーゼ酵素の発現が、反復部位の間の組み換えを促進し得る。本明細書中に規定する改変酵母細胞の外来性3‐HP発酵経路遺伝子は、あらゆる好適な起源からの起源遺伝子から得られる。例えば、外来遺伝子は、酵母、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類の起源から得てもよい。本明細書中に使用される、天然の起源遺伝子から得られる外来遺伝子は、1天然遺伝子によってコードされるポリペプチドへの同一である、2天然遺伝子によってコードされるポリペプチドと少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を共有する、及び/又は33‐HP発酵経路の中で天然遺伝子によってコードされるポリペプチドと同じ機能を持つ、ポリペプチドをコードする。例えば、I.オリエンタリスPYC遺伝子から得られるPYC遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するポリペプチド、及び/又はピルバートからOAAへの転換を触媒する能力を持つポリペプチドをコードし得る。天然遺伝子から得られる遺伝子は、天然遺伝子のコード領域と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、天然遺伝子から得られる遺伝子は、起源遺伝子のコード領域と同一のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、I.オリエンタリスPYC遺伝子から得られるPYC遺伝子は、配列番号1のヌクレオチド配列を含んでも、配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。本明細書中に規定する改変酵母細胞の特定の実施形態において、外来性3‐HP発酵経路遺伝子を得た天然起源遺伝子は、3‐HP発酵経路に関与するポリペプチドを産生する。しかしながら、他の実施形態において、天然起源遺伝子は、3‐HP発酵経路にかかわらないか、又は3‐HP発酵経路において逆反応を触媒するポリペプチドをコードし得る。これらの実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、天然起源遺伝子に対する、改変された活性及び/又は基質選択性をもたらす1若しくは複数の標的化又はランダム突然変異を受ける。例えば、天然起源遺伝子は、3‐HP発酵経路において所望の反応方向で高い活性を有し、及び/又は望ましくない方向で低い活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を作り出すようい変異させてもよい。例えば、天然起源遺伝子が、3‐HP発酵経路で順反応と逆反応の両方を触媒することができるポリペプチドをコードする場合、遺伝子は、得られた外来遺伝子が順方向で高い活性を、そして逆方向で低い活性を有するように改変されてもよい。同様に、天然起源遺伝子を、天然ポリペプチドに比べて異なった基質選択性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を産生するように変異させてもよい。例えば、3‐HP経路遺伝子を、天然ポリペプチドが好まない又は全く作用しない基質に作用する能力を有するポリペプチドを産生するように変異させてもよい。これらの実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子によってコードされたポリペプチドは、天然起源遺伝子によってコードされたポリペプチドが完全に触媒できない反応を触媒してもよい。天然起源遺伝子はまた、1若しくは複数の下流の3‐HP経路中間体又は副生物の存在下で、得られた3‐HP経路遺伝子がDNA、RNA、又はタンパク質レベルでフィードバック阻害の低減を示すように変異されてもよい。本明細書中に規定する改変酵母細胞の特定の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、宿主酵母種から得てもよい。例えば、宿主細胞がI.オリエンタリスである場合、外来遺伝子をI.オリエンタリスの遺伝子から得てもよい。これらの実施形態において、外来遺伝子は、宿主細胞内へのその外来遺伝子の取り込みが天然遺伝子配列のコピー数を増やす、及び/又は野生型細胞内の遺伝子の発現を駆動するプロモーターと異なるプロモーター制御下にあるのであれば、その遺伝子の調整又は発現レベルを変更するような、天然遺伝子のコード領域と同一のヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、天然3‐HP経路遺伝子のコード領域と異なるが、それにもかかわらず、天然3‐HP経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと同一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに他の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、1若しくは複数の天然3‐HP経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定のこれらの実施形態において、外来遺伝子は、1若しくは複数の天然遺伝子と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態において、外来性3‐HPの遺伝子は、天然3‐HP経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと50未満の配列同一性しか有していないが、それにもかかわらず、3‐HP発酵経路において天然ポリペプチドと同じ機能すなわち、同じ反応を触媒する能力を持つポリペプチドをコードし得る。天然起源遺伝子は、普通の真核開始コドンATGで開始されるコード配列を提供するために必要であれば、又は他の目的のために突然変異誘発に供されてもよい。他の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、宿主酵母細胞の種と異なった種から得てもよい。特定のこれらの実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、宿主細胞と異なった酵母種から得てもよい。例えば、宿主細胞がI.オリエンタリスである場合、外来遺伝子をS.セレビシエから得てもよい。他の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、真菌、細菌、植物、昆虫、又は哺乳類の起源から得てもよい。例えば、宿主細胞がI.オリエンタリスである場合、E.コリなどの細菌起源から外来遺伝子を得てもよい。外来性3‐HP経路遺伝子を酵母起源以外から得るそれらの実施形態において、外来遺伝子配列は、酵母宿主細胞内での発現のために最適化されたコドンであってもよい。外来性3‐HP経路遺伝子を宿主細胞種以外の種から得るそれらの実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの天然3‐HP経路遺伝子によってコードされたポリペプチドと同一のポリペプチドをコードし得る。特定のこれらの実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、起源生物体からの天然3‐HP経路遺伝子と同一のものであってもよい。他の実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの天然3‐HP経路遺伝子と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を共有し得る。他の実施形態において、外来性3‐HP経路遺伝子は、起源生物体からの天然3‐HP経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を共有するポリペプチドをコードし得る。特定のこれらの実施形態において、外来遺伝子は、起源生物体からの1若しくは複数の天然3‐HP経路遺伝子と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。さらに他の実施形態において、外来性3‐HPの遺伝子は、起源生物体からの天然3‐HP経路遺伝子によってコードされるポリペプチドと50未満の配列同一性しかないが、それにもかかわらず、3‐HP発酵経路において起源生物体からの天然ポリペプチドと同じ機能を持つポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、次の酵素から成る群から選択される酵素をコードする1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子を発現する:ACCアセチル‐CoAからマロニル‐CoAへの転換を触媒する、アラニン2,3アミノムターゼAAM、アラニンからβ‐アラニンへの転換を触媒する、アラニンデヒドロゲナーゼピルバートからアラニンへの転換を触媒する、アルデヒドデヒドロゲナーゼ3‐HPAから3‐HPへの転換を触媒する、KGDOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、AATOAAからアスパラタートへの転換を触媒する、ADCアスパラタートからβ‐アラニンへの転換を触媒する、BCKAOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、BAATβ‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、4‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、gabT、β‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼβ‐アラニル‐CoAからアクリロイル‐CoAへの転換を触媒する、Co‐Aアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼマロニル‐CoAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、CoAシンテターゼβ‐アラニンからβ‐アラニル‐CoAへの転換又はラクタートからラクチル‐CoAへの転換を触媒する、CoAトランスフェラーゼβ‐アラニンからβ‐アラニル‐CoAへの転換及び/又はラクタートからラクチル‐CoAへの転換を触媒する、グリセロールデヒドラターゼグリセロールから3‐HPAへの転換を触媒する、IPDAOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、LDHピルバートからラクタートへの転換を触媒する、ラクチル‐CoAデヒドラターゼラクチル‐CoAからアクリロイル‐CoAへの転換を触媒する、リンゴ酸デカルボキシラーゼリンゴ酸から3‐HPへの転換を触媒する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼOAAからリンゴ酸への転換を触媒する、マロニル‐CoAレダクターゼマロニル‐CoAからマロン酸セミアルデヒド又は3‐HPへの転換を触媒する、OAAギ酸リアーゼピルビン酸‐ギ酸リアーゼやケト酸ギ酸リアーゼとしても知られている、OAAからマロニル‐CoAへの転換を触媒する、OAAデヒドロゲナーゼOAAからマロニルCoAへの転換を触媒する、PPCPEPからOAAへの転換を触媒する、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼピルバートからアラニンへの転換を触媒する、PYCピルバートからOAAへの転換を触媒する、PDHピルバートからアセチル‐CoAへの転換を触媒する、2ケト酸デカルボキシラーゼOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する、3‐HP‐CoAデヒドラターゼアクリロイルCoAヒドラターゼとしても知られている、アクリロイルCoAから3‐HP‐CoAへの転換を触媒する、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換を触媒する、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ3‐HP‐CoAから3‐HPへの転換を触媒する、HIBADHマロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換を触媒する、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ3‐HP‐CoAから3‐HPへの転換を触媒する、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼマロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換を触媒する。これらの酵素活性のそれぞれについて、括弧内の着目の反応は、天然の活性の結果であっても、非天然の活性の結果であってもよい。本明細書中で使用されるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はPYC遺伝子は、ピルバート、CO2、及びATPからOAA、ADP、及びホスファートへの転換を触媒する能力を意味するピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、PYC遺伝子を酵母起源から得てもよい。例えば、PYC遺伝子を、配列番号2に規定するアミノ酸配列をコードするI.オリエンタリスPYC遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、I.オリエンタリス由来PYC遺伝子は、配列番号1に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号1に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、PYC遺伝子を細菌起源から得てもよい。例えば、補充反応にPPC以下を参照のことではなくPYCだけを使用する数種類の細菌種、例えば、R.スフェロイデスなど、又はPYCとPPCの両方を持つ細菌種、例えば、R.エトリなどのうちの1つからPYC遺伝子を得てもよい。R.スフェロイデス及びR.エトリのPYC遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号3及び4に規定する。PYC遺伝子は、配列番号3又は4のアミノ酸配列をコードする遺伝子から得ても、配列番号3又は4のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。あるいは、PYC遺伝子は、活性化に関してアセチル‐CoAに依存性を持っていない酵素をコードするPYC遺伝子、例えば、配列番号5カルボキシトランスフェラーゼサブユニット又は配列番号6ビオチンカルボキシラーゼサブユニットに規定するアミノ酸配列をコードするP.フルオレッセンスPYC遺伝子、配列番号7に規定するアミノ酸配列をコードするC.グルタミクムPYC遺伝子などから、あるいは、配列番号5、6、又は7のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。PYC遺伝子はまた、アスパラタートによって阻害されない酵素をコードするPYC遺伝子、例えば、配列番号8SauerFEMSMicrobiolRev29765に規定するアミノ酸配列をコードするS.メリロティPYC遺伝子から得ても、又は配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はPPC遺伝子は、PEPとCO2からOAAとホスファートへの転換を触媒する能力を意味するPEPカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、PPCの遺伝子を細菌PPCの遺伝子から得てもよい。例えば、PPC遺伝子は、配列番号10に規定するアミノ酸配列をコードするE.コリPPC遺伝子から得ても、又は配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列から得てもよい。特定の実施形態において、E.コリ由来PPC遺伝子は、配列番号9に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号9に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、PPC遺伝子は、アセチルCoAで活性化されない、且つ、アスパラタートでそれほど阻害されない、多くの始原細菌archeaと限られた数の細菌に見られるAタイプPPCから得ることができる。例えば、PPC遺伝子は、配列番号11に規定するアミノ酸配列をコードするM.サーモオートトロフィカムPPCA遺伝子、配列番号12に規定するアミノ酸配列をコードするC.パーフリンゲンスPPCA遺伝子、又は配列番号11又は12のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。特定のこれらの実施形態において、遺伝子は、改良された特徴を有する酵素を作り出すために天然遺伝子に対して1若しくは複数の突然変異を受けてもよかった。例えば、遺伝子は、天然ポリペプチドに対して、アスパラタートフィードバックに対する耐性を高めたPPCポリペプチドをコードするように変異させてもよかった。他の実施形態において、PPC遺伝子を植物起源から得てもよい。本明細書中で使用されるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子又はAAT遺伝子は、OAAからアスパラタートへの転換を触媒する能力を意味するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、EC2.6.1.1に分類される。特定の実施形態において、AAT遺伝子をI.オリエンタリス又はS.セレビシエなどの酵母起源から得てもよい。例えば、AAT遺伝子は、配列番号に14に規定するアミノ酸配列をコードするI.オリエンタリスAAT遺伝子、又は配列番号15に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエAAT2遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号14又は15のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、I.オリエンタリス由来AAT遺伝子は、配列番号13に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号13に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、AAT遺伝子を細菌起源から得てもよい。例えば、AAT遺伝子は、配列番号16に規定するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするE.コリaspC遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。本明細書中で使用されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はADC遺伝子は、アスパラタートからβ‐アラニンへの転換を触媒する能力を意味するアスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、EC4.1.1.11に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からADC遺伝子を得てもよい。活性なアスパラギン酸デカルボキシラーゼが不活性なプロ酵素のタンパク質分解的プロセシングを必要とする可能性があるので、これらの実施形態において、酵母宿主細胞は、細菌ADC遺伝子によってコードされた活性酵素の形成をサポートするように選択されなければならない。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号17が規定されるアミノ酸配列をコードするS.アベルミチリスpanD遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、S.アベルミチリス由来ADC遺伝子は、配列番号130、145、146、又は147のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列、又は配列番号130、145、146、又は147のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ADC遺伝子を、配列番号18に規定するアミノ酸配列をコードするC.アセトブチリカムpanD遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、C.アセトブチリカム由来ADC遺伝子は、配列番号131に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号131に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ADC遺伝子を、配列番号133に規定するアミノ酸配列をコードするH.ピロリADC遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号133のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、H.ピロリ由来ADC遺伝子は、配列番号133に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号133に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ADC遺伝子を、配列番号135に規定するアミノ酸配列をコードするバチルス属BacillusspTS25ADC遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号135のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、バチルス属TS25由来ADC遺伝子は、配列番号134に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号134に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ADC遺伝子を、配列番号137に規定するアミノ酸配列をコードするC.グルタミクムADC遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号137のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、C.グルタミクム由来ADC遺伝子は、配列番号136に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号136に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ADC遺伝子を、配列番号139に規定するアミノ酸配列をコードするB.リチェニフォルミスADC遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、ADC遺伝子は、配列番号139のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、B.リチェニフォルミス由来ADC遺伝子は、配列番号138、148、149、150、又は151のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列、又は配列番号138、148、149、150、又は151のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。本明細書中で使用されるβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子又はBAAT遺伝子は、β‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。β‐アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、EC2.6.1.19に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からBAAT遺伝子を得てもよい。例えば、BAAT遺伝子は、配列番号20に規定するアミノ酸配列をコードするpyd4遺伝子のI.オリエンタリス相同体から得られてもよい。いくつかの実施形態において、BAAT遺伝子は、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、I.オリエンタリス由来BAAT遺伝子は、配列番号19に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号19に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、BAAT遺伝子は、配列番号21に規定するアミノ酸配列をコードするS.クルイベリpyd4遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、BAAT遺伝子は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、S.クルイベリ由来BAAT遺伝子は、配列番号142に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号142に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、細菌起源からBAAT遺伝子を得てもよい。例えば、BAAT遺伝子を、配列番号22に規定するアミノ酸配列をコードするS.アベルミチリスBAAT遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、BAAT遺伝子は、配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、S.アベルミチリス由来BAAT遺伝子は、配列番号140に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号140に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。BAAT遺伝子はまた、それが4‐アミノブチラート並びにβ‐アラニンに対して天然活性を有することを意味する4‐アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ又はgabT遺伝子であってもよい。あるいは、BAAT遺伝子は、BAAT活性を有するポリペプチドをコードするための、細菌又は酵母起源からの天然gabT遺伝子のランダム又は部位指定操作によって得られてもよい。例えば、BAAT遺伝子を、配列番号23に規定するアミノ酸配列をコードするS.アベルミチリスgabTから得てもよい。いくつかの実施形態において、S.アベルミチリス由来BAAT遺伝子は、配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。他の実施形態において、BAAT遺伝子を、配列番号24に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエgabT遺伝子UGA1から得てもよい。いくつかの実施形態において、S.セレビシエ由来BAAT遺伝子は、配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、S.セレビシエ由来BAAT遺伝子は、配列番号141に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号141に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。本明細書中で使用される3‐HPデヒドロゲナーゼ遺伝子又は3‐HPDH遺伝子は、マロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換を触媒する能力を意味する3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、それらがNADH補因子を利用するなら、EC1.1.1.59に分類され、そして、それらがNADPH補因子を利用するなら、EC1.1.1.298に分類される。あるいは、EC1.1.1.298に分類される酵素は、マロン酸セミアルデヒドレダクターゼとも呼ばれる。特定の実施形態において、酵母起源から3‐HPDH遺伝子を得てもよい。例えば、3‐HPDH遺伝子は、配列番号26に規定するアミノ酸配列をコードするYMR226C遺伝子のI.オリエンタリス相同体から得られてもよい。いくつかの実施形態において、3‐HPDH遺伝子は、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、I.オリエンタリス由来3‐HPDH遺伝子は、配列番号25に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号25に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、3‐HPDH遺伝子は、配列番号129に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエYMR226C遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、3‐HPDH遺伝子は、配列番号129のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、S.セレビシエ由来3‐HPDH遺伝子は、配列番号144に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号144に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、細菌起源から3‐HPDH遺伝子を得てもよい。例えば、3‐HPDH遺伝子は、配列番号27のアミノ酸配列をコードするE.コリydfG遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子は、配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、E.コリ由来3‐HPDH遺伝子は、配列番号143に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号143に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、3‐HPDH遺伝子は、配列番号29に規定するアミノ酸配列をコードするM.セデュラマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子から得てもよい。いくつかの実施形態において、3‐HPDH遺伝子は、配列番号29に規定するアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態において、M.セデュラ由来3‐HPDH遺伝子は、配列番号343に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号343に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。本明細書中で使用される3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はHIBADH遺伝子は、3‐ヒドロキシイソ酪酸からメチルマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、EC1.1.1.31に分類される。一部の3‐ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼにはさらに、3‐HPDH活性もある。特定の実施形態において、細菌起源からHIBADH遺伝子を得てもよい。例えば、HIBADH遺伝子は、配列番号28に規定するアミノ酸配列をコードするA.フェカリスM3A遺伝子、それぞれ配列番号30又は配列番号31に規定するアミノ酸配列をコードする、P.プチダKT2440又はE23440mmsB遺伝子、あるいは、配列番号32に規定するアミノ酸配列をコードするP.エルギノーサPAO1mmsB遺伝子から得てもよい。特定の実施形態において、HIBADH遺伝子は、配列番号28、30、31、又は32に規定するアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。本明細書中で使用される4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、4‐ヒドロキシブタノアートからコハク酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味する4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、EC1.1.1.61に分類される。一部の4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼにはさらに、3‐HPDH活性もある。特定の実施形態において、細菌起源から4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号33に規定するアミノ酸配列をコードするR.ユートロファH164hbd遺伝子、又は配列番号34に規定するアミノ酸配列をコードするC.クルイベリDSM555hbd遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、遺伝子は、配列番号33又は34に規定するアミノ酸配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。本明細書中で使用されるPEPカルボキシキナーゼ遺伝子又はPCK遺伝子は、PEP、CO2、及びADP又はGDPからOAA及びATP又はGTPへの転換、あるいはその逆を触媒する能力を意味するPEPカルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。PEPカルボキシキナーゼ活性を有する酵素は、EC4.1.1.32GTP/GDP資化性及びEC4.1.1.49ATP/ADP資化性に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からPCK遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からPCK遺伝子を得てもよく、そして、特定のこれらの実施形態において、遺伝子は、PCK反応が脱炭酸が優位である反応のより一般的な形態よりむしろOAAの産生を支持する細菌から得てもよい。例えば、PCK遺伝子は、配列番号35に規定するアミノ酸配列をコードするM.スクシニシプロデュセンスMsucciniciproducensPCK遺伝子、配列番号36に規定するアミノ酸配列をコードするA.スクシニシプロデュセンスPCK遺伝子、配列番号37に規定するアミノ酸配列をコードするA.スクシノゲネスPCK遺伝子、又は配列番号38に規定するアミノ酸配列をコードするR.ユートロファPCK遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、PCK遺伝子は、得られた遺伝子がPEPからOAAへの転換を好ましくは触媒するポリペプチドをコードするように、PCK遺伝子をそこから得る天然遺伝子に対して1若しくは複数の突然変異が加えられた。例えば、PCK遺伝子は、遺伝子が好ましくはPEPからOAAへの転換を触媒するように変異させた場合に、配列番号39に規定するアミノ酸配列をコードするE.コリK12株PCK遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、PEPからOAAへの転換は、ATP/ADPやGTP/GDPよりむしろ無機リン酸塩や二リン酸とを使用するプロピオン酸菌例えば、P.シャーマニイPshermanii、A.ウーディイAwoodiiに見られるPEPカルボキシトランスホスホリラーゼによって触媒される。本明細書中で使用されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、OAAからリンゴ酸への転換を触媒する能力を意味するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、細菌又は酵母起源からリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。本明細書中で使用されるリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、マレアートから3‐HPへの転換を触媒する能力を意味するリンゴ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。リンゴ酸デカルボキシラーゼ活性は、天然に起こらないことが知られている。そのため、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする天然起源遺伝子に1若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、2‐ヒドロキシ‐2‐メチル‐3‐オキソブタノアートから2‐アセトインへの転換を触媒するので、EC4.1.1.5に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号40に規定するアミノ酸配列をコードするL.ラクチスLlactisaldB遺伝子、配列番号41に規定するアミノ酸配列をコードするS.サーモフィルスSthermophilusaldB遺伝子、配列番号42に規定するアミノ酸配列をコードするB.ブレビスBbrevisaldB遺伝子、又は配列番号43に規定するアミノ酸配列をコードするE.アエロゲネスEaerogenesbudA遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるα‐ケトグルタル酸AKGデカルボキシラーゼ遺伝子又はKGD遺伝子は、α‐ケトグルタラート2‐オキソグルタラートからコハク酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するα‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。AKGデカルボキシラーゼ活性がある酵素は、EC4.1.1.71に分類される。KGD遺伝子は、OAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然KGD遺伝子に見られるか、又は天然KGD遺伝子に1若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得られる。特定の実施形態において、細菌起源からKGD遺伝子を得てもよい。例えば、KGD遺伝子は、配列番号44に規定するアミノ酸配列をコードするM.ツベルクロシスMtuberculosisKGD遺伝子、配列番号45に規定するアミノ酸配列をコードするB.ジャポニクムBjaponicumKGD遺伝子、又は配列番号46に規定するアミノ酸配列をコードするM.ロティMloti別名、リゾビウムロティRhizobiumlotiKGD遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用される分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はBCKA遺伝子は、分岐鎖α‐ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれは、3~6個の炭素の長さのα‐ケト酸の範囲を脱炭酸する役割を果たすことができる。BCKA活性を有する酵素は、EC4.1.1.72に分類される。BCKA遺伝子は、OAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然BCKA遺伝子に見られるか、又はそれは、天然BCKA遺伝子に1若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。特定の実施形態において、細菌起源からBCKA遺伝子を得てもよい。例えば、BCKA遺伝子は、配列番号47に規定するアミノ酸配列をコードするL.ラクチスkdcA遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるインドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はIPDA遺伝子は、インドールピルバートからインドールアセトアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するインドールピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。IPDA活性を有する酵素は、EC4.1.1.74に分類される。IPDA遺伝子は、OAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得るために使用され得る。この活性は、天然IPDA遺伝子に見られるか、又はそれは、天然IPDA遺伝子に1若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得ることができる。特定の実施形態において、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、酵母、細菌、又は植物起源から得てもよい。本明細書中で使用されるピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はPDC遺伝子は、ピルバートからアセトアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するピルバートデカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。PDC活性を有する酵素は、EC4.1.1.1に分類される。好ましい実施形態において、本明細書中に規定されているように改変酵母細胞に組み入れられるPDC遺伝子は、得られた遺伝子がOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、そこからPDC遺伝子を得た天然遺伝子に対して1若しくは複数の突然変異が加えられた。特定の実施形態において、酵母起源からPDC遺伝子を得てもよい。例えば、PDC遺伝子は、配列番号49に規定するアミノ酸配列をコードするI.オリエンタリスPDC遺伝子、配列番号50に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエPDC1遺伝子、又は配列番号51に規定するアミノ酸配列をコードするK.ラクチスPDCから得てもよい。特定の実施形態において、I.オリエンタリスPDC遺伝子から得られるPDC遺伝子は、配列番号48に規定するヌクレオチド配列、又は配列番号48に規定するヌクレオチド配列と少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも97、又は少なくとも99の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、細菌起源からPDC遺伝子を得てもよい。例えば、PDC遺伝子は、配列番号52に規定するアミノ酸配列をコードするZ.モビリスZmobilisPDC遺伝子、又は配列番号53に規定するアミノ酸配列をコードするA.パスツリアヌスApasteurianusPDC遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ベンゾイルホルマートからベンズアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、EC4.1.1.7に分類される。好ましい実施形態において、本明細書中に規定されているように改変酵母細胞に組み入れられるベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、得られた遺伝子がOAAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、そこからベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得た天然遺伝子に対して1若しくは複数の突然変異が加えられた。特定の実施形態において、細菌起源からベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号54に規定するアミノ酸配列をコードするP.プチダmdlC遺伝子、配列番号55に規定するアミノ酸配列をコードするP.エルギノーサmdlC遺伝子、配列番号56に規定するアミノ酸配列をコードするP.スツットゼリPstutzeridpgB遺伝子、又は配列番号57に規定するアミノ酸配列をコードするP.フルオレッセンスilvB‐1遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるOAAギ酸リアーゼ遺伝子は、アシレートケト酸からその対応するCoA誘導体への転換を触媒する能力を意味するOAAギ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。OAAギ酸リアーゼ遺伝子によってコードされたポリペプチドは、ピルバート又は別のケト酸に対する活性を有し得る。特定の実施形態において、OAAギ酸リアーゼ遺伝子は、OAAをマロニルCoAに転換するポリペプチドをコードする。本明細書中で使用されるマロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子は、マロニル‐CoAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒する能力を意味するCo‐Aアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とも呼ばれるマロニル‐CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子は、マロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換を触媒する能力も持つ二機能性マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子から得ることもできる。特定のこれらの実施形態において、細菌起源からマロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子は、配列番号58に規定するアミノ酸配列をコードするC.アウランティアクスCaurantiacusマロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子、配列番号59に規定するアミノ酸配列をコードするR.カステンホルジイRcastenholziiマロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子、又は配列番号60に規定するアミノ酸配列をコードするエリスロバクター属ErythrobacterspNAP1マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子は、マロニル‐CoAからマロン酸セミアルデヒドへの転換を触媒するだけのポリペプチドをコードするマロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子から得ることもできる。例えば、マロニル‐CoAレダクターゼ遺伝子は、配列番号に61に規定するアミノ酸配列をコードするM.セデュラMsed_0709遺伝子、又は配列番号62に規定するアミノ酸配列をコードするS.トコダイイStokodaiiマロニル‐CoAレダクターゼから得てもよい。本明細書中で使用されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はPDH遺伝子は、ピルバートからアセチルCoAへの転換を触媒する能力を意味するピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母起源からPDH遺伝子を得てもよい。例えば、PDH遺伝子は、それぞれ配列番号63~66に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエLAT1、PDA1、PDB1、又はLPD遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からPDH遺伝子を得てもよい。例えば、PDH遺伝子は、それぞれ配列番号67~69に規定するアミノ酸配列をコードするE.コリ株K12亜株MG1655aceE、aceF、又はlpd遺伝子、又はそれぞれ配列番号70~73に規定するアミノ酸配列をコードするB.ズブチリスBsubtilispdhA、pdhB、pdhC、又はpdhD遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるアセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子又はACC遺伝子は、アセチル‐CoAからマロニルCoAへの転換を触媒する能力を意味するアセチル‐CoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アセチル‐CoAカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、EC6.4.1.2に分類される。特定の実施形態において、酵母起源からアセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号74に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエACC1遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からアセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子は、それぞれ配列番号75~78に規定するアミノ酸配列をコードするE.コリaccA、accB、accC、又はaccD遺伝子、又はそれぞれ配列番号79~82に規定するアミノ酸配列をコードするC.アウランティアクスaccA、accB、accC、又はaccD遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ピルバートからアラニンへのNAD依存性還元的アミノ化を触媒する能力を意味するアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、EC1.4.1.1に分類される。特定の実施形態において、細菌起源からアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号83に規定するアミノ酸配列をコードするB.ズブチリスから得られるアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、ピルバートとL‐グルタマートからアラニンと2‐オキソグルタラートへの転換を触媒する能力を意味するピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母起源からピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子から得られる。例えば、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号84に規定するアミノ酸配列をコードするS.ポンベSpombeピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、又は配列番号85に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエALT2遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるアラニン2,3アミノムターゼ遺伝子又はAAM遺伝子は、アラニンからβ‐アラニンへの転換を触媒する能力を意味するアラニン2,3アミノムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を指す。アラニン2,3アミノムターゼ活性は、天然に生じないことが知られている。そのため、アラニン2,3アミノムターゼ遺伝子は、例えば、リジン2,3アミノムターゼ活性などの類似活性を有するポリペプチドをコードする天然起源遺伝子に1若しくは複数の突然変異を組み入れることによって得られる例えば、米国特許第7,309,597号を参照のこと。特定の実施形態において、その天然起源遺伝子は、配列番号86に規定するアミノ酸配列をコードするB.ズブチリスリジン2,3アミノムターゼ遺伝子、配列番号87に規定するアミノ酸配列をコードするP.ジンジバリスPgingivalisリジン2,3アミノムターゼ遺伝子、又は配列番号88に規定されてもアミノ酸配列をコードするF.ヌクレアツムFnucleatumATCC‐10953リジン2,3アミノムターゼ遺伝子であってもよい。本明細書中で使用されるCoAトランスフェラーゼ遺伝子は、CoAトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、β‐アラニンからβ‐アラニル‐CoAへの転換、及び/又はラクタートからラクチル‐CoAへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、酵母起源からCoAトランスフェラーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からCoAトランスフェラーゼ遺伝子を得てもよい。例えば、CoAトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号89に規定するアミノ酸配列をコードするM.エルスデニイMelsdeniiCoAトランスフェラーゼ遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるCoAシンテターゼ遺伝子は、CoAシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。一例において、これには、β‐アラニンからβ‐アラニル‐CoAへの転換を触媒する能力が含まれる。別の例において、これには、ラクタートからラクチル‐CoAへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、酵母起源からCoAシンテターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、CoAシンテターゼ遺伝子は、S.セレビシエCoAシンテターゼ遺伝子から得てもよい。他の実施形態において、細菌起源からCoAシンテターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、CoAシンテターゼ遺伝子は、E.コリCoAシンテターゼ、R.スフェロイデス、又はS.エンテリカSentericaCoAシンテターゼ遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるβ‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ遺伝子は、β‐アラニル‐CoAからアクリロイル‐CoAへの転換を触媒する能力を意味するβ‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ遺伝子は、細菌起源、例えば、配列番号90に規定するアミノ酸配列をコードするC.プロピオニクムCpropionicumβ‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ遺伝子などから得てもよい。本明細書中で使用される3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子又はアクリロイル‐CoAヒドラターゼ遺伝子は、アクリロイル‐CoAから3‐HP‐CoAへの転換を触媒する能力を意味する3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。3‐HP‐CoAデヒドラターゼ活性を有する酵素は、EC4.2.1.116に分類される。特定の実施形態において、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子は、酵母又は真菌起源、例えば、配列番号91に規定するアミノ酸配列をコードするP.ソーヤPsojae3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子などから得てもよい。他の実施形態において、細菌起源から3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号92に規定するアミノ酸配列をコードするC.アウランティアクス3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子、配列番号93に規定するアミノ酸配列をコードするR.ルブルムRrubrum3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子、又は配列番号94に規定するアミノ酸配列をコードするR.カプスラツスRcapsulates3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子から得てもよい。さらに他の実施形態において、哺乳類起源から3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号95に規定するアミノ酸配列をコードするH.サピエンスHsapiens3‐HP‐CoAデヒドラターゼから得てもよい。本明細書中で使用される3‐HP‐CoAヒドロラーゼ遺伝子は、3‐HP‐CoAから3‐HPへの転換を触媒する能力を意味する3‐HP‐CoAヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、酵母又は真菌起源から3‐HP‐CoA遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、細菌又は哺乳類起源から3‐HP‐CoA遺伝子を得てもよい。本明細書中で使用される3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子は、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、3‐HP‐CoAから3‐HPへの転換を触媒する能力が含まれる。特定の実施形態において、例えば、配列番号96に規定するアミノ酸配列をコードするP.フルオレッセンス3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子、又は配列番号97に規定するアミノ酸配列をコードするB.セレウスBcereus3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子など、細菌起源から3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、例えば、配列番号98に規定するアミノ酸配列をコードするH.サピエンス3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子など、哺乳類起源から3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子を得てもよい。本明細書中で使用される乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子又はLDH遺伝子は、ピルバートからラクタートへの転換を触媒する能力を意味する乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、真菌、細菌、又は哺乳類起源からLDH遺伝子を得てもよい。本明細書中で使用されるラクチル‐CoAデヒドラターゼ遺伝子は、ラクチル‐CoAからアクリロイル‐CoAへの転換を触媒する能力を意味するラクチル‐CoAデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、細菌起源からラクチル‐CoAデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。例えば、ラクチル‐CoAデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号99~101に規定するアミノ酸配列をコードするM.エルスデニイラクチル‐CoAデヒドラターゼE1、EIIa、又はEIIbサブユニット遺伝子から得てもよい。本明細書中で使用されるアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指し、そしてそれには、一例において、3‐HPAから3‐HPへの転換を触媒する能力及びその逆の能力が含まれる。特定の実施形態において、例えば、配列番号102に規定するアミノ酸配列をコードするS.セレビシエアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、又は配列番号122、124、又は126に規定するアミノ酸配列をコードするI.オリエンタリスアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子など、酵母起源からアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を得てもよい。他の実施形態において、例えば、配列番号103に規定するアミノ酸配列をコードするE.コリaldH遺伝子、又は配列番号104に規定するアミノ酸配列をコードするK.ニューモニエKpneumoniaeデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子など、細菌起源からアルデヒドデヒドロゲナーゼを得てもよい。本明細書中で使用されるグリセロールデヒドラターゼ遺伝子は、グリセロールから3‐HPAへの転換を触媒する能力を意味するグリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子を指す。特定の実施形態において、例えば、K.ニューモニエKpneumonia又はC.フレアンディイCfreundiiグリセロールデヒドラターゼ遺伝子など、細菌起源からグリセロールデヒドラターゼ遺伝子を得てもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊をさらに含む。天然遺伝子に関する欠失又は破壊とは、遺伝子の全コード領域が排除欠失されること、あるいは、遺伝子のコード領域、プロモーター、及び/又はターミネータ領域が、遺伝子がもう活性酵素を生じさせないように改変例えば、欠失、挿入、又は突然変異などされ、大きく低減された量少なくとも75の低減、好ましくは少なくとも90の低減の活性酵素が産生されるか、又は大きく低減された活性少なくとも75は低減、好ましくは少なくとも90の低減の酵素が産生されることを意味する。特定の実施形態において、1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊は、1若しくは複数の天然代謝経路の欠失又は破壊をもたらす。代謝経路に関する欠失又は破壊とは、その経路が働かないか、又は天然経路に比べて少なくとも75、少なくとも85、又は少なくとも95低減された活性を示すことを意味する。特定の実施形態において、天然代謝経路の欠失又は破壊は、3‐HP産生を低減する1若しくは複数の天然遺伝子の発現低下をもたらす1若しくは複数の遺伝子組み換えを組み込むことによって達成される。特定の実施形態において、天然遺伝子の欠失又は破壊は、強制進化、突然変異誘発、又は遺伝子工学的方法と、それに続く、所望の突然変異体を確認するための適当な選択又はスクリーニングによって達成される。特定の実施形態において、天然宿主細胞遺伝子の欠失又は破壊は、宿主細胞内への1若しくは複数の外来遺伝子の取り込みと対にされることもある、すなわち、外来遺伝子は、欠失構築物でもある遺伝子発現組み込み構築物を使用することで組み込まれてもよい。他の実施形態において、欠失又は破壊は、外来遺伝子を含まない欠失構築物を使用することで、又は当該技術分野で知られている他の方法によって達成され得る。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼPDC、ピルバートをアセトアルデヒドに転換する、及び/又はアルコールデヒドロゲナーゼADH、アセトアルデヒドをエタノールに転換する遺伝子を含めたエタノール発酵に関与する酵素をコードする1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。これらの改変は、エタノールを産生する酵母細胞の能力を減少させ、その結果、3‐HP産生を最大化する。しかしながら、特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、3‐HPとエタノールを同時産生するように設計されてもよい。それらの実施形態において、エタノール発酵に関与する酵素をコードする天然遺伝子は、好ましくは欠失も破壊もさせられず、そして、特定の実施形態において、酵母細胞は、エタノール産生を増強する1若しくは複数の外来遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えば、グリセロール、又は、例えば、アセタートやジオールなどの他の副産物などの別の発酵産物を産生するのに関与する酵素をコードする1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。例えば、本明細書中に規定する細胞は、グリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼGPD、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール3‐リン酸への反応を触媒する、グリセロール3‐ホスファターゼGPP、グリセロール‐3ホスファートからグリセロールへの転換を触媒する、グリセロールキナーゼグリセロール3‐リン酸からグリセロールへの転換を触媒する、ジヒドロキシアセトンキナーゼジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンへの転換を触媒する、グリセロールデヒドロゲナーゼジヒドロキシアセトンからグリセロールへの転換を触媒する、アルデヒドデヒドロゲナーゼALD、例えば、アセトアルデヒドをアセタート又は3‐HPを3‐HPAにに転換する、又はブタンジオールデヒドロゲナーゼブタンジオールからアセトインへの転換又はその逆を触媒する遺伝子のうちの1若しくは複数の欠失又は破壊を含み得る。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えば、PEPカルボキシキナーゼPCK、OAAデカルボキシラーゼ活性を有する酵素、又はCYB2A若しくはCYB2Bラクタートからピルバートへの転換を触媒するを含めた3‐HP発酵経路において逆反応を触媒する酵素をコードする1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。PCKは、PEPからOAAへの転換又はその逆を触媒するが、OAAからPEPへの反応を優先する。OAAからPEPへの転換を低減するために、天然PCK遺伝子の1若しくは複数のコピーが、欠失又は破壊させられてもよい。特定の実施形態において、1若しくは複数の天然PCK遺伝子が欠失又は破壊された酵母細胞は、PEPからOAAへの転換を好むポリペプチドをコードするように変異させた1若しくは複数の外来性PCK遺伝子を発現してもよい。OAAデカルボキシラーゼは、OAAからピルバートへの転換を触媒する。OAAデカルボキシラーゼ活性を有する酵素、例えば、E.コリでeda遺伝子によってコードされるもの、及び酵母や真菌のリンゴ酸酵素MAEなどが、同定された。OAAデカルボキシラーゼ活性を低減するために、OAAデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする天然遺伝子の1若しくは複数のコピーが、欠失又は破壊させられてもよい。特定の実施形態において、1若しくは複数の天然OAA脱炭酸遺伝子が欠失又は破壊させられた酵母細胞は、ピルバートからOAAへの転換を触媒するポリペプチドをコードするように変異させた1若しくは複数の外来性OAA脱炭酸遺伝子を発現してもよい。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、3‐HP発酵経路産物又は中間体との望ましくない反応に関与する酵素をコードする1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。そうした遺伝子の例としては、3‐HPを3‐HPのアルデヒドに転換する酵素をコードするものが挙げられ、そしてそれは、細菌細胞に毒性であることが知られている。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、例えばGAL6ガラクトースをグルコースに転換するGALシステムの負の調節因子を含めた3‐HP発酵経路に中立的効果を持つ酵素をコードする1若しくは複数の天然遺伝子の欠失又は破壊を含む。中立遺伝子の欠失又は破壊は、天然発酵経路に影響しない1若しくは複数の外来遺伝子の挿入を可能にする。特定の実施形態において、本明細書中に規定する酵母細胞は、3‐HP耐性酵母細胞である。本明細書中で使用される3‐HP耐性酵母細胞は、4.0未満のpHにて75g/L以上の3‐HPを含む培地において、少なくとも2.5g/L/時間の平均解糖速度を示す酵母細胞を指す。そうした速度と条件は、経済的な3‐HP生産工程の典型である。特定のこれらの実施形態において、酵母細胞は、それらの天然型において3‐HP耐性を示していてもよい。他の実施形態において、細胞は、突然変異及び/又は選択された細胞が同種の野生型細胞より高度な3‐HP耐性を持つように、活性な3‐HP発酵経路に関連する遺伝子組み換えの導入前、導入中、又は導入後に突然変異及び/又は選択例えば、ケモスタット選択又は頻回連続継代培養repeatedserialsubculturingを受けてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子で遺伝子を組み換えられる前に3‐HP又は乳酸の存在下で突然変異及び/又は選択を受けた。特定の実施形態において、突然変異及び/又は選択は、それらの天然型で3‐HP耐性を示す細胞でおこなわれ得る。突然変異及び/又は選択を受けた細胞は、異なったレベルの3‐HPの存在下で3‐HP生産のための工業的宿主としてのそれらの能力を測定するために糖消費と他の特性について試験されてもよい。3‐HP耐性に加えて、本明細書中に規定する酵母細胞は、1若しくは複数の追加の有機酸例えば、乳酸又は他の発酵産物、副産物、若しくは培地成分に対する耐性に関する突然変異及び/又は選択を受けてもよかった。3‐HP又は他の化合物への耐性に関する選択などの選択は、当該技術分野で周知の方法を使用することで実行され得る。例えば、先に言及されたとおり、選択はケモスタット選択であってもよい。ケモスタット選択は、比成長速度と細胞数が独立に制御できる、微生物例えば、酵母の連続培養を可能にするケモスタットを使用する。連続培養は、そこに培地が連続的に加えられ、且つ、そこからのあらゆるオーバーフローの除去が連続的に起こる、本質的に一定体積の流動系である。そうした系がいったん平衡状態になると、細胞数と栄養状態は一定なままなので、その系は定常状態になる。ケモスタットは、希釈率及び、例えば、炭素源若しくは窒素源などの栄養制限物質の濃度の変更により、培養物の個体群密度と比成長速度の両方の制御を可能にする。培養物を培養した条件を変更する例えば、特に、接種株の成長に必要な第二級炭素起源の濃度を減少させることによって、集団における変更された条件で早く成長できる微生物は、選択され、そして、新しい条件下で同じように機能しない微生物より成長する。典型的に、そうした選択は、えるところでケモスタット培養の一連の培養にわたる、少なくとも1種類の培養成分の漸進的な増加又は減少を必要とする。ケモスタットの運転と微生物の定向進化におけるその利用は、当該技術分野で周知である例えば、NovickProcNatlAcadSciUSA36708719HarderJApplBacteriol43124を参照のこと。選択のための他の方法としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、米国特許第7,629,162号に記載の選択条件下の頻回連続継代培養が挙げられる。そうした方法は、先に記載したグルコース制限ケモスタット法の代わりに、又はそれに加えて使用できる。以下の実施例で開示されるように3‐HP培地中で成長とグルコース消費量の最良の組み合わせを示す酵母株が、3‐HP発酵経路に関連する様々な遺伝子組み換えのための好ましい宿主細胞である。4未満のpHにて75g/L超の3‐HPの存在下での成長で示されるように、比較的高度の3‐HP耐性の可能性を持つ酵母属としては、例えば、カンジダ、クルイベロマイセス、イサタケンキア、サッカロマイセス、ピキア、シゾサッカロマイセス、トルラスポラ、及びチゴサッカロマイセスが挙げられる。3‐HP耐性を示す種としては、I.オリエンタリスC.クルセイCkruseiとしても知られている、C.ランビカピキアファーメンタンスとしても知られている、及びS.ブルデリカザチスタニアブルデリKazachstaniabulderiとしても知られているが挙げられる。I.オリエンタリスとC.ランビカは、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群からである一方、S.ブルデリは、サッカロマイセス分岐群からである。3‐HP耐性示す具体的な株としては、I.オリエンタリス株24210、PTA‐6658、60585、及びCD1822、S.ブルデリ株MYA‐402及びMYA‐404、並びにC.ランビカATCC38617が挙げられる。本明細書中に記載した高レベルの3‐HPの存在下で合格レベルの成長とグルコース利用率を持つか、他の野生型酵母又は真菌を同様に試験し、そして判断することもできる。例えば、GrossとRobbinsHydrobiologia43391109は、潜在的な生産宿主としての試験に関連し得る低pH<4環境で同定された81の真菌種から成るリストを編集した。特定の実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、クラブトリー陰性の宿主酵母細胞に1若しくは複数の遺伝子組み換えを組み入れることによって作り出される。特定のこれらの実施形態において、宿主酵母細胞は、イサタケンキア属、カンジダ属、又はサッカロマイセス属に属し、そして、特定のこれらの実施形態において、宿主細胞は、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス又はサッカロマイセス属分岐群に属する。特定の実施形態において、宿主細胞は、I.オリエンタリス、C.ランビカ、又はS.ブルデリである。I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群は、少なくとも種、I.オリエンタリス、P.ガレフォルミスPgaleiformis、P.sp.YB‐4149NRRL指定番号、C.エタノリカCethanolica、P.デセルティコラPdeserticola、P.メンブラニファシエンスPmembranifaciens、及びP.ファーメンタンスを含めた最も端末の分岐群である。I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群のメンバーは、参照により本明細書中に援用するIdentificationandPhylogenyofAscomycetousYeastsfromAnalysisofNuclearLargeSubunitRibosomalDNAPartialSequencesAntonievanLeeuwenhoek733313711998特に349頁を参照のことの中でKurtzmanとRobnettにより記載された方法を使用して、酵母種の26SリボソームDNAの可変D1/D2ドメインの分析によって同定される。何百もの子嚢菌からの26SリボソームDNAの可変D1/D2ドメインの分析では、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群が非常に近い近縁種を含むことが明らかなった。I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群のメンバーは、分岐群以外の酵母種に比べて分岐群のメンバーに対して26SリボソームDNA可変のD1/D2ドメインの高い類似性を示す。そのため、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群の他のメンバーが、それらのそれぞれのリボソームDNAのD1/D2ドメインの比較によって、及びKurtzmanとRobnettの方法を使用して、分岐群の他のメンバーのものと分岐群以外の近縁種のものを比較することによって同定できる。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞は、イサタケンキア属に属し、そして、特定のこれらの実施形態において、酵母細胞はI.オリエンタリスである。最初に特徴づけされたとき、菌種I.オリエンタリスは、ピキアクドリアヴゼヴィイと命名された。I.オリエンタリスのアナモルフ無性形態は、カンジダクルセイとして知られている。菌種I.オリエンタリスの多数の更なる同義語を、ほかの場所に列挙したKurtzmanandFellTheYeastsaTaxonomicStudySection35IssatchenkiaKudryavtsevpp222223。3‐HP生産に理想的な酵母細胞は、低pHレベルで理想的に成長できる。低pHで発酵を行う能力は、下流の回収コストを削減させ、そして、より経済的な生産をもたらす。そのため、特定の実施形態において、酵母宿主細胞は低pHレベル例えば、7、6、5、4、又は3より低いpHレベルで成長できる。好適な宿主細胞は、3‐HP耐性及び/又は低pH成長能力に加えて1若しくは複数の長所を有することもある。例えば、3‐HP耐性を示す潜在的宿主細胞は、解糖速度、比成長速度、熱耐性、バイオマス加水分解物阻害剤への耐性、総合的な工程ロバスト性などに基づいてさらに選択されてもよい。これらの基準が、3‐HP発酵経路に関連するいずれかの遺伝子組み換え前に評価されても、又はそれらは、1若しくは複数の係る改変がおこなわれた後に評価されてもよい。ほとんどの酵母がエタノールの天然産生体であるので、ピルバートPDCからのエタノール産生における第1ステップを触媒する酵素の排除又は大きな低減は、十分な収量の代替産物を必要とする。例えば、サッカロマイセスなどのクラブトリー陽性の酵母では、欠失又は破壊されたPDC遺伝子が、宿主に例えば、エタノール又はアセタートなどの二炭素化合物に対する栄養要求性を獲得させ、そして、グルコース含有培地での成長不足をもたらす。これらの制限を克服できる突然変異体は、アセタート独立性及び耐糖性に関する漸進的な選択を使用することで得ることができる例えば、vanMarisAppIEnvironMicrobiol70159を参照のこと。そのため、特定の実施形態において、好ましい酵母宿主細胞は、クラブトリー陰性の酵母細胞であり、そしてその中のPDC欠失株は、グルコースにより成長でき、且つ、C2原栄養性を維持している。所定の細胞で利用されるべき遺伝子発現レベル及び/又は外来遺伝子の数は、選択した酵母種によって異なる。完全にゲノム配列決定された酵母に関して、全ゲノム量論モデルが、所望の経路の3‐HP発酵経路を起こすために発現されなければならない酵素を決定するのに使用できる。全ゲノム量論モデルは、例えば、HjerstedetalGenomescaleanalysisofSaccharomycescerevisiaemetabolismandethanolproductioninfedbatchcultureBiotechnolBioeng2007;及びFamilietalSaccharomycescerevisiaephenotypescanbepredictedbyusingconstraintbasedanalysisofagenomescalereconstructedmetabolicnetworkProcNatlAcadSci2003100131349に記載されている。ゲノム配列が知られていない酵母に関して、過剰発現候補として又は挿入部位として着目の遺伝子配列は、典型的に、例えば、以下の実施例2Aに記載したものなどの技術を使用することで得られる。3‐HP経路で機能する遺伝子及び酵素を含めて、様々な遺伝子の発現や様々な酵素の活性を試験するために、日常的な実験計画が利用できる。各酵素を、好ましくはすべての経路酵素を含むそれ以下の酵素の個別に若しくはブロックで酵母内で発現させる実験をおこない、どれが改良された3‐HP生産に必要であるか又は所望されるかを証明することができる。1つの説明に役立つ実験計画で、それぞれの個々の酵素、並びにそれぞれの独特な酵素ペアの発現を試験し、そしてさらに、すべての必要な酵素又はそれぞれの独特な酵素の組み合わせの発現を試験できる。理解されるように、多くのアプローチを取ることができる。特定の実施形態において、本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞からの3‐HPを生産する方法が提供される。特定の実施形態において、これらの方法は、少なくとも1種類の炭素源の存在下で本明細書中に規定する遺伝子組み換え酵母細胞を培養し、一定期間、細胞に3‐HPを産生させ、次に、培養物から細胞が産生した3‐HPを単離することを含む。炭素源は、規定する酵母によって発酵できるいずれの炭素源であってもよい。炭素源は、十二炭素糖、例えば、スクロースなど、ヘキソース糖、例えば、グルコース若しくはフルクトースなど、グリカン又は他のグルコースの重合体、グルコースオリゴマー、例えば、マルトース、マルトトリオース及びイソマルトトリオースなど、パノース、並びにフルクトースオリゴマーであってもよい。五炭糖を発酵させる能力を与えるために細胞が改変されるのであれば、発酵培地には、例えば、キシロース、キシラン若しくはキシロースのその他のオリゴマー、及び/又はアラビノースなどの五炭糖が含まれ得る。そうした五炭糖は、ヘミセルロース含有バイオマスの加水分解物に適当である。オリゴマーの糖の場合には、細胞による発酵のためにこれらを対応する単糖に消化するために、発酵ブロスに酵素を加えるのが必要なこともある。特定の実施形態において、2タイプ以上の遺伝子組み換え酵母細胞が培養物中に存在していてもよい。同様に、特定の実施形態において、遺伝子組み換え酵母細胞と同じ又はそれとは異なった種の1若しくは複数の天然酵母細胞が培養物中に存在していてもよい。特定の実施形態において、3‐HPを産生するように本明細書中に規定する細胞の培養は、相に分割され得る。例えば、細胞培養プロセスは、培養相、産生相、及び回収相に分割され得る。当業者は、これらの相に使用される条件が、例えば、使用される酵母種、酵母によって利用される具体的な3‐HP発酵経路、所望の収量、又は他の因子などの因子に基づいて変化し得る。培地は、窒素源例えば、アミノ酸、タンパク質、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩などの無機窒素源など、及び様々なビタミン、ミネラルなどを含め、特定の細胞の必要に応じた栄養素を典型的に含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、化学的に定義された培地中で培養できる。一例において、培地は、約5g/Lの硫酸アンモニウム、約3g/Lのリン酸二水素カリウム、約0.5g/Lの硫酸マグネシウム、微量元素、ビタミン、及び約150g/Lのグルコースを含んでいる。pHは、培養中、自由に変動させててもよいが、pHが所定のレベルより下がるか若しくはそれを超えるのを防ぐために、必要であれば緩衝化されてもよい。特定の実施形態において、発酵培地は、約1.0のOD600を生じるのに十分な評価の対象である酵母細胞が植菌される。別段の明らか注意がない限り、本明細書中で使用されるOD600は、モデルDU600分光光度計BeckmanCoulterを使用して1cmの路程で600nmの波長にて計測された吸光度を指す。培養温度は約30~40°Cの範囲をとることができ、そして、培養時間は最長で約120時間になり得る。一例において、発酵培地中の細胞濃度は、典型的に、産生相の間、約0.1~20、好ましくは0.1~5、より一層好ましくは1~3g乾燥細胞/リットルの発酵培地の範囲内にある。発酵は、経路要件によって、好気的に、微好気的に、又は嫌気的におこなわれ得る。所望であれば、酸素摂取速度OURが、工程管理として発酵を通じて変更できる例えば、WO03/102200を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、2~45mmol/L/時間、例えば、2~25、2~20、2~15、2~10、10~45、15~40、20~35、又は25~35mmol/L/時間、の酸素吸収速度を特徴とする微好気性条件下で培養される。特定の実施形態において、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、2~25mmol/L/時間の酸素吸収速度を特徴とする微好気性条件下で培養されると、特に良好に機能し得る。培地は、産生相の間、pHが約3.0~約7.0、又は約4.0~約6.0の範囲内で維持されるように緩衝化されてもよい。好適な緩衝剤には、それが形成されるときに酸を中和する塩基性物質、例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムなどが含まれる。一般に、従来の発酵工程で使用される緩衝剤もまた、ここで好適である。緩衝化された発酵が利用される実施形態において、酸性発酵産物は、それらが形成されるときに対応する塩へと中和される。それらの実施形態において、酸の回収は、遊離酸の再生に関与する。これは、細胞を取り除き、そして、例えば硫酸などの強酸で発酵ブロスを酸性化することによっておこなわれる。このことは、塩副産物の形成をもたらす。例えば、カルシウム塩が中和剤として利用され、硫酸が酸性化剤として利用される場合、石膏が塩副産物として産生される。この副産物は、ブロスから分離され、そして、酸が、例えば、液体‐液体抽出、蒸留、吸収、及びその他のものなどの技術を使用して回収される例えば、TBVickroyVol3Chapter38ofComprehensiveBiotechnologyPergamonOxford1985;RDattaetalFEMSMicrobiolRev199516221231;米国特許第4,275,234号、同第4,771,001号、同第5,132,456号、同第5,420,304号、同第5,510,526号、同第5,641,406号、及び同第5,831、122号、並びにWO93/00440を参照のこと。他の実施形態において、発酵培地のpHは、培養中、開始pH、つまり、3‐HPのpKa以上、典型的には4.5以上から、酸性発酵産物のpKa以下、例えば、4.5未満又は4.0、例えば、約1.5~約4.5の範囲内、約2.0~約4.0の範囲内、若しくは約2.0~約3.5の範囲内などに下がることが容認され得る。さらに他の実施形態において、発酵は、発酵工程の開始前又は開始時に産物の酸のpKa以下に発酵ブロスのpHを調整することによって、産物の酸を産生するように実施できる。pHはその後、培養を通じて産物の酸のpKa以下に維持され得る。特定の実施形態において、pHは、4.5未満又は4.0、例えば、約1.5~約4.5の範囲内、約2.0~約4.0の範囲内、又は約2.0~約3.5の範囲内に維持され得る。本明細書中に規定する方法の特定の実施形態において、遺伝子組み換え酵母細胞は、比較的低レベルのエタノールを産生する。特定のこれらの実施形態において、エタノールは、10以下の収率、好ましくは2以下の収率で産生され得る。特定のこれらの実施形態において、エタノールは検出可能なほど産生されない。他の実施形態において、しかしながら、3‐HPとエタノールは同時に産生され得る。これらの実施形態において、エタノールは、10超、25超、又は50超の収率にて産生され得る。本明細書中に規定する方法の特定の実施形態において、炭素源に対する3‐HPの最終収率は、理論収率の少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、又は50超である。3‐HPの濃度又は力価は、収率、並びに炭素源の開始濃度の関数になる。特定の実施形態において、力価は発酵中のある時点、そして好ましくは発酵の終了時に少なくとも1~3、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、又は50g/L超に達することもある。特定の実施形態において、3‐HPの最終収率は、特に産生相中に、発酵培地の温度を変更することによって増強されることもある。産生されれば、発酵培地から3‐HPを単離するために、当該技術分野で公知のいずれかの方法を使用できる。例えば、一般的な分離技法が、ブロスからバイオマスを取り出すのに使用でき、そして、一般的な単離手順例えば、抽出、蒸留、及びイオン交換手順が、微生物不含ブロスから3‐HPを得るのに使用できる。加えて、3‐HPは、それが産生されている間に単離できるし、それは、産物産生相が終了した後でもブロスから単離できる。本明細書中に開示された方法を使用することで、産生された3‐HPを、他の有機化合物に化学的に転換できる。例えば、3‐HPを、水素化させて、貴重なポリエステル単量体である1,3プロパンジオールを形成できる。プロパンジオールはまた、試験管内又は生体内において、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを使用することで3‐HPから作り出すことができる。例えば、3‐HPなどの有機酸の水素化は、例えば、コハク酸及び/又は乳酸を水素化するのに使用される方法などのいずれかの方法を使用することで実施できる。例えば、3‐HPは、金属触媒を使用することで水素化できる。別の実施例において、3‐HPは、脱水反応をおこなうことが知られているいずれかの方法を使用することで、脱水されて、アクリル酸を形成することができる。例えば、3‐HPは、触媒例えば、金属又は鉱酸触媒の存在下で加熱されて、アクリル酸を形成することができる。以下の実施例は、請求項に記載した発明をよりよく例示するために提供しているので、本発明の範囲を制限していると解釈されることはない。具体的な物質に触れる程度で、それは単に例示目的のためだけに存在し、本発明を限定することは意図していない。当業者は、本発明の発明能力及び本発明の範囲から逸脱することなく、同党の手段又は反応物を作り出すこともできる。当然のことながら、本発明の制限の範囲内に留まったままでも、本明細書中に記載した手順にはまだ多くの変更を加えることができる。そうした変更が本発明の範囲内に含まれるという本発明者の意図である。培地と溶液TEは、10mMのTris塩基及び1mMのEDTA、pH8.0から構成された。2×YTampプレートは、16g/Lのトリプトン、10g/Lの酵母抽出物、5g/LのNaCl、100mg/Lのアンピシリン、及び15g/LのBactoアガーから構成された。ura選択プレートは、6.7gの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、5gのカザミノ酸、100mLの0.5Mコハク酸pH5、20gのNobleアガー、及び855mLの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50のグルコース及び2mLの10mg/mLクロラムフェニコールを加え、そしてプレートに注ぎ入れた。ura選択培地は、6.7gの硫酸アンモニウム含有酵母窒素塩基、5gのカザミノ酸、100mLの0.5Mコハク酸pH5、及び855mLの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50グルコース及び2mLの10mg/mLクロラムフェニコールを加えた。YP10グルコース培地は、500mLのYPブロスと100mLの無菌の50グルコースから構成された。YPブロスは、10g/Lの酵母抽出物、20g/Lのペプトンから構成された。YPDプレートは、10gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのバクトアガー、及び960mLまでの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、40mLの無菌の50グルコースを加え、そして、プレートに注ぎ入れた。TAEは、4.84g/LのTris塩基、1.14mL/Lの氷酢酸、及び2mL/Lの0.5MEDTApH8.0から構成された。TBEは、10.8g/LのTris塩基、5.5g/Lのホウ酸、及び4mL/Lの0.5MEDTApH8.0から構成された。LiOAc/TE溶液は、8部の滅菌水、1部の1MLiOAc、及び1部の10×TEから構成された。10×TE200mLは、2.42gのTris塩基、4mLの0.5MEDTA、pH8.0から構成された。5MのHClを、7.5にpHを調整するのに使用し、そして、溶液をオートクレーブで滅菌した。PEG/LiOAc/TE溶液は、8部の50PEG3350、1部の1MLiOAc、及び1部の10×TEから構成された。50のPEG3350は、100gのPEG3350を150mLの水に加え、加熱し、そして溶解するまで撹拌することによって調製された。そして、水で体積を200mLに合わせ、そしてオートクレーブで滅菌処理した。ScDFOAプレートは、275mLの2×‐ScD2×FOA液体培地及び275mLの2×‐ScD2×FOAプレート培地から構成され、溶解させ、そして、65°Cまで冷やした。2×‐ScD2×FOA液体培地は、6.66gのアミノ酸不含酵母窒素塩基、1.54gのura‐DOサプリメントClontech、MountainViewCAUSA、20gのデキストロース、50mgのウラシル、2mgのウリジン、2gの5‐FOA5‐フルオロオロチン酸、一水和物;TorontoResearchChemicalsNorthYorkONCanada、及び1Lまでの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するために濾過した。2×‐ScD2×FOAプレート培地は、11gのバクトアガーと275mLの水から構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理した。DM2培地は、硫酸アンモニウム5.0g/L、硫酸マグネシウム七水和物0.5g/L、リン酸二水素カリウム3.0g/L、微量元素溶液1mL/L、及びビタミン溶液1mL/Lから構成された。すべての培地成分を溶解した後に、培地のpHを、適当な塩基例えば、KOHを使用して所望の初期pHに調整した。微量元素溶液は、EDTA15.0g/L、硫酸亜鉛7水和物4.5g/L、無水塩化マンガン1.0g/L、塩化コバルトII六水和物0.3g/L、硫酸銅II五水和物0.3g/L、無水モリブデン二ナトリウム0.4g/L、無水塩化カルシウム4.5g/L、硫酸鉄七水和物3g/L、ホウ酸1.0g/L、及びヨウ化カリウム0.1g/Lから構成された。ビタミン溶液は、ビオチンD-;0.05g/L、パントテン酸カルシウムD;1g/L、ニコチン酸5g/L、ミオイノシトール25g/L、塩酸ピリドキシン1g/L、p‐アミノ安息香酸0.2g/L、及び塩酸チアミン1g/Lから構成された。Butterfieldsリン酸バッファーは、1.25mL/Lの原液26.22g/Lのリン酸二水素ナトリウムと7.78g/Lの炭酸ナトリウム及び5mL/Lの塩化マグネシウム溶液81.1g/LのMgCl2‐6H2Oから構成された。得られた溶液を、滅菌するためにオートクレーブ処理し、そして、pHを7.2に調整した。CNB1振盪フラスコ培地は、尿素2.3g/L、硫酸マグネシウム七水和物0.5g/L、リン酸二水素カリウム3.0g/L、微量元素溶液1mL/L及びビタミン溶液1mL/L、グルコース120.0g/L、2‐N‐モルホリノエタンスルホン酸MES97.6g/Lから構成された。すべての培地成分を溶解させた後に、培地のpHを、適当な塩基例えば、KOHを使用して5.8の初期pHに調整した。多岐にわたる配列プロモーター:実施例に記載のPDC、TDH3、ENO1、及びPGK1プロモーターをそれぞれ、配列番号244、245、246、及び247のI.オリエンタリス配列から得た。ターミネータ:実施例に記載のTAL、TKL、RKI、及びPDCターミネータをそれぞれ、配列番号248、249、250、及び251のI.オリエンタリス配列から得た。実施例に記載のURA3プロモーター、ORF、及びターミネータを、配列番号252のI.オリエンタリス配列から得た。実施例1A:3‐HP耐性に基づく宿主酵母細胞の選択一群の野生型酵母株を、3‐HPの存在下で成長するそれらの能力について試験した。一次スクリーニング手順で利用する3‐HP濃度の範囲は、7種の野生型酵母株表1、セットAが様々なレベルの3‐HPを含む培地上で成長する能力を評価することによって決定した。これらの実験に使用する3‐HPは、WO04/076398に記載のとおり、200psi及び175°Cにて水性アクリル酸溶液30及びCO2触媒から化学的に合成した。残留アクリル酸を、室温にてイソプロピルエーテルを用いた向流抽出を使用して取り除いたWO05/021470を参照のこと。細胞を、YPDプレート上に画線接種し、そして一晩培養した。約4のOD600を有する細胞スラリーを、YPD培地、pH3.0中で作製し、そしてこのスラリーを、様々な濃度の3‐HPpH3.9を含むマイクロタイターウェルに0.05のOD600まで植菌するのに使用した。プレートを、ガス浸透性膜によって覆い、そして30°C/300RPMの振盪機内で一晩インキュベートした。各ウェルへの吸光度を、GENiosモデルプレートリーダTecanにより600nmの波長で計測し、そしてプレートを目視で成長について観察した。1若しくは複数の株がその中に成長した最も高い3‐HP濃度125g/Lを、一次スクリーニング手順の範囲の上限として選んだ。一次スクリーニング一次スクリーニング手順のために、89種の野生型酵母株を、範囲を見つけるために使用したのと同じプロトコールを使用して、0g/L、75g/L、100g/L、又は125g/Lの3‐HPpH3.9のマイクロタイタープレートにおける成長についてスクリーニングした。新しいYPDプレートを各株に使用し、そして約4のOD600を有するスラリーを、YPD培地、pH3.0中に作製した。そのスラリーを、0.05のOD600までの各ウェルに植菌に使用した。プレートを、ガス浸透性膜によって覆い、30°C/300RPMの振盪機内で一晩インキュベートした。各ウェルの吸光度を、GENiosモデルプレートリーダにより600nmの波長で計測し、そしてプレートを目視により成長について観察した。同様のプロトコールを、0g/L、30g/L、45g/L、及び60g/Lの乳酸濃度における成長を評価するために実行した。表1に成長が観察された最高濃度の3‐HP又は乳酸をまとめた。100g/Lの3‐HPにて成長できたか、又は75g/Lの3‐HPにて成長が良好であった15株を同定した表1、セットB。株をさらに絞るために、第2のマイクロタイタープレート試験をおこなった。この試験は、第1と同様であったが、しかし、100g/L、112.5g/L、及び125g/LpH3.9の3‐HP濃度を利用した。この試験から、75g/Lの3‐HPにて成長が良かったか、又は75及び112.5g/Lの両方の3‐HPにて何らかの成長を示した11株を同定した表1、セットC。これらの11株を、二次スクリーニングに進めた。75g/Lの3‐HPにて成長が乏しかった、及び112.5g/Lの3‐HPにて成長がなかった、4株は二次スクリーニングには進めなかった。二次スクリーンに至らなかった株は、商業的発酵工程において経済的に劣った能力を示すと予想される。しかしながら、そうした株の1若しくは複数を、それにもかかわらず商業的に実施可能な発酵工程の最低限の要求を満たすことができるようにすることは可能である。先に試験したI.オリエンタリス株CD1822は、グルコース制限ケモスタット内で91日間、I.オリエンタリスATCCPTA‐6658を進化させることによって作り出した。系には、DM培地中の15g/Lのデキストロースを与え、そして餌料培地中の追加の乳酸を用いてpH=3にて0.06h1の希釈速度で運転した。条件を、約2mmolL1h1の低い酸素移動速度に維持し、そして、溶存酸素濃度を0の空気飽和度で一定に維持した。最後の時点からの単離したシングルコロニーを、2つの振盪フラスコアッセイで特徴づけした。第1のアッセイで、株を、pH調節していないDM1既知組成培地中の25g/Lの総乳酸の存在下でグルコースをエタノールに発酵させるそれらの能力について特徴づけした。第2のアッセイで、単離株の成長速度を、pH調節のないDM1既知組成培地中の25、32、及び45g/Lの総乳酸の存在下で計測した。菌株CD1822は、計測した発酵速度及び増殖速度に基づいて選択しただ一つの単離株であった。I.オリエンタリスのための他の進化方法は、これだけに限定されるものではないが、含んでいるが、が制限されない、例えば、米国特許第7,629,162号に記載のような、選択条件下での頻回連続継代培養である。そうした方法を、使用するか、又は先に記載したグルコース制限ケモスタット法の使用の代わりに又はそれに加えて使用できる。当業者によって理解され得るように、菌株は、改善された3‐HP耐性を作製するために乳酸よりむしろ3‐HPの存在下で同様の進化手順を用いて作り出される場合がある。さらに、菌株は、本明細書中に記載したように、選択前に突然変異誘発される場合がある例えば、実施例1Bを参照のこと。二次スクリーニング二次スクリーンの第1部に関して、増殖速度を、pH3.9にて、0g/L、35g/L、又は75g/Lの3‐HPを含むYPD培地中で計測した。振盪フラスコに、6~10のOD600まで一晩培養した種菌用フラスコから集菌したバイオマスを植菌した。250mLのバッフル付き増殖速度フラスコ50mLの作業容量に、0.1のOD600まで植菌し、250rpm及び30°Cにて培養した。サンプルを、アッセイの時間経過の至るところで採取し、そして、OD600によってバイオマスの成長を分析した。得られたOD600データをプロットし、そして増殖速度を確立した。二次スクリーンの第2部に関して、グルコース消費量を、100g/Lのグルコース及び0g/L、35g/L、又は75g/Lの3‐HPを含むYPD培地中、pH3.9にて同じ10株に関して計測した。6~10のOD600まで一晩培養した種菌用フラスコから集菌したバイオマスを、振盪フラスコに植菌した。250mL容バッフル付き糖分解アッセイフラスコ50mLの作業容量に、0.1のOD600まで植菌し、そして250RPM及び30°Cにて培養した。サンプルをアッセイの時間経過の至るところで採取し、そしてYellowSpringsInstrumentsYSI製の2700BiochemistryAnalyzerを使用してグルコース消費量を分析した。得られたデータをプロットし、そしてグルコース消費量を確立した。前記菌株のうち4株P.メンブラニファシエンス、S.ポンベ、C.バリダCvalida、及びZ.レンツスZlentusは、経済的発酵工程に必要とされるであろう75g/Lの3‐HPpH3.9の条件下での2.5g/L/時間のグルコース利用速度を達成しなかった。3‐HPに関して優れた菌株を同定するために、菌株の能力を、3つのカテゴリで等級付けした。これらのうちの2つのカテゴリは、増殖速度の異なった側面:1最高の酸濃度における増殖速度及び2酸濃度に対してプロットした増殖速度のスロープ、に基づいた。第3のカテゴリは、最高の酸濃度における解糖速度であった。この等級付けは、標準化境界としてそれぞれ等級の最高値及び最低値を使用した標準化等級においておこなった。よって、各菌株は、各カテゴリにつき、1が最高スコアである0~1の等級を受けた。菌株の総合的な格付け法は、3つのカテゴリに関する標準化数値の合計であった。増殖速度と解糖速度に等しく加重した加重スコアを導いた。この場合、最高の酸濃度における解糖速度には50加重した一方、2つの増殖速度の格付けにはそれぞれ25加重した。カテゴリごとに標準化した数値、合計、及び加重スコアを、表4にまとめる。試験した菌株のうち、I.オリエンタリス種、C.ランビカ種、及びS.ブルデリ種からの菌株が、低pHにおける3‐HP産生宿主として最高の可能性を示した。同じ手順を、pH2.85にて0、25、及び50g/Lの乳酸~80の遊離酸を含む培地を用いた一次スクリーンからの元の91株の野生型酵母菌株のスクリーニング、格付け、そしてスコア化に利用した。標準化数値と加重及び合計スコアを、二次スクリーンを進めた13菌株について得た。乳酸に関して、S.ジャベンシスSjavensisだけが、50g/L乳酸を含む培地中、pH2.85にて2.5g/L/時間のグルコース利用速度を達成しなかった。その一方、I.オリエンタリス、C.ランビカ、及びS.ブルデリは、3‐HPと乳酸の両方に対する酸耐性を示したが、酸の一方にしか耐性がない多数の菌株が存在した。このことはまた、一次スクリーニングの結果でも分かる表1。例えば、C.ミレリCmilleri、C.ルゴサCrugosa、C.バンデルワルチイCvanderwaltii、K.オーメリKohmeri、S.バヤヌスSbayanus、S.ジャベンシス、Y.リポリチカ、Z.ビスポルスZbisporus、及びZ.コンブカエンシスZkombuchaensisはすべて、45~60g/Lの乳酸における成長を実証したにもかかわらず、試験した3‐HPの最低濃度35g/Lにおいてさえ成長しなかった。よって、1種類の有機酸に対する菌株の耐性は、他の酸に対する耐性の予測因子として断定的に使用できない。このことは、上記の3‐HP耐性を示した菌株を、WO03/049525で有機酸生産の好ましい宿主として同定された8菌株のリストと比較することによってさらに注目される。それらの菌株のうちの2種類C.ジッデンシアCdiddensiaeとC.エントモフィラCentomophilaは試験のために入手できなかったが、その他の6種類は先に記載した一次スクリーンに含まれていた。これらの6種類のうち、I.オリエンタリスとして試験したC.クルセイだけが35g/Lの3‐HPの存在下で成長できた。実施例1B:突然変異誘発と、3‐HPに対して耐性を持つ突然変異株の選択実施例1Aで選択した酵母細胞を、高い3‐HP耐性を有する突然変異体を同定するために、突然変異誘発にかけ、そして選択圧に晒す。例えば、新しいYP酵母抽出物/ペプトン20g/Lグルコースプレート又は液中培養OD6001~4からの酵母細胞を、滅菌水で約10のOD600に再懸濁する。この細胞懸濁液の200μLのアリコートを、個々のチューブにピペットで計り取り、そして3μLのエタンスルホン酸メチルEMSに約一時間、晒すが、これで、細胞の約65が死滅する。より高いEMS濃度もまた、殺傷率を高めるのに使用する。晒した後に、細胞を、5のチオ硫酸ナトリウムによって中和し、PBSバッファー中で洗浄し、リッチ培地中で約4時間、回復させ、そして選択培地上で培養する。条件が選択的であることを保証するために、模擬サンプルEMS不含もまた実施する。あるいは、UV照射を使用することで、細胞に突然変異を誘発できる。3‐HP耐性突然変異菌株を選択するために、EMS処理細胞懸濁液約2x108個の突然変異細胞のアリコートを、親系統が成長しないか又は非常に成長が遅いレベルで3‐HPを含むポテトデキストロース寒天PDA又は別の培地上で平板培養する。これらのプレートを、コロニーが現れるまで数日間インキュベートする。シングルコロニーを、精製し、非選択培地上で画線接種して選択のあらゆる順応効果を断ち、そして選択培地で再テストして耐性増大を確認する。そして、耐性菌を、産物及び基質のHPLC分析の定期的サンプル抽出を伴った振盪フラスコ形式で試験した。あるいは、3‐HP耐性の選択を、ケモスタット又は連続振盪フラスコ進化によっておこなってもよい。突然変異誘発及び選択の追加ラウンドを実施できる。突然変異誘発は、商業的な3‐HP生産に必要とされる特性を有するように、3‐HP生産要件を自然には満たさない宿主の耐性を増強するのに使用できる。実施例2A:宿主ゲノム内へのDNAの形質転換手順以下の実施例に記載の改変酵母菌株を作り出すための酵母宿主ゲノム内へのDNA形質転換を、以下の具体的な手順に基づいておこなった。4mLのYP10グルコース培地を、14mLのFalconチューブに加え、そして、所望の菌株を、無菌の白金耳を使用してこの培地に植菌した。培養物を、250rpmで振盪しながら37°Cにて一晩培養した~16時間。一晩培養物1mLを、50mLの液体YP10のグルコース培地を入れた250mL容バッフル付きのフラスコに加えた。フラスコを、250rpmで振盪しながら37°Cにて培養した。培養物の小量のアリコートを、約1時間の間隔で抜き取り、そしてOD600を計測した。培養物を、OD600が0.6~1.0になるまで培養した。細胞を、室温にて2279×gで遠心分離で集菌し、ペレットを、25mLの滅菌水で再懸濁し、次に、室温にて2279×gで遠心分離した。ペレットを1mLの滅菌水で再懸濁し、再懸濁した細胞を、1.5mL容チューブに移し、次に、16100×gにてペレット状にした。細胞を、1mLのLiOAc/TE溶液で再懸濁し、次に、16100×gでペレット状にした。そして、細胞ペレットを、500μLのLiOAc/TE溶液で再懸濁した。以下の成分:100μLの上記細胞、10μLの新たに沸騰し、そして氷冷したサケ精子DNAAgilentTechnologiesSantaClaraCA、USA、及び10μLの所望の線状形質転換DNA、を1.5mL容チューブに加えた。DNAの代わりに水を用いた対照反応物もまた、調製した。各形質転換反応物に、600μLのPEG/LiOAc/TE溶液を加え、そして反応物を、横にして250rpmの振盪機プラットフォーム上で30°Cにて30分間インキュベートした。40μLのDMSOを各反応物に加え、次に、42°Cの水浴中で5分間インキュベートした。細胞を、5,400×gにて1分間でペレット状にした。細胞を水で再懸濁し、2つに分け、そして、形質転換反応物の半分のそれぞれをura選択培地プレート上で平板培養した。プレートを37°Cに置いた。コロニーは、一般に18~24時間の培養後に目視できるが、それは、菌株の背景による。無菌の白金耳を使用して、ペトリディッシュから300μLのYeastLysis溶液EPICENTRE登録商標Biotechnologies、MadisonWlUSAの入った1.5mL容チューブに少量の酵母を移し、そして、ゲノムDNAを、製造業者の取扱説明書に従ってMasterPure商標YeastDNAPurificationKitEPICENTRE登録商標Biotechnologiesを使用して抽出した。単離した形質転換体で正しい組み込み事象が起こっているかどうか判断するために、MasterPure商標YeastDNAPurificationKitEPICENTRE登録商標Biotechnologiesを使用して調製したゲノムDNAを、PCR反応に使用した。PCR反応物25μLには、0.5μLのスクリーニングされるべき菌株のゲノムDNA、1×CrimsonTaq商標反応バッファーNewEnglandBiolabs、IpswichMAUSA、それぞれ25pmolのセンス及びアンチセンスプライマー、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに0.625単位のCrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsが含まれていた。PCRを、95°Cにて30秒間を1サイクル、続いてそれぞれ95°Cにて30秒間、50°Cにて30秒間、及び68°Cにて予想される最大産物1kbpにつき1分間を30サイクル、それと68°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientific、WestburyNewYorkUSAで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、TAE又はTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてバンドのサイズを可視化し、記載した特異的プライマーセットに関するものと見なした。実施例2B:挿入部位の選択宿主酵母細胞内に外来遺伝子を組み入れるための好適な挿入部位は、酵母宿主細胞内で欠失する3‐HP産生に有益であるか又は中立の効果を持つ遺伝子の遺伝子座であり得る。選択した酵母菌株の好適な挿入部位の制限されることのない例は、本明細書中の実施例に記載されている。当業者は、これら及び他の挿入部位、例えば、PDC例えば、配列番号49に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号48に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスPDC遺伝子、ADH例えば、配列番号106、108、又は110に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号105、107、又は109に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスADH遺伝子、GAL6例えば、配列番号112に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号111に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスGAL6遺伝子、CYB2A例えば、配列番号114に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号113に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスCYB2A遺伝子、CYB2B例えば、配列番号116に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号115に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスCYB2B遺伝子、GPD例えば、配列番号118に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号117に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスGPD遺伝子、ALD例えば、配列番号120に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号119に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子5680、配列番号122に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号121は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42026、配列番号124に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号123に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42426、あるいは、配列番号126に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号125は規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスALD相同性遺伝子42727、又はPCK例えば、配列番号128に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号127に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスPCK遺伝子遺伝子又はその相同体の1若しくは複数の遺伝子座、の使用に関する本明細書中の教示を容易に適用できる。これら遺伝子の配列が未発表である場合、それらは、例えば、ゲノム配列決定、ゲノム又はcDNAライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、又は公知の相同体配列に基づく縮重プライマーを使用する遺伝子断片の増幅と、それに続く完全な配列を得るためのゲノムウォーキングなどの標準手続きを使用して得られる。挿入部位のための他の好適な位置としては、オープンリーディングフレームを含まない遺伝子間領域が挙げられる。実施例2C:挿入ベクター、選択マーカーカセット、遺伝子発現カセット、及び組み込み構築物のための技術挿入部位ベクターを、1若しくは複数の外来性遺伝子を宿主酵母細胞内に組み込むために作製する。宿主酵母細胞は、実施例1に記載の選択過程を受けた細胞であってもよいし、それらは、突然変異誘発及び/又は選択を受けていない細胞であってもよい。挿入部位ベクターを作り出すために、所望の挿入部位の領域上流5’及び領域下流3’を、鋳型として宿主ゲノムDNAを使用して両方とも増幅する。上流領域は、好ましくは70bp超且つ1.5kbp未満である。得られた標的配列は、クローニングベクターに同時又は連続して連結されて、その断片が隣接するか又はほとんど隣接するように、1コピーのそれぞれの断片を持つベクターを得る。独特な制限部位が断片の間に組み込まれて、遺伝子発現カセット及び/又は選択マーカーカセットの挿入を可能にし得る。独特な制限酵素部位はまた、上流断片の5’末端若しくはその付近、及び下流の断片の3’末端若しくはその付近に組み込まれて、クローニングベクターからこれらの部位の間のDNAのその後の除去を可能にする。挿入部位ベクター内への取り込みのための選択マーカーカセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製する。これらの選択マーカーカセットは、選択マーカーのため遺伝子を含んでいて、上流プロモーター及び/又は下流ターミネータ配列もまた含み得る。好適な選択マーカー遺伝子の例としては、URA3、TRP1、HIS、MEL5、CYB2A、LEU2、及びG418遺伝子が挙げられる。組み換えによるマーカーの将来的な破壊を可能にするために、フランキング配列を、プロモーター/マーカー遺伝子/ターミネータ配列のどちらの側のカセット内に組み入れることもできる。これらのフランキング配列は、直接反復配列若しくは逆位反復配列機能性若しくは無機能性配列のどちらか又は1若しくは複数のloxP部位を含み得る。遺伝子発現カセットを、標準的なクローニング技術を使用して作製する。これら遺伝子発現カセットは、過剰発現されるべき遺伝子を含んでいて、上流プロモーター及び/又は下流ターミネータ配列もまた含み得る。特定の実施形態において、これらのプロモーター/遺伝子/ターミネータ組み合わせの2以上のコピーを、1つの遺伝子発現カセット内に組み入れてもよい。宿主酵母菌株における改善された発現のために、異種遺伝子をコドン最適化してもよい。本明細書中に記載の選択マーカーカセットを、それが過剰発現されるべき遺伝子、並びにいずれかの関連プロモーター及び/又はターミネータに隣接又はほとんど隣接するように、遺伝子発現カセット内にクローン化できる。あるいは、天然プロモーターの外来プロモーターでの置き換えのために、発現カセットには、ターゲッティング配列の間に組み込まれるべきプロモーターの上流に選択カセットがあってもよい。遺伝子発現カセットを、遺伝子発現組み込み構築物を作り出すための標準的なクローニング技術を使用した本明細書中に記載した挿入部位ベクター内の2つの標的部位配列の間に挿入できる。1若しくは複数の選択マーカーカセットもまた、どちらか遺伝子発現カセットの一部として又は別個に標的配列の間に挿入してもよい。特定の変形形態において、遺伝子発現カセットのピースは、組み込み断片の間で共通したオーバーラップ断片が存在するように、異なった挿入部位ベクター内にクローン化されることができる。例えば、あるベクターには、上流挿入断片、プロモーター、遺伝子、及びターミネータが含まれるかもしれず、そして2つ目のベクターには、ターミネータ、選択マーカーカセット、及び下流挿入断片が含まれるかもしれない。別の例において、2つ遺伝子の同時挿入を可能にするために、あるベクターには、上流挿入断片、プロモーター、遺伝子、ターミネータ、及び選択マーカーカセットの全部若しくは一部が含まれる場合があり、そして2つ目のベクターには、選択マーカーカセットの全部若しくは一部、第2のプロモーター、遺伝子、ターミネータ、及び下流挿入断片が含まれるだろう。遺伝子ノックアウト構築物を作り出すために、挿入部位ベクターを、欠失又は破壊すべき遺伝子の上流及び下流のフランキング領域から得られる標的DNA配列を使用して作る。選択した標的配列は、標的遺伝子の上流及び下流フランキング領域、及び/又は標的遺伝子コード配列の全部若しくは一部、又はその調節要素例えば、プロモーター又はターミネータを含み得る。1若しくは複数の選択マーカーカセットを、2つの標的配列の間の挿入部位ベクター内に組み入れてもよい。ノックアウトが外来遺伝子の発現と対にされる場合、1若しくは複数の遺伝子発現カセットもまた、挿入部位ベクター内に組み入れられる。宿主酵母ゲノムに組み込まれるべきDNA断片を、クローニングベクターからの断片、又は複数のベクターからのオーバーラップ断片の制限酵素消化によって線状できる。あるいは、線状組み込み断片を、PCR、又はPCRと制限酵素消化の組み合わせを使用して作製できる。挿入部位フランキング領域を、ベクター鋳型内のそれらの存在によって、又は増幅プライマー内への取り込みによって組み込み断片に組み入れることができる。後者の場合では、最短で70ヌクレオチドのフランキング領域が好ましくはプライマーに組み入れられる。選択酵母菌株のための好適な挿入ベクター、選択マーカーカセット、遺伝子発現カセット、及び組み込み構築物の制限されることのない例を、以下の実施例に記載する。当業者は、これらの実施例からの教示と先の明細書を3‐HPを産生する代替の改変酵母菌株を作出するために容易に適用できる。実施例2D:adh1202遺伝子座の外来遺伝子を発現するための挿入ベクターの構築プラスミドpMIBa107を、選択マーカーとしてURA3を使用して、PDCプロモーターとターミネータの制御下でI.オリエンタリスadh1202遺伝子座における単一遺伝子の組み込みを可能にするために作製した。ura選択マーカーを伴ったPDCプロモーターとターミネータを、以下で記載するようにPCR増幅し、そしてpCR4商標BLUNTTOPO登録商標Invitrogen、LaJollaCAUSA内にクローン化した。PDCプロモーター、ターミネータ、及びURA3選択マーカーを含むPCR断片を、SOEPCRによって組み立てた。PDCプロモーターを、PCR産物の3’末端にPDCターミネータに対する相同性を持つプライマーで増幅し、そして、PDCターミネータ及びURA3選択マーカーを、産物の5’末端にPDCプロモーターに対する相同性を有するプライマーを使用して増幅した。そして、これらの2つの断片を、SOEPCRを介して組み立てた。PDCプロモーターを、pACN5図19からプライマー0611184と0611195を使用して増幅した。プライマー0611184は、PCR産物の5’末端にNotI制限部位を導入する。プライマー0611195は、PDCプロモーターの後にXbaI制限部位を導入し、且つ、PCR産物の3’末端にPDCターミネータに対する相同性を導入する。増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを使用して実施した。各PCR反応は、50μLの終量の中に0.5μLの希釈したpACN5図19、それぞれ25pMのプライマー0611184と0611195、1×Pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、0.2mMのdNTPミックス、1.25単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含んでいた。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を30サイクル、それと72°Cにて3分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。PCR産物を、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約700bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagen、ValenciaCAUSAを使用してアガロースから抽出した。PDCターミネータとURA3選択マーカーを、pHJJ76図24からプライマー0611189及び0611185を使用して増幅した。プライマー0611189は、PCR産物の5’末端にPDCプロモーターに対する相同性を導入し、且つ、PDCターミネータの前に直接PacI制限部位を導入する。プライマー0611185は、PCR産物の3’末端にNotI制限部位を導入する。増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを使用して実施した。各PCR反応物は、50μLの終量に0.5μLの希釈したpHJJ76、それぞれ25pMのプライマー0611189及び0611185、1×Pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、0.2mMのdNTPミックス、1.25単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含んでいた。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を30サイクル、それと72°Cにて3分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。PCR産物を、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約2000bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。2000bpのPDCターミネータ、URA3選択マーカーPCR産物、及び700bpのPDCプロモーターPCR産物を、SOE‐PCRを使用して融合させた。増幅反応を、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを使用して実施した。各PCR反応物は、100μLの終量に8ngの2000bpのPDCターミネータ及びURA3選択マーカーPCR産物、24ngの700bpのPDCプロモーターPCR産物、それぞれ50pMのプライマー0611184及び0611185、1×Pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、0.2mMのdNTPミックス、2.5単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含んでいた。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして68°Cにて3分間を30サイクル、さらに68°Cにて3分間を1サイクルをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。2700bpのPCR産物を、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約2700bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。2700bpのPCR産物を、製造業者の取扱説明書に従って配列決定のためのにZeroBlunt登録商標TOPO登録商標PCRクローニングキットInvitrogenを使用してpCR商標4BLUNTTOPO登録商標Invitrogenベクター内にクローン化した。6μLの総反応容量中で、1又は4μLの2700bpのPCR産物、1μLの塩類溶液Invitrogen及び1μLのpCR商標4BLUNTTOPO登録商標Invitrogenを、室温にて15分間、一緒にインキュベートした。2μLのそれぞれのクローニング反応物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリInvitrogen細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NotI消化によって所望のPCR産物の適切な挿入に関してスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいことを確認し、pMIBa100と呼んだ。プラスミドpHJJ76図24は、adh1202遺伝子座に遺伝子組み込みを可能にする相同性を含んでいる。プラスミドpHJJ76を、NotIで消化し、adh1202相同配列の内側に存在しているURA3選択マーカーを切り出した。消化したpHJJ76を、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲル電気泳動によって精製した。5.2kbpの断片を、QIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出し、次に、T4DNAリガーゼを使用して一つに連結し直した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリInvitrogen細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ApaI及びSacI消化によってスクリーニングした。所望の消化産物をもたらしたクローンを、pHJJ76‐nouraと呼んだ。pMIBa100前掲からのPDCプロモーターとターミネータ、及びURA3選択マーカーを、pHJJ76‐noura内にクローン化して、遺伝子がadh1202における組み込みのためのPDCプロモーターとターミネータの制御下に置かれるプラスミドを作製した。pHJJ76‐nouraを、NotIで消化し、続いてCIPで処理した。線状の5.2kbpの断片を、QIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。pMIBa100を、NotIで消化し、そして89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。2742bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して抽出し、次に、T4DNALigaseを使用してpHJJ76‐nouraの5.2kbpの断片に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリInvitrogen細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩でインキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、KpnI及びXbaI消化によってスクリーニングした。所望の消化産物をもたらしたクローンを、pMIBa107と呼んだ図2。実施例2E:PDC遺伝子座において複数の外来遺伝子を発現するための挿入ベクター断片の構築以下の挿入ベクター断片を、内在性I.オリエンタリスPDC遺伝子を、複数の遺伝子、例えば、PDC、ENO1、及びTDH3プロモーターから発現される本明細書中に記載した3つ遺伝子を発現するカセットに置き換える設計DNA構築物を作り出すのに使用できる。左の構築物pMhCt068及び誘導体と右の構築物pMhCt069及び誘導体の間の相同組み換えは、URA3タンパク質の発現をもたらし、そしてそれは、菌株のウラシル栄養要求性からウラシル原栄養性への転換をもたらして、所望の組み込み体の選択を可能にする。それぞれの左側構築物の5’末端は、PDC遺伝子座のDNA上流に相同であるのに対して、それぞれの右側構築物の3’末端は、PDC遺伝子座のDNA下流に相同である。これらの相同領域は、PDC遺伝子座に発現カセットを標的化するのに役立つ。この標的化アプローチを、図3に図式的に示し、そして、いずれかの好適な遺伝子座を標的とするために、本明細書中に記載した複数の遺伝子のいずれかの組み合わせ、例えば、先に記載したいずれかの遺伝子座、例えば、ADH遺伝子座以下の例を参照のこと又はALD遺伝子座など、を使用するように改変できる。左側断片の構築空ベクターである左側構築物pMhCt068を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。PDCプロモータ領域と所望の追加制限部位を含むPCR断片及びフランキングDNAを、ゲノムI.オリエンタリスDNAからプライマー0611166と0611167を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、100ngのゲノムI.オリエンタリスDNA例えば、EPICENTRE登録商標BiotechnologiesからMasterPure商標YeastDNAPurificationKitを使用して調製可能、1×ThermoPol反応バッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611166と0611167、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2μLの100mMMgSO4、及び2単位のVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、94°Cにて2分間を1サイクル分と続く、それぞれ94°Cにて30秒間、54°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約780塩基対のPCR産物を、ゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagel、BethlehemPAUSAを使用して精製した。TALターミネータ領域と所望の追加制限部位を含むPCR断片、及びフランキングDNAを、pACN5図19からプライマー0611168と0611169を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpACN5ミニプレッププラスミドDNA、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、HerculesCAUSA、それぞれ100pmolのプライマー0611168と0611169、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、1.5μLのDMSO、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んていた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約460塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、PCRを、上記の産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。PCR反応物50μLは、125ngのPDCプロモーター含有PCR産物、76ngのTALターミネータ含有PCR産物、1×ThermoPol反応バッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611166と0611169、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2μLの100mMMgSO4、及び2単位のVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、94°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ94°Cにて30秒間、54°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1250塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。ENO1プロモータ領域と所望の追加制限部位を含むPCR断片、及びフランキングDNAを、pACN43図22からプライマー0611170と0611171を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpACN43ミニプレッププラスミドDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611170と0611171、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、1050塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に、RKIターミネータ領域とそれに続く、URA3プロモータ領域とURA3ORFの5’末端を含むPCR断片を、pACN43図22からプライマー0611172と0611173を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpACN43ミニプレッププラスミドDNA、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0611172と0611173、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLのDMSO、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物は、1400塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCRを、上記の産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。PCR反応物50μLは、93ngのENO1プロモーター含有PCR産物前掲;125ngのRKIターミネータ、URA3プロモーター、及び部分的なORF含有PCR産物前掲;1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs;それぞれ100pmolのプライマー0611170と0611173;それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP;1.5μLのDMSO;並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、56°Cにて20秒間、そして72°Cにて2分と45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をでをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、2460塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCR産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドpMhCt017無関係の挿入物を有する標準的なクローニングベクターpUC19を、HindIIIとEcoRIで消化し、10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで37°Cにて30分間処理し、そしてTAEバッファー中の0.9がアガロースゲル電気泳動によって精製し、さらに、約2.6kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。得られたHindIII~EcoRI精製断片は、pUC18YanischPerronCVieiraJandMessingJGene33103119で見られたものと同一であった。そして、先の精製した1250bp及び2460bpのPCR産物を、125ngのpMhCt017のHindIII~EcoRIベクター断片、92ngのPDCプロモーターとTALターミネータPCR産物、165ngのENO1プロモーターとURA3プロモーター、及び部分的なORF含有PCR産物、1×InFusionバッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成される10μLの総反応物容量でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して消化したpMhCt017断片内に挿入した。反応を、37°Cにて分間、50°Cにて15分間インキュベートし、その後、氷上に置いた。次に、反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ApaLI消化によって所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt068と呼んだ。プラスミドpMhCt068は、PDCプロモータ領域とそれに続く、本明細書中に記載した着目の異所性遺伝子の追加のためのNheI及びAscI制限部位、TALターミネータ、ENO1プロモータ領域とそれに続く、本明細書中に記載した着目の第2の異所性遺伝子のクローニングのためのXbaI及びPacI制限部位、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、並びにI.オリエンタリスURA3ORFの5’末端を含んでいる。プラスミドpMhCt068は、PDCプロモーター内に約200bpのAからTへのヌクレオチド変化、PDCプロモータ内にその約2/3にGからTへの変化、並びにNheI制限部位の5’側に存在する未熟開始コドンATGを持つことがわかった。従って、pMhCt068の修正版を、以下で記載するように構築した。PDCプロモータ領域を、pACN5図19からプライマー0611166と0611828を用いてPCR増幅し、これで、上記の望ましくない開始コドンを導入することはない。PCR反応物50μLは、1μLの1~50倍希釈のpACN5のミニプレップ、1×ThermoPol反応バッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611166と0611828、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、2μLの100mMMgSO4、並びに2単位のVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、94°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ94°Cにて30秒間、54°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約780塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。そして、PDCプロモーター含有PCR産物を、先に記載したように、TALターミネータ含有PCR産物に融合させた。TALターミネータPCR断片は0611168プライマーを用いて作製したので、得られたPCR融合産物は、未熟開始コドンを欠き、且つ、望ましくない開始コドンを含んでいる産物を伴った混合物のはずである。得られた~1250bpのPCR産物を、精製し、そしてInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechによってRKIターミネータ、URA3プロモーター、及び先に記載した融合PCR産物とpUC18を含む部分的なORFと組み合わせた。予想されるApaLI消化パターンをもたらすクローンは、PDCプロモーター内の変異群の所望の不存在、及びNheI制限部位の未熟ATG5’の欠損を含めて、DNA配列決定によって正しいことが示され、そしてpMhCt082と呼ばれた。右側断片の構築空ベクターである右側構築物pMhCt069を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。I.オリエンタリスURA3ORFの3’末端、URA3ターミネータURA3終止コドンの275bp下流、URA3プロモーター酵母宿主内への組み込み後にマーカーのループアウトための反復領域として機能する及び所望の追加制限部位、並びにフランキングDNAを含むPCR断片を、pACN43図22からプライマー0611174と0611175を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpACN43ミニプレッププラスミドDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611174と0611175、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1210bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。TDH3プロモータ領域と所望の追加制限部位を含むPCR断片、及びフランキングDNAを、pACN23図20からプライマー0611176と0611177を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpACN23ミニプレッププラスミドDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611176と0611177、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1028bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリスPDC遺伝子領域の終止コドンの3’領域PDCターミネータ領域と所望の追加制限部位を含むPCR断片、及びフランキングDNAを、I.オリエンタリスゲノムDNAからプライマー0611178と0611179を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、100ngのI.オリエンタリスゲノムDNA、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0611178と0611179、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLのDMSO、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約938塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCRを、先に記載した最後の2つのPCR産物の両方を融合して一つの増幅産物を作製するのに使用した。PCR反応物50μLは、125ngTのDH3プロモーター含有PCR産物、114ngのPDCターミネータ領域含有PCR産物、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611176と0611179、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、56°Cにて20秒間、そして72°Cにて2分と30秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、1966塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして、製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、精製した1210bpのPCR産物と、上記からの1966bpのPCR融合産物を、先に記載したHindIII及びEcoRI消化pMhCt017断片内に、InFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して、125ngのpMhCt017HindIII~EcoRIベクター断片、54ngのURA3ORFの3’末端とそれに続くURA3ターミネータを含むPCR産物は、200ngのTDH3プロモーター及びPDCターミネータ融合PCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成される10μLの総反応物容量中で挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ApaLI消化によって所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、pMhCt069と呼んだ。プラスミドpMhCt069は、I.オリエンタリスURA3マーカーの3’末端、対応するURA3ターミネータ、URA3プロモーター後のURA3マーカーのループアウトための、TDH3プロモーター、異所性発現のための所望遺伝子のサブクローニングのためのXbaI及びPacI制限部位、並びにPDC遺伝子座の3’フランキング領域を含んでいる。実施例2F:adh9091遺伝子座において複数の外来遺伝子を発現するための挿入ベクター断片の構築:以下の挿入ベクター断片を、内在性I.オリエンタリスadh9091遺伝子を本明細書中に記載した着目の複数の遺伝子を発現するカセットに置き換えるために、実施例2Eに記載のものと同様のアプローチを使用して設計した。左側断片の構築空ベクターである左側構築物pGREr125を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。I.オリエンタリスadh9091遺伝子座における相同組み換えに必要である5’隣接部を含んだ構築物、並びに空の発現カセットPDCプロモーター/TALターミネータを、ベクタープラスミドpCR2.1-TOPOInvitrogen内にPCRクローン化した。PDCプロモーター断片を、プラスミドpACN5図19からプライマー0611250と0611251を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN5DNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611250と0611251、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約900bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約753bpであり、断片の5’末端にNotI制限部位があり、且つ、断片の3’末端にPacI及びXbaI制限部位がある。プライマー0611252と0611253を使用してプラスミドpACN5図19からTALターミネータ領域を増幅するために、XbaI及びPacI制限部位を含む先のPCR産物に対する5’相同性を含む第2のPCR断片を作製した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN5DNA前掲、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611252と0611253、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約900bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約435bpであり、断片の5’末端にXbaI及びPacI制限部位があり、3’末端にはPmeI制限部位があった。753bpの断片と435bpの断片を、プライマー0611250と0611253を使用したPCRによって1つに融合させ、そして、PDCプロモーターがTALターミネータの上流にある1149bpの断片を得た。PCR反応物50μLは、125ngの753bpの断片、75ngの435bpの断片、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611250と0611253、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1149bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。プライマー0611254と0611255を使用してI.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’隣接部を増幅するために、NotI制限部位を含む、先の1149bpのPCR産物に対して3’相同性を含むPCR断片を作製した。PCR反応物50μLは、15ngの鋳型DNAとしてのプラスミドpHJJ27図21、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611254と0611255、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約900bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約891bpであり、断片の5’末端にはHpaI制限部位があり、且つ、3’末端にはNotI制限部位があった。そして、891bpの断片を、プライマー0611254と0611253を使用したPCRによって1149bpのPDCプロモーター/TALターミネータ断片の上流に融合させ、そして約2005bpの断片を作製した。PCR反応物50μLは、125ngの1149bpの断片、95ngの891bpの断片、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611254と0611253、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約2005bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。adh9091遺伝子座における組み込みのための5’隣接部を含む2005bpの得られた断片、PDCプロモーター、及びTALターミネータを、製造業者の取扱説明書に従ってTOPOTACloningキットInvitrogenを使用して、pCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、AvaI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを確認し、そしてpGMEr112と呼んだ。プラスミドpGMEr112は、adh9091遺伝子座における相同組み換えのための5’隣接部と、それに続く空の発現カセットPDCプロモーター/TALターミネータを含む。URA3プロモーター断片によって駆動される切断5’URA3マーカー遺伝子を、プラスミドpHJJ27図21からプライマー0611283と0611263を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpHJJ27、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611263と0611283、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約900bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約885bpであり、断片の5’末端にはHpaI及びPmeI制限部位があり、且つ、3’末端にはNheI制限部位がある。得られた885bpの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPOTACloningキットInvitrogenを使用してpCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BglI消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを確認し、そしてpGMEr108と呼んだ。プラスミドpGMEr108は、URA3プロモーターとそれに続く、URA3遺伝子の切断5’セグメントを含んでおり、そうした断片には、5’末端にHpaI及びPmeIが、3’末端にNotI制限部位が隣接する。5’adh9091隣接部とそれに続く、構築物PDCプロモーター/TALターミネータを含んでいる、プラスミドpGMEr112前掲からの1998bpのHpaI及びPmeI制限断片を、HpaI及びPmeIによって線状にしたpGMEr108前掲からの4806bpのベクターに連結した。二重制限反応産物を、1998bpの挿入物断片及び4806bpのベクター断片をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製する、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離した。連結反応を、1:3のベクター:挿入物比を使用して実施した;特に反応物を、2μLの4806bpの線状ベクター、6μLの1998bpの挿入物断片、9μLの2×QuickLigation反応バッファー、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを用いてセットし、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。5μLの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、E.コリXL10Gold登録商標UltracompetentCellsAgilentTechnologiesに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、HindIII消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr117と呼んだ。プラスミドpGMEr117は、5’adh9091隣接部とそれに続く、空の発現カセットPDCプロモーター/TALターミネータ、及びURA3プロモーターによって駆動される切断5’URA3遺伝子を含む。さらに、プラスミドpGMEr117は、異なった2つのXbaI制限部位:着目遺伝子を挿入するのに使用できるPDCプロモーターとTALターミネータの間の且つ、制限部位PacIに隣接する第1の制限部位、及び本来のpCR2.1-TOPO骨格から引き継がれた第2のXbaI制限部位、を担持する。この第2のXbaI制限部位を取り除くために、プラスミドpGMEr117を、制限酵素ApaIで消化し、次に、線状プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って酵素DNAポリメラーゼI、ラージクレノーフラグメントNewEnglandBiolabsで処理した。得られた線形ベクター平滑末端を含むを、制限酵素EcoRVで消化し、そしてそれは、ベクターからXbaI制限部位を含む43bpの断片を切り取った。制限反応産物を、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして6761bpのベクター断片を、ゲルから切り出し、製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。自己連結反応物を、3μLの線状ベクター、6μLの無菌の再蒸留水、10μLの2×QuickLigation反応バッファー、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。5μLの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従ってE.コリXL10Gold登録商標UltracompetentCellsAgilentTechnologiesに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr122と呼んだ。ENO1プロモーター断片を、プラスミドpACN43図22からプライマー0611295と0611296を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN43、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611295と0611296、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1009bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約1009bpであって、断片の5’末端にはPmeI制限部位があり、且つ、3’末端にはApaI及びNruI制限部位がある。NruI及びApaI制限部位を含んでいる、先のPCR産物に対する5’相同性を含む第2のPCR断片を、RKIターミネータ領域を増幅するために、プラスミドpACN43図22からプライマー0611297と0611298を使用して作製した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN43DNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolプライマーの0611297と0611298、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約438bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約438bpであって、その断片の5’末端にはNruI及びApaI制限部位があり、且つ、その断片の3’末端にはPmeI制限部位があった。1009bpのプロモーター断片と438bpのターミネータ断片を、プライマー0611295と0611298を使用したPCRによって1つに融合させ、ENO1プロモーターがRKIターミネータの上流に存在する、約1447bpの断片を得た。PCR反応物50μLは、125ngの1009bpの断片、65ngの438bpの断片、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611295と0611298、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLのDMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1447bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。ENO1プロモーター/RKIターミネータ構築物を含んでいる、得られた1447bpの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPOTACloningキットInvitrogenを使用して、pCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞内に形質転換する。形質転換体を、2×YTampプレート上に平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr114と呼ぶが、それは、空の発現カセットENO1プロモーター/RKIターミネータを含んでいた。プラスミドpGMEr122及びpGMEr114を、37°Cにて3時間、制限酵素PmeIで消化した。末端を脱リン酸化し、そして自己連結を予防するために、それぞれの消化反応を止める約一時間前に、1μLのCalfIntestinalAlkalinePhosphataseNewEnglandBiolabsをそれぞれの消化チューブに加えた。プラスミドpGMEr122からの6761bpの得られたベクター断片、及びプラスミドpGMEr114からの構築物ENO1プロモーター/TALターミネータ1439bpを含んでいる得られた挿入物断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製する、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離した。次に、3μLのプラスミドpGMEr122からベクター断片、4μLのプラスミドpGMEr114からの挿入物断片、2μLの無菌のdd水、10μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseNewEnglandBiolabsを含んでいる、それに続く連結反応物を調製し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。5μLの先の連結反応物のアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってXL10Gold登録商標UltracompetentE.コリ細胞AgilentTechnologiesに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びBstBIを使用した消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定によって確認し、そしてpGMEr125と呼んだ。ENO1プロモーター/RKIターミネータ構築物を、反対方向に挿入し、a及びbと呼ぶ2つのバージョンのプラスミドpGMEr125を得た図4及び5。プラスミドpGMEr125a及びpGMEr125bは、PDCプロモータ領域、TALターミネータ、ENO1プロモータ領域、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、対応するURA3マーカーの5’末端、及びI.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’フランキング領域を含んでいる。右側断片の構築空ベクターである右側構築物pGREr121を、以下で記載するように複数のステップでクローン化した。TDH3プロモーター断片を、プラスミドpACN23図20からプライマー0611256と0611257を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN23DNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611256と0611257、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約994bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約994bpであって、その断片の5’末端にはSfoI制限部位があり、且つ、3’末端にはPacI及びNruI制限部位があった。NruI及びPacI制限部位を含んでいる、先のPCR産物に対して5’相同性を含む第2のPCR断片を、TKLターミネータ領域を増幅するために、プラスミドpACN23図20からプライマー0611258と0611259を使用して作製した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpACN23DNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611258と0611259、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約469bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中で0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約469bpであって、その断片の5’末端にはNruI及びPacI制限部位があり、且つ、3’末端にはNotI制限部位があった。先の994bp及び469bpの断片を、プライマー0611256と0611259を使用したPCRによって1つに融合させ、そしてTDH3プロモーターがTKLターミネータの上流にある約1433bpの断片を得た。PCR反応物50μLは、125ngの994bpの断片、60ngの469bpの断片、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー061159と0611256、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1433bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。NotI制限部位を含んでいる先の1433bpのPCR産物の3’末端に対して5’相同性を含むPCR断片を、adh9091遺伝子座の3’隣接部を増幅するために、プライマー0611260と0611261を使用して作製した。PCR反応物50μLは、鋳型DNAとして15ngのプラスミドpHJJ27DNA図21、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611260と0611261、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1019bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約1019bpであって、その片の5’末端にはNotI制限部位があり、且つ、3’末端にはApaI制限部位があった。次に、1019bpの断片を、プライマー0611256と0611261を使用したPCRによって1433bpのTDH3プロモーター/TKLターミネータ断片の下流に融合させ、そして約2405bpの断片を作製した。PCR反応物50μLは、125ngの1433bpの断片、90ngの1019bpの断片、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611256と0611261、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約2405bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。TDH3プロモーター/TALターミネータ構築物の下流のadh9091遺伝子座における組み込みのための3’隣接部を含んでいる得られた2405bpの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPOTACloningキットInvitrogenを使用してpCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、AvaI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr113と呼んだ。プラスミドpGMEr113は、空の発現カセットTDH3プロモーター/TKLターミネータが前にあるI.オリエンタリスadh9091遺伝子座における相同組み換えのための3’隣接部を含んでいる。プライマー0611264と0611284を使用してプラスミドpHJJ27図21からURA3ORFの切断3’断片、URA3ターミネータ、及びURA3プロモーター先に記載したように酵母宿主への組み込み後のマーカーのループアウトための反復領域として機能するを増幅するために、PCRを使用した。PCR反応物50μLは、15ngのプラスミドpHJJ27DNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611264と0611284、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1324bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は約1324bpであって、その断片の5’末端にはNheI制限部位があり、且つ、3’末端にはApaI及びSfoI制限部位があった。先のゲル精製した1324bpの断片を、製造業者の取扱説明書に従ってTOPOTACloningキットInvitrogenを使用してpCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、HindIII消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr109と呼んだ。プラスミドpGMEr109は、URA3ORFの3’断片とURA3プロモーターとそれに続く、URA3ターミネータを含んでいる。プラスミドpGMEr109内のURA3遺伝子の3’断片の上流部分は、プラスミドpGMEr108内にクローン化された切断5’URA3断片の先端との460bpの相同性を有する。相同部分は、両セグメントを含んでいる構築物を用いた宿主生物の同時形質転換により、機能的選択マーカーを作り出す遺伝子の2つの部分の間での組み換えを可能にする。プラスミドpGMEr109を、KpnIで消化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、DNAポリメラーゼI、ラージクレノーフラグメントNewEnglandBiolabsで処理した。線状pGMEr109プラスミド平滑末端を含むをBamHIで消化した。産物を、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして5247bpのベクター断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。プラスミドpGMEr113を、BamHI及びEcoRVで消化し、そしてそれが、URA3ターミネータとそれに続くURA3プロモーターを伴う構築物TDH3プロモーター/TKLターミネータとそれに続く、URA3ORFの切断3’断片を担持する2466bpの断片をもたらした。二重制限反応産物を、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約2466bpのベクター断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。次に、2466bpのBamHI/EcoRV消化断片を、プラスミドpGMEr109からの5247bpのベクター断片に連結した。連結反応物を、3μLの5247bpの線状ベクター、3μLの2466bpの挿入物断片、3μLの無菌のdd水、10μLの2×QuickLigation反応バッファー、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。5μLの連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、E.コリXL10Gold登録商標UltracompetentCellsAgilentTechnologies内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びPacIを用いた消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr121図6と呼んだ。プラスミドpGMEr121は、I.オリエンタリスURA3マーカーの3’末端とそれに続く対応するURA3プロモーター、TDH3プロモーター、TKLターミネータ、及びadh9091遺伝子座の3’フランキング領域を含んでいる。実施例2G:I.オリエンタリスCNB1の構築I.オリエンタリスCNB1を、以下で記載するように、I.オリエンタリスCD1822から構築したI.オリエンタリスATCCPTA‐6658からI.オリエンタリスCD1822の作出に関する実施例1Aを参照のこと。菌株CD1822に含まれているURA3遺伝子の両方のコピーを、遺伝子工学の選択マーカーとしてこの遺伝子の使用できるように欠失させた。遺伝子の存在ウラシル欠乏培地での成長によると不存在5‐フルオロオロチン酸の存在下での成長によるの両方に利用可能な選択であるため、URA3は酵母遺伝学の多目的マーカーである。URA3遺伝子のうちの1つの破壊を、反復DNA配列が隣接するMEL5選択マーカーを含んでいる選択カセットでの置き換えによっておこなった。次に、MEL5選択カセットについての検査で陽性であった菌株を、MEL5マーカー遺伝子の欠失についてスクリーニングした。そして、第2のURA3遺伝子の欠失を、5‐フルオロオロチン酸の存在下での成長によって選択した。CD1822を、2.8μgのベクターpMI458のSacI/PspOMI消化DNA図27で形質転換した。プラスミドpMI458は、I.オリエンタリスURA3遺伝子の上流の配列P‐loURA3、配列番号253及び下流の配列T‐loURA3、配列番号254に対して相同のDNA断片が隣接するI.オリエンタリスPGKプロモーターP‐loPGK、配列番号247の制御下にあるS.セレビシエMEL5遺伝子配列番号255を含んでいる。P‐loURA3及びT‐loURA3断片は、I.オリエンタリスゲノム内と同じ相対的配向で存在している。約500個のMelコロニーを、30°Cにて5日後に得た。10個のコロニーを、10mLのBFPButterfieldsリン酸バッファーチューブに植菌し、そしてDM1X‐α‐galプレート上で25μLを平板培養することによってシングルコロニーに単離した。次に、初期の単離菌株からの単一ブルーコロニーのそれぞれを、更なる分析のためにYPD上に釣り出した。PCRを、所望の遺伝的事象について形質転換体をスクリーニングするために使用した。PCRスクリーニングで鋳型として使用するためのゲノムDNAを得るために、1.5mLの一晩培養物からの細胞を、スクリューキャップ微小遠心管で遠沈し、0.2mlの2TritonX‐100、1のSDS、100mMのNaCl、10mMのTrisHClpH8.0、1mMのNa2EDTApH8.0溶液中に再懸濁した。10mMのTrispH8.0/1mMのEDTASigmaで平衡化した、0.2mLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール25:24:1混合物、及び0.3gのガラスビーズを加えた。チューブを、Mini‐BeadBeater‐8BioSpecにより全速力で2分間、振盪した。0.2mLのTEは加え、そして、チューブを簡単にボルテックスにかけた。水相を、16100×gにて5分間の遠心分離によって分離した。上清を、新しいチューブに取り出し、そして1mLの100エタノールを加えた。分間5、そして、チューブを、20°Cにて30分間置いておき、16100×gで遠心分離し、そして液体をデカンテーションにより除いた。DNAを、風乾し、そして500μLのTE中に再懸濁した。所望の5’交差についてのPCRスクリーンを、プライマーoCA405とoCA406を使用しておこない、そして1.5kbpの産物を作製した。所望の3’交差についてのスクリーンを、プライマーWG26とCM647を使用しておこない、そして1.6kbpの産物を作製した。pMI458を作製するのに使用されるURA3領域の外側さらに上流又は下流のプライマーは、oCA405とCM647であり、それらは、野性型では3.2kbpの産物を生じ、pMI458破壊対立遺伝子では5.0kbpの産物を生じ、そして、選択マーカーがループアウトされた場合には2.2kbpの産物を生じる。これらのPCR反応物を、55°Cのアニーリング温度を使用しておこなった。PCRはまた、4プライマーアプローチを使用したURA3オープンリーディングフレームの欠失についてのスクリーニングにも使用した。プライマーpJLJ28及びpJLJ29は、アクチン遺伝子の800bpの断片を増幅し、そしてプライマーpJLJ30及びpJLJ31は、URA3遺伝子の600bpの断片を増幅する。1つの反応におけるすべてのプライマーの使用は、内的な陽性対照アクチン断片を提供する。Roche製のTaqDNAポリメラーゼを、製造業者のプロトコールに従って61°Cのアニーリング温度で使用した。菌株1822urahetMEL‐1及び1822urahetMEL‐2を、URA3遺伝子座にMEL5選択カセットが組み込まれたと確認した。次に、KtSEQ1a配列番号256配列とKtSEQ1b配列番号257配列の間の組み換えを起こすことによって、1822urahetMEL‐1及び1822urahetMEL‐2のゲノムからMEL5マーカーは取り除いた。MEL菌株を、約0.5~2.0のOD600までYPD培地中で一晩培養した。次に、培養物を、YPD培地で希釈して約0.00001のOD600に戻した。200μLの培養希釈物を、96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移した。そのプレートを、粘着性のカバーで覆い、そして、最も強く撹拌しながら6~7時間菌株の増殖速度により約6回の細胞分裂、30°Cのインキュベータ内でインキュベートした。各ウェルから100μL1プレートあたり約~1000cfuを、DM1X‐α‐gal培地上で平板培養した。プレートを、30°Cにて一晩又は室温にて2日間インキュベートして、呈色性分化を観察した。ホワイトコロニー推定上mel-を、同様の培地に画線接種し、そして先に記載したようにPCRによってスクリーニングした。2つの独立したループアウトを見つけ出し、1822urahetMEL‐1からの一つを、1822urahetmel‐1として保存し、そして1822urahetMEL‐2からのもう一つを1822urahetmel‐2としてを保存した。不思議なことに、得られたホワイトコロニーの大部分は、2.2kbpの予想したバンドをもたらさなかった。ura-誘導体を得るために、1822urahetmel‐1及び1822urahetmel‐2を、YP5D培地YP100g/Lのデキストロース中で一晩培養し、そして、一晩培養物のアリコート0.5、5、及び50μLをScD‐2×FOAプレート上で平板培養した。FOA耐性コロニーを、シングルコロニー用に画線接種し、そしてScD‐uraプレート上で平板培養することによって、ura-表現型を確認した。1822urahetmel‐2からの2つのコロニーと1822urahetmel‐1からの6つのコロニーを更なる分析のために釣り出した。これらのコロニーを、YPD中で一晩培養し、そして、ゲノムDNAを、上記のフェノール/クロロホルム法を使用して抽出した。URA3オープンリーディングフレームの存在を、PCRでスクリーニングした;8つの菌株のいずれもURA3遺伝子を含まなかった。1822urahetmel‐1の2つのura-子孫を、yJLJ3CNB1及びyJLJ4と命名した。ゲノム配列決定に基づいて、yJLJ3CNB1及びyJLJ4が、URA3遺伝子とすぐ隣のパーミアーゼ遺伝子の両方の欠失を含むと決定した;好ましくはURA3遺伝子だけが欠失していると思う。このパーミアーゼ遺伝子の破壊なしにCD1822のura3栄養要求変異菌株を作製するために、CD1822を、1μgのSacI/ApaI消化pCM208図28で形質転換した。プラスミドpCM208は、I.オリエンタリスURA3遺伝子の隣接領域の上流5’URA隣接部近接、配列番号258と下流3’URA3隣接部近接、配列番号259に対するDNA配列相同性を含んでいる。約200個のMelコロニーを、30°Cにて5日後に得た。8つのブルーコロニーを、ScDX‐α‐galプレート上に画線接種することによって単離した。形質転換体を所望の遺伝的事象についてスクリーニングするために、PCRを使用した。5’交差スクリーンを、プライマーoJY11とoJY12を使用しておこない、そしてそれは、所望の形質転換体で0.9kbpの産物を生じる。3’交差スクリーンを、プライマーoJY13とoJY14を使用しておこない、そしてそれは、所望の形質転換体で1.0kbpの産物を生じる。8つのコロニーのうち3つは所望のPCR産物を示した。これらのコロニーのMELマーカーは、ループアウトされることができるので、先に記載したように、第2のURA3遺伝子は欠失した。あるいは、yJLJ3又はyJLJ4から得られる菌株におけるURA3及びパーミアーゼ遺伝子欠失を、実施例2Hに記載のワンステップ形質転換で解決できる。実施例2H:URA3選択マーカーを含むMBin500対照菌株の構築前掲に記載したように、URA3遺伝子のホモ接合欠失のため、本明細書中に使用したCNB1と呼ばれたI.オリエンタリス菌株は、ウリジン栄養要求変異菌株であった。URA3遺伝子座の異型接合修復を、691bpの5’隣接DNA、及び1500bpの3’隣接DNAを含んでいるURA3遺伝子を含むuraフィックスカセットを含むuraフィックスベクター、pJLJ62図26を使用しておこなった。uraフィックスカセットは、5’NotI制限部位及び3’ApaI制限部位によって隣接する。NotI及びApaIを使用した制限消化を実施し、ベクター骨格から2796bpのuraフィックスカセットを切り出した。消化産物を、製造業者によって指定されているとおりQIAquickPCRPurificationキットQiagenを使用して精製した。DNAを、ガラス蒸留水で溶出し、そして1μgを、I.オリエンタリスCNB1の形質転換に使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、そしてウリジン追加を必要としなかったシングルコロニーを、MBin500と呼んだ。実施例2I:URA3選択マーカーの除去組み込みカセット内に存在している2つのURA3プロモータ領域の組み換えによって、URA3選択マーカー遺伝子を取り除いた菌株を単離するために、着目のura菌株を、3mLのYP10グルコース培地中に植菌し、そして250rpmで振盪しながら37°Cにて少なくとも4時間、そして最長一晩培養した。50‐100μLの培養物を、ScDFOAプレート上で平板培養し、そしてコロニーが現れるまで37°Cにて48~60時間培養した。FOAはURA3タンパク質によって毒性化合物に転換され、そしてura細胞の死滅をもたらすので、FOA上での培養は、URA3マーカーの除去について選択した。いくつかのFOA耐性コロニーを、37°CにてYPDプレート上で培養することによって二度精製した。次に、これらの精製単離菌株を、本明細書中に記載したように、PCRによって適当なURA3ループアウトについてスクリーニングした。実施例2J:ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS‐PAGE分析及び酵素アッセイのための改変酵母菌株の振盪フラスコ培養の手順4mLのura選択培地を14mL容Falconチューブに加え、そして所望の菌株を、無菌の白金耳を使用してこの培地に植菌した。培養物を、250rpmで振盪しながら37°Cにて一晩~16時間培養した。I.オリエンタリス遺伝子座の少なくとも1種類の野生型コピーを持つ菌株については、500μLの一晩培養物を、25mLのYP10グルコース培地の入った125mL容バッフル付きフラスコに加えた。pdcΔ/pdcΔ菌株については、1mLの一晩培養物を、25mLの液体YP100g/Lデキストロース培地の入った125mL容バッフル付きフラスコに加えた。フラスコを、250rpmで振盪しながら37°Cにて培養した。培養物の少量アリコートを、ほとんど1時間おきの間隔で取り出し、そしてOD600を計測した。OD600が4~6になるまで、培養物を培養した。SDS‐PAGE分析のために細胞の少量サンプルを調製するために、2.5OD単位に相当する量の培養物を、培養物から採取し、そして1.5mL容チューブに加えた。細胞を、16100×gにてペレット状にし、上清を取り除き、そして細胞ペレットを-20°Cにて使用まで保存した。培養フラスコ内に残っている細胞を、室温にて2279×gの遠心分離により集菌し、ペレットを、12.5mLの0.85MNaCl中に再懸濁し、次に、室温にて2279×gで遠心分離した。ペレットを、1mLの0.85MNaClで再懸濁し、そして再懸濁細胞を、2.0mL容チューブに移し、次に、16100×gでペレット状にした。次に、上清は取り除き、そして、それらが1週間以内に酵素分析法に使用される場合には、ペレットを-20°Cにて保存し、より長期間の保存のためには-80°Cにて保存した。2.5OD単位に相当する細胞ペレットのSDS‐PAGE分析のために、細胞を、100dH2Oで再懸濁し、次に、100μLの0.2MNaOHを加えた。サンプルを、室温にて5分間インキュベートし、次に、細胞を、16100×gの遠心分離によってペレット状にし、そして100μLのSDSサンプルバッファーBioRadLaboratoriesで再懸濁した。サンプルを、95°Cにて5分間加熱し、そして、細胞を、簡単な遠心分離によってペレット状にした。1~5μLの上清を、製造業者の取扱説明書に従ってCriterion8~16Pre‐CastゲルBioRadLaboratoriesで分析した。バンドを、InstantBlue商標CoomassieBasedStaining溶液ExpedeonProteinSolutions、SanDiegoCAUSAを使用して可視化した。実施例2K:産物分析のための改変酵母菌株の振盪フラスコ培養の手順菌株を、シングルコロニー用にUraSelectionPlates上に画線接種し、30°Cにて1~2日間インキュベートした。種菌用培養物を、UraSelectionPlateからの1~2個のコロニーを植菌した50mLのCNB1振盪フラスコ培地の入った250ml容バッフル付きフラスコ内に調製した。種菌用培養物を、200rpmで振盪しながら30°Cにて約18時間培養した。次に、4~6のOD600に達するまで、培養物の少量アリコートをOD600を計測するために取り出した。残留グルコースの存在を、Uristix登録商標ReagentStripBayer、ElkhartINUSAを使用して計測した。種菌用フラスコ培養物を、50mLのCNB1振盪フラスコ培地の入った125ml容バッフル付きフラスコにOD600=0.2まで植菌するのに使用した。培養物を、30°Cにて140rpmで20時間振盪しながらインキュベートした。ブロスのサンプルを、分析のために以下で記載するように取り出した。サンプルのアリコートを、培養物の吸光度ODを計測するのに使用し、そして、残留グルコースの存在を、Uristix登録商標ReagentStripを使用して計測した。次に、サンプルの残りを遠心分離し、そして上清を産物分析に使用した。実施例2L:産物分析のための改変酵母菌株の発酵手順本明細書中に記載した菌株を、種子繁殖期を使用して培養し、それに続いて2L容バイオリアクターApplikon、FosterCityCAUSAでのシングルステップ発酵をおこなった。種子期の準備のために、25mLの1×DM2培地KOHで所望のpHに調整したを125mL容バッフル付きフラスコに加え、それに続いて無菌の白金耳を使用して着目の菌株を植菌した。培養物を、250rpmで振盪しながら所望の温度で一晩、約16時間培養した。次に、4~6のOD600に達するまで、培養物の少量アリコートをほとんど1時間おきの間隔で取り出して、OD600を計測した。残留グルコースの存在を、Uristix登録商標ReagentStripBayer、ElkhartINUSAを使用して計測した。次に、12mLの培養物を、4mLの無菌の冷蔵75グリセロールに加え、十分に混合し、そして氷上で10分間インキュベートした。次に、培養物とグリセロール混合液を、再び混合し、そして1.0mLを、10個の無菌の1.8mL容クライオバイアルThermoScientific、RochesterNYUSAのそれぞれに等分し、そして-80°Cにて保存した。25mLの種菌用フラスコ培養物を、1.5LのDM2培地が入った2L容バイオリアクターの植菌に使用した。バイオリアクター内での発酵を、約30°C~40°Cの温度にて、約2.0~7.0の範囲内に制御したpH、並びに2~45mMol/L/時間の範囲内の酸素吸収速度OURにつながる撹拌及び通気条件下で実施した。本明細書中に提示した実施例において、バイオリアクターにおける培養のための温度、pH、及びOURは、それぞれ30°C、4.0、及び25~30であった。発酵ブロスのサンプルを、分析のために定期的に取り出した。簡単に言えば、サンプルのアリコートを、培養物の吸光度OD、グルコース濃度、及びpHを計測するのに使用した。そして、サンプルの残りを遠心分離した。ペレットを、酵素アッセイのために-80°Cにて保存し、そして、上清を、3‐HP及び他の細胞外の化合物の分析に使用した。本明細書中に報告した全3‐HP産生値は、別段の指定がない限り、発酵の48時間の時点についてである。発酵工程中の二酸化炭素産生と酸素消費を、バイオリアクターから排気される気体中の二酸化炭素含量及び酸素含有量を測定することによって計測した。実施例2M:改変酵母菌株によって産生される3‐HP及びβ‐アラニンの分析手順培養物のサンプルを、1のギ酸中への10×希釈で酸性化し、そして0.46μmの96ウェルフィルタープレートを通して濾過した。サンプル中の被分析物濃度によっては、水で更なる希釈をした。更なる10×希釈を、1mMのNH4Ac、0.1のNH3、及び5mg/Lの13C均一標識3‐HP3‐HPの内部標準として、又は1のギ酸及び3mg/Lの13C均一標識β‐アラニンβ‐アラニンの内部標準としてのサンプルバッファー中でおこなった。総希釈係数は、β‐アラニン又は3‐HPの濃度によって約100~1000を使用した。2μLのサンプルを、表6で列挙した機器の設定及びカラムを使用して、Agilent6410TripleQuadMSMS検出装置を備え、MassHunterプログラムによって制御されたAgilent1200HPLCAgilentに注入した。定量化イオンフラグメントピーク面積対内部標準からのその安定同位体対応物の比を、イオン抑制効果及び機器のドリフティングを排除するために定量化に使用した。標準偏差は、日々のアッセイごと5未満であった。実施例3:3‐HP発酵経路遺伝子を発現する改変酵母菌株様々な3‐HP発酵経路に関与する酵素をコードする1若しくは複数の遺伝子を、酵母宿主細胞内で単独又は組み合わせで発現させることができる。3‐HP経路酵素は、外来遺伝子から発現されても、内在性遺伝子から発現されても、又はその組み合わせから発現されてもよい。発現されるべき外来遺伝子は、遺伝子発現構築物、例えば、実施例2に記載の発現構築物、を使用して酵母細胞内に導入してもよい。外来遺伝子は、単独の部位にも、複数の位置にも宿主酵母ゲノム内に組み込まれることができ、且つ、外来遺伝子の組み込みは、以下で記載するように、挿入部位における標的遺伝子の欠失又は破壊と対にされてもよい。実施例3A:アスパラギン酸/マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株経路に関与する1若しくは複数の酵素を発現することによって、PEP及び/又はピルバート、OAA、アスパラタート、β‐アラニン、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を操作できる。発現遺伝子には、PPC、PYC、AAT、ADC、BAAT、gabT、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む、HIBADH、又は4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数が含まれ得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然のものである遺伝子から得られる。例えば、酵母宿主細胞がI.オリエンタリスである場合、発現遺伝子は、I.オリエンタリスPYC例えば、配列番号2に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号1に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスPYC遺伝子、AAT例えば、配列番号14に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号13に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスAAT遺伝子、BAAT例えば、配列番号20に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号19に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むI.オリエンタリスpyd4相同性遺伝子、又は3‐HPDH例えば、配列番号26に規定するアミノ酸配列をコードする、及び/又は配列番号25に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むYMR226C遺伝子に対するI.オリエンタリス相同体遺伝子から得られる。酵母宿主細胞が別の3‐HP耐性酵母菌株である場合、当該技術分野で公知の技術を使用して遺伝子配列を得ることができ、そして、経路遺伝子の天然相同体を、外来的に又は外来性調節要素と組み合せて発現させることができる。天然の経路遺伝子は、1若しくは複数のPPC、PYC、AAT、BAAT、及び/又は3‐HPDH遺伝子を含み得る。あるいは、発現される3‐HP遺伝子のうちの1若しくは複数が、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得ることもできる。例えば、酵母宿主細胞がI.オリエンタリスである場合、細胞は、1若しくは複数の非天然のPYC遺伝子、例えば、配列番号3のアミノ酸配列をコードするR.スフェロイデスPYC遺伝子、配列番号4のアミノ酸配列をコードするR.エトリPYC遺伝子、配列番号5又は6のアミノ酸配列をコードするP.フルオレッセンスPYC遺伝子、配列番号7のアミノ酸配列をコードするC.グルタミクムPYC遺伝子、又は配列番号8のアミノ酸配列をコードするS.メリロティPYC遺伝子など;1若しくは複数の非天然のPPC遺伝子、例えば、配列番号10のアミノ酸配列をコードするE.コリPPC遺伝子、配列番号11のアミノ酸配列をコードするM.サーモオートトロフィカムPPC遺伝子、又は配列番号12のアミノ酸配列をコードするC.パーフリンゲンスPPC遺伝子など;1若しくは複数の非天然のAAT遺伝子、例えば、配列番号16のアミノ酸配列をコードするE.コリaspC遺伝子又は配列番号15のアミノ酸配列をコードするS.セレビシエAAT2遺伝子など;1若しくは複数の非天然のADC遺伝子、例えば、配列番号17のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号130、145、146、又は147のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むS.アベルミチリスpanD遺伝子、配列番号18のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号131に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むC.アセトブチリカムpanD遺伝子、配列番号133のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号132に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むH.ピロリADC遺伝子、配列番号135のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号134に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むバチルス属TS25ADC遺伝子、配列番号137のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号136に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むC.グルタミクムADC遺伝子、又は配列番号139のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号138、148、149,150、又は151のいずれか1つに規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むB.リチェニフォルミスADC遺伝子など;1若しくは複数の非天然のBAAT又はgabT遺伝子、例えば、配列番号21のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号142に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むS.クルイベリpyd4遺伝子、配列番号22のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号140に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むS.アベルミチリスBAAT遺伝子、配列番号23に規定するアミノ酸配列をコードするS.アベルミチリスgabT遺伝子、又は配列番号24に規定するアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号141に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むS.セレビシエUGA1遺伝子など;1若しくは複数の非天然の3‐HPDH遺伝子、例えば、配列番号27のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号143に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むE.コリydfG遺伝子又は配列番号129のアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号144に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むS.セレビシエYMR226C遺伝子など;1若しくは複数の非天然のマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子、例えば、配列番号29に規定するアミノ酸配列をコードする及び/又は配列番号343に規定するヌクレオチド配列のコード領域を含むM.セデュラマロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子など;1若しくは複数の非天然のHIBADH遺伝子、例えば、配列番号28に規定するアミノ酸配列をコードするA.フェカリスM3A遺伝子、それぞれ配列番号30又は配列番号31に規定するアミノ酸配列をコードするP.プチダKT2440又はE23440mmsB遺伝子、又は配列番号32に規定するアミノ酸配列をコードするP.エルギノーサPAO1mmsB遺伝子など;及び/又は1若しくは複数の非天然の4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、例えば、配列番号に33に規定するアミノ酸配列をコードするR.ユートロファH164hbd遺伝子又は配列番号34に規定するアミノ酸配列をコードするC.クルイベリDSM555hbd遺伝子など、を発現するように操作され得る。実施例3A‐0:酵素活性は、アスパラギン酸/マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株の酵素活性アッセイ酵素アッセイ用の未精製無細胞抽出物CFEの調製:振盪フラスコ又はバイオリアクタ培養からの本明細書中に示した細胞を、遠心分離で回収し、上清を捨て、そして、細胞ペレットを、先に記載したように-80°Cにて保存した。CFEの調製のために、細胞ペレットを、解凍し、リン酸緩衝食塩水PBSで洗浄し、そして再び遠心分離で回収した。上清を捨て、そして細胞ペレットを、2.0mL容微小遠心管内で、1のProteaseInhibitorCocktail、P8215Sigmaを含んでいる約等量の溶解バッファー中に再懸濁した。約300μLの0.5mmジルコニアビーズBioSpecを加え、そして、細胞分解を、6/20秒の設定にて3ラウンド、FastPrep登録商標‐24破壊器MPBiomedicalsで実施した。各ラウンドの間、サンプルチューブを氷で5分間冷やした。溶解後に、サンプルを、最高速度の微小遠心分離器により4°Cにて15分間遠心分離した。上清を新しい1.5mL容チューブに移し、そして氷上に維持した。溶解物中の総タンパク質濃度、及び標準としてのウシ血清アルブミンを、製造業者によって規定される取扱説明書に従って、Bio‐Radタンパク質分析試薬ブラッドフォードアッセイを使用して測定した。ピルビン酸カルボキシラーゼPYC活性:本明細書中に示した細胞のCFEのピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてCFEに組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した:TrispH8.0、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.2mM;ATP、1mM;アセチルCoA、1mM;ピルバート、1mM;ビオチンアッセイするPYC酵素に必要であれば、5μM;ウシ心臓リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応物を開始させる。NADHの消費を、SpectraMax340PCプレートリーダを使用して340nmにて観察した。ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を、nmolNADH消費/秒/mgタンパク質と表現する。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼPPC活性:CFEのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼPPC活性を、以下の通り測定し得る。アッセイ反応混合物においてCFEと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製する:TrispH8.0、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.1mM;アセチルCoA、0.5mM;ホスホエノールピルビン酸、3.3mM;ウシ心臓又はブタ心臓リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応を開始させた。NADHの消費を、SpectraMax340PCプレートリーダを使用して340nmにて観察する。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAAT活性:本明細書中に示した細胞のCFEのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、以下の通り測定した。アッセイ反応混合物においてCFEと組み合わせられた場合に、以下の成分終濃度を提供する、ストック反応ミックス溶液を調製した:100mMのTrispH8.0、100mM;NaHCO3、10mM;MgCl2、5mM;NADH、0.1mM;アスパラタート、1mM;ケトグルタル酸、1mM;リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、0.02単位/mL。いくつかのアッセイにおいて、ストック反応混合物はまた、ピリドキサール5’‐リン酸0.1mMも含んでいた。270μLのこの混合物を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加え、そして、30μLの適切に希釈したCFEを加えて、反応を開始させた。NADHの消費を、SpectraMax340PCプレートリーダを使用して340nmにて観察した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を、nmolNADH消費/秒/mgタンパク質と表現する。アスパラギン酸デカルボキシラーゼADC活性:本明細書中に示した細胞のCFEのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を、以下の通り測定した。165μLの100mMNH4AcバッファーpH6.8及び25μLの80mMアスパラタートを、37°Cに温度設定した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、10μLのCFEを加えることによって開始させた。異なった時間間隔5、10、15、20、25、30、40、60分に、20μLのサンプルを、反応混合物から取り出し、そして180μLのクエンチングバッファー2のギ酸内部標準としての2mg/Lの13C標識β‐アラニンに加えた。濾過後に、サンプル中のβ‐アラニンを、LC/MS/MSによって分析した。β‐アラニン対時間のプロットからスロープを得た。活性は、反応物中の総細胞タンパク質濃度でスロープを割ることによって計算した。ADC活性を、μmol形成されたβ‐アラニン/秒/gタンパク質と表現する。変法ADCアッセイを、いくつかの実験に使用した。これらの場合では、本明細書中に示した細胞のCFEのADC活性を、以下の通り測定した。110μLの100mMNH4AcバッファーpH7.6及び80μLの25mMアスパラタートNaOHで中和後を、40°Cに温度設定した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、10μLのCFEを加えることによって開始させた。異なった時間間隔2、4、6、8、10分に、20μLのサンプルを、反応混合物から取り出し、内部としてのβ‐アラニン標準に標識であった180μLのクエンチングバッファー2のギ酸2mg/Lの内部標準としての13C標識β‐アラニンを伴う又は2のギ酸中でクエンチし、次に、1:10で20メタノール/80水2mg/Lの内部標準としての13C標識β‐アラニンを伴う中に移したに加えた。濾過後に、サンプル中のβ‐アラニンを、LC/MS/MSによって分析した。β‐アラニン対時間のプロットからスロープを得た。活性は、反応物中の総細胞タンパク質濃度でスロープを割ることによって計算した。ADC活性を、μmol形成されたβ‐アラニン/秒/gタンパク質と表現した。β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT活性:CFEのβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT活性を、以下の通り測定した。100mMのNH4HCO3pH7.6、8mMのα‐ケトグルタル酸、0.5mMのアセチル‐CoA、0.1mMのピリドキサール‐5’‐リン酸、及び200mMのβ‐アラニンを含む190μLの反応混合物を、室温にて96ウェルマイクロタイタープレートに加えた。反応を、10μLのCFEを加えることによって開始した。それぞれ20μLのサンプルを、2、4、6、8、10、12、15、及び20分に取り出し、そして75μLのクエンチングバッファー2.5のギ酸に加えた。サンプルを、中和し、そして5μLの10MNaOH及び50μLの100mMNaCO3pH10を加えることによって、pHを制御した。濾過したサンプルを、注入時にOPAo‐フタルジアルデヒド試薬10mg/mLAgilentTechnologies5061‐3335と混合することによって誘導体化した。OPAで誘導体化したグルタミン酸を、HPLC分離後に蛍光検出340nmの励起;460nmの発光によって定量化した。15μLのサンプルを、5μmパッキングPhenomonex150×4.6mmを用いた分析逆相GeminiC18カラムに注入した。カラムを、62.5の20mMリン酸緩衝液pH7.8A及び37.5のメタノールBで平衡化した。線形グラジエントは、以下の通りであった:40のBに勾配、0~0.3分;40のB、0.3~1分;85のBに勾配、1~1.75分;85のB、1.75~2.25分;37.5に勾配、2.25~3分;37.5のB、3~4分。流量は2mL/分であった。反応バッファー中のグルタミン酸の検量線を、サンプルの濃度を決定するのに使用した。スロープを、[グルタミン酸]対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性:本明細書中に示した細胞のCFEの3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、以下の通り測定した。100mMのNH4HCO3pH7.6中の希釈典型的に100×希釈CFE190μL、及びNADPHを、37°Cに温度設定した96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。反応を、10μLの60mMマロン酸セミアルデヒドMSA、10mMのH2SO4中の200mMのMSAストック溶液から10mMのH2SO4中に新たに調製したを加えることによって開始した。それぞれ20μLのサンプルを、1、2、4、6、8、10、及び12分に取り出し、そして80μLの熱湯中でクエンチした。冷却後に、75μLの冷却混合物を、75μLのバッファーの含有の2mMのNH4AcpH6.8及び3mg/Lの13C標識3‐HPと混合する。濾過後に、サンプル中の3‐HPを、LC/MS/MSによって定量化した。スロープを、3‐HP対時間プロットから得た。活性を、スロープを反応物中の総細胞タンパク質濃度で割ることによって計算した。3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、nmol形成されたNADPH/秒/mgタンパク質と表現する。変法3‐HPDHアッセイを、いくつかの実験に使用した。これらの場合には、本明細書中に示した細胞のCFEの3‐HPDH活性を、以下の通り測定した。マロン酸セミアルデヒドの減少を、340nmでの経時的なNADPHの消滅をたどることによって計測した。マロン酸セミアルデヒドを、Yamada及びJacobyYamadaEWJacobyWB1960DirectconversionofmalonicsemialdehydetoacetylcoenzymeAJournalofBiologicalChemistryVolume235Number3pp589594によって開発されたプロトコールに従って合成した。アッセイを、96ウェルマイクロプレート上でおこない、そして、終量は200μLであった。反応を、170μLのアッセイバッファー2mMのマロン酸セミアルデヒド、100mMのTrispH8.0及び0.5mMのNADPH中に30μLのCCEを追加することによって開始させた。340nmの吸収度を、室温~25°Cにて10分間、マイクロプレートリーダーSpectraMax340PC、MolecularDevicesLLC、SunnyvaleCAにより追跡した。一単位の3‐HPDH活性を、マロン酸セミアルデヒドの存在下、1分以内に1μmolのNADPHを酸化するのに必要な酵素の量と規定する。実施例3A‐1:adh1202遺伝子座においてアスパラギン酸デカルボキシラーゼADCを発現するための挿入ベクターいくつかのアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、そしてGeneArt登録商標Burlingame、CAUSAによって合成し、表7で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターpMA‐Tに至り、そしてXbaI及びPacI制限消化によってベクターから取り出せる。次に、制限断片を、遺伝子をPDCプロモーター及びターミネータの制御下に置くpMIBa107の同じ部位内にクローン化できるので、組み込みがI.オリエンタリスadh1202遺伝子座で起こるようにできる。プラスミド1045172、105387、105388、105389、105390、及び105391を、XbaI及びPacIで消化し、TBEバッファーを使用した1.3アガロースゲルで泳動した。ADCpanD遺伝子に相当するそれぞれの消化からの400~500bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。プラスミドpMIBa107を、XbaIとPacIで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、そしてベクターバンドを、TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動法後に精製した。XbaIとPacIで消化したpanD断片を、製造業者の取扱説明書に従ってT4DNAリガーゼとQuickLigation反応キットNewEnglandBiolabsを使用してこの精製pMIBa107ベクターに連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、XL10GoldULTRA細胞AgilentTechnologies内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。各反応物からの24の形質転換体を2×YTampプレートに釣り出した。4つのそれぞれの得られた形質転換体からのミニプレップDNAを、ApaI、NcoI、及びSad消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定で正しいと確認し、そして表7に示したように呼んだ。得られたプラスミドは、順方向に向いた発現カセットを用いたadh1202遺伝子座におけるそれぞれのADC遺伝子の組み込みを可能にする。それぞれ約10μgのそれぞれの組み込み構築物を、ApaIとKpnIで消化し、そして89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲルで泳動した。各プラスミドの約4450bpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAquickゲル抽出キットQiagenを使用して抽出した。精製産物の濃度が、39~138ng/μlであることがわかった。ApaIとKpnIで消化した組み込み構築物からの0.39~1.4μgの断片を、先に記載したようにI.オリエンタリスCNB1に形質転換した。形質転換体を、ura選択培地に平板培養し、37°Cにてインキュベートし、ura選択培地に再び画線接種し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。ゲノムDNAを、URA3コロニーから調製し、そしてPCRによってチェックして組み込みを確認した。組み込みを確認するために2.5kbpの断片を増幅するために、プライマー0611718と0611632を使用した。各PCR反応物は、25μLの終量に2.5μLのゲノムDNA、それぞれ12.5pMのプライマー0611718と0611632、1×CrimsonTaq商標反応バッファーNewEnglandBiolabs、0.2mMのdNTPミックス、0.625単位のCrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。増幅反応物を、95°Cにて30秒間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間、50°Cにて30秒間、そして68°Cにて3分間を30サイクル;68°Cにて10分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。各構築物のための2つのURA3確認形質転換体を、表7に示したように呼んだ。これらの菌株は、I.オリエンタリスからのPDCプロモーターとターミネータによって駆動される発現を伴う、指示したADC遺伝子にとってadh1202において異型接合である。表7で列挙した菌株及び陰性対照としての菌株MBin500、前掲からのPanD発現と酵素活性を試験した。それぞれの菌株の一晩培養物を、YPDON中で37°Cにて一晩培養し、125mL容バッフル付きフラスコ内、37°Cにて25mLの新しいYPD中に1:50に希釈し、そしてOD600~2‐8まで培養した。次に、細胞ペレットを、CFEを調製するのに使用し、そしてそれを、前掲に記載したようにADC活性についてアッセイした。代表的な結果を表8に示す。次に、yWTY5‐17とyWTY7‐25のホモ接合バージョンを作製した。最初に、ura-誘導体yWTY5‐17とyWTY7‐25を、先に記載したように単離した。ゲノムDNAを、FOA耐性コロニーから調製し、URA3選択マーカーの欠失を確認するために先に記述のとおりPCRによってチェックした。プライマー0611718と0611632を、uraマーカーが存在している組み込みのための2.4kbpの断片、及び、uraマーカーがない1100bpの断片を増幅するのに使用した。プライマー0611718と0611632を用いて1100bpのPCR断片をもたらしたUra-菌株のyWTY5‐17及びyWTY7‐25を、それぞれMIBa331及びMIBa332と呼んだ。それぞれ10μgのpWTY10‐0033‐5とpWTY10‐0033‐7を、ApaI、KpnI、及びNcoIで消化し、そして89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用した1アガロースゲルで泳動した。各プラスミドに関して約4450bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して抽出した。pWTY10‐0033‐5とpWTY10‐0033‐7からの精製断片を、先に記載したように、それぞれMIBa331とMIBa332に形質転換した。形質転換体を、ura選択培地に平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートし、次に、ura選択培地に再び画線接種し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。ゲノムDNAを調製した、そして先に記載したようにCrimsonTaq商標PCRを実施して、組み込みを確認した。プライマー0611718と0611632は、uraマーカーが存在している組み込みに関して2.4kbpの断片を増幅し、uraマーカーがないとき1100bpの断片を増幅する。プライマー0611718と0611632を用いて1100bpと2.4kbpのPCR断片をもたらしたMIBa331とMIBa332の形質転換体を、保存し、それぞれMIBa338とMIBa337と呼んだ。MIBa337は、adh1202遺伝子座におけるS.アベルミチリスからのADC遺伝子のホモ接合であり、そして、MIBa338は、adh1202遺伝子座におけるB.リチェニフォルミスからのADC遺伝子のホモ接合である。両菌株とも、I.オリエンタリスからのPDCプロモーターとターミネータ下でそれぞれのADC遺伝子を制御する。panDホモ接合菌株MIBa337及びMIBa338からのADC発現と酵素活性を、異型接合panD菌株yWTY5‐17及びyWTY7‐25と比較した。培養物を、YPD中で37°Cにて一晩培養し、次に、37°Cにて125mL容バッフル付きフラスコ内で25mLの新しいYPD中に1:50に希釈し、そしてOD600~2‐8まで培養した。細胞ペレットをCFEを調製するのに使用し、次にそれを、先に記載したようにADC活性についてアッセイした。2回の独立した実験の代表的な結果を、表9Aに示す。菌株MIBa337とMIBa338から調製したCFEのADC活性の比較のための第3の独立した実験の結果を、表9Bに示す。上記のサンプルのSDS‐PAGE分析は、MIBa338からのpanD発現がこれらの菌株の中で最も高いことを示した。本明細書中に記載した方法を使用して、菌株MBin500、MIBa337、及びMIBa338を、3‐HP生産についてバイオリアクター内で評価した。対照菌株MBin500は、検出可能な3‐HPを生じなかった2回の独立した発酵の平均。菌株MIBa337は、1.33g/Lの3‐HPを生じ実施した1回の発酵、そして菌株MIBa338は、3.15g/Lの3‐HPを生じた3回の独立した発酵の平均。菌株MIBa337とMIBa338の個々の発酵を、それらの3‐HP生産能力とADC活性に関してさらに比較した表10。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、3‐HP生産能力を、細胞質量の単位あたりの3‐HP濃度[g/L3‐HP]/[g/L乾燥細胞重量]と表現するとして表10で報告する。バチルスリケニホルミスpanD遺伝子菌株MIBa338対ストレプトマイセスアベルミチリスpanD遺伝子菌株MIBa337を使用したとき、結果は、改善されたADC活性及び3‐HP生産能力を示す。実施例3A‐2:adh1202遺伝子座においてβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT又は3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現するための挿入ベクターS.アベルミチリスからのBAAT、S.セレビシエからのUGA1、S.クルイベリからのPYD4、S.セレビシエからのYMR226c、及びE.コリからのydfGのI.オリエンタリスのコドン最適化バージョンを、GeneArt登録商標によって合成し、そして以下で列挙したプラスミドを得た。合成遺伝子は、ベクターpMA‐Tに至り、そしてXbaIとPacIを使用した消化によってベクターから取り出せる。次に、消化断片を、pMIBa107の同じ部位にクローン化し、PDCプロモーターとターミネータの制御下にその遺伝子を置き、そしてadh1202遺伝子座において組み込みが起こるようにできる。プラスミド1054168、1054169、1054170、1054171、1054172、及び1054173を、XbaIとPacIで消化し、そして89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。1045168から761ydfGbp、1045169から1430UGA1bp、1045170から1370BAATbp、1045171から1442PYD4bp、又は1045173から814YMR226cbpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。プラスミドpMIBa107を、XbaIとPacIで消化し、続いてCIPで処理し、そして7.9kbpの線状断片を得た。消化産物を、QIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。次に、ydfG、UGA1、BAAT、PYD4、又はYMR226cの消化断片を、本明細書中に記載したようにT4DNAリガーゼを使用してpMIBa107XbaIとPacIで消化し、そしてCIPで処理したに連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaIとPacIでの消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいことを確認し、そしてそれぞれydfG、BAAT、UGA1、YMR226c、又はPYD4のためのpMIBa120、pMIBa121、pMIBa122、pMIBa123、及びpMIBa124と呼んだ。得られたプラスミドは、順方向に向けられた発現カセットを用いたadh1202遺伝子座において所望遺伝子の組み込みを可能にする。表11の組み込み構築物を、PDCプロモーターとターミネータの制御下のadh1202遺伝子座に、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した着目の遺伝子を組み込むために使用した。発現カセットはまた、本明細書中に記載したように、ura-宿主内の形質転換体の選択を可能にするURA3選択マーカーも含んでいる。発現カセットとadh1202ホモロジー領域は、プラスミドからの断片の切り出しを可能にするために、ApaI及びKpnI制限部位が隣接している。それぞれ15μgの表11の組み込み構築物を、ApaI、KpnI、及びNcoIで消化し、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。NcoIによる消化は、ベクター骨格を壊すので、アガロースゲルから着目の断片を抽出するのがより簡単になる。pMIBa120、pMIBa121、pMIBa122、pMIBa123、及びpMIBa124からの、それぞれ4884bp、5493bp、5553bp、4937bp、及び5565bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。精製産物の濃度は、80~120ng/μLにあるのがわかった。0.8~1.2μgのpMIBa120‐4からの制限断片を、本明細書中に記載したように、I.オリエンタリスCNB1ura-内に形質転換した。次に、形質転換体を、ura選択培地に平板培養し、そして室温にて60時間培養した。形質転換体を、ura選択培地に再び画線接種し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。それぞれのいくつかの形質転換体を、組み込みを確認するためにコロニーPCRによってチェックした。正しい組み込みを、組み込みの5’末端と3’末端をチェックする、そして以下で列挙するプライマー対を使用することによって確認した。プライマー0611717が、逆方向のPDCプロモーターにアニールするのに対して、プライマー0611225は、順方向のURA3選択マーカーにアニールする。プライマー0611631と0611632は、それぞれ順方向と逆方向で組み込み部位の外側にアニールし;プライマー0611717と0611631は、正しい組み込み体では976bpの断片を増幅し;プライマー0611225と0611632は、正しい組み込み体では1.4kbpの断片を増幅し;そして、プライマー0611631と0611632は、2.7kbpの断片を増幅し、それは野生型染色体を示しているので、組み込みに対しては~5kbpの断片を増幅する。ゲノムDNAを作製するために、それぞれの形質転換体の1つのコロニーを、TE中の0.05U/μLのlyticaseSigma、StLouisMOUSA50μL中、37°Cにて30分間インキュベートし、続いて、95°Cにて10分間インキュベトした。組み込みを確認するために、PCRを、本明細書中に記載したように実施した。0611717と0611631を用いて976bp、0611225と0611632を用いて1.4kbp、及び0611631と0611632を用いて2.7kbpのPCR断片をもたらすそれぞれの異型接合組み込み体の1つの形質転換体を保存し、そして表11に示すようにMIBa308、MIBa309、MIBa310、MIBa311、及びMIBa312と呼んだ。形質転換体MIBa308、MIBa309、MIBa310、MIBa311、及びMIBa312の培養物を、YPD中で37°Cにて一晩培養した。次に、培養物を、37°Cにて125mL容バッフル付きフラスコ内の25mLの新しいYPDで1:50に希釈し、そしてOD600~4‐10まで培養した。細胞のサンプルを、本明細書中に記載した方法を使用したSDS‐PAGEによってタンパク質の発現について分析した。CFEもまた、培養物からの細胞ペレットから調製し、そして3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、CFEで本明細書中に記載した方法を使用して計測した。菌株MIBa310とMIBa312からのUGA1及びPYD4の発現を、どちら遺伝子についても組み込みがなかった菌株内に存在する~53KDaのバンドの出現をSDS‐PAGEによってそれぞれ検出した。MIBa309のBAAT発現は、これらの条件下でSDS‐PAGEによって検出されなかった。表12Aは、菌株のCFEにおける3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性を示す。改善された測定条件を使用した独立した実験において、菌株MBin500対照、MIBa310、MIBa309、及びMIBa312から調製したCFEのBAAT活性を比較した。この実験の結果を表12Bに示す。プラスミドpMIBa120‐4前掲は、以下の発現カセット:PDCプロモーター、着目の遺伝子BAAT又は3‐HPDH、PDCターミネータ、及びURA3選択マーカー、に隣接するNotI制限部位を含んでいる。adh1202遺伝子座における組み込みのための相同性は、NotI制限部位の外側に存在する。これらのプラスミドはすべて、順方向に向いた発現カセットを持つ。ホモ接合組み込み菌株のスクリーニングを容易にするために、新しいプラスミドを、逆方向に向いている発現カセットを組み立てた。プラスミドpMIBa120‐4を、NotIで消化し、そして89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。3.5kbppMIBA120、4.2kbppMIBa121、4.2kbppMIBA122、3.5kbppMIBa123、及び4.2kbppMIBA124の断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。これらの断片のそれぞれを、本明細書中に記載したように、T4DNAリガーゼを使用して5.2kbpの線状NotI/CIP処理pHJJ76‐nouraに連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaIとKpnI消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、それぞれUGA1、YMR226c、PYD4、ydfG、及びBAATに関して、pMIBa131、pMIBa132、pMIBa133、pMIBa134、及びpMIBa135と呼んだ。得られたプラスミドは、逆方向に向いた発現カセットを用いたadh1202遺伝子座における所望の遺伝子の組み込みを可能にする。Ura-誘導体のMIBa308‐12を、本明細書中に記載したように単離した。MIBA308‐1のいくつかのFOA耐性コロニーは、37°CにてYPDプレート上で培養することによって二度精製したコロニーであった。ゲノムDNAを、FOA耐性コロニーから調製し、そして本明細書中に記載したように、URA3選択マーカーの欠失を確認するためにPCRによってチェックした。プライマー0611631と0611632は、それぞれ順方向と逆方向で組み込み部位の外側にアニールする。プライマー0611718は、ura選択マーカーのPDCターミネータ上流にアニールし;プライマー0611632と0611631は、野生型染色体に対して2.7kbpの断片を増幅し;そしてプライマー0611718と0611632は、uraマーカーが存在している組み込みに対して2.4kbpの断片を増幅し、且つ、uraマーカーの不存在下で1100bpの断片を増幅する。0611718と0611632を用いると1100bp、0611631と0611632を用いると2.7kbpのPCR断片をもたらすMIBa308‐12の1つのura-菌株を保存し、そしてMIBa314MIBa310のura-菌株、MIBa315MIBa312のura-菌株、MIBa316MIBa311のura-菌株、MIBa326MIBa308のura-菌株、及びMIBA328MIBa309のura-菌株と呼んだ。それぞれ10~15μgのpMIBa131、pMIBa132、pMIBa133、及びpMIBa135を、ApaI、KpnI、及びNcoIで消化し、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。NcoIによる消化は、着目の断片のアガロースゲルからの抽出を容易にする。pMIBa131‐3、pMIBa135からのそれぞれ5553bp、4937bp、5565bp、5493bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。精製産物の濃度が、67~80ng/μLにあることがわかった。0.67~0.8μgのpMIBa131‐3及びpMIBa135からの制限断片を、本明細書中に記載したように、MIBa314、MIBa316、MIBa315、又はMIBa328に形質転換する。形質転換体を、ura選択培地に平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートし、次に、ura選択培地に再び画線接種し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。ゲノムDNAを、URA3コロニーから調製し、そして着目の遺伝子についてホモ接合菌株を作る第2の発現カセットの組み込みを確認するために、本明細書中に記載したようにPCRによってチェックした。プライマー0611718と0611632は、先に記載した第1の組み込みの1100bpの断片を増幅し、そして、プライマー0611632と0611717は、逆方向で第2の組み込みの814bpの断片を増幅する。0611718と0611632を用いると1100bpの断片、そして0611717と0611632を用いると814bpの断片が増幅されるそれぞれの系統のURA3形質転換体を、MIBA317、MIBA318、MIBA319、及びMIBa329と呼んだ表13を参照のことYMR226C、UGA1、PYD4、及びBAATに関して、ホモ接合と異型接合の菌株からの発現と酵素活性を測定した。MIBA309‐12、MIBa317‐9、及びMIBa329の一晩培養物を、37°CにてYPDON中で培養し、次に、37°Cにて125mL容バッフル付きフラスコ内で25mLの新しいYPDに1:50に希釈し、そしてOD600~4‐10まで培養した。細胞のサンプルを、本明細書中に記載した方法を使用したSDS‐PAGEによって、タンパク質の発現について分析した。CFEもまた、培養物からの細胞ペレットから調製し、そして3‐HPデヒドロゲナーゼ活性を、本明細書中に記載した方法を使用してCFEにおいて計測した。SDS‐PAGEの結果に基づくと、菌株MIBa310、MIBa318、MIBa312、及びMIBa319は、~53KDaUGA1又はPYD4遺伝子によってコードされるタンパク質の予想サイズの質量を有するタンパク質を含んでいた。このタンパク質に相当するバンドは、菌株MBin500のSDS‐PAGE分析において観察されなかった。加えて、ホモ接合菌株MIBa318及びMIBa319からのそれぞれUGA1及びPYD4の発現は、SDS‐PAGE分析によって判断されるように対応する異型接合の菌株MIBa310又はMIBa312より優れていた。これらの条件下では、菌株MIBa309又はMIBa329において、BAAT発現はSDS‐PAGEによって検出されなかった。表14Aは、菌株MBin500、MIBa311、及びMIBa317のCFEにおける3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性を示す。改善された測定条件を使用した独立した実験において、菌株MBin500対照、MIBa319、及びMIBa329から調製したCFEのBAAT活性を比較した。この実験の結果を、表14Bに示す。菌株MIBa317、MIBa318、及びMIBa319のUra-誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。MIBa317、MIBa18、及びMIBa19のいくつかのFOA耐性コロニーは、37°CにてYPDプレート上で培養することによって精製したコロニーであった。ゲノムDNAを、FOA耐性コロニーから調製し、そして本明細書中に記載したように、URA3選択マーカーの欠失を確認するためにPCRによってチェックした。プライマー0611718と0611632は、先に記載した第1の組み込みを示す1100bpの断片を増幅し、そしてプライマーに0611632と0611717は、逆方向での第2の組み込みの存在を示す814bpの断片を増幅する。プライマー0611718と0611631は、uraマーカーを伴う第2の組み込みを示す2.6kbpの断片、及びuraマーカーを伴わない1200bpの断片を増幅する。00611718と0611632により1100bp、0611632と0611717により814bp又は611718と0611631により1200bpのPCR断片をもたらすMIBa317とMIBa318のUra-菌株を保存し、そしてそれぞれMIBa320とMIBa321と呼んだ。uraマーカーをMIBa319から取り除いたとき、予想された遺伝子転換事象が起き、そして両方の発現セットが順方向に向けられるような0611632と0611631プライマーによる2.7kbpの断片又は0611632と0611717による814bpの断片はないが、0611718と0611632により1100bpの断片は増幅されるPCRによって示されるMIBa322をもたらした。実施例3A‐3:pdc遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現するための挿入ベクターの左側断片の構築左側断片を含んでいるS.アベルミチリスADC配列番号130及びS.アベルミチリスBAAT配列番号140ENO1プロモーターとPDCターミネータ領域の間の発現のため遺伝子の挿入を可能にするために、pMhCt068ベクターを、XbaIとPacIで消化し、10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsを用いて37°Cにて30分間処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約6.1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、サッカロマイセスクルイベリSaccharomyceskluvyeriBAATpyd4遺伝子配列番号142を、この後のサブクローニングのための制限部位を含むプライマー0611196と0611186で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのS.クルイベリpyd4遺伝子を含むプラスミドのミニプレップの1~50倍希釈物、1×Pfx増幅バッファーInvitrogen、それぞれ100pmolのプライマー0611196と0611186、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLのDMSO、及び2.5単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含んでいた。PCRを、95°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ95°Cにて30秒間、40.8°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分30秒を34サイクル、それと72°Cにて5分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1428bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によってし、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製分離した。先に作製したpyd4PCR産物を、XbaIとPacIで消化し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約1.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。この精製DNAを、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、100ngのXbaI/PacIpMhCt068ベクター、70.5ngのXbaI/PacIpyd4挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいる連結反応物20μL中で、先に記載したXbaIとPacIで制限消化したpMhCt068ベクター内にクローン化した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷で冷やした。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIとの消化によって所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングし、検証済み単離菌株の1つを左側pyd41と呼んだ。配列番号17のS.アベルミチリスADCをコードし、且つ、E.コリにおける発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチドを、プライマー0611376と0611377で増幅するプライマー0611376は、In‐FusionによるpMhCt068への挿入後にNheI制限部位の5’末端におけるT塩基の除去をもたらし、そしてそれが、最初のpMhCt068クローンに存在している好ましくないATG開始コドンを取り除くことに注意する。PCR反応物50μLは、1μLのE.コリに最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子を含むプラスミドのミニプレップの1~50倍希釈物、1×ThermoPol反応バッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611376と0611377、それぞれ200μMのdATPとdCTP、dGTPとdTTP、2μLの100mMMgSO4、及び2単位のVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、94°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ94°Cにて30秒間、54°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約420bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、左側pyd41プラスミドを、NheIとAscIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。E.コリのために最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子を含む先の精製PCR断片を、NheIとAscIで消化し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、約420bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、得られた断片を、1×Quickligation反応バッファーNewEnglandBiolabs、100ngのNheI/AscI左側pyd41ベクター、31ngのNheIとAscIで消化したpanD挿入物、及び1μLのQuickT4DNAリガーゼNewEnglandBiolabsを含む連結反応物20μL中で線状左側pyd41ベクターに連結した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、AscIとPvuIIでの消化によって、E.コリのために最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt070と呼んだ。プラスミドpMhCt070は、酵母宿主における発現のためにコドン最適化したADC及びBAAT相同体の追加のためのベースベクターとして機能した。pMhCt070を、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約6.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。S.アベルミチリスBAAT配列番号140をコードし、且つ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したポリヌクレオチドを含む先に記載したXbaI及びPacI消化断片を、以下の通りpMhCt070切断ベクターに連結した:連結反応物20μLは、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、42ngのXbaI及びPacI消化pMhCt070ベクター、4μLのコドン最適化S.アベルミチリスBAATのXbaI及びPacI消化挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいた。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、本明細書中に記載したように、XbaI、PacI及びEcoRV消化によって所望のBAATORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt072と呼んだ。次に、pMhCt072中の、E.コリにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したバージョン配列番号130と置き換えた。I.オリエンタリスコドン最適化ADC遺伝子配列番号130、所望の追加制限部位、及びフランキングDNAを、プライマー0611378と0611379で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLの、コドン最適化S.アベルミチリスpanDを含んでいるプラスミドGeneArt登録商標のミニプレップの1~50倍希釈物、1×ThermoPol反応バッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0611378と0611379、それぞれ200μMのdATPとdCTP、dGTPとdTTP、2μLの100mMMgSO4、及び2単位のVentR登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、94°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ94°Cにて30秒間、54°Cにて30秒間、そして72°Cにて45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約420塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。5μLのpMhCt072のミニプレップを、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。上記からのコドン最適化S.アベルミチリスADC遺伝子を含む単離PCR産物を、以下のInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontech反応においてベクターに加えた:10μLの反応物容量は、6μLのpMhCt072の消化及び精製ベクター、1μLの精製コドン最適化panDPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NheI、AscI、及びClaI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt074と呼んだ図7。pMhCt074は、コドン最適化S.アベルミチリスADCpanD、配列番号130の発現を駆動するPDCプロモーター、TALターミネータ、コドン最適化S.アベルミチリスBAAT配列番号140の発現を駆動するENO1プロモーター、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、及びI.オリエンタリスURA3ORFの5’断片を含んでいる左側PDCターゲッティング構築物である。S.アベルミチリスADC配列番号130及びS.クルイベリBAAT配列番号142を含んでいる左側断片S.クルイベリBAATpyd4を発現する左側DNA構築物を作製するために、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.クルイベリBAAT配列配列番号142、前掲を含むXbaI及びPacI消化からの断片を、以下の通り先のpMhCt070消化ベクターに連結した:連結反応物20μLには、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、42ngのXbaI及びPacI消化pMhCt070ベクター、4μLのXbaI及びPacIで消化したコドン最適化S.クルイベリpyd4挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsが含まれていた。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI、PacI、及びEcoRV消化によって、所望のpyd4ORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt073と呼んだ。プラスミドpMhCt073は、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した所望のS.クルイベリBAATpyd4配列を含んでいるが、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した所望のS.アベルミチリスADCpanD配列は含んでいない。このORFに入れるために、5μLのpMhCt073のミニプレップを、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、そしてTAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。コドン最適化S.アベルミチリスpanD前掲を含む単離PCR産物を、以下のInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontech反応においてベクターに加えた:10μLの反応物容量は、6μLのpMhCt073の消化及び精製ベクター、1μLの精製コドン最適化panDPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された。反応物を、37°Cにて15分間、50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NheI、AscI、及びClaI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt076と呼んだ。プラスミドpMhCt076は、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADCの発現を駆動するPDCのプロモーターpanD、配列番号130、TALターミネータ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.クルイベリBAATの発現を駆動するENO1プロモーターpyd4、配列番号142、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、及びI.オリエンタリスURA3ORFの5’断片を含む左側PDCターゲッティング構築物である。配列決定では、プラスミドpMhCt076が、PDCプロモーター内に約200bpのAからTへのヌクレオチド変化、及びpMhCt068親ベクター前掲内に存在しているPDCプロモーターを通じて~全体の2/3にGからTへのヌクレオチド変化を含んでいると断定した。遺伝子発現の潜在的改変に関するいずれかの懸念に対処するために、pMhCt076に類似しているが、修正PDCプロモーターを含む構築物を、以下で記載するようにクローン化した。5μLのpMhCt082のミニプレップを、NheとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約4.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。4μLのpMhCt076のミニプレップを、NheIとPacIで消化し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約3.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、精製した4.7kbpのベクターと3.3kbpの挿入物を、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、3μLのpMhCt082ベクター、6μLのpMhCt076挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含む連結反応物20μL中で一つに連結した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、StuIとNotIでの消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt083と呼んだ図8。プラスミドpMhCt083は、前者が正しいPDCプロモータ配列を含んでいる一方、後者が先に記載したから1つのAからTへのヌクレオチド変化と1つのGからTへのヌクレオチド変化を持つということを除いて、pMhCt076と同一である。試験は、pMhCt083及びpMhCt077と比較した場合、pMhCt076及びpMhCt077の組み込みからS.アベルミチリスpanDを発現する菌株と、panD酵素活性に違いがないことを示した。S.アベルミチリスADC配列番号130及びサッカロマイセスセレビシエgabT配列番号141を含む左側断片4μLのpMhCt083のミニプレップを、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約6.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したサッカロマイセスセレビシエgabTUGA1、配列番号141を含んでいる、XbaI及びPacI消化した断片を、以下の通りpMhCt083切断ベクターに連結した:連結反応物20μLは、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、1μLのXbaIとPacIで消化した精製pMhCt083ベクター、3μLのコドン最適化S.セレビシエUGA1のXbaI及びPacI消化挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいる。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、チューブを氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びBglII消化によって、所望のBAATORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、pMhCt087と呼んだ図9。プラスミドpMhCt087は、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADCの発現を駆動するPDCのプロモーターpanD、配列番号130、TALターミネータ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.セレビシエgabTの発現を駆動するENO1プロモーターUGA1、配列番号141、RKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、及びI.オリエンタリスURA3ORFの5’断片を含む左側PDCターゲッティング構築物である。実施例3A‐4:pdc遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現するための挿入ベクターの右側断片の構築E.コリ3‐HPDHを含む右側断片配列番号1432μgのpMhCt069前掲のミニプレップを、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約2.2kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したE.コリ3‐HPDH遺伝子を含むXbaI及びPacIで消化した断片ydfG、配列番号143を、以下の通りpMhCt069切断ベクターに連結した:連結反応物20μLは、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、2μLのXbaIとPacIで消化した精製pMhCt069ベクター、4μLのXbaIとPacIで消化したコドン最適化E.コリydfG挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsが含まれた。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI、PacI、及びEcoRV消化によって、所望のydfGORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、本明細書中に記載したように、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt075と呼んだ図10。プラスミドpMhCt075は、I.オリエンタリスURA3ORFの3’断片、後でURA3マーカーのその後のループアウトためのURA3プロモーターが続くI.オリエンタリスからのURA3ターミネータ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、且つ、I.オリエンタリスTDH3プロモーターによって駆動されるE.コリ3‐HPDH遺伝子ydfG、配列番号143、及びI.オリエンタリスPDCターミネータ領域を含んでいる。サッカロマイセスセレビシエ3‐HPDHを含む右側断片配列番号144I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.セレビシエYMR226C遺伝子を含む、XbaIとPacIで消化した断片前掲を、以下の通りpMhCt069切断ベクターに連結した:連結反応物20μLは、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、2μLのXbaIとPacIで消化した精製pMhCt069ベクター、4μLのXbaIとPacIで消化したコドン最適化S.セレビシエ3‐HPDH挿入物YMR226C、配列番号144、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいた。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして、室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI、PacI、及びEcoRV消化によって、所望のYMR226CORFの適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらしたクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt077と呼んだ図11。プラスミドpMhCt077は、I.オリエンタリスURA3ORFの3’断片、後のURA3マーカーのループアウトためのURA3プロモーターが続くI.オリエンタリスからのURA3ターミネータ、I.オリエンタリスTDH3プロモーターによって駆動されるI.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子YMR226C、配列番号144、及びI.オリエンタリスPDCターミネータ領域を含む。実施例3A‐5:PDC遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現する異型接合及びホモ接合酵母菌株先の実施例3A‐3及び実施例3A‐4は、I.オリエンタリスPDC遺伝子座に対する、3つの異所性遺伝子の同時ターゲッティング発現のための様々な左側又は右側構築物の構築を記載している。形質転換前に、約10μgのそれぞれの構築物1つの所望の左側構築物と1つの所望の右側構築物をNotIで消化し、pUC18骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した;ほとんどの消化について、制限酵素PvuIもまた、NotI消化に含まれていた。制限酵素PvuIは、pUC18ベクター断片を約半分に消化し、ゲル電気泳動によるより大きな、所望のDNA断片の分離をより容易にする。より大きな発現カセットを含んでいるバンドを、ゲル電気泳動によってpUC18骨格DNAと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。30μLの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で10μLの等モル比の1の左側構築物と1の右側構築物を、I.オリエンタリス菌株CNB1又は適当な誘導体を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、培養のために37°Cに置いた。翌日、約12の形質転換体を、釣り出し、そしてシングルコロニー用にura選択プレートに再び画線接種し、そして37°Cにて培養した。翌日、シングルコロニーを、それぞれの最初の形質転換体によって作り出されたそれぞれの画線から釣り出し、そしてシングルコロニー用にura選択プレートに再び画線接種した。37°Cにてもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、そしてura選択プレート上に再び画線接種し、37°Cにて一晩培養した。この第2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖後に、ゲノムDNAを、先に記載した通り所望の標的組み込みが起こったのを確かめるためのPCRでの使用のために調製した。左側及び右側構築物を使用したPDCに対する標的化のために、所望の組み込み事象の検証を、プライマー0611814、0611554、及び0611555を使用して判断した。プライマー0611554は、右側PDCターゲッティング構築物内に存在しているI.オリエンタリスゲノムDNAのちょうど3’のPDCターミネータ領域に結合し;プライマー0611555は、PDCORF内に結合し、終止に向かって増幅をおこない;そしてプライマー0611814は、右側構築物内に存在しているTDH3プロモータ領域の3’末端の近くに結合し、3’方向に増幅する。プライマー0611814及び0611554を含んだPCRからの約1.9kbpのバンドの発生は、PDC遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。プライマー0611555及び0611554を含んだPCRからの約1.4kbpのバンドの発生は、野生型PDC遺伝子座の存在を示した。この組み込み事象は二倍体I.オリエンタリスCNB1における第1のターゲッティング事象であるので、所望の組み込み体は、プライマー0611814及び0611554に関して1.9kbpのバンド、及びプライマー0611555及び0611554から1.4kbpのバンドの両方を示す。各プラスミドに所望のバンドパターンをもたらす2つの独立した形質転換体を、表15に示すように呼んだ。次に、yMhCt004又はyMhCt005のura-誘導体を、先に記載したように単離した。それぞれの親菌株のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0611817を用いた所望のループアウト事象についてPCRによってスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてURA3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてURA3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在が、所望のura3の瘢痕部位親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターだけが存在することを示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。CrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを用いたPCR反応を、先に記載したように実施した。yMhCt012と呼ばれる、親菌株yMhCt004からの1つのFOA耐性コロニー、及びyMhCt007と呼ばれる、親菌株yMhCt005からの1つのFOA耐性コロニーは、所望の828bpのバンドをもたらす。菌株yMhCt012とyMhCt007を次に、形質転換して、PDC遺伝子を欠失し、且つ、それぞれpanD、pyd4、及びYMR226C若しくはpanD、UGA1、及びYMR226Cの発現カセットで置き換えたホモ接合菌株を作出した。菌株yMhCt012を、pMhCt083とpMhCt077からの線状DNAによって形質転換したのに対して、yMhCt007を、pMhCt087とpMhCt077からの線状DNAによって形質転換した。2ラウンドのシングルコロニー精製後に、各親菌株からのいくつかの形質転換体からのゲノムDNAを、先に記載したようにプライマー0611815と0611817を用いたPCRによってスクリーニングした。元々標的としていたPDC遺伝子座からのura3瘢痕領域の増幅からの828bpのバンドともう一つの染色体における第2の組み込み事象からのURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの組み込みからの2.2kbpのバンドの両方を持つ各親菌株からの独立に単離した2つの組み込み体を、表16に示すように呼んだ。yMhCt008のura-誘導体を、先に記載したように単離した。yMHCt008親菌株からのいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、本明細書中に記載したように、プライマー0611815と0611817を用いて、所望のループアウト事象についてPCRによってスクリーニングした。828bpのバンドの存在は、所望されるura3瘢痕部位親菌株における2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターだけが存在することを示した。828bpのバンドだけを示した単離菌株を、本明細書中に記載したように、プライマー0611555と0611554を使用してさらにスクリーニングした。プライマー0611555と0611554を含んだPCRからの約1.4kbpのバンドの発生は、野生型PDC遺伝子座の存在を示した。両染色体上のPDC遺伝子座が欠失したことを示す、このバンドを欠く単離菌株を、yMhCt010と呼んだ。菌株を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そして本明細書中に記載のとおり、アスパラギン酸デカルボキシラーゼADC活性及び3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性についてアッセイした。いくつかのアッセイセットトライアル1~4と表すの実験結果を表17に示す。表17のトライアル1からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにSDS‐PAGEによって分析した。トライアル1の菌株74/751及び菌株yMhCt002は、トライアル1の対照菌株MBin500に存在していない27kDにSDS‐PAGE分析いおいてバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、ydfG遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。別のアッセイセットについての実験結果を、表17トライアル2に示す。表17のトライアル2からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにSDS‐PAGEによって分析した。MBin500以外のトライアル2の全菌株が、SDS‐PAGE分析において29kDにバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、YMR226c遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。トライアル2の菌株yMhCt005及び87/772は、このトライアルの他の3サンプルに存在しない53kDのバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、UGA1遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。別のアッセイセットについての実験結果を、表17トライアル3に示す。表17のトライアル3からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにSDS‐PAGEによって分析した。MBin500以外のトライアル3の全菌株が、SDS‐PAGE分析において29kDのバンドと53kDのバンドをもたらした。これらのタンパク質バンドのサイズは、それぞれUGA1遺伝子とYMR226c遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル3の菌株MBin500及びyMhCt005は、このトライアルのyMhCt008及びyMhCt009には不存在のSDS‐PAGE分析における64kDのバンドを示した。このタンパク質バンドのサイズは、I.オリエンタリスCNB1の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。別のアッセイセットについての実験結果を、表17トライアル4に示す。表17のトライアル4からの菌株もまた、本明細書中に記載したようにSDS‐PAGEによって分析した。MBin500以外のトライアル4の全菌株が、29kDのバンドをもたらした。このタンパク質バンドのサイズは、YMR226c遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。トライアル4の菌株yMhCt005、yMhCt008、及びyMhCt009は、53kDのバンドを示した。このバンドのサイズは、UGA1遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル4の菌株yMhCt013及びyMhCt014は、53kDのほのかなバンドを示した。このバンドのサイズは、PYD4遺伝子によってコードされるタンパク質と一致している。トライアル4の菌株MBin500、yMhCt004、及びyMhCt005は、菌株yMhCt008、yMhCt009、yMhCt013、及びyMhCt014に不存在の64kDのバンドを示した。このタンパク質バンドのサイズは、I.オリエンタリスCNB1の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子によってコードされるタンパク質の正体と一致している。菌株MBin500及びyMhCt008を、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクターにおいて試験及び評価した。対照菌株MBin500は、検出可能な3‐HPを産生しなかった2回の独立した発酵の平均。菌株yMhCt008は、2.45g/Lの3‐HPを産生した12回の独立した発酵の平均。実施例3A‐6:adh1202遺伝子座においてβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT又は3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現し、且つ、pdc遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現する酵母菌株20μgのpMhCt077、pMhCt083、及びpMhCt087前掲を、NotIとPvuIで消化し、次に、89mMのTris塩基‐89mMのホウ酸‐2mMのEDTA二ナトリウムTBEバッファーを使用して1アガロースゲルで泳動した。それぞれpMhCt077、pMhCt083、及びpMhCt087からの3815bp、5332bp、又は5320bpのNotI消化断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。560ngのNotI消化pMhCt077及び560ngのNotI消化pMhCt083又はpMhCt087を、菌株MIBa320、MIBa321、及びMIBa322に形質転換した。MIBa320を、pMhCt077/83及びpMhCt077/87の組み合わせで形質転換した。MIBa321をpMhCt077/87で本明細書中に記載したように形質転換し、そしてMIBa322をpMhCt077/83で本明細書中に記載したように形質転換した。形質転換体を、ura選択培地に平板培養し、室温にて約60時間インキュベートした。形質転換体を、ura選択培地に再び画線接種し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。ゲノムDNAを、URA3コロニーから調製し、そして、発現カセットの組み込みを確認するために、本明細書中に記載したようにPCRによってチェックした。プライマー対611814と611554は、組み込みを示す1.9kbpの断片を増幅する。プライマー対611555と611554は、野生型遺伝子座を示す1.4kbpの断片を増幅する。611554と611814により1.9kbpのPCR断片を増幅し、且つ、611555と611554により1.4kbpのPCR断片を増幅したそれぞれの系統の1つのURA3形質転換体を保存し;これらを、MIBa323、MIBa324、MIBa325、及びMIBa327と呼んだ遺伝子型に関しては表18を参照のこと。プロモーターとターミネータを、I.オリエンタリス遺伝子から得た。菌株を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そして3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性について、本明細書中に記載したようにアッセイした。結果を表19に示す。MIBa323、MIBa324、MIBa325、及びMIBa327のUra-誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。ゲノムDNAを、FOA耐性コロニーから調製し、そしてURA3選択マーカーの欠失を確認するために、本明細書中に記載したようにPCRによってチェックした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてURA3プロモーターに向かって増幅する、そしてプライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、URA3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在は、所望される、URA3の瘢痕部位親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起きなかったことを示す。プライマー0611815と0611817により828bpのPCR断片をもたらす、Ura-菌株のMIBa323、MIBa324、MIBa325、及びMIBa327を保存し、そしてそれぞれMIBa335、MIBa333、MIBa334、及びMIBa336と呼んだ。MIBa320‐2の形質転換の項において先に記載したように、菌株MIBa333及びMIBa334を、pMhCt077及びpMhCt087からの断片で形質転換し、そして、菌株MIBa335及びMIBa336を、pMhCt077及びpMhCt083からの断片で形質転換した。形質転換体を、本明細書中に記載したように、ura選択培地での培養によって選択した。発現カセットの組み込みを確認するために、ゲノムDNAを、本明細書中に記載したようにURA3コロニーから調製し、そしてPCRによってチェックした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてURA3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてURA3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在は、第1の組み込みに関して所望される、URA3の瘢痕部位親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、第2の組み込みのための完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示す。uraマーカーが存在しているとき、プライマー対0611815と0611816は、625bpの断片を増幅する。PDC遺伝子座が存在しているとき、プライマー0611555及び0611554は、1.4kbpの断片を増幅する。ホモ接合の組み込み体は、これらのプライマーでは断片を増幅しないはずである。プライマー0611815と0611817により828bpと2.2kbpのPCR断片が増幅され、プライマー0611815と0611816により625bpのPCR断片が増幅され、そしてプライマー0611555と0611554では断片が増幅されないそれぞれの系統の1つのURA3形質転換体を保存した;これらを、MIBa340、MIBa341、MIBa345、及びMIBa348と呼んだ表20Aを参照のこと。菌株MBin500対照、MIBa345、MIBa348、MIBa340、及びMIBa341から調製したCFEにおけるアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性を比較した。この実験の結果を表20Bに示す。実施例3A‐7:adh1202遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現するための複数のヌクレオチド配列を持つ挿入ベクターの左側断片構築物を、I.オリエンタリスadh1202遺伝子座にADCをコードするヌクレオチド配列番号17を4コピー組み込むように設計した。PDC遺伝子座に関して本明細書中に記載したものと同様のアプローチにおいて、相同組み換えを可能にするように、左側構築物と右側構築物を設計した。組み込みベクターの全体的な設計と所望の組み換え事象を図3に示す。このアプローチはまた、以下の実施例に記載の代替ADC配列番号139の発現にも使用した。組み換えが同じADC配列をコードするヌクレオチド配列の複数のコピーの間で起こるのを予防するために、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した4つの異なったヌクレオチド配列配列番号130、145、146、及び147を、配列番号17と同じADC配列をコードするように設計した。さらに、I.オリエンタリスのald5680遺伝子座を標的化するように、最初の構築物セットを設計したので、adh1202ターゲッティング配列を、クローニングの後期ステップでこれらのベクターに組み入れた。ald5680構築物は、ald5680におけるpanDの更なる4コピーを用いて、adh1202におけるpanDの異所性の4コピーに関して既にホモ接合であるI.オリエンタリスCNB1菌株の第2の遺伝子座を標的化するのに使用できる。左側ald5680ターゲッティングベクターを、以下の通り構築した。ald5680ORFのすぐ5’側の配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に含むPCR産物を、プライマー0612271と0612272で増幅する。PCR反応物50μLは、1μLのpHJJ75のニプレッププラスミドDNAの1~50倍希釈物図23、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612271と0612272、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、製造業者の取扱説明書に従って約930塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そしてNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。大量のDNAの精製を可能にするために、先に記載したPCR反応物を、鋳型DNAとして930bpの精製PCR産物を使用して繰り返した。5つの50μLの反応物を、準備し、そして鋳型DNAとして、1μLの930bpの精製PCR産物をpHJJ75プラスミド前掲と置き換えたことを除いて、先に記載の条件で増幅した。サーモサイクリングに続いて、930bpの増幅産物を上述のとおり精製した。配列番号130のI.オリエンタリスコドン最適化S.アベルミチリスADCコード配列を含むPDCpromo‐optPanD‐ENO1‐UGA1を含む断片を、NotI及びEcoRI消化によってpMhCt087前掲から切り出した。10μgのpMhCt087のミディプレップを、NotIとEcoRIで消化し、次に、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製した。約4.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAを持つURA3スプリットマーカーの5’側半分を含むPCR産物を、プライマー0612273と0612274を使用して増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpMhCt082ミニプレッププラスミドDNA前掲の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612273と0612274、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約960の塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。上記のDNA断片のための受容ベクターを作製するために、プラスミドpUC19YanischPerronCVieiraJandMessingJGene33103119を、HindIIIとEcoRIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約2.6kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、先の精製した930bp、4.4kbp、及び960bpのDNA断片を、150ngのHindIIIとEcoRIで消化したpUC19ベクター、56ngのald5680フランキングDNAを含む930bpのDNA、250ngのNotIとEcoRIで消化したpMhCt087からのPDCpromo‐optPanD‐ENO1‐UGA1断片、55ngのURA3スプリットマーカーの5’側半分を含む960bpの5’側のPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのIN‐FUSION商標が酵素Clontechから構成された10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して消化pUC19断片内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。次に、反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SalI及びHpaI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt089と呼んだ。次に、pMhCt089内のUGA1ORFを、配列番号17のADCをコードする、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスpanD遺伝子と置き換えた。S.アベルミチリスpanDバージョンr1配列番号145を、ベクターpMA‐T内にGeneArt登録商標によって合成した。プラスミドpMA‐Tを、XbaI及びPacIで消化し、得られた断片をTAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約434bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。プラスミドpMhCt089を、XbaIとPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、得られた断片をTAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして約4.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。pMhCt089ベクターとS.アベルミチリスpanDバージョンr1を、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、2μLのXbaI/PacIpMhCt089ベクター、2μLのXbaI/PacIS.アベルミチリスpanDバージョンr1挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含む連結反応物20μL中で接合した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びPacI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定で正しいと確認し、そしてpMhCt092と呼んだ。左側構築物の最終的なクローニングステップは、pMhCt092内に存在しているald5680の5’ホモロジー領域を、adh1202の5’ホモロジー領域に置き換えることであった。adh1202ORFの5’側配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に含むPCR産物を、プライマー0612470と0612471で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpGMEr140ミニプレッププラスミドDNAPCR増幅領域が同一である、本明細書中に記載したpMIBa107誘導体の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612470と0612471、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて30秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約790bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。上記のPCR産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドpMhCt092を、HpaIとNotIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.0kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCR産物と線形ベクターを、120ngのHpaIとNotIで消化したpMhCt092ベクター、30ngのadh1202の5’側の相同性を含むPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して接合した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI及びPstIでの消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt095と呼んだ図12。プラスミドpMhCt095は、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子の発現を駆動するPDCのプロモーター配列番号130、TALターミネータ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第2のS.アベルミチリスADC遺伝子の発現を駆動するENO1プロモーター配列番号145、I.オリエンタリスRKIターミネータ、I.オリエンタリスURA3プロモーター、及びI.オリエンタリスURA3ORFの5’断片を含む左側I.オリエンタリスadh1202ターゲッティング構築物である。実施例3A‐8:adh1202遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現するための複数のヌクレオチド配列を有する挿入ベクターの右側断片I.オリエンタリスURA3ORFの3’断片を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に含むPCR産物を、プライマー0612275と0612276で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpMhCt069ミニプレッププラスミドDNA前掲の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612275と0612276、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1155bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。TDH3プロモーター、異所性遺伝子の挿入のためのXbaI及びPacI制限部位、及びPDCターミネータを含む断片を、NotI及びPmeIでの消化によってpMhCt069から切り出した。10μgのpMhCt069のミディプレップを、NotIとPmeIで消化し、次に、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約1.85のkbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。ald5680ORFの3’側の配列を、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に含むPCR産物を、プライマー0612277と0612278で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpHJJ75ミニプレッププラスミドDNA図23の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612277と0612278、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、及び1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約844bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、先の精製した1155bp、1.85kbp、及び844bpのDNA断片を、150ngのHindIIIとEcoRIで消化したpUC19ベクターからの断片;66ngのURA3分割マーカーの3’部分を含む1155bpのDNA;106ngの、pMhCt069からのTDH3プロモーター、異所性遺伝子の挿入のためのXbaI及びPacI制限部位、及びPDCターミネータを含むPmeIとNotIで消化した1.85kbpの断片;48ngのald5680フランキングDNAの3’側を含む844bpのPCR産物;1×InFusion反応バッファーClontech、並びに1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して、EcoRIとHindIIIで消化したpUC19内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SalI及びHpaI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてald5680右側20と呼んだ。TKLターミネータ、PGK1プロモーター、XbaI及びPacI制限部位、及びPDCターミネータ領域のより短いバージョンを、以下の通り、ald5680右側20のTDH3プロモーターと3’ald5680フランキングDNAの間に付加した。TKLターミネータを、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に、プライマー0612356と0612357で増幅した。所望のPCR産物は、いくつかの反応でアニール温度の代わりに温度勾配、及びDMSOを使用して増幅した。4つの同一のPCR反応物を、1μLのpACN23ミニプレッププラスミドDNAの1~50倍希釈物図20、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612356と0612357、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含むそれぞれのPCR反応物50μLによって調製した。第2セットの4本のチューブを、反応物が追加の1.5μLのDMSOをそれぞれ含んでいることを除いて、上記の通り準備した。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、X°Cにて20秒間{X=47.6°C、51.8°C、57.1°C又は62.1°C}、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。DMSOの有無にかかわらず、PCRを示した各アニール温度で実施した。サーモサイクリングに続いて、10μLのそれぞれのPCR反応物を、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、2つの最高のアニール温度にてDMSOを用いて、及び2つの最低アニール温度にてDMSOなしで実施したPCR反応が844bpの所望の産物の最も高い収率をもたらしたことを明らかにした。これらの4つのPCRを、組み合わせ、約844の塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。所望のPGK1プロモーター領域のPCR増幅をツーステップ工程としておこなった。最初に、PGK1プロモーターDNAを含んだPCR産物を、以下のプライマー0612150と0612151を用いた増幅に続いてクローン化した。PCR反応物50μLは、3μLのpJLJ49ミニプレップDNA図25、1×Pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、それぞれ100pmolのプライマー0612150と0612151、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1.25単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含んでいた。PCRを、95°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ95°Cにて1分間、55°Cにて1分間、そして72°Cにて3分間を25サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約630bpのPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。約630bpのPCR産物を、製造業者の取扱説明書に従って、配列決定のためのZeroBlunt登録商標TOPO登録商標PCRクローニングキットInvitrogenを使用してpCR4商標BLUNTTOPO登録商標Invitrogenベクター内にクローン化した。6μLの総反応物容量中、0.5若しくは4μLの630bpのPCR産物、1μLの塩類溶液Invitrogen及び1μLのpCR4商標BLUNTTOPO登録商標Invitrogenを、室温にて15分間一緒にインキュベートした。2μLのそれぞれのクローニング反応物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリInvitrogen細胞内に形質転換した。形質転換体を、LBkanプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてPGK1_in_TOPOと呼んだ。PGK1_in_TOPOからのPGK1プロモーターを、以下の通りPCR鋳型としての使用する前に単離し、そして精製した。25μLのPGK1_in_TOPOのミディプレップを、XbaI及びPacIで消化し、そしてTAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約640bpのバンドをゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PGK1プロモーターを、クローニングのための所望の追加制限部位及びフランキングDNAと共に、プライマー0612358と0612359を用いて温度勾配を使用して増幅した。8つの同一のPCR反応物を準備し、各PCR反応物50μLは、20ngのPGK1_in_TOPOのXbaI及びPacI消化による精製PGK1プロモーターDNA、1×Herculase反応バッファーAgilentTechnologies、それぞれ100pmolのプライマー0612358と0612359、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに2.5単位のHerculaseHotStartDNAPolymeraseAgilentTechnologiesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、X°Cにて20秒間X=53.7°C、55.4°C、57.6°Cと、60.0°C、62.4°C、64.8°C、66.9°C、68.6°C、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、10μLのそれぞれのPCR反応物を、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、最高アニール温度で実施した4つのPCR反応物が、約700bpの所望の産物の最も高い収率をもたらすことを明らかにした。これら4つのPCRを、組み合わせ、約700の塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。プラスミドald5680_右側20は、約870bpの、PDCターミネータ領域としてのI.オリエンタリスPDCORFから下流の領域を含む。しかしながら、この領域は、ターミネータとしての正常機能に必要とされているよりおそらく大きいので、その現在のサイズで維持するのであれば、PDC遺伝子座への好ましくない相同組み換えの触媒として機能するだろう。そのため、より小さいバージョンでald5680_右側20のPDCターミネータを置き換えるためのPCR産物を、プライマー0612360と0612361で増幅した。所望のPCR産物を、いくつかの反応において、アニール温度の代わりの温度勾配、及びDMSOを使用して増幅した。4つの同一のPCR反応物を準備し、各PCR反応物50μLは、1μLのpJLJ49ミニプレッププラスミドDNA図25の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612360と0612361、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。第2セットの4本のチューブを、反応物がそれぞれ追加の1.5μLのDMSOを含んでいることを除いて、上述の通り準備した。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、X°Cにて20秒間X=47.6°C、51.8°C、57.1°C、又は62.1°C、そして72°Cにて45秒間を32サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。DMSOの有無にかかわらず、PCRを示した各アニール温度で実施した。サーモサイクリングに続いて、10μLのそれぞれのPCR反応物を、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離した。このゲルの視覚化は、DMSOを用いて実施した4つのPCR反応物がアニール温度にかかわらず338bpの所望の産物の最も高い収率をもたらすことを明らかにした。これらの4つのPCRを、組み合わせ、約338塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCRを、約700bpのPGK1含有PCR産物を、338bpのPDCターミネータ産物に融合する1つの増幅産物を作製するのに使用した。PCR反応物50μLは、107ngのPGK1含有PCR産物、56ngのPDCターミネータ含有PCR産物、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ100pmolのプライマー0612358と0612361、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のPhusion商標HighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、56°Cにて20秒間、そして72°Cにて2分と45秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、1020塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。プラスミドald5680_右側20を、XbaIとNotIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、そしてTAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製した。約5.6kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、先の精製した487bp及び1020bpのPCR産物を、150ngのXbaIとNotIで消化したald5680_右側20ベクター、13ngのTKLターミネータPCR産物、28ngのPGK1プロモーター‐PDCターミネータPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成される10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して消化したald5680_右側20断片に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、AccI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt091と呼んだ。プラスミドpMhCt091は、I.オリエンタリスURA3ORFの3’断片、I.オリエンタリスTDH3プロモーターとそれに続く着目遺伝子の追加のためのNheI及びAscI制限部位、I.オリエンタリスTKLターミネータ、I.オリエンタリスPGK1プロモーターとそれに続く第2の着目遺伝子の追加のためのXbaI及びPacI制限部位、並びにI.オリエンタリスPDCターミネータと、3’ald5680遺伝子座への標的相同組み換えのためのフランキングDNAを含む空の右側I.オリエンタリスald5680標的構築物である。S.アベルミチリスpanDバージョンr5配列番号146を、ベクター1075328_SaPanD_r5内にGeneArt登録商標によって合成した。PCRによるpMhCt091の5’クローニング部位へのクローニングのために、XbaI及びPacI制限部位を所望のNheI及びAscI部位に変更した。PCR反応物50μLは、1μLの1075328_SaPanD_r5ミニプレッププラスミドDNAGeneArt登録商標の1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612378と0612379、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLのDMSO、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて30秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約471塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。プラスミドpMhCt091前掲を、NheI及びAscIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.9kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。次に、先の精製したpanDr5含有PCR産物を、150ngのNheI及びAscIで消化したpMhCt091ベクター、19ngのpanDr5PCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して、消化したpMhCt091断片内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SmaI消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt093と呼んだ。プラスミドpMhCt093を、XbaI及びPacIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。S.アベルミチリスpanDバージョンr2配列番号147を、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化し、そしてベクターpMA‐T内にGeneArt登録商標によって合成した。プラスミドを、XbaI及びPacIで消化し、そして、得られた断片を、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって分離した。約434bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。先の精製した~434bpの断片を、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、2μLのXbaIとPacIで消化したpMhCt093ベクター、2μLの先の~434bpの断片、並びに1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいる連結反応物20μL中で、XbaI及びPacIで消化したpMhCt093ベクター内にクローン化した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートした、次に、そのチューブを氷上に置いた。5μLのこの反応物を、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて3日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びPacIでの消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。単離pMhCt094を今後の作業のために選択した。右側構築物の最終的なクローニングステップは、pMhCt094内に存在しているald56803’ホモロジー領域をadh1202の3’ホモロジー領域に置き換えることであった。adh1202ORFのすぐ3’側の配列を、クローニングのための所望の相加制限部位及びフランキングDNAと共にを含んでいるPCR産物を、プライマー612472と612473で増幅した。PCR反応物50μLは、1μLのpGMEr140前掲ミニプレッププラスミドDNAの1~50倍希釈物、1×iProof商標HFバッファーBioRadLaboratories、それぞれ100pmolのプライマー0612472と0612473、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに1単位のiProof商標HighFidelityDNAポリメラーゼBioRadLaboratoriesを含んでいた。PCRを、98°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて10秒間、59°Cにて20秒間、そして72°Cにて30秒間を34サイクル、それと72°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約620塩基対のPCR産物をゲルから切り出す、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。上記PCR産物のための受容ベクターを作製するために、プラスミドpMhCt094を、SacII及びNotIで消化し、37°Cにて30分間10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.0kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PCR産物と線形ベクターを、191ngのSacII及びNotIで消化したpMhCt094ベクター、36ngのadh1202の3’相同性を持つPCR産物、1×InFusion反応バッファーClontech、並びに1μLのInFusion商標酵素Clontechから構成された10μLの総反応物容量中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して接合した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物を、40μLのTEバッファーで希釈し、そして、2.5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NsiI及びPvuIでの消化によって、所望のPCR産物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMhCt096と呼んだ図13。プラスミドpMhCt096は、I.オリエンタリスURA3ORFの3’断片、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第3のS.アベルミチリスADC遺伝子配列番号146の発現を駆動するI.オリエンタリスTDH3プロモーター、I.オリエンタリスTKLターミネータ、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化した第4のS.アベルミチリスADC遺伝子配列番号147の発現を駆動するI.オリエンタリスPGK1プロモーター、I.オリエンタリスPDCターミネータ、及び標的adh1202遺伝子座の3’側への相同組み換えのためのフランキングDNAを含んでいる右側I.オリエンタリスadh1202ターゲッティング構築物である。実施例3A‐9:pdc遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現し、且つ、adh1202遺伝子座において4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現する酵母菌株先の実施例3A‐7及び3A‐8は、adh1202遺伝子座における、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスADC遺伝子の4つのヌクレオチド多型の発現を標的化するための左側及び右側構築物の作製を説明している。I.オリエンタリスCNB1への形質転換の前に、10μgのpMhCt095を、HpaIとSacIIで消化して、pUC19骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した。同様に、10μgのpMhCt096を、EcoRIとSacIIで消化して、pUC19骨格ベクターから所望の形質転換DNAを切り出した。~5kbpの発現カセット含有バンドを、ゲル電気泳動によってpUC19骨格DNAと分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。30μLの溶出バッファーを溶出ステップに使用した。合計で10μLになる等モル比のpMhCt095及びpMhCt096線形形質転換DNAを、菌株yMhCt010前掲を形質転換するのに使用した。形質転換体を、ura選択プレート上で選択し、培養のために37°Cに置いた。12個位の形質転換体を、翌日釣り出し、シングルコロニーのためにura選択プレートに再び画線接種し、そして37°Cにて一晩培養し、次に、それぞれの最初の形質転換体及びura選択プレートへの再画線接種によって生じた画線のそれぞれからシングルコロニーを釣り出した。37°Cにてのもう一晩の培養後に、最終的なシングルコロニーを、各画線から釣り出し、ura選択プレートに再び画線接種し、そして37°Cにて一晩培養した。この第2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後、本明細書中に記載したように起こった所望の標的組み込みを確かめるためのPCRに使用するために、ゲノムDNAを調製した。adh1202遺伝子座へのpMhCt095及びpMhCt096断片の正しいターゲッティングを、プライマー0611718と0611632前掲を使用して検証した。プライマー0611718は、pMhCt096内に存在しているPDCターミネータ領域に結合するのに対して、プライマー0611632は、標的とした領域のadh1202遺伝子座DNAの3’側に結合し、そしてアンチセンス方向に増幅する。これらのプライマーを用いたPCRからの約727bpのバンドの発生は、adh1202遺伝子座における所望の組み込み事象の出現を示した。PCR反応物25μLは、0.5μLのスクリーニングされるべき菌株のゲノムDNA、1×CrimsonTaq商標反応バッファーNewEnglandBiolabs、25pmolのセンスプライマー、25pmolのアンチセンスプライマー、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びに0.625単位のCrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsが含まれていた。PCRを、95°Cにて30秒間を1サイクルと続く、それぞれ95°Cにて30秒間、50°Cにて30秒間、そして68°Cにて2.5分間を30サイクル、それと68°Cにて10分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、TAEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって分離し、バンドのサイズを可視化し、そして先に記載したように判断した。所望の727bpのバンドをもたらす独立に単離した2つの形質転換体を、yMhCt019又は95/962と呼んだ表21の遺伝子型を参照のこと。次に、yMhCt019のura-誘導体を、本明細書中に記載したように単離した。yMhCt019のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0612795を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー0611815が、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてURA3プロモーターに向かって増幅するのに対して、プライマー0612795は、pMhCt096又は内在性adh1202遺伝子座の3’adh1202相同内にアニールし、そして5’領域に向かって戻る方向に増幅する。PCR反応を、伸長相の長さを3.5分間に変更したことを除いて、先にyMhCt019の分離について記載したようにおこなった。これらのプライマーによる3.7kbpのバンドの発生が、所望のループアウト事象が起こったので、改変adh1202遺伝子座にURA3プロモーターの瘢痕だけが残っていることを示すのに対して、約5.1kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そしてそれは、所望の組み換え事象が起こらなかったことを示しているはずである。所望の3.7kbpのバンドをもたらした菌株を、保存し、そしてyMhCt021と呼んだ。adh1202における複数のpanD発現カセット用にyMhCt021ホモ接合誘導体を単離するために、yMhCt021を、先に記載したように、線状pMhCt095及びpMhCt096で形質転換した。2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが起こったことを確認するためのPCRにおける使用のために、ゲノムDNAを調製した。yMhCt021の残っている野生型adh1202遺伝子座へのpMhCt095及びpMhCt096断片の正しいターゲッティングを、プライマー0612891と0612893によって確認した。プライマー0612891は、r1終止後にpMhCt095のSaPanDr1の3’領域PacI部位の半分にアニールする。プライマー0612893は、SaPanDr5の5’領域の末端にアニールし、NheI部位及びpMhCt096のリーダを含み、そして相補的な向きで戻る方向に増幅する。これらのプライマーによる3.2kbpのバンドの発生が、yMhCt021の残っているadh1202野生型遺伝子座におけるpMhCt095及びpMhCt096による第2の組み込み事象から予想される完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示すのに対して、約1.7kbpのバンドは、最初の組み込み事象とその後のURA3マーカーのループアウトからの他のadh1202遺伝子座におけるURA3瘢痕部位の存在を示すはずである。PCR反応を、伸長相の長さを3.5分間に変更したことを除いて、先のyMhCt019の分離について記載したようにおこなった。これらのバンドサイズの両方をもたらす菌株を、yMhCt022と呼んだ遺伝子型に関しては表22を参照のこと。菌株を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そしてアスパラギン酸デカルボキシラーゼADC活性について本明細書中のようにアッセイした。実験結果を表23Aに示す。菌株MBin500対照、yMhCt019、95/96‐2、yMhCt008、及びyMhCt022から調製したCFEにおけるアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDH活性を比較した。この実験の結果を表23Bに示す。菌株yMhCt019及び95/962もまた、本明細書中に記載したようにSDS‐PAGEによって分析した。両菌株とも、53kD、29kD、~14kD、及び~3kDにタンパク質バンドを示した。53kD及び29kDのタンパク質バンドのサイズは、それぞれUGA1及びYMR226c遺伝子によってコードされるタンパク質のサイズと一致している。14kDと3kDのタンパク質バンドを合わせたサイズは、panD遺伝子によってコードされる翻訳後切断タンパク質と一致している。53kD、29kD、14kD、及び3kDタンパク質は、対照菌株MBin500のSDS‐PAGE分析で観察されなかった。菌株MBin500及びyMhCt019を、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産のためのバイオリアクターにおいて評価した。対照菌株MBin500は検出可能な3‐HPを産生しなかった2回の独立した発酵の平均。菌株yMhCt019は、5.23g/Lの3‐HPを産生した3回の独立した発酵の平均。実施例3A‐10:adh1202遺伝子座において4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現する酵母菌株追加の構築物を、adh1202遺伝子座においてB.リチェニフォルミスからの代替のADCをコードするヌクレオチド配列番号1394コピーを組み込むように設計した。先に記載したものと同様のアプローチにおいて、左側構築物及び右側構築物を、I.オリエンタリスadh1202遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。左側断片の構築プラスミドpMhCt095前掲を、本明細書中に記載したように、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。バチルスリケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼADCpanD遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化しバージョン1;配列番号149、そしてプラスミド1110206GeneArt登録商標内に合成により構築した。プラスミド1110206を、本明細書中に記載したように、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約380bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。~380bpの精製断片を、60.5ngの消化pMhCt095、6.3ngの380bpの1110206からの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して7.3kbpのpMhCt095線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて1.5時間インキュベートし、そして、反応物の3μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaIとPacIを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMeJi309と呼んだ。プラスミドpMeJi309を、NheI及びAscIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。バチルスリケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼpanD遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化しバージョン2;配列番号148、そしてプラスミド1110205GeneArt登録商標内に合成によって構築した。PCRを、50μLの終量中に、3μLの1110205、それぞれ25pMのプライマー0612695と0612724、1×pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、1.25単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含む混合物により実施した。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて1分間、55°Cにて1分間、そして72°Cにて1分間を25サイクル;そして72°Cにて3分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。増幅反応物からのPCR産物を、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約400bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。精製したPCR産物を、93ngのpMeJi309ベクター断片、52ngの上記PCR産物、2μLの1×InFusion商標反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechを含む反応物中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して先の消化pMeJi309ベクター内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物の2.5μLのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、XbaI及びPacIを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMeJi310‐2と呼んだ図14。右側断片の構築プラスミドpMhCt096前掲を、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約4.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。バチルスリケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼpanD遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化しバージョン3;配列番号151、そしてプラスミド1110208GeneArt登録商標内に合成により構築した。プラスミド1110208を、XbaI及びPacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約380bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。先の380bpの断片を、72.2ngの消化pMhCt096、6.9ngの380bpの1110208からの断片、1μLの10mMATP含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して7.3kbpのpMhCt096線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて1時間半インキュベートし、そして、反応物の3μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NheI及びAscIを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMeJi311と呼んだ。プラスミドpMeJi311を、酵素NheI及びAscIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約7.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。バチルスリケニホルミスのアスパラギン酸デカルボキシラーゼpanD遺伝子を、I.オリエンタリスにおける発現のために再びコドン最適化しバージョン4;配列番号150、そしてプラスミド1110207GeneArt登録商標内に合成によって構築した。PCRを、50μLの終量中に、3μLの1110207、それぞれ25pMの0612698と0612725、1×pfx増幅バッファーInvitrogen、2mMのMgSO4、1.25単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInvitrogenを含む混合物により実施した。増幅反応物を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて1分間、55°Cにて1分間、そして72°Cにて1分間を25サイクル;そして72°Cにて3分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificでインキュベートした。増幅反応物からのPCR産物を、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約400bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。精製したPCR産物を、65.1ngのpMeJi311NheI及びAscI消化ベクター断片、85ngの上記PCR産物、2μLの1×InFusion商標反応バッファーClontech、及び1μLのInFusion商標酵素Clontechを含む反応物中でInFusion商標AdvantagePCRCloningKitClontechを使用して先の消化pMeJi311ベクター内に挿入した。反応物を、37°Cにて15分間、そして50°Cにて15分間インキュベートし、次に、氷上に置いた。反応物の2.5μLのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて二日間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、NheI及びAscIを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認し、そしてpMeJi312‐2と呼んだ図15。左側及び右側断片の組み込みプラスミドpMeJi310‐2を、本明細書中に記載したように、HpaI及びSacIIで消化し、そしてプラスミドpMeJi312‐2を、EcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして約5kbpのバンド2本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリスCNB1を、消化pMeJi310‐2及びpMeJi312‐2DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、本明細書中に記載のように、CrimsonTaqNewEnglandBiolabsPCRによって確認した。プライマー0612794と0611245は、約3.17kbpのバンドをもたらし;プライマー612479と0611632は、約1.48kbpのバンドをもたらし;そして、プライマー611248と612795は、約2.3kbpのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、MeJi409‐2と呼んだ。そして、先に記載したように、菌株MeJi409‐2のura-誘導体を得た。本明細書中に記載した方法を使用して、菌株MBin500及びMeJi409‐2を、3‐HP生産について発酵バイオリアクター内で評価した。対照菌株MBin500は、検出可能な3‐HPを産生しなかった2回の独立した発酵の平均。菌株MeJi409‐2は4.62g/Lを産生した1回の発酵。他の例えば、今後の発酵と比較したこれらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、単位細胞質量あたりの3‐HP濃度[g/L3‐HP]/[g/L乾燥細胞重量]と表現されるが、MeJi409‐2に関しては0.20になることを計算した。実施例3A‐11:adh9091遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAATを発現する酵母菌株配列番号14のI.オリエンタリスのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAATをコードするヌクレオチド配列配列番号13を、I.オリエンタリスゲノムDNAからプライマー0611268と0611269を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、50ngの菌株I.オリエンタリスゲノムDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611268と0611269、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、及び1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約1278bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約1278bpであり、そして5’末端にNruI制限部位を有し、且つ、3’末端にPacI制限部位を有する。次に、AAT遺伝子CDS配列番号13を含む先の1278bpの得られた断片を、pCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10E.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって、所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定によって確認し、そしてpGMEr111と呼んだ。プラスミドpGMEr121とpGMEr111を、制限酵素PacI及びNruIで二重消化した。プラスミドpGMEr121からの7695bpの得られたベクター断片、及びプラスミドpGMEr111からのAATコード配列を含む1272bpの得られた挿入物断片を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。次に、連結反応物を、3μLのベクター断片、4μLの挿入物断片、2μLの無菌dd水、10μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseQuickLigationKit、NewEnglandBiolabsで準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってXL10Gold登録商標UltracompetentE.コリ細胞AgilentTechnologiesに形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SmaI/PpuMI二重消化によって、所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、配列決定で確認し、そしてpGMEr126と呼んだ図16。プラスミドpGMEr126は、I.オリエンタリスAAT発現カセットを含み、そしてそこでは、遺伝子転写は、上流にURA3コード配列の切断3’領域及びURA3プロモーターが隣接し、且つ、下流にI.オリエンタリスadh9091遺伝子座を含む3’相同性領域が隣接している、I.オリエンタリスTDH3プロモーター及びTKLターミネータによって制御されている。I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスpanD遺伝子配列番号130を、プライマー061166と0611662を使用してGeneArt登録商標製のpMA‐TベクターからPCR増幅した。PCR反応物50μLは、50ngの菌株プラスミドDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611661と0611662、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約453bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片の全長は、約453bpであり、その断片の5’末端にNruI制限部位を、そして3’末端にApaI制限部位を有していた。コドン最適化バージョンのS.アベルミチリスpanD遺伝子を含む、453bpの得られた断片を、製造業者の取扱説明書に従って、pCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてpGMEr127と呼んだ。プラスミドpGMEr127及びpGMEr125aを、制限酵素NruI及びApaIで消化した。消化反応を止める前に、末端の脱リン酸化と自己連結防止のためにpGMEr125a消化物に1μLのCalfIntestinalAlkalinePhosphataseNewEnglandBiolabsを加えた。プラスミドpGMEr125aからの得られた8188bpのベクター断片前掲、及びプラスミドpGMEr127前掲からのS.アベルミチリスpanD遺伝子配列番号130のコドン最適化バージョンを含む440bpの挿入物断片を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。次に、連結反応を、4μLのベクター断片、4μLの挿入物断片、9μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備し、そして製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、XL10Gold登録商標UltracompetentE.コリ細胞Stratagene内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって所望の挿入物の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr130と呼んだ図17。プラスミドpGMEr130は、以下の断片:I.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’隣接部、I.オリエンタリスPDCプロモーター/TALターミネータを含む空の発現カセット、I.オリエンタリスENO1プロモーターとRKIターミネータの制御下にあるpanD発現カセット配列番号130を含む、及びI.オリエンタリスURA3プロモーターの制御下にあるURA3マーカー遺伝子の切断5’断片からできた構築物を含む。酵母菌株I.オリエンタリスCNB1が、S.アベルミチリスpanD遺伝子のI.オリエンタリスコドン最適化バージョン配列番号130及びI.オリエンタリスAAT遺伝子配列番号13を発現することができるかどうか判断するために、発現プラスミドpGMEr130及びpGMEr126を構築した。プラスミドpGMEr130は、5’から3’へI.オリエンタリスadh9091遺伝子座における構築物のゲノムの組み込みのための5’フランキング領域、ENO1プロモーター及びRKIターミネータの制御下にあるpanD発現カセット、並びにURA3プロモーターによって駆動されるURA3選択マーカーの切断5’部分を含んでいる。プラスミドpGMEr126は、5’から3’へURA3選択マーカーの3’部分、TDH3プロモーター及びTKLターミネータの制御下にあるAAT遺伝子発現カセット、及びはI.オリエンタリスadh9091遺伝子座における構築物のゲノム組み込みのための3’隣接部を含んでいる。すべてのプロモーターとターミネータをI.オリエンタリスから得た。プラスミドpGMEr126を、制限酵素EcoRIで消化し、そしてそれが、着目の4758bpの断片を切り出したのに対して、プラスミドpGMEr130を、制限酵素HindIIIで消化し、そして形質転換に必要な5034bpの断片を作製した。4758bp及び5034bpの断片を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。I.オリエンタリスCNB1を、本明細書中に記載したように、培養し、そして約500ngの4758bpと5034bpの線状断片の両方を用いて同時形質転換した。8つの形質転換体菌株を得、次に、振盪フラスコで培養した。得られたブロスを、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスpanD遺伝子配列番号130及びI.オリエンタリスAAT遺伝子配列番号13の発現を検出するためのSDS‐PAGE、TrisHClBioRadLaboratoriesゲルに泳動するために使用した。陽性菌株を、yGMEr008と呼び、そしてそのブロスもまた、先に記載したように、ADC及びAAT活性レベルを測定するのに使用した。実施例3A‐12:adh9091遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼPYC、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAATを発現する酵母菌株配列番号2のI.オリエンタリスのピルビン酸カルボキシラーゼPYCをコードするヌクレオチド配列を、I.オリエンタリスゲノムDNAからプライマー0611266と0611267を使用してPCR増幅した。PCR反応物50μLは、50ngのI.オリエンタリスゲノムDNA、1×PhusionHFバッファーNewEnglandBiolabs、それぞれ50pmolのプライマー0611266と0611267、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、1.5μLの100DMSONewEnglandBiolabs、並びに1単位のPhusionHighFidelityDNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを含んでいた。PCRを、98°Cにて2分間を1サイクルと続く、それぞれ98°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分と30秒間を35サイクル、それと72°Cにて7分間の最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約3557bpのPCR産物をゲルから切り出す、TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。得られたPCR断片は、その断片の5’末端にXbaI制限部位を、そして3’末端にPacI制限部位を持っていた。I.オリエンタリスPYC遺伝子CDS配列番号1を含む、得られた3557bpの断片を、製造業者の取扱説明書に従って、pCR2.1-TOPOベクター内にクローン化し、そしてOneShotTOP10E.コリ細胞Invitrogen内に形質転換する。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらす6個のクローンを、確認し、そしてpGMEr132.7、pGMEr132.14、pGMEr132.16、pGMEr132.25、pGMEr132.27、及びpGMEr132.30と呼んだ。配列解析は、プラスミドpGMERI32.14には適切なPYCCDSがあるが、CDS5’末端のXbaI、制限部位を失ったことを明らかにした。この制限部位が発現プラスミドpGMEr125にPYCCDSを挿入するのに必要なので、プラスミドpGMEr132.14の315bpのHindIII断片変更されたXbaI部位を有するPYCCDSの5’末端を含むを、プラスミドpGMEr132.7からの315bpのHindIII断片と置き換えたが、それは、正しいXbaI部位を含んでいるPYCCDSの変更のない5’末端を持つ。プラスミドpGMEr132.14からの、得られた7173bpのHindIIIベクター断片、及びプラスミドpGMEr132.7からの、315bpのHindIII挿入物断片を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。次に、連結反応を、4μLのベクター断片、5μLの挿入物断片、10μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備し、製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10E.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI及びXbaIの二重消化によって、所望の挿入物の適切な挿入と方向についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr133と呼んだ。PDCプロモーターのI.オリエンタリスPYCCDS下流をプラスミドpGMEr125b内に挿入するために、プラスミドpGMEr125b及びpGMEr133前掲をPacI及びXbaIで消化した。プラスミドpGMEr125bからの、得られた8188bpのベクター断片、及びプラスミドpGMEr133からの、I.オリエンタリスPYCCDS配列番号1を含む3553bpの挿入物断片を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。次に、連結反応を、3μLのベクター断片、6μLの挿入物断片、10μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備し、製造業者の取扱説明書に従って実施した。上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10E.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって所望の断片の適切な挿入についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、確認し、そしてpGMEr136と呼んだ。プラスミドpGMEr136は、I.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’隣接部、I.オリエンタリスPDCプロモーター及びTALターミネータの制御下にあるI.オリエンタリスPYC遺伝子発現カセット配列番号1、I.オリエンタリスENO1プロモーター/RKIターミネータを有する空の発現カセット、及びURA3プロモーターの制御下にあるI.オリエンタリスURA3マーカー遺伝子の切断5’断片を含んでいる。約5μgのプラスミドpGMEr136前掲及び4μgのプラスミドpGMEr127を、制限酵素ApaI及びNruIで消化した。プラスミドpGMEr136からの、得られた11729bpのベクター断片、及びプラスミドpGMEr127からのI.オリエンタリスにおける発現のためにコドンで最適化したS.アベルミチリスpanD遺伝子配列番号130436bpを含む得られた挿入物断片を、製造業者の取扱説明書に従ってNucleoSpin登録商標ExtractIIMachereyNagelを使用した1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって精製した。次に、連結反応を、5μLのベクター断片、4μLの挿入物断片、9μLの2×QuickLigaseバッファー、及び1μLのQuickT4LigaseNewEnglandBiolabsを用いて準備した。反応物を、室温にて1時間インキュベートした。上記の連結反応物の5μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、BamHI消化によって所望の挿入物についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、選択し、そしてpGMEr137と呼んだ図18。プラスミドpGMEr137は、I.オリエンタリスPDCプロモーターとTALターミネータの転写調節下にあるI.オリエンタリスPYC遺伝子配列番号1、I.オリエンタリスENO1プロモーター及びRKIターミネータの転写調節の下にある、I.オリエンタリスにおける発現のためにコドン最適化したS.アベルミチリスpanD遺伝子配列番号130、URA3プロモーターとそれに続くURA3マーカーの5’末端、並びにI.オリエンタリスadh9091遺伝子座の5’フランキング領域を含む。プラスミドpGMEr126前掲を、制限酵素EcoRIで消化し、そしてそれで、着目の4758bpの断片を切り出した;その一方、プラスミドpGMEr137前掲を、制限酵素HpaIとNheIで消化し、8400bpの断片を作製した。4758bp及び8400bpの断片の両方を、1×TBEバッファー中での0.8アガロースゲル電気泳動によって分離し;バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNucleoSpin登録商標ExtractIIMachereyNagelを使用して精製した。形質転換体yGMEr009をもたらして、I.オリエンタリスCNB1を培養し、そして本明細書中に記載したように、約500ngの4758bpと8400bpの線状断片の両方で同時形質転換した。実施例3A‐13:pdc遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現し;且つ、adh9091遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼPYC、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAATを発現する酵母菌株アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAAT、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDHを既に過剰発現している菌株でピルビン酸カルボキシラーゼPYC及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAAT活性を増強するために、菌株yMhCt010前掲を、先に記載したように、pGMEr137前掲及びpGMEr126前掲の線状断片で形質転換した。2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが記載するように起こったの立証するために、ゲノムDNAをPCRにおける使用のために調製した。adh9091遺伝子座へのpGMEr137及びpGMEr126断片の正しいターゲッティングを、プライマー0611814と0612055を使用して確認した。プライマー0611814は、pGMEr126のTDH3プロモーターの3’末端にアニールし、そして3’方向に増幅する。プライマー0612055は、pGMEr126内に存在しているadh90913の3’フランキング相同部にアニールする、したがって、組み込みDNAが相同組み換えによって正しい遺伝子座路に標的化された場合にだけ、このプライマー対を用いたPCR産物の増幅が起こる。プライマー0611814と0612055を含むPCRからの約3066bpのバンドの存在は、pGMEr126及びpGMEr137断片の所望の組み込みがadh9091遺伝子座で起こったことを示す。pGMEr137及びpGMEr126の線状断片を用いたyMhCt010のいくつかの独立した形質転換体の2ラウンドのシングルコロニー精製及び増殖の後に、所望の標的組み込みが先に記載したように起こったことを確かめるためのPCRにおける使用のために、ゲノムDNAを調製した。プライマー0611814と0612055を含むPCRから約3066bpのバンドをもたらす、3つの独立に単離した菌株を、yMhCt020、GMErin0102、及びGMErin0103と呼んだ。これらの菌株は、両方のpdc遺伝子座及び1つのadh9091遺伝子座で対応するADC配列番号17をコードするポリヌクレオチド配列番号130;両方のpdc遺伝子座で対応するgabT配列番号24をコードするポリヌクレオチド配列番号141;両方のpdc遺伝子座で対応する3‐HPDH配列番号129をコードするポリヌクレオチド配列番号144;1つのadh9091遺伝子座で対応するPYC配列番号2をコードするポリヌクレオチド配列番号1;及び1つのadh9091遺伝子座で対応するAAT配列番号14をコードするポリヌクレオチド配列番号13を含んでいる表24を参照のこと。菌株yMhCt020、GMErin0102、及びGMErin0103を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そして本明細書中に記載のように、PYC、AAT、及び3‐HPDH活性についてアッセイした。実験結果を表25に示す。表25の菌株をさらに、本明細書中に記載したように、SDS‐PAGEによっても分析した。MBin500及びGMEr009‐2は、他の4サンプルで欠けている~64kDのタンパク質バンドを示した。これらのタンパク質の質量は、I.オリエンタリスCNB1の天然ピルビン酸デカルボキシラーゼとしてのそれらの正体と一致している。菌株yMhCt008、yMhCt020、GMErin0102、及びGMErin0103は、53kD及び29kDのバンドを示した。これらのタンパク質の質量は、それぞれUGA1及びYMR226c遺伝子によってコードされるタンパク質の質量と一致している。菌株GMEr009‐2、yMhCt020、GMErin0102、及びGMErin0103はすべて、46.3kDにバンドを示した。これらのタンパク質の質量は、AAT遺伝子によってコードされるタンパク質の質量と一致している。実施例3A‐14:両方のadh1202遺伝子座において4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現する酵母菌株配列番号139前掲のB.リチェニフォルミスADCをコードする4コピーのヌクレオチドを含むMeJi409‐2のura3-誘導体を、先に記載したFOA対抗選択ループアウトプロトコールを使用して単離した。親菌株MeJi409‐2のいくつかのFOA耐性コロニーのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0611817を用いたPCRによってスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位親菌株における2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターのみの存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。CrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを用いたPCR反応物を、先に記載したようにおこなった。MeJi411と呼ばれる、親菌株MeJi409‐2からの1つのFOA耐性コロニーは、所望の828bpのバンドを得た。左側断片及び右側断片の組み込み本明細書中に記載したように、プラスミドpMeJi310‐2を、HpaI及びSacIIで消化し、そして、プラスミドpMeJi312‐2を、EcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、2本の約5kbpのバンドをゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。MeJi411を、消化したpMeJi310‐2及びpMeJi312‐2DNAで形質転換し、そして、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、本明細書中に記載したように、CrimsonTaqNewEnglandBiolabsPCRによって確認した。プライマー0611225と0611632は、約5kbpのバンドをもたらし;プライマー0611815と0611632は、uraマーカーを含む約6kbpのバンドをもたらしたが、4.5kbpのバンドはなかった。プライマー0611631と0612579は、野生型adh1202遺伝子座がまだ完全である場合に、約936bpのバンドをもたらすこのバンドを示さなかった菌株を選択した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、MeJi412と呼んだ。実施例3A‐15:PDCプロモーターの制御下にあるアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCをコードするヌクレオチドの2つのコピー、及びTDH3プロモーターの制御下にある2つのコピーを含む、adh1202遺伝子座においてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現する酵母菌株この実施例では、I.オリエンタリスPDCプロモーター制御下にある2つのコピー及びI.オリエンタリスTDH3プロモーターの制御下にある2つのコピーを含んでいる、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピー4を組み込むように設計した構築物を説明する。先に記載したものへの同様のアプローチにおいて、左側及び右側構築物を、I.オリエンタリスCNB1のadh1202遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。左側断片の構築プラスミドpMeJi310‐2前掲;図14を参照のことを、XbaIとStuIで消化し、続いてCIPで処理し、そして本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。NotIでの消化、それに続くクレノーを用いた補充反応、そしてその後のNheIでの消化によって、PDCプロモーターをpMeJi310‐2から切り出した。約708bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。708bpの精製断片を、1μLのpMeJi310‐2からの6.7kbpの断片、1又は5μLのpMeJi310‐2からの708bpの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、並びに1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して線状ベクターを6.7kbpのpMeJi310‐2に連結した。反応物を、16°Cにて一晩インキュベートし、そして反応物の4μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ApaLIを使用した制限消化によって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa137と呼んだ。右側断片の構築プラスミドpMeJi312‐2前掲を、XbaIとStuIで消化し、続いてCIPで処理し、そして本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。TDH3プロモーターを、PmeI及びNheIで消化することによってpMeJi312‐2から切り出した。約966bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。966bpの精製断片を、1μLのpMeJi312‐2からの6.8kbpの断片、1~5μLの966bpのpMeJi312‐2からの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して6.8のkbpのpMeJi312‐2の線状ベクターに連結した。反応物を、16°Cにて約6時間インキュベートし、そして、反応物の4μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従ってOneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SalIを使用した制限消化によって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa136と呼んだ。左側断片及び右側断片の組み込み本明細書中に記載したように、プラスミドpMIBa137をHpaI及びSacIIで消化し、そしてプラスミドpMIBa136をEcoRI及びSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、約5kbpのバンド2本を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。I.オリエンタリスCNB1を、消化pMIBa137及びpMIBa136DNAで形質転換し、そして本明細書中にに記載したように、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換についてCrimsonTaqNewEnglandBiolabsPCRによって確認した。プライマー0611717と0611631は、約2.5kbp及び955bpのバンドをもたらし;プライマー0611718と0611632は、約733bpのバンドをもたらし;プライマー0612794と0611245は、約2.7kbpのバンドをもたらし;プライマー0611225と0612795は、約4.2kbpのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、MIBa351と呼んだ。MIBa351からのuraマーカーの除去MIBa351のura-誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa351のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0611817を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。828bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.2kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起きなかったことを示す。CrimsonTaq商標DNAポリメラーゼNewEnglandBiolabsを用いたPCR反応物を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより828bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認するために、2.7kbp産物をもたらすプライマー0612794と0611245、及び4kbpの産物をもたらすプライマー0611815と0612795を用いて試験した。MIBa353と呼ばれる親菌株MIBa351からの1つのFOA耐性コロニーは、3つのプライマーセットのすべてで所望のPCR産物をもたらした。逆発現カセットの右側断片の構築プラスミドpMIBa136は、前進の方向に進行する2個の発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、pMIBa136のpanDbl発現カセットを逆方向に置いた新しいプラスミドを構築した。プラスミドpMIBa136前掲を、本明細書中に記載したように、NotIとPmeIで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約3.4及び4.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。pMIBa136からの4.4kbpの断片を、CIPで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。pMIBa136からの3.4kbpの精製断片を、1μLのpMIBa136からの4.4kbpの断片、1~5μLのpMIBa136からの3.4kbpの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して4.4kbpのpMIBa136ベクター内に連結した。反応物を、16°Cにて一晩インキュベートし、そして反応物の4μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、PacIIとEcoRIを使用した制限消化によって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa138と呼んだ。左側断片及び右側断片の組み込み共に本明細書中に記載したように、プラスミドpMIBa137を、HpaIとSacIIで消化し、そしてプラスミドpMIBa138を、EcoRIとSacIIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、約5kbpのバンド2本をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。MIBa353を、消化pMIBa137及びpMIBa138DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。プライマー0611718と0611632は、約733bpのバンドをもたらし第1の組み込みがまだ存在していることを確認するため;プライマー0612367と0611632は、約960bpのバンドをもたらし第2のコピーが組み込まれたことを確認するため;プライマー0611631と0612579は、野生型adh1202遺伝子座がまだ存在しているのであれば、約936bpのバンドをもたらしたこのバンドの欠如はwtadh1202遺伝子座の欠失を確認する。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした2つの菌株を、保存し、そしてMIBa355及びMIBa356と呼んだ。MeJi409‐2、MeJi412、MIBa351、及びMIBa355のアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼ活性菌株MeJi409‐2、MeJi412、MIBa351、及びMIBa355を、振盪フラスコで培養し、そして本明細書中に記載したように、CFEを調製し、そしてアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC活性についてアッセイした。結果を表26に示す。各菌株の活性は、2つの独立した振盪フラスコ培養物の平均である。菌株MeJi409‐2、MeJi412、MIBa351、及びMIBa355もまた、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表26に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するために、表26に示した3‐HP生産能力を、単位細胞質量あたりの3‐HP濃度として表現した[g/L3‐HP]/[g/L乾燥細胞重量]として表現した。結果は、細胞内のADC活性のレベルが増強するのに従って3‐HP生産能力が増強されることを示している。実施例3A‐16:PDC遺伝子座におけるピルビン酸カルボキシラーゼPYCを発現するためのプラスミドの構築PDC遺伝子座における組み込みのための配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードする配列番号1のヌクレオチド配列を含むプラスミドpANN28を、以下で記載するように構築した。I.オリエンタリスPDCの上流及び下流フランキング領域を、製造業者の取扱説明書に従って、鋳型Pfuポリメラーゼ、StratageneとしてゲノムDNAを使用したPCRによって増幅した。プライマーoANN7とoANN8は、上流領域に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にし、プライマーoANN9とoANN10は、下流領域に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にした。PCR産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。各PCR産物の約800bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製したPCR産物を、製造業者の取扱説明書に従って、TOPOベクターInvitrogen内にクローン化し、そして電気的コンピテントE.コリDH10B細胞Invitrogen内に形質転換した。得られた形質転換体のいくつかを、PCR産物を作製するのと同じプライマーを使用したコロニーPCRによって適切な挿入についてスクリーニングした。陽性クローンを、配列決定によってさらに確認した。正しいPDC下流の隣接部をもたらしたクローンを、pANN04と呼んだ。正しいPDC上流の隣接部をもたらしたクローンを、pANN07と呼んだ。プラスミドpANN04を、ApaIとSacIで消化しベクター/骨格としての使用のため;プラスミドpANN04を、NotIとSacIで消化し;プラスミドpANN07を、NotIとApaIで消化した。各断片を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターのための約3.5kbpのバンド、及び各挿入物のための約1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製産物を、49ngのベクター、120ngの下流挿入物、41ngの上流挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して連結した。反応物を、室温にて30分間インキュベートし、そして反応物の2μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10電気的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、約1.7kbpのバンドをもたらすプライマーoANN7とoANN10を用いたコロニーPCRによって適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、pANN12と呼んだ。pGMEr137前掲からのI.オリエンタリスPYCコード配列配列番号1を、部位特異的突然変異誘発によって改変し、コードしている酵素のアミノ酸配列を変更しない3つのEcoRI制限部位を排除した。プラスミドpGMEr137を、製造業者の取扱説明書に従ってMultichangekitStratageneを使用した、先に触れた制限部位の排除に使用するプライマーoANN13、oANN14、及びoANN15を伴って鋳型として使用した。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRIを使用した制限消化によってスクリーニングした。陽性クローンを、配列決定によってさらに確認した。正しいpycコード配列をもたらしたクローンを、pANN14と呼んだ。プラスミドpJY39図29を、XhoIとPacIで消化し;プラスミドpACN5前掲;図19を参照のことを、XhoIとXbaIで消化し;プラスミドpANN14を、XbaIとPacIで消化した。各断片を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。ベクターのための約8kbpのバンド、第1の挿入物のための約700bpのバンド、及びPYCをコードする第2の挿入物のための約3.6kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製産物を、51ngのベクター、49ngの第1の挿入物、210ngの第2の挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して連結した。反応物を、室温にて30分間インキュベートし、そして、反応物の2μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10電気的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、プライマーoJLJ57とoJLJ43約1kbpのバンドをもたらす、プライマーoJLJ45とoANN16約730bpのバンドをもたらす、及びプライマーoANN20とoJY45約1.2kbpのバンドをもたらすを用いたコロニーPCRによって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、pANN15と呼んだ。プラスミドpANN12及びpANN15を、NotIで消化した。プラスミドpANN15を、骨格の更なる分画及び所望の断片の分離の改善のために、NcoIでさらに消化した。消化したpANN12を、製造業者の取扱説明書に従ってQiagenキットを使用して精製した。NotI断片を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約5kbppANN12から及び約6.3kbppANN15からのバンドを、製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用してゲル精製した。pANN15からの精製産物を、50ngのベクター、115ngの挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でにT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用してpANN12線状ベクターに連結した。反応物を、室温にて1.5時間インキュベートし、そして、反応物の2μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10電気的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、約1.2kbpのバンドをもたらすプライマーoANN20とoJY45を用いたコロニーPCRによって、適切な挿入についてスクリーニングした。正しい挿入をもたらすクローンを、挿入方向を識別するために、SacI/EcoRI及びSacI/EcoRVで制限酵素消化によってさらにスクリーニングした。上流PDC隣接部に近いura3マーカーをもたらしたクローンを、pANN27と呼んだ。下流PDC隣接部に近いura3マーカーをもたらしたクローンを、pANN28と呼んだ。実施例3A‐17:adh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを、及びpdc遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼPYCを発現する酵母菌株この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピー及びpdc遺伝子座において配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。MeJi412からのuraマーカーの除去MeJi412のura-誘導体を、先に記載したように単離した。MeJi412のいくつかのFOA耐性コロニーを、0611815と0611817プライマーを用いたコロニーPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。プライマー0611815は、左側構築物のRKIターミネータにアニールし、そしてura3プロモーターに向かって増幅する。プライマー0611817は、TDH3プロモーターにアニールし、そしてura3カセットに向かって戻る方向に増幅する。869bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.6kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。Phire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを用いたPCR反応を、先に記載したように実施した。上記のプライマーにより869bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、3.8kbpの産物をもたらすプライマー0612794と0611817、及び3.7kbpの産物をもたらすプライマー611815と612795を用いてさらに試験して、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。MeJi413と呼んだ、親菌株MeJi412からの1つのFOA耐性コロニーは、3つのプライマーセットすべてで所望のPCR産物をもたらした。断片の組み込みプラスミドpANN28前掲を、AscIとSacIで消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル精製キットQiagenを使用して精製した。菌株MeJi413を、pANN28からの消化及び精製した断片で形質転換し、そして、製造業者の取扱説明書に従って、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、コロニーPCRFailsafemixEEpicenterによって確認した。プライマーoANN12とoJLJ44は、約1kbpのバンドをもたらし;プライマーoANN11とoANN16は、約1.3kbpのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、yANN35と呼んだ。次に、yANN35のura-誘導体を、先に記載したように単離した。いくつかのFOA耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、プライマーoANN12とoJY44を用いたコロニーPCRによってスクリーニングした。プライマーoANN12は、下流隣接領域の外側にアニールする。プライマーoJY44は、TALターミネータにアニールする。1.5kbpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.8kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。FailsafeDNAポリメラーゼEpicenterを用いたPCR反応を、先に記載したように実施した。この事象に関して陽性の単離菌株を、プライマーoANN16とoANN11を用いたコロニーPCRによってさらに確認した。1つのFOA耐性コロニーを、yANN37と呼んだ。菌株yANN37を、pANN28からの消化及び精製断片で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってコロニーPCRFailsafemixEEpicenterによって確認した。PDC遺伝子に特異的なプライマーoHJJ116とoHJJ117を用いて予備的なスクリーンをした。約500bpのバンドは、遺伝子の存在を示し、それにより所望の組み込みについて陰性を示す。PDCの欠失について陽性である単離菌株を、追加のPCR反応物でさらに確認した。プライマーoANN11とoANN16は、約1.3kbpのバンドをもたらし;プライマーoANN12とoJLJ44は、約1kbpのバンドをもたらし;プライマーoANN12とoJY44は、約1.5kbpのバンドと約2.9kbpのバンドをもたらしたそれぞれ第1及び第2の組み込み事象に対応する。さらに、adh1202遺伝子座における先の組み込み事象を、先に記載したように、コロニーPCRによって確認した。プライマー0611631と0611245は、約3.8kbpのバンドをもたらした。プライマー0611245とoNovo3は、約3kbpのバンドをもたらした。プライマー0611815と0612795は、約3.6kbpのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、yANN41と呼んだ。実施例3A‐18:adh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC及びpdc遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼPYCを発現する酵母菌株この実施例は、adh1202遺伝子座における配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーPDCプロモーター制御下の2つのコピーとTDH3プロモーター制御下の2つのコピーによる及びpdc遺伝子座において配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチドを発現する酵母菌株の構築を説明する。MIBa355からのuraマーカーの除去MIBa355のura-誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa355のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、プライマー0611815と0611718を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。約500bpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみの親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約1.9kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示す。PCRを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用して実施した。上記のプライマーにより約500bpの断片をもたらしたFOA耐性コロニーを、3.5kbpの産物をもたらすプライマー0611631と0611245、及び4.5kbpの産物をもたらすプライマー0611815と0611632を用いてさらに試験し、配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする配列番号138のヌクレオチド配列の4つのコピーが元の状態のまま残っていることを確認した。それらをまた、adh1202における第1の改変が存在していることを確認するために、プライマー0611815と0611817を使用したPCRを用いて試験した。これらのPCRプライマーは、828bpの断片をもたらした。MIBa357と呼ばれる、親菌株MIBa355からの1つのFOA耐性コロニーは、4つのプライマーセットすべてで所望のPCR産物をもたらした。プラスミドpANN28前掲を、AscIとSacIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。MIBa357を、消化pANN28DNAで形質転換し、そしてPhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって、正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について確認した。プライマー0611622と0611552は、約850bpのバンドをもたらし;プライマー0611245と0612794は、約2.8kbpのバンドをもたらし;プライマー0611815と0612795は、約3.9kbpのバンドをもたらした。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs241と呼んだ。次に、McTs241のura-誘導体を、以前に記載したように単離した。McTs241のいくつかのFOA耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、プライマー0614233と0611554を用いたPCR、及びuraマイナス選択プレート上での成長の欠如によってスクリーニングした。4.6kbpのバンドの存在が、所望されるura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約5.9kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用するPCR反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株McTs241からの1つのFOA耐性コロニーを、McTs247と呼んだ。ホモ接合組み込み体を作製するために、McTs247を、消化pANN28DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。第1のスクリーンとして、形質転換体を、pdc遺伝子座が完全である、よって、PDC遺伝子座におけるPYCのホモ接合組み込みが起こらなかった場合にだけ約850bpのバンドをもたらすはずであるプライマー0611552と0611553を用いたPCRによってスクリーニングした。このPCRからのバンドが陰性であったものを、次に、プライマー0611555と0611554を用いた追加PCRによってスクリーニングした。これらのプライマーにより、産物は、PDCが完全であり、よって、PDC遺伝子座におけるPYCのホモ接合組み込みがない場合にだけ、1.4kbpのバンドを増幅するはずである。形質転換体の更なるスクリーニングを、約850bpのバンドをもたらすプライマー0611622と0611552;約2.8kbpのバンドをもたらしたプライマー0611245と0612794;約3.9kbpのバンドをもたらしたプライマー0611815と0612795を使用したPCRによっておこなった。発現カセットの正しい組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs253と呼んだ。実施例3A‐19:菌株MeJi412、yANN35、yANN41、MIBa355、McTs241、及びMcTs253のPYC活性、ADC活性、及び3‐HP生産能力菌株MeJi412、yANN35、yANN41、MIBa355、McTs241、及びMcTs253を、振盪フラスコで培養し、CFEを調製し、そして本明細書中に記載したように、ピルビン酸カルボキシラーゼPYC活性、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADC活性についてアッセイした。結果を表27に示す、菌株MeJi412、yANN35、yANN41、MIBa355、McTs241、及びMcTs253はまた、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらのバイオリアクター実験からの結果もまた、表27に示す。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、示した3‐HP生産能力は、[g/L3‐HP]/[g/L乾燥細胞重量]と表現される細胞質量単位あたりの3‐HP濃度として表現されている。結果は、細胞のPYC活性レベルに増強に従って3‐HP生産能力が増強したことを示している。実施例3A‐20:adh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からβ‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAATを発現し、且つ、アスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCの欠失がある酵母菌株この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現し、且つ、配列番号20のBAATPYD4をコードする天然I.オリエンタリス遺伝子の欠失がある酵母菌株の構築と能力を説明する。I.オリエンタリスBAATPYD4欠失プラスミドの構築プラスミドpMIBa123前掲は、本明細書中に記載したように、NotI、KpnI、ApaIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約3.6kbpと3.8kbpの2本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。これらの2つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号144のS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子YMR226cを持つura選択カセットを含んでいた。上流I.オリエンタリスPYD4相同性のためのPCR産物を、プライマー0613178及び0613180を使用して、先に記載したように調製したI.オリエンタリスMBin500ゲノムDNAを使用したPCR増幅によって作製した。下流I.オリエンタリスPYD4相同ピースを、プライマー0613179と0613181を使用して、MBin500ゲノムDNAからPCR増幅によって調製した。それぞれの50pmolのプライマーを、50μLの終量中に0.5μLの鋳型としてのMBin500ゲノムDNA、0.2mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、1×ExpandHighFidelityバッファーRoche、3.5UのExpandHighFidelityEnzymeMixRocheを含むPCR反応物において使用した。増幅反応物を、95°Cにて3分間を1サイクル;そしてそれぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を30サイクルをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標5333Eppendorfで実施した。サイクル後に、反応物を、72°Cにて5分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで10°Cに冷やした。プライマー0613178と0613180を使用したPCRからの約800bpのバンド、及びプライマー0613179と0613181を使用したPCRからの約900bpのバンドを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。PYD4上流PCR産物、PYD4下流PCR産物、及びpMIBa123のNotI/KpnI/ApaI消化プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSIONHD商標ClontechLaboratoriesIncを用いた反応で構築した。In‐FUSION反応物から、2μLを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenに形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mLあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを選択プレートから選択した、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化及び配列決定によって分析した。正しい配列を有するプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてpMcTs61と命名した。プラスミドpMcTs61は、PDCプロモーター、S.セレビシエからのYMR226c遺伝子、及びPDCターミネータをまだ含んでいる。これらが望ましくないセグメントを取り出すために、pMcTs61を、EcoRI及びXhoIで消化し、続いてクレノー断片を加えて、平滑末端を作製した。7.1kbpの断片を、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。消化した平滑プラスミドを、T4DNAリガーゼNewEnglandBiolabs、IpswichMAUSAを使用して一つに連結した。反応混合物は、20μLの全容積中に1×T4DNAリガーゼバッファー、1μLのT4DNAリガーゼ、5μLのpMcTs61消化及び平滑化精製DNAを含んでいた。反応物を、室温にて2時間インキュベートした。連結反応物の10μLのサンプルを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenを形質転換するのに使用した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mLあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから選択した。クローンを、コロニーPCRによって分析した。各コロニーからの鋳型DNAを、1つのコロニーを50μLの滅菌水中に溶解することによって調製し、95°Cにて10分間加熱し、次に、使用まで氷上で冷やした。プライマー0612911と0612909を、形質転換体をスクリーニングするのに使用した。これらのプライマーを用いたPCR反応物は、プラスミドが正しければ、1kbpのバンドを増幅する。10pmolのそれぞれのプライマーを、20μLの終量中に2μLのコロニーDNA鋳型、0.1mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、1×CrimsonTaq反応バッファーNewEnglandBiolabs、1UのCrimsonTaqDNAPolymeraseNewEnglandBiolabsを含むPCR反応物中で使用した。増幅反応を、95°Cにて3分間を1サイクル;そして、それぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて3分間を30サイクルをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標5333Eppendorfで実施した。サイクル後に、反応物を、72°Cにて5分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで10°Cに冷やした。5μLのPCR反応物から、1kbpのPCR断片を、TAEバッファー中のエチジウムブロマイドを用いて1のTAE‐アガロースゲル上で可視化した。正しいサイズPCR産物を有する1つの形質転換体を、選択し、そしてpMcTs64と命名した図30。pMcTs64のプラスミドDNAを、BIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。pMcTs64構築物を使用したMeJi413からの天然I.オリエンタリスBAATPYD4の欠失プラスミドpMcTs64前掲;図30を参照のことを、ApaI、NcoI、KpnIで消化し、1TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約3.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。菌株MeJi413前掲を、消化pMcTs64DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。プライマー0612908と0613242は、約1.7kbpのバンドをもたらし;プライマー0613241と0612909は、欠失カセットの組み込みを確認するために約1.5kbpのバンドをもたらす。プライマー0611815と0611632は、約4.2kbpのバンドをもたらし;プライマー0611817と0611631は、ADH1202遺伝子座におけるADCカセットが完全なままであることを確認するために約4.8kbpのバンドをもたらす。欠失カセットとADCカセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs225と呼んだ。次に、McTs225のura-誘導体を、以前に記載したように単離した。McTs225のいくつかのFOA耐性コロニーを、プライマー0612911と0612910を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。1.1kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.5kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。プライマー0611815と0611632は、約4.2kbpのバンドをもたらし;プライマー0611817と0611631は、adh1202遺伝子座にADCカセットが完全なままであることを確認するために約4.8kbpのバンドをもたらす。PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCR反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株McTs225からの1つのFOA耐性コロニーを、McTs228と呼んだ。配列番号20のI.オリエンタリスBAATPYD4をコードする天然遺伝子のホモ接合欠失を作製するために、McTs228を、消化pMcTs64で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用するPCRによって確認した。2つのプライマーセットを、PYD4遺伝子座の欠失についてのPCRによるスクリーニングに使用した。プライマー0613550と0612910は、PYD4のホモ接合欠失が起こらなかったのを示す、PYD4遺伝子座が完全である場合にだけ、約700bpのバンドをもたらす。さらに、形質転換体を、PYD4が欠失されていなければ、約600bpのバンドをもたらすプライマー0612911と0613551を用いてスクリーニングした。I.オリエンタリスPYD4遺伝子座に関して陰性であった形質転換体を、約3.5kbpと2.1kbpのバンドをもたらすプライマー0613242と0613243;約1.7kbpのバンドをもたらしたプライマー0612908と0613243;約950bpのバンドをもたらしたプライマー0612909と0612911でスクリーニングした。約4.8kbpをもたらすプライマー0611817と0611631、及び約4.2kbpのバンドをもたらすプライマー611815と612712を用いて、adh1202遺伝子座のADCカセットが、まだ完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs236と呼んだ。次に、McTs236のura-誘導体を、以前に記載したように単離した。McTs236のいくつかのFOA耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、約2.1kbpのバンドをもたらすプライマー0613242及び0613243を用いたPCRによってスクリーニングした。ADH1202遺伝子座のADCカセットを、約3kbpをもたらすプライマー0611245と0612794、並びに約3.6kbpのバンドをもたらすプライマー0611815と0612795を用いて、ADH1202遺伝子座のADCカセットが完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs245と呼んだ。菌株MIBa372及びMcTs245を、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、3‐HP生産能力を、単位細胞質量あたりの3‐HP濃度として表現する[g/L3‐HP]/[g/L乾燥細胞重量]と表現する。菌株MIBa372及びMcTs245のg/L3‐HP/g/L乾燥細胞重量は、それぞれ1.66及び0.16である。これらの結果は、I.オリエンタリスの天然PYD4遺伝子がβ‐アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの転換に関与することを示唆している、なぜならば、この遺伝子の欠失が3‐HP生産能力の10分の1への減少につながるからである。実施例3A‐21:adh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からのアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCの発現、且つ、3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDHを欠失した酵母菌株この実施例は、adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現し、且つ、配列番号26の3‐HPDHPYD4をコードする天然I.オリエンタリス遺伝子を欠失した酵母菌株の構築と能力を説明する。I.オリエンタリス3‐HPDH欠失プラスミドの構築プラスミドpMIBa123前掲は、本明細書中に記載したように、NotI、KpnI、ApaIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動法によって精製した。約3.6kbpと3.8kbpの2本のバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。これらの2つのピースが、プラスミド骨格及び配列番号144のS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子を持つura選択カセットを含んでいた。上流I.オリエンタリス3‐HPDH相同性のためのPCR産物を、プライマー0613183及び0613184を使用して、先に記載したように調製したI.オリエンタリスMBin500ゲノムDNAから増幅した。下流I.オリエンタリス3‐HPDH相同ピースを、プライマー0613185と0613186を使用して、I.オリエンタリスMBin500ゲノムDNAから増幅した。それぞれの50pmolのプライマーを、50μLの終量中に0.5μLの鋳型としてのMBin500ゲノムDNA、0.2mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、2のDMSO、1×PhusionHFバッファーFinnzymes、2UのPhusion登録商標HotStartHighFidelityDNAPolymeraseFinnzymesを含むPCR反応物において使用した。増幅反応物を、95°Cにて3分間を1サイクル;そしてそれぞれ95°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を30サイクルをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標5333EppendorfScientificInc、WestburyNYUSAで実施した。サイクル後に、反応物を、72°Cにて5分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで4°Cに冷やした。プライマー0613183と0613184のPCRからの約640bpのバンド、及びプライマー0613185と0613186を使用したPCRからの約670bpのバンドを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリス3‐HPDH上流PCR産物、I.オリエンタリス3‐HPDH下流PCR産物、及びpMIBa123のNotI/KpnI/ApaI消化プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSIONHD商標ClontechLaboratoriesIncを用いた反応で構築した。In‐FUSION反応物から、2μLを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogenに形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mLあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを選択プレートから選択した、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化及び配列決定によって分析した。正しい配列を有するプラスミドを、配列決定によって確認し、そしてpMcTs60と命名した。プラスミドpMcTs60はまだPDCプロモーター、S.セレビシエからのYMR226c遺伝子、及びPDCターミネータを含んでいる。これらの望ましくないセグメントを取り出すために、pMcTs60をNotI及びXbaIで消化し、そして3‐HPDHホモロジー領域及びプラスミド骨格を含んでいる約5kbpのバンドを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。ura3選択カセットを、1回がプライマー0613416と0613417を用い、もう1回がプライマー0613418と0613419を用いる、2回のPCR反応で増幅した。50pmolの各プライマーを、50μLの終量中に0.5μLの鋳型としてpMcTs60プラスミドDNA、0.2mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、1×ExpandHighFidelityバッファーRoche、3.5UのExpandHighFidelityEnzymeMixRocheを含むPCR反応物に使用した。増幅反応を、95°Cにて3分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1分間を30サイクルをプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標5333EppendorfScientificIncで実施した。サイクル後に、反応物を、72°Cにて5分間インキュベートし、次に、さらに処理するまで4°Cに冷やした。プライマー0613416と0613417のPCRからの約700bpのバンド及びプライマー0613418と0613419からのPCRの約1kbpのバンドを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。I.オリエンタリス3‐HPDHホモロジー領域とura3カセットPCR産物を含むプラスミド骨格を、製造業者の取扱説明書に従って、IN‐FUSIONHD商標ClontechLaboratoriesIncを用いた反応で構築した。In‐FUSIONからの反応物2μLを、製造業者の取扱説明書に従って、SoloPackGoldSuperCompetentCellsStratageneに形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mLあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから選択し、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、pMcTs65と命名した図31。pMcTs65構築物を使用したMeJi413からの天然I.オリエンタリス3‐HPDHの欠失プラスミドpMcTs65前掲;図31を参照のことを、ApaI、SphI、KpnIで消化し、1TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約2.9kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。菌株MeJi413前掲を、消化pMcTs65DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。プライマー0613034と0613035は、欠失カセットの組み込みを確認するために約2.7kbpのバンドをもたらす。プライマー0611815と0611632は、約4.2kbpのバンドをもたらし;プライマー0611817と0611631は、adh1202遺伝子座におけるADCカセットが完全なままであることを確認するために約4.8kbpのバンドをもたらす。欠失カセットとADCカセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs229と呼んだ。次に、McTs229のura-誘導体を、以前に記載したように単離した。McTs229のいくつかのFOA耐性コロニーを、プライマー0613034と0613241を用いたPCRによって、所望のループアウト事象についてスクリーニングした。1.4kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位のみ親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターの存在を示すのに対して、約2.8kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。1.9kbpのバンドの存在は、これらは欠失のための異型接合部であるので、これらの形質転換体に存在している野生型遺伝子座を示す。プライマー0611631と0612366は、約4.5kbpのバンドをもたらし;プライマー0611817と0611631は、adh1202遺伝子座にADCカセットが完全なままであることを確認するために約4.8kbpのバンドをもたらす。PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCR反応を、先に記載したように実施した。所望のループアウト事象があった親菌株McTs225からの1つのFOA耐性コロニーを、McTs238と呼んだ。配列番号26のI.オリエンタリス3‐HPDHをコードする天然遺伝子のホモ接合欠失を作製するために、McTs238を、消化pMcTs65で形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、PhirePlantDirectPCRkitFinnzymesを使用するPCRによって確認した。2つのプライマーセットを、YMR226c遺伝子座の欠失についてのPCRによるスクリーニングに使用した。プライマー0613034と0613747は、3‐HPDHのホモ接合欠失が起こらなかったのを示す、3‐HPDH遺伝子座が完全である場合にだけ、約500bpのバンドをもたらす。さらに、形質転換体を、3‐HPDHが欠失されていなければ、約660bpのバンドをもたらすプライマー0613746と0613241を用いてスクリーニングした。I.オリエンタリス3‐HPDH遺伝子座に関して野生型陰性であった形質転換体を、約2.8kbpと1.4kbpのバンドをもたらすプライマー0613034と0613241;約1.5kbpのバンドをもたらしたプライマー0612908と0613241;約1kbpのバンドをもたらしたプライマー0613034と0612909でスクリーニングした。約3kbpをもたらすプライマー0611245と0612794、及び約3.6kbpのバンドをもたらすプライマー611815と612795を用いて、adh1202遺伝子座のADCカセットが、まだ完全なままであることを確認した。発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらした菌株を、McTs244と呼んだ。次に、McTs244のura-誘導体を、以前に記載したように単離した。McTs244のいくつかのFOA耐性コロニーを、所望のループアウト事象について、約1.4kbpのバンドをもたらすプライマー0613034と0613241を用いたPCRによってスクリーニングした。約3kbpのバンドをもたらすプライマー0611245と0612794、及び約3.6kbpのバンドをもたらすプライマー0611815と0612795を用いて、ADH1202遺伝子座のADCカセットがまだ完全なままであることを確認した。所望のループアウト事象があった親菌株McTs244からの1つのFOA耐性コロニーを、McTs259と呼んだ。菌株MIBa372とMcTs244を、本明細書中に記載した方法を使用して、3‐HP生産についてバイオリアクター内で試験した。これらの発酵における細胞質量の違いを考慮するため、3‐HP生産能力を、細胞質量単位あたりの3‐HP濃度として表現するg/L3‐HP/g/L乾燥細胞重量と表現する。菌株MIBa372とMcTs259のg/L3‐HP/g/L乾燥細胞重量は、それぞれ1.66と<0.1であった。これらの結果は、I.オリエンタリス内の天然3‐HPDH遺伝子がマロン酸セミアルデヒドから3‐HPへの転換に関与することを示す、なぜならば、この遺伝子の欠失が3‐HP生産を止めるからである。実施例3A‐22:pdc遺伝子座においてピルビン酸カルボキシラーゼPYC、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAAT、β‐アラニンアミノトランスフェラーゼBAAT、及び3‐ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ3‐HPDH、並びにadh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを発現する酵母菌株追加構築物を、adh1202遺伝子座に配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードする4つのコピーのヌクレオチドも含む菌株のI.オリエンタリスpdc遺伝子座に、配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードするヌクレオチド配列配列番号1、配列番号14のI.オリエンタリスAATをコードするヌクレオチド配列配列番号13、配列番号21のS.クルイベリBAATをコードするヌクレオチド配列配列番号142、及び配列番号129のS.セレビシエ3‐HPDHをコードするヌクレオチド配列配列番号144を組み込むように設計した。先に記載したものへの同様のアプローチでは、左側構築物と右側構築物を、I.オリエンタリスCNB1pdc遺伝子座における相同組み換えを可能にするように設計した。これらの構築物を調製し、そして以下に記載したようにMIBa357内に形質転換した。左側断片の構築配列番号14のI.オリエンタリスAATをコードするヌクレオチド配列配列番号13を、製造業者の取扱説明書に従って鋳型としてプラスミドpGMEr126図16を使用したPCRによって増幅したPfuポリメラーゼ、Stratagene。プライマーのoANN1とoANN2は、遺伝子コード配列に隣接する独特な制限部位の取り込みを可能にした。PCR産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約1.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製したPCR産物を、ApaI及びNruIで消化し、そして本明細書中に記載したようにゲル精製した。プラスミドpGMEr135ENO1プロモーター/RKIターミネータ挿入物が反対方向であることを除いて、上記のpGMEr136と同一であるを、本明細書中に記載したように、ApaIとNruIで消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約11.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製した1.3kbpのPCR産物を、49.8ngのベクター、354ngの1.3kbpの挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して11.7kbpのpGMEr135線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて30分間インキュベートし、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の2μLのアリコートを、電気的コンピテントE.コリDH10B細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーoHJ2とoANN1約2.3kbpのバンドをもたらす及びプライマーoANN5とoANN6約877bpのバンドをもたらすを用いたコロニーPCRによってスクリーニングした。PCRによって増幅したaat断片の配列もまた確認した。正しい挿入及び配列をもたらすクローンを、本明細書中に記載したように、ApaIとNruIで消化し、そしてゲルが精製した。約1.3kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。配列番号2のI.オリエンタリスPYCをコードする所望のヌクレオチド配列配列番号1を含むプラスミドpGMEr137前掲;図18を参照のことを、本明細書中に記載したように、ApaIとNruIで消化し、TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約11.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。精製した1.3kbpのPCR産物を、49.4ngのベクター、54ngの1.3kbpの挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して11.7kbpのpGMEr137線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて30分間インキュベートし、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の2μLのアリコートを電気的コンピテントE.コリDH10B細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーoHJ2とoANN1約2.3kbpのバンドをもたらす、プライマーoANN5とoANN6約877bpのバンドをもたらすを用いたコロニーPCRによってスクリーニングした。正しい挿入と配列をもたらしたクローンを、pANN02と呼んだ。反対向きにAATコード配列を含む左側断片の構築プラスミドpANN02を、本明細書中に記載したように、PmeIで消化し、そしてTBEバッファーでアガロースゲル電気泳動によって精製した。約10.3kbpのバンド及び約2.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってゲル抽出キットQiagenを使用して精製した。pANN2からの10.3kbpのベクター断片を、CIPNewEnglandBiolabsで脱リン酸化し、そして製造業者の取扱説明書に従って、精製キットQiagenで精製した。pANN02からの2.7kbpの断片を、pANN02からの脱リン酸化した10.3kbpの線状ベクターを、36ngのベクター、28ngの挿入物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して連結した。反応物を、間室温にて30分インキュベートした、そして製造業者の取扱説明書に従って、反応物の2μLのアリコートを電気的コンピテントE.コリTOP10細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、LBカナマイシンプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、プライマーoJY44とoHJ1約1.3kbpのバンドをもたらすを用いたコロニーPCRによってスクリーニングした。正しい挿入をもたらしたクローンを、pANN5と呼んだ。右側断片の構築2つのB.リチェニフォルミスADCコード領域、及びI.オリエンタリスPDC遺伝子座3’ターゲッティングフランキングDNAを含む右側構築物を、以下の通り構築した。pMhCt071プラスミドS.セレビシエ3‐HPDHORFがI.オリエンタリスに最適化したコドンでないことを除いて、先のpMhCt077と同一のプラスミドを、PmeIとPacIで消化し、10単位の仔ウシ腸ホスファターゼNewEnglandBiolabsで処理し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製して、そして約4.7kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitを使用して精製した。プラスミドpMeJi312‐2前掲;図15を参照のことを、2個のB.リチェニフォルミスADC発現カセットを抽出するために、PmeIとPacIで消化し、TAEバッファー中での0.9アガロースゲル電気泳動によって精製した。約2.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitを使用して精製した。次に、pMeJi312‐2からの二つのB.リチェニフォルミスADCコード領域を含む断片を、1×QuickLigation反応バッファーNewEnglandBiolabs、1μLの4.7kbpのpMhCt071ベクター断片、3μLのpMeJi312‐2からの2.8kbpの挿入物、及び1μLのQuickT4DNALigaseNewEnglandBiolabsを含んでいる連結反応物20μL中で線状pMhCt071ベクター断片内に連結した。連結反応物を、室温にて5分間インキュベートし、次に、チューブを氷上に置いた。この反応物5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってSoloPackGoldSuperCompetentCellsAgilentTechnologiesを形質転換するのに使用した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、ApaLI消化によって所望の断片の適切な連結についてスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらすクローンを、保存し、そしてpMhCt110と呼んだ。プラスミドpMhCt110を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIで消化し、続いてCIPで処理し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.1kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。配列番号144のコドン最適化S.セレビシエ3‐HPDHコード配列を、pMIBa123前掲からXbaIとPacIでの消化によって切り出し、そして本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約814bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。814bpの精製断片を、1μLの消化pMhCt110、1~7μLのpMIBa123からの814bpの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用してpMhCt110からの7.1kbpの断片内に連結した。反応物を、室温にて30分間インキュベートし、そして反応物の4μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして室温にて週末の間インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入について、酵素XbaIとPacI及びAscIとPacIの2つの組み合わせを使用した制限消化によってスクリーニングした。各消化産物からの正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa142と呼んだ。プラスミドpMIBa142を、AscIで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてその後、NheIで消化し、そしてCIPで処理した。消化産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約7.5kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。配列番号21のS.クルイベリBAATをコードするヌクレオチド配列配列番号142を、PacIで消化し、続いてクレノーを用いた補充反応に供し、そしてその後、XbaIで消化して、pMIBa124前掲から切り出した。消化産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約1.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。pMIBa124からの1.4kbpの精製断片を、1μLの消化pMIBa142、7μLのpMIBa124からの1.4断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用してpMIBa142からの7.5kbpの断片に連結した。反応物を、16°Cにて2.5時間インキュベートし、そして、連結反応物の全部を、製造業者の取扱説明書に従って、Sure細胞Agilent内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩であるとインキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてStuIとPmeIでの制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa144と呼んだ。MIBa357内への左側断片及び右側断片の組み込み本明細書中に記載したように、プラスミドpANN5を、NotIとNheIで消化し、そしてプラスミドpMIBa144を、NotIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、pANN5からの8.2kbpの断片とpMIBa144からの6kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。MIBa357を、消化pANN5及びpMIBa144DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。プライマー0611552と0613695は、約4.1kbpのバンドをもたらしpdc遺伝子座における左側半分の組み込みを確認する;プライマー0612358と0611554は、約2.5kbpのバンドをもたらしpdc遺伝子座における右側半分の組み込みを確認する;0611245と0611631は、約3.5kbpのバンドをもたらし左側半分の4×ADC組み込みがadh1202遺伝子座に残ったことを確認する;そして、プライマー0611815と0611632は、約4.6kbpのバンドをもたらした右側半分の4×ADC組み込みがadh1202遺伝子座に残ったことを確認する。pdc遺伝子座における発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらし、且つ、adh1202遺伝子座に発現カセットを保有する1個の単離菌株を、保存し、そしてMIBa360と呼んだ。MIBa360からのuraマーカーの除去MIBa360のura-誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa360のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0613689を用いたPCRによってスクリーニングした。約1.9kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターによるuraマーカーの除去を示すのに対して、約3.3kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。PCRを、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用して実施した。上記のプライマーにより約1.9kbpの断片をもたらした2つのFOA耐性コロニーを、保存し、そしてMIBa363及びMIBa364と呼んだ。逆発現カセットの右側断片の構築プラスミドpMIBa144は、順方向に進む所望のADC及び3‐HPDH発現カセットを含んでいる。ホモ接合菌株のスクリーニングを簡単にするために、pMIBa144のADC発現カセットが逆の方向に置かれた新しいプラスミドを構築した。プラスミドpMIBa144前掲を、本明細書中に記載したように、StuIとPmeIで消化し、そしてTBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約6.1kbpと2.8kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。pMIBa144からの6.1kbpの断片を、CIPで処理し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。pMIBa144からの2.8kbpの精製断片を、1μLのpMIBa144からの6.1kbpの断片、7μLのpMIBa144からの2.8kbpの断片、1μLの10mMATP含有10×連結反応バッファーNewEnglandBiolabs、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して6.1kbpのpMIBa144線状ベクター内に連結した。反応物を、16°Cで4時間インキュベートし、そして反応物の4μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてSphIとXbaIを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa146と呼んだ。MIBa363への左側断片及び右側断片の組み込み本明細書中に記載したように、プラスミドpANN5を、NotIとNheIで消化し、そしてプラスミドpMIBa146を、NotIで消化した。これらを、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてpANN5からの8.2kbpの断片とpMIBa146からの6.2kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従って、QIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenによって精製した。MIBa363を、消化pANN5及びpMIBa144DNAで形質転換し、そして正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換について、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymes又はKapaRobustDNAポリメラーゼを使用するPCRによって確認した。pdc遺伝子座における組み込みを確認するのに、以下のプライマー対を使用した。プライマー0613689と0611815は、約1.9kbpのバンドをもたらし;プライマー0612366と0611554は、約2.5kbpのバンドをもたらし;0613688と0611815は、約3.2kbpのバンドをもたらし;0611622と0611552は、約945bpのバンドをもたらした。adh1202における組み込みを確認するために、以下のプライマー対を使用した。プライマー0611245と0612794は、約2.8kbpのバンドをもたらし、そしてプライマー0611815と0612795は、約3.9kbpのバンドをもたらした。pdc遺伝子座における発現カセットの適切な組み込み、及びadh1202遺伝子座における発現カセットの保有が予想されるバンドをもたらす2個の単離菌株を、保存し、そしてMIBa372及びMIBa373と呼んだ。MIBa372からのuraマーカーの除去MIBa372のura-誘導体を、先に記載したように単離した。MIBa372のいくつかのFOA耐性コロニーからのゲノムDNAを、所望のループアウト事象について、プライマー0611815と0613688を用いたPCRによってスクリーニングした。約2.1kbpのバンドの存在が、所望される、ura3瘢痕部位親菌株の2つのURA3プロモーターの間の相同組み換え後に取り残された1つのURA3プロモーターによるuraマーカーの除去を示すのに対して、約3.3kbpのバンドは、完全なURA3プロモーター‐URA3ORF‐URA3ターミネータ‐URA3プロモーターカセットの存在を示し、そして所望の組み換え事象が起こらなかったことを示した。MIBA372のFOA耐性コロニーもまた、第1の染色体の改変を確認するために、プライマー0611815と06136891.9kbpの断片を増幅する及びpdc遺伝子座の欠失を確認するために、0611552と0611553pdc遺伝子座が存在していれば、850bpの断片を増幅するを用いたPCRによってスクリーニングした。PCRを、製造業者の取扱説明書に従って、Phire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用して実施した。0611815と0613689で約1.9kbpの断片をもたらすが、0613688と0611815又は0611552と0611553で断片を増幅しないFOA耐性コロニーを、保存し、そしてMIBa375と呼んだ。実施例3A‐23:グリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼGPD遺伝子を欠失した酵母菌株菌株MIBa375におけるGPD遺伝子の欠失追加の構築物を、宿主I.オリエンタリスゲノムから両コピーのグリセロール3‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列番号117、配列番号118のGPDをコードするを欠失するように設計した。これらの構築物は、中間にクローン化されたTPDC‐URA3マーカーカセットPDCターミネータ‐URA3プロモーター‐URA3遺伝子URA3ターミネータ‐URA3プロモーターを含む、GPD遺伝子の上流配列に相同な約1003bpのヌクレオチド配列とGPD遺伝子の下流配列に相同な約852bpの配列を含んでいた。GPDの上流及び下流の領域を、生産者の仕様書に従って、PfuDNAポリメラーゼを使用してI.オリエンタリスCNB1ゲノムDNAから増幅した。上流領域はApaI部位を含んでいた;これは、ApaI認識配列内のヌクレオチドの1つに対するミスマッチを想定して設計したオーバーラッププライマーを使用したPCRによって排除された。プライマー対oACN48/oACN51とoACN49/oACN50を、上流領域に対してこれらの2つのオーバーラップ断片を増幅するのに使用した。これらのPCR産物を、分離し、1アガロースゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQiaquickGelExtractionKitQiagenを使用して精製し、そしてそれらを、順方向ApaI/逆方向NotI部位を持つプライマーoACN48/oACN49を用いた第2のラウンドのPCRの鋳型として使用した。下流領域を、製造業者の仕様書に従ってPfuDNAポリメラーゼを使用して、順方向NotI/逆方向SacI部位を持つプライマーoACN52/oACN53を用いてI.オリエンタリスゲノムDNAから増幅した。両PCR産物を、ゲル精製し、そしてベクターpCR登録商標‐BluntII‐TOPO登録商標Invitrogen内に別々にクローン化した。単離菌株を、プラスミドDNAの制限消化によって所望の挿入物を持つことを確認し、そして配列決定によって確認した。ベクターpACN58はクローン化上流断片を含み、そしてpACN59は下流断片を含んでいた。プラスミドpACN58を、ApaI/NotIで消化し、上流隣接部を切り出し、プラスミドpACN59をSacI/NotIで消化し、下流隣接部を切り出し、そしてpACN59を、ApaI/SacIで消化して、ベクター骨格を得た。3つの所望の断片を、1アガロースゲルで分離し、切り出し、精製し、そしてT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用した3‐ピース連結反応によって連結した。連結反応物を、E.コリTOP10電気的コンピテント細胞内に形質転換し、そして、形質転換体を、プラスミドDNAの制限消化によって確認した。この手順の間、下流領域の追加SacI部位を検出したが、それは、1kbpと対照的に853bpの下流領域をもたらした。所望の挿入物を有する2つの単離菌株を、pACN62及びpACN63と命名した。TPDC1‐URA3カセットを、NotI消化とゲル精製を使用してベクターpJLJ8図32から単離した。この断片を、次に、NotIで消化し、そして脱リン酸化したpACN62前掲に連結し、そして、連結反応物を、E.コリDH10B的コンピテント細胞Invitrogen内に形質転換した。URA3挿入物を有するコロニーを、プライマーoACN48/oJLJ44とoACN48/oJLJ46を使用したPCRによって確認した。プライマーoJLJ44は、下流URA3プロモーターの末端にアニールし、そしてTPDC1‐URA3カセットから外側に向かって増幅する。プライマーoJLJ46は、PDCターミネータの5’末端にアニールし、そしてTPDC1‐URA3カセットから外側に向かって増幅する。ベクターpHJJ56は、下流GPD領域に面するURA3を含み、そして、pHJJ57は、上流GPD領域に面するURA3を含んでいる。プラスミドpHJJ56とpHJJ57を、KpnIとApaIで消化することによって線状にし、そして欠失カセットを含む断片をゲル抽出で精製した。線状pHJJ56を、ura-菌株MIBa375内に形質転換した。シングルコロニーを、精製のために再び画線接種し、そして所望のGPD欠失について、プライマーoJLJ44、oJLJ46、oACN54、及びoACN55を使用したPCRによって試験した。細胞を、40μLのY‐Lysisバッファー及び2μLのザイモリエースZymoResearch中で37°Cにて30分間溶菌し、そして1μLの溶解反応物を、25μLのPCR反応物に使用した。PCR反応は、生産者の仕様書通りにFailsafeDNAポリメラーゼとバッファーEを使用し、55°Cのアニール温度と以下のサイクルプロフィール:94°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ94°Cにて30秒間、55°Cにて30秒間、そして72°Cにて1.5分間を29サイクル;及び72°Cにて3分間を1サイクル、を用いた。1コピーのGPDノックアウトを持つ菌株は、約0.9と1.2kbpのバンドを生じるので、yHJN1とyHJN2と命名した。菌株yHJN1及びyHJN2を、一晩YPD培地で培養し、そしてURA3マーカーの欠失を選択するためにScD‐2×FOA培地上に平板培養した。シングルコロニーを、YPDで精製し、そしてura-表現型を確認するためにScD‐uraとYPD培地上にパッチした。Ura-コロニーを、第1の組み込みを確認するのに使用したのと同じPCR反応物を使用してノックアウトを保有することを確認した。yHJN1のura-誘導体を、yHJN3と命名し、そしてyHJN2のura-誘導体を、yHJN4と命名した。線状pHJJ57を、yHJN3及びyHJN4内に形質転換し、そしてシングルコロニーをScD‐ura培地で精製した。2コピーのGPDノックアウトの存在を、1つの反応物にプライマーoJLJ44、oACN54、及びoACN55を使用し、そして2番目の反応にプライマーoJLJ46、oACN54、及びoACN55を使用したPCRによって確認した。プライマーoACN54が、GPDの上流フランキング配列の約37bp上流の領域にアニールするのに対し、oACN55は、下流隣接部の約24bp下流の領域にアニールする。GPDの両コピーが欠失すれば、前者の反応は約900と1050bpのバンドを生じ、そして後者の反応は約1025と1200bpのバンドを生じる。GPDノックアウトの2つのコピーを有するコロニーは、1コピーの欠失があるものよりScD‐uraプレート上でゆっくり増殖した。GPD遺伝子の両方のコピーを欠失した菌株を、yHJN7yHJN3由来及びyHJN8yHJN4由来と命名した。本明細書中に記載した方法を使用して、菌株MIBa372、yHJN7、及びyHJN8を、グリセロール生産についてバイオリアクター内で試験した。菌株MIBa372は、48時間で29.5g/Lグリセロールを産生した。菌株yHJN7又はyHJN8は、発酵中に、検出可能なグリセロールを産生しなかった。最終的な発酵ブロス中のグリセロールの不存在は、発酵ブロスからの3‐HPの回収及び精製に利点を提供し得る。実施例3A‐24:adh1202遺伝子座における4つのヌクレオチド配列からアスパラギン酸1‐デカルボキシラーゼADCを、及びadh9091遺伝子座において3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDHを発現し、且つ、天然3‐HPデヒドロゲナーゼ3‐HPDHを欠失した酵母菌株adh9091遺伝子座におけるI.オリエンタリス3‐HPDHの組み込みのためのプラスミドの構築配列番号26のI.オリエンタリス3‐HPDHをコードする配列番号25のヌクレオチド配列、及び配列番号20のI.オリエンタリスBAATPYD4をコードする配列番号19のヌクレオチド配列を、以前に記載したように、プライマー0611954と06119573‐HPDHのため又は0611997と0611998PYD4を使用して調製したMBin500のI.オリエンタリスゲノムDNAから増幅した。増幅中に、プライマー0611954は、5’末端にkozak配列TAAAとNheI部位を加え、そしてプライマー0611957は、3‐HPDHの3’末端にPacI部位を加える。増幅中に、プライマー0611997は、5’末端にkozak配列TAAAとPacI部位を加え、そしてプライマー0611998は、PYD4の3’末端にPacI部位を加える。50pmolのそれぞれのプライマーを、50μLの終量中に、50ngの鋳型としてMBin500ゲノムDNA、0.2mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP、1×ExpandHighFidelityバッファーRoche、及び2.6単位のExpandHighFidelityDNAPolymeraseRocheを含むPCR反応物に使用した。PCRを、95°Cにて3分間を1サイクルと続く、それぞれ95°Cにて1分間、55°Cにて1分間、そして72°Cにて1分間3‐HPDHPCR又は2分間PYD4PCRを30サイクル、それと72°Cにて5分間最終伸長をプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificで実施した。サーモサイクリングに続いて、PCR反応産物を、約831bpの3‐HPDHPCR産物又は1.4kbpのPYD4PCR産物をゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製する、TAEバッファー中での1.0アガロースゲル電気泳動によって分離した。精製した3‐HPDH又はPYD4の5μLを、製造業者の取扱説明書に従ってTOPO‐TACloningKitInvitrogenを使用してpCR2.1Invitrogen内にクローン化した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、EcoRIでの消化によってスクリーニングした。所望の挿入物サイズをもたらすクローンを、DNA配列決定によって正しいと確認した。3‐HPDH含む1つのクローンを、pMBin190と呼び、そしてPYD4を含む別のクローンを、pMBin193と呼んだ。プラスミドpMBin193を、XbaIとPacIで消化し、そして1.4kbpのPYD4バンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製する、TAEバッファー中での1.0アガロースゲルで泳動した。消化PYD4断片を、T4DNAリガーゼを使用してXbaIとPacIで制限処理した線状pMIBa107プラスミド前掲に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、SnaBI又はEcoRIでの消化によってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらした1個のクローンを、pMBin203と呼んだ。プラスミドpMBin203は、以下の発現カセットに隣接するNotI部位を含んでいる:PYD4CDSターミネータの上流と下流のPDCプロモーター及びターミネータ、URA3プロモーター、URA3ORF、及びURA3ターミネータとそれに続くURA3プロモーター。プラスミドpMBin203を、NotIで消化し、そしてPDCプロモーター、PYD4CDS、PDCターミネータ、及びURA3選択マーカーを含む約4.1kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製する、TAEバッファー中での1.0アガロースゲルによって分離した。プラスミドpHJJ27adh9091遺伝子座に対する5’及び3’相同領域を含む;図21を参照のことを、NotIで消化し、CIPで処理し、約5.7kbp線状プラスミドを、先に記載したように精製する、TAEバッファー中での1.0アガロースゲルで分離した。次に、pMBin203からの断片を、先に記載したように、T4DNAリガーゼを使用してNotI制限処理したpHJJ27内に連結した。連結産物を、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10ChemicallyCompetentE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、PstIで消化することによってスクリーニングした。所望のバンドサイズをもたらす1個のクローンを、pMBin204と呼んだ。プラスミドpMBin204は、adh9091遺伝子座におけるPYD4のターゲッティングを可能にする。配列番号26のI.オリエンタリス3‐HPDHをコードする配列番号25のヌクレオチド配列を、本明細書中に記載したように、NheIとPacIでの消化によってプラスミドpMBin190前掲から切り出し、TBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約827bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。プラスミドpMBin204前掲を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIで消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約8.4kbpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。上記の約827bpの精製したI.オリエンタリス3‐HPDH遺伝子産物を、1μLの8.4kbpベクター、10μLの827bpの挿入物、2μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された20μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して8.4kbpのpMBin204線状ベクター内に連結した。反応物を、16°Cにて18時間インキュベートし、そして反応物の10μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10細胞Invitrogen内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mlあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析した、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、pMcTs90と呼んだ。adh9091遺伝子座におけるS.セレビシエ3‐HPDHの組み込みのためのプラスミドの構築配列番号129のS.セレビシエ3‐HPDHをコードする826bpの野生型ヌクレオチド配列を、JGI69ゲノムDNAからPCR増幅し、そして遺伝子の5’末端のXbaI部位及び遺伝子の3’末端のPacI部位で修正した。増幅反応物は、製造業者の取扱説明書に従ってPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInVitrogenを使用して実施した。MasterPCR反応物は、200μLの終量中に1.125μlのS.セレビシエゲノムDNA、それぞれ112.5pMのプライマー611191と611199、1×Pfx増幅バッファーInVitrogen、2mMのMgSO4、0.2mMのdNTPミックス、5単位のPlatinum登録商標PfxDNAポリメラーゼInVitrogenを含んでいた。混合物を、8本のチューブに等分し、そしてグラジエントPCRを実施した。増幅反応を、95°Cにて2分間を1サイクル;それぞれ95°Cにて30秒間、勾配40‐55°Cにて30秒間、そして72°Cにて2分間を30サイクル;及び72°Cにて3分間を1サイクルとプログラムしたEppendorf登録商標MASTERCYCLER登録商標EppendorfScientificIncでインキュベートした。826bpの野生型YMR226cPCR遺伝子産物を、本明細書中に記載したように、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製した。約826bpの断片を、ゲルから切り出し、そしてQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用してアガロースから抽出した。PCR産物を、XbaIとPacIを用いて37°Cにて一晩消化し、次に、QIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。プラスミドpMIBa100前掲を、XbaIとPacIで消化し、続いて、CIPで処理し、そして約6.8kbpの線状断片を得た。消化産物を、製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。826bpのYMR226c精製及び消化PCR断片を、1μLのpMIBa100から6.7kbpの断片、1μL又は7μLの826bpのYMR226cPCR産物、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μL、の総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して6.8kbpのpMIBa100線状ベクター内に連結した。反応物を、16°Cにて約4時間インキュベートし、そして反応物全体を、製造業者の取扱説明書に従って、化学的コンピテント細胞Aglient内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてXbaIとPacIを使用した制限消化によってスクリーニングした。消化による正しいクローンを、DNA配列決定で確認した。正しい消化バンドサイズとDNA配列をもたらしたクローンを、pMIBa101と呼んだ。プラスミドpHJJ76‐noura前掲を、NotIで消化し、それに続いてCIPで処理した。5.2kbpの線状断片を、QIAQUICK登録商標PCRPurificationKitQiagenを使用して精製した。YMR226c発現カセットを、NotIでの消化でpMIBa101から切り出した。約3546bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってQIAQUICK登録商標GelExtractionKitQiagenを使用して精製した。pMIBa101からの3546bpの精製断片を、1μLの5.2kbpのpHJJ76‐nouraから断片、1μL又は5μLのpMIBa101からの3546bpの断片、1μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された10μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して5.2のkbpのpHJJ76no‐ura線状ベクター内に連結した。反応物を、16°Cにて一晩インキュベートし、そして、反応物の4pLアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShot登録商標TOP10化学的コンピテントE.コリ細胞Invitrogen内に形質転換した。形質転換体を、2×YTampプレート上で平板培養し、そして37°Cにて一晩インキュベートした。得られた形質転換体のいくつかを、適切な挿入についてXbaIとKpnIを使用した制限消化によってスクリーニングした。正しい消化バンドサイズをもたらしたクローンを、pMIBa109と呼んだ。配列番号129のS.セレビシエ3‐HPDHをコードする野生型ヌクレオチド配列を、本明細書中に記載したように、プラスミドpMIBa109からXbaIとPacIとの消化によって切り出し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約818bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。精製した約818bpのS.セレビシエ3‐HPDH遺伝子産物を、1μLの8.4kbpベクター、10μLの818bpの挿入物、2μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された20μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して、先の8.4kbpのpMBin204線状ベクター内に連結した。反応物を、16°Cにて18時間インキュベートし、そして、反応物の10μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、OneShotTOP10細胞Invitrogen内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mLあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドDNAをそれぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、pMcTs91と呼んだ。adh9091遺伝子座におけるM.セデュラ3‐HPDHの組み込みのためのプラスミドの構築配列番号29のM.セデュラ3‐HPDHをコードする配列番号343のI.オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt登録商標によって合成し、そしてプラスミド11AAE2APを得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIを用いてプラスミドから消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約959bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。精製した約959bpのM.セデュラ3‐HPDH遺伝子産物を、1μLの8.4kbpベクター、16μLの959bpの挿入物、2μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された20μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して8.4kbpのpMBin204線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて1時間インキュベートし、そして反応物の10μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、SoloPackGoldSuperCompetent細胞Agilent内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mlあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、pMcTs76と呼んだ。adh9091遺伝子座におけるE.コリ3‐HPDH組み込みのためのプラスミドの構築配列番号27のE.コリ3‐HPDHをコードする配列番号143のI.オリエンタリスコドン最適化ヌクレオチド配列を、GeneArt登録商標によって合成し、そしてプラスミド1045168を得た。合成遺伝子を、本明細書中に記載したように、XbaIとPacIを用いてプラスミドから消化し、そしてTBEバッファー中でのアガロースゲル電気泳動によって精製した。約761bpのバンドを、ゲルから切り出し、そして製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。精製した約761bpのE.コリ3‐HPDH遺伝子産物を、1μLの8.4kbpベクター、16μLの761bpの挿入物、2μLの10mMATPNewEnglandBiolabs含有10×連結反応バッファー、及び1μLのT4リガーゼNewEnglandBiolabsから構成された20μLの総反応物容量中でT4リガーゼNewEnglandBiolabsを使用して8.4kbpのpMBin204線状ベクター内に連結した。反応物を、室温にて1時間インキュベートし、そして反応物の10μLのアリコートを、製造業者の取扱説明書に従って、SoloPackGoldSuperCompetent細胞Agilent内に形質転換した。回復期間後に、形質転換反応物からの100μLの2つのアリコートを、1mlあたりの100μgのアンピシリンを補った150mMの2×YTプレート上で平板培養した。プレートを、37°Cにて一晩インキュベートした。推定上の組み換えクローンを、選択プレートから釣り出し、そしてプラスミドDNAを、それぞれからBIOROBOT登録商標9600Qiagenを使用して調製した。クローンを、制限消化によって分析し、そして正しい制限消化パターンを有するプラスミドを、pMcTs77と呼んだ。McTs259のadh9091における3‐HPDH断片の組み込み本明細書中に記載したように、プラスミドpMcTs76、pMcTs77、pMcTs91を、KpnIとApaIで消化し、そして、プラスミドpMcTs90を、SacIとApaIで消化した。得られた消化産物を、TBEバッファー中での1アガロースゲル電気泳動によって精製し、pMcTs76からの5.5kbpの断片、pMcTs77からの5.3kbpの断片、pMcTs90からの5.4kbpの断片、及びpMcTs91からの5.4kbpの断片を、ゲルから切り出し、そして、製造業者の取扱説明書に従ってNUCLEOSPIN登録商標ExtractIIKitMachereyNagelを使用して精製した。adh1202遺伝子座において配列番号139のB.リチェニフォルミスADCをコードするヌクレオチドの4つのコピーを発現し、且つ、配列番号26前掲の3‐HPDHをコードする天然I.オリエンタリス遺伝子を欠失した菌株McTs259を、消化したpMcTs76、pMcTs77、pMcTs90、又はpMcTs91DNAで形質転換した。正しい遺伝子座ターゲッティング及び形質転換を、製造業者の取扱説明書に従ってPhire登録商標PlantDirectPCRkitFinnzymesを使用したPCRによって確認した。adh9091遺伝子座における組み込みを確認するために、以下のプライマー対を使用した。プライマー0614627と0612909は、組み込まれたpMcTs76からの断片に対する約3.47kbpのバンド、組み込まれたpMcTs77からの断片に対する約3.27kbpのバンド、組み込まれたpMcTs90からの断片に対する約3.34kbpのバンド、組み込まれたpMcTs91からの断片に対する約3.33kbpのバンドをもたらし;プライマー0612908と0614626は、約1.97kbpのバンドをもたらした。adh1202における組み込みをチェックするために、以下のプライマー対は使用した。プライマー0611245と0612794は、約3.0kbpのバンドをもたらし、そしてプライマー0611815と0612795は約3.6kbpのバンドをもたらした。天然I.オリエンタリス3‐HPDH遺伝子の欠失をチェックするために、以下のプライマーを使用した。プライマー0613034と0613241は、約1.4kbpのバンドをもたらした。adh9091遺伝子座における発現カセットの適切な組み込みが予想されるバンドをもたらし、adh1202に発現カセットを保有し、且つ、I.オリエンタリス3‐HPDH遺伝子座の欠失を保有した単離菌株を、表29に示すように、保存し、そしてMcTs261pMcTs76断片、McTs263pMcTs77断片、McTs267pMcTs90断片、及びMcTs269pMcTs91断片と呼んだ。形質転換菌株を、3‐HP生産について、先に記載した振盪フラスコ法を使用して試験した。異型接合の形質転換体McTs267、McTs269、及びMcTs263は、それぞれ、0.149/-0.024、0.168/-0.052、及び0.162/-0.018g/L3‐HP/g/L乾燥細胞重量を生じた。天然菌株MeJi412は、0.263/-0.026g/L3‐HP/g/L乾燥細胞重量を産生し、そして3‐HPDH欠失菌株は、検出可能な3‐HPを生じなかった。この実験で、異型接合の形質転換体McTs261は検出可能な3‐HPを生じなかった。これらの結果は、異型接合の3‐HPDH形質転換体であっても、外来性又は内在性の3‐HPDH遺伝子配列を使用して3‐HPDH欠失菌株の3‐HPDH活性をいくらか復元できることを示している。実施例3B:リンゴ酸経路遺伝子を発現する改変酵母菌株PEP、OAA、及びリンゴ酸中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3C:マロン酸セミアルデヒド経路遺伝子を発現する改変酵母菌株PEP、OAA、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、2‐ケト酸デカルボキシラーゼ、KGD、BCKA、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3D:マロニル‐CoA経路遺伝子を発現する改変酵母菌株PEP、OAA、マロニル‐CoA、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、OAAギ酸リアーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3E:マロニル‐CoA経路遺伝子を発現する改変酵母菌株ピルバート、アセチル‐CoA、マロニル‐CoA、及び任意にマロン酸セミアルデヒド中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PDH、アセチル‐CoAカルボキシラーゼ、マロニル‐CoAレダクターゼ、CoAアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3F:アラニン経路遺伝子を発現する改変酵母菌株ピルバート、アラニン、β‐アラニン、及び任意にマロン酸セミアルデヒド、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、及び3‐HP‐CoA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン2,3アミノムターゼ、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、BAAT、3‐HPDHマロン酸セミアルデヒドレダクターゼを含む、HIBADH、及び4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3G:乳酸経路遺伝子を発現する改変酵母菌株ピルバート、ラクタート、ラクチル‐CoA、アクリロイル‐CoA、及び3‐HP‐CoA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、LDH、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、ラクチル‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、及び3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例3H:グリセロール経路遺伝子を発現する改変酵母菌株グリセロールと3‐HPA中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、グリセロールデヒドラターゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。実施例31:β‐アラニルCoA経路遺伝子を発現する改変酵母菌株PEP若しくはピルバート、β‐アラニン、β‐アラニル‐CoA、アクリロイル‐CoA、3‐HP‐CoA、並びに任意に、OAA、アスパラタート、及びアラニン中間体を利用する経路を経て3‐HPを産生する酵母細胞を、この経路に関与する1若しくは複数の酵素の発現によって変更できる。発現遺伝子は、PPC、PYC、AAT、ADC、CoAトランスフェラーゼ、CoAシンテターゼ、β‐アラニル‐CoAアンモニアリアーゼ、3‐HP‐CoAデヒドラターゼ、3‐HP‐CoAヒドロラーゼ、3‐ヒドロキシイソブチリル‐CoAヒドロラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸/アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びAAM遺伝子のうちの1若しくは複数を含み得る。発現遺伝子は、宿主細胞にとって天然である遺伝子から得ても、宿主細胞にとって非天然である起源遺伝子から得てもよい。いくつかの態様において、酵母細胞又はその使用方法を、次の番号付きの段落によって説明できる。[B1]活性な3‐HP発酵経路を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、以下の:外来性PPC遺伝子;外来性PYC遺伝子;外来性AAT遺伝子;外来性ADC遺伝子;外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び外来性3‐HPDH遺伝子、から選択される1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を含む細胞。[B2]外来性AAT遺伝子を含む、段落B1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B3]外来性PYC遺伝子を含む、段落B1又はB2に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B4]外来性ADC遺伝子を含む、段落B1~B3のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B5]外来性BAAT又はgabT遺伝子を含む、段落B1~B4のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B6]外来性3‐HPDH遺伝子を含む、段落B1~B5のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B7]以下の:外来性PYC遺伝子;外来性AAT遺伝子;外来性ADC遺伝子;外来性BAAT又はgabT遺伝子;及び外来性3‐HPDH遺伝子、を含む、段落B1に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B8]外来性PPC遺伝子を含む、段落B1~B7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B9]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号2、3、4、5、6、7、及び8から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B7のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B10]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号2から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B11]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B12]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B13]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B14]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B15]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号7のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B16]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号8のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B9に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B17]前記外来性PYC遺伝子が、配列番号1のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B16のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B18]前記AAT遺伝子が、配列番号14、15、及び16から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B17のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B19]前記AAT遺伝子が、配列番号14のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B20]前記AAT遺伝子が、配列番号15のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B21]前記AAT遺伝子が、配列番号16のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B18に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B22]前記AAT遺伝子が、配列番号13のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B21のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B23]前記ADC遺伝子が、配列番号17、18、133、135、137、及び139から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B22のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B24]前記ADC遺伝子が、配列番号17のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B25]前記ADC遺伝子が、配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B26]前記ADC遺伝子が、配列番号133のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B27]前記ADC遺伝子が、配列番号135のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B28]前記ADC遺伝子が、配列番号137のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B29]前記ADC遺伝子が、配列番号139のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B23に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B30]前記ADC遺伝子が、配列番号130、131、132、134、136、及び138から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B29のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B31]前記ADC遺伝子が、配列番号130のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B32]前記ADC遺伝子が、配列番号131のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B33]前記ADC遺伝子が、配列番号132のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B34]前記ADC遺伝子が、配列番号134のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B35]前記ADC遺伝子が、配列番号136のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B36]前記ADC遺伝子が、配列番号138のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B30に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B37]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号20、21、22、23、及び24から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B36のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B38]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号20のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B39]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号21のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B40]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号22のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B41]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号23のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B42]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、配列番号24のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B37に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B43]前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19、140、141、及び142から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B42のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B44]前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号19のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B45]前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号140のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B46]前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号141のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B47]前記BAAT遺伝子又はgabT遺伝子が、配列番号142のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B43に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B48]前記外来性BAAT遺伝子又は外来性gabTが、gabT遺伝子でもあるBAAT遺伝子である、段落B1~B47のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B49]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26、27、28、29、30、31、32、33、34、及び129から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B48のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B50]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号26のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B51]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号27のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B52]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号28のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B53]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号29のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B54]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号30のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B55]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号31のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B56]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号32のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B57]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号33のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B58]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号34のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B59]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号129のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B49に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B60]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25、143、144、及び343から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B59のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B61]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号25のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B62]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号143のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B63]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号144のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B64]前記3‐HPDH遺伝子が、配列番号343のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B60に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B65]前記3‐HPDH遺伝子が、HIBADH遺伝子でもある、段落B1~B64のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B66]前記3‐HPDH遺伝子が、4‐ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子でもある、段落B1~B65のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B67]前記PPC遺伝子が、配列番号10、11、及び12から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B1~B66のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B68]前記PPC遺伝子が、配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B69]前記PPC遺伝子が、配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B70]前記PPC遺伝子が、配列番号12のアミノ酸配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、段落B67に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B71]前記PPC遺伝子が、配列番号9のヌクレオチド配列に対して少なくとも60、例えば、少なくとも65、70、75、80、85、90、95、97、98、99、又は100の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、段落B1~B70のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B72]前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、段落B1~B71のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B73]前記酵母細胞が、イサタケンキア属、カンジダ属、クルイベロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、トルラスポラ属、チゴサッカロマイセス属、及びサッカロマイセス属から選択される属に属している、段落B1~B72のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B74]前記酵母細胞が、I.オリエンタリス/P.ファーメンタンス分岐群及びサッカロマイセス分岐群から選択される分岐群に属している、段落B73に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B75]前記酵母細胞が、I.オリエンタリス、C.ランビカ、及びS.ブルデリから選択される、段落B73に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B76]前記細胞が、PDC、ADH、GAL6、CYB2A、CYB2B、GPD、GPP、ALD、及びPCK遺伝子から選択される天然遺伝子の1若しくは複数の欠失又は破壊をさらに含む、段落B1~B75のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B77]前記1若しくは複数の欠失又は破壊が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子の挿入の結果である、段落B76に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B78]1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子が、1若しくは複数の外来性調節要素に作動可能なように連結されている、段落B1~B77のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B79]前記1若しくは複数の調節要素が、1若しくは複数の3‐HP経路遺伝子にとって外来のものである、段落B78に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B80]前記外来性PYC遺伝子が、PYC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B79のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B81]前記外来性AAT遺伝子が、AAT遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B80のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B82]前記外来性ADC遺伝子が、ADC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B81のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B83]前記外来性BAAT又はgabT遺伝子が、BAAT又はgabT遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B82のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B84]前記外来性3‐HPDH遺伝子が、3‐HPDH遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B83のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B85]前記外来性PPC遺伝子が、PPC遺伝子にとって外来のものである外来プロモーターに作動可能なように連結されている、段落B1~B84のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B86]前記細胞が、75g/L以上の3‐HPを含む培地中、4未満のpHでも培養できる、段落B1~B85のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B87]前記細胞が、3‐HP耐性酵母細胞である、段落B1~B86のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B88]前記細胞が、突然変異及び/又は選択細胞が同種の野生型細胞より高い3‐HP耐性を有するように突然変異及び/又は選択を受ける、段落B1~B87のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B89]前記細胞が、1若しくは複数の外来性3‐HP経路遺伝子を用いて遺伝子組み換えされる前に、突然変異及び/又は選択を受ける、段落B88に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B90]前記細胞が、乳酸又は3‐HPの存在下で選択を受ける、段落B88又はB89に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B91]前記選択が、ケモスタット選択である、段落B91に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。[B92]以下の:i少なくとも1種類の炭素源を含む培地の存在下で、段落B1~B91のいずれか1項に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を培養し;そしてii培養物から3‐HPを単離すること、を含む3‐HPの生産方法。[B93]前記炭素源が、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、グルコースオリゴマー、及びグリセロールから選ばれる、段落B92に記載の方法。[B94]培地が、5未満のpH、例えば、約1.5~約4.5、約2.0~約4.0、又は約2.0~約3.5の範囲内のpHである、段落B92又はB93に記載の方法。"