"構成発現型プロモーターとキシロース異性化酵素遺伝子を挿入したプラスミドベクターが導入されたことを特徴とする形質転換大腸菌前記構成発現型プロモーターが,GAPDHプロモーターであることを特徴とする請求項1に記載の形質転換大腸菌前記キシロース異性化酵素遺伝子が,xylAであることを特徴とする請求項1又は2に記載の形質転換大腸菌前記プラスミドベクターに,さらにキシルロースリン酸化酵素遺伝子を挿入することを特徴とする請求項1ないし3に記載の形質転換大腸菌前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子が,xylBであることを特徴とする請求項4に記載の形質転換大腸菌前記プラスミドベクターに,さらにキシロース輸送タンパク遺伝子を挿入することを特徴とする請求項1ないし5に記載の形質転換大腸菌前記キシロース輸送タンパク遺伝子が,xylF,xylG,xylHであることを特徴とする請求項6に記載の形質転換大腸菌前記大腸菌が,KO11株であることを特徴とする請求項1ないし7に記載の形質転換大腸菌非特許文献1には,エタノール発酵が可能な菌株として,酵母の1種であるPichiastipitisやPachysolentannophilusに関する技術が開示されている。しかしながら,これらの菌株は約1程度という僅かなエタノールしか生産できないことからエタノールの生産効率という点において,必ずしも十分な技術とはいえない。また,特許文献1等に開示されているKO11株は,キシロースなどの五炭糖からも優れたエタノール生産能を有している。しかしながら,KO11株はグルコース存在下ではカタボライト抑制を受けるため,キシロースよりもグルコースを優先的に消費し,キシロースをあまり消費しないという技術的課題が存在する。特許文献3には,ペントース糖の利用および発酵に必要な酵素をコードする外来構造遺伝子を含む,安定なZymomonas組込み体の製造方法が開示されている。しかしながら,KO11株やキシローストランスポーターに関する遺伝子の導入についても何ら開示はない。さらには,カタボライト抑制についての開示もない。特許文献4には,xylABFGHR遺伝子座などのキシロース資化酵素をコードする遺伝子の発現量が増加されたEscherichia属細菌を用いて,Lヒスチジン,Lスレオニン,Lリジン,Lグルタミン酸およびLトリプトファンなどのLアミノ酸を生産する方法が開示されている。しかしながら,特許文献4に記載の技術に関しては,キシロース代謝を促進するため,xylオペロンの調節遺伝子であるxylRも含めてキシロース代謝に関連する一連のタンパクをコードする遺伝子をほとんどすべて導入し,その発現量を増加させようとする技術に過ぎないものである。よって,特許文献4に記載の技術は,結局は,グルコースによるキシロース代謝の抑制を受けてしまう技術にとどまり,培養液中のグルコースを大腸菌が消費した後にカタボライト抑制が解除されxylABFGH遺伝子が発現されるため,グルコースと同時にキシロースが消費されないという技術的課題を含むものである。かかるカタボライト抑制の問題は,KO11株のみにとどまらず形質転換に広く汎用されている大腸菌にも存在する問題である。すなわち,大腸菌にキシロース代謝関連遺伝子を単に導入したとしても,グルコース代謝によりキシロースオペロン調節遺伝子が作動し,キシロース代謝が抑制されるものと考えられる。上記事情を背景として,本発明では,グルコース存在下のカタボライト抑制の影響を受けにくく,キシロース代謝が改善された大腸菌株の開発を課題とする。発明者らは,大腸菌におけるキシロース代謝経路の分析を行った。大腸菌では,キシロースの輸送や代謝に関する種々のタンパクが存在するが,発明者は,それらの中でもキシロースの異性化を行う酵素に着目した。すなわち,大腸菌のキシロース異性化酵素は,キシロースとの基質親和性が極端に低く,触媒効率も低い。このため,大腸菌において,キシロース異性化の段階がキシロース代謝の律速段階になっていることに発明者は着目した。この知見を基に発明者は,構成発現型のプロモーターおよびキシロース異性化酵素遺伝子を挿入したプラスミドベクターを大腸菌株に導入することにより,培養初期からキシロース異性化酵素を発現させ,カタボライト抑制の影響を受けにくい形質転換大腸菌の開発に成功した。加えて,発明者は更なる改良を行い,キシロース異性化酵素に加え,一連のキシロースに関連する酵素やタンパクを発現させることにより,キシロース代謝をさらに改善した形質転換大腸菌の開発に成功した。本発明は,以下から構成される。本発明の第1の構成は,構成発現型プロモーターとキシロース異性化酵素遺伝子を挿入したプラスミドベクターが導入されたことを特徴とする形質転換大腸菌である。本発明の第2の構成は,前記構成発現型プロモーターが,GAPDHプロモーターであることを特徴とする請求項1に記載の形質転換大腸菌株である。本発明の第3の構成は,前記キシロース異性化酵素遺伝子が,xylAであることを特徴とする第1又は2の構成に記載の形質転換大腸菌である。本発明の第4の構成は,前記プラスミドベクターに,さらにキシルロースリン酸化酵素遺伝子を挿入することを特徴とする第1ないし3の構成に記載の形質転換大腸菌株である。本発明の第5の構成は,前記キシルロースリン酸化酵素遺伝子が,xylBであることを特徴とする第4の構成に記載の形質転換大腸菌である。本発明の第6の構成は,前記プラスミドベクターに,さらにキシロース輸送タンパク遺伝子を挿入することを特徴とする第1ないし5の構成に記載の形質転換大腸菌である。本発明の第7の構成は,前記キシロース輸送タンパク遺伝子が,xylF,xylG,xylHであることを特徴とする第6の構成に記載の形質転換大腸菌である。本発明の第8の構成は,前記大腸菌が,KO11株であることを特徴とする請求項1ないし7に記載の形質転換大腸菌である。本発明により,グルコース存在下においてもカタボライト抑制の影響を受けにくく,キシロース代謝が改善された形質転換大腸菌の提供が可能となった。かかる形質転換大腸菌により,グルコース消費中のカタボライト抑制が緩和され,キシロースの代謝が改善される。ひいては,かかる形質転換大腸菌により,木質系および草本系バイオマスからのエタノール生産向上ないしエタノール生産方法の改善に期待できる。さらには,本発明にかかる形質転換大腸菌をさらに改良することにより,エタノール以外での利用,例えばアミノ酸発酵や乳酸発酵などについても期待できる。以下,本発明にかかる形質転換大腸菌について,説明を行う。まず,本発明を構成する主な要素について説明を行う。本発明において,大腸菌とは,Escherichia属に属するグラム陰性桿菌として定義される。本発明では,この大腸菌に,構成発現型プロモーターおよびキシロース代謝関連酵素遺伝子を挿入したプラスミドベクターを導入することにより,本発明にかかる形質転換大腸菌を得ることができる。本発明で用いられる大腸菌は,特に限定する必要はないが,安全性等の観点から,O157等病原性を有する大腸菌を用いることは避けたほうがよい。好ましい大腸菌株としては,JM109,JM110,BL21,DH5αなどが挙げられる。本発明において構成発現型プロモーターとは,常時目的遺伝子を発現させるプロモーターとして定義される。かかる構成発現型プロモーターは,種々の観点から選択することができる。例えば,入手のしやすさ,MultiplecloningsiteMCS領域への挿入のしやすさなどである。好ましい構成発現型プロモーターとしては,グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素遺伝子GAPDHプロモーター,ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターPGKプロモーターなどを用いることができる。本発明においてキシロース異性化酵素遺伝子とは,キシロースをキシルロースに変換する酵素をコードする遺伝子として定義される。かかる場合,大腸菌やKO11株内においてキシロースを異性化する酵素を発現しうる限り,特に限定する必要はないが,大腸菌やKO11株において発現し,かつ,キシロースとの基質親和性が高い酵素を発現する遺伝子を選択することが好ましい。好ましくは,大腸菌由来や放線菌由来,乳酸菌由来のキシロース異性化酵素遺伝子を用いることができる。大腸菌由来としては,xylAを用いることが好ましい。また,放線菌由来としては,xylA,SCO1169,SGR1070などを,乳酸菌由来としては,LAF0402,LVIS0183などを用いることができる。また,キシルロースリン酸化酵素遺伝子とは,キシルロースの5位をリン酸化し,キシルロース5リン酸に変換する酵素をコードする遺伝子として定義される。かかる場合,大腸菌やKO11株内においてキシルロースの5位をリン酸化する酵素を発現しうる限り,特に限定する必要はないが,大腸菌やKO11株において発現し,かつ,キシルロースのリン酸化能が高い酵素を発現する遺伝子を選択することが好ましい。好ましくは,xylBを用いることができる。さらに,キシロース輸送タンパク遺伝子とは,キシロースを細胞内に輸送する機能を果たすタンパクをコードする遺伝子として定義される。かかる場合,大腸菌やKO11株において,キシロースを細胞内に輸送する機能を果たしうる限り,特に限定する必要はなく,種々のキシローストランスポーターやキシロースシンポーターをコードする遺伝子を用いることができる。好ましくは,キシロースABCトランスポーターをコードするxylF,xylG,xylHの遺伝子群を用いることができる。また,キシロースシンポーターとして,xylEを用いることができる。本発明においてKO11株とは,エタノール発酵細菌Zymomonasmobilis由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pdcとアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhBを大腸菌の染色体上のピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子pfl内に組み込んだ菌株として定義される。かかるKO11株は,標準株ATCC55124株として既に市販されており,これを用いればよい。続いて,本発明にかかる形質転換大腸菌の作製方法について説明する。本発明にかかる形質転換大腸菌は,プラスミドベクターに構成発現型プロモーターとキシロース異性化酵素遺伝子ないしはその他のキシロース関連遺伝子を挿入し,かかる遺伝子挿入プラスミドベクターを大腸菌にトランスフェクションすることにより得ることができる。用いるプラスミドベクターとしては,構成発現型プロモーターおよびキシロース異性化酵素遺伝子を挿入しうる限り特に限定する必要はなく,種々の観点から選択することができる。例えば,選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を持つことや,MCS領域を有すること,大腸菌内で多コピーになること,入手のしやすさなどの観点から適宜選択することができる。かかる観点から,pUC18,pUC19,pBluescriptIIなどを用いることが好ましい。プラスミドベクターに,構成発現型プロモーターおよびキシロース異性化酵素遺伝子を挿入する方法としては,通常用いられる方法を用いればよい。また,遺伝子を挿入したプラスミドベクターについても,通常用いられる方法により,大腸菌にトランスフェクションすることができる。以下,例を挙げて説明を行う。まず,構成発現型プロモーターおよびキシロース異性化酵素遺伝子など,挿入を行う遺伝子のインサートDNAを準備する。このインサートDNAは,大腸菌のDNA抽出物から所定のプライマーを用いてPCRにより増殖したものから準備してもよいし,人工的に合成したものから準備してもよい。これら準備された前段階のインサートDNAについては,必要に応じて,増殖精製を行う。また,必要に応じて制限酵素処理ないし修飾処理を,プラスミドベクターとのライゲーションに先立って行うこともできる。続いて,プラスミドベクターを準備する。プラスミドベクターは市販されているものを用いてもよいし,ボイルプレップ法,アルカリプレップ法,アルカリCsCl法など種々のプラスミド分離法を用いて細胞から抽出精製したものを用いてもよい。プラスミドベクターは,HindIIIやSalIなど選択したプラスミドベクターに対応した種々の制限酵素を用いてMCSの切断を行い,必要に応じて脱リン酸化などの処理をさらに行ったうえで,準備されたインサートDNAとのライゲーションを行う。ライゲーションの後,コンピテントセルへのトランスフォーメーションを行う。このコンピテントセルを,プラスミドベクターの抗生物質耐性遺伝子に従って,適切な抗生物質を含むLB培地プレートに塗り広げ,単一プラスミドを有するコロニーを形成させる。この形成されたコロニーについて,遺伝子挿入プラスミドのインサートDNAの配列や挿入方向を,通常用いられる分析方法,例えばコロニーダイレクトPCR法などで確認することにより,目的に合致した形質転換コロニーを得ることができる。この形質転換コロニーを培養増殖し,プラスミド分離法を用いることにより,本発明に用いられる構成発現型プロモーターとキシロース異性化酵素遺伝子等を導入したプラスミドベクター遺伝子挿入プラスミドベクターを得ることができる。遺伝子挿入プラスミドベクターは,大腸菌に塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法などにより大腸菌にトランスフェクションすることにより,本発明にかかる形質転換大腸菌を得ることができる。なお,KO11株についても,大腸菌と同様,トランスフェクションを行うことにより,形質転換KO11株を得ることができる。以上,本発明にかかる形質転換大腸菌を説明してきた。プラスミドベクターに導入する遺伝子については,構成発現型プロモーターおよびキシロース異性化酵素遺伝子を挿入することにより,本発明にかかる形質転換大腸菌を得ることができるが,キシルロースリン酸化酵素遺伝子,キシローストランスポーター遺伝子を発現させることにより,本発明にかかる形質転換大腸菌のキシロース代謝改善効果をより効果的にすることができる。さらには,構成発現型プロモーターとしてGAPDHpromoterを用いることにより,さらに効果的なキシロース代謝改善効果を期待することができる。本発明により,グルコース存在下においてもカタボライト抑制の影響を受けにくく,キシロース代謝が改善された形質転換大腸菌の提供が可能となった。かかる形質転換大腸菌により,グルコース消費中のカタボライト抑制が緩和され,キシロースの代謝が改善される。ひいては,かかる形質転換大腸菌により,木質系および草本系バイオマスからのエタノール生産向上ないしエタノール生産方法の改善に期待できる。さらには,本発明にかかる形質転換大腸菌をさらに改良することにより,エタノール以外での利用,例えばアミノ酸発酵や乳酸発酵などについても期待できる。以下,本発明にかかる形質転換大腸菌について,KO11株を用いた場合を例に挙げて詳述するが,当然のことながら,本発明の内容は実施例に限定されるものではない。<<実施例1および実施例2,形質転換KO11株の作製>>実施例1では,キシロース異性化酵素をコードするxylA遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードするxylB遺伝子を挿入したプラスミドベクターを作製し,KO11株へトランスフェクションを行った。実施例2では,xylA遺伝子,xylB遺伝子に加え,キシローストランスポーターを構成する一連のタンパクをコードするxylF,xylG,xylHの遺伝子を挿入したプラスミドベクターを作製し,KO11株へトランスフェクションを行った。いずれの実施例についても,プラスミドベクターのMCS領域に,GAPDHpromoterおよびmalEterminatorを合わせて導入した。図1に,実施例1および実施例2のプラスミドベクターのMCS領域における遺伝子配置を示す。<I.インサートDNAの準備>1.大腸菌JM109タカラバイオ株式会社製を用いて,ゲノムDNAを抽出した。すなわち,LB液体培地にて培養した大腸菌JM109について,遠心分離を行った後,上清を除去し,細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物をDNA抽出キット株式会社ニッポンジーン製のソリューションバッファーを用いて溶菌し,溶菌溶液を得た。この溶菌溶液について遠心分離後,上清を除去し,粗DNA沈殿物を得た。得られた粗DNA沈殿物を70エタノールにてリンスし,RNaseAを加え反応させた後,CIA処理を行い,精製DNA沈殿物を行った。さらに得られた精製DNA沈殿物について,エタノール沈殿,PEG沈殿を行った後,70エタノールにてリンスを行い,減圧乾燥後,超純水を加え溶解し,JM109ゲノムDNAを含むJM109ゲノムDNA抽出液とした。2.I-1で得られたJM109ゲノムDNA抽出液を用いて,下記プライマーによりPCRを行い,xylABのPCR産物を得た。すなわち,200μLPCRチューブに10×Reactionbuffer5μL,25mMdNTPs溶液5μL,50mMMgCl2溶液2μL,下記プライマーを含む溶液各25μL,超純水305μL,JM109ゲノムDNA抽出液2μLを加え,最後にDNApolymerase05μLを加えて全量20μLとした。この溶液をサーマルサイクラーにセットし,94°Cで5分間加温しDNApolymeraseを活性化した後,94°Cで30秒間,51°Cで30秒間,72°Cで35分間の反応を25サイクル行った。反応後,さらに72°Cで10分間反応させ,増幅末端にAを付加したPCR産物を得た。得られたPCR産物は,xylABSacKpnとして以降用いた。ForwardprimerSacxylAB:5CTTGAGCTCATTACGACATCATCCATCAC3ReverseprimerKpnxylAB:5CGGGTACCTTACGCCATTAATGGCAG33.I-2と同様に,xylFGHのPCR産物を得た。すなわち,下記プライマーを含む反応溶液をサーマルサイクラーにセットし,94°Cで5分間加温しDNApolymeraseを活性化した後,94°Cで30秒間,55°Cで30秒間,72°Cで35分間の反応を25サイクル行い,PCR産物を得た。得られたPCR産物は,xylFGHHindIIIとして以降用いた。ForwardprimerPxo14:5CCCAAGCTTACTACAGAAGGCC3ReverseprimerPxo10:5CCCAAGCTTTCAAGAACGGCGTTTGG34.I-2で得られたPCR産物,xylABSacKpnを用い,TAクローニングにより,形質転換体を得た。すなわち,xylABSacKpnとプラスミドベクターpCR21Invitrogen,Ligationmixニッポンジーンを混合,反応させ,PCR産物のプラスミドベクターpCR21へのライゲーションを行った。これを,EcoliJM109competentcellタカラバイオ株式会社製に緩やかに加え撹拌することにより,トランスフォーメーションを行った。反応後のコンピテントセルを培養した後,XgalならびにIPTGを塗布しておいたアンピシリン含有LBプレート培地にコンラージ棒を用いて塗布,培養を行った。5.I-4でプレート上に生じた白色コロニーの増幅断片有無をコロニーダイレクトPCR法により確認することにより,形質転換体の確認を行った。すなわち,15mLチューブに超純水1032μL,10×Reactionbuffer16μL,25mMdNTPs溶液16μL,50mMMgCl2溶液8μL,M13universalprimer,M13reversalprimerをそれぞれ8μL,最後にDNApolymerase08μLを加えプレミックスを作り,200μLPCRチューブに20μLずつ分注し,プレート上に生じた形質転換体のコロニーを楊枝で少量とり,チューブ内で懸濁させた後,サーマルサイクラーにセットした。94°Cで5分間加温し,DNApolymeraseを活性化した後,94°Cで30秒間,50°Cで30秒間,72°Cで1分間の反応を25サイクル行った。この方法によりは,xylABSacKpnは,約3000bp付近に遺伝子の増幅断片が確認されたものを形質転換体とした。M13universalprimer:5GTTTTCCCAGTCACGACGTTM13reversalprimer:5GGAAACAGCTATGACCATGA6.I-3で得られたPCR産物,xylFGHHindIIIについて,制限酵素反応とゲル抽出を行うことにより,インサートDNAxylFGHHindIIIならびにベクターDNApUC18を得た。すなわち,2つの15mLチューブにそれぞれ10×HBuffer5μL,プラスミドベクターpUC18とPCR産物xylFGHHindIIIを43μLずつ入れ,最後にSalI2μLを,混合させ,37°Cで16時間処理した。反応後さらに,それぞれフェノクロ処理,エタノール沈殿,リンス,減圧乾燥後超純水44μLに溶解後それぞれのチューブに10×BBufferを5μL,HindIII1μL加え37°Cで16時間処理した。そして,フェノクロ処理,エタノール沈殿,リンス減圧乾燥後xylFGHHindIIIを制限酵素消化したものはTEbuffer30μLに溶解し,プラスミドベクターpUC18を制限酵素消化したものは超純水30μLに溶解した。このうちxylFGHHindIIIを制限酵素消化したものを,2アガロースゲルを用いて電気泳動した後,約3900bp付近のDNA断片をゲルよりカッターで切り出した。その後,QIAquickGelExtractionKitを用いてゲルよりDNAを抽出し,インサートDNAxylFGHHindIIIとした。また,約27bpのバンドについても同様の操作を行い,ベクターDNApUC18とした。7.なお,上記により得られたインサートDNAについては,I-4のTAクローニングおよびI-5のコロニーダイレクトPCR法と同様の作業により,約3900bp付近に遺伝子増幅断片が確認できるものを形質転換体とした。8.I-5およびI-7により得られた2つの形質転換体について,遺伝子の挿入方向と挿入遺伝子配列の確認を行った。すなわち,それぞれの形質転換体の遺伝子挿入プラスミドベクターDNAをミニプレップ法により抽出し,制限酵素処理およびアガロースゲル電気泳動を行い,インサートDNAの方向確認を行った。さらに,それぞれの形質転換体についてコロニーダイレクトPCR法により,シークエンス解析を行い,増幅されている遺伝子がそれぞれxylA,xylB,xylF,xylG,xylHであることを確認した。9.遺伝子の挿入方向および挿入遺伝子配列の確認を行ったI-5およびI-7により得られた2つの形質転換体について,ミニプレップ法により遺伝子挿入プラスミドの抽出を行った。さらに,I-5で得られた形質転換体の抽出プラスミドについて,SacIとKpnIによる制限酵素処理を行い約3500bp付近のDNA断片をゲルよりカッターで切り出し,抽出を行うことにより,インサートDNAxylABSacKpnを得た。同様に,I-7で得られた形質転換体の抽出プラスミドについて,HindIIIによる制限酵素処理を行い,約3800bp付近のDNA断片をゲルから切り出し,抽出を行うことにより,インサートDNAxylFGHHindIIIを得た。<II.プラスミドベクターの準備>1.プラスミドベクターとして,上記の記載と同様の方法により,GAPDH遺伝子プロモーターおよびmalE遺伝子ターミネーターを導入したプラスミドベクターpUC18compの作製を行った。なお,それぞれのPCR産物を得るために下記のプライマーを用いた。図2に,プラスミドベクターpUC18compの遺伝子配置を示す。GAPDHプロモーターForwardprimerSalPgap:5ATTAGTCGACATTACGTGACTGATTCTAAC3ReverseprimerHindPgap:5CCCAAGCTTATATTCCACCAGCTATTTG3,又はSacPgap:5CTTGAGCTCATATTCCACCAGCTATTTG3malEターミネーターForwardprimerKpnmalTT:5GAGGTACCAGATGTTGTTCTGCCAATG3ReverseprimerKpnmalTT:5GCTCTAGAGAGCACGAAAGAGAATTATC3<III.遺伝子挿入プラスミドベクターの作製>1.プラスミドベクターpUC18compを制限酵素消化,ゲル抽出を行い,ベクターpUC18compSacKpn,ベクターpUC18compHindIIIを作製した。すなわち,プラスミドベクターpUC18compをSacI,KpnIにて処理を行い,2アガロースゲルを用いて電気泳動した後,約3500bp付近のDNA断片をゲルよりカッターで切り出し,抽出を行うことにより,ベクターpUC18compSacKpnとした。同様に,HindIIIで処理を行い脱リン酸化した後に,2アガロースゲルを用いて電気泳動を行い約3500bp付近のDNA断片をゲルよりカッターで切り出し,抽出を行うことにより,ベクターpUC18compHindIIIとした。2.III-1で得られたベクターpUC18compSacKpnとI-9で得られたインサートDNAxylABSacKpnについて,I-4と同様の方法により,ライゲーションを行い,コンピテントセルにトランスフェクションをした後,コロニーを得た。得られたコロニーのうち,白色コロニーについて,I-5と同様に,遺伝子増幅の有無をコロニーダイレクトPCR法により確認することにより,形質転換体を得た。得られた形質転換体については,I-8と同様の方法により,インサート方向の確認を行った。3.III-2と同様に,III-1で得られたベクターpUC18compHindIIIとI-9で得られたインサートDNAxylFGHHindIIIのライゲーションを行い,コロニーダイレクトPCR法により遺伝子増幅の有無を確認することにより,形質転換体を得た。得られた形質転換体については,得られた形質転換体については,I-8と同様の方法により,インサート方向の確認を行った。4.III-2で得られた形質転換体について,ミニプレップ法にて遺伝子挿入プラスミドベクターを抽出し,制限酵素処理を行い脱リン酸化した後,ゲル抽出により約3800bp付近のDNA断片を切り出し,ベクターDNAxylABHindIIIとした。加えて,III-3で得られた形質転換体についても,ミニプレップ法にて遺伝子挿入プラスミドベクターを抽出し,制限酵素処理を行った後,ゲル抽出により約3800bp付近のDNA断片を切り出し,インサートDNAxylFGHHindIIIとした。これらにより得られた,ベクターDNAxylABHindIIIとインサートDNAxylFGHHindIIIを,I-4と同様の方法により,ライゲーションを行い,コンピテントセルにトランスフェクションをした後,コロニーを得た。得られたコロニーのうち,白色コロニーについて,I-5と同様に,遺伝子増幅の有無をコロニーダイレクトPCR法により確認することにより,約4000bp付近に遺伝子の増幅断片が確認されたものを形質転換体として得た。得られた形質転換体については,I-8と同様の方法により,インサート方向の確認を行った。<IV.KO11株へのトランスフェクション>1.KO11株について,コンピテントセルとしての調製を行った。すなわち,試験管にLB液体培地5mLを作製しオートクレーブし,600μgmLとなるようにクロラムフェニコールを加え,EcoliKO11株を植菌し,濁度がOD660≒06に達するまで37°C,60rpmで回転振とう培養した。この培養液10mLをチューブに移し,6000rpmで5分間遠心分離した後,上清を捨てた。残ったペレットを滅菌水1mLに再懸濁した。この遠心分離,再懸濁の操作を計3回行い,菌体を洗浄し,さらに10グリセロール溶液1mLに再懸濁した。この遠心分離,再懸濁の操作を計2回行い,菌体を洗浄し,最終的に10グリセロール溶液に100μLに再懸濁したものをKO11株のコンピテントセルとした。2.IV-1で調製したKO11株のコンピテントセルに,所定の遺伝子挿入プラスミドベクターをエレクトロポレーション法によりトランスフェクションした。すなわち,III-2で得られた形質転換体からプラスミドベクターDNAxylABを,IV-4で得られた形質転換体からプラスミドベクターxylABxylFGHを抽出し,それぞれの遺伝子挿入プラスミドベクター溶液をKO11株コンピテントセルに加えて混合し,エレクトロポレーションキュベットに移した。ジーンパルサーIIおよびパルスコントローラーPLUSを用いて,電圧15kV,抵抗200,静電容量25μFでエレクトロポレーションを行った後,直ちにLB液体培地900μLを加え,15mL容チューブに移し,37°Cで1時間回転振とう培養した。培養液100μLを,LBAmpプレート培地にコンラージ棒を用いて塗布し,37°Cで16時間培養した。プレート上に生じたコロニーを形質転換体とし,プレートは4°Cで保存した。その後,コロニーを5mLLBAmp液体培地に植菌し,37°Cで16時間培養した。プラスミドベクターDNAxylAB導入株を実施例1,プラスミドベクターxylABxylFGH導入株を実施例2として20グリセロール中で-84°Cにて保存し,以降の評価に用いた。<<実施例1および実施例2,KO11株における糖消費およびエタノール生産能評価>>実施例1および実施例2で作製した形質転換KO11株の糖消費およびエタノール生産能を評価するため,遺伝子導入を行っていないKO11株を比較例として実験を行った。<方法>1.評価する際の培地としてM9混合糖培地を用いた。すなわち,748gのグルコースと32gのキシロースを含む水溶液32mLを加えた100mL三角フラスコをオートクレーブ滅菌した。オートクレーブ滅菌後順次下記材料を加え培地調製を行い,グルコースおよびキシロースの最終濃度をそれぞれ6と4とした培地をM9混合糖培地として用いた。グルコースキシロース滅菌水20×M9salts...NH4Cl20gL,KH2PO460gL,NaHPO4120gL,NaCl10gLとなるように蒸留水に溶解し,オートクレーブ滅菌120°C,15分間したものを用いた。20CSL...CSL原液と滅菌水を用いて終濃度が20となるように調製した。MgSO47H2O1Mリン酸緩衝液...1MのNa2HPO412H2O溶液に,30°CでpH67となるまで1MのKH2PO4溶液を添加し,オートクレーブ滅菌したものを用いた。2.実施例1および実施例2の形質転換KO11株について,クリーンベンチ内において,クロラムフェニコール入りLB液体培地ないしアンピシリン入りLB液体培地5mLに植菌を行い,37°C,60rpmの条件下で16時間回転振とう培養した。この培養液100μLを,クリーンベンチ内において,LB液体培地150mLと各種抗生物質を含む500mL容三角フラスコに加え,37°C,150rpmの条件下で24時間振とう培養した。この培養液を前培養液とした。前培養液を6000×gで10分間遠心し菌体を回収後,本培養液としてM9混合糖培地に乾燥菌体重量が1gLとなるように植菌し,濃硫酸を入れた発酵栓にて栓をした。発酵栓をした100mL容三角フラスコは,インキュベーターを用いて37°C,150rpmの条件下で4日間発酵試験を行った。3.HPLCを用いて,各時間点におけるグルコースやキシロースの残存率等の分析を行った。すなわち,発酵試験を行った前記100mL容三角フラスコ中の懸濁液から1mLを各時間点において回収し,それらを15000rpmの条件下で5分間遠心分離を行うことにより固形成分を沈殿させ上清を得た。得られた上清は,300μLずつ2本に分けエタノール600μLを加え混合した後,フィルターろ過したものを試料溶液とし,1本をエタノール濃度測定用,もう1本を培地糖濃度測定用としてHPLC分析を行った。なお,HPLC分析の分析条件は,下記であり,検出器としては示差屈折率検出器を用いた。また,前記上清の分析と同様に,糖濃度の標準溶液の分析を合わせて行った。すなわち,0,25,5,75,10グルコース溶液,または0,2,4,6,8キシロース溶液300μLを用い同様の分析を行い,ピーク面積の比から培養液上清中の糖濃度を算出した。HPLC分析条件カラムAsahipakNH2P504E直径40mm,長さ250mm溶媒アセトニトリル水=82カラム温度40°C流速075mLmin4.GC分析により,各時間点におけるエタノール濃度の分析を行った。すなわち,前述のように得られた上清300μLと等容量の5イソプロパノールを混合し,下記条件によるGC分析を行った。また,エタノール濃度の標準溶液として,5イソプロパノールと0,2,4,6,8,10エタノールをそれぞれ等容量混合したもの作製したものについても合わせて分析を行い,検出したピーク面積の比から培養液上清中のエタノール濃度を算出した。分析条件カラム温度150°C,検出器温度250°C,気化室温度250°Cカラム液相5Thermon1000担体SunpakA直径32mm長さ21m流速40mLminキャリアガスN2<結果>1.HPLCによる糖濃度分析各培養時間におけるM9混合糖培地中のキシロース残存率およびキシロース消費率の比較を表1に,グルコース残存率およびグルコース消費率の比較を表2に示す。なお,各糖における残存率および糖消費率は,下記式に従い算出を行った。糖残存率=各時間点における培地中の糖濃度/0時間における培地中の糖濃度×100糖消費率=100-残糖率実施例1において,キシロース残存率は発酵初期の12時間後や24時間後では95以上とキシロース消費はあまり進んでいなかった。しかしながら,発酵36時間後では比較例とほぼ同じ水準までキシロース消費が進行し,発酵48時間後では662と,比較例よりも約20も多くキシロースを消費していた。一方,実施例2では,発酵初期は比較例と同様のキシロース消費が進行し,発酵36時間後では約11,発酵48時間後では約19,比較例よりも多くキシロースを消費していた。これらより,実施例1および実施例2は,実用化において現実的な培養時間と考えられる48時間で,比較例と比べて優れたキシロース代謝を示すことが分かった。また,発酵48時間後におけるグルコース残存率は,実施例1が187,実施例2が169であった。これらは,比較例のグルコース残存率と比べると,実施例1は約12,実施例2では約10の差であり,グルコース消費の差は比較的小さいことが分かった。2.GCによるエタノール濃度分析各培養時間におけるM9混合糖培地中のエタノール濃度の比較を表3に示す。発酵48時間後におけるエタノール濃度は,実施例1が415,実施例2が418であった。一方,比較例は407であり,わずかではあるものの実施例においてエタノール生産の増加が見られた。"