"マウスであって、重鎖定常領域の核酸配列と作動可能に連結した、再構成されていない軽鎖Vセグメントおよび再構成されていないJセグメントを該マウスの生殖系列に含む、マウス。前記再構成されていない軽鎖Vセグメントが、ヒトκセグメント、ヒトλセグメント、およびこれらの組合せから選択される、請求項1に記載のマウス。前記重鎖定常領域の核酸配列が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のマウス。前記再構成されていない軽鎖Vセグメントおよび前記再構成されていないJセグメントにより、マウス内因性重鎖遺伝子座におけるマウス内因性重鎖Vセグメントおよびマウス内因性重鎖Jセグメントが置き換えられる、請求項1に記載のマウス。前記再構成されていない軽鎖Vセグメントにより、前記マウス内因性重鎖遺伝子座の、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖Vセグメントが置き換えられる、請求項4に記載のマウス。前記再構成されていないJセグメントが軽鎖Jセグメントを含み、該軽鎖Jセグメントにより、前記マウス内因性重鎖遺伝子座の、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖Jセグメントが置き換えられる、請求項4に記載のマウス。前記再構成されていない軽鎖Vセグメントと前記再構成されていない軽鎖Jセグメントとが作動可能に連結され、前記マウスが、前記再構成されていない軽鎖Vセグメントと前記再構成されていない軽鎖Jセグメントとの間で機能的なDセグメントを欠いている、請求項6に記載のマウス。前記再構成されていない軽鎖Vセグメントがヒトκセグメントであり、前記再構成されていない軽鎖Jセグメントがヒトκセグメントである、請求項7に記載のマウス。マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結したヒトκ可変領域を含む再構成された免疫グロブリン遺伝子を前記マウスのゲノムに含むB細胞を含む、請求項1に記載のマウス。前記再構成された免疫グロブリン遺伝子が、マウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に位置する、請求項1に記載のマウス。軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結したヒト軽鎖Vセグメントおよびヒト軽鎖Jセグメントを前記マウスの生殖系列にさらに含む、請求項1に記載のマウス。前記軽鎖定常遺伝子が、マウス軽鎖定常遺伝子である、請求項11に記載のマウス。前記ヒト軽鎖Vセグメントが、ヒトκVセグメントである、請求項12に記載のマウス。前記マウス軽鎖定常遺伝子が、マウスκ軽鎖定常遺伝子である、請求項13に記載のマウス。マウスであって、免疫グロブリン重鎖定常領域と融合している第1のヒト軽鎖可変領域配列を含む第1のポリペプチドと、免疫グロブリン軽鎖定常領域と融合している第2のヒト軽鎖可変領域を含む第2のポリペプチドとを含む免疫グロブリンを該マウスの生殖系列から発現する、マウス。前記第1のヒト軽鎖可変領域配列がヒトκ可変領域配列を含み、前記第2のヒト軽鎖可変領域がヒトκ可変領域およびヒトλ可変領域から選択される、請求項15に記載のマウス。前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒト重鎖定常領域およびマウス重鎖定常領域から選択される、請求項16に記載のマウス。前記免疫グロブリン軽鎖定常領域が、ヒト軽鎖定常領域およびマウス軽鎖定常領域から選択される、請求項16に記載のマウス。前記第1のポリペプチドを、機能的な内因性重鎖V遺伝子セグメントを欠く、改変されたマウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、請求項16に記載のマウス。前記第2のポリペプチドを、機能的な内因性軽鎖V遺伝子セグメントを欠く、改変されたマウス内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現する、請求項19に記載のマウス。マウスであって、該マウスの生殖系列におけるマウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖可変遺伝子セグメントの、少なくとも6つ以上の再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメントおよび1または複数の再構成されていないJ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで該再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメントと該J遺伝子セグメントとが作動可能に連結されており、ここで該マウスは重鎖V遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖を発現することが不可能であり、ここで該マウスは野生型マウスの脾性B細胞集団B220/IgMの少なくとも約75のサイズである脾性B細胞集団B220/IgMを含む、マウス。ヒト軽鎖可変ドメインを含む結合タンパク質を生成させるための、前記請求項のいずれかに記載のマウスの使用。抗体を生成させるための、請求項1から21のいずれかに記載のマウスの使用。前記抗体がヒト抗体である、請求項23に記載の使用。二重特異性抗体を生成させるための、請求項1から21のいずれか一項に記載のマウスの使用。請求項1から21のいずれか一項に記載のマウスに由来する細胞または組織。ES細胞、B細胞、およびハイブリドーマから選択される、請求項26に記載の細胞。当技術分野では、軽鎖可変領域などの免疫グロブリン可変領域を含めた免疫グロブリン構造に基づく結合タンパク質が必要とされており、これには従来の抗体を上回る多様性の増強を呈示する結合タンパク質が含まれる。また、多様な軽鎖免疫グロブリン可変領域配列を含む結合タンパク質を含めた有用な結合タンパク質を作製するためのさらなる方法および動物も必要とされている。また、例えば、ヒト用治療剤を作製するのに用いられる、体細胞変異し、クローン選択された免疫グロブリン可変ドメインを生成させるための組成物および方法を含め、そこから選択するための結合タンパク質の多様性の増強、および免疫グロブリン可変ドメインの多様性の増強をもたらす、免疫グロブリンベースの結合タンパク質に有用なフォーマットも必要とされている。一態様では、軽鎖すなわち、カッパκ鎖および/またはラムダλ鎖免疫グロブリン可変ドメインには由来するが、全長重鎖免疫グロブリン可変ドメインには由来しない免疫グロブリン可変ドメインを含む結合タンパク質が記載される。遺伝子改変マウスを含めた、結合タンパク質を作製するための方法および組成物もまた提供される。一態様では、ヒトλまたはκ軽鎖可変ドメインおよびヒトまたはマウス重鎖定常領域配列を含むタンパク質を含めた、1または複数のκ軽鎖および/またはλ軽鎖可変領域免疫グロブリン配列ならびに免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含むタンパク質を作製するための核酸構築物、細胞、胚、マウス、および方法が提供される。一態様では、マウス内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における1または複数の免疫グロブリン重鎖可変領域VH遺伝子セグメント、重鎖多様性DH遺伝子セグメント、および重鎖接合JH遺伝子セグメントの、1または複数の軽鎖可変領域VL遺伝子セグメントおよび1または複数の軽鎖接合領域JL遺伝子セグメントによる置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一態様では、内因性重鎖遺伝子座VLH遺伝子座においてVL遺伝子セグメント配列を形成するための、全てのまたは実質的に全てのVH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントの、1または複数のVL遺伝子セグメントおよび1または複数のJL遺伝子セグメントによる置き換えであって、上記VLH遺伝子座が、マウス内因性CH遺伝子と組み換えられて、VL遺伝子セグメント、JL遺伝子セグメント、およびマウス内因性CH遺伝子に由来する再構成された遺伝子を形成することが可能である置き換えを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一実施形態では、上記VLセグメントが、ヒトVLセグメントである。一実施形態では、上記JLセグメントが、ヒトJLセグメントである。特定の実施形態では、上記VLセグメントおよびJLセグメントが、ヒトVLセグメントおよびヒトJLセグメントである。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのVH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントを、少なくとも6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのVH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントを、少なくとも16のヒトVκ遺伝子セグメントヒトVκおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのVH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントを、少なくとも30のヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、全てのまたは実質的に全てのVH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントを、少なくとも40のヒトVκ遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントで置き換える。一実施形態では、少なくとも1つのJκ遺伝子セグメントが、2つ、3つ、4つ、または5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、ヒトVκセグメントである。一実施形態では、上記ヒトVκセグメントが、4-1、5-2、7-3、2-4、1-5、および1-6を含む。一実施形態では、上記κVLが、3-7、1-8、1-9、2-10、3-11、1-12、1-13、2-14、3-15、1-16を含む。一実施形態では、上記ヒトVκセグメントが、1-17、2-18、2-19、3-20、6-21、1-22、1-23、2-24、3-25、2-26、1-27、2-28、2-29、および2-30を含む。一実施形態では、上記ヒトVκセグメントが、3-31、1-32、1-33、3-34、1-35、2-36、1-37、2-38、1-39、および2-40を含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、ヒトVκセグメントであり、4-1、5-2、7-3、2-4、1-5、1-6、3-7、1-8、1-9、2-10、3-11、1-12、1-13、2-14、3-15、および1-16を含む。一実施形態では、上記Vκセグメントが、1-17、2-18、2-19、3-20、6-21、1-22、1-23、2-24、3-25、2-26、1-27、2-28、2-29、および2-30をさらに含む。一実施形態では、上記Vκセグメントが、3-31、1-32、1-33、3-34、1-35、2-36、1-37、2-38、1-39、および2-40をさらに含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、ヒトVλセグメントであり、ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターAの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターAの断片が、hVλ3-27~hVλ3-1に及ぶ。一実施形態では、上記VLセグメントが、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターBの断片を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターBの断片が、hVλ5-52~hVλ1-40に及ぶ。一実施形態では、上記VLセグメントが、クラスターAのゲノム断片およびクラスターBのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターAの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、クラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターCの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、hVλ3-1、hVλ4-3、hVλ2-8、hVλ3-9、hVλ3-10、hVλ2-11、およびhVλ3-12を含む。特定の実施形態では、上記VLセグメントが、Vλ3-12~Vλ3-1にわたる上記ヒトλ軽鎖遺伝子座の隣接配列を含む。一実施形態では、上記隣接配列が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12のhVλを含む。特定の実施形態では、上記hVλが、3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、および3-12を包含する。特定の実施形態では、上記hVλが、Vλ3-12~Vλ3-1にわたるヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。一実施形態では、上記hVλが、13~28以上のhVλを含む。特定の実施形態では、上記hVλが、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、および3-27を包含する。特定の実施形態では、上記hVλが、Vλ3-27~Vλ3-1にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、29~40のhVλを含む。特定の実施形態では、上記VLセグメントが、Vλ3-29~Vλ3-1にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列、およびVλ5-52~Vλ1-40にわたる上記ヒトλ遺伝子座の隣接配列を含む。特定の実施形態では、上記遺伝子改変マウスにおけるhVλ1-40~hVλ3-29における全てのまたは実質的に全ての配列が、天然では例えば、ヒト集団では上記hVλ1-40遺伝子セグメントの下流3’側非翻訳部分の下流に見出される約959bpのヒトλ配列、制限酵素認識部位例えば、PI-SceI部位、これに後続する、天然では上記hVλ3-29遺伝子セグメントの上流に見出される約3,431bpのヒトλ配列から本質的になる。一実施形態では、上記Jκが、ヒトJκであり、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、およびこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、上記Jκが、Jκ1~Jκ5を含む。一実施形態では、上記VLセグメントが、ヒトVλセグメントであり、上記Jκ遺伝子セグメントが、12マーのスペーサーを有するRSSであって、上記Jκ遺伝子セグメントの上流端で近接するisjuxtaposedRSSを含む。一実施形態では、上記VL遺伝子セグメントが、ヒトVλであり、上記VLH遺伝子座が、2つ以上のJκ遺伝子セグメントを含み、各Jκ遺伝子セグメントが、12マーのスペーサーを有するRSSであって、各Jκ遺伝子セグメントの上流端で近接するRSSを含む。特定の実施形態では、上記VLセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Vκ4-1~Vκ2-40にわたる隣接するヒトκ遺伝子セグメントを含み、上記JLセグメントが、上記ヒトκ遺伝子座Jκ1~Jκ5にわたる隣接するヒトκ遺伝子セグメントを含む。上記VLセグメントがVλセグメントであり、上記VLセグメントとJセグメントとの間にDHセグメントが存在しない一実施形態では、上記VLセグメントが、下流で23マーのRSSと隣接しすなわち、その下流側で近接し、存在する場合のJκセグメントまたは存在する場合のJλセグメントが、上流で12マーのRSSと隣接するすなわち、その上流側で近接する。V遺伝子セグメントがVκ遺伝子セグメントであり、上記V遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントとの間にDH遺伝子セグメントが存在しない一実施形態では、上記Vκ遺伝子セグメントの各々が、下流側で、12マーのRSSで近接し、存在する場合のJκセグメントまたは存在する場合のJλセグメントの各々が、上流側で、23マーのRSSと近接する。一実施形態では、上記マウスが、VL遺伝子セグメント、JL遺伝子セグメント、およびマウス内因性CH遺伝子に由来する再構成された遺伝子を含む。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、体細胞変異している。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のN付加Nadditionを含む。一実施形態では、上記VLセグメントおよび上記JLセグメントに由来する再構成された遺伝子において観察される上記N付加および/または上記体細胞変異が、内因性軽鎖遺伝子座において再構成される、再構成された軽鎖可変ドメイン同じVL遺伝子セグメントおよび同じJL遺伝子セグメントに由来するにおいて観察されるN付加および/または体細胞変異の数の1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または少なくとも5倍である。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、対象の抗原に特異的に結合するB細胞であって、対象の抗原に低ナノモル濃度範囲以下のKD例えば、10ナノモル濃度以下のKDで結合するB細胞内に存在する。特定の実施形態では、上記VLセグメント、上記JLセグメント、またはこれらの両方、が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記VLセグメントおよびJLセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記マウスのCH遺伝子が、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEから選択される。特定の実施形態では、上記マウスのIgGが、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、およびIgG3から選択される。別の特定の実施形態では、上記マウスのIgGが、IgG1である。一実施形態では、上記マウスが、B細胞を含み、ここで、上記B細胞が、上記B細胞の染色体における遺伝子座から、4つのポリペプチド鎖から本質的になる結合タンパク質を作製し、ここで、上記4つのポリペプチド鎖が、aVL領域と融合しているマウス内因性CH領域を含む、2つの同一のポリペプチドと、b上記マウスCH領域と融合しており、かつ一実施形態ではヒト例えば、ヒトκVL領域であるVL領域に関してコグネイトであるVL領域と融合しているマウス内因性CL領域を含む、2つの同一のポリペプチドとから本質的になる。一実施形態では、上記マウス内因性CH領域と融合しているVL領域が、ヒトVL領域である。特定の実施形態では、上記マウスCH領域と融合しているヒトVL領域が、Vκ領域である。特定の実施形態では、上記マウスCH領域と融合しているヒトVL領域が、再構成されたヒト生殖系列軽鎖ヌクレオチド配列によりコードされるV領域と同一である。特定の実施形態では、上記マウスCH領域に融合しているヒトVL領域が、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスCH領域に融合しているヒトVL領域が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む再構成された遺伝子によりコードされる。一実施形態では、上記マウスにより作製される全てのIgG分子のうちの少なくとも50が、IgGアイソタイプのCH領域およびVL領域を含むポリペプチドを含み、ここで、上記ポリペプチドの長さが、535、530、525、520、または515アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、全てのIgG分子のうちの少なくとも75が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。一実施形態では、全てのIgG分子のうちの少なくとも80、85、90、または95が、本段落で列挙されるポリペプチドを含む。特定の実施形態では、上記マウスにより作製される全てのIgG分子が、本段落で列挙されるポリペプチドの長さ以下であるポリペプチドを含む。一実施形態では、上記マウスにより、再構成されたヒトV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントによりコードされるが、DH遺伝子セグメントによってはコードされない可変ドメインと融合しているマウス内因性CH領域を含む第1のポリペプチド、ならびに再構成されたヒトV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントによりコードされるが、DH遺伝子セグメントによってはコードされないVドメインと融合しているマウス内因性CL領域を含む第2のポリペプチドを含む結合タンパク質を作製するが、この結合タンパク質は、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のアフィニティーで抗原に特異的に結合する。一実施形態では、上記Jセグメントが、ヒトJセグメント例えば、ヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、ヒトVセグメントが、ヒトVκセグメントである。一実施形態では、上記マウス内因性CH領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性CL領域と融合している可変領域より多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウス内因性CH領域と融合している可変領域が、上記マウス内因性CL領域に融合しているV領域の約1.5、2、3、4、または5倍以上の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウスCH領域と融合しているV領域が、上記マウスCL領域と融合しているV領域より少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウスCH領域と融合しているV領域が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む再構成された遺伝子によりコードされる。一実施形態では、上記マウスが、免疫グロブリン重鎖定常領域配列と融合している第1の軽鎖可変ドメインVL1、および免疫グロブリン軽鎖定常領域と融合している第2の軽鎖可変ドメインVL2を含む結合タンパク質を発現し、ここで、VL1が、VL2に存在する体細胞超変異の数の約1.5~約5倍以上の数の体細胞超変異を含む。一実施形態では、VL1における体細胞超変異の数が、VL2における数の約2~約4倍である。一実施形態では、VL1における体細胞超変異の数が、VL2における数の約2~約3倍である。一実施形態では、VL1が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む配列によりコードされる。一態様では、以下のポリペプチド:各々がVL遺伝子セグメントおよびJL遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているCH領域から本質的になる第1の2つの同一のポリペプチド、ならびに各々がVLセグメントおよびJLセグメントから本質的になる遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているCL領域から本質的になる第2の2つの同一のポリペプチドから本質的になる免疫グロブリンを発現する遺伝子改変マウスが提供される。特定の実施形態では、上記CH領域を有する2つの同一のポリペプチドが、マウスCH領域を有する。特定の実施形態では、上記CL領域を有する2つの同一のポリペプチドが、マウスCL領域を有する。一実施形態では、上記CL領域と融合している可変ドメインが、上記CH領域に融合している可変ドメインとコグネイトの可変ドメインである。一実施形態では、上記マウス内因性CH領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性CL領域と融合している可変ドメインより多数の体細胞超変異を含み、特定の実施形態では、上記マウス内因性CH領域と融合している可変ドメインが、上記マウス内因性CL領域と融合している可変ドメインの約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍以上の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記マウス内因性CL領域と融合している可変ドメインが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のN付加を含む遺伝子によりコードされる。一実施形態では、上記Vセグメントおよび上記Jセグメントのうちの1または複数が、ヒト遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Vセグメントおよび上記Jセグメントの両方が、ヒトκ遺伝子セグメントである。別の特定の実施形態では、上記Vセグメントおよび上記Jセグメントの両方が、ヒトλ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記Vセグメントおよび上記Jセグメントが、ヒトκ遺伝子セグメントおよびヒトλ遺伝子セグメントから個別に選択される。特定の実施形態では、上記Vセグメントが、Vκセグメントであり、上記Jセグメントが、Jλセグメントである。別の特定の実施形態では、上記Vセグメントが、Vλセグメントであり、上記Jセグメントが、Jκセグメントである。一実施形態では、上記CL領域と融合している可変ドメインおよび上記CH領域と融合している可変ドメインのうちの1または複数が、ヒト可変ドメインである。特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、ヒトVκドメインである。別の特定の実施形態では、上記ヒト可変ドメインが、Vλドメインである。一実施形態では、上記ヒトドメインが、ヒトVκドメインおよびヒトVλドメインから個別に選択される。特定の実施形態では、上記CL領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトVλドメインであり、上記CH領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトVκドメインである。別の実施形態では、上記CL領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトVκドメインであり、上記CH領域と融合しているヒト可変ドメインが、ヒトVλドメインである。一実施形態では、上記第1の2つの同一のポリペプチドのうちのVL遺伝子セグメントが、ヒトVλセグメントおよびヒトVκセグメントから選択される。一実施形態では、上記第2の2つの同一のポリペプチドのうちのVLセグメントが、ヒトVλセグメントおよびヒトVκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第1の2つの同一のポリペプチドのうちのVLセグメントが、ヒトVκセグメントであり、上記第2の2つの同一のポリペプチドのうちのVLセグメントが、ヒトVκセグメントおよびヒトVλセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第1の2つの同一のポリペプチドのうちのVLセグメントが、ヒトVλセグメントであり、上記第2の2つの同一のポリペプチドのうちのVLセグメントが、ヒトVλセグメントおよびヒトVκセグメントから選択される。特定の実施形態では、上記第1の2つの同一のポリペプチドのうちのヒトVLセグメントが、ヒトVκセグメントであり、上記第2の2つの同一のポリペプチドのうちのヒトVLセグメントが、ヒトVκセグメントである。一実施形態では、上記マウスのIgGが、抗原に対する反応により作製された結合タンパク質を含み、ここで、上記結合タンパク質が、可変ドメインおよびCH領域から本質的になるポリペプチドを含み、ここで、上記可変ドメインが、再構成されたVLセグメントおよび再構成されたJセグメントから本質的になるヌクレオチド配列によりコードされ、ここで、上記結合タンパク質が、上記抗原のエピトープに、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のKDで特異的に結合する。一態様では、抗原に対する反応によりマウスにより作製されるIgGのうちの全てのまたは実質的に全てが、可変ドメインを含む重鎖を含み、ここで、上記可変ドメインが、本質的にV遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントからなる遺伝子セグメントに由来する、再構成された遺伝子によりコードされるマウスが提供される。一実施形態では、上記再構成された遺伝子が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む。一実施形態では、上記Vセグメントが、軽鎖のVセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記Vセグメントが、ヒトVセグメントである。特定の実施形態では、上記Vセグメントが、ヒトVκセグメントであり、Jセグメントが、ヒトJκセグメントである。一実施形態では、上記Jセグメントが軽鎖のJセグメントである。一実施形態では、上記軽鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される。特定の実施形態では、上記軽鎖がκ軽鎖である。特定の実施形態では、上記JセグメントがヒトJセグメントである。別の実施形態では、上記Jセグメントが重鎖のJセグメントすなわち、JHセグメントである。特定の実施形態では、上記重鎖がマウス起源のものである。別の特定の実施形態では、上記重鎖がヒト起源のものである。一実施形態では、VセグメントおよびJセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインが、体細胞変異している可変ドメインである。一実施形態では、VセグメントおよびJセグメントだけから作製される重鎖の可変ドメインがマウスCH領域に融合している。特定の実施形態では、抗原に対する反応により上記マウスにより作製されるIgGのうちの全てまたは実質的に全てが、1つ以下のヒトVセグメントおよび1つ以下のヒトJセグメントに由来する可変ドメインを含み、上記可変ドメインが、マウスIgG定常領域に融合しており、上記IgGが、マウスCL領域と融合しているヒトVLドメインを含む軽鎖をさらに含む。特定の実施形態では、上記マウスCL領域と融合しているVLドメインが、ヒトVκセグメントおよびヒトJκセグメントに由来する。特定の実施形態では、上記マウスCL領域と融合しているVLドメインが、ヒトVλセグメントおよびヒトJλセグメントに由来する。一態様では、CH領域を含むポリペプチドにおける第1のCDR3およびCL領域を含むポリペプチドにおける第2のCDR3を含むIgGを作製するマウスであって、ここで、上記第1のCDR3および上記第2のCDR3の両方が、各々個別に2つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記2つの遺伝子セグメントが、本質的にVL遺伝子セグメントおよびJL遺伝子セグメントからなるマウスが提供される。一実施形態では、上記CH領域を含むポリペプチドにおけるCDR3が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含むCDR3のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。一実施形態では、上記VLセグメントおよび上記JLセグメントが、ヒト遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記VLセグメントおよび上記JLセグメントが、κ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記VLセグメントおよび上記JLセグメントが、λ遺伝子セグメントである。一態様では、CH領域を含む第1のポリペプチドにおける第1のCDR3およびCL領域を含む第2のポリペプチドにおける第2のCDR3を含むIgGを作製するマウスであって、ここで、上記第1のCDR3および上記第2のCDR3の両方が、各々アミノ酸の配列を含み、ここで、上記アミノ酸のうちの75超がV遺伝子セグメントに由来するマウスが提供される。一実施形態では、上記CH領域を含むポリペプチドにおけるCDR3が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含むCDR3のヌクレオチド配列に由来する配列を含む。一実施形態では、上記第1のCDR3のアミノ酸のうちの80超、90超、または95超、ならびに上記第2のCDR3のアミノ酸のうちの80超、90超、または95超が、軽鎖Vセグメントに由来する。一実施形態では、上記第1のCDR3のうちの2つ以下のアミノ酸が、軽鎖Vセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記第2のCDR3のうちの2つ以下のアミノ酸が、軽鎖Vセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、上記第1のCDR3のうちの2つ以下のアミノ酸および上記第2のCDR3のうちの2つ以下のアミノ酸が、軽鎖Vセグメント以外の遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、上記IgGのCDR3が、D遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含まない。一実施形態では、第1のポリペプチドのCDR3が、Dセグメントに由来する配列を含まない。一実施形態では、上記Vセグメントが、ヒトV遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、上記Vセグメントが、ヒトVκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記第1および/または上記第2のCDR3が、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの体細胞超変異を有する。一実施形態では、上記第1のCDR3が1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む核酸配列によりコードされる。一実施形態では、上記第1のCDR3が、ヒト軽鎖V遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖J遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になり、上記第2のCDR3が、ヒト軽鎖V遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖J遺伝子セグメントに由来するアミノ酸から本質的になる。一実施形態では、上記第1のCDR3が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む核酸配列に由来する。一実施形態では、上記第1のCDR3が、2つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記2つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントであり、かつ、上記第2のCDR3が、2つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記2つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトJκセグメント、ヒトJλセグメント、およびヒトJHセグメントから選択されるヒトVκ遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントである。一実施形態では、上記第1のCDR3が、2つ以下の遺伝子セグメントに由来し、ここで、上記2つ以下の遺伝子セグメントが、ヒトJκセグメント、ヒトJλセグメント、およびヒトJHセグメントから選択されるヒトVλセグメントおよびJセグメントである。一態様では、DH遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含有しないIgGであって、ここで、マウスCL領域と融合している第1のVLドメインを有する第1のポリペプチド、およびマウスCH領域と融合している第2のVLドメインを有する第2のポリペプチドを含み、ここで、上記第1のVLドメインおよび上記第2のVLドメインが同一ではないIgGを作製するマウスが提供される。一実施形態では、上記第1および第2のVLドメインが、異なるVセグメントに由来する。別の実施形態では、上記第1および第2のVLドメインが、異なるJセグメントに由来する。一実施形態では、上記第1および第2のVLドメインが、同一のVセグメントおよびJセグメントに由来し、ここで、上記第2のVLドメインが、上記第1のVLドメインと比較してより多数の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記第1および上記第2のVLドメインが、ヒトVLドメインおよびマウスVLドメインから個別に選択される。一実施形態では、上記第1および第2のVLドメインが、VκドメインおよびVλドメインから個別に選択される。特定の実施形態では、上記第1のVLドメインが、VκドメインおよびVλドメインから選択され、上記第2のVLドメインが、Vκドメインである。別の特定の実施形態では、上記Vκドメインが、ヒトVκドメインである。一態様では、上記マウスにより作製されるIgGのうちの全てまたは実質的に全てが、マウスCLドメインと融合している第1のヒトVLドメインを有する軽鎖、およびマウスCHドメインと融合している第2のヒトVLドメインを有する重鎖から本質的になるマウスが提供される。一実施形態では、上記マウスCHドメインと融合させるヒトVLドメインが、ヒトVκドメインである。一実施形態では、上記第1および上記第2のヒトVLドメインが同一ではない。一態様では、マウスであって、ここで、上記マウスにより作製される免疫グロブリンGのうちの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、または約100が、a免疫グロブリンVLドメインおよび免疫グロブリンCL領域から本質的になる第1のポリペプチドと、b535アミノ酸以下の長さの第2のポリペプチドであって、ここで、CH領域およびDH遺伝子セグメントに由来する配列を欠くVドメインから本質的になる上記第2のポリペプチドとの二量体から本質的になる、マウスが提供される。一実施形態では、上記第2のポリペプチドが、約435~535アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドが、約435~530アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドが、約435~525アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドが、約435~520アミノ酸の長さである。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドが、約435~515アミノ酸の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製されるIgGのうちの約90以上において、上記第2のポリペプチドが、約535アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製されるIgGのうちの約50以上において、上記第2のポリペプチドが、約535アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、マウスにより作製される免疫グロブリンGのうちの約50以上において、第2のポリペプチドが、約530、525、520、515、510、505、500、495、490、485、480、475、470、465、460、455、または450アミノ酸以下の長さである。一実施形態では、上記マウスにより作製されるIgGのうちの約60、70、80、90、または95以上が、上記列挙される長さのIgGである。特定の実施形態では、上記マウスにより作製されるIgGのうちの全てまたは実質的に全てが、上記列挙される長さのIgGである。一実施形態では、上記第2のポリペプチドのVドメインが、VLドメインである。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドのVドメインが、VκドメインおよびVλドメインから選択される。特定の実施形態では、上記第2のポリペプチドのVドメインが、ヒトVκドメインまたはヒトVλドメインである。一態様では、マウスの生殖系列におけるヌクレオチド配列から、軽鎖可変配列例えば、V配列および/またはJ配列、DH配列、および重鎖定常領域を含むポリペプチドを発現するマウスが提供される。一実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖遺伝子座可変遺伝子セグメントの、マウス内因性重鎖遺伝子座における、複数のヒト遺伝子セグメントによる置き換えを含む、上記マウス内因性重鎖遺伝子座に由来するポリペプチドを発現する。一実施形態では、上記ポリペプチドが、Vλ遺伝子セグメントまたはVκ遺伝子セグメントに由来するVL配列を含み、上記ポリペプチドが、DH遺伝子セグメントに由来するCDR3を含み、上記ポリペプチドが、JH遺伝子セグメントまたはJλ遺伝子セグメントもしくはJκ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なVH遺伝子セグメントの、1または複数のヒト軽鎖Vλ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、1または複数のヒトVλセグメントの各々が、下流側で、23マーのスペースを置いた23-merspaced組換えシグナル配列RSSを近接させており、ここで、上記Vλセグメントが、12マーのスペースを置いたRSSを上流および下流で近接させているヒトDHセグメントまたはマウスDHセグメントに作動可能に連結されており、上記DH遺伝子セグメントが、そのDH遺伝子セグメントを近接させている上記12マーのスペースを置いたRSSで組み換えるrecombiningのに適する、23マーのスペースを置いたRSSと上流で近接するJセグメントと作動可能に連結され、ここで、上記Vセグメント、DHセグメント、およびJセグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なVH遺伝子セグメントの、12マーのスペースを置いた組換えシグナル配列RSSと各々が下流側で近接する1または複数のヒトVκ遺伝子セグメントによる置き換えを含み、ここで、上記Vセグメントが、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流の両方で近接するヒトDHセグメントまたはマウスDHセグメントに作動可能に連結され、上記DHセグメントが、上記DHセグメントを近接させる上記23マーのスペースを置いたRSSで組み換えるのに適する、12マーのスペースを置いたRSSと上流側で近接するJセグメントと作動可能に連結され、ここで、上記V遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、および遺伝子セグメントが、重鎖定常領域をコードする核酸配列に作動可能に連結される。一実施形態では、上記重鎖定常領域が、マウス内因性重鎖定常領域である。一実施形態では、その核酸配列が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択される配列をコードする。一実施形態では、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、およびCH3配列のうちの1または複数が、ヒト配列である。一実施形態では、上記マウスは、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含み、その遺伝子座は、全ての機能的なVH遺伝子セグメントの、23マーのスペースを置いたRSSと各々が下流で近接する複数のヒトVλ遺伝子セグメントまたはヒトVκ遺伝子セグメント、12マーのスペースを置いたRSSによって上流および下流の両方で近接させられた複数のヒトDHセグメント、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流の両方で近接する複数のヒトJセグメントJHセグメントまたはJλセグメントもしくはJκセグメントによる置き換えを含み、ここで、上記遺伝子座が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択されるマウス内因性定常領域配列を含む。特定の実施形態では、上記マウスが、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメント、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトDHセグメント、および全てのまたは実質的に全てのJHセグメントまたはJλセグメントもしくはJκセグメントを含む。一実施形態では、上記マウスが、aマウス配列を含む重鎖定常配列に連結されたヒト軽鎖配列を含むポリペプチドと、bヒト軽鎖定常配列またはマウス軽鎖定常配列に連結されたヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとを含む抗原結合タンパク質を発現する。特定の実施形態では、上記軽鎖配列が、ヒト軽鎖配列であり、抗体をFcおよびFabへと切断することが可能であるプロテアーゼに曝露されると、少なくとも4つの軽鎖CDRを含む完全ヒトFabが形成され、ここで、少なくとも4つの上記軽鎖CDRが、λ配列、κ配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記Fabが、少なくとも5つの軽鎖CDRを含む。一実施形態では、上記Fabが、6つの軽鎖CDRを含む。一実施形態では、上記Fabの少なくとも1つのCDRが、VλセグメントまたはVκセグメントに由来する配列を含み、少なくとも1つのCDRが、Dセグメントに由来する配列をさらに含む。一実施形態では、少なくとも1つの上記CDRがCDR3であり、上記CDRがヒトVκセグメント、ヒトDセグメント、およびヒトJκセグメントに由来する。一実施形態では、上記ポリペプチドが、ヒトVλ遺伝子セグメントまたはヒトVκ遺伝子セグメント、ヒトDH遺伝子セグメント、およびヒトJH遺伝子セグメントまたはヒトJλ遺伝子セグメントもしくはヒトJκ遺伝子セグメントに由来する可変領域を含む。特定の実施形態では、上記重鎖定常配列が、ヒトCH1配列およびマウスCH2配列およびマウスCH3配列に由来する。一態様では、ヒトJ遺伝子セグメントおよび重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再構成されていないヒトVκ遺伝子セグメントまたはヒトVλ遺伝子セグメントをマウスの生殖系列に含むマウスであって、ここで、重鎖定常領域と融合しているヒトVκドメインを含むVL結合タンパク質を発現し、移行B細胞CD19IgMhiIgDint、および成熟B細胞CD19IgMintIgDhiを含めたCD19B細胞においてVL結合タンパク質を発現する脾性B細胞集団を呈示する、マウスが提供される。一態様では、ヒトJ遺伝子セグメントおよび重鎖定常領域配列に作動可能に連結した、再構成されていないヒトVκ遺伝子セグメントまたはヒトVλ遺伝子セグメントをマウスの生殖系列に含むマウスであって、ここで、B細胞において重鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、マウスの骨髄中のリンパ球集団が、野生型マウスのプロ/プレB細胞集団骨髄中のリンパ球とほぼ同じ数であるプロ/プレB細胞集団を呈示する、マウスが提供される。一実施形態では、上記マウスが、少なくとも6つの再構成されていないhVκ遺伝子セグメントおよび1または複数の再構成されていないhJκ遺伝子セグメントを含み、上記マウスが、VL結合タンパク質を発現する、リンパ球ゲーティングされ、かつIgMの脾細胞集団を含み、これらの集団が、野生型マウスの、リンパ球ゲーティングされ、かつIgMの脾細胞集団の少なくとも75の大きさである。一実施形態では、上記マウスが、全体の約90を占めるIgD細胞およびIgM細胞による、成熟B細胞ゲーティングされるCD19脾細胞集団を呈示し、一実施形態では、改変マウスのIgD細胞およびIgM細胞による、成熟B細胞ゲーティングされるCD19脾細胞集団が、成熟B細胞ゲーティングされるCD19脾細胞集団である、野生型マウスのIgD細胞およびIgM細胞の全体とほぼ同じ例えば、10以内、または5以内である。一態様では、マウスの生殖系列における改変された内因性重鎖遺伝子座に由来する免疫グロブリンタンパク質を発現するマウスであって、ここで、上記改変された内因性重鎖遺伝子座が、機能的なマウス重鎖V遺伝子セグメントを欠き、かつ上記遺伝子座が、再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメントおよび再構成されていないJ遺伝子セグメントを含み、ここで、上記再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメントおよび再構成されていないJ遺伝子セグメントが、重鎖定常領域配列と作動可能に連結され、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドから本質的になり、ここで、上記第1のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖配列および免疫グロブリン重鎖定常配列を含み、かつ、上記第2のポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域を含む、マウスが提供される。一態様では、免疫グロブリンタンパク質を発現するマウスであって、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを欠き、上記免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖遺伝子に由来する第1の可変ドメイン、および軽鎖遺伝子に由来する第2の可変ドメインを含み、ここで、上記第1の可変ドメインおよび上記第2の可変ドメインが、互いに関してコグネイトであり、ここで、上記第1および上記第2の軽鎖可変ドメインが、同一ではなく、かつ、ここで、上記第1および上記第2の軽鎖可変ドメインが会合し、会合すると対象の抗原に特異的に結合する、マウスが提供される。一態様では、マウスの生殖系列における再構成されていない遺伝子セグメントから、再構成されていないヒト遺伝子セグメントから本質的になる遺伝子セグメントに完全に由来する可変領域を含む免疫グロブリンタンパク質を作製するマウスであって、ここで、上記免疫グロブリンタンパク質が、免疫グロブリン軽鎖定常配列およびCH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せからなる群から選択される免疫グロブリン重鎖定常配列を含む、マウスが提供される。一態様では、マウスの生殖系列における再構成されていない遺伝子セグメントから、可変領域を含む、免疫グロブリンタンパク質を作製するマウスであって、ここで、全ての可変領域の全てのCDR3が、もっぱら軽鎖V遺伝子セグメントおよび軽鎖J遺伝子セグメント必要に応じて、1または複数の体細胞超変異例えば、1または複数のN付加のあるから生成する、マウスが提供される。一態様では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する、体細胞変異している免疫グロブリンタンパク質をマウスの生殖系列に作製するマウスであって、ここで上記免疫グロブリンタンパク質が、D遺伝子セグメントに由来する配列を含むCDRを欠き、ここで上記免疫グロブリンタンパク質が、軽鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第1のCDR3を含み、重鎖定常領域と融合している軽鎖可変ドメインにおける第2のCDR3を含み、かつ、ここで上記第2のCDR3が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む、再構成された軽鎖可変領域配列に由来する、マウスが提供される。一態様では、本明細書で記載されるマウスであって、λ遺伝子座、κ遺伝子座、およびこれらの組合せから選択される、機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座を含むマウスが提供される。一実施形態では、λ遺伝子座および/またはκ遺伝子座が非機能性となるように、上記マウスが、全体的または部分的に、λ遺伝子座および/またはκ遺伝子座の欠失を含む。一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞を含むマウス胚が提供される。一実施形態では、上記マウスが、キメラであり、その胚の細胞のうちの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または95が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚の細胞のうちの少なくとも96、97、98、99、または99.8が、本明細書で記載される、改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、宿主細胞およびドナーES細胞に由来する細胞を含み、ここで、上記ドナーES細胞に由来する細胞が、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む。一実施形態では、上記胚が、2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、または64細胞期の宿主胚、または胚盤胞であり、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含むドナーES細胞をさらに含む。一態様では、本明細書で記載される核酸構築物を用いて作製されたマウスまたは細胞が提供される。一態様では、本明細書で記載される細胞を用いて作製されたマウスが提供される。一実施形態では、上記細胞が、マウスES細胞である。一態様では、第2のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列VL2とコグネイトである、第1のヒト軽鎖免疫グロブリン可変配列VL1をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ポリペプチド1と融合している上記VL1が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域ポリペプチド2と融合しているVL2とともに、ポリペプチド1/ポリペプチド2の二量体として発現してVL1-VL2抗体を形成する。一態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖配列と融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用であって、ここで上記核酸配列がヒトVL-CHポリペプチドをコードし、ここで上記ヒトVL-CHポリペプチドが二量体として発現し、かつ、ここで上記二量体が免疫グロブリン軽鎖の非存在下において例えば、ヒトλ軽鎖またはヒトκ軽鎖の非存在下において発現する。一実施形態では、そのVL-CH二量体が、λ軽鎖の非存在下において、かつ、κ軽鎖の非存在下において、対象の抗原に特異的に結合する。一態様では、免疫グロブリン可変ドメインの全部または一部をコードする核酸配列を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用。一実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインが、ヒトVλドメインまたはヒトVκドメインである。一態様では、完全ヒトFabヒト軽鎖定常領域と融合している第1のヒトVL、およびヒト重鎖定常領域配列と融合している第2のヒトVLを含むまたは完全ヒトFab2を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一実施形態では、上記不死化細胞系が、マウス定常領域核酸配列を含む核酸配列に作動可能に連結したヒトVλドメインまたはヒトVκドメインをコードする核酸配列を含む。一態様では、ハイブリドーマまたはクァドローマを作製するための、本明細書で記載されるマウスの使用が提供される。一態様では、本明細書で記載される改変された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞が提供される。一実施形態では、上記細胞が、全能性細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞iPS細胞、およびES細胞から選択される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス細胞、例えば、マウスES細胞である。一実施形態では、上記細胞が、上記改変された免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性である。一態様では、ヒト重鎖定常領域配列に融合した、体細胞変異させた、第1のヒトVκ配列または第1のヒトVλ配列を含む第1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞が提供される。一実施形態では、上記細胞は、ヒト軽鎖定常領域配列と融合させた、体細胞変異させた、第2のヒトVκ配列または第2のヒトVλ配列を含む第2のポリペプチド鎖をさらに含む。一実施形態では、上記第1のポリペプチドの上記ヒトVκ配列または上記ヒトVλ配列が、上記第2のポリペプチドの上記ヒトVκ配列または上記ヒトVλ配列とコグネイトである。一実施形態では、上記第1のポリペプチドの上記Vκまたは上記Vλおよび上記第2のポリペプチドの上記ヒトVκまたは上記ヒトVλが、会合すると、対象の抗原に特異的に結合する。特定の実施形態では、上記第1のポリペプチドが、ヒトVκから本質的になる可変ドメインを含み、上記第2のポリペプチドが、上記第1のポリペプチドのヒトVκとコグネイトであるヒトVκからなる可変ドメインを含み、上記ヒト定常領域配列が、IgG配列である。一実施形態では、上記細胞が、CHO細胞、COS細胞、293細胞、HeLa細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞例えば、PERC.6商標細胞から選択される。一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む染色体を含むマウス体細胞が提供される。一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変を含む核酸配列を含むマウス胚細胞が提供される。一態様では、本明細書で記載されるマウスに由来する多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞が提供される。特定の実施形態では、上記細胞が、マウス胚性幹ES細胞である。一態様では、マウス、細胞、または治療用タンパク質例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質を製造するための、本明細書で記載される細胞の使用が提供される。一態様では、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDH遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトVκ遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同な相同性アームを含む。一実施形態では、ターゲティング構築物は、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で各々が近接する、全てのまたは実質的に全てのヒトDH遺伝子セグメントを含む。一態様では、12マーのスペースを置いたRSSと上流で近接するヒトJκ遺伝子セグメントを含む核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、上記核酸構築物が、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトゲノムDH遺伝子配列に対する相同性を含有する第1の相同性アームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトゲノムJ遺伝子配列に対する相同性を含有するか、またはマウス重鎖定常領域配列に対する相同性を含有するか、またはマウス定常領域重鎖配列の上流におけるJ-C遺伝子間配列に対する相同性を含有する第2の相同性アームを含む。一態様では、23マーのスペースを置いたRSSと下流で近接するヒトVλセグメント、12マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDHセグメント、ならびに23マーのスペースを置いたRSSと上流で近接するJκセグメント、23マーのスペースを置いたRSSと上流で近接するヒトJλセグメント、および、23マーのスペースを置いたRSSと上流で近接するヒトJHセグメントから選択されるヒトJセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、マウス定常領域配列、マウスJ-C遺伝子間配列、および/またはヒトVλ配列に対する相同性を含有する相同性アームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターAの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターAの断片が、hVλ3-27~hVλ3-1に及ぶ。一実施形態では、上記核酸構築物が、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターBの断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、上記ヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターBの断片が、hVλ5-52~hVλ1-40に及ぶ。一実施形態では、核酸構築物が、クラスターAのゲノム断片およびクラスターBのゲノム断片を含むヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターAの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記ヒトλ軽鎖可変領域配列が、クラスターBの少なくとも1つの遺伝子セグメントおよびクラスターCの少なくとも1つの遺伝子セグメントを含む。一態様では、通常天然ではJκセグメント、JHセグメント、Vλセグメント、またはVHセグメントのいずれかと隣接して見出される、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDHセグメントを含む核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒトV-J遺伝子間領域に相同であるか、またはヒトV遺伝子セグメントを含むヒトゲノム配列に相同な、第1の相同性アームを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列に相同な、第2の相同性アームを含む。特定の実施形態では、上記ヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択される。一実施形態では、上記核酸構築物が、上流で12マーのRSSと隣接するヒトJ遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、上記核酸構築物が、12マーのRSSと上流で隣接するJ遺伝子セグメントに対する相同性を含有する第2の相同性アームを含む。一実施形態では、上記J遺伝子セグメントが、ヒトJκセグメント、ヒトJλセグメント、およびヒトJHセグメントから選択される。一態様では、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDHセグメント、ならびに部位特異的リコンビナーゼの認識配列、例えば、Creタンパク質、Flpタンパク質、またはDreタンパク質などの部位特異的リコンビナーゼにより認識される配列を含む核酸構築物が提供される。一態様では、ヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメント、12マーまたは23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するDHセグメント、ならびに12マーまたは23マーのスペースを置いたRSSを伴うヒトJセグメントを含み、ここで上記12マーまたは23マーのスペースを置いたRSSが、上記ヒトJセグメントに対してすなわち、転写方向に対してすぐの5’側に位置する核酸構築物が提供される。一実施形態では、上記構築物が、23マーのスペースを置いたRSSと3’側で近接するヒトVλセグメント、12マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDHセグメント、ならびに、23マーのスペースを置いたRSSと5’側で近接するヒトJκセグメントを含む。一実施形態では、上記構築物が、12マーのスペースを置いたRSSと3’側で近接するヒトVκ、23マーのスペースを置いたRSSと上流および下流で近接するヒトDHセグメント、ならびに、12マーのスペースを置いたRSSと5’側で近接するヒトJλセグメントを含む。一態様では、ターゲティングベクターであって、aヒトターゲティングアームおよびマウスターゲティングアームから個別に選択され、そのベクターを、内因性免疫グロブリンV領域遺伝子の遺伝子座または改変された免疫グロブリンV領域遺伝子の遺伝子座へと方向付ける、第1のターゲティングアームおよび第2のターゲティングアームと、bihVκ4-1~hVκ1-6およびJκ1、iihVκ4-1~hVκ1-6およびJκ1~Jκ2、iiihVκ4-1~hVκ1-6およびJκ1~Jκ3、ivhVκ4-1~hVκ1-6およびJκ1~Jκ4、vhVκ4-1~hVκ1-6およびJκ1~Jκ5、vihVκ3-7~hVκ1-16、viihVκ1-17~hVκ2-30、viiihVκ3-31~hVκ2-40、およびixこれらの組合せからなる群から選択される、ヒトVL遺伝子セグメントの隣接配列、またはヒトVL遺伝子セグメントおよび少なくとも1つのヒトJκ遺伝子セグメントの隣接配列を含むターゲティングベクターが提供される。一実施形態では、上記ベクターを、内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座へと方向付けるターゲティングアームが、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座または改変された免疫グロブリン遺伝子座における配列と同一であるか、または実質的に同一である。一態様では、マウス、細胞、または治療用タンパク質例えば、抗体または他の抗原結合タンパク質を製造するための、本明細書で記載される核酸構築物の使用が提供される。一態様では、ヒト用治療剤を製造するための細胞系を作製するための、本明細書で記載されるマウス由来の核酸配列の使用が提供される。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒト重鎖定常配列と融合しているヒト軽鎖可変配列例えば、ヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメントに由来するヒト軽鎖可変配列を含む結合タンパク質である。一実施形態では、上記ヒト用治療剤が、ヒトλ免疫グロブリン軽鎖またはヒトκ免疫グロブリン軽鎖である第1のポリペプチド、およびヒト重鎖定常配列と融合しているヒトVλ可変配列またはヒトVκ可変配列を含む第2のポリペプチドを含む。一態様では、ヒトCHドメインと融合させた、体細胞変異させた、ヒトVLドメインを含むポリペプチドをコードするDNA構築物でトランスフェクトした、哺乳動物細胞を含む発現系が提供される。一実施形態では、上記発現系が、ヒトCLドメインと融合している免疫グロブリンVLドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、ここで上記ヒトCLドメインと融合している上記VLドメインが、上記ヒトCHドメインと融合している上記VLドメインとコグネイト軽鎖である。一実施形態では、上記哺乳動物細胞が、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、293細胞、およびウイルス遺伝子を発現する網膜細胞例えば、PER.C6商標細胞から選択される。一態様では、結合タンパク質を作製する方法であって、VLドメインをコードするヌクレオチド配列を、本明細書で記載されるマウスの細胞に由来するCH領域に融合しているVL領域をコードする遺伝子から得るステップと、ヒトCH領域をコードする遺伝子とともにインフレームで上記VL領域配列をコードするヌクレオチド配列をクローニングしてヒト結合タンパク質配列を形成し、適切な細胞において上記ヒト結合タンパク質配列を発現させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、上記マウスを対象の抗原で免疫し、上記CH領域に融合しているVL領域が、対象の抗原エピトープに特異的に結合する例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲にあるKDで特異的に結合する。一実施形態では、上記CH領域に融合しているVL領域をコードするヌクレオチド配列を、上記マウスにおいて体細胞変異させる。一実施形態では、上記適切な細胞が、B細胞、ハイブリドーマ、クァドローマ、CHO細胞、COS細胞、293細胞、HeLa細胞、およびウイルス核酸配列を発現するヒト網膜細胞例えば、PERC.6商標細胞から選択される。一実施形態では、上記CH領域が、ヒトIgGアイソタイプを含む。特定の実施形態では、上記ヒトIgGが、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択される。別の特定の実施形態では、上記ヒトIgGが、IgG1である。別の特定の実施形態では、上記ヒトIgGが、IgG4である。別の特定の実施形態では、上記ヒトIgG4が、改変されたIgG4である。一実施形態では、上記改変されたIgG4が、ヒンジ領域における置換を含む。特定の実施形態では、改変されたIgG4が、野生型ヒトIgG4と比べて、KabatのEU番号付け指標により番号付けされたアミノ酸残基228における置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸残基228における置換が、KabatのEU番号付け指標により番号付けされたS228P置換である。一実施形態では、上記細胞が、上記CH領域に融合しているVLドメインとコグネイトである軽鎖に由来するVLドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その方法が、ヒトCκドメインまたはヒトCλドメインに融合している上記コグネイトVLドメインをコードするヌクレオチド配列を発現するステップをさらに含む。一態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法であって、マウス内因性重鎖遺伝子座において、1または複数のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、1または複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントで置き換えるステップを含む方法が提供される。一実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス免疫グロブリン重鎖セグメントすなわち、VHセグメント、DHセグメント、およびJHセグメントの、1または複数の機能的なヒト軽鎖セグメントすなわち、VLセグメントおよびJLセグメントによる置き換えである。一実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス重鎖VHセグメント、DHセグメント、およびJHセグメントの、全てのまたは実質的に全てのヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメントおよび少なくとも1つのJλセグメントまたはJκセグメントによる置き換えである。特定の実施形態では、上記置き換えが、全てのまたは実質的に全ての機能的なヒトJλセグメントまたはヒトJκセグメントを包含する。一態様では、マウス重鎖定常領域と融合しているヒト免疫グロブリンVλセグメントもしくはVκセグメントおよび/またはヒト免疫グロブリンJλセグメントもしくはJκセグメントに由来する配列を含むポリペプチドを発現するマウスを作製するための方法であって、マウス内因性重鎖免疫グロブリン可変セグメントVHセグメント、DHセグメント、およびJHセグメントを、少なくとも1つのヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメントおよび少なくとも1つのヒトJλセグメントまたはヒトJκセグメントで置き換えるステップを含み、ここで、上記置き換えを、遺伝子改変されたマウス前駆細胞を形成するための多能性マウス細胞、人工多能性マウス細胞、または全能性マウス細胞における置き換えとし、上記遺伝子改変されたマウス前駆細胞を、マウス宿主に導入し、上記遺伝子改変された前駆細胞を含む上記マウス宿主を懐胎させて、上記遺伝子改変されたマウス前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する方法が提供される。一実施形態では、上記宿主が胚である。特定の実施形態では、上記宿主が、マウスの前桑実胚pre-morula例えば、8細胞期または4細胞期、四倍体胚、胚性細胞塊、または胚盤胞から選択される。一態様では、本明細書で記載される遺伝子改変マウスを作製するための方法であって、核移植によって本明細書で記載される改変を含有する核酸を細胞へと導入するステップと、適切な条件下で上記細胞を維持して、本明細書で記載されるマウスへと発生させるステップ例えば、上記細胞を培養するステップ、および代理母体において上記細胞を含む胚を懐胎させるステップを含めたとを含む方法が提供される。一態様では、改変マウスを作製するための方法であって、マウスES細胞またはマウス多能性細胞もしくはマウス全能性細胞もしくはマウス人工多能性細胞を、本明細書で記載される通り、免疫グロブリン重鎖定常配列に作動可能に連結した、1または複数の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを包含するように改変するステップと、上記ES細胞を培養するステップと、その培養ES細胞を宿主胚へと導入してキメラ胚を形成するステップと、上記キメラ胚を適切な宿主マウスへと導入して改変マウスへと発生させるステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、1または複数の、上記再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトλ遺伝子セグメントまたはヒトκ遺伝子セグメントである。一実施形態では、1または複数の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトVλセグメントまたはヒトVκセグメントおよび1または複数のJλセグメント、Jκセグメント、またはJHセグメントを含む。一実施形態では、上記重鎖定常遺伝子配列が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択されるヒト配列である。一実施形態では、1または複数の、上記再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントにより、上記マウス内因性重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての機能的なマウス内因性重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換え、上記重鎖定常配列が、CH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、およびCH3配列を含むマウス配列である。一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された免疫グロブリン可変領域VR例えば、ヒトJL配列、またはヒトJH配列、またはヒトDH配列およびヒトJH配列、またはヒトDH配列およびヒトJL配列と融合しているヒトVL配列を含むが提供される。特定の実施形態では、上記免疫グロブリンVRが、VκセグメントおよびVλセグメントから選択される生殖系列のヒト遺伝子セグメントに由来し、ここで上記VRが上記マウスに由来する再構成された配列によりコードされ、ここで上記再構成された配列が体細胞超変異している。一実施形態では、上記再構成された配列が、1~5カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列が、少なくとも6、7、8、9、または10カ所の体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列が、10カ所を超える体細胞超変異を含む。一実施形態では、上記再構成された配列を、1または複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列例えば、ヒトまたはマウスのCH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択されると融合させる。一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製された結合タンパク質の免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列が提供される。一実施形態では、上記VRを、1または複数のヒト重鎖定常領域配列またはマウス重鎖定常領域配列例えば、ヒトまたはマウスのCH1配列、ヒンジ配列、CH2配列、CH3配列、およびこれらの組合せから選択されると融合させる。一態様では、本明細書で記載されるマウスに由来する核酸配列によりコードされる軽鎖可変ドメインが提供される。一態様では、本明細書で記載されるマウスにおいて作製されるか、または本明細書で記載されるマウスにおいて作製された配列に由来する、抗体またはその抗原結合断片例えば、Fab、Fab2、scFvが提供される。二重特異性結合タンパク質という語句は、2つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能である結合タンパク質を包含する。二重特異性結合タンパク質は、第1のCH領域と融合している第1の軽鎖可変ドメインVL1および第2のCH領域と融合している第2の軽鎖可変ドメインVL2を含む2つの異なるポリペプチドを含む。一般に、上記第1および上記第2のCH領域は、同一の場合もあり、1または複数のアミノ酸置換例えば、本明細書で記載されるアミノ酸置換だけ異なる場合もある。VL1およびVL2は、異なるエピトープ2つの異なる分子例えば、抗原または同じ分子例えば、同じ抗原ににに特異的に結合する。二重特異性結合タンパク質が2つの異なるエピトープ第1のエピトープおよび第2のエピトープに選択的に結合する場合、上記第1のエピトープに対するVL1のアフィニティーは一般に、上記第2のエピトープに対するVL1のアフィニティーより、少なくとも1~2または3または4桁小さく、VL2についてはその逆である。上記二重特異性結合タンパク質により認識されるエピトープは、同じ標的に存在する場合もあり、異なる標的に存在する場合もある例えば、同じ抗原に存在する場合もあり、異なる抗原に存在する場合もある。二重特異性結合タンパク質は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識するVL1とVL2とを組み合わせることにより作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識するVL配列をコードする核酸配列は、異なるCH領域をコードする核酸配列に融合させることができ、このような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現させることもでき、免疫グロブリン軽鎖を発現しない細胞内で発現させることもできる。典型的な二重特異性結合タンパク質は、各々が3つの軽鎖CDRにN末端からC末端へ後続するCH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを有する2つの重鎖と、抗原結合特異性は付与しないが、各重鎖と会合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合していることが可能であり、VL1および/もしくはVL2が結合するエピトープのうちの1または複数に結合し得る免疫グロブリン軽鎖、または各重鎖と会合していることが可能であり、重鎖のうちの一方もしくは両方がエピトープのうちの一方もしくは両方に結合することを可能とするかもしくはそれ支援する免疫グロブリン軽鎖とを有する。したがって、二重特異性結合タンパク質の2つの一般的な種類は、1VL1-CH二量体、および2VL1-CH:軽鎖VL2-CH:軽鎖その軽鎖が同じであるかまたは異なるである。いずれの場合においても、上記CHすなわち、上記重鎖定常領域を、本明細書で記載される通りに示差的に改変することもでき例えば、プロテインAに示差的に結合するように改変される、血清半減期を延長するように改変されるなど、同じとすることもできる。配列を発現させることとの関連で用いられる場合の細胞という用語は、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞を包含する。細胞には、原核生物および真核生物の細胞単細胞または複数細胞、細菌細胞例えば、E.coli、Bacillus属種、Streptomyces属種などの株、ミコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞例えば、S.cerevisiae、S.pombe、P.pastoris、P.methanolicaなど、植物細胞、昆虫細胞例えば、SF-9細胞、SF-21細胞、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞、Trichoplusianiなど、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、B細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクァドローマなどの細胞融合体が含まれる。一部の実施形態では、上記細胞が、ヒト細胞、サル細胞、類人猿細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、上記細胞が、真核細胞であり、以下の細胞:CHO細胞例えば、CHOK1細胞、DXB-11CHO細胞、Veggie-CHO細胞、COS細胞例えば、COS-7細胞、網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎臓細胞例えば、HEK293細胞、293EBNA細胞、MSR293細胞、MDCK細胞、HaK細胞、BHK細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC5細胞、Colo205細胞、HB8065細胞、HL-60細胞例えば、BHK21細胞、Jurkat細胞、Daudi細胞、A431細胞上皮細胞、CV-1細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、P2/0細胞、NS-0細胞、MMT060562細胞、Sertoli細胞、BRL3A細胞、HT1080細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上述の細胞に由来する細胞系から選択される。一部の実施形態では、上記細胞が1または複数のウイルス遺伝子を含み、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞例えば、PER.C6商標細胞である。~とコグネイトの意味、例えば、第2のVLドメイン~とコグネイトである第1のVLドメインの意味で用いられる場合のコグネイトという用語は、本発明に従うマウスにより作製される同じ結合タンパク質に由来する2つのVLドメイン間の関係に対する言及を包含することを意図する。例えば、本発明の実施形態に従い遺伝子改変されているマウス、例えば、VH領域、DH領域、およびJH領域が、VL領域およびJL領域で置き換えられた重鎖遺伝子座を有するマウスにより、第1のヒトVLドメインと融合している同じマウスCH領域例えば、IgGアイソタイプから作製された2つの同一のポリペプチド鎖、ならびに第2のヒトVLドメインと融合している同じマウスCL領域から作製された2つの同一のポリペプチド鎖を有する抗体様結合タンパク質が作製される。上記マウスにおけるクローン選択では、単一の抗体様結合タンパク質のコンテクストにおいて共に現れるように、上記第1および上記第2のヒトVLドメインを、クローン選択工程により選択した。したがって、クローン選択工程の結果として、単一の抗体様分子において共に現れる第1および第2のVLドメインを、コグネイトと称する。これに対し、第1および第2の抗体様分子が同一の重鎖を有するのでない限りすなわち、上記第1のヒト重鎖領域に融合しているVLドメインと上記第2のヒト重鎖領域に融合しているVLドメインとが同一でない限り、上記第1の抗体様分子において現れるVLドメインと上記第2の抗体様分子において現れるVLドメインとはコグネイトとならない。相補性決定領域という語句またはCDRという用語は、通常すなわち、野生型動物では免疫グロブリン分子例えば、抗体またはT細胞受容体の軽鎖または重鎖の可変領域における2つのフレームワーク領域間に現れる、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を包含する。CDRは、例えば、生殖系列配列、または再構成されているかもしくは再構成されていない配列によりコードされ得、例えば、ナイーブB細胞もしくはナイーブT細胞または成熟B細胞もしくは成熟T細胞によりコードされ得る。一部の状況では例えば、CDR3の場合は、CDRが、隣接していない例えば、再構成されていない核酸配列ではが、B細胞の核酸配列では、例えば、その配列をスプライシングまたは連結する結果として例えば、重鎖CDR3を形成するV-D-J組換えの結果として隣接する、2つ以上の配列例えば、生殖系列配列によりコードされ得る。遺伝子セグメントまたはセグメントという語句は、再構成されたV/J配列またはV/D/J配列を形成する再構成例えば、内因性リコンビナーゼにより媒介されるに関与し得る、免疫グロブリン遺伝子座では再構成されていない配列例えば、ヒトおよびマウスではを包含する、V重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはD免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはJ重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子セグメントに対する言及を包含する。別段に示されない限り、上記Vセグメント、Dセグメント、およびJセグメントは、12/23ルールによるV/J組換えまたはV/D/J組換えを可能とする組換えシグナル配列RSSを含む。別段に示されない限り、上記セグメントは、天然ではそれらが会合する配列またはその機能的な同等物例えば、Vセグメントの場合はプロモーター複数可およびリーダー複数可をさらに含む。重鎖または免疫グロブリン重鎖という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含し、別段に指定されない限り、重鎖可変ドメインVHを包含する。別段に指定されない限り、VHドメインは、3つの重鎖CDRおよび4つのフレームワークFR領域を包含する。重鎖の断片は、CDR、CDRおよびFR、ならびにこれらの組合せを包含する。典型的な重鎖は、以下の可変ドメインN末端からC末端へ:CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、CH3ドメイン、および、必要に応じて、CH4ドメイン例えば、IgMまたはIgEの場合、ならびに膜貫通Mドメイン例えば、リンパ球における膜結合免疫グロブリンの場合から本質的になる。重鎖定常領域とは、FR4の外側から上記重鎖のC末端へとN末端側からC末端側へと広がる重鎖の領域である。わずかな逸脱、例えば、C末端からの1つ、2つ、3つまたは数個のアミノ酸の切断を伴う重鎖定常領域の他、配列の修飾、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸置換を伴う重鎖定常領域も、重鎖定常領域という語句により包含される。アミノ酸置換は、例えば免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトIgG定常領域についてのEU付番を参照すると、228位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、241位、248位、249位、250位、252位、254位、255位、256位、258位、265位、267位、268位、269位、270位、272位、276位、278位、280位、283位、285位、286位、289位、290位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、301位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、315位、318位、320位、322位、324位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、337位、338位、339位、340位、342位、344位、356位、358位、359位、360位、361位、362位、373位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、386位、388位、389位、398位、414位、416位、419位、428位、430位、433位、434位、435位、437位、438位、および439位から選択される1または複数の位置において作製することができる。限定を目的とせずに述べると、例えば、血清半減期の延長列挙される修飾複数可を伴わない、同じ重鎖定常領域と比較したを呈示させるために、重鎖定常領域を修飾し、250位例えば、EまたはQ、250位および428位例えば、LまたはF、252位例えば、L/Y/F/WまたはT、254位例えば、SまたはT、ならびに256位例えば、S/R/Q/E/DまたはTにおける修飾、または428位および/もしくは433位例えば、L/R/SI/P/QまたはKおよび/もしくは434位例えば、H/FまたはYにおける修飾、または250位および/もしくは428位における修飾、または307位もしくは308位例えば、308F、V308Fおよび434位における修飾をもたらすことができる。別の例では、上記修飾が、428Lの修飾例えば、M428Lおよび434Sの修飾例えば、N434S、428Lの修飾、259Iの修飾例えば、V259I、および308Fの修飾例えば、V308F、433Kの修飾例えば、H433Kおよび434位例えば、434Yの修飾、252、254、および256位例えば、252Y、254T、および256Eの修飾、250Qおよび428Lの修飾例えば、T250QおよびM428L、307位および/もしくは308位例えば、308Fまたは308Pの修飾を含み得る。軽鎖という語句は、任意の生物に由来する免疫グロブリン軽鎖定常CL領域配列を包含し、別段に指定されない限り、ヒトκ軽鎖およびヒトλ軽鎖を包含する。別段に指定されない限り、軽鎖可変VLドメインは、典型的に、3つの軽鎖CDRおよび4つのフレームワークFR領域を包含する。一般に、全長軽鎖VLCLは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を包含するVLドメイン、およびCL領域を包含する。本発明と共に用い得る軽鎖VLCLは、例えば、上記結合タンパク質が選択的に結合する第1のまたは第2の二重特異性結合タンパク質の場合エピトープ例えば、CHドメインと融合しているVLドメインが選択的に結合するエピトープ複数可に選択的には結合しない軽鎖を包含する。上記CHドメインと融合しているVLドメインが結合するエピトープ複数可に選択的には結合しないVLドメインは、既存の抗体ライブラリーウェットライブラリーまたはインシリコinsilicoにおいて最も一般的に用いられる軽鎖であって、上記結合タンパク質のエピトープ結合ドメインのアフィニティーおよび/または選択性には実質的に干渉しない軽鎖についてのスクリーニングにより同定され得るVLドメインを包含する。適切な軽鎖は、上記CH領域に融合しているVL領域が特異的に結合するエピトープに結合し得る単独でまたは上記CH領域と融合しているそのコグネイトVL領域と組み合わせて軽鎖を包含する。マイクロモル濃度の範囲という語句は、1~999マイクロモル濃度を意味することを意図し、ナノモル濃度の範囲という語句は、1~999ナノモル濃度を意味することを意図し、ピコモル濃度の範囲という語句は、1~999ピコモル濃度を意味することを意図する。非ヒト動物という用語は、円口類、硬骨魚類、サメおよびエイなどの軟骨魚類、両生類、爬虫類、哺乳動物、および鳥類など、任意の脊椎動物を包含することを意図する。適切な非ヒト動物は、哺乳動物を包含する。適切な哺乳動物は、非ヒト霊長動物、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、および齧歯動物を包含する。適切な非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含めた齧歯動物科から選択される。一実施形態では、非ヒト動物が、マウスである。マウス、ヌクレオチド配列、および結合タンパク質免疫グロブリン遺伝子座のエレメントによりコードされる結合タンパク質であって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合している免疫グロブリン重鎖定常領域を含む結合タンパク質が提供される。さらに、マウスにおける免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座によりコードされるエレメントを含有する結合タンパク質をコードするように遺伝子改変する複数の戦略が提供される。このような遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン構造を有するが、従来の抗体を上回る多様性の増強を呈示する結合タンパク質の固有の集団を生成させるための供給源を表す。本明細書で記載される結合タンパク質の態様は、改変された免疫グロブリン遺伝子座によりコードされる結合タンパク質であって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインまたはその一部を通常すなわち、野生型動物ではコードする遺伝子セグメントが、重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように改変される結合タンパク質を包含する。上記軽鎖遺伝子セグメントが再構成されると、重鎖定常領域をコードする配列と融合している、軽鎖可変ドメインをコードする配列を含む、再構成されたヌクレオチド配列が得られる。この配列は、重鎖定常領域と融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有するポリペプチドをコードする。したがって、一実施形態では、上記ポリペプチドが、N末端からC末端へ、VLドメイン、CH1領域、ヒンジ、CH2領域、CH3領域、および、必要に応じて、CH4領域から本質的になる。本明細書で記載される改変されたマウスでは、コグネイト軽鎖であって、一実施形態では、抗体様である結合タンパク質を作製するための、上に記載したポリペプチドを伴うコグネイト軽鎖対もまた含む結合タンパク質が作製されるが、この結合タンパク質は、CH領域に融合しているVL領域VH領域ではなくを含む。多様な実施形態では、上記改変マウスにより、CH領域と融合しているVL領域ハイブリッド重鎖を含む結合タンパク質であって、そのハイブリッド重鎖のVL領域が体細胞超変異度の増強を呈示する、結合タンパク質が作製される。これらの実施形態では、上記増強がCL領域と融合しているVL領域軽鎖を上回る。一部の実施形態では、ハイブリッド重鎖のVL領域が、CL領域と融合しているVL領域の約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍以上の体細胞超変異を呈示する。一部の実施形態では、抗原に対する反応において改変されたマウスが、ハイブリッド重鎖のVL領域を含む結合タンパク質の集団であって、上記ハイブリッド重鎖のVL領域において、平均で、同じ抗原に対する反応において野生型マウスで観察されるハイブリッド重鎖のVL領域における場合の約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍以上の体細胞超変異を呈示する、結合タンパク質の集団を呈示する。一実施形態では、上記ハイブリッド重鎖のVL領域における体細胞超変異が、CDR3において、1もしくは複数のN付加、または2つ以上のN付加を含む。多様な実施形態では、上記結合タンパク質が、天然において内因性軽鎖遺伝子座から再構成された軽鎖について観察されるN付加より多数のN付加を含む免疫グロブリン軽鎖配列によりコードされる可変ドメインを含み、例えば、ヒト軽鎖V遺伝子セグメントに由来する可変ドメインと融合しているマウス重鎖定常領域、およびヒト軽鎖または重鎖J遺伝子セグメントを含む結合タンパク質であって、上記ヒトVセグメントおよびヒトJセグメントが再構成されて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を含む、再構成された遺伝子を形成する、結合タンパク質である。多様な実施形態では、本発明のマウスにより、平均で野生型抗体すなわち、VHドメインを有する抗体より小型で、より小型のサイズであることと関連した利点を保有する、結合タンパク質が作製される。より小型のサイズは、少なくとも部分的には、通常VHドメインに存在する、DH領域によりコードされるアミノ酸配列の非存在により実現される。より小型のサイズはまた、例えば、Vκ領域およびJκ領域に由来するCDR3の形成によっても実現することができる。別の態様では、体細胞超変異しているVLドメイン、例えば、体細胞変異しているヒトVκドメイン、および、例えば、1~10以上のN付加を含む再構成されたκ可変領域遺伝子によりコードされるヒトVκドメインを有する結合タンパク質の集団を提供するためのマウスおよび方法が提供される。一実施形態では、抗体の多様性を生成させるためのVH領域の非存在下において、本発明のマウスは、例えば、そのVドメインがVLドメインに限られるかまたは実質的にVLドメインである抗原による感作に対する反応による結合タンパク質を生成させる。したがって、上記マウスによるクローン選択工程は、VHドメインではなくVLドメインを有する結合タンパク質だけからの選択、または実質的にVHドメインではなくVLドメインを有する結合タンパク質からの選択に限定される。上記VLドメインの体細胞超変異は、高頻度であるか、または野生型マウスこれもまた、ある程度の頻度でVLドメインを変異させるにおける体細胞超変異より実質的に高頻度である例えば、2~5倍以上高頻度である。本発明のマウスにおけるクローン選択工程は、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のアフィニティーでエピトープに特異的に結合する結合タンパク質を含め、改変された免疫グロブリン遺伝子座に由来する高アフィニティーの結合タンパク質を生成させる。このような結合タンパク質をコードする配列は、適切な発現系を用いて、ヒト可変領域およびヒト定常領域を含有する治療用結合タンパク質を作製するのに用いることができる。他の実施形態では、本発明によるマウスであって、上記マウス重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座が、無効化されるか、非機能性とされるか、またはノックアウトされ、完全ヒトトランス遺伝子またはヒト-マウスキメラトランス遺伝子がマウスに移入され、ここで上記トランス遺伝子のうちの少なくとも1つが、改変された重鎖遺伝子座例えば、軽鎖遺伝子セグメントを1または複数の重鎖遺伝子配列に作動可能に連結したを含有する、マウスを作製することができる。このようなマウスによって、本明細書で記載される結合タンパク質もまた作製することができる。一態様では、体細胞超変異により多様性を増大させるための方法、またはVLドメインにおけるN付加により多様性を増大させるための方法を含めた、多様性を増大させるための方法であって、再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメントおよび再構成されていないJ遺伝子セグメントを、マウスCH遺伝子配列と作動可能に連結するステップと、上記動物を対象の抗原に曝露するステップと、上記動物の、再構成され、体細胞超変異しているV軽鎖/J遺伝子配列であって、免疫グロブリンCH領域をコードするヌクレオチド配列と融合している、上記再構成されたV軽鎖/J遺伝子配列を上記動物から単離するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、超変異しているVLと融合している免疫グロブリン重鎖がIgMであり、別の実施形態ではIgGであり、別の実施形態ではIgEであり、別の実施形態ではIgAである。一実施形態では、体細胞超変異し、クラススイッチしているVLドメインが、CL配列に作動可能に連結したVL配列を有する、再構成され、クラススイッチしている抗体について観察される体細胞超変異の約2~5倍以上を含有する。一実施形態では、体細胞超変異しているVLドメインにおいて観察される体細胞超変異が、CH領域に融合しているVH遺伝子から発現させたVHドメインにおいて観察される体細胞超変異とほぼ同じ数である。一態様では、高アフィニティーのヒトVLドメインを作製するための方法であって、本発明のマウスを対象の抗原に曝露するステップと、上記マウスに対象の抗原に対する免疫反応を発生させるステップと、対象の抗原に高アフィニティーで特異的に結合する、体細胞変異し、クラススイッチしているヒトVLドメインを、上記マウスから単離するステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、体細胞変異し、クラススイッチしているヒトVLドメインを含む結合タンパク質のKDが、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲にある。一実施形態では、上記結合タンパク質が、ポリペプチド二量体から本質的になり、ここで上記ポリペプチドが、ヒトCH領域と融合しているヒトVLドメインを含む、体細胞変異し、クラススイッチしている結合タンパク質から本質的になる。一実施形態では、上記結合タンパク質が、ポリペプチド二量体および2つの軽鎖から本質的になり、ここで上記ポリペプチドが、ヒトCH領域と融合しているヒトVLドメインを有する、体細胞変異し、クラススイッチしている結合タンパク質から本質的になり、ここで上記二量体の各ポリペプチドが、コグネイト軽鎖VLドメインおよびヒトCL領域を含むコグネイト軽鎖と会合している。一態様では、ヒトVL遺伝子配列を体細胞超変異させるための方法であって、ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJL遺伝子セグメントを、マウス内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座においてマウス内因性CH遺伝子と作動可能に連結するステップと、上記マウスを対象の抗原に曝露するステップと、対象の抗原に結合する、体細胞超変異しているヒトVL遺伝子配列をマウスから得るステップとを含む方法が提供される。一実施形態では、上記方法が、対象の抗原に結合する、体細胞超変異しているヒトVL遺伝子配列とコグネイトである軽鎖に由来するVL遺伝子配列をマウスから得るステップをさらに含む。DH配列を伴うVL結合タンパク質多様な態様では、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖V遺伝子セグメントおよび再構成されていない例えば、軽鎖または重鎖J遺伝子セグメントを含むマウスがまた、Jセグメントと組み換えて、再構成されたD/J配列を形成することが可能である、再構成されていないDH遺伝子セグメントであって、この再構成されたD/J配列を、次に、上記軽鎖Vセグメントと共に再構成して、a軽鎖Vセグメント、bDHセグメント、およびc例えば、軽鎖または重鎖Jセグメントに由来する再構成された可変配列を形成することが可能であり、この場合、上記再構成された可変配列が、重鎖定常配列に作動可能に連結される例えば、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびこれらの組合せから選択される重鎖定常配列に作動可能に連結される、例えば、マウスまたはヒトのCH1、ヒンジ、CH2、およびCH3に作動可能に連結される、再構成されていないDH遺伝子セグメントも含む。多様な態様では、再構成されていないヒト軽鎖VセグメントおよびJセグメントを含むマウスであって、ヒトDセグメントもまた含むマウスが、例えば、CDR3配列の多様性を増大させた供給源として有用である。通常、CDR3配列は、V/J組換えに由来する軽鎖、およびV/D/J組換えに由来する重鎖において生じる。組換えにおいて生じるヌクレオチド付加例えば、N付加によりさらなる多様性が提供されるが、また、体細胞超変異の結果として生じるヌクレオチド付加によってもさらなる多様性が提供される。CDR3配列により付与される結合特徴は一般に、場合によって、軽鎖CDR3配列、重鎖CDR3配列、ならびに軽鎖CDR3配列および重鎖CDR3配列の組合せにより付与される結合特徴に限定される。しかし、本明細書で記載されるマウスでは、第1の軽鎖CDR3その重鎖ポリペプチドにおけるおよび第2の軽鎖CDR3その軽鎖ポリペプチドにおけるの組合せの結果として付与される結合特徴のために、多様性の供給源の追加が可能である。本明細書で教示されるRSS操作を用いてDセグメントに作動可能に連結し、かつ、Jセグメント軽鎖または重鎖にも作動可能に連結した、軽鎖V領域に由来する再構成されていないVセグメントを含む、本明細書で記載されるとおり、マウスに由来するような、上記第1の軽鎖CDR3が、D遺伝子セグメントに由来する配列を含有する場合は、さらなる多様性が可能である。多様性の別の供給源は、記載されるマウスにおいて可能なV軽鎖/J組換えまたはV軽鎖/D/J組換えにおいて生じ得るNおよび/またはP付加である。したがって、本明細書で記載されるマウスは、異なる多様性の供給源軽鎖間をもたらすだけでなく、本明細書で記載されるマウスにおける、再構成されたV軽鎖/J遺伝子または再構成されたV軽鎖/D/J遺伝子における、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10以上のN付加を追加するために、さらなる多様性の供給源ももたらす。多様な態様では、J遺伝子セグメントおよび軽鎖V遺伝子セグメントに作動可能に連結したD遺伝子セグメントの使用により、多様性の増強がもたらされる。この場合におけるDHセグメントの作動可能な連結は、このDセグメントが、それと共に列挙されるJセグメントと組み換え得ることを必要とする。したがって、上記Dセグメントは、上記Dセグメントおよび上記Jセグメントが再構成されるように、上記Jセグメントの上流で近接するRSSと一致するmatched、下流のRSSを近接させることを必要とする。さらに、上記Dセグメントは、上記再構成されたD/Jセグメントおよび上記Vセグメントが再構成されて可変ドメインをコードする遺伝子を形成するように、上記Vセグメントの下流で近接したRSSと一致する、上流で近接した適切なRSSも必要とする。RSSまたは組換えシグナル配列は、12塩基対bpまたは23塩基対bpの非保存配列により、保存された核酸ノナマー配列から隔てられた、保存された核酸ヘプタマー配列を含む。RSSは、リコンビナーゼにより、上記12/23ルールに従う再構成過程において免疫グロブリン遺伝子セグメントの接合を達成するのに用いられる。上記12/23ルールによれば、12bpの非保存のスペーサーを有するRSSと近接する遺伝子セグメントは、23bpの非保存のスペーサーを有するRSSと近接する遺伝子セグメントと共に再構成される、すなわち、各々が12bpのスペーサーを伴うRSSを有する遺伝子セグメント間の再構成、または各々が23bpのスペーサーを伴うRSSを有する遺伝子セグメント間の再構成は一般に観察されない。上記λ軽鎖遺伝子座の場合は、可変遺伝子セグメントVλ遺伝子セグメントが、23マーのスペーサーを有するRSSと下流でV配列の転写方向に対して隣接し、接合遺伝子セグメントJλ遺伝子セグメントが、12マーのスペーサーを有するRSSと上流で上記J配列の転写方向に対して隣接する。したがって、VλセグメントおよびJλセグメントは、上記12/23ルール下で適合性であるRSSと隣接し、したがって、再構成において組み換えることが可能である。しかし、野生型生物のκ遺伝子座では、各機能的なVκセグメントが、12マーのスペーサーを有するRSSと下流で隣接する。したがって、Jκセグメントは、Jκセグメントの上流側で、23マーのスペースを近接させる。上記重鎖遺伝子座では、VH遺伝子セグメントが、23マーのスペーサーを有するRSSと下流で近接するのに続き、DHセグメントが、12マーのスペーサーと上流および下流で近接し、JHセグメントの各々が、そのJHセグメントの上流側で近接する23マーのセグメントを伴う。上記重鎖遺伝子座では、まず、12マーのスペーサーを伴う下流のDHRSSおよび23マーのスペーサーを伴う上流のJHRSSを介してD/J組換えが生じ、12マーのスペーサーを伴うRSSを上流側で近接させる、RSSを有する中間体の再構成D/J配列がもたらされる。次いで、12マーを伴うRSSを上流側で近接させる再構成されたD/Jセグメントが、23マーを伴うRSSをその下流側で近接させるVHセグメントと共に再構成されて、再構成されたV/D/J配列を形成する。一実施形態では、Vλセグメントを、JλセグメントであるJ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Vλセグメントは、そのVλ配列の下流側で近接するRSSを含み、そのRSSは、23マーのスペーサーを含み、上記Jセグメントは、その上流側で、12マーのスペーサーを有するRSSが近接しているJλセグメント例えば、天然で見出されるである。一実施形態では、Vλセグメントを、Jκ遺伝子セグメントまたはJH遺伝子セグメントであるJ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、そのVλ配列は、その下流側で、23マーのスペーサーを含むRSSを近接させ、上記JκセグメントまたはJHセグメントは、その上流側で、12マーのスペーサーを含むRSSに近接させる。一実施形態では、Vλセグメントを、DH遺伝子セグメントおよびJ遺伝子セグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用いる。一実施形態では、上記Vλセグメントが、23マーのスペーサーを有するRSSを伴うそのVλ配列の下流側で近接するRSSを含み、上記DHセグメントが、12マーのスペーサーを有するRSSを伴うそのDH配列の上流側および下流側で近接するRSSを含み、Jセグメントが、その上流側で、23マーのスペーサーを有するRSSを近接させ、この場合、Jセグメントは、Jλ、Jκ、およびJHから選択される。一実施形態では、Vκセグメントを、J遺伝子セグメントDセグメントを介在させないとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Vκセグメントは、12マーのスペースを置いたRSSを含む上記Vκセグメントの下流側でRSSを近接させ、上記Jセグメントは、その上流側で、23マーのスペースを置いたRSSを近接させ、上記Jκセグメントが、Jκセグメント、Jλセグメント、およびJHセグメントから選択される。一実施形態では、上記Vセグメントおよび/または上記Jセグメントが、ヒトVセグメントおよび/またはヒトJセグメントである。一実施形態では、上記Vκセグメントを、DセグメントおよびJセグメントとともに上記重鎖遺伝子座で用い、この場合、上記Vκセグメントは、12マーのスペースを置いたRSSを含む上記Vκセグメントの下流側でRSSを近接させ、上記Dセグメントは、その上流側および下流側で、23マーのスペースを置いたRSSを近接させ、上記Jセグメントは、その上流側で、12マーのスペースを置いたRSSを近接させる。一実施形態では、上記Jセグメントが、Jκセグメント、Jλセグメント、およびJHセグメントから選択される。一実施形態では、上記Vセグメントおよび/または上記Jセグメントが、ヒトVセグメントおよび/またはヒトJセグメントである。その上流端に近接する、23マーのスペーサーを有するRSSを伴うJλセグメント、またはその上流端で近接させた、12マーのスペーサーを有するRSSを伴うJκセグメントもしくはJHセグメントは、当技術分野において公知である、核酸配列を作製するのに適する任意の方法を用いて作製する。上流で、RSSを近接させるJセグメントであって、上記RSSが選択されたスペーサー例えば、12マーまたは23マーのスペーサーを有するJセグメントを作製するのに適する方法は、ヘプタマー、ノナマー、および選択されたスペーサーを含む核酸を化学合成し、これを、化学合成したかまたは適切な供給源例えば、ヒト配列供給源からクローニングされるJセグメント配列に融合させ、その融合させたJセグメント配列およびRSSをターゲティングベクター内で用いて、上記RSS-Jを適切な部位に向かわせる。上流および下流で近接する、23マーのスペースを置いたRSSを伴うDセグメントは、当技術分野において公知である任意の方法により作製することができる。1つの方法は、上流における23マーのRSSおよびDセグメント配列および下流における23マーのRSSを化学合成するステップと、RSSに隣接するDセグメントを適切なベクター内に入れるステップとを含む。上記ベクターは、1または複数のマウスDセグメントを、上流側および下流側で近接する、12マーのRSS配列を伴うヒトDセグメントで置き換えることを指向する場合もあり、例えば、ヒトVセグメントとヒトまたはマウスのJセグメントとの間の位置にあるヒト化遺伝子座に挿入することを指向する場合もある。当技術分野では、RSSを構築するのに適切なノナマーおよびヘプタマーが公知である例えば、参照により組み込まれるJaneway’sImmunobiology、7版、Murphyら2008年、GarlandScience、TaylorFrancisGroup,LLC、148頁、図4.5を参照されたい。適切な非保存のスペーサー配列には、例えば、ヒト免疫グロブリンまたはマウス免疫グロブリンの遺伝子座のRSS配列において観察されるスペーサー配列が包含される。二重特異性結合タンパク質本明細書で記載される結合タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、多重特異性結合タンパク質、例えば、二重特異性結合タンパク質を作製するのに用いることができる。この態様では、本質的にCH領域と融合している第1のVLドメインから本質的になる第1のポリペプチドが、CH領域と融合している第2のVLドメインから本質的になる第2のポリペプチドと会合することができる。上記第1のVLドメインと上記第2のVLドメインとが異なるエピトープに特異的に結合する場合は、その2つのVLドメインを用いて二重特異性結合分子を作製することができる。上記CH領域は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、例えば、上記CH領域のうちの1つが、プロテインAに対する結合決定基を消失させるように改変され得る一方、他の重鎖定常領域は、そのように改変されない。この特定の配列は、例えば、ホモ二量体例えば、上記第1のポリペプチドのホモ二量体または第2のポリペプチドのホモ二量体の混合物からの二重特異性結合タンパク質の単離を単純化する。一態様では、本明細書で記載される方法および組成物を用いて二重特異性結合タンパク質を作製する。この態様では、CH領域に融合している第1のVLおよびCH領域に融合している第2のVLの各々を、同じアイソタイプのヒトIgG配列例えば、ヒトIgG1配列、ヒトIgG2配列、ヒトIgG3配列、またはヒトIgG4配列とインフレームで個別にクローニングする。上記第1のVLは、第1のエピトープに特異的に結合し、上記第2のVLは、第2のエピトープに特異的に結合する。上記第1および第2のエピトープは、異なる抗原に存在する場合もあり、同じ抗原に存在する場合もある。一実施形態では、上記第1のVLに融合しているCH領域のIgGアイソタイプと上記第2のVLに融合しているCH領域のIgGアイソタイプとが同じアイソタイプであるが、1つのIgGアイソタイプが少なくとも1つのアミノ酸置換を含む点で異なる。一実施形態では、少なくとも1つの上記アミノ酸置換により、上記置換を保有する重鎖が、その置換を欠く重鎖と比較して、プロテインAに結合することが不可能となるかまたは実質的に不可能となる。一実施形態では、上記第1のCH領域が、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第1のCH3ドメインを含み、上記第2のCH領域が、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第2のCH3ドメインを含み、ここで上記第2のCH3ドメインが、上記第2のCH3ドメインのプロテインAに対する結合性を低減するかまたは消失させる修飾を含む。一実施形態では、上記第2のCH3ドメインが、KabatのEU付番により番号付けられた435R修飾を含む。別の実施形態では、上記第2のCH3ドメインが、KabatのEU付番により番号付けられた436F修飾をさらに含む。一実施形態では、上記第2のCH3ドメインが、KabatのEU付番により番号付けられたD356E、L358M、N384S、K392N、V397M、およびV422Iからなる群から選択される修飾を含むヒトIgG1のCH3ドメインである。一実施形態では、上記第2のCH3ドメインが、KabatのEU付番により番号付けられたN384S、K392N、およびV422Iからなる群から選択される修飾を含むヒトIgG2のCH3ドメインである。一実施形態では、上記第2のCH3ドメインが、KabatのEU付番により番号付けられたQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、およびV422Iからなる群から選択される修飾を含むヒトIgG4のCH3ドメインである。一実施形態では、上記結合タンパク質が、1または複数の本明細書で列挙される修飾を有するCH領域を含み、ここで上記結合タンパク質の定常領域が、ヒトにおいて非免疫原性であるかまたは実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、上記CH領域が、ヒトにおいて免疫原性エピトープを提示しないアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、上記結合タンパク質が野生型ヒト重鎖では見出されないCH領域を含み、そのCH領域がT細胞エピトープを生成させる配列を含まない。以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのようにして作製し用いるかについて記載するように提示されるものであり、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。別段に示されない限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または大気圧近傍とする。実施例I軽鎖遺伝子セグメントの重鎖遺伝子座への導入VELOCIGENE登録商標遺伝子操作法例えば、米国特許第6,586,251号、およびValenzuela,D.M.、Murphy,A.J.、Frendewey,D.、Gale,N.W.、Economides,A.N.、Auerbach,W.、Poueymirou,W.T.、Adams,N.C.、Rojas,J.、Yasenchak,J.、Chernomorsky,R.、Boucher,M.、Elsasser,A.L.、Esau,L.、Zheng,J.、Griffiths,J.A.、Wang,X.、Su,H.、Xue,Y.、Dominguez,M.G.、Noguera,I.、Torres,R.、Macdonald,L.E.、Stewart,A.F.、DeChiara,T.M.、Yancopoulos,G.D.2003年、High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis、NatBiotechnol、21巻、652~659頁を参照されたいを用いて、マウスゲノムの細菌人工染色体BACライブラリーを改変するための多様なターゲティング構築物を作製した。再構成されていないヒト生殖系列のκ軽鎖遺伝子配列の挿入図2の上方を確保するために、マウスBACDNAを相同組換えにより改変して、VH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失を介してマウス内因性重鎖遺伝子座を不活化した。略述すると、リコンビナーゼを介する組換えを用いて、2回にわたる継起的なターゲティングイベントにおいて、マウス重鎖遺伝子座を欠失させた。第1のターゲティングイベントは、上記マウス重鎖遺伝子座の5’端において、5’側から3’側への、マウス5’側相同性アーム、リコンビナーゼ認識部位、ネオマイシンカセット、および3’側相同性アームを含むターゲティングベクターを用いる第1のターゲティングを包含した。上記5’側相同性アームおよび3’側相同性アームは、上記マウス重鎖遺伝子座の5’側配列を含有した。第2のターゲティングイベントは、上記JH遺伝子セグメントの領域内のマウス重鎖遺伝子座の3’端において、5’側から3’側への、マウス5’側相同性アーム、5’側リコンビナーゼ認識部位、第2のリコンビナーゼ認識部位、ハイグロマイシンカセット、第3のリコンビナーゼ認識部位、およびマウス3’側相同性アームを含有する第2のターゲティングベクターを用いる、ターゲティングを包含した。上記5’側相同性アームおよび3’側相同性アームは、上記マウスJH遺伝子セグメントおよびイントロンエンハンサーの5’側および定常領域に隣接する配列を含有した。両方のターゲティングベクター上に記載したでターゲティングされた、改変された重鎖遺伝子座を含有する陽性ES細胞は、核型分析karyotypingにより確認した。次いで、DNAを、二重ターゲティングされたES細胞から単離し、リコンビナーゼによる処理にかけると、これにより、第1のターゲティングベクターにおける5’側リコンビナーゼ認識部位と第2のターゲティングベクターにおける5’側リコンビナーゼ認識部位との間におけるマウス重鎖遺伝子座のゲノムDNAの欠失が媒介され、単一のリコンビナーゼ認識部位および2つのリコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットが残される図2の上方を参照されたい。したがって、下記で記載されるターゲティングベクターを用いて、正確な様式で順次ヒトκ生殖系列遺伝子セグメントを挿入するために、完全なCH遺伝子を含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。当技術分野において認知される標準的な分子的技法を用いて、4つの個別のターゲティングベクターを操作して、40のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを、不活化させたマウス重鎖遺伝子座上に記載したへと順次挿入した図2。上記4つのターゲティング構築物を操作するのに用いたヒトκ遺伝子セグメントは、天然では、ヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子座の近位コンティグにおいて見出される図1Bおよび表1。第1の6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、約110,499bpのヒトゲノム断片を、ヒトJκ5遺伝子セグメントの431bp下流3’側におけるPI-SceI部位を含有するように工学的に作製したengineered。別のPI-SceI部位を、上記マウス重鎖のイントロンエンハンサー、IgMのスイッチ領域Sμ、およびマウス重鎖遺伝子座のIgM遺伝子を含有する、約7,852bpのゲノム断片の5’端において工学的に作製した。約110.5kbのヒト断片とのライゲーションにより、このマウス断片を3’側相同性アームとして用い、これにより、5’側から3’側への、上記第1の6つの連続するVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントを含有する、約110.5kbにわたるヒトκ軽鎖遺伝子座のゲノム配列、PI-SceI部位、マウスイントロンエンハンサー、SμおよびマウスIgM定常遺伝子を含有する、約7,852bpのマウス重鎖配列を含有する3’側接合部を作製した。ヒトVκ1-6遺伝子セグメントの上流5’側には、マウス重鎖遺伝子座の5’側の配列に対応する19,752bpのマウスゲノムDNAを含有する、マウス5’側相同性アームの始点の前に、さらなる3,710bpのヒトκ配列を配置した。上記5’側相同性アームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、3つのリコンビナーゼ認識部位に隣接するネオマイシンカセットを配置した図2のターゲティングベクター1を参照されたい。ヒトκ配列を最初に挿入するための最終のターゲティングベクターは、5’側から3’側への、上記重鎖遺伝子座の5’側に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アーム、第1のリコンビナーゼ認識部位R1、ネオマイシンカセット、第2のリコンビナーゼ認識部位R2、第3のリコンビナーゼ認識部位R3、上記第1の6つの連続するヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、約110.5kbのヒトゲノムκ配列、PI-SceI部位、ならびにイントロンエンハンサー、Sμ、およびマウスIgM定常遺伝子を含めた約8kbのマウスゲノム配列を含有する3’側相同性アームを包含した図2のターゲティングベクター1を参照されたい。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖すなわち、ヒトVκドメインおよびマウスCH領域の形成をもたらす、マウス内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入:10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第2のターゲティングベクターを工学的に作製した図2のターゲティングベクター2を参照されたい。ヒトκ軽鎖遺伝子座に由来する12の連続するヒトVκ遺伝子セグメントを含有する、140,058bpのヒトゲノム断片を、上記マウス重鎖遺伝子座の5’側のマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する3’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトVκ1-16遺伝子セグメントの上流5’側には、ターゲティングベクター1を構築するために用いた同じ5’側相同性アームである、マウス5’側相同性アームの始点の前に、さらなる10,170bpのヒトκ配列を配置した図2を参照されたい。上記5’側相同性アームとヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットを配置した。3’側相同性アームは、ターゲティングベクター1のヒトゲノムκ配列の約110.5kbの断片と同等の5’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の31,165bpの重複が存在した図2。10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、5’側から3’側への、上記重鎖遺伝子座の5’側に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アーム、第1のリコンビナーゼ認識部位R1、ハイグロマイシンカセット、第2のリコンビナーゼ認識部位R2、およびそのうちの約31kbが、ターゲティングベクター1のヒトκ配列の5’端と重複し、このターゲティング構築物についての3’側相同性アームとして働く、12の連続するヒトVλ遺伝子セグメントを含有する、約140kbのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとハイブリッド重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した16のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。14のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入:14のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第3のターゲティングベクターを工学的に作製した図2のターゲティングベクター3を参照されたい。15の連続するヒトVκ遺伝子セグメントを含有する、160,579bpのヒトゲノム断片を、マウス重鎖遺伝子座の5’側のマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する3’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトVκ2-30遺伝子セグメントの上流5’側には、前出の2つのターゲティングベクターに用いたのと同じ5’側の相同性である、マウス5’側相同性アームの始点の前に、さらなる14,687bpのヒトκ配列を配置した上に記載した、図2もまた参照されたい。上記5’側相同性アームと上記ヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するネオマイシンカセットを配置した。3’側相同性アームは、ターゲティングベクター2のヒトゲノムκ配列の約140kbの断片と同等の5’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の21,275bpの重複を包含した図2。14のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、5’側から3’側のへ、マウス重鎖遺伝子座の5’側に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アーム、第1のリコンビナーゼ認識部位R1、ネオマイシンカセット、第2のリコンビナーゼ認識部位R2、およびそのうちの約21kbが、ターゲティングベクター2のヒトκ配列の5’端と重複し、このターゲティング構築物についての3’側相同性アームとして働く、15のヒトVκ遺伝子セグメントを含有する、約161kbのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した30のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した。10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントのハイブリッド重鎖遺伝子座への導入:10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを、上記で記載した改変されたマウス重鎖遺伝子座へと導入するために、第4のターゲティングベクターを工学的に作製した図2のターゲティングベクター4を参照されたい。16の連続するヒトVκ遺伝子セグメントを含有する、90,398bpのヒトゲノム断片を、マウス重鎖遺伝子座の5’側のマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アームおよびヒトゲノムのκ配列を含有する3’側相同性アームで工学的に作製した。上記ヒトVκ2-40遺伝子セグメントの上流5’側には、前出のターゲティングベクターと同じ5’側の相同性である、マウス5’側相同性アームの始点の前に、さらなる8,484bpのヒトκ配列を配置した上に記載した、図2もまた参照されたい。上記5’側相同性アームとヒトκ配列の開始部との間には、リコンビナーゼ認識部位に隣接するハイグロマイシンカセットを配置した。3’側相同性アームは、ターゲティングベクター3のヒトゲノムκ配列の約160kbの断片と同等の5’端に対応する、ヒトゲノムκ配列の61,615bpの重複を包含した図2。10のさらなるヒトVκ遺伝子セグメントを挿入するための最終のターゲティングベクターは、5’側から3’側への、マウス重鎖遺伝子座の5’側に約20kbのマウスゲノム配列を含有する5’側相同性アーム、第1のリコンビナーゼ認識部位R1、ハイグロマイシンカセット、第2のリコンビナーゼ認識部位R2、およびそのうちの約62kbが、ターゲティングベクター3のヒトκ配列の5’端と重複し、このターゲティング構築物についての3’側相同性アームとして働く、16のヒトVκ遺伝子セグメントを含有する、約90kbのヒトゲノムκ配列を包含した。このターゲティングベクターで相同組換えすることにより、組み換えられるとキメラκ重鎖の形成をもたらす、マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結した40のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する、改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製した図3。上記で記載したのと同様の手法を用いて、マウス重鎖定常領域のコンテクストにおけるヒト軽鎖可変ドメイン他の組合せを構築する。さらなる軽鎖可変ドメインは、ヒトVλ遺伝子セグメントおよびヒトJλ遺伝子セグメントに由来し得る図4Aおよび4B。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、1,000kbを超えて広がり、可変Vセグメントまたは接合Jセグメントをコードする、80を超える遺伝子を含有する。公表された報告によれば、ヒトλ軽鎖遺伝子座のうちの70のVλ遺伝子セグメントでは、30~38のいずれかの数のものが機能的な遺伝子セグメントであると考えられている。70のVλ配列は、その全てが異なるV遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含有する3つのクラスタークラスターA、B、およびCに配置されている。ヒトλ軽鎖遺伝子座内では、全ての観察されるVλドメインの過半が、遺伝子セグメント1-40、1-44、2-8、2-14、および3-21によりコードされている。存在する7つのJλ遺伝子セグメントのうち、4つだけが、一般に機能的なJλ遺伝子セグメントJλ1、Jλ2、Jλ3、およびJλ7と考えられている。一部の対立遺伝子では、第5のJλ-Cλ遺伝子セグメント対が、偽遺伝子Cλ6であると報告されている。複数のヒトJλ遺伝子セグメントの、本明細書で記載されるハイブリッド重鎖遺伝子座への組込みは、新規の合成により構築される。このように、生殖系列の構成において複数のヒトJλ遺伝子セグメントを含有するゲノム断片を、複数のヒトVλ遺伝子セグメントで工学的に作製すると、重鎖定常領域のコンテクストにおいて正常なV-J組換えが可能となる。軽鎖可変ドメインの重鎖定常領域との結合は、非ヒト動物においてヒトVL領域を伴う固有のVL結合タンパク質を生成させるための潜在的に豊富な多様性の供給源を表す。マウスにおいてヒトλ軽鎖遺伝子座または上記で記載したヒトκ遺伝子座のこの多様性を利用することにより、固有のハイブリッド重鎖の工学的に作製が結果としてもたらされ、遺伝子改変動物の免疫レパートリーおよび治療剤をもたらすための次の生成のプラットフォームとしてのそれらのその後の使用に、別次元の結合タンパク質がもたらされる。加えて、ヒトDH遺伝子セグメントおよびヒトJHまたはJκ遺伝子セグメントを、ヒトVκ遺伝子セグメントまたはヒトVλ遺伝子セグメントとともに取り込ませて、組み換えられると工学的に作製された新規の可変ドメインをもたらす新規のハイブリッド遺伝子座を構築することもできる図5Aおよび5B。この後者の場合、通常は単一の遺伝子座に含有されない遺伝子セグメントの組合せを工学的に作製すれば、それらを単一の遺伝子座へと組み合わせるときに正常な組換えを達成し得るように、それぞれの遺伝子セグメントに付随する組換えシグナル配列RSSに対する特別の注意が必要となる。例えば、VDJ組換えは、組換えが生じる正確な位置において各遺伝子セグメントに隣接して見出されるヘプタマー配列およびノナマー配列として公知である保存された非コードDNA配列により誘導されることが公知である。これらの非コードDNA配列の間には、12または23塩基対bpの長さである非保存のスペーサー領域が存在する。一般に、組換えは、同じ染色体に位置する遺伝子セグメントだけで生じ、12bpのスペーサーが隣接するこれらの遺伝子セグメントは、23bpのスペーサーが隣接する遺伝子セグメントに接合され得るすなわち12/23ルールが、抗体のうちのごく一部では、2つのDH遺伝子セグメント各々に12bpのスペーサーが隣接するの接合も観察されている。通常では適合性のスペーサーを有さない遺伝子セグメント間における組換え例えば、VκとDHとの間における組換え、またはDHとJλとの間における組換えを可能とするには、軽鎖可変領域を含有する固有の重鎖を形成するための組換えの成功を可能とする固有のハイブリッド重鎖を構築するために所望される遺伝子セグメントと隣接する位置において、固有の適合性のスペーサーを合成する。したがって、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを、内因性重鎖遺伝子座へと組み込むために、上記で概括された戦略を用いることにより、他のヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの組合せ、ならびに特定のヒト重鎖遺伝子セグメント例えば、DH遺伝子セグメントおよびJH遺伝子セグメントおよびこれらの組合せの使用が可能となる。実施例II内因性重鎖遺伝子座においてヒト軽鎖遺伝子セグメントを保有する、ターゲティングされたES細胞の同定マウスES細胞を電気穿孔して、VL結合タンパク質すなわち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結したヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを発現するキメラマウスを発生させるための、改変されたES細胞を作製するのに、前出の実施例において作製された、ターゲティングされたBACDNAを用いた。再構成されていないヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有するES細胞は、定量的PCRアッセイであるTAQMAN登録商標により同定したLieおよびPetropoulos、1998年、Curr.Opin.Biotechnology、9巻:43~48頁。ヒトκ配列および関連する選択カセットを挿入し、マウス重鎖配列を消失させ、かつ、内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列を保持するために、特異的なプライマーセットおよびプローブをデザインした。ヒトκ遺伝子セグメントを含有するターゲティング構築物の挿入により導入される任意の所望されない選択カセットを除去するために、上記ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを保有するES細胞を、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトすることができる。必要に応じて、上記選択カセットは、上記リコンビナーゼを発現するマウスに交配させることにより除去することができる例えば、US6,774,279。必要に応じて、上記選択カセットは、マウスにおいて保持される。実施例IIIVL結合タンパク質を発現するマウスの発生および解析上記で記載したターゲティングされたES細胞をドナーES細胞として用い、VELOCIMOUSE登録商標法により、8細胞期のマウス胚に導入した例えば、米国特許第7,294,754号、およびPoueymirou,W.T.、Auerbach,W.、Frendewey,D.、Hickey,J.F.、Escaravage,J.M.、Esau,L.、Dore,A.T.、Stevens,S.、Adams,N.C.、Dominguez,M.G.、Gale,N.W.、Yancopoulos,G.D.、DeChiara,T.M.、Valenzuela,D.M.2007年、F0generationmicefullyderivedfromgene-targetedembryonicstemcellsallowingimmediatephenotypicanalyses、NatBiotechnol、25巻、91~99頁を参照されたい。上記マウス重鎖遺伝子座においてヒトκ遺伝子セグメントを個別に保有するVELOCIMICE登録商標上記ドナーES細胞に完全に由来するF0世代のマウスは、内因性重鎖遺伝子座における固有のヒトκ遺伝子セグメントの存在を検出したValenzuelaら、前出対立遺伝子アッセイの変法前出を用いて遺伝子型決定することにより同定した。マウス仔を遺伝子型決定し、ハイブリッド重鎖遺伝子の遺伝子座についてヘテロ接合性であるマウス仔を、VL結合タンパク質の発現を特徴付けるために選択する。フローサイトメトリー:ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの上記マウス重鎖遺伝子座への導入は、上記マウスκ軽鎖遺伝子セグメントの、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントによるinsituの置き換えUS6,596,541をさらに含有する、129S6/SvEvTacヘテロ接合性の胚およびC57BL/6NTacヘテロ接合性の胚に由来するF1期のES細胞系F1H4、Valenzuelaら、2007年、前出において実施した。ヒト生殖系列κ軽鎖可変遺伝子セグメントは、IgMaハプロタイプを保有する129S6対立遺伝子に向かわせるtargeted一方で、改変されていないC576BL/6Nマウスの対立遺伝子は、IgMbハプロタイプを保有する。これらのIgMの対立遺伝子形態は、上記IgMaまたはIgMbの対立遺伝子において見出される多型に特異的な抗体を用いるフローサイトメトリーにより識別することができる。フローサイトメトリーを用いて、実施例Iで記載した上記内因性重鎖遺伝子座においてヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを保有する、ヘテロ接合性のマウスを、ヒトVL結合タンパク質の発現について評価した。略述すると、血液をマウス群1群当たりn=6匹から採取し、スライドガラスを用いて破砕した。C57BL/6マウスおよびBalb/cマウスを対照群として用いた。ACK溶解緩衝液LonzaWalkersvilleにより赤血球RBCを溶解した後、細胞をBDPharmingenのFACS用染色緩衝液中で再懸濁させ、抗マウスCD16/32抗体BDPharmingenでブロッキングした。リンパ球を抗マウスIgMb-FITC抗体BDPharmingen、抗マウスIgMa-PE抗体BDPharmingen、抗マウスCD19抗体クローン1D3、BDBiosciences、および抗マウスCD3抗体17A2、BIOLEGEND登録商標で染色した後、全て製造業者の指示に従い、BDCYTOFIX商標で固定した。最終の細胞ペレットを、染色緩衝液中で再懸濁させ、BDFACSCALIBUR商標およびBDCELLQUESTPRO商標ソフトウェアを用いて解析した。表2は、各遺伝子改変を保有する動物群において観察されるB細胞CD19、T細胞CD3、ハイブリッド重鎖CD19IgMa、および野生型重鎖CD19IgMbの発現についての平均百分率値を示す。同様の実験では、多様な細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリーを用いて、上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した6つのヒトVκおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメント実施例I、図2に記載したについてホモ接合性であるマウスに由来する脾コンパートメント、血液コンパートメント、および骨髄コンパートメントのB細胞含量を、B細胞発生の進行について解析した。略述すると、野生型マウス、ならびに上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した、6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウスの2つの群のマウス各群8週齢の雌n=3匹ずつを屠殺し、血液、脾臓、および骨髄を採取した。血液は、EDTAを伴うmicrotainer試験管BDBiosciencesへと回収した。骨髄は、完全RPMI培地ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Hepes、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、およびゲンタイマイシンを補充したRPMI培地でフラッシュすることにより、大腿骨から回収した。脾臓調製物および骨髄調製物に由来するRBCは、ACK溶解緩衝液LonzaWalkersvilleで溶解させた後、完全RPMI培地で洗浄した。細胞1×106個を、抗マウスCD16/CD32抗体2.4G2、BDと共に、氷上で10分間にわたりインキュベートした後、以下の抗体カクテル:抗マウスFITC-CD43抗体1B11、BIOLEGEND登録商標、PE-ckit抗体2B8、BIOLEGEND登録商標、PeCy7-IgM抗体II/41、EBIOSCIENCE登録商標、PerCP-Cy5.5-IgD抗体11-26c.2a、BIOLEGEND登録商標、APC-eFluor780-B220抗体RA3-6B2、EBIOSCIENCE登録商標、APC-CD19抗体MB19-1、EBIOSCIENCE登録商標により、氷上で30分間にわたり標識した。骨髄:未成熟B細胞B220intIgM、成熟B細胞B220hiIgM、プロB細胞CD19ckitCD43、プレB細胞CD19ckit-CD43-、プレB細胞CD19CD43intIgM/-、未成熟B細胞CD19CD43-IgM/-。血液および脾臓:B細胞CD19、成熟B細胞CD19IgMintIgDhi、移行/未成熟B細胞CD19IgMhiIgDint。染色の後、細胞を洗浄し、2のホルムアルデヒドで固定した。LSRIIフローサイトメーターによりデータ収集を実施し、FLOWJO商標ソフトウェアTreeStar、Inc.で解析した。図6A、6B、および6Cは、脾コンパートメントの結果を示す。図7A~7Gは、骨髄コンパートメントの結果を示す。各群のマウスに由来する血液コンパートメントについて得られる結果により、各群に由来する脾コンパートメントによる結果と比較して同様の結果が裏付けられたデータは示さない。同様の実験では、多様な細胞表面マーカーについてのフローサイトメトリーを用いて、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した30のヒトVκおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメント実施例I、図2に記載したについてホモ接合性であるマウスに由来する脾コンパートメント、血液コンパートメント、および骨髄コンパートメントB細胞含量を、B細胞発生の進行について解析した。略述すると、野生型重鎖遺伝子座と、内因性Vκ遺伝子セグメントおよび内因性Jκ遺伝子セグメントの、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントによる置き換えとを含有するマウスWT、ならびに30のhVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントと、内因性Vκ遺伝子セグメントおよび内因性Jκ遺伝子セグメントの、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントによる置き換えとについてホモ接合性であるマウス30hVκ-5hJκHOの2つの群のマウス各群6週齢の雌N=3匹ずつを屠殺し、脾臓、および骨髄を採取した。骨髄および脾細胞を、多様な細胞表面マーカー上に記載したによる染色のために調製した。細胞1×106個を、抗マウスCD16/CD32抗体2.4G2、BDBiosciencesと共に、氷上で10分間にわたりインキュベートした後、骨髄パネルまたは脾細胞パネルにより、氷上で30分間にわたり標識した。骨髄パネル:抗マウスFITC-CD43抗体1B11、BIOLEGEND登録商標、PE-ckit抗体2B8、BIOLEGEND登録商標、PeCy7-IgM抗体II/41、EBIOSCIENCE登録商標、APC-CD19抗体MB19-1、EBIOSCIENCE登録商標。骨髄および脾臓パネル:抗マウスFITC-Igκ抗体187.1、BDBiosciences、PE-Igλ抗体RML-42、BIOLEGEND登録商標、PeCy7-IgM抗体II/41、EBIOSCIENCE登録商標、PerCP-Cy5.5-IgD抗体11-26c.2a、BIOLEGEND登録商標、PacificBlue-CD3抗体17A2、BIOLEGEND登録商標、APC-B220抗体RA3-6B2、EBIOSCIENCE登録商標、APC-H7-CD19抗体ID3、BD。骨髄:未成熟B細胞B220intIgM、成熟B細胞B220hiIgM、プロB細胞CD19ckitCD43、プレB細胞CD19ckit-CD43-、未成熟B細胞IgκB220intIgMIgκIgλ-、未成熟IgλB細胞B220intIgMIgκ-Igλ、成熟IgκB細胞B220hiIgMIgκIgλ-、成熟IgλB細胞B220hiIgMIgκ-Igλ。脾臓:B細胞CD19、成熟B細胞CD19IgDhiIgMint、移行/未成熟B細胞CD19IgDintIgMhi。骨髄および脾臓:IgκB細胞CD19IgκIgλ-、IgλB細胞CD19Igκ-Igλ。染色の後、細胞を洗浄し、2のホルムアルデヒドで固定した。LSRIIフローサイトメーターによりデータ収集を実施し、FLOWJO商標ソフトウェアTreeStar、Inc.で解析した。その結果により、3つのコンパートメント全てについて、6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス上に記載したと比較して同様の染色パターンおよび細胞集団が裏付けられた。しかし、これらのマウスでは、内因性λ軽鎖の遺伝子座が完全であるにもかかわらず、これらのマウスでは、脾コンパートメントおよび骨髄コンパートメントの両方において、上記内因性λ軽鎖発現の消失が裏付けられたそれぞれ、図8Aおよび8B。これは、重鎖定常領域のコンテクストで、再構成されたヒトκ軽鎖ドメインが、Igλ細胞の欠失をもたらすマウスλ軽鎖ドメインと対合または会合できないことを反映し得る。アイソタイプの発現:ヒト重鎖可変遺伝子およびκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座についてホモ接合性であるマウスVELOCIMMUNE登録商標HumanizedMice、US7,105,348を参照されたいならびに内因性重鎖遺伝子座に工学的に作製された6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウス6hVκ-5hJκHOについて、TAQMAN登録商標プローブを用いる定量的PCRアッセイ上記の実施例IIに記載されるにより、全免疫グロブリンMIgMおよび全免疫グロブリンG1IgG1ならびに表面すなわち、膜結合IgMおよび表面IgG1を決定した。略述すると、製造業者の指示に従い、マウスCD19MicrobeadsMiltenyiBiotecを用いて、CD19B細胞を、マウス1群当たりn=3~4匹のマウス群の脾臓から精製した。全RNAは、RNEASY商標MiniキットQiagenを用いて精製した。ゲノムRNAは、RNase-freeDNaseon-columntreatmentQiagenを用いて取り出した。FirstStandcDNASynthesisキットInvitrogenを用いて、約200ngのmRNAを、cDNAへと逆転写させ、次いで、これを、ABI7900SequenceDetectionSystemAppliedBiosystemsを用いるTAQMAN登録商標UniversalPCRMasterMixAppliedBiosystemsにより増幅した。固有のプライマー/プローブの組合せを用いて、IgMおよびIgG1アイソタイプの全形態、表面形態すなわち、膜貫通形態、および分泌形態の発現を特異的に決定した表3。マウスκ定常領域mCκに対して、相対発現を標準化した。定量的TAQMAN登録商標PCRアッセイによる結果により、全IgMおよび全IgG1の減少が裏付けられた。しかし、IgMおよびIgG1の表面形態と対比した分泌形態の比は、VELOCIMMUNE登録商標ヒト化マウスhumanizedmiceと比較して正常であると考えられたデータは示さない。ヒトκ遺伝子セグメントの使用状況usageおよびVκ-Jκ接合部の解析:脾細胞から単離されるRNAを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRにより、30のhVκ遺伝子セグメントおよび5つのJκ遺伝子セグメントと、内因性Vκ遺伝子セグメントおよび内因性Jκ遺伝子セグメントの、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントによる置き換えとについてホモ接合性であるナイーブマウス30hVκ-5hJκHOを、マウス重鎖IgGにおける固有のヒトVκ-Jκ再構成について解析した。略述すると、脾臓を採取し、滅菌ディスポーザブルバッグ中に5のHI-FBSを伴う10mLのRPMI-1640Sigmaで還流した。次いで、単一の脾臓を含有する各バッグをSTOMACHER商標Sewardに入れ、中程度の設定で30秒間にわたりホモジナイズした。次いで、ホモジナイズした脾臓を、0.7μmの細胞ろ過器cellstrainerを用いて濾過し、次に、遠心分離1000rpmで10分間にわたるによりペレット化し、RBCを、BDPHARMLYSE商標BDBiosciences中で3分間にわたり溶解させた。脾細胞を、RPMI-1640で希釈し、再度遠心分離した後、1mLのPBSIrvineScientific中で再懸濁させた。当技術分野において公知である標準的な技法を用いて、ペレット化された脾細胞からRNAを単離した。ヒトhVκ遺伝子セグメントおよびマウスIgGに特異的なプライマーを用いて、脾細胞RNAについてのRT-PCRを実施した。マウスIgG用のプライマーは、それが全てのマウスIgGアイソタイプに由来するRNAを増幅することが可能であるようにデザインした。PCR産物をゲル精製し、pCR2.1-TOPOTAベクターInvitrogenへとクローニングし、上記ベクター内のそのクローニング部位に隣接する位置に配置して、順方向プライマーM13GTAAAACGACGGCCAG:配列番号16および逆方向プライマーM13CAGGAAACAGCTATGAC:配列番号17により配列決定した。12の選択されたクローンにおけるヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントの使用状況を、表4に示す。図9は、12の選択されたRT-PCRクローンについて、hVκ-hJκ-mIgG接合部のヌクレオチド配列を示す。この実施例で示される通り、6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるか、または上記マウス重鎖定常領域に作動可能に連結した30のヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントについてホモ接合性であるマウスにより、それらの生殖系列の構成において軽鎖可変遺伝子セグメントを含有する、改変された重鎖遺伝子座からのヒト軽鎖可変領域の発現が裏付けられた。種々の段階にわたるB細胞発生の進行がこれらのマウスにおいて観察されたことから、内因性重鎖遺伝子座に由来する軽鎖可変遺伝子セグメント、およびこのようなハイブリッド重鎖すなわち、重鎖定常領域に連結されたヒト軽鎖可変領域の、抗体レパートリーの一部としての発現を伴う、複数の生産的な組換えイベントが示される。実施例IVVL結合タンパク質を発現するマウスの増殖VL結合タンパク質の新規の生成を創出するために、再構成されていないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスを、他の内因性重鎖対立遺伝子の欠失を含有する別のマウスに交配させることができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例Iで記載したハイブリッド重鎖だけを発現する。交配は、当技術分野において認知される標準的な技法により実施するが、代替的には、企業、例えば、JacksonLaboratoryに実施させる。ハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウス株を、固有のハイブリッド重鎖の存在および従来のマウス重鎖の非存在についてスクリーニングする。代替的に、マウス重鎖遺伝子座において、上記再構成されていないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスは、上記マウス軽鎖遺伝子座κおよびλに1または複数の欠失を含有する他のマウスに交配させることにより、最適化することができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例Iで記載した固有のヒトκ重鎖抗体だけを発現する。交配は、当技術分野において認知される標準的な技法により同様に実施するが、代替的には、企業、例えば、JacksonLaboratoryに実施させる。ハイブリッド重鎖遺伝子座および1または複数のマウス軽鎖遺伝子座の欠失を保有するマウス株を、ヒトκ軽鎖ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含有する固有のハイブリッド重鎖の存在ならびにマウス内因性軽鎖の非存在についてスクリーニングする。また、再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウスを、マウス内因性κ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座の、ヒトκ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座による置き換えUS6,596,541、RegeneronPharmaceuticals、VELOCIMMUNE登録商標ヒト化マウス技術HumanizedMouseTechnologyを参照されたいを含有するマウスとも交配させる。抗原刺激に対する反応により、上記マウスが、ヒトκ軽鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常ドメインを含む抗体を生成するように、VELOCIMMUNE登録商標ヒト化マウスHumanizedMouseは、部分的に、マウス内因性κ軽鎖可変定常領域遺伝子座に作動可能に連結する、ヒトκ軽鎖可変領域を含むゲノムを有することを包含する。上記抗体の軽鎖の可変領域をコードするDNAは、単離して、ヒト軽鎖定常領域をコードするDNAに作動可能に連結することができる。次いで、上記DNAを、上記抗体の完全ヒト軽鎖を発現することが可能である細胞において発現させることができる。適切な交配スケジュールでは、上記マウス内因性κ軽鎖の、上記ヒトκ軽鎖遺伝子座による置き換え、および再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を保有するマウスが得られる。対象の抗原で免疫すると、体細胞変異したヒトVκドメインを含有する固有のVL結合タンパク質を単離することができる。実施例VVL結合タンパク質の生成上記再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座を含有するマウスを、他の内因性Ig遺伝子座の改変および欠失を含有する、所望される多様なマウス株に交配させた実施例IVで記載した後で、選択されたマウスを対象の抗原で免疫することができる。一般に、少なくとも1つのハイブリッド重鎖遺伝子座を含有するVELOCIMMUNE登録商標ヒト化マウスを抗原で感作し、細胞B細胞などを上記動物から例えば、脾臓またはリンパ節から回収する。上記細胞を骨髄腫細胞系と融合させて、不死化ハイブリドーマ細胞系を調製し、このようなハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、免疫に用いた抗原に特異的なハイブリッド重鎖を含有する抗体を生成するハイブリドーマ細胞系を同定する。上記ハイブリッド重鎖のヒトVκ領域をコードするDNAを単離し、所望の定常領域、例えば、重鎖および/または軽鎖定常領域に結合することができる。上記マウス重鎖定常領域に融合しているヒトVκ遺伝子セグメントが存在するために、固有の抗体様レパートリーが生成され、固有の抗体フォーマットが作製される結果として、上記免疫グロブリンレパートリーの多様性が劇的に増大する。このため、免疫されると、抗原特異的レパートリーに対する多様性のレベルが付加される。結果として得られる、クローニングされた抗体配列は、その後、CHO細胞などの細胞において生成させることができる。代替的に、抗原特異的VL結合タンパク質またはその可変ドメインをコードするDNAを、抗原特異的リンパ球例えば、B細胞から直接単離することもできる。まず、ヒトVκ領域およびマウス定常領域を有する、高アフィニティーのVL結合タンパク質を単離する。上に記載したとおり、上記VL結合タンパク質を、アフィニティー、選択性、エピトープなどを含めた所望の特徴について特徴付け、および選択する。上記マウス定常領域を、所望されるヒト定常領域で置き換えて、本発明の再構成されていないハイブリッド重鎖遺伝子座から、体細胞変異したヒトVκドメインを含有する固有の完全ヒトVL結合タンパク質を生成させる。適切なヒト定常領域は、例えば、野生型IgG1定常領域もしくは野生型IgG4定常領域、または改変されたIgG1定常領域もしくは改変されたIgG4定常領域、あるいは、Cκ定常領域またはCλ定常領域を包含する。マウス内因性重鎖遺伝子座の、6つのヒトVκ遺伝子セグメントおよび5つのヒトJκ遺伝子セグメントによる置き換え実施例Iで記載したとおり、ならびに上記内因性Vκ遺伝子セグメントおよび内因性Jκ遺伝子セグメントの、ヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントによる置き換えを含有するマウスの個別のコホートを、ヒト細胞表面受容体タンパク質抗原Xで免疫した。抗原Xは、3~4日毎に6回にわたる連続の注射により、マウスの後足蹠へと直接投与する。注射の前に、2~3マイクログラムの抗原Xを、10μgのCpGオリゴヌクレオチド型番:tlrl-modn-ODN1826オリゴヌクレオチド、InVivogen、SanDiego、CAおよび25μgのAdju-Phosリン酸アルミニウムゲルアジュバント、型番:H-71639-250、BrenntagBiosector、Frederikssund、Denmarkと混合する。最終の抗原リコールの前に、6回全ての注射を施すが、これは屠殺の3~5日間前に施す。4回目および6回目の注射後における採血血液を回収し、標準的な抗原特異的イムノアッセイにより、抗体免疫反応をモニタリングする。所望される免疫反応を達成したら、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存能力を保ち、ハイブリドーマ細胞系を形成する。上記ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、抗原X特異的VL結合タンパク質を生成する細胞系を同定する。この技法を用いて、複数の抗抗原X特異的VL結合タンパク質すなわち、マウス重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインのコンテクストでヒトVκドメインを保有する結合タンパク質を得る。代替的には、抗抗原XVL結合タンパク質を、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれるU.S.2007/0280945A1において記載される通り、骨髄腫細胞へと融合させることなしに、抗原陽性B細胞から直接単離する。この方法を用いて、複数の完全ヒト抗抗原XVL結合タンパク質すなわち、ヒトVκドメインおよびヒト定常ドメインを保有する抗体を得た。ヒトκ遺伝子セグメントの使用状況:作製した抗抗原XVL結合タンパク質の構造を解析するため、US2007/0280945A1前出において記載されている方法から適合させた方法を用いて、上記ヒトVκドメインをコードする核酸上記VL結合タンパク質の重鎖および軽鎖の両方に由来するをクローニングおよび配列決定した。上記抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、免疫したマウスから得られる、選択されたVL結合タンパク質のハイブリッド重鎖可変領域上に記載したについて、遺伝子使用状況を同定した。表5は、選択された抗抗原XVL結合タンパク質に由来するヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントの遺伝子使用状況について示すが、これにより、本発明によるマウスは、いずれもが再構成されていないヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントを含有する内因性重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座における多様な再構成のために、多様なヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントから、抗原特異的VL結合タンパク質を生成することが裏付けられる。多様なヒトJκセグメントと共に再構成されたヒトVκ遺伝子セグメントは、固有の抗原特異的VL結合タンパク質をもたらす。酵素結合免疫吸着アッセイELISA:ELISAアッセイにより、抗原Xに対して得られたヒトVL結合タンパク質を、それらが抗原Xの天然のリガンドリガンドYの結合を遮断する能力について調べた。略述すると、PBS中2μg/mLの濃度に希釈したリガンドYで96ウェルプレートをコーティングし、一晩にわたりインキュベートした後で、0.05のTween-20を含むPBSで4回にわたり洗浄した。次いで、室温で1時間にわたり、そのプレートを、0.5w/vのBSASigma-AldrichCorp.、St.Louis、MOを含有するPBSIrvineScientific、SantaAna、CAでブロッキングした。個別のプレートにおいて、抗抗原XVL結合タンパク質を含有する上清を、緩衝液中で1:10に希釈した。上記VL結合タンパク質のものと同じ成分を含む偽上清を、陰性対照として用いた。抗原Xの細胞外ドメインECDを、マウスIgG2aのFc部分とコンジュゲートした抗原X-mFc。抗原X-mFcを、0.150nMの最終濃度まで添加し、室温で1時間にわたりインキュベートした。次いで、VL結合タンパク質/抗原X-mFc混合物を、リガンドYを含有するプレートに添加し、室温で1時間にわたりインキュベートした。リガンドYに結合した抗原X-mFcの検出は、抗ペンタHis抗体Qiagen、Valencia、CAにコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼHRPにより決定し、テトラメチルベンジジンTMB基質BDBiosciences、SanJose、CAを用い、硫酸により中和した標準的な比色反応により発色させた。吸光度は、OD450で0.1秒間にわたり読み取った。抗原Xを含まない試料のバックグラウンドの吸光度を、全ての試料から差し引いた。>2503つの96ウェルプレートの抗原X特異的VL結合タンパク質について、バックグラウンドを差し引いた各試料のMFIを、調整された陰性対照値で除し、100を乗じ、結果として得られる値を100から差し引くことにより、遮断の百分率を計算した。その結果により、マウスIgG2aのFc部分に融合している抗原Xの細胞外ドメインに特異的に結合した抗原Xで免疫したマウスから単離された複数のVL結合タンパク質が示されたデータは示さない。アフィニティーの決定:選択された抗原X特異的VL結合タンパク質上清の平衡解離定数KDを、BIACORE商標T100測定器GEHealthcareを用いるSPR表面プラズモン共鳴により決定した。全てのデータは、ランニングバッファーおよび試料緩衝液の両方としてのHBS-EP10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.3mMのEDTA、0.05の界面活性剤P20、pH7.4を25°Cで用いて得た。略述すると、VL結合タンパク質は、粗上清試料から、標準的なアミン結合化学反応を用いて高濃度の抗ヒトFc抗体により予め誘導体化したderivatizedCM5センサーチップ表面に捕捉した。その捕捉工程では、上清を、抗ヒトFc表面全体に、3μL/分の流速で合計3分間にわたり注入した。上記捕捉工程の後、100nMの濃度のランニングバッファーまたは分析物を、35μL/分の流速で2分間にわたり注入した。捕捉された上記VL結合タンパク質からの抗原の解離を、6分間にわたりモニタリングした。10mMのグリシン、pH1.5を短時間にわたり注入することにより、捕捉された上記VL結合タンパク質を取り出したremoved。全てのセンサーグラムは、緩衝液の注入に由来するセンサーグラムを、分析物に由来するセンサーグラムから減じ、これにより、その捕捉表面からの上記VL結合タンパク質の解離により引き起こされるアーチファクトを除去することにより、二重に基準化した。各VL結合タンパク質の結合データは、BIAcoreT100Evaluationソフトウェアv2.1を用いて、物質移動を伴う1:1の結合モデルに当てはめた。34の選択されたVL結合タンパク質の結合アフィニティーは様々であったが、全てがナノモル濃度範囲のKD1.5~130nMを呈示した。さらに、選択された上記VL結合タンパク質のうちの約7034例のうちの23例により、一桁のナノモル濃度単位のアフィニティーが裏付けられた。これらの選択されたVL結合タンパク質についてのT1/2の測定により、約0.2~66分間の範囲が示された。34のVL結合タンパク質のうち、6つが、抗原Xに対して3nMを超えるアフィニティー1.53、2.23、2.58、2.59、2.79、および2.84を示した。そのアフィニティーのデータは、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に連結された、再構成されたヒト軽鎖可変ドメインの組合せによる会合combinatorialassociationから結果として得られるVL結合タンパク質表4に記載されているが、高アフィニティーの、クローン選択され、体細胞変異したVL結合タンパク質であることと符合する。本明細書で記載されるマウスが生成する上記VL結合タンパク質は、抗原Xにおける1または複数のエピトープに対する特異性を呈示する、多様な、高アフィニティーで固有の結合タンパク質のコレクションを含む。別の実験では、LUMINEX登録商標ビーズベースのアッセイにより、抗原Xに対して得られた、選択されたヒトVL結合タンパク質を、それらが抗原Xの天然のリガンドリガンドYの結合を遮断する能力について調べたデータは示さない。その結果により、ナノモル濃度範囲のアフィニティーで抗原Xの細胞外ドメインに特異的に結合すること上に記載したに加え、選択されたVL結合タンパク質はまた、カニクイザルMacacafascicularisに由来する抗原Xに結合することも可能であることが裏付けられた。"