miR-29をコードする核酸配列に作動可能に連結された、B細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト:をゲノムが含む、トランスジェニック動物。少なくとも一つの転写制御配列がVHプロモーターを含む、請求項1に記載のトランスジェニック動物。少なくとも一つの転写制御配列がIgH-Eμエンハンサーをさらに含む、請求項2に記載のトランスジェニック動物。miR-29をコードする核酸配列が、ヒトmiR-29をコードするDNA配列を含む、請求項1に記載のトランスジェニック動物。VHプロモーターがマウスに由来する、請求項2に記載のトランスジェニック動物。IgH-Eμエンハンサーがマウスに由来する、請求項3に記載のトランスジェニック動物。動物がマウスである、請求項1に記載のトランスジェニック動物。動物がCD5B細胞の増殖された集団を示す、請求項1に記載のトランスジェニック動物。動物がリンパ増殖性症状を示す、請求項1に記載のトランスジェニック動物。リンパ増殖性症状が前白血病症状を含む、請求項9に記載のトランスジェニック動物。リンパ増殖性症状が白血病を含む、請求項9に記載のトランスジェニック動物。白血病がヒトB-CLLの特性を示す、請求項11に記載のトランスジェニック動物。ゲノムがmiR-29をコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトを含むトランスジェニック動物であって、該配列がVHプロモーター及びIgH-Eμエンハンサーに作動可能に連結され、miR-29が該動物の未成熟B細胞及び成熟B細胞において発現する、トランスジェニック動物。amiR-29をコードする核酸配列に作動可能に連結された、B細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト:をゲノムが含むトランスジェニック動物から白血球を得ること;b細胞を数えること;及びc多数の細胞をトランスジェニック動物と同系のレシピエント動物の中に注入すること、ここで、そのように注入された多数の細胞が、該レシピエント動物においてリンパ増殖性疾患を引き起こすのに効果的である:の工程を含む、リンパ増殖性疾患を有する動物を作製する方法。リンパ増殖性疾患に影響を及ぼす治療法の能力を決定する方法であって、amiR-29をコードする核酸配列に作動可能に連結された、B細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト:をゲノムが含む第一のトランスジェニック動物を提供すること;b第一のトランスジェニック動物に治療法を施すこと;cこのトランスジェニック動物におけるB細胞の集団の分析を実施すること;d対照動物を提供すること、ここで、該対照動物は、miR-29をコードする核酸配列に作動可能に連結された、B細胞に対して発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクト:をゲノムが含む第二のトランスジェニック動物であり、該対照動物は治療法を受けない;e対照動物におけるB細胞の集団の分析を実施すること;及びf工程cの分析を工程eの分析と比較すること、ここで、リンパ増殖性疾患に影響を及ぼす治療法の能力が、第一のトランスジェニック動物と対照動物との間のB細胞集団における差によって証明される:の工程を含む、方法。リンパ増殖性疾患がB細胞性新生組織形成を含む、請求項15に記載の方法。B細胞性新生組織形成がB-CLLである、請求項16に記載の方法。第一のトランスジェニック動物及び対照動物がマウスである、請求項15に記載の方法。分析がCD5B細胞の数及び/又は相対比の計測を含む、請求項18に記載の方法。ゲノムがヒトB-CLLをコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がVHプロモーター及びIgH-Eμエンハンサーに作動可能に連結され、該トランスジェニックマウスが対照マウスと比較してCD5B細胞の増殖された集団を発生させる、前記トランスジェニックマウス。VHプロモーターがマウスVHプロモーターを含む、請求項20に記載のトランスジェニックマウス。IgH-EμエンハンサーがマウスIgH-Eμエンハンサーを含む、請求項20に記載のトランスジェニックマウス。マウスがヒトB-CLLの特性を示すリンパ性白血病を発症させる、請求項20に記載のトランスジェニックマウス。ゲノムがヒトmiR-29をコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスであって、該配列がVHプロモーター及びIgH-Eμエンハンサーに作動可能に連結され、そして該トランスジェニックマウスがヒトB-CLLの特性を示すリンパ性白血病を発症させる、前記トランスジェニックマウス。VHプロモーターがマウスVHプロモーターを含む、請求項24に記載のトランスジェニックマウス。IgH-EμエンハンサーがマウスIgH-Eμエンハンサーを含む、請求項24に記載のトランスジェニックマウス。B細胞においてmiR-29を過剰発現するトランスジェニックマウス。請求項27に記載のトランスジェニックマウスの使用。マウスmiR-29a/bクラスターの発現が、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質hrGFP及びシミアンウイルス40SV40ポリA部位とともにVHプロモーター-IgH-Eμエンハンサーによって調節される、トランスジェニックマウス。miR-29aが上方制御されるかどうかを決定することを含む、慢性リンパ性白血病の治療に使用される治療剤の有効性を評価する方法であって、miR-29の上方制御が、進行性B-CLL及び正常CD19B細胞と比べて緩徐進行性ヒトB-CLLの指標となる、前記方法。ゲノムが、マウスのB細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトを含む、トランスジェニックマウスであって、該転写制御配列が、miR-29と少なくとも90の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmiR-29遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結され、該マウスがB細胞性悪性腫瘍を示す、前記トランスジェニックマウス。少なくとも一つの転写制御配列がVHプロモーターを含む、請求項31に記載のトランスジェニックマウス。少なくとも一つの転写制御配列がIgH-Eμエンハンサーを含む、請求項31に記載のトランスジェニックマウス。核酸が[SEQIDNo:1]を含むmiR-29遺伝子産物をコードする、請求項31に記載のトランスジェニックマウス。VHプロモーターがマウスに由来する、請求項32に記載のトランスジェニックマウス。IgH-Eμエンハンサーがマウスに由来する、請求項33に記載のトランスジェニックマウス。B細胞性悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫又は新生物である、請求項31に記載のトランスジェニックマウス。B細胞性悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特性を示す、請求項31に記載のトランスジェニックマウス。amiR-29遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結された、マウスのB細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトをゲノムが含むトランスジェニックマウスに剤を投与すること、ここで、該マウスがB細胞性悪性腫瘍を示し、;及びb剤をトランスジェニックマウスに投与した後、該マウスにおけるB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候を同一の遺伝子型の対照マウスのB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候と比較すること、ここで、該対照マウスは剤を投与されておらず、トランスジェニックマウスにおけるB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候の検出性及び/又は出現割合の対照マウスに対する差がB細胞性悪性腫瘍に影響を及ぼす剤の指標となる:を含む、剤がB細胞性悪性腫瘍に影響を及ぼすかどうかを決定する方法。amiR-29遺伝子産物をコードする核酸に作動可能に連結された、マウスのB細胞内での発現を方向付けることのできる少なくとも一つの転写制御配列を含む核酸コンストラクトをゲノムが含むトランスジェニックマウスに剤を投与すること、ここで、該マウスがB細胞性悪性腫瘍を示し、;及びb剤をトランスジェニックマウスに投与した後、該マウスにおけるB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候を同一の遺伝子型の対照マウスのB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候と比較すること、ここで、該対照マウスは剤を投与されておらず、剤が該マウスにおけるB細胞性悪性腫瘍の一以上の症状及び/又は兆候を対照マウスと比較して阻害、防止及び/又は低減する場合に、剤がB細胞性悪性腫瘍の治療又は予防に治療効果を有すると考えられる:を含む、B細胞性悪性腫瘍の治療における剤の治療効果を試験する方法。少なくとも一つの転写制御配列が、VHプロモーター、IgH-Eμエンハンサー又はそれらの組み合わせを含む、請求項40又は41に記載の方法。転写制御配列がマウスに由来する、請求項40又は41に記載の方法。B細胞性悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、B細胞性リンパ腫、B細胞性新生物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項40又は41に記載の方法。B細胞性悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特性を示す、請求項41又は42に記載の方法。詳細な説明0053本開示を通じて、様々な刊行物、特許及び公開特許明細書が、同定する引用によって参照とされる。これらの刊行物、特許及び公開特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の技術水準をより十分に記載するために、参照により本開示に援用される。0054本発明は、少なくとも部分的には、B細胞性白血病におけるmiR-29の役割を明確にするという本発明者らの知見に基づく。0055第一の側面において、B細胞内でmiR-29を過剰発現するトランスジェニックマウスが本明細書において提供され;そしてこのマウスモデルの表現型が、目下、本明細書において報告される。miR-29aは、進行性B-CLL及び正常CD19B細胞と比べて、緩徐進行性ヒトB-CLLにおいて上方制御される。0056B-CLLにおけるmiR-29の役割を研究するため、本発明者らは本明細書において、マウスB細胞内でmiR-29を過剰発現するEμ-miR-29トランスジェニックマウスを作製した。フローサイトメトリー分析は、2ヶ月齢で開始したこれらのマウスの脾臓におけるCD5集団が顕著に増殖することを示し、この場合、miR-29トランスジェニックマウスの8534/40が、B-CLLの特徴であるCD5B細胞集団の増殖を示した。平均して、これらのトランスジェニックマウスにおけるB細胞の50がCD5陽性であった。00572年齢で、マウスは、著しく肥大化した脾臓とCD5B細胞集団の~100への増加とを示した。24~26月齢となった20匹のEμ-miR-29トランスジェニックマウスのうち、4匹20が真正白血病を発症させ、そしてその疾患によって死亡した。これらの結果は、miR-29の制御異常が緩徐進行性B-CLLの発症に寄与し得ることを示す。0058実施例0059本発明は、以下の実施例においてさらに定義され、この中で、別に言及しない限り、全ての部分及び割合は重量によるものであり、そして温度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のみのために提供されることが理解されるべきである。上記考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を解明することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなく、多様な用法及び条件に適応させるために、本発明の多様な改変及び修飾を行うことが可能である。特許及び非特許文献を含む、本明細書において参照される全ての刊行物は、参照により明確に援用される。以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様を例示することが意図されるのであって、特に規定のない限り、特許請求の範囲において定義されるような本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。0060従って、本発明の価値は、本明細書における実施例を参考することによって見ることができる。0061材料及び方法0062Eμ-miR-29トランスジェニックマウス及びヒトのCLL試料。マウスmiR-29abクラスターを含有する1.0-kbフラグメントを、hrGFP及びSV40ポリA部位と共にマウスVHプロモーターV186.2及びIgH-Eμエンハンサーを含有するプラスミドのBamHI及びSalI部位の中にクローニングした。miR-29a/bクラスター配列は、このコンストラクトのイントロン内に挿入した。トランスジェニックマウスを、オハイオ州立大学トランスジェニックマウス施設において作製した。遺伝子型の判定を、尾のDNAについてプライマー:miR-29d:gctgacgttggagccacaggtaag[SEQIDNo:5];miR-29r:acaaattccaaaaatgacttccag[SEQIDNo:6]を用いたPCRにより行った。0063ヒトCLL試料は、CLLと診断された患者からインフォームドコンセントを得た後、ChronicLymphocyticLeukemiaResearchConsortiumより入手した。研究は、オハイオ州立大学の施設内倫理委員会InstitutionalReviewBoardの承認に基づいて実施した。RNA抽出を実施した。リアルタイムPCRは、miR-29a、miR-29b、及びリアルタイムPCR用PXDNアッセイAppliedBiosystemsを用いて製造者のプロトコールに従って実施した。対照ヒト臍帯血CD19B細胞は、Allcells及びLonzaより購入した。0064miR-29トランスジェニックリンパ球の特性0065脾臓及び骨髄由来のリンパ球を単離した。SRBC免疫応答、Igレベル、及びB細胞集団の増殖のフローサイトメトリー測定を実施した。IgH遺伝子の再構成を分析するために、EcoRI消化及びマウスJH4プローブを用いて脾臓リンパ球DNAのサザンブロット分析を行った。0066組織学及び免疫組織化学のため、マウスを剖検して、脾臓、肝臓、及び腎臓を10緩衝化ホルマリン内で固定し、パラフィンの中に含ませ、次いで4μm切片に切断した。標準的なプロトコールに従って切片をHEで染色した。0067miR-29標的の分析0068B細胞単離キットMiltenyiBiotecを用いて、製造者の指示書に従ってB細胞を単離した。脾臓由来のタンパク質を抽出した。Cdk6H-96;SantaCruzBiotechnology、DNMT3A2160;CellSignalingTechnology、Ptenmmac1;LabVision、Mcl1S-19;SantaCruzBiotechnology、PdxnNovus、及びGAPDH2118;CellSignalingTechnologyの抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。ルシフェラーゼアッセイについては、miR-29に相補的な領域を含むPXDN、BCL7A、及びITIH5のcDNAのフラグメントを、ルシフェラーゼのストップコドンからすぐ下流にあるXbaI部位を用いてpGL3ベクター内に挿入した。miR-29a、miR-29b、及びスクランブル対照RNA二量体はAmbionより購入した。全長ヒトPXDNを含有する発現コンストラクトはOriGeneより購入した。トランスフェクションを実施した。0069結果0070CLLにおけるmiR-29発現及びEμ-miR-29トランスジェニックマウスモデルの作製0071CLL及び正常CD19B細胞におけるmiR-29の発現レベルを決定するため、本発明者らは本明細書において、29の進行性CLL試料、33の緩徐進行性CLL試料、及び2つの正常CD19B細胞対照におけるmiR-29a及びmiR-29bの発現を研究した。0072図1A及び図1Bは、これらの試料におけるリアルタイムRT-PCRの結果を示す。miR-29a発現は、正常CD19B細胞におけるよりも緩徐進行性CLLにおいての方が4.5倍高かったのに対して、進行性CLL試料は3.2倍の増加を示した。同様に、miR-29b発現は、正常CD19B細胞と比較して緩徐進行性CLLにおいて4倍、進行性CLLにおいて3.5倍増加した。miR-29a及びmiR-29bの両方共が、緩徐進行性CLLと対比して進行性CLLの方で下方制御されたが、miR-29bの場合ではこの差は統計学的に有意なものではなかった図1B。0073興味深いことに、全ての試料においてmiR-29a発現レベルはmiR-29bのそれよりも20倍を超えて高かった図1A及び図1B。0074miR-29a及びmiR-29bの発現レベルが正常CD19B細胞におけるよりも緩徐進行性CLLにおいての方が著しく高かったことから、本発明者らは本明細書において、miR-29はCLLの発症に寄与している可能性があると目下のところ考える。0075調査すべく、本発明者らは本明細書において、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質hrGFP及びシミアンウイルス40SV40ポリA部位とともにマウスmiR-29a/bクラスターの発現がVHプロモーター-IgH-Eμエンハンサーによって調節されたトランスジェニックマウスを開発した。0076このプロモーター/エンハンサーの組み合わせは、未成熟及び成熟B細胞内でのmiR-29a/bの発現を駆動する図1C。miR-29a/bクラスター配列は、このコンストラクトのイントロン内に挿入した図1C。F1及びF2と指定されたFVB/N背景の2つの創始個体を作製し、繁殖させてトランスジェニック系統を樹立した。miR-29a及びmiR-29bの発現を、トランスジェニック動物の脾臓から単離したRNAを用いてノーザンブロット分析により調べた。0077図1D及び図1Eは、非トランスジェニックのWT同胞種と比較した、両トランスジェニック系統F1及びF2におけるmiR-29a及びmiR-29bの過剰発現を示す。導入遺伝子がB細胞内で発現することを確認するため、本発明者らは、CD19をB細胞マーカーとして用いてフローサイトメトリーを実施した。0078図1Fは、両トランスジェニック系統における全てのCD19細胞がGFPも発現したのに対してF1及びF2、WT同腹子ではGFP発現が検出されなかったことを示す。0079Eμ-miR-29トランスジェニックマウスはCLL表現型を示す0080フローサイトメトリーを使用して、miR-29トランスジェニックマウス由来の脾臓リンパ球の免疫表現型プロファイルを決定した。12~24月齢では、フローサイトメトリー解析は、40匹のmiR-29トランスジェニックマウスのうちの34匹85の脾臓においてCD5B細胞集団が著しく増殖することCLLの特徴を明らかにし;これらのトランスジェニックマウスにおけるB細胞の~50はCD5であった。図2A左は代表的な例を示す。この動物由来のほとんど全ての脾臓B細胞がCD5CD19IgMであったが、これらの細胞は全脾臓リンパ球の25~30しか表さなかった。より進行性のCLLの症例が図2A中央に示されている。この動物の脾臓におけるほぼ全ての正常リンパ球が、悪性のCD5CD19IgMB細胞に置き換わった。WT同腹子の脾臓では、CD5CD19IgMB細胞はほとんど検出されなかった図2A、右。0081増殖したCD5CD19B細胞の集団は、miR-29トランスジェニックマウス由来の末梢血及び骨髄でも検出されたが、WT同腹子からは検出されなかった図2B及び図2C。0082図2D-2Fは、脾臓におけるCD5CD19IgM集団が増加した動物の数を示す。40匹のmiR-29トランスジェニックマウスのうち7匹のみ17が0~20のCD5B細胞を示したが、40匹のうちの16匹40が、60又はそれを超えるCD5CD19IgM細胞を示した。さらに、miR-29トランスジェニックマウスは、年齢に伴ってCD5脾臓B細胞の割合が著しく増加することを示した図2F。15月齢よりも若い動物では、CD5B細胞は総B細胞のわずか~20を示し;15~20月齢になるとその割合は~40に増加した図2F。008320~26月齢では、平均すると、全てのB細胞の>65がCD5であった図2F。これらのデータは、miR-29トランスジェニックマウスにおいて緩徐進行性CLLが徐々に進行することを示す。20匹のEμ-miR-29トランスジェニックマウスは、24~26月齢となるまで追跡した。これらのマウスのほぼ全てが著しく肥大化した脾臓を示し、20匹のうち4匹20が真正白血病を発症し、そして疾患により死亡した。図2Gは、肥大化した脾臓及び肝臓並びに進行したリンパ節腫脹を表す真正白血病の代表的な症例を示す。0084クローン性IgH遺伝子再構成は、ヒトCLL症例において典型的である。これらの再構成は、CLLのTcl1駆動性のマウスモデルでも観察された。Eμ-miR-29トランスジェニックマウス由来のCD5B細胞がクローン性を示すかどうかを決定するため、少なくとも50のCD5CD19IgMB細胞を示す症例から単離された脾臓リンパ球DNAを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。図2Hは、分析した5症例のうちの3つにおけるIgH遺伝子のクローン性再構築を示す。これらの結果はさらに、Ep-miR-29マウスにおけるCD5B細胞の増殖がヒトCLLに似ていることを示す。0085Ep-miR-29マウスがCLL様疾患を発症させることをさらに確認するため、組織学的及び免疫組織学的分析を実施した。図3A-3Cは、Ep-miR-29トランスジェニックマウス及びWT対照の血液からの代表的な塗沫標本を示す。WTマウスからの塗沫標本は、正常な外観を有する希少なリンパ単球を示した図3A。対照的に、軽度のCLLを伴ったEμ-miR-29マウスからの塗沫標本は非定型リンパ球細胞の数の増加を示し図3B、黒色の矢印、そして進行したCLLを伴ったmiR-29トランスジェニックマウスからの塗沫標本は、CLLの典型であるスマッジ細胞図3C、差し込み図;スマッジ細胞は矢頭により示されるを含む多数の悪性のリンパ球細胞を示した。0086図3D-3Lは、Ep-miR-29トランスジェニックマウス及びWT対照の代表的な組織学的画像を示す。WTマウスの脾臓は、保存された構造と正常に見えるいくつかのリンパ濾胞とを示す図3D、緑色の矢印。対照的に、CLLを伴う病的なmiR-29トランスジェニックマウスの脾臓は構造が変形されていることを示し図3E、そして進行したCLLを伴うmiR-29マウスの脾臓は、悪性リンパ球の増殖により正常な構造が全て消失していることを示す図3F。0087同一切片のB220染色は、正常なB細胞性質を示すWTマウスのリンパ濾胞を示す図3G。対照的に、トランスジェニックの脾臓は、軽度悪性リンパ球の増殖のために乱れたリンパ濾胞を示し図3H、或いはB細胞悪性集団の広範囲に及ぶ分布を伴うCLLを示す図3I。0088図3J-3Lは、WT脾臓におけるサイクリンD1の低い発現図3J並びに軽度CLL図3K及び進行したCLL図3Lにおける中程度から高いサイクリンD1発現を示す。従って、組織学的及び免疫組織学的試験は、Ep-miR-29マウスがCLL様疾患を発症することを確認した。0089上述したように、Ep-miR-29トランスジェニックマウスの20のみが進行した白血病を発症し、そして該疾患により死亡した。図7A-7Lは、肝臓及び腎臓に浸潤したCLLの進行した代表的な症例を示す。組織学的試験は、B220、サイクリンD1、及びKi67の高発現を伴う、正常な脾臓構造の全般的な消失を示した図7A-7D。0090これらのB220悪性B細胞は、肝臓図7E-7H及び腎臓図7I-7Lに浸潤した。0091CLLリンパ球の集積は、生存期間の延長のみならず、骨髄、リンパ節、又は脾臓に由来するCD5B220細胞の増殖によっても生じることができる。従って、Ep-miR-29マウス由来のCLL細胞が増殖するかどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、BrdU組み込みに基づく細胞周期分析を使用した。本発明者らは、WTB220脾臓リンパ球との比較において、B220CD5並びにB220CD5-トランスジェニックの脾臓リンパ球の増殖能力を評価した。図4A-4Jは、Eμ-miR-29マウス由来のB220CD5B細胞が増殖するのに対して、B220WTリンパ球についての増殖は検出されなかったことを示すトランスジェニックのB細胞についてS期の細胞は2.7及び5.6、対してWTB細胞については0.3及び0.5図4I-4J対図4C-4D。興味深いことに、B220CD5-トランスジェニックのリンパ球でさえ、B220WTB細胞と比べてさらに増殖することを、S期の細胞が1.0及び0.95、対してWTB細胞については0.3及び0.5であることと共に示した図4G-4H対図4C-4D。0092これらのデータは、miR-29過剰発現が、CD5-細胞においてでさえも、B細胞増殖を促進することを示す。ヒトCLLは、免疫不全、及び最終的にほとんど全ての患者において発症する進行性の重度低ガンマグロブリン血症によって特徴付けられる。従って、Eμ-miR-29マウスが低ガンマグロブリン血症を発症させるかどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、18月齢でのトランスジェニックマウス及びWT同腹子における血清Igのレベルを比較した。0093図4Kは、IgG1、IgG2a、及びIgG2bのレベルが、Eμ-miR-29トランスジェニックマウスにおいてWT対照と比較して2から4倍減少したことを示す。Eμ-miR-29マウスが免疫応答障害を示すかどうかを決定するため、本発明者らは、抗ヒツジRBCSRBC抗体のレベルを、miR-29トランスジェニックマウス及びWT同法種にSRBCを注入した後で比較した。図4Lは、抗SRBC抗体の血清レベルが、miR-29トランスジェニックマウスの血清において同年齢のWTマウスと比較して~4倍減少したことを示す。これらのデータは、ヒトCLLにおけるように、Eμ-miR-29マウスにおけるCLL様疾患が低ガンマグロブリン血症及び免疫不全によって特徴付けられることを明らかに示す。0094本明細書に記載された本発明のマウスモデルでは、TCL1ORF3’UTRが欠如しているがVHプロモーター-IgH-Eμエンハンサーの調節下にあった。トランスジェニックコンストラクト内の3’UTR不存在のため、miR-29はこれらのマウスにおけるTCL1発現を阻害することができなかった。Eμ-TCL1トランスジェニックマウスは進行性CLLを発症し、そして全てのマウスが疾患のために12~15月齢で死亡した。トランスジェニックmiR-29発現がERTCL1マウスにおいてCLLを加速させることが可能かどうかを決定するため、本発明者らは本明細書において、Eμ-miR-29及びEμ-TCL1のトランスジェニックマウスを交配させた。Eμ-miR-29/Eμ-TCL1同腹子を約8月齢で屠殺し、そして分析した。0095図5Aは、これらの遺伝子型の脾臓リンパ球の代表的なFACS分析を示す。TCL1/miR-29ダブルトランスジェニックマウスは、Eμ-TCL1マウスと比較してCD5CD19B細胞集団及びCD5IgMB細胞集団の著しい増加を示した93.9及び93.3対48.3及び50。平均すると、Eμ-miR-29/Eμ-TCL1マウスは、Eμ-TCL1マウスと比較して40多くのCD5CD19脾臓B細胞を有し、脾臓重量は3倍増加した図5B-5C。これらのデータは、miR-29が、Tcl1とは独立してCLLの病因に寄与することが可能であることを示す。0096miR-29標的の分析0097マウスB細胞内でのmiR-29過剰発現がその標的の発現に影響を及ぼすかどうかを決定するため、miR-29トランスジェニックマウス及びWT対照由来の選別されたB220B細胞において、以前に報告されているいくつかのmiR-29標的である、Cdk6、Mcl1、及びDNMT3Aの発現レベルを分析した。その結果、Cdk6及びDNMT3Aの2つの標的はmiR-29トランスジェニックマウスにおいて下方制御されるのに対して、Mcl1及びPtenでは差が検出されないことが明らかとなった図6A[Ptenは証明されたmiR-29標的ではないが、それは潜在的な標的であると以前より予測されている]。0098Cdk6及びDNMT3Aは腫瘍抑制因子であるとは知られていないことから、Affymetrix遺伝子発現アレイを用いて、その発癌活性に寄与する潜在的なmiR-29標的を決定した。マイクロアレイ分析を使用して、miR-29トランスジェニックマウス及びWT対照由来の選別されたB220B細胞において遺伝子発現を比較した。次いで、本発明者らは、Targetscanソフトウェアより得られた潜在的なmiR-29標的のリストと共に公知の又は潜在的な腫瘍抑制因子の機能を有したmiR-29トランスジェニックマウスにおいて下方制御される遺伝子を相互参照した。3つの潜在的な標的が同定された:AMLにおいて下方制御されるp53反応性遺伝子である、ペルオキシダシンperoxidasinPXDN;T細胞リンパ腫において下方制御されるアポトーシス促進性遺伝子である、Bcl7A;及び乳癌において下方制御されるインターαトリプシンインヒビターファミリーのメンバーである、ITIH5。0099図6B-6Cは、miR-29トランスジェニックマウス対WT同腹子のCD19B細胞におけるこれらの3つの遺伝子の発現の下方制御、並びにmiR-29a及び対応する3’UTRのアラインメントを示す。miR-29が実際にPXDN、Bcl7A、及びITIH5の発現を標的とするかどうかを確認するため、これらのcDNAの3’UTRフラグメントmiR-29相同性領域を含むをpGL3ベクターの中のルシフェラーゼORFの下流に挿入した。HEK293細胞を、示されたように、miR-29a、miR-29b、又はスクランブル陰性コントロールと、miR-29に相同な領域を含むPXDN、Bcl7A、及びITIH5cDNAのフラグメントを含有するpGL3コンストラクトとを同時トランスフェクションした図6D。00100miR-29a又はmiR-29bの発現は、PXDNの3’UTRを含有するコンストラクトのルシフェラーゼ発現を著しく~3倍減少したのに対して、Bcl7A及びITIH5については顕著な効果は観察されなかった図6D。従って、理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは本明細書において、PXDN発現はmiR-29によって標的化される可能性があると目下のところ考える。確認すべく、5’UTR及び3’UTRを含む全長PXDNcDNAをサイトメガロウイルス哺乳動物発現ベクター内で使用して、miR-29発現がPdxnタンパク質発現レベルに影響を及ぼすかどうかを調査した。00101このコンストラクトを、図6Eに示されるように、miR-29a、miR-29b、又はプレmiR陰性コントロールスクランブル化とともにHEK293細胞内に同時トランスフェクションした。これらの実験は、PXDNのmiR-29a又はmiR-29bとの同時発現がほぼ完全にPxdn発現を阻害したことを明らかにした図6E。本発明者らは本明細書において、miR-29a及びmiR-29bはmRNA及びタンパク質レベルでPxdn発現を標的とすると目下のところ考える。PdxnがヒトCLLの病因に重要な役割を果たすかどうかを確認するため、25のヒトCLL試料及び正常CD19B細胞対照におけるPXDNの発現を研究した。00102図6Fは、これらの試料におけるリアルタイムRT-PCRの結果を示す。PXDN発現は、CLL試料において正常CD19B細胞と比較して劇的に下方制御された50倍又はそれを超える。これらの結果は、B細胞におけるmiR-29の発癌的な役割が、少なくとも部分的には、ペルオキシダシンを標的とすることに依存している可能性があることを示す。00103考察00104本発明は、B細胞内でのmiR-29過剰発現がCLLをもたらすこと、及びmiR-29が正常B細胞と比べて緩徐進行性CLLにおいて過剰発現することを示す。00105Eμ-miR-29トランスジェニックマウスの20のみが老齢期に白血病で死亡したが、ほとんど全てのマウスは増殖したCD5CD19B細胞集団を示したことから、Eμ-miR-29の表現型は緩徐進行性CLLのそれと類似している。従って、miR-29の上方制御は緩徐進行性CLLの病因を開始させ、或いは少なくとも著しくそれに寄与する。一方、TCL1は緩徐進行性CLLにおいてほとんど発現せず、おそらく緩徐進行性CLLにおいて重要な役割は果たさない。00106理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは本明細書において、miR-29過剰発現は進行性CLLを惹起するのには十分ではないと目下のところ考える。対照的に、Tcl1の上方制御はCLLの進行性形態の病因において重大な事象である。miR-29はTCL1を標的とすることから、緩徐進行性の形態と比較した場合進行性CLLにおけるその下方制御は、Tcl1の上方制御及び進行性の表現型の発症に寄与する。00107本発明は多様な及び好ましい態様に言及して記載されているが、多様な改変が実施されてもよく、そして本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、均等物がその要素に対して代用されてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本発明の教示に適合させるように、多くの修飾が行われてもよい。00108従って、本発明は、本発明を実行するために予期される本明細書に開示された特定の態様に限定されるものでなく、本発明は、特許請求の範囲内に属する全ての態様を含むであろうことが意図される。