"疼痛を有するか又は疼痛を有するリスクがあると思われる対象に、LPAに結合し、中和し、それによって疼痛の治療又は予防を達成するヒト化モノクローナル抗体又は抗体断片を投与することを含む、疼痛を治療又は予防する方法であって、該モノクローナル抗体又は抗体断片が、RSSQSLLKTNGNTYLH配列番号4、TSGQSLVHINGNTYLH配列番号11、RSSQSLVHSNGNTYLH配列番号15及びSASSSLSYMH配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第一の軽鎖相補性決定領域と、KVSNRFS配列番号5、KVSNLFS配列番号12及びDTSKLAS配列番号21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第二の軽鎖相補性決定領域と、SQSTHFPFT配列番号6及びHRRSSYT配列番号22からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第三の軽鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの軽鎖可変ドメインと、NYLIE配列番号7及びSGYYWT配列番号23からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖可変ドメインを含む第一の重鎖相補性決定領域と、LIYPDSGYINYNENFKG配列番号2、LINPGSDYTNYNENFKG配列番号9、LIIPGTGYTNYNENFKG配列番号13、YIGYDGSNDSNPSLKN配列番号18及びAINPGSDYTNYNENFKG配列番号34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第二の重鎖相補性決定領域と、RFAYYGSGYYFDY配列番号3、RFGYYGSGNYFDY配列番号10、RFGYYGSSNYFDY配列番号14、RFGYYGSGYYFDY配列番号16及びAMLRRGFDY配列番号19からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第三の重鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの重鎖可変ドメインと、を含む、疼痛を治療又は予防する方法。前記モノクローナル抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列TSGQSLVHINGNTYLH配列番号11を含む第一の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列KVSNLFS配列番号12を含む第二の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列SQSTHFPFT配列番号6を含む第三の軽鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの軽鎖可変ドメインと、アミノ酸配列NYLIE配列番号7を含む第一の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列LINPGSDYTNYNENFKG配列番号9を含む第二の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列RFGYYGSGNYFDY配列番号10を含む第三の重鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの重鎖可変ドメインと、を含む、請求項1に記載の方法。前記モノクローナル抗体又は抗体断片が、アミノ酸配列RSSQSLLKTNGNTYLH配列番号4を含む第一の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列KVSNRFS配列番号5を含む第二の軽鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列SQSTHFPFT配列番号6を含む第三の軽鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの軽鎖可変ドメインと、アミノ酸配列NYLIE配列番号7を含む第一の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列LIYPDSGYINYNENFKG配列番号2を含む第二の重鎖相補性決定領域と、アミノ酸配列RFAYYGSGYYFDY配列番号3を含む第三の重鎖相補性決定領域と、を含む、少なくとも1つの重鎖可変ドメインと、を含む、請求項1に記載の方法。前記モノクローナル抗体又は抗体断片が、配列番号27、35、36、37、38、39、40、41、42又は43を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む少なくとも1つの軽鎖ポリペプチドと、配列番号26、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57,58、59、60、61又は62を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む少なくとも1つの重鎖ポリペプチドと、を含む、請求項1に記載の方法。前記疼痛が神経因性疼痛である、請求項1に記載の方法。前記対象がヒト対象である、請求項1に記載の方法。抗LPA抗体を含む抗LPA剤1.導入様々な疾患及び障害に対する治療処置剤としてのモノクローナル抗体mAb又は抗原結合活性を保持するその断片、例えばFab断片は、安全で効果的な治療剤であることが示されるにつれて、その使用が急速に増加している。認可済み治療用モノクローナル抗体としてはAvastin商標、Erbitux商標及びRituxan商標が挙げられる。さらなるモノクローナル抗体は、様々な疾患に対する臨床開発の様々なフェーズにあり、殆どが様々な形態の癌を標的とする。一般に、モノクローナル抗体は非ヒト哺乳動物において産生される。マウスモノクローナル抗体の治療的有用性は、非ヒト哺乳動物抗体のキメラ化又はヒト化により改善され得る。ヒト化によって、投与される治療用モノクローナル抗体に対する免疫反応の発現が大きく抑制され、それにより半減期の短縮及びこのような反応における結果である治療効果の低下が回避される。殆どの部分に対して、ヒト化過程は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域FRにマウス相補性決定領域CDRを移植することから構成される。最初の移植コンストラクトにおいて喪失される親和性を改善するか又は取り戻すために、FRにおける選択残基のマウスアミノ酸残基への復帰突然変異を必要とすることが多い。モノクローナル抗体の製造は、免疫グロブリンタンパク質そのものの多様性が原因となる複雑な過程である。異種性は、選択的なジスルフィド対形成の形成、脱アミド化及びイソアスパルチル残基の形成、メチオニン及びシステイン酸化、ピログルタミン酸に対するN末端グルタミン残基の環状化及び哺乳動物カルボキシペプチダーゼによるC末端リジンの部分的酵素性切断に起因し得る。安定性向上、プロテアーゼに対する耐性、凝集挙動及び異種系での発現レベル向上など、抗体分子の特性を改善するために、通常、抗体分子に対して改変が行われる。2.LPAの疾患関連性及び抗LPA剤に対する治療的使用LPAは、多くの疾患及び障害と関連付けられている。概説としては、Gardell,etal.,2006TrendsMolMed.122:65-75及びChunJ.andRosen,H.,2006Curr.Pharma.Design12:161-171を参照のこと。これらには、自己免疾患、例えば糖尿病、多発性硬化症及び強皮症など;癌を含む過剰増殖性疾患;疼痛、血管形成及び血管新生が関連する疾患;肥満;アルツハイマー病を含む神経変性疾患;統合失調症、免疫関連障害、例えば移植拒絶及び移植片対宿主病など及びその他が含まれる。多くの疾患及び障害におけるLPAの役割は、例えば本願発明と所有者が共通し、その全体において及び全ての目的に対して本願発明及びその全体において本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第20100034814号USSN12/406,874でさらに記載されている。LPAの異常なレベルが関連する、下記で列挙されるものなどの疼痛を含む疾患は、LPAに結合し、中和する抗体又は抗体断片での治療に対して特に適切である。疼痛は、米国において医師の診察を受けるための最も一般的な理由であり、広範囲の疾患、障害及び状態の一部として存在する。疼痛は、急性又は慢性であり得、身体の場所に従い及び/又は病因によって分類され得るが、多くの場合、疼痛の病因は不明であるか又は重複し得るいくつかの可能性のある原因によるものであり得る。疼痛はまた例えばアロディニア疼痛の異常知覚又は痛覚過敏疼痛感覚過剰として質的にも記載され得る。神経因性疼痛は、複雑で、しばしば慢性タイプの、神経系の損傷又は機能不全が関連する疼痛である。簡単に述べると、神経因性疼痛は、神経系における病理学的変化により引き起こされる慢性痛状態である。Myers,etal2006DrugDisc.Today11:8-20。急性及び/又は慢性神経因性疼痛の原因としては、中枢又は末梢神経系に対する損傷、外傷又は傷害例えば脊髄損傷、椎間板ヘルニア、多発性硬化症又はその他の変性又は神経変性疾患、炎症、薬物への曝露例えば、細胞毒性剤、例えばパクリタキセルTAXOL、シスプラチン及びその他の化学療法剤など、糖尿病、ウイルス性疾患例えば、HIV及び帯状疱疹など、代謝性疾患、重篤な虚血侵襲、栄養不足、毒物への曝露及び癌が挙げられるがこれらに限定されない。癌神経因性疼痛は、神経における腫瘍インピンジメントからの直接的な又は放射線、外科手術もしくは薬物治療などからの間接的な結果であり得る。神経因性疼痛には、最初の損傷に対する炎症反応により制御され、神経系組織に影響を与える神経炎症の機構が介在する。Myers,etal2006,DrugDisc.Today11:8-20。TNFαなどの多くの炎症性メディエーターは、神経因性疼痛において極めて重要であることが分かっている。LeungL,CahillCM.2010JNeuroinflamm.,7:27。神経因性疼痛は最も一般的な鎮痛剤には反応しない。炎症性メディエーターは、疼痛の発生、持続及び重症度に関与する。IL-6は強力な疼痛発生炎症性メディエーターである。IL-6は、末梢神経損傷後、ラット脊髄で産生され、IL-6レベルはアロディニアの強度と正の相関がある。Arruda,etal.2000,BrainRes.879:216-25。IL-6レベルはストレス又は炎症中に向上し、関節リウマチには滑液中のIL-6レベル向上が関連する。Matsumoto,etal2006,Rheumatol.Int.26:1096-1100;Desgeorges,etal.1997,J.Rheumatol.24:1510-1516。神経因性疼痛はIL-6ノックアウトマウスにおいて阻止される。Xu,etal1997,Cytokine9:1028-1033。IL-8は、疼痛発生炎症性メディエーターである。ヘルペス後神経痛の薬物治療によってIL-8濃度の50の低下が示され、これは疼痛緩和と相関して低下する。Kotani,etal.2000,NewEngl.J.Med.343:1514-1519。TNF-αは、軸索損傷、マクロファージの動員及び末梢神経線維における異所性活性を誘発し、痛覚過敏の発生に関与する。TNF-αは、末梢神経病変の部位で及び神経因性疼痛のある患者において上方制御される。TNF産生の選択的ブロッカーであるサリドマイドは、神経因性疼痛慢性絞扼性損傷の動物モデルにおいて痛覚過敏を軽減する。George,etal.2000,Pain88:267-275。様々な薬理学的及び遺伝学的アプローチを使用することによって、神経因性疼痛の発現におけるLPAの顕著な役割が確立された。LPAは、持続性の機械的アロディニア及び温熱性痛覚過敏ならびに脱髄及びLPA1受容体を通じた疼痛関連タンパク質の上方制御に関与する。さらに、LPAの髄腔内注射は、神経結紮後に観察されるものと同様の、後根の脱髄に伴う疼痛刺激に対する感受性延長など、行動的、形態的及び生化学的変化を誘導する。Fujita,R.,Kiguchi,N.Ueda,H.2007,NeurochemInt50,351-5。神経損傷がある野生型動物は、後根における脱髄及び脊髄後角内のタンパク質キナーゼCアイソフォーム及び後根神経節における21カルシウムチャネルサブユニットの両方の発現上昇に並行して行動性アロディニア及び痛覚過敏を発現する。LPA1受容体遺伝子を欠くマウスlpa1-/-マウスは、神経損傷誘導性の神経因性疼痛性行動及び現象がないことが明らかになっている。Inoue,etal.2004,NatMed10,712-8。オートタキシン遺伝子に対するヘテロ接合性突然変異体マウスatx/-は、神経損傷誘導性神経因性疼痛のおよそ50の回復を示した。lpa1-/-及びatx/-マウスの両方で痛覚過敏が完全に消失した。さらに、Rho及びRhoキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤も神経因性疼痛を阻止した。Mueller,B.K.,Mack,H.Teusch,N.2005,NatRevDrugDiscov4,387-98。従って、LPA生合成及び/又はLPA1受容体を標的とすることは、神経損傷誘導性神経因性疼痛を緩和するための、新規の特許性のあるアプローチに相当する。ヒト及び動物モデルの両方における1型及び2型糖尿病の糖尿病性神経障害は、末梢神経系の全成分感覚、運動及び自律の病態生理学変化を特徴とする。一次求心性神経の変化に加えて、中枢性感作は、神経因性及び炎症性疼痛を含む持続性の疼痛の基礎となる重要な機構であると考えられる。G.Baranauskas,A.Nistri1998ProgNeurobiol54,349;T.J.Coderre,R.Melzack1992JNeurosci12,3665;R.Dubner,M.A.Ruda1992TrendsNeurosci15,96;M.J.Millan1999ProgNeurobiol57,1;C.J.Woolf,S.W.Thompson,1991Pain44,293。最近、持続性疼痛での中枢性感作において、LPAに対する役割が提案された。具体的には、一次求心性神経線維の刺激によって脊髄におけるLPAの産生が引き起こされることが明らかとなった。M.Inoue,etal.2008,JNeurochem107,1556。ATXによるLPAへのLPCの変換が、神経因性疼痛に関与するCNSにおけるLPAの主要な供給源であることが提案された。L.Ma,etal.2010JPharmacolExpTher333,540。細胞レベルにおいて、LPAは、神経及びグリア細胞における形態変化の強力な誘導因子である。Kingsbury,etal.2003,NatNeurosci6,1292-9;Jalink,etal.1993,CellGrowthDiffer4,247-55;Tigyi,G.Miledi,R.1992,JBiolChem267,21360-71992;Fukushima,etal.2000,DevBiol228,6-18;Yuan,X.B.,etal.2003NatCellBiol5,38-45;Fukushima,etal.2007,NeurochemInt50,302-7。初代星状膠細胞ならびに神経膠腫由来細胞株において、LPAは、活性のあるRhoAにより支配され、接着斑タンパク質の再編成及び活性化が関連する過程である、突起伸長星型化stellationの逆転を引き起こす。Ramakers,G.J.Moolenaar,W.H.1998,ExpCellRes,245:252-62。ミエリン化におけるLPAに対する役割は、LPAがシュワン細胞における細胞-細胞接着及び生存を促進するという知見によっても示唆される。Weiner,etal.2001,JNeurosci.21:7069-78;Ramer,etal2004,JNeurosci.24:10796-805。3.抗体作製及び特徴評価本発明は、疼痛の治療における抗LPA抗体及び抗体断片の使用に関する。LPAに対するマウス及びヒト化モノクローナル抗体の作製、特徴評価及び組み換え作製は、本願発明と所有者が共通し、その全体において本明細書中に組み込まれる上記米国特許出願公開第20100034814号を含むいくつかの特許出願に記載されている。4.製剤処方、投与及び投与経路患者において望ましくないLPAの量を調節するための1つの方法は、1以上のLPA種に結合し、従ってこれを中和し、それによって、望ましくない遊離LPAレベルを低下させる治療用スポンジとして作用するための1以上の抗LPA抗体又はそれらの断片を含む組成物を提供することによる。化合物が遊離していると言われる場合、化合物は、その望ましくない効果をそれが発揮する部位への到達を何ら制限されない。一般に、遊離化合物は、その遊離化合物の作用部位であるか又はそれを含有する、又は化合物がその作用部位に自由に移動できる、血液及び組織に存在する。遊離化合物はまた、化合物を望ましくない化合物へと変換する何らかの酵素による作用に対して利用可能でもあり得る。抗LPA抗体及び抗体断片は、疾患、障害又は身体外傷の治療を含む様々な目的のために有用である医薬組成物中で処方され得る。生物活性脂質に対する抗体に適切な医薬組成物は、上記の米国特許出願公開第US20100098700号で開示される。本発明の1以上の抗LPA抗体及び/又は抗体断片種を含む医薬組成物は、当該治療のためのキット及び医療装置に組み込まれ得る。本発明の医薬組成物の投与を必要とする患者に、本発明のある実施態様に従い本発明の医薬組成物を投与するために、医療装置を使用し得、このような装置を含むキットが提供される。このような装置及びキットは、本発明の医薬組成物の自己投与を含む通例の投与のために設計され得る。このような装置及びキットは、緊急使用に対して、例えば救急車もしくは救急治療室でもしくは外科手術中において又は創傷が起こり得るが完全な医療的配慮がすぐに用意され得ない活動例えばハイキング及びキャンプ又は戦闘状態での使用に対しても設計され得る。保管のために、所望の程度の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で抗体及び/又は抗体断片の治療製剤を調製するRemington’sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.1980。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投与量及び濃度で受容者に対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及びその他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど;低分子量約10残基未満ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTAなど;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなど;塩形成対イオン、例えばナトリウムなど;金属錯体例えばZn-タンパク質錯体;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN商標、PLURONICS商標又はポリエチレングリコールPEGなどを含む。本明細書中の処方物はまた、治療する特定の適応に対して必要に応じて複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補足的活性を有するものも含有し得る。このような分子は、意図する目的に対して有効である量の組み合わせで適切に存在する。活性成分は、例えば従来技術により又は界面重合により調製されるマイクロカプセル中、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中、コロイド薬物送達系中例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル又はマクロエマルジョン中でも封入され得る。このような技術は、Remington’sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.1980で開示される。インビボ投与に対して使用しようとする処方物は無菌でなければならない。これは、例えば滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。持続放出製剤が調製され得る。持続放出製剤の適切な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられるが、この場合、マトリクスは例えばフィルム又はマイクロカプセルなどの成型品の形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル例えば、ポリ2-ヒドロキシエチル-メタクリレート、又はポリビニルアルコール、ポリラクチド米国特許第3,773,919号、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えば、LupronDepot商標乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア及びポリ-D---3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸グリコール酸などのポリマーが100日以上にわたり分子を放出することができる一方、ある種のヒドロゲルは、タンパク質を放出する時間がより短い。封入抗体が長時間にわたり身体に残存する場合、これらは、37°Cで湿気に曝露される結果として変性又は凝集し得、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に依存して、安定化のために合理的ストラテジーが考案され得る。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通じた分子間S--S結合形成であることが発見される場合、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。治療への応用のために、非経口的に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは点滴を含む。又は頭蓋内、髄腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、経口、局所、気管内又は吸入経路によりヒトに投与され得るものを含む上記で論じたものなどの医薬的に許容可能な剤形で、抗LPA剤、例えば本発明の抗体その抗原結合断片が、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。疾患の予防又は治療に対して、抗体又は抗体断片の適切な投与量は、上記で定義されるような治療しようとする疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で又は治療目的で投与されるか、薬歴、患者の病歴及び抗体への反応ならびに担当医師の裁量に依存する。本抗体又は抗体断片は、1回又は一連の治療にわたり患者に適切に投与される。例えば1回以上の個別投与によるものであれ又は連続点滴によるものであれ、疾患のタイプ及び重症度に依存して、約1μg/kgから約50mg/kg例えば0.1-20mg/kgの抗体及び/又は抗体断片が、患者への投与に対する第一の候補投与量である。典型的な1日又は週間投与量は、上述の要因に依存して、約1μg/kgから約20mg/kg以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、疾患症候の所望の抑制が起こるまで治療が反復される。しかし、他の投与計画が有用であり得る。この治療の進行は、例えば放射線画像を含む従来技術及びアッセイによって容易に監視される。治療用抗LPA抗体及び/又は抗体断片への患者の曝露を最適化するため、体液又は組織中のLPAレベルを調べるために抗体を使用する検出方法を使用し得る。本発明の別の実施態様に従い、LPA活性を阻害する薬剤、例えば抗LPAmAb又はFabを含む組成物は単剤療法剤として投与され、一方で他の好ましい実施態様において、LPA活性を阻害する薬剤を含む組成物は、併用療法の一部として投与される。ある場合において、連続的に又は、癌治療用の化学療法剤又は従来の鎮痛剤など、このような目的に有効である別の薬剤と組み合わせて本抗体を投与することによって、疾患を予防又は治療することにおける抗体の有効性を向上させ得る。このような他の薬剤は、投与される組成物中に存在し得るか又は個別に投与され得る。また、本抗体は、連続的に又は他の薬剤もしくは方式と組み合わせて適切に投与される。5.キット及び製品本発明の別の局面において、疼痛の治療に有用な物質を含有する製品が提供される。本製品又はキットは容器及びラベルを含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ及び試験管が挙げられる。これらの容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。本容器は、症状を処置するのに有効な組成物を収容し、無菌アクセスポートを有し得る例えば、本容器は、静注液バッグ又は皮下注射針が貫通可能なストッパー付きのバイアルであり得る。本組成物中の活性物質は、抗LPA抗体又は抗体断片である。本容器上の又はこれに付随するラベルは、選択される状態を治療するために本組成物が使用されることを示す。本製品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などを含む第二の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための説明がある添付文書を含め、商業的見地及び使用者の見地から所望される他の物質をさらに含み得る。本発明の実施に対して知られる現時点での最良の形態を単に説明するものである次の実施例を参照することによって、本発明がより詳細に理解されよう。本発明の範囲は、それに限定されるとみなされるべきものではない。実施例次の詳細な例を参照することにより本発明をさらに説明する。これらの実施例は、何ら本発明の範囲を限定するものとみなされるものではない。実施例1:LPAに対するモノクローナル抗体上述の米国特許出願公開第20100034814号に記載のとおり、LPAに対するマウスモノクローナル抗体を作製した。その優れた生化学的及び生物学的特性に基づく特徴評価に対して6種類のハイブリドーマクローンが選択された。LPathInc.の代理として特許寄託のためにマウスハイブリドーマ細胞株504B3-6C2、504B7.1、504B58/3F8、504A63.1及び504B3A6本明細書中でそれぞれB3、B7、B58、A63及びB3A6と呼ぶクローンに対応は、2007年5月8日にAmericanTypeCultureCollectionATCCPatentDepository,10801UniversityBlvd.,Manassas、VA20110により受託され、寄託番号PTA-8417、PTA-8420、PTA-8418、PTA-8419及びPTA-8416がそれぞれ付与された。本命明細書中で言及される全ての抗LPA抗体及びそれらの一部はこれらの細胞株由来であった。直接的結合カイネティクス12:0及び18:1LPA0.1μMに対する6種類の抗LPAmAbB3、B7、B58、A63、B3A6、D22の結合をELISAによって測定した。精製mAbの6種類の漸増濃度0から0.4μg/mLを用いて、力価曲線からEC50値を計算した。EC50は、最大結合の50となる有効抗体濃度に相当する。Maxは最大結合を示すOD450として表される。。結果を下記表1で示す。BIAcore3000Biosensormachineを用いて6種類のリード候補物に対してカイネティクスパラメーターka結合速度定数、kd解離速度定数及びKD結合平衡定数を求めた。この実験において、センサー面上にLPAを固定し、抗LPAmAbを表面全体の溶液中で流した。示されるように、全6種類のmAbが、0.34から3.8pMの範囲の同様のKD値及び同様のカイネティックパラメーターでLPAに結合した。抗LPAマウスmAbはLPAに対して高い親和性を示す。150共鳴単位の範囲の密度でLPAをセンサーチップ上に固定化した。各mAbの希釈液を固定化LPAに流し、結合/解離相の非線形回帰によってカイネティック定数を得た。2つ組の実験操作において少なくとも3種類の決定因子を使用して、標準偏差として誤差を与える。結果を下記の表2で示す。KD=ka/kdによりみかけの親和性を求めた。ka=M-1s-1での結合速度定数kd=s-1での解離速度定数6種類の抗LPAmAbの特異性プロファイルLPAの多くのアイソフォームが生物学的に活性があることが同定されており、mAbは、それらの全てを治療的に関連のある程度まで認識することが好ましい。競合脂質を抗体固定化脂質混合物に添加する競合アッセイを用いて、抗LPAmAbの特異性を評価した。抗体の特異性を評価するために抗LPAmAbを用いて競合ELISAアッセイを行った。18:1LPAをELISAプレート上で捕捉した。BSA1mg/mL-PBS中で各競合脂質10μM以下を連続希釈し、次いでmAb3nMとともに温置した。次に、LPA被覆ウェルに混合物を移し、二次抗体を用いて抗体結合量を測定した。シグナルA450を最大化するためにデータを正規化し、パーセント阻害として表す。3つ組でアッセイを行った。IC50:最大半量阻害濃度;MI:最大阻害阻害剤非存在下での結合;‐‐‐:阻害が弱いため推定しない。高い阻害の結果から、抗体による競合脂質の認識が示される。下記表3で示されるように、全抗LPAmAbが様々なLPAアイソフォームを認識した。興味深いことに、抗LPAmAbは、12:0ラウロイル、14:0ミリストイル、16:0パルミトイル、18:1オレオイル、18:2リノレオイル及び20:4アラキドノイルLPAを区別することができた。最終的薬物開発に対する所望のEC50順位は、特異性が高いこととともに、不飽和脂質に対しては18:2>18:1>20:4であり、飽和脂質に対しては14:0>16:0>18:0である。抗LPAmAbの特異性をジステアロイル-ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、S1P、セラミド及びセラミド-1-ホスフェートなどのLPA関連生体脂質へのそれらの結合について評価した。ジステアロイルPA及びLPC、LPAの直接的代謝前駆体に対して交差反応性を示した抗体はなかった。実施例2:マウス抗LPA抗体のクローニング-概要ヒトIgG1免疫グロブリンのFc領域を有するハイブリドーマからの3種類のマウス抗体の1つの活性LPA結合領域を含有する可変ドメインFvを用いて、LPAに対するキメラ抗体を作製した。当業者が認識するように、IgG1のフレームワーク領域などのヒト抗体フレームワーク領域例えばFr1、Fr4などとともにマウス抗LPAmAbの相補性決定領域CDR、例えばCDR1-4を移植することによって、ヒト化抗体を作製することができる。LPAに対するマウスmAbのクローニングのための全体的なストラテジーは、各抗体からの軽鎖VL及び重鎖VH両方のマウス可変ドメインをクローニングすることからなる。この遺伝子のコンセンサス配列は、定常領域断片がγアイソタイプと一致し、軽鎖がκアイソタイプと一致することを示す。ヒト抗体軽鎖CLの定常ドメインと一緒に及びヒト重鎖の定常ドメインCH1、CH2及びCH3とともにマウス可変ドメインをクローニングし、その結果、キメラ抗体コンストラクトが得られる。この過程及び結果として得られるキメラ抗体は、共同所有の上記米国特許出願公開第20100034814号でさらに詳細に記載されている。上述の’814刊行物に記載されるような標準的方法を用いてマウスVH及びVLドメインをクローニングし、配列決定を行った。下記表4-8は、5種類のマウス抗LPAモノクローナル抗体クローンに対する可変VH及びVLドメインの相補性決定領域CDRに対するアミノ酸配列を示す。各CDRH1アミノ酸配列の場合、Kabatにより定義されるCDRは、示される10アミノ酸配列である。太字で示されるKabat配列の5アミノ酸の部分は、カノニカルなCDRH1配列である。対応する核酸配列は米国特許出願公開第20100034814号で見出される。Chofhia/AbMに従い定義されるCDRH1配列は、示される10アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の5アミノ酸部分NYLIE;配列番号7は、Kabatに従い定義されるCDRH1配列である。Chothia/AbMに従い定義されるCDRH1配列は、示される10アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の5アミノ酸部分NYLIE;配列番号7は、Kabatに従い定義されるCDRH1配列である。Chothia/AbMに従い定義されるCDRH1配列は、示される10アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の5アミノ酸部分NYLIE;配列番号7は、Kabatに従い定義されるCDRH1配列である。Chothia/AbMに従い定義されるCDRH1配列は、示される10アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の5アミノ酸部分NYLIE;配列番号7は、Kabatに従い定義されるCDRH1配列である。Chothia/AbMに従い定義されるCDRH1配列は、示される11アミノ酸配列である。太字で示されるこの配列の6アミノ酸部分SGYYWT;配列番号23は、Kabatに従い定義されるCDRH1配列である。下記表9-13は、マウス抗LPA抗体可変ドメインのアミノ酸配列を示す。実施例3:マウス抗体B7マウス抗体クローンB7は、シグナル伝達脂質LPAに対する高い親和性を有しBiaCoreアッセイにおいて及び直接結合ELISAアッセイにおいて表面プラズモン共鳴により明らかにされる場合1-50pMのKD;さらに、B7は、LPAに対して高い特異性を示し、一部がLPAと構造的に類似する20種類以上の生物活性脂質を含む、100以上の様々な生物活性脂質及びタンパク質に対しては結合親和性を示さない。マウス抗体は、総分子量155.5kDaの2本の同一の軽鎖及び2本の同一の重鎖から構成される全長IgG1kアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性は下記表14でまとめる。B7は、サイトカイン放出、移動及び浸潤など予備的な細胞に基づくアッセイにおいても生物学的活性を示し;これらは、LPAアイソフォーム及びその他の生物活性脂質に対するB7の特異性及びインビトロでの生物学的効果を示すデータとともに下記表15でまとめる。LPAに対するB7/LT3000の強力かつ特異的な結合の結果、細胞外LPAの利用可能性が低下しLPAの有効濃度の低下、これは治療上有効である可能性がある。第二のマウス抗LPA抗体であるB3も下記表16で示されるような結合分析に供した。実施例4:LpathomabB7、LT3000のヒト化本願発明と同一出願人によるものであり、それらの全体において本明細書中にその内容が組み込まれる、米国特許出願公開第20100034814及び米国特許出願第12/761,584号及び対応外国出願PCT/US10/31339において完全に記載されるように、LPAに対する高い親和性、特異性及び結合能を保持する抗体を作製することを目的として、マウスCDRをヒトフレームワーク領域FRに移植することによってマウス抗LPAモノクローナル抗体B7の可変ドメインをヒト化した。ヒト化変異体の改変LT3000VH及びVLからのKabatCDRを受容側のヒトフレームワークに移植することによって、マウス抗LPA抗体をヒト化した。血清不含条件下で7種類のヒト化変異体をHEK293細胞において一過性に発現させ、精製し、次いでアッセイパネルにおいて特徴を調べた。作製のために各軽鎖及び重鎖の配列を含有するプラスミドを哺乳動物細胞に形質移入した。培養5日後、定量的ELISAを用いてmAbタイターを測定した。重及び軽鎖の全ての組み合わせから、細胞培養物1mLあたり2から12μgのmAbが得られた。CDRを形成する残基に対して並置されるFR残基を同定するためにヒト化VL及びVH配列を含有する三次元3Dモデルを構築した。これらのFR残基は、CDRループ構造及び抗体が抗原に対する高い親和性及び特異性を保持する能力に影響を及ぼす可能性がある。この分析に基づき、LT3000とは顕著に異なるとみなされる、AJ002773中の6残基及びDQ187679中の3残基を同定し、マウス配列に戻す突然変異について検討した。フレームワーク選択及び復帰突然変異の同定は、DataMabs,LLP,Radlett,Hertfordshire,UKにより行われた。ヒト化変異体の一覧を下記表17でまとめる。調べた全ての変異体の軽鎖内に存在するI2V突然変異は、CDRL3における残基の提示を支持する。他の軽鎖復帰突然変異には、溶媒曝露状態であるQ45K及び、CDRの反対側の可変ドメイン側に位置する保存的Y87F突然変異が含まれる。それらの位置に基づき、重鎖復帰突然変異は、mAbの安定性及びLPA-結合特性に影響を及ぼす可能性がより大きいと思われる。I24A及びV28Gは、CDRH1を形成する残基を支持し、一群の復帰突然変異I37V、M48I、V67A及びI69Lは、折りたたまれている可変ドメインの安定性及びCDRH2の位置に影響を与えると思われる疎水性相互作用の複雑なネットワークを形成する。完全ヒト化、抗LPAモノクローナル抗体の開発に対するリード候補を同定するために、LPA結合、温度安定性及び放出サイトカインにおけるこれらの復帰突然変異の役割を調べた。ヒト化変異体の発現血清不含条件下、HEK293細胞中で、上記の表で示されるヒト化変異体を一過性に発現させ、精製し、次いでアッセイパネルにおいて特徴を調べた。作製のために各軽鎖pATH500シリーズ及び重鎖pATH600シリーズの配列を含有するプラスミドを哺乳動物細胞に形質移入した。培養5日後、定量的ELISAを用いてmAbタイターを測定した。重及び軽鎖の全ての組み合わせから、細胞培養物1mLあたり2から12μgの抗体が得られた。還元条件下でのSDS-PAGEから、軽及び重鎖の予想質量と適合する25kDa及び50kDaの高い純度>98の2本のバンドが明らかになった。非還元条件下で~150KDaの予想質量の1本のバンドが観察された。ヒト化変異体の特徴評価ヒト化変異体の結合親和性、結合能、回収率、効力及び安定性について、それらの生物物理学的特性の特徴評価を行った。ヒト化抗LPAmAb変異体全てが、キメラ抗LPA抗体LT3010としても知られる。及びマウス抗体LT3000と同等の低ピコモル範囲の結合親和性を示した。ヒト化変異体の全てが、LT3000と同等であるか又はより高いTMを示し、殆どがおよそ71°CのTmを有した。特異性に関して、ヒト化変異体は、LT3000と同等の特異性プロファイルを示した。例えば、LT3000は、リゾホスファチジルコリンLPC、ホスファチジン酸PA、リゾホスファチジン酸の様々なアイソフォーム14:0及び18:1LPA、環状ホスファチジン酸cPA及びホスファチジルコリンPCに対して交差反応性を示さなかった。哺乳動物細胞における抗体発現及び産生ハイブリドーマからマウス抗体遺伝子をクローニングした。ヒトフレームワーク配列及びマウスCDRを含有する合成遺伝子を合成オリゴヌクレオチドから組み立て、平滑末端制限部位を用いてpCR4Blunt-TOPOにクローニングした。配列決定を行い、100配列調和を観察した後、重及び軽鎖をクローニングし、重鎖遺伝子に対してpConGammaベクターを、軽鎖遺伝子に対してpConKappaベクターを用いて全長IgG1キメラ抗体として発現させたLonzaBiologies、PortsmouthNH。これらの遺伝子のそれぞれに対する発現カセットは、プロモーター、Kozak配列及びターミネーターを含有した。これらのプラスミドをE.コリに形質転換しOneShotTop10化学的コンピーテントE.コリ細胞、Invitrogen、CatNo.C4040-10、LB培地中で増殖させ、グリセロール中で保存した。製造者Qiagen、エンドトキシン不含MAXIPREP商標キット、Cat.No.12362により記載のようにして大量のプラスミドDNAを調製した。293フェクチンを用い、培養のために293F-FreeStyleMediaを用いて、ヒト胎児腎臓細胞株293Fにプラスミドを形質移入した。形質移入培養物は、およそ2-12mg/Lのヒト化抗体を発現した。抗体精製プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて培養上清からモノクローナル抗体を精製した。0.5mLのProSep-vA-UltraレジンMillipore、Cat.No115115827を含有するアリコートを自然落下型gravity-flow使い捨てカラムPierce、Cat.No29924に添加し、10から15mLの結合緩衝液Pierce、Cat.No21001で平衡化した。一過性発現ヒト化抗体を含有する培養上清を結合緩衝液で1:1希釈し、レジンに通した。カラム上に保持された抗体を15mLの結合緩衝液で洗浄し、低pH溶出緩衝液Pierce、Cat.No21004で溶出し、pHを中和するために100μLの結合緩衝液を含有する1mL分画中で回収した。1LのPBS緩衝液Cellgro、Cat.No021-030に対して、吸収280nmが>0.1である分画を一晩透析したSlide-A-Lyzerカセット、3500MWCO、Pierce、Cat.No66382。セントリコン-YM50Amicon、Cat.No4225濃縮装置を用いて透析済み試料を濃縮し、0.22μM酢酸セルロース膜Costar、Cat.No8160を通じてろ過した。SDS-PAGEを用いて各標品の純度をアクセスした。定量的ELISA定量的ELISAを用いて抗体タイターを調べた。ヤギ抗ヒトIgG-Fc抗体BethylA80-104A、1mg/mLを炭酸緩衝液100mMNaHCO3、33.6mMNa2CO3、pH9.5中で1:100希釈した。100μL/ウェルの被覆溶液を37°Cで1時間温置することによってプレートを被覆した。このプレートをTBS-T50mMTris、0.14MNaCl、0.05tween-20、pH8.0で4回洗浄し、37°Cで1時間、200μL/ウェルのTBS/BSA50mMTris、0.14MNaCl、1BSA、pH8.0でブロッキング処理した。2つ組で操作を行うのに十分な量の試料及び標準物質を非結合プレート上で調製した。次の濃度:500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL及び0.0ng/mLに、TBS-T/BSA50mMTris、0.14NaCl、1BSA、0.05Tween-20、pH8.0中でヒト参照血清BethylRS10-110;4mg/mLを希釈することによって、標準物質を調製した。TBS-T/BSA中で適切な希釈液を調製することによって試料を調製し、試料の光学密度ODが標準物質の範囲内に入るようにし、最も直線的な範囲は125ng/mL15.625ng/mLであった。このプレートをTBS-Tで4回洗浄した後、100μLの標準物質/試料標品を各ウェルに添加し、37°Cで1時間温置した。次に、このプレートをTBS-Tで4回洗浄し、37°Cで1時間、TBS-T/BSA中で1:150,000希釈した100μL/ウェルのHRP-ヤギ抗ヒトIgG抗体BethylA80-104P、1mg/mLとともに温置した。このプレートをTBS-Tで4回洗浄し、4°Cに冷却した100μL/ウェルのTMB基質を用いて発色させた。7分後、1MH2SO4100μL/ウェルで反応を停止させた。450nmでODを測定し、GraphpadPrizmソフトウェアを用いてデータを解析した。4パラメーター方程式を用いて標準曲線をフィットさせ、試料中のヒトIgG含量を計算するために使用した。直接結合ELISA直接結合ELISAアッセイを用いてヒト化抗体のLPA-結合親和性を調べた。37°Cで1時間、0.1M炭酸緩衝液pH9.5中で希釈したImjectマリエイミドmalieimide活性化ウシ血清アルブミンBSAPierceCo.に結合させた1.0μg/mLC12:0LPAで、マイクロタイターELISAプレートCostarを一晩被覆した。PBS137mMNaCl、2.68mMKCl、10.1mMNa2HPO4、1.76mMKH2PO4;pH7.4でプレートを洗浄し、PBS/BSA/tween-20で室温にて1時間又は4°Cで一晩、ブロッキング処理した。最初の温置室温で一時間に対して、抗LPA抗体の希釈系列0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.0125μg/mL及び0μg/mLをマイクロプレートに添加した100mL/ウェル。プレートを洗浄し、1:20,000希釈した100μL/ウェルのHRP結合ヤギ抗ヒトHLJackson、cat109-035-003とともに室温で1時間温置した。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質Sigma、catNoT0440を用いてペルオキシダーゼを発色させ、1MH2SO4を添加することによって停止させた。ThermoMultiskanEXを用いて450nmで光学密度ODを測定した。GraphpadPrismソフトウェアを用い、4パラメーター方程式を用いて用量反応曲線の最小二乗法フィットによってEC50最大半量結合濃度を調べた。ヒト化抗体、LT3015のEC50を調べたところ、75.6ng/mLであり、一方でマウス抗体、LT3000のEC50は65.3ng/mLであった。LPA競合ELISA競合ELISAによってヒト化抗体の特異性を調べた。炭酸緩衝液100mMNaHCO3、33.6mMNa2CO3、pH9.5でC18:0LPA被覆物質を0.33μg/mLに希釈した。プレートを100μL/ウェルの被覆溶液で被覆し、37°Cで1時間温置した。このプレートをPBS100mMNa2HPO4、20mMKH2PO4、27mMKCl、1.37mMNaCl、pH7.4で4回洗浄し、150μL/ウェルのPBS、1BSA、0.1tween-20で室温にて1時間ブロッキング処理した。5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM及び0.0μMで脂質競合物質14:0LPAAvanti、Cat.No857120、18:1LPAAvanti、Cat.No857130、18:1LPCAvanti、Cat.No845875、cLPAAvanti、Cat.No857328、18:1PAAvanti、Cat.No840875、PCAvanti、Cat.No850454に対して、ヒト化抗LPA抗体を試験した。この抗体をPBS、0.1tween-20中で0.5μg/mLに希釈し、非結合プレート中で、抗体と試料との1:3比で脂質試料と合わせた。このプレートをPBSで4回洗浄し、100μL/ウェルの一次抗体/脂質複合体とともに室温で1時間温置した。次に、このプレートをPBSで4回洗浄し、PBS、1BSA、0.1tween-20中で1:20,000希釈した100μL/ウェルのHRP結合ヤギ抗ヒト抗体とともに室温で1時間温置した。再びプレートをPBSで4回洗浄し、TMB基質100μL/ウェルを用いて4°Cで発色させた。8分後、100μL/ウェルの1MH2SO4により反応を停止させた。ThermoMultiskanEXを用いて光学密度ODを450nmで測定した。生データを解析のためにGraphPadソフトウェアに移した。ヒト化mAbLT3015に対するIC50を調べたところ、0.08μMであり、一方で、対応するマウス抗体、LT3000に対するIC50は0.28μMであった。温度安定性直接結合ELISAを用いて、加熱後LPA-結合親和性EC50を測定することによって、ヒト化抗体の温度安定性を調べた。PBSCellgo、Cat.No021-040中で溶解させた抗体を25μg/mLに希釈し、60°C、65°C、70°C、75°C及び80°Cで10分間温置した。温度を上昇させる前に、各試料を10μL採取し、90μLのPBSで希釈し、氷上で保存した。次に、試料を短時間、ボルテックスにより混合し、13,000rpmで1分間遠心することにより不溶性物質を除去した。直接的LPA-結合ELISAを用いて上清の結合活性を調べ、加熱処理以外は同じ試料からなる対照と比較した。ヒト化抗体、LT3015に対するTmを調べたところ、71.5°Cとなり、Tmが67°Cであったマウス親抗体、LT3000よりも高かった。表面プラズモン共鳴全結合データをProteOn光学バイオセンサーBiorad、HerculesCA上で回収した。12:0LPA-チオール及び18:0LPA-チオールをマレイミド修飾GLCセンサーチップCat.No176-5011に連結させた。最初に、スルホ-NHS/EDCの等量混合物で7分間、GLCチップを活性化し、続いてエチルジアミンを用いて7分間、ブロッキング処理段階を行った。次に、HBSランニング緩衝液10mMHEPES、150mMNaCl、0.005tween-20、pH7.4中0.5mMの濃度で、スルホ-MBSPierceCo.,cat22312を表面全体に行き渡らせた。LPA-チオールをHBSランニング緩衝液に入れて10、1及び0.1μMの濃度に希釈し、7分間注入し、3種類の密度が異なるLPA表面を生成させた-100、-300及び-1400RU。次に、最大濃度として25nMから始まる3倍希釈系列を用いてヒト化抗体に対する結合データを回収したオリジナル保存液をそれぞれ1から100に希釈。10秒間の100mMHClパルスにより表面を再生した。全データを25°Cで回収した。参照表面ならびにブランク注入を用いて対照を処理した。各表面からの反応データから、様々な程度の多価結合により引き起こされたと思われる複雑な結合挙動が示された。結合定数の推定を抽出するために、1サイト及び2サイトモデルを用いて様々な抗体濃度からのデータを全体的にフィットさせた。これにより、2価サイト1及び1価サイトサイト2に対する親和性の推定値が得られた。LPAモル結合能置換アッセイを用いてLPA:mAbのモル比を調べた。乾燥窒素気流を用いて5ナノモルのビオチン化LPA脂質50μgEchelonBioscienes、Cat.NoL-012B、LotNoF-66-136を705μLの1:1クロロホルム:メタノール中で懸濁し、100μM溶液を得た。でホウケイ酸チューブFisherbrand、Cat.No14-961-26を被覆した。PBSCellgro、Cat.No021-030中で溶解した75μL125pモルの抗体とともに室温で被覆チューブを温置した。温置3時間後、タンパク質脱塩カラムPierce、Cat.No89849を用いてLPA:mAb複合体を遊離脂質から分離し、製造者の説明書に従い、HABA/アビジン置換アッセイPierce、Cat.No28010を用いて結合ビオチン化LPAのモル濃度を測定した。SKOV3細胞におけるLPA-誘導性IL-6及びIL-8放出の測定抗LPA抗体は、SKOV3卵巣細胞の馴化培地中でヒトCXCL8/IL-8のLPA依存性放出を阻害し、このことから、これらの抗体が生物学的に活性であることが示唆される。2mLの1xトリプシンEDTAMediatechInc、Cat.No25-053-CVを用いてSKOV3細胞LotNo4255558、継代数14を回収し、8mLの完全培地10FBS、MediatechInc.Cat.no35-011-CV中で再懸濁した。この細胞を5分間11,000rpm遠心し、5mLの完全培地中で再懸濁した。0.4トリパンブルー10μL細胞90μLトリパンブルー、Invitrogen、Cat.No15250-061を用いて血球計算盤を使用し、2つ組みで細胞数を数えた。96ウェルプレート中で、細胞1x105個/ウェルを播種した最終体積100μL/ウェル。37°Cで一晩温置することにより細胞を接着させ、コンフルエントの単層を形成させた。翌日、最小培地L-グルタミン含有のマッコイ培地中1mg/mLBSA、Mediatech、Cat.No10-050-CVで細胞を穏やかに2回洗浄した。この培地を1ペニシリン/ストレプトマイシンMediatech、Cat.No30-002CI及び2.2g/L重炭酸ナトリウムMediatech、Cat.No25-035-CIに調整した。次に、細胞を37°Cで正確に24時間、血清飢餓状態にし、続いてヒト化LPA抗体LT3015150、300又は600μg/mL存在下又は非存在下で、1時間にわたり予め温置した1mg/mLBSA/PBSCalbiochem、Cat.No126575中で溶解させた1μMC18:1LPAAvanti、Cat.No857130によりサイトカイン刺激を行った。次に、細胞に対してトリートメントtreatmentsを添加した。サイトカイン刺激22時間後、細胞を4°Cで5分間遠心し13,500rpm、上清細胞-馴化培地を回収した。販売者の説明書RDSystems、MinneapolisMN、Cat.NoD8000Cに従い、QuantikineヒトCXCL8/IL-8ELISAキットを用いて、各上清中のCXCL8/IL-8レベルを測定した。QuantikineヒトIL-6免疫アッセイキットRDsystems、Cat.No.D6050を用いてELISAによってIL-6レベルを測定した。片側ANOVA、続いてボンフェローニの事後検定によりデータを解析し、ヒトIL-8又はヒトIL-6の倍単位での増加として表した。データは下記表18及び表19で示す。p<0.05、p<0.001及びp<0.001、n=3疾患モデルでのLT3015の活性LT3015は、スクラッチアッセイにおいて卵巣腫瘍細胞移動を阻止することが示されており、さらに、卵巣腫瘍SKOV3の進行を抑制し、マウス体液中の循環サイトカインを減少させることが示された。さらなる詳細については、本願発明と所有者が共通し、その全体において参照において本明細書中に組み込まれる2010年4月16日出願の米国特許出願第12/761,584号代理人整理番号LPT-3210-UTを参照のこと。実施例5:ヒト化抗LPA可変領域配列マウス抗体B7及びマウス抗体B3重鎖の及びB3重鎖の、さらなるヒト化抗LPA変異体を上述のように作製した。ヒト化抗LPAモノクローナル抗体変異体の可変領域のアミノ酸配列を下記表20及び22で示す。対応するヌクレオチド配列情報は本願発明と所有者が共通し、その全体において本明細書中に組み込まれる2010年4月16日出願の米国特許出願第12/761,584号代理人整理番号、LPT-3210-UTで見出され得る。表20及び22において、復帰突然変異は太字で示す。CDR配列は灰色で示す。カノニカルな残基は、それらが関連するCDR1、2又は3に従い付番する。表21及び23において、復帰突然変異の種類及び位置を提供する。注目すべきは、ヒト化重鎖変異体B7-608ベクター名:pATH608が、マウスB7抗体に存在しないCDRH2突然変異L50Aの最初の位置においてロイシンからアラニンへの突然変異を含有することである。従って、この変異体のCDRH2配列は、配列AINPGSDYTNYNENFKG配列番号34を有する実施例6:細胞株開発のためのベクターpATH3015の作製LT3015は、高親和性で生物活性脂質リゾホスファチジン酸LPAに結合する組み換えヒト化モノクローナル抗体である。LT3015は、総分子量が150kDaの、2本の同一の軽鎖及び2本の同一の重鎖からなる全長IgG1kアイソタイプ抗体である。重鎖はN結合型グリコシル化部位を含有する。2本の重鎖は、ヒトIgG1の構造と調和する2つの分子間ジスルフィド結合を通じて互いに共有結合される。LT3015は元来、LPAで免疫付与されたマウスから作製されたハイブリドーマを用いて産生されたマウスモノクローナル抗体由来であった。マウス抗体のヒト化は、マウス親抗体に対するその構造類似性について選択されたヒト抗体フレームワークの相補性決定領域CDRの代わりに、6個のマウス相補性決定領域CDRを挿入することを含む。ヒト化抗体を改変するためにフレームワークにおいて一連の置換を行った。これらの置換は復帰突然変異と呼ばれ、抗原との相互作用に関与するマウス残基でヒト残基を置き換える。最終的なヒト化抗体は、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける6個のマウス復帰突然変異pATH602及び軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける3個のマウス復帰突然変異pATH502を含有する。ベクターpATH3015を作製するために、LonzaBiologiesのGS遺伝子発現系のベクターIgG1kにヒト化抗LPAモノクローナル抗体の可変ドメインをクローニングした。この発現系は、抗体遺伝子の定常ドメイン及び選択可能マーカー、グルタミンシンテターゼGSを保有する発現ベクターからなる。GSは、グルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの生合成に関与する酵素である。細胞が外からのグルタミンなしで生存するために十分なグルタミンを与えるチャイニーズハムスター卵巣CHOK1SV細胞株に、抗体遺伝子及び選択可能マーカーの両方を保有するベクターを形質移入した。さらに、内因性GS活性を阻害するために、特異的なGS阻害剤、メチオニンスルホキシミンMSXを培地中に補給し、ベクターにより提供されるGS活性がある細胞のみが生存し得るようにした。MSX存在下でのグルタミン不含培地中での増殖能に関して、形質移入細胞を選択した。pATH3015を作製するための、LonzaBiologicsのGS遺伝子発現系の二重遺伝子ベクターIgGlκへのヒト化抗LPAモノクローナル抗体の可変ドメインのクローニング段階のさらなる詳細は、本願発明と所有者が共通し、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、2010年4月16日出願の米国特許出願第12/761,584号代理人整理番号LPT-3210-UTで見出され得る。血清不含培地中での増殖に馴化させたLonza特許チャイニーズハムスター卵巣CHOK1SV宿主細胞株へ、エレクトロポレーションによりpATH3015を導入した。この形質移入由来の細胞株をLH2と名付け、製剤原料を調製するために使用する。発現された薬物LT3015は次の特徴を有する:pATH3015と同様にpATH3016を作製した。上述のように、pATH3015及び3016の重鎖は同一であるがpATH602由来、6個の復帰突然変異を有する。、pATH3016軽鎖pATH506由来が含有する復帰突然変異は、I2Vの僅か1個のみである。pATH3016から作製されるヒト化モノクローナル抗体はLT3016である。pATH3015及びpATH3016の両者ともAmericanTypeCultureCollectionManassasVAに寄託し、それぞれATCC特許寄託番号PTA-9219及びPTA-9220を有する。ヒト化変異体の活性5種類のヒト化変異体LT3011、LT3013、LT3014、LT3015及びLT3016をインビトロ細胞アッセイにおいてさらに評価した。LPAは、癌細胞からのインターロイキン-8IL-8の放出を誘発することにおいて重要な役割を果たすことが知られている。LT3000は、濃度依存的に卵巣癌細胞からのIL-8放出を低下させた。これらのヒト化変異体は、LT3000と比較して、同等なIL-8放出低下を示した。一部のヒト化変異体については、血管新生に対するマトリゲル管腔形成アッセイにおいて、それらの微小血管密度MVDへの影響に関しても試験した。両者とも、MVD形成を減少させることが示された。ヒト化抗LPA抗体LT3015Lpathomabとも呼ばれる。をさらなる特徴評価のために選択した。本ヒト化mAbは、マウス親抗体、B7の結合、特異性及び温度安定性を保持する。別のヒト化抗LPA変異体、LT3114も、さらなる特徴評価及びLT3015との比較のために選択した。マウスモノクローナル抗体B3に基づき、LT3114をヒト化したが、これは2本のpATH702軽鎖及び2本のpATH804重鎖を有するこれらの配列及び復帰突然変異の位置及び種類は上記表20-23で示す。。LT3114及びLT3015の開発及び特徴評価結合LPAに対する高親和性及び特異性を保持するヒト化抗体を作製することを目的とし、Lpathomabをヒト化した。選択されたヒト抗体フレームワークのIgGk1重及び軽鎖可変ドメインの6個の相補性決定領域CDRを、マウス抗LPAmAb、Lpathomab由来のKabatで定義されるCDRで置換することによって、マウス抗体のヒト化を達成した。ヒト化抗体の抗原との相互作用を最大化するために、フレームワークにおいて一連の復帰突然変異を行った。いくつかのヒト化変異体を改変し、哺乳動物細胞で発現させ、マウスLpathomabと殆ど同じようにLPAに結合することが示された。LPAに対するヒト化変異体の結合親和性及び関連脂質に対するそれらの交差反応性について、ヒト化変異体の特徴評価を行った。ELISAに基づく競合-結合アッセイにおいて、ヒト化抗LPA抗体、LT3015、LT3114及びマウスmAb、B3の特異性を測定した。簡潔に述べると、ヤギ-抗ヒト又はマウスIgGで予め被覆したELISAプレート上で抗体を捕捉させた。競合脂質の一連の希釈液を固定量のビオチン標識化18:0LPAの存在下で結合させた。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、結合した標識化LPAを検出した。特異性に関して、本ヒト化変異体は、競合ELISAにより、LPC、PA、PC、血小板活性化因子PAF又はリゾ-PAFへの交差反応性がないこと及び環状LPAcLPAとの交差反応性が最小限であることを含め、Lpathomabと同様の特異性プロファイルを示した図1。LPAの異なるアイソフォームに対する異なる抗体の親和性を比較するために、競合結合ELISAも使用した。ELISAに基づく競合-結合アッセイにおいて、ネイティブ18:1及び18:2LPAに対する抗体の親和性を測定した。簡潔に述べると、ヤギ-抗ヒト又はマウスIgGで予め被覆したELISAプレート上で抗体を捕捉させた。ネイティブ脂質の一連の希釈液を固定量のビオチン標識化18:0LPAの存在下で結合させた。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを用いて、結合した標識化LPAを検出した。GraphPadPrismソフトウェアにおいてCheng及びPrusoffの式を用いて、競合結合データをフィットさせることによって、ネイティブ脂質への各抗体結合に対するKiを調べ、別個の飽和結合ELISA実験において、ビオチン-標識化LPAに対する各抗体のKdを調べた。この2種類のヒト化抗体候補LT3114及びLT3015及び元のマウス抗LPA抗体B3と呼ばれる。に対する代表的データを図2で示す。これらのデータから、18:1及び18:2LPAに対する競合結合曲線が示される。ヒト化抗体変異体、LT3114及びLT3114CDRが由来したマウス抗体B3は、ネイティブ脂質に対して基本的に同一の結合特徴を有し、Kiは、18:2LPAに対して15nMであり、18:1LPAに対して360nMであった。2種類のLPAアイソフォームに対するLT3015ヒト化抗体変異体のKiは幾分低く、18:2に対して200nMであり、18:1LPAに対して600nMであった。16:0、18:0及び20:4LPAアイソフォームに対する結合も調べた。各場合において、ヒト化抗体LT3114による結合は、元のマウスB3抗体により得られたものと同一であった。Lpathomabは、LPA1受容体へのLPAの結合を阻止し、細胞活性化を妨げることができることが明らかになっている。ヒト化mAb、LT3114及びLT3015の、LPA1過剰発現細胞におけるLPAによる刺激の阻害能を試験した。LPA1受容体形質移入細胞に、18:0、18:1、18:2又は20:4LPAとともにマウス抗体B3及びヒト化抗体LT3114及びLT3015の漸増濃度0-1、500μg/mLを添加し、それらの受容体シグナル伝達阻止能について試験した。全3種類の抗体が、各被験脂質に反応したLPA1受容体シグナル伝達を効果的に阻害した。実施例7:Lpathomabの動物薬物動態予備試験Lpathomabを用いてPK予備試験を行った。IV投与群の場合、単回30mg/kg用量をマウスに注射し、15日後までに屠殺した。抗体はi.p.でも投与し、最初の24時間内に動物を屠殺し、この時間内で様々な送達経路に対して血中mAbレベルを比較した。WinNonlinによって薬物動態パラメーターを評価した。3匹のマウスを各時点で屠殺し、血漿試料を回収し、ELISAによってmAbレベルについて分析した。マウスにおけるLpathomabの半減期を調べたところ、i.v.投与では102時間4.25日であった。さらに、i.p.で投与した場合、6-12時間以内に本抗体が血液に完全に分布し、このことから、i.p.投与が適切であることが示唆された。パラメーターを計算するために使用したソフトウェア:WinNonlinv1.1AUC曲線下面積K10-HL排泄半減期Cmax用量関連ピーク値ClクリアランスAUMC一次モーメント曲線下の面積MRT平均滞留時間Vssみかけの分布体積、定常状態実施例8:抗LPAmAbはLPA誘発性IL-6放出を阻害する。IL-6は、強力な疼痛発生炎症性メディエーターである。IL-6は、末梢神経損傷後、ラット脊髄で産生され、IL-6レベルのレベルはアロディニアの強度と直接相関がある。Arruda,etal.2000,BrainRes.879:216-25。IL-6レベルはストレス又は炎症の最中に上昇し、関節リウマチは、滑液中のIL-6レベルの上昇を伴う。Matsumoto,etal2006,Rheumatol.Int.26:1096-1100;Desgeorges,etal.1997,J.Rheumatol.24:1510-1516。神経因性疼痛はIL-6ノックアウトマウスにおいて阻止される。Xu,etal1997,Cytokine9:1028-1033。初代星状膠細胞において、LPA1μMでの処理によって、IL-6放出が起こる。初代星状膠細胞でのIL-6放出における抗LPA抗体の影響を評価するために実験を行った。CambrexCharlesCity、IAからラット初代星状膠細胞を購入し、販売者の説明書に従い培養した。IL-6放出アッセイに対して、細胞1x104個/ウェルの密度で96ウェルプレートに細胞を播種し、血清不含培地中で24時間にわたり血清飢餓状態にした。血清飢餓後、マウス抗LPAモノクローナル抗体B3150又は300mg/mL抗体1:1又は1:2モル比、mAb:LPA;5CO2湿潤恒温槽中、37°Cで1時間の存在下又は非存在下で予め温置した1mMLPAPBS中1mg/mL脂肪酸不含BSAで可溶化により初代星状膠細胞を処理した。24時間後、馴化培地を回収し、販売者の説明書に従い、ヒトIL-6ELISARatIL-6QuantikineKit、RDsystems、MinneapolisMNにより試験した。GraphPadソフトウェアLaJollaCAを用いてIL-6値pg/mLを計算した。B3抗体1:1又は1:2、mAb:LPAのモル比濃度の存在下又は非存在下で1mMLPAとともに24時間温置した後、ヒト初代星状膠細胞からの細胞馴化培地をIL-6レベルについて試験した。比が2:1である、LPALPAに対する抗体マウス抗体B3での処理によって、IL-6放出が阻止されただけでなく、IL-6レベルが対照レベルのおよそ半分に低下した。1:1の比のLPA抗体によって、IL-6レベルがほぼ同程度に低下した。従って、抗LPAmAbは、LPAによる星状膠細胞処理に反応して起こるIL-6放出を阻止する。実施例9:LPAに対する抗体は、糖尿病誘発性神経因性疼痛モデルにおけるアロディニアを軽減する。糖尿病誘発性神経因性疼痛の行動指標としてホルマリン試験中の触覚アロディニア及び痛覚過敏を用いて、ストレプトゾトシン誘発性1型インスリン欠損糖尿病のラットモデルにおいて試験を行った。実験手順は全て公開されている。CalcuttNA,FreshwaterJD,O’BrienJS2000,Anesthesiology93:1271-1278;JolivaltCG,RamosKM,HerbetssonK,EschFS,CalcuttNA2006,Pain121:14-21。体重225-250グラムの雌Sprague-DawleyラットHarlanIndustries、SanDiegoCAをそれぞれ30から70の相対湿度、65から82oFの室温で維持した。飼育室は、毎日12時間の明/暗サイクルで蛍光灯により照明を点灯した。全動物をケージあたり2匹ずつ、乾燥餌及び水道水を自由に摂取できるようにして維持した。一晩絶食させた後、0.9滅菌生理食塩水中で溶解させたストレプトゾトシン55mg/kgの単回IP注射によってインスリン欠損糖尿病を誘発した。4日後及びまた行動試験前にも、ストリップオペレーテッドstripoperated反射率計を用いて、尾部突き刺しにより得た血液試料中で高血糖を確認した。全動物を毎日観察し、試験期間中、定期的に体重測定を行った。触覚応答閾値:底部がメッシュ状の試験ケージにラットを移し、順応させた。肢逃避footwithdrawalに対する50機械的閾値を調べるために、VonFreyフィラメントStoelting、WoodDaleILを使用した。フィラメントが曲がる圧力で、2.0gのバックリング重量を有するものから始まる一連のフィラメントを、右後肢の足底面に順に適用した当てた。肢の持ち上げを陽性応答として記録し、次に軽いフィラメントを次の測定に選択した。5秒後に応答がない場合、より重い次のフィラメントを使用するものとした。行動の最初の変化後4回の測定が行われるまで又は5回連続して陰性スコアを15gとする。もしくは4回陽性スコアを0.25gとする。スコアが生じるまで、このパラダイムを継続した。50応答閾値を挿入するために、得られた一連の陽性及び陰性スコアを使用した。50触覚応答閾値が6gを下回るラットのみをアロディニア性であるとみなし、薬物試験に進めた。ホルマリン試験:ラットを手で拘束し、ホルマリン0.2又は0.5溶液50μLを後肢背面に皮下注射した。次に、ラットを観察用チャンバーに入れ、5分ごとに1分間のブロックで、1時間にわたり、フリンチングflinching行動の回数を数えた。組織回収:拘束したラットから尾部突き刺しにより血液を採取し、ストリップオペレーテッドstripoperated反射率計を用いて糖尿病ラットにおいて高血糖を確認した。血液試料あたり0.3-0.5mLは、氷上に置いたヘパリン被覆チューブに採取し、遠心し1500g、2°C、10分間、その後のアッセイのために血漿を-70°Cで保存することもできる。CSF20-50μLを回収し、-70°Cで保存した。末梢中枢神経軸及び脊髄の一部を採取して固定液に入れるか又はその後のアッセイのために解剖時に-70°Cで保存した。実験計画4群の糖尿病ラット及び1群の対照ラットを確立し、高血糖1週間後にアロディニアについて試験した。ラットにITカテーテルを埋め込み、IV尾部静脈及びIT注射の両方により処置した。ラットは、第2週及び第3週の間、各経路により週に2回の処置を受けた月曜/木曜はIT、火曜/金曜はIV。IT月及びIV火の処置から1、3及び6時間後に処置ラットにおいて触覚アロディナallodynaがある場合、第4週の初め最終処置から3-4日後及びその後に触覚アロディニアについて試験した。それ以外は、未処置の糖尿病ラットにはガバペンチンによる単回処置を行い、次いで薬物投与から1、3及び6時間後に触覚アロディニアの測定を行い、陽性処置対照とした。この試験の終わりに、全ラットに対して、選択された時間に抗LPA抗体IV及び/又はIT経路、触覚試験データに基づき決定又はガバペンチンの最終注射を行った後に肢ホルマリン注射0.2を行い、誘発されたフリンチングを最長で1時間観察した。ホルマリン試験の最後に動物を安楽死させ、上述のように保存用に組織を回収した。予備実験糖尿病発症から4週間後、マウス抗LPA抗体B3で2週間にわたりラットを処置し、疼痛逃避閾値を測定するという予備実験を行った。非糖尿病マウスを対照として使用した。この予備実験において、抗LPA抗体B3によって、糖尿病ラットにおいて肢逃避閾値が上昇し、このことから、糖尿病誘発性神経因性疼痛があるラットのアロディニアの軽減が示された。これらの好ましい結果に基づき、糖尿病性神経障害の予防実験を計画し、下記のように行った。糖尿病性神経障害予防実験糖尿病誘発性神経因性疼痛の発現予防におけるマウス抗体B3の有効性を調べるために、STZでの処置によって3群の糖尿病ラットを確立した。糖尿病発症から2週間後であるが触覚アロディニアの兆候が現れる前に開始し、末梢及び中枢神経系のどちらが又は両区画が制御不能のLPAレベルを示すかに関する文献が不明なので、末梢及び中枢神経系区画の両方に抗体が確実に到達できるようにするために動物に静脈内及び髄腔内の両方で投与した。治療群に対する投与計画は、2群の試験動物に週に2回、抗体10mg/kgを静脈内投与するというものであった。静脈内投与抗体に加えて、髄腔内カテーテルを介して動物に抗体を週に2回投与した。1群の動物低用量Dには2μgの抗体を投与し、1群の動物高用量Dには10μgの抗体を髄腔内投与した。1群の糖尿病動物にはビヒクルのみを投与したVehD。非糖尿病ラットを対照として使用したVehC。第3週の初め、最終処置から4日後に、触覚応答閾値を測定した。測定結果を図3で示す。抗LPA抗体B3によって、糖尿病ラットにおいて非糖尿病ラットで観察されるものと同様のレベルまで肢逃避閾値PWTが上昇し、これにより、糖尿病誘発性神経因性疼痛があるラットにおいてアロディニアが顕著に軽減したことが示された。糖尿病性神経障害介入試験予防実験における有望な結果に基づき、次に、既存の糖尿病誘発性神経因性疼痛の可逆性を評価するために及び抗LPA抗体B3の静脈内投与と髄腔内投与とを差別化するために、その実験からの9匹の対照糖尿病ラットを使用した。これらのラットは様々な日に次の処置を受けた:第1日に対照薬としてガバペンチン腹腔内、第3日にLpathomabi.t.、第6日にLpathomabi.v.及び第12日に組み合わせi.t.i.v.。各投与後、1、3及び6時間での触覚アロディニアPW応答のその後の測定を予防実験に対して前に述べたように記録した。実験終了時に全動物を安楽死させ、組織を回収し、さらなる分析のために保存した。この実験の結果を図4で示す。肢逃避閾値に対する経時グラフ図4a及び曲線下面積AUCグラフ図4bの両方を提供する。この介入試験は、抗体の単回投与が、既存の糖尿病誘発性神経因性疼痛の改善においてガバペンチンと同程度有効であったことを示す。ビヒクルと比較した場合、静脈内抗体投与及び髄腔内投与の両方とも効果的であった。静脈内投与後の有効性は一般に、末梢神経系機構の関与を示し、一方でi.t.投与後に見られる応答は中枢神経系の関与を示唆するものと考えられる。両投与経路からのLpathomabの疼痛応答緩和能から、痛覚伝達の末梢及び中枢機構の双方にLPAが介在することが示される。これは、両投与経路を組み合わせて動物にLpathomabを投与した際にさらなる効果が認められることにより支持される。実施例10:神経因性疼痛の坐骨神経損傷モデルにおける抗LPA抗体リゾホスファチジン酸LPAは、様々な細胞タイプにおける、増殖、分化、血管形成、運動性及びアポトーシスの防御を含む複数の細胞反応に介在する内因性生物活性物質である。LPAは、坐骨神経損傷があるマウスにおいて、神経因性疼痛及び、LPA1受容体シグナル伝達を通じた基礎となる機構を開始させるUedaatal.,NatureMed,107:712-82004。実際に、LPA1-ヌルマウスは、様々な神経損傷誘発性神経因性疼痛及び脱髄、ミエリンタンパク質の下方制御及びCava2d-1及び脊髄PKCgの上方制御などのその基礎となる機構を欠く。坐骨神経SCN及び後根DRにおいて坐骨神経損傷誘発性脱髄が観察されたが、脊髄神経SNでは観察されず、LPA1受容体ノックアウトマウスにおいては、DRでは脱髄が消失していたが、SCNでは消失していなかった。何れか一方による刺激ではなくサブスタンスPNMDAによって脊髄スライスを刺激した場合、LPAレベルの顕著な時間依存的上昇があるが、これはオートタキシンの作用を通じて新たに産生されたリゾホスファチジルコリンLPCから変換されたものであるInoue,M.etal.2008,JNeurochem,1076:1556-65。従って、知覚線維の激しい刺激によりLPA産生が導かれ、次に後根線維の脱髄が起こることが明らかとなる。末梢神経因性疼痛の坐骨神経損傷誘発性モデルに加えて、脊髄損傷誘発性中枢神経因性疼痛及び中枢ストレス誘発慢性痛モデルも開発した。末梢神経因性疼痛の坐骨神経損傷誘発性モデルにおいて、抗LPA抗体を評価しSeltzer,etal.1990,Pain,432,205-218、脊髄損傷誘発性中枢神経因性疼痛及び中枢ストレス誘発慢性痛のモデルにおいても評価することができた。この実験は、長崎大学の植田弘師博士の研究室において行われた。インビボ実験体重18-22gの6週齢雄及び雌C57BL/6Jマウスを使用した。使用前に、24±2°C、湿度60±5に維持した飼育室で、標準的な実験動物用餌及び水道水を自由摂取できるようにしてこれらのマウスを個別に維持した。1部分的坐骨神経損傷PSNIモデルマウスに50mg/kgペントバルビタールで深麻酔をかけた。右又は左後肢の総坐骨神経を小さな切開部を通じて大腿のレベルで露出させ、神経厚の背側半分を絹糸できつく結紮した。2脊髄損傷SCIモデルペントバルビタール50mg/kg麻酔下で、第9胸椎でのマウスの椎弓切除後、硬膜の背面を露出させる。市販のSCI装置InfiniteHorizonimpactor、PrecisionSystemsInstrumentation、FairfaxStationVAを用いて40kdynを用いて、T9の脊髄分節で脊髄損傷を生成させる。3間欠的寒冷負荷ICSモデル第1日の午後4:30に1群あたり2匹のマウスを4±2°Cの寒冷室で維持し、餌を与え、水の代わりに寒天を与える。マウスをステンレス鋼メッシュ上に置き、プレキシガラスケージで被覆した。翌朝午前10:00に、24±2°Cの常温の部屋にマウスを移す。これらを常温に30分間置いた後、マウスを再び寒冷室に30分間入れる。午後4:30までこれらの過程を繰り返す。次に、マウスを寒冷室に一晩入れる。翌日同じ処置を行った後、最終的に午前10:00にマウスを寒冷室から出す。125mMNaCl、3.8mMKCl、2.0mMCaCl2、1.0mMMgCl2、1.2mMKH2PO4、26mMNaHCO3及び10mMD-グルコースpH7.4を含む人工脳脊髄液aCSF中で希釈した0.2μg/μLの最低濃度で抗LPA抗体B3を供給した。1PSNIモデル抗LPA抗体注射:脊髄L5とL6セグメント間でフリーハンドで抗LPA抗体の髄腔内i.c.v.又はi.t.注射を行った。5μL1μgの体積でi.c.v.又はi.t.注射を行った。侵害受容試験。デジタルvonFrey装置試験Anesthesiometer、IITCInc.、WoodlandHills、USAを用いて肢加圧試験pawpressuretestを行った。この実験において、マウスの肢逃避行動を引き起こすための所定の圧力閾値グラム単位を評価した。熱性刺激を用いて、熱性刺激肢逃避試験[Hargreaves,al.1988,Pain32:77-88]を行ったIITCInc.,WoodlandHills,CA,USA。これらの行動実験は、マウスにおいて結紮から1、3、7及び14日後に行った。タンパク質キナーゼCγ及びCaα2δ1に対する免疫組織化学:侵害受容試験第14日後、i.p.ペントバルビタールでマウスに深麻酔をかけ、K不含PBSと続いて4パラホルムアルデヒドPFAを経心的にかん流させた。L4-L5分節間の後根神経節DRG及び脊髄を除去し、4PFA中で後固定した。次に、タンパク質キナーゼCのγアイソフォームPKCγ及びCaα2δ1の免疫染色のために、切片をウサギポリクローナル抗体と反応させる。次いで、この切片をFITC結合抗ウサギIgGとともに温置する。脱髄のためのトルイジンブルー染色及び透過型電子顕微鏡:2.5グルタルアルデヒドでDR線維を固定する。固定したDR線維を2四酸化オスミウムで後固定し、段階的なアルコールシリーズ中で脱水し、Epon812中に包埋する。この切片1μmを各ブロックから切り出し、アルカリ性トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡により調べる。超薄切片80nm厚をUltracutSLeica、Austriaで切り出し、次いで酢酸ウラニル及びクエン酸鉛でそれぞれ染色する。染色した切片を電子顕微鏡下で観察するJEM-1200EX;JEOL、Tokyo、Japan。2SCIモデル抗LPA抗体注射:マウスの右側脳室に抗LPA抗体の脳室内i.c.v.又はi.t.注射を行う。i.c.v.又はi.t.注射は5μL1μgの体積で1-5回行う。侵害受容試験。SCIから2、4、8及び12週間後に、肢加圧試験及び熱性刺激肢逃避試験を行う。3ICSモデル抗LPA抗体注射:抗LPA抗体のi.c.v.又はi.t.注射を5μL1μgの体積で1-5回行う。侵害受容試験。ICSから1、3、5、12及び19日後に肢加圧試験及び熱性刺激肢逃避試験を行う。PSNI予備試験の結果を図5で示す。1.予防実験図5A:末梢神経因性疼痛を誘発する部分的坐骨神経損傷の1時間前にLPAB3に対する抗体をマウスに注射した1μg、髄腔内[Seltzer,etal.1990,Pain,432,205-218]。動物ごとに一方の後肢にのみ損傷付与を行い、損傷同側及び非損傷反対側側で疼痛応答を測定した。熱性刺激肢逃避潜時PWL試験Hargreaves,etal.,1988を使用して、疼痛反応を定量した。簡潔に述べると、ガラス面上に置いたマウスの後肢の肉趾に温熱ビームを当て、逃避応答潜時を測定した秒単位。従って、より高いより長い時間応答は疼痛が少ないことを示し、より低いより短い時間応答は疼痛がより大きいことを示す。図5Aは、部分的坐骨神経損傷により、抗体処置の非存在下では、非損傷側逆側と比較して、損傷側ipsiの疼痛応答が劇的に上昇するPWL時間の短縮ことを示す白色のバーの比較。この影響は、抗LPA抗体B3での処置により予防される黒色のバー。2.介入実験図5B:マウスにLPAに対する抗体B33μg、髄腔内を部分的坐骨神経損傷前記から3時間後に注射した。図5Bは、上述のように、部分的坐骨神経損傷により、抗体処置の非存在下では、非損傷側逆側と比較して、損傷側ipsiで疼痛応答が劇的に上昇するPWL時間の短縮ことが示される白色のバーの比較。この影響は、抗LPA抗体B3での損傷後処置によって少なくとも部分的に逆転される黒色のバー。これらの実験により、LPAが神経損傷誘発性神経因性疼痛に対する標的として立証され、神経因性疼痛の緩和においてLPAの有効濃度を低下させる抗体などのLPAの阻害剤が治療上有用であることが示唆される。事後の経時変化実験において、50mg/kgペントバルビタールでマウスに深麻酔をかけた。小さな切開部を通じて右又は左後肢の総坐骨神経を大腿のレベルで露出させ、神経厚の背側半分を絹糸できつく結紮した。損傷1時間前に抗LPA抗体を髄腔内i.t.注射し、脊髄L5とL6セグメント間でフリーハンドで行った。5μL1μgの体積でi.t.注射を行った。結紮から最長で14日後に、侵害受容行動に対する熱性刺激肢逃避Hargreaves及び肢加圧試験を行った。坐骨神経損傷誘発性末梢神経障害において、Lpathomabが1週間以上、神経因性疼痛を軽減することが分かった図6。実施例11:アジュバント誘発性関節炎AIAのラットモデルにおける抗LPA抗体の効果雌Lewisラット150-200gにおいて炎症を確立した。パラフィンオイル中で懸濁した3mgの熱殺菌ミコバクテリウムブチリクムMycobacteriumbuytricum3mg/0.150mLを第0日に投与群あたり10匹の動物の尾部に皮下注射した。対照動物にはパラフィンオイルのみを注射した。ラットに番号を割り当て、体重を毎週調べた。第9-10日までに、ラットは疾患の兆候を現し、プレシスモメーターplethysmometerで肢浮腫体積を測定することによってベースラインを取った。疾患ラットにおいて、この実験に組み込むための要件は、対照ラットの肢体積1.2mLより肢体積が0.200mL大きいこととした。肢浮腫に基づいて動物を無作為に分け、次いでビヒクル、アイソタイプ対照又はヒト化抗LPA抗体LT3015を投与した。抗体投与から7日及び11日後に肢体積を測定した。投与から11日後のデータに基づき、ED50及びED80データを計算した。本実験の最終日に、被験ラットにおいて疼痛の尺度として発声を評価した。最終的血液回収を行った。血漿試料を抗体濃度について分析した。血漿及び肢の体液pawfluid試料をサイトカイン、エイコサノイド又は関心のあるその他の炎症性メディエーターについて分析した。組織学的評価を行う可能性があるので最後に肢を回収した。投与:疾患が発現したらおよそ第11-25日投与を開始した。投与は、3日ごとに腹腔内におよそ5回行った。群:4群=次の通りの全部で32匹のラット:1.陰性対照-パラフィンオイルのみ-ビヒクル2.陽性対照-ナプロキセン10mg/kg、毎日経口投与3.アイソタイプ対照-40mg/kg非関連抗体、3日ごと4.抗LPA抗体LT3015-40mg/kg、3日ごと5.抗LPA抗体LT3015-8mg/kg、3日ごと6.抗LPA抗体LT3015-1.6mg/kg、3日ごと。この実験において、ヒト化抗LPA抗体LT3015による治療が、関節炎のラットAIAモデルにおいて疼痛による発声応答を緩和することが分かった。これは図7で示される。バーは、発声の軽減を示す。ビヒクルのみ及びアイソフォーム対照で発声は軽減せず;抗LPA抗体の中8mg/kg及び高40mg/kg用量により、陽性対照であるナプロキセンのように、70-75発声が軽減した。LT3015の低用量1.6mg/kgにより発声はおよそ30軽減し、このことから、用量依存的効果が示された。実施例12:パクリタキセル誘発性神経因性疼痛における抗LPA抗体の評価神経因性疼痛は、癌に対するパクリタキセルTAXOL治療の、問題となり、用量を制限することが多い副作用である。パクリタキセル誘発性神経因性疼痛におけるLPAの役割及びこの疼痛に対する抗LPA抗体B3の緩和能を評価した。この実験は、DrDanielaSalvemini、St.LouisUniversitySchoolofMedicineの研究室で行われた。材料及び方法:実験動物:HarlanIndianapolis、INからの雄SpragueDawleyラット開始体重200-210gを制御環境下12時間明/暗サイクルでケージあたり3-4匹ずつ収容し、自由に餌及び水を摂取できるようにした。InternationalAssociationfortheStudyofPain及びNationalInstitutesofHealthの実験動物福祉におけるガイドライン及びSaintLouisUniversityInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeによる推奨に従い、全実験を行った。実験者に対して治療条件が分からないようにして全実験を行った。パクリタキセル誘発性神経因性疼痛及び薬物投与:これは、Bennettにより開発された、全身毒性又は運動障害が僅かである、低用量パクリタキセルの反復腹腔内i.p注射により神経因性疼痛機械的アロディニアが誘発される、特徴がよく分かっているラットモデルである。行動応答は数週間から数ヶ月にわたり継続し、従って、患者における有痛性神経障害をモデル化する。Flatters,S.J.Bennett,G.J.2006.Pain122,245-257;Jin,H.W.,etal.2008ExpNeurol210,229-237;Polomano,R.C.,etal.2001Pain94,293-304。4mg/kgの最終累積用量となるように1mg/kgで1日おきに4回、即ち第D0、2、4及び6日に、ラットにおいてパクリタキセル又はそのビヒクル1:1比のCremophorEL及び95無水エタノールをi.p注射した。1-3次の実験被験物質:マウス抗LPA抗体B3及びアイソタイプ対照抗体、LT1015を使用し、これらを生理食塩水中で溶解し、個別のバイアル中でLpathにより提供した。次のようにLpathにより設計される投与計画に従い及び、実験計画、パワーポイント方式の図表を参照、実験被験物質を25mg/kgで静脈内i.v投与した。最初のパクリタキセル注射の1日前D-1及び続いて最初のパクリタキセル注射後のD2、D5、D8、D11及びD14に実験被験物質を投与した。パクリタキセル処置群又はその個々のビヒクルにおいて、試験物質を溶解するために使用されたビヒクル生理食塩水を同じ投与パラダイムに従い注射した。実験被験物質の注射がパクリタキセル注射と一致した場合即ちD2、パクリタキセルの15分前に実験被験物質を送達した。実験被験物質注射前のD-1、パクリタキセルの最初のi.p.注射後D0及び前及び続いてD12及びD16に、電気的なvonFrey試験ダイナミックプランターエステシオメータdynamicplantaraesthesiometer、モデル37450;UgoBasile、Milan、Italyを用いて、機械的逃避閾値を評価した。この目的を達成するために、各ラットをプレキシガラスチャンバー28x40x35-cm、ワイヤーメッシュ床に置き、15分間順応させた。順応後、サーボ制御機械刺激鋭い金属フィラメントを足底面に当て、点状圧力を徐々に増大させて10秒以内に50gまで到達させた。明確な自発的後肢逃避応答を誘発する圧力を自動的に記録し、機械的閾値指標とした。各時点で機械的閾値を3回評価し、平均値を得て、これを平均絶対閾値グラム、gとして報告する。機械的アロディニアの発現は、パクリタキセル処置前ベースラインに逃避応答を誘発できなかった力で機械的な平均絶対肢逃避閾値グラム、gが有意にP<0.05低下することにより証明された。パクリタキセル処置の結果、両側性アロディニアが起こり、何れの時点でも何れの群でも左右の後肢間で閾値が異ならなかったので、さらなる分析及びデータ提示のために両肢からの値の平均値を求めた。ラットn=3匹/群で全部で4群を使用した。群1:パクリタキセル生理食塩水の代わりのビヒクル群2:パクリタキセル生理食塩水群3:パクリタキセル504B3群4:パクリタキセルLT1015D-1及び実験被験物質又はそれらのビヒクル生理食塩水のi.v注射前の肢逃避閾値gは、それぞれ平均/s.em:43.6±0.296、43.3±0.376、42.8±0.120及び42.7±0.203であった。統計解析データは、1群あたり3匹の動物に対して平均±SEMとして表し、パクリタキセル群に対するボンフェローニの事後比較とともに両側、2要因ANOVAによって解析した。P<0.05、P<0.001パクリタキセルvs.ビヒクル群。結果パクリタキセル誘発性神経因性疼痛における抗LPA抗体B3及び対照抗体の効果:ビヒクル処置群と比較した場合、パクリタキセルの投与により、機械的アロディニアの発現が導かれた。16時間での機械的アロディニアの発現は、抗LPA抗体B3により有意に減弱したが、アイソタイプ対照LT1015では減弱しなかった図8。本明細書中に記載され主張される組成物及び方法は全て、本開示に照らして、不要な実験を行うことなく為され、実施され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様に関して記載してきたが、この組成物及び方法に対して変更が適用され得ることは当業者にとって明白であろう。当業者にとって明白なこのような同様の代替物及び変更は全て、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の精神及び範囲内にあるものとみなされる。本願で言及される特許明細書及び刊行物は全て、本発明が関連する当業者のレベルを示すものである。優先権又は別の利益が主張されるものを含め、全ての特許、特許明細書及び刊行物は、個々の刊行物が具体的に及び個別に参照により組み込まれることが示される場合と同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中で適切に例示的に記載される本発明は、本明細書中で具体的に開示されない要素なく、実施され得る。従って、例えば、本明細書中の各例において、を含む、基本的に~からなる及びからなるという用語は何れも、他の2つの語と互いに置き換えられ得る。使用してきた用語及び表現は、説明を目的とする用語であり、限定を目的とする用語ではないものとして使用され、このような用語及び表現の使用において、示され、記載される特性又はそれらの一部の何れの同等物も排除するものではないが、様々な変更が主張される本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、好ましい実施態様及び任意の特性によって本発明が具体的に開示されるものの、本明細書中で開示される内容の変更及び改変物が当業者により再分類され得ること及びこのような変更及び改変物が、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。"