"キメラの凝固因子であって、iFVII、FIXおよびFXからなる群より選択される凝固因子と、ii血小板に結合する標的部分と、iii前記凝固因子と前記標的部分との間のスペーサー部分と、を含む、キメラの凝固因子。請求項1に記載のキメラの凝固因子であって、式ABCによって示される構造を含み、ここでAは凝固因子であり;ここでBはスペーサー部分であり;かつここでCは、血小板に結合する、少なくとも1つの標的部分である、キメラの凝固因子。請求項2に記載のキメラの凝固因子であって:ABC;CBAからなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む、キメラの凝固因子。前記キメラの凝固因子が、少なくとも1つの標的部分を欠いている適切なコントロールと比較した場合、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す、請求項1に記載のキメラの凝固因子。さらに、足場部分および必要に応じて第二のスペーサー部分を含む、請求項1に記載のキメラの凝固因子。請求項5に記載のキメラの凝固因子であって、さらにDおよびEを含み、ここでDがスペーサー部分であり;かつEが足場部分であり、かつここで前記キメラの凝固因子が:ABCDE;ADEBC;EDABC;CBADE;EDCBA;およびCBEDA、からなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む、キメラの凝固因子。Eが、第一のFc部分F1および第二のFc部分F2を含んでいる二量体Fc領域である、請求項6に記載のキメラの凝固因子。請求項7に記載のキメラの凝固因子であって、前記凝固因子が、2つのFc部分の間に差し込まれた切断性scFccscFcリンカーを含むポリペプチドとして発現され、ここでcscFcリンカーが、cscFcポリペプチドリンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接する、キメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、cscFcリンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接する、請求項8に記載のキメラの凝固因子。前記少なくとも1つの酵素的切断部位が、細胞内プロセシング部位である、請求項9に記載のキメラの凝固因子。前記ポリペプチドリンカーが、同じ酵素によってまたは異なる酵素によって認識される、2つの酵素的切断部位に隣接される、請求項9に記載のキメラの凝固因子。前記ポリペプチドリンカーが、約10アミノ酸~約50アミノ酸の長さを有する、請求項9に記載のキメラの凝固因子。前記ポリペプチドリンカーが、約20アミノ酸~約30アミノ酸の長さを有する、請求項9に記載のキメラの凝固因子。前記ポリペプチドリンカーが、gly/serペプチドを含む、請求項9に記載のキメラの凝固因子。前記gly/serペプチドが、式Gly4Sern、またはSerGly4Sernのペプチドであり、ここでnが、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択される、正の整数である請求項14に記載のキメラの凝固因子。前記Gly4Sernリンカーが、Gly4Ser6、SerGly4Ser6、Gly4Ser4およびSerGly4Ser4からなる群より選択される、請求項15に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、2つのポリペプチド鎖を含む、請求項8に記載のキメラの凝固因子。請求項7に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記キメラの凝固因子が、スペーサー部分を介してF1に連結されたAおよびF2に連結されたCと;スペーサー部分を介してF1に連結されたAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されたCと;F1に連結されたAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されるCと;スペーサー部分を介してF1に連結されるAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されるCと、からなる群より選択される構造を有する、キメラの凝固因子。請求項18に記載のキメラの凝固因子であって、2つのポリペプチドを含み、ここで前記第一のポリペプチドが、部分ABF1;ABF1;ABF1、ABF1DCを含み、および前記第二のポリペプチドが部分CF2;CDF2;:F2DC、F2DCを含み、ここで前記2つのポリペプチド鎖が、Fc領域を形成する、キメラの凝固因子。前記標的部分が、Fc領域のポリペプチド鎖の少なくとも1つに融合される、請求項7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、F1およびF2のうちの少なくとも1つに直接融合される、請求項7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、スペーサー部分を介してF1およびF2のうちの少なくとも1つに融合される、請求項7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、切断リンカーを介してF1およびF2のうちの少なくとも1つに融合される、請求項7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:抗体分子、抗体分子の抗原結合フラグメント、scFv分子、レセプターのレセプター結合部分、ペプチド、からなる群より選択される、請求項1に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、休止血小板に結合する、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、活性化血小板に選択的に結合する、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:GPIba、GPVI、およびGPIIb/IIIaの不活性型からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項25に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:GPIIb/IIIaの活性型、Pセレクチン、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、およびLOX-1からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項26に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、GPIb複合体に結合する、請求項25に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:PS4、OS1、およびOS2からなる群より選択されるペプチドである、請求項25に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:SCE5、MB9、およびAP3からなる群より選択される抗体由来の抗体可変領域を含む、請求項25に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第VII因子である、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第VII因子の高い比活性の改変体である、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第IX因子である、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第IX因子の高い比活性の改変体である、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第X因子である、請求項1、2、5または7に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第X因子の高い比活性の改変体である、請求項1、3、4、または5に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、ある細胞によって活性型で分泌される、請求項8に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、インビボで活性化される、請求項1に記載のキメラの凝固因子。前記キメラの凝固因子が、前記凝固因子中に天然には存在しない異種の酵素的切断部位を含む、請求項39に記載のキメラの凝固因子。前記酵素的切断部位が、前記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている、請求項40に記載のキメラの凝固因子。前記足場部分が、前記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である、請求項5に記載のキメラの凝固因子。前記足場部分が、もし存在する場合、アルブミンおよびXTEN登録商標からなる群より選択される、請求項42に記載のキメラの凝固因子。FVIIを含んでいるポリペプチドであって、前記FVIIが、凝固カスケードのある成分によって活性化され得る異種の酵素的切断部位を含む、ポリペプチド。前記ポリペプチドが、足場部分、および必要に応じてスペーサー部分を含む、請求項44に記載のポリペプチド。前記足場部分が、第一のFc部分F1と第二のFc部分F2とを含む二量体Fc領域である、請求項45に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、2つのポリペプチド鎖を含む、請求項44に記載のキメラの凝固因子。請求項44に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記キメラの凝固因子は、スペーサー部分を介して第一のFc部分に連結された凝固因子と;スペーサー部分を介して第二のFc部分に連結された凝固因子と;F1に直接連結される凝固因子と;F2に直接連結される凝固因子と、からなる群より選択される構造を有する、凝固因子。さらに標的部分Cを含む、請求項47に記載のキメラの凝固因子。前記キメラの凝固因子が、cscFcリンカーを含んでいる単一のポリペプチド鎖として合成される、請求項47に記載のキメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、前記リンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接する、請求項49に記載のキメラの凝固因子。前記少なくとも1つの酵素的切断部位が細胞内プロセシング部位である、請求項50に記載のキメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、同じ酵素によって、または異なる酵素によって認識される2つの酵素的切断部位に隣接される、請求項50に記載のキメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、約10~約50アミノ酸の長さを有する、請求項49に記載のキメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、約20~約30アミノ酸の長さを有する請求項49に記載のキメラの凝固因子。前記cscFcリンカーが、gly/serペプチドを含む、請求項49に記載のキメラの凝固因子。前記gly/serペプチドが、式Gly4SernまたはSerGly4Sernのペプチドであり、ここでnが1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択される正の整数である、請求項56に記載のキメラの凝固因子。前記Gly4Sernリンカーが、Gly4Ser6、SerGly4Ser6、Gly4Ser4およびSerGly4Ser4からなる群より選択される、請求項56に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子が、第VII因子の高い比活性の改変体である、請求項45に記載のキメラの凝固因子。前記凝固因子の天然には存在しない異種の酵素的切断部位が、血栓形成の部位で切断される、請求項44に記載のキメラの凝固因子。前記切断部位が;第XIa因子切断部位、第Xa因子切断部位、およびトロンビン切断部位からなる群より選択される、請求項44に記載のキメラ凝固因子。酵素的切断部位が、前記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている、請求項59に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が休止血小板に結合する、請求項48に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が、活性化された血小板に対して選択的に結合する、請求項48に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:GPIba、GPVI、およびGPIIb/IIIaの不活性型、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項63に記載のキメラの凝固因子。前記標的部分が:GPIIb/IIIaの活性型、Pセレクチン、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、およびLOX-1、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する、請求項64に記載のキメラの凝固因子。前記足場部分が、前記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である、請求項64に記載のキメラの凝固因子。前記足場部分が、もし存在する場合、アルブミンおよびXTEN登録商標からなる群より選択される、請求項67に記載のキメラの凝固因子。請求項44のキメラの凝固因子であって:ABC;CBA;ABCDE;ADEBC、EDABC、CBADE、EDCBA、CBEDA、からなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直線配列を含み、ここでAは活性化可能な凝固因子、Bは存在しないか、またはリンカーであり、Cは標的部分であり、Dは存在しないか、またはリンカーであり、およびEは足場部分である、キメラの凝固因子。請求項44に記載のキメラの凝固因子であって、ここで前記凝固因子が、凝固因子の軽鎖および重鎖を含み、かつ前記軽鎖および重鎖の各々が、別々のポリペプチド鎖として発現される、キメラの凝固因子。請求項1、2、5、7、44、45、45および58のいずれか1項に記載のキメラの凝固因子をコードする核酸分子。前記核酸分子が、ベクター中に存在する、請求項71に記載の核酸分子。前記ベクターがさらに、前記酵素的切断部位のうちの少なくとも1つを切断する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項72に記載のベクター。請求項72に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。前記宿主細胞が、細胞内プロセシングし得る酵素を発現する、請求項72に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。前記酵素が、細胞に対して内因性である、請求項75に記載の宿主細胞。前記酵素が、細胞に対して異種である、請求項75に記載の宿主細胞。キメラの凝固因子を産生するための方法であって、請求項76または77に記載の宿主細胞を培養中で培養することと、この培地からキメラの凝固因子を回収することとを包含する、方法。2つのポリペプチド鎖を含む、プロセシングされたヘテロ二量体ポリペプチドであって、前記プロセシングされた、ヘテロ二量体ポリペプチドは、細胞培養培地中で培養される細胞中で請求項78に記載のベクターを発現すること、および前記培養培地から、成熟したヘテロ二量体ポリペプチドを単離することによって作製される、ヘテロ二量体ポリペプチド。請求項1、2、5、7、44、45、48および58のいずれかに記載のキメラ凝固因子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。請求項71に記載の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物。請求項80または81に記載の組成物を投与することを包含する、被験体における止血を改善するための方法。このような組み換え分子は有効であるが、治療剤を凝固の部位に局在化するか、薬物動態特性の改善を有するか、クリアランス速度の低下を有するか、改善された製造可能性を有するか、血栓形成性が低下しているか、活性が増強されているか、またはこれらの特徴のうちの2つ以上を有する改善版が必要である。本発明は、活性が増強されたキメラの凝固因子に関する。本発明は、とりわけ、キメラの凝固因子を作製するための方法を特徴づけるが、このキメラの凝固因子は、これらの方法を用いて作製され、かつ止血を改善するための方法は、これらの凝固因子を用いる。本発明のキメラの凝固因子は、増強された薬物動態特性を保有するか、クリアランス速度を低下するか、製造可能性が改善されているか、血栓形成性が低下しているか、活性が増強されているか、またはこれらの特徴のうちの2つ以上を有する。一実施形態では、本発明の改善された凝固因子は活性が増大しており、ここでは、例えば、血小板に対して凝固因子を標的すること、または血栓形成の部位で活性化される、活性化可能な形態天然には存在しない活性化可能な形態で被験体に存在することを必要とする。一態様では、本発明は、FVII、FIXおよびFXからなる群より選択される凝固因子と、血小板に結合する標的部分と、必要に応じて、この凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分とを含むキメラの凝固因子に関する。一実施形態では、この凝固因子は、式ABCによって示される構造を含み、ここでAは凝固因子であり;ここでBはスペーサー部分であり;かつここでCは、血小板に結合する、少なくとも1つの標的部分である。一実施形態では、上記の凝固因子は:ABC;CBAからなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む。一実施形態では、上記の凝固因子は、少なくとも1つの標的部分を欠いている適切なコントロールと比較した場合、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す。一実施形態では、上記の凝固因子は、足場部分および必要に応じて第二のスペーサー部分を含む。一実施形態では、上記の凝固因子はさらに、DおよびEを含み、ここでDがスペーサー部分であり;かつEが足場部分であり、かつここでこのキメラの凝固因子は:ABCDE;ADEBC;EDABC;CBADE;EDCBA;およびCBEDA、からなる群より選択される式によって提示されるアミノ末端からカルボキシ末端の構造を含む。一実施形態では、Eは、第一のFc部分F1および第二のFc部分F2を含んでいる二量体Fc領域である。一実施形態では、上記の凝固因子は、2つのFc部分の間に差し込まれた切断性scFccscFcリンカーを含むポリペプチドとして発現され、ここでこのcscFcリンカーは、cscFcポリペプチドリンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接する。一実施形態では、上記cscFcリンカーは、cscFcリンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接する。一実施形態では、上記少なくとも1つの酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位である、請求項9に記載のキメラの凝固因子。一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、同じ酵素によってまたは異なる酵素によって認識される、2つの酵素的切断部位に隣接される。一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、約10アミノ酸~約50アミノ酸の長さを有する。一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、約20アミノ酸~約30アミノ酸の長さを有する。一実施形態では、上記ポリペプチドリンカーは、gly/serペプチドを含む。一実施形態では、上記gly/serペプチドは、式Gly4Sern、またはSerGly4Sernのペプチドであり、ここでnは、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択される正の整数である。一実施形態では、このGly4Sernリンカーは、Gly4Ser6、SerGly4Ser6、Gly4Ser4およびSerGly4Ser4からなる群より選択される。一実施形態では、上記凝固因子は、2つのポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、上記キメラの凝固因子は:スペーサー部分を介してF1に連結されたAおよびF2に連結されたCと;スペーサー部分を介してF1に連結されたAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されたCと;F1に連結されたAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されるCと;スペーサー部分を介してF1に連結されるAおよびスペーサー部分を介してF2に連結されるCと、からなる群より選択される構造を有する。一実施形態では、キメラの凝固因子は、2つのポリペプチドを含み、ここで第一のポリペプチドは、部分ABF1;ABF1;ABF1;またはABF1DCを含み、および上記第二のポリペプチドが部分CF2;CDF2;F2DC;またはF2DCを含み、ここでこの2つのポリペプチド鎖が、Fc領域を形成する。一実施形態では、上記標的部分は、Fc領域のポリペプチド鎖の少なくとも1つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、F1およびF2のうちの少なくとも1つに対して直接融合される。一実施形態では、この標的部分は、スペーサー部分を介してF1およびF2のうちの少なくとも1つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、切断リンカーを介してF1およびF2のうちの少なくとも1つに融合される。一実施形態では、この標的部分は、切断可能なリンカーを介してF1およびF2の少なくとも1つに融合される。一実施形態では、この標的部分は:抗体分子、抗体分子の抗原結合フラグメント、scFv分子、レセプターのレセプター結合部分、ペプチド、からなる群より選択される。一実施形態では、この標的部分は、休止血小板に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は、活性化血小板に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は:GPIba、GPVI、およびGPIIb/IIIaの不活性型からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は:GPIIb/IIIaの活性型、Pセレクチン、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、およびLOX-1からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は、GPIb複合体に結合する。一実施形態では、この標的部分は:PS4、OS1、およびOS2からなる群より選択されるペプチドである。一実施形態では、この標的部分は:SCE5、MB9、およびAP3からなる群より選択される抗体由来の抗体可変領域を含む。一実施形態では、上記凝固因子は、第VII因子である。一実施形態では、上記凝固因子は、第VII因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子は、第IX因子である。一実施形態では、この凝固因子は、第IX因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子は、第X因子である。一実施形態では、凝固因子は、第X因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、上記凝固因子は、ある細胞によって活性型で分泌される。一実施形態では、この凝固因子は、インビボで活性化される。一実施形態では、上記キメラの凝固因子は、上記凝固因子中の天然には存在しない異種の酵素的切断部位を含む。一実施形態では、上記酵素的切断部位は、上記凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている。一実施形態では、上記凝固因子は、足場部分を含み、この足場部分は、上記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である。一実施形態では、この足場部分は、もし存在する場合、アルブミンおよびXTEN登録商標からなる群より選択される。別の態様では、本発明は、FVIIを含んでいるポリペプチドであって、このFVIIが、凝固カスケードのある成分によって活性化され得る異種の酵素的切断部位を含む、ポリペプチドに関与する。一実施形態では、上記ポリペプチドは、足場部分、および必要に応じてスペーサー部分を含む。一実施形態では、上記足場部分は、第一のFc部分、F1と第二のFc部分、F2とを含む二量体Fc領域である。一実施形態では、上記凝固因子は、2つのポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、上記キメラの凝固因子は:スペーサー部分を介して第一のFc部分に連結された凝固因子と;スペーサー部分を介して第二のFc部分に連結された凝固因子と;F1に直接連結される凝固因子と;F2に直接連結される凝固因子と、からなる群より選択される構造を有する。一実施形態では、上記キメラ凝固因子はさらに標的部分を含む。一実施形態では、上記キメラの凝固因子は、cscFcリンカーを含む単一のポリペプチド鎖として合成される。一実施形態では、このcscFcリンカーは、このリンカーの切断を生じる少なくとも1つの酵素的切断部位に連結される例えば、直接連結されるかまたは隣接する。一実施形態では、上記少なくとも1つの酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位である。一実施形態では、上記cscFcリンカーは、同じ酵素によって、または異なる酵素によって認識される2つの酵素的切断部位に隣接される。一実施形態では、このcscFcリンカーは、約10~約50アミノ酸の長さを有する。一実施形態では、このcscFcリンカーは、約20~約30アミノ酸の長さを有する。一実施形態では、上記cscFcリンカーは、gly/serペプチドを含む。一実施形態では、上記gly/serペプチドは、式Gly4SernまたはSerGly4Sernのペプチドであり、ここでnは1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群より選択される正の整数である。一実施形態では、このGly4Sernリンカーは、Gly4Ser6、SerGly4Ser6、Gly4Ser4およびSerGly4Ser4からなる群より選択される。一実施形態では、上記凝固因子は、第VII因子の高い比活性の改変体である。一実施形態では、この凝固因子に存在する異種の酵素的切断部位は、血栓形成の部位で切断される。一実施形態では、この切断部位は;第XIa因子切断部位、第Xa因子切断部位、およびトロンビン切断部位からなる群より選択される。一実施形態では、この酵素的切断部位は、凝固因子の重鎖部分のアミノ末端に対して遺伝子的に融合されている。一実施形態では、上記標的部分は休止血小板に結合する。一実施形態では、この標的部分は、活性化された血小板に対して選択的に結合する。一実施形態では、上記標的部分は:GPIba、GPVI、およびGPIIb/IIIaの不活性型、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、この標的部分は:GPIIb/IIIaの活性型、Pセレクチン、GMP-33、LAMP-1、LAMP-2、CD40L、およびLOX-1、からなる群より選択される標的に対して選択的に結合する。一実施形態では、上記足場部分は、上記キメラの凝固因子の流体力学半径を増大するタンパク質分子である。一実施形態では、上記足場部分は、もし存在する場合、アルブミンおよびXTEN登録商標からなる群より選択される。一態様では、本発明は:ABC;CBA;ABCDE;ADEBC、EDABC、CBADE、EDCBA、CBEDA、からなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直線配列に関し、ここでAは活性化可能な凝固因子、Bは存在しないか、またはリンカーであり、Cは標的部分であり、Dは存在しないか、またはリンカーであり、およびEは足場部分である。一実施形態では、上記凝固因子は、凝固因子の軽鎖および重鎖を含み、かつ上記軽鎖および重鎖の各々が、別々のポリペプチド鎖として発現される。一実施形態では、本発明は、本発明のキメラの凝固因子をコードする核酸分子に関与する。一実施形態では、この核酸分子は、ベクター中に存在する。一実施形態では、このベクターはさらに、上記酵素的切断部位のうちの少なくとも1つを切断する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む、宿主細胞に関する。一実施形態では、この宿主細胞は、細胞内プロセシングし得る酵素を発現する。一実施形態では、この酵素は、宿主に対して内因性である。一実施形態では、この酵素は、細胞に対して異種である。別の実施形態では、本発明は、キメラの凝固因子を産生するための方法であって、上記宿主細胞を培養中で培養することと、この培地からキメラの凝固因子を回収することとを包含する、方法に関する。別の実施形態では、本発明は、2つのポリペプチド鎖を含む、プロセシングされたヘテロ二量体ポリペプチドであって、上記プロセシングされた、ヘテロ二量体ポリペプチドが、細胞培養培地中で培養される細胞中で上記ベクターを発現すること、およびこの培養培地から、成熟したヘテロ二量体ポリペプチドを単離することによって作製される、ヘテロ二量体ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、キメラ凝固因子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物を投与することを包含する、被験体における止血を改善するための方法に関与する。一態様では、本発明は、凝固因子の軽鎖部分および重鎖部分、ならびに少なくとも1つの標的部分を含むキメラ凝固因子であって、ここでこの標的部分iは、血小板に対して特異的に結合し、iiこの凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれず、かつここでこのキメラの凝固因子は、少なくとも1つの標的部分を欠く適切なコントロールに比較して、血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示すキメラの凝固因子に関する。別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって、部分A-B-C-D-Eを直鎖状配列で含む凝固因子に関し、ここでAは凝固因子、活性化可能な凝固因子、または活性化された凝固因子であり;Bは存在しないか、またはリンカーであり;Cは標的部分であり;Dは存在しないか、またはリンカーであり;かつEは存在しないかまたは足場部分である。さらに別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって:ABC;ABCDE;ADEBC、EDABC、CBADE、EDCBA、CBEDAからなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直鎖状配列を含み、ここでAが凝固因子、活性化可能な凝固因子、または活性化された凝固因子であり、Bは存在しないか、またはリンカーであり、Cは標的部分であり、Dは存在しないか、またはリンカーであり、かつEは足場部分である、キメラ凝固因子に関する。さらに別の態様では、本発明は、キメラの凝固因子であって:ABF1:F2;ABF1:CDF2;ABF1:F2DC、ABF1DC:F2DCからなる群より選択されるアミノ末端からカルボキシ末端の部分の直鎖状配列を含み、ここでAは凝固因子、活性化可能な凝固因子または活性化された凝固因子であり、Bは存在しないか、またはリンカーであり、Cは標的部分であり、Dは存在しないか、またはリンカーであり、かつF1およびF2は各々、Fc部分であり、かつ:2つのポリペプチド鎖のF1およびF2鎖によって媒介される二量体化を示す、キメラの凝固因子に関する。さらに別の態様では、本発明は、凝固因子の軽鎖部分および重鎖部分、ならびに少なくとも1つの標的部分を含むキメラ凝固因子であって、ここでこの標的部分は、血小板に特異的に結合し、ここでキメラの凝固因子は、2つのポリペプチド鎖を含むジスルフィド連結したFc領域を含む、キメラの凝固因子に関する。発明の詳細な説明本発明は、キメラの凝固因子に関する。本発明は、凝固因子の有効性、薬物動態特性、および/または製造可能性を増強する新規な方法の開発に少なくとも一部は基づく。一実施形態では、本発明の改善された凝固因子は、活性が増大しており、ここでは、例えば、血小板に対して凝固因子を標的すること、または血栓形成の部位で活性化される、活性化可能な形態天然には存在しない活性化可能な形態で被験体に存在することを必要とする。これは、例えば、凝固因子を標的することによって、またはそれらを活性化可能な形態で作製することによって達成され得る。一実施形態では、本発明の凝固因子は、凝血の部位に標的される。凝固因子を休止血小板または活性化された血小板に標的する標的部分を組み込むことによって、凝固因子の活性は、増強され得る。例えば、第VII因子の場合、活性化因子XFXaを生成するために内皮細胞表面で組織因子TFによって活性化される可能性が高い内因性のFVIIとは異なり、外因性のFVIIaは、TFとは独立した方式でFXa/FIXaを生成する可能性が高い他の凝固因子が局在化される活性化血小板の表面で最も有効である。しかし、生理学的には、FVIIaは、内皮細胞のようなTF保有性の細胞の表面で作用して、血小板に低い親和性を有する。治療的な組み換えFVIIaは、活性化された血小板の表面上で第X因子を第Xa因子に変換することによって作用するという仮説がなされた。低い血小板親和性を克服して、出血を処置するのに有効であるには、組み換えFVIIaは、生理学的なレベルを上回って投与される。従って、FVIIaの場合、血小板表面に対する標的化は、この分子の有効性を有意に増大し得る。他の凝固因子例えば、FIX、FVIII、FXは、血小板に対して高い親和性を有するが、血小板標的化部位を組み込むことによって、これらは活性の増強を示し過ぎる場合がある。さらに、FVIIaはヒトでは比較的半減期が短い約2.3時間。この半減期の短さのせいで、出血を制御するために組み換えFVIIaは複数回投与する必要をもたらす可能性がある。従って、血小板に対して凝固因子、詳細にはFVIIaを標的することは有効性を改善する。標的部分は、キメラの凝固因子の多数の位置に配置され得る。標的化されたキメラの凝固因子の例示的な構造は、例えば、図1-4、7、8、17、19、21、44、46、49、51、および53に示される。別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、凝血の部位で活性化可能な形態で作製される。バイパス療法における使用のためには、外因性の凝固因子は、活性化型で与えられる場合のみ有効である。しかし、このような活性化された凝固因子は、内因性の経路例えば、アンチトロンビンIII、TFPIによって急速に不活性化されて、活性型のクリアランスおよび短い有効半減期がもたらされる。より高用量を考慮すれば、この問題は解決されない。なぜなら、これは、血栓形成効果を生じ得るからである。従って、一実施形態では、本発明は、活性化可能なキメラの凝固因子構築物であって、凝固因子に正常は存在しない異種の酵素的切断部位を含む、キメラの凝固因子構築物に関する。これらの分子は、増強されたチモーゲンとして循環し、投与の際に不活性化がないことで半減期が長いが、酵素による切断によって凝固部位で容易に活性化され得る。一実施形態では、このような異種の酵素的切断部位は、凝固ケスケードの間に産生される酵素についての切断部位である。例えば、一実施形態では、活性化可能な構築物の異種切断部位は、第XIa因子、第Xa因子、またはトロンビン切断部位を含む。例示的なFXIa切断部位としては、例えば、以下が挙げられる:TQSFNDFTRおよびSVSQTSKLTR。例示的なトロンビン切断部位としては、例えば、以下が挙げられる:DFLAEGGGVR、TTKIKPR、およびALRPR。一実施形態では、異種の切断部位は、上記凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれる。別の実施形態では、異種の切断部位は、この凝固因子の2つの鎖の間に差し込まれない。一実施形態では、この異種切断部位は、この凝固因子の重鎖に対してアミノ末端である。この異種切断部位は、切断性のリンカー中に存在し、キメラの凝固因子において多数の位置に位置し得る。活性化可能なキメラの凝固因子の例示的な構造は、例えば、図5、6、9、29、27、31、および41に示される。例示的なこのような構築物は、血栓形成の存在下で活性化されて、下にさらに詳細に記載される。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、例えば、分子の流体力学半径を増大するための足場を備える。例えば、本発明のキメラの凝固因子は、融合タンパク質であってもよい。例示的な足場としては、例えば、FcRn結合部分例えば、完全Fc領域またはFcRnに結合するその部分、単鎖のFc領域ScFc領域,例えば、米国特許出願公開第2008/0260738号、WO2008/012543、またはWO2008/1439545に記載される、切断可能scFc領域本明細書に記載されるようなcscFc領域を含む、複雑性の少ないタンパク質またはその一部、例えば、XTenポリペプチド登録商標、またはアルブミンが挙げられる。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、Fc領域またはそのFcRn結合部分を足場部分として使用する。一実施形態では、キメラの凝固因子が融合されるFc部分は、天然に存在するまたは野性型WTのFc部分である。別の実施形態では、Fc部分は、配列中に1つ以上の変動を含む。別の実施形態では、Fc部分は、scFc部分例えば、非切断性のまたはcscFcリンカーを含むである。cscFcリンカーを含む構築物では、プロセシングされていない分子は、切断性の単鎖のFc領域を含み、ここでは成分のFc部分は単一のポリペプチド鎖中に遺伝子的に融合されて、機能的な単鎖の二量体Fc領域を形成する。cscFcリンカーは、ポリペプチドの二量体Fc領域を縦列で含むFc部分を連結してもよいし、または1つのFc部分をこの構築物の非-Fc部分、例えば、凝固因子もしくは標的部分に連結してもよく、これが次に第二のFc部分に連結される。このcscFcリンカーは、scFc領域を含み、少なくとも1つの酵素的切断部位、例えば、細胞内酵素プロセシング部位に隣接するFc部分の間に差し込まれる。一実施形態では、scFcリンカーは、核酸分子によってコードされるタンパク質が細胞中でプロセシングされるとき、リンカー例えば、そのリンカーの全てまたは実質的に全ての切除を生じる2つの酵素的切断部位に隣接される。別の実施形態では、このscFcリンカーは、ポリペプチドが細胞によって分泌された後に、インビトロでこのリンカーの切除を可能にする少なくとも1つの酵素的切断部位に隣接するか、またはこの構築物が被験体に投与された後に、インビボでリンカーの切断を可能にする少なくとも1つの酵素的切断部位を備える。従って、一実施形態では、このようなポリペプチドは、プロセシングされていない形態で1つの連続ヌクレオチド配列の一部として単一のオープンリーディングフレームORF中にコードされるscFc領域単数または複数を備えるが、cscFcリンカーは酵素的に切断され例えば、投与の前、または投与後インビボで、単一アミノ酸鎖に融合されていないFc領域を含むヘテロ二量体分子であるポリペプチドを生じ、すなわち、この得られたプロセシングされた構築物は、2つのポリペプチド鎖を含むFc領域を有する。このような実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、RRRR切断部位という4つのアルギニンが残る場合がある。一実施形態では、scFcリンカーは、切断のための2つのプロセシング部位に隣接する。この2つのプロセシング部位は、同じであってもまたは異なってもよい。一実施形態では、少なくとも1つのプロセシング部位は、アルギニンkex2/フリン酵素によって認識されるような塩基性アミノ酸残基のクラスターである。このような酵素は、アルギニン残基のすぐC末端側で切断する。別の実施形態では、少なくとも1つの切断部位は、インビボで切断され得る部位、例えば、トロンビンによって認識される切断部位である。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、csFcリンカーを含むscFc分子の状況では、活性型で製造される。例えば、第VII因子は一般には、チモーゲンとして組み換え的に産生され、投与のための活性型を産生するには製造の間に活性が必要である。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、製造可能性を改善するためにこれが活性型で発現される細胞から分泌される。下にさらに詳細に示すとおり、このような凝固因子は、分子中に単鎖のFc領域を組み込むことによって産生され得る。単鎖Fc領域は、単一のポリペプチド鎖中に存在するFc部分の二量体化によって形成される。一実施形態では、このような構築物は、少なくとも1つの細胞内プロセシング部位に隣接するscFcの2つのFc部分を連結するscFcポリペプチドリンカーを備える。このような構築物の切断は、分泌経路において後期まで、例えば、タンパク質がトランスゴルジ装置中で活性プロセシング酵素と共存するときまで、遅れる。一実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする構築物を発現する細胞は、2つのポリペプチド鎖を含む二量体分子を生じる1つ以上のプロセシング部位でscFcリンカーを切断する酵素を内因性に発現する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする構築物を発現する細胞は、1つ以上のプロセシング部位でscFcリンカーを切断する酵素を外因性に発現する。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、最適の構築物を創出するためにこれらの特徴のうちの2つ以上を組み合わせてもよい、例えば、休止血小板に対して活性化可能な融合タンパク質構築物を標的することその結果、効果的におよび活性な凝固の部位でより高い局所濃度で活性化される。例示的なこのような組み合わせの構築物は、両方ともが標的されるキメラの凝固因子を備え、かつプロセシングの増強のためのscFcリンカーを備える。別の実施形態では、本発明の構築物は、標的化されて、活性化可能である。例示的な本発明の構築物は、添付の図面および配列表に図示される。一実施形態では、本発明は、図に示される構造を有するポリペプチドに関する。別の実施形態では、本発明は、添付の配列表に示される配列を有するポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸分子に関する。一実施形態では、本発明は、添付の配列表に示される配列を有するポリペプチドの成熟型に関する。これらの構築物およびそれらをコードする核酸分子は、被験体において止血を改善するために用いられ得ることが理解される。本明細書および特許請求の範囲の明確に理解するために、以下の定義を下に示す。1.定義本明細書において用いる場合、タンパク質またはポリペプチドという用語は、2つ以上の天然のアミノ酸または天然でないアミノ酸のポリマーを指す。アミノ酸という用語には、アラニンAlaまたはA;アルギニンArgまたはR;アスパラギンAsnまたはN;アスパラギン酸AspまたはD;システインCysまたはC;グルタミンGlnまたはQ;グルタミン酸GluまたはE;グリシンGlyまたはG;ヒスチジンHisまたはH;イソロイシンIleまたはI;ロイシンLeuまたはL;リジンLysまたはK;メチオニンMetまたはM;フェニルアラニンPheまたはF;プロリンProまたはP;セリンSerまたはS;トレオニンThrまたはT;トリプトファンTrpまたはW;チロシンTyrまたはY;およびバリンValまたはVを包含する。非伝統的なアミノ酸も、本発明の範囲内であり、ノルロイシン、オミチン、ノルバリン、ホモセリン、およびEllmanら、Meth.Enzym.202:301-3361991に記載されるものなどの他のアミノ酸残基アナログを包含する。そのような非天然のアミノ酸残基を生成するために、Norenら、Science244:1821989および上述のEllmanらの手順を用いてもよい。簡潔に述べると、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基を用いてサプレッサーtRNAを化学的に活性化し、その後、RNAのインビトロの転写および翻訳を行うことを包含する。非伝統的なアミノ酸の導入は、当該分野で公知のペプチド化学を用いて達成することもできる。本明細書において用いられる極性のアミノ酸という用語は、正味ゼロ電荷を有するが、それらの側鎖例えば、M、F、W、S、Y、N、Q、Cの異なる部分にゼロでない部分電荷を有するアミノ酸を包含する。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。本明細書において用いられる荷電アミノ酸という用語は、それらの側鎖例えば、R、K、H、E、Dに非ゼロ正味荷電を有することができるアミノ酸を包含する。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用および静電相互作用に関与する場合がある。アミノ酸置換とは、第2の異なる置換アミノ酸残基による、所定のアミノ酸配列出発ポリペプチドのアミノ酸配列における少なくとも1つの既存のアミノ酸残基の置換を指す。アミノ酸挿入とは、所定のアミノ酸配列への少なくとも1つの付加的アミノ酸の組み込みを指す。挿入は、通常、1つまたは2つのアミノ酸残基の挿入からなるが、この大きなペプチド挿入は、例えば、約3~約5または最大約10、15、もしくは20のアミノ酸残基までにおよぶ挿入さえ行うことができる。挿入された残基単数または複数は、上記において開示されるように、天然、または非天然であり得る。アミノ酸欠失は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも1つのアミノ酸残基の除去を指す。ポリペプチドは、単量体モノマーまたは多量体マルチマーのいずれであってもよい。例えば、一実施形態では、本発明のタンパク質は、二量体である。本発明の二量体ポリペプチドは2つのポリペプチド鎖を含んでもよく、または1つのポリペプチド鎖からなってもよい例えば、scFc分子の場合。一実施形態では、本発明の二量体はホモ二量体であり、2つの同一のモノマーサブユニットまたはポリペプチド例えば、2つの同一のFc部分または2つの同一の生物学的に活性な部分を含んでいる。別の実施形態では、本発明の二量体は、ヘテロ二量体であり、2つの同一でないモノマーのサブユニットまたはポリペプチドを含んでいる例えば、2つの異なる凝固因子またはその部分または1つの凝固因子のみを含んでいる。例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許第7404956号を参照のこと。本明細書において用いる場合、ポリペプチドリンカーという用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における2つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列を指す。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、構築物を作製する2つのFc部分を直接または間接的に接続するポリペプチドリンカーをコードする核酸分子によってコードされる。これらのリンカーは、本明細書においては、scFcリンカーと呼ばれ、このscFcリンカーは、Fc部分を含んでいるポリペプチドの2つのFc部分の間に差し込まれる。scFcリンカーが2つのFc部分を連続して直鎖状のポリペプチド配列中で接続する場合、これは直接連結である。対照的に、scFcリンカーが、第一のFc部分を結合部分に連結し得、これが次に第二のFc部分に連結されて、これによって間接的な連結が形成される。これらのscFcリンカーによって、単鎖の遺伝子構築物の形成が可能になる。一実施形態では、このポリペプチドはまた、酵素的切断部位を備え、これが切断可能なscFcリンカーcscFcリンカーを生じ、一実施形態では、実質的に切除される例えば、細胞によるプロセシングの間。従って、得られたプロセシングされたポリペプチドは、二量体分子であり、これは、少なくとも2つのアミノ酸鎖を含み、かつ外来のリンカーのアミノ酸配列を実質的に欠く。いくつかの実施形態では、全てまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、RRRR切断部位の4つのアルギニンが残る場合がある。別の実施形態では、本明細書においてはスペーサーと呼ばれる別の種類のポリペプチドリンカーを用いて、異なる部分、例えば、凝固因子または標的部分をポリペプチド上のFc部分に接続してもよい。この種のリンカーは、ポリペプチド分子に対して可塑性を提供し得る。スペーサーは一般的には切断されない;しかし特定の実施形態では、このような切断は所望され得る。スペーサーの例示的な部分は、添付の図面に示される。スペーサーは、凝固因子、標的化部分、および/または足場の間に、例えば、これらの部分のN末端またはC末端に位置してもよい。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシングの間に除去されない。本発明のキメラの凝固因子に存在し得る第三種のリンカーは、本明細書では、異種の切断部位を含む切断性切断可能リンカーと呼ばれ、これは異種の切断部位例えば、第XIa因子、Xa、またはトロンビン切断部位を含み、追加のスペーサーリンカーを、切断部位のN末端もしくはC末端のいずれかまたは両側の上に含んでもよい。このような部位の例示的な位置は、添付の図面に示され、そして、例えば、標的化部分に隣接する位置を含む。別の実施形態では、このようなリンカーは、凝固因子またはその一部に隣接さしてもよい。例えば、一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の重鎖のN末端に融合されて、この凝固因子の活性化可能な形態を作製し得る。このような場合、この切断性のリンカーは、その切断部位のN末端で追加のスペーサーリンカーを含んでもよいが、その凝固因子の重鎖のアミノ末端に対する切断部位のC末端での直接融合を必要とする。本明細書において用いる場合、gly-serポリペプチドリンカーという用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なgly/serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Gly4Sern配列番号4を含む。別の例示的なgly/serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列SGly4Sernを含む。一実施形態では、n=1である。他の実施形態では、n=2である。別の実施形態では、n=3、すなわち、Gly4Ser3である。別の実施形態では、n=4、すなわち、Gly4Ser4配列番号6である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。別の実施形態では、n=7である。さらに別の実施形態では、n=8である。別の実施形態では、n=9である。さらに別の実施形態では、n=10である。別の例示的なgly/serポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列SerGly4Sern配列番号26を含む。一実施形態では、n=1である。一実施形態では、n=2である。好ましい実施形態では、n=3である。別の実施形態では、n=4である。別の実施形態では、n=5である。さらに別の実施形態では、n=6である。指名されたポリペプチドまたはタンパク質由来のポリペプチドまたはアミノ酸の配列とは、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、ポリペプチドまたはアミノ酸配列特定の配列に由来するは、その配列またはその一部に対して本質的に同一であるアミノ酸配列を有するここでこの一部は、少なくとも10~20アミノ酸、好ましくは少なくとも20~30アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも30~50アミノ酸からなるか、そうでなければ、その配列の起源を有すると当業者に確認できる。別のペプチド由来のポリペプチドは、出発ポリペプチドに対して1つ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された1つ以上のアミノ酸残基、または1つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失を有する1つ以上のアミノ酸残基を有する場合がある。好ましくは、このポリペプチドは、天然には存在しないアミノ酸配列を含む。このような改変体は、必然的に出発抗体と100未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態では、この改変体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約75~100未満、より好ましくは、約80~100未満、さらに好ましくは約85~100未満、さらに好ましくは約90~100未満例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99、そして最も好ましくは約95~100未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を、例えば、改変体分子の長さにわたって有する。一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列との間に1つのアミノ酸相違がある。この配列に関する同一性または類似性は、本明細書において、配列を整列させ、もし必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントしてギャップを導入した後、出発アミノ酸残基と同一であるすなわち、同じ残基の候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。本発明の好ましいポリペプチドは、ヒトタンパク質配列由来のアミノ酸配列例えば、少なくとも1つの凝固因子またはFc部分またはドメインを含む。しかし、ポリペプチドは、別の哺乳動物種由来の1つ以上のアミノ酸を含んでもよい。例えば、凝固因子、Fcドメイン、または標的部分は、非ヒト種由来であって、本発明のポリペプチドに含まれてもよい。あるいは、1つ以上のアミノ酸が、非ヒト種由来のポリペプチドに存在してもよい。本発明の好ましいポリペプチドは、免疫原性ではない。本発明のポリペプチドは、それらが天然に存在するかまたは天然のポリペプチドそれが由来するとは、天然のポリペプチドの所望の活性を保持したままで、アミノ酸配列において変化するように変更され得ることがまた当業者によって理解される。例えば、非必須アミノ酸残基で保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換が作製されてもよい。免疫グロブリン由来のポリペプチド例えば、Fcドメイン、部分、または抗原結合部位の非天然の改変体をコードする単離された核酸分子は、免疫グロブリンのヌクレオチド配列への1つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失その結果1つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がこのコードされたタンパク質に導入されるによって創出され得る。変異は、標準的な技術、例えば、部位指向性突然変異誘発、およびPCR媒介性の突然変異誘発によって導入され得る。本発明のポリペプチドは、1つ以上のアミノ酸残基で、例えば、必須または非必須アミノ酸残基で、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、これには塩基性の側鎖例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、酸性の側鎖例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、非荷電極性側鎖例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、非極性側鎖例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、β分岐側鎖例えば、トレオニン、バリン、イソロイシンおよび芳香族側鎖例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが挙げられる。従って、ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換されてもよい。別の実施形態では、アミノ酸のストリングを、構造的に同様のストリング順序および/または側鎖ファミリーメンバーの組成が異なるで置換してもよい。あるいは、別の実施形態では、変異体は、飽和突然変異誘発などによってコード配列の全てまたは一部にそって無作為に導入されてもよいし、得られた変異体は、本発明のポリペプチドに導入されてもよいし、それらが所望の標的に結合する能力についてスクリーニングされてもよい。ポリペプチドの状況では、直鎖状配列または配列とは、アミノからカルボキシル末端方向における、ポリペプチド中のアミノ酸の順序であり、ここでは配列中でお互いと隣接する残基は、このポリペプチドの一次構造中で連続する。本明細書において用いる場合、連結される、融合される、または融合という用語は、ペプチド結合例えば、遺伝子融合、化学的結合または他の手段を介した連結を指す。例えば、分子または部分が連結され得る1つの方法は、ペプチド結合を介して分子または部分を連結するポリペプチドリンカーを使用する。遺伝子的に融合される、遺伝子的に連結されるまたは遺伝子的融合は、交換可能に用いられ、2つ以上のタンパク質、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントの、それらの個々のペプチド骨格を介した、これらのタンパク質、ポリペプチドまたはフラグメントをコードする単一のポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じた、同一線上の、共有結合、または結合を指す。このような遺伝子的融合は、単一の連続の遺伝子的配列の発現を生じる。好ましい遺伝子的融合は、インフレームであり、すなわち、2つ以上のオープンリーディングフレームORFが融合されて、連続するより長いORFが、もとのORFの正確なオープンリーディングフレームを維持する方式で形成される。従って、得られた組み換え融合タンパク質は、もとのORFによってコードされるポリペプチドに対応する2つ以上のタンパク質セグメントを含む単一のポリペプチドであるこのセグメントは、正常には、自然にはそのように連結されない。この場合、この単一のポリペプチドは、プロセシングの間に切断されて、2つのポリペプチド鎖を含む二量体分子が生じる。本明細書において用いる場合、Fc領域という用語は、天然の免疫グロブリンのFc領域に対応するポリペプチドの一部すなわち、その2つの重鎖のそれぞれのFcドメインの二量体会合によって形成されるようなとして定義される。天然のFc領域は、ホモ二量体であり、2つのポリペプチド鎖を含む。対照的に遺伝子的に融合されるFc領域または単鎖Fc領域scFc領域という用語は、本明細書において用いる場合、単一ポリペプチド鎖内で遺伝子的に連結されるすなわち、単一の連続の遺伝子配列でコードされるFcドメインからなる合成の二量体Fc領域を指す。本明細書において用いる場合、Fcドメインという用語は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まりすなわち、重鎖定常領域の第一の残基を114として、IgGの残基216、抗体のC末端で終わる、単一の免疫グロブリン重鎖の一部を指す。従って、完全Fcドメインは、少なくともヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。本明細書において用いる場合、Fcドメイン部分またはFc部分という用語は、Fcドメインのアミノ酸配列を含むか、またはFcドメイン由来である。特定の実施形態では、Fc部分は、以下の少なくとも1つを含む:ヒンジ例えば、上、中および/または下のヒンジ領域ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、または改変体、一部、またはそのフラグメント。他の実施形態では、Fc部分は、完全Fcドメインすなわち、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含む。一実施形態では、Fc部分は、CH3ドメインまたはその一部に融合されたヒンジドメインまたはその一部を含む。別の実施形態では、Fc部分は、CH3ドメインまたはその一部に融合されたCH2ドメインまたはその一部を含む。別の実施形態では、Fc部分は、CH3ドメインまたはその一部からなる。別の実施形態では、Fc部分は、ヒンジドメインまたはその一部およびCH3ドメインまたはその一部からなる。別の実施形態では、Fc部分は、CH2ドメインまたはその一部およびCH3ドメインからなる。別の実施形態では、Fc部分は、ヒンジドメインまたはその一部およびCH2ドメインまたはその一部からなる。一実施形態では、Fc部分は、CH2ドメインの少なくとも一部例えば、CH2ドメインの全てまたは一部を欠く。本明細書において用いる場合、半減期という用語は、インビボにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、被験体に投与された量の半分がその動物の循環および/または他の組織から除去されるのに必要な時間で示され得る。所定のポリペプチドのクリアランス曲線が、時間の関数として構築される場合、その曲線は通常は、急性のα相とより長いβ相との二相性である。このα相は典型的には、血管内腔と血管外腔との間の投与されたFcポリペプチドの平衡に相当し、そして部分的にはポリペプチドのサイズによって決定される。このβ相は典型的には、血管内腔のポリペプチドの代謝に相当する。従って、好ましい実施形態では、本明細書において用いられる半減期という用語は、β相のポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の代表的なβ相半減期は21日である。本明細書において用いる場合、部分という用語は、キメラポリペプチドの区画部分または構成要素を指す。本明細書において用いる場合、標的化部分という用語は、所望部位または細胞に対して本発明のポリペプチドを局在するかまたは指向する、分子、そのフラグメントまたはポリペプチドの成分を指す。一実施形態では、本発明の構築物は、例えば、所望の部位に対して分子を局在化することによって、ポリペプチドの活性を増強する標的化部分を含む。このような部分は、例えば、抗体またはその改変体例えば、およびscFvまたはペプチドであってもよい。別の実施形態では、このような標的部分は、ポリペプチド、リガンドのレセプター結合部分、またはレセプターのリガンド結合部分本発明のポリペプチドに連結されて、例えば、細胞または組織の上で、所望の標的に結合するであってもよい。この標的部分は、構築物に対して遺伝子的に融合されてもよく、構築物に対して結合体化されてもよく、またはスペーサーを介して構築物に連結されてもよい。例えば、標的化部分は、標的部分と、構築物のFc部分との間の結合の形成によって本発明の構築物に結合されてもよく、ここでこの標的化部分は、第一の官能基を含み、そしてFc部分は、第二の官能基を含み、ここでこの第一および第二の官能基は、お互いと反応して、化学結合を形成し得る例えば、米国特許第7381408号を参照のこと。一実施形態では、標的部分は、血小板に結合する。例示的な標的化部分は、下にさらに詳細に記載される。一実施形態では、本発明の構築物における使用のための標的部分は、抗体改変体を含む。抗体改変体または改変された抗体という用語は、天然には存在せず、アミノ酸配列またはアミノ酸側鎖化学本明細書に記載されるような、天然に由来する抗体のものとは少なくとも1つのアミノ酸またはアミノ酸改変で異なるを有する抗体を包含する。本明細書において用いる場合、抗体改変体という用語は、それが天然には存在しないように変更されている抗体の合成型、例えば、少なくとも2つの重鎖部分を含むが、2つの完全な重鎖は含まない抗体例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディ;2つ以上の異なる抗原または単抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された多特異性型の抗体例えば、二重特異性、三重特異性など;scFv分子に接合する重鎖分子;一本鎖抗体;ジアボディ;トリアボディ;ならびに変化したエフェクター機能を有する抗体などを包含する。本明細書において用いる場合scFv分子という用語は、1つの軽鎖可変ドメインVL、またはその一部、および1つの重鎖可変ドメインVH、またはその一部からなる結合分子を含み、ここで、各々の可変ドメインまたはその一部は、同じまたは異なる抗体に由来する。scFv分子は、好ましくは、VHドメインとVLドメインとの間に差し込まれるscFvリンカーを含む。ScFv分子は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第5,892,019号、Hoら、1989.Gene77:51、Birdら、1988Science242:423、Pantolianoら、1991.Biochemistry30:10117、Milenicら、1991.CancerResearch51:6363、Takkinenら、1991.ProteinEngineering4:837において記載される。本明細書において用いられるscFvリンカーとは、scFvのVLとVHドメインとの間に差し込まれる部分を指す。scFvリンカーは、好ましくは、抗原結合の高次構造においてscFv分子を維持する。一実施形態においては、scFvリンカーは、scFvリンカーペプチドを含むか、またはそれからなる。特定の実施形態においては、scFvリンカーペプチドは、gly-serポリペプチドリンカーを含むか、またはそれからなる。他の実施形態においては、scFvリンカーは、ジスルフィド結合を含む。グリコシル化という用語は、ポリペプチドに対する1つ以上の炭水化物の共有結合を指す。代表的には、グリコシル化は、細胞の細胞内環境またはそれからの抽出物内で生じ得る翻訳後事象である。グリコシル化という用語は、例えば、N-連結グリコシル化ここでは1つ以上の糖がアスパラギン残基に連結されるおよび/またはO-連結グリコシル化ここでは1つ以上の糖がヒドロキシル基を有するアミノ酸残基例えば、セリンまたはトレオニンに連結されるを包含する。一実施形態では、本発明の分子はグリコシル化される。別の実施形態では、本発明の分子は、非グリコシル化されているaglycosylated。さらに別の実施形態では、本発明の分子は、野性型Fc領域におけるグリコシル化と比較してグリコシル化が低下している。本明細書において用いられるジスルフィド結合という用語は、2つの硫黄原子の間に形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成し得るか、第2のチオール基と架橋し得るチオール基を含む。大半の天然に存在するIgG分子では、CH1およびCL領域は、天然ジスルフィド結合によって結合され、2つの重鎖は、Kabatのナンバリングシステムを用いて239および242EUナンバリングシステムでは位置226または229に対応する位置で2つの天然ジスルフィド結合によって結合される。ベクターまたは発現ベクターという用語は、所望のポリヌクレオチドを細胞に導入して発現するためのビヒクルとして、本発明に従って用いられるベクターを意味する。当業者に公知のように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核または原核細胞に進入および/または複製する能力を含む。本発明のキメラの凝固因子を産生するために、多数の発現ベクター系を使用してもよい。例えば、ベクターの1つのクラスは、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスRSV、MMTVまたはMOMLV、またはSV40ウイルスなどの動物ウイルスに由来するDNAエレメントを利用する。さらに、染色体内にDNAを組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性例えば、抗生物質、または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択性のマーカー遺伝子は、発現されるべきDNA配列に直接結合されてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。一実施形態においては、誘導性発現系を使用してもよい。付加的エレメントも、mRNAの最適な合成に必要となる場合がある。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含んでもよい。一実施形態においては、分泌シグナル、例えば、幾つかのよく特徴付けられた細菌性リーダーペプチド例えば、pelB、phoA、またはompAのいずれか1つが、ポリペプチドの最適な分泌を得るために、本発明のポリペプチドのN末端とインフレームで融合されてもよいLeiら、1988,Nature,331:543、Betterら、1988Science,240:1041、Mullinaxら、1990.PNAS,87:8095。宿主細胞という用語は、組み換えDNA技術を用いて構築され、少なくとも1つの異種遺伝子をコードするベクターによって形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのタンパク質の単離のためのプロセスの説明において、細胞および細胞培養という用語は、他に明確に特定されない限り、同義的に使用され、タンパク質源を意味する。言い換えれば、細胞からのタンパク質の回収は、スピンダウンした全細胞、または培地および懸濁された細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。タンパク質発現のために用いられる宿主細胞株は、最も好ましくは、哺乳動物由来のものであり;当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に対して最も適切な特定の宿主細胞株を優先的に判定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株しては、限定するものではないが、DG44およびDUXB11チャイニーズハムスター卵巣株、DHFRマイナス、HELAヒト子宮頸癌、CVIサル腎臓株、COSSV40T抗原を有するCVIの誘導体、R1610チャイニーズハムスター線維芽細胞BALBC/3T3マウス線維芽細胞、PerC6細胞、HAKハムスター腎臓株、SP2/Oマウス骨髄腫、P3x63-Ag3.653マウス骨髄腫、BFA-1c1BPTウシ内皮細胞、RAJIヒトリンパ球、および293ヒト腎臓が挙げられる。宿主細胞株は、通常、商業サービスであるAmericanTissueCultureCollection、または既刊の文献から入手可能である。本発明のポリペプチドは、細菌もしくは酵母などの非哺乳動物細胞、または植物細胞においても発現することができる。この点において、細菌のような様々な単細胞性非哺乳動物微生物;すなわち、培養または発酵において増殖できる微生物も形質転換することができることが理解される。形質転換を起こしやすい細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌Escherichiacoliまたはサルモネラ属の株;Bacillussubtilisのようなバシラス科;肺炎球菌;連鎖球菌、およびインフルエンザ菌Haemophilusinfluenzaeが挙げられる。細菌において発現される場合、ポリペプチドは、通常、封入体の一部となることがさらに認識される。ポリペプチドは、単離、精製され、その後に、機能分子に組み立てられなければならない。原核生物に加えて、真核微生物を用いてもよい。Saccharomycescerevisiae、すなわち一般的なパン酵母は、真核微生物の間で最も一般的に用いられるが、Pichiapastorisを含む、多数の他の株が、一般に入手可能である。サッカロミセス属における発現のために、例えば、プラスミドYRp7Stinchcombら、1979,Nature,282:39、Kingsmanら、1979,Gene,7:141、Tschemperら、1980,Gene,10:157が、一般的に用いられる。このプラスミドは、例えば、ATCC番号44076またはPEP4-1Jones,1977,Genetics,85:12などの、トリプトファンにおいて成長する能力を欠いている酵母の変異株に対する選択マーカーを提供するTRP1遺伝子を既に含んでいる。そのため、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのtrpl損傷の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。本明細書において用いる場合、内因性のという用語は、細胞中に天然に存在する分子例えば、核酸および/またはタンパク質分子を指す。対照的に、外因性のまたは異種のという用語は、所定の状況、例えば細胞中、またはポリペプチド中で通常には見出されない、このような分子を指す。例えば、外因性または異種の分子は、例えば、トランスフェクションもしくは他の形態の遺伝子操作によって、細胞内に導入されて、細胞の操作後にのみ存在してもよいし、または異種アミノ酸配列は、それが天然には見いだされないタンパク質中に存在ししてもよい。本明細書において用いる場合、切断部位または酵素的切断部位という用語は、酵素によって認識される部位を指す。特定の酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、凝固カスケードの間に活性化される酵素によって切断される酵素的切断部位を有し、その結果このような部位の切断が血栓形成の部位で生じる。例示的なこのような部位としては、例えば、トロンビン、第XIa因子または第Xa因子によって認識される部位が挙げられる。例示的なFXIa切断部位としては、例えば、TQSFNDFTRおよびSVSQTSKLTRが挙げられる。例示的なトロンビン切断部位としては、例えば、DFLAEGGGVR、TTKIKPR、LVPRG配列番号35およびALRPRが挙げられる。他の酵素的切断部位は当該分野で公知である。本明細書において用いる場合、プロセシング部位または細胞内プロセシング部位という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素のための標的であるポリペプチド中のある種の酵素的切断部位を指す。一実施形態では、このような酵素は、ゴルジのルーメンからトランスゴルジ区画への輸送の間に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞からのタンパク質の分泌の前にポリペプチドを切断する。このようなプロセシング部位の例としては、例えば、エンドペプチダーゼのPACE/フリンここでPACEは、対の塩基性アミノ酸切断酵素PairedbasicAminoacidCleavingEnzymeについての頭文字であるファミリーによって標的される部位が挙げられる。これらの酵素は、ゴルジ膜に局在し、配列モチーフArg-[任意の残基]-LysまたはArg-Argのカルボキシ末端側でタンパク質を切断する。本明細書において用いる場合、酵素のフリンファミリーとしては、例えば、フリン、PC2、PC1/Pc3、PC4、PACE4、PC5/PC6、およびLPC/PC7/PC8/SPC7が挙げられる。他のプロセシング部位は当該分野で公知である。2つ以上のプロセシング部位または切断部位を備える構築物では、このような部位は同じであっても異なってもよいことが理解される。インビトロの産生によって、本発明の所望の変更されたポリペプチドを大規模化して大量に生成することが可能になる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は、当該分野で公知であり、かつ同種の懸濁培養物を、例えば、エアリフトリアクター中に、もしくは連続スターラーリアクター中に、または固定されるかもしくは取り込まれた細胞培養物を、例えば、中空ファイバー、マイクロカプセル中に、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上に包含する。必要および/または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーHIC、DEAE-セルロース上でのクロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーによって精製されてもよい。本明細書において用いる場合、ポリペプチドの投与から利益を得る被験体という句は、例えば、止血を改善するための、本発明のポリペプチドの投与から利益を得る、哺乳動物被験体のような被験体を包含する。キメラのタンパク質または融合タンパク質とは本明細書において用いる場合、第二の供給源由来の第二のアミノ酸配列に対して、共有結合的にまたは非共有結合的に結合された、第一の共有原由来の第一のアミノ酸配列から構成される任意のタンパク質であって、ここでこの第一および第二の供給源は同じではないタンパク質を指す。同じではない第一の供給源および第二の供給源は、2つの異なる生物学的実体、または同じ生物学的実体由来の2つの異なるタンパク質、または生物学的実体および非生物学的実体を包含し得る。キメラのタンパク質は、例えば、少なくとも2つの異なる生物学的供給源由来のタンパク質を含んでもよい。生物学的供給源としては、任意の非合成的に産生された核酸またはアミノ酸配列例えば、上記のいずれかの、本明細書にさらに記載されるような、ゲノムまたはcDNAの配列、プラスミドまたはウイルスベクター、天然のビリオンまたは変異体もしくはアナログを挙げることができる。合成の供給源としては、化学的に産生され、生物学的な系によるのではない例えば、アミノ酸配列の固相合成、タンパク質または核酸の配列を挙げることができる。キメラのタンパク質としてはまた、少なくとも2つの異なる合成の供給源由来のタンパク質、または少なくとも1つの生物学的供給源および少なくとも1つの合成の供給源由来のタンパク質を挙げることもできる。キメラのタンパク質はまた、任意の供給源由来、または任意の供給源由来の低分子の有機もしくは無機の分子由来の、核酸に対して共有結合されるかまたは非共有結合された、第一の供給源由来の第一のアミノ酸配列を含んでもよい。このキメラのタンパク質は、第一と第二のアミノ酸配列の間、または第一のアミノ酸配列と核酸との間、または第一のアミノ酸配列と低分子の有機または無機の分子との間にリンカー分子を含んでもよい。本明細書において用いる場合、凝固因子という用語は、天然に存在するかまたは組み換え産生され、被験体における出血エピソードの期間を防止するかまたは減少する、分子またはそのアナログを指す。言い換えれば、これは、凝固促進活性を有する分子である、すなわち、フィブリノーゲンの不溶性フィブリンのメッシュ血液を凝固または凝血させるへの変換を担うことを意味する。凝固活性とは、本明細書において用いる場合、フィブリン塊の形成において頂点に達するか、および/または出血もしくは放血のエピソードの重篤度、期間もしくは頻度を低減する生化学的反応のカスケードに関与する能力を意味する。止血とは、本明細書において用いる場合、放血もしくは出血の停止もしくは緩徐化;または血管もしくは体部を通じた血流の停止もしくは緩徐化を意味する。止血障害とは、本明細書において用いる場合、フィブリン塊を形成する能力の障害または不全に起因して、自発性または外傷の結果として、出血傾向によって特徴づけられる遺伝子的に受け継がれるかまたは後天性の状態を意味する。このような障害の例としては、血友病が挙げられる。3つの主な形態とは、血友病A第VIII因子欠損、血友病B第IX因子欠損またはクリスマス病および血友病C第XI因子欠損、中度の出血傾向であり、フォンヴィレブランド病、第Xi因子欠損PTA欠損、第XII因子欠損、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第V因子、第VII因子、第X因子または第XIII因子における欠損または構造的な異常、ベルナールスリエBernard-Soulier症候群は、GPIbの血管または欠損である。GPIbvWFのレセプターは、欠損性であって、一次的な血栓形成一次止血の欠失および出血傾向の増大、ならびにグランツマン-ネーゲリ血小板無力症グランツマン血小板無力症をもたらし得る。肝不全急性型または慢性型では、肝臓による凝固因子の産生が不十分であり;これは出血のリスクを増大し得る。本発明のキメラの分子は、予防的に用いられてもよい。本明細書において用いる場合、予防的処置という用語は、出血エピソードの前の分子の投与を指す。一実施形態では、一般的な止血剤の必要な被験体とは、手術を受けているか、または手術を受けるところである。本発明のキメラのタンパク質は、予防剤として術前に投与されてもまたは術後に投与されてもよい。本発明のキメラのタンパク質は、急性の出血エピソードを管理するために術中または術後に投与され得る。手術としては、限定するものではないが、肝移植、肝切除、または幹細胞移植を挙げることができる。オンデマンドの処置としては、出血エピソード、関節血症、筋出血、口腔出血bleed、出血hemorrhage、筋肉への出血、口腔出血hemorrhage、外傷、頭部の外傷頭部外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙出血、後腹膜腔出血、または腸腰筋鞘の出血のための処置が挙げられる。この被験体は、外科的な予防、周術期管理、または手術の処置の必要の必要がある場合がある。このような手術としては、例えば、小手術、大手術、抜歯、扁桃摘出術、鼠径ヘルニア切除術、骨膜切除術、人工膝関節置換術、開頭術、骨接合術、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術または関節置換術が挙げられる。本明細書において用いる場合急性出血という用語は、背景にある原因にかかわらず出血エピソードを指す。例えば、被験体は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害例えば、第VII因子欠損血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発達に起因する耐性を有し得る。本明細書に用いられる処置する、処置、処置することとは、例えば、ある疾患または状態の重篤度の軽減;ある疾患経過の期間の減少;ある疾患または状態に関連する1つ以上の症状の寛解;ある疾患または状態を有する被験体に対する有益な効果の提供この疾患または状態を治癒する必要がない、ある疾患または状態に関連する1つ以上の症状の予防を指す。II.凝固因子詳細には、本発明は、第VII因子、第IX因子、および第X因子の改善バージョンに関する。これらの因子は全てが、軽鎖のアミノ末端が各々、追加部分の組み込みを受け入れられないという点で構造的に関連している。同様に、これらの3つの凝固因子の重鎖のアミノ末端部分は、切断可能な部分すなわち、切断部分を介して連結される部分または切断部位からなる部分以外は、追加部分の組み込みを受け入れられない。本発明のキメラの凝固因子構築物は、これらの共有される特性に基づいて命名され、第VII因子は、本発明の例示的な実施形態を例示するために示されることが多いが、本発明の構築物は、第VII因子、第IX因子、または第X因子を用いて作製され得ることが理解される。例えば、当業者は、本発明の構築物のFVII部分が、FVIII、FIXまたはFX部分で置換されて、これらの凝固因子のうちの1つの増強バージョンを作製できることを理解する。本発明の例示的なキメラの凝固因子構築物は、添付の図面に示される。この図は一般に、凝固因子を単鎖としてそのチモーゲン型で図示するが、この凝固因子はまた、本発明の構築物中でその活性型、例えば、二本鎖のジスルフィド結合型として存在してもよいことが理解される。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、細胞によって活性型で発現される。別の実施形態では、キメラの凝固因子は不活性型で発現され、引き続き、インビトロで適切な条件下で活性化され、その結果この凝固因子の活性型が、この構築物中に存在する。別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、凝固因子を不活性型で含み、そしてこの凝固因子は、投与後にインビボで活性化される。一実施形態では、scFc足場は、活性型の分子を産生するために用いられ得る。特定の凝固因子は、組み換え的にチモーゲンとして産生され、従って、製造の間に活性化を要する。活性型の第VII因子、第IX因子、および第X因子は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によってのみ連結されている二量体分子から構成される。一実施形態では、キメラの凝固因子は、止血を改善するために被験体への投与前に活性化される。凝固因子を活性化するための方法は当該分野で公知である。例えば、一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、約5mMの濃度でCaCl2を含有する培地と接触させられる。別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、それを発現する細胞によって活性型で分泌される。一実施形態では、活性なキメラの凝固因子は、凝固因子の重鎖および軽鎖を別々のポリペプチドとして発現することによって作製される。別の実施形態では、凝固因子の重鎖のN末端は、分泌経路で後期まですなわち、トランスゴルジネットワークにおける活性なプロセシング酵素とタンパク質が共局在化するまで、合成の間の凝固因子の活性化を遅らせる細胞内プロセシング部位を含むように改変されて、より大きい生産性をもたらす。例示的なこのような細胞内プロセシング部位としては、フリンによって認識される部位が挙げられる。このファミリーの酵素のための例示的な切断部位としては、モチーフArg-Xaa-Lys/Arg-Argを含むアミノ酸配列が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の活性な構築物は、例えば、scFcリンカー例えば、cscfcリンカーを用いて、Fc融合タンパク質の状況で作製される。例示的な構築物は、添付の図面に示される。一実施形態では、本発明は、プロセシングされた例えば、成熟ポリペプチドであって、scFcポリペプチドリンカーに隣接する少なくとも1つの切断部位が切断され、その結果、その分子がもはや単一のポリペプチド鎖ではなく、その結果、このポリペプチドが、少なくとも2つのポリペプチド鎖から構成される酵素的切断部位単数または複数P1および/またはP2での切断に起因する、ポリペプチドに関する.一実施形態では、このようなプロセシングされたポリペプチドは、ポリペプチドリンカーの切断後に遊離のアミノ末端を有する第二のFc部分すなわち、ポリペプチドリンカーの切断の前にアミノ末端からカルボキシ末端をカウントしたとき、第二のFc部分に連結された凝固因子またはその一部を含む。一実施形態では、第二のFc部分のN末端に結合された凝固因子は、触媒的に活性であり、例えば、酵素活性を有する。別の実施形態では、第二のFc部分のN末端に結合された凝固因子は、細胞によってチモーゲンとして分泌されて、この凝固因子が完全に活性化されるためのさらなる酵素的プロセシングを必要とする。一実施形態では、本発明は、プロセシングの間、さらなる活性化の必要のない、細胞から活性型または活性化型で分泌される凝固因子に関する。例えば、第VII因子は一般に、組み換え的にチモーゲンとして産生され、投与のための活性型を産生するために製造の間の活性化を必要とする。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、製造可能性を改善するためにそれが活性型で発現される細胞から分泌される。下にさらに詳細に示すとおり、このような凝固因子は、cscFcリンカーを含んでいるscFc分子の状況では凝固因子の軽鎖およびこの凝固の重鎖を別々に発現することによって産生され得る。このような構築物の活性化は、トランスゴルジ装置において活性なプロセシング酵素とタンパク質が共存するとき例えば、プロセシングの間の分泌経路で後期まで遅らせられる。一実施形態では、本発明の凝固因子は、第VII因子の成熟型またはその改変体である。第VII因子FVII、F7;第7因子、凝血第VII因子、血清第VII因子、血清プロトロンビン変換加速因子、SPCA、プロコンバーチンおよびエプタコグアルファとも呼ばれるは、凝血カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。FVIIは、Glaドメイン、2つのEGFドメインEGF-1およびEGF-2、およびセリンプロテアーゼドメインまたはペプチダーゼS1ドメイン例えば、キモトリプシンとのような、セリンプロテアーゼのペプチダーゼS1ファミリーの全てのメンバーの間で高度に保存されているを含む。FVIIは、単鎖チモーゲン、活性化されたチモーゲン様の二本鎖のポリペプチドおよび完全に活性化された二本鎖型として存在する。本明細書において用いる場合、チモーゲン様タンパク質またはポリペプチドとは、タンパク質分解性切断によって活性化されたが、依然として、チモーゲンに関連する特性、例えば、低い活性もしくは不活性、またはタンパク質のチモーゲン型の高次構造を模倣する高次構造などを呈するタンパク質を指す。例えば、組織因子に結合されない場合、FVIIのこの二本鎖の活性化型は、チモーゲン様タンパク質である;これは、非切断のFVIIチモーゲンと類似の高次構造を保持し、従って、極めて低い活性を呈する。組織因子に対する結合の際、FVIIのこの二本鎖の活性化型は、高次構造の変化を受け、凝固因子としてその完全活性を獲得する。例示的なFVII改変体としては、比活性が増大した改変体、例えば、その酵素活性KcatまたはKmを増大することによってFVIIの活性を増大する変異体が挙げられる。このような改変体は、当該分野で記載されており、これには、例えば、Perssonら、2001.PNAS98:13583;PetrovanandRuf.2001.J.Biol.Chem.276:6616;Perssonら、2001J.Biol.Chem.276:29195;Soejimaら、2001.J.Biol.Chem.276:17229;Soejimaら、2002.J.Biol.Chem.247:49027に記載されるような分子の変異体型が挙げられる。一実施形態では、FVIIの改変体は、変異体を含み、例示的な変異としては、V158D-E296V-M298Qが挙げられる。別の実施形態では、FVIIの改変体型としては、FVII成熟配列からのアミノ酸608-619LQQSRKVGDSPN,170-ループに対応するのトリプシンの170ループ由来のアミノ酸EASYPGKでの置換が挙げられる。FIXの高い比活性の改変体も当該分野で公知である。例えば、Simioniら、2009N.E.JournalofMedicine361:1671は、R338L変異体を記載する。Changら、1988JBC273:12089およびPierriら、2009ヒトGeneTherapy20:479は、R338A変異体を記載する。他の変異体は、当該分野で公知であり、そして例えば、ZoggおよびBrandstetter.2009Structure17:1669;Sichlerら.2003.J.Biol.Chem.278:4121;ならびにSturzebecherら、1997.FEBSLett412:295に記載されるものが挙げられる。これらの引用文献の内容は、参照によって本明細書に援用される。チモーゲン様形態からの高次構造変化の際に生じる完全活性は、その補因子に対する結合の際に組織因子を生じる。また、組織因子の非存在下における高次構造変化を生じる変異も導入され得る。従って、FVIIaという言及には、その二本鎖型、チモーゲン様型、および完全活性化された二本鎖型を包含する。一実施形態では、本発明の凝固因子は、第VIII因子またはその改変体の成熟型である。FVIIIは、血液凝固の内因性経路において、カルシウムイオンの存在下で、負に荷電されたリン脂質表面上に存在する反応である、第IXa因子による第X因子の活性化を加速する補因子として機能する。FVIIIは、ドメイン構造A1-A2-B-A3-C1-C2を有する2351のアミノ酸単鎖ポリペプチドとして合成される。Wehar,G.A.ら、Nature312:337-3421984およびToole,J.J.ら、Nature312:342-3471984。FVIIIのドメイン構造は、相同な凝固因子、第V因子FVのドメイン構造と同一である。Kane,W.H.ら、PNASUSA83:6800-68041986およびJenny,R.J.ら、PNASUSA84:4846-48501987。TheFVIIIA-ドメインは、330アミノ酸であり、かつお互いと、ならびにFVのAドメインおよび血漿銅結合タンパク質セルロプラスミンに対して40のアミノ酸同一性を有する。Takahashi,N.ら、PNASUSA81:390-3941984。各々のC-ドメインは、150アミノ酸であり、かつFVのCドメインに対して、ならびに複合糖質および負に荷電されたリン脂質に結合するタンパク質に対して40の同一性を呈する。Stubbs,J.D.ら、PNASUSA87:8417-84211990。FVIIIB-ドメインは、単一のエキソンによってコードされて、FVB-ドメインを含んでいる任意の公知のタンパク質に対してわずかな相同性を示す。Gitschier,J.ら、Nature312:326-3301984andCripe,L.D.ら、Biochemistry31:3777-37851992。FVIIIは、A1ドメインとA3ドメインとの間の非共有結合の二価金属イオン結合を通じて会合される重鎖ドメインA1-A2-Bおよび軽鎖ドメインA3-C1-C2のヘテロ二量体として血漿中に分泌される。血漿中では、FVIIIは、フォンヴィレブランド因子に対する結合によって安定化される。さらに詳細には、FVIII軽鎖は、フォンヴィレブランド因子のアミノ末端における一次結合部位に対して非共有結合的相互作用によって結合される。トロンビンによるタンパク質分解性活性の際、FVIIIは、2つの重鎖フラグメントA1、50kDaフラグメント、およびA2、43kDaフラグメントおよび軽鎖A3-C1-C2、73kDa鎖のヘテロ二量体へ活性化される。従って、FVIIIの活性型FVIIIaは、トロンビン切断されたA3-C1-C2軽鎖に対する二価金属イオン連結を通じて会合されたA1サブユニット、およびイオン会合を通じてA1ドメインと会合された遊離A2サブユニットからなる。Eaton,D.ら、Biochemistry25:5051986;Lollar,P.ら、J.Biol.Chem.266:124811991;およびFay,P.J.ら、J.Biol.Chem.266:89571991。このFVIIIaヘテロ二量体は、不安定であり、かつ生理学的条件下でA2サブユニットの解離を通じて急速な不活性化を受ける。一実施形態では、凝固因子は、第VIII因子のBドメイン欠失バージョンを含む。第VIII因子のB-ドメインとは、本明細書において用いる場合、内部のアミノ酸配列同一性およびタンパク質分解性切断の部位によって規定される当該分野で公知のBドメインと同じである例えば、全長ヒト第VIII因子の残基Ser741-Arg1648。他のヒト第VIII因子ドメインは、以下のアミノ酸残基によって定義される:A1、残基Ala1-Arg372;A2、残基Ser373-Arg740;A3、残基Ser1690-Asn2019;C1、残基Lys2020-Asn2172;C2、残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2配列は、残基Ser1690-Tyr2332を含む。残りの配列、残基Glu1649-Arg1689は、通常は、a3酸性領域と呼ばれる。全ドメインブタ、マウスおよびイヌの第VIII因子についてのBドメインを含むに関する境界の位置もまた当該分野で公知である。一実施形態では、第VIII因子のBドメインは欠失されるB-ドメイン-欠失第VIII因子またはBDDFVIII。BDDFVIIIの例は、当該分野で公知のREFACTO登録商標S743/Q1638融合を有する組み換えBDDFVIIIである。B-ドメイン-欠失第VIII因子は、その各々がその全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第6,316,226号、同第6,346,513号、同第7,041,635号、同第5,789,203号、同第6,060,447号、同第5,595,886号、同第6,228,620号、同第5,972,885号、同第6,048,720号、同第5,543,502号、同第5,610,278号、同第5,171,844号、同第5,112,950号、同第4,868,112号、および同第6,458,563号に開示される全欠失または部分欠失を有する場合がある。いくつかの実施形態では、本発明のB-ドメイン欠失の第VIII因子配列は、米国特許第6,316,226号また米国特許第6,346,513号にもの第4欄、第4行~第5欄の28行および実施例1~5に開示される欠失のいずれか1つを含む。別の実施形態では、B-ドメイン欠失の第VIII因子は、S743/Q1638Bドメイン欠失の第VIII因子SQバージョンの第VIII因子例えば、アミノ酸744~アミノ酸1637の欠失の第VIII因子、例えば、配列番号6、すなわち配列番号2のアミノ酸1-743およびアミノ酸1638-2332を有する第VIII因子である。いくつかの実施形態では、本発明のB-ドメイン欠失の第VIII因子は、米国特許第5,789,203号また米国特許第6,060,447号、米国特許第5,595,886号、および米国特許第6,228,620号もの第2欄26~51行および実施例5~8に開示される欠失を有する。いくつかの実施形態では、B-ドメイン欠失の第VIII因子は、米国特許第5,972,885の第1欄の25行~第2欄の40行;米国特許第6,048,720号の第6欄,行1-22および実施例1;米国特許第5,543,502号の第2欄、行17-46;米国特許第5,171,844号の第4欄、行22~第5欄、行36;米国特許第5,112,950号の第2欄、行55~68、図2、および実施例1;米国特許第4,868,112号の第2欄、行2~第19欄、行21および表2;米国特許第7,041,635号の第2欄、行1~第3欄、行19、第3欄、行40~第4欄、行67、第7欄、行43~第8欄、行26、および第11欄、行5~第13欄、行39;または米国特許第6,458,563号の第4欄、行25~53に記載の欠失を有する。いくつかの実施形態では、B-ドメイン欠失の第VIII因子は、ほとんどのBドメインが欠失しているが、その全体が参照によって本明細書に援用される、WO91/09122に開示されるように、2つのポリペプチド鎖中への一次翻訳産物のインビボでのタンパク質分解性プロセシングに必須であるBドメインのアミノ末端配列を依然として含む。いくつかの実施形態では、B-ドメイン欠失の第VIII因子は、アミノ酸747-1638の欠失、すなわち、事実上Bドメインの完全アミノ酸欠失で構築されている。HoebenR.C.,ら.J.Biol.Chem.26513:7318-73231990は、その全体が参照によって本明細書に援用される。AB-ドメイン欠失の第VIII因子はまた、第VIII因子のアミノ酸771~1666またはアミノ酸868~1562の欠失を含んでもよい。MeulienP.,ら.ProteinEng.24:301-61988は、その全体が参照によって本明細書に援用される。本発明の一部である追加のBドメイン欠失としては以下が挙げられる:アミノ酸982~1562または760~1639の欠失Tooleら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.198683,5939-5942、797~1562の欠失Eaton,ら、Biochemistry198625:8343-8347,741~1646の欠失Kaufman国際公開WO87/04187、747-1560の欠失Sarver,ら、DNA19876:553-564、741~1648の欠失PasekPCTapplicationNo.88/00831、または816~1598もしくは741~1648の欠失LagnerBehringInst.Mitt.1988No82:16-25,欧州特許第295597号その各々は、その全体が参照によって本明細書に援用される。前述の欠失の各々は、任意の第VIII因子配列で作製され得る。一実施形態では、本発明は、FVIIIの標的化バージョンであって、ここで標的化はi血小板に特異的に結合し、ii凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれず、かつここでこのキメラの凝固因子は、少なくとも1つの標的化部分を欠いている適切なコントロールに比較して血小板の存在下でトロンビンの生成の増大を示す、標的化バージョンに関する。一実施形態では、本発明の凝固因子は、第IX因子の成熟型またはその改変体である。第IX因子は、415個のアミノ酸の単鎖血漿チモーゲンとして循環するA.Vysotchinら、J.Biol.Chem.268,84361993。FIXのチモーゲンは、FXIaによって、または組織因子/FVIIa複合体によって活性化される。アルギニン-アラニン145-146とアルギニン-バリン180-181との間の特定の切断によって、システイン132とシステイン289との間の単一のジスルフィド結合によって連結される軽鎖および重鎖が生じるS.Bajajら、Biochemistry22,40471983。FIXの構造的な組織化は、ビタミンK依存性の血液凝固タンパク質FVII、FXおよびプロテインCのものと同様であるB.FurieおよびB.Furie,前出。アミノ末端のほぼ45アミノ酸は、γ-カルボキシグルタミン酸、またはgla、ドメインを含む。この後ろに、2つの上皮細胞増殖因子相同性ドメインEGF、活性化ペプチドおよび触媒性重鎖セリンプロテアーゼファミリーのメンバーであるA.Vysotchinら、J.Biol.Chem.268,84361993;S.Spitzerら、BiochemicalJournal265,2191990;H.Brandstetterら、Proc.Natl.AcadSci.USA92,97961995が続く。一実施形態では、本発明の凝固因子は、第X因子の成熟型である。第X因子は、58.5kDaという分子量のビラミンK依存性糖タンパク質であり、肝細胞から血漿中にチモーゲンとして分泌される。最初に、第X因子は、全部で488個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを有するプレプロペプチドとして産生される。このシグナルペプチドは、小胞体中への移入の間にシグナルペプチドによって切断され、このプロペプチド配列は、成熟N末端鎖のN末端で最初の11のグルタミン酸残基でγカルボキシル化が生じた後に切断される。さらなるプロセシング工程は、Arg182とSer183との間での切断によって生じる。このプロセシング工程はまた、3つのペプチドArg180-Lys181-Arg182の欠失を同時に生じる。得られた分泌された第X因子チモーゲンは、Cys172とCys342との間のジスルフィド架橋を介して共有結合される139アミノ酸のN末端軽鎖M,16,200および306アミノ酸のC末端重鎖M,42,000からなる。さらなる翻訳後プロセシング工程は、Asp103のβヒドロキシル化、ならびにN-型グリコシル化およびO-型グリコシル化を包含する。これらの凝固因子の野性型WTバージョンまたはその生物学的に活性な部分に加えて、本発明はまた、活性を有するその前駆体の短縮型、対立遺伝子改変体および種改変体、スプライス改変体によってコードされる改変体、およびこの凝固因子の成熟型に対して少なくとも40、45、50、55、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99以上の配列同一性を有するポリペプチドを含んでおり、血栓形成を促進する能力を保持している他の改変体も使用する。例えば、TF結合、第X因子結合、リン脂質結合および/またはFVIIの凝固活性のようなFVIIの少なくとも1つの活性を保持する、改変されたFVIIポリペプチドおよびその改変体が使用されてもよい。活性を保持することによって、この活性は、保持される活性のレベルが検出可能な効果を生じるのに十分である限り、野性型凝固因子に比較して、減少されるかまたは増大されるなど、変更されてもよい。本発明の構築物で用いられ得る凝固因子の例示的な配列は、添付の配列表に見出される。例示的な改変されたポリペプチドとしては、限定するものではないが、組織特異的なアイソフォームおよびその対立遺伝子改変体、核酸の翻訳によって調製される合成の分子、組み換え方法を通じる、より短いポリペプチドの連結を含む合成のような、化学合成によって生成されるタンパク質、ヒトおよび非ヒト組織および細胞から単離されるタンパク質、キメラのポリペプチドおよびその修飾型が挙げられる。本発明の凝固因子はまた、十分な長さのWT分子のフラグメントもしくは一部からなってもよいし、または全長の成熟ポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する必要に応じて活性化の際ための適切な領域を含んでもよい。例示的な凝固因子改変体は、当該分野で公知である。本明細書において用いる場合、Glaドメインという用語は、プロトロンビン、凝固因子VII、IXおよびX、タンパク質C、S、およびZのような、ビタミンK依存性タンパク質に存在する保存された膜結合モチーフを指す。これらのタンパク質は、これらのタンパク質のN末端Glaドメイン中でクラスター化されるアミノ酸である、g-カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンKを必要とする。このドメインに存在する全てのグルタミン酸残基は、潜在的なカルボキシル化部位であり、従ってそれらの多くはカルボキシル化によって改変される。カルシウムイオンの存在下では、Glaドメインは、ホスファチジルセリンを含むリン脂質膜と相互作用する。Glaドメインはまた、組織因子TFであるFVIIa補因子に対する結合においてある役割を果たす。TFと複合体化され、FVIIaのGlaドメインは、7つのCa2イオンをロードされ、細胞表面上のリン脂質との相互作用のために細胞膜の方向に3つの疎水性側鎖を突出させTFのC末端ドメインとの有意な接触を有する。第VII因子のGlaドメインは、負に荷電されたリン脂質表面に対する凝固因子の結合で重要な役割を果たす、一般的でないアミノ酸カルボキシグルタミン酸Glaを含む。GLAドメインは、カルシウムイオンの高親和性の結合を担う。これは、成熟型のタンパク質のN末端の先端で開始して、保存された芳香族残基で終わる。保存されたGla-x3-Gla-x-Cysモチーフは、カルボキシラーゼによる基質認識のために重要であるとみなされるドメインの中央で見出される。表面プラズモン共鳴分析と組み合わせたストップトフロー蛍光動態測定を用いて、Glaドメインは、事象の順序に重要であり、それによってFVIIaのプロテアーゼドメインがsTFと接触を開始することが見出されたBiochemicalおよびBiophysicalResearchCommunications.2005.337:1276。さらに、凝固因子のクリアランスは、例えば、肝臓細胞およびクリアランスレセプター上で、例えば、EPCR上で。Gla相互作用を通じて有意に媒介され得る。一実施形態では、標的化凝固因子は、Glaドメインを欠くように改変される。Glaドメインは、肝細胞、EPCRのようなクリアランスレセプターなどに対する結合のような、複数の経路を介して凝固因子のクリアランスの媒介を担う。従って、Glaドメインを排除することは、凝固因子の半減期に有益な効果を有する。Glaドメインはまた、凝固の部位に対して凝固因子を局在化することによって活性に一般的に必要であるが、血小板標的化ドメイン部分を含むことによって、Gla欠失の凝固因子を血小板に標的する。一実施形態では、本発明の凝固因子は、標的部分を含み、かつGlaドメインを欠く。例えば、第VII因子の場合には、Glaドメインは、軽鎖のアミノ末端に存在し、かつアミノ酸1-35からなる。例示的な凝固因子のGlaドメインは、添付の配列表に示される。このドメインは、標準的な分子生物学的技術を用いて除去されて、標的化ドメインで置き換えられ、そして改変された軽鎖が本発明の構築物に組み込まれてもよい。一実施形態では、切断部位は、この分子の活性化を容易にするためにGlaドメインを欠いている構築物中に導入されてもよい。例えば、一実施形態では、このような切断部位は、凝固因子が活性化されたときに切断されるアミノ酸の間に導入されてもよい例えば、第VII因子の場合はアミノ酸152~153の間。Glaドメインを欠いている例示的な凝固因子は、添付の図面に示される。一実施形態では、分子の活性化を容易にするためにGlaドメインを欠いている構築物中に切断部位が導入されてもよい。例えば、一実施形態では、このような切断部位は、凝固因子が活性化されたときに切断されるアミノ酸の間に導入されてもよい例えば、第VII因子の場合はアミノ酸152~153の間。Glaドメインを欠いている例示的な凝固因子は、添付の図面に示される。例示的な凝固因子は、哺乳動物、例えば、ヒト由来のものである。例示的な凝固因子の配列は、添付の配列表中に、例えば、単独で、またはキメラの凝固因子構築物と関連して示される。III.標的部分一実施形態では、本発明の凝固因子は、血小板上で発現される標的分子に結合する、標的化部分を用いて凝固の部位に対して凝固因子を局在化することによって、その有効性を増強するように血小板に標的される。好ましくは、この標的化分子は、血小板以外の細胞または組織上では発現されず、すなわち、この標的化部分は特異的に血小板に結合する。一実施形態では、休止血小板上で見出されるレセプター/高次構造が標的される。標的されることによって、凝固のための部位は、有効性の増強のためにプライムされ得る。このような分子を標的することはまた、凝固因子の半減期を延長するか、および/またはクリアランスを妨げ得る。このような標的の例としては、GpIb/V/IX複合体のGpIb、ならびにGPIIb/IIIaのGpVIおよび不活性型が挙げられる。一実施形態では、活性化された血小板上でのみ見出されるレセプター/高次構造は、活性な凝固の部位に対して凝固因子を標的化するために標的化される。このような標的の例としては、例えば、GpIIb/IIIaの活性型およびCD62Pが挙げられる。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、血小板に親和性を有しており、血小板に結合する標的化部分を含む。例えば、一実施形態では、標的部分は、GPIb複合体、例えば、GPIb-αに結合する。このような標的化部分の例としては、活性な血小板および不活性な血小板の両方に結合するペプチドPS4、OS1、およびOS2が挙げられるBenardら、2008Biochemistry47:4674;別の実施形態では、標的部分は、GPIIbIIIaの活性な高次構造に結合する。このような標的化部分の例としては、SCE5およびMB9可変領域活性な血小板のみに結合するが挙げられるSchwarzら、2004FASEBJournalexpressarticle10.1096/fj.04-1513fje;Schwarzら、2006CirculationResearch.99:25-33;米国特許出願公開第20070218067号。別の実施形態では、標的部分は、GPIIbIIIaの活性な/不活性な高次構造の両方に結合する。このような標的部分の例は、AP3抗体の可変領域であるPetersonら、2003.Hemostasis,Thrombosis、およびVascularBiology101:937;WO2010115866。他の標的および標的化部分は当該分野で公知である。凝固活性が増強された第IX因子の別バージョン3つ組の変異体V86A/E277A/R338Aは、Linら、2010.JournalofThrombosisおよびHaemostasis8:1773によって記載されている。これらの引用文献の内容は、本引用文献によって本明細書に援用される。本発明のキメラの凝固因子は、1つ以上の標的部分を含んでもよい。例示的な立体配置は添付の図面に示される。さらに、2つ以上の標的化部分はお互いに対して例えば、スペーサーを介して連続して連結されて、直列の配列が本発明の構築物に対して作動可能に連結されてもよい。2つ以上の標的化部分が本発明のキメラの凝固因子に存在する場合、この部分は、同じであっても異なってもよい。一実施形態では、標的部分は、凝固の部位で標的部分を除去するために切断され得る切断可能なリンカーによって、本発明のキメラの凝固因子に融合される。別の実施形態では、標的部分は、切断可能なリンカーを介して結合されず、従って、凝固の部位では切断されない。一実施形態では、標的部分は、第VIII因子のN末端またはC末端に配置される。別の実施形態では、標的部分は、FVII、FIX、FXのC末端、またはFVIIa、FIXaもしくはFXaのいずれかまたは両方の鎖のC末端上に配置される。Fc領域またはその一部が使用される実施形態では、標的部分は、第二のFc鎖のN末端もしくはC末端、またはFc鎖のいずれかもしくは両方のC末端に配置されてもよい。一実施形態では、標的部分は、ある構築物に対して直接遺伝子的に融合されないが、この構築物に対してスペーサーまたは化学結合を介して連結される。例えば、標的化部分は、ある構築物の標的部分とFc部分との間の結合の形成によって本発明の構築物に結合され得、ここでこの標的化部分は、第一の官能基を含み、かつこのFc部分は、第二の官能基を含み、ここでこの第一のおよび第二の官能基は、お互いと反応して化学結合を形成し得る例えば、米国特許第7381408号を参照のこと。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗原結合部位例えば、抗体の抗原結合部位、抗体改変体、または抗体フラグメント、ポリペプチド、リガンドのレセプター結合部分、またはレセプターのリガンド結合部分血小板、例えば、休止血小板または活性化された血小板に対して特異的に結合するのうちの少なくとも1つを含む。例示的な標的化部分としては、標的されるべき分子に結合するscFv分子またはペプチドが挙げられる。標的化部分の例は、本発明の実施例および図面に見出される。標的部分として有用な他の分子は、本明細書における教示に基づいて当業者によって容易に選択され得る。A.血小板に結合する抗原結合部位特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗体の少なくとも1つの抗原結合部分例えば、結合部位を含む。一実施形態では、抗原結合部分は、ポリペプチドを血小板に対して標的する。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗原結合部分を含んでもよい。抗原結合部分という用語は、抗原に結合するか、または抗原結合すなわち、特異的な結合についてインタクトな抗体とすなわち、それらが由来するインタクトな抗体と競合する、免疫グロブリン、抗体または抗体改変体のポリペプチドフラグメントを指す。例えば、この抗原結合部分は、上記の任意の抗体または抗体改変体に由来し得る。抗原結合部分は、当該分野で周知の組み換え方法または生化学的方法によって産生され得る。例示的な抗原結合部分としては、Fv、Fab、Fab’、およびFab’2、ならびにscFv分子が挙げられる。他の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、単鎖の結合分子由来の結合部分を含んでもよい例えば、単鎖の可変領域またはscFv。単鎖抗体の産生について記載された技術米国特許第4,694,778号;Bird,Science242:423-4421988;Hustonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-58831988;およびWardら、Nature334:544-5541989は、単鎖の結合分子を産生するように適合され得る。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、結果として単鎖抗体が生じる。E.coliにおける機能的なFvフラグメントのアセンブリのための技術もまた用いられてもよいSkerraら、Science242:1038-10411988。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、単鎖の可変領域配列scFvを含むか、またはそれらからなる、1つ以上の結合部位または領域を含む。単鎖可変領域配列は、1つ以上の抗原結合部位を有する単独のポリペプチド、例えば、VHドメインに対して可塑性リンカーによって連結されるVLドメインを含む。このVLおよび/またはVHドメインは、上記の任意の抗体または抗体改変体由来であってもよい。ScFv分子は、VH-リンカー-VL方向で構築されても、またはVL-リンカー-VH方向で構築されてもよい。抗原結合部位を作製するVLおよびVHドメインを連結する可塑性リンカーは好ましくは、約10~約50アミノ酸の残基を含む。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、gly-serポリペプチドリンカーである。例示的なgly/serポリペプチドリンカーは、式Gly4Sernであって、ここでnが正の整数例えば、1、2、3、4、5、または6である、リンカーである。他のポリペプチドリンカーは当該分野で公知である。単鎖の可変領域配列を有する抗体例えば、単鎖のFv抗体およびこのような単鎖抗体を作製する方法は当該分野で周知である例えば、Hoら、1989.Gene77:51;Birdら、1988Science242:423;Pantolianoら、1991.Biochemistry30:10117;Milenicら、1991.CancerResearch51:6363;Takkinenら、1991.ProteinEngineering4:837。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドで使用されるscFv分子は、安定化されたscFv分子である。一実施形態では、この安定化されたcFv分子は、VHドメインとVLドメインとの間に差し込まれたscFvリンカーを含んでもよく、ここでVHおよびVLドメインは、VHドメインのアミノ酸とVLドメインのアミノ酸との間のジスルフィド結合によって連結される。他の実施形態では、安定化されたscFv分子は、最適化された長さまたは組成を有するscFvリンカーを含み得る。さらに他の実施形態では、この安定化されたscFv分子は、少なくとも1つの安定化アミノ酸置換単数または複数を有するVHドメインまたはVLドメインを含んでもよい。さらに別の実施形態では、安定化されたscFv分子は、上記の安定化特徴のうち少なくとも2つを有してもよい。安定化されたscFv分子は、改善されたタンパク質安定性を有するか、または改善されたタンパク質安定性をこの分子が作動可能に連結されるポリペプチドに対して付与する。本発明の好ましいscFvリンカーは、従来のポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチドの熱安定性を少なくとも約2°Cまたは3°Cまで改善する。比較は、例えば、本発明のscFv分子の間で行ってもよい。特定の好ましい実施形態では、この安定化されたscFv分子は、Gly4Ser4scFvリンカーおよびジスルフィド結合VHアミノ酸44およびVLアミノ酸100を連結するを含む。他の例示的な安定化されたscFv分子本発明のポリペプチド中で使用され得るは、その各々が全体として参照によって本明細書に援用される、2006年12月8日出願の米国特許仮出願第60/873,996号、または2007年3月19日出願の米国特許出願第11/725,970号に記載される。本発明のポリペプチドは、当該分野で認識されるプロトコールを用いて、抗体に由来する可変領域またはその一部例えば、VLおよび/またはVHドメインを含んでもよい。例えば、可変ドメインは、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットにおいて、この哺乳動物を抗原またはそのフラグメントで免疫することによって、産生された抗体由来であってもよい。全ての目的のために参照によって援用される、HarlowLane前出を参照のこと。免疫グロブリンは、関連の抗原例えば、精製された腫瘍関連抗原または細胞またはこのような抗原を含む細胞抽出物およびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって生成され得る。免疫は典型的には、活性化された脾臓細胞またはリンパ球由来の抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を惹起する。可変領域は、免疫された哺乳動物の血清から採取されるポリクローナル抗体由来であってもよいが、所望の可変領域が由来するモノクローナル抗体MAbの同種の調製物を提供するために、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい場合が多い。ウサギまたはモルモットが、通常、ポリクローナル抗体を作製するために用いられる。マウスが、通常、モノクローナル抗体を作製するために用いられる。モノクローナル抗体は、抗原フラグメントをマウスに注入し、ハイブリドーマを調製し、抗原に特異的に結合する抗体に対してハイブリドーマをスクリーニングすることによって、フラグメントに対して調製することができる。この周知のプロセスKohlerら、1975、Nature,256:495では、抗原を注入されたマウス由来の比較的短命か、または臨死のリンパ球は、不死の腫瘍細胞株例えば、骨髄腫細胞株と融合されるため、したがって、不死であり、かつB細胞によって遺伝的にコードされる抗体を産生することが可能なハイブリッド細胞またはハイブリドーマを産生する。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のための特定の遺伝子を含む各々の個々の株による選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝株に分離される。それらは、所望の抗原に対して同種であり、それらの純粋な遺伝的血統に関してモノクローナルと称される抗体を産生する。このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する1つ以上の物質を含有する適切な培地において播種され、増殖する。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および成長のための試薬、細胞株、および培地が、多数の供給源より市販され、標準的プロトコールが、十分に確立していることを認識している。概して、ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイRIAもしくは酵素結合免疫吸着剤アッセイELISAのようなインビトロアッセイによって測定される。所望の特異性、親和性および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ、標準方法によって成長されてもよいGoding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesおよびPractice,pp59-103AcademicPress,1986。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー例えば、プロテインA、プロテインG、またはタンパク質Lアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または透析等の従来の精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から分離することができることはさらに認識されている。必要に応じて、抗体は、抗原の他の非重複フラグメントに結合することなく、特定の活性状態の血小板に対する結合について、または抗原の特定の領域または所望のフラグメントに対する結合についてスクリーニングされてもよい。後者のスクリーニングは、抗原の欠失変異体の集合への抗体の結合を判定すること、およびどの欠失変異体が抗体に結合するかを判定することによって達成することができる。結合は、例えば、ウエスタンブロット法またはELISAによって評価することができる。抗体への特定の結合を示す最小のフラグメントが、抗体のエピトープを定義する。あるいは、エピトープ特異性は、試験抗体および参照抗体が抗原への結合に関して競合する競合アッセイによって判定され得る。試験抗体および参照抗体が競合するならば、それらは、同じエピトープまたは十分近接するエピトープに結合し、その結果1つの抗体の結合が他の抗体の結合に干渉する。所望のモノクローナル抗体またはその結合部位をコードするDNAは、定常領域ドメイン配列の単離のための上述の任意の従来の手順を用いて例えば、マウス抗体の重鎖または軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、容易に単離および配列決定され得る。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として作用する。より詳しくは、単離されたDNA本明細書において記載されるように合成することができるは、本発明のポリペプチドへの組み込みのための所望の可変領域配列をクローニングするために用いられ得る。他の実施形態においては、結合部位は、完全ヒト抗体に由来する。ヒトまたは実質的なヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生が不可能なトランスジェニック動物例えば、マウスにおいて生成され得る例えば、それぞれの内容は、参照によって、本明細書に援用される米国特許第6,075,181号、同第5,939,598号、同第5,591,669号、および同第5,589,369号を参照のこと。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。そのような生殖細胞系列変異体マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。SCIDマウスを用いるヒト抗体を生成するための別の好ましい手段は、米国特許第5,811,524号において開示され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質はまた、本明細書において記載されるように単離され、操作されてもよいことが認識される。他の態様においては、本発明のポリペプチドは、抗体の改変型に由来する抗原結合部位、またはその一部を含んでもよい。例示的なそのような型としては、例えば、ミニボディ、ジアボディ、トリアボディ、ナノボディ、カメリド、Dab、四価抗体、イントラジアボディ例えば、Jendreykoら、2003.J.Biol.Chem.278:47813、融合タンパク質例えば、抗体サイトカイン融合タンパク質、Fcレセプターの少なくとも一部と融合されるタンパク質、および二重特異性抗体が挙げられる。他の改変抗体は、例えば、米国特許第4,745,055号、欧州特許第256,654号、Faulknerら、Nature298:2861982、欧州特許第120,694号、欧州特許第125,023号、Morrison,J.Immun.123:7931979、Kohlerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:21971980、Rasoら、CancerRes.41:20731981、Morrisonら、Ann.Rev.Immunol.2:2391984、Morrison,Science229:12021985、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:68511984、欧州特許第255,694号、欧州特許第266,663号、およびWO88/03559号において記載される。再分類された免疫グロブリン鎖も、公知である。例えば、米国特許第4,444,878号;WO88/03565号;ならびに欧州特許第68,763号、および本明細書において記載される参考文献を参照のこと。別の実施形態においては、本発明のキメラの凝固因子は、ジアボディである抗原結合部位もしくは領域、またはそれに由来する抗原結合部位を含む。ジアボディは、二量体の四価分子であり、それぞれ、scFv分子と同様のポリペプチドを有するが、同じポリペプチド鎖上のVLおよびVHドメインが、相互作用することができないように、通常、可変ドメインの両方に接続する短い例えば、10未満、好ましくは1~5アミノ酸残基リンカーを有する。その代わりに、1つのポリペプチド鎖のVLおよびVHドメインは、第2のポリペプチド鎖上のVHおよびVLドメインそれぞれと相互作用する例えば、国際公開第WO02/02781号を参照。一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つの遺伝子的に融合されたFc領域すなわち、scFc領域のN末端および/またはC末端に対して作動可能に連結されるジアボディを含む。特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、単一ドメイン結合分子例えば、単一ドメイン抗体を標的部分として含む。例示的な単一ドメイン分子は、軽鎖可変ドメインを有さない、抗体の単離された重鎖可変ドメインVH、すなわち、重鎖可変ドメイン、および重鎖可変ドメインを有さない、抗体の単離された軽鎖可変ドメインVL、すなわち、軽鎖可変ドメインを含む。本発明の結合分子において使用される例示的な単一ドメイン抗体としては、例えば、Hamers-Casterman,ら、Nature363:446-4481993、およびDumoulin,ら、ProteinScience11:500-5152002に記載される、例えば、ラクダ科Camelid重鎖可変ドメイン約118~136のアミノ酸残基が挙げられる。他の例示的な単一ドメイン抗体としては、Dabs登録商標DomantisLtd.,Cambridge、UKとしても周知の単一のVHまたはVLドメインが挙げられる。さらに他の単一ドメイン抗体としては、サメ抗体例えば、サメIg-NARが挙げられる。サメIg-NARは、1つの可変ドメインV-NARおよび5つのC様定常ドメインC-NARのホモ二量体を含み、ここで多様性は、長さが5~23残基と異なる伸長CDR3領域に集中される。ラクダ科例えば、ラマにおいては、VHHと称される重鎖可変領域は、全抗原-結合ドメインを形成する。カメリドVHH可変領域と従来の抗体VHに由来する領域との間の主な相違としては、aVHHにおける対応する領域と比較して、VHの軽鎖接触表面におけるよりも疎水性のアミノ酸、bVHHにおけるより長いCDR3、およびcVHHにおけるCDR1とCDR3との間のジスルフィド結合の頻繁な出現、が挙げられる。単一ドメイン結合分子を作製するための方法は、米国特許第6,005,079号および同第6,765,087号において記載され、その両方の内容とも、参照によって本明細書に援用される。VHHドメインを含む例示的な単一ドメイン抗体としては、Nanobodies登録商標AblynxNV、Ghent、Belgiumが挙げられる。本発明の結合分子での使用のための、結合部位が由来し得る、例示的な抗体は、当該分野で公知である。このような標的化部分の例としては、活性な血小板のみを結合するSCE5およびMB9可変領域が挙げられるSchwarzら、2004FASEBJournalexpressarticle10.1096/fj.04-1513fje;Schwarzら、2006CirculationResearch.99:25-33;米国特許出願公開第20070218067号。別の実施形態では、標的部分は、GPIIbIIIaの活性な/不活性な高次構造の両方に結合する。このような標的部分の例は、AP3抗体の可変領域であるPetersonら、2003.Hemostasis,Thrombosis、およびVascularBiology101:937;WO2010115866。B.非免疫グロブリン血小板結合分子特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、非免疫グロブリン結合分子に由来する1つ以上の血小板結合部位を含む。本明細書において用いる場合、非免疫グロブリン結合分子という用語は、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来するが、血小板標的に対して所望の結合特異性を付与するために操作され得る例えば、変異誘発され得る部分例えば、骨格またはフレームワークを、結合部位が含む結合分子である。抗体分子に由来しない結合部位を含む結合分子の他の例としては、レセプター結合部位およびリガンド結合部位血小板に結合するが挙げられる。非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化された結合部位を有する結合分子のライブラリーからの標的結合改変体の選択または単離によって特定され得る。多様化されたライブラリーは、完全に無作為のアプローチ例えば、エラープローンerror-pronePCR、エキソンシャッフリング、または指向性進化を用いて生成されてもよいし、または当該分野において承認されている設計ストラテジーによって補助されてもよい。例えば、結合部位は、その同族標的分子と相互作用する場合に、通常、関与するアミノ酸部分は、結合部位をコードする核酸内における対応する位置での縮重コドン、トリヌクレオチド、無作為ペプチド、またはループ全体の挿入によって無作為化され得る例えば、米国特許出願公開第20040132028号を参照のこと。アミノ酸位置の場所は、標的分子を有する複合体における結合部位の結晶構造の検討によって特定され得る。無作為化の候補位置としては、ループ、平面、らせん、および結合部位の結合腔が挙げられる。特定の実施形態においては、多様化の候補である可能性が高い結合部位内のアミノ酸は、当該分野で公知の技術を用いて特定できる。無作為化後、次に多様化されたライブラリーを選択またはスクリーニング手順に供して、当該分野で公知の方法を用いて、所望の結合特徴を有する結合分子、例えば、特定の結合血小板を得る。選択は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、またはリボソームディスプレイのような当該分野において承認されている方法によって達成することができる。一実施形態においては、血小板に結合することが当該分野で公知の分子を、本発明の構築物で使用してもよい。例えば、当該分野で記載されるGPIbaに結合するペプチド例えば、PS4、0S1、または0S2を用いてもよいBenardら、2008.Biochemistry47:4674-4682。IV.活性化可能凝固因子バイパス療法のために与えられる凝固因子は、活性型で与えられるときは有効である。なぜなら外因性の凝固因子は、十分な動態で有効であるように活性化されない場合が多いからである。しかし、それらはまた、内因性の経路によって例えば、アンチトロンビンIIIまたはTFPIによって急速に不活性化され、活性型のクリアランスおよび短い有効半減期がもたらされる。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、活性化可能である。このような活性化可能な構築物は、より長い半減期を有する増強されたチモーゲンとして循環するが、必要に応じて凝固部位で容易に切断され得る。一実施形態では、本発明の活性化可能な構築物は、切断性のリンカーを含み、このリンカーは、例えば、第XIa因子、第Xa因子、またはトロンビン切断部位それぞれ、第XIa因子、Xa、またはトロンビンによって切断されるを含み、凝固の部位で活性型の凝固因子の形成をもたらす。例示的な第FXIa因子切断部位は、例えば、TQSFNDFTRおよびSVSQTSKLTRを含む。例示的なトロンビン切断部位は、例えば、DFLAEGGGVR、TTKIKPR、およびALRPRを含むかまたはそれからなる配列例えば、ALRPRVVGGAを含む。一実施形態では、切断性のリンカーは、スペーサー部分によって1つ以上の側上流、下流または両側に隣接され得る。一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれる。別の実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の軽鎖と重鎖との間に差し込まれない。一実施形態では、切断性のリンカーは、重鎖のアミノ末端に配置される。例示的な活性化可能な構築物は、添付の図面および以下の実施例に示される。V.足場部分本発明のいくつかの実施形態は、例えば、タンパク質部分、cscFc領域、Fc部分、アルブミン、XTENなどから選択され得る、足場部分を含む。A.タンパク質部分一実施形態では、足場はタンパク質部分である。このような部分は、完全タンパク質もしくはその一部、または合成分子を含んでもよい。好ましいタンパク質部分は、構築物に組み込まれる場合、本発明のキメラの凝固因子の半減期を改善する十分な分子サイズのものである。例えば、一実施形態では、人工のタンパク質、XTENが、足場として構築物中に含まれてもよいSchellenbergerら、2009.27:1186。別の実施形態では、アルブミン例えば、ヒト血清アルブミンは、本発明の構築物中に含まれてもよい。例えば、当該分野で公知のように、血清アルブミン例えば、HSAをタンパク質足場として用いてもよい。特定の種々のドメインおよびHSAのサブドメインでは、血清アルブミン足場ベースのタンパク質ライブラリーの生成のための変異または無作為化に十分受け入れられる構造を有する。本発明で用いられ得る、アルブミン、例えば、そのフラグメントの例は、公知である。例えば、米国特許第7,592,010;米国特許第6,686,179;およびSchulte,ThrombosisRes.124Suppl.2:S6-S82009その各々が、その全体が参照によって本明細書に援用される。B.scFc領域一実施形態では、本発明は、cscFcを含んでいる、一実施形態における単一ポリペプチド鎖内に少なくとも1つの遺伝子的に融合されたFc領域またはその一部を含むポリペプチドすなわち、単鎖のFcscFc領域を含むポリペプチドを提供する。一実施形態では、キメラの凝固因子は、FVII、FIXおよびFXからなる群より選択される凝固因子、および血小板に結合する標的部分、および必要に応じて凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはFVIIを含み、このFVIIは、凝固カスケードの成分によって活性化可能な異種の酵素的切断部位を含む。一実施形態では、本発明は、プロセシングされていないポリペプチドであって、ここで同じ直鎖状ポリペプチド鎖内の少なくとも2つのFc部分またはドメイン例えば、2、3、4、5、6、またはそれ以上のFc部分またはドメインが、Fcポリペプチドリンカーによって連結される1つの機能的なscFc領域を形成するように折り畳まれ得る例えば、分子内にまたは分子間に折り畳まれ得るポリペプチドを提供する。例えば、1つの好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのscFc領域を介して、少なくとも1つのFcレセプター例えば、FcRn、FcγRレセプター例えば、FcγRIII、または補体タンパク質例えば、C1qに対して結合して、半減期を改善するか、または免疫エフェクター機能例えば、抗体依存性細胞毒性ADCC、食作用、または補体依存性細胞毒性CDCCを誘発するか、および/または製造可能性を改善し得る。別のデザインの種々のポリペプチドが、本発明の範囲内である。例えば、一実施形態では、ポリペプチドは以下の部分を含む:A-F1-P1-L-P2-B-F2Iアミノ末端からカルボキシル末端の直鎖状配列では、Aは存在する場合、凝固因子またはその一部であり、F1は第一のFc部分またはドメインであり、P1は酵素的切断部位であり、LはScFcリンカーであり、P2は酵素的切断部位Bであり、存在するならば、凝固因子またはその一部であり、F2は第二のFc部分またはドメインであり、かつ-は、ペプチド結合である。式Iは、少なくともAまたはBであり、必要に応じてその両方である。AおよびBは、両方が存在する場合、凝固因子の対応する重鎖および軽鎖であり得る。式Iは、少なくともP1またはP2、および必要に応じて両方を含む。P1およびP2は、両方が存在する場合、同じであっても異なってもよい。式Iは、少なくともF1およびF2を含む。F1およびF2は、両方とも存在する場合、同じであっても異なってもよい。式Iによる例示的なポリペプチドとしては以下が挙げられる:A-F1-P1-L-P2-F2;F1-P1-L-P2-B-F2;A-F1-P1-L-F2;F1-P1-L-B-F2;A-F1-L-P2-F2;およびF1-L-P2-B-F2。一実施形態では、F1およびF2は各々が、CH2およびCH3部分を含む。一実施形態では、cscFcリンカーLの切断および実質的な切除後、本発明のポリペプチドは、2つのポリペプチド鎖であって、第一のポリペプチド鎖が第一のFc部分に連結されたAを含み、第二のポリペプチド鎖が第二のFc部分に連結されたBを含み、ここでF1およびF2が二量体化してFc領域を形成する、ポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、AおよびBは必要に応じて存在し、かつ凝固因子またはその一部である。一実施形態では、Aは、凝固因子の軽鎖であり、かつBは凝固因子の重鎖である。一実施形態では、Bは凝固因子の軽鎖であり、かつAは凝固因子の重鎖である。一実施形態では、AおよびBがポリペプチド中で会合する場合、次にこのポリペプチドは、機能的な凝固因子、例えば、FVII、FIXまたはFXを形成する。一実施形態では、このようなポリペプチドは、細胞からの分泌の際に酵素的に活性である。iFc部分またはドメイン本発明のポリペプチドを産生するためのF1およびF2として有用なFc部分は、多数の異なる供給源から得ることができる。好ましい実施形態においては、このポリペプチドのFc部分は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、Fc部分は、例えば、げっ歯類例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットまたは非ヒト霊長類例えば、チンパンジー、マカク種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリン由来であってもよい。さらに、ポリペプチドFcドメインまたはその一部は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含む、任意の免疫グロブリンクラス、ならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む、任意の免疫グロブリンイソタイプに由来してもよい。好ましい実施形態においては、ヒトイソタイプIgG1が用いられる。様々なFc部分遺伝子配列例えば、ヒト定常領域遺伝子配列は、公的にアクセス可能な寄託の形態で入手可能である。特定のエフェクター機能を有するかまたは特定のエフェクター機能を欠いている、または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するFc部分配列を含む定常領域ドメインを選択してもよい。抗体および抗体コード遺伝子の多くの配列は公開されており、適切なFc部分配列例えば、ヒンジ、CH2、および/またはCH3配列、またはそれらの一部は、当該分野において承認されている技術を用いてこれらの配列から導くことができる。前述の方法のいずれかを用いて得られた遺伝物質は、次いで、本発明のポリペプチドを得るために変化または合成されてもよい。本発明の範囲は、定常領域DNA配列の対立遺伝子、改変体、および変異体を包含することがさらに認識される。Fc部分配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、および対象のドメインを増幅するよう選択されるプライマーを用いてクローニングされてもよい。抗体からFc部分配列をクローニングするためには、mRNAは、ハイブリドーマ、脾臓、またはリンパ細胞から単離され、DNAへ逆転写され、抗体遺伝子がPCRによって増幅されてもよい。PCR増幅方法は、米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;同第4,800,159号;同第4,965,188号、および例えば、PCRProtocols:AGuidetoMethodsおよびApplicationsInnisら、編集,AcademicPress,SanDiego,CA1990;Hoら、1989.Gene77:51、Hortonら、1993.MethodsEnzymol.217:270において詳述される。PCRは、コンセンサス定常領域プライマー、または公表された重鎖または軽鎖DNAおよびアミノ酸配列に基づくさらに特異的なプライマーによって開始され得る。上記のように、PCRを用いて、抗体軽鎖および重鎖をコードするDNAクローンを単離してもよい。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブ等のより大きい同種プローブによってスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に適切な多数のプライマーセットが、当該分野で周知である例えば、精製抗体のN末端配列に基づく5’プライマーBenharおよびPastan.1994.ProteinEngineering7:1509、cDNA端部の迅速増幅Ruberti,F.ら、1994.J.Immunol.Methods173:33、抗体リーダー配列Larrickら、1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250。抗体配列のクローニングは、1995年1月25日出願のNewmanらの米国特許第5,658,570号においてさらに記載され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。本発明のポリペプチドは、2つ以上のFc部分例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれ以上のFc部分を含んでもよい。これらの2つ以上のFc部分は、Fc領域を形成し得る。一実施形態においては、Fc部分は、異なる型のものであってもよい。一実施形態においては、このポリペプチドに存在する少なくとも1つのFc部分は、ヒンジドメイン、またはその一部を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのCH2ドメイン、またはその一部を含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのCH3ドメイン、またはその一部を含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのCH4ドメイン、またはその一部を含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのヒンジドメイン、またはその一部、および少なくとも1つのCH2ドメイン、またはその一部例えば、ヒンジ-CH2の方向におけるを含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくとも1つのCH2ドメイン、またはその一部、および少なくとも1つのCH3ドメイン、またはその一部例えば、CH2-CH3の方向におけるを含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、例えば、ヒンジ-CH2-CH3、ヒンジ-CH3-CH2、またはCH2-CH3-ヒンジの方向において、少なくとも1つのヒンジドメイン、またはその一部、少なくとも1つのCH2ドメイン、またはその一部、および少なくとも1つのCH3ドメイン、またはその一部を含む少なくとも1つのFc部分を含む。特定の実施形態においては、このポリペプチドは、1つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも1つの完全Fc領域を含む例えば、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含む、Fc部分であるが、これらは同じ抗体に由来する必要はない。他の実施形態においては、このポリペプチドは、1つ以上の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも2つの完全Fc領域を含む。好ましい実施形態においては、完全Fc部分は、ヒトIgG免疫グロブリン重鎖例えば、ヒトIgG1に由来する。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、完全CH3ドメインEUナンバリングによる抗体Fc領域のアミノ酸約341~438を含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、完全CH2ドメインEUナンバリングによる抗体Fc領域のアミノ酸約231~340を含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、少なくともCH3ドメイン、および少なくとも1つのヒンジ領域EUナンバリングによる抗体Fc領域のアミノ酸約216~230、およびCH2ドメインを含む少なくとも1つのFc部分を含む。一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ヒンジおよびCH3ドメインを含む少なくとも1つのFc部分を含む。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含む少なくとも1つのFc部分を含む。好ましい実施形態においては、Fc部分は、ヒトIgG免疫グロブリン重鎖例えば、ヒトIgG1に由来する。一実施形態では、Fc部分は、EUナンバー221~447に相当するアミノ酸を含むか、またはそれからなる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、FcRn結合パートナーを含む少なくとも1つのFc部分を含む。FcRn結合パートナーは、FcRn結合パートナーのFcRnレセプターによる必然的な能動的輸送を伴いFcRnレセプターによって特異的に結合され得る、分子またはその一部である。特異的に結合したとは、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成する2つの分子を指す。特異的な結合は、通常は中~高度の能力で低い親和性を有する非特異的な結合とは識別される、高い親和性および低~中度の能力によって特徴づけられる。通常は、結合は、親和性定数KAが106M-1より高く、またはさらに好ましくは108M-1より高い場合に特異的とみなされる。必要に応じて、非特異的な結合は、結合条件を変化することによって特異的な結合に実質的に影響することなく減少され得る。分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤例えば、血清アルブミン、ミルクカゼインの濃度などのような適切な結合条件は、慣用的な技術を用いて当業者に最適化され得る。FcRnレセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離された。ヒトFcRn、サルFcRnラットFcRn、およびマウスFcRnの配列は公知であるStoryら、1994,J.Exp.Med.180:2377。FcRnレセプターは、IgGただしIgA、IgM、IgD、およびIgEのような他の免疫グロブリンクラスではないに、比較的低いpHで結合し、IgGを管腔中で漿膜の方向に経細胞的に能動輸送し、次いで、間質液中で見られる比較的高いpHでIgGを遊離する。これは、成体の上皮組織米国特許第6,485,726号、同第6,030,613号、同第6,086,875;WO03/077834;米国特許出願公開第2003-0235536号A1例としては、肺および腸管上皮Israelら、1997,Immunology92:69腎近位尿細管上皮Kobayashiら、2002,Am.J.Physiol.RenalPhysiol.282:F358ならびに鼻上皮、膣表面、および胆道系表面で発現される。本発明のFcRn結合パートナーは、FcRnレセプターによって特異的に結合され得る分子、例としては、IgG全体、IgGのFcフラグメント、およびFcRnレセプターの完全結合領域を含む他のフラグメントを包含する。FcRnレセプターに結合するIgGのFc部分の領域は、X線結晶学に基づいて記載されているBurmeisterら、1994,Nature372:379。FcRnとのFcの主な接触領域は、CH2およびCH3ドメインの接合部に近い。Fc-FcRn接触は全て、単一のIg重鎖内である。FcRn結合パートナーとしては、IgG全体、IgGのFcフラグメントおよびFcRnの完全結合領域を含むIgGの他のフラグメントが挙げられる。主な接触部位としては、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250~257、272、285、288、290~291、308~311、および314、ならびにCH3ドメインのアミノ酸残基385~387、428、および433~436が挙げられる。免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸ナンバリングに対する言及は全て、Kabatら、1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofPublicHealth,Bethesda,Md.に基づく。IgGのFc領域は、十分認識された手順、例えば、部位指向性突然変異誘発などによって改変され得、FcRnに結合される改変されたIgGまたはFcフラグメントもしくはその一部を生成する可能性が高い。このような改変としては、FcRn接触部位とは離れた改変、およびFcRnに対する結合を予防または増強さえする接触部位内の改変が挙げられる。例えば、ヒトIgG1FcFcγ1における以下の単一アミノ酸残基が、FcRnについてFc結合親和性の有意な損失なしに置換され得る:P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A、およびK447A、ここで、例えば、P238Aは、238位置でアラニンによって置換される野性型プロリンである。一例として、1つの特定の実施形態では、N297A変異体を組み込み、高度に保存されたN-グリコシル化部位を除去する。アラニンに加えて、他のアミノ酸を、上記の特定の位置で野性型アミノ酸に関して置換してもよい。変異を単独でFcに導入して、天然のFcとは別個の100を超えるFcRn結合パートナーを生じ得る。さらに、これらの個々の変異体のうち2つ、3つまたはそれ以上の組み合わせを一緒に導入して、100を超えるFcRn結合パートナーを生じてもよい。さらに、本発明の構築物のFcRn結合パートナーの1つを変異してもよく、他のFcRn結合パートナーは全く変異されなくてもよく、または両方とも変異されてもよく、ただし異なる変異はない。N297Aを含む、本明細書に記載の任意の変異体が、生理学的に活性な分子例えば、EPO,IFN、第VII因子、第IX因子、T20にかかわらず、Fcを改変するために用いられてもよい。特定の上記の変異体は、FcRn結合パートナーに対して新規な機能を付与し得る。例えば、一実施形態は、N297Aを組み込み、高度に保存されたN-グリコシル化部位を除去する。この変異の効果は、免疫原性を低下して、それによって、FcRn結合パートナーの循環半減期を増強すること、ならびにFcRnについての親和性を損なうことなく、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIIAに対して結合できないFcRn結合パートナーをもたらすことであるRoutledgeら、1995,Transplantation60:847;Friendら、1999,Transplantation68:1632;Shieldsら、1995,J.Biol.Chem.276:6591。FcRnに対する上記の変異から生じる新規な機能のさらなる例としては、いくつかの場合には、野性型のものを上回って増大され得る。この増大された親和性は、結合速度定数の増大、解離速度定数の低下、または結合速度定数の増大および解離速度定数の低下の両方を反映し得る。FcRnに対する親和性の増大を付与すると思われる変異としては、T256A、T307A、E380A、およびN434Aが挙げられるShieldsら、2001,J.Biol.Chem.276:6591。さらに、少なくとも3つのヒトFcγレセプターは、下部のヒンジ領域内のIgG上の結合部位、一般にはアミノ酸234~237を認識すると思われる。従って、新規な機能および潜在的な免疫原性の減少の別の例は、例えば、IgG2PVA1つのアミノ酸欠失を有する由来の対応する配列に対してヒトIgG1ELLGのアミノ酸233~236を置き換えることによって、この領域の変異から生じ得る。種々のエフェクター機能を媒介するFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIは、このような変異が導入されたとき、IgG1に結合しないことが示された。WardおよびGhetie1995,TherapeuticImmunology2:77およびArmourら、1999,Eur.J.Immunol.29:2613。一実施形態では、FcRn結合パートナーは、配列PKNSSMISNTP配列番号12および必要に応じてさらにHQSLGTQ配列番号13、HQNLSDGK配列番号14、HQNISDGK配列番号24、またはVISSHLGQ配列番号25米国特許第5,739,277号から選択される配列を含むポリペプチドである。2つのFcRnレセプターは、単一のFc分子に結合し得る。結晶学的データによって、各々のFcRn分子がFcホモ二量体の単一のポリペプチドに結合することが示唆される。一実施形態では、FcRn結合パートナー、例えば、IgGのFcフラグメントを、生物学的に活性な分子に連結することは、生物学的に活性な分子を経口的に、口腔内に、舌下に、直腸に、膣に、経鼻的に投与されるエアロゾルとして、または肺経路を介して、または眼の経路を介して送達するという意味をもたらす。別の実施形態では、キメラのタンパク質は、侵襲的に、例えば、皮下に、静脈内に投与され得る。本発明のポリペプチドのFc部分を作製するための定常領域ドメインまたはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、本発明のポリペプチドは、IgG1分子由来のCH2ドメインまたはその一部、およびIgG3分子由来のCH3領域またはその一部を含んでもよい。別の例では、ポリペプチドは、部分的には、IgG1分子由来、および部分的にはIgG3分子由来のヒンジドメインを含んでいるFc部分を含んでもよい。本明細書に示されるとおり、当業者には、Fc部分が天然に存在する抗体分子からアミノ酸配列を変化させるように変更されてもよいことが理解される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、1つ以上の短縮Fc部分を含んでいるscFc領域を、この部分がFc領域に対してFcレセプターFcR結合特性を付与するのに十分であるにもかかわらず、含む。例えば、FcRnに結合するFcドメインの一部すなわち、FcRn結合部分は、IgG1のおよそアミノ酸282~438EUナンバリングを含み、ここで主な接触部位は、CH2ドメインのアミノ酸248、250~257、272、285、288、290~291、308~311、および314、ならびにCH3ドメインのアミノ酸残基385~387、428、および433~436である。従って、本発明のポリペプチドのFc部分は、FcRn結合部分を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。FcRn結合部分は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含んでいる任意のアイソタイプの重鎖に由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプIgG1の抗体由来のFcRn結合部分を用いる。別の実施形態では、ヒトアイソタイプIgG4の抗体由来のFcRn結合部分を用いる。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全Fc領域の1つ以上の定常領域ドメインを欠き、すなわち、それらのドメインは部分的にまたは完全に欠失されている。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、完全CH2ドメインを欠くΔCH2構築物。当業者は、このような構築物が、抗体の異化速度に対するCH2ドメインの調節特性に起因して好ましい場合があることを理解する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、IgG1ヒト定常領域ドメインをコードするベクター例えば、IDECPharmaceuticals,SanDiego由来由来のCH2ドメイン欠失Fc領域を含む例えば、WO02/060955A2およびWO02/096948A2を参照のこと。この例示的なベクターは、CH2ドメインを欠失するように操作されて、ドメイン欠失のIgG1定常領域を発現する合成ベクターを提供する。これらの例示的な構築物は好ましくは、結合CH3ドメインを直接それぞれのFcドメインのヒンジ領域に融合するように操作される。他の構築物では、2つ以上の構成要素Fc部分の間にスペーサー部分を提供することが所望され得る。例えば、スペーサー部分は、ヒンジ領域とCH2ドメインとの間、および/またはCH2とCH3ドメインとの間に配置されてもよい。例えば、適合する構築物が、発現されてもよく、ここではCH2ドメインが欠失されており、残りのCH3ドメイン合成または非合成のが5~20アミノ酸のスペーサー部分を有するヒンジ領域に連結される。このようなスペーサー部分は、例えば、定常ドメイン領域の調節性エレメントが遊離のままであり、かつアクセス可能であること、またはヒンジ領域が可塑性のままであることを保証するために追加され得る。好ましくは、本発明と適合する任意のリンカーペプチドは、比較的非免疫原性であり、かつscFc領域の適切な折り畳みを妨げることはない。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、二量体のFc領域であって、同じかまたは実質的に同じ配列組成のFc部分を含んでいるFc領域を含んでもよい本明細書においては、ホモ二量体Fc領域と呼ばれる。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、二量体Fc領域であって、配列組成が異なっている少なくとも2つのFc部分を含むFc領域を含んでもよいすなわち、本明細書においてはヘテロ二量体Fc領域と呼ばれる。1つの例示的な実施形態では、ヘテロ二量体Fc領域は、第一のFc部分にアミノ酸置換を含む例えば、EUの位置297でのアスパラギンのアミノ酸置換が、第二のFc部分には含まない。特定の実施形態では、Fc領域は、半グリコシル化される。例えば、ヘテロマーのscFc領域は、第一の、グリコシル化された、Fc部分例えば、グリコシル化されたCH2領域および第二の、非グリコシル化された、Fc部分例えば、非グリコシル化されたCH2領域を含んでもよく、ここでリンカーは、グリコシル化された部分と非グリコシル化されたFc部分との間に差し込まれる。他の実施形態では、Fc領域は、完全にグリコシル化され、すなわち、全てのFc部分がグリコシル化されている。なおさらなる実施形態では、Fc領域は、非グリコシル化されてもよく、すなわち、グリコシル化されているFc部分はない。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドで使用されるFc部分は、例えば、アミノ酸変異体例えば、付加、欠失、または置換によって変更される。例えば、一実施形態では、Fc部分は、そのFc部分が由来する野性型Fcと比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。例えば、ここで、このFc部分は、ヒトIgG1抗体由来であり、改変体は、ヒトIgG1のFc領域の対応する位置での野性型アミノ酸に比較して少なくとも1つのアミノ酸変異例えば、置換を含む。Fc改変体のアミノ酸置換単数または複数は、その残基が抗体中のFc領域で与えられる位置の数EUナンバリング習慣を用いて示されるようなに対応するとされるFc部分内の位置に位置してもよい。当業者は、Fc部分における位置にどのEU番号が対応するかを決定するために容易にアラインメントを作製し得る。一実施形態では、Fc改変体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH2ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH3ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。別の実施形態では、Fc改変体は、CH4ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置で置換を含む。特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、2つ以上のアミノ酸置換を含むFc改変体を含む。本発明のポリペプチドは、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。好ましくは、アミノ酸置換は、少なくとも1アミノ酸部分、またはそれ以上、例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、またはそれ以上というアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに空間的に位置する。より好ましくは、操作されたアミノ酸は、少なくとも5、10、15、20、または25のアミノ酸位置、またはそれ以上の間隔で互いに離れて空間的に位置する。特定の実施形態においては、Fc改変体は、このような野生型Fcドメインを含むFc領域によって付与された少なくとも1つのエフェクター機能の変化例えば、Fcレセプター例えば、FcγRI、FcγRII、もしくはFcγRIII、または補体タンパク質例えば、C1qに結合するか、または抗体依存性細胞毒性ADCC、食作用、もしくは補体依存性細胞毒性CDCCを誘引するFc領域の能力の改善または低下を付与する。他の実施形態では、Fc改変体は、遺伝子操作されたシステイン残基を提供する。本発明のポリペプチドは、エフェクター機能および/またはFcRもしくはFcRn結合における変化例えば、増強または減少を付与することが公知である当該分野で認識されるFc改変体を使用し得る。詳細には、本発明の結合分子は、例えば、国際公開WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、およびWO06/085967A2;米国特許出願公開第2007/0231329号、米国特許出願公開第2007/0231329号、米国特許出願公開第2007/0237765号、米国特許出願公開第2007/0237766号、米国特許出願公開第2007/0237767号、米国特許出願公開第2007/0243188号、米国特許出願公開第20070248603号、米国特許出願公開第20070286859号、米国特許出願公開第20080057056号;または米国特許第5,648,260号;同第5,739,277号;同第5,834,250号;同第5,869,046号;同第6,096,871号;同第6,121,022号;同第6,194,551号;同第6,242,195号;同第6,277,375号;同第6,528,624号;同第6,538,124号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,998,253号;同第7,083,784号;および同第7,317,091各々は、本明細書において参照によって援用されるに開示されるアミノ酸位置のうちの1つ以上で変化例えば、置換を含んでもよい。一実施形態では、特定の変化例えば、当該分野で開示される1つ以上のアミノ酸の特定の置換が、開示されるアミノ酸位置のうちの1つ以上で作製され得る。別の実施形態では、開示されるアミノ酸位置のうちの1つ以上のでの異なる変化例えば、当該分野で開示される1つ以上のアミノ酸位置の異なる置換がなされてもよい。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗体の抗原-非依存性エフェクター機能、詳細には抗体の循環半減期を変化するFc部分に対するアミノ酸置換を含む。このようなポリペプチドは、これらの置換を欠くポリペプチドと比較した場合、FcRnへの結合の増加または低下のいずれかを示し、従って、それぞれ、血清中の半減期が延長または短縮している。FcRnに対して親和性が改善されているFc改変体は、より長い血清半減期を有することが見込まれ、そのような分子は、例えば、慢性疾患または障害を治療するために、投与されたポリペプチドの長い半減期が望ましい場合の哺乳動物を治療するための方法において有用な用途を有する例えば、米国特許第7,348,004号、同第7,404,956号および同第7,862,820号を参照のこと。対照的に、FcRn結合親和性が低下したFc改変体は、より短い半減期を有すると期待され、そのような分子も、例えば、インビボ画像診断、あるいは出発ポリペプチドが、長期に渡って循環に存在する場合に毒性副作用を有する状況など、短い循環時間が有利であり得る哺乳動物への投与において有用である。また、低下したFcRn結合親和性を有するFc改変体はまた、胎盤を通過する可能性もより低くなるため、妊婦における疾患または障害の治療においても有用である。さらに、低下したFcRn結合親和性が望ましい可能性がある他の用途としては、脳、腎臓および/または肝臓での局所化が望ましい場合の用途が挙げられる。1つの例示的な実施形態においては、本発明のポリペプチドは、血管系から腎臓糸球体の上皮を横切る運搬の低下を示す。別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、脳から血液脳関門BBBを横切る脈管性間隙への運搬の低下を示す。一実施形態においては、変化したFcRn結合を有するポリペプチドは、Fc部分のFcRn結合ループ内に1つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも1つのFc部分例えば、1つまたは2つのFc部分を含む。FcRn結合ループは、野生型の完全長Fc部分のアミノ酸残基280~299EUナンバリングによるから構成される。他の実施形態においては、変化したFcRn結合親和性を有する本発明のポリペプチドは、15ÅのFcRn接触ゾーン内に1つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも1つのFc部分例えば、1つまたは2つのFc部分を含む。本明細書において用いられる場合、15ÅのFcRn接触ゾーンという用語は、以下の野生型完全長Fc部分の位置にある残基を含む:243~261、275~280、282~293、302~319、336~348、367、369、372~389、391、393、408、424、425~440EUナンバリング。好ましい実施形態においては、変化したFcRn結合親和性を有する本発明のポリペプチドは、以下のEU位置のいずれか1つに対応するアミノ酸位置に1つ以上のアミノ酸置換を有する少なくとも1つのFc部分例えば、1つまたは2つのFc部分を含む:256、277~281、283~288、303~309、313、338、342、376、381、384、385、387、434例えば、N434AまたはN434K、および438。FcRn結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、国際公開WO05/047327号に開示され、この内容は、参照によって、本明細書に援用される。本発明のポリペプチドはまた、ポリペプチドのグリコシル化を変更する当該分野で認識されるアミノ酸置換を含み得る。例えば、結合ポリペプチドのscFc領域は、グリコシル化の低下をもたらす変異を有するFc部分を含んでもよいし例えば、N-連結またはO-連結のグリコシル化、または野性型Fc部分の変更された糖型例えば、低フコースまたはフコースなしのグリカンを含んでもよい。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、溶媒露出表面に位置する、遺伝子操作されたシステイン残基またはそのアナログを有する少なくとも1つのFc部分を含む。好ましくは、遺伝子操作されたシステイン残基またはそのアナログは、scFc領域によって付与されるエフェクター機能を妨害しない。さらに好ましくは、この変更は、scFc領域がFcレセプター例えば、FcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIまたは補体タンパク質例えば、C1qに結合する能力、または免疫エフェクター機能例えば、抗体依存性細胞毒性ADCC、食作用、または補体依存性細胞毒性CDCCを誘発する能力を妨害しない。一実施形態では、本発明のプロセシングされていないポリペプチドは、遺伝子的に融合されたFc領域すなわち、scFc領域であって、本明細書に記載されるFc部分から独立して選択されるその構成要素Fc部分の2つ以上を有する領域を含み得る。一実施形態では、二量体Fc領域のFc部分は同じである。別の実施形態では、Fc部分の少なくとも2つは異なる。例えば、本発明のポリペプチドのFc部分は、同じ数のアミノ酸残基を含むか、またはそれらは、1つ以上のアミノ酸残基ずつ長さが異なり得る例えば、約5アミノ酸残基例えば、1、2、3、4、または5アミノ酸残基、約10残基、約15残基、約20残基、約30残基、約40残基、または約50残基ずつ。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチドのFc部分は、1つ以上のアミノ酸位置で配列が異なってもよい。例えば、少なくとも2つのFc部分が、およそ5アミノ酸位置例えば、1、2、3、4、または5アミノ酸位置、約10位置、約15位置、約20位置、約30位置、約40位置、または約50位置で異なり得る。VI.ポリペプチドリンカー本明細書において用いる場合、ポリペプチドリンカーという用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列における2つのドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列例えば、合成のペプチドまたはポリペプチド配列を指す。本発明のポリペプチドは、構築物を作製する2つのFc部分を直接または間接的に接続するポリペプチドリンカーをコードする核酸分子によってコードされる。これらのリンカーは、本明細書においてはscFcリンカーと呼ばれる。scFcリンカーが2つのFc部分を連続して直鎖状ポリペプチド配列で接続する場合、これは、直接連結である。対照的に、scFcリンカーは、結合部分に対して第一のFc部分を連結し得、これが次に、第二のFc部分に連結され、それによって間接的な連結が形成される。これらのscFcリンカーLは、単鎖の遺伝子的構築物の形成を生じる。しかし、一実施形態では、scFcポリペプチドはまた、酵素的切断部位を含み、これによってscFcリンカーは切断性cscFcリンカーになり、一実施形態では、実質的には切除される例えば、細胞によるプロセシングの間。従って、プロセシングされた分子は、二量体分子であって、少なくとも2つのアミノ酸鎖を含み、かつ実質的に外因性のリンカーアミノ酸配列を欠いている二量体分子である。いくつかの実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切り出されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、RRRR切断部位の4つのアルギニンが残る場合がある。別の実施形態では、本明細書においてはスペーサーと呼ばれる別の種類のポリペプチドリンカーを用いて、異なる部分、例えば、凝固因子または標的部分をFc部分に接続してもよい。この種のポリペプチドリンカーは、ポリペプチド分子に対して可塑性を提供し得る。スペーサーは一般的には切断されないが、このような切断は所望され得る。スペーサーの例示的な位置は、添付の図面に示される。スペーサーは、凝固因子、標的化部分、および/または足場の間に、例えば、これらの部分のN末端またはC末端に位置してもよい。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシングの間に除去されない。本発明のキメラの凝固因子に存在し得る第三種のリンカーは、切断部位例えば、第XIa因子、Xa、またはトロンビン切断部位を含み、かつ追加のスペーサーリンカーを、切断部位のN末端もしくはC末端のいずれかまたは両側の上に含み得る切断性切断可能リンカーである。これらの切断性リンカーは、凝固因子に組み込まれた場合、異種切断部位を有するキメラ分子を生じる。このような部位の例示的な位置は、添付の図面に示されており、これには、例えば、標的部位に対する隣接が挙げられる。別の実施形態では、このようなリンカーは、凝固因子またはその一部に隣接してもよい。例えば、一実施形態では、切断性のリンカーは、凝固因子の重鎖のN末端に融合されて、この凝固因子の活性化可能な形態を作製し得る。このような場合、この切断性のリンカーは、その切断部位のN末端で追加のスペーサーリンカーを含んでもよいが、その凝固因子の重鎖のアミノ末端に対する切断部位のC末端での直接融合を必要とする。一実施形態では、本発明のプロセシングされていないポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖に含まれるFc領域を形成するようにcscFcリンカーを介して連結される2つ以上のFcドメインまたは部分を含む。cscFcリンカーは、少なくとも1つの酵素的切断部位、例えば、細胞内酵素によるプロセシングのための部位に隣接する。少なくとも1つの酵素的切断部位でのポリペプチドの切断は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含むポリペプチドを生じる。一実施形態では、cscFcリンカーは、F1またはF2を、例えば、凝固因子に、必要に応じて切断部位を介して連結する。上記で示されるとおり、他のポリペプチドリンカーは必要に応じて、例えば、凝固因子または標的部分をFc部分に接続するために、本発明の構築物中で用いられ得る。ある種のポリペプチドリンカーは、本明細書においてはスペーサーと呼ばれる。本発明と関連して用いられ得るスペーサーのいくつかの例示的な位置としては、例えば、添付の図面に示され、下にさらに詳細に記載されるアミノ酸などのGlySerアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。一実施形態では、スペーサーは、各々が独立して、凝固因子、足場部分、例えば、Fc、切断部位、および標的部分から選択される1つ以上の部位に隣接してもよい。一実施形態では、ポリペプチドリンカーは合成であり、すなわち、天然には存在しない。一実施形態では、ポリペプチドリンカーとしては、ペプチドまたはポリペプチドこれは天然に存在しても、または天然には存在しなくてもよいが挙げられ、これはアミノ酸の第一の直鎖状配列を、これが天然には連結されていないし、または事実上遺伝子的に融合されてもいない、アミノ酸の第二の直鎖状配列に連結するかまたは遺伝子的に融合する、アミノ酸配列を含む。例えば、一実施形態ではこのポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変型である例えば、付加、置換または欠失などの変異を含んでいる、天然には存在しないポリペプチドを含んでもよい。別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、天然には存在しないアミノ酸を含んでもよい。別の実施形態では、このポリペプチドリンカーは、天然には生じない直鎖状配列に存在する天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施形態では、このポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、同一のFc部分を融合し、それによってホモマーのscFc領域を形成するために用いられ得る。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、異なるFc部分例えば、野性型Fc部分およびFc部分改変体を融合し、それによってヘテロマーのscFc領域を形成するために用いられ得る。別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、gly-serリンカーを含むか、またはそれらからなる。一実施形態では、scFcまたはcscFcリンカーは、免疫グロブリンヒンジの少なくとも一部およびgly-serリンカーを含む。本明細書において用いる場合、gly-serリンカーという用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なgly/serリンカーは、式Gly4Sern配列番号4のアミノ酸配列を含み、ここでnは正の整数である例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10。好ましいgly/serリンカーは、Gly4Ser2配列番号29、Gly4Ser4配列番号6、またはGly4Ser6配列番号5である。別の例示的なgly-serリンカーは、GGGSSGGGSG配列番号30である。特定の実施形態では、このようなgly-serリンカーは、ポリペプチドリンカーの2つの他の配列例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドリンカー配列の間に挿入され得る。他の実施形態では、gly-serリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチドリンカー配列の一方または両端に結合される。さらに他の実施形態では、2つ以上のgly-serリンカーが、ポリペプチドリンカーに連続して差し込まれる。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、上部ヒンジ領域の少なくとも一部例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4分子由来、中央ヒンジ領域の少なくとも一部例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4分子および一連のgly/serアミノ酸残基例えば、Gly4Sern配列番号4のようなgly/serリンカーを含む。本発明のポリペプチドリンカーは、少なくとも1アミノ酸長であり、かつ変化する長さのアミノ酸であってもよい。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約1~約50アミノ酸長である。この文脈で用いる場合、約という用語は、/-2つのアミノ酸残基を示す。リンカー長は、正の整数でなければならないので、約1~約50アミノ酸長という長さは、1-3~48-52アミノ酸長という長さを意味する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約10-20アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約15~約50アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約20~約45アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約15~約35または約20~約30アミノ酸長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、または60アミノ酸長である。一実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、20または30アミノ酸長である。ポリペプチドリンカーは、当該分野で公知の技術を用いてポリペプチド配列に導入され得る。改変は、DNA配列分析によって確認され得る。プラスミドDNAを用いて、産生されるポリペプチドの安定な産生のために宿主細胞を形質転換してもよい。VIII.酵素的切断部位一実施形態では、1つ以上の酵素的切断部位単数または複数が、本発明のプロセシングされていないポリペプチドのcscFcリンカーLに連結され、例えば、横にあるか、または隣接される。このような切断部位は、cscFcリンカーの上流もしくは下流、またはその両方であってもよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする構築物の一実施形態では、切断部位は、cscFcリンカーLの一端または両端に対して例えば、直接または間接的に連結される。例えば,一実施形態では、本発明の核酸分子は、以下の式によって示されるポリペプチドを規定する:A-F1-P1-L-P2-B-F2Iアミノ末端からカルボキシル末端の直鎖状配列では、Aは存在する場合、凝固因子またはその一部であり、F1は第一のFc部分またはドメインであり、P1は酵素的切断部位であり、LはcscFcリンカーであり、P2は酵素的切断部位Bであり、存在するならば、凝固因子またはその一部であり、F2は第二のFc部分またはドメインであり、かつ-は、ペプチド結合である。式Iは、少なくともAまたはB、必要に応じてその両方を含む。AおよびBは、両方が存在する場合、凝固因子の対応する重鎖および軽鎖であり得る。式Iは、少なくともP1またはP2、および必要に応じて両方を含む。P1およびP2は、両方が存在する場合、同じであっても異なってもよい。式Iは、少なくともF1およびF2を含む。F1およびF2は、両方とも存在する場合、同じであっても異なってもよい。別の実施形態では、第XIa因子または第Xa因子の切断部位は、本発明の構築物中に、例えば、切断性のリンカーに組み込まれてもよい。例示的なFXIa切断部位は、例えば、TQSFNDFTRおよびSVSQTSKLTRを含む。例示的なトロンビン切断部位は、例えば、DFLAEGGGVR、TTKIKPR、LVPRG配列番号35およびALRPRVVGGAを含む。他の有用な切断部位が当該分野で公知である。一実施形態では、このリンカーのいくつかの部分は、少なくとも1つの酵素的切断部位で切断後に残る場合がある。外因性のアミノ酸配列の存在を最小化するために、2つの切断部位が、本発明のポリペプチド中に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、全てのまたは実質的に全てのリンカーが切除されるが、いくつかの実施形態では、切断部位の一部、例えば、RRRR切断部位の4つのアルギニンが残る場合がある。ポリペプチドの調製本発明のキメラの凝固因子を組み換え的に産生するには種々の方法が利用可能である。一実施形態では、本発明は、本発明のキメラのタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物に関する。コードの縮重性のおかげで、種々の核酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることが理解される。所望のポリヌクレオチドは、新規の固相DNA合成によって、または初期に調製したポリヌクレオチドのPCR突然変異誘発によって産生され得る。オリゴヌクレオチド媒介性の突然変異誘発は、アミノ酸置換をコードするコドンを例えば、Fc改変体部分へ導入するための置換、インフレーム挿入または変更例えば、変更されたコドンを調製するための1方法である。例えば、出発ポリペプチドDNAは所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖のDNAテンプレートにハイブリダイズすることによって変更される。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーに組み込むテンプレートの全体的な第二の相補的な鎖を合成する。一実施形態では、遺伝子操作、例えば、プライマーベースのPCR突然変異誘発が、本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するために、変更を組み込むために十分である。組み換え産生のために、キメラのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を適切な発現ビヒクル、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必須のエレメントを含むベクター、またはRNAウイルスベクターの場合は、複製および翻訳のために必須のエレメントを含むベクター中に挿入する。キメラのタンパク質をコードする核酸を、適切なリーディングフレーム中でベクターに挿入する。次いで、この発現ベクターを、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞中にトランスフェクトする。当該分野で公知のトランスフェクション技術としては、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿Wiglerら、1978,Cell14:725およびエレクトロポレーションNeumannら、1982,EMBO,J.1:841が挙げられる。種々の宿主発現ベクター系を利用して、真核生物細胞中で、本明細書に記載のキメラのタンパク質を発現してもよい。一実施形態では、真核生物細胞は、動物細胞であり、これには哺乳動物細胞例えば、293細胞、PerC6、CHO、BHK、Cos、HeLa細胞が挙げられる。キメラのタンパク質が、真核生物細胞で発現される場合、キメラのタンパク質をコードするDNAはまた、キメラのタンパク質が分泌されることを可能にするシグナル配列をコードしてもよい。当業者は、タンパク質は翻訳されるが、シグナル配列は細胞によって切断されて成熟キメラタンパク質が形成されることを理解する。種々のシグナル配列、例えば、天然の第VII因子シグナル配列、天然の第IX因子シグナル配列およびマウスIgK軽鎖シグナル配列が当該分野で公知である。あるいは、シグナル配列がキメラのタンパク質に含まれない場合、細胞を溶解することによって回収され得る。本発明のキメラのタンパク質は、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシのようなトランスジェニック動物で合成されてもよい。トランスジェニック動物という用語は、それらのゲノム中へ外来の遺伝子を組み込んでいる非ヒト動物を指す。この遺伝子は、生殖細胞系列の組織に存在するので、この遺伝子は親から子孫に受け継がれる。外因性の遺伝子は、単一細胞の胚に導入されるBrinsterら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4438。免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニックを含む、トランスジェニック動物を産生する方法は当該分野で公知であるWagnerら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6376;McKnightら、1983,Cell34:335;Brinsterら、1983,Nature306:332;Ritchieら、1984,Nature312:517;Baldassarreら、2003,Theriogenology59:831;Roblら、2003,Theriogenology59:107;Malassagneら、2003,Xenotransplantation103:267。発現ベクターは、組み換え的に産生されたタンパク質の容易な精製または特定を可能にするタグをコードしてもよい。例としては、限定するものではないが、ベクターpUR278Rutherら、1983,EMBOJ.2:1791が挙げられ、ここでは本明細書に記載されるキメラのタンパク質をコードする配列を、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、laczコード領域とともにインフレームでベクター中に連結してもよい;pGEXベクターを用いて、グルタチオンS-トランスフェラーゼGSTタグを有するタンパク質を発現してもよい。これらのタンパク質は通常、可溶性であり、かつグルタチオン-アガロースビーズに対する吸着によって、続いて、遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって細胞から容易に生成され得る。このベクターは、精製後のタグの容易な除去のための切断部位を含む例えば、PreCissionProteasePharmacia,Peapack,N.J.。本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を使用してもよい。これらの発現ベクターは典型的には、宿主生物体中で、エピソームとして、または染色体DNAの一体部分として、複製可能である。発現ベクターは、発現制御配列を含んでもよく、この配列には限定するものではないが、プロモーター例えば、天然に会合するかまたは異種のプロモーター、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント、および転写末端配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核生物プロモーター系である。発現ベクターはまた、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスRSV、MMTVまたはMOMLV、サイトメガロウイルスCMV、またはSV40ウイルスのような動物ウイルス由来のDNAエレメントを利用し得る。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性の系の使用を包含する。通常は、発現ベクターは、選択マーカー例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性を含んで、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする例えば、Itakuraら、米国特許第4,704,362号を参照のこと。DNAをそれらの染色体に組み込んでいる細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする1つ以上のマーカーを導入することによって選択され得る。このマーカーは、栄養要求性宿主への原栄養性、殺生物剤耐性例えば、抗生物質、または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきDNA配列に直接結合されてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞に導入されてもよい。好ましい発現ベクターは、NEOSPLAである米国特許第6,159,730号。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、SV40複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン1およびエキソン2、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の組み込み、細胞中のトランスフェクション、その後のG418含有培地中での選択およびメトトレキサート増幅の際に極めて高レベルの抗体発現を生じることが見出された。ベクター系はまた、米国特許第5,736,137号および同第5,658,570号その各々がその全体が本明細書において参照によって援用されるに教示される。この系は、高い発現レベル、例えば、>30pg/細胞/日を提供する。他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第6,413,777号に開示される。他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ポリシストロン性の構築物を用いて発現され得る。これらの発現系では、本発明の複数の遺伝子産物、例えば、多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドが、単一のポリシストロン性構築物から産生され得る。これらの系は有利には、内部リボソーム進入部位IRESを用いて、本発明の比較的高レベルのポリペプチドを真核生物宿主細胞に提供する。適合性のIRES配列は、本明細書にこれも援用される米国特許第6,193,980号に開示される。当業者は、このような発現系を用いて、本出願に開示されるポリペプチドの全範囲を効率的に生成し得ることを理解する。さらに一般的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはDNA配列を一旦調製すれば、この発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入してもよい。すなわち、宿主細胞を形質転換してもよい。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成され得る。これらとしては限定するものではないが、トランスフェクション電気泳動およびエレクトロポレーションを含む、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープDNAによる細胞融合、マイクロインジェクションおよびインタクトなウイルスでの感染が挙げられる。Ridgway,A.A.G.MammalianExpressionVectors第24.2章,470-472頁Vectors,RodriguezおよびDenhardt,編集.Butterworths,Boston,Mass.1988を参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションを介する。この形質転換された細胞は、軽鎖および重鎖の産生に対して適切な条件下で増殖され、重鎖および/または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイELISA、ラジオイムノアッセイRIA、または蛍光活性化された細胞分取分析FACS、免疫組織化学などが挙げられる。本明細書において用いる場合、形質転換という用語は、遺伝子型を変化し、結果としてレシピエント細胞の変化を生じる、レシピエントの宿主細胞へのDNAの導入を指して広義に用いられるものである。これらの同じ表現によれば、宿主細胞とは、組み換えDNA技術を用いて構築され、少なくとも1つの異種遺伝子をコードしているベクターで形質転換された細胞を指す。組み換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの説明では、細胞および細胞培養物という用語は、交換可能に用いられて、明らかに他を特定するのでない限り、ポリペプチドの供給源を指す。言い換えれば、細胞からのポリペプチドの回収とは、スピンダウンした細胞全体から、または培地および懸濁細胞の両方を含む細胞培養物からのいずれを意味してもよい。タンパク質発現のために用いられる宿主細胞は、哺乳動物由来の細胞が最も好ましい;当業者は、所望の遺伝子産物をその中で発現させるのに最適の特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を承知している。例示的な宿主細胞株としては、限定するものではないが、DG44およびDUXB11チャイニーズハムスター卵巣株、DHFRマイナス、HELAヒト子宮頸癌、CVIサル腎臓株、COSSV40のT抗原を有するCVIの誘導体、R1610チャイニーズハムスター線維芽細胞BALBC/3T3マウス線維芽細胞、HAKハムスター腎臓株、SP2/Oマウス骨髄腫、P3.times.63-Ag3.653マウス骨髄腫、BFA-1c1BPTウシ内皮細胞、RAJIヒトリンパ球、PerC6、および293ヒト腎臓が挙げられる。宿主細胞株は通常は、商業的供給源、AmericanTissueCultureCollectionから、または公表文献から入手可能である。一実施形態では、宿主細胞は、成熟ポリペプチドを形成するためのプロセシングの間にscFcリンカー例えば、このようなリンカーが存在する場合、細胞内プロセシング部位単数または複数を含むを切断するために必要な酵素単数または複数を内因性に発現する。このプロセシングの間、scFcリンカーは、外因性のアミノ酸の存在を減少するために実質的に除去され得る。本発明の別の実施形態では、宿主細胞を形質転換して、細胞に対して外因性である1つ以上の酵素を発現し、その結果scFcリンカーのプロセシングが生じるかまたは改善される。一実施形態では、細胞によって内因性にまたは外因性に発現され得る酵素は、酵素のフリンファミリーのメンバーである。ヒトフリンすなわち、PACEの完全cDNAおよびアミノ酸配列は、1990.VandenOuwelandAMら、1990NucleicAcidsRes.18:664;Erratumin:NucleicAcidsRes.18:13321990に公表されている。Barrらに発行された米国特許第5,460,950号は、組み換えPACEおよびPACEと異種タンパク質の基質前駆体ポリペプチドとの同時発現活性な成熟異種タンパク質の発現を改善するを記載する。vandeVenら、に発行された米国特許第5,935,815号は同様に、組み換えヒトフリンすなわち、PACEおよびフリンと異種タンパク質の基質前駆体ポリペプチドとの同時発現活性な成熟異種タンパク質の発現を改善するを記載する。この特許で開示される、潜在的な基質前駆体としては、第IX因子の前駆体が挙げられる。PACEに加えて、哺乳動物フリン/サブチリシン/Kex2p様プロタンパク質転換酵素PCファミリーの他のメンバーは、PC1/PC3、PC2、PC4、PC5/6本明細書において以降では単にPC5と呼ぶ、PACE4、およびLPC/PC7/PC8/SPC7を包含すると報告されている。これらの種々のメンバーは、特定の保存された全体的な構造特徴を共有するが、それらは、組織分布、細胞内の局在、切断特性、および好ましい基質が異なる。概説については、NakayamaK1997BiochemJ.327:625-35を参照のこと。PACEと同様に、これらのプロタンパク質転換酵素は一般には、アミノ末端から開始して、シグナルペプチド、プロペプチド自己触媒的に切断され得る、サブチリシン様触媒ドメインAsp、His、Ser、およびAsn/Asp残基によって特徴付けられる、およびHomoBドメインこれも本質的に触媒活性に必須であり、かつArg-Gly-AspRGD配列によって特徴づけられるを含む。PACE、PACE4、およびPC5はまた、Cysリッチなドメイン機能は未知であるを含む。さらに、PC5は、膜貫通ドメインの有無のアイソフォームを有し;これらの異なるアイソフォームは、それぞれPC5BおよびPC5Aとして公知である。PACEの触媒性ドメインのアミノ酸配列とこのプロタンパク質転換酵素のファミリーの他のメンバーの触媒性ドメインのアミノ酸配列との間の比較によって以下の同一性程度が明らかになる:PC4について70パーセント;PACE4およびPC5について65パーセント;PC1/PC3について61パーセント;PC2について54パーセント;およびLPC/PC7/PC8/SPC7について51パーセント。NakayamaK1997BiochemJ.327:625-35。PACEおよびPACE4は、部分的に重複するが別個の基質を有することが報告された。具体的には、PACE4は、PACEとは著しく対照的に、FIXの前駆体ポリペプチドを処理できないことが報告された。WasleyLCら、1993JBiolChem.268:8458~65;RehemtullaAら、1993Biochemistry.32:11586-90。Seidahらに発行された米国特許第5,840,529号は、ヒトPC7のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに他のPCファミリーメンバーと比較してPC7がHIVgp160をgp120およびgp41に切断する顕著な能力を開示する。げっ歯類PC5のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、最初、LussonJら、1993ProcNatlAcadSciUSA90:6691-5によってPC5として、およびNakagawaTら、1993JBiochemTokyo113:132-5によってPC6として記載された。Dayらに発行された米国特許第6,380,171号は、膜貫通ドメインのないアイソフォームであるヒトPC5Aのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を開示する。これらの酵素の配列およびそのクローニング方法は当該分野で公知である。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物の細胞などの非哺乳動物細胞中で発現され得る。この関連では、細菌のような種々の単細胞の非哺乳動物微生物がまた形質転換され得ることも理解される;すなわち、それらは、培養物またはファファーメンテーション中で増殖可能である。形質転換し易い細菌としては、腸内細菌科のメンバー、例えば、大腸菌Escherichiacoliまたはサルモネラ属の株;Bacillussubtilisのようなバシラス科;肺炎球菌;連鎖球菌、およびインフルエンザ菌Haemophilusinfluenzaeが挙げられる。細菌において発現される場合、ポリペプチドは、通常、封入体の一部となることがさらに認識される。このポリペプチドは、単離、精製され、その後に、機能分子に組み立てられなければならない。原核生物に加えて、真核生物微生物もまた用いられてもよい。Saccharomycescerevisiae、または一般的なパン酵母は真核生物微生物の中でも最も一般的に用いられるが、多数の他の株が共通して利用可能である。サッカロミセス属での発現のためには、プラスミドYRp7が、例えば、Stinchcombら、Nature,282:391979;Kingsmanら、Gene,7:1411979;Tschemperら、Gene,10:1571980共通して用いられる。このプラスミドは既に、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の変異体株の選択マーカーを提供するTRP1遺伝子、例えば、ATCC番号44076またはPEP4-1Jones,Genetics,85:121977を含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp1損傷の存在によって、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境が得られる。Pichiaのような他の酵母宿主もまた使用されてもよい。酵母発現ベクターは、発現制御配列例えば、プロモーター、複製起点、終止配列などを必要に応じて有する。典型的なプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロムC、ならびにメタノール、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素が挙げられる。あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳中へのその後の発現のために導入遺伝子に組み込まれ得る例えば、Deboerら、米国特許第5,741,957号、Rosen,米国特許第5,304,489号、およびMeadeら、米国特許第5,849,992号を参照のこと。適切な導入遺伝子としては、カゼイン、またはβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結しているポリペプチドのコード配列が挙げられる。インビトロの産生によって、大量の所望のポリペプチドを得るための大規模化が可能になる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は、当該分野で公知であり、かつ同種の懸濁培養物を、例えば、エアリフトリアクター中に、もしくは連続スターラーリアクター中に、または固定されるかもしくは取り込まれた細胞培養物を、例えば、中空ファイバー、マイクロカプセル中に、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上に包含する。必要および/または所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣習的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロースまたはイムノ-アフィニティークロマトグラフィー上でのクロマトグラフィーによって、例えば、合成のヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成後、または本明細書に記載されるHICクロマトグラフィーの前にもしくは後に精製されてもよい。アフィニティータグ配列例えば、His6タグは必要に応じて、下流の精製を容易にするためにポリペプチド配列に結合されてもまたはその中に含まれてもよい。一実施形態では、本発明の宿主細胞は、scFcリンカー足場を含むポリペプチドをコードする遺伝子構築物、およびcscFcリンカーをプロセシングし得る1つ以上の酵素を含む。この構築物および酵素単数または複数は、単一のベクターまたは2つのベクターを用いて発現され得る。一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関与する。一実施形態では、この核酸分子は、FVII、FIXおよびFXからなる群より選択されるキメラの凝固因子をコードし、この凝固因子は、血小板に結合する標的部分と、必要に応じて凝固因子と標的部分との間のスペーサー部分とを含む。別の実施形態では、本発明は、FVIIを含む、ポリペプチドをコードする核酸分子に関与し、このFVIIは、凝固カスケードの成分によって活性化可能な異種の酵素的切断部位を含む。一旦発現されれば、このキメラの凝固因子は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、HPLC精製、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的手順に従って精製されてもよく一般にハイブリダイズ、Scopes、ProteinPurificationSpringer-Verlag,N.Y.,1982を参照のこと、本発明の実施例で用いられる方法を特に参照のこと。薬学的用途に対しては、少なくとも約90~95という均質性の実質上純粋なタンパク質が好ましく、そして98~99またはそれ以上の均質性が、最も好ましい。IX.本発明のポリペプチドを投与する方法別の実施形態では、本発明は、本発明の増強された凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、止血障害を有する被験体を処置する方法に関する。被験体に対する投与のための組成物は、本発明のキメラの凝固因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子遺伝子治療の適用のためおよびポリペプチド分子を含む。一実施形態では、本発明の増強された凝固因子組成物は、止血を促進する少なくとも1つの他の薬剤と組み合わせて投与される。止血を促進するこのような他の剤は、凝固活性を示す治療剤である。例であって、限定するものではないが、止血剤としては、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子、第XIII因子、プロトロンビンもしくはフィブリノーゲン、または任意の前述の活性化型を挙げることができる。止血剤の凝固因子はまた、抗線維素溶解薬、例えば、ε-アミノ-カプロン酸、トラネキサム酸を含んでもよい。本発明の一実施形態では、組成物例えば、ポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードする核酸分子とは、被験体に投与された場合、凝固因子が活性型で存在する組成物である。このような活性分子は細胞によって活性型で発現されてもよいし、または被験体に対する投与の前にインビトロで活性化されてもよい。別の実施形態では、この組成物は、凝固因子が活性化可能な形態で存在し、かつ凝固因子が被験体への投与後に凝固の部位においてインビボで活性化される、組成物である。本発明のキメラの凝固因子は、静脈内に、皮下に、筋肉内にまたは、任意の粘膜表面を介して、例えば、経口的に、舌下に、口腔内に、舌下に、経鼻的に、直腸内に、膣内にまたは肺経路を介して投与され得る。キメラのタンパク質は、キメラのタンパク質の所望の部位への緩徐な放出を可能にするバイオポリマー固体支持体内に移植されるか、またはそれに連結され得る。経口投与のために、薬学的組成物は、従来の手段によって調製される錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。この組成物はまた、液体、例えば、シロップまたは懸濁液として調製されてもよい。この液体は、懸濁剤例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂、乳化剤レシチンまたはアカシア、非水性ビヒクル例えば、アーモンドオイル、油性エステル類、エチルアルコールまたは分画植物油、および防腐剤例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸を含んでもよい。この調製物はまた、香味剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。あるいは、この組成物は、水または別の適切なビヒクルでの構成のための乾燥製品として調製されてもよい。口腔内および舌下投与のためには、この組成物は、従来のプロトコールによる錠剤、トローチ剤、または急速溶解フィルムの形態をとってもよい。吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧の形態で例えば、PBS中で、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスとともに都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。例えば、インヘイラーまたは吸入器での使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、ラクトースまたはデンプンのような化合物および適切な粉末基剤の粉末混合物を含んで処方され得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドの投与経路は、非経口である。非経口という用語は本明細書において用いる場合、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣の投与を包含する。静脈内型の非経口投与が好ましい。これらの投与形態の全てが明確に本発明の範囲内であるとみなされるが、投与の形態は、注射用の溶液、特に静脈内または動脈内の注射または点滴である。通常、注射用の適切な薬学的組成物は、緩衝液例えば、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩の緩衝液、サーファクタント例えば、ポリソルベート、必要に応じて安定化剤例えば、ヒトアルブミンなどを含んでもよい。しかし、本明細書の教示と適合する他の方法では、このポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達されて、それによって、治療剤に対する疾患の組織の暴露を増大し得る。非経口投与のための調製物としては、無菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性の担体としては、水、アルコール溶液/水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例としては、生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。本発明では、薬学的に許容される担体としては、限定するものではないが、0.01~0.1M、好ましくは0.05Mのリン酸緩衝液、または0.8の生理食塩水が挙げられる。他の共通の非経口ビヒクルとしては、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、液体および栄養補充因子、電解質補充因子、例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの、などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加物もまた存在してもよい。さらに詳細には、注射用途に適した薬学的組成物としては、滅菌注射用溶液または懸濁液の即時的な調製のための、滅菌水溶液ここでは水溶性または分散剤および無菌粉末が挙げられる。このような場合、この組成物は、滅菌しなければならず、かつ容易にシリンジから出る程度まで液体でなければならない。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、好ましくは、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存される。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、などおよびその安定な混合物を含んでいる、溶媒または分散媒体であってもよい。この適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、およびサーファクタントの使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含ませるのが望ましい。注射可能組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることによってもたらされ得る。任意の場合に、滅菌注射溶液は、本明細書に挙げた成分の1つ以上の組み合わせと共に適切な溶媒中に必要な量の活性化合物例えば、ポリペプチドをそれ自体で、または他の活性剤と組み合わせて組み込み、必要に応じて、その後に濾過殺菌することによって調製してもよい。一般には、分散は、活性化合物を滅菌ビヒクル中塩基性分散媒体および上記で列挙されたものから必要な他の成分を含むに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用のための滅菌粉末の場合には、好適な調製方法は真空乾燥および凍結乾燥法であり、これは活性成分に加え、その事前に滅菌濾過された溶液中に任意の付加的な所望成分の粉末を生じる。注射用の調製物は、処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルのような容器中に充填され、当該分野で公知の方法による無菌状態のもとで密閉される。さらにこの調製物は、充填されて、キットの形態で販売されてもよい。このような製品は好ましくは、関連の組成物が凝固障害に罹患しているか、またはその素因がある被験体を処置するために有用であることを示している、ラベルまたは添付文書を有する。薬学的組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリド類などの従来の坐剤の基剤を含む、坐剤または停留浣腸として直腸投与用に処方されてもよい。状態の処置のための、本発明の組成物の有効量は、多くの異なる要因、例としては投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、他の併用薬、および処置が予防的か治療的かに依存して変化する。通常は、患者は、ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために当業者に公知の慣用的方法を用いて滴定されてもよい。一実施形態では、生物学的に活性な部分例えば、FIXを含むの用量は、約25~100IU/kg、例えば、0.417mg/kg~1.67mg/kgにおよんでもよい。別の実施形態では、生物学的に活性な部分例えば、FVIIIを含むの用量は、約25~65IU/kg、例えば、0.003125mg/kg~0.008125mg/kgにおよんでもよい。別の実施形態では、生物学的に活性な部分の用量例えば、FVIIを含んでいるは、約90~270ug/kgまたは0.090~0.270mg/kgにおよんでもよい。投薬量は、1000ug/kg~0.1ng/kg体重におよんでもよい。一実施形態では、投薬範囲は、1ug/kg~100ug/kgである。このタンパク質は、連続して投与されても、または特定の時間間隔で投与されてもよい。インビトロアッセイを使用して、最適の投与量範囲および/または投与スケジュールを決定してもよい。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは、当該分野で公知、例えば、STA-CLOTVIIa-rTF凝固アッセイである。さらに、有効用量は、動物モデル、例えば、血友病イヌMountら、2002,Blood998:2670から得られる用量応答曲線から外挿され得る。上記の範囲の用量の中間もまた、本発明の範囲内であるものとする。被験体は、その用量を毎日、一日おきに、毎週、または経験的な分析によって決定される任意の他のスケジュールによって投与されてもよい。例示的な処置は、例えば、少なくとも6か月という長期間にわたって複数用量の投与を必要とする。いくつかの方法では、2つ以上のポリペプチドを同時に投与してもよく、その場合、投与される各々のポリペプチドの投薬量は、示した範囲内におさまる。本発明のポリペプチドは、複数回投与されてもよい。単回投薬の間の間隔は、毎日であっても、毎週であっても、毎月であってもまたは毎年であってもよい。間隔はまた、患者の改変されたポリペプチドまたは抗原の血液レベルを測定することによって示されるとおり不規則であってもよい。あるいは、ポリペプチドは、必要な投与頻度が少なくてもよい、徐放性処方物として投与されてもよい。投薬量および頻度は、患者におけるこのポリペプチドの半減期に応じて変化する。投与の用量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化し得る。予防的な適用では、本発明のポリペプチドまたはそのカクテルを含んでいる組成物を、まだ疾患状態ではない患者に投与して、患者の耐性を向上するか、または疾患の影響を最小限にする。このような量は、予防上有効な用量であると定義される。比較的低用量を、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与する。数例の患者は、死ぬまで処置を受け続ける。本発明のポリペプチドは必要に応じて、処置例えば、予防的または治療的の必要な障害または状態を処置するのに有効な他の剤と組み合わせて投与されてもよい。本明細書において用いる場合、補助療法と組み合わせるかまたは併用した本発明のポリペプチドの投与は、治療および開示されたポリペプチドの連続的、同時、同延、同時発生、併用または同時期の投与または適用を意味する。当業者は、併用療法の投与計画の種々の成分の投与または適用が、処置の全体的な有効性を増強するために調節され得ることを理解する。当業者例えば、医師は、選択された補助療法および本明細書の教示に基づいて過度の実験しに、有効な併用療法の投与計画を容易に判別できる。本発明のポリペプチドが、薬剤例えば、併用療法の投与計画を提供するためと組み合わせて、または併用して用いられ得ることがさらに理解される。本発明のポリペプチドが組み合され得る例示的な剤としては、処置されている特定の障害について現在の標準的な治療に相当する剤が挙げられる。このような剤は、事実上、化学的であっても、生物学的であってもよい。生物学的または生物製剤という用語は、治療剤としても使用を意図する、生きている生物体および/またはそれらの産物から作製された任意の薬学的に活性な剤を指す。本発明のポリペプチドと組み合わせて用いられるべき剤の量は、被験体によって変化してもよいし、または当該分野で公知であるものに応じて投与されてもよい。例えば、BruceAChabnerら、AntineoplasticAgents,inGoodmanGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics1233-1287JoelG.Hardmanら、第9版.1996を参照のこと。別の実施形態では、標準的な治療と一致するこのような剤の量が投与される。前に考察したとおり、本発明のポリペプチドは、凝固障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与されてもよい。この点において、本発明のポリペプチドは、活性剤の投与を容易にし、安定性を促進するように処方され得ることが理解される。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、生理食塩水、非毒性の緩衝液、防腐剤などのような薬学的に許容される、非毒性の、無菌の担体を含む。当然ながら、本発明の薬学的組成物は、このポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単一用量で投与されても、または複数用量で投与されてもよい。一実施形態では、本発明のキメラの凝固因子は、核酸分子として投与され得る。核酸分子は、当該分野で公知の技術を用いて投与され得、この技術としては、ベクター、プラスミド、リポソーム、DNA注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、静脈内注射または肝動脈注入が挙げられる。遺伝子治療の実施形態における使用のためのベクターは当該分野で公知である。本開示の範囲と一致して、本発明のキメラの凝固因子は、治療効果または予防効果を生じるのに十分な量で処置の前述の方法に従って、ヒトまたは他の動物に投与され得る。本発明のキメラのタンパク質は、当業者に理解されるとおり、ある疾患または状態を有する被験体を処置する方法を含むがこれには限定されない、多くの用途を有する。この疾患または状態としては、限定するものではないが、止血の障害が挙げられる。一実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも1つのキメラの凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、止血障害を有する被験体の処置方法に関する。本発明のキメラの凝固因子は、フィブリン塊の形成を促進することによって、止血障害を処置または予防する。本発明のキメラの凝固因子は、凝血カスケードの任意のメンバーを活性化し得る。凝固因子は、外因経路、内因経路、またはその両方に関与し得る。本発明のキメラの凝固因子は、止血障害、例えば、キメラの凝固因子に存在する特定の凝固因子で処置可能であることが公知の障害を処置するために用いられ得る。本発明のキメラのタンパク質の投与によって処置され得る止血障害としては、限定するものではないが、血友病A、血友病B、フォンヴィレブラント病、第XI因子欠損PTA欠損、第XII因子欠損、同様にフィブリノーゲン、プロトロンビン、第V因子、第VII因子、第X因子、または第XIII因子の欠損または構造異常が挙げられる。一実施形態では、止血障害は、遺伝性の障害である。一実施形態では、被験体は、血友病Aを有し、キメラのタンパク質は、第VII因子または第VIIIa因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Aを有し、キメラの凝固因子は、第VII因子または第VIIa因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Bを有し、キメラの凝固因子は、第IX因子または第IXa因子を含む。別の実施形態では、被験体は、血友病Bを有し、キメラのタンパク質は第VII因子または第VIIa因子を含む。別の実施形態では、被験体は、第VII因子または第VIIIa因子に対する阻害性抗体を有し、キメラの凝固因子は、第VII因子または第VIIa因子を含む。さらに別の実施形態では、被験体は、第IX因子または第IXa因子に対する阻害性抗体を有し、キメラのタンパク質は、第VII因子または第VIIa因子を含む。本発明のキメラの凝固因子は、止血障害を有する被験体を予防的に処置するために用いられ得る。本発明のキメラの凝固因子は、止血障害を有する被験体において急性の出血エピソードを処置するために用いられ得る。一実施形態では、止血障害は、凝固因子、例えば、第IX因子、第VIII因子の欠損の結果である。別の実施形態では、止血障害は、不完全な凝固因子の結果であり得る。別の実施形態では、止血障害は、後天性の障害であり得る。後天性の障害は、背景にある二次疾患または状態から生じ得る。無関係の状態は、例えば、限定するものではないが、癌、自己免疫疾患、または妊娠であってもよい。後天性の障害は、高齢から、または背景にある二次障害を処置するための薬物療法例えば、癌化学療法から生じ得る。本発明はまた、止血障害、または止血障害を生じる二次的な疾患もしくは障害を有さない被験体を処置する方法に関する。従って、本発明は、本発明の少なくとも1つのキメラ凝固因子の治療上有効な量を投与することを包含する、一般的な止血剤の必要な被験体を処置する方法に関する。例えば、一実施形態では、一般的な止血剤の必要な被験体は、手術を受けているか、または手術に臨んでいる。本発明のキメラの凝固因子は、術前または術後に予防剤として投与されてもよい。本発明のキメラの凝固因子は、急性の出血エピソードを管理するために術中または術後に投与され得る。手術としては、限定するものではないが、肝移植、肝切除または幹細胞移植を挙げることができる。別の実施形態では、本発明のキメラの凝固因子を用いて、止血障害を受けていない急性の出血エピソードを有する被験体を処置してもよい。急性の出血エピソードは、重度の外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、銃による裂創、または制御されない出血を生じる任意の他の外傷性事象から生じ得る。本発明はさらに、以下の実施例で例示されるが、これは限定と解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用される全ての引用文献、特許および公開特許出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。本実施例を通じて、別段言及しない限り、以下の材料および方法を用いた。一般的な材料および方法一般には、本発明の実施は、別段示さない限り、化学、生物物理学、分子生物学、組み換えDNA技術、免疫学特に、例えば、抗体技術の従来の技術、および電気泳動の標準的な技術を使用する。例えば、Sambrook、FritschandManiatis,MolecularCloning:ColdSpringHarborLaboratoryPress1989;AntibodyEngineeringProtocolsMethodsinMolecularBiology、510,Paul,S.,HumanaPr1996;AntibodyEngineering:APracticalApproachPracticalApproachSeries,169、McCafferty,編集,IrlPr1996;Antibodies:ALaboratoryManual,Harlowら、CS.H.L.Press,Pub.1999;ならびにCurrentProtocolsinMolecularBiology,編集Ausubelら、JohnWileySons1992を参照のこと。実施例1第二のFc鎖のアミノ末端でFVII-FcおよびMB9-Fcを含んでいるヘテロ二量体構築物。pSYN-FVII-027のクローニングFVII-027構築物は、細胞中の製造の間にプロセシングされるとき、切断のためのcscFcを含む。この構築物は、標的部分、scFv部分GPIIbIIIaに結合する、MB9を含む。プラスミドpSYN-FVII-027を、FVII-FcおよびMB9-Fcヘテロ二量体発現のために生成し、ここでMB9は、活性化された血小板上のレセプターGPIIb/IIIaに結合することが以前に示されたscFvである。pSYN-FVII-027由来のタンパク質は、細胞中で単一のポリペプチドとして発現され、ここでFVII-FcサブユニットのC末端は、GGGGS6xポリペプチドリンカーによってMB9-FcサブユニットのN末端に連結される。さらに、RRRRSおよびRKRRKR配列を、各々の配列での最後のArg後のプロタンパク質転換酵素による細胞内切断のために、それぞれ、ポリペプチドリンカーの5’末端および3’末端に挿入した。引き続き、細胞は、2つの鎖FVII-Fc/MB9-Fcヘテロ二量体を発現し、ここでFVII-Fc鎖は、RRRRS配列をC末端で有するが、このリンカーの残りおよびRKRRKR配列は、そうでなければ除去された。第一の工程として、一連の中間体プラスミドを以下のプライマーを用いて生成した:HindIII-SalI-BpsEI-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamHI-リンカー-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGBclI-Fc-FCAGTCTTGATCAGACAAAACTCACACATGCCCACCscFc-EcoRI-RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGHindIII-Kozak-FVII-F:CGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVII-HC-BspEI-R:AGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGG50ulのPCR反応を、以下のサイクルを用いて、25pmolのHindIII-SalI-BpEI-Fc-FおよびBamHI-リンカー-Fc-RおよびテンプレートpSYN-Fc-001で行った:95°C2分間;30サイクルの95°C30秒間、54°C30秒間、72°C1分間。予想される大きさのバンド約700bpを、GelExtractionキットQiagen,Valencia,Calif.を用いてゲル精製して、pBUDCE4Invitrogen,Carlsbad,Calif.のHindIIIおよびBamHI制限部位にクローニングして中間体pSYN-FVII-007を生成した。プライマーHindIII-SalI-BpEI-Fc-FおよびBamHI-リンカー-Fc-Rは、アミノ酸221EUナンバリングで開始するFc領域を増幅して、HindIIIおよびSalI制限酵素部位を、Fc領域部位のすぐ上流に付加し、同様に、GGGGS4xリンカーをコードするDNAフラグメント、続いてBamHI部位をFcコード領域のすぐ下流に付加した。次に、50ulの反応を、25pmolのBclI-Fc-FおよびscFc-EcoRI-R、およびテンプレートpSYN-Fc-011を用い、上記と同じサイクルを用いて行った。予想される大きさのバンド約700bpを上記のようにゲル精製して、制限酵素BamHIおよびEcoRIで切断し、pSYN-FVII-007のBclI/EcoRI制限部位にクローニングして中間体プラスミドpSYN-FVII-008を生成した。プライマー対BclI-Fc-FおよびscFc-EcoRI-Rは、Fc領域を増幅したが、一方で、BclIおよびEcoRI制限部位を、それぞれFcコード領域のすぐ上流および下流に付加した。最後の中間体プラスミドを生成するために、50ulのPCR反応を、25pmolのHindIII-Kozak-FVII-FおよびFVII-HC-BspEI-RおよびテンプレートpSYN-FVII-001を用い、以下のサイクルを用いて行った:95°C2分間;30サイクルの95°C30秒間、55°C30秒間、72°C90秒間。このプライマー対は、FVIIコード領域を増幅するが一方で、GGGGS6xポリペプチドリンカーをコードする分子の3’末端でDNAフラグメントを、続いてアミノ酸221EUナンバリングをコードするFc領域のフラグメントを付加した。プライマーHindIII-Kozak-FVII-Fは、この分子の5’末端でHindIII制限部位を、続いて、FVIIコード領域のすぐ上流でKozak配列を生成する。このFVII-HC-BspEI-Rプライマーは、ポリペプチドリンカーをコードするDNAおよびFc部分を導入する。予想される大きさのバンド約1500bpを上記のようにゲル精製して、pSYN-FVII-008のHindIII/BspEI部位にクローニングしてpSYN-FVII-011を生成した。次に、2つのDNAフラグメントを合成した:Genescript-FVII-027-1およびGenscript-FVII-026-2。Genescript-FVII-027-1は、Fc領域の一部をコードするDNAフラグメントヌクレオチド1306で開始するEUナンバリング、続いて配列RRRRS-GGGGS6x-RKRRKR、続いてMB9scFvの一部残基1-142からなる。EcoRI部位を、遺伝子コードの縮重性を用いてMB9のコード配列に導入して、適切なアミノ酸配列を保存して、Genescript-FVII-027-1の最後の6塩基を重複させる。さらに、5’の最初の塩基は、Fc領域中に見出されるSpaI部位を含む。Genscript-FVII-026-2は、MB9残基143-273の一部をコードするDNAフラグメント、続いてGGGGS6xポリペプチドリンカー、続いてFc領域およびEcoRI部位からなる。EcoRI部位を、遺伝子コードの縮重性を用いてMB9のコード配列に導入して、適切なアミノ酸配列を保存して、Genescript-FVII-026-2の最後の6塩基を重複させる。Genescript-FVII-027-1を、pSYN-FVII-011のSapIおよびEcoRI部位にクローニングして、pSYN-FVII-036を生成した。次に、Genscript-FVII-026-2を、pSYN-FVII-036のEcoRI部位にクローニングして、pSYN-FVII-027を生成した。最後のクローニング部位の正確な方向は、制限酵素分析およびDNA配列決定によって確認した。実施例2第二のFc鎖のカルボキシ末端でFVII-FcおよびMB9-Fcを含んでいるヘテロ二量体構築物、MB9。FVII-037のクローニングFVII-037構築物は、プロセシングの間に切断されないscFc足場を用いて作製される。この構築物では、標的部分、やはりMB9scFvGPIIbIIIaに結合するは、第二のFc部分のC末端に結合される。DNAフラグメントGenscript-FVII-037の合成は、外注したGenscript。このフラグメントは、Fc領域の一部残基434~447、EUナンバリング続いてGGGGS4xポリペプチドリンカーおよびMB9scFvを含む。Genscript-FVII-037のSapI/EcoRIフラグメントを、pSYN-FVII-011P0830と呼ぶのSapI/EcoRIにサブクローニングして、中間構築物を生成した。pSYN-FVII-011由来のSapIフラグメントを、この中間構築物のSapI部位にサブクローニングして、pSYNFVII-037を生成した。実施例3第二のFc鎖のカルボキシ末端でFVII-FcおよびGPIbに対するペプチドを含んでいるヘテロ二量体構築物pSYN-FVII-041中間体構築物のクローニング。この構築物を作製するために、FVII-041構築物を最初は、ある中間体として作製した。DNA分子Genscript-FVII-041の合成は、外注したGenscript。このフラグメントを、SapIで消化して、pSYN-FVII-011のSapI部位にクローニングして、pSYN-FVII-041を生成した。このプロセスによって、第二のFc中にSalI部位残基412-413EUナンバリング,GTGGAC~GTCGACを導入する。pSYN-FVII-044-、-045および-046のクローニング。FVII-041構築物を、出発材料として用いて、GPIbに結合するペプチドである標的部分を含むいくつかの構築物を生成した。PS4ペプチドは-044構築物中で、OS1ペプチドは、-045構築物中で、OS2ペプチドは、-046構築物中で用いる。これらの構築物中では、scFc足場を用いて、そのペプチドを、リンカーを介して第二のFc部分のC末端に結合する。Genscript-FVII-044、-045および-046の合成は、外注したGenscript。これらのDNAフラグメントを、SalI/EcoRIで切断して、pSYN-FVII-041のSalI/EcoRI部位中にサブクローニングして、pSYN-FVII-044、-045および-046を生成した。実施例4第二のFc鎖のアミノ末端でFVII-FcおよびGPIbに対するペプチドを含んでいるヘテロ二量体構築物pSYN-FVII-043中間体のクローニングこの構築物を作製するために、FVII-043構築物を、最初に中間体として作製した。DNAフラグメントGenscript-FVII-043の合成は、外注したGenscript。このフラグメントは、Fc領域の一部をコードするDNA分子残基232~447、EUナンバリング続いてGGGGS4xポリペプチドリンカーおよび別のFc領域の一部残基221~238、EUナンバリングを含む。このDNAフラグメントは、BspEIおよびRsrIIで消化して、pSYN-FVII-042のBspEI/RsrII部位中にサブクローニングして、pSYN-FVII-050を生成した。このプロセスは、固有のSalI部位残基412-413EUナンバリング、GTGGAC~GTCGACを第一のFc中に導入する。pSYNFVII-050のHindIII/EcoRIフラグメントを、pSYN-FVII-011のHindIII/EcoRI部位中にサブクローニングして、pSYN-FVII-043を生成した。pSYN-FVII-047、-048および-049のクローニング。FVII-043構築物を、出発材料として用いて、GPIbに結合するペプチドである標的化部分を含むいくつかの構築物を生成した。PS4ペプチドを、-047構築物中で、OS1ペプチドを-048構築物中で、およびOS2ペプチドを-049構築物中で用いる。これらの構築物では、scFc足場を用いて、ペプチドを、scFcリンカーと第二のFc部分のN末端に連結されるリンカーとの間に差し込む。DNA分子Genscript-FVII-047、-048および-049の合成は、外注したGenscript。Genscript-FVII-047、-048および-049由来のSal/RsrIIフラグメントを、pSYN-FVII-043のSalI/RsrII部位にサブクローニングして、それぞれ、pSYN-FVII-047、-048および049を生成した。実施例5Gla欠失のFVII-Fcおよび標的化分子を含んでいるヘテロ二量体構築物FVII-028中間体のクローニングこの構築物を作製するために、FVII-028構築物を第一の中間体として作製した。DNAフラグメントGenscript-FVII-028の合成は、外注したGenscript。このフラグメントは、HindIII/XbaIで切断して、pSYN-FVII-011中にサブクローニングして、pSYN-FVII-028を生成した。FVII-053のクローニングFVII-028構築物を、出発材料として用いて、標的部分を含む構築物を生成し、Glaドメインを欠く凝固因子を使用する。この構築物について、アミノ酸1-35を、FVIIから除去して、RKRRKR挿入を、残基R152WTFVIIナンバリングの後ろに添加して、細胞内活性化を容易にした。MB9scFvは、標的部分として役立った。DNA分子Genscript-FVII-025は、外注し、この分子由来のXbaI/BsiWIフラグメントを、pSYN-FVII-028のXbaI/BsiWI部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-053を生成した。実施例62つの別々のポリペプチドとして第VII因子重鎖および軽鎖を含んでいるヘテロ二量体構築物pSYN-FVII-024中間体構築物のクローニングFVII-024構築物は、第FVIIの重鎖および軽鎖が単鎖分子で連続しない構築物である。この構築物は、cscFcリンカーが、トランス-ゴルジ網目状構造におけるプロテアーゼによって切断されるように、cscFcを使用する。この切断によって、リンカーの除去、およびFVIIの活性化が生じ、これは活性化されたFVIIFcの発現を生じる。FVIIのコード配列は、以下のプライマーを用いて、ヒト肝臓mRNAライブラリーAmbion,Austin,Texasからポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写によって得た:FVII-F1GGGAATGTCAACAGGCAGGGFVII-R1CTTGGCTTTCTCTCCACAGGC50μlの反応を、製造業者の標準的なプロトコールに従って、MJサーモサイクラー中でPlatinumTaqsystemInvitrogen,Carlsbad,Calif.を備えるSuperscriptOne-stepRT-PCRを用いて各々の10pmolのプライマーで行った。用いたサイクルは、逆転写について50°Cで30分間、続いて94°Cで2分間の変性および30サイクルの94°C30秒間、53°C30秒間、72°C90秒間続いて、10分間、72°Cであった。予想される大きさのバンド約1400bpを、GelExtractionキットQiagen,Valencia,Calif.を用いてゲル精製して、TOPOTACloningキットInvitrogen,Carlsbad,Calif.を用いてpCR2.1TOPO中にクローニングして、中間体プラスミドpSYN-FVII-001を生成した。二本の鎖のFVII-FcおよびFcヘテロ二量体の発現のためのプラスミドを構築するために、FVIIコード配列を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した:HindIII-Kozak-FVII-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspeI-Fc-FVII-RCGACTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGGAAATGGGGCTCGCAGGフォワードプライマーHindIII-Kozak-FVII-Fは、HindIII制限部位、続いてKozak配列を、FVIIコード領域のすぐ上流に付加する。リバースプライマーBspeI-Fc-FVII-Rは、アミノ酸221~223EUナンバリングを含んでいるIgG1の定常領域Fc領域のフラグメントを付加する。このプロセスはまた、遺伝子コードの縮重性を用いてアミノ酸231~233にBspEI制限部位を組み込み、正確なアミノ酸配列EUナンバリングを保存する。50ulの反応を、15pmolの各々のプライマーおよびテンプレートpSYN-FVII-001を用い、PlatinumPfxDNAPolymeraseシステムを製造業者のプロトコールに従って、MJサーモサイクラー中で用いて、以下のサイクルを用いて行った:95°C2分間;30サイクルの95°C15秒間、49°C30秒間、68°C90秒間;68°C10分間。プラスミドpSYN-FIX-027pBUDFIXFc/Fcを、HindIIIおよびBspEIで消化して、ベクターについて予想される大きさのバンド約5800bpを、FIX挿入物予想される大きさのバンド約1480bpから離れて、GelExtractionキットQiagen,Valencia,Calif.を用いて精製した。次にPCR増幅したFVII配列を、FIX挿入物を除去した後、pSYN-FIX-027由来のベクターのHindIIIおよびEcoRI部位中にサブクローニングした。これによって、pSYN-FVII-002pBUDFVIIFc/Fcを生成した。次に、AGGGGS6xポリペプチドリンカーをFVIIとpSYN-FVII-002中のFc領域コード配列との間に以下のプライマーを用いて付加した:FVII-リンカー-F:CATCCCCAGCACGTACGTCCFVII-Linker-R:GGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFc-リンカー-F:GACAAAACTCACACATGCCCACCFc-リンカー-R:GCAGAATTCTCATTTACCCGGAG2つの12μlのPCR反応を、12pmolのFVII-リンカー-FおよびFVII-リンカー-R反応1またはFc-リンカー-FおよびFc-リンカー-R反応2のいずれかを用いて、ExpandHighFidelitySystemBoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.を用いて、製造業者の標準的なプロトコールによってMJサーモサイクラー中で行った。第一のおよび第二の反応を、1μgのpSYN-FVII-002をテンプレートとして用い、以下のサイクルを用いて行った:94°C、2分間;14サイクルの94°C、30秒間、55°C、30秒間、72°C、2分間;72°C、10分間。予想される大きさのバンド反応1については532bpおよび反応2については670bpを、GelExtractionキットQiagen,Valencia,Calif.を用いてゲル精製し、次いでPCR反応中で、25pmolのFVII-リンカー-FおよびFc-リンカー-Rと前のとおり組み合わせて、ただし増幅は30サイクルとした。予想される大きさのバンド1200bpを、GelExtractionキットQiagen,Valencia,Calif.で精製して、制限酵素KpnIおよびEcoRIで消化した。予想される大きさのバンド920bpは、前のとおりゲル精製して、pSYN-FVII-002のKpnI/EcoRI部位にクローニングして、pSYN-FVII-003pBUDFVIIFc/6xGGGGS/Fcを生成した。二本鎖のヘテロ二量体を発現するためのpSYN-FVII-024のクローニングプラスミドpSYN-FVII-024を、二本鎖のヘテロ二量体ここで、1つの鎖は、FVII軽鎖残基1-152続いてGGGGS6xリンカー続いてFc領域からなり、一方他方の鎖は、FVII重鎖残基153~406続いてGGGGS6xリンカー続いてFc領域を含むの発現のために生成した。このプラスミドを、ヘテロ二量体を、単一のポリペプチドここでFVII重鎖-リンカー-Fc鎖のC末端は、重鎖-リンカー-Fc鎖のN末端に接続されるとして発現するように、以下のポリペプチド配列によって設計する:RRRRS-GGGGS6x-RKRRKR、ここでRRRRSおよびRKRRKR配列は、プロタンパク質転換酵素的切断部位である。各々の切断部位での最後のArgの後のプロタンパク質転換酵素による細胞内切断は、ポリペプチドリンカーの除去を生じ得る。結果として、細胞は、2つの鎖のヘテロ二量体ここでFVII軽鎖-リンカー-Fc鎖は、C末端でRRRRS配列を有するが、このリンカーの残りおよびRKRRKR配列は、そうでなければ除去されたを発現する。pSYN-FVII-024およびいくつかの中間体プラスミドの構築には、以下のプライマーの使用を必要とした:HindIII-SalI-BpEI-Fc-FAGTCAAGCTTGTCGACTCCGGAACTCCTGGGCGGACCBamHI-リンカーPACE1-Fc-RCATCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGCTCCGGCGGCGCCGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGHindIII-Kozak-FVII-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGBspEI-Fc-リンカー-FVIILC-RGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGBamHI-2xlink-pace-HC-FCAGTCTGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGATCAAGGAAGAGGAGGAAGAGGATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCFc-EcoRI-RATGTCTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG第一の中間体プラスミドを生成するために、PCR反応は、25pmolのプライマーHindIII-SalI-BpEI-Fc-FおよびBamHI-リンカーPACE1-Fc-RおよびテンプレートpSYN-Fc-001を用いて、ExpandHighFidelitySystemBoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.を用い、製造業者の標準的なプロトコールによってMJサーモサイクラー中で行った。以下のサイクルを用いた:95°C2分間;30サイクルの95°C30秒間、58°C30秒間、および72°C1分間;72°C10分間。正確な大きさのバンド約730bpを上記のようにゲル精製して、pBUDCE4ベクターInvitrogen,Carlsbad,Calif.のHindIII/BamHI部位にクローニングして、pSYN-FVII-014を生成した。プライマーHindIII-SalI-BpEI-Fc-FおよびBamHI-リンカーPACE1-Fc-Rを用いるPCR増幅によって、Fc領域の一部アミノAX-Y続いてRRRRS配列およびGGGGS2xポリペプチドリンカーをコードするDNAフラグメントを生成した。プライマーHindIII-SalI-BpEI-Fc-Fは、この分子の5’末端でHindIIIおよびSalI制限部位を導入し、一方で、プライマーBamHI-リンカーPACE1-Fc-Rは、BamHIを、GGGGSリンカーの最後の2つの残基をコードするコドンと重複する3’末端に導入するコドンGGATCCを有する残基GS。次に、別のPCR反応を、上記のとおり、プライマーHindIII-Kozak-FVII-FおよびBspEI-Fc-リンカー-FVIILC-RおよびテンプレートpSYN-FVII-002を用い、pSYN-FVII-014のクローニングについて記載される同じ条件を用い、ただしアニーリング温度は57°Cで行った。予想される大きさのバンド約700bpは、ゲル精製して、pSYN-FVII-014のHindIIIおよびBspEI部位中にクローニングして、pSYN-FVII-023を生成した。プライマーHindIII-Kozak-FVII-FおよびBspEI-Fc-リンカー-FVIILC-Rは、FVII軽鎖、続いてGGGGS6xポリペプチドリンカーおよびFc領域の一部を最大アミノ酸232EUナンバリングまでをコードするDNAフラグメントを増幅した。プライマーHindIII-Kozak-FVII-Fは、この分子の5’末端にHindIII制限部位を続いてKozak配列を導入し、一方で、プライマーBspEI-Fc-リンカー-FVIILC-Rは、この分子の3’末端にBspeI部位を付加する。最終工程では、PCR反応は、上記のように、プライマーBamHI-2xリンクlink-ペースpace-HC-FおよびFc-EcoRI-RおよびテンプレートpSYN-FVII-003を用い、以下のサイクルを用いて行った:95°C2分間;30サイクルの95°C30秒間、55°C30秒間、および72°C2分間;72°C7分間。このPCR反応によって、GGGGS2xポリペプチドリンカー続いてRKRRKR配列続いてFVII重鎖をコードするDNA分子を生成した。プライマーBamHI-2xリンクlink-ペースpace-HC-FおよびFc-EcoRI-Rは、それぞれ、分子の5’末端および3’末端にBamHI部位およびEcoRI部位を導入する。予想される大きさのバンド約1600bpを、pSYN-FVII-023のBamHIおよびEcoRI部位にクローニングして、pSYN-FVII-024を生成した。中間体pSYN-FVII-073のクローニングサイレント変異体を、FVII-024の第一のFc部分に、PCRベースの部位指向性突然変異誘発方法によって導入して、位置412および413EUナンバリングのアミノ酸をコードするDNA領域でSalI部位を生成した。これによって、中間体構築物FVII-073を生成した。pSYN-FVII-057のクローニングpSYN-FVII-057のSalI~BsiWI部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-073のSalI/BsiWI部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-057を生成した。pSYN-FVII-058、pSYN-FVII-059、pSYN-FVII-060、pSYN-FVII-061およびpSYN-FVII-062のクローニングこれらの構築物を、pSYN-FVII-057SalI~BsiWIのDNA合成は外注して、pSYN-FVII-073の中にサブクローニングしたについて記載のとおりクローニングした。pSYN-FVII-066のクローニングSYN-FVII-066のSalI~RsrII部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-043のSalI/RsrII部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-066を生成した。pSYN-FVII-067のクローニングpSYN-FVII-067のSalI~EcoRI部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-041のSalI/EcoRI部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-067を生成した。pSYN-FVII-090のクローニングpSYN-FVII-090のBamHI~BsiWI部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、3ウェイライゲーションによってpSYN-FVII-061ここでは、外注したDNAを、BamHI/BsiWIおよびpSYN-FVII-061を用い、BamHI/BsiWI/NotIを用いて切断した中にサブクローニングして、pSYN-FVII-090を生成した。pSYN-FVII-100のクローニングFVIIの170ループの一部FVII成熟配列のアミノ酸311~322を、トリプシンの170ループアミノ酸EASYPGKで置き換えた。この変異を、標準的な重複PCR方法によって、pSYN-FVII-090をテンプレートとして、および骨格構造を用いて、導入してpSYN-FVII-100を生成した。pSYN-FVII-115のクローニング3ポイントの変異V158D、E296VおよびM298Q;成熟FVII配列ナンバリングを、pSYN-FVII-090のFVIIコード領域中に、PCRベースの部位指向性突然変異誘発によって導入して、pSYN-FVII-115を生成した。pSYN-FVII-118のクローニングpSYN-FVII-118のXbaI~BsiWI部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-011のXbaI/BsiWI部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-118を生成した。pSYN-FVII-119のクローニングpSYN-FVII-119のXbaI~BsiWI部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-011のXbaI/BsiWI部位中にサブクローニングして、pSYN-FVII-119を生成した。pSYN-FVII-127のクローニングトリプシンの170ループを含むDNAフラグメントを、PCRによって、pSYN-FVII-100をテンプレートとして用いて生成した。このPCR反応によって、それぞれ5’および3’でBsiWIおよびBspEI制限部位を生成した。このDNAフラグメントを、pSYN-FVII-118のBsiWI/BspEI部位中にサブクローニングして、pSYN-FVII-127を生成した。pSYN-FIX-042のクローニングpSYN-FIX-030米国特許第7566565に記載のHindIII/BspEIフラグメントを、pSYN-FVII-011のHindIII/BspEI部位にサブクローニングして、pSYN-FIX-042を生成した。pSYN-FIX-068のクローニングpSYN-FIX-030米国特許第7566565号に詳細に記載されるプラスミドのHindIII/BspEIフラグメントを、pSYN-FVII-066のHindIII/BspEI部位中にサブクローニングして、pSYN-FIX-068を生成する。pSYN-FIX-088のクローニングpSYN-FIX-067由来のBspEI-EcoRIフラグメントを、pSYN-FIX-053のBspEI-EcoRI部位にサブクローニングして、pSYN-FIX-088を生成する。pSYN-FIX-089のクローニングpSYN-FIX-048由来のBspEI-EcoRIフラグメントを、pSYN-FIX-053のBspEI-EcoRI部位にサブクローニングして、pSYN-FIX-089を生成する。pSYN-FIX-090のクローニングタンパク質のXbaI部位~C末端に由来するFIXコード領域、続いて6xGGGGGSリンカー、SCE5コード配列およびEcoRI部位を含むDNAフラグメントは、合成について外注し、pSYN-FIX-053のXbaI/EcoRI部位中にサブクローニングして、pSYN-FIX-090を生成した。SCE5配列は以下に示す:AQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFMFSRYAMSWVRQAPGKGPEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGATYTSRSDVPDQTSFDYWGQGTLVTVSSGSASAPKLEEGEFSEARVSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRNFYASWYQQKPGQAPTLVIYGLSKRPSGIPDRFSASSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCLLYYGGGQQGVFGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPSSAApSYN-FVII-094のクローニング6xGGGGSリンカーをコードする配列、続いてSCE5コード配列を含んでいるDNAフラグメントを、合成外注して、pSYN-FVII-011改変体FVIIコード領域のC末端でEcoRV部位を生成するように事前に改変されたのEcoRV/EcoRI部位にクローニングした。pSYN-FVII-088のクローニングpSYN-FVII-088のSalI~RsrII部位由来のヌクレオチドを含むDNA配列の合成は、外注した。このDNAを、pSYN-FVII-066のSalI/RsrII部位にサブクローニングして、pSYN-FVII-088を生成した。pSYN-FVII-125のクローニングDNAフラグメントは、AP3領域およびリンカーの一部を含んでいる、pSYN-FVII-088からPCR増幅した。このPCR反応によって、それぞれ、5’および3’でBamHIおよびEcoRI部位を生成した。このDNAフラグメントを、pSYN-FVII-011のBamHI/EcoRI部位中にサブクローニングしてpSYN-FVII-125を生成した。pSYN-FVIII-041のクローニングヒト組み換えB-ドメイン欠失FVIIIのコード配列を、FVIII特異的なプライマーを用いてヒト肝臓ポリARNAClontechから逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCRによって得た。このFVIII配列は、FVIIIの天然のシグナル配列を含む。B-ドメイン欠失は、セリン743S743;2287bpの後で開始して、グルタミン1638Q1638;4969bpの前で終わり、2682bpという総欠失であるSQバージョン。ヒト組み換えFcのコード配列は、Fc特異的なプライマーを用いてヒト白血球cDNAライブラリーClontechからRT-PCRによって得た。プライマーは、B-ドメイン欠失のFVIII配列が、介在するリンカーなしでFc配列のN末端に直接融合されるように、設計した。FVIIIFcのDNA配列を、哺乳動物の二重発現ベクターpBUDCE4.1Invitrogenの中に、CMVプロモーターの制御下でクローニングした。マウスIgkシグナル配列を含んでいる第二の同一のFc配列は、RT-PCRによって得て、発現ベクターpBUDCE4.1中で、第二のプロモーターEF1αの下流にクローニングした。この最終の構築物を、pSYN-FVIII-013と命名した。第二のプラスミドを、PCRおよび標準的な分子生物学的技術を用いて同様の構築物から創出し、rFVIIIBDD-Fc-FcrFVIIIBDDFcコード配列を、第二のFc配列に対してGGGGS4リンカーとともに融合したを発現して、rFVIIIBDD-Fcモノマー-二量体ハイブリッドのみの産生を、一過性トランスフェクションで可能にした。この構築物は、pSYN-FVIII-041と命名した。pSYN-FVIII-049のクローニング中間体pSYN-FVIII-048は、pBUD-CE4.1由来のNheI/XhoIフラグメントをpSYN-FVIII-013中にクローニングすることによって生成した。pSYN-FVIII-049のRsrII~XbaI部位由来の領域を含むDNAフラグメントの合成を、外注した。このフラグメントを、pSYN-FVIII-048のRsrII/XbaI部位中にサブクローニングして、pSYN-FVIII-049を生成した。pSYN-FVIII-108のクローニングpSYN-FVII-066由来のSalI/RsrIIフラグメントを、pSYN-FVIII-049中にサブクローニングして、pSYN-FVIII-108を生成したことが示された。実施例7活性化された構築物の発現での追加の試みいくつかの他の構築物を、活性化されたFVIIを発現するという目標で作製した。しかし、これらの構築物は、活性化された分子を首尾よく発現することはなかった。ウエスタンブロットによって、FVII重鎖は、異種のシグナルペプチドを重鎖のN末端に融合するという一般的方法を用いると遊離のN末端では発現できなかった。pSYN-FVII-010のクローニングFVII-010構築物とは、第VII因子の重鎖がscFc足場の状況で発現され、軽鎖が別々に発現された構築物である。プライマー対FVII-HC-Hind3-IggKss-F/FVII-HC-BspEI-Rを用い、pSYN-FVII-001上記を参照のことを用いてPCR増幅する。pSYN-FVII-008上記を参照のことのBspEI/HindIII部位におけるクローンで、pSYN-FVII-009を生成する。PCRでは、pSYN-FVII-003P0830を参照のこと由来のFVII軽鎖をプライマーFVII-LC-NotI-F/FVII-LC-XhoI-Rを用いて増幅して、pSYN-FVII-009中にクローニングし、pSYN-FVII-010を生成する。プライマーFVII-HC-BspEI-RAGGAGTTCCGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGFVII-HC-Hind3-IggKss-fACTGACAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCFVII-LC-NotI-FACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGFVII-LC-XhoI-RACTGACCTCGAGTTATCGGCCTTGGGGTTTGCTGGpSYN-FVII-013のクローニングFVII-013構築物とは、軽鎖がscFc足場の状況で発現され、重鎖が別々に発現された構築物である。pSYN-FVII-001P0830を参照のこと由来のプライマー対FVII-LC-リンカー-BamHI-R/HindIII-Kozak-FVII-Fandを用いてPCR増幅して、pSYN-FVII-011のBamHI/HindIII部位にクローニングして、pSYN-FVII-012を生成する。プライマー対FVII-HC-NotI-F/FVII-HC-XhoI-Rを用いてpSYN-FVII-009由来のFVII-HCをPCR増幅して、pSYN-FVII-012中にサブクローニングしてpSYN-FVII-013を生成する。プライマーFVII-LC-6xリンカー-BamHI-RACTGACGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCTGATCCACCCCCACCTGATCCGCCGCCACCGGACCCACCTCCGCCGGAGCCACCGCCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCHindIII-Kozak-FVII-FCGACAAGCTTGCCGCCACCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGFVII-HC-NotI-FACTGACGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGACFVII-HC-XhoI-RACTGACCTCGAGTTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGpSYN-FVII-018のクローニングFVII-018構築物のために、FVIIの重鎖をFc融合タンパク質として発現して、FVIIの軽鎖を、別々のFc融合タンパク質として別々に発現した。プライマーFVII-HC-Hind3-IggKss-F/scFc-EcoRI-Rを用いて、HCFVII-リンカー-Fcを、pSYN-FVII-010をテンプレートとして用いてPCR増幅した。pBUDCE4のHindIII/EcoRI部位中にサブクローニングする。これによってpSYN-FVII-017を作製する。次に、pSYN-FVII-013から、プライマーsFVII-LC-NotI-F/FC-XHOI-Rを用いてPCR増幅して、FVII-017のXhoI/NotI部位中にサブクローニングする。これによってPSYN-FVII-018を作製する。プライマーscFc-EcoRI-RACTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGFc-XhoI-RAGCTCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGG実施例8活性化可能な構築物の発現の試みFVII-039、-040のクローニングDFTR第XIa因子切断部位の場合は、適切な切断部位を用いて、第VII因子が凝固の部位で、インビボで活性化され得るいくつかの構築物を、構築物を生成する試みで作製した。039構築物は、scFc足場の状況で作製した。この構築物は、FVII軽鎖、FXIa切断部位、およびI153V変異体を有するrFVII重鎖を、第一のFc部分のN末端に結合された直鎖状配列に含んだ。040構築物はまた、scFc足場の状況でも作製した。この構築物は、R152欠失を有するFVII軽鎖、XIa切断部位、およびI153V変異体を有するFVII重鎖を、第一のFc部分のN末端に連結された直鎖状配列中に含んだ。DFTR切断配列は、FIXに見出される天然のFXIa配列である。FIXでは、DFTR配列にはバリンが続き、そのためI152V変異体を、pSYN-FVII-039、-040に導入してFXIa切断有効性を増大した。DNA分子Genscript-FVII-039および-040の合成は、外注したGenscript。Genscript-FVII-039および-040由来のXbaI/BsiWIフラグメントを、pSYN-FVII-011のXbaI/BsiWI部位にサブクローニングして、それぞれpSYN-FVII-039および-040を生成した。実施例9構築物の一過性トランスフェクション構築物の発現のために、HEK-293-F細胞を、ビタミンK3FVIIおよびFIXトランスフェクションのみのためSigmaAldrich,St.Louis,MOを補充したFreestyle培地Invitrogen中の懸濁物中で2μg/リットル増殖培地まで、懸濁細胞として37°C/10CO2で増殖させた。細胞は、3日ごとに4日まで、5×105細胞/mlの細胞密度で播種することによって継代培養した。トランスフェクションの24時間前、細胞を、LONG商標R3IGF-1SigmaAldrich,St.Louis,MOを補充した増殖培地中で、20μg/リットルトランスフェクション培地に7×105細胞/mlで播種した。トランスフェクションの日、トランスフェクション溶液を、トランスフェクトされるべき細胞培養物の総容積の5に等しい溶液で作製した。トランスフェクション溶液中で、DNAを、トランスフェクション培地中のPEI60mg/Lの新鮮に作製された溶液に添加した最終濃度20mg/L。この溶液を、30秒間旋回させて、室温で5分間インキュベートした後に細胞培養物に直接添加した。4時間後、ビタミンK3、LONG商標R3IGF-1および200mMのL-グルタミンを補充したOptiCHOInvitrogenの細胞培養容積に等しい容積を、細胞に添加した。その細胞培養物を、上記で示されたように増殖させて、毎日の培地のサンプルを採取して、タンパク質発現を評価した。回収の日に、細胞をスピンダウンして、培地をタンパク質生成、またはプロテインAプルダウン/ウエスタンブロットによるタンパク質分析のために調製物中に濾過した。実施例10FVIIFc分子FVII-028およびFVII-053を除くおよびFIXFc分子のタンパク質精製FVIIFc分子は、以下のカラム:1シュード-アフィニティー溶出による陰イオン交換クロマトグラフィー例えば、Qセファロース4FFGEHealthcare続いて、最も活性な種を選択的に溶出する種々のレベルのCaCl2での溶出、続いて2shFcRn可溶性ヒトFcRnアフィニティーセファロース4FFビーズとのNHS-カップリングshFcRnクロマトグラフィー、を用いて馴化培地から精製して、Fc-含有タンパク質を低いpH例えば、pH6.2で結合し、中性のpH例えば、pH8.0を溶出する。いくつかの場合には、NaCl溶出による陰イオン交換クロマトグラフィーを利用している追加の工程を含んだ。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、SEC分析およびSDS-PAGEによって95を超える純度の精製タンパク質を生成した。FIXFcタンパク質は、米国特許第7,566,565号に以前に記載されるとおりに精製した。実施例11FVII-028およびFVII-053のタンパク質精製FVII-028および-053を、以下のカラムを用いて馴化培地から精製した:1疎水性相互作用クロマトグラフィー例えば、PhenylFFhighsubGEHealthcare、続いて2塩溶液を用いる陰イオン/陽イオン交換クロマトグラフィー。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、SEC分析およびSDS-PAGEによって95を超える純度の精製タンパク質を生成した。実施例12FIX-090のタンパク質精製FIX-090を、2-工程のクロマトグラフィープロセス、最初は、抗GLAドメイン抗体によるイムノアフィニティークロマトグラフィー、つづいて上記のFIXFcタンパク質と同様のシュードアフィニティー溶出を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを通じて精製した。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、SEC分析およびSDS-PAGEによって95を超える純度の精製タンパク質を生成した。実施例13FVIIIFcタンパク質の精製FVIIIFcタンパク質を、FVIII特異的アフィニティー精製工程McCue2009続いて陰イオン交換と標準NaCl溶出との組み合わせおよび/またはshFcRn可溶性ヒトFcRnアフィニティーセファロース4FFビーズとのNHSカップリングshFcRnクロマトグラフィーを含む、2または3つのカラム精製プロセスを用いて、浄化されかつ化学的に定義された回収培地から精製して、Fc-含有タンパク質を低pH例えば、pH6.2で結合して、中性のpH例えば、pH8.0で溶出する。これらの精製工程は、当業者に公知の標準的な方法を利用して、SEC分析およびSDS-PAGEによって95を超える純度の精製タンパク質を生成した。実施例14FVII構築物の活性化FVIIFcを含んでいるFcRnカラムから溶出した画分を、プールして、総タンパク質を、4mg/mlまで濃縮した。CaCl2濃度を、5mMまで上げて、そのサンプルを、4°Cで24~48時間、少なくとも80のFVIIFcが活性化されるまでインキュベートした。活性化の程度は、SDSPAGEによって評価した図10。実施例15FVIIa活性アッセイ、可溶性組織因子方法FVIIaFc改変体の不活性を、可溶性組織因子方法によって決定した。脂質化された全長組織因子とは異なり、可溶性組織因子組織因子の細胞外部分は、FVIIをFVIIaに活性化できないが、これは、FVIIaによる第X因子の第Xa因子への変換の活性化因子として機能する。FVIIaFc改変体の比活性を決定するために、ASTACLOT登録商標FVII-rTFキットDiagnosticaStago,Asnieres、Franceを、以下の製造業者の推奨に従って用いた。表1は、データをまとめており、全ての改変体について匹敵する比活性を示す。実施例18FVIIaFcおよび血小板の結合を研究するためのFACアッセイ本実施例では、以下の試薬および方法を用いた:試薬ADP:SigmaAldrich,カタログ番号A2754,ストック1mM、作業濃度10uMSFLLRNペプチド:社内合成、ストック濃度5mg/ml6.7mM、作業濃度50ug/ml67uMFVII抗体-FITC-標識:AffinityBiologicalsSAFVII-APFTC血小板緩衝液:15mMのHEPES、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、1mMのMgCl2、5mMのCaCl2、5.5mMのデキストロースおよびmg/mlのBSA、pH7.4方法●血小板をカウントする●20ulの約2~4×108細胞/mlのゲル精製血小板を1mlの血小板緩衝液に添加する。●各々のサンプルについて100ulのアリコートを作製する●必要に応じてアゴニストおよびFVIIFcを所望の濃度まで添加して、37°Cで15分間インキュベートする●等容積のHBS/5mMのCaCl2/1.5ホルムアミドを添加して、20分間、RTでインキュベートする●3000gで15分間スピンする●HBS/5mMのCaCl2/1mg/1mlのBSA中で洗浄し、再度スピンして、100ulの血小板緩衝液中に再懸濁した。●2.5ulのFVII抗体-FITC標識を添加し、30分間室温でインキュベートする。●FACで分析する実施例17トロンビン生成アッセイ本実施例では、以下の試薬および方法を用いた:試薬FV:HTI,カタログ番号HCV-0100,ロット番号Z0413、5.1mg/mlプロトロンビン:HTI,カタログ番号HCP-0010,ロット番号Z0128,4.8mg/mlFX:HTI,カタログ番号HCX-0050,ロット番号X0401,5.4mg/mlATIII:HTI,カタログ番号HCATIII-0120,ロット番号Y0401,8.2mg/mlTFPI:AmericanDiagnostica,カタログ番号4900PC,ロット番号081031,100ug/mlリーダー:Fluorskan,ThermoElectronFluorometerトロンビン標準物質:トロンビンスコープThrombinoscope,カタログ番号TS20.00フルカFluca:トロンビンスコープThrombinoscope,カタログ番号TS50.00血小板緩衝液:15mMのHepespH7.4、138mMのNaCl、2.7mMのKCl、1mMのMgCl2,5.5mMのデキストロース,1mg/mlのBSAを補充使用前にADP:SigmaAldrich,カタログ番号A2754,ストック1mM,作業濃度10uMSFLLRNペプチド:社内合成、ストック濃度5mg/ml6.7mM、作業濃度50ug/ml67uM方法-製造業者の推奨に従ってソフトウェアを設定する。-水およびFluca緩衝液を事前に温める。-凝固因子ミックス混合物を作製する。FV、FII、FX,ATIIIおよびTFPIのストック濃縮物を希釈して、作業溶液を作製する。5ul/ウェルが必要であり、そのため30ウェルのアッセイのために、単一のバルク溶液中に全ての凝固因子溶液の180μlの各々のミックスを調製する。-FVIIaFc希釈物を予備調製する。1200nMの溶液12ulを88ulの緩衝液中にを100ul中に作製して、4倍25ulを75ulの緩衝液にに希釈して、200nMおよび62.5nMの溶液を得る。-標準物質溶液を作製する1mlの温水を標準物質バイアルに-20ulの緩衝液または標準物質をウェルに添加する-25ulの凝固因子ミックスをウェルに添加するまたは25ulの緩衝液を標準物質ウェルに-20ulのFVIIaFcウェルに添加するまたは緩衝液を標準物質ウェルに-35ulの血小板を添加する事前にADPおよびSFLLRNを添加する。血小板を標準物質ウェルに添加する。-装置にプレートを置き、Fluca緩衝液を調製し、プレートを装置に置いた5分後、反応を開始する20ulFluca/ウェルを添加する。実施例18一過性トランスフェクションから生成されるタンパク質の分析一過性トランスフェクションからのタンパク質の分析のために、pSYN-FVII-010、011、-013、-018、-003、-019-020および-024のトランスフェクション由来の馴化培地を、プロテインA免疫沈降に供した。要するに、細胞培養上清を、ほぼ50ulのプロテインA-セファロース50スラリーと混合して、4°Cで1時間振盪しながらインキュベートし、次いで遠心分離してプロテインAビーズをペレットにした。ビーズを、1mlのPBS中に再懸濁することによって2回洗浄し、スピンして、吸引する。そのビーズを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEで、減圧条件または非還元条件下で再懸濁して、100°Cで5分間加熱し、スピンダウンして、SDS-PAGEゲル上にロードして、標準的なプロトコールに従って泳動した。ゲルを、ニトロセルロース膜に移して、ウエスタンブロットを行い、Fc領域またはFVII軽鎖を検出した。Fc検出のために、用いた抗体は、ヤギ抗ヒトIgGFc特定の-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体PierceImmunoPure抗体,カタログ番号31413であった。FVII軽鎖検出のために、抗軽鎖モノクローナル抗体を用いたGreenMountain,clone6MA-219。この抗体を、5の脱脂粉乳を含むPBSTPBSに加えて0.1のTween-20中で、1:15,000Fc検出のためまたは1:200軽鎖検出のために希釈し、膜とともに室温で1時間インキュベートした。次いで、膜をPBST中で3回10分間洗浄し、シグナルをFc検出のための化学発光法によって検出した。FVII軽鎖検出のためには、膜をさらに、PBST中で1:5000希釈した、HRP-標識ヤギ抗-マウス抗体SouthernBiotech,1010-05を含有する溶液中で1時間インキュベートした。この膜をまた、PBST中で3回10分間洗浄して、シグナルを、化学発光法によって検出した。化学発光検出は、ECLPlusWesternBlottingDetectionSystemAmershamBiosciencesカタログ番号RPN2132を用いて、製造業者のプロトコールに従って行った。シグナルは、Storm840PhosphorimagerMolecularDevicesで可視化した。FVII-024リンカー中のプロタンパク質転換酵素的切断部位のプロセシングに対するPC5の効果を、図26に示すように試験した。非還元条件下では、切断部位プロセシングに対するPC5の効果は、検出できない。なぜなら、FVII軽鎖-FcおよびFVII重鎖-Fcサブユニットは、Fc領域中で2つのジスルフィド結合を介して連結されたままであるからであるレーン2および3。還元条件下で、本発明者らは、PC5と同時トランスフェクトされてない細胞から生成されたFVII-024の部分的プロセシングレーン4、ただし細胞がPC5で同時トランスフェクトされた場合は、完全プロセシングレーン5を観察した。このリンカーの完全プロセシングによって、活性化されたFVIIFVIIaの分泌が生じる。なぜなら、重鎖の遊離のN末端が必要であり、タンパク質を活性化するのに十分であるからである。実施例19FXIaによるFVII-039およびFVII-040の切断FXIaによる活性化FVII-039およびFVII-040これらのタンパク質におけるFVII軽鎖のすぐ上流に挿入されたFXIa切断部位の結果としてをインビトロで特徴づけた。50mMのTris-HCl、100mMのNaCl、10mMのCaCl2、pH7.4中に15nMのFXIaを含有する、FVII-039、FVII-040またはFVII-011不活性化されたの1.5μM溶液を、5分または20分間インキュベートして、FVIIFcの切断を、還元条件下でSDSPAGEによって、続いてSYPRORuby染色Invitrogenによって決定した。FXIaは、図28に示されるように、FVII-039、FVII-040および不活性化されたFVII-011を切断できなかった。実施例20別の活性化可能なFVIIFc構築物FXIaがFVII-039およびFVII-040を切断できないことは、立体障害によって切断部位に対してプロテアーゼが接近できないことで生じた場合がある。FXIaまたはトロンビン切断部位の接近性を改善するためには、この部位は、重鎖に軽鎖が先行しない構造では重鎖の上流に位置する軽鎖-リンカー-Fc-scFcリンカー-FXIa/トロンビン切断部位-重鎖-リンカー-Fc。いくつかの実施形態では、重鎖は、I152V変異体を含む、一旦、最高の切断部位が決定されれば、cscFcが導入され、その結果細胞は、以下の構造を有するヘテロ二量体タンパク質を分泌する:軽鎖-リンカー-Fc第二の鎖に結合されるジスルフィドである:FXIa/トロンビン切断部位-重鎖-リンカーFc。図28に示される構築物で観察される活性化のレベルを改善するために、図31で図示される活性化可能な改変体の第二の生成図6Eに示されるものと構造が同様を用いて、切断部位の接近可能性を増大した。この例では、FXIaおよびトロンビン切断部位をこれらの構築物のために用いた図31を参照のこと。構築物は、前に記載のように一過性にトランスフェクトされた。FVIIFcは、プロテインAを用いて培地から捕獲した。ビーズに結合したFVIIFcを、緩衝液中に入れ、FXIaまたはトロンビンを添加して、インキュベートした。FVIIFcを、ビーズからSDSPAGEローディング緩衝液を用いて100°Cで5分間溶出した。そのゲルを、ロードして、ウエスタンブロットを行い、前に記載のようにFcを検出し、その結果を図32に示す。図32に示されるとおり、トロンビンおよび第XIa因子切断部位の両方とも、切断されて、適切な酵素の存在下でFVII重鎖および軽鎖分子を生じ得る。最高の切断が、構築物FVII-060およびFVII-061について観察されたが、トロンビンの存在下で、負のコントロールFVII-062については、切断は観察されなかった。実施例21第VII因子活性化可能な構築物図33に示される構築物は、FVII-090、FVII-089およびFVII-062であって、以前に記載のとおり、クローニングされ、発現され、精製されたこれらのタンパク質は、活性化の必要がない。クローニングのエラーに起因してVVGGA配列を、FVII-060およびFVII-061のALRPRトロンビン切断配列の後ろに挿入したが、一方でこの挿入は、活性に影響すると予想されるが、SDS-PAGEベースのアッセイにおいてトロンビンによる切断の評価に影響するとは予測されない。この配列を、FVII-089およびFVII-090中で除去した。125nMのFVII-090、FVII-089、FVII-062、または血漿由来FVIIFVIIに、漸増濃度のトロンビンを添加して、10分間37°Cでインキュベートした。この混合物を、SDS-PAGEゲル上で泳動して、トロンビンによる切断を決定した図33。FVII軽鎖-FcおよびFVII重鎖-Fcの生成は、トロンビンとのインキュベーション後にFVII-089およびFVII-090について観察された。血漿由来FVIIまたはFVII-062陰性コントロールのトロンビンによる切断がなかったという事実によって特異性が示される。FVII-089およびFVII-090について切断有効性の有意な相違は観察されなかった。トロンビン生成アッセイを用いて、活性化可能な改変体FVII-090の活性を測定した。FVIII欠損の血小板豊富な血漿におけるトロンビン生成アッセイは、前に記載のとおり行い、ただし凝固因子および血小板は、FVIII欠損の血小板豊富な血漿で置き換えている。図34に示される結果は、トロンビン生成が、50nMのFVIIFcで活性化されたアッセイからである。図34に示すとおり、トロンビンは、50nMのFVIIaFcによって生成する。200nMFVII-090陰性コントロールFVII-062ではないを50nMのFVIIFcに添加することによって、トロンビン生成の有意な増大が生じ、このことは、FVI-090が、FVIIFcによって生成されるトロンビンによって活性化されることを示唆する。なんらFVIIFc活性化のないFVII-090は、活性化の存在しないFVII-062に対してトロンビン生成の増大を示す。これは、組織因子または接触経路活性化の残留レベルによって生成される少量のトロンビンからのFVII-090の活性化によって生じ得る。実施例22高い比活性の第VII因子活性化可能構築物高い比活性のバージョンの第VII因子、FVII-100を作製するために、FVII-090由来のFVII成熟配列のアミノ酸311~322LQQSRKVGDSPN,170-ループに相当するを、トリプシンの170-ループ由来のアミノ酸EASYPGKで置き換えた。この置換は、高い比活性を付与することが示された。さらなる高い比活性のバージョンの第VII因子、FVII-115を構築した。このバージョンでは、170ループは野性型であるが、FVIIの重鎖には3つのポイントミューテーション、V158D、E296VおよびM298Qがある。FVII-100およびFVII-115を、図41に図示する。可溶性組織因子アッセイでは、FVII-011野性型FVIIaFcの比活性は、10,000IU/mgである。FVII-090は、0.32IU/mgという比活性を、FVII-100は、0.25IU/mgという比活性、およびFVII-115は、14IU/mgという比活性を有する。従って、各々の活性化可能な形態適切な酵素による活性化の前は、このアッセイでは本質的に不活性である。活性化されたFVIIの状況では、このような高い比活性の改変体は、より有効であるという可能性を有するが、またアンチトロンビンのようなタンパク質による阻害をさらに受けやすい可能性もある。この阻害は、FVIIaが活性であることに依存し;従って、活性化可能な高い比活性の改変体不活性タンパク質として投与されるは、アンチトロンビン阻害に対してより耐性でなければならないが、損傷部位で一旦活性化されれば、高い比活性を有する可能性がある。トロンビンによる、精製されたFVII-090およびFVII-100および115高い比活性の改変体の切断は、前に記載のとおり試験した。結果を図35に示す。SDSPAGE分析では、3つのタンパク質が、トロンビンによって、匹敵する効率で切断されたことが示された。FVII-100について、FVII重鎖-Fcおよび軽鎖Fcは、1バンド中で崩壊する。なぜなら、グリコシル化部位は、トリプシン170ループの挿入後に重鎖から除去され、FVIIHC-Fcバンドの質量を減らし、従ってこれは、ゲル上でより高速に移動し、FVIILC-Fcバンドと共遊走するからである。トロンビン生成アッセイを用いて、活性化可能な改変体FVII-090および高い比活性の改変体FVII-100の活性を測定した。前に本明細書で記載したとおり、トロンビン生成は、ヒト血小板、第X因子、第V因子、プロトロンビン、アンチトロンビンおよび組織因子経路インヒビターを用いて、再構成した系で試験した。活性は、5nMトロンビン活性化の有無で測定した。図36に示すとおり、FVII-090の活性は、トロンビンの存在下で増強され、このことは、トロンビンによるFVII-090の活性化を示唆する。しかし、活性は、トロンビン活性化で高い比活性の改変体FVII-100の状況で有意に増大される。トロンビンの非存在下におけるrFVII-100について長い開始時間の高い活性によって、組織因子の残留レベル、トロンビンまたは接触経路活性化は、トロンビンを外因性に付加することなくFVII-100を活性化するのに十分なトロンビンを生成し得る。図37は、他の高い比活性の改変体、FVII-115に関して同様の結果が得られたことを示す。実施例23種々のアッセイを用いる活性化可能な改変体の活性の確認本実施例では、色素生産性アッセイを用いて、FVII活性を測定した。用いたアッセイの1つは、FVIIaによって色素生産性基質の切断を測定することによってFVIIaFcのアミド分解活性を測定する。これらのうち別のアッセイは、FVIIaがFXを活性化する能力を測定することによってFX活性化の活性を測定するが、これは活性化されるFXFXaによって切断される色素生産性基質のレベルを測定することによって決定される。アミド分解アッセイにおいて、色素生産性基質Chromozymet-PAを用いた。FVIIaは、この基質を用量依存性の方式で切断する。この基質はまた、トロンビンによって切断されるが、このトロンビンによる切断は、ヒルジンによって阻害され得るデータ示さず。図38に示されるとおり、活性化可能な改変体のアミド分解活性は、トロンビン活性化後に測定し得、FVII-090に比較して高い比活性の改変体について大きいアミド分解活性がある。これらのアッセイでは、トロンビンによる活性化可能な分子の活性化後、ヒルジンを添加して、色素生産性基質のトロンビン切断を阻害する。この方式では、トロンビンは、FVIIa活性を検出する能力を妨害しない。FVIIaによるFXの活性化はまた、高い比活性のFVII活性化可能な改変体でも増強される。FVIIaによるFXの活性を測定するために、基質S2765を用いた。この色素生産性基質はまた、FXによっても認識される。このアッセイでは、10uMのFXを、FVIIaFcとともに15分間インキュベートして、反応をEDTAでクエンチした。図39は、FVIIaFcによるFX活性化が検出され得ることを示すコントロール実験の結果を示す。図40に示される実験によって、高い比活性の活性化可能な改変体FVII-100についてのFX活性化活性の増大があることが示される。この実験では、FVIIFc100nMをトロンビン100nMで20分間、37°Cで活性化した。ヒルジンを添加してトロンビンを阻害した。FX10uMを添加して、15分間37°Cでインキュベートし、続いてEDTAによって反応を阻害した。S2765基質を添加して、FXa生成を、基質切断をモニタリングすることによって検出した。実施例24単量体Fc分子はまた、活性化可能な形態で合成され得る。3つの単量体の構築物を、図41に示されるように作製した。FVII-118では、ALRPR切断部位を、軽鎖と重鎖との間に挿入した。FVII-119では、配列GGGGS-ALRPRを、軽鎖と重鎖との間に挿入した。FVII-127については、構築物を、FVII-118のように、ただし、FVII-100で用いられる同じ高い比活性の変異体を用いて作製した。これらの構築物の不活性化精製型の比活性を、可溶性の組織因子アッセイで試験して、FVII-01110,000IU/mgという活性を有した野性型FVIIaFcと比較した。FVII-118は、4.5IU/mgという活性を有し、FVII-127は、1.8IU/mgという活性を有し、これによって、これらの分子が、それらの活性化可能な形態で本質的に活性がなかったことが示された。FVII-118、FVII-119およびFVII-090のトロンビン切断反応、続いてSDSPAGE分析を、以前に記載のとおり行った。図42で示されるように、活性化可能な構築物中の切断部位は、モノマーおよびヘテロ二量体Fc分子の両方の状況で切断可能であり得る。この図では、トロンビン濃度が増大している不活性化されたFVIIFcバンドの強度の低下は、FVII-118、FVII-119、およびFVII-090構築物について同様である。別の活性化可能な単量体の構築物、FVII-127を作製して、試験した。FVII-127は、FVII-118の骨格を有し、ただし、高い比活性を付与するためにFVII-100において用いたのと同じ170ループ置換を有する。図43に示すとおり、FVII-127の活性は、高い比活性のアミノ酸置換を欠いているFVII-118と比較して有意に増大される。トロンビンの非存在下におけるFVII-127について長い開始時間の高い活性によって、組織因子の残留レベル、トロンビンまたは接触経路活性化は、トロンビンを外因性に付加することなくFVII-127を活性化するのに十分なトロンビンを生成し得ることが示唆される。FVII-127活性は、トロンビンによって加速される。実施例25活性型のGPIIbIIIaに対して標的されたFVIIaFc改変体本実施例では、図44Aに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングして、一過性に発現して、精製して、活性化した。FVII-066を、PC5を用いて同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたcscFcリンカーを完全にプロセシングして、第一のFc部分を血小板標的部分に接続した。これらの構築物は、標的部分SCE5GPIIbIIIaの活性な高次構造に対するscFvを使用した。SCE5は、マウスおよびヒトのレセプターと交差反応することが示された。SCE5標的部分を、FVIIFcの第二のFc部分のN末端FVII-066またはC末端FVII-067で置き換えた。さらに、SCE5を、FVIIaFVII-094のC末端で置き換えた。FVIIaFcFVII-011およびNovosevenを、コントロールとして用いた。図44Bに示されるとおり、これらのタンパク質を、以前に記載のとおりFVIII欠損のヒト血漿においてトロンビン生成アッセイによって試験した。これらの実験によって、コントロールに対してSCE5標的部分を含んでいる全てのタンパク質についてトロンビン生成の速度の増大が明らかになった。最高速度のトロンビン生成が、FVII-066で、続いてFVII-094およびFVII-067で観察され、このことでSCE5標的部分の配置は、タンパク質の活性に対して有意な影響を有し得ることが示唆された。活性化されたヒト血小板に対するこれらのタンパク質の結合は、前に記載のとおりFACSアッセイで測定した図44C。SCE5標的部分を含んでいる全てのFVIIaタンパク質は、FVIIaFcコントロールに対する血小板の結合の増大を示した。これによって、FVIIaに対するSCE5標的部分の結合は、血小板からその親和性を増大し得ることが示される。SCE5標的部分は、マウスGPIIbIIIaレセプターとの相互作用を示したので、FVII-066を、トロンビン生成アッセイで、マウスFVIII欠損の血小板豊富な血漿を用いて、ならびに再構成システムでは、ヒトの精製された成分および血小板を、以前に記載のとおり用いて試験した。図29。本発明者らは、両方のシステムにおいてコントロールに対してFVII-066についてトロンビン生成の速度の増大を観察した。実施例26活性型のGPIIbIIIaに対して標的化された追加のFVIIaFc改変体本実施例では、図12Aに図示される構築物FVII-027をクローニングし、発現しPC5を用いて同時トランスフェクションして、タンパク質配列が記載されたcscFcリンカーを完全にプロスセシングして、第一のFc部分を血小板標的部分に接続する、精製して、活性化した以前に記載のとおり。この構築物は、標的部分MB9GPIIbIIIaの活性な高次構造に結合することが示されたscFvを使用する。FACSアッセイは、以前に記載のとおり行って、活性化された血小板に対する結合を評価し、FVII-027が、FVII-011コントロールよりも高い親和性を有する活性化された血小板に対して結合することが示された図12B。トロンビン生成アッセイを、再構成された精製されたヒトタンパク質および血小板を用いて、以前に記載のとおり行った図13A、13Bおよび13C。FVII-027は、コントロールに対してトロンビン生成の速度の増大を示した。図13Dでは、トロンビン生成アッセイに基づいて、FVII-027は、FVII-011またはNovosevenよりも4倍大きい活性を有することが図示される。図14では、FVII-027の血小板結合およびトロンビン生成活性の増強が、PAC1GPIIbIIIaの活性化型に対する結合についてMB9と競合する抗体によって廃されることを図示しており、このことは、この効果がMB9と活性化型のGPIIbIIIaとの相互作用によって媒介されることを示している。MB9標的部分はまた、図15に図示されるFVII-037を生成するためにFVIIFcの第二のFc部分のC末端に配置された。血小板を用いるFVIII欠損の再構成された系でのトロンビン生成アッセイによって、Novosevenコントロールに対してFVII-037についてトロンビン生成の速度増大が明らかになった図16。実施例27活性化された血小板および不活性化された血小板の両方に対して標的化された第VII因子構築物本実施例では、図45Aに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングし、発現し、精製して、活性化した。FVII-088を、PC5と同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたcscFcリンカーを完全にプロセシングして、第一のFc部分を血小板標的部分に接続した。FVII-088およびFVII-125は、AP3標的部分ヒトGPIIbIIIaに活性なおよび不活性な高次構造の両方に結合するscFvを使用した。図45Bの結果によって、FVIII欠損の血小板豊富な血漿におけるトロンビン生成アッセイが示され、そしてFVII-088およびFVII-125の両方とも、コントロールに対してトロンビン生成の速度増大を示し、このことは、GPIIbIIIaの活性なおよび不活性な高次構造に対するFVIIaFcまたはFVIIaの標的が、活性の増大を生じることを示している。活性化されたヒト血小板に対するFVII-088およびFVIIaFcの結合を、FACS図45Cによって試験した。これらのデータによって、FVII-088が血小板に対して、FVIIFcFVII-011よりも高い親和性で結合することが明らかになり、これによって、AP3標的部分が、血小板についてFVIIaFcの親和性を増大し得ることが示される。RotationThromboelastometryROTEM登録商標、PentapharmGmbH,Munich,Germanyは、血小板-標的化FVIIa構築物を評価するための別の方法である。なぜなら、これによって全血中での血小板の存在下でのいくつかの凝固パラメーターの特徴付けが可能になるからである。FVII-088および野性型組み換えFVIIaFcrFVIIaFcが強固でかつ安定な凝固を形成する能力を、ROTEMによって、塩化カルシウムを活性化因子NATEMとして用いて、製造業者の推奨に従って評価した。ヒトドナー由来の血小板A血液を、FVIIFcを用いて100、30または10nMという最終濃度までスパイクした。NATEM反応は、CaCl2の添加によって開始した。凝固パラメーター、例としては、凝固時間凝血開始時間に関する、血栓形成時間凝血速度に関するおよびアルファ角凝血速度に関するを、図30に示すとおり評価した。FVII-088は、FVII-088の凝固反応速度の増強と一致して、凝固時間および血栓形成時間の有意な低下、ならびに野性型rFVIIFcに対するアルファ角の増大を示した。これらのデータによって、FVII-088は、トロンビン生成アッセイと一致して野性型FVIIFcに対して活性の増強があることが示される。実施例28血小板に対してFVIIaを標的するためのペプチドの使用図46Aに図示される構築物を、以前に記載のとおり、クローニングし、発現し、精製して、活性化した。これらのタンパク質を、血小板レセプターGPIb-α活性化されたおよび不活性化された血小板で見出されるに結合するペプチド、特異的にはPS4、OS1、およびOS2を血小板標的化部分として用いて作製した。これらの分子の作製おいて、ペプチドを、この構築物の第二のFc部分のN末端またはC末端のいずれかに結合した。FVII-044構築物は、この構築物の第二のFc部分のC末端に結合されたPS4ペプチドを使用し;FVII-045は、この構築物の第二のFc部分のC末端に結合されたOS1ペプチドを使用し;そしてFVII-046構築物は、この構築物の第二のFc部分のC末端に結合されたOS2分子を使用した。対照的に、FVII-047構築物は、この構築物の第二のFc部分のN末端に結合されたPS4ペプチドを使用し;FVII-048分子は、この構築物の第二のFc部分のN末端に結合されたOS1ペプチドを使用し;そしてFVII-049分子は、この構築物の第二のFc部分のN末端に結合されたOS2ペプチドを使用した。トロンビン生成アッセイは、以前に記載のとおりFVIII欠損の血小板豊富な血漿を用いて行った。図46Bに示すとおり、このアッセイを、限界濃度のFVIIaで行った場合、FVII-044、FVII-045、およびFVII-046のC-末端融合構築物の各々が、Novosevenコントロールに比較して増強されたトロンビン生成を示した。同様の結果を、N末端融合構築物について図47Aに示す。図47Bでは、FVII-045構築物が、このアッセイにおいてFVII-048構築物よりもわずかに優れている場合があること、ただし、やはりN末端およびC末端融合の両方ともNovosevenコントロールよりも優れていることが示される。さらに、各々のペプチドについて公開されたGPIb-α親和性図48とFVIIFcに対して組み換え的に融合された場合そのペプチドと関連する活性の増大との間に相関がある。図48は、FACSで決定した、活性化血小板に対するFVII-049、FVII-048および野性型FVIIFcFVII-011コントロールの結合、ならびにBernardら、Biochemistry2008.47:4674-4682に報告される標的ポリペプチドについての親和性を示す。FACSデータによって、FVII-011コントロールに対する血小板についてのFVII-045およびFVII-048の活性の増大が明らかになった。実施例29活性型のGPIIbIIIaに対して標的されるAnFVIIIFc改変体図49Aに図示される構築物は、以前に記載のとおり作製された。FVIII-041は、野性型FVIIIFcであるが、FVIII-108は、第二のFc部分のN末端でSCE5血小板標的化部分を有する。発現のために、FVIII-108を、PC5を用いて同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されたcscFcリンカーを完全にプロセシングして、第一のFc部分を血小板標的部分に接続する。これらのタンパク質を、以前に記載のとおりFVIII欠損の血小板豊富な血漿を用いてトロンビン生成アッセイで試験し、ただし、さらに、トロンビン生成アッセイはまた、組織因子でも活性化した。図49Bに示すとおり、FVIIIFcの標的化バージョンを用いて有意な改善は示されなかった。本明細書に記載されるトロンビン生成アッセイは、血小板の表面上でのトロンビン生成を測定し、従って活性の正確な指標であることが注目に値する。実施例30Glaドメインを欠く血小板に対して標的されたFVIIのバージョンの作製および試験本実施例では、図21に図示されるバージョンのFVIIaFcを生成した。このタンパク質は、N末端でMB9scFvおよびGlaドメイン除去する欠失を有する。FVII-053は、細胞内活性化のために軽鎖と重鎖との間に挿入されたRKRRKR配列を含む。FVII-053を、一過性に発現してタンパク質の活性化を生じるRKRRKR配列のプロセシングのためにPC5で同時トランスフェクトした、以前に記載のとおり精製した。精製した成分および血小板を用いるトロンビン生成アッセイによって、FVII-053がいくつかの活性を有する図22この活性がFVII-011コントロールに対して損なわれるにもかかわらず図22Dことが明らかになる。図23のデータは、GPIIbIIIa結合についてMB9と競合するPAC1抗体がいかに、FVII-053と関連するトロンビン生成活性を阻害するかを示しており、これによって血小板標的化は、活性に重要であることが示唆される。FVII-053と同一ただしRKRRKR挿入物を欠いている別の構築物を生成しFVII-028不活性化されたFVII-011と一緒に不活性化するのにおいてPk研究で試験した。図50に示されるとおり、標的化されたGla-なしのFVII-028分子の終末半減期は、FVII-011コントロールの半減期7.1時間よりもほぼ3倍長く20.3時間、このことは、Glaドメインを除去すれば、FVIIFcの終末半減期が増大することを示唆している。実施例31血小板標的したFIX分子本実施例では、図51Aに図示されるFIX構築物を作製して、試験した。FIX-068を、PC5で同時トランスフェクトして、タンパク質配列が記載されるcscFcリンカーを完全にプロセシングし、第一のFc部分を標的部分に接続した。FIX-068は、第二のFc部分のN末端にSCE5血小板標的部分を有するが、FIX-088は、第二のFc部分のC末端にSCE5を有する。FIX-090は、FcドメインなしのFIX構築物であり、FIXタンパク質のC末端に結合されたSCE5部分を有する。FIX-042は、標的部分のない単鎖のFcとしてのFIXFcであり、コントロールとして作製された。BeneFIXPfizerもまた、コントロールとしても用いられた。トロンビン生成アッセイで誤った結果を生じるBeneFIXサンプル由来の微量の活性化されたFIXFIXaを除去するため、BeneFIXサンプルを、不可逆的な活性部位インヒビターであるグルタミル-グリシル-アルギニル-クロロメチルケトンHematologicTechnologiesで処理した。BeneFIXを、過剰量のインヒビターとともに室温で180分間インキュベートした。次いでそのサンプルを透析して、未結合のインヒビターを除去した。この処理したBeneFIXは以降、BeneFIXと呼ぶ。作製された分子の比活性は、FIX-042、6IU/nmol;FIX068、5.1IU/nmol;FIX-088、3.5IU/nmol;FIX-090、13.8IU/nmol、およびBeneFIX、12IU/nmolであった。これらの構築物FIX-068、FIX-088およびFIX-042を、図51Bに示されるように、血小板豊富なFIX欠損の血漿において、トロンビン生成アッセイで試験した場合、各々の標的された分子は、FIX-042コントロールよりも高い活性を有した。図51Cは、FIX-068およびFIX-088の両方とも、トロンビン生成で測定した場合、FIX-042よりも少なくとも4倍大きい活性を有することを図示する。FIX-042の1つ以上の活性は、FIX-068およびFIX-088よりも高いので、トロンビン生成アッセイで観察される活性の増大は、過小評価され得、従って、血小板標的による活性の増大は、4倍より大きい場合がある。図52Aに示されるとおり、FIX-090Fcを欠くも、BeneFIXに対して活性の増大を示し、このことは、Fcの非存在下で血小板に対してFIXを標的化することはまた活性も増大することを示唆している。図52Bは、FIX-090の活性がBeneFIXの少なくとも4倍であることを示す。FIX-090およびBeneFIXの両方とも同様の比活性を有するので、トロンビン生成アッセイでの活性の4倍の増大は、血小板標的化効果によって生じたに違いない。実施例32血小板に対してFIXを標的化するためのペプチドの使用本実施例では、図53Aに図示されるFIX-089構築物を、以前に記載のとおり、クローニングして、一過性に発現して、精製した。この分子は、この構築物の第二のFc部分のN末端に結合された、GPIb-αレセプターに結合するOS1ペプチドを含む。FIX-089構築物の比活性は、コントロールのFIX-042分子のコントロールについての6IU/nmolに比べて、2.4IU/nmolであった。図53Bに示されるとおり、FIX-089分子は、FIX-血小板豊富な血漿を用いるトロンビン生成アッセイにおいてFIX-042コントロールよりも活性であり;これは、FIXの限界濃度では特に明白である。図53Cによって、FIX-089が、トロンビン生成で測定した場合、FIX-042よりもほぼ4倍強いが、一方で有する不活性は低いことが示される。これによってさらに、GPIbに対する標的化は、FIXFcの活性を増大することが示唆される。ドラフトの配列表FVII-027アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域にFVIIまたはMB9を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示しているFVII-027のDNA配列Genscript-FVII-027-1DNA配列Genscript-FVII-026-2DNA配列FVII-037アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域にFVIIまたはMB9を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そして両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示しているFIX-037DNA配列FVII-053アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Fc領域に対してFVIIを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示している、そしてMB9は、イタリック体にしている。FVII-053DNA配列FVII-044アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはPS4を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてPS4ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-044DNA配列FVII-045アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはOS1を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてOS1ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-045DNA配列FVII-046アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはOS2を接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてOS2ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-046のDNA配列FVII-047アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはPS4を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてPS4ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-047のDNA配列FVII-048アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはOS1を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてOS1ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-048のDNA配列FVII-049アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはOS2を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてOS2ペプチドは、イタリック体にしている。FVII-049のDNA配列FVII-011アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Glaドメインは、イタリック体にしており、Fc領域に対してFVIIを接続するリンカー領域は、下線を付しており、そして両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示している。FVII-011DNA配列Bドメイン欠失のFVIIIアミノ酸配列:シグナルペプチドは下線であり;HC配列とLC配列との間の14アミノ酸リンカー残りのBドメインを含んでいるは、二重の下線であり、太字で示されるS743/Q1638融合部位を備える。全長FVIIIアミノ酸配列:シグナルペプチドは下線FIXアミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは二重の下線である。FIXDNA配列FXアミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは二重の下線である。FXDNA配列FVII-066のDNA配列FVII-066アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはSCE5を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示しているFVII-057のDNA配列FVII-057アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよび第XIa因子切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そして第XIa因子切断部位は、破線の下線で示す。FVII-058のDNA配列FVII-058アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示すFVII-059のDNA配列FVII-059アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示すFVII-060のDNA配列のDNA配列FVII-060アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示す。FVII-061のDNA配列FVII-061アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示すFVII-062のDNA配列FVII-062アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIa軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてFcおよびFVIIa重鎖を接続するリンカー領域は、太字で示すFVII-090のDNA配列FVII-090アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、そしてトロンビン切断部位は、破線の下線で示すFVII-100のDNA配列FVII-100アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示している,トロンビン切断部位は、破線の下線で示す、そしてトリプシン170ループ領域は、波線の下線を付す。FVII-115のDNA配列FVII-115アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVII軽鎖または重鎖を接続するリンカー領域は、下線を付しており、Fcおよびトロンビン切断部位を接続するリンカー領域は、太字で示しており、トロンビン切断部位は、破線の下線で示す、そしてFVIIaにおける3つの点変異V158D、E296VおよびM298Qは太字でかつ下線を付している。FVII-118のDNA配列FVII-118アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、トロンビン切断部位は、破線の下線で示し、Fc領域に対してFVII重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は、太字で示しているFVII-119のDNA配列FVII-119アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、GGGSリンカーを有するトロンビン切断部位は下線で示し、Fc領域に対してFVII重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。FVII-127のDNA配列FVII-127アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、トロンビン切断部位は、破線の下線で示し、トリプシン170ループ領域は、波線の下線を付す、Fc領域に対してFVII重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は、太字で示しているFVII-125のDNA配列FVII-125アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてAP3に対してFVIIを接続するリンカー領域は太字であり、そしてAP3scFvは、イタリック体にしている。FVII-067のDNA配列FVII-067アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIaを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFc領域を接続するリンカーは破線の下線を付しており、そしてFc領域をSCE5に対して接続するリンカーは太字である。FVII-094のDNA配列FVII-094アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてFVIIをSCE5に接続するリンカー領域は下線を付している。FVII-028のDNA配列FVII-028アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Fc領域に対してFVIIを接続するリンカー領域は、下線を付しており、両方のFcs部位を接続するリンカーは、太字で示しており、そしてMB9は、イタリック体にしている。DNA配列FVII-039のDNA配列FVII-039アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、FXIa切断部位は、破線の下線で示す,Fc領域に対してFVII重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。FVII-040のDNA配列FVII-040アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、FXIa切断部位は、破線の下線で示し、Fc領域に対してFVII重鎖を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は、太字で示している。FIX-042のDNA配列FIX-042アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてFc領域を接続するリンカー領域は下線を付している。FIX-068のDNA配列FIX-068アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してSCE5を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。FIX-088のDNA配列FIX-088アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、両方のFc領域を接続するリンカーは下線を付しており、そしてFc領域をSCE5に対して接続するリンカーは太字である。FIX-089のDNA配列FIX-089アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してOS1を接続するリンカー領域は下線を付しており、そしてOS1ペプチドは、イタリック体にしている。FIX-090のDNA配列FIX-90アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、そしてFIXをSCE5に接続するリンカー領域は下線を付している。FVII-088のDNA配列FVII-088アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、プロペプチドは、二重の下線であり、Fc領域に対してFVIIまたはAP3を接続するリンカー領域は、下線を付しており、AP3scFvはイタリック体であり、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。FVIII-041のDNA配列FVIII-041アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、そしてFc領域を接続するリンカー領域は下線を付している。FVIII-108のDNA配列FVIII-108アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、Fc領域に対してSCE5を接続するリンカー領域は、下線を付しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。pSYN-FVIII-049のDNA配列FVIII-049アミノ酸配列。シグナル配列は、破線の下線で示しており、そしてプロタンパク質転換酵素プロセシング部位を有するリンカーは、太字で示している。"