"組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Iを得るステップ1と、前記一次産物Iを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物IIを得るステップ2と、前記二次産物IIを疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップ3とを順に備える、トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法。前記ステップ3の疎水性クロマトグラフィーの前に、前記二次産物IIをセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて精製するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、UNOSphereS、CaptoMMC、NuviaS及びMacroPrep-CMからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項1に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、UNOSphereSまたはCaptoMMCを用いて行われる、請求項3に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、QSepharoseFF、UNOSphereQ及びDEAESepharoseFFからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項1に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、QSepharoseFFを用いて行われる、請求項5に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーが、PhenylSepharoseHP、PhenylSepharoseFF、Macro-prept-butylと及びMacro-prepmethylからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項1に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーが、PhenylSepharoseHPを用いて行われる、請求項7に記載の方法。前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型及びII型からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項2に記載の方法。前記組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物が、i組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネの子実を砕いたものを抽出用緩衝液と1:5の重量体積比kg/lで混合し、55~60°Cにて1~1.5時間抽出して混合物Iを得るステップであって、その内、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液10~30mMに、酢酸ナトリウム10~20mMと、硫酸アンモニウム15~30mMと、オクタン酸ナトリウム5~20mMとを含み、そのpHが6.5~8であるステップと、iiステップiで得られる混合物IのpHを4.0~4.5に調整し、更に3~12時間沈降させて混合物IIを得るステップと、iiiステップiiで得られる混合物IIを、ろ布式のプレートフレームフィルターで加圧ろ過し、その後、孔径が0.20μm~0.45μmのポリエーテルスルホン中空糸膜で精密ろ過した後、ろ液を集めて高濃度の組換えヒト血清アルブミンを含む粗抽出液を得るステップとを含む方法により製造される、請求項1に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる注入用緩衝液は、酢酸塩緩衝液で構成され、pHが5.0未満である、請求項1に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、またはリン酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、pHが5.0~6.7である、請求項1に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、UNOSphereSを用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが5.2である溶出用緩衝液が使われる、請求項3に記載の方法。陽イオン交換クロマトグラフィーは、NuviaSを用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが5.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項3に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、CaptoMMCを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に1M塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、酢酸塩緩衝液に1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.7である溶出用緩衝液が使われる、請求項3に記載の方法。前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、MacroPrep-CMを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に1M塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、酢酸塩緩衝液に1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.5である溶出用緩衝液が使われる、請求項3に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、QSepharoseFFを用いて行い、かつリン酸塩緩衝液に0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項5に記載の方法。前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、DEAESepharoseFFを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、リン酸塩緩衝液に0.1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項5に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーにおいて、精製すべき前記二次産物IIには、更に濃度が0.1M~1Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項7に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーは、PhenylSepharoseHPを用いて行い、かつ精製すべき前記二次産物IIには、更に濃度が0.4Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項7に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーは、PhenylSepharoseFFを用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物IIには、更に濃度が0.1Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項7に記載の方法。前記疎水性クロマトグラフィーは、MacroPrep-t-Butylを用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物IIには、更に濃度が0.6~1.0Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項7に記載の方法。前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、リン酸塩緩衝液で構成され、pHが7.0~7.5の溶出用緩衝液が使われる、請求項9に記載の方法。本発明は、トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンrHSAを大規模に分離し、精製する方法を提供することを目的とする。本発明の上述した目的は、以下の技術的解決案により達成される。即ち、トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法であって、順に、1組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Iを得るステップと、2一次産物Iを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物IIを得るステップと、3二次産物IIを疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップとを備える。ステップ1において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、UNOSphereS、NuviaS、CaptoMMC及びMacroPrep-CMからなる群より選択される強陽イオンクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィー担体として行ってもよい。UNOSphereSまたはCaptoMMCを用いて行うことが好ましい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、pH勾配による溶出またはNaCl濃度勾配による溶出を用いてもよく、pH勾配による溶出が好ましい。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが5.2であった。ステップ2において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、UNOSphereQ、QSepharoseFF及びDEAESepharoseFFからなる群より選択される強陰イオンクロマトグラフィー樹脂をクロマトグラフィー担体として行ってもよく、QSepharoseFFを用いて行うことが好ましい。一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、0.2M塩化ナトリウムを含み、pHが7.5であった。ステップ3において、疎水性クロマトグラフィーは、PhenylSepharoseHP、PhenylSepharoseFF、Macro-prept-butyl及びMacro-prepmethylからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行ってもよい。PhenylSepharoseHPを用いて行うことが好ましい。疎水性クロマトグラフィーによって得られる標的蛋白質を含む溶出物は、例えば、限外ろ過による濃縮、冷凍乾燥などの周知の技術で最終産物に加工することができる。更に、前記方法において、前記ステップ3の疎水性クロマトグラフィーの前に、二次産物IIをMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて精製するステップを含んでもよい。即ち、このような実施形態において、ステップ3として、標的蛋白質を含む二次産物についてMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、その後、ステップ4として、疎水性クロマトグラフィーを行って精製された標的蛋白質を得た。セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型及びMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトII型からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行ってもよく、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型を用いて行うことが好ましい。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる注入用緩衝液は、酢酸塩緩衝液から構成されを含み、そのpHが5.0未満であった。陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる標的蛋白質を溶出するための溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、またはリン酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、pHが5.0~6.7であった。好ましくは、塩化ナトリウムの濃度が0.25Mであり、溶出用緩衝液のpHが5.2であった。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、UNOSphereSまたはCaptoMMCを用いて行い、ここで使われる溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが5.2または6.7であった。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、NuviaSをクロマトグラフィー担体として用い、その溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが5.0または5.2であった。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、CaptoMMCをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、1M塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.7であった。一つの実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、MacroPrep-CMをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に、1M塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、0.1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.5であった。一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、QSepharoseFFをクロマトグラフィー担体として用い、ここで使われる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0であった。一つの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、DEAESepharoseFFをクロマトグラフィー担体として用い、不純物の除去に用いられる洗浄用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、0.1M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0である。標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に、0.25M塩化ナトリウムを含み、pHが6.0~7.0であった。一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーにて精製すべきrHSA含有画分に、更に硫酸アンモニウムを含んでもよく、硫酸アンモニウムの濃度が0.1M~1Mの範囲にあってもよい。一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、PhenylSepharoseHPをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきrHSA含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が0.4Mであった。一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、PhenylSepharoseFFをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきrHSA含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が0.1Mであった。一つの実施形態において、疎水性クロマトグラフィーは、MacroPrep-t-Butylをクロマトグラフィー担体として用いて行い、精製すべきrHSA含有画分に含まれる硫酸アンモニウムの濃度が0.6~1.0Mであった。一つの実施形態において、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、標的蛋白質の溶出に用いられる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液から構成されを含み、pHが7.0~7.5であった。本発明に係わる前記rHSAは、本出願の出願人によって提出された中国特許出願200510019084.4号に開示されている方法に従い、イネ胚乳細胞を生物反応器として用いて製造することができる。トランスジェニックイネに発現するrHSAは、本出願の出願人によって提出された中国特許出願201010597544.2号に開示されている方法に従って抽出することができ、好ましくは、当該方法に、i粉砕済みのrHSA含有トランスジェニックイネを抽出用緩衝液と、1:5の重量体積比kg/lで混合し、55~60°Cにて1~1.5時間抽出を行って混合物Iを得るステップであって、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液10~30mMに、酢酸ナトリウム10~20mMと、硫酸アンモニウム15~30mMと、オクタン酸ナトリウム5~20mMとを含み、そのpHが6.5~8であるステップと、iiステップiで得られる混合物IのpHを4.0~4.5に調整し、更に3~12時間かけて沈降させて混合物IIを得るステップと、iiiステップiiで得られる混合物IIをろ過して澱粉や非標的蛋白質を取り除いた後、ろ液を回収して高濃度のrHSAを含む粗抽出液を得るステップとを含む。一つの実施形態において、前記ろ過に、ろ布式のプレートフレームフィルターを用いて加圧ろ過し、その後、ポリエーテルスルホン中空糸膜にて精密ろ過するステップが含まれる。前記中空糸膜は、孔径が0.20μm~0.45μmであり、0.22μmのものが好ましい。本発明により提供される技術的解決案は、以下の利点があった。1イネに色素と多糖類の物質が比較的高い含有量で含有されていることに対して、本発明において、第1の精製ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、rHSAを捕集または結合するために許容注入量を有効に高め、クロマトグラフィーの精製効率を高めている。これに対し、第1の精製ステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーを用いると、rHSAを捕集するための許容注入量が理論値の20程度にしかならない。また、UNOSphereSとCapto-MMCは、いずれも水酸化ナトリウムに対して極めて高い安定性と長い寿命を有するので、クロマトグラフィー担体の耐用期限が延長されるとともに、本発明の洗浄作業を容易にできるようにし、最終的に目的産物のコストを削減できる。2本発明において、第2の精製ステップとして陰イオン交換クロマトグラフィーを行っている。溶出条件を最適化した結果、イネの子実に含まれる80以上の非標的蛋白質を除去することができ、結果として、非標的蛋白質を有効に取り除いた上でrHSAを回収することができた。また、イネの子実に含まれる色素と多糖類の物質が、第1の精製ステップにおいて陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより既に取り除かれているため、陰イオン交換クロマトグラフィーの許容注入量及び精製効率への影響が取り除かれる。3本発明において、第3の精製ステップとしてMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行い、二量体以上の多量体を取り除く。rHSAを注射用の薬剤にする場合、過剰量の二量体以上の多量体によってアレルギーを引き起こす恐れがあった。そこで、このステップで純度を著しく向上させ、臨床応用における純度の高さに対する要求またはそれ以上の要求に応えられるようにする。4本発明において、仕上げの精製ステップとして疎水性クロマトグラフィーを行う。以上のように、三段階に分けてクロマトグラフィーを行うことにより、目的とする産物のHPLC純度を99.0以上にすることができる。以下、本発明の特徴と利点をより容易に理解できるように実施例を挙げて説明する。これらの実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体と溶出条件の選定本発明において、クロマトグラフィー担体をBio-Rad社製のUNOSphereS、NuviaS、CaptoMMCなどを含む高い作業流速workingflowrateを有する陽イオン交換樹脂とした。実験より分かるように、CaptoMMC、NuviaSとUNOSphereSは、何れもrHSAの精製に利用可能であった。その内、CaptoMMCによる蛋白質の精製効果が最もよく、その次にNuviaSとUNOSphereSであった。NuviaSとUNOSphereSは、蛋白質精製において両者の効果に明らかな区別がないと確認できる。しかし、同じ作業流速の場合においてUNOSphereSの許容注入量がCaptoMMCの1.5倍である。また、UNOSphereSの作業流速は、CaptoMMCと同じであった。なお、UNOSphereSは、高濃度の水酸化ナトリウム中においても極めて優れた安定性を示しており、CaptoMMCと比べて洗浄プロセスが簡便で、使用寿命が長く、コストが低いといった利点があった。NuviaSとUNOSphereSは、類似した性質を有しているが、リガンドの伸長長さと基質粒子の大きさに区別があった。両者各自の最適の作業流速において、NuviaSの許容注入量がUNOSphereSの1.4倍になっているが、NuviaSの作業流速は、UNOSphereSの約半分であった。代わりに、同じ流速の場合、UNOSphereSの許容注入量がNuviaSより大きく、また、両者の精製能力は同等のレベルにあった。各要素を纏めて見ると、陽イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフィー担体としてUNOSphereSを使うのが好ましい。rHSAが担体に完全に吸着できるように、rHSAを含む抽出液を比較的低いpH値pH=4.4でUNOSphereSを充填したカラムに添加し、その後、それぞれpH勾配を有する溶出用緩衝液とNaCl勾配を有する溶出用緩衝液で溶出させて基本的な溶出条件を調べる。結果から示されるように、pH勾配による溶出の際において、UNOSphereSカラムに吸着されたrHSAは、溶出用緩衝液のpHが5.5を超える場合において僅かながらも脱着する傾向を示しため、注入用緩衝液のpHを5.5以下にする必要があることが示唆された。また、溶出用緩衝液のpHを5.68にする場合、rHSAは、カラムから完全に脱着する。このことから、rHSAがUNOSphereSクロマトグラフィーカラムでのpH勾配による溶出に対して非常に敏感であることが分かる。NaCl濃度勾配による溶出で、標的蛋白質rHSAは、35から60までの1M塩化ナトリウムNaCl濃度勾配において脱着の傾向を示し、従って、rHSAがUNOSphereSクロマトグラフィーカラムでのNaCl濃度勾配による溶出に敏感に反応しないことが確認された。これらの結果から、pH勾配とNaCl勾配が何れもrHSAの溶出に利用できることが証明された。また、pH勾配の場合、より敏感に且つより少量の溶出用緩衝液を使ってrHSAを溶出することができる。一方、NaCl勾配によってrHSAを溶出し難く、必要とされるNaClの濃度が高く、且つ大量の溶出用緩衝液を使用する必要があった。精製効果と回収率を総合的に考慮すると、好ましい溶出用緩衝液として、0.25MNaClのリン酸塩緩衝液pH5.2が挙げられる。陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体と溶出条件の選定陽イオン交換樹脂と同様に、陰イオン交換樹脂もrHSAの精製に用いることができる。本発明において、クロマトグラフィー担体をUNOSphereQ、QSepharoseFF及びDEAESepharoseFFなどを含む、高い流速と高い許容注入量を有する陰イオン交換樹脂とした。実験より分かるように、UNOSphereQ、QSepharoseFF及びDEAESepharoseFFは、何れもrHSAの精製に用いることができる。UNOSphereQはQSepharoseFFと比べて流速が大きいが、QSepharoseFFはUNOSphereQと比べて精製効率が優れている。また、DEAESepharoseFFは、QSepharoseFFと類似した精製効率を示しているが、QSepharoseFFと比べて流速が低い。上述から分かるように、陽イオン交換クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体として、UNO-sphereSは、精製性能においてCaptoMMCと比べてやや劣っている。しかし、実験により証明されたように、このような不利な影響は、全体の精製効率を改善することによって受けないようにすることが出来る。また、UNO-sphereSは、後の陰イオン交換クロマトグラフィーに不利な影響を与えない。一つの好ましい実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラフィー担体としてQSepharoseFFを用いるのが好ましく、標的蛋白質の溶出に用いる溶出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液に0.2MNaClを含み、pHが6.8であった。陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの実施順番の確定陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーは、何れもrHSAの一次精製に用いることができるが、実験から分かるように、QSepharoseFF陰イオン交換樹脂を一次精製ステップに用いた時は、その許容注入量が理論上の許容量より遥かに低い。これはイネの子実に大量に存在する可溶性多糖類と核酸の関与によるものと考えられる。その理由して、可溶性多糖類と核酸は負電荷を持っており、よって、QSepharoseFFに結合してその許容注入量を低下させることが考えられる。実験により証明されたように、透析によってrHSA抽出液に含まれる可溶性多糖類の含有量を減らすことが出来るため、QSepharoseFFの許容注入量を高めることができる。その一方、UNOSphereS、NuviaSとCaptoMMCなどの陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、可溶性多糖類及び核酸と結合できず、よって、許容注入量の低下を回避することができる。このことから、本発明において、一次精製に陽イオン交換クロマトグラフィーを用い、二次精製に陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることとした。疎水性クロマトグラフィーにおけるクロマトグラフィー担体の選定本発明において、幾つかの疎水性クロマトグラフィー担体を当該精製ステップに用いた。疎水性クロマトグラフィー担体として、例えば、PhenylSepharoseHP、PhenylSepharoseFFLS、Macro-prept-butyl及びMacro-prepmethylが挙げられ、これらは類似した性質を持っている。PhenylSepharoseHPは、強い疎水性と優れた精製性能を持っている。粗抽出液からほぼ全ての非標的蛋白質とその他の不純物を除去する性能は、精製効率の向上に鍵となっているが、当該クロマトグラフィー担体は、粒子のサイズが比較的小さく、流速が低く、作業方式が特別であることから、その応用においてやや利便性が低い。PhenylSepharoseHPと比較して、PhenylSepharoseFFLSは、同じリガンドと基質を有しているが、球状基質の粒径とリガンドの密度が異なっている。PhenylSepharoseFFLSの基質の平均粒径は、PhenylSepharoseHPと比べて3倍大きく、よって、前者は大きい作業流速を有する。このためrHSAの生産に用いる際に製造時間を短縮することができる。MacroPrep-Butylは、PhenylSepharoseFFとPhenylSepharoseHPより疎水性が弱く、Macro-prepmethylは、疎水性においてMacroPrep-butylより弱い。PhenylSepharoseFFは、PhenylSepharoseHPと同様の作業方式で浸透液transmissionfluidを集めるほうがよい。添加サンプルの塩濃度を選定する際、25mMPB0.5MNH42SO4、pH6.8の平衡用緩衝液を用いて添加してから100の水で溶出する場合、50を超えるrHSAがカラムに保持されていることが確認できる。結果として平衡用緩衝液の塩濃度を低くする必要がある。UNOSphereSとQSepharoseFFカラムにてろ過した後のサンプルに硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウムの濃度をそれぞれ0.2Mと0.1Mとなるように調整した後、PhenylSepharoseFFLSカラムに添加する。浸透液transmissionfluidと、純水による溶出液を集めてSDS-PAGE解析を行う。結果より示されるように、PhenylSepharoseFFLSは、PhenylSepharoseHPと比べてより強い疎水性を示し、且つ添加サンプルにおける硫酸アンモニウムの濃度が0.1Mと低くなっている場合においてもなおサンプル中の非標的蛋白質に対する良好な除去効果を有している。また、PhenylSepharoseFFLSにより得られる産物の純度は93.5に達している。一方で、約30のrHSAがPhenylSepharoseFFLSカラムに保持されて失われる。硫酸アンモニウムの代わりに塩化ナトリウムを用いて上記実験を行う場合、同様の結果となる。カラムに保持されることによるrHSAのロスが一定程度で低減されるが、産物のHPLC純度は依然として約93であった。UNOSphereSとQSepharoseFFカラムにてろ過した後のサンプルに硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウムの濃度をそれぞれ1M、0.8Mまたは0.6Mとなるように調整した後、Macro-prept-butylとMacro-prepmethylカラムに添加する。浸透液transmissionfluidと、純水による溶出物とを集めてSDS-PAGE解析を行う。結果より示されるように、Macro-prept-butylとMacro-prepmethylは、何れも疎水性が弱い。更に両者のrHSAに対する精製特性もも良好ではなく、得られるrHSAのHPLC純度は90であった。Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型またはII型を選定するために、BioRad社製の二つのMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトについて比較を行った。比較の結果から、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型がII型より適しているのが確認された。Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型を用いてクロマトグラフィーを行うと、モノマーの含有量を98.998にまで引き上げることができる。上述したことから、PhenylSepharoseHPと比べて高流速で作業できる点で他のクロマトグラフィー担体が優れていることには間違いないが、他のクロマトグラフィー担体からは、何れもPhenylSepharoseHPに匹敵する精製効率を得られない。PhenylSepharoseHPは、精製速度が比較的低いが、98より大きい純度を有する標的蛋白質を確保できる。従って、PhenylSepharoseHPを疎水性クロマトグラフィー担体として用いることが好適であった。材料と装置ろ布式のプレートフレーム加圧ろ過器は、型番がXMS4/500-UBであり、メーカーが上海天立加圧ろ過器技術有限公司中国である。0.20μmの中空糸セルロースカラムは、湖州科濾膜技術有限公司中国により購入する。UNOSphereS、NuviaS、CaptoMMC、MacroPrep-CM、MacroPrep-methyl及びMacroPrep-Butylの各担体は、Bio-Rad社米国により購入する。QSepharose、PhenylSepharoseHP、PhenylSepharoseFF及びDEAE-SepharoseFFの各担体は、GEHealthcare社米国により購入する。C10/10とXK16/20の各クロマトグラフィーカラムは、GEHealthcare社米国により購入する。Biological15/200クロマトグラフィーカラムは、Bio-Rad社米国により購入する。[実施例1]トランスジェニックイネからのrHSAの抽出本発明の発明者による中国特許出願200510019084号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネが作製された。水稲栽培されたトランスジェニックイネの外皮を除去して半精米を得、その後、粒度が80~100メッシュの米粉となるように砕いた。砕いた米粉を抽出用緩衝液と1:5重量/体積、kg/Lの割合で混合し、60°Cにて1.5時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液25mMに、酢酸ナトリウム20mMと、硫酸アンモニウム10mMと、オクタン酸ナトリウム10mMとを含み、pHが7.5であった。上記のようにして得られた混合物を酢酸でpH4.5に調整し、更に少なくとも3時間置いて非標的蛋白質を沈降させた。その後、得られた混合物を、順にろ布式のプレートフレーム加圧ろ過器で加圧ろ過してから孔径が0.22μmの中空糸セルロースカラムで精密ろ過し、透明なrHSA抽出液を得た。rHSAの濃度は、約0.66mg/mlであった。[実施例2]陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製1UNOSphereSクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーXK16/100カラムに約8.7mlのUNOSphereSを充填し、流出液のpH値が安定するまで200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って300cm/hcm/時の流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、600cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.1mS/cmであり、pHが4.53であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.2、塩化ナトリウム14.61g/Lを使って300cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS-PAGEで観察し、rHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Aに示した。2NuviaSクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーXK16/100カラムに約9.3mlのNuviaS担体を充填し、流出液のpH値が安定するまで200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、300cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.0、塩化ナトリウム14.61g/Lを使って300cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS-PAGEで観察し、rHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Bに示した。3CaptoMMCクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーXK16/100カラムに約15.1mlのCaptoMMC担体を充填し、流出液のpH値が4.5で安定するまで200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、600cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH4.7、塩化ナトリウム58.44g/Lを使って300cm/hの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム58.44g/L、pH6.7でサンプルを溶出してrHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Cに示した。4MacroPrep-CMクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーXK16/100カラムに約10mlのMacroPrep-CM担体を充填し、流出液のpH値が4.5で安定するまで300mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って200cm/hの流速で平衡化した。250mlの実施例1で得られたrHSA抽出液サンプルを、300cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、洗浄用緩衝液酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH4.7、塩化ナトリウム58.44g/Lを使って200cm/hの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム5.84g/L、pH6.5でサンプルを溶出してrHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Dに示した。5NuviaS担体とUNOSphereS担体の許容注入量の比較XK16/100カラムに、それぞれ約5mlのNuviaSとUNOSphereS担体を充填し、流出液のpH値が4.5となるまで200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプルを、300cm/hの流速でNuviaSカラムとUNOSphereSカラムにそれぞれ添加した。サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を記録し、当該吸収値が水平域を10分超えるまで記録を続けた。サンプルの添加体積をそれぞれ記録し、300cm/hの流速における1ミリリットル当たりのNuviaSまたはUNOSphereSの実際の許容注入量を算出した。なお、流出液のpH値が4.5となるまで平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したものを使って300cm/hの流速でUNOSphereSカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液のサンプルを600cm/hの流速でUNOSphereSカラムに添加し、サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を10分超えるまで計測を続けた。サンプルの添加体積を計測し、600cm/hの流速においての1ミリリットル当たりのUNOSphereSの実際注入量を算出した。許容注入量の比較結果は、図2に示した。[実施例3]陰イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製1UNOSphereQ担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーBiological15/200カラムに約10mlのUNOSphereQ担体を充填し、流出液のpH値が7.5となるまで200mlの平衡用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpH7.5に調整したものを使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH7.5に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した後、300cm/hの流速でUNOSphereQカラムに添加した。当該サンプルを洗浄用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/Lで洗浄して不純物を除去した後、溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム23.36g/Lで溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図3Aに示した。2QSepharoseFF担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーBiological15/200カラムに約10mlのQSepharoseFF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpH7.0に調整したものを使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH6.8に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した後、300cm/hの流速でQSepharoseFFカラムに添加した。当該サンプルを溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム5.84g/Lで溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図3Bに示した。3QSepharoseFFの実際注入量の測定10/100カラムに約5mlのQSepharoseFF担体を充填し、流出液のpH値が7.0に安定するまで200mlの平衡用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したものを使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH7.5に調整し、当該緩衝液で導電率が10.0mS以下に、かつ総体積が1000mlになるまで希釈した。得られたサンプルを300cm/hの流速でQSepharoseFFカラムに添加した。サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を10分超えるまで計測を続けた。サンプルの添加体積を記録し、300cm/hの流速におけるQSepharoseFF1ミリリットル当たりの実際の許容注入量を算出した。その後、樹脂を再生した。実施例1で得られたrHSAの抽出液のサンプルをpH7.0に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した後、GE30KDメンブレンカセットで400mlに濃縮した。硫酸‐フェノール法を用いて透析前後の多糖類含有量を測定した後、当該サンプルを平衡化済みのQSepharoseFFカラムに添加した。サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を10分超えるまで記録を続けた。サンプルの添加体積を計測し、300cm/hの流速においての1ミリリットル当たりのQSepharoseFFの実際の許容注入量を算出した。許容注入量の変化と多糖類含有量の変化は、図4に示した。[実施例4]陰イオン交換クロマトグラフィーによる二次精製実施例2で得られたrHSA含有画分を均一に2等分し、以下の実験に用いた。1QSepharoseFF担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー15/200カラムに約7mlのQSepharoseFF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したものを使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記画分の一方をpHが7.0になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した。当該サンプルを300cm/hの流速でQSepharoseFFカラムに添加した後、溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/Lで溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図5Aに示した。2DEAESepharoseFF担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーBiological15/200カラムに約8mlのDEAESepharoseFF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したものを使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記画分の他の一方をpHが7.5になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した。当該サンプルを300cm/hの流速でDEAESepharoseFFカラムに添加した後、溶出用緩衝液リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/Lで溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図5Bに示した。[実施例5]疎水性クロマトグラフィーによる三次仕上げ精製1PhenylSepharoseHP担体を用いる疎水性クロマトグラフィーXK16/100カラムに約8mlのPhenylSepharoseHP充填し、200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム66g/Lを使って流速100cm/hでカラムを平衡化した。実施例4QSepharoseFFで得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウム0.4Mを加え、導電率が80.0mSとなるようにした。その後、当該サンプルを100cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Aに示した。2PhenylSepharoseFF担体を用いる疎水性クロマトグラフィーXK16/100カラムに約10mlのPhenylSepharoseFFを充填し、200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム13.2g/Lを使って流速150cm/hでカラムを平衡化した。実施例4QSepharoseFFで得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウム0.1Mを加え、導電率が80.0mSとなるようにした。その後、当該サンプルを150cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Bに示した。3MacroPrep-t-butyl担体を用いる疎水性クロマトグラフィー15/200カラムに約6mlのMacroPrep-t-butyl担体を充填し、200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム13.2g/Lを使って流速150cm/hでカラムを平衡化した。実施例3QSepharoseFFで得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウムそれぞれ1.0M、0.8M、0.6Mを加え、導電率がそれぞれ130.0mS、90.0mS、70.0mSとなるようにした。その後、当該サンプルを150cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Cに示した。[実施例6]rHSA含有抽出液からのrHSAの分離及び精製ステップ1:UNOSphereSを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製XK16/20カラムに約12mlのUNOSphereS担体を充填し、500mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH4.5を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSA含有抽出液のサンプル300mlを600cm/hの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が6.5mS/cmであり、pHが4.5であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.0、塩化ナトリウム14.61g/Lを使って200cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS-PAGEで観察を行い、rHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図7Aに示した。ステップ2:QSepharoseFFを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによる二次精製XK16/100カラムに約13mlのQSepharoseFF担体を充填し、400mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム6.51g/L、リン酸二水素ナトリウム0.72g/L、pH6.8を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記ステップで得られたrHSA含有画分を約200mlに希釈し、導電率が10.0mS未満となるようにした後、300cm/hの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が8.3mS/cmであり、pHが6.8であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液リン酸水素二ナトリウム6.51g/L、リン酸二水素ナトリウム0.72g/L、塩化ナトリウム11.69g/Lを使って100cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS-PAGEで観察を行い、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図7Bに示した。ステップ3:PhenylSepharoseHPを用いる疎水性クロマトグラフィーによる三次仕上げ精製XK16/100カラムに約12mlのPhenylSepharoseHPを充填し、200mlの平衡用緩衝液無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム66g/Lを使って流速100cm/hでカラムを平衡化した。上記ステップで得られた20mlのrHSA含有画分に硫酸アンモニウムを加え、導電率が90.0mSとなるようにした。その後、サンプルを100cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図7Cに示した。精製されたrHSA産物のHPLCクロマトグラムは、図8に示した。HPLC解析により、rHSAがモノマーに、二量体と多量体を合わせて99を超える純度を有することが確認できる。[実施例7]rHSA含有抽出液からのrHSAの精製本実施例において、4ステップを有する精製法にてrHSAを分離、精製するため、実施例1で得られたrHSAの粗抽出液を、それぞれUNOSphereS、QSepharoseFF、Macro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型及びPhenylSepharoseHPをクロマトグラフィー担体とする陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーで順に処理した。陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーは、実施例6と同様に行われる。CHTカラムに約15mlのMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトI型の担体を充填し、200mlの平衡用緩衝液20mMリン酸ナトリウム50mMNaCl、pH7.5を使って流速100cm/hでカラムを平衡化した。陰イオン交換クロマトグラフィーから得るrHSA含有画分を、そのまま流速100cm/hでカラムに添加した。サンプルの導電率が26mS/cmであり、pHが7.4~7.6であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液500mMリン酸ナトリウム、pH7.5でサンプルを溶出し、浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。rHSAの精製容量が30mg/gCHTIであったと推定され、rHSAの回収率が80以上に達した。最後に、CHTセラミックヒドロキシアパタイトカラムを、カラム容積の3~5倍量の緩衝液500mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で再生した。必要に応じてカラムを1~2NNaOHで殺菌し、0.1NNaOHに保存した。電気泳動図は、図9に示した。その後、上記で得られたrHSA含有画分を実施例6と同様の方法を用いて疎水性クロマトグラフィーで処理した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。精製されたrHSA産物のHPLCクロマトグラムは、図10に示した。HPLC解析により、rHSAが約99モノマーのみの純度を有することが確認できる。[実施例8]rHSA含有抽出液からのrHSAの精製本実施例において、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしてMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトII型のクロマトグラフィー担体を用いる以外、実施例7と同様の方法で精製を行った。CHTカラムに約15mlのMacro-prepセラミックヒドロキシアパタイトII型のクロマトグラフィー担体を充填し、200mlの平衡用緩衝液20mMリン酸ナトリウム50mMNaCl、pH7.0を使って流速100cm/hでカラムを平行化した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィーから得るrHSA含有画分を、そのまま流速100cm/hでカラムに添加した。サンプルの導電率が26mS/cmであり、pHが7.4~7.6であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液500mMリン酸ナトリウム、pH7.0でサンプルを溶出し、浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。rHSAの精製量が≦25mg/gCHTIIであったと推定され,rHSAの回収率は85以上に達した。最後に、CHTカラムをカラム容積の3~5倍量の緩衝液500mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0で再生した。必要に応じてカラムを1~2NNaOHで殺菌し、0.1NNaOHに保存した。その後、実施例7と同様の方法に従い、上記ステップで得られたrHSA含有画分を疎水性クロマトグラフィーで処理した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図11に示した。精製されたrHSA産物のHPLCクロマトグラムは、図12に示した。HPLC解析により、rHSAが約99モノマーのみの純度を有することが確認できる。実施例6~8の結果から示されるように、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、rHSA最終産物におけるモノマーの含有量を有効に高めることができ、その純度が約99に達した。なお、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、PhenylSepharoseHPを用いる精製ステップで使われる方式と同様の通過方式を用いてrHSAを更に精製し、且つ同じ溶出液を、塩濃度とpH値を調整しなくとも適用できるので、その操作が簡便である。セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いることで、上記精製されたrHSAは、臨床応用の要求水準を満たすことができる。"