プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマスの合成のため、あるいはプランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される1つまたは複数のプランタリシンの調製のための生物工学的方法であって、以下の工程、すなわちaラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖bCDM、WFH、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程aに記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種cインキュベーションならびに場合により、d乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離を含み、またはこれらの工程からなる方法。工程aからの懸濁液の細胞密度が、各乳酸菌種について約90Logufcmlであり、これが、基質体積に対して1~4の範囲の百分率で基質に添加される、請求項1に記載の方法。インキュベーションが、30~37°C、好ましくは30°Cの温度で、18~24時間、好ましくは18時間実施される、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。遠心分離が、4°Cで、10000×gで15分間実施される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。乾燥または凍結乾燥による、工程dで得られた上清の脱水のための工程eをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。請求項1から5のいずれか一項に記載の方法によって入手可能であり、あるいは得られるバイオマスであって、プランタリシンA、K、もしくはN、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマス。1つまたは複数の医薬として許容可能な賦形剤およびまたはアジュバントと共に、活性成分として請求項6に記載のバイオマスを含み、またはこれらからなる医薬品組成物または美容組成物。表皮または腸壁の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、請求項6に記載のバイオマスまたは請求項7に記載の組成物の使用。創傷治癒用の薬物を調製するための、請求項6に記載のバイオマスまたは請求項7に記載の組成物の使用。ラクトバシラスプランタルムDSM23213もしくはラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌、またはこれらの混合物。表皮の関門機能を増大させるための薬物を調製するための、プランタリシンA、K、またはN、好ましくはAから選択される1つまたは複数のプランタリシンの使用。創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンA、K、またはN、好ましくはAから選択される1つまたは複数のプランタリシンの使用。原核細胞および真核細胞相互の細胞コミュニケーションの機構はある程度解明されているが、細菌のクオラムセンシング機構に関与するシグナル分子と、ヒト腸粘膜の細胞との間の相互作用に関して、非常に限られた文献しか存在しない。ユニークな例は、コンピテンス現象および胞子形成現象に関与する分子として、枯草菌プロバイオティック微生物によって合成されるCSFペンタペプチドである。前記ペンタペプチドは、p38MAPキナーゼ、Bキナーゼ、および低温耐性を誘導するのに適しており、したがって、腸レベルでの酸化的損傷の予防を促進し、関門機能を強固にすることが実証された。さらに、現在の技術水準において、ヒト表皮に関して、細菌細胞間コミュニケーションの機構に関与するシグナル分子の効果に注目した刊行物または特許はまったく存在しない。本発明の著者らは今や、プランタリシン、特にプランタリシンAは、ヒト表皮およびその上腸細胞において、ケラチノサイトの関門機能に対して正の効果を発揮することを発見した。細菌単一培養を使用するプランタリシン調製のための方法についての研究は公知である。しかし、対象の微生物の培養は、治療目的用のシグナル分子を調製するために、工業レベルでスケールアップされるのに、複雑であまりに高価な培地中で実施される。本発明の著者らは今や、公知技術によって得られる収率より高い収率を得るのに適した2つの特定の乳酸菌の共培養を使用する、プランタリシンを調製するための方法を開発した。特に、LロシアエDPPMA174との共培養としてのLプランタルムDC400の培養は、プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成を活性化するのに適しており、LプランタルムDC400単一栽培の存在下におけるものより約50倍高い濃度を得る。さらに、天然サワードウによっても単離される、乳酸菌の他の種とのLプランタルムDC400培養は、Lロシアエと共同した場合のように、ペプチドフェロモンの合成を刺激するのに適していないことが証明された。本発明によるプロセスの別の重要な態様は、乳酸菌の実験室培養に通常使用される培地中だけでなく、グレープマスト、乳清、および果実および植物性産物からの水性抽出物でも実行可能であることである。公知技術によれば、どの刊行物または特許にも、焼いた、パン種で膨らませた製品の生産に使用される天然サワードウのような、同じ栄養生態系で行われる2つの乳酸菌の共培養に対する応答機構としてのプランタリシンA型合成は開示されていない。さらに、文献によれば、単一培養条件に対する共培養におけるプランタリシンAの合成の増大は報告されていない。さらに、上記に報告したように、公知の方法によれば、非常に高価で複雑な培地が使用される。さらに、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174乳酸菌と関連した1つまたは複数のプランタリシンを含む、本発明の方法によって得られるバイオマスは、表皮または腸壁のレベルでの関門機能の増強において、プランタリシン単独より高い有効性を発揮することが以外にも発見された。本発明による乳酸菌は、ラクトバシラス種に属し、南イタリアにおける一般的なパン生産のための天然サワードウから単離された。CDM、WFH、グレープマスト、乳清、または野菜および果実製品の水性抽出物中で前記2つの細菌を、30~37°Cで18~24時間共培養する工程を伴う生物工学プロトコールが標準化され、最適化された。培養の最後に、細胞を遠心分離によってブロス培養液から取り出すことができ、または取り出さなくてもよく、次いで、上清は、乾燥または凍結乾燥による脱水プロセスにかけられる。プランタリシンAに基づく配合物を配合するための生物工学プロトコールのスキームを以下に記載する。90logufcmlの細胞密度での、30°Cで24時間の乳酸菌培養物の増殖、洗浄、水中での懸濁、および培地の共接種↓30~37°Cで18~24時間の培養↓遠心分離による細胞の取り出し↓乾燥または凍結乾燥による上清の脱水↓皮膚ケア製品用途のための配合物の配合上記前記基質のいずれかでの共培養条件下で、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174の培養が実施される場合、25~40μgmLの濃度でプランタリシンAの合成が検出された。単一培養条件下で、LプランタルムDC400によって合成されるプランタリシンAの濃度は、約006μgmLである。他の乳酸菌種、ラクトバシラスペントサス、ラクトバシラスブレビス、ラクトバシラスロシアエ、ラクトバシラスラムノサスとの共培養条件下で、プランタリシンAの合成は、著しくより低い。LロシアエDPPMA174との共培養条件下で、プランタリシンK型およびN型のような他のペプチドフェロモンの合成が検出されたが、プランタリシンAより低い濃度、特に002~006μgmlの範囲内であった。1つの可能な配合によって、25μgmlのプランタリシンAの適用により、再生表皮モデルおよび経上皮電気抵抗アッセイを使用して証明されたように、関門機能が刺激された。同様の結果が、腸粘膜を再生するのに適したCaco2TC7腸細胞を使用して得られた。微生物学的な、クロマトグラフィー技法、ならびに細胞培養でのインビトロおよびエキソビボアッセイを使用して実施される相補的な分析によれば、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174の共培養は、先の研究において使用されておらず、本発明によれば、単一生態系内で他の乳酸菌群集の存在下において検出可能でない濃度での種間細胞コミュニケーション機構に関与するシグナル分子の合成、やはり低費用基質を使用するプランタリシンA、および他のプランタリシンの合成、ならびに表皮および腸細胞レベルでの関門機能を増強する保護効果を可能にし、したがって、原核細胞によって合成されるシグナル分子は、真核細胞によっても検出されることを実証する。したがって、プランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物から選択される少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌を含み、あるいはこれらからなるバイオマスの合成のため、あるいはプランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物から選択される1つまたは複数のプランタリシンの調製のための生物工学的方法は、本発明の具体的な目的であり、前記方法は、以下の工程を含み、または以下の工程からなるaラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌の培養増殖bCDM、WFH、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物抽出物からなる群から選択される基質の、工程aに記載の乳酸菌の水性懸濁液との共接種cインキュベーションならびに場合により、d乳酸菌細胞を取り出すための培養ブロスの遠心分離。特に、工程aからの懸濁液の細胞密度は、各乳酸菌種について約90Logufcmlとすることができ、これは、基質体積に基づいて1~4の範囲の百分率で基質に添加される。インキュベーション工程は、30~37°C、好ましくは30°Cの温度で、18~24時間、好ましくは18時間実施することができ、一方、遠心分離は、10000×gで、4°Cで15分間実施することができる。本発明によるプロセスは、乾燥または凍結乾燥による、工程dから得られる上清の脱水のための工程eをさらに含むことができる。プランタリシンA、K、もしくはN、好ましくはA、またはこれらの混合物からなる少なくとも1つのプランタリシン、ならびにラクトバシラスプランタルムDSM23213およびラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌を含み、またはこれらかなる上記プロセスによって入手可能な、または得られるバイオマスは、本発明のさらなる目的である。本発明はさらに、1つまたは複数の医薬として許容可能な賦形剤およびまたはアジュバントと共に、活性成分として上記に定義したようなバイオマスを含み、またはこれらからなる医薬品組成物または美容組成物に関する。本発明の特定の態様はさらに、表皮もしくは腸壁の関門機能を増大させるため、または創傷治癒用の薬物を調製するための、上記に定義したようなバイオマスまたは組成物の使用に関する。ラクトバシラスプランタルムDSM23213もしくはラクトバシラスロシアエDSM23214乳酸菌、またはこれらの混合物は、本発明のさらなる目的である。さらに、本発明は、表皮もしくは腸壁の関門機能を増大させるため、または創傷治癒用の薬物を調製するための、プランタリシンA、K、またはN、好ましくはAから選択される1つまたは複数のプランタリシンの使用に関する。これから本発明を、特に添付の図面を参照して、本発明の好適な実施形態に従って、例示的であるが限定的でない方法によって説明する。実施例1プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製、ならびに表皮およびCaco2細胞に対するその効果の試験天然サワードウから先に単離された、CollezionediColturedelDipartimentodiProtezionedellePianteeMicrobiologiaApplicatadellUniversitadegliStudidiBariからのLプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174を、通常の成分に加えて5のマルトースおよび10のサワードウ水最終pH56を含有する改良MRS培地中で、30°Cで24時間増殖させた。24時間培養した細胞を、遠心分離によって収集し、50mMのリン酸緩衝液、pH70で2回洗浄し、90logufcmlの細胞密度で水中に再懸濁し、WFH培地上で、単一培養または共培養条件下で接種した。培養基質としてグレープマスト、乳清を参照、または野菜および果実製品の水性抽出物を使用して、同じ手順を適用し、同じ結果を得、連続的に記載した。インキュベーションは、30°Cで18時間実施する。遠心分離によって細胞を取り出した後、単一培養および共培養の上清に、トリフルオロ酢酸を添加し、10000×gで10分間遠心分離した。上清を022μmの孔のフィルターを使用して濾過した。HPLC分析は、214nmで作動する検出器を備えたAKTAPurifier装置を使用し、逆相C18XTerraカラムを使用して実施した。水、2プロパノール、およびトリフルオロ酢酸の混合物を移動相として使用した。すべてのA型プランタリシン含有画分を、ESIイオントラップMS質量分析計結合多次元クロマトグラフを使用して分析した。プランタリシンA、K、およびNを同定および定量化するための分析条件は、DiCagnoらinductionofplantaricinAundercocultivationwithotherlacticacidbacteriaandeffectofPlnAonbacterialandCaco2cells、Proteomics近刊に従う。ラクトバシラスロシアエDPPMA174の増殖動態LロシアエDPPMA174の増殖動態学的データは、Gompertzの式を使用して処理し、引き続いて修正した。細胞計数は、SDB培地上に30°Cで48時間プレーティングすることによって実施した。細胞生存能ならびに損傷およびまたは死亡した細胞の数は、LIVEDEADbacLightBacterialViabilityキットによって求めた。二次元電気泳動分析およびタンパク質同定単一培養または共培養されたLロシアエDPPMA174由来の細胞質タンパク質の二次元電気泳動分析は、インモビリンを使用して実施した。各条件について4つのゲルを分析し、データを、Biniらによる手順に従って標準化した。タンパク質同定は、LCESIMSMS分析、および得られた配列の様々なデータベースに対する比較を使用して実施した。再生表皮に対するアッセイおよびTEER測定再生ヒト表皮SkinEthicは、多層ヒト表皮からの通常のケラチノサイトからなる。これは、空気液体界面で、不活性な多孔質ポリカーボネート支持体上で、子ウシ血清を添加することなく、17日間既知組成培地中でヒトケラチノサイトを培養して、完全に分化した表皮である。この増殖工程において、形態的な分析は、10を超える緻密な細胞層からなる多層状の生存可能な表皮および角質層を示す。再生ヒト表皮SkinEthicは、以前に記載されたプロトコールbyLactobacillusplantarumDSMZ19463functionalgrapemustbeverageanddermatologicalapplication、ApplBiotechnolMicrobiolDOI101007s0025300923704に従って使用した。TEER測定は、MillicellERSVolthommeterを使用して実施したundercocultivationwithotherlacticacidbacteriaandeffectofPlnAonbacterialandCaco2cells、Proteomics近刊。Caco2TC7細胞についてのアッセイヒトCaco2TC7細胞を、子ウシ血清、非必須アミノ酸、ゲンタマイシンストレプトマイシン、グルタミン、および42ヒドロキシエチル1ピペラジニルエタンスルホン酸を添加したダルベッコ培地中で培養したundercocultivationwithotherlacticacidbacteriaandeffectofPlnAonbacterialandCaco2cells、Proteomics近刊。細胞生存能は、ニュートラルレッド色素を使用する吸収アッセイを用いて求めた、NYAcademicPress、45~58頁。様々な配合物で24~72時間処置した後、細胞をPBS緩衝液で洗浄し、ニュートラルレッド溶液を用いて37°Cで4時間インキュベートした。引き続いて、細胞をPBS緩衝液で再び洗浄し、溶解液で処理した。プレートの読みは、Novapathプレートリーダーを使用して実施した。undercocultivationconditionswithotherlacticacidbacteriaandeffectofPlnAonbacterialandCaco2cells、Proteomics近刊TEER測定のために、Caco2TC7細胞を、24ウェルプレートおよびポリエチレンフィルター中でインキュベートした。処置の前に、細胞を37°Cで21日間インキュベートした。様々な配合物を用いた処置を、18、24、および48時間実施した。したがって、細胞層の完全性をTEER測定によって判定した。結果プランタリシン型ペプチドフェロモンの合成および精製WFH培地培養中で18時間増殖させた後、LプランタルムDC400単一培養の細胞密度は、927±018logufcmlであった。μmaxおよびλ値は、それぞれ、約027logufcml時間、および377時間であった。乳酸菌の細胞密度は、90±005から943±031logufcmlまで変化した。μmax値は、011±005から015±004logufcml時間まで変化し、ならびにλ値は、037±007から420±036時間まで変化した。単一培養と比較して、微生物を他の乳酸菌とともに共培養した場合、LプランタルムDC400の細胞密度は、著しく変化しなかった。LプランタルムDPPMA20、ラクトバシラスパラリメンタリウス8D、Lペントサス12H5、ラクトバシラスロイテリ、およびワイセラシバリア10XA16の細胞収率も、共培養条件によって調整されなかった。反対に、LロシアエDPPMA174およびPペントサセウス2XA3の細胞密度は、単一培養条件と比較して著しく減少する。一般に、LプランタルムDC400と共培養される場合、μmax値は、すべての乳酸菌で減少する。LプランタルムDPPMA20を例外として、λ潜伏期もすべての乳酸菌で増大する。LプランタルムDC400共培養の結果として阻害を示した乳酸菌株およびPペントサセウス2XA、ならびに共培養条件によって影響されなかったいくつかの株を、引き続く実験で使用した。以前の結果と一致して、LロシアエDPPMA174生細胞の数は、単一培養からLプランタルムDC400との共培養条件で、90±028から832±025log小細胞mlに減少する。生存可能で培養可能な細胞の数は、有意な差異を示さなかった。やはり単一培養条件を参照して、死亡または損傷したLロシアエDPPMA174細胞の数は、LプランタルムDC400との共培養条件で著しく増加した。培養可能なPペントサセウス細胞の数も、乳酸菌がLプランタルムDC400と共培養された場合、著しく減少する。細胞を取り出した後、単一培養上清および共培養上清を、ナノESIMSMS質量分析結合MDLC分析を使用するプランタリシン型ペプチドフェロモンの測定に使用する。図1aは、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養試料のフルスキャンクロマトグラムを示す。基質の複雑性のために、いくつかの種を同定することが可能であったが、反対に、隣接するピークの完全な分離を実施することは困難であった。しかし、特定のmz値に対応したシグナルろ過によって、共溶出された種を分離することが可能であった。同定された種の例を図1bに報告する。MSMSスペクトルをそれぞれの種について得た。例えば、図1cは、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養からの試料について選択された、14937mz値に対応するスペクトルを示す。NCBInrデータベースでの配列検索のために、以下のパラメータを特定した属、イオン認識のためのmzトレランス比、、および分析のために使用した計測装置。プランタリシンAの存在が、LプランタルムDC400単一培養およびDPPMA20単一培養の両方、ならびにDC400株が他の乳酸菌と培養されたすべての共培養について観察された。以前の結果に基づいて、単一培養および共培養からの試料を、他のペプチド汚染を除外するために、4回のクロマトグラフィーの実施を使用して精製し、ナノESIMSを使用してさらに分析した。LプランタルムDC400で合成されたプランタリシンAの濃度を、逆相C18XTerraカラムおよびOPA法を使用して、クロマトグラフィー分析によって求めた。図2は、様々な条件下でのプランタリシンAの濃度を示す。ペプチドフェロモンの合成収率が、単一培養からLロシアエDPPMA174の存在下での共培養条件で増大するのを観察することが可能である。ある特定の実験条件下で、プランタリシンAの濃度は約40μgmlである。他の乳酸菌種との共培養条件下でもプランタリシンAの産生が観察されたが、得られた量は、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA74共培養より著しく低い。この結果は、ペプチドフェロモンの合成は、シグナル分子の放出を誘導するのに適した特定の微生物相互作用の存在下で特異的であることを証明する。プランタリシンAの合成は、中間の指数増殖期の間に始まり、最大で指数相の最後まで増大する。より低い濃度、すなわち、約002006mgmlであるが、K型およびN型プランタリシンも、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養においてのみ観察された。共培養の基質としてCDM、グレープマスト、乳清、または果実および植物性産物の水性抽出物を使用して、同じ結果が得られた。ラクトバシラスロシアエDPPMA174の増殖動態LロシアエDPPMA174を、25μgmlの精製された、または化学合成されたプランタリシンAを添加したWFH培地上で培養した。図3において、精製されたプランタリシンAの存在は、細胞数の顕著な減少、すなわち、918±026から84±014logufcmlをもたらしたことが観察される。同様の結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。両方のこれらの場合において、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養について見出されたものと同様の結果が観察された。培養が精製された、または化学合成されたプランタリシンAの存在下で実施された場合の損傷または死亡したLロシアエDPPMA174細胞数は、DPPMA174単一培養より著しく高かった。得られたデータは、LロシアエDPPMA174に対するLプランタルムDC400の阻害効果は、プランタリシンA、およびおそらく、同じ化学的クラスに属する他のペプチドフェロモンの合成から生じることを示す。LロシアエDPPMA174のタンパク質発現レベルの変動単一培養と比較して、LプランタルムDC400との共培養、または精製されたプランタリシンAの存在下で培養されたLロシアエDPPMA174の細胞質ゾル抽出物の二次元電気泳動分析は、それぞれ、51および27タンパク質の発現レベルの変動を示す。プランタリシンAの存在下で高発現したすべてのタンパク質は、共培養条件下でも高発現した。例として、図4は、単一培養、LプランタルムDC440との共培養、および精製されたプランタリシンAの存在下での単一培養条件を指すゲルの一部を示す。より高発現したタンパク質のいくつかは、質量分析を使用して同定され、タンパク質生合成、エネルギー代謝、タンパク質およびアミノ酸の異化、環境ストレス応答、ならびに酸化還元電位恒常性に関与することが見出された。これらのタンパク質の大部分は、環境ストレス条件に対する応答およびまたは細胞コミュニケーション機構として、他の乳酸菌においても同定された。特に、グルコース6リン酸脱水素酵素は、大腸菌細胞のプログラム死の機構におけるフラトリサイドペンタペプチドの放出を触媒する。得られた結果は、プランタリシンA合成の結果としてのLロシアエDPPMA174の阻害効果は、細胞コミュニケーション機構に基づき、おそらく、標的微生物の死をもたらす応答を誘発するのに適していることを示す。これらの結果は、シグナル分子の殺菌価を証明する。再生表皮についてのアッセイおよびTEER測定25μgmlのプランタリシンA濃度を伴うプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養からのバイオマス試料、ならびに25μgmlの同じ濃度の共培養由来の精製されたプランタリシンAの両方を、SkinEthicモデルによる再生ヒト表皮の処置についてアッセイした。このモデルは、科学界によって広く使用され、認められているbyLactobacillusplantarumDSMZ19463functionalgrapemustbeverageanddermatologicalapplication、ApplBiotechnolMicrobiolDOI101007S0025300923704。24時間処置した後、TEER測定を実施した。このタイプの分析は、国際的な科学界によって広く認められており、角質層の完全性、および関門機能を参照として採用して組織腐食を評価する。特に、この評価を使用して、角質層レベルでの層状の緻密な構造の存在、タイトな完全な接合部、および表皮の厚さについての情報を得ることが可能である。これらの要因は、全体として効率的な関門機能を定義する。図5は、プランタリシン含有バイオマス、および対象の共培養由来の精製されたプランタリシンAの存在の両方において、TEER値の有意な増大が起こり、したがって、皮膚レベルでのこの分子の保護活性を実証する。同じ結果が、化学合成されたプランタリシンAを使用して得られた。現在の最新技術によれば、細菌細胞コミュニケーション機構に関与するペプチドフェロモンの適用のこの最初の例は、表皮ヒト細胞によって感知されるのに適しており、関門機能の刺激をもたらす。Caco2TC7細胞についてのアッセイCaco2TC7細胞の生存能を、ニュートラルレッド色素吸着能力として評価した。DMEM培地と比較して、精製されたプランタリシンAを用いた24~72時間のインキュベーションは、Caco2TC7細胞の生存能を著しく増大させた。同じ結果を、化学合成されたプランタリシンAを使用して得た。プランタリシンAに使用した同じクロマトグラフィー条件によって溶出した、LロシアエDPPMA174単一培養で精製した画分に由来する試料を使用する処置によって、誘導はまったく観察されなかった。予期されたように、Caco2TC7細胞のγインターフェロンへの曝露は、顕著な生存能減少をもたらした。反対に、IFNγの負の効果は、精製された、または化学合成されたプランタリシンAを用いた同時の処置の存在下で完全に排除される。精製されたプランタリシンAの添加は、Caco2TC7細胞についてのTEER値の顕著な増大をもたらした。同じ結果が、Caco2TC7細胞を使用して観察された。DMEM培地と比較して、IFNγの添加により、TEER値が著しく低減した。しかし、精製された、または化学合成されたプランタリシンAの添加により、この場合も、負の効果が排除された。Caco2TC7細胞は、腸粘膜をシミュレートするためにインビトロで最も使用される系の1つである。腸粘膜の腫瘍起源であるが、前記細胞は、成熟した腸細胞に自発的に分化させ、刷子縁酵素を発現させるのに適している。培養条件下で、Caco2TC7細胞は、完全性がTEER測定によって判定される、タイトな細胞間接合部を含めた形態学的および機能的特性を発展させるのに適している。この試験の結果は、精製された、LプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養に由来する、または化学合成されたプランタリシンAは、腸粘膜の関門機能を刺激し、γインターフェロン処置の負の効果を防止するのに適していることを実証する。プランタリシンAを合成するための生物工学プロトコール、および皮膚科学的分野におけるその使用の開発本文の他の部分で上記に概略したように、プランタリシンAを合成するための生物工学的方法、および皮膚科学的分野におけるその使用を開発した。前記プロセスはamMRS培地上の純粋な培養液中でのLプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174の培養b細胞収集、洗浄、WFH、CDM、グレープマスト、乳清、または培地としての養分利用可能性のために適切にインテグレートしている野菜もしくは果実の水性抽出物中での再懸濁c30~37°C、好ましくは30°Cで、18~24時間、好ましくは24時間の共培養インキュベーションd遠心分離による細胞分離。プロセスの変形によれば、配合物は、乳酸菌細胞を含有することもできるe乾燥または凍結乾燥プロセスによる配合物の脱水f皮膚用配合物の生産を含む。実施例2創傷治癒における本発明によるバイオマスおよびプランタリシンAの効果についての試験方法培養したヒトケラチノサイトを、プランタリシンAまたはプランタリシンA含有バイオマスとともに1時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞を洗浄し、培地を復元した。創傷治癒試験は、損傷境界を越えて遊走し、したがって外傷を治癒するケラチノサイトの能力を促進または促進しないかにおける処置効果が評価されるように、細胞単層の連続性の機械的な中断を実施する工程からなる。この目的のために、上述したように処置したケラチノサイト単層を、刺激を施した後にさらに24時間にわたってインキュベートし、次いで固定し、ヘマトキシリンエオシン染色を使用して染色した。画像を、5倍対物レンズを使用して、光学顕微鏡で観察した。各画像について、最大細胞遊走限界およびこの限界の間の距離またはギャップをそれぞれ検出および計算した。結果図9において、創傷治癒アッセイの結果を報告する。細胞連続性の中断後に24時間インキュベートした後に、刺激されなかったケラチノサイト単層は、創傷の縁から及ぶいくつかの細胞を示す。しかし、細胞がヒアルロン酸で刺激される場合、細胞遊走は特に明らかである。この場合、実際に、外傷部のギャップは処置されなかった細胞より狭く、創傷治癒についての細胞遊走能力を立証している。細胞遊走能力を分析的に見積もるために、図10に報告するように、創傷の縁に輪郭を描き、これらを測定および分析した。プランタリシンAまたはプランタリシンA含有バイオマスでインキュベートされたケラチノサイトは、対照細胞と比較して、創傷の縁の間のギャップを低減する。対照と比較した治癒率の増大を図11に報告する。アッセイシステムヒト再生表皮使用した表皮モデルは、SkinethicLaboratories、Niceによって作製され、120μのバッチ平均厚さを有する、分化17日目からの05cm2の試料として使用される完全に分化した表皮は、空気液体界面で、多孔質ポリカーボネート不活性支持体上で、子ウシ血清を添加することなく、17日にわたって既知組成培地中で培養したヒトケラチノサイトから得るこの分化段階で、形態的な分析は、多層の生き生きした表皮および10を超える緻密な細胞層からなる角質層を示す。TEER測定経上皮電気抵抗は、皮膚の関門機能性の直接の測定法である。これは、厚さおよび構造の両方から全体として生じる組織の抵抗を反映する。これは、タイトな接合部レベル、外側の物質の貫通を保護する2層脂質構造での細胞間接触の完全性を反映する。TEERは、パラメータ、すなわちラット皮膚電気抵抗を区別するアッセイであり、エンドポイントとして角質層の完全性および関門機能を考慮する腐食性評価のためのEUが認証した試験である。これは、インビボで測定される場合、経表皮水喪失の尺度であるTEWLに反比例する。より高いTEWLは、関門機能のより高い損傷に対応し、一方、より高いTEERは、関門機能のより低い損傷に対応する。挿入の間、PBS1mlが投与され、経上皮電気抵抗がMillicellERS計測器を使用して測定される。様々な測定を各組織について実施した。図5は、3回の測定を3つの組織それぞれについて実施した、3つの組織についての平均を指すTEER値を示す。TEER値に関して、以下の特性が重要である角質層レベルでの層状の緻密な構造の存在、完全なタイトな接合部、および効率的な関門機能を全体として規定する表皮の厚さ。どの組織も、t0およびt24時間での測定を含む自己参照である。得られた結果は特に興味深く、実際に、プランタリシンAおよびプランタリシンA含有バイオマスの存在の両方において、TEERの顕著な増大が明らかである。この増大は、表皮の厚さの増大、ならびにタイトな接合部レベルでの角質層のより良好な緻密度および完全性の両方の誘導された結果である。実施例3プランタリシンA皮膚の関門機能の維持および回復のためのその役割についての試験この試験は、以下の目的が達成されるためのLプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養によって得られるプランタリシンAの使用に基づく陽性対照および市販の公知活性の陰性対照と比較したヒトケラチノサイト単層の遊走および増殖に対する効果の試験を通じた、創傷修復に対するバイオマス効果の評価。処置を、3つの連続の時間で、様々な濃度の対象のプランタリシンで実施する。リアルタイムPCRによる、陽性対照および市販の公知活性の陰性対照と比較したIL8、KGF、TGFβ1のようなメディエーター調節を評価する、考慮された時間および濃度での細胞損傷応答の分析。物質および方法細胞培養使用した細胞株は、1のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10の子ウシ血清、2mMのLグルタミン、1の非必須アミノ酸を添加したMEM培地中、5のCO2の高湿度雰囲気中で、37°Cでインキュベートした、滅菌したフラスコ内で培養したヒトNCTC2544ケラチノサイト細胞株709~717である。細胞は、単層として培養プレート表面に接着してインビトロで増殖する。創傷治癒による経時的な組織損傷治療に対する試験方法の原理実験は第1にコンフルエントな細胞単層の成長を伴う。引き続いて、カットが実施され、生じたギャップを、細胞が徐々に移動して損傷を修復する際に顕微鏡を使用して観察する。この瘢痕形成プロセスは、細胞株、創傷条件、および程度に応じて数時間から1日を超えて続く場合がある。実験手順○NCTC2544細胞を蒔き、37°Cで5のCO2とともに24時間培養する。○24時間後に、細胞増殖に対する血清効果を回避するために完全成長培地を無血清培地と置き換え、細胞を、37°C、5のCO2でさらに24時間インキュベートする。○24時間後に、細胞単層を、200μlのピペットチップで穏やかにブラッシングし、約1mmの幅の水平の線の跡をつけることによって機械的に損傷させる。次いで単層を洗浄し、試験される物質を添加した後、37°C、5のCO2で、72時間、プレートをインキュベートする。○細胞運動性に対する物質の効果を、位相差倒立顕微鏡を使用して評価し、様々な適切に選択された分析時間で画像を得る。○損傷治療は、画像処理ソフトウェアを使用して、カットして0、4、8、12、24、48、72時間後に、カット部と2つの遊走前線との間のクリアな領域を測定して判定する。○各実験のすべてのデータは、0、4、8、12、24、48、および72時間での測定についてExcelで統計的に処理する。リアルタイムPCRを使用するIL8、KGF、TGFβ遺伝子発現の評価による細胞損傷応答の分析手順は、3つの基本的な工程からなるI細胞からのトータルRNAの抽出IIcDNAにおけるレトロ転写IIIリアルタイムPCRI細胞からのトータルRNAの抽出1のペニシリンおよびストレプトマイシンの存在下で、10の子ウシ血清、2mMのLグルタミン、1の非必須アミノ酸を添加したMEM培地中、5のCO2の高湿度雰囲気中で、37°Cでインキュベートした、培養フラスコ内で維持された、不死化されたNCTC2544ヒトケラチノサイト細胞株を使用する。細胞株を、200μlのピペットチップを使用してこすり、様々な時間および濃度で処置する。IIcDNAにおけるRNAレトロ転写このプロセスは、HighCapacitycDNAReverseTranscriptionKitを使用して抽出されたRNA試料の増幅を含む。IIIリアルタイムPCRこのプロセスは、特定のTaqman遺伝子アッセイ、およびTaqManUniversalPCRMasterMixwithAmperaseUNG2Xキットを使用するcDNA増幅を含む。陽性対照に対する標的遺伝子発現の可能な変動を求めるための相対的定量化を、2ΔΔCt法によるデータ正規化およびデータ分析のためのハウスキーピング遺伝子によって使用する。結果創傷治癒創傷治癒アッセイによる共培養由来プランタリシンのヒトNCTC2544ケラチノサイトの遊走を変更する能力を評価した。この試験は、合成プランタリシン、ならびにLプランタルムDC400およびLロシアエDPPMA174共培養由来プランタリシンの効果の比較による評価にも関係した。細胞単層上のカットを、200μlのピペットチップを使用して実施し、2本のカットラインの間のギャップ内の細胞を完全に取り出した後、前記細胞を、以下の濃度、すなわち01110μgmlの合成プランタリシンおよび共培養プランタリシンで処置する。陽性対照および陰性対照も二重に試験した。カット領域内の細胞遊走をモニターするために、同じカット領域上の画像を、時間0、ならびに4、8、12、24、48、および72時間後に取得した。図12~16は、NCTC2544細胞株遊走に対する共培養されたプランタリシンならびに合成プランタリシンの効果についての時間的分析を示す。図12は、試験された活性剤ならびに陽性対照および陰性対照の両方についての、それぞれの考慮された時間における瘢痕形成進行を示す。細胞瘢痕形成の初期段階の間、対照と試験された活性剤との間の細胞遊走において、時間0で意味のある差異を検出することは可能でない。図12aにおいて明らかなように、01μgmlおよび1μgmlの濃度の共培養されたプランタリシンは、対照と比較して細胞遊走を著しく加速するのに適していない。効果は、カットして4時間後にすでに著しく、最大72時間一定で著しいままである。10gmlの濃度の共培養されたプランタリシンを用いた処置は、代わりに、すべての考慮された間隔について、陽性対照、すなわち処置されていない細胞に匹敵する組織損傷の治療を生じる。合成プランタリシンの等価な濃度で、同じ時間的期間の細胞処置を用いて実施した同様の実験は、この場合も、プランタリシンを用いた処置は、陰性対照と比較して、2本のカットライン内の細胞遊走を促進するより大きい能力を有することを証明した。特に、この場合も、細胞瘢痕形成の初期段階の間、2つの使用した対照および2つの試験下の活性剤の両方について、細胞遊走において、時間0で意味のある差異を検出することは可能でない。図12bは、それぞれ01μgmlおよび10μgmlの濃度の合成プランタリシンは、カットして4時間後にすでに陽性対照および陰性対照の両方より高い細胞遊走の増大を生じさせ、最大72時間まで、考慮されたすべての時間間隔で一定のままであることを示す。10μgmlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、代わりに、陽性対照および陰性対照に匹敵する組織損傷の治療を生じる。すべての考慮された時間間隔において、陽性対照および陰性対照に対する共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いた処置の効果をより完全に構成し、分析するために、本発明者らは、画像解析から得られる測定を統計的に分析した。図13および14は、それぞれ共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いた処置の両方について、陽性対照と比較した、2本のカットラインを通じて遊走した細胞の百分率としてデータを報告する。また、それぞれ2本のカットラインの面積および初期面積についての面積百分率として、結果を報告する。図13および14中で報告したチャートは、それぞれ陽性対照および陰性対照、共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンについての、様々な考慮された時間間隔の間に遊走した細胞の百分率に関するデータを示す。画像処理から得られるデータと一致して、処置をして最初の8時間後に、陰性対照はカットの瘢痕形成活性を持続せず、陽性対照と同様の遊走した細胞の百分率を与える。共培養されたプランタリシンに関して、一般論として、3つすべての使用した処置濃度で、最低濃度の処置でも、時間0から最大72時間の処置までの細胞遊走のより大きい増大を略述することが可能であることを断言することが可能である。特に、10μgmlの濃度の共培養されたプランタリシンを用いた処置は、72時間の処置後を除いてすべての考慮された時間間隔で最高の遊走百分率値を示すが、それぞれ16556、13818、13464、11808、13907、および14904の遊走した細胞の百分率値を有するこれらのデータは有意でない。図14は、合成プランタリシンの等価な濃度で、様々な考慮された時間間隔での処置後の遊走した細胞の百分率を示す。01μgmlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、すべての考慮された時間間隔について、遊走した細胞の最高の百分率値を生じ、開始時間から最大72時間の処置まで、それぞれ15830、11515、12432、14182、14191、および12851の値を有する。10μgmlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、01μgmlの濃度の同じ活性剤を用いた処置と比較して、すべての考慮された時間間隔について、遊走した細胞の百分率をもたらすが、同時に、8時間から最大72時間の処置後の陰性対照と比較して、遊走した細胞の百分率のより高い上昇をもたらし、百分率の上昇はそれぞれ、462、2028、1484、および747である。反対に、1μgmlの濃度の合成プランタリシンを用いた処置は、12時間および24時間の処置後のみ、陰性対照と比較して、遊走した細胞の百分率のより大きい上昇を生じ、それぞれ986および1548の百分率値である。同じ濃度の共培養されたプランタリシンおよび合成プランタリシンを用いた細胞の処置は、すべての考慮された時間間隔において、陰性対照より高い遊走した細胞の百分率上昇をもたらさないが、共培養されたプランタリシンを用いて処置されたヒトNCTC2544ケラチノサイトに対する創傷治癒アッセイの結果と、同じ条件下での合成プランタリシンからの結果の比較は、共培養されたプランタリシンは、考慮された陰性対照と比較して、生じさせたカット領域を通じた細胞遊走についてより大きい効果を有することを実証することを可能にした。TGFβ1遺伝子は、瘢痕形成プロセスに最も関与する。創傷治癒モニタリングのために考慮されたすべての時間の中で、瘢痕形成評価から得られたデータの確認として、遺伝子発現の評価を、処置して8時間後に実施した。得られた結果により、瘢痕形成に対するコンネクチビンの顕著な効果が略述および確認される。合成プランタリシンについてのデータに関して、同じ濃度で、共培養されたプランタリシンが遺伝子発現のより高い増大を刺激することを立証することが可能であっても、遺伝子発現は著しく増大し、バイオマス効果のさらなる確認であることが注目される。