"細胞集団のうち、80超の細胞が胚体内胚葉系definitiveendodermlineageに特徴的なマーカーを発現する、細胞集団。細胞集団のうち、80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.グルコース濃度が10.5mMを超えない培地中で、多能性幹細胞集団を、細胞集団のうち80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む、方法。前記多能性幹細胞集団が、アクチビンAとWntリガンドとを用い、細胞集団のうち80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される、請求項2に記載の方法。前記多能性幹細胞集団が、GDF-8と、アニリン-ピリジノトリアジン、環状アニリン-ピリジノトリアジン、N-{[1-フェニルメチルアゼパン-4-イル]メチル}-2-ピリジン-3-イルアセトアミド、4-{[4-4-{[2-ピリジン-2-イルアミノエチル]アミノ}-1,3,5-トリアジン-2-イルピリジン-2-イル]オキシ}ブタン-1-オール、3-{3-[4-{2-[メチルピリジン-2-イルアミノ]エチル}アミノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]ピリジン-2-イル}アミノプロパン-1-オール、N~4~-[2-3-フルオロフェニルエチル]-N~2~-[3-4-メチルピペラジン-1-イルプロピル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-2,4-ジアミン、1-メチル-N-[4-ピリジン-3-イル-2-{[3-トリフルオロメチルフェニル]アミノ}-1,3-チアゾール-5-イルメチル]ピペリジン-4-カルボキサミド、1,1-ジメチルエチル{2-[4-{5-[3-3-ヒドロキシプロピルフェニル]-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル}アミノフェニル]エチル}カルバマート、1,1-ジメチルエチル{[3-{5-[5-3-ヒドロキシプロピル-2-メチルオキシフェニル]-1,3-オキサゾール-2-イル}アミノフェニル]メチル}カルバマート、1-{5-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-オール、1-{4-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-カルボキサミド、及び2-{[4-1-メチルエチルフェニル]アミノ}-N-2-チオフェン-2-イルエチル-7,8-ジヒドロピリド[4,3-d]ピリミジン-65H-カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも1つの他の因子と、を用い、細胞集団のうち80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される、請求項2に記載の方法。前記少なくとも1つの他の因子が14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンである、請求項4に記載の方法。グルコース濃度が5.5mMを超えない、請求項2に記載の方法。よりβ細胞に類似している、機能性のインスリン発現細胞を生成するためのinvitro法の開発が未だに強く求められている。本発明は、細胞集団の80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。一実施形態では、本発明は、細胞集団を提供し、この細胞集団のうち、80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する。一実施形態では、本発明は、細胞集団のうち、80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成する方法であって、a.多能性幹細胞集団を培養する工程と、b.グルコース濃度が10.5mMを超えない培地中で、多能性幹細胞集団を、細胞集団のうち80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む、方法を提供する。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、発明を実施するための形態を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。定義幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し、分化して後代細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉層内胚葉、中胚葉及び外胚葉から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉層の組織を生じ、胚盤胞への注入後、すべてではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。幹細胞は、発生能によって、1全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、2全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、3細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性例えば、造血幹細胞HSCは、HSC自己再生、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素例えば、血小板を含む後代を産生できる、4複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに51つの細胞系例えば、精子形成幹細胞を生じる能力を意味する単能性に分類される。分化は、専門化されていない中立の又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導した細胞は、細胞系内でより専門化された分化決定された状況を示す細胞である。分化プロセスに適用した際の用語傾倒したは、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて又は傾倒していない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞に由来するか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系とは、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞又はステージ1細胞又はステージ1とは、以下のマーカー、すなわち、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix-様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、eomesoderminEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99、又はOTX2のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のマーカー、すなわち、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、又はPROX1のうちの少なくとも1つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。本明細書で使用するとき、胚体内胚葉は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99、及びMIXL1を発現する。本明細書で使用するときマーカーとは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。本明細書で使用するとき、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン発現細胞又は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞とは、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが可能な細胞を指す。多能性幹細胞の単離、増殖及び培養多能性幹細胞の特徴付け多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原SSEA3及び4、並びにTra-1-60及びTra-1-81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を発現するThomsonら、Science282:1145,1998。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、SSEA-4、Tra-1-60、及びTra-1-81の発現が減少し存在する場合、SSEA-1の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を4パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者VectorLaboratoriesBurlingameCalif.によって記載されるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有しする。未分化の多能性幹細胞はまた、RT-PCRにより検出されるように、一般にOCT4及びTERTも発現する。増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、3つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症SCIDマウスに注入し、4パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを3つの胚葉由来の細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を3つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は正常な核型を有することが望ましく、正常な核型とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性幹細胞の供給源使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期必ずしもではないが、通常は妊娠約10~12週よりも前に採取した前胚性組織例えば胚盤胞など、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞株H1、H7及びH9WiCellなどのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株が挙げられる。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される1次多能性細胞である。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、BG01vBresaGen,Athens,GAなどの変異型ヒト胚幹細胞株も好適である。一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Thomsonらに開示される方法の通りに調製される米国特許第5,843,780号;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133ff.,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:7844,1995。多能性幹細胞の培養一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、基本的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、ほぼ分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。多能性幹細胞を分化させずに無フィーダー培養液中で増殖させる際には、以前に他の細胞種を予め培養しておいて馴化させた培地を使用することでこの操作が支持される。代替的に、多能性幹細胞を無フィーダー培養液中で分化させずに増殖させる際は、合成培地を使用することでこの操作が支持される。一実施形態において、多能性幹細胞は、ReubinoffらNatureBiotechnology18:399~4042000に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Thompsonらに開示されている方法に従ってマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよいScience6November1998:Vol.282.no.5391,pp.1145~1147。あるいは、多能性幹細胞は、RichardsらStemCells21:546~556,2003に開示されているフィーダー細胞層の任意の1つの上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、WangらStemCells23:1221~1227,2005に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態では、多能性幹細胞は、StojkovicらStemCells200523:306~314,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、MiyamotoらStemCells22:433~440,2004に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、AmitらBiol.Reprod68:2150~2156,2003に開示されるヒトフィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、InzunzaらStemCells23:544~549,2005に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、米国特許出願公開第2002/0072117号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6642048号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005014799に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、XuらStemCells22:972~980,2004に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2007/0010011号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0233446号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第6800480号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005065354号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、国際公開第2005065354号に開示される培養培地中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005086845号に開示される培養培地中で培養されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞は、CheonらBioReprodDOI:10.1095/biolreprod.105.046870,October19,2005に開示される方法に従って培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、LevensteinらStemCells24:568~574,2006に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0148070号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開2005/0244962号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開第2005086845号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。多能性幹細胞は、好適な培養基質上に播くことができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体-リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はMATRIGEL登録商標BectonDickensonである。MATRIGEL登録商標は、Engelbreth-HolmSwarm腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な希釈率にて播かれてもよい。これらの特徴のすべては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。好適な培地は、以下の成分、すなわち例えば、ダルベッコ改変イーグル培地DMEM、Gibco11965-092;ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地KODMEM、Gibco10829-018;ハムF12/50DMEM基本培地;200mML-グルタミン、Gibco15039-027;非必須アミノ酸溶液、Gibco11140-050;β-メルカプトエタノール、SigmaM7522;ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF、Gibco13256-029等から調製することもできる。多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成本発明は、多能性幹細胞集団からの、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の生成方法を提供する。一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌系マーカーを発現する細胞へと更に分化させる方法を提供する。一実施形態では、この操作は、段階的分化プロトコルを用いて実施される。このプロトコルでは、まず始めに、多能性幹細胞集団は胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。次に、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。次に、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化される。本発明は、80超の細胞が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。この細胞集団は更に処理されて、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成してもよい。この膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は更に処理されて、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成してもよい。分化の効率は、処理した細胞集団を、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤例えば、抗体などに暴露することにより測定することができる。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。この方法としては、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RT-PCR、ノーザンブロット、インサイツハイブリダイゼーション例えば、CurrentProtocolsinMolecularBiologyAusubelら、eds.2001supplementを参照されたい、並びにイムノアッセイ、例えば、免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティング、及びインタクトな細胞で利用できるマーカーについてのフローサイトメトリー分析FACS例えば、Harlow及びLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress1998参照が挙げられる。多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81の1つ以上の発現が挙げられる。多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばCXCR4等のタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤例えば、抗体等に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株H9NIHコード:WA09、ヒト胚性幹細胞株H1NIHコード:WA01、ヒト胚性幹細胞株H7NIHコード:WA07、及びヒト胚性幹細胞株SA002Cellartis,Swedenが挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、及びTra1-81のうちの少なくとも1つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix様ホメオボックスタンパク質、FGF4、CD48、エオメソダーミンEOMES、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、c-Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9、及びPROX1からなる群から選択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。膵内分泌系に特徴的なマーカーは、NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3、及びPTF-1αからなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも1つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、PDX1と、以下の転写因子、すなわち、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。多能性幹細胞からの胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成本発明の一態様では、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で多能性幹細胞を培養することで、多能性幹細胞集団は胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化されてもよい。一実施形態では、多能性幹細胞集団の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団への分化は、多能性幹細胞をアクチビンA及びWntリガンドにより活性化処理することで実施される。別の実施形態では、多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団への分化は、GDF-8と、次の:アニリン-ピリジノトリアジン、環状アニリン-ピリジノトリアジン、N-{[1-フェニルメチルアゼパン-4-イル]メチル}-2-ピリジン-3-イルアセトアミド、4-{[4-4-{[2-ピリジン-2-イルアミノエチル]アミノ}-1,3,5-トリアジン-2-イルピリジン-2-イル]オキシ}ブタン-1-オール、3-{3-[4-{2-[メチルピリジン-2-イルアミノ]エチル}アミノ-1,3,5-トリアジン-2-イル]ピリジン-2-イル}アミノプロパン1-オール、N~4~-[2-3-フルオロフェニルエチル]-N-2~-[3-4-メチルピペラジン-1-イルプロピル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-2,4-ジアミン、1-メチル-N-[4-ピリジン-3-イル-2-{[3-トリフルオロメチルフェニル]アミノ}-1,3-チアゾール-5-イルメチル]ピペリジン-4-カルボキサミド、1,1-ジメチルエチル{2-[4-{5-[3-3-ヒドロキシプロピルフェニル]-4H-1,2,4-トリアゾール-3-イル}アミノフェニル]エチル}カルバマート、1,1-ジメチルエチル{[3-{5-[5-3-ヒドロキシプロピル-2-メチルオキシフェニル]-1,3-オキサゾール-2-イル}アミノフェニル]メチル}カルバマート、1-{5-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-オール、1-{4-[6-{4-[4-メチルピペラジン-1-イルスルホニル]フェニル}アミノピラジン-2-イル]チオフェン-2-イル}メチルピペリジン-4-カルボキサミド、及び2-{[4-1-メチルエチルフェニル]アミノ}-N-2-チオフェン-2-イルエチル-7,8-ジヒドロピリド[4,3-d]ピリミジン-65H-カルボキサミドからなる群から選択される少なくとも1つの他の因子とで多能性幹細胞を処理することで実施される。使用に好適な因子の例は、米国特許出願公開第12/494,789号に見ることができる。一実施形態では、少なくとも1つの他の因子は14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンである。多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で約1日~約7日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で約1日~約6日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で約1日~約5日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で約1日~約4日間にわたって培養することができる。あるいは、多能性幹細胞集団は、グルコース濃度が10.5mMを超えない培地で約4日間にわたって培養することができる。一実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約500ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約50ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約5ng/mL~約25ng/mLの濃度で使用される。別の実施形態では、GDF-8は約25ng/mLの濃度で使用される。アクチビン-Aは、約1pg/mL~約100μg/mLの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約1pg/mL~約1μg/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約1pg/mL~約100ng/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約50ng/mL~約100ng/mLであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約100ng/mLであってもよい。Wntリガンドは、Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a及びWnt-7aからなる群より選択されてもよい。一実施形態において、Wntリガンドは、Wnt-1である。代替的な実施形態において、Wntリガンドは、Wnt-3aである。Wntリガンドは、約1ng/mL~約1000ng/mLの濃度で使用されてもよい。代替実施形態では、Wntリガンドは、約10ng/mL~約100ng/mLの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、Wntリガンドの濃度は約20ng/mLである。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成一実施形態では、本発明の方法により生成された胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当該技術分野の任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology24,1392~14012006に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、本発明の方法に従って得られた胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞の生成一実施形態において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当技術分野における任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化する。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、D’Amourら、NatureBiotechnology,2006に開示されている方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/736,908号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許出願公開第11/779,311号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許第60/953,178号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、米国特許第60/990,529号に開示される方法に従って処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させることができる。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例1ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化における培地及び播種プロトコルの役割継代数41のヒト胚性幹細胞株H1の細胞p41をTrypLEカタログ番号12604-013Invitrogen、CAにより剥離させ、MATRIGEL登録商標コーティングしたディッシュ1:30希釈で、20ng/mLのFGF2カタログ番号100-18BPeproTech、NJ及び10μMのY-27632Rhoキナーゼ阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100,000個/cm2で播種した。並行して、継代数41のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、Dispaseカタログ番号17105-041,Invitrogen,CAにより剥離させ、細胞コロニーとして、継代比1:3で、MATRIGEL登録商標コーティングしたディッシュ1:30希釈内の20ng/mlのFGF2を添加したMEF-CMに播種した。単細胞に分散させた状態での細胞培養及びコロニー状態での培養のいずれについても、播種後24時間及び48時間で、培地を20ng/mlのFGF2を添加した新鮮なMEF-CM培地と交換した。播種後72時間で、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた:a.追加で0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOを含有させ、2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加えて20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CAで1日、次に追加で0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムと2のBSA、Glutamaxと100ng/mlのアクチビンAを添加したMCDB-131で3日間培養した条件1、又はb.2脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IA及び100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加えて20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したRPMI-1640カタログ番号22400-105,Invitrogen,CAで1日間、次に2のBSA及び100ng/mlのアクチビンAを添加したRPMI-1640培地で、更に3日間、毎日同様の培地で培地交換して培養した条件2。4日目にFACS解析に備えて試料を回収した。図1では、CXCR4及びCD9発現に関してのフローサイトメトリー結果を、Y軸はCXCR4発現をプロットしX軸はCD9発現をプロットする分散プロット形式で示す。CXCR4、CD9、及びCD99他の分化マーカーを発現する細胞の割合を表1に要約する。細胞表面マーカーCXCR4及びCD99の発現の増加により測定される分化は、MCDB-131培地を使用した場合に改善され、CXCR4及びCD99の発現は、コロニー形態で培養する形式から単細胞を培養する形式へと変化させた場合に更に上昇した。更に、これらのデータは、フローサイトメトリーにより測定されたCD9の発現低下と相関した。CD9は未分化の細胞に関する細胞マーカーである。興味深いことに、図1において、クラスタ又はコロニー形式の形態のいずれかでMCDB-131を使用した場合、どちらのマーカーも陰性CXCR4-/CD9-である細胞はより少なくなることが示された。すなわち、MCDB-131培地で処理した培養物中には、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現していない細胞は、より少なかったことが示された。総じて、これらのデータは、H1ヒト胚性幹細胞は、RPMI-1640培地よりもMCDB-131培地の存在下でより効率的に分化し、かつMCDB-131の分化は、細胞をコロニー形式で播種及び培養するよりも、単細胞として播種及び培養することでより改善され得ることを意味する。実施例2ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるグルコースの役割グルコースは可溶性のヘキソース糖であり、Ames’培地;イーグル基本培地BME;Fitton-Jackson変法BGJb培地;Click’s培地;CMRL-1066培地;ダルベッコ改変イーグル培地DMEM;DMEM/HamF-12栄養培地50:50;Coon’s変法F-12培地;Fischer’s培地;H-Y培地Hybri-Max登録商標;Iscove’s改変ダルベッコ培地IMDM;McCoy’s5A改変培地;MCDB培地;培地199;イーグル最少培地EMEM;NCTC培地;HamF-10栄養培地;HamF-12栄養培地;Kaighn変法HamF-12栄養培地F12K;RPMI-1640;無血清/無タンパク質ハイブリドーマ培地;Waymouth培地MB;Williams培地E並びに各種専用培地など、ほとんどすべての細胞培養培地に添加される。http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.htmlを参照されたい。細胞培養培地に含まれるグルコース濃度は異なる。MCDB系の培地では、グルコースは3.9~10mMの範囲の濃度で含有され、ほとんどの培地は1g/L5.5mM~10g/L55mMの範囲の濃度でグルコースを含有するのに対し、RPMI-1640はグルコースを11mM含有する。10mMのグルコース濃度は、細胞培養系では、糖尿病条件と類似する。invivoの細胞及び分子に影響を及ぼすものと同様の工程がinvitroにおいても生じ得ることから、この濃度の類似性は重要である。本質的に糖尿病性のものである条件下で細胞を増殖させると、細胞及び細胞産物は糖化及び糖酸化glyoxidation過程により変更を受け、グルコースに介在される酸化及びカルボニルストレスにより損傷を受ける恐れがある。http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/glucose.htmlを参照されたい。現在、胚性内胚葉の生成に使用されている培地としては、例えば25mMのグルコースを含有しているIscove’s改変ダルベッコ培地IMDMKuboら;April1,2004,Development131,1651~1662、11mMのグルコースを含有しているRPMID’Amourら、NatBiotechnol.2005Dec;2312:1534~41又は17.5mMのグルコースを含有しているDMEM-F12が挙げられる。これらの各培地のグルコース濃度は糖尿病性の条件と同様10mMを超える。これらを踏まえ、我々は、高グルコース培養培地により細胞に生じ得るストレスを減少させるために、ヒト胚性幹細胞を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させる際にグルコース濃度を10mMよりも低くすることを試みた。グルコース濃度が10mMよりも低い培地としては、例えば、基本的にグルコース濃度が5.5mMであるMCDB-131が挙げられる。継代数41のヒト胚性幹細胞株H1の細胞p41をTrypLEカタログ番号12604-013,Invitrogen,CAにより剥離させ、MATRIGEL登録商標コーティングしたディッシュ1:30希釈で、20ng/mLのFGF2カタログ番号100-18BPeproTech,NJ及び10μMのY-27632Rhoキナーゼ阻害剤、カタログ番号Y0503Sigma、MOを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、個別の細胞として密度100,000個/cm2で播種した。播種後24時間及び48時間の時点で、培地を20ng/mlのFGF2を含有させた新鮮なMEF-CMと交換した。72時間後、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた。a.2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOと使用濃度のGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mLのアクチビンARDSystems,MNと20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNと、0、5、10、15、20、又は25mMのいずれかの濃度のグルコースカタログ番号G8769,Sigma,MOを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CA培地で1日培養し、次にb.2のBSAと重炭酸ナトリウムとGlutamaxと100ng/mLのアクチビンAと、0、5、10、15、20、又は25mMのいずれかの濃度のグルコースを添加したMCDB-131培地で更に3日間培養した。4日目に、FACS解析、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析、並びにViaCount登録商標Guava登録商標,Millipore,Billerica,MAによる細胞計数のために、試料を回収した。実施例1で得られた結果と同じく、多能性幹細胞から胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた細胞は、胚体内胚葉系に関連するマーカーを強く発現していた図2A。培地に添加されるグルコース濃度が0、5、10、15、20、又は25mMそれぞれ最終濃度:5.5、10.5、15.5、20.5、25.5,又は30.5mMである場合、図2Bに示す通り、更に10mMのグルコース最終グルコース濃度15.5mMで処理した試料において、細胞数の最も穏やかな増加が観察された。図2Aに示す通り、更に5mMグルコース最終グルコース濃度10.5mMを添加した場合、細胞ではCXCR4発現の中程度の増加が観察された。しかしながら、細胞数及びCXCR4の増加は、合計細胞生存率の低下により相殺された図2B。基本濃度のグルコース5.5mMでは、培養物中のほとんどすべての細胞がSOX17陽性であり、細胞は培養皿中に均一に分散していた図3A及びB。グルコース濃度を増加させると、細胞は、SOX17の高発現を維持しつつもクラスタを形成するようになったことが観察された。これらのクラスタを形成している細胞は、基本濃度のグルコースで培養した細胞集団と比べ、培養皿表面に不均一に分散していた。この影響は、クラスタを形成した細胞において、未分化細胞の細胞マーカーCD9及びOCT4、並びに胚体外外胚葉の細胞マーカーSOX7の発現が僅かに上昇し、かつホメオボックスHB9HLXB9としても公知である膵臓ホメオボックス1MNX1の遺伝子発現が減少したことと相関した図4。5.5mM低又は25mM高のいずれかの濃度でグルコースを含有させたDMEMカタログ番号10567-014及び21063-029,Invitrogen,CAで分化させた培養物においても、グルコース濃度に相関して同様の影響が観察された。上記のように、対照については、細胞は単細胞として播種し、MEF馴化培地で3日間培養し、5.5mM若しくは25mMのグルコースを添加したMCDB-131培地、又は2の脂肪酸不含BSAと100ng/mlのアクチビンAと20ng/mlのWNT-3aとを添加した高若しくは低グルコースDMEM培地で1日分化させ、続いて2脂肪酸不含BSAと100ng/mlのアクチビンAを添加した日用培養培地と交換して更に3日間培養した。MCDB-131培地により得られた結果、すなわち、グルコース濃度を上昇させることで、低濃度のグルコースで培養した場合と比較して胚胎内胚葉形成が阻害されるという結果と同様、DMEM中のグルコース濃度を上昇させた場合にhES細胞の分化が低下することが観察された。胚体内胚葉への分化後のフローサイトメトリーによると、5.5mMグルコースを含有している培地では細胞の88.6はCXCR4陽性であったのに対し、25mMグルコースを含有している培地ではCXCR4陽性細胞は80であった。加えて、qRT-PCRSOX17により測定したところ、高グルコースの細胞供給培地では、低グルコースの細胞供給培地と比べ、胚体内胚葉への分化マーカーが減少した一方で、未分化の細胞OCT4又は別の分化運命CDX2に関するマーカーが増加していた図5。この影響は、4日間の分化工程において分化を開始して48時間後に培地pHが低下したと我々が指摘する培地pHの変化に少なくとも部分的に起因した。更に、胚体内胚葉生成の開始及び終了時の培養培地のpHが高くなる程8.1>pH>7.6図6、より完全に胚体内胚葉へと変換された。要約すると、我々の示す結果により、細胞の80超が胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成するにあたり、基本濃度のグルコース5.5mMを分化培地に含有させれば十分であることが示される。分化培地に含まれるグルコース濃度を10.5mMに増加させた場合、この濃度は同様の集団を生成するのに十分な濃度であったものの、グルコース濃度が10.5mMを超えると、多能性/未分化度を示すCD9若しくはOCT4などのマーカーの発現が増加する、又は別の分化運命/胚体外外胚葉に関連付け得られるSOX7若しくはCDX2などのマーカーの発現が増加する恐れがある。実施例3ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるpH調整の役割継代数46のヒト胚性幹hES細胞株H1の細胞p46を、Dispaseカタログ番号17105-041,Invitrogen,CAにより剥離させ、細胞コロニーとして、MATRIGEL1:30希釈コーティングしたディッシュ内の、20ng/mlのFGF2を添加したMEF-CMに継代比1:3で播種した。次の通りに胚体内胚葉DEへの分化を開始するまで、毎日この培地を20ng/mlのFGF2を添加した新鮮なMEF-CMと交換した:a.2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加えて20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CA培地で1日培養し、続いて2のBSAとGlutamaxと100ng/mlのアクチビンAを添加したMCDB-131で更に3日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した;又はb.更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOを含有させ、2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加え20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したMCDB131培地で1日間培養し、続いて更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムを含有させ、2のBSAとGlutamaxと100ng/mlのアクチビンAを添加したMCDB-131で更に3日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。4日目に、FACS解析、リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析、並びにViaCount登録商標Guava登録商標,Millipore,Billerica,MAによる細胞計数のために、試料を回収した。実施例2で示す通り、我々は、分化培地のpHを比較的より酸性のものpH7.6未満にすることで、分化指向性が低下しかつ他の分化指向性が増加することに起因して、CXCR4発現が低下し得ることに気づいた。この効果がpHによるものなのか試験するために、我々は公開濃度の1g/Lの重炭酸ナトリウムを含有させたMCDB-131基本培地で細胞を分化させ、並びに重炭酸塩濃度3.7g/LのDMEMで細胞を分化させた。細胞表面マーカーCXCR4の発現の増加とCD9の発現の低下により分化を測定したところ、緩衝剤を使用することで分化が改善されることが観察された。緩衝剤として3.7g/lの重炭酸ナトリウムを添加したMCDB-131培地で分化させた細胞では、重炭酸ナトリウムを基本濃度1g/lで含有させたMCDB-131で分化させた細胞と比較して、有意にCXCR4の発現レベルが高くかつCD9の発現レベルは低かった図7A及びB。これは、MCDB-131培地のpHが7.5であり、かつ2.7g/lの重炭酸ナトリウムを添加することでpHが7.6に上昇していたことに一部起因する。更に、分化の終了時には、pH指示薬のフェノールレッドを含有させた未分化培地で増殖させた培養物の培地では、有意に黄色みが増し、酸性が増していたのに対し、重炭酸ナトリウムを添加し緩衝化させた培地で培養させた培養物は赤色を保持していた。これらの結果により、培地のpHを7.6以上に上昇させることで多能性幹細胞から胚体内胚葉へのより効率的な分化が促進され、また、培地のpHを上昇させかつ安定させるには、重炭酸塩系の緩衝剤の代わりに、限定するものではないが、CO2濃度を増加させたインキュベータ、並びにHEPES又はリン酸などのその他の可溶性緩衝系を使用することができることが示される。実施例4ヒト多能性幹細胞の胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化におけるRPMI-1640又はMCDB-131培地並びにTGF-βスーパーファミリーメンバーのアクチビンA及びGDF-8の役割継代数47のヒト胚性幹細胞株H1の細胞p47をTrypLEカタログ番号12604-013,Invitrogen,CAにより剥離させ、単細胞として、MATRIGEL登録商標コーティングしたディッシュ1:30希釈内の、20ng/mLのFGF2カタログ番号100-18B,PeproTech,NJ及び3μMのH-1152,glycylRhoキナーゼ阻害剤,カタログ番号555554,EMDchemicals,Gibbstown,NJを添加したMEF-CMマウス胚性線維芽細胞馴化培地に、密度100,000個/cm2で播種した。播種後72時間で、次の通りに培養物を胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させた:a.更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOを含有させ、2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加え20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CAで1日間培養し、次に更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムと2のBSAとGlutamaxと100ng/mlのアクチビンAを添加したMCDB-131で3日間培養した。b.更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOを含有させ、2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IA、1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのGDF-8RDSystems,MNに加え2.5μMのGSK3B阻害剤14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CAで1日間培養し、次に、更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムと2のBSAとGlutamaxと100ng/mlのGDF-8を添加したMCDB-131で3日間培養した。又はc.更に0.0025g/mlの重炭酸ナトリウムカタログ番号S3187,Sigma,MOを含有させ、2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと1XのGlutaMax商標カタログ番号35050-079,Invitrogen,Caと100ng/mlのGDF-8RDSystems,MNを添加したMCDB-131カタログ番号10372-019,Invitrogen,CAで4日間培養した。又はd.2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと100ng/mlのアクチビンARDSystems,MNに加え20ng/mlのWNT-3aカタログ番号1324-WN-002,RDSystems,MNを添加したRPMI-1640カタログ番号22400-105,Invitrogen,CAで1日間培養し、次に2のBSAと100ng/mlのアクチビンAを添加したRPMI-1640培地で、更に3日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。e.2の脂肪酸不含BSAカタログ番号68700,Proliant,IAと100ng/mlのGDF-8RDSystems,MNに加え2.5μMのGSK3B阻害剤14-プロパ-2-エン-1-イル-3,5,7,14,17,23,27-ヘプタアザテトラシクロ[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]ヘプタコサ-125,227,3,5,826,9,11,21,23-ノナエン-16-オンを添加したRPMI-1640カタログ番号22400-105,Invitrogen,CAで1日間培養し、次に2のBSAと100ng/mlのGDF-8を添加したRPMI-1640培地で、更に3日間、毎日同様の培地で培地交換して処理した。4日目に、FACS解析並びにqRT-PCRに備えて試料を回収した。表2に、CXCR4、CD9、及びCD99その他の分化マーカーを発現する細胞の割合を要約した。細胞表面マーカーCXCR4の発現の増加により測定された分化は、RPMI-1640を使用した場合よりもMCDB-131培地を使用した場合の方が改善され、CXCR4の発現は、アクチビンA及びWnt3aを使用した場合よりも、GDF-8とGSK3Bを組み合わせて使用した場合に更に上昇した。MNX-1遺伝子についてのqRT-PCRにより、MCDB-131培地を使用した場合に、RPMI-1640よりも分化が改善され、また、GDF-8とGSK3B阻害剤と組み合わせて使用した場合に、アクチビンAとWnt3aを併用した場合よりも分化が改善されるという同様の結果が観察された図8。更に、これらのデータは、フローサイトメトリーによって測定された、未分化の細胞に関する細胞マーカーのCD9発現の低下表2、又はqRT-PCRにより測定された、OCT4及びCD9の発現の低下図8と相関した。これらのデータは、H1ヒト胚性幹細胞の分化は、RPMI-1640培地よりもMCDB-131培地の存在下でより効率的であり、かつMCDB-131での分化効率は、細胞をGDF-8とGSK3B阻害剤の存在下で分化させることで、アクチビンAとWnt3aを用い分化させた場合よりも更に改善できることを意味する。本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。"