"a多形成を有するターゲットDNAの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、b前記ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする段階と、c検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、前記多形成を含むターゲットDNA配列の選択された領域に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された領域に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、d前記プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間のPCR断片を増幅させる段階と、e前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、ターゲットDNA内多形成の存在を示すターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出方法。前記プロープ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記RNA:DNA異型二本鎖内プローブのRNA配列のRNaseH切断から引き起こされることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブのRNA核酸配列は、前記ターゲットDNA内の多形成に相補的であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記多形成は、単一ヌクレオチド多型SNPであることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項1に記載の方法。前記蛍光標識は、FRET対を含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。前記PCR断片は、固体支持体に結合されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。a多形成を有するターゲットDNAの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、b前記ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、c検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、前記多形成位置で、野生型DNA配列を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、d前記プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間のPCR断片を増幅させる段階と、e前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、前記信号の減少は、前記ターゲットDNA内の多形成の存在を示すターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出方法。a多形成を有するターゲットRNAの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、b前記RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、c検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むcDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、d逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むRT-PCRDNA断片内の相補的な配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間の逆転写酵素PCR断片を増幅させる段階と、e前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、前記RNAターゲット内の多形成の存在を示すRNAターゲット内多形成のリアルタイム検出方法。前記プロープ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記RNA:DNA異型二本鎖内プローブのRNA配列のRNaseH切断から引き起こされることを特徴とする請求項10に記載の方法。前記プローブのRNA核酸配列は、前記ターゲットRNA内の多形成位置のcDNAに相補的なRNA配列を含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。前記多形成は、単一ヌクレオチド多型SNPであることを特徴とする請求項10に記載の方法。前記RNAターゲットは、mRNA転写体であることを特徴とする請求項10に記載の方法。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項10に記載の方法。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項10に記載の方法。前記蛍光標識は、FRET対であることを特徴とする請求項16に記載の方法。前記プローブまたはPCR断片は、固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項10に記載の方法。前記RNaseH活性は、ホットスタート、熱安定性の活性であることを特徴とする請求項10に記載の方法。a多形成を有するRNAターゲットの存在について試験されるサンプルを提供する段階と、b前記RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする段階と、c検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、前記多形成位置で、野生型DNA配列を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、d逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むRT-PCRDNA断片内の相補的な配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間の逆転写酵素PCR断片を増幅させる段階と、e前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階とを含み、前記信号の減少は、前記RNAターゲット内の多形成の存在を示すRNAターゲット内多形成のリアルタイム検出方法。a第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、b検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、c増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びRNaseH活性とを含むターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のためのキット。前記プローブのRNA核酸配列は、前記ターゲットDNA内多形成に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項21に記載のキット。前記多形成は、単一ヌクレオチド多型SNPであることを特徴とする請求項21に記載のキット。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項21に記載のキット。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項21に記載のキット。前記蛍光標識は、FRET対であることを特徴とする請求項25に記載のキット。前記プローブまたはPCR断片は固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項21に記載のキット。a第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、b検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置で、野生型DNA配列を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、c増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びRNaseH活性とを含むターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のためのキット。a第1増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、b検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、c逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液;及びRNaseH活性とを含むRNAターゲット内多形成のリアルタイム検出のためのキット。前記プローブのRNA核酸配列は、前記ターゲットDNA内多形成の位置に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項29に記載のキット。前記多形成は、単一ヌクレオチド多型SNPであることを特徴とする請求項29に記載のキット。前記プローブのDNA配列及びRNA配列は、共有結合されていることを特徴とする請求項29に記載のキット。前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項28に記載のキット。前記蛍光標識は、FRET対であることを特徴とする請求項33に記載のキット。前記プローブまたは逆転写酵素PCR断片は、固体支持体に結合されたことを特徴とする請求項29に記載のキット。前記逆転写酵素活性及び増幅ポリメラーゼ活性は、同一の分子で発見されることを特徴とする請求項29に記載のキット。a第1増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、b検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置で、野生型DNA配列を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、c逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液;及びRNaseH活性とを含むRNAターゲット内多形成のリアルタイム検出のためのキット。本発明は、DNA配列及びRNA配列を含む特異的プローブを使用するリアルタイムPCRの間、SNPの迅速な検出のための方法及びそのキットを開示するものである。前記方法は、コスト効率が高く、信頼するだけの方法であり、単一PCR断片上の一つ以上のSNPの高処理率検出highthroughputdetectionを促進するように保証する。一具現例において、多形成を有するターゲットDNAの存否について試験するサンプルを提供する段階と、第1増幅プライマーが、前記多形成位置positionofthepolymorphismの上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする、前記ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマーamplificationprimer対を提供する段階と、検出可能な標識labelと、DNA核酸配列及びRNA核酸配列とを含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的でありentirelycomplementary、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的substantiallycomplementaryである段階と、前記プローブ内のRNA配列が、多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列と、RNA:DNA異型二本鎖heteroduplexとを形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼamplifyingpolymerase活性、増幅緩衝液amplificationbuffer、RNaseH活性とプローブとの存在下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間のPCR断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、ターゲットDNA内の多形成の存在を示す、ターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。一様態で、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記RNA:DNA異型二本鎖内の、プローブのRNA配列のRNaseH切断に起因する。他の具体例において、多形成を有するターゲットDNAの存否について試験するサンプルを提供する段階と、第1増幅プライマーが、前記多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、前記多形成位置の下流にアニーリングする、前記ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階と、検出可能な標識、及びDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、前記多形成位置で、野生型wildtypeDNA配列を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、前記プローブ内のRNA配列が、多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間のPCR断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、前記信号の減少は、ターゲットDNA内の多形成の存在を示す、ターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。さらに他の具体例において、RNAターゲットを提供する段階と、前記RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする段階と、検出可能な標識、及び前記RNAターゲットのcDNAに実質的に相補的なDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、予想suspectedSNP配列位置の相応するcDNA配列に完全に相補的である段階と、逆転写酵素reversetranscriptase活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液、部位特異的sitespecificRNaseH活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のRNA配列が、RT-PCRDNA断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間の逆転写酵素PCR断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加を検出する段階と、を含み、前記信号の増加は、RNAターゲットのcDNA内の多形成の存在を示す、RNAターゲット内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される一様態で、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム増加は、前記RNA:DNA異型二本鎖内の、プローブのRNA配列のRNaseH切断に起因する。さらに他の具体例において、多形成を有するRNAターゲットについて試験されるサンプルを提供する段階と、前記RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対を提供する段階であり、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする段階と、検出可能な標識、及びDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブを提供する段階であり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置で、野生型DNA配列を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である段階と、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液、RNaseH活性とプローブとの存在下、及び前記プローブ内のRNA配列が、多形成位置で、野生型DNA配列を含むRT-PCRDNA断片内の相補的な配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、前記第1増幅プライマー及び第2増幅プライマー間の逆転写酵素PCR断片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識からの信号放出のリアルタイム減少を検出する段階と、を含み、前記信号の減少は、RNAターゲット内の多形成の存在を示す、RNAターゲット内多形成のリアルタイム検出のための方法が開示される。さらに他の具体例において、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びRNaseH活性とを含む、ターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のためのキットkitが開示される。さらに他の具体例において、第1増幅プライマーは、多形成位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成位置の下流にアニーリングする、ターゲットDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置で、野生型DNA配列を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びRNaseH活性とを含む、ターゲットDNA内多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。さらに他の具体例において、第1増幅プライマーは、多形成配列polymorphicsequence位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液及びRNaseH活性とを含む、RNAターゲット内の多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。さらに他の具体例において、第1増幅プライマーは、多形成配列位置の上流にアニーリングし、第2増幅プライマーは、多形成配列位置の下流にアニーリングする、RNAターゲットのcDNAにアニーリングすることができる増幅プライマー対と、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含むプローブであり、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置で、野生型DNA配列を含むcDNAの選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記cDNAの選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的であるプローブと、逆転写酵素活性、増幅ポリメラーゼ活性、逆転写酵素PCR緩衝液及びRNaseH活性とを含む、RNAターゲット内の多形成のリアルタイム検出のためのキットが開示される。前記多形成は、単一ヌクレオチド多型SNP:singlenucleotidepolymorphismであってもよい。前記ターゲットDNAは、ゲノムDNAgenomicDNAであってもよい。前記ターゲットRNAは、ゲノムRNAまたはmRNA転写体transcriptであってもよい。前記プローブのDNA及びRNA配列は、共有結合されてもよい。前記プローブ上の検出可能な標識は、FRET対のような、蛍光標識fluorescentlabelであってもよい。前記PCR断片またはプローブは、固体支持体solidsupport上に結合されたものであってもよい。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼであり、前記部位特異的RNaseH活性は、熱安定性RNaseHの活性またはホットスタートhotstart熱安定性RNaseH活性であってもよい。特定の具体例において、前記逆転写酵素及び増幅ポリメラーゼ活性は、同一の分子で発見される。本発明によれば、ターゲット核酸で、リアルタイムでSNPの存在を検出する能力を含む多数の利点を有する。前記検出方法は、迅速であり、正確であり、高処理率highthroughput適用に適する。異なる遺伝子座geneticlociでのSNP検出のための、便利であって、使いやすく、信頼するだけの診断キットdiagnostickitがさらに開示される。本発明の実施は、取り分けて明示されない場合、当該技術分野内の通常の分子生物学的技法を使用する。かような技法は、熟練技術者に周知であり、文献に十分に説明されている。例えば、Ausubelらによる、すべての補助資料supplementを含むCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileySons,Inc.,NY,N.Y.;SambrookらによるMolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.を参照する。取り分けて定義されない場合、本明細書で使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、当該技術分野の通常の技術者によって、一般的に理解されるところと同一の意味を有する。本明細書はまた、本出願の開示内容及び特許請求の範囲の解釈に一助とするための用語の定義を提供する。この定義が他のところでの定義と一致しない場合、本出願で提示された定義が優先される。用語多形成polymorphismは、互いに異なるゲノムgenomeまたは個体の間、または前記ゲノムまたは個体内で、二つ以上の代案的ゲノム配列genomicsequenceまたは対立遺伝子alleleの存在を指す。用語多形成のpolymorphicは、個体群内で、特定のゲノム配列の2以上の変異体variantが発見される状態を指す。用語多形成部位polymorphicsiteは、前記変異が発生する座位locusを意味する。多形成部位は、一般的に、2以上の対立遺伝子を有し、それぞれは、選択された個体群内で、有意な頻度で発生する。多形成座位polymorphiclocusは、1つの塩基対ほど小さく、その場合、単一ヌクレオチド多型SNP:singlenucleotidepolymorphismとされる。最初に同定された対立遺伝子形態が、任意に基準reference、野生型wildtype、一般commonまたは多数majorの形態と命名され、他の対立遺伝子形態は、代案的alternative、少数minor、レアrareまたは変異体variantの対立遺伝子と命名される。用語遺伝子型genotypeは、個体またはサンプルの中に含まれた遺伝子の対立遺伝子alleleに係わる記述を指す。用語単一ヌクレオチド多型SNP:singlenucleotidepolymorphismは、対立遺伝子間に異なる1つのヌクレオチド部位を指す。単一ヌクレオチドは、変化したり置換、ポリヌクレオチド配列から除去欠失されたり、または付加挿入される。挿入SNMPまたは欠失SNPは、翻訳フレームシフトtranslationalframeshiftを引き起こすことがある。単一ヌクレオチド多型は、遺伝子のコーディング配列codingsequence、遺伝子の非コーディング領域noncodingregion、または遺伝子間の遺伝子間領域intergenicregionに属することができる。コーディング配列内のSNPは、遺伝子コードの縮退性degeneracyにより、生産されるタンパク質のアミノ酸配列を必ずしも変化させるものではない。2つの形態がいずれも同一であるポリペプチド配列を引き起こすSNPは、同義的synonymousときには、沈黙突然変異とされると命名されるが、異なるポリペプチド配列が生産される場合、それらは、非同義的nonsynonymousである。非同義的変化は、ミスセンスmissenseまたはノンセンスnonsenseであり、ミスセンス変化は、異なるアミノ酸を生成させる一方、ノンセンス変化は、早期ストップコードンprematurestopcodonを引き起こす。機能的SNPfunctionalSNPは、遺伝子発現、または遺伝子産物の発現または機能に変化を誘発するSNPであり、従って、可能な臨床的表現型について、ほぼ予測性がある。機能的SNPによる遺伝子機能の変化は、コーディングされたポリペプチドの変化、mRNA安定性、DNAまたはRNAに係わる転写因子または翻訳因子の結合性変化などを含む。タンパク質-コーディング領域にないSNPは、遺伝子スプライシングsplicing、転写因子結合、または非コーディングRNAの配列に対して結果を示すことができる。一具現例よれば、熟練技術者は、SNPが、それぞれ染色体内に存在することができるヌクレオチドに該当する2つの代案的対立遺伝子を有するということを理解するであろう。従って、SNPは、4個のヌクレオチドA,C,G,Tのうち2個のヌクレオチドによって特徴づけられる。その例は、それぞれの染色体上の与えられた位置で、対立形質alleleCまたは対立形質Tを有するSNPである。これは、C>TまたはC/Tと表示される。さらに多く発生する対立形質が最初に表示されその場合、C、多数、一般または野生型の対立形質と呼ぶ。さらに少なく発生する代案的対立形質その場合、Tを、少数、レアまたは変異体の対立形質と呼ぶ。野生型及び変異体の対立形質は、それぞれ一般対立形質及びレア対立形質とされてもよい。人間は、それぞれの染色体が2個の写本で存在することを意味する二倍体有機体であるので、それぞれの個体は、1つのSNPで、2つの対立形質を有する。この対立形質は、同一な対立形質の2個の写本CCまたはTTであったり、または互いに異なる対立形質CTであってもよい。前記CC、CT及びTTを遺伝子型と呼ぶ。それらのうち、CC及びTTは、同一対立形質の2個の写本を有することを特徴とし、同型接合性homozygous遺伝子型とされる。遺伝子型CTは、それぞれの染色体上に異なる対立形質を有し、異型接合性遺伝子型である。同型接合体または異型接合体の遺伝子型を有する個体は、それぞれ同型接合性及び異型接合性とされる。SNPの選択一具体例は、任意の標的核酸配列内の一つ以上のSNPを検出するための新規の方法を提供する。目的遺伝子におけるSNPの位置決定は、SNPに係わる生物情報データベースを参考することにより、非常に容易に行われる。dbSNPは、生物情報センターNCBI:NationalCenterforBiotechnologyInformationから提供されるSNPデータベースである。SNPediaは、併合組職から提供されるウィキ様式wikistyleデータベースである。OMIMデータベースは、多形成と、例えば、疾病との関連性を文書形態で開示する一方、HGVbaseG2Pは、実質的な要約レベルの関連データを視覚的に質疑することができるようにする。SNPに係わる有用な情報は、ヒトゲノム全体にわたし、約5kbごとに1つの情報性SNPの遺伝子型を究明するための国際ハップマッププロジェクトInternationalHapMapProjectでも見つけることができる。ヒトDNA配列変異単相型haplotypeの一般的なパターンを決定し、かような情報を公衆領域で自由に利用可能とするために、ナイジェリア、ヨーロッパ及び中国/日本に由来した先祖を有する個体群の遺伝子型を分析した。この情報は、ありふれた疾病及び薬学的反応に影響を及ぼす配列変異体の発見を容易にするであろう。ヒト単相型の製作は、あつらえ型医薬personalizedmedicineのための重要な段階である。遺伝子型分析のためのプライマーの選択遺伝子及び関連SNPが選択されれば、ターゲット核酸配列の遺伝子型分析genotypingのためのプライマーオリゴヌクレオチド及びプローブを準備する。ターゲットDNAまたはターゲットRNAtargetDNAortargetRNAまたはターゲット核酸targetnucleicacidまたはターゲット核酸配列targetnucleicacidsequenceは、分析されなければならず、かつ関心ある多形成部位を含む核酸の領域を指す。ターゲット核酸配列は、PCR反応及び逆転写酵素PCR反応で、増幅のためのテンプレートとして使用される。ターゲット核酸配列は、天然分子及び合成分子をいずれも含んでもよい。例示的な核酸配列は、ゲノムDNAまたはゲノムRNAを含むが、これらに制限されるものではない。本明細書で使用される、用語核酸nucleicacidは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、変形されたり、または変形された塩基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、2個ないし60個のヌクレオチドを含む一本鎖ヌクレオチド重合体である。ポリヌクレオチドは、2個以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド重合体である。ポリヌクレオチドは、第2鎖が第1オリゴヌクレオチドの逆方向相補配列reversecomplementsequenceを有するオリゴヌクレオチドである、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを含んだ二本鎖DNA、デオキシチミジンを含む一本鎖核酸重合体、一本鎖RNA、二本鎖RNAまたはRNA/DNA異型二本鎖heteroduplexであってもよい。核酸は、ゲノムDNA;cDNA;hnRNA;snRNAl;mRNA;rRNA;tRNA;核酸断片fragmentednucleicacid;ミトコンドリアまたは染緑体のような細胞以下の小器官subcellularorganelleから得られる核酸;及び生物学的サンプル内に存在する微生物、DNAウイルスまたはRNAウイルスから得られる核酸を含むが、これらに制限されるものではない。核酸は、例えば、RNA及びDNAの場合のような単一形態の糖モイエティ、または、例えば、RNA/DNAキメラchimeraの場合のような異なる糖モイエティの混合物から構成されてもよい。本明細書で使用される用語オリゴヌクレオチドoligonucleotideは、プライマーprimerまたはポリヌクレオチドpolynucleotideと互換的に使用される。前記用語プライマーは、PCR反応で、DNA合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一般的に、約14ないし約35ヌクレオチドの長さであり、ターゲット配列の相補的な領域に混成化する。オリゴヌクレオチドは、当該技術分野に公知された化学的合成のような任意の適する方法によって、合成及び製造される。オリゴヌクレオチドはまた、商業的供給先を介して便利に利用可能である。熟練技術者は、PCR反応で、目的多形成部位の側面に配置されるflankプライマーを容易に最適化して識別することができるであろう。商業的に利用可能なプライマーが、特定のSNPについて、特定の目的遺伝子を増幅させるのに使用される。多数のコンピュータプログラム例えば、Primer-Expressが最適のプライマーセットをデザインするために容易に使用される。提供されたまたは、登録番号によって公衆によって利用可能な核酸情報に基づいたプライマー及びプローブが、それによって製造されるということは、当業者に自明であろう。用語アニーリングannealing及び混成化hybridizationは、互換的に使用され、二本鎖、三本鎖、またはその他高次構造の形態をもたらす、核酸とは異なる核酸の塩基対相互作用を意味する。特定の具体例において、一次的相互作用は、ワトソン/クリックWatson/Crick及びフーグスティーン型水素結合Hoogsteentypehydrogenbondingによる塩基特異的相互作用、例えばA/T及びG/Cである。特定の具体例において、塩基重畳basestacking及び疎水性相互作用が二本鎖安定性にも寄与することができる。実質的に相補的なsubstantiallycomplimentaryは、アニーリングして安定した二本鎖を形成するのに十分に相補的な配列の2つの核酸鎖を指す。当業者は、目的多形成部位の側面に配置されるPCRプライマーをいかようにデザインするか分かるであろう。合成オリゴヌクレオチドは、一般的に、約55°Cの融点TMを有する20ないし26塩基対の長さである。プライマーデザインのための側面配列flankingsequenceは、国際ハップマッププロジェクトによって制作された配置ファイルallocationfileで見つけることができる。このファイルは、観察された対立形質製造及びそれぞれの側面核酸テンプレート製造のための、100bpのNCBIによって隠されたNCBI-masked配列を含むそれぞれのSNPに係わる豊かな情報を含む。一部具体例において、サンプルは、精製された核酸テンプレート例えば、mRNA、rRNA、及びそれらの混合物を含む。サンプルからのRNAの抽出過程及び精製過程は、当該技術分野に周知である。例えば、RNAは、TRIzolTM試薬Invitrogen抽出法を使用して細胞から分離することができる。その後、例えば、NanodropTM分光光度計spectrophotometer及びAgilent2100バイオアナライザbioanalyzerを使用し、RNAの量と質とを決める。他の具体例において、前記サンプルは、pH約6ないし約9の溶解緩衝液lysisbuffer、約0.125ないし約2の濃度を有する双性イオン洗剤zwitterionicdetergent、約0.3ないし約2.5mg/mLの濃度を有するアジ化物azide及びプロテイナーゼKproteinaseKのようなプロテアーゼ約1mg/mLを使用して、細胞を溶解させて製造された細胞溶解物celllysateである。55°Cで15分間インキュベーションした後、95°Cで10分間、前記プロテイナーゼKを不活性化させ、高効率PCRhighefficiencyPCR分析または逆転写PCRreversetranscriptionPCR分析と相溶性がある、タンパク質が実質的に除去された溶解物を得る。一具現例において、1x溶解試薬は、12.5mMのトリスtrisアセテート、トリス-HClまたはHEPES4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸pH=7‐8;0.25w/vCHAPS、0.3125mg/mlアジ化ナトリウム及び1mg/mLのプロテイナーゼKを含む。本明細書で使用される用語溶解物lysateは、溶解された細胞残骸物及び核酸を含む液体相を指す。本明細書で使用される用語タンパク質が実質的に除去されたsubstantiallyproteinfreeは、ほとんどのタンパク質がプロテアーゼproteaseによるタンパク質分解によって不活性化された溶解物を指す。プロテアーゼは、プロテイナーゼKを含んでもよい。細胞溶解中でのプロテイナーゼKの添加は、不活性化されない場合、標的核酸を分解することができる、ヌクレアーゼnucleaseを速かに不活性化させる。用語タンパク質が実質的に除去されたは、不活性化されたタンパク質を除去するための処理を受けもするし、あるいは受けないこともある。本明細書で使用される用語細胞cellは、原核細胞または真核細胞を指す。一具現例において、前記用語細胞は、グラム陽性バクテリア、グラム陰性バクテリア、抗酸性acid-fastバクテリアなどを含むが、これらに制限されない微生物を指す。特定の具体例において、前記試験される細胞は、表面のスワップサンプル採取swapsamplingを使用して収集することができる。他の具体例において、前記細胞は、病原性有機体を指す。他の具体例において、サンプルは、ウイルス核酸、例えば、レトロウイルス核酸を含む。特定の具体例において、前記サンプルは、HIV-1またはHIV-2のようなレンチウイルス核酸を含んでもよい。本明細書で使用される、双性イオン洗剤zwitterionicdetergentは、CHAPS、CHAPSO及びバイン誘導体binederivative、例えば、望ましくは、商品名Zwittergent登録商標Calbiochem、SanDiego、CA及びAnzergent登録商標Anatrace,Inc.Maumee、OH下で市販されるスルホバインsulfobineを含むが、これらに制限されない、双性イオン特性を示す例えば、純電荷を有さず、電気伝導性conductivity及び電気泳動性electrophoreticmobilityを有さず、イオン交換樹脂に結合せず、タンパク質-タンパク質相互作用を破壊する洗剤を指す。一具現例において、前記双性イオン洗剤は、下記構造を有する、3-[3-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネートの略語であるCHAPSCAS番号:75621-03-3;SIGMAALDRICHから入手可能、商品番号C3023-1G米国登録特許第4,372,888号明細書によって詳細に記述されるである。追加的な具体例において、CHAPSは、全組成物において、約0.125ないし約2重量/体積w/vの濃度で存在する。追加的な具体例において、CHAPSは、全組成物において、約0.25ないし約1w/vの濃度で存在する。他の具体例において、CHAPSは、全組成物において、約0.4ないし約0.7w/vの濃度で存在する。他の具体例において、前記溶解緩衝液は、ノニデットNonidet、ツインTweenまたはトリトンX-100TritonX-100のような他の非イオン性洗剤を含んでもよい。本明細書で使用される用語溶解緩衝液は、25°Cで約6ないし約9のpKaを有する、pH値を6ないし9に効果的に維持させることができる組成物を指す。本明細書で記述される緩衝液は、一般的に、酵素活性の機能と両立可能であり、生物学的巨大分子がその本来の物理的及び生化学的機能を維持させる生理学的に適するphysiologicallycompatible緩衝液である。溶解緩衝液に添加される緩衝液の例は、4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPES、3-N-モルホリノ-プロパンスルホン酸MOPS、N-トリスヒドロキシメチルメチルグリシン酸Tricine、トリスヒドロキシメチルメチルアミン酸Tris、ピペラジン-N,N’-ビス2-エタンスルホン酸PIPES、及びアセテート含有緩衝液またはホスフェート含有緩衝液K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4などを含むが、これらに制限されるものではない。本明細書で使用される用語アジ化物azideは、化学式-N3で代表される。一具現例において、前記アジ化物は、一般的な殺菌剤と作用するアジ化ナトリウムNaN3CAS番号26628-22-8;SIGMA-ALDRICHからで購入可能、製品番号:S2002-25Gである。本明細書で使用される用語プロテアーゼproteaseは、ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有する酵素である。プロテアーゼはまた、例えば、ペプチダーゼpeptidase、プロテイナーゼproteinase、ペプチド加水分解酵素peptidehydrolaseまたはタンパク質分解酵素proteolyticenzymeともされる。本発明による用途のためのプロテアーゼは、ポリペプチド鎖に内部的に作用するエンド型endotypeエンドペプチダーゼendopeptidaseであってもよい。一具体例において、前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼKproteinaseKEC3.4.21.64;RocheAppliedSciencesから入手可能、組み換えプロテイナーゼK50U/mlPichiapastorisから由来Cat.No.03115887001であってもよい。プロテイナーゼKは、タンパク質を消化させ、核酸製剤nucleicacidpreparationから汚染物質を除去するのに使用される。核酸製剤へのプロテイナーゼKの添加は、不活性化されない場合、精製中にDNAまたはRNAを分解することができるヌクレアーゼを迅速に不活性化させる。前記酵素は、タンパク質を変性させる化学物質の存在下でも活性を示し、約95°Cの温度で、約10分間の処理時に不活性化されるので、本出願に非常に適する。一具現例において、リステリアListeriaサルモネラSalmonella及び大腸菌E.Coliのような、グラム陽性バクテリア及びグラム陰性バクテリアの溶解も、プロテイナーゼK1mg/mlを含む溶解試薬lysisreagentを必要とする。細胞溶解物中のタンパク質は、55°Cで15分間、プロテイナーゼKを処理し、次に、95°Cで10分間、プロティアナゼKを不活性化させることにより、消化させることができる。冷却後に、タンパク質が実質的に除去された溶解物は、高効率PCR増幅に適する。プロテイナーゼKと共に、または前記酵素の代わりに、溶解試薬は、トリプシンtrypsin、キモトリプシンchymotrypsin、エルラスターゼelastase、サブチリシンsubtilisin、ストレプトグリシンstreptogrisin、テルミターゼthermitase、アクアリシンaqualysin、プラスミンplasmin、ククミシンcucumisinまたはカルボキシペプチダーゼcarboxypeptidaseA,D,CまたはYのような、セリンプロテアーゼを含んでもよい。セリンプロテアーゼ以外に、前記溶解溶液は、パパインpapain、カルパインcalpainまたはクロストリパインclostripainのようなシステインプロテアーゼ;ペプシン、キモシンchymosinまたはカテプシンcathepsinのような酸プロテアーゼ;またはプロナーゼpronase、サーモリシンthermolysin、コラゲナーゼcollagenase、ディスパーゼdispase、アミノペプチダーゼaminopeptidaseまたはカルボキシペプチダーゼcarboxypeptidaseA,B,E/H,M,TまたはUのような、メタロプロテアーゼmetalloproteaseを含んでもよい。プロテイナーゼKは、広範囲なpHにわたってpH4.0-10.0安定しており、双性イオン洗剤を含む緩衝液で安定している。ターゲット核酸配列のPCR増幅プライマーが製造された後、核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR:polymerasechainreaction、核酸配列基盤の増幅NASBA:nucleicacidsequencebasedamplification、リガーゼ連鎖反応LCR:ligasechainreaction及びローリングサークル増幅RCA:rollingcircleamplificationを含むが、これらに限定されるものではないさまざまな方法によってなされる。ポリメラーゼ連鎖反応PCRは、特異的なターゲットDNA配列の増幅に最も頻繁に使用される方法である。ポリメラーゼ連鎖反応またはPCRは、一般的に所望するヌクレオチド配列をインビトロinvitroで増幅させる方法を指す。一般的に、PCR法は、所望のターゲット配列を含む反応混合物に、2つ以上の伸張可能なオリゴヌクレオチドプライマーのモル過量を導入することによって行われ、前記ライマーは、二本鎖ターゲット配列の反対鎖に相補的である。前記反応混合物を対象に、DNAポリメラーゼの存在下で、熱周期thermalcyclingプログラムを実施し、DNAプライマーが側面に付着した所望するターゲット配列を増幅させる。PCR技法は、PCR:APracticalApproach,M.J.McPhersonら,IRLPress1991、PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innisら,AcademicPress1990、及びPCRTechnology:PrincipalsandApplicationsforDNAAmplification,H.A.Erlich,StocktonPress1989を含む多数の文献に開示されている。PCRはまた、米国登録特許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書、同第4,800,159号明細書、同第4,965,188号明細書、同第4,889,818号明細書、同第5,075,216号明細書、同第5,079,352号明細書、同第5,104,792号明細書、同第5,023,171号明細書、同第5,091,310号明細書及び同第5,066,584号明細書を含む多数の米国特許でも開示され、それぞれは、参照によって本明細書に挿入される。用語サンプルsampleは、核酸物質を含む任意の物質を指す。本明細書で使用される用語PCR断片PCRfragmentまたは逆転写酵素PCR断片reversetranscriptase-PCRfragmentまたはアンプリコンampliconは、特定のターゲット核酸の増幅結果として生産されるポリヌクレオチド分子または、総称して複数の分子を指す。PCR断片は、常にではないが、一般的には、DNAPCR断片である。PCR断片は、一本鎖または二本鎖であり、または任意の濃度比率を有するこれらの混合物であってもよい。PCR断片またはRT-PCTは、約100-約500nt、またはそれ以上の長さであってもよい。緩衝液bufferは、増幅反応のpHを調節することにより、増幅反応の一つ以上の成分の安定性、活性及び/または持続性longevityを変化させる、増幅反応に添加される化合物である。本発明の緩衝剤bufferingagentは、PCR増幅及び部位特異的RNaseH切断活性sitespecificRNaseHcleavageactivityと両立可能である。一部の緩衝剤が、当該技術分野で周知であり、トリス、トリシン、3-N-モルホリノプロパンスルホン酸MOPS及び4-2-ヒドロキシエチル-1-ピペラジンエタンスルホン酸HEPESを含むが、それらに限定されるものではない。また、PCR緩衝液は、一般的に、最大約70mMKCl及び約1.5mM以上のMgCl2、約50-200mMのそれぞれのヌクレオチドdATP,dCTP,dGTP及びdTTPを含む。本発明の緩衝液は、効率的な逆転写酵素PCRまたはPCR反応を最適化するための添加物質を含んでもよい。本明細書で使用される、用語ヌクレオチドnucleotideは、リボースribose、アラビーノスarabinose、キシロースxyloseとピラノースpyranoseのような糖、及びそれらの糖類似体の、C-1’炭素に結合されたヌクレオチド塩基を含む化合物を指す。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体を含む。前記糖は、置換または非置換のものである。置換されたリボース糖は、炭素原子のうち1つ以上、例えば、2’-炭素原子が、同一であるか、あるいは異なる、Cl、F、-R、-OR、-NR2前記それぞれのRは独立して、H、C1-C6アルキルまたはC5-C14アリールであるまたはハロゲン基のいずれかで置換されたものであるリボースを含むが、それらに限定されるものではない。例示的なリボースは、2’-C1-C6アルコキシリボース、2’-C5-C14アリールオキシリボース、2’,3’-ジデヒドロリボース、2’-デオキシ-3’-ハロリボース、2’-デオキシ-3’-フルオロリボース、2’-デオキシ-3’-クロロリボース、2’-デオキシ-3’-アミノリボース、2’-デオキシ-3’-C1-C6アルキルリボース、2’-デオキシ-3’-C1-C6アルコキシリボース及び2’-デオキシ-3’-C5-C14アリールオキシリボース、リボース、2’-デオキシリボース、2’,3’-ジデオキシリボース、2’-ハロリボース、2’-フルオロリボース、2’-クロロリボース及び2’-アルキルリボース、例えば、2’-O-メチル、4’-α-アノマーanomericヌクレオチド、1’-α-アノマーヌクレオチド、2’-4’-及び3’-4’-結合linked並びにその他固定lockedまたはLNA二環糖変形体bicyclicsugarmodificationを含むが、それらに限定されるものではない例えば、PCT公開出願WO98/22489、WO98/39352及びWO99/14226;米国登録特許第6,268,490号明細書及び同第6,794,499号明細書を参照。添加物質は、組成物中の一つ以上の成分の安定性、活性及び/または持続性を変化させる、組成物に添加される化合物である。特定の具体例において、前記組成物は、増幅反応組成物である。特定の具体例において、添加物は、汚染性酵素を不活性化させ、タンパク質フォールディングproteinfoldingを安定化し、かつ/または凝集を低減させる。増幅反応に含まれる例示的な添加物質は、bine、ホルムアミド、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、NaCO32、LiCl、MnOAc、NMP、トレハロースtrehalose、デメチルスルホキシドDMSO:demethylsulfoxide、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトールDTT:dithiothreitol、テルモプラズマアリドフィルムThermoplasmaacidophilum無機ピロホスファターゼTAPを含むが、それらに限定されるものではないピロホスファターゼpyrophosphatase、ウシ血清アルブミンBSA:bovineserumalbumin、プロピレングリコール、グリシンアミドglycinamide、CHES、PercollTM、アルリントリカルボン酸aurintricarboxylicacid、ツインTween20、ツイン21、ツイン40、ツイン60、ツイン85、Brij30、NP-40、トリトンX-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、N-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシドLDAO、Zwittergent3-10、Xwittergent3-14、XwittergentSB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、大腸菌SSB、RecA、ニッキングエンドヌクレアーゼnickingendonuclease、7-デアザG、dUTP、UNG、陰イオン洗剤、陽イオン性洗剤、非イオン性洗剤、双性イオン洗剤zwittergent、ステロール、浸透物質osmolyte、陽イオン、及び増幅効率を変化させることができる任意の他の化学物質、タンパク質、または補助因子を含むが、それらに限定されるものではない。特定の具体例において、2以上の添加物質が増幅反応に含まれる。本発明によれば、添加物質は、RNaseHの活性を干渉しない場合、プライマーアニーリングの選択性を改善する目的で添加すされる。本明細書で使用される、用語熱安定性thermostableは、酵素に適用される場合、昇温条件例えば、55°Cまたはそれ以上で、その生物学的活性を維持するか、あるいは加熱及び冷却の反復周期後、その生物学的活性を維持する酵素を指す。熱安定性ポリヌクレオチドのポリメラーゼは、PCR増幅反応で特に有用である。本明細書で使用される増幅ポリメラーゼ活性amplifyingpolymeraseactivityは、デオキシリボヌクレオチドの重合化を触媒する酵素活性を指す。一般的に、前記酵素は、核酸テンプレートの配列にアニーリングされたプライマーの3’末端で合成を開始するものであり、前記テンプレート鎖の5’末端方向に進む。特定の具体例において、増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性DNAポリメラーゼである。本明細書で使用される熱安定性ポリメラーゼは、熱に比較的安定した酵素であり、それぞれのPCR周期前に酵素を添加する必要性を除去する。熱安定性DNAポリメラーゼの非制限的な例は、好熱性バクテリアサーマスアクアチクスThermusaquaticusTaqポリメラーゼ、サーマスサーモフィルスThermusthermophilusTthポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリスThermococcuslitoralisTliポリメラーゼまたはVENTTMポリメラーゼ、ピュロコックスフリオサスPyrococcusfuriosusPfuポリメラーゼまたはDEEPVENTTMポリメラーゼ、ピュロコックスウーシーPyrococcuswoosiiPwoポリメラーゼ及びその他ピュロコックス種、バチルスステアロテルモフィルスBacillusstearothermophilusBstポリメラーゼ、スルホロブスアシドカルダリウスSulfolobusacidocaldariusSacポリメラーゼ、サーモプラズマアシドフィルムThermoplasmaacidophilumTacポリメラーゼ、サーマスラバーThermusrubberTruポリメラーゼ、サーマスブロキアヌスThermusbrockianusDYNAZYMETMポリメラーゼiTneポリメラーゼ、サーモトガマリティマThermotogamaritimeTma及びサーモトガThermotoga属のその他種Tspポリメラーゼ、及びメタノバクテリウムサーモオートトロフィカムMethanobacteriumthermoautotrophicumMthポリメラーゼから分離されたポリメラーゼを含むが、それらに限定されるものではない。PCR反応は、ターゲット配列のさらに効率的な増幅を引き起こす、相互補完的な特性を有する1つ以上の熱安定性ポリメラーゼ酵素を含んでもよい。例えば、高い進行度processivity大きいヌクレオチド断片を複製する能力を有するヌクレオチドポリメラーゼを、校正proofreading能力ターゲット核酸配列の伸長中にエラーを修正する能力を有する他のヌクレオチドポリメラーゼに補完することにより、長いターゲット配列を高正確度fidelityに複製することができるPCR反応を制作することができる。前記熱安定性ポリメラーゼは、その野生型形態で使用することができる。代案として、PCR反応を促進させるために、前記ポリメラーゼを酵素の断片を含むか、あるいは有益な特性を提供する突然変異を含むように変形させることができる。一具体例において、前記熱安定性ポリメラーゼは、Taqポリメラーゼである。向上した特性を有する多数のTaqポリメラーゼ変異体が公知されており、AmpliTaqTM、AmpliTaqTM、ストフェルStoffel短編、SuperTaqTM、SuperTaqTMplus、LATaqTM、LAproTaqTM及びEXTaqTMを含むが、それらに限定されるものではない。他の具体例において、本発明のマルチプレックス増幅反応に使用される熱安定性ポリメラーゼは、AmpliTaqストフェルStoffel断片である。RNAターゲット核酸配列の逆転写酵素PCR増幅遺伝子発現研究のために、最も広く使用される技法の中で一つは、PCRによる増幅用テンプレートとして、mRNA配列に係わる第1鎖cDNAfirststrandcDNAを使用することである。用語逆転写酵素活性reversetranscriptaseactivity及び逆転写reversetranscriptionは、テンプレートとしてRNA鎖を使用し、DNA鎖すなわち、相補的DNAcDNAを合成することができる、RNA依存的DNAポリメラーゼとしての特徴を有するポリメラーゼ種類の酵素活性を指す。逆転写酵素PCRreversetranscriptase-PCRまたはRNAPCRは、DNA依存的DNAポリメラーゼプライマー伸張の多重周期前に、まず一本鎖DNA分子を生産するために、RNAテンプレート及び逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を使用するPCR反応である。マルチプレックスPCRは、一般的に、単一反応内に2個以上のプライマーを含め、単一反応で、一種以上の増幅産物を生成するPCR反応を指す。例示的な逆転写酵素は、米国登録特許第4、943、531号明細書に開示されたモロニーマウス白血病ウイルスM-MLV:MoloneymurineleukemiavirusRT、米国登録特許第5,405,776号明細書に開示されたM-MLV-RTの突然変異形態、ウシ白血病ウイルスBLV:bovineleukemiavirusRT、ラウス肉腫ウイルスRSV:RoussarcomavirusRT、トリ骨髄芽球症ウイルスAMV:avianmyeloblastosisvirusRT、及び米国登録特許第7,883,871号明細書に開示された逆転写酵素を含むが、それらに制限されるものではない。終点endpoint分析またはリアルタイムrealtime分析によって行われる逆転写酵素PCR過程は、2つの別個の分子合成を含む:iRNAテンプレートからのcDNAの合成、及びiiPCR増幅を解した前記新たに合成されたcDNAの複製。逆転写酵素PCRと折々係わる技術的問題を処理するための試みとして、前記過程の3種の基本的な段階を考慮した多数のプロトコルが開発された:aRNAの変性及び逆方向プライマーの混成化、bcDNAの合成及びcPCR増幅。いわゆる、カップルリングされていないuncoupled逆転写酵素PCR過程例えば、2段階逆転写酵素PCRで、逆転写は、逆転写酵素活性のための最適の緩衝条件を使用した独立的な段階として行われる。cDNA合成に続き、反応物を希釈させ、TaqDNAポリメラーゼ活性に最適な条件に、MgCl2及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸dNTPの濃度を低下させ、標準条件によってPCRを行う米国登録特許第4,683,195号明細書及び同第4,683,202号明細書を参照。一方、カップルリングされたcoupledRTPCR方法は、逆転写酵素及びTaqDNAポリメラーゼ活性に最適化された一般的な緩衝液を使用する。一様態で、逆方向プライマーのアニーリングは、酵素の添加前に行われる独立した段階であり、その次の単一反応容器に添加される。他の様態で、前記逆転写酵素活性は、熱安定性TthDNAポリメラーゼの一成分である。アニーリング及びcDNA合成は、Mn2存在下で行われ、その次のPCRは、キレート化剤chelatingagentによってMn2を除去した後、Mg2の存在下で行われる。最後に連続的continuous方法例えば、1段階逆転写酵素PCRは、前記3つの逆転写酵素PCR段階を1つの連続的反応に統合し、構成成分または酵素の添加のために、反応容器を開くことを避けることができる。連続的逆転写酵素PCRは、熱安定性TaqDNAポリメラーゼ及びTthポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する単一酵素システム、及び初期温度が65°CであるAMVRT及びTaqDNAポリメラーゼを使用する2酵素システムとして記述されてきた。RNA変性段階は、省略することができる。特定の具体例において、一つ以上のプライマーを標識化することができる。本明細書において、互換可能に使用される用語標識label、検出可能な標識detectablelabel、あるいはマーカーmarkerまたは検出可能なマーカーdetectablemarkerは、ヌクレオチド、ヌクレオチドポリマー、または核酸結合因子nucleicacidbindingfactorに付着する任意の化学的モイエティを指し、前記付着は、共有的結合または非共有的結合によるものであってもよい。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、本発明の実施者をして、ヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーを検出可能にさせる。検出可能な標識は、発光luminescent分子、化学発光chemiluminescent分子、蛍光色素、有色分子、放射性同位元素または閃光体scintillantを含む。検出可能な標識はまた、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、HRP、タンパク質AproteinA、タンパク質G、抗体またはその断片、Grb2、ポリヒスチジン、Ni2、FLAGタグ、mycタグのような任意の有用なリンカ分子、重金属、酵素例として、アルカリホスファターゼ、ペルキシダーゼ及びルシフェラーゼを含む、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステルacridiniumester、色素及び比色気質calorimetricsubstrateを含む。また、表面プラズモン共鳴surfacePlasmonresonanceの場合でのように、質量の変化が検出可能な標識として考慮されると予想される。熟練技術者は、本発明の実施に使用される、前記で言及されていない有用な検出可能な標識を容易に認識するであろう。1段階逆転写酵素PCRは、カップルリングされていない逆転写酵素PCRに比べて、さまざまな利点を提供する。1段階逆転写酵素PCRは、カップルリングされていない逆転写酵素PCRに比べて、反応混合物試薬及び核酸産物の取り扱いをさらに少なく必要とし例えば、2つの反応段階間で、構成成分または酵素の添加のために、反応容器を開くこと、従って、さらに労動集約的ではなく、工数要求量requirednumberofpersonhourを低減させる。1段階逆転写酵素PCRはまた、さらに少ない試料を必要とし、汚染危険を低減させる。1段階逆転写酵素PCRの敏感性及び特異性は、与えられたサンプルのうち、一つあるいはさまざまな遺伝子の発現レベル研究、または病原性RNAの検出に非常に適すると分かった。一般的に、この過程は、cDNA合成を開始するための遺伝子特異的プライマーの使用に制限された。かような逆転写酵素PCR技法と組み合わされた、オンライン検出によるPCR反応の動力学測定能は、高い敏感度により、RNA写本数の正確であって精密な定量化を可能にした。これは、下記で論じる5’蛍光ヌクレアーゼ分析fluorogenicnucleaseassayTaqManTMまたはエンドヌクレアーゼ分析endonucleaseassayCataCleaveTMのような蛍光二重標識混成化プローブfluorescentduallabeledhybridizationprobe技術による、増幅過程中の蛍光モニタリング、及びPCR産物の測定を介して逆転写酵素PCR産物を検出することによって可能になった。CataCleaveTMプローブを使用したリアルタイムPCR増幅後、アンプリコン検出は、手間がかかり、長期間が必要となる。PCR過程中に増幅をモニタリングするために、リアルタイム方法が開発された。この方法は、一般的に、新たに合成されたDNAに結合する蛍光標識されたプローブ、または二本鎖DNA間に挿入される場合、蛍光放出が増加する色素を使用する。リアルタイム検出方法は、ゲノムDNAまたはゲノムRNAにおいて、SNPのPCR検出に適用可能である。前記プローブは、一般的に、2つの発色団chromophore間の蛍光共鳴エネルギー転移FRET:fluorescenceresonanceenergytransferによって、ターゲット不在時に、供与者donor放出が消光されるようにデザインされる。供与発色団は、励起状態で、受容発色団と近距離にある場合、受容発色団にエネルギーを転移させることができる。かような転移は、常に非放射性であり、双極子-双極子カップルリングを介して発生する。2つの発色団間の距離を十分に増大させる全ての過程は、FRET効率を低減させ、供与発色団放出が、放射によってradiatively検出されるようにするであろう。一般的な供与発色団は、FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5及びテキサスレッドTexasRed.を含む。受容発色団は、その励起スペクトルが供与者の放出スペクトルと重畳されるように選択される。かような対の例は、FAM-TAMRAである。また、多様な供与者を消光させることができる非蛍光性受容者が存在する。供与者受容者FRET対の他の適切な例が、当業者に公知されているであろう。PCRのリアルタイム検出に使用される一般的なFRETプローブの例は、分子ビーコンmolecularbeacon例えば、米国登録特許第5,925,517号明細書、TaqManTMプローブ例えば、米国登録特許第5,210,015号明細書及び同第5,487,972号明細書、及びCataCleaveTMプローブ例えば、米国登録特許第5,763,181号明細書を含む。前記分子ビーコンは、非結合状態では、プローブが、供与者及び受容者の発色団が近接した距離にあり、供与者放出が減少する二次構造を形成するようにデザインされたものである一本鎖オリゴヌクレオチドである。適切な反応温度で、前記ビーコンは広がり、アンプリコンに特異的に結合する。広がった後には、供与者発色団及び受容者発色団間の距離が増大してFRETが反転され、特殊機器を使用して供与者放出をモニタリングすることができる。TaqManTM技術及びCataCleaveTM技術は、供与者発色団及び受容者発色団が、FRETを反転させるほどに十分に分離されるようにするのために、使用されるFRETプローブが切断されるという点で、分子ビーコンと異なる。TaqManTM技術は、5’末端が供与発色団で標識され、3’末端が受容発色団で標識された、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用する。増幅に使用されるDNAポリメラーゼは、5’→3’のエキソヌクレアーゼ活性を有さなければならない。TaqManTMプローブは、プライマーが結合すると同時に、アンプリコンの一鎖に結合する。DNAポリメラーゼがプライマーを伸張させながら、前記ポリメラーゼは、結局、結合されているTaqManTMプローブと対面するであろう。その時点で、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、5’末端から順次に、TaqManTMプローブを分解するであろう。プローブが分解されれば、前記プローブを含むモノヌクレオチドは、反応緩衝液内に放出される。供与者は、受容者から遠くなり、FRETは反転される。プローブ切断を確認するために、供与者からの放出をモニタリングする。TaqManTMが作用する方式のため、特定のアンプリコンは、PCRの毎周期について、たった1回だけ検出される。TaqManTMターゲット部位を介したプライマーの伸張は、二本鎖産物を生成させ、アンプリコンが後続PCR周期で変性されるまで、TaqManTMプローブの追加的な結合を阻む。その内容が参照によって本明細書に挿入される米国登録特許第5,763,181号明細書は、CataCleaveTMとする他のリアルタイム検出方法を開示する。CataCleaveTM技術は、プローブの切断がポリメラーゼ活性を有さない第2酵素によって達成されるという点で、TaqManTMと区別される。CataCleaveTMプローブは、例えば、制限酵素またはRNaseのような、エンドヌクレアーゼのターゲットである分子内配列を有する。一例として、CataCleaveTMプローブは、前記プローブの5’末端及び3’末端がDNAで構成され、切断部位は、RNAを含むキメラchimeric構造を有する。前記プローブのDNA配列部分は、両末端または内部が、FRET対で標識される。PCR反応は、RNA-DNA二本鎖RNA配列部分を特異的に切断させるRNaseH酵素を含む。切断後、前記プローブの2個の半分は、反応温度で、ターゲットアンプリコンから解離され、反応緩衝液で拡散する。供与者及び受容者が分離することにより、FRETは、TaqManTMプローブと同様の方式で反転され、供与者放出をモニタリングすることができる。切断及び解離は、追加的なCataCleaveTM結合のための部位を再生させる。かような方法で、単一アンプリコンは、プライマーがCataCleaveTMプローブ結合部位を介して伸張されるまで、ターゲットとして、または多数回のプローブ切断のために使用される。CataCleaveTMプローブの標識化用語プローブprobeは、特異的核酸配列、例えば、ターゲット核酸配列の相補的な領域に、配列特異的に混成化するように考案された、特異的な部分を含むポリヌクレオチドを含む。一具現例において、オリゴヌクレオチドプローブは、15ないし60ヌクレオチドの長さを有する。さらに望ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、18ないし30ヌクレオチドの長さを有する。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの具体的な配列及び長さは、それが結合するターゲットポリヌクレオチドの性質に部分的に依存する。結合位置及び長さは、特別な具体例において、適切なアニーリング及び溶融特性を達成するように変化させることができる。かようなデザイン選択のための指針は、その内容が参照によって本明細書に挿入される、米国登録特許第5,763,181号明細書、同第6,787,304号明細書及び同第7,112,422号明細書に開示されたTaqManTM分析またはCataCleaveTMについて説明する多数の参照文献に見ることができる。特定の具体例において、前記プローブは、ターゲット核酸配列に対して実質的に相補的である。本明細書で使用される用語実質的に相補的なsubstantiallycomplementaryは、アニーリングして安定した二本鎖を形成することができるほどに、配列において十分に相補的な2本の核酸鎖を指す。相補性は、完全である必要はない。例えば、2つの核酸間に、任意数のマッチングされない塩基対が存在することができる。しかし、ミスマッチの数が過度に多く、ストリンジェンシーが最も低いtheleaststringent混成化条件でさえも混成化がなされない場合、前記配列は、実質的に相補的な配列ではない。本明細書で、2つの配列が実質的に相補的であるとされる場合、それは、前記配列が選択された反応条件下で混成化するのに、相互間に十分に相補的であるということを意味する。核酸相補性と、特異度達成に十分な混成化のストリンジェンシーstringencyとの関係は、当該技術分野に周知である。実質的に相補的な二本鎖は、例えば、完全に相補的であるか、あるいは混成化条件が、例えば、ペアリングpairing配列及び非ペアリングnonpairing配列の区別を可能にするのに十分であり限り、一つあるいは多数のミスマッチを含んでもよい。従って、実質的に相補的である配列は、二本鎖領域で、100,95,90,80,75,70,60,50またはそれ未満、または前記範囲間の任意の百分率の塩基対相補性を有する配列を指すことができる。本明細書で使用される選択された領域selectedregionは、プローブのRNA配列にアニーリングするターゲットDNAまたはターゲットcDNAのポリヌクレオチド配列を指す。一具現例において、ターゲットDNAまたはターゲットcDNAの選択された領域は、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25またはそれ以上のヌクレオチド長を有することができる。本明細書で使用される部位特異的RNaseH切断は、ターゲットDNA配列に完全にentirely相補的であり、それと混成化して、RNA:DNA異型二本鎖を形成する、CataCleaveTMプローブ中のRNAモイエティの切断を指す。前記CataCleaveTMプローブにおけるRNAモイエティが、単一ヌクレオチド多型を含み、標的DNA配列が、前記多形成の位置に、野生型配列を含む場合、CataCleaveTMプローブと、野生型ターゲットDNA配列との間のRNA:DNA異型二本鎖形成は、前記多形成位置で、単一ヌクレオチドミスマッチをもたらし、これは、RNaseHによるCataCleaveTMプローブにおけるRNAモイエティの切断を阻む。同様に、ターゲットDNA配列がSNP配列を含み、CataCleaveTMプローブのRNAモイエティが多形成位置に、野生型配列を含む場合、CataCleaveTMプローブと、SNP配列を含む野生型ターゲットDNA配列との間のRNA:DNA異型二本鎖形成は、前記多形成位置で、単一ヌクレオチドミスマッチをもたらし、これは、RNaseHによるCataCleaveTMプローブにおけるRNAモイエティの切断を阻む。本明細書で使用されるCataCleaveTMプローブの標識labelまたは検出可能な標識detectablelabelは、前記プローブに共有的または非共有的な手段によって付着された蛍光色素fluorochrome化合物を含む任意の標識を指す。本明細書で使用される蛍光色素fluorochromeは、放出される光よりもさらに短波長の光によって励起された後で光を放出する蛍光化合物を指す。用語蛍光供与者fluorescentdonorまたはfluorescencedonorは、本発明で記述される分析試験で測定される光を放出する蛍光色素を指す。さらに特別には、前記蛍光供与者は、蛍光受容者によって吸収される光を提供する。用語蛍光受容者fluorescentacceptorまたはfluorescenceacceptorは、蛍光供与者から放出される光を吸収する第2蛍光色素またはケンチャquencher分子を指す。第2蛍光色素は、蛍光供与者から放出される光を吸収し、前記蛍光供与者から放出される光よりもさらに長波長の光を放出する。ケンチャ分子は、蛍光供与者から放出される光を吸収する。AlexaFluorTM350、AlexaFluorTM430、AlexaFluorTM488、AlexaFluorTM532、AlexaFluorTM546、AlexaFluorTM568、AlexaFluorTM594、AlexaFluorTM633、AlexaFluorTM647、AlexaFluorTM660、AlexaFluorTM680、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸、フルオレセインfluorescein、オレゴングリーンOregonGreen488、オレゴングリーン514、テトラメチルロダミンtetramethylrhodamine、ロダミンX、テキサスレッド色素TexasReddye、QSY7、QSY33、Dabcyl、BODIPYFL、BODIPY630/650、BODIPY6501665、BODIPYTMR-X、BODIPYTR-X、ジアルキルアミノクマリン、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPAEu3-AMCA及びTTHAEu3AMCAを含む任意の発光分子、望ましくは、蛍光色素及び/または蛍光ケンチャfluorescentquencherが本発明の実施に使用される。一具現例において、前記オリゴヌクレオチドプローブの3’末端ヌクレオチドは、ブロッキングされたり、あるいは核酸ポリメラーゼによる伸張が不可能になるように処理される。かようなブロッキングは、便利であるようには、プローブの末端3’位置にリポータまたはケンチャ分子を付着させることによって行われる。一具現例において、リポータ分子は、連結モイエティlinkingmoietyによって、プローブの末端3’または末端5’に付着するように誘導された蛍光有機色素である。望ましくは、ケンチャ分子はまた、本発明の具体例よって、蛍光性または非蛍光性である有機色素である。例えば、本発明の望ましい具体例において、ケンチャ分子は蛍光性である。一般的に、ケンチャ分子が蛍光性であるか、あるいは非放射崩壊nonradiativedecayによってリポータから転移されたエネルギーを単純に放出するかということとは係わりなく、ケンチャの吸収バンドは、リポータ分子の蛍光放出バンドと実質的に重畳されなければならない。励起されたリポータ分子からエネルギーを吸収するが、エネルギーを放射的に放出しない非蛍光ケンチャ分子は、本出願で発色分子chromogenicmoleculeとする。例示的なリポータケンチャ対は、フルオレセインを含む、キサンテンxanthene色素及びロダミンrhodamine色素から選択されてもよい。オリゴヌクレオチドに付着するための結合部位、または結合作用基として使用されるそのフェニルモイエティ上に置換体を有する、前記化合物の多数の適する形態が広く市販されている。他の蛍光化合物の群は、α位置またはβ位置に、アミノ基を有するナフチルアミンnaphthylamineである。かようなナフチルアミノ化合物に含まれるものとしては、1-ジメチルアミノナフチル-5-スルホネート、1-アニリノ-8-ナフタレンスルホネート及び2-p-トルイジニル-6-ナフタレンスルホネートがある。その他の色素は、3-フェニル-7-イソシアナトクマリン;9-イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジンacridine;N-フェニルマレイミド、ベンゾオキサジアゾールbenzoxadiazole、スチルベンstylbene、ピレンpyreneなどを含む。一具現例において、リポータ及びケンチャ分子は、フルオレセイン色素及びロダミン色素から選択される。下記参照文献によって例示される、前記リポータまたはケンチャ分子を、オリゴヌクレオチドの5’末端または3’末端に付着させるための多数の連結モイエティ及び方法が存在する:Eckstein編集、OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproachIRLPress、Oxford、1991;ZuckermanらによるNucleicacidsResearch、15:5305-53211987オリゴヌクレオチド上の3’チロール基;SharmaらによるNucleicacidsResearch、19:301919913’スルフヒドリルsulfhydryl;GiustiらによるPCRMethodsandApplications、2:223-2271993及びFungらによる米国登録特許第4,757,141号AppliedBiosystems、FosterCity、Calif.から入手可能な、Aminolink.TM.IIによる5’ホスホアミノ基;Stabinskyによる米国登録特許第4,739,044号3’アミノアルキルホスホリル基;AgrawalらによるTetrahedronLetters、31:1543-15461990ホスホラミデート連結による付着;SproatらによるNucleicacidsResearch、15:483719875’メルカプト基;Nelsonら、NucleicacidsResearch、17:7187-719419893’アミノ基など。ロダミン色素及びフルオレセイン色素はまた、便利であるように、ホスホラミダイトモイエティを含む色素誘導体による固相合成、例えば、Wooらによる、米国登録特許第5,231、191号明細書、及びHobbs,Jr.による米国登録特許第4,997,928号明細書の最後の段階において、オリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシ基に付着する。固体支持体へのCataCleaveTMプローブの付着一具現例において、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体に付着される。異なるプローブが、前記固体支持体に付着され、サンプル中に存在する異なるターゲット配列の同時検出に使用される。異なる蛍光波長を有するリポータ分子が、前記異なるプローブに使用され、それによって、独立的に検出される異なるプローブとの混成化が可能になる。オリゴヌクレオチドプローブの固定化のための望ましい固体支持体の種類の例は、制御された多孔性ガラス、ガラスプレート、ポリスチレン、アビジンがコーティングされたポリスチレンビーズセルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、活性化されたデキストラン、制御された多孔性ガラスCPG:controlledporeglass、ガラスプレート及び高度架橋ポリスチレンhighcrosslinkedpolystyreneを含む。この固体支持体は、その化学的安定性、作用基化の容易性、及び良好に定義された表面積により、混成化及び診断研究に望ましい。制御された多孔性ガラス500Å、1000Å、及び非膨潤性nonswelling高度架橋ポリスチレン1000Åのような固体支持体が、そのオリゴヌクレオチド合成との相溶性に照らして、特に望ましい。オリゴヌクレオチドプローブは、多様な方式で、固体支持体に付着される。例えば、プローブは、プローブの3’末端または5’末端のヌクレオチドが、前記固体支持体に付着することにより、固体支持体に付着される。しかし、プローブは、前記プローブを固体支持体から距離をとらせるリンカlinkerによって、固体支持体に付着される。前記リンカは、30原子以上の長さを有することが望ましく、さらに望ましくは、50原子以上の長さを有する。固体支持体に固定化されるプローブの混成化は、一般的に、前記プローブが固体支持体から30原子以上、さらに望ましくは、50原子以上分離していることを必要とする。かような分離を達成するために、リンカは、望ましくは、前記リンカと3’ヌクレオシドとの間に配置されたスペーサspacerを含む。オリゴヌクレオチド合成のために、前記オリゴヌクレオチドを固体支持体から解離させるために、リンカアームarmは、塩基性試薬に分解されるエステル結合によって、前記3’ヌクレオシドの3’-OHに付着する。オリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させるために使用される多様なリンカが、当該技術分野に公知されている。前記リンカは、固体支持体に付着したプローブと標的配列との混成化を著しく干渉しない任意の化合物で構成されてもよい。リンカは、自動化された合成によって、前記リンカに容易に付加されるホモポリマーオリゴヌクレオチドからなる。代案として、作用基化ポリエチレングリコールのようなポリマーが、リンカとして使用される。かようなポリマーは、プローブとターゲットオリゴヌクレオチドとの混成化を著しく干渉しないから、ホモポリマーオリゴヌクレオチドに比べて望ましい。ポリエチレングリコールは、商業的に利用可能であり、有機性媒質及び水性媒質いずれもに溶解可能であり、作用基化が容易であり、オリゴヌクレオチド合成及び合成後条件で、完全に安定するので特に望ましい。固体支持体、リンカ及びプローブ間の結合は、望ましくは、高温の塩基性条件下で、塩基保護基を除去する間に切断されない。望ましい結合の例は、カルバメートcarbamate結合及びアマイド結合を含む。プローブの固定化は、当該技術分野に周知であり、当業者は、固定化条件を決定することができる。前記方法の一具現例よれば、CataCleaveTMプローブを固体支持体に固定化させる。前記CataCleaveTMプローブは、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含み、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である。その後、前記プローブを、プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、RNaseHの存在下で、核酸サンプルと接触させる。前記RNA:DNA異型二本鎖内のRNA配列のRNaseH切断は、プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を引き起こし、前記信号の増加は、ターゲットDNA内の多形成の存在を示す。前記方法の他の具体例よれば、固体支持体に固定化されたCataCleaveTMプローブは、検出可能な標識、並びにDNA核酸配列及びRNA核酸配列を含み、前記プローブのRNA核酸配列は、多形成位置に野生型DNA配列を含むターゲットDNA配列の選択された部位に完全に相補的であり、前記プローブのDNA核酸配列は、前記ターゲットDNA配列の選択された部位に隣接したDNA配列に実質的に相補的である。その後、前記プローブを、プローブ内のRNA配列が、前記多形成を含むPCR断片内の相補的なDNA配列とRNA:DNA異型二本鎖を形成することができる条件下で、RNaseHの存在下で、核酸サンプルと接触させる。前記ターゲットDNA配列が多形成を含む場合、前記RNA:DNA二本鎖内の多形成位置でのミスマッチは、前記RNA:DNA異型二本鎖内のRNA配列のRNaseH切断を阻害し、これは、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム減少を引き起こし、前記信号の減少は、ターゲットDNA内の多形成の存在を示す。プローブの固体支持体への固定化は、前記プローブに混成化されたターゲット配列をサンプルから容易に分離させる。後期段階で、前記分離したターゲット配列を固体支持体から分離し、研究者の具体的な必要性により、当該技術分野に周知の方法によって、加工例えば、精製、増幅することができる。CataCleaveTMプローブのRNaseH切断RNaseHは、RNA-DNA混成体内のRNAを加水分解する。子牛胸腺で最初に同定されたRNaseHは、次に、多様な有機体で発見された。実に、RNaseH活性は、真核生物及びバクテリアで、普遍的に現れる。RNaseHは、多様な分子量及び核酸分解nucleolytic活性を有するタンパク質科familyを構成するにもかかわらず、基質要件は、多様なイソタイプisotypeにおいて、類似して現れる。例えば、これまで研究されたほとんどのRNaseHは、エンドヌクレアーゼとして機能し、5’ホスフェート末端及び3’ヒドロキシ末端を有する分解産物を生成するために、n二価陽イオン例えば、Mg2、Mn2を必要とする。原核生物で、RNaseHは、クローニングされ、広くその特性が究明されたCrookeら、1995BiochemJ、312Pt2、599-608;Limaら、1997JBiolChem、272、27513-27516;Limaら、1997Biochemistry、36、390-398;Limaら、1997JBiolChem、272、18191-18199;Limaら、2007MolPharmacol、71、83-91;Limaら、2007MolPharmacol、71、73-82;Limaら、2003JBiolChem、278、14906-14912;Limaら、2003JBiolChem、278、49860-49867;Itaya,M.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1990、87、8587-8591を参照。例えば、大腸菌RNaseHIIは、213アミノ酸長を有し、RNaseHIは、155アミノ酸長を有する。大腸菌RNaseHIIは、大腸菌RNaseHIと、ただ17だけの相同性を有する。S.チフィムリウムS.typhimuriumからクローニングされたRNaseHは、大腸菌RNaseHIと、ただ11個の位置のみ異なり、155アミノ酸長を有するItaya,M.及びKondo,K.、NucleicacidsRes.、1991、19、4443-4449。多数のウイルス、その他バクテリア及び酵母から、RNaseH活性を示すタンパク質がまたクローニング及び精製されたWintersberger、U.Pharmac.Ther.、1990、48、259-280。多数の場合で、RNaseH活性を有するタンパク質は、RNaseHが他の酵素、一般的にDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合タンパク質であると分かった。前記RNaseHドメインは、大腸菌RNaseHIと高いレベルの相同性を有すると一貫して明かかにされたが、他のドメインが相当に多様であるので、融合タンパク質の分子量及び他の特性は、広範囲に異なる。高次真核生物で、分子量、二価陽イオンの効果、スルフヒドリル作用剤sulfhydrylagent、及び免疫学的交差反応性の差に基づいて、2種類のRNaseHが定義されたBusenら、Eur.J.Biochem.、1977、74、203-208。RNaseHI酵素は、68-90kDa範囲の分子量を有し、Mn2またはMg2によって活性化され、スルフヒドリル作用剤に鈍感であると報告された。対照的に、RNaseHII酵素は、31-45kDa範囲の分子量を有し、Mg2を必要として、スルフヒドリル作用剤に非常に敏感であり、Mn2によって抑制されると報告されたBusen,W.及びHausen,P.、Eur.J.Biochem.、1975、52、179-190;Kane,C.M.、Biochemistry、1988、27、3187-3196;Busen,W.、J.Biol.Chem.、1982、257、7106-7108。RNaseHII特性を有する酵素はまた、ヒト胎盤から、近い相同性をもって精製されたFrankら、NucleicacidsRes.、1994、22、5247-5254。このタンパク質は、約33kDaの分子量を有し、pH6.5-10の範囲、最適pH8.5-9で活性を有する。この酵素は、Mg2を必要とし、Mn2及びn-エチルマレイミドによって抑制される。切断反応の産物は、3’ヒドロキシ末端及び5’ホスフェート末端を有する。多様な種で分離したRNaseの詳細な比較は、OhtaniN、HarukiM、MorikawaM、KanayaS.、JBiosciBioeng.1999;881:12-9に報告されている。本具体例で使用されるRNaseH酵素の例は、ピュロコックスフリオサスPyrococcusfuriosus、ピュロコックスホリコシPyrococcushorikoshi、サーモコックスリトラリスThermococcuslitoralisまたはサーマスサーモフィルスThermusthermophilusのような、好熱性有機体から分離した熱安定性RNaseH酵素を含むが、それらに制限されるものではない。本具体例で使用される他のRNaseH酵素が、例えば、Uemoriによる米国登録特許第7,422,888号明細書、またはWalderによる米国特許出願公開第2009/0325169号公報に開示されており、その内容は、参照によって本明細書に挿入される。一具現例において、前記RNaseH酵素は、下記に表示された、PfuRNaseHII配列番号13のアミノ酸配列と、40,50,60,70,80,90,95または99の相同性を有する熱安定性RNaseHである。MKIGGIDEAGRGPAIGPLVVATVVVDEKNIEKLRNIGVKDSKQLTPHERKNLFSQITSIA60DDYKIVIVSPEEIDNRSGTMNELEVEKFALALNSLQIKPALIYADAADVDANRFASLIER120RLNYKAKIIAEHKADAKYPVVSAASILAKVVRDEEIEKLKKQYGDFGSGYPSDPKTKKWL180EEYYKKHNSFPPIVRRTWETVRKIEESIKAKKSQLTLDKFFKKP配列番号13相同性は、例えば、コンピュータプログラムDNASIS-MacTakaraShuzo、コンピュータアルゴリズムFASTAversion3.0;Pearson,W.R.ら、Pro.Natl.Acad.Sci.、85:2444-2448、1988、またはコンピュータアルゴリズムBLASTversion2.0、Altschulら、NucleicacidsRes.25:3389-3402、1997を使用して決定することができる。他の具体例において、RNaseH酵素は、配列番号13の5-20,33-44,132-150及び158-173位置に該当する、一つ以上の相同性部位homologyregion1-4を有する、熱安定性RNaseHである。この相同性部位は、ピュロコックスフリオシスPyrococcusfuriosis,ピュロコックスホリコシPyrococcushorikoshi,サーモコックスコダカレンシスThermococcuskodakarensis,アルケオグルロブスプロファンダスArcheoglobusprofundus,アルケオグルロブスフルジダスArcheoglobusfulgidis,サーモコックスセレルThermococcusceler,サーモコックスリトラリスThermococcuslitoralisRNaseHIIポリペプチド配列の配列配置によって定義される。相同性部位1:GIDEAGRGPAIGPLVV配列番号20;配列番号13の5-20位置に該当相同性部位2:LRNIGVKDSKQL配列番号21;配列番号13の33-44位置に該当相同性部位3:HKADAKYPVVSAASILAKV配列番号22;配列番号13の132-150位置に該当相同性部位4:KLKKQYGDFGSGYPSD配列番号23;配列番号13の158-173位置に該当一具現例において、RNaseH酵素は、配列番号20,21,22または23のポリペプチド配列と、50、60、70、80、90の配列同一性sequenceidentityを有する相同性部位のうち一つ以上を含む熱安定性RNaseHである。他の具体例において、RNaseH酵素は、下記に表示されたサーマスサーモフィルスRNaseHIのアミノ酸配列配列番号25と、40、50、60、70、80、90、95または99の相同性を有する熱安定性RNaseHである。MNPSPRKRVALFTDGACLGNPGPGGWAALLRFHAHEKLLSGGEACTTNNRMELKAAIEGLKALKEPCEVDLYTDSHYLKKAFTEGWLEGWRKRGWRTAEGKPVKNRDLWEALLLAMAPHRVRFHFVKGHTGHPENERVDREARRQAQSQAKTPCPPRAPTLFHEEA配列番号25さらに他の具体例において、RNaseH酵素は、前記配列番号25の23-48,62-69,117-121及び141-152位置に該当する相同性部位5ないし8のうち一つ以上を含む熱安定性RNaseHである。この相同性部位は、ヘモフィルスインフルエンザHaemophilusinfluenzae,サーマスサーモフィリスThermusthermophilis,サーマスアクアティクスThermusacquaticus,サルモネラエンテリカSalmonellaenterica及びアグロバクテリウムツメファシエンスAgrobacteriumtumefaciensRNaseHIポリペプチド配列の配列配置によって定義される。相同性部位5:KVLFTDGCGNPGGGALLRY配列番号29;配列番号25の23-48位置に該当相同性部位6:TTNNRMEL配列番号30;配列番号25の62-69位置に該当相同性部位7:KPVKN配列番号31;配列番号25の117-121位置に該当相同性部位8:FVKGHGHENE配列番号32;配列番号25の141-152位置に該当さらに他の具体例において、前記RNaseH酵素は、配列番号29,30,31または32のポリペプチド配列と、50、60、70、80、90の配列同一性を有する相同性部位4ないし8のうち一つ以上を含む熱安定性RNaseHである。本明細書で使用される配列同一性sequenceidentityは、比較範囲にわたってアミノ酸対アミノ酸を基準に、同一であるか、あるいは機能的または構造的に類似した配列の範囲を指す。従って、配列同一性の百分率percentageofsequenceidentityは、例えば、比較範囲にわたって最適に配列された2つの配列を比較する段階と、両配列で同一のアミノ酸が存在する位置の数を決定し、マッチする位置の数を得る段階と、マッチされる位置の数を、比較範囲内の全体位置数すなわち、範囲サイズで割る段階と、その結果に100を乗じて配列同一性の百分率を算出する段階と、によって計算されてもよい。特定の具体例において、RNaseHを変形させ、ホットスタート誘導性inducibleRNaseHを製造することができる。本明細書で使用される用語変形されたRNaseHmodifiedRNaseHは、RNaseHのエンドヌクレアーゼ活性の喪失をもたらす抑制因子に、逆にカップルリングしたり、あるいは逆に結合するRNaseHであってもよい。前記RNaseHから抑制因子の放出または脱カップリングdecouplingは、前記RNaseHのエンドヌクレアーゼ活性を完全に、または少なくとも部分的に回復させる。純粋RNaseHのエンドヌクレアーゼ活性のうち、約30ないし100であるならば、十分である。前記抑制因子は、リガンドまたは化学的変形体であってもよい。前記リガンドは、抗体、アプタマーaptamer、受容体、補助因子cofactorまたはキレート化剤であってもよい。前記リガンドは、RNaseH酵素の活性部位に結合し、それによって、酵素活性を抑制したり、あるいは前記RNaseの活性部位から遠く離れた部位に結合することができる。一部具体例において、リガンドは、構造的変化を誘導することができる。前記化学的変形は例えば、ホルムアルデヒドによる架橋化またはアシル化である。RNaseHからの抑制因子の放出または脱カップリングは、サンプルまたはカップルリングされたRNaseH不活性を、約65°Cないし約95°C以上の温度に加熱する段階、及び/または前記混合物またはサンプルのpHを、約7.0以下に低める段階によって達成される。本明細書で使用されるホットスタート誘導性inducibleRNaseH活性は、リガンドとの関連性によって調節されるエンドヌクレアーゼ酵素活性を有する、本明細書で記述される変形されたRNaseHを指す。緩和された条件で、RNaseHエンドヌクレアーゼ酵素活性が活性化される一方、複製が許容されないnonpermissive条件で、この酵素活性は抑制される。一部具体例において、変形されたRNaseHの酵素活性は、逆転写を行うことができる温度、すなわち、約42°Cで抑制され、PCR反応で観察されるさらに上昇した温度、すなわち、約65°Cないし95°Cでは活性化される。かような特性を有する変形されたRNaseHは、熱誘導性heatinducibleであると呼ばれる。他の具体例において、変形されたRNaseHの酵素活性は、前記酵素を含む溶液のpHを変化させることによって調節される。本明細書で使用されるホットスタートhotstart酵素組成物は、複製が許容されない温度、すなわち、約25°Cないし約45°Cで抑制され、PCR反応に適する温度、例えば、約55°Cないし約95°Cで活性化される。特定の具体例において、ホットスタート酵素組成物は、当該技術分野に公知されたホットスタートRNaseH及び/またはホットスタート熱安定性DNAポリメラーゼを有することができる。RNaseH酵素の架橋化は、例えば、ホルムアルデヒドを使用して行われる。一具現例において、熱安定性RNaseHは、ホルムアルデヒドを使用した、制御されて制限された架橋化を経ることができる。活性状態である変形されたRNaseHを含む、増幅反応組成物を延長された時間、例えば、約15分間約95°Cまたはそれ以上に加熱することによって架橋化は反転され、RNaseH活性が回復する。一般的に、架橋化度degreeofcrosslinkingが低いほど、架橋化反転後、前記酵素のエンドヌクレアーゼ活性が高い。架橋化度は、ホルムアルデヒドの濃度及び架橋化反応の持続時間を変化させることにより、制御することができる。例えば、RNaseH酵素を架橋させるために、約0.2w/v、約0.4w/v、約0.6w/vまたは約0.8w/vのホルムアルデヒドを使用することができる。0.6ホルムアルデヒドを使用した約10分の架橋化反応が、ピュロコックスフリオサスから由来したRNaseHIIを不活性化させるのに十分である。架橋化されたRNaseHは、約37°Cで、測定可能なエンドヌクレアーゼ活性を示さない。一部の場合、架橋化されたRNaseHの測定可能な部分的再活性化が、PCR熱変性温度より低い約50°Cの温度で発生する。かような酵素の意図しない再活性化を阻むために、変形されたRNaseHを再活性化前まで、50°C未満の温度で保管及び維持することが要求される。一般的にPCRは、二本鎖ターゲット配列を熱変性させるため、各周期ごとに、増幅組成物を約95°Cまで加熱しなければならず、これはまた、RNaseHから不活性化因子inactivatingfactorを放出させ、酵素の活性を部分的に、または完全に回復させるであろう。RNaseHはまた、前記酵素をアシル化剤、例えば、ジカルボン酸によって、リシン残基をアシル化させて変形させることができる。RNaseHのアシル化は、アシル化緩衝液のうち、RNaseHの溶液にシスアコニット酸無水物cisaconiticanhydrideを添加し、得られた混合物を、約1ないし20°Cで、5ないし30時間インキュベーションさせることによって行われる。一具現例において、前記アシル化は、約3ないし8°Cで、18ないし24時間実施される。アシル化緩衝液の種類は、特別に制限されるものではない。一具現例において、前記アシル化緩衝液は、pH約7.5ないし約9.0を有する。アシル化されたRNaseHの活性は、増幅組成物のpHを約7.0未満に低下させることにより、回復させることができる。例えば、緩衝剤として、トリス緩衝液が使用される場合、前記組成物を約95°Cまで加熱し、pHを約8.725°Cから約6.595°Cに低めることができる。増幅反応組成物で、加熱段階の持続時間は、変形されたRNaseH、PCRで使用された緩衝液などによって変わる。しかし、一般的には、増幅組成物を95°Cで約30秒ないし4分間加熱すれば、RNaseH活性の回復に十分である。一具現例において、商業的に利用可能な緩衝液、及び一つ以上の非イオン性洗剤は、使用したとき、2分の加熱後に、ピュロコックスフリオサスRNaseHIIの完全な活性が回復する。RNaseH活性は、当該技術分野に周知の方法を使用して決定される。例えば、第1方法によれば、単位活性unitactivityは、決められた分析条件で、モル当量のポリチミジル酸polythymidylicacidの存在下で、一定モル数の放射性標識されたポリアデニル酸の酸可溶化として定義されるEpicentreHybridasethermostableRNaseHIを参照。第2方法で、前記単位活性は、モル当量のプローブ及び相補的テンプレートDNAを含む反応物の相対蛍光強度の特異的増加として定義される。SNPのリアルタイム検出ターゲット核酸におけるSNPのリアルタイム検出のためのプローブとして、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。CataCleaveTMオリゴヌクレオチドプローブは、単一ヌクレオチド多型SNPを含むPCRアンプリコン内で発見される配列に相補的なDNA配列及びRNA配列を使用して最初に合成された。前記プローブは、例えば、FRET対、例えば、プローブの一末端にフルオレセインfluorescein、及び他の末端にロダミンrhodamineケンチャ分子を使用して合成されてもよい。前記プローブは、選択されたSNPの位置を含むターゲット核酸配列に、実質的に相補的になるように合成される。特定の具体例において、前記プローブのRNA配列は、野生型配列に相補的な配列を有するように操作することができる。他の具体例において、前記プローブのRNA配列は、SNP配列に相補的な配列を有するように操作することができる。一具現例において、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、RNaseH活性、SNPを含むターゲットポリヌクレオチドに混成化することができるPCR増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveTMオリゴヌクレオチドプローブの存在下、ターゲットポリヌクレオチドに対して行われる。リアルタイムPCR反応の間、CataCleaveTMオリゴヌクレオチドプローブと、PCRアンプリコン内に存在するSNPとの間に形成されたRNA:DNA異型二本鎖プローブのRNaseH切断は、蛍光ケンチャから蛍光供与者を分離させ、PCRアンプリコン、及びそれによるターゲットDNAのうちSNPのリアルタイム検出に相応するプローブ蛍光のリアルタイム増大をもたらす。特定の具体例において、前記プローブのRNAモイエティは、ターゲットDNA配列内SNP位置に、野生型配列を含む。従って、SNPを含むPCRアンプリコンとプローブとの混成化後に、SNP位置で単一ヌクレオチドミスマッチを有するRNA:DNA異型二本鎖形態は、RNaseHによって切断されない。他の具体例において、前記プローブのRNAモイエティは、ターゲットDNA配列内のSNP位置で、相補的なSNP配列を含む。従って、前記SNPを含むPCRアンプリコンと前記プローブとの混成化後に、RNaseH活性によって切断されるSNP位置で、ミスマッチを有さないRNA:DNA異型二本鎖が形成される。キット本明細書の開示はまた、ターゲット核酸内SNPのリアルタイム検出のための一つ以上の試薬を有するパッケージ単位を含むキット形態を提供する。前記キットはまた、下記アイテムのうち一つ以上を含む:緩衝液、使用説明書、及び陽性または陰性の対照物質。キットは、本明細書に記述された方法を実施するのに適する比率に混合した試薬がこめられた容器を含んでもよい。試薬容器は、望ましくは、対象方法を実施するとき、測定段階を省略するための単位含量unitquantityに前記試薬を含む。また、キットは、熱安定性ポリメラーゼ、RNaseH、SNPの位置を含む部位を増幅するために選択されたプライマー、及びリアルタイムPCR産物にアニーリングし、本明細書に記述された方法によってSNPを検出させる標識されたCataCleaveTMオリゴヌクレオチドプローブを含むが、それに制限されるものではないリアルタイムPCR用試薬を含んでもよい。キットは、単一遺伝子内のSNP、または2以上の遺伝子におけるSNPの座位を検出するための試薬を含んでもよい。他の具体例において、前記キット試薬は、生物学的サンプルから、ゲノムDNAまたはRNAを抽出するための試薬を追加して含む。キット試薬はまた、適用可能な場合、逆転写酵素PCR分析のための試薬を含んでもよい。本明細書で明示された、任意の特許、特許出願、文献またはその他開示内容は、参照によって全体として本明細書に挿入される。参照によって本明細書に挿入されることに指示されたが、本明細書で提示された既存の定義、説明またはその他開示内容と相反する任意の内容またはその一部は、前記統合される内容と本開示内容との間に相反が発生しない範囲においてのみ統合される。下記実施例は、本発明による、RNaseH酵素組成物を使用する方法を提示する。この実施例で記述された方法の段階は、制限的なものであると意図されるものではない。前記言及されたところ以外の本発明の追加的な目的及び利点は、本発明の範囲を制限すると意図されない下記実施例から自明になるであろう。実施例1サルモネラinvA遺伝子における合成SNPの等温的検出ターゲットDNA配列内で、単一ヌクレオチド配列差を区別するCataCleaveTMプローブの能力を検定するために、サルモネラのinvA遺伝子配列番号33内に合成単一ヌクレオチド多型SNPを製造した。前記単一ヌクレオチド変化は、サルモネラinvAコーディング配列配列番号33の116番位置で、TをGに転換させた。FRET対を生成するために、それぞれ二重標識化した2つの類似した19ヌクレオチドCataCleaveTMプローブを、前記SNPヌクレオチドを含むinvA部位を横切って塩基対を形成するようにデザインした。野生型特異的プローブinv-CCProbe2配列番号1は、invAの野生型に対して完璧な相補性を有し、SNP特異的プローブinv-CCProbe2-2C配列番号2は、invAの突然変異形態と完璧な相補性を有している。前記プローブを、CataCleaveTMプローブの4個のRNA塩基のうち、2番目プローブの5’末端基準が、SNPヌクレオチド位置で、塩基対を形成するようにデザインした。2種のDNAオリゴヌクレオチド、野生型特異的invAプローブに相補的なinv2-Target1配列番号3、及びSNP特異的invAプローブに相補的なinv2-Target8配列番号4を合成した。前記2つのプローブの単一ヌクレオチドミスマッチを識別する能力を評価するために、等温的処理反応isothermalprocessingreactionを遂行した。反応での各構成成分の最終濃度は、200nMプローブ、0.4nMターゲットオリゴヌクレオチド、10mMトリスアセテートpH8.6、50mM酢酸カリウム、2.5mM酢酸マグネシウム、1mMDTT及び2.5uハイブリダーゼ熱安定性RNaseGIhybridasethermostableRNaseHIEpicentreの通りであった。前記反応物を55°Cで60分間インキュベーションしながら、毎分蛍光データを収集した。図1は、inv-CCProbe2配列番号1が、inv2-Target1配列番号3またはinv2-Target8配列番号4と反応したときに生成される蛍光信号を示している。inv-CCProbe2をinv2-Target1とインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、線形に増加し、RNaseHIがオリゴヌクレオチドと完璧に対を形成したプローブを認識及び切断したということを示している。inv-CCProbe2をinv2-Target8とインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、ほとんど生成されておらず、これは、ミスマッチされたオリゴヌクレオチドがRNaseHIに対してほぼターゲットとして作用していないということを示唆する。図2は、inv-CCProbe2-2C配列番号2を、inv2-Target1配列番号3またはinv2-Target8配列番号4と反応させたときに生成された蛍光信号を示している。蛍光の増加と示された完璧に対になったinv2-Target8とインキュベーションさせたとき、RNaseHIによって、Inv-CCProbe2-2Cが切断した。野生型invAターゲットとインキュベーションしたとき、蛍光信号はほとんど観察されておらず、これは、ミスマッチされた対に対する不良なプローブ切断を示す。実施例2サルモネラinvA遺伝子における合成SNPのリアルタイムPCR検出野生型または前述の突然変異型塩基を含む267ヌクレオチドのinvA配列を含むプラスミドDNAを合成した。40pgの野生型プラスミド、突然変異体プラスミド、または前記2つのプラスミドの混合体を、野生型配列または突然変異配列に相補的である、異なるように標識化されたプローブを含んだマルチプレックスリアルタイムPCR反応のテンプレートとして使用した。それぞれの構成成分の最終濃度は、800nM順方向プライマーサルモネラF1配列番号5、800nM逆方向プライマーsal-invR2配列番号6、200nM野生型特異的プローブinv-CCProbe2配列番号1、200nMSNP特異的プローブinv-CCProbe2-2C配列番号2、80uMそれぞれのdNTP、10mMトリスアセテートpH8.6、50mM酢酸カリウム、2.5mM酢酸マグネシウム、1mMDTT、2.5uプラチナTaqDNAポリメラーゼLifeTechnologies及び2.5uハイブリダーゼ熱安定性RNaseHIEpicentreの通りであった。前記PCR反応物を95°Cで2分間インキュベーションさせ、ホットスタートDNAポリメラーゼを活性化させた後、95°Cで10秒、及び60°Cで20秒の周期を40回遂行した。図3は、FAM標識されたinv-CCProbe2配列番号1から、PCRの間に生成された蛍光信号を示し、図4は、TYE665標識されたinv-CCProbe2-2C配列番号2から、PCRの間に生成された蛍光信号を示す。このPCR反応に係わる蛍光曲線は、それぞれのプローブが、完全に相補的なターゲットの増幅を検出することができ、1つのミスマッチを含むターゲットの増幅は、検出していないということを示す。実施例3ウシbカゼイン遺伝子のA1及びA2対立遺伝子の等温的検出乳牛の牛乳の中には、A2カゼイン及びA1bカゼインと呼ばれる、bカゼインタンパク質の2種の完全な天然変異体または形態が存在する。A1カゼインとA2bカゼインとの差は、67番位置にある単一アミノ酸である。A1変異体で、塩基はTであり、A2変異体で、前記塩基はGである。牛乳中のA1変異体bカゼインは、前記位置でヒスチジンアミノ酸を有するという点で、全ての哺乳動物のbカゼインのうちで唯一である。他種の乳は、そのbカゼイン鎖の同一の位置で、プロリンアミノ酸を有する点で、A2類似体と考えられることができるbカゼインを含む。水牛、ヤク、ヤギ及びヒトの乳は、いずれもA2類似形態のbカゼインを含む。本実施例では、それぞれFRET対を生成するために、二重に標識された2種の類似した19ヌクレオチドCataCleaveTMプローブを、ウシbカゼイン遺伝子のA1/A2SNPヌクレオチド位置を横切って塩基対を形成するようにデザインした。A1-CCProbe2-RC配列番号7は、A1対立遺伝子と完全に塩基対を形成し、A2-CCProbe1-RC配列番号8は、A2対立遺伝子と完全に塩基対を形成する。A1-CCProbe2-RCは、前記CataCleaveTMプローブの4個のRNA塩基のうち、最初プローブの5’末端基準がSNPヌクレオチド位置で塩基対を形成するようにデザインされた。A1対立遺伝子を示す、A1-Target-RC配列番号9及びA2対立遺伝子を示すA2-Target-RC配列番号10の2種DNAオリゴヌクレオチドを合成した。前記2つのプローブの単一ヌクレオチド差を識別する能力を評価するために、RNaseHIを使用して、等温処理反応を行った。反応物のうち、それぞれの構成成分の最終濃度は、200nMプローブ、0.4nMターゲットオリゴヌクレオチド、10mMトリスアセテートpH8.6、50mM酢酸カリウム、2.5mM酢酸マグネシウム、1mMDTT及び2.5uハイブリダーゼ熱安定性RNaseHIEpicentreの通りであった。前記反応物を55°Cで60分間インキュベーションしながら、毎分蛍光データを収集した。図5は、A1-CCProbe2-RC配列番号7が、A1-Target-RC配列番号9またはA2-Target-RC配列番号10と反応したときに生成される蛍光信号を示している。A1-CCProbe2-RCをA1-Target-RCとインキュベーションさせたとき、蛍光信号は線形に増加し、RNaseHIが完全に対を形成したオリゴヌクレオチドを認識して切断したということを示している。A1-CCProbe2-RCをA2-Target-RCとインキュベーションさせた場合、蛍光信号は、ほとんど生成されておらず、これは、ミスマッチされたオリゴヌクレオチドがRNaseHIに係わる不良なターゲットであるということを示唆する。図6は、A2-CCProbe1-RC配列番号8を、A1-Target-RC配列番号9またはA2-Target-RC配列番号10と反応させたときに発生する蛍光信号を示している。RNaseHIによるA2-CCProbe1-RC切断は、A2-CCProbe1-RCをA2-Target-RCとインキュベーションさせたときに行われたが、A1-Target-RCとインキュベーションさせた場合に切断は発生しなかった。実施例4ウシbカゼイン遺伝子のA1対立遺伝子及びA2対立遺伝子のリアルタイムPCR検出CataCleaveTM基盤SNP検出を利用した遺伝子型分析のために、3種セットの乳牛dairybullDNAを使用した。前記3種DNAは、前もって配列分析によって遺伝子型を分析し、bカゼイン遺伝子の3種の可能な遺伝子型、A1/A1、A2/A2及びA1/A2を示すということが分かった。Heyenらによって前もって開示されたところにより、オス牛の精液からDNAを抽出した。200ngのA1/A2遺伝子型、A2/A2遺伝子型またはA1/A2遺伝子型のゲノムDNAを、異なるように標識したA1-CCProbe2-RC配列番号7及びA2-CCProbe1-RC配列番号8をいずれも含む、マルチプレックスリアルタイムPCR反応物のテンプレートとして使用した。それぞれの構成成分の最終濃度は、800nM順方向プライマーA2D-F配列番号11、800nM逆方向プライマーA2D-R-150配列番号12、200nMA1-CCProbe2-RC配列番号7、200nMA2-CCProbe1-RC配列番号8、80uMそれぞれのdNTP、10mMトリスアセテートpH8.6、50mM酢酸カリウム、2.5mM酢酸マグネシウム、1mMDTT、2.5uプラチナTaqDNAポリメラーゼLifeTechnologies及び2.5uハイブリダーゼ熱安定性RNaseHIEpicentreの通りであった。前記PCR反応物を95Cで2分間インキュベーションさせ、ホットスタートDNAポリメラーゼを活性化した後、95°Cで10秒及び60°Cで30秒の周期を40回遂行した。図7は、TYE563標識されたA1-CCProbe2-RC配列番号7から、PCRの間に発生した蛍光信号を示し、図8は、TYE665標識されたA2-CCProbe1-RC配列番号8から、PCRの間に発生した信号を示す。前記PCR反応に係わる蛍光曲線は、それぞれのプローブが完璧に相補的なターゲットの増幅を検出することができ、単一ミスマッチを含むターゲットの増幅は、検出しないということを示唆する。本明細書で明示された任意の特許、特許出願、文献またはその他開示内容は、参照によって全体として本明細書に挿入される。本明細書に参照によって統合されるが、本明細書で提示された既存の定義、説明またはその他開示内容と相反する任意の内容、またはその一部は、統合された内容と本開示内容との間に相反が発生しない範囲においてのみ統合される。配列リスト自由テキスト添付された配列リスト配列番号1ないし33を参照する。"