式RリンカーAXで示される化合物。ロードコッカスデハロゲナーゼの基質である、請求項1に記載の化合物。XはClまたはBrである、請求項1~2のいずれか1項に記載化合物。Aはnであり、またn2~10である、請求項1~3のいずれか1項に記載化合物。リンカーは炭素原子数約2~約30の二価分枝または非分枝炭素鎖であって、随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有し、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わり、また該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子はアリールまたはヘテロアリール環に置き換わることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載化合物。リンカーはRとAを少なくとも12原子だけ分け隔てる、請求項1~4のいずれか1項に記載化合物。LおよびまたはAは単数または複数のアリールまたはヘテロアリール環を含む、請求項1に記載の化合物。少なくとも1つの機能性基はアミノ酸、アミノアシル化tRNA、化学療法薬、キレート剤、タンパク質、糖タンパク質、多糖、酵素、デハロゲナーゼ以外の酵素の基質、酵素阻害物質、自殺基質、補酵素、補因子、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、光学検出適性分子、光学検出適性分子の消光剤、核酸分子、金属、ヘム、金属キレート剤、グルタチオン、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、ヌクレオチド類似体、cAMP、NTA、cAMPのリガンド、ホスファチジルイノシトール、薬物、脂質、固体担体、Ca2結合分子、K結合分子、Na結合分子、pH感受性分子、放射性核種、高電子密度分子、発色団、MRI造影剤、X線造影剤、NOの存在下で蛍光を発する分子、三重項増感剤、反応性酸素に対して感受性である分子、またはナノ粒子を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物。固体担体は表面プラズモン共鳴センサーチップ、磁性体粒子、セファロースビーズ、セルロースビーズまたは導電性担体である、請求項8に記載の化合物。核酸分子はオリゴヌクレオチド、関心遺伝子に対応するDNA、タンパク質に結合するDNA、関心遺伝子に対応するRNA、終止コドンを欠くmRNA、またはRNAi用2本鎖RNAである、請求項8に記載の化合物。タンパク質はimmunoglobin分子である、請求項8に記載の化合物。化学療法薬はドキソルビシン、5フルオロウラシルまたはCPT11である、請求項8に記載の化合物。脂質はポリエチレングリコール修飾リン脂質である、請求項8に記載の化合物。三重項増感剤はエオシンまたはマラカイトグリーンである、請求項8に記載の化合物。ナノ粒子は免疫金粒子、量子ドット、常磁性体ナノ粒子、またはアップコンバージョンナノ粒子である、請求項8に記載の化合物。機能性基はATP、ADP、AMP、GTP、GDP、NADP、NAD、フラビンアデニンヌクレオチド、リン酸ピリドキサル、金属イオン、5デオキシアデノシルコバラミン、テトラヒドロ葉酸補酵素A、チアミン、リポフラビン、ニコチンアミド、CoAまたは補酵素B12である、請求項8に記載の化合物。阻害物質は可逆的酵素阻害物質である、請求項8に記載の化合物。阻害物質は非可逆的酵素阻害物質である、請求項8に記載の化合物。阻害物質はキャスパーゼ阻害物質、随意に逆転写酵素阻害物質でもあるポリメラーゼ阻害物質、キナーゼ阻害物質、テロメラーゼ阻害物質またはホスファターゼ阻害物質である、請求項8に記載の化合物。光学検出適性分子は蛍光団である、請求項8に記載の化合物。機能性基はアルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼまたはアルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ基質、またはキャスパーゼ基質である、請求項8に記載の化合物。2つの機能性基を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物。蛍光団とビオチンとを含む、請求項22に記載の化合物。少なくとも2つの機能性基が2種類の酵素に対応する基質を含む、請求項22に記載の化合物。1つの機能性基はルシフェリン基質であり、別の機能性基はプロテアーゼ基質である、請求項24に記載の化合物。3つの機能性基を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物。3つの機能性基は蛍光団、プロテアーゼ認識部位をもつタンパク質、および該蛍光団に対応する消光剤を含む、請求項26に記載の化合物。式RリンカーAX式中Rは単数または複数の機能性基であり、リンカーはC、N、SまたはOを含む多原子直鎖または分枝鎖であり、AXはデハロゲナーゼ基質であり、またXはハロゲン原子であり、少なくとも1つの機能性基はアミノアシル化tRNA、化学療法薬、キレート剤、光学検出適性分子の消光剤、多糖、表面プラズモン共鳴センサーチップ、セファロースビーズ、セルロースビーズ、導電性担体、ポリエチレングリコール修飾リン、X線造影剤、三重項増感剤、免疫金粒子、量子ドット、常磁性体ナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子、NADP、NAD、フラビンアデニンヌクレオチド、リン酸ピリドキサル、金属イオン、5デオキシアデノシルコバラミン、テトラヒドロ葉酸補酵素A、チアミン、リポフラビン、ニコチンアミド、CoA、補酵素B12、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、グルタチオン、ヘム、ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、ヌクレオチド類似体、NTA、cAMP、ホスファチジルイノシトール、cAMPのリガンド、自殺基質、アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ、可逆的酵素阻害物質または非可逆的酵素阻害物質であるか、または2以上の機能性基が存在する場合には、それらの機能性基は随意に蛍光団とビオチンまたは2種類の酵素に対応した2つの基質を含むか、または3以上の機能性基が存在する場合には、それらの機能性基は随意に蛍光団、プロテアーゼ認識部位をもつタンパク質、および該蛍光団に対応する消光剤を含むで示される化合物。対応する野生型デハロゲナーゼと比べて少なくとも2つのアミノ酸置換を含み、単数または複数の機能性基を含むデハロゲナーゼ基質と結合を形成する変異デハロゲナーゼであって、該結合は対応する野生型デハロゲナーゼと基質の間で形成される結合よりも安定しており、また変異デハロゲナーゼにおける少なくとも1つのアミノ酸置換は野生型デハロゲナーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または野生型デハロゲナーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であり、また第2の置換は野生型デハロゲナーゼにあって、活性部位ポケット内の、しかも野生型デハロゲナーゼに結合したデハロゲナーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基の置換であることを特徴とする変異デハロゲナーゼ。第2の置換は、単数または複数の電荷を導入する、単数または複数の水素結合を導入する、または立体障害を緩和することで、基質との結合を強めるようなアミノ酸の置換である、請求項29に記載の変異デハロゲナーゼ。少なくとも1つの置換はロードコッカスロードクロウスデハロゲナーゼのアミノ酸残基272に対応する位置での置換である、請求項29~30のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。アミノ酸残基272に対応する位置の置換アミノ酸はフェニルアラニン、グリシンまたはアラニンである、請求項31に記載の変異デハロゲナーゼ。少なくとも1つの置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基106に対応する位置での置換である、請求項29~32のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。アミノ酸残基106に対応する位置の置換アミノ酸はシステインまたはグルタミン酸である、請求項33に記載の変異デハロゲナーゼ。第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換である、請求項29~34のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。アミノ酸残基175に対応する位置の置換アミノ酸はメチオニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、セリンまたはシステインであり、アミノ酸残基176に対応する位置の置換アミノ酸はセリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニンまたはアルギニンであり、またはアミノ酸残基273に対応する位置のアミノ酸置換はロイシン、メチオニンまたはシステインである、請求項35に記載の変異デハロゲナーゼ。野生型デハロゲナーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型デハロゲナーゼに結合したデハロゲナーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基に第3の、また随意に第4の、置換をさらに含む、請求項29~36のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。第3または第4の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換である、請求項37に記載の変異デハロゲナーゼ。アミノ酸残基175に対応する位置の置換アミノ酸はメチオニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、セリンまたはシステインであり、アミノ酸残基176に対応する位置の置換アミノ酸はセリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニンまたはアルギニンであり、またはアミノ酸残基273に対応する位置のアミノ酸置換はロイシン、メチオニンまたはシステインである、請求項38に記載の変異デハロゲナーゼ。単数または複数の関心タンパク質をさらに含み、以って融合タンパク質を生成する、請求項29~39のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。対応する野生型デハロゲナーゼに対して少なくとも85のアミノ酸配列同一性を有する、請求項29~40のいずれ1項に記載の変異デハロゲナーゼ。対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも2つのアミノ酸置換を含み、少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成する変異ヒドロラーゼであって、また変異ヒドロラーゼにおける1つのアミノ酸置換は野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であり、また第2の置換は野生型ヒドロラーゼにあって、活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基の置換であることを特徴とする変異ヒドロラーゼ。第2の置換は、単数または複数の電荷を導入する、単数または複数の水素結合を導入する、または立体障害を緩和することで、基質との結合を強めるようなアミノ酸の置換である、請求項42に記載の変異ヒドロラーゼ。セリンβラクタマーゼではない、請求項42に記載の変異ヒドロラーゼ。第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換である、請求項42~44のいずれ1項に記載の変異ヒドロラーゼ。アミノ酸残基175に対応する位置の置換アミノ酸はメチオニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、セリンまたはシステインであり、アミノ酸残基176に対応する位置の置換アミノ酸はセリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニンまたはアルギニンであり、またはアミノ酸残基273に対応する位置のアミノ酸置換はロイシン、メチオニンまたはシステインである、請求項45に記載の変異ヒドロラーゼ。野生型デハロゲナーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型デハロゲナーゼに結合したデハロゲナーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基に第3の、また随意に第4の置換をさらに含む請求項42~46のいずれ1項に記載の変異ヒドロラーゼ。第3または第4の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換である、請求項47に記載の変異ヒドロラーゼ。アミノ酸残基175に対応する位置の置換アミノ酸はメチオニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、セリンまたはシステインであり、アミノ酸残基176に対応する位置の置換アミノ酸はセリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニンまたはアルギニンであり、またはアミノ酸残基273に対応する位置のアミノ酸置換はロイシン、メチオニンまたはシステインである、請求項48に記載の変異ヒドロラーゼ。変異ヒドロラーゼの存在または量を検出または測定するためのa請求項42~49のいずれか1項に記載の変異ヒドロラーゼを、単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質と接触させるステップおよびb該機能性基の存在または量を検出または測定し、以って変異ヒドロラーゼの存在または量を検出または測定するステップを含む方法。試料中の関心分子、細胞または細胞内小器官を単離するためのa請求項42~49のいずれか1項に記載の変異ヒドロラーゼと単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質とを含み、かつ関心分子、細胞または細胞内小器官と結合するタンパク質を含む融合タンパク質と試料を接触させるステップおよびb該関心分子、細胞または細胞内小器官を単離するステップを含む方法。少なくとも1つの機能性基は固体担体または固体担体と結合する分子である、請求項51に記載の方法。関心分子はタンパク質である、請求項51に記載の方法。請求項42~49のいずれか1項に記載の変異ヒドロラーゼを含む細胞を、単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質と接触させて、細胞を標識するようにするステップを含む細胞標識の方法。機能性基の存在または量を検出または測定するステップをさらに含む、請求項54に記載の方法。変異ヒドロラーゼは細胞内または細胞表面に存在する、請求項50~55のいずれか1項に記載の方法。変異ヒドロラーゼは単数または複数の関心タンパク質をさらに含み、以って融合タンパク質を生成する、請求項50~56のいずれか1項に記載の方法。関心タンパク質はGSTまたはFLAGである、請求項57に記載の方法。1つの関心タンパク質は変異ヒドロラーゼを細胞膜または小胞体に誘導する、請求項57に記載の方法。関心タンパク質はインテグリンまたはそのドメイン、カドヘリンまたはそのドメイン、リガンド依存性イオンチャンネルまたはそのドメイン、またはHERGチャンネルまたはそのドメインである、請求項57に記載の方法。融合タンパク質は、変異ヒドロラーゼを小胞体へと誘導するタンパク質とグリコシルホスファチジルイノシトールシグナル配列である別のタンパク質という2つの関心タンパク質を含む、請求項57に記載の方法。ヒドロラーゼはデハロゲナーゼである、請求項56~61のいずれか1項に記載の方法。少なくとも1つの機能性基はアミノ酸、タンパク質、糖タンパク質、核酸分子、薬物、脂質、ビオチン、固体担体、光学検出適性分子である、請求項50~62のいずれか1項に記載の方法。少なくとも1つの機能性基は蛍光団である、請求項63に記載の方法。基質は2つの機能性基を含む、請求項50~64のいずれか1項に記載の方法。基質は請求項1~28のいずれか1項に記載の化合物である、請求項50~65のいずれか1項に記載の方法。変異ヒドロラーゼはさらに選択マーカータンパク質を含む、請求項51に記載の方法。基質に含まれる少なくとも1つの機能性基は蛍光団である、請求項67に記載の方法。細胞を、基質との接触の前または後に、固定剤と接触させるステップをさらに含む、請求項51に記載の方法。細胞を基質と接触させるステップと同時並行で細胞を固定剤と接触させるステップをさらに含む、請求項51に記載の方法。細胞をメタノール、アセトンおよびまたはパラホルムアルデヒドで固定する、請求項69または70に記載の方法。変異デハロゲナーゼは特定宿主細胞で発現させるよう最適化した核酸配列によってコードされる、請求項62に記載の方法。式XXIX~XXXIVのいずれかで示される化合物。変異ヒドロラーゼは変異デハロゲナーゼであり、また基質は式RリンカーAXで示される、請求項50~72のいずれか1項に記載の方法。リンカーはC、N、SまたはOを含む多原子直鎖または分枝鎖である、請求項74に記載の方法。次のステップを含む、変異ヒドロラーゼの存在または量を検出または測定する方法a変異ヒドロラーゼを、単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質と接触させるステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であり、また該基質は請求項1~28のいずれか1項に記載の化合物であることを特徴とするステップおよびb該機能性基の存在または量を検出または測定し、以って変異ヒドロラーゼの存在または量を検出または測定するステップ。変異ヒドロラーゼは細胞内に存在する、請求項76に記載の方法。次のステップを含む、試料中の関心分子、細胞または細胞内小器官を単離する方法a試料を、変異ヒドロラーゼと単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質とを含む融合タンパク質と接触させるステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であり、該融合タンパク質は関心分子、細胞または細胞内小器官と結合するタンパク質を含み、また該基質は請求項1~28のいずれか1項に記載の化合物であることを特徴とするステップおよびb該関心分子、細胞または細胞内小器官を単離するステップ。次のステップを含む、細胞を標識する方法変異ヒドロラーゼを含む細胞を、単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質と接触させて、細胞を標識するようにするステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質と、Rhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼの位置175、176または273に対応するアミノ酸残基においてエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップ。機能性基の存在または量を検出または測定するステップをさらに含む、請求項79に記載の方法。請求項42~49のいずれか1項に記載の変異ヒドロラーゼをコードするポリヌクレオチド。対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも2つのアミノ酸置換を含む変異ヒドロラーゼであって、1つの置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基272に対応する位置またはRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基106に対応する位置での置換であり、第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼの位置175、176または273に対応するアミノ酸残基の置換であることを特徴とする変異ヒドロラーゼ。さらに第3および随意に第4の置換を位置175、176または273に対応するアミノ酸残基に含む、請求項82に記載の変異ヒドロラーゼ。Rhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175および272に対応する位置に置換がある変異デハロゲナーゼである、請求項82に記載の変異ヒドロラーゼ。アミノ酸残基176およびまたは273に対応する位置に置換をさらに含む、請求項84に記載の変異ヒドロラーゼ。Rhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175に対応する位置に少なくとも1つの置換を含む熱安定性変異デハロゲナーゼであって、該置換はアミノ酸残基175に対応する位置に変異を含まない変異デハロゲナーゼと比べた場合の熱安定性の向上と相関することを特徴とする熱安定性変異デハロゲナーゼ。置換アミノ酸はメチオニンである、請求項86に記載の熱安定性デハロゲナーゼ。次のステップを含む、試料中の関心分子、細胞または細胞内小器官を単離する方法試料を融合タンパク質と接触させて関心分子、細胞または細胞内小器官を単離しうるようにするステップであって、該融合タンパク質は第1部分と変異ヒドロラーゼとに結合しうる第1タンパク質、第3部分に結合しうる第2部分に連結した単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質、該第3部分と関心分子、細胞または細胞内小器官と結合するタンパク質との融合体、および固定化されたまたは固定化しうる第1部分を含み、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップ。第1タンパク質はFlagタグまたはGSTである、請求項88に記載の方法。第1部分は抗体またはその断片である、請求項88に記載の方法。第3部分はHisタグである、請求項88に記載の方法。次のステップを含む、関心分子を単離する方法a単数または複数の融合タンパク質を含む試料であってそのうちの少なくとも1つは変異ヒドロラーゼと関心分子に結合したタンパク質とを含む融合タンパク質である試料と単数または複数のヒドロラーゼ基質を含む固体担体とを準備するステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップおよびb該試料と該固体担体を接触させて関心分子を単離しうるようにするステップ。次のステップを含む、関心タンパク質を単離する方法a単数または複数の融合タンパク質を含む試料であってそのうちの少なくとも1つは変異ヒドロラーゼと関心タンパク質とを含む融合タンパク質である試料と単数または複数のヒドロラーゼ基質を含む固体担体とを準備するステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップおよびb該試料と該固体担体を接触させて関心タンパク質を単離しうるようにするステップ。関心分子はクロマチンである、請求項92に記載の方法。固体担体は表面プラズモン共鳴チップ、磁性体粒子、膜、ガラス、セルロース、自己組織化単分子膜、マルチウェルプレートのウェル、電子伝導性表面またはアガロースビーズである、請求項92~94のいずれか1項に記載の方法。複数の融合タンパク質は異なる関心分子にタンパク質を結合させている、請求項92に記載の方法。複数の融合タンパク質は異なる関心タンパク質を含む、請求項92に記載の方法。変異ヒドロラーゼは少なくとも2つの置換を含み、第2の置換は野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基の置換である、請求項92~97のいずれか1項に記載の変異ヒドロラーゼ。第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置の置換である請求項98に記載の方法。野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基に、第3の、また随意に第4の、置換をさらに含む、請求項98に記載の方法。第2の置換は、単数または複数の電荷を導入する、単数または複数の水素結合を導入する、または立体障害を緩和することで、基質との結合を強めるようなアミノ酸の置換である、請求項98に記載の方法。次のステップを含む、単数または複数の関心分子を試料から単離する方法a変異ヒドロラーゼを含む固体担体、および少なくとも1つは単数または複数の関心分子と結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を準備するステップであって、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップおよびb該試料、該固体担体および該ヒドロラーゼ基質を接触させて単数または複数の関心分子を単離しうるようにするステップ。固体担体は磁性体粒子、ナノ粒子、電子伝導性担体、マルチウェルプレートのウェル、表面プラズモン共鳴センサーチップ、ガラス、膜、プラスチック表面またはアルギン酸である、請求項102に記載の方法。1つの機能性基はグルタチオン、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、金属、NTA、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、酵素基質、酵素阻害物質、関心遺伝子に対応するDNA、タンパク質に結合するDNA、または関心遺伝子に対応するRNAである、請求項102または103に記載の方法。機能性基は可逆的酵素害物質である、請求項104に記載の方法。関心分子はタンパク質またはペプチドと融合している、請求項102に記載の方法。タンパク質またはペプチドはGST、FLAGタグ、Strepタグ、カルモジュリン結合ペプチド、NuA、マルトース結合ペプチド、ビオチン化ペプチド、チオレドキシン、低分子量のユビキチン様修飾因子またはHisタグである、請求項106に記載の方法。関心分子はタンパク質、遺伝子、RNAまたはペプチド核酸である、請求項102に記載の方法。変異ヒドロラーゼは少なくとも2つの置換を含み、第2の置換は野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基の置換である、請求項102~108のいずれか1項に記載の方法。第2の置換は、単数または複数の電荷を導入する、単数または複数の水素結合を導入する、または立体障害を緩和することで、基質との結合を強めるようなアミノ酸の置換である、請求項102~108のいずれか1項に記載の方法。第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置の置換である、請求項110に記載の方法。野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基に、第3の、また随意に第4の、置換をさらに含む、請求項102~110のいずれか1項に記載の方法。次のステップを含む、単数または複数の関心分子を試料から単離する方法試料、変異ヒドロラーゼ、および少なくとも1つは関心分子と結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を接触させて単数または複数の関心分子を単離しうるようにするステップであって、試料は変異ヒドロラーゼと少なくとも1つは関心分子と結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を含むか、または試料は少なくとも1つは関心分子および変異ヒドロラーゼと結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を含み、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップ。次のステップを含む、試料中の単数または複数の関心分子を検出する方法a試料、変異ヒドロラーゼ、および少なくとも1つは関心分子と結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を接触させるステップであって、試料は変異ヒドロラーゼと少なくとも1つは関心分子と結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を含むか、または試料は少なくとも1つは関心分子および変異ヒドロラーゼと結合することができる単数または複数の機能性基を含むヒドロラーゼ基質を含み、該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼと比べて少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、該少なくとも1つのアミノ酸置換の結果として対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合を基質と形成し、また変異ヒドロラーゼにおける該少なくとも1つのアミノ酸置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質との間で形成される結合を開裂させる水分子の活性化に関連するアミノ酸残基の置換、または対応する野生型ヒドロラーゼにあって基質とエステル中間体を形成するアミノ酸残基の置換であることを特徴とするステップおよびb関心分子の存在または量を検出または測定するステップ。少なくとも1つの反応性基はルシフェリン、プロテアーゼ認識部位、蛍光団、蛍光団の消光剤、DNAまたはRNA、関心遺伝子またはその一部分に対応し随意にタンパク質に結合するDNAまたはRNA、グルタチオン、金属、NTA、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、酵素基質、酵素阻害物質、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、ホスファチジルイノシトール、cAMP対応リガンド、蛍光cAMP、終止コドンを欠くmRNA、またはアミノアシル化tRNAである、請求項113または114に記載の方法。関心分子はタンパク質、酵素、cAMP、RNA、DNA、転写複合体、または翻訳複合体である、請求項113または114に記載の方法。酵素はキナーゼ、ホスホジエステラーゼまたはプロテアーゼである、請求項116に記載の方法。プロテアーゼはキャスパーゼである、請求項117に記載の方法。キナーゼはホスファチジルイノシトール3キナーゼである、請求項117に記載の方法。基質は少なくとも2つの機能性基を含む、請求項113または114に記載の方法。1つの機能性基はホスファチジルイノシトールであり、別の機能性基は蛍光団である、請求項120に記載の方法。少なくとも1つの機能性基は関心分子に結合せず、また発光性または蛍光性である、請求項120に記載の方法。関心分子に結合しない少なくとも1つの機能性基ルシフェラーゼ基質である、請求項120に記載の方法。少なくとも1つの機能性基は光学検出適性の分子である、請求項113または114に記載の方法。少なくとも1つの機能性基は蛍光団である、請求項124に記載の方法。基質は少なくとも3つの機能性基を含む、請求項124に記載の方法。変異ヒドロラーゼは少なくとも2つの置換を含み、第2の置換は野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基の置換である、請求項113~126のいずれか1項に記載の方法。第2の置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置の置換である、請求項127に記載の方法。野生型ヒドロラーゼの活性部位ポケット内の、しかも野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の、アミノ酸残基に、第3の、また随意に第4の、置換発明の詳細な説明用語の定義求核剤は電子を供与する分子である。選択マーカーは、細胞にある種の必須栄養素を欠く培地で増殖する能力を付与する酵素活性をコードするか、または抗生物質または他の薬物を添加した培地で増殖する能力を付与する酵素活性をコードする。すなわち選択マーカーをコードする遺伝子がある細胞で発現すると、該細胞には、該遺伝子を欠く、対応する細胞にはない抗生物質または薬物に対する耐性が付与される。宿主細胞が選択培地で増殖するには選択マーカーを発現しなければならないとき、該マーカーは陽性選択マーカーという。選択マーカーはまた、特定遺伝子を含む宿主細胞の選択に使用することもできる。こうした使われ方をする選択マーカーは陰性選択マーカーまたは排除選択マーカーという。共通の選択マーカー遺伝子配列は抗生物質たとえばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Zeocin登録商標などに対する耐性に対応する配列を含む。選択可能な栄養要求性遺伝子配列はたとえばヒスチジノール存在下のヒスチジン無添加培地での増殖を可能にするhisDを含む。好適な選択マーカー遺伝子はブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオルイン遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子、AURI遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、チミンキナーゼ遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などを含む。核酸はここでは、共有結合でつながった一連のヌククレオチドであって、そこではあるヌクレオチドのペントースの3位がホスホジエステル基を介して次のヌクレオチドのペントースの5に結合しており、またそこではヌクレオチド残基が特定の配列で連結されていることを特徴とする一連のヌクレオチドすなわち線形順序のヌクレオチドであり、またその類似体たとえば塩基、糖鎖およびまたはリン酸骨格に単数または複数の修飾体をもつ類似体を包含する。ポリヌクレオチドはここでは、鎖長約100ヌクレオチド以上の配列を含む核酸をいう。オリゴヌクレオチドまたはプライマーはここでは、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部分をいう。用語オリゴヌクレオチドまたはオリゴはここでは、2以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを、好ましくは3以上、また通常は10以上の、ただし250以下の、好ましくは200以下のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドは任意の方法で、たとえば化学合成、DNA複製、増幅たとえばPCR、逆転写、またはそれらの併用法で生成させてよい。プライマーは、プライマー伸張が開始される条件下に置かれたときに核酸合成の開始点として機能しうるオリゴヌクレオチドである。プライマーはその3末端に、標的の特定配列に対して実質的に相補的である領域をもつように選択する。プライマー伸張が起こるためには、プライマーは標的とハイブリダイズしうるほど相補的でなければならない。プライマー配列は標的配列の厳密な反映である必要はない。たとえば非相補的な配列断片がプライマーの5末端に付着していても、プライマーの残りの配列が標的と実質的に相補的であれば、かまわない。プライマー配列が標的配列とハイブリダイズしうるほどの相補性を有し、従ってプライマー伸張産物の合成に必要な複合体を形成しうる限り、プライマーの中に非相補的な塩基またはもっと長い配列を散在させることも可能である。ある遺伝子配列とマッチするまたは相補的なプライマーは増幅反応、RTPCRなどに使用してもよい。核酸分子は5末端と3末端をもつと言われるが、それは核酸のホスホジエステル結合が隣り合うモノヌクレオチドのペントース環の5炭素と3炭素の間で起こるためである。新しい結合が5炭素に対するものとなるポリヌクレオチド末端は5末端ヌクレオチドである。新しい結合が3炭素に対するものとなるポリヌクレオチド末端は3末端ヌクレオチドである。末端ヌクレオチドはここでは3または5末端の末端位のヌクレオチドである。DNA分子は5末端と3末端をもつと言われるが、それはモノヌクレオチド同士が反応して、一方のモノヌクレオチドのペントース環の5リン酸がその隣のペントース環の3酸素に、ホスホジエステル結合を介して一方向へと結合し、オリゴヌクレオチドを形成するからである。従って、オリゴヌクレオチドの末端は、5リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の3酸素に結合していない場合には5末端といい、また3酸素が隣のモノヌクレオチドのペントース環の5リン酸に結合していない場合には3末端という。核酸配列はここでは、たとえもっと大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに内在する場合でも、やはり5末端と3末端をもつと言ってもよい。線状、環状いずれのDNA分子でも、離散配列を上流または下流配列という。この用語は転写がDNA鎖に沿って5→3へと進行することを反映している。一般に、結合している遺伝子の転写を指揮するプロモーターまたはエンハンサー配列はコード領域の5または上流に位置するのが普通である。しかし、エンハンサー配列は、たとえプロモーター配列およびコード領域の3に位置する場合でも、その影響力を行使することができる。転写終結およびポリアデニル化シグナルは3すなわちコード領域の下流に位置する。用語コドンはここでは、ポリペプチド鎖に組み込まれるべき特定アミノ酸を指定する3個1組のヌクレオチドからなる基本的な遺伝暗号単位であるか、または開始または終止シグナルである。用語コード領域は、構造遺伝子との関連で使用されるときは、mRNA分子の翻訳の結果としての新生ポリペプチド中に見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列をいう。一般に、コード領域は5側がイニシエーターのメチオニンをコードするトリプレットATGを、また3側が終止コドンを、それぞれ境界とする。コード領域はトリプレットTTGを開始コドンとする例もある。用語単離およびまたは精製は核酸分子、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の、invivo物質を伴わないinvitro合成、単離およびまたは精製をいう。従って、用語単離は単離オリゴヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドなどのように核酸に関連して使用されときは、その源泉では付随しているのが普通である少なくとも1つの不純物から分離された、同定済みの核酸配列をいう。単離核酸は天然で見られる状態とは異なる形で存在する。それに対して、非単離核酸は天然に存在する状態で見られる。たとえば任意のDNA配列は宿主細胞の染色体上に近隣遺伝子と隣接して存在し、またRNA配列は多様なタンパク質をコードする多数の他mRNAと共に混合体として細胞内に存在する。従って、ゲノム、cDNAまたは合成に由来するポリヌクレオチド、またはそれらの混合体、を含む単離核酸分子に関しては、該単離核酸分子は天然に存在する状態では共に見られるポリヌクレオチドを全くまたは部分的に伴わない、天然では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結している、またはより大きな配列の一部として天然には存在しない。該単離核酸分子は1本鎖でも2本鎖でもよい。核酸分子は、タンパク質の発現に使用されときは、少なくともセンス鎖またはコード鎖を含むが、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでもよい。用語野生型はここでは、天然源から単離された遺伝子または遺伝子産物の特質をもつ遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は個体群の中で最も頻繁に見られる遺伝子であり、そのため恣意的に野生型遺伝子と呼ばれる。それに対して、変異は野生型遺伝子または遺伝子産物と比べて配列およびまたは機能的性質の変化を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然の変異体が単離されることもあるが、これらは野生型遺伝子または遺伝子産物と比べて特質が変化していることから識別される。用語組み換えDNA分子は自然では一緒に見付からないのが普通である少なくとも2つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドDNA配列を意味する。用語ベクターは、その中にDNA断片を挿入またはクローニングされる核酸分子であって、DNA断片の細胞への導入に使用することができ、また細胞内での複製が可能である核酸分子をいう。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどに由来する。用語組み換えベクター、発現ベクターまたはコンストラクトはここでは、所期のコード配列を含むDNAまたはRNA配列、および作動可能に連結したコード配列の、特定宿主生物での発現に必要な適正なDNAまたはRNA配列をいう。原核生物発現ベクターは宿主細胞での自己複製のためのプロモーター、リボソーム結合部位および複製起点を含み、またおそらく他の随意配列、たとえばオペレーター配列、制限酵素部位などを含む。プロモーターは、RNAポリメラーゼにDNAへの結合とRNA合成とを指示するDNA配列である。真核生物発現ベクターはプロモーター、随意にポリアデニル化シグナル、および随意にエンハンサー配列を含む。ペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、対応する完全長ペプチド、タンパク質またはポリペプチドと実質的に同じ活性をもつ遺伝子産物をコードする遺伝子のコード領域またはその断片を含む核酸配列を意味する。コード領域はcDNA、ゲノムDNAまたはRNAのいずれの形で存在してもよい。DNAの形で存在するときは、オリゴヌクレオチドは1本鎖でも2本鎖でもよい。適正な転写開始およびまたは1次RNA転写産物の正しい加工に必要ならば、好適な制御因子たとえばエンハンサープロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどを遺伝子のコード領域の近傍に配置してもよい。あるいは、本発明の発現ベクターに利用されるコード領域は内在性のエンハンサープロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含んでもよい。さらなる実施形態では、コード領域は内在性、外来性の両調節因子の組み合わせを含む。用語転写調節因子または転写調節配列は、核酸配列の発現のいくつかの側面を制御する遺伝因子または配列をいう。たとえばプロモーターは作動可能に連結したコード領域の転写開始を促す調節因子である。調節因子の他の非限定的な例は転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、およびエンハンサー配列などであり、また結合した配列の転写を、たとえばトランス作用性因子の存在下に、増減させる配列などもある。真核生物の転写調節シグナルはプロモーターおよびエンハンサー配列を含む。プロモーターおよびエンハンサーは転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いDNA配列からなる。プロモーターおよびエンハンサー配列はすでに酵母、昆虫および哺乳動物の各細胞内の遺伝子など種々の真核細胞源から単離されている。プロモーターおよびエンハンサー配列はウイルスからも単離されており、また類似の調節因子たとえばプロモーターは原核生物でも見付かっている。特定プロモーターおよびエンハンサーの選択は関心タンパク質の発現に使用する細胞型に左右される。真核生物プロモーターおよびエンハンサーは宿主範囲が広いものもあれば、宿主が限られるものもある。たとえばSV40初期遺伝子エンハンサーは多数の哺乳動物種に由来する多様な細胞型に対応するため、哺乳動物細胞でのタンパク質発現に広く使用されてきた。広範囲の哺乳動物細胞型に対応するプロモーターエンハンサー配列の他の2例はヒト伸張因子1遺伝子およびラウス肉腫ウイルスやヒトサイトメガロウイルスの長い末端反復配列に由来する。用語プロモーターエンハンサーは、プロモーター、エンハンサー両機能を提供しうる配列を含むDNAセグメントを意味する。たとえばレトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーター、エンハンサー両機能を含む。エンハンサープロモーターは内在性、外来性、異種のいずれでもよい。内在性エンハンサープロモーターはゲノム中の任意の遺伝子と自然に連結されているものである。外来性または異種エンハンサープロモーターは、結合されたエンハンサープロモーターにより遺伝子の転写が指示されるよう、遺伝子操作により該遺伝子と並置されるものである。発現ベクター上にスプライシングシグナルが存在するとしばしば、真核生物宿主細胞での組み換え転写産物の発現レベルを上昇させる結果となる。スプライシングシグナルは1次RNA転写産物からのイントロンの除去を媒介し、またスプライス供与および受容部位からなる。常用のスプライス供与および受容部位はSV40の16SRNAに由来するスプライス部位である。組み換えDNA配列が真核細胞で効率的に発現するには、効率的な転写終結および転写産物のポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流で見付かり、その長さは数百ヌクレオチドである。用語ポリ部位またはポリ配列はここでは、転写終結と新生RNA転写産物のポリアデニル化の両方を指示するDNA配列をいう。組み換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましいのは、ポリテールを欠く転写産物は不安定で、急速に分解するためである。発現ベクターに利用されるポリシグナルは異種でも内在性でもよい。内在性ポリシグナルは任意のゲノム遺伝子のコード領域の3末端に自然に存在するものである。異種ポリシグナルはある遺伝子から単離され、別の遺伝子の3に置かれたものである。常用の異種ポリシグナルはSV40ポリシグナルである。SV40ポリシグナルは237bpのBamHIBclI制限断片に含まれ、転写終結とポリアデニル化の両方を指示する。真核生物発現ベクターはまたウイルスレプリコンまたはウイルス複製起点を含んでもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現するベクターの宿主細胞内での染色体外複製を可能にするウイルスDNA配列である。SV40またはポリオーマウイルス複製起点を含むベクターは適切なウイルスT抗原を発現する細胞では高コピー数へと複製する。一方、ウシパピローマウイルスまたはEpsteinBarrウイルスに由来するレプリコンを含むベクターは染色体外で低コピー数の複製をする。用語invitroは人工環境また人工環境内での過程または反応をいう。invitro環境の非限定的な例は試験管および細胞溶解液などである。用語insituは細胞培養をいう。用語invivoは自然環境および自然環境内での過程または反応をいう。用語発現系は関心遺伝子の発現を判定するためのアッセイまたはシステムをいう。分子生物学分野の当業者には自明であろうが、多種多様な発現系のうち任意のものを使用してよい。広範囲の好適な哺乳動物細胞が広範囲のソースから入手可能である。形質転換またはトランスフェクション方法、および発現媒体の選択は選択される宿主系に依存しよう。形質転換およびトランスフェクションの方法はSambrooketal1989などで開示されている。発現系はinvitro遺伝子発現アッセイを含むが、そこでは関心遺伝子が調節配列に連結され、遺伝子の発現を抑制または誘導する薬剤による処理の後に遺伝子の発現がモニターされる。遺伝子発現の検出は、発現mRNAまたはタンパク質の検出または関心遺伝子を発現するの表現型の検出可能な変化などを非限定的に含む任意好適の手段で行うことができる。発現系はまた、開裂イベントまたは他の核酸または細胞変化を検出するアッセイを含んでもよい。用語遺伝子は、ポリペプチドの産生に必要なコード配列と随意に制御配列とを含むDNA配列をいう。ポリペプチドをコードするのは完全長コード配列でもよいし、また完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性をもつ遺伝子産物をコードする限りで、該コード配列の一部分でもよい。核酸は種々のタイプの変異を含むことが知られている。点変異はヌクレオチド配列中の一塩基位置の、野生型配列からの変化をいう。変異はまた、参照配列たとえば野生型配列との比較で単数または複数塩基の挿入または欠失をいう。用語ハイブリダイズするおよびハイブリダイゼーションは標的核酸に対する相補配列のアニーリングを、すなわち相補性配列を含む2核酸ポリマーの塩基対合によるアニーリングを、いう。用語アニールしたおよびハイブリダイズしたは終始、互換的に使用されており、また相補配列と標的核酸の間の任意の特異的かつ再現可能な相互作用を、部分的に相補性を有するだけの領域の結合を含めて、包摂する。本発明の核酸には天然核酸には通常見られないある種の塩基が含まれてもよいが、イノシンおよび7デアザグアニンなどはその一例である。核酸技術の当業者なら、相補鎖長、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度、塩基対ミスマッチ頻度などを含む数多くの変数を考慮して、2本鎖の安定性を経験的に求めることができる。核酸2本鎖の安定性は融点Tmによって測定する。指定条件下の特定核酸2本鎖のTmは、塩基ペアの半数が解離する温度である。用語ストリンジェンシーは核酸ハイブリダイゼーションを実行するときの温度、イオン強度および他化合物の存否といった条件に関連して使用される。高ストリンジェンシー条件では、相補塩基配列の出現頻度が高い核酸断片の間でだけ核酸塩基の対合が起こる。従って、互いに完全には相補的でない核酸を一緒にハイブリダイズまたはアニールさせたいときは中または低ストリンジェンシー条件がしばしば求められる。多数の同等条件を採用して中または低ストリンジェンシー条件としうることは技術上周知である。ハイブリダイゼーション条件の選択は一般に当業者には自明であり、またハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションのタイプ、および配列間の所期関連性レベルなどによって導かれるのが普通である。核酸2本鎖の安定性はミスマッチ塩基数の増加に伴い低下していくことが、またハイブリッド2本鎖内の相対的なミスマッチ位置によっても多かれ少なかれ低下していくことが、判明している。従って、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを利用して、そうした2本鎖の安定性を極大化または極小化することができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは次の方法で変化させることができるハイブリダイゼーション温度の調整ハイブリダイゼーションミックス中のらせん構造不安定化剤たとえばホルムアミドの百分率の調整および洗浄液の温度およびまたは塩濃度の調整。フィルターハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの最終ストリンジェンシーはしばしばハイブリダイゼーション後洗浄の塩濃度およびまたは温度で決まる。高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションとの関連では、5×SSPE、05SDS、5×デンハルト試薬および100μgml変性サケ精子DNAからなる溶液による42°Cでの結合またはハイブリダイゼーションとそれに続く01×SSPEと10SDSとを含む溶液による42°Cでの洗浄と同等の条件を含む。中ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションとの関連では、5×SSPE、05SDS、5×デンハルト試薬および100μgml変性サケ精子DNAからなる溶液による42°Cでの結合またはハイブリダイゼーションとそれに続く10×SSPEと10SDSとを含む溶液による42°Cでの洗浄と同等の条件を含む。低ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションとの関連では、5×SSPE、01SDS、5×デンハルト試薬50×デンハルト試薬は500mlあたり5gFicoll5gBSAを含むおよび100μgml変性サケ精子DNAからなる溶液による42°Cでの結合またはハイブリダイゼーションとそれに続く5×SSPEと01SDSとを含む溶液による42°Cでの洗浄と同等の条件を含む。ペプチド、タンパク質およびポリペプチドは任意のアミノ酸を意味し、鎖長または翻訳後修飾の有無は問わない。これらの用語は特に断らない限り互換可能である。本発明の核酸分子は、全長変異タンパク質と実質的に同じ活性をもつ天然タンパク質またはその断片をコードする。好ましくは、そうした変異タンパク質は対応する野生型タンパク質に対するアミノ酸配列の一致率が少なくとも85であり、より好ましくは90であり、最も好ましくは95または99である。ポリペプチド分子はアミノ末端およびカルボキシル末端をもつと言われる。それは第1アミノ酸残基の骨格アミノ基と第2アミノ酸残基の骨格アミノ基の間でペプチド結合が起こるためである。用語N末端およびC末端は、ポリペプチド配列に関しては、それぞれポリペプチドのN末端およびC末端領域の一部分を含めたポリペプチドの領域をいう。ポリペプチドのN末端領域の一部分を含む配列はポリペプチド鎖のN末端側半分に由来するアミノ酸を主に含むが、そうした配列に限定されない。たとえば、N末端配列は該ポリペプチドのN末端側半分とC末端側半分の両方に由来する塩基を含むポリペプチド配列の内部を含んでもよい。C末端領域の場合も同じである。C末端およびN末端領域はポリペプチドの最終的なN末端およびC末端をそれぞれ画定するアミノ酸を含んでもよいが、その必要はない。用語単離は、単離タンパク質または単離ポリペプチドなどのようにポリペプチドとの関連で使用されるときには、その源泉では付随しているのが普通である少なくとも1つの不純物から分離された同定済みのポリペプチドをいう。従って単離ポリペプチドは天然タンパク質とは関係しない、同じ源泉に由来する他タンパク質を、たとえばヒトタンパク質を含まない、別の種に由来する細胞で発現する、または天然には存在しない。一方、非単離ポリペプチドは天然に存在する状態で見付かる。用語単離ポリペプチド、単離ペプチドまたは単離タンパク質は、合成起源のものを含めたcDNAまたは組み換えDNAまたはそれらの組み合わせによってコードされるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含む。用語組み換えタンパク質または組み換えポリペプチドはここでは、組み換えDNA分子から発現するタンパク質分子をいう。一方、用語天然タンパク質はここでは、天然に存在する源泉から単離したタンパク質を指すのに用いる。天然タンパク質と同じ性質を備えた組み換え体のタンパク質の生産には分子生物学的手法を用いてもよい。用語融合ポリペプチドはここでは、関心タンパク質を別種のタンパク質たとえば変異ヒドロラーゼに結合させて含むキメラタンパク質をいう。用語抗体はここでは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子断片によって実質的にコードされる単数または複数のポリペプチドをもつタンパク質をいう。認定された免疫グロブリン遺伝子には無数の免疫グロブリン可変部遺伝子だけでなく、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常部遺伝子もある。軽鎖はκ、λのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、それに応じて免疫グロブリンのクラスIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEができる。基本的な免疫グロブリン構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は軽鎖と重鎖をもつ。各鎖のN末端は可変部であり、100~110超のアミノ酸からなる可変部をなし、主に抗原認識に関与する。用語軽鎖可変部および重鎖可変部はそれぞれ軽鎖、重鎖の可変部をいう。抗体は修飾型免疫グロブリンとして、または種々の形の修飾体として、たとえばFabFc2、Fab、Fv、Fd、2、軽鎖および重鎖の可変部だけを含むFv断片、可変部と定常部の一部分とを含むFabまたは2、単鎖抗体などとして、存在してもよい。Fvの重鎖および軽鎖は同じ抗体に由来してもよいし、異なる抗体に由来してキメラFvを形成してもよい。抗体は動物起源でもヒト起源でもよいし、またキメラ体でもヒト化体でよい。用語抗体はここでは、種々の形態を含む。用語細胞、細胞系、宿主細胞はここでは互換的に使用され、またそうした呼称はすべてその子孫または潜在的な子孫を包摂する。形質転換細胞は本発明の核酸分子をすでに導入してある細胞を意味する。随意に、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを産生することができる安定的にトランスフェクトした細胞系を創出するために、該核酸分子を好適な細胞系に導入してもよい。そうした細胞系を構築するためのベクター、細胞および方法は技術上周知である。用語形質転換体または形質転換細胞は導入数に関係なく、原初の形質転換細胞に由来する初代培養株を包摂する。子孫はどれも、意図的または偶発的な突然変異のためにDNA含量が厳密には同じでなくてもよい。にもかかわらず、原初の形質転換細胞でスクリーニングされた機能性をそのまま受け継ぐ変異体子孫は形質転換体に包摂される。用語相同性は相補性の度合いをいい、部分相同性でも完全相同性でもよい。相同性はしばしば配列分析ソフトウェアを使用して測定する。そうしたソフトウェアは種々の置換、欠失、挿入および他の修飾などに相同性の度合いを割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。同類置換は一般に次のグループ内の置換を含むグリシン、アラニンバリン、イソロイシン、ロイシンアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンセリン、トレオニンリジン、アルギニンおよびフェニルアラニン、チロシン。用語精製または精製するは、関心成分たとえばタンパク質または核酸から若干の不純物を除去する任意の処理の結果を意味する。従って試料中の精製成分の百分率は高まる。用語作動可能に連結したはここでは、任意の遺伝子の転写およびまたは初期タンパク質分子の合成を指示しうる核酸分子が生成されるようにする核酸配列の結合をいう。この用語はまた、機能性のタンパク質またはポリペプチド、またはその前駆体たとえばプレ体またはプレプロ体のタンパク質またはポリペプチドが生成されるようにするアミノ酸コード化配列の結合をもいう。ここで特定されるアミノ酸残基はすべて天然のL型である。標準ポリペプチド命名法に従ったアミノ酸残基の略語を次の対応表に示す。用語ポリヒスチジン配列またはHisタグはHis残基2~10個を含む分子たとえば5~10His配列をいう。ポリヒスチジン配列は共有結合分子の、固定化金属たとえばニッケル、亜鉛、コバルトまたは銅、キレートカラム表面での、または他分子との相互作用による、アフィニティー精製を可能にする。純粋はここでは、支配種として存在する目的種を意味し、また実質的に精製された画分は好ましくは、高分子種の全存在量の少なくとも約50を目的種が占めるような組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は該組成物中に存在する全高分子種の約80超を含み、より好ましくは約85、約90、約95および約99超を含む。最も好ましくは、目的種は本質的に均一に精製され、また該組成物は本質的に単一高分子種からなる。量子ドットは広い励起帯と狭い発光帯をもつ極小の、明るい、高光安定性の半導体結晶子、すなわち蛍光結晶ナノ粒子でである。アップコンバージョンナノ粒子は、赤外光によって励起される吸収体とIR光を可視光に変換する結晶格子内の放出体イオンとが結合したナノ粒子を意味する。三重項増感剤はここでは、化学的にほぼ不活性であって、かつ基質による吸収がないかまたは弱い波長で光を吸収することができる分子または原子団である。該増感剤はその後、該基質または化合物の酸素原子を一重項酸素状態へと励起させるようなエネルギーを放出することができる。一重項酸素状態の酸素原子をもつ基質は分子たとえば近傍タンパク質を分解することができる。三重項増感剤の例はエオシンまたはマラカイトグリーンである。診断用途に有用な放射性核種の例は金属放射性核種であり、たとえばアンチモン124、アンチモン125、ヒ素74、バリウム103、バリウム140、ベリリウム7、ビスマス206、ビスマス207、カドミウム109、カドミウム115、カルシウム45、セリウム139、セリウム141、セリウム144、セシウム137、クロム51、コバルト55、コバルト56、コバルト57、コバルト58、コバルト60、コバルト64、銅67、エルビウム169、ユウロピウム152、ガリウム64、ガリウム68、ガドリニウム153、ガドリニウム157、金195、金199、ハフニウム175、ハフニウム175~181、ホルミウム166、インジウム110、インジウム111、イリジウム192、鉄55、鉄59、クリプトン85、鉛210、マンガン54、水銀197、水銀203、モリブデン99、ネオジム147、ネプツニウム237、ニッケル63、ニオブ95、オスミウム185191、パラジウム103、白金195m、プラセオジム143、プロメチウム147、プロトアクチニウム233、ラジウム106、レニウム186、レニウム188、ルビジウム86、ルテニウム103、ルテニウム106、スカンジウム44、スカンジウム46、セレン75、銀110m、銀111、ナトリウム22、ストロンチウム85、ストロンチウム89、ストロンチウム90、硫黄35、タンタル182、テクネチウム99m、テルル125、テルル132、タリウム204、トリウム228、トリウム232、タリウム170、スズ113、スズ114、スズ117m、チタン44、タングステン185、バナジウム48、バナジウム49、イッテルビウム169、イットリウム86、イットリウム88、イットリウム90、イットリウム91、亜鉛65およびジルコニウム95などである。画像化に有用な放射性核種は銅、ガリウム、インジウム、レニウムおよびテクネチウムの放射性同位体たとえば64Cu、67Cu、111In、99mTc、67Gaまたは68Gaなどが含まれる。X線造影剤に有用な金属はRe、Sm、Ho、Lu、Yt、Pm、Bi、Pd、Gd、La、Au、Yb、Dy、Cu、Rh、AgおよびIrの放射性同位体などである。タンパク質不安定化配列またはタンパク質不安定化ドメインは、タンパク質のN末端またはC末端に存在するとき、結合したタンパク質の半減期を、タンパク質不安定化配列またはドメインを欠く対応するタンパク質と比べて、少なくとも80、好ましくは少なくとも90、なお好ましくは少なくとも95以上たとえば99、増減させるような単数または複数のアミノ酸残基を含む。タンパク質不安定化配列の非限定的な例はPEST配列たとえばサイクリン由来PEST配列、ウラシルペルメアーゼまたはODC、短寿命タンパク質たとえばODCのC末端領域に由来する配列、初期応答タンパク質たとえばサイトカイン、リンホカイン、プロトオンコジーンたとえばcmycまたはcfos、MyoD、HMGCoAレダクターゼ、Sアデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、CL配列、サイクリン分解シグナル、Nデグロン、またはinvivoでユビキチン化されるタンパク質またはその断片などである。関心タンパク質の非限定的な例は選択マーカータンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、酵素、酵素基質、受容体タンパク質、輸送体タンパク質、転写因子、チャンネルタンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝性タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、分泌タンパク質、受容体リガンド、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、または反応性システインをもつタンパク質などである。たとえば、関心タンパク質は変異ヒドロラーゼを細胞膜または小胞体へと誘導してもよい。たとえば該関心タンパク質はインテグリンタンパク質またはそのドメインであり、また一実施形態では変異ヒドロラーゼは、変異ヒドロラーゼ自体を小胞体へと誘導する配列と、またグリコシルホスファチジルイノシトールシグナル配列と、融合される。I変異ヒドロラーゼとその融合体本発明の範囲内の変異ヒドロラーゼの非限定的な例は遺伝子組み換え技術たとえば部位特異的変異誘発または再帰的変異誘発で合成されるものなどであり、また該変異ヒドロラーゼに、対応する非変異ヒドロラーゼの基質たとえば単数または複数の機能性基を含むよう修飾した基質との安定した結合の形成を、対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合よりも安定した結合の形成を、可能にさせる単数または複数のアミノ酸置換を含む。本発明の範囲内の変異ヒドロラーゼの非限定的な例はペプチダーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、ホスファターゼなどである。たとえばヒドロラーゼの非限定的な例はエステル結合に作用する酵素たとえばカルボン酸エステルヒドロラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ、二リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸トリエステルヒドロラーゼ、5ホスホモノエステルを生成するエキソデオキシリボヌクレアーゼ、5ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、3ホスホモノエステルを生成するエキソリボヌクレアーゼ、リボまたはデオキシリボ核酸のいずれかに作用するエキソヌクレアーゼ、リボまたはデオキシリボ核酸のいずれかに作用するエキソヌクレアーゼ、5ホスホモノエステルを生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、5ホスホモノエステル以外を生成するエンドデオキシリボヌクレアーゼ、変異塩基に対して特異的な部位特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼ、5ホスホモノエステルを生成するエンドリボヌクレアーゼ、5ホスホモノエステル以外を生成するエンドリボヌクレアーゼ、リボまたはデオキシリボ核のいずれかに作用するエンドリボヌクレアーゼ、リボまたはデオキシリボ核グリコシダーゼのいずれかに作用するエンドリボヌクレアーゼグリコシダーゼたとえばOおよびSグリコシルを加水分解する、またNグリコシル化合物を加水分解する、酵素他の結合に対して作用するたとえばトリアルキルスルホニウムヒドロラーゼまたは他ヒドロラーゼペプチド結合に対して作用する酵素たとえばアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ、ペプチジルペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ、および触媒機構が未知のエンドペプチダーゼペプチド結合以外の、たとえば線状アミド、環状アミド、線状アミジン、環状アミジン、二トリルまたは他化合物に見られる炭素窒素結合に作用する酵素酸無水物たとえば含リン無水物や含スルホニル無水物に含まれる酸無水物に作用する酵素酸無水物に作用する酵素酸無水物に作用する酵素炭素炭素結合に作用する酵素ハライド結合に作用する酵素リン窒素結合に作用する酵素硫黄窒素結合に作用する酵素炭素リン結合に作用する酵素および硫黄硫黄結合に作用する酵素などである。ハライド結合に作用する例示的なヒドロラーゼの非限定的な例はアルキルハライダーゼ、2ハロ酸デハロゲナーゼ、ハロ酢酸デハロゲナーゼ、チロキシンデヨードナーゼ、ハロアルカンデハロゲナーゼ、4クロロベンゾアートデハロゲナーゼ、4クロロベンゾイルCoAデハロゲナーゼおよびアトラジンクロロヒドロラーゼである。環状アミドの炭素窒素結合に作用する例示的なヒドロラーゼの非限定的な例はバルビツラーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロオロターゼ、カルボキシメチルヒダントイナーゼ、アラントイナーゼ、βラクタマーゼ、イミダゾロンプロピオナーゼ、5オキソプロリナーゼ、クレアチニナーゼ、Lリジンラクタマーゼ、6アミノヘキサノアート環状ダイマーヒドロラーゼ、25ジオキソピペラジンヒドロラーゼ、Nメチルヒダントイナーゼ、シアヌル酸アミノヒドラーゼ、マレイミドヒドロラーゼである。βラクタマーゼはここでは、クラスA、C、Dのβラクタマーゼはもとより、Dalaカルボキシペプチダーゼトランスペプチダーゼ、エステラーゼEstB、ペニシリン結合タンパク質2X、ペニシリン結合タンパク質5およびDアミノペプチダーゼをも包含する。好ましくは、βラクタマーゼはセリンβラクタマーゼであり、たとえばSaureusPC1のセリンβラクタマーゼの残基70に対応する位置に触媒活性セリン残基を、またSaureusPC1のセリンβラクタマーゼの残基166に対応する位置にグルタミン酸残基を、それぞれもち、随意にSaureusPC1のセリンβラクタマーゼの残基73の対応する位置にリジン残基を、また随意に残基234に対応する位置にもリジン残基を、もつものである。一実施形態では、本発明の変異ヒドロラーゼは野生型ヒドロラーゼでは水分子の活性化に関連する残基たとえば触媒残基3点セットのうちの1残基または補助残基のアミノ酸置換を少なくとも1つ含み、活性化した水分子は野生型ヒドロラーゼの触媒活性残基と該ヒドロラーゼの基質との間に形成される結合を開裂させる。補助残基はここでは他残基の活性を変化させる残基、たとえば水分子を活性化する残基の活性を増進する残基である。本発明の範囲内での水分子活性化残基の非限定的な例は酸塩基触媒に関わる残基たとえばヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸などである。別の実施形態では、本発明の変異ヒドロラーゼは野生型ヒドロラーゼでヒドロラーゼ基質の求核攻撃によるエステル中間体を形成する残基のアミノ酸置換を少なくとも1つ含む。本発明の変異ヒドロラーゼに対して有用な基質は変異ヒドロラーゼが特異的に結合する基質であって、好ましくは該変異ヒドロラーゼのアミノ酸たとえば活性残基に対して、該基質と対応する野生型ヒドロラーゼの間で形成される結合よりも安定した結合が形成される結果となるような基質である。該変異ヒドロラーゼは対応する野生型ヒドロラーゼが特異的に結合するような基質を特異的に結合するものの、変異ヒドロラーゼと基質の間の相互作用からは、対応する野生型ヒドロラーゼと基質との反応で生成物が形成されるような条件下で、生成物がまったくまたはずっと少量しか、形成されない。変異ヒドロラーゼによる生成物の形成の欠落または減少は変異ヒドロラーゼの少なくとも1つのアミノ酸置換のためであり、該置換のために、変異ヒドロラーゼは基質と、対応する野生型ヒドロラーゼの間で形成される結合よりも安定した結合を形成する結果となる。本発明の変異ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合は半減期が、対応する野生型ヒドロラーゼと基質の間で生成物が形成されるような条件下で形成される結合のt12と比べて、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも4倍さらには10倍ないし100倍、100倍または10000倍超、長い。好ましくは、本発明の変異ヒドロラーゼと基質の間で形成される結合はt12が少なくとも30分、好ましくは少なくとも4時間ないし少なくとも10時間であり、また洗浄、タンパク質変性、およびまたは高温による破壊に対して耐性がある、たとえば該結合はSDS中での沸騰下でも安定である。さらに別の実施形態では、本発明の変異ヒドロラーゼは少なくとも2つのアミノ酸置換を含み、そのうちの1つの置換は野生型ヒドロラーゼにあって水分子の活性化に関連する残基の置換、または野生型ヒドロラーゼにあってヒドロラーゼ基質の求核攻撃によってエステル中間体を形成する残基の置換であり、またもう1つの置換は対応する野生型ヒドロラーゼにあって、水分子の活性化に関連する、または基質とエステル中間体を形成する残基の置換ではなく、ヒドロラーゼ基質との結合部位またはその近傍に位置する残基たとえば野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内の残基の置換である。一実施形態では、第2置換は野生型ヒドロラーゼにあって該ヒドロラーゼの触媒ポケットの基質入り口に対応する部位の内側を覆う残基の置換、すなわち活性部位ポケット内または野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内にある残基たとえば基質ポケット内の残基であって対応する野生型ヒドロラーゼにあって、水分子の活性化に関連する、または基質とエステル中間体を形成する残基ではない残基の置換である。こうした追加置換は好ましくは、対応する野生型ヒドロラーゼの基質に対する変異体の安定共有結合の形成速度を増す。一実施形態では、1つの置換は野生型ヒドロラーゼにおいて水分子を活性化する残基たとえばヒスチジン残基の置換、またRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基272に対応する位置での置換であって、たとえばアミノ酸残基272に対応する位置の置換アミノ酸はフェニルアラニンまたはグリシンである。別の実施形態では、1つの置換は野生型ヒドロラーゼにおいて基質とエステル中間体を形成する残基たとえばアスパラギン酸残基の置換、またRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基106に対応する位置での置換である。一実施形態では、第2置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼの位置175、176または273に対応するアミノ酸残基の置換であるが、たとえばアミノ酸残基175に対応する位置の置換アミノ酸残基はメチオニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、セリンまたはシステインであり、アミノ酸残基176に対応する位置の置換アミノ酸残基はセリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニンまたはアルギニンであり、およびまたはアミノ酸残基273に対応する位置の置換アミノ酸残基はロイシン、メチオニンまたはシステインである。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼはさらに、野生型ヒドロラーゼの、活性部位ポケット内または野生型ヒドロラーゼに結合したヒドロラーゼ基質の3~5Å内にあるアミノ酸残基の第3の、また随意に第4の、置換を含む。たとえば第3置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換であり、また第4置換はRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基175、176または273に対応する位置での置換である。変異ヒドロラーゼはさらに、他の置換たとえば対応遺伝子またはその一部分のクローニングを容易にするために導入される置換を、およびまたはNおよびまたはC末端またはその近傍に、対応遺伝子またはその一部分のクローニングを容易にするために導入されるが必ずしも活性をもたない、たとえば別個には検出できない、追加の残基を、含んでもよい。たとえば、野生型デハロゲナーゼDhaAはハロゲン化炭化水素の炭素ハロゲン結合を開裂させる。DhaAの触媒中心は古典的な触媒3点セットであり、求核剤、酸およびヒスチジン残基を含む。3点セットを構成するアミノ酸はDhaAの触媒ポケットの内側奥深くに位置する。DhaAのハロゲン化基質のハロゲン原子たとえばClアルカン基質の塩素原子はDhaAの触媒中心近傍に位置する。DhaAは基質に結合し、おそらく酵素基質複合体を形成し、またDhaAのAsp106による基質の求核攻撃によりエステル中間体が形成される。次にDhaAのHis272が水を活性化し、活性化した水が該中間体を加水分解し、触媒中心から生成物を放出する。後述のように、変異DhaAたとえばDhaAH272F変異体はコンピューターモデリング研究に基づく3D構造および野生型DhaAの基本的な物理化学的特質をおそらく保持するが、単数または複数の野生型酵素基質を加水分解することが、たとえばClアルカンの場合には、野生型酵素によって放出される対応するアルコールを放出することが、できなかった。後で詳述するように、変異セリンβラクタマーゼたとえばBlaZE166D変異体、BlaZN170Q変異体およびBlaZE166DN170Q変異体は単数または複数の野生型セリンβラクタマーゼ基質を加水分解することができなかった。従って、本発明の一実施形態では、変異ヒドロラーゼは野生型デハロゲナーゼでは水分子の活性化に関連する残基たとえば触媒3点セットのうちの1残基または補助残基のアミノ酸置換を少なくとも1つ含む変異デハロゲナーゼであり、活性化した水分子は野生型デハロゲナーゼの触媒残基とデハロゲナーゼ基質の間に形成される結合を開裂させる。一実施形態では、少なくとも1つの置換はRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基272に対応する残基の置換である。対応残基は、ある野生型タンパク質にあって参照野生型タンパク質と比べて同じ活性をもつ残基であり、かつ随意に両タンパク質の1次配列をアラインメントしたときに同じ相対位置にくる残基である。たとえば触媒3点セットの一部を構成し、かつある酵素の水分子を活性化する残基は該酵素の残基272であるが、残基272は別の酵素の残基73に対応し、残基73は触媒3点セットの一部を構成しかつ水分子を活性化する。従って一実施形態では、本発明の変異デハロゲナーゼはRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基272に対応する位置にヒスチジン以外の残基たとえばフェニルアラニン残基をもつ。本発明の別の実施形態では、変異ヒドロラーゼはRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基106に対応する残基の少なくとも1つのアミノ酸置換たとえばアスパラギン酸以外の残基への置換を含む変異デハロゲナーゼである。たとえば本発明の変異デハロゲナーゼはRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基106に対応する位置にシステインまたはグルタミン酸残基をもつ。さらなる実施形態では、変異ヒドロラーゼは少なくとも2つのアミノ酸置換を含む変異デハロゲナーゼであり、うち1つはRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基106に対応する残基の置換であり、もう1つは同残基272に対応する残基の置換である。一実施形態では、変異ヒドロラーゼは少なくとも2つのアミノ酸置換を含む変異デハロゲナーゼであり、うち1つはRhodococcusrhodochrous由来のDhaAの残基272に対応する残基の置換であり、もう1つは同残基175、176、245およびまたは273に対応する残基の置換である。別のさらなる実施形態では、変異セリンβラクタマーゼであり、StaphylococcusaureusPC1のセリンβラクタマーゼの残基166または残基170に対応する残基のアミノ酸置換を少なくとも1つ含む。一実施形態では、変異ヒドロラーゼはハロアルカンデハロゲナーゼであり、たとえばハロアルカン資化性細菌のグラム陰性菌および陽性菌で発見されている。ハロアルカンデハロゲナーゼはXanthobacterautotrophicusGJ10由来DhaA、Rhodococcusrhodochrous由来DhaAおよびSpingomonaspaucimobilisUT26由来LinBなどを含めて、対応する炭化水素の加水分解的脱ハロゲン化反応を触媒する酵素である。変換対象のハロゲン化脂肪族炭化水素の例は単数または複数のハロゲン基を結合させたC2C10飽和脂肪族炭化水素であり、その場合、少なくとも2つのハロゲンは隣接炭素原子上にあることを特徴とする。そうした脂肪族炭化水素の例には揮発性塩素化脂肪族炭化水素が含まれる。VCAの例はたとえばジクロロエタン、12ジクロロプロパン、12軸黒ブタン、123トリクロロプロパンなどのような脂肪族炭化水素である。用語ハロゲン化炭化水素はここではハロゲン化脂肪族炭化水素を意味する。用語ハロゲンはここでは塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、アスタチンなどを含む。好ましいハロゲンは塩素である。一実施形態では、変異ヒドロラーゼは熱安定性デハロゲナーゼなどのような熱安定性ヒドロラーゼであり、少なくとも1つの置換をRhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基117およびまたは175に対応する位置に含むが、該置換は熱安定性の向上に関連する。一実施形態では、該熱安定性ヒドロラーゼは低温たとえば0~25°C程度でヒドロラーゼ基質に結合することができる。一実施形態では、該熱安定性ヒドロラーゼは熱安定性変異ヒドロラーゼであり、Rhodococcusrhodochrousデハロゲナーゼのアミノ酸残基117およびまたは175に対応する位置での置換に加えて、単数または複数の置換を含む。一実施形態では、該熱安定性変異ヒドロラーゼは荷電残基たとえばリジンが除去される結果となる置換を含む。一実施形態では、該熱安定性変異ヒドロラーゼはRhodococcusrhodochrous由来DhaAの残基117およびまたは175に対応する位置にセリンまたはメチオニンを含む。本発明はまた、変異ヒドロラーゼと関心タンパク質に対応するアミノ酸配列とを含む融合タンパク質を提供する。該関心タンパク質またはペプチドの例は、マーカータンパク質たとえば選択マーカータンパク質、アフィニティータグたとえばポリヒスチジン配列、関心酵素たとえばルシフェラーゼ、RNasin、RNase、およびまたはGFP、核酸結合タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、分泌タンパク質、抗体またはその一部分たとえばFc、生物発光タンパク質、受容体リガンド、調節タンパク質、血清タンパク質、免疫原性タンパク質、蛍光タンパク質、反応性システインをもつタンパク質、受容体タンパク質たとえばNMDA受容体、チャンネルタンパク質たとえばイオンチャンネルタンパク質、膜タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リンタンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝性タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質たとえばプロテアーゼ基質、転写因子、タンパク質不安定化配列、または輸送体タンパク質およびまたはターゲッティング配列などである。融合タンパク質は、変異ヒドロラーゼと少なくとも1つの関心タンパク質とをコードする組み換えDNAから発現させてもよいし、化学合成で形成してもよい。関心タンパク質は変異ヒドロラーゼのN末端またはC末端に融合させてもよい。一実施形態では、融合タンパク質は変異ヒドロラーゼのN末端に関心タンパク質を、C末端にもう1つのタンパク質たとえば異なるタンパク質を、それぞれ含む。たとえば関心タンパク質は蛍光タンパク質でも抗体でもよい。随意に、融合体内のタンパク質はコネクター配列たとえば好ましくは少なくとも2アミノ酸残基を含む配列により仕切られる。本発明の融合タンパク質におけるコネクター配列の存在は融合体内のどちらのタンパク質の機能をも、各個別タンパク質の機能と比べて、ほとんど変化させない。従って、変異デハロゲナーゼとRenillaルシフェラーゼの融合体では、コネクター配列の存在は変異デハロゲナーゼとその基質の間の結合の安定性を、またはルシフェラーゼ活性を、ほとんど変化させない。融合体を構成するタンパク質のいかなる特定の組み合わせでも、多様なコネクター配列が使用可能である。一実施形態では、コネクター配列は酵素によって認識される配列たとえば開裂性配列である。たとえばコネクター配列はキャスパーゼによって認識される配列たとえばDEVDまたは光開裂性配列である。一実施形態では、融合タンパク質は変異ヒドロラーゼのN末端に関心タンパク質を、また随意にC末端に異なる関心タンパク質を含む。後述のように、変異DhaAとGST、Flag配列およびRenillaルシフェラーゼとの融合体は、変異DhaAと機能性基を含む野生型DhaA基質との間で形成される結合に検出可能な作用を及ぼさなかった。さらに、Flag配列とDhaAH272Fの融合体はストレプトアビジンビオチンC10H21NO2ClDhaAH272Fブリッジを介して固体担体に結合させることができた。一実施形態では、融合タンパク質は変異ヒドロラーゼと膜関連タンパク質またはその一部分たとえばターゲティングタンパク質、細胞膜結合タンパク質、およびまたは変異ヒドロラーゼを細胞表面に連結させるタンパク質を含む。II最適化ヒドロラーゼ配列と該ヒドロラーゼをコードするベクターおよび宿主細胞ヒドロラーゼまたはその融合体をコードする核酸配列を含む単離核酸分子もまた提供される。一実施形態では、該単離核酸分子は少なくとも1つの特定宿主中で発現するよう最適化した核酸配列を含む。最適化配列はコドン最適化配列すなわちある生物で別種の生物たとえば遠縁関係にある生物の場合より高頻度で使用されるコドンだけでなく、Kozak配列およびまたはイントロンを付加または変更するおよびまたは無用の配列たとえば潜在的な転写因子結合部位を除去する修飾をも、含む。一実施形態では、該ポリヌクレオチドはデハロゲナーゼをコードする核酸配列であって、特定宿主細胞で発現するよう最適化された核酸配列を含む。一実施形態では、該最適化ポリヌクレオチドは対応する非最適化配列とはもはや、たとえば中または高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズしない。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは対応する非最適化配列との核酸配列同一性が90未満たとえば80未満であり、また随意に、非最適化配列がコードするポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が80以上たとえば85以上、90以上であるポリペプチドをコードする。さらに、コンストラクトたとえば発現カセット、および単離核酸分子を含むベクターはもちろん、単離核酸分子、コンストラクトまたはベクターを含むキットもまた、提供される。ヒドロラーゼとの融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子は随意に特定宿主細胞で発現するよう最適化され、また随意に転写調節配列たとえば単数または複数のエンハンサー、1プロモーター、1転写終結配列、またはそれらの組み合わせに作動可能に連結されて、発現カセットを形成する。一実施形態では、ヒドロラーゼまたはその融合体をコードする核酸配列が、野生型または変異ヒドロラーゼ配列の中のコドンを特定細胞で優先的に使用されるコドンで置き換えることにより、最適化される。好ましいコドンは特定細胞での使用頻度が比較的高く、また好ましくはその導入は特定宿主細胞に存在する転写因子向け転写因子結合部位、および他の望ましくない構造的属性の導入が比較的少数にとどまる結果となる。従って最適化核酸配列では、コドン使用頻度の向上に伴い発現レベルが上昇するし、また望ましくない転写調節配列の数の減少に伴い不適切な転写挙動のリスクが低下する。本発明の単離最適化核酸分子はコドン組成が対応する野生型核酸配列のそれと比べて30余り、35、40または45余りたとえば50、55、60余りのコドンで異なってもよい。本発明用の好ましいコドンは、特定生物の同じ核酸に対応する他の少なくとも1つのコドンよりも使用頻度が高く、かつ該生物では低使用頻度ではなく、また該核酸配列の発現クローニングまたはスクリーニングに使用される生物でも低使用頻度ではないコドンである。さらに、ある種のアミノ酸に対応する好ましいコドンは他のコドンよりも使用頻度の高い2つ以上のコドンを含んでもよい。ある生物での使用頻度が別種の生物と比べて高いコドンが核酸分子中に存在すると、該核酸分子はそうしたコドンを高頻度で使用する生物の細胞に導入されたとき、該細胞における野生型または親核酸配列の発現よりも高レベルで発現する結果となる。本発明の一実施形態では、異なるコドンは哺乳動物で使用頻度の高いコドンであり、別の実施形態では異なるコドンは植物で使用頻度の高いコドンである。個別生物に応じた好ましいコドンは技術上周知であり、たとえばwwwkazusaorjpcodonを参照。特定種の哺乳動物たとえばヒトは別種の哺乳動物とは異なる好ましいコドンセットをもつであろう。同様に、特定種の植物は別種の植物とは異なる好ましいコドンセットをもつであろう。本発明の一実施形態では、異なるコドンの大半は所期宿主細胞での好ましいコドンである。哺乳動物および植物を含む生物に応じた好ましいコドンは技術上周知である。たとえば好ましいヒトコドンの非限定的な例はである。従って一実施形態では本発明の合成核酸分子は、好ましいヒトコドンたとえばまたはその任意の組み合わせの数が多く、野生型核酸配列とは異なるコドン組成を有する。たとえば、本発明の核酸分子はロイシンをコードするコドンCTGまたはTTG、バリンをコードするコドンGTGまたはGTC、グリシンをコードするコドンGGCまたはGGT、イソロイシンをコードするコドンATCまたはATT、プロリンをコードするコドンCCAまたはCCT、アルギニンをコードするコドンCGCまたはCGT、セリンをコードするコドンAGCまたはTCT、トレオニンをコードするコドンACCまたはACT、アラニンをコードするコドンGCCまたはGCT、またはそれらの任意の組み合わせの数が野生型核酸配列と比べて多くてもよい。別の実施形態では、好ましいCelegansコドンの非限定的な例はまたはその任意の組み合わせである。さらに別の実施形態では、好ましいDrosophiliaコドンの非限定的な例はまたはその任意の組み合わせである。好ましい酵母コドンの非限定的な例はまたはその任意の組み合わせである。同様に、植物での使用頻度が高いコドンの数が多い核酸分子は、またはその任意の組み合わせを非限定的に含む植物コドンの数が多く、野生型または親核酸配列とは異なるコドン組成を有する。好ましいコドンは個別植物種に応じて異なる場合もあろう。一実施形態では、ヒドロラーゼまたはその融合体をコードする最適化核酸配列は、対応するヒドロラーゼまたはその融合体をコードする非最適化核酸配列に対する核酸配列同一性が100未満たとえば90未満または80未満である。たとえばDhaAをコードする最適化核酸配列は、対応するDhaAをコードする非最適化核酸配列に対する核酸配列同一性がおよそ80未満であり、また最適化核酸配列によってコードされるDhaAは野生型DhaAに対するアミノ酸配列同一性が85以上である。一実施形態では、最適化核酸配列によってコードされるDhaAの活性は非最適化核酸配列によってコードされるDhaAの活性の10以上たとえば50以上である。たとえば最適化核酸配列によってコードされる変異DhaAが基質に結合する効率は、非最適化核酸配列によってコードされる変異DhaAが同じ基質に結合する場合とほぼ同じである。例示的な最適化DhaA遺伝子の配列は次のとおりであるhDhaAv216F核酸分子または発現カセットは、随意に選択マーカー遺伝子を含むベクターたとえばプラスミドまたはウイルスベクターに導入してもよいが、該ベクターの導入先は関心細胞たとえばEcoli、Streptomycesspp、Bacillusspp、Staphylococcussppなどの原核細胞や植物、真菌、酵母、または哺乳動物などの真核細胞である。好ましい哺乳動物細胞系の非限定的な例はCHO、COS、293、Hela、CV1、SHSY5Y、HEK293、NIH3T3細胞である。コード化された変異ヒドロラーゼの発現は原核細胞または真核細胞での発現が可能な任意のプロモーターで調節してもよい。好ましい原核細胞プロモーターの非限定的な例はSP6、T7、T5、tac、bla、gal、lacまたはマルトースプロモーターである。好ましい真核細胞プロモーターの非限定的な例は構成的プロモーター、それに調節可能なプロモーターである。好ましい細菌発現用ベクターの例はpGEX5X3であり、また好ましい真核細胞発現用ベクターの例はpCIneoCMVである。本発明の核酸分子、発現カセットおよびまたはベクターは、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、遺伝子銃法などを非限定的に含む任意の方法で細胞に導入してもよい。III機能性基本発明の基質および方法に有用な機能性基は検出可能なまたは検出適性の分子である。本発明の範囲内の機能性基は、二官能性リンカーまたはヒドロラーゼ基質の1つの反応性置換基への共有結合が可能な分子であり、また本発明の基質の一部として、天然に見られる基質には結合していない機能性基とほぼ同じ活性を有し、かつ変異ヒドロラーゼと安定複合体を形成することができる。従って、機能性基は該機能性基をもつ基質と変異ヒドロラーゼの間の安定複合体の検出を、また随意にその単離を、容易にするような単数または複数の特性を有する。たとえば、機能性基は特有の電磁放射または吸収スペクトル特性、磁性、電子スピン共鳴、静電容量、誘電率または導電率を有するものや、強磁性、常磁性、反磁性、発光性、電界発光性、蛍光性、リン光性、発色性、免疫原性、または独特の質量を有するものを含む。機能性基の非限定的な例は、核酸分子すなわちDNAまたはRNAたとえばオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、たとえばヌクレオチド類似体をもつもの、タンパク質結合能をもつDNA、関心遺伝子に対応する1本鎖DNA、関心遺伝子に対応するRNA、終止コドンを欠くmRNA、アミノアシル化開始tRNA、アミノアシル化アンバーサプレッサーtRNAまたはRNAi用2本鎖RNA、タンパク質たとえば発光タンパク質、ペプチド、ペプチド核酸、リガンドによって認識されるエピトープたとえばビオチンまたはストレプトアビジン、ハプテン、アミノ酸、脂質、脂質二分子膜、固体担体、蛍光団、発色団、レポーター分子、放射性核種たとえば放射性測定用の放射性同位体、同位体コード化アフィニティータグ法などの方法に用いる安定同位体、高電子密度分子、X線造影剤、MRI造影剤たとえばマンガン、ガドリニウムまたは酸化鉄粒子などである。一実施形態では、機能性基はアミノ酸、タンパク質、糖タンパク質、多糖、三重項増感剤たとえばCALI、核酸分子、薬物、毒素、脂質、ビオチンまたは固体担体たとえば自己組織化単分子膜であり、Ca2を結合し、Kを結合し、Naを結合し、pH感受性であり、高電子密度であり、発色団であり、MRI造影剤であり、NOの存在下で蛍光を発し、あるいは反応性酸素に対して感受性があり、ナノ粒子、酵素、酵素基質、酵素阻害物質たとえば自殺基質、補因子たとえばNADP、補酵素、スクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、ルシフェリン、グルタチオン、NTA、ビオチン、cAMP、ホスファチジルイノシトール、cAMP対応リガンド、金属、スピントラップ用ニトロキシドまたはニトロン法で検出、金属キレート剤、ホトケージド分子、インターカレーターたとえばDNAの結合に有用なまたは光活性化可能な分子として有用なプソラーレンまたは別のインターカレーター、三リン酸またはホスホロアミダイト、抗体、またはヘテロ二官能性架橋剤たとえばタンパク質または他分子を共役させるのに有用な架橋剤、ヒドラジド、アリールアジド、マレイミド、ヨードアセトアミドブロモアセトアミド、Nヒドロキシスクシンイミジルエステル、混合ジスルフィドたとえばピリジルジスルフィド、グリオキサルフェニルグリオキサル、ビニルスルホンビニルスルホンアミド、アクリルアミド、ボロン酸エステル、ヒドロキサム酸、イミダートエステル、イソシアナートイソチオシアナート、またはクロロトリアジンジクロロトリアジンなどである。たとえば機能性基の非限定的な例は単数または複数のアミノ酸たとえば天然アミノ酸または非天然アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドたとえば抗体またはその断片、Hisタグ、FLAGタグ、Strepタグ、酵素、補因子、補酵素、酵素基質のペプチドまたはタンパク質たとえば分枝ペプチドGlyProAlaLeuAla4ニトロベンジルアミド、自殺基質、または受容体、単数または複数のヌクレオチドおよびその類似体、たとえばオリゴヌクレオチド、遺伝子またはその一部分に対応する2本鎖または1本鎖DNAたとえば転写因子などのようなタンパク質に結合しうるDNA、遺伝子に対応するRNAたとえば終止コドンを欠くmRNA、またはその一部分、RNAi用2本鎖RNAまたはそのベクター、糖タンパク質、多糖、ペプチド核酸、脂質二分子膜を含む脂質固体担体たとえば沈降性粒子、セファロースまたはセルロースビーズ、膜、ガラス、セルロース、アルギン酸、プラスチックまたは他の合成高分子たとえばエッペンドルフチューブまたはマルチウェルプレートのウェル、自己組織化単分子膜、表面プラズモン共鳴チップ、または電子伝導表面をもつ固体担体、薬物たとえば化学療法薬、アミノアシル化tRNAたとえばアミノアシル化開始tRNAまたはアミノアシル化アンバーサプレッサーtRNA、Ca2結合分子、K結合分子、Na結合分子、pH感受性分子、放射性核種、高電子密度分子、造影剤たとえばバリウム、ヨウ素または他のMRI造影剤またはX線造影剤、NOの存在下で蛍光を発する分子または反応性酸素に対して感受性である分子、ナノ粒子たとえば免疫金粒子、常磁性体ナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子、または量子ドット、酵素の非タンパク質基質、酵素阻害物質、可逆的または不可逆的阻害物質、キレート剤、架橋基たとえばスクシンイミジルエステルまたはアルデヒド、グルタチオン、ビオチンまたは他のアビジン結合分子、アビジン、ストレプトアビジン、cAMP、ホスファチジルイノシトール、ヘム、cAMP対応リガンド、金属、NTA、および一実施形態では単数または複数の色素たとえばキサンテン色素、カルシウム感受性色素たとえば12アミノ5フェノキシ2エタンNNNNテトラ酢酸、ナトリウム感受性色素たとえば13ベンゼンジカルボン酸、44141013テトラオキサ716ジアザシクロオクタデカン716ジイルビスビス、NO感受性色素たとえば4アミノ5メチルアミノ27ジフルオレセイン、または他の蛍光団である。一実施形態では、機能性基はハプテンまたは免疫原性分子すなわち該分子に対して特異的な抗体が結合する分子である。別の実施形態では、機能性基は放射性核種であり、たとえば3H、14C、35S、125I、131Iであり、診断方法に有用な分子を含む。特定機能性基を検出する方法は技術上周知である。たとえば核酸分子の検出はハイブリダイゼーション法、増幅法、該核酸に対して特異的な核酸結合タンパク質への結合法、酵素法で行うことができるし、また核酸分子自体が検出可能なまたは検出適性の分子たとえば放射性標識またはビオチンを含む場合には、その分子に適した試験法で検出することができる。例示的な機能性基に含まれるのはハプテン、たとえば免疫原性の増進に資する分子たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、開裂性標識たとえば光開裂性ビオチン、および蛍光標識たとえばNヒドロキシスクシンイミド修飾クマリンおよびスクシンイミドまたはスルホノスクシンイミド修飾BODIPY、ローダミンたとえばR110、ロードール、GRG6、TexasMethylRed、5カルボキシXローダミン、またはフルオレセイン、クマリン誘導体たとえば7アミノクマリンおよび7ヒドロキシクマリン、2アミノ4メトキシナフタレン、1ヒドロキシピレン、レゾルフィン、フェナレノンまたはベンズフェナレノン、アクリジノン、アントラセン、およびαおよびβナフトール誘導体、フッ素化フルオレセインおよびロードールを含むフッ素化キサンテン誘導体、生物発光分子たとえばルシフェリン、セレンテラジン、ルシフェラーゼ、化学発光分子たとえば安定化ジオキセタン、および電気化学発光分子などである。野生型ヒドロラーゼの基質との結合を介して対応する変異ヒドロラーゼに連結した蛍光機能性基は、系の変化たとえばリン酸化をリアルタイムで検知するために使用してもよい。さらに、金属イオン用化学センサーなどのような蛍光分子たとえばCu2検出用の9カルボニルアントラセン修飾グリシルヒスチジルリジンを本発明の基質に取り込んでおいて、該基質に結合するタンパク質の標識に使用してもよい。BODIPY、ローダミングリーン、GFPまたは赤外色素などのような発光または蛍光機能性基はまた、機能性基としての用途もあり、たとえばBRET、ERET、LRETまたは電気泳動法などを使用するたとえば相互作用研究に使用してもよい。別種の機能性基は、受容基を含む分子類と選択的に相互作用する分子である。従って、アフィニティー分子を含むヒドロラーゼ基質はそうした基質と変異ヒドロラーゼとをもつ複合体の分離を容易にすることができる。これは該アフィニティー分子と別の分子たとえば生物起源でも非生物起源でもよい受容体分子との選択的相互作用のためである。たとえばアフィニティー分子と相互作用する特定分子は小分子、化学基たとえばスルフヒドリル基、または大きな生体分子たとえば抗体またはアフィニティー分子に対応する他の天然リガンドである。この結合は通常、化学結合であり、共有または非共有結合またはイオン結合または水素結合などのような相互作用を伴う場合がある。受容体分子は溶液中に遊離していることもあれば、それ自体が固体または半固体表面、ポリマーマトリックスに結合しているか、または固体または半固体表面に存在することもある。相互作用は外的因子たとえば光、温度、圧力、または触媒として作用する化学または生体分子の添加が引き金となってもよい。反応混合物からの複合体の検出およびまたは分離が起こるのは、アフィニティー分子と受容体分子の間の通常は結合という形のこの相互作用のためである。アフィニティー分子の例は、免疫原性分子たとえばタンパク質のエピトープ、ペプチド、糖質または脂質などのような分子すなわち特異抗体の作製に役立つ任意の分子ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびその誘導体金属結合分子およびこれらの分子の断片および組み合わせなどである。例示的なアフィニティー分子はHis5、HisX6、Cmyc、Flag、SteptTag、HATag、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、Sペプチド、T7ペプチド、カルモジュリン結合ペプチド、C末端RNAタグ、金属結合ドメイン、金属結合反応性基、アミノ酸反応性基、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、マルトース結合タンパク質などを含む。たとえばビオチンを含むヒドロラーゼ基質を変異ヒドロラーゼと接触させる。変異ヒドロラーゼと基質の複合体の中にビオチンが存在すると、該複合体のアビジン分子たとえば表面コートストレプトアビジン分子への選択的結合が可能になる。好適な表面はクロマトグラフィー分離用レジン、組織培養表面または結合プレートなどのようなプラスチック、マイクロタイターディッシュおよびビーズ、セラミックス、ガラス、磁性体粒子を含む粒子、ポリマーおよび他マトリックスを含む。処理表面はたとえばリン酸緩衝生理食塩水で洗浄してビオチンを欠く分子を除去し、含ビオチン複合体を単離する。場合によっては、これらの材料は光ファイバー、ChemFETおよびプラズモン検出器などのような生体分子センサーの一部でもよい。アフィニティー分子の別の例はダンシルリジンである。このダンシル環と相互作用する抗体は市販されているか、または周知のプロトコールたとえばAntibodiesALaboratoryManualに記載のプロトコールを使用して作製することができる。たとえば抗ダンシル抗体をクロマトグラフィーカラムの充填材表面に固定化する。この方法は本発明の変異ヒドロラーゼと基質の複合体を固定化抗体との相互作用によりカラムに保持させる一方で、他の分子はカラムを通過させる。後は、抗体抗原相互作用を壊して複合体を溶出させる。特定のクロマトグラフィーカラム材たとえばイオン交換またはアフィニティーSepharose、Sephacryl、Sephadexおよび他クロマトグラフィーレジンは市販されている。ダンシルリジンはその蛍光特性のために都合よく検出されよう。受容体分子として抗体を使用するときは、他の生化学分離法たとえば免疫沈降および固定化などによって分離を行うこともできる。たとえば本発明の変異ヒドロラーゼと基質の複合体は磁気ビーズをアフィニティー分子特異抗体またはヒドロラーゼ特異抗体でコートすることにより単離してもよい。混合物からビーズの分離はしばしば磁界が利用される。別種の機能性分子は電磁放射線を使用して検出しうる分子を含み、またキサンテン蛍光団、ダンシル蛍光団、クマリンおよびクマリン誘導体、蛍光アクリジニウム基、ベンゾピレン系蛍光団、それに7ニトロベンゾ2オキサ13ジアゾールおよび3N23ジアミノプロピオン酸を非限定的に含む。好ましくは、蛍光団分子は天然アミノ酸とは異なる波長で蛍光量子収量が高く、またなお好ましくは可視光または可視光紫外光の波長領域で励起可能な蛍光の量子収量が高い。予め選択した波長で励起すると、該分子は低濃度で目視により、または通常の蛍光検出法により、検出可能になる。電気化学発光分子たとえばルテニウムキレートとその誘導体またはニトロキシドアミノ酸とその誘導体はフェムトモル以下の濃度範囲で検出可能である。一実施形態では、随意に検出可能な機能性基は次のうちの1つを含む本発明の変異ヒドロラーゼと基質の複合体の検出には、蛍光分子に加え、該相互作用と電磁界放射への分子の応答とに基づく物理特性をもつ多様な分子を使用することができる。これらの特性は紫外、可視および赤外スペクトル領域の吸収、ラマン活性であり発色団の存在などを含み、共鳴ラマン分光法、電子スピン共鳴、核磁気共鳴、分子質量たとえば質量分析装置でさらに増進しうる。アフィニティー分子をもつ複合体を検出およびまたは単離する方法にはゲルろ過、高速または高圧液体、逆相、アフィニティー、イオン交換などのクロマトグラフィー技術がある。本発明の変異ヒドロラーゼと基質の複合体の検出には電気泳動法、等電点分離法、質量分析法など他のタンパク質分離法もまた有用である。IVリンカー用語リンカーは、反応性基を含む基質に、または反応性基に、単数または複数の機能性基を共有結合的に付着させる基または基群をいう。リンカーはここでは単一共有結合ではない。リンカーの構造は、標的酵素によって結合されうる基質をもたらす限り、あまり重要ではない。一実施形態では、リンカーは機能性基と反応性基を約5オングストローム~約1000オングストロームの距離だけ引き離す二価基とすることができる。他の好適なリンカーは、Rと反応性基を約5オングストローム~約100オングストロームの距離だけ引き離すリンカー、およびRと反応性基を約5オングストローム~約50オングストロームの距離だけ、約5オングストローム~約25オングストロームの距離だけ、約5オングストローム~約500オングストロームの距離だけ、または約30オングストローム~約100オングストロームの距離だけ引き離すリンカーなどである。一実施形態では、リンカーはアミノ酸である。一実施形態では、リンカーはペプチドである。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖であって、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わり、かつ該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子はアリールまたはヘテロアリール環に置き換わることを特徴とする。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖であって、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わり、かつ該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は単数または複数のアリールまたはヘテロアリール環に置き換わることを特徴とする。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖であって、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わり、かつ該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は単数または複数のヘテロアリール環に置き換わることを特徴とする。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖であって、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わることを特徴とする。別の実施形態では、リンカーは式WFWで示される二価基であり、式中Fはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはであり、WはNC、CN、OC、CO、O、S、S、S2、N、C、または直接結合であり、各Qは独立にHまたはアルキルである。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含む炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは炭素原子数約2~約30の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約2~約20の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは随意に単数または複数の二重または三重結合を含む炭素原子数約2~約20の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは炭素原子数約2~約20の分枝または非分枝炭素鎖である。別の実施形態では、リンカーは110である。別の実施形態では、リンカーはである。別の実施形態では、リンカーは単数または複数の二価ヘテロアリール基を含む。特に、アルキルはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、secイソブチル、ペンチル、3ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルまたはデシルなどであるシクロアルキルはシクロプロピル、シクロプチル、シクロペンチルまたはシクロヘキチルなどてあるアルケニルはビニル、アリル、1プロペニル、2プロペニル、1ブテニル、2ブテニル、3ブテニル、1ペンテニル、2ペンテニル、3ペンテニル、4ペンテニル、1ヘキセニル、2ヘキセニル、3ヘキセニル、4ヘキセニル、5ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニルまたはデセニルなどであるアルキニルはエチニル、1プロピニル、2プロピニル、1ブチニル、2ブチニル、3ブチニル、1ペンチニル、2ペンチニル、3ペンチニル、4ペンチニル、1ヘキシニル、2ヘキシニル、3ヘキシニル、4ヘキシニル、5ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニルまたはデシニルなどであるアリールはフェニル、インデニルまたはナフチニルなどであるまたヘテロアリールはフリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル、チエニル、ピリミジニル、インドリル、イソキノリルまたはキノリルなどである。用語芳香族はアリールおよびヘテロアリール基を含む。アリールはフェニル基であるか、または少なくとも1環が芳香環である環員原子数約9~10のオルト縮合二環式炭素環基である。ヘテロアリールは、炭素と非ペルオキシド酸素、硫黄およびNアルキル、フェニルまたはベンジルであるからなる群より選択される1~4個のヘテロ原子とからなる5または6個の環員原子を含む単環式芳香環の環員炭素を介して結合した基、およびそれから誘導される環員原子数約8~10のオルト縮合二環式ヘテロ環の基、特にベンゾ誘導体またはプロピレン、トリメチレンまたはテトラメチレンのジラジカルを縮合させた誘導体を包含する。用語アミノ酸はリンカーとの関連では、D型またはL型の天然アミノ酸と非天然アミノ酸の残基を含む。この用語はまた、C末端をアルキル、フェニルまたはベンジルエステルまたはアミドとして保護した天然および非天然アミノ酸だけでなく、通常のアミノ保護基をつけた天然および非天然アミノ酸をも包含する。他の好適なアミノおよびカルボキシル保護基は技術上周知である。アミノ酸はC末端またはN末端を介して、または他の任意幸便の結合点を介して、たとえばシステインの硫黄を介して、別の分子に連結することができる。用語ペプチドはリンカーとの関連では、2~25個のアミノ酸またはペプチジル残基の配列をいう。該配列は直鎖状でも環状でもよい。たとえば環状ペプチドはある配列中の2個のシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成により合成することができる、または得られる。ペプチドはC末端またはN末端を介して、または他の任意幸便の結合点を介して、たとえばシステインの硫黄を介して、別の分子に連結することができる。好ましくは、ペプチドは3~25個の、または5~21個のアミノ酸を含む。ペプチド誘導体は米国特許第4612302号、4853371号および4684620号の各明細書で開示されている要領で合成することができる。ここで具体的に引用したペプチド配列はアミノ末端を左側に、カルボキシル末端を右側にして記載してある。一実施形態では、本発明のデハロゲナーゼ基質はリンカーを有し、式で示されるRリンカーAX式中Rは単数または複数の機能性基であるか、または固体担体たとえばミクロスフェア、膜、ポリマープレート、ガラスビーズ、スライドガラスなどであるが、該リンカーはC、N、SまたはOを含む多原子直鎖または分枝鎖であり、AXはデハロゲナーゼ基質であり、またXはハロゲン原子である。一実施形態では、AXはハロ脂肪族またはハロ芳香族のデハロゲナーゼ基質である。一実施形態では、該リンカーは随意に単数または複数のの二重または三重結合を含み、また随意に単数または複数のヒドロキシル基またはオキソ基を置換基として有する炭素原子数約12~約30の二価分枝または非分枝炭素鎖であって、該炭素鎖を構成する単数または複数の炭素原子は随意に非ペルオキシドO、SまたはNHに置き換わることを特徴とする。一実施形態では、リンカーは3~30個の、たとえば11~30個の原子を含む。一実施形態では、リンカーはyを含み、yは2ないし8である。一実施形態では、Aはnであり、nは2ないし10、たとえば4ないし10である。一実施形態では、AはCH2CH2またはCH2CH2CH2である。別の実施形態では、Aはアリールまたはヘテロアリール基を含む。一実施形態では、リンカーはデハロゲナーゼたとえばRhodococcusデハロゲナーゼの基質である、C、N、SまたはOを、かつ機能性基Rが芳香環系を含むときには好ましくは11~30個の原子を、含む多原子直鎖または分枝鎖である、または固体担体である。一実施形態では、本発明のデハロゲナーゼ基質はリンカーを有し、式で示されるRリンカーCH2CH2CH2X式中Xはハロゲン好ましくは塩素である。一実施形態では、Rは単数または複数の機能性基たとえば蛍光団、ビオチン、発光団、または蛍光性または発光性分子であるか、または固体担体たとえばミクロスフェア、膜、ポリマープレート、ガラスビーズなどである。Rが放射性標識であるか、または小さな検出適性原子たとえば分光学的に活性な同位体であるとき、リンカーは0~30個の原子を含みうる。V例示的な基質の合成2エチルカルバミン酸アントラセン9イルメチルエステル。9アントラセンメタノール、クロロギ酸4ニトロフェニルおよび200mlCH2Cl2の撹拌スラリーにトリエチルアミンを添加した。得られた金色溶液を室温で16時間撹拌させた。その時点で、2エタノールを加え、撹拌をさらに24時間続行させた。次いでCH2Cl2反応混合物を2水酸化ナトリウム溶液で、有機層にpニトロフェノールが観測されるまで、洗浄した。ジクロロメタンを硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、減圧留去した。粗生成物をシリカゲル60カラムクロマトグラフィーで1→3メタノールジクロロメタンにより段階的に溶出しながらさらに精製し黄色固形物76gを単離した。質量スペクトル、meC20H22NO4の計算値34015、実測値34023C20H21NNaO4の計算値34015、実測値34023。{22エトキシエチル}カルバミン酸アントラセン9イルメチルエステル。100ml丸底フラスコに2エチルカルバミン酸アントラセン9イルメチルエステルと新鮮な水素化ナトリウム60鉱油混合物を不活性雰囲気下に入れた。20mlの無水THFを加え、反応混合物を30分間撹拌した。次にフラスコを氷NaCl浴で10~20°Cに冷却する。この温度に到達したら、1クロロ6ヨードヘキサンをシリンジで加える。反応系を氷NaCl浴温度に2時間保ち、次いで一晩かけて自然にゆっくりと室温に戻す。ここで減圧下に溶媒を留去しながらシリカゲル60を反応系に共吸着させる。シリカゲルクロマトグラフィーは当初はヘプタンを溶離液とし、ついで10、20および25酢酸エチルを溶離液として行う。合計057gの生成物が然るべき画分から単離される。質量スペクトル、meC26H32ClNO4H2Oの計算値45721、47622実測値45721、45652。22エトキシエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸。4mlのジクロロメタンに溶解した{22エトキシエチル}カルバミン酸アントラセン9イルメチルエステルに、アニソールを2滴添加した。反応混合物を氷NaCl浴で冷却し、10分後にトリフルオロ酢酸を添加する。反応混合物は添加と同時に暗褐色に変わるが、30分間撹拌させる。揮発物をすべて減圧留去する。残渣をCH2Cl2に再溶解し、水で2回洗う。水性画分を終夜、凍結乾燥させる。油性残渣が残るので、無水DMFに溶解し、後続反応でストック液として使用する。質量スペクトル、meC10H23ClNO2の計算値22414、22614実測値2242、2262。22エトキシエチルアミンへのレポーター基付加のための一般手順。1当量のレポーター基スクシンイミジルエステルDMFに3当量の22エトキシエチルアンモニウムトリフルオロ酢酸ストック液を添加し、次いでジイソプロピルエチルアミンを添加する。反応系を室温で8~16時間撹拌する。精製には分取用HPLCまたはシリカゲルクロマトグラフィーを使用する。N{22エトキシエチル}フルオレセイン5アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC31H31ClNO8の計算値58017、58118実測値58018、58131。N{22エトキシエチル}ビオチンアミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製はシリカゲルクロマトグラフィーで行った。質量スペクトル、meC20H37ClN3O4Sの計算値45022、45222実測値44995、45189。N{22エトキシエチル}テトラメチルローダミン5アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。構造異性体の分離が実現した。質量スペクトル、meC35H43ClN3O6の計算値63628、63729、63828実測値63614、63715、63814。N{22エトキシエチル}ローダミンR1105アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。構造異性体の分離が実現した。質量スペクトル、meC31H35ClN3O6の計算値5802、5812、5822実測値5804、5814、5822。64ボラ3a4aジアザsインダセン3イルフェノキシ}アセチルアミノヘキサン酸{22エトキシエチル}アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製はシリカゲルクロマトグラフィーで行った。質量スペクトル、meC37H47BClF2N4O5Sの計算値7433実測値7434。64ボラ3a4aジアザsインダセン3イルスチリルオキシ}アセチルアミノヘキサン酸{22エトキシエチル}アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製はシリカゲルクロマトグラフィーで行った。質量スペクトル、meC39H48BClF2N4NaO5Sの計算値7913実測値7913。トリエチルアンモニウム352エチリデン3エトキシエチルカルボニル}ペンチル246トリオキソテトラヒドロピリミジン1イルプロパン1スルホン酸アニオン。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC42H65ClN4O10Sの計算値8494、8504、8514実測値8496、8500、8515。2tertブチル4{31エトキシエチルカルバモイル}ペンチル33ジメチル5スルホ13ジヒドロインドール2イリデンプロペニル}7ジエチルアミノクロメニリウム塩化物。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC46H67ClN3O7Sの計算値8404、8414実測値8405、8415。N{22エトキシエチル}3{45オキサゾール2イルベンゼンスルホニルアミノ}プロピオンアミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC30H40ClN4O6Sの計算値6192、6202実測値6195、6207。N{22エトキシエチル}9クロロセミナフトフルオレセイン5アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。構造異性体の分離が実現した。質量スペクトル、meC35H34Cl2NO8の計算値66617、66618、66717実測値66646、66844、66751。N{22エトキシエチル}セミナフトジメチルローダミン5アミド。前記手順により標記化合物を合成した。精製には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC37H38ClN2O7の計算値65724、65824、65923実測値65746、65847、65945。6カルボキサドヘキサン酸{22エトキシエチル}アミド。6カルボキサドヘキサン酸スクシンイミジルエステルを入れた100ml丸底フラスコに22エトキシエチルアミンEt2Oを加え、次いで2mlのピリジンを加えた。反応混合物を終夜撹拌させた。減圧濃縮後、残渣をシリカゲル60クロマトグラフィーで、2→5メタノールジクロロメタンを溶離液として処理した。然るべき画分を収集し、減圧乾燥させた。質量スペクトル、meC47H60ClN2O11の計算値86339、86439、86539実測値86294、86407、86494。6カルボキサミドヘキサン酸{22エトキシエチル}アミド。6カルボキサドヘキサン酸{22エトキシエチル}アミドを5mlのメタノールに溶解し、05mlの2M炭酸ナトリウムを加えた。反応混合物を16時間撹拌してからろ過した。精製には分取用HPLCを使用した。構造異性体の分離が実現した。質量スペクトル、meC37H44ClN2O9の計算値65927、69628、69727実測値{22エトキシエチル}カルバミン酸アントラセン9イルメチルエステル。50ml丸底フラスコに2エチルカルバミン酸アントラセン9イルメチルエステルと新鮮な水素化ナトリウム60鉱油混合物を不活性雰囲気下に入れた。10mlの無水THFを加え、反応系を5分間撹拌した。その時点で1クロロ6ヨードブタンをシリンジで加える。反応系を室温で終夜撹拌する。減圧下に溶媒を留去しながらシリカゲル60を反応系に共吸着させる。シリカゲルクロマトグラフィーは当初はヘプタンを溶離液とし、ついで10、20および30酢酸エチルを溶離液として行う。合計01gの生成物が然るべき画分から単離される。質量スペクトル、meC24H28ClNO4H2Oの計算値44718、44818実測値44717、44841。2エトキシエトキシ}エチルイソインドール13ジオン。2エトキシエトキシ}エチルイソインドール13ジオンをNielsenJandJandaKDの方法で合成した。還流式冷却器を付けた25ml丸底フラスコを使用してこの試薬にポリスチレン担持トリフェニルホスフィン約3mmolPgと6mlの四塩化炭素を加えた。この反応系にアルゴンを拡散させ、次いで2時間、加熱還流した。冷却後、追加のポリスチレン担持トリフェニルホスフィンを加え、さらに1時間還流した。冷却した溶液をろ過し、レジンを追加の四塩化炭素で洗った。溶媒を留去して04gの、純粋な標記化合物を得た。質量スペクトル、meC16H21ClNO5の計算値34211、34411実測値34165、34364。22エトキシエトキシ}エトキシエチルイソインドール13ジオン。標記化合物を前実施例の要領で合成した。質量スペクトル、meC18H25ClNO6の計算値38614、38813実測値38588、38783。2{22エトキシエトキシ}エトキシエトキシエチル}イソインドール13ジオン。標記化合物を22エトキシエトキシ}エトキシエチルイソインドール13ジオンの合成と同様の要領で合成した。質量スペクトル、meC20H29ClNO7の計算値43016実測値42985。本発明の基質の合成に使用することができる中間化合物2{24フェノキシエトキシ}エタンアミニウム塩化物は、次に図解しかつステップa~cで説明する要領で、合成することができる。a2{24フェノキシエトキシ}エチルカルバミン酸tertブチル。100mlフラスコに4ヒドロキシフェネチルアルコール、炭酸セシウムおよび2スルホニルオキシ}エトキシエチルカルバミン酸tertブチルを入れた。この反応混合物を10mlのDMFでスラリーにし、油浴により60°Cに加熱した。反応を19時間進行させ、その時点で反応系を冷却し、DMFを減圧留去した。ジクロロメタンを加えてから反応混合物をセライトプラグでろ過し、次に溶媒を留去した。得られた固形物を高真空下に乾燥させた。ほぼ定量収率の生成物を単離した。質量スペクトル、meC17H28NO5の計算値32620、32720実測値32656、32757。b2{24フェノキシエトキシ}エチルカルバミン酸tertブチル。10mlの四塩化炭素に溶解した2{24フェノキシエトキシ}エチルカルバミン酸tertブチルにスチレン担持トリフェニルホスフィンを加えた。反応混合物を加熱し2時間還流した。次いで、反応系を冷却し、ろ過した。乾燥後、定量収率の生成物を単離した。質量スペクトル、meC17H27ClNO4の計算値34416、34616実測値34457、34655。c2{24フェノキシエトキシ}エタンアミニウム塩化物。2{24フェノキシエトキシ}エチルカルバミン酸tertブチルを5mlのジクロロメタンに溶解し、トリエチルシランを加えた。この溶液にトリフルオロ酢酸を室温で滴下した。滴下と同時に反応混合物が黄褐色になるが、それを1時間撹拌させた。揮発物をすべて減圧留去し、残渣をジクロロメタンに再溶解し、希塩酸で2回洗った。水性画分を終夜、凍結乾燥させた。残った油性残渣を無水DMFに溶解し、後続反応でストック液として使用するようにした。本発明の基質の合成に使用することができる中間化合物22フリルメトキシエトキシ}エタンアミンは、次に図解しかつステップd~gで説明する要領で、合成することができる。d2フラン。ジメチルホルムアミドを入れた1Lフラスコにフルフリルアルコール、塩化tブチルジメチルシリルおよびイミダゾールを加えた。室温で22時間撹拌後、反応系をろ過し、揮発物を減圧留去した。得られた物質をジエチルエーテルとクエン酸飽和水溶液に分配し、さらにエーテル層をクエン酸飽和水溶液で洗った。水層を合わせ、1×50mLエーテルで逆抽出した。有機層を合わせ、水1×100mLと塩水1×100mLで順に洗浄した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して生成物281gを得た。e25フラン。2フランTHF溶液を3Åの分子ふるいで乾燥させた。ふるいを除去した後、追加のTHF10mLをTMEDAと共に加え、溶液を氷浴で0°Cに冷却した。BuLiヘキサン溶液を25分間に滴下した。混合物を1時間撹拌した。1クロロ3ヨードプロパンを一挙に注入した。2時間後、反応の完了をTLCで確認した。溶媒を留去し、残渣をエーテルと5クエン酸に分配した。エーテル層を水と塩水で順次洗った。エーテル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。残渣をシリカで精製した。然るべき画分を合わせ、濃縮して生成物49gを得た。TLCRf06。f52フリルメタノール。25フランTHF溶液を0°Cに冷却した。この溶液にフッ化テトラブチルアンモニウムTHF冷却溶液を加えた。20分後、TLCで反応の完了を確認した。溶液に酢酸を加えた。溶液を濃縮した。得られたシロップをエーテルとクエン酸飽和水溶液に分配し、さらにエーテル層を炭酸水素塩飽和水溶液で、次いで水で、洗った。水層を合わせ、50mLのエーテルで逆抽出した。エーテル層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮して黄色シロップ34gを得た。これをシリカでさらに精製し、生成物16gを得た。TLCRf05。g22フリルメトキシエトキシ}エタンアミン。52フリルメタノールエーテル溶液を3Åの分子ふるいで乾燥させた。ふるいを除去した後、溶液にピリジンを加えた。臭化チオニルを溶液に滴下した。7時間撹拌後、この溶液をナトリウム22アミノエトキシエトキシドDMF溶液中に一挙に注入した。をヘプタンで洗浄後に2アミノエトキシエタノールジグリム溶液に添加し、5時間撹拌した後、濃縮するという方法で予め合成しておいた。2時間後、反応系をフリーザーに入れた。18時間後、反応系をジクロロメタンと水に分配した。水層を追加の30mLDCMで抽出し、DCM層を合わせて水で洗った。DCM層を希塩酸と水で順次抽出した。酸性水溶液を希釈水酸化ナトリウムでpH10に調整し、2×20mLDCMで逆抽出した。DCM層を塩水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮して生成物380mgを得た。これは再精製せずに使用した。TLCRf05。質量スペクトル、meC12H21ClNO3の計算値2621、2641実測値2626、2646。2{24フェノキシエトキシ}エタンアミンまたは22フリルメトキシ}エトキシエタンアミンへのレポーター基付加のための一般手順。1当量のレポーター基スクシンイミジルエステルDMFに15当量のストック液を添加し、次いでジイソプロピルエチルアミンを添加する。反応系を室温で8~16時間撹拌する。精製には分取用HPLCまたはシリカゲルクロマトグラフィーを使用する。前記の一般手順に従い、次の本発明基質を合成した。2{24フェノキシエトキシ}エチルテトラメチルローダミン6カルボキサミド。標記化合物を、6カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステルから出発する一般手順で合成した。精製は分取用HPLCで行った。構造異性体の分離も実現した。UVVis544。質量スペクトル、meC37H39ClN3O6の計算値65625、65825実測値65637、65837。この化合物はここではカルボキシテトラメチルローダミンpフェネチルClという。2{24フェノキシエトキシ}エチルフルオレセイン5カルボキサミド。標記化合物を、5カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルから出発する一般手順で合成した。精製と異性体の分離には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC33H27ClNO8の計算値60014、60115、60214実測値60018、60124、60221。この化合物はここではカルボキシフルオレセインpフェネチルClという。2{24フェノキシエトキシ}エチルビオチンカルボキサミド。標記化合物を、Dビオチンスクシンイミジルエステルから出発する一般手順で合成した。精製と異性体の分離には分取用HPLCを使用した。質量スペクトル、meC22H33ClN3O4Sの計算値47019実測値47019。この化合物はここではビオチンpフェネチルClという。2{24フェノキシエトキシ}エチル36ジアセチルフルオレセイン6カルボキサミド。エーテルN{241エトキシフェニルエチル}フルオレセイン6カルボキサミドに2mlの無水酢酸と025mlのピリジンを順次加えた。反応混合物を1時間させた。減圧濃縮後、残渣を2回、トルエンと共濃縮した。次いで固形物を減圧乾燥した。質量スペクトル、meC37H33ClNO10の計算値68618、68718、68818実測値68655、68761、68860。N22フリルメトキシ}エトキシエチルフルオレセイン6カルボキサミド。標記化合物を、6カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステルから出発する一般手順で合成した。精製は分取用HPLCで行った。質量スペクトル、meC37H41ClN3O7の計算値67426、67527、67626実測値6745、6755、6765。この化合物はここではカルボキシテトラメチルローダミンフラニルプロピルClという。N22フリルメトキシ}エトキシエチルフルオレセイン6カルボキサミド。標記化合物を、5カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルから出発する一般手順で合成した。精製と異性体の分離は分取用HPLCで行った。質量スペクトル、meC33H31ClNO9の計算値62017、6027実測値62047、62249。この化合物はここではカルボキシフルオレセインフラニルプロピルClという。VI例示的な使用方法本発明は細胞内の微小環境の変化をモニターするだけでなく細胞内での分子の発現、局在位置およびまたは輸送をもモニターし、また試料たとえば細胞中に存在する可能性のある単数または複数の分子を単離、画像化、同定、局在化、ディスプレイまたは検出するための、本発明のヒドロラーゼ基質およびまたは変異ヒドロラーゼの使用を特徴とする方法を提供する。本発明の基質は好ましくは水や約pH6以上の水溶液を含めた水性の溶液またはほぼ水性の溶液に対して可溶性である。本発明の基質のストック液は有機溶媒に溶解してから水性の溶液またはバッファーで希釈してもよい。好ましい有機溶媒は非プロトン性の極性溶媒たとえばDMSO、DME、Nメチルピロリドン、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、および他のヒドロキシル基を含まない完全に水混和性の溶媒などである。本発明の基質および対応する変異ヒドロラーゼの使用濃度は試験条件や所期目的たとえばバックグラウンドのまたは望ましくない標識を最小限に抑えながら妥当な時間内に結果を得るといった目的に左右される。本発明の基質の濃度は一般にナノモル~マイクロモルの範囲である。本発明基質の所要濃度は対応する変異ヒドロラーゼとの関係で、満足な標識が実現されるまで系統的に変動させていくことで求められる。出発範囲は技術上周知の方法で容易に求められる。一実施形態では、光学特性をもつ機能性基を含む基質を変異ヒドロラーゼと併用して試料を標識する。そうした基質は変異ヒドロラーゼを含む関心試料と、変異ヒドロラーゼが基質に結合するに足る時間だけ、混合し、次いで試料を、機能性基の光学応答を誘発する特定波長で照射する。随意に、試料を洗浄し残量、過剰または未結合基質を除去する。一実施形態では、標識を使用して試料の特定の性質を測定するが、それにはさらに該光学応答を標準または期待応答と比較する。たとえば変異ヒドロラーゼが結合した基質を使用して、試料の特定成分を、試料中の時間空間分布の点からモニターする。あるいは、変異ヒドロラーゼが結合した基質を使用して、特定分子の存否または量を測定または検出する。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼが結合した基質を使用して、機能性基に特異的に応答する分子の存否について試料を分析する。内在性蛍光タンパク質たとえばGFPとは対照的に、蛍光基質に結合した変異ヒドロラーゼは蛍光の保持に天然タンパク質構造を必要としない。変異ヒドロラーゼは蛍光基質が結合した後に、たとえばSDSPAGEなどの変性電気泳動ゲル中で、または有機溶媒たとえばパラホルムアルデヒドで固定した細胞中で、検出してもよい。反応性の求核アミノ酸を含む変異ヒドロラーゼの断片を、たとえばタンパク質分解過程をモニターするために、結合蛍光団によって検出してもよい。検出可能な光学応答は、試験系における、直接観測または計器による感知が可能なあるパラメーターの変化または出現を意味する。そうした検出可能な応答の例は色、蛍光、反射率、化学発光、光偏光、光散乱またはX線散乱の変化または出現などである。一般に、検出可能な応答は蛍光の変化たとえば蛍光強度、励起または発光波長分布、蛍光寿命、蛍光偏光またはこれらの組み合わせの変化である。検出可能な光学応答は変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料全体で起きてもよいし、そうした試料の限局部分でおきてもよい。光学応答の度合いの標準または期待応答との比較は、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料が特定の性質を有するかどうか、またどの程度有するかの判定に使用することができる。別の実施形態では、機能性基は受容体分子に対応するリガンドである。基質が特異的結合ペアの1要素であるような機能性基を含む場合には、相補的な要素または基質は固体または半固体たとえばポリマー、ポリマー膜またはポリマー粒子の表面に固定化してもよいし、両方が溶解していてもよい。一実施形態では、導電性基質コート表面を使用してタンパク質タンパク質相互作用を検出する。代表的な特異的結合ペアの例はビオチンとアビジン、IgGとAタンパク質またはGタンパク質、薬物と薬物受容体、毒素と毒素受容体、糖とレクチンまたは糖受容体、ペプチドまたはタンパク質とペプチドまたはタンパク質受容体、相互作用する複数タンパク質たとえばプロテインキナーゼA調節サブユニットとPKA触媒サブユニット、酵素とその基質たとえばプロテアーゼ、キナーゼ、またはルシフェラーゼとその基質、酵素の補因子と該酵素、センスDNAまたはRNAとアンチセンスDNAまたはRNA、ホルモンとホルモン受容体、それにイオンとキレート剤などである。対応する天然受容体が存在するリガンドの例は天然または合成タンパク質たとえばアビジンとストレプトアビジン、抗体、酵素およびホルモンヌクレオチドと天然または合成オリゴヌクレオチドたとえばRNA用または1本鎖および2本鎖DNA用のプライマー脂質多糖および糖質種々の薬物たとえば治療用薬物、乱用薬物および農薬などである。機能性基がカルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムまたは生物学的に重要な他金属イオンのキレート剤である場合には、そうした機能性基を含む基質は該イオンの標識として機能する。あるいはそうした基質はpH指標として機能してもよい。好ましくは、イオン標識の検出可能な光学応答は蛍光の変化である。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料は一般に受動的な手段で、すなわち基質とのインキュベーションによって、標識する。しかし、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料に基質を導入するには、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料に基質を導入する任意の方法たとえば細胞またはオルガネラへの基質のマイクロインジェクションが使用可能である。本発明の基質は一般に、その使用濃度内では、生細胞または他の生物学的構成要素に対して無害である。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料は本発明の基質との接触直後に観測可能である。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料は随意に、標識化の過程で、他溶液たとえば洗液、透過化およびまたは固定化液、および他の、追加検出試薬を含む溶液と混合する。基質との接触後の洗浄は一般に、非特異的バックグラウンドを減少させるため、光学応答の検出改善に資する。標識化濃度を引き下げれば、洗浄に俟たなくとも満足な可視化が可能である。ホルムアルデヒド、ホルマリン、グルタルアルデヒド、冷メタノール、および31メタノール酢酸など、多数の固定剤や固定条件が技術上周知である。固定化を用いるのは一般に、細胞形態像を保存し、また病原性試料を取り扱う際のバイオハザードを軽減するためである。固定化は随意に、本発明の嵩だかな基質が細胞膜を通れるようにするための、技術上周知の方法によるアセトン、エタノール、DMSOまたは種々の界面活性剤を用いた透過化が後に続くまたは伴う。随意に、基質の使用を、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料における特定細胞成分、細胞内物質または細胞状態の存在に起因する検出可能な応答を生み出す追加の検出試薬の使用と組み合わせてもよい。追加の検出試薬がもつスペクトル特性が基質のそれと異なれば、多色化が可能となる。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料は、光学特性をもつ機能性基を含む基質との接触後または接触中の任意の時点で、検出可能な光学応答を生じる結果となる波長の光で照射し、光学応答を検出するための手段より観測する。基質によっては、周囲光を使用した比色法での検出や親蛍光団の蛍光特性による検出が行われる。紫外光または可視光ランプ、アーク灯、レーザーによる照射を受けると、または日光や通常の室内灯による照射でも、基質は、特異的結合ペアの相補要素に結合した基質を含めて、蛍光発光だけでなく強い可視光吸収をも示す。本発明の基質の照射に有用な特定装置の非限定的な例は携帯型の紫外光ランプ、水銀灯、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオード、YAGレーザーなどである。これらの照射源は随意にレーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準型または小型蛍光光度計、またはクロマトグラフィー用検出器などと連結する。この可視光吸収または蛍光発光の検出には随意に目視法または次のうち任意の装置が使用されるCCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャナー、分光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光プレートリーダー、またはシグナル増幅手段たとえば光増倍管。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料をフローサイトメーター、蛍光顕微鏡または蛍光光度計で検査する場合には随意に、蛍光団である機能性基を含む基質と検出可能に異なる光学特性をもつ第2の蛍光団とを、一般に基質の蛍光応答を第2蛍光団のそれと弁別することにより、弁別および識別するために、該装置を使用する。変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料をフローサイトメーターで検査する場合には、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料の検査は随意に、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料中の粒子の、基質の蛍光応答に基づく、選別装置の使用による、単離を含む。一実施形態では、変異ヒドロラーゼと機能性基を含む対応する基質とを使用して細胞または細胞成分を標識するが、細胞の例は生物の細胞たとえばトランスジェニック動物の細胞、本発明の変異ヒドロラーゼおよびまたは基質を含む細胞を導入した動物の細胞、または培養細胞などである。たとえば細胞を、変異ヒドロラーゼをコードするベクターたとえば変異ヒドロラーゼと核局在化シグナルとの融合体をコードするベクターと接触させる。該細胞はトランスジェニック動物の細胞でも、動物に導入された細胞でもよいが、該細胞内での該ベクターの発現は一時性、制御性または安定性のいずれでもよい。次いで、該細胞または該細胞を含む動物を、変異ヒドロラーゼによって認識される本発明の基質と接触させる。あるいは、細胞を該ベクターおよび基質と同時並行的に接触させる。次いで、動物体内、細胞内または細胞溶解液または細胞亜分画中の機能性基の存在および局在位置を検出または測定する。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼと三重項増感剤を含む機能性基を含む対応する基質とを使用して、たとえば細胞内の分子およびまたは細胞活性を選択的に不活性化または破壊する。この実施形態では、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含む試料を、三重項増感剤を含む基質と接触させた後に、試料にUV光を当てる。タンパク質をinvitroまたはinvivo標識するには、ヒドロラーゼ基質をアミノ酸またはtRNAたとえばinvitro合成タンパク質のN末端修飾のためのアミノアシル化開始メチオニルtRNAなどのようなアミノアシル化tRNAに、変異tRNAシンターゼを使用してtRNAに付加したアミノ酸を含めたタンパク質のN末端標識のためのアンバーサプレッサーtRNAに、付加してもよい。ヒドロラーゼ基質はまた、インテイン媒介法でタンパク質に付加してもよい。関心タンパク質は、C末端インテインドメインGyrAミニインテインとの融合タンパク質として発現する。該融合タンパク質を、システインヒドロラーゼ基質たとえばシステインハロアルカンの存在下に、還元性チオール試薬たとえば還元型2メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムまたは2メルカプトエタノールで処理すると、該融合タンパク質が融合体のインテイン部分のN末端システイン残基で開裂し、またシステインヒドロラーゼ基質たとえばシステインハロアルカンが関心タンパク質のC末端に共有結合的に付加する結果となる。従って、タンパク質は融合タンパク質を作製する必要もなくcDNAまたはmRNAから発現させることができ、また変異ヒドロラーゼを使用して精製することができる。しかも、invitro翻訳タンパク質からは、たとえば固定化変異ヒドロラーゼを使用して、融合タグの必要もなく、タンパク質マイクロアレイを作製することできるし、また翻訳タンパク質だけでなく翻訳タンパク質と相互作用するタンパク質もまた単離することができる。さらに、蛍光団を含む基質の使用は発現タンパク質の精製だけでなく迅速な検出をも可能にする。細胞内のタンパク質のinvivo標識には、メチオニンまたは他の天然型または非天然型アミノ酸を含む基質を使用してもよいが、新合成タンパク質および新合成タンパク質と相互作用するタンパク質は随意に固定化変異ヒドロラーゼを使用して、融合タグの必要もなく、精製することができる。このアプローチはまた、差次的タンパク質発現分析用のマーカータンパク質の単離に使用しても、質量分析装置と併用してもよい。種々の蛍光団を含む基質を使用すれば多重処理も可能である。本発明の基質と変異ヒドロラーゼは試料中の分子の単離、ディスプレイまたは検出に特に有用である。一実施形態ではタンパク質マイクロアレイを作製するが、そこでは変異ヒドロラーゼを固体担体表面に固定化し、また本発明の基質を修飾して、タンパク質固定化用に、単一タンパク質、機能性または構造タンパク質またはタンパク質一般に結合する単数または複数の機能性基を含むようにする。たとえば融合タンパク質システムたとえばチオレドキシンパッチ、インテイン媒介法または他の方法を使用して、固体表面に変異ヒドロラーゼを固定化する。次にタンパク質固定化用の修飾基質を加える。基質の修飾にはスクシンイミジルエステルアルデヒド、グルタチオン、NTAまたは金属、または特異リガンドを用いてもよい。たとえば酵素基質またはヒドロラーゼ基質に連結した酵素の阻害物質を使用して、特定種の酵素類たとえばキャスパーゼまたは逆転写酵素を固定化するようにしてもよいし、またヒドロラーゼ基質に連結したある種のタンパク質に結合するDNAを使用してDNA結合タンパク質用の、またはチップ系アッセイ開発用の、タンパク質マイクロアレイを作製するようにしてもよい。同様に、タンパク質複合体の単離を含めたタンパク質タンパク質相互作用を研究するには、磁性または非磁性体粒子たとえばMagneSil粒子の表面に変異ヒドロラーゼを固定化することができる。これらの方法は新融合タンパク質たとえば新ライブラリーの作製を避けることができる。というのは、たとえばGST融合ライブラリー用に作製する必要があるのは関心タンパク質用基質だけだからである。あるいは、基質を表面に固定化して、変異ヒドロラーゼおよびその融合体を該表面に安定結合させるようにしてもよい。変異ヒドロラーゼは生細胞から、または無細胞法により、たとえば細胞溶解液中での転写翻訳により、獲得してもよい。他分子への結合または酵素活性などの性質の分析には結合タンパク質が有用な場合もある。それはまた、バイオ変換または検出能のための酵素活性を安定的に固定化するのに有用な場合もある。複数の基質を表面に、位置をずらして、または混合体として、固定化して、複数の変異ヒドロラーゼが結合されるようにしてもよい。基質はまた、他の結合性分子たとえばビオチンまたはパラ置換ベンジルグアニンなどで固定化してもよい。一実施形態では、変異ヒドロラーゼとの融合体を使用して、該融合体に結合するタンパク質を同定する。融合タンパク質に結合するタンパク質は、表面に固定化した基質に変異ヒドロラーゼを結合させておくことにより、他の未結合タンパク質から分離してもよい。この方法では、溶液中の未結合タンパク質を固定化された結合タンパク質から洗い流してもよい。融合タンパク質に結合する他分子をこの方法で同定してもよい。変異ヒドロラーゼに結合する分子の結合安定性を高めるために、種々の化学架橋法を使用して結合分子を共有結合的に相互連結してもよい。結合分子を後に結合解除して分析たとえば同定およびまたは単離に回せるという意味では、可逆的架橋剤の使用が好ましい。変異ヒドロラーゼを基質と結合させた後は、混合体中の残りの未反応基質を不活性化する必要があるかもしれない。これは野生型ヒドロラーゼを混合体に加えて残りの未反応基質を生成物に変換するという方法で行ってもよい。たとえば、未反応クロロアルカン基質は野生型のまたは他の触媒能を有するデハロゲナーゼを加えて対応するアルコールへと変換してもよい。未反応基質は溶液中に遊離した状態または表面に結合した状態のいずれかであろう。表面に結合している場合には、触媒能を有するヒドロラーゼを加えれば該基質は対応する生成物へと変換するため、変異ヒドロラーゼの表面への新たな結合は妨げられよう。本発明の基質と変異ヒドロラーゼはタンデムアフィニティー精製法に使用してもよい。これは2連続のアフィニティー精製ステップを使用するタンパク質またはタンパク質複合体の精製法である。各精製ステップではアフィニティータグたとえばHisタグ、GSTタグ、Strepタグ、ビオチンタグ、メンエキグロブリン結合性ドメインたとえばIgG結合性ドメイン、カルモジュリン結合性ドメインなどに対応するリガンドを、関心タンパク質と融合させて使用する。本発明の変異ヒドロラーゼはアフィニティータグとして使用してもよい。たとえば変異ヒドロラーゼとカルモジュリン結合性ペプチドとを含む融合体またはそのタンパク質複合体は、固相に結合させたカルモジュリンにより、次いで固相に結合させヒドロラーゼ基質により、精製してもよい。精製後のタンパク質または複合体はウェスタンブロット方または質量分析法で分析してもよい。TAPを使用すると、タンパク質またはタンパク質複合体は種々の宿主細胞たとえば細菌、Drosophila、植物、哺乳動物の細胞から、また無細胞タンパク質発現系から精製されるし、またタンパク質タンパク質相互作用を同定することができる。TAPへの、たとえば最終アフィニティー精製ステップへの、変異ヒドロラーゼと基質の使用は、TAPに先立つ種々の時点で、または種々の薬物治療後の、タンパク質のリアルタイム分析を可能にする。変異ヒドロラーゼ融合体は基質に共有結合されるため、精製タンパク質複合体が該ヒドロラーゼを含むことはないであろう。別の実施形態では、ビオチン化ヒドロラーゼ基質が、抗原に結合するアビジン標識抗体に結合する。この複合体は、固定化変異ヒドロラーゼを含むエッペンドルフチューブを使用して免疫沈降させてもよい。ある種の分子を検出するために、溶液系または固定化系を用いてもよい。一実施形態では、小分子または化合物で修飾したヒドロラーゼ基質を該付加小分子または化合物の修飾の検出に使用する。たとえばホスファチジルイノシトール3キナーゼなどのようなキナーゼを検出するために、ホスファチジルイノシトールなどのような脂質で修飾したヒドロラーゼ基質を、PI3キナーゼを含む試料と接触させると、ホスファチジルイノシトールがリン酸化される。得られる修飾ヒドロラーゼ基質を次にヒドロラーゼに共有結合させる。リン酸化ホスファチジルイノシトールを電気泳動法または蛍光法で検出する。電気泳動検出法には、放射性標識ヌクレオチドたとえばγ32PATPを使用する標準キナーゼアッセイとそれに続くオートラジオグラフィー、または蛍光標識NTAGa3またはFe3錯体を使用する蛍光検出などがある。リン酸基へのNTAGa3またはFe3錯体の特異的結合はリン酸化ホスファチジルイノシトールの電気泳動による検出を可能にする。PI3キナーゼ活性は自由溶液中でFRETまたは蛍光偏光法を用いて検出してもよい。それには蛍光標識した、ヒドロラーゼ基質を含むホスファチジルイノシトールを使用してもよい。リン酸化ホスファチジルイノシトールは別の蛍光団標識NTAGa3またはFe3錯体を使用して検出する。蛍光偏光法では、ヒドロラーゼ基質を含む非蛍光ホスファチジルイノシトールを分析用試料に加え、次いでGa3またはFe3を添加する。得られるヒドロラーゼ基質を固定化または遊離変異ヒドロラーゼに加える。Ga3またはFe3に結合する蛍光標識NTAを使用して蛍光偏光を測定する。ホスホジエステラーゼを検出するには、蛍光標識cAMPと別の蛍光団とを含むヒドロラーゼ基質を使用してもよい。cAMPの加水分解はホスホジエステラーゼ活性を示す。ホスホジエステラーゼ活性は、たとえばタンパク質マイクロアレイで、遊離または固定化デハロゲナーゼで基質を捕捉した後にFRETを使用して検出することができる。基質に付加した核酸分子は、他の核酸分子、タンパク質またはタンパク質複合体の精製またはディスプレイに使用してもよい。定向進化法用などのリボソームディスプレイまたは精製では、終始コドンを欠くmRNAの3末端にヒドロラーゼ基質を結合させる。該基質をinvitro翻訳反応液に加えて、得られたタンパク質DNAmRNA複合体を、固定化変異ヒドロラーゼを使用して精製する。同様にして、特定遺伝子を単離、検出またはディスプレイするために、蛍光団で標識したDNAまたはRNAたとえば蛍光団で標識した、関心遺伝子に結合する1本鎖DNAと別の蛍光団または消光剤とを含むヒドロラーゼ基質を使用して、FRET法などのような蛍光ベースの方法により該遺伝子を複雑な混合系から単離、検出またはディスプレイするようにする。そうした方法は診断や生物兵器検出に有用でありうる。本発明の基質と変異ヒドロラーゼは種々の形態でcAMPの検出に使用してもよい。一実施形態では、蛍光消光を2つの融合タンパク質および2つの基質と併用する。基質の一方はある蛍光団を含み、他方はその蛍光団に対応する消光色素を含む。融合タンパク質の一方は変異ヒドロラーゼとPKA調節サブユニットとを含み、他方は変異ヒドロラーゼとPKA触媒サブユニットとを含む。各融合タンパク質を基質の一方と接触させ、次いで複合体を一緒に混ぜ合わせる。cAMPが存在すると、消光色素はもはや蛍光団に近接しない。従って、cAMPは蛍光測定によって測定される。別の実施形態では、異なる蛍光団をもつ2つのヒドロラーゼ基質を使用してFRET測定によりcAMPを測定する。別の実施形態では、融合タンパク質の一方は第1変異ヒドロラーゼとPKA調節サブユニットとを含み、他方は第1変異ヒドロラーゼとは異なりかつ第2基質に結合するタンパク質とPKA触媒サブユニットとを含む。変異ヒドロラーゼは、少なくとも1つの蛍光団を含むヒドロラーゼ基質に結合する。第2タンパク質は第2基質に結合し、第2基質は該少なくとも1つの蛍光団に対応する消光剤による修飾を受けるが、該消光剤は該基質の第2タンパク質に対する結合には影響を及ぼさない。第2タンパク質の冷はGST、チオレドキシン、AGT、第1変異ヒドロラーゼの場合とは異なる基質に対して特異的である別種の変異ヒドロラーゼ、第1変異ヒドロラーゼの場合と同じ基質に結合することができる変異ヒドロラーゼ、または他の基質結合タンパク質などである。各融合タンパク質を対応基質と接触させ、複合体を一緒に混ぜ合わせ、cAMPを蛍光測定により測定する。cAMPが存在すると、消光剤はもはや蛍光団に近接しない。別の実施形態では、第2タンパク質は第2基質に結合し、第2基質はヒドロラーゼ基質に連結した蛍光団とは異なる蛍光団による修飾を受けるが、該蛍光団は該基質の第2タンパク質に対する結合には影響を及ぼさない。各融合タンパク質を対応基質と接触させ、複合体を一緒に混ぜ合わせ、FRET法によりcAMPを測定する。cAMPが存在すると、2つの蛍光団はもはや近接しない。さらに別の実施形態では、融合タンパク質の一方は変異ヒドロラーゼとPKA調節サブユニットとを含み、他方は蛍光タンパク質とPKA触媒サブユニットとを含む。蛍光タンパク質の非限定的な例はGFP、YFP、EGFP、DsRedなどである。各融合タンパク質を対応基質と接触させ、次いで複合体を一緒に混ぜ合わせる。cAMPが存在すると、蛍光タンパク質と該蛍光団を含む基質に結合した変異ヒドロラーゼとはもはや近接しない。別の実施形態では、BRET法でcAMPを検出する。蛍光団を含む一方の基質は、変異ヒドロラーゼとPKA調節サブユニットとを含む融合タンパク質と接触させ、またルシフェラーゼとPKA調節サブユニットとを含む別の融合タンパク質と接触させる。各融合タンパク質に由来する調節サブユニットが二量体化するとき、BRETが観測される。BRETはcAMPが存在すると妨げられる。変異ヒドロラーゼと基質は分子インプリント法に使用してもよい。これは分析物特異的なポリマーを生成するために考案された技術である。分子インプリント法は特定化合物に対して選択性であるポリマーの合成法である。この技術は次のステップを含むプリント分子とモノマーを予め準備し、相補的相互作用を起こさせるプリント分子モノマー複合体のまわりをポリマー化させるおよび抽出によりプリント分子をポリマーから除去する。従ってポリマー化により、プリント分子の相補性が保存され、該ポリマーはプリント分子を選択的に吸着することになる。ヒドロラーゼ基質で分子インプリントしたポリマーはヒドロラーゼとその融合体に結合するので融合タンパク質の精製、タンパク質マイクロアレイの作製、タンパク質相互作用の研究、およびTAPに使用してもよい。基質の機能性基は別のタンパク質に可逆的または共有的に結合してもよい。タンパク質に可逆的に結合する機能性基の例は抗体たとえば単鎖抗体に結合するハプテンである。別のタンパク質に共有結合する機能性基の例は変異デハロゲナーゼに結合するクロロアルカンまたはOアルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼに結合するパラ置換ベンジルグアニンである。変異ヒドロラーゼを含む第1融合タンパク質は、生化学的または生物学的プロセスを実現または調節する手段として、第2タンパク質に結合させてもよい。たとえば遺伝子転写は、転写活性化因子たとえばVP16に結合した変異ヒドロラーゼと融合したDNA結合タンパク質によって調節されてもよい。そうした例では、遺伝子転写はDNA結合タンパク質に融合した変異ヒドロラーゼを転写活性化因子に結合させる基質の添加によって増進されよう。別の例では、細胞中のあるタンパク質の活性がその細胞内局在位置によって調節されよう。たとえばあるタンパク質の活性は、該タンパク質を第2タンパク質と融合した変異ヒドロラーゼに結合させると、その結合と同時に該第2タンパク質が該タンパク質を別の細胞内区画へと再誘導または選択的に再分配することにより、変化するようにしてもよい。例はほぼ非細胞核部分に局在する転写因子であり、核ターゲティング配列と融合した変異ヒドロラーゼに結合すると同時に、転写因子は核へと移行する結果となる。そうした例では、該転写因子を変異ヒドロラーゼへと結合させる基質の添加はそれにより、該転写因子に依存する遺伝子の発現を調節することもあろう。該基質は複数の反応性基を有し、変異ヒドロラーゼの相互連結を可能にしてもよい。結合活性を有するタンパク質と融合するときは、変異ヒドロラーゼの相互連結は多価結合性の複合体を生成する。そうした多価複合体は有用な特性たとえば高い見かけ結合効率をもつ。たとえば複数の単鎖抗体を相互連結すると対応抗原と結合効率が高まる。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼと融合したλファージ抑制因子タンパク質のDNA結合領域は、基質を添加して変異ヒドロラーゼを相互連結しようとすると、より効率的にDNAに結合する。変異ヒドロラーゼに融合した種々の結合性タンパク質をもつ多価複合体は、種々の分子たとえば抗原が該複合体を介して結合し合うことを可能にする。変異ヒドロラーゼ間の融合は単一タンパク質への複数基質の結合を可能にしようが、複数基質は同種でも異種でもよい。これにより、融合変異ヒドロラーゼは基質間の架橋分子として働こう。これは分子たとえば官能性基、表面または他分子の共有結合的な相互連結に有用であろう。たとえば表面に結合した基質は基質に結合したポリヌクレオチドに、二価の融合変異ヒドロラーゼを介して、共有結合的に付加されよう。異種変異ヒドロラーゼを融合して、または安定した共有結合をつくれる他のタンパク質たとえばAGTに変異ヒドロラーゼを融合して、ヘテロ多価分子を作製してもよい。一実施形態では、基質は複数の官能性基を含む。たとえば光学的に検出可能な分子と受容体分子に対応するリガンド、2つの異種タンパク質たとえばAGTと蛍光タンパク質またはルシフェラーゼ、光学的に検出可能な分子とプロテアーゼ認識部位、それに光学的に検出可能な分子の消光剤などである。たとえば本発明の基質は蛍光団、プロテアーゼ認識部位および消光剤分子を含む。該基質は変異ヒドロラーゼを発現する細胞によって取り込まれる。プロテアーゼが存在すると消光剤は基質から除去され、結果として蛍光シグナルが生じる。そうした基質の使用はリアルタイムのプロテアーゼアッセイを可能にする。該変異体は感染因子の検出にも使用可能であり、従って臨床診断や生物兵器の検出に使用してもよい。他の形態を使用してプロテアーゼたとえばキャスパーゼまたはプロテオソームを検出してもよい。たとえば分枝ペプチド基質で20Sプロテオソームを検出してもよい。一実施形態では、変異ヒドロラーゼまたは別のレポータータンパク質たとえばルシフェラーゼに対応する遺伝子を哺乳動物細胞発現系に使用する。一実施形態では、プロテアーゼたとえばキャスパーゼ認識部位を、転写抑制因子たとえばtet抑制因子またはlac抑制因子であるタンパク質に導入する。一実施形態では、プロテアーゼ認識部位は抑制因子タンパク質のループ領域または該タンパク質の抑制因子機能を抑制しない別の領域に導入する。レポーター遺伝子に連結した転写抑制因子タンパク質に結合するDNAに連結したプロモーターを含むベクターを、該修飾転写抑制因子タンパク質を含む細胞に導入する。プロテアーゼが存在しなければ、修飾転写抑制因子タンパク質はレポーター遺伝子の発現を抑制する。プロテアーゼが存在すると、修飾転写抑制因子タンパク質はプロテアーゼ認識部位のタンパク質分解による開裂のため不活性化される。そのため、修飾転写抑制因子タンパク質は転写を抑制することができず、その結果としてレポーター遺伝子が発現する。一実施形態では、修飾転写抑制因子タンパク質遺伝子およびまたはレポーター遺伝子を細胞中に安定的にトランスフェクトする。そうしたアッセイ系は、別のレポーター遺伝子を使用するおよびまたは別の分子たとえば別のプロテアーゼを検出するアッセイ系を含めた他のアッセイ系と併用して、多重処理が行えるようにしてもよい。該アッセイ系はまた、たとえば生物兵器の検出にだけでなく臨床診断で感染因子の検出に用いてもよい。一実施形態では、変異ヒドロラーゼと別のタンパク質との融合体をクロマチン免疫沈降法に用いる。変異ヒドロラーゼとDNA結合タンパク質とを含む融合体を細胞内で発現させる。一定期間の培養後、細胞を固定化し、超音波処理し、クロマチンハイブリッドタンパク質複合体を、ヒドロラーゼ基質を含む固体担体で単離するかまたは細胞を超音波処理で破砕し、固体担体に付加したヒドロラーゼ基質を用いてクロマチン複合体を単離する。未結合複合体またはタンパク質は洗浄により除去し、次いで融合タンパク質をクロマチンに架橋結合させるか、または官能性基たとえばビオチンを含むヒドロラーゼ基質を細胞に添加し、一定期間培養する。次いで細胞を固定化し、超音波処理し、クロマチン複合体を固体担体で、たとえばストレプトアビジンに連結した固体担体で、単離する。単離したクロマチンの解析には増幅反応を用いる。さらに別の実施家形態では、変異ヒドロラーゼと核酸結合タンパク質との融合体をinvitro核酸結合アッセイに使用する。該融合体はヒドロラーゼ基質を含む固相表面に固定化する。細胞溶解液または精製核酸を固定化融合タンパク質とインキュベートし、結合核酸をゲル電気泳動またはポリメラーゼ反応により検出する。あるいは該融合体を、ヒドロラーゼ基質を含む電気化学的感受性表面に固定化する。核酸結合は電気化学的変化によって検出する。これらの方法は複数の核酸結合タンパク質を対象とした多重アッセイだけでなくハイスループットアッセイにも使用可能である。別の実施形態では、3個のベクターを使用する。第1ベクターはGAL4、プロテアーゼ認識部位、およびVP16融合体を発現し、第2ベクターはプロモーターを、転写抑制因子タンパク質遺伝子に連結したGAL4結合部位に連結させて含み、また第3ベクターはプロモーターを、レポーター遺伝子に連結した転写抑制因子タンパク質結合部位に連結させて含む。GAL4融合体をGAL4結合部位に結合させると、結果としてRNAポリメラーゼの構成的転写活性化が起こる。転写抑制因子タンパク質が構成的に発現しているときは、レポーター遺伝子の発現は抑制される。しかし、プロテアーゼが存在すると、GAL4とVP16は分離されるため、転写抑制因子タンパク質は合成されない。結果としてレポーター遺伝子が発現する。他の実施形態では、分割ユビキチンまたはアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼおよびまたはその調節因子系を使用する。そうした系は、複数種のレポーターの組み合わせたとえばルシフェラーゼとGFPまたはルシフェラーゼと変異ヒドロラーゼを使用する多重アッセイに、複数のプロテアーゼ認識部位を使用するプロテアーゼ多重アッセイに、プロテアーゼたとえばキャスパーゼの阻害物質のスクリーニングアッセイに、使用してもよい。該アッセイ系はまた、たとえば生物兵器の検出にだけでなく臨床診断で感染因子の検出に用いてもよい。さらなる実施形態では、分解不安定性ドメインの存在下で短いまたは短縮された半減期をもつレポーターたとえば変異ヒドロラーゼまたはルシフェラーゼを使用する細胞系アッセイを使用して単数または複数のプロテアーゼを検出する。プロテアーゼ認識部位をレポータータンパク質とタンパク質不安定化ドメインの間に導入する。プロテアーゼが存在しないと、レポータータンパク質は急速に分解される。プロテアーゼが存在すると、不安定化ドメインが除去される結果として半減期の長いレポータータンパク質が生成する。そうした系は、複数種のレポーターの組み合わせたとえばルシフェラーゼとGFPまたはルシフェラーゼと変異ヒドロラーゼを使用する多重アッセイに、複数のプロテアーゼを使用するプロテアーゼ多重アッセイに、プロテアーゼたとえばキャスパーゼの阻害物質のスクリーニングアッセイに、使用してもよい。一実施形態では、本発明の変異ヒドロラーゼの融合体を使用して細胞内移動をモニターする。たとえばβアレスチンはGタンパク質結合受容体の調節因子であり、活性化されると細胞質から細胞膜へと移動する。本発明の変異ヒドロラーゼβアレスチン融合体と基質とを含む細胞は、βアレスチンが活性化Gタンパク質結合受容体と会合すると、βアレスチンの細胞質から細胞膜への移動の検出を可能にする。該アッセイ系は感染因子の検出に用いてもよいし、また臨床診断や生物兵器の検出に用いてもよい。他の形態を使用してプロテアーゼたとえばキャスパーゼを検出してもよい。一実施形態では、変異ヒドロラーゼと別のレポータータンパク質たとえばルシフェラーゼとの融合体を該融合体の結合部にプロテアーゼ認識部位を導入して構築する。この融合タンパク質を固体担体の表面に固定化し、試料中のプロテアーゼの検出に使用する。融合タンパク質を固定化した固相表面を分析用試料の溶解液およびまたは単離プロテアーゼとインキュベートする。一定期間のインキュベーション後、溶解液を取り出し、レポータータンパク質の有無を調べる。プロテアーゼが存在すればレポータータンパク質たとえばルシフェラーゼは固体担体から溶液中に放出される。このアッセイ系はタンパク質マイクロアレイまたはマルチウェルフォーマットに、また他のアッセイ系たとえば別種のレポーター遺伝子を使用するおよびまたは別種の分子たとえば別種のプロテアーゼを検出するためのアッセイ系との併用による多重処理に、使用してもよい。この方法はまた、感染因子の検出にも使用可能であり、従って臨床診断や生物兵器の検出に有用である。別の実施形態では、FRET法を、変異ヒドロラーゼと蛍光タンパク質たとえばGFPとの融合体、または蛍光分子に結合するタンパク質たとえばOアルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼとの融合体と併用する。あるいは変異ヒドロラーゼと関心タンパク質との融合体および蛍光タンパク質と該関心タンパク質と相互作用するとみられる分子との第2融合体を使用して、関心タンパク質と該分子の相互作用を、たとえばFRET法で調べるようにしてもよい。ある細胞に変異ヒドロラーゼと関心タンパク質との融合体を含ませ、別の細胞に蛍光タンパク質と該関心タンパク質と相互作用するとみられる分子との第2融合体を含ませてもよい。これら2つの細胞集団は基質および作用物質たとえば薬物と接触させた後に細胞をモニターして、2細胞集団に対する作用物質投与の効果を検出するようにしてもよい。一実施形態では、変異ヒドロラーゼと第2タンパク質と相互作用する関心タンパク質との融合体および該第2タンパク質と変異ヒドロラーゼとの第2融合体を使用して、関心タンパク質と第2タンパク質の相互作用を調べるか、または一方または両方のタンパク質と相互作用してそれらの相互作用を変化させる分子たとえばPKA調節サブユニット、PKA触媒サブユニットおよびcAMPを検出するようにする。この実施形態では、少なくとも1つの異なる機能性基をもつ2つの基質を使用してもよい。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼを蛍光タンパク質に融合させる。従って、該融合タンパク質は細胞内で、該蛍光タンパク質を検出することによって、または細胞を本発明の基質と接触させ基質中の機能性基を検出することによって、検出することができる。蛍光タンパク質の検出は機能性基の検出の前に行ってもよい。あるいは機能性基の検出を蛍光タンパク質の前に行ってもよい。さらに、それらの細胞は追加の基質たとえば別種の機能性基をもつ基質と接触させて、最初の基質と未だ結合していない変異ヒドロラーゼに共有結合で連結した該別種の機能性基を、細胞中で検出することも可能である。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼと転写因子との融合体を使用して転写活性化経路の活性をモニターする。たとえば、細胞質中に不活性型で存在するが活性化に伴い核移行する転写因子と変異ヒドロラーゼとの融合体は転写活性化経路をモニターすることができる。別の実施形態では、ビオチンを基質の中の機能性基として使用し、また融合体は変異ヒドロラーゼを、別の分子たとえばタンパク質と細胞内で相互作用するとみられる関心タンパク質に融合させて含む。そうした試薬の使用は、変異ヒドロラーゼに融合させたタンパク質と細胞内で相互作用する該他分子の捕捉を、以って相互作用性分子の同定およびまたは捕捉を、可能にする。一実施形態では、変異ヒドロラーゼを分泌タンパク質に融合させる。該融合体と本発明の基質を使用して、該分泌タンパク質を検出およびまたはモニターしてもよい。同様に、変異ヒドロラーゼを、異なる小胞状区画の間に輸送される膜タンパク質へと融合させると、これらの区画内でのタンパク質プロセッシングを基質の存在下に検出することができる。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼをイオンチャンネルまたは輸送タンパク質または該チャンネルまたは輸送タンパク質と密接に関連するタンパク質へと融合させると、イオンの細胞膜またはオルガネラ膜透過移動を、イオン感受性蛍光団を含む本発明の基質の存在下にモニターすることができる。同様に、変異ヒドロラーゼを小胞または細胞骨格に関連するタンパク質へと融合させると、基質の存在下に、骨格細胞構造に沿ったタンパク質または小胞輸送を容易に検出することができる。別の実施形態では、機能性基は薬物または毒素である。そうした機能性基をもつ基質を変異ヒドロラーゼとターゲッティング分子との融合体と結合させると、細胞内または動物体内での薬物または毒素の誘導が可能になる。あるいは、官能性基は蛍光団でもよい。該蛍光団が基質中に存在していて、変異ヒドロラーゼとターゲッティング分子たとえば単鎖抗体との融合体と結合すると、ターゲッティング分子が標識され、たとえばELISAなどのようなinvitro用途向けの標識抗体が得られる結果となる。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼを細胞表面で発現するタンパク質と融合させ、細胞表面の変異ヒドロラーゼを本発明の基質たとえば蛍光団を含む基質と結合させて、細胞移動のinvivoまたはinvitroモニタリングに使用する。一実施形態では、本発明の基質は細胞膜透過性が低いまたはない基質である。あるいは、そうした系は種々の作用物質たとえば薬物の種々の細胞プールに対する効果のモニタリングに使用することもできる。さらに別の実施形態では、変異ヒドロラーゼはHERGチャンネルへと融合させる。K感受性蛍光団を含む本発明の基質の存在下でそうした融合体を発現する細胞は、HERGチャンネルの活性をモニターするために、たとえば薬物毒性をモニターするために使用してもよい。さらなる実施形態では、そうした融合体を血液細胞の表面で、たとえば動物に導入した外来細胞またはトランスジェニック動物体内の外来性細胞の表面で、発現させてもよい。別の実施形態では、本発明の基質は細胞または生体内の疎水性領域のモニタリングに有用な機能性基たとえばナイルレッドを含む。従って、本発明の変異ヒドロラーゼと基質は多様なアッセイ法たとえばファージディスプレイ、パニング、ELISA、質量分析、ウェスタンブロット、FMAT、動物全身画像化、X線画像化および細胞亜細胞染色などに有用であり、またはバイオセンサーとして有用である。たとえば変異ヒドロラーゼまたはその融合体を含むまたは発現する細胞を、動物たとえば人間または人間以外の動物たとえば哺乳動物または霊長類に、導入たとえば移植または注入する。該細胞は一時的にトランスフェクトしてもよいし、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を安定的に発現させるようにしてもよいし、他の形で変異ヒドロラーゼまたはその融合体と接触させて会合させるようにしてもよい。種々の細胞型が、細胞系、初代培養、または幹細胞を非限定的に含めて、使用可能である。一実施形態では、変異ヒドロラーゼを発現するまたは含む細胞は本発明のヒドロラーゼ基質と接触させてから動物に導入する。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼを発現するまたは含む細胞の動物への導入の後または前に本発明のヒドロラーゼ基質の動物への導入を行う。動物全身または組織標本、または血液等の生理液試料におけるヒドロラーゼ基質の機能性基の存否、局在位置または量が検出または測定される。該変異ヒドロラーゼ、該変異ヒドロラーゼを含む融合体、およびまたは単数または複数の本発明の基質は、たとえば生物学的過程の画像化、内在性遺伝子の転写調節の画像化、および細胞移動の画像化に、単独でまたは他の発光または核レポーター系と共に使用することができる。光イメージング系には、顕微鏡的な解像度を実現するもの、メゾスコピックな解像度を実現するもの、および固有コントラストまたは分子コンストラクトを伴う肉眼解像度を実現するものなどがある。該変異ヒドロラーゼ、該変異ヒドロラーゼを含む融合体、およびまたは単数または複数の本発明の基質はまた種々の高光学密度造影剤と併用することもできるが、そうした造影剤は別個の薬剤として、またはヒドロラーゼ基質に化学的に結合させて、使用してもよい。一実施形態では、造影剤を含むヒドロラーゼ基質を、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を発現する細胞を含む動物に導入する。別の実施形態では、造影剤を含むヒドロラーゼ基質を、変異ヒドロラーゼまたはその融合体を発現する細胞に導入し、それらの細胞を動物に導入する。造影剤はX線、MRI等の技術により検出することができる。一実施形態では、変異ヒドロラーゼと別のタンパク質との融合体および電気化学的感受性表面に結合させたヒドロラーゼ基質を、分子たとえば生理的分子の検出に使用する。たとえば該表面は固定化ヒドロラーゼ基質を含み、また試験液中の関心分子の存否は電気化学的な変化によって判定される。たとえば変異ヒドロラーゼとグルコースオキシダーゼとを含む融合体は、ヒドロラーゼ基質を含む白金電極、金表面、金ナノ粒子またはカーボンナノチューブ上に固定化し、試験試料を加え、試料中のグルコースの存否または量を測定する。同様に、電気化学的感受性表面に固定化した変異ヒドロラーゼコレステロールオキシダーゼ融合体を使用して、試料中のコレステロールを測定してもよい。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼをバイオセンサーとして、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質、キナーゼまたはキナーゼ阻害物質などの検出に使用する。たとえばプロテアーゼ認識部位を変異ヒドロラーゼタンパク質に融合させ、得られた融合体を、ヒドロラーゼ基質を含む電極、金表面、金ナノ粒子またはカーボンナノチューブなどの電気化学的感受性表面に固定化する。プロテアーゼまたはキナーゼなどのような分子が存在すると、分子量がシフトするが、それを電気化学的変化によって検出してもよい。これらの変化の阻害物質には、変異ヒドロラーゼに融合させたタンパク質の阻害物質たとえばプロテアーゼ阻害物質などがあるが、それもまたこの方法で検出してもよい。別の実施形態では、変異ヒドロラーゼはヒドロラーゼ基質以外の基質にたとえば変異ヒドロラーゼのC末端で結合させる、およびまたは変異ヒドロラーゼとタンパク質との融合体をヒドロラーゼ基質以外の基質に結合させる。バイオセンサーの表面は固定化ヒドロラーゼ基質を含む。試験液中の生体分子の存否は電気化学的な変化によって判定する。この方法はある種の分子の捕捉、結合、または他の形でのアッセイ手段の提供に使用してもよいし、また農薬や工業用の有毒化合物の検出、臨床診断、感染因子および生物兵器の検出などにも使用可能である。一実施形態では、この方法をプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質、キナーゼ、キナーゼ阻害物質を非限定的に含む分子類の検出に、またタンパク質の翻訳後修飾の検出に、使用する。以下、非限定的な実施例を以って本発明をさらに詳しく説明する。実施例I一般手順特に断らない限り、ここで使用する専門学術用語はすべて分子生物学および細胞シグナル伝達およびモデリングの分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味をもつ。一般にここで使用する命名法、および後述の分光法、創薬、細胞培養、分子遺伝学、プラスチック製造、高分子化学、診断、アミノ酸核酸化学、アルカン化学の分野のラボ作業手順は、技術上周知でありまた常用されている。プラスチック製造、シグナル検出、組み換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細菌培養および形質転換には一般に標準技法を使用する。種々の技法や手順は一般に技術上通常の方法および種々の一般参考書に従って行うColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYを、また蛍光技法についてはLakowiczJRPrinciplesofFluorescenceSpectroscopyNewYorkPlenumPressを、参照。両書は参照により開示される。化学合成、化学分析および生物アッセイには標準技法を用いる。材料オリゴヌクレオチドはすべてPromegaCorporationまたはUniversityofIowaDNAFacilityが合成、生成および配列分析した。制限酵素とDNA修飾酵素はPromegaCorporation、NewEnglandBiolabsIncまたはStratageneCloningSystemsから入手し、メーカーのプロトコールに従って使用した。コンピテントEcoliJM109はPromegaから提供を受けたか、StratageneCloningSystemsから購入した。小規模のプラスミドDNA単離はQiagenPlasmidMiniKitを使用して行った。DNAライゲーションはStratageneCloningSystemsから購入した予備試験済み試薬キットを使用して行った。DNA断片の精製にはQiagenIncから購入したQIAquickGel抽出キットまたはQIAquickPCR精製キットを使用した。DhaA変異体およびその融合体の生成に使用したベクターは次のとおりであったpET21pRLnullpGEX5x3EGFPおよびDsRED2。SDSPAGEと関連バッファーおよび色素、それにエレクトロブロット転写バッファーはBioWhittakerMolecularApplicationsから入手した。タンパク質分子量マーカーはInvitrogenから購入した。SigmaAldrichは抗FLAGRモノクローナル抗体類抗FLAGRM2モノクローナル抗体、抗FLAGRM2HRP標識体および抗FLAGRM2FITC標識体の供給元であった。Chemiconはモノクローナル抗Renillaルシフェラーゼ抗体の供給元であった。PromegaCorpはHRP標識ヤギ抗マウスIgGおよびHRP標識ストレプトアビジンの供給元であった。1Clブタン、1Clヘキサン、1Clオクタン、1Clデカン、1Clブタノール、1Clヘキサノール、1Clオクタノールおよび1ClデカノールはAldrichまたはFlukaから入手した。諸々の塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、イミダゾール、HEPES、ナトリウムEDTA、硫酸アンモニウムおよびトリス遊離塩基はFisherに由来した。GlutathioneSepharose4FF、グルタチオン、MonoQおよびSephadexG25プレパック型カラムはAmershamBiosciencesに由来した。LuriaBrothはPromegaCorpから提供を受けた。方法PCR反応DNA増幅はPromegaCorp提供の標準PCRバッファーを使用して行った。一般に、50μl反応系は1x濃度のメーカー提供バッファー、15mMMgCl2、125μMdATP、125μMdCTP、125μMdGTP、125μMdTTP、01010μM順方向および逆方向プライマー、5UAmpliTaq登録商標DNAポリメラーゼおよび625μMでは、CHOK1細胞の相対発光が用量依存的に低下し、IC50は約100μMであった。ビオチンC10H21NO2Clは濃度100μMで4時間処理した後でも毒性が検出されなかった。それに対してカルボキシXローダミンC10H21NO2Clは、1時間処理後にCHOK1細胞内のRLUの低下が検出されたことから毒性効果が顕著であった。この効果のIC50値は約75μMであり、濃度25μMでは明らかなATPの低下が見られなかった。5カルボキシXローダミンC10H21NO2Cl毒性のIC50値と5カルボキシXローダミンC10H21NO2Clの最高無毒性濃度は時間依存的に低下し、それぞれ125μMおよび625μMとなった。DカルボキシテトラメチルローダミンまたはDiAcカルボキシフルオレセインを含む基質と固定剤とを接触させたCHO細胞内でのDhaAD106Cの検出8ウェルのチャンバースライドを使用して10FBSと1mMグルタミン酸を含む抗生物質無無添加のDMEMF12培地にCHO細胞を低密度でまいた。2日後、倒立位相差顕微鏡で細胞を検査した。トランスフェクション試薬を添加する前に、次の2つの視覚的判定基準を確認した1チャンバーあたりの細胞コンフルエンシーは約60~80であった290の細胞は接着性であり、扁平な形態像を示した。培地を150μlの新鮮な、予温した増殖培地と交換し、細胞を約1時間培養した。トランスフェクションにはTransItTKOシステムを使用した。TKO脂質は無血清DMEMF12培地100μlあたり7μlの脂質を加えて希釈し、次いで含脂質培地100μlあたり12μgのトランスフェクション用DhaAD106CDNAを加えた。この混合体を室温で15分間インキュベートし、次いで25μlを個別の培養チャンバーに分注した。細胞をインキュベーターに戻して5~6時間置いてから、増殖培地で2回洗い、300μlの新鮮培地を加え、次いで細胞をさらに24時間培養した。トランスフェクト細胞または非トランスフェクト対照細胞を125μMのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clまたは125μMのDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clと10FBSDMEM中で30分間、37°C、5CO2条件下にインキュベートした。細胞を温増殖培地で3回洗い、300μlの新鮮培地を加え、次いで細胞をさらに1時間培養した。増殖培地を温PBSと交換し、生細胞を可視化した。生細胞の可視化にはローダミンフィルターセットとフルオレセインフィルターセットとSpotCCDカメラとを備えたZeissAxiovert100倒立顕微鏡を使用した。画像は露出時間015~060秒、ゲイン設定4または16で記録した。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識細胞とDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl標識細胞の両方で、個々の、特異的に標識したトランスフェクト細胞が明白であった。大半の細胞は非トランスフェクト細胞であり、標識を保持しなかった。PBSを捨て、37パラホルムアルデヒド01Triton添加PBS溶液で15分間、細胞を固定化した。この固定液を捨て、PBSを加え、カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識細胞とDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl標識細胞の両方について、2組目の画像を記録した。PBSを50メタノールPBSに交換し、細胞を15分間インキュベートし、次いで95メタノール中でインキュベートした。3組目の画像を記録し、次いでメタノールアセトン等量混合体を細胞に加え、15分間インキュベートした。培地をPBSに交換し。4組目の画像を記録した。結果は、基質のDhaAD106C変異体への結合がパラホルムアルデヒドによる固定化と後に続く固定化細胞試料のメタノールアセトン中の処理により安定したことを示す。さらに、これらの条件下ではカルボキシテトラメチルローダミンまたはカルボキシフルオレセインの蛍光輝度に変化がなかった。実施例VI変異βラクタマーゼ系係留βラクタム系抗生物質耐性を細菌に付与する酵素であるセリンβラクタマーゼはセリン残基のクラスAコンセンサス番号付け方式に従えばSer70のヒドロキシル基を使用して広範囲のβラクタム化合物を分解すると思われる。この反応は前共有結合的な出会い複合体の形成に始まり、高エネルギーのアシル化反応四面体中間体を経て、一時的に安定なアシル酵素中間体を形成して、触媒残基Ser70を介してエステルを形成する。次いでアシル酵素は加水分解水の攻撃を受けて、高エネルギーの脱アシル化反応中間体を形成し、それが崩壊して加水分解生成物を形成する。該生成物は次いで放出され、遊離型酵素が再生される。セリンプロテアーゼの場合と同様に、この機構はセリン求核剤を活性化して基質のアミド結合を攻撃させ、またアシル酵素中間体の形成後に、加水分解水を活性化して該付加体のエステル中心を攻撃させるようにするには、触媒塩基を必要とする。A変異βラクタマーゼとその融合体材料と方法DrOHerzbergより、StaphylococcusaureusPC1blaZ遺伝子を入れたプラスミドpTS32の提供を受けた。blaZ遺伝子の配列は次のとおりであるblaZ遺伝子に点変異を導入し、またblaZコード領域をpGEX5x3ベクターのSalIAgeI部位にクローニングすることにより、GSTblaZ融合体カセットを構築した。変異導入用の内部プライマーは次のとおりであった。2つの外部プライマーを設計して、blaZの5コード領域にN末端SalI部位とKozak配列を付加し、3コード領域にAgeI部位を付加し、以ってblaZWT鋳型から806bp断片を増幅するようにした。得られた断片はpGEX5X3ベクターのSalIAgeI部位に挿入した。これはグルタチオンSトランスフェラーゼ遺伝子、Xa因子切断部位をコードする配列、およびマルチクローニング部位とそれに続くFlag対応配列および終止コドンを含むベクターである。これらの遺伝子融合体コンストラクトはDNA配列分析で確認した。GSTBlaZ融合タンパク質をコンピテントEcoliBL21細胞で過剰発現させ、DhaAおよびGSTDhaA融合タンパク質の場合と実質的に同じ要領で精製したを使用。タンパク質の均一性はSDSPAGEで検証した。発色基質6βアミドペニシラン酸トリエチルアミン塩をCalbiochemより購入した。FAPの加水分解を、BeckmanDu640分光光度計を使用して344nmでの吸光度の低下によってモニターした。アッセイはすべて25°Cで、01Mリン酸カリウムバッファー中で行った。CCF2では、セファロスポリンコアが7ヒドロキシクマリンをフルオロセインに結合させる。インタクトの分子では、クマリンが励起されると、結果としてフルオレセインへのFRETが起こり、緑色光を発する。βラクタマーゼによるCCF2の開裂は結果として2つの色素の空間的分離を招き、FRETを妨げるため、今度はクマリンの励起により青色の蛍光が生じる。CCF2はAuroraBiosciencesCorporationより購入した。FRETシグナルの減少と青色蛍光の増加は蛍光マルチウェルプレートリーダーCytoFluorIIで計測した。結果βラクタマーゼはStaphylococcusaureusPC1由来のものも含めてすべて、種々の化学構造のβラクタムを加水分解する。加水分解効率は酵素の種類と基質の化学構造に左右される。ペニシリンはStaphylococcusaureusPC1由来βラクタマーゼの好ましい基質と考えられる。βラクタマーゼのペニシリン加水分解能に対する点変異の効果を、Zawadzkeetalで開示されている要領で調べた。図20に示すように、GSTβラクタマーゼPC1融合タンパク質は効率的にFAPを加水分解した。BlaZE166D、BlaZN170QまたはBlazE166DN170Qの各変異体によるFAPの加水分解は共インキュベーションの60分後でも検出できなかった。従って、これらの変異はBlaZの著しい不活性化を招いた。BlaZE166D、BlaZN170QまたはBlazE166DN170Qの各変異体はβラクタムに結合すること、従ってこれらのタンパク質にはβラクタムを介して種々の機能性基を係留しうることを示すために、これらの変異体のGSTとの融合体を蛍光ペニシリンBOCELLIN登録商標FLとインキュベートした。タンパク質をSDSPAGEで分離し、蛍光イメージャーにより特定蛍光団に対応するEexEemで分析した。図22のデータは、どのBlaZ変異体もBOCELLINに結合することを示す。そのうえ、BlaZ変異体と蛍光基質の結合は、SDSによる煮沸とその後のSDAPAGEでも壊れず、非常に強力であり、おそらく共有結合であった。またダブル変異体BlazE166DN170Qの結合効率はいずれのシングル変異体の結合効率よりもずっと高かったし、またBlaZN170Qの結合効率はBlaZE166Dの結合効率よりも高かった。これらのデータは、βラクタムの加水分解における個別アミノ酸の役割に関する現時点の理解と相俟って、追加の変異が変異タンパク質への機能性基の係留効率を改善しうることを示す。βラクタマーゼのセファロスポリン加水分解能に対する点変異の効果もまた、Zlokamiketalで開示されているFRET系基質であるCCF2を使用して、調べた。図23に示すように、GSTβラクタマーゼPC1融合タンパク質は効率的にCCF2を加水分解した。単一点変異は融合タンパク質のCCF2加水分解能を低下させた。2つのアミノ酸の置換はCCF2の加水分解にさらに著しい効果を及ぼした。しかし、BlaZ変異体はいずれもCCF2を加水分解することができた。従って、位置166または170でのアミノ酸置換たとえばGlu166AspまたはAsn170Glyは変異βラクタマーゼによる基質のトラッピングを、従って該基質の機能性基の、安定した結合を介した変異βラクタマーゼへの係留を可能にする。そのうえ、H2O活性化に補助的な効果を及ぼすアミノ酸の変異も係留効率を高めた。実施例VII生きた細胞の核およびサイトゾルへのDhaAH272Fの誘導材料と方法NLS3の3タンデムリピートをpCIneoGFPコネクターDhaAH272FFlagベクターのAgeIBamHI部位に挿入することにより、GFPコネクターDhaAH272FNLS3融合体カセットを構築した。NSL3ペプチドをコードする2つの相補オリゴヌクレオチドをアニールした。アニールしたDNAは5にAgeI部位を、また3にBamHI部位を、それぞれ有した。該DNAをGSTコネクターDhaAH272FFlagコンストラクトへ、AgeIBamHI部位でクローニングした。GFP2βアレスチン2をコードするPackardベクターのpGFP2コード領域をDhaAH272FFlagコード領域に置き換え、DhaAH272Fβアレスチン2融合体カセットを構築した。2つのプライマーを設計して、KpnI部位をDhaAの3コード領域に付加し、pGEX5X3DhaAH272FFlag鋳型から930bp断片を増幅するようにした。pGFP2コード領域をNheIおよびKpnI制限酵素で切り取り、次いでDhaAH272Fをコードする該930bp断片をGFP2βアレスチン2コード化ベクターのNheIKpnI部位に挿入した。遺伝子融合コンストラクトの配列はDNA配列分析で確認した。GFPコネクターDhaAH272FNLS3、GFP2βアレスチン2またはDhaAH272Fβアレスチン2融合タンパク質を一時的に発現するCHOK1または3T3細胞をLTIIチャンバーに30000細胞cm2の密度でまいた。翌日、培地を25μMのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clを含む新鮮培地に交換し、細胞をCO2インキュベーターに戻し60分間置いた。インキュベーション終了後、基質を含む培地を捨て、細胞を素早くPBSで洗い、新しい培地を細胞に加えた。細胞をCO2インキュベーターに戻し、60分後に細胞を素早くPBSで洗った。細胞の蛍光画像を、GFPおよびカルボキシテトラメチルローダミンに対応するフィルターセットを備えた共焦点顕微鏡Pascal5で撮影した。結果図24の画像で示すように、GFPとカルボキシテトラメチルローダミンは、GFPコネクターDhaAH272FNLS3をコードするコンストラクトをトランスフェクトし、カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clで染色した細胞の細胞核に共局在した。図25の画像で示すように、GFPβアレスチン2発現細胞は代表的なβアレスチン2サイトゾル共局在を示した。DhaAH272Fβアレスチン2を含むSDSPAGEゲルのフルオロスキャンは、カルボキシテトラメチルローダミンを含むDhaA基質のDhaAH272Fβアレスチン2発現細胞への強い結合を示す。実施例VIIIDhaA触媒残基130の部位特異的変異誘発ハロアルカンデハロゲナーゼは炭素ハロゲン結合の開裂に3ステップ機構を使用する。この反応は求核剤、塩基および酸からなるアミノ酸残基3点セットによって触媒される。該3点セットはXanthobacterautotrophicus由来のハロアルカンデハロゲナーゼでは、それぞれAsp124、His289、Asp260であり、またそれぞれSphingomonas、Rhodococcus由来のデハロゲナーゼ酵素であるLinB、DhaAでは、類似の残基3点セットはそれぞれAsp108、His272、Glu132およびAsp106、His272、Glu130と同定されている。基質に結合後、Asp残基のカルボキシレートによる基質への求核攻撃により、ハロゲン炭素結合の開裂とアルキルエステル中間体の形成が起こる。DhlAAsp124残基に関する部位特異的変異誘発研究によれば、この最初の反応は共有結合触媒作用によって進行し、アルキル酵素中間体の形成を伴う。デハロゲナーゼ反応経路の次のステップは、活性部位His残基により活性化される水分子による該中間体エステルの加水分解である。触媒His残基は共有結合中間体の脱アルキル化塩基触媒であるが、活性部位Aspの最初の求核攻撃には必ずしも不可欠ではない。重要な触媒His残基を欠くタンパク質変異体はアルキル化半反応を起こし、以って安定した、共有結合エステル中間体を生成することが判明している。たとえばDhlAのHis289Gln変異体は共有結合アルキル酵素中間体を蓄積することがすでに示されている。ハロアルカンデハロゲナーゼの求核剤残基および塩基残基と異なり、3点セットの第3残基の役割は十分には解明されていない。触媒酸は触媒His残基に結合した水素であり、またHis残基の機能を、イミダゾール環の窒素の塩基性度を高めることにより、手助けする可能性がある。Krooshofetalは部位特異的変異誘発法を用いてDhlA触媒酸Asp260の研究を行い、D260N変異体が触媒能を欠くことを示した。さらに、この残基は重要な構造的役割を果たしているように見受けられた。というのは、該変異タンパク質は主に封入体に蓄積したからである。Sphingomonaspaucimobilis由来のハロアルカンデハロゲナーゼはγヘキサクロロシクロヘキサンの分解に関与する酵素である。HynkovaetalはLinBの推定触媒残基をグルタミン残基で置換した。しかしこのE132Qでは、たとえ基質濃度を非常に高くしても、活性は観測されなかった。DhaA触媒3点セット中の酸触媒Glu130のタンパク質産生での役割と該変異タンパク質の蛍光標識ハロアルカン基質と共有結合アルキル酵素中間体を形成する能力を調べるため、部位特異的変異誘発法によりDhaAの位置130のグルタミン酸残基をグルタミン、ロイシンおよびアラニンで置換してみた。材料と方法細胞株とプラスミドウルトラコンピテントEcoliXL10Gold183Δ173endA1supE44thi1recA1gyrA96relA1lacTheFproABlacIqZΔM15Tn10AmyCamrを、部位特異的変異誘発反応による形質転換の宿主として使用した。Ecoli株JM109recAendA1gyrA96thi1hsdR17supE44relA1ΔFtraD36proABlacIqZΔM15を、遺伝子発現および全細胞酵素標識研究用の宿主として使用した。GSTDhaAFLAG遺伝子融合体をクローニングしたプラスミドpGEX5X3をE130変異誘発用の出発鋳型として使用した。標識研究ではDhaAのH272F変異を含む変異体プラスミドを陽性対照として使用し、クローニングベクターpGEX5X3を陰性対照として使用した。DhaAE130残基の部位特異的変異誘発変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドの配列は下記のとおりである。下線で強調したヌクレオチドは変異コドンの位置を示す。これらのオリゴヌクレオチドはIntegratedDNATechnologiesが100nmolスケールで合成し、5末端リン酸化により修飾した。部位特異的変異誘発はQuickChangeMultiキットを使用して、メーカー説明書に従って行った。変異誘発反応をコンピテントEcoliXL10Gold細胞に導入し、形質転換体をアンピシリン添加LB寒天培地で選択した。個別形質転換体から単離したプラスミドDNAについてまず、グルタミン酸コドンの置換によるEcoRI部位の欠失をスクリーニングした。各反応に由来する、所期のコドン変異を含むと見られるクローンを選択し、DNA配列分析にかけた。pGEX5X3ベクター中の変異体の配列を確認するために使用したプライマーは次のとおりであったDhaA変異分析3つのDhaAE130置換変異体を次のコンストラクトと比較した野生型DhaA、DhaAH272FおよびDhaA陰性対照。各クローンの終夜培養液を2mlのアンピシリン添加LB中、30°Cで振とう培養した。50ml新鮮LB培地アンピシリンを入れた滅菌フラスコにこの終夜培養液を加え、150希釈した。これを25°Cで振とう培養して、不溶性タンパク質種の生成を極力抑えるようにした。培養液が中期対数期に達したところで、IPTGを加え、25°Cでさらに22時間振とう培養した。カルボキシテトラメチルローダミン標識ハロアルカン基質で全細胞を標識するために、各培養液の細胞密度をOD6001に調節してから基質を濃度15μMとなるように加えた。細胞を穏やかにかき混ぜながら4°Cで約18時間インキュベートした。インキュベーション後、各標識反応液に由来する20μlの細胞を6μlの4XSDSローディングダイに加え、試料を約3分間煮沸してから420アクリルアミドゲル上に添加した。invitro標識研究では、IPTG誘導培養物の粗溶解液を、3mlの細胞を回収して得られたペレットを75μlのPBSに再懸濁させて、調製した。凍結解凍ステップを経て、リゾチーム添加1XCellCultureLysisReagent225μlを加えて、細胞溶解を促進するようにした。各溶解液の試料20μlを25μlの1XPBSと合わせた。カルボキシテトラメチルローダミン標識ハロアルカン基質を加え、終濃度を25μMとした。この標識反応液を室温で2時間インキュベートした。各標識反応液の試料25μlを6μlの4XSDSローディングダイに加え、試料を約3分間煮沸してから420アクリルアミドゲル上に添加した。570nmでの発光を検出するようセットしたFluoroImagerSI装置を使用してゲルを画像化した。粗溶解液を14000RPMで15分間遠心して無細胞溶解液を調製した。タンパク質の生成をSDAPAGEとウェスタンブロット分析でモニターした。PVDF膜に転写されたタンパク質をアルカリホスファターゼ標識抗FLAGR抗体とインキュベートした。ブロットはアルカリホスファターゼ用のWesternBlue安定化基質で発色させた。結果アルキル酵素中間体の加水分解でのDhaA酸触媒の役割を部位特異的変異誘発法で調べた。DhaAWTE130コドンをグルタミン、ロイシンまたはアラニンのコドンで置換した。これらの置換は該酵素の構造に破壊的影響を与えるおそれが最も少なそうだったからである。変異誘発後、制限酵素スクリーニングおよびDNA配列分析により所期のコドン変異を検証した。配列検証を経たDhaAE130Q、DhaAE130LおよびDhaAE130Aクローンを選び出してさらに分析した。これらのE130変異体の分析項目はタンパク質発現、それにカルボキシテトラメチルローダミン標識ハロアルカン基質と共有結合アルキル酵素中間体を形成する能力であった。3つのE130遺伝子変異体をEcoliJM109細胞で、IPTG誘導後、過剰発現させた。粗細胞溶解液のSDSPAGE分析により、野生型および変異dhaA遺伝子を発現する培養物ではタンパク質の蓄積がほぼ同じレベルとなることが判明した。さらに、DhaAWTおよびDhaAH272Fをコードするコンストラクトによって生成されたタンパク質は大部分が可溶性であった。というのは遠心後もタンパク質量がほとんど変わらなかったからである。空ベクターのレーンに存在する豊富な22kDaタンパク質バンドはGSTタンパク質を表す。しかし、これらの結果はDhaAE130Q、DhaAE130LおよびDhaAE130A変異体とは好対照をなしており、それらの変異体は主に不溶性DhaAタンパク質を蓄積するように見受けられた。この結論は、遠心後に無細胞溶解液中のDhaAタンパク質量が著しく減少したという観測結果に基づく。それにもかかわらず、DhaAと共移動するタンパク質バンドが遠心後に、各DhaAE130変異体レーンで観測された。これは可溶性酵素の存在を示唆する。そこで、DhaAE130変異体で遠心後に観測されたタンパク質バンドが可溶性DhaA物質を表わすのかどうかを、ウェスタン法で調べた。図27に示す免疫ブロットは、各DhaAE130変異体無細胞溶解液に可溶性DhaAタンパク質が存在することを確認してくれた。DhaAE130変異体はまた、アルキル酵素共有結合中間体の成性能についても調べた。種々のコンストラクトのIPTG培養物に由来する粗溶解液をカルボキシテトラメチルローダミン標識基質の存在下にインキュベートした。図28はDhaAH272F変異体の中間体生成能がきわめて高いことを示した。そうした生成物は、DhaAWT、陰性対照いずれの溶解液でも検出されなかった。DhaAE130変異体は最初の検査では、検出可能レベルの共有結合中間体を生成しないように見えた。しかし、蛍光画像を詳しく調べると、微量の共有結合中間体を表す可能性のあるかすかなバンドが観察された。これらの結果に基づき、全細胞の蛍光アルキル酵素共有結合中間体の生成能を調べた。図29は各DhaAE130変異体と陽性対照、陰性対照とを比較したinvivo標識実験の結果である。予想通り、DhaAH272F変異体はアルキル酵素共有結合中間体を生成することができた。それはこのDhaA融合体の予想分子量の近傍に見られる単一蛍光バンドが裏付けている。前にinvitro標識の結果から観測されたように、野生型、陰性対照いずれの培養液でもそうした生成物は検出しえなかったが、3つのDhaAE130置換変異体ではいずれも、正しい位置で移動するかすかなバンドが観察された。これらの結果はDhaAE130QLA変異体が共有結合アルキル酵素中間体を捕捉しうるという可能性を示す。しかし、この反応の効率はDhaAH272F酵素と比べると著しく低い模様である。この変異誘発研究の結果は、DhaAの酸触媒残基DhaAE130が該酵素の正しい折りたたみで重要な構造的役割演じることを示唆する。このDhaAタンパク質はこのアミノ酸残基の置換に対して明らかに敏感であり、それはDhaAE130Q、DhaAE130LおよびDhaAE130A粗溶解液にほぼ不溶性のタンパク質複合体が存在することからも裏付けられる。それにもかかわらず、SDSPAGEおよび免疫ブロット分析によれば、これら3つのDhaAE130変異体の無細胞溶解液ではいずれも、かなりの量の可溶性DhaAタンパク質が検出された。実施例IX生きた哺乳動物細胞で発現するDhaAH272FFlagおよびDhaAH272FFlagRenillaルシフェラーゼ融合タンパク質の捕捉材料と方法CHOK1細胞を24ウェルプレートに30000細胞cm2の密度でまき、pCIneoDhaAWTFlagまたはpCIneohRLucコネクターDhaAH272FFlagベクターでトランスフェクトした。24時間後、培地を、25μMのビオチンC10H21NO2Clと01DMSOまたは01DMSOだけを含む新鮮培地に交換し、細胞をCO2インキュベーター中に60分間置いた。インキュベーション終了後、培地を捨て、細胞を素早くPBSで洗ってから、新しい培地を細胞に加えた。実験によっては培地を交換しなかった。細胞をCO2インキュベーターに戻した。60分後、培地を捨て、プロテアーゼ阻害物質を添加したPBS中に細胞を回収した。細胞を針粉砕法で破砕した。次いで細胞溶解液をMagnaBindストレプトアビジンコートビーズと、メーカーのプロトコールに従って、インキュベートした。要するに、回転ディスクを使用して細胞溶解液をビーズと60分間、室温でインキュベートした。未結合物質を回収し、ビーズはPBSで洗ってから、SDS試料バッファーにまたはPBSに、再懸濁させた。タンパク質をSDSPAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写させ、抗FlagAbまたは抗RLucAbで分析し、また結合抗体を改良化学発光システムで検出した。ビーズに結合したhRLucの活性はPromegaのRenillaLuciferaseAssaySystemを使用して、メーカーのプロトコールに従って測定した。結果生細胞で発現するタンパク質の捕捉は様々な分析法技術によるタンパク質分析を可能にする。多数の捕捉手段が利用可能であるが、ほとんどの手段は非常に特異的な抗体の生成または関心タンパク質と特異標識ペプチドタンパク質との遺伝子的な融合を必要とする。しかし、そうした標識は生細胞の画像化では用途が限られる。DhaH272FおよびDhaH272Fと融合した機能性タンパク質の捕捉にはSAコートビーズが使用された。ビオチンC10H21NO2ClはDhaAWTにより効率的に加水分解され、またinvitroまたはinvivoでDhaH272FおよびDhaH272F融合タンパク質に共有結合した。そのうえ、結合はEcoli細胞、哺乳動物細胞のどちらでも観測された。対照実験では、CHOK1細胞で発現したDhaH272FFlagタンパク質の約80は60分処理後に標識された。DhaH272FFlagを一時的に発現するCHOK1細胞をビオチンC10H21NO2Clで処理した。ビオチンC10H21NO2Cl処理細胞を溶解し、細胞溶解液SAコートビーズインキュベートした。DhaH272Fのビーズとの結合をウェスタンブロット法により、抗FlagR抗体を使用して分析した。図30Dに示すように、ビオチンC10H21NO2Cl処理を欠くとDhaH272FFlagの捕捉は検出されなかった。と同時に、ビオチンC10H21NO2Cl処理した細胞では、発現したDhaH272FFlagの50余りがSAコートビーズ表面に捕捉された。DhaH272FFlagと融合した機能性タンパク質の捕捉を示すために、hRLucコネクターDhaAH272FFlagをコードするベクターで細胞をトランスフェクトし、またビーズ表面に捕捉されたルシフェラーゼ活性を測定した。図30Cに示すように、ビオチンC10H21NO2Cl処理細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面では、かなりのルシフェラーゼ活性が検出された。と同時に、ビオチンC10H21NO2Cl処理をしない細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面では、ルシフェラーゼ活性が検出されなかった。さらに、遊離のビオチンC10H21NO2Clを洗い流さないときは、ビオチンC10H21NO2Cl処理細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面でもhRLuc活性が検出されなかった。総合すれば、DhaH272FFlagと融合した機能性タンパク質がビオチンC10H21NO2ClとSAコートビーズを使用して効率的に捕捉しうることをこれらのデータは示す。この捕捉はビオチン依存的であり、過剰量のビオチンC10H21NO2Clによって競合阻害することができる。hRLuc活性へのビーズの相当な阻害効果が観測されたので、SDSPAGEと抗RLuc抗体によるウェスタンブロット分析とを使用して、hRLucコネクターDhaAH272FFlag融合タンパク質の捕捉効率を推計した。図30Dに示すように、hRLucコネクターDhaAH272FFlag融合タンパク質の50あまりをビオチン依存的に捕捉することができた。これはDhaAH272FFlagの捕捉効率とも十分に一致する。実施例X共有結合形成速度を増したDhaA変異体DhaA触媒塩基His272のフェニルアラニン残基による置換はAsp求核剤に対して適合性があり、DhaAH272Fと命名した組み換えタンパク質を結果したが、これは相当量の共有結合アルキル酵素中間体を蓄積する。水を活性化するHis残基が存在しないと、共有結合エステル中間体のトラッピングが可能になる。こうした変異体の基質結合前および基質結合後の構造モデルを示すと、それぞれ図2E、2Fのようになる。さらに、求核残基Asp106のシステイン置換を含むDhaA変異体もまた、共有結合中間体をトラップすることができる。この変異体は求核剤チオレートの作用によりハライド基を置換する。それによって得られるチオエーテル結合は、水活性化H272残基の存在下でも、加水分解に対して安定である。タンパク質とハロアルカンリガンドの間に安定した共有結合を形成する能力は、哺乳動物細胞中のタンパク質を部位特異的に標識し、局在化し、固定化しおよびまたは蛍光的に可視化することができる汎用レポーター技術を提供する。一実施例では、デハロゲナーゼの活性部位変体がそうした変異体との融合タンパク質を安定した共有結合を介して合成ハロアルカン標識基質へと係留する。DhaAH272FおよびDhaAD106Cの反応速度を上げるために、タンパク質リガンド複合体のモデリングにより、DhaAと基質の間の有利な相互作用を特定し共有結合形成速度を最適化するように努めた。材料と方法細胞株、増殖条件およびプラスミドEcoli株DH10B7697galUgalKrpsLnupGおよびJM109recA1endA1gyrA96thilhsdR17supE44relA1ΔFtraD36proABlacIqZΔM15を、遺伝子発現およびライブラリースクリーニング用の宿主として使用した。Ecoliは定法によりLuriaBertani培地またはTerrificBroth培地で増殖させた。培地には必要に応じてDifco寒天を15加えた。組み換えプラスミドを選択する培地にはアンピシリンを添加した。GSTのDhaAH272FおよびDhaAD106Cとの融合体をそれぞれ含むEcoli発現プラスミドpGEX5X3DhaAH272FFLAGおよびpGEX5X3DhaAD106CFLAGを変異誘発用の出発鋳型として使用した。哺乳動物細胞でのDhaA変異体の発現および標識の検査には発現ベクターpCINeoを使用した。試薬と化学物質化学物質はすべてSigmaAldrichから購入した。酵素は特に断らない限りすべてPromegaに由来した。変異誘発およびPCRプライマーはPromegaCorp、SeqWrightおよびIntegratedDNATechnologiesが合成した。DhaAの変異誘発はQuikChangeMultiキットを使用して行った。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl、カルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl、ジアセチルカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl、およびビオチンを含むクロロアルカンリガンドはPromegaBiosciencesIncが合成した。DNA分析とタンパク質モデリングDNA分析はVectorNTIソフトウェアパッケージversion8を使用して行った。タンパク質の構造情報はProteinDataBankより入手した。構造分析およびモデリングはBiopolymer、Discover、Homology、Modelerの各モジュールを含めたInsightII20001を使用して行った。変異誘発とライブラリー構築組み換えDNA作業はSambrooketal2001で開示されているような標準プロトコールを使用して行った。変異誘発の前に、次のオリゴヌクレオチドを使用してDhaA鋳型の配列を確認した。DhaAH272FまたはDhaAD106C残基175、175および273のsitesaturation変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドの配列を次に示す下線で強調したヌクレオチドは変異コドンの位置を示す。部位特異的変異誘発はQuikChangeMultiキットを使用しメーカーの説明書に従って行った。コンピテントEcoli細胞に変異誘発反応系を導入し、形質変換体をAmp添加LB寒天培地上で選択した。ライブラリー品質を、各ライブリーから無作為抽出した12~48クローンのDNA配列分析によって評価した。配列分析用プラスミドはEcoliから、WizardSVMiniprepKitsを使用して分離した。DNA配列分析はSeqWrightDNATechnologyServicesが行った。175、176および175176ライブラリーを分析するための配列分析用プライマーは次のものを含んだ。スクリーニングアッセイ開発DhaA基質への結合のinvivo検出DhaAH272FまたはDhaAD106Cコード化プラスミドを入れたEcoliのコロニーを200μlLB100μgmlAmpに植菌し、平底96ウェルプレートに入れ、37°Cで終夜培養した。終夜培養液を200μlLBで20倍希釈し、30°Cで終夜培養した。invivo標識に使用した細胞の体積を増殖に対して正規化した。50~100μlの発現誘導細胞をU底96ウェルプレートに移し、ペレット化し、50μlPBS15μMカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clで再懸濁し、室温で60分間、回転振とう機にかけて標識した。未結合リガンドを除去するために2500rpmで5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を捨て、細胞を100μlの10mMTrisHClpH75、09NaClおよび005Tritonで再懸濁して、15分間洗浄した。この洗浄手順は3回繰り返した。蛍光強度をTecanSafireプレートリーダーにより次のパラメーターを使用して測定した励起545nm発光575nm。DhaA変異体の蛍光強度をDha、DhaAH272FおよびDhaAD106Cの各対照細胞と比較した。固定化DhaAの使用による基質捕捉精製DhaAH272FおよびDhaAD106C変異タンパク質FastBreak登録商標細胞溶解試薬を使用して得られたEcoli細胞溶解液から精製、50ngを、抗FlagM2IgGコート済み96ウェルのマイクロタイタープレートに固定化した。コーティングは100μlの抗Flag01MNaHCO3を使用して4°Cで終夜行った。翌日、プレートを空にし、300μlのPBSにより25°Cで1時間ブロッキング処理した。プレートを空にし、01Tween20添加PBSで4回洗浄し、ビオチン化基質を、100μlのPBS005Tween2005BSAを入れたウェルに加え、25°Cで種々の時間にわたりインキュベートした。プレートを空にし、PBSTで4回洗浄することにより、固定化DhaAと基質の反応を停止させた。次いで、100μlのストレプトアビジンHRPをウェルに加え、25°Cで1時間インキュベートした。プレートを空にし、PBSTで8回洗浄し、TMBを100μl加えた。15分後、等量の02MH2SO4を加えて発色を停止させ、450nmでの吸光度を測定してシグナルを定量化した。MagneGST登録商標常磁性体粒子の使用によるタンパク質捕捉細菌コロニーを掻き取ってLBAmp入り96ウェルプレートに入れ、30°Cで振とう培養した。培養液を20倍希釈で、新鮮TB培地、Ampおよび01mMIPTGを入れた96ウェルプレートに加えた。プレートを30°Cで終夜振とう培養した。このIPTG発現誘導培養液を含む96ウェルプレートを遠心し、上清を捨てた。MagneGST登録商標PMPs表面のタンパク質捕捉を飽和させることにより、DhaA変異体をタンパク質濃度について正規化した。MagneGST登録商標細胞溶解試薬、MagneGST登録商標PMPsおよびカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clを含むカクテルを、細胞ペレットを入れた96ウェルプレートに分注した。プレートを室温、約900rpmで10分間振とうした。粒子をMagnaBlot登録商標96磁性体粒子分離装置によりPBSTで3回洗浄した。洗浄液を捨て、MagneGST登録商標溶離液を加え、プレートを室温で振とうさせた。上清を新しい平底の透明96ウェルプレートに移し、550nmの励起波長と580nmの発光波長を使用して蛍光強度を測定した。自動ライブラリースクリーニング特注のTecanFreedomロボットワークステーションを使用してMagneGST登録商標系アッセイにより、DhaA変異体ライブラリーをスクリーニングした。アッセイのパラメーター設定はFACTSスケジュール管理ソフトを使用して自動化して、複数の96ウェルプレートの並行処理を可能にした。細胞ペレットは、プレートが次の処理のために自動的に回収されるときまで、保冷Storexインキュベーターに保存した。試薬類をTeMo液体ハンドリングシステムでプレートに分注した。TecanTeShake登録商標を使用してプレートを室温、約900rpmで10分間振とうした。TeMo液体分注システムとの併用やFACTSスケジュール管理ソフトにも対応する改造したMagnaBlot登録商標96磁性体粒子分離装置により粒子をPBSTで洗浄した。蛍光強度の測定にはTecanSafire蛍光光度計を使用した。生の蛍光強度データは分析のためにExcelスプレッドシートに取り込んだ。改良DhaAクローンの存在の可能性を示唆する親対照より高強度のウェルについて、スクリーニングデータを詳しく調べた。2次ライブラリースクリーニング1次スクリーニング後、親クローンと比べて少なくとも20の改良を示すすべてのクローンをAmp添加LB平板培地に画線塗抹した。各確認済みヒットの4コロニーを無作為に、200μlLBAmpに植菌し、平底96ウェルプレートで終夜30°C培養した。終夜培養液を200μlTBアンピシリンで50倍希釈し、30°Cと37°Cで終夜培養した。発現誘導培養液をMagneGST登録商標系スクリーンにより再アッセイした。改良クローンをすべて配列分析し、保存した。QiagenMiniPrepキットにより配列分析用プラスミドDNAを合成した。すべての改良クローンにつき2mlの培養液を1DMSOの存在下、70°Cで保存した。DhaAタンパク質精製MagneGST登録商標タンパク質精製システムを用いてタンパク質の小規模精製を行った。タンパク質精製では、コロニーを1mlLB100μgmlAmpに植菌し、30°Cで終夜培養した。終夜培養液を10ml新鮮LBμで50倍希釈し、A60006まで培養し、そこで01mMIPTGを加えて発現誘導し、25°Cで終夜培養した。発現誘導した培養液の細胞ペレットを75°Cで15分間凍結させた。細胞溶解液を得るため、ペレットを1Xプロテアーゼ阻害物質カクテルの存在下に2mlの溶解バッファーに再懸濁し、回転振とう機上で30分間インキュベートした。MagneGST粒子は使用前に、25スラリー4mlをMagneGST結合洗浄バッファーで3回平衡化した。最終洗浄後、該粒子を1X容量の結合洗浄バッファー中に再懸濁させた。該粒子を細胞溶解液に直接加え、混合物を回転振とう機上、室温で30分間インキュベートし、GSTDhaA融合タンパク質を該磁性体粒子に結合させた。粒子を25X容量の結合洗浄バッファー1mMDTTで3回洗浄した後、GSTDhaA融合タンパク質を溶離バッファーと15分間インキュベートして溶出した。溶出タンパク質を保存用バッファーに対して2回透析した。DhaA融合タンパク質の大規模精製はGlutathioneSepharose4FastFlowレジンを使用して行った。要するに、500ml発現誘導細胞培養液に由来するペレットを1mMDTT添加1Xリン酸緩衝生理食塩水20mlに再懸濁させた。リゾチーム添加後、混合物を4°Cで30分間インキュベートさせた。プロテアーゼ阻害物質PMSFを加えて終濃度を2mMとしてから、超音波破砕を行った。清澄化した溶解液をレジンに添加し、撹拌しながら2時間~終夜、4°Cでインキュベートした。バッファーAによる2回の40mlバッチ洗浄の後、レジンをWizardMaxiカラムに添加した。カラム内容物を03MNaCl添加10mlバッファーAにより2回洗浄した。融合タンパク質は20mMグルタチオン添加バッファーAの2ml画分に溶出した。含タンパク質画分を、20グリセロールを含む1LのバッファーAで2回透析した。精製DhaA変異体のinvitro標識DhaA変異体への蛍光基質の共有結合係留は蛍光イメージゲル分析により検出した。GSTDhaA変異体を50mMTrisHCl中、カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl、カルボキシフルオレセインC10H21NO2ClまたはローダミングリーンC10H21NO2Clと種々の濃度、温度でインキュベートした。基質の添加により反応を開始させ、また経時変化実験のために18μl分量の反応液を、6μlSDSゲルローディングバッファーを入れた試験管に移し、5分間煮沸し、プレキャストの4~20グラジエントSDSPAGEで分離した。HitachiFMBioIIを使用してゲルを蛍光画像化し、バンドを濃度測定法またはImageQuantを使用して定量した。次の2次反応速度式から反応速度定数を計算したktlnA0B0式中k反応速度定数B0時間0における反応物BmolLA0時間0における反応物AmolLB0x時間tにおける反応物BmolLA0時間tにおける反応物AmolL。lnA0B0と時間の関係を表すグラフは直線となるはずであり、kはその直線の傾きkによって決まる。蛍光偏光法蛍光偏光法によりDhaA変異体の反応速度を分析した。測定はBeacon2000で、またはUltraプレートリーダーを使用して96ウェルフォーマットで、行った。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClまたはカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質を過剰量の精製GSTDhaAタンパク質とインキュベートした。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識研究では、使用タンパク質は次の濃度とした親タンパク質15μM第1世代DhaA変異体15~015μM第2世代DhaA変異体0035μM。カルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl標識研究では、使用タンパク質は次の濃度とした親タンパク質15μM第1世代クローン15~015μM第2世代クローン015μM。反応はタンパク質を基質に添加して開始させた。蛍光偏光および蛍光強度の測定は10~30秒刻みで05~12時間にわたって行った。速度定数は2次反応速度式を使用して計算した。熱安定性の分析DhaAの熱安定性を、精製タンパク質の4、22、30、37、42、50または60°Cで15、30または60分放置後の残留活性を測定して、評価した。FPアッセイは室温で行った。これらの研究では、15μMの親クローンまたは15~015μMの第1世代クローンをカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clで標識し、また015μMの第2世代クローンをカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clで標識した。各クローンにつき、各条件での標識速度を計算した。4°Cで15分放置後に観測された速度を便宜的に100活性とした。各条件での残留活性を計算した。安定性の評価では、放置時間ごとに残留活性を放置温度と対応させてプロットした。半減期の計算では、放置温度ごとに残留活性を放置時間と対応させてプロットした。このグラフから、50活性が失われた時間を外挿した。固定化DhaAの使用によるクロロアルキル化分子の捕捉抗FlagM2IgGをコートしたマイクロタイタープレートを使用して、変異DhaAを前記の要領で固定化した。変動濃度のクロロアルカンを関心モデル分子と溶液中、25°Cでインキュベートした。ビオチン化クロロアルカンの場合には、関心分子はSAHRPであった。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clの場合には、関心分子は抗TMRIgGであった。クロロアルキル化反応を1時間進行させ、次いで反応液を、固定化DhaAを含む洗浄済みプレートに加えた。これらのインキュベーションを25°Cで1~2時間続けてから、プレートを空にしPBSTで4回洗浄することにより停止した。SAHRP反応では、プレートにTMBを100μl加えた。発色を15分間持続させ、次いで等容量の02MH2SO4を加えて発色を止めた。450nmでの吸光度を測定してシグナルを定量した。カルボキシテトラメチルローダミン反応では、2次抗ウサギIgGHRP結合体を使用して結合済み抗カルボキシテトラメチルローダミンIgGを検出した。プレートをPBSTで8回洗浄し、TMBで発色させ、前述の要領で定量した。固定化クロロアルカン基質の使用によるDhaAの捕捉ストレプトアビジン高結合能コート96ウェルマイクロタイタープレートを使用して、ビオチン化クロロアルカン基質、ビオチン14Cl、ビオチンX14ClおよびビオチンPEG414Clを固定化した。過剰量の基質を使用すると、プレートにはウェルあたり約75pmolのビオチンを結合させることができた。100μlのPBS005Tween2005BSAを含むバッファー中で基質を25°Cで1時間固定化した後、プレートを空にし、01Tween20添加PBSで4回洗浄した。固定化基質と変異DhaAの反応は精製GSTDhaAFlag融合体を使用して行った。種々の濃度のタンパク質を固定化基質と25°Cで、種々の時間にわたりインキュベートした後、プレートを空にし、PBSTで4回洗浄して反応を止めた。結合済みDhaAを検出するために、100μlの抗GSTHRPを各ウェルに加え、プレートを25°Cで1時間放置した。プレートを空にし、PBSTで8回洗浄し、次いでTMBを100μl加えた。15分後、等容量の02MH2SO4を加えて発色を止め、450nmでの吸光度を測定してシグナルを定量した。哺乳動物細胞中のDhaA変異体の特性解析配列確認済みの精選DhaA変異体を哺乳動物発現ベクターpCIneoに、次の要領でクローニングした変異体遺伝子のDhaAFLAG部分をpGEX5X3からSalIおよびNotI制限酵素で除去し、断片を1アガロース電気泳動で分離し、切り出し、QIAquickGelExtractionKitを使用して精製した。pCIneoベクターバックボーンもまた同様に、SalIとNotIで消化し、断片を分離し、精製した。ライゲーションはインサートベクター近似比51で、PromegaのLigaFastSystemを使用して行った。DNAを化学的にコンピテントにしたJM109細胞に導入し、Amp添加LB寒天平板で培養した。形質転換体コロニーを掻き取って、1mlのLBAmpを含む96ウェルアッセイブロックに植菌し、終夜37°Cで振とうした。細胞を回収し、Wizard96プラスミド精製キットによりプラスミドを精製した。プラスミドをSalINotI酵素で消化し、DhaAインサートの有無を1アガロース電気泳動で検査した。陽性クローンをDNA配列分析法で確認した。哺乳動物細胞でのタンパク質産生と融合タンパク質の生成を促進するためにプラスミドpHT2を作製した。オリゴヌクレオチドを使用して、DhaAH272FYLFLAGを含むpCIneoからDhaAH272FYLを増幅した。PCR産物と目的ベクターの両方をEcoRVNotIで切断し、ゲル精製し、ライゲートして、JM109に導入した。pHT2によってコードされるDhaAタンパク質はDhaAH272FYLのアミノ酸配列に対する追加の変異を含んだ。追加の変異はH272F、K175M、C176GおよびY273L置換に加えて、1改良Kozak配列を生成させるための位置2へのグリシンの挿入2SmaIXmaIAvaI部位を生成させるためのAla292Gly置換およびNaeI部位を生成させるためのC末端へのアラニンとグリシンの挿入を含んだ。哺乳動物細胞の培養CHOK1細胞またはHeLa細胞を、Ham’sF12栄養素またはDulbecco’s改良最小必須培地それぞれ10ウシ胎児血清、100Umlペニシリンおよび100mgmlストレプトマイシンを添加により95空気5CO2雰囲気下、37°Cで培養した。哺乳動物細胞のトランスフェクション種々のタンパク質の一時的発現を調べるために、細胞を24ウェルプレートまたは8ウェルLTチャンバースライドに30000細胞cm2の密度でまいた。約8090コンフルエンシーで、細胞をリポフェクタミンDNA抗生物質無添加培地の混合体と、メーカーの説明書に従って、接触させた。翌日培地を新鮮培地と交換して、細胞を種々の期間にわたり増殖させた。CelltoGel分析CHOK1細胞を24ウェルプレートにまき、pCIneoCMVDhaA変異体Flagベクターでトランスフェクトした。24時間後、培地を、02~250μMのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClまたはDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clを含む新鮮培地に交換し、細胞をCO2インキュベーター中に1、5、15または60分間置いた。このインキュベーション終了後、培地を捨て、細胞を素早くPBSで洗い、細胞を試料バッファー中で可溶化した。SDSPAGEでタンパク質を分離し、タンパク質へのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clの結合を蛍光イメージャーにより、540575nmに等しいEexEemで検出した。細胞画像化HeLa細胞を8ウェルLTチャンバースライドにまき、pCIneoCMVDhaA変異体またはβアレスチン2コネクターDhaAH11YLベクターでトランスフェクトした。24時間後、培地を、種々の濃度のカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClまたはDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clを含む新鮮培地に交換し、細胞をCO2インキュベーター中に15分間置いた。このインキュベーション終了後、培地を捨て、細胞を素早くPBSで洗った。生細胞の画像化実験のために、新しい培地を細胞に加えた。細胞をCO2インキュベーターに戻し、60分後に培地を新鮮培地と交換した。細胞の蛍光画像を、カルボキシフルオレセインおよびカルボキシテトラメチルローダミンに対応するフィルターセットを備えた共焦点顕微鏡FluorView500で撮影した。細胞を固定化するために、37パラホルムアルデヒド01TritonX100添加PBS溶液200mlを細胞に加えた。室温で15分後、細胞を10TritonX100添加PBSで洗浄した。界面活性剤溶液をPBSに交換し、細胞画像を共焦点顕微鏡FluorView500で撮影した。実験によっては、細胞を100nMのMitoTrackerRGreenFMまたはMitoTrackerROrangeCMTMRosにより、15分間、37°Cで対比染色した。DhaA融合体の生産βアレスチン2コネクターHT2融合体カセットを、pHT2ベクターのNheIBamHI制限部位にβアレスチン2をサブクローニングすることにより、構築した。コネクターとBamHI部位とをコードする配列をβアレスチン2コード領域の3末端に付加し、またβアレスチン2コネクターDhaAH272F鋳型から該断片を増幅するために、2つのプライマーを設計した。phRLucコネクターDhaAH272FFlagをコードするベクター中のDhaAH272Fコード領域をHT2コード領域に置換することでphRLucコネクターHT2Flag融合体カセットを構築した。HT2コード領域の5末端にXbaI部位を、3末端にAgeI部位をそれぞれ付加し、またpHT2鋳型から925bp断片を増幅するために、2つのプライマーを設計した。DhaAH272Fコード領域をXbaI、AgeI制限酵素で切断し、次いでHT2をコードする925bp断片をphRLucコネクターDhaAH272FFlagコード化ベクターのXbaI、AgeI部位に挿入した。融合体コンストラクトの配列はDNA配列分析法で確認した。生きた哺乳動物細胞で発現したRenillaルシフェラーゼHT2Flag融合タンパク質CHOK1細胞を24ウェルプレートにまき、pCIneohRLucコネクターHT2Flagベクターでトランスフェクトした。24時間後、培地を、25μMのビオチンX14Clと01DMSOまたは01DMSOだけを含む新鮮培地に交換し、細胞をCO2インキュベーター中に60分間置いた。インキュベーション終了後、培地を捨て、細胞を素早くPBSで洗ってから、新しい培地を細胞に加えた。実験によっては培地を交換しなかった。細胞をCO2インキュベーターに戻した。60分後、培地を捨て、プロテアーゼ阻害物質を添加したPBS中に細胞を回収した。細胞を針粉砕法で溶解した。次いで細胞溶解液をStreptavidinMagnasphereParamagneticParticlesと、メーカーのプロトコールに従って、インキュベートした。要するに、回転ディスクを使用して細胞溶解液をビーズと60分間、RTでインキュベートした。未結合物質を回収し、ビーズは05TritonX100添加PBSで洗ってから、SDS試料バッファーにまたはPBSに、再懸濁させた。タンパク質をSDSPAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写させ、抗FlagAbで分析し、また結合抗体を改良化学発光システムで検出した。ビーズに結合したhRLucの活性はPromegaのRenillaLuciferaseAssaySystemを使用して、メーカーのプロトコールに従って測定した。結果DhaAH272Fの構造モデルの生成InsightIIModelerを使用してDhaAH272Fの構造モデルを構築した。モデル計算用の参照構造は1BN6pdbであった。5つの高最適化モデルを計算し、全体としての最低エネルギーおよび最低構造パラメーター違反を基に1つの最良モデルを選択した。次に、最良モデルを参照構造1BN6pdbと構造アラインメントして、アラインメントさせたCα原子の平均原子間距離で表わされる全体およびペア間の差の指標を求めた。基質ポケットの同定基質存在下のDhaAの構造はすでに発表されており、触媒3点セット近傍に埋め込み型の活性部位ポケットを示す。しかし、該活性部位ポケットに基質が進入する方向は示していない。基質ポケットが存在しそうな位置は異種基質と複合体を形成した関連ハロアルカンデハロゲナーゼの構造分析により特定された。これらの複合体では、いずれの基質もリガンドポケット全体を満たすわけではないが、それらの基質はやや異なる位置に存在するものの、総合すれば、基質ポケットの全般的な位置を推定することが可能であると構造重ね合わせにより判明した。次いで無基質のDhaA構造の重ね合わせにより、DhaAH272Fで、対応するポケット位置の特定が可能となった。DhaA基質モデルの生成基質を共有結合させたDhaAH272Fの構造モデルを生成させた。まず、カルボキシフルオレセインC10H21NO2ClをDhaAH272Fの基質ポケットに手操作でドッキングさせた。次に、DhaAの求核性アスパラギン酸のカルボキシル酸素の1つとCl除去後に利用可能になる末端Cとの間に共有結合を形成させた。この共有結合の長さは約3Åに抑えて、遷移状態に近似させるようにした。共有結合させた基質はエネルギー極小化を別個に、次いで基質近傍のDhaAH272F残基と共に、行った。エネルギー極小化はDiscover3により、CFF91力場を用いて行った。変異誘発用残基の同定残基の番号付けはDhaAの1次配列に基づいており、公表結晶構造の番号付けとは異なる。DhaA基質モデルを使用して、結合基質の3Åおよび5Å以内のデハロゲナーゼの残基を同定した。これらの残基は変異誘発用の第1標的候補であった。このリストから、置換されたときに立体障害または不都合な相互作用をなくすまたは好都合な電荷、極性または他の相互作用を導入する見込みのある残基を選んだ。たとえば位置175のLys残基は基質ポケット入口のDhaA表面に存在するこの大きな荷電側鎖を除去すればポケットへの基質の進入が容易になるかもしれない。位置176のCys残基は基質ポケットの内側を覆っており、そのかさ高な側鎖はポケットを狭窄させているこの側鎖を除去すればポケットが広がり、基質が進入し易くなるかもしれない。位置245のVal残基は基質ポケットの内側を覆っており、また結合基質の2つの酸素に近接しているこの残基をトレオニンで置換すれば、水素結合の機会が増え、基質の結合を容易にするかもしない。最後に、Bosmaetalはアミノ酸置換Tyr273Pheのある触媒活性DhaA変異体の単離を報告している。この変異はCys176Tyr置換と再結合させると、123トリクロロプロパンの脱ハロゲン効率が野生型デハロゲナーゼと比べて8倍近く高い酵素をもたらした。これらの構造分析に基づき、部位特異的V245T変異を生成させたうえに、位置175、176および273のコドンをランダム化した。得られた変異体をスクリーニングして、蛍光およびビオチン結合DhaA基質との共有結合形成速度の改善の有無を調べた。ライブラリーの生成とスクリーニング諸々のライブラリーおよび変異体構築の出発物は、DhaAH272FおよびDhaAD106Cをコードする遺伝子を収めたpGEX5X3系プラスミドであった。これらのプラスミドは、ハロアルカンリガンドと安定共有結合を形成しうる親DhaA変異体をコードする遺伝子を入れてある。NNKsitesaturation変異誘発法を使用してDhaAH272FおよびDhaAD106C鋳型の位置の175、176および273のコドンをランダム化した。これらの位置のシングル部位ライブラリーに加えて、複合175176NNKライブラリーもまた構築した。しかし、これらのライブラリーに由来するランダムクローンの配列分析から、無変異の野生型配列をもつクローンが高頻度で存在することが判明した。鋳型濃度の変更およびDpnI処理の回数と時間の拡大によるQuickChangeMultiプロトコールのトラブルシューティングも、こうした頻度にはあまり効果がなかった。そこで、各ライブラリーからのスクリーニング対象クローン数の決定ではライブラリーの野生型配列汚染率を勘案した。たとえば、あるシングル部位NNKライブラリーは20種類すべてのアミノ酸をコードするコドン多様性が32であり、可能な配列変異の99をカバーするにはライブリーの約5倍のオーバーサンプリングが必要である。このオーバーサンプリングは少なくとも160個体のクローンをスクリーニングする必要があることを意味する。しかし、これらのライブラリーは野生型配列により著しく汚染されていたため、一般にシングル部位ライブラリーから約400クローンを調べた。複合175176NNKライブリーは400種類のアミノ酸をコードする理論コドン多様性が1024である。各ダブル部位に由来する約3000~4000クローンを調べた。従って、都合約10000クローンを選び出してスクリーニングしたことになる。DhaA変異体ライブラリーの1次スクリーニングツールとして3つのアッセイ法を評価した。第1のinvivo標識アッセイ法は、Ecoli中の改良DhaA変異体は優れた標識特性を有するであろうとの前提に立つ。優秀なクローンではカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clによる短時間の標識と細胞洗浄の後、575nmでの蛍光強度が増しているはずである。図31Aは、96ウェルプレートただ1枚のDhaAH272F175176ライブラリーのスクリーニングで、いくつかの潜在的な改良を首尾よく特定したことを示す。4個のクローンで親クローンの2倍の蛍光強度が検出された。しかし、このアッセイ法は潜在的有用性にもかかわらず、1次スクリーンとして採らなかった。自動化に難があり、また活性DhaA変異体が過剰発現しただけで偽陽性を生じさせるためである。1次スクリーンとして検討した第2のアッセイ法は、96ウェルプレートに固定化した抗FLAG抗体表面に飽和量のDhaA変異体を捕捉することにより、タンパク質濃度を効果的に正規化するinvitroアッセイ法であった。図31Bはこのアッセイ方法を使用して、プレート1枚のDhaAH272F175176複合ライブラリーから得たスクリーニング結果を示す。このアッセイ法もまた、invivo法と同様に、大きな親活性バックグラウンドから潜在的な改良DhaA変異体を明確に同定することができた。数クローンは親DhaAH272Fよりも最高4倍も強いシグナルを生成した。しかし、このアッセイ法は試薬代、アッセイ準備時間、多重インキュベーション洗浄ステップの自動化などの点で、費用がかかった。加えて、このアッセイ法では、以前に優秀として単離、評価された若干の変異体が捕捉できなかった。1次DhaAスクリーンとして最終的に採択されたのはMagneGST登録商標タンパク質精製レジンを使用するアッセイ法であった。このinvitroスクリーニングアッセイ法の概要は図32に示す。要するに、96ウェルプレートで増殖させた培養物に由来する細胞ペレットを、溶解バッファーと標識試薬とMagneGSTレジンとを含む試薬カクテルに再懸濁させた。これは細胞溶解、標識、タンパク質捕捉を単一ステップに集約するものであり、アッセイ法を著しく簡素化した。レジンを振とうさせながら短時間のインキュベーションを行いその間にタンパク質を磁気的に捕捉した後、ウェルを洗浄してから標識DhaA変異体を溶出させた。溶出液を対象に580nmでの蛍光強度を求めた。この簡素化スクリーニングアッセイ法は、96ウェルプレート約20枚を65時間で検査する自動Tecanロボットプラットフォームに容易に適合させることができた。MagneGST登録商標系の自動アッセイ法を使用してDhaA変異タンパク質ライブラリーをスクリーニングした。DhaAH272F系およびDhaAD106C系の175シングル部位ライブラリーのスクリーニングでは、親クローンを有意にしのぐヒットが見付からなかった。図33ABはそれぞれ176シングル部位ライブラリーと175176複合ライブラリーの代表的なスクリーニング結果である。親クローンをしのぐ標識特性を示す数個のクローンが特定された。図34はDhaAH272FY273NNKライブラリーの2つの代表的なスクリーニングプレートを示す。標識特性の有意の改善を示す3個のクローンが、DhaAH272F親クローンを含むバックグラウンドから明確に識別可能である。スクリーニング対象ライブラリーでは、DhaAH272F親クローンよりも50以上高活性のクローンの全ヒット率は1~3であった。DhaAD106Cライブラリーでも同様のスクリーニング結果が得られた。最初の1次スクリーンで同定されたヒットをマスタープレートに移し、養生し、再増殖させ、MagneGST登録商標アセッイ法で再スクリーニングした。対照親クローンの2倍以上のシグナルを示すDhaA変異体だけを選んで配列分析に回した。DhaAヒットの配列分析図35AはDhaAH272Fライブラリーのスクリーニングで絞られたDhaA変異体のコドンを示す。この分析で7つのシングル176アミノ酸置換が判明した。興味深いことに、3種のSerコドンが分離された。位置175および176では多数のダブルアミノ酸置換も同定された。これらのダブル変異体では、位置175で7種のアミノ酸が見付かったが、位置176で見付かったのは3種のアミノ酸にすぎない。分析対象には、ライブラリー品質評価時に同定されたシングルK175M変異を含めた。さらに、標識特性に優れたいくつかのシングルY273置換もまた同定された。図35BはDhaAD106Cライブラリーで同定されたDhaA変異体の変異コドンを示す。シングルC176G変異を除いて、同定されたクローンはほとんどがダブル175176変異を含んでいた。位置175では合計11種のアミノ酸が同定された。一方、位置176では3種のアミノ酸が同定されただけであり、そのうちGlyはD176ダブル変異体のほぼ34で出現している。DhaA変異体の特性解析スクリーニングにより同定された数種のDhaAH272F系およびDhaAD106C系の変異体はMagneGSTアッセイで親クローンよりも有意に高いシグナルを生成した。図36AによればDhaAH272F系変異体のA7とH11、それにDhaAD106C系変異体のD9がカルボキシテトラメルチローダミンC10H21NO2Clでは親クローンを大幅にしのぐ高いシグナルを生成している。加えて、位置273で同定されたDhaAH272F系変異体はみな、ビオチンPEG414Clでは、親クローンに比べて有意に改善しているように見受けられる。これらの分析結果は、SDSPAGE蛍光画像ゲル分析によるタンパク質標識研究結果とも合致した。同定されたDhaAH272F系の最良変異の組み合わせが相加的であるか否かを判定するために、残基273の3変異をDhaAH272F系A7およびH11変異と組み換えてみた。これらの組み換えタンパク質変異体は、第1ラウンドのスクリーニングで同定された変異体と区別するために、第2世代DhaA変異体と呼ぶ。比較反応速度論研究を容易にするために、いくかつの改良DhaA変異体を選んで、GlutathioneSepharose4Bレジンにより精製した。一般に、DhaAH272F系およびDhaAD106C系の融合体のEcoliでの産生はロバストであった。ただし、アミノ酸シングル変異がDhaA産生に負の影響を及ぼしている可能性もある。こうしたタンパク質産生の変動の結果として、DhaA変異体の全般的な収量もまた大幅に変動した。いくつかのDhaA272F系変異体を使用して予備的な速度論的標識研究を行った。図37Aによれば、分析用に選び出した変異体の標識速度は総じて親H272Fをしぐ。実際、経時変化を詳しく調べると、第1世代変異体YLや2つの第2世代変異体A7YM、H11YLを含めたいくつかのDhaA変異体の標識は2分時点までに完了している模様であった。もっと広範囲の経時分析を、DhaA272FA7と2つの第2世代DhaA変異体A7YM、H11YLを対象に行った。図37Bから明らかなように、第2世代クローンの標識反応は第1時点までにほぼ完了している。他方、A7変異体は最終時点でやっと完了に近づいている模様である。ゲル上の蛍光バンドを定量したが、相対的な生成物形成速度を図37Cに示す。標識速度を求めるために、H11YLの濃度を50ngから10ngに下げ、もっと精密な経時分析を行った。図38Aに示す結果によれば、これらの標識条件の下では線形初期速度を測定することができた。蛍光画像化ゲルデータの定量により、2次速度定数の計算が可能となった。観測された傾きに基づくと、DhaA272FH11YLのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識に関する2次速度定数は50×105M1sec1であった。蛍光偏光法はタンパク質に結合する小蛍光リガンドの研究にうってつけである。FP法は基質結合体遊離体比の直接的な指標をほぼ瞬時に与えてくれるという点で、分子結合の分析に使用される方法のなかでは特異である。そこで、精製DhaA変異体の蛍光画像ゲル分析の代替法としてFPアッセイ法を開発した。図39AはH272F親クローンのA7およびH11YL変異体に対する相対標識速度を示す。この実験で使用した標識条件の下では、第2世代変異体DhaAH272FH11YLは比較対象のA7およびH272F変異体よりも有意に高速であった。この速度を別の視点から眺めると、A7およびDhaAH272Fタンパク質である程度の速度を実現するためには、それぞれ約40倍および420倍の量が必要であった。図39Bは、カルボキシフルオレセインC10H21NO2Clを使用したFP結果を示す。この実験に使用した標識条件の下では、フルオレセイン系基質を使用すると、H11YL変異体もまたA7および親DhaAH272Fタンパク質よりもずっと高速であることが明らかである。しかし、カルボキシフルオレセインC10H21NO2ClによるH11YLの標識は対応するカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質による標識よりもずっと低速であるように見受けられる。H11YLタンパク質の所要量はカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clとの反応ではカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clとの反応の場合と比べて4倍あまりも多かったが、それでも図39Bで実測された速度は図39Aに示されるカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clとの実測速度を質的に下回るように見受けられる。FPアッセイ法は、その感受性や真の均一性を踏まえて、蛍光標識基質による、精製DhaA変異体の標識特性の解析に使用した。次に、これらの研究に由来するデータを使用して各DhaA変異体基質ペアについて2次速度定数を計算した。これらの研究の結果は図40に示す。研究に使用した2つの親タンパク質DhaAH272FおよびDhaAD106Cはカルボキシテトラメチルローダミン系およびカルボキシフルオレセイン系基質で同等の速度となることが判明した。しかし、どちらの場合にもカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質による標識のほうが低速となった。FP法で特性を解析した第1世代DhaA変異体の標識速度はみな、対応する親タンパク質よりも7~3555倍も高速であった。標識速度に断然最大のインパクトを及ぼしたアミノ酸シングル置換は、DhaAH272F系の273位置での3種の置換であった。にもかかわらず、試験した各第1世代DhaAH272F変異体では、カルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質による標識がいつも低速であった。ほとんどの第2世代DhaAH272F変異体は改良が最も著しい第1世代変異体と比べても有意に高速であった。特にH11YL変異体は基質がカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clだと2次速度定数の計算値がDhaAH272F親を4桁余りも上回った。H11YLの速度定数22×106M1sec1はカルボキシテトラメチルローダミン結合ビオチンストレプトアビジン相互作用に関する速度定数計算値とほぼ同じであった。この値はビオチンストレプトアビジン相互作用に関して表面プラズモン共鳴法で求めた5×106M1sec1という結合速度とも合っている。第2世代変異体のいくつかは、カルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質でも速度が向上したが、前述のように、その速度はいつもカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質の場合を下回った。たとえばDhaAH272FH11YL変異体の、カルボキシフルオレセインC10H21NO2Clによる標識速度はカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clによる標識速度の100分の1以下であった。改良DhaAH272FH11YL変異体の構造分析InsightIIModelerを使用してDhaAH272FとDhaAH272FH11YLの構造モデルを構築した。モデル計算用の参照構造は1BN6pdbであった。DhaAH272FH11YLモデルの計算では、2つの追加関連ハロアルカンデハロゲナーゼの参照構造を含めた。すなわち1CV2pdbと2DHDpdbである。各配列につき5つの高最適化モデルを計算し、全体としての最低エネルギーおよび最低構造パラメーター違反を基に1つの最良モデルを選択した。次に、これらの最良モデルを参照構造1BN6pdbと構造アラインメントして、アラインメントさせたCα原子の平均原子間距離で表わされる全体およびペア間の差の指標を求めた。基質カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clを共有結合させたDhaAH272FとDhaAH272FH11YLの最良構造モデルに共有結合させた。まず、該基質を基質ポケットに手操作でドッキングさせ、次に該タンパク質の求核性アスパラギン酸のカルボキシル酸素の1つとCl除去後に利用可能になる末端Cとの間に共有結合を形成させた。基質のコンフォメーションを、両モデルで可能な限り類似するよう、調節した。次に、DhaAH272FとDhaAH272FH11YLの、基質未結合状態または基質共有結合状態の初期モデルを、エネルギー極小化を図るべく、pH70で水素を添加し、またCFF91力場を用いてポテンシャルを割り当てて作製した。両モデルはDiscover3により、非結合相互作用を使用して、残基間距離または原子間距離を基準にしたカットオフ、距離依存の比誘電率10、および最後の極小化ステップに対応する最終収束001の条件で、エネルギーを極小化した。基質未結合モデルには次の極小化カスケードを使用したa系全体の水素を極力減らし、また他の原子は固定化するb基質の約8Å以内の残基の側鎖を極力減らし、また他の原子は固定化するd基質の約8Å以内の、高調波Cα拘束のある残基を極力減らし、また他の原子は固定化する。基質結合モデルには次の極小化カスケードを使用したa系全体の水素を極力減らし、また他の原子は固定化するb基質を極力減らし、また他の原子は固定化するc基質と基質の約8Å以内の残基の側鎖を極力減らし、また他の原子は固定化するd基質と基質の約8Å以内の、高調波Cα拘束のある残基を極力減らし、また他の原子は固定化する。すべての極小化モデルについて、基質と基質の約8Å以内の残基の間のバンプ検査を行い、立体障害を測定した。基質ポケットの形状と大きさを、プローブ半径をデフォルト値の14Åとし基質の約5Å以内の残基を対象にコノリー面を計算することにより、可視化した。すべてのモデルを構造的に重ね合わせて、特定残基の位置の変化を評価した。関連残基の位置求核性Asp106は、どちらの変異体でもカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clの結合に伴い、ポケット内へとやや移動した。W107は、求核剤に隣接していて、活性部位に結合した基質を求核攻撃に備えて正しい配向に保持する役目を果たすが、自身の位置をほとんど変化させない。DhaAH272Fでは、F272の側鎖は基質が存在しなければポケット内に突き刺さり、また基質が存在するとポケットから約45度回転して抜け出る。DhaAH272FH11YLでは、F272の側鎖は基質が存在しなければポケット内に突き刺さらず、また基質が存在するとその位置を微調整するだけである。これは基質へのDhaAH272FH11YLの結合を容易にするはずである。Glu130はどの構造でも類似の配向を示すが、基質結合状態のDhaAH272Fの場合に限り、Glu側鎖は基質の受け入れに必要なF272側鎖の回転によりポケットから押し退けられる。基質ポケットへの基質の全般的なフィットエネルギー極小化タンパク質基質構造についてバンプ検査を行い、基質のどの原子がタンパク質のどの原子とかち合うかを示すようにした。2つの原子がvanderWaals半径の少なくとも10オーバーラップしていれば、バンプが存在することになる。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClはDhaAH272FのLys175とCys176に対してバンプを示すが、DhaAH272FH11YLのいずれの残基に対してもバンプを示さない。これはDhaAH272FH11YLに導入された変異がポケットの幅をある程度広げたことを示唆する。基質ポケットの形状と大きさ基質ポケットを、プローブ半径デフォルト値14Åでのコノリー面として可視化した。基質が存在しなければ、DhaAH272Fは触媒3点セットの近くに、Cys176を囲みTyr273へと延びるポケット内の狭窄部または不連続部によって隔てられた、特徴のあるポケット入口と大きなポケットとを見せる。この狭窄部は基質が結合すると押し開かれる。DhaAH272FH11Y変異体は位置176、273でポケット狭窄を示さず、基質の不存在下、存在下のいずれでも、一貫して広い、開放されたポケットを有するが、それは基質の進入がきわめて容易であることを示唆する。DhaAH272FH11YへのK175M変異の導入はポケットの開放にあまり寄与しない模様である。DhaA変異体の熱安定性研究特定の第1および第2世代DhaAH272F変異体の熱安定性を、種々の温度で60分放置後の精製タンパク質の残留活性を測定して、評価した。図43は第1世代DhaH272F変異体と対応するタンパク質の熱安定性プロファイルである。最高活性の第1世代変異体は30°C超の温度では比較的熱不安定性であった。一方、DhaH272F親およびDhaH272FA7変異タンパク質のほうは最高40°Cの温度まで熱安定性であった。DhaH272FH11変異体は50°Cでも有意の標識活性を保持した。第2世代DhaAH272F変異体のうち、DhaH272FH11YLは42°Cでも大部分の活性を保持したが、もちろんDhaH272FH11には及ばなかった。DhaH272FH11に熱安定性を付与する同じ変異はDhaH272FYL変異体の熱安定化にも寄与している可能性がある。DhaH272FH11YLの反応速度に対する温度の効果反応速度に対する温度の効果を調べるために、標識経時実験を室温と氷浴で行った。蛍光画像ゲル分析によれば、温度が下がってもカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clによる標識速度には悪影響がなかった。むしろ、低い温度のほうが反応速度は増すように見える。計算では2次速度定数は0°Cでは31×106M1sec1であるが、25°Cでは5×105M1sec1である。DhaA変異体と固定化ビオチンクロロアルカン基質との反応改良DhaA変異体と固定化基質との反応がどれだけ改善するかを調べるために、ストレプトアビジンをプレコートしたプレートを使用してELISA式のアッセイを行った。8つのDhaAH272F変異体を3種類の含ビオチン基質で力価を測定した。図45Bに示すビオチンPEG414Clの結果によれば、DhaAH272FYL、DhaAH272FYMの両変異タンパク質が該基質と最も効率的に反応する。加えて、DhaAH272FA7YL、DhaAH272FA7YMの双方はDhaAH272FH11YL、DhaAH272FH11YMよりも効率的であった。ビオチンPEG414Clで最高効率を示したこれらのクローンはいずれも他の2つのビオチン基質には結合しなかったが、これはビオチンPEG414Clが好ましい基質であることを示唆する。第1世代DhaA変異体のDhaAH272FA7およびH11は試験したいずれのビオチンともうまく反応しなかった。哺乳動物細胞中のDhaA変異体の特性解析DhaA変異体のinvivoおよびinvitro標識一部のDhaA変異タンパク質のEcoliでの産生は37°Cで低下したが、他の改良DhaA変異体はもっと高い温度で増殖、誘発させても相当の活性を保持した。これらのクローンは高温で折りたたみ面の選択的優位性をもち、その結果として哺乳動物細胞の条件にうまく耐えられるようになるのかもしれない。その優れた速度論的およびまたは生産性能に基づき、変異タンパク質DhaAH272FA7およびH11ををコードする遺伝子を、哺乳動物発現ベクターpCIneoにクローニングし、CHO細胞にトランスフェクトした。速度論的なinvivo標識研究によれば、2種類の第2世代変異体DhaAH272FA7およびH11は基質濃度5μMで親のDhaAH272Fをしのぐ性能特性を示した。従って、Ecoli中、37°Cで著しい活性産生を保持するというDhaAH272F変異体A7およびH11の能力は、哺乳動物細胞中でのその優れた性能と関連していた。3種類の追加のDhaA変異体について、一時的に発現するCHOK1細胞でのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識効率を調べた。図46CDは標識結果のDhaAH272FA7、DhaAH272FH11YLおよびDhaAD106C30H4間比較である。カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質濃度5μMでは、第2世代DhaAH272FH11YLは15分で標識が完了した。これは同じ条件でDhaAH272FA7の標識完了に要する時間の半分であった。それと対照的に、DhaAD106C30H4は同程度の標識に2時間を要した。DhaAH272FA7およびH11YLについて、標識効率の基質濃度への依存も調べた。図46ACは哺乳動物細胞溶解液中での、特に低カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質濃度での、DhaAH272FH11YLの優れた標識特性を示す。この試験結果は精製DhaAタンパク質を使用したinvitro反応速度研究の結果と一致する。invivoではDhaAH272FH11YLのカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clへの結合速度の若干の低下が観測されたが、それは哺乳動物の細胞膜が蛍光リガンドの細胞内への透過を制限する可能性があることを示唆する。DhaA変異体のinvivo安定性一時的にトランスフェクトした哺乳動物細胞中での特定DhaA変異体の安定性を調べた。図48Aは、トランスフェクション後12時間、24時間および48時間の時点でカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clで細胞標識した後に、親変異体と2つの第1世代変異体DhaAH272FA7およびDhaAH272FH11YLから得られた蛍光シグナルを示す。蛍光画像化ゲルの定量から、試験した4クローンからのタンパク質産生はいずれもトランスフェクション後24時間でピークに達したあと、減少に転じて48時間時点の観測レベルに至ると判明した。しかし、DhaAH272FA7およびH11をコードするコンストラクトをトランスフェクトしたCHOK1細胞は、48時間後にも2種類の親変異体をいずれもしのぐ活性タンパク質産生能を保持した。これは、カルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl標識後に生成したロバストな蛍光シグナルから明白である。この結果は、DhaAH272FA7およびH11変異体はinvivoで有意に安定性が高いことを示唆する。図47CDは同様の安定性分析の結果であるが、DhaAH272FA7を第2世代変異体のDhaAH272FH11YLと比較している。DhaAH272FH11YLをコードするコンストラクトをトランスフェクトしたCHOK1細胞は、48時間後にも著しい標識能力を保持した。というより、24~48時間の間にDhaAH272FH11YLによって生成されるシグナルに検出可能な減衰はほとんどまたはまったく見られなかった。生きたまたは固定化した哺乳動物細胞中のDhaAH272FH11YLの画像化図50ABの画像が示すように、哺乳動物細胞で発現したDhaAH272FH11YLはカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClまたはDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2Clで効率的に標識することができる。画像は明るく、卓越したSN比を示す。図50CDの画像が示すように、DhaAH272FH11YLHT2とDhaAH272FはTAMRAC11H21NO3Clで効率的に標識し、また37パラホルムアルデヒドで固定化することができた。DhaAH272FH11YLHT2を発現する細胞であって02、10または50μMTAMRAC11H21NO3Clで5分間染色した細胞の画像は、DhaAH272Fを発現する細胞であって50μMカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clで30分間染色した細胞よりも明るい。これで明らかなように、哺乳動物細胞ではカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2ClはDhaAH272FよりもDhaAH272FH11YLHT2のほうを効率的に標識する。生きた哺乳動物細胞で発現したβアレスチン2コネクターDhaAH272FH11YLHT2融合タンパク質の画像化図50EFの画像が示すように、βアレスチン2コネクターDhaAH272FH11YLHT2発現細胞は一般にβアレスチン2を細胞質に局在させる。融合タンパク質の標識にはDiAcカルボキシフルオレセインC10H21NO2ClまたはカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clを使用。生きた哺乳動物細胞で発現したDhaAH272FH11YLRenillaルシフェラーゼ融合タンパク質の画像化図51ABに示すように、ビオチンX14Clで処理し過剰なビオチンX14Clを洗い流した細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面で有意のルシフェラーゼ活性が検出された。ビオチンX14Clで処理しなかった細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面では有意のルシフェラーゼ活性が検出されなかった。そのうえ、ビオチンX14Clで処理した細胞の溶解液とインキュベートしたビーズ表面でも、遊離ビオチンX14Clを洗い流さなかったときは、hRLuc活性が検出されなかった。総合すると、これらのデータはDhaAH272FH11YLHT2と融合した機能性タンパク質がビオチンX14ClとSAコートビーズを使用して効率的に捕捉しうることを示している。この捕捉はビオチン依存的であり、また過剰量のビオチンX14Clにより競合阻害することができる。hRLuc活性へのビーズの相当の阻害効果が観測されたので、SDSPAGEと抗RLuc抗体によるウェスタンブロット分析とを使用して、hRLucコネクターDhaAH272FH11YLHT2融合タンパク質の捕捉効率を推計した。図51Bに示すように、hRLucコネクターDhaAH272FH11YLHT2融合タンパク質の50あまりをビオチン依存的に捕捉することができた。修飾リンカーを含むハロアルカン基質とのDhaAH272FH11YLの反応性Rhodococcusデハロゲナーゼタンパク質の基質ポケットはXanthobacterDhlAタンパク質の基質ポケットよりも深さ、幅の両面で著しく大きい。標識技術の進化に伴い、DhaA変異体は種々のリンカー構造を含む多様な基質に対応しうるはずである。代替基質の一例はpフェネルチルおよびフラニルプロピル誘導体たとえば図56に示すような化合物である。これらの修飾ハロアルカン基質の反応性を、精製DhaAH272FH11YLタンパク質で試験した。図52AはFP分析で求めた種々のカルボキシテトラメチルローダミン系基質の結合速度を示す。カルボキシテトラメチルローダミンpフェネチルCl基質のDhaAH272FH11YLに対する相互作用に関して求めた見かけ結合速度定数はカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Clの場合の3分の1にすぎなかった。しかし、これらの反応条件の下ではカルボキシテトラメチルローダミンフラニルプロピルCl基質に関しては結合が検出されなかった。カルボキシテトラメチルローダミン系基質の相対標識速度を蛍光画像化ゲル分析により確認した。使用反応条件下では、3種のカルボキシテトラメチルローダミン基質がみな該タンパク質と反応すると判明した。ゲル上の蛍光バンドを定量化して蛍光生成物形成の相対速度を測定した。生成物蓄積の傾きの比較からは、カルボキシテトラメチルローダミンpフェネチルCl基質はDhaAH272FH11YL標識速度がカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質よりもずっと遅いと判明する。カルボキシテトラメチルローダミンフラニルプロピルCl基質の標識速度はカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質のそれの100分の1以下であった。同様のinvitro標識試験を、カルボキシフルオレセイン修飾pフェネチルおよびフラニル基質を使用して行った。図53はFP分析による種々のカルボキシフルオレセイン系基質の結合速度を示す。カルボキシフルオレセインpフェネチルCl基質の見かけ結合速度定数はカルボキシフルオレセイン14Clの場合の約5分の1であった。前のカルボキシテトラメチルローダミンクロロアルカン結合試験でも観測されたように、これらの反応条件の下ではカルボキシフルオレセインフラニル基質に関しては結合が検出されなかった。カルボキシフルオレセイン系基質の相対標識速度を蛍光画像化ゲル分析でも測定した。使用反応条件下では、3種のカルボキシフルオレセイン基質がみな該タンパク質と反応すると判明した。蛍光生成物バンドを定量化により、DhaAH272FH11YL標識速度はカルボキシフルオレセインpフェネチルCl基質がカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質の約3分の1であると判明した。しかし、カルボキシフルオレセインフラニルプロピルCl基質の標識速度はカルボキシフルオレセインC10H21NO2Cl基質のそれの100分の1以下であった。種々のカルボキシテトラメチルローダミン系基質のinvivo標識速度を哺乳動物細胞で測定した。pHT2ベクターで一時的にトランスフェクトしたCHOK1細胞を、種々の濃度のカルボキシテトラメチルローダミンClアルカンで60分間にわたり標識した。様々な時点で回収し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質をSDSPAGEで分離した。標識タンパク質の存在を蛍光イメージャーで検出した。図54は基質濃度1、5および20μMでの標識生成物の蓄積を経時的に示す。蛍光生成物の蓄積の定量化は、カルボキシテトラメチルローダミンpフェネチルCl基質によるDhaAH272FH11YLの標識が試験したどの濃度でもカルボキシテトラメチルローダミンC10H21NO2Cl基質に匹敵することを示す。しかし、カルボキシテトラメチルローダミンフラニルプロピルCl基質によるDhaAH272FH11YL変異体の標識速度は基質濃度1および5μMでは著しく遅かった。ビオチンpフェネチルCl基質の、固定化DhaAタンパク質との反応性を試験した。図55Aに示すような、ELISA式アッセイ用の一般的な反応スキームを行った。抗FLAG抗体を使用して2pmolのDhaAH272FH11YLをマイクロタイタープレートのウェルに固定化した。ハロアルカン基質とのインキュベーションと洗浄の後、ストレプトアビジンHRP結合体を使用して結合済み基質を検出した。発色後の色の量は各ビオチンハロアルカン基質の反応性の指標であった。図55BはビオチンpフェネチルCl基質が固定化DhaAタンパク質と反応したものの、反応性はビオチン14Cl基質、ビオチンPEG414Cl基質のいずれにも劣った。実施例XI細胞表層ディスプレイ用の例示的なDhaA融合体多数の膜性の酵素、受容体、分化抗原および他の活性タンパク質は脂肪酸、イソプレノイド、ジアシルグリセロールおよびグリコシルホスファチジルイノシトールに翻訳後プロセッシングを通じて結合し、またこれらの脂質によって膜にアンカーされる。GPIアンカー型タンパク質は多様な細胞型で発現しており、また細胞接着の制御から補体制御や酵素活性に至るまで多様な機能をもつ。これらの分子は細胞膜の外葉にだけアンカーされ、従って細胞質の中には至らないという点でユニークである。GPIアンカーは例外なくタンパク質のC末端に共有結合する。真核生物のGPIアンカーのコア構造はエタノールアミンリン酸、トリマンノシド、グルコサミンおよびイノシトールリン脂質から、この順序で構成される。既知のGPIアンカー型タンパク質はみなC末端開裂性ペプチドから合成される。このC末端ペプチドは一般に疎水性である15~30アミノ酸からなり、下流細胞質ドメインを含まず、また開裂付加部位の周りにある種のアミノ酸群を特徴とするパターンを確立する。この部位はC末端シグナル除去とGPIアンカー付加の後に残されるアミノ酸であるが、ωアミノ酸と呼ばれてきた。GPIは小胞体内での糖とエタノールアミンリン酸のホスファチジルイノシトールへの逐次付加により合成される。GPIの骨格構造は異種間で共通である。プレフォームのGPIがER内でタンパク質に付加される。GPIによる修飾を受ける前駆タンパク質は2つのシグナルペプチドをもつ。1つはN末端にあり、ER膜透過に必要なシグナルである。もう1つはC末端にあるGPI付加シグナルである。このGPI付加シグナルペプチドはGPIアミド基転移酵素によって認識されるが、この酵素は該シグナルペプチドを切断し、GPIに取って代える。GPIアンカー型DhaA変異体を生成させるには、DeAngelisetal提案のGPIアンカー型GFP生成法を用いてもよい。この方法は新生ポリペプチドをER膜へと誘導するための追加のN末端リーダーペプチドおよびGPI付加のための追加のC末端配列たとえばを必要とする。Hiscoxetalはこの方法により、CHO細胞表面でGFPを発現させることに成功した。このGFPは、3段階PCRによりヒトCD59のシグナルペプチドの下流側とヒトCD59のアミノ酸67~102の上流側にライゲートされた。GFPとDhaAは構造がまったく異なる。従って、哺乳動物細胞用にGPIアンカー型DhaA変異体の融合体を生成させるには、たとえば5ヌクレオチダーゼ、CAMPATH、崩壊加速因子、MIRL、白血球機能関連抗原3、胎盤アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、Thy1、プリオンなど種々のGPIアンカー型タンパク質のシグナル配列とGPI付加配列とを使用してもよい。触媒ポケットへの基質のアクセス可能性を改善するために、DhaAとGPI付加配列の間にペプチドコネクターを導入してもよい。インテグリンは細胞を周囲の細胞外マトリックスに接着させる主要な受容体である。細胞接着をサポートするほかに、可溶性因子の受容体と協力して生存、分化、増殖を調節する。invitroでは、フィブロネクチンへのインテグリンα5β1媒介型細胞接着は繊維芽、上皮および内皮細胞のマイトジェン依存性増殖を特に効率的にサポートする。インテグリンはヘテロ二量体の膜貫通型受容体であり、足場タンパク質を介して皮質アクチン細胞骨格に結合している。αおよびβサブユニットの細胞外領域は非共有結合により球状頭部ドメインを形成する。該ドメインは特定の細胞外マトリックスに結合するが、結合の特異性はαおよびβサブユニットの組み合わせによって決まる。ヒトゲノム配列の分析が進み、24種のαサブユニットと9種のβサブユニットが同定されるに至り、また哺乳動物には目下24種の機能的インテグリンが存在すると判明している。DhaA変異体を細胞表面で発現させるには、DhaA変異体とインテグリンたとえばαまたはβインテグリンとの融合体を使用する。そうした融合タンパク質はインテグリンの膜貫通ドメイン、細胞質ドメインおよびまたは細胞外茎部ドメイン、それにDhaA変異体を含む。インテグリンの細胞質ドメインは不完全ドメインでもよいし、またインテグリンの細胞外茎部ドメインは別のタンパク質の細胞外茎部ドメイン、茎部ドメインの一部分、およびまたは遺伝子組み換えペプチドたとえば合成ペプチドと置換してもよい。インテグリンと他の関心タンパク質との融合体はまた、たとえば関心タンパク質の細胞表層ディスプレイ用にも見込まれる。カドヘリンは固形組織細胞間の付着接触を形成維持するカルシウム依存性細胞接着分子のファミリーを含む。カドヘリンは、細胞外領域にある特有のカドヘリンリピート配列を特徴とする膜1回貫通タンパク質である。これらのリピートは各々110アミノ酸からなり、βサンドイッチドメインを形成する。カドヘリンは一般にこうしたカドヘリンドメインをいくつか、タンデムリピートとして細胞外領域にもつ。これらのドメインの連結は各連続ドメインペア間の3個のCa2イオンの特異的結合によって強化される。カドヘリンは次のようにいくつかのサブファミリーに分類しうる最終的にアクチン細胞骨格に結合するタイプIおよびタイプIIカドヘリン中間径フィラメントに結合するデスモゾームカドヘリンそれに主に神経系で発現するプロトカドヘリン。加えて、いくつかの非定型カドヘリンもまた報告されている。これは単数または複数のカドヘリンリピート配列を含むほかはカドヘリンの特徴をまったく欠くタンパク質である。DhaA変異体を細胞表面で発現させるには、DhaA変異体とカドヘリンたとえばタイプIまたはタイプIIカドヘリンとの融合体を使用する。そうした融合タンパク質は膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、単数または複数の細胞外カドヘリンドメイン、それにDhaA変異体を含む。カドヘリンの細胞質ドメインは不完全ドメインでもよいし、また細胞カドヘリンドメインは除去しても、別のタンパク質または遺伝子組み換えペプチドと置換してもよい。不完全カドヘリンは一種のカドヘリンであり、膜貫通領域と保存W2を欠くもののGPIアンカーを保持するという点でユニークである。細胞表面でDhaAまたはDhaA融合体を発現させるには、新生ポリペプチドをリン脂質二分子膜へと誘導するためのN末端リーダーペプチドが必要である。このN末端リーダーペプチドはDhaA融合相手のリーダーペプチド、または別のポリペプチドのリーダーペプチドでもよい。一実施形態では、追加のポリペプチドたとえばコネクターを、DhaAとN末端リーダーペプチドの間、DhaAと融合相手の膜貫通ドメインの間、およびまたはDhaAと融合相手の細胞外ドメインの間に、挿入する。一般に、細胞表面でDhaA変異体を発現させるために、DhaA変異体と明確なN末端細胞外ドメインをもつ任意の膜タンパク質例nメチルDアスパラギン酸受容体、5メチル4イソオキサゾロプロピオン酸受容体、グリシン受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、P2X受容体、5ヒドロキシトリプタミン3受容体などGalligan2002参照との融合体を使用してもよい。一実施形態では、DhaA変異体と細胞外C末端ドメインをもつ任意の膜タンパク質との融合体を使用する。DhaAはタンパク質のC末端ドメインに付加または挿入する。油剛体の性能を改善するには、DhaAとタンパク質の間にペプチドコネクターを導入してもよい。別の実施形態では、DhaA変異体と細胞外ループドメインタンパク質の膜貫通ドメインに結合するペプチド鎖、たとえばHERGチャンネルのαサブユニット内のS1とS2、S3とS4、S6とS6の各幕貫通ドメインに結合するペプチド鎖をもつ任意の膜タンパク質との融合体を使用する。融合体の性能を改善するために、DhaAと該ループのNおよびまたはC末端フラグメントの間にペプチドコネクターを導入してもよい。さらに別の実施形態では、細胞表面で発現するタンパク質と融合させるときに、細胞表面の変異ヒドロラーゼを使用して、本発明のリガンドたとえば蛍光団を含むリガンドと結合した形で、膜タンパク質の内部化をモニターする。本発明のリガンドが微小環境感受性であれば、膜タンパク質を取り巻く環境の変化をモニターするシステムを使用してもよい。一実施形態では、本発明のリガンドは細胞膜透過性が低いまたは無い。一実施形態では、細胞表面で発現したDhaAの非透過性リガンドによる標識とそれに続く細胞透過性リガンドによる細胞処理とを使用して、膜タンパク質の表面および内部プールの移動を同時にモニターする。あるいは、そうしたシステムを使用して種々の作用物質たとえば薬物の、膜タンパク質の種々のプールに対する効果をモニターしてもよい。さらに別の実施形態では、細胞表面で発現するタンパク質と融合させるときに、細胞表面の変異ヒドロラーゼを使用して、本発明のリガンドたとえば検出可能な機能性基を含むリガンドと結合した形で、膜タンパク質の修飾をモニターする。あるいは、そうしたシステムを使用して種々の作用物質たとえば薬物の、膜タンパク質の修飾に対する効果をモニターしてもよい。さらに別の実施形態では、イオンチャンネルと融合させるとき、細胞表面の変異ヒドロラーゼを使用して、本発明のリガンドたとえば微小環境感受性の機能性基を含むリガンドと結合した形で、該チャンネルの機能的活動をモニターする。あるいは、そうしたシステムを使用して種々の作用物質たとえば薬物の、イオンチャンネルの活動に対する効果をモニターしてもよい。参考文献諸々の刊行物、特許および特許出願明細書は参照をもって開示する。以上、本発明をある種の好ましい実施形態との関連で説明し、また多数の詳細も説明目的のために示したが、本発明が追加の実施形態を受け入れうること、またある種の明細が本発明の基本的な趣旨から逸脱することなく大幅な変更を許すことは当業者には自明であろう。