"組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物を産生する方法であって、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b前記基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;crVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養し、rVWFを発現させ、これを前記細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;およびe少なくとも一部の前記培養液上清を回収するステップ、を含み、前記回収上清が、少なくとも30mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する方法。前記1つまたは複数の細胞の培養の前に、前記基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。前記加水分解物が、植物加水分解物である請求項2に記載の方法。前記加水分解物が、大豆加水分解物である請求項3に記載の方法。前記基本細胞培地が、動物タンパク質不含培地である請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記基本細胞培地が、タンパク質不含培地である請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記基本細胞培地が合成培地である請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、少なくとも4μg/L銅である請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、2.4μg/L~20μg/L銅である請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。前記基本細胞培地を補充する銅が、銅塩,銅キレート,またはこれらの組み合わせとして提供される請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。前記銅塩が、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される請求項10に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞が、哺乳動物細胞である請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。前記哺乳動物細胞が、CHO細胞である請求項12に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞のバッチ培養を含む請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞の連続培養を含む請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。前記細胞の連続培養が、ケモスタット方式で行われる請求項15に記載の方法。前記細胞の連続培養が、灌流方式で行われる請求項15に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの前記補充基本細胞培地中で培養される請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、細胞密度が2.5x106細胞/mL未満に維持される請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が2.0x106細胞/mL未満に維持される請求項19に記載の方法。前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が1.5x106細胞/mL未満に維持される請求項19に記載の方法。少なくとも一部の前記培養液上清の回収ステップが、その一部の培養液上清から細胞を取り出すための濾過または遠心分離を含む請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。前記回収上清が、少なくとも40mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。前記回収上清が、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項23に記載の方法。前記回収上清が、少なくとも60mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項23に記載の方法。前記回収上清が、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項23に記載の方法。前記回収上清が、少なくとも80mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する請求項23に記載の方法。前記上清中の少なくとも10のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。前記上清中の少なくとも20のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。前記上清中の少なくとも30のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する請求項1~27のいずれか1項に記載の方法。前記上清が、14~22の二量体の高分子量VWF多量体を含む請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。前記細胞培養液上清のNH4含量が、10mM未満の濃度で維持されている請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。前記細胞培養上清のNH4含量が、4mM未満の濃度で維持される請求項32に記載の方法。rVWFが、組換え型因子VIIIrFVIIIと同時発現する請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。前記回収上清中に存在する少なくとも50のrFVIIIからrVWFを精製するステップをさらに含む請求項34に記載の方法。前記精製ステップ後のrVWFのrFVIIIに対する比率が、少なくとも10:1である請求項35に記載の方法。rVWF富化ステップをさらに含む請求項1~36のいずれか1項に記載の方法。請求項1~37のいずれか1項に記載の方法により調製される、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清。組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清であって、少なくとも20のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体として存在する上清。組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清であって、少なくとも0.5IUリストセチンコファクター活性/mLを含む上清。請求項1~37のいずれか1項に記載の方法により調製される組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物。組換え型因子VIIIrFVIIIをさらに含む請求項41に記載の組成物。rVWFのrFVIIIに対する比率が、少なくとも10:1である請求項42に記載の組成物。医薬品投与用に処方される請求項42または43に記載の組成物。静脈内投与用に処方される請求項42~44のいずれか1項に記載の組成物。特定の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFおよび組換え型ADAMTS13rA13の発現に使われる細胞培地の補充により、タンパク質発現および酵素活性の顕著な改善がもたらされるという意外な知見に基づいている。第1の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物を提供する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;crVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d銅を補充した細胞培地中で、1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清に排泄させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも30mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、1つまたは複数の細胞の培養の前に、基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む。上記で提供される方法の一実施形態では、加水分解物は、植物加水分解物である。具体的な実施形態では、加水分解物は、大豆加水分解物である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも4μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、2.4μg/L~20μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地に補充する銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。上記で提供される方法の一実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、前記細胞のバッチ培養を含む。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの補充した基本細胞培地中で培養される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、2.5x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、2.0x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、1.5x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも40mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも60mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。またさらに具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも80mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上記で提供される方法の一実施形態では、上清中の少なくとも10のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも25のrVWFが、10超の二量体超の高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。上記で提供される方法の一実施形態では、上清は、14~22二量体の高分子量VWF多量体を含む。上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4含量は、10mM未満の濃度に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4含量は、4mM未満の濃度に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、rVWFは、組換え型第VIII因子rFVIIIと同時発現する。具体的な実施形態では、方法は、回収上清中に存在する少なくとも50のrFVIIIから分離してrVWFを精製するステップをさらに含む。一実施形態では、精製ステップ後のrVWFのrFVIIIに対する比率は、少なくとも10:1である。上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、rVWF濃縮ステップをさらに含む。第2の態様では、本発明は、本明細書で提供される方法により調製された組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物を提供する。上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、組換え型第VIII因子rFVIIIをさらに含む。具体的な実施形態では、rVWFのrFVIIIに対する比率は、少なくとも10:1である。上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与の目的で処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与の目的で処方される。第3の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清を提供し、この上清は、本明細書で提供される方法で調製される。第4の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清を提供し、上清中の少なくとも15のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、上清中の少なくとも10のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも20のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも25のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも30のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。第5の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも0.4IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.5IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.6IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.7IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。第6の態様では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも1.0μg/L最終銅濃度とするステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養してrA13を発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収培養液上清中に、少なくとも1500ユニット/L補充基本細胞培地/日のFRETS-VWF73活性が存在する。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも1μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも2μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも4μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、1μg/L~6μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、2μg/L~4μg/L銅である。上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地を補充する銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞はCHO細胞である。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は細胞のバッチ培養を含む。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの補充基本細胞培地中で培養される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、4.0x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、3.5x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、3.0x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、2.5x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、2.0x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、1.5x106細胞/mL未満に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも2000ユニット/L補充した基本細胞培地/日のFRETS-VWF73活性が存在する。上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも2500ユニット/L補充した基本細胞培地/日のFRETS-VWF73活性が存在する。上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも800mU/μgのrA13特異的FRETS-VWF73活性を有する。上記で提供される方法の好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも1200mU/μgのrA13特異的FRETS-VWF73活性を有する。上記で提供される方法のまた他の実施形態では、回収上清は、少なくとも1600mU/μgのrA13特異的FRETS-VWF73活性を有する。上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4含量は、10mM未満の濃度に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4含量は、5mM未満の濃度に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4含量は、4mM未満の濃度に維持される。上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、rA13濃縮ステップをさらに含む。第7の態様では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13を含む細胞培養上清を提供し、上清は、本明細書で提供される方法で調製される。第8の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清を提供し、上清は、少なくとも5UFRETS-VWF73活性/mLを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも6UFRETS-VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも7UFRETS-VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも8UFRETS-VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも9UFRETS-VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも10UFRETS-VWF73活性/mLを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。第9の態様では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも2μgrA13/mLを含む。具体的実施形態では、上清は少なくとも3μgrA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも4μgrA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも5μgrA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも6μgrA13/mLを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。第10の態様では、本発明は、上述の方法のいずれか1つの方法により調製される組換え型ADAMTS13rA13組成物を提供する。上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与を目的として処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与を目的として処方される。発明の詳細な説明I.緒言組換え型vWFrVWFおよび組換え型ADAMTS13rA13は、大規模哺乳動物細胞培養における発現により産生出来る。しかし、標準的細胞培養条件を使って産生された場合、これらのタンパク質の活性は、全体の培地配合が変更されない場合でも、細胞培養間で変動することが多く、また、組換え型タンパク質の比活性は、血漿由来のvWFおよびrA13の比活性と同じでないことが多い。さらに、哺乳動物細胞培養で発現したrVWFは、低い10未満のパーセンテージの高次多量体高次多量体には、10超のVWF二量体を含む分子が含まれるのタンパク質組成物を産生する傾向がある。rVWFおよびrA13の標準的産生方法のこれらの欠点は、大規模生産用の培養すなわち、10~20,000Lを越える培養を開発する場合に、特に問題となる。異なる細胞培養バッチでよく見られる変動の1つの可能な原因は、細胞培地の成分中の混入物の存在である。これらの混入物は、異なるバッチ中に異なる量で存在する可能性があり、rVWFおよびrA13の産生において変動する原因となる。種々の細胞培地添加物中に認められる異なる混入物を調査後、本発明者等は、加水分解物の存在が細胞培地中の銅濃度の変動の原因であることを見出した。さらなる調査により、合計銅濃度を少なくとも約1μg/L~約20μg/Lにするための細胞培地への銅濃度の補充により、常に、rVWFおよびrA13の全活性および比活性を増加させ、および/または、また、総タンパク質収率の増加に繋げることができるという意外な結果が得られた。従って、本発明は、高比活性を有するrVWFおよびrA13タンパク質の高収率生産のための方法と組成物を提供する。一態様では、本発明は、血漿由来vWFpdVWFまたは血漿由来ADAMTS13pdA13の活性と同等またはそれより高い活性を有するrVWFおよびrA13を大量生産する細胞培養方法および組成物を提供する。さらなる態様では、本発明に従い産生されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い活性を示す。好都合にも、本明細書で提供される方法および組成物の特定の実施形態では、本発明に従って産生されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い比活性すなわち、U/mgタンパク質を示す。同様に、本明細書でrVWFおよびrA13の産生用に提供される方法は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を利用した標準的細胞培養方法に比べて、より高い全活性/培養容量すなわち、U/L/Dを与える。さらなる態様では、本発明は、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約1μg/Lの合計濃度になる細胞培養方法を提供する。他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約2μg/Lの合計濃度になる。さらに他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約1μg/L~約20μg/Lの合計濃度になる。一部の実施形態では、銅の合計濃度は、約1.5~4.5μg/Lである。特定の実施形態では、細胞培地を補充して、約1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/Lの銅、またはそれより高い濃度の銅になる。基本細胞培地は、通常、1μg/L未満の微量の濃度の銅を含む。一部の実施形態では、本発明は、rVWFの産生のために、基本細胞培地に約1.0~約20μg/Lの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、rVWFの産生のために、基本細胞培地に1.5~15、2.0~10、2.5~8、3.0~6、4.0~5.0μg/Lの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、1つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。他の実施形態では、本発明は、rA13の産生のために、基本細胞培地に約1.5~約4μg/Lの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、rA13の産生のために、基本細胞培地に約1.6~3.8、1.7~3.6、1.8~3.4、1.9~3.2、2.0~3.0、2.1~2.8、2.2~2.6、2.3~2.4μg/Lの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、1つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および/または1つまたは複数の加水分解物に加えて、約1.0~約30μMの亜鉛を含む。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および/または1つまたは複数の加水分解物および/または亜鉛に加えて、約0.5~約5.0mMのカルシウムをさらに含む。上記のいずれかに基づいた、またさらなる態様では、本発明は、細胞培養溶液のアンモニウムレベルが低い10mM未満細胞培養方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法は、1、2、3、4、または5μg/Lより高い濃度の銅を、低レベルのアンモニウムと組み合わせて含む細胞培地を利用する。本発明の方法および組成物の利点の1つは、大規模細胞培養による生産を適用できる点である。これらの大規模細胞培養は、少なくとも10L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、750L、1,000L、1,500L、2,000L、5,000L、10,000L、または20,000L培養である。特定の態様では、本発明の方法は、全体的に見て、必ずしも、より多い量の組換え型タンパク質を生成しないが、産生された組換え型タンパク質rVWFまたはrA13は、標準的細胞培養を使って産生したタンパク質で見られるものより、特に、細胞培地が追加の銅で補充されていない細胞培養で産生されたタンパク質に比べて、高い全活性および比活性を示す。さらなる態様では、銅補充培地で細胞培養されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅を補充していない基本細胞培地で培養した細胞に比べて、一貫して1Lの細胞培養液当たりの活性増加を示す。またさらなる態様では、本発明の銅補充培地は、銅を補充していない培地に比べて、タンパク質収率の増加、培養液中の細胞数の増加、および/または1L培養液当たりの全活性の増加をもたらす。本発明の方法と組成物のまたさらなる利点は、高パーセンテージ10超の高次多量体化rVWFを含むタンパク質集団が得られることである。多くの本明細書のADAMTSタンパク質に関する考察は、ADAMTS13A13の観点から行われているが、全てのADAMTSタンパク質は、共通のコアドメイン構造および共通の構造-機能関係性を共有するので、本明細書記載の方法と組成物は、rA13だけでなく、いずれのADAMTSタンパク質の産生にも適用可能であることは理解されよう。II.定義本明細書で使用される組換え型vWFは、組換えDNA技術経由で得られたvWFを含む。特定の実施形態では、本発明のvWFタンパク質は、例えば、Ginsburg等の1986年10月23日付け公報の国際公開第1986/06096号および1990年7月23日出願の米国特許公開第07/559,509号に記載のように調製された構築物を含んでもよい。これらの特許は、組換え型vWFの産生方法に関する参照により本明細書に組み込まれる。本発明のvWFは、単量体および多量体型を含む全ての可能な形態、を含んでもよい。本発明は、組み合わせて使用されるべき異なる形のvWFを包含することは理解されよう。例えば、本発明のvWFは、異なる多量体、異なる誘導体ならびに両方の生物学的に活性な誘導体および生物学的に活性でない誘導体を含んでもよい。例えば、細胞もしくは核酸、タンパク質、またはベクターへの参照に伴って使用される場合の用語組換え型は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変化の導入により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを指す。従って、例えば、組換え型細胞は、ネイティブ非組換え型の細胞内に認められない遺伝子を発現する、または、他の方法では、異常発現するか、低発現するか、または全く発現しないネイティブ遺伝子を発現する。本発明においては、組換え型vWFは、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のvWFファミリーのいずれのメンバーも包含する。好ましい実施形態では、組換え型VWFは、ヒトVWFである。活性を有する突然変異および変種vWFタンパク質も、包含され、vWFタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のvWFは、精製、検出、またはそれら両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のvWFは、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。用語高次多量体vWF、高分子量vWF、およびHMWVWFは、同義に使用でき、10超のVWF二量体を含む共有結合vWF多量体を指す。特定の実施形態では、HMWVWFは、少なくとも11VWF二量体、または少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくはさらに多い数のVWF二量体を含む。本明細書で使用されるADAMTSタンパク質は、メタロプロテイナーゼファミリーのトロンボスポンジンI型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのポリペプチドを指す。このファミリーのメンバーには、ヒトタンパク質ADAMTS1NM_006988、ADAMTS2NM_014244;NM_021599、ADAMTS3NM_014243、ADAMTS4NM_005099、ADAMTS5NM_007038、ADAMTS6NM_014273、ADAMTS7NM_0142727、ADAMTS8NM_007037、ADAMTS9NM_182920;NM_182921;NM_020249、ADAMTS10NM_030957、ADAMTS12NM_030955、ADAMTS13NM_139025;NM_139026;NM_139027;NM_139028、ADAMTS14NM_139155;NM_080722、ADAMTS15NM_139055、ADAMTS16NM_139056、ADAMTS17NM_139057、ADAMTS18NM_199355;NM_139054、ADAMTS19NM_133638、およびADAMTS20NM_025003、NM_175851が含まれる。ADAMTSタンパク質は、完全長タンパク質、および少なくとも部分生物活性、例えば、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90の、またはそれより多い量の、完全長タンパク質により示される活性、特に完全長タンパク質により示されるプロテアーゼ活性を示す部分ポリペプチドの両方を含む。特定の例では、ADAMTSタンパク質は、例えば、酵素的または化学的手段により、インビボまたはインビトロで、翻訳後修飾される。あるいは、本発明のADAMTSタンパク質は、スプライスされたアイソフォーム、保存的に改変されたタンパク質、実質的に同じタンパク質、相同体、等を含むことが理解されよう。本発明においては、ADAMTSタンパク質は、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のADAMTSファミリーのいずれかのメンバーを包含する。活性を有する突然変異および変種ADAMTSタンパク質もまた、包含され、ADAMTSタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のADAMTSタンパク質は、精製、検出、または両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のADAMTSタンパク質は、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。本明細書で使用されるADAMTS13タンパク質は、ADAMTS13活性、特にVWFの残基Tyr-842およびMet-843の間でペプチド結合を切断する能力、を有するいずれかのタンパク質またはポリペプチドを指す。代表的実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620594ADAMTS13アイソフォーム1、プレプロタンパク質またはNP_620594ADAMTS13アイソフォーム1、成熟ポリペプチドのアミノ酸75~1427のアミノ配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。別の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620596ADAMTS13アイソフォーム2、プレプロタンパク質またはNP_620594ADAMTS13アイソフォーム2、成熟ポリペプチドのアミノ酸75~1371のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。また別の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620595ADAMTS13アイソフォーム3、プレプロタンパク質またはNP_620595ADAMTS13アイソフォーム1、成熟ポリペプチドのアミノ酸75~1340のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書で使用されるADAMTS13タンパク質は、vWF切断活性を有する天然変異体およびvWF切断活性を有する人工構築物を含む。本発明で使われるADAMTS13は、一部の基本的活性を保持している任意の天然変異体、代替配列、アイソフォームまたは変異タンパク質を包含する。ヒト集団で見つかったADAMTS13変異の例には、限定されないが、R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、R1336Wが含まれ、これらの多くは、血栓性血小板減少性紫斑病TTPと関連することが解っている。ADAMTS13タンパク質は、また、翻訳後修飾を含むポリペプチドを含む。例えば、ADAMTS13は、残基614、667、および1354の位置で、N-アセチルグルコサミンGlcNAcにより修飾されることが示され、また、残基142、146、552、579、707、828、および1235もまた、同様の方式で修飾される可能性があると予測されている。タンパク分解性活性組換え型ADAMTS13は、Plaimaueretal.、2002、Blood.15;10010:3626-32および米国特許公開第2005/0266528号この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるに記載のように、哺乳動物細胞培養での発現により調製できる。細胞培養での組換え型ADAMTS13の発現方法は、PlaimauerB、ScheiflingerF.SeminHematol.2004Jan;411:24-33および米国特許公開第2011/0086413号この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるで開示されている。また、本明細書で使用される用語生物学的に活性な誘導体は、ADAMTSタンパク質に関連して使われる場合、組換えDNA技術により得られたポリペプチドを包含する。これは、i遺伝子工学、例えば、RNAの逆転写および/またはDNAの増幅による組換えDNAの産生、iiトランスフェクション、すなわち、電気穿孔または微量注入による原核生物または真核細胞への組換えDNAの導入、iii前記形質転換された細胞の、例えば、連続またはバッチ方式で培養、iv例えば、恒常的な、または誘導時のADAMTSタンパク質の発現、およびv例えば、培地からの、または形質転換細胞を回収することにより前記ADAMTSタンパク質を単離し、vi実質的に精製された組換え型ADAMTSタンパク質を、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等により得ること、のために当技術分野で既知のいずれかの方法を含んでもよい。用語の生物学的に活性な誘導体は、また、キメラ分子、例えば、ADAMTSタンパク質、またはその機能性断片を、第2のポリペプチド、例えば、免疫グロブリンFcドメインまたはアルブミンドメインと組み合わせて含み、生物学的/薬理学的特性、例えば、ADAMTSタンパク質の哺乳動物、特にヒトの循環系中半減期を改善する。用語単離された、精製された、または生物学的に純粋なは、実質的にまたは基本的に、ネイティブ状態で認められるような通常随伴する成分を含まない材料を指す。純度と均一性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使って測定される。一実施形態では、配合物中の主な種であるrVWFは、充分に精製されている。別の実施形態では、配合物中の主な種であるrA13は、充分に精製されている。用語の精製されたは、一部の実施形態では、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に一本のバンドを生ずることを意味する。他の実施形態では、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも50純粋であること、より好ましくは少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99またはさらに純粋であることを意味する。他の実施形態では、精製するまたは精製は、精製されるべき組成物から少なくとも1つの混入物を除去することを意味する。この意味では、精製は、精製された化合物が同種、例えば、100純粋であることを必要としない。vWFの生物活性は、既知のインビトロアッセイで測定できる。例えば、リストセチンコファクターアッセイは、vWFの存在下で抗生物質リストセチンにより誘導された、新鮮な、またはホルマリン固定した血小板の凝集に基づいている。血小板凝集度は、vWF濃度に依存し、例えば、血小板凝集計を使って比濁法により測定できるWeissetal.、J.Clin.Invest.52:2708-2716、1973;Macfarlaneetal.、Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308、1975。本明細書に提供されるように、本発明のvWF特異的リストセチンコファクター活性は、インビトロアッセイを使って測定されるvWFをmU/μgに換算して記載される。本明細書で使用される1ユニットのADAMTS活性は、使用されるアッセイに関係なく、1mLのプールされた正常なヒト血漿中の活性の量として定義される。例えば、ADAMTSタンパク質がADAMTS13の場合、1ユニットのADAMTS13FRETS-VWF73活性は、1mLのプールされた正常なヒト血漿により切断されるのと同量のFRETS-VWF73基質Kokameetal.、BrJHaematol.2005Apr;1291:93-100を切断するのに必要な活性の量である。便宜上、ADAMTS13活性は、機能アッセイ、例えば、修飾フォンヴィレブランド因子ペプチドをADAMTS13の基質として用いる機能アッセイTripodietal.JThrombHaemost.2008Sep;69:1534-41により測定できる。組換え型ヒトADAMTS13活性の好ましい測定方法は、Gerritsenetal.分解されたvWFのコラーゲン結合親和性減少に基づく、フォンヴィレブランド因子vWF切断プロテアーゼのアッセイ:血栓性血小板減少性紫斑病TTPの診断ツールAssayofvonWillebrandfactorvWF-cleavingproteasebasedondecreasedcollagenbindingaffinityofdegradedvWF:atoolforthediagnosisofthromboticthrombocytopenicpurpuraTTPThrombHaemost1999;82:1386-1389で開示されている。一実施形態では、上記で定義のADAMTS13タンパク質と見なされるべきポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブADAMTS13の少なくとも1のvWF切断活性を有する必要がある。他の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、ネイティブADAMTS13の活性の少なくとも10の活性を含む。さらに他の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、ネイティブADAMTS13の活性の少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100の活性を含む。また、ADAMTS13タンパク質の量は、例えば、Riegeretal.、2006、ThrombHaemost.2006952:212-20で開示のELISA法を使ってADAMTS13抗原の測定により決定できる。当技術分野で充分確立された約束事は、1mLのプールされた正常なヒト血漿が、1μgのADAMTS13を含むということである。従って、当技術分野の約束事は、1μgの血漿由来ADAMTS13は、1ユニットのADAMTS13活性を有するということである。用語細胞培養溶液、細胞培地または培地、および細胞培養上清は、通常当技術分野でよく知られた細胞培養プロセスの態様を指す。本発明においては、細胞培養溶液は、細胞培地および細胞培養上清を含んでもよい。細胞培地は、任意選択の補充剤と一緒に、細胞培養溶液に外部から添加され、栄養素およびrVWFまたはrA13発現細胞培養用の他の成分を供給する。細胞培養上清は、栄養素および細胞培地ならびに培養中に細胞から放出され、代謝され、および/または排泄された産物由来の他の成分を含み、細胞それ自体を含まない細胞培養溶液を指す。したがって、ある文脈では、細胞培養上清は、細胞培養溶液の液相すなわち、細胞を除く細胞培養溶液を指してもよい。例えば、培養液上清のアンモニウム濃度は、通常、細胞培養溶液中に存在するアンモニウム濃度を指す。他の文脈では、細胞培養上清は、細胞が除かれている細胞培養溶液すなわち、回収細胞培養上清を指す。本明細書で使用される用語ビタミンB3、ニコチン酸アミド、ナイアシンアミド、ナイアシン、およびニコチン酸は、同義に使用でき、ビタミンのB3ファミリーのメンバーを指す。従って、このファミリーのいずれのメンバーも、本発明の方法で使用される培地を補充するために使用できる。本明細書で使用される用語合成培地または合成培地複数は、合成増殖培地を指し、全成分の素性および濃度は既知である。合成培地は、細菌、酵母、動物、または植物抽出物を含まないが、個別の植物または動物由来成分例えば、タンパク質、ポリペプチド、等を含んでも、含まなくてもよい。市販の合成培地の非限定例には、種々のダルベッコ変法イーグルDME培地Sigma-AldrichCo;SAFCBiosciences、Inc、ハム栄養混合物Sigma-AldrichCo;SAFCBiosciences、Inc、こら等の組み合わせ、等が含まれる。合成培地の調製方法は、当技術分野で、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により既知である。これら特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される用語オリゴペプチド不含培地またはオリゴペプチド不含培地複数は、オリゴペプチド、例えば、タンパク質加水分解物由来のオリゴペプチドを含まないタンパク質不含培地を指す。一実施形態では、培地は、20以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の一実施形態では、培地は、15以上のアミノ酸を含むオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態では、培地は、10以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。一実施形態では、培地は、7以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は、5以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらに別の実施形態では、培地は、3以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらなる本発明の実施形態によれば、培地は、2以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。オリゴペプチド不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される用語無血清培地または無血清培地複数は、動物血清で補充していない培地を指す。無血清培地は、合成培地であることが多いが、無血清培地は、個別の動物または植物タンパク質またはタンパク質画分で補充してもよい。無血清培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される用語動物タンパク質不含培地または動物タンパク質不含培地複数は、動物血清、タンパク質、またはタンパク質画分を補充しない培地を指す。動物タンパク質不含培地は、合成培地であることが多いが、動物タンパク質不含培地は、植物または酵母加水分解物を含んでもよい。動物タンパク質不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される用語基本細胞培地または基本細胞培地複数は、加水分解物、例えば、植物または酵母加水分解物を補充していない、合成培地、オリゴペプチド不含培地、無血清培地、または動物タンパク質不含培地を指す。基本培地は、例えば、DMEM、ハムF12、DMEM/ハムF12、Medium199、McCoy、またはRPMIが当技術分野でよく知られている。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞の培養を補助する量で存在できるが、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助的物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、抗酸化剤、機械的な応力に対抗するための安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体および/または混合物を添加してもよい。III.細胞培地および細胞培養上清本発明の一態様は、基本細胞培地を使って産生したrVWFおよびrA13に比べて、活性が増加したrVWFおよび/またはrA13を産生する細胞培地に関する。一態様では、本発明は、基本細胞培地に1つまたは複数の追加の物質を補充したrVWFおよび/またはrA13産生用細胞培地に関する。以下でさらに詳細に考察するように、具体的な実施形態では、本発明の細胞培養条件は、少なくとも1.0μg/Lの銅を有する基本細胞培地を含む。さらなる実施形態では、使用する細胞培地および本発明のプロセス由来の上清は、また、低レベル10mM未満のアンモニウムを含む。特定の実施形態では、rVWFおよび/またはrA13の発現に使われる細胞培養条件は、細胞培養上清が低レベルのアンモニウム、すなわち、10mM未満、好ましくは5mM未満のアンモニウムを維持するように制御される。本発明の培地は、当技術分野でよく知られた適切な基本培地、例えば、DMEM、ハムF12、DMEM/ハムF12、Medium199、McCoy、またはRPMIをベースにしてもよい。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞培養を補助する量で存在してもよく、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、抗酸化剤、機械的な応力に対抗する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体および/または混合物を添加してもよい。一般的に、基本培地は、1μg/L未満の銅を含み、例えば、DMEM/ハムF12は、約0.3μg/Lの濃度の銅を含む。このような濃度の銅は、本発明の高比活性を示すrVWFおよびrA13タンパク質の産生を支援するのに充分な銅イオンを供給しない。銅は、種々の方式により、例えば、培地補充剤の添加により本発明細胞培地に供給できる。一部の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物を含んでもよく、これを供給して培地中の銅濃度を増加させることができる。加水分解物は、当技術分野でよく知られたいずれかの加水分解物、例えば、植物加水分解物、大豆加水分解物、およびコムギグルテン加水分解物を含んでもよい。特定の実施形態では、加水分解物の添加により、約0.2~約10μg/LのCu2の銅濃度の増加に寄与できる。一部の実施形態では、加水分解物より供給される銅の量は、加水分解物中の銅の量ならびに添加される加水分解物の量に依存する。加水分解物の銅含量は、元素分析、例えば、原子吸光分光法GFAA:黒鉛炉原子吸光、または質量分析法例えば、ICP-MSにより測定できる。特定の実施形態では、銅は、培地のみに、または適切な銅塩または銅キレートを含む培地補充剤を用意して、加水分解物に添加することにより供給できる。適切な銅塩には、限定されないが、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅が含まれる。適切な銅キレート剤には、限定されないが、アルブミン、エチレンジアミン四酢酸EDTA、ポリアミンキレート化剤、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、トリエチレンジアミン、テトラエチレンペンタミン、アミノエチルエタノールアミン、アミノエチルピペラジン、ペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミンヒドロクロリド、テトラエチレンペンタミンヒドロクロリド、ペンタエチレンヘキサミンヒドロクロリド、テトラエチルペンタアミン、カプトプリル、ペニシルアミン、N、N’-ビス3-アミノプロピル-1、3-プロパンジアミン、N、N、ビス2アニモエチル1、3-プロパンジアミン、1、7-ジオキサ-4、10-ジアザシクロドデカン、1、4、8、11-テトラアザシクロテトラデカン-5、7-ジオン、1、4、7-トリアザシクロノナントリヒドロクロリド、1-オキサ-4、7、10-トリアザシクロドデカン、1、4、8、12-テトラアザシクロペンタデカン、および1、4、7、10-テトラアザシクロドデカンを含んでもよい。特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約1.0~約20μg/Lの合計銅濃度になる。具体的な実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約1.0~約10μg/Lの最終濃度になる。さらなる実施形態では、基本細胞培地に補充して約1.0~5.0、1.2~4.0、1.3~3.0、1.4~2.9、1.5~2.8、1.6~2.7、1.7~2.6、1.8~2.5、1.9~2.4、2.0~2.3、2.1~2.2μg/Lの最終銅濃度になる。さらなる実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約1.2~9.5、1.4~9、1.6~8.5、1.8~8、2.0~7.5、2.2~7、2.4~6.5、2.6~6.0、2.8~5.5、3.0~5.0、3.2~4.5、3.4~4、および2~4μg/Lの銅濃度になる。さらに他の実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約1-6、2~5、3~4μg/Lの銅濃度になる。一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも1μg/Lの合計銅濃度になる。別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも2μg/Lの合計銅濃度になる。さらに別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4μg/Lの合計銅濃度になる。特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも1μg/L、もしくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/L、またはさらに高い合計銅濃度になる。特定の実施形態では、本明細書でさらに詳細に考察されるように、rA13産生用培養液は、約2~4μg/Lの銅を含んでもよく、一方、rVWF産生用培養液は、少なくとも2μg/Lの銅を含んでもよい。上記で示した濃度は、銅二価型Cu2の純粋な銅のそれぞれの濃度である。銅誘導体、例えば、銅含有水和塩、または化合物、例えば、銅キレート剤が使用される場合は、誘導体またはキレート剤の量は、銅の最終濃度が本明細書記載の範囲に入るように添加される。例えば、2μg/LのCuSO45H2Oは、約0.51μg/Lの銅濃度硫酸塩および5H2Oを除いたと等価である。好都合なことに、細胞培養溶液中ですなわち、培養液上清中で低アンモニウムNH4濃度を生ずる細胞培養プロセスにおける細胞培地の使用は、高比活性を有する組換え型VWFおよび/またはrA13の発現をもたらすことが明らかとなった。従って、特定の実施形態では、上清のNH4濃度は、10mM以下である。好ましい実施形態では、上清のNH4濃度は、5mM以下である。好ましい実施形態では、上清のNH4濃度は、4mM以下である。また別の実施形態では、上清のNH4濃度は、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに少ない濃度である。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、上清中に10mM以下のNH4濃度を生ずるプロセスで使用される、銅を補充した例えば、少なくとも2μg/Lの最終濃度に基本細胞培地の使用に基づいている。また別の実施形態では、表1の組み合わせのバリエーション1~440の内のいずれかに対応した最終の銅とアンモニウム濃度を得るように基本細胞培地が補充される。一部の実施形態では、本発明の銅補充培地は、動物タンパク質不含および/または合成の基本培地を補充することにより産生される。動物タンパク質不含および合成培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、本明細書記載の方法で使用される基本培地は、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地である。特定の実施形態では、培地は、合成できる。特定の実施形態では、培地は、約0.5mg/L~約10mg/Lの濃度で少なくとも1つのポリアミンを含んでもよい。さらなる実施形態では、上記で提供のいずれかの記載に加えて、基本培地に銅および少なくとも1つのカルシウム、亜鉛、および/またはビタミンB3を補充した本発明の培地が提供される。特定の実施形態では、培地は、動物タンパク質不含、オリゴペプチド不含、または合成培地であってもよい。特定の実施形態では、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地は、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号で教示のように調製される。これらの特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの内の両方が、あらゆる目的、およびに対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、追加の銅および任意選択の1つまたは複数のカルシウム、亜鉛、およびビタミンB3で補充される。具体的な実施形態では、合成培地は、ダルベッコ変法イーグル培地/ハムF12の1:1混合物DMEM/ハムF12に類似であってもよく、これは追加の銅および任意選択のカルシウム、亜鉛、および/またはビタミンB3で補充されており、培地中で培養された細胞で発現したrVWFまたはrA13の比活性を増加させる。また別の実施形態では、培地は、動物成分不含である。別の実施形態では、培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清等の血清由来の動物タンパク質を含む。別の実施形態では、培養液は、外部から添加された組換え型タンパク質を有する。別の実施形態では、タンパク質は、認定された病原体不含動物由来である。特定の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L~30mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L~10mg/Lの少なくとも1つのポリアミンを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~8mg/Lの少なくとも1つのポリアミンを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~8mg/Lのプトレシンを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L~30mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1~440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L~10mg/Lの少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1~440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~8mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1~440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~8mg/Lのプトレシンならびに表1で設定されたバリエーション1~440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。さらなる態様では、銅に加えて、本発明で使用の細胞培地は、1つまたは複数の追加のカルシウム、亜鉛、1つまたは複数のビタミン、およびこれらのいずれかの組み合わせをさらに含んでもよい。一般的に、任意のカルシウム塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、CaCl2、CaCl2、CaFPO32H2O、CaI2、CaBr2、C2H3O22Ca、CHO22Ca、C6H7O62Ca、C6H5O72Ca32H2O、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能なカルシウム塩が、本発明の培地の補充に使用可能である。一般的に、任意の亜鉛塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、ZnSO47H2O、ZnSO32H2O、C6H5O72Zn32H2O、ZnBr2、ZnBr22H2O、ZnCl2、ZnNO326H2O、ZnH2PO42H2O、C2H3O22Zn2H2O、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な亜鉛塩が、本発明の培地の補充に使用される。他の実施形態では、亜鉛含有ペプチドまたはタンパク質配合物、例えば、インスリンが、本明細書で提供される培養液を補充するのに使用可能である。またさらなる態様では、銅および上記で考察の1つまたは複数の追加の材料を補充した基本細胞培地は、さらに、上清中の低アンモニウムレベルの培養液中で使用可能である。特定の実施形態では、本発明で使用する補充細胞培地は、細胞培養溶液中の10mM未満のアンモニウムレベルを生ずる。さらなる実施形態では、本発明の補充細胞培地は、約0.5~9.5、1.0~9.0、1.5~8.5、2.0~8.0、2.5~7.5、3.0~7.0、3.5~6.5、4.0~6.0、4.5~5.5mMの細胞培養アンモニウムレベルで使用される。一実施形態では、細胞培地および細胞培養上清の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間の長期間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間、すなわち、rVWFまたはrA13が発現し、大規模細胞培養から回収される時間の間、維持される。特定の実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、培養溶液中で、表1に設定のバリエーション1~440の内のいずれか1つで、維持される。好ましい実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、このような産生プロセスの全体時間にわたり維持される。一部の実施形態では、本発明により提供される培地は、液体またはドライまたは粉末形態で提供できる。培地は、単一使用に適した量で事前分注してもよく、または2つ以上の細胞培養に使用可能な多量で提供されてもよい。一般的に、本発明の培地は、無菌の方法で提供されることになる。rVWFまたはrA13を産生するために使用する細胞培地の具体的詳細については、下記で考察される。下記では、rVWFまたはrA13のいずれかに関して考察されるが、下記のrVWFに関する考察のいずれもrA13に対し適用可能であり、逆もまた同じであることは理解されよう。A.組換え型VWF細胞培地本発明の一態様は、組換え型vWF、さらに具体的には、高比活性を有する高分子量vWF、を産生するための細胞培養溶液に関し、これは本明細書でさらに記載される。一実施形態では、本発明高分子量、組換え型vWFを産生するための細胞培養溶液を提供し、この溶液は、少なくとも約2.4μg/Lの濃度の銅を含む細胞培地、および約14~約22の二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を含む高次多量体vWFを発現する複数の細胞を含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む.好ましい実施形態では、細胞培養液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した銅およびアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上記で与えられた濃度で長期間保持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも3日間、または少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多くの日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液を使ってrVWFを産生している合計時間の間、低レベルで維持される。本発明の一実施形態では、細胞培地は、少なくとも約2.4μg/L、別の実施形態では、少なくとも約3μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約4μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約8μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約10μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約15μg/L、およびさらなる実施形態では、少なくとも約20μg/Lの濃度の銅を含んでもよい。他の実施形態では、本発明の細胞培地中の銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/L、別の実施形態では、約2.4μg/L~約15μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L~約10μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L~約8μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L~約6μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L~約4μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L~約20μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L~約15μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L~約10μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L~約8μg/Lの範囲、また、さらなる実施形態では、約4μg/L~約6μg/Lの範囲であってもよい。本発明は、また、高比活性を有するrVWFの発現に適した培地を含む、rVWFの発現または産生用のキットを提供する。B.ADAMTS13A13細胞培地一態様では、本発明は、高比活性を有するADAMTSタンパク質の発現に有用な培地を提供する。好都合にも、培地に銅を補充することにより、補充した培地中で培養した細胞で発現した組換え型ADAMTS例えば、rADAMTS13酵素の活性が大きく高められ、一方、この酵素は、非補充培地中で培養した細胞より発現レベルが高くない場合は、その細胞と同レベルで発現することが明らかになった。一態様では、本発明は、高比活性を有する組換え型ADAMTS13タンパク質の発現のための銅を補充した細胞培地を提供する。一実施形態では、培地に補充して約2~約4μg/Lの合計銅濃度になる。さらなる実施形態では、培地に補充して、約1~3、2~3、3~4μg/Lの合計銅濃度になる。一実施形態では、培地は、少なくとも1μg/Lの銅濃度を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも4μg/Lの銅を含む。他の実施形態では、培地は、2μg/L~20μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、1μg/L~6μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、2μg/L~5μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、3μg/L~4μg/Lの銅を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも1μg/L、または少なくとも2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、11μg/L、12μg/L、13μg/L、14μg/L、15μg/L、16μg/L、17μg/L、18μg/L、19μg/L、20μg/L、またはそれより高い濃度の銅を含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下の、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、表1で設定のバリエーション1~440のいずれか1つに対応した銅とアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上述の濃度で長期間維持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも3日間、または少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはそれを越える日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間、維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間、維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液を使ってrA13を産生する全体時間の間低レベルで維持される。一実施形態では、少なくとも1μg/L銅および少なくとも2μM亜鉛を含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質例えば、rADAMTS13の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地が銅で補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約5μMの亜鉛も含む。一実施形態では、培地は、また、正確にまたは約2μM~12μMのl亜鉛を含む。別の実施形態では、培地は、また、正確にまたは約5μM~12μMの亜鉛を含む。また別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは2μM、または少なくとも正確にまたは約3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM、またはさらに多い亜鉛を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表2で設定されるバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間低レベルで維持される。一実施形態では、少なくとも1μg/Lの銅および少なくとも正確にまたは約0.5mMカルシウムを含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質例えば、rADAMTS13の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも1.5mMカルシウムを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mM~1.5mMカルシウムを含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約0.5mM、または少なくとも正確にまたは約0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに多いカルシウムを含んでもよい。一実施形態では、培地は、表3に設定されるバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウムを含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培地は、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。また別の実施形態では、細胞培地は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度およびならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間低レベルで維持される。一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびカルシウムが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも0.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも1.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、0.5mM~1.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また別の実施形態では、培地は、少なくとも0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに高いカルシウム濃度、ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。一実施形態では、少なくとも1μg/Lの銅および少なくとも2mg/Lのニコチン酸アミドビタミンB3を含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質例えば、rADAMTS13の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも7mg/Lのニコチン酸アミドビタミンB3を含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~10mg/Lのニコチン酸アミドビタミンB3を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、またはそれより高い濃度のニコチン酸アミドビタミンB3を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、培地は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間低レベルで維持される。一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL~10mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。一実施形態では、細胞培地に銅、カルシウムおよびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL~10mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。IV.高比活性を有する血液因子の産生方法A.細胞培養法本発明は、組換え型タンパク質例えば、rVWFおよびrA13の大規模産生方法を提供する。特定の実施形態では、このような大規模産生方法では、これらの治療用組換え型タンパク質の製造に、攪拌式stirred/agitatedタンク型反応器を利用する。特定の実施形態では、本発明の方法は、バッチまたは連続方式で操作される細胞培養システムの使用を含めてもよい。例えば、バッチ式細胞培養が利用される場合は単一バッチ、流加バッチ、または繰返しバッチ方式により操作できる。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタットまたはケモスタット方式により操作できる。バッチおよび連続細胞培養は、浮遊または接着状態で行うことができる。浮遊状態で操作する場合は、細胞は、自由に浮遊し、培地内で混合される。あるいは、接着状態では、細胞は、固相、例えば、マイクロキャリア、多孔性マイクロキャリア、ディスクキャリア、セラミックカートリッジ、中空繊維、フラットシート、ゲルマトリックス、等に固定される。バッチ培養は、通常、単一バッチとして、細胞接種材料が、タンクまたは培養槽中で最大密度に培養され、採取され、さらに処理される大規模細胞培養である。流加バッチ培養は、通常、新鮮な栄養素例えば、増殖制限基質または添加物例えば、産物の前駆物質が供給されるバッチ培養である。供給液は、通常、バイオリアアクターの希釈を避けるために高濃縮される。繰返しバッチ培養では、細胞は、培地中に置かれ、所望の細胞密度まで増殖される。次に、衰退期および細胞死発生を避けるために、細胞が最大濃度に達する前に、培養液が完全増殖培地で希釈される。希釈の量および頻度は、広く変化し、細胞株の増殖特性および培養プロセスの都合に依存する。このプロセスは、必要に応じ何回でも繰り返すことができ、継代培養時に細胞と培地が廃棄されない限り、培養液の容量は希釈毎に段階的に増えることになる。容量の増加は、充分な大きさの反応器にして容器内での希釈を可能にするか、または希釈した培養液をいくつかの容器に分けることにより対処できる。このタイプの培養の原理は、指数関数的増殖状態中で細胞を維持することである。連続継代培養は、培養液の容量が段階的に増加し、複数回の細胞採取ができ、細胞が増殖を続け、さらにそのプロセスを望む限り続けることができるという点が特徴である。特定の実施形態では、組換え型ADAMTSタンパク質例えば、rADAMTS13は、バッチ培養の上清採取後、回収できる。他の実施形態では、組換え型VWFは、バッチ培養の上清採取後、回収できる。連続培養は、新しい培地の流入により栄養素が連続的に供給される浮遊培養であってもよく、この場合、培養液容量は、通常、同時に生ずる消費された培地の除去により、一定に保持される。ケモスタットおよびタービドスタット法では、抽出した培地は、細胞を含む。従って、細胞培養容器に残っている細胞は、定常状態を維持するために増殖する必要がある。ケモスタット法では、成長速度は、通常、希釈速度、すなわち、新しい培地が添加される速度を調節することにより制御される。培養液中の細胞の成長速度は、希釈速度を変えることにより、例えば、準最大成長速度に制御できる。対称的に、タービドスタット法では、希釈速度は、pHや温度等の所与の操作条件で細胞が到達できる最大成長速度を可能とするように設定される。特定の実施形態では、rVWFまたはrA13は、連続培養の上清採取の後で回収される。連続細胞培養の代表的方法は、国際公開第2011/012725号Grillbergeretal.に記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。灌流培養では、抽出した培地は細胞が枯渇しており、細胞は、例えば、濾過または遠心法により培養液中への細胞を再導入して培養容器中で維持される。しかし、通常、濾過に使用される膜では、100の細胞を保持できないので、培地が抽出される際に、一部は除去される。大部分の細胞は培養容器中に保持されるので、非常に大きい成長速度で灌流培養を行う目的に対しては、これは重要なことではないであろう。特定の実施形態では、rVWFまたはrA13は、灌流培養の上清を採取後、回収される。攪拌式タンク型反応器システムは、浮遊または接着方式で操作されるバッチおよび連続細胞培養に対し使用できる。一般的に、攪拌式タンク型反応器システムは、いずれかの型の攪拌器、例えば、Rushton翼,水中翼,傾斜翼,または船舶翼と組み合わせて、どの従来の攪拌式タンク型反応器としても操作できる。特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法にマイクロキャリアの使用を含めてもよい。一部の実施形態では、その実施形態の細胞培養を、大きなバイオリアクター中で、高細胞密度およびタンパク質発現を得るための高容量特異的培養表面積の提供に適した条件下で行うことができる。このような増殖条件を得る1つの手段は、攪拌式タンク型バイオリアクター中で細胞培養用マイクロキャリアを使うことである。マイクロキャリア上での細胞増殖の概念は、最初にvanWezelvanWezel、A.L.、Nature216:64-51967により記載され、増殖培地中に懸濁された小さい固体粒子の表面上の細胞接着を考慮している。これらの方法は、高表面-対-容量比率を与え、その結果として、効率的な栄養素利用を可能とする。さらに、真核細胞株中の分泌タンパク質の発現に関しては、増加した表面-対-容量比率が、より高レベルの分泌、およびその結果の培養液上清中のより高いタンパク質収率を可能とする。最終的に、これらの方法は、真核生物発現培養の規模拡大を容易にする。vWFおよび/またはrA13を発現している細胞は、細胞培養増殖中に球状または多孔性マイクロキャリアに結合できる。マイクロキャリアは、Butler1988.SpierGriffiths、AnimalCellBiotechnology3:283-303により記載されているような、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロース、等をベースとしたマイクロキャリア分から選択されるマイクロキャリアであってよい。また、細胞を球状マイクロキャリア上で生物量に増殖させて、最終培養槽生物量達した後に多孔性マイクロキャリア上の発現タンパク質を産生する前に、またはその逆の場合に、細胞を継代することが可能である。適切な球状マイクロキャリアには、スムーズ表面マイクロキャリア、例えば、Cytodex登録商標1、Cytodex登録商標2、およびCytodex登録商標3GEHealthcare、ならびにマクロ多孔性マイクロキャリア、例えば、Cytopore登録商標1、Cytopore登録商標2、Cytoline登録商標1、およびCytoline登録商標2GEHealthcareを含めてもよい。上述のように、本発明は、銅濃度を増加させた細胞培地を含む。上記細胞培地セクションで記載された全ての実施形態および濃度が、本明細書記載の発明の方法に適用できることを理解されたい。特定の実施形態では、培養は、少なくとも約7日、または少なくとも約14日、21日、28日、または少なくとも約5週、6週、7週、8週、9週、または少なくとも約2ヶ月、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18ヶ月の間またはさらに長い期間の間、維持してもよい。細胞培養が組換え型vWFまたは組換え型rA13タンパク質の産生のために維持される細胞密度は、タンパク質発現に使われる培養条件および培地に依存する。当業者なら、rVWFまたはrA13産生細胞培養用の最適細胞密度を容易に決定できるであろう。一実施形態では、培養は、約0.5x106~4x107細胞/mLの細胞密度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106~約1.0x107細胞/mLの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106~約4.0x106細胞/mLの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106~約4.0x106細胞/mLの濃度で長期間維持される。また他の実施形態では、細胞密度は、約2.0x106~約4.0x106細胞/mL、または約1.0x106~約2.5x106細胞/mL、または約1.5x106~約3.5x106細胞/mL、またはいずれかの他の類似の範囲の濃度で長期間維持できる。一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。以下に、rVWFおよびrA13産生方法に関する具体的詳細内容を提供する。これから分かるように、rVWFまたrA13に対し条件が具体的に提示されているが、rVWFに対する条件は、rA13の産生に使用可能であり、逆もまた同様である。B.高分子量組換え型vWFの産生方法別の態様では、本発明は、さらに、銅濃度を増加させた細胞培地を含む細胞培養条件下でのvWF産生方法に関する。特定の実施形態では、培養液は、また、低アンモニウム濃度をも含む。本明細書で使用される用語の細胞培養および細胞培養溶液は同義に使用される。一実施形態では、本発明は、高分子量、組換え型vWFの産生方法を提供し、この方法は:a細胞培養液を用意すること;bvWFをコードする核酸配列を導入すること;c核酸配列を含む細胞を選択すること;および、d少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度を含む細胞培地および約10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFを発現させることを含み、ここでvWFは、約14~約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFである。さらなる実施形態では、本発明の方法を使って産生された多量体rVWFは、約10~30、12~28、14~26、16~24、18~22、20~21の二量体を含む。またさらなる実施形態では、本発明により産生されたrVWFは、少なくとも約20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80mU/μg、またはさらに高い比活性を有する.具体的な実施形態では、rVWF産生用連続細胞培養の細胞密度は、2.5x106細胞/mL以下の濃度で長期間維持される。他の具体的な実施形態では、細胞密度は、2.0x106細胞/mL、1.5x106細胞/mL、1.0x106細胞/mL、0.5x106細胞/mL以下、またはさらに少ない密度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、1.5x106細胞/mL~2.5x106細胞/mLで維持される。一実施形態では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.0μg/Lの最終銅濃度とするステップ;crVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d銅補充細胞培地に入れた1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも30mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM未満のアンモニウム濃度で、少なくとも7間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも3μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4.3μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して2μg/L~20μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して3μg/L~10μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して4μg/L~7.5μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充するステップ;crVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d銅補充細胞培地中で1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで上清のNH4濃度が低レベルで少なくとも7日間維持され、さらに、回収上清が少なくとも30mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも14日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも21日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも28日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも5週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも6週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも7週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも8週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4濃度は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも9週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、本発明は、組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組成物の産生方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充し少なくとも2.0μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;crVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;e培養液上清のアンモニウム濃度をモニタリングするステップ;およびf少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで10mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清がrVWF組成物産生に使用されず、さらに、回収上清が少なくとも30mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2~20μg/L、2~10μg/L、3~8μg/L、または4~6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、6mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2~20μg/L、2~10μg/L、3~8μg/L、または4~6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、5mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2~20μg/L、2~10μg/L、3~8μg/L、または4~6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一実施形態では、4mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2~20μg/L、2~10μg/L、3~8μg/L、または4~6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μgrVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。組換え型vWFは、適切な真核生物宿主系での発現により産生出来る。真核細胞の例には、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep、およびHepG2;昆虫細胞、例えば、SF9細胞、SF21細胞、S2細胞、およびHighFive細胞;ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞、が含まれる。一実施形態では、vWFは、酵母細胞、昆虫細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株、等中で発現可能である。一特定実施形態では、細胞株は、CHO、BHK、またはHEK細胞株である。通常、哺乳動物細胞、例えば、連続継代性細胞株由来のCHO細胞は、本発明のvWFの発現に使用可能である。特定の実施形態では、vWFをコードする配列を含む核酸配列は、ベクターであってもよい。ベクターは、ウイルスにより送達されてもよく、プラスミドであってもよい。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子でも、またはそれの生物学的に機能的な部分であってもよい。一実施形態では、タンパク質は、少なくともvWFの生物学的に活性な部分である。各種ベクターをvWFの発現に使用でき、真核生物発現ベクターから選択できる。真核生物発現用ベクターの例には、:ipAO、pPIC、pYES、pMET等のベクターが、AOX1、ギャップ、GAL1、AUG1、等のプロモーターを使って酵母中での発現用として;ii、pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC、等のベクターが、PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh、等のプロモーターを使って、昆虫細胞中での発現用として、ならびにiiipSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV、等のベクター、および、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、等のウイルス系由来のベクターが、CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV、およびβ-アクチン等のプロモーターを使って、哺乳動物細胞中での発現用として、含まれる。rVWF発現用代表的ベクターは、Kaufmanetal.MolCellBiol.1989Mar;93:1233-42により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。本発明の一部の実施形態では、核酸配列は、タンパク質の発現制御のために適した他の配列、例えば、当業者には通常既知である、プロモーター配列、エンハンサー、TATAボックス、転写開始部位、ポリリンカー、制限酵素部位、ポリA配列、タンパク質プロセッシング配列、選択マーカー、等をさらに含む。銅濃度の増加した細胞培地に加えて、本発明細胞培養条件は、培養系の上流プロセス全体にわたって約25mM未満のアンモニウム濃度を含んでもよい。一実施形態では、細胞培養条件には、約25mM未満、別の実施形態では約20mM未満、さらに別の実施形態では約15mM未満、さらに別の実施形態では約10mM未満、およびさらなる実施形態では約5mM未満のアンモニウム濃度を含む。一部の実施形態では、本発明のアンモニウム濃度は、細胞培養系の全上流プロセスにわたり一定に保持される。本発明により使用される細胞は、例えば、この分野で通常知られている従来のバッチ培養および流加培養に比べて、改良されている方法により培養できる。しかし、このような従来の技術は、培養の最後に高濃度のアンモニウムを生じる可能性がある。本発明の方法は、例えば、灌流またはケモスタット培養等の技術により培地の連続的供給が可能な産生系を採用することによりこの問題を克服する。宿主細胞の培養後、vWFは、限外濾過または遠心分離等の標準的な方法を使って、消費培地から回収できる。所望により、vWFは、例えば、イオン交換および/またはサイズ排除クロマトグラフィー、等により精製できる。連続培養例えば、灌流またはケモスタット培養は、新しい培地の流入により栄養素を連続的に供給する浮遊培養であってもよく、この場合、培養容量は常に一定である。同様に、連続発酵は、バイオリアクターから細胞懸濁液の除去により正確に平衡が保たれている新しい培地の連続追加により、細胞または微生物が指数増殖期に培養液中で維持されるプロセスを意味しうる。さらに、攪拌式タンク型反応器システムは、浮遊、灌流、ケモスタット、および/またはマイクロキャリア培養に対し使用可能である。通常、攪拌式タンク型反応器システムは、いずれかの型の攪拌器、例えば、Rushton翼、水中翼、傾斜翼、または船舶翼と組み合わせて、どの従来の攪拌式タンク型反応器としても操作できる。C.組換え型ADAMTS13A13の産生方法別の態様では、本発明は、さらに銅濃度を増やした細胞培地を含む細胞培養条件下で、rA13を産生する方法に関する。特定の実施形態では、培養液は、また、低アンモニウム濃度を含む。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも1.0μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで少なくとも1500ユニットのFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日すなわち、1500ユニットのFRETS-VWF73活性/日/L細胞培養;PFRETSが回収培養液上清中に存在する。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、1~6μg/L、2~5μg/L、2~4μg/L、または3~4μg/Lである。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。特定の実施形態では、この方法は、量的FRETS-VWF73生産性PFRETSの持続性のある改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多い日数の間、毎日回収される。具体的な実施形態では、rA13の産生用連続細胞培養の細胞密度は、4.0x106細胞/mL以下の濃度で長期間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞密度は、3.5x106細胞/mL、3.0x106細胞/mL、2.5x106細胞/mL、2.0x106細胞/mL、1.5x106細胞/mL、1.0x106細胞/mL以下、またはさらに低い密度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、3.0x106細胞/mL~4.0x106細胞/mLで維持される。上述の方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも4ユニットFRETS-VWF73活性/mL上清FRETSを有する。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも6ユニットFRETS-VWF73活性/mL上清を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも8ユニットFRETS-VWF73活性/mL上清を有する。最も好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも10ユニットFRETS-VWF73活性/mL上清を有する。特定の実施形態では、この方法は、FRETS産生の持続的改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも4ユニットFRETS-VWF73活性/mLを有する上清が、毎日、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間回収される。好ましい実施形態では、少なくとも6ユニットFRETS-VWF73活性/mLを有する上清が、毎日、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも8ユニットFRETS-VWF73活性/mLを有する上清が、毎日、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも10ユニットFRETS-VWF73活性/mLを有する上清が、毎日、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間回収される。上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、少なくとも800mUのFRETS-VWF73活性/培養液中の106細胞/日すなわち、qFRETSを生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも1UのFRETS-VWF73活性/培養液中の106細胞/日を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも1.2UのFRETS-VWF73活性/培養液中の106細胞/日を生ずる。最も好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも1.4UのFRETS-VWF73活性/培養液中の106細胞/日を生ずる。特定の実施形態では、この方法は、細胞特異的FRETS-VWF73生産性qFRETSの持続的改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも800mUのFRETS-VWF73活性/培養液中106細胞を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも1UのFRETS-VWF73活性/培養液中106細胞を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも1.2UのFRETS-VWF73活性/培養液中106細胞を生ずる。最も好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、少なくとも1.4UのFRETS-VWF73活性/培養液中106細胞を生ずる。上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも1mgのrA13/L培養液/日PELISAを生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも1.5mgのrA13/L培養液/日PELISAを生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも2mgのrA13/L培養液/日PELISAを生ずる。特定の実施形態では、この方法は、rA13産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも1mgのrA13/L培養液を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも1.5mgのrA13/L培養液を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも2mgのrA13/L培養液を生ずる。上述の方法の一実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも0.5μgのrA13/培養液中106細胞/日すなわちqELISAを生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも0.7μgのrA13/培養液中106細胞/日を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、ELISAで測定して、少なくとも0.9μgのrA13/培養液中106細胞/日を生ずる。特定の実施形態では、この方法は、qELISA産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも0.5μgのrA13/培養液中106細胞を生ずる。好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも0.7μgのrA13/培養液中106細胞を生ずる。さらに好ましい実施形態では、細胞培養は、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、ELISAで測定して、少なくとも0.9μgのrA13/培養液中106細胞を生ずる。上述の方法の一実施形態では、回収上清は、ELISAで測定して、少なくとも3μgのrA13/mL上清を有する。好ましい実施形態では、回収上清は、ELISAで測定して、少なくとも4μgのrA13/mL上清を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、ELISAで測定して、少なくとも5μgのrA13/mL上清を有する。最も好ましい実施形態では、回収上清は、ELISAで測定して、少なくとも6μgのrA13/mL上清を有する。特定の実施形態では、この方法は、rA13産生の持続した改善を提供する。例えば、特定の実施形態では、少なくとも3μgのrA13/mLを有する上清が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。好ましい実施形態では、少なくとも4μgのrA13/mLを有する上清が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。さらに好ましい実施形態では、少なくとも5μgのrA13/mLを有する上清が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。最も好ましい実施形態では、少なくとも6μgのrA13/mLを有する上清が、少なくとも7日間、または少なくとも14、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはさらに多い日数の間、毎日、回収される。上述の方法の一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間すなわち、培養液が使用されrA13を産生している全時間の間、低レベルで維持される。特定の実施形態では、培養溶液は、表1で設定されたバリエーション1~440のいずれか1つに対応する銅およびアンモニウム濃度を有する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅および亜鉛を補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が、回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも1μg/L銅および少なくとも2μM亜鉛を含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/L銅または少なくとも4μg/L銅を含む。培地が銅で補充される一実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約5μM亜鉛を含む。一実施形態では、培地は、また、正確にまたは約2μM~12μM亜鉛を含む。別の実施形態では、培地は、また、正確にまたは約5μM~12μM亜鉛を含む。また他の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約2μM、または少なくとも正確にまたは約3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM、またはさらに多い亜鉛を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応する銅および亜鉛濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が、回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が、回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が、回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅およびカルシウムを補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも1μg/L銅および少なくとも0.5mMカルシウムを含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/L銅または少なくとも4μg/L銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも1.5mMカルシウムを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mM~1.5mMカルシウムを含む。また他の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約0.5mM、または少なくとも正確にまたは約0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに多いカルシウムを含んでもよい。一実施形態では、培地は、表3に設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物産生方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地の銅、亜鉛、およびカルシウムを補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも0.5mMのカルシウム濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも1.5mMのカルシウム濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、0.5mM~1.5mMのカルシウム濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに多いカルシウム濃度、および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物の産生方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅およびニコチン酸アミドを補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、培地は、少なくとも1μg/L銅および少なくとも2mg/Lニコチン酸アミドビタミンB3を含む。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/L銅または少なくとも4μg/L銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも7mg/Lニコチン酸アミドビタミンB3を含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L~10mg/Lニコチン酸アミドビタミンB3を含む。また他の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、またはさらに高い濃度のニコチン酸アミドビタミンB3を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表4で設定されたバリエーション1321~1760のいずれか1つに対応した銅とニコチン酸アミド濃度を含む。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物の産生方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅、亜鉛、およびニコチン酸アミドを補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、細胞培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL~10mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度および表2で設定されたバリエーション441~880のいずれか1つに対応した銅と亜鉛濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、本発明は、組換え型ADAMTS13rA13組成物を産生する方法を提供し、この方法は、a基本細胞培地を用意するステップ;b基本細胞培地に銅、カルシウム、およびニコチン酸アミドを補充するステップ;crA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;d1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rA13を発現させ、これを細胞から培養液上清に排出させるステップ;およびe少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで、少なくとも1500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。一実施形態では、細胞培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表3で設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表3で設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL~10mg/mLのニコチン酸アミド濃度および表3で設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度、および表3で設定されたバリエーション881~1320のいずれか1つに対応した銅とカルシウム濃度を有する。好ましい実施形態では、少なくとも2000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。さらに好ましい実施形態では、少なくとも2500ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。最も好ましい実施形態では、少なくとも3000ユニットFRETS-VWF73活性/L補充基本細胞培地/日が回収培養液上清中に存在する。組換え型ADAMTSタンパク質は、いずれかの適切な原核生物または真核生物宿主系での発現により産生出来る。真核細胞の例には、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep、およびHepG2;昆虫細胞、例えば、SF9細胞、SF21細胞、S2細胞、およびHighFive細胞;ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞が含まれる。一実施形態では、ADAMTSタンパク質は、細菌性細胞、酵母細胞、昆虫細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株、ハムスター細胞株、またはマウス細胞株、等中で発現させてもよい。一特定の実施形態では、細胞株は、CHO、BHK、またはHEK細胞株である。好ましい実施形態では、細胞株は、CHO細胞株である。具体的な実施形態では、安定にrA13を発現できるCHOクローンは、rA13およびジヒドロ葉酸還元酵素例えば、マウスdhfr遺伝子用のコード配列を有するCHO細胞で同時形質移入し、漸増量のメトトレキサートの存在中での増殖に対し選択することにより調製される。一実施形態では、細胞は、培養、好ましくは、製造プロセスすなわち、少なくとも10L、好ましくは、少なくとも100L中で培養してADAMTS13等の所望のADAMTSタンパク質を産生可能ないずれの哺乳動物細胞でもよい。例には、SV40COS-7、ATCCCRL1651により形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚性腎臓株浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた293または293細胞、Grahametal.、J.GenVirol.、36:591977;ベビーハムスター腎臓細胞BHK、ATCCCCL10;チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR、例えば、DUKX-B11サブクローンCHO、UriaubandChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:42161980;マウスセルトリ細胞TM4、Mather、Biol.Reprod、23:243-2511980;サル腎臓細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頚癌細胞HeLa、ATCCCCL2;イヌ腎臓細胞MDCK、ATCCCCL34;バッファローラット肝臓細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝臓細胞HepG2、HB8065;マウス乳房腫瘍MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matheretal.、AnnalsN.Y.Acad.Sci.、383:44-681982;MRC5細胞;FS4細胞;およびヒト肝細胞癌株HepG2が含まれる。好ましくは、細胞株は、げっ歯類細胞株、特に、ハムスター細胞株、例えば、CHOまたはBHKである。各種のベクターをADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13の発現用に使用可能であり、真核生物および原核生物発現ベクターから選択できる。特定の実施形態では、プラスミドベクターが、ADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13の発現のための使用に意図されている。一般的に、プラスミドベクターは、宿主細胞に適合する種由来で、これらの宿主と連携して使われるレプリコンおよび制御配列を含む。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞中で表現型の選択を提供できるマーカー配列を持つことができる。プラスミドは、1つまたは複数の制御配列、例えば、プロモーターと機能的に連結されたADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13をコードするヌクレオチド配列を含む。組換え型ADAMTSタンパク質を発現する安定なCHO細胞クローンを調製するための好ましい方法は、以下の通りである。DHFR欠損CHO細胞株DUKX-B11にDHFR発現ベクターで形質移入し、関連組換え型タンパク質を発現させる。代表的な方法は、Plaimaueretal.Blood.2002Nov15;10010:3626-32.Epub2002Jul12により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。選択をヒポキサンチン/チミジンHT不含培地中での増殖および組換え型ADAMTSタンパク質発現関連領域コードの増幅により行い、また、DHFR遺伝子は、漸増濃度のメトトレキサート中での細胞増殖により得られる。基本的には、米国特許第6、100、061号Reiteretal.、lmmunoAktiengesellschaftで記載されているように、適切な場合には、CHO細胞株は、血清および/またはタンパク質不含培地中での増殖に適している。別の好ましい実施形態では、安定なHEK293細胞は、ヒグロマイシン選択可能マーカーを含む構築物で形質移入し、抗生物質耐性により形質転換体を選択することにより調製される。特定のウイルスの、細胞に感染する能力、または受容体媒介エンドサイトーシスによる細胞へ侵入する能力、および宿主細胞ゲノム中へ組み込み、ウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力は、ウイルスを外部核酸の細胞例えば、哺乳動物細胞中への移入のための魅力的な候補にしている。従って、特定の実施形態では、ウイルスベクターを使ってADAMTS例えば、ADAMTS13タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現のために宿主細胞中に導入する。ウイルスベクターは、ADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13をコードする1つまたは複数の制御配列、例えば、プロモーターに機能的に連結されたヌクレオチド配列を含む。あるいは、ウイルスベクターは、制御配列を含まず、代わりに、宿主細胞内の制御配列に依存してADAMTSタンパク質の発現を進行させてもよい。核酸を送達するために使用できるウイルスベクターの非制限的例には、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれる。一実施形態では、アデノウイルス発現ベクターは、構築物のパッケージングを支援し、最終的にその中に挿入されているADAMTS構築物を発現するために充分なアデノウイルス配列を含む構築物を含む。アデノウイルスベクターは、7kbまでの外部配列の挿入を可能とするGrunhausetal.、SeminarinVirology、2002:535-546、1992。別の実施形態では、アデノ随伴ウイルスAAVは、ADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13をコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞中に導入するのに使用できる。AAV系は、以前記載されており、一般的には当技術分野でよく知られているKelleherandVos、Biotechniques、176:1110-7、1994;Cottenetal.、ProcNatlAcadSciUSA、8913:6094-6098、1992;Curiel、NatImmun、132-3:141-64、1994;Muzyczka、CurrTopMicrobiolImmunol、158:97-129、1992。rAAVベクターの生成と使用に関する詳細は、例えば、米国特許第5,139,941号および同4,797,368号に記載されているそれぞれ、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、レトロウイルス発現ベクターは、ADAMTSタンパク質例えば、ADAMTS13をコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞中に導入するのに使用できる。これらの系は、以前に記載されており、一般的には、当技術分野でよく知られているMannetal.、Cell、33:153-159、1983;NicolasandRubinstein、ベクター:分子クローニングベクターの概要と使用法Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses、RodriguezandDenhardt、eds.、Stoneham:Butterworth中の、pp.494-513、1988;Temin、遺伝子移入GeneTransfer、Kucherlapatied.、NewYork:PlenumPress、中のpp.149-188、1986。具体的な実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである例えば、Naldinietal.、Science、2725259:263-267、1996;Zuffereyetal.、NatBiotechnol、159:871-875、1997;Blomeretal.、JVirol.、719:6641-6649、1997;米国特許第第6,013,516号および同5,994,136号、を参照。原核生物発現のためのベクターの非制限的例には、プラスミド、例えば、pRSET、pET、pBAD、等が含まれ、原核生物発現ベクターで使われるプロモーターには、ラック、trc、trp、recA、araBAD、等が含まれる。真核生物発現のためのベクターの例には、iプロモーター、例えば、AOX1、GAP、GAL1、AUG1、等を使った酵母中での発現用ベクター、例えば、pAO、pPIC、pYES、pMET;iiプロモーター、例えば、PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh、等を使った昆虫細胞中での発現用ベクター、例えば、pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC、等、およびiiiプロモーター、例えば、CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV、およびβ-アクチンを使った哺乳動物細胞中での発現用ベクター、例えば、pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV、等、およびウイルス系、例えば、ワクチニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、等由来のベクターが含まれる。rA13発現用の代表的ベクターは、Plaimaueretal.Blood.2002Nov15;10010:3626-32.Epub2002Jul12により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法は、マイクロキャリアの使用を含んでもよい。本発明は、他の態様の中でも特に、大規模ADAMTSタンパク質の発現方法を提供する。一部の実施形態では、高細胞密度およびタンパク質発現を実現するために、大容量に特異的な培養表面積を得るのに適した条件下で、大きなバイオリアクター中で細胞培養を行うことができる。このような増殖条件を得る1つの手段は、攪拌式タンク型バイオリアクター中での細胞培養用のマイクロキャリアを使うことである。別の実施形態では、これらの増殖要件は、浮遊細胞培養の使用により満たされる。V.具体的な実施形態A.組換え型フォンヴィレブランド因子rVWF組換え型vWFは、哺乳動物細胞中で発現させることができるが、vWFの比活性は、細胞培養条件により大きく変動する可能性があり、血漿から単離されたvWFの比活性に匹敵するか、または等しい値が今まで得られたことがない。本発明は、一部は、少なくとも2.4μg/Lの銅を有する細胞培地が、高比活性を有する高分子量vWFの発現を促進する好都合な効果を与えるという予期せぬ結果に基づいている。特に、本発明の高分子量、組換え型vWFは、約14~約22の二量体をおよび少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体型を含むことができる。本発明による細胞培養プロセスは、また、細胞培養系の上流プロセスの間に、低NH4レベル例えば、10mM未満の維持を可能とし、それにより、翻訳後修飾に対する有害作用を減らすことができる。本発明は、高比活性を有する高次多量体vWFを発現するための、上清中の適切な銅濃度を適切なアンモニウムレベルと組み合わせて有する培地を含む初めての細胞培養条件を提供すると考えられる。一態様では、本発明は、高比活性の組換え型、高分子量vWFを産生する細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件は、例えば、増加した銅濃度および/または低アンモニウムNH4濃度の細胞培養上清を有する細胞培地を含んでもよい。本発明は、また、高比活性の高分子量vWFを発現するための細胞培養条件下で細胞を培養する方法を提供する。一態様では、本発明は、高分子量、組換え型vWFタンパク質を産生するための細胞培養溶液を提供し、細胞培養溶液は、少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度を含む細胞培地;10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清;および高次多量体vWFタンパク質を発現する複数の細胞を含み、vWFタンパク質は、少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、細胞培養溶液は、銅を含む培地補充剤を含む。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、培地補充剤は、加水分解物、任意選択で、大豆加水分解物を含む。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、培地補充剤は、銅塩、銅キレート、およびこれらの組み合わせを含む。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅濃度は、少なくとも約4μg/Lである。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/Lである。上述の細胞培養の一具体的な実施形態では、vWFタンパク質は、約14~約22の二量体を含む。一態様では、本発明は、高分子量、組換え型vWFタンパク質を産生する方法を提供し、この方法は、a組換え型vWFタンパク質コードする核酸を含む細胞培養液を用意するステップ;b少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度および約10mM未満のアンモニウム濃度を有する細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下でvWFタンパク質を細胞中で発現させるステップを含み、vWFタンパク質は、高次多量体vWFタンパク質であり、少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む。上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来である。上述の方法の一具体的な実施形態では、細胞は、CHO細胞である。上述の方法の一具体的な実施形態では、銅濃度は、少なくとも約4μg/Lである。上述の方法の一具体的な実施形態では、銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/Lである。上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、少なくとも約50mU/μg少なくとも約50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、約30mU/μg~約100mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の方法の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、約14~約22二量体を含む。一態様では、本発明は、あるプロセスにより産生された高分子量、組換え型vWFタンパク質を提供し、そのプロセスは、a組換え型vWFタンパク質をコードする核酸を含む細胞培養液を用意するステップ;およびb少なくとも2.4μg/Lの銅濃度および10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFタンパク質を発現させるステップを含み、vWFタンパク質は、高次多量体vWFタンパク質であり、少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む。上述のrVWF組成物の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、少なくとも約50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述のrVWF組成物の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、約30mU/μg~約100mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述のrVWF組成物の一具体的な実施形態では、組換え型vWFタンパク質は、約14~約22二量体を含む。一態様では、本発明は、高分子量、組換え型vWFタンパク質を産生するための細胞培養溶液を提供し、この細胞培養溶液は、少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度を含む細胞培地;10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清;および高次多量体vWFタンパク質を発現する複数の細胞を含み、vWFタンパク質は、約14~約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む。一態様では、本発明は、高比活性の高次多量体型である組換え型高分子量vWFを産生する細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件は、例えば、増加した銅濃度および低アンモニウムNH4濃度を有する細胞培養上清を有する細胞培地を含んでもよい。本発明は、また、高比活性の高分子量vWFを発現するための細胞培養条件中で細胞を培養する方法を提供する。一態様では、本発明は、高分子量、組換え型vWF産生用細胞培養溶液を含み、細胞培養溶液は、少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度;10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清;および約14~約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFを発現する複数の細胞を含む細胞培地を含む。上述の細胞培養溶液の一実施形態では、少なくとも10のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも25のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約4μg/Lであってよく、または銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/Lの範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。特定の実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来であってもよく、また、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型vWFは、少なくとも約50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有し、または特異的リストセチンコファクター活性は、約30mU/μg~約100mU/μgの範囲であってもよい。別の態様では本発明は、高分子量、組換え型vWFを産生する方法を含み、この方法は、a細胞培養液を用意するステップ;bvWFをコードする核酸配列を導入するステップ;cその核酸配列を有する細胞を選択するステップ;および、d少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度および約10mM未満のアンモニウム濃度の細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFを発現させるステップを含み、ここで、vWFは約14~約22二量体、および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFである。上述の細胞培養上清の一実施形態では、少なくとも10のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20のrVWFが10超の別の具体的な実施形態では、少なくとも25のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。一部の実施形態では、細胞は、連続継代細胞株由来でもよく、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約4μg/Lでもよく、または銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/Lの範囲であってよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはそれらの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型vWFは、少なくとも約50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有してもよく、または約30mU/μg~約100mU/μgの範囲の特異的リストセチンコファクター活性であってもよい。また別の態様では、本発明は、あるプロセスで産生された高分子量、組換え型vWFを含み、そのプロセスは、a細胞培養液を用意するステップ;bvWFをコードする核酸配列を導入するステップ;cその核酸配列を有する細胞を選択するステップ;および、d少なくとも2.4μg/Lの銅濃度および10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFを発現させるステップを含み、vWFは、約14~約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFである。上述の細胞培養上清の一実施形態では、少なくとも10のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも25のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーとして存在する。一部の実施形態では、細胞は、連続継代性細胞株由来であってよく、または哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、銅濃度は、少なくとも約4μg/Lであってよく、または銅濃度は、約2.4μg/L~約20μg/Lの範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞培地は、銅を含む培地補充剤を含む。特定の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物または銅塩、銅キレート、もしくはこれらの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、または酸化銅を含んでもよい。一部の実施形態では、組換え型vWFは、少なくとも約50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有し、または特異的リストセチンコファクター活性は、約30mU/μg~約100mU/μgの範囲であってもよい。一態様では、本発明は、少なくとも30mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する組換え型フォンヴィレブランド因子rVWFを含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも40mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも60mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも70mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。またさらに好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも80mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を有する。上述の組成物の一実施形態では、組成物中の少なくとも10のrVWFが10超の二量体の高分子量VWFマルチマーとして存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15のrVWFが10超の二量体の高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20のrVWFが10超の二量体の高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも25のrVWFが10超の二量体の高分子量VWFマルチマーとして存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30のrVWFが10超の二量体の高分子量VWFマルチマーとして存在する。上述の組成物の一実施形態では、組成物は、培養液上清を含む。一具体的な実施形態では、培養液上清は、哺乳動物細胞培養液上清である。さらなる具体的な実施形態では、哺乳動物細胞培養液上清は、CHO細胞上清である。上述の組成物の一実施形態では、rVWFは、少なくとも2.4μg/L銅を含む細胞培養液中で発現する。具体的な実施形態では、細胞培養は、少なくとも4μg/L銅を含む。さらなる具体的な実施形態では、培養液は、2.4μg/L~20μg/L銅を含む。一実施形態では、銅は、銅塩、銅キレート、またはこれらの組み合わせとして提供される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養である。上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、連続培養である。具体的な実施形態では、連続培養は、ケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、連続培養は、灌流方式で行われる。上述の組成物の一実施形態では、培養液中のNH4のレベルは、4mM未満の濃度に維持される。上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、2.5x106細胞/mL未満に維持される。上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、2.0x106細胞/mL未満に維持される。上述の組成物の一実施形態では、培養液は、1.5x106細胞/mL未満に維持される。上述の組成物の一実施形態では、rVWFは、組換え型第VIII因子rFVIIIと同時発現する。具体的な実施形態では、大部分の同時発現したrFVIIIは、除去された。さらなる具体的な実施形態では、組成物中のrVWFのrFVIIIに対する比率は、少なくとも10:1である。上述の組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与用に処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与用に処方される。上述の組成物の一実施形態では、組成物は凍結乾燥される。また別の態様では、本発明は、あるプロセスで産生された高分子量、組換え型vWFを含み、そのプロセスは、a細胞培養液を用意するステップ;bvWFをコードする核酸配列を導入するステップ;c細胞を有するその核酸配列を選択するステップ;および、d少なくとも2.4μg/Lの銅濃度および10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培地を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFを発現させるステップを含み、ここで、vWFは、約14~約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFである。上記細胞培地および組換え型vWFの導入方法セクション中で記載されている全ての実施形態および濃度は、ここでも適用できることは理解されよう。本発明の組換え型vWFは、高比活性の高分子量組換え型vWFタンパク質を含んでもよい。一実施形態では、本発明のvWFは、vWFの高次多量体型である。一部の実施形態では、vWFの高次多量体型は、少なくとも約14二量体までを含み、他の実施形態では、少なくとも約22二量体までを含む。また他の実施形態では、vWFの高次多量体型は、約10~約20二量体、または約15~約25二量体、または約20~約40二量体の範囲であってもよい。特定の実施形態では、組換え型vWFは、血漿vWFに匹敵する。本明細書に記載のように、本発明は、細胞培地中の増加させた銅濃度により、高比活性の高分子量vWFを産生出来るという予期せぬ結果を提供する。例えば、約2.4μg/Lを越える銅濃度を含む細胞培地は、銅を含まない培地に比べて、組換え型多量体vWFの収率を増やすことができる。特定の実施形態では、多量体vWFすなわち、少なくとも2つの二量体を含むrVWFの割合は、約50超、または約75超、または約90超となりうる。vWFの多量体分布は、標準的な方法、例えば、非還元条件下のアガロース電気泳動法を使って分析可能である。本明細書で提供のように、本発明の方法により産生された組換え型vWFは、高比活性、例えば、高特異的リストセチンコファクター活性を持つことができる。一実施形態では、本発明の方法により産生された組換え型vWFは、少なくとも30mU/μg、および別の実施形態では、少なくとも50mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を含んでもよい。他の実施形態では、特異的リストセチンコファクター活性は、約30mU/μg~約100mU/μgまたは約50mU/μg~約100mU/μgの範囲であってもよい。B.組換え型ADAMTS13rA13ADAMTSタンパク質すなわち、ADAMTS-1~ADAMTS-20は、共通モジュラードメイン組織を共有する分泌亜鉛メタロプロテイナーゼファミリーであるFlanneryC.R.、FrontBiosci.2006Jan1;11:544-69のレビュー参照。全てのADAMTSタンパク質は、シグナルペプチド、続けて、亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジンI型反復、システィンリッチドメイン、およびスペーサードメインから構成される共通コアドメイン構造を共有するApteS.S.、JBiolChem.2009Nov13;28446:31493-7。さらに、ADAMTS-4以外の全てが、少なくともさらに1つのトロンボスポンジンI型反復ドメインを含み、さらに多くのADAMTSタンパク質が1つまたは複数の追加の付随ドメインを含む。特に、全ADAMTSタンパク質が、メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン内の位置に少なくとも1つのカルシウム結合部位および少なくとも1つの亜鉛結合部位を含むとみられることが報告されているAndreinietal.、J.ProteomeRes.、2005、43、pp881-888。ADAMTSタンパク質の生物学的役割が、種々の疾患および状態に関し報告がなされており、これには、血管新生抑制、間質性腎線維症、骨リモデリング、卵胞形成、アテローム性動脈硬化、泌尿生殖器形成、および腫瘍増殖/リモデリングADAMTS-1;エーラスダンロス症候群7C型およびウシデルマトスパラキシスADAMTS-2;関節炎、アテローム性動脈硬化、および腱障害ADAMTS-4;関節炎および神経膠芽細胞腫ADAMTS-5;関節炎ADAMTS-7;血管新生抑制、悪性脳腫瘍、関節炎、およびアテローム性動脈硬化ADAMTS-8;関節炎ADAMTS-9、-12;血栓性血小板減少性紫斑病ADAMTS-13;ならびに抗血栓症/脳卒中ADAMTS-18があるLinandLiu、OpenAccessRheumatologyResearchandReviews2009:1121-131、の概説参照。以前、組換え型ADAMTS13A13を哺乳動物細胞で発現させたことがあるが、比活性は、細胞培養条件に依存して大きく変動する。FRETS-VWF73アッセイで測定した活性比率として表し、抗原含量に対しては、ELISAで測定して表して、多くの市販の培地は、高比活性rA13の発現には十分ではないことが明らかになった。一態様では、本明細書で提供される方法は、全および比活性のレベルが増加したrA13の細胞培養発現を可能とするいくつかの好都合な知見に基づいている。従って、分泌メタロプロテイナーゼADAMTSファミリーの間の共有構造-機能関係に起因して、本発明によって提供される方法は、細胞培養中での全てのADAMTSタンパク質の発現および細胞培地からの回収を可能とする。一態様では、本発明は、少なくとも1600mU/μgの特異的FRETS-VWF活性を有する組換え型ADAMTS13rA13を含む組成物を提供する。上述の組成物の一実施形態では、rA13は、少なくとも800mU/μgの特異的FRETS-VWF活性を有する。上述の組成物の一実施形態では、組成物は、培養液上清を含む。具体的な実施形態では、培養液上清は、哺乳動物細胞培養液上清である。さらなる具体的な実施形態では、哺乳動物細胞培養液上清は、CHO細胞上清である。上述の組成物の一実施形態では、rA13は、少なくとも1μg/L銅含有細胞培養液中で発現する。具体的な実施形態では、細胞培養液は、少なくとも2μg/L銅を含む。さらなる具体的な実施形態では、培養液は、2μg/L~20μg/L銅を含む。上述の組成物の一実施形態では、銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして供給される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養である。上述の組成物の一実施形態では、細胞培養は、連続培養である。具体的な実施形態では、連続培養をケモスタット方式で行う。別の具体的な実施形態では、連続培養を灌流方式で行う。上述の組成物の一実施形態では、培養液中のNH4のレベルは、5mM未満の濃度で維持される。上述の組成物の一実施形態では、培養液中のNH4のレベルは、4mM未満の濃度で維持される。上述の組成物の一実施形態では、培養液の細胞密度は、4.0x106細胞/mL未満に維持される。具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、3.0x106細胞/mL未満に維持される。具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、2.0x106細胞/mL未満に維持される。さらなる具体的な実施形態では、培養液の細胞密度は、1.5x106細胞/mL未満に維持される。上述の組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与用に処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内、皮下、または筋肉内投与用に処方される。上述の組成物の一実施形態では、組成物は、凍結乾燥される。VI.製剤一態様では、本発明の組換え型治療用タンパク質rVWFまたはrA13を含む製剤は、投与に先立ち凍結乾燥される。凍結乾燥は、当技術分野で通常の技術を使って行い、開発される組成物用に最適化されるべきである[Tangetal.、PharmRes.21:191-200、2004およびChangetal.、PharmRes.13:243-91996]。医薬製剤調製方法は、1つまたは複数の以下のステップを含んでもよい:凍結乾燥の前に、本明細書記載の安定化剤を前記混合物に加えるステップ、凍結乾燥の前に、それぞれ本明細書に記載の増量剤、浸透圧調節剤、および界面活性剤、から選択される少なくとも1つの薬剤を前記混合物に加えるステップ。凍結乾燥した製剤は、一態様では、少なくとも1つまたは複数の緩衝液、増量剤、および安定剤から構成される。この態様では、界面活性剤の有用性が評価され、凍結乾燥ステップまたは再構成の間に凝集が問題となる場合に適用される。適切な緩衝剤が含まれ、凍結乾燥中、製剤を安定pH領域内に維持する。凍結乾燥材料に対し行われる標準的再構成は、一定容量の注射用純水または無菌の水WFI通常、凍結乾燥中に除去した容量に等しいを加え戻すことであるが、抗菌剤の希釈溶液が非経口の投与用医薬品の産生で使用されることがある[Chen、DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy、18:1311-13541992]。従って、本発明の凍結乾燥組換え型VWF組成物に希釈剤を加えるステップを含む、再構成組換え型VWF組成物の調製方法が提供される。凍結乾燥材料は、水溶液として再構成してもよい。種々の水性キャリア、例えば、注射用無菌水、多用量使用向け防腐剤含有水、または適切な量の界面活性剤含有水例えば、水性懸濁液製造用に適した賦形剤を含む混合物中に活性化合物を含む水性懸濁液がある。種々の態様では、このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、限定されないが、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴム;分散または湿潤剤は、天然ホスファチド、例えば、限定されないが、レシチン、またはアルキレン酸化物と脂肪酸の縮合物、例えば、限定されないが、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、限定されないが、ヘプタデカエチルエネオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルの縮合物およびヘキシトール、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルの縮合物およびヘキシトール無水物、例えば、限定されないが、ポリエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。種々の態様では、水性懸濁液は、また、1つまたは複数の防腐剤、例えば、限定されないが、エチル、またはn-プロピル、p-ヒドロキシベンゾアートを含む。組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアを含む。語句の薬学的にまたは薬理学的に受容可能な、は下記で記載される当技術分野でよく知られた経路を使って投与される場合に、安定で、産物の凝集や切断等のタンパク質分解を抑制し、さらに、アレルギー性、または他の有害反応を生み出さない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容可能なキャリアは、上記で開示の薬剤を含むいずれかおよび全ての臨床的に有用な溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、等を含む。医薬製剤は、静脈内、経口、局所、経皮的、非経口、吸入噴霧、経膣、直腸、または頭蓋内注射により、投与される。本明細書で使われる用語の非経口は、皮下、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳腺内、腹腔内、鞘内、眼球後、肺内注射による投与、および/または特定部位の外科移植も同様に意図されている。通常、組成物は、基本的に、発熱物質、ならびにレシピエントに有害となりうる他の不純物を含まない。組成物の単回または複数回の投与が治療医師により選択される量とパターンを用いて行われる。疾患の予防または治療のための適切な投与量は、治療される疾患の種類、重症度および疾患の経過、薬剤投与は予防目的か治療目的か、治療歴、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。一態様では、本発明の製剤は、初期ボーラスに続けて、連続注入により投与され、製剤の治療循環濃度が維持される。別の例として、発明の化合物は、1回のみの投与量として投与される。当業者なら、良質の医療のための原則、および個別患者の臨床状態により定まる、効果的な投与量および投与計画を容易に最適化できるであろう。投薬頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメータおよび投与経路に依存する。最適医薬製剤は、投与経路および所望の投与量に応じて当業者により決定される。例えば、レミントンの薬学Remington’sPharmaceuticalSciences、18thEd.1990、MackPublishingCo.、Easton、Pa.18042pages1435-1712、を参照。本文献の開示は、ここでの参照によって組み込まれる。このような製剤は、投与薬剤の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響する。投与経路に応じ、適切な用量は、体重、体表面積または器官サイズに従って計算される。適切な投与量は、適切な用量反応データと併せて、血中濃度測定用の確立されたアッセイを使って確認できる。最終投与計画は、薬剤の作用を変える種々の因子、例えば、薬剤の比活性、損傷の重症度および患者の応答性、年齢、状態、体重、患者性別と食事、何らかの感染症の重症度、投与の時間および他の臨床的因子、を考慮して、主治医により決定される。例としてではあるが、典型的な本発明の組換え型vWFの用量は、約50U/kg=500μg/kgである。研究が継続中なので、種々の疾患および状態に対し、適切な投与量レベルおよび治療持続期間に関するさらなる情報が得られるであろう。VII.治療方法本発明は、さらに、本明細書記載の方法により作られたrVWFまたはrA13を必要としている患者の治療方法を意図している。このような治療方法は、本発明の組換え型rA13または高分子量、組換え型vWFを含む医薬製剤の投与を含むことができる。別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるrVWFまたはrA13組成物の投与を含む治療または予防的治療方法を提供する。一般的に、治療への応用のために、治療有効量の製剤が、ADAMTS13またはVWF機能障害に関連した疾患または状態の対象、またはその他にそれを必要としている対象に、投与される。これらの使用に有効な製剤および量は、疾患または状態の重症度および患者の健康の全身状態に依存する。製剤の単回または複数回の投与は、患者により必要とされ、耐容される投与量および頻度に応じて実行できる。一実施形態では、本発明は、ADAMTS13またはVWF機能障害に関連する疾患または状態の治療または予防方法を提供する。さらなる実施形態では、組換え型vWFを含む医薬製剤は、vWF、例えば、フォンヴィレブランド病または血友病に関連する疾患を治療するために投与できる。別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供のrA13組成物の投与を含む1つまたは複数の血栓の形成および/または存在に関連した疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の1つまたは複数の血栓を分解する方法を提供する。また他の実施形態では、本発明は、治療を必要としている対象の梗塞の治療または予防方法を提供する。通常、本発明で提供される方法は、本明細書で提供されるrADAMTS13組成物を、治療を必要としている対象に投与することを含む。1つまたは複数の血栓の形成および/または存在に関連する傷害の非制限的例には、遺伝性血栓性血小板減少性紫斑病TTP、後天性TTP、動脈血栓症、急性心筋梗塞AMI、脳卒中、敗血症、および播種性血管内凝固DICが含まれる。梗塞に関連する傷害の非制限的例には、限定されないが、心筋梗塞心臓発作、肺血栓症、脳血管イベント、例えば、脳卒中、末梢動脈閉塞性疾患壊疽、等、抗リン脂質抗体症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎GCA、ヘルニア、および腸捻転が含まれる。VIII.実施例本発明は、次に、下記の非制限的実施例を用いてさらに説明する実施例1連続細胞培養実験を、vWFを発現する組換え型CHO細胞株の培養液を使って行った。基本培地はDMEM/F12で、約0.3μg/LのCu2を含む。培地に大豆加水分解物および硫酸銅CuSO45H2Oを補充し、培地中の最終銅濃度を少なくとも2.4μg/Lを越える濃度とした。vWFを発現する組換え型CHO細胞を、アンモニウムレベルNH4を約10mM未満の濃度で保持して、連続細胞培養で培養した。従来のバッチまたは供給バッチ技術は、培養の最後に高NH4濃度を生成するために、培地の連続供給を行う産出システム例えば、灌流またはケモスタット培養が好ましいことが分かった。培養の最後に、高次多量体vWFを単離し、vWFの特異的リストセチンコファクター活性を測定した。実施例2GD8/6バッチ細胞培養で組換え型第VIII因子rFVIIIおよびフォンヴィレブランド因子rVWFを同時発現、培地の組成がVWF発現および活性に与える効果を測定した。簡単に説明すると、変法DMEM/F12基本粉末表5および4g/Lの大豆加水分解物表6参照も含む追加の補充剤からなる基本BAV-SP培地に、銅補充の追加の有る場合と無い場合の培地で、GD8/6細胞をバッチ培養した。低い銅濃度のrVWF発現および活性に与える効果を試験するために、基本BAV-SP培地を使用した。0.3μg/L銅を含む基本培地に、大豆加水分解物を補充し、これが、実験的に測定して、追加の0.7μg/L銅に相当し、1.0μg/Lの最終銅濃度を与える。比較として、使用したバッチ培養用のBAV-SP培地に、追加の3.3μg/LのCu2をさらに補充し、4.3μg/Lの最終銅濃度とし、高銅濃度のVWF発現および活性に及ぼす効果を測定した。rVWFを発現するGD8/6細胞を、低銅培地表7または高銅培地表8中で7日間増殖させた。2日後、培養液を継代培養して、5日間、バッチ培養を行った。培養液上清の試料で、毎日、rVWF含量vWFELISA、リストセチンコファクターアッセイにより全活性リストセチンおよび特異的活性比活性の試験を行った。細胞数、細胞生存率、およびアンモニウム濃度等の、種々の培養パラメータも、毎日モニターしたバッチ3日目および4日目を除く。予想に反し、高銅濃度下で増殖させた細胞培養が、顕著に高い全および特異的rVWF活性を含む上澄みを生成した表7および表8の結果を比較されたい。例えば、バッチ4日目に、高銅濃度下増殖させた細胞培養液は、低銅培養液の場合の0.2IUのrVWF活性/mLに比べて、1.52IUのrVWF活性/mLを含んでいた。これは、低銅細胞培養が、高銅細胞培養のほぼ2倍量のrVWFを産生したという事実にもかかわらずである。さらに、高銅培養液から採取した上清の比活性は、低銅培養液上清のそれの13倍高かった831mU/10μgrVWF対62mU/10μgrVWF。表7および表8から解るように、バッチ1日目の高銅培養液の全および特異的リストセチンコファクター活性は、低銅培養液のそれの2倍であった。さらに、高銅培養液で観察されたその後の活性増加とは対称的に、低銅細胞培養液では、バッチ1日目後、リストセチンコファクター活性量の増加は観察されなかった。この結果と一致して、rVWFマルチマー状態のアガロースゲル電気泳動法分析は、バッチ1日目に、低分子量rVWF種の濃度に比べ、低濃度の高分子量rVWFが低銅細胞培養の上清中に存在し、相対的濃度が時間と共にさらに減少したことを示した図1Aと1B。対称的に、培地のCu2による補充で、バッチ培養の4日目まで、リストセチンコファクターRiCoF活性抗原の一貫した形成が生じた。バッチ培養の4日目まで、常に、安定な高分子量rVWF多量体量の減少が起こらなかった図1Aと1B。図1Bのアガロース電気泳動ゲルの濃度測定結果は、低銅条件下の培養液は、バッチ培養1日目は、10すなわち、16.3を越えるrVWFが10超の二量体を有する分子として存在するrVWF集団を産生出来るのみでありすなわち、図1Aアガロースゲルのレーン3の3日目試料、また、特に、この集団は、バッチ培養の5日目には、ただの4に低下したレーン6の7日目試料。高銅条件下では、対称的に、10超の二量体を有するvWF多量体の相対量は、バッチ培養4日目まで、一貫して凡そ30であることを示したレーン7~10の3日目~6日目;28~31.4。特に、高銅バッチ培養のバッチ5日目から始まるが、NH4レベルが100mg/Lを越える約5.0mMを越える場合、追加の抗原の発現18.3対35.4μg/L;表8のバッチ4日目と5日目を比較は、上清のRiCoF活性の同時増加を生じなかった。この結果と一致して、高分子量rVWF多量体のバッチ5日目培養の7日目のレベルは、低分子量rVWF多量体の濃度に比べて減少した。また、バッチ5日目レーン11の培養7日目試料のみで、10超の二量体を有するvWFの相対的量が21.4に減少した。まとめると、上記で提供されるデータは、rVWFを発現する細胞培養液への銅濃度の補充が、全および特異的rVWFリストセチンコファクター活性、さらには、高分子量rVWF多量体の安定な産生を劇的に増加させることを示す。さらに、データは、細胞培養液中の高NH4濃度の存在とrVWFリストセチンコファクター活性および高分子量rVWFマルチマー産生の低下の間の相関を示す。実施例3ケモスタット条件下で操作したGD8/6連続細胞培養で、組換え型第VIII因子rFVIIIおよびフォンヴィレブランド因子rVWFを同時発現させて、培地組成のVWF発現および活性に与える効果を測定した。簡単に説明すると、GD8/6細胞を、実施例2で記載のように、銅補充のある場合と無い場合について、4g/Lの大豆加水分解物を含むBAV-SP培地中で培養した。低銅の濃度のrVWF発現および活性に与える効果を試験するために、基本BAV-SP培地を使用した。基本培地は、0.3μg/L銅を含み、さらに大豆加水分解物で補充したが、これは、追加の0.7μg/L銅に相当し、1.0μg/Lの最終銅濃度となる。比較のため、バッチ培養に使用されたBAV-SP培地に追加の3.3μg/LのCu2をさらに補充し、4.3μg/Lの最終銅濃度として、高銅濃度のVWF発現および活性に与える効果を測定した。高および低銅濃度下で増幅した培養液を高2.8x106細胞/mLおよび低約、1.4x10E06細胞/mL細胞密度を使って培養した。前述のように、培養液上清の試料に対し、rVWF含量vWFELISA、全活性リストセチンおよび特異的比活性活性を、リストセチンコファクターアッセイにより試験した。また、細胞数、細胞生存率、およびアンモニウム濃度、等の種々の培養パラメータをモニターした。データは、ケモスタット培養の2週目および3週目の定常段階から作成した表9~表13。図2Aに示すように、低細胞密度および高銅濃度で増殖させた連続rVWF細胞培養液から採取した上清は、高比活性平均600mU/10μgを含み、一方、高細胞密度下、高または低銅濃度の存在中で増殖させたrVWF細胞培養液および低銅濃度の存在中で低細胞密度下、増殖させたrVWF細胞培養液から採取した上清は、低比活性100mU/10μg未満を含んでいた。バッチ培養に対する観察結果と一致して、図2Bは、高比活性を有するrVWFを発現する連続哺乳動物細胞培養液は、低比活性を有するrVWFを産生する培養液よりも低いNH4濃度を有することを示す。このデータは、細胞培養液中のNH4濃度および培養により産生されるrVWFの比活性の間の相関をさらに強める。特に、細胞培養における高銅濃度と低アンモニウム濃度の組み合わせは、著しく改善されたrVWF活性の生成を可能にする。この結果と一致して、ケモスタット培養のrVWFマルチマー状態のアガロースゲル電気泳動法分析図6は、高銅および低細胞密度ならびにその結果の低アンモニウムで操作された培養液由来の上清のみが、一貫した発現高次多量体vWFそれぞれ、CSTレーン4、8、および12の8、17および24日目の約23~27の発現をもたらすことを示した。すべての他の条件は、延長培養期間にわたり、10超の二量体を有するvWFが10を越える一貫した高い量に達しない。実施例4培地銅濃度のrA13の発現および比活性に与える効果を測定するために、rA13を発現する哺乳動物細胞培養液を、ケモスタット連続培養条件下、変法DMEM/F12基本培地BESP845および0.66μg/L追加の銅補充なしから追加銅補充の4μg/Lまでの範囲の銅濃度を含む追加の補充剤表14を含むADAMTS13培地中で、4週間増殖させた。表15で示すように、細胞培地中の漸増量の銅濃度により、量的Pおよび比q生産性それぞれ、合計rA13活性/L培養液/日、および合計rA13活性/細胞/日、で表されるの顕著な増加を生じた。増加した銅濃度が発現したrA13の健全性に影響するかどうかを判断するために、0.66μg/L、1μg/L、および4μg/L銅を含む培地中で増殖させたrA13細胞培養液から採取した上清をSDS-PAGE分析により調べた。図3A銀染色および図3B抗A13ウェスタンブロットから解るように、ゲル電気泳動での明らかな産物の品質の変化は観察されなかった。具体的には、切断型170kDまたは他の低MWrA13変異体レベルの増加、および他の追加のまたは増加したHCPバンドは、増加した銅濃度の存在下のrA13発現からは生じなかった。rA13の活性に対する銅の最適濃度を推定するために、表15からPFretsvs銅濃度図4のデータの外挿を行うことにより、最適効果は、約2μg/Lで得られ、控えめに見積もっても、約4μg/Lを越えるとマイナスの効果が生じる可能性があることがわかる。上記の結果を踏まえ、追加の実験を行い、0.66μg/L銅と2.0μg/L銅含有細胞培地中でのrA13の発現を比較した。表16に示すように、基本細胞培地に対し、最終濃度2.0μg/L銅への銅の補充により、8週間にわたり、量的Pおよび比q生産性それぞれ、合計rA13活性/L培養液/日、および合計rA13活性/細胞/日、で表されるの顕著な増加を生じた。2つの培養のrA13産生の各週の具体的データを図5に示す。これらのデータから、銅補充が、細胞代謝、比増殖速度およびrA13生産性に測定可能な有益な効果を与えることが明らかである。本明細書記載の実施例および実施形態は、例証のみが目的であるが、当業者には、前記を踏まえると、種々の修正または変形が想起され、これらが本出願の趣旨と範囲内ならびに添付請求項の範囲内に含まれることは理解されよう。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。"