"ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントが、SEQIDNO:20のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントが、SEQIDNO:21のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントが、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントが、SEQIDNO:23のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドシグナル配列。異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項7に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項8に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:20のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項10に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項11に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項12に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:21のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項14に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項15に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項16に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項18に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項19に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項20に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:23のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項22に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項23に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項24に記載の融合タンパク質。異種ポリペプチドが、一つ以上の酵素、一つ以上の生物学的応答修飾物質、一つ以上の毒素、一つ以上の抗体、一つ以上の異種ポリペプチドのフラグメント、またはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項6に記載の融合タンパク質。酵素が、酸性β-グルコセレブロシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。酵素が、酸性α-ガラクトシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。酵素が、酸性α-グルコシダーゼを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。生物学的応答修飾物質が、プロインスリンを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。生物学的応答修飾物質が、インターフェロンを含む、請求項26に記載の融合タンパク質。生物学的応答修飾物質が、治療的抗体を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。生物学的応答修飾物質が、インスリン様成長ホルモン-1IGF-1を含む、請求項26に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:20のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体およびインスリン様成長ホルモン-1IGF-1の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:21のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントが、SEQIDNO:23のアミノ酸配列を含み、そして異種ポリペプチドが、次のもの:酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1の一つ以上を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現を有することを特徴とする、請求項35~38に記載の融合タンパク質。細胞培養において増加した発現が、酵素活性について3日の時間経過にわたって検定することによって測定される、請求項39に記載の融合タンパク質。細胞培養が、非最適細胞培養条件におけるものである、請求項39に記載の融合タンパク質。非最適細胞培養条件が、高細胞密度および枯渇栄養素である、請求項41に記載の融合タンパク質。タンパク質発現ベクターであって、a第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、ここで前記第一DNA配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、プロモーター、およびb前記第一DNA配列にインフレームで融合している第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二DNA配列、を含むタンパク質発現ベクター。第一DNA配列が、SEQIDNO:20のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項44に記載のタンパク質発現ベクター。第一DNA配列が、SEQIDNO:21のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項46に記載のタンパク質発現ベクター。第一DNA配列が、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項48に記載のタンパク質発現ベクター。第一DNA配列が、SEQIDNO:23の一次アミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントをコードしている、請求項43に記載のタンパク質発現ベクター。第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項50に記載のタンパク質発現ベクター。ポリペプチドの製造方法であって、a異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること;およびb前記異種ポリペプチドを回収することを含む方法。前記製造が、培養細胞中で行なわれる、請求項52に記載の方法。前記培養細胞が、酵母細胞を含む、請求項53に記載の方法。前記培養細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項53に記載の方法。前記製造が、トランスジェニックシステム中で行われる、請求項52に記載の方法。前記トランスジェニックシステムが、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはそのいずれかの組み合わせを含む、請求項56に記載の方法。回収が、乳からである、請求項57に記載の方法。前記トランスジェニックシステムが、ニワトリを含む、請求項56に記載の方法。回収が、卵からである、請求項59に記載の方法。タンパク質発現ベクターの作製方法であって、aヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列に、プロモーターを作動可能に連結すること、およびb第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている該第二DNA配列を、前記第一DNA配列にインフレームで融合することを含む方法。前記第一DNA配列が、SEQIDNO:20のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項62に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第一DNA配列が、SEQIDNO:21のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項64に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第一DNA配列が、SEQIDNO:22のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項66に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第一DNA配列が、SEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、請求項61に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。前記第二DNA配列が、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1をコードしている、請求項68に記載のタンパク質発現ベクターの作製方法。タンパク質発現を増加させる方法であって、aヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、およびb該異種タンパク質を回収することを含む方法。タンパク質分泌を増加させる方法であって、aヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、およびb該異種タンパク質を回収することを含む方法。驚くべきことに、大部分のシグナル配列は、タンパク質トランスロケーションを容易にするのに本質的に非効率的である。結果として、ERを標的とする新生タンパク質-リボソーム複合体の多くは、ER膜から解離し、そしてタンパク質合成が中断することによって、それらのタンパク質発現および分泌を減少させる。概要0007本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列を提供する。0008本発明は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む融合タンパク質も提供する。0009更に提供するのは、第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、該第一DNA配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、プロモーター;および第一DNA配列にインフレームで融合している第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列、を含むタンパク質発現ベクターである。0010本発明は、ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bip由来のポリペプチドシグナル配列を含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収すること、を含む方法も提供する。0011更に開示するのは、ポリペプチドを製造する方法であって、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipポリペプチドシグナル配列の改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収することを含む方法である。0012本発明は、更に、第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーターであって、前記第一DNA配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている、プロモーター;および前記第一DNA配列にインフレームで融合している第二DNA配列であって、異種ポリペプチドをコードしている前記第二DNA配列、を含むタンパク質発現ベクターを提供する。0013更に開示するのは、タンパク質発現を増加させる方法であって、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および異種タンパク質を回収することを含む方法である。0014開示される発明は、タンパク質分泌を増加させる方法であって、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および異種タンパク質を回収することを含む方法も提供する。図面の簡単な説明0015本発明の前述のおよび他の側面は、添付の図面と合わせて考慮された場合、以下の発明の詳細な説明から明らかである。本発明を説明するために、現在のところ好適である態様を図面に示しているが、しかしながら、本発明が、開示されている特定の手段に制限されないということは理解される。図面は、必ずしも、一定尺度で描かれていない。図面においては、以下である。0019本明細書中で用いられる場合、異種ポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントではないいずれかのポリペプチドである。0020本明細書中で用いられる場合、Bipは、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質の略語である。0021適切なポリペプチドシグナル配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができる。0022適切な融合タンパク質は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むことができる。この融合タンパク質は、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができる。これら融合タンパク質の全てが、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることもできる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。異種ポリペプチドは、一つ以上の酵素、一つ以上の生物学的応答修飾物質、一つ以上の毒素、一つ以上の抗体、一つ以上の異種ポリペプチドのフラグメント、またはそのいずれかの組み合わせでありうる。異種ポリペプチドは、酸性β-グルコセレブロシダーゼでありうる。異種ポリペプチドは、酸性α-ガラクトシダーゼでもありうる。異種ポリペプチドは、酸性α-グルコシダーゼでもありうる。異種ポリペプチドは、プロインスリンでもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2でもありうる。異種ポリペプチドは、インターフェロンでもありうる。異種ポリペプチドは、治療的抗体でもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン-1IGF-1でもありうる。0023ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、β-グルコセレブロシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型β-グルコセレブロシダーゼ天然のβ-グルコセレブロシダーゼシグナル配列を含むβ-グルコセレブロシダーゼと比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、β-グルコセレブロシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、β-グルコセレブロシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0024ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、酸性α-ガラクトシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型α-ガラクトシダーゼ天然のα-ガラクトシダーゼシグナル配列を含むα-ガラクトシダーゼと比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、α-ガラクトシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、α-ガラクトシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0025ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、酸性α-グルコシダーゼを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型酸性α-グルコシダーゼ天然の酸性α-グルコシダーゼシグナル配列を含む酸性α-グルコシダーゼと比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、酸性α-グルコシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、酸性α-グルコシダーゼ活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0026ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、プロインスリンを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型プロインスリン天然のプロインスリンシグナル配列を含むプロインスリンと比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、プロインスリン活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、プロインスリン活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0027ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インスリン様成長ホルモン-2IGF-2天然のインスリン様成長ホルモン-2IGF-2シグナル配列を含むインスリン様成長ホルモン-2IGF-2と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0028ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インターフェロンを含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インターフェロン天然のインターフェロンシグナル配列を含むインターフェロンと比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インターフェロン活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インターフェロン活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0029ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、治療的抗体を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型治療的抗体天然の治療的抗体シグナル配列を含む治療的抗体と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、治療的抗体活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、治療的抗体活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0030ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む他の適切な融合タンパク質は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができ、そして異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン-1IGF-1を含むことができる。それら融合タンパク質は、野生型インスリン様成長ホルモン-1IGF-1天然のインスリン様成長ホルモン-1IGF-1シグナル配列を含むインスリン様成長ホルモン-1IGF-1と比較して、細胞培養において増加した発現を有することを特徴とすることができる。細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン-1IGF-1活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。細胞培養は、非最適細胞培養条件におけるものでもありうる。非最適細胞培養条件は、高細胞密度および枯渇栄養素でありうる。高細胞密度および枯渇栄養素での細胞培養において増加した発現は、インスリン様成長ホルモン-1IGF-1活性について約3日間にわたって検定することによって測定することができる。0031適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列であって、第一DNA配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができる。第二DNA配列は、β-グルコセレブロシダーゼをコードすることができる。0032適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列であって、第一DNA配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができる。第二DNA配列は、酸性α-グルコシダーゼをコードすることができる。0033適切なタンパク質発現ベクターは、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列に作動可能に連結されたプロモーター、および異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列であって、第一DNA配列にインフレームで融合しているものを含むことができる。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列を含むことができる。第二DNA配列は、酸性α-ガラクトシダーゼなどの他の異種タンパク質をコードすることができる。異種ポリペプチドは、プロインスリンでもありうる。異種ポリペプチドは、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1でもありうる。異種ポリペプチドは、インターフェロンでもありうる。異種ポリペプチドは、治療的抗体でもありうる。異種ポリペプチドは、細胞から分泌されるいずれか他のタンパク質でもありうる。0034ポリペプチドを製造する適切な方法は、異種ポリペプチドに作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含む融合タンパク質を発現させること、および前記異種ポリペプチドを回収すること、を含むことができる。ポリペプチドを製造する方法は、培養細胞中で行うことができる。培養細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞でありうる。ポリペプチドを製造する方法は、トランスジェニックシステム中で行うことができる。そのトランスジェニックシステムは、雌牛、ヤギ、ヒツジ、ウサギまたはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。トランスジェニックシステムからの回収は、乳からでありうる。トランスジェニックシステムは、ニワトリを含むこともできる。トランスジェニックシステムからの回収は、卵からでありうる。0035タンパク質発現ベクターを作成する適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントを含むポリペプチドシグナル配列をコードしている第一DNA配列にプロモーターを作動可能に連結すること、および異種ポリペプチドをコードしている第二DNA配列を第一DNA配列にインフレームで融合すること、を含むことができる。タンパク質発現ベクターの作製方法は、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22またはSEQIDNO:23のアミノ酸配列をコードしている第一DNA配列を有することもできる。タンパク質発現ベクターの作製方法は、酸性β-グルコセレブロシダーゼ、酸性α-ガラクトシダーゼ、酸性α-グルコシダーゼ、プロインスリン、インスリン様成長ホルモン-2IGF-2、インターフェロン、治療的抗体またはインスリン様成長ホルモン-1IGF-1、または細胞から分泌される他のタンパク質をコードしている第二DNA配列を有することもできる。0036タンパク質発現を増加させる適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および該異種タンパク質を回収すること、を含むことができる。0037タンパク質分泌を増加させる適切な方法は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipの改変フラグメントおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質を発現させること、および該異種タンパク質を回収することを含むことができる。実施例1試薬0038野生型ヒトβ-グルコセレブロシダーゼGlcCerasecDNANM_000157.3、野生型ヒト酸性α-ガラクトシダーゼAGLAcDNANM_000169.2、野生型ヒト酸性α-グルコシダーゼGAAcDNANM_000152.2および野生型ヒトインスリン様成長因子-2IGF-2cDNANM_000612.4は全て、OrigeneTMRockvilleMDより購入したが、オリゴヌクレオチドプライマーおよび合成ミニジーンは全て、IntegratedDNATechnologiesTMIDTTM;CoralvilleIAからであった。pEF6/V5-HisA哺乳動物発現ベクター、ダルベッコ改変イーグル培地Dulbecco’smodifiedEaglemediumDMEM、ウシ胎仔血清FBSおよび他の組織培養試薬は、InvitrogenTMCarlsbadCAより入手した。制限エンドヌクレアーゼ、Phusion-HFDNApolymeraseTM、T4DNAリガーゼ、Antarcticホスファターゼ、化学的コンピテント大腸菌EcoliDH5α細胞は全て、NewEnglandBiolabsTMIpswichMAより購入した。いろいろなグリコシダーゼの蛍光発生基質は、ResearchProductsInternationalTMMtProspectILより購入し、DNAGelExtractionキットおよびMiniprepDNAキットは、QIAGENTMValenciaCAからであり、PureYieldMaxiprepDNATMキットは、PromegaTMMadisonWIからであった。特に断らない限り、化学薬品は、SigmaTMStLouisMOからであり、Fugene-HDTMトランスフェクション試薬は、RocheTMIndianapolisINからであり、T抗原で形質転換済みのヒト胚性腎細胞HEK293Tは、ATCCTMからであった。実施例2プラスミド構築0039DNAプラスミドを、それらの天然のシグナル配列を含有するかまたは改変ヒトBipシグナル配列で置き換えられたいろいろなモデルタンパク質をコードするように構築して、試験タンパク質の発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を評価した。0040ヒト酸性β-グルコセレブロシダーゼGlcCerase,EC3.2.1.45を評価するために、いくつかの異なったDNAプラスミドを、その天然のシグナル配列かまたはヒトBipシグナル配列かまたは改変Bipシグナル配列を含む野生型GlcCeraseをコードするように構築した。その天然のシグナル配列を含む野生型ヒトGlcCeraseを作り出すために、ヒトGlcCerasecDNA全体を、Phusion-HFDNApolymeraseTMによるPCRによって、プライマー1およびプライマー2表IおよびGlcCerasecDNAクローンNM_000157.3,Origeneを用いて増幅した。プライマー1は、5’BglII、および天然のGlcCeraseKozak配列の直前にある内部EcoRI制限部位を含有するように構築したが、プライマー2は、終止コドンの後にある3’NheIおよびNotIの制限部位を含有して、哺乳動物発現ベクター中へのPCR産物のクローニングを可能にした。約1.6キロベースkbのPCR産物Aを、分離し、1w/vアガロース分取用ゲルから切り出し、そしてQIAGENTMのGelExtractionkitTMを用いて単離した。次に、PCR産物Aを、制限エンドヌクレアーゼBglIIおよびNotIで37°Cにおいて一晩消化し、再精製し、そしてT4DNAリガーゼを用いて、予めBamHIおよびNotIで消化し、Antarcticホスファターゼで脱リン酸化したpEF6/V5-HisA哺乳動物発現ベクターInvitrogenTM中に連結した。BglII制限部位を、プライマー1中に包含させたことで、pEF6/V5-HisAベクターの適合するBamHI部位中への、BglIIで消化したGlcCerasePCR産物の連結は、マルチプルクローニングサイト内のBamHI制限部位を消失させたが、この改変発現ベクターを、以下、pEF6’と称する。pHD101と命名したこのDNAコンストラクトを用いて、化学的コンピテントE.coli細胞を形質転換し、個々のアンピシリン耐性細菌コロニーを増殖させ、そしてEcoRIおよびNheIを用いたおよびBamHIでの制限消化反応によってそれぞれスクリーニングした。クローン4からの正しいプラスミドDNApHD101.4と命名したを、DNAシークエンシングによって更に確かめ、そして野生型GlcCeraseの発現用に選択した。pHD101.4を用いて、天然のGlcCeraseシグナル配列の代わりにヒトBipシグナル配列かまたはこのBipシグナル配列の改変バージョンのいずれかを含む野生型GlcCeraseをコードしている他のプラスミドを構築した。簡単にいうと、二本鎖DNAミニジーン表IIにおいてミニジーン1と命名したを、酵母アルコールオキシダーゼ1AOX1遺伝子からの天然のKozak配列、その天然のシグナルペプチダーゼ認識配列:Ser-Ala-Ala-Arg-Ala;SAARASEQIDNO:24を含む18残基の天然のヒトBipシグナル配列全体の遺伝子、および成熟野生型ヒトGlcCeraseヌクレオチド118-490のN末端123アミノ酸残基、を含有するように構築したそしてIntegratedDNATechnologiesTM,IDTTMで合成した。ミニジーン1は、更に、AOX1Kozak配列の前にある5’EcoRI制限部位、およびGlcCerase遺伝子内の天然NcoI部位を3’末端に含有して、天然のGlcCeraseシグナル配列をヒトBipシグナル配列で置き換えるためにpHD101.4中にクローニングすることを可能にした。更に、この戦略は、誘導性AOX1プロモーターの制御下にある哺乳動物かまたは酵母のシステムにおいてBipシグナル配列を含む野生型GlcCeraseの発現のためのDNAプラスミドの構築を可能にする。この融合タンパク質および他の融合タンパク質の設計は、SignalP4.0TM分析プログラムを利用して、Bipシグナル配列が試験タンパク質から切断されるかどうか予想した。0041追加のアミノ酸残基を、シグナル配列切断を容易にするのに必要とされる場合にはコンストラクトに加え、そして適当なシグナル配列切断を有すると予想された配列のみを、これら融合試験タンパク質を作り出すために選択した。哺乳動物システムでの発現のために、天然のヒトBipKozak配列を含有するBip-GlcCeraseDNAフラグメントを、PCRによって、プライマー3および4、およびミニジーン1DNA鋳型を用いて合成した。この約440bpのPCR産物Bを、分離し、1w/vアガロース分取用ゲルから切り出し、そしてQIAGENのGelExtractionキットを用いて単離した。PCR産物Bを、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNcoIで一晩消化し、再精製し、そして前記のように、天然のGlcCeraseシグナル配列を欠いた成熟野生型GlcCeraseのアミノ酸残基124-497をコードしているpHD101.4からのNcoI→NotIDNAフラグメント;および約5.8kbのEcoRI→NotIpEF6’ベクターDNAフラグメントと連結した。pHD201と命名したこのDNAコンストラクトを、EcoRI-XbaIを用いた制限消化によって調べ、そして正しいクローンpHD201.2を、DNAシークエンシングによって確かめた後、野生型GlcCeraseの発現および分泌へのヒトBipシグナル配列の効果を評価するのに用いた。同様に、Bipシグナル配列の改変バージョンミニジーン2を、AOX1酵母遺伝子からの天然のKozak配列、天然のヒトBipシグナル配列の最初の13残基、その後に、アミノ酸残基4-13の反復、天然のBipシグナルペプチダーゼ認識配列残基14-18、および成熟野生型ヒトGlcCeraseヌクレオチド118-490のN末端123残基を含有するように構築し、IDTTMで合成した。Bipシグナル配列のこの改変改変Bipシグナル配列-1と命名したは、ER膜全体を貫通するspannedように疎水性ドメインを増大させ、そしてシグナル配列を18~28残基延長した。哺乳動物システムでの発現のために、天然のヒトBipKozak配列フラグメントを含有する改変Bipシグナル配列-1-GlcCeraseDNAを、PCRによって、プライマー3および4ならびにミニジーン2DNA鋳型を用いて合成した。この約470bpのPCR産物Cを、1w/vアガロース分取用ゲルから単離し、EcoRIおよびNcoIで消化し、再精製し、そして前記のように、天然のGlcCeraseシグナル配列を欠いた成熟野生型GlcCeraseのアミノ酸残基124-497をコードしているpHD101.4からのNcoI→NotIDNAフラグメント、および約5.8kbのEcoRI→NotIpEF6’ベクターDNAフラグメントと連結した。pHD204と命名したこのDNAコンストラクトを、EcoRIおよびXbaIを用いた制限消化によって調べ、そして正しいクローンpHD204.1を、DNAシークエンシングによって確かめた後、野生型GlcCeraseの発現および分泌へのこの改変Bipシグナル配列の効果を評価するのに用いた。0042本明細書中においてDNAコンストラクトを作成するのに用いたプライマーを、表1に要約する。0043次に、改変Bipシグナル-1を、他のタンパク質に付加して、それらの発現および分泌へのその効果を評価した。簡単にいうと、ミニジーン3表IIを、天然のヒトBipシグナル配列の最初の13残基、その後に、アミノ酸残基4-13の反復、および天然のBipシグナルペプチダーゼ認識配列の残基14-17を含有するように構築した。ミニジーン3は、ヒトBipからの天然のKozak配列、更には、5’EcoRIならびに3’StuIおよびNotI制限部位を含有した。StuIを、ミニジーン3中に組み込んだが、それは、この制限酵素が、AGGアルギニン、Arg;Rのコドンの後に平滑3’末端を生じ、それが、天然のBipシグナルペプチダーゼ切断配列からの残基17にある天然Argとして役立つからである。したがって、追加のアラニンを、N末端にあるタンパク質配列に加えて、天然SAARASEQIDNO:24シグナルペプチダーゼ認識配列を完成するという条件付きで、いずれかのタンパク質を、この改変Bipシグナル配列フラグメントに連結することができる。0044Bipおよび改変Bipのシグナル配列のためのミニジーンのDNAヌクレオチド配列を、表2に要約する。0045酸性α-ガラクトシダーゼAGLA,EC3.2.1.22を評価するために、その天然のシグナル配列を含む野生型酵素を、PCRにより、プライマー5および6を用いて、GLAcDNAクローンNM_000169.2,OrigeneTM鋳型DNAで増幅した。この約1.3kbのPCR産物を、アガロース分取用ゲルによって単離し、EcoRIおよびNotIで消化し、そしてEcoRI-NotIで消化して脱リン酸化したpEF6’に連結した。このDNAコンストラクトを、pHD214と命名し、そしてGLA発現を評価するのに用いた。改変Bipシグナル配列-1を含むGLAを構築するために、成熟GLA酵素を、PCRによって、プライマー6および7を用いて、GLAcDNAクローン鋳型DNAで合成した。この約1.2kbのPCR産物Dを、NotIで消化し、アガロース分取用ゲルから単離し、そして前記のように、EcoRI→StuIミニジーン3DNAフラグメントおよびEcoRI→NotIで消化したpEF6’ベクターに連結した。このDNAコンストラクトを、pHD215と命名し、野生型GLAの発現および分泌へのこの改変Bipシグナル配列の効果を評価するのに用いた。0046酸性α-グルコシダーゼGAA,EC3.2.1.0を評価するために、その天然のシグナル配列を含む野生型GAA酵素全体を、PCRによって、プライマー8および9を用いて、GAAcDNAクローンNM_000152.2,Origene鋳型DNAで増幅した。この約3kbのPCR産物Eを、アガロース分取用ゲルによって単離し、EcoRIおよびNotIで消化し、そしてEcoRI-NotIで消化して脱リン酸化したpEF6’に連結した。このDNAコンストラクトを、pHD217と命名し、その天然のシグナル配列を含むGAAの発現を評価するのに用いた。GAAは、成熟酵素に先立つ複数のプロ配列と共に発現するのでMorelandetal2005、いろいろな長さを有する異なったGAAタンパク質を合成し、そして試験用に改変Bipシグナル配列-1に付加した。その天然のシグナル配列を欠いているが、残基24-952を含有するGAADNAフラグメントを、PCRによって、プライマー9および10を用いて合成した。この約3kbのPCR産物Fを、アガロース分取用ゲルから単離し、NotIで消化し、そしてEcoRI→StuIミニジーン3DNAフラグメントおよびEcoRI→NotIで消化したpEF6’ベクターに連結した。改変Bipシグナル配列-1およびGAA24-952を含有するこのDNAコンストラクトを、pHD218と命名した。同様に、その天然のシグナル配列を欠いているが、残基57-952を含有するGAADNAフラグメントを、PCRによって、プライマー9および11を用いて合成した。この約2.9kbのPCR産物Gを、アガロース分取用ゲルから単離し、NotIで消化し、そして前記のように、EcoRI→StuIミニジーン3DNAフラグメントおよびEcoRI→NotIで消化したpEF6’ベクターに連結した。改変Bipシグナル配列-1およびGAA57-952を含有するこのDNAコンストラクトを、pHD219と命名した。その天然のシグナル配列を欠いているが、残基78-952を含有するGAADNAフラグメントを、PCRによって、プライマー9および12を用いて合成した。この約2.8kbのPCR産物Hを、アガロース分取用ゲルから単離し、NotIで消化し、そしてEcoRI→StuIミニジーン3DNAフラグメントおよびEcoRI→NotIで消化したpEF6’ベクターに連結した。改変Bipシグナル配列-1およびGAA78-952を含有するこのDNAコンストラクトを、pHD220と命名した。したがって、この改変Bipシグナル配列-1並びにプロ配列のGAA発現および分泌への効果は、DNAコンストラクトpHD217~220を用いて、注意深く調べることができる。0047改変Bipシグナル配列-1から誘導される他の改変Bipシグナル配列表IIIを設計したが、それを評価して、これら追加の改変が、タンパク質発現および分泌を更に改善することができるかどうか評価する。これらの改変は、疎水性ドメイン内の14位および15位にあるセリン残基およびロイシン残基を一つのトリプトファン残基で置き換え且つ18位および19位にあるアラニン残基およびメチオニンmethonine残基を欠失させること改変Bipシグナル配列-2と命名した;疎水性ドメイン内の18位および19位にあるアラニン残基およびメチオニンmethonine残基を欠失させること改変Bipシグナル配列-3と命名した;ならびに疎水性ドメイン内の14位にあるセリン残基をアラニンで置き換え且つ18位および19位にあるアラニン残基およびメチオニンmethonine残基を欠失させること改変Bipシグナル配列-4が含まれる。これらの改変は、疎水性ドメインの疎水性を増加させることを予定していたが、それは、これらシグナル配列と、重要なリボソームタンパク質およびERトランスロコンタンパク質との相互作用、および組換えタンパク質のためのタンパク質トランスロケーションおよび分泌を改善するためにより効率的なシグナルペプチダーゼ切断部位を作り出すことを更に増強することができる。0048ヒトインスリン、インスリン様成長因子-2IGF-2、抗体、インターフェロン、アポリポタンパク質等を含めた他の試験タンパク質も評価して、これら改変Bipシグナル配列が、それらの発現および分泌を改善すると考えられるかどうか決定する。0049改変Bipシグナル配列のためのアミノ酸配列を、表3に要約する。実施例3試験タンパク質の一過性発現0050一過性発現実験のために、HEK293T細胞を、10FBSを補充した1mlのDMEM培地を含む12ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、そして37°Cにおいて5CO2雰囲気でインキュベートした。HEK293T細胞が、70~100密集に達した時点で、消費された培地を、1mlの新鮮DMEM/10FBS培地と交換し、そして各々のウェルを、個々の試験タンパク質またはPBS模擬トランスフェクション陰性対照用について1μgのプラスミドDNAおよび3μlのFugeneTM-HDトランスフェクション試薬で、製造者のプロトコルにしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、24~72時間インキュベートし、そして培地中に分泌された個々の組換え酵素の発現について、酵素活性検定で、ならびに/またはウェスタンブロッティングおよびELISAによって、毎日検査した。実施例4酵素活性検定0051組換えヒト酸性β-グルコセレブロシダーゼGlcCeraseの細胞培養培地中への発現および分泌を、酵素活性検定によって、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または約72時間における馴化培地および4-メチルウンベリフェリル-β-D-グルコピラノシド4-MU-β-Glc蛍光発生基質を用いて評価した。簡単にいうと、各々の試料からの20μlの馴化培地を、指定の時点で採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中において80μlのMcIlvane緩衝液MI緩衝液:50mMクエン酸ナトリウム/リン酸ナトリウムpH5.2/0.25v/vTritonX-100/0.25w/vタウロコール酸ナトリウムで希釈した。25μlの各希釈試料を、三連で行った96ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし、そして50μlの6mM4-MU-β-Glc基質MI緩衝液中で調製を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらプレートを、カバーテープで密封し、37°Cで1時間インキュベートした。酵素反応は、125μlの0.1MNaOHを加えることによって止め、そして遊離した4-MU蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて355nm励起波長および460nm発光波長をそれぞれ用いて読み取った。模擬トランスフェクションした試料からの4-MU蛍光は、バックグラウンド対照として役立ち、全てのGlcCerase試料から差し引いた。0052組換えヒト酸性α-グルコシダーゼGAAの発現および分泌を、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または72時間後の馴化培地および4-メチルウンベリフェリル-α-D-グルコピラノシド4-MU-α-Glc蛍光発生基質を用いて測定した。具体的には、各々の試料からの20μlの馴化培地を、異なった時点で採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中において80μlの50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0で希釈した。25μlの各希釈試料を、96ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし三連、そして50μlの6mM4-MU-α-Glc基質50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0中で調製を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加えた。次に、それらプレートを、カバーテープで密封し、37°Cで1時間インキュベートした。酵素反応を、125μlの0.1MNaOHを加えることによって止め、そして遊離した4-MU蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて355nm励起波長および460nm発光波長をそれぞれ用いて読み取った。模擬トランスフェクションした試料からの4-MU蛍光は、バックグラウンド対照として役立ち、全てのGAA試料から差し引いた。0053組換えヒト酸性α-ガラクトシダーゼGLAの発現および分泌は、酵素活性検定により、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または72時間後の馴化培地および4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシド4-MU-α-Gal蛍光発生基質を用いて測定する。具体的には、各々の試料からの20μlの馴化培地を、異なった時点で採取し、そして0.5mlミクロ遠心管中において80μlの50mMクエン酸ナトリウム/リン酸ナトリウム緩衝液pH4.6で希釈する。25μlの各希釈試料を、96ウェル透明底黒色プレートの個々のウェル中に小分けし三連、そして50μlの8mM4-MU-α-Gal基質50mMクエン酸ナトリウム/リン酸ナトリウム緩衝液pH4.6中で調製を、マルチチャンネルピペッターによって各々のウェルに加える。それらプレートを、カバーテープで密封し、37°Cで1時間インキュベートする。酵素反応は、125μlの0.1MNaOHを加えることによって止め、そして遊離した4-MU蛍光を、蛍光プレートリーダーにおいて355nm励起波長および460nm発光波長をそれぞれ用いて読み取る。模擬トランスフェクションした試料からの4-MU蛍光は、バックグラウンド対照として役立ち、全てのGLA試料から差し引く。実施例50054特定のタンパク質は、極めて高レベルで天然に発現するが、他のものは不十分にしか発現しないということを確認した。mRNAの存在量および安定性は、タンパク質発現に影響することがありうる転写レベルで重要な因子であるが、シグナル配列も、タンパク質レベルで決定的な役割を果たし、この本質的に異なるdisparateタンパク質発現に貢献するということが次第に明らかになっている。ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質Bipは、組換えタンパク質のためのタンパク質発現および分泌を改善する優れたシグナル配列を開発するのに特に好都合であると考えられるという具体的な特徴を有する。一つの改変Bipシグナル配列を作成し、モデルタンパク質に付加して、この非天然のシグナル配列が、モデルタンパク質についてのタンパク質発現および分泌を改善するかどうかを決定した。具体的には、疎水性コアを延長して、より長いαヘリックス構造を形成させた。改変Bipシグナル配列-1中の疎水性ドメインの延長は、いくつかの利点を有するであろうと予想される。第一に、改変されたより長い疎水性ドメインは、より長いαヘリックスを形成し、リボソーム出口トンネル全体に広がると考えられ、それが、リボソームタンパク質Rpl17によって容易に識別されて、Sec61サブユニットなどの他の重要なERタンパク質およびRAMP4とのより良い相互作用を容易にすることができる。第二に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Bipシグナル配列が、トランスロコン細孔において新生ポリペプチドを効率よく配向させるTRAMおよびSec61サブユニットなどの重要なトランスロコンタンパク質と相互作用することを可能にして、必要なタンパク質トランスロケーション適格ループ配向を促進することができる。第三に、より長いαヘリックス疎水性ドメインは、この改変Bipシグナル配列が、シグナルペプチダーゼによってより速い速度で切断されうるように、水性トランスロコン細孔から脂質二重層中へより効率よく移動することを可能にすることができる。第四に、改変Bipシグナル配列は、トランスロコンからより速い速度で離れて移動して、組換えタンパク質が、その合成の際により早く、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、BipなどのERシャペロンタンパク質、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよびカルネキシンなどの他の重要なタンパク質と相互作用することを可能にして、タンパク質フォールディングを改善することができる。これら可能性のある利点のいずれかまたは全てが、タンパク質の発現、フォールディングおよび細胞からの輸出の速度を改善すると考えられる。0055他の改変は、伸長した疎水性ドメインの隣接領域に荷電残基を加えることを包含させて、その疎水性を更に増強し、シグナル配列をトランスロコンで適切に配向させることができる。これらの改変は、特定のリボソームタンパク質、特に、Rpl17とのシグナル配列の相互作用を増強することを予定していて、それが、順次、トランスロコンタンパク質Sec61β、RAMP4およびTRAMとの相互作用を増加させて、タンパク質トランスロケーション、タンパク質発現および分泌を改善すると考えられる。0056野生型ヒトGlcCeraseをコードしているいくつかの異なったDNAコンストラクトを、天然のGlcCeraseシグナル配列WTGlcCeraseかまたはヒトBipシグナル配列CBP201GlcCeraseかまたは新規な改変Bipシグナル配列-1CBP204GlcCeraseのいずれかを含有するように作成した。これらコンストラクト1μgを、約80密集したヒト細胞系HEK293Tにおける一過性発現実験によって試験した。馴化細胞培養培地20μlを、72時間経過中に毎日採取し、そしてGlcCerase酵素活性について4-MU-β-グルコース蛍光発生基質を用いて検定して、GlcCerase発現および分泌へのシグナル配列の効果を評価した。図1で理解されうるように、双方のシグナル配列が、細胞培養培地中へのGlcCeraseの発現および分泌を促進することができる。しかしながら、操作された改変Bipシグナル配列-1CBP204GlcCeraseの場合は、トランスフェクション後72時間のWTGlcCeraseに相対して2倍高いGlcCerase活性を生じることが認められた。基底活性は、模擬トランスフェクションしたエンプティーベクター陰性対照について認められ、そして増加した酵素活性が、組換えGlcCeraseの発現によって生じたことを確かめた。複数のトランスフェクション実験n>3は、新規なシグナル配列が、GlcCerase発現および分泌を増加させたことを確認した。実施例60057タンパク質合成は、栄養素すなわち、ATP、アミノ酸、炭水化物等並びに他の必須細胞成分例えば、開始因子および伸長因子、tRNA、タンパク質シャペロン等の利用可能性によって大きく影響される。前者は、再供給の際に増加させるかまたは細胞培養培地で補給することができるが、後者成分は、細胞中で限られており、タンパク質生産の際に補充することができない。これら生命に必要な成分の枯渇は、顕著な細胞ストレスを引き起こし、それが、大部分のタンパク質の新しいタンパク質合成の減少または停止状態さえももたらす。興味深いことに、いくつかのタンパク質の発現は、これらストレスの多い期間中に適応細胞応答の一部として維持され、そして実際は増加して、ホメオスタシスへ細胞を復帰させている。これら選ばれたタンパク質が、それらの選択的発現を可能にする細胞タンパク質合成機構によってどのように区別されるかは、完全に明らかではないが、シグナル配列は、この過程において重要な役割を果たしていると考えられる。Bipは、このストレスの多い期間中にその発現が維持されて、細胞ホメオスタシスを再確立させる重要なERシャペロンタンパク質であるので、本発明者は、この改変Bipシグナル配列が、異種組換えタンパク質の選択的発現を、他のタンパク質の発現が減少するかまたは停止される条件下において維持することを可能にするであろうと考えている。この仮説を調べるために、本発明者は、KEK293T細胞培養物を、高細胞密度約100密集においてWTGlcCeraseおよびCBP204GlcCeraseでトランスフェクションし、そしてそれらの発現および分泌を63時間にわたって監視した。更に、栄養素を枯渇させる実験中再供給前のバッチ適用中の低栄養素期間を模擬する実験の後期段階中に、細胞培養培地を変えないで、WTGlcCeraseおよびCBP204GlcCeraseの発現が、栄養素の枯渇に応答して変化するかどうかを決定した。0058本結果は、これら実験条件下において、改変Bipシグナル配列-1を含有するCBP204GlcCeraseが、図2に示されるように、63時間の期間を通して、その天然のシグナル配列を含むWTGlcCeraseより良く発現したということを示している。CBP204GlcCeraseレベルは、24時間後に、WTGlcCeraseより1.9倍高く、48時間後に2.1倍高く、そして63時間後に2.5倍高かった。72時間に外挿した場合、CBP204GlcCeraseは、WTGlcCeraseより3.3倍高いと考えられる。重要なことに、CBP204GlcCerase発現は、ほぼ一定速度で維持され、その場合、分泌されたタンパク質の倍増が翌日毎に存在した。対照的に、WTGlcCeraseの発現速度は、より後の時点で顕著に遅くなった。この違いは、これら二つの酵素の発現曲線の形状、すなわち、CBP204GlcCeraseのほぼ線形曲線と、より後の時点で発現速度が横ばいになったようなWTGlcCeraseの非線形曲線とを比較した時に最も明らかであった。これらデータは、おそらくは、栄養素枯渇に応答したCBP204GlcCeraseおよびWTGlcCeraseの示差的発現を示しているが、この相違は、より長いインキュベーションで更に増加すると考えられる。CBP204GlcCeraseとWTGlcCeraseとの間の唯一の違いは、シグナル配列であるので、これらデータは、改変Bipシグナル配列-1が、非最適細胞培養条件中に優先的な発現を可能にしたという仮説を支持する。実施例70059異なったモデルタンパク質の発現および分泌への改変Bipシグナル配列-1の効果を調べるために、DNAプラスミドを、野生型ヒト酸性α-グルコシダーゼGAAであって、その天然のGAAシグナル配列を含有するものWTGAAかまたは、操作されたBipシグナル配列-1およびGAAのアミノ酸残基24-952を含有するものCBP218GAAと命名したをコードするように構築した。これらDNAコンストラクトを、HEK293Tにおける一過性発現によって約2日間にわたって調べて、野生型GAAの発現および分泌へのこれらシグナル配列の効果を直接的に比較した。図3で理解されうるように、CBP218GAAは、培地中においてトランスフェクション後43時間のWTGAAより2.5倍高い分泌GAA活性を有した。基底活性は、模擬トランスフェクションしたエンプティーベクター陰性対照について認められ、そして培地中の観測酵素活性が、組換えGAAの発現によって生じたことを確かめた。これら結果は、CBP218GAAとWTGAAとの間の唯一の違いが、それらのそれぞれのシグナル配列であるので、改変Bipシグナル配列-1CBP218GAAの場合が、同じ実験条件下においてGAA発現および分泌を有意に増加させたということを示している。実施例8ウェスタンブロッティングおよびELISA検定0060試験タンパク質の発現および分泌を、ウェスタンブロット分析によって評価する。簡単にいうと、一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または72時間後の馴化細胞培養培地を集め、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEに供した後、ニトロセルロースメンブランに移す。そのメンブランを、TRIS緩衝生理食塩水/0.1v/vTween-20TBST中の4w/v脱脂乳で、室温において振とうしながら1時間ブロッキングする。次に、メンブランを、TBST中の4w/v脱脂乳中で適当に希釈した例えば、1:5000一次抗体例えば、ウサギ抗ヒトIGF-2と一緒に、室温で1時間または4°Cで一晩振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、TBSTで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って1時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、TBST中の4w/v脱脂乳中で適当に希釈した例えば、1:20,000酵素結合二次抗体例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体と一緒に、室温で1時間振とうしながらインキュベートする。次に、そのブロットを、TBSTで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って1時間にわたって洗浄する。次に、ブロットを、化学発光基質と一緒に室温で5分間インキュベートし、そして画像化システムによってまたはフィルムによって可視化して、試験タンパク質の発現レベルを評価する。0061同様に、試験タンパク質の発現は、固相酵素免疫検定法enzymelinkedimmunosorbentassaysELISAによって評価することができる。簡単にいうと、96ウェルイムノソルベントプレートを、TRIS緩衝生理食塩水TBS中5μg/mlのタンパク質濃度の50μlの一次抗体例えば、ウサギ抗ヒトIGF-2で被覆する。次に、これらプレートを、200μlのTBST中の4w/v脱脂乳で室温において1時間ブロッキングする。一過性トランスフェクション実験による24時間後、48時間後または72時間後の馴化細胞培養培地を集め、これらプレート中において室温で1時間インキュベートする。次に、これらプレートを、200μlのTBSTで、室温において振とうおよび複数回の緩衝液交換を伴って1時間にわたって洗浄する。次に、これらプレートを、TBST中で適当に希釈した例えば、1:20,000酵素結合二次抗体例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体と一緒に室温で1時間インキュベートする。次に、これらプレートを、TBSTで、複数回の緩衝液交換を伴って室温で1時間にわたって洗浄する。次に、これらプレートを、比色用基質例えば、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン,TMBと一緒に室温で5~15分間インキュベートし、0.1M硫酸で止め、そしてプレートリーダー中において適当な波長例えば、450nmで読み取って、試験タンパク質の発現を評価する。"