"単離ヒト成体心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物であって、前記単離心臓幹細胞がc-kit陽性であり、不死DNAを有する組成物。前記心臓幹細胞がIGF-1受容体陽性である請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が5kbp長より長いテロメアを有する請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が7kbp長より長いテロメアを有する請求項3記載の組成物。前記心臓幹細胞がp16INK4a陰性である請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞がヒト心筋組織から単離される請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が、ブロモデオキシウリジンBrdUラベリング後の培養中の細胞の少なくとも1回の継代後にBRdU陰性である請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が少なくとも90の純度である請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が少なくとも95の純度である請求項1記載の組成物。前記心臓幹細胞が約100の純度である請求項1記載の組成物。請求項1記載の組成物を被験者に投与することによるそれを必要とする前記被験者における損傷心筋の修復方法であって、前記損傷心筋の構造的および機能的完全性が前記組成物の投与後に少なくとも部分的に回復される方法。前記単離成体心臓幹細胞が自系である請求項11記載の方法。前記組成物が心筋内にまたは冠動脈内に投与される請求項11記載の方法。前記損傷心筋が心筋梗塞である請求項11記載の方法。前記心臓幹細胞が、前記被験者への投与前に1つ以上のサイトカインに曝露される請求項11記載の方法。前記1つ以上のサイトカインがインスリン様増殖因子Iおよび/または肝細胞増殖因子である請求項15記載の方法。不死DNAを有する成体心臓幹細胞の単離方法であって、以下の:a成体心臓幹細胞をDNA標識に曝露することこの場合、前記心臓幹細胞はc-kit陽性であり、心筋組織から単離される;b少なくとも1回の集団倍加のために前記標識化心臓幹細胞を培養すること;そしてcDNA標識に関して陰性である心臓幹細胞を選択することここで、前記選択幹細胞は不死DNAを有する心臓幹細胞であるを包含する方法。前記DNA標識がBrdU、クロロでオキシウリジンCldUまたはヨードデオキシウリジンIdUである請求項17記載の方法。前記成体心臓幹細胞が、DNA標識への曝露前に、1つ以上の非老化性マーカーから選択される請求項17記載の方法。前記1つ以上の非老化性マーカーが、長いテロメア、高テロメラーゼ活性、IGF-1受容体発現およびp16INK4a発現に関して陰性からなる群から選択される請求項19記載の方法。前記成体心臓幹細胞がヒトである請求項17記載の方法。前記DNA標識に関して陰性である心臓幹細胞を単離することをさらに包含する請求項17記載の方法。製薬上許容可能な担体ならびに請求項17記載の方法により単離される成体心臓幹細胞を含む薬学的組成物。c-kit陽性、IGF-1受容体陽性、p16INK4a陰性であり、不死DNAを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団。前記成体心臓幹細胞がヒトである請求項24記載の細胞集団。本発明は、一部は、優れた再生能力を示し、培養中で数回継代後でさえ細胞老化を示さない成体心筋中に存在する成体心臓幹細胞の小集団の発見に基づいている。これらの細胞は、相対的に多量のテロメラーゼ活性を保持し、長いテロメアを有し、そしてP16INK4a陰性である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、IGF-1受容体を発現する。本発明は、成体心臓幹細胞のこの非老化性小集団を単離するための方法を、ならびに種々の心臓症状を処置するために非老化性心臓幹細胞のこのプールを用いる方法を提供する。本発明は、心筋組織、例えばヒト心筋組織から非老化性成体心臓幹細胞を単離する方法を包含する。一実施形態では、被験体から心臓幹細胞を抽出すること;上記幹細胞を拡張し、培養すること;拡張幹細胞におけるテロメア長、テロメラーゼ活性および/またはIGF-1受容体発現を確定すること;そしてIGF-1受容体に関して陽性であるかおよび/または特定テロメア長およびテロメラーゼ活性のレベルを有する幹細胞を選択することを包含する。一実施形態では、単離非老化性幹細胞は、1つ以上の幹細胞マーカー、例えばc-kitおよびMDR1を発現する。本発明の別の態様では、非老化性心臓幹細胞は、不死DNAを保有する幹細胞に関してさらに選択され得る。細胞複製後に老いたDNA鋳型鎖例えば不死DNAを保持する心臓幹細胞は、新しいDNA鋳型のみを有する心臓幹細胞より大きい成長能力すなわち、より多数の非老化性細胞を生じるおよび修復可能性を有する。一実施形態では、不死DNAを有するこのような心臓幹細胞は、細胞培養中での少なくとも1回の継代後にDNA標識を保持しない心臓幹細胞のクローンを選択することにより同定される。DNA標識に関して陰性である心臓幹細胞すなわち、不死DNAを有する心臓幹細胞は、不死DNAを有する成体心臓幹細胞の純粋集団を得るために単離され得る。したがって、本発明は、不死DNAを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団およびその薬学的組成物も包含する。ある実施形態では、このような心臓幹細胞は、c-kit陽性、IGF-1受容体陽性およびp16INK4a陰性である。本発明は、単離非老化性成体心臓幹細胞の薬学的組成物も提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、単離ヒト心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含み、この場合、上記単離ヒト心臓幹細胞はc-kit陽性、IGF-1受容体陽性であり、そして5kbp長より長いテロメアを有する。別の実施形態では、ヒト心臓幹細胞はp16INK4a陰性である。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、不死DNAを有する単離ヒト心臓幹細胞およびその他の幹細胞例えば、その他の心臓幹細胞、例えば新しいDNA鋳型鎖を有するものの混合物を含む。このような組成物では、当該組成物は、不死DNAを含む単離心臓幹細胞を少なくとも8以上含む。ある実施形態では、組成物は、不死DNAを含む単離心臓幹細胞を少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95含むすなわち、組成物中の心臓幹細胞は、不死DNAを有する心臓幹細胞に関して少なくとも85、少なくとも90または少なくとも95の純度である。本発明は、被験者における損傷心筋および/または加齢関連心筋症の修復方法であって、損傷および/または加齢心筋の領域に単離非老化性生体心臓幹細胞を投与することを包含する方法も包含するが、この場合、上記心臓幹細胞は、それらの投与後に心筋および/または心筋細胞を生じて、それにより損傷心筋および/または加齢関連心筋症を修復する。ある実施形態では、単離非老化性心臓幹細胞は、不死DNAを含有する。このような実施形態では、非老化性心臓幹細胞は、損傷心筋の構造的および機能的完全性を老化性心臓幹細胞例えば、本明細書中に記載されるような非老化のマーカーを有さないより大きい回復を示す。単離非老化性成体心臓幹細胞は、投与前に活性化され得る。一実施形態では、単離非老化性成体心臓幹細胞は、1つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子またはインスリン様増殖因子-1にそれらを曝露することにより活性化される。別の実施形態では、活性化幹細胞は、自系であるか、あるいはそれらが再投与される同一被験体から単離される。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、走化性勾配を形成するために1つ以上のサイトカインの心筋内投与を包含するが、この場合、上記走化性勾配は、加齢または損傷心筋の領域への投与非老化性成体心臓幹細胞の動員を助長する。本発明は、被験体における心不全を防止または処置する方法であって、被験体の心臓に単離非老化性生体心臓幹細胞不死DNAを含有する心臓幹細胞を含むを投与すること、そしてアンギオテンシンII受容体アンタゴニストを投与することを包含する方法も包含する。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、アンギオテンシン変換酵素ACE阻害薬の投与を包含する。単離非老化性心臓幹細胞は、投与前に1つ以上のサイトカインに曝露することにより活性化され得る。他の実施形態では、当該方法はさらに、走化性勾配を形成して、加齢または損傷心筋の領域への委嘱活性化幹細胞の移動を促進するために、1つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子またはインスリン様増殖因子-1の心筋内投与を包含する。本明細書中で用いる場合、自系は、同一個体に由来するかまたはそれから転移されるものを指すすなわち、自系供血;自系骨髄移植片。本明細書中で用いる場合、同種異系は、遺伝子的に異なるが、しかし同一種に属するかまたはそれから得られるものを指す例えば、同種異系組織移植片。本明細書中で用いる場合、幹細胞は始原細胞と互換的に用いられ、有糸分裂によりそれ自体を再生する能力を有し、クローン原性であり、そして種々の特殊化細胞型に分化し得る細胞を指す。本明細書中で用いられる幹細胞は、体細胞性幹細胞、例えば骨髄または心臓幹細胞である。本明細書中で用いる場合、成体幹細胞は、胚起源でなく、胚または胎児組織に由来しない幹細胞を指す。本発明で用いられる幹細胞は、系列陰性であるよう選択されるのが有益である。系列陰性という用語は、細胞が特定細胞系列に特徴的な抗原を発現しないことを意味するとして当業者に既知である。そして、系列陰性幹細胞はc-kit陽性であるよう選択される、というのが有益である。c-kitという用語は、幹細胞の表面に存在することが知られている、そして幹細胞を他の周囲細胞から同定し、分離する方法に語句普通に利用される受容体であるとして、当業者に既知である。本明細書中で用いる場合、非老化性幹細胞は、複製的老化を示すことなく、多数回繰り返して分裂する能力を保有する幹細胞を指す。非老化性幹細胞は、長いテロメアを有するか、および/または若い動物から新たに単離されたc-kit陽性心臓細胞におけるテロメラーゼ活性の少なくとも60であるテロメラーゼ活性のレベルを有する。長いテロメアは、若年動物から単離される心臓幹細胞からの平均テロメア長とほぼ同じかまたはそれより長い長さを有するテロメアを指す。例として、齧歯類における長いテロメアは、約18kbp以上の長さを有するテロメアである。ヒトでは、長いテロメアは、約5kbp以上の長さを有するテロメアである。本明細書中で用いる場合、ヒト非老化性幹細胞は、約5kbp以上の長さのテロメア長を有し、ならびに若い20~40歳個体から新たに単離されたc-kit陽性心臓細胞におけるテロメラーゼ活性の少なくとも60であるテロメラーゼ活性レベルを有する幹細胞を指す。非老化性幹細胞は、p16INK4aのような老化のマーカーに関して陰性である。したがって、非老化性心臓幹細胞はp16INK4a陰性である。いくつかの実施形態では、非老化性心臓幹細胞は、IGF-1受容体を発現するすなわち、非老化性心臓幹細胞は、IGF-1R陽性である。本明細書中で用いる場合、損傷心筋は、虚血状態に曝露されてきた心筋細胞を指す。これらの虚血状態は、心筋梗塞、あるいはその他の心臓血管性疾患または関連愁訴により引き起こされ得る。酸素の欠乏は、周囲区域における細胞の死を引き起こし、梗塞を後に残して、これが結局は瘢痕となる。本明細書中で用いる場合、加齢性心筋症は、生物体が年を取ると生じる内在的メカニズムの結果としての心筋の劣化を指す。本明細書中で用いる場合、サイトカインという用語は増殖因子と互換的に用いられ、細胞表面の受容体を結合し、シグナル伝達カスケードを開始し、したがって細胞過程に影響を及ぼすペプチドまたはタンパク質を指す。サイトカインおよび増殖因子という用語は、ネイティブサイトカインまたは増殖因子の機能的変異体を包含する。サイトカインまたは増殖因子の機能的変異体は、その対応する受容体を活性化する能力を保有する。変異体としては、アミノ酸置換、挿入、欠失、代替的スプライス変異体、またはネイティブタンパク質の断片が挙げられる。ポリペプチドに関する変異体という用語は、参照配列に関連して1つ以上のアミノ酸により変更されるアミノ酸配列を指す。変異体は保存的変化を有し得るが、この場合、置換アミノ酸は、同様の構造的または化学的特性、例えばロイシンのイソロイシンによる置き換えを有する。代替的には、変異体は、非保存的変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置き換えを有する。類似の小変異は、アミノ酸欠失または挿入あるいはその両方も含み得る。生物学的活性を除去することなくどのアミノ酸残基が置換され、挿入され、または欠失され得るかを確定するに際しての指針は、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出され得る。本発明の薬学的組成物は、治療薬として、すなわち治療用途に用いられ得る。本明細書中で用いる場合、処置および治療という用語は、治癒効果、緩和効果および予防効果を包含する。ある実施形態では、治療的有効用量の幹細胞および/またはサイトカインが、心臓に適用され、送達され、または投与されるか、あるいは心臓中に移植される。有効用量または量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。上記用量は、1回以上の投与で投与され得る。本明細書中で用いる場合、患者または被験体は任意の脊椎動物を包含し、例としてはヒト、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられ得るが、これらに限定されない。しかしながら、患者または被験体は、哺乳類、例えばヒト、あるいは家畜化哺乳類のような哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマ等、あるいは生産哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ブタ等であるのが有益である。好ましい一実施形態では、患者または被験体はヒトである。本発明は、特定小集団の成体心臓幹細胞を単離する方法を提供する。これらの非老化性成体心臓幹細胞は、正常テロメラーゼ活性および長いテロメアを保有することにより細胞老化を回避し、これにより、幹細胞は分裂し続け、短縮化テロメアを有する子孫を生じることなく分化することができる。したがって、非老化性成体心臓幹細胞から生成される成育可能な筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞は、先在する心筋に機能的に統合して、加齢性心筋症または損傷心筋を修復し、それにより器官機能を保ち得る。非老化性心臓幹細胞は、本明細書中に記載される非老化性マーカーを欠く心臓幹細胞と比較して、増殖および再生能力増強を示す例えば、長いテロメア、高テロメラーゼ活性、p16INK4a陰性およびIGF-1R発現。本発明の一実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞を単離する方法は、被験体から心臓幹細胞を抽出すること;幹細胞を拡張し、培養すること;培養幹細胞の少なくとも1つの非老化性特質を確定することここで、上記特質は、テロメア長、テロメラーゼ活性、p16INK4a発現およびIGF-1受容体発現からなる群から選択される;そして長いテロメアを有する幹細胞、対照と比較して少なくとも60のテロメラーゼ活性を有する幹細胞、p16INK4a陰性である幹細胞、IGF-1受容体を発現する幹細胞、またはその組合せを選択することここで、上記選択幹細胞は非老化性成体心臓幹細胞であるを包含する。いくつかの実施形態では、単離非老化性成体心臓幹細胞は、c-kit、MDR-1またはその組合せを発現する。別の実施形態では、被験体から心臓幹細胞を抽出するステップは、被験体から心筋組織検体を獲得すること、そして組織検体から幹細胞を単離することを包含する。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。成体幹細胞の単離方法は、当該技術分野で既知である。幹細胞は、被験体または患者から得られる組織検体、例えば心筋または骨髄から単離され得る。例として、組織検体は、切り刻まれ、適切な培地中に入れられる。組織検体から増殖する幹細胞は、初代培養後、約1~2週間で観察され得る。初代培養後約4週間で、拡張幹細胞が遠心分離により収集され得る。米国特許出願公開第2006/0239983号2006年2月16日出願この記載内容は参照により本明細書中で援用されるは、成体幹細胞を培養し、拡張するために適した培地を記載する。しかしながら、当業者は、必要な構成成分を決定し、一般に用いられる細胞培地を本発明の単離幹細胞を培養するのに用いられるよう変更することができる。本発明の幹細胞は系列陰性LinNEGである、ということが好ましい。LinNEG幹細胞は、種々の手段により、例えば幹細胞集団を系列マーカーに対する抗体と接触させ、その後、磁気ビーズおよびバイオマグネットと共役される抗免疫グロブリン抗体を用いることにより抗体結合細胞を単離することによって系列陽性細胞を除去することこれらに限定されないにより単離され得る。代替的には、抗体結合系列陽性幹細胞は、抗免疫グロブリン抗体と共役されるビーズを含有するカラム上に保持され得る。例えば、心臓系列のマーカー例えば、血管細胞または心筋細胞委任のマーカーを発現する細胞は、系列陰性心臓幹細胞を単離するために心臓幹細胞集団から除去され得る。血管系列のマーカーとしては、GATA6SMC転写因子、Ets1EC転写因子、Tie-2アンギオポエチン受容体、VE-カドヘリン細胞接着分子、CD62E/E-セレクチン細胞接着分子、アルファ-SM-アクチンα-SMA、収縮タンパク質、CD31PECAM-1、vWF因子VIIIの担体、バンデイレラシンプリシフォリアBandeiraerasimplicifoliaおよびハリエニシダUlexeuropaeusレクチンEC表面糖タンパク質結合分子が挙げられるが、これらに限定されない。筋細胞鶏痘のマーカーとしては、GATA4心臓転写因子、Nkx2.5およびMEF2C筋細胞転写因子、ならびにアルファ-筋節アクチンα-SA、収縮タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい一実施形態では、LinNEG幹細胞は、幹細胞因子に関する受容体であり、多薬剤耐性-1MDR1であり、染料、毒性物質および薬剤を細胞から押出得るP-糖タンパク質である1つ以上の幹細胞表面マーカー、例えばc-kitを発現する。これらの表面マーカーのいずれか1つを発現するLinNEG幹細胞の一集団を単離するための陽性選択方法は、当業者に周知である。考え得る方法の例としては、種々の型の細胞分類、例えば蛍光活性化細胞分類FACSおよび磁気的細胞分類、ならびにアフィニティークロマトグラフィーの変法が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、LinNEG幹細胞はc-kit陽性である。幹細胞マーカーを発現する単離LinNEG幹細胞は、細胞培養プレートの単一ウェル中で個別にプレート化され、そして個々の幹細胞からクローンを得るために拡張され得る。一実施形態では、テロメア長は、単一幹細胞由来のクローンで測定される。テロメア長の決定方法は、当該技術分野で周知である。テロメア長は、定量的蛍光insituハイブリダイゼーションQ-FISH、サザンブロットまたは定量的PCRのような方法を用いることにより査定され得る。少なくとも5kbp、少なくとも7kbp、少なくとも8kbp、少なくとも9kbp、少なくとも10kbp、少なくとも12kbp、少なくとも13kbp、少なくとも14kbp、少なくとも15kbp、少なくとも16kbp、少なくとも17kbpまたは少なくとも18kbp長が、細胞培養における使用のために、またはさらなる拡張のために選択され得る。好ましい一実施形態では、少なくとも5kbp長、さらに好ましくは少なくとも7kbp長であるテロメアを有するヒト心臓幹細胞が、さらなる使用のために選択される。別の実施形態では、テロメラーゼ活性は、拡張幹細胞クローンで測定される。テロメラーゼ活性の測定方法としては、電気泳動的およびELISAベースのテロメア反復増幅プロトコールTRAP検定、ならびに実時間PCR法が挙げられる。単離幹細胞におけるテロメラーゼ活性は、対照細胞におけるテロメラーゼ活性と比較され得る。対照細胞は、若い動物から新たに単離されたc-kit陽性心臓細胞であり得る。ヒト非老化性心臓幹細胞の場合、対照細胞は、若い20~40歳個体から新たに単離されたc-kit陽性心臓細胞であり得る。対照細胞と比較して少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、好ましくは90、さらに好ましくは95のテロメラーゼ活性を発現する幹細胞が、使用およびさらなる拡張のために選択され得る。さらに別の実施形態では、インスリン様増殖因子-1IGF-1受容体発現が、拡張幹細胞クローンで査定される。IGF-1受容体は表面タンパク質であり、当業者に既知の慣例的方法により検出され、表面マーカーの発現を測定し得る。このような方法としては、FACS、磁気細胞分類およびアフィニティークロマトグラフィーの変法が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、IGF-1受容体発現は、免疫細胞化学またはウエスタンブロッティング技法により測定され得る。好ましい一実施形態では、IGF-1受容体発現に関して陽性である幹細胞クローンが、さらなる使用のために選択される。さらに別の実施形態では、拡張幹細胞クローンは、p16INK4a発現に関して測定され得る。好ましい一実施形態では、p16INK4a発現に関して陰性である幹細胞は、さらなる使用のために選択される。ある実施形態では、拡張心臓幹細胞は、不死DNAを含有するクローンに関して選択され得る。本明細書中で用いる場合、不死DNAは、細胞複製後に保持される老いた鋳型鎖新規合成DNA鎖と対比した場合を指す。小集団の心臓幹細胞は非無作為染色分体分離により分裂して、老いた鋳型鎖すなわち、不死DNAを保持する娘細胞およびより新しい鋳型鎖すなわち新しいDNAを受け継ぐ娘細胞を生じる。両方のクラスの心臓幹細胞すなわち、不死DNAを保有する者と新DNAを保有するものは、損傷心臓組織の構造および機能を有効に修復し得るが、不死DNAを含有する心臓幹細胞は、新DNAを含有する心臓幹細胞と比較して、優れた増殖および再生能力を示す、ということを本発明人等は発見した。実施例8Fを参照。不死DNAを含有する心臓幹細胞クローンは、培養中のDNA標識化親心臓幹細胞の少なくとも1回の継代または集団倍加後、DNA標識に関して陰性であるクローンを選択することにより同定され得る。例えば、心臓幹細胞はブロモデオキシウリジンBrdUで標識され、次いでクローンは、少なくとも1回の集団倍加が起きるまで、DNA標識の非存在下で培養中で標識化親細胞を増殖させることにより、個々のBrdU標識化細胞からその後生成される。その結果生じたBrdU陰性クローンは、老いた鋳型または不死DNAを保持する心臓幹細胞を表す。不死DNAを含有する心臓幹細胞は、他の方法、例えば実施例8に記載されているように、FRET戦略を用い、その後FACs分析する方法によっても同定され得る。他の標識を用いる新規合成DNA鋳型および老いたDNA鋳型を含有する細胞間のその他の識別方法は、当業者に既知であり、不死DNAを含有する心臓幹細胞を同定するために用いられ得る。したがって、本発明は、不死DNAを有する成体心臓幹細胞を単離するための方法を包含する。一実施形態では、当該方法は、成体心臓幹細胞をDNA標識に曝露すること;少なくとも1回の集団倍加のために上記標識化心臓幹細胞を培養すること;そしてDNA標識に関して陰性である心臓幹細胞を選択することここで、上記選択幹細胞は不死DNAを有する心臓幹細胞であるを包含する。好ましくは、成体心臓幹細胞はc-kit陽性であり、心筋組織例えば、ヒト心筋組織から単離される。DNA標識は、標識化ヌクレオシドのような細胞を複製するに際して新規合成DNA中に組入れられる任意の標識であり得る。単離方法に用いるための適切なDNA標識としては、ブロモデオキシウリジンBrdU、クロロでオキシウリジンCldU、ヨードデオキシウリジンIdU等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成体心臓幹細胞は、DNA標識への曝露前に、本明細書中に記載される1つ以上の非老化性マーカーに関して予備選択され得る。例えば、心筋組織から単離される幹細胞例えば、c-kit陽性心臓幹細胞は、テロメア長、テロメラーゼ活性、IGF-1受容体発現および/またはp16INK4a発現に関して検査され得る。長いテロメア例えば、ヒト心臓幹細胞に関しては5kbpより長い、高テロメラーゼ活性、IGF-1受容体陽性および/またはp16INK4a発現陰性を有する心臓幹細胞が、不死DNAを有する心臓幹細胞の単離方法に用いるために選択され、単離され得る。言い換えれば、いくつかの実施形態では、不死DNAを有する心臓幹細胞に関するさらなる選択のためにDNA標識に曝露されるべき心臓幹細胞の出発プールは、本明細書中に記載される非老化性マーカーのうちの1つ以上を有する心臓幹細胞であり得る。ある実施形態では、DNA標識の非存在に関して選択される心臓幹細胞は、不死DNAを有する心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を得るために単離され得る。したがって、本発明は、c-kit陽性であり、不死DNAを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団も包含する。本明細書中で用いる場合、実質的に純粋なは、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99または100純粋であることを意味する。実質的に純粋な集団中の心臓幹細胞は、IGF-1受容体陽性およびp16INK4a陰性でもあり得る。ある実施形態では、成体心臓幹細胞はヒトである。本発明は、製薬上許容可能な担体、ならびに不死DNAを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を含む薬学的組成物も提供する。前に考察されたように、成体心臓幹細胞のこの集団は、老いたDNA鋳型を保持しないすなわち、不死DNAを有さない心臓幹細胞と比較して、優れた再生能力を有する。本発明は、損傷心筋の区域に単離非老化性幹細胞を投与することによるそれを必要とする被験者における損傷心筋または加齢性心筋症の修復および/または再生方法であって、投与幹細胞が、筋細胞、内皮細胞または平滑筋細胞のうちの1つ以上に分化する方法も提供する。ある実施形態では、損傷心筋は心筋梗塞である。分化細胞は、増殖され、種々の心臓構造、例えば冠動脈、小動脈、毛細管および心筋を形成するが、これらはすべて、心臓における適正な機能に不可欠な構造である。内皮細胞および平滑筋細胞を含めた細胞の移植は移植細胞を損傷領域内で生存させるが、しかしながらそれらは完全機能性を心臓が取り戻すことができるために必要な構造を形成しない、ということが文献中に示されている。機能的および構造的完全性の両方を回復する能力は、本発明のさらに別の態様である。好ましい一実施形態では、非老化性幹細胞は、成体心臓幹細胞である。別の実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は、本明細書中に記載される心臓または血管系症状のうちの1つに関して治療的処置を必要とする被験体から採取された心臓組織から単離され、上記非検体に移植し戻されるすなわち、心臓幹細胞は自系である。一実施形態では、当該方法は、不死DNAを含有する単離非老化性心臓幹細胞を投与することを包含する。上記のように、心臓幹細胞のこの小集団は、心臓幹細胞の他の集団例えば、新しいDNAを含有する心臓幹細胞または本明細書中に記載されるような非老化性マーカーを保有しない心臓幹細胞と比較して、優れた再生特性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、損傷心筋の構造的修復は、不死DNAを含有しない心臓幹細胞を用いて観察される修復に比して、不死DNAを含有する心臓幹細胞の投与後に増強される。構造的修復の測定値としては、壁厚増大、形成される筋細胞の数、細胞複製の程度、ならびに再生される小動脈および毛細管の数が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、損傷心筋の機能的修復は、不死DNAを含有しない心臓幹細胞を用いて観察される修復に比して、不死DNAを含有する心臓幹細胞の投与後に増強される。機能的修復の測定値としては、血行力学的測定値、例えば収縮期血圧、陽性および陰性dP/dt、ならびにコンピューター処理拡張期応力の増大における減衰が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、治療的有効用量または量の幹細胞を心臓に投与することを包含する。有効用量は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。上記用量は、1回以上の投与で投与され得る。同時係属中の米国特許出願公開第2006/0239983号2006年2月16日出願この記載内容は参照により本明細書中で援用されるにおける実施例で例証されているように、2×104~1×105個の幹細胞が、心筋梗塞のマウスモデルにおいて心筋修復および再生を実行するために十分であった。マウスおよびヒトの心臓間には明白なサイズ差が認められるが、この範囲の幹細胞は同様にヒトにおいても十分であると考えられる。心臓幹細胞の有効用量は、約2×104~約2×107、さらに好ましくは約1×105~約6×106、最も好ましくは約2×106であり得る。しかしながら、何が有効用量とみなされるかの精確な決定は、各患者に個別の因子、例えばそのサイズ、年齢、心筋損傷の区域、ならびに損傷発生時以来の時間量を基礎にし得る。当業者、具体的には医者または心臓学者は、過度の実験を伴わずに有効用量を構成する幹細胞の数を決定し得る。本発明のいくつかの実施形態では、単離非老化性幹細胞は、被験体への投与前に活性化される。幹細胞の活性化は、1つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子HGF、インスリン様増殖因子-1IGF-1またはその変異体に単離幹細胞を曝露することにより成し遂げられ得る。HGFは、c-Met受容体の活性化を介して幹細胞移動およびホーミングに正の影響を及ぼすKolletetalJClinInvest112160169LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971RosuMylesetalJCellSci11843434352UrbaneketalCircRes97663673。同様に、IGF-1およびその対応する受容体IGF-1Rは、心臓幹細胞分裂を誘導し、テロメラーゼ活性を上方調節し、複製老化を妨げ、心臓中の機能的適格心臓幹細胞のプールを保存するKajsturaetalDiabetes5014141424TorellaetalCircRes94514524DavisetalProcNatlAcadSciUSA10381558160。好ましい一実施形態では、単離非老化性幹細胞は、肝細胞増殖因子HGFおよび/またはインスリン様増殖因子-1IGF-1と接触される。一実施形態では、HGFは、約0.1~約400ng/mlの量で存在する。別の実施形態では、HGFは、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375または約400ng/mlの量で存在する。別の実施形態では、IGF-1は、約0.1~約500ng/mlの量で存在する。さらに別の実施形態では、IGF-1は、約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約225、約250、約275、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475または約500ng/mlの量で存在する。単離非老化性幹細胞の活性化のために適しているサイトカインのいくつかの他の限定例としては、アクチビンA、骨形成タンパク質2、骨形成タンパク質4、骨形成タンパク質6、カルジオトロフィン-1、繊維芽細胞増殖因子1、繊維芽細胞増殖因子4、Flt3リガンド、神経膠細胞由来神経栄養因子、ヘパリン、インスリン様増殖因子-II、インスリン様増殖因子結合タンパク質-3、インスリン様増殖因子結合タンパク質-5、インターロイキン-3、インターロイキン-6、インターロイキン-8、白血病抑制因子、ミッドカイン、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増即因子BB、プロゲステロン、プトレシン、幹細胞因子、間質細胞由来因子-1、トロンボポエチン、形質転換増殖因子-α、形質転換増殖因子-β1、形質転換増殖因子-β2、形質転換増殖因子-β3、血管内皮細胞増殖因子、Wnt1、Wnt3aおよびWnt5aが挙げられるKanemuraetalCellTransplant14673682KaplanetalNature438750751XuetalMethodsMolMed121189202QuinnetalMethodsMolMed121125148AlmeidaetalJBiolChem2804134241351BarnabeHeideretalNeuron48253265MadlambayanetalExpHematol3312291239KamangaSolloetalExpCellRes311167176HeeseetalNeurooncol7476484HeetalAmJPhysiol289H968H972BeattieetalStemCells23489495SekiyaetalCellTissueRes320269276WeidtStemCells22890896EncaboetalStemCells22725740およびBuytaeriHoefenetalStemCells22669674に記載されている。これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される。上記サイトカインの機能的変異体も、本発明に用いられ得る。機能的サイトカイン変異体は、それらの対応する受容体を結合し、活性化する能力を保持する。変異体としては、アミノ酸置換、挿入、欠失、代替的スプライス変異体、またはネイティブタンパク質の断片が挙げられる。例えば、NK1およびNK2は、HGFの天然スプライス変異体であって、これらはc-MET受容体と結合し得る。これらの型の天然スプライス変異体は、機能を保持するサイトカインタンパク質の工学処理された変異体と同様に、本発明により意図される。いくつかの実施形態では、それを必要とする被験体への非老化性幹細胞の投与は、心臓への1つ以上のサイトカインの投与を伴う。サイトカインは、幹細胞因子SCF、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、間質細胞由来因子-1、スチール因子、血管内皮細胞増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージ刺激因子、肝細胞増殖因子HGF、インスリン様増殖因子-1IGF-1、インターロイキン-3、あるいは幹細胞を刺激および/または動員しうる任意のサイトカインからなる群から選択され得る。好ましい一実施形態では、サイトカインは、HGF、IGF-1、HGFまたはIGF-1の機能的変異体、あるいはその組合せから選択される。サイトカインは、非老化性幹細胞と同時的に送達され得る。代替的には、サイトカインの投与は、指定期間による非老化性幹細胞の投与に専攻するかまたはその後に続く。当該期間は、約15分、約30分、約1時間、約3時間、約6時間、約12時間、約24時間、約36時間、約1週間、約2週間、約1ヶ月または約6ヶ月であり得る。サイトカインは、1回以上の投与により心臓に送達され得る。一実施形態では、サイトカインは、単一回投与により送達される。別の実施形態では、多数回投与の同一投与量のサイトカインが心臓に送達される。本発明の好ましい一実施形態は、走化性勾配が形成されるよう、心臓への多数回用量投与のサイトカインの投与を包含する。心臓の心房および/または心尖から左心室の中央領域に延びる走化性勾配は、漸増サイトカイン濃度の多数回用量投与により確立され得る。代替的には、走化性勾配は、非老化性幹細胞の移植の部位から左心室の中央領域または梗塞心筋の境界領域に形成され得る。一実施形態では、少なくとも2つのサイトカインが走化性勾配の形成に用いられる。別の実施形態では、第一サイトカインの濃度は一定のままであるが、一方、第二サイトカインの濃度は可変的で、それにより走化性勾配を形成する。好ましい一実施形態では、走化性勾配は、IGF-1およびHGFの多数回投与により形成されるが、この場合、IGF-1の濃度は一定のままであり、そしてHGFの濃度は可変的である。いくつかの実施形態では、HGFの可変濃度は、約0.1~約400ng/mlの範囲であり得る。他の実施形態では、IGF-1の濃度は、約0.1~約500ng/mlであり得る。単離非老化性幹細胞およびサイトカインは、注入により心臓に投与され得る。注入は、好ましくは、心筋内である。当業者が承知しているように、心臓は作動している筋肉であるので、これは、幹細胞および/またはサイトカインのための好ましい送達方法である。この経路による注入は、心臓の収縮運動のために注入物質が失われないということを保証する。他の実施形態では、心臓幹細胞は冠動脈内投与される。本発明のさらなる一態様では、幹細胞および/またはサイトカインは、経心内膜的に、または経心外膜的注入により投与される。この好ましい実施形態は、サイトカインが心筋内注入される実施形態により必要とされる保護的周囲膜にサイトカインを浸透させる。本発明の別の好ましい実施形態は、経心内膜注入物を送達するためのカテーテルベースのアプローチを包含する。カテーテルの使用は、胸腔の開口が必要とされるより侵襲的な送達方法を排除する。当業者が理解するように、回収の最適時間は、より侵襲性の小さい手順に任される。カテーテルアプローチは、NOGAカテーテルまたは同様の系のような技法の使用を伴う。NOGAカテーテル系は、当該区域の電気機械的マッピング、ならびに標的化注入物を送達するか、または治療薬で標的化区域を浸すために用いられ得る格納式針を提供することにより、誘導投与を促す。本発明の実施形態のいずれかが、このような系の使用により投与されて、注入物を送達し、または治療薬を提供する。画像処理の取込みによる標的化処置を提供する能力も提供する代替的系、ならびに本発明とともに用いられ得るカテーテル送達系を、当業者は理解するであろう。NOGAおよび類似の系の使用に関する情報は、例えばShermanBasicApplMyol131114PateletalTheJournalofThoracicandCardiovascularSurgery130163138;およびPerrinetalCirculation10722942302これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用されるに見出され得る。別の実施形態では、単離非老化性心臓幹細胞は、冠動脈内投与経路により投与される。本発明とともに利用され得る送達または移植のその他の有用な方法、例えばDawnetalProcNatlAcadSciUSA10237663771この記載内容は参照により本明細書中で援用されるに記載された方法を、当業者は理解する。本発明の方法は、心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管性欠損症、加齢性心筋症および動脈炎症、ならびに動脈、小動脈および毛細管のその他の疾患これらに限定されないの処置のために有用である。具体的には、本発明の方法は、上記疾患のうちの1つに起因するか、または年齢に伴う心筋細胞の一般的衰えに起因する損傷心筋の修復および/または再生を提供する。本発明は、被験体における心不全を防止するかまたは処置する方法であって、単離非老化性成体心臓幹細胞を上記非検体の心臓に投与すること、ならびにアンギオテンシンII受容体アンタゴニストを投与することからなる方法も包含する。一実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は不死DNAを含有する。別の実施形態では、非老化性成体心臓幹細胞は、本明細書中に記載されるような1つ以上のサイトカインへの曝露により、投与前に活性化される。さらに別の実施形態では、1つ以上のサイトカインは、心臓に投与されて走化性勾配を形成し、上記の投与非老化性成体心臓幹細胞を心筋損傷の区域に移動させる。別の実施形態では、上記の1つ以上のサイトカインは、HGF、IGF-1またはその変異体である。レニン-アンギオテンシン系RASは、身体における血圧および細胞外容積の調節を促進するホルモン系である。腎還流が低下すると、腎臓中の細胞は酵素レニンを放出する。レニンは、肝臓により分泌される不活性前駆体ペプチドであるアンギオテンシノーゲンをアンギオテンシンIに切断する。アンギオテンシンIは、その後、主に肺で見出されるアンギオテンシン変換酵素ACEによりアンギオテンシンIIAngIIに変換される。AngIIは、AT1受容体の活性化を介して、多数の作用、例えば血管狭窄ならびにアルドステロンおよびバソプレッシンの分泌を生じる。AngIIは、心臓における酸化的損傷の年齢依存的蓄積に関連づけられておりFiordalisoetalDiabetes5023632375KajsturaetalDiabetes5014141424、そして老化を誘導し、内皮始原細胞の数および機能を減少することが報告されているKobayashietalHypertensRes29449455。さらに、AngIIは、筋細胞におけるアポトーシスを誘発しLerietalJClinInvest10113261342、心不全の進行に関与し得るMcMurrayetalLancet362767771。実際、AT1受容体の抑制は、慢性心不全を有する患者の臨床結果を改善し、ヒトの寿命を延ばすことが示されているMcMurrayetalLancet362767771。本発明は、被験体の心臓に非老化性成体心臓幹細胞の投与と組合せてAngII受容体アンタゴニストを投与することにより、被験体における心不全を防止するか、および/または慢性心不全を処置する方法を提供する。好ましくは、AngII受容体アンタゴニストは、AT受容体のアンタゴニストである。本発明により包含されるAngII受容体アンタゴニストのいくつかの非限定例としては、バルサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベラルタン、オルメサルタン、カンデサルタンおよびエプロサルタンが挙げられる。さらに、アンギオテンシン変換酵素ACEの阻害薬は、AngII受容体アンタゴニストに加えて、またはその代わりに、投与され得る。上記のように、ACEは、アンギオテンシンIをアンギオテンシンIIに変換する。この酵素の抑制は、AngIIのレベル低減をもたらし、したがって、心臓幹細胞に及ぼすAngIIの有害作用を減少する。本発明の方法に用いられ得るACE阻害薬としては、ベナゼプリル、エナラプリル、リシノプリル、カプトプリル、フォシノプリル、ラミプリル、ペリンドプリル、キナプリル、モエキシプリルおよびトランドラプリルが挙げられるが、これらに限定されない。AngII受容体アンタゴニストまたはACE阻害薬は、非老化性成体心臓幹細胞の投与後に、多数回用量投与で被験体に投与され得る。当該アンタゴニストまたは阻害薬は、設定時間の間、慣例的スケジュールで摂取され得る。例えば、阻害薬は、非老化性成体心臓幹細胞の投与後、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、約6ヵ月、約12ヶ月または約24ヶ月の間、1日1回摂取され得る。他の用量投与スケジュールが用いられることもある。当業者、特に医者または心臓学者は、ACE阻害薬またはAngII受容体アンタゴニストの投与のための適切な用量およびスケジュールを決定し得る。好ましくは、非老化性心臓幹細胞、ならびにアンギオテンシンII受容体アンタゴニストおよび/またはACE阻害薬の投与後、心不全の1つ以上の症候が低減されるかまたは軽減される。心不全の症候としては、疲労、衰弱、速いまたは不規則な心拍、呼吸困難、持続性の咳または喘鳴、脚または足の浮腫、ならびに腹部の腫脹が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、例えば、心臓血管性疾患、心不全またはその他の心臓症状を処置するための本発明の方法に用いるための、非老化性成体幹細胞および/または少なくとも1つのサイトカインを含む薬学的組成物のような組成物の製造方法も包含する。一実施形態では、薬学的組成物は、単離非老化性非と心臓幹細胞および製薬上許容可能な担体を含むが、この場合、上記の単離ヒト心臓幹細胞は、c-kit陽性、IGF-1受容体陽性であり、5kbp長より長いテロメアを有する。別の実施形態では、心臓幹細胞は7kbp長より長いテロメアを有する。さらに別の実施形態では、心臓幹細胞は9kbp長より長いテロメアを有する。いくつかの実施形態では、非老化性心臓幹細胞はp16INK4a陰性である。ある実施形態では、薬学的組成物は、不死DNAを含有する非老化性成体心臓幹細胞を含む。一実施形態では、薬学的組成物は、不死DNAを含有する非老化性成体心臓幹細胞に加えて、他の成体心臓幹細胞または他の幹細胞型例えば、造血性幹細胞を含み得る。好ましくは、このような薬学的組成物は、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも96、少なくとも97、少なくとも98、少なくとも99の非老化性成体心臓幹細胞不死DNAを含有するを含む。他の実施形態では、薬学的組成物は、純粋なすなわち100の非老化性成体心臓幹細胞不死DNAを含有を含む。このような薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるような不死DNAを有する成体心臓幹細胞の実質的に純粋な集団を製薬上許容可能な担体とともに懸濁するかまたは混合することにより調製され得る。好ましい一態様では、当該方法および/または組成物例えば薬学的組成物は、有効量の非老化性成体心臓幹細胞あるいは2つ以上のサイトカインを、心臓および/または血管性症状を処置するのに有用である適切な薬剤と組合せて含む。付加的な好ましい態様では、本発明の薬学的組成物は、注入により送達される。これらの投与送達経路としては、皮下または非経口、例えば静脈内、動脈内例えば冠動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与、ならびにくも膜下腔内、および輸注技法が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、薬学的組成物は、好ましくは、注入に適した形態である。本発明の治療薬を非経口的に投与する場合、それは一般的に、単位投与量注入可能形態溶液、懸濁液、乳濁液で処方される。本発明に適した薬学的処方物としては、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注入可能溶液または分散液中に再構成するための滅菌粉末が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒質であり得る。適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散駅の場合には必要な粒子サイズの保持により、ならびに界面活性剤の使用により保持され得る。非水性ビヒクル、例えば綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油または落花生油、ならびにエステル、例えばイソプロピルミリステートも、複合組成物のための溶媒系として用いられ得る。さらに、組成物の安定性、滅菌性および等張性を増強する種々の添加物、例えば抗菌防腐剤、酸化防止剤、キレート化剤および緩衝剤が付加され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により保証され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含むのが望ましい。注入可能製剤形態の吸収延長は、吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。しかしながら、本発明によれば、用いられる任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、化合物と相溶性でなければならない。滅菌注入可能溶液は、必要量の適切な溶媒中の本発明を実行するのに利用される化合物を、所望により種々の量の他の成分とともに組入れることにより調製され得る。例えば治療的用量の非老化性心臓幹細胞を含む本発明の薬学的組成物は、任意の相溶性担体、例えば種々のビヒクル、アジュバント、添加物および希釈剤を含有する注入可能処方物中で、被験体に投与され得る;あるいは本発明に利用可能な化合物は、緩徐放出皮下移植片または標的化送達系、例えばモノクローナル抗体、イオン泳動的、ポリマーマトリックス、リポソームおよび微小球の形態で、被験体に非経口的に投与され得る。本発明で利用される薬学的組成物は、被験体に経口投与され得る。錠剤、懸濁液、溶液、乳濁液、カプセル、粉末、シロップ等の中で化合物を投与するといったような慣用的方法が、利用可能である。化合物を傾向的にまたは静脈内に送達し、そして生物学的活性を保持する既知の技法が選択される。一実施形態では、本発明の組成物は最初に投与され、その後、さらなる投与により保持され得る。例えば、本発明の組成物は、一型の組成物中で投与され、その後、異なるかまたは同一の型の組成物中で投与され得る。例えば、本発明の組成物は、静脈内注入により投与されて、血中レベルを適切なレベルにし得る。その時、被験体のレベルは経口剤形により保持され得るが、しかし被験体の症状によって、他の投与形態が用いられ得る。投与されるべき薬学的組成物の量は、処置されている被験体に関して変わる。一実施形態では、2×104~1×105の成体心臓幹細胞および50~500μg/kg/日のサイトカインまたは上記サイトカインの変異体が、被験体に投与される。しかしながら、有効用量を考慮されるべきものの精確な決定は、各被験体に個別の因子、例えばそれらのサイズ、年齢、損傷心筋の区域、および損傷後経過時間を基礎にし得る。したがって、本発明の方法で投与されるべき組成物中の化合物、ならびに任意の添加物、ビヒクルおよび/または担体の投与および量を、当業者は容易に決定し得る。典型的には、任意の添加物活性幹細胞単数または複数および/またはサイトカイン単数または複数に加えては、リン酸塩緩衝化生理食塩水中に0.001~50重量溶液の量で存在し、そして活性成分は、マイクログラム~ミリグラムのオーダーで、例えば約0.0001~約5重量、好ましくは約0.0001~約1重量、最も好ましくは約0.0001~約0.05重量、あるいは約0.001~約20重量、好ましくは約0.01~約10重量、最も好ましくは約0.05~約5重量で存在する。もちろん、動物またはヒトに投与されるべき任意の組成物に関しては、そして任意の特定の投与方法に関しては、したがって、適切な動物モデル、例えば齧歯類、例えばマウスにおける致死用量LDおよびLD50を確定することにより、毒性を;そして組成物単数または複数の投与量、その中の構成成分の濃度、ならびに適切な応答を示す組成物単数または複数の投与時機を確定することが好ましい。このような確定は、当業者の知識、この開示内容および本明細書中で引用される文書により、過度の実験を必要としない。そして、過度の実験なしに、逐次投与のための時機が確認され得る。本発明の治療薬を含む組成物の例としては、開口部、例えば口、鼻、肛門、膣、経口、胃内、粘膜例えば経舌、歯槽、歯肉、嗅覚または呼吸粘膜投与等のための液体調製物、例えば懸濁液、シロップまたはエリキシル;ならびに非経口、皮下、皮膚内、筋肉内または静脈内投与例えば注入可能投与のための調製物、例えば滅菌懸濁液または乳濁液が挙げられる。このような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコース等と混合して存在し得る。組成物はさらにまた、凍結乾燥され得る。組成物は、投与経路、所望の調製物によって、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加物、防腐剤、風味剤、着色剤等を含有し得る。標準テキスト、例えばREMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCE17thedition1985この記載内容は参照により本明細書中で援用されるは、過度の実験を伴わずに、適切な調製物を調製するために参考にされ得る。本発明の薬学的組成物は、選択pHに緩衝され得る液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液または粘性組成物として好都合に提供される。消化管吸収が好ましい場合、本発明の組成物は、ピル、錠剤、カプセル、カプレット等の固体形態、例えば緩徐放出されるか、または液体充填物、例えばゼラチン被覆液体を有し、それによりゼラチンが胃中で溶解されて、腸に送達される固体調製物であり得る。鼻または呼吸器粘膜投与が所望される場合、組成物は、圧搾噴霧ディスペンサー、ポンプディスペンサーまたはエアロゾルディスペンサーにより分配される形態であり得る。エアロゾルは、通常は、炭化水素によって圧力を掛けられている。ポンプディスペンサーは、好ましくは、計量用量または特定粒子サイズを有する用量を分配し得る。本発明の組成物は、特に経口投与される場合、より魅力的にさせるために、製薬上許容可能な風味剤および/または着色剤を含有し得る。粘性組成物は、ゲル、ローション、軟膏、クリームなどの形態例えば、経皮投与のためであり得るし、典型的には、粘度が約2500~6500cpsであるよう十分量の増粘剤を含有するが、しかし、10,000cpsまでというさらに粘性の組成物が用いられることもある。粘性組成物は、好ましくは2500~5000cpsの粘度を有するが、それは、その範囲より粘度が高くなると投与が難しくなるためである。しかしながら、その範囲より高いと、組成物は固体またはゼラチン形態に近づき、そうなると、経口摂取用の嚥下ピルとして容易に投与され得る。明らかに、適切な担体およびその他の添加物の選択は、正しい投与経路ならびに特定剤形の性質、例えば液体剤形例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態の何れで処方されるか、または固体剤形例えば、組成物が、ピル、錠剤、カプセル、カプレット、徐放形態または液体充填形態の何れに処方されるかによって決まる。溶液、懸濁液およびゲルは、普通は、活性化合物のほかに多量の水好ましくは精製水を含有する。少量の他の成分、例えばpH調節剤例えば塩基、例えばNaOH、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、ゼリー化剤例えばメチルセルロース、着色剤および/または風味剤も存在し得る。組成物は等張性であり、すなわちそれらは血液および涙液と同一浸透圧を有し得る。本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいはその他の製薬上許容可能な作用物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、あるいはその他の無機または有機溶質を用いて成し遂げられ得る。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のために特に選択される。組成物の粘度は、製薬上許容可能な増粘剤を用いて選定レベルに保持され得る。入手が容易で且つ経済的であり、そして作業が容易であるため、メチルセルロースが選択される。他の適切な増粘剤としては、例えばキサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択される作用物質によって決まる。重要な点は、選定濃度を達成する量を用いることである。粘性組成物は、普通は、このような増粘剤の付加により溶液から調製される。製薬上許容可能な防腐剤は、組成物の保存寿命を増大するために用いられ得る。ベンジルアルコールが適しているが、しかし種々の防腐剤、例えばパラベン、チメロサール、クロロブタノールまたは塩化ベンズアルコニウムも用いられ得る。防腐剤の適切な濃度は、総重量を基礎にして0.02~2であるが、しかし選択される作用物質によってかなりの程度の変動があり得る。組成物は活性化合物に関して化学的に不活性であるよう選択されるべきである、と当業者は理解する。これは、化学的および薬学的原則として当業者に問題を提示しないし、あるいは標準テキストを参照することにより、または簡単な実験過度の実験を含まないにより、本開示内容および本明細書中で引用される文書から、問題は容易に回避され得る。本発明の組成物は、一般的に許容される手法に従って成分を混合することにより調製される。例えば、選定構成成分は、ブレンダーまたは他の標準装置中で簡単に混合されて、濃化混合物を生成し、これは次に、水または増粘剤、そしておそらくはpHを制御するための緩衝剤または張性を制御するための付加的溶質の付加により、最終濃度および粘度に調整され得る。一般的に、pHは約3~7.5であり得る。組成物は、特定被験体の年齢、性別、体重および症状、そして投与のために用いられる組成物形態例えば固体対液体を考慮しながら、医学および獣医学の当業者に周知の投与量および技法で投与され得る。ヒトまたは他の哺乳類のための投与量は、本開示内容、本明細書中で引用される文書、ならびに当該技術分野での知識から、当業者により過度の実験を伴わずに決定され得る。初期投与およびさらなる用量投与のための、または逐次的投与のための適切なレジメンも可変的であり、初期投与と、その後の投与を包含し得る;しかしそれでも、本開示内容、本明細書中で引用される文書、ならびに当該技術分野での知識から、当業者により確定され得る。本発明の薬学的組成物は、心不全および心臓血管性疾患、例えばアテローム硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、先天性心臓血管性欠損症および動脈炎症、ならびに動脈、小動脈および毛細管のその他の疾患、あるいは関連愁訴これらに限定されないを処置するために用いられる。したがって本発明は、これらの症状、または心臓の衰弱を伴う他の症状のうちの任意の1つ以上の処置または防止のために、本明細書中で考察されるような非老化性成体幹細胞を、単独で、または本明細書中で考察されるような1つ以上のサイトカインまたは前記サイトカインの変異体と組合せて投与することを包含する。そして有益な投与経路は、これらの症状を処置するために最もよく適合するもの、例えば注入によるもの、例えば皮下または非経口的、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻内投与、ならびにくも膜下腔内投与、そして輸注技法を包含するが、これらに限定されない。以下の実施例により本発明をさらに例証するが、それらは本発明を限定するものではない。本出願全体を通して引用される参考文献、特許および公開特許出願の記載内容、ならびに図面は、全ての目的のために参照により本明細書中で援用される。実施例1-心臓幹細胞の機能的プールは老化心臓中に保存されるA.老いた心臓における心臓幹細胞の特性化心臓始原細胞CPCとしても既知である心臓幹細胞CSCは、幹細胞抗原c-kit、MDR-1およびSca-1を、単独でまたは組合せて発現する系列陰性LinNEG細胞であるBeltramietalCell114763776。LinNEG-CPCは、心臓ニッチ中の早期委任細胞で一団を形成されUrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10392269231、これは主に心房および心尖に位置するが、しかしそれらは左心室LVの基部-中央部領域にも存在する図1Aおよび1B参照。心筋老化が老いた筋細胞の蓄積に伴うCPC機能における変化により状態調節されるか否かを明示するために、4、12、20および28月齢のラットにおける加齢関連タンパク質p16INK4aの発現と一緒にCPCの数を、われわれは測定した。これらの月齢は、それぞれ若年成体、十分に成熟した成体、老齢および老化動物に対応する。この分析は、4、12、20および28月齢のラットにおけるLVの心房、基部-中央部領域および心尖におけるc-kit陽性CPCに制限された。c-kitに対する抗体RDSystemsを用いることにより、CPCを同定した。免疫細胞化学により、細胞表現型を限定した。心臓、骨格筋、神経および造血細胞系列のマーカーに関してCPCを試験して、LinNEG-CPCを検出したBeltramietalCell114763776LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971UrbaneketalCirRes97663673。筋細胞の始原細胞および前駆体を知るために、転写因子、ならびに筋細胞に特異的な細胞質タンパク質と一緒にc-kitの存在を確定した。用いられる抗体の完全一覧を、以下の表1に示す。直接的標識化:一次抗体は蛍光色素と共役した。間接的標識化:種特異的二次抗体は蛍光色素と共役した。F:フルオレセインイソチオシアネート、T:テトラメチルローダミンイソチオシアネート、Cy5:シアニン5、QD655:655nmでの発光を有する量子ドット、QD605:605nmでの発光を有する量子ドット。LVおよび心房心筋の単位面積当たりのCPCまたは2つの他の細胞部類の数NcpcAを、共焦点顕微鏡で計数することにより、CPC、筋細胞の始原細胞および筋細胞の前駆体の外形計測測定値を得た。さらに、シュワルツサルティコフ法を利用して、心筋の単位容積当たりのCPCの数NcpcV、ならびにCPCの平均直径Dcpcを得たAnversaandOlivettiinHandbookofPhysiologyEPageHAFozzardandRJSolaroedsNewYorkOxfordUnivPressSect2Vol175144RotaetalCircRes994252UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10392269231。筋細胞の始原細胞および前駆体の測定のために、同一アプローチを続けて用いた。さらに、複製老化および非可逆的増殖停止に達したCPCの数JanzenetalNature443421426MolofskyetalNature443448452KrishnamurthyetalNature443453457を、老化関連タンパク質p16INK4aの発現により評価した。さらにまた、アポトーシスを受けているCPCの割合LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971RotaetalCirRes994252KajsturaetalDiabetes5014141424を、ヘパリン1により評価して、老化を伴う心臓の種々の解剖学的区域において、機能的適格CPCの数を確立したUrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697RotaetalCirRes994252。4ヶ月から28ヶ月まで、心臓におけるCPCの数は~2.9倍増大した図2。しかしながら、invivoでの細胞周期からの幹細胞の恒久的撤退を促すp16INK4aJanzenetalNature443421426MolofskyetalNature443448452KrishnamurthyetalNature443453457は、有意の割合のCPCで検出された図3参照。p16INK4a陽性CPCのパーセンテージは、4ヶ月の~6から28ヶ月の~81に増大した図2。同様に、アポトーシスは年齢に伴って劇的に増大し、p16INK4a陽性CPCに制限された図4。これらの変わりやすい要素のため、機能的CPCの数は20ヶ月までは本質的に一定のままであったが、しかし28ヶ月で急に減少した図2。したがって、年齢に伴うCPC区画の拡張は、老いた、非複製性の死にかけているp16INK4a陽性の蓄積により特性化される。これらのデータは、老化性アポトーシス性p16INK4a陽性筋細胞の数の同様の増大で一致するKajsturaetalAmJPhysiol271H1215H1228KajsturaetalAmJPathol156813819。筋細胞の始原細胞-前駆体は、筋細胞に特異的な転写因子および細胞質タンパク質と一緒にc-kitを発現する分化中のCPCに対応し、これは、CPCと形成中の筋細胞との間の線形関係を示している。筋細胞転写因子転写因子MEF2Cに陽性であるCPC、すなわち筋細胞の始原細胞、あるいはMEF2Cと筋節タンパク質心臓ミオシン重鎖MHCの両方に陽性であるCPC、すなわち筋細胞の前駆体は、年齢に伴って増大したが、これは、筋細胞の生成が老いた心臓において増強された、ということを示している図5。パルスチェイスBrdU標識化検定を実施してUrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10392269231、CPCの増殖行動ならびにCPC分化により形成される筋細胞の始原細胞の程度を査定した。目的は、老化心臓が、分化始原細胞を促すよう活性化され得る機能的適格CPCのプールを含有するか否かという疑問に答えることであった。したがって、4および27ヶ月目のラットに、BrdUを7日間曝露して、BrdU陽性CPCおよび筋細胞を7日目および12週間追跡後に測定した。具体的には、4および27ヶ月目のラットを、各々2つの群に分けた。第1の場合には、4および27ヶ月目のラットを飲料水中のBrdUに7日間曝露して、その後、屠殺し、試験した。第2の場合には、4および27ヶ月目のラットを、飲料水中のBrdUに7日間曝露して、12週間の追跡期間後、それぞれ7および30ヶ月目に試験した。明性および暗性BrdU標識化CPCを蛍光強度により識別して、長期標識保持CPCを採点して、常在性幹細胞の機能的同一性を提供したTumbaretalScience303359363。蛍光レベル>4,000および<2,000単位ピクセル掛ける平均強度は、それぞれ明性および暗性細胞の典型であるとみなされたUrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10392269231。7日および12週目の明性および暗性BrdU標識化筋細胞も確定した。さらに、筋細胞有糸分裂指数UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10392269231も、LV心筋における増幅中の筋細胞の実際の集団の定量的概算値を有するために、若いおよび老いた心臓におけるホスホ-H3の発現により測定したUrbaneketalCirRes97663673AnversaetalCirculation11314511463。7日目に検出されたBrdU-明性CPCの数図6は、若いおよびおいた動物における12週間の追跡後、それぞれ86および93低減した。7日目に、532および2,012個のBrdU-明性CPCが、それぞれ若いおよび老いた心臓において見出された。12週間後の対応する値は73および140で、これは、心筋における遅いサイクリング幹細胞プールを構成した図7。7日から12週まで、BrdU-暗性CPCは、若い心臓では10倍、老いた心臓では32倍増大した。BrdU-明性CPCおよびBrdU-暗性CPCの総数は、若い動物では12週間で変化しなかったが、しかし老いた動物では有意に増大した。したがって、CPCの増殖動態は、若い心臓では原始細胞のプールを保存するが、しかし老いた心筋ではこの区画を拡張する。同様に、BrdU陽性筋細胞を、7日目図8AおよびBならびに12週目図8CおよびDに測定した。12週目のBrdU-明性筋細胞は限定回数の分裂を経た細胞であったが、一方、BrdU-暗性筋細胞はCPCの始原細胞とみなされ、これは曝露時にBrdU陽性になり、多数の適格化細胞を生じた。中間レベルのBrdU2,000より多いが4,000単位未満のピクセル×平均強度を有する細胞は増幅中の筋細胞を表すと考えられ、これは、曝露時点でBrdUを取り込んで、分裂および分化し続けた。散乱したBrdU陽性筋細胞が、若いおよび老いた動物において標識化の7日後に観察された。12週間の追跡後、BrdU-明性筋細胞と一緒にBrdU-暗性筋細胞のクラスターが、両群で、しかし主に老いた動物において観察された。BrdU陽性筋細胞のパーセンテージは、老いた心臓では若い心臓の5.3倍であった図9。両方の場合に、7日目に検出されたBrdU-明性筋細胞の数は、12週間後に顕著に減少した。逆に、BrdU-暗性筋細胞は増大した。insituおよび単離細胞において測定される筋細胞有糸分裂指数により、老いた心臓における高レベルの筋細胞形成を確証した。有糸分裂の種々の時期における筋細胞図10および11を同定し、有糸分裂指数を算定した。有志分裂指数は、若い心臓と比較して、老いた心臓のほうが高かった図12。したがって、老化心臓は、その活性化が強力な筋細胞再生をもたらす機能的適格CPCのプールを含有する。B.短縮化テロメアを有する心臓幹細胞は老化筋細胞を生じる老いた心臓における筋細胞再生増大は、生活年齢に伴うp16INK4a陽性筋細胞の蓄積および心臓老化表現型の獲得と矛盾しているAmJPathol156813819。さらに、p16INK4a陽性筋細胞のアポトーシスは、老いた心筋においては若い心筋より6倍高くKajsturaetalAmJPhysiol271H1215H1228、筋細胞の始原細胞-前駆体および筋細胞有糸分裂指数は、年齢に伴って増大する。これらの明らかに矛盾する結果は、加齢に伴うCPC区画における欠陥を指し示す。老いた心臓において、相対的に短いテロメアを有するCPCの活性化および分化は、急速に老化に達する筋細胞の始原細胞を生成し得る。この仮説を試験するために、3および27ヶ月目の心臓から収集したc-kit陽性細胞のサイトスピンで、テロメア長を測定した。3および27月齢のラットからの心臓から単離した拡張継代P7~P8c-kit陽性CPCを、CHAPS緩衝液中で均質化して、4°Cで遠心分離した。非処置およびRNアーゼ処置細胞抽出物を、[γ-32P]ATP末端標識化テロメラーゼ基質TSオリゴヌクレオチド:5’-AATCCGTCGA-GCAGAGTT-3’、配列番号1、Taqポリメラーゼおよびアンカー逆方向プライマー5’-GCGCGC-[CTAACC]3CTAACC-5’、配列番号2とともに45分間インキュベートした。試料を28回の増幅周期に曝露したLerietalProcNatlAcadSciUSA9886268631TorellaetalCircRes94514524UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697。PCR産物を、12ポリアクリルアミドゲル上で分離した。テロメラーゼ誘導性反応は、6bp周期性を有する梯子を生じた。当該帯域の光学密度ODを、PCR効率に関して正規化した。定量的蛍光insituハイブリダイゼーションQ-FISHおよび共焦点顕微鏡により、3および27ヶ月目の心臓からの新たに単離されたc-kit陽性細胞のサイトスピンで、テロメア長を評価したChimentietalCirRes93604613LerietalEMBOJ22131139UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697。代表的顕微鏡写真を、図13AおよびBに示す。同様に、若いおよび老いた心臓の組織切片中の小さい発達中の筋細胞において、テロメア長を評価した図14AおよびB。フルオレセインイソチオシアネート-ペプチド核酸FITC-PNAプローブを用いた。短いL5178Y-S、7kbpおよび長いL5178Y-R、48kbpテロメアを有するリンパ腫細胞図13Cで測定される蛍光シグナルを、参照点として用いたLerietalEMBOJ22131139ChimentietalCirRes93604613UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697。老いた心臓において、CPC、筋細胞の始原細胞-前駆体および発達中の筋細胞におけるテロメア長の分布は、短い方のテロメア方向に左にシフトした図15。CPC、筋細胞の始原細胞-前駆体および発達中の筋細胞中の平均テロメア長は、若い細胞よりも老いた細胞では、それぞれ30、35および51短かった。老いたCPCのほぼ50、そして若いCPCの~15が、12kbpより短いテロメアを有し、p16INK4a陽性であった。しかしながら、老いたCPCの~20は18kbpより長いテロメアを有したが、これは、老化心筋とは逆の関連増殖を指し示している。したがって、年齢に伴うCPCにおけるテロメア縮小は、器官老化を状態調節する老化表現型を急速に獲得する筋細胞の始原細胞の生成をもたらす。実施例2.増殖因子受容体系の平衡は加齢心臓の幹細胞においてシフトされるA.加齢心臓からの幹細胞におけるIGF-1/IGF-1R、HGF/c-METおよびAngII/AT1Rの発現IGF-1/IGF-1R系は、テロメラーゼの酸化ストレスおよびリン酸化の減弱によりテロメア長を保存する。さらに、この系は、Akt-PI3キナーゼ経路を介してCPC増殖および生存を促進するTorellaetalCircRes94514524GudeetalCircRes99381388。しかしながら、IGF/1-IGF-1Rは、HGF/c-Met受容体系により主に調整されるCPC移動およびホーミングにおける役割を有さないLinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971UrbaneketalCircRes97663673。原始細胞に及ぼすIGF-1の影響は、心臓に限定されない。IGF-1は、骨格筋における衛星細胞の増殖および分化を誘導しMusaroetalProcNatlAcadSciUSA10112061210、心不全を伴う骨格筋萎縮を防止するSchulzeetalCircRes97418426。CPCに関するアンギオテンシンIIAngIIの結果は不明であるが、しかしこの増殖因子は、老化を誘導し、内皮始原細胞の数および機能を減少しKobayashietalHypertensRes29449455、アポトーシスを誘発しLerietalJClinInvest10113261342、そして心不全の進行に関与するMcMurrayetalLancet362767771。したがって、CPCが局所的レニン-アンギオテンシン系RASを保有するか否か、そして加齢がRAS、ならびにCPCにおけるIGF-1、IGF-1R、HGFおよびc-Metの発現に影響を及ぼすか否かを、われわれは確定した。CPCにおけるこれらの増殖因子および対応する受容体の発現を、実施例1に記載した方法と同様の方法により査定した。CPCは、IGF-1R、c-MetおよびAT1-受容体を、IGF-1、HGFおよびAngIIと一緒に発現する図16A~F。新たに単離されたCPCにおける、そして組織切片におけるAngII、IGF-1およびHGFの検出は、増殖因子が細胞内に形成されるか、または循環から隔離されるかを識別できない。したがって、これらの増殖因子およびそれらの対応する受容体に関する転写物を、実時間RT-PCRによりCPC中で検出した。以前に詳細に記載されたようにOjaimietalAmJPhysiol289H1399H1407、トリゾールTRIREAGENTSigmaを用いて市販のRNA単離キットで、3、12、16および24ヶ月目の心臓から得たc-kit陽性CPCから、総RNAを単離した。第一鎖緩衝液、各々0.4mMのdTTP、dATP、dGTPおよびdCTPを、200UのSuperscriptIIIInvitrogen、10UのRNアーゼ阻害薬RNasinPlus、Promegaおよび500ngのランダムヘキサマーPromegaと一緒に含有する20μlの反応液中の500ngの総RNAから、cDNAを得た。この混合物を、42°Cで2時間インキュベートした。その後、PrimerExpressv2.0解析ソフトウェアAppliedBiosystemsを用いて設計されたプライマー表2参照で、実時間RT-PCRを実施した。LightCyclerPCR系RocheDiagnosticsを、重複で実行される実時間RT-PCRのために用いた。各場合に、5ngのcDNAを用いたが、但し、レニンは15ng必要であった。cDNAをSYBRGreenマスターミックスLightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenI、Rocheと併合した。サイクリング条件は以下の通りであった:95°Cで10分間、その後、45回の増幅95°Cで10秒の変性、5秒間アニーリング、そして72°Cで20秒の伸長。各プライマー組のために用いられるアニーリング温度を、以下の表2に列挙する。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンにより決定される入力に対して、定量値を正規化した。CPC加齢は、アンギオテンシンAogenおよびAT1受容体の一貫した下方調節を生じたが、一方、レニンmRNAは12および16ヶ月で増大して、24ヶ月で基線に戻った図17。mRNAにおける変化は年齢に伴って生じたが、しかしAogenおよびAT1受容体のタンパク質レベル標準ウエスタンブロッティング技法により査定は変化せず図18、これは、RAS機能が老いたCPCにおいて無傷のままであったことを示唆している。加齢に伴うIGF-1RmRNAの有意の減少により、CPCIGF-1/IGF-1R系を特性化したが、一方、IGF-1発現は可変的で、24ヶ月目にのみ低減される傾向があった。c-Met転写物は、加齢CPCにおいて少し影響を及ぼされたが、しかしHGFmRNAは24ヶ月目に減衰された図19。さらに原始細胞に及ぼす年齢の作用を特性化するために、IGF-1、HGFおよびAngIIを合成し、分布津する3および27ヶ月でのCPCの能力を測定した。3および27ヶ月目P5~P6の心臓からの拡張c-kit陽性CPCをSFM中で培養し、IGF-1150ng/mL、HGF200ng/mLおよびAngII10~11Mに24時間曝露した。増殖因子を含有する培地を除去し、細胞を2回洗浄して、新鮮なSFMを付加した。SFMは、IGF-1RAbcamおよびc-MetRDSystemsに対する抗体、またはAT1受容体アンタゴニストテルミサルタン10-7M;SigmaおよびAT2受容体遮断薬PD12331910-7M、Sigmaを含有した。遮断薬は、リガンド結合を回避するために用いられた。IGF-1、HGFおよびAngIIに関して、3および9時間後に、培地を収集した。ELISAにより増殖因子量を確定しIGF-1、RDSystems;HGF、BBridgeInternational;AngII、PeninsulaLaboratories、ウエスタンブロッティングにより測定されるCPCタンパク質およびβ-アクチンSigma発現の総量により正規化した。IGF-1に関する基線値は、若いCPCおよび老いたCPCにおいて同様であったが、しかしHGFは老いた細胞のほうが低い傾向にあった。しかしながら、AngIIレベルは、若いCPCのほうが老いたCPCにおけるよりも3倍高かった図20。リガンドで刺激後、IGF-1の生成は、27ヶ月目より3ヶ月目の細胞で8倍高かったが、一方、HGFの合成は若いCPCでは4倍、老いたCPCでは3.5倍増大した。CPCのAngII刺激は、どちらの細胞集団においてもオクタペプチドの分泌の割合を増大しなかった。したがって、加齢は、CPC増殖、生存および移動に関与する調節系に負の作用を及ぼし、細胞における局所的RASの結果を強力にする。これらの表現型特性は、CPC老化および心筋加齢において重要な役割を有し得る。B.若いおよび老いた心臓から単離された心臓幹細胞に及ぼすIGF-1、HGFおよびAngIIの作用CPCにおけるIGF-1/IGF-1R、HGF/c-MetおよびRASの発現の変化の機能的結果を確定するために、P7~P8での3および27ヶ月目の心臓からのc-kit陽性CPCをSFM中で培養し、IGF-1150ng/mL、HGF200ng/mL、IGF-1およびHGF一緒IGF-1-HGFまたはAngII10-9Mで24時間刺激した。BrdUを、8時間間隔で培地に付加した。細胞を固定し、BrdU取込みを以前に記載されたように測定したBeltramietalCell114763776LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971UrbaneketalCircRes97663673。同様に、AngII10-9M単独で、またはIGF-1150ng/mL、HGF200ng/mL、IGF-1-HGFの存在下で、CPCを24時間刺激した。細胞を固定し、TdT検定KajsturaetalAmJPhysiol271H1215H1228RotaetalCircRes994252によりアポトーシスを確定した。CPCにおける酸化ストレスの程度に及ぼす24時間のAngII10-9Mの作用を、8-OH-dGの存在により測定したRotaetalCircRes994252。8-OH-dGシグナルの強度をImageProソフトウェアで測定しDiabetes5014141424TorellaetalCircRes94514524、PI蛍光に関して正規化した。CPC増殖を誘導するIGF-1、HGFおよびIGF-1-HGFの能力は、老いたCPCでは減衰されたが、しかしなくなりはしなかった。AngIIは、若いCPCおよび老いたCPCに及ぼす増殖促進作用を有した図21A。AngIIは若いCPCおよび老いたCPCにおけるアポトーシスを刺激し、そしてIGF-1はAngII媒介性CPC死の程度を減少させた。逆に、HGF単独は、アポトーシスを減少させなかったか、あるいはCPC生存に及ぼすIGF-1の作用を増強しなかった図21B。CPCアポトーシスにおけるIGF-1の抑制的役割は老いた細胞より若い細胞のほうが高かったが、しかしアポトーシスの40低減が老いたCPCで測定された。AngIIは、ヒドロキシルラジカルの生成をもたらし、これは順次、若いCPCOおよび老いたCPC2で変わり得る現象であるデオキシグアノシンdG酸化を促進する。ヒドロキシルラジカルの存在下で、8-OH-dG損傷の形成は、非テロメアDNAよりもテロメアDNAのほうが5倍高かったKawanishiandOikawaAnnNYAcadSci1019278284。酸化ストレスは、テロメア短縮、増殖停止およびアポトーシスを誘導する。8-OH-dGは、若いCPCより老いたCPCにおいてより大きい割合で検出され図21C~E、そしてさらにAngIIは老いたCPCにおいて8-OH-dG陽性細胞の集団を増大し、年齢に伴うAngII媒介性DNA損傷に関する機序を提供する。したがって、老いた心臓は、機能的CPCのプールを含有するが、しかしながら、酸化ストレスおよびDNA完全性に及ぼすその影響により感受性である。これらの結果に基づいて、これらの増殖因子受容体系が年齢の一関数としてすべてのCPCにおいて均一に影響を及ぼされるか、あるいは加齢が始原細胞の小群を無傷のままにしておく多数のCPCを漸増的に包含するか否かを、われわれは確立した。IGF-1、IGF-1R、HGFおよびc-Metに関して陽性であるCPCの割合は、3ヶ月から28ヶ月まで減少し、AngIIおよびAT1受容体を発現するCPCのパーセンテージは増大した図22。IGF-1/IGF-1RおよびHGF/c-Metを発現するCPCはp16INK4aに関して一貫して陰性であったが、一方、p16INK4aはAngIIおよびAT1受容体に関して陽性であるCPC中で検出された示されていない。老いた心臓中の小比率のCPCが若い心筋の場合と同様に増殖能力を保有するか否かを試験するために、3および27ヶ月目のCPCを連続継代して、20集団倍加に達した。誘導増殖期は27ヶ月目のCPCにおいてより長かったが、しかし指数増殖期は両群の細胞で類似していた図23。同様に、P7~P8で5日間のBrdU標識化は、両年齢での匹敵するレベルのBrdU陽性CPCを生じた。重要なことは、P7~P8でのテロメラーゼ活性が老いたCPCにおいて33だけ減少されたことであった図24。したがって、心筋加齢は、機能的適格CPCのプールを枯渇しない。実施例3-若いおよび加齢心臓におけるHGFによる常在心臓幹細胞の動員A.動員心臓幹細胞は長いテロメアを有し、p16INK4A陰性である。加齢心臓における非老化性CPCの区画の存在は、これらの細胞が活性化され、そして心房および心尖におけるそれらの貯蔵部位からLV基部-中央部領域に場所を移すよう誘導され得るという可能性を高めた。EGFPをコードするレトロウイルスベクターを房室間溝に注入して、4および27ヶ月目の動物における複製中の細胞を標識した図25。両方の場合に、~9-12c-kit陽性CPCを注入部位でEGFPに感染させた。この値は、この領域におけるKi67陽性CPCの割合と一致したデータは示されていない。感染2日後、心臓を切り出して、房室間溝近くのCPC蓄積部位からLV中央領域まで、3つの漸増濃度のHGFを投与した図25。以前に実行したように、この走化性勾配を導入して、心臓機能のほとんどを保持する心臓の部分へのCPCの転位置を助けたLinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971UrbaneketalCircRes97663673。さらにまた、心筋損傷は、この解剖学的区域に主に位置するKajsturaetalAmJPhysiol271H1215H1228。各心臓を二光子顕微鏡BioRadRadiance2100MPの台に乗せて、大動脈を逆行的に通して連続的に還流し、ローダミン標識化デキストランの非存在下または存在下で、酸素添加タイロードで37°Cで還流した。デキストランは70,000の分子量を有し、そしてこのサイズのため、デキストランは内皮細胞バリアを横断せず、冠動脈血管系に留まったままであるDawnetalProcNatlAcadSciUSA10237663771UrbaneketalCircRes97663673。EGFPおよびローダミンは、モード同期チタンサファイアフェムト秒レーザーTsunamiSpectraPhysicsで、それぞれ960および840nmで励起される。515および600nmの発光波長で、対応する画像を得た。このアプローチにより、EGFP陽性細胞の転位置ならびに冠動脈血管系に関するそれらの局在化を、経時的に確定したUrbaneketalCircRes97663673。HGF注入後6時間までに、画像を収集した図26~29。その後、心臓を固定し、共焦点顕微鏡により分析した。完了時に、二光子顕微鏡により検査される心筋の区域を処理し、移動いいGFP陽性細胞の同一性に関して分析した。転位置EGFPは、c-kitまたは他の幹細胞抗原MDR1およびSca-1を、c-Metと一緒に発現した。さらに、GATA-4を移動EGFP陽性c-kit陽性細胞のいくつかにおいて検出し、筋細胞系列へのそれらの委任を実証した。Ki67は、これらの細胞の小集団中に存在した図27および29。EGFP陽性細胞の転位置が冠動脈循環、心筋間質またはその両方を介して起こるか否かを確定するために、冠動脈血管系をローダミン標識化デキストランで還流し、HGFを観察時点で注入したUrbaneketalCircRes97663673。5~6時間の期間に亘って、移動中のEGFP陽性細胞で冠動脈の管腔内に見出されたものはなかった図30および31が、これは、CPCが間質を介して移動したことを示唆している。実際、間質フィブロネクチンにより限定されるトンネル内で、EGFP陽性細胞を検出した図32。HGFは、房室間溝からLV中央領域に向けてCPCを動因子、転位置した。しかしながら、2つの加齢作用が観察された:移動速度と移動中のCPCの数は、おいた心臓よりも若い心臓のほうが有意に高かった図33。CPCに及ぼすIGF-1の増殖促進作用のためLinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971UrbaneketalCircRes97663673、IGF-1を、単独で、またはHGFと組合せて注入して図25、EGFP陽性細胞の数および移動速度を、サイクリングEGFP陽性細胞の割合と一緒に確定した。若いおよび老いた心臓において、IGF-1単独は、CPCの移動を刺激できなかった図33。同様に、IGF-1は、HGFの移動能力を増大しなかった。しかしながら、IGF-1は、若い心臓と老いた心臓の両方で、分裂中のCPCの数の有意の増大を生じた図33。移動中のCPCおよびそれらの早期委任始原細胞は、長いテロメアを有し、p16INK4a陰性であった。これは、ビヒクルを注入された対照心臓の中央領域に存在する非転位置CPCの特性と異なる。これらの細胞は、短いテロメアを有し、しばしばp16INK4aを発現した図34。これらの結果は、機能的適格CPCは心房ニッチ中に貯蔵されるが、一方、加齢作用はLV心筋の中央領域でより顕著であった、ということを示唆する。したがって、加齢は、CPCの増殖および移動特性を減衰するが、しかし無くしはしない。B.動員された心臓幹細胞は新しい筋細胞を生じて、加齢性心筋損傷を修復するこれらの観察に基づいて、心臓に及ぼす加齢の負の作用が常在CPCの活性化により逆転され得るか否かを試験した。HGFおよびIGF-1を、15、20および27月齢のラットに心筋内注入した。器官損傷は~15ヶ月で明らかになり、20ヶ月で増大するが、しかし心室機能は保存されるため、これらの月齢を選択したKajsturaetalAmJPhysiol271H12151228。27ヶ月目に、広範な組織損傷は顕在性心不全と一緒に存在するWeiAmJPhysiolRenalPhysiol289F1144F1152KajsturaetalAmJPhysiol271H12151228。CPCは主に心房および心尖に分布されるため、これらの区域からLV中央領域に向かう2つの走化性勾配が作られて、CPC転位置、増殖および分化を増強する図35。45日後に、動物を屠殺した。増殖因子投与の2日前に、房室間溝および心尖にEGFP-レトロウイルスを注入して、サイクリングCPCを標識した。時々に過ぎないが、EGFP陽性細胞はCPCではなかった。しかしながら、これらのEGFP陽性非CPCは、HGF、IGF-1またはその両方により動員されなかった。したがって、感染部位から離れたLV中央領域におけるEGFP陽性細胞の存在は、CPC移動を示すものであった。すべての処置ラットにおいて、LVの中央領域で、冠動脈抵抗小動脈および毛細管構造と一緒に、EGFP陽性分化筋細胞を同定した図36~38。逆に、EGFP陽性筋細胞および血管は、非処置動物においては検出されなかった。新規形成筋細胞が、小クラスターで、または心筋全体に散在して見出された。しばしば、再生された発達中の筋細胞の群が、心筋損傷の病巣に取って替わった図39。定量的に、心筋1mm2当たりのEGFP陽性筋細胞の数は、16~17および21~22ヶ月目の動物よりも28~29ヶ月目の動物の方が有意に多かった。同様の応答は、冠動脈血管に関して観察された図40。~9-12のCPCがEGFP-レトロウイルスに感染したため、EGFP標識化構造は、一部は、組織再生の程度のみを反映した。したがって、増殖因子またはビヒクルの送達後にBrdUを投与し、実験全体を通して継続した。このアプローチを用いて、累積筋細胞および血管形成を、加齢単独で、ならびに増殖因子療法と一緒に確定した。処置の非存在下では、筋細胞および血管増殖は年齢に伴って増大し、これは、組織損傷に部分的に反応する老いた心臓の能力を指し示している。増殖因子による処置は、心筋細胞形成を、16~17、21~22および28~29ヶ月目で、それぞれ55、66および88増大した図41。血管再生も起きたが、しかし筋細胞と同程度ではなかった。28~29ヶ月での処置心臓における新規筋細胞は、p16INK4a陽性細胞の数を20減少した図42が、この変化は、BrdU標識化筋細胞における増大に反映された。したがって、老化性心筋では、機能的適合CPCは筋細胞および血管系列をうまく獲得して、老いた心臓の構造に影響を及ぼし得る。C.常在心臓幹細胞の活性化は心臓に及ぼす加齢の機能的作用を減衰し、寿命を延ばす屠殺前に、非注入ラット、ビヒクルを注入されたラット非処置、または増殖因子を注入されたラット処置において、血行力学的パラメーターを得た。動物を抱水クロラール300mg/kgb.w.、腹腔内で麻酔し、A/D変換器iWorx214およびコンピューター系に接続されたマイクロチップ圧力変換器SPR-612、MillarInstrumentsを用いて、右頚動脈にカニューレ挿入した。非開胸調製物におけるLV拡張末期圧LVEDP、収縮期圧LVSP、最大圧LVDP、ならびにおよび-dP/dtの評価のために、カテーテルを左心室LV心臓腔中に進行させたKajsturaetalAmJPhysiol271H12151228LerietalJClinInvest10113261342BeltramietalCell114763776UrbaneketalCircRes97663673。LV心臓腔の半径と組合せた壁厚測定値下記参照およびLVEDPを用いて、拡張期壁応力をコンピューター計算した。血行力学的測定値の収集後、リン酸塩緩衝液0.2M、pH7.4およびヘパリン100IU/mlを充填したポリエチレンカテーテルを腹部大動脈にカニューレ挿入した。矢継ぎ早に、大動脈カテーテルを通した塩化カドミウム100mMの注入により心臓を拡張期に停止させ、リン酸塩緩衝液による還流を~3分間実行した。胸郭を開き、右心房を切開して血液および環流液のドレナージを可能にした。次いで、10リン酸塩緩衝化ホルマリンでの還流により、心臓を固定した。還流圧を平均心房圧に調整した。手順全体を通して、invivo測定拡張末期圧と等価の高さに設定された加圧レザバーからの固定液で、LV心臓腔を充填したKajsturaetalAmJPhysiol271H12151228LerietalJClinInvest10113261342BeltramietalCell114763776UrbaneketalCircRes97663673。固定後、心臓を解剖して、右心室および心室間中隔を含めたLVの重量を記録した。心臓の基部から心尖への主縦軸を確定し、LVを、この軸と垂直に5つの環を連続切片として切断した。心室の中央領域での最小および最大腔直径ならびに壁厚を得て、縦軸と一緒に、LV心臓腔容積をコンピューター計算するために利用したDawnetalProcNatlAcadSciUSA10237663771LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971。CPC活性化により媒介される心筋再生は、心室解剖学に及ぼす加齢作用を減衰した;LV心臓腔直径および容積は低減され、壁厚対心臓腔半径比およびLV質量対心臓腔容積比は全年齢で増大した図43。腔寸法におけるこれらの変化は、28~29ヵ月での老化性不全心臓の心室機能の改善を伴った。処置の非存在下では、27ヶ月での心不全は、28~29ヶ月でさらに悪化した。逆に、処置後、LV拡張末期圧LVEDP、収縮期圧LVSP、最大圧LVDP、dP/dtおよび-dP/dt、ならびに27ヶ月で見出された算定拡張期壁応力における変化は、28~29ヶ月ではもはや明白でなかった図44。増殖因子投与は、加齢性筋疾患を逆転した。28~29ヶ月での処置心臓の解剖学および機能は、16~17ヶ月目の1年若い非処置心臓の解剖学および機能と同様になった図45。ラットにおける侵襲性血行力学は屠殺時に収集され得るだけで、多重決定を除外する。上記結果を強化するために、27ヶ月目、処置の1日前、次いで45日後、屠殺前、28~29ヶ月目にラットで、心エコーを記録した。ビヒクルを注入されたラットの一群を、同様に試験した。ラットをケタミン100mg/kgb.w.、腹腔内で麻酔して、13-MHz線形変換器を装備したAcusonSequoia256cを利用して、心エコーパラメーターを収集したDawnetalProcNatlAcadSciUSA10237663771LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971。前胸郭を剃毛し、ラットを左外側臥位に置いた。直腸温度プローブを配置して、試験全体を通して加熱パッドで体温を37.0°C~37.5°Cに注意深く保持した。傍胸骨長軸、傍胸骨短軸、および心尖四腔断面像を用いて、2D、Mモードを得た。収縮期および拡張期解剖学的パラメーターを、乳頭筋レベルでMモードトレースにより得た。面積長さ法により、駆出率EFを算定したDawnetalProcNatlAcadSciUSA10237663771LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971。治療は拡張末期および収縮末期LV直径を減少させたが、一方、駆出率は67±7から79±7に、12ポイント増大した。非処置ラットでは、心臓機能は時間に伴って悪化した図46。処置に伴う心臓性能の改善は、心エコーを早期と後期で比較した場合、明らかであった図47AおよびB。最終的な問題は、CPC活性化および分化により媒介される心臓機能における改善が、このモデルにおいて寿命を延長したか否かであった。この目的のために、27ヶ月目のラットの一群で、死亡率試験を実行した。同時に、32匹の非処置ラットおよび48匹の処置ラットを同一条件下で保持し、死亡を経時的にモニタリングした。31ヶ月までに、非処置ラットはすべて死亡した。しかしながら、処置ラットの28が31ヶ月では生きており、最後の動物が死亡したのは33ヶ月目であった図48。増殖因子処置は、27ヶ月で44、57日から82日に、平均余命を増大した。したがって、心不全からの回復は、ラットにおける最大寿命を延長する。実施例4-非老化性心臓幹細胞の単離および加齢性心筋症の修復におけるそれらの使用心臓手術を受けたことのある同意患者から、心筋検体を得た。試料を細かく切断し、肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子-1を200ng/mlの濃度で補足した培地を含有する非被覆ペトリ皿の表面に植えつけた。細胞培養中で~2週間後、当該組織から増殖した細胞を、免疫ビーズでc-kitに関して分類し、培養する。以前に記載されたように、FACSおよび免疫細胞化学により、細胞表現型を限定するBeltramietalCell114763776OrlicetalNature410701705UrbaneketalProcNatlAcadSciUSA10286928697。個々のヒトc-kit陽性細胞を、0.25~0.5細胞/ウェルの密度で、Terasakiプレートの単一ウェル中に植えつけるBeltramietalCell114763776LinkeetalProcNatlAcadSciUSA10289668971。1個より多い細胞を含有するウェルを除外する。個々のc-kit陽性細胞とともに植え付けられたウェルの各々から生成されたクローンを、実施例1に上記したように、テロメア長および/またはテロメラーゼ活性に関して試験する。少なくとも5kbp長のテロメアまたは対照幹細胞のテロメラーゼ活性の少なくとも60のテロメラーゼ活性を有するクローンを選択しヒト非老化性心臓幹細胞、細胞培養中で拡張させ得る。テロメラーゼ活性の比較のための対照細胞は、若い20~40歳個体から新たに単離されたc-kit陽性心臓細胞であり得る。好ましくは、非老化性心臓幹細胞は、投与前に、1つ以上の増殖因子例えば、肝細胞増殖因子および/またはインスリン様増殖因子-1への曝露により活性化される。加齢性心筋症または他の原因のための心筋損傷、例えば心筋梗塞を蒙っている患者は、上記のように単離される非老化性心臓幹細胞の少なくとも1回の注入を受け得る。c-kit陽性細胞は、~200,000c-kit陽性細胞が各クローンから得られるP2で収集され得る。患者は、単離非老化性心臓幹細胞の少なくとも1回の心筋内注入を受ける。増殖因子、例えば肝細胞増殖因子およびインスリン様増殖因子-1の注入は、単離幹細胞の心筋内注入と同時的に投与され得る。代替的には、増殖因子は、幹細胞の注入後に投与され得る。注入非老化性幹細胞は、心筋損傷の区域に動員され、成育可能な筋細胞、内皮細胞および塀核金細胞に分化して、損傷組織を修復し、および/または再生する。新規生成心筋は機能性であり、心臓機能の保存に寄与し、臓器不全を防止する。実施例5-移植非老化性心臓幹細胞の動員は梗塞心臓におけるアンギオテンシンII遮断を補足する心筋梗塞MIの主な悪化因子のうちの2つは、筋肉質量の損失および腔拡張であって、これらはともに、負の左心室LVリモデリングの、ならびに心臓性能の低下の一因となる。MIのこれらの因子を改善するために、心筋梗塞の誘導後に、実施例4に記載したように単離された非老化性心臓幹細胞CSCをマウスに心筋内移植する。非老化性CSCは、投与前に、1つ以上のサイトカイン、例えば肝細胞増殖因子および/またはインスリン様増殖因子-1に曝露することにより、活性化され得る。AT1受容体アンタゴニスト、例えばロサルタンは、約20mg/体重1kg/日の用量でマウスに投与されて、細胞肥大を減じ、それにより心臓腔容積の拡大を減じる。MIをマウスで生じさせて、動物を4つの群に細分する:1.擬似手術SO;2.MIのみ;3.MIAT1受容体遮断薬;4.MIAT1受容体遮断薬非老化性CSC。MIの1ヵ月後に、動物を屠殺し、LV機能、梗塞寸法および心臓リモデリングを評価する。非老化性CSCで処置されたマウスにおいて、心筋再生も測定する。非老化性CSCの移植およびAT1受容体遮断薬を受けている群は、AT1受容体遮断薬単独を受けた動物、ならびに処置されなかった動物と比較して、心臓腔直径に関して損傷心臓のより好ましい結果を有すると予期される。例えば、心臓腔直径および心臓腔容積は、非処置およびAT1受容体遮断薬処置動物と比較して、低減される。LV質量対心臓腔容積比は、MIおよびMIAT1受容体遮断薬群よりもMIAT1受容体遮断薬非老化性CSC群の方が高い。さらに、MIAT1受容体遮断薬非老化性CSC群における組織修復は増大されて、新規の心筋、小動脈および毛細管を示し、これらは、MIサイズを低減するよう作用する。心エコー的には、収縮機能は、AT1受容体遮断薬および非老化性CSCで処置されたマウスの壁の梗塞領域において再現する。血行力学的には、MIAT1受容体遮断薬非老化性CSC群は、低LVEDPおよび高および-dP/dtを有する。要するに、心室リモデリングに及ぼすAT1受容体遮断薬の正の影響は、梗塞区域への移植非老化CSCの転位置により媒介される心臓修復の過程により増強される。動員CSCは、梗塞サイズおよび心室拡張を低減し、それにより梗塞心臓の収縮行動をさらに改善する。実施例6-再生能力を有するヒト心臓幹細胞は加齢性および不全性の心臓から単離され得るこの実施例の目的は、テロメア長が、ヒト心臓幹細胞としても既知であるヒト心臓始原細胞hCPCの増殖行動の重要な変数である、ということを実証することである。短いテロメアを有する始原細胞は、心臓の恒常性および修復における役割をほとんどまたは全く有さず、したがって、ヒト心不全の管理のための治療的価値を最小限有し得るかまたは全く有さないことがある。短いテロメアを有するhCPCは、臨床的に実行されるべき細胞のプールから排除されて、非代償性心臓のための細胞療法の効力を増強し得る。有意の増殖予力を有するhCPC小集団の使用は、投与されるべき細胞の数を劇的に減少させて、正の臨床終点を達成する。さらに、このアプローチは、機能的適格hCPCのプールに不利益となる年齢、性別、ならびに心臓疾患の型および持続期間の結果を回避するのに役立ち得る。A.ヒト心筋組織から単離される心臓幹細胞はinvitroで拡張され、損傷心筋を修復するために用いられ得る心臓手術および体外循環を受けている患者から得られる心筋の小試料から、ヒト心臓始原細胞hCPCを単離した。廃棄試料、例えば心房付属物を、この目的のために利用した。心筋からのhCPC単離後、系列マーカーに関して陰性であり、c-kitに関して陽性である個々のhCPCを、Terasaki培養プレートの単一ウェル中でプレート化して、BearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073に記載されたようにinvitroでクローン拡張した図49。これらのクローン原性hCPCは主に筋細胞に分化したが、しかし平滑筋および内皮細胞も生じた図50。invitro拡張hCPCが分化し、機能的適格性に達し、損傷心筋を修復し得たことを実証するために、免疫不全マウスおよび免疫抑制ラットに梗塞を生じさせて、冠動脈結紮直後に梗塞と隣接する収縮心筋中にhCPCを注入した。図51に示したように、hCPCはヒト筋細胞および冠動脈血管を伴って損傷心筋を再生し、虚血性損傷の大きさを低減し、梗塞心臓の性能を改善した。B.クローン拡張化ヒト心臓幹細胞におけるテロメア長およびテロメラーゼ活性幹細胞の増殖は、テロメラーゼ活性およびテロメア長により調節されるMorrisonetalImmunityVol5207216AllsoppetalBloodVol102517520LansdorpAnnNYAcadSciVol1044220227ArmstrongetalStemCellsVol23516529andvonZglinickiAnnNYAcadSciVol90899110。各分裂中、半保存的DNA複製は、複製フォークのラギング鎖の合成を完了するための慣用的DNAポリメラーゼの無能力からなる内因性の障害物を有するNugentandLundbladVGenesDevVol1210731085。末端複製問題は、DNAの進行性短縮を引き起こす。真核生物細胞では、染色体はテロメアと呼ばれる保護キャップにより護られ、テロメラーゼはテロメアの長さを無傷に保持し得る酵素であるGreiderBioessaysVol12363369。テロメラーゼは、鋳型としてそれ自体のRNAを利用することにより3’染色体末端を延長する逆転写酵素であるBlackburnAnnRevBiochemVol61113129。テロメラーゼ活性は染色体末端の進行性侵食を完全に防止して、増殖停止を延期することはできない。この点で、複製的老化は、臨界長を越えるテロメアの短縮により誘発されるG1増殖停止に対応するKimetalOncogeneVol21503511CampisiCellVol120513522。したがって、テロメア-テロメラーゼ系は、有糸分裂時計およびhCPCの能力を制御して、心筋をdenovoで形成する。心筋形成における欠陥LerietalEMBOJVol22131139はテロメラーゼ欠損マウスにおいて認められるが、しかしこれらの齧歯類CPCが心臓修復を促すのに有効でないか否かは不明である。テロメラーゼ活性およびテロメア長における変化は、始原細胞の滞留および移動を阻みFloresetalScienceVol30912531256FloresetalCurrOpinCellBiolVol18254260SieglCachedenieretalJCellBiolVol179277290、そして誘導される筋細胞の始原細胞は、分裂し、機能的適格収縮細胞を形成するための限定能力を有し得る。hCPCにおけるテロメア長は、対照、急性梗塞心臓で、ならびに末期虚血性心筋症のために心臓移植を受けている患者から外植される心臓で、測定されているChimentietalCircResVol93604613。さらに、テロメア長は、心不全の存在下または非存在下で、加齢性ヒト心臓からの筋細胞で得られているUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697。これらのデータから、重度のテロメア短縮は、不全心臓のhCPCにおいて明らかである。したがって、テロメア長は、損傷心臓に関する最長期再配置能力を保有するhCPCプールを同定するために用いられ得る。テロメアの長さは、細胞の再生能力の良好な予測子であるWengetalImmunityVol9151157YangetalMechAgeingDevVol12216851694andHondaetalClinImmunolVol99211221。移植骨髄細胞の増殖行動は、それらのテロメア長により予測され得る。実際、骨髄移植後の造血再生は、再配置細胞が短いテロメアを有する場合、低効率的であるLinczetalBoneMarrowTransplantVol34439445。サイクリングhCPCはテロメラーゼタンパク質を発現し、テロメラーゼ活性を示すChimentietalCircResVol93604613UrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697andUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol1001044010445。老化性フィッシャー344ラット実施例3およびFVBマウスTorellaetalCircResVol94514524の不全心臓で得られたわれわれの観察と一致して、テロメア-テロメラーゼ軸は、老いたヒトのhCPCにおいて減損されると予期される。hCPCの増殖能力を査定し、hCPC機能に及ぼす培養条件および集団倍加の作用を確立するために、hCPCにおけるテロメラーゼ活性およびテロメア長を測定した。この分析を実施して、hCPCが培養中で迅速に細胞老化に達するか否か、あるいは非可逆的増殖停止が獲得される前に細胞が臨床的関連数に拡張され得るか否かを明確にした。この目的のために、hCPCの核をP3~P4、P5~P6およびP8~P9で得たが、これらは、それぞれ、9~12、15~18および25~28集団倍加PDに対応する。核を、フルオレセイン-イソチオシアネートと共役されたペプチド-核酸テロメアプローブで染色した;既知の短いL5178Y-S細胞、7kbpおよび長いL5178Y-R細胞、48kbpテロメアを有するリンパ腫細胞を、比較および参照点のために用いたBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073UrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697ChimentietalCircResVol93604613andLerietalEMBOJVol22131139。P3~P4からP5~P6までに、平均テロメア長は9.3から8.2kbpに12減少し、そしてP3~P4からP8~P9までに、平均テロメア長は9.3から6.9kbpに26減少した図52BおよびC。重要なことは、ヒト細胞におけるテロメア長は約9.0kbpであるという点であるNotaroetalProcNatlAcadSciUSAVol941378213785。P3からP9までに、~18PDが認められ、平均テロメア短縮はPD当たり130bpであった。これは、2.4kbpという総損失を説明する。テロメア減少のこの比率は、ヒト骨髄造血幹細胞において一般に見出されるものに匹敵するVanZiffleetalStemCellsVol21654660。ヒト造血幹細胞およびほとんどのhCPCの細胞老化ならびに非可逆的増殖停止に関連した臨界テロメア長は、2.0から1.5kbpまで変化があるVanZiffleetalStemCellsVol21654660。したがって、臨界テロメア短縮を有するhCPCの割合は、P3~P4での1からP5~P6での2およびP8~P9での5に増大した。しかしながら、P8~P9での~25-28PD後、69のhCPCが≧5.0kbpのテロメア長を有した。P8~P9での細胞は、複製性老化および非可逆的増殖停止の発生の前に23回の付加的PD5-2=3kbp0.13kkp=23PDsを受け得る、と予測され得る。したがって、複製性老化が達成される前に、~50回のPDが1×1015hCPCの形成を生じ得る。P3~P4、P5~P6およびP8~P9での異なる継代で得られたhCPCにおけるTRAP検定により、テロメラーゼ活性を測定した図52A。テロメラーゼ活性の生成物は50bpで出発し、6-bp周期性を示す。RNアーゼで処置された試料を陰性対照として用い、HeLa細胞を陽性対照として用いた。2つのタンパク質濃度を用いて、反応の特異性を実証した。36bpでの帯域は、PCR効率に関する内部対照に対応する。テロメラーゼ活性はP3~P4からP8~P9までに~50減少したが、しかしテロメラーゼ活性はこれらの後期継代で依然として存在し、このことはhCPCの有意の増殖後退を指し示している。したがって、長いテロメアを有するhCPCはinvitroで広範に増殖され、それらの拡張能力の大きな損失前にinvivoで移植され得る。実施例7-増殖因子受容体系の発現はヒト心臓幹細胞再生能力と相関するヒト心臓始原細胞hCPCは、始原細胞行動に及ぼす異なる作用を有し得る2つの増殖因子受容体系を保有する:レニン-アンギオテンシン系RASとインスリン様増殖因子-1/インスリン様増殖因子-1受容体IGF-1-IGF-1R系である。RASおよびIGF-1-IGF-1R増殖因子系の構成成分の各々の転写物を、実時間RT-PCRにより拡張hCPCP5~P6で検出した図53、パネルA~C、H、K、L。各場合に、5ngのcDNAを用いたが、但し、レニンは15ng必要であった。cDNAをSYBRGreenマスターミックスLightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenI、Rocheと併合した。サイクリング条件は以下の通りであった:95°Cで10分間、その後、45回の増幅95°Cで10秒の変性、5秒間アニーリング、そして72°Cで20秒の伸長。ゲノム汚染の影響を回避するために、各遺伝子に関する順方向および逆方向プライマーを異なるエキソン中に配置した。逆転写酵素ナシで生成されたcDNAを含有する反応、ならびにプライマー単独との反応も含まれた。4つの連続希釈点の標準曲線を用いて、PCR効率を評価した。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンにより決定される入力に対して、定量値を正規化した。ゲル電気泳動により、RT-PCR生成物の予測分子量を確証した。さらに、図53パネルD~G、I、J、M、Nに示したように、RASおよびIGF-1-IGF-1R系の構成成分の細胞分布を、以前に記載されたように免疫染色および共焦点顕微鏡により評価したBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073GonzalezetalCircResVol102597606。同様の観察は、齧歯類実施例2参照;UrbaneketalCircResVol97663673およびイヌLinkeetalProcNatlAcadSciUSAVol10289668971CPCでなされており、始原細胞機能の調整における細胞RASおよびIGF-1-IGF-1Rの関連性を強化する。A.IGF-1-IGF-1R増殖因子系IGF-1は強力な増殖促進ならびに心臓および骨格筋始原細胞に及ぼす抗アポトーシス作用を発揮する、ということを一連の試験が示しているため、局所的IGF-1-IGF-1R系は、hCPCの増殖および生存を保護するのに重要な役割を果たす。トランスジェニックマウスにおいて、骨格筋に対して標的にされる局所的に作用性IGF-1は、筋肉増殖および分化を増強し、加齢性筋萎縮を防止し、損傷後の再生を強力にするMusaroetalProcNatlAcadSciUSAVol10112061210SchulzeetalCircResVol97418426。同様に、IGF-1の心臓限定発現は、心室筋細胞の形成を増大し、細胞機械的行動を改善し、筋細胞死を減じ、加齢性筋疾患の発症を遅らせるTorellaetalCircResVol94514524ReissetalProcNatlAcadSciUSAVol9386308635RedaellietalCircResVol82594603。IGF-1は、トランスジェニックマウスにおいて、CPCの分裂を誘導し、テロメラーゼ活性を上方調節し、複製性老化を妨げ、そして機能的適格CPCのプールを保持するLinkeetalProcNatlAcadSciUSAVol10289668971TorellaetalCircResVol94514524UrbaneketalCircResVol97663673。骨格筋損傷後、IGF-1は筋肉再生の一助となる衛星細胞の活性化、動員および分化を促すMusaroetalProcNatlAcadSciUSAVol10112061210。心不全は、骨格筋質量の損失を伴う異化状態をもたらしLevineetalNEnglJMedVol323236241AnkeretalCirculationVol96526534、そしてIGF-1はこの過程に反対に作用するSchulzeetalCircResVol97418426。同様に、IGF-1の心臓過剰発現は、心筋梗塞LietalJClinInvestVol10019911999NagoshietalJClinInvestVol11521282138、冠動脈狭窄LietalCircResVol8410071019、拡張心筋症WelshetalCircResVol90641648、および糖尿病KajsturaetalDiabetesVol5014141424NorbyetalJEndrocrinolVol180175182の作用を減衰させる。IGF-1は細胞死を減じ、細胞再生を増強するが、これは、損傷の程度を減衰させ、構造的および機能的回復の程度を決定する。下等生物、例えば線虫およびショウジョウバエにおける短い寿命は、成体期における体細胞組織の再生能力の損失と関連しているMaieretalGenesDevVol18306319。瀕死の細胞は取り替えられ得ず、これは器官機能における急速な且つ進行性の低下を生じる。逆に、常在始原細胞の活性化および委任による細胞代謝回転は、哺乳類では依然として活性であり、そして経時的に蓄積する老いた損傷細胞は、新しい、より若い、より良好に機能する細胞に取って替わられ得る。IGF-1は、CPCを含めた感受性細胞における細胞代謝回転および再生を協力にする実施例2参照;LinkeetalProcNatlAcadSciUSAVol10289668971TorellaetalCircResVol94514524UrbaneketalCircResVol97663673。IGF-1活性化およびCPCの増殖により媒介される心筋再生は、哺乳類における心不全およびその合併症の開始を遅らせる実施例3参照;LinkeetalProcNatlAcadSciUSAVol10289668971TorellaetalCircResVol9451452424950。実際、高齢固体におけるIGF-1レベルの回復は、健康利益を有するCarteretalTrendsGenetVol18295301。hCPCに及ぼすIGF-1-IGF-1R増殖因子系の考え得る一作用は、酸化ストレスおよび細胞加齢をもたらすフリーラジカルの減衰である。この可能性を試験するために、無血清培地単独で、またはIGF-1100ng/mlを伴って培養された新たに単離されたマウスCPCにおける、二光子顕微鏡によるスーパーオキシド陰イオンの生成を測定したRedoxSensoRedCC-1。ミトコンドリアをMitoTrackerGreenおよび二光子顕微鏡により同時に確認し、スーパーオキシド陰イオンのミトコンドリア局在化を確証した。IGF-1は、スーパーオキシド陰イオンの生成を劇的に減少させた。ミトコンドリアスーパーオキシド陰イオンは、無血清培地中のマウスCPCと比較して、IGF-1に曝露されたマウスCPCにおいて約64低減された。IGF-1の非存在下および存在下での新たに単離されたマウスCPCにおけるヒドロキシルラジカルの基線生成および過酸化水素100μM誘導性生成も測定した。IGF-1は、ヒドロキシルラジカルの基線生成および過酸化水素誘導性生成の両方を有意に低減した。これらの実験の結果は、IGF-1-IGF-1R系が細胞老化の防止において重要な役割を果たす、ということを示唆している。総体的に、これらの知見は、IGF-1Rの発現がhCPCの増殖能力の保存のために重要である、ということを示唆する。重要なのは、IGF-1Rの存在が、老化細胞のプールからのhCPCを分類し、invitroおよびinvivoでのそれらのそれぞれの増殖および分化能力を評価するために用いられ得る、ということである。この見解を支持して、若いおよび老いた患者の両方からのIGF-1R発現に関して陽性または陰性であるhCPCを単離し、invitroでそれらの増殖および分化能力を測定した。各hCPC調製物から、P1でのc-kit陽性hCPCを、FACSAria細胞選別機BectonDickinsonを用いてIGF-1Rの発現によって分類した。その後、実施例1Bに記載したようにQ-FISHによりテロメア長を確定して、これらのhCPC小集団におけるIGF-1Rエピトープとテロメア長との間の直接的関係を確立した。いくつかのパラメーター、例えばサイクリング細胞のパーセンテージ、集団倍加時間PDT、細胞周期の時機、連続分裂に伴う老化性細胞の蓄積およびテロメア短縮、ならびに複製に伴うテロメラーゼ活性の変化を分析して、invitroで分裂、分化するhCPCクラスの能力を確定した。サイクリングおよび非サイクリング細胞の割合を測定するために、IGF-1R陽性hCPCおよびIGF-1R陰性hCPCを低密度100細胞/cm2でプレート化し、BrdU1μg/mlを、1日3回1週間、培地に付加した。細胞を固定誌、前に記載されたように免疫細胞化学によりBrdU取込みを確定した実施例1;UrbaneketalCircResVol97663673。長い標識化期間にかんがみて、BrdU陽性および陰性細胞は、それぞれサイクリングおよび非サイクリングhCPCとみなされた。図54に示したように、IGF-1Rに関して強陽性のhCPCは、この受容体に関して陰性であるhCPCより、BrdU取込みにより測定下場合に有意に高い分裂速度を有すると思われる。分析した場合、若い心臓および老いた不全心臓から得られたIGF-1R陽性hCPCの増殖行動に実際的差異は認められなかった。老化性hCPCの区画は非不全心臓におけるよりも不全心臓の方が大きかったUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697が、しかし若いc-kit陽性IGF-1R陽性hCPCの集団を代償不全心臓から単離し、顕著な増殖後退を保有することが判明した。分裂するIGF-1R陽性hCPCの無傷能力を、IGF-1R陰性hCPCの低レベルの増殖と対比したが、これは、典型的には、アンギオテンシン1AT1受容体の発現の上方調節により成し遂げられた図55。これらのデータは、RASがhCPC老化および死において一役を果たし得る、ということを示唆する。RASは、齧歯類CPCの老化に関与しており実施例2参照、この場合、生活年齢は、おいた細胞におけるAngIIの生成と一緒に、RASの種々の構成成分の発現増強により特性化されて、CPC増殖停止およびアポトーシスにおけるこのオクタペプチドの役割を支持する証拠を提供する。AngIIは、心臓における酸化的損傷の年齢依存的蓄積の有意の一助であり得るKajsturaetalDiabetesVol5014141424。AngIIの抑制は、心不全を確かに阻止し、ヒトにおける寿命を延長するO’MearaetalCirculationVol11531113120。AngIIは活性酸素種ROSを生成し、持続性酸化ストレスは細胞DNA修復過程の限度を越えることがある。フリーラジカルにより誘導されるDNA損傷の最も顕著な形態は、AngIIに曝露されたCPCにおいて実施例2、または慢性的不全心臓でChimentietalCircResVol93604613実証された8-OH-dGである。酸化ヌクレオチド8-OH-dGは、AngIIを用いて有意に、そして若いCPCよりも老いたCPCにおいてより多く、増大する;8-OH-dGは、テロメアのGGGトリプレットで蓄積して、テロメア短縮および無キャップを生じる傾向がありKawanishiandOikawaAnnNYAcadSciVol1019278284、テロメア完全性の損失は、細胞老化および死の主な決定因子である。逆に、IGF-1は、ROSの生成を阻止しKajsturaetalDiabetesVol5014141424、加齢心筋における酸化ストレスを減少させTorellaetalCircResVol94514524、そして相同組換えにより酸化的DNA損傷を修復するYangetalAmJPhysiolVol289F1144F1152。B.IGF-1R陽性ヒト心臓幹細胞による損傷心筋の修復これらの試験の目的は、免疫不全ラットにおける梗塞直後に、invivoでIGF-1R陽性の長いテロメアのhCPC小集団の治療効力を確定することである条件1。同様に、梗塞直後のinvivoでのIGF-1R陰性短テロメアhCPC小集団の治療効力も試験する条件2。これらの実験の結果は、IGF-1R発現とhCPCの再生能力との間の相関を確立する。心臓手術を受けている患者からのヒト心筋組織試料から、ヒトCPCを単離する。上記パートAに記載したようにIGF-1Rの発現により、c-kit陽性hCPCをさらに特性化する。hCPCの小集団を、invitroでのそれらの増殖特質に基づいて選択する。例えば、IGF-1Rに関して陽性で、最適増殖速度を示すhCPCを、条件1における梗塞動物への投与のために選択する。IGF-1Rに関して陰性で、低増殖速度を示すhCPCを、条件2における梗塞動物への投与のために選択する。投与前に、以前記載されたようにレンチウイルス感染によりEGFPでhCPCの選択小集団を標識するBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073。麻酔メス免疫不全ラットにおいて、心筋梗塞を誘導する。冠動脈閉塞直後に、各々~15,000EGFP標識化hCPCの2回の注入を、境界域の反対部位に実行する。動物をBrdUに曝露し、梗塞および細胞移植の1ヵ月後に屠殺する。週2回、心エコーにより動物を追跡する。線形変換器15-6Lを装置したPhilipsSonos5500を用いて、軽く麻酔されたラットケタミンで心エコーを実施する。前胸郭を剃毛し、乳頭筋のレベルで傍胸骨短軸から二次元2D画像およびMモードトレースを記録する。Mモードトレースから、拡張期および収縮期の解剖学的パラメーター、ならびに後壁の短縮率を確定する。2D短軸における左心室LV横断画像から駆出率EFを得る:EF=[LVDA-LVSA/LVDA]100ここで、LVDAおよびLVSAは拡張期および収縮期のLV面積に対応する。心筋梗塞および細胞移植の1ヵ月後、血行力学的および形態学的に動物を試験する。麻酔抱水クロラール、300mg/kgb.w.、腹腔内下で、A/D変換器iWorx214およびコンピューター系に接続されたマイクロチップ圧力変換器SPR-612、MillarInstrumentsを用いて、右頚動脈にカニューレ挿入した。左心室圧ならびにおよび-dP/dtの評価のために、カテーテルを左心室LV中に進行させる。血行力学的データの収集後、形態学的に試験されるべき動物において、CdCl2の静脈内注入により心臓を拡張期に停止させ、ホルマリンでの冠動脈血管系の還流により、心筋を固定する。LV心臓腔を、invivo測定拡張末期圧と等価圧に保持する。この手順は、解剖学的データの獲得のために重要である。残存する筋細胞数ならびに心室間中隔を含めて左心室から失われた筋細胞数の外形計測分析により、梗塞寸法を得る。新規生成筋細胞の数およびそれらの容積分布を測定する。さらに、生存筋細胞における肥大性応答を確定する。新規形成小動脈および毛細管の査定のために、同様の分析を実行する。予備の心筋の血管新生も確定する。共焦点顕微鏡、ならびに核、細胞質および膜タンパク質の標識化により、筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を同定するBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073。I型およびIII型コラーゲン抗体により、コラーゲンを検出する。筋細胞の数およびサイズに関する心筋再構成の程度ならびに再生組織内の血管形成の程度を、定量的に確定するLinkeetalProcNatlAcadSciUSAVol10289668971BearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073UrbaneketalCircResVol97663673。損傷心室内の新筋細胞の生理学的組込みの形態学的同等物を、コネキシン43およびN-カドヘリンの発現により実証する。細胞融合が心筋再生の一因であるという可能性も評価する。したがって、臨床的に用いられるべき心臓幹細胞の最も適切な小集団の選択のためのinvitroプロトコールの妥当性を確立する。C.ヒト心臓幹細胞老化におけるp53の役割今までのところ、細胞老化の最も信頼できるマーカーは、テロメア-テロメラーゼ系であるKimetalOncogeneVol21503511CampisiJCellVol120513522andYangetalMechAgeingDevVol12216851694。テロメラーゼ活性は、正常成体心臓において存在し、心筋肥大UrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol1001044010445、急性および慢性虚血性心筋症UrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697、ならびに早発性心筋加齢ChimentietalCircResVol93604613において増大される。しかしながら、このリボ核タンパク質は、テロメア侵食を防止しない;重度のテロメア短縮が、不全ヒト心臓の筋細胞およびhCPCで検出されているUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697ChimentietalCircResVol93604613andUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol1001044010445。これらの観察は、造血幹細胞HSCで得られる結果と一致する。HSCは、低~中レベルのテロメラーゼを発現するが、しかしテロメアは年齢に伴ってかなり短縮するNotaroetalProcNatlAcadSciUSAVol941378213785。検出可能なテロメラーゼ活性の存在下でのテロメア短縮を説明するために、2つの可能性が提唱されている:すなわち、テロメラーゼ機能のサプレッサーが細胞周期中に働くこと、あるいはテロメアクロマチンの再構築とテロメラーゼによるテロメアの伸長との間に競合が生じることであるNotaroetalProcNatlAcadSciUSAVol941378213785。HSCと同様に、hCPCにおけるテロメア短縮は、集団倍加当たり~130bpの割合で起きる図52。慢性心臓代償障害および加齢は、hCPCにおけるテロメラーゼ活性とテロメアの長さとの間の不均衡をもたらして、臨界テロメア短縮、増殖停止および細胞老化を引き起こすUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10286928697;ChimentietalCircResVol93604613。これらの特質を有するhCPCの存在は、心室機能に及ぼす顕著な結果を有する。無傷長のテロメアは、染色体の末端を見えないようにするループ構造を形成するGriffithetalCellVol97503514。テロメアが短縮されると、T-およびD-ループはつぶれ、DNA損傷の部位として細胞に感知されるGriffithetalCellVol97503514;GreiderCWCellVol97419422;およびYangetalMolCellBiolVol2510701080。二本鎖TTAGGG反復は短くなり過ぎてテロメア結合タンパク質を結合できず、T-ループを形成し、そして一本鎖化3’オーバーハングはD-ループを形成できないGriffithetalCellVol97503514GreiderCWCellVol97419422。短いテロメアのレベルでの多重チェックポイントタンパク質の蓄積は、主要プレイヤーが転写因子p53であるDNA損傷応答を、機能不全テロメアが誘発する、ということを示すStanseletalJBiolChemVol2771162511628。毛細管拡張性運動失調突然変異化ATMプロテインキナーゼは、セリン15でのp53のリン酸化のために必要とされるCellianddeLangeNatCellBiolVol7712718。この事象は、p53の翻訳後修飾のカスケードを活性化し、これがp53標的遺伝子の転写とその後のアポトーシスプログラムの活性化または細胞老化の開始を引き起こす。セリン15でのp53リン酸化は、可能な場合は、DNA修復を促すためのp21Cip1の発現増強を伴うCampisiJCellVol120513522。したがって、p53は、特定タンパク質、例えばp21Cip1、BaxおよびBadの上方調節により、増殖停止、アポトーシスおよび老化を調整するSelivanovaandWimanAdvCancResVol66143180LevineAJCellVol88323331。BaxおよびBadはアポトーシスに関与するが、一方、高レベルのp21Cip1は非可逆的増殖停止および細胞老化を誘発する。p16INK4aは稀に、DNA二本鎖切断と共存するHerbigetalMolCellVol14501513;p16INK4aは、p53およびp21Cip1の誘導を追跡する遅延応答を示すJacobsanddeLangeCellCycleVol413641368。心筋細胞において、p53は筋細胞RASの構成成分のための転写因子として作用しPierzchalskietalExpCellResVol2345765;LerietalCirculationVol97194203;LerietalJClinInvestVol10113261342;LerietalAmJPatholVol154567580;LerietalCircResVol84752762;LerietalAmJPatholVol157843857;およびFiordalisoetalDiabetesVol5023632375、そしてp53の類似の機能は、hCPCで有効であると仮定される。AogenおよびAT1受容体のプロモーターは、p53に関するコンセンサス結合部位を含有する。Aogen基質の利用可能性はAngIIの生合成における制限段階を表すため、p53によるAogenの調節は特に関係がある。さらに、hCPCにおけるAngIIの生合成および放出の増大は、AT1受容体の長期刺激を生じて、hCPCアポトーシスまたは老化を持続する陽性フィードバックループを作り出す。AT1受容体活性化に伴うAngIIの継続的分泌は、順次、PKCおよびp38-MAPKによるセリン390でのp53のC末端のリン酸化を誘発するFiordalisoetalDiabetesVol5023632375。この翻訳後修飾は、p53依存性Bax、Bad、p21Cip1およびp53調節化Aogen、AT1受容体遺伝子の転写と一緒に、p53機能を上方調節する。p53の抑制が、AngIIの合成、p53およびp38MAPキナーゼリン酸化ならびに細胞死を防止する、ということは重要である。同様に、AT1受容体遮断薬ロサルタンは、AngIIにより誘導されるp53およびp38MAPキナーゼのリン酸化を防止するFiordalisoetalDiabetesVol5023632375。さらに、p38MAPキナーゼの抑制は、AngII媒介性筋細胞死によるロサルタンの結果を、より遠位レベルで、模倣するFiordalisoetalDiabetesVol5023632375。IGF-1-IGF-1R系におけるp53の有力な機能は、転写の抑制によるWerneretalBiochemistryVol9383188323;PriscoetalMolCellBiolVol1710841092;およびGirnitaetalCancerResVol6052785283、または受容体と、IGF-1Rのユビキチン化および分解をもたらすMdm2との間の複合体の形成によるGirnitaetalProcNatlAcadSciUSAVol10082478252、IGF-1R発現の下方調節からなる。さらにまた、IGF-1刺激は、p53のアミノ末端のリン酸化をもたらし、そしてリン酸化p53はMdm2を上方調節しLerietalAmJPatholVol154567580LerietalCircResVol84752762、これが順次、IGF-1Rを分解し得るGirnitaetalProcNatlAcadSciUSAVol10082478252。p53活性増大が、上皮組織器官におけるIGF-1産生と関連づけられてきた、ということは重要であるGatzaetalDevBiolVol313130141。さらに、p53-標的遺伝子PTENは、PIP3においてホスファターゼとして作用し、Aktリン酸化LevineetalGenesDevVol20267275およびIGF-1細胞応答を阻止する。IGF-1は、Mdm2の上方調節およびMdm2-p53不活性タンパク質複合体の形成を介してp53を抑制し、最終的にAngIIの合成およびp53機能を減少させるLerietalAmJPatholVol154567580LerietalCircResVol84752762。IGF-1の主な下流エフェクターはAktであって、これは、p53のN末端をリン酸化して、mdm2遺伝子の選択的転写を生じるAshcroftetalMolCellBiolVol2032243233HauptYCellCycleVol3884885。p53αらせんペプチドの残基16~28は、Mdm2の疎水性ポケットと結合してChenetalMolCancerTherVol410191025、タンパク質-タンパク質複合体を形成する。Mdm2は、核小体区画に転写因子を隔離することにより、p53機能を抑圧し、その半減期を減少させて、そのDNA結合活性を抑制するStommelandWahlCellCycleVol4411417VousdenandPrivesCellVol120710。Mdm2-p53不活性複合体の生成の結果として、hCPCに及ぼすIGF-1の抗アポトーシスおよび抗加齢作用は、局所的RASの下方調節により媒介され得る。総体的に、これらの知見は、hCPCの老化は、一方ではRASと、他方でIGF-1との間の不均衡によって決まり得る、ということを示唆する。別の重要な態様は、テロメラーゼとp53との間の関係に関する。p53はテロメラーゼの触媒サブユニットTERTのプロモーターと直接結合し得ないが、しかしp53は2つの機序によりTERT発現を抑圧する。p53はSp1と複合体を形成するが、これはTERTプロモーターの活性化のためにはもはや利用可能でないKusumotoetalClinCancerResVol52140-2147;KanayaetalClinCancerResVol61239-1247;XuetalOncogeneVol195123-5133;およびShatsetalJBiolChemVol27950976-50985。さらに、p53は、リン酸化ポケットタンパク質Rbの蓄積に好都合であるp21Cip1の誘導によりTERT転写を抑制するHelmboldetalOncogeneVol2552575262。活性化Rbは、TERTのプロモーターにおける抑圧的E2F-Rbタンパク質複合体のアセンブリーによりTERTを安定的に抑えるShatsetalJBiolChemVol27950976-50985WonetalProcNatlAcadSciUSAVol10111328-11333。したがって、局所的RASはテロメラーゼを下方調節するが、一方、IGF-1はp53機能の調整によりテロメラーゼを上方調節する。IGF-1がPI3K-Akt経路を介してhCPCにおけるテロメラーゼをリン酸化し得る、ということは重要である。マウステロメラーゼにおけるAktリン酸化に関するコンセンサス部位RVRLRELSQEアミノ酸585~594;配列番号23を同定したがTorellaetalCircResVol94514524、同様の配列はヒトTERTに存在しKangetalJBiolChemVol2741308513090、これは、IGF-1がテロメラーゼを上方調節し、それによりhCPC増殖および生存を上方調節して、細胞加齢を遅延する、ということを示唆している。これらの観察に基づいて、hCPCの増殖および生存は、p53機能により、局所的RASおよびIGF-1-IGF-1R経路の活性を制御して、hCPC老化および死を状態調節するテロメア-テロメラーゼ系により調節される、という仮説を試験する。酵素的解離およびウサギc-kit抗体SantaCruzBiotechnologyを用いた分類により明白な心不全を有する患者から得られる心筋組織試料から、ヒトCPCを単離する。5~10FBSおよびインスリン-セレン-トランスフェリン混合物を補足したF12培地中で、分類細胞を拡張させるP5~P6。各hCPC調製物から、IGF-1RおよびAT1受容体の発現によって、細胞をさらに分類する。hCPCのペレットを液体窒素中で急速凍結させて、分子解析のために-80°Cで保存する。単離hCPC中に存在する異なる増殖因子受容体系を解析するために、P5~P6での分別hCPCを無血清培地SFM中で培養して、IGF-1およびAngII分泌を測定する。さらに、培養をIGF-1ヒト組換えIGF-1150ng/mlまたはAngII10-11mol/Lで24時間の期間中刺激して、陽性フィードバックループが増殖因子生成に関与するか否かを検出する。増殖因子を含有する培地を除去し、細胞を2回洗浄する。新鮮なSFMを付加する。SFMは、IGF-1Rに対する抗体AbcamまたはAT1受容体アンアゴニストロサルタン10-7MおよびAT2受容体遮断薬PD12331910-7mol/L、Sigmaを含有する。遮断薬は、リガンド結合を回避するために用いられる。IGF-1およびAngII測定のために、3、9、15および24時間後に培地を収集する。ELISAにより増殖因子量を確定し、そしてウエスタンブロッティングにより測定されるhCPCタンパク質およびβ-アクチン発現の総量により正規化する。さらに、アンギオテンシノーゲンAogen、レニン、カテプシン、アンギオテンシン変換酵素ACE、ACE2、チマーゼ、AT1受容体、AT2受容体、IGF-1およびIGF-1Rを、実時間RT-PCR、ウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学により確定する。細胞老化はIGF-1-IGF-1R系の下方調節ならびにRAS系の上方調節と相関する、と予期される。実験の次のシリーズは、単離hCPCにおけるテロメア-テロメラーゼ系の発現および活性を検査する。テロメラーゼの触媒性サブユニットおよびテロメア関連タンパク質の発現を査定するために、低張および高張緩衝液中での分別hCPCのインキュベーションにより、核抽出物を得た。タンパク質を、テロメラーゼ逆転写酵素TERT抗体と免疫沈降させて、ウエスタンブロッティングにより検出するテロメラーゼ酵素サブユニットの検出のためか、または8~10SDS/PAGE上に載せて、ニトロセルロース上に移して、TRF-1およびTRF-2に対する特定の抗体に曝露するテロメア関連タンパク質の検出。テロメラーゼは、120~125kDa帯域に対応する。HeLa細胞を、陽性対照として用いるLerietalProcNatlAcadSciUSAVol988626-8631。TRAP検定により、テロメラーゼ活性を査定する。分別hCPCをCHAPS緩衝液中で均質化して、4°Cで遠心分離する。1~5μgの非処置およびRNアーゼ処置hCPC抽出物を、[γ32P]ATP-末端標識化テロメラーゼ基質TSオリゴヌクレオチド:5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’、配列番号1、Taqポリメラーゼおよびアンカー逆方向プライマー3’-GCGCGC[CTTACC]3CTAACC-5’、配列番号19とともに30分間インキュベートする。試料を27回の増幅周期に曝露する。IGF-1R陽性およびAT1受容体陽性hCPCにおいて、2つのアプローチによりテロメア長を測定する。第一のアプローチは、テロメア制限断片TRF解析からなる。このアプローチでは、hCPCを、制限酵素RsaIおよびHinfIとともに一晩インキュベートする。消化DNA断片を、0.5×TBE緩衝液を有する1アガロースゲル中で移動させる。5×デンハート溶液、5×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム緩衝液、0.1SDSおよび20mMのNaH2PO4中で、55°Cで5時間、ゲルを予備ハイブリダイズする。配列TTAGGGnを含有する1.6kbの32P-標識化プローブを付加し、ハイブリダイズする。ゲルを洗浄し、フィルムに曝露する。既知のテロメア長を有する細胞株を、比較のために利用する。サザンブロットハイブリダイゼーションは、種々のサイズのテロメア断片のスメアを生じて、全細胞集団における平均テロメア長の概算を提供するKangetalJBiolChemVol2741308513090。第二のアプローチは、Q-FISH技法を伴い、実施例1に記載されている。2つの異なる検定により、テロメラーゼリン酸化を査定する。第一の検定であるAktプロテインキナーゼ検定は、テロメラーゼをリン酸化する上流キナーゼAktの活性を査定する。この検定は、PepTag非放射性プロテインキナーゼCPKC検定系11のプロトコールに従って実施される。Aktキナーゼ基質に関しては、フルオレセイン共役H2Bヒストン30RKRSRKESYS39、配列番号20およびhTERT817AVRIRGKSYV826、配列番号21オリゴペプチドを用いる。低張および高張緩衝液中での分別hCPCのインキュベーションにより、核抽出物を得る。5μgのフルオレセインオリゴペプチドを、20μlのプロテインキナーゼ反応混合物20mMHEPES、pH7.2、10mMMgCl2、10mMMnCl2、1mMジチオトレイトール、0.2mMEGTA、20μMATP、1μgホスファチジルセリン、プロテインキナーゼ活性剤中の10μlの溶解物とともに、30°Cで30分間インキュベートする。95°Cで10分間加熱することにより、反応を停止する。リン酸化ペプチドを、100Vで15分間、0.8アガロースゲル上で分離する。リン酸化負荷電基質は、陽極に移動する。第二の検定は、リン酸化ヒトTERTの存在を検出する。HNTG緩衝液20mMHEPES、pH7.5;150mMNaCl;0.1トリトンX-100;および10グリセロールを用いてhCPC溶解物を調製し、次いで、抗TERTH-231、SantaCruzとともに一晩インキュベートする。免疫沈降タンパク質を氷冷HNTG緩衝液で洗浄し、抗-ホスホ-Ser-Akt-基質CellSignalingを用いてイムノブロッティングに付す。この抗体は、位置-3および-5でArgが前置されるホスホ-Serを含有するAktコンセンサス部位を含有するタンパク質RXRXXS、配列番号22を認識する。高い増殖能力を示すhCPCは、不十分な増殖特質を有するhCPCと比較して、長い、テロメア、高いテロメラーゼ活性およびより多くのリン酸化テロメラーゼを有すると予期される。さらに、IGF-1R発現は、高増殖能力およびより長いテロメアと相関すると予期されるが、一方、AT1受容体発現は、低増殖能力およびより短いテロメアと相関すると予期される。実験の次のシリーズは、hCPCの細胞老化におけるp53の役割を査定する。10SDS-PAGE上でタンパク質溶解物30~50μgを分離し、分離タンパク質をニトロセルロースに移し、そしてニトロセルロースを、TBST中に1~2μg/mlの濃度で、ホスホ-Ser390-p53抗体およびホスホ-Ser15-p53抗体、ATMプロテインキナーゼ抗体、ホスホ-p38MAPキナーゼ抗体およびホスホSer473-Akt抗体に曝露することによる分別hCPCの調製において、p53およびそれぞれのキナーゼリン酸化を検査する。リン酸化Rbの発現も測定する。p53-標的遺伝子、Bax、Mdm2、PTENおよびp21Cip1の発現を、ウエスタンブロッティングにより確定する。p53とMdm2、ならびにp53とSp1との間の複合体の形成を、免疫沈降およびウエスタンブロッティングにより検出する。具体的には、3つの別個の免疫沈降検定を実施する:タンパク質抽出物を、3μgのマウスモノクローナル抗p53Pab240、SantaCruzおよび250μlのHNTG緩衝液とともに4°Cで一晩インキュベートする。その後、50μlのプロテインA-アガロースを付加する。洗浄後、試料を、14,000rpmで2分間、遠心分離する。免疫沈降タンパク質を10SDS-PAGE上で分離し、ニトロセルロースフィルター上に移して、ウサギポリクローナル抗Mdm2C-18およびK-20、SantaCruzまたは抗Sp1Abeamに1μg/mlの濃度で曝露する。この免疫沈降から得られる上清を、抗p53Pab240、SantaCruzで再び免疫沈降して、次に、ウサギポリクローナル抗p53FL-393、SantaCruzに曝露して、非結合p53の量を得る。分別hCPCにおけるp53の活性を評価するために、p53の転写活性を2つのアプローチにより評価する。第一のアプローチは、電気泳動移動度シフト検定を用いる。Aogen、AT1受容体、Bax、p21Cip1およびIGF-1受容体のプロモーター領域におけるp53に関するコンセンサス結合部位を利用して、検定に用いるためのオリゴヌクレオチドを設計する。[γ32ATP]標識化オリゴヌクレオチドを帯域シフト検定に用いるが、これは、AngII、IGF-1、ロサルタン、PD123319またはIGF-1遮断抗体の存在下および非存在下で培養される分別hCPCで実施される。低張および高張緩衝液に細胞を曝露することにより、核抽出物を得て、過剰量の非標識化自己オリゴヌクレオチドおよびp53抗体とともにインキュベートする。第二アプローチは、クロマチン免疫沈降を包含する。Aogen、AT1受容体、Bax、p21Cip1およびIGF-1受容体特異的遺伝子のプロモーター上のp53の位置をマッピングするために、音波処理によりホルムアルデヒド架橋DNAを断片化し、p53抗体で分解する。免疫沈降クロマチンを回収し、架橋を消失する。当該遺伝子のプロモーター領域を、PCRにより認識する。hCPCの老化は、p53機能の上方調節と相関すると予期される。実施例8-不死DNAを有するヒト心臓幹細胞は優れた再生能力を有する幹細胞自己複製についての一般的理解は、35年前に提唱された古い理論の復活により、近年、混乱を生じているCairnsNatureVol255197200。古いDNAを受け継ぐ娘細胞が幹細胞特徴を保持するよう、連続分裂において、幹細胞は、元の鋳型DNA鎖最も古いを同時分離し得るが、一方、新DNAを獲得する娘細胞は一過性増幅プールに進入する、ということが示唆されている。不死DNA鎖の非無作為分離は、非修復性複製の誤りに起因する突然変異の蓄積を阻止し、細胞分裂中のテロメア短縮を部分的に防止するCairnsPottenetalNCellSciVol11523812388FalconeretalNatProtocVol513621377。造血およびその他の幹細胞にこの概念が適用可能であるか試されてきているしKieletalNatureVol449238242、幹細胞分裂のこの機序に対する反論が主張されているLansdorpCellVol12912441247。不死鎖仮説が正しい場合、母幹細胞の数は寿命の多少早期に各器官で遺伝子的に決定されなければならず、この細胞クラスはその後、拡張され得ない。逆に、この部類の真の幹細胞は、ヒトの寿命の進行に伴って一般に存在する環境因子、酸化ストレスおよび疾病過程の結果として劇的に減少し得る。しかしながら、老いたDNAを保有する心臓幹細胞CSCは、損傷心臓を再集団形成し得る最も強力な幹細胞プールを代表する。ヒト心筋が不死DNA鎖仮説に従って分裂するCSCを含有するという実証は、ヒト心臓が、組織恒常性および修復が常在CSCの区画により調節される自己複製器官である、という認識を支持する強力な証拠を提供する。A.ヒトCSCは非対称的および対称的染色分体分離により分裂するヒトCSChCSCの分裂中に非無作為DNA鋳型分離から無作為DNA鋳型分離を識別するために必要とされるアプローチは、複雑である;ヒトにおけるinvivo試験は実施できず、原始または委任状態の幹細胞はinvivoでの任意の系において明確に確認され得ないKieletalLansdorp。先祖祖父母DNAは、外因性送達チミジン類似体により標的化され得ず、老いたおよび新規合成標識化親DNAの共存は第二世代で失われPottenetalFalconeretalKarpowiczetalJCellBiolVol170721732ShininetalNatCellBiolVol8677687ConboyetalPLoSBiolVol5e102RandoCellVol12912391243、不死DNAを保有するhCSCのinvivo運命を追跡できなくする。染色分体の非無作為および/または無作為分離によるhCSCの分裂は、ブロモデオキシウリジンBrdUタグ化hCSCのクローン検定によって実証されるに過ぎない。このプロトコールは、幹細胞レベル、すなわちクローン形成能レベルで、老いたDNAを有するBrdU陽性親hCSCの分裂により形成されるクローン細胞がBrdU標識化細胞親DNAの新規合成鎖のみを示し、一方、クローン中の他のhCSCはすべてBrdU陰性であり、完全DNA鋳型を保有する母細胞の子孫であることを強調する。これに対比して、染色分体の無作為分離に伴うhCSCの分裂により形成されるクローンは、すべてBrdU陽性であるがしかしBrdUの希釈がクローン拡張に伴って起きる細胞で構成されると予期される。以前に詳述されたようにBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1041406814073、16のヒト心筋試料から系列陰性c-kit陽性hCSCを収集した。その後、これらのhCSCの細胞周期の長さn=6を、標識化有糸分裂法により確定しBasergaEdTheBiologyofCellReproductionHarvardUniversityPressCambridgeMassLongdonEngland1985、26±3時間であることが判明した図59A。このパラメーターに基づいて、ほぼ100祖父母hCSCがBrdU陽性になるまで99.5±1.0、~5-6集団倍加の期間の間、系列陰性c-kit陽性hCSCをBrdUに曝露した。次いで、これらの細胞は分裂して、BrdUに関しても陽性である親hCSCを生成した図56A。次にBrdUタグ化hCSCを、1細胞/cm2の限界希釈でプレート化するか、または0.25~0.5細胞/ウェルの密度でTerasakiプレートの個々のウェル中に投入した図56B。1個より多い細胞を含有するウェルは除外した。平均13,000のhCSCを患者当たりで植え付けた;総体的に、1,281クローンを得て、0.6のクローン効率に達した図57AおよびB。クローン効率は、年齢および心臓疾患の継続期間とは無関係であった。1,281クローンのうち、77が単一hCSCのBrdU標識化により特性化され図56CおよびE、1,204が全クローン細胞のBrdU標識化により特性化された図56DおよびEが、これは、始祖hCSCの6が分裂して元のDNA鋳型を保有し、一方、94が複製して、新規合成DNAのみを保有したことを示している。したがって、hCSCは、染色分体の非無作為および無作為分離により自己複製する2つの細胞クラスからなると思われるが、後者が優勢である。16例の患者において、老いたDNAを保有するhCSCのパーセンテージは年齢と反比例的に関連したが、一方、冠動脈疾患、大動脈狭窄およびそれらの継続期間は、老いたおよび新しいDNAを有するhCSCの相対的割合に影響を及ぼさなかった。B.細胞老化および拡張性増殖はhCSC分裂のパターンに影響を及ぼさないhCSC分裂の非無作為染色分体分離モデルを立証するかまたは反証するために論じられるべき重要な一変数は、クローンの6でBrdUを保有した単一細胞の特性化を包含する。以下の3つの可能性が考えられたLansdorp:a個々のBrdU陽性細胞はクローンの形成における早期に増殖停止および複製的老化に達し、標識の漸増的希釈に伴いクローン細胞を生成できない;b非老化BrdU標識化姉妹細胞は、BrdUの漸増的希釈に伴うクローンの生成に関与し、これは免疫標識により検出不可能になった;そしてc分裂中のBrdU陽性hCSCは、複製中のBrdU陰性細胞と一緒に、BrdU陰性およびBrdU陽性hCSCで構成される混合クローンを生成し得た。各々1つだけのBrdU陽性細胞を含有する40のクローンを、p16INK4aに関して標識した;老化関連タンパク質p16INK4aの存在は、恒久的に細胞周期への幹細胞の再入を防止するJanzenetalNatureVol443421426MolofskyetalNatureVol443448452KrishnamurthyetalNatureVol443453457。これらのクローンでは、BrdU陽性およびBrdU陰性クローン細胞はともにp16INK4aを発現しなかったが図58A、但し、標識化新DNAを受け継いだ細胞は非可逆的増殖停止に達した。老いたDNAを保有した各クローン中の個々の細胞、ならびに新DNAを含有した他の細胞はともに、細胞周期撤退を受けなかった。クローン細胞が実際に、細胞複製を伴うチミジン類似体の極端なレベルの希釈の生成物というよりむしろ、老いたDNAを有するhCSCの何回かの分裂の生成物であったということを支持する証拠を集めるために、BrdU標識化親hCSC図56A参照を量子ドットQドットで負荷し、プレート化した。このプロトコールを実行して、BrdUを失い、不死DNA鎖を保有した細胞が、細胞質に置けるQドット標識化を顕著に低減する数回の分裂を受けたか否かを決定した;各々1つのBrdU陽性細胞を含有する14のクローンを分析した。クローンBrdU陰性hCSCにおけるQドット蛍光の強度は、分裂の数に比例して減少したが、一方、14のBrdU陽性hCSCは大量のQドットを保有した図58B。さらに、BrdUを保有するおよび保有しない細胞の組合せからなるクローンの例は、検査した全クローンにおいて認められなかった。したがって、hCSC分裂の非無作為染色分体分離モデルは、著しくBrdU標識された細胞の老化表現型の獲得、老いたDNAを保有する細胞の複製の欠如、あるいは分裂中のBrdU陽性およびBrdU陰性hCSCのクローン拡張への同時的関与を包含しない。不死DNA鎖仮説、ならびに複製の間、老いたおよび新DNAを別様に分離するhCSCの2つのプールをヒト心臓が保有する、という認識の重要な一態様は、これらの別個のDNA分配機序の直接的形態学的証拠の獲得を必要とした。この目的のために、c-kit陽性hCSCをBrdUに~36時間曝露して、それらにハロゲン化ヌクレオチドを取り込ませた。次いで、BrdUを除去し、~30時間の追跡期間を導入して、BrdUの非存在下でhCSCに1回の細胞周期を経過させた。この期間の終了時に、細胞を固定し、有糸分裂後期画像におけるBrdUの分布を検査した。ほとんどの場合に、両組の後期染色体はBrdUに標識されたが、これは、無作為染色分体分離を実証している。しかしながら、限定数の有糸分裂細胞において、1組の後期染色体においてのみBrdUが検出され、これは、細胞分裂中の非無作為染色分体分離と一致した図59CおよびD。hCSCの一小集団が染色分体の非無作為分離により分裂するということをさらに実証するために、クロロデオキシウリジンCldU標識化親hCSCをクローン分析のためにプレート化した。その後、ヨードデオキシウリジンIdUを~26時間の細胞周期の期間中に負荷して、CldU標識化親hCSC由来の2つの細胞の第一世代における新規合成DNA鎖を同定した。次に、IdUを培養から除去し、第二細胞世代におけるDNA鎖の分析を、~26時間の追跡期間後に実施した。このアプローチにより、3細胞のクローンが見出されたが、この場合、1つの細胞はCldUおよびIdUに関して陽性であり、1つの細胞はIdUのみに陽性で、そして1つの細胞はCldUおよびIdUの両方に関して陰性であった図59B。後者細胞は老いたDNAを保有したが、一方、他の2つの細胞は新DNAを含有した。C.不死DNAを保有するhCSCはより大きい増殖余力を有する老いたDNAを保有する幹細胞の増殖余力が理論的に新規合成DNAのみを受け継いでいる幹細胞の余力より優れている、という仮定に基づいて、これら2つのクラスのhCSCに由来するクローン子孫のサイズおよび年齢を確定した。この定量的分析を7例の患者で実行し、染色分体の非無作為分離により生成される105クローン、ならびに無作為分離により形成される135クローンを包含した。最初の7日の間、最大300細胞/クローンからなる発達中のクローンを分析した。老いたDNAを有するhCSCにより生成されるクローン中に存在する細胞の数は、新DNAを有するhCSCにより生成されるクローンで見出されるものより1.6倍多かった図60A~DおよびF。非無作為染色分体分離により分裂するhCSCで観察された細胞生成速度増強は、この細胞プールの23短い集団倍加時間と一致した図60E。重要なことは、クローンのサイズの差が時間に伴って増大した、ということである。12日目に、老いたDNAを有するhCSCは、新DNAを保有するhCSCで得られるものより2.2倍大きいクローンを形成した。不死DNAを保有するhCSCにより発達したクローンは多数回の分裂を経たが、3つのp16INK4a陽性細胞のみが、105クローンで検出された。逆に、p16INK4a標識化は、無作為染色分体分離を伴うhCSCの複製により生成されるクローン細胞の2を占めた図60H。単一BrdU標識化親hCSCは~10,000個のc-kit陽性細胞のクローンを生じたが、この場合、1つの細胞のみがBrdU陽性であった図61。Q-FISHにより測定されるテロメア長は、老いたおよび新DNAを保有するhCSC由来の細胞において、それぞれ7~10kbpから2.0~9kbpまで変化した、ということは重要である。両hCSCクラスにおいて、テロメア長は心臓の年齢と反比例の関係を有した。さらに、すべての細胞がp16INK4aを発現した30個以下の細胞からなる小コロニー/クローンは、新DNAを有するhCSCの分裂に限定された;40のこのような例が、1204の生成クローンにおいて認められた。老いたDNAを有するhCSCの複製から得られた105例において、老化クローンは見出されなかった。老いたDNAを有するhCSCにより生成されるクローンは、有意に大きく、すべてp16INK4a陰性で、IGF-1受容体を発現するクローン細胞で構成された。逆に、新DNAを有するhCSCにより形成されるクローンのうちのいくつかは非常に小さく、時折、クローン細胞は均一にp16INK4a陽性で、IGF-1受容体を欠いた。したがって、不死DNAを保有するhCSCは、高度の増殖余力を有する強力な始原細胞のプールを構成する。D.hCSCの線状および指数増殖上で考察した知見は、いくつかの挑戦的問題を提起した。不死DNAを保有するhCSCにより予期されるべき線状増殖、ならびに新規合成DNAを有するhCSCが経験する指数増殖は、これらの細胞部類により形成されるクローンのサイズと一致しなかった。実際、反対の結果が得られた。当該過程の早期に、より少数のクローン細胞が老いたDNAを有するhCSCにより生成されるはずであり、その後、新規合成DNAのみを含有する娘細胞は増殖停止に入らなかったが、しかし指数的に増殖する子孫を作った。クローン検定のためのhCSCのプレート化後7および12日目に収集されたデータに基づいて、両方の型のクローンが等しいサイズになったと基をコンピューター計算して、4日であることが判明した。したがって、不死DNAを保有するhCSCの増殖パターンの変化は、4日の期間に亘って起こるはずであった。老いたDNAを有するhCSCの線状拡張が、植えつけの~26-30時間後に、CldU標識化親細胞の最初の分裂中に保存される、ということをわれわれの以前の実験は示唆したが、これは、細胞分裂におけるシフト、すなわち線状増殖から指数増殖への臨界間隔として2および3日を指し示している。老いたおよび新DNAを有するhCSCを起源とするクローンにおける細胞増殖の機序を特性化するために、各幹細胞により発達する細胞の数を時間の一関数として確定した。植え付けの4日後、両細胞クラスは指数増殖を示したが、しかし細胞複製速度は、不死DNAを保有するhCSC由来のクローンにおいてより高かった。データを対数スケールでプロットした場合、その線は、4日目に交差する指数的および線状セグメントを有した。クローンを作り、プレート化後2、3および6日目のクローン細胞の特性を確定して、それらの運命:細胞周期停止、線状増殖および指数増殖を確立した。CldU標識化親hCSCを、Terasakiプレートの単一ウェル中に植えつけた。24時間後、各植える中に2つの細胞が認められた時に、IdUを24時間付加した。次いで、クローンを6日まで拡張させた。染色分体の無作為分離により分裂するhCSCにより作られるクローン細胞は、2、3および6日目に同一パターンを示した;クローン内の全細胞がCldUおよびIdUに関して陽性であった。さらに、これらの細胞は、細胞周期阻害薬p53に関して陰性で、細胞周期タンパク質Ki67およびMCM5に関して陽性であったが、これは、指数増殖を実証している。造血系と同様にして、p53を細胞静止のマーカーとして用いたLiuetalCellStemCellVol43748vanOsetalCellStemCellVol478。Ki67とMCM5の組合せを用いたが、それは、これらのタンパク質が細胞周期の種々の期を一緒に担当するためであったScholzenandGerdesJCellPhysiolVol182311322BellandDuttaAnnuRevBiochemVol71333374。染色分体の非無作為分離により分裂するhCSCから得られるクローンにおいて、複雑なパターンの細胞行動が見出された。2日目に、クローンは、3つの細胞で構成された:不死DNAを保有する細胞はCldUおよびp53に関して陰性であったが、しかしIdUを含有し、Ki67-MCM5を発現した;他の2つの細胞は、p53に関して陽性で、CldUまたはIdUにより標識された。3日目に、クローンは4つの細胞で構成された:老いたDNAを有する細胞は、CldU、IdUおよびp53に関して陰性であったが、しかしKi67-MCM5を発現した;2つの細胞は、p53に陽性で、CldUまたはIdUにより標識された;そして1つの細胞は、CldUおよびp53に関して陰性であったが、しかしIdUおよびKi67-MCM5に関して陽性であった。この細胞は、静止状態に入らず、指数的に増殖し始めたIdU陽性母幹細胞の分裂により生成される娘細胞を反映した。実際、6日目に、クローンは14の細胞で構成された:指数的拡張集団を表す8つの細胞は、希釈IdU標識化を示し、p53に関して陰性で、Ki67-MCM5に関して陽性であった;2つの細胞はp53を発現し、CldUまたはIdU陽性であった;3つの細胞は、CldU、IdUおよびKi67-MCM5に関して陰性であったが、しかしp53を発現した;そして最後に、不死DNAを保有する1つの細胞はKi67-MCM5陽性で、CldU、IdUおよびp53に関して陰性であった。したがって、これらのクローンは、不死DNAを保有するhCSCの線状増殖、ならびに新規合成DNAを保有する1つのhCSCの指数増殖の結果であったが、これらは第3分裂後、増殖抑制を免れた。大型クローンは、12日目に、類似の行動を保持した。Ki67は、大多数のクローン子孫の生成に関与する新DNAを有するサイクリング細胞を同定した。Ki67-MCM5陰性細胞は、p53を発現し、増殖停止に入る老いたDNAを有するhCSCの線状増殖由来のクローン細胞を構成した。p53がKi67-MCM5に関して陰性であるすべての静止細胞において検出され、新規合成DNAを含有する細胞における増殖停止の機序としてのこの腫瘍サプレッサーを指し示しているということは重要である。p53陽性hCSCは、非相同末端結合媒介性DNA修復のマーカーである53BP1およびRad51を発現したHuertasNatStructMolBiolVol171116が、これは、新規DNAを保有する非分裂中娘細胞が、誤りがちなDNA修復応答を活性化することによりDNA損傷と反応した、ということを示唆しているMohrinetalCellStemCellVol7174185。53BP1およびRad51は、新DNAを有するhCSC由来のクローンにおいて指数的に増殖する細胞中で検出されなかった。総体的に、これらの観察は、幹細胞自己複製の不死鎖仮説がヒト心臓の始原細胞の一クラスにおいて有効である、ということを示唆している。E.非対称的染色分体分離により分裂するhCSCにより生成される子孫幹細胞分裂中の染色分体の非無作為分離が、古いDNAを有する娘幹細胞ならびに新DNAを有する娘委任細胞の形成を必然的に生じるCairnsPottenetalFalconeretalKarpowiczetalRandoという認識は、議論の余地がある。このパターンの細胞増殖は、対称的細胞分裂、ならびに幹細胞がそれらのプールを迅速に拡張し、あるいは2つの娘幹細胞または2つの娘分化細胞の生成により大型子孫を作るという可能性を除外するMorrisonandKimbleNatureVol44110681074。したがって、老いたDNAを含有する単一hCSCにより形成されるクローンが実際に1つだけの真の幹細胞老いたDNAおよび委任細胞新DNAのクラスターにより構成されるか否かを確定した。これらの細胞小集団におけるBrdU標識化の非存在または存在を確立するために、クローン細胞の小アリコートを検査した;非無作為DNA鋳型分離由来のクローンは、BrdU陽性細胞を全く含有しないかまたは多くても1つ含有し、そして無作為DNA鋳型分離により形成されるクローンはすべてBrdU陽性細胞で構成された。次に、FACSにより両クラスのクローン原性細胞を分析し、転写因子ならびに筋細胞、ECおよびSMCに特異的な細胞質タンパク質を、1未満で発現することが判明した。これらの結果は、非無作為であっても無作為であってもDNA鋳型分離により分裂したhCSC由来の新DNAを含有するクローン原性細胞の系列委任を除外する傾向がある。非無作為染色分体分離により分裂したhCSCにより形成されるクローン細胞の免疫標識により、同様のデータを収集した;全クローン細胞が、Nkx2.5およびGATA4に関しておおむね陰性であった。これらのデータは、hCSCの分裂中の染色分体の非対称分離が委任子孫を生成せず、非対称幹細胞分裂と同等とみなされず、しかしむしろ対称幹細胞分裂と同等であり得る、ということを示唆している。この見解をさらに支持するために、クローン細胞をサブクローニングして、細胞分裂中の非対称染色分体分離の役割の付加的特性化を獲得した。さらにまた、ビルド標識化親hCSC由来のクローンを、ビルドに関するクローン細胞の小アリコートを染色することにより同定した。ハロゲン化ヌクレオチドに関する陽性細胞の非存在は、非無作為DNA鋳型分離からのクローン細胞の生成、ならびにサブクローン分析のための適切な試料を示すと考えられる。したがって、BrdU陰性クローン細胞を、限界希釈で沈着させて、細胞付着後、BrdUを~26時間細胞周囲の長さの期間中付加して、すべてのサイクリング細胞を標識した;次いで、BrdUを除去した。単一BrdU陽性細胞を有するサブクローンを1つだけ得たが、一方、他のサブクローンはすべて、非分化BrdU標識化細胞で構成された。したがって、非無作為染色分体分離は、一方はおいたDNAを有し、他方は新DNAを有する2つの娘幹細胞の形成に伴う対称幹細胞分裂を反映した。DNA分離の有糸分裂非対称は、紡錘体機構の構成成分により状態調節され得るNeumuellerandKnoblichGenesDevVol2326752699。分裂中の細胞は、老いた動原体または中心小体これらは母細胞により受け継がれ得るを、不死DNA鎖と一緒に認識し得るShininetalNatCellBiolVol8677687。有糸分裂紡錘体は、動的微小管および有糸分裂モーターを用いて、染色体の探索および捕捉、ならびにそれらのアラインメントおよび分離を引き起こす動きを駆動するBrunetandVernosEMBORepVol2669673。hCSCにおける染色分体の偏向的分離の分子的基礎を理解するために、左右ダイニンモータータンパク質LRDを試験したArmakolasandKlarScienceVol315100101。LRD遺伝子の突然変異は胚性左右身体軸非対称をもたらし、この現象は、細胞分裂の様式の変更により媒介されるSapienzaScienceVol3154647。したがって、BrdU標識化hCSCを、LRDおよびEGFPに関するsiRNAを含有するプラスミドでトランスフェクト氏、EGFPに関してFACS分類して、限界希釈でプレート化した。対照hCSCにスクランブルsiRNAで形質導入し、正常レベルのLRDを発現させた。対照hCSCにより生成されるクローンのほぼ5が、単一BrdU明細胞を示したが、これは、始祖細胞の非対称染色分体分離により分離する予測数のhCSCを反映している。これに対比して、始祖hCSCにおけるLRDの下方調節は、対称染色分体分離により専ら形成されるクローンを生じるが、これは、LRDが染色分体の非対称分離に関与する因子の1つであり得る、ということを示唆している。F.梗塞後の心筋再生老いたおよび新しいDNAを有するhCSCの臨床的移入を実証するために、考察されたアプローチは、今までのところ用いられ得なかった。梗塞心臓にinvivoで送達されるべき、両クラスの、有意数の生きているhCSCの同定および収集を可能にするプロトコールを開発しなければならなかった。この新規の戦略は、複製中のhCSCのDNA中に組み込まれるBrdUとDNA染料の蛍光強度との間の相互作用を利用するCrissmanetalMethodsCellBiolVol41341349RampaletalJChromatogrAVol781357365。単量体シアニン核酸染色TO-PRO-3は二本鎖DNA中に介在し、BrdU-アデノシン対に隣接して位置する場合、蛍光のTO-PRO-3固有レベルが劇的に増大されるRampaletalBeiskeretalCytometryVol37221229。これは、非介在染料、すなわちヨウ化プロピジウムPIを用いる場合は起きないが、それは、その蛍光効率が隣接ヌクレオチドと無関係であるためであるCrissmanetal。DNAがPIおよびTO-PRO-3の両方によって標識される場合、蛍光共鳴エネルギー移動FRETが起こるBeiskeretalChanandHolmesMethodsMolBiolVol263281292VanWageningenetalCytometryAVol69291298。これは、老いたおよび新しいDNAを有する生きているhCSCのFACS分類、すなわち、BrdU陰性細胞老いたDNAからのBrdU陽性細胞新しいDNAの分離のための基礎を形成した。FRETに及ぼすBrdU取込みの影響を確定するために、hCSCをBrdUに~5-6集団倍加の間曝露して、ほぼ100のBrdU標識化を達成した。次いで、BrdU陽性hCSCを、PIおよびTO-PRO-3の両方で標識した。BrdUの存在は、PIスペクトルの振幅の減少を、ならびにTO-PRO-3シグナルの増大をもたらした。母DNAを有するhCSCを分裂させて、新規合成BrdU標識化DNAを娘細胞の1つに移させる36時間の追跡期間後、BrdU陽性およびBrdU陰性hCSCをFACS分類して、5日間別々に培養し、それらの集団倍加時間PDTを確定した;老いたDNAを有するhCSCは、前に示したように、高増殖率と一致するより短いPDTを有した。母DNAを有するhCSCにより生成される子孫のinvitroでの増強された増殖能力がinvivoで保存される場合、この細胞クラスは、損傷心臓におけるより強力なレベルの心臓修復を誘導すると予期され得る。したがって、老いたおよび新しいDNAを有するhCSCの子孫により促進される心筋再生の程度を、免疫抑圧ラットにおける梗塞後に確定したBearzietalBearzietalProcNatlAcadSciUSAVol1061588515890。これらのinvivo試験において、2つの部類のhCSCを、上記のFACS-FRETプロトコールにより調製し、それらのその後の追跡のためにEGFPレンチウイルスに感染させた。冠動脈閉塞および細胞送達の10日後に、老いたおよび新しいDNAを有するhCSCの子孫の治療効力に、有意差が認められた。前者の細胞型は、優等度の組織再構成を生じた;梗塞は、この部類のhCSCの増殖および分化によりほぼ完全に取り替えられた修復応答は従来観察されていなかったBearzietalBeltramietalCellVol114763776UrbaneketalCircResVol97663673PadinIruegasetalCirculationVol87688773942。壁肥厚、精製された筋細胞の数、および細胞複製の程度は、母DNAを有するhCSCの子孫に関しては全て高かったが、但し、筋細胞のサイズは、両群の梗塞動物の場合と同様であった。新規形成筋細胞はコネキシン43およびN-カドヘリンを発現し、筋細胞膜した領域における筋節横紋を示した。再生された小動脈および毛細管の数も、この細胞型に関しては多かった。ヒト起源の再生構造物を、AluプローブによるヒトDNA配列の検出、ならびにスペクトル分析により記録される免疫標識シグナルの特異性により確証した。両hCSC子孫が梗塞心臓の血行力学的性能を改善したが、、しかし不死DNAを保有するhCSC由来の細胞は付加的陽性作用を示した、ということは重要である。収縮期血圧の回復、ならびに陽性および陰性dP/dt、そして拡張期ストレスのコンピューター算定値の増大における減衰は、新DNAを有するhCSCにより生成される細胞を用いて得られるものより有意に大きかった。G.考察この実施例に記載された結果は、ヒト心臓が、分裂中に、老いた鋳型DNA鎖を保持する心臓幹細胞の小プールを保有し、そして増殖抑制、ならびに新規合成DNAを保有する娘細胞における誤りがちなDNA修復応答の活性化後、それぞれ老いたおよび新規のDNAを保持する2つの娘細胞を生成する、という直接的証拠を提供する。前者は線状増殖を経るが、一方、後者は指数増殖を経験し、心筋において染色分体の選択的分配の非存在下で複製するhCSCの大型区画の原因であり得る。しかしながら、両hCSCクラスは、invitroおよびinvivoで、非分化、自己複製性およびクローン原性である幹細胞特質を保有する。これらの観察は、JohnCairnsにより提唱された幹細胞増殖のモデル、ならびに娘細胞の運命に関するその密接な関係Cairnsを、一部のみ支持する。不死鎖仮説によれば、老いたDNA鋳型を保有する細胞は幹細胞として機能し、器官の幹細胞プールを保存するが、一方、新規合成DNA鎖を含有する細胞は系列特異化を受ける。したがって、染色分体の非対称分離は非対称幹細胞分裂と等価とみなされているが、しかしこれは事実ではない。さらに、われわれの従来の知見は、hCSCはinvitroおよびinvivoで対称的および非対称的に分裂して、同一のまたは相違する運命を有する娘細胞を生じる、ということを示すBearzietalBearzietal。hCSC分裂のこれらのパターンは、エンドサイトーシスタンパク質であるnumbおよびα-アダプチンの局在化ZhongNeuronVol371114ならびにノッチ受容体の機能BonietalProcNatlAcadSciUSAVol1051552915534に基づいて確定されている。幹細胞自己複製のCairnモデルの欠点のいくつかを強調する最新の観察は、各心臓幹細胞ニッチが老いたDNAを保有する優勢な細胞、ならびに新DNAを含有するCSCのクラスターで構成される。各ニッチ構造内に見出される明るくBrdU標識されるCSCUrbaneketalProcNatlAcadSciUSAVol10392269231は、その後分裂しなかったBrdU標識化祖父母CSCにほぼ対応する。この認識は、上記のようなマウス心臓のBrdU明性CSCにおけるp53、53BP1およびRad51の発現の欠如と一致する。無作為染色分体分離により形成されるCSCのみがニッチ区域を出て、機能的適格心筋細胞および血管構造物に分化する。幹細胞増殖のこのパターンは、ニッチ内の祖父母CSCのプールサイズを保護する。チミジン類似体により明るく標識されるCSCの存在が、低指令細胞の運命を制御する不死DNAを保有する真の幹細胞を含有する心臓ニッチの認識を可能にする、ということは重要である。不死DNA鎖を保有するヒトCSCは長いテロメアを有し、非老化性細胞の大きなプールを生じる。この高自己複製能力は、新規合成DNAのみを保有するhCSCの増殖を有意に越えて、前者クラスの幹細胞を、損傷後の心筋再生のためのより望ましい始原細胞にする。実際、老いたDNAを有するhCSCにより生成される子孫は、新DNAを有するhCSCにより得られる細胞によって誘導されるものより構造的および機能的に優れている梗塞心筋の回復をもたらした。新規形成心筋細胞および冠動脈血管による壁の全梗塞領域の取替えは、心臓および非心臓始原細胞に関して、以前には観察されなかった。母DNAを保有するhCSCから開発されたクローン原性細胞により媒介される心室血行力学および解剖学における印象的な回復は、虚血性および非虚血性心不全に関するこの幹細胞部類の臨床的関連性を強調する。前記の詳細な説明は理解し易くするために示されただけで、修正は当業者には明らかであるので、本発明は上記の記載内容に限定されると解釈されるべきでない。本明細書中で提供される情報のいずれもが従来技術であるかまたは目下主張される発明に関連するということ、あるいは具体的にまたは無条件に参照される出版物のいずれもが従来技術であるということではない。別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明をその具体的実施形態と結びつけて記載してきたが、さらなる修正が可能であると理解されるし、概して、本発明の原理に従って、そして本発明が関連する当該技術分野内で既知のまたは慣例的な実行の範囲内であるような、本明細書中で前記したような本質的特徴に当てはまり得るような、添付の特許請求の範囲に従うような本発明の開示内容からの逸脱を含めて、本発明のあらゆる変形、用途または適用を網羅するよう意図される。"