"配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45または配列番号46を含む抗体またはその抗原結合性部分。配列番号31CDR-H1の残基31-35、配列番号31CDR-H2の残基50-66、配列番号31CDR-H3の残基99-113、配列番号32CDR-L1の残基24-34、配列番号32CDR-L2の残基50-56または配列番号32CDR-L3の残基89-97を含む少なくとも1つのCDRを含む、TNFαに結合しうる抗体またはその抗原結合性部分。結合性タンパク質が少なくとも3つのCDRを含む、請求項2に記載の結合性タンパク質。少なくとも3つのCDRが、a配列番号31CDR-H1の残基31-35、配列番号31CDR-H2の残基50-66および配列番号31CDR-H3の残基99-113、またはb配列番号32CDR-L1の残基24-34、配列番号32CDR-L2の残基50-56および配列番号32CDR-L3の残基89-97の可変ドメインCDRセットを含む、請求項3に記載の結合性タンパク質。少なくとも2つの可変ドメインCDRセットを含む、請求項4に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、a配列番号31CDR-H1の残基31-35、配列番号31CDR-H2の残基50-66および配列番号31CDR-H3の残基99-113、ならびにb配列番号32CDR-L1の残基24-34、配列番号32CDR-L2の残基50-56および配列番号32CDR-L3の残基89-97の両方を含む、請求項5に記載の結合性タンパク質。ヒトアクセプターフレームワークを更に含む、請求項6に記載の結合性タンパク質。ヒトアクセプターフレームワークが配列番号10~19または配列番号20~30のいずれか1つを含む、請求項7に記載の結合性タンパク質。ヒトアクセプターフレームワークが少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列がヒトアクセプターフレームワークの配列に対して少なくとも65同一であり、ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも70個のアミノ酸残基を含む、請求項7または8に記載の結合性タンパク質。ヒトアクセプターフレームワークが、CDRに隣接した残基、グリコシル化部位残基、稀有残基、ヒトTNF-αと相互作用しうる残基、CDRと相互作用しうる残基、カノニカルcanonical残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との接触残基、バーニアVernier領域内の残基、およびチョチアChothiaにより定義された可変領域鎖CDR1とカバトKabatにより定義された第1重鎖フレームワークとの間で重複する領域内の残基に、少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む、請求項8に記載の結合性タンパク質。残基が1H、2H、67H、69H、71H、82H、85H、91Hおよび2L、43L、44L、49L、71Lまたは87Lである、請求項10に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質がコンセンサスヒトアクセプターを含む、請求項11に記載の結合性タンパク質。a配列番号33、配列番号34、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41および配列番号42を含む可変重鎖ポリペプチド、ならびにb配列番号35、配列番号36、配列番号43、配列番号44、配列番号45および配列番号46を含む可変軽鎖ポリペプチドを含む、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、以下のそれぞれのアミノ酸配列:配列番号31および配列番号32;配列番号33および配列番号35;配列番号33および配列番号43;配列番号33および配列番号44;配列番号33および配列番号36;配列番号33および配列番号45;配列番号33および配列番号46;配列番号34および配列番号35;配列番号34および配列番号43;配列番号34および配列番号44;配列番号34および配列番号36;配列番号34および配列番号45;配列番号34および配列番号46;配列番号37および配列番号35;配列番号37および配列番号43;配列番号37および配列番号44;配列番号37および配列番号36;配列番号37および配列番号45;配列番号37および配列番号46;配列番号38および配列番号35;配列番号38および配列番号43;配列番号38および配列番号44;配列番号38および配列番号36;配列番号38および配列番号45;配列番号38および配列番号46;配列番号39および配列番号35;配列番号39および配列番号43;配列番号39および配列番号44;配列番号39および配列番号36;配列番号39および配列番号45;配列番号39および配列番号46;配列番号40および配列番号35,配列番号40および配列番号43;配列番号40および配列番号44;配列番号40および配列番号36;配列番号40および配列番号45;配列番号40および配列番号46;配列番号41および配列番号35;配列番号41および配列番号43;配列番号41および配列番号44;配列番号41および配列番号36;配列番号41および配列番号45;配列番号41および配列番号46;配列番号42および配列番号35;配列番号42および配列番号43;配列番号42および配列番号44;配列番号42および配列番号36;配列番号42および配列番号45;または配列番号42および配列番号46を含む可変重鎖ポリペプチドおよび可変軽鎖ポリペプチドを含む、請求項13に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が免疫グロブリン分子、ジスルフィド結合Fv、モノクローナル抗体、scFv、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、CDRグラフティング抗体、ジアボディ、ヒト化抗体、多重特異性抗体、Fab、二重特異性抗体、DVD-Igタンパク質、Fab’、二重特異性抗体、Fab’2またはFvである、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、ヒトIgG1定常ドメイン、ヒトIgE定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメインまたはヒトIgA定常ドメインを含む、請求項1に記載の結合性タンパク質。配列番号2または配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を更に含む、請求項1に記載の結合性タンパク質。配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を更に含む、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質がヒトTNF-αを中和しうる、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、表面プラズモン共鳴による測定で少なくとも約102M-1s-1、少なくとも約103M-1s-1、少なくとも約104M-1s-1、少なくとも約105M-1s-1または少なくとも約106M-1s-1の、標的に対するオンon速度定数Konを有する、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、表面プラズモン共鳴による測定で多くとも約10-3s-1、多くとも約10-4s-1、多くとも約10-5s-1または多くとも約10-6s-1の、標的に対するオフoff速度定数Koffを有する、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、多くとも約10-7M、多くとも約10-8M、多くとも約10-9M、多くとも約10-10M、多くとも約10-11M、多くとも約10-12Mまたは多くとも10-13Mの、標的に対する解離定数KDを有する、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、多くとも約10-7M、多くとも約10-8M、多くとも約10-9M、多くとも約10-10M、多くとも約10-11M、多くとも約10-12Mまたは多くとも10-13Mの、TNF-αに対する解離定数KDを有する、請求項22に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が、免疫接着分子、イメージング剤、治療用物質または細胞毒性物質を更に含む、請求項1に記載の結合性タンパク質。イメージング剤が放射能標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識またはビオチンである、請求項24に記載の結合性タンパク質。放射能標識が3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoまたは153Smである、請求項25に記載の結合性タンパク質。治療用または細胞毒性物質が代謝拮抗物質、アルキル化物質、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生物質、抗有糸分裂物質、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス性物質である、請求項24に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有する、請求項1に記載の結合性タンパク質。結合性タンパク質が結晶化結合性タンパク質である、請求項1に記載の結合性タンパク質。請求項1に記載の結合性タンパク質アミノ酸配列をコードする単離された核酸。請求項1に記載の結合性タンパク質アミノ酸配列をコードする単離された核酸を含むベクター。ベクターがpcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybEまたはpBJである、請求項31に記載のベクター。請求項31に記載のベクターを含む宿主細胞。宿主細胞が原核細胞である、請求項32に記載の宿主細胞。宿主細胞が真核細胞である、請求項32に記載の宿主細胞。真核細胞が原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞または昆虫細胞である、請求項34に記載の宿主細胞。真核細胞がエスセレビシエS.cerevisiae、CHO細胞、COS細胞またはSF9細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。TNF-αに結合しうる結合性タンパク質を産生するのに十分な条件下、請求項32に記載の宿主細胞を培地内で培養する工程を含む、TNF-αに結合しうるタンパク質の製造方法。請求項37に記載の製造方法により製造されるタンパク質。請求項1または請求項37に記載の結合性タンパク質と医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。TNF-α活性が有害である障害を治療するための少なくとも1つの追加的物質を更に含む、請求項39に記載の医薬組成物。追加的物質が、治療用物質、イメージング物質、細胞毒性物質、血管新生インヒビター、キナーゼインヒビター、共刺激分子ブロッカー、接着分子ブロッカー、抗サイトカイン抗体またはその機能性フラグメント、メトトレキセート、シクロスポリン、ラパマイシン、FK506、検出可能な標識またはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋肉弛緩薬、麻酔薬、非ステロイド抗炎症薬NSAID、鎮痛薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制物質、成長ホルモン、ホルモン補充療法薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、興奮薬、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、経口ステロイド、エピネフリンまたはその類似体、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストである、請求項40に記載の医薬組成物。請求項39に記載の組成物の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の治療方法。ヒトTNF-α活性が低減するように、ヒトTNF-αを請求項1に記載の結合性タンパク質と接触させることを含む、ヒトTNF-α活性を低減するための方法。TNF-α活性が有害である障害に罹患しているヒト対象においてヒトTNF-α活性を低減するための方法であって、ヒト対象におけるヒトTNF-α活性が低減するように、請求項1に記載の結合性タンパク質をヒト対象に投与することを含む方法。TNF-α活性が有害である疾患または障害に対する対象の治療方法であって、治療が達成されるように、請求項1に記載の結合性タンパク質を対象に投与することによる治療方法。障害が自己免疫および/または炎症障害である、請求項45に記載の方法。障害がクローン病、尋常性乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、若年性特発性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性糖尿病、アレルギーおよび自己免疫ブドウ膜炎である、請求項46に記載の方法。障害が、呼吸障害;喘息;アレルギー性および非アレルギー性喘息;感染による喘息;呼吸器合胞体ウイルスRSV感染による喘息;慢性閉塞性肺疾患COPD;気道炎症を伴う状態;好酸球増加症;線維症および過剰粘液産生;嚢胞性線維症;肺線維症;アトピー性障害;アトピー性皮膚炎;蕁麻疹;湿疹;アレルギー性鼻炎;アレルギー性胃腸炎;皮膚の炎症性および/または自己免疫状態;胃腸器官の炎症および/または自己免疫状態;炎症性腸疾患IBD;潰瘍性大腸炎;クローン病;肝臓の炎症および/または自己免疫状態;肝硬変;肝線維症;B型および/またはC型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝線維症;強皮症;腫瘍または癌;肝細胞癌;神経膠芽腫;リンパ腫;ホジキンリンパ腫;ウイルス感染;細菌感染;寄生虫感染症;HTLV-1感染;防御1型免疫応答の発現の抑制、およびワクチン接種中の防御1型免疫応答の発現の抑制である、請求項46に記載の方法。請求項1に記載の結合性タンパク質を、第2物質の投与の前、それと同時またはその後で投与することを含む、TNF-αが有害である障害に罹患した患者の治療方法であって、第2物質が、以下のものに結合しうる抗体またはそのフラグメント:ヒトIL-12;PGE2;LPA;NGF;CGRP;SubP;RAGE;ヒスタミン;ヒスタミン受容体ブロッカー;ブラジキニン;IL-1アルファ;IL-1ベータ;VEGF;PLGF;メトトレキセート;コルチコステロイド;グルココルチコイド受容体モジュレーター;シクロスポリン、ラパマイシン、FK506または非ステロイド性抗炎症物質である、治療方法。請求項1に記載の結合性タンパク質を、第2物質の投与の前、それと同時またはその後で投与することを含む、TNF-αが有害である障害に罹患した患者の治療方法であって、第2物質が、TNFアンタゴニスト;TNF受容体の可溶性断片;ENBREL登録商標;TNF酵素アンタゴニスト;TNF変換酵素TACEインヒビター;ムスカリン性受容体アンタゴニスト;TGF-ベータアンタゴニスト;インターフェロンガンマ;ピルフェニドンperfenidone;化学療法剤、メトトレキセート、レフルノミド;シロリムスラパマイシンまたはその類似体、CCI-779;COX2またはcPLA2インヒビター;NSAID;免疫調節物質;p38インヒビター;TPL-2、MK-2およびNFkBインヒビター;ブデノシド;上皮増殖因子;コルチコステロイド;シクロスポリン;スルファサラジン;アミノサリチル酸;6-メルカプトプリン;アザチオプリン;メトロニダゾール;リポキシゲナーゼインヒビター;メサラミン;オラサラジン;バルサラジド;抗酸化物質;トロンボキサンインヒビター;IL-1受容体アンタゴニスト;抗IL-1b抗体;抗IL-6抗体;増殖因子;エラスターゼインヒビター;ピリジニル-イミダゾール化合物;TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-II、GM-CSF、FGFまたはPDGFの抗体またはアゴニスト;CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90またはそれらのリガンドの抗体;FK506;ラパマイシン;ミコフェノール酸モフェチル;イブプロフェン;プレドニゾロン;ホスホジエステラーゼインヒビター;アデノシンアゴニスト;抗血栓剤;補体インヒビター;アドレナリン作動性物質;IRAK、NIK、IKK、p38またはMAPキナーゼインヒビター;IL-1β変換酵素インヒビター;TNFa変換酵素インヒビター;T細胞シグナリングインヒビター;メタロプロテイナーゼインヒビター;6-メルカプトプリン;アンジオテンシン変換酵素インヒビター;可溶性サイトカイン受容体;可溶性p55TNF受容体;可溶性p75TNF受容体;sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R;抗炎症性サイトカイン;ならびにTGFbから選択される、治療方法。対象への投与が、少なくとも非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内、腹腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻腔内または経皮によるものである、請求項40~48のいずれか1項に記載の方法。i請求項1に記載のTNF-α結合性タンパク質またはそのTNF-α結合性部分とサンプルを接触させ、iiサンプル中のTNF-αとTNF-α結合性タンパク質またはその結合性部分との複合体の形成を検出するサンプル中の対照サンプルまたは関連TNF-αのものと比較した場合の、サンプル中の複合体の形成の統計的に有意な変化ことを含む、サンプル中のヒトTNF-αを検出する方法。サンプルが全血、血漿、血清、尿、唾液または組織生検である、請求項53に記載の方法。ヒト対象におけるヒトTNF-αを検出する方法であって、i請求項1に記載のTNF-α結合性タンパク質またはそのTNF-α結合性部分を、ヒトTNF-αへのTNF-α結合性タンパク質またはそのTNF-α結合性部分の結合を可能にする条件下、試験対象または対照対象に投与し、ii結合性タンパク質またはその結合性部分とTNF-αとの複合体の形成を検出することを含み、ここで、対照対象と比較した場合またはより早い時点での試験対象における複合体の形成と比較した場合の、試験対象における複合体の形成の統計的に有意な変化が、TNF-αの存在を示す、方法。[実施例1]:抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体の作製マウス抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体を以下のとおりに得る。[実施例1.1]:ヒトTNF-α抗原でのマウスの免疫化完全フロイントアジュバントまたはImmunoeasyアジュバントQiagen,Valencia,CAと混合された20マイクログラムの組換え精製ヒトTNF-αRDSystems,Minneapolis,MN,USAを5匹の6~8週齢のBalb/Cマウス、5匹のC57B/6マウスおよび5匹のAJマウスに第1日に皮下注射する。第24日、第38日および第49日に、不完全フロイントアジュバントまたはImmunoeasyアジュバントと混合された20マイクログラムの組換え精製ヒトTNF-α抗原を同じマウスに皮下注射する。第84日または第112日または第144日に、1μgの組換え精製ヒトTNF-α抗原をマウスに静脈内注射する。[実施例1.2]:ハイブリドーマの作製実施例1.1に記載されている免疫化マウスから得られた脾細胞を、KohlerおよびMilstein1975Nature256:495に記載されている確立された方法により、SP2/O-Ag-14細胞と5:1の比で融合させて、ハイブリドーマを得る。融合産物を、96ウェルプレート内の、アザセリンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地内で、ウェル当たり2.5×106個の脾細胞の密度でプレーティングする。融合の7~10日後、肉眼的ハイブリドーマコロニーが観察される。ハイブリドーマコロニーを含有する各ウェルからの上清を、TNF-αに対する抗体の存在に関して、ELISAにより試験する。ついで、TNF-α特異的活性を示す上清を、L929バイオアッセイにおいてTNF-αを中和する能力の存在に関して試験する実施例2.7に記載されているとおり。[実施例1.3]:抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体の特定および特徴づけTNF-αに結合する抗体、およびTNF-αに特異的に結合しうる抗体、および特に、L929バイオアッセイにおいて5nMまたはそれ未満のIC50値を有する抗体を産生するハイブリドーマを拡大させ、限界希釈によりクローニングする。ハイブリドーマ細胞を、10低IgGウシ胎児血清HycloneSH30151,Logan,UTを含有する培地内で増殖させる。平均250mLの各ハイブリドーマ上清クローン集団由来のものを集め、濃縮し、標準的な方法によるプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。TNF-α活性を精製mAbが抑制する能力を、実施例2.7に記載されているとおり、L929バイオアッセイを用いて決定する。[実施例1.4]:各マウス抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列の決定各アミノ酸配列決定のために、約10×106個のハイブリドーマ細胞を遠心分離により単離し、加工して、全RNAを単離する。これは、TrizolGibcoBRL/Invitrogen,Carlsbad,CAを該製造業者の説明に従い使用して行う。SuperScriptFirst-StrandSynthesisSystemInvitrogen,Carlsbad,CAを該製造業者の説明に従い使用して、全RNAを第1鎖DNA合成に付す。ポリARNAを選択するために第1鎖合成をプライミングするために、オリゴdTを使用する。ついで該第1鎖cDNA産物を、マウス免疫グロブリン可変領域の増幅のために設計されたプライマーIg-PrimerSets,Novagen,Madison,WIを使用するPCRにより増幅する。PCR産物をアガロースゲル上で分離し、切り出し、精製し、ついでTOPOCloningキットを使用してpCR2.1-TOPOベクターInvitrogen,Carlsbad,CA内にサブクローニングし、TOP10化学的コンピテント大腸菌Invitrogen,Carlsbad,CA内に形質転換する。コロニーPCRを該形質転換体上で行って、インサートを含有するクローンを特定する。QIAprepMiniprepキットQiagen,Valencia,CAを使用して、インサートを含有するクローンからプラスミドDNAを単離する。M13フォワードおよびM13リバースプライマーFermentasLifeSciences,HanoverMDを使用して、該可変重鎖または可変軽鎖DNA配列を決定するために、該プラスミド内のインサートを両鎖上で配列決定する。該抗TNF-αモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を表5に示す。[実施例2]:組換え抗ヒトTNF-α抗体[実施例2.1]:組換えキメラ抗ヒトTNF-α抗体の構築および発現マウス抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体MAK199の重鎖定常領域をコードするDNAを、細菌内の相同組換えにより、2個のヒンジ-領域アミノ酸突然変異を含有するヒトIgG1定常領域をコードするcDNA断片により置換した。これらの突然変異は、234位EU番号付けのロイシンからアラニンへの変化、および235位のロイシンからアラニンへの変化であるLundら1991J.Immunol.147:2657。これらの抗体のそれぞれの軽鎖定常領域をヒトカッパ定常領域により置換した。pHybE発現プラスミド米国特許公開第US20090239259号内に連結されたキメラ重鎖および軽鎖cDNAのコトランスフェクションにより、完全長キメラ抗体をHEK293-6E細胞内で一過性に発現させた。組換えキメラ抗体を含有する細胞上清をプロテインAセファロースクロマトグラフィーにより精製し、結合抗体を酸バッファーの添加により溶出した。抗体を中和し、PBS中に透析した。ついで該精製キメラ抗ヒトTNF-αモノクローナル抗体を、ELISAにより、hTNF-αタンパク質へのそれらの結合能に関して試験して、抗原結合を確認した。[実施例2.2]:CDRグラフティング抗ヒトTNF-α抗体の構築当技術分野でよく知られた標準的な方法を適用することにより、モノクローナル抗体MAK199のVHおよびVL鎖のCDR配列前記表5を参照されたいを種々のヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列内にグラフティングする。モノクローナル抗体MAK199のVHおよびVL配列に対する配列VHおよびVLのアライメントに基づいて、以下の公知ヒト配列を選択する:aVH1-18IGHV1-18およびVH7-4.1IGHV7-4-1、ならびに重鎖アクセプター配列を構築するための連結配列hJH6;b1-39/12および6-D1/A14、ならびに軽鎖アクセプター配列を構築するためのhJK2。MAK199の対応VHおよびVLCDRを該アクセプター配列内にグラフティングすることにより、CDRグラフティングヒト化および修飾VHおよびVL配列を調製した前記表6も参照されたい。[実施例2.3]:CDRグラフティング抗体におけるフレームワーク復帰突然変異の構築ヒト化抗体フレームワーク復帰突然変異を作製するために、可変ドメインのデノボdenovo合成により、ならびに/または突然変異誘発性プライマーおよびPCR、および当技術分野でよく知られた方法を用いて、実施例2.2により調製されたCDRグラフティング抗体配列内に突然変異を導入する。種々の組合せの復帰突然変異および他の突然変異を、以下のとおり、CDRグラフトのそれぞれに関して構築する。これらの突然変異に関する残基番号はKabat番号付け系に基づいている。重鎖hMAK199VH.2zに関しては、以下のバーニアおよびVH/VL界面残基の1以上を以下のとおりに復帰突然変異させる:V2→I、Y91→F。追加的な突然変異には以下のものが含まれる:Q1→E。重鎖hMAK199VH.2zに関しては、以下のバーニアおよびVH/VL界面残基の1以上を以下のとおりに復帰突然変異させる:V2→I、V67→F、M69→F、T71→L、Y91→F。追加的な突然変異には以下のものが含まれる:Q1→E、R82→S、D85→E。軽鎖hMAK199Vk.1に関しては、以下のバーニアおよびVH/VL界面残基の1以上を以下のとおりに復帰突然変異させる:A43→T、P44→V、F71→Y、およびY87→F。軽鎖hMAK199Vk.2に関しては、以下のバーニアおよびVH/VL界面残基の1以上を以下のとおりに復帰突然変異させる:V2→I、A43→T、P44→V、K49→Y、F71→Y、およびY87→F。[実施例2.4]:CDRグラフティング抗体におけるフレームワーク復帰突然変異を含有するヒト化抗HTNFα抗体の作製該配列を使用して、標準的なDNA合成または増幅技術により核酸を合成し、標準的な組換えDNA技術を用いて所望の抗体フラグメントを発現ベクターへと合体させ、細胞内での発現を行うことが可能である。例えば、アミノ酸配列から核酸コドンが決定され、BlueHeronBiotechnology,Inc.www.blueheronbio.comBothell,WAUSAによりオリゴヌクレオチドDNAが合成される。該オリゴヌクレオチドを300~2,000塩基対の二本鎖DNAへと合体させ、プラスミドベクター内にクローニングし、配列を確認する。酵素法を用いて、クローン化断片を合体させて、完全な遺伝子を得、発現ベクター内にサブクローニングする7,306,914;7,297,541;7,279,159;7,150,969;20080115243;20080102475;20080081379;20080075690;20080063780;20080050506;20080038777;20080022422;20070289033;20070287170;20070254338;20070243194;20070225227;20070207171;20070150976;20070135620;20070128190;20070104722;20070092484;20070037196;20070028321;20060172404;20060162026;20060153791;20030215458;および20030157643を参照されたい。例えば、前記のインシリコで構築されたヒト化抗体をpHybEベクター米国特許公開第US2009/0239259号内のマルチクローニング部位内に挿入することが可能である。細菌コロニーを単離し、プラスミドDNAを抽出し、cDNAインサートの全体を配列決定する。各抗体に対応する正しいヒト化重鎖および軽鎖をHEK293-6E細胞内にトランスフェクトして、完全長ヒト化抗ヒトTNF-α抗体を一過性に産生させる。該重鎖グラフティングcDNAおよび該軽鎖グラフティングcDNAを含有するpHybEベクターをHEK293-6E細胞内にコトランスフェクトした。組換えキメラ抗体を含有する細胞上清をプロテインAセファロースクロマトグラフィーにより精製し、結合抗体を酸バッファーの添加により溶出する。抗体を中和し、PBS中に透析する。ヒト化抗体を表7に示す。[実施例2.5]:ヒト化抗hTNFαhMAK199抗体VH/VLペア形成[実施例2.6]:BIACORE技術を用いるアフィニティの決定BIACORE法:BIACOREアッセイBiacore,Inc,Piscataway,NJは、オン速度およびオフ速度定数の速度論的測定により、抗体のアフィニティを決定する。標的抗原例えば、精製組換え標的抗原への抗体の結合は、25°Cで、ランニングHBS-EP10mMHEPES[pH7.4],150mMNaCl,3mMEDTAおよび0.005界面活性剤P20を使用するBiacore登録商標1000または3000装置Biacore登録商標AB,Uppsala,Swedenでの、表面プラズモン共鳴に基づく測定により決定される。全ての化学物質はBiacore登録商標ABUppsala,Swedenから得られ、そうでなければ、記載されている異なる入手元から得られる。例えば、10mM酢酸ナトリウムpH4.5中に希釈された約5000RUのヤギ抗マウスIgG,Fcγ,フラグメント特異的ポリクローナル抗体PierceBiotechnologyInc,Rockford,ILを、25μg/mlで、標準的なアミンカップリングキットを製造業者の説明および手順に従い使用して、CM5研究等級バイオセンサーチップに直接固定化する。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロッキングする。フローセル2および4における修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用する。フローセル1および3におけるヤギ抗マウスIgGを含有しない未修飾カルボキシメチルデキストランを参照表面として使用する。速度論的分析のために、1:1ラングミュア結合モデルから導き出された速度式を、Biaevaluation4.0.1ソフトウェアを使用して、グローバルフィット解析を用いて8つ全ての注入の会合および解離段階に同時にフィットさせる。ヤギ抗マウスIgG特異的反応表面上の捕捉のために、精製抗体をHEPES緩衝食塩水中で希釈する。リガンドとして捕捉されるべき抗体25μg/mlを5μl/分の流速で反応マトリックスに注入する。会合および解離速度定数konM-1s-1およびkoffs-1を25μl/分の連続的流速下で決定する。速度定数は、10~200nMの範囲の種々の抗原濃度において速度論的結合測定を行うことにより導き出される。ついで抗体と標的抗原との反応の平衡解離定数Mを、以下の式:KD=koff/konにより、該速度論的速度定数から計算する。時間の関数として結合を記録し、速度論的速度定数を計算する。このアッセイにおいては、106M-1s-1という速いオン速度および10-61s-1という遅いオフ速度が測定されうる。Biacore技術により特徴づけられる全てのヒト化構築物の結合が維持され、それはマウス親抗体のものに匹敵した。[実施例2.7]:ヒトTNFαの中和L929細胞を半コンフルエント密度まで増殖させ、0.25トリプシンGibco25300を使用して回収した。該細胞をPBSで洗浄し、計数し、4μg/mLアクチノマイシンDを含有するアッセイ培地内に1E6細胞/mLで再懸濁させた。該細胞を96ウェルプレートCostar3599内に100μLの容量および5E4細胞/ウェルで播いた。該抗体および対照IgGをアッセイ培地中で4倍濃度まで希釈し、系列1:4希釈を行った。huTNFαをアッセイ培地内で400pg/mLまで希釈した。抗体サンプル200μLをhuTNFα200μLに1:2の希釈系で加え、室温で0.5時間インキュベートした。該抗体/ヒトTNFα溶液を100μLでプレート化細胞に加えて、100pg/mLhuTNFαおよび150nM~0.0001nM抗体の最終濃度にした。該プレートを37°C、5CO2で20時間インキュベートした。生存性を定量するために、100μLを該ウェルから取り出し、10μLのWST-1試薬Rochecat11644807001を加えた。プレートをアッセイ条件下で3.5時間インキュベートした。該プレートをSpectromax190ELISAプレートリーダーでOD420~600nmで読取った。幾つかのアッセイからの平均EC50が表10に含まれている。全ての抗hTNFα抗体が該TNFα中和アッセイにおいて中和を示した。[実施例2.8]:ヒト化モノクローナル抗体の物理化学的およびインビトロ安定性分析サイズ排除クロマトグラフィー抗体を水で2.5mg/mLに希釈し、TSKゲルG3000SWXLカラムTosohBioscience,catk5539-05kを使用して、20mLをShimadzuHPLC系で分析した。サンプルを211mM硫酸ナトリウム、92mMリン酸ナトリウムpH7.0で0.3mL/分の流速で該カラムから溶出した。HPLC系運転条件は以下のとおりであった。移動相:211mMNa2SO4、92mMNa2HPO47H2O、pH7.0勾配:無勾配流速:0.3mL/分検出器波長:280nmオートサンプラー冷却温度:4°Cカラムオーブン温度:外界実施時間:50分表11は、前記方法により決定された、単量体単量体百分率予想分子量の非凝集タンパク質として表された抗体構築物の複数のデータを含む。抗hTNFα抗体は優れたSECプロファイルを示し、最良体は>95単量体を示した。SDS-PAGE還元および非還元の両方の条件下、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEにより抗体を分析する。アダリムマブのロットAFP04Cを対照として使用する。還元条件の場合、該サンプルを、100mMDTTを含有する2×トリスグリシンSDS-PAGEサンプルバッファーInvitrogen,catLC2676,lot1323208と1:1で混合し、60°Cで30分間加熱する。非還元条件の場合、該サンプルをサンプルバッファーと1:1で混合し、100°Cで5分間加熱する。該還元サンプル10mg/レーンを12プレキャストトリス-グリシンゲルInvitrogen,catEC6005box,lot6111021上にローディングし、該非還元サンプル10mg/レーンを8~16プレキャストトリス-グリシンゲルInvitrogen,catEC6045box,lot6111021上にローディングする。SeeBluePlus2Invitrogen,catLC5925,lot1351542を分子量マーカーとして使用する。該ゲルをXCellSureLockミニセルゲルボックスInvitrogen,catEI0001においてランニングさせ、まず、該ゲル内で該サンプルを積層させることにより75ボルトの電圧を適用し、ついで、色素先端が該ゲルの底に達するまで125ボルトの一定電圧を適用することにより、該タンパク質を分離する。使用したランニングバッファーは、10×トリスグリシンSDSバッファーABC,MPS-79-080106から調製された1×トリスグリシンSDSバッファーである。該ゲルをコロイド性青色染料Invitrogencat46-7015,46-7016で一晩染色し、バックグラウンドが透明になるまでMilli-Q水で脱染する。ついで該染色ゲルを、EpsonExpressionスキャナーモデル1680,S/NDASX003641を使用してスキャンする。沈降速度分析抗体を3個の標準的な2セクターカーボンエポンセンターピースtwo-sectorcarboneponcenterpieceのそれぞれのサンプルチャンバ内にローディングする。これらのセンターピースは1.2cmの光路長を有し、サファイアウィンドウsapphirewindowを備えている。参照バッファーにはPBSを使用、各チャンバの容積は140μLであった。BeckmanProteomeLabXL-I分析用超遠心機シリアルPL106C01において4穴AN-60Tiローターを使用して、全てのサンプルを同時に検査する。実施条件をプログラムし、ProteomeLabv5.6を使用して遠心機の制御を行う。該サンプルおよびローターを1時間にわたって熱的に平衡させた後、分析を行う20.0±0.1°C。適切な細胞ローディングの確認を3000rpmで行い、単一のスキャンを各セルに関して記録する。沈降速度条件は以下のとおりである:サンプルセル容積:420mL参照セル容積:420mL温度:20°Cローター回転速度:35,000rpm時間:8:00時間UV波長:280nmラジアルステップサイズ:0.003cmデータ収集:シグナル平均化を伴わずに、ステップ当たり、1データ点スキャン総数:100。完全抗体のLC-MS分子量測定完全抗体の分子量をLC-MSにより分析する。各抗体を約1mg/mLまで水で希釈する。タンパク質マイクロトラップMichromBioresources,Inc,cat004/25109/03を有する1100HPLCAgilent系を使用して、5mgの該サンプルを脱塩し、APIQstarパルサーi質量分析計AppliedBiosystems内に導入する。短い勾配を用いて、該サンプルを溶出する。該勾配は、移動相A0.08FA,0.02TFAHPLC水中および移動相B0.08FAおよび0.02TFAアセトニトリル中で50mL/分の流速で行う。該質量分析計は、2000~3500の質量対電荷比のスキャン範囲で、4.5kボルトのスプレー電圧で操作する。抗体軽鎖および重鎖のLC-MS分子量測定抗体軽鎖LC、重鎖HCおよび脱グリコシル化HCの分子量測定をLC-MSにより分析する。抗体を1mg/mLまで水で希釈し、該サンプルを最終濃度10mMのDTTで37°Cで30分間、LCおよびHCに還元する。該抗体を脱グリコシル化するために、100mgの該抗体を、100mLの合計体積中、2mLのPNGアーゼF、5mLの10N-オクチルグルコシドと共に37°Cで一晩インキュベートする。脱グリコシル化後、該サンプルを最終濃度10mMのDTTで37°Cで30分間還元する。C4カラムVydac,cat214TP5115,S/N060206537204069を有するAgilent1100HPLC系を使用して、該サンプル5mgを脱塩し、APIQstarパルサーi質量分析計AppliedBiosystems内に導入する。短い勾配を用いて、該サンプルを溶出する。該勾配は、移動相A0.08FA,0.02TFAHPLC水中および移動相B0.08FAおよび0.02TFAアセトニトリル中で50mL/分の流速で行う。該質量分析計は、800~3500の質量対電荷比のスキャン範囲で、4.5kボルトのスプレー電圧で操作する。ペプチドマッピング抗体を75mM炭酸水素アンモニウム中の最終濃度6Mの塩酸グアニジンで室温で15分間変性させる。該変性サンプルを最終濃度10mMのDTTで37°Cで60分間還元し、ついで暗所にて37°Cで30分間、50mMヨード酢酸IAAでのアルキル化を行う。アルキル化後、該サンプルを4リットルの10mM炭酸水素アンモニウムに対して4°Cで一晩透析する。該透析サンプルを1mg/mLの10mM炭酸水素アンモニウムpH7.8で希釈し、100mgの抗体をトリプシンPromega,catV5111またはLys-CRoche,cat11047825001で1:20w/wのトリプシン/Lys-C:抗体比にて37°Cで4時間消化する。消化物を1mLの1NHClでクエンチする。質量分析計での検出を用いるペプチドマッピングのために、40mLの該消化物を、Agilent1100HPLC系を用いるC18カラムVydac,cat218TP51,S/NNE960610.3.5上での逆相高速液体クロマトグラフィーRPHPLCにより分離する。該ペプチド分離は、移動相A0.02TFAおよび0.08FAHPLC等級水中および移動相B0.02TFAおよび0.08FAアセトニトリル中を用いる勾配で50mL/分の流速で行う。該APIQSTARPulsari質量分析計は、4.5kボルトのスプレー電圧および800~2500の質量対電荷比のスキャン範囲で正モードで操作する。ジスルフィド結合マッピング該抗体を変性させるために、100mMの該抗体を100mM炭酸水素アンモニウム中の300mLの8MグアニジンHClと混合する。pHが7~8となるようにpHを調べ、該サンプルを、最終濃度6MのグアニジンHCl中、室温で15分間変性させる。該変性サンプルの一部100mLを600mLのMilli-Q水で希釈して、1Mの最終グアニジン-HCl濃度を得る。該サンプル220mgをトリプシンPromega,catV5111,ロット22265901またはLys-CRoche,cat11047825001,ロット12808000で1:50のトリプシンまたはLys-C:抗体w/w比4.4mg酵素:220mgサンプルにて37°Cで約16時間消化する。更に5mgのトリプシンまたはLys-Cを該サンプルに加え、消化を37°Cで更に2時間進行させる。1mLのTFAを各サンプルに加えることにより、消化を停止させる。AgilentHPLC系でC18カラムVydac,cat218TP51S/NNE020630-4-1Aを使用するRPHPLCにより、消化されたサンプルを分離する。該分離は、50mL/分の流速で移動相A0.02TFAおよび0.08FAHPLC等級水中および移動相B0.02TFAおよび0.08FAアセトニトリル中を用いて、ペプチドマッピングに用いたのと同じ勾配で行う。該HPLC操作条件は、ペプチドマッピングに用いたものと同じである。該APIQSTARPulsari質量分析計は、4.5kボルトのスプレー電圧および800~2500の質量対電荷比のスキャン範囲で正モードで操作する。該ペプチドの観察されたMWを、ジスルフィド結合により連結されたトリプシンまたはLys-C処理ペプチドの予想MWと合致させることにより、ジスルフィド結合を帰属する。遊離スルフヒドリル決定抗体における遊離システインを定量するために用いた方法は、特徴的な発色産物5-チオ-2-ニトロ安息香酸TNBを与える、スルフヒドリル基SHとのエルマン試薬5,5¢-ジチオ-ビス2-ニトロ安息香酸DTNBの反応に基づくものである。該反応は、式:DTNBRSH→RS-TNBTNB-Hで示される。Cary50分光光度計を使用して、該TNB-の吸光度を412nmで測定する。2-メルカプトエタノールb-MEの希釈液を遊離SH標準物として使用して、吸収曲線をプロットし、該タンパク質中の遊離スルヒドリル基の濃度を該サンプルの412nmにおける吸光度から決定する。該b-ME標準ストックは、0.142mMの最終濃度までのHPLC等級水での14.2Mのb-MEの系列希釈により調製する。ついで各濃度に関する3通りの標準物を調製する。アミコンウルトラamiconultra10,000MWCO遠心フィルターMillipore,catUFC801096,ロットL3KN5251を使用して抗体を10mg/mLに濃縮し、該バッファーを、アダリムマブに使用される製剤化バッファー5.57mM第一リン酸ナトリウム、8.69mM第二リン酸ナトリウム、106.69mMNaCl、1.07mMクエン酸ナトリウム、6.45mMクエン酸、66.68mMマンニトール、pH5.2、0.1w/vTweenに変更する。該サンプルを振とう機上で室温で20分間混合する。ついで180mLの100mMトリスバッファーpH8.1を各サンプルおよび標準物に加え、ついで10mMリン酸バッファーpH8.1中の300mLの2mMDTNBを加える。十分に混合した後、該サンプルおよび標準物をCary50分光光度計で412nmの吸光度に関して測定する。b-ME標準物のOD412および遊離SHの量をプロットすることにより、標準曲線を得る。ブランクの差し引きの後、この曲線に基づいてサンプルの遊離SH含量を計算する。弱陽イオン交換クロマトグラフィー抗体を10mMリン酸ナトリウムpH6.0で1mg/mLに希釈する。WCX-10ProPac分析用カラムDionex,cat054993,S/N02722と共にShimadzuHPLC系を使用して、電荷不均一性を分析する。該サンプルを、80移動相A10mMリン酸ナトリウム、pH6.0および20移動相B10mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH6.0中の該カラム上にローディングし、1.0mL/分の流速で溶出する。オリゴ糖のプロファイリング抗体のPNGアーゼF処理の後に遊離したオリゴ糖を2-アミノベンズアミド2-AB標識試薬で誘導体化する。順相高速液体クロマトグラフィーNPHPLCにより該蛍光標識オリゴ糖を分離し、既知標準物との保持時間の比較に基づいて種々の形態のオリゴ糖を特徴づけする。まず、N結合オリゴ糖を重鎖のFc部分から切断するために、該抗体をPNGアーゼFで消化する。該抗体200mgを2mLのPNGアーゼFおよび3mLの10N-オクチルグルコシドと共に500mLエッペンドルフチューブ内に配置する。リン酸緩衝食塩水を加えて最終体積を60mLにする。該サンプルを、700RPMに設定されたエッペンドルフサーモミキサー内で37°Cで一晩インキュベートする。アダリムマブのロットAFP04Cも対照としてPNGアーゼFで消化する。PNGアーゼF処理後、該サンプルを、750RPMに設定されたエッペンドルフサーモミキサー内で95°Cで5分間インキュベートして、該タンパク質を析出させ、ついで該サンプルをエッペンドルフ遠心機内に10,000RPMで2分間配置して、該沈殿タンパク質を遠心沈殿させる。該オリゴ糖を含有する上清を500mLエッペンドルフチューブに移し、スピードバックspeed-vac内で65°Cで乾燥させる。Prozymeから購入した2AB標識キットcatGKK-404,ロット132026を使用して、該オリゴ糖を2ABで標識する。該標識試薬を該製造業者の説明に従い調製する。酢酸150mL,キットにおいて提供されているものをDMSOバイアルキットにおいて提供されているものに加え、該溶液を上下に数回ピペッティングすることにより混合する。該酢酸/DMSO混合物100mLを2-AB染料のバイアルに移し使用の直前、該染料が完全に溶解するまで混合する。ついで該染料溶液を還元剤のバイアルキットにおいて提供されているものに加え、十分に混合する標識試薬。該標識試薬5mLを各乾燥オリゴ糖サンプルバイアルに加え、十分に混合する。該反応バイアルを、65°Cおよび700~800RPMに設定されたエッペンドルフサーモミキサー内に2時間の反応時間にわたって配置する。該標識反応後、ProzymeからのGlycoCleanSCartridgescatGKI-4726を使用して過剰の蛍光染料を除去する。該サンプルを加える前に、該カートリッジを1mLのmilli-Q水で洗浄し、ついで5イッシュishの1mLの30酢酸溶液で洗浄する。該サンプルを加える直前に、1mLのアセトニトリルBurdickおよびJackson,catAH015-4を該カートリッジに加える。該アセトニトリルの全てが該カートリッジを通過した後、該サンプルを、新たに洗浄されたディスクの中心にスポットし、該ディスク上に10分間吸着させる。該ディスクを1mLのアセトニトリルで洗浄し、ついで5イッシュの1mLの96アセトニトリルで洗浄する。該カートリッジを1.5mLエッペンドルフチューブ上に配置し、該2-AB標識オリゴ糖を3イッシュ各イッシュにつき400mLのmilliQ水で溶出する。ShimadzuHPLC系に接続されたGlycosepNHPLCcatGKI-4728カラムを使用して、該オリゴ糖を分離する。該ShimadzuHPLC系は、系コントローラ、脱気装置、バイナリーポンプ、サンプル冷却器を伴うオートサンプラー、および蛍光検出器からなる。高温での安定性該抗体の最終濃度を適当なバッファー、界面活性剤、安定剤および/または糖で2mg/mLに調節する。ついで該抗体溶液を濾過滅菌し、0.25mLのアリコートを無菌条件下で調製する。該アリコートを-80°C、5°C、25°Cまたは40°Cで1、2または3週間放置する。該インキュベーション期間の終了時に、該サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEにより分析する。該安定性サンプルを還元性および非還元性の両方の条件下でSDS-PAGEにより分析する。用いる方法は、本明細書に記載されているものと同じである。該ゲルをコロイド性青色染料Invitrogencat46-7015,46-7016で一晩染色し、バックグラウンドが透明になるまでMilli-Q水で脱染する。ついで、EpsonExpressionスキャナーモデル1680,S/NDASX003641を使用して、該染色ゲルをスキャンする。より高い感度を得るために、銀染色キットOwlScientificを使用して、同じゲルを銀染色し、該製造業者により提供される推奨方法を用いる。[実施例2.9]:HEK293-6E細胞におけるトランスフェクションおよび発現該抗hTNFα抗体ベクター構築物をタンパク質産生のために293細胞内にトランスフェクトした。用いた293一過性トランスフェクション法は、Durocherら2002NucleicAcidsRes.302:E9およびPhamら2005Biotech.Bioengineering903:332-44に公開されている方法の変法である。該トランスフェクションにおいて使用した試薬には以下のものが含まれていた。130rpm、37°Cおよび5CO2に設定された加湿インキュベーターにおいて使い捨てエーレンマイヤーフラスコ内で培養されたHEK293-6E細胞EBNA1を安定に発現するヒト胎児腎細胞系;NationalResearchCouncilCanadaから入手。培地:FreeStyle293発現培地Invitrogen12338-01825μg/LゲネチシンG418Invitrogen10131-027および0.1プルロニックF-68Invitrogen24040-032。トランスフェクション培地:FreeStyle293発現培地10mMHEPESInvitrogen15630-080。ポリエチレンイミンPEIストック:直鎖状25kDaPEIPolysciencesを使用して調製され-15°C未満で貯蔵された1mg/mL無菌ストック溶液pH7.0。トリプトン供給培地:FreeStyle293発現培地内のトリプトンN1Organotechnie,19554の5w/v無菌ストック。トランスフェクションのための細胞調製:トランスフェクションの約2~4時間前に、HEK293-6E細胞を遠心分離により集め、生細胞約100万個/mLの細胞密度で培地に再懸濁させた。各トランスフェクションのために、40mLの該細胞懸濁液を使い捨ての250mLエーレンマイヤーフラスコ内に移し、2~4時間インキュベートした。トランスフェクション:トランスフェクション培地およびPEIストックを室温RTに予め加温した。各トランスフェクションに関して、25μgのプラスミドDNAおよび50μgのポリエチレンイミンPEIを5mLのトランスフェクション培地内で一緒にし、室温で15~20分間インキュベートして、DNA:PEI複合体を形成させた。BR3-Igトランスフェクションのために、25μgのBR3-Igプラスミドをトランスフェクションごとに使用した。それぞれの5mLのDNA:PEI複合体混合物を、予め調製された40mLの培養に加え、130rpm、37°Cおよび5CO2に設定された加湿インキュベータに戻した。20~28時間後、5mLのトリプトン供給培地を各トランスフェクションに加え、該培養を6日間継続した。表12は、HEK293-6E細胞における、ミリグラム/リットルとして表された親抗体に関する収量データを含む。全ての抗体がHEK293-6E細胞において良好に発現された。ほとんどの場合、>50mg/Lの精製抗体がHEK293-6E細胞の上清から容易に入手可能であった。本開示は、分子生物学の分野でよく知られた技術の全体を、出典明示により援用するものである。これらの技術には、限定的なものではないが以下の刊行物に記載されている技術が含まれる。Ausubelら編,ShortProtocolsInMolecularBiology4thEd.1999JohnWileySons,NYISBN0-471-32938-X.LuおよびWeiner編,CloningおよびExpressionVectorsforGeneFunctionAnalysis2001BioTechniquesPress,Westborough,MA,298pp.ISBN1-881299-21-X.KontermannおよびDubel編,AntibodyEngineering2001Springer-Verlag,NY,790pp.ISBN3-540-41354-5.OldおよびPrimrose,PrinciplesofGeneManipulation:AnIntroductionToGeneticEngineering3dEd.1985BlackwellScientificPublications,Boston,MA.StudiesinMicrobiology;V.2:409pp.ISBN0-632-01318-4.Sambrookら,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,Vols.1-3ISBN0-87969-309-6.Winnacker,FromGenesToClones:IntroductionToGeneTechnology1987VCHPublishers,NY翻訳:HorstIbelgaufts,634pp.ISBN0-89573-614-4.出典明示による援用本出願の全体にわたって引用されうる全ての引用参考文献文献参照物、特許、特許出願およびウェブサイトを含むの内容の全体を、それらにおいて引用されている参考文献も同様に、あらゆる目的で、参照により本明細書に明示的に組込むこととする。本実施形態の実施は、特に示されていない限り、当技術分野でよく知られている免疫学、分子生物学および細胞生物学の通常の技術を用いる。均等物該実施形態は、その精神または必須特徴から逸脱することなく、他の特定の形態においても実施されうる。したがって、前記実施形態は、全ての点において、限定的なものではなく例示的なものであるとみなされるべきである。したがって、前記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって範囲が示されており、したがって、特許請求の範囲の均等論の意義および範囲内に含まれる全ての変更が本発明に含まれると意図される。"