"患者における腫瘍の脂質生成性を決定するための試験管内法であって、少なくとも1種のモノ-不飽和リン脂質及び少なくとも1種のポリ-不飽和リン脂質の、腫瘍試料対正常な試料における相対的な発現レベルを決定することを含んでなり、かつ、該モノ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける向上及び該ポリ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける低下は、より侵略的な脂質生成性表現型に関する指標である、試験管内法。少なくとも1種の飽和リン脂質の、腫瘍試料対正常な試料における相対的な発現レベルを決定することをさらに含んでなり、かつ、該飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける低下、該モノ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける向上及び該ポリ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける低下は、より侵略的な脂質生成性表現型に関する指標である請求項1に記載の試験管内法。患者における腫瘍の脂質生成性を決定するための試験管内法であって、腫瘍試料及び正常な試料において少なくとも1種のモノ-不飽和リン脂質及び少なくとも1種のポリ-不飽和リン脂質の発現レベルを決定することを含んでなり、かつ、正常な試料と比較される腫瘍試料におけるモノ-不飽和リン脂質対ポリ-不飽和リン脂質の比の増加は、より侵略的な脂質生成性表現型に関する指標である、試験管内法。患者における腫瘍の脂質生成性を決定するための試験管内法であって、患者における腫瘍の脂質生成プロファイルを決定することを含んでなり、かつ、1個もしくは2個の不飽和両アシル鎖を一緒にした中にを有する種における増加ならびに3個より多い不飽和を有するPL種における減少は、より侵略的な脂質生成性表現型に関する指標である、試験管内法。患者における腫瘍の脂質生成プロファイルを決定することをさらに含んでなり、かつ、飽和種における減少、1個もしくは2個の不飽和両アシル鎖を一緒にした中にを有する種における増加ならびに3個より多い不飽和を有するPL種における減少は、より侵略的な脂質生成性表現型に関する指標である請求項4に記載の試験管内法。リン脂質がグリセロリン脂質、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスホイノシチドを含んでなる群から選ばれる請求項1~5のいずれか1つに記載の方法。飽和リン脂質がPC30:0、PC32:0、PC34:0、PC36:0及びPC38:0を含んでなる群から選ばれる飽和ホスファチジルコリン種及び/又はPE36:0及びPE38:0を含んでなる群から選ばれる飽和ホスファチジルエタノールアミン及び/又はPS36:0、PS38:0、PS40:0及びPS42:0を含んでなる群から選ばれる飽和ホスファチジルセリン及び/又はPI34:0、PI36:0及びPI38:0を含んでなる群から選ばれる飽和ホスファチジルイノシチドである請求項2、5又は6のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がPC28:1、PC30:1、PC30:2、PC32:1、PC32:2、PC34:1、PC34:2、PC36:1、PC36:2、PC38:1、PC38:2、PC40:1及びPC40:2を含んでなる群から選ばれる、1個もしくは2個のモノ-不飽和脂肪アシル鎖を有するホスファチジルコリンPCである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がモノ-不飽和ホスファチジルコリンPCPC34:1である請求項1~8のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がPC32:3、PC34:2、PC34:3、PC34:4、PC36:2、PC36:3、PC36:4、PC36:5、PC36:6、PC38:3、PC38:4、PC38:5、PC38:6、PC38:7、PC40:3、PC40:4、PC40:5、PC40:6、PC40:7、PC40:8、PC42:3、PC42:4、PC42:5、PC42:6、PC42:7、PC42:8、PC42:9、PC42:10、PC42:11、PC44:3、PC44:4、PC44:5、PC44:6、PC44:7、PC44:8、PC44:9、PC44:10、PC44:11及びPC44:12を含んでなる群から選ばれるポリ-不飽和ホスファチジルコリンPCである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がPC36:3、PC38:3、PC36:4、PC38:4、PC40:4、PC36:5、PC38:5、PC40:5を含んでなる群から選ばれるポリ-不飽和ホスファチジルコリンPCである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がポリ-不飽和ホスファチジルコリンPC36:4又はPC38:4である請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がPE32:1及びPE34:2を含んでなる群から選ばれる1個もしくは2個のモノ-不飽和脂肪アシル鎖を有するホスファチジルエタノールアミンPEである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がPE36:4、PE38:4及びPE40:4を含んでなる群から選ばれるポリ-不飽和ホスファチジルエタノールアミンPEである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がPS36:2、PS38:2、PS40:2及びPS42:2を含んでなる群から選ばれる1個もしくは2個のモノ-不飽和脂肪アシル鎖を有するホスファチジルセリンPSである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がPS38:4、PS40:4、PS38:5、PS40:5及びPS38:6を含んでなる群から選ばれるポリ-不飽和ホスファチジルセリンPSである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がPI34:1、PI36:1、P38:1、PI34:2、PI36:2及びP38:2を含んでなる群から選ばれる1個もしくは2個のモノ-不飽和脂肪アシル鎖を有するホスファチジルイノシチドPIである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。ポリ-不飽和リン脂質がPI36:4及びPI38:4を含んでなる群から選ばれるポリ-不飽和ホスファチジルイノシチドPIである請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。モノ-不飽和リン脂質がモノ-不飽和ホスファチジルコリンPCPC34:1であり、且つここでポリ-不飽和リン脂質がポリ-不飽和ホスファチジルコリンPCPC36:4及び/又はPC38:4である請求項1~7のいずれか1つに記載の方法。腫瘍が前立腺ガン、乳ガン、肺ガン、結腸ガン、胃ガン、卵巣ガン、子宮内膜ガン、肝臓ガン、食道ガン、膀胱ガン、口腔ガン、甲状腺ガン、膵臓ガン、網膜ガン及び皮膚ガン、好ましくは前立腺ガンを含んでなる群から選ばれる請求項1~19のいずれか1つに記載の方法。侵略的脂質生成性表現型に関する1種もしくはそれより多い他のバイオマーカーの、腫瘍試料対正常な試料における相対的な発現又はリン酸化/活性化を測定することをさらに含んでなり、ここで該1種もしくはそれより多い他のバイオマーカーの相対的な発現における増加、該モノ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける向上及び該ポリ-不飽和リン脂質の相対的な発現レベルにおける低下はより侵略的な脂質生成性表現型の指標である請求項1~20のいずれか1つに記載の方法。侵略的脂質生成性表現型に関する1種もしくはそれより多い他のバイオマーカーがFASN、ACCA、コリンキナーゼ及びACLYから選ばれる請求項21に記載の方法。リン脂質の発現レベルを、ESI-MS/MS又はMALDI-TOF及びMSに基づくリン脂質画像化を含む他の質量分析に基づく方法によるリン脂質の分析を介して決定する請求項1~22のいずれか1つに記載の方法。患者における腫瘍の脂質生成性を決定するための、請求項1~23のいずれか1つに記載の予後的又は予測的試験管内法の使用。分析されるべき試料から単離されるリン脂質のESI-MS/MSあるいは他のMSに基づく試料調製のための試薬を含んでなる、請求項1~23のいずれか1つに記載の試験管内法を実施するためのキット。酸化防止剤、溶媒及び標準を含んでなる請求項25に記載のキット。マイクロ流体チップならびに微小水泡に関する親和性を有するかあるいは微小水泡粒子を結合させることができる分子又は薬剤がコーティングされた表面に微小水泡を固定するためのコーティングされた表面を含んでなる請求項25に記載のキット。該微小水泡に関する親和性を有するかあるいは微小水泡粒子を結合させることができる分子又は薬剤が;抗体種、タンパク質、アプタマー、排泄passageからの微小水泡を選択的に制限する表面及び微小水泡への選択的付着性を有する表面を含んでなる群の1つもしくはそれより多くである請求項25に記載のキット。タンパク質がレクチン又は他の糖結合化合物を含んでなるリストから選ばれる請求項28に記載のキット。レクチンがGNA、NPA、コンカナバリンA又はシアノビリンを含んでなる群から選ばれる請求項29に記載のキット。マイクロ流体チップが請求項26~29において定義されるコーティングされた表面を含む請求項27~30のいずれか1つに記載のキット。以下の実施例は本発明を例示する。これらの実施例を見て、当該技術分野における熟練者は他の態様を思いつくであろう。前立腺ガン細胞における初めからの脂質生成は、ガン細胞中のモノ-不飽和脂肪酸のレベルの向上及びポリ不飽和脂肪酸のレベルの低下と関連する。材料及び方法細胞培養及び処理LNCaP及びCOS-7細胞は、AmericanTypeCultureCollectionManassas,VAから得た。加湿インキュベーター中で37°Cにおいて、10FCSInvitrogen,Carlsbad,CAが補足されたRPMI1640培地中で5CO2/95空気雰囲気を用い、細胞を培養した。形態の検査及び核型決定karyotypingにより、基準とすることauthenticationに関して細胞系を調べた。マイコバクテリウムソランギウムセルロスムmycobacteriumSorangiumcellulosumから精製されたソラフェンAソラフェンは、Dr.KlausGerth及びDr.RolfJansenにより親切に提供されたHelmholtz-ZentrumfuerInfektionsforschung,Braunschweig,GermanyBedorfetal.著,1993年;Gerthetal.著,1994年。2-14C-アセテート導入アッセイ及びTLC分析LNCaP細胞をソラフェン又はビヒクルエタノールで24時間処理した。最後の4時間、培地に2-14C-標識アセテート57mCi/ミリモル;2μCi/皿;AmershamInternational,Aylesbury,UKを加えた。以前に記載されたDeSchrijveretal.著,2003年修正Bligh-Dyer法に従って、脂質を抽出した。種々の脂質の種類への2-14C-アセテートの導入を分析するために、TLC分析を行い、以前に記載された通りにDeSchrijveretal.著,2003年、定量のためのPhosphorImagerスクリーンMolecularDynamics,Sunnyvale,CAに脂質を暴露した。臨床的組織試料clinicaltissuespecimens新しい急速-冷凍されたsnap-frozen前立腺ガン組織及び対抗する正常な試料を、限局性前立腺ガンに関する根治的恥骨後式前立腺摘除術を受けた患者から得た。脂質分析及びウェスターンブロッティング分析に用いられる組織に隣接する領域の組織学的分析により、正常な組織及び腫瘍組織を同定した。全細胞リン脂質、トリグリセリド及びコレステロールの定量小さい修正を有する以前に記載された方法を用いVanVeldhovenandBell著,1988年;VanVeldhovenetal.著,1998年;VanVeldhovenetal.著,1997年、Bligh-Dyer脂質抽出物DeSchrijveretal.著,2003年につきリン脂質、トリグリセリド及びコレステロールの定量を行った。ESI-MS/MSによる無損傷のリン脂質種の分析ESI-MS/MS分析のための脂質抽出物を調製するために、組織又は細胞を1.6mlの0.1NHCl:CH3OH1:1v/v中で均質化した。CHCl30.8ml及び200μg/mlの酸化防止剤、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールSigmaを加えたMilneetal.著,2006年。脂質標準を加えた後、200gにおける5分間の遠心により、有機画分を集めた。試料を蒸発させ、CH3OH:CHCl3:NH4OH90:10:1.25v/v/v中で再構成し、自動操縦ナノフロー/イオン源roboticnanoflow/ionsourceAdvionBiosciencesが備えられたハイブリッド四重極線状イオントラップ質量分析計hybridquadrupolelineariontrapmassspectrometer4000QTRAP系;AppliedBiosystems,FosterCity,CA上で、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析ESI-MS/MSにより脂質を分析した。個々の種の定量のために、系をMRMモードで運転した。データを標準試料未処理の細胞又は対抗する正常な組織に対する倍変化として表わし、HeatmapBuilderソフトウェアCliftonWatt,StanfordUniversity,USAを用いてヒートマップとして示した。結果細胞脂質組成への、腫瘍に関連する初めからの脂質生成の影響を研究するために、我々は高い脂質生成活性を有するLNCaP前立腺ガン細胞を、既知の脂肪酸合成の阻害剤であるソラフェンAで処理したBeckersetal.著,2007年。2-14C-アセテート導入により、脂肪酸合成の阻害及び従って初めからの脂質生成が確証された図1A。続いて主要な無損傷の脂質種のすべてを分析するために、全細胞脂質抽出物をエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析ESI-MS/MSに供した。図1Bに示す通り、個々のホスファチジルコリンPC種において劇的な変化があった。ソラフェン処理は、1不飽和度onedegreeofunsaturationを有するPC種を実質的に4分の1まで減少させたdecreaseduptofour-fold。2個の不飽和を有するPC種は、2個のモノ-不飽和鎖を有する分子ならびに1個の飽和鎖及び1個の二-不飽和鎖を有する分子を示し得るので、ソラフェン処理はこれらの種に不明確な、又は小さい正味の影響を有した。全体的に、より多くの不飽和>3個を有するPC種のレベルは、種に依存して最高で8-倍に増加した。別の脂質生成性前立腺ガン細胞系である22Rv1において脂質生成を阻害する時も、ポリ不飽和へのシフトを検出することができたデータは示されていない。ガン細胞の脂質生成性表現型が生体内におけるリン脂質の飽和の向上とも関連するか否かを評価するために、前立腺腫瘍試料及び正常な対抗する標準組織を、ウェスターンブロット分析により脂肪酸シンターゼFASNの過剰発現に関して分析し、リン脂質プロファイルを記録した。5つの対抗試料腫瘍対標準の中の3つは、腫瘍組織におけるFASNの実質的な過剰発現を示した図2A。ESI-MS/MSによるリン脂質組成の分析は、非-脂質生成性腫瘍と比較して脂質生成性腫瘍において劇的に異なるPCに関するプロファイルを示した図2B。FASN発現の低いレベルを有する腫瘍患者4及び5は、対抗する正常な組織と比較してポリ不飽和種における全体的な増加及びモノ-不飽和種における減少を有した。しかしながら、増加したFASN発現を有する腫瘍患者1、2及び3は逆を示した:対抗する正常な組織と比較して、腫瘍組織においてモノ-不飽和アシル鎖における一貫した増加及びポリ不飽和種における減少があった図2B。これらのデータは、脂質生成阻害剤ソラフェンを用いる我々の発見を支持し、腫瘍に関連する脂質生成がヒト腫瘍におけるリン脂質の飽和を向上させるという生体内の証拠を与える。結論要するに、これらのデータは、ガン細胞における初めからの脂質生成が細胞に飽和及びモノ-不飽和アシル鎖を与え、それは細胞に膜成分を補充し、同時にリン脂質の相対的な飽和度、特にホスファチジルコリンPCのそれを向上させることを示している。前立腺ガン細胞における初めからの脂質生成の調節は、より侵略的な脂質生成性表現型に関連する多くのパラメーターに影響する。材料及び方法細胞培養及び処理実施例1を参照されたい。ESI-MS/MSによる無損傷のリン脂質種の分析実施例1を参照されたい。パルミチン酸救済rescue実験の場合、以前に記載された通りにBrusselmansetal.著,2005年パルミチン酸Sigma,St.Louis,MOを脂肪酸非-含有ウシ血清アルブミンBSAInvitrogen,Carlsbad,CAに錯体化させた。脂質過酸化生成物アッセイ等量の細胞を氷-冷PBS中でこすり取り、氷上に15分間保ち、次いで音波処理した10発10bursts。3,000gにおける10分間の遠心の後、脂肪酸過酸化物分解から生成するマロンジアルデヒド及び4-ヒドロキシアルケナールの量を定量する脂質過酸化アッセイキットOxfordBiomedicalResearch,Oxford,MIを用いて上澄み液を分析した。CD36-結合アッセイLNCaP細胞を、ソラフェン及び/又はパルミチン酸の存在下又は不在下で72時間培養した。細胞をH2O2300μMに30分間暴露した。細胞をトリプシン処理し、CellTrackerDyeOrangeCMRAC34551で標識した。標識されたLNCaP細胞1.5x105を、続いて、ガラスのカバースライド上で培養され、CD36-コード構築物pCD36又は対応する空ベクターpEF-BOS両方ともR.Thorne,UniversityofNewcastle,Australiaにより親切に提供されたを用いてトランスフェクションされたCOS-7細胞の単層の上に層化したlayered。細胞を1mlのRPMI培地中で37°Cにおいて1時間共-培養した。広範囲に洗浄した後、培養物を固定し、画像化した。AdobePhotoshopソフトウェアSanJose,CAを用い、CellTrackerDyeの蛍光シグナルを測定した。フリップ-フロップ速度及びドキソルビシン堆積の決定ドキソルビシンのフリップ-フロップ速度の測定のために、細胞をソラフェン又はビヒクルで72時間処理した。処理の最後の24時間の間、10μMのNBD-ホスファチジルエタノールアミンNBD-PE;Invitrogenを加えた。トリプシン処理により細胞を収穫する1時間前に、ベラパミルを100μMの濃度で加えた。原形質膜を横切るドキソルビシンフリップ-フロップ速度を、ドキソルビシンによるNBD-PEのクエンチングの故のNBDの蛍光における減少として測定したRegevetal.著,2005年詳細に関し、補足的方法SupplementalMethodsを参照されたい。細胞内ドキソルビシン堆積を視覚化するために、ドキソルビシンを10μMの最終的な濃度で加えた。30分後、蛍光顕微鏡検査515nm長波長パス発光フィルターlongpassemissionfilter及びLIDAソフトウェアLeicaMicrosystemsGmbHを用い、細胞を分析した。ドキソルビシン堆積を蛍光測定により測定するために、細胞を10μMのドキソルビシンに30分間暴露し、PBS中で洗浄し、50エタノールv:v中の0.3MHCl中でライシスし、700gで5分間遠心した。ドキソルビシンの蛍光を、490nmの励起波長及び580nmの発光波長で測定した。示されている場合は、培地にパルミチン酸を補足した。細胞死アッセイソラフェン及び/又は他の化合物に暴露してから示される時間の後に、トリプシン処理及び遠心により、付着細胞及び浮遊細胞を集め、両方の細胞集団を合わせた。以前に記載されたDeSchrijveretal.著,2003年トリパンブルー色素排除アッセイを用い、生存細胞及び死細胞をカウントした。統計的分析Tukeyポストホックテストを用いる一元ANOVAone-wayANOVAにより結果を分析した。P-値<0.05は、統計的に有意であると考えられた。与えられるすべてのデータは、図の凡例に示される通り、平均±SEを示す。結果ガン細胞における初めからの脂肪酸合成の調節は、細胞膜の脂質過酸化への感受性susceptibilityに影響する。飽和及びポリ不飽和アシル鎖は、それらの構造的及び生理化学的性質の点で劇的に異なる。重要な差の1つはそれらの過酸化への感受性である。この過程において、フリーラジカルは細胞膜中の脂質から電子を抽出し、それは酸化された脂質種の生成を生ずる。これらの脂質種は重要な生物学的機能を有し、究極的にマロンジアルデヒドMDA及び4-ヒドロキシアルケナールを含むもっと小さい反応性生成物に分解され得、それらは高レベルで発現されると細胞損傷を引き起こし得るDeiningerandHermetter著,2008年;RabinovichandRipatti著,1991年;Schneideretal.著,2008年。メチレンCH2基中の二重結合の間の水素は特に反応性なので、ポリ不飽和アシル鎖はもっとずっと過酸化を受け易い。ガン細胞における初めからの脂肪酸合成の調節が、細胞膜のリン脂質における飽和及びポリ不飽和アシル鎖の間のバランスに影響するという我々の発見に基づき、我々は、この代謝経路の調節がラジカル-誘導脂質過酸化へのガン細胞の感受性に影響するか否かを評価した。LNCaP細胞をソラフェンで3日間処理し、次いでH2O2に暴露した。脂質過酸化の生成物を測色法により測定した。ソラフェン処理は脂質過酸化生成物のレベルを有意に増加させ図3、それはソラフェン処理を用いて観察されるリン脂質のポリ不飽和へのシフトと一致する。より高いレベルのフリーラジカルを生ずる外因性H2O2を用いる処理は過酸化生成物のさらなる増加を誘導し、ソラフェンが増感効果を媒介することを示している。興味深いことに、培地に外因性パルミチン酸を補足することによる飽和アシル鎖の部分的な補充は、これらの変化を大きく逆転させ、強化される脂質生成が、リン脂質ポリ不飽和化の程度を制限することにより、ガン細胞を脂質過酸化に対してより感受性でなくするという考えを支持している。初めからの脂肪酸合成は、ガン細胞のCD36-媒介細胞認識に影響する。細胞膜中の酸化されたリン脂質はコンホメーション変化を経、それは酸化されたアシル鎖が疎水性膜の内部から極性水性環境中に突き出ることを強制し、極性水性環境においてそれらは内在性パターン認識リガンドとして機能することが知られているHazen著,2008年。露出細胞表面の酸化されたリン脂質、特に酸化されたPC種は、スカベンジャー受容体CD36により認識され得る。この受容体は、例えば宿主組織のサーベイランスsurveillance及び損傷を受けた細胞、老化した細胞又はアポプトシス細胞apoptoticcellのクリアランスに含まれる先天性免疫細胞上で発現される。我々は、ガン細胞における初めからの脂質生成の阻害がリン脂質のポリ不飽和の程度及びそれらの過酸化に対する感受性を向上させることを決定したので、我々は脂質生成の調節がCD36-陽性細胞によるガン細胞の認識に影響するか否かを調べた。ソラフェンの存在下又は不在下で培養されたLNCaP細胞を、CD36-発現構築物pCD36又は空ベクターpEF-BOSを用いてトランスフェクションされたCOS細胞上に重ねて置いたThorneetal.著,1997年。広範囲の洗浄の後、結合LNCaP細胞をカウントした。図4Aに示される通り、ソラフェン処理及び続く単時間のH2O2への暴露は、実質的にCD36-結合LNCaP細胞の数を増加させた。外因性パルミチン酸の添加は、これらの影響を妨害した。これらの発見は、腫瘍-関連脂質生成が、膜リン脂質の飽和度、特にPCのそれを高めることにより、細胞表面上における酸化されたポリ不飽和種の露出を制限することを示唆している。この反応はCD36-陽性細胞による腫瘍細胞の認識を最小にし得、おそらく免疫系からの脂質生成性ガン細胞の逃避を助長し得るHazen著,2008年。初めからの脂質生成は、酸化的ストレス-誘導細胞死へのガン細胞の感受性を決定する。酸化されたリン脂質及びそれらの分解生成物が、細胞アポプトシスの誘導において重要な役割を果たすという証拠が増加しつつあるDupertuisetal.著,2007年;FruhwirthandHermetter著,2008年;Tangetal.著,2002年;Westetal.著,2004年。従って我々は、初めからの脂質生成の調節が酸化的ストレス-誘導細胞死へのガン細胞の感受性に影響するか否かを調べた。本来のLNCaP細胞はH2O2-誘導細胞死に十分に抵抗性であったが、ソラフェンを用いる予備処理は、トリパンブルー染色により示される通り、H2O2に反応してのそれらの死を顕著に増加させた図4B。これらの影響は、外因性パルミチン酸により妨害された。興味深いことに、培地に飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸の混合物を補足すると、救済効果はずっと顕著でなくなった。全体的にこれらのデータは、脂質生成の増加が細胞膜の飽和の程度を変えることにより、ガン細胞を酸化的ストレス-誘導細胞死から保護するという考えを支持する。腫瘍-関連脂肪酸合成は通常の化学療法薬の吸収及びそれへの反応に影響する。膜脂質組成の調節は、脂質過酸化へのその影響の他に、膜成分の移動性に大きな影響を有することが知られているRabinovichandRipatti著,1991年;StillwellandWassall著,2003年。フリップ-フロップとも呼ばれる膜成分の横方向の移動性は、それが特異的な輸送物質により助長されなければ、低い速度で起こる。しかしながら、通常用いられる化学療法薬、例えばドキソルビシンを含むある外因性化合物の場合、受動的フリップ-フロップは細胞中への侵入の主要な機構であるRegevetal.著,2005年。外因性ポリ不飽和脂肪酸を用いる細胞の処理はドキソルビシンの吸収を促進することが知られているのでDaviesetal.著,1999年、我々は、脂肪酸合成の阻害が膜フリップ-フロップ及びドキソルビシン吸収を促進するか否かを決定した。ドキソルビシンのフリップ-フロップを測定するために、ソラフェン又はビヒクルに暴露されたLNCaP細胞を7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールホスファチジルエタノールアミンNBD-PE、蛍光標識されたリン脂質で処理し、それは原形質膜の両リーフレット中に導入される。ドキソルビシンの添加の後、NBD蛍光の急速なクエンチングがあり、それは外側のリーフレット中のリン脂質とのドキソルビシンの会合により起こる。ドキソルビシンが内側のリーフレットに移動すると共に、さらなるNBDのクエンチングが観察されるRegevetal.著,2005年。NBDクエンチングの監視は、ソラフェンがドキソルビシンのフリップ-フロップ速度における6-倍の増加を誘導することを示した図5A。P-糖タンパク質阻害剤であるベラパミルの存在下で類似の結果が得られたので、これらの影響は、ドキソルビシンのような疎水性分子を細胞から汲み上げるP-糖タンパク質の間接的な影響により引き起こされたのではなかった図5A。細胞抽出物の蛍光顕微鏡検査及び蛍光測定分析により評価される通り、向上したフリップ-フロップ速度にはドキソルビシンの細胞内堆積における有意な増加が伴った図5B。外因性パルミチン酸の添加は、ソラフェンの影響を妨害した図5B。ソラフェン処理はLNCaP細胞をドキソルビシンの細胞毒性効果に対して顕著に増感し、それはソラフェン-処理細胞におけるドキソルビシンの堆積の増加及び細胞死へのそれらの感受性の向上と一致した。標準的な培養条件下で生育されたLNCaP細胞はドキソルビシン-誘導細胞死に十分に抵抗性であったが4μMにおいて8の細胞死図5C、単独で細胞の最高で20において死を誘導するソラフェンを用いる予備処理は、細胞死の率を約50に増加させた。この有力な効果は、CombinationIndexCI法ChouandTalalay著,1984年を用いて評価すると、相乗的であった。ドキソルビシン/ソラフェンの調べられたすべての比80:1;40:1;20:1及び10:1において、CI値は1より小さかった。パネルC実験において用いられた組み合わせ4μMドキソルビシン、100nMソラフェンは強く相乗的であった0.1<CI<0.3データは示されていない。外因性パルミチン酸の添加はこれらの影響を妨害し、細胞を死から大きく救済した図5C。前立腺ガン細胞系22Rv1を用いて類似の結果が得られたデータは示されていない。ひとまとめにすると、これらのデータは、ガン細胞における初めからの脂質生成が化学療法薬の吸収に影響し、これらの薬剤へのガン細胞の反応を調節することを示している。議論まとめると、実施例1及び2からの発見は、初めからの脂質生成の活性化により、ガン細胞はそれらの脂質供給の点でより自律性となり、同時にそれらの脂質組成を飽和の向上に向けてシフトさせること示している。さらに、該腫瘍-関連脂質生成はガン細胞に有意な利点を与え、それは、ガン細胞が発ガン性-及び治療薬-媒介の両方の障害にもかかわらずに生き残るのをそれが助けるからである。従って、リン脂質プロファイリングは、リン脂質飽和の決定に基づき、脂質生成性、より侵略的且つ耐性の腫瘍を同定することを可能にする。広範囲の患者のグループにおけるPC、PE、PS及びPIプロファイルを利用するリン脂質プロファイリング組織収集前立腺腫瘍組織及び対抗する正常な試料を、限局性前立腺ガンに関する根治的恥骨後式前立腺摘除術を受けた14人の患者から得た。直径が6又は8mmのパンチ生検器具を用いて前立腺組織試料を採取した。試料を液体窒素中で急速-冷凍し、脂質、タンパク質及びRNA抽出のために-80°Cで保存した。Tissue-TekOCTMilesInc,Westhaven,CT中に包埋された組織に隣接する領域の組織学的分析により、正常な組織及び腫瘍組織を同定した。連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン染色のために加工した。ガン試料をそれらのグリーソンスコアに関して評価し、それらが含有するガンのパーセンテージを見積もった。DNA濃度の決定DNA濃度の決定を用い、脂質分析に用いられる試料に加えられる標準及びランニング溶液runningsolutionの量を標準化した。試料を音波処理し、ホモジナイゼーション緩衝液5x10-2MNa2HPO4/NaH2PO4緩衝液pH7.4;2MNaCl及び2x10-3MEDTA中で希釈した。ニシン精子DNAPromega,Madison,WI;0-5μgDNA/125μlを用い、ホモジナイゼーション緩衝液中の種々の希釈液を作ることにより、標準曲線を作成した。次に、試料を37°Cで1時間インキュベーションし、ライシスを増進させた。その後、2μg/mlのHoechst33258試薬Calbiochem,LaJolla,CAを加えた。蛍光計FluostarSLT,BMGLabtech,Offenburg,Germanyを用いて試料及びニシン精子DNAのDNA含有量を測定した。励起:355nm;発光:460nm。各試料のDNA含有量を、標準曲線のデータに基づいて計算した。脂質抽出Dounceホモジナイザーを用い、800μlのPBS中で約40mgの組織を均質化することにより、試料の脂質抽出物を作った。100μlのアリコートをDNA分析のために取っておいた。残る700μlを、テフロンの内張りを有するガラス管に移し、900μlの1NHCl:CH3OH1:8v/v、800μlのCHCl3及び500μgの酸化防止剤2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールBHTSigma,St.Louis,MOを加えた。最初の試料のDNAの量に基づいて適した脂質標準を加えたDNAのmg当たりに:150ナノモルのPC26:0;50ナノモルのPC28:0;150ナノモルのPC40:0;75ナノモルのPE28:0;8.61ナノモルのPI25:0及び3ナノモルのPS28:0。回転振盪機中における5分間の混合及び相分離4°Cでの5分間の17300gにおける高速遠心の後、ガラスパスツールピペットを用いて下部の有機画分を集め、SavantSpeedvacspd111vThermoFisherScientific,Waltham,MAを用いて蒸発させた。残る脂質ペレットを-20°Cで保存した。質量分析質量分析MSのために、脂質ペレットを、最初の組織試料のDNAの量に依存してDNAの1μg当たりに1μlのランニング溶液ランニング溶液CH3OH:CHCl3:NH4OH;90:10:1.25,v/v/v中で再構成した。自動的試料注入のためのAdvionTriVersa自動操縦ナノフロー/イオン源装置AdvionBiosciences,Ithaca,NYが備えられたハイブリッド四重極線状イオントラップ質量分析計4000QTRAP系;AppliedBiosystems,FosterCity,CA上で、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析ESI-MS/MSによりPL種を分析した。測定の前に、試料をランニング溶液中で希釈した。ホスファチジルコリンPC、ホスファチジルセリンPS及びホスファチジルイノシトールPI種の測定のために1/30の希釈を用いた。ホスファチジルエタノールアミンPE種の分析のために、1/3希釈を用いた。それぞれPC、PE、PI及びPS種に関し、前駆体prec.184のために50eV、中性脱離neutrallossnl.141のために35eV、nl.87のために-40eV及びprec.241のために-55eVの衝突エネルギーにおいて、正及び負のイオンスキャンモードでPLプロファイルを記録した。個々の種の定量のために、系をMRMモードで運転した。典型的には、各スペクトルのために3分間のシグナル平均化signalaveragingを用いた。炭素同位体効果に関してデータを集め、同じPL群の測定可能な全PL種に対するofパーセンテージとして表わす。同じ群の測定されたリン脂質の合計量に対する0.1より多くの割合になるPL種のみをグラフ中に示す。クラスター分析Cluster3.0ソフトウェア[Eisen,M.B.,P.T.Spellman,P.O.Brown,andD.Botstein著,Clusteranalysisanddisplayofgenome-wideexpressionpatterns.ProcNatlAcadSciUSA,9525:1998年,p.14863-8.]のセントロイドリンケージクラスタリングアルゴリズムcentroidlinkageclusteringalgorithmを用いることにより、クラスタリング分析を行った。JavaTreeView1.1.5.ソフトウェア[Saldanha,A.J.著,JavaTreeview-extensiblevisualizationofmicroarraydata.Bioinformatics,2017:2004年,p.3246-9]を用いてクラスタリングの結果を視覚化した。結果腫瘍試料の特性ガン組織対正常な組織における、ならびに個々の患者の腫瘍組織の間におけるPLプロファイルにおける変化を研究するために、限局性前立腺ガンに関する根治的恥骨後式前立腺摘除術を受けた14人の前立腺ガン患者から、約40mgの前立腺腫瘍組織及び隣接する正常な前立腺組織を得た。組織学的検査によりにより、すべての腫瘍組織を、少なくとも80パーセントの腫瘍組織を含むと確認した。リン脂質プロファイリング法の最適化無損傷のPL種を調べるために、我々はProf.R.DeruaandProf.E.WaelkensDepartmentofMolecularCellBiology,K.U.leuvenと共同して社内でinhouse開発された質量分析に基づく方法を用いた。この方法はBrueggeretal[Brugger,B.,G.Erben,R.Sandhoff,F.T.Wieland,andW.D.Lehmann著,Quantitativeanalysisofbiologicalmembranelipidsatthelowpicomolelevelbynano-electrosprayionizationtandemmassspectrometry.ProcNatlAcadSciUSA,946:1997年.p.2339-44]及びMilneetal[Milne,S.,P.Ivanova,J.Forrester,andH.AlexBrown著,Lipidomics:ananalysisofcellularlipidsbyESI-MS.Methods,392:2006年,p.92-103]により記載された案に基づいており、それを自動的試料注入のためのTriversa自動操縦ナノフロー/イオン源装置が備えられたABI4000QTRAP質量分析計上で用いるために適応させた。この案は培養された細胞のPL分析用に開発されたので、我々はそれを臨床試料について用いるために適応させた。要するに、開始材料の量を変えることにより、及びDounceホモジナイゼーション用に方法を修正するストロークstrokeの数ことにより、ホモジナイゼーション法を最適化した。MS法は、脂質抽出物の希釈を変えることにより、最適化された。前立腺ガン組織及び対抗する正常な組織のリン脂質プロファイリングショットガン法において全脂質抽出物から直接、リン脂質の個々の種類を検出するために、タンデム質量分析MS/MSにおいて種々の前駆体イオン及び中性脱離スキャンを行った。この方法は、脂質の特別な種類に焦点を当てることを可能にし、スペクトルの複雑性を軽減し、ベースラインノイズを除去する。4つの主要なPLの種類:PC、PE、PS及びPIを分析した。PC種は正のイオンモードで、MS/MSモードにおける断片化の後のホスホコリン頭部基ピークに対応するm/z184に関する前駆体スキャンにおいて、検出された。PE種は正のイオンモードで、ホスホエタノールアミンのnl.に対応するイオンを与える衝突-誘導分解により検出された。PS及びPIは負のイオンモードスキャンで、それぞれnl.87及びprec.241に関して測定された。種の定量は、最も豊富なPL種に焦点を当てた同位体修正の後に、多重反応モニタリングMRMモードで行われた。不飽和度の最適な同定のために、脂質種の数を絶対値で表わさず、むしろリン脂質の1つの種類例えばPC内のすべての測定可能な種に対するパーセンテージとして表わした。イオン化効率における差の故の誤差を避けるために、パーセンテージにおける差を、対抗する正常な組織と比較されるガン組織における値の比として示した。両方向増加及び減少における差を平等にするequalizeために、log2スケールを用いた。背景ノイズの故の誤差を避けるために、1つのPL群のすべての種の合計強度に対する0.1より低い割合となる種は、勘定に入れなかった。14人の前立腺ガン患者からのPL種における前立腺腫瘍対正常な前立腺組織での相対的な変化を決定した。14人の患者中の13人において、PLプロファイルにおける顕著な差が観察された。興味深いことに、種々の患者の中で種々の変化のパターンが観察されたデータは示されていない。いくつかの変化例えばPS40:8における増加はすべての患者において観察された。ほとんどの他の変化は、患者の特定のサブセットに限られた例えばPE38:0における増加。種々の患者の間のPLプロファイルにおける差及び類似性をより明らかにするために、クラスター分析を行った。これは周期的変化recurrentchangesを明らかにし、患者を2つの主要なグループに分けた。図6は、調べられたリン脂質種のそれぞれに関する平均増加/減少log2を示す。クラスターA図6A患者3、4、5、6、7、9、10、11及び13は、完全に飽和したPL種における顕著な減少、1個もしくは2個の不飽和両アシル鎖を一緒にした中にを有する種における増加及び3個より多い不飽和を有するPL種における減少を特徴とする。このパターンはPC画分において最もあからさまであり、それは脂質生成スイッチにより大部分が説明され得るので、それを脂質生成プロファイルと呼ぶ下記を参照されたい。クラスターB図6B患者1、2、8及び14は、脂質生成プロファイルのない腫瘍を含有する。患者12は、腫瘍と正常な組織の間でPLプロファイルにおいてほとんど変化を示さず、クラスターA又はB内に分類され得ない。"