"最終混合物中の生物学的製剤の濃度を増進または増加させるための方法であって、前記生物学的製剤は、1つ以上の選択された特徴を有し、前記方法は、a前記選択された特性を伴う、および伴わない生物学的製剤の初期混合物が、クロマトグラフィ媒体に接触することを可能にすることであって、前記初期混合物中の生物学的製剤の数量は、前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超える、可能にすることと、b前記1つ以上の選択された特性を持たない生物学的製剤が、前記クロマトグラフィ媒体によって分離されることを可能にすることと、c前記クロマトグラフィ媒体から生物学的製剤の最終混合物を回収することであって、前記最終混合物は、前記初期混合物中の生物学的製剤の濃度と比較して、1つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の増進または増加した濃度を含む、回収することと、を含む、方法。前記クロマトグラフィ媒体は、aイオン交換媒体、bアニオン交換媒体、cカチオン交換媒体、dヒドロキシアパタイト媒体、e疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体、f抗体親和性媒体、g免疫グロブリンFc領域親和性媒体、hリガンド親和性媒体、i受容体親和性媒体、j混合モード媒体、k任意の順序で連続的に行われるaからjのうちのいずれか2つ以上の使用、から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力は、a10以上、b20以上、c30以上、d40以上、e50以上、f100以上、g200以上、h500以上、およびi1000以上、から成る群より選択される量だけ超えられる、請求項1に記載の方法。前記クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力は、a1.5倍以上、b2倍以上、c3倍以上、d4倍以上、e5倍以上、f6倍以上、g7倍以上、h8倍以上、i9倍以上、j10倍以上、k20倍以上、l30倍以上、m40倍以上、n50倍以上、o100倍以上、およびp500倍以上、から成る群より選択される量だけ超えられる、請求項1に記載の方法。前記初期混合物中の生物学的製剤の量と比較した、前記最終混合物中の生物学的製剤の量は、a約10から約80回収された、b約20から約60回収された、c約30から約60回収された、d約30から約50回収された、e約35から約50回収された、f約35から約45回収された、g約40から約45回収された、h約40から約50回収された、i約45から約50回収された、j約10回収された、k約15回収された、l約20回収された、m約25回収された、n約30回収された、o約35回収された、p約40回収された、q約45回収された、r約50回収された、s約55回収された、t約60回収された、u約65回収された、v約70回収された、w約75回収された、およびx約80回収された、から成る群より選択される量である、請求項1に記載の方法。1つ以上の選択された特性を伴う前記生物学的製剤の濃度は、前記生物学的製剤の初期混合物と比較して、a少なくとも約5、b少なくとも約10、c少なくとも約20、d少なくとも約30、e少なくとも約40、f少なくとも約50、g少なくとも約60、h少なくとも約70、i少なくとも約80、およびj少なくとも約90、から成る群より選択される量だけ増加または増進させられる、請求項1に記載の方法。前記選択された特性または複数の特性は、a設定pH値における正味負電荷の程度、b設定pH値における正味正電荷の程度、c疎水性の程度、d親水性の程度、e炭水化物含量の数量および/または種類、fN結合型糖鎖付加含量の数量および/または種類、gO結合型糖鎖付加含量の数量および/または種類、h全シアル酸含量、およびiaからhのうちのいずれか1つ以上、から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記生物学的製剤は、aタンパク質、b抗体またはその断片、c細胞外受容体リガンド結合ドメインを含む、ポリペプチドd受容体リガンド、e異種融合タンパク質、f免疫グロブリンFc領域を含む、融合タンパク質、およびg細胞外受容体リガンド結合ドメインと、免疫グロブリンFc領域とを含む、融合タンパク質、から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。前記方法はさらに、製造規模で前記生物学的製剤の回収を含む、請求項1から8のうちのいずれか1項に記載の方法。前記方法はさらに、治療的に有用な生物学的製剤の回収を含む、請求項8に記載の方法。少なくとも部分的に、以前の方法は、不純物および望ましくない生成物形態またはアイソフォームが吸収剤に結合し、望ましい生成物がカラム貫流の中で収集される、貫流動作モードを説明するため、本発明は、前述の方法とは異なる。少なくとも部分的に、本方法は、生物学的製剤が、クロマトグラフィ媒体または他の基質の静的または動的結合能力を超える濃度または量で、クロマトグラフィ媒体または他の基質に接触することを許可される、過負荷結合および溶出動作モードを利用するため、本発明は、前述の方法と比べた改良である。これは、本発明の過負荷および結合部分を構成する。過負荷および結合ステップ中に、選択された特性高い全体正味負電荷または高いシアル酸含量等を有する生物学的製剤が、優先的にクロマトグラフィ媒体または他の基質に結合する一方で、選択された特性を持たない、またはより低い全体正味負電荷、またはより低いシアル酸含量を有する生物学的製剤等の選択された特性をあまり持たない生物学的製剤ならびに他の不純物は、媒体または基質から除外または分離される。過負荷および結合ステップの後に、結合された標的生成物が、クロマトグラフィ媒体または他の基質から溶出されあるいは別様に解離または分離され、回収される。したがって、得られる生物学的製剤混合物は、過負荷結合および溶出精製ステップの適用前の生成物の混合物と比較して、選択された標的特性を有する、より高い濃度の生成物で富化されている。本発明の方法は、任意の数の物理的、生物学的、および/または化学的特性に基づいて、生物学的製剤の分離/精製に適合および適用することができる。例えば、適切な吸着材例えば、電荷に基づいた分離のための強または弱アニオンまたはカチオン交換樹脂、および疎水性に基づく分離のための疎水性吸着材等を使用することによって、生成物アイソフォームが、電荷および/または疎水性に基づいて選択的に分離されてもよい。加えて、本発明の方法は、2つの直交生成物属性例えば、電荷および疎水性に基づく分離のための混合モードクロマトグラフィ混合モード媒体を使用して適用されてもよい。一実施形態では、生成物は、例えば、ピーク生成物pI値に基づいて、選択的に富化/分離されてもよく、例えば、より高いpIのアイソフォームは、より低いpIから分離されてもよく、カチオン交換吸着材上の脱アミド化生成物アイソフォームである。一実施形態では、本発明は、生物学的製剤アイソフォームまたは糖型を選択的に富化するために有用であり、選択された、または所望の生成物特性は、シアル酸含量の増加または増進した全体全レベルを有するものである。一実施形態では、全生成物の濃度がクロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超えるように、生物学的製剤の混合物でアニオン交換クロマトグラフィ媒体例えば、TMAEHiCapに過負荷をかけることによって、増加した全シアル酸含量を伴う生物学的製剤が得られる。過負荷を受けた望ましくない生成物例えば、より低いシアル酸含量を伴う生成物、および他の不純物は、クロマトグラフィ媒体を貫流することを許可され、次いで、高シアル酸含量を伴う選択された結合生成物が溶出されるあるいは別様にクロマトグラフィ媒体から分離または解離される。本発明の実施形態は、多種多様な生物学的製剤の高度に均質の混合物を得るために有用である。そのような生物学的製剤のいくつかの実施例は、制限なく、タンパク質およびタンパク質断片すなわち、全長および部分長ポリペプチド/ペプチド、抗体免疫グロブリン、異種融合タンパク質等を含む。一実施形態では、本発明の方法は、免疫グロブリンまたはそのドメイン、領域、断片と融合された非免疫グロブリンタンパク質またはその断片の分離/精製に使用されてもよい。一実施形態では、例えば、本発明の方法は、免疫グロブリンのFc領域IgG分子のFc領域等と結合されたすなわち、融合された細胞外受容体リガンド結合ドメインを含む、融合タンパク質の分離/精製に使用される。本発明の方法が適用されてもよい、抗体融合タンパク質例えば、Fc融合タンパク質は、当技術分野で周知であり、例えば、AntibodyFusionProteins,editedbyStevenM.CharnowAviAshkenazi,Wiley-Liss,Inc.,USA1999ISBN0-471-18358-X;およびSolubleFcFusionProteinsforBiomedicalResearchbyMeg.L.Flanaganetal.inMethodsinMolecularBiology:MonoclonalAntibodies:MethodsandProtocols,378:33-522007,editedbyM.Albitar,HumanaPressInc.USADOI:10.1007/978-1-59745-323-3_3を参照されたい。本発明の方法が適用されてもよい、Fc融合タンパク質のいくつかの具体的実施例は、制限なく、例えば、Fungetal.,米国特許第7,294,481号2007年11月13日発行;Drapeauetal.,米国特許第7,300,773号2007年11月27日発行;およびRylletal.,米国特許第6,528,286号2003年3月4日発行で説明されているもの等を含む。本発明の実施形態は、制限なく、最終混合物中の生物学的製剤の濃度を増進または増加させるための方法を含み、該生物学的製剤は、1つ以上の選択された特徴を有し、該方法は、a選択された特性を伴う、および伴わない生物学的製剤の初期混合物が、クロマトグラフィ媒体に接触することを可能にすることであって、該初期混合物中の生物学的製剤の数量は、該クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力を超える、可能にすることと、b該1つ以上の選択された特性を持たない生物学的製剤が、該クロマトグラフィ媒体から解離または分離されることを可能にすることと、c該クロマトグラフィ媒体から生物学的製剤の最終混合物を回収することであって、該最終混合物は、該初期混合物中の生物学的製剤の濃度と比較して、1つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の増進または増加した濃度を含む、回収することと、を含む。本発明の実施形態は、任意の既知である、あるいは後に開示または開発される、クロマトグラフィ媒体または基質の使用を含む。そのような媒体の実施例は、制限なく、イオン交換媒体、アニオン交換媒体、カチオン交換媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体、抗体親和性媒体例えば、タンパク質Aまたはその変異形、免疫グロブリンFc領域親和性媒体例えば、Fc受容体親和性媒体、およびリガンド親和性媒体、受容体親和性媒体、および混合モード媒体を含む。本発明の実施例は、クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力が、10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、100以上、200以上、500以上、および1000以上超えられる、方法を含む。本発明の実施形態は、該クロマトグラフィ媒体の結合能力または動的結合能力が、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、100倍以上、および500倍以上超えられる、方法を含む。本発明の実施形態は、初期混合物中の生物学的製剤の量と比較した、最終混合物中で回収される生物学的製剤の量は、約10から約80回収された、約20から約60回収された、約30から約60回収された、約30から約50回収された、約35から約50回収された、約35から約45回収された、約40から約45回収された、約40から約50回収された、約45から約50回収された、約10回収された、約15回収された、約20回収された、約25回収された、約30回収された、約35回収された、約40回収された、約45回収された、約50回収された、約55回収された、約60回収された、約65回収された、約70回収された、約75回収された、および約80回収された、方法を含む。本発明の実施形態は、1つ以上の選択された特性を伴う生物学的製剤の濃度が、生物学的製剤の初期混合物と比較して、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、および少なくとも約90増加または増進させられる、方法を含む。本発明の実施形態は、選択された特性または複数の特性が、設定pH値における正味負電荷の程度、設定pH値における正味正電荷の程度、疎水性の程度、親水性の程度、炭水化物含量の数量および/または種類、N結合型糖鎖付加含量の数量および/または種類、O結合型糖鎖付加含量の数量および/または種類、全シアル酸含量のうちのいずれか1つ以上を含む、方法を含む。本発明の実施形態は、生物学的製剤が、タンパク質、抗体またはその断片、細胞外受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、受容体リガンド、異種融合タンパク質、免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質、細胞外受容体リガンド結合ドメインおよび免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質を含む、方法を含む。本発明の実施形態は、製造規模で選択された生物学的製剤を回収するための方法を含み、選択された生物学的製剤は、治療的に有用または有益な化合物である。定義および略称:動的結合能力DBC:クロマトグラフィ媒体の動的結合能力は、非結合標的生成物の破過が起こる前に実際の流動条件下で媒体が結合する、標的生成物の量である。このパラメータは、流速が増加させられるにつれて生じ得る質量移動制限の影響を反映するため、飽和または静的結合能力の単純な判定よりも、実際のプロセス性能を予測する際にはるかに有用である。例えば、MilliporeCorp.,TechnicalBrief,Lit.No.TB1175EN002005を参照されたい。一般に、流速が低くなるほど、動的能力が高くなる。動的結合能力は、当業者によって日常的に判定される。例えば、DBCは、標的生成物の既知の濃度を含有するサンプルを装填し、サンプルを適用しながらカラム貫流の中の生成物を監視することによって判定することができる。例えば、BioseparationandBioprocessing,Vol.1,Sect.1.4.3editedbyGanapathySubramanian,publishedbyWiley-VCHVerlagGmbHCo.KGaA,Weinheim,Germany2ndEd.;2007を参照されたい。結合能力/静的結合能力:静的非貫流条件下で媒体が結合する標的生成物の量。過負荷/過負荷をかける/過負荷を受ける:吸着材あるいは他の親和性または生成物捕捉媒体または樹脂の結合能力または動的結合能力を超えること。AEX:アニオン交換クロマトグラフィCEX:カチオン交換クロマトグラフィcHT:カルシウムヒドロキシアパタイトCV:カラム体積DF:透析濾過DoE:実験計画HIC:疎水性相互作用クロマトグラフィHMW:高分子量PS:パイロット規模OD:光学密度TSA:全シアル酸UF:限外濾過WFI:注射用蒸留水当技術分野の技能の範囲内の知識を適用することによって、本発明の実施形態は、本発明の一般的概念から逸脱することなく、必要以上の実験なしで、種々の用途のために修正および/または適合されてもよい。したがって、そのような適合および修正は、本明細書で提示される教示および誘導に基づいて、開示された実施形態の同等物の意味および範囲内にあることを目的としている。実施例1概要同じ初期混合物中に存在する、減少したレベルまたはより低いレベルのシアル化を伴う生物学的製剤と比較して、増進または増加したレベルのシアル化を伴う生物学的製剤の単離/精製/富化のために、クロマトグラフィプロセスが開発された。1はじめに本実施例で利用された生物学的製剤は、ヒトヒト免疫グロブリンのFcドメインに結合された細胞外受容体リガンド結合ドメイン以降ではExcR-Fcを含む、Fc融合タンパク質であった。生物学的製剤は、130~150kDaの見掛けの分子量および7.15の理論的pIを有する。それは、組み換えDNA技術によって、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞ほ乳類発現系において産生された。生成物は、細胞外ドメインおよびFc領域の中に複数の潜在的Nグリカンを伴う複雑な炭水化物プロファイルを有する。加えて、生成物は、細胞外ドメインの中に複数の潜在的Oグリカンを有する。翻訳後修飾のためのこれらの複数の潜在的部位は、様々な程度のNおよびOグリカン占有ならびに様々なレベルのシアル化を伴う分子を含有する、不均質生成物プールをもたらす。生物学的製剤の高度にシアル酸化した形態は、極めて望ましい部類の治療的に有利なタンパク質アイソフォームを表すことができる。本実施例は、許容可能な生成物回収および収率を維持しながら、生物学的製剤の回収/単離された高度にシアル酸化した形態の含量を富化することが可能である、堅調なプロセスの開発を説明する。この特定の実施例では、TMAEHiCapクロマトグラフィが、Fc融合タンパク質の高度にシアル酸化した形態を回収/単離するために使用された、プロセスが開発された。最初に、多くの異なる吸着材およびクロマトグラフィモードすなわち、CEX、AEX、HIC、およびcHTが、シアル化の程度の差に基づいてタンパク質アイソフォームを分離する能力について選別された。TMAEHiCapが、他の試験された吸着材と比較して、生成物糖型の向上した分解能およびより高い生成物収率を提供したため選択された。貫流モードでのExcR-Fcの動的結合能力および糖型の分割を測定するために、TMAEHiCap上で破過実験が行われた。これらの結果に基づいて、過負荷結合および溶出プロセスが開発され、より高度にシアル酸化した糖型が、TMAEHiCap吸着材上で優先的に吸着および濃縮された一方で、ExcR-Fcの低シアル酸化または非シアル酸化糖型がカラムを貫流した。後に、生成物プールの中で富化した高シアル酸化糖型を回収するように、カラムが溶出された。荷重条件を最適化して、生成物のシアル化および回収の増進を最大限化するように、TMAEHiCapカラム上で結合および溶出実験が行われた。プロセスのロバスト性を評価するため、ならびに生成物品質および収率への主要プロセスパラメータの影響を識別するために、実験計画DoEアプローチが採用された。加えて、所望の生成物品質条件を一貫して満たすプロセスの能力を検査するために、例示的な最悪条件下で精製の実行が行われた。2材料クロマトグラフィ吸着材Fractogel登録商標EMDTMAEHiCapMFractogel登録商標EMDSEHiCapMBio-RadcHTTypeIPhenylSepharose商標6FFhighsubカラムC0969:TMAEHiCap、0.66cm内径×15.7cm層高1CV=5.46mLC1021:TMAEHiCap、0.66cm内径×14.5cm層高1CV=4.96mLC1063:TMAEHiCap、0.66cm内径×15.3cm層高1CV=5.23mLC1099:TMAEHiCap、0.66cm内径×15.3cm層高1CV=5.23mLC1104:TMAEHiCap、0.46cm内径×10.0cm層高1CV=1.662mLC1005:SEHiCap、0.66cm内径×16.2cm層高1CV=5.54mLC0981:cHTTypeI、0.66cm内径×16.1cm層高1CV=5.51mLC1028:PhenylSepharose、0.66cm内径×16.1cm層高1CV=5.51mL機器AKTAExplorer100ChromatographyWorkstationGEHealthcare,ピスカタウェイ,ニュージャージー州3方法以下の項は、ExcR-Fc生成物のシアル化の全体的レベルを高めるためにクロマトグラフィプロセスを開発および最適化するように行われる、実験の詳細な説明を提供する。初期の開発実験第4.1~4.3項は、酵素ベースの脱シアル化を採用し、その後に、放出されたシアル酸の蛍光標識およびTSA含量の定量のための蛍光分析すなわち、DMB方法が続いた。しかしながら、この検定は、低い精度および感度を有した。したがって、脱シアル化のために酸加水分解を採用し、その後に放出されたシアル酸のUV-HPLC分析が続いた、新しく、より正確なTSA検定が開発され、後続の開発研究に採用された第4.4項および4.5項。各分析では、プロセスステップおよび/または研究で評価されている実験条件によって提供された相対的TSA増進の判定を可能にした、内部検定対照として、対照サンプルが実行された。3.1吸着材選別開発の開始時に、シアル化のレベルに基づいて、生成物糖型の良好な分解能を提供したクロマトグラフィモードおよび吸着材を識別するように、線形勾配実験が、カチオン交換SEHiCap、アニオン交換TMAEHiCapおよびCaptoDEAE、およびヒドロキシアパタイトcHTTypeIクロマトグラフィに行われた。これらの実験は、中和されたProsepUltraPlus溶出緩衝液すなわち、75mM酢酸塩、pH3.3が2.4Mトリスベースを使用してpH5.0に中和されたに透析濾過された初期パイロット規模実行PS4から得られた、PhenylSepharose6FFカラム溶出液を使用した。加えて、PhenylSepharose6FFhighsub上の疎水性相互作用クロマトグラフィも、ExcR-Fcのシアル化のレベルを高める能力について評価された。したがって、PhenylSepharoseクロマトグラフィの開発中に行われた実験からの溶出液サンプルも、全シアル酸TSA分析のために評価された。いったんTMAEHiCapが、さらなるプロセスの開発のために吸着材として選択されると、種々の生成物糖型の分解能へのpHすなわち、pH5.5、6.5、7.5、および8.5の影響を評価するように、付加的な線形勾配実験が行われた。これらの実施形態は、出発材料として、pH5.0の50mM酢酸塩溶液に透析濾過されたパイロット規模実行PS10から得られた、生物学的製剤を使用した。以下の方法は、280、300、および313nmで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は150cm/hrの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。1.pH8.0である50mMトリス/3MNaClの3CVで、カラムが事前に平衡化された。2.それぞれ、5.5、6.5、7.5、および8.5の負荷pHレベルについて、pH5.5である50mM酢酸塩、pH6.5である50mMビストリス、pH7.5である50mMトリス、およびpH8.5である50mMトリスの5CVで、カラムが平衡化された。3.2.4Mトリスベースで適切なpHに調整された出発材料を用いて、カラムが20mg/mLまで装填された。4.平衡溶液の3CVでカラムが洗浄された。5.対応する平衡溶液中で、30CVにわたって0~300mMNaClの線形塩勾配でカラムが溶出された。勾配の終わりに、高食塩水でカラムを洗浄するように、Bが2CVにわたって100で維持された。カラム溶出液が2CV留分で収集された。6.pH8.0である50mMトリス3MNaClの3CVで、カラムが揮散された。7.0.5MNaOHの3CVで、カラムが浄化された。8.pH2.5である50mM酢酸塩1MNaClの3CVで、カラムが再生された。9.pH3.2である1ベンジルアルコール0.5M酢酸16mMNaOHの3CVで、カラムが保管された。3.2破過および分割実験負荷pH、すなわち、pH5.5、6.5、7.5、および8.5の関数として、糖型の分割ならびにTMAEHiCap上の動的結合能力DBCを評価するように、実験が行われた。これらの実験は、pH5.0の50mM酢酸塩に透析濾過され、DF緩衝液で約5mg/mLに希釈され、2.4Mトリスベースで適切なpHに調整された、パイロット規模実行PS10からの生物学的製剤を採用した。各負荷pH条件について、TMAEHiCapカラムが150mg/mLまで装填され、貫流留分が10mg/mL増分で収集され、TSAレベルについて分析された。以下の方法は、280、300、および313nmで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は150cm/hrの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。1.pH8.0である50mMトリス/3MNaClの3CVで、カラムが事前に平衡化された。2.それぞれ、5.5、6.5、7.5、および8.5の負荷pHレベルについて、pH5.5である50mM酢酸塩、pH6.5である50mMビストリス、pH7.5である50mMトリス、およびpH8.5である50mMトリスの5CVで、カラムが平衡化された。3.平衡の終わりに、UVモニタが自動的にゼロにされた。4.適切なpHにある負荷プールを用いて、カラムが150mg/mLまで装填された。5.平衡溶液の3CVでカラムが洗浄された。6.300mMNaClを含有する、対応する平衡溶液の3CVで、カラムが溶出された。7.pH8.0である50mMトリス3MNaClの3CVで、カラムが揮散された。8.0.5MNaOHの3CVで、カラムが浄化された。9.pH2.5である50mM酢酸塩1MNaClの3CVで、カラムが再生された。10.pH3.2である1ベンジルアルコール0.5M酢酸16mMNaOHの3CVで、カラムが保管された。3.3予備開発分割実験の結果に基づいて、シアル酸化した生成物糖型を富化する目的で、過負荷モードでTMAEHiCapを使用することの実行可能性を判定するように、予備結合および溶出実験が行われた。これらの実験は、pH5.0の50mM酢酸塩に透析濾過され、DF緩衝液で約5mg/mLに希釈され、2.4MトリスベースでpH5.5に調整された、PS10生物学的製剤を採用した。100および150mg/mLのカラム搭載が調査され、対応する溶出液プールがTSAおよびSEC検定によって分析された。以下の方法は、280、300、および313nmで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は150cm/hrの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。1.pH8.0である50mMトリス/3MNaClの3CVで、カラムが事前に平衡化された。2.pH5.5である50mM酢酸塩の5CVで、カラムが平衡化された。3.適切なpHにある負荷プールを用いて、カラムが標的装填状態まで装填された。4.平衡溶液の3CVでカラムが洗浄された。5.pH5.5である50mM酢酸塩300mMNaClの8CVで、カラムが溶出された。溶出液プール収集が溶出ステップの開始時に開始され、≦0.1AUのOD280に達した時に完結された。6.pH8.0である50mMトリス3MNaClの3CVで、カラムが揮散された。7.0.5MNaOHの3CVで、カラムが浄化された。8.pH2.5である50mM酢酸塩1MNaClの3CVで、カラムが再生された。9.pH3.2である1ベンジルアルコール0.5M酢酸16mMNaOHの3CVで、カラムが保管された。以前のUF/DFステップを必要とすることなく、カラム装填材料として希釈生物学的製剤を採用するというオプションを評価するために、過負荷結合および溶出実験が、カラム性能への負荷組成の影響を評価するように希釈生物学的製剤を用いて実行された。この目的を果たすために、pH5.5に調整されたPS10生物学的製剤が、iWFIで5倍、iiWFIで10倍、およびiiiWFIで5Xに希釈され、その後にpH5.5である50mM酢酸塩での2倍希釈が続いた。上記で説明される方法を使用して、各負荷調製について、100mg/mL装填時の結合および溶出実行が行われた。3.4実験計画DoE研究過負荷結合および溶出TMAEHiCapステップに対する好適な動作条件を識別して、許容生成物収率を維持しながら、生成物のシアル化の所望のレベルの富化を提供するように、実験計画DoE研究が行われた。主要プロセスパラメータおよびそれらの調査された範囲は、カラム装填90~160mg/mL、負荷pH5.2~5.8、および負荷伝導度2.4~4.4mS/cmであった。Stat-EaseDesignExpertv8.0Stat-Ease,Inc.,ミネアポリス,ミネソタ州ソフトウェアを使用して、18回の実行4回の中心点実験を含むから成る中心複合設計が作成された。各DOE実行について、動作パラメータはDoE実験計画表表1の通りに様々であった。DoE実験に採用された装填材料は、pH5.5の50mM酢酸塩に透析濾過され、DF緩衝液で約5mg/mLに希釈された、プロトタイプ実行PS14から得られた生物学的製剤から生成された。各DoE実行について、1Mビストリスまたは2N酢酸で滴定することによって、負荷が所望のpHに調整された一方で、WFIまたはpH5.5の500mM酢酸塩溶液を使用して、負荷伝導度が調整された。TSAおよびHMWといった、2つの主要プロセス出力が、各溶出液プールについて測定され、データを分析し、各応答のモデルを構築するために、ソフトウェアが採用された。加えて、プロセス回収も分析され、モデル化された。上記で説明されるクロマトグラフィ方法が、これらのDoE実験に採用された。3.5付加的なプロセス特性化以下のために、付加的な一点結合および溶出実験表2がTMAEHiCap上で行われた。1.DoEモデルの予測能力を立証し、TMAEHiCapプロセス性能への負荷ロット可変性の影響を調べる実行2、5、8。2.大規模産生で使用するためのTMAEHiCap吸着材ロットの性能を評価する実行2、5、8。3.プロセス性能への流速の影響を検討する実行1~3および11~13。4.生成物品質および収率への負荷濃度の影響を調べる実行4~6および7~9。5.負荷TSA実行12および負荷HMW実行10の最悪条件下で得られる、シアル酸SA富化および溶出液HMWレベルを評価する。pH5.5の50mM酢酸塩に別々に透析濾過されたPS10およびPS16生物学的製剤が、これらの実験に採用された。各実行について、1Mビストリスまたは2N酢酸で滴定することによって、負荷が所望のpHに調整された一方で、WFIおよび/またはpH5.5の500mM酢酸塩溶液を使用して、負荷伝導度が調整された。以下の方法は、280、300、および313nmで監視されたカラム流出物とともに採用された。実験は150cm/hrの線流速で行われ、全てのステップは下降流で操作された。1.pH8.0である50mMトリス/3MNaClの3CVで、カラムが事前に平衡化された。2.pH5.5である50mM酢酸塩の5CVで、カラムが平衡化された。3.適切な濃度、pH、および伝導度に調整された負荷プールを用いて、カラムが標的装填状態まで装填された。4.平衡溶液の3CVでカラムが洗浄された。5.pH5.5である50mM酢酸塩300mMNaClの8CVで、カラムが溶出された。溶出液プール収集が溶出ステップの開始時に開始され、≦0.1AUのOD280に達した時に完結された。6.pH8.0である50mMトリス3MNaClの3CVで、カラムが揮散された。7.0.5MNaOHの3CVで、カラムが浄化された。8.pH2.5である50mM酢酸塩1MNaClの3CVで、カラムが再生された。9.pH3.2である1ベンジルアルコール0.5M酢酸16mMNaOHの3CVで、カラムが保管された。後に、TMAEHiCapプロセスステップの負荷濃度をさらに最適化するように、付加的な一点実験が行われた。2~30mg/mLの負荷濃度が評価された。pH5.3の55mM酢酸塩に透析濾過されたPS16生物学的製剤が、これらの実験用の出発材料として採用された。透析濾過されたプールは、HMWの最悪負荷pHおよび伝導度条件すなわち、pH5.1および3.9mS/cmに調整され、pH5.1および3.9mS/cmに調整された55mM酢酸塩を使用して、適切な標的負荷濃度に希釈された。上記で説明されるクロマトグラフィ方法を使用して、100cm/hrの線流速において、1.66mL0.46×10cmスクリーニングカラム上で実験が行われた。注記:これらの実行の速度は、15cm層高開発カラム上の滞留時間に合致するために低減された。4結果および考察4.1吸着材選別生成物のシアル化の富化のための好適なクロマトグラフィステップを識別するために、線形勾配実験が、種々のクロマトグラフィモードおよび吸着材を選別するように行われた。この目的を果たすために、カチオン交換SEHiCap、アニオン交換TMAEHiCapおよびCaptoDEAE、ヒドロキシアパタイトcHTTypeI、およびHICPhenylSepharose6FF吸着材が評価された。各実行の溶出液留分について行われたTSA分析に結果が、以下に示される。これらの結果は、TMAEHiCapが、この研究で評価された他の吸着材と比較して、比較的高いプロセス収率で最高量のSA富化を提供したことを明確に示した。4.1.1FractogelSEHiCap図1は、SEHiCap上で行われた線形勾配実行について得られたクロマトグラムを示す。結果は、SEHiCapがシアル化の限定された富化を提供し、全ての留分中のTSAレベルが対照サンプルレベルを下回ったことを示した図2。4.1.2FractogelTMAEHiCapTMAEHiCap上の線形勾配クロマトグラムが、図3に示されている。溶出液留分のTSA分析は、TMAEHiCapがシアル酸化した生成物糖型の良好な分解能を提供したことを示した図4。予想通りに、高シアル酸化種が、より強力に結合し、勾配の後期で溶出した。後期溶出留分すなわち、留分9から11の蓄積TSAレベルは、対照サンプルのレベルと合致した。4.1.3CaptoDEAE図5は、CaptoDEAE上で行われた線形勾配実行のクロマトグラムを示す。溶出液留分の分析は、この吸着材が糖型の限定された分離を提供したことを示した図6。4.1.4cHTTypeIcHTTypeI上で行われた実験の線形勾配クロマトグラムが、図7に示されている。図8に示されるように、この吸着材は、生成物のシアル化の富化をほとんど全く提供しなかった。4.1.5PhenylSepharose6FFhighsubExcR-Fc精製プロセスにおける第3のステップとして、PhenylSepharoseカラムの開発の経過中に400~700mMの硫酸アンモニウムの異なる溶出条件を使用して生成された、溶出液プールが、TSA検定によって分析された。図9に示されるように、提供されたPhenylSepharoseは、種々の糖型の非常に限定された分解能を提供した。4.1.6糖型分離へのpHの影響TMAEHiCap上でのExcR-Fcの糖型の分離へのpHの影響を評価するために、付加的な分離が行われた。この目的を果たすために、pH5.5、6.5、7.5、および8.5で実験が行われ、溶出液留分がTSA分析によって分析された。図10は、これらの線形勾配実行のオーバーレイしたクロマトグラムを示す。これらの結果は、同等生成物収率図11およびシアル酸化した糖型の分解能図12が、これらのプロット中の平行な曲線によって示されるように、異なるpH条件で得られたことを示した。予想通りに、高シアル酸化糖型のより優れた結合親和性により、生成物のシアル化のレベルが、分数の増加とともに増加した。注記:異なるpH条件での曲線は、TMAEHiCap吸着材上でのより強力な結合により、pHの増加とともにより高い分数に向かって移動し、相互からわずかにオフセットされた。加えて、溶出液サンプルはまた、SECによってHMW図13、無傷質量分析によってOグリカン占有図14、およびCE-LIFによって末端GalNAc図15についても分析された。HMWレベルは、TMAEHiCap上のHMW種のより高い結合親和性により、TSAについて見られた傾向と同様に、分数の増加とともに増加した。同様に、無傷質量およびCE-LIFの結果はそれぞれ、分数の増加とともに、Oグリカン占有が増加し、末端GalNAcの割合が減少し、対照サンプル材料でのレベルに近づいたことを示した。再度、これらの生成物品質属性の相対的変化は、これらの図中の平行な曲線によって示されるように、異なるpHで同等であった。したがって、TMAEHiCapステップは、生成物の全体的グリカンプロファイルOグリカン占有および末端GalNAcの同時向上を提供しながら、対照サンプル材料のレベルに合致する、またはレベルを超えるように、TSAレベルを増進させることができた。同時に、これらの結果は、溶出pH条件を変化させることによって、糖型分解能および/または選択性の向上がTMAEHiCap上で得られなかったことを示した。4.2破過および分割実験TMAEHiCap吸着材上の異なってシアル酸化された生成物糖型の分割を評価するように、異なる負荷pH条件で破過実験が行われた。図16は、異なる負荷pHで得られた、オーバーレイした破過曲線を示す。図に示されるように、急な生成物破過がpH7.5および8.5で得られた一方で、より浅い破過曲線がpH5.5および6.5で観察され、これらの条件下での固定および移動相の間の生成物分割を示唆した。表3は、異なる負荷pH条件で計算された動的破過能力値すなわち、10DBCを示す。pH5.5および6.5での実行に対するカラム貫流留分のTSA結果は、より負に帯電した、高シアル酸化生成物形態が、低シアル酸化または非シアル酸化種と比較して、TMAEHiCap吸着材へのより優れた結合親和性を有したことを示した。カラム装填および貫流留分の生成物濃度およびTSA含量に基づいて、カラム装填の関数として吸着された生成物の質量すなわち、回収およびTSAを判定するように、質量平衡が行われた図17および18。これらの図に示されるように、これらの条件下での動作は、カラムに過負荷をかけ、後にカラムから吸着されたタンパク質を溶出して、高度にシアル酸化した生成物プールを得ることによって、TMAEHiCap吸着材上でシアル酸化した糖型を濃縮することにより、生成物のTSAレベルを高める独自の機会を提供した。結果はまた、pH6.5負荷条件と比較して、比較的高い生成物収率での有意に優れたTSA富化がpH5.5で得られたことを示した。したがって、≧100mg/mLのカラム装填でのpH5.5/約3.2mS/cm負荷条件が、さらなる開発のために選択された。4.3予備開発上記の破過/分割研究で識別された負荷条件下、すなわち、pH5.5/約3.2mS/cmで、過負荷結合および溶出モードで操作することによって、生成物のシアル化を増加させるTMAEHiCapカラムステップの能力を評価するように、概念実証実験が行われた。100および150mg/mLカラム装填で行われた一点実験の結果が、表4で要約される。結果は、このモードで操作された時に、TMAEHiCapがシアル化の有意な富化を提供し、TSAレベルが、負荷中の11.3molSA/molExcR-Fcから溶出液プール中の14.3~15.4mol/molまで増加させられたことを示した。加えて、溶出液TSAレベルは、カラム貫流中のより高い生成物損失による回収の同時低下を伴って、負荷の増加とともに増加する。したがって、対照サンプルシアル化のレベルすなわち、14.6~15.2mol/molに合致するTMAEHiCapステップの能力の実証が成功した。SEC分析は、HMWレベルが負荷中の2.2から溶出液プール中の2.9~3.1までわずかに増加したことを明らかにした。しかしながら、カラム溶出液中のHMWレベルは、生物学的製剤の放出に対する≦3.5の作用限界を下回った。全ての以前のTMAEHiCap開発実験は、パイロット規模で生成されたExcR-Fc生物学的製剤からTMAEHiCap装填材料を調製するために、UF/DFシステムで行われた透析濾過ステップを採用した。生物学的製剤の再処理がシアル化を富化するために必要とされる単位動作の数を削減するために、カラム装填材料として希釈生物学的製剤を採用することの実行可能性を評価するように実験が行われた。図19に示されるように、生物学的製剤の単純5倍希釈で行われた実験は、非定型の不規則な負荷破過曲線を示し、処方緩衝液構成要素からの潜在的な干渉および/または装填材料におけるpH干渉能力の欠如を示唆した。生物学的製剤がWFIで10倍に希釈された時に、非定型破過曲線ならびに有意な生成物結合より低い負荷伝導度によるが得られたデータは示されていない。これらの条件下でのプロセス制御の欠如により、これらのオプションは考慮から除外され、サンプルは分析試験のために提出されなかった。WFIで5倍に希釈され、その後に緩衝液50mM酢酸塩、pH5.5による2倍希釈が続いた、生物学的製剤を用いて行われた実験は、より典型的な破過挙動クロマトグラムは示されていない、6を示した。加えて、この場合に得られた負荷TSAに対するTSA富化は、同等のカラム装填ならびに負荷pHおよび伝導度すなわち、表5の3.1mol/mol富化対表4の3.0mol/mol富化で透析濾過された生物学的製剤を用いて得られたものと同等であった。しかしながら、この場合、透析濾過された生物学的製剤を使用して行われた実行に対して、より優れた生成物結合および結果的により低い収率が得られたすなわち、表5の56対表4の65。したがって、上記の結果は、より良好なプロセス制御およびTMAEHiCapステップからのより高い生成物収率を確保するように、ExcR-Fc生物学的製剤を適切な負荷緩衝液に透析濾過するためのUF/DFステップの必要性を明確に実証する。4.4実験計画DoE研究表6は、TMAEHiCap過負荷結合および溶出クロマトグラフィプロセスの動作のための好適な条件を判定するように行われた、DoE実験の結果を示す。TSA、HMW、および回収が測定され、主要プロセス出力としてモデル化された。全ての他の純度標的がプロセスによって十分制御されたことを確実にするように、還元性または非還元性LC90/GXIIによる宿主細胞タンパク質HCPレベルおよび生成物純度も監視された。表に示されるように、全てのDoE実行の溶出液プールは、同等の高い純度、ならびに非常に低いレベルのHCP、すなわち、検定LOQまたはその付近にあるレベルを有した。実験実行からの結果は、Stat-EaseDesignExpertv8.0ソフトウェアにインポートされ、分析された。各出力の分析は、その出力へのプロセスパラメータの影響を表した数学的モデルの選択を伴った。データは、最良モデル方程式によって適合され、あらゆる有意でないパラメータを除去するように分散分析ANOVAが行われた。これは、後続の項で各出力について概説される。以下の方法が、各応答の分析に利用された。適合概要プログラムが、回帰計算を行って、多項式モデルの全てを選択された応答に適合させるために活用された。適合概要プログラムは、全てのモデル項に対する影響を計算し、最良モデル複数可を比較して選択するために、P値、不適合度、およびR2統計を生じた。選択されたモデルは、付加的な項が有用であり、モデルがエイリアス作成されず、不適合度が最小限化され、調整および予測されたR2値が最大限化された、最上位多項式であった。応答への影響が雑音のみによるものとなり得る5未満の可能性があったより大きいF値[Prob>F]<0.05の確率、p値<0.05場合に、プロセス変数のみが残るまで、後方選択を介して1度に1つの入力パラメータを除去することによって、各応答の分散分析を使用して、有意なパラメータが判定された。これらの要因は、応答に影響を及ぼす有意な要因であると見なされた。要因は、階級を支持するためにP値≧0.05である時に、モデルに含まれた。モデルが有意であり、不適合度が有意でなかったp値≧0.05ことを確実にするように、かつ調整および予測されたR2値を調べるように、付加的な分散分析が調べられた。≧0.5の予測されたR2値は、モデルがプロセスモデル化のために十分であるかどうかを判定するために利用された。予測および調整されたR2値は、相互の0.2以内となるべきである。データが残余の異常値、非正常性、または不均一分散性を含有するか、あるいは変換を必要とするかを調べるために、診断ツールが利用された。変換が適用された、異常値が調査された後に、有意な要因が識別され、モデルが生成された。表7は、各応答に影響を及ぼす有意な要因を識別する分散分析からの結果を要約しp値<0.05、二乗誤差計算の合計および不適合度の有意性を通して、モデル適合および予測能力を調べる。HCPおよび純度率に影響を及ぼした有意なモデルまたは有意なパラメータは識別されなかった。個々の応答の分析は、第5.4.1項~5.4.6項で見出すことができる。以下の方程式の形態で、各応答についてモデルが生成された。各応答の係数が表8に記載される。TSA、HMW、回収応答について、対応する応答レベルを予測するように、動作空間内の入力パラメータの所与の組み合わせに対して99予測区間が生成された。いずれのモデルも識別されなかった応答、すなわち、HCP、最高単一不純物、および純度について、応答レベルを予測するために、平均値の周囲の3つの標準偏差が利用された表9。4.4.1全シアル酸TSATSAの増進は、ExcR-Fc下流精製プロセスにおけるTMAEHiCapクロマトグラフィステップの主要な機能である。したがって、溶出液プール中のTSAレベルは、このステップの設計およびモデル化のための主要な応答であった。これらのデータの適合概要が、図10~12に示される。連続モデル二乗和の表表10は、高次モデル項が追加されるにつれて、モデル適合の蓄積向上を示す。例えば、線形対ブロックは、線形およびブロック項を計上した後の線形項の有意性を示す。同様に、2FI対線形は、2因子交互作用項をモデルに追加することの有意性を生じ、二次対2FIは、二次項を線形、ブロック、および2FI項に追加することの有意性を示す等である。表中の各行は、完全モデルの統計ではなく、付加的な項の統計のみを含有する。モデル項の追加と関連付けられる有意性は、モデルの二乗和SSならびに残余誤差を使用して計算される。モデルに含まれなかった全ての影響に対する二乗和は、ともに統合され、残余誤差の推定値として使用された。二乗和を自由度で割ることによってSS/df、平均二乗誤差が計算された。平均二乗の比MSModel/MSResidualが、モデルのF値を判定するために使用され、次いで、F値は、モデルの分散を残余誤差の分散と比較するために使用された。F値が大きくなるほど、モデルが有意である尤度が大きかった。所与の危険率について、F値を既知のF分布表と比較することによって、モデル有意性の定量的尺度を得ることができる。これらの表の上で挙げられる臨界値よりも大きいF値は、規定された危険率以内で有意と見なされる。加えて、確率>F値すなわち、p値が計算された。この値は、観察されたF値を超えるF分布の曲線の下の分数領域に等しい。例えば、<0.05のp値は、モデルが有意であり、実験の雑音によるものではないという95信頼があることを示す。一般に、<0.05のp値を有するモデル項は、有意であると見なされる。付加的な項が有意であり、エイリアシングが存在しなかった高次モデルが、提案モデルとして表に示された。TSAデータの分析は、二次モデルがこの応答を最も良く表したことを示唆した表10。適合概要で編纂された第2の表は、不適合度試験の表表11である。この表は、各モデルがどれだけ良くデータに適合するかを比較する。不適合度試験は、残余誤差を複製設定点からの純粋誤差と比較する。純粋誤差よりも有意に大きい不適合度誤差は、モデルによって予測される値とは有意に異なる実験点があることを示す。したがって、より適切なモデルが、データに適合するために使用されるべきである。p値は、不適合度を測定するために使用される。p値が高くなるほど、実験点とモデル点との間の差が実験の雑音によるものであるという尤度が大きくなる。一般に、0.1よりも大きいp値が所望される。TSA応答については、二次モデルが非エイリアス作成モデルに対して最高p値を有し、それがデータへの最良適合を有することを示唆した。表12は、TSA応答のモデル概要統計を含有する。各完全モデルタイプのR二乗、調整R二乗、予測R二乗、およびPRESS統計が示されている。表に示されるように、二次モデルが、最高R二乗および調整R二乗値を有し、それが実験データに最も良く適合することを示した。次いで、TSAの二次モデルは、有意ではなかったモデル項を除去するように削減された。これは、後方選択プロセスを使用し、モデルのANOVA分散分析の計算を伴い、最小有意モデル項を除去し、項が除去されたモデルのANOVAを計算し、再度、最小有意項を除去することによって行われた。このプロセスは、p値>0.05を有する全てのモデル項がモデルから除去されるまで繰り返された。溶出液TSAモデルのANOVA結果が表13に示される。ANOVA結果は、TSAのモデルが高いR2値>0.9を有したことを示し、モデルがデータの分散の90以上を捕捉したことを示した。加えて、予測R2値は、調整R2値とほぼ一致し、このモデルが良好な予測能力を有することを示した。信号対雑音比を測定する、適正精度は、44.28という値を有し、モデルが適正信号を有し、設計空間を進むために使用されてもよいことを示した。ANOVAの仮定残余の正規分布、誤差の独立性、および定数分散を検証するために、いくつかの診断プロットが評価された。診断プロットにおける全ての残余が、比較の目的でスチューデント化されたすなわち、残余がそれらの推定標準偏差で割られた。正規分布プロット図20は、残余が正常に分布しているかどうかを示す。図に示されるように、TSA応答に対する残余は、正常に分布しているように思われ、特有のパターンがデータに見出されなかった。図21は、ANOVA計算における定数分散の仮定を調べる、スチューデント化された残余対予測値のプロットを示す。このTSA応答のプロットは、有意な傾向を示さず、ANOVA計算における定数分散の仮定の有効性を確認した。TSA残余対実行数のプロット図22における傾向の欠如は、結果に有意な影響を及ぼした潜伏変数がなかったことを示した。予測溶出液TSAレベル対実測値のグラフ図23は、スクリーニングDOEの探索範囲内で、TMAEHiCap溶出液中のTSAレベルの実験値と予測値との間の妥当な一致があったことを示す。図24は、TSA応答のBoxCox応答を示す。Box-Coxプロット内の垂直の青い線は、現在のデータのべき変換に対応するラムダが変換のパラメータである。垂直の緑の線は、最低SSEをもたらす変換に対応する。最良適合線の両側の垂直の赤い線によってプロット上で示される、95信頼区間も計算された。現在の変換が最良適合の95信頼内にある場合には、変換が推奨されない。図に示されるように、TSAデータが正常に分布していることが分かった。したがって、いずれの変換も推奨されなかった。図25および26は、TMAEHiCap過負荷結合および溶出クロマトグラフィステップに対するカラム搭載、負荷pH、および負荷伝導度といった主要なプロセスパラメータの関数として、溶出液TSAレベルの変化を示す、DesignExpertソフトウェアによって生成された等高線図を示す。これらの図に示されるように、TSAレベルは、装填の増加とともに、および/または負荷pHの減少とともに、および/または負荷伝導度の増加とともに増加した。4.4.2HMW以前の開発結果は、TMAEHiCap溶出液が対応する装填材料よりも高いHMWレベルを有したことを示した。これは、単量体に対するHMWのより高い結合親和性により予期され、吸着材上のHMWの蓄積および集中、それに対応してより高い溶出液中のレベルをもたらした。この挙動は、高シアル酸化糖型によって示されるものと類似し、HMW種の共同富化につながる。したがって、溶出液HMWは、モデル化および特性化され、必要であれば制御されなければならない、別の主要なプロセス出力である。DesignExpertソフトウェア内のTMAEHiCap溶出液プールのHMWの分析結果は、線形モデルがこの応答を最も良く表したことを示唆した表は示されていない、7。有意な要因を識別するように、アルファ=0.05を用いた後方選択を適用した後に、モデルのANOVA表は、有意な要因としてA、B、およびCを識別した表14。上記のモデルの不適合度は、有意ではなく、モデルは、高いR2および調整R2値を有した。また、予測R2値は、調整R2と十分一致し、モデルが良好な予測能力を有したことを示した。診断プロットは、残余の分布が正常であり、分散が一定であり、潜伏変数による応答への影響がなかったことを明らかにし、ANOVAが有効であったことを確認したプロットは示されていない、7。モデルプロットの分析図示せず、7は、TMAE溶出液中のHMWレベルが、カラム装填の増加、負荷pHの減少、および/または負荷伝導度の増加とともに増加したことを示した。これらの実験に採用された装填材料が約0.9HMWを有したため、全ての実行の溶出液HMWレベルは、>3.5HMWの作用限界を十分下回った表6。したがって、溶出液HMWが、最高負荷HMWレベルで、かつTMAEHiCapに対する最悪の動作条件下で許容できることを確実にするように行われた、付加的な一点実験があった第4.5項および5.5項。4.4.3回収回収データの分析は、この応答が2因子交互作用2FIモデルによって最も良く表されたことを示したデータは示されていない。有意な要因を識別するように、アルファ=0.05を用いた後方選択を適用した後に、モデルのANOVA表は、有意な要因としてA、B、C、AB、およびACを識別した表15。付加的な詳細を他の場所で見出すことができる。全体で、モデルは、高いR2および調整R2値を有し、予測R2値は、調整R2と十分一致し、モデルが良好な予測能力を有したことを示した。不適合度は、上記のモデルでは有意ではなかったが、p値は、わずか>0.05しかなく、すなわち、雑音により、この大きさの不適合度値が生じ得るという5.16の確率があった。典型的には、p値>0.1が、モデルの有意ではない不適合度に望ましい。しかしながら、比較的大きい不適合度値が、複製から計算されるわずかな純粋誤差のアーチファクトであり、実験データとモデル予測との間の任意の不適合度の真の指示ではなかった場合がある。診断プロットは、残余の分布が正常であり、分散が一定であり、潜伏変数による応答への影響がなかったことを明らかにし、ANOVAが有効であったことを確認したデータは示されていない。モデルプロットの分析データは示されていないは、プロセス回収が、装填の減少、負荷pHの増加、および/または負荷伝導度の減少とともに増加したことを示した。4.4.4還元性および非還元性LC90/GXIIによる純度、および最高単一不純物還元性および非還元性LC90/GXII検定の結果の精査は、DoE実行に対する純度率の値と最高単一不純物HIS率の値との間の差が、それぞれの検定の可変性の範囲内であったことを示した。したがって、平均±3標準偏差が、これらの応答の最良の予測因子であると判定され、いずれのモデルも作成されなかった。4.4.5HCPTMAEHiCap溶出液プール中のHCPレベルの分析は、全ての値が検定の定量限界LOQに非常に近かった、またはそれを下回ったことを示した。したがって、この応答にはいずれのモデルも作成されなかった。4.4.6DoE研究概要TSAおよび回収率に対して作成された予測モデルは、許容生成物収率を維持しながら、所望のレベルのTSA富化を達成するために、カラム装填ならびに負荷pHおよび伝導度の好適な範囲を識別するように採用された。より低いSA富化が、より低いカラム装填で得られるため、この条件は、生成物品質にとっての最悪の場合を表す。したがって、図27のTSAモデルプロットに示されるように、プロセスのロバスト性および良好な製造適合のために負荷pH5.2~5.5および伝導度2.9~3.9mS/cmの妥当な範囲を提供しながら、16.0~16.5mol/molの対照サンプルTSAレベルに合致する、またはそれを超えるために、TMAEHiCapステップに対する最小カラム装填は、150mg/mLに設定された。他方では、前述のように第5.4.3項、プロセス回収はカラム装填の増加とともに減少する。したがって、妥当なプロセス収率を維持するように、製造におけるカラム装填の上限範囲を特定する必要があった。製造カラムサイズ決定の検討に基づいて、ならびに出発材料すなわち、ExcR-Fc生物学的製剤の質量の可変性および上流UF/DFステップのステップ収率を考慮して、180mg/mLの最大装填がTMAEHiCapに対して判定された。最大装填条件での回収率モデルから生成された等高線図に示されるように、約36の最小ステップ収率が予測された。全体で、カラム装填ならびに負荷pHおよび伝導度の特定動作範囲内のTMAEHiCapプロセスに対して、36~59の間のステップ収率を期待することができる。注記:負荷pH範囲は、製造の対称動作範囲、すなわち、5.3±0.2を提供するために、後に5.1~5.5に変更された。以下の予測プロットに基づいて、この変化は、プロセス性能に悪影響を及ぼすことが見込まれない。4.5付加的なプロセス特性化初期のDoE研究で調べられなかった他の入力パラメータ例えば、負荷濃度および流速の影響を評価するため、ならびにプロセスのロバスト性をさらに評価するために、付加的な一点実験が、DoE研究から判定された動作範囲内のTMAEHiCapステップに行われた。これらの実験の結果は、表16で要約される。第5.4項で論議されたDoE実験は、TMAEHiCapカラム用の装填材料として、PS14からの透析濾過された生物学的製剤を採用した。装填材料における可変性との関連でTMAEHiCapステップのロバスト性を評価するために、異なる生物学的製剤ロットすなわち、PS16を使用して、実験実行2、5、8が行われた。これらの実行の結果は、DoEモデルの予測能力を立証するための試験点として使用された。図17に示されるように、回収率およびTSAの実測値は、対応するモデルの99予測区間内であった。したがって、これらのDoEモデルの立証が成功した。したがって、測定されたHMW値は、予測範囲よりも高かった。これは、DoE実験に使用された材料PS14負荷における0.9HMWと比較して、立証実行に採用された装填材料におけるより高いHMWレベルPS16負荷における1.5HMWによるものであった。全体で、1つのロットの装填材料を使用して生成されたDoEモデルは、異なるロットのカラム装填材料に対するTMAEHiCapプロセス性能の予測に成功することができた。したがって、装填材料におけるロット間可変性に対するTMAEHiCapプロセスのロバスト性を、これらの結果から推測することができる。加えて、これらの実行に採用された吸着材は、プロセス開発に使用されたロットとして同等の性能を有することが示された。したがって、この吸着材ロットは、20112KGMP製造キャンペーンで使用するために好適であると見なされた。20102KGMP製造キャンペーン中に産生されたExcR-Fc生物学的製剤は、代表的なプロトタイプ実行PS14および16を含むについて観察されたものよりも低いTSAレベルを有した。したがって、TSA富化の最悪の条件実行12下で得られた生成物品質を判定するために、GMPバッチについて観察されたものと同等であるTSAレベルを有するPS10材料を用いて、実験が行われた。実行10に対する溶出液プールの分析は、TSAレベルが、対照サンプル対照について測定されたTSAレベル、すなわち、16.0~16.5mol/molと同等であった、16.0mol/molであったことを示した。したがって、TMAEHiCapプロセスは、これらの最悪条件下でさえも、対照サンプルに合致するようにExcR-Fc生物学的製剤のSA含量を富化することが可能であることが分かった。加えて、代表的なプロトタイプおよびGMP生物学的製剤ロットにおけるHMWレベルは、≦1.6であった。TMAEHiCap溶出液において期待することができる最高HMWレベルを評価するために、実行12は、2.0HMWを有したPS10負荷を採用し、HMWに対する最悪の動作条件下で行われた。表16に示されるように、実行10に対する溶出液HMWレベルは、3.3であり、生物学的製剤に対して特定された>3.5の作用限界よりも小さかった。≦1.6HMWを伴うGMP材料の使用は、溶出液HMWレベルに対する十分な安全範囲を提供することが見込まれる。したがって、TMAEHiCapステップにわたって観察されたHMW増加は、許容できると見なされ、生物学的製剤におけるHMWレベルをさらに低減するために、いずれの付加的なプロセスステップの必要とされなかった。TMAEHiCapプロセスの流速は、生成物品質への影響を評価するように、75~250cm/hrの間で変化させられた実行1~3および11~13。これらの実行の結果は、溶出液におけるHMWレベルが流速の増加とともに低下した一方で、生成物収率およびTSAレベルが検定可変性の限界内で同等であったことを示した。観察されたHMWの増加は、より大きいHMW種が流速の増加とともにカラム上に結合するために利用可能である、より短い滞留時間によるものである可能性が高かった。したがって、TMAEHiCapカラム溶出液におおけるHMWレベルを最小限化するように、より高い負荷速度で動作することが有利である。したがって、カラム装填ステップに対する150~250cm/hrの流速範囲が、製造に推奨された。実行4~6および7~9は、プロセス性能への負荷濃度の影響を検討するために行われた。表16に示されるように、HMWレベルは、負荷濃度が3mg/mLから7mg/mLに増加するにつれて減少することが観察された。加えて、溶出液HMWレベルの減少は、負荷濃度が3mg/mLから5mg/mLに増加するにつれて、5mg/mLから7mg/mLまでの負荷濃度の増加について観察されるものと比較して、より有意であることが観察された。同時に、プロセス回収および溶出液TSAレベルは、異なる負荷濃度で同等であった。これらの結果に基づいて、最適負荷濃度を判定して溶出液HMWレベルを最小限化するように、付加的な一点実験が行われた。図28に示されるように、HMWレベルは最初に、負荷濃度が約7mg/mLまで増加するにつれて増加し、それは以前の結果と一貫していた。しかしながら、7~30mg/mLの負荷濃度のさらなる増加は、HMWレベルの有意な低減を提供しなかった。これらのサンプルのTSA分析は、異なる負荷濃度で同等のSA富化が得られたことを示したデータは示されていない。この挙動をさらに調査するために、バッチ実験が、上記の実験9に使用された同じ装填材料を用いて、単量体およびHMWの等温線を測定するように行われた。これらの実験に対する入力負荷濃度は、2~45mg/mL負荷HMW約1.6の間で変化させられ、それは、TMAEHiCapカラムに対する実行可能な動作範囲全体を表した。図29は、TMAEHiCap上のExcR-Fc単量体の多成分吸着等温線を示す。図に示されるように、0~約5mg/mLおよび約5~約8mg/mLの単量体濃度範囲は、それぞれ、等温線の線形および非線形領域を表す。これらの領域内で、単量体結合が、濃度の増加とともに増加する。吸着材は、Cmonomer≧8mg/mLで飽和し、いずれの付加的な単量体結合も起こることができない。同時に、HMW等温線は、非常に低いレベルの吸着を示し、調べられた負荷濃度の範囲内のHMW結合に有意な変化はなかった図30。総合すれば、これらの結果は、0~8mg/mLの負荷濃度の間で、カラム上のQmonomerが増加した一方で、QHMWは有意に変化しなかったことを実証する。これは、負荷濃度が約8mg/mLまで増加させられるにつれて、溶出液HMWレベルの観察された減少をもたらした。単量体飽和が負荷濃度≧8mg/mLで達成され、QHMWが大部分は不変のままであったため、溶出液HMWレベルのさらなる低減が、負荷濃度の増加とともに得られなかった。これらの結果に基づいて、TMAEHiCapカラム溶出液におけるHMWレベルを最小限化するように、10±2mg/mLの負荷濃度が製造に推奨された。5終わりにExcR-Fc生物学的製剤のシアル酸SAレベルの富化のために、第I相TMAEHiCapクロマトグラフィプロセスの開発が成功した。最初に、シアル化の程度の差に基づいて、種々のExcR-Fcアイソフォームを分離するクロマトグラフィの異なる吸着材およびモードの能力を評価するように、実験が行われた。この目的を果たすために、カチオン交換SEHiCap、アニオン交換TMAEHiCapおよびCaptoDEAE、疎水性相互作用PhenylSepharose、およびヒドロキシアパタイトcHTTypeIクロマトグラフィが、線形勾配または段階溶出実験によって評価された。対照サンプルロットの全シアル酸TSAレベルに合致する、およびそれを超越しさえする可能性がある、最高度のSA富化を提供したため、TMAEHiCapがさらなる開発のために選択された。後に、新規の過負荷結合および溶出プロセスが開発され、より高い正味負電荷およびTMAEHiCapへの結合親和性を有する、高シアル酸化糖型は、より低い親和性の低シアル酸化または非シアル酸化糖型と、結合部位を求めて有効に競争し、したがって、これらのより低い親和性の種を変位させた。これは、カラム装填の増加とともに、吸着材表面上での高シアル酸化ExcR-Fc分子の蓄積をもたらした。後に、カラムは、生成物プール中の高シアル酸化糖型を回収するように溶出された。主要なプロセスパラメータ、すなわち、装填、負荷pH、および負荷伝導度の動作範囲を最適化するように、DoE研究が行われた。これらの研究の結果は、TMAEHiCap溶出液におけるTSAレベルが、調べられた設計空間内で、装填の増加、負荷pHの減少、および/または負荷伝導度の増加とともに増加したことを示した。他方で、生成物収率および溶出液HMWレベルは、同じ動作空間内で逆の傾向を示した。したがって、妥当なプロセス収率を維持しながら、生成物品質標的が達成されたことを確実にするように、動作範囲がカラム装填ならびに負荷pHおよび伝導度に対して確立された。加えて、負荷濃度および流速を最適化して、TMAEHiCap溶出液における生成物品質具体的にはHMWレベルを向上させるように、単一点実験もTMAEHiCapに行われた。最終的に、最悪の動作条件下でTMAEHiCapプロセスのロバスト性を試験するように、一点実験が行われた。これらの実行は、全体的なプロセス能力を試験するために、低いTSAレベルおよび高いHMWレベルすなわち、最悪の場合の負荷PQを有するパイロット規模材料を採用した。これらの実験の結果は、TMAEHiCapプロセスが、最悪の動作条件下でさえも一貫して機能し、全ての所定の品質標的を満たした生成物を送達したことを明確に実証した。6TMAEHICAPクロマトグラフィプロセスの説明1下降流において≦75cm/hrにて、pH8.0である50mMトリス/3MNaClの≧3CVを使用して、カラムが平衡化される。2下降流において≦150cm/hrにて、pH5.3である55mM酢酸塩の≧5CVを使用して、カラムが平衡化される。3下降流において負荷プールを用いて150~250cm/hrにて、カラムが150~180mg/mLの間まで装填される。[注記:負荷プールpH=5.3±0.2および伝導度=3.4±0.5mS/cm]4下降流において150~250cm/hrにて、pH5.3である55mM酢酸塩の3CVでカラムが洗浄される。5下降流において≦75cm/hrにて、pH5.3である50mM酢酸塩300mMNaClを使用して、カラムが溶出される。溶出収集が、溶出ブロックの開始時に即時に開始され、その後、溶出プールが8CV収集される。6下降流において≦150cm/hrにて、pH8.0である50mMトリス3MNaClの≧3CVで、カラムが揮散される。7下降流において≦150cm/hrにて、0.5NNaOHの≧3CVで、カラムが浄化される。8下降流において≦150cm/hrにて、pH2.5である50mM酢酸塩1MNaClの≧3CVで、カラムが浄化される。9下降流において≦150cm/hrにて、pH3.2である1ベンジルアルコール0.5M酢酸16mMNaOHの≧3CVで、カラムが保管される。図31は、TMAEHiCap上のExcR-Fcに対して開発された過負荷結合および溶出プロセスの代表的なクロマトグラムを示す。クロマトグラフィプロセスにおける異なるステップは、このクロマトグラムで明確に概説される。"