a変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する第1タバコ植物を準備し、b少なくとも1つの表現型形質を含有する第2タバコ植物を準備し、c第1タバコ植物と第2タバコ植物とを交配させてF1後代植物を得、d変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現のために該F1後代の種子を集め、e該種子を発芽させて、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下を伴うタバコ植物を得る工程を含んでなる、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下を伴うタバコ植物を生産するための育種方法。第1タバコ植物が、変異を有する内因性ニコチンデメチラーゼ遺伝子を含む、請求項1記載の方法。第1タバコ植物が含む変異が欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複または挿入である、請求項2記載の方法。第1タバコ植物が、ヌル変異を有するニコチンデメチラーゼ遺伝子を含む、請求項1記載の方法。内因性ニコチンデメチラーゼ遺伝子をサイレンシングする組換え遺伝子を含む、請求項1記載の方法。酵素活性の低下または改変を伴うニコチンデメチラーゼを含む、請求項1記載の方法。第1タバコ植物がトランスジェニック植物である、請求項1記載の方法。第1タバコ植物が、NicotianaafricanaNicotianaamplexicaulisNicotianaarentsiiNicotianabenthamianaNicotianabigeloviiNicotianacorymbosaNicotianadebneyiNicotianaexcelsiorNicotianaexiguaNicotianaglutinosaNicotianagoodspeediiNicotianagosseiNicotianahesperisNicotianaingulbaNicotianaknightianaNicotianamaritimaNicotianamegalosiphonNicotianamiersiiNicotiananesophilaNicotiananoctifloraNicotiananudicaulisNicotianaotophoraNicotianapalmeriNicotianapaniculataNicotianapetunioidesNicotianaplumbaginifoliaNicotianarepandaNicotianarosulataNicotianarotundifoliaNicotianarusticaNicotianasetchelliNicotianastocktoniiNicotianaeastiiNicotianasuaveolensまたはNicotianatrigonophyllaを含む、請求項1記載の方法。第1タバコ植物が、NicotianaamplexicaulisNicotianabenthamianaNicotianabigeloviiNicotianadebneyiNicotianaexcelsiorNicotianaglutinosaNicotianagoodspeediiNicotianagosseiNicotianahesperisNicotianaknightianaNicotianamaritimaNicotianamegalosiphonNicotiananudicaulisNicotianapaniculataNicotianaplumbaginifoliaNicotianarepandaNicotianarusticaNicotianasuaveolensまたはNicotianatrigonophyllaを含む、請求項8記載の方法。第1タバコ植物がNicotianatabacumである、請求項1記載の方法。第1タバコ植物が、オリエンタル、いぶしdarkタバコ、火力乾燥フルーキュアリングもしくは空気乾燥エアキュアリングタバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物である、請求項1記載の方法。第2タバコ植物がNicotianatabacumである、請求項1記載の方法。Nicotianatabacumが、BU64CC101CC200CC27CC301CC400CC500CC600CC700CC800CC900Coker176Coker319Coker371GoldCoker48CU263DF911GalpaoタバコGL26HGL350GL737GL939GL973HB04PK149K326K346K358K394K399K730KT200KY10KY14KY160KY17KY171KY907KY160LittleCrittendenMcNair373McNair944msKY14xL8NarrowLeafMadoleNC100NC102NC2000NC291NC297NC299NC3NC4NC5NC6NC606NC71NC72NC810NCBH129OXFORD207PeriqueタバコPVH03PVH09PVH19PVH50PVH51R610R630R711R712RG17RG81RGH4RGH51RGH4RGH51RS1410SP168SP172SP179SP210SP220SPG28SPG70SPH20SPNF3TN86TN90TN97TND94TND950TRMadoleVA309VA309またはVA359である、請求項11記載の方法。第2タバコ植物が、オリエンタル、いぶしdarkタバコ、火力乾燥フルーキュアリングもしくは空気乾燥エアキュアリングタバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物である、請求項1記載の方法。該表現型形質が、耐病性、高い収量、高い等級指標、乾燥性、乾燥の質、機械的収穫性、保持能holdingability、葉の質、丈、成熟度、柄のサイズ、または植物当たりの葉数を含む、請求項1記載の方法。雄性不稔体または工程bの植物との雄性不稔雑種を受粉させることを更に含む、請求項1記載の方法。工程eの発芽種子から得た植物を戻し交配または受粉させることを更に含む、請求項1記載の方法。a変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する第1タバコ植物を第2タバコ植物と交配させ、b該交配の後代タバコ植物を得、c後代タバコ植物からDNAサンプルを抽出し、d該DNAサンプルを、ニコチンデメチラーゼ遺伝子またはその断片にハイブリダイズするマーカー核酸分子と接触させ、e該変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現形質に関するマーカー補助育種法を行う工程を含む、タバコ植物内へニコチンデメチラーゼ欠損形質を育種するための方法。該マーカー補助育種法が、増幅断片長多型、制限断片長多型、ランダム増幅多型提示、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、またはタバコゲノムにおける標的化誘導性局所損傷targettedinducedlocallesionの利用を含む、請求項18記載の方法。NicotianaafricanaNicotianaamplexicaulisNicotianaarentsiiNicotianabenthamianaNicotianabigeloviiNicotianacorymbosaNicotianadebneyiNicotianaexcelsiorNicotianaexiguaNicotianaglutinosaNicotianagoodspeediiNicotianagosseiNicotianahesperisNicotianaingulbaNicotianaknightianaNicotianamaritimaNicotianamegalosiphonNicotianamiersiiNicotiananesophilaNicotiananoctifloraNicotiananudicaulisNicotianaotophoraNicotianapalmeriNicotianapaniculataNicotianapetunioidesNicotianaplumbaginifoliaNicotianarepandaNicotianarosulataNicotianarotundifoliaNicotianarusticaNicotianasetchelliNicotianastocktoniiNicotianaeastiiNicotianasuaveolensおよびNicotianatrigonophyllaよりなる群から選ばれるタバコ植物のいずれかをそれ自身と又は第2の異なるタバコと交配させることを含む、タバコ種子の生産方法。変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する第1タバコ植物を第2の異なるタバコ植物と交配させることを含む、雑種タバコ種子の生産方法を含む、請求項20記載の生産方法。交配が、a変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物と第2の異なるタバコ植物との交配から得られた種子を植え、b該種子からのタバコ植物を成長させて、該植物を開花させ、c変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の花を第2のタバコ植物からの花粉で受粉させ、あるいは第2のタバコ植物の花を、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の花からの花粉で受粉させ、d該受粉から得られた種子を収穫する工程を含む、請求項21記載の生産方法。a変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物またはその成分を準備し、bタバコ植物育種技術を用いて育種材料源として該植物または成分を使用することを含む、タバコ育種計画においてタバコ植物を開発するための方法。該植物育種技術が、集団選抜bulkselection、戻し交配、自家受粉、移入交雑、系統選抜、純系選抜、半数体/倍加半数体育種または単粒系統法を含む、請求項23記載の方法。請求項1、18、20または23のいずれか1項に従い製造されたタバコ植物またはその成分。変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の生理学的および形態学的特徴のすべてを発現しうるタバコ植物を再生する、請求項1、18、20または23のいずれか1項に従い生産された植物のいずれかから得られた再生可能なタバコ細胞の組織培養。再生可能な細胞が、胚、分裂細胞、種子、花粉、葉、根、根端または花であり、あるいはそれらに由来するプロトプラストまたはカルスである、請求項26記載の組織培養。a請求項1、18、20または23のいずれか1項に従い生産されたタバコ植物を準備し、b該タバコ植物からタバコ製品を製造することを含んでなる、タバコ製品の製造方法。該タバコ製品が、乾燥した葉または茎stemである、請求項28記載の製造方法。該タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項28記載の製造方法。該タバコ製品が湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコまたはビーディbidiである、請求項28記載のタバコ製品。a図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有する第1タバコ植物を準備し、b少なくとも1つの表現型形質を含有する第2タバコ植物を準備し、c第1タバコ植物を第2タバコ植物と交配させてF1後代植物を得、d前記の修飾された属性の該F1後代の種子を集め、e該種子を発芽させて、前記の修飾された属性を有するタバコ植物を得る工程を含んでなる、修飾された属性を有するタバコ植物を生産するための育種方法。第1タバコ植物が、変異を含む、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む、請求項32記載の方法。第1タバコ植物が、欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複または挿入である変異を含む、請求項33記載の方法。第1タバコ植物が、ヌル変異を含む、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む、請求項32記載の方法。第1タバコ植物が、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子の発現をサイレンシングする組換え遺伝子を含む、請求項32記載の方法。第1タバコ植物は、低下または変化した酵素活性を有するポリペプチドをコードする、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる内因性核酸分子を含む、請求項32記載の方法。第1タバコ植物がトランスジェニック植物である、請求項32記載の方法。第1タバコ植物が、NicotianaafricanaNicotianaamplexicaulisNicotianaarentsiiNicotianabenthamianaNicotianabigeloviiNicotianacorymbosaNicotianadebneyiNicotianaexcelsiorNicotianaexiguaNicotianaglutinosaNicotianagoodspeediiNicotianagosseiNicotianahesperisNicotianaingulbaNicotianaknightianaNicotianamaritimaNicotianamegalosiphonNicotianamiersiiNicotiananesophilaNicotiananoctifloraNicotiananudicaulisNicotianaotophoraNicotianapalmeriNicotianapaniculataNicotianapetunioidesNicotianaplumbaginifoliaNicotianarepandaNicotianarosulataNicotianarotundifoliaNicotianarusticaNicotianasetchelliNicotianastocktoniiNicotianaeastiiNicotianasuaveolensまたはNicotianatrigonophyllaを含む、請求項32記載の方法。第1タバコ植物がNicotianatabacumである、請求項32記載の方法。第1タバコ植物が、オリエンタル、いぶしdarkタバコ、火力乾燥フルーキュアリングもしくは空気乾燥エアキュアリングタバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物である、請求項32記載の方法。第2タバコ植物がNicotianatabacumである、請求項32記載の方法。Nicotianatabacumが、BU64CC101CC200CC27CC301CC400CC500CC600CC700CC800CC900Coker176Coker319Coker371GoldCoker48CU263DF911GalpaoタバコGL26HGL350GL737GL939GL973HB04PK149K326K346K358K394K399K730KT200KY10KY14KY160KY17KY171KY907KY160LittleCrittendenMcNair373McNair944msKY14xL8NarrowLeafMadoleNC100NC102NC2000NC291NC297NC299NC3NC4NC5NC6NC606NC71NC72NC810NCBH129OXFORD207PeriqueタバコPVH03PVH09PVH19PVH50PVH51R610R630R711R712RG17RG81RGH4RGH51RGH4RGH51RS1410SP168SP172SP179SP210SP220SPG28SPG70SPH20SPNF3TN86TN90TN97TND94TND950TRMadoleVA309VA309またはVA359である、請求項32記載の方法。第1タバコ植物が、オリエンタル、いぶしdarkタバコ、火力乾燥フルーキュアリングもしくは空気乾燥エアキュアリングタバコ、バージニア、またはバーレータバコ植物である、請求項32記載の方法。該表現型形質が、耐病性、高い収量、高い等級指標、乾燥性、乾燥の質、機械的収穫性、保持能holdingability、葉の質、丈、植物成熟度、柄のサイズ、または植物当たりの葉数を含む、請求項32記載の方法。雄性不稔体または工程bの植物との雄性不稔雑種を受粉させることを更に含む、請求項32記載の方法。工程eの発芽種子から得た植物を戻し交配または受粉させることを更に含む、請求項32記載の方法。a図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有する第1タバコ植物を、第2タバコ植物と交配させ、b該交配の後代タバコ植物を得、c後代タバコ植物からDNAサンプルを抽出し、d該DNAサンプルを、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列またはそれらの断片にハイブリダイズするマーカー核酸分子と接触させ、e修飾された属性に関するマーカー補助育種法を行う工程を含んでなる、タバコ植物内へ属性を育種するための方法。該マーカー補助育種法は、増幅断片長多型、制限断片長多型、ランダム増幅多型提示、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、またはタバコゲノムにおける標的化誘導性局所損傷targettedinducedlocallesionの利用を含む、請求項48記載の方法。NicotianaafricanaNicotianaamplexicaulisNicotianaarentsiiNicotianabenthamianaNicotianabigeloviiNicotianacorymbosaNicotianadebneyiNicotianaexcelsiorNicotianaexiguaNicotianaglutinosaNicotianagoodspeediiNicotianagosseiNicotianahesperisNicotianaingulbaNicotianaknightianaNicotianamaritimaNicotianamegalosiphonNicotianamiersiiNicotiananesophilaNicotiananoctifloraNicotiananudicaulisNicotianaotophoraNicotianapalmeriNicotianapaniculataNicotianapetunioidesNicotianaplumbaginifoliaNicotianarepandaNicotianarosulataNicotianarotundifoliaNicotianarusticaNicotianasetchelliNicotianastocktoniiNicotianaeastiiおよびNicotianasuaveolensよりなる群から選ばれる第1タバコ植物を、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有する第2タバコ植物と交配させることを含む、タバコ種子の生産方法。第2タバコ植物がNicotianatabacumである、請求項50記載の生産方法。Nicotianatabacumが、BU64CC101CC200CC27CC301CC400CC500CC600CC700CC800CC900Coker176Coker319Coker371GoldCoker48CU263DF911GalpaoタバコGL26HGL350GL737GL939GL973HB04PK149K326K346K358K394K399K730KT200KY10KY14KY160KY17KY171KY907KY160LittleCrittendenMcNair373McNair944msKY14xL8NarrowLeafMadoleNC100NC102NC2000NC291NC297NC299NC3NC4NC5NC6NC606NC71NC72NC810NCBH129OXFORD207PeriqueタバコPVH03PVH09PVH19PVH50PVH51R610R630R711R712RG17RG81RGH4RGH51RGH4RGH51RS1410SP168SP172SP179SP210SP220SPG28SPG70SPH20SPNF3TN86TN90TN97TND94TND950TRMadoleVA309VA309またはVA359である、請求項51記載の生産方法。交配が、a修飾された属性を有するタバコ植物と第2の異なるタバコ植物との交配から得られた種子を植え、b該種子からのタバコ植物を成長させて、該植物を開花させ、c修飾された属性を有するタバコ植物の花を第2のタバコ植物からの花粉で受粉させ、あるいは第2のタバコ植物の花を、修飾された属性を有するタバコ植物の植物からの花粉で受粉させ、d該受粉から得られた種子を収穫する工程を含んでなる、請求項51記載の生産方法。a図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸分子の変異体遺伝子発現を含む修飾された属性を有するタバコ植物またはその成分を準備し、bタバコ植物育種技術を用いて育種材料源として該植物または植物成分を使用することを含んでなる、タバコ育種計画においてタバコ植物を開発するための方法。該植物育種技術が、集団選抜bulkselection、戻し交配、自家受粉、移入交雑、系統選抜、純系選抜、半数体/倍加半数体育種または単粒系統法を含む、請求項54記載の方法。請求項32、48または54のいずれか1項に従い製造されたタバコ植物またはその成分。修飾された属性を有するタバコ植物の生理学的および形態学的特徴のすべてを発現しうるタバコ植物を再生する、請求項32、48、50または54のいずれか1項に従い生産された植物のいずれかから得られた再生可能なタバコ細胞の組織培養。再生可能な細胞が、胚、分裂細胞、種子、花粉、葉、根、根端または花であり、あるいはそれらに由来するプロトプラストまたはカルスである、請求項57記載の組織培養。a請求項32、48、50または54のいずれか1項に従い生産されたタバコ植物を準備し、b該タバコ植物からタバコ製品を製造することを含んでなる、タバコ製品の製造方法。該タバコ製品が、乾燥した葉または茎stemである、請求項59記載の製造方法。該タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項59記載の製造方法。該タバコ製品が湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコまたはビーディbidiである、請求項59記載のタバコ製品。図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列に対して実質的に同一である核酸配列を含んでなる単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列に対して少なくとも70同一である核酸配列を含んでなる、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が構成的またはエチレンもしくは老化誘導性である、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が、図1、図3および4、図10~158、図160A~160E、図162~170ならびに図1721~17219に示すアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードしている、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が異種遺伝子に機能しうる形で連結されている、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。該核酸配列が、誘導性、構成的、病原体もしくは創傷誘導性、環境もしくは発生調節性または細胞もしくは組織特異的プロモーターに機能しうる形で連結されている、請求項63記載の単離された遺伝的マーカー。図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含んでなり、該核酸配列によりコードされるポリペプチドの発現を導きうる発現ベクター。植物または植物成分において発現される図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる単離された核酸配列を含んでなる該植物または該植物成分。該植物または植物成分がNicotiana種である、請求項71記載の植物または植物成分。該Nicotiana種が、表8に示すNicotiana種の群から選ばれる、請求項72記載の植物または植物成分。該植物成分が葉、茎stemまたは種子である、請求項71記載の植物または植物成分。該葉が、乾燥したタバコ葉である、請求項74記載の植物または植物成分。請求項71記載の植物または植物成分を含んでなるタバコ製品。該タバコ製品が無煙タバコ製品である、請求項76記載のタバコ製品。該タバコ製品が湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコまたはビーディbidiである、請求項76記載のタバコ製品。請求項74記載の発芽種子から生産された植物。植物細胞における内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルまたは酵素活性を低下させることを含んでなる、該植物細胞における構成的またはエチレン誘導性もしくは老化誘導性タバコポリペプチドの発現または酵素活性を低下させるための方法。該タバコポリペプチドがp450である、請求項80記載の方法。該植物細胞がNicotiana種である、請求項80記載の方法。該Nicotiana種が、表8に示すNicotiana種の群から選ばれる、請求項82記載の方法。該内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることが、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列のアンチセンス核酸分子をコードするトランスジーンを該植物細胞において発現させることを含む、請求項80記載の方法。該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることが、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含むトランスジーンを発現させることを含み、該トランスジーンが、該植物細胞において構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの二本鎖RNA分子をコードしている、請求項80記載の方法。該内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることが、該植物細胞における該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの共抑制cosuppressionを含む、請求項80記載の方法。該内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを低下させることが、該植物細胞においてドミナントネガティブ遺伝子産物を発現させることを含む、請求項80記載の方法。該内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドが、図1、図3および4、図10~158、図160A~160E、図162~170ならびに図1721~17219に示すアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列をコードする遺伝子内に変異を含む、請求項87記載の方法。該発現の低下が、転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルにおいて生じる、請求項80記載の方法。植物細胞における内因性構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルまたは酵素活性を上昇させることを含んでなる、該植物細胞における構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドの発現または酵素活性を上昇させるための方法。該植物細胞がNicotiana種である、請求項90記載の方法。該Nicotiana種が、表8に示すNicotiana種の群から選ばれる、請求項91記載の方法。該構成的またはエチレンもしくは老化誘導性タバコポリペプチドのレベルを上昇させることが、図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す核酸配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含むトランスジーンを該植物細胞において発現させることを含む、請求項90記載の方法。該発現の低下が、転写レベル、翻訳レベルまたは翻訳後レベルにおいて生じる、請求項90記載の方法。詳細な説明伝統的には、いずれかの新規の望ましい植物生殖質の開発は多数の段階を含むものであった。植物育種は、現在の生殖質の問題および弱点の分析および明確化、計画目標の確立ならびに特定の育種対象の明確化から開始される。次の段階は、計画目標に合致した形質を有する生殖質の選択である。該目標は、親生殖質からの望ましい形質の、改良された組合せを、単一の品種において組合せることである。望ましい形質には、例えば、より高い種収量、耐病性、耐虫性、干ばつおよび熱に対する耐性、ならびにより良好な農学的品質が含まれる。しかし、販売および流通の最終段階につながるこれらの過程には、最初の交配を行ってから6~12年間を要しうる。したがって、新規品種の開発は、厳密な将来的計画、資源の効率的利用および最低限の方針変更を要する、時間のかかるプロセスである。現代の植物育種には遺伝的形質転換による植物品種の改良が益々重要になっている。商業的な関心が持たれうる遺伝子、例えば、耐病性、耐虫性または品質改良の特定の望ましい植物形質を付与する遺伝子が、種々の遺伝子導入技術により作物種に組込まれうる。遺伝子発現を操作しうることは、形質転換植物における新規特性を得るための手段を提供する。いくつかの場合には、高い又は上昇したレベルの遺伝子発現が望ましいであろう。例えば、それ自体が耐病性、収量、香味または任意の他の商業的に望ましい植物属性を最大にするタンパク質の産生を増強することが望ましい。同様に、例えば遺伝子サイレンシングによる内因性遺伝子発現の調節は、より貴重な植物または植物製品を与えうる。タバコの熟成または乾燥キュアリング中に、エチレン誘導性または老化関連遺伝子であると特定された遺伝子例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288の配列を有するもののいずれかの活性化、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、最終産物の品質特性例えば、耐病性、耐虫性、品質の改良、香りの修飾、香味の修飾などに影響を及ぼすテルペノイド、ポリフェノール、アルカロイドなどを含む多数の二次代謝産物の形成に関与するそれらの代謝経路に影響を及ぼしうる。本明細書中に特定されている遺伝子により同様に影響を受けるものとしては、老化過程で蓄積する乾物の率およびタイプまたは老化過程の植物内の乾物の分配に関連した代謝経路が挙げられうる。デンプン蓄積、リグニン形成、セルロース析出および糖輸送の率およびタイプにおける変化が示されうるであろう。本明細書中に特定されている遺伝子の制御は、老化速度、葉内および単一植物の葉間の老化の均一性ならびに人工的または自然手段による老化の誘導の決定に関与するそれらの代謝経路にも影響を及ぼしうる。本明細書中に特定されている遺伝子を刺激または活性化する老化誘導性物質または作用因子には、例えば、化学物質、例えば薄い過酸化物、殺虫剤、除草剤、成長調節物質、熱処理、創傷、またはガス、例えばオゾン、および二酸化炭素の濃度上昇が含まれる。タバコの構成的に発現される又はエチレンもしくは老化により誘導される配列の特定本発明においては、変換体converterおよび非変換体Nicotiana系統のNicotiana組織からRNAを抽出した。ついで、抽出されたRNAをcDNAの作製に使用した。ついで本発明の核酸配列を、2つの方法を用いて作製した。第1の方法においては、ポリA富化RNAを植物組織から抽出し、cDNAを逆転写PCRにより作製した。ついで該一本鎖cDNAを使用して、縮重プライマーおよびオリゴdプライマーを用いてp450特異的PCR集団を得た。該プライマー設計は、他の植物のp450遺伝子配列の高度に保存されたモチーフに基づくものであった。特異的縮重プライマーの具体例は特許出願公開US20040111759A1、US20040117869A1およびUS20040103449A1の図1に記載されている該特許出願公開を参照により本明細書に組み入れることとする。適当なサイズのインサートを含有するプラスミドからの断片の配列を更に分析した。これらのインサートのサイズは、典型的には、使用するプライマーに応じて約300~約800ヌクレオチドの範囲である。第2の方法においては、まず、cDNAライブラリーを構築した。該プラスミド内のcDNAを使用して、縮重プライマーおよびT7プライマーを用いてp450特異的PCR集団を得た。第1の方法の場合と同様に、適当なサイズのインサートを含有するプラスミドからの断片の配列を更に分析した。高レベルのノルニコチンを産生することが知られているNicotiana植物系統変換体converterおよび低レベルのノルニコチンを有する植物系統を出発材料として使用することが可能である。ついで葉を植物から摘出し、エチレンで処理して、本明細書で定義されているp450酵素活性を活性化することが可能である。当技術分野で公知の技術を用いて、全RNAを抽出する。ついで、図161に記載のとおりのオリゴdプライマー配列番号2260と共にPCRRTPCRを用いて、cDNA断片を作製することが可能である。ついで、本明細書中の実施例に更に詳しく記載されているとおり、cDNAライブラリーを構築することが可能である。p450型酵素の保存領域を縮重プライマーの鋳型として使用した。それらの具体例を図161に示す。縮重プライマーを使用して、p450特異的バンドをPCRにより増幅した。p450様酵素を示すバンドをDNA配列決定により特定した。BLAST検索、アライメントまたは適当な候補を特定するための他の手段を用いて、PCR断片を特徴づけした。特定された断片からの配列情報を用いて、PCRプライマーを作製した。cDNAライブラリ-内のプラスミドプライマーと組合されたこれらのプライマーを使用して、完全長p450遺伝子をクローニングした。得られたすべての断片クローンおよびいくつかの場合には完全長クローンに関する示差的発現を調べるために、ラージスケールサザン逆分析を行った。本発明のこの態様においては、すべてのクローン化インサートをスクリーニングするために、クローン化DNA断片にハイブリダイズするプローブとして、種々の組織からの標識された全cDNAを使用して、これらのラージスケールリバースサザンアッセイを行うことが可能である。クローン化p450断片および完全長クローンを特徴づけるために、非放射性および放射性P32ノーザンブロットアッセイも用いた。所望のレベルのp450酵素を発現する植物細胞が得られたら、当技術分野でよく知られた方法および技術を用いて該細胞から植物組織および全植物を再生させることが可能である。ついで該再生植物を通常の手段により再生させ、通常の植物育種技術を用いて該導入遺伝子を他の株および栽培品種に導入することが可能である。エチレン誘導性または老化関連遺伝子、例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288において特定されているものは、種々のタバコ製品にとって重要なタバコ葉の品質パラメーターの重要な決定因子である酵素をコードしうる。該タバコ製品には、湿性もしくは乾燥かぎタバコ、噛みタバコ、巻きタバコ製品、葉巻製品、シガリーロ、パイプタバコ、ビーディbidiおよび同様の喫煙製品が含まれる。葉の品質パラメーターには、視覚的属性、例えば色、表面規則性、テクスチャーまたは斑入りにより示される構造的または物理的特性;葉身中骨の比、油性度oiliness、巻きタバコ充填能、かさ密度、水分保持能および柔軟性;香味、芳香、発酵能、枯上がりburn速度、枯上がりburn温度、人工香味剤の吸収および放出に関連した化学的または生化学的形質;ならびにタールまたは粒状物、アルカロイドおよび他の属性を含むタバコ成分の生成が含まれうる。これらのエチレン誘導性または老化関連遺伝子から生じる酵素反応は、タバコ葉の収量および品質に影響を及ぼす病原体または昆虫相互作用に影響を及ぼす二次代謝産物をも産生しうる。例えば、WagnerらNatureBiotechnology193713742001は、p450ヒドロキシラーゼ遺伝子の抑制が、アブラムシ耐性に影響を及ぼす二次代謝産物であるセムブラチエンオールcembratieneolの蓄積を著しく増強することを示した。抗体の生成ペプチドのアミノ酸配列を誘導し、他のクローンとの対比において特有であり抗原性であるペプチド領域を選択することにより、ペプチド特異的抗体を製造した。担体タンパク質に結合した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を産生させた。これらの抗体を使用して、植物組織に関してウエスタンブロット分析または他の免疫学的方法を行った。また、ペプチドのアミノ酸配列を誘導し、他のクローンとの対比において特有であり潜在的に抗原性であるペプチド領域を選択することにより、いくつかの完全長クローンに関して、ペプチド特異的抗体を製造した。担体タンパク質に結合した合成ペプチドに対して、ウサギ抗体を産生させた。これらの抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。遺伝子発現のダウンレギュレーションおよび酵素活性の改変ポリペプチドの発現の低下を伴う植物を、標準的な遺伝子サイレンシング法総説としては、ArndtandRankGenome407857971997TurnerおよびSchuchJournalofChemicalTechnologyandBiotechnology758698822000ならびにKlinkおよびWolniakJournalofPlantGrowthRegulation193713842000を参照されたいにより作製した。特に、タバコニコチンデメチラーゼ核酸配列例えば、配列番号4、5、7、8および9、またはそれらの断片、例えば配列番号1および62の配列および実質的に同一な核酸配列例えば、配列番号188の配列を使用して、任意のNicotiana種におけるタバコ表現型またはタバコ代謝産物、例えばノルニコチンを改変することが可能である。タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低下は、例えばRNA干渉RNAiSmithらNature4073193202000FireらNature3913063111998WaterhouseらPNAS9513959139641998StalbergらPlantMolecularBiology236716831993BrignettiらEMBOJ17673967461998AllenらNatureBiotechnology22155915662004;ウイルス誘導性遺伝子サイレンシングVIGSBaulcombeCurrentOpinionsinPlantBiology21091131999CogoniandMacinoGenesDev106386432000NgelbrechtらPNAS9110502105061994センス配向で植物内因性遺伝子を導入することによる標的遺伝子のサイレンシングJorgensenらPlantMolBiol319579731996;アンチセンス遺伝子の発現;相同組換えOhlらHomologousRecombinationandGeneSilencinginPlantsKluwerDordrechtTheNetherlands1994;CreloxQinらPNAS91170617101994KoshinskyらThePlantJournal237157222000ChouらPlantandAnimalGenomeVIIConferenceAbstractsSanDiegoCA1721January1999;遺伝子トラップおよびTDNAタギングBurnsらGenesDev8108711051994SpradlingらPNAS9210824108301995SkarnesらBioTechnology88278311990SundaresanらGenesDev9179718101995;ならびにタバコポリペプチドの発現のダウンレギュレーションまたはその酵素活性の低下を引き起こす、科学分野において利用可能なその他の可能な遺伝子サイレンシング系のいずれかを用いて達成されうる。本明細書中で更に詳しく説明するとおり、本明細書中に記載の核酸配列のいずれかは、本明細書に記載の技術および当技術分野において見出される他の技術を用いてダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされうる。典型的な方法を以下に更に詳しく説明する。RNA干渉RNA干渉RNAiは、植物などの多数の生物における強力かつ特異的な翻訳後遺伝子サイレンシングを誘導するために一般に適用可能な方法である例えば、BosherらNatCellBiol2E31362000およびTavernarakisらNatGenetics241801832000を参照されたい。RNAiは、細胞内または細胞外環境内への、部分的または完全な二本鎖特性を伴うRNAの導入を含む。抑制性RNAを産生するよう標的遺伝子例えば、タバコニコチンデメチラーゼの部分からのヌクレオチド配列が選択される点で、抑制は特異的である。選択された部分は一般には標的遺伝子のエキソンを含むが、選択された部分は非翻訳領域UTRおよびイントロン例えば、配列番号7の配列、または所望の植物遺伝子からの核酸配列、例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列をも含みうる。例えば、二本鎖形成能を有するRNAを産生する形質転換ベクターを構築するためには、2つの核酸配列一方はセンス配向、もう一方はアンチセンス配向を、機能しうる形で連結し、強力なウイルスプロモーター、例えばCaMV35SまたはキャッサバブラウンストリークウイルスcassavabrownstreakvirusCBSVから単離されたプロモーターの制御下に配置することが可能である。しかし、内因性プロモーター、例えば配列番号8の配列を有するニコチンデメチラーゼプロモーター、または転写を駆動するその断片の使用も望ましいであろう。そのような構築物中に含まれるタバコニコチンデメチラーゼ核酸配列の長さは、望ましくは、少なくとも25ヌクレオチドであるが、完全長までのタバコニコチンデメチラーゼを含む配列を含みうる。二本鎖形成能を有するRNAを産生する構築物は、アグロバクテリウムに媒介される形質転換ChuangらProcNatlAcadSciUSA97498549902000により、植物例えば、タバコ植物のゲノム内に導入されて、タバコニコチンデメチラーゼにおける特異的かつ遺伝可能な遺伝的干渉を引き起こしうる。該二本鎖RNAは細胞の中へすなわち、細胞内に直接的に導入されることも可能であり、あるいは細胞外において、例えば、該二本鎖RNAを含有する溶液に種子、実生または植物を浸けることにより導入されうる。運搬された二本鎖RNA物質の量に応じて、RNAiは、標的遺伝子に関する機能の部分的または完全な喪失をもたらしうる。標的細胞の少なくとも99における遺伝子発現の低下または喪失が得られうる。一般には、より低い量の注入物質、およびdsRNAの投与後の、より長い時間が、細胞の、より小さな割合における抑制を引き起こす。RNAiにおいて使用するRNAは重合リボヌクレオチドの1以上の鎖を含むことが可能であり、それは、リン酸糖バックボーンまたはヌクレオシドに対する修飾を含みうる。該二本鎖構造は、単一の自己相補的RNA鎖により又は2つの相補的RNA鎖により形成されることが可能であり、RNA二本鎖形成は細胞の内部または外部で開始されうる。該RNAは、少なくとも1コピー細胞の運搬を可能にする量で導入されうる。しかし、より多い量例えば、少なくとも5、10、100、500または1000コピー細胞の二本鎖物質は、より効率的な抑制をもたらしうる。該RNAの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝的抑制のために標的化される点で、抑制は配列特異的である。抑制のためには、標的遺伝子の部分と同一のヌクレオチド配列を含有するRNAが好ましい。標的配列と比較した場合に挿入、欠失および単点変異を有するRNA配列も抑制に有効でありうる。例えば、配列同一性は、当技術分野で公知のアライメントアルゴリズムおよび該ヌクレオチド配列間の差の算出により最適化されうる。あるいは、該RNAの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列として機能的に定められうる。また、RNAiに使用されるRNAはinvivoまたはinvitroで合成されうる。例えば、該細胞内の内因性RNAポリメラーゼはinvivoでの転写をもたらすことが可能であり、あるいはクローン化RNAポリメラーゼはinvivoまたはinvitroでの転写に使用されうる。invivoでのトランスジーンまたは発現構築物からの転写のためには、RNA鎖を転写させるために調節領域が使用されうる。三本鎖干渉タバコ遺伝子の調節領域例えば、プロモーターまたはエンハンサー領域に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞内での該タバコ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによっても、内因性タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子発現、または所望の植物遺伝子からの核酸断片例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列の発現がダウンレギュレーションされうる全般的には、HeleneAnticancerDrugDes65695841991HeleneらAnnNYAcadSci66027361992およびMaherBioassays148078151992。転写の抑制のための三重らせんの形成において使用される核酸分子は、好ましくは、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般には相当な大きさのプリンまたはピリミジン伸長が二重らせんの一方の鎖上に存在することを要するフーグスティーン型塩基対形成則による三重らせん形成の促進をもたらすはずである。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づくものでありうる。これは、生じる三重らせんの3本の会合鎖を横切るTATおよびCGCトリプレットを与えるであろう。ピリミジンに富むピリミジンリッチ分子は、二重らせんの一本鎖のプリンリッチ領域に対する塩基相補性を、その鎖に対して平行配向で与える。また、プリンリッチ例えば、G残基の伸長を含有する核酸分子が選択されうる。これらの分子は、GC対に富むDNA二重らせんと共に三重らせんを形成し、この場合、該プリン残基の大多数は標的二重らせんの一本鎖上に位置して、三重らせん内の三本鎖を横切るCGCトリプレットを与える。あるいは、三重らせん形成のために標的化されうる潜在的配列を、スイッチバックswitchback核酸分子を生成させることにより増加させることが可能である。スイッチバック分子は、交互の53、35様態で合成される。これにより、それらは、二重らせんの最初の1つの鎖と塩基対形成し、ついで他方と塩基対形成して、二重らせんの一方の鎖上の相当な大きさのプリンまたはピリミジン伸長の存在の必要性を排除する。リボザイムリボザイムは、酵素として作用するRNA分子であり、他のRNA分子を切断するよう設計されうる。リボザイムは、実質的に任意の標的RNAと特異的に対形成しホスホジエステルバックボーンを特定の位置で切断して標的RNAを機能的に不活性化するよう設計されうる。この過程においてはリボザイム自体は消費されず、複数のコピーのmRNA標的分子を切断するよう触媒的に作用しうる。したがって、リボザイムは、タバコニコチンデメチラーゼの発現をダウンレギュレーションするための手段としても使用されうる。標的RNA特異的リボザイムの設計および使用はHaseloffらNature3345855911988に記載されている。好ましくは、リボザイムは、該リボザイムの活性部位の両側に、標的配列例えば、タバコニコチンデメチラーゼ、または所望の植物遺伝子からの核酸断片、例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列に相補的な少なくとも20個の連続的ヌクレオチドを含む。また、RNA切断活性をアンチセンスRNAに付与して該アンチセンス構築物の有効性を増強するために、リボザイム配列をアンチセンスRNA内に含有させることも可能である。相同組換え遺伝子置換技術は、与えられた遺伝子の発現をダウンレギュレーションするためのもう1つの望ましい方法である。遺伝子置換技術は相同組換えに基づくものであるSchnableらCurrOpinionsPlantBiol11231291998。関心のある酵素例えば、タバコニコチンデメチラーゼ、または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列によりコードされるポリペプチドの核酸配列を、酵素機能を低下させるために変異誘発例えば、挿入、欠失、重複または置換により操作することが可能である。ついで、改変された配列をゲノム内に導入して、相同組換えにより既存遺伝子例えば、野生型遺伝子を該配列で置換することが可能であるPuchtaらProcNatlAcadSciUSA93505550601996およびKempinらNature3898028031997。あるいは、内因性タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子は、デメチラーゼ活性を有さない遺伝子例えば、配列番号188の配列で置換されうる。共抑制遺伝子発現のサイレンシングのためのもう1つの望ましい方法は共抑制cosuppressionセンス抑制とも称されるである。この技術は、センス配向で配置された核酸例えば、所望の植物遺伝子からの核酸断片、例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列の導入を含むものであり、標的遺伝子の転写を有効に阻止することが示されている例えば、NapoliらPlantCell22792891990およびJorgensenら米国特許第5034323号を参照されたい。一般には、センス抑制は、導入された配列の転写を含む。しかし、導入された配列がコード配列自体を含有しないが、イントロンもしくは非翻訳配列または他のそのような配列が、抑制すべき内因性遺伝子の一次転写産物中に存在する配列と実質的に同一である場合にも、共抑制が生じうる。導入される配列は、一般には、抑制のために標的化される内因性遺伝子と実質的に同一である。そのような同一性は典型的には約50より大きいが、より高い同一性例えば、80または更には95が好ましい。なぜなら、それらはより有効な抑制を引き起こすからである。共抑制の効果は、相同性または実質的な相同性を示す類似遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に対して適用されうる。1つの植物からの遺伝子からのセグメントは、例えば異なる植物種における相同遺伝子の発現を抑制するために直接的に使用されうる。センス抑制においては、導入配列は、絶対的というほどの同一性は要求されず、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAとの対比において完全長である必要はない。完全長より短い配列における、より高い配列同一性は、より低い同一性の、より長い配列を補償する。さらに、導入される配列は、同じイントロンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、非コードセグメントの同一性は同様に有効でありうる。少なくとも50塩基対の配列が好ましく、より長い導入配列が好ましい例えば、Jorgensenら米国特許第5034323号に記載されている方法を参照されたい。アンチセンス抑制アンチセンス技術においては、所望の植物遺伝子からの核酸セグメント例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列をクローニングし、発現制御領域に機能しうる形で連結して、RNAのアンチセンス鎖が合成されるようにする。ついで該構築物を植物内に形質転換し、RNAのアンチセンス鎖を産生させる。植物細胞においては、アンチセンスRNAは遺伝子発現を抑制することが示されている。アンチセンス抑制において導入すべき核酸セグメントは、一般には、抑制すべき内因性遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるが、同一である必要はない。本明細書に開示されているタバコニコチンデメチラーゼの核酸配列は、標的遺伝子に対して相同性または実質的な相同性を示す遺伝子ファミリー内の他のタンパク質に対して該抑制効果が適用されるように設計されたベクター内に含まれうる。1つの植物からの遺伝子からのセグメントは、例えば異なるタバコ品種における相同遺伝子の発現を抑制するために直接的に使用されうる。導入される配列は、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAとの対比において完全長である必要はない。一般には、より短い配列の使用を補償するために、より高い相同性が用いられうる。さらに、導入される配列は、同じイントロンまたはエキソンパターンを有する必要はなく、非コードセグメントの相同性は同様に有効であろう。一般には、そのようなアンチセンス配列は、通常、少なくとも15塩基対、好ましくは約15~200塩基対、より好ましくは200~2000塩基対またはそれ以上の長さであろう。該アンチセンス配列は、抑制すべき遺伝子の全部または一部に対して相補的でありうる。当業者に理解されるとおり、アンチセンス配列が結合する個々の部位およびアンチセンス配列の長さは、所望の抑制の度合およびアンチセンス配列の特有性によって異なるであろう。植物の負調節性アンチセンスヌクレオチド配列を発現する転写構築物は、転写の方向に、プロモーター、センス鎖上でアンチセンスRNAをコードする配列、および転写終結領域を含む。アンチセンス配列は、例えばvanderKrolらRodermelらMolらWeigelおよびNilssonCheungらならびにShewmakerらに記載されているとおりに構築し発現させることが可能である。ドミナントネガティブ体タバコ遺伝子産物のドミナントネガティブ遺伝子産物をコードするトランスジーンを発現するトランスジェニック植物は、該トランスジーンが該トランスジェニック植物におけるタバコ遺伝子産物をダウンレギュレーションすることを示すために、人工的環境において又は圃場においてアッセイされうる。ドミナントネガティブトランスジーンは当技術分野で公知の方法に従い構築される。典型的には、ドミナントネガティブ遺伝子は、過剰発現されると野生型酵素の活性を損なうタバコ遺伝子産物の変異負調節性ポリペプチドをコードする。変異体タバコ遺伝子産物の発現または酵素活性の低下を伴う植物は、標準的な変異法を用いることによっても作製されうる。そのような変異誘発法には、限定的なものではないが、エチルメチルスルファートでの種子の処理HilderingおよびVerkerkInTheuseofinducedmutationsinplantbreedingPergamonpresspp3173201965またはUV照射、X線および高速中性子照射例えば、VerkerkNethJAgricSci191972031971およびPoehlmanBreedingFieldCropsVanNostrandReinholdNewYork1987を参照されたい、トランスポゾンの使用Fedoroffら1984米国特許第4732856および米国特許第5013658号ならびにTDNA挿入法Hoekemaら1983米国特許第5149645号が含まれる。タバコ遺伝子内に存在しうる変異のタイプには、例えば点変異、欠失、挿入、重複および逆位が含まれる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコード領域内に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域およびイントロンまたは非翻訳領域内の変異も望ましいであろう。例えば、TDNA挿入変異誘発は、遺伝子の発現をダウンレギュレーションする、タバコ遺伝子内の挿入変異を作製するために用いられうる。理論的には、任意の与えられた遺伝子における挿入を95の確率で得るためには、約100000個の独立したTDNA挿入が必要であるMcKinnetPlantJ86136221995およびForsthoefelらAustJPlantPhysiol193533661992。植物のTDNAタグ付き系統は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR分析を用いてスクリーニングされうる。例えば、1つのプライマーをTDNAの一方の末端に対して設計し、もう1つのプライマーを、目的の遺伝子に対して設計することが可能であり、両方のプライマーを該PCR分析に使用することが可能である。PCR産物が全く得られない場合には、関心のある遺伝子内に挿入は存在しない。これに対して、PCR産物が得らた場合には、関心のある遺伝子内に挿入が存在する。変異タバコ遺伝子産物の発現は、標準的な方法例えば、本明細書に記載されている方法により評価することが可能であり、所望により、該非変異酵素の発現と比較することが可能である。非変異植物と比較した場合、タバコ遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の低下を伴う変異植物は、本発明の望ましい実施形態である。本明細書に記載の任意の核酸配列内に変異を有する植物は、本明細書に記載の育種計画において使用されうる。構成的またはエチレンもしくは老化誘導性配列の過剰発現Nicotiana系統またはその系統の植物から製造されるタバコ製品における望ましい形質を増強するために、本発明の核酸配列例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列またはその断片の過剰発現を用いることが可能である。特に、二次代謝産物から生じる望ましい香味および芳香産物の生合成を増強するために、本発明の核酸配列の過剰発現およびそれらの翻訳産物を使用することが可能である。タバコポリペプチドをコードする核酸配列の更なる過剰発現を用いて、Nicotiana系統内の該ポリペプチドの発現を増強することが可能である。本発明の核酸を過剰発現させることによりNicotiana系統に付与されうる更なる望ましい形質には、青枯病、グランビレ枯病Granvillewilt、立枯病、ジャガイモウイルスY、タバコモザイクウイルス、タバコ腐食etchウイルス、タバコ葉脈斑紋veinmottlingウイルス、アルファルファモザイクウイルス、野火病、根こぶ線虫、南Southern根こぶ線虫、シスト線虫、黒根病、青かび病、レース0タバコ疫病菌およびレース1タバコ疫病菌に対する耐性が含まれる。本発明の核酸配列を発現させることによりNicotiana植物において増強されうる他の望ましい形質には、収量および/または等級の増加、乾燥性、収穫性、保持能、葉品質または乾燥特性の向上、丈の増加または減少、成熟時間の変化例えば、早熟、早熟ないし中生、中生、中生ないし晩熟または晩熟、柄のサイズの増加または減少、ならびに植物当たりの葉数の増加または減少が含まれる。植物プロモーター望ましいプロモーターは、カリモウイルスプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVプロモーターまたはキャッサバ葉脈モザイクウイルスCsVMVプロモーターである。これらのプロモーターはほとんどの植物組織において高レベルの発現をもたらし、これらのプロモーターの活性はウイルスコード化タンパク質に依存的ではない。CaMVは35Sおよび19Sの両方のプロモーターの入手源である。これらのプロモーターを使用する植物発現構築物の具体例は当技術分野において公知である。トランスジェニック植物のほとんどの組織においては、CaMV35Sプロモーターは強力なプロモーターである。CaMVプロモーターは単子葉植物においても非常に活性である。さらに、このプロモーターの活性はCaMV35Sプロモーターの重複により更に増強すなわち、2~10倍されうる。他の有用な植物プロモーターには、限定的なものではないが、ノパリンシンターゼNOSプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスFMVプロモーター、コメアクチンプロモーターおよびユビキチンプロモーター系が含まれる。典型的な単子葉植物プロモーターには、限定的なものではないが、イネリナイエローモットルウイルス、サトウキビバドナウイルスプロモーター、イネツングロバシリフォルムtungrobacilliformウイルスプロモーター、トウモロコシストリークstreakウイルス要素、およびコムギ萎縮病ウイルスプロモーターが含まれる。ある用途には、タバコ遺伝子産物、例えばドミナントネガティブ変異遺伝子産物を、適当な組織において、適当な量で、または適当な生育時点で産生させることが望ましいかもしれない。この目的には、環境、ホルモンおよび/または発育刺激のような誘導性シグナルに応答して調節されることが示されている遺伝子プロモーター群それぞれはその調節配列において具現化されるそれ自身の異なる特性を有するが存在する。これらには、限定的なものではないが、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現例えば、エンドウrbcS3A;トウモロコシrbcSプロモーター;エンドウにおいて見出されるクロロフィルab結合性タンパク質遺伝子;またはArabssuプロモーター、ホルモン調節性遺伝子発現例えば、コムギのEm遺伝子からのアブシジン酸ABA応答配列;オオムギおよびArabidopsisのABA誘導性HVA1およびHVA22ならびにrd29Aプロモーターならびに創傷誘導性遺伝子発現例えば、wunlのもの、器官特異的遺伝子発現例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子;記載されているトウモロコシからの23kDaゼイン遺伝子;またはインゲンマメβファセオリン遺伝子をもたらす遺伝子プロモーター、または病原体誘導性プロモーター例えば、PR1、prp1またはβ13グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性wirlaプロモーターおよび線虫誘導性プロモーター、タバコおよびパセリのそれぞれTobRB75AおよびHmg1が含まれる。植物発現ベクター典型的には、植物発現ベクターは、15および3調節配列の転写制御下のクローン化植物遺伝子ならびに2優性選択マーカーを含む。そのような植物発現ベクターは、所望により、プロモーター調節領域例えば、誘導性もしくは構成的、病原体もしくは創傷誘導性、環境もしくは発生調節性、または細胞もしくは組織特異的発現を付与するもの、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位および/またはポリアデニル化シグナルをも含有しうる。植物発現ベクターは、所望により、RNAプロセシングシグナル、例えばイントロンこれは、効率的なRNA合成および蓄積に重要であることが示されているをも含有しうる。RNAスプライス配列の位置は植物におけるトランスジーン発現のレベルに劇的な影響を及ぼしうる。この事実を考慮すると、遺伝子発現のレベルを改変するためには、トランスジーン内のタバコニコチンデメチラーゼコード配列の上流または下流にイントロンを配置することが可能である。発現ベクターは、前記の5調節制御配列に加えて、一般には植物遺伝子の3領域内に存在する調節制御領域をも含みうる。例えば、mRNAの安定性を増加させるために、3ターミネーター領域を発現ベクター内に含有させることが可能である。1つのそのようなターミネーター領域は、ジャガイモのPIIIターミネーター領域に由来するものでありうる。また、他の一般に使用されるターミネーターはオクトピンまたはノパリンシンターゼシグナルに由来する。植物発現ベクターは、典型的には、形質転換された細胞を特定するための優性選択マーカー遺伝子をも含有する。植物系のための有用な選択遺伝子には、トランスポゾンTn5のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子AphII、抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。光合成に必要な遺伝子も光合成欠損株における選択マーカーとして使用されうる。最後に、除草剤耐性をコードする遺伝子が選択マーカーとして使用されうる。有用な除草剤耐性遺伝子には、酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードし広域スペクトル除草剤Basta登録商標BayerCropscienceDeutschlandGmbHLangenfeldGermanyに対する耐性を付与するbar遺伝子が含まれる。他の選択マーカーには、他のそのような除草剤、例えばグリホセートなど、およびイミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン除草剤、クロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。さらに、メトトレキセートのような分子と共に、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子が使用されうる。選択マーカーの効率的な使用は、個々の選択因子に対する植物細胞の感受性の決定、および形質転換細胞の全てではなくともほとんどを有効に殺すこの因子の濃度の測定により促進される。タバコの形質転換に対する抗生物質の有用な濃度のいくつかには、例えば20~100μgmlカナマイシン、20~50μgmlハイグロマイシンまたは5~10μgmlブレオマイシンが含まれる。除草剤耐性に関する形質転換体の選択のための有用な方法は、例えばVasilにより記載されている。選択マーカーに加えて、レポーター遺伝子を使用することが望ましいであろう。いくつかの場合には、レポーター遺伝子は選択マーカーの非存在下で使用される。レポーター遺伝子は、典型的には受容生物または組織内に存在せず発現もされない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、いくつかの表現型変化または酵素特性をもたらすタンパク質をコードする。そのような遺伝子の具体例は、参照により本明細書に組み入れるWeisingらに記載されている。好ましいレポーター遺伝子には、限定的なものではないがグルクロニダーゼGUS遺伝子およびGFP遺伝子が含まれる。植物発現ベクターの構築後、植物宿主内に該ベクターを導入してトランスジェニック植物を作製するためにいくつかの標準的な方法が利用可能である。これらの方法には、1Agrobacterium媒介形質転換AtumefaciensまたはArhizogenes例えば、LichtensteinおよびFullerInGeneticEngineeringvol6PWJRigby編LondonAcademicPress1987ならびにLichtensteinCPおよびDraperJInDNACloningVolIIDMGlover編OxfordIRIPress1985米国特許第46939764762785494083850048635104310514964551591355177010523101954631745469976および5464763号ならびに欧州特許第01316240159418012051601761120116718029079902924350320500および0627752号、ならびに欧州特許出願番号0267159および0604622を参照されたい、2粒子運搬系例えば、米国特許第4945050および5141131号を参照されたい、3マイクロインジェクション法、4ポリエチレングリコールPEG法、5リポソーム媒介DNA取り込み、6エレクトロポレーション法例えば、WO8706614ならびに米国特許第538425354728695641664567955857121356002070および6074877号を参照されたい、7ボルテックス法、または8いわゆるウイスカーズwhiskers法例えば、Coffeeら米国特許第5302523および5464765号を参照されたいが含まれる。発現ベクターで形質転換されうる植物組織のタイプには、胚組織、カルス組織IおよびII型、胚軸、分裂組織などが含まれる。植物組織内への導入後、当技術分野で公知の任意の手段により構造遺伝子の発現をアッセイすることが可能であり、転写されたmRNAとして、または合成されたタンパク質として、またはタバコにおける二次アルカロイドの化学分析による代謝産物モニターにより測定される生じた遺伝子サイレンシングの量として、発現を測定することが可能である本明細書中に記載のとおり;参照により本明細書に組み入れる米国特許第5583021号も参照されたい。植物組織のinvitro培養のための、そして多くの場合には全植物への再生のための技術が公知である例えば、米国特許第5595733および5766900号を参照されたい。導入された発現複合体を商業的に有用な栽培品種へ移すための方法は当業者に公知である。所望のレベルの望ましい遺伝子産物を発現する植物細胞が得られたら、当技術分野でよく知られた方法および技術を用いて、植物組織および全植物をそれから再生させることが可能である。ついで、再生された植物を通常の手段により生殖させ、導入された遺伝子を通常の植物育種技術により他の株および栽培品種へ移すことが可能である。トランスジェニックタバコ植物はゲノム遺伝子の任意の部分の核酸をダウンレギュレーションまたは過剰発現のための異なる配向例えば、それぞれアンチセンス配向またはセンス配向で含みうる。Nicotiana系統内の遺伝子産物の発現を増強するためには、完全長タバコ遺伝子のアミノ酸配列の全体または機能的部分をコードする核酸配列の過剰発現が望ましい。タバコ遺伝子の転写または翻訳レベルの測定遺伝子発現は、例えば、タバコ遺伝子または遺伝子断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用する標準的なノーザンブロット分析AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkNYおよびSambrookらMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNYにより測定されうる。RNA発現レベルの測定は、定量的rtPCRKawasakiらinPCRTechnologyPrinciplesandApplicationsofDNAAmplificationStocktonPressWangらinPCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplicationsAcademicPressならびにFreemanらBiotechniques26112122および1241251999を含む逆転写PCRrtPCRによっても補助されうる。タバコ遺伝子の発現を測定するための更なるよく知られた技術には、insituハイブリダイゼーションおよび蛍光insituハイブリダイゼーション例えば、AusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkNYを参照されたいが含まれる。前記の標準的な技術は、植物間、例えば、タバコ遺伝子内に変異を有する植物と対照植物との間で発現レベルを比較するためにも有用でありうる。所望により、同じ一般的アプローチおよび標準的なタンパク質分析技術、例えばブラッドフォードアッセイ、分光光度アッセイ、および免疫学的検出技術、例えば所望のポリペプチドに特異的な抗体でのウエスタンブロット法または免疫沈降を用いて、タバコ遺伝子の発現例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列またはそれらの断片をタンパク質産生のレベルで測定することが可能であるAusubelらCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkNYおよびSambrookらMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNY。本明細書に記載の任意のポリペプチドの活性は、当技術分野における標準的な方法を用いてアッセイされうる。例えば、p450の活性は、典型的には、蛍光に基づくアッセイ例えば、DonatoらDrugMetabDispos326997062004を参照されたいを用いてアッセイされる。特に、ニコチンデメチラーゼの活性は、酵母ミクロソームアッセイを用いて、本明細書に記載されているとおりにアッセイされうる。タバコ遺伝子産物のモジュレーターの特定また、cDNAの単離は、遺伝子産物の発現を上昇または低下させる分子の特定を促進する。1つのアプローチにおいては、タバコmRNAを発現する細胞例えば、原核細胞、例えば大腸菌Ecoliまたは真核細胞、例えば酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞もしくは植物細胞の培地に候補分子を種々の濃度で加える。ついで、例えば本明細書に記載されているような標準的な方法を用いて、遺伝子産物の発現を候補分子の存在下および非存在下で測定する。候補モジュレーターは、精製または実質的に精製された分子であることが可能であり、あるいは化合物混合物の1つの成分でありうる。混合化合物アッセイにおいては、単一の化合物または最小化合物混合物がタバコニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を改変することが示されるまで、候補化合物プール例えば、標準的な精製技術、例えばHPLCにより得られたものの次第に小さくなる亜群に対して遺伝子産物の発現を試験する。本発明の1つの実施形態においては、遺伝子産物の発現の低下を促進する分子が特に望ましいと考えられる。遺伝子産物の発現または活性のレベルで有効であることが見出されたモジュレーターは、インプランタinplantaにおいて有用であると証明されうる。農業用には、本明細書に開示されている方法を用いて特定された分子、化合物または物質は、植物の茎葉上への噴霧剤または粉剤として施用される化学物質として使用されうる。該分子、化合物または物質は、植物に何らかの利益をもたらす別の分子と共に植物に施用されうる。用途本明細書に記載の任意の配列に対応する内因性遺伝子の調節、例えば遺伝子サイレンシングは、より貴重な植物または植物製品を与えうる。特に、エチレンにより誘導される又は老化に関連しているものとして本明細書中で特定されている配列例えば、配列番号4、40、44、52、54、60、70、104、138、140、158、162、188、212、226、234および288の配列または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列もしくはそれらの断片を有するものを使用して、最終産物の品質特性に影響を及ぼすテルペノイド、ポリフェノール、アルカロイドなどを含む多数の二次代謝産物の形成に関与する代謝経路に影響を及ぼすことが可能である。同様に、本明細書中で特定されている遺伝子は、老化過程で蓄積する乾物の率およびタイプまたは老化過程の植物内の乾物の分配に関連した代謝経路を調節するために使用されうる。本明細書中で特定されている遺伝子の調節は、老化速度、葉内および単一植物の葉間の老化の均一性ならびに本明細書中で特定されている遺伝子を刺激または活性化して葉または他の植物成分を含む製品または製造品の質を制御する物質または活性による老化の誘導の決定に関与する代謝経路に影響を及ぼすためにも用いられうる。本明細書に記載の遺伝子のプロモーター領域は、作物の品質を改良し又は特定の形質を増強する任意の望ましい遺伝子産物の発現を駆動するために使用されうる。二次代謝産物から生じる香味および芳香産物の生合成に関与する特有の遺伝子を発現させるために、植物内への導入のための構築物において、植物の生活環の特定の期間中に発現される誘導性プロモーターが使用されうる。また、末端用途特性に影響を及ぼす構造的炭水化物またはタンパク質の発現を上昇または修飾するために、タバコ遺伝子プロモーターが使用されうる。更に、タバコ遺伝子プロモーターは、栄養製品、医薬物質または産業用物質の生合成に関与する遺伝子を含む異種遺伝子と組合されうるであろう。プロモーター配列の調節は、アルカロイド生合成および/または他の経路に関与する遺伝子を含む内因性タバコ遺伝子をダウンレギュレーションするために用いられうる。望ましくは、タバコ遺伝子プロモーター領域または他の転写調節領域は、植物内のノルニコチン含量およびニトロソアミンレベルのような化学的特性を改変するために用いられる。また、当技術分野における標準的な方法を用いてプロモーター配列内で容易に特定されうるプロモーターモチーフを用いて、タバコ遺伝子産物例えば、p450の発現に関連した又はそれを調節する因子を特定することが可能である。更に、本発明の配列例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列もしくはそれらの断片のいずれかは、本明細書に記載の標準的な方法を用いて遺伝子産物例えば、p450の遺伝子発現を低下させ又はその酵素活性を改変する方法において使用されうる。そのような技術には、限定的なものではないがRNA干渉、三本鎖干渉、リボザイム、相同組換え、ウイルス誘導性遺伝子サイレンシング、アンチセンスおよび共抑制技術、ドミナントネガティブ遺伝子産物の発現、標準的な変異誘発技術を用いる変異遺伝子の生成が含まれる。例えば、植物病原体相互作用および耐病性に関連した脂肪酸を改変するために、あるいは選択された脂肪酸の植物プロフィールを改変して該植物または植物成分の香味または芳香を改変するために、p450発現の低下またはp450酵素活性の改変が用いられうる。更に、他のタバコNicotiana種における関連遺伝子に関するスクリーニングのための又は植物が対応内因性遺伝子内に変異を有するかどうかを決定するための、関連遺伝子、プロモーターまたは調節領域を単離するための遺伝的マーカーとして、プロモーター、コード配列、イントロンまたは3UTRまたはそれらの断片などのタバコ遺伝子の任意の部分が標準的な方法により使用されうる。また、特定の遺伝子の移入または喪失を追跡するために育種操作による遺伝子の流れをモニターするために、タバコ遺伝子の一部が使用されうる。例えば、Nicotianatabacumは、その他のNicotiana種のいくつかと同様に異質四倍体であり、元の遺伝子が存在するゲノムとは異なる親ゲノム内の相同遺伝子または関連遺伝子を特定するために使用されうるであろう。関連遺伝子に関するマーカーは、既存のタバコ生殖質、交雑により生じた分離または合成集団、変異誘発処理または種々の組織培養法により生じた集団をスクリーニングするためにも使用されうるであろう。したがって、本明細書に記載の核酸配列例えば、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列またはそれらの断片は、耐病性、耐虫性、香味および芳香特性、除草剤耐性、葉収量を増加させる又は葉に影響を及ぼす又は構造的形質もしくは繊維含量に関連した植物成分例えば、リグニン、セルロースなどに影響を及ぼす或いは望ましくない成分に関連した品質因子に関与する遺伝子を特定し又はそれに影響を及ぼすために使用されうる。製品ニトロソアミン含量の低下を伴うタバコ製品は、当技術分野で公知の標準的な方法により、本明細書に記載の任意のタバコ植物材料を使用して製造される。1つの実施形態においては、タバコ製品は、乾燥タバコ植物から得られたタバコ植物材料を使用して製造される。乾燥タバコ植物は、低下したニコチンデメチラーゼ活性を含有しうる。あるいは乾燥タバコ植物は、低下したニコチンデメチラーゼ活性を含有するよう育種されたものでありうる。例えば、乾燥タバコ植物は、ニコチンデメチラーゼの変異発現を伴うものとして特定されたタバコ植物を含む交配から得られたタバコ植物でありうる。望ましくは、タバコ製品は、約5mgg未満、約45mgg未満、約40mgg未満、約35mgg未満、約30mgg未満、約25mgg未満、約20mgg未満、約15mgg未満、約10mgg未満、約750μgg未満、約500μgg未満、約250μgg未満、約100μgg未満、約75μgg未満、約50μgg未満、約25μgg未満、約10μgg未満、約70μgg未満、約50μgg未満、約40μgg未満、約20μgg未満、約10μgg未満、約05μgg未満、約04μgg未満、約02μgg未満、約01μgg未満、約005μgg未満または約001μgg未満の、低下した量のノルニコチンまたはNNNを含有し、あるいは、ここで、それに含有される全アルカロイド含量に対する二次アルカロイドの比率は90未満、70未満、50未満、30未満、10未満、5未満、4未満、3未満、2未満、15未満、1未満、075未満、05未満、025未満または01未満である。低下した量量の低下なる表現は、ノルニコチンまたはNNNの低下のためにトランスジェニックにされていない同様に加工された同品種由来の野生型タバコ植物または植物成分またはタバコ製品において見出されるものより低い、タバコ植物または植物成分またはタバコ製品におけるノルニコチンまたはNNNまたはそれらの両方の量を意味する。1つの具体例においては、ノルニコチンまたはNNNまたはそれらの両方の減少が本明細書に記載の方法により得られたのかどうかを判定するための対照として、同様に加工された同品種の野生型タバコ植物を使用する。もう1つの具体例においては、標準的な方法を用いて、例えば、遺伝子または遺伝子産物例えば、ニコチンデメチラーゼまたは特定の遺伝子内変異の存在または非存在をモニターすることにより、ニトロソアミン含量の低下を伴う植物を評価する。更にもう1つの具体例においては、育種計画から得られた植物のニトロソアミン含量を、ニトロソアミン量の低下を伴う植物を育種するために使用した受容系統または供与系統またはそれらの両方のニトロソアミン含量と比較する。必要に応じて、当技術分野で公知の他の適当な対照も使用される。ノルニコチンおよびNNNまたはそれらの両方のレベルは、タバコ分野においてよく知られた方法に従い測定される。以下の実施例は、本発明を実施するための方法を例示するものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の例示に過ぎないと理解されるべきであり、そのような本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。植物組織の開発およびエチレン処理植物の成長植物をポット内に播種し、温室内で4週間成長させた。該4週齢実生を個々のポットに移植し、該温室内で2ヶ月間成長させた。成長中に、150ppmのNPK肥料を含有する水で該植物に1日2回灌水した。大きくなった緑葉を植物から切断して、後記のとおりにエチレン処理を行った。細胞系78379タバコ系統78379は、UniversityofKentuckyにより公開されたバーレータバコ系統であり、それを植物材料源として使用した。100個の植物を、タバコの成長の分野における標準体として培養し、移植し、異なる番号1~100で識別した。推奨されているとおりに施肥および圃場管理を行った。それらの100個の植物の4分の3がニコチンの20~100をノルニコチンへと変換した。それらの100個の植物の4分の1はニコチンの5未満をノルニコチンへと変換した。植物番号87は最低の変換率2を示し、一方、植物番号21は100の変換を示した。3未満の変換率の植物は非変換体として分類された。遺伝的および表現型相違を調べるために、植物番号87および植物番号21の自己受粉種子ならびに交配21×87および87×21種子を得た。自殖した21からの植物は変換体であり、87からの自殖の99は非変換体であった。87からの植物の残りの1は低い変換率5~15を示した。正逆交雑からの植物はすべて変換体であった。細胞系4407Nicotiana系統4407は、バーレー系統であり、それを植物材料源として使用した。均一かつ代表的な植物100個を選抜し、番号で識別した。それらの100個の植物のうちの97個は非変換体であり、3個は変換体であった。植物番号56は最低の変換率12を示し、一方、植物番号58は最高レベルの変換率96を示した。これらの2つの植物を使用して自己受粉種子ならびに交配種子を得た。自殖した58からの植物は変換体非変換体の比31で分離した。植物5833および5825は、それぞれホモ接合変換体およびホモ接合非変換変換体として特定された。5833の安定な変換がその後代の分析により確認された。細胞系PBLB01PBLB01は、ProfiGenIncにより開発されたバーレー系統であり、それを植物材料源として使用した。PBLB01の原種から変換体植物を選抜した。エチレン処理方法緑葉を2~3ヶ月の温室栽培植物から切断し、それに03エチレン溶液PrepbrandEthephonを噴霧した。各噴霧葉を、加湿器を備えた乾燥棚内に吊るし、プラスチックで覆った。該処理中に、該サンプル葉にエチレン溶液を定期的に噴霧した。エチレン処理の約24~48時間後、RNA抽出のために葉を集めた。葉代謝産物およびより詳細な対象成分例えば、種々のアルカロイドの濃度を測定するための代謝成分分析のために、別の小サンプルを採取した。一例として、アルカロイド分析を以下のとおりに行うことが可能であった。05mlの2NNaOH、ならびに内部標準としてのキノリンおよびtブチルエーテルを含有する5mlの抽出溶液と共に、サンプル01gを150rpmで振とうした。サンプルを、FID検出器を備えたHP6890GC上で分析した。該検出器および注入器には250°Cの温度を用いた。5フェノールおよび95メチルシリコンで架橋された溶融シリカよりなるHPカラム30m032nm1mmを、10°C分minで110~185°Cの温度勾配で使用した。該カラムは、キャリヤーガスとしてヘリウムを使用して、100°C、17cm3min1の流速、401のスプリット比、21の注入容量で、該カラムを運転した。RNAの単離RNA抽出のために、2月齢の温室栽培植物からの中葉を、前記のとおりにエチレンで処理した。その0および24~48時間のサンプルをRNA抽出に使用した。いくつかの場合には、花の頭部の除去の10日後の植物から、老化過程中の葉サンプルを採取した。これらのサンプルも抽出に使用した。RneasyPlantMiniKit登録商標を該製造業者のプロトコールに従い使用して、全RNAを単離した。DEPCで処理された乳鉢および乳棒を使用して、組織サンプルを液体窒素下で粉砕して微粉末を得た。約100マイクログラムの粉砕組織を15mlの無菌エッペンドルフチューブに移した。すべてのサンプルが集まるまで、このサンプルチューブを液体窒素中に配置した。ついで、該キットとして提供されている450μlのバッファーRLTをメルカプトエタノールの添加と共に各チューブに加えた。該サンプルを激しくボルテックスし、56°Cで3分間インキュベートした。ついでライセートを、2ml収集チューブ内に配置されたQIAshredder登録商標遠心カラムに適用し、最大速度で2分間遠心分離した。流出物を集め、05容量のエタノールを該清澄化ライセートに加えた。該サンプルを十分に混合し、2ml収集チューブ内に配置されたRneasy登録商標小型遠心カラムに移した。該サンプルを10000rpmで1分間遠心分離した。つぎに700μlのバッファーRW1をRneasy登録商標カラム上にピペッティングし、10000rpmで1分間遠心分離した。バッファーRPEを新しい収集チューブ内のRneasy登録商標カラム上にピペッティングし、10000rpmで1分間遠心分離した。バッファーRPEを再びRneasy登録商標カラムに加え、最大速度で2分間遠心分離して、該膜を乾燥させた。エタノールキャリーオーバーを除去するために、該膜を別の収集チューブ内に配置し、最大速度で更に1分間遠心分離した。該Rneasy登録商標カラムを新たな15ml収集チューブ内に移し、40μlのRNアーゼ非含有水を該Rneasy登録商標膜上に直接的にピペッティングした。この最終溶出チューブを10000rpmで1分間遠心分離した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により全RNAの定性および定量分析を行った。Origotex登録商標ポリARNA精製キットQiagenIncを該製造業者のプロトコールに従い使用して、ポリRNAを単離した。250μlの最大容量中の約200μgの全RNAを使用した。その250μlの全RNAに容量250μlのバッファーOBBおよび15μlのOligotex登録商標懸濁液を加えた。内容物をピペッティングにより十分に混合し、加熱ブロック上で70°Cで3分間インキュベートした。ついで該サンプルを室温で20分間放置した。最大速度で2分間の遠心分離により、Oligotex登録商標mRNA複合体をペレット化した。50mlを除くすべての該懸濁液を該ミクロ遠心チューブから除去した。該サンプルをOBBバッファーで更に処理した。該Oligotex登録商標mRNAペレットを、ボルテックスすることにより400μlのバッファーOW2に再懸濁させた。この混合物を、新たなチューブ内に配置された小さな遠心カラム上に移し、最大速度で1分間遠心分離した。該遠心カラムを新たなチューブに移し、更に400μlのバッファーOW2を該カラムに加えた。ついで該チューブを最大速度で1分間遠心分離した。該遠心カラムを最終的な15mlのミクロ遠心チューブに移した。該サンプルを60μlの加温70°CバッファーOEBで溶出した。ポリA産物を変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により分析した。逆転写PCRSuperScript逆転写酵素を製造業者のプロトコールInvitrogenCarlsbadCaliforniaに従い使用して、第1鎖cDNAを得た。ポリA富化RNAオリゴdTプライマー混合物は5μg未満の全RNA、1μlの10mMdNTP混合物、1μlのオリゴd1218および10μlまでのDEPC処理水よりなるものであった。各サンプルを65°Cで5分間インキュベートし、ついで氷上で少なくとも1分間配置した。以下の成分のそれぞれを順番に加えることにより、反応混合物を調製した:2μl10×RTバッファー4μlの25mMMgCl22μlの01MDTTおよび1μlのRNアーゼOUTRecombinantRNaseInhibitor。9μlの反応混合物の添加物を各RNAプライマー混合物にピペッティングし、穏やかに混合した。それを42°Cで2分間インキュベートし、1μlのSuperScriptIIRTを各チューブに加えた。該チューブを42°Cで50分間インキュベートした。該反応を70°Cで15分間で終結させ、氷上で冷却した。該サンプルを遠心分離により集め、1μlのRNアーゼHを各チューブに加え、37°Cで20分間インキュベートした。200pmolのフォワードプライマーおよび100pmolのリバースプライマー18ntのオリゴdおよびそれに続く1個のランダムな塩基を使用して、第2のPCRを行った。反応条件は94°Cで2分間、ついで94°Cで1分間、45°C~60°Cで2分間、72°Cで3分間の40サイクルのPCR、および72°Cで更に10分間の伸長であった。1アガロースゲルを使用する電気泳動により、10μlの該増幅サンプルを分析した。正しいサイズの断片をアガロースゲルから精製した。PCR断片集団の作製実施例3からのPCR断片をpGEMTEasyVector内に該製造業者の指示に従い連結した。連結産物をJM109コンピテント細胞内に形質転換し、青/白選択のためにLB培地プレート上でプレーティングした。コロニーを選択し、12mlのLB培地を含有する96ウェルプレート内で37°Cで一晩成長させた。選択したすべてのコロニーの凍結ストックを作製した。WizardSVMiniprepキットと共にBeckmansBiomeck2000ミニプレップロボティックスを用いて、プレートからプラスミドDNAを精製した。プラスミドDNAを100μlの水で溶出し、96ウェルプレート内で保存した。プラスミドをEcoR1で消化し、1アガロースゲルを使用して分析して、DNAの量およびインサートのサイズを確認した。CEQ2000シークエンサーを使用して、400~600bpのインサートを含有するプラスミドを配列決定した。BLAST検索により該配列をGenBankデータベースと整列させた例えば、図159A~159Kを参照されたい。p450関連断片を特定し、更に分析した。あるいは、p450断片をサブトラクションライブラリーから単離した。これらの断片も、前記のとおりに分析した。cDNAライブラリーの構築以下のとおり、エチレンで処理された葉から全RNAを調製することにより、cDNAライブラリーを構築した。まず、修飾された酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコールを用いて、タバコ系統5833のエチレン処理葉から全RNAを抽出した。1グラムの組織を使用し、それを粉砕し、ついで、5mlのフェノールおよび5mlのクロロホルムが加えられた5mlの抽出バッファー100mMTrisHClpH85200mMNaCl10mMEDTA05SDS中でボルテックスするよう、該プロトコールを修飾した。抽出されたサンプルを遠心分離し、上清を取っておいた。上清が透明になるまで、この抽出工程を2~3回反復した。微量のフェノールを除去するために、約5mlのクロロホルムを加えた。3倍容量のエタノールおよび110容量の3MNaOAcを加え、20°Cで1時間保存することにより、合わせた上清画分からRNAを沈殿させた。Corexガラス容器に移した後、該RNA画分を9000rpm、4°Cで45分間遠心分離した。該ペレットを70エタノールで洗浄し、9000RPM、4°Cで5分間遠心した。該ペレットの乾燥後、該ペレット化RNAを05mlのRNアーゼ非含有水に溶解した。変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計により全RNAをそれぞれ定性および定量分析した。得られた全RNAを使用し、以下のプロトコールによりオリゴセルロースプロトコールおよびミクロ遠心カラムを使用してポリARNAを単離した。約20mgの全RNAを2回精製に付して、高品質のポリARNAを得た。mRNAの高品質性を保証するために、既知完全長遺伝子の変性ホルムアルデヒドゲルおよびそれに続くRTPCRを行うことにより、ポリARNA産物を分析した。つぎに、ポリARNAを鋳型として使用し、cDNA合成キット、ZAPcDNA合成キットおよびZAPcDNAGigapackIIIゴールドクローニングキットを使用してcDNAライブラリーを得た。該方法は、示されているとおりの該製造業者のプロトコールに従い行った。約8μgのポリARNAを使用してcDNAライブラリーを構築した。該一次ライブラリーの分析は約25×106~1×107pfuを示した。IPTGおよびXgalを使用する相補性アッセイにより該ライブラリーの品質バックグラウンド試験を完了した。この場合、組換えプラークはバックグラウンド反応の100倍以上で発現された。ランダムPCRによる該ライブラリーの、より定量的な分析は、インサートcDNAの平均サイズが約12kbであることを示した。該方法は2工程のPCR法を用いるものであった。第1工程では、p450断片から得た予備配列情報に基づいてリバースプライマーを設計した。設計されたリバースプライマーおよびT3プライマーを使用して、cDNAライブラリーから対応遺伝子を増幅した。PCR反応をアガロース電気泳動に付し、高分子量の対応バンドを切り出し、精製し、クローニングし、配列決定した。第2工程においては、リバースプライマーp450の3UTRから設計したものと共に、フォワードプライマーとしてp450の5UTRおよび開始コード領域から設計した新たなプライマーを、後続のPCRにおいて使用して、完全長p450クローンを得た。該p450断片は、リバースプライマー以外は、実施例3に記載の構築されたcDNAライブラリーからのPCR増幅により得た。cDNAインサートの下流の該プラスミド上に位置するT7プライマーをリバースプライマーとして使用した。実施例4に記載のとおりに、PCR断片を単離し、クローニングし、配列決定した。構築されたcDNAライブラリーから、このPCR法により完全長p450遺伝子を単離した。遺伝子特異的リバースプライマーp450断片の下流配列から設計されたものおよびフォワードプライマーライブラリープラスミド上のT3を使用して完全長遺伝子を得た。PCR断片を単離し、クローニングし、配列決定した。必要に応じて、第2のPCR工程を行った。この第2の工程においては、p450クローンの3UTRから設計したリバースプライマーと共に、クローン化p450の5UTRから設計した新たなフォワードプライマーを、後続PCR反応において使用して、完全長p450クローンを得た。ついで該クローンを配列決定した。クローン化断片の特徴づけリバースサザンブロット分析示差的発現を検出するために、前記実施例において特定されたすべてのp450クローン上で、非放射性ラージスケールリバースサザンブロットアッセイを行った。異なるp450クラスター間の発現のレベルは非常に異なることが観察された。更に、高い発現を示すクローン上でリアルタイム検出を行った。非放射性サザンブロット法は以下のとおりに行った。1実施例2に記載のとおりに、QiagenRnaeasyキットを使用して、エチレンで処理された及び処理されていない変換体5833および非変換体5825葉から全RNAを抽出した。2前記工程で得たポリA富化RNAに由来する一本鎖cDNAをビオチン尾部標識することにより、プローブを作製した。この標識一本鎖cDNAは、プライマーとしてビオチン化オリゴdTを使用すること以外は実施例3に記載のとおりの変換体および非変換体全RNAInvitrogenのRTPCRにより作製した。これらを、クローン化DNAにハイブリダイズさせるためのプローブとして使用した。3プラスミドDNAを制限酵素EcoR1で消化し、アガロースゲル上で泳動させた。ゲルを同時に乾燥させ、2つのナイロンメンブレンBiodyneBにトランスファーした。1つのメンブレンを変換体プローブでハイブリダイズさせ、もう1つを非変換体プローブでハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション前にメンブレンをUV架橋自動架橋セッティング254nmStratageneStratalinkerに付した。あるいは、pGEMプラスミド、T3およびSP6の両アーム上に位置する配列をプライマーとして使用して、該インサートを各プラスミドからPCR増幅した。96ウェルReadytorunアガロースゲル上で泳動させることにより、PCR産物を分析した。確認されたインサートを2つのナイロンメンブレン上にドット化dotした。1つのメンブレンを変換体プローブでハイブリダイズさせ、もう1つを非変換体プローブでハイブリダイズさせた。4該膜をハイブリダイズさせ、洗浄ストリンジェンシーを変更すること以外は製造業者EnzoMaxSencekitEnzoDiagnosticsIncFarmingdaleNYの指示に従い洗浄した。該膜をハイブリダイゼーションバッファー界面活性剤およびハイブリダイゼーション増強剤を含有する2×SSC緩衝化ホルムアミドで42°Cで30分間、プレハイブリダイズさせ、10μlの変性プローブで42°Cで一晩ハイブリダイズさせた。ついで該膜を1×ハイブリダイゼーション洗浄バッファー中、室温で10分間1回および68°Cで15分間4回洗浄した。該検出法のための該膜の準備は整った。5それらの洗浄された膜を、製造業者の検出指示書EnzoDiagnosticsIncに記載されているとおりにアルカリホスファターゼ標識およびそれに続くNBTBCIP比色検出により検出した。該膜を1×ブロッキング溶液で室温で1時間ブロッキングし、1×検出試薬で10分間3回洗浄し、1×前現像predevelopment反応バッファーで5分間2回洗浄し、ついで該ドットが出現するまで、現像溶液中、30~45分間、該ブロットを現像した。すべての試薬は製造業者EnzoDiagnosticsIncから入手した。また、KPLサザンハイブリダイゼーションおよび検出キットを製造業者の指示KPLGaithersburgMarylandに従い使用して、ラージスケールリバースサザンアッセイを行った。クローンのキャラクタライゼーションノーザンブロット分析サザンブロット分析の代わりに、ノーザンブロットアッセイの実施例において記載されているとおりに、いくつかの膜をハイブリダイズさせ検出した。以下のとおりに、Nicotianaにおいて示差的に発現されたmRNAを検出するために、ノーザンハイブリダイゼーションを用いた。クローン化p450MegaprimeDNALabellingSystemsAmershamBiosciencesからプローブを調製するために、ランダムプライミング法を用いた。以下の成分を混合した:25ngの変性DNA鋳型;4ulの各未標識dTTP、dGTPおよびdCTP;5μlの反応バッファー;P32標識dATPおよび2ulのクレノウI;ならびにH2O該反応液を50μlに調整する。該混合物を37°Cで1~4時間インキュベートし、2μlの05MEDTAで停止させた。使用前に95°Cで5分間のインキュベーションにより、該プローブを変性させた。いくつかのペアのタバコ系統の、エチレンで処理された及び処理されていない新鮮な葉から、RNAサンプルを調製した。いくつかの場合には、ポリA富化RNAを使用した。約15μgの全RNAまたは18μgのmRNA実施例5に記載のとおりのRNAおよびmRNA抽出の方法をDEPCH2Oで等容量にした。同じ容量のローディングバッファー1×MOPS185ホルムアルデヒド50ホルムアミド4Ficoll400ブロモフェノールブルーおよび05μlのEtBrを加えた。ついで電気泳動による該RNAの分離のための準備において、該サンプルを変性させた。サンプルを、1×MOPバッファー04Mモルホリノプロパン硫酸01M酢酸Na3×H2O10mMEDTANaOHでpH72に調節を含有するホルムアルデヒドゲル1アガロース1×MOPS06Mホルムアルデヒド上の電気泳動に付した。10×SSCバッファー15MNaCl015Mクエン酸Na中、毛管法により、RNAを24時間にわたってHybondNメンブレンNylonAmershamPharmaciaBiotechトランスファーした。ハイブリダイゼーションの前に、RNAサンプルを含有するメンブレンをUV架橋させた自動架橋セッティング254nmStratageneStratalinkerに付した。該メンブレンを5~10mlのプレハイブリダイゼーションバッファー5×SSC50ホルムアルミド5×デンハルト液1SDS100μgml熱変性せん断非相同DNAで42°Cで1~4時間プレハイブリダイズさせた。古いプレハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たなプレハイブリダイゼーションバッファーおよびプローブを加えた。該ハイブリダイゼーションは42°Cで一晩行った。該膜を2×SSCで室温で15分間洗浄し、ついで2×SSCで洗浄した。以下の表1に示すとおり、ノーザンブロットおよびリバースサザンブロットは、非誘導植物との対比においてどの遺伝子がエチレン処理により誘導されたかを決定するのに有用であった。興味深いことに、該変換体および非変換体において、必ずしもすべての断片が同様に影響を受けたわけではなかった。シトクロムp450断片のいくつかを部分的に配列決定して、それらの構造関連性を決定した。ついで、目的の完全長遺伝子クローンを単離し特徴づけるために、この情報を用いた。エチレン処理により誘導された変換体および非変換体バーレー系統から得たタバコ組織上で完全長クローンを使用して、ノーザン分析を行った。この分析を用いて、エチレン誘導性非変換体バーレー系統との対比においてエチレン誘導性変換体系統における発現の上昇を示す完全長クローンを特定した。そのように行うことにより、変換体系統と非変換体系統との間の葉成分における生化学的相違を比較することにより、完全長クローンの機能関連性が決定されうる。以下の表2に示すとおり、により示される非変換体処理組織の発現と比較して、変換体エチレン処理組織においては、6個のクローンが、およびにより示される有意に高い発現を示した。これらのクローンの全ては、エチレン処理されていない変換体および非変換体系統において、発現をほとんど又は全く示さなかった。クローン化遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫検出3個のp450クローンからの20~22アミノ酸長に対応するペプチド領域を、1他のクローンに対して、より低い相同性を有する又は相同性を有さないこと、および2良好な親水性および抗原性を有することに関して選択した。それぞれのp450クローンから選択したペプチド領域のアミノ酸配列を以下に列挙する。該合成ペプチドをKHLキーホールリンペットヘモシアニンと共役させ、ついでウサギに注射した。4回目の注射AlphaDiagnosticIntlIncSanAntonioTXの2週間後および4週間後に抗血清を集めた。D234AD1DIDGSKSKLVKAHRKIDEILGD90aBB3RDAFREKETFDENDVEELNYD89AB1FKNNGDEDRHFSQKLGDLADKYウエスタンブロット分析により、タバコ植物組織からの標的タンパク質に対する交差活性に関して抗血清を検査した。変換体および非変換体系統のエチレン処理0~40時間中葉から粗タンパク質抽出物を得た。RCDCProteinAssayKitを該製造業者のプロトコールに従い使用して、該抽出物のタンパク質濃度を測定した。2μgのタンパク質を各レーン上にローディングし、LaemmliSDSPAGE系を使用して該タンパク質を10~20勾配ゲル上で分離した。TransBlotSemiDryセルを使用して該タンパク質をゲルからPROTRANNitrocelluloseTransferMembranesにトランスファーした。ECLAdvanceWesternBlottingDetectionKitを使用して、標的p450タンパク質を検出し可視化した。該合成KLHコンジュゲートに対する一次抗体をウサギにおいて調製した。ペルオキシダーゼに共役した、ウサギIgGに対する二次抗体を、Sigmaから購入した。一次抗体および二次抗体は共に11000の希釈度で使用した。抗体は、該ウエスタンブロット上の単一のバンドに対して強力な反応性を示した。このことは、該抗血清が、関心のある標的ペプチドに対して単一特異性であったことを示している。また、抗血清はKLH共役合成ペプチドに対して交差反応性であった。核酸の同一性、単離された核酸断片の構造関連性およびGeneChip登録商標ハイブリダイゼーション100個を超えるクローン化p450断片を、それらの構造関連性を決定するためのノーザンブロット分析と共に配列決定した。該アプローチは、p450遺伝子のカルボキシル末端付近に位置する2つの共通のp450モチーフのいずれかに基づくフォワードプライマーを使用するものであった。該フォワードプライマーはシトクロムp450モチーフFXPERFまたはGRRXCPに対応するものであった。リバースプライマーとしては、ポリA尾部またはpGEMプラスミドの両アーム上に位置するプラスミドSP6またはT7からの標準的なプライマーを使用した。用いたプロトコールを以下に説明する。製造業者のプロトコールBeckmanCoulterに従い出発二本鎖DNAの濃度を推定するために、分光光度法を用いた。該鋳型を適当な濃度まで水で希釈し、95°Cで2分間の加熱により変性させ、ついで氷上に配置した。該配列決定反応は、05~10μlの変性DNA鋳型、2μlの16pmolのフォワードプライマー、8μlのDTCSQuickStartMasterMixを使用して氷上で調製し、全容量を水で20μlにした。熱サイクルプログラムは以下のサイクルの30サイクルよりなるものであった:96°Cで20秒間、50°Cで20秒間および60°Cで4分間ならびにそれに続く4°Cでの維持。5μlの停止バッファー等容量の3MNaOAcおよび100mMEDTAおよび1μlの20mgmlグリコーゲンを加えることにより、該配列決定反応を停止させた。該サンプルを60μlの冷95エタノールで沈殿させ、6000×gで6分間遠心分離した。エタノールを捨てた。該ペレットを200μlの冷70エタノールで2回洗浄した。該ペレットが乾燥した後、40μlのSLS溶液を加え、該ペレットを再懸濁させた。鉱油層を重層し、更なる分析のために該サンプルをCEQ8000AutomatedSequencer上に配置した。核酸配列を確認するために、p450遺伝子のFXPERFまたはGRRXCP領域に対するフォワードプライマー、あるいはプラスミドまたはポリA尾部に対するリバースプライマーを使用して、該核酸配列を両方向に再び配列決定した。すべての配列決定は両方向に少なくとも2回行った。シトクロムp450断片の核酸配列を、GRRXCPモチーフをコードする領域の後の第1核酸から終止コドンまでに対応するコード領域に関してお互いに比較した。p450タンパク質間の遺伝的多様性の指標として、この領域を選択した。他の植物種の場合と同様に、70遺伝子を超える多数の遺伝的に異なるp450遺伝子が観察された。核酸配列の比較に際して、該遺伝子は、配列同一性に基づいて、異なる配列群内に配置されうることが判明した。p450メンバーの最良の特有の群分けは、75またはそれ以上の核酸同一性配列を有する配列であることが見出された例えば、参照により本明細書に組み入れるUS20040162420特許出願公開のTable1を参照されたい。同一性の減少は有意に大きな群を与えた。好ましい群分けは、81またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、91またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99またはそれ以上の核酸同一性を有する配列で認められた。それらの群のほとんどは少なくとも2個のメンバーを、そしてしばしば3個以上のメンバーを含有していた。他のものは反復的には見出されなかった。このことは、採用したアプローチが、使用した組織において低発現mRNAおよび高発現mRNAの両方を単離し得たことを示唆している。75またはそれ以上の核酸同一性に基づき、2つのシトクロムp450群が、該群該のものとは遺伝的に異なるかつてのタバコシトクロム遺伝子に対して核酸配列同一性を含有することが判明した。群23は、表3Aで用いるパラメーターにおいて、GenBank配列GI1171579およびGI14423327に対して核酸同一性を示した。GI1171579は群23のメンバーに対して969~995の範囲の核酸同一性を有し、一方、GI14423327はこの群に対して954~969の範囲の同一性を示した。群31のメンバーは、GI14423319のGenBankに報告されている配列に対して767~978の核酸同一性を有していた。表3Aのその他のp450同一性群はいずれも、既に報告されているNicotianap450遺伝子に対して、表3Aにおいて用いるパラメーター同一性を含有していなかった。Nicotiana植物からの各群の追加的なメンバーを優先的に同定し単離するためには、群に関して、適当な核酸縮重プローブでコンセンサス配列を誘導することが可能であろう。表3A:Nicotianap450核酸配列同一性群群断片1D58BG7D58AB1D58BE42D56AH7D13a53D56AG10D3533D34624D56AA7D56AE1185BD35D35BB7D177BA7D56AAB6D144AE26D56AG11D179AA17D56AC7D144AD18D144AB59D181AB5D73AC910D56AC1211D58AB9D56AG9D56AG6D35BG11D3542D35BA3D3457D3452D342512D56AD101356AA1114D177BD5D177BD715D56AAG10D58BC5D58AD1216D56AC11D3539D58BH4D56AD617D73AAD6D70ABA1118D70AAB5D70AAA819D70AAB8D70ABH2D70AAA420D70ABA1D70ABA921D70ABD422D181AC5D144AH1D346523D35BG224D73AAH725D58AA1D185BC1D185BG226D73AE1027D56AC1228D177BF7D185BE1D185BD229D73AAG330D70AAA12D176BF231D176BC332D176BB333D186AH4エチレン活性化後に同質遺伝子系統に近い非変換体と変換体との間の示差的発現パターンを有する遺伝子を特定するために、GeneChip登録商標マイクロアレイハイブリダイゼーションAffymetrixIncSantaClaraCAを使用した。チップサイズは18ミクロンであり、アレイフォーマットは100~2187であり、528個のプローブセット11628個のプローブを収容する。マイクロアレイの結果を、独立して証明するために、7個のペアのハイブリダイゼーションを用いた。これらは、440733440725の未処理バーレータバコサンプルの1個のペア変換体/非変換体、エチレン処理された440733440725サンプルの4個のペア、エチレン処理されたいぶしdarkタバコNLMadole181の1個のペア、ニコチン変換に関して同質に近い系統のもう1個のペア、および44073325の天然で老化した葉の1個のペア表3Bよりなるものであった。GenomeExplorationsIncによる検出装置を使用して作成したエクスプレッションレポートにより示されるとおり、全14セットのハイブリダイゼーションは成功した。メインレポートは、ノイズ、スケール因子、バックグラウンド、全プローブセット、存在する及び存在しないプローブセットの数および比率、ハウスキーピング対照のシグナル強度の分析を含んでいた。ついで、ソフトウェアGCOSを他のソフトウェアと共に使用して、該データを分析し、表示した。処理ペア間のシグナル比較を行い、すべてのハイブリダーゼーションのすべてのそれぞれのプローブに関する全体のデータをまとめ、発現データも分析した。シグナル強度に基づく結果は、2つの遺伝子D121AA8およびD120AH4および1つの断片D121AA8の部分断片であるD35BG11だけが、エチレン処理変換体系統において、非変換体系統と比較した場合に、再現可能な誘導を受けることを示した。変換体系統、例えばバーレータバコ品種440733における遺伝子のシグナルは、関連非変換体同質遺伝子系統440725における遺伝子のシグナルに対する比として測定された。エチレン処理を行わなかった場合には、すべての遺伝子に関する非変換体シグナルに対する変換体シグナルの比は100に近かった。バックグラウンドの相違の影響を排除するために、正規化されたシグナル比も計算した。正規化シグナル比は、処理ペア比を対応非ペア比で割り算することにより得られる。エチレン処理および分析に際して、2つの遺伝子D121AA8およびD120AH4は、4つの異なる分析による測定では、非変換体系統との対比において変換体系統において誘導されることが確認された。これらの2つの遺伝子は998の相対相同性を共有し、変換体品種におけるそれらの相対ハイブリダイゼーションシグナルはそれらの非変換体対応物におけるシグナルより約2~22倍高かった。正規化された比に基づけば、2つのアクチン様内部対照クローンは変換体系統においては誘導されなかった。また、断片D35BG11そのコード領域の全体はD121AA8およびD120AH4遺伝子内に含有されているは、ペアになった同質遺伝子変換体および非変換体系統の同じサンプルにおいて高度に誘導された。更に、D121AA8およびD120AH4遺伝子は同質遺伝子いぶしdarkタバコペアNLMadoleおよび181の変換体系統において強力に誘導された8~28倍。したがって、このことは、変換体系統におけるこれらの遺伝子のエチレン誘導がインプランタinplanta応答であったことを示している。44073325の天然老化サンプルハイブリダイゼーションから行った比較においても、同じ遺伝子が特定された。D121AA8に特異的なプライマーを使用するこれらの材料のRTPCRアッセイは、この遺伝子に関するマイクロアレイの結果を証明した。これらの結果に基づき、D121AA8遺伝子そのcDNA配列は配列暗号5の配列である図4が、関心のあるタバコニコチンデメチラーゼ遺伝子として特定された。p450の命名法を考慮すると、D121AA8はCYP82Eファミリー内のp450に最も類似していることが確認されたTheArabidopsisGenomeInitiativeandTheArabidopsisInformationResourceFrankPlantPhysiol110103510461996WhitbredらPlantPhysiol12447582000SchopferおよびEbelMolGenGenet2583153221998ならびにTakemotoらPlantCellPhysiol40123212421999。酵素活性の生化学的分析生化学的分析例えば、参照により本明細書に組み入れる既に出願されている出願に記載されているものは、配列番号5の配列がタバコニコチンデメチラーゼ配列番号3;図3および4をコードしていることを確認している。特に、以下のとおり、酵母細胞内で異種発現されるp450の酵素活性をアッセイすることにより、候補クローンD121AA8の機能をニコチンデメチラーゼのコード遺伝子として確認した。1.酵母発現ベクターの構築タバコニコチンデメチラーゼをコードするcDNAの推定タンパク質コード配列D120AH4、D121AA8、208AC8およびD208AD9を酵母発現ベクターpYeDP60内にクローニングした。適当なBamHIおよびMfeI部位以下の下線部を、翻訳開始コドンATGの上流または停止コドンTAAの下流にこれらの配列を含有するPCRプライマーにより導入した。増幅されたPCR産物上の該ベクター上のMfeIはEcoRI部位に適合性である。D121AA8cDNAを増幅するために使用したプライマーは5’TAGCTACGCGGATCCATGCTTTCTCCCATAGAAGCC3’および5’CTGGATCACAATTGTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTATAAAGCTCAGGTGCCAGGC3’であった。6個のヒスチジンを含む該タンパク質のC末端の更に9個のアミノ酸をコードする配列のセグメントを、誘導された際の6Hisタグ付きp450の発現を促進するためにリバースプライマー内に組込んだ。酵素消化の後、GAL10CYC1プロモーターに対してセンス配向で、PCR産物をpYeDP60ベクター内に連結した。該酵母発現ベクターの適切な構築を制限酵素分析およびDNA配列決定により確認した。また、p450タンパク質の発現を酵母ミクロソームの界面活性剤相に関してSDSPAGEゲル電気泳動上で可視化した。遺伝子配列に基づけば、p450タンパク質の予想サイズは59kDであり、結果をゲル分析により確認した。2.酵母形質転換ArabidopsisNADPHシトクロムp450レダクターゼATR1を発現するよう修飾されたWAT11酵母系をpYeDP60p450cDNAプラスミドで形質転換した。50μlのWAT11酵母細胞浮遊液を、02cmの電極間隙を有するキュベット内で~1μgのプラスミドDNAと混合した。Eppendorfエレクトロポレーターにより20kVの1パルスを加えた。細胞をSGIプレート5gLバクトカザミノ酸アミノ酸を含有しない67gL酵母窒素塩基20gLグルコース40mgLDLトリプトファン20gL寒天上に広げた。ランダムに選択したコロニー上で直接的に行ったPCR分析により形質転換体を確認した。3.形質転換酵母細胞内でのp450発現単一酵母コロニーを使用して、それを30mlSGI培地5gLバクトカザミノ酸アミノ酸を含有しない67gL酵母窒素塩基20gLグルコース40mgLDLトリプトファンに接種し、30°Cで約24時間成長させた。この培養のアリコートを1000mLのYPGE培地10gL酵母エキス20gLバクトペプトン5gLグルコース30mlLエタノール内に150希釈し、Diastix尿分析試薬片BayerElkhartINの比色変化による表示でグルコースが完全に消費されるまで成長させた。DLガラクトースを2の最終濃度まで加えることによりクローン化P450の誘導を開始した。invivo活性アッセイまたはミクロソーム調製に使用する前に、該培養を更に20時間成長させた。pYeDP60CYP71D20Nicotianatabacumにおける5エピアリストロケンおよび1デオキシカプシジオールのヒドロキシル化を触媒するp450を発現するWAT11酵母細胞を、p450発現および酵素活性アッセイのための対照として使用した。p450の酵母発現の有効性を詳細に評価するために、還元CO差分光法reducedCOdifferencespectroscopyを行った。還元COスペクトルは、全4種のp450形質転換酵母系統から、450nmタンパク質においてピークを示した。対照の未形質転換酵母細胞またはブランクのベクター対照酵母細胞に由来する対照ミクロソームにおいては、類似したピークは観察されなかった。これらの結果は、pYeDP60CYP450を含有する酵母系においてp450タンパク質が有効に発現されたことを示した。酵母ミクロソームにおける発現p450タンパク質の濃度は45~68nmolemg全タンパク質であった。4.invitro酵素アッセイ酵母培養にDLニコチンピロリジン214Cを供給することにより、形質転換された酵母細胞におけるニコチンデメチラーゼ活性をアッセイした。14C標識ニコチンを55μMの最終濃度で75μlのガラクトース誘導培養に加えた。該アッセイ培養を、14mlのポリプロピレンチューブ中、振とうしながら6時間インキュベートし、900μlのメタノールで抽出した。遠心後、20μlの該メタノール抽出物をrpHPLCで分離し、ノルニコチン画分をLSCにより定量した。WAT11pYeDP60CYP71D20の対照培養はニコチンをノルニコチンへ変換しなかった。このことは、WAT11酵母株が、ニコチンからノルニコチンへの生物変換の過程を触媒する内因性酵素活性を含有していないことを示している。これとは対照的に、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子を発現する酵母は、検出可能な量のノルニコチンを産生した。これは配列番号4または配列番号5の翻訳産物のニコチンデメチラーゼ活性を示している。5.酵母ミクロソームの調製ガラクトースによる20分間の誘導の後、酵母細胞を遠心分離により集め、TESMバッファー50mMTrisHClpH751mMEDTA06Mソルビトール10mM2メルカプトエタノールで2回洗浄した。該ペレットを抽出バッファー50mMTrisHClpH751mMEDTA06Mソルビトール2mM2メルカプトエタノール1ウシ血清アルブミンプロテアーゼインヒビターカクテルに再懸濁させた。ついで細胞をガラスビーズ直径05mmSigmaで破壊し、細胞抽出物を20000×gで20分間遠心分離して細胞残渣を除去した。上清を100000×gで60分間の超遠心分離に付した。得られたペレットはミクロソーム画分を含有していた。該ミクロソーム画分をTEGMバッファーに1mgmLのタンパク質濃度で懸濁させた。ミクロソーム調製物を、使用するまで液体窒素冷凍機内で保存した。6.酵母ミクロソーム調製物における酵素活性アッセイ酵母ミクロソーム調製物でのニコチンデメチラーゼ活性アッセイを行った。特に、DLニコチンピロリジン214CをMoravekBiochemicalsから得、それは54mCimmolの比活性を有していた。クロルプロマジンCPZおよび酸化型シトクロムccytC共にP450インヒビターであるをSigmaから購入した。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸NADPHは、NADPHシトクロムP450レダクターゼを介した、シトクロムP450に対する典型的な電子供与体である。対照インキュベーションにはNADPHを除いた。通常の酵素アッセイはミクロソームタンパク質約1mgml、6mMNADPHおよび55μM14C標識ニコチンを含むものであった。CPZおよびCytCの濃度は、それらを使用した場合には、それぞれ1mMおよび100μMであった。反応を25°Cで1時間行い、それぞれ25μlの反応混合物への300μlのメタノールの添加により停止させた。遠心分離後、20μlの該メタノール抽出物を、VarianからのInertsilODS33μクロマトグラフィーカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィーHPLC系Agilentで分離した。イソクラティック移動相はメタノールと50mMリン酸カリウムバッファーpH625との6040vvの比の混合物であり、流速は1ml分であった。真正非標識ノルニコチンとの比較により決定されたノルニコチンのピークを集め、定量のために2900トリカーボtricarbLiquidScintillationCounterに付した。ニコチンデメチラーゼの活性は、1時間のインキュベーションにわたる14C標識ノルニコチンの産生に基づいて計算される。CYP71D20を発現する対照酵母細胞からのミクロソーム調製物、ならびに遺伝子D120AH4、D208AC8およびD208AD9で形質転換された3つの試験p450酵母培養物において、p450様活性が観察された。しかし、該対照およびそれらの3つの試験p450はノルニコチン変換形成を全く示さなかった。このことは、それらが、ニコチンのデメチル化を触媒しうる内因性または誘導性酵素を含有していなかったことを示唆している。これとは対照的に、HPLCおよびLSC分析からの結果は、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子D121AA8を発現する酵母細胞から得たミクロソームサンプルを使用した場合には、ニコチンのデメチル化から生じた検出可能な量のノルニコチンを示した。これらの結果は、ニコチンデメチラーゼ活性がD121AA8遺伝子産物から生じることを示している。ニコチンデメチラーゼ活性はNADPHを要し、p450特異的インヒビターにより抑制されることが示され、これは、タバコニコチンデメチラーゼがp450であることに符合する。タバコニコチンデメチラーゼD121AA8に関する酵素活性は、放射能強度およびタンパク質濃度による計算では約108pKatmgタンパク質であった。該酵母細胞に関して得られた一連の典型的な酵素アッセイの結果を以下の表表4に示す。D121AA8酵母細胞由来のミクロソームを使用するアッセイからNADPHを除いた場合には、ニコチンデメチラーゼ活性の阻止が生じた。したがって、ノルニコチンは形成しなかった表4。2つの公知P450インヒビターであるクロルプロマジンCPZ1mMおよび酸化型シトクロムccytC100μMを別々に該酵素アッセイ混合物中に加え、1時間インキュベートした後でメタノール停止溶液を加えた場合には、ニコチンデメチラーゼ活性が有意に低下した表4。総合すると、これらの実験は、D121AA8が、酵母内で発現されるとニコチンからノルニコチンへの変換を触媒するシトクロムp450タンパク質をコードしていることを示した。単離された核酸断片の関連アミノ酸配列同一性実施例8からシトクロムp450断片に関して得られた核酸配列のアミノ酸配列を演繹した。該演繹領域はGXRXCP配列モチーフの直後のアミノ酸からカルボキシル末端または終止コドンまでに対応するものであった。該断片の配列同一性を比較したところ、70またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列に関して、特有の群分けが見られた。好ましい群分けは、80またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、90またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。それらの特有の核酸配列のいくつかは他の断片に対して完全なアミノ酸同一性を有することが見出されたため、同一アミノ酸を有する唯一のメンバーを報告した。表5の群19に関するアミノ酸同一性は、それらの核酸配列に基づけば、3つの異なる群に対応した。群メンバーのアミノ酸配列およびそれらの同一性を図159Hに示す。アミノ酸の相違が示されている。植物を使用する遺伝子クローニングおよび機能研究のために、各アミノ酸同一性群の少なくとも1つのメンバーを選択した。また、ノーザンおよびサザン分析により評価した場合にエチレン処理または他の生物学的相違により異なって影響される群メンバーを、遺伝子クローニングおよび機能研究のために選択した。遺伝子クローニング、発現研究および全植物評価を補助するために、配列同一性および特異な配列に基づき、ペプチド特異的抗体を調製することが可能である。完全長クローンの関連アミノ酸配列同一性実施例5においてクローニングされた完全長Nicotiana遺伝子の核酸配列をそれらの全アミノ酸配列に関して演繹した。カルボキシル末端におけるUXXRXXZ、PXRFXFまたはGXRXCここで、UはEまたはKであり、Xは任意のアミノ酸であり、ZはP、T、SまたはMであるに対応する3つの保存されたp450ドメインモチーフの存在により、シトクロムp450遺伝子を特定した。お互いに対して及び公知タバコ遺伝子に対して完全長配列を比較するBLASTプログラムを使用して、アミノ酸同一性に関してすべてのp450遺伝子を特徴づけした。該プログラムはNCBIスペシャルspecialBLASTツールtoolhttpwwwncbinlmnihgovblastb12seqb12htmlを使用するものであった。2つの配列を、核酸配列に関してはフィルター無しでBLASTNで、アミノ酸配列に関してはBLASTPで整列させた。それらのアミノ酸同一性に基づき、各配列を同一性群に群分けした。この場合、該群分けは、別のメンバーに対して少なくとも85の同一性を共有するメンバーを含有するものであった。好ましい群分けは、90またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、95またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。これらの基準を用いて、25個の特有の群を特定した。それらを表6に示す。完全長ニコチンデメチラーゼ遺伝子のアミノ酸配列は、配列番号5図4に記載の配列を有するように演繹された。アミノ酸同一性に関して表6で用いたパラメーターにおいては、3つの群は、公知タバコ遺伝子に対して85またはそれ以上の同一性を含有することが判明した。群5のメンバーはGeneBank配列GI14423327に対して完全長配列に関して96までのアミノ酸同一性を有していた。群23はGI14423328に対して93までのアミノ酸同一性を、群24はGI14423318に対して92の同一性を有していた。カルボキシル末端付近のGXRXCp450ドメインとUXXRXXZp450ドメインとの間の高度に保存されたアミノ酸相同性に基づき、完全長遺伝子を更に群分けした。図160A~160Eに示すとおり、個々のクローンを保存ドメイン間の配列相同性に基づいて整列させ、種々の同一性群内に配置した。いくつかの場合には、該クローンの核酸配列は特有なものであったが、該領域に関するアミノ酸配列は同一であった。好ましい群分けは、90またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、より好ましい群分けは、95またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましい群分けは、99またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する配列で認められた。この最終的な群分けは、2つの異なる群に分類された群17表6以外はクローンの全アミノ酸配列に関する同一性に基づくものに類似していた。表7におけるアミノ酸同一性に関して用いたパラメーターにおいては、3つの群は、公知タバコ遺伝子に対して90またはそれ以上の同一性を含有することが判明した。群5のメンバーはGeneBank配列GI14423326に対して完全長配列に関して934までのアミノ酸同一性を有していた。群23はGI14423328に対して918までのアミノ酸同一性を、群24はGI14423318に対して92の同一性を有していた。タバコP450特異的ドメインの1以上を欠くNicotianaシトクロムP450クローン4個のクローンは、表6に報告されている他のタバコシトクロム遺伝子に対して90~99の範囲の高い核酸相同性を有していた。それらの4個のクローンには、D136AD5、D138AD12、D243AB3およびD250AC11が含まれた。しかし、ヌクレオチドフレームシフトにより、これらの遺伝子は3個のC末端シトクロームp450ドメインの1以上を含有しておらず、表6または表7に示す同一性群から除外された。1つのクローンD95AG1のアミノ酸同一性は、表6または表7においてp450タバコ遺伝子を群分けするのに用いた第3のドメインGXRXCを含有していなかった。このクローンの核酸配列は他のタバコシトクロム遺伝子に対して低い相同性を有し、したがって、このクローンはNicotianaのシトクロームp450遺伝子の新規群に相当する。タバコの品質の調節の改変におけるNicotianaシトクロムP450断片およびクローンの使用タバコp450核酸断片または全遺伝子の使用は、タバコ表現型またはタバコ成分の改変、そしてより重要なものとして代謝産物の改変を伴う植物の特定および選択において有用である。ダウンレギュレーション例えば、アンチセンス配向または過剰発現例えば、センス配向などのための配向で、本明細書に記載のものから選ばれる核酸断片または完全長遺伝子を組込む種々の形質転換系により、トランスジェニックタバコ植物を作製することが可能である。完全長遺伝子に対する過剰発現のためには、本発明に記載の完全長遺伝子の全体または機能的部分またはアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が望ましい。そのような核酸配列は、望ましくは、ある酵素の発現を増強してNicotianaにおける表現型効果をもたらすのに有効である。ホモ接合であるNicotiana系統は、一連の戻し交配により得られ、当業者に一般に利用可能な技術を用いて内因性p450RNA、転写産物、p450発現ペプチドおよび植物代謝産物の濃度を分析することとなどこれらに限定されるものではないにより、表現型変化に関して評価される。タバコ植物において示される変化は、選択された関心のある遺伝子の機能的役割に関する情報を提供し、あるいは好ましいNicotiana植物種として有用である。変換体バーレータバコからのゲノムタバコニコチンデメチラーゼのクローニングQiagenPlantEasyキットを前記実施例に記載のとおりに該製造業者の説明も参照されたい使用して、変換体バーレータバコ植物系統440733Nicotianatabacum品種4407系統からゲノムDNAを抽出した。前記実施例においてクローニングした5プロモーターおよび3UTR領域に基づいて、プライマーを設計した。フォワードプライマーは5’GGCTCTAGATAAATCTCTTAAGTTACTAGGTTCTAA3’および5’TCTCTAAAGTCCCCTTCC3’であり、リバースプライマーは5’GGCTCTAGAAGTCAATTATCTTCTACAAACCTTTATATATTAGC3’および5’CCAGCATTCCTCAATTTC3’であった。100μlの反応混合物を使用して440733ゲノムDNAにPCRを適用した。Pfx高忠実度酵素をPCR増幅に使用した。電気泳動後に1アガロースゲル上でPCR産物を可視化した。約35kbの分子量を有する単一のバンドが観察され、それを該ゲルから切り出した。ゲル精製キットQiagenbasedonmanufacturer’sprocedureを使用して、生じたバンドを精製した。精製されたDNAを酵素XbaINEB製造業者の指示に従い使用するで消化した。同じ方法を用いてpBluescriptプラスミドをXbaIで消化した。該断片をゲル精製し、pBluescriptプラスミド内に連結した。該連結混合物をコンピテント細胞GMlO9内に形質転換し、青白選択を伴う100mglのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレーティングした。白色コロニーを拾い、アンピシリンを含有する10mlのLB液体培地内で成長させた。DNAをミニプレップにより抽出した。CEQ2000シークエンサーBeckmanFullertonCaliforniaを製造業者の説明に従い使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。T3およびT7プライマーならびに8個の他の内部プライマーを配列決定に使用した。該配列を集合させ、分析して、ゲノム配列配列番号4図3を得た。該ゲノム配列に基づき、変換体および非変換体の両方のタバコ系統におけるニコチンデメチラーゼ遺伝子は転移因子を含有しないことが確認された。配列番号5の配列と配列番号4との比較は該遺伝子のコード部分コードの単一のイントロン配列番号7の配列として特定される図5の決定を可能にした。図2に示すとおり、タバコニコチンデメチラーゼのゲノム構造は、単一のイントロンに隣接する2つのエキソンを含む。第1エキソンは配列番号4のヌクレオチド20102949に伸長し、これは配列番号3のアミノ酸1313をコードし、第2エキソンは配列番号4のヌクレオチド39474562に伸長し、これは配列番号3のアミノ酸314517をコードしている。したがって、イントロンは配列番号4のヌクレオチド29503946に伸長している。該イントロン配列を図5に示す。それは配列番号7の配列である。ゲノムDNA配列の翻訳産物を配列番号3の配列として図3に示す。タバコニコチンデメチラーゼアミノ酸配列は、小胞体膜アンカーモチーフを含有する。変換体タバコからの5隣接配列配列番号8および3UTR配列番号9のクローニングA.変換体タバコ葉組織からの全DNAの単離変換体タバコ440733の葉からゲノムDNAを単離した。QiagenInc社のDNeasyPlantMiniKitを該製造業者のプロトコールに従い使用してDNAの単離を行った。その製造業者のマニュアルDneasy’PlantMiniandDNeasyPlantMaxiHandbookQiagenJanuary2004を参照により本明細書に組み入れることとする。DNA調製の方法は以下の工程を含むものであった。タバコ葉組織約20mgの乾燥重量を、液体窒素下で1分間、微粉末に粉砕した。該組織粉末を15mlのチューブ内に移した。バッファーAP1400μlおよび4μlのRNアーゼストック溶液100mgmlを最大100mgの粉砕葉組織に加え、激しくボルテックスした。該混合物を65°Cで10分間インキュベートし、チューブを反転させることによりインキュベート中に2~3回混合した。ついでバッファーAP2130μlをライセートに加えた。該混合物を混合し、氷上で5分間インキュベートした。該ライセートをQIAshredderMiniSpinColumnにアプライし、2分間14000rpm遠心分離した。該細胞残渣ペレットを乱すことなく、流出画分を新たなチューブに移した。ついでバッファーAP3E15容量を清澄化ライセートに加え、ピペッティングにより混合した。存在しうる沈殿物を含む前工程からの混合物650μlをDNeasyMiniSpinColumnにアプライした。該混合物を6000×g8000rpmで1分間遠心分離し、流出物を捨てた。残りのサンプルについて、これを繰返し、流出物および収集チューブを捨てた。DNeasyMiniSpinColumnを新たな2mlの収集チューブ内に配置した。ついでバッファーAW500μlをDNeasyカラムに加え、1分間8000rpm遠心分離した。流出物を捨てた。収集チューブを次の工程で再利用した。ついでバッファーAW500μlをDNeasyカラムに加え、2分間14000rpm遠心分離して該メンブレン膜を乾燥させた。該DNeasyカラムを15mlのチューブに移した。ついでバッファーAE100μlをDNeasyメンブレン上にピペッティングした。該混合物を室温15~25°Cで5分間インキュベートし、ついで1分間8000rpm遠心分離して溶出させた。アガロースゲル上でサンプルを泳動させることにより、該DNAの質および量を評価した。B.構造遺伝子の5隣接配列のクローニング配列番号5からの構造遺伝子の5隣接配列の750ヌクレオチドをクローニングするために、修飾された逆PCR法を用いた。まず、既知配列断片内の制限部位および5隣接配列の下流の制限部位距離に基づき、適当な制限酵素を選択した。この既知断片に基づき、2つのプライマーを設計した。フォワードプライマーはリバースプライマーの下流に配置した。リバースプライマーは該既知断片の3部分に配置した。クローニング操作は以下の工程を含むものであった。精製されたゲノムDNA5μgを、50μlの制限混合物中、20~40単位の適当な制限酵素EcoRIおよびSpeIで消化した。該DNAが完全に消化されたかどうかを確認するために、該反応混合物の110容量でのアガロースゲル電気泳動を行った。完全な消化の後に、4°Cで一晩の連結により直接的な連結を行った。10μlの消化DNAおよび02μlのT4DNAリガーゼNEBを含有する200μlの反応混合物を4°Cで一晩連結させた。人工的な小さな環状ゲノムが得られた後、該連結反応物に対してPCRを行った。50μlの反応混合物中、2つの異なる方向の既知断片からの2個のプライマーおよび10μlの連結反応物を使用して、PCRを行った。45~56°Cのアニーリング温度を用いるグラジエントPCRプログラムを適用した。PCR反応を調べるために、アガロースゲル電気泳動を行った。所望のバンドを該ゲルから切り出し、QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該バンドを精製した。pGEMTEasyVector内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SVMiniprepキットを該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ2000シークエンサーを使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。5隣接配列の約758nt配列番号4のヌクレオチド12412009を前記方法によりクローニングした。C.構造遺伝子の、より長い5隣接配列配列番号8図6のクローニング構造遺伝子D121AA8の更なる5隣接配列をクローニングするために、BDGenomeWalkerUniversalKitを該製造業者のユーザーマニュアルに従い使用した。その製造業者のマニュアルBDGenomeWalkerAugust2004を参照により本明細書に組み入れることとする。サンプルを05アガロースゲル上で泳動させることにより、タバコゲノムDNAのサイズおよび純度を試験した。タバコ33ライブラリーゲノムウォーキング構築のために、合計4つの平滑末端反応DRAISTUIECORVPVUIIを準備した。消化されたDNAの精製の後、消化されたゲノムDNAをゲノムウォーカーアダプターに連結した。D121AA8からの遺伝子特異的プライマーCTCTATTGATACTAGCTGGTTTTGGAC配列番号2282およびアダプタープライマーAP1を使用することにより、それらの4つの消化DNAに一次PCR反応を適用した。該一次PCR産物をネスティッドPCR用の鋳型として直接使用した。該キットにより供給されたアダプターネスティッドプライマーおよび公知クローンD121AA8配列番号5からのネスティッドプライマーGGAGGGAGAGTATAACTTACGGATTC配列番号2283を該PCR反応において使用した。ゲル電気泳動を行うことにより、PCR産物を調べた。所望のバンドを該ゲルから切り出し、QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該バンドを精製した。pGEMTEasyVector内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SVMiniprepキットを該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ2000シークエンサーを使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。配列番号4のヌクレオチド3991240を含む5隣接配列の更に約853ntを前記方法によりクローニングした。以下のプライマーGWR1AおよびGWR2Aを使用する以外は同じ方法で、第2ラウンドのゲノムウォーキングを行った。配列番号4のヌクレオチド1398を含む隣接配列の更に約398ntをこの方法によりクローニングした。調節要素に関する検索は、TATAボックス、CAATボックスおよびGAGAボックスに加えて、いくつかのMYB様認識部位および器官特異性要素がタバコニコチンデメチラーゼプロモーター領域内に存在することを示した。標準的な方法を用いて特定された推定エリシター応答要素および窒素調節要素も該プロモーター領域内に存在する。D.構造遺伝子の3隣接配列のクローニング構造遺伝子D121AA8の更なる3隣接配列をクローニングするために、BDGenomeWalkerUniversalKitを該製造業者のユーザーマニュアルに従い使用した。該クローニング手順は、遺伝子特異的プライマー以外は、この実施例の前記C節に記載されているのと同じである。第1プライマーはD121AA8構造遺伝子の末端の近傍から設計した5’CTAAACTCTGGTCTGATCCTGATACTT3’。ネスティッドプライマーは、D121AA8の構造遺伝子のプライマー1の更に下流から設計した。ゲル電気泳動により、最終的なPCR産物を調べた。所望のバンドを該ゲルから切り出した。QIAGENのQIAquickゲル精製キットを使用して該PCR断片を精製した。pGEMTEasyVector内に、該製造業者の説明に従い、精製されたPCR断片を連結した。SVMiniprepキットを該製造業者の説明に従い使用して、該形質転換DNAプラスミドをミニプレップにより抽出した。CEQ2000シークエンサーを使用して、該インサートを含有するプラスミドDNAを配列決定した。更に3隣接配列の約1617ヌクレオチド配列番号4のヌクレオチド47316347を前記方法によりクローニングした。3UTR領域の核酸配列を図7に示す。ニコチンデメチラーゼ遺伝子の存在または非存在に関するNicotiana属のスクリーニング以下の表8に示すとおり、43種のNicotiana種、49種のNicotianarustica系統および約600種のNicotianatabacumをポット内に播種し、生じた植物を温室内で成長させた。葉サンプルを6週齢の植物から採取した。DNeasyPlantMiniKitを該製造業者のプロトコールに従い使用して、葉からのDNA抽出を行った。プライマーは、本明細書に記載の5プロモーターおよび3UTR領域に基づいて設計した。フォワードプライマーは5’GGCTCTAGATAAATCTCTTAAGTTACTAGGTTCTAA3’であり、リバースプライマーは5’GGCTCTAGAAGTCAATTATCTTCTACAAACCTTTATATATTAGC3’であった。すべての前記Nicotiana系統から抽出したゲノムDNAをPCR分析に使用した。100μlの反応混合物およびPfx高忠実度酵素をPCR増幅に使用した。種間の相同性がより低かったため、用いたアニーリング温度は54°Cであったこの温度は、前記の4407変換体タバコからのゲノム配列のクローニングに用いた温度より2°C低い。電気泳動後、08アガロースゲル上でPCR産物を可視化した。約35kbの分子量を有する単一のバンドが該ゲル上に存在した、または存在しなかった。陽性バンドを有するこの系統は標的遺伝子を有すると評価された。陽性バンドを欠く系統に関しては、更に4つのプライマーセットを使用して4つの追加的なPCR反応を行った。これらのプライマーセットは、該遺伝子の異なる領域から選択した。それらのプライマーセットは以下のとおりであった。1開始コドンから終止コドンまで5’ACCAAGATGAAAGATCTTAGGTTTTAA3’、2開始コドンの570nt下流からイントロンの終わりまで、3イントロンの始まりの300nt下流からイントロンの終わりまで、および4イントロンの始まりの300nt下流から3UTRまで。5つの前記PCR反応がすべて正しいバンドを示した場合には、該系統は標的遺伝子を欠いていると評価された。標的ニコチンデメチラーゼ遺伝子に関するゲノムDNA量およびPCR産物の具体例を図8および9に示す。ニコチンデメチラーゼ遺伝子を欠くものとして特定された生殖質を、栽培タバコとの育種のための原材料として使用する。しかし、図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列またはそれらの断片が同様に使用されうる。異常な又は存在しないニコチンデメチラーゼ遺伝子または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片をドナー源から栽培タバコへ移入するためには、戻し交配または系統育種法のような標準的な育種法と組合された種間または種内交雑法が用いられうる。ニコチンデメチラーゼに関するスクリーニング実験の結果を以下の表9に記載する。ニコチンデメチラーゼに関して陰性である系統をそれ自身または別の陰性系統と交配させることが可能である例えば、Nicotianaafricana×Nicotianaafricana、またはNicotianaafricana×Nicotianaamplexicaulis、または任意の適当な交配組合せ。また、当技術分野で公知の標準的なタバコ育種技術により、陰性系統をタバコの任意の実用品種と交配させることも可能である。当技術分野における標準的な方法により、タバコ系統を任意の他の適合植物と交配させることが可能である。変異の作製または生成およびニコチンデメチラーゼ遺伝子内の遺伝的変異に関するスクリーニングニコチンデメチラーゼをコードする配列または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列もしくはそれらの断片により表される任意の他の遺伝子における既存の遺伝的変異または変異を、ゲノム内標的化誘発性局所損傷targetedinducedlocallesionsingenomes、DNAフィンガープリンティング法、例えば増幅断片長多型AFLPおよび一塩基多型SNPを含む分子的技術を用いてスクリーニングする。実際には、既存の遺伝的変異を表す植物集団、例えばトランスジェニック植物例えば、本明細書に記載の任意のトランスジェニック植物または生殖組織または他の植物組織を化学的変異誘発、例えばアルキル化剤、例えばエタンメチルスルホナートEMSまたは放射線、例えばX線もしくはγ線に付すことにより作製された植物を使用する。変異誘発された集団を得るためには、変異誘発化合物または放射線の量は、致死または生殖不稔により特徴づけられる閾値レベルより低い変異頻度が得られるよう植物組織の各タイプごとに実験的に決定される。変異誘発処理から生じたM1世代種子の数またはM1植物集団のサイズは、変異の予想頻度に基づいて推定される。M1植物のの後代であるM2世代は、望ましくは遺伝子例えば、ニコチンデメチラーゼ遺伝子内の変異に関して評価される集団に相当する。誘発された又は天然で生じる遺伝的変異を望ましい遺伝子例えば、ニコチンデメチラーゼ遺伝子内で検出するためには、耕作tilling、DNAフィンガープリンティング、SNPまたは同様の技術が用いられうる。該変異は、欠失、置換、点変異、転座、逆位、重複、挿入または完全なヌル変異から生じうる。これらの技術は、ニコチンデメチラーゼ遺伝子または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片のヌルまたは異類dissimilar対立遺伝子を他のタバコ内に移入または育種するためのマーカー補助選別MA育種計画において用いられうるであろう。育種家は、ヌルまたは異類対立遺伝子を含有する遺伝子型と農業に望ましい遺伝子型との交雑により分離集団を作製しうるであろう。既に挙げた技術の1つを用いて、ニコチンデメチラーゼ配列または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す核酸配列もしくはそれらの断片から生じたマーカーを使用して、F2または戻し交配世代における植物をスクリーニングしうるであろう。ヌルまたは同類対立遺伝子を有すると特定された植物を戻し交配または自家受粉させて、スクリーニングされうる次の世代を作製することが可能であろう。予想される遺伝パターンまたは用いるMAS技術に応じて、所望の個々の植物の特定を補助するために、戻し交配の各サイクルの前に、選抜された植物を自家受粉させることが必要かもしれない。戻し交配または他の育種法は、反復親の所望の表現型が回復するまで反復されうる。栽培タバコ内への変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現の交配または移入A.親系統の選択変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する供与タバコ系統例えば、PCRに基づく方法を用いて、ニコチンデメチラーゼ遺伝子を欠く、またはニコチンデメチラーゼに関してヌルである、または酵素活性の改変を伴うニコチンデメチラーゼを発現するものとして特定されるタバコ系統、あるいは遺伝子発現を改変もしくはサイレンシングするトランスジーンを発現するタバコ系統も、ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現に関する変異体であるとみなされるまたは図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片を特定し、供与親として用いるために選択する。そのような植物は、当技術分野で公知の標準的な方法例えば、本明細書に記載のものにより作製される。他の供与親には、変異誘発され次いで変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子活性または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされる遺伝子産物の変異活性を有すると特定されたタバコ植物が含まれる。1つの典型的な供与親としては、neタバコ系統Nicotianarusticaが挙げられる。受容レシピエントタバコ系統は、典型的には、任意の商業用タバコ品種、例えばNicotianatabacumTN90である。他の有用なNicotianatabacum品種には、BU64CC101CC200CC27CC301CC400CC500CC600CC700CC800CC900Coker176Coker319Coker371GoldCoker48CU263DF911GalpaotobaccoGL26HGL350GL737GL939GL973HB04PK149K326K346K358K394K399K730KT200KY10KY14KY160KY17KY171KY907KY160LittleCrittendenMcNair373McNair944msKY14xL8NarrowLeafMadoleNC100NC102NC2000NC291NC297NC299NC3NC4NC5NC6NC606NC71NC72NC810NCBH129OXFORD207PeriquetobaccoPVH03PVH09PVH19PVH50PVH51R610R630R711R712RG17RG81RGH4RGH51RGH4RGH51RS1410SP168SP172SP179SP210SP220SPG28SPG70SPH20SPNF3TN86TN97TND94TND950TRMadoleVA309VA309またはVA359が含まれる。そのような品種からの種子も、標準的な化学的または分子的方法を用いてニコチン変換の欠如または存在に関してスクリーニングすることにより得られた起源に由来しうる。そのような商業用品種は、本明細書に記載の方法によりニコチンデメチラーゼ活性を改変するための材料をも提供しうる。当技術分野で公知の他のヌル系統および受容または供与系統も有用であり、本明細書に記載のニコチンデメチラーゼ遺伝子とは異類であると特定された系統も供与親として使用される。また、受容系統は、火力乾燥フルーキュアリング、バーレー、いぶしdarkタバコ、バージニアまたはオリエンタルタバコのための任意のタバコ品種から選択されうる。表10は、Nicotianatabacumに対して育種適合性を示す典型的なNicotiana種を示す例えば、APSにより公開されているCompendiumofTobaccoDiseasesまたは日本たばこ産業により公開されているTheGenusNicotianaIllustratedも参照されたい。B.遺伝子導入標準的な育種法により、供与親を反復的に供与親と交配または交雑させる。標準的な方法により特定される、交雑の成功は、稔性であるか又は所望により反復親と戻し交配されるF1植物を与える。F1植物に由来するF2世代における植物集団を、変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現に関して例えば、標準的な方法により、例えば、本明細書に記載のニコチンデメチラーゼに関するヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを使用するPCRにより、ニコチンデメチラーゼ遺伝子の非存在によりニコチンデメチラーゼを発現しない植物が特定されるまたは図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片の変異体発現に関してスクリーニングする。あるいは、植物アルカロイド含量を評価するための、当技術分野で公知の任意の標準的なスクリーニング法を用いて、ニコチンをノルニコチンへ変換しない植物を特定する。ついで、選択した植物を受容親と交雑させ、第1戻し交配BC1世代植物を自家受粉させてBC1F2集団を得、これを変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現例えば、ニコチンでメチラーゼ遺伝子のヌル形態に関して再びスクリーニングする。稔性であり受容親に合理的に類似した植物を最終スクリーニングが与えるまで、戻し交配、自家受粉およびスクリーニングの過程を例えば少なくとも4回繰返す。所望により、この植物を自家受粉させ、ついでその後代を再びスクリーニングして、該植物が変異ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現例えば、ニコチンデメチラーゼに関してヌル状態を示す植物または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片の変異体発現を示すことを確認する。所望により、染色体相補および染色体対合関係を確認するするために、選択した植物の細胞遺伝学的分析を行う。標準的な方法、例えば、圃場試験、ニコチンデメチラーゼに関するヌル状態または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされるポリペプチドのヌルもしくは促進状態の確認、ならびに乾燥葉の化学的分析アルカロイドのレベル、特にノルニコチンの含量およびノルニコチン/ニコチンノルニコチンの比、または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片において見出されるそれらの遺伝子配列によりもたらされる他のそのような所望の特性を測定するためのものを用いて、選択した植物の育種用種子を得る。受容植物例えば、Nrusticaと供与親例えば、TN90との間の交配から得られた元のF1雑種を該供与植物例えば、TN90と交雑または戻し交配させる場合には、この戻し交配の後代を自家受粉させてBC1F2世代を得、これを、ニコチンデメチラーゼのヌルもしくは異類形態または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片によりコードされるポリペプチドのヌルもしくは促進状態に関してスクリーニングする。育種操作のその他の点については、前段落で説明したとおりである。C.農業上の特性の試験および表現型の確認該育種および変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現例えば、ニコチンデメチラーゼに関するヌル状態、または図1、3~7、10~158、162~170、1721~17219および1731~173294に示す任意の核酸配列もしくはそれらの断片のヌル状態に関するスクリーニングから得られた系統を、標準的な圃場法を用いて圃場において評価する。元の受容親例えば、TN90を含む対照遺伝子型を加え、登録体を、完全無作為ブロック設計または他の適当な圃場設計において圃場に配置する。タバコのための標準的な農業的実施を行い、例えば、該タバコを収穫し、秤量し、乾燥キュアリングの前および途中に化学的および他の一般的な試験のためにサンプル化する。選択された系統の、受容植物例えば、親系統TN90に対する類似性を確認するために、データの統計解析を行う。栽培タバコへの修飾属性の交配育種または移入本明細書に記載の任意の遺伝子、例えば図1、図3~7、図10~158、図162~170、図1721~17219および図1731~173294に示す任意の核酸配列の発現を本明細書に記載の方法により修飾することも可能である。そのような遺伝子は、植物の表現型を修飾するための、例えば香味または芳香またはそれらの両方を改良するための、感覚刺激特性を改良するための、または乾燥性を改良するための基礎となる。ついで、修飾された表現型を有すると特定された植物を、当技術分野で公知の標準的な方法例えば、本明細書に記載の方法による育種プロトコールにおいて使用する。雑種植物の作製プロトプラスト融合を用いる、雑種植物の生産のために開発された標準的なプロトプラスト培養法の適用も、変異体遺伝子発現例えば、変異体ニコチンデメチラーゼ遺伝子発現を有する植物を作製するために有用である。したがって、変異体遺伝子発現を有する第1および第2タバコ植物からプロトプラストを作製する。成功裏に得られたプロトプラスト融合体からカルスを培養し、ついで植物を再生させる。生じた後代雑種植物を特定し、標準的な方法により、変異体遺伝子発現に関して選択し、所望により、任意の標準的な育種プロトコールにおいて使用することが可能である。WO03078577、WO2004035745、PCTUS2004034218およびPCTUS2004034065ならびに本明細書中で言及されている全ての他の参考文献、特許、特許出願公開および特許出願を、これらの参考文献、特許、特許出願公開および特許出願のそれぞれが参照により本明細書中に個別に組み入れられている場合と同等に、参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の前記の詳細な説明を考慮すれば、本発明の実施における多数の修飾および変更が当業者に見出されると予想される。したがって、そのような修飾および変更も特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。