"DNAサンプル中のFMR遺伝子座を特徴づける方法であって:a該サンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程;b該サンプルにGC参照標準を加える工程であって、該参照標準は、少なくとも75のGC含量を有する、工程;c該サンプルの該第1部分および第2部分であって、各々が該GC参照標準を含む、該第1部分および第2部分を、DNA増幅反応に供する工程であって、各部分において増幅されたDNAは、異なる標識で標識される、工程;およびd該サンプルの該第1部分および該第2部分からの該増幅されたDNAを分析することにより、該FMR遺伝子座のメチル化状態を特徴づける工程を包含する、方法。工程dが、キャピラリー電気泳動CEを含む、請求項1に記載の方法。前記GC参照標準が、前記メチル化感受性DNaseについての認識部位を欠いている、請求項2に記載の方法。前記第1部分および前記第2部分からの前記増幅されたDNAが、単回のCEランにおいて分析される、請求項2に記載の方法。前記GC参照標準が、天然に存在するFMR対立遺伝子と重複しないCE移動時間を有する、請求項2に記載の方法。前記GC参照標準が、約20未満、約24~27または約32超のCGGリピートの相対保持時間を有する、請求項2に記載の方法。前記GC参照標準が、約3未満のCGGリピートの相対保持時間を有する、請求項2に記載の方法。前記GC参照標準が、約175~約225のCGGリピートの相対保持時間を有する、請求項2に記載の方法。前記メチル化感受性DNaseが、HpaII、EagIまたはNruIから選択される、請求項1に記載の方法。前記増幅反応が、少なくとも200のCGGリピートを増幅することができる、請求項1に記載の方法。前記増幅反応が、1を超えるGC/AT比を有するdNTP混合物を含む、請求項10に記載の方法。前記GC/AT比が、約2.5~約10である、請求項11に記載の方法。前記FMR遺伝子座が、FMR1遺伝子座である、請求項1に記載の方法。前記GC参照標準が、前記第1部分を前記DNaseと接触させた後に前記サンプルに加えられる、請求項1に記載の方法。前記GC参照標準が、前記第1部分を前記DNaseと接触させる前に前記サンプルに加えられる、請求項1に記載の方法。前記サンプルの前記第2部分をコントロール酵素と接触させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。前記コントロール酵素が、EcoRIおよびSau3A1から選択される、請求項16に記載の方法。前記GC参照標準が、前記第1部分を前記DNaseと接触させる前に前記サンプルに加えられ、前記コントロール酵素が、HindIII-HF、EcoRI、DpnIおよびNaeIから選択される、請求項16に記載の方法。前記サンプルの前記第1部分を前記メチル化感受性DNaseと接触させる前に、該サンプルに消化コントロールを加える工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。前記消化コントロールが、約3未満のCGGリピートの相対保持時間を有し、前記GC参照標準が、約3未満のCGGリピートの相対保持時間を有し、該消化コントロールの増幅産物および該参照標準の相対保持時間が、約4またはそれを超えるCGGリピートによって異なる、請求項19に記載の方法。ヒトDNAサンプルを分析する方法であって:a該サンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程;b該サンプルにGC参照標準を加える工程であって、該参照標準は、少なくとも75のGC含量を有する、工程;c該サンプルの該第1部分および第2部分をDNA増幅反応に供する工程であって、各部分において増幅されたDNAは、異なる標識で標識される、工程;およびd該サンプルの該第1部分および該第2部分からの該増幅されたDNAを分析することにより、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦運動失調症候群および/または脆弱X関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出する工程を包含する、方法。以下の式の核酸配列:5’-A-B-C-3’を含むGC参照標準であって、ここで、Aは、配列番号40の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列であり、ここで、Aは、ゲノムFMR1の5’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ;Cは、配列番号41の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列であり、ここで、Cは、ゲノムFMR1の5’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ;Bは、少なくとも75のGC含量を有する配列であり、かつX-300ヌクレオチド長~X10ヌクレオチド長であり、ここで、Xは、aAの3’末端~配列番号40の最後のヌクレオチドのヌクレオチド数;およびb配列番号41の最初のヌクレオチドからCの5’末端までのヌクレオチド数の合計である、GC参照標準。Bが、150ヌクレオチド長~200ヌクレオチド長である、請求項22に記載のGC参照標準。Bが、少なくとも90のGC含量を有する、請求項23に記載のGC参照標準。Bが、少なくとも94のGC含量を有する、請求項23に記載のGC参照標準。Aが、を含む、請求項22に記載のGC参照標準。Cが、を含む、請求項22に記載のGC参照標準。Bが、配列番号48の少なくとも100ヌクレオチドまたは配列番号49の少なくとも100ヌクレオチドを含む、請求項22に記載のGC参照標準。現在までに、SB以外の単一のアプローチで、男性と女性の両方のサンプルにおいて、伸長された対立遺伝子に対して正確なメチル化の評価を示したものはない。ゆえに、GCリッチな遺伝子座のメチル化およびリピート状態を特徴づけるために使用できる簡便なワークフローの迅速かつ正確なアッセイが必要とされている。本明細書中に記載される方法は、男性と女性の両方のサンプルにおけるGCリッチリピート長の範囲にわたってメチル化状態を検出および解明し得るPCRベースの技術に関する。その全体的なワークフローは、日常的な試験およびハイスループットスクリーニングの用途に適用可能であり、SB分析を必要としない広範なFMR1分析の基礎を提供する。1つの実施形態において、本方法は、DNAサンプル中のFMR遺伝子座を特徴づけることに関し、その方法は:aそのサンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程;bそのサンプルにGC参照標準を加える工程ここで、その参照標準は、少なくとも75のGC含量GC-richnessを有する;cそのサンプルの第1部分および第2部分各々がGC参照標準を含むをDNA増幅反応に供する工程ここで、各部分において増幅されたDNAは、異なる標識で標識される;およびdそのサンプルの第1および第2部分からの増幅されたDNAを分析することにより、そのFMR遺伝子座のメチル化状態を特徴づける工程を包含する。ある特定の実施形態において、工程dは、キャピラリー電気泳動CEを含む。さらなる実施形態において、第1および第2部分からの増幅されたDNAは、単回のCEランにおいて分析される。いくつかの方法において、GC参照標準は、メチル化感受性DNaseについての認識部位を欠いている。ある特定の方法において、GC参照標準は、天然に存在するFMR対立遺伝子と重複しないCE移動時間を有する。例えば、GC参照標準は、約20未満、約24~27または約32超のCGGリピートの相対保持時間を有し得る。さらなる例では、GC参照標準は、約175~約225のCGGリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、GC参照標準は、第1部分をDNaseと接触させた後にサンプルに加えられる。他の実施形態において、増幅反応は、少なくとも200のCGGリピートを増幅することができる。ある特定の増幅反応物は、約2.5~約10などの1を超えるGC/AT比を有するdNTP混合物を含む。ある特定の方法において、FMR遺伝子座は、FMR1である。いくつかの方法において、メチル化感受性DNaseは、HpaII、EagIまたはNruIから選択される。さらなる実施形態において、サンプルの第2部分は、コントロール酵素と接触させられる。いくつかの場合において、コントロール酵素は、EcoRIおよびSau3A1から選択される。他の場合において、コントロール酵素は、EcoRI、DpnI、NaeIおよびHindIII-HFから選択される。本明細書中に記載されるある特定の実施形態は、ヒトDNAサンプルを分析する方法に関し、その方法は:aそのサンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程;bそのサンプルにGC参照標準を加える工程ここで、その参照標準は、少なくとも75のGC含量を有する;cそのサンプルの第1部分および第2部分をDNA増幅反応に供する工程ここで、各部分において増幅されたDNAは、異なる標識で標識される;およびdそのサンプルの第1および第2部分からの増幅されたDNAを分析することにより、FXS、脆弱X関連振戦運動失調症候群および/または脆弱X関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出する工程を包含する。本明細書中に記載されるある特定の実施形態は、式:5’-A-B-C-3’の核酸配列を含むGC参照標準に関し、ここで、Aは、配列番号40の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列であり、Aは、ゲノムFMR1の5’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ;Cは、配列番号41の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含む配列であり、Cは、ゲノムFMR1の5’非翻訳領域に特異的にハイブリダイズすることができ;Bは、少なくとも75のGC含量を有する配列であり、X-300ヌクレオチド長~X10ヌクレオチド長の長さである。Xは、aAの3’末端~配列番号40の最後のヌクレオチドのヌクレオチド数;とb配列番号41の最初のヌクレオチドからCの5’末端までのヌクレオチド数との合計である。ある特定の実施形態において、Bは、150~200ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、Bは、少なくとも90のGC含量を有する。さらなる実施形態において、Bは、少なくとも94のGC含量を有する。1つの実施形態において、Aは、GCGCTCAGCTCCGTTTCGGT配列番号17を含む。追加の実施形態において、Cは、AGTGCGGGGCTCCAATGGCG配列番号39を含む。前述の全般的な説明と以下の詳細な説明との両方が、単に例示的かつ説明的なものであって、特許請求されるような本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。例示的な実施形態ある特定の態様において、本発明は、GCリッチな核酸鋳型のメチル化状態を特徴づけるための方法を提供する。例示的な実施形態において、その方法は、GC参照標準の存在下におけるPCRと組み合わせたメチル化感受性DNaseによる処理を含む。本明細書中に記載される方法は、mPCR法と呼ばれることがある。本発明の理解を助けるために、まず、ある特定の用語を定義する。追加の定義は、本願全体を通して提供される。a、anまたはtheとの語の使用は、特許請求の範囲および/または明細書において用語含むとともに使用されるとき、1つを意味し得るが、1つ以上、少なくとも1つおよび1つまたは1つより多いの意味とも一致する。GC/AT比は、所与の溶液または混合物における、dCTP、dGTPおよびそれらのすべてのヌクレオチドアナログの合計の濃度対、dATP、dTTP、dUTPおよびそれらのすべてのヌクレオチドアナログの合計の濃度の比のことを意味する。dNTPは、デオキシヌクレオチド三リン酸を表し、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTPおよびそれらのアナログのことを指す。ヌクレオチドアナログは、天然の塩基であるアデニンA、シトシンC、グアニンG、チミンTもしくはウラシルU以外の塩基部分、デオキシリボースと同一もしくは類似の糖部分、および少なくとも1つのリン酸もしくは複数のリン酸例えば、二リン酸または三リン酸部分を含む、分子またはイオンである。ヌクレオチドアナログは、三リン酸および糖部分その両方の構造および配置が、ポリメラーゼによって核酸の二重らせんに組み込まれるのに適している、ならびに塩基核酸の二重らせんにおけるその塩基対形成特性、および核酸の二重らせんにおけるDNAポリメラーゼによって組み込まれる遺伝子座におけるその塩基対形成特性が、dATP、dCTP、dGTP、dTTPまたはdUTPのうちの1つに最も類似しているを含むとき、dTTPのアナログが一般にdUTPのアナログでもあり、その逆もまた同じであることを除いて、特定のヌクレオチド、特に、先に列挙された5つのヌクレオチドのアナログである。GC含量は、ある核酸中の、グアニン残基、シトシン残基またはそれらのアナログである全核酸塩基残基の割合またはパーセンテージである。例えば、厳密に30個のシトシン、厳密に30個のグアニン、厳密に1つのシトシンアナログおよび厳密に1つのグアニンアナログを含む100nt核酸は、62というGC含量を有する。いくつかの実施形態において、GCリッチ鋳型は、少なくとも51、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または99.5のグアニン残基、シトシン残基またはそれらのアナログを含み得る。I.メチル化状態を特徴づける方法ある特定の実施形態において、本発明は、GCリッチな核酸鋳型のメチル化状態を特徴づける方法に関する。概して、その方法は、サンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程、そのサンプルにGC参照標準を加える工程、そのサンプルの第1部分および第2部分を核酸増幅反応に供する工程、ならびにそのサンプルの第1および第2部分からの増幅された核酸を分析する工程を包含する。いくつかの実施形態において、第1部分および第2部分は、異なって標識される。さらなる実施形態において、第2部分は、増幅前にコントロール酵素と接触させられるここで、そのコントロール酵素は、増幅された配列を切断しない。そのコントロール酵素は、例えば、EcoRI、DpnI、NaeIおよびHindIII-HFから選択され得る。さらに可能性のあるものとしては、Sau3A、NheI、TfiI、ApaLI、MluCI、NcoI、ScaI、StuI、XmnIおよびHpy16611が挙げられる。いくつかの実施形態において、コントロール酵素は、DNA増幅反応によって増幅される領域内に存在しない認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼから選択される。いくつかの実施形態において、コントロール酵素は、DNA増幅反応によって増幅される領域内の非標的部位において、非特異的切断スター活性をたとえあったとしてもほとんど示さない酵素から選択される例えば、DNA増幅反応によって増幅される領域内において、20、15、10、5、3または1未満の非標的部位の切断。切断の程度は、DNA増幅反応によって増幅される領域内で少なくとも1つの切断事象を起こす分子の割合について表される。さらなる実施形態において、第1および第2部分の分析は、単一のアッセイで行われる。図1および10は、本発明の方法に従った例示的なアッセイの概略を表している図を示している。ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、FXS、脆弱X関連振戦運動失調症候群および脆弱X関連原発性卵巣機能不全に関連する遺伝子型を検出するために使用され得る。これらの状態に関連する遺伝子座は、当該分野で公知であり、それらとしては、FMR1、FMR2、FMR1の5’UTR、FMR2の5’UTR、FMR1の5’UTR内のCGGリピートおよびFMR2の5’UTR内のCCGリピートが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されるとき、用語FMR遺伝子座とは、FMR1遺伝子座またはFMR2遺伝子座のことを指す。追加の実施形態において、本方法は、GCリッチトリヌクレオチドリピート障害例えば、FXS、脆弱X関連振戦運動失調症候群および脆弱X関連原発性卵巣機能不全、筋緊張性ジストロフィ、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ならびに/または脊髄小脳失調に関連する遺伝子型を検出するために使用され得る。これらの状態に関連する遺伝子座は、当該分野で公知であり、それらとしては、FMR1、FMR2、DMPK、ZNF9、HTT、AR、ATN1、ATXN1-3、ATXN7、ATXN10、CACNA1A、SCA8、PPP2R2BおよびTBPが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、NatGenet.1996May;131:105-8;NatGenet.1996May;131:109-13を参照のこと。これらの遺伝子座におけるGCリッチ領域の過剰伸長Hyperexpansionおよび/または過剰メチル化は、それらの疾患に関連している。A.GC参照標準いくつかの態様において、本発明は、本明細書中に記載される方法に従って使用され得るGC参照標準に関する。本明細書中に記載される方法のGC参照標準は、外部参照標準であり、FMR遺伝子座と共に増幅されるようにデザインされる。いくつかの実施形態において、GC参照標準は、FMR1遺伝子付近に存在するGCリッチな遺伝子座などの遺伝子座に存在するCGGリピートの数を評価するために使用され得る。例示的な実施形態において、GC参照標準は、CEによる所望の相対保持時間を有するようにデザインされる。本明細書中で使用されるとき、用語相対保持時間とは、所与の長さおよび/またはGC含量の他の増幅産物の移動時間と比較したときの、GC参照標準から増幅された産物がCEにおいてキャピラリーを通って移動するのに要する時間の長さのことを指す。ある特定の実施形態において、GC参照標準の相対保持時間は、既知の数のCGGリピートを含む配列と比較される。いくつかの場合において、GC参照標準は、ヒト被験体のFMR1遺伝子座におけるCGGリピートの数を決定するために使用される。ある特定の実施形態において、GC参照標準の相対保持時間は、増幅のために同じプライマーを用いる遺伝子座と比較される。いくつかの実施形態において、GC参照標準は、CEアッセイにおいて、天然に存在するFMR1対立遺伝子と重複しないような相対保持時間を有する。例えば、FMR1遺伝子座におけるCGGリピートのメチル化状態および数を決定するアッセイにおいて、CGGリピートを含む天然に存在するゲノム対立遺伝子と比較される、0のCGGリピートの相対保持時間を有するGC参照標準が、含められ得る。別の実施形態は、約40のCGGリピートの相対保持時間を有するGC参照標準を含む。さらなる実施形態において、GC参照標準は、ゲノムサンプルと比較される、約20未満、約24~約27または約32超のCGGリピートの相対保持時間を有する。例示的なGC参照標準は、以下の式:5’-A-B-C-3’を有する配列を含み、ここで、AおよびCは、順方向および逆方向PCRプライマーによって認識される配列であり、Bは、GCリッチ配列である。一般に、GC参照標準は、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99パーセントのGC含量を有する。配列Aは、GCリッチ領域またはCGGリピート領域の上流のゲノム配列から選択され得、配列Cは、そのような領域の下流のゲノム配列から選択され得る。増幅反応中、これらの配列またはその相補体は、プライマー認識部位として使用され得、参照標準は、標的配列と同じプライマーを用いて増幅される。ある特定の実施形態において、配列AおよびCは、それぞれGCリッチ領域の上流および下流のFMR15’-UTRから選択される。AおよびCまたはそれらの相補体の配列は、増幅反応用のプライマーとして使用され得る。配列Aの例としては:が挙げられる。配列Cの例としては:が挙げられる。配列番号40および41は、CGGリピート領域の上流および下流のFMR1配列を示している。ある特定の実施形態において、配列Aは、配列番号40の少なくとも10個のヌクレオチドを含み、配列Cは、配列番号41の少なくとも10個のヌクレオチドを含む。配列Bは、GCリッチ配列であり、CE分析において参照標準が特定の相対保持時間を有するような長さを有し得る。その保持時間は、規定の長さおよびGC特徴を有する既知の標準に対して測定され得る。例えば、配列Bの長さは、参照標準が、ゲノムサンプルと比較される、約20未満、約24~約27または約32超のCGGリピートの相対保持時間を有するように選択され得る。配列Bの長さは、参照標準が、0未満または約0のCGGの相対保持時間を有するように選択され得る。ある特定の例において、参照標準は、約-100、-90、-80、-70、-60、-50、-40、-30、-20、-10または0のCGGリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、GC参照標準は、3、2、1、0、-1、-2、-3、-4、-5、-10、-15または-20以下のCGGリピートの相対保持時間を有する。参照標準の相対保持時間は、プライマーのピークまたは天然に存在するFMR1対立遺伝子と重複しないように選択され得る。GC参照標準の相対保持時間はまた、消化コントロール下記で論じられるが使用されるとき、その消化コントロールと重複しないようにも選択され得る。GC参照標準は、例えば、その参照標準が、ゲノムサンプルから増幅された産物よりも短いGCリッチ領域周辺の隣接配列を有するとき、負の相対保持時間を有し得る。したがって、GC参照標準は、実際には、正の数のCGGリピートを含むが、隣接配列の含有量の差に起因して、負の数のCGGリピートを有する仮定上のゲノムサンプルと等価な保持時間を有し得る。いくつかの実施形態において、Bの長さは、X-300からX10のヌクレオチド長であり、ここで、Xは:a配列Aの3’末端とGCリッチ領域の始まりとの間のヌクレオチド数;とbGCリッチ領域の終わりと配列Cの5’末端との間のヌクレオチド数との合計である。いくつかの実施形態において、Bは、配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、Bは、配列番号48の少なくとも50、75、100または125ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Bは、配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、Bは、配列番号49の少なくとも50、75、100または125ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Bは、ストリンジェントな条件下において配列番号48または配列番号49とハイブリダイズする配列を含むかまたはそれからなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、50ホルムアミド、5×SSCここで、1×SSCは、150mMNaCl、15mMクエン酸三ナトリウムである、50mMリン酸ナトリウムpH7.6、5×デンハート液、10デキストラン硫酸および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中での42°Cにおけるハイブリダイゼーションに続く、0.1×SSCを含む溶液中での65°Cにおける洗浄である。図2は、FMR1のGCリッチな遺伝子座の天然に存在する配列と重複しない相対保持時間を有するGC参照標準の例を示している。ある特定の実施形態において、GC参照標準は、プラスミド内または他のベクター内に含まれている。そのプラスミドまたは他のベクターは、例えば、制限酵素を用いた消化によって、線形化されてもよいし、インタクトなままであってもよい。1つの実施形態において、プラスミドは、pBR322である。GC参照標準が、プラスミドなどのより長いDNA分子の一部としてサンプルまたはサンプルの一部に加えられるとき、増幅反応は、必ずしもそのより大きなDNA分子のすべての部分を増幅せず例えば、増幅されない可能性のある配列としては、プラスミド複製起点、抗生物質耐性マーカー、介在する非コード配列などが挙げられ得る、本開示の場合、GC参照標準を含む分子内のそのような増幅されない配列は、GC参照標準の相対保持時間またはGC含量を決定する際に考慮されない。GC参照標準は、メチル化感受性DNaseによる処理の前または後に核酸サンプルに加えられ得る。メチル化感受性DNaseによる処理の前にGC参照を加えることは、そうでなければGC参照標準をサンプルの2つの部分そのうちの1つは、メチル化感受性DNaseで処理され、もう1つは処理されないにピペットで加えることに起因し得る誤差を減少させ得る。つまり、GC参照が、メチル化感受性DNaseで処理する前にサンプルに加えられるとき、そのGC参照は、サンプルを2つの部分に分ける前にサンプルに加えられ得る。GC参照標準がメチル化感受性DNaseまたはコントロール酵素の前にサンプルに加えられる実施形態において、そのGC参照標準は、そのDNaseによって切断されず、例えば、そのGC参照標準は、そのDNaseについての認識部位を欠いている可能性があり、かつ/またはメチル化感受性DNaseによる切断に耐性であるようにメチル化されている可能性がある。GC参照標準が、メチル化感受性DNaseでサンプルの部分を処理した後にそのサンプルに加えられるとき、そのGC参照標準は、そのサンプルの第1および第2部分に加えられる。サンプルに加えられるGC参照標準の量は、増幅反応のタイプおよび増幅の程度例えば、サイクル数または等温インキュベーションの長さに応じて変動し得る。例えば、増幅反応としてPCRを用いるいくつかの実施形態において、約750~約12,000コピーのGC参照標準が、各PCR反応のために加えられ得る。B.消化コントロール本明細書中に記載される方法は、消化コントロールの使用を含み得る。その消化コントロールは、サンプルDNA中の、FMR遺伝子座などの領域と共に増幅されるようにデザインされる。その消化コントロールは、メチル化されておらず、メチル化感受性DNaseに対する少なくとも1つの認識部位を含み、ゆえに、そのメチル化感受性DNaseで処理されると切断される。結果として、このコントロール鋳型は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化の有効性を報告する。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、CE分析において特定の相対保持時間を有するような構造および長さを有する。増幅反応がPCRを含む実施形態では、ゲノム標的遺伝子座および消化コントロールを増幅するために、同じプライマーが使用され得る。メチル化感受性DNaseによる消化から生じる消化コントロールのフラグメントは、消化コントロールの増幅を支持しない。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、ゲノムサンプルと比較される、約20未満、約24~約27または約32超のCGGリピートの相対保持時間を有する。ある特定の例において、消化コントロールは、約-100、-90、-80、-70、-60、-50、-40、-30、-20、-10または0のCGGリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、3、2、1、0、-1、-2、-3、-4、-5、-10、-15または-20以下のCGGリピートの相対保持時間を有する。消化コントロールの相対保持時間は、プライマーのピークまたは天然に存在するFMR1対立遺伝子と重複しないように選択され得る。消化コントロールの相対保持時間はまた、GC参照標準と重複しないようにも選択され得る。ある特定の実施形態において、消化コントロールは、プラスミド内または他のベクター内に含まれている。そのプラスミドまたは他のベクターは、例えば、制限酵素を用いた消化によって、線形化されてもよいし、インタクトなままであってもよい。1つの実施形態において、プラスミドは、pBR322である。消化コントロールが、プラスミドなどのより長いDNA分子の一部としてサンプルまたはサンプルの一部に加えられるとき、増幅反応は、必ずしもそのより大きなDNA分子のすべての部分を増幅せず例えば、増幅されない可能性のある配列としては、プラスミド複製起点、抗生物質耐性マーカー、介在する非コード配列などが挙げられ得る、本開示の場合、消化コントロールを含む分子内のそのような増幅されない配列は、消化コントロールの相対保持時間またはGC含量を決定する際に考慮されない。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、配列を含むかまたはそれからなる。下線の部分は、得られるアンプリコンのサイズを改変するために調整され得る隣接配列の例である。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、配列番号50の少なくとも100、150、175、200または220ヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、ストリンジェントな条件下において配列番号50にハイブリダイズする配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、消化コントロールが上で論じられたような相対保持時間を有するように、より多いかまたは少ない数のCGGリピートを有する点で改変された配列番号50のバージョンである配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、消化コントロールおよび参照標準の相対保持時間は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上のCGGリピート相当分だけ異なる。GCリッチな増幅反応では、鋳型またはプライマーのスリッピングslippingが生じ得、元の標的と約1~3個のCGGリピートだけ長さが異なる産物がもたらされ得る。したがって、特定の実施形態において、消化コントロールおよび参照標準の相対保持時間は、シグナルの重複を最小にするために4またはそれ以上のCGGリピート相当分だけ異なる。いくつかの実施形態において、消化コントロールと参照標準の両方が、3、2、1、0、-1、-2、-3、-4、-5、-10または-15以下のCGGリピートの相対保持時間を有する。いくつかの実施形態において、消化コントロールは、上に記載されたようなA、BおよびC配列を含む、GC参照標準のいくつかの実施形態について上記のI.Aの項に記載された一般的な1次構造を有する。消化コントロールとGC参照標準の両方が、上に記載されたようなA、BおよびC配列を含むとき、その消化コントロールにおけるA、BまたはCセグメントの少なくとも1つは、GC参照標準中のその対応物と長さが異なり得、その消化コントロールは、参照標準の長さと少なくとも1、2、3、4、5またはそれ以上のCGGリピートの相当分だけ異なる長さである。消化コントロールは、なおも、メチル化感受性ヌクレアーゼによる消化に対して適切なメチル化状態その状態は、参照標準のメチル化状態の反対であり得るを有する。サンプルに加えられる消化コントロールの量は、増幅反応のタイプおよび増幅の程度例えば、サイクル数または等温インキュベーションの長さに応じて変動し得る。例えば、増幅反応としてPCRを用いるいくつかの実施形態において、約750~約12,000コピーの消化コントロールが、各PCR反応のために加えられ得る。C.メチル化感受性ヌクレアーゼ本明細書中に記載される方法は、メチル化感受性ヌクレアーゼの使用を含み得る。いくつかの場合において、そのヌクレアーゼは、制限酵素などのDNaseである。本明細書中に提供される方法のメチル化感受性ヌクレアーゼは、そのメチル化状態に基づいて、増幅されたFMR遺伝子座の一部を異なって切断する。コントロールヌクレアーゼは、その部分を切断しない。メチル化感受性DNaseとしては、が挙げられる。ある特定の実施形態において、メチル化感受性DNaseは、HpaI、NruI、EagI、BssHIIおよびHhaIから選択される。ある特定の実施形態において、メチル化感受性DNaseは、HpaIIである。選択されるメチル化感受性DNaseについての認識部位を下記に示す:ある特定の実施形態において、サンプルの第1部分は、メチル化感受性ヌクレアーゼで処理され、一方、第2部分は、コントロールヌクレアーゼで処理される。そのコントロールヌクレアーゼは、増幅された遺伝子座を切断しない制限酵素であり得る。そのコントロールヌクレアーゼは、非メチル化感受性ヌクレアーゼであり得る。多くの制限酵素およびそれらの特異性は、当該分野で周知である。記載される方法において使用され得るコントロールヌクレアーゼの例としては、とりわけ、HindIII-HF、DpnI、NaeI、EcoRIまたはSau3A1が挙げられる。コントロールヌクレアーゼは、上記のIの項の最初の部分で詳細に論じられている。D.増幅方法本発明の方法は、核酸増幅も含む。核酸配列を増幅するための方法は数多く存在し、それらとしては、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リアルタイムPCRRT-PCR、核酸配列ベース増幅NASBA、リガーゼ連鎖反応、多重連結可能multiplexligatableプローブ増幅、インベーダー技術invadertechnologyThirdWave、ローリングサークル増幅、インビトロ転写、鎖置換増幅、転写媒介性増幅TMA、RNAEberwine増幅、ループ媒介性等温増幅および当業者に公知の他の方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、それらの方法は、下流の分析のために非連結状の増幅産物を提供するために、ローリングサークル増幅またはループ媒介性等温増幅などの増幅反応によって生成された連結状の増幅産物を、例えば、増幅鋳型または組み込まれるプライマーに存在する認識部位のエンドヌクレアーゼ的切断によって、プロセシングする工程をさらに包含する。代表的なPCR反応は、標的核酸種を選択的に増幅する複数の増幅工程またはサイクルを含む。代表的なPCR反応は、3つの工程:標的核酸を変性する変性工程;PCRプライマーのセット順方向および逆方向プライマーが相補DNA鎖にアニールするアニーリング工程;および熱安定性DNAポリメラーゼがプライマーを伸長する伸長工程を含む。これらの工程を複数回繰り返すことによって、DNAフラグメントが増幅されて、標的DNA配列に対応するアンプリコンが生成される。代表的なPCR反応は、変性、アニーリングおよび伸長の20以上のサイクルを含む。サイクルが2工程だけを含む多くの場合において、アニーリング工程および伸長工程は、同時に行われ得る。ある特定の方法において、プライマーのセットは、各標的配列に対して使用される。いくつかの実施形態において、単一のプライマーセットが、GC参照標準と標的核酸の両方を増幅し得る。ある特定の実施形態において、プライマーの長さは、多くの因子に左右され、その因子としては、プライマー間の所望のハイブリダイゼーション温度、標的核酸配列、および増幅される種々の標的核酸配列の複雑さが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、プライマーは、約15~約35ヌクレオチド長である。他の実施形態において、プライマーは、15、20、25、30または35ヌクレオチド長以下である。さらなる実施形態において、プライマーは、35ヌクレオチド長より長い。いくつかの実施形態において、プライマーセットは、配列番号40にハイブリダイズする1つのプライマー、および配列番号41にハイブリダイズする第2のプライマーを含む。プライマーは、配列番号40に示されている少なくとも10個連続したヌクレオチドを含み得るか、またはプライマーは、配列番号41の示されている鎖に対して相補的な少なくとも10個連続したヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、本方法は、少なくとも100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000またはそれ以上のCGGリピートを増幅することができるPCR反応を含む。大きなGCリッチ鋳型を増幅することができる例示的な方法は、例えば、米国特許出願公開第2010/0209970号その全体が本明細書中で参考として援用されるに記載されている。PCR反応は、1より大きいGC/AT比で、かつGCリッチ鋳型を用いてDNAの合成をもたらす全dNTP濃度で、dNTPを提供する工程を包含し得る。そのGC/AT比は、約1.1、1.2、1.4、1.6、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25またはそれ以上であり得る。そのGC/AT比は、1.1~20、1.1~15、1.1~10、1.1~8、1.1~7、1.1~6、1.1~5、1.2~25、1.4~25、1.6~25、2~25、3~25、4~25、5~25、2~15、2.5~10または4~10であり得る。全dNTP濃度は、約0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、2または3mMであり得る。dNTP濃度は、0.4~3mM、0.5~3mM、0.6~3mM、0.7~3mM、0.8~3mM、0.9~3mM、1~3mM、0.4~2mM、0.4~1.5mM、0.4~1.2mM、0.4~1mM、0.4~0.9mM、0.4~0.8mM、0.4~0.7mM、0.5~2mM、0.5~1mMまたは0.6~0.9mMであり得る。PCR反応において使用されるDNAポリメラーゼは、野生型のもの、改変されたもの、好熱性のもの、キメラのもの、操作されたもの、および/または2つ以上のポリメラーゼの混合物を含み得る。そのDNAポリメラーゼは、由来の天然に存在するDNAポリメラーゼを含み得る。例示的な実施形態において、増幅される核酸は、増幅反応中に標識される。ある特定の場合において、メチル化感受性DNaseで処理されたサンプルの部分が、第1の標識で標識され、そのサンプルのコントロール部分が、第2の標識で標識される。いくつかの実施形態において、各標識は、CEによって検出可能である。標識としては:検出可能な蛍光、化学発光または生物発光シグナルを発生するかまたはクエンチする、発光性、光散乱性および光吸収性の化合物が挙げられるが、これらに限定されない例えば、Kricka,L.,NonisotopicDNAProbeTechniquies,AcademicPress,SanDiego1992およびGarmanA.,Non-RadioactiveLabeling,AcademicPress1997を参照のこと。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、フルオレセイン例えば、米国特許第5,188,934号、同第6,008,379号および同第6,020,481号を参照のこと、ローダミン例えば、米国特許第5,366,860号、同第5,847,162号、同第5,936,087号、同第6,051,719号および同第6,191,278号を参照のこと、ベンゾフェノキサジン例えば、米国特許第6,140,500号を参照のこと、ドナーおよびアクセプターの対を含むエネルギー移動蛍光色素例えば、米国特許第5,863,727号;同第5,800,996号;および同第5,945,526号を参照のこと、およびシアニン例えば、WO9745539を参照のことが挙げられるが、これらに限定されない。フルオレセイン色素の例としては、6-カルボキシフルオレセイン;2’,4’,1,4,-テトラクロロフルオレセイン;および2’,4’,5’,7’,1,4-ヘキサクロロフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。シアニン色素の例としては、WellRed登録商標赤外色素D1、D2、D3またはD4が挙げられる。追加の標識は、リサミン、フィコエリトリン、ならびに別の標識とは異なる検出可能な色素シグナルを発生することができる他の任意の蛍光部分から得てもよい。フルオレセイン色素の例としては、6-カルボキシフルオレセイン;2’,4’,1,4,-テトラクロロフルオレセイン;および2’,4’,5’,7’,1,4-ヘキサクロロフルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様において、蛍光標識は、CE分析と適合性である、SYBR-Green、6-カルボキシフルオレセインFAM、TET、NED、ROX、VIC商標またはJOEから選択される。例えば、ある特定の実施形態において、標識は、スペクトル的に分解可能な異なる波長で発光することができる種々のフルオロフォア例えば、4つの異なる色のフルオロフォアであり;ある特定のそのように標識されたプローブは、当該分野で公知であり、上記および米国特許第6,140,054号に記載されている。レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識された蛍光プローブが、いくつかの実施形態において使用される。他の例としては、一般的な色素に対する商業的に入手可能な代用物であるFreedom登録商標色素が挙げられ得る。容易に区別され得るように、異なる発光スペクトルを有するフルオロフォアの対が選択されることが認識されるだろう。なおもさらなる態様において、標識は、二重鎖のハイブリダイゼーションを増強するか、安定化するかまたはそれに影響するように働くハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーターおよびインターカレート色素エチジウムブロマイドおよびSYBR-Greenを含むがこれらに限定されない、副溝結合剤および架橋官能基である例えば、Blackburnら編DNAandRNAStructureNucleicAcidsinChemistryandBiology1996を参照のこと。単一アッセイにおいて2つ以上の標識を用いる状況では、異なる発光スペクトルを有する標識が容易に区別され得るように選択されることが認識されるだろう。いくつかの例では、FAMおよびHEX標識が、サンプルの第1部分および第2部分を標識するために使用され得る。さらなる実施形態において、FAMまたはHEXは、本明細書中に記載される方法において、とりわけNEDまたはROX標識とともに使用され得る。E.分析方法いくつかの実施形態において、増幅された核酸は、メチル化状態を決定するために分析される。例示的な実施形態において、その分析方法は、当業者によく知られた装置例えば、ABI3100、3130、3730または3500モデルを用いるキャピラリー電気泳動CEである。他の実行には、DNAの電気泳動によるサイジングおよび多色分解が可能な任意の装置が含まれる。例えば、WellRed赤外色素D1、D2、D3およびD4の検出用のBeckmanVidieraもしくはSEQ6000キャピラリー電気泳動システム、またはIRDyesを組み込んでいるLi-Cor装置も使用され得る。使用され得る他の方法としては、マイクロ流体CEシステム例えば、Agilent2100Bioanalyzerおよび同様のプラットフォーム、質量分析、アガロースゲル電気泳動に続くスキャンデンシトメトリー、およびphosphorImagerまたはオートラジオグラフのスキャンデンシトメトリーを用いた放射標識産物の分析が挙げられる。さらなる実施形態において、サンプルの第1および第2部分からの増幅された核酸は、単一のCEアッセイにおいて分析される。CEなどのある特定の分析方法は、鋳型に存在するメチル化状態とCGGリピート数の同時の特徴づけを可能にする。ある特定の実施形態において、CE分析は、36または50cmカラムとともにPOP-4、5、6または7液体ポリマーを用いて行われる。1つの実施形態において、その液体ポリマーは、POP-7である。ある特定の実施形態において、メチル化のパーセンテージが計算され得る。CE電気泳動図、phosphorimagerスキャン、デンシトメトリースキャン、質量スペクトルまたは他の形態のデータにおいて観察されるピークの強度は、当該分野で公知の好適な方法、例えば、ピーク高さ、曲線下面積積分またはカーブフィッティングなどの方法に従って決定され得る。次いで、コントロールとして処理されたサンプルの一部およびメチル化感受性DNaseによる消化に供されたサンプルの一部からの対応するピークのピーク強度の値が、比較され得;それらのピーク強度は、GC参照標準を用いて正規化され得る。例えば、正規化は、観察された各ピーク強度を、同じサンプルの一部においてGC参照標準に対して観察されたピーク強度に対する比として表現することによって、行われ得る。他の実施形態において、メチル化状態は、メチル化されていないかまたはメチル化されたと特徴づけられ得る。なおもさらなる実施形態において、メチル化状態は、メチル化されていない、部分的にメチル化された、または完全にメチル化されたと分類され得る。II.サンプル本明細書中に提供される方法は、サンプル中の核酸鋳型のメチル化状態の特徴づけに関する。ある特定の実施形態において、核酸サンプルは、ヒトから得られる。例えば、サンプルは、患者サンプルであり得る。患者サンプルは、患者由来の任意の生物学的検体である。その用語には、生体液例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液および他の液体サンプルならびに生物学的起源の細胞および組織が含まれるがこれらに限定されない。細胞および組織には、頬側の細胞、口腔洗浄液の収集物または皮膚細胞毛嚢を含むが含まれ得る。上記用語には、ヒトから単離された細胞またはそれに由来する細胞培養中の細胞、細胞上清および細胞溶解産物を含むも含まれる。さらにそれには、器官または組織の培養物に由来する流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプルおよび生理学的組織から抽出された流体、ならびに固形組織から分離された細胞、組織切片および細胞溶解産物が含まれる。それには、脳由来のサンプルなどの死後の固形組織サンプルも含まれ得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、約80、100、150、200、500または1,000ng未満のDNAを含む。いくつかの場合において、サンプルは、ゲノムDNAを含む。そのDNAは、本発明の方法に供される前に、サンプルの他の非DNA成分から分離され得る。DNAの分離および精製の多くの方法が、当該分野で公知である。サンプルは、DNA鋳型を含み得る。本明細書中に記載されるある特定の方法において、DNA鋳型は、DNAポリメラーゼによって触媒される反応における合成の標的であり得る。そのDNA鋳型のGC含量は、75、80、85、90、95、96、97、98、99または99.5以上のCおよびG残基であり得る。DNA鋳型は、CおよびG残基を含むジ、トリまたはテトラヌクレオチドリピートを含み得る。DNA鋳型は、疾患に関連する遺伝子座内またはその遺伝子座付近の配列を含み得る。DNA鋳型は、FMR1またはFMR2遺伝子の5’UTRの少なくとも一部を含み得る。DNA鋳型は、FMR1の5’UTRのCGGリピートまたはFMR2遺伝子の5’UTRにおけるCCGリピートを含み得る。DNA鋳型のサイズは、約50、100、200、300、500もしくは700bp、または1、1.5、2、2.5、3、4、5、7もしくは10kbであり得る。DNA鋳型のサイズは、50bp~10kb、100bp~10kb、200bp~10kb、300bp~10kb、500bp~10kb、700bp~10kb、1kb~10kb、1.5bp~10kb、2bp~10kb、3bp~10kb、50bp~7kb、50bp~5kb、50bp~4kb、50bp~3kb、50bp~2kb、50bp~1.5kb、100bp~7kb、200bp~5kbまたは300bp~4kbであり得る。III.実施例以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証するものであり、本発明の範囲を限定すると意図されていない。実施例1.メチル化状態を特徴づけるためのワークフロー図1は、本明細書中に記載されるmPCR法の例を示している。メチル化されていない鋳型を分解するがメチル化された対立遺伝子を保持する、HpaIIiなどのメチル化感受性DNaseを含む反応混合物、またはメチル化感受性酵素を含まないコントロール混合物でサンプルDNAが処理される。サンプルDNAの各部分は、GC外部参照標準の存在下においてPCRに供される。そのPCRはさらに、200を超えるCGGリピートを有する対立遺伝子を増幅することができる。HpaII部分およびコントロール部分についてのプライマーは、異なる標識例えば、FAMおよびHEXを有する。次いで、PCR産物が、プールされ、キャピラリー電気泳動によって分析される。CEにおけるアンプリコンのシグナルの喪失は、HpaII部位において消化されたこと、およびメチル化されていなかったことを示すのに対し、シグナルの保持は、対応する対立遺伝子がメチル化されていたことを示す。対立遺伝子ごとのメチル化の割合は、HpaIIで消化された所与の対立遺伝子についてのアンプリコンの収量と、対応する消化されていない対立遺伝子についてのアンプリコンの収量との比から決定される。この比は、GC外部参照標準のシグナルに対して正規化される。実施例2.実験の手順A.臨床上のおよび細胞株のDNAサンプル血液サンプル由来のgDNAは、M.I.N.D.InstituteClinicで診察された被験体から、InstitutionalReviewBoardの承認後に得たFilipovic-Sadicら、ClinChem2010;56:399-408。細胞株DNAサンプルは、CoriellCellRepositoriesCCR,CoriellInstituteforMedicalResearch,Camden,NJから入手した。臨床上のおよび細胞株のDNAサンプルを、PCRの前に、10mMTris、0.5mMEDTA,pH8.8中に20ng/μLに希釈した。B.FMR1メチル化PCR各サンプルからの40ngのgDNAの2つのアリコートを、メチル化評価のために、AmplideX商標MethylationPCR試薬Asuragen,Inc.,Austin,Texasを用いて調製する。制限酵素は、NewEnglandBiolabs製である。一方のDNAアリコートを、消化緩衝液およびメチル化感受性酵素別段述べられない限り、HpaIIと混合し、第2のアリコートを、消化緩衝液およびSau3AIまたはEcoRIなどのコントロール酵素と混合する。これらの制限酵素は、0.15U/μlという最終濃度で反応混合物中に存在する。各反応物中の緩衝液の成分の最終濃度の例を表1に示す酵素貯蔵緩衝液からの試薬の寄与は含まない。HpaII反応物およびコントロール反応物を、シールされた96ウェルプレートにおいて37°Cで2時間インキュベートする。HpaII処理産物FAMプライマーまたは非HpaIIコントロール産物HEXプライマーに対して、メチル化PCR試薬の別個のPCRマスターミックスを調製し、制限酵素消化混合物中またはコントロール消化混合物中に直接分注する。各マスターミックスは、mPCRAMPBufferAsuragen,CatalogNo.145152、GC-richPolymeraseMixAsuragen,CatalogNo.145153、脱イオン水およびmPCRプライマーを含む。各マスターミックスは、GC外部参照標準PCRサイクル数に応じて、約3000~12,000コピー/PCR反応も含む。最終的なPCR緩衝液/試薬の条件は、消化緩衝液から持ち越される、追加の0.67mMMgCl2、2.66mMビス-Tris-プロパン,pH7.0および0.266mMDTT消化混合物Aサンプルの場合;追加の10mMTrisHCl,pH7.5および20mMNaCl消化混合物Bサンプルの場合;または追加の2.66mMTrisHCl,pH7.5および26.6μg/mlBSA消化混合物Cサンプルの場合を除いて、AmplideX商標FMR1キットAsuragen,CatalogNo.49402;米国特許出願公開第2010/0209970号におけるものと同じである。ある特定の反応は、30ヌクレオチドの非ヒトDNA配列を、30個のCGGリピートを含むプラスミドに挿入することによって構築された40CGG配列番号44;40-CGG-Controlの相対保持時間を有するGC参照標準を使用し得る。PCR工程中に、その参照標準は、そのプラスミドから増幅される。追加の例としては、やはりプラスミド内に含まれる0CGGAsuragen,CatalogNo.49441;配列番号45;0-CGG-Controlの相対保持時間を有する参照標準が挙げられる。記載の通り、代わりの移動時間を有する非プラスミドコントロールも使用される。上記サンプルは、95°C5分間の最初の熱変性工程に続く、97°C35秒間、62°C35秒間および72°C4分間の25サイクル、ならびに72°C10分間を用いてPCR増幅される。アンプリコンは、CE分析のために調製されるか、または-15~-30°Cで保管される。プロービングされる2つのHpaII部位の指摘とともに、FMR1アンプリコンの配列が、以下のとおり示される:5’-X-CGGリピート領域-Y-3’である。配列番号46および47において、下線の領域は、順方向および逆方向プライマーによって結合される配列を指し示しており、イタリック体かつ下線のCCGG配列は、2つのHpaII部位を指摘している。C.キャピラリー電気泳動CE断りのない限り、3130xlGeneticAnalyzerAppliedBiosystemsInc.,ABI,FosterCity,CAがこの実験のために使用される。合計2μLの未精製PCR産物HEX標識産物およびFAM標識産物からの各々1μLを、11μLのHI-DIFormamide登録商標ABIおよび2μLのROX1000SizeLadderAsuragenと混合し、95°Cで2分間熱変性し、分析のためにCEシステムに移す。断りのない限り、注入は、2.5kVでの20秒間の注入および15kVでの40分間のランを用いる標準的なフラグメントサイジング条件36cm,POP7に従う。断りのある場合、ABI3500xLCE50cm,POP7を使用する。POP7ポリマーの分解能の限界のために、>250のCGGリピートを有するすべてのFMR1アンプリコンが、CEにおいて同様の移動度を有する。D.データ分析GeneMapper4.03500xLデータの場合は4.1またはPeakScannerV1.0ソフトウェアABIを用いて、電気泳動図を分析する。塩基対サイズからCGGリピート数への変換は、20、29、31、54および119個のCGGリピートを有する鋳型から生成されたコントロールアンプリコンに対する線形回帰によって決定されるFilipovic-Sadic,2010。各ピークに対するピークサイズは、Sizei-230.3/2.975を用いてCGGリピート長に変換される。検出された各対立遺伝子に対するCGGリピート長およびメチル化パーセントの結果を、MSExcelで表にまとめる。メチル化パーセントであるMiは、等式1に示されるように、GC参照標準のアンプリコンのピーク高さCTRLHEXまたはCTRLFAMに対して正規化された、消化されたサンプルPeaki,FAMと消化されていないサンプルPeaki,HEXとのピーク高さの比として計算される:約100であるかまたは名目上100を超えるメチル化の値が、完全にメチル化されたとスコア付けされる。そのような値は、概して、下記で述べられるように十分に表されている対立遺伝子についてはアッセイの変動の範囲内に観察されたが、CE装置の検出の下側範囲付近に対立遺伝子特異的シグナルが存在するがゆえにGC参照標準のピークのシグナルに対して定量的な信頼性が低いとき、少量の対立遺伝子例えば、臨床上の完全変異サンプルのわずか1の質量分率の投入のメチル化の評価では、時折、過大になる例えば、120~137。E.サザンブロット分析80個の臨床サンプルのSB分析が、Tassoneら、JMolDiagn2008;10:43-9に記載されているように行われる。細胞株DNAは、EcoRIおよびEagINEBを用いてSBのために調製される。SBイメージは、分類によってcategorically評価されメチル化されていない対立遺伝子、部分的にメチル化された対立遺伝子、および完全にメチル化された対立遺伝子、各サンプルにおけるメチル化のパーセントは、Tassone,2008に記載されているように決定される。実施例3.メチル化されたDNA標準およびサンプルを用いたmPCRの精度および再現性2色mPCRワークフローの精度を評価するために、30個のCGGリピートおよび既知のメチル化割合を含む規定の8つの分析標準のセットを開発した。メチル化されたおよびメチル化されていないDNAコントロールを、標準的な手順SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarbor,NY:CSHLPress,1989に従ってpBR322にクローニングされた30CGGリピート対立遺伝子のPCR産物から調製した。その30CGG標準を、HpaIIメチルトランスフェラーゼNewEnglandBiolabs,NEB,Ipswich,MAでメチル化し、HindIIINEBで線形化した。様々な比率のメチル化されたかまたはメチル化されていない30CGG標準を、0~100で混合し、20ng/μLの645CGG細胞株DNANA04025,CCRにおいて1.5×104コピー/μLに希釈した。細胞株DNAサンプルをCoriellCellRepositoriesCCR,CoriellInstituteforMedicalResearch,Camden,NJから入手した。各サンプルを、消化混合物AにおけるHpaII消化コントロール反応物の場合は消化混合物AにおけるSau3A1、40-CGG-Controlの存在下における25サイクルのPCR、および実施例2に記載したようなCEに供した。30CGG標準に対するFAMチャネルにおけるシグナルの比例変化を強調している一連の電気泳動図を図3Aに示す。メチル化パーセントが上昇するにつれて、30CGG標準に対するシグナルは、40-CGG-controlおよび混合された645CGG完全変異対立遺伝子に対するピークと比べて増加した。そのピーク高さの変化を、40-CGG-Controlのピーク高さに対して正規化し、HEXチャネルにおける正規化された比と比較した等式1。3つの異なるランの日にわたって2人の技師によって行われたとき図3B、既知のメチル化の割合とmPCR後に実験的に得られた割合との間に直線関係R2=0.998が観察された投入されたメチル化がx軸上に示され、測定されたメチル化がy軸上に示されている。645CGG対立遺伝子のメチル化が、評価された各標準に対して定量的104±5であると決定された図3B。2つのCE装置プラットフォームABI3130xlおよび3500xLにおける、2つの正常対立遺伝子女性の臨床サンプル由来の30および32CGGおよび2つの完全変異対立遺伝子550CGGおよび940CGGの8つの複製物にわたって、mPCRの再現性をさらに評価した。メチル化割合、標準偏差、変動係数CVおよび95信頼区間CIを表2に示す。計算されたmPCRメチル化割合から、2つの異なるプラットフォームにおいて、正常対立遺伝子に対してはCV=7~8、および完全変異対立遺伝子に対してはCV=8~16が得られた。さらに、4つの完全変異サンプルを含む8つの細胞株サンプルを用いたとき、mPCRの結果は、2人の異なる技師において再現性があったCV=7。時折100を超えるメチル化パーセントの測定値は、本方法の所定の変動の結果であり、そのようなサンプルは、SB分析との比較目的のために、完全にメチル化されたものとして表に記載した。下記の実施例で証明されるように、mPCR法は、臨床サンプルに対して、少なくともSB分析と同程度に良好な結果をもたらした。実施例4:細胞株DNAのmPCR評価およびSB分析との比較男性と女性の両方のサンプル由来の、正常、前変異および完全変異の対立遺伝子を含む8つの商業的に入手可能な細胞株DNA鋳型を用いて、mPCRを評価した。サンプルを、消化混合物AにおけるHpaII消化コントロール反応物の場合は消化混合物AにおけるSau3A1、40-CGG-Controlの存在下における25サイクルのPCR、および実施例2に記載したようなCEに供した。対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態についてのmPCRおよびSB分析の結果を表3に要約する。4つのサンプルの電気泳動図を、該当するSBデータとともに図4A~Dに示す。各図において、上のパネルは、HpaIIで処理されていないサンプルの部分を示しており、下のパネルは、消化されたサンプルを示している。表3のサンプルIDをリピート長とともに各図に示している。図4におけるリピート長は、>250CGGに対してはCoriellの指摘を用いて、および<250CGGのときはPCRの結果を用いて表示されている。各図は、mPCRによって決定されたメチル化パーセンテージも含んでいる。Ctrlと表示されたピークは、40-CGG-controlを示している。いずれの場合においても、mPCRの結果は、対応するSBデータと定性的に一致した。例えば、図4Aに示されるように、男性の前変異対立遺伝子NA06892,90CGGは、mPCRによって2のメチル化を示し、これは、SBのメチル化されていない領域のみで検出される産物の存在と一致した。完全にメチル化された完全変異対立遺伝子を伴う女性の正常対立遺伝子NA07537,図4Cの偏ったX不活性化8メチル化もまた、SB分析および以前に公開されたデータZhouら、ClinChem52:1492-15002006と一致した。mPCRは、約250までのCGG長の複雑なサンプルにおける対立遺伝子特異的メチル化状態のより詳細な解釈を提供した。例えば、モザイク女性サンプルNA06896,CCRによるところの23/95-140は、23、112、136CGGの主要なピーク、ならびに153、175、196および219CGGの4つの追加の少量のピークによって検出された図4D。23CGGおよび112CGGのピークは、部分的にメチル化されており、136CGGピークは、完全にメチル化されており、153~219のピークは、完全にメチル化されていなかった。これらの結果は、SB分析の結果と定性的に類似していた。SBから、ほとんどメチル化されていない23CGG対立遺伝子、伸長していてメチル化されていない対立遺伝子の広範なセット<5.2kb、および伸長していてメチル化された対立遺伝子のより明確なセットが明らかになった。重要なことには、mPCRデータは、SBにおけるメチル化されていないスメアのパターンに対する、個々のサイズのモザイクの寄与を明らかにした。例えば、SBイメージは、mPCRによって報告されたような、部分的にメチル化された112CGGおよび153~219CGGのメチル化されていないより高リピートの対立遺伝子と一致した。実施例5.臨床DNAサンプルを用いたときのメチル化PCRアッセイの性能臨床的に関連する対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態の全範囲を表しており、対立遺伝子のサイズについて以前に評価されたものと同じセットFilipovic-Sadic,2010から選択される、80個の臨床検体のセットを用いて、FMR1mPCRアッセイを評価した。実験は、実施例4に記載したように行った。メチル化状態は、SBTassone,2008によっても決定した。CGGリピート長、メチル化パーセントおよびSBデータとの比較を、各臨床サンプルについて表にまとめ表4、要約した表5。表4において、mPCRを用いて検出された対立遺伝子は、SBの分解能の限界とマッチするようにグループ化された。完全変異対立遺伝子を有するサンプルは、灰色で影を付けられ、太字のものは、図5および6に示されている。各図において、Ctrlと表示されているピークは、40-CGG-Controlを示している。X活性化Rousseauら、JMedGenet28:830-61991は、正常サンプルおよび完全変異サンプルにおいて、女性の正常対立遺伝子についてのメチル化パーセントと相反する。X活性化の平均は、女性の正常対立遺伝子n=8については0.51、および女性の完全変異n=12サンプルの正常対立遺伝子については0.67であり、deVriesらによって報告された値それぞれ0.50および0.71deVriesら、AmJHumGenet58:1025-321996と一致した。aRousseauらおよびdeVriesら;ある特定のサンプルだけに対して入手可能なデータ。b完全=<5.4kbのバンドの証拠なし、部分的=ブロットの両方の領域にバンドの証拠、なし=>5.4kbのバンドの証拠なし。cメチル化された分離バンドとメチル化されていない分離バンドとの間のバンド強度のパーセント推定値として得たd電気泳動図およびSBイメージは図6に示される。e電気泳動図およびSBイメージは図5に示される。f少量の対立遺伝子が160CGGに検出された60メチル化mPCRの結果は、SB分析と一致していたが、しかしながら、mPCRでは、SBと比べて、種々のメチル化状態の検出および解釈が単純化され、改善された。CEのより高い分解能のために、mPCRによって容易に区別されたいくつかの対立遺伝子は、SBでは分解されなかった例えば、類似サイズの2つの前変異。これらの場合において、SB分析の分解能の限界にマッチするように対立遺伝子をグループ化した。2つの異なる実験を通して、mPCRの感度に焦点をあてた。第1の実験では、正常な31CGG対立遺伝子のバックグラウンドにおける1もの低い質量分率の臨床上の完全変異対立遺伝子の検出が、HEXとFAMの両方のチャネルにおいて検出可能だった図7。第2の実験では、10質量分率の完全にメチル化された完全変異サンプル♯08を、90質量分率の完全にメチル化されていない完全変異サンプル♯125のバックグラウンドにおいて同定することができた図8。両方のサンプルのメチル化状態を、表4に示されるようにSB分析によって確かめた。したがって、図3と一致して、臨床サンプルを用いたとき、10のメチル化モザイクでさえも検出できた。A.完全変異対立遺伝子のメチル化状態の同定および分解代表的な完全変異サンプルに対する電気泳動図および該当するSBイメージを図5に示す。以前に記載されたようにFilipovic-Sadic,2010、これらの実験において使用されたCEの設定では、アンプリコンの差次的な分解は<250CGGを有するものに限定され、ゆえに、より大きなリピート伸長の増幅産物は、共に移動するが、広範なカテゴリーの完全変異に対する全体的なメチル化のパーセンテージは、下記のデータによって支持されるように正確に評価された。例えば、男性の完全変異サンプル♯88図5Aにおいて、伸長した対立遺伝子が、SBのメチル化された領域において主に検出され、メチル化されていない領域では微弱な生成物約10~20シグナルが検出された。mPCRは、SBの結果と一致して、このサンプルに対して82のメチル化を明らかにした。さらに、女性の完全変異サンプル♯117に対してSBを用いたとき、正常対立遺伝子に対する部分的なメチル化および伸長した対立遺伝子に対する完全なメチル化が観察された図5B。そのmPCRの結果はまた、30CGG対立遺伝子の部分的な44メチル化および伸長された対立遺伝子の完全な104メチル化を示唆した。mPCRは、SBにとっては問題となり得るより複雑なサンプルにおける、メチル化状態の同定を単純化した。男性の完全変異サンプル♯125図5Cは、メチル化されていない領域3~>5kbの範囲にわたって低強度のスメアを示した。mPCRを用いたとき、完全変異のピークは、HEXでは明らかに検出されたが、FAMチャネルでは40-CGG-Controlの増幅にもかかわらず検出されなかった。したがって、完全変異対立遺伝子は、メチル化されていなかった。別の実施例図5Dでは、サイズおよびメチル化のモザイク現象の稀なパターンが解明された。SB分析によって、完全変異対立遺伝子は、部分的にメチル化されたと見られたのに対し、mPCRは、偏ったメチル化を有する2つの異なる対立遺伝子サイズを明らかにした。顕著な完全変異シグナルが、メチル化されていない長い鋳型において観察されたのに対し、約200CGGにおけるより少量の鋳型は、完全にメチル化されていた。したがって、サイズのモザイク現象は、mPCRによってより明らかに解明され、メチル化パターンは、SBによって示されたものよりも複雑だった。B.SB分析によって隠された女性の前変異対立遺伝子における新規の偏ったパターンの同定4つの代表的な女性の前変異サンプルに対する電気泳動図および該当するSBイメージを図6に示す。各サンプルの特徴的な特徴は、より長い対立遺伝子、すなわち53および54~56CGG、70および71~75CGG、90および92~101CGGならびに107および109~125CGGについての2つの群のリピートサイズの検出だったそれぞれ図6A~D。消化およびFAM標識プライマーを用いた増幅の後、各モザイクサンプル内のより短いCGGリピート長だけが検出された。そのサイズのモザイク現象は、特徴的な女性サンプルのHpaIIで処理されたFAMチャネルで観察されず、対応するリピート長の試験された11個のいずれの男性前変異対立遺伝子のPCRの後でも観察されなかったなかったので、このパターンは、ポリメラーゼのスタッタリングstutteringのアーチファクトではなかったとみられる。各場合において、前変異対立遺伝子のより伸長したCGGリピートは、完全にメチル化されていなかった。この前述のモザイク現象および偏ったメチル化パターンは、試験されたコホート内の8419個のうちの16個の女性前変異サンプルにおいて同定された。対照的に、SBの分解能の限界のために、ただ1つの検出可能な前変異バンドしか得られなかったので、このレベルの生物学的詳細については不明瞭だった。さらに、観察された偏ったモザイク現象は、メチル化されたHpaII部位の分析に特異的というわけではなかった。具体的には、HpaIIではなくEagIを用いてもmPCR分析を行った。コントロール反応のために、消化混合物BにおいてEcoRIを使用した。EagI分析では、約-12.8CGGリピートの相対保持時間で移動するCGGコントロールを使用し、そのコントロールは、プラスミドベースの40-CGG-Controlの代わりにPCRアンプリコンから得た。さらに、EagI認識部位がアンプリコン内に存在するようにPCRプライマーを選択した。鋳型をHpaIIではなくEagIで処理し、EagIメチル化部位の評価を可能にするmPCR法の変法を用いて分析したとき、同じパターンが観察された図9;Refとは、HpaIIサンプルでは40-CGG-Control、およびEagIサンプルでは-12.8GCCコントロールのことを指す。mPCR研究の手順は、大量のサンプル分析を支援し得、技師1人あたり最大48サンプルを処理するための全実施hands-on時間その多くは自動化され得るとして1日、およびおよそ2時間しか必要としない。さらに、mPCRは、たった80ngのDNAの投入量しか必要としないSBと比べて1/50~1/100に低減しており、亜硫酸水素塩Panagopoulosら、HumMutat14:71-91999;Zhouら、ClinChem52:1492-5002006;Dahlら、NucleicAcidsRes35:e1442007または以前に報告されたHpaII媒介性PCR法Carrelら、AmJMedGenet64:27-301996;Klineら、FertilSteril85:1488-952006;Allenら、AmJHumGenet51:1229-391992と比べて1/10に低減している。結果として、外胚葉の細胞系列をニューロン細胞と分け合う、全血に対する代替サンプルタイプ例えば、頬側の細胞または皮膚細胞が、SBに対して十分なDNA収量を提供しないとしても、mPCR分析に適用可能であり得る。本研究において評価されたmPCR技術は、男性と女性の両方のサンプルにおけるCGGリピート長の範囲にわたってメチル化状態を検出および解明するPCRベースの方法である。その全体的なワークフローは、日常的な試験およびハイスループットスクリーニングの用途に適用可能である。それらの方法は、SB分析を必要としない広範なFMR1分析の基礎を提供する。実施例6:代替のメチル化感受性酵素を用いたmPCRmPCR法の汎用性を証明するために、選択された臨床サンプルを、EagIおよびNruIならびにHpaII酵素を用いて分析した。実験は、概して、実施例2に記載されているように行い、サンプルを、消化混合物BにおいてEagIまたはNruIで2時間処理し、コントロールサンプルを、消化混合物BにおいてEcoRIで2時間処理した。非プラスミド-12.8CGG標準をEagI実験のために使用し、非プラスミド-41CGG標準をNruIサンプルとともに使用した。EagIおよびNruI実験用のPCRプライマーを、アンプリコンが適切な酵素についての認識部位を含むように選択した。HpaII実験は、実施例4に記載したように行った。表6は、これらの実験の結果を比較している。様々な酵素を用いたときの結果は、メチル化された対立遺伝子に対してメチル化されていない対立遺伝子を、ならびにメチル化されていない、部分的にメチル化されたおよび完全にメチル化された対立遺伝子を区別した。実施例7.HpaII部位におけるメチル化を評価するために、0CGG参照標準を用いたメチル化PCRアッセイの成果CoriellCellRepository由来の6つのサンプルのメチル化状態を、生物学的FMR1対立遺伝子の検出範囲外の相対保持時間を有する0-CGG-Controlを用いて評価した。実施例2に記載したように、消化混合物C中のHpaIIまたはSau3A1コントロール、および27サイクルのPCRを用いて実験を行った。表7に示されるように、参照標準の選択によって、2メチル化から定量的にメチル化されたものまでのメチル化状態の範囲におけるメチル化データの解釈は変化しなかった。結果を、実施例4に記載したような40-CGG-Controlを用いてもたらされた結果と比較した。実施例8.コントロールヌクレアーゼ本明細書中に記載される方法は、コントロール反応物中でのエンドヌクレアーゼの使用を含み得、これは、大きなゲノムDNAをFMR1遺伝子座の増幅領域外で切断し、メチル化感受性消化反応におけるDNA鋳型と同等にDNA鋳型のサイズを減少させ、したがって、PCR増幅にとって同等に好ましくなる。多くの制限酵素およびそれらの特異的な認識部位は、十分に特徴づけられている。Sau3A、EcoRI、NaeI、DpnI、HindIII-HF、NheI、TfiI、ApaLI、MluCI、NcoI、ScaI、StuI、XmnIおよびHpy16611を含む合計14個の商業的に入手可能な制限エンドヌクレアーゼを試験のために選択した。本方法において使用され得る制限酵素の例としては、Sau3A、EcoRI、NaeI、DpnIおよびHindIII-HFが挙げられる。Sau3Aは、鋳型上の非標的部位の切断に対して低い選択性を示した。鋳型内の非標的部位がほとんど~まったく切断されないことが観察されたという点ですなわち、配列番号40および41が境界となるFMR1遺伝子座の領域、EcoRI、NaeI、DpnIおよびHindIII-HFは、高度の選択性を示した。実施例9.メチル化状態を特徴づけるための代替のワークフローメチル化状態を特徴づけるための代替のワークフローを図10に示す。このワークフローでは、ゲノムDNAサンプルを、消化コントロールおよびGC参照標準この図ではCGGDNAコントロールと呼ばれていると予め混合する。DNA混合物の各部分を、メチル化感受性ヌクレアーゼHpaIIまたはコントロールヌクレアーゼHindIII-HFによる処理に供する。続いて、消化されたDNA混合物を、それぞれFAM標識プライマーHindIII-HF反応またはHEX標識プライマーHpaII反応を用いるPCR増幅に供する。次いで、PCR産物をプールし、キャピラリー電気泳動によって分析する。消化コントロールとGC参照標準の両方が、電気泳動図の早いウィンドウearlywindowに移動し、サンプル特異的プロファイルを干渉しない。HEX標識PCRにおける消化コントロールからのアンプリコンの減少は、HpaII消化の効率を示す。GC参照標準は、FAM標識PCR産物とHEX標識PCR産物との間のシグナル強度を正規化するために使用される。制限酵素消化前のGC参照標準の添加は、各反応物中のゲノムDNAの量の変動を正規化するために使用される。ゆえに、各対立遺伝子によるメチル化のパーセンテージは、対応する反応物のGC参照標準に対して正規化した後の、消化された反応物HEXとコントロール反応物FAMとの間のピーク高さの比として決定される。実施例10.代替のワークフローにおける細胞株DNAのmPCR評価およびSB分析との比較実施例9の代替のワークフローに従ったmPCRを、男性と女性の両方のサンプル由来の正常、前変異および完全変異の対立遺伝子を含む商業的に入手可能な4つの細胞株DNA鋳型CoriellInstituteforMedicalResearchを用いて評価した。各サンプルを、配列番号50およびGC参照標準を含む消化コントロールと予め混合し、ここで、A、BおよびC配列は、それぞれ配列番号17、48および39を含んだ。消化コントロールおよびGC参照標準を加えた後、サンプルを2つの部分に分けた。そのサンプルの一方をHpaII消化に供し、他方をコントロール反応物としてHindIII-HF消化に供した。次いで、実施例9におけるような標識プライマーを使用し、その2つの部分の各々を用いて、25~27サイクルのPCR増幅を行い、産物をCEで分離した。同じ細胞株由来のDNAを、SBでも分析した。mPCRおよびSBからの対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態に対する結果を、表9に要約する。対応するSBデータとともに4つのサンプルの電気泳動図を図11A~11Dに示す。各図において、上のパネルは、コントロールとしてHindIII-HFで処理されたサンプルの部分を示しており、下のパネルは、HpaIIで消化された同じサンプルを示している。各図は、mPCRによって決定されたメチル化パーセンテージも含んでいる。各サンプルについて、mPCRの結果は、一貫してSBデータと一致していた。例えば、2つの男性完全変異サンプルNA07862およびNA06852は、SBにおいて>200CGGの対立遺伝子についてのメチル化された領域だけに産物が存在することと一致して、mPCRによって≧100メチル化を有すると測定された。さらに、mPCRは、複雑なモザイク現象を有するサンプルにおいて、対立遺伝子特異的なメチル化状態に対してより詳細な情報を提供した。例えば、2つのモザイク女性サンプルNA06896,23/96-140およびNA20242,30/73は、SBでは主要なピークによって検出されたが、これらのサンプルは、mPCRで分析されたとき、SBでは可視化されない少量のピークも示した図11C~11D。そのmPCRデータは、SBにおけるメチル化パターンに対する各対立遺伝子の個別の寄与も明らかにした。例えば、NA06896は、完全にメチル化された113CGGおよび138CGG対立遺伝子、ならびに143~>200CGGのメチル化されていないより大きな対立遺伝子によって検出され図11C、これは、SBにおいて報告された部分的にメチル化されたFMと一致する。実施例11.代替のワークフローにおいて臨床DNA検体を用いたmPCRの評価実施例9に係る代替のワークフローに従ったmPCRアッセイを、ある範囲の臨床的に関連する対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態を表している12個の臨床検体のセットを用いてさらに評価した。実施例10に記載したように実験を行った。mPCRからの対立遺伝子のサイズおよびメチル化状態に対する結果ならびにSBとの比較を表10に要約する。表10中のでマークされたサンプルの電気泳動図は、対応するSBデータとともに図12A~12Gに提供されている。mPCRの結果は、SB分析と良好に一致していた。mPCRは、より高い分解能を提供し、SBよりも、種々のメチル化状態のより詳細な検出および解釈を可能にした。SBによって分解されないいくつかの対立遺伝子が、mPCRによって容易に区別された例えば、類似サイズの2つの対立遺伝子。例えば、サンプル♯7は、30および31CGG対立遺伝子を含み、これらは、SBによって区別できなかった。mPCRでは、これらの2つの対立遺伝子は、メチル化された30CGGおよびメチル化されていない31CGGによって明確に検出された図12Fので、SB分析によって検出可能でなかった対立遺伝子特異的メチル化が明らかになった。本明細書の検討および本明細書中に開示される本発明の実施から、本発明の他の実施形態が当業者には明らかであろう。本明細書および実施例が、単に例示として考えられるべきであることが意図されており、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。ある方法における特定の順序での工程の列挙は、それとは反対の明示的な指摘がある場合、または1つの工程の結果が別の工程の存在にとって必要である場合を除き、それらの工程が、その順序で行われなければならないということを示しているとして解釈されるべきでない。例えば、サンプルの第1部分をメチル化感受性DNaseと接触させる工程およびそのサンプルにGC参照標準を加える工程は、いずれの工程も他方の結果を必要としないので、任意の順序で行ってよい。他方、各々がGC参照標準を含むサンプルの第1部分および第2部分をDNA増幅反応に供する工程は、そのサンプルにGC参照標準を加える工程の後で行われる。なぜならば、供する工程が、加える工程からもたらされるサンプルの部分においてGC参照の存在を必要とするからである。本明細書中に引用されたすべての参考文献は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。参考として援用される刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる本発明と矛盾する範囲において、本明細書は、任意の矛盾する材料に取って代わることになる。"