COPDを有すると診断された対象、COPDの症状を示す対象、またはCOPDを発症するリスクを有する対象へ、治療的に有効な量のアルドース還元酵素阻害剤を投与する工程を含む、対象におけるCOPDを処置する方法。前記対象が現在喫煙者であるかまたは以前に喫煙者であった、請求項1記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤がプロドラッグとして投与される、請求項1記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤が吸入または滴注により投与される、請求項1記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤が経口投与される、請求項1記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤が特異的阻害剤である、請求項1記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤が、カルボン酸、ヒダントイン、ピリダジノン、またはこれらの薬学的に許容される誘導体である、請求項6記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤が、フィダレスタット、ソルビニル、エパルレスタット、ポナルレスタット、メトソルビニル、リサレスタット、イミレスタット、ALO1567、ケルセチン、ゾポルレスタット、AD5467、NZ314、M16209、ミナルレスタット、AS3201、WP921、ルテオリン、トルレスタット、EBPC、またはこれらの薬学的に許容される誘導体である、請求項7記載の方法。前記アルドース還元酵素阻害剤がフィダレスタットである、請求項8記載の方法。。前記アルドース還元酵素阻害剤が1~800mg日の用量で投与される、請求項10記載の方法。現在喫煙者であるかまたは以前に喫煙者であった対象へ、治療的に有効な量のアルドース還元酵素阻害剤を投与する工程を含む、喫煙に関連した健康リスクを処置する方法。発明の詳細な説明本発明者らは、アルドース還元酵素ARが、脂質アルデヒドの解毒にとって重要であることを証明した。解毒の役割に加えて、AR活性は、炎症および様々な疾患をもたらす組織機能障害を引き起こす、細胞のアポトーシスおよび増殖を引き起こすサイトカイン、ケモカイン、内毒素、高グルコース、および増殖因子の細胞シグナル伝達のために必要であり、即ち、ARは、キナーゼのカスケードを通した転写因子NFκBおよびAP1の活性化により誘導される、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および細菌内毒素の必須メディエーターである。転写因子の活性化は、細胞傷害を引き起こす多数のサイトカイン、ケモカイン、および増殖因子の合成および放出を担う。それらは、COPDおよびアレルギー性喘息に関連している炎症全般を引き起こす原因となる全て、参照により本明細書に組み入れられる、米国公開第20040047919号、米国公開第20060293265号、および米国公開第20100144748号を参照のこと。Iアルドース還元酵素およびCOPD本発明のある種の局面において、アルドース還元酵素阻害剤ARIは、COPDを処置するために使用される。タバコ煙、有毒ガス、および/または粒子への慢性曝露に起因する慢性閉塞性肺疾患COPDは、世界的な主要な罹患および死亡の最も一般的な理由のうちの一つであり、WorldHealthOrganizationにより推定されるように、6億人以上の人々を苦しめている。気道の炎症が、COPDの病原において主要な役割を果たしており、それは、気道への炎症細胞の浸潤および炎症性粘膜滲出液の蓄積を含む。COPDの病原における主要なリスクファクターは、活性酸素種ROSを生成しプロテアーゼを放出して細胞損傷をもたらす、気道上皮細胞、マクロファージ、好中球、およびTリンパ球を含む、常在細胞を活性化することにより、気道炎症を引き起こすタバコ煙である。ROSの生成は、肺損傷を直接引き起こすか、または二次性の代謝反応種の生成を通して、多様な細胞応答を誘導することがある、タンパク質、DNA、および脂質の酸化に直接関連付けられている。本発明者らは、アルドース還元酵素ARの阻害が、細胞アポトーシス、ならびにサイトカイン、ケモカイン、およびその他の炎症マーカーの分泌を含む、COPDの特徴である、ヒト小気道上皮細胞SAECにおけるタバコ煙抽出物CSEにより誘導される細胞変化を防止することを証明した。アルドケト還元酵素スーパーファミリーのメンバーであるアルドース還元酵素ARは、糖尿病合併症に関係している、高血糖状態においてグルコースのソルビトールへのNADPH依存的な還元を触媒する細胞質タンパク質である。しかしながら、ARが酸化ストレスにより誘導される分子シグナルにおいて重大であること、そしてARにより触媒された代謝産物が、糖尿病合併症、心血管疾患、喘息、COPD、癌、および感染性疾患のような様々な炎症関連病理において重要な役割を果たす酸化還元シグナル伝達の優れたメディエーターであることを示す証拠が、最近提示された。本明細書に記載された結果は、インビトロでもインビボでも、IL13により誘導される杯細胞形成がAR阻害により防止されることを示す。これらの結果および当結果は、共に、AR阻害が、ヒト気道上皮細胞における細胞死、サイトカイン放出、および粘液形成を防止したため、COPDの防止および処置において有益であることを示唆する。アルドケト還元酵素スーパーファミリーのメンバーであるアルドース還元酵素ARは、糖尿病合併症に関係している、高血糖状態におけるグルコースのソルビトールへのNADPH依存的な還元を触媒する細胞質タンパク質である。ARが酸化ストレスにより誘導される分子シグナルにおいて重大であること、そしてARにより触媒された代謝産物が、酸化還元シグナル伝達の優れたメディエーターであることを示す証拠が、最近提示された。本明細書に記載された結果は、インビトロでもインビボでも、IL13により誘導される杯細胞形成がAR阻害により防止されることを示す。これらの結果は、AR阻害が、ヒト気道上皮細胞における細胞死、サイトカイン放出、および粘液形成を防止したため、COPDの防止および処置において有益であることを示唆する。IIアルドース還元酵素阻害剤アルドース還元酵素阻害剤とは、酵素アルドース還元酵素を阻害する任意の化合物である。例示的なアルドース還元酵素阻害剤は、容易に入手可能であるか、または従来の有機合成法を使用して、当業者により容易に合成され得る。これらの多くは、当業者に周知であり、フィダレスタットSNK860、2アミノホルミル6フルオロスピロクロマン44イミダゾリジン25ジオンCAS番号136087859;トルレスタット、N6メトキシ51ナフタレニルチオキソメチルNメチルグリシン[WyethAyerstPrincetonNJ;別名トルレスタチンTolrestatin、CAS登録番号82964043、ドラッグコードDrugCodeAY27773、商標ALREDASEAmHomeおよびLORESTATRecordati;ポナルレスタット、34オキソ3Hフタラジン1イル酢酸[ICIMacclesfieldUK;別名CAS登録番号72702955、ICI128436、およびSTATILICI;ソルビニル、6フルオロ23ジヒドロスピロ4H1ベンゾピラン44イミダゾリジン25ジオンPfizerGrotonConn;CAS登録番号68367522、ドラッグコードCP45634;エパルレスタットONOJapan;メトソルビニルMETHOSORBINILEisai;アルコニルALCONILAlcon;AL1576Alcon;CT112Takeda;ならびにAND138Kyorinのような多数の薬学的等級のAR阻害剤が市販されている。その他のARIが記載されている。スポロヒダントインおよび関連構造、スピロイミダゾリジン25ジオン;ならびに複素環式アルカン酸のような、糖尿病に関して使用されるARIの概説に関しては、HumberAldoseReductaseInhibitionAnApproachtothePreventionofDiabetesComplicationsPorteedCh5pp325353;Tomlinsonetal1992を参照すること。その他のアルドース還元酵素阻害剤は、ONO2235;ゾポルレスタット;SNK860;53チエニルテトラゾール1イルTAT;WAY121509;ZENECAZD5522;M16209;2チオヒダントイン;ゼナレスタット;ゼナレスタット1Oアシルグルクロニド;SPR210;6フルオロ25ジオキソスピロクロマン44イミダゾリジン2カルボキサミドSNK880;アリールスルホニルアミノ酸;27ジフルオロスピロフルオレン95イミダゾリジン24ジオンイミリエスタットimiriestat、Al11576、HOE843;イソリキリチゲニン;34ジヒドロ4オキソ352ベンゾチアゾリルメチル1フタラジン酢酸;6フルオロスピロクロマン44イミダゾリジン25ジオン;N6メトキシ1ナフタレニルチオキソメチルNメチルグリシン;334ジヒドロ4オキソ1フタラジン酢酸;5βメチルシンナミリデン4オキソ2チオキソ3チアゾリデン酢酸;37クロロ34ジヒドロ24ジオキソ1キナゾリン酢酸;34ジヒドロ3オキソ4メチル2H14ベンゾチアジン2酢酸;N35ジメチル4スルホニルフェニル2メチルベンゼンアセトアミド;6フルオロ25ジオキソスピロ2カルボキサミド;2メチル6フルオロスピロイソキノリン43ピロリジン1235テトロン;2R4R67ジクロロ4ヒドロキシ2メチルクロマン4酢酸;2R4R67ジクロロ6フルオロ4ヒドロキシ2メチルクロマン4酢酸;34ジヒドロ28ジイソプロピル3オキソ2H14ベンゾキサジン4酢酸;d2メチル6フルオロスピロ25ジオン;2フルオロスピロ25ジオン;27ジフルオロスピロ25ジオン;27ジフルオロ5メトキシスピロ25ジオン;7フルオロスピロ25ジオン;dシス6クロロ23ジヒドロ2メチルスピロピリジン25ジオン;スピロイミダゾリジン45キノリン25ジオン3クロロ78ジヒドロ7メチル;34ジヒドロ34オキソフタラジン1イル酢酸;334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸;334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸;334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸;34ジヒドロ4オキソ3フタラジン1イル酢酸;34ジヒドロ34オキソフタラジン1イル酢酸;334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸;334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸;および334ジヒドロ4オキソフタラジン1イル酢酸である。いくつかの態様において、アルドース還元酵素阻害剤は、酵素アルドース還元酵素により触媒されるグルコースのソルビトールへの生物変換を直接阻害する化合物である。そのようなアルドース還元酵素阻害剤は、本発明の一部として企図される直接阻害剤または特異的阻害剤である。直接阻害は、標準的なアッセイMalone1980に従って、当業者により容易に決定される。活性による分類に加えて、化学構造によりARIを分類することもできる。一つの態様において、ARIは、カルボン酸、ヒダントイン、ピリダジノン、またはこれらの薬学的に許容される誘導体である。いくつかの態様において、ARIは、合成化学化合物である。あるいは、ARIは、天然に由来する化合物例えば、アルドース還元酵素を阻害する植物抽出物または内在性抗酸化物質である。各々、参照により本明細書に完全に組み入れられる、以下の特許および特許出願は、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて使用され得るアルドース還元酵素阻害剤を例示し、それらのアルドース還元酵素阻害剤を調製する方法に言及している:米国特許第4251528号;第4600724号;第4464382号、第4791126号、第4831045号;第4734419号;第4883800号;第4883410号;第4883410号;第4771050号;第5252572号;第5270342号;第5430060号;第4130714号;第4540704号;第4438272号;第4436745号、第4438272号;第4436745号、第4438272号;第4436745号、第4438272号;第4980357号;第5066659号;第5447946号;および第5037831号。本明細書に具体的に記載されたアルドース還元酵素阻害剤に加えて、その他のアルドース還元酵素阻害剤も当業者に公知であろう。適用可能な場合には、化合物を開示している適切な特許文献の参照と共に、一般的な化学名または別名を、括弧内に示す。従って、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて有用なアルドース還元酵素阻害剤の例には、334ジヒドロ4オキソ1フタラジン酢酸ポナルレスタット、米国特許第4251528号;N6メトキシ1ナフタレニルチオキソメチルNメチルグリシントルレスタット、米国特許第4600724号;5βメチルシンナミリデン4オキソ2チオキソ3チアゾリデン酢酸エパルレスタット、米国特許第4464382号、米国特許第4791126号、米国特許第4831045号;37クロロ34ジヒドロ24ジオキソ1キナゾリン酢酸ゼナレスタット、米国特許第4734419号および米国特許第4883800号;2R4R67ジクロロ4ヒドロキシ2メチルクロマン4酢酸米国特許第4883410号;2R4R67ジクロロ6フルオロ4ヒドロキシ2メチルクロマン4酢酸米国特許第4883410号;34ジヒドロ28ジイソプロピル3オキソ2H14ベンゾキサジン4酢酸米国特許第4771050号;34ジヒドロ3オキソ4メチル2H14ベンゾチアジン2酢酸SPR210、米国特許第5252572号;N35ジメチル4スルホニルフェニル2メチルベンゼンアセトアミドZD5522、米国特許第5270342号および米国特許第5430060号;6フルオロスピロクロマン44イミダゾリジン25ジオンソルビニル、米国特許第4130714号;d2メチル6フルオロスピロ25ジオン米国特許第4540704号;2フルオロスピロ25ジオン米国特許第4438272号;27ジフルオロスピロ25ジオン米国特許第4436745号、米国特許第4438272号;27ジフルオロ5メトキシスピロ25ジオン米国特許第4436745号、米国特許第4438272号;7フルオロスピロ25ジオン米国特許第4436745号、米国特許第4438272号;dシス6クロロ23ジヒドロ2メチルスピロイミダゾリジン444Hピラノピリジン25ジオン米国特許第4980357号;スピロイミダゾリジン45キノリン25ジオン3クロロ78ジヒドロ7メチル米国特許第5066659号;6フルオロ25ジオキソスピロ2カルボキサミドフィダレスタット、米国特許第5447946号;ならびに2メチル6フルオロスピロイソキノリン43ピロリジン1235テトロンミナルレスタット、米国特許第5037831号が含まれるが、これらに限定されない。その他の化合物には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6720348号、第6380200号、および第5990111号に記載されたものが含まれる。さらに、他の態様において、これらのうちのいずれかが本発明の一部として排除され得ることが、具体的に企図される。III薬学的組成物および投与経路本発明の薬学的組成物は、対象に対して薬学的に許容される担体に溶解または分散した1種または複数種のAR阻害剤を、有効量、含み得る。薬学的なまたは薬理学的に許容されるという語句は、適宜、例えば、ヒトのような動物へ投与された時に、有害反応、アレルギー反応、またはその他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物をさす。少なくとも1種のAR阻害剤または付加的な活性成分を含有している薬学的組成物の調製は、本開示を考慮すれば、そして参照により本明細書に組み入れられるRemingtonsPharmaceuticalSciences18thEdMackPrintingCompany1990により例示されるように、当業者に公知であろう。さらに、動物例えば、ヒトへの投与のため、調製物は、FDAOfficeofBiologicalStandardsにより必要とされるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の標準を満たすべきであることが理解されるであろう。本発明のアルドース還元酵素阻害剤の薬学的に許容される塩は、共溶媒において、遊離酸型のアルドース還元酵素阻害剤を、一般的には1当量の適切な塩基と反応させることにより容易に調製され得る。典型的な塩基は、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水素化ナトリウム、カリウムメトキシド、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、ベンザチン、コリン、ジエタノールアミン、ピペラジン、およびトロメタミンである。塩は、濃縮乾燥により、または非溶媒の添加により単離される。多くの場合において、塩は、好ましくは、酸の溶液を、異なるカチオンの塩エチルヘキサン酸ナトリウムもしくはエチルヘキサン酸カリウム、オレイン酸マグネシウムの溶液と混合し、溶媒例えば、酢酸エチルを利用して、そこから所望のカチオン塩を沈殿させることにより調製され、または濃縮および/もしくは非溶媒の添加により他の方法で単離されてもよい。本発明のアルドース還元酵素阻害剤の酸付加塩は、アルドース還元酵素阻害剤の遊離塩基型を適切な酸と反応させることにより容易に調製され得る。塩が、一塩基酸例えば、塩酸、臭化水素酸、pトルエンスルホン酸、酢酸、二塩基酸の水素型例えば、水素硫酸、コハク酸、または三塩基酸の二水素型例えば、リン酸二水素、クエン酸のものである時、少なくとも1モル当量、一般的には、モル過剰の酸が利用される。しかしながら、硫酸、ヘミコハク酸、リン酸水素、またはリン酸のような塩が望まれる時には、適切かつ正確な化学当量の酸が一般に使用されるであろう。一般的には、共溶媒において、遊離塩基および酸を組み合わせ、そこから、所望の塩を沈殿させるが、濃縮および/または非溶媒の添加により他の方法で塩を単離することもできる。さらに、本発明に従って使用され得るアルドース還元酵素阻害剤、それらのプロドラッグ、およびそれらまたは該プロドラッグの薬学的に許容される塩は、水和物または溶媒和化合物として存在してもよい。これらの水和物および溶媒和化合物も、本発明の範囲内である。本発明の薬学的組成物は、固体の形態で投与されるか、液体の形態で投与されるか、またはエアロゾルの形態で投与されるかに依って、そして注射のような投与経路のため無菌である必要があるか否かに依って、異なる型の担体を含み得る。本発明の薬学的組成物は、当業者に公知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、関節内、胸膜内、気管支内、胸膜内、鼻腔内、外用、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、経口、外用、局所、吸入例えば、エアロゾル吸入、滴注、注射、注入、連続注入、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物例えば、リポソームで、もしくはその他の方法、またはそれらの任意の組み合わせにより投与され得る例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemingtonsPharmaceuticalSciences18thEdMackPrintingCompany1990を参照のこと。担体には、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤例えば、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、風味剤、色素、当業者に公知であろう同様の材料、およびそれらの組み合わせが含まれる例えば、参照により本明細書に組み入れるRemingtonsPharmaceuticalSciences18thEdMackPrintingCompany1990pp12891329を参照のこと。任意の従来の担体が、活性成分と非適合性でない限り、治療用組成物または薬学的組成物において使用されることが企図される。対象へ投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重度、処置されている疾患の型、以前のまたは同時の治療的介入、患者の特発性、および投与経路のような、理学的因子および生理学的因子により決定され得る。投薬回数および投薬が行われる期間は、変動し得る。投与を担う実務者は、いかなる場合にも、個々の対象について、組成物中の活性成分の濃度および適切な用量ならびに投与の時間の長さを決定するであろう。アルドース還元酵素活性を阻害するために有効である量のアルドース還元酵素阻害剤が使用される。典型的には、阻害剤の有効投薬量は、単回投与または分割投与による約001mgkg日~100mgkg日、好ましくは、単回投与または分割投与による01mgkg日~20mgkg日の範囲である。約001、005、01、015、020、025、030、035、040、045、050、055、060、065、070、075、080、085、090.095、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100mgkg日の用量、少なくともそれらの用量、または多くともそれらの用量、またはそれらの中の任意の導出可能な範囲。典型的には、用量は、1日当たり25~1200mgであり、ある種の局面において、1日当たり100~800mgである。ある種の態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約01の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位の重量の約2~約75、または、例えば、約25~約60、およびその中の任意の導出可能な範囲を構成し得る。他の非限定的な例において、用量は、1回の投与当たり約1μgkg体重、約5μgkg体重、約10μgkg体重、約50μgkg体重、約100μgkg体重、約200μgkg体重、約350μgkg体重、約500μgkg体重、約1mgkg体重、約5mgkg体重、約10mgkg体重、約50mgkg体重、約100mgkg体重、約200mgkg体重、約350mgkg体重、約500mgkg体重~約1000mgkg体重またはそれ以上、およびその中の任意の導出可能な範囲も含み得る。本明細書にリストされた数から導出可能な範囲の非限定的な例において、上記の数に基づき、約5mgkg体重~約100mgkg体重、約5μgkg体重~約500mgkg体重等の範囲が、投与され得る。いかなる場合にも、組成物は、1種または複数種の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含み得る。さらに、パラベン例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、様々な抗菌剤および抗真菌剤のような保存剤によって、微生物の作用を防止することができる。本発明のある種の局面において、AR阻害剤は、経口摂取のような経路による投与のために調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル例えば、硬もしくは軟シェルゼラチンカプセル、徐放性製剤、バッカル組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハー、またはそれらの組み合わせを含み得る。経口組成物は、食事の食品と共に直接取り込まれ得る。経口投与のための好ましい担体には、不活性希釈剤、同化可能食用担体、またはそれらの組み合わせが含まれる。本発明の他の局面において、経口組成物は、シロップまたはエリキシルとして調製され得る。シロップまたはエリキシルは、例えば、少なくとも1種の活性薬剤、甘味剤、保存剤、風味剤、色素、保存剤、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある種の好ましい態様において、経口組成物は、1種または複数種の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、風味剤、およびそれらの組み合わせを含み得る。ある種の態様において、組成物は、以下のうちの1種または複数種を含み得る:例えば、トラガント、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、もしくはそれらの組み合わせのような結合剤;例えば、第二リン酸カルシウム、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、もしくはそれらの組み合わせのような賦形剤;例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、もしくはそれらの組み合わせのような崩壊剤;例えば、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤;例えば、ショ糖、乳糖、サッカリン、もしくはそれらの組み合わせのような甘味剤;例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、サクランボ風味剤、オレンジ風味剤のような風味剤等;またはそれらの組み合わせ。投薬単位形態がカプセルである時、それは、上記の型の材料に加えて、液体担体のような担体を含有し得る。コーティングとして、またはその他の方法で投薬単位の物理的形態を修飾するため、様々なその他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シェラック、糖、またはその両方によりコーティングされ得る。無菌の注射可能溶液は、上に列挙された様々な他の成分と共に、必要とされる量の活性化合物を適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後、ろ過減菌することにより調製される。一般に、分散物は、基本の分散媒および/またはその他の成分を含有している無菌の媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、または乳濁液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、事前に滅菌ろ過された液体媒体から、活性成分任意の付加的な所望の成分の粉末を与える、真空乾燥または凍結乾燥の技術である。液体媒体は、必要であれば、適当な緩衝剤で処理されるべきであり、液体の希釈剤がまず等張にされた後、十分な生理食塩水またはグルコースと共に注射されるべきである。直接注射のための高度に濃縮された組成物の調製も、企図され、その場合、溶媒としてのDMSOの使用は、極めて迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな区域へ送達すると予想される。特定の態様において、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組み合わせのような、吸収を遅延させる薬剤を組成物において使用することにより、注射可能組成物の長期的な吸収をもたらすことができる。AR阻害剤のような本発明の組成物による処置の有効性を増加させるため、それを他の治療剤と組み合わせることが望ましい場合がある。この過程は、細胞をAR阻害剤および治療剤と同時に接触させることを含んでいてもよいし、または細胞、組織、もしくは生物へのモジュレーターおよび薬剤の別々の投与が、所望の治療的利益を生ずる期間内に、細胞をAR阻害剤および治療剤と接触させることを含んでいてもよい。細胞、組織、または生物に適用された時、接触および曝露という用語は、AR阻害剤および/または治療剤が、標的の細胞、組織、もしくは生物へ送達されるか、または標的の細胞、組織、もしくは生物と直接隣接するよう置かれる過程を記載するために、本明細書において使用される。細胞、組織、または生物は、AR阻害剤および1種もしくは複数種の薬剤の両方を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と例えば、投与により接触させられてもよいし、または2個以上の別個の組成物もしくは製剤一方の組成物はAR阻害剤を含み、他方は1種もしくは複数種の薬剤を含むと接触させられてもよい。AR阻害剤は、数分~数週間の範囲の間隔で、他の薬剤に先行してもよいし、同時であってもよいし、かつ/または後続してもよい。AR阻害剤および他の薬剤が、細胞、組織、または生物へ別々に適用される態様においては、阻害剤および薬剤が、細胞、組織、または生物に対して有利に組み合わせられた効果を発揮することができるよう、各送達の時点の間に有意な期間が経過しないことが、一般に確実にされるであろう。例えば、そのような場合においては、モジュレーターとして、2種、3種、4種、またはそれ以上のモダリティと、実質的に同時に即ち、約1分以内に、細胞、組織、または生物を接触させることが企図される。他の局面において、1種または複数種の薬剤は、実質的に同時から、AR阻害剤の投与の約1分、約5分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約2時間、もしくはそれ以上、または約1日以上、または約4週間以上、または約3ヶ月以上、または約1年以上、およびその中の任意の導出可能な範囲だけ前および/または後までの範囲内で投与され得る。そのような組み合わせにおいて、AR阻害剤および他の活性薬剤は、共に投与されてもよいし、または別々に投与されてもよい。さらに、ある薬剤の投与が、他の薬剤の投与より前であってもよいし、同時であってもよいし、または後であってもよい。IV実施例以下の実施例および添付の図面は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。実施例または添付の図面に開示された技術は、本発明の実施においてよく機能することが本発明者らにより発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると見なされ得ることが、当業者により認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を入手することが可能であることを認識するべきである。Aタバコ煙抽出物1結果CSEは、125、25、50、および75のCSEの濃度で、それぞれ、24時間で、23、26、37、および40であった、SAECにおける用量依存的な細胞死を引き起こした。フィダレスタットによるSAECの処理は、CSEにより誘導される細胞死を防止し、50CSEで、>85の細胞が生存しており、125では、95を超える細胞が生存していた図1。SAECにおけるTNFαにより誘導される細胞死を、陽性対照として使用した。さらに、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子のレベルを、CSE50処理の24時間後のSAEC培養培地において測定した図2。IL1αおよびIL8のようなサイトカインのレベルは、およそ2倍増加し、およそ10倍、TNFαは3倍増加した。全ての変化が、SAECにおけるAR阻害により、有意にp<005および001防止された図2。同様に、GCSFおよそ7倍、MCP1およそ15倍、GMCSFおよそ075倍、およびIP1030倍超のようなケモカイン、ならびにTGFα3倍およびVEGF4倍のような増殖因子のレベルの有意な増加が存在し、AR阻害剤による処理は、50超、これらの変化を防止した図2。2材料および方法細胞の選択:アレルゲンと呼吸器との間の最初の接触点である気道上皮細胞は、COPDをもたらす、気道上皮細胞の細胞生存能、形態学、および生理学の変化をもたらす、細胞酸化還元ホメオスタシスを妨害する、環境的なガスおよび粒子、タバコ煙、ならびにその他の生体異物を含む外来粒子に対する障壁として、重要な機能を果たしている。従って、本発明者らは、初代ヒト小気道上皮細胞を選んだ。細胞培養:LonzaWalkersvilleMDから入手された初代ヒト小気道上皮細胞SAECは、18歳男性ドナーの遠位気腔から採集された正常ヒトSAECであった。細胞は、52μgmlウシ下垂体抽出物、05ngmlヒト組換え上皮増殖因子EGF、05μgmlエピネフリン、1μgmlヒドロコルチゾン、10μgmlトランスフェリン、5μgmlインスリン、01ngmlレチノイン酸RA、65ngmlトリヨードチロニン、50μgmlゲンタマイシン/アムホテリシンBGA1000、および50μgml脂肪酸不含ウシ血清アルブミンBSAを含有している補助剤を含む小気道上皮基本培地SABMにおいて、95空気および5CO2を含有している加湿雰囲気において、37°Cで、供給元の指示に従い培養された。タバコ煙抽出物CSEの調製:UniversityofKentuckyLexingtonKYのKentuckyTobaccoResearchandDevelopmentCenterからのフィルター付き研究用タバコ1R3Fを、CarpおよびJanoffAmRevRespirDis1978118617621により開発された方法の変法を使用して、ドラフト内で、フィルターの05cm上まで燻煙した。1本のタバコからの煙を10mlの無血清培地へ1cm分の速度で通すことにより、CSEを調製し、100と表記した。培地で希釈することにより、様々な濃度のCSEを調製した。培地のpHを74に調整し、培地を02μmフィルターMilliporeにより滅菌ろ過した。CSEは、常に、実験当日に新鮮に調製された。細胞生存能アッセイ:SAECを、96穴プレートに5000細胞ウェルの密度で蒔き、完全培地を、フィダレスタット20μMまたは担体を含有している新鮮な基本培地へ交換することにより、24時間、増殖を阻止した。細胞を、フィダレスタットの存在下または非存在下で、さらに24時間、CSE75、50、25、125、0と共にインキュベートし、その後、10μlのMTT5mgmlを各ウェルへ添加し、さらに2時間、37°Cでインキュベートした。培地を除去し、ホルマザン顆粒を100DMSOに溶解させた。吸光度を96穴ELISAプレートリーダを使用して、570nmで読み取った。細胞培養培地中のmilliplexによるサイトカインおよびケモカインの決定:細胞をコンフルエンスに増殖させ、PBSにより洗浄した後、CSEまたは媒体に曝露した。1本のタバコの喫煙を模倣するため、細胞を15分間CSEに曝露した。CSEを除去し;細胞をPBSにより洗浄し、新鮮な培地に置いた。培養培地を、収集し、2500rpmでの5分間の遠心分離により清澄化した。分析のために使用するまで、200°Cで上清を保管した。上清中のサイトカインおよびケモカインのレベルを、製造業者の指示MilliporeCorporationBellericaMAに従って、MilliplexMAPキットにより決定した。統計:平均値±SDおよび統計的有意性として提示されたデータは、graphpadprismソフトウェアGraphPadSoftwareIncLaJollaCAを使用して独立スチューデントt検定により決定された。P<005の値を、統計的に有意と見なした。Bブタクサ花粉抽出物1結果AR阻害はSAECにおけるIL13により誘導されるROSレベルを防止する:サイトカインにより誘導される酸化ストレスは、気道上皮細胞の粘液細胞への分化をもたらす分子シグナル伝達を媒介することが公知であるため、本発明者らは、2種の異なる方法により、SAECにおけるIL13により誘導されるROSレベルに対するAR阻害の効果を決定した。図3Aおよび3Bに示されるように、IL13による刺激は、対照に対するROSレベルのおよそ2倍の増加を引き起こし、フィダレスタットによる細胞の処理は、その増加を有意に80防止した。これらの結果は、ARの阻害により、サイトカインにより誘導される酸化ストレスを防止し得ることを示唆する。AR阻害はSAECにおけるIL13により誘導される杯細胞化生を防止する:杯細胞化生およびムチン産生の調節におけるARの役割を調査するため、本発明者らは、インビボ気道環境を模倣する気液界面培養系を使用した。最初に、本発明者らは、コラーゲン1型コーティングを有するポリエチレンテレフタレートPET膜インサート上で初代ヒト気道上皮細胞を培養した。コラーゲンによりコーティングされた膜インサート上の細胞は、一貫して、2~3細胞の厚さの気道細胞の層を形成した。さらに、11日間、EGF含有培地においてALI上で培養された時、単層細胞は繊毛細胞へ完全に分化し図4A、これらの細胞を48時間IL13により刺激した時、βチューブリン特異抗体を使用した免疫染色によっても決定されたように、繊毛細胞の数が著しく低下した。しかしながら、フィダレスタットによるAR阻害は、繊毛形態学を保存した図4B。単独のAR阻害剤は毒性効果を有しておらず、繊毛細胞の単層は概して完全であった。PAS染色により決定されたように、48時間、IL13により刺激された時、多数の繊毛細胞およそ6倍が、粘液が充満した杯細胞へ形質転換したが、IL13チャレンジ前にAR阻害剤フィダレスタットを培地へ添加することにより、気道細胞の杯細胞への分化が防止された示されないデータ。AR阻害は気道上皮単層におけるムチンおよびSPDEFのIL13により誘導される発現を防止する:次に、単層細胞の切片を、Muc5ACに対する抗体により染色した。図5Aおよび5Bに示されるように、IL13刺激は、多数のMuc5AC免疫陽性細胞をもたらした。細胞をAR阻害剤により処理し、IL13と共にインキュベートした時、Muc5AC染色陽性細胞の数が、有意におよそ70減少し、このことから、極少数の細胞しか杯細胞へ形質転換しなかったことが示唆された。次に、本発明者らは、ELISAを使用して、培養培地中の分泌されたMuc5ACのレベルを測定した。IL13刺激後の培地にはMuc5ACの分泌の著しい増加があったが、それは、AR阻害剤による処理により、有意におよそ80防止された図5C。これらの結果は、ARが気道上皮細胞におけるIL13により誘導される化生および粘液生成を調節すること、そしてARの阻害がこれらのイベントを防止し得ることを示唆する。次に、本発明者らは、これらの細胞におけるムチンレベルが、転写または翻訳により調節されるか否かを調査した。図6A、上パネルに示されるように、IL13により処理されたSAEC単層においては、Muc5AC特異的なRNA発現がおよそ3倍増加し、フィダレスタットはその増加を有意に防止した。SPDEFは、酸性ムチンおよび中性ムチンの両方を含む気道上皮細胞における数種の遺伝子の発現を調節し、杯細胞過形成を引き起こすことを、多数の研究が示している。従って、本発明者らは、細胞培養モデルにおいて、RTPCRによりSPDEFmRNA発現レベルを決定し、IL13は上皮細胞におけるSPDEFの発現を有意に増強するが、対照細胞は基底レベルの発現のみを有することを観察した。これらの細胞を、IL13刺激の前にAR阻害剤により処理した時、SPDEFmRNAレベルは有意に減少した図6A、下パネル。次に、24時間および48時間のIL13とのインキュベーションの後、SAEC単層において、Muc5ACタンパク質およびMuc5Bタンパク質のレベルをイムノブロッティングにより測定した。Muc5ACBは、24時間後には検出可能でなかったが、IL13との48時間のインキュベーションの後、タンパク質発現レベルの頑強な増加が起こり図6B、上2枚のパネル、それは、フィダレスタットにより処理された細胞において有意にそれぞれ、およそ75、およそ50防止された。また、IL13と共にインキュベートされた気道上皮細胞単層においては、細胞内のSPDEFタンパク質のレベルも、24時間後に有意に増加し、48時間後にさらに増加し、その増加は、AR阻害剤により処理された細胞において有意におよそ50防止された図6B。タンパク質レベルの減少は、SPDEFおよびMuc5ACBのmRNAレベルの減少と一致し、そのことから、SPDEF遺伝子およびMuc5AC遺伝子がIL13の存在下で誘導されること、そしてMuc5ACの発現が転写レベルでAR阻害により防止されることが示唆された。AR阻害はシグナル伝達中間体のIL13により誘導されるリン酸化および活性化を防止する:ALI上の気道上皮細胞単層におけるAR阻害は、転写調節因子SPDEFの発現およびその後のムチンの発現を成功裡に防止したため、これらの喘息メディエーターの発現を調節する分子機序に対するAR阻害の効果を研究した。ALI上で増殖させた細胞を、AR阻害剤の存在下または非存在下でIL13により刺激し、JAK1タンパク質、ERK12タンパク質、およびSTAT6タンパク質のリン酸化を決定した。図7に示されるように、IL13は、STAT6ならびにJAK1およびERK12のような上流メディエーターのリン酸化の時間依存的な増加を引き起こした。これらの細胞をIL13刺激の前にAR阻害剤により処理した時、これらのタンパク質のリン酸化は有意に減少した。さらに、AR阻害剤単独により処理された細胞においては、JAK1の基底リン酸化が減少したが、ERK12およびSTAT6については減少しなかった。これらの結果は、ARが、気道繊毛上皮細胞を粘液分泌杯細胞へ形質転換させる杯細胞化生に関与する重要シグナル伝達中間体の活性化を調節することを示唆する。AR阻害はIL13のRWEにより誘導される発現およびマウス肺におけるSTAT6の活性化を防止する:Th2サイトカイン、特に、IL13は、杯細胞化生に関与しているため、本発明者らは、RWEチャレンジ後のマウス肺におけるIL13の発現レベルを調査し、そのレベルが対照と比較しておよそ6倍増加すること、そしてチャレンジ前のフィダレスタットによる処理がこの増加を防止することを見出した図8。IL13レベルの増加が、化生において主要な役割を果たすSTAT6のリン酸化および活性化と同時発生するか否かを調査するため、RWEチャレンジの20時間後にマウスを屠殺し、ホスホSTAT6抗体を使用した免疫蛍光研究を、肺切片に対して実施した。対照マウスの肺はバックグラウンドのみを示したが、RWEチャレンジを受けたマウス肺上皮は、ホスホSTAT6に特異的な蛍光強度の著しい増加を示し、それが、AR阻害により防止されることが観察された図9A。結果は、肺切片に対するDABに基づく免疫組織化学によっても同様に確認された図9B。これらの結果は、ARの阻害が、インビボで、アレルゲンにより誘導されるIL13発現およびその後のSTAT6の活性化を防止し得ることを示唆する。AR阻害/欠損はマウス肺におけるRWEにより誘導される杯細胞化生を防止する:本発明者らは、次に、RWEにより感作されチャレンジされたマウスにおける杯細胞化生に対するAR阻害の効果を調査した。チャレンジの72時間後、肺切片を入手し、PASにより染色し、気道上皮の変化を調査した。図10Aに示されるように、RWEチャレンジを受けたマウスの気道においては、PAS陽性細胞の有意な増加が存在したが、RWEチャレンジ前にフィダレスタットにより処理されたマウスの肺には存在しなかった。阻害剤により処理されたマウスに類似して、RWEによりチャレンジされたARヌルマウスは、気道におけるPAS陽性細胞の欠如を示した図10B。これらの結果は、ARが杯細胞化生において有意な役割を果たすこと、そしてAR阻害がアレルギー性喘息における化生を防止し得ることをさらに確認する。2材料および方法動物:全ての動物実験が、NationalInstitutesofHealthGuideforCareandUseofExperimentalAnimalsに従い実施され、UniversityofTexasMedicalBranchAnimalCareandUseCommittee動物福祉保証番号AnimalwelfareassuranceNoA331401により承認された。試薬:小気道上皮基本培地SABMおよび小気道上皮増殖培地SAGM商標bulletkit;ならびにトリプシン0025EDTA001、トリプシン中和溶液、およびHEPES緩衝生理食塩水溶液を含有しているReagentpack商標は、LonzaWalkersvillleIncWalkersvilleMDから購入された。ダルベッコ変法イーグル培地DMEMおよびリン酸緩衝生理食塩水PBSは、GibcoInvitrogenGrandIslandNYから購入された。AR阻害剤フィダレスタットは、SanwaKayaguSouthKoreaからの寄贈であった。ヒト組換えIL13は、RDsystemsMinneapolisMN製であった。ジメチルスルホキシドDMSOは、FischerscientificPittsburgPAから入手された。ヒトmucin5ACELISAキットは、CosmoBioUSACarlsbadCA製であった。STAT6、ホスホSTAT6、ホスホJAK1、JAK1、ERK12、ホスホERK12に対する抗体は、CellSignalingTechDanversMA製、ムチン5サブタイプAおよびCMuc5AC、Muc5B、GAPDH、ならびにβアクチンに対する抗体は、SantaCruzBiotechnologyIncSantaCruzCA製であった。SAMポインテッドドメイン含有ETS転写因子SAMpointeddomaincontainingETStranscriptionfactorSPDEFに対する抗体は、AbcamIncCambridgeMAから購入された。10μM孔を有するポリエチレンテレフタレート透明12穴Millicell細胞培養インサートは、MilliporeCorpBillericaMAから購入された。ラット尾コラーゲン1型およびオールトランスレチノイン酸は、SigmaAldrichSaintLouisMO製であった。ウエスタンブロット分析において使用された試薬は、Sigmaから入手された。使用されたその他の試薬は、全て、分析用であった。細胞培養:LonzaWalkersvilleIncWalkersvilleMDから入手された初代ヒト小気道上皮細胞SAECは、遠位気腔から採集された正常ヒトSAECであった。細胞は、52μgmlウシ下垂体抽出物、05ngmlヒト組換え上皮増殖因子EGF、05μgmlエピネフリン、1μgmlヒドロコルチゾン、10μgmlトランスフェリン、5μgmlインスリン、01ngmlレチノイン酸RA、65ngmlトリヨードチロニン、50μgmlゲンタマイシン/アムホテリシンBGA1000、および50μgml脂肪酸不含ウシ血清アルブミンBSAが補足された小気道上皮基本培地SABMにおいて、95空気および5CO2を含有している加湿雰囲気において、37°Cで、供給元の指示に従い培養され維持された。ROSレベル決定:およそ5×104個のSAECを2チャンバー培養スライドにトリプリケートに播種するか、または1ウェル当たり10000個のSAECを96穴プレートに蒔いた。付着後、細胞を、フィダレスタット10μMを含まないかまたは含む、01血清を含有している基本培地において、一夜、飢餓状態にした。翌日、細胞を1×HBSS緩衝液により洗浄し、37°Cで30分間、10μMH2DCFDAと共にインキュベートし、過剰のH2DCFDAを除去するために再び洗浄し、IL1325ngmlにより1時間処理した。インキュベーションの終了後、細胞を、冷1×HBSS緩衝液により2回洗浄した。培養スライド上の細胞を、DAPIを含むfloursave封入剤を使用してマウントし、その後、蛍光顕微鏡Nikonを使用して顕微鏡写真を取得した。96穴プレート内の細胞について485nmの励起波長および538nmの放出波長を使用して蛍光を決定した。相対ROS生成が平均蛍光強度MFI任意単位として表される。気液界面培養:気液界面ALI培養のため、ラット尾コラーゲン1型SigmaAldrichにより予めコーティングされた10μM孔を有する12mm直径PET透明インサート12wellmillicellcultureinsert;Milliporeに、1個当たり85×104細胞のSAECを播種した。ZhenらAmJRespirCellMolBiol362442532007により以前に記載されたようにして、細胞を、分化培地において液内増殖させた。分化培地は、DMEMと、ゲンタマイシン硫酸塩、アムホテリシンB、およびトリヨードチロニンが、1ペニシリン/ストレプトマイシンおよび50nMオールトランスレチノイン酸に交換された以外は上記のように補足された小気道上皮増殖培地との11混合物を含有していた。SAECを最初の7日間は液内に維持し、その後、頂端側培地を除去し、気液界面培養を確立した。培養期間の残りは、ALIで細胞を維持した。培地を3日毎に更新し、1週間に1回、蓄積された粘液および細胞片を除去するため、細胞の頂端側表面をPBSにより濯いだ。細胞を、加湿インキュベーター内で、95空気および5CO2において37°Cで維持した。ALI上の細胞を、ALIの確立後11日目に、EGFを含まない分化培地において、基底側から、一夜、AR阻害剤フィダレスタット10μMにより前処理し、示されたような様々な期間、組換えヒトIL1325ngmlを培地へ添加することにより、IL13により刺激した。細胞固定および免疫細胞化学:IL13とのインキュベーションの完了後、細胞の頂端側表面をPBSにより濯ぎ、細胞を10zfix、水性緩衝亜鉛ホルマリンAnatechLtd;BattleCreekMIで4°Cで24時間固定し、パラフィン包埋した。膜インサート上の上皮細胞単層の5μMの薄い切片を、HEおよび過ヨウ素酸シッフPAS染色により染色した。染色された切片を分析し、代表的な領域を、NIKONEclipseTE200UV顕微鏡にマウントされたPhotometrixCoolSNAPFxカメラを使用して写真撮影した。βチューブリンおよびMuc5ACに対する抗体SantaCruzBiotechnologySantaCruzCA、および対応する対照IgGを、免疫細胞化学のために使用した。製造業者により提案された通りに、VectorLSABキットVectorLaboratoriesBurlingameCAを使用して、抗体を検出した。RTPCR:供給元の指示の通りに、RNeasyキットQiagenを使用することにより、AR阻害剤の存在下または非存在下でIL13により処理された分化SAECから、全RNAを単離した。各試料から単離されたRNAのアリコート10μgを、30分間55°CでHotStarTaqDNApolymeraseを含むOmniscriptandSensiscriptreversetranscriptaseonestepRTPCR系Qiagenにより逆転写した後、PCR増幅した。オリゴヌクレオチドプライマー配列は以下の通りであった:。以下の条件の下で、PCRSprintサーマルサイクラーThermoelectroncorporationMilfordMAにおいてRTPCR反応を実施した:95°C15分の初期変性、94°C1分、60°C1分、72°C1分を35サイクル、続いて、最終伸張のための72°C10分。RTPCR産物を、05μgml臭化エチジウムを含有している15アガロース1×TAEゲル上の電気泳動に供した。ゲルの濃度測定分析を、NIHimage分析ソフトウェアを使用して実施した。ウエスタンブロット分析:インキュベーション後、細胞を冷PBSにより洗浄し、RIPA溶解緩衝液で溶解した。細胞溶解物をプールし、遠心分離により清澄化した。Bradford試薬BioradHerculesCAを使用して、タンパク質レベルを決定した。40μgのタンパク質を、試料緩衝液と混合し、10SDSPAGE上で分離した。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜に電気的に移し、TBST中の5脱脂乳によりブロッキングし、4°Cで一夜、ホスホERK12、ERK12、ホスホSTAT6、STAT6、Muc5AC、Muc5B、およびSPDEFに対する抗体によるプロービングを行った。次いで、ブロットを洗浄し、HRP結合二次抗体15000希釈に1時間曝露し、抗原抗体複合体を増強化学発光AmershamPharmaciaBiotechPiscatawayNJUSAにより検出した。負荷対照を示すため、膜のストリッピングおよびGAPDHに対する抗体によるリプロービングを行った。UltraViolateProductsLtdCambridgeUK製のbiospectrum410imagesystemにより、濃度測定を実施した。Muc5ACELISA:培養培地中のMuc5ACレベルを、本質的に製造業者CosmoBioUSA;CarlsbadCAにより記載されたようにして、市販のヒト抗Muc5ACELISAを使用して、ELISAにより査定した。動物の感作およびチャレンジ:野生型のC57BL6マウスおよびBalbcJマウスは、HarlanSpragueDawleySanDiegoCAUSAから購入され、C57BL6バックグラウンドのARヌルマウスは、AnimalresourcecenterUTMBGalvestonTXにおいて本発明者らにより作出された。6~8週齢雌マウスを、以前に記載されたようにしてHwangetalFASEBJ197957972005、RWEにより感作した。簡単に説明すると、0日目および4日目に、31比vvでミョウバンアジュバント1mgと組み合わせた100μlの内毒素不含RWE150μgを、2回、腹腔内投与することにより、マウスを感作した。11日目に、マウスn=6を、RWE100μgにより鼻腔内チャレンジした。マウスの並行群は、チャレンジの1日前から飲料水中のフィダレスタット7mgkg体重日を受容した。マウスの対照群は、等しい容量のPBSによりチャレンジされた。動物を、ケタミン135mgkg体重およびキシラジン15mgkg体重により、言及されたような異なる時点で安楽死させ、肺を灌流し、4パラホルムアルデヒドにより固定し、パラフィン包埋し、5μmに切片化した。肺切片をPASにより染色し、代表的な領域を、NIKONEclipseTE200UV顕微鏡上にマウントされたPhotometrixCoolSNAPFxカメラにより観察し、写真撮影した。マウス肺におけるIL13の決定:RWEチャレンジの16時間後にマウス肺を採集し、全RNAを単離した。各試料から、1μgの全RNAを第一鎖cDNAへ転写し、IL13特異的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用して、定量的RTPCRを実施し;GAPDH特異的なプライマーを、ハウスキーピング遺伝子HKG対照として使用した。ABI7000Systemの装置およびソフトウェアAppliedBiosystemsFosterCityCAにより、データを収集し、分析した。発現レベルを査定するため、デルタデルタCt法ΔΔCTを使用した。増加倍率対照に対する比率としての発現の値を、デルタデルタCTΔΔCTの方法による相対発現についての式:F=2ΔΔCを使用して計算した。F=変化倍率対照に対する比率、ΔΔCT=TimexTime0。Timexは、任意の時点である。Time0は、HGKに対してノーマライズされた標的遺伝子の1×発現を表す。マウス肺におけるSTAT6リン酸化の検出:RWEチャレンジのおよそ20時間後、マウスを屠殺し、肺を灌流し、4パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、5μm切片を入手した。切片を、pSTAT6特異的な一次抗体により免疫染色した後、FITC標識二次抗体によりプロービングし、DAPIを含むflourosave媒体によりマウントするか、またはVectorLSABキットVectorLaboratoriesBurlingameCAからのDABに基づくHRP結合抗体によりプロービングし、ヘマトキシリンおよびエオシンにより対比染色した。それぞれ、蛍光顕微鏡検または明視野顕微鏡検を使用して、NIKONEclipseTE200UV顕微鏡上にマウントされたPhotometrixCoolSNAPFxカメラにより顕微鏡写真を取得した。統計:平均値±SEおよび統計的有意性として提示されたデータは、graphpadprismソフトウェアGraphPadSoftwareIncLaJollaCAを使用して独立スチューデントt検定により決定された。P<005の値を、統計的に有意と見なした。