"修飾された単一ドメイン抗原結合分子であって、i1つ又は複数の標的に結合する、1つ又は複数の単一抗原結合ドメインと、ii非ペプチドリンカーと、iii1つ又は複数のポリマー分子と、を含み、該非ペプチドリンカーが式Iの部分である、修飾された単一ドメイン抗原結合分子:式中、W1及びW2はそれぞれ独立して、結合又はNR1から選択され、Yは結合、0~2個のRaで置換されたC1~4アルキレン、又はピロリジン-2,5-ジオンであり、XはO、結合であるか、又は存在せず、ZはO、NR3、S、又は結合であり、R1及びR3はそれぞれ独立して、水素又はC1~6アルキルであり、R2は存在していないか、又は1つ若しくは複数のポリマー部分であり、Raはヒドロキシル、C1~4アルキル又はC1~4アルコキシから選択され、mは0又は1であり、nは0、1、2又は3であり、pは0、1、2、3又は4である。1つ又は複数のポリマー分子がポリエチレングリコールPEGモノマー又はその誘導体を含む、請求項1に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。PEGポリマー分子が分岐しており、該PEGモノマーがメトキシポリエチレングリコールmPEG又はその誘導体である、請求項2に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。PEGポリマー分子が式a~式hからなる群から選択される分岐PEGポリマー分子である、請求項3に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子:各PEGポリマー部分が独立して、1KDa~100KDaの分子量を有する、請求項2~4のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。各PEGポリマー部分が独立して、10KDa~50KDaの分子量を有する、請求項5に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。各PEGポリマー部分が独立して、10KDa、20KDa、30KDa、40KDa及び50KDaからなる群から選択される分子量を有する、請求項5に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。リンカー及びPEGポリマー分子が以下からなる群から選択される構造を有する、請求項5に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子:リンカー及びPEGポリマー分子が以下の式で表される、請求項8に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子:前記単一抗原結合ドメインの少なくとも1つがヒトTNFαに結合する、請求項1~9のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。一価、二価又は三価である、請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。単一特異性、二重特異性又は三重特異性である、請求項1~11のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。前記単一抗原結合ドメインの1つ又は複数が、CDRグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、又はファージディスプレイによって選択されている、請求項1~12のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。N末端からC末端へと以下の順序で:抗TNFα単一抗原結合ドメイン-任意でペプチドリンカー-抗TNFα単一抗原結合ドメイン-非ペプチドリンカー-1つ又は複数のポリマー分子を含む一本鎖融合ポリペプチドである、請求項1~10のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。前記単一抗原結合ドメインの1つ又は複数が、図2に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して少なくとも85同一なアミノ酸配列を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。前記単一抗原結合ドメインの1つ又は複数が、以下のアミノ酸配列:DYWMYCDR1、EINTNGLITKYPDSVKGCDR2及びSPSGFNCDR3を有する3つのCDRを含むか、又は1つのアミノ酸置換が存在するという点で前記CDRの1つとは異なるCDRを有する、請求項14又は15に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。前記ペプチドリンカーが、Gly3-Ser又はGly4-Ser配列番号8の少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回又はそれ以上の反復を含む、請求項14~16のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子。以下の構造で表される、請求項17に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子:請求項1~18のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。サイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、又は細胞増殖抑制剤の1つ又は複数から選ばれる第2の作用物質を更に含む、請求項19に記載の医薬組成物。被験体において炎症状態又は自己免疫状態を改善する方法であって、該被験体に、該TNFα関連障害の症状の1つ又は複数が軽減するような量で請求項1~18のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン抗原結合分子を投与することを含む、被験体において炎症状態又は自己免疫状態を改善する方法。第2の作用物質を該修飾された単一ドメイン抗原結合分子と併せて投与することを更に含み、前記第2の作用物質がサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、又は細胞増殖抑制剤の1つ又は複数から選ばれる、請求項21に記載の方法。TNFα関連障害が、関節リウマチRA、関節炎状態、乾癬性関節炎、多関節型若年性特発性関節炎JIA、強直性脊椎炎AS、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、又は多発性硬化症の1つ又は複数から選ばれる、請求項21又は22に記載の方法。修飾された単一ドメイン抗原結合分子又は第2の作用物質を皮下注射、血管注射、筋肉注射又は腹腔内注射により又は吸入により該被験体に投与する、請求項23に記載の方法。修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する方法であって、請求項1~18のいずれか一項に記載の修飾されたSDAB分子を被験体に投与することと、該修飾されたSDAB分子の1つ又は複数の薬物動態/薬力学PK/PDパラメータを評価することと、を含む、修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する方法。修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する又は選択する方法であって、被験体において請求項1~18のいずれか一項に記載の修飾されたSDAB分子の少なくとも1つのPK/PDパラメータに関する試験値を被験体に提示することと、提示された該試験値を少なくとも1つの参照値と比較し、それにより該修飾されたSDAB分子を評価する又は選択する、比較することと、を含む、修飾された単一ドメイン抗原結合分子を評価する又は選択する方法。修飾されたSDAB分子を含有するサンプルを準備することと、捕捉検出アッセイで該サンプルを試験することと、を更に含む、請求項25又は26に記載の方法。評価されるPK/PDパラメータが、該修飾されたSDAB分子のinvivo濃度例えば血液、血清、血漿及び/又は組織中の濃度;該修飾されたSDAB分子のクリアランスCL;該修飾されたSDAB分子の定常状態の体積分布Vdss;該修飾されたSDAB分子の半減期t1/2;該修飾されたSDAB分子のバイオアベイラビリティ;該修飾されたSDAB分子の用量で正規化した最大血中濃度、最大血清濃度若しくは最大血漿濃度;該修飾されたSDAB分子の用量で正規化した曝露量;又は該修飾されたSDAB分子の組織対血清比の1つ又は複数から選ばれる、請求項25~27のいずれか一項に記載の方法。修飾された単一ドメイン結合分子を評価する捕捉検出アッセイであって、固体支持体に固定化された標的と、結合した修飾された単一ドメイン抗原結合分子-標的複合体を検出するための該修飾された単一ドメイン抗原結合分子のタンパク質部分又はポリマー部分に結合する試薬とを準備することを含む、修飾された単一ドメイン結合分子を評価する捕捉検出アッセイ。請求項1~17のいずれか一項に記載の修飾された単一ドメイン結合分子を含有するデバイス、シリンジ又はバイアルを含み、任意で使用説明書を含む、キット又は製造物。修飾された単一ドメイン結合分子を製造する方法であって、単一ドメイン結合分子を準備することと、該単一ドメイン結合分子を式Iの非ペプチドリンカーに、少なくとも1つの化学結合が形成される条件下で接触させることと、を含む、修飾された単一ドメイン結合分子を製造する方法:式中、W1及びW2はそれぞれ独立して、結合又はNR1から選択され、Yは結合、0~2個のRaで置換されたC1~4アルキレン、又はピロリジン-2,5-ジオンであり、XはO、結合であるか、又は存在せず、ZはO、NR3、S、又は結合であり、R1及びR3はそれぞれ独立して、水素又はC1~6アルキルであり、R2は存在していないか、又は1つ若しくは複数のポリマー部分であり、Raはヒドロキシル、C1~4アルキル又はC1~4アルコキシから選択され、mは0又は1であり、nは0、1、2又は3であり、pは0、1、2、3又は4である。本発明は、修飾された単一ドメイン抗原結合分子本明細書ではSDAB分子とも称されるに関する。修飾されたSDAB分子は、1つ又は複数の標的と相互作用する、例えば1つ又は複数の標的に結合する1つ又は複数の単一抗原結合ドメインを含み得る。一実施形態では、修飾されたSDAB分子の単一抗原結合ドメインの1つ又は複数が腫瘍壊死因子-αTNFαに結合する。SDAB分子は、invivoでのその生物学的特性を増大するように修飾することができる。例えば、SDAB分子は、修飾されていないSDAB分子と比較して半減期の増大、免疫原性の低減、又は少なくとも1つの薬物動態/薬力学PK/PDパラメータの改善の1つ又は複数が改善するように修飾することができる。一実施形態では、修飾されたSDAB分子には、1つ又は複数のポリマー分子、例えばポリエチレングリコールPEG又はその誘導体が含まれる。修飾されたSDAB分子は、例えば被験体、例えばヒトへの投与に有用である。TNFα関連障害を治療する又は予防するための修飾されたSDAB分子を調製する及び使用する方法も開示されている。本発明をより容易に理解するために、初めに或る特定の用語を定義する。更なる定義は発明を実施するための形態にわたって説明される。本明細書に使用される場合、不定冠詞thearticlesaandanは冠詞の文法上の対象物が1つ又は2つ以上例えば少なくとも1つであることを指す。又は若しくはという用語は、文脈上、他にはっきりと示されていなければ、本明細書では及び/又はという用語を意味するのに用いられ、その用語と区別なく用いられる。タンパク質及びポリペプチドという用語は、本明細書では区別なく用いられる。約及びおよそは一般的に、測定の性質又は正確性を前提として、測定される量に対して許容可能な程度の誤差を意味するものとする。誤差の程度の例は、与えられる値又は値の範囲の20パーセント以内、典型的には10以内、より典型的には5以内である。ヌクレオチド配列に関連して、実質的に同一なという用語は、第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列とが共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造的ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能性ポリペプチド活性をコードするように、第2の核酸配列にアラインしたヌクレオチドと同一のヌクレオチドを十分な又は最低限の数含有する第1の核酸配列、例えば参照配列に対して少なくとも約85、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の同一性を有するヌクレオチド配列を表すのに本明細書で用いられる。また本発明のポリペプチドには、上述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体又は変異体、及びそれらの任意の組合せも含まれる。本発明のタンパク質に言及する場合、断片、変異体、誘導体及び類似体という用語は、対応する天然の抗体又はポリペプチドの機能特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、タンパク質分解断片及び欠失断片に加えて、本明細書の他の箇所で述べられている特異的な抗体断片も含まれる。本発明のポリペプチドの変異体には、上記の断片の他に、アミノ酸の置換、欠失又は挿入によりアミノ酸配列が変化したポリペプチドも含まれる。変異体は自然発生的であっても、又は自然発生的でなくてもよい。自然発生的ではない変異体は当該技術分野で既知の突然変異誘発技法を用いて生成することができる。変異体ポリペプチドは、保存的な又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失又は付加を含み得る。本発明の断片の誘導体は、天然ポリペプチドには見られない更なる特徴を示すように変化しているポリペプチドである。例としては融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書ではポリペプチド類似体とも表すことができる。本明細書に使用される場合、ポリペプチドの誘導体は機能的側基の反応により化学的に誘導体化された1つ又は複数の残基を有する主題となるポリペプチドを表す。誘導体には、20種の標準アミノ酸の1つ又は複数の自然発生的なアミノ酸誘導体を含有するそれらのポリペプチドも含まれる。例えば、プロリンを4-ヒドロキシプロリンに置換することができ、リシンを5-ヒドロキシリシンに置換することができ、ヒスチジンを3-メチルヒスチジンに置換することができ、セリンをホモセリンに置換することができ、リシンをオルニチンに置換することができる。機能的変異体という用語は、自然発生的な配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、又は実質的に同一のヌクレオチド配列でコードされ、自然発生的な配列の1つ又は複数の活性を有することが可能なポリペプチドを指す。配列間の相同性又は配列同一性それらの用語は本明細書では区別なく用いられるの算出は以下のとおりに行われる。2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、それらの配列を最適比較目的でアライメントする例えばギャップを最適アラインメントのために第1のアミノ酸配列又は核酸配列及び第2のアミノ酸配列又は核酸配列の片方又は両方に導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる。典型的な実施形態では、比較目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50若しくは60、又は少なくとも70、80、90、又は100である。それから、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列の位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占有される場合、それらの分子はその位置では同一である本明細書で使用される場合、アミノ酸又は核酸の同一性はアミノ酸又は核酸の相同性と同等である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列が共有する同一の位置の数に応じたものである。配列の比較及び2つの配列間の同一性パーセントの決定を、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態では、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossum62マトリクス又はPAM250マトリクスのいずれかと、16、14、12、10、8、6又は4のギャップウェイトと、1、2、3、4、5又は6のレングスウェイトとを用いて、GCGソフトウェアパッケージwwwgcgcomで入手可能においてGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanandWunschJMolBiol48444453アルゴリズムを使用して決定される。更に別の実施形態では、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリクスと、40、50、60、70又は80のギャップウェイトと、1、2、3、4、5又は6のレングスウェイトとを用いて、GCGソフトウェアパッケージwwwgcgcomで入手可能においてGAPプログラムを使用して決定される。典型的なパラメータ集合の1つ他に特に規定がない場合に使用するものは、12のギャップペナルティと、4のギャップ伸長extendペナルティと、5のフレームシフトギャップペナルティとを用いるBlossum62である。2つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、PAM120weightresiduetableと、12のギャップ長ペナルティと、4のギャップペナルティとを用いてALIGNプログラムバージョン2.0に組み込まれているEMeyersandWMillerCABIOS41117のアルゴリズムを使用して決定することができる。本明細書に記載の核酸配列及びタンパク質配列を、公開データベースの検索を行い、例えば他のファミリー成員又は関連配列を同定するためのクエリ配列として使用することができる。かかる検索を、AltschuletalJMolBiol21540310のNBLASTプログラム及びXBLASTプログラムバージョン2.0を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12で行い、本発明で特徴付けられる核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3で行い、本発明で特徴付けられるタンパク質配列番号1分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップドgappedアラインメントを得るために、ギャップドBLASTを、AltschuletalNucleicAcidsRes2533893402に記載のように利用することができる。BLASTプログラム及びギャップドBLASTプログラムを利用する場合、各プログラム例えば、XBLAST及びNBLASTのデフォルトパラメータを使用することができる。保存的アミノ酸置換はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基へと置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン、酸性側鎖を有するアミノ酸例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、非極性側鎖を有するアミノ酸例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、β分岐側鎖を有するアミノ酸例えばトレオニン、バリン、イソロイシン、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンが含まれる。本発明の様々な態様を以下で更に詳細に記載する。単一ドメイン抗原結合SDAB分子単一ドメイン抗原結合SDAB分子には、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子が含まれる。例としては、重鎖可変ドメイン、自然状態で軽鎖を欠いた結合分子、ナノボディ商標、従来の四鎖抗体から誘導される単一ドメイン、改変ドメイン、及び抗体から誘導されるもの以外の単一ドメインスカフォールドが挙げられるが、それらに限定されない。SDAB分子は当該技術分野のもののいずれであっても、又は任意の将来の単一ドメイン分子であってもよい。SDAB分子は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ及びウシを含むが、それらに限定されない任意の種から誘導することができる。この用語には、ラクダ科動物及びサメ以外の種由来の自然発生的な単一ドメイン抗体分子も含まれる。一態様では、SDAB分子は、例えばサメの血清中で見られる新規抗原受容体NARとして知られる免疫グロブリンアイソタイプから誘導されるように、魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域から誘導することができる。NARの可変領域から誘導される単一ドメイン分子IgNARを作製する方法が、国際公開第03/014161号及びStreltsovProteinSci1429012909に記載されている。別の態様によれば、SDAB分子は、軽鎖を欠いた重鎖として知られる自然発生的な単一ドメイン抗原結合分子である。かかる単一ドメイン分子は、例えば国際公開第9404678号及びHamersCastermanCetalNature363446448に開示されている。明確にするために、軽鎖を自然状態で欠いた、重鎖分子から誘導されるこの可変ドメインは、本明細書ではVHH又はナノボディ商標として知られ、四鎖免疫グロブリンの従来のVHとは区別する。かかるVHH分子は、ラクダ科動物種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルカパ及びグアナコのラクダ科動物種から誘導することができる。ラクダ科動物以外の他の種で、自然状態で軽鎖を欠いた重鎖分子を作製することができ、かかるVHHは本発明の範囲内にある。SDAB分子は、以下でより詳細に記載されるように、組換え型、CDRグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び/又はinvitroで生成した例えばファージディスプレイによって選択されたものであり得る。抗原結合という用語は、標的抗原又はそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含むポリペプチドの一部、例えば本明細書に記載の単一ドメイン分子を含むことが意図される。タンパク質又はタンパク質模倣体に関連して、抗原結合部位は典型的には、標的抗原に結合する界面を形成する1つ又は複数のループ少なくとも4つのアミノ酸又はアミノ酸模倣体の1つ又は複数のループを含む。典型的には、ポリペプチドの抗原結合部位、例えば単一ドメイン抗体分子は、少なくとも1つ若しくは2つのCDR、又はより典型的には少なくとも3つ、4つ、5つ若しくは6つのCDRを含む。免疫グロブリン可変ドメインという用語は、ヒト又は動物起源のVLドメイン又はVHドメインに同一である又は実質的に同一であるとして当該技術分野で理解されることが多い。免疫グロブリン可変ドメインを或る特定の種、例えばサメ及びラマで展開させ、ヒト又は哺乳動物のVL又はVHとはアミノ酸配列が異なるものにすることができることが認識されている。しかしながら、これらのドメインは主に抗原結合にかかわるものである。免疫グロブリン可変ドメインという用語は典型的に、少なくとも1つ若しくは2つのCDR、又はより典型的には少なくとも3つのCDRを含む。定常免疫グロブリンドメイン又は定常領域は、ヒト又は動物起源のドメインであるCL、CH1、CH2、CH3又はCH4と同一の又は実質的に類似の免疫グロブリンドメインを含むことが意図される。例えばCharlesAHasemannandJDonaldCapraImmunoglobulinsStructureandFunctioninWilliamEPauledFundamentalImmunologySecondEdition209210218を参照されたい。Fc領域という用語は、免疫グロブリンドメインCH2及びCH3を含む定常免疫グロブリンドメイン、又はそれらと実質的に類似の免疫グロブリンドメインのFc部分を指す。或る特定の実施形態では、SDAB分子は、一価又は多重特異性分子例えば二価分子、三価分子又は四価分子である。他の実施形態では、SDAB分子は、単一特異性分子、二重特異性分子、三重特異性分子又は四重特異性分子である。分子が単一特異性又は多重特異性、例えば二重特異性であるかどうかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を表す。多重特異性分子は、本明細書に記載の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、又は標的ポリペプチドに加えて、異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体支持体材料にも特異的であり得る。本明細書に使用される場合、価数という用語は、SDAB分子に存在する可能性のある結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインが1つのエピトープと特異的に結合する。SDAB分子が2つ以上の結合ドメインを含み、それぞれの結合ドメインが同じエピトープと特異的に結合する場合、2つの結合ドメインを有する抗体に対しては二価単一特異性と称し、又はそれぞれの結合ドメインが異なるエピトープと特異的に結合する場合、2つの結合ドメインを有するSDAB分子に対しては二価二重特異性と称する。SDAB分子は二重特異性であり、それぞれの特異性に対して二価でもあり得る二重特異性四価分子と称する。二重特異性二価分子及びそれらを作製する方法は、例えば米国特許第5,731,168号、同第5,807,706号、同第5,821,333号、並びに米国特許出願公開第2003/020734号及び同第2002/0155537号それら全ての開示は引用することにより本明細書の一部をなすに記載されている。二重特異性四価分子及びそれらを作製する方法は、例えば国際公開第02/096948号及び国際公開第00/44788号それらの開示は引用することにより本明細書の一部をなすに記載されている。一般的には、PCT国際公開第93/17715号、国際公開第92/08802号、国際公開第91/00360号、国際公開第92/05793号、TuttetalJImmunol1476069、米国特許第4,474,893号、同第4,714,681号、同第4,925,648号、同第5,573,920号、同第5,601,819号、KostelnyetalJImmunol14815471553を参照されたい。或る特定の実施形態では、SDAB分子は、相補性可変ドメイン、又は1つ若しくは複数の標的抗原に結合する免疫グロブリン定常例えばFc領域を欠いた1つ又は複数の単一ドメイン分子を含む一本鎖融合ポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドで認識される標的抗原の例としては腫瘍壊死因子αTNFαが挙げられる。或る特定の実施形態では、抗原結合単一ドメイン分子は、そのドメインをPEG、例えば分岐PEG分子と会合させる、例えば共有結合的に付着させることにより修飾される。TNFα腫瘍壊死因子アルファは、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症等の炎症性障害に関連することが当該技術分野で知られている。TNFα及び受容体CD120a及びCD120bの両方が極めて詳細に研究されている。TNFαはその生物学的活性形態では三量体である。抗TNFα抗体を用いてTNFαの作用に拮抗するという戦略が幾つか開発されており、Remicade商標及びHumira商標等が現在市販されている。TNFαに対する抗体分子が知られている。TNFα結合型の単一ドメイン抗原結合分子の多くの例が、国際公開第2004/041862号、国際公開第2004/041865号、国際公開第2006/122786号その内容の全体が引用することにより本明細書の一部をなすに開示されている。単一ドメイン抗原結合分子の更なる例が、米国特許出願公開第2006/286066号、米国特許出願公開第2008/0260757号、国際公開第06/003388号、米国特許出願公開第05/0271663号、米国特許出願公開第06/0106203号その内容の全体が引用することにより本明細書の一部をなすに開示されている。他の実施形態では、TNFαに対する単一特異性、二重特異性、三重特異性及び他の多重特異性の単一ドメイン抗体及びPEGである。本明細書に使用される場合、TNF、TNFα及びTNF-アルファという用語は区別なく用いられ、同じ意味を有する。特定の実施形態では、TNFα結合型のSDAB分子は、本明細書の表11及び国際公開第2006/122786号に開示されたSDAB分子を1つ又は複数含む。例えば、TNFα結合型のSDAB分子は、国際公開第2006/122786号に開示された一価、二価、又は三価のTNFα結合型のSDAB分子であり得る。TNFα結合型のSDAB分子の例としては、TNF1、TNF2、TNF3、それらのヒト化型例えばTNF29、TNF30、TNF31、TNF32、TNF33が挙げられるが、それらに限定されない。一価のTNFα結合型のSDAB分子の更なる例は国際公開第2006/122786号の表8に開示されている。二価のTNFα結合型のSDAB分子の例としては、ペプチドリンカーを介して連結し、単一の融合ポリペプチドを形成する2つのTNF30SDAB分子を含み、TNF55及びTNF56が挙げられる国際公開第2006/122786号に開示されるが、それらに限定されない。二価のTNFα結合型のSDAB分子の更なる例は、国際公開第2006/122786号の表19に、TNF4、TNF5、TNF6、TNF7、TNF8として開示されている。他の実施形態では、SDAB分子の単一抗原結合ドメインの2つ以上が、連結基を用いて又は連結基を用いずに、遺伝子融合体又はポリペプチド融合体として融合する。連結基は当業者にとって明らかな任意の連結基であり得る。例えば、連結基は1個~100個の原子の長さの生体適合性ポリマーであり得る。一実施形態では、連結基は、ポリグリシン残基、ポリセリン残基、ポリリシン残基、ポリグルタミン酸残基、ポリイソロイシン残基若しくはポリアルギニン残基、又はそれらの組合せを含むか、又はそれらからなる。例えば、ポリグリシンリンカー又はポリセリンリンカーには、少なくとも5個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、20個、30個、35個及び40個のグリシン残基及びセリン残基が含まれ得る。使用することができるリンカーの例としては、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回又はそれ以上の反復を有するGly-Ser反復、例えばGly4-Ser配列番号8反復が挙げられる。幾つかの実施形態では、リンカーは以下の配列を有する:Gly4-Ser-Gly3-Ser配列番号9又はGly4-Sern配列番号10ここでnは4、5又は6である。1つの例示的な実施形態では、標的抗原、例えば腫瘍壊死因子アルファTNFαに結合する2つの単一ドメイン抗体分子例えば2つのラクダ科動物可変領域の一本鎖ポリペプチド融合体、及び分岐PEG分子から構成される抗原結合ポリペプチドは、トランスジェニックマウスモデルにおいて既に罹患したestablished関節炎に対する用量依存的な治療効果を有することが示された。SDAB-01は、ヒト化した二価二重特異性のTNFα阻害性の融合タンパク質である。このタンパク質に対する抗原は腫瘍壊死因子-アルファTNFαである。対応する発現ベクターのDNA配列から予測されるSDAB-01ポリペプチド鎖の完全アミノ酸配列を図1に示す残基は、配列番号1の残基番号1としてNH2末端から数える。DNA配列でコードされた最後のアミノ酸残基はC264であり、タンパク質のCOOH末端を構成する。ジスルフィド結合したSDAB-01翻訳後修飾は伴わない予測分子量は約27000Daである。ナノエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析により主要なアイソフォームで観察される分子量は67000Daに相当し、それにより翻訳後修飾が存在しないことが確認される。特有の生化学特徴は以下のとおりである:264個のアミノ酸、27365Daの分子量、PI=8.67及びUV=Ec=280nmで1.83。図1において、相補性決定領域CDRは太字で示す。これらの結合ドメインを結ぶアミノ酸リンカーは小文字で示す。SDAB分子の調製SDAB分子は、組換え型、CDRグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び/又はinvitroで生成した例えばファージディスプレイによって選択された1つ又は複数の単一ドメイン分子からなり得る。抗体及びSDAB分子を生成し、それらを組換えにより修飾する技法は当該技術分野で既知であり、以下で詳細に記載されている。当業者にとって既知の多くの方法が抗体を得るのに利用可能である。例えば、モノクローナル抗体を、既知の方法に従ってハイブリドーマの生成により作製することができる。それから、このようにして形成されたハイブリドーマを、標準的な方法、例えば酵素免疫測定法ELISA及び表面プラズモン共鳴BIACORE商標分析を用いてスクリーニングし、特定の抗原に特異的に結合するSDAB分子を産生する1つ又は複数のハイブリドーマを同定する。任意の形態の特定の抗原、例えば組換え抗原、その自然発生型、任意の変異体又は断片、及びその抗原ペプチドを免疫原として使用することができる。抗体及びSDAB分子を作製する例示的な1つの方法は、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えばLadneretalの米国特許第5,223,409号、SmithScience22813151317、国際公開第92/18619号、国際公開第91/17271号、国際公開第92/20791号、国際公開第92/15679号、国際公開第93/01288号、国際公開第92/01047号、国際公開第92/09690号及び国際公開第90/02809号に記載されている。ディスプレイライブラリの使用に加えて、特定の抗原を用いて、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスター又はラットに免疫を付与することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトIg遺伝子座の大きい断片を用いて、マウス抗体産生が欠損しているマウス株を遺伝子操作で作り出すengineerことが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子から誘導される抗原特異的なモノクローナル抗体を作製する及び選択することができる。例えば、XENOMOUSE商標、GreenetalNatureGenetics71321、米国特許出願公開第2003-0070185号、1996年10月31日付けで公開された国際公開第96/34096号及び1996年4月29日付けで出願された国際出願PCT/US96/05928号を参照されたい。別の実施形態では、SDAB分子を非ヒト動物から得て、それから当該技術分野で既知の組換えDNA技法を用いて、修飾された、例えばヒト化、脱免疫化、キメラSDAB分子を作製することができる。キメラ抗体及びキメラSDAB分子を作製する多様なアプローチが記載されている。例えば、MorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168511985、TakedaetalNature3144521985、Cabillyetalの米国特許第4,816,567号、Bossetalの米国特許第4,816,397号、Tanaguchietalの欧州特許第171496号、欧州特許第0173494号、英国特許第2177096号を参照されたい。ヒト化抗体及びヒト化SDAB分子は、例えばヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現するが、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを用いても作製することができる。Winterは、本明細書に記載のヒト化抗体及びヒト化SDAB分子を調製するのに使用することができる例示的なCDRグラフト化方法を記載している米国特許第5,225,539号。特定のヒト抗体の全てのCDRを非ヒトCDRの少なくとも一部で置き換えることができ、又はCDRの一部のみを非ヒトCDRで置き換えることができる。ヒト化抗体及びSDAB分子と所定の抗原との結合に要求される数のCDRを置き換えるだけでもよい。ヒト化抗体は、抗原結合に直接はかかわらないFv可変ドメインの配列をヒトFv可変ドメイン由来の同等の配列に置きかえることにより生成することができる。ヒト化抗体又はその断片を生成する方法の例は、MorrisonScience22912021207、OietalBioTechniques4214、並びに米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,859,205号及び米国特許第6,407,213号で与えられる。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも1つに由来する免疫グロブリンFv可変ドメインの全て又は一部をコードする核酸配列を単離する、操作する、及び発現することを含む。かかる核酸を、上記のように所定の標的に対するSDAB分子を産生するハイブリドーマから、及び他の供給源から得ることができる。それから、ヒト化SDAB分子をコードする組換えDNAを適当な発現ベクターにクローニングすることができる。或る特定の実施形態では、ヒト化SDAB分子を、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖系列の置換及び/又は復帰突然変異の導入最適化する。かかる変異した免疫グロブリン分子は、当該技術分野で既知の幾つかの技法のいずれかにより作製することができ例えばTengetalProcNatlAcadSciUSA80730873121983、KozboretalImmunologyToday472791983、OlssonetalMethEnzymol923161982、PCT国際公開第92/06193号又は欧州特許第0239400号の教示に従って作製することができる。SDAB分子のヒト化に関する技法は国際公開第06/122786号に開示されている。SDAB分子を、ヒトT細胞エピトープの特異的欠失、又は国際公開第98/52976号及び国際公開第00/34317号に開示の方法による脱免疫化により修飾することもできる。要するに、SDAB分子の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをMHCクラスIIに結合するペプチドについて分析することができ、これらのペプチドは潜在的なT細胞エピトープを表す国際公開第98/52976号及び国際公開第00/34317号に規定されているとおりである。潜在的なT細胞エピトープの検出のために、ペプチドスレッディングと呼ばれるコンピュータモデリングアプローチを適用することができ、加えて国際公開第98/52976号及び国際公開第00/34317号に記載されるように、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースでVH配列及びVL配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは18種の主なMHCクラスIIDRアロタイプのいずれかに結合し、そのため潜在的なT細胞エピトープを構成する。検出される潜在的なT細胞エピトープを、可変ドメインにおける少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は単一アミノ酸置換により排除することができる。典型的には、保存的置換が行われる。排他的なものではないが多くの場合、ヒト生殖系列の抗体配列の位置に共通するアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖系列の配列は例えば、TomlinsonetalJMolBiol227776798、CookGPetalImmunolTodayVol16237242、ChothiaDetalJMolBiol227799817、及びTomlinsonetalEMBOJ1446284638に開示されている。VBASEディレクトリがヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的ディレクトリを与えるTomlinsonIAetalMRCCentreforProteinEngineeringCambridgeUKによってまとめられている。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びCDRに使用することができる。例えば米国特許第6,300,064号に記載のようにヒトのコンセンサスフレームワーク領域も使用することができる。SDAB分子の作製SDAB分子を、タンパク質を産生するように遺伝子操作した生存宿主細胞によって作製することができる。タンパク質を産生するように細胞を遺伝子操作する方法は当該技術分野で既知である。例えば、AusabeletaledsCurrentProtocolsinMolecularBiologyを参照されたい。かかる方法は、タンパク質をコードし、タンパク質の発現を可能にする核酸を生存宿主細胞に導入することを含む。それらの宿主細胞は培養液中で成長した細菌細胞、真菌細胞又は動物細胞であり得る。細菌宿主細胞としては、大腸菌細胞が挙げられるが、それに限定されない。好適な大腸菌株の例としては、HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539、及び外来DNAを切断しない任意の大腸菌株が挙げられる。使用することができる真菌宿主細胞としては、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、ピチアパストリスPichiapastoris及びアスペルギルス細胞が挙げられるが、それらに限定されない。使用することができる動物細胞株の幾つかの例は、CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3及びWI38である。新たな動物細胞株を、当業者に既知の方法を用いて例えば形質転換、ウイルス感染、及び/又は選抜によって樹立することができる。任意で、宿主細胞によってタンパク質を培地へと分泌させることができる。幾つかの実施形態では、SDAB分子を細菌細胞、例えば大腸菌細胞において作製することができる。例えば、ディスプレイエンティティとバクテリオファージタンパク質又はその断片との間に抑制性終止コドンを含むファージディスプレイベクターにおいてFabが配列によりコードされている場合、ベクターの核酸を、終止コドンを抑制することのできない細菌細胞に導入することができる。この場合、FabはgeneIIIタンパク質に融合せず、ペリプラズム及び/又は培地へと分泌される。SDAB分子は真核細胞でも作製することができる。一実施形態では、抗体例えばscFvをピチア属例えば、PowersetalJImmunolMethods25112335を参照されたい、ハンゼヌラ属正:Hansenula又はサッカロミセス属等の酵母細胞で発現させる。一実施形態では、SDAB分子を哺乳動物細胞において作製する。クローン抗体又はその抗原結合断片を発現するための典型的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞例えばKaufmanandSharpMolBiol159601621に記載のDHFR選択マーカーとともに使用される、UrlaubandChasinProcNatlAcadSciUSA7742164220に記載のdhfr-CHO細胞を含む、リンパ球細胞株、例えばNS0骨髄腫細胞及びSP2細胞、COS細胞、並びにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳房上皮細胞である。SDAB分子をコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、更なる配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列例えば複製起点及び選択マーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする例えば、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号及び同第5,179,017号を参照されたい。例えば典型的に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬剤、例えばG418、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を与える。SDAB分子の組換え発現のための例示的なシステムにおいて、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションによってdhfr-CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子がそれぞれ、エンハンサー/プロモーター調節因子例えばSV40、CMV、アデノウイルス等から誘導されるもの、例えばCMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節因子又はSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター調節因子に操作可能に連結し、遺伝子の高い転写レベルを誘導する。組換え発現ベクターもDHFR遺伝子を保有し、それによりメトトレキサート選択/増幅を用いてベクターがトランスフェクトされたCHO細胞の選択が可能になる。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体の重鎖及び軽鎖を発現させることができ、無傷抗体が培養培地から回収される。標準的な分子生物学的技法を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトして、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養して、抗体分子を培養培地から回収することができる。例えば、一部のSDAB分子をアフィニティクロマトグラフィによって単離することができる。SDAB分子はトランスジェニック動物によっても作製することができる。例えば、米国特許第5,849,992号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法を記載している。乳汁特異的なプロモーターと、抗体分子をコードする核酸と、分泌のためのシグナル配列とを含む導入遺伝子が構築される。かかるトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳汁は、その中に対象の抗体が分泌されている。抗体分子を乳汁から精製するか、又は用途によっては直接使用することができる。SDAB分子の結合特性を、任意の方法、例えば以下の方法:BIACORE商標分析、酵素免疫測定法ELISA、x線結晶構造解析、配列分析及びスキャニング突然変異誘発の1つによって測定することができる。SDAB分子と標的例えばTNFαとの結合相互作用を、表面プラズモン共鳴SPRを用いて分析することができる。SPR又は生体分子相互作用分析BIAは、いかなる相互作用体も標識することなく、リアルタイムで生体特異的な相互作用を検出する。BIAチップの結合表面での質量の変化結合事象の指標となるにより、表面付近の光の屈折率の変化が起こる。生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定される屈折率の変化によって検出可能なシグナルが発生する。SPRを使用する方法は、例えば米国特許第5,641,640号、RaetherSurfacePlasmonsSpringerVerlag、SjolanderandUrbaniczkyAnalChem6323382345、SzaboetalCurrOpinStructBiol5699705、及びBIAcoreInternationalABによって与えられるオンラインリソースに記載されている。SPRからの情報を用いて、平衡解離定数Kd、及び分子と標的との結合に関する反応速度パラメータKon及びKoffを含むの正確かつ定量的な評価基準を与えることができる。かかるデータを用いて、異なる分子を比較することができる。SPRからの情報を用いて、構造と活性との関係性SARを展開することもできる。例えば、異なる抗体分子の反応速度パラメータ及び平衡結合パラメータを評価することができる。特定の結合パラメータ、例えば高い親和性及び小さいslowKoffと相関する、所定の位置での変異体アミノ酸を同定することができる。この情報を構造モデリングと例えば相同性モデリング、エネルギー最小化、又はx線結晶構造解析若しくはNMRによる構造決定を用いて組み合わせることができる。結果として、タンパク質とその標的との間の物理的相互作用の理解を系統立てて説明し、他の設計プロセスを導くのに使用することができる。修飾されたSDAB分子SDAB分子は、フレームワーク領域の1つにおいて少なくとも1つのアミノ酸位置が、自然発生的なドメイン、例えばVHドメインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し得る。一部のSDAB分子、例えばヒト化SDAB分子のアミノ酸配列は、フレームワーク領域の少なくとも1つにおいて少なくとも1つのアミノ酸位置が、自然発生的なドメイン、例えば自然発生的なVHI-Iドメインのアミノ酸配列とは異なり得ることを理解されたい。本発明はSDAB分子の誘導体の配合物も含む。かかる誘導体は一般的に、修飾によって、特にSDAB分子及び/又は本発明で開示されるSDAB分子を形成するアミノ酸残基の1つ若しくは複数の化学的及び/又は生物学的例えば酵素修飾によって得ることができる。かかる修飾の例、並びにこのようにして修飾することができるSDAB分子配列内のアミノ酸残基すなわちタンパク質骨格又は側鎖上のアミノ酸残基、かかる修飾を導入するのに使用することができる方法及び技法、並びにかかる修飾の潜在的用途及び利点の例が当業者にとって明らかであろう。例えば、かかる修飾は、1つ又は複数の官能基、残基又は部分のSDAB分子への又はSDAB分子上への例えば共有結合的な連結による又は任意の他の好適な方法での導入、特に1つ又は複数の所望の特性又は官能基を与える1つ又は複数の官能基、残基又は部分のSDAB分子への導入を含み得る。かかる官能基の例は当業者にとって明らかであろう。例えばかかる修飾は、SDAB分子の半減期、溶解性及び/又は吸収を増大する、SDAB分子の免疫原性及び/又は毒性を低減する、SDAB分子の任意の望ましくない副作用を排除する若しくは軽減する、及び/又はSDAB分子に他の有益な特性を与える、及び/又はSDAB分子の望ましくない特性を低減する、又は上述の2つ以上の任意の組合せを与える、1つ又は複数の官能基の例えば共有結合による又は任意の他の好適な方法での導入を含み得る。かかる官能基及びそれらを導入する技法の例は当業者にとって明らかであり、概して上記で引用される一般的な背景技術において言及されるあらゆる官能基及び技法と、それ自体が医薬タンパク質の修飾で、特に抗体又は抗体断片ScFv抗体及び148単一ドメイン抗体を含むの修飾で知られている官能基及び技法とを含み得る。それらに関しては、例えばRemingtonsPharmaceuticalSciences16thedMackPublishingCoEastonPAを参照する。かかる官能基は例えば、同様に当業者にとって明らかであるように、本発明で特徴付けられるSDAB分子に直接例えば共有結合的に、又は任意で好適なリンカー若しくはスペーサーを介して連結することができる。非ペプチドリンカー本明細書に記載のSDAB分子において、1つ又は複数のSDAB分子及び/又はタンパク質と、1つ又は複数の許容可能なポリマーとが、互いに直接連結することができ、及び/又は1つ若しくは複数の好適なリンカーを介して互いに連結することができる。或る特定の用語が本明細書で規定される。アルコキシル又はアルコキシという用語は、本明細書で使用される場合、酸素ラジカルが付着した以下に規定のアルキル基を指す。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、tert-ブトキシ等が挙げられる。アルキルという用語は、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基を含む飽和脂肪族基のラジカルを指す。好ましい実施形態では、直鎖アルキル又は分岐鎖アルキルは、12個以下、他に特に述べられていなければ例えば1個~12個、1個~8個、1個~6個、又は1個~4個の炭素原子をその骨格に有する。アルキル部分の例としては、メチル、エチル、プロピル例えばイソプロピル、ブチル例えばイソブチル又はt-ブチルが挙げられる。アルキレンという用語は、二価アルキル、例えば-CH2-、-CH2CH2-及び-CH2CH2CH2-を指す。ハロ又はハロゲンという用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のいずれかのラジカルを指す。一実施形態では、好適な許容可能なポリマーを本明細書に記載のSDAB分子に連結させるのに用いられるリンカー部分は式Iの部分で表される:幾つかの実施形態では、リンカーは以下の式で表される:2つ以上のリンカーを本明細書に記載のSDAB分子に使用する場合、これらのリンカーは同じであっても、又は異なっていてもよい。当業者であれば、本発明のSDAB分子での使用に最適なリンカーを認識するとともに理解するであろう。PEG化医薬タンパク質の半減期を増大するのに及び/又は免疫原性を低減するのに広く用いられる技法の1つは、好適な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリエチレングリコールPEG又はその誘導体例えばメトキシポリエチレングリコールすなわちmPEGの付着を含む。一般的に、任意の好適な形態のPEG化、例えば当該技術分野において抗体及び抗体断片単一ドメイン抗体及びScFvを含むが、それらに限定されないに使用されるPEG化を使用することができる。例えば、ChapmanNatBiotechnol54531545、VeroneseandHarrisAdvDrugDelivRev54453456、HarrisandChessNatRevDrugDiscov2、及び国際公開第04/060965号を参照する。タンパク質のPEG化のための様々な試薬が、例えばNOFAmericaCorporationから市販されてもいる例えばPEGの式Bに関するもの。典型的には、部位特異的なPEG化が特にシステイン残基を介して用いられる例えば、YangetalProteinEngineering1610761770を参照されたい。例えばこのために、PEGをSDAB分子において自然発生するシステイン残基に付着することができ、PEGの付着のために1つ又は複数のシステイン残基が好適に導入されるように、SDAB分子を修飾することができる。さらに、いずれもタンパク質工学の技法を用いて、PEG化のために1つ若しくは複数のシステイン残基が好適に導入されるように、本明細書に記載のSDAB分子を修飾することができるか、又はPEG化のために1つ若しくは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を本発明のSDAB分子のN末端及び/又はC末端に融合することができる。PEG化に関連して、本発明は概して、上記PEG化が、1invivoでの半減期を増大し、2免疫原性を低減し、3PEG化に関してそれ自体が既知の1つ又は複数の更なる有益な特性を与え、4SDAB分子の親和性には本質的に影響を与えず例えば以下の実施例に記載されるような好適なアッセイにより決定されるように、90を超えて、50を超えて、又は10を超えて、上記親和性を低減しない、及び/又は4SDAB分子の他の所望の特性のいずれにも影響を与えないように、1つ又は複数のアミノ酸位置でPEG化している任意のSDAB分子も包含することに留意されたい。好適なPEG基及び好適なPEG基を特異的に又は非特異的に付着させる方法は当業者にとって明らかであろう。SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは、1KDa以上、例えば10KDa以上及び200KDa未満、例えば90KDa未満の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは、1KDa~100KDaの範囲の分子量を有し得る。典型的には、SDAB分子には、5000を超える、例えば10000を超える、及び200000未満、例えば100000未満の、例えば20000~80000の範囲の分子量を有するPEGを使用する。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは10KDa~50KDaの範囲の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは15KDa~45KDaの範囲の分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは20KDaの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは40KDaの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、SDAB分子及び本明細書に記載のタンパク質に使用されるPEGは10KDaの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、PEGモノマー、ポリマー又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各PEGはメトキシPEG誘導体mPEGモノマー、ポリマー又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、1KDa~100KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、10KDa~50KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、40KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、15KDa~35KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、30KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、20KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、17.5KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、12.5KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、10KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は7.5KDaの分子量を有する。幾つかの実施形態では、各PEG分子は独立して、5KDaの分子量を有する。別の通常あまり典型的ではない修飾は、SDAB分子を発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、通常翻訳時修飾及び/又は翻訳後修飾の一部としてN連結型グリコシル化又はO連結型グリコシル化を含む。幾つかの実施形態では、PEG分子は分岐している。幾つかの実施形態では、PEG分子は式a~式hの部分から選択される:ここで各PEG分子は独立して、PEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各PEG分子はmPEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、修飾されたSDAB分子は、PEG分子に連結した式Iのリンカーを含み、以下から選択される構造を有する:ここで、各PEG分子は独立して、PEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各PEG分子はmPEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、修飾されたSDAB分子は、PEG分子に連結した式Iのリンカーを含み、以下から選択される構造を有する:ここで、各PEG分子は独立して、PEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、各PEG分子はmPEGモノマー、ポリマー、又はその誘導体である。幾つかの実施形態では、式Iのリンカーは以下の式で表されるPEG分子に連結する:幾つかの実施形態では、式Iのリンカーは以下の式で表されるPEG分子に連結する:幾つかの実施形態では、式Iのリンカーは以下の式で表されるPEG分子に連結する:リンカー-PEG分子はSDAB分子と会合する例えば結び付くことができ、それにより修飾されたSDAB分子が形成する。SDAB分子の単一ドメイン分子は、N末端からC末端へと以下の順序で配置され得る:TNFα結合型の単一ドメイン分子-TNFα結合型の単一ドメイン分子-PEG分子例えば分岐したPEG分子。一実施形態では、修飾されたSDAB分子は以下の式で表される:一実施形態では、修飾されたSDAB分子は以下の式で表される:一実施形態では、修飾されたSDAB分子は以下の式で表される:修飾されたSDAB分子の1つの例示的な実施形態は以下の式で表される:SDAB分子の反応基は一般的に、SDAB分子に付着した求核部分を介して付着する。幾つかの実施形態では、求核部分は硫黄例えばシステイン残基の硫黄である。他の実施形態では、求核部分は窒素例えば末端のα-アミノ基又は窒素含有アミノ酸側鎖例えばリシン鎖のε-アミノ基の窒素である。他の実施形態では、求核部分はC末端基である。SDAB分子の反応基は一般的に、リンカーに付着した求電子部分を介して付着する。幾つかの実施形態では、求電子部分はカルボニル基例えば活性化エステル又はアルデヒドである。幾つかの実施形態では、求電子部分はマレイミド基である。投与及び治療方法SDAB分子を被験体例えばヒト被験体に単独で、又は第2の作用物質、例えば治療的に若しくは薬理学的に活性のある第2の作用物質に併せて投与し、TNFα関連障害、例えば炎症性障害又は自己免疫障害を治療する又は予防する例えばTNFα関連障害に関連する1つ又は複数の症状を低減する又は改善することができる。治療するという用語は、障害に関連する状態、症状若しくはパラメータを改善するのに、又は障害の進行を統計学的に有意な程度まで若しくは当業者に検出可能な程度まで抑えるのに効果的な量、方法及び/又は様式で療法剤therapyを投与することを指す。治療に使用する場合、治療は被験体の障害若しくは状態を改善する、治癒する、維持する、又は障害若しくは状態の期間を低減することができる。治療上の使用では、被験体には症状の部分的な又は全体的な兆候があり得る。典型的な場合、治療は被験体の障害若しくは状態を医師が検出可能な程度まで改善するか、又は障害若しくは状態の悪化を防ぐ。効果的な量、方法又は様式は被験体に強く依存して変化し得るとともに被験体に合わせられ得る。本明細書に使用される場合、被験体及び患者という用語は区別なく用いられる。本明細書に使用される場合、被験体subjectandsubjectsという用語は、動物、例えば非霊長類例えばウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ及び霊長類例えばサル、例えばカニクイザル、ゴリラ、チンパンジー及びヒトを含む哺乳動物を指す。治療することができる免疫障害の非限定的な例としては、自己免疫障害、例えば関節炎関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、ループス関連関節炎又は強直性脊椎炎を含む、強皮症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎アトピー性皮膚炎及び湿疹様皮膚炎を含む、重症筋無力症、炎症性腸疾患IBD、クローン病、大腸炎、糖尿病I型;炎症状態、例えば皮膚の炎症状態例えば乾癬;急性炎症状態例えば内毒素血症、敗血症sepsisandsepticemia、毒素性ショック症候群及び感染性疾患;移植片拒絶反応及びアレルギーが挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、TNFα関連障害は、関節障害、例えば関節リウマチ、若年性関節リウマチRA例えば中度から重度の関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多関節型若年性特発性関節炎JIA;若しくは乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、及び/又は多発性硬化症の1つ又は複数から選ばれる障害である。或る特定の実施形態では、SDAB分子又は配合物を第2の治療薬と併せて投与する。例えば、TNFαSDAB分子では、第2の作用物質は抗TNFα抗体又はそのTNFα結合断片であり得る。ここで第2のTNFα抗体は配合物のTNFα結合SDAB分子とは異なるエピトープ特異性を有する。TNFα結合型のSDABと同時に配合することができる作用物質の他の非限定的な例としては、例えばサイトカイン阻害剤、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性薬、及び細胞増殖抑制薬が挙げられる。一実施形態では、更なる作用物質は関節炎に標準的な治療薬であり、これには非ステロイド系抗炎症剤NSAID;コルチコステロイドプレドニゾロン、プレドニゾン、コルチゾン及びトリアムシノロンを含む;及び疾患修飾性抗リウマチ剤DMARD、例えばメトトレキサート、ヒドロキシクロロキンPlaquenil及びスルファサラジン、レフルノミドArava商標、腫瘍壊死因子阻害剤エタネルセプトEnbrel商標、インフリキシマブRemicade商標メトトレキサートを伴う又は伴わない及びアダリムマブHumira商標を含む、抗CD20抗体例えばRituxan商標、可溶性インターロイキン-1受容体、例えばアナキンラKineret、金、ミノサイクリンMinocin商標、ペニシラミン、並びに細胞毒性薬アザチオプリン、シクロホスファミド及びシクロスポリンを含むが含まれるが、それらに限定されない。かかる併用療法はより低い投与量の投与治療薬を有益に利用することができ、それにより様々な単剤療法に関連する可能性のある毒性又は合併症が回避される。SDAB分子を液体溶液例えば注射溶液及び注入溶液の形態で投与することができる。かかる組成物を非経口形式例えば皮下注射、腹腔内注射又は筋肉注射によって、又は吸入によって投与することができる。非経口投与及び非経口投与するという語句は、本明細書で使用される場合、通常注射による腸内投与及び局所投与以外の投与形式を意味し、皮下投与又は筋肉投与、並びに静脈内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、表皮下、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨下での注射及び注入を含む。一実施形態では、本明細書に記載の配合物を皮下投与する。医薬組成物又は医薬配合物は滅菌されており、製造及び保存の条件下で安定である。医薬組成物は投与に関する規制基準及び産業基準を満たすように試験することもできる。医薬組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高いタンパク質濃度に好適な他の規則構造として配合することができる。滅菌済みの注射溶液は、要求に応じて、適切な溶媒中で要求される量の本明細書に記載の作用物質を上で挙げられた成分の1つ又は組合せと組み合わせて、その後滅菌ろ過することにより調製することができる。概して、分散液は基本となる分散媒と上で列挙されたものの中の要求される他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに本明細書に記載の作用物質を組み込むことによって調製する。溶液の適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合、要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に包含させることにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。組成物/配合物SDAB分子の配合物には、SDAB分子と、抗凍結剤として働くことができる化合物と、バッファーとが含まれる。配合物のpHは概して、pH5.5~7.0である。幾つかの実施形態では、配合物を液体として保存する。他の実施形態では、配合物を液体として調製し、それから例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥により乾燥させた後、保存する。乾燥した配合物を乾燥化合物として、例えばエアロゾル若しくは粉末として使用するか、又は例えば水、バッファー若しくは他の適切な液体を用いてその元の濃度若しくは別の濃度へと再構成することができる。SDAB分子精製プロセスは、SDAB分子が凍結液体としての長期保存に、及び続くフリーズドライ例えばヒスチジン/スクロース配合物を用いたフリーズドライに好適な配合物に導入されるように設計する。配合物は特定濃度のタンパク質を用いて凍結乾燥する。それから凍結乾燥した配合物を必要に応じて好適な希釈剤例えば水で再構成し、元の配合成分を所望の濃度、概して凍結乾燥前の濃度と比較して同じ又は高い濃度まで再溶解させることができる。凍結乾燥した配合物を再構成し、初めにフリーズドライした液体の体積と比べての凍結乾燥物に添加される水又は希釈剤の量に応じて、元のすなわち凍結乾燥前の濃度とは異なる濃度を有する配合物を作製することができる。好適な配合物は抗体の完全性の1つ又は複数のパラメータをアッセイすることにより同定することができる。製造品本願は本明細書に記載の配合物を含み、配合物の使用説明書を備える製造品も提供する。被験体への投与に、例えば医薬品として用いられる配合物は滅菌されていなければならない。これは当該技術分野で既知の方法を用いて、例えば液体の配合、又は凍結乾燥及び再構成の前又は後の滅菌ろ過膜によるろ過によって達成される。代替的には、構造が損傷を受けない場合、配合物の成分をオートクレーブにより滅菌し、それからろ過滅菌した又は放射線滅菌した成分と組み合わせて、配合物を作製することができる。医薬品配合物を、例えば皮下注射用シリンジ又はマルチチャンバシリンジを含むシリンジ等の経皮送達デバイスを用いて投与することができる。一実施形態では、デバイスは針付きの又は針が内蔵された充填済みシリンジである。他の実施形態では、デバイスは針の付いていない充填済みシリンジである。針は充填済みシリンジとともにパッケージングされていてもよい。一実施形態では、デバイスは自己注射デバイス、例えば自己注射器シリンジである。別の実施形態では、注射デバイスはペン型注射器である。更に別の実施形態では、シリンジは固定staked針シリンジ、ルアーロックシリンジ、又はルアースリップシリンジである。他の好適な送達デバイスは、ステント、カテーテル、顕微針及び埋込み型制御放出デバイスを含む。組成物は例えばインラインフィルターを備える又は備えていない、IVチューブtubingsを含む標準的なIV機器を用いて静脈投与することができる。或る特定の実施形態では、シリンジは自己注射器デバイスとの使用に好適である。例えば、自己注射器デバイスは、単回バイアルシステム、例えば溶液送達用のペン型注射器デバイスを含み得る。かかるデバイスは、例えばBectonDickensenFranklinLakesNJ、YpsomedBurgdorfSwitzerlandwwwypsomedcom、BiojectPortlandOreg、NationalMedicalProducts、WestonMedicalPeterboroughUK、MediJectCorpMinneapolisMinn、及びZogenixIncEmeryvilleCAにより作製又は開発された、BDPens、BDAutojector商標、Humaject商標、NovoPen商標、B-D商標Pen、AutoPen商標、及びOptiPen商標、GenotropinPen商標、GenotronormPen商標、HumatroPen商標、Reco-Pen商標、RoferonPen商標、Biojector商標,Iject商標、J-tipNeedle-FreeInjector商標、DosePro商標、Medi-Ject商標のように、製造業者から市販されている。広く認められている二重バイアルシステムを含むデバイスは、再構成溶液の送達のためにカートリッジ中で凍結乾燥した薬剤を再構成するペン型注射器システム、例えばHumatroPen商標を含む。製造品は配合物を含有するのに好適な容器を含み得る。好適な容器としては、デバイス、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、ネブライザー例えば超音波ネブライザー又は振動メッシュネブライザー、静脈注射溶液バッグ、又は吸入具例えば定量吸入具MDI又は乾燥粉末吸入具DPIが挙げられるが、それらに限定されない。容器は、ガラス、金属、又はポリカーボネート、ポリスチレン若しくはポリプロピレン等のプラスチックのような任意の好適な材料からなり得る。概して容器は、配合物から相当量のタンパク質を吸収せず、配合物の成分との反応性がない材料の容器である。本明細書に記載の製造品はパッケージング材料を更に含み得る。パッケージング材料は、使用又は投与に関する情報に加えて、例えば規制当局が要求している、製品を使用することができる条件に関する情報を備える。例えばパッケージング材料は、本明細書に記載の配合物を含有する充填済みシリンジを注射する方法、又は特定の期間内で、例えば2時間~24時間又はそれ以上の期間で、凍結乾燥した配合物を水性希釈剤で再構成し、溶液を形成する方法について、患者に指示を与えることができる。本発明で請求される配合物はヒト医薬製品用途に有用である。或る特定の実施形態では、配合物をネブライザーとして投与することができる。ネブライザーの例としては、非限定的な例であるが、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー及び振動メッシュネブライザーが挙げられる。これらの類は液体からエアロゾルを作製するのに異なる方法を用いる。概して、これらの配合物中でタンパク質の完全性を維持することができる任意のエアロゾル発生デバイスは、本明細書に記載の配合物の送達に好適である。他の実施形態では、医薬組成物は医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、医薬組成物は無針の皮下注射デバイス、例えば米国特許第5,399,163号、同第5,383,851号、同第5,312,335号、同第5,064,413号、同第4,941,880号、同第4,790,824号、又は同第4,596,556号で開示されたデバイスを用いて投与することができる。既知のインプラント及びモジュールの例としては、米国特許第4,487,603号制御速度で医薬を分配する埋込み型マイクロ注入ポンプを開示している、米国特許第4,486,194号皮膚を通して医薬medicantsを投与する治療用デバイスを開示している、米国特許第4,447,233号医薬を正確な注入速度で送達する医薬注入ポンプを開示している、米国特許第4,447,224号連続薬剤送達のための可変流量の埋込み型注入装置を開示している、米国特許第4,439,196号多重チャンバコンパートメントを備える浸透圧薬剤送達システムを開示している、及び米国特許第4,475,196号浸透圧薬剤送達システムを開示しているが挙げられる。治療用組成物は皮下投与又は筋肉投与のための生分解性又は非生分解性の持続放出配合物の形態であってもよい。例えば、米国特許第3,773,919号及び同第4,767,628号、並びにPCT国際公開第94/15587号を参照されたい。連続投与は、埋込み型ポンプ又は外付けポンプを用いても達成することができる。投与は断続的に、例えば1日1回の注射で、又は低用量で連続して、例えば持続放出配合物で実施することもできる。SDAB分子の投与に最適合化するように、送達デバイスに改良を加えることができる。例えばシリンジをSDAB分子の保存及び送達に最適な程度までシリコン処理することができる。当然ながら、多くの他のかかるインプラント、送達システム及びモジュールも既知である。本発明は第1の作用物質及び第2の作用物質を投与するデバイスも特徴とする。デバイスは、例えば医薬調製物を保存するための1つ又は複数のハウジングが含むことができ、単位用量の第1の作用物質及び第2の作用物質を送達するように構築することができる。第1の作用物質及び第2の作用物質を同じコンパートメント又は別々のコンパートメントに保存することができる。例えば、本デバイスでは作用物質を組み合わせた後、投与を行うことができる。第1の作用物質及び第2の作用物質を投与するのに異なるデバイスを使用することも可能である。以下の実施例は本発明の理解を助けるために記載されているが、決してその範囲を限定する意図はなく、またそのように解釈されるものではない。実施例1.抗TNFα構成要素の生成及びSDAB-01の遺伝子操作SDAB-01二価ヒト化SDABポリペプチドを、4つのグリシン及び1つのセリンの6つの反復からなる30個のアミノ酸のフレキシブルリンカーを介した2つの同一のTNFα抗原結合ドメイン配列番号1のアミノ酸1~115の遺伝子融合によって構築した。部位特異的なPEG化の準備をするために、遊離システインを3つのグリシンアミノ酸リンカーに続くC末端で遺伝子操作した図1。タンパク質をCHO哺乳動物発現系で産生し、プロテインA親和性捕捉により精製した。それからC末端システインをジチオスレイトール処理により還元し、活性化2×20kDa分岐PEG図2のマレイミド官能基と反応させた。最終生成物を遊離PEG及びごく一部の非PEG化タンパク質から更に精製するとともに、特性化した。それによりSDAB-01は、30個のアミノ酸のフレキシブルリンカーで隔てられた配列番号1のアミノ酸1~115のアミノ酸配列を有する2つの同一のヒト化抗TNFα特異的なSDAB分子と、マレイミドで誘導体化した40kDa2×20kDaの分岐ポリエチレングリコールを有する特異的にPEG化したC末端システイン部位2×20PEGとの遺伝子融合体を含む図3。図4Aは直鎖mPEG-マレイミドと、SDAB-01を含む2つの分岐mPEG-マレイミドとを示す。図4BはSDAB-01と[配列番号1]-PEG40とのサイズを比較するスキャン図である。解析的な分析によって、直鎖40KmPEG-マレイミドSDABと分岐40KmPEG-マレイミドSDABとの間のPEG化効率が同程度であることが示された。直鎖40KmPEG-マレイミド又は分岐40KmPEG-マレイミドのいずれかでPEG化した抗TNFαSDAB分子は同程度の生体活性を示した。見掛けの電荷及び形状は、2つの分岐40KmPEG-マレイミド材料分岐PEGの式A及び分岐PEGの式Bの間でほぼ同程度であるように見える。長さを最適化したフレキシブルリンカーを介した2つの同一のTNFα抗原結合ドメイン配列番号1のアミノ酸1~115の二価フォーマットとしてのSDAB-01の構築は、細胞ベースのTNFα中和アッセイにおいてその一価フォーマットと比較してその効力を約50倍改善させた。遺伝子操作したC末端システインの部位特異的なPEG化は、薬剤候補に、その効力に影響を与えることなくinvivo半減期が延長した所望の薬物動態プロファイルを与えた。実施例2.フローサイトメトリーによるSDAB-01と膜結合型のTNFαとの結合特性化SDAB-01は、ヒトTNFαを発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞株にその細胞表面上で結合することがフローサイトメトリーによって実証されている。13アミノ酸の欠失が部位特異的な突然変異誘発によりヒトTNFαコード領域に導入され、タンパク質切断が低減し、TNFαの培地への放出が起こった。安定したCHO株をこの構築物を用いて生成した。細胞表面上のTNFαの発現は、特異的な抗ヒトTNFα抗体を用いるフローサイトメトリーにより実証された。SDAB-01を用いて、細胞株pW2128CHO-TNF-D13を染色し、その後ビオチン化抗PEG抗体を用いて二次染色を行い、それからストレプトアビジン-PEを用いる三次染色によって検出し、細胞表面結合がもたらされることを実証した図5。実施例3:ヒトTNF又はアカゲザルTNFに対するSDAB-01の親和性ヒトTNFα及びアカゲザルTNFαとの抗TNFαSDAB-01結合の詳細な特性化を、Biacore機器で表面プラズモン共鳴を用いて実施した。ビオチン化SDAB-01をストレプトアビジンセンサーチップ表面上に捕捉し、様々な濃度のヒトTNFα又はアカゲザルTNFαをこの実験で試験した。TNFαタンパク質を注入し、100μL/分で1.5分、会合させ、20分解離させた。速度定数及びKdを、Biaevaluationソフトウェアv4.1の1:1結合モデルを用いて全体的適合により決定した。速度定数で示されるデータは少なくとも2つの独立した実験による平均及び標準偏差である。Kdは会合速度及び解離速度onandoffratesの平均から算出した。ヒトTNFα又はアカゲザルTNFαに対するSDAB-01の親和性を表1に示す。表1.Biacoreにより決定されるヒトTNFα又はアカゲザルTNFαに対するSDAB-01の親和性実施例4:細胞ベースの細胞毒性アッセイにおけるSDAB-01の特性化ヒトTNFα又はアカゲザルTNFαを用いたL929細胞ベースの細胞毒性アッセイにおける、SDAB分子対照4及び非PEG化SDAB分子対照3と比較したSDAB-01の生体活性の評価。SDAB-01のTNFα0.5ng/mlの細胞毒性を中和する能力を細胞ベースの用量応答アッセイで評価した。SDAB-01及び非PEG化TNFαSDAB分子である対照3を同じ実験でアッセイした。用量応答曲線を図6に示し、EC50の結果を表2にまとめる。表2.SDAB対照4、SDAB-01及び非PEG化SDAB対照3の生体活性これらの結果は、SDAB-01がL929細胞ベースのアッセイにおいてヒトTNFα及びアカゲザルTNFαの両方を中和することが可能であることを示している。それらの結果は、PEG化がSDAB-01の中和活性に関して顕著な効果を有しないことも示している。実施例5.様々な種のTNFαとのTNFαSDAB-01結合反応速度の比較本研究の目的は、SDAB-01と、ヒト、アカゲザル、ラット、マウス及びウサギを含む様々な種のTNFαとの間の結合速度及び平衡解離定数を研究して、有効性モデル、薬物動態モデル及び毒物学モデルに使用することができる、これらの異なる種間で結合親和性を比較する方法を理解することであった。Biacore機器を用いて、表面プラズモン共鳴によりリアルタイムで結合する反応速度を測定した。速度定数は直接測定し、平衡解離定数はBiacore評価ソフトウェアv4.1を用いて結合速度から誘導した。TNFα結合の評価のために、SDAB-01を60RU~75RUの密度でセンサーチップ表面上に固定化した。ヒトTNFα及びアカゲザルTNFαが速い会合速度及び非常に遅い解離速度でSDAB-01に同じように結合した図7a、図7b。SDAB-01との結合がヒトTNFα及びアカゲザルTNFαの濃度に依存し、飽和に達した。最高濃度では、結合が平衡に達した。SDAB-01とヒトTNFα及びアカゲザルTNFαとの高親和性の結合に対して、ラットTNFα及びマウスTNFαとSDAB-01との結合はごく僅かなものであった図7c、図7d。試験した最高濃度、100nMでラットTNFα結合及びマウスTNFα結合では、結合に関して非常に低いシグナルが観察され、5RU未満の結合応答にしか達しなかった図7。試験した最高濃度、最大100nMでの見掛けの速い解離速度及び飽和の欠如が弱い結合の指標である。ラットTNFα又はマウスTNFαでは、飽和がなく、結合速度が測定するには速すぎたため、平衡解離定数を算出することが不可能であった。このことは、幾らかのごく僅かな結合が存在するが、ラットTNFα及びマウスTNFαはSDAB-01と極めて弱く結合することを示唆している。ウサギTNFαとSDAB-01との結合は、試験した最高濃度の400nMのウサギTNFαであっても観察されなかった図7。これらのデータは、SDAB-01は、ヒトTNFαと同程度にアカゲザルTNFαと結合するが、マウス、ラット又はウサギではTNFαリガンドと係合しないことを示している。SDAB-01とのヒトTNFα及びアカゲザルTNFαの結合の間の会合速度定数及び解離速度定数を1:1の結合モデルを用いて図7に示される結合から算出した表3。ヒトTNFα及びアカゲザルTNFαは非常に類似した会合速度及び解離速度を有し、それぞれ19.54.17pM及び34.17.23pMというほぼ同一のKd値が得られた。表3.SDAB-01とヒトTNFα及びアカゲザルTNFαとの結合親和性実施例6.SDAB-01に対する補体依存性の細胞毒性及び抗体依存性の細胞毒性の欠如SDAB-01はヒトTNFα及びサルTNFαに対する高い中和効力を示す。CDC及びADCCの両方が、Fc媒介性のエフェクター機能である。代替的な補体カスケードにおいて第1のタンパク質であるC1qが2つ以上のIgG分子上でFc領域のCH2ドメインと結合する場合、CDCが生じ得る。このことが下流の補体経路成分を誘発し、最終的に細胞の表面上に膜傷害複合体の形成をもたらし、細胞が溶解する。ADCCは、細胞表面上でTNFαに結合した抗TNFα抗体のFc領域と、NK細胞、単球、マクロファージ及び好中球等の免疫エフェクター細胞上で発現したFcγRとの間の相互作用によって標的細胞の死滅を誘発し得る。本研究の目的は、SDAB-01によるCDC活性及びADCC活性に関して試験し、それを抗TNFα抗体対照1及び抗TNFα抗体対照2、抗TNFα抗体対照3と比較することであった。抗体対照1及び抗体対照2はヒトIgG1Fcを有し、そのためエフェクター機能を有し得る。抗体対照3及びSDAB-01はFc領域を欠いている。本分析によって、SDAB-01及び抗体対照3は、抗体対照1及び抗体対照2と比較してCDC活性及びADCC活性を全く有していないことが実証された図30及び図31。抗体のFc領域は、分子がCDC活性及びADCC活性を媒介するのに必要とされ、抗体対照3及びSDAB-01はFc領域を欠いている。そのためSDAB-01は、細胞毒性となり得るエフェクター機能活性を引き起こすことなく、細胞表面上でTNFαと結合するとともに中和する可能性がある。実施例7:好中球浸潤に対するSDAB-01の効果これらのinvivo研究の目的は、ネズミ気嚢モデルにおいて様々な用量のSDAB-01の組換えヒトTNFαにより誘導される細胞浸潤を低減する能力を評価することであった。TessieretalJourofImmunol159359536021997によって、TNFαのマウス気嚢への注入が気嚢への白血球の集積を誘導することがこれまでに示されている。SDAB-01は、TNFαと結合し、TNFαの効果を中和するように設計された。SDAB-01がinvivoモデルでの細胞集積に対する効果を有するか否かを試験するために、SDAB-01をマウスに投与した後、TNFαを気嚢に注入した。細胞を気嚢から回収し、TNFα投与後6時間で差次的にカウントした。嚢液を各実験の終了時にTNFαの投与後6時間で回収し、細胞数をCellDyneで決定した。実験1の結果を図8及び図9に示す。0.18mg/kgで投与したSDAB-01は、10ngの組換えヒトTNFαにより誘導される気嚢への細胞浸潤を有意に低減した。0.18mg/kgのSDAB-01によって好中球の集積も有意に阻害された。リンパ球及び単球の浸潤は6時間の時点では微量成分の細胞浸潤であり、この細胞浸潤は本研究ではSDAB-01による影響を受けなかった。実験2は実験1と同じプロトコルを用いて行った。その結果を図10及び図11に示す。その結果は実験1で観察されたものと一致していたが、本実験では好中球の浸潤が0.18mg/kg及び0.09mg/kgの用量のSDAB-01の両方で有意に阻害された。総細胞浸潤は0.09mg/kgのSDAB-01のみで有意に低減し、単球浸潤又はリンパ球浸潤では有意な低減は観察されなかった。実験3では、SDAB-01を先に行ったものと同じ用量で投与した。図12及び図13に示されるように、総白血球浸潤の有意な低減が0.09mg/kg用量で観察され、両方の用量のSDAB-01で好中球浸潤の有意な低減が観察された。リンパ球は0.09mg/kg用量で有意に低減したが、0.18mg/kg群では有意に低減しなかった。試験したいずれの用量でも単球浸潤に対する効果はなかった。要約すると、0.09mg/kg用量で有意ではない正の傾向が与えられた1つの研究を除いて、両方の濃度のSDAB-01で対照群と比較しての好中球浸潤の有意な阻害が観察された表4。表4:SDAB-01を用いたネズミ気嚢実験の概要0.09mg/kgと低い用量のSDAB-01の投与が、10ngの組換えヒトTNFαにより誘導される細胞浸潤及び好中球浸潤を有意に低減した。試験したいずれの用量でもリンパ球浸潤及び単球浸潤にはほとんど効果がなかった。これらのデータは、SDAB-01が組換えヒトTNFα刺激により引き起こされる好中球の浸潤を一貫して遮断することができることを示している。実施例8:関節炎のTg197ヒトTNFαトランスジェニックマウスモデルにおけるSDAB-01の有効性SDAB-01の治療効果を関節リウマチのTNFαトランスジェニックマウスモデルで評価した。このモデルでは、TNFαトランスジェニックマウスは、4週齢~7週齢で100の発生率で慢性多発性関節炎を発症する。この疾患はヒトTNFαの過剰発現に依拠する。様々な処理用量10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、0.03mg/kgのSDAB-01の効果を治療投与計画で研究した。100のマウスが疾患の徴候を示した場合に、動物を無作為に群に割り当てた。群に割り当てた後、SDAB-01、抗TNFα抗体対照2、対照抗体又はビヒクルによる処理を開始し、1週間に2回、7週間継続した。全ての動物に、疾患症状の視覚的兆候に関して盲検で1週間ごとスコアリングを行った。研究の終了時に、後肢を摘出し、処理して、疾患の指標に関して顕微鏡によって評価した。実験1では、10mg/kg、3mg/kg及び1mg/kgの用量でのSDAB-01による処理は、ビヒクル処理群と比較して用量依存的に関節炎の更なる発症を予防することによる顕著な効果を示した。より高い用量のSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kgによる処理は、両方の対照群と比較して組織病理学的スコアの顕著な改善を示した。そのため、臨床的に顕微鏡によって評価した、対照処理群と比較して関節炎の改善を示した最小治療用量は、1mg/kgのSDAB-01であった。実験2では、10mg/kg、3mg/kg及び1mg/kgの用量でのSDAB-01による処理は、臨床スコア及び組織病理スコアの両方で退行を示し、確立された関節炎に対する治療効果を示した。そのため、臨床的に顕微鏡によって評価した、対照処理群と比較して関節炎の改善を示した最小治療用量は1mg/kgであった。要約すると、SDAB-01による抗TNFα処理は、疾患の増悪の予防、並びに臨床スコア及び組織病理スコアの両方での退行から明らかなように、確立された関節炎に対する用量依存的な治療効果を示した。この処理の結果は、Tg197マウス関節炎モデルにおいて、対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現したrecapitulatedことから、ヒトTNFαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった。実験設計SDAB-01及び抗破傷風毒素対照抗体は、標準的な方法によってPfizerで調製された。インフリキシマブRemicadec、抗TNFα抗体、ロット番号7HD98016を、MedWorldPharmacyカタログ番号NDC57894-030-01から購入した。ヒトTNF-グロビンハイブリッド導入遺伝子CBA×C57BL/6遺伝的バックグラウンドで維持されるが同型の雄のTg197マウスをCBA×C57BL/6F1雌と交配させた。異型のトランスジェニック子孫を本研究に使用した。100のマウスが関節炎の兆候を示した場合、全てのマウスを処理群に無作為に割り当てた。動物を処理群に割り当てた日から、マウスで腹腔内注射によるPF-05230905、対照抗体抗破傷風毒素抗体、インフリキシマブ、又はビヒクル対照10mML-ヒスチジン、5スクロースバッファー、ロット番号C-51683、D-20216の投与を開始した。投与用量及び投与頻度は各実験のサブセクションに記載されている。各マウスの両後肢を規定の間隔で以下のように疾患の進行に関して評価した:0関節炎なし正常な外観及び屈曲。0.5関節炎の発症軽度の関節腫脹。1軽度の関節炎関節の歪み。1.5上記のような指の変形を伴い、屈曲に対する強度が弱い。2中度の関節炎重度の腫脹、関節変形、屈曲に対する強度がない。2.5上記のような肢の指の変形。3重度の関節炎屈曲及び重度の運動障害で検出される関節強直。それから各マウスに0~3の平均スコアを割り当てた。疾患の進行をモニタリングするために、同様に関節炎を患っていたTg197マウスの4匹の同腹子を処理開始点である6週齢で屠殺した。本研究の終了時に、全てのマウスを屠殺し、足関節の組織病理学的分析を行った。実験マウスのスコアを4匹の同腹子のスコアと比較した。組織病理スコアを、以下のように0~4で顕微鏡によって盲検で評価した:0検出可能な病変なし1滑膜の過形成及び多形核浸潤の存在2パンヌス及び線維組織の形成、並びに局所的な軟骨下正:subchondral骨侵食3軟骨破壊及び骨侵食4広範な軟骨破壊及び骨侵食。実験1実験1では、様々な用量のSDAB-01の有効性を関節リウマチの治療的なTNFαトランスジェニックネズミモデルで評価した。マウスを関節炎の兆候に関して1週間に2回モニタリングした。100のマウスが疾患の兆候を示した場合、全ての動物を処理群に無作為に割り当てた。異型のTg197マウスをそれぞれ8匹のマウスの群に分けた。1週間に2回のSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg、対照抗体10mg/kg、インフリキシマブ10mg/kg、3mg/kg又はビヒクルヒスチジン/スクロースバッファー、10mL/kgによる処理を開始した。処理を7週間継続し、関節の形態の肉眼的変化関節炎スコア及び各動物の平均体重を週ごとに記録した。CO2を用いて安楽死させた後、血清を回収し、各動物の2つの後肢を組織学的評価のために処理した。実験1では、SDAB-01の投与は、ビヒクル処理群と比較して体重減少の改善図14及び疾患の進行の抑制図15により極めて顕著な効果を示した。インフリキシマブは臨床スコアを安定させる上でSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kg投与と同一であった。スコアリングの最終日に評価した疾患の重症度を図16に示す。疾患症状が低減した動物の数は、ビヒクル又は対照抗体と比較してSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kg及びインフリキシマブ10mg/kgで処理した群で最大であった。各マウスの2つの後肢のそれぞれに由来するヘマトキシリン及びエオシンで染色した一切片を盲検で顕微鏡によって評価した。確立された関節炎に対するSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kgによる処理は、疾患の増悪を抑え、組織病理学的スコアの退行を段階的にもたらすことによって有効性を示した。この処理の結果は、対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現したことからヒトTNFαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった図17、図18。実験2実験2では、1週間に2回、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg及び0.1mg/kgのSDAB-01による処理の効果を反復し、1週間に2回、0.03mg/kgのSDAB-01、並びに1週間に2回、10mg/kg及び3mg/kgのインフリキシマブを含んでいた。SDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg及び0.03mg/kgの投与は体重減少を改善することにより顕著な効果を示した図19。しかしながら、ビヒクル処理群と比較して10mg/kg、3mg/kg及び1mg/kgの用量しか疾患の進行を抑えるのに成功しなかった図20。SDAB-010.3mg/kg又はインフリキシマブ3mg/kgによる処理によって、ビヒクル処理群又は対照抗体処理群のいずれかと比較して、臨床評価の中程度であるが有意ではない改善がもたらされた。スコアリングの最終日に評価した疾患の重症度を図21に示す。疾患症状が低減した動物の数は、ビヒクル対照と比較してSDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kg及びインフリキシマブ10mg/kgで処理した群で最大であった。各マウスの2つの後肢のそれぞれに由来するヘマトキシリン及びエオシンで染色した一切片を盲検で顕微鏡によって評価した。SDAB-0110mg/kg、3mg/kg、1mg/kgによる処理は、疾患の増悪を抑え、組織病理学的スコアの退行を段階的にもたらすことによって確立された関節炎に対する有効性を示した図22。この処理の結果は、ヒト対照抗体処理がビヒクル処理で明らかとなった病変を再現したことからヒトTNFαに対する特異的な拮抗作用の直接的な結果であった。ビヒクル処理群のスコアと対照抗体処理群のスコアとに有意な差がなかったことから、3つのより高い用量のSDAB-0110mg/kg、3mg/kg及び1mg/kgは、両方の対照群と比較しての組織病理スコアの有意な低減で明らかなように効果的であった図23。したがって臨床的に顕微鏡によって評価された最小有効用量は、1mg/kgのSDAB-01であった。3つのより高い用量のSDAB-0110mg/kg、3mg/kg及び1mg/kgによる処理によって、組織病理スコアの改善がもたらされた。これらのスコアは、本研究の開始時に回収した対照同腹子のスコアよりも有意に小さかった。1mg/kgのMEDでは、定常状態出血終了時endbleedの血清SDAB-01の実測濃度の平均は4.81μg/mLであり、これはTg197マウスへの1mg/kgの単回IP投与後のSDAB-01の薬物動態プロファイルに基づき予測された7.70μg/mLの定常状態出血終了時の血清濃度と比較して2倍差内にあった。定常状態出血終了時の血清SDAB-01濃度の平均は、0.3mg/kg、3mg/kg及び10mg/kg用量群でそれぞれ0.21μg/mL、42.1μg/mL及び120μg/mLであった。0.03mg/kg及び0.1mg/kg用量群では、1匹を除いて全ての動物が0.049μg/mLの定量限界未満の血清SDAB-01濃度を有していた。実施例9.ピチアパストリスで発現した二価SDAB分子のPEG化ジチオスレイトールDTTを中和画分に添加し、SDAB分子のカルボキシ末端のシステイン間で形成される潜在的なジスルフィド架橋を還元した。10mMの最終濃度のDTT及び4°Cで一晩のインキュベーションが最適であることが見出された。還元を分析用のサイズ排除クロマトグラフィSECにより評価した。それから、25mlの還元型のSDAB分子を75mlのダルベッコPBSD-PBSに添加し、D-PBSで平衡状態にしたSup7510/300GLカラムに注入した。非還元型のSDAB分子及びDTTをD-PBSで平衡状態にしたHiload26/60Superdex75調製グレードのカラムでの分取SECにより取り除いた。還元型のSDAB分子の濃度を、280nmで吸光度を測定することにより決定した。Uvikon943DoubleBeamUS/VIS分光光度計を使用した。吸光度absorptionを245nm~330nmの波長スキャンで測定した。QuartzSuprasilでできた2つの精密セルを使用した。初めに、ブランクの吸光度を、900μlのD-PBSを充填した2つのセルを配置することにより280nmで測定した。サンプルを100μlのサンプルを第1のセルに添加し、読み取る前にそれを混合することにより希釈した1/10。サンプルの吸光度を280nmで測定した。濃度は以下の式で算出した:SDAB分子をPEG化するために、5×モル過剰の新たに作製した1mMのPEG40溶液を還元型のSDAB分子溶液に添加した。SDAB分子-PEG混合物を穏やかにかき混ぜながら室温で1時間、インキュベートし、その後4°Cに移行した。PEG化を分析用SECで評価した。その後、25μlのSDAB分子を75μlのD-PBSに添加し、D-PBSで平衡状態にしたSup75HR10/300カラムに注入した。PEG化SDAB分子をカラムの排除体積範囲75KDa超で溶出させた。PEG化SDAB分子と非PEG化SDAB分子とをカチオン交換クロマトグラフィCEX-バッファーAは25mMのクエン酸であり、バッファーBはPBS中の1MのNaClであったで分離した。サンプルを希釈し、電気伝導率を5mS/cmとし、pHを4.0に調整した。カラムを平衡状態にし、サンプル適用後、バッファーAで十分に洗浄した。PEG化SDAB分子を3CV勾配で溶出した。回収したSDAB分子では、D-PBSで平衡状態にしたHiload26/60Superdex75prepgradeカラムでのSECによりD-PBSへとバッファーを交換した。続いてアニオン交換カラムを通すことによってSDAB分子をLPSフリーにした。このカラムを1MのNaOHで洗い流しsanitized、その後内毒素フリーD-PBSで平衡状態にした。ビオチン化SDAB分子をビオチン化するために、10mMのストック溶液の5×モル過剰のビオチンを還元型のSDAB分子に添加した。ビオチンSDAB分子混合物を穏やかにかき混ぜながら室温で1時間インキュベートし、それから4°Cで保存した。ビオチン化SDAB分子の純度を分析用SECにより制御した。続いて、25μlのビオチン化SDAB分子を75μlのD-PBSに添加し、D-PBSで平衡状態にしたSup75HR10/300カラムに注入した。得られたクロマトグラムは、SDAB分子ビオチンが更に精製する必要がないことを示しており、遊離スルフヒドリルの酸化によるSDAB分子の二量化は検出することができなかった。脱塩カラムであるSephadexG25微細カラムを通すことによりD-PBSへのバッファーの交換を行った。アニオン交換カラムを通すことによって、SDAB分子-ビオチンをLPSフリーにした。カラムを1MのNaOHで一晩洗い流し、それからD-PBSで平衡状態にした。実施例10a.単回の静脈投与及び皮下投与後の雄のカニクイザルにおけるSDAB-01の薬物動態第1の研究では、SDAB-01は、3mg/kgタンパク質含有量ベースでで単回のIVボーラス注射又はSCボーラス注射によって、雄のカニクイザル1群当たりn=3:IVではサルSAN1~3、SCではサルSAN4~6に投与した。PK分析のために血清サンプルを投与前0時間及び投与後0.083時間~1536時間で、それぞれの動物から回収した。更なる血清サンプルを投与前0時間及び投与後336時間、672時間、1008時間及び1536時間で採取し、抗SDAB-01抗体の形成を評価した。血清SDAB-01濃度を、限定qualified酵素免疫測定法ELISAを用いて決定し、結果を用いて、SDAB-01に関する薬物動態パラメータを決定した。抗SDAB-01抗体の存在を、限定ELISAを用いて決定した。IV投与又はSC投与後の雄のカニクイザルにおけるSDAB-01の平均血清濃度-時間プロファイルを図24に示す。サルにおけるIV投与又はSC投与後のSDAB-01の平均薬物動態パラメータを表5にまとめる。表5:3mg/kgタンパク質含有量ベースでの単回のIV投与又はSC投与後の雄のカニクイザル1つの処理群当たりn=3におけるSDAB-01の平均±SD薬物動態パラメータSDAB-01は3mg/kgのSC投与後に注射部位から十分に吸収された。3匹の雄のカニクイザルにおける3mg/kgの単回SC投与後、31.7±2.72μg/mLの平均最大血清濃度Cmaxが投与後72時間で観察され、それによりSC注射後のSDAB-01の吸収が緩やかなプロセスであることが示された。3匹のサルでの終末相半減期は110時間~131時間の範囲であり、平均値は123時間およそ5日間であった。SC投与後に観察される相対的に短いt1/2は、抗SDAB-01抗体の形成によるものであり得る。抗SDAB-01抗体に関して陽性であるSC処理群由来の2匹のサル。3匹のサルの平均AUCは8958μghr/mLであった。サルにおけるSC投与後のバイオアベイラビリティは、IV処理サル及びSC処理サルの両方での抗SDAB-01抗体の形成のために本研究からは正確に決定することができない。しかしながら、SC投与とIV投与との間のAUC0~∞比を用いることで推測値を得ることができ、この推測値はおよそ69.3であることが見出された。この値はサルでのSDAB-01のバイオアベイラビリティを低く推測する又は高く推測する場合があることから、使用には注意が必要である。まとめると、抗SDAB-01抗体の形成は抗SDAB-01を投与した動物の503/6で検出された。抗SDAB-01抗体の発生率は、3mg/kgのIV群の動物で33.31/3であり、3mg/kgのSC群の動物で66.72/3であった。抗体2.19~2.52のlog力価をサルSAN1IV処理群及びサル5SC処理群での投与後1008時間及び1536時間で検出した。抗体1.71のlog力価をサルSAN4SC処理群での投与後1536時間で検出した。全ての投与前サンプルが陰性であることから、これらの動物はSDAB-01に対する免疫応答を有していると考えられた。循環レベルのSDAB-01は抗SDAB-01抗体の検出を妨げる可能性があることに留意されたい。SDAB-01の半減期は抗SDAB-01抗体形成に関して陽性であったサルにおいてより短く、それにより抗SDAB-01抗体の形成が、サルにおけるSDAB-01の薬物動態に対して影響を与えることが示唆された。第2の研究では、雄及び雌のカニクイザル1群当たりn=12に、単回の5mg/kgのIV用量、100mg/kgのIV用量及び100mg/kgのSC用量のSDAB-01を投与し、血清濃度を、限定ELISAを用いて測定した。SDAB-01の5mg/kg又は100mg/kgのIV投与後、平均AUC0~∞、CL及びt1/2値はそれぞれ、24600μgh/mL及び395000μgh/mL、0.210mL/hr/kg及び0.263mL/hr/kg、並びに149時間及び144時間であった。全身曝露Cmax、AUC0~∞、及びAUC0~168は、用量が増大するにつれておよそ用量に比例して増大した。単回の100mg/kgのSC投与後、平均Tmax、AUC0~∞及びt1/2値はそれぞれ、150時間、352000μgh/mL及び165時間であった。SC投与後のバイオアベイラビリティ100mg/kgのIV投与及びSC投与の後の平均AUC0~∞値を用いて推測したは89であった。抗SDAB-01抗体の発生率は、5mg/kgIV用量群、100mg/kgIV用量群、及び100mg/kgSC用量群それぞれで動物12匹中4匹33.3、動物12匹中1匹8.3、及び動物12匹中1匹8.3であった。実施例10b.SDAB-01TNFαSDAB分子2×20PEG、TNFαSDAB分子4×10PEG、及びTNFαSDAB分子の直鎖1×40PEGの血清薬物動態の比較TNFαSDAB分子の分岐2×20kDaPEG構築物、TNFαSDAB分子の分岐4×10kDaPEG構築物、及びTNFαSDAB分子の直鎖1×40kDaPEG構築物の血清PKプロファイルを2mg/kg又は3mg/kgタンパク質含有量ベースでの単回IV投与後のB6CBAF1/Jマウス、スプラーグドーリーラット、及びカニクイザルで検査した。血清濃度を特異的ELISAマウス及びサル又はガンマ線計測ラットのいずれかを用いて決定した。検査した3種全てで、分岐2×20kDaPEG構築物は、直鎖1×40kDaPEG構築物と比較して有意に高い暴露量AUCを有していたp<0.05図25及び表6~表8。特に、直鎖1×40kDaPEG構築物と比べての分岐2×20kDaPEG構築物に関する平均用量で正規化したAUC0~∞の相対的増大は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ約94、102及び136であった。したがって、分岐2×20kDaPEG構築物の総身体クリアランスCLは、直鎖1×40kDaPEG構築物と比較してより低く、分岐2×20kDaPEGの排除半減期t1/2は、直鎖1×40kDaPEG構築物と比較してより長いと考えられた。特に、分岐2×20kDaPEG構築物に関する平均CL値の相対的低減は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ約48、50及び66であり、平均t1/2値の相対的増大は、マウス、ラット及びサルでそれぞれ43、26、54であった。ラット及びサルにおいて、分岐4×10kDaPEG構築物は、直鎖1×40kDaPEG構築物と比較してより高い平均血清AUC0~∞及びより低いCLも有していたが、マウスではそうではなかった表6~表8。ラット及びサルでは、直鎖構築物と比べての分岐4×10kDaPEG構築物に関するPKパラメータの変化の程度は、分岐2×20kDaPEG構築物に関するPKパラメータの変化の程度と比較してあまり顕著なものではなかったAUC0~∞の43~51の増大及びCLの35~45の低減。表6.B6CBAF1/Jマウスへの単回IV投与後のPEG化TNFαSDAB分子の薬物動態パラメータ。雄のB6CBAF1/Jマウスに単回IVボーラス用量の指定の試験物質を投与した。血清サンプルを1回の投与後5分~14日目で各マウス1つの時点当たりn=3から採取し、血清濃度を特異的ELISAにより決定した。PKパラメータを、スパースサンプリング法を用いた非コンパートメント分析により決定し、AUClast/投与の値の統計分析を、ANOVAを用いてダネット事後検定により行った。直鎖1×40PEG群を対照として用いた。アスタリスクは直鎖PEG群と比べての統計的に有意な差異p<0.05を示す。C5分=IV投与後、最初のサンプリング時点である5分での濃度。CL=血清濃度ベースの総身体クリアランス。Vdss=定常状態での分布体積。t1/2=排除半減期。AUC0~∞=時間0~無限大での濃度時間曲線下面積。AUClast=時間0~定量可能な濃度が見られるサンプリング時間での濃度時間曲線下面積。表7.スプラーグドーリーラットへの単回IV投与後の125Iで標識したPEG化TNFαSDAB分子の薬物動態パラメータ平均±SD雄のスプラーグドーリーラットに、単回IVボーラス用量の指定の125Iで標識した試験物質を与え、血清サンプルを投与後5分~24日目で採取し、血清中の放射性当量RE濃度を、ガンマ線計測により決定した。PKパラメータを、非コンパートメント分析によりそれぞれ個々の動物で算出した2×20kDaPEG構築物及び4×10kDaPEG構築物ではn=7及び1×40kDaPEG構築物ではn=5。AUC0~∞、AUC0~∞/投与、CL、Vdss及びt1/2の値の統計分析を、ANOVAを用いてダネット事後検定により行った。直鎖1×40kDaPEG群を対照として用いた。アスタリスクは直鎖PEGと比べての統計的に有意な差異p<0.05を示す。表8.カニクイザルへの単回IV投与後のPEG化TNFαSDAB分子の薬物動態パラメータ平均±SD雄のカニクイザルに、単回IVボーラス用量の指定の試験物質を投与し、血清サンプルを2×20kDaPEG構築物、4×10kDaPEG構築物及び1×40kDaPEG構築物でそれぞれ、5分~62日目、57日目及び56日目で採取し、血清濃度をELISAにより決定した。PKパラメータを非コンパートメント分析によりそれぞれ個々の動物で算出した1つの構築物当たりn=3。急激な濃度低下を伴うデータ点をPK算出には使用しなかった2×20kDaPEG構築物を投与した3匹のサルの内の1匹。AUC0~∞、AUC0~∞/投与、CL、Vdss及びt1/2の値の統計分析を、ANOVAを用いてダネット事後検定により行った。直鎖1×40kDaPEG群を対照として用いた。アスタリスクは直鎖PEG群と比べての統計的に有意な差異p<0.05を示す。更なる研究をSDAB-01構築物のみで行った:初めに、マウス及びサルの血清サンプルを、2つの異なる免疫測定法フォーマットを用いて分析した:全分子対分子のタンパク質部分を測定する免疫測定法。タンパク質検出アッセイは、ビオチン化標的分子を利用することによりタンパク質部分を介してPEG化薬剤コンジュゲートを捕捉した。ポリクローナル抗薬剤抗体検出器は分子のタンパク質部分とも結合し、そのためアッセイは遊離タンパク質及びPEG化タンパク質を検出した。全分子検出アッセイはProteinDetectionアッセイと同じ捕捉モードを使用したが、モノクローナルウサギ抗PEG抗体を介してPEG部分によって検出が起こった。この検出抗体はPEG分子のメトキシ基に特異的である。このアッセイフォーマットはPKプロファイルにはほとんど影響を与えず、マウス及びサルの動物モデルでパラメータを算出した。第2に、SDAB-01の薬物動態プロファイルを、マウスへの単回SC投与又はIP投与後に検査した。雄のB6CBAF1/Jマウスへの単回の2mg/kgのSC投与又は3mg/kgのIP投与後、Tmaxは24時間であり、t1/2値はそれぞれ、52.4時間およそ2.2日及び57.7時間およそ2.4日であった。IP投与又はSC投与後のバイオアベイラビリティはそれぞれ、68.7及び56.6であった。雄のTg197マウスへの単回の0.3mg/kgのIP投与後、Tmax、t1/2及びAUC0~∞の値はそれぞれ、6時間、24.6時間及び165μgh/mLであった。1mg/kgへのIP用量の増大によって、暴露量がおよそ用量に比例して増大しAUC0~∞=528μgh/mL、Tmax6時間及びt1/221.4時間の値は、0.3mg/kgで観察されたものと同程度であった。実施例10c.SDAB-01TNFαSDAB分子2×20PEG及びTNFαSDAB分子の直鎖1×40PEGの生体分布TNFαSDAB分子の分岐2×20kDaPEG構築物及びTNFαSDAB分子の直鎖1×40kDaPEG構築物の生体分布を、0.3mg/kgタンパク質含有量ベースでの125Iで標識した試験物質の単回IV投与後にB6CBAF1/Jマウスにおいて7日間168時間にわたって検査した。血清及び組織での放射性当量RE濃度を、ガンマ線計測を用いて決定し、血清及び組織での暴露量AUC0~168hr及び組織対血清T/SAUC比を算出した。非放射性標識PEGコンジュゲートによるB6CBAF1/Jマウスでの先の研究の観察結果と同様に、分岐2×20kDaPEG構築物は、直鎖1×40kDa構築物と比較して約80高いAUC0~168hrを有していたp<0.05図26。分岐構築物は、試験した全てではないが幾つかの組織で有意に高い暴露量も有していた図26。特に、直鎖1×40kDaPEG構築物と比べての分岐2×20kDaPEG構築物に関するAUC0~168hrの増大は、心臓、肺、筋肉、皮膚及び胃でそれぞれ72、115、43、55及び80であった。T/SAUC比表9及びT/S濃度比データは示していないは、これらの組織に関して2つの構築物間でおよそ同様のものであった。血清、心臓、肺、筋肉、皮膚及び胃に対して、脂肪、腎臓、肝臓及び脾臓のAUC0~168hrは2つの構築物で同程度であり、分岐2×20kDaPEG構築物でより低いT/SAUC比表9及びT/S濃度比データは示していないをもたらした。TNFαSDAB分子の直鎖1×40PEG及びSDAB-01の両方で、投与後1週間168時間以内に総投与放射能のおよそ60が尿中に排出され、尿中に排出される放射能のほとんどおよそ70が遊離ヨウ素に起因するものであった。表9.B6CBAF1/Jマウスへの単回の0.3mg/kgのIV投与後の125Iで標識したPEG化TNFαナノボディの組織対血清T/SAUC比B6CBAF1/Jマウスに、125Iで標識したTNFαSDAB分子の分岐2×20kDaPEG黒色のバー又はTNFαSDAB分子の直鎖40kDaPEG灰色のバーの単回の0.3mg/kgのIVボーラス投与を行った。血清サンプル及び組織サンプル1つの時点当たりn=8~12を7日間168時間にわたり回収し、組織及び血清での放射性当量RE濃度を、本明細書に記載のようにガンマ線計測によって決定した。血清のAUC0~168hrμg×当量/mL単位で及び各組織のAUC0~168hrμg×当量/gを、スパースサンプリング法を用いた非コンパートメント分析により決定し、組織対血清T/SAUC比AUC0~168hr、組織/AUC0~168hr、血清を算出した。実施例11.SDAB分子及び対照分子の生物物理学的分析3つのTNFαSDAB分子40kDaPEGコンジュゲートの異なるPKプロファイルに対する潜在的原因を調べるために、更なる生物物理学的分析を実施した。CEX-HPLCを行い、3つの構築物の電荷不均一性をモニタリングした。代表的なクロマトグラフィプロファイルを図27に示す。かなりの量の電荷不均一性が全てのPEG化TNFαSDAB分子コンジュゲートで観察された。直鎖PEGコンジュゲートの主ピークは、2つの分岐コンジュゲート2×20kDa及び4×10kDaと比較した場合により遅い保持時間で溶出し、そのことにより直鎖コンジュゲートは分岐コンジュゲートと比較して表面上により多くの正電荷を有することが示唆された。2つの分岐コンジュゲート2×20kDa及び4×10kDaに関する主ピークの保持時間は同様のものであった。比較すると、非コンジュゲートタンパク質は、全ての試験したPEG化コンジュゲートよりもかなり遅く溶出し、そのことにより非コンジュゲートタンパク質が更に大きい正の表面電荷密度を有することが示された。非コンジュゲートタンパク質の理論等電点は9を超え、そのためこのタンパク質はpH4.0であるCEX泳動バッファー中で正味の正電荷を有すると予測される。サイズ分布及び質量分布を、UV吸光度によってモニタリングされる多角度光散乱MALS、示差屈折率dRI、及びオンラインの準弾性光散乱QELSによるSE-HPLCを用いて決定した。TNFαSDAB分子-PEGコンジュゲートでのPEGが280nmで吸収しないことから、UV検出及びdRI検出によるSEC-MALSを用いて、コンジュゲートにおけるタンパク質及びPEGの分布を決定することが可能である。算出したタンパク質及びPEGの質量分布は3つ全てのコンジュゲートで互いに一致していた表10及び図28。分岐4×10kDaPEGコンジュゲートは、SEC-MALSで、分岐2×20kDaPEGコンジュゲート及び直鎖1×40kDaPEGコンジュゲートよりも著しく遅い溶出体積を有しており、そのことにより分岐4×10kDaPEGコンジュゲートが他の2つのコンジュゲートと比較して流体力学的により小さいことが示された図29。4×10kDa分岐PEGコンジュゲートのより小さい流体力学半径Rh、測定されるサンプルと同じ拡散係数を有する球体の半径として定義されるはQELS測定によって確認された表10。MALSによって測定される散乱光の角度依存性を用いて、二乗平均平方根RMS半径の分布を決定することができる。RMS半径旋回の半径、Rgとも称されるは、任意の所与の時点での分子の全ての部分のその質量の中心からの二乗平均平方根距離の測定結果であり、分子が専有する平均体積についての情報を与える。分岐2×20kDaPEGコンジュゲート及び分岐4×10kDaPEGコンジュゲートの両方が、直鎖PEGコンジュゲートよりも小さいRgRMS半径を有していた表10及び図29。最後に、立体配座情報を、RMS/RhRg/Rh比を算出することにより得ることができる:比の値が大きければ、分子がより伸長する又は拡張する。RMS/Rh比は直鎖1×40kDaPEGコンジュゲート、分岐2×20kDaPEGコンジュゲート及び分岐4×10kDaPEGコンジュゲートでそれぞれ、1.77、1.45及び1.37であり、それにより直鎖1×40kDaPEGを有するコンジュゲートは、分岐PEGを含有するより小型のコンジュゲートよりも拡張した立体配座を有することが示された表10。PEG化コンジュゲートを分析するのに用いたSE-HPLC法は、非コンジュゲートタンパク質の比較sidebyside分析には好適ではないことに留意されたい。表10.SEC-MALS分析によるPEG化TNFαSDAB分子の算出された重量全てのサンプルを2.0mg/mLに希釈し、100μLの各サンプルを30°Cに保持したSuperose6カラム0.5mL/分で400mMのNaCl、20mMのNaPO4pH7.2に注入した。モル質量、Rh及びRMSを、WyattTechnologiesのASTRAVv5.3.4.14を用いて決定した。3つ全てのSDABPEGコンジュゲート及び非PEG化タンパク質は、細胞ベースのバイオアッセイU937細胞でのTNFα誘導性のアポトーシスをベースとするにおいてPEG化参照材料と比べて92以上の生体活性を有し、それによりPEG化がタンパク質の活性を変えなかったことが示唆された。表11.タンパク質配列表12.cDNA配列均等物本明細書で引用される参考文献は全て、それぞれ個々の刊行物又は特許又は特許出願が、あらゆる目的で引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとなるように具体的にかつ個々に示されていた場合と同じ程度に、あらゆる目的で引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。本発明は本明細書に記載の特定の実施形態によっては範囲が限定されないものとする。実際、本明細書に記載のもの以外の本発明で特徴付けられる様々な変更が、上述の記載及び添付の図面から当業者にとって明らかとなるであろう。かかる変更は添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。"