"成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの5’末端にタグ配列を付加するとともに,前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの3’末端にリボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列を付加し,前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾物を得る工程と,前記末端修飾配列物を転写させ,転写物を得る転写工程と,前記転写物をインビトロで翻訳するインビトロ翻訳工程と,を含み,前記成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリがランダムオリゴヌクレオチドライブラリである,成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法。前記ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,NNK配列,NNS配列又はNNY配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである請求項1に記載の方法。前記リボソームの翻訳伸長を停止させるアレスト配列は,SecM配列である請求項1又は2に記載の方法。前記タグ配列は,FLAG配列である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。前記インビトロ翻訳工程は,無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である,請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。前記インビトロ翻訳工程は,大腸菌無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である,請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。前記インビトロ翻訳工程は,再構成型無細胞翻訳系を用いて前記転写物をインビトロで翻訳する工程である,請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。本発明は,一度に多種類の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリを短時間に簡便かつ安価に製造できる成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法を提供することを目的とする。また,本発明は,インビトロ選択系のリボソームディスプレイ特開2008-271903号公報を用いたランダムオリゴヌクレオチドライブラリの効率的な成熟化方法を提供することを目的とする。本発明は,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリを成熟化するに際して,オリゴヌクレオチドの3’末端にアレスト配列例えば,SecM配列を付加することでインフレーム率を向上させ,極めて効率的に成熟化を達成できるという知見に基づくものである。本発明の第1の側面は,成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法に関する。この方法は,まず,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの5’末端にタグ配列を付加するとともに,3’末端にアレスト配列例えば,SecM配列を付加し,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾物末端修飾配列物を得る。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリは,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリである。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリの例は,NNS配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである。NNS配列の例は,31アミノ酸に対応するコドンを含むNNS配列である。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリが完全なランダムオリゴヌクレオチドライブラリの場合,約1/21の割合でストップコドンが出現する。このため,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,完全なランダム配列NNNを含まないものが好ましい。次に,末端修飾配列物を転写させ,転写物を得る。その後,転写物をインビトロで翻訳する。上記の方法においてタグ配列の例は,FLAG配列である。例えば,アンチ-FLAG抗体を固定化したビーズを用いることで,生成物を容易に回収できる。上記の方法においては,無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものが好ましい。完全にインビトロで処理を行うため,オリゴヌクレオチドライブラリの成熟化効率を向上させることができる。無細胞翻訳系の例は,大腸菌無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系として好ましいものは,再構成型無細胞翻訳系である,いわゆるPUREシステムである。再構成型無細胞蛋白質合成系は,本発明者らを含むグループによって開発された蛋白質合成に関与する翻訳因子やリボソームなどの特定された因子のみからなる合成系である。リボソームディスプレイは,インビトロ翻訳系において,mRNA-リボソーム-オリゴペプチドの3者複合体リボソームディスプレイ複合体を形成させ,特定の機能を有するポリペプチドをコードする蛋白質を選択する方法である。上記の通り,本発明の末端修飾物は,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの3’末端にアレスト配列を有している。インビトロ翻訳系に導入したランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドにストップコドンが存在する場合や,塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトがある場合,翻訳の際に正常にアレスト配列まで翻訳されない。このためストップコドンが導入されたオリゴヌクレオチドや,フレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを翻訳しても,mRNA-リボソーム-オリゴペプチドの3者複合体が形成されない。よって,例えば,導入したタグ配列に対する抗体でこれら複合体を選択することによって,アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドのみを選択することができる。本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は,完全にインビトロで処理を行うため,大きな多様性を有する例えば,1011~1012種類以上オリゴヌクレオチドライブラリを選択の対象とすることができる。本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は,操作が簡便であり,かつ効率的であるため,例えば,個々に独立して作成した8種類の成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリを1日で同時に成熟化できる。これは,1種類の成熟化に1週間程度要した従来法に比べて顕著な差である。さらに,本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法は,高価な酵素類を大量に必要としないためコストを軽減することも同時に達成できる。本発明の第1の側面は,成熟化オリゴヌクレオチドライブラリの製造方法に関する。この方法は,まず,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの5’末端にタグ配列を付加するとともに,3’末端にアレスト配列例えば,SecM配列を付加し,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの末端修飾配列物を得る。本明細書において,成熟化とは,オリゴヌクレオチドライブラリから,ストップコドンや,塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを取り除くことを言う。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリは,成熟化され得るオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,後述の定義のように,様々な配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。成熟化オリゴヌクレオチドライブラリは,成熟化されたオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの例は,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリである。ランダムオリゴヌクレオチドライブラリの例は,NNS配列を含むオリゴヌクレオチドライブラリである。NNS配列の例は,31アミノ酸コドンを含むNNS配列である。成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリが完全なランダムオリゴヌクレオチドライブラリの場合,約1/21の割合でストップコドンが出現する。このため,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,完全なランダム配列NNNを含まないものが好ましい。そのようなランダム配列不完全なランダム配列の例は,NNK配列,NNS配列及びNNY配列である。ここで,NはアデニンA,グアニンG,シトシンC,チミンTのいずれかであることを意味する。KはグアニンGもしくはチミンTのいずれかを意味する。SはシトシンCもしくはグアニンGのいずれかを意味する。YはシトシンCまたはチミンTのいずれかを意味する。本明細書において,NNK配列とは,NNKを連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列すなわちNNK×mmは2以上の整数をいう。本明細書において,NNS配列とは,NNSを連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列すなわちNNS×mmは2以上の整数をいう。本明細書において,NNY配列とは,NNYを連続して複数個含むオリゴヌクレオチド配列すなわちNNY×mmは2以上の整数をいう。一態様において,ランダムオリゴヌクレオチドライブラリは,NNK配列,NNS配列又はNNY配列を繰り返し含むオリゴヌクレオチドライブラリである。NNK配列,NNS配列又はNNY配列を繰り返し含むオリゴヌクレオチドとは,1つのオリゴヌクレオチドの中に,NNK配列,NNS配列及びNNY配列からなる群から選択されるランダム配列を複数個含むオリゴヌクレオチドをいう。この場合,NNK配列,NNS配列又はNNY配列を複数個含んでいてもよいし,NNK配列とNNS配列の双方を含む様に,相互に異なるランダム配列を複数個含んでいてもよい。本明細書におけるランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドとしては,3×n塩基のものがあげられる。ここで,nの例は,5以上20以下であり,7以上11以下でもよい。具体的なnの例は9である。ランダムヌクレオチドライブラリを合成する方法は公知である。よって,公知の方法に従ってランダムヌクレオチドライブラリを生成すればよい。上記の方法において,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの5’末端に付加するタグ配列の例は,FLAG配列である。タグ配列は,FLAG配列に限定されない。タグ配列の他の例は,ミック配列である。FLAGタグ及びミックタグに特異的に結合する抗体は,既に販売されている。このため,それらのタグを融合したタンパク質は,抗体又は抗体を固定した物質を用いて,容易に標識及び精製できる。例えば,本発明の成熟化オリゴヌクレオチドライブラリを含むリボソームディスプレイ複合体がFLAGタグを有する場合,アンチ-FLAG抗体を固定化したビーズを用いることで,リボソームディスプレイ複合体を容易に回収及び精製できることとなる。アレスト配列は,リボソームの翻訳を途中で停止させる配列である。大腸菌由来のアレスト配列の例は,SecM配列,及びTnaC配列である。また,人工的に合成された大腸菌に対するアレスト配列の例は,ターナーらの報告にある配列Tanneretal2009JBiolChemvol284p3480934818がある。さらに,真核生物由来のアレスト配列の例は,uORF配列であるHoodetal2009AnnuRevMicrobiolvol63p385409。次に,末端修飾配列物を転写させ,転写物を得る。転写工程は,バイオテクノロジーの分野において公知である。よって,公知の方法に基づいて転写工程を行うことができる。その後,転写物をインビトロで翻訳する。この翻訳工程の例は,無細胞翻訳系を用いて転写物をインビトロで翻訳するものである。この場合,完全にインビトロで処理を行うことにより,オリゴヌクレオチドの成熟化効率を向上させることができる。アレスト配列として大腸菌由来のものを用いた場合,好ましい無細胞翻訳系の例は,大腸菌無細胞翻訳系である。さらに無細胞翻訳系として好ましいものは,再構成型無細胞翻訳系である,いわゆるPUREシステムである例えば,ShimizuYInoueATomariYSuzukiTYokogawaTNishikawaKUedaT2001CellfreetranslationreconstitutedwithpurifiedcomponentsNatureBiotechnology19751755を参照。PUREシステムは,翻訳に必要な因子を個々で調製し,それらを再構成した無細胞翻訳系である。PUREシステムは,リボソームディスプレイを実施する上で効率低下の原因となるヌクレアーゼやプロテアーゼの混入がほとんど認められない。このため,細胞抽出型の無細胞翻訳系を使用した場合よりもPUREシステムを使用した場合の方が,高い選択効率を持つ事が報告されているVillemagneetal2006JImmunolMethodsvol313p140148。一方,多くの生物は,翻訳中に生ずるリボソームの翻訳停止を回避する手段を備えている。例えば,大腸菌の場合,10S-RNAtmRNAとSmpB蛋白質が関与するtrans-translationと呼ばれる反応が起こり,リボソームのストールが解除されるMooreandSauer2007AnnuRevBiochemvol76p101124。そして,細胞内成分を含む一般的な細胞抽出液型の無細胞翻訳系は,これらの回避成分も系内に含まれている。このため細胞抽出液型の無細胞翻訳系を用いた場合,リボソームディスプレイ複合体の形成効率が低下すると考えられる。実際,大腸菌抽出液系の無細胞翻訳系に10S-RNAのアンチセンス配列を加えることで,リボソームディスプレイ複合体の形成効率が上昇することが報告されている。すなわち,本発明においては,上記に説明した回避成分が含まれていないPUREシステムが,最適な無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系は,エネルギー再生系と少なくとも一種のアミノ酸とを有する。エネルギー再生系は,タンパク質の合成に必要なATPやGTP等のエネルギー源の再生に関わる要素を意味する。エネルギー再生系物質の例は,ATP再生に関わる酵素クレアチンキナーゼやピルビン酸キナーゼ等,その基質クレアチンリン酸やホスホエノールピルビン酸等である。無細胞翻訳系は,アミノ酸を少なくとも一種,好ましくは天然に存在する20種のアミノ酸を含む。無細胞翻訳系は,さらに非天然のアミノ酸を含んでいても良い。無細胞翻訳系は,例えば,緩衝液例えば,HEPESカリウムやトリス酢酸等,各種の塩類,界面活性剤,RNAポリメラーゼT7,T3,及びSP6RNAポリメラーゼ等,シャペロンタンパク質DnaJ,DnaK,GroE,GroEL,GroES,及びHSP70等,RNAmRNA,tRNA等,プロテアーゼ阻害剤,又はリボヌクレアーゼ阻害剤を含んでもよい。上記に説明した通り,本発明の好ましい利用は,リボソームディスプレイを用いてランダムオリゴヌクレオチドライブラリを成熟化する方法である。リボソームディスプレイは,インビトロ翻訳系において,mRNA-リボソーム-オリゴペプチドの3者複合体を形成させ,特定の機能を有するポリペプチドをコードする蛋白質を選択する方法である。上記の通り,本発明の末端修飾配列物は,成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリの3’末端にアレスト配列を有している。すると,インビトロ翻訳系に導入したランダムオリゴヌクレオチドライブラリを構成するオリゴヌクレオチドにストップコドンが存在する場合や,塩基の欠失又は挿入によるフレームシフトがある場合,翻訳の際に正常にアレスト配列まで翻訳されない。このためストップコドンが導入されたオリゴヌクレオチドや,フレームシフトを含むオリゴヌクレオチドを翻訳しても,mRNA-リボソーム-オリゴペプチドの3者複合体が形成されない。例えば,導入したタグ配列に対する抗体でこれら複合体を選択することにより,アレスト配列まで翻訳されたインフレームのオリゴヌクレオチドのみを選択することができる。以下,実施例を示して本発明をより具体的に説明するが,本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。鋳型の構築成熟化の対象とする9アミノ酸をコードするコドンを含むランダムオリゴヌクレオチドライブラリの5’側にFLAG配列,3’側にミック配列を付加した状態でDNA合成した。3‘末端にFLAG配列を付加したT7プロモーターおよびSD配列を含む5’UTR配列もDNA合成した配列番号2:gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccaatggactataaagatgacgatgacaaa。M13ファージのgeneIIIの部分配列アミノ酸残基220-326位はM13KO7由来ファージゲノムを鋳型としてプライマーMyc-g3p及び,プライマーg3p-SecMstopを用いてKODPlusDNAPolymerase東洋紡製によってPCR増幅変性:94°C15秒;アニーリング:57°C30秒;伸長:68°C60秒;25サイクル後,精製カラムキアゲン社製によって精製した。5’UTRランダムオリゴヌクレオチドライブラリ,g3pの3種類のDNAをそれぞれ1pmol,5’プライマー配列番号5:gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctag10pmol,SecMストップ配列10pmol,KODPlusDNAポリメラーゼを含むPCR反応液を調製し,10サイクルのPCR反応変性:94°C15秒;アニーリング:57°C30秒;伸長:68°C60秒を実行した。1アガロースを用いた電気泳動によって,3遺伝子がつながったバンドを確認後,そのバンドを切り出した後カラム精製しキアゲン製,最終的なランダム配列を含む成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリとした。インビトロ転写精製した成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリDNA1μgを20μlのインビトロ転写キットRibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7プロメガ社によってmRNAとし,カラム精製したRNeasyminiカラム,キアゲン社。無細胞翻訳系を用いたインビトロ翻訳リボソーム-Peptide-mRNA複合体の構築:蛋白質合成反応試薬である無細胞翻訳系PUREシステムは既報Shimizuetal2005Methodsvol36p299-304に従い調製した。調製した反応液100μlに100pmolの成熟化対象オリゴヌクレオチドライブラリmRNAを加え,37°Cで30分間インキュベートした。氷冷したWash緩衝液50mMTris-OAcpH7.5,150mMNaCl,50mMMgOAc2,0.5パーセントTween20,10μgml出芽酵母SaccharomycescereviseaetotalRNA500μL,加えてBlocking緩衝液50mMTris-OAcpH7.5,150mMNaCl,50mMMgOAc2,0.5パーセントTween20,10μgml出芽酵母SaccharomycescereviseaetotalRNAシグマ社製,5パーセントSuperBlockPierce500μLを加えた。インビトロ選択予め5SuperBlockで4°Cにおいて一晩ブロッキングしておいたFLAGM2担体50μLスラリー,シグマ社製を500μlWash緩衝液でMicroSpin登録商標カラムを用いて2回洗浄後,回収したFLAGM2担体に翻訳反応液を加え4°Cで1時間ローテーションによって攪拌した。MicroSpin登録商標カラムによって上清を廃棄し,回収したFLAGM2担体に1mLのWash緩衝液を加え,4°Cで5分ローテーションによって攪拌した。この操作を20回繰り返した後,100μlエルーションElution緩衝液50mMTris-OAcpH7.5,150mMNaCl,50μgFLAGペプチドシグマ社製を回収したFLAGM2担体に加え,4°Cで15分静置した。このようにして,複合体をFLAGM2担体から遊離させた。MicroSpin登録商標カラムによって上清を回収し,RNeasyMicroによってmRNAを回収,精製した。RT-PCR回収したmRNAはトランスクリプションハイフィデリティcDNA合成キットロッシュ社によってcDNAとした後,KODプラスDNAポリメラーゼを用いてPCR反応変性:94°C15秒;アニーリング:57°C30秒;伸長:68°C60秒;20サイクルを行った。なお,使用したプライマーを以下に示す。逆転写リバースプライマー:Myc-RPCRプライマー:FLAG-FMyc-R塩基配列解析用サブクローニング選択前および選択後のDNA100ngをrTaqDNAポリメラーゼ東洋紡社製によって3’末端にAを付加した。その後,TOPOTAクローニングキットインビトロジェン社製によってサブクローニングを行った。サブクローニングは,このキットの説明書に基づいて行った。形質転換後の大腸菌シングルコロニーをそれぞれ20コロニー3mlLB培地で培養し,増幅した大腸菌からプラスミドを回収し,塩基配列解析に使用した。結果及び考察図1に,成熟化前後のランダムオリゴヌクレオチドライブラリNNS配列を示す。図1に示されるように,成熟化前の塩基配列解析の結果,ストップコドンTAGを含むオリゴヌクレオチドの出現頻度は40パーセント,塩基の欠失では5パーセント120,塩基の挿入では0020であり,最終的に完全なインフレームオリゴヌクレオチドの出現頻度は551120であった。また,成熟化後においては,ストップコドン,塩基の欠失,挿入を含むものの出現頻度は0パーセント020であり,すべてのオリゴヌクレオチドがインフレームであることが確認された。この結果は,本法によるインフレームオリゴヌクレオチドの選択がほぼ完全に達成されていることを示しており,本法の有効性が証明された。"