"糖タンパク質におけるリン酸化N-グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、aリン酸化N-グリカンを有する該糖タンパク質を提供する工程、およびb該糖タンパク質を、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程を含む、方法。前記マンノシダーゼはAspergillussatoi由来である、請求項1に記載の方法。前記マンノシダーゼはCellulosimicrobiumcellulans由来である、請求項1に記載の方法。本文書は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼの発見を基にしている。一態様においては、本文書は、糖タンパク質におけるリン酸化N-グリカンを脱マンノシル化するための方法を特色にしている。本方法には、リン酸化N-グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程、および上記糖タンパク質を、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程を含む。上記マンノシダーゼは、AspergillussatoiまたはCellulosimicrobiumcellulans由来であることができる。該方法にはさらに、脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを含有する糖タンパク質を単離する工程を含むことができる。上記タンパク質は、真菌において発現するヒトタンパク質であり得る。例えば、真菌は、YarrowialipolyticaまたはArxulaadeninivoransであり得る。上記真菌は、上記タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。例えば、上記リソソームタンパク質は、リソソーム蓄積障害LSDと関連したリソソーム酵素のようなリソソーム酵素であり得る。LSDは、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイサックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマンピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトーラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコシェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキーパドラック症候群、チェディアック東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症Geleophysicdysplasiaであり得る。本文書は、真菌における脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを有する標的タンパク質を産生する方法も特色にする。上記方法は、上記基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞を提供する工程、ならびに標的タンパク質をコードする核酸を該細胞へ導入する工程を含む。本文書は、脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞も特色にする。上記真菌細胞は、YarrowialipolyticaまたはArxulaadeninivoransであり得る。上記真菌細胞は、上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記真菌細胞は、OCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作され得る。上記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、ここで、該真菌細胞は、OCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作される。真菌細胞にはさらに、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸を含むことができる。上記標的タンパク質は、ヒトタンパク質であり得る。上記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質であり得る。上記リソソームタンパク質は、リソソーム酵素であり得る。上記標的タンパク質は、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイサックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマンピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトーラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコシェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキーパドラック症候群、チェディアック東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症GeleophysicdysplasiaのようなLSDと関連したタンパク質であり得る。マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、MNN4ポリペプチド例えば、Yarrowialiplyticaポリペプチド、S.cerevisiaeポリペプチド、Ogataeaminutaポリペプチド、Pichiapastorisポリペプチド、またはC.albicansポリペプチドであり得る。マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドは、P.pastorisPNO1ポリペプチドであり得る。さらに別の態様においては、本文書は、Yarrowialipolytica細胞、Pichiapastoris細胞、Hansenulapolymorpha細胞、Ogataeaminuta細胞、Pichiamethanolica細胞、Arxulaadeninivorans細胞、またはAspergillusniger細胞の実質的に純粋な培養を特色にし、これらの細胞のうちのかなりの数は、脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを含有する糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作される。上記細胞にはさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。上記細胞は、OCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作されることができる。上記細胞にはさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むことができ、かつOCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作されることができる。別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似のまたは等価の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および材料を下記に説明する。本明細書において記載されている刊行物、特許出願、特許、Genbank登録商標受託番号、および他の参考文献はすべて、それらの内容が全体として参照により援用されている。矛盾する場合においては、定義を含む本出願が支配する。材料、方法、および実施例は、例示的であるに過ぎず、制限するよう意図するものではない。本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から明らかである。詳細な説明一般に、本文書は、すぐ接して基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解するための方法および材料を提供する。本明細書に記載される方法および材料は、リソソーム中の蓄積産物の分解に関与する触媒酵素のそこなわれた活性によるリソソーム中の該蓄積産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の1つの異なる群であるリソソーム蓄積障害LSDを有する患者を処置するための薬剤を生成するのに特に有用である。蓄積産物の集積は、細胞の機能障害および進行性の臨床症状をもたらす。異化酵素の欠損は、酵素補充療法ERTによって修正することができるが、但し、投与される酵素が罹患した細胞のリソソームへ導かれることができることを条件とする。リソソーム酵素は、典型的には、小胞体ERにおいて合成され、分泌経路を介してゴルジ体へ輸送され、次いでリソソームへ動員される糖タンパク質である。本明細書に記載される方法および材料を用いて、微生物を基にしたプロセスは、脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを有する治療タンパク質を得るために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法および材料は、LSDのような代謝障害の処置のために糖タンパク質を調製するのに有用である。マンノシダーゼ本文書は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することができるマンノシダーゼをコードする単離された核酸を提供する。用語核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書においては互換可能に使用され、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、および核酸類似体を含有するDNAまたはRNAを含む、RNAおよびDNAの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖であることができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNAmRNA、転移RNA、リボソームRNA、siRNA、ミクロRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書においては互換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。典型的には、本明細書に記載されるポリペプチド例えば、マンノシダーゼまたは脱マンノシル化した標的タンパク質は、該ポリペプチドが、調製物中の総タンパク質の少なくとも60重量、例えば、試料中の総タンパク質の60を構成する場合、単離されている。一部の実施形態においては、本明細書に記載されるポリペプチドは、調製物中の総タンパク質の少なくとも75重量、少なくとも90重量、または少なくとも99重量からなる。単離された核酸は、天然に存在するゲノム例えば、酵母ゲノムにおける核酸の片側または両側に正常に隣接している核酸を含む、天然に存在するゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を指す。用語単離されたは核酸に関して本明細書で使用する場合、天然に存在しない任意の核酸配列も含んでおり、なぜなら、このような非天然の配列は天然には見出されず、かつ天然に存在するゲノムにおいてじかに接触する配列を有さないからである。単離された核酸は、例えば、DNA分子であることができるが、但し、天然に存在するゲノムにおける該DNA分子にじかに隣接することが通常見出されている核酸配列のうちの1つは、除去されており、または不在であることを条件とする。したがって、単離された核酸は、他の配列とは独立した別個の分子例えば、化学的に合成された核酸、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたcDNAもしくはゲノムDNA断片として存在するDNA分子、およびベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルスへと、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへと組み込まれたDNAを含むが、これらに限定されない。加えて、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるDNA分子のような操作された核酸を含むことができる。例えばcDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー内に、またはゲノムDNA制限消化物を含有するゲルスライス内にある何百~何百万もの他の核酸のうちに存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。用語外来性は、核酸および特定の宿主細胞に関して本明細書において使用する場合、天然に見出されるような特定の細胞において生じないかつその細胞から得ることができない任意の核酸を指す。したがって、天然に存在しない核酸は、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であるとみなされる。天然に存在しない核酸が、天然に見出される核酸配列の核酸部分配列または断片を含有することができることを留意することは重要であり、但し、該核酸は全体として天然には存在しないことを条件とする。例えば、発現ベクター内にゲノムDNA配列を含有する核酸分子は天然に存在しない核酸であり、したがって、宿主細胞へと一旦導入されると該宿主細胞に対して外来性であり、なぜなら、該核酸分子は全体ゲノムDNAにベクターDNAを加えたものとして天然には存在しないからである。したがって、全体として天然には存在しない任意のベクター、自律的に複製するプラスミド、またはウイルス例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスは、天然に存在しない核酸であるとみなされる。PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたゲノムDNA断片ならびにcDNAは、天然には見出されない別個の分子として存在するので、天然に存在しない核酸であるとみなされるということになる。天然には見出されない配置のプロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列例えば、cDNAまたはゲノムDNAを含有する任意の核酸が天然に存在しない核酸であることにもなる。天然に存在する核酸は、特定の細胞に対して外来性ともなり得る。例えば、酵母xの細胞から単離された全染色体は、一旦、該染色体が酵母yの細胞へと導入されると、酵母yの細胞に関して外来性の核酸である。マンノシダーゼをコードする核酸は、配列番号3、または配列番号4において示されるヌクレオチド配列と少なくとも70の配列同一性例えば、少なくとも80、85、90、95、97、98、99、または100の配列同一性を有することができる。一部の実施形態においては、本明細書に記載される核酸は、配列番号5において示されるアミノ酸配列と少なくとも70例えば、少なくとも75、80、85、90、95、99、または100の同一性を有するマンノシダーゼポリペプチドをコードすることができる。特定のアミノ酸配列と配列番号5において示されるアミノ酸配列の間の同一性は、以下のとおり決定することができる。まず、BLASTPバージョン2.0.14を含有する独立型バージョンのBLASTZ由来のBLAST2SequencesBl2seqプログラムを使用してアミノ酸配列を整列させる。この独立型バージョンのBLASTZは、FishRichardsonのウェブサイト例えば、www.fr.com/blast/または米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.govから得ることができる。Bl2seqプログラムを使用する方法を説明する指示は、BLASTZに添付のリードミーファイルにおいて見出すことができる。Bl2seqは、BLASTPアルゴリズムを使用して2つのアミノ酸配列間の比較を実行する。2つのアミノ酸配列を比較するために、Bl2seqのオプションは、以下のとおり設定される。-iは、比較されるべき第一のアミノ酸配列を含有するファイル例えば、C:\seq1.txtに対して設定され、-jは、比較されるべき第二のアミノ酸配列を含有するファイル例えば、C:\seq2.txtに対して設定され、-pはblastpに対して設定され、-oは任意の所望のファイル名例えば、C:\output.txtに対して設定され、かつ他のオプションはすべて該オプションのデフォルト設定のままである。例えば、2つのアミノ酸配列間の比較を含有する出力ファイルを生じるために、以下のコマンド、すなわちC:\Bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastp-oc:\output.txtを使用することができる。この2つの比較される配列が相同性を共有する場合、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列した配列として示す。この2つの比較される配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列した配列を示さない。類似の手順は、blastnを使用することを除き、核酸配列について行なわれてよい。一旦整列すると、マッチ数は、同一のアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を計数することによって決定される。同一性は、マッチ数を全長のマンノシダーゼポリペプチドアミノ酸配列の長さによって除した後に、結果として生じる値に100を乗じることによって決定される。同一性の値は、最も近い10分の1の位に丸められることは留意される。例えば、78.11、78.12、78.13、および78.14は78.1へと切り捨てられるのに対し、78.15、78.16、78.17、78.18、および78.19は78.2と切り上げられる。長さの値が常に整数であることも留意される。多くの核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることは認識される。遺伝暗号の縮重は、当該技術分野に周知であり、すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のためのコドンとして機能する1つを超えるヌクレオチドのトリプレットがある。例えば、所与のマンノシダーゼポリペプチドについてのコード配列におけるコドンは、特定の種例えば、細菌または真菌における最適な発現が、該種のための適切なコドンバイアス表を使用して得られるよう改変され得る。2つの核酸配列間の相同性を評価するために、ハイブリダイゼーションを使用することもできる。本明細書に記載される核酸配列、またはその断片もしくはバリアントは、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。関心対象のプローブ例えば、Aspergillussaitoiヌクレオチド配列の一部を含有するプローブの、試験源由来のDNAまたはRNAとのハイブリダイゼーションは、該試験源におけるプローブに対応するDNAまたはRNA例えば、Aspergillussaitoiヌクレオチド配列の存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、CurrentProtocolsinMolecularBiology、JohnWileySons、N.Y.、6.3.1~6.3.6、1991において得ることができる。中程度のハイブリダイゼーション条件は、30°Cでの2×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCにおけるハイブリダイゼーションに続く50°Cでの1×SSC、0.1SDSにおける洗浄と等価として定義される。高度にストリンジェントな条件は、45°Cでの6×塩酸ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSCにおけるハイブリダイゼーションに続く、65°Cでの0.2×SSC、0.1SDSにおける洗浄と等価として定義される。本明細書における使用に好適なマンノシダーゼポリペプチドの他の候補物は、ヌクレオチドおよびポリペプチドの配列アラインメントの分析によって同定することができる。例えば、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のデータベースに関する質問を実行することにより、マンノシダーゼポリペプチドのホモログおよび/またはオルトログを同定することができる。配列分析は、公知のマンノシダーゼアミノ酸配列を使用する非重複データベースのBLAST分析、ReciprocalBLAST分析、またはPSI-BLAST分析を包含することができる。40超の配列同一性を有するデータベースにおけるマンノシダーゼポリペプチドは、マンノシダーゼポリペプチドとしての好適性についてのさらなる評価のための候補物として同定することができる。アミノ酸配列類似性は、ある疎水性残基の別の疎水性残基との置き換えまたはある極性残基の別の極性残基との置き換えのような保存的アミノ酸置換を可能にする。所望の場合、さらに評価されるべき候補物の数を絞るために、このような候補物の手動点検を実施することができる。本文書は、本明細書に記載されるマンノシダーゼのi生物活性のあるバリアントおよびiiその生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントも提供する。マンノシダーゼの生物活性のあるバリアントは、配列番号5に示すアミノ酸配列または配列番号3および4に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対する付加、欠失、または置換を含有することができる。置換を有するタンパク質は一般的に、50以下例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、または50を超えないの保存的アミノ酸置換を有する。保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似の特徴を有する別のアミノ酸との置換である。保存的置換には、以下の群内の置換が含まれる:バリン、アラニン、およびグリシン;ロイシン、バリン、およびイソロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;セリン、システイン、およびトレオニン;リシンおよびアルギニン;ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した塩基性アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。上記の極性基、塩基性基、または酸性基のうちのある構成員の、同一群の別の構成員による任意の置換は、保存的置換であるとみなすことができる。対照的に、非保存的置換とは、あるアミノ酸の、類似していない特徴を有する別のアミノ酸との置換である。欠失バリアントは、2つ以上のアミノ酸の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のアミノ酸セグメントまたは非連続的な単一のアミノ酸を欠失することができる。付加付加バリアントには、a配列番号3もしくは4に示す核酸配列によってコードされるマンノシダーゼまたは配列番号5に示すアミノ酸配列を有するマンノシダーゼまたはその断片と、b内部または末端CまたはNの無関係のまたは異種性のアミノ酸配列とを含有する融合タンパク質が含まれる。このような融合タンパク質の文脈においては、用語異種性アミノ酸配列は、a以外のアミノ酸配列を指す。異種性配列は例えば、組換えタンパク質例えば、FLAG、ポリヒスチジン例えば、ヘキサヒスチジン、赤血球凝集素hemagluttaninHA、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、またはマルトース結合タンパク質MBPの精製に使用される配列であることができる。異種性配列は、診断用マーカーまたは検出可能なマーカーとして有用なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質GFP、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATであることもできる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、別のタンパク質由来のシグナル配列を含有する。ある宿主細胞例えば、酵母宿主細胞においては、標的タンパク質の発現および/または分泌は、異種性シグナル配列の使用によって増大することができる。一部の実施形態においては、融合タンパク質は、例えば抗体産生のための免疫応答を惹起するのに有用なキャリア例えば、KLH、または小胞体もしくはゴルジ装置の保持シグナルを含有することができる。異種性配列は多様な長さであることができ、一部の場合においては、異種性配列が結合する全長の標的タンパク質よりも長い配列であることができる。マンノシダーゼの生物活性のある断片または生物活性のあるバリアントは、野生型の全長の成熟タンパク質のマンノシダーゼ活性例えば、脱マンノシル化することの少なくとも40例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、97、98、99、99.5、もしくは100、またはさらにそれより大を有する。本明細書に記載されるマンノシダーゼを使用して、脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。該方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。糖タンパク質を脱マンノシル化する方法本明細書に記載する場合、リン酸化N-グリカンを含有する糖タンパク質は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化することができる。このようなマンノシダーゼの非限定例としては、AspergillussatoiAsAspergillusphoenicisとしても公知由来のマンノシダーゼまたはCellulosimicrobiumcellulans例えば、CcMan4由来のマンノシダーゼが挙げられる。Aspergillussatoiマンノシダーゼのアミノ酸配列を配列番号5図15を参照されたいおよびGenBank受託番号BAA08634に示す。CcMan4ポリペプチドは、配列番号4に示すヌクレオチド配列図4を参照されたいによってコードされる。AspergillussatoiマンノシダーゼおよびCellulosimicrobiumcellulansマンノシダーゼ例えば、CcMan4を組換えで産生することができる。マンノシダーゼポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、標準的な技術によって生成することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR技術は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含有する単離された核酸を得るために使用することができる。PCRは、全ゲノムDNAまたは全細胞RNAに由来する配列を含む、DNAならびにRNAに由来する特定の配列を増幅するために使用することができる。一般的には、関心対象の領域の末端からのまたはそれを越えたところからの配列情報を使用して、増幅されるべきテンプレートの反対鎖と配列が同一または類似であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。種々のPCR戦略も利用可能であり、該戦略によって、部位特異的ヌクレオチド配列改変は、テンプレート核酸へと導入することができる。単離された核酸は、単一の核酸分子として例えば、ホスホルアミダイト技法を使用する3’から5’への方向における自動DNA合成を使用して、または一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされる場合に二本鎖が形成されるよう、各対が相補性のある短いセグメント例えば、約15ヌクレオチドを含有する所望の配列を含有する、1対以上の長いオリゴヌクレオチド例えば、100ヌクレオチド超を合成することができる。DNAポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長し、結果として、オリゴヌクレオチド対あたり単一の二本鎖核酸分子を生じ、それを次にベクターへと連結することができる。単離された核酸は、例えば、天然に存在するDNAの変異誘発によって得ることもできる。マンノシダーゼポリペプチドを組換え生成するために、マンノシダーゼポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有するベクターを使用する。本明細書で使用する場合、プロモーターは、遺伝子が転写されるようにすることができるDNA配列を指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼによって認識され、そのRNAポリメラーゼが転写を開始する。したがって、プロモーターは、RNAポリメラーゼが直接結合するかまたはRNAポリメラーゼの動員に関与するかのいずれかであるDNA配列を含有する。プロモーター配列は、エンハンサー領域も含まれ得、該領域は、タンパク質すなわち、トランス作用因子であり、ほとんどが1群の転写因子のようであると結合して遺伝子クラスターにおける遺伝子の転写レベルを高めることのできるDNAの1つ以上の領域したがって、その名前を有するである。エンハンサーは、コード領域の5’末端では典型的に、プロモーター配列とも異なることができる一方で、例えば、遺伝子のイントロン領域内または該遺伝子のコード領域に対して3’内にあることができる。本明細書で使用する場合、作動可能に連結されたは、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を有効に制御するよう、遺伝子コンストラクト例えば、ベクターへと組み込まれることを意味する。発現ベクターは、コードされたポリペプチドの発現のために宿主細胞へと例えば、形質転換またはトランスフェクションによって導入したのち、精製することができる。マンノシダーゼポリペプチドの小規模または大規模な産生のために使用することのできる発現系は、上記核酸分子を含有する組換えバクテリオファージDNA発現ベクター、プラスミドDNA発現ベクター、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌例えば、大腸菌E.coli、および該核酸分子を含有する組換え真菌発現ベクターで形質転換された真菌例えば、S.cerevisiae、Yarrowialipolytica、Arxulaadeninivorans、Pichiapastoris、Hansenulapolymorpha、またはAspergillusのような微生物を含むが、これらに限定されない。有用な発現系は、上記核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター例えば、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞系、および組換えウイルス発現ベクター例えば、タバコモザイクウイルスに感染させたまたは該核酸分子を含有する組換えプラスミド発現ベクター例えば、Tiプラスミドで形質転換した植物細胞系も含む。マンノシダーゼポリペプチドは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター例えば、メタロチオネインプロモーターもしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有する組換え発現コンストラクトを有する細胞例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ヒト胎児由来腎臓293細胞、および3T3L1細胞のような不死化した細胞系を含む哺乳類発現系を使用して産生することもできる。典型的には、組換えマンノシダーゼポリペプチドに、FLAG、ポリヒスチジン例えば、ヘキサヒスチジン、赤血球凝集素hemagluttaninHA、グルタチオン-S-トランスフェラーゼGST、またはマルトース結合タンパク質MBPのような異種性アミノ酸配列をタグ付けして、該タンパク質を精製するのを支援する。タンパク質を精製するための他の方法には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術が含まれる例えば、Scopes、ProteinPurification:PrinciplesandPractice、第3版、Springer-Verlag、NewYork1993;BurtonおよびHarding、J.Chromatogr.A814:71~811998を参照されたい。脱マンノシル化した糖タンパク質を産生するために、基礎をなすマンノースがリン酸化される末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を含有する標的分子を、好適な条件下で、マンノシダーゼまたは組換え産生されたマンノシダーゼを含有する細胞溶解産物と接触させる。好適なマンノシダーゼは上述されている。細胞溶解産物は、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞を含む遺伝子操作された任意の細胞由来であり得る。動物細胞の非限定例としては、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、および、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒトのような哺乳類が挙げられる。標的分子例えば、糖タンパク質を精製されたマンノシダーゼまたは細胞溶解産物に接触させると、末端α-1,2マンノース結合を加水分解して、脱マンノシル化した標的分子を生成することができる。細胞溶解産物におけるマンノシダーゼ活性の活性度または完全性を保存する該細胞溶解産物を得るのに好適な方法には、該細胞溶解産物におけるN-グリコシル化活性の変化を保存または最小化する適切なバッファならびに/またはヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤を含む阻害剤の使用を含めることができる。このような阻害剤は例えば、エチレンジアミン四酢酸EDTA、エチレングリコールビスP-アミノエチルエーテルN,N,N1,N1-四酢酸EGTAのようなキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニルPMSF、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなどのようなプロテアーゼ阻害剤、ならびにホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどのようなホスファターゼ阻害剤が挙げられる。酵素活性を含有する溶解産物を得るのに適切なバッファおよび条件は、例えば、Ausubelら、CurrentProtocolsinMolecularBiology別冊47、JohnWileySons、NewYork1999;HarlowおよびLane、Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress1988;HarlowおよびLane、UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress1999;Tietz、TextbookofClinicalChemistry,第3版、BurtisおよびAshwood編、W.B.Saunders、Philadelphia1999に記載されている。細胞溶解産物は適宜、干渉する物質の存在を除去または最小化するようさらに処理することができる。所望の場合、細胞溶解産物は、細胞下分画subcellularfractionation、およびイオン交換クロマトグラフィー、疎水性および逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィーなどのようなクロマトグラフィー技術を含む、当業者に周知の種々の方法によって分画することができる。一部の実施形態においては、細胞溶解産物は、細胞小器官全体が無傷および/または機能的であるままで調製することができる。例えば、溶解産物は、無傷の粗面小胞体、無傷の滑面小胞体、または無傷のゴルジ装置のうちの1つ以上を含有することができる。無傷の細胞小器官を含有する溶解産物を調製して、該小器官の機能性について試験するのに好適な方法は、例えば、Moreauら1991J.Biol.Chem.2667:4329~4333;Moreauら1991J.Biol.Chem.2667:4322~4328;Rexachら1991J.CellBiol.1142:219~229;およびPaulikら1999Arch.Biochem.Biophys.3672:265~273に記載されている。標的分子は、本明細書で使用する場合、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合の、末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を含有する任意の分子を指す。一部の実施形態においては、標的タンパク質は、ヒト糖タンパク質である。好適な標的タンパク質には、破傷風トキソイドまたはジフテリアdiptheriaトキソイドのような病原体タンパク質;サイトメガロウイルスCMV糖タンパク質B、H、およびgCIII、ヒト免疫不全ウイルス1型HIV-1エンベロープ糖タンパク質、ラウス肉腫ウイルスRSVエンベロープ糖タンパク質、単純ヘルペスウイルスHSVエンベロープ糖タンパク質、エプスタインバーウイルスEBVエンベロープ糖タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスVZVエンベロープ糖タンパク質、ヒトパピローマウイルスHPVエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、ならびに肝炎ファミリー表面抗原のようなウイルス表面タンパク質、リソソームタンパク質例えば、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、セレブロシダーゼ、またはガラクトセレブロシダーゼ、インスリン、グルカゴン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ならびにこれらの抗体または断片を挙げることができる。増殖因子には、例えば、血管内皮増殖因子VEGF、インスリン様増殖因子IGF、骨形態形成因子BMP、顆粒球コロニー刺激因子G-CSF、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF、神経成長因子NGF、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子PDGF、エリトロポエチンEPO、トロンボポエチンTPO、ミオスタチンGDF-8、増殖分化因子9GDF9、塩基性線維芽細胞増殖因子bFGFまたはFGF2、上皮増殖因子EGF、肝細胞増殖因子HGFが含まれる。サイトカインには、例えば、IL-1~IL-33例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、またはIL-15のようなインターロイキンが含まれる。ケモカインには、例えば、I-309、TCA-3、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1γ、エオタキシン、MCP-5、MCP-4、NCC-1、Ckβ10、HCC-1、ロイコタクチン-1、LEC、NCC-4、TARC、PARC、またはエオタキシン-2が含まれる。腫瘍糖タンパク質例えば、腫瘍関連抗原、例えば、がん胎児性抗原CEA、ヒトムチン、HER-2/neu、および前立腺特異抗原PSAも含まれる[HendersonおよびFinn、AdvancesinImmunology,62,pp.217~561996]。一部の実施形態においては、標的タンパク質は、リソソーム蓄積障害と関連したものであることができ、該標的タンパク質は、例えば酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、β-D-マンノシダーゼ、α-L-フコシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸-2-スルファターゼ、α-グルコサミニド-N-アセチルトランスフェラーゼ、β-D-グルクロニダーゼglucoronidase、ヒアルロニダーゼ、α-L-マンノシダーゼ、α-ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンK、およびリポタンパク質リパーゼを含む。一部の実施形態においては、標的タンパク質は、それが別のポリペプチド配列に、またはポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、もしくは検出可能な例えば、蛍光、発光、または放射性部分に融合した融合タンパク質である。例えば、標的タンパク質は、低分子タンパク質の分子量を増加させるために、および/または循環滞留時間を延長するために、ポリエチレングリコールのようなポリマーに結合することができる。糖タンパク質を脱マンノシル化するインビボでの方法本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、脱マンノシル化した標的分子を産生するために使用することができる。例えば、細胞を基にした方法は、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、末端α-1,2マンノース結合または末端α-1,2マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、脱マンノシル化したリン酸化N-グリカンを含有する標的分子を産生する工程を含むことができる。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼおよび標的分子をコードする核酸は、該マンノシダーゼおよび標的分子が共分泌されるよう、分泌配列を含有する。本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、マンノシダーゼをコードする核酸を含有する。標的分子のインビボでの産生に好適な細胞は、このような細胞は、本明細書に記載されるような遺伝子操作の前に、種々の商業的供給源および研究資源施設例えば、米国培養細胞系統保存機関米国メリーランド州ロックヴィルなどから得ることができる。標的分子には、本明細書に記載される任意の標的タンパク質などのタンパク質が含まれる上を参照されたい。細胞の遺伝子操作は、マンノシダーゼをコードする外来性核酸に加えて、i外側鎖伸長OCH1タンパク質をコードする内在性遺伝子の欠失、iiマンノシルリン酸化を促進してマンノース残基のリン酸化を増大させることができるポリペプチド例えば、Yarrowialiplytica、S.cerevisiae、Ogataeaminuta、Pichiapastoris、もしくはC.albicansに由来するMNN4ポリペプチド、またはP.pastorisに由来するPNO1ポリペプチドをコードする組換え核酸の導入、iiiOCH1タンパク質の機能的発現に干渉するRNA分子の導入または発現、ivN-グリコシル化活性を有する野生型例えば、内在性または外来性タンパク質をコードするすなわち、N-グリコシル化活性を有するタンパク質を発現する組換え核酸の導入、v上記の標的分子をコードする組換え核酸の導入、あるいはvN-グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする1つ以上の内在性遺伝子のプロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントを変更し、したがってそれらののコードタンパク質の発現を変更などの1種類以上の遺伝子改変を含むことができる。RNA分子は、例えば、低分子干渉RNAsiRNA、低分子ヘアピン型RNAshRNA、アンチセンスRNA、またはマイクロRNAmiRNAが含まれる。遺伝子操作には、N-グリコシル化活性を有して、付加例えば、異種性配列、欠失、または置換例えば、点変異のような変異、保存的変異または非保存的変異を有するタンパク質を産生するタンパク質をコードする内在性遺伝子を変更することも含まれる。変異は、例えば、部位特異的変異誘発または相同組換えによって特異的に導入することができ、または無作為に導入することができる例えば、細胞は、例えばNewmanおよびFerro-Novick1987J.CellBiol.1054:1587に記載されるように化学的に変異誘発され得る。本明細書に記載される遺伝子改変は結果的に、i遺伝子改変細胞における1種類以上の活性の増大、ii遺伝子改変細胞における1種類以上の活性の低下、またはiii遺伝子改変細胞における1種類以上の活性の局在性もしくは細胞内分布の変化、のうちの1つ以上を生じることができる。特定の活性の量の増大例えば、マンノシルリン酸化を促進することは、マンノシルリン酸化を促進することのできる1種類以上のタンパク質を過剰発現させること、内在性遺伝子のコピー数の増加例えば、遺伝子重複、または内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増大を刺激する該遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサーの変更によることができる。1種類以上の特定の活性の低下は、変異体形態例えば、ドミナントネガティブ形態の過剰発現、特定の活性を有する1種類以上のタンパク質の発現を低下させる1種類以上の干渉性RNA分子の導入もしくは発現、または特定の活性を有するタンパク質をコードする1種類以上の内在性遺伝子の欠失によることができる。相同組換えによって遺伝子を破壊させるために、遺伝子置換ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子を含むような方法で構築することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、5’末端および3’末端の両方で、相同組換えを仲介するのに十分な長さの遺伝子の部分に作動可能に連結され得る。選択可能なマーカーは、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、およびHIS3遺伝子を含む、宿主細胞栄養要求性を補完するかまたは抗生物質耐性を提供するかのいずれかである任意の数の遺伝子のうちの1つであることができる。他の好適な選択可能なマーカーには、酵母細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与えるCAT遺伝子、またはβ-ガラクトシダーゼの発現による青色コロニーを結果として生じるlacZ遺伝子が挙げられる。次に、遺伝子置換ベクターの線状化DNA断片を、当該技術分野で周知の方法を使用して上記細胞へと導入する下記を参照されたい。その線状断片のゲノムへの組込みおよび上記遺伝子の破壊は、選択マーカーを基にして決定することができ、例えば、サザンブロット分析によって実証することができる。選択可能なマーカーは、例えばCre-loxPシステムによって宿主細胞のゲノムから除去することができる下記を参照されたい。あるいは、遺伝子置換ベクターは、破壊されるべき遺伝子の一部を含むような方法で構築することができ、該一部は、任意の内在性遺伝子プロモーター配列がまったくなく、かつ該遺伝子のコード配列のいずれもコードせず、または該コード配列の不活性断片をコードする。不活性断片とは、上記遺伝子の全長のコード配列から生成されるタンパク質の活性の例えば約10未満例えば、約9未満、約8未満、約7未満、約6未満、約5未満、約4未満、約3未満、約2未満、約1未満、または0を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。上記遺伝子のこのような一部を、公知のプロモーター配列が該遺伝子配列に作動可能に連結されないものの、終止コドンおよび転写終結配列が該遺伝子配列の一部に作動可能に連結されるような方法で、ベクターに挿入する。このベクターはその後、遺伝子配列の一部において線状化し、細胞へと形質転換することができる。単一の相同組換えによって、この線状化ベクターを次に、上記遺伝子の内在性対応物に組み込む。発現ベクターは、自律的または組込み型であることができる。組換え核酸例えばマンノシダーゼをコードする組換え核酸は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはウイルス粒子のような発現ベクターの形態で細胞へと導入することができる。組換え核酸は、染色体外で維持することができ、または酵母細胞染色体DNAへと組み込むことができる。発現ベクターは、所望の核酸で形質転換した細胞の検出および/または選択を可能にするために、選択された条件下で細胞生存度に必要なタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子例えば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするURA3、またはトリプトファン生合成に必要な酵素をコードするTRP1を含有することができる例えば、米国特許第4,704,362号を参照されたい。発現ベクターには、自律複製配列ARSも含めることができる。例えば、米国特許第4,837,148号は、Pichiapastorisにおけるプラスミドを維持するのに好適な手段を提供する自律複製配列を記載している。統合型ベクターは、例えば、米国特許第4,882,279号において開示されている。統合型ベクターには一般的に、少なくとも1つの第一の挿入可能なDNA断片、1つの選択可能なマーカー遺伝子、および1つの第二の挿入可能なDNA断片からなる連続的に配置された配列が含まれる。第一および第二の挿入可能なDNA断片は各々、長さ約200例えば、約250、約300、約350、約400、約450、約500、または約1000、またはそれより長いヌクレオチドであり、かつ形質転換されるべき種のゲノムDNAの部分に対して相同的であるヌクレオチド配列を有する。発現のための関心対象の遺伝子例えば、N-グリコシル化活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前であろうと後であろうと、このベクターにおいて、第一の挿入可能なDNA断片と第二の挿入可能なDNA断片の間に挿入される。統合型ベクターは、関心対象のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進するために、酵母形質転換前に線状化され得る。発現ベクターは、酵母例えば、Yarrowialipolytica、Arxulaadeninivorans、P.pastoris、または他の好適な真菌種プロモーターの制御下での組換え核酸の特色をなすことができ、該プロモーターによって、真菌細胞において発現することができる。好適な酵母プロモーターには、例えば、ADC1プロモーター、TPI1プロモーター、ADH2プロモーター、hp4dプロモーター、POXプロモーター、およびGal10プロモーターが含まれる例えば、Guarenteら1982Proc.Natl.Acad.Sci.USA7923:7410を参照されたい。追加の好適なプロモーターは、例えば、ZhuおよびZhang1999Bioinformatics157~8:608~611ならびに米国特許第6,265,185号に記載されている。プロモーターは、構成的または誘導性条件的であることができる。構成的プロモーターは、は、標準的な培養条件下で発現が一定であるプロモーターであると理解されている。誘導性プロモーターとは、1つ以上の誘導指示Cueに対して応答性であるプロモーターである。例えば、誘導性プロモーターは、化学的に調節されることができ例えば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の低分子のような化学的誘導剤の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター、または物理的に調節され得る例えば、光または高温もしくは低温のような物理的誘導因子の存在または不在によってその転写活性が調節されるプロモーター。誘導性プロモーターは、化学的指示または物理的指示によってそれ自体が直接的に調節される1種類以上の転写因子によって間接的に調節されることもできる。遺伝子操作された他の改変も条件的であることができることは理解される。例えば、遺伝子は、例えばCre-loxP系のような部位特異的DNA組換え酵素を使用して、条件的に欠失させることができる例えば、Gossenら2002Ann.Rev.Genetics36:153~173および米国特許出願公開第20060014264号を参照されたい。組換え核酸は、スフェロプラスト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換法のような種々の方法を使用して、本明細書に記載された細胞へと導入することができる。プラスミドまたは線状核酸ベクターの細胞への形質転換に有用な他の方法は、例えば、米国特許第4,929,555号、Hinnenら1978Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929、Itoら1983J.Bacteriol.153:163、米国特許第4,879,231号、およびSreekrishnaら1987Gene59:115に記載されており、これらの各々の開示は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている。電気穿孔法およびPEG1000全細胞形質転換法も、CreggおよびRussel、MethodsinMolecularBiology:PichiaProtocols、第3章、HumanaPress、Totowa、N.J.、pp.27~391998に記載されているとおり使用してもよい。形質転換した真菌細胞は、新たな表現型の選択および検出のために細胞の栄養要求性により必要とされる生化学的産物の不在下で形質転換後に栄養要求性細胞を培養すること、または形質転換体に含有される耐性遺伝子の不在下で酵母に対して毒性のある抗生物質の存在下で培養することを含むがこれらに限定されない適切な技術を使用することによって選択することができる。形質転換体は、例えばサザンブロットまたはPCR分析によって評価することのできる、ゲノムへの発現カセットの組込みによって選択および/または実証することもできる。ベクターを関心対象の標的細胞に導入する前に、ベクターは、上に記載したとおり、大腸菌E.coliのような細菌細胞において増殖させる例えば、増幅させることができる。ベクターDNAは、ベクターDNAの細菌環境からの精製を結果として生じる、当該技術分野で公知の方法のうちの何らかによって、細菌細胞から単離することができる。精製されたベクターDNAは、大腸菌タンパク質が哺乳類細胞に対して毒性であることができるので、これらのタンパク質がプラスミドDNA調製物中に存在しないことを確保するために、フェノール、クロロホルム、およびエーテルで徹底的に抽出することができる。一部の実施形態においては、遺伝子操作された真菌細胞は、OCH1遺伝子またはその遺伝子産物例えば、mRNAまたはタンパク質を欠いており、OCH1活性を欠損している。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチド例えば、Yarrowialipolytica、S.cerevisiae、Ogataeaminuta、Pichiapastoris、もしくはC.albicansに由来するMNN4ポリペプチド、またはP.pastorisに由来するPNO1ポリペプチドを発現する。例えば、真菌細胞は、Y.lipolytica由来のMNN4ポリペプチドGenbank登録商標受託番号:XM_503217、Genolevures参照コード:YALI0D24101gを発現することができる。一部の実施形態においては、遺伝子操作された細胞は、OCH1活性を欠損しており、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドを発現する。脱マンノシル化の後、標的分子は単離することができる。一部の実施形態においては、標的分子は、酵母細胞内で維持され、細胞溶解の際に放出される。一部の実施形態においては、標的分子は、上記細胞からの該分子の分泌を誘導する、外来性核酸に対して天然であるかまたは発現ベクターへと操作されるかのいずれかであるコード配列によって提供される機序を介して培養培地へと分泌される。細胞溶解産物または培養培地中のキャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子の存在は、該分子の存在を検出するための種々の標準的なプロトコルによって実証することができる。例えば、変更した標的分子がタンパク質である場合、このようなプロトコルは、変更した標的タンパク質に特異的な抗体または該標的タンパク質自体を使用するイムノブロッティングまたは放射性免疫沈降、変更した標的タンパク質に特異的なリガンドまたは該標的タンパク質自体の結合、または変更した標的タンパク質または該標的タンパク質自体の酵素の比活性についての試験が含まれ得るが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、単離後に、脱マンノシル化した標的分子は、例えば酵素的手段または化学的手段を使用して異種性部分に結合することができる。異種性部分は、変更した標的分子に例えば、共有結合でまたは非共有結合で結合した任意の構成要素を指し、該構成要素は、変更した標的分子に元々存在する構成要素とは異なる。異種性部分には、例えばポリマー、キャリア、アジュバント、免疫毒素、または検出可能な例えば、蛍光、発光、または放射性部分を含む。一部の実施形態においては、追加のN-グリカンは、変更した標的分子に付加することができる。標的分子のグリコシル化を検出するための方法には、DNAシーケンサー支援型DSA、フルオロフォア支援型炭水化物電気泳動FACEまたは表面支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法SELDI-TOFMSが挙げられる。例えば、分析は、例えば糖タンパク質を変性させた後に、例えばメンブラン上へ固定化するDSA-FACEを利用することができる。上記糖タンパク質は次に、ジチオトレイトールDTTまたはβ-メルカプトエタノールのような好適な還元剤を用いて還元することができる。上記タンパク質のスルフヒドリル基は、ヨード酢酸のような酸を使用してカルボキシ化することができる。次に、N-グリカンは、N-グリコシダーゼFのような酵素を使用して該タンパク質から放出することができる。N-グリカンは必要に応じて、還元アミノ化によって再構成および誘導体化することができる。誘導体化したN-グリカンは次に濃縮することができる。N-グリカン分析に好適な計測手段には、例えば、ABIPRISM登録商標377DNAシーケンサーAppliedBiosystemsが含まれる。データ分析は、例えばGENESCAN登録商標3.1ソフトウェアAppliedBiosystemsを使用して実施することができる。単離されたマンノプロテインは、そのN-グリカン状態を確認するために、仔ウシ腸ホスファターゼのような1種類以上の酵素を使用してさらに処理することができる。N-グリカン分析の追加の方法には、例えば、質量分析例えば、MALDI-TOF-MS、順相、逆相における高圧液体クロマトグラフィーHPLC、およびイオン交換クロマトグラフィー例えば、グリカンが標識されていない場合にはパルス電流検出を使用し、グリカンが適切に標識されている場合、紫外吸収または蛍光を使用するが含まれる。Callewaertら2001Glycobiology114:275~281、およびFreireら2006Bioconjug.Chem.172:559~564も参照されたい。操作された細胞の培養物本文書は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちの任意の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において使用する場合、遺伝子操作された細胞の実質的に純粋な培養物とは、該培養物における生細胞の総数の約40未満すなわち、約35未満、約30未満、約25未満、約20未満、約15未満、約10未満、約5未満、約2未満、約1未満、約0.5未満、約0.25未満、約0.1未満、約0.01未満、約0.001未満、約0.0001未満、またはさらにより小が遺伝子操作された細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞酵母を含む、マイコプラズマ細胞、または原生動物細胞以外の生細胞である。本文脈における用語約とは、関連した百分率が、指定された百分率の15ほど指定された百分率を上回るまたは下回ることができることを意味する。したがって、例えば、約20とは、17~23であることができる。遺伝子操作された細胞のこのような培養物には、細胞および、増殖媒体、保存媒体、または輸送媒体が含まれる。媒体は、液体、半固形例えば、ゼラチン媒体、または凍結であることができる。上記培養物には、液体または半固形媒体で増殖する細胞、または、凍結保存媒体または輸送媒体を含む保存媒体または輸送媒体中で保存または輸送される細胞が含まれる。上記培養物は、培養容器または保存容器または基材例えば、培養皿、培養フラスコ、もしくは培養チューブ、または保存バイアルもしくは保存チューブの中にある。本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、例えば、凍結した細胞懸濁液として、例えば、グリセロールまたはスクロースのような凍結保護物質を含有するバッファ中に、凍結乾燥した細胞として保存することができる。あるいは、上記細胞は、例えば、流動床乾燥もしくは噴霧乾燥、または任意の他の好適な乾燥方法によって得られる乾燥した細胞調製物として保存することができる。代謝障害脱マンノシル化した分子は、種々の代謝障害を処置するために使用することができる。代謝障害とは、個々のヒトまたは動物細胞内でのエネルギー産生に影響する障害である。ほとんどの代謝障害は遺伝性であるが、一部は、食事、毒素、感染症などの結果として後天的であることができる。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知である。一般に、遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程における一部のプロセスに必要な酵素を失うことまたは不適切に構成されることを結果的に生じる遺伝的欠陥に起因する。最大のクラスの代謝障害は、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、有機酸代謝の障害有機酸性尿、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、プリン代謝もしくはピリミジン代謝の障害、ミトコンドリア機能におけるステロイド代謝障害の障害、ペルオキシソーム機能の障害、およびリソソーム蓄積障害LSDである。脱マンノシル化した1つ以上の分子または該分子の薬学的組成物の投与によって処置することのできる代謝障害の例としては、遺伝性ヘモクロマトーシス、眼皮膚型白皮症、プロテインC欠乏症、遺伝性血管性浮腫I型、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠損症、クリグラーナジャーII型、ラロン症候群、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ、原発性甲状腺機能低下症、先天性QT延長症候群、チロキシン結合グロブリン欠損症、家族性高コレステロール血症、家族性乳糜血症、無ベータリポタンパク血症abeta-lipoproteinema、低い血漿リポタンパク質Aレベル、肝損傷を伴う遺伝性気腫、先天性甲状腺機能低下症、骨形成不全症、遺伝性低フィブリノゲン血症、α1-アンチキモトリプシン欠損症、腎性尿崩症、神経下垂体性尿崩症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ペリツェウスメルツバッハー病、フォンウィルブランド病IIA型、複合第V因子第VIII因子欠損症、遅発性脊椎骨端異形成、コロイデレミア、I細胞病、バッテン病、毛細管拡張性運動失調、ADPKDすなわち常染色体優性多発嚢胞腎症、微絨毛性封入体病、結節硬化症、ローの眼脳腎症候群、筋萎縮性側索硬化症、骨髄異形成症候群、不全リンパ球症候群、タンジアー病、家族性肝内胆汁鬱滞、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー、スコット症候群、ヘルマンスキーパドラック症候群1型および2型、ツェルヴェーガー症候群、近接短縮性点状軟骨異形成症、常染色体劣性原発性高シュウ酸尿症、モールトラネビャエルグTranebjaerg症候群、脊髄性および延髄性筋萎縮症spinalandbullarmuscularatrophy、原発性線毛運動不全カルタゲナー症候群、巨人症および先端巨大症、乳汁漏出、アジソン病、副腎性男性化、クッシング症候群、ケトアシドーシス、原発性または続発性アルドステロン症、ミラーディカー症候群、滑沢脳、運動ニューロン疾患、アッシャー症候群、ヴィスコットオールドリッチ症候群、オピッツ症候群Optizsyndrome、ハンチントン病、遺伝性膵炎、抗リン脂質抗体症候群、オーバーラップ結合組織病overlapconnectivetissuedisease、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、ブルガダ症候群、フィンランド型先天性腎炎症候群、デュービンジョンソン症候群,X染色体連鎖低リン酸血症X-linkedhypophosphosphatemia、ペンドレッド症候群、新生児持続性高インスリン性低血糖症、遺伝性球状赤血球症、無セルロプラスミン血症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、偽性軟骨形成不全症および多発性骨端骨形成不全症multipleepiphyseal、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、X染色体連鎖シャルコーマリーツース病、常染色体優性網膜色素変性、ウォルコットラリソン症候群Wolcott-Rallisonsyndrome、クッシング病、肢帯筋ジストロフィー、ムコ多糖症mucoploy-saccharidosisIV型、フィンランド型遺伝性家族性アミロイドーシスhereditaryfamilialamyloidosisofFinish、アンダーソン病、肉腫、慢性骨髄単球性白血病、心筋症、顔面生殖器形成不全症faciogenitaldysplasia、捻転症、ハンチントン運動失調および脊髄小脳性運動失調、遺伝性高ホモシステイン血症hereditaryhyperhomosyteinemia、多発ニューロパチー、下位運動ニューロン疾患、色素性網膜炎pigmentedretinitis、セロネガティブ多発性関節炎、間質性肺線維症、レイノー現象、ウエゲナー肉芽腫症Wegner’sgranulomatosis、タンパク尿preoteinuria、CDG-Ia型、CDG-Ib型、CDG-Ic型、CDG-Id型、CDG-Ie型、CDG-If型、CDG-IIa型、CDG-IIb型、CDG-IIc型、CDG-IId型、エーラースダンロス症候群、多発性外骨腫症、グリセリ症候群1型または2型、またはX染色体連鎖非特異的精神遅滞を挙げることができる。加えて、代謝障害には、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイサックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマンピック病A型、B型、およびC型、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトーラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシスII型、III型、およびIV型、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコシェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキーパドラック症候群、チェディアック東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症などだがこれらに限定されないリソソーム蓄積障害も含めることができる。代謝障害の症状は多岐にわたっており、例えば、貧血、疲労、容易な紫斑形成、少ない血小板、肝腫脹、脾腫脹、骨格の弱化、肺の欠陥、感染症例えば、胸部の感染症または肺炎、腎臓の欠陥、進行性脳障害、発作、非常に濃い胎便、咳嗽、喘鳴、唾液または粘液の過剰産生、息切れ、腹痛、腸閉塞または消化管閉塞、妊孕性の問題、鼻の中のポリープ、指/足指の爪および皮膚の太鼓ばち指形成、手または足の疼痛、被角血管腫、少ない発汗、角膜およびレンズの混濁、白内障、僧帽弁逸脱症および/または僧帽弁逆流、心肥大、温度不耐症temperatureintolernce、歩行困難、嚥下困難、進行性失明、進行性聴覚喪失、緊張低下、巨舌、反射消失、腰痛、睡眠時無呼吸、起座呼吸、傾眠、脊柱前弯、あるいは脊柱側弯のうちの1種類以上を含むことができる。欠損しているタンパク質または存在しないタンパク質の多様な性質および結果として生じる疾患の表現型例えば、代謝障害の症候的呈示により、所与の障害が一般的には、その特定の障害に対して特徴的な症状のみを示すことは理解される。例えば、ファブリー病患者は、温度不耐症、角膜回転、疼痛、皮疹、吐き気、または下痢のような、しかしこれらに限定されない上記の症状の特定の部分集合を示し得る。ゴーシェ症候群患者は、巨脾腫症、硬変、痙攣、緊張亢進、無呼吸、骨粗鬆症、または皮膚変色を示し得る。本明細書に記載される脱マンノシル化した1つ以上の分子の投与に加えて、代謝障害は、適切な栄養およびビタミン類例えば、補因子療法、理学療法、および疼痛用薬物適用によっても処置することができる。所与の代謝障害の具体的な性質に応じて、患者は、いずれかの齢においてこれらの症状を示し得る。多くの症例においては、症状は、小児期にまたは青年期に示し得る。例えば、ファブリー病の症状は、少年期、例えば10歳または11歳で示し得る。本明細書で使用する場合、代謝障害を発達させる危険にある被験体とは、障害を発達させる素因、すなわち、酸性αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、β-D-マンノシダーゼ、α-L-フコシダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、イズロン酸-2-スルファターゼ、α-グルコサミニド-N-アセチルトランスフェラーゼ、β-D-グルクロニダーゼglucoronidase、ヒアルロニダーゼ、α-L-マンノシダーゼ、α-ノイラミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、酸性リパーゼ、酸性セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、チオエステラーゼ、カテプシンK、またはリポタンパク質リパーゼのような酵素における変異の結果として代謝障害を発達させる遺伝素因を有する被験体である。明らかに、代謝障害を発達させる危険にある被験体とは、関心対象の種内の被験体すべてではない。障害を有すると疑われる被験体とは、本明細書に記載される代謝障害のうちのいずれかなど代謝障害の1つ以上の症状を有する被験体である。薬学的組成物および処置方法脱マンノシル化した標的分子は、治療有効量の該分子と1種類以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および/または希釈剤とを含有する薬学的組成物へと組み込むことができる。許容し得る希釈剤、キャリア、および賦形剤は典型的には、受容者の恒常性例えば、電解質平衡に有害に影響することはない。許容し得るキャリアには、生体適合性、不活性、または生体吸収可能な塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、保存剤などが含挙げられる。ある例示的なキャリアは、生理食塩水0.15MNaCl、pH7.0~7.4である。別の例示的なキャリアは、50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムである。薬学的組成物の製剤化および投与についての技術に関するさらなる詳細は、例えば、Remington’sPharmaceuticalSciencesMaackPublishingCo.、米国ペンシルバニア州イーストンにおいて得ることができる。補充用活性化合物も上記組成物中に組み込むことができる。脱マンノシル化した分子を含有する薬学的組成物の投与は、全身性または局所性であることができる。薬学的組成物は、非経口投与および/または経口投与に好適であるよう製剤化することができる。具体的な投与様式には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、髄腔内投与、経口投与、直腸投与、口腔投与、局所投与、鼻投与、眼投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、リンパ投与、膣投与、および子宮内投与が含まれる。投与は、薬学的組成物のボーラスによる周期的注入によることができるか、または外部例えば、静脈内用の袋または内部例えば、生分解性埋没物、生体人工臓器、または植え込み型の改変N-グリコシル化分子産生細胞のコロニーである貯蔵器からの静脈内投与または腹腔内投与によって中断されないでいることができ、もしくは持続的であることができる。例えば、米国特許第4,407,957号、同第5,798,113号、および同第5,800,828号を参照されたい。薬学的組成物の投与は、ポンプ例えば、AnnalsofPharmacotherapy,27:9121993;Cancer、41:12701993;CancerResearch、44:16981984を参照されたい、マイクロカプセル封入例えば、米国特許第4,352,883号、同第4,353,888号、および同第5,084,350号を参照されたい、持続放出性ポリマー埋没物例えば、Sabelの米国特許第4,883,666号を参照されたい、マクロカプセル封入例えば、米国特許第5,284,761号、同第5,158,881号、同第4,976,859号、および同第4,968,733号、ならびにPCT公開特許出願WO92/19195号、WO95/05452号を参照されたい、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、もしくは他の好適な部位のいずれかへの注射、またはカプセル剤、液剤、錠剤、丸剤、もしくは持続放出製剤での経口投与のような好適な送達手段を使用して達成することができる。非経口送達系の例としては、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み可能な注入系、ポンプ送達、被包細胞送達、リポソーム送達、針送達系注射、無針注射、ネブライザー、エーロゾライザー、電気穿孔法、および経皮パッチが挙げられる。非経口投与に好適な製剤は、改変N-グリコシル化分子の滅菌水性調製物を便利に含有しており、好ましくは受容者の血液と等張である例えば、生理学的塩類溶液。製剤は、単位用量形態または複数回用量形態で提供することができる。経口投与に好適な製剤は、各々、あらかじめ決めておいた量の改変N-グリコシル化分子を含有するカプセル剤、カシェ剤、錠剤、もしくはロゼンジ、またはシロップ剤、エリキシル剤、乳剤、もしくは頓服水剤draughtのような、水性リカーもしくは非水性液中の懸濁剤のような分離した単位として提供することができる。局所投与に好適な脱マンノシル化した分子は、哺乳類例えば、ヒト患者へ、例えばクリーム、スプレー、泡状物質、ジェル、軟膏、塗薬、またはドライラブdryrubとして投与することができる。ドライラブは、投与部位で再含水することができる。このような分子は、包帯、ガーゼ、またはパッチへも直接注入することができ例えば、浸漬して、および乾燥して、次に、それは局所的に適用することができる。このような分子は、局所投与のための包帯、ガーゼ、またはパッチに半液状、ゲル状、または完全に液状で維持することもできる例えば、米国特許第4,307,717号を参照されたい。治療有効量の薬学的組成物は、それを必要とする被験体へ、当業者によって確かめることのできる投与計画で投与することができる。例えば、組成物は、上記被験体へ、例えば1投薬あたり、被験体の体重1kgあたり0.01μg~10,000μgの薬用量で全身投与することができる。別の例においては、薬用量は、1投薬あたり、被験体の体重1kgあたり1μg~100μgである。別の例においては、薬用量は、1投薬あたり、被験体の体重1kgあたり1μg~30μg、例えば、1投薬あたり、被験体の体重1kgあたり3μg~10μgである。治療効能を最適化するために、脱マンノシル化した分子はまず、異なる投与計画で投与することができる。単位用量および計画は、例えば、哺乳類の種、その免疫状態、該哺乳類の体重を含む因子に左右される。典型的には、組織におけるこのような分子のレベルは、例えば、所与の処置計画の効能を決定するための臨床試験手順の一部として適切なスクリーニングアッセイを使用して監視することができる。脱マンノシル化した分子についての投与頻度は、医療従事者例えば、医師または看護師の技術および臨床的判断のうちにある。典型的には、投与計画は、最適な投与パラメータを確立し得る臨床試験によって確立する。しかしながら、上記従事者は、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医学的状態に従ってこのような投与計画を変更してもよい。投与の頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変更することができる。このような分子またはその薬学的組成物の毒性および治療的効能は、例えば細胞培養物または実験動物における公知の医薬手順によって決定することができる。これらの手順は、例えば、LD50集団の50が致死する量およびED50集団の50における治療有効量を決定するために使用することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それはLD50/ED50の比として表すことができる。高い治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。毒性のある副作用を示す薬学的組成物を使用することはできるが、正常細胞例えば、非標的細胞に対する潜在的な障害を最小化し、それにより副作用を低減するために、影響される組織の部位にこのような化合物を向ける送達系を設計するよう注意を払うべきである。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、適切な被験体例えば、ヒト患者における使用のためのある範囲の薬用量を製剤化する上で使用することができる。このような薬学的組成物の薬用量は一般的に、ほとんどまたはまったく毒性を有さないED50を含むある範囲の循環濃度内に収まる。薬用量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。例えば、被験体における代謝障害を処置するために本明細書に記載されるように使用される薬学的組成物については、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなIC50すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する薬学的組成物の濃度を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。本明細書において定義する場合、脱マンノシル化した分子の治療有効量とは、処置された被験体における医学的に望ましい結果例えば、代謝障害の1種類以上の症状の改善を生むことのできる分子の量である。治療有効量すなわち、有効薬用量には、被験体の体重または試料の重量の1キログラムあたりの化合物のミリグラム量またはマイクログラム量例えば、1キログラムあたり約1マイクログラム~1キログラムあたり約500ミリグラム、1キログラムあたり約100マイクログラム~1キログラムあたり約5ミリグラム、または1キログラムあたり約1マイクログラム~1キログラムあたり約50マイクログラムを含めることができる。被験体は、任意の哺乳類、例えばヒト例えば、ヒト患者または非ヒト霊長類例えば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウマ、ある種の家畜例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギ、イヌ、ネコ、またはクジラであることができる。本明細書に記載される分子またはその薬学的組成物は、被験体へ、別の処置、例えば、代謝障害例えば、リソソーム蓄積障害のための処置との併用療法として投与することができる。例えば、併用療法には、被験体例えば、ヒト患者へ、代謝障害例えば、リソソーム蓄積障害を発達させるまたは有すると疑われる危険を有するまたは該危険にある被験体へ治療上の利点を提供する1種類以上の追加の薬剤を投与することを含めることができる。したがって、上記化合物または薬学的組成物および1種類以上の追加の薬剤は、同時に投与することができる。あるいは、上記分子を第一に投与し、かつ第二に上記1種類以上の追加の薬剤を投与することができ、またはその逆を行なうこともできる。以前の治療薬が特に毒性である場合例えば、重大な副作用特性を有する、代謝障害に対する処置においては、本明細書に記載される分子の投与を用いて、以前の治療薬の量を、毒性を有さずに同じかまたは改良された治療上の利点を与えるのに十分なレベルまで代償するおよび/または低下させることができる。本明細書に記載される薬学的組成物のうちの任意のものが、投与のための指示とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。以下は、本発明の実施例である。該実施例は、本発明の範囲をいずれかの方法で制限するものとして解釈されるべきではない。実施例1huGAA発現株の生成3コピーのヒトαグルコシダーゼ酸性αグルコシダーゼGAAまたは酸性マルターゼEC3.2.1.3としても公知および2コピーのY.lipolyticaMNN4遺伝子を含有する、Y.lipolytica株OXYY1589を構築した。OXY1589株の遺伝子型は、以下のとおりである。形質転換はすべて、異なる選択的マーカーについての改変を使用する十分に確立されたプロトコルに従って実施した。別段の指定がない限りすべての場合において、カナマイシン耐性遺伝子を発現プラスミドから除去するために、huGAA組込み断片をNotI制限消化によって得た。結果的に生じる断片をすべてアガロースゲル電気泳動によって分離した後に、正確なhuGAA断片をQiagenカラムにより精製した。ヒトGAAhuGAAをY.lipolytica発現ベクターへとまずクローニングして、Y.lipolyticaMNN4縦列発現ベクターを構築することによって、OXYY1589株を構築した。次に、最終のhuGAA産生株OXYY1589を得るために、3つの安定した組込み型形質転換を実施した。Y.lipolyticaコドン最適化huGAA発現ベクター110kDAのヒトGAAhuGAA前駆体をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成し、Y.lipolytica発現についてコドン最適化した。合成コンストラクトにおいては、上記タンパク質がアミノ酸57において開始するよう、プレhuGAAシグナルペプチドおよびプロhuGAAシグナルペプチドを除去した。huGAAの合成オープンリーディングフレームORF図1AをY.lipolyticaLIP2シグナル配列プレの5’末端から3’末端までをインフレームで融合させ、2つのXxx-Ala切断部位のコード配列をその後に続け、発現ベクターへのクローニングのためのBamHI制限部位およびAvrIIの制限部位を隣接させた。上記コンストラクトは、誘導性POX2プロモーターの制御下にある。融合タンパク質の完全なアミノ酸配列を図1Bに示す。発現ベクターの一般的な概略図を図2に示す。細菌部分は、pHSS6プラスミドに由来したので、細菌複製起点oriおよびカナマイシンに対する耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子KanRを含む。組込みカセットは、aYarrowialipolyticaへの形質転換のための選択マーカーURA3、LEU2、GUT2、bプロモーターから構成される発現カセット、cインフレームでシグナル配列とともにhuGAAを挿入するためのマルチプルクローニングサイトMCS、およびdLIP2遺伝子のターミネーターを含んでいた。組込みカセットは、Y.lipolyticaゲノムへの安定した非相同組込みのためにζ配列によって隣接させた。2つのNotI制限部位は、形質転換前の発現カセットの単離を可能にする。pRAN034プラスミド、pRAN036プラスミド、およびOXYP183プラスミドを使用して、URA3形質転換マーカー、LEU2形質転換マーカー、およびGUT2形質転換マーカーをそれぞれ含有するhuGAA発現ベクターpRAN058、pRAN059、およびpRAN060を生成した。縦列YlMNN4発現ベクターYlMNN4遺伝子を、誘導性pPOX2プロモーターの制御下で、かつ半構成的hp4dプロモーターの制御下でクローン化した。YlMNN4のこれら2つの発現カセットを1つのベクターへと、ゲノムのADE2遺伝子座への標的化組込みのためのADE2遺伝子と選択的マーカーとしてのADE2遺伝子からなる隣接領域PTを保有する縦列コンストラクトとしてサブクローニングした。中間株OXYY1569第一の形質転換は、中間の組換え株OXYY1569を作製するため、URA3マーカーおよびLEU2マーカーを使用して、pRAN058ベクターおよびpRAN059ベクターから精製した発現カセットの共形質転換であった。OXYY1569は、G014株のゲノムに無作為に組み込まれたpPOX2プロモーターの制御下でhuGAAの2つの発現コンストラクトを保有している。OXYY1569を以下のとおり選択した。Y.lipolyticaのゲノムへの外来性huGAADNAの組込みを確認するために、ゲノムDNAのPCRスクリーニングを実施した。プライマーは、huGAAヌクレオチド配列由来の2552塩基対の断片を増幅させるよう設計した。少なくとも2コピーのhuGAADNAの組込みを確認するために、ゲノムDNAのサザンブロット分析も実施した。詳細には、OXYY1569クローン由来のゲノムDNAをHindIIIで消化し、huGAADIG標識した特異的プローブを使用して探査した。高レベルのhuGAAを分泌するクローンを選択するために、PCRスクリーニングおよびサザンブロットにおいて陽性として同定された無作為に選択したいくつかのクローンを、POX2誘導条件下で標準的な手順に従って振盪フラスコ中で増殖させた。すべての場合において、培養上清を誘導72時間後に回収し、標準的なウェスタンブロットおよび酵素活性アッセイ分析においてスクリーニングした。OXYY1569のN-グリカン分析は、OXYY1569における支配的な構造がMan8GlcNAc2であることを示した。中間の株OXYY1584Y.lipolyticaMNN4遺伝子の2つのコピーをそのゲノムに組み込んで、OXYY1584を生成するために、組換え株OXYY1569を形質転換した。プラスミドOXYP1479Bから切り出したSacII/XmaI由来の発現カセットを使用して、形質転換を実施した。Y.lipolyticaゲノムのADE2遺伝子座への標的化組込みのために発現カセットを設計した。組換え株をサザンブロット法およびグリカン分析の後に選択して、増大したリン酸化に関する該株の挙動を評価した。任意に選択したいくつかの形質変換体のゲノムDNAをSpeIで消化し、MNN4特異的なDIG標識したプローブを使用して探査した。Y.lipolyticaゲノムのADE2遺伝子座へのMNN4発現カセットの正確な標的化組込みは、4207塩基対および5683塩基対のバンドを生じるべきである。サザンブロット陽性クローンを標準的な振盪フラスコ手順で増殖させた。中間のクローンOXYY1584を選択するために、分泌したタンパク質のN-グリカン分析を実施した。親株OXXY1569と比較して、MNN4過剰発現後の支配的な構造は、Man8GlcNAc2PMan1およびMan8GlcNAc2PMan2であった。産生株OXYY1589最終の原栄養体産生株OXYY1589を生成するために、huGAAの第三のコピーを組換えOXYY1584株のゲノムに組み込んだ。pRAN069からNotIで切り出した発現カセットを使用して形質転換を実施した。最初に、huGAAの追加のコピーの存在について、形質転換体のgDNAに関するPCRによってスクリーニングした。huGAA産生を評価するために、標準的な振盪フラスコ培養後の発現について、任意に選択したPCR陽性クローンをさらに分析した。最高レベルのhuGAAを発現するクローンOXYY1589をウェスタンブロット分析および酵素活性アッセイ後に選択した。M8のMP2-M8N-グリカンおよびMP-M8N-グリカンへの転換レベルが追加のhuGAA発現カセットの存在によって影響されないことも再確認した。実施例2OXYY1589株の流加培養OXYY1589株実施例1からhuGAAを産生するために、作業容積6~8Lを有する撹拌した10Lタンクを使用して流加プロセスを確立した。上記プロセスを2つの相に分割した。1バイオマス形成のためのグルコースに関するバッチ増殖2限定されたオレイン酸供給の支援による誘導による産物形成。典型的には、バッチ相は約20時間hであり、産生相はおよそ72時間であった。上記プロセスの終了時点で、培養ブロスを遠心分離し、上清を回収した。上清をGAAの精製のための出発材料として使用した実施例3を参照されたい。以下のパラメータを発酵中に制御した。エアレーションを1.5vvm空気1分間あたり1容積あたりの容積の一定値で維持した。溶存酸素DOを初期には30で維持した。撹拌を600rpmから1200rpmへとDOレベルに応じて増大させた。一旦撹拌が最大値1200rpmに到達すると、その速度を一定のままにし、DO設定値を10に設定した。10DOを維持するために、酸素を50の最大百分率で反応器へと加えた。泡沫の発生foamevolutionを泡沫プローブによって制御した。泡沫検出のケースでは、消泡剤をバイオリアクターへ添加した。pH6.8の一定値を維持するために、14v/vアンモニア塩基または10リン酸を添加することによって、pHを制御した。全プロセスの間中、温度を28°Cで一定のままにした。バイオマスを、600nmでの光学密度OD600の測定によって監視した。試料を蒸留水で2~1000倍希釈して、分光光度計の直線範囲で値を得た。産物形成をウェスタンブロット分析および特異的酵素活性試験によって検出した。実施例3組換えhuGAArhGAAの精製培養後の上清実施例2を参照されたいを、デプス濾過を介して清澄化した。次に、結果として生じる材料を、TFFを介して20倍濃縮し、10kDaのMNCOメンブランMilliporeで、20mMリン酸ナトリウムpH6および100mMNaClに対して透析濾過した。rhGAAの精製を、最高1M濃度までの硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。遠心分離後、上清をToyopearl-Phenyl650MTosohBiosciencesを充填したXK16/40カラムにのせた。1Mから0Mへの硫酸アンモニウムの直線勾配を溶出に適用した。次に、rhGAAを含有する画分をプールし、10mMBIS-TRISpH6へのバッファ交換に供した。0Mから1MへのNaClの直線塩勾配を使用する、ソース30Qを充填したTricorn10/50またはXK25/20カラムGEHealthcareの陰イオン交換クロマトグラフィーを介して、さらなる精製を達成した。次に、結果として生じるGAA含有画分を濃縮した後、50mMリン酸ナトリウムpH6および200mMNaClであらかじめ平衡化しておいた最終のHiload16/60superdex200ゲル濾過カラムGEHealthcareにのせた。比活性およびクーマシー染色したSDS-PAGEゲルにおける純度を基にして画分を選択した後、合一して、5~10mg/mlの終濃度へと濃縮した。10kDaの分子量カットオフを備えた15mlのAmicon超遠心分離デバイスMilliporeを使用して、タンパク質を濃縮した。rhGAAについての定性的スクリーニングの反応を、10:1または20:1の容積比で、0.35mM4-MUG、0.1BSA、および100mM酢酸ナトリウムpH4からなる反応緩衝液を10μlまたは5μlの溶出画分へ添加することによって開始した。すべての反応を96ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて実施した。37°Cで30分間~1時間のインキュベーション時間後、等容積の100mMグリシンpH11を添加して、反応を停止させ、蛍光原性反応産物4-メチルウンベリフェロンの放出を紫外光の下で観察した。比活性単位/mgタンパク質を、黄色のp-ニトロフェノラート反応産物の酵素放出を測定する合成基質p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシドPNPGを用いる比色アッセイを使用して決定した。上記反応は、10μlの酵素溶液および90μlの基質反応緩衝液150mMクエン酸-リン酸緩衝液pH4、1BSA中の2mMPNPGをマイクロタイタープレートの反応ウェル中で混合することによって開始し、その後37°Cでインキュベートした。1~2時間後、等容積の停止バッファ10炭酸ナトリウムpH12を添加して、その反応をクエンチし、放出されたp-ニトロフェノールPNPをイオン化状態に転換した。バックグラウンド補正した吸光度およびp-ニトロフェノラート標準物質を405nmの波長で測定し、比活性を算出した。タンパク質濃度をビシンコニン酸BCA法を用いて決定した。1単位を、クエン酸-リン酸緩衝液pH4.0中の2mMの最終基質濃度において37°C、1分間当たり1nmolのPNPGから1nmolのPNPおよびD-グルコースへの変換を触媒する酵素の量として定義した。実施例4CcMan5およびCcMan4の発現CcMan4のORFおよびCcMan5のORFを、DsbAシグナル配列を含有して結果的にN末端ポリヒスチジンタグを有するタンパク質の発現を生じるpLSAH36ベクターへとクローン化した。上記タンパク質の発現を大腸菌E.coliBL21細胞において実施した。ペリプラズムに存するタンパク質を、Talonカラムを使用して単離および精製した。DsbA-CcMan5およびDsbA-CcMan4のORFのヌクレオチド配列を図3および図4に提供する。pLSAHCcMan5プラスミドおよびpLSAHCcMan4プラスミドの図解表示を図5に与える。実施例5APTS標識したリン酸化N-グリカンのGH47α-マンノシダーゼによる脱マンノシル化HypocreajecorinaHjアナモルフ:Trichodermareesei由来のGH47α-1,2-マンノシダーゼは、オリゴ糖Man9GlcNAc2由来の4つのα-1,2結合型マンノース糖をすべて逐次的に切断することができるMaras,M.ら、J.Biotechnol、77:255~2632000。類似の活性をAspergillussatoiAsAspergillusphoenicisとしても公知由来のα-1,2-マンノシダーゼについて記載されているIchishimaE.ら、Biochem.J.、339:589~597。HjManGenbanknrAAF34579をPichiapastorisにおいて発現させ、Maras,M.ら、J.Biotechnol,77:255~2632000に記載されるとおり精製した。AsManGenbank番号BAA08634の市販の酵素調製物は、Prozyme-Glyco社から入手可能である。H.jecorinaおよびA.satoi由来のα-1,2-マンノシダーゼを、Man8GlcNAc2M8糖、一リン酸化したManP-Man8GlcNAc2MP-M8糖、および/または二リン酸化したManP2-Man8GlcNAc2MP2-M8糖を含有する、MNN4遺伝子を過剰発現するYarrowialipolytica細胞に由来する8-アミノ-1,3,6,-ピレントリスルホン酸APTS標識した糖の混合物に関して試験した。図6においては、潜在的な最終加水分解産物を概略的呈示で示しており、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、α-1,2-マンノシダーゼは末端α-1,2-マンノースも加水分解できると想定される。キャップの外されたホスフェート残基を有するリン酸化N-グリカンしたがって、末端ホスフェートが存在するオリゴ糖でα-1,2-マンノシダーゼの活性を試験することができるよう、MNN4糖を、ホスフェートのキャップ外し活性を有するCellulosimicrobiumcellulans由来のGH92酵素であるCcMan5で処理した図7。CcMan5は、マンノース-ホスホ-マンノースジエステル結合における末端マンノースを除去する。別段の記載がない限り、AsManおよびHjManによるAPTS標識したN-グリカンへの反応はすべて、2mMCaCl2を含む10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH5.0中で37°C、一晩実施した。CcMan5反応を室温かつpH7.0で、2mMCaCl2を添加した10mMHEPES緩衝液を使用して実施した。ホスフェートがキャップを外されたグリカンの存在を確認するために、または末端ホスフェートを有する迅速に泳動されるグリカンの構造を同定することができるよう、仔ウシ腸ホスファターゼCIPをその後、反応混合物に添加した。ホスフェート加水分解後に中性N-グリカンが得られるが、それはRNAseBから放出されたAPTS標識したN-グリカン由来の電気泳動図との比較を通じて同定することができるMan9-5GlcNAc2。図8においては、Man8GlcNAc2および一リン酸化糖ManP-Man8GlcNAc2を含有するN-グリカン調製物パネルBの、HjManおよびAsManによる加水分解についてのDSA-FACE電気泳動図を示す。両α-1,2-マンノシダーゼによって、Man8GlcNAc2はMan5GlcNAc2へと加水分解されたのに対し、ManP-Man8GlcNAc2の加水分解についての差が観察された。HjManは、2つのα-1,2結合型マンノースを放出した可能性が高いパネルCにおけるManP-Man6GlcNAc2。AsMan処理後に現れるわずかに迅速に泳動されるピークは、3つのα-1,2結合型マンノースの放出、したがって、ManP-Man5GlcNAc2の形成を示唆したパネルD。新たに形成された産物は、仔ウシ腸ホスファターゼCIPによる処理後に消失せず、ホスフェートがなおもマンノースでキャップ形成されていることが確認されたパネルEおよびパネルF。パネルEにおける迅速に泳動するピークがManP-Man6GlcNAc2でありかつパネルDにおける該ピークがManP-Man5GlcNAc2であることを確認するために図8、HjManおよびAsManによる実験をMNN4糖に関して反復し、まず該糖をホスフェートのキャップを外す酵素CcMan5P-Man8GlcNAc2を生じる、図8におけるパネルCで処理した。α-1,2-マンノシダーゼとともに37°Cで20分間、40分間、および180分間インキュベートした後、この反応混合物を100°Cで3分間加熱することによって、この反応を停止させた。次に、CIP処理を実施した。HjManによる結果を図9Aに示す。HjManは、P-Man8GlcNAc2をP-Man7GlcNAc2およびP-Man6GlcNAc2へと逐次的に切断したパネルD~パネルF。AsManは、3つのα-1,2結合型マンノースを逐次的に除去して、P-Man7GlcNAc2、P-Man6GlcNAc2、およびP-Man5GlcNAc2の形成を結果として生じた。図9Bを参照されたい。上記の結果図9Aおよび図9Bは、MNN4グリカンのα-1,2-マンノシダーゼによる一晩の消化図8とともに、α-1,6アームN-グリカンの右側のアーム図6Aおよび図6Bにおいて概略的に示されているのみがリン酸化されているかどうかを説明し得るに過ぎない。基礎をなすマンノースがリン酸化される場合、A.satoiα-1,2-マンノシダーゼのみが、末端α-1,2-マンノースを加水分解できるリン酸残基は、マンノース残基でキャップ形成されており、またはキャップ形成されていない。HjManのみが、2つのα-1,2結合型マンノースを非リン酸化型α-1,3アームから除去する。基礎をなすマンノースがリン酸化されている場合にAsManが末端α-1,2-マンノースを除去できかつHjManは除去できないという事実も、一リン酸化したManP-Man8GlcNAc2および二リン酸化したManP2-Man8GlcNAc2から構成されるMNN4調製物が使用される場合に確認される図10、パネルC。AsManは、パネルDにおける迅速に泳動される2つの特別のピークManP2-Man7GlcNAc2およびManP2-Man6GlcNAc2の可能性が高いの出現から観察されたように、ManP2-Man8GlcNAc2を加水分解することができる。HjManは、ManP2-Man8GlcNAc2を加水分解しなかった図10、パネルE。実施例6Yarrowialypolytica株において発現する高次のリン酸化N-グリカンを有する糖タンパク質のGH47α-マンノシダーゼによる脱マンノシル化ヒトリソソームα-グルコシダーゼhuGAAをY.lipolytica株OXYY1589において発現させて、高次のリン酸化N-グリカン構造を有する糖タンパク質を得た。huGAAを実施例3に記載したとおり精製した。HjManおよびAsManを2mMCaCl2を有する100mM酢酸アンモニウムpH5.0中のhuGAAの溶液に添加した。この反応混合物を室温で一晩インキュベートした。本質的にはLaroyW.ら、NatureProtocols、1:397~4052006に記載されるとおり、N-グリカンをPNGaseFで放出させ、APTSで標識した後、DSA-FACEにおいて分析した。α-1,2-マンノシダーゼ処理の前および後のN-グリカン特性を図11に示す。精製されたhuGAAから放出されたN-グリカン混合物は、主としてManP-Man8GlcNAc2およびManP2-Man8GlcNAc2から構成されていた図11、パネルBおよびパネルE。ManP-Man8GlcNAc2よりのわずかに迅速に泳動されるピークは、ManP-Man7GlcNAc2と定めることができた。非常に微量のMan8GlcNAc2およびMan7GlcNAc2しか存在しなかった。huGAAのHjManとのインキュベーション後、ManP-Man8GlcNAc2からManP-Man7GlcNAc2およびManP-Man6GlcNAc2への転換を観察したのに対し、ManP2-Man8GlcNAc2は加水分解されなかった図11、パネルC。パネルDにおける電気泳動図は、huGAAのAsManによる処理の後に得られた糖を示している。AsManは、ManP2-Man8GlcNAc2を加水分解し、それとともに電気泳動図の左側にはManP2-Man7GlcNAc2およびManP2-Man6GlcNAc2を、ManP-Man7GlcNAc2およびManP-Man6GlcNAc2の隣に形成した。ManP-Man5GlcNAc2は、ManP-Man8GlcNAc2の加水分解からも形成された。これらのデータは、α-1,6アームがManP-Man8GlcNAc2構造においてリン酸化されること、および基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に、糖タンパク質レベルにおいて、AsManが末端α-1,2-マンノースを加水分解することができることを確認している。HjMan活性は、中性Man8GlcNAc2N-グリカンからのα-1,2結合型マンノースの放出、またはManP-Man8GlcNAc2の非リン酸化型α-1,3アームにおける2つのα-1,2結合型マンノースの除去に限定されていた。実施例7APTS標識したリン酸化N-グリカンのGH92α-マンノシダーゼによる脱マンノシル化CcMan4およびCcMan5を大腸菌E.coliにおいて発現させ、異なる細胞画分を実施例4に記載したとおり単離した。ペリプラズム溶液の活性をMNN4過剰発現株に由来するAPTS標識したN-グリカンに関して試験し、DSA-FACEにおいて分析した図12。N-グリカンを、2mMCaCl2を有する10mMHEPES緩衝液pH7.0におけるCcMan4、CcMan5とともに、または両酵素の混合物とともに室温で一晩インキュベートした。AsManを使用する対照実験が含まれ、実施例5に記載したとおり実施した。図12Aに示す実験においては、主としてMan8GlcNAc2M8および一リン酸化したManP-Man8GlcNAc2MP-M8を含有するMNN4画分を使用したパネルB。CcMan4は、Man8GlcNAc2およびManP-Man8GlcNAc2をそれぞれMan5GlcNAc2およびManP-Man5GlcNAc2に加水分解したパネルC。AsManを使用して同じ反応産物を得たパネルDおよび実施例5。CcMan5は、2つのα-1,2マンノースの間のグリコシド結合を加水分解しなかったしたがって、Man8GlcNAc2ピークのシフトなしが、ManP-Man8GlcNAc2におけるホスフェートのキャップを外し、迅速に泳動されるP-Man8GlcNAc2のピークを生じたパネルE。この反応混合物のCIPとのインキュベーション後、Man8GlcNAc2に対応するピークのみを観察しているパネルF。CcMan4およびCcMan5の混合物は、Man8GlcNAc2およびManP-Man8GlcNAc2をMan5GlcNAc2およびP-Man5GlcNAc2にそれぞれ加水分解したパネルG。それゆえ、Man5GlcNAc2に対応するピークのみがCIP処理後に観察されるパネルH。CcMan4はまた、AsManを使用しても観察されたようにパネルKおよび実施例5、二リン酸化したManP2-Man8GlcNAc2をManP2-Man6GlcNAc2に加水分解した図12B、パネルJ。CcMan4およびCcMan5の混合物は、P2-Man6GlcNAc2およびP-Man5GlcNAc2を生成したパネルN。CcMan4はしたがって、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α-1,2-マンノースを加水分解することもできるα-1,2-マンノシダーゼである。CcMan4は、ホスフェートのキャップを外す酵素であるCcMan5と併用することができる。実施例8Yarrowialypolytica株において発現する高次のリン酸化N-グリカンを有する糖タンパク質のGH92α-マンノシダーゼによる脱マンノシル化CcMan4およびCcMan5をY.lipolyticaにおいて発現するhuGAAとともにインキュベートした。この分析を実施例6に記載したとおり実施した。2mMCaCl2を有する100mMHEPES緩衝液pH7.0をCcMan4およびCcMan5の両方について室温での一晩のアッセイにおいて使用した。DSA-FACE分析を図13に示す。精製されたhuGAAから放出されたN-グリカン混合物は主として、ManP-Man8GlcNAc2およびManP2-Man8GlcNAc2から構成されたパネルB。ManP-Man8GlcNAc2よりもわずかに迅速に泳動されるピークは、ManP-Man7GlcNAc2と定めることができた。CcMan4は、huGAA糖タンパク質を脱マンノシル化した。電気泳動図パネルCにおいては、ManP2-Man6GlcNAc2、ManP-Man5GlcNAc2、およびManP-Man6GlcNAc2に対応するピークが観察された。CcMan5との併用においては、ホスフェートがキャップを外された産物P2-Man6GlcNAc2、P-Man5GlcNAc2、およびP-Man6GlcNAc2をパネルEに示すとおり形成した。実施例9Yarrowialypolytica株において発現する高次のリン酸化N-グリカンを有する糖タンパク質のGH47α-マンノシダーゼによる脱マンノシル化に関する追加の例小胞体ManIおよびゴルジ体ManIAは、GH47ファミリーに属する2クラスのIα-1,2-マンノシダーゼである。組換え発現した小胞体ManIおよびゴルジ体ManIAを室温で一晩、Y.lipolyticaにおいて発現したhuGAAとともにインキュベートした。この分析を実施例6および図10に記載したとおり実施した。2mMCaCl2を有する100mMHEPES緩衝液pH7.0を小胞体ManIについて使用したのに対し、ゴルジ体ManIAとのインキュベーションは、2mMCaCl2を有する100mMMES緩衝液pH6.0において実施する。DSA-FACE分析を図14に示す。小胞体ManIおよびゴルジ体ManIAの両方は、huGAA糖タンパク質を脱マンノシル化することができたが、該両方の活性は、ManP-Man8GlcNAc2のManP-Man6GlcNAc2への加水分解に限定されたそれぞれ、パネルDおよびE。この結果は、また、H.Jecorina由来のGH47α-1,2-マンノシダーゼHjMan、図11、パネルCを使用して得られたのに対し、A.satoi由来のGH47α-1,2-マンノシダーゼAsMan、図11、パネルFおよびGH92CcMan4図12、パネルCは、ManP2-Man8GlcNAc2およびManP-Man8GlcNAc2をManP2-Man6GlcNAc2およびManP-Man5GlcNAc2へそれぞれ刈り込んだ。他の実施形態本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、上の記載は、本発明の範囲を明示するよう意図されており、かつ該範囲を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。"