"下記1~3を含むことを特徴とする多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法。1多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる第一工程2第一工程で細胞保護溶液と接触させた多能性幹細胞由来の組織を凍結保存液に保持する第二工程3第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて凍結保存する第三工程スルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液が、スルホキシド、鎖状ポリオール及びオリゴ糖を含む細胞保護溶液である請求項1記載の凍結保存方法。スルホキシドがジメチルスルホキシドであり、鎖状ポリオールがエチレングリコールであり、オリゴ糖がスクロースである請求項2記載の凍結保存方法。前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である請求項1~3のいずれか記載の凍結保存方法。組織が、脳神経組織である請求項1~4のいずれか記載の凍結保存方法。組織が、網膜組織である請求項1~4のいずれか記載の凍結保存方法。第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて凍結保存する第三工程が、第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて10°C分以上の温度低下速度で凍結保存する第三工程である請求項1~6のいずれか記載の凍結保存方法。冷却剤が、液体窒素である請求項1~7のいずれか記載の方法。凍結保存液が、ジメチルスルホキシド、アセトアミド及びプロピレングリコールを含む凍結保存液である請求項1~8のいずれか記載の凍結保存方法。ジメチルスルホキシドの濃度が1~4M、アセトアミドの濃度が0.5~2M、プロピレングリコールの濃度が1.5~6Mである請求項9記載の凍結保存方法。多能性幹細胞由来の組織を再生医療や安全性薬効評価等に使用する際に、多量の組織を安定的に供給するには当該組織の保存方法の開発が急務である。本発明者らは、このような状況を鑑み鋭意検討した結果、多能性幹細胞由来の組織を安定的に保存する方法を見出し、本発明に至った。即ち、本発明は[1]下記1~3を含むことを特徴とする多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法。1多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる第一工程2第一工程で細胞保護溶液と接触させた多能性幹細胞由来の組織を凍結保存液に保持する第二工程3第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて凍結保存する第三工程[2]スルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液が、スルホキシド、鎖状ポリオール及びオリゴ糖を含む細胞保護溶液である前記[1]記載の凍結保存方法。[3]スルホキシドがジメチルスルホキシドであり、鎖状ポリオールがエチレングリコールであり、オリゴ糖がスクロースである前記[2]記載の凍結保存方法。[4]前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である前記[1]~[3]のいずれか記載の凍結保存方法。[5]組織が、脳神経組織である前記[1]~[4]のいずれか記載の凍結保存方法。[6]組織が、網膜組織である前記[1]~[4]のいずれか記載の凍結保存方法。[7]第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて凍結保存する第三工程が、第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を、冷却剤存在下にて10°C分以上の温度低下速度で凍結保存する第三工程である前記[1]~[6]のいずれか記載の凍結保存方法。[8]冷却剤が、液体窒素である前記[1]~[7]のいずれか記載の方法。[9]凍結保存液が、ジメチルスルホキシド、アセトアミド及びプロピレングリコールを含む凍結保存液である前記[1]~[8]のいずれか記載の凍結保存方法。[10]ジメチルスルホキシドの濃度が1~4M、アセトアミドの濃度が0.5~2M、プロピレングリコールの濃度が1.5~6Mである前記[9]記載の凍結保存方法。本発明により、多能性幹細胞由来の組織の安定な保存が可能となる。以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。本発明における形質転換体とは、形質転換により作製された細胞等の生命体の全部又は一部を意味する。形質転換体としては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主等とも呼ばれることがある。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。本発明に関連した、遺伝子操作技術で使用される原核生物細胞としては、例えば、Eschericia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する原核生物細胞、例えば、EschericiaXL1Blue、EschericiaXL2Blue、EschericiaDH1等を挙げることができる。このような細胞は、例えば、MolecularCloning3rdeditionbySambrook,JandRussellDWAppendix3Volume3,VectorsandBacterialstrainsA32ColdSpringHarborUSA2001に具体的に記載されている。本発明に関連したベクターとは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であり、又は、染色体中への組込みが可能である、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターをクローニングベクターと記すこともある。このようなクローニングベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該技術分野において多数存在しており、販売元により、微妙な違い例えば、マルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列から名前を代えて販売されている。例えば、MolecularCloning3rdeditionbySambrookJandRussellDWAppendix3,VectorsandBacterialstrainsA32に代表的なものが記載発売元も記載されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。本発明に関連したベクターは、発現ベクター、レポーターベクター、組換えベクターも含む。尚、発現ベクターとは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。調節エレメントとしては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含むもの等を挙げることができる。生物例えば、動物の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に関連して組換えベクターとしては、例えば、aゲノムライブラリーのスクリーニングのためには、ラムダFIXベクターファージベクター、bcDNAのスクリーニングのためには、ラムダZAPベクターファージベクター、cゲノムDNAのクローニングするためには、例えば、pBluescriptIISK-pGEM,pCR21ベクタープラスミドベクター等を挙げることができる。また発現ベクターとしては、例えば、pSV2neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRcRSVベクター、pLenti6V5Destベクター、pAdCMVV5DESTベクター、pDONAI2neoベクター、pMEI5neoベクター等プラスミドベクター等を挙げることができる。またレポーターベクターとしては、例えば、pGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL410ベクター、pGL411ベクター、pGL412ベクター、pGL470ベクター、pGL471ベクター、pGL472ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を挙げることができる。このようなベクターは、前述のMolecularCloning誌を参考にして適宜利用すればよい。本発明に関連して、核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、AusubelFAら編1988、CurrentProtocolsinMolecularBiologyWileyNewYorkNYSambrookJら1987MolecularCloningALaboratoryManual2ndEd及びその第三版,ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY、別冊実験医学遺伝子導入発現解析実験法羊土社、1997等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。また、本発明に関連して、ベクターの導入方法としては、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換等例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン遺伝子銃を用いる方法等を挙げることができる。本発明凍結保存方法は、下記1~3を含むことを特徴とする凍結保存方法である。1多能性幹細胞由来の組織とスルホキシド及び鎖状ポリオールを含む細胞保護溶液とを接触させる第一工程2第一工程で細胞保護溶液と接触させた多能性幹細胞由来の組織を凍結保存液に保持する第二工程3第二工程で凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を冷却剤存在下にて凍結保存する第三工程本発明において幹細胞とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞ES細胞又は組織幹細胞組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう、又は人工多能性幹細胞iPS細胞:inducedpluripotentstemcell細胞であり得るがそれらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織細胞は組織再生が可能なことから分かるように生体に近い正常な細胞を分化できることが知られている。幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞の例としては、EB5細胞などが挙げられる。幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清FCS、KnockoutSerumReplacementKSR、LIFを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。本発明において多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞三胚葉外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の組織に分化しうる能力分化多能性pluripotencyを有する幹細胞をいい、胚性幹細胞ES細胞もこれに含まれる。多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化多能性を人工的に持たせた細胞人工多能性幹細胞ともいうも含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作製することが可能である。作製方法としては、例えばCell1315pp.861-872や、Cell1264pp.663-676に記載の方法などが挙げられる。本発明において胚性幹細胞ES細胞とは、自己複製能を有し、多分化能すなわち多能性pluripotencyを有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。本発明において人工多能性幹細胞とは、繊維芽細胞等分化した細胞をOct34、Sox2、Klf4、Myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立されたTakahashiKYamanakaSCell2006126p663676。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有するTakahashiKTanabeKOhnukiMNaritaMIchisakaTTomodaKYamanakaSCell2007131p861872、YuJVodyanikMASmugaOttoKAntosiewiczBourgetJFraneJLTianSNieJJonsdottirGARuottiVStewartRSlukvinIIThomsonJAScience2007318p19171920、NakagawaMKoyanagiMTanabeKTakahashiKIchisakaTAoiTOkitaKMochidukiYTakizawaNYamanakaSNatBiotechnol200826p101106。本発明において、分化とは、1個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的及び/又は機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団細胞系譜が、特定のタンパク質の産生等はっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を、ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内或いは細胞外の因子又は条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では,別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。本発明において組織とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさし、本発明において多能性幹細胞に由来する組織とは、多能性幹細胞から分化誘導される細胞の凝集体であり、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。多能性幹細胞から分化誘導される細胞としては、大脳神経細胞、間脳神経細胞、視床下部神経細胞、大脳基底核神経細胞、小脳神経細胞、腸組織細胞、心筋細胞、すい臓細胞、肝臓細胞、またはこれらの前駆細胞が挙げられる。具体的には、WO2009148170、JNeurosci2011Feb231191933、NatNeurosci2010Oct13117180、CellStemCell2008Nov6351932、ProcNatlAcadSciUSA2008Aug1910511796801、Nature2011Feb34701059、NatBiotechnol2011Mar2926772、CellStemCell2011Feb4822840、2011Mar13886171、NatBiotechnol2006Nov24140211に基づいて作製することができる。本発明において、脳神経組織とは生体の大脳、間脳、中脳、小脳、後脳において各神経層を構成する細胞やその前駆細胞例えば大脳の場合、第6層特異的なTbr1陽性細胞、第5層特異的なCrip2陽性細胞、第2-3層特異的なBrn2陽性細胞などが少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した構造体を意味する。脳神経組織の一部として、網膜組織を挙げることが出来る。網膜組織とは生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、またはこれらの前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーChx10、L7双極細胞、Tuj1節細胞、Brn3節細胞、Calretininアマクリン細胞、Calbindin水平細胞、Recoverin視細胞、Rhodopsin視細胞、RPE65色素上皮細胞、Mitf色素上皮細胞などの発現により確認できる。例えば網膜組織はヒトES細胞を分化させることにより作製可能であり、具体的には、Nature472p5156、WO2011055855記載の方法により作製することができる。本発明において、凍結保護溶液とは、凍結保護物質と溶媒との混合液をいう。凍結保護物質とは、凍結保存を行う際、細胞の機能や生存率をできるだけ維持するため、凍結に由来する様々な障害を防止する目的で添加される物質をいう。凍結保護物質として、具体的に言えば、例えば、ジメチルスルホキシドDMSO等のスルホキシド;エチレングリコール、グリセロール、プロパンジオール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール等の鎖状ポリオール;アセトアミド等のアミド化合物;スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノース等のオリゴ糖;パーコール、フィコール70、フィコール70000、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。溶媒としては、例えば、生理食塩水、PBS、EBSS、HBSSなどの緩衝液やDMEM、GMEM、RPMIなどの細胞や組織などを培養する培養液、血清、血清代替物KnockOutSerumReplacementInvitrogen社または、これらの混合物などを用いることができる。本発明において、凍結保護溶液は、スルホキシドおよび鎖状ポリオールを含み、好ましくはスルホキシド、鎖状ポリオールおよびオリゴ糖を含む。本発明において、凍結保護溶液中のスルホキシドの終濃度は、5~15、好ましくは9~13、より好ましくは11前後を挙げることができる。本発明において、凍結保護溶液中の鎖状ポリオールの終濃度は、4~15、好ましくは4.5~8、より好ましくは5.5前後を挙げることができる。本発明において、凍結保護溶液中のオリゴ糖の終濃度は、5~20、好ましくは8~12、より好ましくは10前後を挙げることができる。本発明において、凍結保存液とは、多能性幹細胞由来の組織を凍結保存するための媒体をいう。凍結保存液としては、セルバンカー1、1プラス、2、3十慈フィールド株式会社、TCプロテクターDSファーマバイオメディカル株式会社、FreezingMediumforhumanESiPSCells株式会社リプロセル、クライオスカーレスDMSOフリー株式会社バイオベルデ、ステムセルキープ株式会社バイオベルデ、EFS溶液NKsystem等の市販のものを用いることもできる。また、凍結保存液としては、凍結保護物質と溶媒との混合液でもよいを含んでもよい。凍結保護物質および溶媒としては、上記記載のものを挙げることができる。本発明における凍結保存液は、ジメチルスルホキシド、アセトアミド及びプロピレングリコールを含有することが好ましい。本発明において、凍結保存液中のジメチルスルホキシドの濃度は、1~4M、アセトアミドの濃度は、0.5~2M、プロピレングリコールの濃度は1.5~6Mであることが好ましい。本発明凍結保存方法における第一工程は、多能性凍結前に幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる工程である。上記第一工程では、多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる。多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させるには、スルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液中に、多能性幹細胞由来の組織を移してもよいし、多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を加えてもよい。多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる時間としては、1分~180分、好ましくは5分から60分、より好ましくは15分から30分を挙げることができる。また、多能性幹細胞由来の組織にスルホキシドと鎖状ポリオールとを含む細胞保護溶液を接触させる温度としては、―10°C~40°C、好ましくは0°Cから25°C、より好ましくは0°C~8°Cを挙げることができる。上記第一工程における接触系内での多能性幹細胞由来の組織の密度としては、例えば、凝集体数に換算して、1~1000個mL程度、好ましくは凝集体1~100個mLを挙げることができる。なお、1凝集体あたりの細胞数は、10の3乗~10の6乗個程度である。細胞保護溶液を接触させる時に用いられる培養器は、特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。本発明凍結保存方法における第二工程は、細胞保護溶液と接触させた多能性幹細胞由来の組織を凍結保存液に保持する工程である。上記第二工程では、第一工程で細胞保護溶液と接触させた多能性幹細胞由来の組織を、凍結保存液に保持する工程である。上記第二工程における細胞保存液中での多能性幹細胞由来の組織の密度としては、例えば、凝集体数に換算して、1~1000個mL程度、好ましくは凝集体1~100個mLを挙げることができる。1凝集体あたりの細胞数は10の3乗~10の6乗個程度である。本発明凍結保存方法における第三工程は、凍結保存液に保持された多能性幹細胞由来の組織を冷却剤存在下にて凍結保存する工程である。組織等を凍結保存する方法にはいくつかの方法が知られている。代表的な凍結保存法としては、01~10°C分という緩慢な速度で長時間かけて凍結させる方法が挙げられる。この方法は、プログラムフリーザーやバイセル日本フリーザー株式会社などの装置や器具等を用いて実施することが出来る。急速凍結保存方法としては、結晶質の液体または気体を結晶化させずに急激にガラス転移温度以下の固体にしたときに生じるガラス化という現象を応用した方法が挙げられる。本方法は、あらかじめ高濃度の保存液に浸漬した組織や胚、卵子をガラス化させることにより安定的に短時間かつ簡単な操作で凍結保存することができる点で優れている。ここで、急速凍結保存方法とは、生物試料に対する凍結法であり、液体窒素などの冷却剤に試料を投入する方法をいう。例えば、氷上で多能性幹細胞由来の組織と凍結保存液とを凍結チューブに入れ、ピンセットを用いて、前記凍結チューブを冷却剤へ沈める方法が挙げられる。多能性幹細胞由来の組織を凍結保存液に保持してから冷却剤に投入するまでの時間は、可能な限り短い方が好ましく、30秒以内、好ましくは10秒以内を挙げることができる。本発明において使用する冷却剤は、細胞のガラス化を起こすことができるものが好ましく、通常-20°C以下、好ましくは80°C以下、より好ましくは、150°C以下の冷却剤を用いることができる。冷却剤として、具体的に言えば、例えば、液体窒素、スラッシュ窒素SlushNitrogen、液体ヘリウム、液体プロパン、エタンスラッシュを挙げることができ、好ましくは、液体窒素又はスラッシュ窒素である。スラッシュ窒素は、液体窒素を減圧下で保持することにより液体窒素温度を常圧の-196°Cより低い-205~-210°Cに下げた窒素のことであるHuangら、HumanReproduction,Vol.20,No.1,pp.122-1282005。冷却剤としてスラッシュ窒素を用いる場合には、例えば、Vit-MasterTMIMT、NesZiona、イスラエル等の装置により、ガラス化保存を行うことができる。冷却剤存在下にて凍結保存を行う際の温度低下速度は、10°C分以上、好ましくは30°C分以上、より好ましくは50°C分以上、特に好ましくは100°C分以上の温度低下速度を挙げることができる。冷却剤存在下にて凍結保存を行う際の常温から目的とする凍結保存温度例えば、液体窒素の場合は-196°Cまでに要する時間は、例えば、5分以内、より好ましくは3分以内、さらに好ましくは1分以内を挙げることができる。以下、本発明の実施例をさらに詳しく説明する。RAXノックインヒトES細胞の樹立網膜前駆細胞のマーカー遺伝子の1つであるRAX遺伝子座にGFPをノックインしたヒトES細胞株の作製を実施した。ヒトES細胞株KhES1:京都大学が樹立したヒトES細胞株のゲノムDNA上RAX遺伝子を特異的に切断するZincFingerNucleaseZFNをSigmaAldrich社から購入した。単一細胞化したヒトES細胞を用いて、エレクトロポレーション法により、ZFNをコードするmRNAとGFP及び薬剤選択遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子が搭載されたノックインベクターを共導入し、マイトマイシンC処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞上へ播種した。播種翌日から培地中にG418を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、PCR法やサザンブロット法により、ノックイン細胞を選別し、RAXGFPノックインヒトES細胞株を樹立した。RAXノックインヒトES細胞を用いた網膜組織の分化誘導樹立したRAXGFPノックインヒトES細胞を用いて、網膜組織の分化誘導を実施した。RAXGFPノックインヒトES細胞KhES1由来をUenoMetalPNAS2006WatanabeKetalNatBiotech2007に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEMF12培地Invitrogenに20KSRKnockoutSerumReplacement;Invitrogen、0.1mM2-メルカプトエタノール、5~10ngmlbFGFなどを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織分化誘導には、0.25trypsin-EDTAInvitrogenを用いてES細胞を単一分散し、非細胞接着性の96穴培養プレートスミロンスフェロイドプレート,住友ベークライト社の1ウェルあたり9×10^3細胞になるように150μlの分化培地に浮遊させ、凝集塊を速やかに形成させた後、37°C、5CO2で培養した。その際の分化培地には、G-MEM培地に20KSR、Y27632などを添加した無血清培地を用いた。また、培養2日目からマトリゲルを添加して培養した。分化誘導開始後、12日目くらいから凝集塊内にGFPの発現が蛍光顕微鏡観察で確認され、14日目くらいで凝集塊周囲にGFPを発現する神経上皮様構造体が形成された。18日目から30日目の間に、この神経上皮様構造体をピンセットを用いて凝集塊から分離し、非接着性プラスチックシャーレ内でウシ胎児血清やレチノイン酸を添加して培養を継続した後、切片を作製し、蛍光免疫染色法で分化状態を解析した。例えば、分化誘導開始から40日を経過した神経上皮様構造物はRAX遺伝子が発現しているGFP陽性細胞で構成されており、GFP陽性細胞においては、網膜前駆細胞マーカー遺伝子の一つであるPax6陽性細胞、双極細胞マーカー遺伝子の1つであるChx10陽性細胞、神経節細胞マーカー遺伝子の1つであるBrn3陽性細胞が層状に配列した網膜組織が形成されていることが明らかとなった。比較例1ヒトES細胞から分化誘導された網膜組織の凍結による凍結保存分化誘導した網膜組織を用いて100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行った。DMEMF12培地に2MジメチルスルホキシドDMSO、1Macetamideand3Mpolypropyleneglycolを添加したものDAP213を凍結保存液として用いた。10個程度の網膜組織を培養皿から15mlポリプロピレンチューブへ回収し、上清を除去した後、200μlの凍結保存液を加え、網膜組織を凍結保存液と一緒に凍結チューブへ移し、即座にピンセットを用いて凍結チューブを液体窒素中に浸し、100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を実施した。凍結したチューブは解凍を実施するまで150°Cフリーザーで保存した。150°Cフリーザーから凍結チューブを取り出し、37°Cウォーターバスを用いて事前に37°Cに温めておいた培地を凍結チューブに入れ、解凍を行った。15mlチューブに分注し、37°Cに加温しておいた培地10ml中へ網膜組織を移した後、上清を除去した。PBS10mlを用いて洗浄後、DMEMF12培溶液にN2、10FBS、レチノイン酸などを添加した培地網膜組織培養用培地を入れた浮遊培養皿へ移し、37°Cで培養した。解凍の翌日以降に顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察により、細胞の生存状態、上皮構造の外見について凍結保存を実施していない網膜組織図6ABと比較し、凍結保存の成否判定を実施した。その結果、殆どの細胞が死んでしまっており、死細胞の破片が多く観察された。また、GFPの発現も殆ど観察されなかった。よって、単なる100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を実施したでは網膜組織は全く凍結保存できないことが示された。図6CD比較例2ヒトES細胞から分化誘導された網膜組織の凍結保護物質110ジメチルスルホキシドDMSO浸透処理後に凍結することによる凍結保存分化誘導した網膜組織を用いて凍結前に凍結保護物質としてジメチルスルホキシドDMSOを含む溶液を用いて浸透処理を行った後、100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行った。10~20個程度の網膜組織を培養皿から15mlポリプロピレンチューブへ移し、上清を除去した後、あらかじめ氷上で冷却しておいた凍結保護物質を含む溶液1mlを添加し、氷上で15分~30分間静置した。凍結保護物質を含む溶液として、前述の網膜組織培養用培地に110ジメチルスルホキシドDMSOを加えたものを用いた。凍結保護物質を含む溶液を除去した後、凍結保存液としてDAP213200μlを加え、網膜組織を凍結保存液と一緒に凍結チューブへ移し、即座にピンセットを用いて凍結チューブを液体窒素中に浸し、100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行った。凍結したチューブは解凍を実施するまで150°Cフリーザーで保存した。110ジメチルスルホキシドDMSOを凍結保護物質として含む網膜組織培養用培地を用いて浸透処理を実施した後に100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行った場合は、凍結を実施していない対照と比較するとRAXを発現する網膜組織が大幅に縮小していた図6E、F。実施例1ヒトES細胞から分化誘導された網膜組織の凍結保護物質110ジメチルスルホキシドDMSO及び555エチレングリコール浸透処理後に凍結することによる凍結保存分化誘導した網膜組織を用いて凍結前に凍結保護物質として110ジメチルスルホキシドDMSO及び555エチレングリコールEGを含む溶液を用いて浸透処理を行った以外は、比較例2と同様に行った。110ジメチルスルホキシドDMSO及び555エチレングリコールEGを含む網膜組織培養用培地を用いて凍結保護物質浸透処理を実施した後に100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行った場合、前述の110ジメチルスルホキシドDMSOを含む網膜組織培養用培地を用いた凍結保護物質浸透処理を実施した場合より、RAXを発現する網膜組織の保存性が改善され図6G、H、層構造を保持していることが分かった図8AB。実施例2ヒトES細胞から分化誘導された網膜組織の凍結保護物質110ジメチルスルホキシドDMSO、555エチレングリコールEG及び10スクロース浸透処理後に凍結することによる凍結保存分化誘導した網膜組織を用いて凍結前に凍結保護物質として110ジメチルスルホキシドDMSO、555エチレングリコールEG及び10スクロースを含む溶液を用いて浸透処理を行った以外は、比較例2と同様に行った。110ジメチルスルホキシドDMSO、555チレングリコールEGに加え10スクロースを添加した網膜組織培養用培地を用いて凍結保護物質浸透処理を実施後、100°C分以上の温度低下速度で凍結保存を行ったところ、凍結保存を行っていない網膜組織と比較して、ややGFPの発現強度が弱いものの凍結保存を行っていない網膜組織に匹敵するほどの状態が保たれており保存性は非常に良好であり図6IJ、層構造も維持されていた図8CDE。比較例3ヒトES細胞から分化誘導された網膜組織の凍結保護物質スクロース浸透処理後に凍結することによる凍結保存凍結保護物質浸透溶液として、前述の網膜組織培養用培地に5スクロースを加えたもの、10スクロースを加えたもの、20スクロースを加えたもの、555EG及び10スクロースを加えたもの、11ジメチルスルホキシドDMSO及び10スクロースを加えたものをそれぞれ用いて上述と同様の手順で凍結及び解凍を実施した。網膜組織培養用培地にスクロースのみを加えた凍結保護物質浸透溶液を用いて浸透処理を行った後に100°C分以上の温度低下速度で凍結保存した場合、凍結していない対照図7ABと比較すると、5、10、20のいずれの濃度においても、解凍後の細胞生存性が非常に悪く、GFPの発現も殆ど観察されなかった図7CDEFGH。555EG及び10スクロースを含む網膜組織培養用培地を用いて浸透処理を行った後に100°C分以上の温度低下速度で凍結保存した場合においても、凍結保存していない対照と比較すると、解凍後の細胞生存性が非常に悪く、GFPの発現も殆ど観察されなかった図7KL。110ジメチルスルホキシドDMSO及び10スクロースを含む網膜組織培養用培地を用いて浸透処理を行った後に100°C分以上の温度低下速度で凍結保存した場合、凍結していない対照と比較すると、細胞生存性が悪く、GFPの発現も弱く、凍結していない対照に匹敵する程度の状態で保存することはできなかった図7IJ。"