活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下させ、vWF結合に干渉しない抗体。トロンビン活性化を加速しない、請求項1に記載のモノクローナル抗体。A2ドメインに結合する、請求項1または2のいずれか一項に記載の抗体。A3ドメインに結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体。ペプチド断片407~428およびまたは591~602と同一の、または重複するエピトープに結合する、請求項1から2のいずれか一項に記載の抗体。ペプチド断片1965~1976と同一の、または重複するエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体。4F143抗体との結合と競合する、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなるリストから選択されるCDR配列の1つまたは複数と少なくとも95の同一性を有する1つまたは複数のCDR配列を含む、請求項1に記載の抗体。配列番号9と少なくとも95の同一性を有するVL配列、および配列番号10と少なくとも95の同一性を有するVH配列を含む、請求項5に記載の抗体。血友病Aの処置のための薬剤としての、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体の使用。血友病Aの処置のための第VIII因子分子と組み合わせての、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体の使用。請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体、および第VIII因子分子を含む医薬組成物。皮下投与用である、請求項12から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体を作製する方法であって、そのような抗体をコードする宿主細胞の、前記抗体を発現するのに適した条件下でのインキュベーションを含む方法。したがって、血友病Aを患っている患者において、頻度の少ない投与をサポートし、かつまたは内因性FVIIIの活性を増強し、その結果として凝血促進性応答を増強する能力がある治療の必要性が当技術分野においてある。内因性FVIIIを有する患者には、軽度型から中等度型を患っている血友病A患者、および重度患者のいくらかの割合が含まれる。本発明は、活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下または抑制し、vWF結合に干渉しない抗体に関する。本発明はさらに、そのような分子の治療的使用に関する。そのような抗体は、FVIIIaFIXa複合体の寿命を延長することに有用であり得、その結果として、より多くのトロンビンが生成され、それゆえ、血餅形成が改善される。したがって、そのような抗体は、血友病Aを患っており、かつ軽度および中等度の血友病Aを有する患者ならびに重度血友病Aを有する患者の一部などの内因性FVIIIを完全に欠いているわけではない患者の処置に適している。任意で、そのような抗体は、第VIII因子補充療法と組み合わせて用いられてもよい。定義第VIII因子抗体本発明による第VIII因子抗体は、活性化第VIII因子に結合する能力を有し、さらに、好ましくは、トロンビン活性化前と活性化後の両方において、第VIII因子に結合する能力を有する。本発明による抗体はさらに、例えば、1つまたは複数の側基をコンジュゲートした第VIII因子分子などの修飾型第VIII因子変異体に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体はさらに、第VIII因子を含み、任意で側基をコンジュゲートした、融合タンパク質に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体はさらに、血友病A患者に見出されるもの、または例えば、Bドメイン切断型欠失型第VIII因子、vWFとの結合能力が減少した第VIII因子、様々な分子に結合する改変した能力を有する第VIII因子変異体などのアミノ酸欠失、置換、およびまたは付加を含む第VIII因子変異体に結合する能力を有してもよい。本発明による抗体は、換言すれば、第VIII因子活性を有するいかなる第VIII因子変異体にも結合する。本発明による抗体は、典型的には、wtFVIIIの循環半減期と比較して有意に長い循環半減期を有してもよい。本発明による抗体はさらに、例えば、通常、IV投与より用いるのが便利かつ簡単である投与型である皮下に、投与することができる。本明細書で用いられる場合、用語抗体または第VIII因子抗体は、第VIII因子およびまたはFVIIIaに特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子およびその断片を指すことが意図される。完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された、2つの重鎖および2つの軽鎖である4つのポリペプチドを含む。各重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLで構成される。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域と呼ばれる超可変の領域へさらに細分することができ、その超可変領域の間に、フレームワーク領域と呼ばれる、より保存されている領域が組み入れられている。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置されているFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。したがって、本発明による抗体の定義内には、第VIII因子に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片もある。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行することができることが示されている。用語抗体内に含まれる結合断片の例には、Fab断片、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片F2断片およびF2断片、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片VHドメインからなるdAb断片Nature341544~546頁ならびに単離された相補性決定領域が挙げられる。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、VL領域とVH領域が対になって一価分子として知られている例えば、Birdら、Science242423~426頁およびHustonら、ProcNatlAcadSciUSA855879~5883頁参照を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、連結することができる。そのような一本鎖抗体はまた、本発明によれば、用語第VIII因子抗体内に含まれることを意図される。ダイアボディなどの他の型の一本鎖抗体もまた用語第VIII因子抗体に含まれる。ダイアボディは二価であり、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、同じ鎖上のその2つのドメイン間の対形成を可能にするのには短すぎるリンカーを用いて、それにより、それらのドメインが別の鎖の相補性ドメインと対形成するように強制し、2つの抗原結合部位を生じる二特異性抗体であるProcNatlAcadSciUSA906444~6448頁PoljakRJら、Structure21121~1123頁参照。本明細書で用いられる場合、用語ヒト抗体とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する本発明による第VIII因子抗体を意味する。本発明のヒト第VIII因子抗体は、例えばCDR、特にCDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。この関連における用語ヒト化抗体は、ヒトスキャフォールドへグラフト化されている、本発明による第VIII因子抗体由来のCDR配列を指す。したがって、本発明による第VIII因子抗体は、例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよい。本明細書で用いられる場合、用語エピトープは、抗体が結合する抗原上の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学活性のある表面群からなり、通常、特異的な3次元構造的特性、および特異的な電荷特性を有する。本明細書で用いられる場合、用語免疫反応するまたは免疫反応することとは、104M未満の解離定数Kdでの抗体のそのエピトープとの任意の結合を意味する。用語免疫反応するまたは免疫反応することは、必要な場合には、用語特異的に結合すると相互交換可能に用いられる。エピトープは、FVIIIFVIII抗体結合後に抗体によって覆われるFVIII分子のアミノ酸配列における1つもしくは複数の領域、およびまたは個々のアミノ酸残基を指すことが多い。例えばエピトープの小区分または領域と重複している領域へ結合する抗体もまた、その抗体が、FVIIIエピトープ内のアミノ酸の少なくとも1個、好ましくは少なくとも2個、より好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも4個、最も好ましくは少なくとも5~10個との非共有結合性相互作用を形成し、またはそれらを覆うと言うことができる限り、このエピトープへ結合する抗体とみなされる。本明細書で用いられる場合、用語親和性は、抗体のエピトープとの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、解離定数Kdによって測られ、その解離定数は、Ab×AgAbAgと定義される。親和定数Kaは、1Kdによって定義される。モノクローナル抗体の特異性および親和性を競合阻害によって決定するための好ましい方法は、Harlowら、AntibodiesALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NY、、Colliganら編、CurrentProtocolsinImmunology、GreenePublishingAssocandWileyInterscience、NY、、およびMuller、MethEnzymol92589~601頁に見出すことができ、それらの文献は参照により本明細書に完全に組み入れられている。同時投与本発明による第VIII因子抗体は、血液由来であるかまたは組換え技術を用いて産生されるかのいずれでもよい治療用第VIII因子と共に同時投与することができる。同時投与は、両方の型の治療用タンパク質を含む医薬製剤のIV投与によって実施されてもよい。同時投与はまた、治療用第VIII因子分子を含む医薬組成物のIV投与、および本発明による第VIII因子抗体を含む組成物のIVまたは皮下投与によって実施されてもよい。同時投与は、同時か、または約1分から1カ月まで、1時間から1日まで、もしくは1日から1週間の間隔のいずれでも行うことができる。任意でFVIII分子またはFVIII変異体誘導体との同時投与としての形をとる、本発明による抗体の投与は、例えば、毎日1回、毎週1回、隔週1回、2週間おきに1回、または毎月1回、実施されてもよい。第VIII因子分子FVIII第VIII因子は、主に肝細胞によって産生される、大きく、複雑な糖タンパク質である。ヒトFVIIIは、シグナルペプチドを含む2351個のアミノ酸からなり、相同性によって定義されるような、数個の異なるドメインを含有する。3つのAドメイン、唯一のBドメイン、および2つのCドメインがある。ドメインの順序は、NH2A1A2BA3C1C2COOHと記載することができる。FVIIIは、血漿中、BA3境界で分離した2つの鎖として循環する。その鎖は、二価金属イオン結合によって連結されている。A1A2B鎖は重鎖と呼ばれ、A3C1C2は軽鎖と呼ばれる。FVIIIは、フォンビルブランド因子と会合して循環する。VWFは、FVIIIについての担体としての役割を果たす大きな多量体糖タンパク質であり、血管壁の成分への正常な血小板接着に必要とされる。VWFとの複合体におけるFVIIIの血漿中半減期は約12時間である。FVIIIは、トロンビンまたはFXaによりHCおよびLCにおける切断によって活性化され、その切断によりVWFからFVIIIaが放出される。この過程は、イオン性相互作用によってA3C1C2軽鎖に非共有結合性に連結されたA1ドメインおよびA2ドメインからなるヘテロ三量体分子を生成する。FVIIIa分子は、自発的A2サブユニット解離および同時に生じる補因子活性の喪失の結果として本質的に不安定であるJBC、2668957~8962頁LamphearJBC2673725~3730頁FayJBC26713246~13250頁FayJBC26817861~17866頁FayJBC2716027~6032頁ParkerJBC28113922~13930頁ParkerBiochemistry469737~9742頁。解離は、約2分間の半減期で起こり、FVIIIaFIXa複合体の下方制御についての主な生理機構であるように思われるBloodReviews、181~15頁。FVIIIaはまた、重鎖における追加の部位でFVIIIaを切断する活性化プロテインCである、抗凝固性セリンプロテアーゼによって不活性化することができる。しかしながら、この経路の生理的関連性は、軽微であるように思われるBloodReviews、181~15頁。天然FVIIIは、配列番号1に示されているような完全長ヒトFVIII分子である。Bドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741~1648に及ぶ。配列番号1ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される第VIII因子分子は、血漿から単離された第VIII因子、およびまたは組換え第VIII因子であってもよい。本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される第VIII因子分子は、例えば、Bドメイン切断型第VIII因子分子であってもよく、その分子において、例えば、その残りのドメインが、配列番号1におけるアミノ酸1~740位および1649~2332位に示されているような配列と密接に対応する。本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与されるBドメイン切断型分子は、配列番号1に示された配列からわずかに異なってもよく、残りのドメインは、例えばvWF結合能力を低下させるために突然変異を導入することができるという事実により、配列番号1に示されているようなアミノ酸配列から、わずかに、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、もしくは10個のアミノ酸が、異なってもよく、あるいは、約1、2、3、4、もしくは5、異なってもよいことを意味する。さらに、例えば、LRP、様々な受容体、他の凝固因子、細胞表面などの様々な他の成分との第VIII因子の結合能力を改変するために分子中の他の場所でアミノ酸改変が導入されること、グリコシル化部位の導入およびまたは破壊などは、理にかなっている。本発明による第VIII因子抗体と共に同時投与される第VIII因子分子は、第VIII因子活性を有し、その活性とは、凝固カスケードにおいてFVIIIと機能的に類似する、または等しい様式で、機能し、活性化血小板上でFIXaとの相互作用を介してFXaの形成を誘導し、血餅の形成を支援する能力を意味する。その活性は、例えば、血餅分析、内因性トロンビン生成能分析などの当技術分野においてよく知られた技術によってインビトロで評価することができる。本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子は、天然ヒトFVIIIのFVIII活性の少なくとも約10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、および100またはさらに100より多いFVIII活性を有する。A2サブユニットの解離の低下抑制は、A2サブユニットの活性化FVIIIからの解離速度が、抗体の存在下で測定される場合、FVIIIのFVIIIaへの活性化から例えば5分後、10分後、15分後、20分後、または25分後、例えばwtFVIIIの解離速度と比較して、低下している状況を指す。本発明による抗体は、10以上、好ましくは15以上、より好ましくは20以上、より好ましくは25以上、より好ましくは30以上、より好ましくは35以上、より好ましくは40以上、より好ましくは45以上、より好ましくは50以上、より好ましくは55以上、より好ましくは60以上、より好ましくは65以上、より好ましくは70以上、より好ましくは75以上、より好ましくは80以上、最も好ましくは90以上のA2ドメインの解離の低下を生じる。そのような性質は、実施例4および他の箇所JBC、2716027~6032頁Parkerら、JBC、28113922~13930頁で記載されているような機能的減衰アッセイにおいて決定することができる。アッセイは、FVIIIのトロンビンによる活性化後の時間の関数として、FVIIIaの補因子活性を測定する。FVIIIaの補因子活性は、適切なリン脂質表面および第IXa因子の存在下で、FXのFXaへの変換を刺激するその能力として測定される。Bドメイン第VIII因子におけるBドメインは、配列番号1におけるアミノ酸741~1648に及ぶ。Bドメインは、数個の異なる部位で切断され、循環血漿FVIII分子において大きな不均一性がもたらされる。重くグリコシル化されたBドメインの正確な機能はわかっていない。わかっていることは、そのドメインが、凝固カスケードにおいてFVIII活性にとって必要ではないということである。この明らかな機能の欠如は、Bドメイン欠失型切断型FVIIIが、完全長の天然FVIIIについて見られるものと同一のインビボ性質を有するようにみえるという事実によって裏付けされる。Bドメイン切断型欠失型第VIII因子分子内因性完全長FVIIIは、一本鎖の前駆分子として合成される。分泌前に、その前駆体は、重鎖と軽鎖へ切断される。組換えBドメイン欠失型FVIIIは、2つの異なるストラテジーから産生することができる。Bドメインを含まない重鎖、および軽鎖のいずれも、2つの異なるポリペプチド鎖として個々に合成され、またはBドメイン欠失型FVIIIが、単一の前駆ポリペプチド鎖として合成され、その前駆ポリペプチド鎖が、完全長FVIII前駆体と同じ様に、重鎖と軽鎖へ切断される。Bドメイン欠失型FVIII前駆ポリペプチドにおいて、重鎖部分および軽鎖部分は、通常、リンカーによって分離している。Bドメイン欠失型FVIIIにおいて免疫原性エピトープを導入するリスクを最小限にするために、リンカーの配列は、好ましくはFVIIIBドメイン由来である。最低限として、リンカーは、Bドメイン欠失型FVIII前駆ポリペプチドを重鎖と軽鎖へ切断するプロテアーゼの認識部位を含まなければならない。完全長FVIIIのBドメインにおいて、アミノ酸1644~1648は、この認識部位を構成する。Bドメイン欠失型FVIIIの活性化においてリンカーの除去をもたらすトロンビン部位は、重鎖に位置する。したがって、リンカーのサイズおよびアミノ酸配列が、トロンビン活性化による残りのFVIII分子からのそれの除去に影響する可能性は低い。Bドメインの欠失切断は、FVIIIの産生に有利である。とは言っても、Bドメインの一部を、生産性を低下させることなくリンカー中に含めることができる。Bドメインの生産性に対する負の効果は、Bドメインの任意の特定のサイズまたは配列に起因するものではなかった。本発明による第VIII因子抗体と同時投与することができるBドメイン切断型欠失型第VIII因子変異体は、1つまたは複数のOグリコシル化部位を含有してもよい。しかしながら、好ましい実施形態によれば、その分子は、切断されたBドメイン中のたった1つのO連結型オリゴ糖を含むその例は、WO09108806の図7に開示されたBDDFVIII40KDaPEG分子であり、Bドメインのアミノ酸配列は、SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRである。O連結型グリカンは、例えば、WO0331464の方法に記載されているように、第VIII因子分子を様々な側基とコンジュゲートするために用いられてもよい。本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子は、いくつかのN連結型オリゴ糖を含み、これらのそれぞれは、同様に、側基の付着のためのアンカーとしての役割を果たす可能性がある。wtFVIII分子内のBドメインの長さは、約907アミノ酸である。本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子分子内の切断型Bドメインの長さは、例えば、約10アミノ酸から約700アミノ酸まで、例えば、約12~500アミノ酸、12~400アミノ酸、12~300アミノ酸、12~200アミノ酸、15~100アミノ酸、15~75アミノ酸、15~50アミノ酸、15~45アミノ酸、20~45アミノ酸、20~40アミノ酸、または20~30アミノ酸など、約10アミノ酸から約800アミノ酸まで変化し得る。切断型Bドメインは、重鎖およびもしくは軽鎖の断片、ならびにまたはwtFVIII分子中に見出されない人工的に導入された配列を含んでもよい。用語Bドメイン切断型およびBドメイン欠失型は、本明細書で交換可能に用いられてもよい。フォンビルブランド因子vWFは、血漿中に存在する大きな単量体多量体糖タンパク質であり、内皮、巨核球、および内皮下結合組織中に構成的に産生される。その主要な機能は、他のタンパク質、特に第VIII因子との結合であり、それは、創傷部位への血小板粘着において重要である。第VIII因子は、循環中、vWFに結合しており、同時に不活性である第VIII因子は、vWFに結合していない場合、迅速に分解し、またはクリアランスされる。本発明による抗体は、vWFのFVIIIまたはFVIII変異体との結合に干渉しない。vWF結合への非干渉は、本発明の関連において、抗体FVIII相互作用についての測定される解離定数より10倍高い抗体濃度などのFVIII飽和を保証する抗体の濃度において、好ましくは0、または2未満、もしくは5未満、もしくは10未満、もしくは15未満、もしくは20未満、もしくは25未満、もしくは30未満のvWFとの結合の低下として定義される。vWFFVIII結合を測定するために用いることができるアッセイは、例えば実施例5に開示されている。用語vWFを結合する能力の低下とは、本明細書では、本発明による第VIII因子抗体と同時投与される第VIII因子変異体を含むことを意図され、vWFを結合する能力は、少なくとも50、好ましくは少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、より好ましくは少なくとも80、より好ましくは少なくとも90、最も好ましくは約100、減少する。FVIIIのvWFとの結合は、固相アッセイによるか、または表面プラズモン共鳴を用いる固定化vWFとの直接的結合としてかのいずれでも測定され得る。vWFとの結合に関与する第VIII因子における領域は、EP0319315に開示されているように、残基1670~1684に及ぶ領域である。この領域に関わる第VIII因子点突然変異体およびまたは欠失突然変異体は、vWFに結合する能力を改変することは認識されている。本発明による特に好ましい点突然変異の例には、以下の点突然変異の1つまたは複数を含む変異体が挙げられるY1680F、Y1680R、Y1680N、およびE1682T、およびY1680C。本発明による抗体と共に同時投与されるFVIII変異体が、vWFに結合する能力に関して改変されている場合には、そのようなFVIII変異体は、好ましくは、例えば、PEG、脂肪酸誘導体、アルブミンなどの延長基を用いて延長される。本発明による抗体、および本発明による第VIII因子抗体と同時投与することができる組換え第VIII因子タンパク質を産生するための適切な宿主細胞は、好ましくは、その分子がフォールディング中ならびに翻訳後修飾、例えば、グリコシル化および硫酸化中に正しく処理されることを保証するために哺乳類起源である。本発明を実施するにおいて、細胞は、哺乳類細胞、より好ましくは樹立哺乳類細胞系であり、それには、非限定的に、CHO細胞系、COS1細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、およびHEK293細胞系が挙げられる。好ましいBHK細胞系は、tkts13BHK細胞系であり、以下、BHK570細胞と呼ぶ。BHK570細胞系は、AmericanTypeCultureCollection、12301ParklawnDr、Rockville、MD20852からATCCアクセッション番号CRL10314により入手できる。tkts13BHK細胞系もまた、ATCCからアクセッション番号CRL1632より入手できる。好ましいCHO細胞系は、ATCCからアクセッション番号CCl61により入手できるCHOK1細胞系、ならびに細胞系CHODXB11およびCHODG44である。他の適切な細胞系には、非限定的に、ラットHepI、ラットHepII、TCMK、ヒト肺、NCTC1469DUKX細胞、およびDG44が挙げられる。3T3細胞、Namalwa細胞、骨髄腫細胞および骨髄腫細胞の他の細胞との融合体もまた有用である。いくつかの実施形態において、細胞は突然変異体または組換え細胞であってもよく、例として、由来する細胞型と定性的または定量的に異なる範囲の、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素を発現する細胞である。DUKX細胞は特に好ましい。現在好ましい細胞は、HEK293、COS、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、および骨髄腫細胞、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。改変された循環半減期本発明による第VIII因子抗体の単独での、または治療用第VIII因子分子と組み合わせての投与は、結果として、内因性第VIII因子の循環半減期の延長、または治療用第VIII因子と組み合わせた内因性第VIII因子の半減期の延長、または治療用第VIII因子分子の半減期の延長を生じ得る。循環半減期は、好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、好ましくは少なくとも20、好ましくは少なくとも25、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも35、好ましくは少なくとも40、好ましくは少なくとも45、好ましくは少なくとも50、好ましくは少なくとも55、好ましくは少なくとも60、好ましくは少なくとも65、好ましくは少なくとも70、好ましくは少なくとも75、好ましくは少なくとも80、好ましくは少なくとも85、好ましくは少なくとも90、好ましくは少なくとも95、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも125、より好ましくは少なくとも150、より好ましくは少なくとも175、より好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250または300、増加する。さらにより好ましくは、そのような分子は、少なくとも400、500、600、またはさらに700増加している循環半減期を有する。側鎖測基第VIII測基は、例えば、PEG分子などの親水性ポリマー、例えば、脂肪酸などの主に疎水性の分子、ペプチド起源の分子などを含んでもよい。測基は、通常、リンカーを介して第VIII因子にコンジュゲートしている。そのようなコンジュゲートした第VIII因子分子は、本発明による第VIII因子抗体と同時投与されてもよい。医薬組成物医薬組成物は、本明細書では好ましくは、例えば、すぐに使える滅菌水性組成物、または例えば、水もしくは水性緩衝液中に再構成することができる乾燥滅菌組成物などの非経口投与に適した、任意で第VIII因子分子と組み合わせて、本発明による第VIII因子抗体を含む組成物を包含することを意図される。本発明による組成物は、様々な薬学的に許容される賦形剤、安定剤などを含んでもよい。そのような組成物における追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張性調節剤、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質、および双性イオンを挙げることができる。そのような追加の成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼすべきではない。非経口投与は、シリンジ、任意でペン型シリンジを用いて、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射により実施されてもよい。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて実施することができる。さらなる選択肢は、鼻腔用または肺用スプレーの形をとるFVIII抗体化合物の投与のための溶液または懸濁液であり得る組成物である。なおさらなる選択肢として、本発明のFVIII化合物を含有する医薬組成物はまた、例えば無針注射による、もしくはパッチ、任意でイオン泳動的パッチからの経皮投与に、または経粘膜、例えば、頬側の投与に適応してもよい。本明細書で用いられる場合、用語処置とは、医学療法を必要としている任意のヒトまたは他の動物の対象の医学療法を指す。前記対象は、医師による理学的検査を受けていることが予想され、その医師は、前記の特定の処置を用いることが前記ヒトまたは他の動物の対象の健康にとって有益であることを示す暫定的または確定的診断を下している。前記処置のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状により、個体によって異なり得る。したがって、前記処置は、予防的、緩和的、対症的、およびまたは治癒的であり得る。実施形態のリスト本発明は、以下の非限定的実施形態を含む実施形態1活性化ヒト第VIII因子に結合する能力を有するモノクローナル第VIII因子抗体であって、活性化第VIII因子との結合によりA2ドメインの解離を低下させ、vWF結合に干渉しない抗体。実施形態2A2サブユニット会合の低下が、リン脂質表面の非存在下または存在下で起こる、実施形態1に記載の抗体。実施形態3活性化第VIII因子分子からのA2サブユニット解離の低下が、リン脂質表面の存在下で増強される、実施形態1に記載の抗体。実施形態4この抗体の投与が結果として、血小板の存在下でトロンビン活性化の増加を生じる、実施形態2または3に記載の抗体。実施形態5トロンビン活性化を加速しない、実施形態1~4のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。実施形態6A2ドメインに結合する、実施形態1~5のいずれか1つに記載の抗体。実施形態7A3ドメインに結合する、実施形態1~5のいずれか1つに記載の抗体。実施形態8配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなるリスト、または配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号21、配列番号22、および配列番号23からなるリストから選択されるCDR配列の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つと少なくとも95の同一性、より好ましくは少なくとも96の同一性、より好ましくは少なくとも97の同一性、より好ましくは少なくとも98の同一性、より好ましくは少なくとも99の同一性、または最も好ましくは100の同一性を有する1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのCDR配列を含む、実施形態1~6のいずれか1つに記載の抗体。実施形態9前記抗体のCDR配列が、以下のCDR配列配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号11、配列番号12、および配列番号13、または配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号21、配列番号22、および配列番号23と少なくとも95の同一性、好ましくは少なくとも96の同一性、好ましくは少なくとも97の同一性、好ましくは少なくとも98の同一性、好ましくは少なくとも99の同一性、最も好ましくは100の同一性を有する、実施形態8に記載の抗体。実施形態10配列番号10または配列番号20と少なくとも95の同一性、好ましくは少なくとも96の同一性、好ましくは少なくとも97の同一性、好ましくは少なくとも98の同一性、最も好ましくは100の同一性を有するVL配列、および配列番号9または配列番号15と少なくとも95の同一性、好ましくは少なくとも96の同一性、好ましくは少なくとも97の同一性、好ましくは少なくとも98の同一性、最も好ましくは100の同一性を有するVH配列を含む、実施形態8~9のいずれか1つに記載の抗体。実施形態11ペプチド断片407~428およびまたは591~602と同一の、または重複するエピトープに結合する、実施形態1~10のいずれか1つに記載の抗体。実施形態12ペプチド断片1965~1976と同一の、または重複するエピトープに結合する、実施形態1~10のいずれか1つに記載の抗体。実施形態134F143抗体との結合と競合する、実施形態1~12のいずれか1つに記載の抗体。実施形態14実施形態1~13のいずれか1つに記載の抗体をコードするDNA配列を含むDNA分子。任意で、このDNA分子は、発現ベクター内に包埋される。実施形態14A実施形態14に記載のDNA分子を含む宿主細胞。実施形態15軽度、中等度、または重度の血友病Aなどの血友病Aの処置のための薬剤としての、実施形態1~13のいずれか1つに記載の抗体の使用。実施形態16実施形態1~13のいずれか1つに記載の抗体および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。実施形態17実施形態1~13のいずれか1つに記載の抗体、および第VIII因子分子、および任意で薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。実施形態16または17のいずれか1つに記載の医薬組成物は、皮下投与用であってもよい。実施形態18実施形態1~13のいずれか1つに記載の抗体を作製する方法であって、そのような抗体をコードするDNA分子を含む宿主細胞の、前記抗体を発現するのに適した条件下でのインキュベーションを含む方法。実施形態19血友病性疾患の処置の方法であって、それを必要としている患者に、実施形態1~13のいずれか1つに記載の分子の治療有効量を、任意で第VIII因子分子と組み合わせて投与することを含む方法。実施形態1~13のいずれか1つに記載の分子は、実施形態16または17に記載の医薬組成物の形をとってもよい。タンパク質Bドメイン欠失型第VIII因子を、他の箇所で記載されているように、チャイニーズハムスター卵巣細胞において組換え的に調製した。組換えヒルジンを、pET26bへクローン化し、標準ニッケルニトリロ三酢酸クロマトグラフィーを用いて、導入されたLeuGln6タグによって、大腸菌における周辺質発現後、精製した。抗体産生本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル方法、例えば、KohlerおよびMilsteinNature256495頁の標準体細胞雑種技術を含む様々な技術によって産生することができる。基本的には体細胞雑種手順が好ましいが、モノクローナル抗体の産生のための他の技術、例えば、Bリンパ球のウイルス形質転換または発癌性形質転換、ヒトまたは他の種の抗体遺伝子のライブラリーを用いるファージディスプレイ技術を用いることができる。RBF、Balbc、NMRICF1、またはFVIII欠損マウスを、マウスモノクローナル抗体の免疫化および産生のために用いた。免疫化のための抗原として、FVIIIを、トロンビンであらかじめ活性化しておくか、またはプロ補因子の形かのいずれかで用いた。マウスの背中に皮下注射した。FVIIIを、1回目の注射としてフロイント完全アジュバントと混合した。その後の免疫化において、フロイント不完全アジュバントを、同じ濃度の抗原と共に用いた。最後の免疫化から10日後、マウス由来の眼血液を、FVIII特異的抗体についてELISAを用いてスクリーニングした。陽性血清力価を有するマウスを、最初の免疫化に用いられたFVIII変異体の10μgで静脈内注射によりブーストし、3日後、屠殺した。脾臓を無菌的に取り出し、単細胞懸濁液へと分散させた。脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合を、PEG方法により、または電気融合法により行った。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いてモノクローナル抗体を精製した。ハイブリドーマ上清における安定化抗FVIIIa抗体の検出抗FVIIIa抗体のFVIIIaを安定化する能力を、以下のように、機能的色素生産性一次スクリーニングアッセイにおいて評価した30μlの抗FVIII上清を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの104nMFVIIIを加えた。その後、20μlの14nMトロンビンを加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。インキュベーション後、50ATUmlヒルジンおよび1625μM2575PSPCリン脂質を含有する20μlを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で75分間、解離させておき、続いて、残存するFVIIIa活性を定量化した。この目的を達成するために、13nMFIXaと1625nMFXの40μlの混合物を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、920μMにおけるFXa基質S2765の100μlを加えた。室温で5分間のインキュベーション後、25μl1Mクエン酸、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダーにおいて測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。以下の3つの媒体対照をアッセイに含めた1解離時間なし、275分間の解離時間、375分間の解離時間およびFVIIIが緩衝液に置き換えられている。最初の2つの対照試料は、アッセイウィンドウを規定し、3番目の対照は、全ての測定値から減算された。図1におけるデータは、FVIIIを自発的解離に対抗して安定化させる抗FVIII上清の能力を実証している。ハイブリドーマ上清における安定化抗FVIIIa抗体の検出一次スクリーニングからの抗FVIIIa上清を、数個の時点で、かつ2つの抗体濃度においてFVIIIa減衰に対するそれらの効果を評価するために、二次の時間経過アッセイで再スクリーニングした。アッセイを以下のとおり実施した15μlまたは30μlの抗FVIII上清を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの104nMFVIIIを加えた。トロンビンを加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。活性化後、50ATUmlヒルジンおよび1625μM2575PSPCリン脂質を含有する20μlを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で75分間、15分間、および25分間、解離させておいた。13nMFIXaと1625nMFXの40μlの混合物を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、100μlの920μMS2765色素生産性FXa基質S2765を加えることにより、残存するFVIIIa活性を測定した。5分後、25μl1Mクエン酸、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダーにおいて測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。アッセイにおけるFVIIIの依存性を検証するために媒体対照をアッセイに含めた。対照は、75分間の解離時間をもち、FVIIIの代わりに緩衝液が加えられた。機能的色素生産性スクリーニングアッセイにおける精製抗FVIIImAbの特性精製された抗FVIIIa抗体を、動態学的FVIIIa減衰に対するそれらの効果、ならびにリン脂質の存在および抗体濃度への依存性を評価するために、時間経過アッセイにおいて、異なる濃度で、かつリン脂質存在下または非存在下で試験した。アッセイは以下のとおり実施した30μlの精製抗FVIII抗体を96ウェルSpectramaxマイクロタイタープレートへ移し、続いて、20μlの104nMFVIIIを、または代わりに、104nMFVIIIおよび1625μM2575PSPCリン脂質を含有する20μlを加えた。トロンビンを加え、室温で5分間、インキュベートして、FVIIIを活性化させた。インキュベーション時間後、20μlの50ATUmlヒルジンを加えることによって、トロンビンを不活性化した。その後、活性化FVIIIを、室温で75分間、15分間、25分間、解離させておいた。13nMFIXaと1625nMFXの40μlの混合物を、または代わりに、13nMFIXaと1625nMFXと8125μM2575PSPCリン脂質とを含有する40μlの混合物を加え、室温で5分間、インキュベートし、続いて、100μlの920μMS2765色素生産性FXa基質を加えることにより、残存するFVIIIa活性を測定した。室温で5分後、25μl1Mクエン酸、pH3を加えて、反応を停止した。405nmにおける吸光度を、Envisionプレートリーダーにおいて測定し、参照波長として620nmにおける吸光度を用いた。アッセイにおけるFVIIIの依存性を検証するために媒体対照をアッセイに含めた。対照は、75分間の解離時間をもち、FVIIIの代わりに緩衝液が加えられた。図2におけるデータは、75分間、15分間、および25分間のインキュベーション時間にわたる自発的解離に対抗してFVIIIを安定化させる抗FVIII上清の能力、ならびに観察された安定化効果の全てがFVIII依存性であることを実証している。抗体のエピトープ結合Biacore3000装置においてタンデムブロッキングアッセイを用いるFVIIIとの競合結合を実施することにより、抗体をエピトープビンに割り当てた。アッセイは、C2ドメインを認識する固定化非干渉抗体によるチップ上へのFVIIIの配向捕獲、続いてFVIIIの飽和を保証するためのそれぞれ200nMにおける一次抗体および二次抗体の逐次結合を含む3ステップからなった。重複するエピトープは、二次抗体が、一次抗体結合後に結合することができないこととして観察され、抗体をエピトープビンへ分類するために用いられた。10mM酢酸緩衝液、pH50中50μgmlでのFVIII捕獲抗体を、製造会社により記載されているように、標準NHSEDCカップリング化学反応を用いてCM5チップのフローセル1および2に固定化した。最終カップリングレベルは10kRUであった。その後の結合実験を、25°C、ランニング緩衝液中5μ分の流速で、オンライン参照減算のためにフローセル1を用いて実施した。FVIIIは、フローセル2にわたって4nMを2分間、注射することにより400RUのレベルで捕獲された。これに続いて、両方のフローセルにわたる200nM一次抗体注入への3分間の暴露、および最後に、200nM二次抗体の同一の注入を行った。各結合実験の終わりに、10mMグリシン、pH20の2分間のパルスによって再生を実施した。全工程を、4F136を除くTable1に列挙された抗体の全ての対での順列について繰り返した。これらの交差競合研究に基づいて、抗体は、クラス1およびクラス2と表示される2つのエピトープビンに分類することができた。クラス1に属するメンバーは、4F143、4F50、4F140、および4F136であり、一方、クラス2は、4F11、4F41、および4F17に代表された。2つのクラスにわたる抗体間の競合は観察されなかったが、各クラス内のメンバーは、FVIII結合に関して相互排他的であり、部分的または完全に重複するエピトープを示している。FVIIIについての親和性FVIIIの抗体との結合の動態を、Biacore3000装置を用いる表面プラズモン共鳴によって決定した。各抗体を、製造会社により記載されているように、ウサギ抗マウスIgG抗体でコーティングされたCM5チップのフローセル2に70~110RUのレベルで捕獲した。動態分析を、参照としてフローセル1を用いて、25°C、ランニング緩衝液中30μl分の流速で実施した。0nMから40nMまでのFVIIIの2倍段階希釈溶液を分析した。ランニング緩衝液中のフローセルの3分間の平衡後、150μlFVIIIを注射した。解離相は9分間続き、10mMグリシン、pH17の3分パルスで再生を実施した。得られた、参照を減算したセンサーグラムは、11のLangmuir結合モデルによく適合し、その結合モデルにより、BIAevaluation41ソフトウェアを用いて会合速度定数および解離速度定数、ならびに平衡解離定数の推定が可能になった。FVIIIaの安定化FVIIIaの自発的解離に対する抗体の効果を、本質的には他の箇所で記載されているように、機能的減衰アッセイにおいて測定した。200μlの体積におけるFVIIIの活性化を、40nMの最終トロンビン濃度まで20μlのヒトαトロンビンと混合することにより実行した。30秒間の活性化後、20μlの組換えヒルジンを加えて、トロンビンを阻害し、生成されたFVIIIaを規定の期間、減衰させておいた。残留するFVIIIaを、FXのFXaへの変換を支援するその能力を測定することにより定量化した。2575PSPCリン脂質ベシクルを含有する60μlの血漿由来FXIaにFVIIIa減衰混合物を移し、Xase複合体を構築し、15秒間のインキュベーション後、20μlのヒト血漿由来FXを加えた。FX活性化中の最終濃度は、それぞれ、10nM、25μM、および150nMであった。FX活性化を30秒間、進行させ、その後に、等量のクエンチ緩衝液への希釈により反応を停止させ、生成されたFXaを、04mMS2765色素生産性基質の存在下で、405nmにおける吸光度の増加を時間とともに測定することにより、測定した。全ての実験を、96ウェルプレート内で20mMHEPES、150mMNaCl、5mMCaCl2、5mgmlBSA、pH74の緩衝液中、室温で、迅速な混合を確実にするために振盪させながら、実施した。指示がある場合、10μMリン脂質およびもしくは20nM抗体を、FVIIIもしくはヒルジンと共に加え、または活性化後にwtFVIIIより約4倍速く自発的に解離することが示されている変異体FVIIIS289LにFVIIIを置き換えた。これらの実験からの結果は、4F143および他のクラス1の抗体が、リン脂質表面の存在に厳密に依存する機構により自発的FVIIIa解離の速度を遅くすることを実証している。トロンビン活性化前のFVIIIと抗体の前もっての会合は、安定化に必要とされない。FVIIIS289L変異体の部分的~完全な救出が観察される。抗体の存在下または非存在下での最初の時点でのFX活性化の類似した速度は、抗体が、選択された実験条件下でFXのFXaへの変換の速度に影響しないことを示している。FVIIIのvWFとの相互作用に対する抗体の効果FVIIIのフォンビルブランド因子との結合に対する抗体の効果を固相競合アッセイにより研究し、そのアッセイにおいて、vWFでコーティングされたウェルを、添加される抗体の異なる濃度においてFVIIIに曝した。NuncMaxiSorpマイクロタイタープレートウェルを、20mMイミダゾール、150mMNaCl、10mMCaCl2、pH73中の1μgmlのvWFで、4°Cで一晩、コーティングし、その後、10mgmlウシ血清アルブミンおよび002Tween80を追加した同じ緩衝液で1時間、ブロッキングした。コーティングされたウェルを、0~162nMの抗体の存在下で、005nMから64nMまでの範囲の濃度へブロッキング緩衝液中に希釈された100μlFVIIIと、室温で1時間、インキュベートした最大濃度は、FVIII抗体相互作用についての測定されたKd参照を有意に超える。ブロッキング緩衝液での頻回の洗浄後、720~740領域を認識する333nMビオチン化モノクローナル抗FVIII抗体1F5を、100μlの体積のブロッキング緩衝液において加え、15分間、インキュベートした。ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート化ストレプトアビジンを100μlブロッキング緩衝液において加え、存在するビオチンに15分間、結合させた。ブロッキング緩衝液での頻回の洗浄後、結合したFVIIIを、ペルオキシダーゼにより処理されるTMBの量として定量化した。5分後、等量の2Mリン酸の添加により反応を停止し、形成された生成物の量を、SpectraMaxプレートリーダーにおいて450nmにおける吸光度により定量化した。図4に示されているように、試験された抗体のいずれも、FVIIIの抗体での本質的に完全な飽和を保証する濃度においてさえも、FVIIIのvWFとの相互作用に影響を及ぼさなかった。FVIIIのトロンビンによる活性化に対する抗体の効果FVIIIの活性化補因子への変換は、トロンビンまたは第Xa因子により触媒される、重鎖および軽鎖における3つの部位でのタンパク質限定加水分解によって起こる。軽鎖におけるR1689での切断は、酸性A3領域を遊離し、FVIIIのvWFからの解離を引き起こす。重鎖の切断は、ドメイン間領域内のA2B接合部およびA1A2接合部、それぞれにおいて起こる。後者部位におけるタンパク質分解は、FVIIIが補因子活性を獲得するのに必須であり、50kDaのA1サブユニットの生成によりモニターすることができる。最近、抗FVIII抗体が、FVIIIのタンパク質分解性活性化を加速することが記載された。加えて、本発明者らは、によって最初に記載され、かつAmericanDiagnosticaIncから入手できる、よく知られたモノクローナル抗FVIII抗体ESH5およびESH8もまた、トロンビンによるFVIII活性化を加速することを見出している。本発明由来の抗体のFVIII活性化の動態に対する効果を決定するために、逆相HPLCによりA1サブユニット生成をモニターするタンパク質分解性アッセイを用いた。FVIIIaの自発的減衰に対抗しての抗体媒介による安定化に起因するいかなる交絡効果も避けるために、時間の関数としてFVIIIa活性を定量化する伝統的な機能アッセイを支持して、この特定のアッセイを選択した。FVIIIの1nMトロンビンによる活性化を20mMHEPES、150mMNaCl、5mMCaCl2、001Tween80、pH74緩衝液中、37°Cで実施した。規定の間隔をおいて、200nMのヒルジンの添加により、活性化をクエンチした。クエンチされた試料を氷上で冷却し、その後、生成された軽鎖の量を定量化するためにrpHPLCにより分析した。時間経過研究により、ヒルジンの添加がFVIIIのさらなる活性化を効果的に阻止することが実証された。FVIII軽鎖を、VydacC18カラム上への34溶媒B中10~20μlの注射により定量化した。移動相は、009トリフルオロ酢酸を含有する水、および009トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルからなる。1ml分の流速で15分間かけて34から65までの溶媒Bの直線的勾配により分離を達成した。カラムを40°Cに維持し、溶出FVIIIaサブユニットを、280nmでの励起および340nmでの発光を有する蛍光によって検出および定量化した。トロンビン活性化により調製された規定量のFVIIIaの注射により作成された標準曲線に基づいてピーク領域をモル濃度へ変換した。A1サブユニットを表すピークを、発表された手順に従って調製された単離FVIIIaサブユニットの溶出時間から同定した。図5に示されているように、ESH5およびESH8が、トロンビンによるFVIIIの活性化を加速することが見出された。同様に、moAb216が、発表された研究に一致して、FVIII活性化を加速することが見出されたが、4F143、4F50、および4F140について加速は観察されなかった。血友病A血漿におけるトロンビン産生に対する抗体の効果洗浄した血小板を記載されているように調製し、血友病A血漿へ150000血小板μlの最終密度まで加えた。80μlの血小板含有血漿を、マイクロタイターウェル中で5μl再脂質付加組織因子と混合し、FlouroskanAscentプレートリーダーにおいて37°Cで10分間、予熱した。野生型FVIIIもしくは変異体、または50nM4F143抗体と同時製剤化された野生型FVIIIを15μl、加えた。CaCl2と混合された蛍光発生基質を20μl、加え、その後、1時間連続して蛍光を測定した。記載されているように、蛍光シグナルをα2マクログロブリン結合トロンビン活性について補正し、キャリブレータおよびThrombinoscopeソフトウェアを用いることによりトロンビン濃度へ変換した。0011nMFVIIIで得られたトロンビン活性の最大レベルを、Thrombinoscopeソフトウェアによって測定した。以下のとおり、トロンビン産生の最大速度を、Thrombinoscopeソフトウェアから得られたパラメータから計算したトロンビン産生の最大速度トロンビン活性の最大レベル。トロンビン産生の両方のパラメータは、抗体4F143が01nMFVIIIのトロンビン産生を増強したことを示している。HXMSによるFVIIIa安定化mAbのFVIII上のエピトープマッピングHXMSテクノロジーは、タンパク質の水素交換を質量分析法により容易に追跡できることを利用している。水素を含有する水性溶媒を、重水素を含有する水性溶媒で置き換えることにより、タンパク質における所定の部位での重水素原子の取り込みが1Daの質量の増加を生じる。この質量増加は、交換反応のクエンチした試料において質量分析法により時間の関数としてモニターすることができる。重水素標識情報は、クエンチ条件下でのペプシン消化により、かつ生じたペプチドの質量増加に従って、タンパク質における領域へ亜局在化させることができる。HXMSの一つの用途は、タンパク質タンパク質複合体形成後の水素交換の低下の領域を同定することにより分子相互作用に関与する部位を探索することである。通常、結合界面は、溶媒の立体的排除による水素交換の著しい低下によって明らかにされる。タンパク質タンパク質複合体形成は、それぞれの結合パートナーの存在下および非存在下でいずれかのタンパク質メンバーに取り込まれた重水素の総量を時間の関数として測定することにより、HXMSによって簡単に検出され得る。HXMS技術は、天然の成分、すなわち、タンパク質および抗体またはFab断片を用い、溶液中で実施される。したがって、HXMSは、インビボの条件を模倣する可能性を提供するを参照。器具およびデータ記録全てのタンパク質について、実験前に、pH73に調整された、20mMイミダゾール、10mMCaCl2、150mMNaClへ緩衝液交換を行った。HX実験は、LeapShellソフトウェアによって操作されるLeapロボットにより自動化され、そのロボットは、重水素交換反応の開始、反応時間の管理、クエンチ反応、UPLCシステムへの注射、および消化時間の管理を実施した。Leapロボットは、緩衝液貯蔵およびHX反応のために20°Cに維持され、タンパク質の貯蔵およびクエンチ溶液のために2°Cに維持された、それぞれの温度制御スタックを2つ備えていた。Leapロボットはさらに、ペプシンカラム、プレカラム、および分析カラムを保持する冷却TrioVSユニット、ならびに1°CにおけるLCチュービングバルブおよびスイッチングバルブを内蔵した。スイッチングバルブは、HPLCからMicroboreUHPLCスイッチバルブへアップグレードしている。インラインペプシン消化について、015pmolFVIIIを含有する100μLのクエンチした試料を負荷し、Poroszyme固定化ペプシンカートリッジに、200μL分のアイソクラチック流速を用いて通した。生じたペプチドをVanGuardプレカラムBEHC1817μm上に捕捉し、脱塩した。その後、バルブを切り換え、プレカラムインラインを分析カラム、UPLCBEHC1817μmと共に配置し、AQUITYUPLCシステムから150μL分で送達される15~40Bの9分間のグラジエントを用いてペプチドを分離した。移動相は、A水中01ギ酸、およびBCH3CN中01ギ酸からなった。ESIMSデータおよびエネルギー上昇実験は、QTofPremierMSを用いて陽イオンモードにおいて得られた。ロイシンエンケファリンがロックマスとして用いられ、データは、連続体モードで収集された。データ分析消化性ペプチドを、MSE方法を用いて別々の実験において同定した。MSEデータを、BiopharmaLynx12を用いて処理した。HXMS生データファイルを、連続ロックマス補正に供した。データ分析、すなわち、重水素化ペプチドの重心決定、および内部交換曲線のプロットを、HXExpressWeisら、JAmSocMassSpectrom、17、1700頁を用いて行った。4F143および4F41のエピトープマッピングアミド水素重水素交換を、4F143または4F41のいずれかの非存在下または存在下で、30μMの濃度のFVIII溶液の、対応する重水素化緩衝液、すなわち、D2O、98D2O最終、pH73中に調製された20mMイミダゾール、10mMCaCl2、150mMNaClへの調製によって開始した。全てのHX反応は、20°Cで実行され、FVIIIの抗体での飽和を保証するために過剰量のFVIIImAbの非存在下または存在下で、3μMFVIIIを含有した。10秒間から2時間46分40秒間までの範囲の適切な時間間隔で、HX反応のアリコートを、等量の氷冷クエンチング緩衝液135MTCEPホスフィンハイドロクロライド、EMDChemicalsincによってクエンチし、結果として、26の最終pHを生じた。4F143エピトープを同定する生データの例は図6Aに示されている。4F143エピトープFVIIIの一次配列の82を網羅する412個のペプチドの重水素取り込み速度を、4F143の存在下または非存在下で、8つの時点、すなわち、10秒目、30秒目、100秒目、300秒目、1000秒目、3000秒目、および10000秒目においてモニターした。4F143の存在下または非存在下での観察された交換パターンは、以下の2つの群に分けられ得るペプチドの一つの群は、4F143の結合によって影響されない交換パターンを示し、それはペプチドの982を構成する。対照的に、FVIII消化性ペプチドのもう一つの群は、4F143との複合体形成後の交換からの保護を示し、それは消化性ペプチドの17を含む。例えば、30秒目のD2Oとの交換において、4F413結合後に領域アミノ酸407~428において約1個のアミドが交換から保護されている。2つの領域が、4F413結合後に保護を示すことが見出され、一つの領域は、残基アミノ酸407~428、414~428、415~428、416~428、および406~431にわたる5つの消化性ペプチドを含み、別の領域は、残基アミノ酸591~602および593~597にわたる2つの消化性ペプチドを含む。2つのエピトープ領域は、両方ともFVIIIのA2サブドメイン内に見出される。重複ペプチドによる交換保護の相対的量の比較により、配列アミノ酸407~428および591~602内に見出される、4F143との複合体形成後に影響したFVIIIの領域を狭めることが可能になった。遊離FVIII対4F143との複合体形成におけるFVIIIのHX結果を比較することによって、2つのエピトープ領域に含まれる消化性ペプチドについて相対的交換保護率を決定した。配列アミノ酸407~428内のエピトープ領域について、残基アミノ酸414~428、415~428、416~428にわたるペプチドについて同定された相対的交換保護は、同等のレベルであり、残基アミノ酸406~431、407~428にわたるペプチドについて決定された相対的レベルの約50であることが見出された。配列アミノ酸591~602内のエピトープ領域について、残基アミノ酸593~597にわたるペプチドについて同定された相対的交換保護が、残基アミノ酸591~602にわたるペプチドについて決定された相対的保護レベルの約40であることが見出された。配列アミノ酸407~428および591~602にわたる2つのエピトープ領域は、FVIIIの発表された結晶構造へドッキングさせた場合、構造的に接近していることが見出されている、16、597~606頁。4F41エピトープFVIIIの一次配列の82を網羅する412個のペプチドのHX時間経過を、4F41の存在下および非存在下で、8つの時点、すなわち、10秒目、30秒目、100秒目、300秒目、1000秒目、3000秒目、および10000秒目においてモニターした。4F41の存在下または非存在下での観察された交換パターンは、以下の2つの群に分けられ得るペプチドの一つの群は、4F41の結合によって影響されない交換パターンを示し、それはペプチドの993を構成する第2の群は、4F41との複合体形成後の交換からの保護を示し、それは消化性ペプチドの07を含む。重複消化性ペプチドの研究により、FVIIIのドメインA3に見出される配列アミノ酸1965~1970内に限局される、同定されたエピトープ領域の亜局在化が可能になった。短いインキュベーション時間、すなわち、10秒間および30秒間で、検出可能な重水素取り込みレベルの有意な低下を示す3つのペプチドが同定された。これは明らかに、それらが、エピトープ内に位置していることを示している。これらのペプチドは、それぞれ、配列アミノ酸1963~1972、1963~1974、1965~1976にわたる。マウス抗FVIII4F143および4F50モノクローナル抗体のクローニングおよびシークエンシングこの実施例は、マウスの抗FVIII抗体4F143の重鎖および軽鎖の配列のクローニングおよびシークエンシングを記載する。全RNAを、Qiagen製のRNeasyMiniKitを用いてハイブリドーマ細胞から抽出し、cDNA合成の鋳型として用いた。Clontech製のSMARTerRACEcDNA増幅キットを用いて5’RACE反応においてcDNAを合成した。その後のHCおよびLC配列の標的増幅を、PhusionHotStartポリメラーゼおよびフォワードプライマーとしてSMARTerRACEキット内に含まれるユニバーサルプライマーミックスを用いるPCRによって実施した。以下の配列を有するリバースプライマーをHC増幅に用いた5’CCCTTGACCAGGCATCCCAG3’以下の配列を有するリバースプライマーをLC増幅に用いた5’GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3’PCR産物をゲル電気泳動によって分離し、GEHealthcareBioSciences製のGFXPCRDNAGelBandPurificationKitを用いて抽出し、ZeroBluntTOPOPCRCloningKitおよび化学的コンピテントTOP10Ecoliを用いてシークエンシングのためにクローン化した。AppliedBiosystems製のAmpliTaqGoldMasterMixおよびM13uniM13revプライマーを用いて、選択されたコロニーにコロニーPCRを実施した。コロニーPCRクリーンアップを、ExoSAPIT酵素ミックスを用いて実施した。M13uniM13revシークエンシングプライマーを用いて、MWGBiotech、MartinsriedGermanyにおいてシークエンシングを実施した。配列を分析し、VectorNTIプログラムを用いてアノテートした。全てのキットおよび試薬は、製造会社の使用説明書に従って用いられた。抗FVIII4F143単一の固有のマウスκ型LCおよび単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を同定した。核酸配列およびアミノ酸配列は下記に挙げており、リーダーペプチド配列は含まれていない。抗FVIIIa4F143VHアミノ酸配列、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、下線が引かれている1QIQFVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGW51INSYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGA101SYAMDYWGQGTSVTVSS抗FVIIIa4F143VH核酸配列5’CAGATCCAGTTCGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACTCCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGCTTCTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA抗FVIIIa4F143VLアミノ酸配列、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、下線が引かれている1DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPVKTNKLLIYS51GSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHYEYPLTFGA101GTKLELKR抗FVIIIa4F143VL核酸配列5’GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGTGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATTATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG抗FVIII4F50単一の固有のマウスκ型LCおよび単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を同定した。核酸配列およびアミノ酸配列は下記に挙げており、リーダーペプチド配列は含まれていない。抗FVIIIa4F50VHアミノ酸配列、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、下線が引かれている1QIQFVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGW51INSYTGEPTYADDFKGRFDFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGA101SYAMDHWGQGTSVTVSS抗FVIIIa4F50VH核酸配列5’CAGATCCAGTTCGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACTCCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGACTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGCTTCTTATGCTATGGACCACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA抗FVIIIa4F50VLアミノ酸配列、CDR2、およびCDR3はそれぞれ、下線が引かれている1DVQITQSPSYLAASPGETISINCRASKSISKYLAWYQEKPVKTNKLLIYS51GSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHYEYPLTFGA101GTKLELKR抗FVIIIa4F50VL核酸配列5’GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTAGTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGTGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATTATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG[参考文献]