"少なくとも1×109M-1の結合力定数KaでヒトCD4に結合する単離されたヒト免疫グロブリンであって、CDR1、CDR2及びCDR3配列を含むHC2トランスジーンから由来する重鎖可変領域と、CDR1、CDR2及びCDR3配列を含むKCo5トランスジーンから由来する軽鎖可変領域を含み、配列番号7または61によって示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号8または62によって示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域とを含む、単離された免疫グロブリン。上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在することは明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するDセグメントの全部または一部を含む機能的V-D-J遺伝子再配列を受けることができる異種免役グロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。更に、1機能的なB細胞発達が起こり、そして2療法上有用な異種抗体が産生されるようにV-D-J組換えとイソタイプスイッチングを支えることができるトランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるB細胞源に対する要求も存在する。機能的V-D-J組換えおよび/またはイソタイプスイッチングを受けることができる異種免疫グロブリントランスジーンはそれらの要求を満たすことができる。上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提洪される。更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物からのB細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化されている前記B細胞を提供することが本発明の目的である。この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供することが本発明の目的である。更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが本発明の目的である。更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが本発明の目的である。本発明の更なる目的は、本発明の1または複数のトランスジーンを作製するために使われる免疫グロブリン可変領域遣伝子セグメントレパートリーを作製する方法を提供することである。上記の参考文献は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利がないと認めることと解釈してはならない。異種抗体、例えばヒト抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。そのような異種抗体は、IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,IgA1,IgA2,IgAscc,IgDまたはIgEを含む様々なイソタイプのものであることができる。そのようなトランスジェニッグ非ヒト動物が免疫応答を行うには、B細胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックB細胞および前B細胞が表面結合型免疫グロブリン、特にIgMことによるとIgDイソタイプのものを産生することが必要である。そのようなIgMまたはIgD表面結合型免疫グロブリンの発現はB細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期には一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟B細胞は他のイソタイプを産生し得る。典型的には、B細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生するだろうが、μS分泌型μおよびμM膜結合型μ型、並びにμおよびδ免疫グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択一RNAスプライシングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従って、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なIgG,IgAおよびIgMイソタイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチングが起こることが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラススイッチであってもよく、または1もしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ機構から生じてもよい。本発明は、異種免疫グロブリントランスジーンおよびそのようなトランスジーンを有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生することができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジーン中の少なくとも1つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換えδ-関連欠失により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランスジーン間および/または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことができる。そのようなトランスジーンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型B細胞成熟に必要である第一の免疫グロブリンイソタイプを産生し、そして療怯的および/または診断的効用を有する1または複数の第二の異種イソタイプをコードし産生するようにスイッチすることができる。よって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遣伝子配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するIgG,IgAおよび/またはIgE抗体を産生することができる。本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェニック動物からのB細胞にも関し、そのようなB細胞は、特定抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなB細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の1つの源として働くことができる。本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトランスジェニック動物から外植されたB細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプスイッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供する。そのようなイソタイプスイッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたB細胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばT細胞由来のリンホカイン例えばIL4およびIFNγで処理することによって誘導することができる。更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を誘導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものであることができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプIgG.IgAおよびIgMの異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび前記動物のB細胞から誘導されるモノクローナル抗I本クローンが多様なイソタイプのものであり得るように、トランスジーンがイソタイプスイッチを果たす配列を含む方法を提供する。本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遣伝子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異なる時間順序で起こるように、トランスジーンのイソタイプスイッチを促進する方法を提供する。スイッチ領域は、様々なCH遺伝子から移植しそしてトランスジーン構成物中の別のCH遺伝子に連結せしめることができる。そのような移植スイッチ配列は典型的には結合されたCH遺伝子とは独立的に機能し、そのため、トランスジーン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ一結合欠失配列が様々なCH遺伝子に連結され、2つのδ-結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイッチを果たすことができる。よって、特定のCH遺伝子が異なるスイッチ配列に連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こるよりも頻繁にスイッチされるトランスジーンを作製することができる。本発明はまた、免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物においてトランスジーン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列欠失を含んでもよいのサブセットを含有する免疫グロブリントランスジーン構成物、および免疫グロブリントランスジーン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免疫グロブリントランスジーンの容易なクローニングと作製のための特別な方法であって、2つのユニークNotl部位により隣接されたユニークXholおよびSalI制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。本発明のトランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、トランスジェニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中での該遺伝子セグメントの組換え機能的再配列並びに生成した再配列された免役グロブリン重鎖および/または軽鎖の発現を可能にする。本発明の一観点によれば、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、再配列された異種DNAの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのC,Jおよび重鎖の場合にはDセグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セダメントの実質的部分も含んで成る。一態様では、そのようなトランスジーン構成物は、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種DNAから誘導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有するトランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを組み合わせることができる。本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリシトランスジーン-即ちD細胞分化中にVDJ結合を受けるもの-を抗原と接触せしめ、二次レパートリーB細胞における異種抗体の産生を誘導する。本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベクターおよび方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、トランスジーン、好ましくはポジティブ-ネガティブ選別ベクターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物にとって内因性である重鎖および/または軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子セグメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。そのような内因性遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常領域遺伝子セグメントが挙げられる。本発明のこの観点によれば、ポジティブ-ネガティブ選別ベクターを少なくとも1つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ-ネガティブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応答を開始することが実質的に不可能である。そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使うことができ、または異種免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの受容体として使うことができる。本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、1または複数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および組成物を提供する。そのような方法は、トランスジーンによってコードされる1または複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジーンによってコードされる1または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑制は、破壊された内因性Ig遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。内因性Ig遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ig鎖抑制は、1内因性Ig鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスRNAをコードし発現するトランスジーン、2内因性Ig鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスズリゴヌクレオチド、および3内因性Ig鎖ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができる。本発明は、機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の同型接合対、機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも1つのコピー、及び非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも1つのコピーを含み、ヒト抗原例えばCO4といった抗原での免疫化に続いて抗体応答を行なう、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明は同様に、前記機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子がJH領域相同組換えノックアウトであり、前記機能的に分断された内因性軽鎖対立遺伝子がJk領域相同組換えノックアウトであり、前記非相同免疫グロブリン重鎖トランスジーンがHC1又はHC2ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、前記非相同軽鎖トランスジーンがKC2又はKCleヒトκトランスジーンであり、前記抗原がヒト抗原であるような、ヒト以外のトランスジェニック動物をも提供する。本発明は同様に、内因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座を抑制、切除及び/又は機能的に分断するためのさまざまな実施態様をも提供している。本発明は同様に、ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列重鎖恒常領域を含むキメラ重鎖及びヒト配列重鎖の両方を発現するトランスジェニックマウスをも提供する。このようなキメラ重鎖は一般に、機能的に再配置されたヒトトランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域γ1,γ2a,γ2b,γ3の間でのトランススイッチにより産生される。標準的にはトランスジーンコードされたヒト配列軽鎖又は内因性マウス軽鎖と引合わされたこのようなキメラ重鎖を含む抗体は、予め定められた抗原での免疫化に応答して形成される。これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、第1の時点でヒト配列重鎖を産生発現し、第2次に続く時点でヒト可変領域及びマウス恒常領域例えば、γ1,γ2a,γ2b,γ3から成るキメラ重鎖を産生発現するべくトランススイッチするB細胞を含むことができる;このようなヒト配列及びキメラ重鎖は軽鎖をもつ機能的抗体内に組込まれる:このような抗体は、かかるトランスジェニックマウスの血清中に存在する。かくして換言すると、これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、ヒト配列重鎖を発現しその後、ヒト可変領域及び交互の恒常領域例えばマウスγ1,γ2a,γ2b,γ3:ヒトγ,α,εから成るキメラ又はアイソタイプスイッチを受けた重鎖を発現するべくスイッチトランススイッチ又はシススイッチによるするB細胞を含むことができ;かかるヒト配列及びキメラ又はアイソタイプスイッチされた重鎖は軽鎖を伴う機能的抗体ヒト又はマウスの中に組込まれ;かかる抗体はかかるトランスジェニックマウスの血清内に存在する。本発明はまた、大きなトランスジーンを生じる方法を提供し、該方法は、次のことを含む:哺乳動物の細胞に、少なくとも3つのポリヌクレオチド種を導入することであって;第1のポリヌクレオチド種は、第2のポリヌクレオチド種と共有された配列一致sequenceidentityの組換え遺伝子領域recombinogenicregionを有し、第2のポリヌクレオチド種は、第1のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域および第3のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域を有し、かつ第3のポリヌクレオチド種は、第2のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域を有する。組換え遺伝子領域は、哺乳動物細胞例えばES細胞における、好ましくはまた非哺乳動物の真核細胞例えばサッカロマイセスおよび他の酵母または菌の細胞における、インビボでの相同組換えを生じるのに十分な実質的な配列一致の領域である。典型的には、組換え遺伝子領域は少なくとも50~100000ヌクレオチド長、好ましくは500ヌクレオチド~10000ヌクレオチド長で、たいてい80~100同一、しばしば95~100同一の、たいてい同質遺伝子である。本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのような開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはならない。化2及び化3はベクターpGPeの配列を示す。化4及び化5は遺伝子VH498の配列を示す。表1は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトIgMおよびIgGの検出を示す。化6及び化7はVDJ接合の配列を示す。表2は、成人の末梢血リンパ球PBLにおいて見つかるJセグメントに対する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたJセグメントの分布を示す。表3は、成人の末梢血リンパ球PBLにおいて見つかるDセグメントに対する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたDセグメントの分布を示す。化8及び化9は、pHC1トランスジェニックマウス中またはヒトPBL中のフレーム内VDJ接合を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さを示す。表4は、pHC1トランスジェニックマウスから分析された30クローンのVDJ領域の推定アミノ酸配列を示す。表5は、指摘の実験において使用したライン112のトランスジェニックマウスを示す;は各トランスジーンの存在を示し、は該動物がJHD突出トランスジーンについてホモ接合性であることを示す。表6は、複数の0011マウスの遺伝子型を示す。表7は、トランスジェニックマウスにおけるHC2重鎖トランスジーン内の体細胞突然変異の発生を示す。表8は、トランスジーンVおよびJセグメント使用を示す。表11は、トランスジェニックマウスからのハイブリドーマにおけるヒト可変領域使用を示す。表14は、YAC4x17E1でのヒトVkセグメントの同定を示す。表15、マウス系統KCo5-9272において発現したヒトVk遺伝子の同定。表16、ヒトIgGk抗nCD4モノクローナル抗体についての分泌レベル。表17、ヒトCD4に結合するモノクローナル抗体についての速度および親和性affinity定数。表18、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の親和性affinityおよび速度定数。表19、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の結合力avidityおよび速度定数。表20、抗CD4モノクローナル抗体について報告された結合力avidityおよび速度定数。表21、フローサイトメトリーにより測定された、ヒト抗ヒトCD4モノクローナル抗体の親和性avidity定数。表22、機能的転写のための部分ヌクレオチド配列。表23、ハイブリドーマ転写における生殖細胞系VJセグメント使用。表24、ミニジーン構成において使用されるプライマー、ベクターおよび産物。表25、末梢のチンパンジーのリンパ球でのヒトmAbsの効果。上述したように、有望な治療および/または診断上の標的である特異的ヒト抗原と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。第一に、B細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応答を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、例えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的な免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの同種異系間エピトープであろうからである。第二に、ハイブリドーマを形成させるためのB細胞の源として働く動物一例ではヒトが真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のB細胞源としてヒトを使う場合には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なされる。かくして予め定められたヒト抗原に対する抗体応答を誘発できるヒト抗体分泌B細胞が必要とされることから、予め定められたヒト抗原と特異的反応性をもつヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することには問題が多い。ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる1つの方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構成物を含有するトランスジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジーン、またはヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成小遺伝子座下記、並びに同時継続米国特許出願第08352322号、第07990860号、第07810279号、第07904068号;第07853408号、第07574748号、第07575962号1990年8月31日に出願およびPCTUS9106185号1991年8月28日に出願に記載されているを含有するトランスジーンを使ってトランスジェニック非ヒト動物を作製する。そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原に対して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなトランスジェニック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことができ、そのようなトランスジェニック動物からのB細胞をミエローマ細胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造することができる。様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造は以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列されたマウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたはγ1定常領域を含む機能的に再配列されたヒトIg遺伝子がトランスジェニックマウス中で発現されている。しかしながら、トランスジーンが再配列されていない再配列されないV-D-JまたはV-J免疫グロブリン遺伝子を含んで成る実験は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最少の再配列を生じることがあった。しかし、トランスジーン中のCH遺伝子間での好結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない免疫グロブリントランスジーンの例は1つも報告されていない。本発明は同様に、基本的にヒト恒常領域配列に対するポリペプチド結合におけるヒトVDJ配列から成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ候補を同定するための方法をも提供する。かかるハイブリドーマ候補は、1基本的にヒトVDJ領域とヒト恒常領域から成る免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン、及び2基本的にヒトVDJ領域及びマウス恒常領域から成るヘテロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランススイッチされたハイブリドーマを含むハイブリドーマクローンのプールから同定される。個々の又はプールされたハイブリドーマクローンの上清は、予め定められた抗原結合特異性をもつ抗体を選択するための結合条件下で、標準的には固定基質例えばマイクロタイターウェル上に吸着により不動化される抗原である予め定められた抗原と接触させられる。ヒト恒常領域に特異的に結合する抗原も同様に、抗体が少なくとも1つのヒト恒常領域エピトープに選択的に結合するもののマウス恒常領域エピトープには結合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上清及び予め定められた抗原と接触させられ、かくして予め定められた抗原及び特異的にヒト恒常領域と結合する抗体に結合されたハイブリドーマ上清トランスジェニックモノクローナル抗体で基本的に構成されている複合体を形成するそして、これは検出可能な標識又はリポーターで標識付け可能である。このような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン又はプールを表わす。本発明の好ましい実施態様において、スクリーニングにおいて使用される抗ヒト定常領域免疫グロブリンは、非-μ、非-δイソタイプ、好ましくはαまたはε、より好ましくはγイソタイプ定常領域を特異的に認識する。γイソタイプのモノクローナル抗体が好ましい。というのは、IgG免疫グロブリンの特性が、いくつかの治療的な適用について、IgM免疫グロブリンに対して好ましい例えばIgMペンタマーに比べてIgGダイマーのより小さい大きさの故にこと、および体細胞突然変異のプロセスが、μ定常領域から非μ例えばγ定常領域へのクラススウィッチに相関されることのためである。クラススウィッチを受けた免疫グロブリンの集団から選ばれた免疫グロブリン例えばIgGは、クラススウィッチを受けていない集団から選ばれた免疫グロブリン例えばIgMより高い親和性で抗体を結合する傾向にある。例えばロンベルグおよびハスザー、InternRevImmunol136593を見よ。1つの実施態様において、候補者のハイブリドーマがまず、γイソタイプ定常領域についてスクリーニングされ、次に、IgG発現ハイブリドーマのプールが、予め決められた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。かくして、この方法によれば、本発明のトランスジェニックマウスは、予め決められた抗原で免疫されて、免疫応答を引起す。B細胞がマウスから集められ、不死細胞に融合されてハイブリドーマを生じる。ハイブリドーマはまずスクリーニングされて、非μ、非δイソタイプのIg例えばIgGを分泌する個々のハイブリドーマを同定する。このハイブリドーマの組は次に、関心のある、予め決められた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。スクリーニングは、例えば、ハーローおよびレイン、Antibodiesアラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク1988年に記載されたような標準的技術を用いて行われる。この方法を用いると、高親和性例えば約107M1より大きいKaの免疫グロブリンを実用的に効率的に同定することが可能である。定義本明細書中で使用する時、用語抗体は、少なくとも2本の同一の軽ポリペプチド鎖と2本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重および軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分を含有する。重および軽ポリペプチド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域通常はカルボキン末端部分も含んで成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、或る種の食細胞および典型的補体系の第一成分Clqを含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する。本明細書中で使用する時、異種抗体は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有するかまたはDNA配列をコードする抗体である。本明細書中で使用する時、ヘテロハイブリッド抗体は、異なる生物体起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。本明細書中で使用する時、イソタイプは、重鎖定常領域遺伝子によりコ-ドされる抗体クラス例えばIgMまたはIgG1を言う。本明細書中で使用する時、イソタイプスイッチは、抗体のクラスまたはイソタイプが或るIgクラスから別のIgクラスのうちの1つへ変化する現象を言う。本明細書中で使用する時、非スイッチイソタイプは、イソタイプスイッチが起こらなかった時に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイブをコードするCH遺伝子は、典型的には磯能的に再配列されたVDJ遺伝子のすぐ下流の最初のCH遺伝子である。本明細書中で使用する時、用語スイッチ配列は、スイッチ組換えを招くそれらのDNA配列を言う。スイッチ供与体配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の5′即ち上流にあるだろう。スイッチ受容体領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領域例えばγ,ε等との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は1つもないので、典型的には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。本明細書中で使用する時、グリコシル化パターンは、タンパク質、より詳しくは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコゾル化パターンをトランスジーンのCH遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコシル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質上類似していると特徴付けることができる。本明細書中で使用する時、特異的結合は、抗体が1予め決定された抗原に少なくとも1×107M1の親和力で結合し、そして2予め決定された抗原以外の非特異的抗原例えばBSA、カゼインへの結合親和力よりも少なくとも2倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。本明細書中で使用する時天然に存在するという用語は、対象物に用いた時に対象物が天然に見つけることができることを言う。例えば、天然源から単離することができ且つ人間によって実験室で故意に変更されていない、生物体ウイルスを含む中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。本明細書中で使用する時再配列されたという用語は、Vセグメントがそれぞれ本質的に完全なVHまたはVLドメインをコードする構造においてD-JまたはJセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を言う。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞DNAとの比較によって同定することができ;再配列された遺伝子座は少なくとも1つのヘプタマー/ナノマー相同性要素を有するだろう。Vセグメントに関して本明細書中で使用する時、再配列されていないまたは生殖細胞配置なる用語は、DまたはJセグメントのすぐ近くになるようにVセグメントが組換えられない配置を言う。核酸については、実質的相同性ともいうのは、最適な形で整列され比較された場合、2つの核酸又はその指定配列が、少なくとも約80のヌクレオチド、通常は少なくとも約90~95、より好ましくは少なくとも約98~995のヌクレオチドにおいて適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って同一であることを表わす。代替的には、選択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの補体に対しセグメントがハイブリッド形成するときに実質的な相同性が存在する。核酸は、全細胞中に、細胞リゼイト中に、又は部分的に精製された形又は実質的に純粋な形で存在しうる。核酸は、アルカリ/SDS処理、CSClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野において周知のその他の技術を含む標準的技術により、例えばその他の細胞核酸又はタンパク質といったその他の細胞成分はその他の汚染物質から精製された時点で、分離され又は実質的に純粋な状態にされている。F.Ausubel,et.al,ed.分子生物学における現在のプロトコル、GreenePublishingandWileyInterscience、ニューヨーク1987参照。本発明の核酸組成物は、往々にして、cDNAゲノミック又は混合物のいずれかからの未変性配列修正された制限部位などを除くにあるものの、標準的技術に従って遣伝子配列を提供するべくそこからの突然変異を受けることができる。コーディング配列については、これらの突然変異は望まれるとおりにアミノ酸配列に影響を及ぼしうる。特に、未変性にD.J.結合スイッチと実質的に相同な又はこれらから誘導されたDNA配列及び本書に記されているその他のこのような配列が考慮されるここで誘導されたというのは、1つの配列がもう1つの配列と同一であるか又はそれから修正されたものであることを表わす。核酸は、他の核酸と機能的関係におかれたとき、それは使用可能に連結される。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与えるとき、作用可能に連結される。転写抑制配列に関し、作用可能に連結されるとは、連結されたDNA配列が隣接することを意味し、2つの蛋白質コード領域を連結するのに必要な場合、隣接しており、そしてリーディングフレーム内にある。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。異種抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物のデザインは、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントランスジーンがB細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする。好ましい態様では、異種重鎖トランスジーンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従って、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの1つまたは複数をもたらすように本発明のトランスジーンが作製される:1高レベルで且つ細胞型特異的な発現、2機能的な遺伝子再配列、3対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、4十分な一次レパートリーの発現、5シグナル形質導入、6体細胞高度突然変異hypermutation、および7免疫応答の間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性化。下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されるそれらの態様では、トランスジーンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない。更に、トランスジーンが機能的に再配列された重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含んで成る態様では、2番目の基準である機能的な遺伝子再配列は、少なくとも既に再配列されているトランスジーンには不要である。分子免疫学に関する背景につては、FundamentalImmunology,第2版,PaulWilliamE編,RavenPress,NY.を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる。本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞ジャームライン中に再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されていないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジーンの各々は少なくとも1つのCH遺伝子を含んで成る。加えて、重鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物のB細胞中で多数のCH遺伝子をコードする異種トランスジーンのイソタイプスイッチを支持することができる機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジーンCH遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在するものであることができ、またはトランスジーン構成物を受け入れることになっている種トランスジェニック動物に存在するものから誘導することもできる。例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジーン構成物は、それがマウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことができる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナーゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化されないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しクローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初めから合成することができるMillsら、Nucl.AcidsRes.18730573161991Siderrasら、IntlImmunol1631642、これらは参考として本明細書中に組み込まれる。上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、トランスジェニック動物の有意な率少なくとも10パーセントのB細胞中に検出される。本発明のトランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトランスジーンは、抗原に暴露されると、トランスジェニック非ヒト動物内でV,DおよびJ遺伝子セグメントの組換え機能的再配列を支持し、そして好ましくは結果として得られる再配列された免疫グロブリン重鎖中へのD領域遺伝子セグメントの全部または部分の組み込みを支持する。本発明の別の観点によれば、該トランスジーンは、再配列された小遺伝子座を含んで成る。そのようなトランスジーンは、典型的にはC,DおよびJセグメントの実質的部分並びにVセグメントのサブセットを含んで成る。そのようなトランスジーン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、RNAプロセシング用のスプライス供与体およびスプライス受容体、組換えシグナル等は、異種DNAから誘導された対応配列を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、トランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる。あるいは、トランスジーン中に合成調節配列を組み込むこともでき、この場合、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知られている機能的DNA配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデザインされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター/エンハンサーモチーフの許容配列を特定するものである。例えば、ミニ遺伝子座は、天然に発生する生殖細胞系Ig遺伝子座と異なり、可欠DNA部分例えば介在配列;イントロン又はその一部分の少なくとも1つの内部すなわちこの部分の末端にはないの欠失を有するゲノミック免疫グロブリン遺伝子座の一部分を含む。本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含有するトランスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジーンの一方は再配列された遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む。好ましい態様では、再配列されたトランスジーンが軽鎖免役グロブリントランスジーンであり、再配列されていないトランスジーンが重鎖免役グロブリントランスジーンである。抗体の構造および産生全ての免役グロブリンの基本構造は、2つの軽鎖ポリペプチドと2つの重鎖ポリペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として知られる2つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる2つの領域を含んで成る。重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域遺伝子CHセグメントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgMクラスを限定し、一方でγ,γ2,γ3またはγ4定常領域遺伝子セグメントが抗体のIgGクラス並びにIgGのサブクラスIgG1~IgG4を限定する。同様に、α1またはα2定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体のIgAクラス並びにIgA1およびIgA2サブクラスを限定する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれIgDおよびIgE抗体クラスを限定する。重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、一緒になって抗体の抗原結合領域を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするDNAは、特定の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるDNAセグメントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変V遺伝子セグメントと連結J遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初期可変領域は1つのV遺伝子セグメントと1つのJ遺伝子セグメントによってコードされ、各セグメントはその生物のゲノムDNA中に含まれるVおよびJ遺伝子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期または一次レパートリー可変領域をコードするDNAは、1つの重鎖V遺伝子セグメント、1つの重鎖多様性D遺伝子セグメントおよび1つのJ遺伝子てグメントを含んで成り、各セグメントはゲノムDNA中の適当な免疫グロブリン遺伝子セグメントのV,DおよびJファミリーから選ばれる。抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トランスジーンが再配列されたV-D-J遺伝子配列中にD領域の全部または部分を組み込むことができる機能的V-D-J再配列を支持するシス作用性配列を含むことが好ましい。典型的には、発現されたトランスジーンによってコードされる重鎖またはmRNAの少なくとも約1がV領域中に認識可能なD領域配列を含有する。好ましくは、トランスジーンによってコードされるV領域の少なくとも約10、より好ましくは少なくとも約30、最も好ましくは50が認識可能なD領域配列を含有する。認識可能なD領域配列は一般に、重鎖トランスジーンのD領域遺伝子セグメント中に存在する配列に相当する少なくとも約8個の連続するヌクレオチドおよび/またはそのようなD領域ヌクレオテド配列によりコードされるアミノ酸配列である。例えば、トランスジーンがD領域遺伝子DHQ52を含むならば、V遺伝子セグメント配列とJ遺伝子セグメント配列の間のV領域中に配列5TAACTGGG3’を含有するトランスジーンによってコードされるmRNAは、D領域配列、特にDHQ52配列を含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トランスジーンがD領域遺伝子DHQ52を含むならば、V遺伝子セグメントアミノ酸配列とJ遺伝子セグメントアミノ酸配列の間のV領域中に置かれたアミノ酸配列DAFを含有するトランスジーンによってコードされる重鎖ポリペプチドは、D領域配列、特にDHQ52配列を含むものとして認識可能である。しかしながら、D領域セグメントをさまざまな程度までのさまざまな読み取り枠内でのVDJジョイニング内に取り込むことができることから、特定のDセグメントの取込みを見極めるには、トランスジーン内に存在するD領域セグメントに対する重鎖可変領域のD領域部域の比較が必要である。その上、組換え中の潜在的エキソヌクレアーゼ消化は、V-D-J組換え中の不精確なV-D及びD-J連結を漂く可能性がある。しかしながら、体細胞突然変異またはN領域付加のために、幾つかのD領域は、認識可能であるが連続するD領域配列と全く同一には一致しないことがある。例えば、ヌクレズテド配列5′CTAAXTGGGG3′ここでXはA,TまたはGであり、該配列は重鎖V領域中にあり、V領域遺伝子配列とJ領域遺伝子配列によって隣接されているは、DH52配列5′CTAACTGGG3′に相当すると認識され得る。同様に、例えば、V領域中にありそしてアミノ末端側でトランスジーンV遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されそしてカルボキン末端側でトランスジーンJ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されているポリペプチド配列DAFDI,DYFDYまたはGAFDIは、D領域配列として認識され得る。従って、体細胞突然変異やN領域付加はトランスジーンD領域に由来する配列中に変異をもたらし得るので、認識可能なD領域配列の存在を決定するための指標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のような場合にD領域として認識可能である:1該配列がV領域中に存在し、一方の側がV遺伝子配列ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列により隣接されており、そして他方の側がJ遺伝子配列ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列により隣接されており、且つ2該配列が既知のD遺伝子配列ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列と実質的に同じであるかまたは実質的に相同である場合。ここで使用する用語実質的な同一は、ポリペプチド配列が参照配列に比較して少なくとも50の配列一致、しばしば少なくとも約80の配列一致および、時には約90より多い配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくとも70の配列一致を有する、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴を表す。配列一致のは、参照配列の合計35未満である小さな欠失または付加を除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全なD遺伝子であってもよい;しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さが少なくとも8ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも3アミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少なくとも8~12ヌクレオチドまたは少なくとも3~4アミノ酸であり、好ましくは12~15ヌクレオチドもしくはそれ以上または少なくとも5アミノ酸である。ここで使用する用語実質的な相同は、ポリペプチド配列が参照配列に対して少なくとも80の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同性のは、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数えることにより算出される。位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドンが異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き換えられる。例えば、配列LysGluArgValは配列AsnAspSerValと実質的に相同である。何故なら、コドン配列AAAGAAAGAGUUは、わずか3つの置換変異2つの元のコドンのうちの3つに単一ヌクレオチド置換を導入することによってAACGACAGCGUUに変異せしめることができるからである。参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なD遺伝子であってもよい;しかしながら、参照配列は長さが少なくとも4アミノ酸残基である。典型的には参照配列は少なくとも5アミノ酸であり、好ましくは6アミノ酸またはそれ以上である。一次レパートリー重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするDNAを作製する方法は、主としてB細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの結合前、V,D,Jおよび定常C遺伝子セグメントは、大部分、一次レパートリーB細胞の前駆体中にV,D,JおよびC遺伝子セグメントのクラスターとして見つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一の染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前のそのようなゲノムDNAは、本明細書中再配列されていないゲノムDNAと呼称される。B細胞分化の間に、V,D,Jまたは軽鎖遺伝子の場合はVとJのみの適当なファミリーメンバーのいずれか1つの遺伝子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。そのような機能的再配列は、機能的な可変領域をコードするDNAを形成する可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連続的であると思われる。最初に、重鎖D-J接合が作られ、次いで重鎖V-DJ接合と軽鎖V-J接合が作られる。軽鎖および/または重鎖中の機能的可変領域のこの初期形態をコードするDNへは、機能的に再配列されたDNAまたは再配列されたDNAと呼ばれる。重鎖の場合、そのようなDNAは再配列された重鎖DNΛと呼はれ、そして軽鎖の場合、そのようなDNAは再配列された軽鎖DNAと呼ばれる。本発明のトランスジーンの機能的再配列を記述するためにも同様な用語が使われる。機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え応答能のあるV,DおよびJセグメントに隣接する組換えシグナル配列RSSにより媒介される。組換えを指令するのに必要且つ十分なRSSは、二分子対称ヘプタマー、高ATノナマー、および12塩基対または23塩基対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それらのシグナルは、D-JまたはV-J組換えを行いそして機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座および種の間で保存されている。Oettingeら,Science24815171523およびその中に引用された参考文献を参照のこと。配列CACAGTGまたはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次いで配列ACAAAAACCまたはその類似体を有するノナマーが存在する。それらの配列は、各VおよびD遺伝子セグメントのJ側、即ち下流側上に見つかる。生殖細胞型たおよび遺伝子セグメントの直前に、再び2つの組換えシグナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプタマーがある。VL,VHまたはDセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列は、それらが組み換わるJL,DまたはJHセグメントの前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配列との間のスペーサーは12塩基対の長さかまたは22~24塩基対の長さかのいずれかである。V,DおよびJセグメントの再配列に加えて、軽鎖のVセグメントとJセグメントとの間および重鎖のDセグメントとJセグメントとの間の可変的祖換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確な場所の変位ずれによって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典型的にはV遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびJセグメントの最初のコドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上ではDセグメントとJHセグメントとの間に起こり、10ヌクレオチドほどの多数に及ぶことがある。更に、DセグメントとJHセグメントとの間およびVHセグメントとDセグメントとの間に、ゲノムDNAによりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それらのヌクレオチドの付加はN領域多様性として知られている。VJおよび/またはVDJ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメントおよび再配列された可変領域の下流に置かれた1または複数の定常領域遺伝子セグメントの転写は、一次RNA転写物を生成し、これが適当なRNAスプライシングを受けると、全長の重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするmRNAを生じる。そのような重鎖および軽鎖は、B細胞の経膜領域中への免役グロブリンの挿入および/またはB細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル配列をコードするDNAは、免役グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域を形成するのに使うVセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コードされる免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドこれは互いとの適切な会合によって抗体分子を形成するを生成するmRNAの翻訳を調節するためにmRNA中に適当な調節配列も存在する。可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起こり得る可変的組換えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般に、この段階まで分化された各B細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生する。この分化過程の間に、機能的に再配列されたIg遺伝子内に含まれるもの以外の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体B細胞がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。二次レパートリー一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現するB細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なVJおよびVDJ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる一次応答によって産生される抗体は比較的低い親和性のものである。2つの異なる型のB細胞がこの初期応答を作成する一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパトリ-B細胞の前駆体Lintonら、Cell,59104910591989。最初の型のB細胞は或る種の抗原に応答してIgM分泌性形質細胞に成熟する。他方のB細胞は、T細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に応答する。抗原により感作されたB細胞クローンのT細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造が2つの経路で変化する。第一は、定常領域が非IgMサブタイプにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更されて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。前に指摘したように、Ig重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、3つの相補性決定領域CDR1,CDR2およびCDR3;これは超可変領域1,2または3とも呼ばれるを含むV領域の至るところで起こることが決定されているKabatら、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest1991US.DepartmentofHealthandHumanServices,Washington,DC;これは参考として本明細書中に組み込まれる。CDR1とCDR2は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方CDR3は大部分がV遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントの間またはV,DおよびJ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。CDR1,2または3を構成しない可変領域の部分は、一般に、FR1,FR2,FR3およびFR4と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図1を参照のこと。高度突然変異の間に、再配列されたDNAが変異されて異なるIg分子を有する新しいクローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクローンがヘルパーT細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き起こす。クローン選択は、典型的にはCDR1,CDR2および/またはCDR3領域中に新規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こる。異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物本発明の1観点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも1つの本発明の免疫グロブリントランスジーン後述を非ヒト動物の接合子または初期胚中に導入することにより製造される。本発明に有用である非ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列して一次抗体応答を生ぜしめることができる任意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知である他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは齧歯類の他のメンバーである。しかしなから、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジおよびブタの種、齧歯科の他のメンバー、例えはラット、並びにウサギおよびモルモットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモットであり、最も好ましくはマウスである。本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列されていない形で重鎖および軽鎖トランスジーンに使われる。この態様では、そのようなトランスジーンがマウスに導入される。軽鎖および/または重鎖トランスジーンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の円因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固有のDNA配列を有する。それらは生殖細胞やB細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態でそしてB細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。本発明の別の態様では、トランスジーンは、再配列された重鎖および/または軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含んで成る。そのようなトランスジーンの機能的に再配列されたVDJまたはVJセグメントに相当する特定セグメントは、マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能である免疫グロブリンDNA配列を含む。そういったDNA配列の相違は、マウスB細胞によりコードされるアミノ酸配列に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコードされるアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を検出することができる。ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジーンを含有するトランスジェニックB細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。そのような再配列されたトランスジーンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動物中で通常遭遇するものとは異種であるDNAおよび/またはアミノ酸配列を有することは容易に明らかであろう。再配列されていないトランスジーン本明細書中で使用する時、再配列されていない免疫グロブリン重鎖トランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの多様性遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る。前記重鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするDNAから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。同様に、本明細書中で使用する時、再配列されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジーンは、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの連結遺伝子セグメントおよび少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントをコードするDNAを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、前記軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするDNAから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。本発明のこの観点でのそのような重鎖および軽鎖トランスジーンは、再配列されていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランスジーン中のV,DおよびJセグメントの間および軽鎖トランスジーン中のVとJセグメントの間には、適当な組換えシグナル配列RSSが置かれる。加えて、そのようなトランスジーンは、定常領域遺伝子セグメントをVJまたはVDJ再配列された可変領域と結合するための適当なRNAスプライシングシグナルも含む。複数のC領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのCμおよびCγ1を含む重鎖トランスジーン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロブリンクラススイッチ、例えばIgMからIgGへのクラススイッチを考慮した前記定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するようなスイッチ領域が組み込まれる。そのような重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節配列典型的にはTATAモチーフを含むも含有する。プロモーター領域は、下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を指令することができるDNA配列として大体定義することができる。プロモーターは、効率的転写を指令するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列の例は、Rothmanら、Intl.Immunol26216271990;Reidら、ProcNatlAcadSciUSA868408441989;Stavnezerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85770477081988およびMillsら、Nucl.AcidsRes18730573161991この各々は参考として本明細書中に組み込まれるを包含する、発表文献中に見つけることができる。それらの配列は、典型的にはスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50bp、好ましくはスイッチ領域の上流の少なくとも約200bp、より好ましくはスイッチ領域の少なくとも約200~1000bpまたはそれ以上を含む。適当な配列はヒトSγ1Sγ2Sγ3Sγ4Sα1Sα2およびSεスイッチ領域のすぐ上流に存在するが、ヒトSγ1およびSγ3スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。それに代えて、又はそれと組合わせて、ネズミIgスイッチ配列を用いることができる。トランスジェニック非-ヒト動物と同じ種のIgスイッチ配列を用いるのが、しばしば有利である。特に、インターフェロンIFN誘導性転写調節要素、例えばIFN誘導性エンハンサーがトランスジーンスイッチ配列のすぐ上流に含まれるのが好ましい。プロモーターに加えて、主にB系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる。例えば、軽鎖トランスジーン上の好ましくはJセグメントと定常領域遺伝子セグメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列は、トランスジーンの発現を増強し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジーンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような調節配列は、トランスジーンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的高いレベルのトランスジーン発現を提供するために用いられる。上述のプロモーターおよびエンハンサー調節配列は包括的に記載されているけれども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムDNAから誘導することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖および軽鎖トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の対応する調節配列から誘導される。好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのような重鎖および軽鎖トランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのような動物に投与される特異抗原に対してIg介在型免疫応答を開始することができる。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生することのできるB細胞が産生される。不死化後、および適当なモノクローナル抗体Mab、例えばハイブリドーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。そういったヒトMabは、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫原性を有する。好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎖および軽鎖トランスジーンの作製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメントの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされた療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を生成せしめることができる。再配列されたトランスジーン別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖細胞中に機能的に少なくとも1つの再配列された異種重鎖免疫グロブリントランスジーンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎖トランスジーンを発現する一次レパートリーB細胞を含有する。そのようなB細胞は、好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親和性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトランスジーンは、少なくとも2つのCH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を含むだろう。本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含み、前記トランスジーンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再配列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する。そのような動物では、重鎖トランスジーンが少なくとも2つのCH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。本発明は更に、本発明のトランスジーンにおいて使うことができる合成可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免疫グロブリンVセグメントDNAの集団を作製することを含んで成る。ここで前記VセグメントDNAの各々は免疫グロブリンVセグメントをコードし、そして各末端に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリンVセグメントDNAの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンVセグメントレパートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トランスジーンは、少なくとも2つのCH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。イソタイプスイッチBリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたVHおよびVL領域によって決定される結合特異性を有するIgMを最初に産生する。続いて、各B細胞とその子孫の細胞が同じLおよびH鎖V領域を有する抗体を合成するが、それらはH鎖のイソタイプをスイッチすることができる。μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、IgMおよびIgDを単一細胞中で同時発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重鎖イソタイプγ,αおよびεは、遺伝子再配列現象がCμおよびCδエクソンを欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプスイッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子δを除くのすぐ上流に置かれたいわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。個々のスイッチセグメントは長さが2~10kbであり、主として短い反復配列から成る。組換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。cDNA由来のCHプローブを用いるサザンブロット法または溶液ハイブリダイゼーション速度論を使った実験は、スイッチが細胞からのCH配列の消失に関係し得ることを確証した。μ遺伝子のスイッチS領域、Sμは、コード配列の約1~2kb5′側に位置し、そしてGAGCTnGGGGTの形の配列の多数の縦列反復から成る。ここでnは通常2~5であるが、17ほどの大きさに及ぶことができる。T.Nikaidoら、Nature,292845848を参照のこと。他のCH遺伝子の5′にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Sα領域は配列決定されており、縦列に反復した80bpの相同性単位から成ることが判明した。一方、S2a,S2bおよびS3は全て、互いに非常に類似している反復した49bpの相同性単位を含むP.Szurekら、JImmunol,1356206261985およびT.Nikaidoら、J.Biol.Chem257732273291982を参照のこと;これらは参考として本明細書中に組み込まれる。全ての配列決定されたS領域は、Sμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタマーGAGCTおよびGGGGTの多数の存在を含むT.Nikaidoら、J.Biol.Chem257732273291982;これは参考として本明細書中に組み込まれる;他のS領域では、それらのペンタマーはSμのようには正確に縦列に反復されていないが代わりに大きな反復単位中に埋もれている。Sγ1領域は追加の高次構造を有し、即ち、2つの直接反復配列が49bpの縦列反復の2つのクラスターの各々に隣接するMRMowattら、J.Immunol136267426831986を参照のこと;これは引用して不明細書中に組み込まれる。ヒトH鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似していることがわかっている。実際、CH遺伝子の5′側のヒトクローンとマウスクローンの間の類似性はS領域に限られることがわかっており、これは、それらの領域の生物学的重要性を確証する事実である。μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合Sμ-Sα配列をもたらす。典型的には、組換えが常に起こるような特異部位はSμ領域中にも他のS領域中にも存在しない。一般に、V-J組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生殖細胞S前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いで該配列を異なる位置で一直線上に連結することができる。THRabbittsら、NucleicAcidsRes9450945241981およびJ.Ravetchら、Proc.Natl.AcadSciUSA77673467381980を参照のこと;これらは参考として本明細書中に組み込まれる。特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である。リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコンビナーゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあらゆるイソタイプへのスイッチを触媒し、そして特異性がこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領域に向けることにある可能性もある。T細胞由来のリンホカインIL4およびIFNγは、幾つかのイソタイプの発現を特異的に促進することが証明されているIL4はIgM,IgG2a,IgG2bおよびIgG3発現を減少させ、IgEおよびIgG1発現を増加させる;IFNγはIgG2a発現を選択的に刺激し拮抗する一方、IgEとIgG1発現の増加を誘導するCoffmanら、J.Immunol1369499541986およびSnapperら、Science236944947;これらは参考として本明細書中に組み込まれる。スイッチに関するT細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しかし、最もありそうな説明はリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するというものである。クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物に関係があるらしいLutzekerら、MolCellBiol818491988;Stavnezerら、ProcNatlAcadSciUSA8577041988:EsserおよびRadbruch,EMBOJ84831989;Bertonら、Proc.Natl.AcadSci.USA8628291989;Rothmanら、Int.Immunol.26211990;これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる。例えば、観察されるIL4によるγ1繁殖不能転写物の誘導およびIFNγによる阻害は、IL4がB細胞中でのγ1へのクラススイッチを促進し、IFNγがγ1発現を阻害するという観察結果と一致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包含は、イソタイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖不能転写物の転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタイプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。それらの理由により、トランスジーンがイソタイプに使用する予定の各スイッチ領域の約1~2kb上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサー要素を含み、より好ましくはスイッチ領域と生来関連している即ち生殖細胞配置で存在する5′隣接即ち上流領域を含む。この5′隣接領域は、典型的には長さが少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500~1000ヌクレオチドである。1つのスイッチ領域からの5′隣接配列をトランスジーン構成物用の別のスイッチ領域に作用可能に連結させることができる例えば、ヒトSγ1スイッチからの5′隣接配列をSα1スイッチのすぐ上流に融合させることができ;ネズミSγ1フランキング領域をヒトγ1スイッチ配列の隣りに移殖することができ;あるいはネズミSγ1スイッチをヒトγ1コード領域に移植することができるけれども、或る態様では、トランスジーン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する5′隣接配列を有することが好ましい。モノクローナル抗体モノクローナル抗体は、当業者にとっては周知のさまざまな技術によって得ることができる。簡単に言うと、望ましい抗原で免疫化された動物からの脾細胞を、一般には骨髄腫細鉋との融合によって不死化させる。Kchle及びMilstein,Eur.J.Immunol,65115191976を参照のこと。不死化の代替的方法としては、エプスタインーバーウイルス、オンコ遺伝子又はレトロウイルスでの形質転換、又はその他の当該技術分野において周知の方法が含まれる。単一の不死化された細胞から発生したコロニーは、抗原に対する望ましい特異性及び親和力を有する抗体の産生についてスクリーニングされ、かかる細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔内への注入を含むさまざまな技術によって増強できる。免疫グロブリンを産生するための動物の免疫化、モノクローナル抗体の産生;プローブとしての使用を目的とした免疫グロブリンの標識付けイムノアフィニティ精製及び免疫学的検定法を含め、これらの技術分野で有効なさまざまな技法が、例えば、Harlow及びLane、抗体:その研究室マニュアル、ColdSpringHaborNewYork1988の中で論述されている。トランスジェニック一次レパートリーA.ヒト免疫グロブリン遺伝子座トランスジーン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免疫応答を開始させるのに十分な程度に多様である一次抗体レパートリーの作製である。再配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソン、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列整列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免役グロブリンクラスの定常部分をコードする。B細胞発達の間に、定常領域に近いV領域が欠失されて新規重鎖クラスの発現をもたらす。各重鎖クラスについては、RNAスプライシングの別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。ヒト重鎖遺伝子座は、2Mbにわたる約200個のV遺伝子セグメント今回のデーターは約50-100V遺伝子セグメントの存在を支持している。、約40kbにわたる約30個のD遺伝子セグメント、3kbの範囲内に密集した6個のJセグメント、および約300kbにわたる9個の定常領域遺伝子セグメントから成ると予想される。全遺伝子座は、染色体14の長い方の腕の遠位部分約25Mbに及ぶ図4。B.遺伝子断片トランスジーン1.重鎖トランスジーン好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンは、ヒト由来の再配列されていないゲノムDNAを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトランスジーンは670~830kbの長さを有するNotI断片を含んで成る。この断片の長さは、3′制限部位が実際にマッピングされていないため、不明瞭である。しかしながら、α1とψα遺伝子セグメントとの間にあることが知られている。この断片は、6つの既知VHファミリーの全部のメンバー、DおよびJ遺伝子セグメント、並びにμ,δ,γ3.γ1およびα1定常領域を含む。Bermanら、EMBOJ7727738。このトランスジーンを含有するトランスジェニックマウス系は、B細胞の発達に必要とされる重鎖クラスIgMを正しく発現し、そしてほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリーと共に、少なくとも1つのスイッチされた重鎖クラスIgG1を発現する。2.軽鎖トランスジーンヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有するゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に記載のようにして作製される。C.生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジーン単一DNA断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの670830kbNotI断片は、トランスジーン形成の間に非ヒト動物の生体内で形成させることができる。そのような生体内トランスジーン作製は、2以上の重複するDNA断片を非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。DNA断片の重複部分は、実質的に相同であるDNA配列を有する。胎児性核内に含まれるレコンビナーゼに暴露されると、重複しているDNA断片が適切な方向において相同的に組み換わって670830kbのNotl重鎖断片を形成する。生体内トランスジーン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製またば操作が因難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジーンを形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トランスジーン作製は、YACベクターMurrayおよびSzostakNature305189192により繰作することができるDNA断片よりも大きい免疫グロブリントランスジーンを作製するのに有用である。そのような生体内トランスジーン作製は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入する場合にも使うことができる。ゲノム免疫グロブリントランスジーンを形成させることに加えて、実施例に記載の如く小遣伝子座トランスジーンを形成させるのにも生体内相同組換えを使うことかできる。生体内トランスジーン作製を利用する好ましい態様では、各々の重複するDNA断片は、好ましくは第一のDNA断片の末端部分と第二のDNA断片の末端部分の間で重復する実質的に相同なDNA配列を有する。DNA断片のそのような重復部分は、好ましくは約500bp約2000bp、最も好ましくは10kb~20kbを含む。生体円でトランスジーンを形成させるための重複DNA断片の相同組換えは、1992年3月19日に公開された哺乳類細胞における相同性組換えと称するPCT公開WO9203917に更に詳しく記載されている。D.小遺伝子座トランスジーン本明細書中で使用する時、免疫グロブリン小遺伝子座なる用語は、通常は約150kb未満、典型的には約25~100kbのDNA配列であって、前記DNA配列が少なくとも1つの実質的不連続性例えば、相同ゲノムDNA配列に関して、通常は少なくとも約2~5kb、好ましくは10~25kbミたはそれ以上の欠失を有するような、次のものを各々少なくとも1つ含むDNA配列を言う:機能的可変V這伝子セグメント、機能的運結J領域セグメント、少すくとも1つの機能的定常C領域遣伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の場合には、機能的多様性D領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トランスジーンは、長さが少なくとも25kb、典型的には50~80kbであるだろう。重鎖トランスジーンは、スイッチ領域に作用可能に連結された2つの定常領域を有する、典型的には約70~80kb、好ましくは少なくとも約60kbの長さであろう。更に、小遺伝子座の個々の要素は好ましくは生殖細胞ジァームライン配置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物の前駆体B細胞において遺伝子再配列を受けることができる。更に、少なくとも2つのCH遺伝子と必要なスイッチ配列とを含んで成る重鎖小遺伝子座は、典型的には、異なる免役グロブリンクラスの機能的抗体分子が生成されるように、イソタイプスイッチを受けることができる。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するB細胞中で生休内で起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたB細胞系列の培養細胞中で起こり得る。他の好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンはVHDおよびJH遺伝子セグメントを各々1つまたは復数並びにCH遺伝子を2つ以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも1つが小遺伝子座トランスジーンに組み込まれる。重鎖トランスジーンのCHセグメントに関しては、トランスジーンが少なくとも1つのμ遣伝子セグメントと、少なくとも1つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遣伝子セグメント、最も好ましくはγ3またはγ1遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのIgM形とIgG形の間のクラススイッチおよび分泌形の高親和性非IgM免疫グロブリンの産生を考慮したものである。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばIgD,IgAおよびIgEの産生をコードするものも使うことができる。当業者は、重鎖CH遺伝子の発生の順序が該CH遺伝子の供与体として働く種の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトランスジーンも作製するだろう。更に、当業者は、1つの種の複数の個体からCH遺伝子を選択することができ例えば、同種異系CH遺伝子、そしてイソタイプスイッチを受けることができる過剰のCH遣伝子として前記遣伝子をトランスジーン中に組み込むことができる。次いで、結果として生じたトランスジーン非ヒト勤動物は、或る態様では、トランスジーンCH遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含する様々なクラスの抗体を生産することができる。更にまた、当業者は、異なる種からCH遺伝子を選択してトランスジーン中に組み込むことかできる。各CH遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるが、使用するスイッチ配列は必ずしもCH遺伝子の隣に天然に存在するものである必要はない。種間のCH遺伝子組み合わせは、様々な種からのCH這伝子に相当する多様はクラスの抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物をもたらすだろう。腫間CHトランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを作製するためのB細胞の源として働くことができる。ヒトの重鎖j領域セグメントは、3kbのDNA長さにおいて密集した6個の機能的Jセグメントこ3個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイズであることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の5′部分と一緒に単一の23kbSFil/Soel断片として単離できることSadoら、BiochemBiophysResCommun154246271;これは参考として本明細書甲に組み込まれるjを仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のJ領域遺伝子セグメントを使うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した3′調節要素の全部を含むことが適当である。更に、この断片は完全なJ領域を含むため、重鎖エンハンサーとμスイッチ領域を含むMillsら、Nature306809;YancopoulosおよびAlt,AnnRevImmunol4339368;これらは参考として本明細書中に組み込まれる。それは、VDJ結合を開始させて一次レパートリーB細胞を形成させる転写開始部位も含むYancopoulosおよびAlt,Cell40271281これは参考として本明細書中に組み込まれる。あるいは、23kbSfiISpeI断片の代わりに、D領域の一部を含む36kbBssHIISpeI断片を使うことができる。そのような断片の使用は、効率的D-j結合を促進させる5′隣接配列の量を増加させる。ヒトD領域は、縦列に結合した4または5個の相同な9kbの亜領域から成るSiebenlistら、Nature294631635。各亜領域は10個までの個々のDセグメントを含む。それらのセグメントの一部はマッピングされており、それを図4に示す。2つの異なる方策を使って小遺伝子座D領域を作製する。第一の方策は、1つまたは2つの反復D亜領賊を含む短いDNAの連続鎖の中に置かれたそれらのDセグメントのみを使うものである。候補となるのは、12個の個々のDセダメントを含む単一の15kb断片である。DNAのこの断片は2つの連続するEcoRI断片から成り、そして完全に配列決定されているIchiharaら、EMBOJ741414150。12のDセグメントが一次レバートリーに十分であろう。しかしなから、D領域の分散性質があるとすれば、別の方策は、幾つかの不連続D断片含有断片を一緒に連結して、より多数のセグメントを有する一層小型のDNA断片を作製することである。例えば、特徴的な隣接ノナマーまたはヘブタマー配列前傾の存在により、および文献への参照により、追加のDセグメント遺伝子を同定することができる。重鎖小遺伝子座トランスジーンを作製するのには、少なくとも1つ、好ましくは複数のV遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないVセグメントは、異種性抗体を生産することができるトランスジェニック非-ヒト動物TransgenicNonHumanAnimalCapableofProducingHeterologousArtibodiesと称する。1992年3月19日に公開されたPCT公開WO109203918に記載の通りに単離することができる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないVセグメント、Dセグメント、JセグメントおよびC遺伝子は、1992年3月19日に公開されたPCT公開WO109203918に記載の通りに単することができる。小遺伝子座軽鎖トランスジーンは、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のDNA断片、少なくとも2つ、3つまたは4つのDNA断片から、V,D,Jおよび定常領域配列各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同であるをコードする、例えば約75kbの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジーン構成物を形成せしめることができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして再配列を受けることができる。2以上の適当に置かれた定常領域配列例えばμおよびγおよびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖トランスジーン構成物は、1990年8月29日出願の同時係属出願USS07574748に記載の通りに、ヒトDNAに実質的に相同であり且つ再配列を受けることのできる複数のDNA断片から同様に形成せしめることができる。E.イソタイプスイッチを受けることができるトランスジーン構成物理想的には、クラススイッチを受けることになっているとランスジーン構成物は、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列例えばIFN誘導性要素は、イソタイプスイッチを受けることかできるトランスジーン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好ましくはヒトγ1スイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50塩基対、好ましくは少なくとも約200塩基対、より好ましくは少なくとも500~1000塩基対またはそれ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ1スイッチ配列に作用可能に連結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存在しないCH遺伝子の上流に且つ近隣に連結せしめることができる。例えば、限定のつもりでないが、ヒトγ1スイッチ領域をヒトα2CH遺伝子の上流に連結してもよく、またはマウスγ1スイッチ領域をヒトCH遺伝子に連結してもよい。トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ例えばδ-関連欠失を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400bpの直接反復配列Yasuiら、EurJImmunol191399の包含を伴う。それらの二配列の間の相同組換えはIgD型のみのB細胞においてμ遺伝子を欠失せしめる。重鎖トランスジーンは、次の式によって表すことができる:xyzmnPq上式中、VHは重鎖可変領域遺伝子でセグメントであり、Dは重鎖D多様性領域遺伝子セグメントであり、JHは重鎖J連結領域遺伝子セグメントであり、SOはイソタイブスイッチが起こるようなSd受容体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる供与体領域セグメントであり、CIはB細胞発達ににおいて使われるイソタイプ例えばμまたはδをコート ゙する重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、Tは少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調節領域セグメントであり、S4はイソタイプスイッチが起こるような選択されたSO供与体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる受容体領肢セグメントであり、C2はμ以外のイソタイプ例えばγ1γ2γ3γ4α1α2εをコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、xyzmnpおよびqは整数であり、xは1~100、nは0~10、yは1~50、pは1~10、zは1~50、qは0~50、mは0~10である。典型的には、トランスジーンがイソタイプスイッチを受けることができる時、qは少なくとも1であり、mは少なくとも1であり、nは少なくとも1であり、そしてmはnと等しいかまたはそれより大きくなければならない。VHDJHSOC1TSAおよびC2セグメントは様々な種、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞DNAから選択することができる。VHセグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在するVHセグメント、例えばVH251から選択することができる。典型的には、約2個のVHセグメント、好ましくは約4個、より好ましくは少なくとも約10個のVHセグメントが含まれる。典型的には少なくとも1個のDセグメントか含まれるが、奸ましくは少なくとも10個のDセグメントか含まれ、態様によっては、10個以上のDセグメントが含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトDセグメントを含む。典型的には少なくとも1個のJHセグメントがトランスジーンに含まれるが、約6個のJHセグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約6個以上のJHセグメントを含み、非ヒトJHセグメントを1つも含まない。SOセグメントは該トランスジーンのSAセグメントとの組換え現象に参加することかできる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、SOおよびSA領域はSμSγ1Sγ2Sγ3Sγ4SαSα2およびSEといったスイッチ領域である。好ましくは、スイッチ領或はマウスまたはヒトであり、より好ましくはSOがヒトまたはマウスSμであり、SAがヒトまたはマウスSγ1である。非古典的イソタイプスイッチδ関連欠失でが、SOおよびSA領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する400塩基対の直接復配列である。C1セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子であり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。Tセグメントは、典型的には天然に存在する即ち生殖細胞スイッチ領域に隣接する5′隣接配列を含む。Tセグメントは典型的には長さが少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも500~1000ヌクレオチドである。好ましくはTセグメントは、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する5′隣接配列である。前記Tセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在しないシス作用性転写調節配列例えばウイルスのエンハンサーおよひプロモーター、例えばSV40、アデノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス中に見つかるものを含んでもよいことは当業者にとって明白である。C2セグメントは、典型的にはγ1γ2γ3γ4α1α2またはεC11遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトC11遺伝子であり、より好ましくはヒトγ1またはγ3遺云子である。様々な種からの下流スイッチされるイソタイプ遺伝子としてマウスγ24およびγ2bを使ってもよい。重鎖トランスジーンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含む場合、該トランスジーンの全長は典型的には150キロ塩基対未満であろう。一般に、該トランスジーンは、生来の重鎖Ig遺伝子座以外のものであるだろう。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換か存在するだろう。FIgトランスジーン中の機能的イソタイプスイッチを決定する方法トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界で公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては次のものが挙げられ、それらば単独でまたは組み合わせて使用される。1δ以外の少なくとも1つのトランスジーン下流CH遺伝子に相同である配列とトランスジーンVH-DH-JH再配列された遺伝子に相同である隣接配列とを含有するmRNA転写物の検出;そのような検出はノーザンハイブリダイゼーション、S1ヌクレアーゼ保護アッセイ、PCR増幅、cDNAクローニングまたはその他の方法によることができる。2トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジェニック動物のB細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流CH遺伝子によりコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、そのようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもできる。3トランスジェニック動物のB細胞からのDNA中の、またはハイブリドーマ細胞からのゲノムDNA中の、該トランスジーン中のイソタイプスイッチの発生と一致するDNA再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイブリダイゼーション、PCR増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成することができる。4イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチに関与する特徴的な酵素の産生例えばスイッチレコンビナーゼ、あるいは現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。各々のトランスジェニック系列はトランスジーンの異なる組み込み部位とトランスジーン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジーンと隣接DNA配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レべルのヒト免疫グロブリン、特にIgGイノタイプのものを発現し、且つ最少コピー数の該トランスジーンを含有するマウスの系統を同定しそれを使用することが好ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝子発現の問題を最少にする。トランスジーンは典型的には宿主染色体DNA中、最も普通には生殖細胞DNA中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は、適宜および所望により、当業界において既知であるかまたは後に開発される他のベクターおよびトランスジェニック法に置換することができる。内因性非ヒト重鎖恒常領域遺伝子に対するトランススイッチが起こって、キメラ重鎖及びかかるキメラヒト/マウス重鎖を含む抗体を産生する可能性がある。かかるキメラ抗体は、本書で記述するいくつかの用途には望まれるかもしれないが、望ましくない場合もある。G.内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能的破壊好結果に再配列された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制することにより優性作用を有すると予想される。しかしながら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方注は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパ-トリ-を容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用に合わぜて容易に改変することができる。簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性細胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グロブリンの変更コピーを含むDNA構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その細胞の一部において、導入されたDNAマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わり、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を宿主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変異細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キメラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系列を獲得することが可能であるCapecchiScience24412881292により概説されている。マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか5に寄与するため、重鎖および/またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破壊するのには3つの方法があり、J領域の欠失、J-Cイント0ンエンハンサーの欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。DNA構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の排除はB細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎖セグメントにクラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊ノックアウトする方策を下記に概説する。マウスμおよびκ遺伝子を破壊するためには、Jaenischおよび共同研究者ZijlstraらNature342435433によりマウスβ2ミクログロブリン遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした標的ベクターを用いる。プラスミドpnMClneoからネオマインン耐性遺伝子を標的遺伝子のコード領域中に挿入する。pMClneo挿入断片はneo発現を指令するのにハイブリッドワイルスプロモーター/エンハンサー配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性である。従って、破壊ノックアウト構成物の組込みのための選択マーカーとしてneoを使うことができる。ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーしてHSVチミジンキナーゼ遺伝子を該構成物の末端に付加するZijlstraら、前掲。重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方策はJ領域の削除である。この領或はマウスではかなり小さく、わずか13kbに及ぶ。遺伝子標的ベクタ-を作製するために、分泌されるA定常領域エクソンの全部含む15kbのKpnI断片をマウスゲノムライブラリ-から単離する。13kbのJ領賊をpMCleoからの11kb挿入断片により置き換える。次いで該KpnI断片の5′末端にHSVtk遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構成物の正しい組込みは、neo遺伝子によるマウスJH領域の置換をもたらすだろう。neo遺伝子を基にしたプライマーとD頑域中のKpnI部位の5′のマウス配列に相同のプライマーとを使って、PCRにより組換え体をスクリーニングする。あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎖遺伝子座を破壊ノックアウトする。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ15kbのKpnI断片を必要とする。pMIClneoからの11kb挿入断片をエクソンII中のユニークBamHI部位のところに挿入し、そしてHSKtk遺伝子を3′KpnI末端に付加する。neo挿入断片の片側における二重交差これはtk遺伝子を削除するを選択する。それらは、選択されたクローンのプールからPCR増幅により検出される。PCRプライマーの一方はneo配列に由来し、そして他方は標的ベクターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊は実施例に記載される。G.内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制内因性Ig遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ig遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性Ig遺伝子の抑制は、1または複数の組み込まれたトランスジーンから産生されるアンチセンスRNAにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および/または1または複数の内因性Ig鎖に特異的な抗血清の投与により達成することができる。アンチセンスポリヌクレオチド特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するためにアンチセンスRNAトランスジーンを使うことができるPepinらNature355725Helene.C.およびToulmeJBiochmicaBiophysActa104999StoutJおよびCaskeyTSomatCellMolGenet1G369MunirらSomatCellMolGenet16383これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる]。アンチセンスポリヌクレオチドは、1参照配列、例えば内因性IgのCHまたはCL領域配列の全部または一部に相捕的であり、且つ2相捕的な標的配列、例えば染色体遺伝子座またはIgmRNAに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付那加、欠失または転位を含んでもよい。相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のmRNA種に特異的にハイブリダイズしそして該mRNA種の転写および/またはRNAプロセシングおよび/またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことができる、可溶性アンチセンスRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドが挙げられるChingら、ProcNatiAcad.SciUSA861000610010;Broderら、AnnIntNed113604613;Loreauら、FEBSLetters2745356;Holcenbergら、WO09111535;USSN07530165新規ヒトCRIPRO遺伝子WO09109865;WO9104753;WO9013641およびEP386563;これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる。アンテセンス配列は、長さが少なくとも約15の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約30以上の連続ヌクレオチドの少なくとも1つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列である。しかしながら、或る態様では、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として特異的ハイブリダイセーションが保持される限り、アンチセンス配列は相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失を有することができる。一般的に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはDNA再配列後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子列に一致するセンス配列が特に転写を妨害することによっで発現を抑制する働きをすることがある。従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に関して、1または複数の内因性Ig遺伝子座の転写および/または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ig遺伝子座によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および/または特異性を変更することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成するのに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジェニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしくは間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞質に接近しそして特定のmRNA種の翻訳を阻害することが証明されている。ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成分を含んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはO-メチルリボヌクレオチドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよいOagleらNucleicAcidsRes184751。ある用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を含んてもよいNielsenらScience2541497。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般法については、AntisenseRNAandDNA,DAHelton編ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNYを参照のこと。1または復数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写、RNAプロセシング、および/または同起源のmRNA種の翻訳を阻害し、それによってコードされる各ポリペプチドの量を滅少させる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内で1または復数の内因性Ig遺伝子座の形成を阻害することにより治療機能を提供することができる。可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジーンから転写されたアンチセンスRNAとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ig配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジーンによりコードされる異種Ig配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約25~35以上トランスジーンIgf発現を阻害しないであろう。坑血清抑制内因性Ig鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに1または復数の内因性Ig鎖に対する抗血清を注入することにより達成することができるProcNatlAcadSciUSA81211;これは参考として本明細書中に組み込まれる。抗血清は、1または復数の内因性Ig鎖とは特異的に反応するが本発明のIgトランスジーンによりコードされる異種Ig鎖とは最少の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よって、Weissら前掲のものにより代表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与は、内因性Ig鎖発現を抑制するが本発明のトランスジーンによりコードされる1または複数の異積Ig鎖の発現を許容する。抗体適切な抗体共給源としては、以下のものが含まれる:1特異的にマウスμγκ又は入鎖に結合するものの本発明のヒトIgトランスジ-ンによりコ-ドされるヒト免疫グロブリン鎖と反応しない、モノクロ-ナル抗体といったようなモノクロ-ナル抗体、2混合物が、内因性Ig鎖の単一種上の多重エピトープと、多重内因住Ig鎖例えばマウスμ及ひマウスγと、又は多重エピトープ及び多重の鎖又は内因性免疫グロブリンと結合するような、かかるモノクローナル抗体の混合物;3ポリクローナル抗血清又はその混合物。標準的には、かかる抗血清単鎖は、内因性Ig鎖の単一種例えばマウスμマウスγマウスκマウスλ又は内因性Ig鎖の多重種に結合するため単一特異性のものであり、最も好ましくは、かかる抗結清は、本発明のトランスジーンによりコードされたヒト免疫グロブリン鎖に対して無視できる結合力しか有していない:及び/又は4内因性Ig鎖の単一又は多重種に対し結合し、最も好ましくは不発明のトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン領に対して無視できるほどの結合力しかもたないポリクローナル抗血清とモノクロ-ナル抗体の混合物。一般にポリクローナル抗体が好まれ、かかる実質的に単一特異性のポリクローナル抗体は、有利には、ヒト以外の動物種例えばマウスから誘導される抗体での予備吸着及び/又ば例えば不動化されたヒトIgを含む親和性樹脂上での抗血清又はその精製分画のアフィニティクロマトグラフィここで結合された分画は抗血清中の望ましい抗ヒトIgについて冨化されており、この結合分画は標準的には低pH又はカオトロピック塩溶液という条件で溶離されるによりヒト免疫グロブリンに対して生成された抗血清から産生できる。内因性の例えばマウスの免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体により誘導された細胞の枯渇を増強させるため、細胞分裂及び/又は補体固定を利用することができる。例えば、一実施態様においては、マウスIgを発現する外植された造血細胞及び/又はヒトIgトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスから得たB-系列のリンパ球の半ビボ枯渇のために抗体が利用される。かくして、造結細胞及び又はB系列リンパ球が、ヒトIgトランスジーンを宿す好ましくはヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンの両方を宿すヒト以外のトランスジェニック動物から外植され、外植された細胞は、1内因性免疫グロブリン例えばマウスμ及び/又はκに結合し、2トランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する実質的な結合力に欠ける抗体単数又は複数と共にインキュベートされる。このような抗体は、明確化を期して抑制抗体と呼ばれる。外植された細胞集団は、抑制抗体単複に結合する細胞を選択的に枯渇させられる,このような枯渇は、1末結合細胞から抑制抗体結合細胞を除去するための物理的分離例えば、抑制抗体に結合している細胞を不動化し除去するため固体支持体又は磁気ビードに抑制抗体を結合させることができる、2抑制抗体により結合された細胞の抗体依存型細胞死滅例えば、ADCC、補体固定、又は抑制抗体に連関された毒素による、及び3抑制抗体により誘発されたクローンアネルギー、などのさまざまな方法により達成できる。往々にして、内因住Ig鎖産生の抗体抑制のために用いられる抗体は、補体を固定することができる。ウサギ又はモルモットといったように半ビボ/インビトロ枯渇のための便利な補体源と充分反応するようにかかる抗体を選択できることが往々にして好ましい。インビボ枯渇については、一般に抑制抗体がヒト以外のトランスジェニック動物種においてエフェクター機能を有することが好ましい。かくして、トランスジェニックマウスでの使用のためには、一般に、マウスエフェクター機能例えば、ADCC及び補体固定を含む抑制抗体が好ましい。1変形実施態様においては、内因性免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビボインビトロ枯渇のために、予め定められた内因性免疫グロブリン鎖に特異的に結合する抑制抗体が用いられる。ヒト免疫グロブリントランスジーンを宿すヒト以外のトランスジェニック動物からの細胞外植体例えばリンパ球試料は抑制抗体と接触させられ、抑制抗体に特異的に結合する細胞は枯渇させられ例えば、不動化、補体固定などにより、かくして内因性非ヒト免疫グロブリンを発現する細胞例えばマウスIgを発現するリンパ球内で枯渇された細胞副次集団を生成する。結果として得られた枯渇したリンパ球集団T細胞、ヒトIg-陽性B細胞などは、内因性抗体を産生する能力が実質的に無い同じ種の免疫適合性あるすなわちNHC適合性あるヒト以外の動物例えばSCIOマウス、RAG1又はRAG2ノックアウトマウスの体内へとトランスファさせることができる。再構成された動物マウスを次に抗原で免疫化させ又は外稙体を提供したドナー動物を免疫化するのに使用した抗原を用いて再免疫化させる、高親和性親和性成熟した抗体及びかかる抗体を産生するB細胞を得ることができる。かかるB細胞は、従来の細胞融合によりハイブリドーマを生成するのに使用でき、スクリーニングできる。抗体抑制はその他の内因性Igの失活/抑制方法例えばJHノックアウト、CHノックアウト、D-領域切除、アンチセンス抑制、補償されたフレームシフト失活と組合わせて使用することもできる。完全な内因性Ig遺伝子座失活或る種の実施態様では、ヒト可変領域及び非ヒト例えばマウス恒常領域を含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないような形で例えばトランスジーン及び内因性Ig配列の間のトランス切換えにより、内因性Ig遺伝子座の完全な失活を行なうことが望ましい。JH領域においてのみ機能的に分断されている原文with→whichの誤り内因性重鎖対立遺伝子を支持するノックアウトマウスは、標準的にはトランスジーンによりコードされた再配置されたヒト可変領域VDJが内因性マウス恒常領域に連鎖された融合タンパク質として発現されるトランススイッチを頻繁に示すが、その他のトランススイッチされた連結も可能である。この潜在的問題を克服するためには、一般に、制眼的な意味なく以下のものを含むさまざまな方法のうちのいずれかにより内因性重鎖遺伝子座を完全に失活することが望ましい:1少なくとも1つ、好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を、相同組換えによって機能的に分断及び/又は欠失させること、2少なくとも1つ好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を突然変異させて、終止コドン又はフレームシフトをコードし、切形又はフレームシフトされた産物トランスススイッチされた場合を産生すること、及び当業者にとっては明白なその他の方注及び戦略。重鎖恒常領域遺伝子及び/又はD-領域遺伝子の実質的部分又は全ての欠失は、特にヒットエンドランタイプなどの相同組換えターゲティングベクターによる遂次欠失を含むさまざまな方法によって達成できる。同様にして、内因性軽鎖恒常領域遺伝子を切除するための少なくとも1つの内因性軽鎖遺伝子例えばκの機能的分断及び/又は欠失が往々にして好ましい。頻繁に、非相同トランスジーンがJセグメント単複内のフレームシフト及びトランスジーン恒常領域遺伝子のうちの単数又は複数のもの好ましくは全ての初期領域すなわちアミノ末端コーディング部分内の補償フレームシフト例えば原読取り枠を再生させるためを含んでいるようなフレームシフトされたトランスジーンを利用することが好ましい。内因性IgH遺伝子座恒常遺伝子補償フレームシフトを含まないものに対するトランススイッチは、切形又はミスセンス産物を結果としてもたらすことになり、その結果、トランススイッチされたB細胞は欠失されるか又は選択されなくなり、かくしてトランススイッチされた表現型は抑制されることになる。内因性Ig遺伝子産物発現例えば、マウス重鎖及び軽鎖配列及び/又はトランススイッチされた抗体例えばヒト可変/マウス恒常キメラ抗体の実質的に完全な機能的失活を実施するためにはアンチセンス抑制及び抗体抑制も同様に使用することができる。内因性例えばマウスのIg鎖発現の基本的に完全な抑制を行なうためには、失活及び抑制戦略のさまざまな組台せを使用することが可能である。トランス-スイッチいくつかの変形態様においては、トランススイッチされた免疫グロブリンを産生することが望ましい場合がある。例えば、このようなトランススイッチされた重鎖は、キメラのものでありうるすなわち非マウスヒト可変領域及びマウス恒常領域。このようなトランススイッチされたキメラ免疫グロブリンを含む抗体は、非ヒト例えばマウス恒常領域を有することか望まれるさまざまな利用分野例えば、ヒト恒常領域を結合しない二次抗体の結合のためといったようなマウス免疫学的決定因子の存在について宿主内のエフェクター機能の保持のためのために使用することができる。1例を挙げると、或る種の抗体に関して、マウス可変領域能力範囲レパートリーに比べて、ヒト可変領域能力範囲が有利である可能性がある。おそらくは、ヒトVHDJHVL及びJL遺伝子は、進化の間に、或る種の進化上重要な抗原を結合する免疫グロブリンをコードするその能力のために選択されてきたのであろう:マウスの能力範囲のための進化上選択的な圧力を提供した抗原は、ヒトの能力範囲を形作るのに進化的圧力を提供した抗原と全く異なるものである可能性がある。マウス恒常領域例えばトランススイッチされたマウスのアイソタイプと組合わされたときヒト可変領域能力範囲を有利なものにするその他の能力範囲の利点も存在しうる。マウス恒常領或の存在は、ヒト恒常領域に比べ利点を提供する可能性がある。例えば、トランススイッチによりヒト可変領域に連鎖されたマウスγ恒常領域は、予め定められた抗原例えばヒトIL-2レセプターと反応性あるキメラ抗体好ましくはモノクローナルを、マウス内のTリンパ球が機能的ヒトIL-2レセプターを発現する移植細胞対宿主病のマウスモデルといったマウス疾病モデルの中でテストできるように、マウスエフェクター機能例えばAOCC、マウス補体固定を有する抗体を提供しうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を例えば供給源ハイブリドーマクローンからのcDNAクローニング又はPCR増復により分離させ、望ましいヒト恒常領域をコードする配列にスプライシングして、免疫原性が好ましくは最小限にされているヒトの治療用途により適したものであるヒト配列抗体をコードすることが可能である。結果として得られる完全にヒトのコーディング配列単復を有するポリヌクレオチド単複を宿主内で発現させ例えば哺乳動物細胞中の発現ベクターから、医薬品のため精製することが可能である。いくつかの利用分野では、マウス恒常領域をヒト恒常領域と置換することなく直接キメラ抗体を使用することができる。トランススイッチされたキメラ抗体のその他の変形態様及び用途は、当事者にとって明白であろう。本発明は、一般にヒト重鎖トランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子の間のトランススイッチの結果として得られるキメラ抗体を発現するBリンパ球を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。このようなキメラ抗体は、一般にマウスのスイッチされたすなわち非μ、非δアイソタイプであるマウス恒常領域とヒト配列可変領域を含む。予め定められた抗原に対するキメラ抗体を作ることのできるヒト以外のトランスジェニック動物は、通常、ヒト可変及びヒト恒常領域遺伝子をコードするヒト重鎖及びヒト軽鎖トランスジーンの両方が組込まれた場合、完全にヒトの配列の抗体を作る能力もある。最も標準的には、機能的に分断された重鎖遺伝子座及び/又は軽鎖遺伝子座について同型接合であるが、トランススイッチできる単数又は複数の内因性重鎖恒常領域遺伝子例えばγαεを保持し、頻繁にシス連鎖したエンハンサーを保持する。このようなマウスは、通常アシュバントと組合わせた形で予め定められた抗原を用いて免疫化され、マウス恒常領域配列に連鎖されたヒト配列可変領域から成る重鎖を含む検出可能な量のキメラ抗体を含む免疫応答が生み出される。標準的には、かかる免疫化された動物の血清ば少なくとも約1μg/ml往々にして約10μgml以上、頻繁には30μg/ml以上、そして最高50~100μg/ml以上の濃度でこのようなキメラ抗体を含みうる。キメラヒト可変/マウス恒常領域重鎖を含む抗体を含む抗血清は標準的に、ヒト可変/ヒト恒常領域完全ヒト配列重鎖を含む抗体をも含んでいる。トランススイッチされたキメラ抗体は通常、1ヒト可変領域とマウス恒常領域標準的にはマウスガンマから成るキメラ重鎖及び2ヒトのトランスジーンコーディングを受けた軽鎖標漂準的にはけカッパ又はマウス軽鎖標準的にはカッパノックアウトパックグラウンド内のラムダを含んでいる。かかるトランススイッチされたキメラ抗体は、一般に、約1×107M1以上、好ましくは5×107M1以上、より好ましくは1×10nM1~1×102M1以上の親和力で予め定められた抗原例えば免疫原に結合する。頻繁には、予め定められた抗原は、ヒトタンパク質、例えばヒト細胞表面抗原例えばCD4CD8IL-2レセプター、EGFレセプター、POGFレセプター、その他のヒト生物学的巨大分子例えばトロンボモジュリン、プロテインC、炭水化物抗原、シアリルールイス抗原、L-セレクチン又は非ヒト疾病関連巨大分子例えば細菌性LPS、ビリオンカプシドタンパク質又は外被糖タンパク質などである。本発明は、次のものを含むゲノムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する:すなわち、1例えば、機能的スイッチ組換え配列、標準的には機能的エンハンサーに対するシス連鎖におけるトランススイッチすることのできる少なくとも1つのマウス恒常領域遺伝子を含む同型接合で機能的に分断された内因性重鎖遺伝子、2機能的ヒト重鎖可変領域をコードし発現するよう再配置することができかつトランススイッチすることのできる例えばシス連鎖されたRSSを有するヒト重鎖トランスジーン;さらに任意には3機能的ヒト軽鎖可変領域をコードするべく再配置しかつヒト配列軽鎖を発現することのできるヒト軽鎖例えばカッパトランスジーン;さらに任意には、4同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座κ、好ましくはκ及びλ;そしてさらに任意に5ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及ひ内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子例えばγ1γ2aγ2bγ3によりコードされたマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清。かかるトランスジェニックマウスはさらに、約1×104M1以上、好ましくは約5×104M1以上、より好ましくは1×107M1~1×102M1以上の親和力で、予め定められたヒト抗原例えば、CD4CD8CBAに結合するキメラ抗体を含む血清を含みうる。頻繁には、こうして産生されたモノクローナル抗体か少なくとも8×107M1の親和力をもつハイプリドーマを作ることかできる。往々にして非ヒト抗体に結合することができる、マウス恒常領域とヒト可変領域から成る重鎖を含むキメラ抗体が同様に血清中に、又はハイプリドーマから分泌された抗体として、存在しうる。いくつかの変形態様においては、無傷の重鎖恒常領域遺伝子を保持する失活した内因性マウス重鎖遺伝子座を有し、トランススイッチできるヒト重鎖トランスジーンを有し、任意には単数又は複数の失活した内因性マウス軽鎖遺伝子座を伴い、ヒト軽鎖トランスジーンをも有するトランスジェニックマウスを生成することが望ましい。かかるマウスは有利にも、トランススイッチにより、完全にヒトの重鎖を含む抗体及びキメラヒト可変/マウス恒常重鎖を含む抗体を交互に発現することのできるB細胞を産生することができる。このマウスの血清には、完全にヒトの重鎖を含む抗体及び、好ましくは完全にヒトの軽鎖と組合わせた状態でキメラヒト可変/マウス恒常重鎖を含む抗体を含む抗体が含まれる。ハイブリドーマは、このマウスのB細胞から生成されうる。一般にこのようなキメラ抗体はトランススイッチにより生成でき、ここで、インピボで産生能あるV-D-J再配置によりコードされるヒト可変領域及びヒト恒常領域、標準的にはヒトμをコードするヒトトランスジーンは、非トランスジーン免疫グロブリン恒常遺伝子スイッチ配列RSSでのスイッチ組換えを受け、かくしで、標準的に内因性マウス免疫グロブリン重鎖恒常領域又は第2のトランスジーン上でコードされた非相同例えばヒト重鎖恒常領域である、前記トランスジーンによりコードされていないヒト重鎖恒常領域とトランスジーンコーデイングを受けたヒト可変領域を作動的に連結させる。シスースイッチというのは、トランスジーン内のRSS要索の組換えによるアイソタイプスイッチのことであるが、トランススイッチには、往々にしてトランスジーンを宿す染色体とは異なる染色体上で、トランスジーンRSSとこのトランスジーンの外側のRSS要その間での組換えが関与する。トランススイッチは、一般に、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子と、非μアイソタイプ、標準的にはγの内因性マウス恒常領域遺伝子のRSS又は往々にして別々の染色体上に組込まれている第2のトランスジーン上に含まれたヒト恒常領域遺伝子のRSSのいずれか一方の間で起こる。トランススイッチが第1の、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子例えばμのRSSと、第2のトランスジーン上に含まれたヒト重鎖恒常領域遺伝子のRSSの間で起こる場合、実質的に完全にヒトの配列をもつ非キメラ抗体が産生される。制眼的な意味のない例として、ヒト重鎖恒常領域例えば、γ1及び作動的に連鎖されたRSS例えばγIRSSをコードするポリヌクレオチドを、トランスジーンコーディングと受けたヒトμ鎖を含む抗体を発現するトランスジェニックマウスのB細胞又はB細胞集団から生成されたハイブリドーマ細胞の集団内に導入例えばトランスフェクションすることができる。結果として得られたハイブリドーマ細胞を、導入されたポリヌクレオチドの存在について、及び/又は、ヒトμ鎖の可変領域イディオタイプ/抗原反応性を有しかつ導入されたポリヌクレオチド配列例えば、ヒトγ1によりコードされる恒常領域をもつ重鎖を含むトランススイッチされた抗体の発現について、選択することができる。トランスジーンにコードされたヒトμ鎖のRSSと下流のアイソタイプ例えばγ1をコードする導入されたポリヌクレオチドのRSSの間のトランススイッチ組換えは、かくしてトランススイッチされた抗体を生成することかできる。本発明はと同様に、1トランススイッチすることのできる少なくとも1つのマウス恒常領域遺伝子例えばγ2aγ2bγ1γ3を含む、同型接合で機能的に分離された内因性重鎖遺伝子座、2機能的ヒト重鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列重鎖を発現することができ、かつアイソタイプスイッチ及ビ/又はトランススイッチを受けることのできるヒト重鎖トランスジーン;さらに任意には3機能的ヒト軽例えはカッパ鎖可変領域をコードするべく再配置しヒト配列軽鎖を発現することができるヒト軽鎖例えばカッパトランスジーン、そしてさらに任意には4同型接合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座標準的にはκ、好ましくはκとλの両方、そしてさらに任意には5ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子例えば、γ1γ2aγ2bγ3によりコードされるマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清、を含むゲノムを含むトランスジェニックマウスを予め定められた抗原で免疫化する段階を含む、このようなトランススイッチされたキメラ抗体を産生するための方法も提供している。親和性標識:スイッチされたアイソタイプについての巽択有利なことに、体細胞突然変異のプロセスは、トランススイッチ及びシススイッチと結びつけられる。体細胞突然変異は、B細胞のクローン後代によりコードされる抗体親和力の範囲を拡張する。例えば、スイッチトランス-又はシス-を受けたハイブリドーマ細胞により産生された抗体は、スイッチを受けなかったハイブリドーマ細胞内に存在するよりも広い抗原結合親和力範囲を示す。従って、第1のヒト重鎖恒常領域例えばμに対するポリペプチド結合において第1のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む第1の抗体を発現するハイブリドーマ細胞集団標準的にはクローンのを、第2の重鎖恒常領域例えはヒトγ、α又はε恒常領域に対するポリペプチド結合において前記第1のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細抱クローン変異株についてスクリーニングすることができる。かかるクローン変異株は、インビトロでシススイッチを生成する天然クローン変異によって、又はT細胞誘導されたリンホカイン例えばIL-4及びIFNγといったアイソタイプスイッチを促進する作用物質の投与を通してといったようなクラススイッチトランス-又はシス-の誘発によって、又はトランススイッチのための基質として役立つべき非相同例えばヒト重鎖恒常領域遺伝子及ひ機能的RSSを含むポリヌクレオチドの導入によって、又は上述のものの組合せなどによって、産生させることかできる。往々にして、作動的に連鎖されたRSSを伴うヒト下流アイソタイプ恒常領域例えばγ1γ3などを含むポリヌクレオチドが同様に、ハイブリドーマ細胞内に導入され、トランススイッチメカニズムを介してアイソタイプスイッヂを促進する。クラススイッチ及び親和性成熟は、本発明のトランスジェニック動物から誘導されたB細胞の同じ集団内で発生する。従って、クラススイッチされたB細胞又はそれから誘導されたハイブリドーマの同定を、高親和力のモノクローナル抗体を得るための1つのスクリーニング段階として使用することができる。シス-スイッチトランスジーン内スイッチ、トランススイッチ又はその両方といったクラススイッチ事象を容易にするため、さまざまなアプローチを利用することができる。例えば、付随するRSS要素及びスイッチ調節要素例えば不稔写しプロモーターを伴うμ及ひγの両方の恒常領域遺伝子を含む単一の連続ヒトゲノミックフラグメントを、トランスジーンとして使用することができる。しかしながら、望まれる単一の隣接するヒトゲノミックフラグメントの一部分は、例えばクローニング宿主などの中で複製されるときの不安定さの問題などにより、効果的にクローニングすることが困難でありうる:特にδとγ3の間の領域は、特にμ遺伝子、γ3遺伝子、V遺伝子、D遺伝子セグメント及びJ遺伝子セグメントを含む隣接するフラグメントのように効率良くクローニングしにくいことが判明する可能性がある。同様に例として、ヒトμ遺伝子、ヒトγ3遺伝子、ヒトV遺伝子単復、ヒトD遺伝子セグメント及びヒトJ遺伝子セグメントから成り、介入するイントロンの又はその他の形で可欠な配列例えば単数又は復数のV、D、及び/又はJセグメント及び/又は単数又は複数の非μ恒常領域遺伝子の単数又は復数の欠失を伴う、不連続のヒトトランスジーンミニ遺伝子、がある。このようなミニ遺伝子は、効率良い免疫グロブリンの発現及びスイッチのための必須要素の全てにまたがるゲノミックDNAの単一の隣接セグメントを分離することに比べて、いくつかの利点を有する。例えば、このようなミニ遺伝子は、クローニングし難い配列例えば、不安定配列、毒物配列などを内含しうるDNAの大きい断片を分離する必要性を無くする。さらに、シス-又はトランス-スイッチのためのアイソタイプスイッチのために必要な要素例えば、ヒトγ不稔写しプロモータを含むミニ遺伝子座は、有利にもインビボで体細胞突然変異及びクラススイッチを受けることができる。多くの真核性DNA配列がクローニングし難いものであることが立証されているため、可欠配列を削除することが有利であることが判明する。一変形態様においては、高い結合親和力例えば1×107M1以上、好ましくは1×108M1以上、より好ましくは1×109M1以上をもつ抗体を産生するハイブリドーマクローンは、産生力ある枠内V-D-J再配置を受けることができる内因性マウス重鎖遺伝子座が実質的に欠如しアイソタイプスイッチを行なうことのできる以上参照ヒト重鎖トランスジーンを宿すトランスジェニックマウスのB細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞のプールから、ヒト又はマウス非μ重鎖恒常領域に対するポリペプチド結合においてヒト配列重鎖可変領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマを選択することによって得られる。これらの抗体は、インビボ又は細胞培養中でのシス-スィッチ及び/又はトランス-スイッチの結果として産生されるスイッチされた重鎖を含むことから、スイッチされた抗体と呼ばれる。スイッチされた抗体を産生するハイブリドーマは、一般に、体細胞突然変異プロセスを受けており、このハイブリドーマのブールは一般により広い抗原結合親和力範囲を有することになり、この中から高親和力の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することができる。標準的には、予め決定された抗原について実質的な結合親和力1×107M1~1×108M1以上をもつヒト配列抗体を分泌し、このヒト配列抗体がヒト免疫グロブリン可変領域単復を含んでいるようなハイブリドーマを、2段階プロセスを含む方方により選択することかできる。1つの段階は、例えば、スイッチされた重鎖に特異的に結合しスイッチされていないアイソタイプ、例えばμ、に対して実質的に結合しない不動化された免疫グロブリンに対しハイブリドーマ細胞を結合することにより、スイッチされた重領を含む免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定し分離することにある。もう1つの段階は、例えばハイブリドーマクローン上清のELISA、標識づけされた抗原を用いたFACS分析などにより実質的な結合親和力で予め定められた抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定することにある。標準的には、スイッチされた抗体を分泌するハイブリドーマの選択は,予め定められた抗原を結合するハイブリドーマ細胞を同定する前に行なわれる。予め定められた抗原に対する実質的な結合親和力をもつスイッチされた抗体を発現するハイブリドーマ細胞が分離され、標準的には個々の選択されたクローンとして当該技術分野において既知の適切な成長条件下で培養される。任意には、この方法には、モノクローナル抗体の発現に適した条件下で前記選択されたクローンを培養する段階が含まれる。このモノクローナル抗体を収集し、これを治療、予防及び/又は診断の目的で投与することができる。往々にして、選択されたハイブリドーマクローンは、予め定められた抗原に結合する又はこれに対する結合力を付与する免疫グロブリン例えば可変領域をコードする免疫グロブリン配列を分離するめたのDNA又はRNA原として役立ちうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を分離し例えばPCR増幅又は供給源ハイブリドーマクローンからのcDNAクローニングによる、好ましくは免疫原性が最小限にされるヒトの治療用途により適したヒト配列抗体をコードするべく望ましいヒト恒常領域をコードする配列に対しスプライシングする。結果として得られた完全にヒトのコーディング配列単復をもつポリヌクレオチド単複を宿主細胞例えば哺乳細胞内の発現ベクターからの中で発現させ、医薬品のために精製することが可能である。キセノ異種エンハンサーヒト免疫グロブリン例えば重鎖をコードすることのできる非相同トランスジーンは、有利にも、マウスゲノムから誘導されていない、及び/又は非相同トランスジーンのエキソンとシスで自然に結びつけられていないシス-連鎖されたエンハンサーを含んでいる。例えば、ヒトκトランスジーン例えばκミニ遺伝子座は有利にも、ヒトVK遺伝子、ヒトjK遺伝子、ヒトCK遺伝こ及びキセノエンハンサーを含んでいる可能性があり、標準的には、このキセノエンハンサーは、標準的にJK遺伝子とCK遺伝子の間にあるか又はCK遺伝子の下流に位置づけされた、ヒト重鎖イントロンエンハンサー及び/又はマウス重鎖イントロンエンハンサーを含む。例えば、マウス重鎖J-μイントロンエンハンサーCell33729は、プラスミドpkVe2の09kbのkba1フラグメント上で分離されうる下記参照。ヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーHaydayetalNature307334は、14kbのMluIHindIIIフラグメントとして分離されうる下記参照。基本的にマウスJ-μイントロンエンハンサーに対しシスで連鎖されたヒトJ-μイントロンエンハンサーで構成されている組合されたきせノエンハンサーといった、トランスジーンに対する転写的に活性なキセノエンハンサーの付加は、特にこのトランスジーンかヒトκといった軽鎖をコードする場合、トランスジーンの高い発現レベルを付与することかできる。同様に、ラット3′エンハンサーを、ヒト重鎖とコードできるミニ遺伝子座構成体内に有利にも含み入れることかできる。核酸実質的相同性なる用語は、2つの核酸またはデザインしたその配列を最適に整列しそして比較した時に、少なくとも約80のヌクレオチド、通常は少なくとも約90~95、より好ましくは少なくとも約98~995のヌクレオチドが同一であることを指摘する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が存在する。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純枠な形で、存在することかできる。核酸は、標準技術により、例えばアルカリ/SOS処理、CsClバンド沈降、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された時、単離されまたは実質的に純粋にされる。FAusubelら編、CurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingandWileyInterscienceNewYorkを参照のこと。本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しばしばcDNA、ゲノムDNAまたは混合物のいずれかからの生来の配列修飾された制限部位等を除くを変異せしめることができる。コード配列については、それらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のV,DJ定常スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的に相同であるかまたはそれから誘導されるDNA配列が考えられるここで、誘導されるとは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されていることを指摘する。核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、作用可能に連結されるという。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に作用するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列については、作用可能に連桔されるとは、連結されるDNA配列が連続であって、そして2種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続であって且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。特定の好ましい態様本発明の好ましい態様は、実施例568または14に記載の軽鎖トランスジーンの単一のコピーを含有する動物と交配させた実施例12に記載のトランスジーン例えばpHC1またはpHC2の少なくとも1回のコピー、典型的には2~10回のコピー、時には25~50回以上のコピーを含有する動物、並びに実施例10に記載のJH欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの3つの特性について同型接合に交配される。そのような動物は次の遺伝子型を有する:再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座実施例12に記載の単一コピー染色体の一倍体1組あたり、再配列されたヒトκ軽鎖構成物実施例14に記載の単一コピー染色体の一倍体1組あたり、および機能的JHセグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝子座のところの欠失実施例10に記載。そのような動物は、jHセグメントの欠失について同型接合であるマウスと交配させる実施例10と、JH欠失について同型接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については半接合である子孫を生産する。生じた動物に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に使う。そのような動物がら単離されたB細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみを含むため、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。というのは、実施例9および12に記載のようにして導入されたjH領域に広がる欠失によって、両万の内因性マウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、B細胞の実質的部分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、B細胞の実質的部分における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうからである。好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのものと実質的に同じである、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を示すだろう。例えば、内因性Ig遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブリンレベルは約01~10mg/ml血清、好ましくは05~5mg/ml、理想的には少なくとも約1Omg/mlの範囲であろう。IgMからIgGにスイッチすることができるトランスジーンをトランスジェニックマウスに導入した時、血清尾IgG対IgMの成熟マウス比は好ましくは約10:1である。もちろん、IgG対IgM比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、脾臓およびリンパ節B細胞の約10より多く、好ましくは40~80が、もっぱらヒトIgGタンパク質のみを発現する。レパートリーは理想的にば非トランスジェニックマウス中にしめされるものとほぼ等しく、通常は少なくとも約10ほど高く、好ましくは25~50またはそれ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるVJおよびD領域の数に主として依存して、通常少なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン理想的にはIgG、好ましくは104~106またはそれ以上の免疫グロブリンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリンば、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。抗原性タンパク質としては、ハトチトクロームC、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマイトジェン、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコッカスブロテインA、マッコウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサータンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは、予め選択された抗原に対して、少なくとも約107M1、好ましくは108M1~109M1またはそれ以上の親和性を示すだろう。いくつかの実施態様においては、予め定められた抗原タイプに対する抗対応答において表わされるV遺伝子の選択を制限する目的で、予め定められた能力範囲をもつマウスを生成することが好まれる可能性がある。予め定められた能力範囲をもつ重鎖トランスジーンは例ば、人間ににおける予め定められた抗原タイプに対する抗体応答で好んで用いられるヒトVH遺伝子を含みうる。代替的には、さまざまな範囲により例えば、予め定められた抗原に対する高い親和力のV領域をコードする確率が低い;対細胞突然変異及び親和力激化を受ける傾向が弱い;又は一定の人間に対する免疫原性をもつ、規定された能力範囲からいくつかのVH遺伝を除外することができる。様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジーンの再配列の前に、それらの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはDNA配列決定により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容易に同定することができる。本発明のトランスジェニックマウスは、ヒトの抗体が望ましいところの、予め決められた抗原、例えば膜通過蛋白質、細胞表面巨大分子または他の適当な抗原例えばTNF、LPS等で免疫され得る。マウスは、トランスジーン内スウィッチ組換えシスースウィッチを経てクラススウィッチを受け、予め決められた抗原と反応する免疫グロブリンを発現するB細胞を生成する。免疫グロブリンは、ヒト配列抗体であり得、ここで、重鎖および軽鎖ポリペプチドがヒトトランスジーン配列によってエンコードされ、これは体細胞突然変異によって誘導される配列およびV領域組換えジョイント、ならびに生殖細胞系エンコード配列を含み;これらのヒト配列免疫グロブリンは、ヒトVLまたはVH遺伝子セグメントおよびヒトJLまたはJLセグメントによってエンコードされたポリペプチド配列に実質的に同一であるとされ得る。たとえ他の非生殖細胞系配列が、体細胞突然変異および分化VJおよびVDJ組換えジョイントの結果として存在し得るとしても。そのようなヒト配列抗体に関して、各鎖の可変領域は、ヒト生殖細胞系V、Jおよび重鎖の場合にはD遺伝子セグメントによって、典型的には少なくとも80エンコードされており;しばしば少なくとも85の可変領域が、トランスジーンに存在するヒト生殖細胞系配列によってエンコードされており;時には90または95またはそれ以上の可変領域配列がトランスジーンに存在するヒト生殖細胞系配列によってエンコードされている。しかしながら、非生殖細胞系配列は体細胞突然変異およびVJおよびVDJ結合によって導入されるので、ヒト配列抗体はしばしば、マウスの生殖細胞系におけるヒトトランスジーンに見出されるように、ヒトV、D、またはJ遺伝子セグメントによってエンコードされるいくつかの可変領域配列を有するであろう。典型的には、そのような非生殖細胞系配列または個々のヌクレオチド配置は、CRDの中もしくは近くに、または体細胞突然変異が集中することが知られている領域に、集中するであろう。予め決められた抗原に結合するヒト配列抗体は、ヒト配列γ鎖例えばγ1、γ2a、γ2Bまたはγ3およびヒト配列軽鎖例えばκを含むヒト抗体が生成されるようなイソタイプスウィッチから、結果として生じ得る。そのようなイソタイプスウィッチされたヒト配列抗体はしばしば、典型的には可変領域に、特に二次的な引き続く抗原チャレンジに続く、抗原によるB細胞の親和性突然変異および選択の結果として、しばしばCDRの約10残基内で、1またはそれ以上の体細胞突然変異を含む。これらの高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも1x109M1、典型的には少なくとも5x109M1、しばしば1x1010M1より上、時には5x1010M1~1x1011M1またはそれ以上の結合親和性を有することができる。そのような高い親和性ヒト配列抗体は、ヒト抗原、例えばヒトCD4等のヒト巨大分子例えばヒト膜通過または細胞表面蛋白質または他の細胞表面抗原に対して高い結合親和性を有して、作られ得る。そのようなマウスからのB細胞は、ヒト蛋白質たとえばCD4等を含む種々の抗原に対してモノクローナル高親和性2x109M1より上のヒト配列抗体を発現するハイブリドーマを生じるのに使用され得る。これらのハイブリドーマは、予め決められたヒト抗原への結合について、少なくとも2x109M1の親和性定数Kaを有する免疫グロブリンを含む組成物を生じるために使用され得る。ここで、前記免疫グロブリンは、つぎのものから成る:ヒト配列軽鎖であって、ヒトVL遺伝予セグメントおよびヒトJLセグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域およびヒトCL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリぺプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖:およびヒト配列重鎖であって、ヒトVH遺伝子セグメント、任意的にはD領域、およびヒトJHセグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域およびヒトCH遺伝子セグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。しばしば、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンによって、それぞれ別々にエンコードされ、マウス細胞のゲノムに組込まれる。しかしながら、両方の鎖が単一のトランスジーン上にエンコードされ得るか、または一方もしくは両方の鎖が多重トランスジーン上にエンコードされ得る。多重トランスジーンは、例えば、マウス生殖細胞におけるヒト重鎖トランスジーンと同じ遺伝子座で、組込まれていないVH配置を含むYACからV遺伝子セグメントを誘導したヒト重鎖トランスジーン例えばHC2である。1つの実施態様において、組成物は、K定常領域を有するヒト配列軽鎖およびγ定常領域を有するヒト配列重鎖を含む免疫グロブリンを含む。マウスおよびそれから誘導されたハイブリドーマは、予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも1x1010M1の親和性定数Kaを有する免疫グロブリンのための供給源である。ここで、該免疫グロブリンは、次のものから成る:ヒト配列軽鎖であって、ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJLセグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域およびヒトCL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖;およびヒト配列重鎖であって、ヒトVH遺伝子セグメント、任意的にはD領域、およびヒトJH七グメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域およびヒトCH遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。本発明は、次のものを含むトランスジーンマウスを提供する:機能的に分断された内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因性の軽鎖対立遺伝子のホモ接合の組、ヘテロガス免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも1のコピー、およびヘテロガス免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも1のコピー。ここで、該動物は、ヒト抗原との免疫に続いて抗体応答をし、抗体応答は、予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも2x109M1の親和性定数を有する免疫グロブリンを含み、該免疫グロブリンは、次のものから成る:ヒト配列軽鎖であって、ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJLセグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖可変領域およびヒトCL遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域を含むヒト配列軽鎖;およびヒト配列重鎖であって、ヒトVH遺伝子セグメント、任意的にはD領域、およびヒトJHセグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域およびヒトCH遺伝子セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトの少なくとも1の体細胞系上に存在するヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合するところのヒト配列免疫グロブリンを生成することができ、ここで、免疫グロブリンは、15x10M1~18x1010M1の親和性定数Kaで、該ヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合する。そのようなヒトの表面もしくは膜通過蛋白質の1例はCD4であるが、他のものが所望の免疫原として使用され得る。予め決められた抗原に対する高親和性のヒト配列抗体の発生は、組込まれたヒト免疫グロブリントランスジーンを含むゲノムを有するトランスジエニックマウスにおいてヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを広げるための方法によって促進され、該方法は、該組込まれたヒト免疫グロブリントランスジーンに存在しないV領域遺伝子セグメントを含むv遺伝子トランスジーンをゲノムに導入することを含む。しばしば、このV領域トランスジーンは、ヒトゲノムに自然に生じ得るような、または組換え法によって別々にスプライスされ得るような、ヒトのVHまたはVLVK遺伝子セグメント配置の部分を含む、酵母の人工的な染色体であり、これは、適切でないoutoforderまたは省略されたV遺伝子セグメントを包含し得る。しばしば、少なくとも5またはそれ以上の機能的v遺伝子セグメントがYACに含まれる。この変形において、Vレパートリー拡張法Vrepertoireexpansionmethodによって生成されたトランスジェニックマウスを作ることが可能であり、ここで、マウスは、V領域トランスジーンに存在するV領域遺伝子セグメントによってエンコードされた可変領域配列およびヒトIgトランスジーンにエンコードされたC領域を含む免疫グロブリン鎖を発現する。vレパートリー拡張法によって、少なくとも5の明瞭なV遺伝子を有するトランスジェニックマウスが生成されることができ、また、少なくとも約24のv遺伝子またはそれ以上を有するマウスが生成され得る。もちろん、いくつかのV遺伝子セグメントは非機能的であることができ例えば偽遺伝子等、これらのセグメントは保持されることができ、または所望なら当業者に入手可能な組換え法により削除されることができる。マウス生殖細胞系が、JおよびC遺伝子セグメントを含むヒトIgトランスジーンにおいて実質的に存在しない、拡張されたVセグメントレパートリーを有する機能的YACを含むように処理されたなら、形質は増殖され、他の遺伝子バックグラウンドへと繁殖され得る。他の遺伝子バックグラウンドは、拡張されたVセグメントレパートリーを有する機能的YACが、異なるヒトIgトランスジーンを有するマウス生殖細胞系へと繁殖されるところのバックグラウンドを包含する。拡張されたVセグメントレパートリーを有する多重の機能的YACは、生殖細胞系へと繁殖されて、ヒトIgトランスジーンまたは多重ヒトIgトランスジーンと共に働き得る。ここで、YACトランスジーンと称するけれども、ゲノムに組込まれたときそのようなトランスジーンは、酵母の配列を実質的に欠き得る。それは、例えば酵母での自律性の複製に必要とされる配列であり、そのような配列は、もはや必要ではない、酵母での複製後にすなわち、マウスES細胞またはマウスプロザイゴートに導入されるに先立って、遺伝子工学例えば制限消化およびパルス場ゲル電気泳動pulsedfieldqelelectrophoresisまたは他の適当な方法によって任意的に除去され得る。本発明はまた、ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を増殖させる方法を提供し、この方法は、ヒトIgトランスジーンを有し、かつ拡張されたVセグメントレパートリーを有する機能的YACを任意的にまた有するトランスジェニックマウスを繁殖させることを含む。VHおよびVL遺伝子セグメントの両方が、YACの上に存在し得る。トランスジェニックマウスは、実行する人が所望する任意のバックグラウンドへと繁殖され得、このバックグラウンドは、ヒトIgトランスジーンおよび/または他のヒトリンパ球蛋白質をエンコードするトランスジーンを含む、他のヒトトランスジーンを収容するバックグラウンドを包含する。本発明はまた、拡張されたV領域レパートリーYACトランスジーンを有するトランスジェニックマウスにより生成された高親和性ヒト配列免疫グロブリンを提供する。上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記戴したけれども、他の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトランスジーンにより定義される。トランスジェニック動物の4つのカテゴリーが定義され得るI.再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。II.再記列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。III再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない軽鎖免役グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。IV.再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫ダロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖遺伝子または少なくともκ遺伝子が相同組換えまたは他の方法により破壊されている場合にはII>II>III>IVであり、そして内因性軽鎖遺伝子が破壊されておらず且つ対立遺伝子排除により優性になるに違いない場合にはI>II>III>IVである。先に議論したように、本発明は、ヒトの疾病の処置において有用なヒト配列モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体の治療上の使用は、例えばラリックおよびボーラ、JournalofBiologicalResponseModifiers5:379-393において議論されている。ヒトモノクローナル抗体の使用は、自己免疫疾患、癌、感染症、移植組織の拒絶、血液障害例えば凝固障害、および他の疾病の処置を包含する。本発明の抗体は、蛋白質の送り出しについて医療分野で公知の任意の方法により、患者に投与され得る。抗体は、非経口投与すなわち皮下、筋肉内、または静脈内投与に特に適している。本発明の薬剤組成物は、代替的薬剤送り出しアプローチを用いた投与にまた適している例えばランガー、サイエンス、249:1527-1533。非経口投与のための薬剤組成物は通常、受け入れ可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解されたモノクローナル抗体の溶液を含む。種々の水性担体が使用でき、例えば水、緩衝された水、04塩水、03グリシンなどである。これらの溶液は、無菌であり、一般に微粒子物質を含まない。これらの組成物は、慣用の公知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、適当な生理的条件に必要とされるような、薬剤的に受け入れ可能な補助的物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、緊張調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含むことができる。これらの処方における抗体の濃度は、広く変わり得る。すなわち、約05重量より下から、通常01重量以上、15または20重量までであり、選択された投与の特定の様式にしたがって、第1に流体体積、粘度などに基づいて選択されるであろう。非経口投与可能な組成物を実際に調製する方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、より詳細には、例えばレミントンの薬学科学RemingtonsPharmaceuticalScinences、第17版、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルバニアに記載されている。本発明の抗体またはその混合物を含む組成物は、予防的および/または治療的処置のために投与されることができる。治療的施与において、組成物は、治療するのに十分な量、または感染およびその合併症を少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で患者に投与される。これを成し遂げるのに適切な量は、治療的に有効な投与量として定義される。この使用のために有効な量は一般に、約005mgkg体重~約5mg/kg体重、好ましくは約02mqkq体重~約15mg/kg体重の範囲である。いくつかの例においては、本発明の免疫グロブリン分子を変性してその生物学的活性を変化させることが望ましいであろう。例えば、免疫グロブリンは、直接または間接に、他の化学療法薬と一緒にすることができる。種々の化学療法薬が標的にするために一緒にされ得る。例えば、一緒にされ得る抗炎症剤は、免疫調節薬、血小板活性化因子PAF拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン拮抗剤を包含する。いくつかの好ましい部分は、シクロスポリンA、インドメタシン、ナプロキセン、FK-506、マイコフェノール酸等を含む。同様に、抗酸化剤例えばスーパーオキシドジスムターゼが、リパーヒュージョン障害reperfudioninjuryの処置において有用である。同様に、抗がん剤たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ブレオマイシン等が標的にされ得る。本発明のモノクローナル抗体はまた、患者の部位に対して両親媒性のもの例えばリポソームを標的にするのに使用され得る。これらの調製において、受け渡しされるべき薬剤が、ヒトモノクローナル抗体が埋め込まれるところのリポソームの部分として組込まれる。本発明のヒト配列モノクローナル抗体は、それらが向けられた、予め決められた抗原に特異的に結合するので、有用である。予め決められた抗原がヒト抗原すなわち、ヒト蛋白質またはそのフラグメントであるとき、本発明のヒト免疫グロブリンがまた非ヒト動物、特に薬剤試験例えば生物学的活性、薬物動態学および安全の臨床前試験のためによく使用される動物で見出されたコグネイト抗原に結合するなら、それは時には有利である。これらの動物は、マウス、ウサギ、ラット、イヌ、ブタ、および特に非ヒト霊長類例えばチンパンジー、無尾猿および猿例えばレサスモンキーを含む。実験動物において抗原を認識する能力は、免疫グロブリンの生物分布での特異的結合の効果を測定するのに特に有用である。コグネイト抗原は、iヒト抗原と実質的に同様の構造例えばアミノ酸配列を有するすなわち、動物のコグネイト蛋白質のアミノ酸配列は、典型的にはヒト蛋白質に少なくとも約50同一、通常少なくとも約70同一、およびしばしば少なくとも約80またはそれ以上同一である;iiヒト抗原と実質的に同じ機能を有する;およびヒト抗原と同じ細胞区画にしばしば見出されるところの抗原である。ヒトおよび動物のコグネイト抗原は、典型的にはいつもではないが同じ名前を有する。コグネイト抗原の例は、ヒトチューブリンおよびマウスチューブリン、ヒトCD4およびレサスCD4およびヒトIgGおよびラットIgGを含む。別の観点では、本発明は、人工遺伝子によってエンコードされた少なくとも1のポリペプチドを有する抗原結合ヒトmABを提供する。人工遺伝子は、細胞誘導された鋳型核酸ストランド例えば細菌性の細胞または免疫もしくはハイブリドーマ細胞から得られた核酸鋳型および人工遺伝子の複製を経た子孫を必要としない化学的または酵素的方法によってインビボで合成された、ポリペプチドをエンコードする核酸セグメント、すなわち完全に合成された核酸を含む。短い核酸をプライマー、リンカー等として使用することは遺伝子工学においてルーチンであるが、化学的および/または酵素的手段によって、30、50またはそれ以上の塩基を長さに有する、完全に合成の蛋白質をエンコードする核酸を生成することがまた可能である。本発明の人工遺伝子は、合成核酸領域と細胞誘導核酸領域との両方を含み得る。人工遺伝子の合成核酸領域は一般に、少なくとも約50塩基、しばしば少なくとも約100塩基、典型的には少なくとも約200塩基、よりたびたびには少なくとも約250塩基、通常300塩基または400塩基より多い塩基の長さがある。典型的には、合成核酸領域は、可変遺伝子セグメントまたはその部分例えばCDR領域をエンコードし、定常領域は、細胞誘導された核酸によってエンコードされる。免疫グロブリンポリペプチドすなわち、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は、ポリペプチドをエンコードする人工遺伝子を用いて簡便に発現され得る。通常、人工遺伝子は、転写プロモーター配列、例えば免疫グロブリン遺伝子からまたはウィルス例えばSV40、CMV、HIV、RSVまたはハイブリッドプロモーターから誘導されたプロモーター配列に動作可能に結合される。人工遺伝子は、他の配列例えばポリアデニル化配列およびイントロンにもまた結合され得る。免疫グロブリンポリペプチドを発現するための1つの方法は、免疫グロブリンポリペプチドの1つの領域例えば可変領域またはその部分をエンコードする合成核酸を、残留するセグメントまたは免疫グロブリン鎖の部分例えばμ、γ、γ2、γ3、γ4、δ、ε、α1、α2定常領域、および任意的にプロモーター例えばCMVサイトメガロウィルスプロモーター、ポリアデニル化もしくは他の配列をエンコードするベクターへ挿入することを含む。そのようなベクターは、細胞に導入されると、ベクター配列の細胞性転写および翻訳が免疫グロブリンボリペプチドをもたらすように構成される。機能的ヒト配列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子およびポリペプチドは、人工遺伝子を用いて構成され、予め決められた抗原に特異的に結合するような所望の特異性を有する免疫グロブリンを生成するために使用され得る。これは、予め決められた抗原で免疫されたトランスジェニック動物からの細胞またはその動物から誘導されたハイブリドーマによって発現されたボリペプチドと実質的に同様の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工遺伝子を構成することによって達成される。かくして、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工遺伝子および、人工遺伝子を用いてヒト配列免疫グロブリンを生成する方法を提供する。この方法に従って、トランスジェニック動物例えば、機能的に分断された内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因性の軽鎖対立遺伝予のホモ接合の組、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも1つのコピー、およびヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも1つのコピーを有するトランスジェニックマウスが、予め決められた抗原、例えばヒト蛋白質で免疫される。核酸、好ましくはmRNAは次に、集められまたは、免疫グロブリン遺伝子転位が起こるところの細胞または細胞集団から分離され、免疫グロブリンの重鎖および/または軽鎖特にVセグメントをエンコードする核酸又はその部分の配列が決定される。この配列情報は、人工遺伝子の配列のための基礎として使用される。配列の決定は一般に、興味ある遺伝子またはcDNAの少なくとも部分、例えば転位されたヒトトランスジーンまたは免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする対応するcDNAの部分の分離を必要とする。通常、これは、ヒト免疫グロブリンポリペプチドをエンコードするDNA、または好ましくはmDNA、モレキュラークローニングアラボラトリーガイド、第1-3巻、コールドスプリングハーバープレスを見よを用いて行う。例えば、cDNAライブラリーは、ポリAmRNA、好ましくは膜結合mRNA、および免疫グロブリンボリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングされたライブラリーの逆転写によって構成される。しかしながら、好ましい実施態様において、ポリメラーゼ鎖反応pcRが、興味のある免疫グロブリン遺伝子セグメント例えば軽鎖可変セグメントをエンコードするcDNAまたは全長さのcDNAの部分の増幅に使用される。ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子の配列は当業者に容易に入手可能なので、ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントを特異的にハイブリッド化するまたは増幅するプローブまたはPCRプライマーは容易に設計され得る。テイラーら、NucAcidsRes20:62871992年を見よ。さらに、トランスジェニックマウスのヒトトランスジーンの配列はしばしば、実施する人には公知であり、プライマー配列は、トランスジーンの適当な領域にハイブリッド化するように選択され得る。増幅された配列は、任意の適当なベクターたとえば発現ベクター、ミニジーンベクター、またはファージ表示ベクターへと、容易にクローン化され得る。興味のある免疫グロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能である限りは、使用される特定のクローン化の方法は重要ではないことが正しく認識される。ここで使用されるように、クローン化され、増幅され、標識を付けられた、またはさもなければ、興味のある核酸の配列が決定され得るようにバックグラウンド核酸から区別された核酸は、分離されたと考えられる。クローニングおよび配列に使用されるRNAの1つの供給源は、トランスジェニックマウスからB細胞を得、かつB細胞を不死細胞に融合することによって製造されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらが容易にスクリーニングされ、興味のあるヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマが選択されることである。あるいは、RNAが、免疫した動物のB細胞または脾臓全部から分離され得る。ハイブリドーマ以外の供給源が使用されるとき、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする配列についてスクリーンニングするのが好ましい。そのようなスクリーニングの方法の1つは、ファージ表示技術の使用である。ファージ表示は、例えばダウアーら、国際特許出願WO9117271、マックカファーティら、国際特許出願WO9201047、およびカトンおよびコプロウスキー、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87645064541990年に記載されている。ファージ表示技術を用いた1つの実施態様において、免疫されたトランスジェニックマウスからのcDNA例えば全脾臓cDNAが分離され、ポリメラーゼ鎖反応が、免疫グロブリンポリペプチドの部分、例えばCDR領域をエンコードするcDNA配列を増幅するのに使用され、かつ、増幅された配列は、ファージベクターに挿入される。興味のあるペプチド、例えば所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをエンコードするcDNAは、パニングのような標準の技術によって同定される。次に、増幅されたまたはクローン化された核酸の配列が決定される。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全部をエンコードする配列が決定されるが、しかし、時には可変領域の部分、例えばCDRをエンコードする部分のみを配列することが適当であろう。典型的には、配列された部分は、少なくとも30塩基の長さであり、よりしばしば、可変領域の長さの少なくとも約3分の1または少なくとも約2分の1の長さについて基づいたコーディングbasedcodingが配列されるであろう。配列は、cDNAライブラリーから分離されたクローン上で、またはPCRが使用されるときは、増幅された配列のサブクローニングの後で、または増幅されたセグメントの直接PCR配列によって、行われることができる。配列は標準技術例えばサムブルックら、、モレキュラークローニング:アラボラトリーガイド、第1-3巻、コールドスプリングハーバープレスおよびサンガー、Fら、、proc.NatlAcadSciUSA7454635467を見よを用いて行われる。クローン化された核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの公開された配列と比べることにより、配列された領域に依存して、ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド重鎖のイソタイプを含むの生殖細胞系セグメント使用および重鎖および軽鎖可変領域の配列N領域添加および体細胞突然変異のプロセスから生じた配列を含むを、当業者は容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝予配列情報の1つの供給源は、ナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション、ナショナルライブラリーオブメディシン、ナショナルインスティテューツオブヘルス、ベセスダ、エムディーである。代替的な実施態様においては、興味のある免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接蛋白質配列によって決定することができる。免疫グロブリン発現遺伝子すなわち、転位トランスジーンの少なくとも一部分に一致するかまたは実質的に同様の配列を有する人工遺伝子を構成することができる。同様に、人工遺伝子は、転位トランスジーンの配列された部分によりエンコードされたポリペプチドに一致するかまたは実質的に同様であるところのポリペプチドをエンコードすることができる。遺伝子コードの縮重は同じポリペプチドが多重核酸配列によってエンコードされるのを許す。時には核酸配列を変えて、例えば制限部位を誘導する、コドンの使用を変えて特定の発現系を反映する、またはグリコシル化部位を除去することが望ましい。さらに、ハイブリドーマ配列における変化は、免疫グロブリンの特性例えば結合特性を変えるために導入され得る。例えば、重鎖および軽鎖可変領域のCDR領域において特に、予め決められた抗原にたいしての免疫グロブリンの親和性を増加するために、変化が導入される。合成核酸を構成するための方法はよく知られている。完全に化学的合成が可能であるが、一般に混合した化学的-酵素的合成が行われ、この方法では、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドがライゲーション反応および/またはポリメラーゼ鎖反応に使用されて、より長いポリヌクレオチドを作り上げる。もっとも好ましい実施態様において、ボリメラーゼ鎖反応は、増幅の結果が人工遺伝子のために望ましい配列を有するDNAであるように選ばれたオーバーラッププライマーを用いて行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、固相または溶液中で合成され得る。一般に、固相合成が好ましい。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステルおよびHホスホネート化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成についての工程の詳細な記載は、広く入手可能である。例えば、イタクラ、米国特許第4401796号明細書:カルサーズら、米国特許第4458066号明細書および第4500707号明細書;ビユーケイジら、TetrahedronLett,221859-1862;マッチューチら、J.AmerChem.Soc,103:3185-31911981年;カルサーズら、GeneticEngineering,4:1-171982年;ジョーンズ、第2章、アトキンソンら、第3章、およびスプロートら、第4章、ガイト編、オリゴヌクレオチド合成:アプラクティカルアプローチ、IRLプレス、ワシントンD.Cカーターら、Biotechnology10:163-1671992年に記載されている。核酸例えば人工遺伝子の導入方法はよく知られており、トランスフェクション例えばエレクトロポレーションによってまたはリポソームが媒介するおよび形質転換を含む。導入された遺伝子の発現のためのシステムは、一般に、サムブルックらの上記の文献に記載されている。免疫グロブリン例えばIgG分子がインビボで生成されるように、同じ細胞中で2つの免疫グロブリンポリペプチドすなわち、重鎖および軽鎖を発現することがしばしば望ましい。したがって、2つの人工遺伝子すなわち、1つは重鎖をエンコードし、1つは軽鎖をエンコードするを細胞に導入するのが時には望ましい。この2つの人工遺伝子は単一のベクター上に導入され得る。あるいは、1つの免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする1つの人工遺伝子が、遺伝子的に操作されて他の免疫グロブリンポリペプチドを発現する細胞に導入され得る。人工遺伝子がトランスフェクトされた細胞が増殖すると、人工遺伝子の合成核酸部分全部が、複製および転写のための鋳型としてふるまうことが明らかである。それにもかかわらず、子孫の遺伝子は、合成核酸由来であったであろう。そして、ここで使用されているように、これはまた、人工遺伝子と考えられる。かくして、ハイブリドーマの、発現されたトランスジーンに対する人工遺伝子の合成部分の関係は、情報的結合すなわち、配列情報はあるが、直接物理的結合はないところのものである。本発明はまた、治療的および診断的な適用において、特にヒトの疾病の処置において有用な、抗CD4モノクローナル抗体を提供する。CD4は、胸腺細胞およびT細胞にまず発現される細胞表面蛋白質であり、これは、T細胞機能および抗原のMHCクラスII認識に含まれる。CD4に向けられた抗体は、CD4細胞の活性を減らすようにふるまい、かくして、望まない自己免疫反応、炎症性の応答および移植した器官の拒絶を減らす。実際に、抗CD4mAbの投与は、動物モデルにおいて、自己免疫疾患を防ぐウォオフジーら、J.Exp.Med,161:378-391または逆転させるウォフジーら、J.Immunol,138:3247-3253、ワルダーら、サイエンス、227:415-417ことが示された。ネズミまたはキメラの抗CD4mAbの、リュウマチ様の関節炎患者への投与は、臨床的恩恵を示したノックスら、Blood7720-301991年;ゴールドベリーら、J.Autoimmunity,4:617-630;ヘルツォグら、ランセット、ii:1461-1462;ホーネフら、ArthritisRheum34129-140ライターら、ArthritisRheum34:525-536;ウェンディングら、J.Rheum,38:325-327;ファンデルルツベら、ArthritisRheum38:1097-1106;ファンデルルッベら、ArthritisRheum,36:1375-1379;モァランドら、ArthritisRheum,36:307-318およびチョイら、ArthritisandRheumatism,39:52-56。さらに、上記したように、キメラ抗CD4mAbは、菌状息肉症の患者においていくらかの臨床的効力を示したノックスら、1991年Blood,77:20。抗CD4抗体はまた、ニューマンら、バイオテクノロジー、10:1455-14601992年において議論されている。方法および材料トランスジェニックマススは、lloganら、ManipulatingtheMouseEmbryoALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryこれは参考として本明細書中に組み込まれるに従って誘導される。胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作されるTeratocarcinomasandembryonicstemcells:apracticalapproachEJRobertson編IRLPress,WashingtonDC1987Zjilstraら、Nature342435438およびSchwartzbergPら、Science246799803この各々は参考として本明細書中に組み込まれる。DNAクローニング方法は、J.Sambrookら、MolecularCloningALaboratoryManual第2版1989ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNYこれは参考として本明細書中に組み込まれるに従って実施される。オリゴヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従ってAppoliedBiosystemsのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。ハイブリドーマ細胞および抗体は、AntibodiesALaboratoryManualHaralowおよびDavidLane編,ColdSpringHarborLaboratory1988これは参考として本明細書中に組み込まれるに従って操作される。実施例1ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーンこの実砲例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングとマイクロインジェクションを記載する。MarzluffWFら、TranscriptionandTranslationAPracticalApproachBDHammesおよびSJHigins編89129頁IRLPress,Oxfordにより記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核またはPBSで洗浄したヒト精母細胞を低融点アガロース母材中に埋め込み、EDTAとプロティナーゼKで溶解せしめで高分子量DNAを暴露させ、このDNAを次いでMFinneyによりCurrentProtocolsinMoleculerBiologyにより記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。Noti断片に冨む画分をサザンブロットハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によりコードされる1または復数の配列を検出する。そのような配列ば、重鎖Dセグメント、Jセグメント、μおよびγ1定常領域と一緒に8種のVHファミリーの全部の代表物を含むこの断片は、Bermanら前掲によりHeLa細胞から87Okb断片として同定されているが、本発明者らはヒト胎盤および精子DNAからは830kb断片としてであることを発見した。このNotI断片を含む画分図4参照をプールし、そして酵母細胞中のベクターpYACNNのNotI部位にクロ-ニングする。プラスミドpYACNNは、pYAC4NeoCook,Hら、Nucl.AcidsRes.16118171988]をEcoRIで消化しそしてオリゴヌクレオチド5′-AATTGCGGCCGC-3′の存荘下で連結せしめることにより調製する。BrownsteinらScience24413481351およびGreen.E.ら、ProcNatl.Acad.Sci.USA87121312171990これらは参考として本明細書中に組み込まれるにより記載されたようにして、重鎮NotI断片を含むYACクローンを単離する。M.Finncy.前掲により記載されたパルスフィールドゲル電気泳動により、高分子量酵母DNAからクローン化NotI挿入断片を単離する。1Mmのスベルミンの添加によりこのDNAを凝縮さぜ、上述の単細胞胚の核に直接マイクロインジュクトする。[実施例2]生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーンヒトκ軽鎖の地図はLorenz.Wら、Nucl.AcidsRes.15966796771987に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。全てのCκ、3′エンハンサー、全てのJセグメントおよび少なくとも5つの異なるVセクメントを含む450kbのXhoI-NotI断片を実施例1に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェクトする。[実施例3]生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン前記成分の全部と少なくとも20個多いVセグメントとを含む750kpMluI-NotI断片を実施例1に記載の如く単離し、そしてBssHIIで消化して約400kbの断片を生戊せしめる。450kbXhoI-NotI断片と約400kbMIuI-BssHII断片は、BssHII制限部位とXhoI制限部位とにより眼定される配列重複を有する。マウス接合子のマイクロインジェクションによるそれらの2断片の相同組換えは、450kbXhoI/NotI断片実施例2中に見つかるものよりも少なくとも15~20個追加のVセグメントを含むトランスジーンをもたらす。[実施例4]重鎖小遺伝子座の作製A.pGP1およびpGP2の作製pBR322をEcoRIとSFtyIで消化し、下記のオリゴヌクレオチドと連結せしめることにより、図8に記載の制限部位を有する147塩基対の挿入断片を含むpGP1を作製する。それらのオリゴの概括的重複は図9にも示される。オリゴヌクレオチドは下記のものである:オリゴ-15′-CTTGAGCCCGCCTAATAGGCGGGCTTTTTTTTGCATACTGCGGCC-3′オリゴ-25′-GCAATGGCCTGGATCCATGGCGCGCTAGCATCGATATCTAGAGCTCGAGCA-3′オリゴ-35′-TGCAGATCTGAATTCCCGGGTACCAAGCTTACGCGTACTAGTGCGGCCGCT-3′オリゴ-45′-AATTAGCGGCCGCACTAGTACGCGTAAGCTTGGTACCCGGGAATT-3′オリゴ-55′-CAGATCTGCATGCTCGAGCTCTAGATATCGATGCTAGCGCGCCATGGATCC-3′オリゴ-65′-AGGCCATTGCGCCCGCAGTATGCAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCT-3′このプラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離することができる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性NotI部位により隣接された大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、pUC系プラスミドに比べて比較的低コピー数であるpBR322に由来するpGP1は複製開始点の近くにpBR322コピー数調節領域を保持している。低コピー数は挿入配列の潜在的毒性を減少させる。加えて、pGP1は、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に挿入された、trp由来の強力な転写ターミネーター配列Christie.G.E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA7841801981も含む。これは、アンピシリンプロモーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る腫の挿入断片に関係する毒性を減少させる。ブラスミドpPG2は、ポリリンカー中に追加の制限部位SfiIを導入するようにpGP1から誘導される。pGP1をMIuIとSpeIで消化し、該プラスミドのポリリンカー邪分の中の認識配列を切除する。このように消化されたpGP1に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せしめてpGP2を作製する。5′CGCGTGGCCGCAATGGCCA3′5′CTAGTGGCCATTGCGGCCA3′pGP2はMIuI部位とSpeI部位の間に置かれた追加のSfiI部位を含むこと以外はpGP1と同じである。これは挿入断片をSfiIで並びにNotIで完全に切除することを可能にする。B.pRE3ラットエンハンサー3′の作製ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重鎮構成物中に導入する。Petterssonら、Nature3441651681990により記載された重鎖領域3′エンハンザーを単離し、クロ-ニングする。次のオリゴヌクレオチド5′CAGGATCCACATATCAGTACCTGAAACAGGGCTTGC3′5′GAGCATGCACAGGACCTGGAGCACACACAGCCTTCC3′を使って、ラットIGH3′エンハンサー配列をPCR増幅せしめる。こうして形成された3′エンハンサーをコードする二本鎖DNAをBamHIとSphIで切断し、BamHISphIで切断されたpGP2中にクロ-ニングしてpRE3ラットエンハンサ-3′を得る。C.ヒトJ-μ領域のクローニングこの領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離された2以上の断片を組み合わせることによりクロ-ニングする。図9を参照のこと。オリゴヌクレオチドGCACTGTGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATGTCTGGGGCCAAGを使って、全部のヒトjセグメントを含む63kbBamHI/HindIII断片Matsudaら、BMBOJ.71O4710511988:Ravetechら、Cell275835911981、これらは参考として本明細書中に組み込まれるをヒトゲノムDNAライブラリーから単離する。オリゴヌクレオチドCACCAAGTTGACCAGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGAを使って、エンハンザー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣接の10kbHindIII/BamHI断片Yasuiら、Eur.J.Immunol.19139914031989を同様にして単離する。プローブとしてクローンpMUM挿入断片pMUMは、μ膜エクソン1オリゴヌクレオチド:CCTGTGGACCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTTCCTCCTを使ってヒトゲノムDNAライブラリーから単離された4kbEcoRI/HindIII断片であるを使って隣接の3′15kbBamHI断片を同様に単雌し、そしてpUCl9中にクロ-ニングする。pGP1をBamHIとBglIIで消化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する。図9からの断片aおよびbを前記消化pGP1中にクロ-ニングする。次いで5′BamHI部位がBamHI/BglII融合により破壊されるように置かれたクローンを単離する。それをpMUと命名する図10参照。pMUをBamHIで消化し、図9からの断片cを挿入する。HindIII消化により方向性を確認する。生じたプラスミドpHIG1図10は、およびCμセグメントをコードする18kb挿入断片を含有する。D.Cμ領域のクロ-ニングpGP1をBamHIとHindIIIで消化し、次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理するhttpswwwnricyberpatentcojppatentcachemeisaishokindtyear2000no502324useridsgac1041session1395155103service1fig14fig14図14。このように処理された図14の断片bおよび図14のcを、BamHI/HindIIIで切断したpGP1中にクローニングする。HindIII消化により断片cの正しい方向を確認し、Cμ領域をコードする12kb挿入断片を含むpCONIを得る。PHIGIは、NotI部位により隣接されたポリリンカ-ー中にSfiI3′部位とSpeI5′部位を有する18kb挿入断片内にJセグメント、スイッチおよびμ配列を含む故に、再配列されたVDJセグメントに使われるだろう。pCONIはJ領域を欠き12kb挿入断片のみを含むこと以外はpHIGIと同じである。再配列されたVDJセグメントを含む断片の作製におけるpCONIの使用については後で記載する。E.γ-1定常領域のクローニングoREG2ヒトγ-1領域のクローニングは図16に描写される。Yamamuraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86215221561986は、組込み時に部分的に削除されたトランスジーン構成物からの膜結合ヒトγ-1の発現を報告している。彼らの結果は、3′BamHI部位が、5kb未満のV-Cイントロンを有する経膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭となることを指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない遺伝子では、最初のγ-1定常エクソンの5′末端から5kb未満のところで始まる配列中にスイッチ領域全体が含まれる。従ってそれは5′53kbHindIII断片中に含まれるEIIison,JW.ら、NucleicAcidsRes.10407140791982;これは参考として本明細書中に組み込まれる。Takahash1ら、Cell296716791982これは参考として本明細書中に組み込まれるもまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告しており、この断片と77kbHindIII-BamHI断片とを合わせると我々がトランスジーン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定遺伝子のイントロン中に存在する少なくとも15の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。γ-1の第三エクソンCH3に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使って、γ-1領域を含むファージクローンを同定し単離する。5′TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG3′77kbHindIIIBglII断片図11中の断片aをHindIII/BglIIで切断されたpRE3中にクロ-ニングしてpREG1を作製する。上流の53kbHindIII断片図11中の断片bをHindIII消化されたpREG1中にクロ-ニングしてpREG2を作製する。BamHI/SpeI消化により正しい方向を確かめる。F.CγとCμの結合上述したプラスミドpHIG1はヒトjセグメントとCμ定常領域エクソンを含む。Cμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジーンを提供するために、pHIGエをSfiIで消化した図10。プラスミドpREG2もSfiIで消化し、ヒトCγエクソンとラット3′エンハンザー配列を含む135kb挿入断片を得た。それらの配列を連結し、315kb挿入断片上にヒトJセグメント、ヒトCμ定常領域、ヒトCγ1定常領域およびラット3′エンハンサー配列を含むプラスミドpH1G3′を作製した図12。pCONIをSfiIで消化し、そしてpREG2をSfiIで消化して得られたヒトCγ領域とラット3′エンハンサーとを含むSfiI断片と連結せしめることにより、ヒトCμおよびヒトCγ1をコードするがJセグメントを含まない第二のプラスミドを作製する。得られたプラスミドpCON図12は、ヒトCμ、ヒトγ1およびラット3′エンハンサー配列を有する20kbのNotI/SpeI挿入断片を含有する。G.DセグメントのクローニングヒトDセグメントをクローニングするための方策は図13に描写される。Dセグメントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを、多様性領域配列Y.Ichiharaら、EMBOJ7414141501988に特異的なプローブを使って同定しそして単離する。次のオリゴヌクレオチドを使用する。OXP1:5′-TGGTATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAACCACAGTGTC-3′DXP4:5′-GCCTGAAATGGAGCCTCAGGGCACAGTGGGCACGGACACTGT-3′DN4:5′-GCAGGGAGGACATGTTTAGGATCTGAGGCCGCACCTGACACC-3′オリゴDXP1を使って同定されたファージクローンから、DLR1,DXP1,DXP1およびUA1を含む52kbXhoI断片図13中の断片bを単離する。オリゴDXP4を使って同定されたファージクローンから、DXR4OA4およびOK4を含む32kbXbeI断片図13中の断片cを単離する。図13中の断片b,cおよびdを結合し、pGP1のXbaI/XhoI部位中にクローニングして、106kb挿入断片を含むpHIG2を形成せしめる。このクロ-ニングは連続的に行われる。まず、図13の52kb断片bと図13の22kb断片dを子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてXhoIとXbaIで消化されたpGP1中にクロ-ニングする。生じたクローンを該52kbおよび22kb挿入断片を用いてスクリ-ニングする。52kbおよひ22kb挿入断片での試験に陽性であるそれらのクローンの半分が、BamHI消化により確かめると正しい方向で52kb挿入断片を有する。次いで図13の32kbXbaI断片を、断片bとdを含むこの中間プラスミド中にクロ-ニングし、pHIG2を形成せしめる。このプラスミドは、ユニーク5′SfiI部位とユニーク3′SpeI部位を有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全なポリリンカーはNotI部位により隣接される。H.重鎖小遺伝子座の作製下記は、1または複数のVセグメンントを含むヒト重鎖小遺伝子座の作製を説明する。Newkirkら、J.Clin.Invest81151115181988これは参考として本明細書中に組み込まれるのハイブリドーマ中に含まれるVセグメントとして同定されたものに相当する再配列されていないVセグメントを、次のオリゴヌクレオチド5′-GATCCTGGTTTAGTTAAAGAGGATTTTATTCACCCCTGTGTC-3′を使って単離する。再配列されていないVセグメントの制限地図を調べて、消化すると3′および5′隣接配列と一緒に再配列されていないVセグメントを含む約2kbの長さを有するDNA断片を提供するユニーク制限部位を同定する。5′開始配列はプロモーターおよび他の調整配列を含み、一方3′隣接配列はV-DJ結合に必要な組換え配列を提供するだろう。この約30kbVセグメント挿入断片をpGB2のポリリンカー中にクロ-ニングし、pVHIを形成せしめる。pVHIをSCiIで消化し、得られた断片をpHIG2のSfiI部位にクロ-ニングしてpHIG5′を作製する。pHIG2はDセグメントのみを含むので、生成したpHIG5′プラスミドはDセグメントと一緒に単一のVセグメントを含む。pHIG5に含まれる挿入断片のサイズは、106kb÷Vセグメント挿入断片のサイズである。NotIとSpeIでの消化によりpHIG5から挿入断片を切り出す。J.CμおよびCγ1セグメントを含むpHIG3′をSpeIとNotIで消化し、そして上記配列とラット3′エンハンサーとを含む3kb断片を単離する。それらの2断片を一緒にして、NotIで消化されたpGP1中に連結せしめ、Vセグメント、9つのDセグメント、6つの機能的なJセグメント、Cμ、Cγおよびラット3′エンハンザーを含むPHIGを作製する。この挿入断片のサイズは約43kb÷Vセグメント挿入断片のサイズである。I.相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製前の章で指摘したように、pHIG挿入断片は単一のVセグメントを使用すると約43~45kbである。この挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニングすることかできる限界かまたはそれに近い。より多数のVセグメントの使用に備えるために、接合子またはES細胞内での相同組換えによってラット3′エンハンサー配列、ヒトCμ、ヒトCγ1、ヒトJセグメント、ヒトDセグメントおよび多数のヒトVセグメントを含むトランスジーンを形成する、重複DNA断片の生体内相同組換えを下記に記載する。ヒトJセグメントを含む63kbBamHI/HindIII断片図9中の断片aを参照のことを、次のアダブター:5′GATCCAAGCAGT3′5′CTAGACTGCTTG3′5′CGCGTCGAACTA3′5′AGCTTAGTTCGA3′を使って、MIuI/SpeIで消化されたpHIG5′中にクローニングする。生成したプラスミドをpHIG5’0重複と命名する。このプラスミド中に含まれる挿入断片はヒトV,DおよびJセグメントを含む。pVH1からの単一Vセグメントが使われる時、この挿入断片のサイズは約17kb÷2kbである。この挿入断片を単離し、そしてヒトJ,Cμ,γ1およびラット3′エンハンサー配列を含むpHIG3′からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片は、2つのDNA断片の間の約63kbの重復部分に備えるヒトJ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注入すると、生体内相同組換えが起こり、pHIG中に含まれる挿入断片と同等のトランスジーンを生成する。このアプローチは生体内で形成されるトランスジーン中への多数のVセグメントの付加に備える。例えば、単一のVセグメントをpBIG5′中に組み込む代わりに、1単離されたゲノムDNA、2ゲノムDNAから誘導された連結DNA、または3合成VセグメントレパートリーをコードするDNA、上に含まれる多数のVセグメントをpHIG2のSfiI部位にクローニングしてpHIG5′VNを作製する。次いで図9のJでグメント断片aをpHIG5′VN中にクローニングし、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、pHIG3′から単離した挿入断片上に含まれるJセグメントと重複するJセグメントと多数のVセグメントを含むようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えか起こり、多数のVセグメントおよび多数のJセグメント、多数のDセグメント、Cμ領域、Cγ1領域全てヒト由来並びにラット3′エンハンサー配列をコードするトランスジーンを生成する。[実施例5]軽鎖小遺伝子座の作製A.pEμlの作製pEμlの作製は図16に描写される。オリゴ5′GAATGGGAGTGAGGCTCTCTCATACCCTATTCACAACTGACT3′を使ってファージクローンから678bpのXbaI-EcoRI断片JBanerjiら、Celi337297401983においてマウス重鎖エンハンサーを単離する。このEμ断片を、EcoRI部位の平滑末端フィルインにより、EcoRV/XbaI消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpEμlと命名する。B.κ軽鎖小遺伝子座の作製κ構成物は、少なくとも1つのヒトVκセグメント、5つのヒトJκセグメント全部、ヒトJ-Cκエンハンサー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的にはヒト3′κエンハンサーを含むK.Meyerら、EMBOJ819591964。マウスのκエンハンサーはCκから9kb下流である。しかしながら、ヒトではまだ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重J-CμエンハンサーのIコピーも含む。この小遺伝子座は次の4つの成分断片から作製されるaマウス遺伝子座との類推によりヒトCκエクソンと3′ヒトエンハンサーとを含む16kbSmaI断片:b5つのJセグメント全部を含む5′隣接5kbSmaI断片:cρεμ1から単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサーこの配列は、B細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遣伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎮エンハンサーはおそらくイントロンκエンハンサーよりも早い段階で活性であろう。;およびd1または複数のVセグメントを含む断片。この構成物の調整は次の通りである。ヒト胎盤DNAをSmaIで消化し、電気泳動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤DNAをBamHIで消化し、電気泳動により分画する。SmaIで消化したゲルから16kb画分を単離し、同様にBamHIで消化したDNAを含むゲルから11kb領域を単離する。16kbSmaI画分を、XhoIで消化されXhoI制限消化生成物をフィルインするためにクレノウ断片DNAポリメラーゼで処理されているラムダFIXIIStratagene.LaJo11a,Ca1ifornia中にクローニングする。16kbSmaI画分の連結はSmaI部位を破壊するがXhoI部位はそのまま残す。11kbBamHI画分を、クローニング前にBamHIで消化したラムダFIXIIStratagene.LaJolla.Callfornia中にクローニングする。各ライブラリーからのクローンを、Cκ特異的オリゴ5′GAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG3′を用いて探査する。CκかSmaIに隣接するように、16kbXhoI挿入断片をXhoIで切断されたpEμl中にサブクローニングする。生じたブラスミドをpKap1と命名する。上記Cκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλEML3BamIIIライブラリーを探査し、11kbクローンを同定する。5kbSmaI断片図25の断片bをザブクローニングし、次いでSmaIで消化されたpKap1中に挿入する。正しい方向のJセグメント、CκおよびEμエンハンサーを含むそれらのプラスミドをpKap2と命名する。その後、1または複数のVκセグメントをpKap2のMIuI中にサブクローニングし、ヒトVκセグメント、ヒトJκセグメント、ヒトCκセグメントおよびヒトEμエンハンサーをコードするプラスミドpKapHを生ぜしめる。pKapHをNotI消化することによりこの挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により情製する。こうして精製された挿入断片を上述の如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトする。C.生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製11kbBamHI断片を、その3′末端がSfiI部位の方に向くように、BamHIで消化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpKAPintと命名する。pKAPint中のBamHI部位とSpeI部位との間のポリリンカー中に1または複数のVκセグメントを挿入してpKapHVを作製する。pkapHVの挿入断片をNotIでの消化により切り出し、そして精製する。pKap2からの挿入断片をNotIでの消化により切り出し、精製する。それらの2断片の各々は、pKapHVからの断片が、pKap2がら得られる挿入断片中に含まれる5kbSMaI断片と実質的に相同であるJκセグメントを含む5kbのDNA配列を含むという点で、相同性領域を含有する。それ故に、それらの挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると相同組換えして、Vκ,JκおよびCκをコードするトランスジーンを形成することができる。[実施例6]免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムクローンの単離この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免役グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは4コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その2コピーは融合相手の細胞系からのものであり、2コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのB細胞からのものである。それらの4コピーのうち、数個が再配列することかできるという事実にもかかわらず、ただ1つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。A.二本鎖cDNAヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしくは分泌形態またはその両形態のκ軽鎖含有IgMを合成する他の細胞系を、ポリARNAの単離に使用する。次いで該RNAを、逆転写酵素を使ったオリゴdT開姑cDNAの合成に使用する。次で一本鎖cDNAを単離し、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼ酵素を使って3′末端にG残基を付加する。次いでG末端が付けられた一本鎖cDNAを精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド5-GAGGTACACTGACATACTGGCATGCCCCCCCCCCCC-3′を使った第二鎖合成DNAポリメラーゼ酵素により触媒されるのための鋳型として用いる。二本鎮cDNAを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするmRNAの5′末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次いで、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖遺伝子のクロ-ニング方法は、下記のB部に要約される。B.軽鎖A部に記載された二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマ5′-GATCGCCATATCAGCTGGATGAAGTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCA-3を使った第3巡目のDNA合成のための鋳型として使用する。このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分に特異的な配列TCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCA並びに新たに合成されるDNA鎖のPCR増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列GTACGCCATATCAGCTGGATGAAGを含む。この配列を、次の2つのオリゴヌクレオチドプライマー5′-GAGCTACACTGACATACTGGCATG-3′5′-GTACGCCATATCAGCTGGATGAAG-3′を使ってPCRにより増幅せしめる。PCR増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATG-3′を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このDNAの合成42ヌクレオチドセグメントを、以後o-カッパと称することにする。Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびSmaIを含む幾つか異なるの制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わぜて消化したDNAのサザンブロットを、32P標識したユニークオリゴヌクレオチドo-カッパを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたVセダメントの上流に同定される。次いでIg発現細胞系からのDNAをSmaIおよび第二の酵素Vセグメントの内側にSmaI部位がある場合にはBamHIまたはKpnIで切断する。いずれかの生成した非平滑末端をT4DNAポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化DNA分子を与える。次いで制限部位をコードするリンカー断片中にどの部位が存在しないかに応じてBamHI,EcoRIまたはXhoIを付加し、そして対応するリンカー酵素で切断してBamHI,EcoRIまたはXhoI末端を有するDNA断片を与える。次いで該DNAをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるVセグメントを包含するDNA断片を含む画分をラムダEMBL3またはラムダFIXF2マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、次いでHoganらに記載の通りに、生存している胚を偽妊娠に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部DNAのサザンプロット分折によりトランスジーン配列の存在について分析した。既知量のクローン化DNAを含有する対照標準に比較したバンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよびLaneAntibodiesALaboratoryManual,1988.ColdSpringHarborLaboratory,NewYorkにより記載された通りに、トランスジーンによりコードされるヒトIgκタンパク質の存在についてELISAにより分析した。マイクロタイタープレートウエルをヒトIgκクローン6E1,0173.AMACInc,Westbrook,MEヒトIgMクローンAF6.0285.AMACIncWestbrook,MEおよびヒトIgGlクローンJL512,0280AMACIncWesLbrook,MEに特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル中に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニディー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg多価を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出した。図41は、8匹のマウスID.676.674,673,670.666,665.664および496からの血清のELISAアッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の7匹はρKClトランスジーン挿入断片が注入された胚から発育し、そして8番目のマウスはphClトランスジーン前記のマイクロインジェクションにより生まれたマウスに由来する。pKC1注入胚からの7匹のマウスのうちの2匹ID.666と664は、DNAサザンプロット分析により分析するとトランスジーン挿入断片を含んでおらず、5匹ID.676,674,673,670および665は該トランスジーンを含んでいた。pKC1トランスジーン陽性動物の一匹を除く全てが検出可能なレベルのヒトIgκタンパク質を発現し、残りの一匹の非発現性動物はDNAサザンプロット分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい。pHCl陽性トランスジェニックマウスはヒトIgMとIgGlを発現するがIgκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の特異性を証明する。pkC2Vκ655を含む8kbXhoI/Sa1I断片をpKC1の5′XhoI部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC2を作製した。2つのVκセグメントを含む生成トランスジーン挿入断片をマイクロインジェクション前にNotIでの消化により単離した。pKVe2この構成物は、Jκの5′に12kbの追加配列を含みそしてVκ658の3′の45kbの配列を欠いていること以外は、pKC1と同じである。該構成物は更に、マウス重鎖J-mイントロンエノハンサーBanrjiら、Cell337297401982を含む091kbXbaI断片と、下流に挿入されたヒト重鎖J-mイントロンエンハンサーHaydayら、Nature307334340を含む ゙14kbMIuI-HindIII断片を含有する。この構成物を、対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始する可能性について試験する。異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの3′κまたは重鎖エンハンサーMeyerおよびNeuberger.EMBOJ8195919641989,Pettersonら、Nature3441651691990:これらは参考として本明細書中に組み込まれるを有する類似構成物を作製することができる。再配列された軽鎖トランスジーンヒトB細胞DNAからPCRにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するためにκ軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図39に示す。PCR増幅させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子655から単離した37kbの5′隣接配列を含むベクターpK5nx中にクローニングする。次いで、Jκ24、Jκイントロンエンハンサー、Cκおよび9kbの下流配列を含むベクターpK31sのユニークXhoI部位中に、5′転写調節配列に融合させたVJセグメントをクローニングする。生じたプラスミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トランスジーンを含有し、このトランスジーンは胚へのマイクロインジェクションのためにNotIで切り出すことができる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿入のために3′末端にユニークSalI部位も含有する。ヒト脾臓ゲノムDNA由来の再配列されたκ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに2つの合成オリゴヌクレオチドo130,o131を使った。オリゴヌクレオチドo130ggacccagagggaaccatggaaは、VκIIIファミリー軽鎖遺伝子の5′領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のATCと重複している。オリゴヌクレオチドo131gtgcaatcaattctcgagtttgactacagacは、Jκ1の約150bp3′よりの配列に相補的であり、XhoI部位を含む。それらの2つのオリゴヌクレオチドは、Jκ1セグメントに連結された再配列されたVκIII遺伝子に相当するヒト脾臓DNAからの07kbのDNA断片を増幅する。PCR増幅されたDNAをNcoIとXhoIで消化し、個々のPCR生成物をプラスミドpNNO3中にクローニングした。5つのクローンのDNA配列を決定すると、機能的VJ連結転写解読枠を有する2つのクローンが同定された。追加の機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクローンは上記軽鎖発現カセット図39中に個別にクローニングすることができる。再配列された軽鎖構成物を用いて生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小遺伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、一次レパートリーの多様性の全てが重鎖により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現するマウス株を生産することができる。軽鎖多様性の1つの起源は体細胞突然変異からであることができる。全ての軽鎖が様々な異なる重鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないので、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス抹を生成せしめ試験することができる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対に、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖VDJ連結が起こるような軽鎖を有することから生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わせは、完全にヒトの抗体を発現するB細胞の頻度の増加をもたらし、かくしてヒトIg発現性ハイプリドーマの単離を容易にすることができる。プラスミドpIGM1,pHCl,pIGH1,pKC1およびpKC2のNotI挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入断片を、受精したF2マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そしてHoganらにより記載された通りにHoganら、MethodsofManipulatingtheMouseEmbryo,ColdSpringHarborLaboratory.NewYork、生存している胚を偽妊娠雌中に移した。[実施例9]相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹細胞中での相同組換えによるマウス内因性κ遺伝子座の不活性化に次いで、不活性化されたκ対立遺伝子を有する標的ES細胞を初期マウス胚胚盤胞中に注入することによるマウス生殖細抱系中への変異遺伝子の導入を記載する。方策は、Jκ遺伝子とCκセグメントに及ぶ遺伝子座の45kbセグメントが削除されそして選択マーカーneoにより置き換えられているマウスκ遺伝子座に相同なDNA配列を含むベクターを用いた相同組換えによりJκ遺伝子とCκ遺伝子を欠失せしめることである。κ標的ベクターの作製プラスミドpGEM7MA.RudnickiWhiteheadInstituteは、クローニンダベクタ-7Zf中のマウスホスホグリセレートキナーゼプロモータ-XbaI/TaqI断片;Adra,CNら、Gene6065741987]の転写調節下に、トランスフェクトされたES細胞の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子neoを含む。このプラスミドは、マウスpgk遺伝子の3′領域に由来する、neo遺伝子にとって異種のポリアデニル化部位PvuII/HindIII断片Boer,PHら、Biochem1calGenetics282993081990も含む。このプラスミドをκ福的ベクターの作製のための出発点として使った。第一段階はneo発現カセットの3′のκ遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。Cκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ5′-GGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAG-3′とJκ遺伝子でグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ5′CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAG-3′を使って、肝臓DNAから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウスκ鎖配列図25aを単離した。陽性ファーンクローンから2断片において、即ち12kbBgIII/SacI断片と63kbSacI断片として、マウスCκセグメントの3′に及ぶ8kbBgIII/SacI断片を単離し、それをBgIII/SacIで消化されたpGEM中にサブクローニングし、プラスミドpNEOK3′を作製した図25b。Jκ領域の5′に及ぶ12kbEcoRI/SphI断片も陽性ファージクローンから単離した。この断片のSphI部位にSphI/XbaI/BglII/EcoRIアダプターを連結せしめ、生じたEcoRI断片をneo遺伝子および下流の3′κ配列と同じ5′-3′方向で、EcoRIで消化されたpNEOK3′に連結せしめ、pNEOK5′3′図25cを作製した。次いで、Mansourら、Nature3363483521988これは参考として本明細書中に組み込まれるにより記載されたようにして、相同組換え体を有するESクローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含めた。プラスミドpGEM7からHSVTKカセットを得た。このカセットは、pGEMについて上述したのと同様に、マウスpgkプロモーターとポリアデニル化配列とにより隣接されたHSVTK遺伝子の構造配列を含む。pGEM7のEcoRI部位をBamHI部位に変更し、そしてTKカセットをBamHI/HindIII断片として切り出し、pGP1b中にサブクローニングしてpGP1bTKを作製した。このプラスミドをXhoI部位のところで線状化し、Jκの5′からのゲノム配列とCκの3′からのゲノム配列とにより隣接されたneo遺伝子を含む、pNEOK5’3’由来のXhoI断片をpGP1bTK中に挿入し、標的ベクターJCK1図25dを作製した。JCK1を用いた相同組換え後のゲノムκ遺伝子座の推定構造を図25eに示す。κ対立遺伝子の標的不活性化によるES細胞の作製および分析使用したES細胞は、本質的には記載された通りにRobertson,E.J,TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproach,EJRobertson編OxfordIRLPress71112頁、分裂上不活性なSNL767支持細胞層McMahonおよびBradley,ACell62107310851990上で増殖させたAB1系であった。他の適当なES系としては、E14系Hooperら、Nature326292295、D3系Doetschmanら、JEmbryol.Exp.Morph.872845、およびCCE系Robertsonら、Neture323445448が挙あげられるが、それらに限定されないい。特異的な標的変異を有するES細胞からマウス系統をうまく作製できるのは、ES細抱の多分化能性即ち、宿主胚盤胞中に注入されれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞に貢献することができるそれらの能力に依存している。任意の与えられたES細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用することになっているES細胞の特定集団がESゲノムの生殖細胞伝達を行うことができるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。この理由により、遺伝子標的の前に、ABI細胞の親集団の一部をC57O16J胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の大部分がESゲノムを子孫に伝達できるがどうかを確かめる。κ鎖不活性化ベクタ-JCK1をNotIで消化し、そして記載された方法Hasty,PR.ら、Nature350243246によりAB1細胞中にエレクトロポレートぜしめた。エレクトロポレートされた細胞を100mm皿上に2~5×105細胞/皿の密度で塗抹した。24時間後、G418200μgmlの活性成分およびFIAU05μMを培地に添加し、10~11日に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、2部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。サザンブロットハイブリダイゼーションによりDNA分析を行った。記載の如くLaird,PWら、Nucl.AcidsRes.194293クローンからDNAを単離し、XbaIで消化し、そして標特的プローブとして図25eに指摘の800bpEcoRI/XbaI断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の37kbXbaI断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な18kbバンドを検出した図25aおよびeを参照のこと。サザンブロット分析によりスクリーニングした901個のG418およびFIAU体制クローンのうち、7つのクローンがκ遺伝子のうちの1つへの相同組換えを示す18kbXbaIバンドを表した。それらの4つのクローンを更にBgIII.SacIおよびPstI酵素で消化し、κ遺伝子のうちの1つに該ベクターが相同的に組み込まれたことを確認した。標徴的800bpEcoRI/XbaI断片プローブAを用いて探査すると、野生型DNAのBgIII.SacIおよびPstI消化物がそれぞれ41,54,および7kbの断片を生成し、一方標的されたκ対立遺伝子の存在はそれぞれ24,75および57kbの断片により指摘された図25aおよびeを参照のこと。XbaI消化物により検出された7つの陽性クローンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴的である期待のBgIII,SacIおよびPstI制限断片を示した。不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製前の章で記載した標的されたESクローンのうちの5つを、記載の如く8radley.A.,TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproachEJ.Robertson編,113151頁C57B16J胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移し、注入ES細胞から誘導された細胞と宿主の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製丁る。黒いC57B16J背景上において、ES細抱系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した、それらの大部分が皮膜着色への過剰のES細胞の貢献70以上を示した。A81ES細胞はXY細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コロニー形成された雄ES細胞による雌胚の性転換のために雄であった。雄のキメラをC57BL6Jと交配さぜ、ESゲノムの生殖細胞伝達の指標である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの2つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。κ遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローンに標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50有した。尾部生検試料からのBgIII消化DNAのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブプローブA、図25eを使って、標的遣伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50が41kbの野生型バンドに加えて24kbのハイブリダイズするBgIIIバンドを示した。この結果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫のκ遣伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から3つの遺伝子型か誘導された:2コピーの正常κ遺伝子座を有する野生型マウス、1コピーの標的κ遺伝子と1つのNTκ遺伝子を有する異型接合体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスからのκ配列の欠失は、Jκに特異的なプローブブローブC、図25aを使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Jκプローブのハイブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのDNA試料に観察されたが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかった。これは、標的変異の結果としての欠失によりκ遺伝子座の両方のコピーが不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。[実施例10]相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎖遣伝子の活性化を記載する。方策は、JH領域が削除されそして選択マーカー遺伝子neoにより置き換えられている重鎖配列を含むベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Jセグメントを欠失せしめることである。重鎖標的ベクターの作製JH4特異的オリゴヌクレオチドプローブ5′-ACTATGCTATGGACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCG-3 ́を使って、03ES細胞系Gosslerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83906590691986から誘導されたゲノムファージライブラリーから、JH領域を含むマウス重鎖配列図26aを単離した。JH領域に及ぶ35kbのゲノムSacI/StuI断片を陽性ファージクローンから単離し、それをSacI/SmaIで消化されたpUC18中にサブクローニングした。生じたプラスミドをpuc18JHと命名した。トランスフェクトされたES細胞の薬剤選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子は、プラスミドpGEM7の修復変形から誘導された。文献中の報告Yenofskiら、Proc.Natl.Acad.SciUSA.8734353439は、pGEM7KJI中に使用されるneo遺伝子の源として働いたpMClneoThomasおよびCappechi.Cell51503512を含む幾つかの常用の発現ベクターのneoコード配列の点変異を証明している。この変異はneo遺伝子産物の活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野生型neoクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。pGEM7KJl中のHindlll部位を合成アダプターの付加によってSalI部位に変更し、そしてXbaI/SalIでの消化によりneo発現カセットを切り出した。次いでneo断片の両端をDNApolIのクレノウ形での処理により平滑末端化し、pUC13JHのNaeI部位中にサブクローニングし、プラスミドpUC18JHneo図26bを作製した。標的ベクターの更なる作製は、プラスミドpGPlbの誘導体において行った。pGPlbを制限酵素NotIで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチド5′-GGCCGCTCGACGATAGCCTCGAGGCTATAAATCTAGAAGAATTCCAGCAAAGCTTTGGC3 ́と連結せしめた。生じたプラスミドpGETと命名を使ってマウス免疫グロブリン重鎖標的構成物を構築した。Mansourら、Nature336348352により記載されたようにして、相同組換え体を有するESクローンの冨化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含めた。プラスミドpGEMからEcoRIとHindIIIでの消化によりHSVTK遺伝子を得た。このTKDNA断片をpGMTのEcoRI部位とHindIII部位との間にサブクローニングし、プラスミドpGMTTK図26cを作製した。標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージクローンからXhoIでのDNAの限定消化およびXbaIでの部分消化により、JH領域の5′に位置する59kbのゲノムXbaI/XhoI断片を誘導した。図26aに示されるように、このXbaI部位はゲノムDNA中には存在せず、むしろ陽性ファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐに隣接するファージ配列から誘導される。この断片をXbaI/XhoIで消化されたpGMTTK中にサブクローニングし、プラスミドpGMTTKJH5′図27dを作製した。作製の最終段階は、neo遺伝子および隣接するゲノム配列を含むpUC18JHneoからの28kbEcoRI断片の切除を含んだ。この断片をクレノポリメラーゼにより平滑末端にし、同様に平滑末端化されたpGMTTKJH5′のXhoI部位中にサブクローニングした。生じた構成物JHKOl図27eは、JH遺伝子座を隣接する69kbのゲノム配列を含み、neo遣伝子が中に挿入されているJH領域に及ぶ23kbの欠失を有する。図27fは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝子の構造を示す。[実施例11]標的されたES細胞の生産および分析本質的には記載された通りにRobertson.EJTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproach,EJRobertson編,71112頁、分裂上不活性なSNL767支持細胞層McMahonおよびBradley,Cell6210731085上でAB1ES細胞を増殖させた。前の実施例に記載した通り、標的指向性構成物JHKOlによるES細胞のエレクトロポレーションの前に、ESゲノムの生殖細胞伝達能力を有することが証明されたAB1由来のキメラの作製により、ES細胞の多分化能力を決定した。重鎖不活性化ベクタ-JHKOlをNotIで消化し、そして記載された方法Hastyら、Nature350243246にこよりAB1細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100mm皿上に1~2×105細胞/皿の密度で塗抹した。24時間後、G418200mg/mlの活性成分およびFIAU05mMを培地に添加し、8~10日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、2部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。サザンプロットハイブリダイゼーションによりDNA分析を行った。記載の如くLairdら、Nucl.AcidsRes.194293クローンからDNAを単離し、StuIで消化し、そしてプローブAとして図27fに示される500bpEcoRI/StuI断片を用いて探査した。このプローブは野生型遣伝子座中の47kbStuI断片を検出し、一方で3kbバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに標徴的である図26aおよび27fを参照のこと。サザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした525個のG418およびFITU二重耐性クローンのうち、12個が標的指向ベクターとの組換えに標徴的な3kb断片を含むことがわかった。それらのクローンがJH遣伝子座のところに期待の標的現象図27fに示されるような示すことは、HindIII、SpeIおよびHpaIでの更なる消化により確認された。Hindlll、SpeIおよびHpaIで消化されたDNAのサザンプロットへのプローブA、図27f参照のハイブリダイゼーションは、野生型遣伝子座についてはそれぞれ23kb、>10kbおよび>10kbのバンドをもたらし、一方標的された鎖遺伝子座についてはそれぞれ53kb、38kbおよび19kbのバンドが予想される図27f参照。StuI消化物により検出された12個の陽性クローンの全てが、標的JH遺伝子に標徴的な推定HindIII、SpeIおよびHpaIバンドを示した。加えて、neo持異的プローブプローブB、図27fを使った12個のクローン全てのStuI消化物のサザンプロット分析は3kbの推定断片のみを生じ、それらのクローンが各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを証明した。JH欠失を有するマウスの作製前の章で記載した標的されたESクローンのうちの3つを解凍し、記載の如くBradley,A.TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApprocach,E.J.Robertson編.113151頁C57B16J胚盤胞子中に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移した。黒色C57816J背景上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのES細胞の貢献の程度を外観的に同定する。2つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した、3つ目の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が皮膜着色へのES細胞のかなりの貢献度70以上を示した。ABlES細胞はXY細胞系であり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ES細胞により性転換されたために雄であった。雄キメラをC57BL6J雌と交配させ、ESゲノムの生殖細胞伝達の標徴である優性のアグーテ皮膜色の存圧について子孫を観察する。それらのクローンのうちの両方からのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。重鎖遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローン中に標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50有した。尾部生検試料からのStuI消化DNAのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブプローブA、図27fを使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50が47kbの野生型バンドに加えて約3kbのハイブリダイズする。StuIバンドを示した。この結果は、標的されたJH遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から3つの遣伝子型が誘導された:2コピーの正常JH遺伝子座を有する野生型マウス、該遺伝子の1つの標的コピーと1つの正常コピーを有する異型接合体、およびJH変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスからのJH配列の欠失は、JHに特異的なプローブプローブC、図26を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。異型接合性子孫と野生型子孫からのDNA試料において47kb断片へのJHプローブのハイブリダイゼーションが観察されたが、一方でJH変異体同型接合体からの試料には全くシグナルが検出されなかった。これは、JH配列の欠失により重鎖遺伝子の両方のコピーが変異されている新規マウス株の生成を証明する。[実施例12]重鎖小遺伝子座トランジーンA.大型DNA配列をクローニングするためのプラスミドベクターの作製1pGPlaプラスミドpBR322をEcoRIとStyIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリゴ-425′caagagcccgcctaatgagcgggcttttttttgcatactgcggccgct-3′オリゴ-435′-aattagcggccgcagtatgcaaaaaaaagcccgctcattaggcgggct-3′と連結せしめた。生じたプラスミドpGPlaを、稀少切断性制限酵素NotIにより切除することができる非常に大型DNA構成物をクローニングするために改変する。それは、trpA遺伝子に由来する強力な転写終結シグナルChristieら、Proc.Natl.AcadSci.USA784180の下流にアンピシリン耐性遺伝子AmpRに関してNotI制限部位を含む。この終結シグナルは、AmpR遺伝子からの読み通し転写を排除することにより、NotI部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下させる。加えて、このプラスミドは、pBR322コピー数調節領域を保持しているためにpUCプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜在的毒性を更に低下させ、そしてDNA複製による大型挿入断片に対する選択を減少させる。ベクターpGPlb,pGPlc,pGPldおよびpGPlfはpGPlaから誘導され、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカー配列を下記に与える。それらの各プラスミドは大型トランスジーン挿入断片の作製に利用することができ、該挿入断片はNotIで切り出すことができ、その結果トランスジーンDNAをマイクロインジェクション前に、ベクター配列から精製することができる。2.pGPlbpGPlaをNotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド:オリゴ-475′-ggccgcaagcttactgctggatccttaattaatcgatagtgatctcgaggc-3′オリゴ-435′-ggccgcctcgagatcactgattaattaaggatccagcagtaagcttgc-3′と連結せしめた。生じたプラスミドpGPlbは、NotIにより隣接された短いポリリンカー領域を含む。これは、NotIにより切除することができる大型挿入断片の作製を容易にする。3.pGPe次のオリゴヌクレオチドオリゴ-445′-ctccaggatccagatatcagtacctgaaacagggcttgc-3′オリゴ-455′-ctcgagcatgcacaggacctggagcacacacagccttcc-3′を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓DNA由来の免疫グロブリン重鎖3′エンハンサーS.Pettersonら、Nature344165168を増幅せしめた。増幅生成物をBamHIとSph.Iで消化し、そしてBamHI/SphIで消化されたpNNO3pNNO3は、記載順に次の制限部位:NotI,BamHI,NcoI,ClaI,EcoRV,XbaI,SacI,XhoI,SphI,PstI,BglII,EcoRI,SmaI,KpnIHindIIIおよびNotIを有するポリリンカーを含むpUC由来のプラスミドである中にクローニングした。生じたプラスミドpRE3をBamHIとHindIIIで消化し、そしてラットIg重鎖3′エンハンサーを含む挿入断片を、BamHI/HindIIIで消化されたpGPlb中にクローニングした。生じたプラスミドpGPe図28および化2及び化3は、配列をクローニングすることができそして次いでNotI消化によって3′エンハンサーと一緒に切り出すことがかできる幾つかのユニーク制限部位を含有する。ベクターpGPeの配列B.IgMを発現する小遺伝子座トランスジーンpIGMlの作製1J-μ定常領域クローンの単離およびpJMlの作製ファージベクターλEMBL3SP6T7ClonetechLaboratories,Inc,PaloAlto,CA中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーを、ヒト重鎖J領域特異的オリゴヌクレオチド:オリゴ-15′-ggactgtgtccctgtgtgatgcttttgatgtctggggccaag-3′を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ13を単離した。6つのJセグメント全部並びにDセグメントOHG52および重鎖J-μイントロンエンハンサーを含む、6kbのHindIII/KpnI断片をこのクローンから単離した。同じライブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド:オリゴ-25′-caccaagttgacctgcctggtcacagacctgaccacctatga-3′を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ21を単離した。μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、105kbのHindIII/XhoI断片をこのクローンから単離した。それらの2断片を、KpnI/XhoIで消化されたpNNO3と一緒に連結せしめ、プラスミドpJMIを得た。2.pJM2ファージクローンλ21から4kbのXhoI断片を単離した。該断片は、ある種のIgO発現B細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素HYasuiら、Eur.J.Immunol191399;これは参考として本明細書中に組み込まれるを含む、pJMlの配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をDNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、そしてXhoIで切断されクレノウで処理されたpJMlと連結せしめる。生じたプラスミドpJM2図29は、内部のXhoI部位を失っているが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として3′XhoIを保持している。pJM2は完全なヒトJ領域、重鎖J-μイントロンエンハンサー、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連欠失に関与する2つの04kbの直接反復σμおよびΣμを含有する。3.D領域クローンの単離およびpOH1の作製次のヒトD領域特異的オリゴヌクレオテドオリゴ-45′-tggtattactatggttcggggagttattataaccacagtgtc-3′を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをD領域クローンについてスクリーニングした。ファージクローンλ41とλ43を単離した。D要素DK1.DN1およびDM2Y.Ichiharaら、EMBOJ.74141を含む55kbのXhoI断片をファージクローンλ41から単離した。D要素DLR1,DXP1,DXP1およびDA1を含む上流の隣接52kbXhoI断片をファージクローンλ43から単離した。それらのD領域XhoI断片の各々をプラスミドベクターρSP72Promega,Madison、WIのSalI部位中にクローニングし、2配列を結合するXhoI部位を破壊した。次いで上流断片をXhoIとSmaIで切り出し、下流断片をEcoRVとXhoIで切り出した。得られた単離断片をSalIで消化されたpSP2と一緒に連結せしめ、プラスミドpOH1を与えた。pOH1は、少なくとも7つのDセグメントを含みXhoI5′およびEcoRV3′で切り出すことができる106kbの挿入断片を含有する。4pCOR1プラスミドpJM2をAsp718KpnIのアイソシゾマーで消化し、そしてDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて突出末端をフィルインした。次いで生じたDNAをClaIで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をpOH1のXhoI/EcoRV挿入断片およびXhoI/ClaI消化pGPeと連結せしめ、pCOR1を作製した図30。5.pVH2512つのヒト重鎖可変領域セグメントVH251とVH105Humphriseら、Hature3314461988を含む103kbのゲノムHindIII断片をpSP72中にサブクローニングし、プラスミドpVH251を与えた。6pIGM1プラスミドpCOR1をXhoIで部分消化し、そしてpVH251の単離XhoI/SalI挿入断片を上流のXhoI部位にクローニングし、プラスミドpIGM1図31を作製した。pIGM1は、下記の配列要素の全邪がNotIでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離することができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトすることができるように、2つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのヒトDセグメント、6つのヒトJHセグメント全部、ヒトμエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部およびヒトΣμ要素を、ラット重鎖3′エンハンサーと共に含有する。C.IgMとIgGを発現する小遺伝子座トランスジーンpHClの作製1γ定常領域クローンの単離次のヒトIgG定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドオリゴ-295′-cagcaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggac-3′を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ294とλ295を単離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ294の4kbHindIII断片を使って、ファージベクターラムダFIXTMIII中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーを探査した。ファージクローンλSgl13を里離した。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、鋳型として上記3つのファージクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチドオリゴ-675′-tgagcccagacactggac-3′を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。ファージクローンλ295とλSγ113は両方ともγ1サブクラスであると決定された。2oγelγ1コード領域を含むファージクローンλ295の78kbHindIII断片をpUC18中にクローニングした。生じたプラスミドpLT1をXhoIで消化し、クレノウ断片で処理し、そして再連結せしめて内邪XhoI部位を破壊した。生じたクローンpLTlxkをHindIIIで消化し、挿入断片を単離し、pSP72中にクローニングしてプラスミドクローンpLTlxksを作製した。ポリリンカーXhoI部位とヒト配列由来のBamHI部位のところでのpLTlxksの消化は、γ1定常領域コードエクソンを含む76kb断片を与えた。この76kbXhoI/BamHI断片を、ファージクローンλ295からの隣接の下流45kbBamHI断片と一緒に、XhoI/BamHIで消化されたpGPe中にクローニングし、プラスミドpγe1を作製した。pγe1は、ラット重鎖3′エンハンサーに連結された、5kbの下流配列と共にγ1定常領域コードエクソンの全部を含有する。3pγe2γ1スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物P.Siderasら、InternationalImmunol1631の第一エクソンとを含む53kbのHindIII断片をファージクローンλSγ113から単離し、そして挿入断片の5′末端の近隣にポリリンカーXhoI部位を有するpSP71中にクローニングし、プラスミドクローンpSγlsを作製した。pSγlsのXhoI/SalI挿入断片をXhoIで消化されたpγe1中にクローニングし、プラスミドクローンpγe2を作製した図32。pγe2は、ラット重鎖3′エンハンサーに連結された、下流の5kb配列と共に、γ1定常領域コードエクソン全部並びに上流のスイッチ領域および緊殖不能転写物エクソンを含有する。4pHC1プラスミドpIGM1をXhoIで消化し、43kb挿入断片を単離し、そしてXhoIで消化されたpγe2中にクローニングし、プラスミドpHC1を作製した図31。pHC1は、下記の配列要素の全部がNotIでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製することができるように、ラット重鎖3′エンハンサーと共に、2つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのヒトDセグメント、6つのヒトJHセグメント全部、ヒトJ-μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ1定常領域関連のスイッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含むを含有する。D.IgMとIgGを発現する小遺伝子鎖トランスジーンpHC2の作製1.ヒト重鎖V領域遺伝子VH498の単離ヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーラムダFIXTMIIを、次のヒトVH1ファミリー特異的オリゴヌクレオチド:オリゴ-495gttaaagaggattttattcacccctgtgtcctctccacaggtgtc-3を用いてスクリーニングした。ファージクローンλ498を単離し、そして可変セグメントVH498を含む61kbXbaI断片をpNNO3中にサブクローニングしポリリンカーClaI部位がVH498の下流にそしてポリリンカーXhoI部位が上流にくるように、プラスミドpVH498を作製した。この挿入断片の800bp領域を配列決定すると、VH498は転写解読枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することがわかり、よって該遺伝子が機能的であることを指摘する表2。ヒトVHIファミリー遺伝子VH498の配列2.pV2プラスミドpUCl2中にサブクローニングされたヒトVHIVファミリー遺伝子VH421I.Sanzら、EMBOJ.83741を含む4kbXbaIゲノム断片をSmaIとHindIIIで切り出し、ポリメラーゼIのクレノウ断片で処理した。平滑末端化された断片を、ClaIで消化されクレノウで処理されたpVH498中にクローニングした。生じたプラスミドpV2は、挿入断片の3′末端のユニークSalI部位および5′末端のユニークXhoI部位を使って、同じ方同でVH421の上流に連結された、ヒト重鎖遺伝子VH498を含む。3.pSγ15近隣の上流31kbXbaI断片と一緒に07kbXbaI/HindIII断片プラスミドpγe2中の53kbγ1スイッチ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を表すをファージクローンλSg113から単離し、そしてHindIII/XbaIで消化されたpUCl8ベクター中にクローニングした。生じたプラスミドpSγ15は、γ1イソタイプにスイッチする前のB細胞中に見つかる繁殖不能転写物PSiderasら、InternationalImmunol,1631の開始部位の上流の配列を表す38kb挿入断片を含む。該転写物はイソタイブスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを促進するためにそれらの配列がトランスジーン構成物中に含まれる。4.pVGElpSγ15挿入断片をSmaIとHindIIIで切り出し、クレノウ酵素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリンカー5′-ccggtcgaccgg-3′と連結せしめた。この連結生成物をSalIで消化し、SalIで消化されたpV2に連結せしめた。生じたブラスミドpVPは、2つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントVH498とVH421表2化4及び化5参照の下流に連結された38kbのγ1スイッチ5′隣接配列を含む。SalIでの部分消化およびXhoIでの完全消化の後、アガロースゲル上での15kb断片の精製により、pVP挿入断片を単離する。次いで該挿入断片をpγe2のXhoI部位中にクローニングし、プラスミドクローンpVGE1図33を作製する。pVGE1は、ヒトγ1定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に2つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領域との間のユニークSalI部位を用いて、D,Jおよびμ遺伝子セグメントをクローニングすることができる。γ1遺伝子の3′末端にラット重鎖3′エンハンザーが連結され、そして挿入断片全体はNotI部位により隣接される。5.pHC2プラスミドクローンpVGE1をSalIで消化し、pIGM1のXhoI挿入断片をその中にクローニングした。生じたクローンpHC2図31は、4つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも8つのDセグメント、6つのヒトJHセグメント全部、ヒトJ-μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ1定常領域繁殖不能転写物開始部位の上流の4kb隣接配列と共に、関連のスイッチ領域と繁殖不能転写物関連エクソンを含むを含有する。それらのヒト配列は、前記配列要素全部をNotIでの消化によりベクター配列を含まない単一鎖上に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を生せしめることができるように、ラット重鎖3′エンハンサーに連結される。該挿入断片の5′末端のユニークXhoI部位を使って、追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎖小遺伝子座の組換え多様性を更に増大させることができる。E.トランスジェニックマウスプラスミドpIGM1およびpHC1のNotI挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精したC57BL6×CBAF2マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生存している胚を、Hoganらにより記載された通りにB.Hogan,F.CostantiniおよびE.Lacy,MethodsofManipulatingtheMouseEmbryo,1986,ColdSpringHarborLaboratory.NewYork偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部DNAのサザンプロット分析によりトランスジーン配列の存在について分折した。既知量のクローン化DNΛを含有する対照標準物に比較したバンド強度により、トランスジーンコピー数を評価した。3~8週齢において、それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよびLaneE.HarlowおよびD.LaneAntibodiesALaboratoryManual,1988,ColdSpringHarborLaboratoryNewYorkにより記載されたように、トランスジーンによりコードされるヒトIgMおよびIgG1の存在についてELISAによりアッセイした。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトIgMに特異的なマウスモノクローナル抗体クローンAF6,0285,AMAC,Inc.WestbrookMEおよびヒトIgGに特異的なマウスモノクローナル抗体クローンJL512,0280,AMAC,IncWestbrookMEによりコーティングした。該ウエル中に血清試料を連続的に希釈し、予備吸着させることによってマスウ免疫グロブリンとの交差反応性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg多価を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。表1と図34は、プラスミドpHC1のトランスジーン挿入断片を注入した胚から発育した2匹の動物の血清中のヒトIgMおよびIgG1の存在についてのELISAアッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トランスジェニックマウスは全て、ヒトIgMおよびIgGの発現について陰性であった。pIGN1NotI挿入断片を含有する2系統のマウス系統6と15はヒトIgMを発現するがヒトIgG1を発現しない。我々はpHC1挿入断片を含む6つの系のマウスを試験した。その結果、4系統系26,38,57および122がヒトIgMとヒトIgG1の両方を発現し、2系統のマウス系統19および21は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1トランスジェニックマウスは、マイクロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該トランスジーンの存在についてモザイクであり得る、いわゆるG0マウスであった。サザンブロット分析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジーンの1つまたは少数のコピーを含むことを示した。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgM、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgMとIgG1の検出は、トランスジーン配列がVDJ連結、転写およびイソタイプスイッチを指令することにおいて正しく機能しているという証拠を提供する。1匹の動物は、サザンブロット分折によりトランスジーンについて陰性であり、検出可能レベルのヒトIgMまたはIgG1を全く示さなかった。2番目の動物は、サザンブロッティングによりアッセイすると該トランスジーンの約5コピーを含んでおり、そして検出可能レベルのヒトIgMとIgG1の両方を示した。トランスジーンを注入した胚から発育した11匹の動物についてのELISAアッセイの結果を下表表1に要約する。表1は、組み込まれたトランスジーンDNAの存在と血清中のトランスジーンによりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。pHC1トランスジーンを含むことがわかった動物のうちの2匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロブリノを発現しなかった。それらは共に低コピー動物であり、該トランスジーンの完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝的モザイクを有している動物21について評価された細胞あたり<1コピーにより指摘されることがあり、そしてトランスジーン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。あるいは、トランスジーンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合がある。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgMの検出、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgMとIgG1の検出は、トランスジーン配列がVDJ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正しく機能することを指摘する。F.cDNAクローンVDJ連結およびクラススイッチ、並びにB細胞発達および対立遺伝子排除におけるトランスジーンがコードするヒトB細胞レセプターの関与に関するpHC1トランスジーンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓mRNAから誘導した免疫グロブリンcDNAクローンの構造を調べた。DおよびJセグメント用法、N領域の付加、CDR3の長さ分布、並びに機能的mRNA分子をもたらす接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジーンによりコードされる重鎖の総合的多様性を調べた。VH105とVH251を組み込んだIgMおよびIgGをコードする転写物を調べた。第11週の雄第二世代57系列pHC1トランスジェニックマウスからポリアデニル化RNAを単離した。このRNAを使ってオリゴdT開始-本鎖cDNAを合成した。次いで得られたcDNAを、次の4つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使った4つの各PCR増幅反応のための鋳型として使用した:VH251特異的オリゴ-149ctagctcgagtccaaggagtctgtgccgaggtgcagctggatc;VH105特異的オリゴ-150gttgctcgagtgaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggatc;ヒトγ1特異的オリゴ-151ggcgctcgagttccacgacaccgtcaccggttc;およびヒトμ特異的オリゴ-152cctgctcgaggcagccaacggccacgctgctcg。反応1はプライマーo149とo151を使ってVH251-γ1転写物を増幅せしめ、反応2はプライマーo149とo152を使ってVH251-μ転写物を増幅せしめ、反応3はプライマーo150とo151を使ってVH105-γ1転写物を増幅せしめ、そして反応3はプライマーo150とo152を使って、VH105-μ転写物を増幅せしめた。得られた05kbのPCR産物をアガロースゲルから単離した。対応するELISAデータ図40と一致しで、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。PCR産物をXhoIで消化し、プラスミドpNN03中にクローニングした。4つのPCR増幅の各々からの9個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドDNAを単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの2つがDまたはJセグメントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正常のRNAスプライシング生成物からは誘導することができなかったので、おそらくPCR増幅中に導入された欠失から生じたのであろう。該DNA試料のうちの1つは、2つの個々のクローンの混合物であることがわかり、そして他の3つのクローンは読み取り可能なDNA配列を生成しなかったおそらくDNA試料か十分に純粋でなかったためであろう。残りの30個のクローンからのVDJ接合部のDNA配列を化6及び化7にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でないこと、またはトランスジーン発現性B細胞の単一クローンが優性でないことを示す。どの2配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性が2個のVセグメント、10個のDセグメントおよび6個のJセグメントのみを含む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。該トランスジーン中に含まれるVセグメントの両方、6個のJセグメントの全部および10個のDセグメントの7個がVDJ接合部に使われる。加えて、両定常領域遺伝子μとγ1が転写物中に含まれる。VH105プライマーは実施した反応においてVH105に特異的であることがわかった。従って、反応3および4からのクローンの多くがVH251転写物を含んでいた。更に、連結反応3のPCR産物から単離されたクローンはIgGよりもむしろIgMをコードすることがわかった;しかしながら、これは、DNAを同一ゲル上で単離したため、反応4からのPCR産物による汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球PBLから免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてVDJ接合部のDNA配列を決定した同様な実験が、細菌Yamadaらにより報告されたJ.Exp.Med1733954071991;これは参考として本明細書中に組み込まれる。このヒトPBLからのデータをpHC1トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較した。G.Jセグメント選択表2は、成人PBL免疫グロブリン転写物中に見つかるJセグメントに対して、pHC1トランスジーンによりコードされる転写物中に取り込まれるJセグメントの分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系ともJ4セグメントが優性セグメントであり、次いでJ6セグメントが優性である。J2はヒトPBL中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメントである。H.Dセグメント選択Yamadaらにより分析されたクローンの4982のうち40が、pHClトランスジーン中に含まれるDセグメントを含んでいた。他の11クローンは、該著者らにより既知Dセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含んだ。それらの指定されなかった11個のクローンのうちの2つは、pHCl構成物中に含まれるDlR2セグメントの逆位から誘導されるようだ。lchiharaらEMBOJ.74141により予想されそしてSanzJlmmunol.14717201729により観察されたこの機構を、YamadaらJ.Exp.Med171395407は考慮に入れなかった。表2は、pHClトランスジェニックマウスについてのDセグメント分布とYamadaらによりヒトPBL転写物について観察されたものとの比較である。Yamadaらのデータを、DlR2使用を包含しそしてpHClトランスジーン中にないDセグメントを除外するように再編集した。表3は、Dセグメント組み込みの分布がトランスジェニックマウスとヒトPBLとにおいて非常に類似していることを証明する。2つの優性なヒトDてグメントOXP’1とDNlは、トランスジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。2つの分布間の最も大きな相違点は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのDHQ52の高頻度である。DHQ52の高頻度はヒト胎児肝臓中のDセグメント分布を思い出させる。Sanzは重鎖転写物の14がDHQ52配列を含んだことを報告している。pHCl中に見つからないDセグメントを分析から除外すれば、Sanzにより分析された胎児転写物の31がDHQ52を含んでいる。これは、不発明者らがpHClトランスジェニックマウス中に観察した27と同等である。I.VDJ接合部の機能性表4は、pHClトランスジェニック動物から分析された30個のクローンからのVDJ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、30個の、VDJ接合部のうちの23個77が可変セグメントとJセグメントに関して枠内inframeであることを示す。VDJ接合部の機能性J.C0R3の長さ分布表4は、pHClトランスジェニックマウス中の枠内VDJ接合部を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さをヒトPBL中のそれと比較したものである。ヒトPBLデータは同じくYamadaらから得られたものである。両分布は類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒトPBLから観察されたものよりもわずかに小さいCOR3ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウスにおけるCOR3の平均長さは103アミノ酸である。これはSanzJ.Immunol.14717201729によりヒトCDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同じである。[実施例13]再配列された重鎖トランスジーンA.再配列されたヒト重鎖VDJセグメントの単離ファージベクターλEMBL3SP6T7C1onetechLaboralories,Inc,PaloAlto,CA中にクローニングされた2種のヒト白血球ゲノムDNAライブラリーを、ヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーを含むλl3のlkbPacI/HindIII断片を用いてスクリーニングする。陽性クローンを、次のVH特異的オリゴヌクレオチド:オリゴ-75′-tcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcacc-3′オリゴ-85′-tccctgagactctcctgtgcatctggattcaccttcagt-3の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する。VプローブとJ-μプロ-ブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そして再配列されたVDJセグメントのDNA配列を決定する。B.再配列されたヒト重鎖トランスジーンの作製機能的VJセグメントを含む断片転写解読枠およびスプライスシグナルを、プラスミト ゙由来のXhoI部位が挿入断片配列の5′末端に隣接するように、プラスミドベクタ-pSP72中にサブクローニングする。機能的VDJセグメントを含むサブクローンをXholとPacIPacIはJ-μイントロンエンハンサ-近くの部位を認識する稀少な切断酵素であるで消化し、そして挿入断片をXhoI/PacIで消化されたpHC2中にクローニングし、機能的、VDJセグメント、J-μイントロンエンハンサー、μスイッテ要索、μ定常領域コードエクソンおよひγ1定常領域これは緊殖不能転写物関連配列、γ1スイッチおよびコードエクソンを含むを有するトランスジーン構成物を作製する。上述したように、このトランスジーン構成物をNotIで切り出し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。[実施例14]軽鎖トランスジーンA.プラスミドベクターの作製1.プラスミドベクターpGPlcプラスミドベクターpGPlaをNol消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリゴ-815′-ggcctcatcccggagctcgaggacgacaagctttcgaggatccgc-3オリコ ゙-825′ggccgctcctgaaagttgtcgacccgagacccgggatgc-3をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1cは、Nol部位により隣接されたXmaIXholSalIHindIIIおよびBamHI制眼部位を有するポリリンンカ-を含む。2.プラスミドベクタ-pGP1dプラスミドベクタ-pGP1aNotI消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリコ ゙-875′-ggccgctgtcgacaagttatcgatggatcctcgagtgc-3′オリコ ゙-885′-ggcgcactcgaggatccatcgataagcttgtcgacagc-3′をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1dは、NotI部位により隣接されたSa1I,HindlllClaIBamIIIよびXhoI制限部位を有するポリリンンカーを含む。B.JκおよびCκクローンの単離ファージベクターλEMBL3SP6T7C1onetechLaboratories,Inc,PaloAlto,CA中にクロ-ニングされたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーを、ヒトκ軽鎖J領域特異的オリゴヌクレオチド:オリコ ゙365caccttcggccaagggacacgactggagattaaacgtaagca-3′を用いてスクリ-ニングし、そしてファージクローン1362と1365を単離する。1362からJκ1セグメントを含む74kbXhol断片を単離し、プラスミドpNNO3中にサブクロ-ニングしてプラスミドクローンp362を作製する。Cκ遺伝子セグメントと共にJκセグメント2~5を含む近隣の13kbXhoI断片をファージクローン1365から単離し、そしてプラスミドpNNO3中にサブクロ-ニングしてプラスミドクロ-ンp365を作製する。それら2つのクローンを一緒にすると、Jκ1の72kb上流で始まりCκの9kb下流で終わる領域に及ぶ。C.再配列された軽鎖トランスジーンの作製1.再配列された可変セグメントを発現さぜるためのCκベクタ-pCK1Cκ遺伝子を含むプラスミドクロ-ンp365の13kbXhoI断片を、9kbの下流配列と一緒に、該挿入断片の5′末端がプラスミドXhoI部位に隣接した状態で、プラスミドベクタ-pGP1cのSalI部位中にクロ-ニングする。生じたクローンpCK1は、再配列された、VJκセグメントを含むクロ-ン化断片をユニーク5′XhoI部位に収容することができる。次いで該トランスジーンをNotIで切り出し、ゲル電気泳勤によってべクター配列から精製する。得られたトランスジ-ン構成物は、ヒトJ-Cκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト3′κエンハンサーを含むことができる。2.再配列された可変セグメントを発現させるための重鎖エンハンサー含有CκベクターpCK2マウス重鎖J-μイントロンエンハンサーJ.Banerjiら、Cell33729740を含むマウスゲノムDNAの09kbXbal断片をpUCl8中にサブクローニングし、プラスミドpJH22lを作製した。このプラスミドをSphtにより線状化し、クレノウ酵素を用いて末端をフィルインした。クレノウ処理されたDNAを次いでトHindlllで消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサーHaydayら、Nature307334340を含むファージクローンλ13前の実施例のuIクレノウ/Hind1ll断片をそれと連結した。生じたプラスミドpMHEl、両者が単一のBamHI/Hindlll断片上に切除されるように、pUC18中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエンハンサーから成る。この23kb断片を単離し、pGPlc中にクロ-ニングしてpMHE2を作製する。pMHE2をSallで消化し、p365の13kbXhoI挿入断片をその中にクロ-ニングする。生じたプラスミドpCK2は、マウスとヒトの重鎖J-μイントロンエンハンサーがトランスジーン挿入断片の3′末端に融合していること以外は、pCKlと同一である。最終トランスジーンの発現を調節するために異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの3′κまたは重鎖エンハンサーMeyerおよびNeubrrgerEMBDJ.819591964;Pettersonら、Nature344165168を使って類似構成物を作製することができる。3.再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離ファージベクターλEMBL3SP6T7ClonetechLaboratories.Inc.PaloAlto,CA中にクロ-ニングされた2つのヒト白血球ゲノムDNAライブラリーを、p365の35kbXhoI/SmaI断片を含むヒトκ軽鎮J領域を用いてスクリーニングした。陽性クローンを、次のVκ特異的オリゴヌクレオチドオリゴ-655′-aggttcagtggcagtggcagtgggtctgggacagacttcctcaccatcagc-3′とのハイブリダイゼーションについて試験した。VプロープとJブローブの両方とハィブリダイズしたクローンを単離し、そして再配列されたVJκセグメントのDNA配列を決定する。4.再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製機能的VJセグメントを含む断片転写解読枠およびスプライススグナルをベクタ-pCK1およびpCK2のXhoI部位中にサブクロ-ニングし、再配列されたκ軽鎖トランスジーンを作製する。Notlでの消化により該トランスジーン構成物をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断片をマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製する。ヒトκ鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を含有するトランスジェニック動物実施例14と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。VJκ組合せの全部か、広域スペクトルの種々の重鎖VDJ組合せと安定な重鎖ー軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたVJκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジーン構成物を作製し、そして重鎖小遺伝子座トランスジーンを発現するマウスと交配させる。ニ重トランスジェニック重鎖構成物と軽鎖構成物の両方動物から、末梢血、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに特異的な蛍光抗体中にクロ-ニングされたヒト胎盤ゲノムDNAを探査する。生じたタローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断するための基準は、転写解読格、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列を含むことである。選択された可変遺伝子セグメントを含むDNA断片をプラスミドpJCKlのユニークXhol部位にクロ-ニングし、小遺伝子座構成物を作製する得られたクローンをNotIで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジーンは、B細胞発達の際にV-J結合を受けるであろう。ヒトκ鎮を発現丁る動物を、重鎮小遣伝子座を含有丁るトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを得る。[実施例15]ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーンこの実施例は、接合子中へのマイクロインジェクンョンまたはES細胞中への組み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジーンのクロ-ニングを記裁する。MarzluffWFら、TranscriptionandTranslationAPractricalApproachBDHammesおよびSJHiggins偏98129頁,IRLPressOxordにより記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核またはPDSで洗浄したヒト精母細胞を05低融点アガロースブロック中に埋め込み、そして核については5OOmMEDTA.1SOS中の1mgmlのプロテイナーゼKにより、精母細泡については5OOmMEDTA,1SOS.10mMDTT中の1mg/mlのプロテイナーゼKにより、50°Cにて18時間溶解せしめる。該ブロックを40μgmlのPMSF/TE中で50°Cにて30分間インキュベートすることにより、プロテイナ-ゼKを不活性化する。次いでM.FinneyによりCurrentProtocolsinMolecularBiologyにより記載されたようにバルスフィールドゲル電気泳勤により分画する。NotI断片に冨む画分をサザンハイブリダイゼーションによりアッセイしの断片によってコードされる1または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎮Dセグメント、Jセグメントおよびγ1定常領域と共に6つのVHファミリー全部の代表物を含むこの断片は、Bermanら,前掲によればHeLa細鉋から670kb断片として同定されているけれども、本発明者らはそれかヒト胎盤および精子DNAからのは330kb断片であることを発見した。このNotI断片を含む画分図4参照を記載の如くMcCormickら、Tehnique26571199Oべクタ-pYACNNのNotI部位中に連結せしめる。プラスミドpYACNNは、pYACneoをEcoRIで消化しそしてオリコ ゙ヌクレオチド5′AATTGCGGCCGC-3′の存在下で連結せしめることにより、調製される。Traverら、ProcNatlAcadSciUSA8658985902により言己載された通りに、重鎖NotI断片を含むYACベクターを単離する。クローン化されたNotI挿入断片を、MFinney前掲により記截されたようなパルスフィールドゲル電気泳動により高分子量酵母DNAから単離する。lmMスペルミンの添加によりDNAを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。あるいは、DNAをパルスフィールドゲル電気泳動により単離し、そしてリポフェクションGnirkeら、EMBDJ1016291634によりES細胞中に導入するか、またはYACをスフェロプラスト融合によりES細胞甲に導入する。[実施例16]不連続ゲノム重鎖lgトランスジーンVH6、Dセグメント、Jセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を含むヒトゲノムDNAの85kbSpel断片は、不質的には実施例1に記裁した通りのYACクロ-ニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来の断片、例えは多コピーのV1~V5を含む上記の670830kbNotI断片の上流の570kbNotI断片、を含有するYACを上述の如く単離る。Bermanら,前掲は、各々が多数のVセグメントを含有する2つの570kbNotI断片を検出した。jこの2断片を実施例Iに記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。典型的には、2つの異なるDNA断片の同時注入は、染色の体内の同一部位のところへの両断片の組込みをもたらす。従って、該2断片各々の少なくとも1コピーを含む生じたトランスジェニック動物の約50が、定常領域含有断片の上流に挿入されたVセグメント断片を有する。それらの動物のうち、85kbSpeI断片の位置に関する570kbNotI断片の方向性に依存して、約50がDNA逆位によりV-DJ結合を行い、そして約50が欠失によりV-DJ結合を行うだろう。生じたトランスジェニック勤物からDNAを車離し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーソョンにより両方のトランスジーンを含んでいることが示された動物詳しくは、多数のヒトVセグメントとヒト定常領域遺伝子の両方を含む動物標準技術に従って、ヒト免疫グロブリンを発現する能力について試験する。[実施例17]トランスジェニックB細胞中の機能的に再配列された可変領域配列の同定着目の抗原を使って、次の遺伝的特性:JHの欠失実施例10については内因性所有鎮遺伝子座中の同型接合性;再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン実施例5および14の単コピーについては半接合性;および再配列されたヒトκ軽鎖トランスジーン実施例6および14の単一コピーにつては半接合性、を有するマウスを免疫化するHarlowおよびLaneAntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborNewYorkを参照のこと。免役化スケジュールの後、脾臓を取り出し、脾細胞を使ってハイブリドーマを調整する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリド-マクロ-ンからの細胞を使ってゲノムDNAを調整する。ゲノムDNAの試料を、ユニークな6塩基対配列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロ-スゲル上で分固する。サザンブロットハイブリグイゼーションを凹って2~10kb範囲内の2つのDNA断片を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重鎖VDJ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列されたヒト軽鎖VJ配列の単一コピーを含む。それらの2断片をアガロースゲル上でサイズ分画し、pUCl8中に直接クロ-ニングする。クローン化された挿入断片を、定常碩域配列を含む重鎮および軽鎮発現カセット中にそれぞれサブクロ-ニングする。プラスミドクローンpγe1実施例12を重鎖発現カセットとして使用し、再配列されたVDJ配列をXhol部位中にクロ-ニングする。プラスミドクローンpCK1を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたVJ配列をXhoI部位中にクローニングする。生じたクローンを一緒に使ってSP。細胞をトランスフェクトせしめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめるMS.Coら、Proc.NatlAcadSclUSA882869。あるいは、上述のクローン化ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離し、cDNAを合成するのに使う。発現されるヒト重鎖および軽鎖VDJおよび、Vj配列を、次いでPCRにより増幅し、クロ-ニングするJWLarrichらBio1.Technologv7934938。それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そしてCQueenら、ProcNatlAcadSciUSA8454545458により記載されたようにして合成発現ベクターを作製する。複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤皿球上の抗原のような複合抗原により好結果に免役化することができ、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論に類似した速度論で応答することができることを証明する。血液細胞は一般に適当な免役原であり、赤皿球と白皿球の表面上には多数の異なる型の抗原を含んで成る。ヒト血液による免疫化一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座JHDを有し且つヒト重鎖小遺伝子構成物を含有するトランスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系112と命名する。血液を洗浄し、50mlのハンクス溶液中に再懸濁し、1×106細胞/mlに希釈した。次いで23ゲージの針とccの注射器を使って02ml2×107細胞を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを6週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験することにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠牲にする3日前に、ハイブリドーマの生産を増大させるために尾部静脈内への1×103細胞による免疫化を1回行った。動物マウス2343と2348は所望の表現型を有する:重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遣伝子トランスジェニック。ハイブリドーマの作製上述の通り免疫化された約16週齢のトランスジェニックマウス表5のマウス脾細胞を非分泌性HAT感受性ミエローマ細胞系X63Ag8653から成る融合相手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含有するハイブリドーマ上清を、例えばフロ-ザイトメトリーにより、同定した。フローサイトメトリーフロ-サイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者からの赤血球をハンクス溶液中で4回洗浄し、50000個の細胞を11mlのポリプロピレン微小菅中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清または抗血清と共に染色媒質フェノールレッドまたはビオチン、3新生ウシ血清、01ナトリウムアジドを含まない1×RPMI培地中で氷上で30分間ィンキュベートした。対照は他の遺伝子型を有する同腰マウスから成った。次いで細胞をSorvallRT600B中で1000rpmで5~10分間4°Cにて遠心することにより洗浄した。細胞を2回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検出した。2種類のモノクローナル試薬を使って試験した。1つはFITCで標識されたマウス抗ヒトμ重鎖抗体Pharmagen,SanDiego,CAであり、もう1つはPEで標識されたラット抗マワスκ軽鎖抗体BectonDickenson,SanJose,CAであった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血赤血球と白血球および白血球のみを標的細胞として使用した。両方の組が陽性結果を与えた。トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または他の個体がらの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒトIgMFITC標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した。結果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウスマウス2343および2348からの血清がヒトIgM反応性を示し、一方全ての同腹動物23442345.2346,2347からの血清は該反応性を示さなかった。正常マウス血清NSとリン酸塩緩衝化塩溶液PBSを負の対照として使用した。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように濾過された。比較を与えるためにx軸とy軸上に線が引かれている。融合体2348からの100の上清に関してフローサイトメトリーを実施した。4つの上清が血球細胞抗原に対する陽性反応性を示した。[実施例18]アンチセンスRNAによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少A.アンチセンスIg配列の発現用のベクター1.クローニングベクターpGPlhの作製ベクターpGP1b前の実施例に記載をXhoIとBamHIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド5′gatcctcgagaccaggtaccagatcttgtgaattcg-3′5tcgacgaattcacaagatctggtacctggtctcgag3′と連結せしめてプラスミドpGPlhを作製した。このプラスミドは、次の制限部位:NotI,EcoRl,Bglll,Asp718,BamHI,Hindlll,NotIを含むポリリンカーを含有する。2.pBCElの作製プロモーター-リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトVH-Vファミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、pVH251前の実施例に記載の08kbXbaI/Bgl11断片を、XbaI/Bglllで消化したベクターpXN03中に挿入してプラスミドpVH251Nを作製した。ヒト成長ホルモン遺伝子hGH;SeeburgDNAl239249のコードエクソンを含む22kbBamHI/EcoRIDNA断片を、BamHI/EcoRIで消化したpGH1h中にクローニングした。生じたプラスミドをBamHIで消化し、そしてpVH251NのBammHI/EcoRI断片をhGH遣伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドpVhghを作製した。マウス重鎖J-μイントロンエンハンサーBanerjiら1983Cell33729740を含むマウスゲノムDNAのO9kbXbaI断片をpUC18中にサブクローニングしてプラスミドpJH221を作製した。このプラスミドをSphIで直鎖状にし、末端をクレノウ酵素でフィルインした。次いでクレノウ処理したDNAをHindlllで消化し、そしてヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーHaydayら1984Nature307334340を含むファージクローンλ13上記実施例の14kbMluIクレノウ/HIindlll断片をそれと運結せしめた。得られたプラスミドpMHE1は、単一のBamHI/Hindlll断片において切り出すことができるようにpUCl8中に一緒に連結されたマウスおよひヒトの重鎖-μイントロンエンハンザーから成る。pMHE1のBamHI/Hindlll断片をBamHI/Hindlllで切断されたpVhgh中にクローニングし、B細胞発現ベクタ-pBCE1を作製した。このベクター図42に描写はユニークXhoIおよびAsp718クローニング部位を含有し、その中にアンテセンスDNA断片をクロ-ニングすることができる。それらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎖プロモーター-エンハンサー組み合わせにより指令され、下流のhGH遺伝子配列はイントロン配列に加えてトランスジーン構成物の発現を促進するポリアデニル化配列を提洪する。pBCE1から作製されたアンチセンストランスジーン構成物はNotIでの消化によりベクター配列から分離することができる。B.IgMアンチセンストランスジーン構成物下記オリゴヌクレオチド:5′cgcggtaccgagagtcagtccttcccaaatgtc3′5′cgcctcgagacagctggaatgggcacatgcaga3′を、基質としてマウス胛朦cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応PCRによるマウスIgM定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られたO3kbのPCR産物をAsp718とXhoIで消化し、そしてAsp718/XhoIで消化したpBCE1中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pMAS1を作製した。pMAS1の精製済NotI挿入断片を、単独でまたは1もしくは復数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgMのmRNAとハイブリダイズするB細胞中のRNA転写物を発現し、よってマウスIgMタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。pMAS1とpHCC1のようなヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座とを含有する二重トランスジェニックマウス両構成物の同時注入によるかまたは一重トランスジェニックマウスの交配により作製されるは、ヒト重鎖小遺伝子座のみについてトランスジェニックであるマウスよりも高い比率のB細胞上に、ヒトトランスジーンによってコードされるIgレセプターを発現するだろう。ヒト対マウスIgレセプター発現細胞の比は、一部はB細胞の分化と発展を促進する因子および細胞に対する2集団間の競争のためである。IgレセプターはB細胞発達において重要な役割を果たすので、表面上に減少したレベルのIgMを発現するマウスIg特異的アンチセンスダウンレギュレーションのためマウスIgレセプター発現B細胞も、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだろう。C.Igκアンチセンストランスジーン構成物次の2つのオリゴヌクレオテド:5′cgcggtaccgctgatgctgcaccaactgtatcc3′5′cgcctcgagctaacactcattcctgttgaagct3′を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応PCRによるマウスIgκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた03kbのPCR産物をAsp718とXhoIで消化し、そしてAsp718/XhoIで消化したpBCE1中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pKAS1を作製した。pMAS1の精製済NotI挿入断片を、単独でまたは1もしくは複数の別のトランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgκmRNAとハイブリダイズするB細胞中のRNA転写物を発現し、よってpMAS1について上述したのと同様にマウスIgκタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。実施例19この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と免疫応答を証明する。マウスの免疫化1分子あたり400以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシアニンCalbiochemLajottaCaliforniaを以前発表された方法を使って抗体の反応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘモシアニンCalbiochem、ハブデンおよび/または修飾アミノ基に対する反応性の同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定にはKLHDNPを使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免疫グロブリンとの交差反応性を全く持たないIgMおよびIgGサブクラスに特異的な酵素接合本により険出した。簡単に言えば、PBS中5μgmlのタンパク質を37°Cにて一晩乾燥することによりマイクロタイタープレートを抗原コーティングした。PBS、5ニワトリ血清、O5Tween20中に希釈した血清試料をウエル中で室温にて1時間インキュベートし、次いで同希釈剤中の抗ヒトIgGFcおよびIgGF-西洋ワサヒペルオキシダーゼまたは抗ヒトIgMFc-西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベートした。室温で1時間後、ABTS基質Sigma,St.Louis,Missouriの添加により酵素活性を評価し、30分後に415490nmで読み取った。トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎖の関与図43は、KLHDNPによる免疫化に対する3匹の同腹子マウスの応答を表す。第1296号のマウスは再配列されていないヒトIgMおよびIgGトランスジーンを有し、マウスIg重鎖破壊について同型接合性であった。第1299号のマウスは無破壊の背景上にトランスジーンを有し、1301号のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも遺伝しなかった。別の同腹子である第1297号のマウスはヒトトランスジーンを有し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化対照として実験に組み入れた。結果は、ヒトIgGとIgM応答は両方ともタンパク質への接合という状況においてハプテンに対して発生したことを証明する。ヒトIgMはKLHに対しても発生したが、この時点では有意なレベルのヒトIgGは存在しなかった。同じマウスからの免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった。[実施例20]この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好結果の免疫化および免疫応答を証明し、そしてヒトトランスジーンの可変領域配列中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含んで成る抗体応答の証明この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的内因性マウス重鎖生産の欠失をもたらすJ領域のところへのトランスジーンの導入前掲により作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座について同型接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも1つの完全な再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーンHC1、前掲も含み、該トランスジーンは単一の機能的VH遺伝子VH251、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトr1定常領域遣伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランスジーン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス前掲をヒト抗原による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対して免疫応答を生じる能力を有することを証明した。HC126系統のマウス3匹とHC157系統のマウス3匹前掲にヒト抗原を注射した。ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原CEA100μgを不児全フロイントアジュバント中で0日目に注射し、次いで更に7.14.21および28日目に不完全フロイントアジュバント中のミョンバン沈澱CEAを毎週注射した。CEAの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グループ中の3匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。マイクロタイタープレート上に固定化したヒトCEAに結合したヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをELISAアッセイにより測定した。ヒトμ鎖含有免段グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについてのELISAアッセイの結果をそれぞれ図44および45に示す。7日目までは両系統について有意なヒトμ鎖Ig抗体価が検出され、約21日目まで上昇が観察された。ヒトγ鎖Igについては、有意な抗体価は遅れ、前者がHC157系統で14日目そして後者はHC126系統で21日目に明らかになった。ヒトγ鎖Igの抗体価は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ig応答は、平坦域に達した後、遅れて発生する上昇し続げるγ鎖応答と組み合わせると、親和性の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的である。21日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモシアニンに対する反応性の欠失を示した。これは、抗体応答が特異的な形でCEAに対して向けられたことを指摘する。それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックである動物が、1ヒト抗原例えばヒト糖タンパク質、CEAに対して応答でき、2観察されたμからγへのクラススイッチにより例示されるようなイソタイプスイッチクラススイッチを受けることができ、そして3それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すことを示す。一般に、それらのデータは、1ヒトIgトランスジェニックマウスが異種抗体を誘導する能力を有すること、2単一のトランスジーン重鎖可変領域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、3一次方よび二次応答形成に典型的は時期に渡る応答速度論、4IgMからIgGへの、トランスジーンによってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および5トランスジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有することを指摘する。ヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座における体細胞変異の証明HC1トランスジーンの多重コピーを含有するHC157系統のトランスジェニックマウスを免役グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、HC1トランスジーンを含み且つ内因性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た前掲。それらのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ1重鎖を発現する前掲。それらのマウスのうちの1匹を、15カ月の期間に渡る反復腹腔内注射により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、脾臓、鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単離した。該細胞を合わせ、全RNAを単離した。該RNAから第一鎖cDNAを合成し、次の2つのオリゴヌクレオチドプライマー1495′ctagtccgagtccaaggagtctgtgccgaggtgcagctg31515′ggcgctcgagttccacgacaccgtcaccggttc3’を用いたPCR増幅のための鋳型として使用した。それらのプライマーはVH25lγ1cDNA配列を特異的に増幅する。増幅された配列をXhoIで消化し、ベクターpNN03中にクローニングした。23個のランダムクローンの挿入断片のDNA配列を図46~51に示す;生殖細胞配列からの配列変異が指摘され、ドットは配列が生殖細胞と同じであることを示す。VH251トランスジーンの生殖細胞配列と該cDNA配列との比較は、クローンのうちの3個が完全に未変異であり、他の23個は体細胞変異を含むことを明らかにした。3個の未変異配列のうちの1つは枠外outofframeVDJ連結に由来する。特定の位置において観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起こるCaiら1992J.ExpMed.1761073;これは参考として不明細書中に組み込まれる。体細胞変異の総体的頻度は約1である;しかしアよがら、CORI同の頻度は約5にまで及び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重細配列の抗原指令型親和性成熟を証明する。[実施例21]この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座トランスジーンを形成する2つの別々のボリヌクレオテドを同時導入することによる、好結果のトランスジーンの形成を証明する。2つの重複DNA断片の同時注入による再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーンの作製1.再配列されていない機能的Vκ遺伝子セグメントvκ653.vκ658およびvk6515の単離Vκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ655’aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagc3を使って、ファージベクターλBMBL3SP6T7中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムDNAライブラリーを探査した。陽性ファージクローンからのVκセグメントを含有するDNA断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。得られたクローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われるクローンを選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む:転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法により単離された4つの異なるるプラスミドクローンからの4つの機能的Vκ遺伝子セグメントのDNA配列を図52~55に示す。4つのプラスミドクローンp653f,p655gl,p658およびp6515fを下記に説明する。p653fファージクローンλ653の3kbXbaI断片を、べクター由来のSalI部位が該挿入断片の3′末端に近位になり且つベクター由来の8amlll部位が該挿入断片の5′末端に近位になるようにpUC19中にサブクローニングした。このクローンの3kbBamHl/SalI挿入断片をpGPlf中にサブクローニングしてp653fを得た。p655glファージクローンλ655の68kbEcoRI断片を、ベクター由来のXhoi部位が該挿入断片の5′末端に近位になり且つベクター由来のSall部位が該挿入断片の3末端に近位になるようにpGPlf中にサブクローニングした。得られたプラスミドをp655glと命名した。p658ファージクローンλ653の65kbHindlll断片をpSP72中にクローニングしてp658を得た。p6515fファージクローンλ6516の10kbEcoRI断片をpUCl8中にサブクローニングしてプラスミドp65153を作製した。該プラスミド挿入断片中のVκ遺伝子セグメントを46kbEcoRI/Hindlll小断片にマッピングし、これをpGPlf中にサブクローニングした。得られたクローンp6515fは、挿入断片の5′および3′末端にそれぞれユニークXhoI部位およびSalI部位が置かれている。2.pkV4p658のXhoI/SalI挿入断片をp6515fのXhoI部位中にクローニングしてプラスミドpKV2を作製した。p655glのXhoI/SalI挿入断片をpKV2のXhoI部位中にクローニングしてpKV3を作製した。pKV3のXhoI/SalI挿入断片をp653fのXhoI部位中にクローニングしてプラスミドpKV4を作製した。このプラスミドは、4つの機能的Vκ遺伝子セグメントを含む単一の21kbXhoI/Sal1挿入断片を含有する。NotIを使って挿入断片全体を切り出すことができる。3.pKCIBpKcorヒトゲノムDNAファージλクローンに由来する2つのXhoI断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である13kbのJκ2-jκ5/Cκ含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてHndlllで消化されクレノウ処理されたプラスミドpGPld中にクローニングした。挿入断片の5′末端がベクター由来のClaI部位に近いプラスミドクローンpK31を選択した。第二のXhoI断片である、jκlを含有する74kbのDNA断片を、3′挿入断片XhoI部位がベクターSalI部位への連結により破壊されるように、XhoI/SalIで消化されたpSP72中にクローニングした。得られたクローンp362sは、Jκlの45kb上流に挿入断片由来のClaI部位、およびJκ1とJκ2の間に天然に存在するXhoI部位の少し下流にポリリンカー由来のClaI部位を含有する。このクローンをClaIで消化して47kb断片を遊離せしめ、該断片を正しい5′-3′方向においで、ClaIで消化されたpK31中にクローニングし、全部で5個のヒトJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、Cκ、45kbの5′隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラスミドpKcorは、挿入断片のそれぞれ5′および3′側にユニークな隣接XhoI部位およびSalI部位を含有する。pKcorBヒト3′κエンハンサーを含有する4kbBamHI断片Judde,JG.およびMaxEE,MolCellBiol.125206;これは参考として本明細書中に組み込まれるを、5′末端がベクターのXhoI部位に近位になるようにpGPlf中にクローニングした。得られたブラスミドp24BfをXhoIで切断し、pKcorの177kbXhoI/SalI断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中にクローニングした。得られたブラスミドpKcorBは、該挿入断片の5′および3′末端にそれぞれユニークKhoIおよびSa1I部位を含有する。pKC1BpKcorBのXhoI/SalI挿入断片をp653fのSalI部位の中にクローニングして軽鎖小遺伝子座トランスジーンプラスミドpKCIBを作製した。このプラスミドは、5個のJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトCκ、およびヒト3′κエンハンサーを含有する。この25kb挿入断片全体をNotI消化により単離することができる。4.Co4プラスミドpKV4とpKClBからの2つのNotI挿入断片を各々25μgmlの濃度でマイクロインジェクション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランスジーン動物は、2断片が一緒に組み込まれたトランスジーン挿入断片Co4と命名、図56に示した組換えの生成物を含有する。pKV4挿入断片の3′の3kbとpKCIB挿入断片の5′の3kbは全く同じである。幾つかの組み込み現象は3kbの共通配列に渡って2断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Co4は遺伝子座はトランスジェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指令するだろう。本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる。それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限するつもりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更が可能である。本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたかのように、参考として本明細書中に組み込まれる。[実施例22]この例は、ヒトIgトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖を含みかつ特異的免疫原と反応性をもつモノクローナル抗体を分泌するマウスのハイブリド-マクローンの産生の成功を実証している。ヒト重鎖トランスジーン産物を取込むモノクローナル抗体の生成1.ヒト重鎖トランスジーンを宿すマウスの免疫化内因性重鎖遺伝子上記実施例20を参照のノックアウトすなわち機能的分断について同型接合でトランスジーンをコードするヒト重鎖を含むマウスを、精製されたヒトCEAで免疫化し、その後適切な免疫応答期間の後に脾細胞を収穫した。従来の技術を用いてKohler及びMilstein,EurJImmunol,6:5115191976,Harlow及びLane、抗体:その研究所マニュアル、ColdSpringHarborNewYork1988参照ハイブリドーマを生成するべく、マウスの脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させた。免疫化のために用いられたマウスは、単一の機能的VH遺伝子VH251、ヒトD及びJセグメント、ヒトμ恒常領域、及びヒトγl恒常領域遺伝子を含むヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンを内含していた。それが由来したトランスジェニック系統はHCl-57上記と呼称された。ミョウバン上で不溶化させた精製ヒトガン胎児性抗原CEACyrstalChem、シカゴ,IL又はScrippsLabs,サンディエゴ,CAを100μg、完全フロイントアジュバントの中で、0日目に注入し、その後さらに7日目、14日目、21日目及び28日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈降したCEAを週に一度注入した。さらに20μgの可溶性CEAを83日目に静脈内で投与し、その後92日目に、不完全フロイントアジュバント中の50μgのミョウバン沈降させたCEAを注入した。骨髄腫細胞と脾細胞の融合に先立って血清試料中に、CEAに対するヒト重鎖応答を確認した。95日目に動物を安楽死させ、脾臓を除去し、ポリエチレングリコールを用いてP3X63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞ATCCCRC1580,AmericnTypeCultureCollection,Rockville,MOと融合させた。2週間後、ELISAによりヒト重鎖μ又はγ恒常領域エピトープを含む、CEAと特異的に反応する抗体の存在について、融合ウエルからの上清をスクリーニングした。簡単に言うと、2.5μg/mlでPVCマイクロタイタープレート上に精製されたヒトCEAをコーティングさせ、これを、PBS、0.5のTween、5のニワトリ血清内で1:4又は1:5に希釈された培養上清と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、その後ひきつづき、ヒトIgGFcに対し特異的なホースラディッシュベルオキシダーゼで接合されたヤギ抗血清又はヒトIgMFc5Muに特異的なウサギ抗血清JacksonImmunoResearch.WestGrove,PAを付加した。さらに洗浄した後、ABTS基質の付加により、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を確認した。独立した2つの融合ウエルがCEAに対する実質的な結合力をもつ抗体を含んでいることがわかった。クローニングの後、ELISAにより、ヒトμ鎖及びマウスκ鎖の存在について、両方のハイブリドーマが陽性であることがわかった。類似の検定を用いて、いかなるマウスIgGもIgMも検出されなかった。2つの独立した親ハイブリドーマのサブクローニングの結果、92-09A-4F7-A5-2及び92-09Aa、-ID7-1-7-1と呼称される2つのクローンが得られた。両方の系統共、ブタぺスト条約に基づきATCC特許培養寄託所に寄託され、それぞれATCC呼称HB11307及びHB11308を受けた。これらの細胞系統からの培養上清に関し、ELISAを用いていくつかの精製された標的タンパク質に対する反応性についてテストすることによって、特異性を評価した。図57に示されているように、さまざまな抗原に対するモノクローナル抗体の反応性を決定するためのELISA検定は、CEA及びCEA関連抗原NCA-2のみが有意の反応性を示すことを立証したが、これは、ヘテロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域について制限された反応性の発達を表わしている。[実施例23]この例は、ヒトIgミニ遺伝子座トランスジーンによりコードされる再配置されたヒトVDJ遺伝子を、キメラヒト/マウスIg鎖をコードするべく例えばトランススイッチメカニズムによって、内因性Ig恒常領域遺伝子を含む写しとして転写させることができるということを立証している。キメラヒト-マウス重鎖をコードするトランス-スイッチ写しの同定内因性重鎖Jセグメント欠失について同型接合の高度免疫されたHCl系統57のトランスジェニックマウスからRNAを分離させた上記。本書に参考として内含されているTayloretalNucleicAcidsRes.20:6287に従ってcDNAを合成し、以下の2つのプライマを用いてPCRにより増幅したo-149ヒトVH251:5′-CTAGCTCGAGTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTG-3′o-249マウスガンマ:5′-GGCGCTCGAGCTGGACAGGGTCCAAGTTCCA-3′オリゴヌクレオチドo-149は、HClでコードされた可変遺伝子セグメントVH251に特異的であり、一方o-249は、次のような特異性順序でマウス及びヒトの両方のガンマ配列に対しハイブリッド形成するマウスγ1=マウスγ2b=マウスγ3>マウスγ2a≫ヒトγ1PCR産物から生成された無作為に選択した10個のクローンからのDNA配列を決定し、これらを図58に示す。2つのクローンが、ヒトVDJ及びマウスγ1を含んでいた:4つのクローンがヒトVDJ及びマウスγ2bを含んでいた。又4つのクローンがヒトVDJとマウスγ3を含んでいた。これらの結果は、トランスジェニックB細胞の一分画の中で、トランスジーンでコードされたヒトVDJが、クラススイッチ又は類似の組換えにより内因性マウス重鎖遺伝子座内に組換わったということを表している。[実施例24]この例は、ヒトIg鎖をコードし発現するクローンから、キメラヒト/マウスIg鎮をコードするクローンを弁別するためのハイブリドーマプールのスクリーニング方法について記述する。例えば、J領域で分断された内因性重鎖遺伝子座について同型接合でありヒトIg重鎖トランスジーンを含むトランスジェニックマウスから作られたハイブリドーマクローンのプールの中で、トランススイッチされたヒトVDj-マウス恒常領域重鎖をコードするハイブリドーマクローンを、ヒトVDJ-ヒト恒常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンから同定し分離することが可能である。キッメラIg鎖を除去するためのハイブリドーマのスクリーニングスクリーニングプロセスには、単独で又は任意には組合わせた形で実施できる次の2つの段階が関与している:1予備的なELISAに基づくスクリーン及び2ハイブリドーマ候補の二次的分子特徴づけ。好ましくは、ヒトVDJ領域及びヒト恒常領域を発現するハイブリドーマ候補の初期同定のためには、予備的なELISAに基づくスクリーンが用いられる。例えば、トランスジェニックマウス内での抗体応答を惹起するのに用いられる免疫原などの抗原との陽性の反応性を示すハイブリドーマを、マウスμ.γ,κ及びλ及びヒトμ.γ及びκと特異的に反応するモノクローナル抗体のパネルを用いてテストした。ヒト重鎖及び軽鎖に対して陽性でありかつマウス鎖について陰性であるハイブリドーマだけが、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマ候補として同定される。かくして、ハイブリドーマ候補は、特定の抗原との反応性を有し、ヒト恒常領域の特徴であるエピトープを有することがわかる。RNAをハイブリドーマ候補から分離し、最初のストランドのcDNAを合成するのに使用する。この最初のストランドのcDNAを次に、1本鎖DNAを連結するRNAリガーゼを用いて、予め定められた配列の唯一の1本鎖オリゴヌクレオチドに連結する。連結されたcDNAを次に、2組のオリゴヌクレオチドプラマーを用いてPCRにより2つの反応において増幅させる。セットH重鎖は、ELISAの結果に応じてヒトμ又はヒトγ1のいずれかへと特異的にアニールするオリゴ、及び、オリゴ-X配列へとアニールするオリゴを含む。こうして、ヒトミニ遺伝子座内へトランス再配置している可能性のあるマウスVセグメントを含め、特別なVセグメントの検出に対抗する偏が防止される。第2の組のプライマ、つまりセットL軽鎖は、ヒトκへと特異的にアニールするオリゴと、オリゴ-Xへと特異的にアニールするオリゴを含む。PCR産物を分子クローニングし、ヒト及びマウスIg配列に対する配列比較に基づいてハイブリドーマが唯一のヒト抗体を産生しているか否かを確かめるため、そのいくつかのDNA配列を決定する。実施例25この例は、ヒト軽鎖κミニ遺伝子座を宿すトランスジェニックマウスの産生を実証する。ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックスマウスKCI上記のようなκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによるヒトゲノミックDNAファージライブラリから分離されたファージクローンからの13kbのXhoIJκ2-Kκを含むフラグメントをクレノウ酵素で処理し、pK-31を産生するべくpGPldのクレノウ処理されたHindlll部位にクローニングさせた。これにより、インサートXhoI部位が破壊され、唯一のポリリカー誘導されたXhoI部位はJκ2の隣り5′末端に位置つげされた。唯一のポリリカー誘導されたClaI部位をこのXhoI部位とインセット配列の間に位置設定し、一方唯一のポリリカー誘導されたSalI部位をインサートの3′末端に位置設定する。jκl及び上流配列を含む7.5kbのXhoIフラグメントも同様に、上述のようにκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによりヒトゲノミックDNAファージライブラリーから分離されたヒトゲノミックDNAファージクローンから分離した。この7.5kbのXhoIフラグメントをpSP72Promega,Madison,MisconsinのSall部位内にクローニングさせ、かくして両方のXhoI部位を破壊し、Jκ1の3′にポリリンカーClaI部位を位置づけた。結果として得られたクローンをClaIで消化させると、上流配列を4.5kbとJκ1を含む4.7kbのフラグメントが放出された。この4.7kbのフラグメントをpK-31のClaI部位内にクローニングさせ、pKcorを作り出した。残りの唯一の5′XhoI部位をポリリンカー配列から誘導する。再配置されていないヒトVκlll遺伝子セグメント65.8プラスミドp65.8、実施例21を含む6.5kbのXhoI/SallDNAフラグメントをpKcorのXhoI部位内にクローニングしてプラスミドpKC1を生成させた。pKC1のNotIインサートを1/2日目のマウス胎児内に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。2つの独立したpKC1誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統KCl-673及びKC1-674は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンのおよそ1及び10~20のコピーの組込みを含むものとして見積られた。KCleマウス及びヒト重鎖J-μイントロンエンハンサーを両方共含む2.3kbのインサートを切除するため、BamH[及びHindlllを用いてプラスミドpMHEl実施13及び18を消化した。このフラグメントをクレノウ処理し、SallリンカーNewEnglandBiolabs,BeverlyMassachusettsに連結させ、pKCIの唯一の3′Sall部位の中にクローニングさせてプラスミドpKC1eを生成した。pKCleのNotlインサートを1/2日目のマウス胎児に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。4つの独立したpKCle誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両方共含むマウスを繁殖させるのに使用した。これらの系統KCle-1399.KCle-1403.KCle-1527及びKCle-1536は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約20~50,5~10,1~5及び3~5のコピーの組込みを含むものであると見積られた。oKC2再配置されていないヒトVκlll遺伝子セグメント65.5プラスミドp65.5gl、実施例21を含む6.8kbのXhol/SalIDNAフラグメントをpKClの唯一の5′XhoI部位内にクローニングしてブラスミドpKC2を生成した。このミニ遺伝子座トランスジーンは、2つの異なる機能的Vκlll遺伝子セグメントを含む。1/2日目のマウス胎児の中にpKC2のNOtIインサートを微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。5つの独立したpKC2誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座の両方を含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統KC2-1573,KC2-1579,KC2-1588,KC2-1608及ひKC2-1610は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約1~5,10~50,1~5,50~100及び5~20のコピーの組込みを含むものと見積られた。実施例26この例は、ヒトκトランスジーンを支持するトランスジェニックマウスが、機能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成する抗原誘発された抗体応答を発生させることができるということを示している。ヒトIgκ軽鎖と結びつけられた抗体応答HCl-57ヒト重鎖及びKCleヒトκトランスジーンを含むトランスジェニックマウスを精製されたヒト可溶性CD4ヒト糖タンパク質抗原で免疫化した。ポリスチレンラテックス粒子Polysciences.Marrington,PAに対する接合コンジュゲーションにより不溶化された精製ヒトCD4NENResearchの製品、Westwood,MAを20μg、0日目にジメチルジオクタデシル臭化アンモニウムCalbiochem,SanDiego,CAを伴う食塩水中で腹腔内注射し、その後20日目及び34日目にさらに注射を行なった。25日目と40日目に眼窩後方出血をとり、ELISAにより、ヒトIgM又はヒトIgG重鎖を含むCD4に対する抗体の存在についてスクリーニングした。簡単に言うと、PVCのマイクロタイタープレート上に2.5μg/mlで精製されたヒトCD4をコーティングし、PBS、0.5Tween-20、5のニワトリ血清中で1:4/1:5に希釈された培養上清と共にインキュベートさせた。プレートを洗浄し、その後、ヒトIgGFcに特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗血清又はヒトIgMFc5Muに特異的なウサギ抗血清JacksonImmunoResearch,WestrGrove,PAを付与したABTS基質の付加によるさらなる洗浄後に、捕獲された抗体に結合された接合体の存在を見極めた。両方の出血において、抗原との反応性をもつヒトμを検出したが、γ反応性は基本的に検出不能であった。40日目に、ヤギ抗ヒトκペルオキシダーゼ接合体Sigma,StLouis,MOでの同じ検定を用いて抗原反応性ヒトκ鎖についても試料をテストした。この時点でCD4を結合するκ反応性が検出された。検定の結果は、図59に示されている。実施例27この例は、機能的に分断されたマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座重鎖及びκ鎖遺伝子座について同型接合であり、しかも、機能的ヒト重鎖及び機能的ヒト軽鎖をコードするべく産生的に再配置することのできるヒト軽鎖トランスジーンとヒト重鎖トランスジーンを並行して宿すマウスの生成の成功を示している。このようなマウスは0011マウスと呼ばれ、ここで最初の2ケタの2つのゼロはこのマウスに機能的な重鎖及び軽鎖遺伝子座が欠如していることを表わし、次の2ケタの1は、このマウスがヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンについて半接合であることを表わしている。この例は、かかる0011マウスに予め定められた抗原に対する特異的抗体応答を発生させる能力があること、又かかる抗体応答にアイソタイプスイッチが関与しうることを示している。0011/0012マウス:内因性IgノックアウトヒトIgトランスジーン上述のHCl-26トランスジェニックマウス系統といったヒトHClトランスジーンも宿し、機能的JH領域が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝子座JHD÷÷又はJHΔ÷÷と呼ばれるについて同型接合であったマウスを、機能的JH領域の欠如した機能的に分断された内因性カッパ鎖遺伝子座ここではJKD÷÷又はJK△÷÷と呼ばれる、図9参照について同型接合のマウスと同系交配させて、JHD÷÷/JKD÷÷と呼ばれるHClトランスジーンを含む機能的に分断された重鎖及びカッパ鎖遺伝子座重鎖/カッパ鎖ノックアウトについて同型接合のマウスを産生した。かかるマウスを、同系交配により産生させ、ゲノミックDNAのサザンブロットにより評価されるとおりの遺伝子型に基づいて選択した。HCl-26÷/JKD÷/JHDマウスと呼ばれるこれらのマウスを、ヒトカッパ鎖トランスジーンを宿すマウスと同系交配させ、機能的に分断された重鎖及び軽鎖遺伝子座について同型接合でしかもHClトランスジーン及びKC2又KCleトランスジーンについで半接合である子孫マウスを同定するのに、ゲノミックDNAのサザンブロット分析を用いた。このようなマウスは番号で呼称され、以下の略号を用いてその遺伝子型に関して同定された:すなわち、HCl-26÷はHCl-26系統のヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン組込みに対する半接合を表わし;JHD÷はJHノックアウトに対する同型接合を表わし;JKD÷÷はJκノックアウトに対する同型接合を表わし;KC2-1610÷は、系統KC2-1610の場合と同じように組込まれたKC2ヒトκトランスジーンについての半接合を麦わし:KCle-1527÷は、系統KCle-1527の場合と同じように組込まれたKCleヒトκトランスジーンについての半接合を表わし;KCle-1399÷は、系統KCle-1399の場合と同じように組込まれたKCleヒトκトランスジーンについての半接合を表わす。結果して得られた個々の子孫には各々数字で表わした呼称例えば6295.6907など。が与えられ、各々JHノックアウト対立遺伝子、Jκノックアウト対立遺伝子、HCl-26トランスジーン及びκトランスジーンKC2又はKCleの存在について評価され、各遺伝子座において半接合÷又は同型接合÷÷のいずれかであることが決定された。表10は、子孫マウスのいくつかの番号呼称、性別及び遺伝子型を示している。我々は、生後6週間の雌マウスから脾臓をとり出した。サザンプロットハイブリダイゼーションにより、マウス7655は、HCl系統26及びKC2系統1610トランスジーン取込みについて半接合であり、マウスμ及びκJ領域のJHΔ及びJκΔターゲティングされ欠失について同型接合であることが見極められた。マウス7656は、サザンプロットハイブリダイゼーションにより、KC2系統1610トランスジーン組込みについて半接合でありマウスμ及びκJ領域のJHΔ及びJκΔターゲッティングされた欠失について同型接合であることが見極められた。マウス7777は、サザンプロットハイブリダイゼーションにより、マウスμ及びκJ領域のJHΔ及びJκΔターゲティングされた欠失について半接合であると見極められた。これらの欠失が劣性であることから、このマウスは表現型上野生型であるはずである。0011マウスにおける内因性Ig鎖の発現1野生型マウス7777、2重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン7656を宿す0001マウス及び3重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン及びヒト重鎖トランスジーン7655を宿す0011マウスから外植されたリンパ球を選別するため、ヒトμ、マウスμ、ヒトκ、マウスκ、又はマウスλのいずれかと反応性ある抗体のパネルを用いたFACS分析を使用した。我々は、Mishell及びShiigiMishell,BB.ShiigiSM.eds細胞免疫学における選択された方法。WHFreemanCo,NewYork,1980により記述されているように、脾臓から単細胞懸濁液を調製し、NH4、Clで赤血球を溶解させた。リンパ球を以下の試薬で染色するヨウ化プロピジウム分子プローブ、Eugene,OR、FITC接合された抗ヒトIgMクローンG20-1271Pharmingenサンディエゴ,CA、FITC接合された抗マウスIgMクローンR6-60.2;Pharmingen,サンディエゴ,CA、フィコエリトリン接合された抗ヒトIgκクローンHP6062;CalTag,サウスサンフランシスコ,CA、FITC接合された抗マウスIgλクローンR26-46;Pharmingen,サンディエゴ,CA、FITC接合された抗マウスB220クローンRA3-6B2;Pharmingen,サンディエゴ,CA、及びCy-クロム接合された抗マウスB220クローンRA3-6B2;Pharmingen,サンディエゴ,CA。我々は、FACScanフロー血球計算器及びLYSISIIソフトウェアBectonDickinson,サンホゼ,CAを用いて染色された細胞を分析した。マクロファ-ジ及び残留赤血球を、前方及び側方散乱をゲ-トオンすることにより排除する。死濁細胞は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲートアウトすることにより排除する。図60及び図61のフローサイトメトリーデータは、サザンブロットハイブリダイゼーションデータを確認し、マウス7655がヒトμ及びヒトκの両方を発現し、あったとしても比較的わずかなマウスμ又はマウスκを発現することを実証している。それでも、B細胞の有意な分画約70~80がヒト重鎖及びマウスλ軽鎖から成るハイブリッドIgレセプターを発現すると思われる。図60は、細胞表面上でヒトμ又はマウスμを発現するB細胞の相対的分布を示す;0011マウス7655リンパ球はヒトμに対し陽性であるが、相対的にマウスμが欠如している;0001マウス7656リンパ球は、多くのヒトμ又はマウスμを発現しない;野生型マウス7777リンパ球はマウスμを発現するが、ヒトμが欠如している。図61は、細胞表面上でヒトκ又はマウスκを発現するB細胞の相対的分布を示す;0011マウス7655リンパ球はヒトκについて陽性であるが、相対的マウスκが欠如している;0001マウス7656リンパ球は多くのヒトκ又はマウスκを発現しない;野生型マウス7777リンパ球はマウスκを発現するが、ヒトκか欠如している。図62は、細胞表面上でマウスλを発現するB細胞の相対的分布を示す;0011マウス7655リンパ球はマウスλについて陽性である;0001マウス7656リンパ球は、有意なマウスλを発現しない;野生型マウス7777リンパ球はマウスλを発現するが、0011マウス7655に比べ相対的に低いレベルにある。図63は、ヒトκトランスジーンでコードされたものに比べての内因性マウスλについて陽性のB細胞の相対的分布を示す。左上の図版は、機能的内因性重鎖及び軽鎖対立遺伝子を有しヒトトランスジーン単複が欠如している野生型マウスからの細胞の結果を示す;細胞はマウスラムダについて陽性である。右上の図版は、κノックアウトバックグラウンドJKD÷÷を有しKCle-1399系統のヒトκトランスジーンの組込みを宿すマウス5822からの細胞を示す細胞は、おおまかに比例する量でヒトκ又はマウスλについて陽性である。左下図版は、κノックアウトバックグラウンドJKD÷÷を有しKC2-1610系統のヒトκトランスジーン組込みを宿すマウス7132からの細胞を示すヒトκに対してよりマウスλに対してより多くの細胞が陽性であり、KC2-1610トランスジーン組込みがKCle-1399トランスジーン組込みほど効率が良くないということを表わしている可能性がある。右下図版は、ヒトκミニ遺伝子座トランスジーンKCo4を宿し機能的内因性マウスκ対立遺伝子か欠如しているマウスからの細胞を示す。図63に示されているデータは同様に、トランスジーン間の表現型の可変性をも実証している。かかる可変性は、組込まれたトランスジーンの結果もたらされる単数又は複数の表現型上の特徴例えばアイソタイプスイッチ、高レベル発現、低マウスIgバックグラウンドを発現する個々のトランスジーン及び/又はトランスジェニック系統について選択するのが望ましいことであるということを表わしている。-般に、1トランスジーン、2トランスジーン組込みの部位、及び/又は3遣伝的背景により異なっている多数の個別のトランスジェニック系統を形成するため、別々に単一又は多数のトランスジーン種例えばpKCle.pKC2,KCo4が利用される。次のような望ましいパラメータについて個々のトランスジェニック系統を検査する:1予め定められた抗原に対する免疫応答を高める能力、2トランスジーンでコードされた恒常領域内のアイソタイプスイッチの頻度及び/又は内因性例えばマウスIg恒常領域遣伝子に対するトランススイッチの頻度、3トランスジーンでコードされた免疫グロブリン鎖及び抗体の発現レベル、4内因性例えばマウス免疫グロブリン、免疫グロブリン配列の発現レベル、及び5産生的VDJ及びVJ再配置の頻度。標準的には、トランスジーンでコードされる例えばヒト免疫グロブリン鎖を最大濃度で産生するトランスジェニック系統が選択される;好ましくは、選択された系統は、トランスジェニック動物の血清中で少なくとも約40μg/mlのトランスジーンコードされた重鎖例えばヒトμ又はヒトγ及び/又は少なくとも約100μg/mlのトランスジーンコードされた軽鎖例えばヒトκを産生する。マウスの免疫化を受けていない血清及び特異的抗原つまりヒトCD4での免疫化の後の血清の中のヒト及びマウス免疫グロブリン鎖の発現について、マウスを検査した。図64はさまざまな遺伝子型の別々の4匹の免疫化を受けていない0011マウスの血清の中に存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒトκ、マウスκ及びマウスλ鎖の相対的発現を示しているnt=テストせず;ヒトκが最も豊富な軽鎖として優勢であり、ヒトμ及びマウスγ推定上はトランススイッチの産物が最も豊富な重鎖であるが、系統間で可変性が存在しており、このことは、ヒト鎖の発現を可能にしながらマウス鎖の発現を最小限にする有利な遺伝子型組合せを同定するための選択段階の有用性を表わしている。マウス6907及び7088は、ヒトμからヒトγへのアイソタイプスイッチトランスジーン内のシススイッチを示している。図65は、さまざまな0011遺伝子型のマウス内のヒトμhuμ、ヒトγhuγ、ヒトκhuκ、マウスμmsμ、マウスγmsγ、マウスκmsκ、及びマウスλmsλについての血清免疫グロブリン鎖レベルを示している。0011マウス内の特異的抗体応答0011マウス6295を、次の免疫化計画に従って免疫原性用量のヒトCD4を用いて免疫化した:0日目、CD4マウス免疫血清100μlの腹腔内注入;1日目、100μl中DDAを伴いラテックス溶球上で20μgのヒトCD4AmericanBioTechを注入する;15日目、10μl中DDAを伴いラテックス溶球上で20μgのヒトCD4AmericanBioTechを注入する;29日目、100μl中DDAを伴いラテックス溶球上で20μgのヒトCDAAmericanBioTechを注入する;43日目、100μl中DDAを伴いラテックス溶球上で20μgのヒトCD4AmericanBioTechを注入する。図67は、抗CD4応答におけるヒトμ、ヒトκ及びヒトγ鎖の存在を立証する3週間目及び7週間目のCD4免疫化に対する相対的抗体応答を示す。ヒトγ鎖は、7週間目の血清中で著しく増大した発生量で存在し、野生型動物におけるァィソタイプスイッチのものと似た時間的関係で重鎖トランスジーン内でのシス-スイッチアイソタイプスイッチが発生していることを表わしている。図68は、さまざまなヒト重鎖及び軽鎖トランスジーンの概略的寄せ集めを示す。実施例28この例は、マウスλ軽鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。マウスラムダ軽鎖遺伝子座のターゲティングされた失活Ig重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスVλJλ及びCλ遺伝子セグメントは、5′-3′アレイの形に配置された3つのグループにまとめられておらず、その代りに散在させられている。最も5′の部分は2つのVセグメントVλ2及びVλXで構成されており、これら2つのセグメントの後には、3′方向に続行して各々独自のJセグメントJλ2Cλ2及び遺伝子Jλ4Cλ4と結びつけられた2つの恒常領域エキソンが続いている。次にくるのは最も広く用いられるVセグメントVλ1であり、このセグメントの後には恒常領域エキソンの第2のクラスターJλ3Cλ3及びJλ1Cλ1が続いている。全体として、遣伝子座は約200kbにまたがり、2つのクラスター間の間隔は~20~90kbである。ラムダ遺伝子座の発現には、優越してJλ2までのVλ2又はVλXの再配置そして稀にのみJλ3又はJλ1に対してさらに3′の再配置が関与する。Vλ1はJλ3及びJλ1の両方と組換え可能である。かくして、遺伝子座の組換え及び発現を充分に削除するため、ラムダ遺伝子座を突然変異させることが可能である。2つのラムダ遣伝子クラスターの間の距離は、マウスIg重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を失活させる上で用いられたとおりに、単一のち密なターゲッティングされた欠失の生成を介して遺伝子座の発現を失活することを困難にする。その代り、発現ラムダ軽鎖を削除することになる小さい単一の欠失は、Jλ2Cλ2からJλ1Cλ1までに広がる約120kbにまたがっている図69。こうしてラムダ恒常領或エキソンの全てならびにVλ1遺伝子セグメントが除去され、遺伝子座の失活が確保される。欠失された1201kbがPGK発現カセット内で選択可能な標識遣伝子neoと置換されている、置換型ターゲティングベクターThomas及びCapecehi1987前掲書中が構築される。このマーカーは、ラムダ遺伝子座に対する相同性を提供するため欠失にフランキングするゲノミックラムタダ配列内に埋め込まれており、同様に、ベクターを相同的に組込んだ細胞についての富化を可能にするため、相同性領域の1つの端部にHSV-tk遺伝子を含むこともできる。ターゲティングされている染色体DNAに対し同質遺伝子型のターゲティングベクターの使用が相同組換えの効率を増強することが報告されていることから、ラムダ遺伝子座ゲノミッククローン配列は、ターゲティングされているES系統と同質遺伝子型の系129/Svゲノミックファージライブラリのスクリーニングによって得られる。ラムダ遣伝子座に対する相同性の長さで相異のあるターゲティングベクターが構築される。第1のベクター図70中のベクター1は、合計約8~12kbのラムダ遺伝子座配列によりフランキングされた標識遣伝子を含む。置換ベクターが数kbのDNAの付加又は検出を媒介するターゲティング事象については、これは、充分以上の相同性範囲であることが実証されてきたHastyetal.1991、前掲書M中;Thomasetal1992前掲書中。フランキングラムダ配列をさらに約40~60kb伴うベクターも又構築される図70中のベクタ-2。少なくとも80kbのヒト1gミニ遣伝子座が日常的にクロ-ニングされ、プラスミドベクタ-pGP1の中で増殖されるTayloretal1993前掲書中ラムダ遣伝子座の失活のための代替的なアプローチでは、同じES細胞内において、例えば2つの恒常領域クラスタ一又は2つのV領域遺伝子座の突然変異といった2つの独立した突然変異が利用される。恒常領域が両方共各々DNAの~6kb内に内含されているのに対しV遺伝子座の1つは~19kbにまたがっていることから、ターゲディングベクターはλ2Cλ2/Jλ4Cλ4及びJλ3Cλ3/Jλ1Cλ1遺伝子座を独立して欠失するように構築される。図170に示されているように、各々のベクターは、各欠失にフランキングする合計~8~12kbのラムダ遺伝子座ゲノミックDNAによりとり囲まれた、PGK発現カセット内の選択可能なマーカー例えばneo又はpacから成る。陽性-陰性選択による相同組換え事象のため富化するべく、ターゲディングベクターに対し、HSV-tk遣伝子を付加することが可能である。恒常領域遺伝子のうちの1つの欠失を支持するクローンが生成されるように、ES細胞を2つのベクターで逐次的にターゲッティングさせる。次にこれらのクローンを2つのベクターで逐次的にターゲティングさせて、恒常領域遺伝子座の1つの欠失を支持するクローンが生成されるようにし、その後これらのクローンを残りの機能的恒常領域クラスターの欠失を生成するべくターゲティングさせる。両方のターゲティング事象がかくして同じ細胞に対し向けられていることから、2つのターゲティングのために異なる選択可能なマーカーを使用することが好ましい。図70に示されている概略的な例においては、ベクターのうち一方はneo遺伝子を含み、もう一方はpacピュロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。第3の潜在的に優性な選択可能マーカーは、hygハイグロマインンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子である。pac及びhyg遣伝子は両方共、Ig重鎖及びカッパ軽鎖遣伝子座の中にneo遺伝子座をターゲティングするためにうまく使用されるPGK発現構成体の中に挿入され得る。2つのラムダ恒常領域クラスターは密に連鎖されるされていることから、2つの突然変異が同じ染色体上にあることが重要である。好ましくは独立した2つのターゲティング事象により同じ対立遺伝子を突然変異させる確率は50あり、突然変異の連鎖は、2重にターゲティングされたES細胞から誘導されたキメラの繁殖交配中のその同時分離により確立される。実施例29この例は、マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供する。マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた失活ES細胞内での遺伝子ターゲティングによりマウス重鎖遣伝子座恒常領域遺伝子のうちの少なくとも1つ好ましくは実質的に全てを欠失するために、図91に示された構造をもつ相同組換え遺伝子ターゲティングトランスジーンを使用する。図91は、ターゲティングトランスジーンの全体的概要図を示す。セグメントaは、欠失されるべき恒常領域遺伝子単複の上流にあるすなわち遺伝子に近接するクローニングされたゲノミックDNA配列である:セグメントbは、pgk-neoといった正の選択マーカーを含みセグメントcは欠失すべき恒常領域遺伝子単複の下流にあるすなわち恒常領域遺伝子単複及びJH遺伝子に対し遠位にあるクローニングされたゲノミックDNA配列である;又任意のものであるセグメントdは、負の選択マーカー遺伝子例えばHSV-tkを含む。図71は、免疫グロブリン遺伝子、HonjoT.Alt,FW及びRabbitsTHAcademicPress,MYp129からとったマウス重鎖遣伝子座の地図を示す。ターゲティングトランスジーンは、図91に従った構造を有し、ここで1aセグメントは、クローンJH8.1の11.5kbのインサートChenetalIntImmunol5647又は、マウスCμ遺伝子の上流にある少なくとも約1~4kbの配列を含む同等の部分であり、2bセグメントは上述のとおりのpgk-neoであり、3cセグメントは、5′-gtgttgcgtgtatcagctgaaacctagaaacagggtgaccag-3′という配列をもつ末端標識づけされたオリゴヌクレオチドでマウスゲノミッククローンライブラリをスクリーニングすることにより分離されたマウスCα遺伝子のファージクローンから分離された4~6kbのインサート又は図72に示された1674bpの配列を含んでおり、4dセグメントは上述のHSV-tk発現カセットを含んでいる。代替的には、第1のターゲティングが相同性領域すなわち恒常領域遺伝子単複、第1種の正の選択マーカー遺伝子pgk-neo及びHSV-tk負の選択マーカーにフランキングする配列に相同なセグメントa及びcを含んでいる、単数又は複数の重鎖恒常領域遺伝子の段階的欠失を実施する。かくして、aセグメントは、Cγ3の上流にある領域に相同な少なくとも約1~4kbの配列を含むことができ、cセグメントはCγ2aの上流にある領域に対して相同な少くなくとも約1~4kbの配列を含むことができる。このターゲティングトランスジーンはCγ3,Cγ1.Cγ2b及びCγ2a遺伝子を欠失させる。この第1のターゲティングトランスジーンはES細胞内に導入され、適正にターゲティングされた組換え体が選択され例えばG418で、適正にターゲティングされたC碩域欠失を生み出す。次にHSV-tkカセットの喪失についての負の選択が行なわれる例えばganciclovir又はFIAUで。結果として得られる適正にターゲティングされた第1図のC欠失組換え体は、Cγ3.Cγ1.Cγ2b及びCγ2a遣伝子が欠如した重鎮遣伝子座を有する。第2のターゲティングトランスジーンは、相同性領域すなわち、恒常領域遣伝子単複、第1の種とは異なる第2種の正の選択マーカー遣伝子例gpt又はpae及びHSV-tk負の選択マーカーにフランキングする配列と相同なセグメントa及びcを含んでいる。かくして、aセグメントは、Cεの上流にある領域に対し相同な少なくとも約1~4kbの配列を含むことができ、cセグメントは、Cαの上流にある領域に相同で少なくとも約1~4kbの配列を含むことかできる。このターゲティングトランスジーンはCε及びCα遣伝子を欠失させる。この第2のターゲティングトランスジーンは、第1のターゲティング事象から得られた適正にターゲティングされたC-領域組換え型ES細胞の中へ導入される。第2のノックアウト事象のために適正にターゲティングされているすなわち第2のターゲティングトランスジーンでの相同組換えによる細胞は、第2種の正の選択マー力ー遺伝子に特異的な選択薬剤例えば、gptについて選択するためのミコフェノール酸pacについて選択するためのピュロマイシンを用いて選択される。その後、HSV-tkカセットの喪失についての負の選択が行なわれる例えばganciclovir又はFIAUを用いて。結果として得られるこれらの適正にターゲティングされた第2回目のC領取組換え体は、Cγ3.Cγ1.Cγ2b.Cγ2a,Cε及びCα遺伝子が欠如した重鎖遺伝子座を有する。単数又は複数のC領域遺伝子が欠如した適正にターゲティングされた第1回又は第2回目の組換え型ES細胞を、上述のとおり、胚盤胞注入のために使用し、キメラマウスを産生する。ターゲティングされた重鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝播が樹立され、結果として得られた創立者マウスの繁殖交配を行なってC領域ノックアウトに対して同型接合のマウスを生成する。このようなC領域ノックアウトマウスは、JHノックアウトマウスに比べていくつかの利点を有する:-例を挙げると、C領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランスジーンと内因性重鎖遺伝子座恒常領域の間のトランススイッチを受ける能力が低下しており又はこの能力が完全に欠如している、かくしてトランスジェニックマウス内のキメラヒト/マウス重鎖の頻度を減少している。μ及びデルタも同様に頻繁に相同ターゲティングによって欠失させられているものの、マウスガンマ遣伝子のノックアウトが好まれる。内因性マウス重鎖遣伝子座内のその他のターゲティングされた病巣と合わせて、C領域ノックアウトを行なうことが可能である:中でも、マウス重鎮遺伝子座の産生的VDJ再配置を排除するため及びヒト重鎖トランスジーンとマウス重鎖遣伝子座の間のトランススイッチを排除又は削減するために、JHノックアウトとC領域欠失を組合わせることが可能である。いくつかの実施態様については、内因性重鎖遣伝子座の単数又は複数のC領域遺伝子が特定的に欠如しているもののその他のいくつかのC領域遺伝子を保持しているマウスを産生することが望ましい可能性がある。例えば、キメラヒト/マウスIgA、が有利な表現型を付与し実質的にマウスの望ましい有用性と干渉しない場合、このIgAのトランススイッチによる産生を可能にするべくマウスCα遺伝子を保持することが好ましい可能性がある。実施例30この例は、ヒトトランスジーンを宿トランスジェニックマウスから得られるリンパ球試料からの内因性マウス免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ピボ枯渇を実証する。マウスIgを発現するリンパ球は、トランスジーン単複によりコードされるヒト免疫グロブリンに対する実質的結合力が欠如している抗マウス免疫グロブリン抗体に対する特異的結合により選択的に枯渇される。マウスIg-発現B細胞の半ビボ枯渇ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンHIC2及びヒト軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンKCo4に対して同型接合のマウスをC57BL/6B6同系繁殖マウスと繁殖交配させ、2211マウスすなわち、機能的内因性マウス重鎖遺伝子座に対し同型接合で、機能的内因性マウス軽鎖遺伝子座に対し同型接合で、かつヒト重鎖トランスジーンの1つのコピーとヒト軽鎖トランスジーンの1つのコピーを有するマウスを得る。かかる2211マウスば同様にB6主要及び非主要組織適合抗原をも発現する。これらのマウスを、免疫原性用量の抗原でプライミングさせ、約1週間後に脾細胞を分離させる。標準的方法WysockietalProcNatlAcadSci.75;2844;MACS磁気細胞選別、MiltenyiBiotecInc.Sunnyvale,CAに従った固相連結されに抗体依存型細胞分離及び、それに続く、マウスIgに関し陽性の残留細胞を実質的に除去するための抗体依存型補体媒介の細胞溶解細胞免疫学における選択された方法、Mishell88及びshiigiSM,WMFreemanandCompany,NewYork,1980,p211~212によって、マウスIgに関して陽性のB細胞を除去する。枯渇された試料中の残りの細胞例えば、ヒトIgについて陽住なB細胞、T細胞を、好ましくは発生するB細胞に対する付加的な抗マウスIg抗体と合わせて、SCID/B6又はRAG/B6マウスに静脈内注射する。再構成されたマウスを次に、さらに抗原に対し免疫化させ、ハイブリド-マクローンを産生するための抗体及び親和力の成熟した細胞を得る。実施例31体細胞キメラ内の完全にヒトの抗体の産生体細胞キメラマウス内で完全にヒトの抗体を産生するための方法が記述される。これらのマウスは、ヒト免疫グロブリンIg重鎖及び軽鎖トランスジーンを有し、機能的マウスIg重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子が欠如した胚幹ES細胞を、RAG-1又はRAG-2欠損マウスからの胚盤胞の中に導入することによって生成される。RAG-1及びRAG-2欠損マウスMombaertsetal.Cell68869;Shinkaietal.Cell68:855には、VDJ再配置を開始しIgsをコードする遺伝子セグメント及びT細胞レセプタTCRを組立てることができないため、マウスB及びT細胞が欠如している。B及びT細胞の産生におけるこの欠陥は、RAG-2欠損動物から誘導された胚盤胞内への野生型ES細胞の注入によって補完できる。結果として得られたキメラマウスは、注入されたES細胞から完全に誘導された成熟したB及びT細胞を産生するChenetalProcNatlAcadSciUSA90:4528。キメラのB及び/又はT細胞全ての中に、規定の突然変異及び/又は外因性DNA構成体を導入するために、注入されたES細胞の遺伝子操作を使用する。ChenetalProcNatlAcadSciUSA90:4528-4532RAG胚盤胞内に注入された時点で、B細胞が無い状態でT細胞を作るキメラを産生した、Ig重鎖遺伝子座の同型接合失活を有する生成されたES細胞原文不明瞭。突然変異体ES細胞内への再配置されたマウス重鎖のトランスフェクションの結果、B細胞の発達が救われ、キメラ内でB細胞及びT細胞の両方が再生されることになる。マウスIg重鎖又はカッパ軽鎖の合成が無い状態で完全にヒトの抗体を発現するキメラマウスを生成することが可能である。マウスIg重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の両方の失活について同型接合であるES細胞の中に、ヒトIg重鎖及び軽鎖構成体を導入する。このときES細胞を、RAG2欠損マウスから誘導された胚盤胞の中に注入する。結果として得られるキメラは、マウスIg重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子を発現することはできないもののヒトIg遺伝子は発現する注入されたES細胞から排他的に誘導されたB細胞を含んでいる。免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の失活について同型接合のES細胞の生成それぞれ既知の手順に従ったChenetalEMBOJ12:821;及びChenetalIntImmunol前掲書中、ES細胞内でのIgJH及びJκ/Cκ配列のターゲティングされた欠失により、失活されたIg重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座を支持するマウスを生成した。2つの突然変異体系のマウスを合わせて繁殖させて、両方のIg遺伝子座の失活について同型接合の系を生成した。この2重突然変異体の系を、ES細胞の誘導のために使用した。使用されたプロトコルは、基本的に、Robertsonにより記述されたものであった1987、奇形ガン腫及び胚幹細胞;1つの実践的アプローチ中。p71~112。EJRobertson編、IRLプレス。簡単に言うと、同系接合の2重突然変異体マウスの自然交配により、胚盤胞が生成された。受胎した雌を妊娠2.5日目に卵巣摘出し、妊娠7日目に子官から遅延した胚盤胞を洗い流し、支持細胞上で培養して、それらの未分化状態の維持を助けた。その形態で同定できる胚盤胞の内部細胞質量からの幹細胞をとり出し、解離させ、支持細胞上で継代させた。正常な核型をもつ細胞を同定し、雄細胞系統は、キメラを生成しマウスの生殖細胞に寄与するその能力についてテストされることになる。雄キメラははるかに多くの子孫を産生できることから、雌系統よりも雄ES細胞の方が好ましい。マウスIg重鎖及びカッパ軽鎖欠損ES細胞内へのヒトIg遺伝子の導入HCS及びKC-CO4といったミニ遺伝子座構成体又はJ1.3PといったYACクローンのいずれかとして、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を突然変異体ES細胞内に導入する。ヒトIgDNAでのES細胞のトランスフェクションを、電気穿孔又は陽イオン脂質でのリポフェクションといった技術によって行なう。ヒトDNAを取込んだES細胞の選択を可能にするため、選択可能マーカーを構成体に連結させるか又はES細胞へと構成体と同時トランスフェクションさせる。突然変異体ES細胞は、Ig遺伝子失活を生成した遺伝子ターゲティング事象の結果としてネオマイシンホスフォトランスフェラーゼneo遺伝子を含んでいることから、ヒトIg遺伝子をES細胞内に導入するため、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼhyg又はピュロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼpacといったさまざまな選択可能なマーカーが使用される。ヒトIg重鎖及び軽鎖遺伝子は、異なる選択可能マーカーを用いて、突然変異体ES細胞内に同時に又は逐次的に導入することができる。トランスフェクションの後、適切な選択可能マーカーで細胞を選択し、ヒト遺伝子配列の組込みを確認し分析するべく凍結しDNA分析する目的で薬剤耐性コロニーを拡張させる。キメラの生成記述されているとおりBradley,A.,奇形ガン腫及び胚幹細胞:1つの実践的アプローチ中、p113~151,EJRobertson編、IRLプレスRAG-2胚盤胞内にヒトIg重鎖及び軽鎖遺伝子を含むESクローンを注入し、偽妊娠の雌の子官内にトランスファさせる、血清試料のELISA険定により、ヒト抗体の存在について子孫をスクリーニングする。ヒトモノクローナル抗体の免疫化及び産生のために陽性動物を使用する。実施例32この例は、スイッチ組換えを受けるB細胞の欠失へと導くマウス重鎖遺伝子座内へのターゲティングされたフレームシフト突然変異の、ES細胞内の相同組換えを介しての導入について記述する。フレームシフトされたマウスは、ヒト配列免疫グロブリンをコードするマウス以外の例えばヒトのトランスジーンを宿すための適切な宿主である。新しいフレームシフトされたマウスは、なかでも、重鎖トランスジーン単複及び/又は軽鎖トランスジーンによりコードされる非マウス例えばヒト配列免疫グロブリンを発現させるため、及び導入されたトランスジーンからのクラススイッチされた親和力が成熟したヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの分離のために使用可能である。4つのマウスJH遺伝子セグメントのうちの1つの中、そしてマウスμ遺伝子の第1のエキソンの中に、フレームシフトを導入する。導入された2つのフレームシフト突然変異は、互いに補償し合い、かくして、機能的VDJ連結のためにB細胞がフレームシフトされたJHを使用するときの完全に機能的なマウスμ重鎖の発現を可能にする。残りのJH遺伝子内で補償されないμ内のフレームシフトのため、その他の3つのJHセグメントのいずれも機能的VDJジョイニングに使用することができない。代替的には、多数のマウスJH遺伝子の中に、補償するフレームシフトを工作することもできる。補償されフレームシフトされた免疫グロブリン重鎖対立遺伝子に対し同型接合のマウスは、ほぼ生理学的レベルの末梢B細胞及び、マウスとヒトのμを両方共含むほぼ生理学的レベルの血清IgMを有する。しかしながら胚中心内に動員されたB細胞は、頻繁に、非μアイソタイプへのクラススイッチを受ける。内因性マウスμ鎖を発現するB細胞内のこのようなクラススイッチは、残りの非μCH遺伝子が補償するフレームシフトを有していないことから、補償されていないフレームシフトmRNAの発現を導く。結果として得られるB細胞は、B細胞レセプタを発現せず、欠失される。従って、マウス重鎖を発現するB細胞はそれらがアイソタイプスイッチの起こる分化段階にひとたび達した時点で欠失される。しかしながら、アイソタイプスイッチの能力をもちかかるアイソタイプ制限フレームシフトを含まない、非マウス例えばヒトトランスジーンによりコードされる重鎖を発現するB細胞は、アイソタイプスイッチ及び/又は親和力成熟などを含むさらなる発達の能力をもつ。従って、フレームシフトを受けたマウスはマウス重鎖に関して二次応答が損なわれているが、トランスジーンコードされた重鎖に関しては有意な二次応答を有する。クラススイッチを受けることのできる重鎖トランスジーンがこの突然変異体バックグラウンド内に導入された場合、非-IgM二次応答は、B細胞を発現するトランスジーンにより支配される。かくしてこれらのフレームシフトされたマウスからハイブリドーマを発現する親和力成熟したヒト配列免疫グロブリンを分離することが可能である。さらに、フレームシフトされたマウスは一般に、ヒト重鎖トランスジーンが可変領域の制限された能力能囲しかコードできない場合に有利でありうるマウスIgMの免疫防御レベルを有する。ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るために、トランスジェニック突然変異体マウスを免疫化し、その脾臓を骨髄細胞系統と融合させ、結果として得られたハイブリドーマを、トランスジーンでコードされたヒト非μアイソタイプの発現についてスクリーニングする。さらに、フレームシフトしたマウスは、シススイッチのための活性基質として役立つ転写されたVDJに隣接した搬能的μスイッチ配列を含むことになりGuetalCell731155、かくしてキメラヒト/マウス抗体を発現するトランススイッチされたB細胞レベルを低下させるため、JH欠失したマウスに比べ有利でありうる。フレームシフトベクターの構築2つの別々のフレームシフトベクターを構築する。これらのベクターのうちの1つは、マウスJ4遺伝子セグメントの3′末端で2つのヌクレオチドを導入するのに用いられ、もう1つのベクターは、マウスμ遺伝子のエキソン1の5′末端からこれらの同じ2つのヌクレオチドを欠失させるために用いられる。1.JHベクターホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下でヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター内に、マウス重鎖J領域及びμイントロンエンハンサーを網羅する3.4kbのXhoI/EcoRIフラグメントをサブクローニングするtk/neoカセット、Hastyetal1991Nature350:243。次に以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて2つの異なるPCRフラグメントを生成するための基質として、このクローンを使用する:o-A15′ccacactctgcatgcagcagaagcttttctgat3′o-A25′ggtgactgaggtaccttgaccccagtagtccag3′o-A35′ggttacctcagtcaccgtctcctcagaggtaataatggcctc3′oA45′aggctccaccagacctctctagacagcaactac3′SphI及びKponI消化される1.2kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドo-A1及びo-A2を使用する。KpnI及びXbaIで消化される0.6kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドo-A3及びo-A4を使用する。次にこれら2つの消化されたフラグメントを、SphI/XbaIで消化されたプラスミドAの中にクローニングし、プラスミドBを生成する。プラスミドBは、J4の末端に2ヌクレオチド挿入を含み、さらに挿入の上流に新しいKpnI部位を含む。挿入のための診断マーカーとして、KpnI部位を使用する。相同組換え効率を増大させるため、プラスミドの5′XhoI部位及び3′EcoRI部位の中に、付加的フランキング配列をクローニングすることができる。その後、SphI又はインサート内に単一の部位をもつもう1つの制限酵素で、結果として得られたプラスミドを消化し、胚幹細胞へと電気穿孔させ、これらの細胞を次に、Hastyetal、前掲書中、により記述されているとおりに、G418で選択させる。サザンプロットハイブリダイゼーションにより相同組換え体を同定し、次にHastyetalにより記述されているとおりにFIAUにより選択させて、2塩基対挿入とJH4内の新たなKpnI部位のみを含む欠失されたサブクローンを得る。これらを、KpnI消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定し、PCR増幅されたJH4DNAのDNA配列分析により確認する。結果として得られたマウスは、突然変異されていない配列:すなわちTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGgtaagaatggcctctccTrpGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGluから突然変異体配列すなわち、TGGGGTCAAGGTACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctccTrPGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGluへと変換されたJH4セグメントを含む。μエキソンlベクターJHd遺伝子セグメント内への2塩基対挿入を工作するべく上述したものと類似のインビトロ突然変異誘発を用いて、第1のμエキソンの5′末端で2塩基対欠失を含むベクターを作り出すため、PCR産物及びゲノミックサブクローンを組立てる。さらに突然変異をマーキングするため、AをGに変更することにより新しいXmnI部位も下流に導入する。突然変異を受けていないμ遺伝子の配列は以下のとおりである:ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTCGluSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal突然変異を受げけたμ遺伝子の配列は以下のとおりである。XmnIctggtcctcag_AGTCAGTCCTTCCCGAATGTCTTCCCCCTCGTCSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal突然変異体配列を含む相同組換えベクターを、JH4挿入を含むES細胞系統へと線形化させ電気穿孔させる。ネオマイシン耐性クローンから相同組換え体を同定する。JH挿入と同じ染色体上のフレームシフト挿入を含むこれらの相同組換え体を、KonI/BamHIで消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。野生型11.3kbから突然変異体9kbまでのKpnI/BamHIを含むJ-μイントロンのサイズを減少させる新しいKpnI部位とJH4挿入を結びつける。次に、FIAUを用いて、挿入されたtk/neoカセットの欠失のために、結果として得られたクローンを選択する。突然変異体μエキソンを含むクローンを、XmnIで消化されたDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定する。突然変異は、PCR増幅されたμエキソンlDNAのDNA配列分析により確認される。フレームシフトされたマウスの生成次に、JH4内の2塩基対挿入及びμエソキン1内の2塩基対欠失の両方を含むES細胞系統を、キメラを生成するべく偽妊娠の雌の体内に挿入される胚盤胞段階の胚の中に導入する。キメラ動物を繁殖させて生殖細胞系列の伝播を得、結果として得られた動物を同型接合まで繁殖させて、補償されたフレームシフトされた重鎖遺伝子座に対し同型接合でかつマウス重鎖を発現するB細胞内の二次体液性免疫応答が損なわれている突然変異体動物を得る。例えばpHCI又はpHC2といったヒト重鎖トランスジーンを、フレームシフトされたマウスIgH遺伝子座をもつマウスの中にかかるヒトトランスジーンを宿すマワスを交雑育種することによってマウス重鎖フレームシフトバックグラウンドへと繁殖させることができる。同系交配及び戻し交配を介して、μ補償されフレームシフトされたマウスIgH対立遺伝子に対してマウスIgH遺伝子座で同型接合ですなわちマウスの非μ鎖ではなくμ鎖のみの補償された枠内発現をすることのできるしかも機能的ヒト重鎖トランスジーン例えばpHCl又はpHC2の少なくとも1つの組込みコピーを宿すマウスを産生させる。かかるマウスは任意には、上述のとおりの内因性マウスκ及び/又はλ遺伝子のノックアウトを内含していてよく、又任意には、ヒト又はその他の非マウス軽鎖トランスジーン例、pKC1e,pKC2tよどを含む可能性がある。代替的には、トランスジーン恒常領域遺伝子単複内のフレームシフトにより補償されるフレームシフトがトランスジーンJ遺伝子単複に含まれるように、ヒトトランスジーン単複重鎖及び/又は軽鎖にば補償フレームシャフトが含まれていてもよい、内因性恒常領域遺伝子に対するトランススイッチは、補償されす、切形の又はナンセンス産生を産生する;かかる補償されていないトランススイッチされた免疫グロブリンを発現するB細胞に対し選択を行ない、これを枯渇させる。実施例33D領域切除による内因性重鎖の失活この例は、マウス生殖細胞系統免疫グロブリン重鎖D領域を非機能的な再配置されたVDセグメントで置換するための正-負選択相同組換えベクターについて記述する。結果として得られる対立遺伝子は、対立遺伝子内重鎖クラススイッチを受けかくしてトランススイッチレベルを活性トランスジーン遺伝子座まで減少させている状態で、正常な非産生的対立遺伝子としてB細胞内で機能する。D領域ターゲティング構成体マウスD領域の上流にある8~15kbのDNAフラグメントを、GenBankにリストアップされたDFL16.1セグメントに対する公表済み配列の約50の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウス系129ファージライブラリから分離し、サブクローニングする。DFL16.1は、上流Dセダメントすなわち、V領域遺伝子クラスターに近位で、恒常領域遺伝子クラスタに遠位のものである。同様に、JH3,JH4,Eμ,Sμ及びμ恒常領域の最初の2つのコーティングエキソンを含む9.5kbのBamHIフラグメントを、マウス系129ゲノミックファージライブラリーから分離しサブクローニングする。次にマウスハイブリドーマあらゆる系から5~10kbの再配置されたVDJを分離し、停止コドンを含む合成リンカーをJセグメント内に挿入する。V置換再配副が可能であるため、枠外VDJ連結よりもJの内部の停止リンカーが好まれる。これら3つのフラグメントをPGKneo正の選択カセット及びPGKHSVtk負の選択カセットと合わせて組立てて、相同組換えにより129-誘導ES細胞例えばABl内のマウスD領域を削除するための正-負選択ベクターを形成する。ターゲティングベクターは、それ自体9.5kbのBamHIフラグメントに連結される再配置された5~10kbの再配置済みVDJにそれ自体連結されている正の選択カセット例えばPGKneoに8~15kbのDNAフラグメントを連結させることによって形成される。次に、ターゲティング構成体のいずれかの端部で負の選択カセット例えばPGKHSVtkを連結させる。かかるD領域ターゲティングベクターの構成は、図73に概略的に示されている。D領域ターゲディング構成体を、AB1ES細胞内にトランスファし、正及び負の選択を上述のとおりに行ない、適正にターゲディングされたES細胞をクローニングする。胚盤胞注入のために、適正にターゲティングされたES細胞クローンを使用し、キメラマウスを産生する。D領域失活された重鎖対立遺伝子を宿す創立者マウスを産生するため、キメラマウスを繁殖させる。機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如した同型接合体を産生するため、子孫の同系交配を行なう。このような同型接合体を用いて、ヒトIgトランスジーン例えばpHC1,pHC2.pKC2.pKC1e,KCo4を宿マウスまで交雑育種し、さらに、機能的D領域が欠如した同型接合体までもどし交配することにより、機能的内因性重鎖遺伝子座が欠如しかつヒト重鎖トランスジーンそして好ましくはヒト軽鎖トランスジーンもを宿すマウスを生み出す。いくつかの機能的内因性軽鎖遺伝子座例えばλ遺伝子座が残る実施態様においては、一般に、トランスジーンがヒト軽鎖例えばκポリペプチドの高レベル発現を誘導する転写制御配列を含み、かくしてトランスジーンの遺伝子座が残りの同因性軽鎖例えばλ遺伝子座と有効に競合できるようにすることが好ましい。例えば、Co4カッパ軽鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物内の内因性λ遺伝子座と有効に競合する能力に関してpKC1に比べ一般に好まれている。実施例34この例は、ヒトVκ遺伝子座の一部分を含む酵母人工染色体とヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座の同時注入によるヒト軽鎖トランスジーンV遺伝子の能力範囲の拡張について記述する。Vκ含有YACDNAとκミニ遺伝子座の同時注入による機能的ヒト軽鎖Vセグメントの導入一般に入手可能なICRFYACライブラリーのクローン4×17E1から、増幅されていないYACDNAとして、ヒトVκ遺伝子座の一部を含む約450kbのYACクローンを得たLarineta1.ProcNatlAcadSci。臭化エチジウムを用いて6つの個別のバルスフィールドゲルを染色し、YACクローンDNAを含むゲル材料をゲルがら切除し、次に三角形のゲルトレイ内に流し込まれた新しい標準ゲル緩衡液中の低融点アガロースゲル内にこれを埋込む。標準電気泳動緩衝液に加えて2MのNaOAcを伴う狭いアガロースゲルを用いて頂点において、結果として得られた三角形のゲル6つの切除されたYAC含有ゲルブロックを内含するを伸展させた。次にゲルを、標準ゲル緩衝液中に浸潰された電気泳動チャンバ内に入れた。Y形状のゲルフォーマは、電流流動が狭く高いソルトゲル部分までだけ流れるように、緩衝液の表面より上に立上っている。緩衝液内へのNaOAcの拡散を防ぐため、高ソルトゲル切片全体にわたり、アクリルのブロックを置いた。次に、YACDNAを切片化された埋込まれたもとの切除ゲルから狭い高ソルトゲル部分内へと電気泳動させた。低ソルトゲルから高ソルトゲルへの遷移の時点で、三角形のゲルの頂点でDNAの移動を有効に停止させる抵抗の低下が存在する。電気泳動及び臭化エチジウムでの染色の後、濃縮したYACDNAを残りのゲルから切り離し、アガロースをGELaseEpiCentreTechnologies,Madison,Wisconsinで消化した。次に、結果として得られたYAC含有液体に塩化セシウムを付加し、1.68g/mlの密度を得た。この溶液を36時間37000rpmで遠心分離し、あらゆる汚染物質からYACDNAを分離した。結果として得られた密度勾配の0.5ml分画を分離し、5mMのTrispH7.4、5mMのNaCl、0.1MのEDTAに対してピークDNA分画を透析した。透析の後、結果として得られたYACDNAの0.65ml溶液の濃縮は、2μg/mlのDNAを含んでいることがわかった。このYACDNAを、20:1:1マイクログラムYAC4×17El:KClB:KV4の比率で、プラスミドpKClB及ひpKV4からの精製されたDNAインサートと混合した。半日のB6CBF2の胚の前後の中に、結果として得られた2μg/mlの溶液を注入し、95の存続する微量注入された胚を偽妊娠の雌の卵菅内に移送した。微量注入された胚から発達した12匹のマウスが生まれた。実施例35この例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座に対して同型接合でありかつHCl又はHC2重鎖トランスジーンを含む免疫化したトランスジェニックマウスの中でのクラススイッチ、体細胞突然変異及びB細胞発達について記述するヒト配列生殖細胞系統配置ミニ遺伝子座が真正遺伝子座と置換できることを実証するために、我々は、ヒト生殖細胞系統-配置IgHトランスジーンを含む系を用いて、内因性IgHが欠如したマウス系を繁殖させた。2つのトランスジーンミニ遺伝子座HC1及びHC2は、それぞれ1つ及び4つの機能可変Vセグメント、10及び16の多様性Dセグメント、6つのジョイニングJHセグメント全て、及び両方のμ及びγ1垣常領域でグメントを含む。ミニ遺伝子座は、コーディングでグメントに密に連鎖されているJH-μイントロンエンハンサー及びμ及びγ1スイッチ配列といったヒトシス作用性調節配列を含む。これらは同様に、ラットIgH遺伝子座の3′末端から誘導された付加的なエンハンサー要累も含んでいる。我々は、HC1及びHC2トランスジェニックマウスを、記述のとおり前出JHセグメントJHDマウスが欠如し従って機能的重鎖再配置を受けることのできない幹細胞由来の突然変異マウスと交配させた。結果として得られたトランスジェニック-JHDマウスは、導入された重鎖配列に依存するB細胞を含んでいる。免疫化及びハイブリドーマ我々は、50~100μgの抗原の腹腔内注入によりマウスを免疫化した。抗原には、ヒトのガン胎児性抗原CEA;CrystalChem,Chicago,IL、ニワトリ卵白リゾチームHEL;Picrce.Rockford,IL及びキーホールリンペットヘモシアニンKLH;Pierce.Rockford,ILが含まれていた。一次注入のために、我々は抗原を完全フロイントアジュバントと混合し、その後の注入については不完全フロイントアジュバントを用いた。脾細胞を、非分泌性マウス骨髄腫P3X63-Ag8.653ATCC,CRL1580と融合させた。我々は、ELISAにより、ヒト重鎖配列を含む特異的及び非特異的抗体の存在について血清試料及びハイブリドーマ上清を検定した。非特異的抗体の検出のために、我々は、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体マウスMAbαヒトIgGl、クローンHP6069、Calbiochem,LaJolla,CA;マウスMAbαヒトIgM、クローンCH6、TheBindingSite.Birmingham,UKでマイクロタイターウエルをコーティングし、ペルオキシダーゼ接合抗血清ポリクローナルヤギαヒトIgGfcからのホースラディッシュベルオキシダーゼ接合の親和性精製されたfabフラグメント、cat109-036-098;親和性精製されたホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたボリクローナルウサギαヒトIgMfc.cat309-035-095。jacksonImmunoResearch,WestGrove,PAを用いて発達させた。抗原特異的抗体の検出のため、我々はマイクロタイターウエルを抗原でコーティングし、ペルオキシダーゼ接合されたヒト重鎖アイソタイプ特異血清を用いて発達させた。我々は、過酸化水素及び2,2′-アジノ-ピス-3-エチルベンズテアソリン-b-スルフォン酸、SigmaChem.Co,StLouls,Moでのインキュベーションにより、結合ベルオキシダーゼを検出した。反応産物を415nmで吸収により測定し、490nmでの吸収について補正する。フローサイトメトリー我々は、脾臓、骨髄及び腹腔から単細胞懸濁液を調製し、Mishell及びShiigiにより記述されているとおりにNH4Clで赤血球を溶解した。次の試薬でリンパ球を染色した:すなわち、フィコエリトリン接合された抗マウスIgκクロ-ンX36;BectonOickinson.SanJoss.CA,FITC接合された抗マウスIgDクローンSBAI.SouthernBiotech.AL.FITC接合された抗マウスCD5クローン53-7.3;BectonDickinson,SanJose.CA,FITC接合された抗マウスIgλクローンR26-46;Pharmingen,SanDiego,CA及びCy-クロム接合された抗マウスB220クローンRA3-6B2;Pharmingen,SanDiego,CA、我々はFACScanクローン血球計算器及びLYSISIIソフトウェアを用いて染色した細胞を分析した。前方及び側方散乱器上でのゲーティングにより、大部分のマクロファージ、好中球及び残留赤血球を排除する。B細胞区画の救助HC1トランスジェニック-JHD動物の腹腔内では、CD5B細胞の正常レベル及び従来のCD5B細胞の正常レベルの約4分の1が見られる。トランスジェニック腹腔CD5B細胞は、正常な動物内での記述されたいわゆるB-1細胞に類似している:すなわち、これらは従来のB及びTリンパ球よりも大きく、脾臓内で見られる従来のB細胞よりも低いレベルのB220を発現し、より高い割合のλ軽鎖発現細胞を含んでいる。脾臓B細胞の90以上がκを発現し、一方最高50の腹腔B細胞がλを発現する。かくして、従来のB細胞のレベルは全ての組織内で均等に減少している一方で、自己更新の能力がはるかに大きいものとして報告されているB-1のレベルは、HC1トランスジュニック-JHD動物において正常であると思われる。クラススイッチトランスジェニッタ-JHDマウスにおいては、抗原に対して反復的に露呈することにより、ヒトr1抗体ならびにμ抗体が結果として産生される。我々は、一週間の間隔でトランスジェニック-JHDマウス内にヒトCEAを注入し、4週間にわたり抗原特異的IgM及びIgG1の血清レベルを監視した図74。1週間目に、検出可能なIgM応答があるがIgG1応答は全く無い。しかしながらIgG1応答は2週間後IgM応答よりも大きく、IgM応答が比較的恒常な状態にとどまっているのに対して増大し続けている。このパターン、すなわち初期のIgM応答とそれに続くIgG反応は、二次免免応答に典型的なものであり、これは、トランスジーン内に内含されているシス作用性配列が、クラススイッチを導くサイトカインに対し応答しているかもしれないということを示唆している。我々は、各々文献中で論述されてきた非μアイソタイプの発現について考えられる3つのメカニズムを考慮した。これらのメカニズムとはすなわち、μ遺伝子の欠失が関与しない交互のスプライシング;フランキング反復配列間の相同組換えを介してのμ遺伝子の欠失が関与したδ-型スイッチ;そしてスイッチ領域間の非相同組換えである。以下で記述する我々の実験の結果はスイッチ領域組換えモデルを表わしている。アイソタイプシフトを説明するのに2つのタイプの非欠失性交互スプライシングメカニズムを喚起することができる。第1に、μ及びγ1の両方をカバーする単一の写しをトランスジーンから発現させることが可能である;この写しは抗原に対する露出により誘発されたサイトカインに応答して交互にスプライグさせることができた。代替的には、サイトカイン誘発されたγ1の上流で開始する不稔写しを、μ写しにトランススプライシングさセることができた。これらのメカニズムのうちのいずれかがヒトγ1配列の発現の原因であったならば、μ及びγ1の両方を発現するハイブリドーマを分離できるということを期侍したであろう。しかしながら、ヒトμ又はヒトγ1のいずれかを発現する数百のハイブリドーマをスクリーニングしてきたものの、かかる二重産生者μ,γ1ハイブリドーマは全く発見されなかった。このことは、γ1の発現にμ遺伝子の欠失が供っていることを表わしている。μ遺伝子の欠失は、μとγ1スイッチ領域の間の非相同組換えによって、又はHC1及びHC2トランスジーン内に含まれている2つのフランキングする400bpの直接反復σμ及びΣμの間の相同組換えによって媒介されうる。σμ及ひΣμの間の欠失組換えは、いくつかのヒトB細胞のIgD,IgM表現型の原因であることが報告されてきた。第1のメカニズムすなわち非相同スイッチ組換えは可変的な長さのスイッチ産物を産生するはずであるが、一方第2のメカニズムすなわちσμ/Σμ組換えはつねに同じ産物を生成するはずである。我々は、μを発現するもの1つとγ1を発現するもの2つの計3つのハイブリドーマ図75から分離したゲノミックDNAのサザンプロット分析を行なった。γ1スイッチ領域のうち2つの中にのみトランスジーンγ1の上流にゲノミック再配置が発見される図76。さらに、観察した構造のうちいずれもσμとΣμの間の相同組換えと両立性がない。従って、我々の結果は、トランスジーンでコードされたμ及びγ1のスイッチ領域の間での欠失性非同組換えによって媒介されるγ1アイソタイプ発現のためのモデルと一貫性を有する。トランススイッチヒトγ1に加えて、HC1及びHC2トランスジェニック-JHDマウスの血清中にマウスγが見い出される。これらの動物から、マウスγ発現ハイブリドーマも得られた。非トランスジェニック同型接合JHD動物は、検出可能なレベルのマウス免疫グロブリンを発現しないことから、HC1及びHC2トランスジェニック-JHD動物内のマウスγの発現は、トランススイッチ現象のせいであると思われる。我々が分析したトランスジェニックハィブリドーマの全ては、マウス又はヒトのいずれかの恒常領域配列を発現するものの両方を発現することはない。従ってトランススプライシングメカニズムが関与する可能性は低い。トランススイッチ産物のcDNAクローンを分離するためのPCR増幅を用い、結果として得られるクローンのうちの10個のヌクレオチド配列を決定した図77。PCR増幅中の5′オリゴヌクレオチドはトランスジーンコードされたVH251に特異的であり、3′オリゴヌクレオテドはマウスγ1,γ2b及びγ3配列に特異的である。これら3つのマウス恒常領域の全てを取込んだトランススイッチ産物の例が見られる。体細胞突然変異図7に示されているトランススイッチ産物の可変領域内のヌクレオチドの約1が、生殖細胞系統コーディングを受けていない。これはおそらく、休細胞突然変異のせいであると思われる。突然変異を受けた配列は内因性遺伝子座にトランスロケートされていたため、これらの突然変異を導くシス作用性配列は、マウスγスイッチから3′のどこにでも位置設定することができた。しかしながら以下で論述するとおり、かかるトランスロケーションを受けなかったVDJでセグメント内の体細胞突然変異も観察される。そしてこの結果は、重鎖体細胞突然変異が必要とする配列がトランスジーン内に内含されているということを表わしている。HC1及びHC2構成体が、トランスジェニック-JHDマウス円で体細胞突然変異が起こるのに充分なシス作用性配列を含んでいるか否かを決定するため、我々は、2つの独立したHC1トランスジェニック系統そして1つのHC2系統から誘導されたcDNAクローンを分離し部分的に配列決定した。トランスジェニック-JHDマウスからのγ1写しのいくつかが、広範な体細胞突然変異を伴うV領域を含んでいることがわかる。これらの突然変異を受けた写しの頻度は、免疫化の反復に伴って増大するように思われる。図78及び79は、2組のcDNA配列を示す:すなわち1組は、RNAを分離する5日前に抗原の一回の注入で免疫化したHC1系統26トランスジェニック-JHDマウスから誘導体されている;第2の組は、RNAを分離する5カ月前から始めて異なる日に3回抗原を注入することによって高度免疫させたHC1系統26トランスジェニック-JHDマウスから誘導されている;第2の組は、RNAを分離する5カ月前から始めて異なる日に3回抗原を注入することによって高度免疫させたHC1系統26ソランスジェニック-JHDマウスから誘導されている原文重複。露呈後5日目から13のV領域のうちわずか2つだけがいずれかの生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。これらのVの各々は単一のヌクレオチド変更しか含まず、この試料について0.1未満の全体的体細胞突然変異頻度を与えている。これとは対照的に、高度免疫された動物からの13のV配列のいすれも完全に生殖細胞系統ではなく、全体的体細胞突然変異頻度は16である。単一の組織試料から分離されたμ及びγ1写しの比較は、体細胞突然変異の頻度がクラススイッチを受けたトランスジーンコピーの場合よりも高いということを示している。我々は高度免疫したCH1系統57トランスジェニック-JHDマウスからの47の独立したμ及ひγ1cDNAクローンを分離し、部分的に配列決定した図80及び81。μcDNAクローンのほとんどは、生殖細胞系統配列との関係において修正されておらず、一方γ1クローンの半数以上は、多数の生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。γ1発現細胞は、μ発現細胞とは全く異なり、2つのプロセスは必ずしも連関されていないものの、クラススイッチと体細胞突然変異は、B細胞の同じ副次集団内で起こっている。高度免疫を受けていないCH1トランスジェニックマウス同にVH251遺伝子の広範な体細胞突然変異は見られないが、特定の実験を受けていないHC2トランスジェニックマウスにおいてはVH56p1及びVH51p1遺伝子の中で著しい体細胞突然変異が発見された。生後9週間の免疫化を受けていない雌のHC2トランスジェニック動物から脾臓及びリンパ節RNAを分離した。我々は、V及びγ1特異的プライマを用いてHC2トランスジーン内の4つのV領域の各々を取込むγ1写しを個別に増幅した。特異的PCR産物の各々の相対的収量はVH56p1≫VH51p1>VH4.21>VH251であった。この技術は厳密に定量的ではないものの、HC2マウス同でのVセグメントの使用における偏りを表わす可能性がある。図82は、4つのV特異的プライマ全ての等モル混合物を用いたPCR増幅から誘導された、無作為にとり上げた23個のγ1cDNA配列を示している。ここでも又、VH56p119/23クローン向かっての偏りが見られる。さらに、VH56p1配列は、V遺伝子セグメント内で2.1の全体的頻度で、著しい体細胞突然変異を示している。CDR3配列を検査すると、19のうち17の個別のVH56p1クローンが固有のものであるけれども、それらがわずか7つの異なるVDJ組換え事象のみから誘導されている、ということかわかる。従って、特定の実験を受けていない動物において、恐らくは内因性病原体又は自己抗原によりVH56p1発現B細胞が選択されるように思われる。この同じ遺伝子がヒトの胎児能力範囲内で過剰表示されることが適切である可能性がある。要約上流シス作用性配列は、個々のスイッチ領域の機能性を規定し、クラススイッチには必要なものである。HC1トランスジーン内のクラススイッチが二次応答に関与する細胞に大幅に制限されており、全B細胞集団を横切って無作為に発生しないという我々の観察は、トランスジーンと共に内含される最低限の配列が充分なものであるということを示唆している。この構成体の中に内含されるγ配列は、γ1不稔写しの開始部位の上流わずか116個のヌクレオチドのところで始まっていることから、スイッチ調節領域はち密なものである。我々の結果から、これらの重要なシス作用性調節要素が個々のγ遺伝子に密に連鎖されているか又はHC1及びHC2トランスジーン内に含まれている3′重鎖エンハンサーと結びつけられているかであるということが立証される。HC1及びHC2インサートは、体細胞突然変異を受けている可能性の高い配列に対するマーカーとして役立ちうるトランスジーン自律性クラススイッチを受けていることから、我々は内因性遺伝子座へのトランスロケーションに由来したものでない高度に突然変異を受けた写しを容易に見い出すことができた。我々は、3つの独立したトランスジェニック系統2つのHC1系統及び1つのHC2系統の中に体細胞突然変異を受けたγ写しを見い出した。従って、トランスジーンの組込み部位にフランキングする配列がこのプロセスに影響を及ぼすという可能性は低い:その代り、トランスジーン配列は、体細胞突然変異を導くのに充分なものである。実施例36この実施例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座について同型接合であり、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖をコードするトランスジーン配列を含むマウスからのハイブリドーマの生成について記述する。ここで記述されるハイブリドーマは、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌し、T細胞上で発現される予め定められた抗原に結合する。この実施例は同様に、ヒト由来の免役原ヒトCD4に応えてヒト配列抗体を作るマウスの能力、及びヒト抗原と反応性あるヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るための供給源としてのかかるマウスの適性をも立証する。A.ヒトCD4抗原で免疫化されたHC1トランスジェニックマウスから誘導されたヒトIgモノクローナル抗体の生成機能的に分断されたJH遺伝子座について同型接合でしかも、ヒト配列重鎖をコードするべく再配置可能なトランスジーン及びヒト配列軽鎖をコードするべく再配列可能なトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスを免疫化した。マウスの遺伝子型はHC1-26KCle-1536JHDJKDであり、これはマウス重鎖失活に対する同型接合、及びHC1ヒト配列重鎖トランスジーン及びKCleヒト配列軽鎖トランスジーン生殖細胞系統コピーの存在を表わしていた。マウスを、安定した形でトランスフェクションされたポリヌクレオチドによりコードされたマウスーヒトハイブリッドCD4分子を発現するEL4細胞系統ATCCの変異体で免疫化した。発現されたCD4分子は、実質的にヒト様のCD4配列を含む。100μlの完全フロイントアジュバントCFAを伴う100μlのPBSの中の約5×105の細胞を、0日目に1腹腔内注入を介してマウス体内に導入した。7日目、14日目、21日目、28日目、60日目及び77日目に接種をくり返し行ない、18日目、35日目及び67日目にテスト出血を行なった。81日目に脾臓を除去し、標準的な方法PEG融合により約12×107の融合パートナ-細胞P3×63Ag8.653細胞系統:ATCCに対して約7.2×107の脾細胞を融合させ、RPMI1640.15FCS,4mMグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウムにHAT及びPSN培地を加えたものの中で培養させた。多数の融合を実施した。ハイブリドーマを成長させ、CHO細胞内で発現された精製組換え型可溶性ヒト配列CD4AmcricanBioTechnologics.Inc.Cambridge,MA及び/又はNEWDuPontから得られるCD4といった市販の供給源に対する結合力について、ELISAを用いて上清をテストした。ABT試料は、ヒトCD4のV1~V3ドメインから成る精製された55kOのヒトCD4分子を含んでいた。検定プレートに対して、組換え型ヒト配列CD4CHO-K1細胞内で産生されたものを吸着させ、ハイブリドーマ上清からの抗体を捕獲するのに用い、次に捕獲した抗体を、ヒトμ、ヒトκ、ヒトγ、マウスμ又はマウスκのいずれかを結合する抗体のパネルに対する結合力について評価した。1つのハイブリドーマを、1F2と呼ばれるその培養プレートウエルからサブクローニングした。ABTCD4調製物に対して結合された1F2抗体は、ヒトμ及ひヒトκについて陽性であり、ヒトγ、マウスγ及びマウスκについて陰性であった。B.ヒトCDd及びヒトIEで免疫化されたHC2トランスジェニックマウスから誘導されたヒトIgモノクローナル抗体の生成重鎖トランスジーンHC2は図68に示され、上で記述したきた実施例34参照。図68に記されているヒト軽鎖トランスジーンKCo4は、マウスゲノム内の単一部位での2つの個別にクローニングされたDNAフラグメントの同時組込みにより生成される。フラグメントは4つの機能的VKセグメント、5Jセグメント、CKエキソンそしてイントロン及び下流の両方のエンハンサー要素を含んでいる実施例21参照Meyer及びNeuberge,EM80J.819591964judde及びMax.MolCellBiol12:52065216。2つのフラグメントは共通の3Kb配列を共有していることから図67参照、これらは、重複する配列の間の相同組換えの後、隣接する43kbのトランスジーンとしてゲノミックDNAの中に潜在的に組込まれうる。かかる組換え事象は、重複するDNAフラグメントの微量注入の時点で頻繁に発生することが立証されてきたPieperetal..NucleicAacidsRes20:12591264。同時注入されたDNAは同様に接合体内に同時組込みされる傾向をもち、個々にクローニングされたフラグメント内に含まれた配列は、その後B細胞の発達中DNA再配置により連結されることになる。表8は、トランスジェニック系統のうち少なくとも2つからのトランスジーンインサートが機能的であることを示す。4つのトランスジーンコーディングを受けたVセグメントの各々及び5Jセグメントの各々を取込んだVJ連結の例が、この36クローンの組の中に表わされている。上記の表はKCo4トランスジェニックマウスにおけるヒト軽鎖V及びJセグメントの使用を示す。この表は、示されたヒトカッパー配列を含有する、2つのトランスジェニック系に由来するcDNAから増幅されたPCRクローンの数を示す。w個々のKCo4トランスジェニックマウスマウス8490、3mo、雄性KCo4系4437;マウス8867、2.5mo.、雌性、KCod系4436から単離された脾臓RNAを用いてcDNAを合成した。Ck特異的オリゴヌクレオチド5TAGAAGGAATTCAGCAGGCACACAACAGAGGCAGTTCCA3′、並びに2つのVk特異的オリゴヌクレオチド5′AGCTTCTCGAGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCC3′及び5′CAGCTTCTCGAGCTCCTGCTACTCTGGCTCCAGATACC3′の1:3混合物を用いてPCRによりcDNAを増幅した。このPCR生成物をXhoI及びEcoRIにより消化し、そしてプラスミドベクター中にクローニングした。各動物からの無作為にとり上げた18個のクローンにつき、ジデオキシチェンターミネージョン法により部分ヌクレオチド配列を決定した。各クローンの配列を未組換えunrearrangedトランスジーンのジァームライン配列と比較した。23の軽鎖ミニ遺伝子座陽性及び18の重鎖陽性マウスが、注射した胚から発達した。機能的マウス重鎖及びκ軽鎖遺伝子座が無い状態でヒト重鎖及びκ軽鎖を含むマウスを得るため、内因性マウス重鎖系jHD及びκ軽鎖遺伝子座系JCKDの中にターゲティングされた突然変異を含むマウスを用いて、これらのマウス及びその後代を繁殖させた。これらのマウスにおいて、あったとしても、マウスの軽鎖の寄与のみがマウスλ遺伝子座からのものである。表7は、体細胞突然変異がトランスジェニックマウスのトランスジーンコーディングを受けたヒト重鎖写しの可変領域の中で発生することを示している。HC2トランスジニニックマウスがらの23のcDNAクローンを部分的に配列決定して可変領域内の生殖細胞系統コーディングされていないヌクレオチドの頻度を決定した。データには各クローンからのVセグメントコドン17~94の配列のみが含まれており、N領域は含まれていない。RNAは、マウス5250の脾臓及びリンパ節から分離したHC2系統2550半接合、JHD同型接合、記述されているとわり参考一本鎖cDNAを合成し、γ写しをPCRで増幅した。増幅したcDNAをプラスミドベクターにクローニングし、ジデオキシ読み終り方法により23の無作為にとり上げたクローンを部分的に配列法定した。PCR導入されたヌクレオチド変更の頻度は、恒常領域成配列から<0.2として見積られる。フローサイトメトリー我々は、FACScanフロー血球計算器及びLYSISIIソフトウェアBectonDickinson,SanJose.CAを用いて染色した細胞を分析した。以下の試薬を用いて脾細胞を染色した;ヨウ化プロビシウム分子プローブ、Eugene,OR、フィコエリトリン接含されたα-ヒトIgκクローンHP6062;Caltag,SSanFrancisco,CA、フィコエリトリン接合されたα-マウスIgκクローンX36;BectonDickinson,SanJose.CA、FITC接合されたα-マウスIgλクローンR26-46;Pharmingen,Sandiego,CA、FiTC接合されたα-マウスIgμクローンR6-602;Pharmingen,Sandiego,CA、FITC接合されたα-ヒトIgμクローンG20-127Pharmingen.SanDicgo,CA、及びCy-クロム接合された抗-マウスB220クローンRA3-6B2;Pharmingen.SanDiego,CA。ヒトIgトランスジーンの発現図83は、JHD及びJCKDの両方の突然変異について同型接合であるKCo4及びHC2マウスからの脾細胞のフロー血球計算法による分析を示す。ヒト配列HC2トランスジーンはJHD突然変異バックグラウンド内でのB細胞の発達を救助し、脾臓内のB220細胞の相対的数を野生型動物の約半分まで回復させた。これらのB細胞はトランスジーンコーディングを受けた重鎖を用いた細胞表面免疫グロブリンレセプタを発現した。ヒトKCo4トランスジーンは同様に機能的であり、無傷の内因性λ軽鎖遣伝子座をうまく競合した。重鎖及び軽鎖ヒトトランスジーンを両方共含む2重トランスジェニックJHD/JCKD同型接合突然変異体マウスの中のB脾細胞のほぼ95が、完全にヒト細胞表面IgMκを発現した。血清Igレベルを以下のとおりELISAによって決定した:ヒトμ:マウスMabαヒトIgMクローンCH6、結合部位、Birmingham,UKでコーティングされベルオキシダーゼ接合されたウサキαヒトIgMfccat309-035-095,JacksonImmunoResearch.WestGrovePAで発達させられたマイクロタイターウエル。ヒトγ4:マウスMAbαヒトIgGlクローンHP6069,Calblochem,LaJolla,CAでコーティングされ、ベルオキシダーゼ接合されたヤギαヒトIgGfccat109-036-098.JacksonImmunoResearch,WestGvove,PAで発達させられたマイクロタイターウエル。ヒトκ:マウスMabαヒトIgκcat0173.AMAC.Inc,IgκcatA7164,SigmaChem.Co,StLouis.NOでコーティングされマイクロタイターウエル。マウスγ:ヤギαマウスIgGcat115-006-071.JacksonImmunoResearch,WestGrove,PAでコーティングされたマイクロタイターウエル。マウスλ:ラットMAbαマウスIgλcat02171D.Pharmingen,SanDiego,CAでコーティングされ、ペルオキシダーゼ接合されたウサギαマウスIgMfccat309-035-095,JacksonImmunoResearch,WestGrovePAで発達させられたマイクロタイターウエル。結合したペルオキシダーゼを、過酸化水素及び2,2′-アジノ-ビス-13-エチルベンズチアゾリン-6-スルフォン酸、SigmaChemCoStLouis,MOを用いたインキュベーションにより検出する。反応産物を、415nmでの吸収により測定する。2重トランスジェニックマウスは、血清中で完全にヒトの抗体をも発現する。図84は、いくつかの異なるトランスジェニック創立者動物から誘導された重及びカッパ軽鎖失活について同型接合である18の個々の2重トランスジェニックマウスに関する免疫グロブリンタンパク質の測定された血清レベルを示す。我々は、検出可能なレベルのヒトμγ1及びκを発見した。我々は以上で、発現されたヒトγ1がトランスジーンμ及びγ1スイッチ領域の間のゲノミック組換えによる真正なクラススイッチの結果として得られるということを示した。その上、我々は、トランスジーン内邪のクラススイッチが重鎖可変領戚の体細胞突然変異により達成されることを発見した。ヒト免疫グロブリンに加えて、我々は血清内のマウスγ及びλをも発見した。内因性遺伝子座が完全に無傷であることからマウスλタンパク質の存在が予想される。我々は他の箇所で、マウスγ発現が、内因性重鎖遺伝子座内へのトランスジーンVDJセグメントのトランススイッチ組換えの結果であるということを示した。当初野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたVDJトランスジーンについて立証されていたこのトランススイッチ現象Durdiketal,ProcNatlAcadSciUSA86:23462350;Gersteinetal,細胞63:537548は、下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要累がなおも無傷であることから、突然変異体JHDバックグラウンド内で起こる。2重トランスジェニックマウス内のヒトIgMκの血清濃度は約0.1mg/mlであり、動物間又ば系統間での偏差はほとんど無い。しかしながら、ヒトγ1、マウスγ及びマウスλレベルは0.1~10マイクログラム/mlの範囲に及んでいる。個々の動物間で見られたγレベルの変動は、γが誘発可能な恒常領域であるという事実の結果である可能性がある。発現はおそらく、動物の健康、抗原に対する露呈そして場合によってはMHCタイプといった要因により左右されると思われる。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック系統と相関すると思われる唯一のパラメータである。1回の組込みあたりのトランスジーンのコピー数が最も少ない約1~2コピーKCo4系統4436マウスは、最高の内因性λレベルを有し、一方KCo4系統の4437マウス組込み一回あたり~10コピーは最低のλレベルを有する。これは、κトランスジーンに続いて内因性λが再配置し、血清λレベルが選択されずその代りに前駆体B細胞プールの相対的サイズを反映しているような1つのモデルと一貫性をもつ。多数の軽鎖インサートを含むトランスジーン遺伝子座は、1つ以上のV~Jへの組換え事象を受げる磯会を有する可能性があり、そのうちの1つが機能的なものとなる確率は増大する。かくして、高いコピー系統は、より小さい潜在的λ細胞プールを有することになる。ヒトCD4及びIgEでの免疫化免疫応答に参加するトランスジェニックB細胞の能力をテストするために、我々はヒトタンパク質抗原で2重トランスジェニックマウスを免疫化し、ELISAにより抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。腹腔内注入により完全フロイントアジュバント内のポリスチレン溶球cat08226,PolysciencesInc,Warrington,PAに共役結合された50μg組換え型sCD4cat,013101,AmericanBioTechnologieslnc,Cambridge,MAでマウスを免反化した。マウスの各々は、内因性μ及びκ遺云子座の分断について同型接合であり、ヒト重鎖トランスジーンHC2系統2500及びヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4系統4437について半接合である。方法血清試料を、組換え型sCD4でコーティングされたマイクロタイターウエルへと希釈させた。ベルオキシダーゼ接合されたウサギαヒトIgMfcJacksonImmunoResearch,WestGrove,PA又はベルオキシダーゼ接合されたヤギの抗ヒトIgκSigma,StLouis,MOを用いて、ヒト抗体を検出した。図85は、組換えヒト可溶性CD4で免疫化されたトランスジェニックマウスの一次応答を示す。免疫化された4匹の動物は全て、抗原特異的ヒトIgM応答を1週間目に示す。CD4特異的血清抗体は、ヒトμ重鎖及びヒトκ軽鎖の両方を含んでいる。HC2トランスジーンの二次応答に参加する能力を評価するため、我々は、抗原を反復的に注入することによりトランスジェニックマウスを高度免疫し、誘発された抗体の重鎖アイソタイプを監視した。ヒト重鎖トランスジーンHC2及びヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4について同型接合であるマウスを、0日目に完全フロイントアジュバント内の25μgのヒトIgEκTheBindingSiteirmingham,UKで免疫化した。その後、約一週間おきで不完全フロイントアジュバント中でIgEκをマウスに注入した。血清試料を1対10の割合で希釈させ、ヒトIgE,λでコーティングされたプレート上で抗原特異的ELISAを行なった。図86は、これらの動物からの免疫応答の標準的時間的経過を示している。我々は、完全フロイントアジュバント中のヒトIgEを2重トランスジェニックマウスに注入し、その後週一回、不完全フロイントアジュバント内のIgEで追加免疫した。初期ヒト抗体応答はIgMκであり、その後抗原特異的ヒトIgGκが現われた。これらのマウス内の誘発された血清抗体は、ヒトIgM又はBSAに対していかなる反応反応性も示さなかった。ヒトIgGの経時的発達、原文抜け。我々は、重鎖トランスジーンのインビトロでのクラススイッチを受ける能力もテストした:同じ重鎖構成体HC2、系統2550について半接合である脾臓B細胞が精製された形の動物は、LPS及び組換え型マウスIL-4の存在下で、ヒトIgMからヒトIgG1へとスイッチする。しかしながら、インビトロスイッチは、LPS及び組換え型マウスIL-2又はLPS独自の存在下で起こらなかった。2重トランスジェニック/2重ノックアウト0011マウスの脾臓、リンパ節、腹膜及び骨髄内にヒトIgM発現細胞が見られる。腹腔には正常な数のB細胞が含まれているものの、骨髄及び脾臓中のトランスジェニックB細胞の絶対数は、正常値の約10~50である。トランスジーン依存性のB細胞の発達における遅延の結果として、減少がもたらされる可能性がある。2重トランスジェニック/2重ノックアウト0011マウスは同様に、これらのマウスにおけるヒトμ、γ1及びκのレベルが有意なものである状態で、血清中で完全にヒトの抗体を発現する。発現されたヒトγ1は、トランスジーンμとγ1のスイッチ領域の間でのゲノミック組換えによる真正のクラススイッチの結果として得られる。さらに、トランスジーン内のクラススイッチには、トランスジーンによりコードされた重鎖可変領域の体細胞突然変異が伴う。ヒト免疫グロブリンに加えて、これらのマウス内にはマウスμ及びマウスλが見られる。マウスμ発現は、トランスジーンVDJ遺伝子が内因性マウス重鎖遺伝子座内に組込まれるトランススイッチ組換えの結果であると思われる。もともと野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたVDJトランスジーンについて文献内に見られたトランススイッチは、マウス下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなおも無傷であることから、我々のJHバックグラウンド内で起こる。トランスジェニックB細胞の免疫応答に参加する能力を実証するため、我々は、ヒトタンパク質抗原で0011マウスを免疫化し、抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを監視した。初期ヒト抗体応答はIgMであり、その後抗原特異的ヒトIgGの発現が続く図86及び図88。ヒトIgG抗体が現われる前の遅延は、抗原に対する二次応答とクラススイッチの間の結びつきと一貫性をもつヒトCD4で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいては、CD4抗原に対するヒトIgGの反応性は、2×102~1.6X104の範囲の血清濃度で検出可能であった。抗ヒト体CD4ハイブリドーマの同定ヒト重鎖トランスジーンHC2及びヒトκ軽鎖トランスジーンKCo4について同型接合のトランスジェニックマウスを、0日目に完全フロイントアジュバント内の組換え休ヒトCD420μgで免疫化した。その後、約一週間の間隔をおいて不完全フロイントアジュバント中のCD4をマウスに注入した。図88は、トランスジェニックマウスの血清中のヒトCD4に対するヒト抗体応答を示す。血清試料を1:50で希釈し、ヒトCD4でコーティングされたプレート上で抗原特異性ELISAを行なった。各々のラインは、個々の試料の測定値を表わす。黒丸はIgMを、白丸はIgGを表わす。我々は同様に、ヒトCD4免疫化に応答したマウスの一匹からハイブリドーマ細胞系統も分離した。クローニングされたハイブリドーマのうちの5つは、組換え型ヒトCD4に結合しその他の糖タンバク質抗原のパネルと交又反応しないELISAにより測定される通りヒトIgGκヒトγ1/ヒトκ抗体を分泌する。IgGκハイブリドーマ、4E4.2及び2C5.1の2つにより分泌されたモノクローナル抗体に対する免疫化用ヒトCD4抗原の結びつき及び解離の速度を測定した。実験的に誘導された結合定数Kaはそれぞれ抗体4E42及び2C5.1について約9×107M1及び8×101であった。これらのKaの値、その他の者による臨床的試験に万いて用いられてきたChenetalIntImmunol.6647マウスIgG抗ヒトCD4抗休の範囲内に入る。ライン749d0012;HCl-26;;JHD,JKD;KC2-1610のマウスを0日目、13日目、20日目、28日目、33日目及び47日目にヒトCD4で免疫化すると、ヒトκ及びヒトμ又はγから成る抗ヒトCD4抗体を産生した。28日目に、血清中にヒトμ及びヒトκが見られた。47日目までに、ヒトCD4に対する血清応答には、ヒトμ及びヒトγよらびにヒトκが含ミれていた。50日目に、P3×63-Ag8.653マウス骨髄腫細胞で脾細胞を融合させ、培養した。700のウエルのうち446.3がヒトγ及び/又はκ抗ヒトCD4モノクローナル抗体を含んでいた。これらのウエルのうち3つは、ヒトγ抗CD4モノクローナル抗体を含んでいることが確認されたが、ヒトκ鎖おそらくはマウスλを発現するが欠如していた。9つの1次ウエルは、完全にヒトのIgMκ抗-CD4モノクローナル抗体を含んでおり、さらなる特徴づけのため選択された。完全にヒトのIgMκ抗-CD4モノクローナル抗体を発現する1つのこのようなハイブリドーマを2CII-8と呼称した。限界希釈法により一次ハイブリドーマをクローニングし、CD4に対して反応性あるヒトμ及びκモノクローナル抗体の分泌について評価した。9つのハイブリドーマのうち5つがCD4ELISAにおいて陽性にとどまった。ヒトCD4についてのこれらのヒトIgMκモノクローナル抗体の特異性は、オバルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘマシアニン及びガン胎児性抗原を含むその他の抗原との反応性が欠如していることによって実証された。これらのモノクローナル抗体が細胞表面上のCD4例えば未変性CD4を認識できるか否かを見極めるため、CD4T細胞系統、SupT1との反応性について、これら5つのクローンの上清もテストした。5つのヒトIgMκモノクローナル抗体のうち4つがこれらのCD4細胞と反応した。これらのIgMκモノクローナル抗体の特異性をさらに確実にするため、これらの抗体で、分離されたばかりのヒト末梢血リンパ球PBLを染色した。5つの一次ハイブリッドのうちの4つから誘導されたクローンからの上清はCD4リンパ球のみに結合し、CD8÷リンパ球には結合しなかった図87。図87は、ヒトPBLとのIgMκ抗CDdモノクローナル抗体の反応性を示す。ヒトPBLを各クローンからの上清又はアイソタイプ整合された負の対照モノクローナル抗体及びそれに続くPEに接合されたマウス抗ヒトCD4モノクローナル抗体上段又はFITCに接合されたマウス抗ヒトCD8Ab下段のいずれかを用いてインキュベートした。それぞれFITC又はPEに接合されたマウス抗ヒトμで、あらゆる結合したヒトIgMκを検出した。クローンの1つ、2C11-8及び対照IgMκ左側についての代表的結果が示されている。予想通り、負の対照IgMκはT細胞と反応せず、ヤギ抗ヒトμは、おそらくはヒトB細胞である約10のPBLと反応した。IgMκ抗-CD4モノクローナル抗体の産生のレベルの高さ及び優れた成長は、発達のためのクローナルハイブリドーマ細胞を選択する上で重要な要因である。ハイブリドーマのlつ2C11-8からのデータは、最高5pg/細胞/日が産生されうることを示している図89。第2のクローンの場合にも類似の結果が見られた。-般に観察されるように、細胞が定常期成長に入るにつれて産生は劇的に増大する。図89は、細胞の成長及び小規模培養におけるヒトIgMκ抗-CD4モノクローナル抗体の分泌を示す。総量2mlの甲に1mlあたり2×105細胞の割合で重複培養を播種した。その後4日間24時間毎に、培養を収穫した。生存可能な細胞を計数することにより細胞の成長を決定し、全ヒトμ上の図版についてELISAによりIgMκ産生の量を計った。IgMκの量を細胞の数で除することにより、一日細胞一個あたりの産生を計算した下の図版。図90は、ヒトIgMκ抗-CD4モノクローナル抗体のエピトープ地図作製を示す。IgMκ抗-CD4モノクローナル抗休2C11-8HB11668により認識されるエピトープを位置設定するため競合結合フロー皿球計算実験を使用した。これらの研究のためには、CD4上の重復しないユニークエピトープに結合するマウス抗CD4モノクローナル抗体Leu3a及びRPA-T4を用いた。減少する濃度のRPA-TA又はLeu-3aのいずれかで予備インキュベートされその後ひきつづき2C11-8で染色させたCD4÷細抱のPE螢光を、PE接合されたヤギ抗ヒトIgMで検出した。Leu3aによるヒトIgMκ抗-CD4モノクローナル抗体2C11-8の結合については濃度依存性競合が存在したが、RPA-T4によるその結合については存在しなかった。かくして、2C11-8により認識されたエピトープは、モノクローナル抗体Leu3aにより認識されたエピトープと類似していたか又は同一であったが、RPA-T4により認識されたものとは全く異なっていた。要約すると、我々は、未変性ヒトCD4と特異的に反応しヒトPBLSをCD4及びCD4副次集団へと弁別するのに用いることのできるヒトIgMκモノクローナル抗体を分泌する複数のハイブリドーマクローンを産生した。これらの抗体のうち少なくとも1つはモノクローナル抗体Leu3aにより構成されたエピトープに又はその近くに結合する。このエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体は、混合型の白血球応答を阻害するものであることが示されてきたEnglemanetalJEypMed153:193。モノクローナル抗体Leu3aのキメラバージョンは、菌状患肉腫を患う患者においていくつかの臨床的効力を示したKnoxetalBlood77:20。われわれは、3つの異なるハイブリドーマ細胞系2C118、2C51および4E42からcDNAクローンを分離し、これらの細胞系のそれぞれにおいて、発現された免疫グロブリン遺伝子のいくつかの部分的ヌクレオチド配列を決定した。配列の分析のために、全RNAを約5x106ハイブリドーマ細胞から分離した。オリゴdTでの逆転写をプライミングPrimingすることにより、sscDNAを合成した。このsscDNAの部分を、二重PCR反応において使用した。この反応は、HClまたはHC2トランスジーン内に含まれる重鎖可変骨格領域および定常ヒトガンマ配列に特異的な単一の下流オリゴ、またはKC2またはKCo4トランスジーン内に含まれる軽鎖可変骨格領域および定常ヒトカッパ配列に特異的な単一の下流オリゴについて特異性を有するオリゴのプールによってプライムされた。これらのPCR反応からの産物を適当な制限酵素によって消化し、ゲル精製し、そしてpNNO3ベクターへと独立にクローン化した。DNAを分離し、手動のジデオキシおよび/または自動の蛍光配列化反応をdsDNAに行った。3つのハイブリドーマ2C118、2C51および4E42の特性を以下の表11に示す。nd測定せず2つのIgGkハイブリドーマ2C51および4E42からの発現された重鎖および軽鎖配列のヌクレオチド配列分析は、それらが、同じプロゲニターB細胞から誘導された同胞クローンであることを示す。正確なヌクレオチド配列は予定運命体細胞突然変異によって異なるが、2つのクローンからの重鎖および軽鎖VJ接合は一致する。重鎖VDJ結合配列は、である。軽鎖VJ接合は、以下の非生殖細胞系エンコードコドンを同定した予定運命体細胞突然変異:これらの2つのガンマハイブリドーマは、規定された量の体細胞突然変異を受けたB細胞から誘導されたと推断する。このデータは、HC2トランスジェニック動物がVH551akaVH251Vセグメントを使用することを示す。VH434、VHI69およびVH3303がこれらのマウスによって発現されることを、われわれは予め示した。これらの結果の組合せは、HC2トランスジェニックマウスは、ヒトVH遺伝子をエンコードしたトランスジーンの4つすべてを発現することを証明する。ヒト免疫グロブリン発現B細胞は、発生を経験し、かつマウス免疫系の状況において抗原に応答することを我々は推断した。抗原応答性は、免疫グロブリン重鎖イソタイプスウィッチおよび可変領域体細胞突然変異に至る。われわれはまた、慣用のハイブリドーマ技術を、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るために使用することができることを証明した。したがって、これらのトランスジェニックマウスは、ヒトターゲット抗原に対するヒト抗体の供給源を意味する。実施例37この実施例は、不活化された内因性重鎖およびκ鎖遺伝子座についてホモ接合であり、かつ多重下流ヒトCH遺伝子にイソタイプスウィッチ可能なトランスジーンを収容する、トランスジェニックマウスの生成を記載する。この実施例はまた、重複する相同の配列結合図92をみよを含む多重DNAフラグメント断片の共ミクロ注入によって、大きいトラスジーン例えば160kbを集めるためのクローニング方法を証明し、これは、インビボで集められるべきフラグメントの組の、例えばミクロ注入されたES細胞またはそのクローン子孫において、遠位端での複数の相同領域の相同の組換えによって、2より多い重複するフラグメント断片からの大きなトランスジーンの構成を許す。この実施例はまた、とりわけ、トランッスジェニック動物から分離されたリンパ球が、例えばIL4およびLPSを用いて、インビトロでのイソタイプスウィッチを受けるために導入され得ることを示す。5つの異なるプラスミドクローンの組を、プラスミド挿入部が分離され得、実質的にべタター配列がないように;かつ挿入部は共におよそ150kbの長さに及ぶ重複配列の単一の重なった組を形成するように構成した。この組は、ヒトV、D、J、μ、γ3およびγ1コード配列ならびにマウス重鎖3′エンハンサー配列を含む。5つのクローンは、5′から3′順で、pH3V4D、pCOR1xa、p1114、pP1570およびpHP3aである。このクローンの組を生成するために、いくつかの異なるクローニングベクターを使用した。ベクターのいくつかは、大きいトランスジーンを構築する目的で特異的に設計された。これらのベクターは、pUCベクターより細胞当たりのコピ数が低く保持されたpBR322に基づくプラスミドであるヤニッシュ-ペロンら、1985年Gene33:103119。これらのベクターはまた、ポリリンカーとプラスミドβラクターゼ遺伝子の3′末端との間にtrpA転写終止シグナルを含む。ポリリンカーは、まれな切断rarecutting酵素NotIについての制限部位によって隣接され;かくして胎児ミクロ注入に先立つベクター配列から挿入部を分離することを見込む。NotI部位の内部で、ポリリンカーは、どちらの末端でも、ユニークXhoIおよびSalI部位を含む。pGPlベクターは、テイラーら、、NucleicAcidsRes23:6287に記載されている。pGP2ベクターを生成するために、pGPlfをまずAlwNIで消化し、合成オリゴヌクレオチドo236およびo237o236、5ggcgcgccttggcctaagaggcca-3:o237、5′cctcttaggccaaggcgcgcctgg3′でライゲートした。得られたプラスミドはpGP2aと呼ばれる。プラスミドpGP2aは次に、KpnIおよびEcoRIで消化され、オリゴヌクレオチドo288およびo289。pGPプラスミドを用いてトランスジーンを構成するための一般的スキームは、図94パスAおよびBに略述されている。要素DNAフラグメントのすべてがまず、pGPベクターにおいて同じ5から3定位方向で独立してクローン化される。挿入部NotI、XhoIおよびSalI部位は、オリゴヌクレオチド突然変異生成によって、または可能なら、部分的消化、ポリメラーゼ充填および平滑末端連結反応によって壊される。これは、各挿入部の5および3末端に、ポリリンカー誘導XhoIおよびSalI部位のみを残す。個々の挿入部は次に、1つのクローンからXhoI/salIフラグメントを分離し、かつ分離されたフラグメントを別のクローンの5XhoIまたは3SalI部位に挿入する方法によって、段階的に結合されることができる。形質転換体を次に、1以上の挿入部フラグメントを用いてフィルターハイブリッド化によってスクリーニングして、集められたクローンを得る。XhoI/SalI結合はいずれの酵素によっても裂くことができないので、得られた産物は、ユニーク5XhoIおよび3SalI部位を維持し、構成の段階で使用され得る。このスキームの変形は、ベクターpGP2aおよびpGP2bを用いて行われる。これらのプラスミドは、アンピシリン抵抗性遺伝子と複製のプラスミド源との間にSfiI部位を含む。SfiIおよびXhoIまたはSalIを用いての切断によって、薬剤抵抗性配列または複製の起源と共に、挿入部が分離され得る。合成の各段階において、1つのSfiI/XhoIフラグメントが、1つのSfiI/SalIフラグメントにライゲートされる。このスキームには、3つの利点がある:アンピシリンの存在中で、両方のフラグメントからの配列がプラスミドの複製に必要とされるので、バックグラウンド形質転換体が減らされる;iiライゲーションは単一の5から3定位方向でのみ起こり得る;およびSfiI末端が自己和合性でなく、SalIまたはXhoIと和合性でなく、かくして非生産的ライゲーションのレベルを下げる。このスキームの不都合は、挿入部SfiI部位がNotI、XhoIおよびSalIと同様に除去されなければならないことである。これらの培地複写ベクターは、よく使われるpUC誘導クローニングベクターより改良されている。これらのベクターの能力を比較して大きいDNA挿入部を維持するために、ヒトJHCμ領域を含む43kbのXhoIフラグメントを、pSP72プロメガ、マジソン、WI、pUC19BRL、グランドアイラインド、ニューヨークおよびpGP1fのSalI部位にライゲートした。形質転換体クローンをニトロセルロースに移し、挿入部を含むクローンを放射能標識したプローブでのハイブリッド化により選択した。正のクローンを3mlの培地で一晩育て、DNAを分離した:得られたDNAのEcoRI消化は、すべてのpSP72およびpUC19誘導クローーンが挿入部を欠失した図95が;18のpGP1f誘導クローンのうちの12が完全な挿入部を含んでいたことを示す。両方の定位方向が、これらの12のクローンにおいて示される。HCo7トランスジーンを生成するために使用された5つのクローンpH3V4D、pCOR1xa、p1114、pP1570およびpHP3aの構成および分離を以下に略述する。pH3V4D生殖細胞系配置重鎖可変遺伝子セグメントを、VH1およびVH3クラスについての合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ファージ1ゲノムDNAライブラリーから分離した。VH1クラスプローブは、o49であった:5gttaaagaggattttattcacccctgtgtcctctccacaggtgtc3VH3クラスプローブは、o184であった:5gtttgcaggtgtccagtgtaggtgcagctgtggagtcg3正にハイブリッド化されたクローンを分離し、部分的に制限地図を作成し、サブクローン化し、そして部分的に配列した。ヌクレオチド配列から、o49プローブで分離されたVH1クローンの1つが、hv1263遺伝子の公開された配列に含まれたものと一致するアミノ酸配列を含む、VH遺伝子セグメント、498をエンコードすることが決定された、ArthritisRheum32:72。0184プローブで分離されたVH3遺伝子のうちの3つ、1843、18414、および18417は、VH遺伝予DP50、DP54およびDP45について公開されたものに含まれるものに一致するアミノ酸配列をエンコードする配列を含んでいたトムリンソンら、、JMolBiol227:776。これら4つのVH遺伝子は、pH3V4Dプラスミドを構築するために使用された。1843遺伝子は、3kbのBamHIエフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカーのXhoI部位が遺伝子の5であり、かつSalI部位が3であるように、プラスミドベクターpGP1fへとサブクローン化された。得られたプラスミドはp184336fと呼ばれる。18414遺伝子は、48kbのHindIIIフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、遺伝子がさらに、遺伝子のゲノムXhoI部位07kb上流でおよびポリリンカーが誘導した遺伝子のsalI部位3でのXhoIsalI消化によって35kbのフラグメントとして分離され得るような定位方向で、プラスミドベクターpUC19へとサブクローン化された。得られたプラスミドはp184141と呼ばれる。18417遺伝予は、57kbのHindIIIフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカー誘導XhoIおよびSalI部位がそれぞれ、遺伝子の5および3であるような定位方向で、プラスミドベクターpSP72プロメガ、マジソン、WIへとサブクローン化された。このプラスミドの挿入部は、XhoIでの部分消化、クレノーフラグメント充填、および再ライゲーションによって除去された遺伝子の3末端にXhoI部位を含む。得られたプラスミドはp18417SKと呼ばれる。498遺伝子は、63kbのXbaIフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリンカー誘導XhoIおよびClaI部位がそれぞれ、遺伝子の5および3であるような定位方向で、プラスミドベクターpNNO3へとサブクローン化されて、プラスミドpVH498を作ったテイラーら、、InternationalImmunol6:579。pVH498のXhoI/ClaI挿入部を次に、pGP1fへとサブクローン化して、プラスミドp498fを作り、これは、ユニークXhoIおよびSalI部位をそれぞれ498遺伝子の5および3末端に含む。p184141の35kbのXhoI/SaIIフラグメントを、p184336fのXhoI部位にクローン化して、プラスミドpRMVH1を生じ、これは18414および1843遺伝子の両方を同じ定位方向に含む。このプラスミドをXhoIで消化し、そしてp18417SKの57kbのXhoI/SalIフラグメントを挿人してプラスミドpRMVH2を作り、これは5から3へ、3つのVH遺伝子、18417、18414および1843を、すべて同じ定位方向で含む。プラスミドpRMVH2を次にXhoIで切断し、そしてp498fの63kbのXhoI/SalI挿入部を挿入してプラスミドpH3VH4を作り、これは5から3へ、4つのVH遺伝子、498、18417、18414および1843を、すべて同じ定位方向で含む。ヒトD領域クローンpDH1の106kbのXhoI/EcoRV挿入部前述した;例えば実施例12においてを、XhoI/EcoRV消化pGPeプラスミドベクターへとタローン化して新しいプラスミドpDH1eを作った。次にこのプラスミドをEcoRVで消化し、そしてSaIl部位を含む合成リンカーフラグメント5ccggtcgacccg3でライゲートした。得られたプラスミド、pDH1esは、XhoI部位は5末端にあり、Sa1l部位は3末端にあるように、XhoIおよびSalIで除去され得る挿入部内にヒトD1クラスターのほとんどを含む。この挿入部を分離し、pH3VH4のSalI部位にクローン化してプラスミドpH3VH4Dを作り、これは4つの生殖細胞系配置ヒトVH遺伝子セグメントおよび8つの生殖細胞系配置ヒトDセグメントを含み、すべてが同じ5から3への定位方向にある。このクローンの挿入部は、NotIでの消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離されることができる。pCOR1xa9つのヒトDセグメント、6つのヒトJセグメント、Jμイントロン重鎖エンハンサー、μスウィッチ領域およびCμコードエクソンを含む32kbのXhoI挿入部を含むプラスミドpCUR1前記を、XhoIで部分的に消化し、クレノ一処理し、そして合成SalIリンカーライゲートして、新しいプラスミドpCOR1xaを生じ、これはユニークXhoI部位を5末端に有し、ユニークSalI部位を3末端に有する。pCOR1およびpCOR1xaの両方が06kbのラット重鎖3エンハンサーフラグメントを3末端に含み、これは、プラスミドがXhoIまたはXhoI/salIの代わりにNotIで消化されるなら、挿入部に含まれる。pP1570ファージP1ライブラリーGenomesystemsIncセントルイス、ミズーリ州を、次のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてPCRによってスクリーニングした:5tcacaagcccagcaacaccaag35aaaagccagaagaccctctccctg3このプライマー対を、ヒトγ遺伝子鋳型を有する216bpPCR産物を生成するようにデザインした。同定されたP1クローンの1つはヒトγ3およびγ1遺伝子の両方を80kbの挿入部内に含むことが見出された。このクローンの挿人部図96に示すは、NotIおよびSa1Iでの消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離することができる。p1114ヒトγ3/γ1クローンP1-570の制限酵素地図化は、挿入部の5末端に近い14kbのBamHエフラグメントを示した。この14kbのフラグメントを、ポリリンカー誘導SalI部位が挿入部の5末端に隣接するように、プラスミドベクターpGP1fへサブクローン化した。得られたプラスミドはpB14と呼ばれる。別に、プラスミドクローンpJ1NAチョイら、1993年NatureGenetics4:117から誘導された、ヒトμ遺伝子の3末端およびヒトδ遺伝子の5末端をカバーする11kbのNdeI/SpeIゲノムDNAフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドアダプターを用いて、pBluescrlptStratageneLaJollaCAのSalI部位へサブクローン化した。次に、得られたSalI挿入部を分離し、pJ1NAからのμフラグメントの5から3への相対的定位方向がP1-570からのγフラグメントと同じであるように、pB14のSalI部位へクローン化した。得られたクローンはp11-14と呼ばれる。このクローンの挿入部は、NotIでの消化によって、ベクター配列を実質的に含まず、分離することができる。pHP3aマウス重鎖3エンハンサーダリアバッハら、1991年EurJImmunol21:1499;リーべルソンら、1991年NucleicacidsRes19:933をbalbcマウスゲノムDNAファージλライブラリーからクローン化した。プローブを得るために、全balbcマウス胸腺DNAを、以下の2つのオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅のための鋳型として使用した:cck76:5-caataggggtcatggaccc3’cck77:5tcattctgtgcagagttggc3’得られた220bpの増幅産物を、TAクローニング商標キットInvitrogen、サンジエゴ、CAを用いてクローン化し、挿入部を、マウスファージλライブラリーをスクリーニングするために使用した。得られたファージクローンの1つからの正にハイブリッド化された58kbのHindエエエフラグメントをpGP1fへサブクローン化した。このサブクローンの挿入部、pHC3ENfaの定位方向は、ポリリンカーXhoI部位が挿入部の5末端に隣接し、SalI部位が3末端に隣接するような方向である。このHindIIフラグメントの部分のヌクレオチド配列分析は、それが3重鎖エンハンサーを含むことを確認した。pHC3ENfaの挿入部はエンハンサー配列のコアで、ECoR1部位の約19kb上流にXhoI部位を含む。このXhoI部位は、部分消化、クレノー充填および再ライゲーションによって除去されて、クローンpH3Efxを作り、これはユニークXhoIおよびSalI部位をそれぞれ、挿入部の5および3末端に含む。ヒトγ3/γ1クローンP1-570の3末端を次のようにしてサブクローン化した:P1-570DNAをNotIで消化し、クレノー処理し、次いでXhoIで消化し;そして13kbの末端フラグメントを分離し、プラスミドベクターpGP2bBamHIで消化し、クレノー処理し、次いでXhoIで消化されているへライゲートした。得られたプラスミド、pPX-3は挿人部の5末端でポリリンカーXhoI部位に隣接するポリリンカーNotI部位を失った;しかし、XhoI部位はそのまま残り、挿入部はNotIおよびXhoIまたは、SalIおよびXhoIでの消化により分離され得る。pH3EfxのXhoI/SalI挿入部を含む3エンハンサーを分離し、そしてpPX-3の3SalI部位へライゲートして、プラスミドpHP3aを作った。pHP3a挿人部内にフラグメントを含むエンハンサーは、P1-570クローンの3末端として逆の定位方向でライゲートされる。したがって、pHP3aは内部SalI部位を含み、挿入部はXhoIおよびNotIの消化によって分離される。これはエンハンサー要素であるので、5から3方向は一般に機能のために重要でない。HCo7前核ミクロ注入用のHCo7DNA混合物を調製するために、上記した5つのプラスミドのそれぞれからのDNAを制限酵素で消化し、アガロースゲル上で分離した。クローンpH3V4DをNotIで切断し;pCOR1xaをNotIで切断し;p1114をNotIで切断し;pP1570をNotIおよびSalIで切断し;そしてpHP3aをNotIおよびXhoIで切断した。DNA挿入部を電気溶出し、さらにEtBrなしの平衡CsCl勾配上で精製した。挿入部を注入緩衝液中へ透析し、次のように混合した:50マイクロリットルのpH3V4D挿入部204ng/マイクロリットル;50マイクロリットルのpCOR1xa挿入部208ng/マイクロリットル;50マイクロリットルのp11-14挿入部156ng/マイクロリットル;300マイクロリットルのpP1570挿人部88ng/マイクロリットル;60マイクロリットルのpHP3a挿人部108ng/マイクロリツトル;および149mlの注入緩衝液。HCo7トランスジェニック動物HCo7DNA混合物を、12日令の胚の前核にミクロ注入し、ホーガンらによって記載されているマウスの胚の操作、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバーNYように、この胚を偽妊娠したメスの卵管に移した。テールチップDNAtailtipDNAを、ミクロ注入した胚から発生した202の動物から分離した。ヒトμおよびDH配列を含むプローブを用いた、このDNAのサザンブロット分析は、HCo7トランスジーンの少なくとも一部を組込んだ22の創立動物を示した。図97は、HCo7DNAをミクロ注入された胚から発生した6匹のGO動物の血清におけるヒトμおよびヒトγ1の発現の分析を示す。ヒト免疫グロブリン蛋白質の血清濃度を、ロンバーグら、1994年nature368:865に記載されたELISAによって測定した。これら6匹のマウスのうちの4匹は、サザンブロット分析によるトランスジーンの組み込みの証拠を示し、これらのマウスのうちの3匹は、それらの血清中にヒトμおよびヒトγ1蛋白質の両方を発現した。ヒト免疫グロブリン蛋白質を発現しなかった1匹のトランスジェニックマウスが、サザンブロット分析により、トランスジーンの少数のコピーのみを含むことが決定され、全部のトランスジーンが組込まれなかったこと、またはこのマウスが遺伝モザイクであったことの可能性がある。創立HCo7マウスのうちの2匹、11952および11959は、ヒトκミニ遺伝子座または小遺伝子座トランスジェニックマウスこのマウスはまた、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座ロンバーグら、前述の分裂についてホモ接合であったを用いて繁殖されて、2つの内因性遺伝子座分裂についてホモ接合であり、かつ2つの誘導されたヒトミニ遺伝子座、KCo4およびHCo7についてヘミ接合であるマウスを生じた。これらのいわゆる二重トランスジェニック/二重欠失マウスのうちの5匹を、ヒトIgM、ヒトIgG1およびヒトIgG3の発現について分析した。対照として、3匹のHC2KCo4二重トランスジェニック/二重欠失マウスを分析に含めた。この実験を図98に示す。この図におけるELISAデータを、ロンバーグら前述におけるようにただしヒトIgG3の欠失を除く集め、コーティング抗体はヒトIgG3cat08041、ファーミンゲン、ラジョラ、CAに対して向けられた特異的mAbであり;IgG3アッセイの他の詳細はIgG1について公開されたものと同一であつた。HC2KCo4マウスがヒトIgMおよびヒトIgG1のみを発現し、一方HC2KCo4マウスはまた、これら2つのイソタイプのほかにヒトIgG3を発現する。HCo7マウスにおけるヒトγ3およびχ1の発現はまた、トランスジェニックマウスの脾臓から分離されたRNAから合成されたcDNAのPCR増幅によって検出された。図99は、トランスジェニックマウスの3つの異なる系統からの脾臓cDNAを用いて合成されたPCR増幅産物を示す:系2550はHC2トランスジェニック系であり、系11959および11952はHCo7トランスジェニック系である。単一の残されたcDNAを、テイラーら、、NucleicAcidRes206287に記載されたように、脾臓RNAから合成した。このcDNAを次に、以下の2つのオリゴヌクレオチドを用いて、PCR増幅した:o382:5gtccagaattcggtcagctggtgagtctgg3o383:5ggtttctcgaggaagaggaagactqacggtcc3’このプライマーの対は、ヒトγ転写のヒンジ領域に及ぶPCR産物の合成を支配する。ヒトγ1およびγ3ヒンジ領域の構造の違いの故に、PCR増幅は、これら2つの転写の間を区別する。ヒトγ1鋳型は752bpPCR産物の合成を支配し、一方、ヒトγ3は893bp産物の合成を支配する。ヒトγ1鋳型のみが、HC2系2550およびHCo7系11959脾臓で検出可能であるが、γ1およびγ3転写の両方が、HCo7系11952脾臓で検出可能である。このアッセイの非定量性の故に、かつ個々の動物の間のγ3発現における違い図98においてELISAによって示したの故に、図99におけるHCo7系11959脾臓にγ3を観察することの不能は、γ3がこの系に発現されないことを示さない。HCo7KCo4マウスから分離された牌臓細胞はまた、LPSおよびIL4での刺激によりインビトロで、IgG1およびIgG3の両方を発現するように誘導され得る。この実験は、図100に示される。7周令のオスのHCo7KCo4二重トランスジェニック/二重欠失マウス12496;系11959/4436から分離された脾臓細胞を、単独で、および種々のサイトカインと結合して、胸腺非依存B細胞分裂促進因子、LPSに応答しての免疫グロブリン分泌について試験した。脾臓細胞は、T細胞による細胞障害性除去によって、B細胞が豊富にされた。B豊富にされた細胞を、24のウェルプレート中で、RPMI1640中10FCS2ml中、2x106細胞/ウエルで、培養した。LPSを、10マイクログラム/mlで、すべてのウェルに添加した。IL2を50単位/mlで添加し、IL4を15ng/mlで添加し、IL6を15ng/mlで添加し、γIFNを100単位/mlで添加した。培養物を37°C、5CO2で10日間インキュベートした後、上清をELISAによつてヒトIqG1およびIgG3について分析した。ELIZAのためのすべての試薬は、ジャクソンイムノロジカルズウエストグローブ、PAからのポリクローナル抗血清であったが、ただし、キャプチャー抗ヒトIqMは、ザバインディングサイトバーミンガム、UKからのモノクローナル抗体であった。実施例38この実施例は、ヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座および、多重ヒトVKセグメントを含むYACクローンの共注入coinjectionによる、機能的ヒト軽鎖Vセグメントのマウスゲノムへの好結果の導入を説明する。この実施例は、YACに含まれるVKセグメント遺伝子が、得られたマウスにおいてヒトκ鎖の発現されたレパートリーに寄与することを示す。この実施例は、トランスジーンエンコードヒト免疫グロブリン蛋白質のレパートリー拡張のための方法を証明し、詳細には、ヒトκ鎖可変領域レパートリーが、結合されていないポリヌクレオチドヒト免疫グロブリン可変領域セグメントを含むの共導入の部分を含む、450kbの酵母人工染色体を含む酵母株から分離した。このYACクローンに含まれるVK遺伝子セグメントのいくつかの同一性を決定するために、一連のVKファミリー特異的PCR増幅反応のための基質として、ゲノムDNAを使用した。4組の増幅において、4つの異なる5プライマーを、単一のコンセンサス3プライマーとそれぞれ対にした。この5プライマーは:o270、o271、o2725-gaaattcagctgacgcagtctcc3およびo273であった。これらのプライマーは、マークスらEur.JImmunol199121,985により、VRファミリー特異的プライマーとして使用される。3プライマー、o2745gcaagcttctgtcccagacccactgccactgaacc3は、FR3のためのコンセンサス配列に基づく。4組のプライマーのそれぞれが、YACクローン4x17E1を含む酵母ゲノムDNAからの期待された02kbのフラグメントの増幅を支配した。次に、異なる4組の増幅産物はゲル精製され、プラスミドベクターpSP72プロメガのPvuII/HindIII部位へクローン化された。11の得られたクローンのヌクレオチド配列分析は、7つのはっきりとしたV遺伝子を同定した。これらの結果を以下の表14に示す。遺伝子セグメントは、遠位のVKクラスター内で地図を描いたコックスら、EurJImmunol1994.24,827;パージェントら、EurJImmunol1991.21、1829;スカブル及びザツチュー、Biol.Chem.HoppeSeyler1993.374,1001。YACクローンから増幅された配列のすべてが、遠位のクラスターに地図を描かれるVK遺伝子に明白に割り当てられるか、またはそれらは遠位の遺伝子配列と適合し得る。配列はどれも近位のV遺伝子に明白に割り当てられないので、YAC4x17E1は遠位のVK領域からの配列を含むことが明白である。さらに、同定された配列のうちの1つ、クローン7VkO2は、遠位のクラスターのJ近位末端の近くに地図を描き、一方、別の配列、クローン1および4VkL22は、遠位のクラスターのJ遠位末端の近くに、300kbを超えて上流に地図を描く。かくして、450kbのYACクローン4x17E1が、対応するヒトゲノムフラグメントの非欠失コピーを示すなら、それは、少なくとも32の異なるVKセグメントを含む。しかし、これらのうちのいくつかは、非機能偽遺伝子である。2.YAC誘導VK遺伝子セグメントを含むトランスジェニックマウスの生成胚の前核へのミクロ注入のための精製YACDNAを得るために、全ゲノムDNAをアガロースゲル上で、サイズ分画sizefractionをした。YAC4x17E1を含む酵母細胞を、溶解に先立ってアガロース中に埋め込み、そしてYACDNAを、標準パルスフィールドゲル電気泳動製品明細:CHEFDRII電気泳動細胞、BIORADラボラトリーズ、リッチモンドCAによって、酵母染色体DNAから分離した。6つの独立のパルスフィールドゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、YACクローン含有ゲル物質をゲルの残部から切り離した。次に、YAC含有ゲル片を,三角形のゲルトレー中の新たな低い融点のアガロースゲルキャスト中に埋め込んだ。得られた三角形のゲルを、標準ゲル緩衝液の他に2モル/リットルの酢酸ナトリウムを含む細いゲルを用いて、頂点で広げた。次に、ゲルを、標準ゲル緩衝液に浸した電気泳動チャンバー中に置いた。電流が細い高塩ゲル片にだけ流れることができるように、Y字形のゲル型を緩衝液の表面より上に上げた。プレキシグラスブロックを細い高塩ゲル片の上に置いて、NaOAcがゲル緩衝液へと拡散するのを防いだ。次に、YACDNAを、元のゲル片から細い高塩ブロックへと電気泳動した。低塩ゲルから高塩ゲルへの移動の時点で、ゲルを通ったYACDNAの移動を効果的に停止させる抵抗低下がある。これは、三角形のゲルの頂点でYACDNAの濃縮に至る。電気泳動および染色に続いて、濃縮したYACDNAをDNAの残部から切り離し、アガロースをGELaseEPICENTRETechnologiesで消化した。次に、塩化セシウムをYACDNA含有液体に添加して、168g/mlの密度を得た。この溶液を37000rpmで36時間遠心分離して、汚染物質からDNAを分離した。得られた密度勾配の05ml画分を分離し、ピークDNA含有画分を、5mMトリスpH74/5mMNaCl/01MEDTAに対して透析した。透析後、YACDNAの得られた065ml溶液の濃度は、2マイクログラム/mlであることがわかった。このDNAを、プラスミドpKC1BおよびpKV4からの精製DNA挿入部ロンバーグら、1994年、ネイチャー368、856と、2011マイクログラムYAC4x17E1:KC1B:KV4で混合した。得られた2マイクログラム/ml溶液を、半日マウス胚の前核に注入し、95の生き残ったミクロ注入した胚を、偽妊娠したメスの卵管に移した。ミクロ注入した胚から発生した、39のマウスが生まれた。これらマウスのうちの2匹、9269および9272を、トランスジェニック系を確立するために使用した。この系は、KCo5-9269およびKCo5-9272と称する。系KCo5-9269およびKCo5-9272マウスからのゲノムDNAのサザンブロット分析を行って、YAC4x17E1誘導VKセグメントがそれらのゲノム中に組込まれたかどうかを決定した。遠位のVKクラスターの中央からのVK遺伝子セグメント、VkA10アセッション:x12683;ストロービンガーら、1988、Biol.chem.Hoppe-Seyler369、601-607を、サザンブロット分析のためのプローブとして選択した。クローン化したプローブを得るために、VkA1O遺伝子をまずPCRによって増幅した。2つのオリゴヌクレオチド、o337およびo3385-gggttaactcattgcctccaaagcac3を、YAC4x17E1から1kbフラグメントを増幅するためのプライマーとして使用した。増幅産物をゲル精製し、HincIIで消化し、そしてpUC18へクローン化して、プラスミドp17E1A10を得た。次に、このプラスミドの挿入部を、KCo5-9269およびKCo5-9272DNAのサザンブロットを調べるために使用した。ブロットは、KCo5-9272マウスDNAのみにおいて予想される制限フラグメントへのプローブのハイブリッド化を示した。このことは、VkA1O遺伝子が、KCo5-9272マウスのゲノムに組込まれ、KCo5-9269マウスには組込まれなかったことを示す。次に、系KCo5-9272マウスをHC22550JHDJKDマウスと交配して、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の分断についてホモ接合であり、かつHC2およびKCo5トランスジーンについてヘミまたはホモ接合であるマウスを得た。内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の分断についてホモ接合で、ヒト重鎖およびκ軽鎖トランスジーンについてヘミまたはホモ接合である動物は、二重トランスジェニック/二重欠失マウスと称する。cDNAクローニング実験を行って、YAC誘導Vk遺伝子のいずれかがKCo5-9272系マウスに発現されるかどうかを決定した。二重トランスジェニック/二重欠失マウス12648HC22550KCo5-9272JHDJKDを犠牲にし、全RNAを牌臓から分離した。1つのよられたcDNAをRNAから合成し、オリゴヌクレオチドo270、o271、o272およびo273を5プライマーとして用い、かつCk特異的オリゴヌクレオチド、o1865tagaaggaattcagcaggcacacaacagaggcagttcca3を3プライマーとして用いて、4つの別々のPCR反応における鋳型として使用した。増幅産物をpCRIITAクローニングベクターインビトロゲンへクローン化した。19の挿入部のヌクレオチド配列を決定した。配列分析の結果を以下の表15にまとめる。★トランスジーンプラスミド配列によってエンコードされたVk遺伝子★★YAC誘導トランスジーン配列によっで唯一にエンコードされたVk遺伝子これらの結果は、少なくとも3のYAC誘導Vk遺伝子セグメント、A10、L18およびL24が、KCo5-9272系マウスの発現されたヒトレパートリーに寄与することを示す。骨髄および脾臓での種々のB220細胞集団のサイズにおけるこの増加したレパートリーの効果を決定するために、KCo5-9272系マウスにおいて、フローサイトメトリー分折を行った。この分析の一部が、図102および図103に示されている。2匹の二重トランスジェニック/二重欠失マウス一匹はKCo5トランスジーンを含み、一匹はKCo4トランスジーンを含むをこの実験において比較した。これら2つのトランスジーンは、同じ結合および定常領域配列、ならびに同じイントロンおよび3エンハンサー配列を共にする。それらはまた、4つの異なるクローン化されたV遺伝子セグメントを共にするが;KCo5トランスジーンは、KCo4トランスジーンには含まれない、YAC4x17E1から誘導された追加のVセグメントを含む。細胞を、マウス13534HC22550KCo5-9272JHDJKDおよびマウス13449HC22550KCo4-4436JHDJKDから分離した。骨髄細胞を、抗マウスB22Oカルタグ、サウスサンフランシスコ、CA、抗マウスCD43ファーミンゲン、ラジョラ、CAおよび抗ヒトIgMジャクソンイムノロジック、ウエストグローブ、PAで染色した。脾臓細胞を抗マウスB220および抗ヒトIgMで染色した。図102は、KCo5およびKCo4マウスの骨髄におけるB細胞およびB細胞前駆体集団の比較を示す。骨髄中のB細胞の画分B220、IgMは、KCo5マウスにおいて6は、KCo4マウスにおける2より、約3倍高い。プレB細胞集団B220、CD43、IgMがまた、KCo5マウスにおいて、より高い9、KCo4の4に比べて。さらに、プロB区画がこれらのマウスにおいて上昇している。これら3つの区画のそれぞれは、KCo5マウスでは、KCo4マウスにおけるより大きいが、そのレベルはなお、野生型マウスにおいて見出された約半分である。骨髄B細胞の数の増加はたぶん、増加したレパートリーサイズの直接の結果である。これらのマウスのより大きい第1のレパートリーは、内因性の抗原についていくらかの最小の閾値親和性を膜Igに提供し得る。次に、レセプターライゲーションが反応性Igを発現するそれらB細胞の増殖を見込むことができた。しかしながら、プレBおよびプロB細胞は軽鎖遺伝子を発現しないので、KCo5マウスにおけるこれら2つの区画の増加したサイズについての説明は直ぐに明らかではない。増加したB細胞の数は、これらの集団の拡張に、より助けとなる骨髄環境をつくるので、B細胞前駆体区画はKCo5マウスにおいてより大きくあり得る。この効果は、分泌された因子によって、またはB細胞と前駆細胞との間の細胞-細胞接触によって直接媒介されることができたか、または、さもなければ前駆細胞の生存または増殖を阻害するであろう因子または細胞の滴定によって、間接的に媒介されることができた。図103は、KCo5およびKCo4マウスにおける脾臓B細胞集団の比較を示す。これらの2匹のマウスの間の主な違いは、B220曇っているB細胞集団の相対的サイズである。B220曇っている細胞は、B220明るいB細胞より大きく、それらのより高い画分は、1つの軽鎖を発現する。これらは、通常、野生型マウスでの末梢B細胞集団を支配する、いわゆるB1細胞集団の特性である。KCo4マウスの脾臓は、B220曇っている細胞の変則的に高い画分を含み、一方、KCo5マウスは、これらの細胞のより普通の分布を有する。しかしながら、両方の系統が、脾臓のB細胞の通常の数の約12~13を含む。実施例39この実施例は、高親和性の抗原特異的なヒトIgGモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを分離するために、実施例38のKCo5トランスジェニックマウスの好結果の使用を説明する。免疫化二重欠失/二重トランスジェニックマウスKCo5-9272HC22550JHDJKD、12657を、8週間1週おきに、腹腔内に、4~10x106照射T4D3細胞、ヒトCD4を発現するネズミT細胞系ドクタージェインパーンズ、スタンフォード大学で免疫し、次いで2週間後、不完全フロイントアジュバントシグマ中の20mgの可溶な組換えヒトCD4sCD4;イントラセルを腹腔内に1回注入した。このマウスを、20mgのsCD4と融合するに先立って3日間に1度、静脈内に追加した。ハイブリドーマ融合免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、16の数のP3X63Ag8653非分泌マウスミエローマ細胞に、50PEGシグマを用いて融合した。平底ミクロ滴定プレートに、約2x106で、細胞を移植し、次いで、20胎児クローン血清、18653ならし培地、5オリジエン、4mMLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mMHEPES、0055mM2メルカプトエタノール、50単位/mlmMペニシリン、50mg/mlストレプトマイシン、50mg/mlmMゲンタマイシンおよび1xHATシグマ;融合の24時間後にHATを添加したを含有する選択培地中で2週間インキュベートした。2週間後、HATをHTで置き換えた培地中で細胞を培養した。広範囲のハイブリドーマの成長または培地が使われたことが観察されたら、ウェルをELISAおよびフローサイトメトリーでスクリーニングした。ELISAによるハイブリドーマのスクリーニング抗CD4mAbを検出するために、ミクロ滴定プレートファルコンを、PBS中25mg/mlのsCD450mlで、4°Cにて1晩被覆し、PBS中5のチキン血清100mLで1時間室温にてブロックし、次いで室温にて1時間インキュベートした。インキュベーションはそれぞれ、ハイブリドーマからの上清の希釈14、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGジャクソンのF2フラグメントの11000希釈または、HRPO結合ヤギ抗ヒトIgK抗体シグマプラス1通常のマウス血清の1:250希釈で行い、および最後に、00024H2O2を有する、01Mのクエン酸燐酸緩衝液中022mg/mlABTSを用いて行った。最初以外はすべてのインキユベーション間で、プレートを洗浄緩衝液で3~6回洗浄した。希釈液5チキン血清を有する洗浄緩衝液を使用して、上清およびHRPOコンジュゲートを希釈した。二重波長を用いて吸光度を測定した490nmの参照波長でのODを415nmでのODから引いた。マウスλ含有mAbを検出するために、以下のこと以外は、上記のELISAプロトコールを使用した。ミクロ滴定プレートのウェルを、100mlの1125mg/mlヤギ抗マウスλピアス、2125mgmlヤギ抗ヒトFcγジャクソン、または325mg/mlsCD4で被覆した。検出段階について、ビオチンに結合した15000ヤギ抗マウス1100mlを使用し、次いでHRPOジャクソンに結合した11000ストレプトアビジン100mlを使用した。ネズミおよびヒトのmAb標準を、示された濃度で使用した。関連のない抗原に対する交差反応性をさがすために、ウェルを、CEAクリスタルケム、KLHカルバイオケム、HSAシグマ、BSAシグマまたはOVAシグマ;すべて2mg/ml、ただしCEAは25mg/mlであったで被覆した。適当な抗体を滴定し、正の対照ヒトIgM抗CEAジェンファーム、ウサギ抗KLHシグマ、ヒツジ抗HSAザバインディングサイト、ヒツジ抗BSAザバインディングサイトおよびヒツジ抗OVAザバインデイングサイトとして使用した。どの結合された抗体も、ヤギ抗ヒトIgM、ロバ抗ウサギIgGまたはロバ抗ヒツジIgGのF2フラグメント15mg/mlで15分間インキュベートし、1回洗浄し、そしてFACScanベクトン-ディッキンソンで直ちに分析した。CD4反応性ハイブリドーマ上記したELISAおよびフローサイトメトリー技術を用いて、自生種ヒトCD4と特異的に反応するヒトIgGを分泌する12のハイブリドーマクローンを同定した。これら12のクローンのうちの10をさらにサブクローン化した。これらサブクローンのうちの8つをヒトIgG1k分泌ハイブリドーマとして同定した。他の2つは、マウスλ軽鎖を発現した。8つの完全なヒトクローンのためのペアレントウェルは、1E11、2E4、4D1、6C1、6G5、7G2、10C5および1G1であった。完全なヒトIgGkサブクローンのうちの3つ4D14、6G51および10C56の結合のフローサイトメトリーアッセイを図104に示す。図104は、IgGk抗nCD4モノクローナル抗体のnCD4SupT1細胞への結合を示す。ログフェーズグロース培養logphasegrowthcultureからの細胞を洗浄し、モノクローナル抗体なし、4E42、キメラLeu3a正の対照としてまたは10のヒトIgG抗nCD4モノクローナル抗体のうちの1つで染色した。どの結合したモノクローナル抗体も、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγで検出された。10のモノクローナル抗体のすべてがSupT1細胞に結合した。ただし、そのうちの3つしか、データがここに示されていない。クローン化されたハイブリドーマによるヒト抗体分泌の分析mAbの成長および分泌レベルを比べるために、サブクローンを複製培養物2x105細胞/mlの初期密度で、24のウェルプレート中、HT培地中に入れた。7日間毎日、各サブクローンについての複製培養物の1つを取り、細胞数、細胞生存度トリパンブルー排除によるおよび上清中のmAbの量全ヒトγについて定量的ELISAによるを測定した。表16は、ハイブリドーマサブクローンのうちの7つによる抗体分泌についてのデータを示す。★pg細胞=mAbの最大量/生存細胞の最大数pg/細胞/dpg細胞/7日ヒトmAbの精製個々のハイブリドーマクローンをHTおよびオリジェンなしの培地中で成長させ、FCSを徐々に減らして、最終1リットル培地中で約2~3までにした。ハイブリドーマの生存度が約30より下に落ちたら、上清を取った。IgGkmAbを精製するために、使用した上清を遠心分離して細胞を除去し、超音波にて約50~100mlに濃縮し、PBS、pH74で15に希釈し、そして5mlのプロテインAファルマシアカラムに載せた。カラム体積の3~5倍のPBSで洗浄した後、ヒトIgGkmAbを、01HCl、150mMNaCl、pH28で溶出し、そして直ちに1Mトリス塩基で中和した。OD280>02の物質を含むカラム画分を集め、PBSに透析した。次に、OD280を測定し、14の吸収係数を使用して、ヒトIgGの蛋白質濃度を計算した。流れの中にmAbは検出されず、回収率は93~100の範囲であった。3~6mgの各精製mAbが得られ、純度>90であった。クローン化されたハイブリドーマからのモノクローナル抗体の分析mAbの結合の特異性を調べるために、ヒトPBMCをフィコール上で分離し、以下のように染色した。染色緩衝液中のヒトPBMCを氷上で30分間インキュベートし、別々の反応において、サブクローン化したハイブリドーマの3つ4D14、6G51および10C56のそれぞれからの同体積の上清を用いて、またはイソタイプが合った負の対照mAbを用いて行い、2回洗浄し、そして、フィコエリトリンに結合したマウス抗ヒトCD4mAb10ml、PEに結合したマウス抗ヒトCD8mAbLeu2a;ベクトン-ディッキンソン10mlまたはPEに結合したマウス抗ヒトCD19mAbをFACScanフローサイトメーターベクトンディッキンソン、サンジョゼ、CAで分析した。3つの抗体すべてが、ヒトPBMCのCD4画分に特異的に結合することが見出された。これら3つのmAbによって認識されるエピトープの位置を近づけるために、5x105SupT1細胞を、緩衝液、25mgmlRPAT4、または染色緩衝液中の25mg/mlLeu3aを用いて氷上で20分間、次いで10のヒトIgGmAb12に希釈した上清中のうちの1つを用いて30分間、そして最後に05mg/mlFITC結合ヤギ抗ヒトFcγを用いてプレインキュベートして、結合したヒトIgGをいずれも検出した。最後の段階の前に2回、その後に1回、細胞を染色緩衝液で洗浄した。このブロッキングアッセイの結果を図105に示す。3つの抗体のどれも、RPA-T4とエピトープを共にしないが、6G51および10C56は、Leu3aによって認識されたのと同じまたは隣接するエピトープを認識するようである。速度および平衡定数の測定ヒトsCD4を、製品の指示に従って、センサーチップ表面に、アミン基を介して共有結合によって固定した。抗体希釈物を、平衡に到達するまで、抗原結合センサーチップの上を流し、次いで緩衝液のみを流れるようにした。反応、結合および解離の各相について、結合した抗体の画分を時間に対してプロットした。結合曲線の導関数dR/dtを計算し、各濃度についての応答に対してプロットした。会合速度定数k会合を計算するために、それらの得られた線の勾配を、モノクローナル抗体の濃度に対してプロットした。このグラフからの線の勾配がk会合に対応した。解離速度定数k解離を、時間間隔に対しての応答緩衝液の流れ相中における低下の対数から、計算した。k会合をk解離で除して、Kaを誘導した。KCo5/HC2二重トランスジェニック/二重欠失マウスから誘導された5つの異なる精製モノクローナル抗体および、市販の供給源ベクトンディッキンソン、サンジョゼ、CAから得られた1つの精製抗体について測定した速度および親和性定数データを表17に示す。混合リンパ球反応KCo5トランスジェニックマウスから誘導されたヒトモノクローナル抗体10C56のインビトロでの効力を、マウス抗体Leu3aと比較するために、MLRアッセイを行った。2人の関連のないドナーからのヒトPBMCをフィコール上で分離し、各ドナーからのCD4PBLを、製品の指示に従って、CD4カラムヒトCD4セレクト、バイオテックスラボラトリーズ、インク、カナダを用いて精製した。両方のドナーからのPBMCを、培地次のものを含むRPMI1640:10加熱-不活化ヒトAB血清、ヘペス、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、pen/strep、およびbメルカプトエタノール中の100mg/mlマイトマイシンcアルドリッチを用いて、37°Cで30分間処理した後、培地で3回洗浄することによって、不活化された刺激物細胞を得た。培地で希釈した種々の濃度のmAbまたは培地のみを、滅菌ろ過し、96ウェルの丸底プレートに、トリプルtriplicateでウェル当たり100mlで加えた。次に、1人のドナーからの105CD4PBL培地中50mlおよび別のドナーからの105マイトマイシンC処理したPBMC50mlの培地中を、各ウェルに加えた。mAbのいかなる毒性または分裂促進因子効果についても対照するために、CD4PBL反応物のみプラスmAbを有する対照プレートをセットした。刺激物のみの対照および培地バックグラウンド対照をまた含めた。37°C、5CO2加湿インキュベータにて7日間の後、各ウェルから上清100mlを除去し、2Omlの比色分析試薬セルタイター96AQキット、プロメガコーポレーション、マジソン、WIを加えた。4~6時間発色させ、490nmにてプレートを読んだ。図106に示されたこの実験の結果は、ヒトIgG1k抗体10C56は、このアッセイにおいて、ヒトPBMCCD4細胞の機能を妨げることにおいて、少なくともLeu3aと同様に有効であることを示す。実施例40ヒトIgGカッパ抗CD4モノクローナル抗体の結合特性この実施例は、ヒトCD4で免疫したHC2KCo5JHDJCKDトランスジェニックマウスから得たハイブリドーマクローンから誘導されたヒトIgGkモノクローナル抗体の結合特性を提供する。このモノクローナル抗体は、組換えおよび天然ヒトCD4に対して高い結合力および親和性を有することが示された。ヒトCD4と反応性のヒトIgGカッパモノクローナル抗体を分泌する、10の個々のハイブリドーマ細胞系1E11、1G2、6G5、10C5、1G1、6C1、2E4、7G2、1F8および4D1からの細胞を、JHDJCKDHC2KCo5トランスジェニックマウスから誘導した。細胞系を培地で成長させ、抗体蛋白質を上清から分離したフィッシュワイルドら、1996年、ネイチャーバイオテクノロジー14、845851。プロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより精製した抗体を結合定数を測定するために使用した。結果を表18および19に示す。表18に示された速度および平衡定数は、センサーチップに結合されたヤギ抗ヒトIgGFc特異的を使用し、飽和濃度のmAbを流して、次いで種々の抗原rCD4濃度で、BIAcoreファルマシアバイオセンサーを用いて測定された。これらの定数は、精製したmAbを用いた3つの実験から誘導された。表19に示した速度および平衡定数は、センサーチップに結合した抗原rCD4を用い、次いでmAbを流して、BIAcoreにて測定した。これらの定数は、精製mAbを用いて、少なくとも3つの独立した実験から誘導された。表20は、科学文献に示された抗CD4mAbについての平衡定数を与える。NR報告なし、JCellBiol15EA179JImmunol1452839ClinImmunolImmunopath64248Biotechnology101455MolImmunol301443欧州特許出願0626389A1上記した結合力および親和性の測定は、組換えCD4rCD4を用いて行った。野生種CD4nCD4についてのヒトモノクローナル抗体の結合力を測定するために、変性されるべき抗体を必要としない、追加の結合アッセイを使用した。特異的に、抗体の連続希釈物を、SupT1細胞と共に、6時間氷上でインキュベートし、洗浄し、FITCヤギ抗ヒトFcγと結合したどの抗体をも検出した。Kaを、最大蛍光の1/2を与える抗体の濃度から測定した。その結果は、10のヒトモノクローナル抗体すべてが、Ka値>109M1で、nCD4に非常によく結合したことを証明する。ほとんどの抗体キメラLeu3aを含むが、rCD4よりもnCD4に、あまりよく結合しなかった。このことは、抗原の密度の差ならびに2つの抗原の間の差異に帰することができた。★ヒトモノクローナル抗体は、SupT1細胞と共に、連続希釈物中で6時間インキュベートし、2回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγ抗血清と共にインキュベートし、洗浄し、固定した。4つのパラメータフィットから測定したように、最大蛍光の1/2を与える抗体の濃度からKaを計算した。実施例41ヒトIgGκ抗CD4抗体をエンコードするヌクレオチド配列の同定この実施例は、試験したハイブリドーマのそれぞれが1つの機能的重鎖または軽鎖RNA転写物のみを生成することを証明し、これは、適当な機能する対立遺伝子排除と一致する。さらに、重鎖および軽鎖CDRセグメントの配列分析は、免疫グロブリントランスジーンの体細胞突然変異が起こったことを示す。ヒトCD4と反応するヒトIgGκモノクローナル抗体を分泌し、JHDJCKDHC2KCo5トランスジェニックマウスから誘導された、5つの個々のハイブリドーマ細胞系からの細胞が、個々の抗体のそれぞれをエンコードするRNAを分離するために使用されたフィッシュワイルドら、1996年、NatureBiotechnology14、845851。RNAが、cDNAを合成するための基質として使用され、これは次に、ヒトVH、Vκ、Cγ、およびCκに特異的なプライマーを用いて、PCRによってヒトIgγおよびκ転写配列を増幅するために使用されたテイラーら、1992年、NucleicAcidsRes20、62876295;ラリック、JWら、、BioTechnology7.934938;マークス、JDら、、EurJ.Immunol21985991テイラーら、1994年、IntImmunol.6、579591。増幅されたIg重鎖およびκ軽鎖の配列を、細菌のプラスミドへクローン化し、ヌクレオチド配列を決定した。重鎖VDJおよび軽鎖VJ結合に広がる配列の分析は、5つのクローンのそれぞれについてフレーム内inframe重鎖および軽鎖転写を示し、いくつかの場合には、非機能的対立遺伝子を表している追加のフレーム外outofframe無菌転写物を示す。適当な機能する対立遺伝子排除と一致して、個々のクローンのそれぞれについて同定された1より多いユニーク機能的重鎖または軽鎖転写物がある場合はない。10の機能的転写物のそれぞれについて、部分ヌクレオチド配列が、以下の配列ID.番号に割り当てられ:1E11γ配列IDNo1;1E11κ配列IDNo2;1G2γ配列IDNo3;1G2κ配列IDNo4;6G5γ配列IDNo5;6G5κ配列IDNo6;10C5γ配列IDNO7;10C5κ配列IDNo84D1γ配列IDNo94D1κ配列IDNo10、表22に示される。総ての配列が5から3への方向で示される。これらのDNA配列の分折は、5つのハイブリドーマクローンが4つの個々のプライマリーB細胞の子孫を示すことを証明する。表23は、10のCDR3領域のそれぞれについて誘導されたアミノ酸配列およびこれらの転写物をエンコードする遺伝子のそれぞれに挿入された生殖細胞系遺伝子セグメントについての割り当てを示す。生殖細胞系の割り当ては、ナショナルセンターオブバイオテクノロジーインフォメーション、ナショナルライブラリーオブメディシンNationalLibraryofMedlcine、ナショナルインスティテューツオブヘルス、Bethesda、Mdから入手可能な公開された遺伝子配列に基づく。また、次をみよ:クックら、1994年、NatureGenet.7、162168;トムリンソンら、1992年、J.Mol.Biol.227、776798;マツダら、1993年、NatureGenet.3、8894;スカブルザッチュー、1993年、Biol.Chem.HoppeSeyler374、10011022;コックスら、1994年、EurJImmunol24、827836;ラベッチら、1981年、Cell27、583591;イチハラら、1988年、EMBOJ.7、41414150;ヤマダら、1991年、J.Exp.Med.173、395407;サンツ、1991年、J.Immunol.147、17201729。ndは、ヌクレオチド配列から決定することができなかった。実施例42トランスフェクトされた細胞系におけるヒトIgGκ抗CD4抗体の発現のためのミニジーンの構成この実施例は、免疫グロブリンポリペプチドすなわち、免疫グロブリン重鎖または軽鎖をエンコードする、完全に人工の遺伝子を作る方法を説明する。PCR増幅したV重鎖およびV軽鎖cDNA配列が完全な重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るように、プラスミドを構成した。κ軽鎖プラスミド、pCK796は、κ定常領域およびポリアデニル化部位配列IDNo11を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHindIII部位を含む5プライマーで増幅されたκ配列が、HindIIIおよびBbsIで消化されることができ、かつHindIIIおよびBbsIで消化されたpCK796へクローン化されて、ポリアデニル化部位と共に配列をコードする完全な軽鎖を再構成するように行われる。このカセットは、HindIII/NotIフラグメントとして分離され、転写プロモータ配列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのための機能的ミニジーンを作ることができる。γ1重鎖プラスミド、pCG7-96は、ヒトガンマ1定常領域およびポリアデニル化部位配列IDNo12を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHindIII部位を含む5プライマーで増幅されたγ配列が、HindIIIおよびAgeIで消化されることができ、かつHindIIIおよびAgeIで消化されたpCG796へクローン化されて、ポリアデニル化部位と共に配列をコードする完全なγ1重鎖を再構成するように行われる。このカセットは、HindIII/SalIフラグメントとして分離され、転写プロモータ配列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのための機能的ミニジーンを作ることができる。以下の実施例は、ハイブリドーマからのヌクレオチド配列データがどのようにして、機能的Ig重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るかを説明する。ハイブリドーマ6G5および10C5からの重鎖および軽鎖転写物のヌクレオチド配列が、合成オリゴヌクレオチドの重複する組をデザインして、自然配列と一致するアミノ酸コードキャパシティーを有する合成V配列を作るために使用された。合成重鎖およびκ軽鎖配列示されたHC6G5配列ID.No61およびLC6G5配列ID.No62は、3つの方法において自然配列と異なっていた:反復したヌクレオチド塩基の糸が中断されてオリゴヌクレオチド合成およびPRC増幅を促進する;最適翻訳開始部位がコザクの規則Kozak、1991年、JBiolChem266、19867-19870に従って挿入された;およびHindIII部位が翻訳開始部位の上流で操作された。A合成κ軽鎖軽鎖PCR反応1以下のオリゴヌクレオチドをプールし:o548配列IDNo13、o549配列IDNo14、o550配列IDNo15、o551配列IDNo16、o552配列IDNo17、o563配列IDNo18、o564配列IDNo19、o565配列IDNo20、o566配列IDNo21、o567配列IDNo22、以下の2つのプライマーで増幅した:o527配列IDNo23およびo562配列IDNo24。軽鎖PCR反応2以下のオリゴヌクレオチドをプールし:o553配列IDNo25、o554配列IDNo26、o555配列IDNo27、o556配列IDNo28、o557配列IDNo29、o558配列IDNo20、o559配列IDNo31、o560配列IDNo32、o561配列IDNo33、o562配列IDNo24、そして以下の2つのプライマーで増幅した:o552配列IDNo17およびo493配列IDNo34。軽鎖PCR反応3次に軽鎖PCR反応1および2の産物をまとめ、かつ次の2つのプライマーで増幅した:o493配列IDNo34]およびo527配列IDNo23。次に軽鎖PCR反応3の産物をHindIIIおよびBbsIで消化し、HindIII/BbsI消化pCK7-96配列IDNo11にクローン化して、pLC6G5配列IDNo35を生成した。B合成γ重鎖重鎖PCR反応1以下のオリゴヌクレオチドをプールし:o528配列IDNo36、o529配列IDNo37、o530配列IDNo38、o531配例IDNo39、o532配列IDNo40、o543配列IDNo41、o544配列IDNo42、o545配列IDNo43、o546配列IDNo44、o547配列IDNo45、そして以下の2つのプライマーで増幅した:o496配列IDNo46およびo542配列IDNo47。重鎖PCR反応2以下のオリゴヌクレオチドをプールし:o533配列IDNO48、o534配列IDNo49、o535配列IDNo50、o536配列IDNo51、o537配列IDNo52、o538配列IDNo56、o539配列IDNo53、o540配列IDNo54、o541配列IDNo55、o542配列IDNo47、ならびに、pCG7-96配列IDNo12の分離した439bpBbsIフラグメント、そして以下の2つのプライマーで増幅した:o490配列IDNo57およびo520配列IDNo58。重鎖PCR反応3次に重鎖反応1および2の産物をまとめ、かつ次の2つのプライマーで増幅した:o520配列IDNo58およびo521配列IDNo59。次に重鎖反応3の産物をHindIIIおよびAgeIで消化し、HindIII/AgeI消化pCG7-96配列IDNo12にクローン化して、pHC6G5配列IDNo60を生成した。実施例43ヒト抗CD4モノクローナル抗体の非ヒト霊長類リンパ球への結合動物モデルにおいて、ヒト抗CD4モノクローナル抗体の前臨床的毒物学および薬物動力学的研究を行うことができるのは望ましい。いくつかの目的で、動物が、モノクローナル抗体でそれが認識されるように、ヒトCD4と交差反応性のエピトープを含むCD4を発現する非ヒト霊長類であることが更に望ましい。3匹の異なる非ヒト霊長類種、チンパンジー、アカゲザルリーサスモンキーおよびカニクイザルシノモルガスモンキーを、ハイブリドーマ1E11、1G2、6G5、10C5および4D1からの5つの異なるヒト抗CD4モノクローナル抗体と交差反応性CD4エピトープについて試験した。チンパンジー、アカゲザルおよびカニクイザルの全血から末梢血リンパ球を分離した。分離した細胞を、これら5つのハイブリドーマのそれぞれからのヒト抗体FITC抗ヒトIgGで検出したおよびPE抗CD8またはPE抗CD4で二重染色した。染色した細胞を次に、フローサイトメトリーで分析して、ヒトモノクローナル抗体のそれぞれが、これら3種の非ヒト霊長類のそれぞれからのリンパ球の表面の内因性CD4に結合したかどうか決定した。5つの抗体のうちの4つ、1E11、6G5、10C5および4D1が、チンパンジーのCD4細胞に結合することがわかった。さらに、5つの抗体のうちの4つ、1G2、6G5、10C5および4D1が、アカゲザルおよびカニクイザルの両方のCD4細胞に結合することがわかった。かくして、5つの抗体のうちの3つ、6G5、10C5および4D1が、試験した3種の非ヒト霊長類のそれぞれにおけるCD4細胞に結合する。実施例44モノクローナル抗体が患者において非欠乏または免疫抑制的であるかどうかを確実に予言することができる、インビボでのアッセイは知られていない。しかしながら、ヒトおよび非ヒト霊長類例えばチンパンジーおよびカニクイザルにおいて、3つの異なるmAbの、不足するまたは不足しない能力の間に相関関係が観察された例えばM.ジョンカーら、ClinExpImmunol93:301307。したがって、非ヒト霊長類においてヒトmAbを用いて研究を行った。この研究にチンパンジーを使用した。というのは、抗CD4mAbのうちの1つ、1E11はチンパンジーにおいてのみCD4を認識し、アカゲザルまたはカニクイザルでは認識しないからである。第2のmAb、6G5は、チンパンジー、アカゲザルおよびカニクイザルにおいてCD4を認識する。第3のmAb、1G2は、チンパンジーにおいてCD4を認識しないが、アカゲザルおよびカニクイザルにおいてCD4を認識する。そのmAbはすでに、カニクイザルにおいてインビボで非欠乏であることが示された。末梢血中でCD4T細胞数におけるヒトmAbの効果を調べるだけでなく、インビボでのT細胞機能におけるmAb投与の効果をまた評価した。これを行うために最も受け入れられるやり方は、抗原例えばツベルクリンまたは破傷風トキソイドに前感作された、かつ皮膚に過敏性反応を固定する動物を使用することである。3匹のオスのチンパンジーをこの研究に登録した。7、3および1日に、ベースライン全血試料を得た。1日に血液を採取した後、1匹のチンパンジー毎に、2mg/kgにて、2つのヒトmAbのうちの1つ1E11または6G5を静脈内注入した。第3のチンパンジーは、等体積/kgの緩衝液のみを受け入れた。血液を、注入後30分、2時間、8時間、24時間および48時間に採取した。2日に、皮膚反応性試験を行った。以下の表25に示された結果は、1E11が末梢血リンパ球の一時的欠乏を引起し、ほとんどのCD4T細胞が欠乏されていることを明らかに証明している。6G5はリンパ球またはCD4T細胞の欠乏を引起さなかったが、mAbの両方が、対照チンパンジーに比べて、破傷風トキソイドへの過敏性応答を阻害することができた。かくして、ヒトmAbは両方、インビボで免疫抑制的であるのが明らかであり、この免疫抑制は、必ずしもT細胞欠乏を必要としない。前述した本発明の好ましい実施態様は、説明し、記載する目的のために示されたものである。それらは、網羅されていること、または本発明を開示された通りの形に限定することを意図せず、上記の教示に照らして、多くの修正および変形が可能である。いくらかの変化および変形が請求の範囲内で行われ得ることが明らかである。すべての公開物および特許出願は、各公開物または特許出願が詳細にかつ個々に示されたのと同じ程度に、参照することにより本明細書に組込まれている。一般に挙げられた出願USSN085444041995年10月10日出願、USSN083523221994年12月7日出願、USSN08209741、USSN08165699、国際特許出願WO9203918、USSN07810279、USSN07853408、USSN07904068、USSN07990860、国際特許出願WO9312227およびUSSN080531311993年4月26日出願は、参照することにより本明細書に組込まれている。ここで、ヒト免疫グロブリンを発現するB細胞が発達を受け、マウス免疫系の情況の下で抗原に応答するという結論を下したい。抗原反応性は免疫グロブリン重鎖アイソタイプスイッチ及び可変領域体細胞突然変異を導く。我々は又、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るのに従来のハイブリドーマ技術を用いることができるということも実葵証してきた。従ってこれらのトランスジェニック抗体は、ヒト標的抗原に対するヒト抗体の供給源である。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表B及ひCから選択されたひト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのB細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。上記表Bは不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの分化のクラスターclusteofdifferentiationCDの例のリストである。上記表Cは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの非-CD抗原の例のリストである。本発明のトランスジェニックマウスを表Dから選択されたヒト-病原体又は抗原により免疫する。トランスジェニックマウスば、ヒト病厘i本と結台する抗i本を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのB細胞を用いて、前記選択されたヒト病原体に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。上記表Dは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生せしめるための、ヒト病原体及びその抗原の例のリストである。上記の表Eは、不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体に対するモノクロ-ナル抗体を生産するハイブリドーマを発生させるためのヒト病原体及びそれらの抗原の例のリストである。本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記截してきたが、請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。"