"マレーシア産のLuciola属に属するホタルに由来するルシフェラーゼ。pH8における最大発光波長が580nmである請求項1記載のルシフェラーゼ。Rhodamine6Gによる発光強度の23.3倍以上の発光強度を示す請求項1に記載のルシフェラーゼ。配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のルシフェラーゼ。請求項1から4の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。前記ルシフェラーゼの遺伝子のコドンが哺乳類細胞における発現に最適化された請求項5に記載の核酸。配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号29または配列番号30に示される塩基配列を含む請求項5に記載の核酸。以下の工程を含む、細胞内機能を解析する方法:請求項5から7の何れか1項に記載のルシフェラーゼを細胞内に導入する工程;および前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程。以下の工程を含む、細胞内タンパク質を解析する方法:請求項1から4の何れか1項に記載のルシフェラーゼと前記タンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程;および前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程。配列番号1に示されるアミノ酸配列の438番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸がグリシンであり、配列番号1に示されるアミノ酸配列の532番目のイソロイシンに対応するアミノ酸がアルギニンであり、配列番号1に示されるアミノ酸配列の356番目のグルタミン酸に対応するアミノ酸がアルギニンであり、および/または配列番号1に示されるアミノ酸配列の368番目のバリンに対応するアミノ酸がアラニンであるアミノ酸配列を有する請求項1に記載のルシフェラーゼ。配列番号1に示されるアミノ酸配列の438番目のアスパラギン酸に対応するアミノ酸がグリシンであり、配列番号1に示されるアミノ酸配列の532番目のイソロイシンに対応するアミノ酸がアルギニンであり、および配列番号1に示されるアミノ酸配列の356番目のグルタミン酸に対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列を有する請求項10に記載のルシフェラーゼ。配列番号1に示されるアミノ酸配列の356番目のグルタミン酸に対応するアミノ酸がアルギニンであり、および配列番号1に示されるアミノ酸配列の368番目のバリンに対応するアミノ酸がアラニンであるアミノ酸配列を有する請求項10に記載のルシフェラーゼ。[実施例1:ルシフェラーゼ遺伝子のクローニング]1.材料材料としてマレーシアにて採集したホタルの幼虫を用いた。このホタルは、Luciola属に属することは判明しているものの、学名が決定されていない種であった。本願では、この種をLuciolasp1と称する。2.TotalRNAの抽出およびcDNAの合成ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysingMatrixDチューブMP-Biomedicals社に、採取した発光器および1mLのtotalRNA抽出試薬TRIzolReagentインビトロジェン社を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep24MP-Biomedicals社またはFastPrepFP100AMP-Biomedicals社に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。次に、totalRNA抽出試薬TRIzolReagentの説明書に従って、破砕した溶液からtotalRNAの分離精製を行った。得られたmRNA溶液100μlを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長cDNA合成試薬GeneRacerインビトロジェン社をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したtotalRNAから完全長cDNAを合成した。得られたcDNA溶液20μlをホタル完全長cDNAライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。3.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側の同定3-1.RACERapidAmplificationofcDNAEnd法に用いるプライマーの作製新規のルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPCRPolymerasechainreaction法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼのアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている10種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアDNASISPro日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、Lampyrisnoctiluca登録番号CAA61668、Luciolacruciata登録番号P13129、Luciolalateralis登録番号Q01158、Luciolamingrelica登録番号Q26304、Hotariaparvula登録番号AAC37253、Photinuspyralis登録番号BAF48390、Photurispennsylvanica登録番号Q27757、Pyrocoeliamiyako登録番号AAC37254、Pyrocoeliarufa登録番号AAG45439およびRhagophthalmusohbai登録番号BAF34360である。その結果、ホタルルシフェラーゼのC末端側440残基付近に位置するL-I-K-Y-K-G-Y-Q-V配列番号6のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この9つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、5’末端RACEPCRに用いる12種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りであるプライマー配列中のY、RおよびNは混合塩基を示す:flexLuc5-ATA5’-ACYTGRTANCCYTTATATTTAAT-3’:配列番号7、flexLuc5-ATG5’-ACYTGRTANCCYTTATATTTGAT-3’:配列番号8、flexLuc5-ATT5’-ACYTGRTANCCYTTATATTTTAT-3’:配列番号9、flexLuc5-ACA5’-ACYTGRTANCCYTTATACTTAAT-3’:配列番号10、flexLuc5-ACG5’-ACYTGRTANCCYTTATACTTGAT-3’:配列番号11、flexLuc5-ACT5’-ACYTGRTANCCYTTATACTTTAT-3’:配列番号12、flexLuc5-GTA5’-ACYTGRTANCCYTTGTATTTAAT-3’:配列番号13、flexLuc5-GTG5’-ACYTGRTANCCYTTGTATTTGAT-3’:配列番号14、flexLuc5-GTT5’-ACYTGRTANCCYTTGTATTTTAT-3’:配列番号15、flexLuc5-GCA5’-ACYTGRTANCCYTTGTACTTAAT-3’:配列番号16、flexLuc5-GCG5’-ACYTGRTANCCYTTGTACTTGAT-3’:配列番号17、flexLuc5-GCT5’-ACYTGRTANCCYTTGTACTTTAT-3’:配列番号18。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。3-2.5’-RACEPCRによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側のクローニング上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’:配列番号19およびGeneRacer5’NestedPrimer5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’:配列番号20を用いて5’-RACEPCRを行った。GeneRacer5’PrimerおよびGeneRacer5’NestedPrimerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキットインビトロジェン社に含まれているものを使用した。5’-RACEPCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnestedPCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx-Taqタカラバイオ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。一度目のPCRとして、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーのいずれかとGeneRacer5’Primerとから成る12通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μl、最終濃度が1.0μMの12種類プライマーの内1つおよび最終濃度が0.3μMのGeneRacer3’Primerを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへホタル完全長cDNAライブラリー溶液を0.2μl加えた。なお、ホタル完全長cDNAライブラリー溶液の濃度は未定量であった。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、45°C30秒および72°C90秒を30サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1トリス酢酸緩衝液TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。12の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのPCR反応溶液を鋳型としてそれぞれnestedPCR反応を次の通り実施した。nestedPCRとして、一度目のPCRで使用した12種類プライマーのうちの4つとGeneRacer3’NestedPrimerとから成る4通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.005U/μlのTaKaRaExTaq5U/μl、最終濃度が1.0μMの12種類プライマーの内1つおよび最終濃度が0.3μMのGeneRacer3’Primerを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として1度目のPCR反応溶液を滅菌水で10倍希釈した溶液を1.0μl加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、45°C30秒および72°C90秒を30サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約1.4kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。3-3.5’-RACEで増幅した遺伝子の塩基配列の決定5’-RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。約1.4kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでPCR最終容量20μlを実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はWizardSVGelandPCRClean-UpSystemプロメガ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。TAクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したPCR産物のサブクローニングを実施した。TAクローニングはpGEM-TEasyVectorSystemプロメガ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターDNAを大腸菌TOP10株またはDH5α株に形質転換し、青白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーPCRに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーPCRには、M13-F-29Primer5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’:配列番号21とM13Reverse5’-GGATAACAATTTCACAGG-3’:配列番号22とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μl、最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマー対を含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94°C1分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を25サイクル繰り返し、最後に72°C2分間の伸長反応を行った。PCR反応後、2μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP-ITGEヘルスケアバイオサイエンスを用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKitアプライドバイオシステムズを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、70エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi-DiFormamideアプライドバイオシステムズを15μl加え、溶解させた。この溶液を94°C2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをAppliedBiosystems3130xlジェネティックアナライザアプライドバイオシステムズを用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェアDNASISProのシークエンス連結機能を用いて解析した。この配列をNationalCenterforBiotechnologyInformation以下NCBIと略すが提供するblastxサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側であると決定した。4.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の3’RacePCRおよび完全長cDNAの取得4-1.3’RacePCRに用いるプライマーの設計5’RacePCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマーおよびNestedPCRに用いるプライマーを作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。4-2.ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長cDNA取得のための3’RacePCR上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマー配列番号23およびGeneRacer3’Primer5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’:配列番号24およびGeneRacer3’NestedPrimer5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’:配列番号25を用いて3’-RACEPCRを行った。GeneRacer3’PrimerおよびGeneRacer3’NestedPrimerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキットインビトロジェン社に含まれているものを使用した。3’-RACEPCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnestedPCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx-Taqタカラバイオ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。一度目のPCRとして、5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとGeneRacer3’Primerとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μlおよび最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマーを含む20μlのPCR反応溶液を作製し、そこへホタル完全長cDNAライブラリー溶液を0.4μl加えた。なお、ホタル完全長cDNAライブラリー溶液の濃度は未定量であった。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を30サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を鋳型としてそれぞれnestedPCR反応を実施した。NestedPCRとして、NestedPCR用のプライマー配列番号26とGeneRacer3’NestedPrimerとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μlおよび最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマーを含む20μlのNestedPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として1度目のPCR反応溶液を滅菌水で10倍希釈した溶液を1.0μl加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を30サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約2kbp付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。4-3.3’-Raceで増幅した遺伝子の塩基配列の決定3’-RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。約2kbp付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでPCR最終容量20μlを実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はWizardSVGelandPCRClean-UpSystemプロメガ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。TAクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したPCR産物のサブクローニングを実施した。TAクローニングはpGEM-TEasyVectorSystemプロメガ株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターDNAを大腸菌TOP10株またはDH5α株に形質転換し、青白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーPCRに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーPCRには、M13-F-29Primer5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’:配列番号21とM13Reverse5’-GGATAACAATTTCACAGG-3’:配列番号22とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μl、最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマー対を含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94°C1分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を25サイクル繰り返し、最後に72°C2分間の伸長反応を行った。PCR反応後、2μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP-ITGEヘルスケアバイオサイエンスを用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKitアプライドバイオシステムズを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、70エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi-DiFormamideアプライドバイオシステムズを15μl加え、溶解させた。この溶液を94°C2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをAppliedBiosystems3130xlジェネティックアナライザアプライドバイオシステムズを用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列配列番号2もしくはアミノ酸配列番号1へ翻訳した配列について、NCBIが提供するblastxまたはblastpサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長cDNA配列であると決定した。以下、この新規のルシフェラーゼをSP1ルシフェラーゼと称する。[実施例2:新規ルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定]1.新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現ホタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET-Bベクターインビトロジェンに導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。1-1.新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変上述の通り決定した塩基配列によれば、新規ルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで羊土社、2001年発行、p.17-25に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。1-2.新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET-Bベクターの制限酵素サイトBamHI-EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRにはポリメラーゼKOD-Plis-東洋紡績株式会社を用いて、マニュアルに従って実施した。最終濃度が等倍の10×PCRBuffer、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が1.0mMのMgSO4、最終濃度が0.02U/μlのTOYOBOKOD-Plis-1U/μl、最終濃度がそれぞれ0.3μMのプライマー対を含む20μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてBamHIとEcoRI認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を0.4μl加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、55°C30秒および68°C2分を30サイクル繰り返し、最後に68°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このPCR反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用10×HBufferを4μl、制限酵素BamHI東洋紡績株式会社および制限酵素EcoRI東洋紡績株式会社を各2μlならびに滅菌脱イオン水32μlを加えて溶解し、37°Cで2時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるDNAバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからWizardRSVGelandPCRClean-UpSystemプロメガを用いてDNAを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、LigationPackニッポンジーンをマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素BamHIと制限酵素EcoRIで処理したpRSET-Bベクターに抽出したDNAを導入した。このベクターDNAを大腸菌JM109DE3株に形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーPCRを実施し、pRSET-Bに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーPCRは、T7promoterPrimer5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’:配列番号27およびT7ReversePrimer5’-CTAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3’:配列番号28のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の10×ExTaqBuffer20mMMg2plus、最終濃度が各0.2mMのdNTPMixture各2.5mM、最終濃度が0.05U/μlのTaKaRaExTaq5U/μlおよび最終濃度がそれぞれ0.2μMのプライマーを含む10μlのPCR反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。PCR反応は、最初に94°C2分間の熱変性を行った後、94°C30秒、50°C30秒および72°C2分を25サイクル繰り返し、最後に72°C5分間の伸長反応を行った。PCR反応後、1μlのPCR反応溶液を、1TAEアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。増幅が確認できたPCR反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。PCR産物精製キットExoSAP-ITを用いて、PCR反応溶液に含まれる余剰なdNTPおよびプライマーを除去し、PCRダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKitを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。PCR産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に2.5倍量の100エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、70エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にHi-DiFormamideアプライドバイオシステムズを15μl加え、溶解させた。この溶液を94°C2分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをAppliedBiosystems3130xlジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターpRSET-Bに導入されていることを確認した。2.発光タンパク質の精製JM109DE3を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42°Cで1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37°Cで20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート100μg/mlのAmpicillinを含むにストリークし、37°Cで一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37°Cで24時間、18°Cで24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1MTris-HCl溶液pH8.0に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離15000rpm、10分し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi-Agar懸濁液500μlと0.1MTris-HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4°Cの条件で行った。25mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD-10GEヘルスケアでろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6ザルトリウスで限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50グリセリン溶液とした。保存は-20°Cで行った。3.発光スペクトルの測定測定のための装置としてLumiFlSpectroCaptureATTOを用い、0.1Mクエン酸/0.1MNa2HPO4bufferpH6.0-8.0に1mMD-ルシフェリン、2mMATPおよび4mMMgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図1に示す。図1より、取得されたルシフェラーゼは、最大発光波長および最大発光強度がpHに応じて大きく変化することがわかる。当該ルシフェラーゼは、pH8.0の環境において、580nm付近に最大発光波長を示している。pHが下がるにつれて、最大発光波長は徐々に大きくなり、pH7.5において587nm付近、pH7.0において598nm付近、pH6.5において606nm付近およびpH6.0において609nm付近となった。また、最大発光強度は、pH7.5において最大値を示した。4.速度論的解析4-1.D-ルシフェリンおよびATPの濃度の決定D-ルシフェリン溶液中のD-ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。UV-VisibleSpectrometerHitachiを用いて、D-ルシフェリン溶液およびATP溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。D-ルシフェリン:λmax328nm、ε18200、pH5.0ATP:λmax259nm、ε15400、pH7.0。測定はそれぞれ10回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したD-ルシフェリン溶液およびATP溶液を用いて、以下のKm値算出を行った。4-2.D-ルシフェリンに対するKm値の測定様々なD-ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、D-ルシフェリンに対するKm値を決定した。D-ルシフェリンを0.1MTris-HClpH8.0に添加して、異なる濃度の12種類のDールシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、D-ルシフェリンの終濃度がそれぞれ0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、480および640μMとなるようにD-ルシフェリンを含む。これらのD-ルシフェリン溶液を96穴マイクロプレートに50μlずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、4mMATPおよび8mMMgSO4を含む0.1MTris-HClpH8.0溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに50μl添加すると同時に測定を行った。測定にはLuminescensorATTOを使用した。測定は各ルシフェリン濃度について3回ずつ行った。得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Vとして、ルシフェリン濃度Sに対してプロットした。このプロットにミカエリスメンテン型のカーブフィッティングを行い、Km値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。4-3.ATPに対するKm値の測定様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対するKm値を決定した。ATPを0.1MTris-HClpH8.0に添加して、異なる濃度の12種類のATP溶液を作製した。これらの溶液は、ATPの終濃度がそれぞれ5、10、20、40、80、160、320、480、640、800、1280、1600および1920μMとなるようにATPを含む。これらのATP溶液をそれぞれ96穴マイクロプレートに50μlずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、1mMD-ルシフェリン、8mMMgSO4を含む0.1MTris-HClpH8.0溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに50μl添加すると同時に測定を行った。測定は各ATP濃度について3回ずつ行った。得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Vとして、ATP濃度Sに対してプロットした。このプロットにミカエリスメンテン型のカーブフィッティングを行い、Km値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。上記のようにして決定されたD-ルシフェリンに対するKm値およびATPに対するKm値を表1に示す。表1には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Km値も示される。GL3とは既知のホタル由来のルシフェラーゼである。また、ELuc、CBGおよびCBRとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販されるものを使用した。さらに、これらの結果について、縦軸をATPに対するKm値とし、横軸をD-ルシフェリンに対するKm値としてプロットした図を、図2として示す。SP1ルシフェラーゼは、ATPに対するKm値およびD-ルシフェリンに対するKm値の両方が、既知のルシフェラーゼのそれらに比べて大きいことがわかる。[実施例3:発光強度の測定]SP1ルシフェラーゼによる発光強度を、既知のルシフェラーゼおよびRhodamine6Gによる発光強度と比較した。1.Rhodamine6Gによる化学発光の測定Rhodamine6Gを0.1Mクエン酸/0.2MNa2HPO4pH4.0溶液に溶解した。このRhodamine6G溶液を15000rpmで1分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を0.1Mクエン酸/0.2MNa2HPO4溶液で1000倍希釈し、希釈液の吸光度を測定した。測定はNanoVueGEヘルスケアで行った。測定は530nmにおいて5回行い、その平均値として0.048の吸光度が得られた。Rhodamine6Gのε値1.16x105mol-1cm-1を用いて元のRhodamine6G溶液の濃度を算出した結果、414μMであった。この溶液を0.1Mクエン酸/0.2MNa2HPO4溶液pH4.0で希釈し、30μMの希釈液を作製した。この希釈液を使用して、以下の表2の通り溶液1を調製した。また、bis2,4,6-trichlorophenyloxlateTCPOをアセトニトリルに最終濃度3mMとなるように溶解して溶液2を作製した。溶液1を96穴のマイクロプレートに100μlずつ分注した。そこへ、ポンプを使用して溶液2を50μl添加すると同時に測定を開始して、溶液2の添加から10秒間のPhotoncountsの積算値を取得した。測定にはLuminescensorATTOを使用し、300nmから650nmの波長の光を取得した。同様の測定を10回行った。2.P.pyralisルシフェラーゼおよびSP1ルシフェラーゼによる化学発光の測定JM109DE3株を含む溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクターを含む溶液0.5μlを添加し、氷上で10分、42°Cで1分、氷上で2分インキュベートした。その後、この大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。大腸菌/SOC培地混合溶液を37°Cで20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート100μg/mlのAmpicillinを含むにストリークし、37°Cで一晩インキュベートした。翌日、できたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37°Cで24時間、18°Cで24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離によって菌体を回収し、0.1MTris-HCl溶液pH8.0に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離し15000rpm、10分間、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi-Agar懸濁液500μlおよび0.1MTris-HCl溶液2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4°Cの条件で行った。25mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1MTris-HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD-10GEヘルスケアでろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6ザルトリウスで限界ろ過した。得られたサンプルの濃度を比色法で測定し、P.pyralisルシフェラーゼおよびSP1ルシフェラーゼの濃度を確認した。最終濃度が1μg/mlとなるように上記ルシフェラーゼを0.1Mクエン酸/0.2MNa2HPO4pH8.0に希釈した。このルシフェラーゼ溶液を50μlずつ96穴マイクロプレートに分注した。2mMD-ルシフェリン、4mMATPおよび8mMMgSO4/0.1MTris-HClpH8.0を含む溶液をルミノメーターの標準ポンプによって50μl添加し、添加と同時に測定を行った。溶液の添加から10秒間のPhotoncountsの積算値を取得した。測定にはLuminescensorATTOを使用し、300nmから650nmの波長の光を取得した。各測定は6回行った。3.測定結果以上のように測定したRhodamine6G、P.pyralisルシフェラーゼおよびSP1ルシフェラーゼによる化学発光の強度を図3に示す。図3から、SP1ルシフェラーゼは、Rhodamine6Gによる発光の23.3倍の強度の発光を示すことがわかった。また、SP1ルシフェラーゼは、P.pyralisルシフェラーゼによる発光の4.9倍の強度の発光を示すことがわかった。[実施例4:哺乳細胞におけるSP1ルシフェラーゼの発現]SP1ルシフェラーゼをHeLa細胞に発現させて、細胞内での発光強度を測定した。SP1ルシフェラーゼ遺伝子の導入のために4種類の発現ベクターを作製した。ルキオラSP1から取得したオリジナルのSP1ルシフェラーゼ遺伝子においてBamHIおよびEcoRIの認識配列を削除した遺伝子配列番号3、さらに哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子配列番号4、さらにKozak配列を付与した2種類の遺伝子配列番号29および配列番号30をそれぞれ含む核酸を、pcDNA3.1ベクターInvitorogenのマルチクローニングサイトのBamHIおよびEcoRIのサイト間に挿入した。また、比較のために、既知であるP.pyralisルシフェラーゼの遺伝子について哺乳細胞における発現に最適化させた遺伝子を含む核酸を、同様にpcDNA3.1ベクターに挿入した。このようにして得られた5種のプラスミドを、それぞれリポフェクション法によってHeLa細胞に遺伝子導入し、24時間後D-MEM培地を交換した。測定直前にD-ルシフェリンを最終濃度1mMで添加し、KronosATTOを用いて発光強度を測定した。その結果を図4に示す。なお、図4に示される発光強度は10秒間の積算値を示している。図4から、SP1ルシフェラーゼのコドンの最適化によって、HeLa細胞で発現させた場合の発光強度が16.2倍増大することがわかる。さらに、Kozak配列を付与することで、コドン最適化前のSP1ルシフェラーゼと比較して、34.6倍Koz-SP1ルシフェラーゼcodonoptimized-1および38.5倍Koz-SP1ルシフェラーゼcodonoptimized-2増大したことがわかる。また、コドン最適化後のSP1ルシフェラーゼ、Kozak-SP1ルシフェラーゼ-1およびKozak-SP1ルシフェラーゼ-2はそれぞれコドン最適化後のP.pyralisルシフェラーゼより1.7倍、3.7倍および4.1倍の発光強度を示した。[実施例5:SP1ルシフェラーゼへの変異導入に伴う発光強度の変化]1.変異体の作製アミノ酸配列に変異を導入したSP1ルシフェラーゼを作製した。導入した変異は、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、438番目のアスパラギン酸をグリシンに置換する変異D438G、532番目のイソロイシンをアルギニンに置換する変異I532R、356番目のグルタミン酸をアルギニンに置換する変異E356Rおよび368番目のバリンをアラニンに置換する変異V368Aであり、これらの4つの変異を単独でまたは任意の組合せでオリジナルのSP1ルシフェラーゼに導入した。変異導入の方法は、AsakoSawanoandAtsushiMiyawakiNucleicAcidsResearch2000Vol28No16に記載の方法に沿って行った。このとき、変異導入用のプライマーとして、配列番号31D438G用、配列番号32I532R用、配列番号33E356R用および配列番号34V368A用に記載のプライマーを使用した。変異導入後、sequencingにより配列を確認し、目的の変異が導入されたことを確認した。作製した変異体のうち、D438G、I532RおよびE356Rの変異を導入したものをSP1変異体1と称し、またE356RおよびV368Aの変異を導入したものをSP1変異体2と称する。SP1変異体1の塩基配列を配列番号35に、アミノ酸配列を配列番号37に示す。SP1変異体2塩基配列を配列番号36に、アミノ酸配列を配列番号38に示す。2.変異体の発光活性の検討このSP1変異体1およびSP1変異体2について、発光活性を調べた。配列番号35または配列番号36に示される塩基配列を有する核酸の断片を、pF9ACMVhRluc-neoFlexiRベクターPromegaのSgfIサイトとPmeIサイトとの間に挿入した。得られた2種の発現ベクターをそれぞれHeLa細胞に導入し、変異体を発現させた。変異を導入していないオリジナルのSP1ルシフェラーゼを発現する細胞を比較対象として、2種の変異体を発現する細胞の発光強度を検出した。このとき、pF9ACMVhRluc-neoFlexiRベクターPromegaが有するhRluc遺伝子に基づく発光を内部標準として使用し、各HeLa細胞の発光強度の補正を行った。図5は、D-ルシフェリン添加直後から120分経過時点までのオリジナルのSP1ルシフェラーゼおよび各変異体の発光強度を示す。なお、内部標準として使用したhRlucルシフェラーゼの発光強度について、セレンテラジン添加直後から120分経過時点までの変化を図6に示す。さらに、90分経過時点でのそれぞれの発光強度を10分経過時点でのhRlucの発光で補正した場合の発光強度比を図7に示す。図7が示すように、オリジナルのSP1に対して、変異体1および変異体2では発光強度が増大した。当業者は、更なる利点および改変を容易に思い浮かべるだろう。それゆえ、本発明は、より広い側面において、ここに示され開示されるし特定の詳細および例示的な実施形態に限定されない。したがって、特許請求の範囲およびその均等物によって定義される一般的発明概念の意図および範囲を逸脱することなく、様々な改変が行われてよい。"