"非還元条件下で15kDaの分子量を有するセクレトグロビンであり、一緒に連結した5kDaの分子量を有する第一のペプチド鎖と10kDaの分子量を有する第二のペプチド鎖とを含む単離されたウマアレルゲン、ならびに抗体に対する該ウマアレルゲンと共通のエピトープを有するそれらの変異体およびフラグメント。ウマから精製された、または、組換え生産された、請求項1に記載のウマアレルゲン。第一のペプチド鎖が、N末端アミノ酸配列ATCPAVATDIASFFLLPDSL配列番号1を含む、請求項1または2に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。第二のペプチド鎖が、N末端アミノ酸配列GSGCQLLEDVVEKTITAELS配列番号2を含む、請求項1~3請求項のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。第一のペプチド鎖が、アミノ酸配列QCINEISAGDRYIITETLGK配列番号3を有するセグメントを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。第一のペプチドセグメントが、アミノ酸配列ATCPAVATDIASFFLLPDSLFKLQLIKYQAPPEAKDATMQVKQCINEISAGDRYIITETLGKIVLQCGA配列番号4を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。第二のペプチドセグメントが、アミノ酸配列GSGCQLLEDVVEKTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKAAIQLKQCYLKQSNETLNDFRTMMNSMYNSAYCALF配列番号5を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、ならびに、抗体に対するエピトープが該ウマアレルゲンと共通であるそれらの変異体およびフラグメント。請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンをコードする単離された核酸配列。請求項8に記載の核酸分子を含むベクター。請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。インビトロでの1型アレルギーの診断に使用するための請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。インビトロでの1型アレルギーの診断のための診断剤組成物を製造するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。アレルゲン抽出物および/または少なくとも1種の精製したアレルゲン構成要素を含む組成物に、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンを添加する工程を含む、アレルゲン組成物の製造方法。請求項13に記載の方法によって得られるアレルゲン組成物。インビトロでの1型アレルギーの診断方法であって、該方法は:1型アレルギーを有する疑いのある患者からの免疫グロブリンを含む体液サンプルを、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項14に記載のアレルゲン組成物と接触させる工程、および、サンプル中の、前記ウマアレルゲンに特異的に結合するIgE抗体の存在を検出する工程、を含み、ここで、このような前記ウマアレルゲンに特異的に結合するIgE抗体が存在することは、1型アレルギーであることを示す、上記方法。請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、請求項14に記載の組成物を含む、請求項15に記載の方法を行うための診断キット。1型アレルギーの予防的または治療的処置に使用するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン。1型アレルギーの予防的または治療的処置のための治療用組成物を製造するための、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲンの使用。1型アレルギーの治療に感受性を有する個体に、請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、IgE結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲンを投与することを含む、1型アレルギーの治療方法。請求項1~7のいずれか一項に記載のウマアレルゲン、または、IgE結合反応を排除するかまたは弱められるように改変された形態のウマアレルゲン、および、任意に医薬的に許容されるキャリアー、賦形剤、緩衝液および希釈剤の少なくとも1種を含む医薬組成物。発明の詳細な説明以下の実施例は、ウマからのセクレトグロビンの単離および使用によって本発明を説明するものである。これらの実施例は単なる説明であり、本発明を制限するものと解釈すべきではなく、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。実施例1:ウマ鱗屑および血清からの既知のアレルゲンの精製および特徴付けEquc1、Equc2およびEquc4/5を精製するための出発原料としてウマ鱗屑を用い、一方でウマ血清からEquc3を精製した。20mMのMOPSpH7.6、0.5MのNaClMBS=MOPS-緩衝食塩水中でウマ鱗屑アレルゴンAllergon,スウェーデン国バリングValingeを抽出し、遠心分離で透明にし、0.45μmの混合型のセルロースエステルフィルターミリポアMillipore,米国マサチューセッツ州ビレリカを通過させてろ過した。3種全てのウマ鱗屑アレルゲンにとって第一の精製工程として、透明化した抽出物を、サイズ排除クロマトグラフィーSECのためにスーパーデックスSuperdexTM75カラムXK26/100,Vt=505mL,GEヘルスケアライフサイエンスGEHealthcareLifeSciences、スウェーデン国ウプサラに適用し、MBSを用いて流速2mL/分で溶出した。Equc1Equc1を精製するために、図1AにおけるピークAを2MのNH4SO4に調整し、20mMトリスpH8.0中の2MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロースPhenylSepharoseTMHPカラムHR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンスに適用した。2M~0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。勾配の中央でEquc1を含む2つのピーク図1BにおけるピークCおよびDが溶出した。20mMのMOPSpH7.6、0.5MのNaClで平衡化したセファデックスSephadexTMG25ファインカラムXK16/20,Vt=34mL,GEヘルスケアライフサイエンスで各ピークを脱塩した後、それぞれのnEquc1調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEで、サンプルと100mMのβ-メルカプトエタノールを含むNuPAGELDSサンプル緩衝液インビトロジェンとを1:3で混合することによって製造された還元サンプルのNuPAGEMES緩衝液系10NuPAGEゲル,インビトロジェンInvitrogen,米国カリフォルニア州カールスバッドを用いて処理した。見かけの分子量の指標として、マーク12Mark12TM標準インビトロジェンを用いた。いずれのnEquc1調製物もSDS-PAGEでの判断から純粋であることがわかった図1E。説明されている通りに、ブルカーダルトニクスオートフレックスAutoflex2装置ブルカーダルトニクスBrukerDaltonics,ドイツ国ブレーメンでペプチドマスフィンガープリンティングPMFを行うことによってタンパク質調製物を明確にEquc1と同定したMattssonetal2009。説明されている通りに、上記タンパク質の両方の形態をイムノCAPImmunoCAPTM固相に固定したMarknellDeWittetal2002。Equc2Equc2を精製するために、SECからの第二のピーク図1AにおけるピークBを1MのNH4SO4に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICにおいて20mMトリスpH8.0中の1MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロースTMHPカラムHR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンスで処理した。同じ緩衝液中の1M~0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。分画図1CにおけるピークEを通過したフロー中にEquc2が含まれており、これをプールして、20mMのビストリスプロパンpH8.5で平衡化したセファデックスTMG25ファインカラムXK26/20,Vt=90mL,GEヘルスケアライフサイエンスで脱塩した。脱塩したEquc2プールを最終的に20mMのビストリスプロパンpH8.5で平衡化した陰イオン交換カラムソースSourceTM15QHR16/10,Vt=9mL,GEヘルスケアライフサイエンスに適用した。同じ緩衝液中の0~0.40Mの直線的なNaCl濃度勾配で溶出させたところ、タンパク質は3つのピークに分解し、これらはいずれも、SDS-PAGE解析で純粋な17kDaのバンドを示した。最も大きい2つのピークをN末端の配列解析プロサイスProciseTMLC452、アプライドバイオシステムズAppliedBiosystems,米国カリフォルニア州フォスターシティーで解析し、これらはいずれも配列DQDPQSEDTYを有しており、これらはEquc2.0201と同定された図1DピークHおよびI。説明されている通りに、IgE結合反応性を評価するために、これらのピークをプールし、イムノCAPTM固相に固定したMarknellDeWittetal2002。Equc4/5SECからの第二のピーク図1AのピークBを用いてEquc4/5の精製を行った。このプールを1MのNH4SO4に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィーHICにおいて20mMトリスpH8.0中の1MのNH4SO4で平衡化したフェニルセファロースTMHPカラムHR10/10,Vt=9.0mL,GEヘルスケアライフサイエンスで処理した。同じ緩衝液中の1M~0MのNH4SO4の直線的なNH4SO4濃度勾配で溶出させた。Equc4/5タンパク質は、勾配の中央で2つの別個のピーク図1CにおけるピークFおよびGに溶出した。第一のピークのSDS-PAGE解析から14kDaのバンドとして移動するタンパク質が明らかになり、第二のピークは19kDaのバンドを含むことが明らかになった。その後、20mMのビストリスプロパンpH8.5で平衡化したセファデックスTMG25ファインカラムXK26/20,Vt=90mL,GEヘルスケアライフサイエンスで脱塩した。いずれのタンパク質もSDS-PAGEにより純粋であることがわかった図1E。これら2種の調製物はいずれもN末端配列VGPLLGPSDAを示し、これは、ウマラセリンまたはEquc4/5と同定された。説明されている通りに、nEquc4/5の2つの形態を別々にイムノCAPTM固相に固定したMarknellDeWittetal2002。Equc3天然Equc3を、実質的に説明されている通りに、ブルーセファロースBlueSepharoseFF、GEヘルスケアライフサイエンスを用いたアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーAIECおよびSECによって、ウマ血清から精製したvanEijketal1999。実施例2:ウマに感作された個体からの血清のパネルにおける個々のウマ鱗屑アレルゲン構成要素へのIgE結合レベルの評価A型およびB型と名付けられたEquc1の2つの形態のIgE結合活性を、社内の血清コレクションから得られたウマ鱗屑に感作された血清1セットを用いて評価した。図2Aで示されるように、Equc1の2つの形態は、同等のIgE結合活性を示した。従って以下の分析にはnEquc1Aで得られた値のみを用いた。ウマ鱗屑反応性血清の類似のセットを用いて、Equc4/5の2つの形態へのIgE抗体結合を比較したところ、図2Bで示されるように、それらは極めて類似していることがわかった。通常の実験用イムノCAPTM試験ファディアPhadia,スウェーデン国ウプサラを用いてウマ鱗屑抽出物および精製したウマアレルゲンへのIgE抗体結合を試験した。実験用イムノCAPTM試験を上述のようにして調製した。ウマ鱗屑で感作された個体からの29種の血清のパネルを用いた。ウマ鱗屑抽出物、nEquc1、nEquc2、nEquc4/5に対するIgE反応の決定を行った。結果は表1に示したが、ここで患者A1~A29の血清中のHDEおよび構成要素および3種の構成要素の合計に対するIgE抗体濃度はkUA/Lで表示した。構成要素の割合は、構成要素の合計とウマ鱗屑抽出物との比率であり、パーセンテージで示した。ウマ鱗屑抽出物に対するIgE結合のレベルが、個々の構成要素、例えば血清番号A1、A21およびA22それぞれが占める可能性があるレベルよりも有意に高いレベルを有する多数の血清を同定した。この段階で評価されていないEquc3反応性の可能性を別にしても、同定した血清は、新規のウマ鱗屑由来IgE結合タンパク質の検索に役立つ可能性がある。実施例3:新規のIgE結合反応性を有するウマ鱗屑からの分画の同定前もって特徴付けられているウマ鱗屑アレルゲンを精製するプロセスの間に、これまでに知られていたウマアレルゲン以外のタンパク質を含む数種の分画が同定された。上記の実施例2で同定された血清を用いてIgE結合活性を解析するために特に興味深い3種の分画を選択した。分画Aには、矢印で示された図3AEquc2の陰イオン交換による精製工程から得られた10kDaのバンド還元SDS-PAGEが含まれていた。それぞれ13kDaおよび10kDaのバンド還元SDS-PAGEを含む分画BおよびCをEquc1のHIC精製工程から得て、これは図3Bにおいて矢印で示した。説明されている通りに、実験用イムノCAPTMファディア試験を調製しMarknellDeWittetal2002、これを血清解析に用いた。表2に結果をまとめたが、表2はさらに、以前のウマ鱗屑抽出物の決定とnEquc1、nEquc2およびnEquc4/5の合計も含み、いずれもkUA/Lとして表示した。分画Cにおいて最大IgE結合レベルが確認された。特筆すべきことに、血清A1において、分画CへのIgE結合レベルが、nEquc1、nEquc2およびnEquc4/5へのIgE結合の合計よりもかなり高かった。この血清において、アルブミンIgEの反応性は1.5kUA/Lしか示さなかった示さずことから、分画Cには新規のウマ鱗屑アレルゲンが含まれることが示唆される。実施例4:分画Cにおいて優勢なタンパク質成分の精製および同定分画Cからのウマ鱗屑タンパク質の精製分画Cに存在する10kDaのタンパク質をより高度に標的化した方法で精製するために、ウマ鱗屑抽出物を実施例1で説明されているようにしてSECで処理した。図で指定された通りに図4AにおけるピークA、SDS-PAGE解析に従ってEquc1を含むピークをプールした。ピークAの右側部分だけに10kDaバンドが含まれており、これをプールした。実施例1においてEquc1に関して説明されている通りに、このプールを2MのNH4SO4に調整し、HICで処理した図4B。図4BにおけるピークJを20mMのトリスpH8.0で1:3に希釈し、同じ緩衝液で平衡化したソースTM15QカラムPE4.6/100,Vt=1.7mL;GEヘルスケアライフサイエンスに適用した。0~0.4MのNaClの直線的な濃度勾配で溶出させたところ、濃度勾配の中央において優勢なピーク、それに続いてより小さいピークが得られた図4CにおけるピークKおよびL。実施例1で説明されているようにNuPAGEMES緩衝液系を用いてSDS-PAGE解析を行ったが、ここでサンプルは、それぞれ還元および非還元条件に応じた4β-メルカプトエタノール含有または非含有のNuPAGELDS緩衝液で1:3に希釈することによってサンプルを調製した。両方のピークのSDS-PAGE解析図4Dから、非還元条件下でおよそ15kDaのバンドが出現した。サンプルを還元した際に、15kDaのバンドが消失したが、同時におよそ5および10kDaの2つのバンドが現れたことから、非還元の15kDaのバンドは、1個またはそれより多くのジスルフィド架橋で互いに連結した5kDaおよび10kDaのバンドを形成するポリペプチドで構成されていることが示唆される。両方のピークは同じタンパク質を含むようにみえるが、大きいピークKのみをさらなる生化学的解析で処理した。IgE結合を研究ために、RPC精製工程でサンプルを0.065TFAの水溶液で平衡化したソースTM5RPCカラムST2.1/150,Vt=0.52mL;GEヘルスケアライフサイエンスに適用することにより精製を行った。0.05TFAを含む90アセトニトリルからなる緩衝液Bの0~70の直線的な濃度勾配で溶出させた。濃度勾配の終わり付近でタンパク質が単一のピークで溶出した図4EにおけるピークM。セクレトグロビンとしての15kDaのウマ鱗屑タンパク質の同定SDS-PAGEゲルから切り出し抽出した還元型5kDaおよび10kDaのタンパク質バンドをN末端の配列解析によって解析した。5kDaのバンドの解析から、アミノ酸配列ATxPAVATDIASFFLLPDSLx:未解析の残基が明らかになり、これは、LppABに類似と表示されたエクウスカバルスEquuscaballusの予測配列Genbank登録番号XP_001502544配列番号1の残基22~41とマッチした。10kDaのバンドの解析から、配列GSGxQLLEDVVEKTITAELSx:未解析の残基が明らかになり、これは、リポフィリンCL2に類似と表示されたエクウスカバルス由来の予測配列GenBank登録番号XP_001494564配列番号2の残基19~38とマッチした。溶液中でトリプシン消化した15kDaの精製タンパク質のMALDI-TOF質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティングPMF解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意なp<0.05マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、ペプチドのMS-MS解析m/z=2281およびm/z=1262.5によって、LppABに類似の予想された配列エクウスカバルスGenBank登録番号XP_001502544から配列QCINEISAGDRYIITETLGK配列番号3が同定された。ゲル中でトリプシン消化した5kDaフラグメントのMALDI-TOF質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティングPMF解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意なp<0.05マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、検出された5種の優勢なペプチドはいずれも、配列番号4の予想されたトリプシンフラグメントに相当するものであり、ここでm/z=903.47残基28~35に相当、m/z=1037.6残基43~53に相当、m/z=1262.6残基43~53に相当、m/z=2281.1残基43~62に相当およびm/z=2384.2残基1~22に相当であり、これらは合計で、配列番号4の予測のアミノ酸残基のうち50残基72にあたる。ゲル中でトリプシン消化した10kDaのバンドのMALDI-TOF質量分析法によるペプチドマスフィンガープリンティングPMF解析を行ったところ、既知のデータベースエントリーとの有意なp<0.05マッチングはまったく得られなかった。しかしながら、検出された2種の優勢なペプチドは、m/z=1433.6およびm/z=2880.4を示し、これは、それぞれ配列番号5の残基1~13および14~39に相当するペプチドGSGCQLLEDVVEKおよびTITAELSPAEYVEAVQEFIPDEATEKの質量と一致した。同定されたデータベースエントリー、XP_001502544配列番号6およびXP_001494564配列番号7両方のアミノ酸配列は、セクレトグロビンタンパク質ファミリーに特有の特徴を示した。従って、総合すると、これらの結果から、15kDaのウマ鱗屑タンパク質はセクレトグロビンであると同定された。以降、このタンパク質はEquc15kと称する。図5に、Equc15kの2種の鎖の前駆体配列の予測される全長配列を示し5kDaフラグメント-配列番号6;10kDaフラグメント-配列番号7、ここでN末端の配列解析によって同定されたアミノ酸を下線で示し、MS-MS解析によって同定されたアミノ酸を太字で示す。5kDaフラグメントの前駆体配列は、21個のアミノ酸のN末端シグナルペプチドを含み、10kDaフラグメントの前駆体配列は、18個のアミノ酸のN末端シグナルペプチドを含む。特筆すべきすることに、シグナルPsignalPwwwcbsdtudkservicesSignalPを用いた前駆体配列のシグナルペプチド予想から、5kDaおよび10kDa鎖の両方について実験的に得られた配列と同じ成熟配列が得られた。図4Dに記載のSDS-PAGE解析は、非還元条件下において、5および10kDaのアミノ酸鎖は1個またはそれより多くのジスルフィド架橋で一緒に保持されており、それによりヘテロ二量体タンパク質が形成されることを示す証拠となる。従って、この解析は、配列番号4をコードする遺伝子を、これまで知られていなかったヘテロ二量体のセクレトグロビンタンパク質を共に構成する配列番号5をコードする異なる遺伝子と結びつけるものである。実施例5:免疫ブロット解析を用いたEquc15kへのIgE結合の評価IgEのタンパク質への反応性がEquc15kのどのサブユニットに対するものなのかを決定するために、還元および非還元条件の両方を用いた免疫ブロット解析を行った。4~20NuPAGEゲルインビトロジェンを用いたSDS-PAGEによって分離した精製Equc15kの還元および非還元サンプルで免疫ブロット解析を行い、ハイボンドHybondECLニトロセルロースメンブレンGEヘルスケアライフサイエンスにエレクトロブロッティングした。ブロッキング緩衝液50mMリン酸塩pH7.4、0.1体積/体積トゥイーンTweenTM20、0.9質量/体積NaCl、0.3質量/体積デキストランT10を用いてタンパク質ブロットを室温で1時間ブロッキングし、それぞれブロッキング緩衝液で1:4.8および1:13.5に希釈した患者3および12の血清と共に一晩インキュベートした。0.5体積/体積トゥイーン-20を含む0.15MのNaCl溶液で洗浄した後に、メンブレンをブロッキング緩衝液中でHRPで標識した抗ヒトIgE抗体と共に3時間インキュベートし、洗浄した後、結合したIgEを、ECLアドバンスECLAdvanceウェスタンブロッティング検出キットGEヘルスケアライフサイエンスおよびLAS4000ミニCCDカメラフジフィルムFujifilm,日本国東京を用いて蛍光分析によって検出した。イムノCAPTM解析によれば、解析患者番号3および12で用いられた2種の血清はいずれもEquc15kに対して優勢な反応性を示した以下の実施例7を参照。いずれの血清も、還元型5kDaおよび10kDaサブユニットに相当する弱いバンドとして観察された、還元条件下で解離したEquc15kのサブユニットとは、弱い反応しか示さなかった図6。Equc15kの非還元型15kDaバンドに相当するバンドとは、非還元条件下でそれよりかなり強い反応性が観察された。この解析において、他のバンドに対して有意な反応性は観察されなかった。この免疫ブロット解析から、IgE結合反応性は、実際には、Equc15k標品の主要なタンパク質バンドに向けられることが実証された。実施例6:組換えEquc15kの生産および免疫学的な特徴付け組換えEquc15kのクローニングおよび精製5kDaおよび10kDaサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、Gly-Gly-Gly-Gly-Serを3回含むリンカーペプチドをコードする配列とを組み合わせることによってEquc15k一本鎖の合成遺伝子を設計した。この合成遺伝子全長を、固定した金属イオンアフィニティークロマトグラフィーIMACによるタンパク質精製ができるようにC末端にヘキサヒスチジンタグを添加したベクターpET23aノバジェンNovagen,米国ウィスコンシン州マディソンのNdeIおよびXhoI部位にクローニングした。配列番号8に、組換えタンパク質全体のアミノ酸配列を示す。大腸菌E.coliDNA2.0,米国カリフォルニア州メンローパークにおいて最適なコドンを使用するために、ヌクレオチド配列を設計した。配列番号9に、組換えタンパク質全体をコードする核酸配列を示す。大腸菌株BL21-AIインビトロジェンにプラスミドDNAコンストラクトを形質転換し、3リットルのバイオリアクターベラーチバイオテクニークBelachBioteknik,スウェーデン国ソルナを用いて組換えEquc15k一本鎖タンパク質を生産した。組換えEquc15kを精製するために、回収した細胞を20mMのトリス-HClpH8.0中に再懸濁し、懸濁液をエマルシフレックスEmulsiflexC5ホモジナイザーアベスチンAvestin,カナダ国オンタリオ州オタワに10000~15000kPaで通過させて溶解させた。懸濁液を遠心分離した後、ペレット化した封入体を6M塩酸グアニジン、20mMトリスpH8.0、0.5MのNaCl、5mMのイミダゾールに溶解させ、0.45μmの混合型のセルロースフィルターミリポアを通過させてろ過した。ろ過した上清をNiSO4を充填したキレート化セファロースFFカラムGEヘルスケアライフサイエンスに入れた。6M尿素を含む20mMのトリス-HClpH8.0、0.15MのNaCl、20mMのイミダゾールを用いてカラムを洗浄し、続いて同じ緩衝液中の6M~2M尿素の直線的な濃度勾配でその場で復元した。復元させた後、同じ緩衝液中の20~500mMのイミダゾールの直線的な濃度勾配によって組換えタンパク質を溶出させた。QセファロースTMFFカラムGEヘルスケアライフサイエンスを用いた20mMのトリス-HClpH8.0でのAIECによってさらなる組換えタンパク質の精製を行った。0~0.5MのNaClの直線的な濃度勾配を用いてタンパク質を溶出させ、SDS-PAGEの結果に従って分画をプールした。280nmにおける吸光度から1mg/mLあたり0.44の吸光係数により計算して最終的な調製物のタンパク質濃度を決定した。組換えEquc15kへのIgE結合の評価組換えEquc15kを実験用イムノCAPTMに固定し、説明されている通りに、36人のウマ鱗屑に感作された被験者の血清に対するIgEの反応性を決定したMarknellDeWittetal2002。精製した天然Equc15kへのIgE結合と組換えEquc15kへのIgE結合との間に優れた一致がみられたことからr=0.98図7、組換えタンパク質は免疫学的に活性であり、天然型タンパク質に構造的に類似していることが実証される。これらのデータから、同定されたゲノム配列情報から予測されたEquc15kの5kDa配列番号4および10kDa配列番号5フラグメントのアミノ酸配列は正しく、精製したウマ鱗屑アレルゲンEquc15kのアミノ酸配列を示すという強い証拠が示される。実施例7:ウマアレルギー患者の同齢集団におけるnEquc1、nEquc2、nEquc3、nEquc4/5およびEquc15kへのIgE結合活性の評価この研究には、スペインn=20およびスウェーデンn=5からの25人のウマアレルギーの被験者の血清が用いられた。全ての患者は、喘息、鼻結膜炎およびじんましんなどの症状、ならびにウマ鱗屑抽出物に対する皮膚プリックテスト陽性を有するウマアレルギーという医者の診断を受けていた。サンプルおよびデータが寄託されているバイオバンクに寄与する各センターにおける地域倫理委員会の承認の元に、全てのサンプルおよび臨床データを回収した。イムノCAPTMを用いて、25人のウマアレルギーの被験者における、ウマ鱗屑抽出物、nEquc1、nEquc2、nEquc3およびnEquc4/5およびrEquc15kに特異的なIgE抗体のレベルを決定した図8,表3。表3に、全てのイムノCAPTMレベルをkUA/Lで示し、各患者の出身国はESスペインまたはSEスウェーデンのように表示した。ウマに曝露された際に記録されたアレルギー症状は、鼻炎rhin、喘息astm、じんましんurtまたはアナフィラキシーanaphである。試験した25人の血清のなかでも、12人48がrEquc15kに対して、16人64がnEquc2に対して、19人76がnEquc1に対して0.35kUA/L以上のIgE反応を示した。nEquc3およびnEquc4/5はいずれも、調査した被験者のなかでも、調査された血清のそれぞれわずか5人20および7人28しかIgE抗体との結合を示さなかったことから、主要ではないアレルゲンのようである。25人の血清16のうち4種が、もっぱらEquc15kのみと反応した。全てのEquc15k反応性を示す血清を平均すると、Equc15kに対するIgE抗体の濃度は、ウマ鱗屑に対するIgE抗体の濃度の37になった。それに相当するnEquc1に対するIgE抗体の相対濃度は、これらのアレルゲンに特異的な反応性を示す血清において52であり、それに対してnEquc2、nEquc3およびnEquc4/5については、相対濃度はそれぞれ35、69および9であった。25人の血清中24種がウマ鱗屑抽出物に対するIgE抗体結合を示した。これら血清はいずれも、試験された5種それぞれのウマアレルゲンのうち少なくとも1種への結合を示した。個々の構成要素に対するIgE結合レベルの合計は、ウマ鱗屑抽出物に対するIgE結合レベルと一致するか、または、それよりも高かった。実施例8:Equc15k、および、ネコ由来のセクレトグロビン、主要なネコアレルゲンFeld1への個別の感作Equc15kはセクレトグロビンタンパク質ファミリーに属することから、同じタンパク質ファミリーに属する主要なネコアレルゲンであるFeld1との免疫学的な関係を調査した。36人のウマ鱗屑に感作された被験者実施例7で説明した25人のウマアレルギー患者を含むの血清におけるFeld1に対するIgE結合のレベルを評価した。組換えEquc15に対するIgEレベルとrFeld1に対するIgEレベルとの間に有意な相関r=0.36は観察されず図9、これは、Equc15kに対するIgE抗体反応は、主としてEquc15kおよびFeld1間の交差反応性の結果によるものではない逆もまた同様ことを示唆している。Equc15kとFeld1との交差反応性の可能性をさらに調査するために、Feld1とEquc15kの両方に対して有意なIgE抗体結合反応性を示す8人の血清を、固相上のrEquc15kおよびrFeld1の両方、阻害剤として最終濃度100μg/mlの加えてnEquc15kおよびrFeld1を用いて交差阻害に関して試験した図10。阻害コントロールとして、IgE希釈剤ファディアを用いた。二連での各阻害の測定値の平均を計算し、阻害の比率を、各阻害剤で抑制することができる希釈阻害剤を用いた結合の比率として計算した。これらの選択した血清において、Feld1による阻害は、固相上のFeld1に結合したときだけ達成が可能であった。同様に、Equc15kを用いた阻害は固相上のEquc15kにおいてのみ可能であったが、これは、これらの被験者において、これらの分子に対する感作は互いに独立して起こっており、交差反応性の結果ではないことを示す。しかしながら、これら2種のタンパク質間に弱い交差反応性の存在を完全に除外することはできない。配列表参考文献AkdisCAAllergyandhypersensitivitymechanismsofallergicdiseaseCurrOpinImmunol18718726AkdisMandCAAkdisMechanismsofallergenspecificimmunotherapyJAllergyClinImmunol119780791BreitenederHKHoffmannSommergruberetalRecombinantallergensbasicandpracticalconsiderationsArbeitenausdemPaulEhrlichInstitutBundesamtfurSeraundImpfstoffeZuFrankfurtAm8086CabanasRMCLopezSerranoetalImportanceofalbuminincrossreactivityamongcatdogandhorseallergensJournalofInvestigationalAllergologyandClinicalImmunology107177CromwellOHFiebigetalStrategiesforrecombinantallergenvaccinesandfruitfulresultsfromfirstclinicalstudiesImmunolAllergyClinNorthAm26261281viiDandeuJPJRabillonetalHydrophobicInteractionChromatographyforIsolationandPurificationofEquCltheHorseMajorAllergenJournalofChromatographyBiomedicalApplications6212331DemolyPBLebeletalAllergeninducedmediatorreleasetestsAllergy58553558EboDGMMHagendorensetalInvitroallergydiagnosisshouldwefollowtheflowReviewClinicalExperimentalAllergy34332339GoubranBotrosHCGregoireetalCrossantigenicityofhorseserumalbuminwithdogandcatalbuminsstudyofthreeshortpeptideswithsignificantinhibitoryactivitytowardsspecifichumanIgEandIgGantibodiesImmunology88340347GoubranBotrosHPPoncetetalBiochemicalcharacterizationandsurfactantpropertiesofhorseallergensEurJBiochem26831263136GoubranBotrosHJRabillonetalThiophilicadsorptionchromatographypurificationofEquc2andEquc3twohorseallergensfromhorsesweatJournalofChromatographyBBiomedicalSciencesApplications7105765GregoireCIRosinskiChupinetalcDNAcloningandsequencingrevealthemajorhorseallergenEquc1tobeaglycoproteinmemberofthelipocalinsuperfamilyJournalofBiologicalChemistry2713295132959GronlundHTSaarneetalTheMajorCatAllergenFeld1inDiagnosisandTherapyIntArchAllergyImmunol151265274HillerRSLafferetalMicroarrayedallergenmoleculesdiagnosticgatekeepersforallergytreatmentFASEBJournal16414416JutelMLJaegeretalAllergenspecificimmunotherapywithrecombinantgrasspollenallergensJAllergyClinImmunol116608613KimJLLElfmanetalCurrentasthmaandrespiratorysymptomsamongpupilsinrelationtodietaryfactorsandallergensintheschoolenvironmentIndoorAir15170182KlugJHMBeieretalUteroglobinClaracell10kDafamilyofproteinsnomenclaturecommitteereportAnnNYAcadSci923348354LiccardiGGDAmatoetalSensitizationtoHorseAllergensinItalyAMulticentreStudyinUrbanAtopicSubjectswithoutOccupationalExposureIntArchAllergyImmunol155412417MarknellDeWittAVNiederbergeretalMolecularandimmunologicalcharacterizationofanoveltimothygrasspollenallergenPhlp11ClinicalExperimentalAllergy3213291340MattssonLTLundgrenetalProstatickallikreinAnewmajordogallergenJAllergyClinImmunol123362368McDonaldRERIFlemingetalLatherinasurfactantproteinofhorsesweatandsalivaPLoSOne4e5726RonmarkEMPerzanowskietalDifferentsensitizationprofileforasthmarhinitisandeczemaamong78yearoldchildrenreportfromtheObstructiveLungDiseaseinNorthernSwedenstudiesPediatrAllergyImmunol149199SaarelainenSMRytkonenNissinenetalAnimalderivedlipocalinallergensexhibitimmunoglobulinEcrossreactivityClinExpAllergy38374381SaarneTLKaiseretalRationaldesignofhypoallergensappliedtothemajorcatallergenFeld1ClinExpAllergy35657663SmithWAJButleretalFeld4acatlipocalinallergenClinicalExperimentalAllergy3417321738SpitzauerSCSchweigeretalCharacterisationofdogallergensbymeansofimmunoblottingInternationalArchivesofAllergyandImmunology1006067StumvollSKWestritschnigetalIdentificationofcrossreactiveandgenuineParietariajudaicapollenallergensJournalofAllergyandClinicalImmunology111974979TutluogluBSAtisetalSensitizationtohorsehairsymptomsandlungfunctioningroomsClinExpAllergy3211701173WainsteinBKAYeeetalCombiningskinprickimmediateskinapplicationandspecificIgEtestinginthediagnosisofpeanutallergyinchildrenPediatrAllergyImmunol18231239ValentaRJLidholmetalTherecombinantallergenbasedconceptofcomponentresolveddiagnosticsandimmunotherapyClinicalandExperimentalAllergy29896904ValentaRandVNiederbergerRecombinantallergensforimmunotherapyJAllergyClinImmunol119826830ValentaRTTwarochetalComponentresolveddiagnosistooptimizeallergenspecificimmunotherapyintheMediterraneanareaJInvestigAllergolClinImmunol17Suppl13640vanEijkHMDRRooyakkersetalAutomatedisolationofhighpurityplasmaalbuminforisotoperatiomeasurementsJournalofChromatographyBBiomedicalSciencesandApplications731199205"