"PCSK9の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、AD-27919からなる、dsRNA。PCSK9の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、AD-9680を除く、表1、2、6、または7に記載のdsRNAからなる、dsRNA。PCSK9の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸dsRNAであって、前記dsRNAは、センス鎖と、PCSK9mRNA転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、前記アンチセンス鎖は、表1、2、6、または7に列挙されるアンチセンス配列のうちの1つとはヌクレオチドが3個以下異なる少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含む、dsRNA。前記相補性領域が、少なくとも17ヌクレオチド長である、請求項3に記載のdsRNA。前記相補性領域が、19~21ヌクレオチド長である、請求項3に記載のdsRNA。前記相補性領域が、19ヌクレオチド長である、請求項3に記載のdsRNA。前記相補性領域が、表1、2、6、または7のアンチセンス配列のうちの1つからなる、請求項3に記載のdsRNA。前記dsRNAが、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項3~7のいずれか1項に記載のdsRNA。前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1個が、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項8に記載のdsRNA。前記修飾ヌクレオチドが、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾ヌクレオチド、2’-デオキシ-修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ-修飾ヌクレオチド、2’-アルキル-修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項8に記載のdsRNA。それぞれの鎖が、30ヌクレオチド長以下である、請求項3~10のいずれか1項に記載のdsRNA。少なくとも1本の鎖が、少なくとも1個のヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項3~11のいずれか1項に記載のdsRNA。少なくとも1本の鎖が、少なくとも2個のヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項12に記載のdsRNA。リガンドをさらに含む、請求項1~13のいずれか1項に記載のdsRNA。前記リガンドが、前記dsRNAの前記センス鎖の3’末端に結合される、請求項14記載のdsRNA。請求項1~15のいずれか1項に記載のdsRNAを含有する細胞。請求項1~15のいずれか1項に記載のdsRNAの少なくとも1本の鎖をコードするベクター。請求項18に記載のベクターを含む細胞。請求項1~15のいずれか1項に記載のdsRNAを含むPCSK9遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。脂質製剤をさらに含む、請求項19に記載の医薬組成物。前記脂質製剤が、核酸脂質粒子製剤である、請求項19に記載の医薬組成物。細胞内のPCSK9発現を阻害する方法であって、a請求項1~15のいずれか1項に記載のdsRNAを前記細胞に導入することと、bステップaにおいて生成された前記細胞をPCSK9遺伝子の前記mRNA転写物の分解をもたらすのに十分な時間維持し、それによって、前記細胞内の前記PCSK9遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。前記PCSK9発現が少なくとも30阻害される、請求項22に記載の方法。PCSK9発現によって媒介される障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とするヒトに、請求項1~15のいずれかに記載の治療的に有効な量のdsRNAを投与することを含む、方法。前記ヒトが、高脂血症を有する、請求項24に記載の方法。前記dsRNAが、前記対象の体重1kg当たり0.01mg~5mgの濃度で投与される、請求項24に記載の方法。LDLR遺伝子に対してヘテロ接合性であるヒトにおける高コレステロール血症を治療するための方法であって、前記ヒトのLDLR遺伝子型または表現型を決定することと、前記ヒトに、脂質で製剤化されたAD-9680dsRNAを含む有効な量のMC3を0.01~5.0mg/kg体重の投与量で投与することと、を含み、投与が、血清コレステロールの低下をもたらす、方法。LDLR遺伝子に対してヘテロ接合性である対象における高コレステロール血症を治療するための方法であって、前記対象に、PCSK9の発現を阻害するために有効な量のdsRNAを投与することを含み、前記dsRNAは、センス鎖と、PCSK9RNA転写物に対する相補性領域を含むアンチセンス鎖と、を含み、前記dsRNAは、30個以下の塩基対の長さである、方法。前記アンチセンス鎖が、AD-9680のセンス配列またはAD-10792のセンス配列の少なくとも15個の連続ヌクレオチドに対して相補的である、請求項28に記載の方法。前記dsRNAが、AD-10792またはAD-9680からなる、請求項28に記載の方法。前記dsRNAが、脂質で製剤化される、請求項28に記載の方法。前記dsRNAが、表Aから選択される製剤において脂質で製剤化される、請求項28に記載の方法。前記対象が、霊長類または齧歯類である、請求項28に記載の方法。前記対象が、ヒトである、請求項28に記載の方法。前記有効な量が、前記対象の体重1kg当たり0.01~5.0mgの濃度である、請求項28に記載の方法。前記対象のLDLR遺伝子型または表現型を決定することをさらに含む、請求項28に記載の方法。投与が、前記対象の血清コレステロールの減少をもたらす、請求項28に記載の方法。前記対象の前記血清コレステロールのレベルを決定することをさらに含む、請求項28に記載の方法。本発明は、PCSK9遺伝子をサイレンシングするためにsiRNAを用いて高脂血症等のPCSK9遺伝子の下方制御によって調節され得る疾患治療の課題に対する解決策を提供する。本発明は、siRNAを用いて対象におけるPCSK9遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明は、PCSK9遺伝子の発現を下方制御することによって調節することができる病理学的状態および疾患例えば、高脂血症を治療するための組成物および方法も提供する。定義便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語および語句の意味が以下に提供される。本明細書の他の部分での用語の用法と、本項に提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義を優先することとする。G、C、A、T、およびUはそれぞれ、概して、塩基として、それぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。TおよびdTは、本明細書において同義に使用され、ヌクレオ塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンを指す。しかしながら、リボヌクレオチドまたはヌクレオチドという用語は、以下でさらに詳述される修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解される。そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが他の部分によって置換されてもよいことは、当業者には周知である。例えば、制限なく、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げられるdsRNAのヌクレオチド配列で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチド中のどこでも、標的mRNAとG-Uゆらぎ塩基対を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルと置換されてもよい。そのような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げられる組成物および方法に好適である。PCSK9という用語は、プロタンパク質転換酵素スブチリシンケキシン9遺伝子またはタンパク質FH3、HCHOLA3、NARC-1、NARC1としても知られているを指す。PCSK9に対するmRNA配列の例として、ヒト:NM_174936、マウス:NM_153565、およびラット:NM_199253が挙げられるが、これらに限定されない。PCSK9mRNA配列のさらなる例は、例えば、GenBankを用いて容易に入手することができる。本明細書で使用されるiRNAという用語は、RNAを含有し、かつRNA誘導サイレンシング複合体RISC経路を介してRNA転写物の標的切断を媒介する作用物質を指す。iRNAという用語は、siRNAを含む。以下により詳しく記載されるように、siRNAおよびsiRNA作用物質という用語は、RNA誘導サイレンシング複合体RISC経路を介してRNA転写物の標的切断を媒介するdsRNAを指す。概して、siRNAは、dsRNAである。本明細書で使用される二本鎖RNAまたはdsRNAは、標的RNAに対してセンスおよびアンチセンス配向を有するといわれる2本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリッド二本鎖領域を有するRNA分子または分子の複合体を指す。標的遺伝子という用語は、発現を阻害するために本発明のsiRNAによって標的化される目的とする遺伝子、例えば、PCSK9または第2遺伝子、例えば、XBP-1を指す。以下により詳しく記載されるように、標的配列は、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む、標的遺伝子の転写中に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。配列の標的部分は、少なくともその部分またはその近くでのiRNA指向切断のための基質としての機能を果たすのに十分な長さである。例えば、標的配列は、概して、9~36ヌクレオチド長、例えば、15~30ヌクレオチド長であり、それらの間のすべての部分的な範囲を含む。本明細書で使用される配列を含む鎖という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、別途示されない限り、相補的という用語は、第2のヌクレオチド配列との関連で第1のヌクレオチド配列を説明するために使用されるとき、当業者に理解されるように、特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。そのような条件は、例えば、400mMのNaCl、40mMのPIPESpH6.4、1mMのEDTA、洗浄後50°Cまたは70°Cで12~16時間を含み得るストリンジェントな条件であり得る。生物の内部で遭遇し得るような生理学的に関連する条件等の他の条件が適用されてもよい。当業者であれば、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、2つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。iRNA内、例えば、本明細書に記載のdsRNA内の相補的配列は、ヌクレオチド配列の一方もしくは両方の全長にわたる、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、相互に対して完全に相補的と称され得る。しかしながら、本明細書において、第1の配列が第2の配列に対して実質的に相補的と称されるとき、これら2つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらの最終的な用途、例えば、RISC経路を介する遺伝子発現の阻害にとって最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を維持しながら、最大30塩基対の二本鎖ハイブリダイゼーション時に、1つ以上であるが、通常5、4、3、または2個以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、2個のオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に1つ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチであると見なされないものとする。例えば、21ヌクレオチド長の1個のオリゴヌクレオチドおよび23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な21個のヌクレオチドの配列を含むdsRNAは、さらに、本明細書に記載の目的のために完全に相補的と称され得る。本明細書で使用される相補的配列は、それらのハイブリダイズする能力に関して上記の要件が満たされる限り、非ワトソン-クリック型塩基対および/または非天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、あるいはこれらの塩基対から完全に形成され得る。そのような非ワトソン-クリック塩基対には、G-Uゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。本明細書の相補的、完全に相補的、および実質的に相補的という用語は、それらの使用の文脈から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間またはiRNA剤のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに対して使用され得る。本明細書で使用される、メッセンジャーRNAmRNAの少なくとも一部に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドは、標的遺伝子のmRNA例えば、PCSK9をコードするmRNAの連続部分に対して実質的に相補的ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がPCSK9をコードするmRNAの中断されていない部分に対して実質的に相補的である場合、PCSK9mRNAの少なくとも一部に対して相補的である。当業者であれば、RNA分子もしくはリボ核酸分子という用語が、発現されるか、または自然界で見つけられるRNA分子だけでなく、本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知の1つ以上のリボヌクレオチド/リボヌクレオシド類似体もしくは誘導体を含むRNAの類似体および誘導体も包含することを理解する。厳密に言えば、リボヌクレオシドは、ヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、リボヌクレオチドは、1つ、2つ、または3つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、リボヌクレオシドおよびリボヌクレオチドという用語は、本明細書で使用されるとき、同等であると見なされ得る。RNAは、例えば、以下の本明細書に記載されるように、核酸塩基構造またはリボースリン酸骨格構造において修飾され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を維持しなければならない。非限定的な例として、RNA分子は、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、5’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックされたヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾ヌクレオシド、2’-アミノ-修飾ヌクレオシド、2’-アルキル-修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデート、もしくはヌクレオシドを含む非天然塩基、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない少なくとも1個の修飾リボヌクレオシドも含み得る。あるいは、RNA分子は、dsRNA分子の全長に至るまで、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個またはそれ以上の修飾リボヌクレオシドを含み得る。この修飾物は、RNA分子におけるそのような複数の修飾リボヌクレオシドのそれぞれに対して同一である必要はない。一実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物における使用が企図される修飾されたRNAは、必要とされる二本鎖構造を形成する能力を有し、かつRISC経路を介して標的RNAの特異的分解を可能にするか、または媒介するペプチド核酸PNAである。一態様において、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。そのような例において、iRNA剤は、例えば、dsRNAの二本鎖部分内でデオキシヌクレオシドオーバーハング複数を含む、または1つ以上のデオキシヌクレオシドを含む、1つ以上のデオキシヌクレオシドを含み得る。しかしながら、いかなる場合でも、iRNAという用語により包含される二本鎖DNA分子でないことは自明である。本明細書で使用されるヌクレオチドオーバーハングという用語は、iRNAの二本鎖構造、例えば、dsRNAから突出する少なくとも1個の不対ヌクレオチドを指す。例えば、dsRNAの一方の鎖の3’末端が、他方の鎖の5’末端を越えて延在するか、またはその逆であるときに、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。dsRNAは、少なくとも1個のヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか、あるいは、該オーバーハングは、少なくとも2個のヌクレオチド、少なくとも3個のヌクレオチド、少なくとも4個のヌクレオチド、少なくとも5個のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドを含むヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含むか、またはこれらからなり得る。該オーバーハング複数を含むは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組み合わせ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド複数を含むは、dsRNAのアンチセンス鎖もしくはセンス鎖のいずれかの5’末端、3’末端、または両方の末端に存在し得る。該オーバーハング中のヌクレオチドのうちの1つ以上を、ヌクレオシドチオホスフェートで置換することができる。dsRNAに関して本明細書で使用される平滑または平滑末端化されたという用語は、dsRNAの所与の末端では不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。dsRNAの一方または両方の末端が平滑であり得る。dsRNAの両方の末端が平滑である場合、該dsRNAは、平滑末端化されていると考えられる。明確にするために、平滑末端化されたdsRNAは、両方の末端で平滑であるdsRNAであり、すなわち、その分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しない。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖である。アンチセンス鎖またはガイド鎖という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むiRNAの鎖、例えば、dsRNAの鎖を指す。本明細書で使用される相補性領域という用語は、配列、例えば本明細書で定義される標的配列に対して実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性領域が標的配列に対して完全に相補的でない場合、ミスマッチは、分子の内部領域または末端領域に存在し得る。概して、最も許容されるミスマッチは、末端領域内、例えば、5’および/または3’末端から5、4、3、または2ヌクレオチド以内に存在する。本明細書で使用されるセンス鎖またはパッセンジャー鎖という用語は、その用語が本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的な領域を含むiRNAの鎖を指す。本明細書で使用されるSNALPという用語は、安定した核酸脂質粒子を指す。SNALPは、iRNAまたはiRNAが転写されるプラスミド等の核酸を含む還元された水性内部をコーティングする脂質の小胞を表す。SNALPは、例えば、米国特許出願公開第20060240093号、同第20070135372号、および国際出願第WO2009082817号に記載されている。これらの出願は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。細胞への導入は、iRNAについて言及するとき、当業者に理解されるように、細胞への取り込みもしくは吸収を促進するか、またはそれをもたらすことを意味する。iRNAの吸収または取り込みは、支援を受けない拡散プロセスもしくは能動的な細胞プロセスを介して、または補助剤もしくはデバイスによって生じ得る。この用語の意味は、インビトロ細胞に限定されず、iRNAを生存生物の一部である細胞に導入することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達の場合、iRNAを組織部位に注入するか、または全身投与することができる。インビボ送達は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,032,401号および同第5,607,677号、ならびに米国公開第2005/0281781号に記載の送達系等のベータグルカン送達系によるものであり得る。インビトロでの細胞への導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当技術分野で既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、以下の本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知である。本明細書で使用される~の発現を調節するという用語は、未処理の細胞における標的遺伝子の発現と比較して、本明細書に記載のiRNA組成物で処理された細胞における標的遺伝子発現の少なくとも部分的な阻害または部分的な活性化を指す。活性化する強化する、~の発現を上方制御する、~の発現を増加させる等の用語は、それらが標的遺伝子を指す限り、本明細書において、第1の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように治療されていない第2の細胞もしくは細胞群対照細胞と比較して、標的遺伝子が転写され、かつ標的遺伝子の発現が増加するように処理された第1の細胞もしくは細胞群から単離または検出され得る標的mRNAの量の増加によって示される、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指す。一実施形態において、標的遺伝子の発現は、本明細書に記載のiRNAの投与により、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、または50活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本発明で取り上げられるiRNAの投与により、少なくとも約60、70、または80活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の発現は、本明細書に記載のiRNAの投与により、少なくとも約85、90、もしくは95、またはそれ以上活性化される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子発現は、未処理の細胞における発現と比較して、本明細書に記載のiRNAで処理された細胞において少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、またはそれ以上増加する。小さいdsRNAによる発現の活性化は、例えば、Lietal.,2006Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:17337-42、米国第20070111963号、米国第2005226848号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。サイレンシング、~の発現を阻害する、~の発現を下方制御する、~の発現を抑圧する等の用語は、それらが標的遺伝子を指す限り、本明細書において、第1の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第2の細胞もしくは細胞群対照細胞と比較して、標的遺伝子が転写され、かつ標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第1の細胞もしくは細胞群から単離または検出され得る標的mRNAの量の減少によって示される、標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑圧を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。あるいは、阻害の程度を、標的遺伝子発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量、またはある特定の表現型を示す細胞の数の減少、例えば、サイトカイン産生の欠如もしくは低下の観点から得ることができる。原則として、標的遺伝子サイレンシングは、構造的に、またはゲノム工学によってのいずれかで、標的を発現する任意の細胞において、任意の適切なアッセイを用いて決定され得る。しかしながら、所与のiRNAが標的遺伝子の発現をある程度阻害するか、したがって、本発明によって包含されるかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、そのような参照のとしての役割を果たすものとする。例えば、ある特定の場合において、標的遺伝子の発現は、本発明で取り上げられるiRNAの投与により、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、または55抑圧される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本発明で取り上げられるiRNAの投与により、少なくとも約60、65、70、75、または80抑圧される。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のiRNAの投与により、少なくとも約81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、またはそれ以上抑圧される。標的遺伝子発現の文脈において本明細書で使用される治療する、治療等の用語は、標的発現によって媒介される病理学的プロセスからの緩和またはその軽減を指す。本発明の文脈において、標的発現によって媒介される病理学的プロセス以外の以下の本明細書に列挙される他の条件のうちのいずれかに関するする限り、治療する、治療等の用語は、そのような条件に関連する少なくとも1つの症状を緩和もしくは軽減するか、またはそのような条件の進行もしくは予想される進行を遅延もしくは逆転させることを意味する。疾患マーカーまたは症状の文脈において、低下するとは、そのようなレベルにおける統計学的に有意な低下を意味する。減少は、例えば、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、またはそれ以上であってもよく、好ましくは、そのような障害を有しない個人の正常範囲内として許容されるレベルまで減少する。本明細書で使用される治療的に有効な量という語句は、標的遺伝子発現、例えば、PCSK9遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの治療もしくは管理、または標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの明らかな症状において治療的有用性を提供する量を指す。予防的に有効な量という語句は、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの予防または標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの明らかな症状において治療的有用性を提供する量を指す。治療的に有効な特定量は、一般の医師であれば容易に決定することができ、例えば、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの種類、患者の病歴および年齢、標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスの段階、ならびに標的遺伝子発現によって媒介される病理学的プロセスを阻害する他の作用物質の投与等の当技術分野で既知の要因に応じて変化し得る。本明細書で使用される医薬組成物は、薬理学的に有効な量のiRNAおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される薬理学的に有効な量、治療的に有効な量、または単に有効な量は、目的とする薬理学的結果もしくは治療結果をもたらすのに有効なiRNAの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも10減少するときに、所与の臨床治療が有効であると見なされる場合、その疾患または障害の治療に治療的に有効な薬物の量は、そのパラメータにおける少なくとも10の減少をもたらすために必要な量である。薬学的に許容される担体という用語は、治療薬、例えば、siRNAの投与のための担体を指す。担体は、以下により詳細に記載されており、脂質製剤、例えば、LNP09およびSNALP製剤を含む。二本鎖リボ核酸dsRNAsiRNA、例えば、PCSK9遺伝子の発現を阻害するdsRNAが本明細書に記載される。dsRNAを、以下でさらに議論される当技術分野で既知の標準の方法によって、例えば、AppliedBiosystems,Incから市販されているもの等の自動DNA合成機の使用によって合成することができる。合成のさらなる説明は、以下および実施例で見出される。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖アンチセンス鎖は、標的遺伝子の発現中に形成されるmRNAの配列に由来する標的配列に対して実質的に相補的であり、かつ概して、完全に相補的な相補性領域を含む。他方の鎖センス鎖は、2本の鎖が好適な条件下で組み合わされるときにハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。二本鎖領域が単一分子の2本の鎖から形成される場合、この分子は、二本鎖構造を形成する一方の鎖の3’末端とそれぞれの他方の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの一本鎖本明細書においてヘアピンループと称されるによって分離される二本鎖領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも1個の不対ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも23個、またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。dsRNAの2本の実質的に相補的な鎖が別個のRNA分子によって含まれる場合、これらの分子は、共有結合される必要はないが、共有結合されてもよい。2本の鎖がヘアピンループ以外の手段により共有結合される場合、その結合構造は、リンカーと称される。概して、siRNA、例えば、dsRNAの二本鎖構造は、15~30塩基対境界値も含む、より一般的には、18~25塩基対境界値も含む、さらにより一般的には、19~24塩基対境界値も含む、および最も一般的には、19~21塩基対境界値も含むの長さである。9~36塩基対の二本鎖を考慮すると、この二本鎖は、例えば、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36の範囲、および15~30塩基対、15~26塩基対、15~23塩基対、15~22塩基対、15~21塩基対、15~20塩基対、15~19塩基対、15~18塩基対、15~17塩基対、18~30塩基対、18~26塩基対、18~23塩基対、18~22塩基対、18~21塩基対、18~20塩基対、19~30塩基対、19~26塩基対、19~23塩基対、19~22塩基対、19~21塩基対、19~20塩基対、20~30塩基対、20~26塩基対、20~25塩基対、20~24塩基対、20~23塩基対、20~22塩基対、20~21塩基対、21~30塩基対、21~26塩基対、21~25塩基対、21~24塩基対、21~23塩基対、または21~22塩基対を含むが、これらに限定されないそれらの間の任意の部分的な範囲の任意の長さであり得る。組成物が2個以上のsiRNAを含むか、または方法が2個以上のsiRNAを用いる場合、それぞれのsiRNAは、同一または異なる二本鎖の長さを有し得る。siRNA内の標的配列に対する相補性領域は、15~30ヌクレオチド長境界値も含む、より一般的には、18~25境界値も含む、さらにより一般的には、19~24ヌクレオチド長境界値も含む、および最も一般的には、19~21ヌクレオチド長境界値も含むである。いくつかの実施形態において、dsRNAは、15~20ヌクレオチド長境界値も含むであり、他の実施形態において、dsRNAは、25~30ヌクレオチド長境界値も含むである。相補性領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長であり得る。非限定的な例として、標的配列は、15~30ヌクレオチド、15~26ヌクレオチド、15~23ヌクレオチド、15~22ヌクレオチド、15~21ヌクレオチド、15~20ヌクレオチド、15~19ヌクレオチド、15~18ヌクレオチド、15~17ヌクレオチド、18~30ヌクレオチド、18~26ヌクレオチド、18~23ヌクレオチド、18~22ヌクレオチド、18~21ヌクレオチド、18~20ヌクレオチド、19~30ヌクレオチド、19~26ヌクレオチド、19~23ヌクレオチド、19~22ヌクレオチド、19~21ヌクレオチド、19~20ヌクレオチド、20~30ヌクレオチド、20~26ヌクレオチド、20~25ヌクレオチド、20~24ヌクレオチド、20~23ヌクレオチド、20~22ヌクレオチド、20~21ヌクレオチド、21~30ヌクレオチド、21~26ヌクレオチド、21~25ヌクレオチド、21~24ヌクレオチド、21~23ヌクレオチド、または21~22ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個のヌクレオチドである。組成物が2個以上のsiRNAを含むか、または方法が2個以上のsiRNAを用いる場合、それぞれのsiRNAは、同一の長さまたは異なる長さの相補性領域を有し得る。dsRNA、例えば、本明細書に記載のsiRNAのうちのいずれかは、1つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。一実施形態において、dsRNAの少なくとも一方の端は、1~4個、または1、2、3、もしく4個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、それらの平滑末端化された対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有する。概して、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の3’末端、またはあるいは、センス鎖の3’末端に位置する。dsRNAは、概してアンチセンス鎖の5’末端に位置する平滑末端も有し得る。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの1つ以上が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。組成物が2個以上のsiRNAを含むか、または方法が2個以上のsiRNAを用いる場合、それぞれのsiRNAは、位置、長さ、およびヌクレオチドによって表される同一または異なるオーバーハングを有し得る。siRNAは、PCSK9遺伝子の第1の領域を標的とする。一実施形態において、PCSK9遺伝子は、ヒトPCSK9遺伝子である。別の実施形態では、PCSK9遺伝子は、マウスまたはラットPCSK9遺伝子である。例示的なPCSK9を標的とするsiRNAは、2007年5月10日出願の米国特許出願第11/746,864号現在の米国特許第7,605,251号および2007年5月10日出願の国際特許出願第PCT/US2007/068655号国際公開第WO2007/134161号として公開されているに記載されている。さらなる開示を、2009年6月4日出願の米国特許出願第12/478,452号米国第2010/0010066号として公開されているおよび2009年1月30日出願の国際特許出願第PCT/US2009/032743号国際公開第WO2009/134487号として公開されているにおいて見出すことができる。標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列は、すべての目的のために参照により組み込まれる。表1、2、6、および7は、PCSK9を標的とするsiRNAの標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列を開示する。いくつかの実施形態において、組成物は、2個以上のsiRNA、例えば、第2のsiRNAを含むか、または方法は、2個以上のsiRNAを用いる。一実施形態において、第2のsiRNAは、第1のsiRNAによって標的化された領域とは異なるPCSK9の領域を標的化する。あるいは、第2のsiRNAは、異なる第2の遺伝子を標的化する。例として、PCSK9と相互作用し、かつ/または脂質代謝もしくはコレステロール代謝に関与する遺伝子が挙げられる。例えば、第2の標的遺伝子は、XBP-1、PCSK5、ApoC3、SCAP、MIG12、HMGCoAレダクターゼ、またはIDOLLDLRの誘導性分解剤等であり得る。一実施形態において、第2の遺伝子は、ヒト遺伝子である。別の実施形態では、第2の遺伝子は、マウスまたはラット遺伝子である。一実施形態において、第2のsiRNAは、XBP-1遺伝子を標的化する。例示的なXBP-1を標的とするsiRNAを、2009年4月17日出願の米国特許出願第12/425,811号米国第2009-0275638号として公開されているにおいて見出すことができる。標的配列、センス鎖配列、およびアンチセンス鎖配列は、すべての目的のために参照により組み込まれる。さらなるdsRNA表1、2、6、および7の配列のうちの1つからの少なくとも15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上の連続ヌクレオチドの部分的な配列を有し、かつ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が完全な配列を含むdsRNAとは5、10、15、20、25、または30以下異なるdsRNAが、本発明に従って企図される。加えて、表1、2、6、および7に提供されるRNAは、RISCによって媒介される切断の影響を受けやすい標的遺伝子転写物中の部位を特定する。したがって、本発明は、そのような配列のうちの1つの配列内を標的とするiRNAをさらに特徴付ける。本明細書で使用されるとき、iRNAは、iRNAがその特定の部位内の任意の場所で転写物の切断を促進する場合、RNA転写物の特定の部位内を標的とすると考えられている。そのようなiRNAは、概して、標的遺伝子中の選択された配列に対して連続的な領域由来のさらなるヌクレオチド配列にカップリングされる本明細書に提供される配列からの少なくとも15個の連続ヌクレオチドを含む。標的配列は、概して、15~30ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的RNAの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性において幅広いバリエーションがある。本明細書に提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的に最適な標的配列の同定に関する指針を提供するが、所与のサイズ非限定的な例として、21個のヌクレオチドのウィンドウまたはマスクが、逐語的または比喩的に例えば、コンピュータ内を含む標的RNA配列上に置かれて、標的配列としての役割を果たし得るそのサイズ範囲内の配列を同定するといった経験的アプローチを取ることもできる。完全な一連の起こり得る配列が選択された任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、配列ウインドウを最初の標的配列位置の1ヌクレオチド上流または下流に徐々に移動させることによって、次の可能性のある標的配列を同定することができる。この過程は、最適に機能するこれらの配列を同定するための本明細書に記載のアッセイまたは当技術分野で既知のアッセイを用いて同定された配列の系統的合成および試験に加えて、iRNA剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するこれらのRNA配列を同定することができる。したがって、例えば、上で同定される配列が効果的な標的配列を示すが、同等またはより良好な阻害特徴を有する配列を同定するために、阻害効率のさらなる最適化を所与の配列の1ヌクレオチド上流または下流に徐々にウィンドウを歩かせるwalkingthewindowことによって達成することができることが企図される。さらに、例えば、表1、2、6、および7において同定される任意の配列について、さらなる最適化を、より長い配列もしくはより短い配列を生成するためにヌクレオチドの系統的な付加または除去のいずれかを行い、かつこれらの配列およびその点から標的RNAを上方または下方により長いサイズもしくはより短いサイズのウィンドウを歩かせることによって生成された配列を試験することによって達成することができることが企図される。この場合もやはり、当技術分野で既知の阻害アッセイまたは本明細書に記載の阻害アッセイにおいて、新規の候補標的を生成するためのこのアプローチとこれらの標的配列に基づくiRNAの有効性についての試験を合わせることにより、阻害効率においてさらなる改善をもたらすこともできる。さらにさらには、そのような最適化配列を、例えば、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドまたは当技術分野で既知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加もしくは変化、または当技術分野で既知の他の修飾および/もしくは本明細書で議論される他の修飾例えば、血清安定性の増加、または半減期の循環、熱安定性の増加、膜貫通送達の強化、特定の位置もしくは細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加等によって調整して、発現阻害剤として分子をさらに最適化することができる。表1、2、6、および7に記載のiRNAは、標的配列に対する1つ以上のミスマッチを含有し得る。一実施形態において、表1、2、6、および7に記載のiRNAは、3つ以下のミスマッチを含有する。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、例えば、相補性領域の5’末端もしくは3’末端のいずれかから最後の5個のヌクレオチド内に制限されることが好ましい。例えば、PCSK9遺伝子の領域に対して相補的な23個のヌクレオチドのiRNA剤のRNA鎖の場合、RNA鎖は、概して、中央の13個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載の方法または当技術分野で既知の方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含有するiRNAが、PCSK9遺伝子の発現の阻害に効果的であるかを決定することができる。特にPCSK9遺伝子内の特定の相補性領域が集団内に多型配列変異を有することで知られている場合、PCSK9遺伝子の発現を阻害する際にミスマッチを有するiRNAの有効性を考慮することは、重要である。共有結合いくつかの実施形態において、組成物は、2個以上のsiRNA、例えば、第2のsiRNAを含むか、または方法は、2個以上のsiRNAを用いる。その2個のsiRNAを、共有リンカーを介して結合することができる。共有リンカーは、当業者に周知であり、例えば、核酸リンカー、ペプチドリンカー等を含む。共有リンカーは、これら2個のsiRNAを結合する。共有リンカーは、2本のセンス鎖、2本のアンチセンス鎖、1本のセンス鎖および1本のアンチセンス鎖、2本のセンス鎖および1本のアンチセンス鎖、2本のアンチセンス鎖および1本のセンス鎖、または2本のセンス鎖および2本のアンチセンス鎖を結合することができる。共有リンカーは、RNAおよび/またはDNAおよび/またはペプチドを含み得る。リンカーは、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖、または部分的に二本鎖であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含む。リンカーは、切断可能であり得るか、または切断不可能であり得る。共有リンカーは、例えば、dTsdTuu=5’-2’デオキシチミジル-3’-チオホスフェート-5’-2’デオキシチミジル-3’-ホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェート、rUsrUチオホスフェートリンカー:5’-ウリジル-3’-チオホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェート、rUrUリンカー、dTsdTaaaadTsdT、5’-2’デオキシチミジル-3’-チオホスフェート-5’-2’デオキシチミジル-3’-ホスフェート-5’-アデニル-3’-ホスフェート-5’-アデニル-3’-ホスフェート、dTsdT5’-2’デオキシチミジル-3’-チオホスフェート-5’-2’デオキシチミジル-3’-ホスフェート、dTsdTuu=uudTsdT=5’-2’デオキシチミジル-3’-チオホスフェート-5’-2’デオキシチミジル-3’-ホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェートであり得る。共有リンカーは、ポリ5’-アデニル-3’-ホスフェート-AAAAAAAAまたはポリ5’-シチジル-3’-ホスフェート-5’-ウリジル-3’-ホスフェート-CUCUCUCU等のポリRNA、例えば、Xn一本鎖ポリRNAリンカーであり得、式中、nは、2~50境界値も含む、好ましくは4~15境界値も含む、最も好ましくは7~8境界値も含むの整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリRNAリンカーにも存在し得る。共有リンカーは、例えば、ポリ5’-2’デオキシチミジル-3’-ホスフェート-TTTTTTTT等のポリDNAであり得、式中、nは、2~50境界値も含む、好ましくは4~15境界値も含む、最も好ましくは7~8境界値も含むの整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリDNAリンカーにも存在し得る。一本鎖ポリDNAリンカーであって、式中、nは、2~50境界値も含む、好ましくは4~15境界値も含む、最も好ましくは7~8境界値も含むの整数である。修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物は、該ポリDNAリンカーにも存在し得る。共有リンカーは、ジスルフィド結合、任意で、ビス-ヘキシル-ジスルフィドリンカーを含み得る。一実施形態において、ジスルフィドリンカーは、以下のものである。共有リンカーは、ペプチド結合を含み得、例えば、アミノ酸を含み得る。一実施形態において、共有リンカーは、好ましくは4~5個アミノ酸、任意でX-Gly-Phe-Gly-Yを含む1~10アミノ酸長のリンカーであり、式中、XおよびYは、任意のアミノ酸を表す。共有リンカーは、HEG、ヘキサエチレングリコールリンカーを含み得る。修飾さらに別の実施形態では、siRNAは、安定性または他の有益な特徴を強化するために化学的に修飾される。本発明で取り上げられる核酸を、参照により本明細書に組み込まれるCurrentprotocolsinnucleicacidchemistry、Beaucage,S.L.etal.Edrs.,JohnWileySons,Inc.,NewYork,NY,USAに記載される方法等の当技術分野において十分確立された方法によって合成および/または修飾することができる。修飾には、例えば、a末端修飾、例えば、5’末端修飾リン酸化反応、共役、逆結合等、3’末端修飾共役、DNAヌクレオチド、逆結合等、b塩基修飾、例えば、安定な塩基、不安定な塩基、もしくはパートナーの広範なレパートリーとの塩基対合する塩基との置換、塩基の除去脱塩基ヌクレオチド、または結合された塩基の除去、c糖修飾例えば、2’位もしくは4’位で、または糖の置換、ならびにdホスホジエステル結合の修飾もしくは置換を含む骨格修飾が含まれる。本発明で有用なRNA化合物の具体的な例として、修飾された骨格を含有するRNAまたは非天然のヌクレオシド間結合を含有するRNAが挙げられるが、これらに限定されない。修飾された骨格を有するRNAには、とりわけ、骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、当技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたRNAも、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。特定の実施形態において、修飾されたRNAは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有する。修飾されたRNA骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な3’-5’結合を有するボラノホスフェート、これらの2’-5’結合した類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が3’-5’から5’-3’へ、または2’-5’から5’-2’へ結合される逆極性を有するものを含む。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。上述のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第3,687,808号、同第4,469,863号、同第4,476,301号、同第5,023,243号、同第5,177,195号、同第5,188,897号、同第5,264,423号、同第5,276,019号、同第5,278,302号、同第5,286,717号、同第5,321,131号、同第5,399,676号、同第5,405,939号、同第5,453,496号、同第5,455,233号、同第5,466,677号、同第5,476,925号、同第5,519,126号、同第5,536,821号、同第5,541,316号、同第5,550,111号、同第5,563,253号、同第5,571,799号、同第5,587,361号、同第5,625,050号、同第6,028,188号、同第6,124,445号、同第6,160,109号、同第6,169,170号、同第6,172,209号、同第6,239,265号、同第6,277,603号、同第6,326,199号、同第6,346,614号、同第6,444,423号、同第6,531,590号、同第6,534,639号、同第6,608,035号、同第6,683,167号、同第6,858,715号、同第6,867,294号、同第6,878,805号、同第7,015,315号、同第7,041,816号、同第7,273,933号、同第7,321,029号、および米国特許第RE39464号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。その中にリン原子を含まない修飾されたRNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される;シロキサン骨格;硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格;アルケン含有骨格;スルファミン酸骨格;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格;スルホネートおよびスルホンアミド骨格;アミド骨格;ならびにN、O、S、およびCH2を混合した構成成分を有するものを有するものが含まれる。上述のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,034,506号、同第5,166,315号、同第5,185,444号、同第5,214,134号、同第5,216,141号、同第5,235,033号、同第5,64,562号、同第5,264,564号、同第5,405,938号、同第5,434,257号、同第5,466,677号、同第5,470,967号、同第5,489,677号、同第5,541,307号、同第5,561,225号、同第5,596,086号、同第5,602,240号、同第5,608,046号、同第5,610,289号、同第5,618,704号、同第5,623,070号、同第5,663,312号、同第5,633,360号、同第5,677,437号、および同第5,677,439号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。iRNAでの使用に好適であるか、またはiRNAでの使用が企図される他のRNA模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基に置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の1つであるRNA模倣物は、ペプチド核酸PNAと称される。PNA化合物では、RNAの糖骨格が、アミド含有骨格、具体的には、アミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は維持され、その骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号、および同第5,719,262号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。PNA化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsenetal.,Science,1991,254,1497-1500で見出すことができる。本発明で取り上げられるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するRNAおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、具体的には、上記の米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2--、--CH2--NCH3--O--CH2--[メチレンメチルイミノまたはMMI骨格として知られている]、--CH2--O--NCH3--CH2--、--CH2--NCH3--NCH3--CH2--、および--NCH3--CH2--CH2--[天然のホスホジエステル骨格は、--O--P--O--CH2--と表される]、ならびに上記の米国特許第5,602,240号のアミド骨格を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で取り上げられるRNAは、上記の米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。修飾されたRNAは、1つ以上の置換糖部分も含有し得る。本明細書で取り上げられるiRNA、例えば、dsRNAは、2’位置で、OH;F;O-、S-、もしくはN-アルキル;O-、S-、もしくはN-アルケニル;O-、S-、もしくはN-アルキニル;またはO-アルキル-O-アルキルのうちの1つを含むことができ、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のC1~C10アルキルまたはC2~C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾には、O[CH2nO]mCH3、OCH2nOCH3、OCH2nNH2、OCH2nCH3、OCH2nONH2、およびOCH2nON[CH2nCH3]2が含まれ、式中、nおよびmは、1~約10である。他の実施形態では、dsRNAは、2’位置で、C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルもしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物、iRNAの薬物動態学的特性を改善する基、またはiRNAの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの1つを含む。いくつかの実施形態において、修飾には、2’-メトキシエトキシ2’-O--CH2CH2OCH3であり、2’-O-2-メトキシエチルまたは2’-MOEとしても知られているMartinetal.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504、すなわち、アルコキシ-アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の以下の実施例に記載の2’-DMAOEとしても知られているOCH22ONCH32基、および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ当技術分野で2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても知られている、すなわち、同様に本明細書の以下の実施例に記載の2’-O--CH2--O--CH2--NCH22である。他の修飾には、2’-メトキシ2’-OCH3、2’-アミノプロポキシ2’-OCH2CH2CH2NH2、および2’-フルオロ2’-Fが含まれる。同様の修飾は、iRNAのRNA上の他の位置、特に、3’末端ヌクレオチド上の糖または2’-5’結合したdsRNAの3’位置および5’末端ヌクレオチドの5’位置でも行われ得る。iRNAは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖模倣物も有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、および同第5,700,920号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちのある特定の特許は、一般に、本出願とともに所有され、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。iRNAは、核酸塩基多くの場合、当技術分野で単に塩基と称される修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される非修飾または天然の核酸塩基には、プリン塩基、アデニンAおよびグアニンG、ならびにピリミジン塩基、チミンT、シトシンC、およびウラシルUが含まれる。修飾された核酸塩基には、5-メチルシトシン5-me-C、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシルシュードウラシル、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン、ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン等の他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらに、核酸塩基には、米国特許第3,687,808号で開示されるもの、ModifiedNucleosidesinBiochemistry,BiotechnologyandMedicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008で開示されるもの、TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceandEngineering,pages858-859,Kroschwitz,J.L,ed.JohnWileySons,1990で開示されるもの、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991,30,613によって開示されるもの、およびSanghvi,YS.,Chapter15,dsRNAResearchandApplications,pages289-302,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Ed.,CRCPress,1993によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちのある特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6~1.2°C増加させることを示しておりSanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.andLebleu,B.,Eds.,dsRNAResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993,pp.276-278、例示的な塩基置換であり、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせられると、さらにより著しくなる。上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちのある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許には、上述の米国特許第3,687,808号、ならびに米国特許第4,845,205号、同第5,130,30号、同第5,134,066号、同第5,175,273号、同第5,367,066号、同第5,432,272号、同第5,457,187号、同第5,459,255号、同第5,484,908号、同第5,502,177号、同第5,525,711号、同第5,552,540号、同第5,587,469号、同第5,594,121号、同第5,596,091号、同第5,614,617号、同第5,681,941号、同第6,015,886号、同第6,147,200号、同第6,166,197号、同第6,222,025号、同第6,235,887号、同第6,380,368号、同第6,528,640号、同第6,639,062号、同第6,617,438号、同第7,045,610号、同第7,427,672号、および同第7,495,088号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第5,750,692号も参照により本明細書に組み込まれる。iRNAのRNAは、修飾されて1つ以上のロックされた核酸LNAを含むこともできる。ロックされた核酸は、2’炭素および4’炭素を結合する追加の架橋を含む修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、3’内部構造立体配座において、リボースを効果的にロックする。siRNAへのロックされた核酸の付加は、血清中のsiRNAの安定性を増加させ、オフターゲット効果を減少させることが示されているElmen,J.etal.,2005NucleicAcidsResearch331:439-447、Mook,OR.etal.,2007MolCancTher63:833-843、Grunweller,A.etal.,2003NucleicAcidsResearch3112:3185-3193。ロックされた核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第6,268,490号、同第6,670,461号、同第6,794,499号、同第6,998,484号、同第7,053,207号、同第7,084,125号、および同第7,399,845号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。RNA分子の末端への潜在的安定化修飾には、N-アセチルアミノカプロイル-4-ヒドロキシプロリノールHyp-C6-NHAc、N-カプロイル-4-ヒドロキシプロリノールHyp-C6、N-アセチル-4-ヒドロキシプロリノールHyp-NHAc、チミジン-2’-O-デオキシチミジンエーテル、N-アミノカプロイル-4-ヒドロキシプロリノールHyp-C6-アミノ、2’-ドコサノイル-ウリジン-3’-ホスフェート、逆塩基dTidT等が含まれ得る。この修飾の開示を、2009年7月7日に出願された米国仮特許出願第61/223,665号‘665出願、表題OligonucleotideEndCaps、および2010年7月7日に出願された国際特許出願第PCT/US10/41214号で見出すことができる。リガンド本発明のsiRNAの別の修飾は、iRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進する1つ以上のリガンド、部分、または結合体のRNAに化学的に結合することを含む。そのような部分には、コレステロール部分等の脂質部分Letsingeretal.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556、コール酸Manoharanetal.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060、チオエーテル、例えば、beryl-S-トリチルチオールManoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309、Manoharanetal.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770、チオコレステロールOberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.,1992,20:533-538、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ,1991,10:1111-1118、Kabanovetal.,FEBSLett.,1990,259:327-330、Svinarchuketal.,Biochimie,1993,75:49-54、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネートManoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651-3654、Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777-3783、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖Manoharanetal.,NucleosidesNucleotides,1995,14:969-973、またはアダマンタン酢酸Manoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651-3654、パルミチル部分Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、リガンドは、組み込まれるiRNA剤の分布、標的、または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドがない種と比較して、選択された標的、例えば、身体の分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞内もしくは臓器内区画、組織、臓器、または領域に対する強化された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖対合に関与しない。リガンドは、タンパク質例えば、ヒト血清アルブミンHSA、低密度リポタンパク質LDL、もしくはグロブリン、炭水化物例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸、または脂質等の天然に存在する物質を含み得る。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸等の組み換えまたは合成分子でもあり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリシンPLL、ポリL‐アスパラギン酸、ポリL‐グルタミン酸、スチレン-無水マレイン酸コポリマー、ポリL-ラクチド-CO-グリコリドコポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、N-2-ヒドロキシプロピルメタクリルアミドコポリマーHMPA、ポリエチレングリコールPEG、ポリビニルアルコールPVA、ポリウレタン、ポリ2-エチルアクリル酸、N-イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジンPLL、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第4級塩、またはαヘリックスペプチドが挙げられる。リガンドは、標的基、例えば、細胞もしくは組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎細胞等の特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンB12、ビオチン、またはRGDペプチドもしくはRGDペプチド模倣物であり得る。リガンドの他の例として、染料、挿入剤例えば、アクリジン、架橋剤例えば、ソラレン、マイトマイシンC、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリン、サフィリン、多環式芳香族炭化水素例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、人工エンドヌクレアーゼ例えば、EDTA、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-Oヘキサデシルグリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-オレオイルリトコール酸、O3-オレオイルコール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン、およびペプチド結合体例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG例えば、PEG-40K、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン例えば、ビオチン、輸送/吸収促進剤例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸、合成リボヌクレアーゼ例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール群、アクリジン-イミダゾール結合体、テトラアザマクロサイクルのEu3複合体、ジニトロフェニル、HRP、またはAPが挙げられる。リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに対する特異親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。それらは、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、多価マンノース、または多価フコース等の非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖体、p38MAPキナーゼの活性化因子、またはNF-κBの活性化因子であり得る。リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および/または中間径フィラメントを破壊することによって、iRNA剤の細胞への取り込みを増加させることができる物質、例えば、薬物であり得る。その薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンA、ファロイジン、スインホリドA、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。1個のリガンドにおいて、リガンドは、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンHSAに結合する。HSA結合リガンドは、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織への結合体の分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合することができる他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、a結合体の分解への耐性を増加させ、b標的細胞もしくは細胞膜への標的化もしくは輸送を増加させることができ、かつ/またはc血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整するために使用することができる。脂質に基づくリガンドを使用して、結合体の標的組織への結合を調節、例えば、制御することができる。例えば、より強力にHSAに結合する脂質または脂質に基づくリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性は低く、したがって、身体から排出される可能性が低い。HSAにそれほど強力に結合しない脂質または脂質に基づくリガンドを使用して、結合体を腎臓に標的化することができる。好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、HSAに結合する。好ましくは、それは、結合体が好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でHSAに結合する。しかしながら、親和性は、HSA-リガンド結合が逆転することができない程度に強力ではないことが好ましい。別の好ましい実施形態において、脂質に基づくリガンドは、結合体が好ましくは腎臓に分布されるように、HSAに弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞を標的とする他の分子を、脂質に基づくリガンドの代わりに、またはそれに加えて使用することもできる。別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性型の望ましくない細胞、例えば、癌細胞の増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンA、E、およびKが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンB、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキーサル、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が含まれる。HSAおよび低密度リポタンパク質LDLも含まれる。別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくは、ヘリックス細胞透過剤である。好ましくは、ヘリックス細胞透過剤は、両親媒性である。例示的なヘリックス細胞透過剤は、tatまたはアンテノペディア等のペプチドである。ヘリックス細胞透過剤がペプチドである場合、それを修飾することができ、ペプチジル模倣物、インバートマー、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびDアミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、好ましくは、αヘリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性および疎油性相を有する。リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物本明細書でオリゴペプチド模倣物とも称されるは、天然ペプチドに類似した定義された三次元構造にフォールディングすることができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣物のiRNA剤への結合は、例えば、細胞認識および吸収を亢進させることにより、iRNAの薬物動態学的分布に影響を及ぼすことができる。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約5~50アミノ酸長、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド例えば、主にTyr、Trp、またはPheからなるであり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列MTSを含むことができる。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP配列番号1を有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP配列番号2も標的部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む極性巨大分子を、細胞膜にわたって運搬することができる送達ペプチドであり得る。例えば、HIVTatタンパク質由来の配列GRKKRRQRRRPPQ配列番号3およびショウジョウバエアンテナペディアDrosophilaAntennapediaタンパク質RQIKIWFQNRRMKWKK配列番号4が、送達ペプチドとして機能することができることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣物は、ファージ表示ライブラリ、または1ビーズ1化合物OBOC組み合わせライブラリLametal.,Nature,354:82-84,1991から同定されるペプチド等のDNAのランダム配列によってコードされ得る。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してdsRNA剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸RGD-ペプチド、またはRGD模倣物等の細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約5アミノ酸長~約40アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接立体配座特性を増加させる等の構造修飾を有し得る。以下に記載の構造修飾のいずれかを利用することができる。RGDペプチド部分を使用して、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞等の腫瘍細胞を標的とすることができるZitzmannetal.,CancerRes.,62:5139-43,2002。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む様々な他の組織の腫瘍へのdsRNA剤の標的化を促進することができるAokietal.,CancerGeneTherapy8:783-787,2001。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓へのiRNA剤の標的化を促進する。RGDペプチドは、線状または環状であってもよく、かつ修飾されてもよく、例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化されてもよい。例えば、グリコシル化されたRGDペプチドは、αVβ3を発現する腫瘍細胞にiRNA剤を送達することができるHaubneretal.,Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001。細胞浸透ペプチドは、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞等の微生物細胞、またはヒト細胞等の哺乳類細胞に浸透することができる。微生物細胞浸透ペプチドは、例えば、αヘリックス線状ペプチド例えば、LL-37もしくはセロピンP1、ジスルフィド結合含有ペプチド例えば、α-デフェンシン、β-デフェンシン、もしくはバクテネシン、または1個または2個のみの支配的なアミノ酸を含有するペプチド例えば、PR-39もしくはインドリシジンであり得る。細胞浸透ペプチドは、核移行シグナルNLSを含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、HIV-1gp41の融合ペプチドドメインおよびSV40ラージT抗原のNLSに由来するMPG等の二分両親媒性ペプチドであり得るSimeonietal.,Nucl.AcidsRes.31:2717-2724,2003。RNA結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第4,828,979号、同第4,948,882号、同第5,218,105号、同第5,525,465号、同第5,541,313号、同第5,545,730号、同第5,552,538号、同第5,578,717号、同第5,580,731号、同第5,591,584号、同第5,109,124号、同第5,118,802号、同第5,138,045号、同第5,414,077号、同第5,486,603号、同第5,512,439号、同第5,578,718号、同第5,608,046号、同第4,587,044号、同第4,605,735号、同第4,667,025号、同第4,762,779号、同第4,789,737号、同第4,824,941号、同第4,835,263号、同第4,876,335号、同第4,904,582号、同第4,958,013号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,245,022号、同第5,254,469号、同第5,258,506号、同第5,262,536号、同第5,272,250号、同第5,292,873号、同第5,317,098号、同第5,371,241号、同第5,391,723号、同第5,416,203号、同第5,451,463号、同第5,510,475号、同第5,512,667号、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号、および同第5,688,941号、同第6,294,664号、同第6,320,017号、同第6,576,752号、同第6,783,931号、同第6,900,297号、同第7,037,646号が挙げられるが、これらに限定されず、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。キメラ所与の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、前述の修飾のうちの2つ以上を、単一の化合物に、またはさらにはiRNA内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるiRNA化合物も包含する。キメラchimericiRNA化合物またはキメラchimeraは、本発明の文脈において、2つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、dsRNA化合物の場合はヌクレオチドで構成されるiRNA化合物、好ましくはdsRNA化合物である。これらのiRNAは、典型的には、少なくとも1つの領域を含有し、RNAは、iRNAに、ヌクレアーゼ分解への耐性の増加、細胞取り込みの増加、および/または標的核酸への結合親和性の増加を付与するように修飾される。iRNAのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を果たすことができる。一例として、RNaseHは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、RNaseHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のiRNA阻害の効率を大きく亢進させる。その結果として、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシdsRNAと比較して、キメラdsRNAが使用されるとき、多くの場合、より短いiRNAで同様の結果を得ることができる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当技術分野で既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法により、日常的に検出することができる。非リガンド基ある特定の場合において、iRNAのRNAは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、iRNAの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにiRNAに結合されており、そのような結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。そのような非リガンド部分は、コレステロール等の脂質部分Kubo,T.etal.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,3651:54-61、Letsingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553、コール酸Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオールManoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306、Manoharanetal.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765、チオコレステロールOberhauseretal.,Nucl.AcidsRes.,1992,20:533、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ.,1991,10:111、Kabanovetal.pFEBSLett.p1990,259:327、Svinarchuketal.,Biochimie,1993,75:49、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネートManoharanetal.,TetrahedronLett.,1995、36:3651、Sheaetal.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖Manoharanetal.,NucleosidesNucleotides,1995,14:969、またはアダマンタン酢酸Manoharanetal.,TetrahedronLett.,1995,36:3651、パルミチル部分Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923を含んでいる。そのようなRNA結合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的な結合プロトコルは、配列の1つ以上の位置にアミノリンカーを有するRNAの合成を含む。次いで、アミノ基は、適切なカップリング試薬または活性化試薬を用いて結合させられる分子と反応する。結合反応は、依然として固体支持体に結合されたRNAを用いて、または溶液相中でのRNAの切断後のいずれかで行われ得る。典型的には、HPLCによるRNA結合体の精製により、純粋な結合体が得られる。iRNAの送達iRNAを必要とする対象へのiRNAの送達を、いくつかの異なる方法において達成することができる。インビボ送達を、対象に、iRNA、例えば、dsRNAを含む組成物を投与することによって直接行うことができる。あるいは、送達を、iRNAの発現をコードして導く1つ以上のベクターを投与することによって間接的に行うことができる。これらの代替案は、以下でさらに議論される。直接送達概して、核酸分子を送達する任意の方法を、iRNAとともに使用するために適合することができる例えば、AkhtarS.andJulianRL.1992TrendsCell.Biol.25:139-144および国際公開第WO94/02595号を参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、インビボでiRNA分子をうまく送達するために考慮すべき重要な3つの要因:a送達された分子の生物学的安定性、2非特異的影響の防止、および3標的組織内での送達された分子の蓄積が存在する。iRNAの非特異的影響を、例えば、組織非限定的な例として、腫瘍への直接注入もしくは移植による局所投与、または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大にし、その他の点では薬剤によって悪影響を与えられ得るか、または薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与されるiRNA分子の全線量を低減させることが可能である。いくつかの研究は、iRNAが局所投与されるとき、遺伝子産物のノックダウンが成功したことを示している。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注入によるVEGFdsRNAの眼球内送達Tolentino,MJ.,etal2004Retina24:132-138およびマウスにおける網膜下注入Reich,SJ.,etal2003Mol.Vis.9:210-216はともに、加齢に伴う黄斑変性の実験モデルにおける新血管形成を予防することを示した。加えて、マウスにおけるdsRNAの直接腫瘍内注入は、腫瘍の大きさを減少させPille,J.,etal2005Mol.Ther.11:267-274、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長させることができるKim,WJ.,etal2006Mol.Ther.14:343-350、Li,S.,etal2007Mol.Ther.15:515-523。RNA干渉も直接注入によるCNSへの局所送達Dorn,G.,etal.2004NucleicAcids32:e49、Tan,PH.,etal2005GeneTher.12:59-66、Makimura,H.,etal2002BMCNeurosci.3:18、Shishkina,GT.,etal2004Neuroscience129:521-528、Thakker,ER.,etal2004Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275、Akaneya,Y.,etal2005J.Neurophysiol.93:594-602および鼻腔内投与による肺への局所送達Howard,KA.,etal2006Mol.Ther.14:476-484、Zhang,X.,etal2004J.Biol.Chem.279:10677-10684、Bitko,V.,etal2005Nat.Med.11:50-55の成功を示している。疾患の治療のためにiRNAを全身投与する場合、RNAを、薬物送達系を用いて修飾するか、またはあるいは送達することができ、これら両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるdsRNAの急速分解を阻止する役目を果たす。RNAまたは医薬担体の修飾は、標的組織へのiRNA組成物の標的化も可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避する。iRNA分子は、コレステロール等の親油基への化学結合によって修飾され、細胞取り込みを亢進し、分解を阻止することができる。例えば、親油性コレステロール部分に結合されるApoBに対するiRNAは、マウスに全身投与され、肝臓および空腸の両方において、ApoBmRNAのノックダウンをもたらしたSoutschek,J.,etal2004Nature432:173-178。アプタマーへのiRNAの結合は、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退行を媒介することが示されているMcNamara,JO.,etal2006Nat.Biotechnol.24:1005-1015。代替の実施形態において、iRNAを、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム等の薬物送達系、またはカチオン性送達系を用いて送達することができる。正電荷を持つカチオン性送達系は、負電荷を持つiRNA分子の結合を促進し、負電荷を持つ細胞膜での相互作用も亢進させ、細胞によるiRNAの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、iRNAへの結合または誘発のいずれかによって、iRNAを包む小胞またはミセル例えば、KimSH.,etal2008JournalofControlledRelease1292:107-116を参照のことを形成することができる。小胞またはミセルの形成は、全身投与されるとき、iRNAの分解をさらに阻止する。カチオン性iRNA複合体を作製および投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である例えば、Sorensen,DR.,etal2003J.Mol.Biol327:761-766、Verma,UN.,etal2003Clin.CancerRes.9:1291-1300、Arnold,ASetal2007J.Hypertens.25:197-205を参照されたく、参照によりこれら全体が本明細書に組み込まれる。iRNAの全身送達に有用な薬物送達系のいくつかの非限定的な例として、DOTAPSorensen,DR.,etal2003,上記参照、Verma,UN.,etal2003,上記参照、オリゴフェクタミン、固体核酸脂質粒子Zimmermann,TS.,etal2006Nature441:111-114、カルジオリピンChien,PY.,etal2005CancerGeneTher.12:321-328、Pal,A.,etal2005IntJ.Oncol.26:1087-1091、ポリエチレンイミンBonnetME.,etal2008Pharm.Res.Aug16Epubaheadofprint、Aigner,A.2006J.Biomed.Biotechnol.71659、Arg-Gly-AspRGDペプチドLiu,S.2006Mol.Pharm.3:472-487、およびポリアミドアミンTomalia,DA.,etal2007Biochem.Soc.Trans.35:61-67、Yoo,H.,etal1999Pharm.Res.16:1799-1804が挙げられる。いくつかの実施形態において、iRNAは、全身投与用のシクロデキストリンを有する複合体を形成する。iRNAおよびシクロデキストリンの投与方法およびそれらの医薬組成物を、米国特許第7,427,605号で見出すことができ、参照によりその全体が本明細書組み込まれる。ベクターによってコードされるdsRNA別の態様では、本発明のdsRNAを、DNAまたはRNAベクターに挿入される転写ユニットから発現させることができる例えば、Couture,A,etal.,TIG.1996,12:5-10、Skillern,A.らの国際PCT公開第WO00/22113号、Conradの国際PCT公開第WO00/22114号、およびConradの米国特許第6,054,299号を参照されたい。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて、一時的約数時間~数週間または持続的数週間~数ヶ月、またはそれ以上であり得る。これらの導入遺伝子を、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み型ベクターまたは非組み込み型ベクターであり得る。染色体外プラスミドとして受け継がれ得るように導入遺伝子を構築することもできるGassmann,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA199592:1292。iRNAの個々の鎖単数または複数を、発現ベクター上のプロモーターから転写することができる。例えば、dsRNAを生成するために2本の別個の鎖を発現させるとき、2つの別個の発現ベクターを、例えば、トランスフェクションまたは感染によって標的細胞に共導入することができる。あるいは、dsRNAのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターで転写することができる。一実施形態において、dsRNAがステムループ構造を有するように、dsRNAをリンカーポリヌクレオチド配列によって接続された逆方向反復として発現させる。iRNA発現ベクターは、概して、DNAプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合性のある発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合性のある発現ベクターを用いて、本明細書に記載のiRNAの発現に対する組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。典型的には、所望の核酸セグメントの挿入に便利な制限部位を含有するベクターが提供される。iRNAを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞に投与し、その後、患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって全身的であり得る。iRNA発現プラスミドを、カチオン性脂質担体例えばオリゴフェクタミン、または非カチオン性脂質に基づく担体例えばTransit-TKO商標を有する複合体として、標的細胞にトランスフェクトすることができる。1週間以上の期間にわたって標的RNAの異なる領域を標的化するiRNA媒介ノックダウンのための複数回の脂質トランスフェクションも、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、様々な既知の方法を用いて観察することができる。例えば、一過性トランスフェクションを、緑色蛍光タンパク質GFP等の蛍光マーカー等のレポーターを用いてシグナル伝達することができる。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションを、ハイグロマイシンB耐性等の特定の環境要因例えば、抗生物質および薬物への耐性を有するトランスフェクト細胞を提供するマーカーを用いて確実にすることができる。本明細書に記載の方法および組成物とともに利用することができるウイルスベクター系には、aアデノウイルスベクター、bレンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス等を含むが、これらに限定されないレトロウイルスベクター、cアデノ関連ウイルスベクター、d単純ヘルペスウイルスベクター、eSV40ベクター、fポリオーマウイルスベクター、g乳頭腫ウイルスベクター、hピコルナウイルスベクター、iオルトポックス等のポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリア痘もしくは鶏痘、およびjヘルパー依存性または弱毒アデノウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスも有益であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためにウイルス配列を含んでもよい。あるいは、構築物を、エピソーム複製能力のあるベクター、例えば、EPVおよびEBVベクターに組み込んでもよい。iRNAの組み換え発現のための構築物は、概して、標的細胞内でのiRNAの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー等を必要とする。ベクターおよび構築物を考慮する他の態様は、以下にさらに記載される。iRNAの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織内でのiRNAの発現に十分な調節要素プロモーター、エンハンサー等を含む。調節要素を、構成性発現あるいは調節性/誘導性発現のいずれかを提供するように選択することができる。iRNAの発現を、例えば、ある特定の生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベルまたはホルモンに感受性のある誘導性調節配列を用いることによって正確に調節することができるDochertyetal.,1994,FASEBJ.8:20-24。細胞または哺乳動物内でのdsRNA発現の制御に好適なそのような誘導性発現系には、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、およびイソプロピル-β-D1-チオガラクトピラノシドIPTGによる調節が含まれる。当業者であれば、iRNA導入遺伝子の使用目的に基づいて、適切な調節/プロモーター配列を選択することができる。特定の実施形態において、iRNAをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができるMilleretal.,Meth.Enzymol.217:581-5991993を参照のこと。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージング、および宿主細胞DNAへの組み込みに必要な構成要素を含有する。iRNAをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する1つ以上のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Boesenetal.,Biotherapy6:291-3021994で見出すことができ、造血幹細胞の化学療法への耐性を高めるために、造血幹細胞にmdr1遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例証する他の参考文献には、Clowesetal.,J.Clin.Invest.93:644-6511994、Kiemetal.,Blood83:1467-14731994、SalmonsandGunzberg,HumanGeneTherapy4:129-1411993、およびGrossmanandWilson,Curr.Opin.inGeneticsandDevel.3:110-1141993がある。使用が企図されるレンチウイルスベクターには、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,143,520号、同第5,665,557号、および同第5,981,276号に記載のHIVに基づくベクターが含まれる。アデノウイルスは、iRNAの送達における使用でも企図される。アデノウイルスは、例えば、遺伝子を呼吸上皮に送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の病気を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。KozarskyandWilson,CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3:499-5031993は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を示す。Boutetal.,HumanGeneTherapy5:3-101994は、アカゲサルの呼吸上皮に遺伝子を移動させるためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルス使用の他の例は、Rosenfeldetal.,Science252:431-4341991、Rosenfeldetal.,Cell68:143-1551992、Mastrangelietal.,J.Clin.Invest.91:225-2341993、PCT公開第WO94/12649号、およびWang,etal.,GeneTherapy2:775-7831995で見出すことができる。本発明で取り上げられるiRNAの発現に好適なAVベクター、組み換えAVベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、XiaHetal.2002,Nat.Biotech.20:1006-1010に記載されている。アデノ関連ウイルスAAVベクターの使用も企図されるWalshetal.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-3001993、米国特許第5,436,146号。一実施形態において、iRNAは、例えば、U6もしくはH1RNAプロモーター、またはサイトメガロウイルスCMVプロモーターのいずれかを有する組み換えAAVベクターから、2つの別個の相補的な単鎖RNA分子として発現され得る。本発明で取り上げられるdsRNAの発現に好適なAAVベクター、組み換えAVベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、SamulskiRetal.1987,J.Virol.61:3096-3101、FisherKJetal.1996,J.Virol,70:520-532、SamulskiRetal.1989,J.Virol.63:3822-3826、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号、国際特許出願第WO94/13788号、および国際特許出願第WO93/24641号に記載されており、全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。別の好ましいウイルスベクターは、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス、例えば、修飾ウイルスアンカラMVAまたはNYVAC等の弱毒化ワクシニア、カナリア痘もしくは鶏痘等のアビポックスである。ウイルスベクターの指向性を、該ベクターをエンベロープタンパク質もしくは他のウイルス由来の他の表面抗原でシュードタイピングすることによって、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって修正することができる。例えば、レンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルスVSV、狂犬病、エボラ、モコラ等由来の表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。AAVベクターを異なるカプシドタンパク質血清型を発現するように操作することによって、AAVベクターを異なる細胞を標的化するように作製することができ、例えば、RabinowitzJEetal.2002,JVirol76:791-801を参照されたく、全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中のベクターを含むことができるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組み換え細胞から無傷で産生する場合、医薬調製は、遺伝子送達系を産生する1つ以上の細胞を含むことができる。iRNAを含有する医薬組成物一実施形態において、本発明は、本明細書に記載のsiRNAおよび薬学的に許容できる担体を含有する医薬組成物を提供する。siRNAを含有する医薬組成物は、PCSK9発現によって媒介される病理学的プロセス等の標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。そのような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例として、非経口送達、例えば、静脈内IV送達による全身投与用に製剤化される組成物がある。別の例として、例えば、連続的なポンプ注入等の脳への注入による脳実質への直接送達用に製剤化される組成物がある。本明細書で取り上げられる医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。概して、siRNAの好適な用量は、1日につきレシピエントの体重1キログラム当たり0.01~200.0ミリグラム、概して、1日につき体重1キログラム当たり1~50mgである。例えば、dsRNAを、単回用量当たり0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、31mg/kg、32mg/kg、33mg/kg、34mg/kg、35mg/kg、36mg/kg、37mg/kg、38mg/kg、39mg/kg、40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、または50mg/kgで投与することができる。医薬組成物を1日1回投与することができるか、あるいはiRNAを1日にわたって適切な間隔で2回、3回、もしくはそれ以上の部分投与として、またはさらには連続注入もしくは放出制御製剤による送達を用いて投与することができる。その場合、それぞれの部分投与に含有されるiRNAは、1日当たりの総投与量を得るために、相応してより少なくなければならない。数日間にわたる送達のために、例えば、数日間にわたってiRNAの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、投与量単位を配合することもできる。持続放出製剤は当技術分野において周知であり、本発明の薬剤とともに使用することができる薬剤等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態において、投与量単位は、相応する複数の1日量を含有する。siRNAの単回用量のPCSK9レベルへの効果が長続きすることができ、したがって、その後の用量が3、4、もしくは5日以下の間隔、または1、2、3、もしくは4週刊以下の間隔で投与される。当業者であれば、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康状態および/もしくは年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療的に有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。本発明によって包含される個々のiRNAの効果的な投与量およびインビボ半減期は、従来の方法を用いて、または本明細書の他の箇所に記載の適切な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて推定することができる。マウス遺伝学の進歩により、PCSK9発現によって媒介される病理学的プロセス等の様々なヒト疾患を研究するためのいくつかのマウスモデルが作製された。そのようなモデルを、iRNAのインビボ試験、ならびに治療的に有効な用量の決定のために使用することができる。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトPCSK9を発現する導入遺伝子を含有するマウスである。本発明は、本発明で取り上げられるiRNA化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物を、局所治療または全身治療が所望されるかに応じて、かつ治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は、局所例えば、経皮パッチによる、噴霧器の使用を含む肺内例えば、粉末もしくはエアロゾルの吸入または吹送による、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注入injectionもしくは注入infusion;例えば、埋め込みデバイスを用いた皮下投与;または頭蓋内、例えば、実質内、髄腔内、もしくは脳室内投与を含む。iRNAを、肝臓例えば、肝臓の肝細胞等の特定の組織を標的化する様式で送達することができる。局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬担体、水溶液、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆コンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるiRNAが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性例えば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン、陰性例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG、ならびにカチオン性例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAP、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMAが含まれる。本発明で取り上げられるiRNAは、リポソーム内に封入されるか、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。あるいは、iRNAは、脂質、具体的には、カチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプリン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはC1-20アルキルエステル例えば、ミリスチン酸イソプロピルIPM、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,747,014号に詳細に記載されている。リポソーム製剤薬物の製剤化のために研究および使用されているマイクロエマルジョンの他に、多くの界面活性剤の組織構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からのそれらが提示する特異性および作用持続期間を理由に、大きな関心を集めている。本発明で使用されるリポソームという用語は、球状の二重層単数または複数に配置された両親媒性脂質から成る小胞を意味する。リポソームは、親油性物質および水性内部から形成される膜を有する単層状または多層状の小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるといった利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁とそれほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによりインビボで取り込まれる。哺乳類の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、それぞれ50nm未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、かつそのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームが生体適合可能および生分解可能であること、リポソームが広範な水溶性および脂溶性薬物を組み込むことができること、リポソームがそれらの内部区画で封入された薬物を代謝および分解から保護することができることが含まれるRosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。リポソームは、作用部位への活性成分の移動および送達に有用である。リポソーム膜が構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、リポソームの内容物が細胞内に出て、そこで活性薬剤が作用し得る。リポソーム製剤は、多くの薬物の送達様式として広範な調査の焦点となっている。局所投与の場合、リポソームが他の製剤に勝るいくつかの利点を示すという証拠が増えつつある。そのような利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連した副作用の減少、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、ならびに多種多様の薬物親水性および疎水性の両方を皮膚に投与する能力が含まれる。いくつかの報告書は、高分子量のDNAを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のDNAを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大半が、表皮上層の標的化をもたらした。リポソームは、2つの広義のクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したDNA分子と相互に作用して安定した複合体を形成する正に荷電したリポソームである。正に荷電したDNA/リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り込まれる。エンドソーム内の酸性pHにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質内に放出するWangetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985。pH感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、DNAと複合体化するのではなく、DNAを封入する。DNAおよび脂質の両方が同様の電荷を持つため、複合体形成ではなく、反発が生じる。それにもかかわらず、一部のDNAは、これらのリポソームの水性内部に封入される。pH感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養中の細胞単層に送達するために使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出されたZhouetal.,JournalofControlledRelease,1992,19,269-274。リポソーム組成物の主要な種類の1つには、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性リポソーム組成物を、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPCまたはジパルミトイルホスファチジルコリンDPPCから形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方で、アニオン性の膜融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPEから形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリンPCから形成される。別の種類は、リン脂質、および/またはホスファチジルコリン、および/またはコレステロールの混合物から形成される。いくつかの研究は、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのテンジクネズミの皮膚への適用が、皮膚ヘルペス痛の減少をもたらした一方で、他の手段例えば、溶液またはエマルジョンとしてを介したインターフェロンの送達は効果的ではなかったWeineretal.,JournalofDrugTargeting,1992,2,405-410。さらに、さらなる研究は、水溶液系を用いて、インターフェロンの投与に対するリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、リポソーム製剤が水溶液投与よりも優れていると結論付けたduPlessisetal.,AntiviralResearch,1992,18,259-265。非イオン性リポソーム系も、皮膚への薬物の送達、具体的には、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における実用性を決定するために試験されている。Novasome商標Iジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルおよびNovasome商標IIジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテルを含む非イオン性リポソーム製剤が、シクロスポリンAをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果として、そのような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンAを皮膚の異なる層に沈着させることを促進する際に効果的であったことが示されたHuetal.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466。リポソームには、立体的に安定化されたリポソームも含まれ、本明細書で使用されるこの用語は、1つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれるときに、そのような特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例として、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、AモノシアロガングリオシドGM1等の1つ以上の糖脂質を含むか、またはBポリエチレングリコールPEG部分等の1つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。任意の特定の理論によって束縛されるものではないが、当技術分野において、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームにおいて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増大が、細網内皮系RESの細胞への取り込みの減少に由来すると考えられているAllenetal.,FEBSLetters,1987,223,42、Wuetal.,CancerResearch,1993,53,3765。1つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当技術分野で周知である。PapahadjopoulosらAnn.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64は、リポソームの血液半減期を向上させるモノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの所見は、Gabizonらによって詳しく説明されたProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949。米国特許第4,837,028号および国際公開第WO88/04924号ともにAllenらは、1スフィンゴミエリンおよび2ガングリオシドGM1または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号Webbらは、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第WO97/13499号Limらに開示されている。1つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびそれらの調製方法は、当技術分野において既知である。SunamotoらBull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778は、PEG部分を含有する非イオン性洗剤である2C1215Gを含むリポソームを記載している。IllumらFEBSLett.,1984,167,79は、ポリマーグリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、血液半減期の著しい向上をもたらすことを指摘した。ポリアルキレングリコール例えば、PEGのカルボキシル基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Sears米国特許第4,426,330号および同第4,534,899号によって記載されている。KlibanovらFEBSLett.,1990,268,235は、PEGまたはPEGステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンPEを含むリポソームが血液循環半減期を著しく増加させることを実証する実験を記載した。BlumeらBiochimicaetBiophysicaActa,1990,1029,91は、そのような見解を、他のPEG誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンDSPEおよびPEGの組み合わせによって形成されるDSPE-PEGに拡大した。リポソームの外部表面上に共有結合したPEG部分を有するリポソームが、Fisherの欧州特許第EP0445131号B1および国際公開第WO90/04384号に記載されている。PEGで誘導体化されたPEの1~20モルパーセントを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Woodleら米国特許第5,013,556号および同第5,356,633号ならびにMartinら米国特許第5,213,804号および欧州特許第EP0496813号B1によって記載されている。いくつかの他の脂質-ポリマー結合体を含むリポソームが、国際公開第WO91/05545号および米国特許第5,225,212号ともにMartinらおよび国際公開第WO94/20073号Zalipskyらに開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開第WO96/10391号Choiらに記載されている。米国特許第5,540,935号Miyazakiらおよび米国特許第5,556,948号Tagawaらは、PEG含有リポソームの表面上の官能部分でさらに誘導体化することができるPEG含有リポソームを記載している。核酸を含むいくつかのリポソームが当技術分野において既知である。Thierryらの国際公開第WO96/40062号は、高分子量の核酸をリポソーム内に封入する方法を開示している。Tagawaらの米国特許第5,264,221号は、タンパク質結合リポソームを開示しており、そのようなリポソームの内容物がdsRNAを含んでもよいことを断言している。Rahmanらの米国特許第5,665,710号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム内に封入するある特定の方法を記載している。Loveらの国際公開第WO97/04787号は、raf遺伝子を標的とするdsRNAを含むリポソームを開示している。トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補者である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴よりも小さい孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適化性であり皮膚の孔の形状に適合する、自己修復性であり、断片化することなく高い頻度で標的に到達し、多くの場合、自己装填性self-loadingである。トランスファーソームを作製するために、表面エッジアクチベータsurfaceedge-activator、通常、界面活性剤を標準のリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームによって媒介される血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同程度に効果的であることが示されている。界面活性剤は、エマルジョンマイクロエマルジョンを含むおよびリポソーム等の製剤において幅広く適用される。多くの異なる種類の界面活性剤天然および合成の両方の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランスHLBを用いた方法である。親水性基頭部基としても知られるの特性が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供するRieger,inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,p.285。界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬製品および化粧品において幅広く適用され、広範なpH値にわたって使用可能である。概して、それらのHLB値は、それらの構造に応じて、2~約18の範囲内である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物、プロポキシ化アルコール、およびエトキシ化/プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのなかで最も一般的な構成員である。界面活性剤分子が水中に溶解されるか、または分散するときに負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤クラスのなかで最も重要な構成員は、アルキル硫酸塩および石鹸である。界面活性剤分子が水中に溶解されるか、または分散するときに正の荷電を保有する場合、その界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスのなかで最も使用される構成員である。界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。薬品、製剤、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用が概説されているRieger,inPharmaceuticalDosageForms,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,p.285。核酸脂質粒子一実施形態において、本発明で取り上げられるsiRNAは、例えば、核酸脂質粒子、例えば、SPLP、pSPLP、またはSNALPを形成するために、脂質製剤中に完全に封入される。本明細書で使用されるSNALPという用語は、SPLPを含む安定した核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用されるSPLPという用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドDNAを含む核酸脂質粒子を指す。核酸脂質粒子、例えば、SNALPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質例えば、PEG-脂質結合体を含有する。SNALPおよびSPLPは、静脈内i.v.注入後に循環寿命の延長を呈し、かつ遠位部位例えば、投与部位から物理的に分離された部位で蓄積するため、全身適用に非常に有用である。SPLPはpSPLPを含み、PCT公開第WO00/03683号に記載の封入された縮合剤-核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約50nm~約150nm、より典型的には、約60nm~約130nm、より典型的には、約70nm~約110nm、最も典型的には、約70nm~約90nmの平均直径を有し、実質的に非毒性である。例えば、粒子の平均直径は、約50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、140nm、145nm、または150nmであり得る。加えて、核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性を示す。核酸脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号、同第5,981,501号、同第6,534,484号、同第6,586,410号、同第6,815,432号、およびPCT公開第WO96/40964号に開示されている。一実施形態において、脂質:薬物の比率質量/質量比率例えば、脂質:dsRNAの比率は、約1:1~約50:1、約1:1~約25:1、約3:1~約15:1、約4:1~約10:1、約5:1~約9:1、または約6:1~約9:1の範囲内である。脂質:dsRNAの比率は、約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、113:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、または50:1であり得る。核酸脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリドDODAC、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミドDDAB、N-I-2,3-ジオレオイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTAP、N-I-2,3-ジオレイルオキシプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリドDOTMA、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシプロピルアミンDODMA、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLenDMA、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-C-DAP、1,2-ジリノレイオキシ-3-ジメチルアミノアセトキシプロパンDLin-DAC、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパンDLin-MA、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパンDLinDAP、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-S-DMA、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパンDLin-2-DMAP、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩DLin-TMA.Cl、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩DLin-TAP.Cl、1,2-ジリノレイルオキシ-3-N-メチルピペラジノプロパンDLin-MPZ、もしくは3-N,N-ジリノレイルアミノ-1,2-プロパンジオールDLinAP、3-N,N-ジオレイルアミノ-1,2-プロパンジオDOAP、1,2-ジリノレイルオキソ-3-2-N,N-ジメチルアミノエトキシプロパンDLin-EG-DMA、l,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMA、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソレンDLin-K-DMA、またはそれらの類似体、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソレンXTC、3aR,5s,6aS-N,N-ジメチル-2,2-ジ9Z,12Z-オクタデカ-9,12-ジエニルテトラヒドロ-3aH-シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール-5-アミンALN100、6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-ジメチルアミノブタノエートMC3、1,1’-2-4-2-2-ビス2-ヒドロキシドデシルアミノエチル2-ヒドロキシドデシルアミノエチルピペラジン-1-イルエチルアザネジイルジドデカン-2-オールTechG1、例えば、C12-200、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約10モル~約70モルまたは約40モルを含み得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の10モル、15モル、20モル、25モル、30モル、35モル、40モル、45モル、50モル、55モル、60モル、65モル、70モル、75モル、80モル、85モル、90モル、または95モルを含み得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の57.1モルまたは57.5モルを含み得る。核酸脂質粒子は、概して、非カチオン性脂質を含む。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリンDSPC、ジオレオイルホスファチジルコリンDOPC、ジパルミトイルホスファチジルコリンDPPC、ジオレオイルホスファチジルグリセロールDOPG、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールDPPG、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミンDOPE、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンPOPC、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミンPOPE、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-N-マレイミドメチル-シクロヘキサン-1-カルボキシレートDOPE-mal、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンDPPE、ジミリストイルホスホエタノールアミンDMPE、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミンDSPE、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミンSOPE、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約5モル~約90モル、約10モル、または約58モルであり得る。非カチオン性脂質は、約5モル、6モル、7モル、7.5モル、7.7モル、8モル、9モル、10モル、11モル、12モル、13モル、14モル、15モル、16モル、17モル、18モル、19モル、20モル、25モル、30モル、35モル、40モル、45モル、50モル、55モル、60モル、65モル、70モル、75モル、80モル、85モル、90モル、または95モルであり得る。核酸脂質粒子は、概して、結合した脂質を含む。粒子の凝集を阻害する結合した脂質は、例えば、限定することなく、PEG-ジアシルグリセロールDAG、PEG-ジアルキルオキシプロピルDAA、PEG-リン脂質、PEG-セラミドCer、またはそれらの混合物を含むポリエチレングリコールPEG-脂質であり得る。PEG-DAA結合体は、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピルCi2、PEG-ジミリスチルオキシプロピルCi4、PEG-ジパルミチルオキシプロピルCi6、またはPEG-ジステアリルオキシプロピルC8であり得る。結合した脂質は、PEG-DMGPEG-ジジミリストイルグリセロールC14-PEG、もしくはPEG-C142000の平均モル重量を有するPEG、PEG-DSGPEG-ジスチリルグリセロールC18-PEG、もしくはPEG-C182000の平均モル重量を有するPEG、またはPEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリストイルオキシプロピルアミン2000の平均モル重量を有するPEGであり得る。粒子の凝集を阻止する結合した脂質は、粒子中に存在する全脂質の0モル~約20モル、または約1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18、19.0、もしくは20.0モルであり得る。いくつかの実施形態において、核酸脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する全脂質の約10モル~約60モルまたは約48モルのコレステロールをさらに含む。例えば、核酸脂質粒子は、約5モル、10モル、15モル、20モル、25モル、30モル、35モル、40モル、45モル、50モル、55モル、または60モルのコレステロールをさらに含む。核酸脂質粒子は、粒子中に存在する全脂質の約31.5モル、34.4モル、35モル、38.5モル、または40モルのコレステロールを含み得る。例示的な核酸脂質粒子LNP01製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第WO2008/042973号に記載されている。さらなる例示的な脂質dsRNA製剤は、以下の通りである。表A製剤を含むSNALP1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパンDLinDMAは、参照により本明細書に組み込まれる2009年4月15日出願の国際公開第WO2009/127060号に記載されている。製剤を含むXTCは、例えば、2009年1月29日出願の米国仮出願第61/148,366号、2009年3月2日出願の米国仮出願第61/156,851号、2009年6月10日出願の米国仮出願第号、2009年7月24日出願の米国仮出願第61/228,373号、2009年9月3日出願の米国仮出願第61/239,686号、および2010年1月29日出願の国際出願第PCT/US2010/022614号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。製剤を含むMC3は、例えば、2009年9月22日出願の米国仮出願第61/244,834号、2009年6月10日出願の米国仮出願第61/185,800号、および2010年6月10日出願の国際出願第PCT/US10/28224号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。製剤を含むALNY-100は、例えば、2009年11月10日出願の国際特許出願第PCT/US09/63933号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。製剤を含むC12-200は、2009年5月5日出願の米国仮出願第61/175,770号、および2010年5月5日出願の国際出願第PCT/US10/33777号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。カチオン性脂質の合成本発明の核酸脂質粒子において使用される化合物、例えば、カチオン性脂質等のいずれも、実施例においてより詳細に記載される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製することができる。すべての置換基は、別途示されない限り、以下に定義されるものとする。アルキルとは、1~24個の炭素原子を含有する直鎖もしくは分枝鎖の非環状もしくは環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等が含まれ、一方で、飽和分枝鎖アルキルには、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、イソペンチル等が挙げられる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれ、一方で、非飽和環状アルキルには、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等が挙げられる。アルケニルとは、上で定義されるように、隣接炭素原子間に少なくとも1つの二重結合を含有するアルキルを意味する。アルケニルには、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分枝鎖アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブチレニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-メチル-1-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル等が挙げられる。アルキニルとは、上で定義されるように、隣接炭素間に少なくとも1つの三重結合をさらに含有する任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝鎖のアルキニルには、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-メチル-1ブチニル等が挙げられる。アシルとは、以下で定義されるように、結合点の炭素がオキソ基で置換される任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、-C=Oアルキル、-C=Oアルケニル、および-C=Oアルキニルが、アシル基である。複素環とは、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される1もしくは2個のヘテロ原子その窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意で酸化されてもよく、その窒素ヘテロ原子は、任意で四級化されてもよいを含有する5~7員の単環式または7~10員の二環式の複素環式環を意味し、これには、上記の複素環のうちのいずれかがベンゼン環に融合される二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合されてもよい。複素環には、以下で定義されるヘテロアリールが含まれる。複素環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニルpiperidinyl、ピペリジニルpiperizynyl、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が含まれる。任意で置換されるアルキル、任意で置換されるアルケニル、任意で置換されるアルキニル、任意で置換されるアシル、および任意で置換される複素環という用語は、置換されるとき、少なくとも1個の水素原子が、ある置換基に置換されることを意味する。オキソ置換基=Oの場合、2個の水素原子が置換される。この点において、置換基には、オキソ、ハロゲン、複素環、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC=ORy、-NRxSO2Ry、-C=ORx、-C=OORx、-C=ONRxRy、-SOnRx、および-SOnNRxRyが含まれ、nは、0、1、もしくは2であり、RxおよびRyは、同一であるか、または異なり、独立して、水素、アルキル、または複素環であり、該アルキルおよび複素環置換基はそれぞれ、オキソ、ハロゲン、-OH、-CN、アルキル、-ORx、複素環、-NRxRy、-NRxC=ORy、-NRxSO2Ry、-C=ORx、-C=OORx、-C=ONRxRy、-SOnRx、および-SOnNRxRyのうちの1つ以上にさらに置換されてもよい。ハロゲンとは、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に周知である例えば、ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Green,T.W.etal.,Wiley-Interscience,NewYorkCity,1999を参照のこと。簡潔に言えば、本発明の文脈内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基を、官能基に付加してある特定の反応中の反応性をマスクし、その後、除去して元の官能基を現すことができる。いくつかの実施形態において、アルコール保護基が使用される。アルコール保護基は、アルコール官能基の望ましくない反応性を減少させるか、または排除する任意の基である。保護基を、当技術分野で周知の手法を用いて付加および除去することができる。式Aの合成一実施形態において、本発明の核酸脂質粒子は、式Aのカチオン性脂質を用いて製剤化され、XTCは、式Aのカチオン性脂質であり、式中、R1およびR2は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されてもよく、R3およびR4は独立して、低級アルキルであるか、またはR3およびR4は、一緒になって、任意で置換される複素環を形成することができる。概して、上の式Aの脂質を、以下の反応スキーム1または2によって作製することができ、すべての置換基は、別途示されない限り、上で定義される通りである。脂質A式中、R1およびR2は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、それぞれ、任意で置換されてもよく、R3およびR4は独立して、低級アルキルであるか、またはR3およびR4は、一緒になって、任意で置換される複素環を形成することができるを、スキーム1に従って調製することができる。ケトン1および臭化物2を購入するか、または当業者に既知の方法に従って調製することができる。1と2の反応により、ケタール3が得られる。ケタール3とアミン4との処理により、式Aの脂質が得られる。式Aの脂質を、式5の有機塩を有する対応するアンモニウム塩に変換することができ、式中、Xは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩等から選択されるアニオン性対イオンである。あるいは、ケトン1の出発物質を、スキーム2に従って調製することができる。グリニャール試薬6およびシアン化物7を購入するか、または当業者に既知の方法に従って調製することができる。6と7の反応により、ケトン1が得られる。ケトン1の式Aの対応する脂質への変換は、スキーム1に記載される通りである。MC3の合成DLin-M-C3-DMAすなわち、6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-ジメチルアミノブタノエートの調製は、以下の通りであった。ジクロロメタン5mL中の6Z,9Z,28Z,31Z-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール0.53g、4-N,N-ジメチルアミノブチル酸塩酸塩0.51g、4-N,N-ジメチルアミノピリジン0.61g、および1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩0.53gの溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で、続いて、希重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒をロータリーエバポレータ上で除去した。残渣を、1~5のメタノール/ジクロロメタン溶出勾配を用いて、シリカゲルカラム20gに通した。精製生成物を含有する画分を合わせ、溶媒を除去し、無色の油0.54gを得た。ALNY-100の合成ケタール519[ALNY-100]の合成を、以下のスキーム3を用いて行った。スキーム3515の合成:2口RBF1L中の200mLの無水THF中のLiAlH43.74g、0.09852molの撹拌懸濁液に、70mLのTHF中の514の溶液10g、0.04926molを、窒素雰囲気下で、0°Cで緩徐に添加した。添加が完了した後、反応混合物を室温まで加温し、その後、4時間加熱還流した。反応の進行をTLCで監視した。TLCによる反応が完了した後、混合物を0°Cまで冷却し、飽和Na2SO4溶液を慎重に添加して反応停止処理した。反応混合物を室温で4時間撹拌し、濾去した。残渣をTHFで十分に洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、400mLのジオキサンおよび26mLの濃縮HClで希釈し、室温で20分間撹拌した。揮発物質を真空下で揮散させて、白色の固体として515の塩酸塩を得た。収量:7.12g、1H-NMRDMSO、400MHz:δ=9.34広域、2H、5.68s、2H、3.74m、1H、2.66~2.60m、2H、2.50~2.45m、5H。516の合成:250mLの2口RBF中の100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌溶液に、NEt337.2mL、0.2669molを添加し、窒素雰囲気下で0°Cまで冷却した。50mLの乾燥DCM中のN-ベンジルオキシ-カルボニルオキシ-スクシンイミド20g、0.08007molを緩徐に添加した後、反応混合物を室温まで加温させた。TLCによる2~3時間の反応が完了した後、混合物を1NのHCl溶液1×100mLおよび飽和NaHCO3溶液1×50mLで順次洗浄した。その後、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗物質を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、粘着性の塊として516を得た。収量:11g89。1H-NMRCDCl3、400MHz:δ=7.36~7.27m、5H、5.69s、2H、5.12s、2H、4.96br.、1H、2.74s、3H、2.60m、2H、2.30~2.25m、2H。LC-MS[MH]-232.396.94。517Aおよび517Bの合成:シクロペンテン5165g、0.02164molを、500mLの1口RBF中の220mLのアセトンおよび水10:1の溶液中に溶解し、これに、N-メチルモルホリン-N-オキシド7.6g、0.06492mol、続いて、4.2mLのtert-ブタノール中の7.6のOsO4の溶液0.275g、0.00108molを室温で添加した。反応が完了した後約3時間、混合物に固体Na2SO3を添加して反応停止処理し、結果として得られた混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をDCM300mLで希釈し、水2×100mL、続いて、飽和NaHCO31×50mL溶液、水1×30mL、最後にブライン1×50mLで洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、ジアステレオマーの混合物を得て、これを分取HPLCで分離した。収量:-6g粗517A-ピーク-1白色の固体、5.13g96。1H-NMRDMSO、400MHz:δ=7.39~7.31m、5H、5.04s、2H、4.78~4.73m、1H、4.48~4.47d、2H、3.94~3.93m、2H、2.71s、3H、1.72~1.67m、4H。LC-MS-[MH]-266.3、[MNH4]-283.5存在、HPLC-97.86。X線により確認された立体化学518の合成:化合物505の合成について記載される手順と同様の手順を用いて、化合物5181.2g、41を無色の油として得た。1H-NMRCDCl3、400MHz:δ=7.35~7.33m、4H、7.30~7.27m、1H、5.37~5.27m、8H、5.12s、2H、4.75m、1H、4.58~4.57m、2H、2.78~2.74m、7H、2.06-2.00m、8H、1.96~1.91m、2H、1.62m、4H、1.48m、2H、1.37~1.25brm、36H、0.87m、6H。HPLC-98.65。化合物519の合成の一般的な手順:ヘキサン15mL中の化合物5181当量の溶液を、THF1M、2当量中のLAHの氷冷溶液に、滴加様式で添加した。添加が完了した後、混合物を0.5時間にわたって40°Cで加熱し、その後、氷浴上で再び冷却した。混合物を飽和Na2SO4水溶液で慎重に加水分解し、その後、セライトを通して濾過し、油に還元した。カラムクロマトグラフィーが純粋な5191.3g、68をもたらし、これを無色の油として得た。13CNMR=130.2、130.1×2、127.9×3、112.3、79.3、64.4、44.7、38.3、35.4、31.5、29.9×2、29.7、29.6×2、29.5×3、29.3×2、27.2×3、25.6、24.5、23.3、226、14.1、エレクトロスプレーMS正:C44H80NO2MHに対する分子量、計算値654.6、実測値654.6.核酸脂質粒子の一般的な合成標準の方法または押出を含まない方法のいずれかによって調製された製剤を、同様の様式で特徴付けることができる。例えば、製剤は、典型的には、目視検査を特徴とする。それらは、凝集体または堆積物を含まない白みがかった半透明の溶液であるはずである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布を、例えば、MalvernZetasizerNanoZSMalvernUSAを用いて、光散乱により測定することができる。粒子は、40~100nm等の約20~300nmの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総dsRNA濃度は、色素排除アッセイを用いて推定される。製剤化されたdsRNAの試料を、製剤破壊界面活性剤、例えば、0.5のTriton-X100の存在下または不在下で、Ribogreen分子プローブ等のRNA結合染料とともにインキュベートすることができる。製剤中の総dsRNAを、標準曲線と比較して、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。捕捉された画分を、遊離dsRNA含有量界面活性剤の不在下におけるシグナルによって測定されるを総dsRNA含有量から差し引くことによって決定する。捕捉されたdsRNAのパーセントは、典型的には、85超である。SNALP製剤について、粒径は、少なくとも30nm、少なくとも40nm、少なくとも50nm、少なくとも60nm、少なくとも70nm、少なくとも80nm、少なくとも90nm、少なくとも100nm、少なくとも110nm、および少なくとも120nmである。好適な範囲は、典型的には、少なくとも約50nm~少なくとも約110nm、少なくとも約60nm~少なくとも約100nm、または少なくとも約80nm~少なくとも約90nmである。他の製剤経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、または小型錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。いくつかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるdsRNAが、1つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および/またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および/またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸/塩には、ケノデオキシコール酸CDCAおよびウルソデオキシケノデオキシコール酸UDCA、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸glucholicacid、グリコール酸glycholicacid、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプリン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそれらのモノグリセリド、ジグリセリド、もしくは薬学的に許容される塩例えば、ナトリウムが含まれる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸/塩と組み合わせた脂肪酸/塩が使用される。1つの例示的な組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。浸透促進剤にはさらに、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるdsRNAを、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達するか、または微小粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合することができる。dsRNA複合剤には、ポリ-アミノ酸類;ポリイミン類;ポリアクリレート類;ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類;カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類PEG、およびデンプン類;ポリアルキルシアノアクリレート類;DEAE誘導体化ポリイミン類、ポルランpollulan類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリ-L-リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンPTDAE、ポリアミノスチレン例えば、p-アミノ、ポリメチルシアノアクリレート、ポリエチルシアノアクリレート、ポリブチルシアノアクリレート、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミンおよびDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリD,L-乳酸、ポリDL-乳酸-co-グリコール酸PLGA、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコールPEGが含まれる。dsRNAの経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第6,887,906号、米国公開第20030027780号、および米国特許第6,747,014号に詳細に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。非経口、実質内脳内への、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、緩衝液、希釈剤、ならびに浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤を含むが、これらに限定されない他の好適な添加剤も含有し得る。本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物を、予め形成された液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含むが、これらに限定されない様々な構成成分から生成することができる。肝癌等の肝障害の治療時に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。好都合に単位剤形で提示することができる本発明の薬学的製剤を、製薬業界で周知の従来の技法に従って調製することができる。そのような技法には、活性成分を医薬担体単数もしくは複数または賦形剤単数もしくは複数と合わせるステップが含まれる。概して、この製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、またはそれら両方と均一かつ密接に合わせ、その後、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。本発明の組成物を、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸剤等であるが、これらに限定されない多くの可能な剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。本発明の組成物を、水媒体、非水媒体、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。懸濁液は、安定剤を含有することもできる。さらなる製剤エマルジョン本発明の組成物を、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、通常直径0.1μmを超える液滴の形態で別の液体中に分散した1つの液体の多相系である例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199、Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,Volume1,p.245、BlockinPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume2,p.335、Higuchietal.,inRemington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1985,p.301を参照のこと。エマルジョンは、多くの場合、相互に密接に混合され、かつ分散する2つの非混合性液相を含む二相系である。概して、エマルジョンは、油中水w/oまたは水中油o/wのいずれかの種類であり得る。水相がバルク油相中で微細に分割され、微小液滴として分散する場合、結果として得られる組成物は、油中水w/o型エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相がバルク水相中で微細に分割され、微小液滴として分散する場合、結果として得られる組成物は、水中油o/w型エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相に加えて、さらなる構成成分と、分離相として水相、油相、またはそれ自体のいずれかに溶液として存在し得る活性薬物とを含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の薬学的賦形剤も、必要に応じて、エマルジョン中に存在してもよい。薬学的エマルジョンは、例えば、油中水中油o/w/oおよび水中油中水w/o/w型エマルジョンの場合等、2つより多い相から成る多重エマルジョンでもあり得る。このような複合製剤は、多くの場合、単純な二元エマルジョンが提供しないある特定の利点を提供する。o/w型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、w/o/w型エマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中で安定化された水の小球で囲まれた油滴の系は、o/w/o型エマルジョンを提供する。エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんどまたは全く特徴としない。多くの場合、エマルジョンの分散相または不連続相は、外相または連続相中に十分に分散し、乳化剤の手段または製剤の粘度によりこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームと同様に、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤を、広範に、4つのカテゴリー、すなわち、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収塩基、および微細分散固体に分類することができる例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199を参照のこと。表面活性剤としても既知の合成界面活性剤は、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献において概説されている例えば、AnselsPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Rieger,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerおよびBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.285、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,1988,volume1,p.199を参照のこと。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性との比率は、親水性/親油性バランスHLBと呼ばれており、製剤を調製する際の界面活性剤の分類および選択における貴重なツールである。界面活性剤は、親水基の性質非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に基づいて、異なるクラスに分類することができる例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NYRieger,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.285を参照のこと。エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜ろう、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、それらが水を吸収してw/o型エマルジョンを形成するが、無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を維持することができるような親水性の性質を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、かつ粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。多種多様の非乳化物質もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれるBlock,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.335、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199。親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント、セルロース誘導体例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース、ならびに合成ポリマー例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー等の天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成し、かつ外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。エマルジョンが、多くの場合、微生物の成長を容易に支援し得る炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等のいくつかの成分を含有するため、これらの製剤には、多くの場合、防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸エステル、およびホウ酸が含まれる。製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤もエマルジョン製剤に一般的に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。皮膚、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献に概説されている例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199を参照のこと。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,およびAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245、Idson,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.199を参照のこと。鉱油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、o/w型エマルジョンとして一般的に経口投与されている物質である。本発明の一実施形態において、iRNAおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンを、水、油、および単一の光学的に等方性および熱力学的に安定した液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245を参照のこと。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を界面活性剤水溶液中に分散させ、その後、十分な量の第4の構成成分、概して、中間鎖長のアルコールを添加することによって調製されて、透明な系を形成する系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される2つの非混合性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散物として記載されているLeungandShah,in:ControlledReleaseofDrugs:PolymersandAggregateSystems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCHPublishers,NewYork,pages185-215。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む3~5個の構成成分を組み合わせて調製される。マイクロエマルジョンが油中水w/o型または水中油o/w型であるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存するSchott,inRemington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1985,p.271。相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンの製剤化方法についての幅広い知識を当業者に提供している例えば、Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Allen,LV.,PopovichNG.,andAnselHC.,2004,LippincottWilliamsWilkins8thed.,NewYork,NY、Rosoff,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.245、Block,inPharmaceuticalDosageForms,Lieberman,RiegerandBankerEds.,1988,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume1,p.335を参照のこと。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定した液滴の製剤において、非水溶性薬物を可溶化するといった利点を提示する。マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独で、または共界面活性剤と組み合わせて、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレートML310、テトラグリセロールモノオレエートMO310、ヘキサグリセロールモノオレエートPO310、ヘキサグリセロールペンタオレエートPO500、デカグリセロールモノカプレートMCA750、デカグリセロールモノオレエートMO750、デカグリセロールセクイオレエートsequioleateSO750、デカグリセロールデカオレエートDAO750が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、1-プロパノール、および1-ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成される空所に起因して不規則な薄膜を形成することによって界面流動性を増加させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤を使用することなく調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型マイクロエマルジョン系が当技術分野で既知である。水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Captex300、Captex355、CapmulMCM、脂肪酸エステル、中鎖C8~C12のモノ、ジ、およびトリ-グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8~C10グリセリド、植物油、ならびにシリコーン油等の物質が含まれ得るが、これらに限定されない。マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の観点から特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョンo/w型およびw/o型の両方がペプチドを含む薬物の経口生物学的利用能を亢進すると提議されている例えば、米国特許第6,191,105号、同第7,063,860号、同第7,070,802号、同第7,157,099号、Constantinidesetal.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385-1390、Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205を参照のこと。マイクロエマルジョンは、改善された薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および浸透性の変化による薬物吸収の潜在的亢進、調製の簡便性、固体剤形を上回る経口投与の簡便性、改善された臨床的有効性、ならびに低下した毒性の利点を提供する例えば、米国特許第6,191,105号、同第7,063,860号、同第7,070,802号、同第7,157,099号、Constantinidesetal.,PharmaceuticalResearch,1994,11,1385、Hoetal.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143を参照のこと。多くの場合、マイクロエマルジョンは、それらの構成成分が周囲温度で合わさるときに自然発生的に生じ得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはiRNAを製剤化するときに特に有利であり得る。マイクロエマルジョンは、化粧用途および薬学的用途の両方における活性構成成分の経皮送達においても効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤が、消化管からのiRNAおよび核酸のさらなる体内吸収を促進し、かつiRNAおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待されている。本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のiRNAおよび核酸の吸収を亢進するために、モノステアリン酸ソルビタンGrill3、Labrasol、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤も含有し得る。本発明のマイクロエマルジョンで使用される浸透促進剤を、5つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの1つに分類することができるLeeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92。これらのクラスはそれぞれ、上に記載されている。浸透促進剤一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にiRNAの効率的な送達をもたらすために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を横断し得ることが見出されている。細胞膜にわたる非親油性薬物の拡散を支援することに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。浸透促進剤を、5つの広範のカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの1つに分類することができる例えば、Malmsten,M.Surfactantsandpolymersindrugdelivery,InformaHealthCare,NewYork,NY,2002、Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92を参照のこと。浸透促進剤の前述のクラスはそれぞれ、以下でより詳細に記載されている。界面活性剤:本発明に関連して、界面活性剤または表面活性剤は、水溶液中に溶解されると溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を低減させ、粘膜を通るiRNAの吸収が亢進されるという結果をもたらす化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル例えば、Malmsten,M.Surfactantsandpolymersindrugdelivery,InformaHealthCare,NewYork,NY,2002、Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92を参照のこと、およびFC-43等のペルフルオロ化合物エマルジョンTakahashietal.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252が含まれる。脂肪酸:浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸n-デカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン1-モノオレオイル-rac-グリセロール、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1-20アルキルエステル例えば、メチル、イソプロピルおよびt-ブチル、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリドすなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等が含まれる例えば、Touitou,E.,etal.EnhancementinDrugDelivery,CRCPress,Danvers,MA,2006、Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,p.92、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、ElHaririetal.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654を参照のこと。胆汁塩:胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる例えば、Malmsten,M.Surfactantsandpolymersindrugdelivery,InformaHealthCare,NewYork,NY,2002、Brunton,Chapter38in:GoodmanGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,9thEd.,Hardmanetal.Eds.,McGraw-Hill,NewYork,1996,pp.934-935を参照のこと。様々な天然胆汁塩およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、胆汁塩という用語には、天然に存在する胆汁の構成成分のうちのいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれかが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸またはその薬学的に許容できるナトリウム塩、コール酸ナトリウム、デヒドロコール酸デヒドロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸デオキシコール酸ナトリウム、グルコール酸グルコール酸ナトリウム、グリコール酸グリコール酸ナトリウム、グリコデオキシコール酸グリコデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸タウロデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ケノデオキシコール酸ナトリウム、ウルソデオキシコール酸UDCA、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウムSTDHF、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルPOEが含まれる例えば、Malmsten,M.Surfactantsandpolymersindrugdelivery,InformaHealthCare,NewYork,NY,2002、Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92、Swinyard,Chapter39In:Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.,Gennaro,ed.,MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1990,pages782-783、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、Yamamotoetal.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25、Yamashitaetal.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583を参照のこと。キレート剤:本発明に関連して使用されるキレート剤を、金属イオンと複合体を形成することによって金属イオンを溶液から除去し、粘膜を通るiRNA吸収が亢進されるという結果をもたらす化合物と定義することができる。本発明での浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴付けられたDNAヌクレアーゼが触媒作用に二価金属イオンを必要とし、それ故に、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、DNase阻害剤としての機能も果たすさらなる利点を有するJarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムEDTA、クエン酸、サリチル酸塩例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチル酸塩、およびホモバニリン酸塩、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9、ならびにβジケトンのN-アミノアシル誘導体エナミンが含まれるが、これらに限定されない例えば、Katdare,A.etal.,Excipientdevelopmentforpharmaceutical,biotechnology,anddrugdelivery,CRCPress,Danvers,MA,2006、Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92、Muranishi,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1990,7,1-33、Buuretal.,J.ControlRel.,1990,14,43-51を参照のこと。非キレート非界面活性剤:本明細書で使用される非キレート非界面活性剤浸透促進化合物を、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るiRNAの吸収を亢進する化合物と定義することができる例えば、Muranishi、CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems、1990、7、1-33を参照のこと。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体Leeetal.,CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,1991,page92、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬Yamashitaetal.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626が含まれる。細胞レベルでiRNAの取り込みを亢進させる作用物質を、本発明の医薬組成物および他の組成物に添加することもできる。例えば、リポフェクチンJunichietal、米国特許第5,705,188号等のカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンLolloetal.、PCT出願第WO97/30731号等のポリカチオン性分子も、dsRNAの細胞取り込みを亢進することが知られている。市販のトランスフェクト試薬の例には、例えば、Lipofectamine商標Invitrogen;Carlsbad,CA,Lipofectamine2000商標Invitrogen;Carlsbad,CA、293fectin商標Invitrogen;Carlsbad,CA、Cellfectin商標Invitrogen;Carlsbad,CA、DMRIE-C商標Invitrogen;Carlsbad,CA、FreeStyle商標MAXInvitrogen;Carlsbad,CA、Lipofectamine商標2000CDInvitrogen;Carlsbad,CA、Lipofectamine商標Invitrogen;Carlsbad,CA、RNAiMAXInvitrogen;Carlsbad,CA、Oligofectamine商標Invitrogen;Carlsbad,CA、Optifect商標Invitrogen;Carlsbad,CA、X-tremeGENEQ2トランスフェクション試薬Roche;Grenzacherstrasse,Switzerland、DOTAPリポソームトランスフェクション試薬Grenzacherstrasse,Switzerland、DOSPERリポソームトランスフェクション試薬Grenzacherstrasse,Switzerland、またはFugeneGrenzacherstrasse,Switzerland、Transfectam登録商標試薬Promega;Madison,WI、TransFast商標トランスフェクション試薬Promega;Madison,WI、Tfx商標-20試薬Promega;Madison,WI、Tfx商標-50試薬Promega;Madison,WI、DreamFect商標OZBiosciences;Marseille,France、EcoTransfectOZBiosciences;Marseille,France、TransPassaD1トランスフェクション試薬NewEnglandBiolabs;Ipswich,MA,USA、LyoVec商標/LipoGen商標Invivogen;SanDiego,CA,USA、PerFectinトランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、NeuroPORTERトランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、GenePORTERトランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、GenePORTER2トランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、サイトフェクチントランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、BaculoPORTERトランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、TroganPORTER商標トランスフェクション試薬Genlantis;SanDiego,CA,USA、RiboFectBioline;Taunton,MA,USA、PlasFectBioline;Taunton,MA,USA、UniFECTORB-BridgeInternational;MountainView,CA,USA、SureFECTORB-BridgeInternational;MountainView,CA,USA、またはHiFect商標B-BridgeInternational,MountainView,CA,USA等が挙げられる。他の作用物質を利用して、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール、2-ピロール等のピロール、アゾン、ならびにリモネンおよびメントン等のテルペンを含む投与される核酸の浸透を亢進させることができる。担体本発明のある特定の組成物は、担体化合物も製剤中に組み込む。本明細書で使用される担体化合物または担体は、不活性すなわち、それ自体は生物学的活性を有しないであるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、または循環からそれを除去することを促進することによって、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させるインビボプロセスにより核酸と認識される核酸もしくはその類似体を指し得る。核酸と担体化合物の同時投与典型的には、後者の物質を過剰に有するは、恐らく共通の受容体への担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または4-アセトアミド-4’イソチオシアノ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸と同時投与されるとき、部分的にホスホロチオエートであるdsRNAの肝組織における回収を低減させることができるMiyaoetal.,DsRNARes.Dev.,1995,5,115-121、Takakuraetal.,DsRNANucl.AcidDrugDev.,1996,6,177-183。賦形剤担体化合物とは対照的に、医薬担体または賦形剤は、1つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされるときに、所望の用量、稠度等を提供するように、計画された投与様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体には、結合剤例えば、アルファ化トウモロコシデンプンmaizestarch、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等、充填剤例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸塩、またはリン酸水素カルシウム等、滑沢剤例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプンcornstartch、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等、崩壊剤例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等、ならびに湿潤剤例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等が含まれるが、これらに限定されない。核酸と有害に反応しない経口non-parenteral投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。好適な薬学的に許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体油基剤中の核酸の溶液を含み得る。この溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない経口non-parenteral投与に好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。好適な薬学的に許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。他の構成成分本発明の組成物は、その技術分野で確立された使用レベルの通常医薬組成物中に見られる他の補助成分をさらに含み得る。したがって、例えば、この組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、もしくは抗炎症薬等の適合性の薬学的に活性な物質をさらに含有し得るか、または、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに有用な物質をさらに含有し得る。しかしながら、そのような物質は、添加されるとき、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌し、所望の場合、その製剤の核酸複数を含むと有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味料、および/または芳香族物質等と混合することができる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤を含有することもできる。いくつかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物は、a1つ以上のiRNA化合物およびb非RNAi機序によって機能する1つ以上の生物学的作用物質を含む。そのような生物学的作用物質の例には、PD-1、PD-L1、もしくはB7-H1CD80のうちの1つ以上例えば、PD-1、PD-L1、もしくはB7-H1に対するモノクローナル抗体、または1つ以上の組み換えサイトカイン例えば、IL6、IFN-γ、およびTNFを標的とする生物学的作用物質が挙げられる。そのような化合物の毒性および治療有効性を、例えば、LD50集団の50に致死的な用量およびED50集団の50に治療的に有効な用量を決定するために、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトに用いる投与量範囲の処方に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投与量は、概して、毒性をほとんどまたは全く有しないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物においても、治療的に有効な用量を、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。細胞培養において決定されるIC50すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度を含む、化合物、または適切な場合には、例えば、減少したポリペプチドの濃度を得る標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を得るために、用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。上述のそれらの投与に加えて、本発明で取り上げられるsiRNAを、PCSK9発現によって媒介される病理学的プロセスの治療に効果的な他の既知の作用物質と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当技術分野で既知であるか、または本明細書に記載される標準の有効性測定値を用いて、観察された結果に基づいて、iRNA投与の量およびタイミングを調整することができる。PCSK9を標的とするsiRNAを用いた方法一態様において、本発明は、哺乳動物におけるPCSK9遺伝子の発現を阻害するためにsiRNAの使用を提供する。方法は、標的PCSK9遺伝子の発現が減少するように、哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、PCSK9発現は、長期間、例えば、少なくとも1週間、2週間、3週間、もしくは4週間、またはそれ以上の期間減少する。例えば、ある特定の場合において、PCSK9遺伝子の発現は、本明細書に記載のsiRNAの投与により、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50抑圧される。いくつかの実施形態において、PCSK9遺伝子は、siRNAの投与により、少なくとも約60、70、または80抑圧される。いくつかの実施形態において、PCSK9遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約85、90、または95抑圧される。本明細書に記載の方法および組成物を用いて、PCSK9遺伝子発現を下方制御することにより調節することができる疾患および病態を治療することができる。例えば、本明細書に記載の組成物を用いて、高脂血症、ならびに他の脂質不均衡の形態、例えば、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および障害に関連する病理学的状態、例えば、心臓疾患、循環器疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、方法は、ヘテロ接合体LDLR遺伝子型を有する患者に有効な量のPCSK9siRNAを投与することを含む。したがって、本発明は、PCSK9によって媒介される障害または疾患の治療のためのsiRNAの使用にも関する。例えば、siRNAは、高脂血症の治療に使用される。PCSK9遺伝子が減少するといった結果は、好ましくは、哺乳動物の血液、より具体的には、血清中のLDLc低密度リポタンパク質コレステロールレベルの減少をもたらす。いくつかの実施形態において、LDLcレベルは、治療前のレベルと比較して、少なくとも10、15、20、25、30、40、50、もしくは60、またはそれ以上減少する。方法は、治療される対象にsiRNAを投与することを含む。治療される生物がヒト等の哺乳動物である場合、組成物を、経口経路、または静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、および気道エアロゾル投与を含む非経口経路を含むが、それらに限定されない当技術分野で既知の任意の手段を用いて投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内への注入infusionまたは注入injectionによって投与される。方法は、例えば、PCSK9mRNAのレベルを少なくとも5日間、より好ましくは7、10、14、21、25、30、または40日間低下させるのに十分な用量のsiRNAを投与すること、および任意で、dsRNA第2の単回用量を投与することを含み、第2の単回用量は、第1の単回用量が投与された後に、少なくとも5日間、より好ましくは7、10、14、21、25、30、または40日間投与され、それによって、対象におけるPCSK9遺伝子の発現を阻害する。一実施形態において、siRNAの用量は、最高で4週間に1回、最高で3週間に1回、最高で2週間に1回、または最高で1週間に1回投与される。別の実施形態において、投与は、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、もしくは6ヶ月間、または1年間、あるいはそれより長い期間継続することができる。別の実施形態において、低密度リポタンパク質コレステロールLDLcレベルが、70mg/dL、130mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、300mg/dL、もしくは400mg/dL等を超える所定の最小レベルに到達するか、またはそれを上回る場合に、投与を提供することができる。概して、siRNAは、免疫系を活性化せず、例えば、TNF-アルファまたはIFN-アルファレベル等のサイトカインレベルを増加させない。例えば、本明細書に記載のインビトロPBMCアッセイ等のアッセイによって測定される場合、TNF-アルファまたはIFN-アルファのレベルの増加は、PCSK9を標的としないdsRNA等の対照dsRNAで処理された対照細胞の30、20、もしくは10未満である。例えば、対象に、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、または2.5mg/kgのdsRNA等のsiRNAの治療量を投与することができる。siRNAを、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間等の期間にわたって、静脈内注入により投与することができる。投与は、例えば、定期的に、例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週すなわち、2週間に1回で繰り返される。最初の治療レジメン後、治療をより低い頻度で投与してもよい。例えば、3ヶ月間隔週で投与した後、投与を、6ヶ月間、もしくは1年間、またはそれ以上の期間、1ヶ月に1回、繰り返してもよい。siRNAの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、または他のコンパートメント中のPCSK9レベルを、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、もしくは少なくとも90、またはそれ以上低減させることができる。iRNAの総量を投与する前に、患者に、5の注入反応等の少量の用量を投与し、アレルギー反応等の副作用、または脂質レベルもしくは血圧の上昇を監視することができる。別の例において、患者を、上昇したサイトカイン例えば、TNF-αまたはINF-αレベル等の好ましくない免疫活性化作用を監視することができる。治療もしくは予防効果は、疾患状態の1つ以上のパラメータにおいて統計的に有意な改善が存在するとき、またはそれらが別の方法で予想される症状の悪化もしくは発現の失敗により、明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも10、好ましくは、少なくとも20、30、40、50もしくはそれ以上の好ましい変化は、効果的な治療を示し得る。所与のsiRNA薬物またはその薬物の製剤の有効性を、当技術分野で既知の所与の疾患について、実験動物モデルを用いて判断することもできる。実験動物モデルを用いるとき、治療の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な減少が観察されるときに明らかである。さらなる作用物質さらなる実施形態において、siRNAの投与は、さらなる治療薬と組み合わせて投与される。siRNAおよびさらなる治療薬を、同一の組成物と組み合わせて、例えば、非経口で投与することができるか、あるいはさらなる治療薬を、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法を用いて投与することができる。さらなる治療薬の例には、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、または脂質異常症等の脂質障害の治療に既知の作用物質が挙げられる。例えば、本発明で取り上げられるsiRNAを、例えば、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤例えば、スタチン、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンII受容体拮抗薬例えば、MerckCo.’sCozaar登録商標等のロサルタンカリウム、アシルCoAコレステロールアセチルトランスフェラーゼACAT阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質CETP阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質MTTP阻害剤、コレステロール調節物質、胆汁酸調節物質、ペルオキシソーム増殖活性化受容体PPAR作動薬、遺伝子に基づく治療、複合血管保護剤例えば、AtherogenicsのAGI-1067、糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様の化合物、IBAT阻害剤例えば、ShionogiのS-8921、スクアレンシンターゼ阻害剤、または単球走化性タンパク質MCP-I阻害剤とともに投与することができる。例示的なHMG-CoAレダクターゼ阻害剤には、アトルバスタチンPfizerのLipitor登録商標/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl、プラバスタチンBristol-MyersSquibbのPravachol、SankyoのMevalotin/Sanaprav、シンバスタチンMerckのZocor登録商標/Sinvacor,BoehringerIngelheim’sDenan,Banyu’sLipovas、ロバスタチンMerckのMevacor/Mevinacor、BexalのLovastatina,Cepa、SchwarzPharmaのLiposcler、フルバスタチンNovartisのLescol登録商標/Locol/Lochol、FujisawaのCranoc、SolvayのDigaril、セリバスタチンBayerのLipobay/GlaxoSmithKlineのBaycol、ロスバスタチンAstraZenecaのCrestor登録商標、およびピチバスタチンイタバスタチン/リシバスタチンNissanChemical,KowaKogyo,Sankyo,およびNovartisが挙げられる。例示的なフィブラートには、例えば、ベザフィブラート例えば、RocheのBefizal登録商標/Cedur登録商標/Bezalip登録商標、KisseiのBezatol、クロフィブラート例えば、WyethのAtromid-S登録商標、フェノフィブラート例えば、FournierのLipitil/Lipantil、AbbottのTricor登録商標、TakedaのLipantil、ジェネリック薬品、ゲムフィブロジル例えば、PfizerのLopid/LipurおよびシプロフィブラートSanofi-SynthelaboのModalim登録商標が挙げられる。例示的な胆汁酸捕捉剤には、例えば、コレスチラミンBristol-MyersSquibbのQuestran登録商標およびQuestranLight商標、コレスチポール例えば、PharmaciaのColestid、ならびにコレセベランGenzyme/SankyoのWelChol商標が挙げられる。例示的なナイアシン治療には、例えば、AventisのNicobid、Upsher-SmithのNiacor、AventisのNicolar、およびSanwakagakuのPerycit等の即時放出製剤が含まれる。ナイアシン持続放出製剤には、例えば、KosPharmaceuticalsのNiaspanおよびUpsher-SmithのSIo-Niacinが挙げられる。例示的な抗血小板薬には、例えば、アスピリン例えば、Bayerのアスピリン、クロピドグレルSanofi-Synthelabo/Bristol-MyersSquibbのPlavix、ならびにチクロピジン例えば、Sanofi-SynthelaboのTiclidおよびDaiichiのPanaldineが挙げられる。PCSK9を標的とするdsRNAとの組み合わせに有用な他のアスピリン様の化合物には、例えば、AsacardPharmaciaの徐放性アスピリンおよびPamicogrelKanebo/AngeliniRicerche/CEPAが含まれる。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤には、例えば、ラミプリル例えば、AventisのAltaceおよびエナラプリル例えば、MerckCo.のVasotecが挙げられる。例示的なアシルCoAコレステロールアセチルトランスフェラーゼACAT阻害剤には、例えば、アバシマイブPfizer、エフルシマイブBioMerieuxPierreFabre/EliLilly、CS-505SankyoおよびKyoto、ならびにSMP-797Sumitoが挙げられる。例示的なコレステロール吸収阻害剤には、例えば、エゼチミブMerck/Schering-PloughPharmaceuticalsZetia登録商標およびパマケシドPfizerが挙げられる。例示的なCETP阻害剤には、例えば、トルセトラピブCP-529414とも呼ばれる、Pfizer、JTT-705JapanTobacco、およびCETi-IAvantImmunotherapeuticsが挙げられる。例示的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質MTTP阻害剤には、例えば、インプリタピドBayer、R-103757Janssen、およびCP-346086Pfizerが挙げられる。他の例示的なコレステロール調節物質には、例えば、NO-1886Otsuka/TAPPharmaceutical、CI-1027Pfizer、およびWAY-135433Wyeth-Ayerstが挙げられる。例示的な胆汁酸調節物質には、例えば、HBS-107Hisamitsu/Banyu、Btg-511BritishTechnologyGroup、BARI-1453Aventis、S-8921Shionogi、SD-5613Pfizer、およびAZD-7806AstraZenecaが挙げられる。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体PPARアゴニストには、例えば、テサグリタザールAZ-242AstraZeneca、ネトグリタゾンMCC-555Mitsubishi/JohnsonJohnson、GW-409544LigandPharniaceuticals/GlaxoSmithKline、GW-501516LigandPharniaceuticals/GlaxoSmithKline、LY-929LigandPharniaceuticalsおよびEliLilly、LY-465608LigandPharniaceuticalsおよびEliLilly、LY-518674LigandPharniaceuticalsおよびEliLilly、およびMK-767MerckおよびKyorinが挙げられる。例示的な遺伝子に基づく治療には、例えば、AdGWEGF121.10GenVec、ApoAlUCBPharma/GroupeFournier、EG-004TrinamArkTherapeutics、およびATP結合カセット輸送体A1ABCA1CVTherapeutics/Incyte、Aventis、Xenonが含まれる。例示的な糖タンパク質Ilb/IIIa阻害剤には、例えば、ロキシフィバンDMP754とも呼ばれる、Bristol-MyersSquibb、ガントフィバンMerckKGaA/Yamanouchi、およびクロマフィバンMillenniumPharniaceuticalsが挙げられる。例示的なスクワレン合成酵素阻害剤には、例えば、BMS-1884941Bristol-MyersSquibb、CP-210172Pfizer、CP-295697Pfizer、CP-294838Pfizer、およびTAK-475Takedaが挙げられる。例示的なMCP-I阻害剤は、例えば、RS-504393RocheBioscienceである。抗アテローム性動脈硬化剤BO-653ChugaiPharniaceuticals、およびニコチン酸誘導体ナイクリンYamanouchiPharmacuticalsも、本発明で取り上げられるdsRNAと組み合わせた投与に適切である。PCSK9を標的とするdsRNAとの投与に好適な例示的な併用療法には、例えば、アドビコールKosPharmacuticalsのナイアシン/ロバスタチン、アムロジピン/アトルバスタチンPfizer、ならびにエゼチミブ/シンバスタチン例えば、Merck/Schering-PloughPharmacuticalsのバイトリン登録商標10/10錠、10/20錠、10/40錠、および10/80錠が含まれる。高コレステロール血症を治療するための薬剤であって、PCSK9を標的とするdsRNAと組み合わせて投与するのに好適な薬剤には、例えば、ロバスタチン、ナイアシンアルトプレブ登録商標持続放出錠剤AndrxLabs、ロバスタチンカデュエット登録商標錠剤Pfizer、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムクレストール登録商標錠剤AstraZeneca、ロスバスタチンカルシウムレスコール登録商標カプセルNovartis、フルバスタチンナトリウムレスコール登録商標Reliant、Novartis、フルバスタチンナトリウムリピトール登録商標錠剤Parke-Davis、アトルバスタチンカルシウムロフィブラ登録商標カプセルGate、ナイアスパン持続放出錠剤Kos、ナイアシンプラバコール錠Bristol-MyersSquibb、プラバスタチンナトリウムトリコール登録商標錠剤Abbott、フェノフィブラートバイトリン登録商標10/10錠Merck/Schering-PloughPharniaceuticals、エゼチミブ、シンバスタチンWelChol商標錠剤Sankyo、塩酸コレセベラムゼチーア登録商標錠剤Schering、エゼチミブゼチーア登録商標錠剤Merck/Schering-PloughPharniaceuticals、およびエゼチミブゾコール登録商標錠剤Merckが挙げられる。一実施形態において、siRNAは、エゼチミブ/シンバスタチンの組み合わせ例えば、Vytorin登録商標Merck/Schering-PloughPharmaceuticalsと組み合わせて投与される。一実施形態において、siRNAが患者に投与され、その後、さらなる治療薬が患者に投与されるまたはその逆も同様。別の実施形態では、siRNAおよびさらなる治療薬は、同時に投与される。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のsiRNAの投与法を、最終使用者、例えば、介護人または対象に指導する方法を取り上げる。方法は、任意で、最終使用者にsiRNAの1つ以上の用量を提供すること、および本明細書に記載のレジメンに基づいてsiRNAを投与するよう最終使用者を指導し、それによって、最終使用者を指導することを含む。患者の特定一態様において、本発明は、患者がHDLの低下、ApoBの低下、または総コレステロールの低下させることなくLDLの低下を必要とするかに基づいて患者を選択することによって、患者を治療する方法を提供する。方法は、例えば、患者のHDLレベルを実質的に低下させることなく、患者のLDLレベルまたはApoBレベルを低下させるのに十分な量のsiRNAを患者に投与することを含む。遺伝性素因は、標的遺伝子関連疾患、例えば、高脂血症の発現に関与する。したがって、家族歴を得ることによって、または例えば、1つ以上遺伝子マーカーまたは変異体をスクリーニングすることによって、siRNAを必要とする患者を特定することができる。高脂血症に関与する遺伝子の例には、例えば、LDL受容体LDLR、アポリポタンパク質ApoA1、ApoB、ApoE等、コレステリルエステル輸送タンパク質CETP、リポタンパク質リパーゼLPL、肝性リパーゼLIPC、内皮リパーゼEL、レシチン:コレステリルアシルトランスフェラーゼLCATが挙げられるが、これらに限定されない。医師、看護師、または家族等の医療サービス提供者は、siRNAを処方または投与する前に家族歴を得ることができる。加えて、遺伝子型または表現型を決定する試験を行うことができる。例えば、PCSK9dsRNAが患者に投与される前に、PCSK9遺伝子型および/または表現型を同定するDNA試験を患者からの試料、例えば、血液試料上で行うことができる。別の実施形態では、関連した遺伝子型および/または表現型、例えば、LDLR遺伝子型を同定する試験が行われる。LDLR遺伝子を有する遺伝的変異体の例を、当技術分野で、例えば、参照により組み込まれる以下の出版物:Costanzaetal2005Relativecontributionsofgenes,environment,andinteractionstobloodlipidconcentrationsinageneraladultpopulation.AmJEpidemiol.15;1618:714-24、Yamadaetal.2008Geneticriskformetabolicsyndrome:examinationofcandidategenepolymorphismsrelatedtolipidmetabolisminJapanesepeople.JMedGenet.Jan;451:22-8,Epub2007Aug31、およびBoesetal2009Genetic-epidemiologicalevidenceongenesassociatedwithHDLcholesterollevels:Asystematicin-depthreview.Exp.Gerontol44:136-160,Epub2008Nov17で見出すことができる。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で取り上げられるiRNAおよび方法の実践または試験の際に、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および物質を使用することができるが、好適な方法および物質が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めて、本明細書が優先される。加えて、物質、方法、および例は、例示に過ぎず、限定するものではない。実施例1.iRNAの合成試薬の供給源試薬の供給源が本明細書に具体的に提供されない場合、そのような試薬を、分子生物学における用途に対する品質/純度基準で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から入手することができる。オリゴヌクレオチドの合成すべてのオリゴヌクレオチドを、AKTAオリゴパイロット合成機上で合成する。標準の保護基、5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイト、および5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホルアミダイトPierceNucleicAcidsTechnologiesを有する市販の制御された孔質ガラス固体支持体dT-CPG、500Å、PrimeSynthesisおよびRNAホスホルアミダイトを、オリゴヌクレオチドの合成のために使用した。2’-Fホスホルアミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルオロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホルアミダイトおよび5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルオロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホルアミダイトをPromegaから購入する。ホスホルアミダイトはすべて、10のTHF/ANCv/v中0.2Mの濃度で使用されるグアノシンを除いては、アセトニトリルCH3CN中0.2Mの濃度で使用する。16分間のカップリング/再循環時間を用いる。活性化剤は、5-エチルチオテトラゾール0.75M、AmericanInternationalChemicalsであり、PO-酸化のためにヨウ素/水/ピリジンを使用し、PS-酸化のために2,6-ルチジン/ACN1:1v/v中のPS-酸化PADS2を使用する。3’-リガンド結合鎖を、対応するリガンドを含有する固体支持体を用いて合成する。例えば、コレステロール単位の配列への導入を、ヒドロキシプロリノール-コレステロールホスホルアミダイトから行う。コレステロールを、6-アミノヘキサノアート結合を介してトランス-4-ヒドロキシプロリノールに係留させて、ヒドロキシプロリノール-コレステロール部分を得る。5’末端Cy-3およびCy-5.5蛍光体標識iRNAを、BiosearchTechnologiesから購入する対応するQuasar-570Cy-3ホスホルアミダイトから合成する。5’末端およびまたは内部位置へのリガンドの結合を、適切に保護されたリガンド-ホスホルアミダイト構成要素を用いて達成する。無水CH3CN中の0.1Mのホスホルアミダイト溶液を、5-エチルチオ-1H-テトラゾール活性化剤の存在下で、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに、15分間にわたってカップリングさせる。リン酸塩へのヌクレオチド間亜リン酸塩の酸化を、1に報告される標準のヨウ素-水を用いるか、またはtert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水10:87:3を用いて10分間の酸化待機時間で、結合したオリゴヌクレオチドを処理することによって実行する。ホスホロチオアートを、DDTTAMChemicalsから購入、PADS、またはBeaucage試薬等の硫黄転移試薬を用いた亜リン酸塩のホスホロチオアートへの酸化によって導入する。コレステロールホスホルアミダイトを、屋内で合成し、ジクロロメタン中0.1Mの濃度で使用する。コレステロールホスホラミダイトのカップリング時間は16分間である。脱保護I核酸塩基脱保護合成が完了した後、支持体を100mLのガラスボトルVWRに移す。オリゴヌクレオチドを、55°Cで6.5時間の80mLのエタノールアンモニア混合物[アンモニア:エタノール3:1]を用いた塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、支持体から切断する。ボトルを氷上で短期間冷却し、その後、エタノールアンモニア混合物を新しい250mLボトルに濾過する。CPGをエタノール/水1:1v/vの2×40mL部分で洗浄する。その後、混合物の体積を、ロータリーエバポレータを用いて約30mLに減少させる。その後、混合物をドライアイス上で冷凍し、真空遠心分離装置Speed-Vacを用いて真空下で乾燥させる。脱保護II2’-TBDMS基の除去乾燥させた残基を、26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩TEA3HFまたはピリジン-HF、およびDMSO3:4:6中に再懸濁し、60°Cで90分間加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリルTBDMS基を除去する。その後、反応物を50mLの20mM酢酸ナトリウムで反応停止処理し、pHを6.5に調整する。精製するまで、オリゴヌクレオチドを冷凍庫に保存する。分析オリゴヌクレオチドを精製前に高速液体クロマトグラフィーHPLCで分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列および/または結合リガンドの性質に依存する。HPLC精製リガンド結合オリゴヌクレオチドを、逆相分取HPLCで精製する。非結合オリゴヌクレオチドを、屋内で充填したTSKゲルカラムの陰イオン交換HPLCで精製する。緩衝液は、10のCH3CN中20mMリン酸ナトリウムpH8.5緩衝液A、および10のCH3CN中20mMリン酸ナトリウム、1MのNaBrpH8.5緩衝液Bである。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥する。約0.15ODの脱塩されたオリゴヌクレオチドを水中で希釈して150μLにし、その後、CGEおよびLC/MS分析のために特殊のバイアルにピペットで移した。その後、化合物をLC-ESMSおよびCGEで分析する。iRNAの調製iRNAの一般的な調製について、等モル量のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、1倍のPBS中で、95°Cで5分間加熱し、室温まで緩徐に冷却する。二本鎖の完全性を、HPLC分析により確認する。核酸配列を、標準の命名法、および具体的には、表Bの略語を用いて以下に提示する。表B:核酸配列の表示において用いるヌクレオチドモノマーの略語これらのモノマーが、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、5’-3’-ホスホジエステル結合によって相互に結合されることが理解される。実施例2.PCSK9siRNA設計、合成、およびスクリーニングPCSK9siRNAを用いた設計、合成、およびアッセイの詳細な記述を、2007年5月10日出願の米国特許出願第11/746,864号現在の米国特許第7,605,251号および2007年5月10日出願の国際特許出願第PCT/US2007/068655号国際公開第WO2007/134161号として公開されているおよび2009年6月4日出願の米国特許出願第12/478,452号米国第2010/0010066号として公開されているおよび2009年1月30日出願の国際特許出願第PCT/US2009/032743号国際公開第WO2009/134487号として公開されているで見出すことができる。すべての目的のために、これらすべては、参照によりこれらの全体が組み込まれる。siRNA設計を実行して、プロタンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシン型9遺伝子ヒトシンボルPCSK9を標的とするsiRNAをヒトおよびカニクイザルcynomolgousmonkeyカニクイザルMacacafascicularis、以下、カニクイザルcynoから同定した。設計は、NCBIRefSeqコレクションからのPCSK9転写NM_174936.2ヒトを使用し、Alnylamのカニクイザルトランスクリプトーム配列決定の試みの一環としてカニクイザルPCSK9転写を得た。RefSeqからのアカゲザルrhesusmonkeyアカゲザルMacacamulatta転写物NM_001112660.1を、カニクイザルデータを欠くPCSK9転写領域でも利用した以下を参照のこと。siRNA設計および特異性の予測3つの組のPCSK9二本鎖、1ヒトとNHPPCSK9利用可能な場合はカニクイザル、さもなければアカゲザルとの間に100の同一性を有する二本鎖、2NHPPCSK9に対してアンチセンス位置1、18、または19でミスマッチを許容したヒトPCSK9に対して100の同一性を有する二本鎖、ならびに3ヒトPCSK9に対してミスマッチおよび/または欠失を含有する二本鎖を設計した。それぞれの二本鎖組の大きさ、内容物、および設計基準は、以下の通りであった。1.ヒトとカニクイザルPCSK9ヒトPCSK9NM_174936.2のスパン位置spanningposition695~2916ならびにヒトおよびアカゲザルPCSK9スパン位置1~695/2916~3561が完全に一致したヒト/NHP二本鎖。すべて25~65のGC含有率を有し、いずれもアンチセンス位置1および2の両方でGまたはCを有さず、いずれも4より長い一連の反復ヌクレオチドを有さなかった。配列は、表1に列挙される。2.アンチセンス位置1、18、および19でミスマッチを有するヒト/NHP二本鎖。これらの二本鎖は、ヒトPCKS9に完全一致するが、アンチセンス位置1、18、または19のうちのいずれかでNHPPCSK9に対するミスマッチを許容する。カニクイザルおよび/またはアカゲザルPCSK9転写物を、上の第1の組で使用した。すべて25~65のGC含有率を有し、いずれもアンチセンス位置1でGまたはCを有さず、いずれも5より長い一連の反復ヌクレオチドを有さなかった。配列は、表1に列挙される。3.設計されたミスマッチ9本の二本鎖、表6を参照のことおよび/または欠失12本の二本鎖、表7を参照のことを有するヒトPCSK9二本鎖。これらの二本鎖は、AD-9680の変異体である。候補二本鎖の予測特異性を、検索し、アライメントを解析し、オフターゲットおよびミスマッチスコアを生成し、頻度を計算し、かつそれぞれのsiRNA配列を特異性カテゴリーに割り当てたアルゴリズムを用いて、それぞれの配列から予測した。PCSK9配列の合成PCSK9配列を、MerMade192合成機上で、1umolスケールで合成した。上および表1に記載のヒト-NHP交差反応性配列を、修飾化学を用いて合成した。表2は、センスおよびアンチセンス鎖の修飾バーションを含む。この化学の詳細は、以下の通りである。センス鎖中のすべてのピリミジンシトシンおよびウリジンを、対応する2’-O-メチル塩基2’O-メチルCおよび2’-O-メチルUに置換した。アンチセンス鎖において、リボAヌクレオシドに隣接した5’位に向かうピリミジンCおよびUを、それらの対応する2-O-メチルヌクレオシドに置換した。センス配列およびアンチセンス配列の両方の3’末端で2塩基dTdTの拡張を導入した。この2塩基オーバーハングは、ホスホロチオエート結合を有する。ヒトのみのPCSK9配列の合成の場合、異なる化学修飾および構造特性を、親一本鎖配列A-14664およびA-14665親二本鎖AD-9680に導入した。表6および表7を参照されたい。構造特性は、一本鎖中の異なる部位でのミスマッチおよびまたは欠失の導入、2’OMe化学修飾部位の交換、3’dTdTオーバーハングの3’uuオーバーハングへの置換、センス鎖の10位でのユニバーサル塩基、2,4ジフルオロトルエン2,4DFTの導入を含む。個々の配列の合成を、96ウェルプレート中、1umolスケールで、高スループットパラレル合成形式で行った。合成プロセスは、ホスホラミダイト化学を用いた固体支持されたオリゴヌクレオチド法に基づいた。個々のアミダイト溶液を、0.1Mアセトニトリル中で調製し、エチルチオテトラゾールアセトニトリル中0.6Mを活性化因子として用いた。切断および脱保護:第1のステップにおいてメチルアミン、および第2のステップにおいてトリエチルアミン3HFを用いて、合成した配列を96ウェルプレート内で切断および脱保護した。粗配列をアセトン:エタノール混合物を用いて沈殿させ、ペレットを0.02Mの酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料をLC-MSによって分析し、結果として得られた質量データにより、配列の同一性を確認した。選択された組の試料もIEXクロマトグラフィによって分析した。精製:粗PCSK9一本鎖を、二等分し、そのうちの1つをイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。Source15Qカラムを用いたAKTAExplorer精製システムをこのプロセスのために使用した。精製を、カラムおよび60°Cに設定したインライン緩衝液加熱器を用いて行った。全長配列に対応する単一ピークを溶離液中に収集した。精製した一本鎖を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて純度について分析した。精製した配列を、AKTA精製器を用いてSephadexG25カラム上で脱塩した。脱塩したPCK9配列を、濃度および純度について分析した。その後、一本鎖をアニーリングに服従させた。センス一本鎖およびアンチセンス一本鎖の等モル量を合わせ、Tecan液体ハンドリングロボットを用いてアニーリングした。個々の二本鎖の純度を試験するために、それらをCGEキャピラリーゲル電気泳動法を用いて試験した。すべての二本鎖をスクリーニングアッセイのために解放した。実施例3:PCSK9siRNAのインビトロスクリーニング:細胞培養およびトランスフェクション:Hela細胞ATCC、Manassas、VAを、10FBS、ストレプトマイシン、グルタミンATCCを補充したEagleのMinimumEssentialMediumEMEM、ATCC中、5CO2の雰囲気下で、37°Cでほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから放出させた。1つのウェル当たり5μLのOpti-MEMおよび5μLのsiRNA二本鎖を、1つのウェル当たり10μLのOpti-MEMおよび0.2μLのLipofectamineRNAiMaxInvitrogen,CarlsbadCA.カタログ番号13778-150とともに96ウェルプレートに添加することによって、逆トランスフェクションを実行し、室温で15分間インキュベートした。抗生物質を有さず、2.0×104Hela細胞を含有する80μLの完全成長培地を添加した。場合によって、細胞を最初にウェルに添加し、4~5時間後に、上述のトランスフェクション試薬を添加した。細胞をRNA精製の前に24時間インキュベートした。0.1または10nMの最終二本鎖濃度で実験を行った。用量応答スクリーニングについて、HeLa細胞を用量の範囲にわたってsiRNAでトランスフェクトした。MagMAX-96全RNA単離キットAppliedBiosystem,ForerCityCA、品番:AM1830を用いた全RNA単離:細胞を回収し、140μLの溶解/結合溶液中に溶解し、その後、EppendorfThermomixerを用いて850rpmで1分間混合した混合速度はプロセスを通して同一であった。20マイクロリットルの磁気ビーズおよび溶解/結合エンハンサー混合物を細胞溶解物に添加し、5分間混合した。磁気ビーズを磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく上清を除去した。上清を除去した後、磁気ビーズを洗浄液1イソプロパノールを添加したもので洗浄し、1分間混合した。ビーズを再度捕捉し、上清を除去した。その後、ビーズを150μLの洗浄液2エタノールを添加したもので洗浄し、捕捉し、上清を除去した。その後、50μLのDNase混合物MagMaxTurboDNase緩衝液およびTurboDNaseをビーズに添加し、それらを10~15分間混合した。混合した後、100μLのRNA再結合溶液を添加し、3分間混合した。上清を除去し、磁気ビーズを150μLの洗浄液2で再度洗浄し、1分間混合し、上清を完全に除去した。磁気ビーズを2分間混合して乾燥させた後、RNAを50μLの水で溶出した。ABI大容量cDNA逆転写キットAppliedBiosystems,FosterCity,CA、カタログ番号4368813を用いたcDNA合成:1反応当たり2μLの10倍緩衝液、0.8μLの25倍dNTP、2μLのランダムプライマー、1μLの逆転写酵素、1μLのRNase阻害剤、および3.2μLの水H2Oのマスター混合物を、10μLの全RNAに添加した。cDNAを、以下のステップ:25°Cで10分間、37°Cで120分間、85°Cで5秒、4°Cで維持を介して、Bio-RadC-1000またはS-1000サーマルサイクラーHercules,CAを用いて生成した。リアルタイムPCR:2μLのcDNAを、LightCycler480384ウェルプレートRoche、カタログ番号0472974001中、1ウェル当たり1μLのGAPDHTaqManプローブAppliedBiosystems、カタログ番号4326317E、1μLのPCSK9TaqManプローブAppliedBiosystems、カタログ番号HS03037355_M1および10μLのRocheプローブマスター混合物Roche、カタログ番号04887301001を含有するマスター混合物に添加した。リアルタイムPCRをLightCycler480リアルタイムPCR機Rocheで行った。それぞれの二本鎖を、2つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、それぞれのトランスフェクションを二重にアッセイした。分枝鎖DNAアッセイ-QunatiGene2.0Panomics、カタログ番号:QS0011:すべての他の二本鎖をスクリーニングするために使用規定された用量単数または複数で24時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を100uLの溶解混合物20mg/mLの最終濃度の、1容量の溶解混合物、2容量のヌクレアーゼを含まない水、および1mL当たり10uLのプロテイナーゼ-Kの混合物中に溶解し、その後、65°Cで35分間インキュベートした。その後、20μLの作業プローブセット遺伝子標的用のTTRプローブおよび内在性コントロール用のGAPDHならびに80uLの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを55°C±1°Cでインキュベートした約16~20時間。翌日、捕捉プレートを1倍洗浄緩衝液ヌクレアーゼを含まない水、緩衝液構成成分1、および洗浄緩衝液構成成分2で3時間洗浄し、その後、1分間遠心分離で乾燥させて240gにした。100uLの事前増幅作業試薬をアルミホイルで密封した捕捉プレートに添加し、55°C±1°Cで1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、洗浄ステップを繰り返し、その後、100μLの増幅作業試薬を添加した。1時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、100μLの標識プローブを添加した。捕捉プレートを50°C±1°Cで1時間インキュベートした。その後、プレートを1倍洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、100μLの基質を捕捉プレートに添加した。5~15分間のインキュベーション後、捕捉プレートをSpectraMax照度計MolecularDevices,Sunnyvale,CAを用いて読み取った。データ分析平均バックグラウンドをそれぞれの三重試料から差し引き、三重GAPDH対照プローブおよびPCSK9実験プローブを平均化し、その後、比率:実験プローブ-バックグラウンド/対照プローブ-バックグラウンドを得ることによって、bDNAデータを分析した。リアルタイムデータを△△Ct法を用いて分析した。それぞれの試料をGAPDH発現に正規化し、ノックダウンを非標的化二本鎖AD-1955でトランスフェクトした細胞と比較して評価した。IC50をXLfitの4パラメータフィットモデルを用いて定義した。結果表2に記載の1072エンドライト化学修飾したPCSK9siRNAを、0.1nMおよび10nMの単回用量実験で使用した。結果が表3に示される。上位45個の機能する二本鎖を、上述の用量応答アッセイで使用した。表4は、用量応答実験の結果を提供する。試験したsiRNAのうちの4つが、先導AD-9680の範囲のIC50を呈した。表5は、0.1nMノックダウンのPCSK9先導最適化siRNAの結果を提供する。先導AD-9680に基づくが、異なる修飾を有する二本鎖を、用量応答アッセイで使用した。結果が表6に示される。先導AD-9680に基づくが、アンチセンス鎖に欠失を有する二本鎖を、用量応答アッセイで使用した。結果が表7に示される。実施例4.LDLR-/トランスジェニックマウスにおけるPCSK9のサイレンシングLDLR遺伝子に対してヘテロ接合性である患者における高コレステロール血症の治療の満たされていないニーズが大いに存在する。これらの個人は、LDLRの1つの変異体および1つの重量コピーを有し、結果として、著しく上昇したLDLcレベルおよび心血管系イベントのより高い発生率/危険性を有する。LDLRヘテロ接合体マウスにおけるsiRNAを用いたPCSK9のサイレンシングおよびそれらの総コレステロールへの効果を調査した。脂質で製剤化されたPCSK9siRNAを、0.1、0.3、1.0、および3.0mg/kgで野生型およびLDLRヘテロ接合体マウスに投与した。3日後、マウスを屠殺し、肝臓PCSK9mRNAレベルおよび血清総コレステロールレベルを決定した。Jackson研究所で、JAX系統B6.129S7-Ldlrtm1Her/Jストック番号002207をC57BL/6Jマウスストック番号000664と交配させ、雌LDLRヘテロ接合体ノックアウトマウスをもたらした。LDLRヘテロ接合体マウス5匹/群、体重18~20gにおけるsiRNAのボーラス投与を、27G針を用いて、低容量尾静脈注入によって行った。マウスに、PCSK9を標的とするsiRNAAF-011-10792を3.0、1.0、0.3、および0.1mg/kgで投与し、対照ルシフェラーゼを標的とするsiRNAAF-011-1955を3mg/kgで投与した。siRNAを本明細書に記載されるように脂質で製剤化した。注入を容易にするために、投与前に約3分間、動物を赤外線ランプ下に置いた。投与の72時間後、動物を二酸化炭素窒息により屠殺した。0.2mLの血液を眼窩後方出血により収集し、分析まで-80°Cで保管した。肝臓を回収し、液体窒素中で凍結させた。凍結した肝臓を、6850Freezer/Mill極低温粉砕機SPEXCentriPrep,Incを用いて粉砕し、粉末を分析まで-80°Cで保管した。マウス血清中の総血清コレステロールを、製造業者の指示に従って、WakoコレステロールE酵素比色法WakoChemicalsUSA,Inc.,Richmond,VA,USAを用いて測定した。SoftMaxProソフトウェアを用いて、測定結果をVERSAMaxTunableマイクロプレートリーダーMolecularDevices,Sunnyvale,CA上で得た。プロトコルに従って、分岐DNA技術ベースのQuantiGene試薬システムPanomics,Fremont,CA,USAを用いてPCSK9mRNAレベルを検出した。10~20mgの凍結した肝臓粉末を600μLの0.3μg/mLプロテイナーゼKEpicentre、番号MPRK092を含む組織および細胞溶解液Epicentre、番号MTC096H中に65°Cで1時間溶解した。その後、10μLの溶解物を90uLの溶解作業試薬2容量の水中、1容量のストック溶解混合物に添加し、マウスPCSK9およびマウス対照配列GAPDHPanomics,USAに特異的なプローブセットを有するPanomics捕捉プレート上で、55°Cで一晩インキュベートした。その後、プロトコルに従って、信号増幅および検出のために捕捉プレートを処理し、化学発光を相対光ユニットRLUとしてマイクロプレート照度計Victor2-LightPerkinElmer上で読み取った。肝臓溶解物中のPCSK9mRNA対GAPDHmRNAの比率をそれぞれの治療群にわたって平均化し、PBSで処理した対照群と比較した。結果が図1に示される。非関連siRNA対照AF-011-1955ではなく、AF-011-10792siRNAでのLDLRヘテロ接合体マウスの治療が、マウス肝臓におけるPCSK9転写レベルの著しく用量依存的60な低下をもたらしPBS対照群に対して正規化されるときにより小さいPCSK9対GAPDH転写比率で示されるように、AF-011で製剤化されたsiRNA分子がインビボで活性であることを示した。図1に示されるように、サイレンシング活性は、これらの動物における総コレステロールの20~30の低下に置き換えられた。LDLRヘテロ接合体ノックアウトマウスにおけるPCSK9サイレンシングは、総血清コレステロールの低下をもたらし、LDLRの単一の重量コピーがPCSK9機構を十分に効果的にすることを示す。実施例5.ヒトにおけるPCSK9を標的とするsiRNAでの総血清コレステロールの低減ヒト対象を医薬組成物、例えば、siRNAを有する核酸脂質粒子で治療する。ゼロ時間で、医薬組成物の好適な第1の用量を対象に皮下投与する。組成物を本明細書に記載されるように製剤化する。しばらくすると、例えば、総血清コレステロールの測定によって、対象の状態を評価する。この測定に伴って、該対象におけるPCSK9発現、および/または成功したPCSK9mRNAのsiRNA標的化の産物を測定することができる。他の関連性のある基準も測定することができる。用量の数と強度を、対象の必要性に従って調整する。いくつかの実施形態において、対象は、LDLR変異または多型に対してヘテロ接合性である。治療後、対象の状態を治療前の状態と比較するか、または同様に罹患しているが、治療されていない対象の条件と比較する。当業者は、本開示に具体的に提示される方法および組成物に加えて、当業者が本発明を以下に添付される特許請求の範囲の全範囲内で実践することを可能にする方法および組成物に精通している。表1.化学修飾していないPCSK9siRNA1072本の二本鎖、AD-27043~28122表2.エンドライト化学修飾したPCSK9siRNA表3.PCSK9の10nMおよび0.1nMノックダウン表4.PCSK9用量応答表5.PCSK9リード最適化siRNAの0.1nMノックダウン表6.AD-9680およびAD-9680の修飾バージョン:用量応答スクリーニング表7.欠失を有するAD-9680および有しないAD-9680:用量応答スクリーニング表8.AD-9680およびAD-10792:センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、および標的配列"