"大腸菌細胞から組み換えリポタンパク質を調製する方法であって、髄膜炎菌NMのAg473タンパク質を発現する大腸菌細胞の細胞膜を界面活性剤の存在下で破壊して、細胞膜画分を生成する破壊工程と、前記細胞膜画分を濾過して、濾液を生成する濾過工程と、混合相クロマトグラフィ、カチオン性膜クロマトグラフィ、及びアニオン性膜クロマトグラフィを任意の順序で含む精製処理により前記濾液を精製して、試料を得る精製工程と、前記試料を透析濾過膜で透析濾過して、調製物を生成する透析濾過工程と、前記調製物から前記界面活性剤を除去して、精製Ag473タンパク質を得る除去工程と、を含む、リポタンパク質の調製方法。前記リポタンパク質は、10kDaを超える分子量及び4.5未満の等電点piを有する請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記界面活性剤は、0.05~1の範囲の濃度を有する請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記界面活性剤は、TritonX-100登録商標、オクチル-b-D-グルコピラノシド、NP-40、TritonX-114登録商標、Tween20、CHAPS及びCHAPSO、SDS及びサルコシンからなる群より選択される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記濾過工程は、0.22μmの孔径のフィルター膜の透過により実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記カチオン性膜クロマトグラフィは、PALL社の0.8μmのMustangS膜で実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記アニオン性膜クロマトグラフィは、PALL社の0.22μmのMustangE膜で実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記精製工程は、シランにより改質され、かつ酢酸により活性化されたシリカ樹脂からなる混合相クロマトグラフィに、前記濾液を通して第1溶出液を得る工程iと、前記第1溶出液をカチオン性膜クロマトグラフィに付して、第2溶出液を得る工程iiと、前記第2溶出液をアニオン性膜クロマトグラフィに付して、前記試料を得る工程iiiと、により実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iの前記混合相クロマトグラフィは、0.25~1Mの範囲のNaClを含有する溶媒を前記樹脂より溶出することを含む請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iの前記シリカ樹脂は、シランに対するシリカ樹脂の比が乾燥重量に基づく計算で2.0~3.5のシラン改質反応により得られる請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iiは、3.0~4.0の範囲のpH値を有するリン酸塩緩衝液系で実施される請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iiのカチオン性膜クロマトグラフィに適用される前記第1溶出液は、酢酸を含有する溶液の添加により2.5~5.0の範囲のpH値になるまで予め酸性化したものである請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iiiは、5を超えるpH値を有する酢酸/リン酸塩緩衝液系で実施される請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記工程iiiのアニオン性膜クロマトグラフィに適用される前記第2溶出液は、NaOHの溶液の添加により5.0~7.5の範囲のpH値になるまで予め塩基性化したものである請求項8に記載のリポタンパク質の調製方法。前記透析濾過膜は、10kDの孔径を有する請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記除去工程は、40~60のアセトニトリルを含有する第1溶媒を適用することによって界面活性剤を洗い出す工程と、60~90のアセトニトリルを含有する第2溶媒を適用することによってタンパク質を回収する工程と、を用いる逆相クロマトグラフィにより実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。前記逆相クロマトグラフィは、GE社のSOURCE30RPC樹脂で実施される、請求項11に記載のリポタンパク質の調製方法。前記除去工程は、40のアセトニトリルを含有する第1溶媒で洗浄して、残留界面活性剤を除去する工程と、80のアセトニトリルを含有する第2溶媒で溶出して、rAg473タンパク質を回収する工程と、を含む逆相クロマトグラフィにより実施される請求項1に記載のリポタンパク質の調製方法。シリカ樹脂及びシランを、当該シランに対する当該シリカ樹脂の比が乾燥重量に基づく計算で2.0~3.5となる条件の下、溶媒中で混合する工程と、前記シリカ樹脂及び前記シランが互いに反応してシラン改質シリカ樹脂を形成するように、前記混合物をインキュベートする混合工程と、前記溶媒を除去して乾燥されたシラン改質シリカ樹脂を得る除去工程と、を含む処理により調製されるシラン改質シリカ樹脂。前記処理は、前記除去工程の後に、酢酸溶液で洗浄することにより前記シラン改質シリカ樹脂を活性化する工程と、前記酢酸溶液を除去する工程と、緩衝液により前記活性化シラン改質シリカ樹脂を洗浄する工程と、を更に含む請求項19に記載のシラン改質シリカ樹脂。そこで、本発明は、組み換えrAg473の産生において、LPSを除去することができるクロマトグラフィ技術を提供することを目的とする。本発明は、組み換えrAg473リポタンパク質を、改良したクロマトグラフィ及び限外濾過技術を使用して、LPS汚染物を有することなく精製する技術に基づいている。具体的には、大腸菌から髄膜炎菌NMB群の組み換えリポタンパク質Ag473を調製及び精製する方法を提供する。本発明の一つの態様は、大腸菌細胞から、10kDaを越える分子量及び4.5未満の等電点piを有するリポタンパク質等の組み換えリポタンパク質を調製する方法を特徴とする。本方法は次の5つの工程を含む。1界面活性剤の存在下で、髄膜炎菌NMのAg473タンパク質を発現する大腸菌細胞の細胞膜を破壊して、細胞膜画分を生成する破壊工程。2細胞膜画分を例えば0.22μmの孔径のフィルター膜に透過させることにより濾過して、濾液を生成する濾過工程。3濾液を精製処理により精製して、試料を得る精製工程精製処理には、任意の順序で、混合相クロマトグラフィ、カチオン性膜クロマトグラフィ及びアニオン性膜クロマトグラフィが含まれる。4試料を透析濾過膜例えば、10kDの孔径を有するで透析濾過して、調製物を生成する透析濾過工程。5界面活性剤を例えば逆相クロマトグラフィにより調製物から除去して、精製されたAg473タンパク質を得る除去工程。逆相クロマトグラフィには、GE社のSOURCE30RPC樹脂等の樹脂を使用することができる。脂質化rAg473が含まれた樹脂を、40~60例えば、40のアセトニトリルを含有する第1溶媒で洗浄して、残留界面活性剤を除去し、次に60~90例えば、80のアセトニトリルを含有する第2溶媒で溶出して、タンパク質を回収することができる。破壊工程1に使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤例えば、TritonX-100登録商標、オクチル-b-D-グルコピラノシド、NP-40、TritonX-114登録商標及びTween20、双性イオン性界面活性剤例えば、CHAPS及びCHAPSO又はイオン性界面活性剤SDS及びサルコシンである。濃度は、0.01~2、例えば0.05~1及び0.1~0.5の範囲を有してもよい。精製工程3の精製処理は、以下の工程i、ii、iiiを含んでよい。シランにより改質され、かつ酢酸により活性化されたシリカ樹脂からなる混合相クロマトグラフィ樹脂に濾液を通して第1溶出液を得る工程i。第1溶出液をカチオン性膜クロマトグラフィに付して、第2溶出液を得る工程ii。第2溶出液をアニオン性膜クロマトグラフィに付して、試料を得る工程iii。シリカ樹脂は、シランに対するシリカ樹脂の比が、乾燥重量に基づく計算で2.0~3.5例えば、2.5~3のシラン改質反応により得ることができる。混合相クロマトグラフィには、NaClを0.25~1M例えば、0.5~0.75Mの範囲で含有する溶媒で樹脂を溶出する工程を含んでよい。カチオン性膜クロマトグラフィに適用される第1溶出液を、酢酸を含有する溶液の添加により予め酸性化して、2.5~5.0の範囲のpH値を得ることができる。アニオン性膜クロマトグラフィに適用される第2溶出液を、NaOHを含有する溶液の添加により予め塩基性化して、5.0~7.5の範囲のpH値を得ることができる。カチオン性膜クロマトグラフィは、PALL社の0.8μmのMustangS膜で実施することができる。アニオン性膜クロマトグラフィは、PALL社の0.22μmのMustangE膜で実施することができる。工程iiは、3.0~4.0の範囲のpH値を有するリン酸塩緩衝液系で実施することができる。工程iiiは、5を超えるpH値を有する酢酸/リン酸塩緩衝液で実施することができる。本発明の別の態様は、シリカ樹脂及びシランを溶媒中で混合する工程シランに対するシリカ樹脂の比は乾燥重量に基づく計算で2.0~3.5であると、シリカ樹脂及びシランが互いに反応してシラン改質シリカ樹脂を形成するように、混合物をインキュベートする工程と、溶媒を除去して乾燥シラン改質シリカ樹脂を得る工程と、を含む処理によって調製されるシラン改質シリカ樹脂を特徴とする。溶媒は、アルコール、例えばエタノール及びメタノールであってもよい。インキュベーションの持続時間は、混合しながら、一般的に11~16時間、例えば10~14時間であり、その後、混合なしで1~2時間である。インキュベーションの後、シラン改質シリカ樹脂を新たな溶媒で数回洗浄して、残りのシランを除去することができる。上記に記載された処理は、酢酸溶液例えば、0.1~1酢酸で洗浄することによるシラン改質シリカ樹脂の活性化、酢酸溶液の除去、及び緩衝液による活性化されたシラン改質シリカ樹脂の洗浄を更に含んでもよい。本発明の1つ以上の実施態様の詳細が、添付図面及び下記の記載により説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本記載及び図面から、並びに請求項から明白となる。本発明は、髄膜炎菌NMB群分離株のサブユニットワクチンの調製に関し、特に、大腸菌発現システムからの髄膜炎菌NMB群の組み換えAg473リポタンパク質rAg473の大規模生産及び精製に関する。一つの態様において、本発明は、大規模大腸菌発現システムから髄膜炎菌NMB群の組み換えリポタンパク質Ag473を精製することを特徴とする方法である。当該方法は、以下のa~fの工程を含む。a細胞膜からrAg473リポタンパク質のみを抽出するのに十分であり、全細胞構造を破壊しないすなわち、細胞の他の成分、例えば細胞壁、細胞質及びゲノムが破壊されず、実質的に無傷である特定の濃度の界面活性剤を使用して、リポタンパク質を過剰発現する大腸菌の上澄みを清澄化する工程。b良好に精製することができる改質剤シランの特定比から作成されたシリカ樹脂においてrAg473リポタンパク質抽出物を混合相クロマトグラフィ処理する工程であって、酢酸による活性化処理と、0.25Mを越える濃度でNaCl塩を添加することによる標的タンパク質の溶出と、を含むことを特徴とする工程。c不純物を選択的に結合するために、酢酸を上述の系に添加して抽出物を酸性化することを特徴とするカチオン性膜クロマトグラフィの工程。dNaOHの溶液を酢酸/リン酸塩緩衝液系に添加することにより5を超えるpH値に調整したアニオン性膜クロマトグラフィの工程であって、LPS汚染物を除去するための工程。e10~100kDの範囲の異なるMWカットオフ値の孔径を有する膜を使用する透析濾過の工程。f任意選択で残留界面活性剤を除去する逆相クロマトグラフィの工程。本発明の一実施態様において、清澄化工程に使用される界面活性剤は、0.05~1の濃度のTritonX-100である。別の実施態様において、混合相クロマトグラフィ処理は、活性化されたシリカゲル及び0.25~1MNaCl/0.1TritonX-100/1×PBSpH7.4緩衝液を溶出液として使用して実施される。更に、本発明は、髄膜炎菌NMB群のサブユニットワクチンの大規模生産方法を提供する。本方法は、以下の工程を含む。rAg473リポタンパク質の発現を誘導するために、動物成分無含有培地を使用したバイオリアクターにおいて大腸菌宿主細胞例えば、C41DE3を発酵する工程。1の濃度の界面活性剤TritonX-100を使用して、細胞膜からrAg473リポタンパク質を抽出する工程;酢酸により予め活性化されたシラン改質シリカ樹脂においてrAg473リポタンパク質抽出物を混合相クロマトグラフィ処理する工程。0.5Nを超える濃度でNaClを添加することによりタンパク質を溶出させる工程。pH値が3.0~4.0の範囲である酢酸/リン酸塩緩衝液系によるカチオン性膜例えば、PALL社の0.8mmのMustangSクロマトグラフィの工程。5を超えるpH値の緩衝液系によるアニオン性膜例えば、PALL社の0.22mmのMustangEクロマトグラフィの工程。10kDaの孔径の膜を使用して透析濾過する工程。40~60のアセトニトリルを含有する溶媒を使用して残留界面活性剤を除去し、60~90のアセトニトリルを含有する別の溶媒を使用して精製rAg473タンパク質を溶出する逆相クロマトグラフィの工程。下記の特定の実施例は、説明としてのみ解釈され、本開示の残りの部分に対して、多少なりとも限定的に解釈されるべきではない。更に詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用されている全ての出版物は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。更に、下記に提案されている任意の機構の工程は、特許請求された発明の範囲を多少なりとも限定しない。<実施例1>:rAg473リポタンパク質の精製のためのシリカ樹脂の調製75~200μmのサイズ分布を有する医薬品等級のシリカ、PharmPrep登録商標60CCMerckGaA、ドイツ、カタログ番号1.09373.1000を、対応する量のシランジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン、CAS登録番号41051-80-3で改質した。エタノールにおける一般的な無水反応を、シランに対するシリカの比が乾燥重量で計算して2.5を超える条件下で実施した。この反応は、10リットルのエタノール95中250gのシリカ粒子、及び、密度がおよそ0.934g/mlである100mlのシランを用いて実施した。得られた混合物を、室温RTで12時間インキュベートし、次に、新たなエタノールに代え、撹拌しながら更に12時間保持した。この処理を2回繰り返した後、改質シリカをオートクレーブ内で120kgf/cm2及び2kgf/cm2で20分間乾燥させた。試験規模では、上記に記載された改質シリカゲル0.05gをUltrafree-MCチューブMillipore社、USA、カタログ番号UFC30HVに詰め、400μlの蒸留水で洗浄し、12,000rpm、室温で1分間遠心分離した。流液を廃棄し、洗浄及び遠心分離工程を1回繰り返した。次に、シリカゲルを200μlの1酢酸で洗浄し、12,000rpm、室温で1分間遠心分離し、流液を廃棄した。その後、シリカゲルを400μlの0.1TritonX-100/1×PBS、pH7.4で平衡にし、12,000rpm、室温で1分間遠心分離し、流液を廃棄した。前処理平衡化工程を2回繰り返した。大規模1,000g以上では、シリカゲルを、ポンプ系を備えたクロマトグラフカラム、AxiChrom登録商標GEHealthcareBio-Sciences社、USAに引き込んで、緩衝液の交換を実施した。<実施例2>:大腸菌宿主細胞において過剰発現したrAg473の精製動物成分無含有培地を使用し、プラスミドpET9aにおけるAg473遺伝子を形質転換された大腸菌C43DE3の5リットル規模発酵を実施して、前臨床研究用のワクチンとしてrAg473を産生した。このリポタンパク質は、105アミノ酸残基と、N末端アミノ酸としてのN-アシル-S-ジアシルグリセリル-Cysとから構成される。その配列は、以下の通りである。CSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAADTLNKAADATQEAADMKDAAK発酵は、酵母抽出物を補充したM9規定培地で実施した。培養細菌を5L発酵槽においてOD600が8になるまで増殖させた。標的タンパク質の発現をラクトースにより誘導した最終濃度は1であった。細胞を採取し、界面活性剤で細胞膜を破壊した後、上澄みを、5,000rpm、4°C、10分間の遠心分離により得て、孔径0.22μmの膜で濾過し、以下の5工程の精製処理に付した。5工程のうち、工程2、3及び4は任意の順序で実施することができる。5工程の精製処理を図1に示した。より詳細には、本処理は、以下の5工程を含んでいる。1特定の濃度例えば、好ましくは1の界面活性剤この実験ではTritonX-1000で大腸菌細胞膜を破壊して、rAg473リポタンパク質を抽出し、膜による精密濾過で抽出物を清澄化する工程。2溶出溶媒として0.5MNaCl/0.1TritonX-100/1×PBS、pH7.4を使用し、上記の実施例1で述べられた方法で調製したシリカ樹脂を用いた、rAg473リポタンパク質抽出物の混合相クロマトグラフィ工程。31酢酸/0.1TritonX-100/1×PBS緩衝液で前処理したPALL社の0.8mmのMustangS膜を使用したアニオン性膜クロマトグラフィ工程。4pH7.4の0.1TritonX-100/1×PBS緩衝液で前処理したPALL社の0.22μmのMustangE膜を使用したアニオン性膜クロマトグラフィ工程。510kDaの膜孔径を有する濃縮膜による透析濾過の工程。各工程の後の精製画分を、SDS-PAGEで分析した。結果は、工程2がrAg473リポタンパク質を有意に精製し、工程3~5がそれを均質になるまで更に精製したことを示す。シリカゲルクロマトグラフィの溶出物における内毒素の含有量は、1,000,000EU/ml超から200,000EU/ml未満まで減少したことが見出され、大部分の内毒素がシリカゲルクロマトグラフィにより除去されたことが示唆された。<実施例3>:精製rAg473リポタンパク質の免疫原性の評価精製rAg473リポタンパク質の免疫原の特性をinvivoで評価するため、アッセイを実施して、多様な用量0、5、10、30及び50μg/mlの精製rAg473リポタンパク質で免疫化したマウスにおけるAg473特異抗体反応の大きさを分析した。より詳細には、8~12週齢のBALB/cマウスの群n=5を、最初に、PBS中に処方されたまたはALPO4アジュバントと共に処方された0、5、10、30もしくは50μg/mlの精製rAg473を用いて、皮下で免疫化した。同じ処方及び量の抗原を使用して、初回免疫の14日後にマウスの皮下に追加免疫した。免疫血清を、追加免疫の2、3、4及び6週間後、尾静脈の出血により収集した。抗Ag473抗体価をELISAで決定した。簡潔には、マイクロタイタープレートをウエル1つあたり50μlのrAg473溶液2g/mLで被覆した。結合IgGを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスIgGFcで検出した。3,3,5,5-テトラメチルベンジジンの添加により色を発生させ、450nmでの吸光度をELISA法にて測定した。吸光度0.2以上となった血清希釈を終点力価として定義した。PBS中の精製rAg473リポタンパク質またはALPO4アジュバントと共に処方されたrAg473リポタンパク質により免疫化されたマウスは、PBS又はALPO4アジュバントのみで免疫化された動物0μg/mlのrAg473の群と比較したとき、検出可能なレベルの抗Ag473IgG抗体反応を誘発した。また、ALPO4アジュバントと共に処方された精製rAg473リポタンパク質により免疫化されたマウスは、PBS中の精製rAg473リポタンパク質により免疫化されたマウスと比較して、はるかに高い力価の抗Ag473抗体を生成した。<他の実施態様>本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されているそれぞれの特徴を、同じ、同等又は同様の目的を果たす代替的特徴に代えることができる。したがって、特に明確に記述のない限り、開示されているそれぞれの特徴は、同等又は同様の特徴の一般的な一連の例にすぎない。本発明の多数の実施態様が記載されているが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく多様な変更を行えることが理解される。したがって、他の実施態様も特許請求の範囲内である。"