ヒト肝細胞成長因子活性化物質に結合する単離された抗体。前記抗体がHGFAの活性部位に結合する、請求項1に記載の抗体。前記抗体が、HGFAの活性部位以外の位置でHGFAに結合する、請求項1に記載の抗体。阻止抗体である、請求項1に記載の抗体。HGFAタンパク分解性活性を阻止する、請求項4に記載の抗体。一本鎖HGFのHGFAタンパク質分解を阻止する、請求項5に記載の抗体。HGF/cmetシグナル伝達を阻害する、請求項1に記載の抗体。細胞増殖を阻害する、請求項7に記載の抗体。血管形成を阻害する、請求項7に記載の抗体。前記抗体がHGFA酵素活性のアロステリックインヒビターである、請求項1に記載の抗体。前記抗体がHGFA酵素活性の完全な又は部分的な競合的インヒビターである、請求項1に記載の抗体。被検体のHGF/cmetシグナル伝達の調節不全を伴う疾患の治療方法であって、被検体に請求項1ないし11の何れか一に記載のようにHGFAに結合する抗体の有効量を投与することを含む方法。前記疾患が癌である、請求項10に記載の方法。前記疾患が、血管形成の調節不全に関するものである、請求項10に記載の方法。前記疾患が免疫関連のものである、請求項10に記載の方法。ヒト肝細胞成長因子活性化物質に特異的に結合する単離された抗体であって、該抗体が図1Aに記載のそれぞれのH1、H2及び/又はH3配列を含有してなる重鎖CDR配列を含むものである抗体。前記H1、H2及び/又はH3配列が図1B、図1C及び/又は図1Dに記載のものである、請求項16に記載の抗体。材料及び方法試薬とうもろこしトリプシンインヒビターはHaematologicTechnologiesから、そしてSpectrozymefVIIaであるHGFAの色素生産性基質はAmericanDiagnosticaから入手した。可溶性HAI1Bは、チャイニーズハムスター卵巣細胞内で発現させ、前述のように精製した。クーニッツドメインインヒビターIV49Cについては既に記載されている。既に記載されているように、ヒト組換えHGFAをバキュロウイルス発現系にて発現させた。プロHGF活性化アッセイ既に記載されているように、プロHGF活性化アッセイおよびIodogenを用いたプロHGF標識を行った。簡潔にいうと、抗HGFA抗体又はsHAI1Bを含むHNCバッファーにてHGFAをプレインキュベートして、その後、125I標識プロHGFを含むHNCバッファーを添加して37°Cで4時間インキュベートした。最終的な混合物の反応物濃度は以下の通りであった:2nMHGFA、0.05mg/ml125I標識プロHGF、0.1mg/ml抗HGFA抗体、1μMsHAI1B。4時間後、一定量を除去して、還元剤ジチオスレイトールと共に試料バッファーに添加した。しばらくの間加熱した後、試料を、4-20の勾配ポリアクリルアミドゲルに流した。電気泳動後、乾燥させたゲルを、X線フィルムに10-20分間露光した。フィルムを感光させ、スキャンして、さらに、AdobeV60フォトショップソフトウェアにて処理した。BIAcore実験HGFAへの抗HGFA抗体の結合親和性を、BIAcore3000計測器上の表面プラスモン共鳴測定値にて測定した。再フォーマットされた完全長抗HGFAIgG1を、パイオニアCM5センサチップのフローセル上に300共鳴単位の密度で固定した。製造者により提供されるプロトコールを使用して、アミノ基によるランダムな共役により固定される。2倍ずつ増加する1μMから8nMの範囲の一連の溶液を注入することによって、これらの表面へのHGFAの結合についてのSensorgramを記録した。対照セルのシグナルは、観察されたSensorgramから減算した。製造者により提供されるソフトウェアを用いた1:1ラングミュア結合モデルに従って、データの非線形回帰分析法によって、反応速度定数を算出した。競合実験では、HGFAを、様々な濃度のsHAI1B又はIV49C又は小分子HGFA活性部位結合物質と共にプレインキュベートした。室温で60分間インキュベーションした後、酵素インヒビター混合物をフローセル内に注入して、sensorgramを記録した。HGFA酵素阻害アッセイ抗体又はsHAI1Bを、HBSAバッファー中でHGFAと共に室温で20分間インキュベートした。SpectrozymefVIIaを添加し、動態学的マイクロプレート読み取り機にて405nmの吸光度の直線的増加率を測定した。酵素活性の阻害は、阻害されない活性の部分的活性として表される。結果及び考察ファージディスプレイによる抗HGFA抗体の同定抗体を同定する一つの方法は、ファージ抗体ライブラリの使用によるものである。例としてLee等を参照のこと。HGFAに対する抗体を同定するために、我々は、既に報告されているヒトの合成ファジミド抗体ライブラリ2ライブラリを用いて4ラウンドのパニングを実行した。5μg/ウェルのHGFAにてプレートをコートした。各ラウンドごとにストリンジェンシーを上げて、10-40回洗浄した。我々は、3ラウンドのパニングの後に濃縮を観察した。4ラウンドのパニングの後、ELISAアッセイのために95クローンを拾った。配列決定の後、HGFAに特異的に結合する67の異なるクローンが明らかとなった。スポット競合ELISAの後、IC50値を測定するために精製したファージを用いてさらに24のクローンが特徴付けされた。これは標準物質ファージ競合ELISAを使用して決定した。IC50値<100nMの14の異なるクローンをPRKヒトIgG1ベクターにサブクローニングした。これらのクローンのためのCDR配列を図1に挙げる。抗HGFAクローンの重鎖および軽鎖に記載されるヒト化4D5抗体からのものを、哺乳類の293細胞内に形質転換した。1週間後に、無血清上清を回収し、プロテインA親和性クロマトグラフィを用いて抗体を精製した。完全長抗HGFA抗体によるHGFA酵素活性の阻害標準的な組換え技術によって、完全長抗体として、選択された抗体を再フォーマットした。これらの完全長抗体は、125I標識プロHGFを用いた高分子基質活性化アッセイにて調べた。4時間の実験の間に、HGFAは完全にプロHGFを2鎖HGFに変換し、既に報告されている通りに、この反応は1μMsHAI1Bにより阻害された。抗体49を除いて、試験した0.67μMの濃度の試験したすべての抗HGFA抗体は、有意にプロHGF変換を阻害した。付加的な実験により、58が0.03μMと同じくらい低い濃度でプロHGF変換を阻害したことが示唆された。これらの結果と一致して、抗体58は小合成基質であるSpectrozymefVIIaに対してHGFA酵素活性を最も高い確率で阻害したが、抗体49は500nMで阻害しなかった。さらに、プロHGF活性化アッセイにおける相対的により弱い阻害活性と同様に、抗体39、86、90および95は色素生産性基質アッセイにおいて、相対的に弱い活性を有した。また、3つの抗体42、61および74も、0.67μMでプロHGF変換をほぼ完全に阻害したにもかかわらず、相対的に弱い阻害を示した。興味深いことに、抗体58により起こる完全な阻害と比較して、抗体75の阻害活性がおよそ70の阻害でプラトーに達した点で、抗体75は異常な阻害反応速度を示した。抗体75および58の阻害機序抗体75による高分子基質プロセシングの完全な阻害を考慮して、小合成基質に対するHGFA酵素活性が完全に中和されないことから、抗体75が活性部位の外ないしは活性部位付近に位置する機能的に重要なHGFA領域と結合することが示唆される。対照的に、抗体58は、HGFAによる高分子及び小基質のプロセシングをともに強力に阻害した。抗体の阻害機序をより詳細に考察するために、様々な公知の活性部位インヒビターを用いて競合結合実験を行った。使用する3つのHGFA活性部位インヒビターは、先に述べた2クーニッツドメインインヒビターsHAI1B、単一のクーニッツドメインインヒビターIV49Cおよび小分子HGFA活性部位結合物質とした。IV49Cは、アルツハイマーのβプロテイン前駆体インヒビター由来の62アミノ酸クーニッツドメインであって、組織因子/第VIIa因子複合体の特異的なインヒビターである。また我々は、図5に示すように、IV49CはHGFA酵素活性の強力なインヒビターであり、IC50が0.079μMであるのに対して、小分子HGFA活性部位結合物質は0.8μMのIC50で阻害したことを発見した。アミド分解アッセイにより測定された親和性と同様に、固定された抗体58に対するHGFAのKDは1.3nMであった。BIAcore測定値により、sHAI1B、IV49Cおよび小分子HGFA活性部位結合物質が58へのHGFA結合を阻害することが示された。このことから、58は、HGFAの活性部位に直接結合するか、ないしは活性部位にアロステリックな影響を及ぼすかの何れかであることが示唆された。抗体75は、HGFAに58より弱く結合する。さらに、小分子HGFA活性部位結合物質は抗体75へのHGFA結合に作用しなかった。これは、抗体75が活性部位のコア領域と結合しないことを示す。興味深いことに、抗体75はHGFAアミド分解活性を部分的に阻害した。このことから、75エピトープが活性部位の外側に位置する場合であっても、これら2つの部位間に分子結合がなければならないことが示唆される。これより、抗体75結合にsHAI1BおよびIV49Cが部分的に作用することがいえる。抗体75と同様に、2つの抗体74および61も小分子活性部位結合物質の存在下でHGFAに結合したが、クーニッツドメインインヒビターによりHGFA結合が阻害された。これらの結果より、74および61のエピトープがHGFAの活性部位の外側に位置することが示唆された。抗体61、74および75は、高分子基質相互作用にとって重要であるか、ないしはアロステリック的に活性部位領域の高次構造を左右するHGFAエキソサイト領域と結合すると考えられる。構造的に関連したセリンプロテアーゼ第VIIa因子において、重要なエキソサイトは、活性部位とカルシウム結合ループの間に位置する。第VIIa因子エキソサイトに結合するペプチド並びに抗体は、高分子基質プロセシングの強力なインヒビターである。例えば、ペプチドインヒビターE76の結合により一つの活性化部位ループに立体構造変化が影響を受け、これによって、基質相互作用部位が崩壊する。加えて、これらの変化により、活性部位でのアロステリック効果が誘発される。これは、E76ペプチドが活性部位領域の外側に結合するにもかかわらずアミド分解活性を阻害するという所見の根拠となる。ビオチン化抗体75および58を用いた付加的な競合結合実験により、75および58がHGFA上にオーバーラップするエピトープを有することが示された。さらに、酵素動態力学的研究により、58が競合的インヒビターであること、及び75が部分的な競合的インヒビターであることが示された。まとめると、これらの結果から、両抗体がHGFA活性部位の外側で結合すること、及びそれらがHGFA酵素活性のアロステリックなインヒビターであることが示唆された。引用文献の一部1KirchhoferDPeekMLiWStamosJEigenbrotCKadkhodayanSElliottJMCorpuzRTLazarusRAMoranPTissueexpressionproteasespecificityandKunitzdomainfunctionsofhepatocytegrowthfactoractivatorinhibitor1BanewsplicevariantofHAI1JBiolChem200327836341363492DennisMSLazarusRAKunitzdomaininhibitorsoftissuefactorfactorVIIaIIPotentandspecificinhibitorsbycompetitivephageselectionJBiolChem199426922137221443PeekMMoranPMendozaNWickramasingheDKirchhoferDUnusualproteolyticactivationofprohepatocytegrowthfactorbyplasmakallikreinandcoagulationfactorXIaJBiolChem200227747804478094LeeCVLiangWCDennisMSEigenbrotCSidhuSSFuhGHighaffinityhumanantibodiesfromphagedisplayedsyntheticFablibrarieswithasingleframeworkscaffoldJMolBiol20043405DickinsonCDKellyCRRufWIdentificationofsurfaceresiduesmediatingtissuefactorbindingandcatalyticfunctionoftheserineproteasefactorVIIaProcNatlAcadSciUSA19969314379143846DickinsonCDShobeJRufWInfluenceofcofactorbindingandactivesiteoccupancyontheconformationofthemacromolecularsubstrateexositeoffactorVIIaJMolBiol19982779599717DennisMSEigenbrotCSkeltonNJUltschMHSantellLDwyerMAOConnellMPLazarusRAPeptideexositeinhibitorsoffactorVIIaasanticoagulantsNature20004044654708BirchmeierCBirchmeierWGherardiEandVandeWoudeGFNatureRevMolCellBiol49159259TrusolinoLandComoglioPMNatureRevCancer228930010HartmannGNaldiniLWeidnerKMSachsMVignaEComoglioPMandBirchmeierWProcNatlAcadSciUSA89115741157811LokkerNAMarkMRLuisEABennettGLRobbinsKABakerJBandGodowskiPJEMBOJ112503251012NakaDIshiiTYoshiyamaYMiyazawaKHaraHHishidaTandKitamuraNJBiolChem267201142011913GakETaylorWGChanAMLandRubinJSFEBSLett311172114MiyazawaKShimomuraTKitamuraAKondoJMorimotoYandKitamuraNJBiolChem268100241002815KirchhoferDPeekMLiWStamosJEigenbrotCKadkhodayanSElliottJMCorpuzRTLazarusRAandMoranPJBiolChem278363413634916ShimomuraTDendaKKitamuraAKawaguchiTKitoMKondoJKagayaSQinLTakataHMiyazawaKandKitamuraNJBiolChem2726370637617LinCYAndersJJohnsonMandDicksonRBJBiolChem274182371824218KawaguchiTQinLShimomuraTKondoJMatsumotoKDendaKandKitamuraNJBiolChem272275582756419MarlorCWDelariaKADavisGMullerDKGreveJMandTamburiniPPJBiolChem272122021220820DelariaKAMullerDKMarlorCWBrownJEDasRCRoczniakSOandTamburiniPPJBiolChem2721220912214