"単一の分子のアレイを製造する方法であって:a標的分析物の分子をある濃度で含むサンプルと、各々の位置が10アトリットル~50ピコリットルの間で規定された容積を有する少なくとも1000個の位置を含むアレイとを提供すること;およびb単一の分子を含有する位置を含むアレイを製造するために、前記標的分析物の分子の前記アレイの各々の位置に対する比が1:1より小さくなるように、前記アレイと前記サンプルとを接触させることを含む、前記方法。標的分析物が生体分子を含む、請求項1に記載の方法。生体分子が、タンパク質、核酸、脂質および炭水化物からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。生体分子が、ホルモン、サイトカインおよび細胞抗原からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。生体分子が受容体である、請求項2に記載の方法。受容体が、神経受容体、ホルモン受容体および栄養因子受容体からなる群より選択される、請求項5に記載の方法。生体分子が標識される、請求項2に記載の方法。標的分析物が環境汚染物質である、請求項1に記載の方法。標的分析物が、農薬、殺虫剤およびトキシンからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。標的分析物が薬物である、請求項1に記載の方法。比が1:5より小さい、請求項1に記載の方法。比が1:10である、請求項1に記載の方法。比が1:5~1:500の間である、請求項11に記載の方法。単一の分子を含有する位置のパーセンテージがサンプル中の分子の濃度の指標を提供する、請求項1に記載の方法。請求項1の方法によって製造されたアレイ。工程bの後に、各々の位置の内容物が該位置から漏出し得ないように、アレイを密封することをさらに含む、請求項1に記載の方法。請求項16に記載の方法によって製造されたアレイ。規定された容積が、フェムトリットルにおいて測定される、請求項1に記載の方法。請求項18に記載の方法によって製造されたアレイ。規定された容積が、各々の位置で同一であって、約30フェムトリットル~約60フェムトリットルの範囲である、請求項18に記載の方法。規定されたフェムトリットルの容積が46フェムトリットルである、請求項20に記載の方法。アレイが、20,000~30,000個の位置を含む、請求項1に記載の方法。アレイが、100,000~10,000,000個の位置を含む、請求項1に記載の方法。アレイの各々の位置が捕獲成分を含む、請求項1に記載の方法。標的分析物が一本鎖核酸を含み、捕獲成分が相補的な核酸を含む、請求項24に記載の方法。サンプル中の標的分析物を検出する方法であって:a生体分子標的分析物を含むサンプルと、各々の位置が10アトリットル~50ピコリットルの間で規定された容積を有する少なくとも1000個の位置を含むアレイとを提供すること;b前記生体分子標的分析物の前記アレイの各々の位置に対する比が1:1より小さくなるように前記アレイと前記サンプルとを接触させること;およびc単一の生体分子を含有する前記アレイの位置の数を決定することを含む、前記方法。比が1:5より小さい、請求項26に記載の方法。比が1:10である、請求項26に記載の方法。比が1:5~1:500の間である、請求項27に記載の方法。生体分子が標識される、請求項26に記載の方法。決定することが、位置における光学特性の変化を標的分析物の存在の指標として検出することを含む、請求項26に記載の方法。単一の生体分子を含有する位置のパーセンテージがサンプル中の生体分子の濃度の指標を提供する、請求項26に記載の方法。工程bの後に、各々の位置の内容物が該位置から漏出し得ないように、アレイを密封することをさらに含む、請求項26に記載の方法。規定された容積が、フェムトリットルにおいて測定される、請求項26に記載の方法。規定された容積が、各々の位置で同一であって、約30フェムトリットル~約60フェムトリットルの範囲である、請求項34に記載の方法。規定されたフェムトリットルの容積が46フェムトリットルである、請求項35に記載の方法。アレイが、20,000~30,000個の位置を含む、請求項26に記載の方法。アレイが、100,000~10,000,000個の位置を含む、請求項26に記載の方法。アレイの各々の位置が捕獲成分を含む、請求項26に記載の方法。標的分析物が一本鎖核酸を含み、捕獲成分が相補的な核酸を含む、請求項39に記載の方法。生体分子が、タンパク質、核酸、脂質および炭水化物からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。生体分子が、ホルモン、サイトカインおよび細胞抗原からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。生体分子が受容体である、請求項26に記載の方法。受容体が、神経受容体、ホルモン受容体および栄養因子受容体からなる群より選択される、請求項43に記載の方法。サンプル中の標的分析物を検出する方法であって:a生体分子標的分析物を第1の濃度で含むサンプルと、各々の位置が規定されたフェムトリットルの容積を有する少なくとも10,000個の位置を含むアレイとを提供すること;b前記サンプルを希釈して、生体分子標的分析物を第2の濃度で含む希釈サンプルを作製すること;c前記生体分子分析物の前記アレイの各々の位置に対する比が1:5~1:500の間であるように、前記アレイと前記希釈サンプルとを接触させること;およびd単一の生体分子を含有する前記アレイの位置の数を決定することを含む、前記方法。生体分子が標識される、請求項45に記載の方法。決定することが、位置における光学特性の変化を標的分析物の存在の指標として検出することを含む、請求項45に記載の方法。単一の生体分子を含有する位置のパーセンテージが希釈サンプル中の生体分子の濃度の指標を提供する、請求項45に記載の方法。工程cの後に、各々の位置の内容物が該位置から漏出し得ないように、アレイを密封することをさらに含む、請求項45に記載の方法。規定された容積が、フェムトリットルにおいて測定される、請求項45に記載の方法。規定された容積が、各々の位置で同一であって、約30フェムトリットル~約60フェムトリットルの範囲である、請求項50に記載の方法。規定されたフェムトリットルの容積が46フェムトリットルである、請求項51に記載の方法。比が1:10である、請求項45に記載の方法。アレイが、20,000~30,000個の位置を含む、請求項45に記載の方法。アレイが、100,000~10,000,000個の位置を含む、請求項45に記載の方法。アレイの各々の位置が、捕獲成分を含む、請求項45に記載の方法。標的分析物が一本鎖核酸を含み、捕獲成分が相補的な核酸を含む、請求項56に記載の方法。生体分子が、タンパク質、核酸、脂質および炭水化物からなる群より選択される、請求項45に記載の方法。生体分子が、ホルモン、サイトカインおよび細胞抗原からなる群より選択される、請求項45に記載の方法。生体分子が受容体である、請求項45に記載の方法。受容体が、神経受容体、ホルモン受容体および栄養因子受容体からなる群より選択される、請求項60に記載の方法。実施例1この例において、フェムトリットルサイズの反応容器のアレイにおける酵素シグナル増幅を用いて、実際に可能であることを示す結合アッセイを行う。より具体的には、本発明のビオチン化アレイを用いて溶液中の多様な量のストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼSβGを検出するために、多様なアッセイを行い、次いで、捕獲されたSβG分子を有するウェルの数とサンプル中のSβGの濃度との相関関係を試験する。この例において、エッチングされた光ファイバーアレイを用いて、各々が特に官能化されて酵素により標識された標的分子を捕獲することができるフェムトリットルサイズの反応容器の集合を作製する。単一の酵素分子を、個々の反応容器に閉じこめ、陽性シグナルを生じるために充分な数の蛍光生成物の生成を触媒する。低い標的分子濃度においては、捕獲位置の一部しか標的分子に結合せず、高密度アレイからの標的の濃度のバイナリ読み出しが可能となる。材料この例における反応容器のアレイを、4.5μmの24000個からなる研磨された1mmの光ファイバーアレイの遠位面の酸エッチングを用いて作製する。コアファイバー材料はシリカであり、各々のファイバーの周囲の被覆剤はゲルマニウムによりドーピングされたシリカであり、これはより遅い速度で腐食する。4.5μmのファイバーを、2.9μmの深さまでエッチングし、各々が46Lの容積を有する反応容器を作製する図1aを参照。ファイバーを、第1に、コアおよび被覆表面の両方に結合するアミノプロピルシランにより修飾した図1bを参照。被覆材へのビオチンの付着を防止するため、アミノ-シラン化ファイバーを、10秒間0.3μmのラッピングフィルムで研磨し、これにより、ファイバーアレイから最上部のアミノ-シラン化被覆層を取り除いた図1cを参照。研磨の後で、NHS-ビオチンをウェル表面上のアミノ基に付着させた図1dを参照。方法第1に、捕獲成分の有効性を試験した。基材のビオチン化の有効性を試験するために、研磨されたファイバーおよび未研磨のファイバーの両方の表面上のビオチン基に、ストレプトアビジンAlexaFluor568登録商標を直接付着させ、その後、修飾された表面の画像を得た図3を参照。図3は、a未研磨のビオチン修飾光ファイバーアレイおよびb研磨されたビオチン修飾光ファイバーアレイに結合しているストレプトアビジンAlexaFluor568登録商標を示す。結合がマイクロウェル反応器の表面のみにおいて起きたbと比較した場合、画像aにおいて観察されるように、ストレプトアビジンの結合は、全ての表面において起きた。したがって、未研磨のファイバーは、被覆表面を含むアレイ全体にわたって色素を示すが、研磨されたファイバーは、ウェル表面においてのみ局在した色素を示す。アレイの修飾の後で、ビオチン化ファイバーアレイを、1時間室温で、多様な量のSβGを含有する150μLのPBSバッファー中でインキュベートした。インキュベーション時間の間に統計学的に1または0個の分子が各々のウェルに結合するように、SβGの濃度を選択した。次いで、未結合の標的を確実に除去するために、アレイをPBSバッファー中で繰り返し洗浄した。SβGの結合のバイナリ読み出しのために、ファイバーアレイを、機械的プラットフォームを備えた正立顕微鏡システムに載せて固定した。β-ガラクトシダーゼの基質であるレゾルフィン-β-ガラクトピラノシドRDGの溶液を、反応容器を含有するファイバーの遠位端に導入し、その後密封した。顕微鏡のステージの下に位置する機械的プラットフォームにより顕微鏡スライドグラスとファイバーアレイとの間でサンドウィッチされた0.01インチの厚さのシリコーンエラストマーガスケットを用いて、基材を密封した。このプラットフォームが、束全体にわたりガスケット材料に対して均一な圧力を適用し、各々の反応チャンバーを密封し、ウェル間での酵素活性の調査を可能にし、β-ガラクトシダーゼは、RDGにハイブリダイズしてレゾルフィンを生じ、これが各々の密封された反応容器中で局所的に高い濃度に蓄積し、検出可能な蛍光シグナルを生じる図4。図4は、各々の実験について、ファイバーアレイの一部を示す。実験の各々は、異なる濃度のSβGを有する異なるサンプルを試験した。各々の実験についての濃度は、以下の通りであった:a128amol、b51amol、c25amol、d7.5amol、およびe2.6amol。図4fは、コントロールを示す。各々の実験について5000個の反応容器の分析により、酵素分子を捕獲した反応容器のパーセンテージと調査されたサンプル中に存在する酵素の量との間の相関が可能となった。活性なウェル間の光度の差異において観察される差異は、表面効果と組み合わせての分子間の触媒活性の差異の結果である可能性が最も高い。表面効果は、反応チャンバー表面に対する酵素分子の配向に基づいて、酵素分子の相対的活性を変化させ得るまた、反応器の表面に対する酵素の結合がビオチン-ストレプトアビジンの相互作用にのみ基づいており、ガラス表面への非特異的な結合に基づくものではなかったことを確認するために、2つのコントロール実験をおこなった。1つのコントロール実験は、最も濃縮されたSβG標的溶液150μL中128amolでインキュベートされた、エッチングされた未修飾のファイバーからなった。第2のコントロール実験は、ストレプトアビジンを欠くβ-ガラクトシダーゼの溶液150μL中128amol中でインキュベートされた修飾ファイバーを用いておこなった。両方のコントロールから、無視することができる活性なウェルのパーセンテージを得た以下に議論する2.6amolの実験に関する0.2に対して、0.06未満。結果図5は、サンプル中に存在する標的のモルのlog対logプロット、およびその結果得られる活性な反応容器のパーセンテージを表す。図5に示される活性な反応容器のパーセンテージとlog対logでの標的のモルと間の直線的関係は、DNAおよび抗原などの実際の標的の検出のためにバイナリ読み出し検出法を用い得ることを示唆する。この方法により、直接的なアッセイの手段を維持しつつ、デジタル読み出しを介した迅速な分析および正確な濃度情報が可能となる。この例におけるビオチン化されたフェムトリットルのアレイに対するストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼの結合についての最低検出限界lowestlimitofdetection:LODが、1時間の標的インキュベーション時間を用いて2.6amole150μLの17fM溶液であったこともまた重要である。実施例2この例において、β-ガラクトシダーゼの単一の分子を、2.0×105個の個々に密封されたフェムトリットルのマイクロウェル反応器にわたって、直径1mmの光ファイバー束を用いてモニタリングした。反応容器のアレイにわたる単一の酵素分子の触媒からの蛍光生成物の蓄積を観察し、ポワソン統計学分析を適用することにより、デジタル濃度読み出しを得た。材料1mmの束にした4.5μmの光ファイバーを、IlluminaSanDiego、CAから購入した。β-ガラクトシダーゼおよびRubpy3Cl2を、SigmaAldrichStLouis、MOから得た、レゾルフィン-D-β-ガラクトピラノシドを、MolecularProbesEugene、ORから購入した。0.01インチの非強化ガラスシリコーンシート材料を、SpecialtyManufacturingIncSaginaw、MIから購入した。使用した全ての他の化学物質は、試薬グレードであり、SigmaAldrichStLouis、MOから得た。特注の正立落射蛍光イメージングシステムにより、水銀抗原、励起フィルターホイールおよび発光フィルターホイール、顕微鏡対物およびCCDカメラQE、Sensicamを用いて、全ての蛍光画像を得た。フィルターホイールおよびシャッターをコンピューターにより制御し、JPlabソフトウェアScanalytics、Fairfax、VAにより分析を行った。システムは、光ファイバーアレイを全実験にわたりシステムに固定する固定デバイスを備えた。ステージの下の機械的プラットフォームを用いて、シリコーン密封層を収納し、その後ファイバーアレイの遠位端と接触させ、各々の反応容器を密封した。全ての測定を、光ファイバー束の遠位端で、フェムトウェルfemtowellアレイを用いて行った。およそ2.4×105個の個々の直径4.5μmの光ファイバーを含む光ファイバー束をフェムトリットルの反応容器のアレイを作製するための基材として用いた。エッチングの深度はエッチング時間およびエッチャント濃度により変化するので、ウェルの容積は正確に制御することができる。これらの実験に於いて用いた光ファイバーを、およそ2.9μmの深さまでエッチングし、46fLのウェル容積を得た。図6は、エッチングされた光ファイバー束の表面の画像である。より具体的には、図6aは、ファイバーアレイ全体およびファイバー束の拡大顕微鏡画像を表し、アレイおよび個々の光ファイバーの両方の規則性を強調している。図6bは、エッチングされた表面の一部のAFM画像であり、エッチングのプロセスから作製されたウェルを示す。方法アッセイβ-ガラクトシダーゼアッセイのために用いられた基質は、レゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシドであった。アレイ中の個々のウェルを酵素および基質の存在下において密封した後、容器のアレイにわたり、酵素生成物であるレゾルフィンex558nm/em573nmについて蛍光強度をモニタリングした。2.0mMのKClおよび0.lmMのMgCl2を含む100μMのTrisバッファーpH8.0中、100μMのレゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシドRDGの溶液を調製した。全ての酵素溶液を、同じ反応バッファーから予め分注して凍結したストックサンプルから調製した。実験の直前に、2つのサンプルを2分間7000RPMで遠心分離し、シリコーンによる密封の機序に干渉し得る全ての粒子状の物質を除去した。およそ1cm2のシリコーンと顕微鏡スライドグラスとを無水エタノールで洗浄した。シリコーンシート材をガラス表面に置き、接着させた。その後、75μLの容積の酵素およびRDG溶液を、シリコーンのガスケット上でピペットを用いて混合した。ガスケットを、ファイバー束の遠位端に向かって、密封が形成されたことを示唆する抵抗を感じるまで機械的に上昇させた。最初の蛍光画像を得、その後、およそ2時間にわたり定期的に画像を得た。密封成分フェムトリットルアレイを密封するために、0.01インチの厚みのシリコーンエラストマーのガスケットを、顕微鏡スライドグラスとファイバーアレイとの間で、機械的プラットフォームを用いてサンドウィッチした。プラットフォームは、束全体にわたって、ガスケット材に均一な圧力を適用し、各々のマイクロウェルを密封して反応容器を作製した。フェムトリットル容器を作製して分離するために用いたシリコーン/ガラスの密封を、光脱色実験を行うことにより、その密封能力について検査した図7を参照。図7は、マイクロチャンバー中への溶液の封入、およびシリコーンの密封の完全性についての評価を表す。図7aは、アレイにわたる赤色蛍光により観察された、チャンバーのアレイ中に封入されたRubpy3C12の溶液を表す。図7bは、UV光を介して光脱色されたファイバー束の小八角形部分を表す。図7cは、60分後のアレイを表す。図において示すとおり、不完全なシリコーン密封の結果としての1つのウェルから別のウェルのRubpy3C12の拡散は、光脱色されたウェルにおける蛍光強度の増大を示すと考えられるが、観察されなかった。実験は、密封が容器のアレイを首尾よく分離する能力についての完全性を立証した。ガラス表面上での酵素分子の変性を、BSAブロッキングバッファーを用いたブロッキングにより防止した。用いられた酵素対容器の比は、1:5から1:500までの範囲であり、2桁にわたる正確な検出を達成した。光脱色実験DI水中、1mMのRubpy3C12の溶液を、光脱色実験のために用いた。およそ1cm2のシリコーン片および顕微鏡スライドグラスを、糸くずの出ないスワブを用いて無水エタノールで洗浄した。シリコーンシート材を、ガラスの表面上に置き、接着させた。50μLのRubpy3C12溶液をシリコーン上に置き、その後ファイバー束と接触させ、個々の容器中に溶液を封入した。イメージングシステムの視野絞りを用いて、UV光を用いてアレイの小さな部分に10分間照射し、Rubpy3C12を光脱色した。次いで、視野絞りを開放し、蛍光の差異を示す異なる画像を得た。次いで、アレイを、密封が維持された状態で静置した。最後の画像を60分後に取得し、密封の完全性を確認した。上記のように、使用される反応容器の数および容積が、この技術により決定することができる濃度の動的な範囲を支配する。この例において使用される反応容器の容積は、46fL下記参照であり;したがって、3.6×10-11Mのβ-ガラクトシダーゼの溶液が、平均して、1容器あたり1個の酵素分子を生じることを計算した。また上記のように、全ての実験ケースにおいて、使用される濃度が3.6×10-11Mより遙かに低い場合、予測される平均値は極めて低くなり、分布は狭くなり、1回の試行あたり0または1以外の事象を観察する確率は、極めて低い。これらの低い濃度において、活性な反応容器のパーセンテージとバルク酵素濃度との間の関係は、ほぼ直線状である。酵素触媒を起こすために充分な時間待った後で、個々の容器を、各々の容器を、酵素活性を有することまたは欠いていることのいずれかに相関するオン/オフ応答について調査した。基質であるレゾルフィン-β-D-ガラクトピラノシドRDGを、実験のための基質として用い、シリコーンガスケット材および機械アームを用いて、全ての容器中へ、トラップされた酵素分子と共に密封した。ポワソン分布統計を適用することにより、用いた各々の濃度について、活性なウェルの予測されるパーセンテージを計算した。結果図8に示すように、β-ガラクトシダーゼアッセイについて、異なるバルク溶液酵素濃度は、容器容積に対する酵素の異なる比に対応し、酵素分子を含有する容器のパーセンテージの変化をもたらした。図8は、β-ガラクトシダーゼの単一分子の活性の検出を表す。図8aは、アレイの一部のバックグラウンド画像であり、一方、図8bは、酵素対容器が1:5であるアッセイの一部を取得した画像を表し、図8cは、酵素対容器が1:80であるアッセイを示す。表1は、占有された容器のパーセンテージをポワソン分布から計算した、各々の実験の結果の比較である。表中のデータにより示されるように、アレイの測定は、調査された濃度の全範囲にわたる単一の酵素β-ガラクトシダーゼ分子の数と、首尾よく相関した。観察されたシグナルにおいて、分子間での触媒活性の差異の結果として、わずかな差異が存在した。この結果は、表面効果に加えて、酵素活性の変化をもたらす酵素の固有の確率論的な性質に起因するものである可能性が最も高い。表1.アレイからのデジタル読み出し。活性を示すチャンバーの、ポワソン分布から計算される予測されるパーセンテージに対する実際のパーセンテージを、分析された多様な濃度について列記した。計算結果と実験結果との間の差異は、確率分布に関連する特有の差異ならびに酵素溶液の調製における実験エラーに起因し得る。実施例3この例において、モデル酵素-阻害剤ペアとして、β-ガラクトシダーゼを競合的阻害剤であるD-ガラクタルDgalactalD-ガラクトースの遷移状態の類似体の存在下において研究した。しかし、この適用の範囲は、特定の酵素-阻害剤ペアに限定されない。β-ガラクトシダーゼは四量体であり、D-ガラクタルは比較的遅い結合および放出を示すことが知られる。図9は、単一分子阻害を測定するためならびに阻害剤放出の検出のためのスキームの一態様を示す。第1の工程において、酵素および阻害剤を、リン酸バッファーこの特定の態様においては、PBS/MgCl2バッファー:2.7mMKCl、KH2PO4、1.5mMKH2PO4、136mMNaCl、8.1mMNa2HPO4、1mMMgCl2、pH7.3などの水性バッファー系において、バルクにおいて、阻害剤濃度[阻害剤]が阻害剤結合のための解離定数Kiより高くなり、酵素の活性部位の全てがブロックされるかまたは占有されるように、プレインキュベートする。Kiは異なる酵素/阻害剤ペアにより異なるので、阻害剤の濃度を調製しなければならない。この実験において用いたこの特定の酵素/阻害剤ペアを用いる場合、100mM~20μMの間の範囲で多様な阻害剤開始濃度を用いることができる。この態様において、[阻害剤]は、100μM~7×Ki14μMであった。第2の工程において、水性バッファー系この特定の態様においては:PBS/MgCl2バッファー中の1または2以上の基質例えば、レゾルフィン-β-ガラクトピラノシドRGPを、好ましくは高い過剰濃度10倍~100,000倍の間において、添加する。さらなる成分この特定の態様においては、位置のアレイの表面への非特異的結合を防止するため、1w/vのウシ血清アルブミンBSAを、バッファー系に添加してもよい。第三の工程において、バルク溶液を位置のアレイに添加する。各々の位置は、規定の容積10アトリットル~50ピコリットルの間、より好ましくはフェムトリットル、この態様においては:46フェムトリットルを有する。この時点において、阻害剤はもはや過剰量ではない。実際には、[阻害剤]<<Kiである100,000分子より少ない阻害剤、および10,000分子より少ない阻害剤、およびさらにより好ましくは3,000分子より少ない阻害剤が、溶液中に残る。酵素濃度1.8nMを、工程2における1,000倍希釈により、いくつかの位置において各々のアレイの位置において単一の酵素のみが存在し、他においては酵素が存在しないように調製する。図9は、四量体の活性部位の1つがブロックされておらず活性である場合の状況を、模式的に示す。この活性部位は、レポーター部分を含む基質と相互作用することができる。このドメインは、酵素分解により発光性および蛍光性シグナルを生じるものであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、蛍光シグナルが発生し、より好ましくは、RGPが蛍光発生基質として用いられる。この方法において、かかる活性を有するアレイ中の位置を、容易に検出することができる図10。一態様において、本発明は、複数のタイムポイント例えば、秒、数十秒、数百秒、分、数十分などの間隔での基質の代謝回転を決定することを企図する。図11は、図9および図10のスキームに従ってアッセイした場合、阻害剤の存在が、阻害剤が存在しないコントロール下段左パネルと比較して基質の代謝回転を遅延させることを示す。基質の代謝回転開始時間の頻度分布をプロットすれば図12、Koff速度定数を計算することができる:4.6×10-3秒。このことは、公開された値とも一致する。興味深いことに、データは、四量体の4つの部位の各々における阻害剤の放出が独立していないことを示唆する。いわば、四量体の4つの独立した触媒部位が存在し、koffが一次速度定数である場合、酵素集合体のkoffは、各々のプロトマーのkoffと同一である。しかし、各々の単一の酵素が4つのプロトマーを含むので、第1の阻害剤を放出する4つの候補が存在する。したがって、koff1=4×koff=1.8×10-2sec-1となる。このデータは、プロトマーからの阻害剤の放出が非独立的であることを示唆する。プレインキュベーションなしの第2の態様において、阻害剤を、リン酸バッファーなどの水性バッファー系この特定の態様においては、PBS/MgCl2バッファー中で、酵素に与える。さらなる成分この特定の態様においては、位置のアレイの表面への非特異的結合を防止するために、1w/vBSAをバッファー系に添加してもよい。[阻害剤]を、Ki14μMと同じ範囲において、好ましくは、100mM~1μMの間で選択し、この態様においては20μMである。この阻害剤濃度において、阻害剤に結合した酵素は、阻害剤フリーの酵素と平衡状態にある。各々のが規定の容積10アトリットル~50ピコリットルの間、より好ましくはフェムトリットル、この態様においては46フェムトリットルを有する位置のアレイにバルク溶液を添加する。酵素濃度18pMを、一部の位置において単一の酵素のみを得、他の位置においては酵素を得ないように、選択する。蛍光を経時的にモニタリングすると、結合、放出およびその後の結合を観察することができる図13。図13A左パネルは、多様な時間トレースからの粗データを表す。図13B右パネルは、左パネルの時間トレースの1つを示し、ここで、明確にするために、y軸は別に目盛り付けされている。図13Bは、阻害剤が酵素から放出された後でシグナルが増大すること、およびそれが阻害剤が結合した後で減少することを示す。阻害剤が酵素に結合して酵素活性が存在しない場合、蛍光シグナルが経時的に一定であり続けると予測すべきである。しかしながら、フルオロフォアを連続的に枯渇させる実質的な量の光脱色が存在するので、これは当てはまらない。このことから、図13に示す正味の結果経時的による動態が生じる。図14は、オフタイムofftime阻害剤が放出される前に酵素上に留まる時間の棒グラフを示す。このことから、半減期指数関数的崩壊に従う量の半減期が、量がその初期値の半分まで崩壊するために必要とされる時間であるの計算が可能となる。半減期は、実験的に、およそ2分30秒であると決定する。この例は、単一の酵素を測定するシステムが、酵素のサブユニットがどのように相互作用するかについて、以前にアンサンブル反応から得られたものよりも動態的なデータを明らかとし得ることを示す。実施例4一態様において、ナノ粒子は、標的の濃度のデジタル読み出しのために利用する。ナノ粒子は、酵素のデジタル読み出しに対して、いくつかの利点を有する。酵素のアプローチを用いる場合、濃度が増加するにつれて、ポワソン分布に従うデジタル読み出しの直線性が失われる。蛍光種により官能化されたナノ粒子を用いて、本発明は、一態様において、デジタル読み出し、ならびに本発明者らの研究室において広範に用いられる古典的なバルク光度読み出しを行うことができることを企図する。デジタル読み出しの直線性が失われるにつれて、分析を、デジタル読み出しからナノ粒子を用いる古典的な光度読み出しへとシフトすることができる。次いで、シグナルを、濃度と相関する、アレイの各々の位置の平均光度例えば、平均ウェル光度として読むことができ、このシステムにより読むことができる濃度の範囲を著しく増大する。ナノ粒子を用いる一部の態様において、アレイを密封しない。金粒子例えば、1~500ナノメートル、およびより好ましくは50~250ナノメートル、およびさらにより好ましくは、80~150ナノメートルの間の金粒子などのナノ粒子を、標的分析物または標的分析物に結合するリガンドに付着させてもよい。標的が金粒子に付着して結合パートナー例えば固定されたリガンドを含むアレイに導入される態様を含む多様な態様が企図されるが、これらに限定されない。別の態様において、標的分析物を、アレイ上に付着させても、他の方法で固定してもよく、金粒子-結合パートナー複合体をアレイに導入して標的分析物と結合させてもよい。別の態様において、第1の結合リガンドを標的に固定し、金粒子-第2の結合リガンドをアレイ中に導入して標的に結合させてもよい。これらの態様を、図15および16において模式的に説明し、ここで、標的は核酸であり、結合パートナーは相補的プローブである。図15において、所望の場合、プローブ1またはプローブ2のいずれかを標的により置換することができる。図16は、標的が標識されていなくともよく、第1にプローブ1とともにインキュベートし、その後、ナノ粒子をプローブ2とともに導入する、2段階サンドウィッチ形式を示す。この態様において、標的はリンカーとして作用するものとみなすことができる。この例において、標的分析物は核酸であり、金粒子は複数およそ2000~8000の鎖の蛍光DNAで標識される。このDNA-金粒子複合体を用いて、シグナルを発生させる。多数の蛍光DNA鎖が各々の名の粒子に付着するので、単一の粒子が、アレイ例えば上記の光ファイバーアレイ単一の位置例えばマイクロウェルにおけるバックグラウンドに対してのシグナルのスパイクに十分である。ナノ粒子の複数の集団にわたる蛍光強度の偏差は、触媒速度の変動が高い酵素と比較して非常に小さい。この高い変動速度に起因して、応yesまたは否noの応答しか読み取ることができず、酵素についての検出の範囲をおよそ2桁の規模に限定している。同等のシグナル強度を有するナノ粒子を用いることにより、酵素により行われるような0または1のものに、2、3、4などの読み出しを伴う、より制御された読み出しが可能となる。控えめな光度レベルを読み出す能力により、2桁を超える、より優れた検出の範囲が可能となる。分析物-官能化金ナノ粒子例えばDNA-金粒子複合体または他の生体分子-金粒子複合体は、分析物例えばDNA検出スキームにおいて、常に極めて低いレベルの非特異的および公差反応性結合を示すので、検出の限界を改善する。A.金粒子の調製金粒子は、多数の方法により調製することができるAnalyticalChemistry20007255355541Science200229618361838Science200229515031506JAmChemSoc200412659325933。ある場合において、金コロイド直径13nmを、FrensNaturePhysSci241201973およびGrabarAnalChem677351995に記載されるように、HAuCl4のクエン酸による還元により調製する。簡単に述べると、全てのガラス器具を使用する前に王水3部のHCl、1部のHNO3中で洗浄し、NanopureH2Oでリンスし、次いでオーブンで乾燥する。HAuCl4およびクエン酸ナトリウムは、AldrichChemicalCompanyから購入する。水性のHAuCl41mM、500mLを、攪拌しながら還流させる。次いで、38.8mMのクエン酸ナトリウム50mLを素早く添加する。溶液の色は、淡黄色から赤紫色burgundyに変化し、還流を15分間続けるべきである。室温に冷却した後で、赤色の溶液を、MicronSeparationsIncの1マイクロンのフィルターを通してろ過してもよい。金コロイドは、HewlettPackard8452Aダイオードアレイ分光光度計を用いるUV/可視光分光法により、およびHitachi8100透過型電子顕微鏡を用いる透過型電子顕微鏡法TEMにより、容易に特徴付けられる。直径13nmの金粒子は、標的およびプローブの10~35ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチド配列とともに凝集した場合、目に見える色の変化を生じる。B.ファイバーの修飾この例において、ファイバーアレイを用いる。研磨されたファイバーアレイを、115秒間0.025MのHClでエッチングし、46fLのウェルを得る。洗浄のために、エッチングされたファイバーを、沸騰するNanopure水で10分間インキュベートする。エッチングされたファイバーの表面を、多数の方法において修飾することができる。この例において、ファイバーのアミン修飾を使用する。第1に、シラン化溶液、すなわち、エタノール:nanopure水の95:5の溶液中、1のDETAトリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミンの溶液を調製する。エッチングされたファイバーを、シラン化溶液中で20分間室温でインキュベートした。次いで、ファイバーを15分間120°Cでキュアさせた。この時点において、ファイバーは、いまやアミン基によって修飾されている。多様な官能基をアミン基と反応させることができる。この例において、プロセスは、ファイバーのマレイミド修飾に関する。3.55mgのSMPBサクシニミジル4-[p-マレイミドフェニル]ブチレートを1mLのDMSO中に溶解させ、ストック溶液を作製した。架橋溶液を調製した:100μLのこのストック溶液を900μLのエタノール:DMSOの90:10溶液に添加した。シラン化ファイバーを架橋溶液中で2時間室温でインキュベートする。次いで、アレイを、エタノール:DMSOの80:20溶液で洗浄し、アルゴン下で乾燥させる。この時点において、ファイバーはいまやマレイミド基により修飾されている。C.DNA脱保護2ナノモルのチオール修飾保護DNAを、110μLのPBSpH7.4中で再構成する。10μLのDTTジチオスレイトールストック1.0Mを保護されたDNA溶液に添加し、2時間室温でインキュベートする。NAP5カラムGEHealthcareを用いて脱保護したDNAを精製した。カラムをNanopure水で平衡化した。脱保護されたチオールDNAの120μLの溶液をカラムに添加し、ゲルに完全に浸入させた。380μLのPBS7.4水をカラムに添加し、ゲルに完全に浸入させた。回収チューブをカラムの下に置き、1.0mLのPBS7.4水をカラムに添加することにより、チオールDNAを溶出させた。NAP5カラムのプロトコル製造者により提供されるに記載されるように、最初の400μLを捨て、400μL~1mLのDNAを回収した。D.DNA付着標的分析物この場合は核酸に対して特異的なリガンドこの場合はプローブを、アレイの位置に直接付着させても、またはナノ粒子例えば金粒子に付着させ、次いで複合体DNA-金ナノ粒子をアレイに導入してもよい。この例において、マレイミド処理されたファイバーを、チオール脱保護されたDNA溶液1μM中で2時間室温でインキュベートした。ファイバーを、PBS7.4でリンスし、結合していないDNAを除去し、アレイをスワブして、被覆材に結合したDNAプローブを除去した。金ナノ粒子この場合80nmを、次いで、ファイバーと共にインキュベートし、予備的な実験により、成功的な結合を示す図16。実施例5この例は、合成一本鎖DNAの半導体ナノ粒子量子ドットQD上への固定化を記載する。ネイティブなCdSe/ZnSのコア/シェルQD-4nmは、有機溶媒中でのみ可溶性であり、アルキルチオ末端を有する一本鎖DNAとの直接的反応は困難である。この問題は、Mirkinらにより、QDを3-メルカプトプロピオン酸でまずキャッピングすることにより回避される。次いで、4-ジメチルアミノピリジンでカルボン酸基を脱保護し、粒子を水溶性にし、QDと3’-プロピルチオールまたは5’-ヘキシルチオール修飾オリゴヌクレオチド配列のいずれかとの反応を促進する。DNA修飾の後で、透析により未反応のDNAから粒子を分離する。次いで、リンカーDNA鎖を、表面結合の配列にハイブリダイズし、拡大したナノ粒子の集合体を生成する。QD集合体は、TEM、UV/可視光分光法および蛍光分光法により容易に特徴付けられる。繰り返し、溶液の温度を制御することにより、これらを可逆的に集合させることができる。結果として、QD集合体および合成物集合体を、QDとナノ粒子との間で形成することができる例えば、およそ13nmの金ナノ粒子。文献目録以下の引用文献の各々は、その全体が参考として援用される。図1a、1bおよび1cは、本発明の一態様によるエッチングされた束の修飾を表す、横から見た断面模式図である。図2a、2bおよび2cは、本発明の一態様によるサンドウィッチアッセイを表す、横から見た断面模式図である。図3aおよび3bは、本発明の一態様によるa未研磨のビオチン修飾光ファイバーアレイおよびb研磨されたビオチン修飾光ファイバーアレイに結合するストレプトアビジンAlexaFluor568登録商標を示す写真である。図4a、4b、4c、4d、4eおよび4fは、本発明の一態様による実験を示す写真であり、ここで、β-ガラクトシダーゼは、RDGにハイブリダイズし、レゾルフィンを形成する。より具体的には、これらの図の各々は、異なる濃度のSβGを有する異なるサンプルを表す。濃度は、a128amol、b51amol、c25amol、d7.5amol、およびe2.6amolであり、fはコントロールであった。図5は、本発明の一態様による、活性な反応容器のパーセンテージを生じる、サンプル中に存在する標的の分子のlog対logのプロットを表す。図6aは、本発明の一態様による、ファイバーアレイ全体の顕微鏡写真と、束の挿入拡大図である。図6bは、本発明の一態様による、エッチングされた表面の一部のAFM画像である。図7a、7bおよび7cは、本発明の一態様による、反応容器の封入enclosureおよび封sealの評価を示す。図7aは、チャンバーのアレイ中に封入されたRubpy3Cl2の溶液の顕微鏡写真である。図7bは、UV光により光脱色された束の小八角形の部分の顕微鏡写真である。図7cは、60分後に撮影された図7bの顕微鏡写真である。図8a、8bおよび8cは、本発明の多様な態様による、β-ガラクトシダーゼの単一の分子の活性の検出を表す顕微鏡写真である。図8aは、アレイの一部のバックグラウンド画像である。図8bは、酵素対容器が1:5であるアッセイの一部を撮影した画像の顕微鏡写真である。図8cは、酵素対容器が1:80であるアッセイの顕微鏡写真である。図9は、単一の酵素レベルでの酵素の速度定数を測定するための一態様の模式図である。図10は、シグナルが阻害剤の放出に起因して検出されるアレイの代表的な画像である。図11a、11bおよび11cは、阻害剤の存在下または阻害剤の不在下11cにおける基質の代謝回転を示す、時間によるトレースである。図12は、特定の酵素/阻害剤のペアについてのKoffの決定を可能にする測定のプロットを示す。図13aおよび13bは、阻害剤放出によるシグナルの増大を示すようにプロットされた複数の時間トレース13aおよび単一の時間トレース13bを示す。図14は、特定の酵素/阻害剤のペアについての半減期の値の計算を可能にするオフタイムofftimesの棒グラフである。図15は、ナノ粒子が検出を増強するために使用される一態様を模式的に示す。図16は、ナノ粒子が検出を増強するために使用される代替的な態様を模式的に示す。図17は、アレイの位置における金ナノ粒子の検出を示す。"