配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号2のa20位、b54位、c119位、d248位、e250位、f335位及びg380位又はそれらに相当する位置のチロシン残基のいずれか一つ以上がフェニルアラニンに置換されたアルカリプロテアーゼ。請求項1記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。請求項2記載の遺伝子を含有する組換えベクター。請求項3記載のベクターを含有する形質転換体。宿主が微生物である請求項4記載の形質転換体。請求項1記載のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。本発明は、分子量約43000のアルカリプロテアーゼ群に属し、弱アルカリ~アルカリ領域である幅広いpH条件において、優れた洗浄性能を発揮するアルカリプロテアーゼを提供することに関する。本発明者らは、分子量約43000のアルカリプロテアーゼ群のアミノ酸配列に特徴的なチロシン残基の内、特定位のチロシン残基のフェニルアラニン残基への置換が、pH9~pH105の幅広いpH条件で、洗浄性能を野生型以上に向上させることを見出した。すなわち、本発明は、以下の1~6に係るものである。1配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号2のa20位、b54位、c119位、d248位、e250位、f335位及びg380位又はそれらに相当する位置のチロシン残基のいずれか一つ以上がフェニルアラニンに置換されたアルカリプロテアーゼ。2上記1のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。3上記2の遺伝子を含有する組換えベクター。4上記3のベクターを含有する形質転換体。5宿主が微生物である上記4の形質転換体。6上記1のアルカリプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。本発明のアルカリプロテアーゼは、分子量約43000のアルカリプロテアーゼ群であって、弱アルカリ条件からアルカリ条件、具体的にはpH9~pH105での洗浄性能が野生型以上に向上されていることから洗剤用酵素として有用である。したがって、当該アルカリプロテアーゼを含有する組成物は、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、且つより洗浄力の優れた洗浄剤組成物となり得る。本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号2で示されるアミノ酸配列又はこれと80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号2のa20位、b54位、c119位、d248位、e250位、f335位及びg380位又はそれらに相当する位置のチロシン残基のいずれか一つ以上がフェニルアラニンに置換されたアルカリプロテアーゼである。ここで、配列番号2で示されるアミノ酸配列と80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動SDSPAGE法による分子量が43000±2000であることが好ましい。特に好ましくは、配列番号2に示すアミノ酸配列と80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなり、pH8以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、50°C、pH10で10分間処理したとき80以上の残存活性を示す、ジイソプロピルフルオルリン酸DFP及びフェニルメタンスルホニルフルオライドPMSFで阻害され、SDSPAGEによる分子量が43000±2000である酵素が挙げられる。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを50mM過酸化水素、5mM塩化カルシウムを含む20mMブリットンロビンソン緩衝液pH10中で、30°C、20分間の放置後の残存活性が少なくとも50以上を保持していることをいう。ここで、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、KP43バチルスエスピーKSMKP43FERMBP6532由来、WO9918218GenBankaccessionnoAB051423が挙げられ、配列番号2に示すアミノ酸配列と80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとしては、例えばプロテアーゼKP9860バチルスエスピーKSMKP9860FERMBP6534由来、WO9918218GenBankaccessionnoAB046403、プロテアーゼE1バチルスNo.D6FERMP1592由来、特開昭4971191GenBankaccessionnoAB046402、プロテアーゼYaバチルスエスピーYFERMBP1029由来、特開昭61280268GenBankaccessionnoAB046404、プロテアーゼSD521バチルスSD521FERMP11162由来、特開平3191781GenBankaccessionnoAB046405、プロテアーゼA1NCIB12289由来、WO8801293GenBankaccessionnoAB046406、プロテアーゼA2NCIB12513由来、WO9856927、プロテアーゼ9865バチルスエスピーKSM9865FERMP18566由来GenBankaccessionnoAB084155や、特開2002218989、特開2002306176、特開2003125783、特開2004000122、特開2004057195、特開2004305175、特開2004305176、特開2006129865に記載の変異プロテアーゼ、又はこれらとアミノ酸配列において80以上、好ましくは87以上、より好ましくは90以上、更に好ましくは95以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。ここで、アミノ酸配列間の同一性とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合をいう。具体的には、リップマン-パーソン法LipmanPearson法;Science2271435によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyxWinVer5.1.1;ソフトウェア開発のホモロジー解析Searchhomologyプログラムを用いて、Unitsizetocomparektupを2として解析を行なうことにより算出できる。また、相当する位置のアミノ酸残基を特定する方法としては、例えばリップマン-パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ親アルカリプロテアーゼということがあるとしては、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ又は上述した配列番号2に示すアミノ酸配列と80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼとして示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼKP43の配列番号2で示されるアミノ酸配列の前記a~gより選ばれる1以上の位置のチロシン残基又は配列番号2に示すアミノ酸配列と80以上の同一性をもつアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて前記a~gに相当する位置より選ばれる1以上の位置のチロシン残基をフェニルアラニン残基に置換することにより得られる。本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子配列番号2に対して本発明の変異を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えば国際公開第9918218号パンフレット、国際公開第9856927パンフレットに記載の方法に従って行えばよい。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われている部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばSiteDirectedMutagenesisSystemMutanSuperExpressKmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントPCRpolymerasechainreaction法PCRprotocolsAcademicPressNewYork1990を用いることによって、遺伝子の任意の配列を、他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法としては、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるDNAベクターに連結させ宿主菌を形質転換する、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる宿主菌の染色体DNA上に導入させる、等の方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられ、これらの菌株を用い、資化性の炭素源、窒素源その他必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すればよい。かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDSPAGEにより認められる分子量が43000±2000であり、アルカリ性域で活性を有すると共に、広範なpH範囲でより高い洗浄性能が認められるという性質を新に獲得したものである。従って、本発明のアルカリプロテアーゼ変異体は、各種洗剤組成物配合用酵素として有用である。洗浄剤組成物中への本発明品プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼ変異体が活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物1kg当たり0.1~5000PUが配合できるが、経済性等を考慮し、500PU以下が好ましい。本発明の洗浄剤組成物は、本発明品プロテアーゼ変異体以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明以外のプロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。プロテアーゼとしては市販のアルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、エバラーゼ、カンナーゼ登録商標;ノボザイムズ社、プロペラーゼ、プラフェクト登録商標;ジェネンコア社、またKAP花王、等が挙げられる。セルラーゼとしてはセルザイム、ケアザイム登録商標;ノボザイムズ社、またKAC、特開平10-313859号公報記載のバチルスエスピーKSM-S237株が生産するアルカリセルラーゼ、特開2003313592の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ以上、花王等が挙げられる。アミラーゼとしてはターマミル、デュラミル、ステインザイム登録商標;ノボザイムズ社、プラスター登録商標;ジェネンコア社、またKAM花王、等が挙げられる。リパーゼとしてはリポラーゼ、リポラーゼウルトラ、ライペックス登録商標;ノボザイムズ社が挙げられる。洗浄剤組成物中で本発明品プロテアーゼ変異体以外のプロテアーゼを併用する場合の配合量は、洗浄剤組成物1kg当たり0.1~500PUが好ましい。セルラーゼを併用する場合は、特開平10-313859号公報の段落0020に記載の酵素活性測定方法より決定される単位KUに基づき、洗浄剤組成物1kg当たり300~3000000KUが好ましい。またアミラーゼを併用する場合は、特開平11-43690号公報の段落0040記載のアミラーゼ活性測定方法より決定される単位IUに基づき、洗浄剤組成物1kg当たり50~500000IUが好ましい。さらにリパーゼを併用する場合は、特表平8-500013号公報の実施例1記載のリパーゼ活性測定方法より決定される単位LUづき、洗浄剤組成物1kg当たり10000~1000000LUが好ましい。本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。1界面活性剤界面活性剤は洗浄剤組成物中0.5~60質量配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については10~45質量、液体洗浄剤組成物については20~90質量配合することが好ましい。また本発明洗浄剤組成物が漂白剤、または自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に1~10質量、好ましくは1~5質量配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の1種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。陰イオン性界面活性剤としては、炭素数10~18のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数8~20のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α-オレフィンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸塩、α-スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が10~14の、より好ましくは12~14の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び/又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル炭素数8~20エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル炭素数8~20フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸炭素数8~22エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸炭素数8~22エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数10~18のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを4~20モル付加したHLB値グリフィン法で算出が10.5~15.0、好ましくは11.0~14.5であるようなポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。2二価金属イオン捕捉剤二価金属イオン捕捉剤は0.01~50質量、好ましくは5~40質量配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩合成ゼオライトが特に好ましく、A型、X型、P型ゼオライトのうち、A型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径0.1~10μm、特に0.1~5μmのものが好適に使用される。3アルカリ剤アルカリ剤は0.01~80質量、好ましくは1~40質量配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにJIS1号、2号、3号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。4再汚染防止剤再汚染防止剤は0.001~10質量、好ましくは1~5質量配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千~10万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。5漂白剤例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は1~10質量配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミンTAEDや特開平6-316700号公報記載などの漂白活性化剤アクチベーターを0.01~10質量配合することができる。6蛍光剤本発明洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤例えばチノパールCBS-Xなどやスチルベン型蛍光剤例えばDM型蛍光染料などが挙げられる。蛍光剤は0.001~2質量配合するのが好ましい。7その他の成分本発明品洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤亜硫酸塩など、抑泡剤シリコーンなど、香料、その他の添加剤を含有させることができる。本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明品プロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。斯くして得られる本洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。実施例1バチルスエスピーKSMKP43株FERMBP6532由来のアルカリプロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約20kb配列番号2に対して成熟酵素領域20位、54位、119位、335位及び380位に部位特異的変異を導入する下記のプライマーをそれぞれデザインした。120位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー1配列番号5とプライマー3配列番号7及びプライマー4配列番号8とプライマー2配列番号6を、254位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー1配列番号5とプライマー5配列番号9及びプライマー6配列番号10とプライマー2配列番号6を、3119位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー1配列番号5とプライマー7配列番号11及びプライマー8配列番号12とプライマー2配列番号6を、4335位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー1配列番号5とプライマー9配列番号13及びプライマー10配列番号14とプライマー2配列番号6を、5380位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー1配列番号5とプライマー11配列番号15及びプライマー12配列番号16とプライマー2配列番号6を、それぞれ用いPCRを行った。プライマー1にはセンス鎖の5’末端側にBamHIリンカーを、プライマー2にはアンチセンス鎖の5’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー3とプライマー4、プライマー5とプライマー6、プライマー7とプライマー8、プライマー9とプライマー10、プライマー11とプライマー12はそれぞれの5’末端から10~15bpの長さで互いに相補するようにデザインした。PCRのDNAポリメラーゼとして、Pyrobestを用い、PCRの条件は94°Cで2分間鋳型DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで1分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をPCRproductpurificationkitロッシュにて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、94°Cで2分間DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで1分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、リコンビナントPCRを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー1とプライマー4によりPCRを行なった。94°Cで2分間鋳型DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで2分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaIロッシュにより切断した。増幅DNA断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドpHA64特許第349293号:プロモーター64の下流にBamHI、XbaI切断部位を有すると混合した後、LigationHigh東洋紡により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルスエスピーKSM9865株FERMP18566を形質転換した。9865株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地スキムミルク1wv、バクトトリプトン1、酵母エキスディフコ05、塩化ナトリウム1、寒天15、炭酸ナトリウム005、テトラサイクリン15ppmに生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、5mlの種母培地60wvポリペプトンS、005酵母エキス、10マルトース、002硫酸マグネシウム7水和物、01リン酸2水素カリウム、025炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリンに植菌し、30°Cで16時間振盪培養を行った。次いで30mlの主培地8ポリペプトンS、03酵母エキス、10マルトース、004硫酸マグネシウム7水和物、02リン酸2水素カリウム、15無水炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリンに種母培養液を1vv植菌し、30°Cで3日間振盪培養を行った。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を回収し、タンパク質量をプロテインアッセイキット和光純薬を用いて測定した。得られた酵素液のpH9及びpH105での洗浄評価結果を表1に示す。上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体は、洗浄力を向上させる以外は野生型アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDSPAGEにより認められる分子量が43000±2000であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。実施例2バチルスエスピーD6株FERMP1592由来のアルカリプロテアーゼ:E1構造遺伝子の終止コドンまでを含む約20kb配列番号4に対して成熟酵素領域の20位、54位、247位、249位、334位及び379位に部位特異的変異を導入するプライマーをそれぞれデザインした。120位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー15配列番号29及びプライマー16配列番号20とプライマー14配列番号18を、254位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー17配列番号21及びプライマー18配列番号22とプライマー14配列番号18を、3247位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー19配列番号23及びプライマー20配列番号24とプライマー14配列番号18を、4249位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー21配列番号25及びプライマー22配列番号26とプライマー14配列番号18を、5334位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー23配列番号27及びプライマー24配列番号28とプライマー14配列番号18を、6379位をフェニルアラニン残基に置換するにはプライマー13配列番号17とプライマー25配列番号29及びプライマー26配列番号30とプライマー14配列番号18を、それぞれ用いPCRを行った。プライマー13にはセンス鎖の5’末端側にBamHIリンカーを、プライマー14にはアンチセンス鎖の5’末端側にXbaIリンカーを付与し、プライマー15とプライマー16、プライマー17とプライマー18、プライマー19とプライマー20、プライマー21とプライマー22、プライマー23とプライマー24及びプライマー25とプライマー26はそれぞれの5’末端から10~15bpの長さで互いに相補するようにデザインした。PCRのDNAポリメラーゼとして、Pyrobestを用い、PCRの条件は94°Cで2分間鋳型DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで1分間を1サイクルとし30サイクル反応させた。増幅したDNA断片をPCRproductpurificationkitロッシュにて精製後、それぞれ対応する増幅断片のみで、94°Cで2分間DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで1分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、リコンビナントPCRを行なった。得られた増幅断片に対し、プライマー1とプライマー4によりPCRを行なった。94°Cで2分間鋳型DNAを変性させた後、94°Cで1分間、55°Cで1分間、72°Cで2分間を1サイクルとし30サイクル反応させ、変異が導入された全長遺伝子を得た。増幅断片を精製後、末端に付与されている制限酵素リンカーを、BamHI、XbaIロッシュにより切断した。増幅DNA断片を予めBamHI、XbaIで処理したプラスミドpHA64特許第349293号:プロモーター64の下流にBamHI、XbaI切断部位を有すると混合した後、LigationHigh東洋紡により、リガーゼ反応を行った。反応液からエタノール沈殿により回収したプラスミドを用い宿主菌であるバチルスエスピーKSM9865株FERMP18566を形質転換した。9865株の形質転換体をスキムミルク含有アルカリ寒天培地スキムミルク1wv、バクトトリプトン1、酵母エキスディフコ05、塩化ナトリウム1、寒天15、炭酸ナトリウム005、テトラサイクリン15ppmに生育させ、ハローの形成状況により、変異プロテアーゼ遺伝子導入の有無を判定した。形質転換体は、5mlの種母培地60wvポリペプトンS、005酵母エキス、10マルトース、002硫酸マグネシウム7水和物、01リン酸2水素カリウム、025炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリンに植菌し、30°Cで16時間振盪培養を行った。次いで30mlの主培地8ポリペプトンS、03酵母エキス、10マルトース、004硫酸マグネシウム7水和物、02リン酸2水素カリウム、15無水炭酸ナトリウム、30ppmテトラサイクリンに種母培養液を1vv植菌し、30°Cで3日間振盪培養を行った。得られた培養液を遠心分離し、培養上清を回収し、タンパク質量をプロテインアッセイキット和光純薬を用いて測定した。得られた酵素液のpH9及びpH105での洗浄評価結果を表2に示す。上記の本発明アルカリプロテアーゼ変異体は洗浄力を向上させる以外は野生型アルカリプロテアーゼの特性、すなわち、酸化剤耐性を有し、高濃度の脂肪酸によるカゼイン分解活性の阻害を受けず、SDSPAGEにより認められる分子量が43000±2000であり、アルカリ性域で活性を有する性質を保持していることを確認した。相対洗浄率変異酵素の洗浄力評価は、ターゴトメーター上島製作所製を用いて行った。市販の衣料用洗剤を所定の使用濃度になるように調製した溶液に、必要に応じて10wv硫酸或いは10N水酸化ナトリウムにてpHを調整した。酵素を最終濃度で01mglになるように添加した。次いで、汚染布EMPA117EMPA社製、血液/ミルク/カーボンを6×6cmに裁断したものを添加し、特に断りのない限り20°Cで洗浄80rpmを行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色差計MINOLTA、CM3500dを用いて明度を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算出した。数1洗浄率=L2-L1/L0-L1×100L0:汚染布の原布の明度L1:洗浄前の汚染布の明度L2:洗浄後の汚染布の明度相対洗浄率は下式から算出した。数2相対洗浄率=変異酵素の洗浄率-酵素無添加の洗浄液の洗浄率/野生型酵素の洗浄率-酵素無添加の洗浄液の洗浄率×100