標的配列を特異的に認識して結合するDNA結合タンパク質であって、N末端から順番に以下のドメインを含んでなるDNA結合タンパク質、ここで、標的配列は二本鎖DNAであり、その塩基配列が5’末端側から順に、以下のドメイン2-1および2-2によって認識されるn1塩基対からなるTALE認識配列を含み、かつ、該TALE認識配列から7または8塩基対のスペースを空けて、以下のドメイン4によって認識される3塩基対からなるジンクフィンガー認識配列を含むものである:1250~312アミノ酸長であるドメイン;2-1アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQDHG配列番号2からなる1塩基認識繰り返しドメインをn個タンデムに含んでなるTALEの標的配列認識ドメイン、または、配列番号2で示されるアミノ酸配列のX1X2以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識ドメイン、配列番号2のアミノ酸配列において、X1X2が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X1X2が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X1X2が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X1X2が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識し、nは7~30の整数である;2-2アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX3X4GGKQALE配列番号3からなる1個の1塩基認識最終繰り返しドメインからなるTALEの標的配列認識最終ドメイン、または、配列番号3で示されるアミノ酸配列のX3X4以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識最終ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列において、X3X4が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X3X4が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X3X4が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X3X4が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識する;37から8塩基対からなる標的配列に相当する長さを有するドメイン;および、4配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する1個のジンクフィンガードメイン、または、配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない変異型ジンクフィンガードメイン、ここで、配列番号5からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAAを認識し、配列番号6からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GACを認識し、配列番号7からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAGを認識し、配列番号8からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GATを認識し、配列番号9からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCAを認識し、配列番号10からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCCを認識し、配列番号11からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCGを認識し、配列番号12からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCTを認識し、配列番号13からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGAを認識し、配列番号14からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGCを認識し、配列番号15からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGGを認識し、配列番号16からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGTを認識し、配列番号17からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTAを認識し、配列番号18からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTCを認識し、配列番号19からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTGを認識し、配列番号20からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTTを認識する。ドメイン3が、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのC末端ドメイン、または、配列番号4で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型C末端ドメインである、請求項1に記載のDNA結合タンパク質。ドメイン1が、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのN末端ドメイン、または、配列番号1で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型N末端ドメインである、請求項1または2に記載のDNA結合タンパク質。請求項1~3いずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインが融合してなる標的配列特異的DNA切断酵素。DNA切断酵素のヌクレアーゼドメインが、配列番号21で示されるアミノ酸配列を有するDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインであるか、または、配列番号21で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、DNA切断酵素FokIのヌクレアーゼ活性を保持しているDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインである、請求項4に記載の標的配列特異的DNA切断酵素。請求項1~3いずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側と請求項5に記載のDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインまたはDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインの間に配列番号22で示すリンカーを含む請求項5に記載の標的配列特異的DNA切断酵素。請求項1~3いずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA転写活性化ドメインが融合してなる標的配列特異的転写活性化因子。DNA転写活性化ドメインが、GAL4およびVP16からなる群から選択される、請求項7に記載の標的配列特異的転写活性化因子。請求項1~3いずれかに記載のDNA結合タンパク質に標識タンパク質が融合してなる標的配列特異的DNA認識試薬。標識タンパク質が、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、請求項9に記載の標的配列特異的DNA認識試薬。請求項1~3いずれかに記載のDNA結合タンパク質または請求項4~6いずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素または請求項7または8に記載の標的配列特異的転写活性化因子または請求項9または10に記載の標的配列特異的DNA認識試薬をコードする核酸分子。請求項11に記載の核酸分子を含むベクター。請求項4~6いずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素を用いて標的二本鎖DNAを切断する工程、および切断された二本鎖DNAに相同組換え修復または非相同末端連結修復を作用させる工程、を含む、標的遺伝子を欠損又は改変させる方法。非相同末端連結修復を作用させることにより標的遺伝子を欠失させる請求項13に記載の方法。請求項13または14に記載の方法により標的遺伝子を欠損又は改変させて得られた遺伝子欠損または改変生物あるいは細胞。ノックアウト生物または細胞である請求項15に記載の生物あるいは細胞。マウス、ラット、ゼブラフィッシュ生物または哺乳類培養細胞である請求項15または16に記載の生物あるいは細胞。このように、ジンクフィンガーは、nを認識する傾向があるため、すべての標的遺伝子にZFNを設計することが困難であった。また、ZFNは作製方法が煩雑で作製方法技術習得に多大な労力と経費が必要とされ、広く使われるに至っていない。一方、TALENは標的配列を任意で作製することが可能であることから、ZFNに代わる強力な人工酵素と期待されているが、TALEのN末端とC末端のサイズや構造がDNA結合特異性に大きく関わり、この部分のサイズの設定や構造の安定化が実用化の鍵と考えられている。上記問題に鑑み、どのような塩基配列でも自由に標的遺伝子とすることでき、かつ正確な結合特異性を有する人工DNA結合ドメインが求められていた。さらに、どのような塩基配列でも自由に標的遺伝子とすることでき、かつ正確に標的塩基配列の箇所を切断できる人工DNA切断酵素が望まれている。さらに、本発明は、どのような塩基配列でも自由に標的とすることができる、DNA結合タンパク質、それを含む標的配列特異的転写活性化因子、標的配列特異的DNA認識試薬を提供することを目的とする。本発明者らはこのたび、1つのジンクフィンガーに植物病原細菌Xanthomonas由来のTranscriptionactivatorlikeeffectorTALEを連結させた新しいタイプのDNA結合ドメインを作製した。さらにこの新規DNA結合ドメインに制限酵素FokIのヌクレアーゼドメインを融合したTALEZincfingerFusionNucleaseTZFNを開発し、高効率での遺伝子破壊法を確立するに至った。本発明により、ジンクフィンガードメインのN末端側に、適切な空間を空けてTALEの標的認識ドメインを融合させて得られた新たなDNA結合タンパク質は、標的とするDNA配列中の任意の塩基配列を認識し、その認識部分に結合することができることが見いだされた。また、本発明のDNA結合タンパク質を、DNA切断酵素のヌクレアーゼドメインに融合させることにより得られる本発明のDNA切断酵素は、任意の塩基配列を標的配列とすることが可能であることが見いだされた。具体的には、本発明者らは、1つのジンクフィガードメインのN末端側に様々な長さのスペースを介してTALEのDNA結合ドメインを融合させ、かつ、当該ジンクフィンガードメインのC末端側にDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインを融合させて得られる各種のタンパク質を構築し、それらの標的配列切断活性を測定した。それにより、本発明者らは、TALEのDNA結合ドメインとジンクフィンガードメインの間のスペースが、7または8bpの標的配列の長さに相当する場合に、効率よく標的DNA配列を認識し、結合することを見いだした。即ち、本発明は以下を提供する。A:標的配列を特異的に認識して結合するDNA結合タンパク質であって、N末端から順番に以下のドメインを含んでなるDNA結合タンパク質、ここで、標的配列は二本鎖DNAであり、その塩基配列が5’末端側から順に、以下のドメイン2-1および2-2によって認識されるn1塩基対からなるTALE認識配列を含み、かつ、該TALE認識配列から7または8塩基対のスペースを空けて、以下のドメイン4によって認識される3塩基対からなるジンクフィンガー認識配列を含むものである:1250~312アミノ酸長であるドメイン;2-1アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQDHG配列番号2からなる1塩基認識繰り返しドメインをn個タンデムに含んでなるTALEの標的配列認識ドメイン、または、配列番号2で示されるアミノ酸配列のX1X2以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識ドメイン、配列番号2のアミノ酸配列において、X1X2が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X1X2が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X1X2が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X1X2が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識し、nは7~30の整数である;2-2アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX3X4GGKQALE配列番号3からなる1個の1塩基認識最終繰り返しドメインからなるTALEの標的配列認識最終ドメイン、または、配列番号3で示されるアミノ酸配列のX3X4以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識最終ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列において、X3X4が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X3X4が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X3X4が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X3X4が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識する;37から8塩基対からなる標的配列に相当する長さを有するドメイン;および、4配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する1個のジンクフィンガードメイン、または、配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない変異型ジンクフィンガードメイン、ここで、配列番号5からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAAを認識し、配列番号6からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GACを認識し、配列番号7からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAGを認識し、配列番号8からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GATを認識し、配列番号9からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCAを認識し、配列番号10からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCCを認識し、配列番号11からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCGを認識し、配列番号12からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCTを認識し、配列番号13からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGAを認識し、配列番号14からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGCを認識し、配列番号15からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGGを認識し、配列番号16からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGTを認識し、配列番号17からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTAを認識し、配列番号18からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTCを認識し、配列番号19からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTGを認識し、配列番号20からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTTを認識する。B:ドメイン3が、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのC末端ドメイン、または、配列番号4で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型C末端ドメインである、Aに記載のDNA結合タンパク質。C:ドメイン1が、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのN末端ドメイン、または、配列番号1で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型N末端ドメインである、AまたはBに記載のDNA結合タンパク質。D:A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインが融合してなる標的配列特異的DNA切断酵素。E:DNA切断酵素のヌクレアーゼドメインが、配列番号21で示されるアミノ酸配列を有するDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインであるか、または、配列番号21で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、DNA切断酵素FokIのヌクレアーゼ活性を保持しているDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインである、Dに記載の標的配列特異的DNA切断酵素。F:A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側とEに記載のDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインまたはDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインの間に配列番号22で示すリンカーを含むEに記載の標的配列特異的DNA切断酵素。G:A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA転写活性化ドメインが融合してなる標的配列特異的転写活性化因子。H:DNA転写活性化ドメインが、GAL4およびVP16からなる群から選択される、Gに記載の標的配列特異的転写活性化因子。I:A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質に標識タンパク質が融合してなる標的配列特異的DNA認識試薬。J:標識タンパク質が、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、Iに記載の標的配列特異的DNA認識試薬。K:A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質またはD~Fいずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素またはGまたはHに記載の標的配列特異的転写活性化因子またはIまたはJに記載の標的配列特異的DNA認識試薬をコードする核酸分子。L:Kに記載の核酸分子を含むベクター。M:D~Fいずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素を用いて標的二本鎖DNAを切断する工程、および切断された二本鎖DNAに相同組換え修復または非相同末端連結修復を作用させる工程、を含む、標的遺伝子を欠損又は改変させる方法。N:非相同末端連結修復を作用させることにより標的遺伝子を欠失させるMに記載の方法。O:MまたはNに記載の方法により標的遺伝子を欠損又は改変させて得られた遺伝子欠損または改変生物あるいは細胞。P:ノックアウト生物または細胞であるOに記載の生物あるいは細胞。Q:マウス、ラット、ゼブラフィッシュ生物または哺乳類培養細胞であるOまたはPに記載の生物あるいは細胞。本発明のDNA結合タンパク質は、あらゆる所望の標的DNA配列を認識し、結合することができる。また、本発明のDNA結合タンパク質をDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインに融合させることにより得られる本発明のDNA切断酵素は、あらゆる所望の標的DNA配列を認識し、結合し、正確な部位でDNAを切断することができる。特に、本発明のDNA結合タンパク質をDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインと融合させて得られる本発明のDNA切断酵素を用いることにより、ほとんどすべての遺伝子を標的遺伝子として切断することが可能になる。これにより、本発明のDNA切断酵素を用いて、目的とする遺伝子がノックアウトされた、ノックアウト生物又は改変生物を得ることができる。また、本発明のDNA切断酵素は、既存のZFNと比較して簡便かつ安価に設計することができる。また、本発明のDNA切断酵素は、ZFNに固有の配列における制限がないため、ZFNの低い標的遺伝子配列の自由度という問題を解決することができる。さらに、本発明のDNA切断酵素は、既存のTALENと比較して正確な位置で標的DNAを切断することができる。具体的には、本発明のDNA切断酵素は、図8に示すように、本発明の2つのDNA結合切断酵素中のジンクフィンガー認識標的配列の間の6bpの配列部位でDNAを切断し、その結果、4bpの突出末端を有するDNA切断箇所が生じる。このように、本発明のDNA切断酵素は、TALENのもつ標的配列の自由性とZFNのもつ切断部位の特異性の両方を併せ持つものである。また、本発明のDNA結合タンパク質は、DNA転写活性化ドメインや標識タンパク質と融合させることにより、あらゆる所望の標的DNA配列を認識する標的配列特異的転写活性化因子や標的配列特異的DNA認識試薬として利用することができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明のDNA結合タンパク質A~Cについて本発明は、態様Aにおいて、以下を提供する:A:標的配列を特異的に認識して結合するDNA結合タンパク質であって、N末端から順番に以下のドメインを含んでなるDNA結合タンパク質、ここで、標的配列は二本鎖DNAであり、その塩基配列が5’末端側から順に、以下のドメイン2-1および2-2によって認識されるn1塩基対からなるTALE認識配列を含み、かつ、該TALE認識配列から7または8塩基対のスペースを空けて、以下のドメイン4によって認識される3塩基対からなるジンクフィンガー認識配列を含むものである:1250~312アミノ酸長であるドメイン;2-1アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQDHG配列番号2からなる1塩基認識繰り返しドメインをn個タンデムに含んでなるTALEの標的配列認識ドメイン、または、配列番号2で示されるアミノ酸配列のX1X2以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識ドメイン、配列番号2のアミノ酸配列において、X1X2が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X1X2が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X1X2が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X1X2が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識し、nは7~30の整数である;2-2アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX3X4GGKQALE配列番号3からなる1個の1塩基認識最終繰り返しドメインからなるTALEの標的配列認識最終ドメイン、または、配列番号3で示されるアミノ酸配列のX3X4以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識最終ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列において、X3X4が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X3X4が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X3X4が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X3X4が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識する;37から8塩基対からなる標的配列に相当する長さを有するドメイン;および、4配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する1個のジンクフィンガードメイン、または、配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない変異型ジンクフィンガードメイン、ここで、配列番号5からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAAを認識し、配列番号6からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GACを認識し、配列番号7からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAGを認識し、配列番号8からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GATを認識し、配列番号9からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCAを認識し、配列番号10からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCCを認識し、配列番号11からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCGを認識し、配列番号12からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCTを認識し、配列番号13からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGAを認識し、配列番号14からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGCを認識し、配列番号15からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGGを認識し、配列番号16からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGTを認識し、配列番号17からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTAを認識し、配列番号18からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTCを認識し、配列番号19からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTGを認識し、配列番号20からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTTを認識する。好ましくは、態様AのDNA結合タンパク質において、ドメイン3は、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのC末端ドメイン、または、配列番号4で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型C末端ドメインである態様B。さらに好ましくは、態様AまたはBのDNA結合タンパク質において、ドメイン1は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのN末端ドメイン、または、配列番号1で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型N末端ドメインである態様C。本発明において変異型のドメインとは、実施例に記載の各配列から構成されるDNA結合タンパク質の各ドメインと比較して、DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないように、即ち、本発明のDNA結合タンパク質の機能が失われない程度にアミノ酸変異欠失、置換、付加が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法NucleicAcidsRes10648765001982が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異欠失、置換、付加したアミノ酸の数は、上記のDNA結合タンパク質の機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内、特に好ましくは、4、3、2または1アミノ酸である。変異型のドメインは、DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないように、即ち、本発明のDNA結合タンパク質の機能が失われない程度に、実施例に記載の各配列から構成されるDNA結合タンパク質の各ドメインに対する配列同一性を有するドメインである。配列同一性は、80以上が好ましく、85以上がさらに好ましく、90以上がより好ましく、特に好ましくは、95、96、97、98または99以上である。本発明において、アミノ酸配列の配列同一性とは、2つのポリペプチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列の領域にわたって最適な状態配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値は両方のアミノ酸配列に存在する同一のアミノ酸を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなどが挙げられる。アミノ酸配列の配列同一性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。本発明のタンパク質の機能を有すること、即ち、DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないことは、例えば、実施例に記載のように、機能を確認すべきDNA結合タンパク質のC末端にFokIのヌクレアーゼドメインを付加すること等により、C末端に切断酵素を融合したタンパク質を発現するコンストラクトを構築し、該コンストラクトから目的の融合酵素を発現させ、実施例に記載のSSAアッセイを用いて、標的部位においてDNAの切断が起こったか否かを検出することによって確認できる。以下、本発明のDNA結合タンパク質を構成するドメイン1、2-1、2-2、3および4について詳細に説明する。本発明のDNA結合タンパク質は、N末端から順に以下のドメイン1、2-1、2-2、3および4から構成される。ドメイン1ドメイン1の大きさは、250~312アミノ酸長からなるドメインであり、好ましくは、280~312アミノ酸長、より好ましくは、290~312アミノ酸長、さらに好ましくは、300~312アミノ酸長、特に好ましくは、312アミノ酸長である。ドメイン1のアミノ酸配列は特に限定されないが、DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない配列である。例えば、ドメイン1のアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのN末端ドメイン、または、配列番号1で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型N末端ドメインである。変異型N末端ドメインの配列番号1に対する配列同一性は、80以上が好ましく、85以上がさらに好ましく、90以上がより好ましく、特に好ましくは、95、96、97、98または99以上である。例えば、配列番号1のアミノ酸配列をコードする核酸は、実施例に記載のように、プラスミド、pTAL3あるいはpTAL4、から得られる。また、市販のキット、GoldenGateTALENandTALEffectorKit、から得ることもできる。あるいは、DNA合成機などを用いて人工的に合成して得ることができる。ドメイン2-1および2-2ドメイン1のC末端側に存在する、ドメイン2-1および2-2は、TALEの標的配列認識ドメインまたはその変異型ドメインである。この部分を所望の標的配列となるように設計することによって、所望の配列を認識する本発明のタンパク質が得られる。具体的には、ドメイン2-1は、アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQDHG配列番号2からなる1塩基認識繰り返しドメインをn個タンデムに含んでなるTALEの標的配列認識ドメイン、または、配列番号2で示されるアミノ酸配列のX1X2以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識ドメインであり、ここで、配列番号2のアミノ酸配列において、X1X2が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X1X2が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X1X2が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X1X2が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識し、nは7~30の整数である。上記のドメイン2-1におけるnは、7~30の整数であるが、好ましくは、nは10~30の整数であり、さらに好ましくは15~30の整数である。ドメイン2-2は、具体的には、アミノ酸配列:LTPDQVVAIASX3X4GGKQALE配列番号3からなる1個の1塩基認識最終繰り返しドメインからなるTALEの標的配列認識最終ドメイン、または、配列番号3で示されるアミノ酸配列のX3X4以外の位置において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないTALEの変異型標的配列認識最終ドメインであり、ここで、配列番号3のアミノ酸配列において、X3X4が、NIの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Aを認識し、X3X4が、HDの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Cを認識し、X3X4が、NNまたはNKの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Gを認識し、そして、X3X4が、NGの場合、その1塩基認識繰り返しドメインは塩基Tを認識する。例えば、配列番号2および3のアミノ酸配列をコードする核酸は、実施例に記載のように、市販のキット、GoldenGateTALENandTALEffectorKit、から得ることができる。あるいは、DNA合成機などを用いて人工的に合成して得ることができる。ドメイン3ドメイン2-1および2-2のC末端側に存在する、ドメイン3は、7から8塩基対からなる標的配列に相当する長さを有するドメインである。ドメイン3の大きさは、好ましくは、150~235アミノ酸長、より好ましくは、170~235アミノ酸長、さらに好ましくは、190~235アミノ酸長、特に好ましくは、200~235アミノ酸長である。このドメインの大きさは、標的配列への正確な結合に重要である。ドメイン3のアミノ酸配列は特に限定されないが、DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない配列である。例えば、ドメイン3のアミノ酸配列は、限定されないが、配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質TALEのC末端ドメイン、または、配列番号4で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しないタンパク質TALEの変異型C末端ドメインである。変異型C末端ドメインの配列番号4に対する配列同一性は、80以上が好ましく、85以上がさらに好ましく、90以上がより好ましく、特に好ましくは、95、96、97、98または99以上である。例えば、配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸は、実施例に記載のように、プラスミド、pTAL3あるいpTAL4、から得られる。また、市販のキット、GoldenGateTALENandTALEffectorKit、から得ることもできる。あるいは、DNA合成機などを用いて人工的に合成して得ることができる。ドメイン4ドメイン3のC末端側に存在する、ドメイン4は、ジンクフィンガードメインまたはその変異型ドメインである。ドメイン2-1および2-2に加えてこの部分を所望の標的配列となるように設計することによって、所望の配列を認識する本発明のタンパク質が得られる。なお、ドメイン2-1および2-2、即ち、TALEの認識ドメインが認識するDNA配列と、ジンクフィンガードメインが認識するDNA配列との間には、7または8塩基対の任意のDNA配列が含まれる図8参照。ドメイン4は、具体的には、配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する1個のジンクフィンガードメイン、または、配列番号5から20のいずれかに示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、前記DNA結合タンパク質全体としての標的配列特異的DNA結合活性を破壊しない変異型ジンクフィンガードメインであり、ここで、配列番号5からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAAを認識し、配列番号6からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GACを認識し、配列番号7からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GAGを認識し、配列番号8からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GATを認識し、配列番号9からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCAを認識し、配列番号10からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCCを認識し、配列番号11からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCGを認識し、配列番号12からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GCTを認識し、配列番号13からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGAを認識し、配列番号14からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGCを認識し、配列番号15からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGGを認識し、配列番号16からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GGTを認識し、配列番号17からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTAを認識し、配列番号18からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTCを認識し、配列番号19からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTGを認識し、配列番号20からなるジンクフィンガードメインは、塩基配列GTTを認識する。例えば、配列番号5~20のアミノ酸配列をコードする核酸は、実施例に記載のように、プラスミド、pC3XB、から得ることができる。また、市販のキット、ZincFingerCorsortiumVectorKit、から得ることもできる。あるいは、DNA合成機などを用いて人工的に合成して得ることができる。本発明のDNA切断酵素D~Fについて本発明は、態様Dにおいて、以下を提供する:態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインが融合してなる標的配列特異的DNA切断酵素。ヌクレアーゼドメインは、DNA切断活性を有する限り、特に限定されないが、好ましくは、態様Dの標的配列特異的DNA切断酵素において、DNA切断酵素のヌクレアーゼドメインは、配列番号21で示されるアミノ酸配列を有するDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインであるか、または、配列番号21で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、DNA切断酵素FokIのヌクレアーゼ活性を保持しているDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインである態様E。DNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列の配列番号21に対する配列同一性は、80以上が好ましく、85以上がさらに好ましく、90以上がより好ましく、特に好ましくは、95、96、97、98または99以上である。変異型ヌクレアーゼドメインが、DNA切断酵素FokIのヌクレアーゼ活性を保持しているかどうかは、標的配列DNAの試験管内での切断活性を測定することにより確認することができる。また好ましくは、態様A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側とEに記載のDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインまたはDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインの間には、3~6アミノ酸長、好ましくは4~6アミノ酸長、より好ましくは5~6アミノ酸長のリンカーを配置するとよい。特に好ましくは、態様Eの標的配列特異的DNA切断酵素において、態様A~Cいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側とEに記載のDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインまたはDNA切断酵素FokIの変異型ヌクレアーゼドメインの間に配列番号22で示すリンカーを含む態様F。配列番号21で示されるアミノ酸配列を有するDNA切断酵素FokIのヌクレアーゼドメインは、例えば、プラスミド、pTAL3あるいはpTAL4、から得ることができる。また、配列番号22で示されるリンカーは、DNA合成機などを用いて人工的に合成することができる。あるいは、FokIのヌクレアーゼドメインは、DNA合成機などを用いて人工的に合成して得ることもできる。態様A~Cに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA切断酵素のヌクレアーゼドメインを融合させる方法は、当業者に周知である。例えば、InFusion反応Clontechでの連結により融合させることができる。本発明の態様D~FのDNA切断酵素が所望の活性を有するか否かは、例えば、実施例に記載のSSAアッセイによって確認することができる。本発明の態様D~FのDNA切断酵素は、所望の標的配列を適切な位置にて正確に切断することができる。当業者に知られているように、また、図3に例示するように、切断された二本鎖DNAは、相同組換えあるいは非相同末端連結により修復を受け、この際に、目的の遺伝子を改変あるいはノックアウトすることができる。目的の遺伝子が改変あるいはノックアウトされたかどうかは、例えば、標的配列の塩基配列の配列決定により確認することができる。また、本発明のEまたはFの態様において、ヌクレアーゼドメインとしてFokIヌクレアーゼドメインを用いる場合、図1や図8に記載のように、このドメインは標的DNA配列への結合を介して二量体を形成することにより、二本鎖DNAを切断する。本発明において、FokIを含むDNA切断酵素は、ホモダイマーとして用いてもよいし、ヘテロダイマーとして用いてもよい。FokIヌクレアーゼドメインをホモダイマーとする場合は、A~Cの態様に記載のDNA結合タンパク質を1種類用意すればよい。一方、FokIヌクレアーゼドメインをヘテロダイマーとする場合、A~Cの態様に記載のDNA結合タンパク質を2種類用意する。2種のDNA結合タンパク質において、認識配列即ち、ドメイン2-1、2-2および4の設計を互いに異なるものとすることにより、回文配列以外の所望の配列を認識し、切断することが可能となる。また、ヌクレアーゼドメインとしてFokIヌクレアーゼドメインを用いる場合、図8に記載するように、標的配列の構造は、TALE結合配列→7あるいは8bpの任意の配列→ジンクフィンガー結合配列→6bpの切断部位→ジンクフィンガー結合配列→7あるいは8bpの任意の配列→TALE結合配列となる。またこの場合、切断部位では、4塩基突出末端が生じる。本発明の標的配列特異的転写活性化因子GおよびHについて本発明は、態様Gにおいて、以下を提供する:態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質のC末端側にDNA転写活性化ドメインが融合してなる標的配列特異的転写活性化因子。好ましくは、態様Gの標的配列特異的転写活性化因子において、DNA転写活性化ドメインは、GAL4およびVP16からなる群から選択される態様H。GAL4およびVP16をコードする核酸分子は、例えば、pActPLGal4ADおよびpActPLVP16ADから入手することができる。また、本発明の態様GおよびHにおいて、態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質とDNA転写活性化ドメインとの融合方法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。本発明の態様GおよびHによる標的配列特異的転写活性化因子が所望の活性を有するか否かは、例えば、標的配列の下流にレポーター遺伝子を連結し、レポーター遺伝子の発現を検出することによって確認することができる。本発明の標的配列特異的DNA認識試薬IおよびJについて本発明は、態様Iにおいて、以下を提供する:態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質に標識タンパク質が融合してなる標的配列特異的DNA認識試薬。好ましくは、態様Iの標的配列特異的DNA認識試薬において、標識タンパク質は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される態様J。蛍光タンパク質としては、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質GFP等が挙げられ、酵素としては特に限定されないが、βラクタマーゼ等が挙げられる。これらは、当業者に周知の入手方法によって得ることができる。また、本発明の態様IおよびJにおいて、態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質と標識タンパク質との融合方法は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。本発明の核酸分子Kについて本発明は、態様Kにおいて、以下を提供する:態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質または態様D~Fのいずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素または態様GまたはHに記載の標的配列特異的転写活性化因子または態様IまたはJに記載の標的配列特異的DNA認識試薬をコードする核酸分子。また、本発明の核酸分子は、態様A~Cのいずれかに記載のDNA結合タンパク質または態様D~Fのいずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素または態様GまたはHに記載の標的配列特異的転写活性化因子または態様IまたはJに記載の標的配列特異的DNA認識試薬をコードする核酸分子に加えて、これら核酸分子の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれ、DNA結合タンパク質、標的配列特異的DNA切断酵素、標的配列特異的転写活性化因子または標的配列特異的DNA認識試薬の機能を保持するタンパク質をコードする核酸分子も含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、02xSSC、01SDS、65°C程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは元の塩基配列からなるDNAと80以上の高い配列同一性を有することが望ましく、より好ましくは85以上、さらに好ましくは90以上、特に好ましくは、95、96、97、98または99以上の配列同一性を有する。ここでいう配列同一性については本発明のタンパク質の項に記載したものにおいて、アミノ酸配列を塩基配列に置き換えたものをいう。本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の、DNA結合タンパク質、標的配列特異的DNA切断酵素、標的配列特異的転写活性化因子または標的配列特異的DNA認識試薬としての機能の確認方法は、本発明のタンパク質の項に記載したとおりである。本発明の核酸分子は、例えば、実施例に記載のように、プラスミド、pcDNA31、Ptal、pc3XB、および市販のキット、GoldenGateTALENandTALEffectorKit、を組み合わせることによって得ることができる。あるいはDNA合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行うことが出来る。本発明のベクターLについて本発明は、態様Lにおいて、以下を提供する:態様Kに記載の核酸分子を含むベクター。本発明のベクターは、態様Kの核酸分子を含む組換えベクターであり、ここで態様Kの核酸分子がコードするタンパク質については上記した通りである。態様Kの核酸分子が組み込まれるベクターとしては、特に限定されないが、例えば、発現ベクターが挙げられる。好ましくは、ベクターは発現ベクターであり、導入される宿主に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pETが挙げられ、哺乳類培養細胞で発現させる場合は、pcDNAが挙げられる。ファージベクターとしてはLambdagt10などが挙げられる。特に好ましくは、ベクターはプラスミドベクターである。選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明のベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、DNA配列に適切に連結した場合、宿主細胞において、そのDNA配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、従来公知の方法を用いることが出来、例えば、塩化カルシウム法、コンピテント法、3親接合triparentalmating法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。組換えタンパク質を発現させる方法は遺伝子工学の常法に基づいて行うことが出来る。ベクターの情報や外来遺伝子の導入、発現方法は多くの実験書に記載されている例えば、SambrookJetalMolecularCloningALaboratoryManual3rdEditionCSHLPress2001。用いる宿主は特に限定されず、大腸菌などが挙げられる。宿主は、好ましくは大腸菌K株またはB株であり、さらに好ましくは大腸菌B株である。形質転換体である宿主細胞の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としては、グルコース、グリセロールなどが挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。培養温度は宿主細胞が成育し、目的タンパク質を発現する範囲で適宜変更できる。目的タンパク質の発現は、該タンパク質の性質を利用して確認すればよい。本発明はまた、本発明のベクターが導入されてなる細胞、かかる細胞を含む、組織、器官、生物体を含む。本発明の標的遺伝子を欠損又は改変させる方法MおよびNについて本発明は、態様Mにおいて、以下を提供する:態様D~Fいずれかに記載の標的配列特異的DNA切断酵素を用いて標的二本鎖DNAを切断する工程、および切断された二本鎖DNAに相同組換え修復または非相同末端連結修復を作用させる工程、を含む、標的遺伝子を欠損又は改変させる方法。好ましくは、態様Mの方法において、非相同末端連結修復を作用させることにより標的遺伝子を欠失させる態様N。相同組換え修復および非相同末端連結修復を作用させる方法は、当業者に周知である。例えば、相同組換え修復は、ドナーベクターの存在下でのZFNによるDNA2本鎖切断で相同領域の置換を誘導することにより行うことができ、非相同末端連結修復は、ドナーベクターの非存在下でのZFNなどの人工酵素によるDNA2本鎖切断による誘導により行うことができる。標的遺伝子が欠失または改変されたかどうかは、例えば、標的配列の塩基配列決定により確認することができる。本発明の遺伝子欠損または改変生物あるいは細胞O~Qについて本発明は、態様Oにおいて、以下を提供する:態様MまたはNに記載の方法により標的遺伝子を欠損又は改変させて得られた遺伝子欠損または改変生物あるいは細胞。好ましくは、態様Oの遺伝子欠損または改変生物あるいは細胞は、ノックアウト生物または細胞である態様P。特に好ましくは、態様OまたはPに記載の生物あるいは細胞は、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ生物または哺乳類培養細胞である態様Q。標的遺伝子が欠損又は改変しているかどうかは、上記態様MまたはNにおいて記載した方法により確認することができる。以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。TZFNによる標的配列の切断活性の検討TALEとZFの2種類のDNA結合ドメインが認識する塩基配列間のスペーシングの長さを検討するため、3~9bpのスペーシングを有する複数のTZFN発現ベクター図4参照を構築し、ヒト培養細胞を用いたSSAアッセイにより切断活性の測定を行った。即ち、TZFN発現ベクターをヒト培養細胞HEK293Tに導入し、標的配列の切断活性を、レポーター遺伝子を用いて評価した。具体的には、TALEのC末端の配列C末端構造の大きさを固定した上で、C末構造の大きさに対応したスペースが何塩基分かを検討した図5。即ち、その他の配列はすべて固定した上で、TALEのDNA結合ドメインのみを1モジュール=1塩基分ずつ削っていき、TALEの結合配列とZFの結合配列の間に何bpのスペースがある時が最適であるかを調べた図4。なお、本明細書においてアレイまたはTALEアレイとは、TALEのDNA結合ドメインのモジュールの並びをいう。切断活性の評価については、TargetedmutagenesisintheseaurchinembryousingzincfingernucleasesFigure3図6参照に記載のSSAアッセイを用いた。簡単に説明すると、SSAアッセイでは、終止コドンと標的配列の挿入によって分断されたルシフェラーゼ遺伝子の2つの不活性断片をコードする核酸を含むSSAレポーターベクターを用いることにより、標的が切断されると、オーバーラップを利用して修復が起こり、ルシフェラーゼ遺伝子が回復するため、標的配列の切断活性をルシフェラーゼ活性として評価することができる。実験方法プラスミド構築TZFN発現ベクターの作製TALEの標的認識配列のN末端側およびC末端側ならびにFokIのヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列配列番号1、4および21をコードすることが知られているpTAL4プラスミドCermakTDoyleELChristianMWangLZhangYSchmidtCBallerJASomiaNVBogdanoveAJVoytasDFEfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffectorbasedconstructsforDNAtargetingNucleicAcidsRes39e82をSacI処理し、T4DNApolymeraseで末端を平滑化した後BglII処理し、切り出される断片をBamHIPmeI処理したpcDNA31ベクターInvitrogenに挿入したpcDNATAL。次に、pcDNATALを鋳型として、以下のプライマーを用いてInversePCRを行ったForward5’ACGGGTGCTGCGGCAAGAGCTCTAGTGAAATCTGAATTGGAAGAGAAG3’配列番号23Reverse5’GGATCTAGATATCGGATCCGGG3’配列番号24。また、ZincFingerConsortiumVectorKitv10Addgeneに含まれる、標的配列GAAを認識するジンクフィンガーのアミノ酸配列配列番号5をコードすることが知られているpc3XBZF63を鋳型として、以下のプライマーを用いてPCRを行ったForward5’CCGATATCTAGATCCGGGGAGAAGCCTTACAAATG3’配列番号25Reverse5’TGCCGCAGCACCCGTATGTGTTCTCTGGTGTCTCACG3’配列番号26。これら2種類のPCR産物を精製後混合し、InFusion反応Clontechを行うことで、TALEの標的認識配列のN末端側およびC末端側、標的配列GAAを認識するジンクフィンガーならびにFokIのヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列をコードするpcDNATZF63ベクターを得た。更にpcDNATZF63ベクターへ、任意のTALEアレイの作成に用いることが知られているGoldenGateTALENandTALEffectorKitAddgeneを用いてTALEアレイを挿入し、7種類のTZFN発現ベクターpcDNATZF6312~18図4を得た。各発現ベクターのTALEアレイを以下の表1に記す。これらの発現ベクターは、特許請求の範囲に記載のnがそれぞれ11~17のものに相当する。表1各TZFN発現ベクターに含まれるTALEアレイSinglestrandannealingSSAレポーターベクターの作製SSAアッセイのために、標的配列を含む以下の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし、SSAアッセイに用いられることが知られているBsaI処理したpGL4SSAベクターOchiaiHFujitaKSuzukiKNishikawaMShibataTSakamotoNYamamotoTTargetedmutagenesisintheseaurchinembryousingzincfingernucleasesGenesCells1587585に挿入しSense5’GTCGGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCCTCGAGGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCAGGT3’配列番号34Antisense5’CGGTACCTGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCCTCGAGGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATC3’配列番号35、SSAレポーターベクターを作製した。細胞培養トランスフェクションルシフェラーゼアッセイOchiaietal前掲の手法に基づき、TZFN発現ベクターpcDNATZF6312~18とSSAレポーターベクター、ウミシイタケルシフェラーゼをコードすることが知られているpRLCMVベクターPromegaをHEK293T細胞に導入し、24時間培養後にルシフェラーゼアッセイを行った。細胞培養HEK293T細胞を、10FBSfetalbovineserumBiologicalIndustries、1nonessentialaminoacidGIBCO、1ストレプトマイシンペニシリンを含むDMEMWakoで、37°C、5CO2の条件で静置培養した。トランスフェクション96wellプレート中で、無血清OptiMEMInvitrogen25μlとDNA溶液2μlTZFN発現ベクター200ngSSAレポーターベクター100ngpRLCMV20ngを含むを混合した。更に各ウェルへOptiMEM25μlとLipofectamineLTXInvitrogen07μlを混合した溶液を加え、室温で30分間インキュベートした。その後15FBSを含むDMEMに懸濁したHEK293T細胞を50000細胞ずつ各ウェルへ加え、37°C、5CO2で24時間培養した。ルシフェラーゼアッセイルシフェラーゼアッセイは、DualGloluciferaseassaysystemPromegaを用いて、キットの取扱説明書の通りに行った。発光強度はTriStarLB941platereaderBertholdを用いて測定した。実験結果上記実験の結果、塩基のスペーシングが3bp4bp5bp6bp9bpのときの発光強度はほぼ一定であり、7bpTZF6314及び8bpTZF6313のときに発光強度の増加が見られた図7。これはTZF6314及びTZF6313タンパク質がSSAレポーターベクターを効率的に切断したことを意味し、このことからTALEZFの両DNA結合ドメイン間の塩基のスペーシングは、7bpもしくは8bpが適当であることが示された。このことから、TALE認識配列のC末端側のドメインは7~8塩基分を覆うような大きさに相当することが予測される。よって、効率的に標的配列を切断するTZFNを作製するためには、図8に示す規定に基づいた設計を行うことが好ましいと考えられる。また本実施例では、左右のTZFN認識配列に挟まれる切断部位を6bpに限定して評価した図8。この規定は、ZFドメインとFokIヌクレアーゼドメインの間のリンカーとしてTGAAARの6アミノ酸を用いることで、切断部位を6bpに限定できるという報告ShimizuYBhaktaMSSegalDJRestrictedspacertoleranceofazincfingernucleasewithasixaminoacidlinkerBioorgMedChemLett1939702に基づいている。一方でTALENでは切断部位を厳密に決定できないことが知られているChristianMCermakTDoyleELSchmidtCZhangFHummelABogdanoveAJVoytasDFTargetingDNAdoublestrandbreakswithTALeffectornucleasesGenetics18675761。言い換えると、本実施例では、切断部位を事実上6bpの範囲に限定できたため、TALENの切断部位が不安定という問題を克服できたといえる。以上の事から、本発明により、TALENのもつ標的配列の自由性とZFNのもつ切断部位の特異性の両方の利点を併せ持つ人工酵素TZFNが作出できることが示された図9。