"1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節領域、興味あるヌクレオチド配列および1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分を含む第1核酸配列と、ジェミニウイルスレプリカーゼをコード化する第2核酸とを含む植物発現系。前記調節領域が、プラストシアニンプロモーター、CaMV35Sプロモーター、2xCaMV35Sプロモーター、CASプロモーター、RbcSプロモーター、Ubiプロモーター、またはアクチンプロモーターから選ばれる、請求項1記載の植物発現系。前記1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーが、コモウイルス5’UTRである、請求項1記載の植物発現系。前記コモウイルス5’UTRが、ササゲモザイクウイルス5’UTRである、請求項3記載の植物発現系。前記ササゲモザイクウイルス5’UTRが、SEQIDNO:23のヌクレオチド配列を含む、請求項4記載の植物発現系。前記1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーが、さらに、コモウイルス3’UTRを含む、請求項3記載の植物発現系。前記コモウイルス3’UTRが、ササゲモザイクウイルス3’UTRおよびプラストシアニン3’UTRから選ばれる、請求項6記載の植物発現系。前記第1核酸配列と第2核酸配列が同じ核酸分子上に配置されているか、或いは、これらの第1核酸配列および第2核酸配列が異なるDNA分子上に配置されている、請求項1記載の植物発現系。前記1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分が、インゲンマメ黄萎縮ウイルス長遺伝子間領域およびBeYDV短遺伝子間領域から選ばれる、請求項1記載の植物発現系。前記興味あるヌクレオチド配列が、インフルエンザ血球凝集素をコード化する、請求項1記載の植物発現系。前記インフルエンザ血球凝集素が、原生シグナルペプチド配列または非原生シグナルペプチドを含む、請求項10記載の植物発現系。前記インフルエンザ血球凝集素が、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15およびH16からなる群から選ばれる、請求項10記載の植物発現系。前記インフルエンザ血球凝集素が、インフルエンザB型血球凝集素、インフルエンザA型サブタイプH1血球凝集素、インフルエンザA型サブタイプH3血球凝集素、およびインフルエンザA型サブタイプH5血球凝集素からなる群から選ばれる、請求項10記載の植物発現系。第3核酸配列をさらに含み、該第3核酸配列がサイレンシングのサプレッサーをコード化する、請求項1記載の植物発現系。サイレンシングの前記サプレッサーが、群HcProおよびp19から選ばれる、請求項14記載の植物発現系。前記第3核酸配列と前記第1核酸配列が同じ分子上に配置されているか、或いは、前記第3核酸配列と前記第1核酸配列が異なる分子上に配置されている、請求項14記載の植物発現系。第4核酸配列をさらに含み、該第4核酸配列がシャペロンタンパク質をコード化する、請求項14記載の植物発現系。前記シャペロンタンパク質が、群Hsp40およびHsp70から選ばれる、請求項17記載の植物発現系。前記第4核酸配列と前記第1核酸配列が同じ分子上に配置されているか、或いは、前記第4核酸配列と前記第1核酸配列が異なるDNA分子上に配置されている、請求項18記載の発現系。1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節領域;興味あるヌクレオチド配列;1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分;およびジェミニウイルスレプリカーゼタンパク質をコード化する核酸配列を含む核酸配列を含む植物発現系。インフルエンザの粒子様ウイルスの植物中または植物の1部中での産生方法であって、前記植物中または前記植物の1部中に請求項10記載の植物発現系を導入する工程;および、前記植物または前記植物の1部を、前記インフルエンザ血球凝集素をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下にインキュベートし、それによって前記インフルエンザVLPを産生させる工程を含むことを特徴とする前記産生方法。前記導入工程において、前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項21記載の方法。前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項22記載の方法。前記インキュベート工程において、前記インフルエンザ血球凝集素をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現が一時的発現である、請求項21記載の方法。前記植物または前記植物の1部を収穫し、それによって前記インフルエンザVLPを含有する収穫植物または収穫植物の1部を得る工程をさらに含む、請求項21記載の方法。前記インフルエンザVLPを、前記インフルエンザVLPを含有する前記収穫植物または収穫植物の1部から分離し、それによって分離インフルエンザVLPを得る工程をさらに含む、請求項25記載の方法。前記導入工程において、前記植物発現系が第3核酸配列をさらに含み、該第3核酸配列がサイレンシング発現のサプレッサーをコード化する、請求項21記載の方法。前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項27記載の方法。前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項28記載の方法。前記導入工程において、前記植物発現系が第4核酸配列をさらに含み、該第4核酸配列がシャペロンタンパク質をコード化する、請求項27記載の方法。前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項30記載の方法。前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項31記載の方法。興味あるタンパク質の植物中または植物の1部中での産生方法であって、前記植物または前記植物の1部中に請求項1記載の植物発現系を導入する工程;および、前記植物または前記植物の1部を、前記興味あるタンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下にインキュベートし、それによって前記興味あるタンパク質を産生させる工程を含むことを特徴とする前記産生方法。前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項33記載の方法。前記第1核酸配列と前記第2核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項34記載の方法。前記興味あるタンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列の発現が一時的発現である、請求項33記載の方法。前記植物または前記植物の1部を収穫し、それによって前記興味あるタンパク質を含有する収穫植物または収穫植物の1部を得る工程をさらに含む、請求項33記載の方法。前記興味あるタンパク質を、前記興味あるタンパク質を含有する前記収穫植物または収穫植物の1部から分離し、それによって分離した興味あるタンパク質を得る工程をさらに含む、請求項37記載の方法。前記導入工程において、前記植物発現系が第3核酸配列をさらに含み、該第3核酸配列がサイレンシング発現のサプレッサーをコード化する、請求項33記載の方法。前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項39記載の方法。前記第3核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項40記載の方法。前記導入工程において、前記植物発現系が第4核酸配列をさらに含み、該第4核酸配列がシャペロンタンパク質をコード化する、請求項40記載の方法。前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を同じ分子上に配置するか、或いは、前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置する、請求項42記載の方法。前記第4核酸配列と前記第1核酸配列を異なる分子上に配置し、そして、これらの異なる分子を、前記植物中または前記植物の1部中に、同時に導入する、請求項43記載の方法。本発明は、興味あるタンパク質を植物中で産生させるための核酸および発現系に関する。上記発現系は、コモウイルス系発現カセットとジェミニウイルス系増幅成分を含む。また、上記興味あるタンパク質を含む植物細胞、植物組織、全植物、接種物、核酸、並びに興味あるタンパク質を植物中で発現させる方法も提供する。さらに、本発明は、1種または2種以上のコモウイルスエンハンサー、興味あるヌクレオチド配列および1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分と操作可能に連結している調節領域を含む第1核酸配列と、ジェミニウイルスレプリカーゼをコード化する第2核酸とを含む植物発現系も提供する。上記第1核酸配列と上記第2核酸配列は同じ核酸分子上に配置されていてもよく、或いは、これらの第1核酸配列と第2核酸配列は異なるDNA分子上に配置されていてもよい。例えば、上記植物発現系は、1種または2種以上のコモウイルスエンハンサーと操作可能に連結している調節配列;興味あるヌクレオチド配列;1種または2種以上のジェミニウイルス増幅成分を含む核酸配列;およびジェミニウイルスレプリカーゼタンパク質をコード化する核酸配列を含み得る。また、本発明は、同じまたは異なる核酸上に配置されたプロモーター配列、コモウイルス調節領域、1種以上の興味あるタンパク質をコード化する1種以上の配列およびジェミニウイルス増幅成分を含む核酸も提供する。該核酸は、ジェミニウイルスレプリカーゼ、コモウイルス3’非翻訳領域またはプラストシアニン3’UTR或いはジェミニウイルスレプリカーゼとコモウイルス3’UTRまたはプラストシアニン3’UTRとの組合せをコード化する配列もさらに含み得る。以下の説明においては、多くの用語を広範囲に亘って使用する;下記の定義は、本発明の多様な局面の理解を容易にするために提示する。本明細書においての、用語例のような実例の使用は、単なる説明目的であって、本発明の実施態様の範囲および意味を限定するものではない。用語ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、本明細書においては互換的に使用し、アミノ酸残基のポリマーを称する。これらの用語は、天然産生アミノ酸ポリマー並びに1個以上のアミノ酸残基が非天然産生アミノ酸、例えば、アミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書において使用するとき、これらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結している、全長タンパク質、例えば、抗原のような、任意の長さを有するアミノ酸鎖を包含する。本明細書において使用するとき、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体に関連しての用語誘導体は、アミノ酸残基置換体の導入、欠落および付加によって改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を称する。また、本明細書において使用するときの用語誘導体は、抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって変性されているポリペプチドまたはタンパク質も称する。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護遮断基による誘導体化、タンパク質分解的開裂、細胞質リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって変性し得る。誘導体、ポリペプチドおよびタンパク質は、限定するものではないが、特異的化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等のような当業者にとって既知の方法を使用する化学変性によって産生させ得る。ある種の実施態様においては、誘導体、ポリペプチドまたはタンパク質は、これらから誘導したポリペプチドまたはタンパク質と同様なまたは同一の機能を有する。本明細書において説明するような発現系は、2分節ウイルスまたは2分節ゲノムを有するウイルスをベースとする発現カセットを含む。例えば、本2分節ウイルスは、コモウイルス科であり得る。コモウイルス科の属種としては、コモウイルス、ネポウイルス、ファバウイルス、チェラウイルスおよびサドワウイルスがある。コモウイルスとしては、ササゲモザイクウイルス、ササゲ重度モザイクウイルス、スカッシュモザイクウイルス、レッドクローバー斑葉病ウイルス、ビーンポッド斑点病ウイルス、カブリングスポットウイルス、ソラマメ真性モザイクウイルス、ソラマメステインウイルス、ダイコンモザイクウイルスがある。本発明の各局面において有用であり得るエンハンサー成分を含むコモウイルスRNA‐2配列の例としては、限定するものではないが、CPMVRNA‐2、RCMVRNA‐2、BPMVRNA‐2、CPSMVRNA‐2、SqMVRNA‐2、TuRSVRNA‐2、BBtMVRNA‐2、BBSVRNA2、RaMVがある。上記2分節コモウイルスRNAゲノムのセグメントは、RNA‐1およびRNA‐2と称する。RNA‐1は複製に関与するタンパク質をコード化し、一方、RNA‐2は細胞間移動に必要なタンパク質および2つのカプシドタンパク質をコード化する。CPMV、CPSMV、SqMV、RCMVまたはBPMVのような任意の適切なコモウイルス系カセットを使用し得る;例えば、上記発現カセットは、CPMVをベースとし得る。発現カセットは、興味ある核酸を、この興味ある核酸の宿主細胞内での転写にとって適切なプロモーターまたは他の調節成分の制御下に且つこれらプロモーターまたは調節成分に操作可能に連結させて含むヌクレオチド配列を称する。全長を有するベンサミアナタバコの形質転換、即ち、CPMVの両ゲノムRNAの複製成分cDNAコピーが増殖感染をもたらし得ることは証明されている。CPMV系発現カセットの例は、WO2007135480号;WO2009087391号;さらに、SainsburyFetal2008PlantPhysiology1481212‐1218;SainsburyFetal2008PlantBiotechnologyJournal682‐92;SainsburyFetal2009PlantBiotechnologyJournal7682‐693に記載されている;これらの文献は、参考として本明細書に合体させる。限定とみなすべきではない例としては、5’リーダー配列中に見出される2つの最初の翻訳開始コドンが欠落しているササゲモザイクウイルスのゲノムRNA2から得られる非翻訳領域は、WO2009087391号に記載されているように使用し得る。CaMV35Sプロモーターおよびノパリンシンターゼターミネーターへ結合させたとき、これらの改変CPMVUTRは、隣接コーディング領域の翻訳を増強させていた。上記CPMV系発現系は、CPMV‐HTと命名した。本明細書において説明しているように、その配列がコモウイルスのような2分節RNAウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来し、ターゲット開始部位を変異させている発現エンハンサー配列は、興味ある核酸配列を発現させるのに使用し得る。さらに、本発明は、2分節ウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来する配列の発現または翻訳増進活性の増強方法も提供し、その方法は、配列中のターゲット開始部位を変異させることを含む。エンハンサー配列としては、コモウイルスのような2分節RNAウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来し、ターゲット開始部位を変異させている配列がある。そのような配列は、これら配列を結合させている非相同性ORFの下流発現を増強する。限定するものではないが、そのような配列は、転写RNA中に存在する場合、これらの配列を結合させている非相同性ORFの翻訳を増強し得るものと信じている。本明細書において説明するような、また、エンハンサー配列に関連してのターゲット開始部位は、当該エンハンサー配列が由来する2分節ウイルス、例えば、コモウイルスの野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントの開始部位である。このターゲット開始部位は、野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントがコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方である105Kタンパク質の産生における開始部位として作用する。105Kタンパク質の産生は、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメント中の位置161の開始部位において開始させる。従って、上記CPMVRNA‐2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列中のターゲット開始部位は、野生タイプCPMVRNA‐2中の位置161における開始部位であり得る。位置161の開始コドン前後の変異は、例えば開始コドンの前後を分裂させることによって位置161の開始コドン自体の変異と同じまたは同様な効果を有し得、開始コドンがより頻繁にバイパス化されることを意味し得る。上記エンハンサー配列は、ターゲット開始部位の上流およびまたは下流の1個以上のヌクレオチドを変異させることによって産生させた間接的に変異されたターゲット開始部位を含むが、野生タイプのターゲット開始部位を保持し得ている。上流、下流または上流および下流双方のヌクレオチドを変異させる効果は、ターゲット開始部位自体を変異させるときに観察される効果と同じまたは同様である。ターゲット開始部位は野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントがコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の産生のための開始部位として作用するとき、ターゲット開始部位は、上記野生タイプRNA‐2がコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の短い方の産生のための開始部位として作用する同じ野生タイプRNA‐2ゲノムセグメント上の第2開始部位とインフレームで存在する結果となる。2つの開始部位は、同じトリプレットリーディングフレーム内に存在する場合、インフレームで存在する。例えば、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列中のターゲット開始部位は、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメント中のCPMVRNA‐2がコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の短い方の産生における開始部位として作用する位置512における開始部位とインフレームで存在する。従って、上記エンハンサー配列が由来する野生タイプRNA‐2ゲノムセグメント中の第2開始部位の上流に位置するターゲット開始部位は、野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントがコード化する2つのカルボキシ共末端ポリタンパク質の短い方の産生における開始部位として作用し得る。さらに、ターゲット開始部位も、上記エンハンサー配列が由来する野生タイプRNA‐2ゲノム中の第3開始部位の下流に位置し得る。CPMVにおいては、位置161のターゲット開始部位は、95Kタンパク質の産生における開始部位として作用する位置512の第2開始部位の上流に位置する。また、位置115の第3開始部位も存在する。従って、2分節ウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列中のターゲット開始部位は、野生タイプRNA‐2がコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の産生における2つの開始部位の第1部位である。この関連における第1部位は、野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントの5’末端のより近くに位置する開始部位と称する。上記配列中の2以上の開始部位は、必要に応じて変異させ得る。例えば、位置115における上記‘第3’開始部位も欠落または変化させ得る。AUG161の除去に加えAUG115の除去は発現をさらに増強させることが証明されている。例えば、本発明のエンハンサー配列は、2分節RNAウイルスのRNA‐2ゲノムセグメント由来の変性配列をベースとし得る。これらのコモウイルスおよび数種の特定株のRNA‐2ゲノムセグメントの配列は、NCBIデータベースから、括弧内に示す受託番号により入手可能である:ササゲモザイクウイルスRNA‐2、ササゲ重度モザイクウイルスRNA‐2、スカッシュモザイクウイルスRNA‐2、スカッシュモザイクウイルスキンブル株RNA‐2、スカッシュモザイクウイルスアリゾナ株RNA‐2、レッドクローバー斑葉病ウイルスRNA‐2、ビーンポッド斑点病ウイルスRNA‐2、ビーンポッド斑点病ウイルスK‐Hopkins1株RNA‐2、ビーンポッド斑点病ウイルスK‐Hancock1株RNA‐2、アンデスポテト斑点病ウイルスおよびダイコンモザイクウイルス。また、ビーンルゴースモザイクウイルスおよびコモウイルス属の暫定的メンバー、即ち、カブリングスポットウイルスから入手し得る部分RNA‐2配列も存在する。また、コモウイルス科の他の属種由来の多くの配列も入手可能である。今日まで、研究されてきた全てのコモウイルスは、それらウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来する2つのカルボキシ共末端ポリタンパク質の発現における2つの選択的開始コドンを有することが証明されている。特に、CPMV、CPSMV、BPMV、SqMVおよびRCMVのRNA‐2ゲノムセグメントは、2つのカルボキシ共末端ポリタンパク質の発現における2つの選択的開始コドンを含むことが知られている。他のコモウイルス中のターゲット開始部位は、CPMVの野生タイプRNA‐2セグメント中の位置161の開始部位と等価であり、従って、当該技術において知られているような方法によって同定し得る。例えば、興味ある配列は、BLASTのような標準の配列アラインメント方法を使用して或いはCMPVの配列によるマニュアルアラインメントによって位置合せして、相応する等価の開始部位の位置を判定し得る。本明細書において説明しているように、上記エンハンサー配列は、例えば、位置161のターゲット開始部位を変異させているところのCPMVRNA‐2ゲノムセグメントのヌクレオチド1~512または1~509を含み得る。また、上記エンハンサー配列は、CPMVの位置161の開始コドンと等価のターゲット開始部位を変異させているところの他のコモウイルス由来の等価の配列も含み得る。ターゲット開始部位は、置換、欠落または挿入によって変異させ得る。例えば、ターゲット開始部位は、点変異によって変異させ得る。上記CPMVエンハンサーは、下記に示すようなSEQIDNO:23を含み得るはアンダーラインを付している:TATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTG本発明のエンハンサー配列は、上記CPMVRNA‐2配列との、少なくとも99、98、97、96、95、90、85、80、75、70、65、60、55または50或いはこれらの間の任意の量の同一性を含み得、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメントの位置161に相応するターゲット開始部位は、置換、欠落または挿入によって変異させている。例えば、上記エンハンサー配列は、上記CPMVRNA‐2配列との、約80~約99、約90~約99または約95~99或いはこれらの間の任意の量の同一性を含み得、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメントの位置161に相応するターゲット開始部位は、置換、欠落または挿入によって変異させている。特定の配列に言及するときの用語パーセント類似性、パーセント同一性およびパーセント相同性は、例えば、UniversityofWisconsinGCGソフトウェアプログラムに説明されているようにして使用する。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術において周知である。比較のための最適の配列アラインメントは、例えば、SmithおよびWatermanのアルゴリズムを使用して、NeedlemanおよびWunschのアラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipmanの類似性方法の研究によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理の実施575ScienceDrMadisonWisにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAによって、或いはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって実施し得る。パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST20アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムは、それぞれ、Altschul等およびAltschul等によって説明されている。BLASTおよびBLAST20は本明細書において説明するパラメーターと一緒に使用して、本発明の核酸およびタンパク質におけるパーセント配列同一性を判定する。例えば、BLASTNプログラムは、デフォルトとして、11の語調、10の期待値、M5、N-4および両ストランドの比較を使用し得る。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3の語調および10の期待値、さらに、50のBLOSUM62スコアリングマトリックスアラインメント、10の期待値、M5、N-4および両ストランドの比較を使用し得る。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、NationalCenterforBiotechnologyInformationにより公的に入手可能である。また、エンハンサー配列は、緊縮条件下に、CPMVRNA‐2の相補配列によってハイブリッド化し得る;但し、野生タイプCPMVRNA‐2ゲノムセグメント中の位置161に相応するターゲット開始部位が変異されていることを条件とする。緊縮ハイブリッド化条件下でのハイブリッド化は、当該技術において既知であるColdSpringHarborLaboratory1982;SambrookandRussellinMolecularCloningALaboratoryManual3rdedition2001を参照されたい;これらの各々は、参考として本明細書に合体させる。1つのそのような緊縮ハイブリッド化条件の例は、65°Cの4XSSC中での約16~20時間のハイブリッド化と、その後の65°Cの01XSSC中での1時間の洗浄または65°Cの01XSSC中での各々20分間または30分間の2回洗浄であり得る。また、典型的な緊縮ハイブリッド化条件は、42°Cの50ホルムアミド、4XSSC中での1夜処理と、その後の65°Cの01XSSC中での1時間の洗浄または65°Cの01XSSC中での各々20分間もしくは30分間または1夜の2回洗浄、或いは65°Cのチャーチ水性リン酸緩衝液中でのハイブリッド化と、01XSSC、01SDS中での各々20分間もしくは30分間の50°Cでの2回洗浄または2XSSC、01SDS中での各々20分間もしくは30分間の65°Cでの2回洗浄であり得る。本発明のエンハンサー配列中のターゲット開始部位は、欠落、挿入または置換によって変異させて、上記ターゲット開始部位が翻訳開始部位としてもはや機能しないようにし得る。例えば、点変異を上記エンハンサー配列中の上記ターゲット開始部位の位置においてなし得る。或いは、上記エンハンサー配列中の上記ターゲット開始部位を部分的にまたは全体的に欠落させてもよい。例えば、上記エンハンサー配列中の上記ターゲット開始部位に亘る欠落をなし得る。上記開始部位に亘る欠落は、その欠落が上記開始部位に亘ることを条件として、上記エンハンサー配列が由来する野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントの配列と比較したとき、長さにおいて約5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個または50個のヌクレオチドであり得る。理論によって拘束することは望まないものの、CPMV中の位置161の開始コドンの変異は、翻訳サプレッサーの不活性化に至り、この不活性化は、不活性化翻訳サプレッサーの下流に位置する開始コドンからの翻訳開始の増進をもたらすと考えられる。従って、本明細書において説明するようにして使用する上記エンハンサー配列は、2分節ウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来し得、上記エンハンサー配列は不活性化翻訳サプレッサー配列を含む。翻訳サプレッサー配列は、当該エンハンサー配列が由来し、野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントがコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の産生における開始部位を含むまたはこの開始部位からなる2分節ウイルスの野生タイプRNA‐2ゲノムセグメント中の配列であり得る。CPMVRNA‐2ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列中の翻訳サプレッサー配列は、上記で説明したターゲット開始部位を含むまたはこの開始部位からなる配列である。従って、翻訳サプレッサー配列は、上記で説明したターゲット開始部位を含みまたはこの開始部位からなり、上記で説明したような変異誘発によって不活性化し得る。本開示は、上記で説明しているような発現エンハンサー配列を含む分離核酸を提供する。本明細書において使用するときの核酸または核酸分子は、1本鎖型または2本鎖型いずれかの任意のDNAまたはRNA分子であって、1本鎖型の場合は、線状または円形いずれかのその相補配列を有する分子を称する。核酸分子を議論するに当っては、この場合、特定の核酸分子の配列または構造を、5’から3’の方向の配列を用いる通常の慣例に従って説明することができる。本発明の核酸に関しては、分離核酸なる用語を、必要に応じて使用する。この用語は、DNAに当てはめる場合、由来する生物体の天然産生ゲノム中で直接隣接する配列から分離したDNA分子を称する。例えば、分離核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクター中に挿入した或いは原核もしくは真核細胞または宿主生物体のゲノムDNA中に一体化させたDNA分子を含み得る。RNAに当てはめる場合、用語分離核酸は、主として、上記で定義したような分離DNA分子がコード化するRNA分子を称する。また、該用語は、その自然状態において関連している他の核酸から十分に分離されているRNA分子も称し得る。分離核酸は、さらに、生物学的または合成手段によって直接産生させ且つ産生中に存在する他の成分から分離した分子も示し得る。従って、上記核酸は、上記エンハンサーが由来する2分節RNAウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントの1部またはフラグメントを含み得る。例えば、上記核酸は、その核酸が由来するRNA‐2ゲノムセグメントのコーディング領域の少なくとも1部を含み得ない。上記コーディング領域は、2つのカルボキシ共末端タンパク質の短い方をコード化するRNA‐2ゲノムセグメントの領域であり得る。上記核酸は、野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントの5’末端から野生タイプRNA‐2ゲノムセグメントがコード化する2つのカルボキシ共末端タンパク質の短い方の産生を開始させる開始部位までに及ぶ2分節ウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントの1部を含み得る。本明細書において説明しているように、上記で説明しているようなエンハンサー配列を含む1種以上の発現系を提供する。また、上記発現系は、上記エンハンサー配列の下流に挿入した興味あるタンパク質をコード化する興味ある核酸も含み得る。興味ある遺伝子、興味あるヌクレオチド配列または興味あるコーディング領域とは、宿主生物体、例えば、植物中で発現さるべきで且つ興味あるタンパク質を産生し得る任意の遺伝子、ヌクレオチド配列またはコーディング領域を意味する。そのような興味あるヌクレオチド配列としては、限定するものではないが、産生物が工業用酵素、タンパク質補助品、栄養補助食品、付加価値製品、或いは飼料、食品または飼料および食品用途双方用のそのフラグメントである遺伝子またはコーディング領域があり得る。また、興味あるヌクレオチド配列またはコーディング領域としては、薬剤活性タンパク質、例えば、成長因子、生長調節物質、抗体、抗原およびこれら物質のフラグメント、或いは免疫化またはワクチン接種において有用なこれら物質の誘導体等をコード化する遺伝子があり得る。そのようなタンパク質としては、限定するものではないが、インターロイキン、例えば、IL‐1~IL‐24の1種または2種以上、IL‐26およびIL‐27;サイトカイン;エリスロポイエチン;インスリン;G‐CSF、GM‐CSF、hPG‐CSF、M‐CSFまたはこれらの組合せ;インターフェロン、例えば、インターフェロン‐アルファ、インターフェロン‐ベータ、インターフェロン‐ガンマ;血液凝固因子、例えば、第VIII因子、第IX因子またはtPAhGH;受容体;受容体作用薬;抗体;神経ポリペプチド;インスリン;ワクチン;成長因子、例えば、限定するものではないが、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、形質転換増殖因子;成長調節物質;抗原、自己抗原、これらのフラグメントまたはこれらの組合せがある。また、興味あるタンパク質としては、インフルエンザ血球凝集素がある。HAは、ホモトリマー膜タイプI糖タンパク質であり、一般に、シグナルペプチド、HA1ドメイン、並びにC‐末端の膜貫通性アンカー部位および小細胞質尾部を含むHA2ドメインを含む。HAをコード化するヌクレオチド配列は、周知であり、入手可能である:biohealthbaseorgGSearchhomedodecoratorInfluenza;或いは、NationalCenterforBiotechnologyInformationが維持するデータベースを参照されたい;両データベースは、参考として本明細書に合体させる。HAタンパク質は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15およびH16の群から選ばれるA型インフルエンザ、B型インフルエンザ、またはA型インフルエンザHAのサブタイプであり得る。本発明のある局面においては、HAは、A型インフルエンザに由来し、群H1、H2、H3、H5、H6、H7およびH9から選ばれ得る。上記のHAのフラグメントも、興味あるタンパク質とみなし得る。さらにまた、上記のHAタイプまたはサブタイプ由来のドメインは、結合させてキメラHAを産生させることもできる。HAタンパク質を含むサブタイプの例としては、Aニューカレドニア2099、Aインドネシア52006、Aニワトリニューヨーク1995、AセグロカモメDE67788、Aテキサス322003、AマガモMN3300、Aアヒル上海12000、AオナガガモTX82818902、Aシチメンチョウオンタリオ611868、AハシビロガモイランG5403、AニワトリドイツN1949、Aアヒルイングランド56、Aアヒルアルバータ6076、Aカモメメリーランド70477、Aマガモグリエフ26382、Aアヒルオーストラリア34183、Aユリカモメスウェーデン599、Bリー40、Cヨハネスブルグ66、Aプエルトリコ834、Aブリスベン592007、Aソロモン諸島32006、Aブリスベン102007、Aウィスコンシン672005、Bマレーシア25062004、Bフロリダ42006、Aシンガポール157、A安徽12005、Aベトナム11942004、Aコガモ香港W31297、Aウマプラハ56、A香港107399がある。HAタンパク質は、H1、H2、H3、H5、H6、H7またはH9サブタイプであり得る。例えば、H1タンパク質は、Aニューカレドニア2099、Aプエルトリコ834、Aブリスベン592007、Aソロモン諸島32006、Aカリフォルニア042009またはAカリフォルニア072009株に由来し得る。また、H3タンパク質も、Aブリスベン102007、Aウィスコンシン672005またはAパース162009株に由来し得る。本発明のさらなる局面においては、H2タンパク質は、Aシンガポール157株に由来し得る。H5タンパク質は、A安徽12005、Aベトナム11942004またはAインドネシア52005株に由来し得る。本発明の1つの局面においては、H6タンパク質は、Aコガモ香港W31297株に由来し得る。H7タンパク質は、Aウマプラハ56株に由来し得る。本発明の1つの局面においては、H9タンパク質は、A香港107399株に由来し得る。本発明のさらなる局面においては、HAタンパク質は、Bマレーシア25062004、Bフロリダ42006またはBブリスベン6008のようなB型ウイルスであり得るインフルエンザウイルスに由来し得る。H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9またはBサブタイプ由来のHAタンパク質のアミノ酸配列の例は、WO2009009876号、WO2009076778号、WO2010003225号に記載されているような配列がある。インフルエンザウイルスHAタンパク質は、H5インドネシアであり得る。上記HAは、原生または非原生シグナルペプチドを含み得る;非原生シグナルペプチドは、植物由来であり得る。例えば、シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドであり得る。原生シグナルペプチドは、発現させている血球凝集素のシグナルペプチドに相応し得、或いは第2血球凝集素に相応し得る。また、本発明は、HAタンパク質をコード化する配列を含む核酸分子も提供する。該核酸分子は、HAタンパク質をコード化する上記配列に操作可能に連結している1種以上の調節領域をさらに含む。上記核酸分子は、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16またはB型インフルエンザ由来のHAをコード化する配列を含み得る。例えば、上記核酸分子がコード化するHAタンパク質は、H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9サブタイプおよびB型由来のHAであり得る。上記核酸分子がコード化するH1タンパク質は、Aニューカレドニア2099、Aプエルトリコ834、Aブリスベン592007、Aソロモン諸島32006、Aカリフォルニア042009またはAカリフォルニア072009株に由来し得る。上記核酸分子がコード化するH3タンパク質は、Aブリスベン102007、Aウィスコンシン672005またはAパース162009株に由来し得る。上記核酸分子がコード化するH2タンパク質は、Aシンガポール157株に由来し得る。また、上記核酸分子がコード化するH5タンパク質も、A安徽12005、Aベトナム11942004またはAインドネシア52005株に由来し得る。上記核酸分子がコード化するH6タンパク質は、Aコガモ香港W31297株に由来し得る。また、上記核酸分子がコード化するH7タンパク質も、Aウマプラハ56株に由来し得る。さらに、上記核酸分子がコード化するH9タンパク質は、A香港107399株に由来し得る。上記核酸がコード化するB型由来のHAタンパク質は、Bフロリダ42006、Bマレーシア25062004またはBブリスベン6008株に由来し得る。H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9サブタイプまたはB型由来のそのようなHAタンパク質をコード化する核酸分子の配列の例は、WO2009009876号、WO2009076778号、WO2010003225号に記載されているような配列がある。上記核酸配列は、インフルエンザウイルスHAタンパク質H5インドネシアをコード化し得る。上記興味ある核酸配列が植物に対して直接または間接的に毒性である産生物をコード化する場合、そのような毒性は、上記興味あるヌクレオチド配列を所望の組織内でまたは植物発育の所望の段階において選択的に発現させることによって低下させ得る。上記興味あるコーディング領域または上記興味あるヌクレオチド配列は、形質転換されているか或いは本発明のヌクレオチド配列、または核酸配列、または遺伝子構築物、またはベクターを含む任意の適切な植物宿主中で発現させ得る。適切な宿主の例としては、限定するものではないが、シロイヌナズナ;例えば、キャノーラ、アブラナ種、トウモロコシ、ニコチアナ種、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、オートムギ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、コットン、トウキビ、ライムギ、ソルガム、ベニバナのような農作物がある。従って、本明細書において説明するように、上記で説明したようなエンハンサー配列および興味あるタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、上記ヌクレオチド配列が上記エンハンサー配列の下流に位置するところの発現系を提供する。上記ヌクレオチド配列および興味あるタンパク質は、上記エンハンサー配列が由来する野生タイプ2分節RNAウイルスに対して非相同性であり得、また、上記RNAウイルスによってコード化され得ない。発現系は、興味あるタンパク質を宿主生物体中で発現させるのに使用し得る。例えば、興味あるタンパク質は、当該宿主生物体にとって非相同性であり得、当該細胞中に、遺伝子操作、形質転換法、または形質転換およびその後の繁殖によって導入し得る。生物体内の非相同性ヌクレオチド配列は、同じまたは同様な機能を通常奏する内在性の等価のヌクレオチド配列と置換わり得る、或いは、挿入配列を上記内在性ヌクレオチド配列に付加し得る。当業者であれば、興味あるヌクレオチド配列の発現は発現すべき遺伝子の上流に位置する開始部位の存在を必要とすることを理解しているであろう。そのような開始部位は、エンハンサー配列の1部としてまたは興味あるタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の1部として付与し得る。調節領域、調節成分またはプロモーターとは、DNAもしくはRNAまたはDNAとRNAの双方からなり得る、遺伝子のタンパク質コーディング流域の典型的には、常にではないが、上流の核酸の1部を意味する。調節領域が活性であり、興味ある遺伝子と操作可能に関連しているかまたは操作可能に連結している場合、この領域は、興味ある遺伝子の発現をもたらし得る。調節成分は、臓器特異性を介在し或いは発現上のまたは一時的遺伝子活性を制御し得ることが可能である。調節領域としては、プロモーター成分、基本的プロモーター活性を示すコアプロモーター成分、外的刺激に対する応答において誘発性である成分、負の調節成分または転写エンハンサーのようなプロモーター活性介在成分がある。また、調節領域としては、本明細書において使用するとき、活性な以下の転写性である成分、例えば、遺伝子発現を調節する翻訳および転写エンハンサーのような調節成分、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列およびmRNA不安定性決定因子もある。これら後者の成分の数種は、上記コーディング領域の近位に位置し得る。本開示の関連において、用語調節成分または調節領域は、典型的には、上記コーディング領域発現を、転写に必要なRNAポリメラーゼおよびまたは他の因子が特定の部位において開始する認識をもたらすことによって制御する、構造遺伝子のコーディング配列の通常、常にではないが、上流のDNA配列を称する。しかしながら、イントロンまたは上記配列の3’内に位置する他のヌクレオチド配列も興味あるコーディング領域発現の調節に寄与することを理解すべきである。RNAポリメラーゼまたは他の転写因子が特定の部位における開始を確保する認識をもたらす調節成分の例は、プロモーター成分である。殆どの真核生物プロモーター成分は、TATAボックス、即ち、転写開始部位のおよそ25塩基対上流に通常位置するアデノシンとチミジンのヌクレオチド塩基対からなる保存核酸配列を含有する。プロモーター成分は、転写の開始に関与する基本プロモーター成分並びに遺伝子発現を改変する他の調節成分を含み得る。発現的に調節されており、誘発性でまたは構造性である調節領域のような数タイプの調節領域が存在する。発現的に調節されている或いは遺伝子の差次的発現をその制御下に制御する調節領域は、ある種の臓器または臓器の組織内で、その臓器または組織の発育中の特定の時期に活性化される。しかしながら、発現的に調節されている数種の調節領域は、ある種の臓器または組織内で特定の発育段階において選択的に活性であり得、また、これらの調節領域は、発現的に調節された形で或いは植物内の他の臓器または組織中の基本的レベルにおいても同様に活性であり得る。組織特異性調節領域、例えば、シー特異性調節領域の例としては、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターがある。葉特異性プロモーターの例としては、プラストシアニンプロモーターがある。誘発性調節領域は、1種以上のDNA配列または遺伝子の転写を誘発因子に応答して直接または間接的に活性化し得る調節領域である。誘発因子の不存在においては、上記DNA配列または遺伝子は、転写しない。典型的には、誘発性調節領域に特異的結合して転写を活性化させるタンパク質因子は、不活性形で存在し、その後、誘発因子により、直接または間接的に活性形に転換し得る。しかしながら、上記タンパク質因子は、存在しなくてもよい。上記誘発因子は、タンパク質、代謝物、成長調節剤、除草剤またはフェノール化合物のような化学剤、或いは熱、寒さ、塩または毒性成分によって直接的にまたはウイルスのような病原体または病因物質の作用によって間接的に負わされる生理的ストレスであり得る。誘発性調節領域を含む植物細胞は、誘発因子に、散水、打ち水、過熱または同様な方法によるように、誘発因子を細胞または植物に外から適用することによって暴露し得る。誘発性調節成分は、植物遺伝子または非植物遺伝子に由来し得る。可能性がある誘発性プロモーターの例としては、限定するものではないが、テトラサイクリン誘発性プロモーター、ステロイド誘発性プロモーター、エタノール誘発性プロモーター、サイトカイニン誘発性IB6およびCKI1遺伝子およびオーキシン誘発性成分DR5がある。構成調節領域は、遺伝子の発現を、植物の各種部分全体に亘って、また、植物発育の全体に亘って連続して管理する。既知の構成調節成分の例としては、CaMV35S転写物と関連するプロモーター、コメアクチン1、アクチン2またはtms2;並びに、トリオースリン酸イソメラーゼ1遺伝子、トウモロコシユビキチン1遺伝子、シロイヌナズナユビキチン1および6遺伝子、タバコ翻訳開始因子4A遺伝子、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター、pCAS、リブロース二リン酸カルボキシゲナーゼの小サブユニットのプロモーター、pRbcS、pUbiがある。本明細書において説明しているように、葉発現において立証された有効性を有するエンハンサー配列を含むプロモーターは、一時的発現において有効であることが判明している。理論によって拘束することは望まないものの、核マトリックスへの結合による光合成遺伝子の上流調節成分の結合が強力な発現を介在し得ている。例えば、エンドウマメプラストシアニン遺伝子の翻訳開始部位から-784までを使用して、強力なレポーター遺伝子発現を介在し得ている。本明細書において使用するときの用語構成は、上記構成調節領域の制御下の遺伝子が全ての細胞タイプにおいて同じレベルで発現されることを必ずしも示唆するものではなく、遺伝子は、広範囲の細胞タイプにおいて、大きく変動しているとしても発現されていることが多くの場合観察されている。操作可能に連結しているとは、特定の配列、例えば、調節成分と興味あるコーディング領域とが直接または間接的に相互作用して、遺伝子発現の介在または調節のような意図する機能を遂行することを意味する。操作可能に連結した各配列の相互作用は、例えば、操作可能に連結した各配列と相互作用するタンパク質が介在し得る。本発明の1種または2種以上のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、または構築物、またはベクターによって形質転換されている任意の適切な植物宿主中で発現させることができる。適切な宿主の例としては、限定するものではないが、シロイヌナズナ;例えば、キャノーラ、アブラナ種、トウモロコシ、ニコチアナ種、アルファルファ、ジャガイモ、サツマイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、オートムギ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、コットン、トウキビ、ライムギ、ソルガム、ベニバナのような農作物がある。本発明の1種以上の構築物は、3’非翻訳領域をさらに含み得る。3’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセッシングまたは遺伝子発現をもたらし得る任意の他の調節シグナルを含有するDNAセグメントを含む遺伝子のその部分を称する。ポリアデニル化シグナルは、mRNAプレカーサーの3’末端へのポリアデニル酸トラックの付加をもたらすことに特徴を有する。ポリアデニル化シグナルは、一般に、標準形5’AATAAA‐3’に対する相同性の存在によって認識されるが、変形は稀ではない。また、本発明の1種以上のキメラ遺伝子構築物は、必要に応じて、翻訳または転写エンハンサーいずれかのさらなるエンハンサーも含み得る。これらのエンハンサー領域は、当業者にとって周知であり、ATG開始コドンおよび隣接配列を含み得る。上記開始コドンは、配列全体の翻訳を確保するためにはコーディング配列の読み枠と一致しなければならない。適切な3’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼのようなアグロバクテリウム腫瘍誘発性プラスミド遺伝子と、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子、リブローゼ‐1の小サブユニット、5‐ビスホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子、プラストシアニン発現の調節において使用するプロモーターのような植物遺伝子とのポリアデニル化シグナルを含有する3’転写非翻訳領域である。また、末端配列も、2分節RNAウイルス、例えば、コモウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来する末端配列であり得る。例えば、末端配列は、上記エンハンサー配列が由来する同じ2分節RNAウイルスに由来し得る。末端配列は、停止コドンを含み得る。また、末端配列は、ポリアデニル化シグナルによって追跡し得る。本明細書において説明しているような発現系は、プロモーターおよび末端配列に操作可能に連結させ得る。従って、発現系は末端配列をさらに含み得、興味あるタンパク質をコード化する遺伝子は、エンハンサー配列と末端配列の間、即ち、エンハンサー配列のの下流で且つ末端配列のの上流に位置し得る。そのように、本開示は、上記で説明したようなエンハンサー配列に操作可能に連結させたプロモーター、興味あるヌクレオチド配列、および末端配列を含む発現カセットをさらに提供する。また、本発明の発現カセット、発現構築物および発現系は、非翻訳領域も含み得る。UTRは、上記発現カセット中に存在するターミネーター配列の上流に位置し得る。上記発現カセットが興味あるタンパク質をコード化する核酸を含む場合、上記UTRは、興味ある核酸の下流に位置し得る。従って、上記UTRは、興味あるタンパク質をコード化する核酸とターミネーター配列に間に位置し得る。上記UTRは、2分節RNAウイルスに、例えば、2分節RNAウイルスのRNA‐2ゲノムセグメントに由来し得る。上記UTRは、上記発現カセット中に存在する上記エンハンサー配列が由来する同じRNA‐2ゲノムセグメントの3’UTRであり得る。好ましくは、上記UTRは、コモウイルスRNA‐2ゲノムセグメントの3’UTR、例えば、CPMVRNA‐2ゲノムセグメントの3’UTRである。上述するような発現構築物は、ベクター中に存在し得る。ベクターは、発現カセットの生物体または宿主のゲノムへの移入または組込みを可能にする境界配列を含み得る。上記構築物は、植物バイナリーベクター、例えば、pPZPをベースとするバイナリー形質転換ベクターであり得る。構築物の他の例としては、pBin19がある。必要に応じて、本発明の構築物は、選択可能なマーカーを含むようにさらに操作し得る。しかしながら、このことは、必須ではあり得ない。有用な選択可能なマーカーとしては、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンのような抗生物質、またはホスフィノトリシン、グリホサート、クロロスルフロンのような除草剤等のような化学薬品に対する耐性をもたらす酵素がある。同様に、GUSのような変色或いはルシフェラーゼまたはGFPのような発光によって同定可能な化合物の産生をもたらす酵素も使用し得る。本明細書において説明しているようにして使用することのできるベクターの例は、発現カセットの5’リーダーと3’UTR間のポリリンカーの使用により直接のクローニングを可能にするpEAQベクターである。また、このベクターも、これもまた遺伝子サイレンシングのサプレッサーおよびNPTIIを含有するT‐DNA上に位置した上記で説明したような翻訳エンハンサーを含み得る。また、上記ポリリンカーは、N‐またはC‐末端Hisタグの興味あるタンパク質への内包を可能にしてタンパク質精製を容易にする1群または2群の6×ヒスチジン残基をコード化し得る。転写後遺伝子サイレンシングは、植物中での導入遺伝子発現の抑制に関与し得、また、ジャガイモウイルスY由来のサイレンシングのサプレッサーの共発現を使用して導入遺伝子mRNAの特異的分解に対抗し得る。サイレンシングの別のサプレッサーは、当該技術において周知であり、例えば、限定するものではないが、以下を本明細書において説明しているようにして使用し得る:TEV‐p1HC‐Pro、BYV‐p21、トマトブッシースタントウイルスのp19、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質、キュウリモザイクウイルスの2b、ジャガイモウイルスXのp25、ジャガイモウイルスMのp11、ジャガイモウイルスSのp11、ブルーベリースコーチウイルスのp16、カンキツトリステザウイルスのp23、ブドウ葉巻随伴病ウイルス‐2のp24、ブドウ葉巻ウイルスAのp10、ブドウ葉巻ウイルスBのp14、ハナウド潜在ウイルスのp10またはニンニク共通潜在ウイルスのp16。従って、サイレンシングの1種以上のサプレッサー、例えば、限定するものではないが、HcPro、TEV‐p1HC‐Pro、BYV‐p21、TBSVp19、TCV‐CP、CMV‐2b、PVX‐p25、rgsCaM、FHV由来のB2タンパク質、CPMVの小外被タンパク質、TCV由来の外被タンパク質、PVM‐p11、PVS‐p11BScV‐p16、CTV‐p23、GLRaV‐2p24、GBV‐p14、HLV‐p10、GCLV‐p16またはGVA‐p10を上記コモウイルス系発現カセット、ジェミニウイルス由来増幅成分、および興味あるタンパク質コード化する上記核酸配列と一緒に共発現させて、植物内での高レベルのタンパク質産生を確保することができる。また、上記発現系は、ジェミニウイルス由来の増幅成分、例えば、インゲンマメ黄萎縮ウイルス由来の増幅成分も含み得る。BeYDVは、双子葉植物に順応したマストレウイルス属に属する。BeYDVは、1本鎖円形DNAゲノムを有する単深裂体であり、ローリングサークルメカニズムによって極めて大量のコピー数に複製し得る。BeYDV由来DNAレプリコンベクター系は、植物中での急速高収率タンパク質産生において使用されている。本明細書において使用するとき、用語増幅成分とは、ジェミニウイルスゲノムの1つ以上の長遺伝子間領域の少なくとも1部を含む核酸セグメントを称する。本明細書において使用するとき、長遺伝子間領域、長遺伝子間繰返しまたはLIRとは、ジェミニウイルスRepタンパク質による切除および複製を介在し得るrep結合部位を含有する長遺伝子間領域の領域を称する。ある局面においては、1つ以上のLIRを含む上記核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短遺伝子間領域をさらに含み得る。本明細書において使用するとき、短遺伝子間領域、小遺伝子間領域またはSIRとは、相補ストランドを称する。任意の適切なジェミニウイルス由来増幅成分を本発明において使用し得る。例えば、WO200020557号、WO2010025285、ZhangX等、HuangZ等、HuangZ等を参照されたい;これらの文献は、参考として本明細書に合体させる。図2Bおよび2Dに示しているように、2つ以上のLIR,例えば、2つのLIRを上記構築物において使用する場合、上記プロモーター、CMPV‐HT領域、興味ある核酸配列およびターミネーターは、2つのLIRの各々によって囲まれている。さらにまた、上記増幅成分は、例えば、HalleyStottetalArchivesofVirology1521237‐1240に開示され、GenBank受託番号DQ458791として寄託されているような配列に由来し得る;上記文献は、参考として本明細書に合体させる。LIRとSIRを含む核酸セグメントは、所望の配列をBeYDVについて本明細書において提供している配列と位置合せすることによって究明し得る。例えば、上記配列、即ち、GenBankDQ458791号のLIRを含む核酸セグメントは、ヌクレオチド2401~2566および1~128を含む。SIRを含む核酸セグメントは、ヌクレオチド1154~1212である。本明細書において説明しているように、インゲンマメ黄萎縮ウイルス由来のベクターとRepRepA供給ベクターとのベンサミアナタバコ葉のアグロ浸潤による共産出は、有効なレプリコン増幅と堅調なタンパク質産生をもたらしている。コモウイルス系発現カセットおよびジェミニウイルス系増幅成分は、それぞれ、第1および第2ベクターからなり得、或いは、各構成成分を1つのベクターに含ませ得る。2つのベクターを使用する場合、第1および第2ベクターは、植物細胞中に、同時にまたは別々に導入し得る。また、ウイルスレプリカーゼも本明細書において説明しているような発現系中に含ませて興味ある核酸の発現を増強させ得る。レプリカーゼの非限定的な例は、BeYDVRepおよびRepAをコード化するBeYDVレプリカーゼである。レプリカーゼのもう1つの非限定的な例は、Halley‐Stott等に開示され、GenBank受託番号DQ458791として寄託されている。C1:C2遺伝子を含む核酸セグメントは、ヌクレオチド1310~2400を含む。共発現させるとは、2以上のヌクレオチド配列を植物内または植物の同じ組織内でおよそ同時に発現させることを意味する。しかしながら、上記複数のヌクレオチド配列は、正確に同時に発現させる必要はない。むしろ、上記2以上のヌクレオチド配列は、コード化産生物が相互作用をする機会を有するような方法で発現させる。上記2以上のヌクレオチド配列は、一時的発現系を使用して共発現させ得る;この場合、上記2以上の配列を、植物内に、両配列を発現させる条件下におよそ同時に導入する。別法としては、上記ヌクレオチド配列の1つを含むプラットフォーム植物を、興味あるタンパク質をコード化し且つ上記プラットフォーム植物に一時的な形で導入したさらなる配列によって安定した形で形質転換させてもよい。本発明の構築物は、植物細胞中に、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接DNA形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して導入し得る。そのような方法を評価するには、例えば、WeissbachandWeissbachMethodsforPlantMolecularBiologyAcademyPressNewYorkVIIIpp421‐463;GeiersonandCoreyPlantMolecularBiology2dEd;および、MikiandIyerFundamentalsofGeneTransferinPlantsInPlantMetabolism2dEdDTDennisDHTurpinDDLefebrveDBLayzellAddisonWeslyLangmansLtdLondonpp561‐579を参照されたい。他の方法としては、直接DNA取込み、リポソームの使用、例えばプロトプラストを使用するエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカ法、および減圧浸潤法がある。例えば、Bilang等;Scheid等;Guerche等;Neuhause等;Klein等;Freeman等;Howell等;Horsch等;DeBlock等;MethodsforPlantMolecularBiology;MethodsinPlantMolecularBiology;WO9209696号;WO9400583号;EP331083号;EP175966号;LiuおよびLomonossoff;EP290395号;WO8706614号;米国特許第4945050号、第5036006号および第5100792号;米国特許出願第08438666号および第07951715号。一時的発現方法を使用して、本発明の構築物を発現させ得る。また、Kapila等またはWO00063400号、WO00037663号によって開示されているような真空に基づく一時的発現方法も使用し得る。これらの方法としては、例えば、限定するものではないが、アグロ接種またはアグロ浸潤、シリンジ浸潤の方法があり得る;しかしながら、他の一時的方法も上記のように使用し得る。アグロ接種、アグロ浸潤またはシリンジ浸潤によれば、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物が、組織、例えば、葉の細胞間空間、植物の中空部分、植物の他の部分または植物全体に入り込む。表皮を交叉した後、バクテリアは感染し、t‐DNAコピーを細胞内に移入する。t‐DNAはエピソームとして転写し、翻訳されたmRNAは、感染細胞内での興味あるタンパク質の産生をもたらす;しかしながら、核内でのt‐DNAの通過は一過性である。また、本発明の検討要旨は、本明細書において説明するような一時的タンパク質発現に適するプラットフォーム植物として使用することのできる、本発明のキメラ遺伝子構築物を含有するトランスジェニックな植物、植物細胞または種子である。また、植物細胞からの全植物の再生方法は、当該技術において既知であるOxfordBIOSScientificPublisherspp121‐148を参照されたい。一般的には、形質転換植物細胞を、抗生物質のような選択剤を含有し得る適切な培地中で培養し、選択性マーカーを使用して形質転換植物細胞の同定を容易にする。カルスが形成した時点で、芽形成を、適切な植物ホルモンを既知の方法に従って使用することによって促進し、芽を植物の再生用の発根培地に移す。その後、植物を使用して、種子からまたは植物繁殖技法を使用して、繰返しの発生を確立し得る。また、上記トランスジェニック植物は、組織培養を使用しないでも発生させることができる。これら生物体の安定な形質転換および再生方法は、当該技術において確立されており、当業者にとって既知である。利用可能な方法は、Vasil等;および、WeissbachおよびWeissbachにおいて論評されている。形質転換し再生させた植物の取得方法は、本発明にとって重要ではない。植物、植物の1部または植物細胞を2以上の核酸構築物によって形質転換または共形質転換しなければならない場合、当該核酸構築物は、アグロバクテリア中に、1回のトランスフェクション処理において導入し、核酸をプールし、バクテリア細胞を、説明しているようにしてトランスフェクション処理し得る。また、上記構築物は、連続して導入してもよい。この場合、第1構築物をアグロバクテリアに上述のようにして導入し、細胞を、1回のトランスフェクション処理バクテリアのみが増殖し得る選択性条件下に増殖させる。この第1の選択工程の後、第2核酸構築物を上記のようなアグロバクテリアに導入し、細胞を、2重トランスフェクション処理バクテリアのみが増殖し得る2重選択性条件下に増殖させる。その後、2重トランスフェクション処理バクテリアを使用して、本明細書において説明しているような植物、植物の1部または植物細胞を形質転換し得、或いは、さらなる形質転換工程に供して第3の核酸構築物に適応させ得る。さらに、本開示は、本発明の発現系を含み、当該カセット中の興味ある非相同性核酸を、本明細書において説明するような発現系の1以上の成分を欠く他の同様な発現系と比較したとき、高められたレベルで発現させるトランスジェニック植物を提供する。さらに、本開示は、本明細書において説明するような発現系を発現する植物または植物部分を調製する工程;少なくとも、興味あるタンパク質を発現している組織を収穫する工程;および、必要に応じての、上記興味あるタンパク質を上記組織から分離する工程を含む、興味あるタンパク質の産生方法も含む。従って、各局面において、限定することなしに、本発明は、下記を提供する:コモウイルス系発現カセット、1種以上のBeYDV増幅成分、プロモーター、興味あるタンパク質をコード化する核酸またはポリリンカー、および任意構成成分としてのターミネーターを含む1種以上の発現系。植物のような宿主生物体中での、本明細書において説明しているような1種以上の発現系またはベクターを使用しての興味あるタンパク質の発現方法。本発明の1種以上の発現系またはベクター由来の興味あるタンパク質を発現する宿主細胞および生物体、および上記宿主および生物体の産出方法。表1:配列リストさらに、本発明を下記の実施例において説明する。しかしながら、これらの実施例は、説明目的のみであって、本発明の範囲を如何なる形においても限定するのに使用すべきではないことを理解すべきである。発現カセットアッセンブリVLPの産生において使用し得る構築物は、WO2009009876号、WO2009076778号およびWO2010003225号、並びに米国仮出願第61220161号に記載されている;これらの特許文献は、全て、本明細書に参考として合体させる。また、構築物の非限定的な例としては、下記の表2に載せている構築物があり得る。これらの構築物のアッセンブリは、WO2009009876号、WO2009076778号、WO2010003225号およびUS61220161号に記載されている。しかしながら、限定するものではないが、表2に提示しているもののような既知のHAを含み、且つ同様なまたは異なる調節成分およびプロモーターと組合せた他の構築物も、本明細書において説明するようなVLPの産生において使用し得る。表2:血球凝集素産生において使用する構築物の例実施例材料および方法CaMV2X35S‐CPMVHT‐系発現カセット2X35S‐CPMVHT‐原生Sp‐HA0H5Aインドネシア52005:原生シグナルペプチドを含むH5Aインドネシア52005由来のHA0に対するコーディング領域をCMV2X35S‐CPMVHT発現カセットの制御下に含む構築物番号972のアッセンブリは、以前に開示されている。得られる発現カセットの配列は、図1Aに提示している。2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H1Aカリフォルニア42009:H1Aカリフォルニア42009由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む構築物番号560のアッセンブリは、以前に開示されている。得られる発現カセットの配列は、図1Bに提示している。2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H3Aブリスベン102007:H3Aブリスベン102007由来のHA0に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、以下のようにして、CaMV2X35S‐CPMV‐HT調節成分中に組込んだ。構築物番号736は、以前に開示されている;要するに、構築物736を制限酵素ApaIおよびStuIによって消化して、H3Aブリスベン102007由来のHA0に融合させたSpPDIをコード化するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、ApaIおよびStuIで前以って消化した構築物972中にクローニングした。得られた構築物に番号971を付した。2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0Bフロリダ42006:Bフロリダ42006由来のHA0に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、以下のようにして、CaMV2X35S‐CPMV‐HT中に組込んだ。構築物番号739は、以前に開示されている;要するに、構築物739を制限酵素ApaIおよびStuIによって消化して、Bフロリダ42006に由来のHA0に融合させたSpPDIをコード化するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、ApaIおよびStuIで前以って消化した構築物972中にクローニングした。得られた構築物に番号973を付した。BeYDV増幅成分を含むCaMV2X35S‐CPMVHT系カセットpCAMBIA系ベクター中にLIR多重クローニング部位‐SIRLIRを含有するアクセプタープラスミド:インゲン黄萎病ウイルス由来の長遺伝子間領域と短遺伝子間領域を、以下のようにして、pCAMBIA二成分ベクター中に挿入した。BeYDVLIR配列を含有する第1PCRフラグメントを、MfeI‐MluI‐AscI‐LIRc:CAATTGACGCGTGGCGCGCCCTAGCAGAAGGCATGTTGTTGTGACTCCGAGGと、SbfI‐AflII‐HindIII‐LIRr:CCTGCAGGCTTAAGAAGCTTGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAとをプライマーと使用して増幅した。構築物pBYGFPの2963pbBglII制限フラグメントをゲル抽出し、第1PCR反応におけるテンプレートとして使用した。ベクターpBYGFPは、Huang等において以前に開示されている。得られたフラグメントをSbfIで消化し、HindIIIで前以って消化したpCAMBIA2300中にクローニングし、T4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSbfIで消化した。得られたプラスミドをpCAMBIA‐LIRと命名した。BeYDVLIRおよびSIR配列を含有する第2フラグメントを、SacI‐EcoRI‐SIRc:TACCGAGCTCGAATTCCGAGTGTACTTCAAGTCAGTTGGAAATCと、SpeI‐FseI‐LIRr:ACTAGTGGCCGGCCGTACGAATAATTCGTATCCGACGGAAATACCTGAとをプライマーとして、また、2116pbBglII制限pBYGFPフラグメントをテンプレートとして使用して増幅した。得られたフラグメントをSacIで消化し、EcoRIで前以って消化したpCAMBIA‐LIR中にクローニングし、T4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSacIで消化した。得られたプラスミドをpCAMBIA‐LIR‐MCS‐SIRLIRと命名した。T‐DNA境界の配向に対するLIR‐MCS‐SIRLIR配列の配向を変化させるために、pCAMBIA‐LIR‐MCS‐SIRLIRを、MluIおよびSpeI制限酵素で消化し、得られたフラグメントを、T4DNAポリメラーゼを使用して平滑末端化し、再連結反応させた。この連結反応産生物の形質転換から得られたクローンを配向についてスクリーニングし、LIR‐MCS‐SIRLIR成分が左から右のT‐DNA配向にあるクローンを選択し、アクセプター構築物849として保った。注釈LIR‐MCS‐SIRLIR配列は、SEQIDNO:9に提示している。BeYDV増幅成分中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0Bフロリダ42006:Bフロリダ42006由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号973を、SbfIおよびXbaIによって消化し、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0Bフロリダ42006発現カセット全体を含有するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、前以ってSbfIおよびXbaIで消化した構築物番号849中にクローニングした。得られた構築物に番号853を付した。BeYDV増幅成分中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H1Aカリフォルニア42009:H1Aカリフォルニア42009由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号560を、SbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐H1Aカリフォルニア42009発現カセットを含有し、NOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、前以ってSbfIおよびStuIで消化した構築物番号853中にクローニングした。得られた構築物に番号561を付した。BeYDV増幅成分中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H3Aブリスベン102007:H3Aブリスベン102007由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号971を、SbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐H3Aブリスベン102007発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuIによって前以って消化した構築物番号853中にクローニングした。得られた構築物に番号851を付した。BeYDV増幅成分中の2X35S‐CPMVHT‐原生Sp‐HA0H5Aインドネシア52005:原生シグナル中のH5Aインドネシア52005由来のHA0をCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下にコード化する配列を、BeYDV増幅成分中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号972を、SbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐原生Sp‐HA0H5Aインドネシア52005発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuIによって前以って消化した構築物番号853中にクローニングした。得られた構築物に番号852を付した。レプリカーゼ発現構築物レプリカーゼ発現構築物BeYDVレプリカーゼの発現用の構築物を担持するプラスミドは、HughMason博士から親切に贈与された。構築物番号834は、Huang等に記載されているプラスミドpREP110に相当する。BeYDV増幅成分およびレプリカーゼ遺伝子をLIRの制御下に含むCaMV2X35S‐CPMVHT‐系カセットLIR‐多重クローニング部位‐SIR‐レプリカーゼ‐LIRをpCAMBIA系ベクター中に含有するアクセプタープラスミドBeYDVレプリカーゼを、以下のようにして、BeYDVSIRおよびLIR繰返しの間に挿入した。PCRフラグメントを、SacI‐EcoRI‐SIRcおよびSpeI‐FseI‐LIRrをプライマーとして使用して増幅した。構築物pBYGFPRの2180pbSacI‐FseI制限フラグメントをゲル抽出し、PCR反応におけるテンプレートとして使用した。ベクターpBYGFPRは、Huang等に以前に開示されている。得られたフラグメントをSacIで消化し、MfeIによって前以って消化した構築物849中にクローニングし、T4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を生じさせ、最後にSacIによって消化した。得られたアクセプター構築物に番号848を付した。BeYDVレプリカーゼ増幅系中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0Bフロリダ42006Bフロリダ42006由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号973をSbfIおよびXbaIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0Bフロリダ42006発現カセット全体を含有するフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびXbaIによって前以って消化した構造番号848中にクローニングした。得られた構築物に番号475を付した。BeYDVレプリカーゼ増幅系中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H1Aカリフォルニア42009H1Aカリフォルニア42009由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構造番号560をSbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐H1Aカリフォルニア42009発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuIによって前以って消化した構築物番号475中にクローニングした。得られた構築物に番号471を付した。BeYDVレプリカーゼ増幅系中の2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐HA0H3Aブリスベン102007H3Aブリスベン102007由来のHA0にCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下に融合させたアルファルファPDIシグナルペプチドをコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を有するBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号971をSbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐SpPDI‐H3Aブリスベン102007発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuIによって前以って消化した構築物番号853中にクローニングした。得られた構築物に番号473を付した。BeYDVレプリカーゼ増幅系中の2X35S‐CPMVHT‐原生Sp‐HA0H5Aインドネシア52005原生シグナル内のH5Aインドネシア52005由来のHA0をCaMV2X35S‐CPMV‐HTの制御下にコード化する配列を、レプリカーゼ増幅系を含むBeYDV中に、以下のようにして組込んだ。構築物番号972を、SbfIおよびStuIによって消化して、2X35S‐CPMVHT‐原生Sp‐HA0H5Aインドネシア52005発現カセットを含有しNOSターミネーターを含まないフラグメントを取出した。得られたフラグメントを、SbfIおよびStuIによって前以って消化した構築物番号853中にクローニングした。得られた構築物に番号474を付した。プラストシアニン‐P19p19の構築は、WO20100003225号に記載されている。簡潔に述べれば、トマトブッシースタントウイルスのp19タンパク質のコーディング配列を、アルファルファプラストシアニン発現カセットに、Darveau等に提示されているPCR系連結反応法によって連結させた。PCR第1ラウンドにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーPlasto‐443c:GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCとsupP19‐plastor:CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATGとをテンプレートとしての構築物660と一緒に使用して増幅させた。並行して、上記p19のコーディング配列を含有するもう1つのフラグメントを、プライマーsupP19‐1c:ATGGAACGAGCTATACAAGGおよびSupP19‐SacIr:AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAGとによって、Voinnet等に記載されているような構築物35S:p19をテンプレートとして使用して増幅させた。その後、増幅産生物を混合し、プライマーPlasto‐443cおよびSupP19‐SacIrによる第2ラウンドの増幅におけるテンプレートとして使用した。得られたフラグメントを、BamHIおよびSacIによって消化し、同じ制限酵素によって前以って消化した構築物番号660中にクローニングして、構築物番号R472を得た。上記プラスミドを使用して、アグロバクテリウムツメファシエンスを、エレクトロポレーションによって形質転換した。全てのAツメファシエンス株の完全性を、制限マッピングによって確認した。R472を含むAツメファシエンス株をAGL1R472と命名した。植物バイオマスの調製、接種材料、アグロ浸潤および収穫ベンサミアナタバコの苗を、市販のピートモス基材を充たしたフラット内で種子から栽培した。苗を、温室内で、168光周期および昼25°C夜20°Cの温度管理下に繁殖させた。播種の3週間後に、個々の胚を摘出し、鉢に移植し、温室内でさらに3週間同じ環境条件下に繁殖させた。各構築物を導入したアグロバクテリアを、10mMの2‐エタンスルホン酸、20μMのアセトシリンゴン、50μgmlのカナマイシンおよび25μgmlのカルベニシリンを補充したYEB培地内で、上記バクテリアが06と16の間のOD600に達するまで培養した。アグロバクテリア懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地中に再懸濁し、4°Cで1夜保存した。浸潤当日に、培養バッチを25培養液量に希釈し、使用前に温めた。ベンサミアナタバコ苗全体を、気密性ステンレススチールタンク内の細菌懸濁液に、266644~533288hPaの真空下に2分間逆さまに入れた。苗を、収穫までの2~6日の培養期間温室に戻した。特に断らない限り、浸潤は、全て、1:1比での株AGL1R472との共浸潤として、或いはBeYDVレプリカーゼの共発現のためのAGL1834と共浸潤させる場合は1:1:1比で実施した。本明細書において説明するような各種構築物を含むAツメファシエンス株は、接頭辞AGL1を使用することによって参照する。例えば、構築物番号972を含むAツメファシエンスは、AGL1972と称する。葉のサンプリングおよび総タンパク質抽出培養後、苗の地上部分を収穫し、-80°Cで凍結し、断片に粉砕した。総可溶性タンパク質を、各凍結粉砕植物材料サンプルを3容量の低温50mMのTrispH80、015MのNaCl、01のTritonX‐100および1mMのフッ化フェニルメタンスルホニル中で均質化することによって抽出した。均質化後、スラリーを10000gで4°Cにて10分間遠心分離し、これらの浄化粗抽出物を分析のために保存した。タンパク質分析および免疫ブロッティング浄化粗抽出物の全タンパク質含有量を、ウシ血清アルブミンを参照標準として使用するブラッドフォードアッセイによって測定した。タンパク質をSDS‐PAGEによって分離し、免疫検出のためのポリビニレンジフルオリド膜上に電気移動させた。免疫ブロッティングの前に、上記膜をトリス緩衝食塩水中の5スキムミルクおよび01のTween‐20によって16~18時間4°Cで遮断した。免疫ブロッティングを、TBS‐01Tween20中の2スキムミルク中2μgmlでの適切な一次抗体によるインキュベーションによって実施した。化学発光検出において使用する二次抗体を、表3に示しているように、TBS‐01Tween20中2スキムミルク中に指示されているように希釈した。免疫反応性複合体を、基質としてルミノールを使用する化学発光によって検出した。ヒトIgG抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ‐酵素接合を、EZ‐LinkPlus活性化ぺルオキシダーゼ接合キットを使用することによって実施した。表3:発現タンパク質の免疫ブロットのための電気泳動状況、抗体および希釈CPMV‐HT発現系とBeYDV増幅系の結合SainsburyとLomonossoffは、植物中での組換えタンパク質発現用の効率的な系を開発している。WO2009087391号において教示しているように、上記の系は、5’リーダー配列中に見出される2つの最初の翻訳開始コドンが欠落しているところのササゲモザイクウイルスのゲノムRNA2の非翻訳領域を使用している。CaMV35Sプロモーターおよびノパリンシンターゼターミネーターに結合させたとき、変性CPMVUTRが隣接コーディング領域の翻訳を増進させることを証明した。該CPMV系発現系をCPMV‐HTと命名した。WO2010025285号は、インゲンマメ黄萎病ウイルスの複製機構をベースとするDNA増幅系が、植物中での組換えタンパク質の一時的発現レベルを効率的に高めることを教示している。ベンサミアナタバコにおけるアグロ浸潤によるインフルエンザ血球凝集素の産生用の上記CPMV‐HT発現系は、試験したHAタイプの全てではないが数種において高レベルのHA蓄積を産出していることを見出した。また、発現可能なHAの蓄積レベルは、上記CaMV35Sプロモーターを、上流調節成分の複製を担持する二重CaMV35Sプロモーターと称する改変形で置き換えることによって高め得ることも観察している。HA蓄積レベルをさらに高めるために、上記CPMV‐HT発現系を上記BeYDV増幅系と結合させたDNA構築物を調製した。これらの構築物のアッセンブリは、材料と方法の章において説明している。試験した構築物の略図は、図2に示している。得られたこれらの構築物を、これら構築物のCPMV‐HT系対応物とアグロ浸潤処理植物中でのHAの高蓄積レベルを促進するそれら構築物の有効性について比較した。CPMV‐HTの制御下にHAを産生する植物を収穫し、浸潤後5~6日で凍結し、一方、CPMV‐HTBeYDVの制御下にHAを産生する植物を収穫し、浸潤後3~4日で凍結した。分析当日に、全可溶性タンパク質を凍結バイオマスから抽出し、HA蓄積レベルを上記で説明したようなウェスタンブロットによって分析した。バイオマス中のHA蓄積レベルのウェスタンブロット分析は、B型ウイルス由来の高レベルのHAが、BeYDV増幅系をCPMV‐HT発現系に結合させた構築物によって形質転換した植物において検出されたことを示しており、CPMV‐HT系単独を使用したときの同じインフルエンザBウイルスHAの検出し得なかった発現と明暗をなしている。H3における同じ発現戦略の比較は、CPMV‐HT単独がH3の検出可能な発現を推進しているものの、BeYDV増幅系のCPMV‐HTへの結合は、H3蓄積レベルをさらに増大させていることを示している。インフルエンザAインドネシア052005由来のH5においては、BeYDV増幅系をCPMV‐HT発現系に結合させている構築物と比較したときよりも、CPMV‐HT発現系単独を使用したときにより高い蓄積が観察された。この観察は、025μg対1μgの負荷量を比較したときに特に目視可能であった。株Aカリフォルニア042009由来のH1蓄積は、AGL1561AGL1834AGL1R472によって形質転換した植物における方が、AGL1560AGL1R472によって形質転換した植物と比較したとき低かった。H1の蓄積プロフィールを、蓄積ピーク時機が他の試験したHAの蓄積ピーク時機と異ならないことを確かめるためにさらに研究した。H1の最高蓄積は、CPMV‐HT発現系を使用したときは浸潤後3日目と5日目の間で観察され、一方、結合CPMV‐HTBeYDV系は、2日目と4日目の間で低めのH1蓄積をもたらした。これらの結果は、BeYDV増幅系のCPMV‐HT系発現系への結合が常に有益ではなく、ある組合せにおいては、その結合は、CPMV‐HT発現系単独の使用と比較して、HA蓄積を低める可能性があることを示唆している。単一プラスミド中の結合させたCPMV‐HT発現系とBeYDV増幅系を使用しての植物中でのHA産生WO2010025285号は、単一ベクター中に組込んだBeYDV系DNA増幅系の使用を教示している。この系においては、レプリカーゼ遺伝子は、ウイルスLIRプロモーターの制御下にある。提示した結果は、単一ベクターBeYDV系が、別々のプラスミド上にレプリカーゼ遺伝子を含むBeYDV系と等価であることを示していた。本発明者等は、CPMV‐HTBeYDV発現系が、単一ベクター上に組込んだときにHA発現において有効であるかどうかを試験した。HAおよびレプリカーゼ発現用の単一ベクターの略図を図2Dに示している。試験した全ての例において、上記ウイルスLIRプロモーターの制御下にC1C2遺伝子を担持する単一ベクター系は、レプリカーゼ遺伝子が別々のプラスミド上に存在する2重ベクターよりも多いHAを産生していた。結果は、図4A~4Dに示している。本明細書において論じた実施態様は、いずれも、本発明のいずれかの方法または組成物と関連して実施し或いは組合せ得ることを意図し、また、逆も然りである。さらにまた、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するためにも使用し得る。引用文献は、全て、各個々の刊行物を本明細書に参考として合体させるように明確且つ個々に指示されているかのように、また、各個々の刊行物が本明細書において完全に説明されているかのように、本明細書に参考として合体させる。本明細書における文献の引用は、そのような文献が本発明にとっての従来技術であることの承認として解釈すべきまたはみなすべきでない。本明細書において直接定義していない用語は、いずれも、本発明の技術の範囲内で理解されているようなそれらの用語と一般的に関連する意味を有するものと理解すべきである。ある種の用語を、本発明の実施態様の装置および方法等を、さらに、それらの装置および方法等を如何にして製造または使用するかを説明するに当って実施者にさらなるガイダンスを提供するために、下記でまたは本明細書のどこかで論じている。同じことを2つ以上の形で言及し得ることも理解されたい。従って、別の用語および同義語を、本明細書において論じている用語のいずれか1以上に対して使用し得る。用語を本明細書において詳述しているかまたは論じているかどうかに有意性はない。幾つかの同義語または代用可能な方法、材料等も使用する。1以上の同義語または等価物の詳説は、特に明確に断らない限り、他の同義語または等価物の使用を除外しない。用語の例のような明細書中での実例の使用は、説明目的のみであって、本発明の実施態様の範囲および意味を限定するものではない。本発明は、実質的に上記で説明したような、また、実施例および図面に関連する全ての全ての実施態様、修正および変形を包含する。当業者にとっては、多くの変形および修正を、特許請求の範囲において定義したような本発明の範囲から逸脱することなくなし得ることは明白であるであろう。そのような修正の例としては、本発明のあらゆる局面における、同じ結果を実質的に同じ方法で達成するための既知の等価物の置き換えがある。"