"人工多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程:1対象としての人工多能性幹細胞においてインプリンティング領域に位置する少なくとも1つの遺伝子またはmiRNAの発現のレベルを測定する工程、および、2基準対照幹細胞と比べて該miRNAまたは該遺伝子を発現のレベルが同等もしくはそれ以上である人工多能性幹細胞を選択する工程を含む方法。前記インプリンティング領域が、Dlk1Dio3領域である、請求項1に記載の方法。前記miRNAが、表1または表3に示されたprimiRNA、および、表2または表4に示された成熟miRNAからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記遺伝子が、表5に示された遺伝子からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。前記遺伝子が、MEG3およびMEG8からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。前記基準対照幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項1に記載の方法。人工多能性幹細胞を選別する方法であって、以下の工程:1対象としての人工多能性幹細胞においてインプリンティング領域のDNAメチル化状態を測定する工程、および、21つのもしくは一方の染色体の該インプリンティング領域がDNAメチル化状態であるが、相同な染色体の同じ領域がDNAメチル化状態でない、人工多能性幹細胞を選択する工程を含む方法。インプリンティング領域が、IGDMRおよびまたはGtl2MEG3DMRである、請求項7に記載の方法。父親由来の染色体の前記インプリンティング領域がDNAメチル化状態である人工多能性幹細胞を選択する工程を含む、請求項7に記載の方法。人工多能性幹細胞が生殖系列伝達可能なものである、請求項1または9に記載の方法。人工多能性幹細胞を選別するためのキットであって、表1または表3に示されたprimiRNA、表2または表4に示されたmiRNA、および表5に示された遺伝子を検出するための少なくとも1つのプライマーまたはプローブを含む、キット。マイクロアレイを含む、請求項11に記載のキット。人工多能性幹細胞を選別するためのキットであって、メチル化感受性制限酵素、あるいは、bisulfite試薬、およびIGDMRおよびまたはGtl2MEG3DMRを増幅させるための核酸を含む、キット。請求項1~10のいずれか1項に記載の方法で選別された、生殖系列伝達可能な人工多能性幹細胞。本発明は、分化能が限りなく高い、かつ、生殖系列伝達germlinetransmissionが可能な人工多能性幹細胞iPS細胞を選別するための方法ならびに選別のためのキットを提供する。iPS細胞の製造方法人工多能性幹細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する、体細胞由来の人工の幹細胞であるKTakahashiandSYamanakaCell126663676KTakahashietalCell131861872JYuetalScience31819171920MNakagawaetalNatBiotechnol26101106国際公開WO2007069666。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えばOct34Klf4Klf1Klf2Klf5Sox2Sox1Sox3Sox15Sox17Sox18cMycLMycNMycTERTSV40LargeTantigenHPV16E6HPV16E7BmilLin28Lin28bNanogEsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。上記の各核初期化物質のマウスまたはヒトcDNAのヌクレオチド配列ならびに該cDNAにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO2007069666に記載のNCBI登録番号accessionnumbersを参照すること、またLMyc、Lin28、Lin28b、EsrrbおよびEsrrgのマウスおよびヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列情報については、それぞれ下記NCBI登録番号を参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。遺伝子名マウスヒトLMycNM008506NM001033081Lin28NM145833NM024674Lin28bNM001031772NM001004317EsrrbNM011934NM004452EsrrgNM011935NM001438これらの核初期化物質は、タンパク質もしくは成熟したmRNAの形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、DNAの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター以上、Cell126pp6636762006Cell131pp8618722007Science318pp191719202007、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターProcJpnAcadSerBPhysBiolSci85348622009などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子、βグルクロニダーゼ、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。さらに、上記ベクターには、染色体への取り込みされなくとも複製されて、エピソーマルに存在するようにEBNA1およびoriP、または、LargeTおよびSV40ori配列を含むこともできる。核初期化に際して、iPS細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼHDAC阻害剤例えば、バルプロ酸795797、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA例えば、HDAC1siRNASmartpool登録商標、HuSH29mershRNAConstructsagainstHDAC1等等の核酸性発現阻害剤など]、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤例えば5’アザシチジンNatBiotechnol26795797、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX01294等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA例えば、G9asiRNA等等の核酸性発現阻害剤など]、Lchannelcalciumagonist、p53阻害剤例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA、WntSignaling例えばsolubleWnt3aCellStemCell3132135、LIFまたはbFGFなどのサイトカイン、ALK5阻害剤例えば、SB431542NatMethods68058、有糸分裂活性化プロテインキナーゼシグナル伝達mitogenactivatedproteinkinasesignalling阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼglycogensynthasekinase3阻害剤PloSBiology622372247、miR2913p、miR294、miR295などのmiRNA、等を使用することができる。iPS細胞誘導のための培養培地としては、例えば10~15FBSを含有するDMEM、DMEMF12またはDME培地これらの培地にはさらに、LIF、ペニシリンpenicillinストレプトマイシンstreptomycin、ピューロマイシンpuromycin、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。、bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地または霊長類ES細胞培養用培地例えば霊長類ヒトサルES細胞用培地、リプロセル、京都、日本、などが含まれる。培養法の例としては、たとえば、37°C、5CO2存在下にて、10FBS含有DMEMまたはDMEMF12培地上で体細胞と核初期化物質を接触させ約4~7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30~約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、510と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。あるいは、その代替培養法として、フィーダー細胞上で10FBS含有DMEM培地これにはさらに、LIF、ペニシリンストレプトマイシン、Lグルタミン、非必須アミノ酸類、βメルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。で培養し、約25~約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。上記培養の間には、好ましくは、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103~約5×106細胞の範囲である。マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地選択培地で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。本明細書中で使用する体細胞は、哺乳動物例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞例、角質化表皮細胞、粘膜上皮細胞例、舌表層の上皮細胞、外分泌腺上皮細胞例、乳腺細胞、ホルモン分泌細胞例、副腎髄質細胞、代謝貯蔵用の細胞例、肝細胞、境界面を構成する内腔上皮細胞例、I型肺胞細胞、内鎖管の内腔上皮細胞例、血管内皮細胞、運搬能をもつ繊毛のある細胞例、気道上皮細胞、細胞外マトリックス分泌用細胞例、線維芽細胞、収縮性細胞例、平滑筋細胞、血液と免疫系の細胞例、Tリンパ球、感覚に関する細胞例、桿細胞、自律神経系ニューロン例、コリン作動性ニューロン、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞例、随伴細胞、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞例、星状グリア細胞、色素細胞例、網膜色素上皮細胞、およびそれらの前駆細胞等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞体性幹細胞が挙げられる。本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。iPS細胞の選別方法上記のように樹立したiPS細胞は、少なくとも1つのインプリンティング領域のmiRNA、または少なくとも1つの同領域に位置する遺伝子のうち母親由来の染色体から発現するべき遺伝子、の発現、あるいは、インプリンティング領域に位置する遺伝子の発現の制御に関与する領域のDNAメチル化を検出することで、分化能が限りなく高い、かつ、生殖系列伝達germlinetransmissionが可能なiPS細胞を選択するができる。本発明において、インプリンティング領域なる用語とは、母親もしくは父親由来の染色体のどちらか一方のみから選択的に発現する遺伝子をコードする領域を意味する。好ましいインプリンティング領域としては、Dlk1Dio3領域が例示される。本明細書で使用するmiRNAという用語は、primiRNA、premiRNAおよび成熟miRNAを指し、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害、または、mRNA分解による、遺伝子発現の調節に関与する。primiRNAは、DNAから転写された一本鎖RNAであり、miRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を有している。premiRNAは、Droshaと呼ばれる核内酵素による部分切断によってprimRNAから生じる。成熟miRNAは、一本鎖RNA2025塩基であり、核外でDicerによる切断によってpremiRNAから生じる。従って、本発明におけて検出されるmiRNAは、primiRNA、premiRNAまたは成熟miRNAのいずれの形態にも限定されない。本発明において好ましいmiRNAは、マウスの場合12番染色体、ヒトの場合は14番染色体から転写されるmiRNAである。より好ましくは、Dlk1Dio3領域に位置するmiRNAである。さらに好ましくは、マウスの場合、例えば、表1に記載のprimiRNAおよび表2に記載の成熟miRNAであり、ヒトの場合、例えば、表3に記載のprimiRNAおよび表4に記載の成熟miRNAである。ここで検出されるmiRNAは、当業者は動物種によって適切なmiRNAを適宜選択できることは言うまでもない。前記miRNAの検出する方法は、特に限定されないが、例えば、ノーザンブロッティング、insituハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション、RNaseプロテクションアッセイ、PCR法,リアルタイムPCR法、およびマイクロアレイ法などが挙げられる。好ましい検出法は、例えば表1および表3、または、表2および表4下記参照に列挙されるもののようなprimiRNAおよびまたは成熟miRNAであるか、それらを包含するmiRNA、あるいは、表5下記参照に列挙されるもののような遺伝子のいずれか一方と、前記miRNAまたは前記遺伝子とハイブリダイズすることが可能である、プローブとしての核酸とのハイブリダイゼーションの使用;あるいは、前記miRNAをコードするDNAの配列または前記遺伝子の配列を増幅することができるプライマーを使用するPCR法の使用を含む。本発明によれば、前記miRNAまたは遺伝子は、人工多能性領域のインプリンティング領域、好ましくはDlk1Dio3領域に位置しており、また好ましい遺伝子は、MEG3またはMEG8である。プローブまたはプライマー核酸の例には、表1、2、3および4に列挙されるRNA、または該RNAをコードするcDNA、の全体の配列または部分配列、表5に列挙された遺伝子、またはそのcDNA、の全体配列または部分配列、あるいは前記全体配列または部分配列に相補的な配列が挙げられる。前記プローブのサイズは、一般に、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも20塩基、例えば20~30塩基、30~70塩基、70~100塩基、などである。前記プライマーのサイズは、一般に、17~30またはそれ以上、好ましくは20~25である。前記プローブまたはプライマーの合成は、例えば、市販の自動核酸合成機を用いて化学的に行うことができる。プローブはまた、LNAlockednucleicacidこれはまた、架橋核酸BNAとも称される。またはPNApeptidenucleicacidなどの人工核酸であってもよく、miRNAの塩基配列に相補的な配列を有するRNAの代替として使用される。LNAは、RNAのリボースの2位と4位とがメチレン基を介して共有結合された架橋構造を有するSObikaetalTetrahedronLett395401。PNAは、リボースをもたないで、バックボーンにアミド結合やエチレンイミン結合を含む構造をもち、例えばPENielsenetalScience2541497、PENielsenedPeptideNucleicAcidsProtocolsandApplications2ndedHorizonBioscienceに記載されている。検出されるべきmiRNAおよび、該miRNAとハイブリダイズ可能なLNA、PNAなどの人工核酸プローブは、例えばマイクロアレイなどの担体上に結合することによって一度に多数のmiRNAを検出したり、同時に定量したりすることができる。人工核酸のサイズは10mer~25mer程度の範囲でよい。必要であれば、上記のプローブは標識されていてもよい。標識として、蛍光標識例えば、シアン、フルオレサミン、ローダミン、それらの誘導体、例えばCy3Cy5FITCTRITCなどを用いることができる。検出するmiRNAの数は、任意の数でよく、少なくとも1個以上、少なくとも5個以上、少なくとも10個以上、少なくとも20個以上、少なくとも30個以上、少なくとも40個以上あるいは少なくとも50個以上である。より好ましくは、そのようなmiRNAの数は36個である。本発明において、インプリンティング領域に位置する遺伝子は、好ましくはDlk1Dio3領域に位置する遺伝子であり、Dlk1、Gtl2Meg3、Rtl1、Rtl1as、Meg8Rian、Meg9MirgおよびDio3が例示される。より好ましくは、母親由来の染色体からのみ発現するインプリンティング遺伝子であり、表5に記載の遺伝子である。前記遺伝子の発現を検出する方法は、特に限定されないが、例えば、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、insituハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション、RNaseプロテクションアッセイ、PCR法、定量PCR、リアルタイムPCR法、およびマイクロアレイ法などが挙げられる。検出は、生物学的試料からmRNAを含む全RNAを抽出し、ポリTカラムを用いてmRNAを取得し、逆転写反応によりcDNAを合成し、ファージもしくはPCRクローニング法を用いて増幅し、標的DNAに相補的な約20mer~70merまたはそれ以上のサイズからなるプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは、約20mer~30merのサイズのプライマーを用いる定量PCR、などによって行うことができる。ハイブリダイゼーションやPCRでの標識としては、蛍光標識を使用することができる。蛍光標識としては、シアン、フルオレサミン、ローダミン、それらの誘導体、例えばCy3Cy5FITCTRITCなどを用いることができる。検出する遺伝子の数は、任意の数でよく、少なくとも1個以上、少なくとも2個以上、少なくとも3個以上である。より好ましくは、4個である。分化能が限りなく高い生殖系列伝達germlinetransmissionが可能なiPS細胞を選別するに際し、生殖系列伝達することが既知である、対照細胞としてのiPS細胞もしくは胚性幹細胞ES細胞の上記の方法で検出した値を基準値陽性基準値として設定し、この陽性基準値と同等もしくはそれ以上である目的のiPS細胞を生殖系列伝達が可能なiPS細胞として選別してもよい。同様に、生殖系列伝達しないことが既知である、対照細胞としてのiPS細胞もしくは胚性幹細胞ES細胞に対して上記の方法で検出した値を基準値陰性基準値として設定し、この陰性基準値より高い目的のiPS細胞を、生殖系列伝達が可能なiPS細胞として選別してもよい。他の態様として、生殖系列伝達の可否が既知である一連の細胞を用いてあらかじめ表6を作成し、表6に示す感度および特異性の値が共に09以上、好ましくは095以上、より好ましくは099以上になるように設定した値を基準値とし、上記の方法で検出した値が、この基準値と同等もしくはそれ以上である目的のiPS細胞を、生殖系列伝達が可能なiPS細胞として選別してもよい。特に好ましくは、感度および特異性の値は、共に1である。ここで、感度および特異性が共に1を示すということは、偽陽性および偽陰性が全くない一致した基準値であることを意味する。さらに本発明において、Dlk1Dio3領域に位置する遺伝子の発現を制御する領域におけるDNAのメチル化を検出することによって、生殖系列伝達germlinetransmissionが可能なiPS細胞の選別方法を実施してもよい。この際、検出する領域として、例えばDlk1をコードする領域とGtl2MEG3をコードする領域との間に位置する、シトシンとグアニンの高含量配列を有する領域であるCpGアイランドと呼ばれる領域であって、母親由来の染色体と父親由来の染色体とでそのDNAのメチル化状態が異なる領域が例示される。好ましくは、遺伝子間で異なってメチル化された領域intergenicdifferentiallymethylatedregion、または、MEG3DMRである。前記IGDMRならびにMEG3DMRは、特に限定されないが、CytogenetGenomeRes113223229、NatGenet4023742またはNatGenet3597102に記載の領域が例示される。詳細には、マウスの場合、前記IGDMRは、NCBIのAJ320506の配列中の80479塩基目から80829塩基目までの範囲の351bp長の領域が例示される。DNAメチル化の検出方法の例としては、制限酵素を用いて目的の認識配列を切断することを含む方法と、亜硫酸水素塩を用いて非メチル化シトシンを加水分解することを含む方法が挙げられる。前者の方法は、メチル化感受性もしくは非感受性の制限酵素を用いる方法で、認識配列中の塩基がメチル化されていると、制限酵素による切断活性が変化することを利用している。生じたDNA断片を電気泳動後、サザンブロッティング等により目的のフラグメント鎖長を測定することで、メチル化部位を検出する。一方、後者の方法には、Bisulfite処理後、PCRを行い、シーケンシングすることを含む方法、メチル化特異的オリゴヌクレオチドMSOマイクロアレイを用いることを含む方法、もしくは、bisulfite処理前後の配列の違いをPCRプライマーに認識させ、PCR産物の有無によって、メチル化DNAの有無を判別するメチル化特異的PCRがある。この他にも、DNAメチル化特異的抗体を用いた染色体免疫沈降法により、DNAメチル化されている領域のDNA配列を抽出し、PCRを行い、シーケンシングする方法により特定の領域のDNAのメチル化領域を検出することが可能である。分化能が限りなく高い、かつ、生殖系列伝達germlinetransmissionが可能なiPS細胞を選別する際、一方の染色体中の目的の領域がDNAメチル化状態にあるが、相同な染色体中の同じ領域が同一方法で検出されるようなDNAメチル化状態にない、目的のiPS細胞が、分化能が限りなく高いiPS細胞または生殖系列伝達が可能なiPS細胞として選択可能である。ここで、一方の染色体中の目的の領域がDNAメチル化状態にあるが、相同な染色体中の同じ領域が同一方法で検出されるようなDNAメチル化状態にないとは、例えば、目的の領域中で検出されるメチル化CpGが、検出されるすべてのCpGの30以上および70以下、好ましくは40以上および60以下、より好ましくは45以上および55以下、特に好ましくは、50である状態をいう。より好ましい実施態様としては、父親由来の染色体のみがメチル化されており、同じ細胞内の母親由来の染色体の同領域はメチル化されておらず、結果として、検出されるメチル化CpGが、検出されるすべてのCpGのうち50を占めるiPS細胞を選択することが望ましい。メチル化されたCpGの割合を検出する方法としては、例えば、非メチル化DNAを認識する制限酵素を用いる場合、メチル化DNAを占める割合は、サザンブロッティング法により定量し、断片化されなかったDNAの量と断片化されたDNAの量を比較することで算出することができる。一方、bisulfite法の場合、任意に選択された染色体がシーケンシングされるため、PCR産物をクローニングしたテンプレートを、複数回、例えば2回以上、好ましくは5回以上、より好ましくは10回以上、繰り返しシーケンシングし、シーケンシングしたクローン数に対するDNAのメチル化が検出されたクローン数を比較することで割合を算出することができる。ここで、パイロシークエンス法を用いた場合では、シトシンまたはチミンの量シトシンの量はメチル化DNAの量を意味し、チミンの量は非メチル化DNAの量を意味する。を測定することによって、前記割合を直接測定することもできる。また、DNAメチル化特異的抗体を用いた染色体免疫沈降法の場合は、沈降した目的のDNAの量と沈降前の該DNA量とをPCRで検出し、比較することで、メチル化DNAが占める割合を検出することができる。iPS細胞の選別用キット本発明に係るiPS細胞選別用キットは、前述の検出方法によるmiRNA測定用試薬、遺伝子測定用試薬またはDNAメチル化測定用試薬を含む。miRNA測定用試薬の例は、上記表1~4に列挙されたRNAまたは該RNAをコードするcDNAの全体配列または部分配列を含む、プローブまたはプライマー核酸である。プローブのサイズは、一般に、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも20塩基、例えば20~30塩基、30~70塩基、70~100塩基またはそれ以上、などである。miRNA測定用試薬はまた、上記表1~4のいずれかに示されるmiRNAの塩基配列に相補的な配列を有するRNAの代替として、LNAとも呼ばれる、またはPNAなどの人工核酸をプローブとして含むことができる。遺伝子測定用試薬は、上記表5に記載されるようなインプリンティング遺伝子の標的DNAまたはmRNAの断片、または該断片に相補的な核酸、である約20mer~70merまたはそれ以上のサイズの核酸プローブ、あるいは前記断片やそれに相補的な核酸に由来する約20mer~30merのサイズのプライマーまたはプライマーセットを含むことができる。キットはまた、上記のプローブを、例えばガラスもしくはポリマーなどの担体と結合することによって調製されたマイクロアレイを含むことができる。DNAメチル化測定用試薬は、bisulfite反応を利用してシトシン塩基のメチル化を検出するためのMSOマイクロアレイ法に使用するための試薬やマイクロアレイを含む畑田出穂実験医学、24巻8号増刊pp212219羊土社日本。bisulfite法では、一本鎖DNAは、bisulfite亜硫酸ナトリウムで処理するとシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンはウラシルに変換されない。メチル化特異的オリゴヌクレオチドMSOマイクロアレイ法では、bisulfite反応を利用してメチル化を検出する。この方法では、bisulfite処理されたDNAをメチル化に関係なく変化のないCpG配列を含まない配列をプライマーに選んでPCRを行う。その結果、メチル化されていないシトシンはチミンとして、またメチル化されているシトシンはシトシンとして増幅する。マイクロアレイの担体には、メチル化されていないシトシンの場合にはメチル化されていないシトシンからチミンに変化させた配列と相補的なオリゴヌクレオチド、あるいはメチル化されたシトシンの場合にはシトシンが未変化のままの配列と相補的なオリゴヌクレオチド、が固定される。増幅したDNAを蛍光標識してマイクロアレイにハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼーションするかによりメチル化を定量することができる。人工多能性幹細胞を選別するためのIGDMRおよびまたはGtl2MEG3DMRのDNAメチル化状態の測定用キットには、メチル化感受性制限酵素、またはbisulfite試薬、およびIGDMRおよびまたはGtl2MEG3DMRを増幅させるための核酸を含むことができる。メチル化感受性制限酵素の例としては、以下に限定されないが、AatIIAccIIBssHIIClaICpoIEco52IHaeIIMluINaeINotINsbIPvuISacIISalIなどが挙げられる。本発明のiPS細胞選別用キットは、miRNAの抽出用試薬、遺伝子抽出用試薬または染色体抽出試薬などを含んでもよい。また、本発明の診断用キットは、判別分析手段、例えば、判別分析の手順を記載した書面や説明書、判別分析の手順をコンピューターに実行させるためのプログラム、当該プログラムリスト、当該プログラムを記録した、コンピューターに読み取り可能な記録媒体例えば、フレキシブルディスク、光ディスク、CDROM、CDR、およびCDRWなど、判別分析を実行する装置またはシステムコンピューターなどを含んでもよい。以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。マウスESおよびiPS細胞表7に示すES細胞RF8、NanogES、FbxESの培養および試料iPS細胞の樹立および培養は、従来の方法で行ったTakahashiKandYamanakaSCell1266632006、OkitaKetalNature4483132007、NakagawaMetalNatBiotechnol261012008、AoiTetalScience3216997022008およびOkitaKetalScience3229492008。また、各細胞由来のキメラマウスの作出および生殖系列伝達germlinetransmissionの有無について、定法に従って検討した結果を表7に示す。ここで、起源originとは、由来として使用する体細胞であり、MEFはMouseEmbryonicFibroblast、TTFは、TailTipFibroblast、Hepは肝細胞、胃細胞Stomachは胃上皮細胞を意味する。また、導入遺伝子transgeneにおいて、OはOct34、SはSox2、MはcMyc、KはKlf4をそれぞれ指す。さらに、無は、プラスミド法によりiPS細胞を作成し染色体に導入遺伝子が組み込まれていないことを意味する。ヒトES細胞およびiPS細胞ヒトES細胞KhES1、KhES3、H1およびH9が培養された。また、iPS細胞サンプルは、従来法によって樹立されおよび培養された。これらの細胞は表8に列挙されており、表中、HDFは、ヒト胚性線維芽細胞を示す。マウス細胞でのmicroRNA発現の確認表7に記載のマウス細胞中で発現するmicroRNAの発現プロファイルをmicroRNAmicroarrayAgilent社を用いて行った。miRNAアレイプローブ672個のうち、29サンプル全てで無効であると判断されたプローブ211個を除去し、計461個のプローブに対して階層型クラスタリングを行った。その結果を図1に示す。体細胞では発現していないが、ES細胞およびiPS細胞で発現しているmiRNA群グループIと、iPS細胞間で発現にばらつきがみられるmiRNA群グループIIを抽出した。グループIを図2Aおよび表9に、グループIIを図2Bおよび表10に示す。グループIIのmiRNA群を解析したところ、全て12番染色体のmiRNAクラスターに含まれていることが分かった。グループIのmiRNA群は、キメラマウスの誕生に寄与するiPS細胞クローンの場合にはES細胞の場合と同等程度に発現していたが、キメラマウスの誕生の寄与に関与しないFbxiPS細胞4クローンの場合においては、ES細胞の場合と比較して低い発現量しか検出されなかった。このことから、グループIのmiRNA群はキメラマウスの誕生に寄与するiPS細胞のマーカーとして使用できると示唆された。グループIIのmiRNA群は、胃上皮細胞由来のiPS細胞2クローン991993を除く、生殖系列伝達germlinetransmissionを確認できたクローン全てにおいて発現していた。また、MEFから作製したiPSクローンの中で、germlinetransmissionを確認できなかった2クローン38C2、38D2においても発現がみられたが、TTFから作製したiPSクローンにおいては、全く発現していないか、あるいは発現していてもES細胞の場合と比較して低い発現量でしかなかった。この結果から、germlinetransmissionが起きるES細胞に非常に類似したiPS細胞のマーカーとしてグループIIのmiRNA群の発現を調べることは有用であると示唆された。ヒト細胞でのmiRNA発現の確認表8に示した細胞で発現されるmiRNAの発現のプロファイルを、HumanmiRNAmicroarrayV3を用いて行った。体細胞で発現されないがES細胞およびiPS細胞で発現されるグループIIIのヒトmiRNA群、ならびに、Dlk1Dio3領域のグループIVのヒトmiRNA群の数個のプローブの結果が、図6および図7に示されている。グループIIIの一覧を表11に、またグループIVの一覧を表12にそれぞれ示す。グループIVのヒトmiRNA群の多くが、ES細胞クローン、およびiPS細胞クローンで発現された。Dlk1、Meg3Gtl2、Meg8Rian、Meg9MirgおよびDio3遺伝子のmRNAの発現確認前記グループIIのmiRNA群と同じ遺伝子部位によってコードされているDlk1、Meg3Gtl2、Meg8Rian、Meg9MirgおよびDio3の発現を遺伝子発現アレイで調べた。その結果を図4に示す。父親由来の染色体においてのみ発現するDlk1遺伝子とDio3遺伝子は、iPS細胞クローン間でほぼ同様に発現されるが、母親由来の染色体においてのみ発現する遺伝子であるMeg3Gtl2、Meg8RianおよびMeg9Mirgの発現はiPS細胞クローン間でばらつきがあり、その分布は前記グループIIのmiRNA群の発現分布と相関していた。従って、この母親由来の染色体からのみ発現する遺伝子は、生殖系列伝達germlinetransmissionが起きるES細胞の機能と同等の機能を有するiPS細胞のマーカーとして有用であると示唆された。MEG3およびMEG8遺伝子のヒトmRNA発現の確認ES細胞およびiPS細胞でのMEG3mRNAおよびMEG8mRNAの発現を、Taqmanプローブによる定量PCRqPCRを用いて調べた。内部標準としてのMEG3、MEG8およびGAPDHのプローブアッセイIDはそれぞれ、Hs00292028m1Hs00419701m1およびHs03929097g1であった。結果を図8に示す。KhES1、201B2、201B7、TIG1034F4、TIG1144F1、TIG1204F1、13754F1、16874F2およびDP314F1は、これらの遺伝子を高度に発現していた。したがって、これらの遺伝子発現は、図6および図7に示されるヒトDLK1DIO3領域に局在するmiRNAの発現と相関していた。IGDMRおよびMEG3DMRのDNAメチル化の確認ES細胞RF8、MEFにOSKの3つの遺伝子を導入することによって作製した生殖系適合性germlinecompetentマウスiPS細胞178B5、およびTTFにOSKの3つの遺伝子を導入することによって作製した生殖系列伝達germlinetransmissionが確認できないiPS細胞について、IGDMRCytogenetGenomeRes113223229参照のメチル化を調べた。詳細には、NCBIのAJ320506の配列中の80479位の塩基から80829位の塩基までの範囲の351bp部分の中のCG配列に対するDNAのメチル化を測定した。DNAのメチル化の確認は、Bisulfite処理試薬としてHumangenetics社のMethylEasyXceedRapidDNABisulphiteModificationKitHumangeneticsを用いて目的の細胞から抽出したDNAを処理した後、IGDMRをPCRにより増幅し、クローニングしたPCR産物をキャピラリーシークエンサーにより解析することで行った。複数の実験を行ったなかで、ひとつの結果を図5に示す。ES細胞RF8の場合には、測定した61クローンのうち62がメチル化されており、178B5iPS細胞の場合には、測定した54クローンのうち50がメチル化された状態であると推定された。これは、父親由来もしくは母親由来の染色体のいずれか一方のみがメチル化されている状態であると推測されることから、これら2つの細胞系では、正常なインプリンティングimprintingが行われていると認められる。一方、生殖系列伝達が起きない335D3iPS細胞の場合においては、インプリンティング異常例えば、すべてのCpGのシトシンがメチル化されている場合であるという結果が得られた。このことより、IGDMRのメチル化を測定し、その領域のインプリンティングが正常か否かを確認することで、生殖系列伝達が起きるiPS細胞を選別することができることが示唆された。同様に、図9に示されたIGDMRCG4およびMEG3DMRCG7中のメチル化シトシンの濃度を、ヒト細胞で調べた。各クローンの結果を図10に示した。図中、図8に示されたqPCRの結果に基づいて、KhES1およびDP314F1は高いMEG3発現クローンとして例示され、KhES3および201B7は、中等度のMEG3発現クローンとして例示され、ならびに、H1および201B6は低いMEG3発現クローンとして例示された。IGDMRCG4およびMEG3DMRCG7内のDNAメチル化の程度は、MEG3およびMEG8のmRNAの発現と逆相間の関係にあった。例えば、IGDMRCG4内の65シトシンは、MEG3およびMEG8のmRNAを高発現しているDP314F1のIGDMR内でメチル化されていた。これに対して、IGDMRCG4内の93のシトシンは、MEG3およびMEG8のmRNAをほとんど発現していないIGDMRof201B6のIGDMR内でメチル化さていた。一方、Oct34遺伝子を発現する未分化細胞が、ES細胞またはiPS細胞の各々から分化誘導された神経細胞に含まれているか否かを、SFEBq法を用いて調べた。このSFEBq法は、次の工程を含む方法によって行った。ES細胞またはiPS細胞を、Y27632含有培地で培養した。フィーダー細胞を除くために、培養皿に、CTK剥離溶液を添加し、ゼラチンをコートした培養皿に移した。ES細胞またはiPS細胞を、Accumaxを用いて剥離した。剥離されたES細胞またはiPS細胞を、LIPIDURECOATPLATEに移し、分化培地、2mMLグルタミン、非必須アミノ酸および1μM2メルカプトエタノールを含有するDMEMHamsF12に10μMY27632、2μMDorsomorphinおよび10μMSB431542を含有させた培地で3または4日間培養した。培地の半分を、Y27632、DorsomorphinおよびSB431542を含有しない新鮮な分化培地と交換し、さらに10または11日間培養した。神経細胞に分化した後、TIG1084F3クローン図8に示されるMEG3およびMEG8のmRNA発現の相対値は、0および000083であった。、およびTIG1184F1クローンは、フローサイトメーターで調べたところ、依然としてOct34陽性細胞を含んでいた。これに対して、KhES1クローン、201B7クローン、などのクローンは、Oct34陽性細胞を含んでいなかった。これらの結果から、IGDMRおよびMEG3DMR内のDNAメチル化の程度、ならびにMEG3およびまたはMEG8の発現は、iPS細胞の品質のマーカーとして使用できることが示された。"