"硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列に動作可能に連結するプロモーターを含む遺伝的構築物であって、該プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターでない遺伝的構築物。該プロモーターが、構成的、非構成的、組織特異的、発生学的に調節された、又は誘導性/抑制性プロモーターである、請求項1記載の遺伝的構築物。該プロモーターが、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター、エンドウ豆プラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルa/b結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α,β-グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又は配列特異的プロモーターである、請求項1又は2記載の遺伝的構築物。該プロモーターが、CERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターである、請求項3記載の遺伝的構築物。硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列に動作可能に連結する、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターのいずれかを含む遺伝的構築物。該プロモーターが、実質的に配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含む、請求項1~5のいずれか1項記載の遺伝的構築物。該プロモーターが、実質的に配列番号2で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含む、請求項1~5のいずれか1項記載の遺伝的構築物。硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列が、シロイヌナズナ種、イネ属種、ポプラ属種又はタバコ属種に由来する、請求項1~7のいずれか1項記載の遺伝的構築物。該コード配列が、シロイヌナズナ、タバコ、コメ又はヨーロッパヤマナラシに由来し、好ましくはシロイヌナズナに由来する、請求項1~8のいずれか1項記載の遺伝的構築物。硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列が、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示される核酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む、請求項1~9のいずれか1項記載の遺伝的構築物。硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドが、実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む、請求項1~10のいずれか1項記載の遺伝的構築物。請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物を含有する組換えベクター。実質的に図5a及び5bに示される、請求項12記載のベクター。試験植物の葉の硝酸塩濃度を、同一条件で栽培した野生型植物の葉の対応する硝酸塩の濃度よりも低濃度に下げる方法であって、試験植物の植物代謝を変化させ、植物の葉の硝酸塩輸送体の濃度を上昇させることを含む方法。請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターで、該試験植物細胞を形質転換することを含む、請求項14記載の方法。下記工程を含む、同一条件で栽培した、対応する野生型植物よりも高い割合で硝酸塩を葉の外に輸送する形質転換植物を製造する方法:i請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターで、植物細胞を形質転換する工程;及びii該形質転換細胞から植物を再生する工程。修飾されていない植物に、硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を導入することを含む、形質転換植物を製造する方法であって、該外来遺伝子によりコードされる硝酸塩輸送体の発現により、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して、形質転換植物の葉の硝酸塩濃度を下げる方法。請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターを含有する形質転換植物。硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を含有する形質転換植物であって、該形質転換植物の葉の硝酸塩濃度が、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して低い、形質転換植物。外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、植物の葉の硝酸塩濃度を下げるための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用。外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、試験植物の老化又は老化表現型を誘導するための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用。該外来遺伝子が、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含み、又は実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含む硝酸塩輸送体をコードする、請求項17記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、又は請求項12若しくは13記載のベクターを含む宿主細胞。該細胞が植物細胞である、請求項23記載の宿主細胞。該植物が、アブラナ科、例えばアブラナ属に由来し、好ましくはセイヨウアブラナ菜種である、請求項14~17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。該植物が、イネ目、例えば、コムギ連、好ましくはコムギ属小麦に由来する、請求項14~17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。該植物が、ナス科、例えばチョウセン朝顔、ナスビ、マンドレイク、セイヨウハシリドコロベラドンナ、唐辛子パプリカ、チリペッパー、ジャガイモ又はタバコに由来する、請求項14~17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。該植物が、タバコ属に由来し、好ましくはタバコである、請求項14~17のいずれか1項記載の方法、請求項18若しくは19記載の形質転換植物、又は請求項20若しくは21記載の使用。請求項17、18又は請求項25~28のいずれか1項記載の形質転換植物から得られる植物繁殖産物。該繁殖産物が、請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項29記載の植物繁殖産物。同一条件で栽培した、野生型植物から得られた収穫された葉の対応する硝酸塩濃度よりも低濃度の硝酸塩を含む、収穫された葉であって、該葉が、請求項18、19又は25~28のいずれか1項記載の形質転換植物から収穫されているか、又は請求項16若しくは請求項17記載の方法により生産されている、収穫された葉。変異体タバコ植物から得られた、硝酸塩が少ないタバコを含むタバコ製品であって、変異体がその葉の硝酸塩濃度を下げることができる、タバコ製品。タバコ製品のタバコが由来する変異体タバコ植物が、請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項32記載のタバコ製品。該タバコ製品が、無煙タバコ製品、例えば嗅ぎタバコ、又は口で供給可能な口腔タバコ製品、例えば、スヌース、又は喫煙物品である、請求項32又は33記載のタバコ製品。変異体タバコ植物から得られる、硝酸塩が減少したタバコを含む喫煙物品であって、変異体が、その葉の硝酸塩濃度を下げることができるものである喫煙物品。タバコ製品のタバコが由来する変異体タバコ植物が、請求項1~11のいずれか1項記載の遺伝的構築物、請求項12若しくは13記載のベクター、又は請求項22に定義された外来遺伝子を含む、請求項35記載の喫煙物品。これらの健康上の懸念の結果として、多くの規制当局は、収穫期による、ほうれん草及びレタス等の緑色葉野菜において許容される硝酸塩の量の限度を設定した例えば、欧州委員会規則653/2003。これらの限度は、商品にならないような高い硝酸塩含有量を有する任意の農産物をもたらした。その結果、窒素含有肥料、又は改良された作物管理のシステムの応用を管理することにより、植物の硝酸塩含有量を低下させようとする努力がなされてきた。当局の中には飲料水中の硝酸塩量に限度を設定しているところもある。その結果、植物の硝酸塩蓄積に関連する悪影響を軽減する手段が必要とされている。この点を考慮し、本発明者らは、意外にも硝酸塩濃度の低下を示す形質転換植物の製造に使用することのできる、一連の遺伝的構築物を開発した。従って、本発明の第一の側面によれば、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列に動作可能に連結するプロモーターを含む遺伝的構築物であって、前記プロモーターがカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターでない遺伝的構築物が提供される。実施例で説明するように、特に、葉で硝酸塩濃度の低下を示す植物を開発する目的で、本発明者らは植物における窒素の再移動を調査した。本発明者らは、硝酸塩輸送体タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターの制御下に配置され、前記プロモーターが構成的プロモーター又は組織特異的プロモーター等のCAMV35Sプロモーターでない、多数の遺伝的構築物を調製した。その結果、本発明者らは、これらの構築物の態様で種々のタバコ種を形質転換し、温室で成長した硝酸塩輸送体を過剰発現する系において、植物が成長し、花芽形成を開始するにつれ、おそらく、葉がシンクからソース組織に変換するにつれ、開花期に近くなると主茎は茶/黒に着色することを観察した。本発明者らは、以前に、過剰の尿素を産生する植物でこの表現型を観察した。更に、本発明者らは植物の下部の葉は、後に低い硝酸塩含有量を有することを示す退緑斑点すなわち、不十分なクロロフィルによる青いパッチの成長を開始したことも示した。従って、本発明者らは、図10~20に示すように、形質転換植物中のタバコに特異的なニトロソアミンTSNAs;すなわち、4-メチルニトロソアミノ-1-3-ピリジル-1-ブタノンNNK、N-ニトロソノルニコチンNNN及びN-ニトロソアナタビンNATの濃度を測定し、前記遺伝的構築物による硝酸塩輸送体の過剰発現により、植物の葉の硝酸塩濃度、それ故、TSNA濃度がかなり低下することが観察されたことに驚いた。硝酸塩輸送体についての以前の研究は、その後に硝酸塩が貯蔵されている植物の液胞に輸送される根からの硝酸塩の吸収の増加を引き起こすことを示唆した。しかし、これらの実験の結果として、本発明者らは、意外にも、硝酸塩輸送体をコードする本発明の構築物が、液胞からの内部硝酸塩の遊離を引き起こし、その結果、以前考えたような葉に向かうのではなく、葉からの窒素の再移動の割合を増大さでる可能性があることを見いだした。本発明者らは、窒素が硝酸塩の形態で、葉から植物の若い部分、例えば植物の種子及び若い新芽に移動するという仮説をたてた。前記プロモーターは、RNAポリメラーゼの硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列への結合を誘導し、転写を開始し得る。本発明の構築物中の前記プロモーターは、構成的、非構成的、組織特異的、発生学的に調節された、又は誘導性/抑制性プロモーターであってもよい。遺伝子は全ての細胞型で同一レベルに発現されない場合があるが、構成的プロモーターは植物成長の際に連続的に植物の種々の器官を通して遺伝子の発現を指示する。公知の構成的プロモーターの例には、ライスアクチン1遺伝子Zhangら、1991,PlantCell,3,1155-65及びトウモロコシユビキチン1遺伝子Cornejoら、1993,PlantMolec.Biol.,23,567-581と関連するものが含まれる。本発明においては、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーターHullら、1986,EMBOJ.,5,3083-3090等の構成的プロモーターが特に好ましい。組織特異的プロモーターは、通常は植物器官の寿命を通じて、植物の1つ又はいくつかの器官での遺伝子発現を指示するものである。組織特異的プロモーターのカテゴリーには、その特異性が絶対的でないものも含まれる。すなわち、それらは好ましい組織以外の組織で低いレベルの発現をも指示する場合がある。当該技術分野で公知の組織特異的プロモーターの例には、ジャガイモ塊茎で発現するパタチン遺伝子に関連するもの、コムギ、オオムギ又はトウモロコシ胚乳で発現する高分子量グルテニン遺伝子が含まれる。発生学的に調節されたプロモーターは、植物の成長の際の特定の時期、例えば老化の際に、植物の1以上の器官で遺伝子発現の変化を指示する。前記遺伝子は、他の時期に植物の器官で種々の通常は低いレベルで発現する場合があり、他の植物器官でも発現する場合がある。誘導性プロモーターは、インデューサーと反応して遺伝子の発現を指示し得る。インデューサーが存在しない場合、前記遺伝子は発現しない。インデューサーは、プロモーター配列に直接作用する場合があり、又はリプレッサー分子の影響に拮抗することにより作用する場合がある。代謝産物、タンパク質、成長調整物質若しくは有害物質等の化学物質、熱、損傷、又は浸透圧等の生理的ストレス、又は病原体若しくは疾病の作用の間接的結果であってもよい。発生学的に調節されたプロモーターは、植物によって生産された内因性インデューサー、又は植物のライフサイクルの特定の時点での環境刺激に反応する特定のタイプの誘導性プロモーターとしても説明することができる。公知の誘導性プロモーターの例には、障害反応、温度応答、及び化学的誘発に関連するものが含まれる。前記プロモーターは、動物、植物、菌類、細菌及びウイルスを含む種々の供給源から得ることができ、種々のプロモーターは、種々の組織で種々の性能をもって機能し得る。プロモーターは、合成的に構築してもよい。従って、適切なプロモーターの例には、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター、エンドウ豆プラストシアニンプロモーター、ルビスコプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、クロロフィルa/b結合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α,β-グリアジンプロモーター、ホルデインプロモーター、パタチンプロモーター、又は配列特異的プロモーターが含まれる。例えば、適切な配列特異的プロモーターは老化関連遺伝子SAGに由来するものであってもよく、SAG12、SAG13、SAG101、SAG21及びSAG18からなる群から選択することができる。好ましくは、前記プロモーターは、CERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターのいずれかである。従って、本発明の第二の側面によれば、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列と動作可能に連結するカーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターのいずれかを含む遺伝的構築物が提供される。一態様においては、前記プロモーターは、当業者に公知である、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター、又はその機能的変異体若しくは断片であってもよいHullら、EMBOJ.,5,3083-3090。CERVプロモーターをコードするDNA配列は232塩基対の長さであり、本明細書では、以下の通り配列番号1と呼ぶ:配列番号1AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAGCTTTTAGGATTCCATAGTGATAAGATATGTTCTTATCTAAACAAAAAAGCAGCGTCGGCAAACCATACAGCTGTCCACAAAAAGGAAAGGCTGTAATAACAAGCGGACCCAGCTTCTCAGTGGAAGATACTTTATCAGACACTGAATAATGGATGGACCCTACCACGATTAAAGAGGAGCGTCTGTCTAAAGTAAAGTAGAGCGTCTTT従って、本発明の構築物における前記プロモーターは、実質的に配列番号1で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含んでいてもよい。CERVプロモーターは、カリオウイルスcauliovirus、又はカリオウイルスの形跡を示すDianthuscaryophyllusすなわち、カーネーション等の植物種から得ることができる。前記プロモーターがCERVプロモーターである態様においては、当然のことながらこのプロモーターは、配列番号1の塩基1~232のそれぞれを含む。しかし、前記プロモーターの機能的変異体又は機能的断片も、本発明の遺伝的構築物において用いることができる。プロモーターの機能的変異体又は機能的断片は、そこに動作可能に連結した任意のコード領域の発現を開始するのに十分機能的である、プロモーターの誘導体又は一部であってもよい。例えば、前記プロモーターがCERVプロモーターをベースとする態様においては、当業者は、なお構築物中で遺伝子発現を開始するように、配列番号1を修飾することができ、又はCERVプロモーターの一部のみを必要とする場合があることを認識するであろう。前記プロモーターの機能的変異体及び機能的断片は、転写酵素が推定上のプロモーター領域と結合し、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチド内のコード領域の転写をもたらすか否かを評価することにより、容易に特定することができる。また、このような機能的変異体及び断片がコード領域と関連づけられている場合、プロモーターに突然変異生成を実施し、遺伝子発現が起こるか否かを評価することによって調べることができる。他の態様においては、前記プロモーターは当業者に公知であるエンドウ豆プラストシアニンプロモーター、又はその機能的変異体若しくは断片であってもよいHelliwellandGray,1995,PlantMol.Biol.293:621-626。エンドウ豆プラストシアニンプロモーターをコードするDNA配列は783塩基対の長さであり、本明細書では、以下の通り配列番号2と呼ぶ:配列番号2TATGCAACTTACAACGTGCACTCGCGGAGGATTGGACGTGTGCAACTTACAACGTACGCATTGTTCGTTCATACAATAGTGTAGAATTGGACATGTGCAACTTACAACATGTGCAACTTACAACGTGCGCTCGCGGAGGAATGTGAAGTTGAACACGTACAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCTGAGCACACAATTCATAATTTGAAGGACACATGATTTGCTATAAAGAACTCTTTAGAAGTACCACAACTTTGACTGAGTTTGATATAGCTAATAAAGATGGAGCTCATTATAATTTGAATGGCATAATCAAGCTAAACGAACAAGCTTAGTTAATCATGTTAAACAACAATTCTTTGTAATAATAAATTGTCTTTCAACTAGTCCAAGTTTATGAGTTGATTCTTCGGAATAAATTAGAAAATATCTTAGATTTTATACTTCATTGATTATTTCATAGAGCAAGTAGGAGAAATAAAAATATACTAGTATTATTTACTAAAAAAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATCCAACCCAGCCAATCACAGCAATGTTCATCAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACATCTTAGCCACACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGATTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAAAA従って、本発明の構築物における前記プロモーターは、実質的に配列番号2で示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を含んでいてもよい。エンドウ豆プラストシアニンプロモーターは、Pisumsativumすなわち、エンドウ豆等のエンドウ属から得ることができる。本発明の第1又は第2の側面の構築物における硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドは、植物等の適切な任意の供給源から得ることができる。硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、例えばシロイヌナズナ属種、イネ属種、ポプラ属種又はタバコ属種等の適切な植物原料から得ることができる。前記コード配列は、シロイヌナズナ、コメ、ヨーロッパヤマナラシ又はタバコから得ることができる。構築体中のコード配列は、シロイヌナズナの硝酸塩輸送体、AtNRT2.7Orselら、PlantPhysiology,2002,129,886-896に開示されているをコードし得る。AtNRT2.7のゲノムDNAは、エクソン1298ヌクレオチド長とエクソン21184塩基長の間に位置する1個のイントロン78ヌクレオチド長を含んでいる。シロイヌナズナの硝酸塩輸送体の一態様をコードするゲノムDNA配列イントロンとエクソンを含むは本明細書において、以下の通り配列番号3として提供される:配列番号3ATGGAGCCATCTCAACGCAACACCAAACCGCCGTCGTTTTCAGATTCCACTATCCCGGTTGATTCCGATGGTCGAGCCACCGTCTTCCGACCATTCTCTCTCTCCTCGCCACACTCACGAGCCTTTCACCTAGCTTGGCTCTCACTCTTCTCATGCTTCTTCTCCACCTTCTCCATCCCTCCTCTGGTCCCCGTCATCTCCTCCGACCTCAACCTCTCTGCCTCCACCGTATCCGCCGCCGGAATCGCTTCCTTCGCTGGCTCCATCTTCTCTCGCCTCGCTATGGGACCACTCTGTGATCTCATCGGACCACGTACTTCCTCAGCGATTCTCTCTTTTCTCACCGCTCCTGTAATCCTCTCCGCCTCACTCGTCTCCTCTCCGACGTCCTTCATCCTCGTCCGTTTCTTCGTCGGCTTCTCGCTCGCTAATTTCGTAGCCAATCAATACTGGATGTCCTCCATGTTCTCCGGTAACGTCATTGGTCTCGCTAACGGTGTCTCAGCCGGTTGGGCTAACGTCGGCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTATGCCTCTCATATACTCCACCATAGCCGAATTCCTTCCACGCGCCGTCGCCTGGCGCGTGTCCTTCGTATTTCCCGCCATTTTTCAGGTTACAACGGCCGTCCTCGTTCTCCTCTACGGCCAAGATACTCCCCACGGTAACAGAAAAAACTCGAACCAGAACAAACTCACAATTCCTGAAGAAGAAGAAGTACTAGTAGTTGAAGAAGACGAACGTTCCAGTTTCGTCGAGATCCTAATCGGCGGACTTGGAAATTACAGAGCGTGGATCTTAGCGCTGCTCTACGGATACTCGTACGGCGTCGAGCTAACGACGGACAACGTGATCGCCGGATATTTCTACGAGAGATTTGGAGTGAATCTGGAGGCGGCGGGGACGATCGCGGCGAGTTTCGGGATATCGAACATTGCGTCGCGACCGGCGGGAGGGATGATATCGGATGCGCTGGGGAAGAGATTCGGTATGAGAGGGAGGCTGTGGGGGCTATGGATCGTGCAATCGGTGGCTGGGTTGTTGTGCGTGTTACTCGGACGAGTCAACTCGCTCTGGGGATCAATCCTCGTCATGTGGGTCTTCTCTGTTTTCGTTCAAGCTGCTTCTGGCCTTGTATTTGGCGTGGTCCCTTTCGTCTCCACGCGGTTAGTTTAAAGTCTACCAATCCGGTTTTTGCTAATAATTTCGGTTTGGTTTTAATTTGGTTTTGTTTATAATGACAGATCGTTAGGAGTGGTGGCGGGAATTACGGGAAGCGGCGGTACGGTTGGTGCGGTGGTGACGCAGTTTCTGTTGTTTTCCGGTGATGATGTTCGAAAACAGAGAAGCATTTCACTTATGGGTTTGATGACTTTTGTGTTTGCTCTTTCTGTTACATCAATTTACTTTCCACAATGGGGTGGAATGTGTTGTGGGCCTTCGTCATCTTCCGAAGAAGAAGATATTTCTCGGGGACTCCTTGTAGAAGACGAAGATGAAGAAGGTAAAGTGGTTAGTGGTAGTCTACGTCCCGTTTGTTGAシロイヌナズナの硝酸塩輸送体をコードするcDNAエクソンのみは本明細書において、以下の通り配列番号4として提供される:配列番号4ATGGAGCCATCTCAACGCAACACCAAACCGCCGTCGTTTTCAGATTCCACTATCCCGGTTGATTCCGATGGTCGAGCCACCGTCTTCCGACCATTCTCTCTCTCCTCGCCACACTCACGAGCCTTTCACCTAGCTTGGCTCTCACTCTTCTCATGCTTCTTCTCCACCTTCTCCATCCCTCCTCTGGTCCCCGTCATCTCCTCCGACCTCAACCTCTCTGCCTCCACCGTATCCGCCGCCGGAATCGCTTCCTTCGCTGGCTCCATCTTCTCTCGCCTCGCTATGGGACCACTCTGTGATCTCATCGGACCACGTACTTCCTCAGCGATTCTCTCTTTTCTCACCGCTCCTGTAATCCTCTCCGCCTCACTCGTCTCCTCTCCGACGTCCTTCATCCTCGTCCGTTTCTTCGTCGGCTTCTCGCTCGCTAATTTCGTAGCCAATCAATACTGGATGTCCTCCATGTTCTCCGGTAACGTCATTGGTCTCGCTAACGGTGTCTCAGCCGGTTGGGCTAACGTCGGCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTATGCCTCTCATATACTCCACCATAGCCGAATTCCTTCCACGCGCCGTCGCCTGGCGCGTGTCCTTCGTATTTCCCGCCATTTTTCAGGTTACAACGGCCGTCCTCGTTCTCCTCTACGGCCAAGATACTCCCCACGGTAACAGAAAAAACTCGAACCAGAACAAACTCACAATTCCTGAAGAAGAAGAAGTACTAGTAGTTGAAGAAGACGAACGTTCCAGTTTCGTCGAGATCCTAATCGGCGGACTTGGAAATTACAGAGCGTGGATCTTAGCGCTGCTCTACGGATACTCGTACGGCGTCGAGCTAACGACGGACAACGTGATCGCCGGATATTTCTACGAGAGATTTGGAGTGAATCTGGAGGCGGCGGGGACGATCGCGGCGAGTTTCGGGATATCGAACATTGCGTCGCGACCGGCGGGAGGGATGATATCGGATGCGCTGGGGAAGAGATTCGGTATGAGAGGGAGGCTGTGGGGGCTATGGATCGTGCAATCGGTGGCTGGGTTGTTGTGCGTGTTACTCGGACGAGTCAACTCGCTCTGGGGATCAATCCTCGTCATGTGGGTCTTCTCTGTTTTCGTTCAAGCTGCTTCTGGCCTTGTATTTGGCGTGGTCCCTTTCGTCTCCACGCGGTCGTTAGGAGTGGTGGCGGGAATTACGGGAAGCGGCGGTACGGTTGGTGCGGTGGTGACGCAGTTTCTGTTGTTTTCCGGTGATGATGTTCGAAAACAGAGAAGCATTTCACTTATGGGTTTGATGACTTTTGTGTTTGCTCTTTCTGTTACATCAATTTACTTTCCACAATGGGGTGGAATGTGTTGTGGGCCTTCGTCATCTTCCGAAGAAGAAGATATTTCTCGGGGACTCCTTGTAGAAGACGAAGATGAAGAAGGTAAAGTGGTTAGTGGTAGTCTACGTCCCGTTTGTTGA従って、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドをコードするコード配列は、実質的に配列番号3若しくは配列番号4で示される核酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含んでいてもよい。本発明者らは、前記イントロンが前記構築物のインビボでの安定性を上昇させ得ると考えている。それ故、前記構築物は、配列番号4、すなわちシロイヌナズナの硝酸塩輸送体をコードするcDNAを含んでいてもよい。シロイヌナズナの硝酸塩輸送体のポリペプチド配列は本明細書において、以下の通り配列番号5として提供される:配列番号5MEPSQRNTKPPSFSDSTIPVDSDGRATVFRPFSLSSPHSRAFHLAWLSLFSCFFSTFSIPPLVPVISSDLNLSASTVSAAGIASFAGSIFSRLAMGPLCDLIGPRTSSAILSFLTAPVILSASLVSSPTSFILVRFFVGFSLANFVANQYWMSSMFSGNVIGLANGVSAGWANVGAGISQLLMPLIYSTIAEFLPRAVAWRVSFVFPAIFQVTTAVLVLLYGQDTPHGNRKNSNQNKLTIPEEEEVLVVEEDERSSFVEILIGGLGNYRAWILALLYGYSYGVELTTDNVIAGYFYERFGVNLEAAGTIAASFGISNIASRPAGGMISDALGKRFGMRGRLWGLWIVQSVAGLLCVLLGRVNSLWGSILVMWVFSVFVQAASGLVFGVVPFVSTRSLGVVAGITGSGGTVGAVVTQFLLFSGDDVRKQRSISLMGLMTFVFALSVTSIYFPQWGGMCCGPSSSSEEEDISRGLLVEDEDEEGKVVSGSLRPVC従って、硝酸塩輸送体活性を有するポリペプチドは、実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含んでいてもよい。本発明者らは、CERVプロモーター又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーターを用いてシロイヌナズナ由来の硝酸塩輸送体タンパク質NRT2.7を発現させる構築物を開発した。このタンパク質は、硝酸塩を液胞に輸送させることに関与していることが示唆されており、以前は潜在的に硝酸塩の捕捉に関与すると考えられていた。しかし、決定的な証拠はなかった。シロイヌナズナのATNRT2.7遺伝子を過剰発現させると、形質転換植物において、特に開花の開始の際に強い表現型を示す。本発明者らは、本発明の構築物を用いたATNRT2.7の過剰発現により、葉の硝酸塩含有量を相当に下げることができ、従って、本発明の構築物で形質転換した植物中のTSNA濃度を都合よく下げることができることを見いだした。前記構築物は、本発明の構築物で形質転換された植物中の硝酸塩濃度を、野生型植物すなわち、本発明の構築物で形質転換されていない植物の硝酸塩の濃度と比較し、少なくとも5、10、15、18、20、32、35、38、40、50、60又は63図2、6及び8に示すように下げることができる。前記構築物は、前記構築物で形質転換された植物中の4-メチルニトロソアミノ-1-3-ピリジル-1-ブタノンNNKの濃度を、野生型植物のNNK濃度と比較し、少なくとも10、20、30、40、50、60、61、62、65、69、71又は75図10~15に示すように下げることができる。前記構築物は、前記構築物で形質転換された植物中のN-ニトロソノルニコチンNNNの濃度を、野生型植物のNNN濃度と比較し、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、71、75、78、80、82、84、85、88、90又は94図10~15に示すように下げることができる。前記構築物は、前記構築物で形質転換された植物中のN-ニトロソアナタビンNATの濃度を、野生型植物のNAT濃度と比較し、少なくとも5、6、10、20、23、24、30、40、46、45、48、50、60、70、80又は85図10~15に示すように下げることができる。前記構築物は、前記構築物で形質転換された植物中のタバコに特異的なニトロソアミンTSNAの総濃度を、野生型植物のTSNA総濃度と比較し、少なくとも10、20、30、40、50、56、60、64、65、70又は75図18~20に示すように下げることができる。好ましくは、前記構築物は、T0、T1及び/又はT2植物群の植物由来の葉又は茎中の硝酸塩、NNK、NNN、NAT及び総TSNAを含む化合物の群から選択される化合物のいずれかの濃度を下げることができる。前記構築物は、植物の下部、中間部又は上部に位置する葉の中の前記化合物のいずれかの濃度を下げることができる。下部は、植物の下3分の1を意味し、上部は植物の上3分の1を意味し、中間部は、前記下部及び上部の間の植物の中央の3分の1を意味する。図24に示すように、PPC-AtNrt2.7を有している植物の葉の中央部のNNK濃度は検出限界未満であった。従って、前記構築物は、植物の中間部に位置する葉の中のNNKの濃度を下げることができる。本発明の遺伝的構築物は、宿主細胞内で硝酸塩輸送体をコードするコード配列の発現に適している発現カセットの形態であってもよい。本発明の遺伝的構築物は、ベクターに組み込むことなく宿主細胞内に取り込むことができる。例えば、核酸分子であってもよい前記遺伝的構築物を、リポソーム又はウイルス粒子内に取り込んでもよい。また、精製した核酸分子例えば、ヒストンを含まないDNA又は裸のDNAを、適切な手段、例えばエンドサイトーシスによる取り込みにより、宿主細胞に直接挿入することができる。前記遺伝的構築物は、形質移入、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、原形質融合又は遺伝子銃照射によって、宿主被験者例えば、植物の細胞に直接導入することができる。また、本発明の遺伝的構築物は、パーティクルガン法を用いて宿主細胞に直接導入することができる。また、前記遺伝的構築物は、例えば適切な宿主細胞内での発現のためにベクター内に保持される場合がある。従って、第3の側面では、第1又は第2の側面の遺伝的構築物を含む組換えベクターが提供される。前記組換えベクターは、プラスミド、コスミド又はファージファージであってもよい。このような組換えベクターは、宿主細胞を本発明の遺伝的構築物で形質転換するのに、また宿主細胞中で発現カセットを複製するのに非常に有用である。当業者であれば、本発明の遺伝的構築物を、発現させるための多くのタイプのバックボーンベクターと結合することができることを理解しているであろう。前記バックボーンベクターは、例えば、大腸菌及びアグロバクテリウムツメファシエンスの両方で複製することのできるバイナリーベクターであってもよい。例えば、適切なベクターは、pBIN19BevanM.,1984,NucleicAcidsResearch12:8711-21等のpBINベクターであってもよい。組換えベクターは、プロモーター例えば、CERV又はエンドウ豆プラストシアニンプロモーター及び硝酸塩輸送体をコードするコード配列に加え、別の種々の機能要素を含んでいてもよい。例えば、前記組換えベクターは、宿主細胞の細胞質ゾル中で自発的に複製するように設計することができる。このケースにおいては、前記組換えベクター中にDNA複製を誘導又は調節する要素が必要な場合がある。また、前記組換えベクターは、宿主細胞のゲノム中で一体化するように設計することができる。このケースにおいては、標的組み込み例えば、相同的組換えに好都合なDNA配列が想定される。前記組換えベクターは、クローニング過程で選択的マーカーとして用いることのできる遺伝子、すなわち、形質移入又は形質転換された細胞の選択を可能にし、異種DNAが組み込まれたベクターを有している細胞の選択を可能にする遺伝子をコードするDNAを含んでいてもよい。前記ベクターは、更にコード配列の発現の制御、又は宿主細胞の特定の器官、例えば葉緑体に発現されたポリペプチドを標的とするために関与するDNAを含んでいてもよい。従って、第3の側面のベクターは、選択的マーカー遺伝子例えば、抗生物質耐性遺伝子;ポリペプチド終始コドン;及びタンパク質標的配列例えば、葉緑体輸送ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの追加の要素を含んでいてもよい。適切なマーカー遺伝子には、抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナマイシン、ジェネティシンG418及びハイグロマイシンnpt-II、hyg-Bに対する耐性を付与するもの等;除草剤耐性遺伝子、例えば、除草剤に基づくホスフィノトリシン及びスルホンアミドに対する耐性を付与するものbar及びsuI、それぞれ、欧州特許出願公開第242246号A、欧州特許出願公開第0249637号A;並びにスクリーニング可能なマーカー、例えば、ベータ-グルクロニダーゼ英国特許第2197653号、ルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質GFPが含まれる。前記マーカー遺伝子は、細胞種であってもなくてもよい内での発現を可能にし、その結果、植物の成長のいずれの段階であっても、マーカーを含む細胞又は組織の選択を可能にする第2のプロモーターにより制御されてもよい。適切な第2のプロモーターは、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター、及び35SカリフラワーモザイクウイルスCaMV転写産物をコードする遺伝子に由来するプロモーターである。しかし、適切な別の第2のプロモーターを使用してもよい。本発明の遺伝的構築物の種々の態様は、以下に要約する実施例に説明するクローニング手順を用いて調製することができる。硝酸塩輸送体をコードする遺伝子のゲノム又はcDNAバージョンは、例えば配列番号6及び7等の適切なプライマーを用いるPCRによりゲノム又はcDNA鋳型から増幅することができる。その後、PCR産物はアガロースゲル電気泳動を用いて調べることができる。次いで、前記PCR産物をクローニングに適したベクター、例えばpCR4Blunt-TOPOベクターInvitrogenに結合することができる。前記PCR産物を保持するベクターを適切な宿主、例えば大腸菌内で成長させることができる。次いで、大腸菌のコロニーを、適切なプライマーを用いるPCRによりスクリーニングすることができ、正しい制限酵素消化パターンを示すプラスミド内の挿入物は、適切なプライマーを用いて配列決定することができる。TOPO-cDNAAtNRT2.7又はTOPOゲノムDNAAtNRT2.7を保持している大腸菌のコロニーを培養して適当量の各プラスミドを産生することができ、その後、これを精製してもよい。次いで、プラスミドを消化し、AtNRT2.7をコードするDNA断片を放出した後、適切なプロモーターを保持しているベクター、例えばCERV又はエンドウ豆プラストシアニンPPCプロモーター、pBNPプラスミドvanEngelenら、1995,TransgenicResearch,4:288-290にクローニングすることができる。得られたAtNRT2.7構築物を、BNP-036AtNRT2.7001エンドウ豆プラストシアニンプロモーターを含む及びCRVAtNRT2.7CERVプロモーターを含むと命名した。第3の側面のベクターの態様は、実質的に図5a及び5bに示すことができる。これらの意外な結果を考慮し、本発明者らは、形質転換植物内での外来硝酸塩輸送体の発現を用いて植物の葉の中の硝酸塩濃度を下げる方法を最初に開発したと考えている。従って、第4の側面においては、試験植物の葉の硝酸塩濃度を、同一条件で栽培した野生型植物の葉の対応する硝酸塩の濃度よりも低濃度に下げる方法であって、試験植物の植物代謝を変化させ、植物の葉の硝酸塩輸送体の濃度を上昇させることを含む方法が提供される。本発明の第5の側面においては、下記工程を含む、同一条件で栽培した、対応する野生型植物よりも高い割合で硝酸塩を葉の外に輸送する形質転換植物を製造する方法が提供される:i第1又は第2の側面の遺伝的構築物、又は第3の側面のベクターで植物細胞を形質転換する工程;及びii該形質転換細胞から植物を再生する工程。第6の側面においては、修飾されていない植物に、硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を導入することを含む、形質転換植物を製造する方法であって、該外来遺伝子によりコードされる硝酸塩輸送体の発現により、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して、形質転換植物の葉の硝酸塩濃度を下げる方法が提供される。第7の側面においては、第1又は第2の側面の遺伝的構築物、又は第3の側面のベクターを含有する形質転換植物が提供される。第8の側面においては、硝酸塩輸送体をコードする外来遺伝子を含有する形質転換植物であって、該形質転換植物の葉の硝酸塩濃度が、修飾されていない植物の葉の硝酸塩濃度と比較して低い、形質転換植物が提供される。第9の側面においては、外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、植物の葉の硝酸塩濃度を下げるための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用が提供される。実施例6で説明するように、本発明者らは、本発明の構築物で形質転換した、硝酸塩輸送体過剰発現系において、硝酸塩濃度が下がることを示すのと同様に、植物が退緑斑点も成長させることを観察した。これらの斑点は、単に硝酸塩濃度が下がることによって起こる単なる黄変よりもはるかに多いように思われ、実際には葉の老化に類似している。従って、本発明者らは、タバコ中のAtNRT2.7の形質転換発現構成的プロモーターを用いるがタバコの葉の中の老化表現型を誘導し得ることを証明した。意外にも、老化誘導は、硝酸塩すなわち、10mMNO3に特異的であり、アンモニウム10mMNH4又はより低濃度では観察されなかった。従って、これらの結果は、AtNRT2.7が葉の硝酸塩濃度を下げることができるだけでなく、老化様表現型を引き起こすか早めることができることを示している。仮説に拘束されることを望まないが、本発明者らは硝酸塩濃度が下がったことの結果として、老化の開始に液胞が重要な役割を果たし得る例えば、タバコにおいてと考えている。従って、本発明者らは、本発明の構築物を、時期を早めて植物の老化又は老化様表現型を誘導するために用いることができると考えている。明らかに、タバコ等の特定の植物種においては、老化の誘導又は加速は、例えば喫煙したタバコの葉の香りを向上させるのに好都合である。従って、第10の側面においては、外来核酸配列を用いた植物の形質転換により、試験植物の老化又は老化様表現型を誘導するための、硝酸塩輸送体をコードする外来核酸配列の使用が提供される。葉の老化は、細胞死の前に細胞が明確な代謝及び構造変化を受ける期間の植物生長の段階である。生理学的及び遺伝的研究では、老化が高度に調節された過程であることが示されている。葉の老化の進行は、葉緑体の分解に起因するクロロフィルの損失と、その後に起こる黄変により明瞭に示される。この成長段階の特徴である葉のクロロフィルの減少は、例えば溶媒抽出及び分光光度測定、又はクロロフィル成分計により測定することができる。好ましくは一定条件下で成長した同じ植物について記録しておいた以前の葉のクロロフィルレベルと比較し、葉のクロロフィル濃度が下がっていることは、老化又は老化様表現型であることを示す。分子的研究では、老化が遺伝子発現の変化と関連することが示されている。光合成に関与するタンパク質をコードするmRNAのレベルは老化の際に減少するが、老化に関与すると思われるタンパク質をコードする遺伝子のmRNAレベルは上昇することを示している。老化は、老化関連遺伝子SAGsとして知られている遺伝子により調節される非常に系統だった過程である。葉の老化は、タンパク質、核酸及び膜の分解、それに続く、この分解に由来する栄養素の植物の他の器官例えば、成長中の種子、葉又は貯蔵器官への輸送を必要とする。従って、これらの特徴のいずれかを所定の方法を用いて測定し、老化又は老化様表現型が時期尚早に誘導されたかを判定することができる。修飾されていない植物という用語は、外来遺伝子又は本発明の構築物で形質転換する前の植物を意味する。従って、修飾されていない植物は野生型植物であってもよい。外来遺伝子という用語は、修飾されていない植物に形質転換される遺伝子が外部に由来する遺伝子、すなわち異なる種から1つの種に形質転換される遺伝子を意味する。前記外来遺伝子は、修飾されていない植物の硝酸塩輸送体をコードする内在性遺伝子と実質的に同一又は異なる核酸配列を有していてもよい。前記外来遺伝子は、シロイヌナズナNRT2.7遺伝子等の任意の種に由来する硝酸塩輸送体をコードするゲノム又はcDNA配列に由来してもよい。外来遺伝子は、それ自体で第1又は第2の側面による遺伝的構築物を構成することのできるキメラ遺伝子に由来してもよい。前記外来遺伝子は、実質的に配列番号5で示されるアミノ酸配列、又はその機能的変異体若しくは機能的断片を有する硝酸塩輸送体をコードし得る。前記外来遺伝子は、実質的に配列番号3若しくは4のいずれかで示されるヌクレオチド配列、又はその機能的変異体若しくは断片を含んでいてもよい。植物の葉の硝酸塩のレベルを測定する方法を実施例で説明する。本発明の方法及び使用は、試験植物細胞又は修飾されていない植物細胞を、第1若しくは第2の側面の遺伝的構築物、第3の側面のベクター、又は本明細書に記載された外来遺伝子で形質転換することを含む。従って、第11の側面においては、第1若しくは第2の側面の遺伝的構築物、又は第3の側面の組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。前記細胞は植物細胞であってもよい。前記細胞は、公知の方法を用い、本発明の遺伝的構築物、ベクター又は外来遺伝子で形質転換されていてもよい。前記遺伝的構築物を宿主細胞に導入するための適切な手段には、例えば、欧州特許出願公開第0116718号A及び第0270822号Aに開示されたような、当該技術分野で公知の方法により、アグロバクテリウムにより輸送される無力化されたTi-プラスミドベクターの使用が含まれる。更なる方法は、最初に細胞壁を除去して核酸を取り込んだ後、細胞壁を再形成することを含む、植物プロトプラストの形質転換であってもよい。次いで、形質転換細胞を植物に成長させる。好ましくは、また好都合には、本発明の方法及び使用は、生成された試験又は形質転換植物の健康又は適応度に支障をきたさない。本発明者らは、植物宿主細胞内での硝酸塩輸送体例えば、AtNRT2.7の過剰発現が、植物の葉からの硝酸塩輸送体を、好ましくは植物細胞の液胞の外に誘導するのに効果的であることに気づいた。従って、本発明の方法及び使用は、硝酸輸送体が過剰発現するように、前記試験植物を本発明の1以上の構築体で形質転換することを含む。本発明の形質転換植物又は試験植物には、アブラナ属等のアブラナ科の植物を含まれる。前記植物はセイヨウアブラナ菜種であってもよい。形質転換植物又は試験植物の更なる例には、コムギ連等のイネ目の植物が含まれる。前記植物はコムギ属コムギであってもよい。コムギ中の種子タンパク質含有量が増大すると、コムギを含む食品、例えばパンの容積が増大する。本発明の適切な形質転換植物又は試験植物の更なる例には、ナス科の植物、例えば、チョウセン朝顔、ナスビ、マンドレイク、セイヨウハシリドコロベラドンナ、唐辛子パプリカ、チリペッパー、ジャガイモ又はタバコが含まれる。適切なナス属の植物の一例はタバコである。タバコの適切な種は、タバコ植物、又は単にタバコと呼ばれる。タバコは、以下のように、本発明の構築物、ベクター及び外来遺伝子で形質転換することができる。タバコは、本質的にHorschらScience227:1229-1231,1985に開示されている通り、リーフディスク共栽培法を用いて形質転換する。最も若い伸長する2枚の葉は、発芽7週間のタバコ植物から得ることができ、Domestos商標の8溶液で10分間表面殺菌し、滅菌蒸留水で6回洗浄してもよい。リーフディスクを、6番のコルクボーラーを用いて切断し、本発明の適切なバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム懸濁液内に約2分間置く。前記ディスクは、滅菌ろ紙の2枚のシートの間にそっとブロットする。10枚のディスクを、LS3ショ糖2μMBAP0.2μMNAAを含むプレートに載せ、培養室内で2日間インキュベートする。ディスクを、500g/Lのクラフォランと100g/Lのカナマイシンを添加した、LS3ショ糖2μMBAP0.2μMNAAを含むプレートに移す。前記ディスクを、2週間後に前記培地の新しいプレートに移す。更に2週間後、前記リーフディスクを、500mg/Lのクラフォランと100mg/Lのカナマイシンを追加した、LS3ショ糖0.5μMBAPを含むプレートに移す。前記リーフディスクを、2週間毎に新鮮な培地に移す。新芽が現れたら、それらを切除し、500mg/Lのクラフォランを追加した、LS3ショ糖を含む瓶に移す。約4週間後、瓶の中の新芽を、LS3ショ糖250mg/Lのクラフォランに移す。更に3~4週間後、植物を、LS3ショ糖抗生物質を含まないに移し、植え付ける。植物がいったん根付いたら、温室内の土壌に移してもよい。第12の側面においては、第7又は第8の側面の形質転換植物から得られる植物繁殖産物が提供される。植物繁殖産物は、更に植物を生産することができる植物から得られるあらゆる植物であってもよい。好適には、前記植物繁殖産物は種子であってもよい。前記植物繁殖産物は、好ましくは本発明の構築物若しくはベクター、又は外来遺伝子を含んでいてもよい。本発明者らは、本発明の構築物で形質転換した試験植物すなわち、形質転換植物が、硝酸塩の濃度、従ってNNK、NNN及び/又はNAT等のTSNAsを葉の中で減少させるように、硝酸塩の葉の外への再移動を増大させることを観察した。従って、明らかにこのような葉は特に好都合である。従って、本発明の第13の側面においては、同一条件で栽培した、野生型植物から得られた収穫された葉の対応する硝酸塩濃度よりも低濃度の硝酸塩を含む、収穫された葉であって、該葉が、第7若しくは第8の側面のいずれかの形質転換植物、又は第5若しくは第6の側面のいずれかの方法により生産されている、収穫された葉が提供される。本発明の第14の側面においては、変異体タバコ植物から得られた、硝酸塩が少ないタバコを含むタバコ製品であって、変異体がその葉の硝酸塩濃度を下げることができる、タバコ製品が提供される。タバコ製品のタバコが由来する変異体タバコ植物は、本発明の構築物、ベクター又は外来遺伝子を含むことが好ましい。前記タバコ製品は、嗅ぎタバコ等の無煙タバコ製品であってもよい。前記タバコ製品は、口で供給可能な口腔タバコ製品であってもよい。前記タバコ製品は湿潤していてもよく、スヌースであってもよい。しかし、前記タバコ製品は喫煙物品であってもよい。従って、第15の側面においては、変異体タバコ植物から得られる、硝酸塩が減少したタバコを含む喫煙物品であって、変異体が、その葉の硝酸塩濃度を下げることができるものである喫煙物品が提供される。硝酸塩が減少したタバコには、硝酸塩濃度が、同一条件で栽培した野生型植物の対応する濃度よりも低いタバコが含まれる。上記喫煙物品には、本発明の第1若しくは第2の側面の遺伝的構築物、第3の側面のベクター、又は外来遺伝子で形質転換されていてもよい変異体タバコ植物から得られるタバコが含まれる。好ましくは、前記変異体タバコ植物は、硝酸塩輸送体、AtNRT2.7を含む。喫煙物品という用語には、タバコ、タバコ派生物、膨張タバコ、再構成タバコ、またはタバコ代替え品に基づく巻きタバコ、シガレット、葉巻、及びシガリロ等の喫煙製品や非燃焼性加熱製品が含まれる。当然のことながら、本発明は、実質的に本明細書で言及されたいずれかのアミノ酸又は核酸配列を含むその機能的変異体又は機能的断片を含む、任意の核酸若しくはペプチド、又はその変異体、誘導体若しくは類似体まで及ぶ。実質的にアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列、機能的変異体及び機能的断片という用語は、本明細書に言及された配列のいずれか1つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列と少なくとも40の配列同一性を有する配列であってもよく、例えば、配列番号3硝酸塩輸送体の一態様をコードするで特定される遺伝子と40の同一性を有する配列であってもよく、又は配列番号5すなわち、硝酸塩輸送体の一態様で特定されるポリペプチドと40の同一性を有する配列であってもよい。言及される配列のいずれかと、65を超え、更に好ましくは70を超え、更に好ましくは75を超え、更に好ましくは80を超える配列同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列は、本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも85の同一性を有し、本明細書で言及される配列のいずれかと、更に好ましくは少なくとも90の同一性、更に好ましくは少なくとも92の同一性、更に好ましくは少なくとも95の同一性、更に好ましくは少なくとも97の同一性、更に好ましくは少なくとも98の同一性、最も好ましくは少なくとも99の同一性を有する。当業者であれば、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性の割合を計算する方法を理解しているであろう。2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性の割合を計算するために、最初に2つの配列のアラインメントを作成した後、配列同一性の値を計算する必要がある。2つの配列についての同一性の割合は、i配列を整列させるのに用いる方法、例えば、ClustalW,FASTA,SmithWaterman異なるプログラムにより実行される、又は3D比較による構造アラインメント、及びiiアラインメント法、例えば全体アラインメントに対する局所アラインメントに使用されるパラメータ、使用される対スコア行列例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnet等、及びギャップペナルティ、例えば関数及び定数によって異なる値をとる可能性がある。アラインメントを作成すると、2つの配列間の同一性の割合の計算方法は多数ある。例えば、i最も短い配列の長さ;iiアラインメントの長さ、iii配列の平均長;ivギャップのない位置の数;又はiv突出部を除く等価位置の数によって同一部分の数を割ってもよい。更に、当然のことながら、同一性の割合は長さにも強く依存する。従って、対の長さが短いと、偶然に生じることを予測することのできる配列の同一性が高くなる。従って、当然のことながら、タンパク質又はDNA配列の正確なアラインメントは複雑な工程である。一般的な多重アラインメントプログラムであるClustalWThompsonら、1994,NucleicAcidsResearch,22,4673-4680;Thompsonら、1997,NucleicAcidsResearch,24,4876-4882は、本発明に従い、タンパク質又はDNAの多重アラインメントを生成するための好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメータは、以下の通りであってもよい:DNAアラインメントについては:ギャップ開始ペナルティー=15.0、ギャップ伸長ペナルティー=6.66及び行列=同一性。タンパク質アラインメントについては:ギャップ開始ペナルティー=10.0、ギャップ伸長ペナルティー=0.2、及び行列=Gonnet。DNA及びタンパク質アラインメントについては:ENDGAP=-1、及びGAPDIST=4。当業者であれば、最適な配列アラインメントのために、これら及び他のパラメータを変える必要があり得ることに気づいているであろう。好ましくは、次に、2つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列間の同一性の割合の計算は、N/T100式中、Nは同一残基を共有する配列の位置の数であり、Tはギャップを含むがオーバーハングを除いて比較される位置の総数であるとして、そのようなアラインメントから計算される。従って、2つの配列間の同一性の割合の最も好ましい計算法は、i一式の適切なパラメータ例えば、前述したようなパラメータを用いるClustalWプログラムを用いる配列アラインメントを作成すること、及びiiN及びTの値を以下の式:-配列同一性=N/T100に挿入することを含む。類似の配列の他の同定法が当該技術分野で公知である。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で配列番号1、2若しくは3に示される配列、又はそれらの相補体とハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約45°Cで3倍の塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウムSSC中でフィルター結合DNA又はRNAとハイブリダイズした後、約20~65°Cで0.2倍のSSC/0.1SDS中で少なくとも1回洗浄されることを意味する。また、実質的に類似のポリペプチドは、配列番号5に示す配列とは、少なくとも1個のアミノ酸が異なっていてもよいが、5、10、20、50又は100個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。遺伝子コドンの縮重のため、任意の核酸配列を、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、変化又は変更して、それらの機能的変異体を得ることができることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって配列が変化し、その結果静的な変化をもたらす変異体である。他の適切な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、置換されたアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって保存的変化をもたらすことにより、変化した配列の全て若しくは一部を含む変異体である。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが含まれる。中性の極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正電荷を持つ塩基性アミノ酸には、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。負の電荷を持つ酸性アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。従って、当然のことながら、アミノ酸は類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換してもよく、当業者であれば、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。本明細書添付の請求の範囲、要約書及び図面のいずれをも含むに記載されている全ての特徴、及び/又はそのように開示されているいずれの方法又は過程の全ての全ての工程は、そのような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除く任意の組み合わせで、前記側面のいずれかと組み合わせてもよい。本発明者らは、a構成的プロモーター、カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーターHullら、1986,EMBOJ.,5,3083-3090;又はb葉特異的プロモーター、エンドウ豆プラストシアニンPPCのいずれかの制御下で、硝酸塩輸送体遺伝子シロイヌナズナのNRT2.7を発現させることにより、硝酸塩及び種々のTSNAsの濃度を著しく減少させる構築物及び形質転換植物を開発した。実施例1-シロイヌナズナの硝酸塩輸送体遺伝子の単離この実験で用いられたシロイヌナズナの硝酸塩輸送体遺伝子はAtNRT2.7であった。プライマーの設計シロイヌナズナ由来の硝酸塩輸送体2.7をコードする全長ゲノム配列を特定したこの配列の受入番号は:T15N1-60であった。ゲノム配列を単離するためにPCRで用いられるプライマーを設計し、それは、4bpのスペーサーと適切な制限酵素認識部位を5’末端に有している。断片の5’末端にSacI及びBamHI制限酵素認識部位を生成し、3’末端にKpnI及びSacI制限酵素認識部位を生成し、前記断片を適切なベクターにクローニングすることができるようにした。これらのプライマーの配列を以下に示す。AtNRT2.7T15FATCGAGCTCGGATCCATGGAGCCATCTCAACGCAACACC[配列番号6]AtNRT2.7T15RATCGAGCTCGGTACCACAAACGGGACGTAGACTACC[配列番号7]当然のことだが、当業者はプライマーと他の制限酵素認識部位の必要な特徴を組み込んで、他のPCRプライマーを設計することができるであろう。NRT2.7をコードするシロイヌナズナのゲノムDNAの単離シロイヌナズナコロンビア変異種var.ColumbiaのゲノムDNAを、QiagenDNAEasyミニプレップ抽出キットを用いて、発芽3ヶ月の植物のロゼット葉から抽出した。手短に言えば、製造業者の使用説明書に従い、QIAGENDNeasyPlantDNA抽出キットカタログ番号69106QIAGENLtd.,クローリー、イギリスを用い、葉試料からゲノムDNAを抽出した。この方法により、遺伝子単離及びクローニング戦略に適した非常にきれいな遺伝子が大量に得られる。前記キットの原理は、高塩濃度条件下でDNAはシリカゲルをベースとする膜に特異的に吸収されるが、タンパク質、炭水化物、ポリフェノール及び他の植物代謝産物等の混入物は洗い流されることを利用する。硝酸塩輸送体DNA断片の単離シロイヌナズナNRT2.7のゲノム配列は1893塩基対の長さである受入番号T15N1-60。シロイヌナズナNRT2.7のゲノムを、T15F配列番号6とT15R配列番号7のプライマー対を用いて増幅し、断片の5’末端にSacI及びBamHI制限酵素認識部位を、3’末端にKpnI及びSacI制限酵素認識部位を生成した。PCRの条件:25μLの反応容量に、0.5μLのプルーフリーディングTAQポリメラーゼ;0.5μLのTAQエクステンダー;0.5μLのシロイヌナズナゲノムDNA;0.25μLのフォワードプライマー;0.25μLのリバースプライマー;2.5μのTAQエクテンダー緩衝液;2.5μLのdNTPs;18μLの水を加え、55°Cでアニーリングし、72°Cで2分間伸長し、これを30サイクル繰り返した。次いで、一定量のPCR反応物をアガロースゲル電気泳動で分析した。反応物を沈殿させた後、保存した。次いで、後述するように、硝酸塩輸送体DNA断片をpTOPOベクターInvitrogenから市販されている。にクローニングした。連結反応:1μLのTOPOを、1μLの塩溶液と4μLのPCR反応液と一緒にした。混合物を室温に30分静置した。2μLの連結反応混合物をTOP10大腸菌細胞と一緒にした後、30分間氷上で静置した。前記細胞に42°Cで30秒間熱ショックを与えた後、氷上に5分間静置した。次いで、前記細胞を250μLのSOC培地中、37°Cで30分間インキュベートした。次いで、前記細胞を、カナマイシンを含む寒天プレートに載せ、37°Cで一晩静置した。プラスミドを含む細胞がコロニーに成長し、約50個のコロニーについて各遺伝子配列を観察した。ゲノムDNA断片がうまく挿入されているpTOPOベクターを含む個々のクローンを選択するためにコロニーPCRを用いた。コロニーを選択してカナマイシンを含む50μLの2YTに入れ、37°Cで1時間増殖させた。10μLのPCR反応物に、1μLのdNTPs、1μLの緩衝液、0.1μLのフォワードプライマーM13F、0.1μLのリバースプライマーM13R、0.3μLのTAQ、及び7.5μLの水を加えた。予想される大きさのPCR断片を含む各配列について3つのコロニーを選択した。次いで、個々のコロニーを増殖し、配列分析のためにプラスミドDNAを抽出した。配列分析いくつかの独立したpTOPOクローン中に存在する硝酸塩輸送体DNA断片の配列決定をした。この配列の分析から、前記クローンが硝酸塩輸送体2.7遺伝子を含んでいることが判明した。実施例2-タバコの形質転換のためのベクターの構築AtNRT2.7をコードするゲノムDNAの、NRT2.7遺伝子を含むバイナリーベクターpTOPOプラスミドへのクローニングは、Kpn1とBamHIで消化してNRT2.7遺伝子断片を単離した後、Kpn1とBamHIでも消化してあるpBNPバイナリーベクターpBNP-PPC-nosTにクローニングし、その後大腸菌エレクトロコンピテントセルに形質転換した。pBNPベクターは、pBNPバイナリーベクターvanEngelenら、1995,TransgenicResearch,4:288-290から作成した自家製ベクターで、PPCプロモーターとノパリンシンターゼターミネーターを含む。プラスミドを含む細胞をカナマイシンプレートで選択した。次いで、次いで、クローンを単離し、DNAを抽出し、制限消化により分析し、配列決定した。CERVは、植物ウイルスのカリモウイルス群の構成的プロモーターである。1986年にHullらにより単離及び特徴付けされ、CaMVの特徴であるがHullら、1986、CaMV35Sプロモーターとわずかな配列類似性を有している図23を参照されたい。エンドウ豆プラストシアニンプロモーターは、HelliwellとGrayにより単離され1995,PlantMolecularBiology293:621-626、発現の研究により、それが葉に特異的であることが示されている。以下のバイナリーベクターが製造された:ipBNP036AtNRT2.7001図5aを参照されたい:エンドウ豆プラストシアニンプロモーター:Nrt2.7cDNA:Nosターミネーター;及びiipBNPCRVAtNRT2.7図5bを参照されたい:カーネーションエッチドリングウイルスCERVプロモーター:Nrt2.7cDNA:Nosターミネーター。次いで、これら2つのバイナリーベクターを、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンスLBA4404に形質転換した。形質転換は、40μLのアグロバクテリウムツメファシエンスエレクトロコンピテントセルと0.5μgのプラスミドDNAを混合し、予め冷却しておいたキュベットに入れることにより実施した。次いで、細胞を、1.5ボルト、600オーム及び25μFDでエレクトロポレートした。キュベットに、1mLの2YT培地を加え、混合物を30mLのユニバーサル容器に静かに移し、振盪インキュベーター中、28°Cで2時間インキュベートした。次いで、100μLの細胞を、カナマイシン50μg/mLとストレプトマイシン100μg/mLを含むLB寒天プレートに蒔いた。このプレートを28°Cで2日間インキュベートした。実施例3-タバコの形質転換タバコ栽培品種Vir40とタバコ栽培品種バーレー52を、HorschらScience227:1229-1231,1985に開示されている通り、リーフディスク共栽培法を用いて、pBNP036AtNRT2.7001又はpBNPCRVAtNRT2.7で形質転換した。最も若い伸長する2枚の葉を、発芽7週間のタバコ植物から得、Domestosの8溶液で10分間表面殺菌し、滅菌蒸留水で6回洗浄した。次いで、リーフディスクを、6番のコルクボーラーを用いて切断し、アグロバクテリウム懸濁液内に約2分間置いた。次いで、前記ディスクを、滅菌ろ紙の2枚のシートの間にそっとブロットした。10枚のディスクを、LS3ショ糖2μMBAP0.2μMNAAを含むプレートに載せた後、培養室内で2日間インキュベートした。次いで、ディスクを、500g/Lのクラフォランと100g/Lのカナマイシンを添加した、LS3ショ糖2μMBAP0.2μMNAAを含むプレートに移した。2週間後に、前記ディスクを前記培地の新しいプレートに移した。更に2週間後、前記リーフディスクを、500mg/Lのクラフォランと100mg/Lのカナマイシンを追加した、LS3ショ糖0.5μMBAPを含むプレートに移した。前記リーフディスクを、2週間毎に新鮮な培地に移した。新芽が現れたら、それらを切除し、500mg/Lのクラフォランを追加した、LS3ショ糖を含む瓶に移した。約4週間後、瓶の中の新芽を、LS3ショ糖250mg/Lのクラフォランに移した。更に3~4週間後、植物を最終的にLS3ショ糖抗生物質を含まないに移し、植え付けた。植物がいったん根付いたら、温室内の土壌に移した。実施例4-AtNRT2.7構築物の存在についての形質転換植物の分析再生タバコ形質転換体の分析再生タバコ植物から葉材料を得、ゲノムDNAを単離した。1枚の大きいタバコの葉約30mgを、インビトロで栽培した植物から切除し、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた。小さい乳棒を用いて前記組織を均質化し、400μLの抽出緩衝液200mMTrisHCLpH8.0;250mMNaCl;25mMEDTA;0.5SDS;40μg/mlRnaseAを加え、再度注意深く粉末にし、完全に混合した。試料をボルテックスで約5秒間混合した後、10,000rpmで5分間遠心分離した。得られた上清の一定量、350μLを新しいエペンドルフチューブに入れ、350μLのクロロホルムを加えた。混合した後、試料を5分間静置した。次いで、これを10,000rpmで5分間遠心分離した。上清の一定量、300μLを新しいエッペンドルフチューブに移した。これに300μLのプロパン-2-オールを加え、エッペンドルフを数回転倒することによって混合した。試料を10分間整地した。沈殿したDNAを、10,000rpmで10分間遠心分離することによって集めた。上清を捨て、沈殿を空気乾燥した。DNAの沈殿物を50μLの蒸留水に再懸濁し、定量PCRの鋳型として用いた。各構築物/変異型の30個の植物を定量PCRにより分析し、形質転換事象を確認した。結果T0:pBNP036AtNRT2.7001:バージニア種9個の単一コピーpBNP036AtNRT2.7001:バーレー種7個の単一コピーpBNPCRVAtNRT2.7:バーレー種10個の単一コピー実施例5-硝酸塩輸送体発現についての形質転換植物の分析RTPCRによりアッセイしたmRNAレベルAmbionRNAqueousキットAmbionInc.,カナダを用いて、タバコリーフディスクから総RNAを単離した。全ての凍結試料を液体窒素で粉砕し、tissuelyserを用いて微粉とした。4°C、13,000rpmで5分間遠心分離することにより、細胞外膜、多糖類、及び高分子量DNAを沈殿させた。上清を、キットに付属のフィルターカートリッジに移し、RNAを洗浄及び精製するために遠心分離した後、溶出緩衝液で溶出した。更に使用するまでにRNA試料を-80°Cに保存した。総RNAについて、Invitrogenの1ステップRTPCRスーパースクリプトIIIを用いてRTPCRを実施した図21aを参照されたい。次いで、AtNrt2.7配列番号8及び9に特異的なプライマーを用いて、得られたcDNAを増幅し、遺伝子発現を達成した。GCGCCGGTATCTCTCAGCTCCTTA=RTPCRプライマー配列RTP0068F2配列番号8。ATATCATCCCTCCCGCCGGT=RTPCRプライマー配列RTP0068R2配列番号9図21bに示すように、RT反応なしでRNAを用いて対照実験を実施し、DNAの混入がないことを確認した。形質転換系と、正しいバンドサイズを与えるためのプラスミド対照群と同時に、野生型対照群を実施した。実施例6-タバコ表現型AtNRT2.7のT0表現型pBNP036AtNRT2.7001:バーレー種は、その植物が発芽約12週間の時に、最も古い葉に退緑斑点を示した。これらの退緑斑点は、葉の老化と同時に、植物の上部の葉で徐々に増加した。植物の主茎に沿って、褐色の染みも観察された。表現型は形質転換体の70で観察された。この表現型は、T1個体群とT2個体群でも観察された。実施例7-硝酸塩含有量についてのタバコの分析植物組織中の硝酸塩の検出植物組織中の硝酸塩濃度を測定する方法は、Masclauxの論文Planta2000211,pp510-518を含む、いくつかの論文に開示されている。この方法は、高度な酸性条件下における植物抽出物中での硝酸塩によるサリチル酸のニトロ化、及び410nmで最大吸収を形成する複合体に依存する。生成した発色団は5-ニトロサリチル酸である。この方法は高感度であり、塩化物、亜硝酸塩及びアンモニウムイオンからわずかな干渉を受けるCataldoD.A.,CommunitySoilScienceandPlantAnalysis,61,pp71-80,1975。材料は:抽出緩衝液:50mMリン酸緩衝液pH7.5;アッセイ溶液:サリチル酸の濃硫酸溶液5濃度であり;2N水酸化ナトリウムも必要である。方法:最初に100mgの組織を液体窒素中で粉砕した後、300μLの抽出緩衝液を加え、均質化した。4°Cで、このホモジネートを30gで15分間遠心分離した後、分析のために上清を取り除いた。1mLのアッセイプレート中で、10μLの上清を40μLのアッセイ溶液と混合した空の対照群を同時に開始した。反応物を室温で20分間インキュベートし、950μLの2N水酸化ナトリウムをゆっくりと加え、12より大きいpHに上昇させた。試料を室温まで冷却し、410nmの吸光度を測定した読み取りのために、タイターテックプレートに250μLを静かに移した。100、50、40、30、20、10、5及び1mMの硝酸カリウムの標準品も測定した。抽出物の着色のため、新鮮な組織試料すなわち、凍結乾燥又はオーブン乾燥していないもの及び分離したブランクが必要である。このブランクは、抽出物、40μLの硫酸サリチル酸ではない及び1950μLの2N水酸化ナトリウムからなる。硝酸塩の標準品は4°Cに保存した。図2~9に説明する硝酸塩の結果は、本発明のCRV-AtNrt2.7構築物とPPC-AtNrt2.7構築物の両方を有する形質転換植物中の葉の硝酸塩濃度が下がっていることを示す。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、AtNrt2.7タンパク質が窒素再移動剤としての役割を果たし、種子の発生等で、植物の液胞の外からシンク領域への硝酸塩を運搬する役割を果たしていると仮説をたてている。これは、硝酸塩が枯渇している葉をもたらし、表現型によって示されるような萎黄病をもたらす。実施例8-TSNA含有量についての乾燥した葉の分析図10~27に示すTSNAの結果は、AtNrt2.7構築物の結果として、総TSNA濃度すなわち、NAT、NNK及びNNNの相当な減少を示す。これは、収穫期にそれほど残っていない葉の硝酸塩と関連すると仮定される。硝酸塩は、乾燥されたタバコの葉の中のTSNA生産のための主な前駆体の1つであるStaafら、2005,ContributionstoTobaccoResearch,21:321-330;deRotonら、2005,ContributionstoTobaccoResearch,21:305-320。従って、T0及びT1個体群に見られるように、葉の中の硝酸塩のレベルの低下は、乾燥された葉の中のTSNAのレベルの低下をもたらすであろう。特に、バーレー種は、畑で栽培された時に高レベルのNNNを含み、NNNのレベルが下がっていることが示された。図23及び24は、NNNとNNKのレベルが、それぞれ、PPC-AtNrt2.7構築物を保持する、畑で栽培した植物の葉の上部、中間部及び下部で下がっていることを示す。更に、図24に示すように、PPC-AtNrt2.7細胞系についての葉の中間部のNNK濃度は、全て検出レベルより低く、従って、このグラフには示されていない。図25及び図26は、10mM硝酸塩図25又は10mMアンモニア図26のいずれかで栽培した時の、CRV-AtNrt2.7構築物を保持する、温室栽培したバーレー種植物からのNNN混合物のレベルを示す。これらのデータは、NNN濃度の低下が、硝酸塩輸送体、AtNrt2.7の過剰発現により起こる、硝酸塩の輸送に特異的であることを示す。これは、図25に示すように、両方の試験植物43及び45と示すが、硝酸塩により栽培することによる濃度の低下を示すが、図26に示すように、硝酸塩輸送体遺伝子AtNrt2.7の過剰発現に影響を受けないアンモニアにより栽培した時に、いずれの植物もNNNの減少を示さないからである。"