"細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生された第1の抗体と、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生された第2の抗体とをを用いて、酵素免疫測定法サンドイッチ法、蛍光免疫測定法サンドイッチ法、放射性同位体免疫測定法サンドイッチ法、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法からなる群より選択されるいずれかの方法により、検体中のネコ由来α1ミクログロブリン濃度を測定する方法。細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生された第1の抗体と、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生された第2の抗体とを含む、ネコ由来α1ミクログロブリン濃度測定用キット。細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053。細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054。配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原とし、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生されたものである、ネコ由来α1ミクログロブリンに特異的に結合する抗体。配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原とし、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生されたものである、ネコ由来α1ミクログロブリンに特異的に結合する抗体。本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、より高感度でネコ由来のα1ミクログロブリンに特異的な抗体の組み合わせによる測定方法およびキット、ならびに、そのための抗体および抗体産生細胞株を提供することである。本発明者は、鋭意研究の結果、この抗体を産生する細胞を取得における、マウスの取得箇所等により、ネコ由来のα1ミクログロブリンの抗体への結合力が異なる点を発見し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。本発明は、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生された第1の抗体と、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生された第2の抗体を用いて酵素免疫測定法サンドイッチ法により、検体中のネコ由来α1ミクログロブリン濃度を測定する方法を提供する。本発明は、さらに、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生された第1の抗体と、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生された第2の抗体とを含む、ネコ由来α1ミクログロブリン濃度を測定するキットについても提供する。また本発明は、新規な抗体産生細胞株である細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054についても提供する。本発明はさらに、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原とし、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053または細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生されたものである、ネコ由来α1ミクログロブリンに特異的に結合する抗体についても提供する。本発明によれば、より確実に検体中のネコ由来α1ミクログロブリン濃度を高感度で測定することができるようになる。本発明によれば、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生された第1の抗体と、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生された第2の抗体とを用いて酵素免疫測定法サンドイッチ法により、検体中のネコ由来α1ミクログロブリン濃度を測定する方法が提供される。ここで、検体とは、ネコ由来の血液、尿、骨髄液およびネコ由来細胞の懸濁液の他、ネコの血液透析で用いた透析液も含まれる。また、ネコ由来α1ミクログロブリンとは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。本発明者は、ネコの遺伝子の中でα1ミクログロブリンをコードする構造遺伝子本明細書中においてα1m遺伝子と呼称する。を初めて特定し、当該α1m遺伝子によりネコ由来のα1ミクログロブリン本明細書中においてα1mと呼称する。のアミノ酸配列も初めて解析し、特許出願をしている特願2010-033676。配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質が、本発明者によって初めてアミノ酸配列が特定されたネコ由来のα1mである。また、本発明者は、このネコ由来α1ミクログロブリンを抗原とする抗体を産生する細胞の作製に成功し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託を行っている受託番号:FERMP21910、FERMP21911。本発明は、上述の抗体よりもより好感度にα1mを測定することに成功し、改めて、平成23年1月12日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託を行ったものである受領番号:FERMAP22053、受領番号:FERMAP22054。本発明は、この新規な抗体産生細胞株である細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054についても提供する。また本発明は、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質ネコ由来のα1mを抗原とし、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受領番号:FERMAP22053により産生されたものである、ネコ由来α1ミクログロブリンに特異的に結合する抗体第1の抗体、ならびに、配列番号1で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質ネコ由来のα1mを抗原とし、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受領番号:FERMAP22054により産生されたものである、ネコ由来α1ミクログロブリンに特異的に結合する抗体第2の抗体についても提供する。本発明の第1の抗体および第2の抗体は、酵素免疫測定法サンドイッチ法、蛍光免疫測定法サンドイッチ法、放射性同位体免疫測定法サンドイッチ法、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法の2つの抗体として用いられる。酵素免疫測定法サンドイッチ法は、タンパク定量における代表的な測定方法であり、当業者であれば容易に実践できる測定方法である。酵素免疫測定法サンドイッチ法は、基本的には、固相に固定する抗体捕獲抗体と、当該捕獲抗体に結合した抗原に対してさらに結合する抗体一次抗体の2種類を用いる。この上で、発色または発光反応を行うための酵素標識が一次抗体になされている。または、一次抗体に酵素標識がなされていない場合は、一次抗体にさらに結合可能な抗体であって、酵素標識がなされている抗体二次抗体を用いてもよい。二次抗体としては、IgGおよびIgM等が利用できる可能性がある。なお、ここでいう酵素標識とは、発色または発光反応に利用可能な酵素を直接一次抗体に標識する態様の他、ある特定の結合様式を介して反応時に間接的に酵素を修飾する態様も含むことは、当業者であれば常識である。特定の結合様式としては、例えば、アビジン-ビオチン結合が代表的である。より詳しく説明すると、ビオチンを修飾の一次抗体と、アビジン修飾ペルオキシダーゼの組み合わせがこの態様に該当し、アビジン-ビオチン結合という結合様式を介してペルオキシダーゼは間接的に一次抗体に修飾している。一次抗体等に標識される酵素は、当業者が適宜選択することができ、ペルオキシダーゼの他、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ等を用いることができる。酵素に用いる基質についても、用いる酵素の種類に応じて当業者が適宜選択することができ、例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合、テトラメチルベンジリン、2,2’-アジノビス3-エチルベゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム塩、4-アミノアンチピリン、4-アミノアンチピリン塩酸塩、5-アミノサリチル酸、2,4-ジクロロフェノール、N,N-ジメチル-m-トルイジンおよびN,N-ジメチルアニリン等が挙げられ、酵素がアルカリフォスファターゼの場合、ブルーテトラゾリウム、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸2ナトリウム塩、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸p-トルイジン塩およびニトロブルーテトラゾリウム等が挙げられる、酵素がルシフェラーゼの場合、D---ルシフェリンが挙げられ、酵素がβ-ガラクトシダーゼの場合、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトシダーゼ、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトシダーゼ、5-ブロモ-3-インドリルβ-D-ガラクトシダーゼおよび6-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトシダーゼ等が挙げられる。本発明の第1の抗体は、捕獲抗体、一次抗体のいずれとして用いられてもよく、限定されるものではない。換言すれば、第2の抗体は、第1の抗体が捕獲抗体である場合は一次抗体であり、第1の抗体が一次抗体である場合は捕獲抗体となる。この点は後述する実施例においても実証されている。また、本発明の第1の抗体および第2の抗体が酵素免疫測定法サンドイッチ法で測定できるということは、当業者であれば、蛍光免疫測定法サンドイッチ法、放射性同位体免疫測定法サンドイッチ法、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法にも応用することができる。例えば、測定法として、蛍光免疫測定法サンドイッチ法を用いる場合は、上述の酵素免疫測定法サンドイッチ法における酵素標識の代わりに蛍光標識を、また、放射性同位体免疫測定法サンドイッチ法を用いる場合は、上述の酵素免疫測定法サンドイッチ法における酵素標識の代わりに放射性同位体標識を適用すればよい。また、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法に至っては、反応系においてこれら2つの抗体を用いればよいだけのことである。ラテックス免疫比濁法におけるラテックスの材料も、当業者であれば適宜選択できるものであるが、一般的に用いられているポリスチレンを用いればよい。本発明は、さらに上述した本発明の第1の抗体、第2の抗体を利用した測定診断キットについても提供するものである。本発明の診断キットは、上述の測定法に応じて、当該測定が利用できる内容で組み合わされるものであり、例えば、測定法として酵素免疫測定法サンドイッチ法を選択する場合、本発明の抗体以外に、ウェル、色原性基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液などを含むよう設計される。以下、参考例、実施例および実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。<参考例>以下、参考例としてネコ由来α1mの合成と、当該α1mを用いた抗体産生ハイブリドーマの作製、ならびに本発明の抗体の作製を示す。これら参考例は、実質的に先願の手法と同一である。<参考例1:ネコ由来α1mの合成>1プライマーの設計シグナルペプチド領域と考えられる部分および複合タンパクであるビクニンを除いた、ネコ由来のα1mタンパク領域のみの核酸を増幅するためにPCRを行った。プライマーは、上流側プライマーは5’末端にEcoRIの制限酵素サイトを付加し、下流側プライマーは3’末端にXhoIの制限酵素サイトおよびHis-Tagを付加し、それぞれ以下の塩基配列を有するように設計した。上流側プライマー:5CACGGATCCAGCCCCGTGCTGACGCCGCCCGATGACATCCAAGTGCAAGAGAACTT3配列番号2下流側プライマー:5CACCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGATGCGTGAGTGGAGAGGGCTCTGGTTCC3配列番号32PCR法上述したような上流側プライマーおよび下流側プライマーを用いて、95°C2分1サイクル、95°C1分、75°C1分、72°C1分30サイクル、72°C10分1サイクルの条件でPCRを行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動した後、アガロースゲルからDNA抽出した。DNA抽出溶液をフェノールと等量混合した後、15700×gで5分間遠心分離後、核酸が含まれる水層を分離した。分離した水層にクロロホルムを等量混合し、15700×gで5分間遠心分離した後、上清を分離した。次に、分離後の溶液に25倍量の100エタノールを添加し、-80°Cで30分静置し、その後15700×gで5分間遠心分離した後、上清を除去し、沈渣を得た。沈渣に70エタノールを添加し、15700×gで5分間遠心分離後、上清を除去し、PCR産物の濃縮試料を得た。PCR産物の濃縮試料に、5μlのEcoRIタカラバイオ株式会社、5μlのXhoIタカラバイオ株式会社、5μlのHBuffer500mMTrisHClpH75、100mMMgCl2、10mMDithiothreitol、1000mMNaClおよび35μlのRNasefreeH2Oを混和した。また、5μl25μgのpGEX6P1GEヘルスケアバイオサイエンスを、5μlのEcoRI、5μlのXhoI、5μlのHBufferおよび30μlのRNasefreeH2Oと混和した。各溶液を37°Cで1晩インキュベートすることで制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、QIAquickGelExtractionKitQIAGENを使用して、各DNAバンドの抽出を行った。DNALigationKitタカラバイオ株式会社を用いてライゲーションを行った。すなわち、5μlのLigationMix、1μlの制限酵素処理されたα1mのcDNA溶液および4μlのpGEX6P1を混和し、16°Cで1晩静置し、α1mのcDNAをライゲーションさせたplasmidvectorpGEXα1mが作出された。さらに、このpGEXα1m溶液25μlを、EcoliJM109CompetentCellsタカラバイオ株式会社25μlに添加し、氷上で30分間静置し、次に42°Cの恒温槽で45秒間HeatShockを与え、直ちに2分間氷冷後SOC培地2tryptone、05Yeastextract、10mMNaCl、25mMKCl、10mMMgSO4、10mMMgCl2、20mMglucose250μlを緩やかに加え、37°C1時間保温した。pGEXα1mがトランスフェクトされた大腸菌溶液100μlをアンピシリン加LB培地にそれぞれ塗布し、37°Cで1晩静置後、コロニーを釣菌し、アンピシリン加LB液体培地12mlに混和後、37°Cで1晩培養した。培養後の液体培地は、13400×gで1分間遠心分離後、上清を完全に除去し、得られた沈渣から、QIAPrepSpinMiniKit50QIAGENを用いて、pGEXα1mの抽出を行った。このpGEXα1mを、アガロースゲル電気泳動法により確認した。また、pGEXα1mのサブクローニングの成否は、T7プライマーを用いてDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingkitAppliedBiosystemsおよびAppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzerAppliedBiosystemsを使用した塩基配列解析により行った。3His-Tag付きGST融合タンパク発現の確認pGEXα1mがトランスフェクトされた大腸菌を、37°C、1晩LB培地で培養後、100μlをIsopropylβDthiogalactopyranosideIPTG:01mM20μlと混和し、30°Cで約2時間振盪培養BR40LF、TAITECした。振盪培養後の大腸菌溶液を、15700×gで1分間遠心分離後、上清を除去し、沈渣に可溶化液50μlの50mMTrisHcl、100μlの1×RIPALysisBufferUpState、140μlのProteaseInhibitor、710μlのH2O30μlを加え可溶化後、15700×gで5分遠心分離し、上清と沈渣とに分けた。上清30μlに、30μlの2×SB溶液2SDS、40Glycerol、06BPB、25mMTrisHClBufferpH68、20°Cおよび1μlの2MEを加え、95°Cで3分間加温した。沈渣にSB溶液20μlを加え、超音波破砕機UR20P、TOMYSEIKOCOLTDで5秒間破砕後、95°Cで3分間加温した。その後、上清および沈渣について、SDSPAGEにてHis-Tag付きGST融合タンパク発現の確認およびHis-Tag付きGST融合タンパクの大腸菌での可溶性を確認した。4SDS-PAGE法SDS-PAGEは、コンパクトPAGEAE7300、ATTOを用いてLaemmliの方法に準拠し、これに以下に示す修正を加え実施した。すなわち、分離ゲルの組成は、15Acrylamide、02NNMethylenebisAcrylamide、01SDS、375mMTrisHClbufferpH88、20°Cとした。ゲルは24連ゲル作製器AE7344、ATTOを用いて作製した。電極緩衝液の組成は、01SDS、129mMglycine、25mMTrispH83、20°Cとした。泳動用試料SBの組成は、1SDS、20Glycerol、03BPB、125mMTrisHClBufferpH68、20°Cとした。また、マーカーとして、プレステインドSDS-PAGEスタンダードBroadマーカーBIORADもしくはSDS-PAGEスタンダードBroadマーカーBIORADを用いた。泳動は、TrisGly/PAGEHighモードで30分泳動した後、TrisGly/PAGELowモードにして、下部イオン界面がゲル下端から1~2mm上方の位置に移動したときに終了した。SDS-PAGE終了後のゲルについて、Oakle法に準拠した銀染色法を実施した。具体的には、ゲルを30ethanol、10aceticacid溶液にて固定後、洗浄し、20ethanolに5分間2回浸漬した。20ethanol除去後、5glutaraldehyde溶液にて4分間反応させ、純水で洗浄後、20ethanolに4分間2回浸漬した。その後、純水で洗浄し、アンモニア性硝酸銀溶液にて5分間反応させ、純水で洗浄後、0005citricacid、0019formaldehyde溶液で発色させた。発色確認後のゲルについて、20ethanol、10aceticacid溶液にて5分間固定し、20ethanolに5分間2回浸漬後、写真を撮影した。なお、銀染色法はすべて遮光条件下にて実施した。5His-Tag付きGST融合タンパクの発現誘導と単離His-Tag付きGST融合タンパクの発現が確認された大腸菌を、アンピシリン加LB寒天培地に塗布し、コロニーを釣菌後、3mlのアンピシリン加LB液体培地に加え1晩37°Cで振盪培養した。続いて、その培養液3mlを、アンピシリン加LB液体培地250mlに加え、37°Cで約150分振盪培養後、25mlの01mMIPTGを添加し、約2時間、25°Cで振盪培養した。His-Tag付きGST融合タンパク発現誘導後の培養液を6000×gで15分間遠心分離した沈渣を、20mlの05mMEDTA、04MNaCl、5mMMgCl2、5グリセロール、05mMPhenylmethylsulfonylfluoridePMSF、1mMDithiothreitoDTTおよび1mg/mlリゾチーム加50mMTrisHClpH80に懸濁し、4°Cで1時間静置後、凍結融解を2回行った。続いて、NonidetP40を05添加し、超音波破砕機で20秒間×5回破砕後、9300×gで20分間遠心分離し、上清と沈渣をSDS-PAGEにて分析した。泳動の結果、His-Tag付きGST融合タンパクは上清に含まれていることが分かった図1。6アフイニティークロマトグラフィー法上記で得られた上清をニッケルアフィニティーカラムBioScaleMiniIMACProfinityBioRadの結合buffer20mMリン酸ナトリウム、05MNaCl、10mMイミダゾール、pH74にて透析後、カラムに添加され結合バッファーでよく洗浄し、溶出バッファー20mMリン酸ナトリウム、05MNaCl、300mMイミダゾール、pH74で溶出した。溶出はペリスタポンプSJ1211L、ATTOを用いて流速05ml/minで行った。また、溶出液の吸光度は紫外部吸光度モニターAC5100L、ATTOを用いて吸光波長220nmでモニターし、記録計R01A、RIKADENKIで記録した。溶出液のSDS-PAGE像は図1に示されたとおり、His-Tag付きGST融合タンパクをメインバンドとして複数のバンドが確認された。得られたHis-Tag付きGST融合タンパク溶出液2mlを、濃度が1mMになるようにDTTを添加し混和後、分子量13kDaカットの透析膜UC3032100、三光純薬株式会社に入れられ150mMNaCl、1mMEDTA加50mMTrisHClpH752Lを用いて約6時間透析した。透析後のHis-Tag付きGST融合タンパク溶出液は、DCProteinAssayBioRadを用いてタンパク定量後、タンパク量200μgに対し、PreScissionProteaseGEヘルスケアバイオサイエンスが1μlを添加して混和後、4°Cで6時間以上反応させた。酵素切断後のSDS-PAGE像では、切断されたGSTとネコの組み替え型α1mが確認された。さらに、この溶液を高速液体クロマトグラフィーHPLC用の試料とした。7HPLC法HPLCシステムは、システムコントローラーSCL10AVP、Shimadzu、送液ユニットLC10ADVP、Shimadzu、紫外部分光高度計SPD10AVP、Shimadzu、カラムオーブンCTO10AVP、Shimadzuおよび脱気ユニットDGU14A、Shimadzuから構成され、カラムはMightysilRP18GP25046関東化学を使用した。HPLCの分離条件は、移動相の流速を1ml/min、試料添加量を400μlとし01trifluoroaceticAcidTFA溶液で平衡化させたカラムに、01TFA加acetonitrile溶液を用いてacetonitrile濃度0~80のライナーグラジエントにして行った。なお、溶出液は、吸光波長220nmで吸光度をモニターし、検出されたピークを分取し、濃縮遠心機CC181、TOMYにて1時間遠心分離後、凍結乾燥機FDU540、EYELAにて乾燥させた後20°Cで保存した。クロマトパターンは、図2に示すとおりで、だいたい8個のピークに分離され、それぞれの溶出された分画のタンパク組成は、SDS-PAGE法により分析された。分析の結果、f分画に単独で溶出された。このタンパクを組み替え型ネコα1mrFeα1mの抗原としてモノクローナル抗体の作成を行った。<参考例2:抗体産生ハイブリドーマ、抗rFeα1m抗体の作製>参考例1で合成したタンパクを組み替え型ネコα1mrFeα1mの抗原としてモノクローナル抗体を作製するにあたり、まずは抗体産生ハイブリドーマを作製した。1抗体産生ハイブリドーマの作製1-1免疫法免疫法は、精製rFeα1mを抗原としてBalb/cマウスの後肢肉球footpadの皮下に注射することにより行った。免疫は5日間隔で4回行い、初回から第3回目までの免疫は抗原溶液100μl1mg/mlとアジュバントを等量混合させてエマルジョン化させた抗原液200μl50μg/footを、また、最終免疫では抗原溶液20μl10μg/footのみを用いて行った。また、アジュバントは初回免疫ではAdjuvantCompleteFreund和光純薬工業株式会社を、第2回目から第3回目の免疫ではAdjuvantIncompleteFreund和光純薬工業株式会社を用いた。1-2細胞融合最終免疫から3日後、膝窩リンパ節を摘出し、リンパ球を回収後、GenomONECF石原産業株式会社を用いて、細胞融合を行った。また、ミエローマ細胞としてはP3X63Ag8653大日本住友製薬株式会社を用いた。融合方法は添付のプロトコールに従って行った。具体的には、まず、リンパ球とミエローマ細胞とを細胞数が51の比率になるように混合し、1000rpm、4°Cで5分間遠心した後、上清を除去した。そこに、氷冷した融合用緩衝液をリンパ球108cellsあたり1ml添加し、均一に懸濁した後、氷冷したHVJEnvelope懸濁液を細胞混合液1mlあたり25μl添加した。細胞懸濁液を氷上で5分間静置した後、1000rpm、4°C5分間遠心し、上清を除去せずに細胞がペレット化した状態のまま37°Cで15分間インキュベートした。インキュベート終了後、37°Cに加温した増殖用培地をリンパ球108cells当たり50ml加え、懸濁後、96穴プレート96WellCellCulturePlate:Greinerbiooneに100μl/wellで播種した。なお、増殖用培地としてRPMI1640InvitrogenにペニシリンGPG;明治製薬株式会社10万IU/ml、ストレプトマイシンSM;明治製薬株式会社100mg/ml、75BriCloneIL6、ヒト、ブライクローン;CatNoBR001、大日本住友製薬株式会社、10非働化ウシ胎仔血清FBS;株式会社ニチレイを加えたものを用い、添加、懸濁の際は穏やかに操作した。24時間培養後、培養培地を上記の増殖用培地に2HATInvitrogenを添加したHAT培地に交換した。2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング得られたハイブリドーマについて、細胞融合から1週間後にELISA法を用いた一次スクリーニングを行い、この結果、反応陽性となったwellのハイブリドーマのみをWesternblotting法を用いた二次スクリーニングで確認した。2-1一次スクリーニングrFeα1mを抗原としたELISA法を用いて、抗体産生ハイブリドーマの一次スクリーニングを行った。ELISAプレートとしては、96WellELISAMicroplateGreinerbiooneを使用した。また、プレートの洗浄には自動洗浄機AutoMiniWasherAMW8、バイオテック株式会社を用い、洗浄液としてはPBS137MNaCl、27mMKCl、100mMNa2HPO4、18mMKH2PO4、pH74、25°Cを使用した。固相として、PBSで3μg/mlに調整したrFeα1mを50μl/wellでプレートに添加し、4°Cで一晩反応させた。固相反応終了後、プレートの抗原液を捨て、ブロッキング液として05BovineSerumAlbuminBSA;和光純薬工業株式会社を添加したPBSを150μl/wellで加え、37°Cで60分間反応させた。ブロッキング反応終了後、プレートを1回洗浄し、一次抗体として各ハイブリドーマ培養の培養上清を50μl/wellで加え、37°Cで60分間反応させた。一次抗体反応終了後、プレートを1回洗浄し、二次抗体として01BSAを添加したPBSで1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体SIGMAALDRICHを50μl/wellで加え、37°Cで60分間反応させた。二次抗体反応終了後、プレートを3回洗浄し、基質液として004oフェニレンジアミン、004H2O2を添加したPBSを150μl/wellで加え、室温、遮光下で30~60分間反応された。基質反応終了後、3MH2SO4を反応停止液として50μl/wellで加え、1分間振盪後、MicroplateReaderModel550、BIORADで波長490nmにおける吸光度を測定した。吸光度の高かった陽性wellの細胞を、24穴プレート24WellCellCulturePlate;Greinerbiooneに移して培養した。2-2二次スクリーニングrFeα1mを抗原としたWesternblotting法で確認し、抗体産生ハイブリドーマの二次スクリーニングを行った。Lowryの方法に基づき、DCProteinAssayKitBIORADを用いて、MicroplateReaderで波長655nmにおける吸光度を測定し、タンパク質を定量した。検量線はBSAを用いて作製した。Westernblotting法はTowbinらの方法に準拠し、以下のように実施した。転写膜はポリビニリデンジフルオリドPVDF膜BIORADを使用した。PVDF膜は100methanolに10秒間、さらに転写用電極buffer25mMTrisHClpH83、20°C、192mMglycine、5methanolに30分間浸潤し、泳動に供した。転写装置の組み立ては、陽極電極板上に下から順に濾紙BIORAD、PVDF膜、SDS-PAGE終了後のゲル、濾紙を重層し、その上に陰極電極板を固定した。なお、濾紙は予め電極bufferに2~3分浸しておいた。転写条件は19mA/cm2の定電流で60分間とした。転写終了後のPVDF膜は10mMTrisHClpH75、20°C、140mMNaCl、001Tween20TBSTに05BSAを加え、室温で60分間振盪し、ブロッキング操作を行った。ブロッキング終了後、TBSTで5分間、2回振盪洗浄し、一次抗体として細胞の培養上清を用い、室温で90分振盪反応させた。一次抗体反応終了後、TBSTで5分間、2回振盪洗浄した後、TBSTで1000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を、室温で60分間振盪反応させた。二次抗体反応終了後、TBSTで5分間、2回振盪洗浄し、00633diaminobenzidinetetrahydrochloride、003H2O2、50mMTrisHClpH76、20°Cを基質反応液として使用し、1~5分間反応させた。基質反応終了後、水洗し反応を停止させた後、乾燥して保存した。反応陽性を示したハイブリドーマについては後述する限界希釈法によりクローニングを行った。3クローニングハイブリドーマのクローニングには限界希釈法を用いた。具体的には、スクリーニング後のハイブリドーマを2cells/100μlとなるようにHAT培地で希釈し、100μl/wellで96穴プレートに播種した。ハイブリドーマはセミコンフルエントになったところで24穴プレートに拡大培養し、再びセミコンフルエントになるまで培養した後、二次スクリーニングと同様にrFeα1mを抗原としたWesternblotting法で確認した。このクローニング操作を2回行った。また、ハイブリドーマを長期間継代培養することにより抗体産生能が減少するのを防ぐため、クローニング毎に細胞凍結保存液セルバンカーBLC1、十慈フィールド株式会社を用いて保存した。4抗体産生ハイブリドーマの大量培養および抗rFeα1mmAbの採取と精製クローニングが終了したハイブリドーマを、浮遊細胞培養フラスコフィルタートップSCフラスコ250ml75cm2;Greinerbiooneを用いて大量培養した。なお、培養は37°C、5CO2、5日間、CO2インキュベーター十慈フィールド株式会社で行い、培地としてはHAT培地を用いた。大量培養されたハイブリドーマを無血清RPMIで懸濁し、ヌードマウスBalb/cnuの腹腔内に2×107cells/headで投与した。投与してから10~20日後、腹水を採取した。ヌードマウスから採取した腹水を室温で1時間、あるいは4°Cで一晩静置した後、3000rpm、4°Cで5分間遠心し、腹水中のフィブリン、ハイブリドーマ、赤血球などを除去した。分離した上清を50の硫安で塩析させた。具体的には、氷上で撹拌しながら上清と等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を徐々に滴下し、滴下後さらに1時間撹拌した。これを10000rpm、4°Cで10分間遠心し、沈殿物を20mMリン酸ナトリウムbufferpH70に溶解した。塩析後のグロブリン溶液を、20mMリン酸ナトリウムbufferpH70で平衡化したSephadexG25FineGEヘルスケアバイオサイエンスカラム内径15cm、長さ30cmを用いて脱塩した。クロマトグラフィーの流速をペリスタポンプSJ1211L、ATTOで05ml/minに調節した。脱塩後のグロブリン溶液を、エコカラム内径25cm、長さ100cm:BIORADに充填したProteinGSepharose4FastFlowGEヘルスケアバイオサイエンスを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製した。具体的には、脱塩後のグロブリン溶液を20mMリン酸ナトリウムbufferpH70で平衡化されたカラムに流速05ml/minで添加し、その後カラムを100mMglycinepH30で溶出させた。溶出液は直ちに10分の1量の1MTrisHClpH90で中和した。精製後の溶出液を50mM酢酸アンモニウムpH70で平衡化させたSephadexG25Fineカラム内径2cm、長さ30cmで脱塩させた後、FreezeDryerFDU540、EYELA東京理化器械株式会社を用いて凍結乾燥し、-20°Cで保存した。<実施例1および2>後述する実験例に用いる実施例1および2の抗体の組み合わせを表1に示す。表1中、α1mmAb3産生抗体は、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb3受託番号:FERMAP22053により産生された抗体を指し、α1mmAb4産生抗体は、細胞株MouseMousehybridomaα1mmAb4受託番号:FERMAP22054により産生された抗体を指す。<実験例>酵素免疫測定法サンドイッチ法により、実施例1および2の評価を行った。具体的には、1匹の健常なネコの尿中のα1mの測定を行った。具体的には、捕捉抗体を05mgwellで固相し、ブロッキングした後、1匹の健常なネコの尿を2時間反応させた。洗浄後、ビオチン標識した一次抗体を2時間反応させた後、アビジンペルオキシダーゼを1時間反応させ、tetramethylbenzidineを用いて基質反応を行い、450nmにおける吸光度の測定を行った。図3はその結果を示すグラフであり、縦軸は吸光度である。図3から明らかなように、実施例1、2の抗体の組み合わせによる吸光度は、十分高かった。この結果から、本発明の抗体の組み合わせは、ネコα1mに対してより高い結合力を示すことが明らかであり、高感度のネコα1mの測定が可能であることを示した。今回開示された実施の形態および実験例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。"