"以下の配列からなる群から選択される少なくとも一のHVR配列KSSQSLLYTSSQKNYLAである配列A1A17を含有してなるHVRL1WASTRESである配列B1B7を含有してなるHVRL2QQYYAYPWTである配列C1C9を含有してなるHVRL3GYTFTSYWLHである配列D1D10を含有してなるHVRH1GMIDPSNSDTRFNPNFKDである配列E1E18を含有してなるHVRH2XYGSYVSPLDYであり、XがRでない配列F1F11を含有してなるHVRH3;変異体HVRが配列番号1、2、3、4、5又は6に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体HVRを含んでなる抗cmet抗体。変異体HVRH3のF1がT又はSであり、F3がR又はSであり、F7がTである、請求項1に記載の抗体。前記抗体がヒト化である、請求項1に記載の抗体。少なくとも一部のフレームワーク配列がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項1に記載の抗体。前記修飾が置換、挿入又は欠損である、請求項1に記載の抗体。HVRL2変異体が、以下の位置:B1、B2、B3、B4、B5、B6及びB7の何れかの組合せにおいて1ないし5の置換を含有する、請求項1に記載の抗体。HVRH1変異体が、以下の位置:D3、D5、D6、D7及びD9の何れかの組合せにおいて1ないし5の置換を含有する、請求項1に記載の抗体。HVRH2変異体が、以下の位置:E7、E9、E10、E14、E15、E16、E17およびE18の何れかの組合せにおいて1ないし4の置換を含有する、請求項1に記載の抗体。HVRH3変異体が、以下の位置:F1、F3、F4、F6、F7、F8、F10及びF11の何れかの組合せにおいて1ないし5の置換を含有する、請求項1に記載の抗体。配列番号1の配列を有するHVRL1を含有してなる、請求項1に記載の抗体。配列番号3の配列を有するHVRL3を含有してなる、請求項1に記載の抗体。変異体HVRH3のF1がTである、請求項1に記載の抗体。変異体HVRH3のF3がR又はSである、請求項1に記載の抗体。変異体HVRH3のF7がTである、請求項1に記載の抗体。抗体のヒトcmetに対する一価親和性が、図7に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性と実質的に同じである、ヒト化抗cmet抗体。抗体のヒトcmetに対する一価親和性が、図7に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性より少なくとも3倍大きいものである、ヒト化抗cmet抗体。前記マウス抗体が、HB11894又はHB11895と称してアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されているハイブリドーマ細胞株によって産生されるものである、請求項15又は16に記載のヒト化抗体。前記結合親和性がKd値として表される、請求項15ないし17の何れか一に記載の抗体。前記結合親和性がBiacore又はラジオイムノアッセイによって測定される、請求項15ないし18の何れか一に記載の抗体。ヒトκサブグループ1コンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項1に記載の抗体。重鎖ヒトサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項1に記載の抗体。前記フレームワーク配列の位置71、73及び/又は78が置換されている、請求項21に記載の抗体。前記置換が、R71A、N73T及び/又はN78Aである、請求項22に記載の抗体。図7に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗cmet抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子のそのレセプターに対する結合を良好に阻害する、ヒト化抗cmet抗体。前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のIC50値の半分よりも少ないIC50値で結合を阻害する、請求項24に記載の抗体。前記IC50がおよそ0.01nMからおよそ1000nMの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項25に記載の抗体。図7に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗cmet抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子レセプター活性を良好に阻害する、ヒト化抗cmet抗体。前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のIC50値の半分よりも少ないIC50値でレセプター活性を阻害する、請求項27に記載の抗体。前記IC50がおよそ0.1nMからおよそ100nMの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項28に記載の抗体。図7に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗cmet抗体を含んでなる参照抗体より、cmet依存性細胞増殖を良好に阻害する、ヒト化抗cmet抗体。前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のIC50値の半分よりも少ないIC50値で細胞増殖を阻害する、請求項30に記載の抗体。前記IC50がおよそ0.01nMからおよそ100nMの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項31に記載の抗体。前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方が一価性である、請求項1ないし32の何れか一に記載の抗体。前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方がFc領域に結合した単一Fab領域を含有してなる、請求項1ないし33の何れか一に記載の抗体。図13に記載のHVR1HC、HVR2HC及び/又はHVR3HC配列を含有する重鎖可変ドメインを含んでなる抗体。前記可変ドメインが、図13に記載のFR1HC、FR2HC、FR3HC及び/又はFR4HC配列を含有してなる、請求項35に記載の抗体。図13に記載のFc配列及び/又はCH1配列を含有してなる、請求項35又は36に記載の抗体。図13に記載のHVR1LC、HVR2LC及び/又はHVR3LCを含有する軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。前記可変ドメインが、図13に記載のFR1LC、FR2LC、FR3LC及び/又はFR4LC配列を含有してなる、請求項38に記載の抗体。図13に記載のCL1配列を含有してなる、請求項38又は39に記載の抗体。請求項35ないし37の何れか一に記載の重鎖可変ドメインと請求項38ないし40の何れか一に記載の軽鎖可変ドメインを含有してなる抗体。前記抗体が一価性であり、Fc領域を含有してなる、請求項41に記載の抗体。前記Fc領域が第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含有してなり、該第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれが野生型ヒトFcに関して一又は複数の変異を含有する、請求項42に記載の抗体。前記第一ポリペプチドが図13に記載のFc配列を含有し、前記第二ポリペプチドが図14に記載の配列を含有する、請求項43に記載の抗体。cmet活性化細胞増殖の阻害方法であって、細胞又は組織に、有効量の請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体を接触させることを含む方法。HGF/cmetシグナル伝達系統の調節不全が関与する疾患を調節する方法であって、有効量の請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体を被検体に投与することを含む方法。癌を有する被検体の治療方法であって、有効量の請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体を該被検体に投与することを含む方法。前記癌が、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、結腸直腸癌及び/又は膵臓癌である、請求項47に記載の方法。被検体の増殖性疾の治療方法であって、有効量の請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体を該被検体に投与することを含む方法。前記増殖性疾患が癌である、請求項49に記載の方法。請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体をコードする核酸。請求項51に記載の核酸を含有してなる宿主細胞。請求項1ないし44の何れか一に記載の抗体を含有してなる組成物。前記組成物が担体を含んでなる、請求項53に記載の組成物。材料および方法残基番号はカバットに従う。一文字アミノ酸表記を用いる。DNA縮重はIUBコードを用いて表す。アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接高頻度可変領域の融合基本的にはLee等JMolBiol340107393にて説明されるように、この実施例に使用するファジミドは、phoAプロモータの制御下に2つのオープンリーディングフレームを有する一価性Fabg3ディスプレイベクターである。第一オープンリーディングフレームはVLに融合するstIIシグナル配列およびCH1ドメインアクセプター軽鎖から成り、第二オープンリーディングフレームはVHに融合するstIIシグナル配列およびアクセプター重鎖のCH1ドメインとその後に続く切断型微量ファージコートタンパク質P3から成る。上記のLee等を参照。マウスの5D5のVLドメインおよびVHドメインは、ヒトコンセンサスκIおよびヒトサブグループIIIコンセンサスVHドメインと整列配置した。HVR移植片を作るために、3つの位置:R71A、N73TおよびL78AがヒトサブグループIIIコンセンサスVHドメインと異なるアクセプターVHフレームワークを用いた。マウスの5D5抗体の高頻度可変領域は、5D5の直接のHVR移植片を生成するために、アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク内に操作した。VLドメインでは、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプターに融合した:位置2434、5056および8997。VHドメインでは、位置2635、4965および95102を融合した。直接の移植片変異体は、各々の高頻度可変領域の異なるオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発法によって生成した。適切なクローンをDNA塩基配列決定によって、評価した。高頻度可変領域の穏やかなランダム化-配列多様性は、マウスの高頻度可変領域配列に対するバイアスを維持する穏やかなランダム化法を用いて、各々の高頻度可変領域に導入した。これは、Gallop等JMedChem3712331251に記述されるように、毒性オリゴヌクレオチド合成法を用いて行った。変異させる高頻度可変領域内の位置を特定するために、野生型アミノ酸をコードするコドンの各々の位置に、平均50パーセントの突然変異率となるようにヌクレオチドの70101010混合物にて毒性を与えた。穏やかにランダム化されたオリゴヌクレオチドを、マウスの高頻度可変領域配列に従って作製し、直接的な高頻度可変領域移植片によって、定められる同じ領域を包含させた。VHドメインのH2の初めのアミノ酸位は、コドンRGCを用いてA、G、S又はTに配列多様性を限定した。ファージライブラリの生成-各々の高頻度可変領域について設定したランダム化オリゴヌクレオチドプールを、660ngのオリゴヌクレオチド、50mMトリスpH7.5、10mMMgCl2、1mMATP、20mMDTTおよび、5Uポリヌクレオチドキナーゼを含む20μlの6つの反応溶液中で、37°Cで1時間によって別々にリン酸化した。次いで、6つのリン酸化オリゴヌクレオチドプールを、オリゴヌクレオチド対鋳型比が3となるように、20μgのキュンケル鋳型と、終容量500μlの50mMトリスpH7.5、10mMMgCl2中で混合させた。混合物を90°Cで4分間、50°Cで5分間アニールさせ、氷上で冷ました。過剰な、アニールされていないオリゴヌクレオチドは、アニールされたDNAの過剰な変性を避けるために変更したプロトコールを用いてQIAQUICKPCR精製キットにより除去した。500μlのアニールされた混合物に、150μlのPBを添加し、混合物を2つの二酸化ケイ素カラムに分割した。それぞれのカラムを750μlのPEで洗浄し、カラムを乾燥させるために余計に回転させた後、各々のカラムを、110μlの10mMトリス、1mMEDTA、pH8にて溶出した。次いで、アニールして精製した鋳型を、1μlの100mMATP、10μlの25mMdNTPs、15μlの100mMDTT、25μlの10×TMバッファ、2400UのT4リガーゼ、および30UのT7ポリメラーゼを充填して、室温で3時間置いた。充填した生成物を、トリス酢酸塩EDTA/アガロースゲルにて分析した。3つのバンドが正常に観察された:下部バンドは正常に充填されてライゲーションされた生成物であり、真ん中のバンドは充填されたがライゲーションされなかった生成物であり、上部バンドは鎖置換された生成物である。上部バンドは、T7ポリメラーゼの内因性の副活性により生産されるものであり、避けるのは難しい、しかしながら、このバンドは、下部バンドの30分の一より低い効率で形質転換するもので、通常ライブラリにほとんど関与しない。真ん中のバンドは、最終ライゲーション反応のためのリン酸塩がないことによる、このバンドは効率よく形質転換するものであり、主に野生型配列を示す。Sidhu等MethodsinEnzymology328333363に記述されるように、充填された生成物を精製し、SS320細胞に電気穿孔して、M13/KO7ヘルパーファージ存在下にて広げた。ライブラリサイズは、1-2×109の独立クローンの範囲とした。最初のライブラリからのランダムなクローンを配列決定して、ライブラリの質を評価した。ファージ選別-ヒトHGFレセプターを生成して、Fc融合として用いた2672616626171。5μg/mlのHGFRFcを含むPBSにてMaxiSorpマイクロタイタープレート上をコートした。最初の選別ラウンドでは、標的として8ウェルを用いた、標的の単一ウェルを選別の連続ラウンドに用いた。ウェルを、カゼインブロッカーを用いて1時間、反応を停止した。ファージを培養液上清から回収し、1BSAおよび0.05TWEEN20を含有するPBSに懸濁した。2時間、ウェルに結合させた後、結合していないファージは、0.05TWEEN20を含有するPBSにて余計に洗浄することによって、除去した。結合したファージは、50mMHCl、0.5MKClにて30分間インキュベートすることによって、溶出させた。ファージは、Top10細胞およびM13/KO7ヘルパーファージを用いて増幅させ、2YT、50μg/mlカルバネシリン中で終夜、37°C生育させた。標的のコートしたウェルから溶出されるファージの力価は、非標的のコートウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。親和性成熟について、ファージライブラリを溶液分類法を用いて分類した。HFGRFcは、500μlの3.6mg/mlHGFRFcを含むPBSと10μlの1Mリン酸カリウムpH8を20μlの4mMスルホNHSLCビオチンと混合することによって、ビオチン化した。ビオチン化されたHGFRFcを、PBSのNAP5カラムを用いて精製した。マイクロタイタウェルを、10μg/mlニュートラビジンにて終夜、4°Cでコートして、カゼインブロッカーを用いて1時間反応を止めた。最初のパニングでは、1BSAおよび0.05Tween20を含有するPBSに懸濁した200μlのファージを、10nMbHGFRFcと1時間混合した。bHGFRFcに結合したファージは10分間でニュートラアビジンコートウェルに捕獲され、結合していないファージはPBSTによって、洗い流した。ファージは、20mMHCl、500mMKClを用いて45分間溶出し、中和して、KO7ヘルパーファージの存在下にてXL1ブルー細胞中で増殖させた。その後の分類ラウンドは、以下を除き、同様に行った:ラウンド2での最終的なbHGFRFc濃度は5.6nM、ラウンド3での最終的なbHGFRFc濃度は0.1nM、ラウンド4での最終的なbHGFRFc濃度は0.5nMであり、780nMの非ビオチン化HGFRFcをニュートラビジン上の捕獲の1時間前に混合物に添加した。ファージELISA-MaxiSorpマイクロタイタープレートを5μg/mlのヒトHGFRFcを含有するPBSにて終夜コートして、カゼインブロッカーにて反応を停止させた。80μlの混合物を標的コートウェルに15分間移して結合しなかったファージを捕獲した後、培養物上清からのファージを組織培養マイクロタイタープレート中で、1BSAを含有するPBSTにて段階的に希釈したHGFRFcとともにインキュベートした。プレートをPBSTにて洗浄し、HRPコンジュゲート抗M13を添加して40分間置いた。プレートをPBSTにて洗浄して、テトラメチルベンジジン基質を添加して反応させた。405nmの吸光度を溶液の標的濃度の関数としてプロットして、IC50を測定した。これは、ファージの表面上に表出されるFabクローンの親和性評価として用いた。Fab産生および親和性決定-親和性測定のためにFabタンパク質を発現させるため、停止コドンを、ファージディスプレイベクターの重鎖とg3の間に導入した。クローンを大腸菌34B8細胞内に形質移入して、AP5培地にて30°Cで生育させた。細胞を遠心分離によって、回収して、10mMトリス、1mMEDTApH8に懸濁して、マイクロフルイダイザーを用いて破壊した。FabはプロテインGアフィニティクロマトグラフィにて精製した。BIAcoreTM2000を用いた表面プラスモン共鳴によって、親和性分析を行った。HGFRFcは、CM5チップに固定し、PBST中の様々な濃度のFabを注入した。各々の注入の後、チップを100mMHClを用いて再生成した。結合応答は、RUを空のフローセルから減算することによって、補正した。konおよびkoffの同時フィッティングの1:1Languirモデルを動態分析のために用いた。HGF/cMet結合のOA5D5ブロックについての電子化学発光アッセイGenentechで産生される精製されたcMetIgタンパク質を、ビオチンXNHSを用いて、20倍過剰モルのNHSXビオチンとともに0.1MNaHCO3、pH8.5中でインキュベートすることによって、ビオチン化した。ジェネンテクで産生される精製されたヒト2鎖HGFは、製造業者の指示に従ってNHSエステル化学を介してBVTAGにて標識した。cMetIgビオチン、HGFルテニウムTagおよび、3333-0.21nMの範囲の抗体力価のOA5D5抗体を、100ul容量のアッセイ希釈液:PBS0.5BSA/0.5Tween20/0.033プロクリン中で共にインキュベートした。混合物を密閉したポリプロピレン丸底96ウェルプレートにて、室温で2-4時間、振とうしながらインキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを添加した。激しく振盪しながら最終的に45分間インキュベートした後、プレートは、BioVerisMシリーズ計測器を用いて読み取った。KIRAA549細胞を成長培地を含有するHamのF12/DMEM5050GibcoGrandIslandNY中で維持した。アッセイのための細胞を調製するために、集密的な培養物から回収した細胞を、アキュターゼを用いて剥離し、1ウェル当たり50000個の細胞の密度で96ウェルプレートに播種した。37°Cで終夜インキュベートした後、成長培地を取り除き、細胞を0.1FBSを含有する培養液中で30-60分間血清飢餓状態とした。cMetリン酸化を阻害するためのOA5D5の能力を決定するために、前記分子を、培地0.1FBS中で200から0.19nMまで段階的に希釈して、アッセイプレートに加えた。37°Cで15分間のインキュベーションの後、HGFを添加した。次いで、プレートを更に10分間、37°Cでインキュベートして、培地を除去し、細胞溶解バッファを添加した。溶解物は、BioVerisMシリーズ計測器を用いた電気化学ルミネセンスアッセイにて、リン酸化cMetについて分析した。抗ホスホチロシンmAbを、製造業者の指示に従ってNHSエステル化学を介するBVTAGにて標識した。cMet細胞外ドメインに対する抗体を、ビオチンXNHSを用いてビオチン化した。BVTAG標識4G10およびビオチン化抗cMetmAbをアッセイバッファにて希釈して、細胞溶解物に混合液として添加した。室温で1.5-2時間、激しく振とうしながらインキュベートした後、ストレプトアビジン磁気ビーズを添加した。最終的に45分間インキュベートした後、プレートをBioVeris計測器にて読み込んだ。細胞培養および増殖アッセイBaF3は、通常cMetを発現せずHGFに反応しないマウスのIL3依存性リンパ系細胞である。しかしながら、ヒトcMet133709718の正常な、完全長cDNAの形質移入によって、得られるBaF3hMetにおいて、HGFは、IL3の非存在下で増殖および生存を促進する。BaF3hMetおよびBaF3ネオ細胞は、通常通り、RPMI1640、5ウシ胎児血清、4μl/Lのβメルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、100μg/mlの硫酸ストレプトマイシン、2mMのLグルタミンおよび、IL3の供与源として5のWEHI調整培養液中で継代した。HGF依存性増殖を測定するために、処理後3日の細胞の数を、25μlのアラマブルーを加えて6時間後の蛍光強度を測定することによって、数量化した。対照実験は、HGFの非存在下での細胞の増殖とした。H358PSF2およびHGFPSF8細胞は、RPMI1640、10ウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlの硫酸ストレプトマイシン、2mMのLグルタミン中で継代した。アッセイ培養液は、RPMI1640にそれぞれ0.1、0.5のBSA又は10のFBSを加えたものとした。アッセイは、上記の通りに行った。免疫沈降およびウエスタンブロットH358細胞は、ヒト非小細胞肺上皮癌から得られる細胞株である。H358PSF2、H358PSF8細胞は、ヒトのHGFを安定して形質移入したH358細胞であり、RPMI1640、10のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、100μg/mlの硫酸ストレプトマイシン、2mMのLグルタミン中で培養した。cMetチロシンリン酸化検出は基本的に既に記述されているように1687181995行った。簡単に言えば、細胞を60mmのプレートに終夜播いて、培養液を0.5BSAを含有するRPMI1640に交換した後に、1nMのHGF又は競合物質OA5D5v2抗体の有無にかかわらず混合した。37°Cで10分間の後、培養液を除去し、細胞を、溶解用バッファを用いて溶解した。回転にかけた後、溶解物の上清を、プロテインGセファロースに結合した抗cMetIgGポリクローナル抗体とともに、4°Cで1時間インキュベートした。免疫複合体を洗浄し、1×試料緩衝液中で煮沸した後に、SDSPAGEによる分離およびニトロセルロースに対するエレクトロブロッティングを行った。ホスホチロシン含有タンパク質を、抗ホスホチロシン抗体の後に、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスFabを用いて、そして、総cMetの場合には、c28抗体の後に化学発光検出を伴うヤギ抗ウサギFcHRPを用いて視覚化した。腫瘍異種移植片研究胸腺欠損雌マウスの皮下に5,000,000個のKP4膵癌細胞を接種した。腫瘍が150-200mm3に到達したときに、マウスを10匹ずつ2群に分けた。グループ1は、週2回、溶媒をIP注入した。グループ2は、週2回、OA5D5v2、30mg/kgをIp注入した。腫瘍サイズは週に2回測定した。腫瘍容量が開始腫瘍容量の2倍を上回るか又は腫瘍が潰瘍化したときに、マウスを屠殺した。結果および考察5D5のヒト化-5D5のヒト化のために使用するヒトアクセプターフレームワークは、コンセンサスヒトκIVLドメインおよびヒトサブグループIIIコンセンサスVHドメインの変異体を含んでなる。変異体VHドメインには、ヒトコンセンサスからの3つの変異:R71A、N73TおよびL78Aがある。マウス5D5のVLドメインおよびVHドメインを、ヒトκIおよびサブグループIIIドメインと整列配置した、各々のHVRを特定し、次いで、ファージ上でFabとして表出される5D5移植片を生成するためにヒトアクセプターフレームワークに融合した。5D5移植片を表出しているファージの固定されたHGFRFcへの結合について試験したところ、結合は観察されなかった。ライブラリは、5D5移植片のHVR領域の各々が穏やかにランダム化されて生成された。このライブラリは、4回の選別のために固定されたHGFRFcに対してパンした。クローンをDNA配列分析のためにピックアップし、示された単一のクローンを選択した。このクローンには、突然変異誘発のために目標とされるHVRH3の目的の領域のちょうど外側の位置94で、VHドメイン内の変異があった。ファージELISAによるこのクローンの分析により、マウスの5D5の一価性親和性と同じ親和性を有することが示された。Fabとして発現させ、Biacoreによって、試験すると、Kdはマウス5D5の一価性親和性の8.3nMと比較して9.8nMであった。したがって、この予想外の置換により5D5移植片に対する結合親和性が完全に回復され、R94Sを有する5D5移植片は完全なヒト化抗体を表す。面白いことに、相同なアミノ酸であるスレオニンは、マウス抗体のこの位置にみられる。MacCallum等は、抗体と抗原との複合体結晶構造を分析して、重鎖の位置93および94が接触領域の一部であることを示した。したがって、抗体をヒト化する場合、H3の高頻度可変領域といえるこれらの位置を含むことは当然であろう。hu5D5v1の親和性成熟-hu5D5v1の親和性を向上させるために、6つのファージディスプレイライブラリをhu5D5v1をバックグラウンドとして生成し、穏やかなランダム化のために各々について単一のHVRを標的とした。バックグラウンドの高い野生型鋳型からのhu5D5v1の再選択を避けるために、停止コドンをHVR内に挿入して、各々のライブラリを生成した。溶液分類法を用いて、親和性ベースのファージ選択方法の有効性を上げた。ビオチン化された標的の濃度を操作することによって、バックグラウンドを低くするためにファージ捕獲時間を短くし、早い解離速度の高親和性クローンにてクローンを溶出するために非ビオチン化標的の添加を減少することによって、うまく選択できた。上記のLee等を参照。選別の初めのラウンドで、濃縮がみられたことにより、HGFRFcに対して有意に高い親和性を有する各々のライブラリに多くのクローンが存在したことが示唆された。選別ストリンジェンシーはその後のラウンドで増加し、ラウンド3で、6つすべてのライブラリを混合して第7のライブラリプールが生成された。4回の選別の後、7つのライブラリの各々のクローンを分析した。HVRL1およびHVRL3を標的とするライブラリ中のすべてのクローンは、hu5D5v1と同一であった、しかしながら、HVRL2、HVRH1、HVRH2およびHVRH3を標的とするライブラリに新規の配列が観察された。6つすべてのライブラリの組合せからなるライブラリプールはHVRH3ライブラリの配列で占められる。このことは、これらの配列がHGFRFcに対する親和性を最も大きく改善したことを示唆する。選択されたクローンをファージELISAによって、スクリーニングして、次いでFabタンパク質として発現させて、その親和性をBiacoreを用いて決定した。HVRH3内の変異を有する混合ライブラリからの様々なクローンは、hu5D5v1又はマウス5D5一価性親和性と比較して親和性が向上した。これらのクローンは、位置94のS/Tの何れか、位置96のR/Sの何れか、および位置100のT/Sの何れかおよび位置100aのP/S/Aのいずれを有した。最もよいクローンであるクローン78は、hu5D5v1からの3つの変異を有しており、13倍の親和性改善があった。したがって、6つのマウス5D5のHVRをヒトアクセプタースキャフォールド内に移植することから初め、HVRH3を伸展させて位置94とHVRH3内に2つの変異を付加することによって、HGFRに対して13倍亢進した結合親和性を有する完全なヒト5D5抗体となる。さらに、本願明細書において、記述される選択されたヒト化抗体は、例えばレセプターリン酸化アッセイなどにおいて、親5D5抗体に少なくとも匹敵する生物活性を有することが明らかとなった。本発明の抗体の特徴づけ-一アーム形抗Met抗体の特徴付けを行った。本発明の2の抗体を試験した。具体的には、OA5D5v2抗体は図13に示す可変ドメイン配列を含有する単一のFabアームを含んでなり、該FabはFc領域と融合し、該Fc領域は、図13に示すFc配列を含有する一Fcポリペプチドと、図14に示すFc配列を含有する一Fcポリペプチドとの複合体であった。抗体は以下のような特徴を有する:HGFのそのレセプターへの結合をブロックするOA5D5v2の能力を試験するためのアッセイにおいて、OA5D5v2は、少なくとも2つの比較抗体と同様にそのレセプターに対するHGF結合をブロックすることができた。その比較抗体は、キメラ一アーム形抗体を含有するものと本発明の他の抗体である。材料および方法の項目で述べた条件で、およそ3333~0.21nMの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、OA5D5v2は、キメラ一アーム形抗体やOA5D5v1などの比較抗体のもののおよそ半分より低いIC50値であったことが明らかとなった。OA5D5v1も、参照キメラ抗体より良好なIC50で有意にブロックした。図8を参照のこと。HGFレセプター活性化を阻害するためのOA5D5v2の能力を試験するためのアッセイにおいて、OA5D5v2は、上記のにて説明したように、少なくとも2つの比較抗体と同様にキナーゼレセプター活性化を阻害することができた。材料および方法の項目で述べた条件で、およそ200~0.19nMの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、OA5D5v2は、キメラ一アーム形抗体やOA5D5v1などの比較抗体のもののおよそ半分より低い値のIC50を有することが明らかとなった。図9を参照のこと。また、OA5D5v2は、ヒト、霊長類、イヌおよびネズミの中の種交差結合についても試験した。OA5D5v2は、ヒトおよび霊長類のHGFレセプターには特異的に結合するが、イヌ又はネズミには結合しないことが明らかとなった。OA5D5v2は、HGFの存在下における細胞増殖の阻害能力について試験した。図10に示すように、OA5D5v2は、少なくともそのキメラ抗体相対物およびOA5D5v1に記載と同様に細胞増殖を阻害した。材料および方法の項目で述べた条件で、およそ0.01~100nMの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、OA5D5v2は、キメラ一アーム形抗体やOA5D5v1などの比較抗体のもののおよそ半分より低いIC50値を有することが明らかとなった。図10を参照のこと。Metを形質移入した細胞に対するOA5D5v2の特異的結合をFAC分析によって、確認した。OA5D5v2は、HGF存在下におけるレセプターチロシンリン酸化の阻害能力について試験した。図11AおよびBに示すように、およそ10~1000nMの抗体濃度で試験した場合、OA5D5v2はレセプターチロシンリン酸化を阻害した。図11AおよびBを参照のこと。OA5D5v2は、膵臓腫瘍細胞株に基づく腫瘍異種移植片モデルを用いてインビボ有効性について試験した。この有効性研究からの結果により、OA5D5v2抗体がインビボでの腫瘍の再発を引き起こしうることと阻害しうることが示唆された。図12に示すように、抗体により処置される多くの動物の腫瘍が十分に減少した。引用文献の一部AngeloniDDanilkovitchMiagkovaAMiagkovALeonardEJandLermanMIThesolublesemadomainoftheRonreceptorinhibitsMSPinducedreceptoractivationJBiolChemAntipenkoAHimanenJPvanLeyenKNardiDeiVLesniakJBartonWARajashankarKRLuMHoemmeCPuschelAWandNikolovDBStructureofthesemaphorin3AreceptorbindingmoduleNeuron39589598BardelliALongatiPGramagliaDStellaMCandComoglioPMGab1couplingtotheHGFMetreceptormultifunctionaldockingsiterequiresbindingofGrb2andcorrelateswiththetransformingpotentialOncogene1531033111BertottiAandComoglioPMTyrosinekinasesignalspecificitylessonsfromtheHGFreceptorTrendsBiochemSci28527533BladtFRiethmacherDIsenmannSAguzziAandBirchmeierCEssentialroleforthecmetreceptorinthemigrationofmyogenicprecursorcellsintothelimbbudNature376768771BlechmanJMLevSBargJEisensteinMVaksBVogelZGivolDandYardenYThefourthimmunoglobulindomainofthestemcellfactorreceptorcouplesligandbindingtosignaltransductionCell80103113BoixLRosaJLVenturaFCastellsABruixJRodesJandBartronsRcmetmRNAoverexpressioninhumanhepatocellularcarcinomaHepatology198891BottaroDPRubinJSFalettoDLChanAMKmiecikTEVandeWoudeGFandAaronsonSAIdentificationofthehepatocytegrowthfactorreceptorasthecmetprotooncogeneproductScience251802804BussolinoFDiRenzoMFZicheMBocchiettoEOliveroMNaldiniLGaudinoGTamagnoneLCofferAandComoglioPMHepatocytegrowthfactorisapotentangiogenicfactorwhichstimulatesendothelialcellmotilityandgrowthJCellBiol119629641ColtellaNManaraMCCerisanoVTrusolinoLDiRenzoMFScotlandiKandFerraciniRRoleoftheMETHGFreceptorinproliferationandinvasivebehaviorofosteosarcomaFasebJ1711621164CooperCSParkMBlairDGTainskyMAHuebnerKCroceCMandVandeWoudeGFMolecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancelllineNature3112933DiRenzoMFOliveroMGiacominiAPorteHChastreEMirossayLNordlingerBBrettiSBottardiSGiordanoSandetalOverexpressionandamplificationofthemetHGFreceptorgeneduringtheprogressionofcolorectalcancerClinCancerRes1147154FergusonKMBergerMBMendrolaJMChoHSLeahyDJandLemmonMAEGFactivatesitsreceptorbyremovinginteractionsthatautoinhibitectodomaindimerizationMolCell11507517FurgeKAZhangYWandVandeWoudeGFMetreceptortyrosinekinaseenhancedsignalingthroughadapterproteinsOncogene1955825589GarrettTPMcKernNMLouMEllemanTCAdamsTELovreczGOZhuHJWalkerFFrenkelMJHoynePAetalCrystalstructureofatruncatedepidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomainboundtotransforminggrowthfactoralphaCell110763773GherardiEYoulesMEMiguelRNBlundellTLIameleLGoughJBandyopadhyayAHartmannGandButlerPJFunctionalmapanddomainstructureofMETtheproductofthecmetprotooncogeneandreceptorforhepatocytegrowthfactorscatterfactorProcNatlAcadSciUSAGiancottiFGandRuoslahtiEIntegrinsignalingScience28510281032GiordanoSCorsoSConrottoPArtigianiSGilestroGBarberisDTamagnoneLandComoglioPMThesemaphorin4DreceptorcontrolsinvasivegrowthbycouplingwithMetNatCellBiol4720724GiordanoSDiRenzoMFNarsimhanRPCooperCSRosaCandComoglioPMBiosynthesisoftheproteinencodedbythecmetprotooncogeneOncogene413831388GiordanoSMaffeAWilliamsTAArtigianiSGualPBardelliABasilicoCMichieliPandComoglioPMDifferentpointmutationsinthemetoncogeneelicitdistinctbiologicalpropertiesFasebJ14399406HamanoueMTakemotoNMatsumotoKNakamuraTNakajimaKandKohsakaSNeurotrophiceffectofhepatocytegrowthfactoroncentralnervoussystemneuronsinvitroJNeurosciRes43554564HartmannGWeidnerKMSchwarzHandBirchmeierWThemotilitysignalofscatterfactorhepatocytegrowthfactormediatedthroughthereceptortyrosinekinasemetrequiresintracellularactionofRasJBiolChem2692193621939JeffersMRongSandVandeWoudeGFEnhancedtumorigenicityandinvasionmetastasisbyhepatocytegrowthfactorscatterfactormetsignallinginhumancellsconcomitantwithinductionoftheurokinaseproteolysisnetworkMolCellBiol1611151125JeffersMSchmidtLNakaigawaNWebbCPWeirichGKishidaTZbarBandVandeWoudeGFActivatingmutationsforthemettyrosinekinasereceptorinhumancancerProcNatlAcadSciUSA941144511450JinLFuchsASchnittSJYaoYJosephALamszusKParkMGoldbergIDandRosenEMExpressionofscatterfactorandcmetreceptorinbenignandmalignantbreasttissueCancer79749760KuniyasuHYasuiWYokozakiHKitadaiYandTaharaEAberrantexpressionofcmetmRNAinhumangastriccarcinomasIntJCancer557275LevSYardenYandGivolDArecombinantectodomainofthereceptorforthestemcellfactorretainsligandinducedreceptordimerizationandantagonizesSCFstimulatedcellularresponsesJBiolChem2671086610873LiuCParkMandTsaoMSOverexpressionofcmetprotooncogenebutnotepidermalgrowthfactorreceptororcerbB2inprimaryhumancolorectalcarcinomasOncogene7181185LokkerNAMarkMRLuisEABennettGLRobbinsKABakerJBandGodowskiPJStructurefunctionanalysisofhepatocytegrowthfactoridentificationofvariantsthatlackmitogenicactivityyetretainhighaffinityreceptorbindingEmboJ1125032510LorenzatoAOliveroMPataneSRossoEOliaroAComoglioPMandDiRenzoMFNovelsomaticmutationsoftheMEToncogeneinhumancarcinomametastasesactivatingcellmotilityandinvasionCancerRes6270257030LoveCAHarlosKMavaddatNDavisSJStuartDIJonesEYandEsnoufRMTheligandbindingfaceofthesemaphorinsrevealedbythehighresolutioncrystalstructureofSEMA4DNatStructBiol10843848MainaFCasagrandaFAuderoESimeoneAComoglioPMKleinRandPonzettoCUncouplingofGrb2fromtheMetreceptorinvivorevealscomplexrolesinmuscledevelopmentCell87531542MatsumotoKandNakamuraTRolesofHGFasapleiotropicfactorinorganregenerationExs65225249MaulikGShrikhandeAKijimaTMaPCMorrisonPTandSalgiaRRoleofthehepatocytegrowthfactorreceptorcMetinoncogenesisandpotentialfortherapeuticinhibitionCytokineGrowthFactorRev134159MeinersSBrinkmannVNaundorfHandBirchmeierWRoleofmorphogeneticfactorsinmetastasisofmammarycarcinomacellsOncogene16920MorelloSOliveroMAimettiMBernardiMBerroneSDiRenzoMFandGiordanoSMETreceptorisoverexpressedbutnotmutatedinoralsquamouscellcarcinomasJCellPhysiol189285290NakaDIshiiTYoshiyamaYMiyazawaKHaraHHishidaTandKidamuraNActivationofhepatocytegrowthfactorbyproteolyticconversionofasinglechainformtoaheterodimerJBiolChem2672011420119NaldiniLWeidnerKMVignaEGaudinoGBardelliAPonzettoCNarsimhanRPHartmannGZarnegarRMichalopoulosGKandetalScatterfactorandhepatocytegrowthfactorareindistinguishableligandsfortheMETreceptorEmboJ1028672878NataliPGPratMNicotraMRBigottiAOliveroMComoglioPMandDiRenzoMFOverexpressionofthemetHGFreceptorinrenalcellcarcinomasIntJCancer69212217NguyenLHolgadoMadrugaMMarounCFixmanEDKamikuraDFournierTCharestATremblayMLWongAJandParkMAssociationofthemultisubstratedockingproteinGab1withthehepatocytegrowthfactorreceptorrequiresafunctionalGrb2bindingsiteinvolvingtyrosine1356JBiolChem2722081120819NusratAParkosCABacarraAEGodowskiPJDelpArcherCRosenEMandMadaraJLHepatocytegrowthfactorscatterfactoreffectsonepitheliaRegulationofintercellularjunctionsintransformedandnontransformedcelllinesbasolateralpolarizationofcmetreceptorintransformedandnaturalintestinalepitheliaandinductionofrapidwoundrepairinatransformedmodelepitheliumJClinInvest9320562065OgisoHIshitaniRNurekiOFukaiSYamanakaMKimJHSaitoKSakamotoAInoueMShirouzuMandYokoyamaSCrystalstructureofthecomplexofhumanepidermalgrowthfactorandreceptorextracellulardomainsCell110775787OliveroMRizzoMMadedduRCasadioCPennacchiettiSNicotraMRPratMMaggiGArenaNNataliPGetalOverexpressionandactivationofhepatocytegrowthfactorscatterfactorinhumannonsmallcelllungcarcinomasBrJCancer7418621868OliveroMValenteGBardelliALongatiPFerreroNCraccoCTerroneCRoccaRossettiSComoglioPMandDiRenzoMFNovelmutationintheATPbindingsiteoftheMEToncogenetyrosinekinaseinaHPRCCfamilyIntJCancer82640643OrianRousseauVChenLSleemanJPHerrlichPandPontaHCD44isrequiredfortwoconsecutivestepsinHGFcMetsignalingGenesDev1630743086ParkMDeanMCooperCSSchmidtMOBrienSJBlairDGandVandeWoudeGFMechanismofmetoncogeneactivationCell45895904PeekMMoranPMendozaNWickramasingheDandKirchhoferDUnusualproteolyticactivationofprohepatocytegrowthfactorbyplasmakallikreinandcoagulationfactorXIaJBiolChem2774780447809PelicciGGiordanoSZhenZSalciniAELanfranconeLBardelliAPanayotouGWaterfieldMDPonzettoCPelicciPGandetalThemotogenicandmitogenicresponsestoHGFareamplifiedbytheShcadaptorproteinOncogene1016311638PlotnikovANSchlessingerJHubbardSRandMohammadiMStructuralbasisforFGFreceptordimerizationandactivationCell98641650PonzettoCBardelliAZhenZMainaFdallaZoncaPGiordanoSGrazianiAPanayotouGandComoglioPMAmultifunctionaldockingsitemediatessignalingandtransformationbythehepatocytegrowthfactorscatterfactorreceptorfamilyCell77261271PonzettoCZhenZAuderoEMainaFBardelliABasileMLGiordanoSNarsimhanRandComoglioPSpecificuncouplingofGRB2fromtheMetreceptorDifferentialeffectsontransformationandmotilityJBiolChem2711411914123RobertsonSCTynanJAandDonoghueDJRTKmutationsandhumansyndromeswhengoodreceptorsturnbadTrendsGenet16265271RoyalIandParkMHepatocytegrowthfactorinducedscatterofMadinDarbycaninekidneycellsrequiresphosphatidylinositol3kinaseJBiolChem2702778027787SchmidtCBladtFGoedeckeSBrinkmannVZschiescheWSharpeMGherardiEandBirchmeierCScatterfactorhepatocytegrowthfactorisessentialforliverdevelopmentNature373699702SchmidtLDuhFMChenFKishidaTGlennGChoykePSchererSWZhuangZLubenskyIDeanMetalGermlineandsomaticmutationsinthetyrosinekinasedomainoftheMETprotooncogeneinpapillaryrenalcarcinomasNatGenet166873SchmidtLJunkerKNakaigawaNKinjerskiTWeirichGMillerMLubenskyINeumannHPBrauchHDeckerJetalNovelmutationsoftheMETprotooncogeneinpapillaryrenalcarcinomasOncogene1823432350SuzukiKHayashiNYamadaYYoshiharaHMiyamotoYItoYItoTKatayamaKSasakiYItoAandetalExpressionofthecmetprotooncogeneinhumanhepatocellularcarcinomaHepatology2012311236TamagnoneLArtigianiSChenHHeZMingGISongHChedotalAWinbergMLGoodmanCSPooMetalPlexinsarealargefamilyofreceptorsfortransmembranesecretedandGPIanchoredsemaphorinsinvertebratesCell997180TempestPRStrattonMRandCooperCSStructureofthemetproteinandvariationofmetproteinkinaseactivityamonghumantumourcelllinesBrJCancer5837TrusolinoLBertottiAandComoglioPMAsignalingadapterfunctionforalpha6beta4integrininthecontrolofHGFdependentinvasivegrowthCell107643654UeharaYMinowaOMoriCShiotaKKunoJNodaTandKitamuraNPlacentaldefectandembryoniclethalityinmicelackinghepatocytegrowthfactorscatterfactorNature373702705VanVactorDVandLorenzLJNeuraldevelopmentThesemanticsofaxonguidanceCurrBiol9R201204WeidnerKMDiCesareSSachsMBrinkmannVBehrensJandBirchmeierWInteractionbetweenGab1andthecMetreceptortyrosinekinaseisresponsibleforepithelialmorphogenesisNature384173176WiesmannCFuhGChristingerHWEigenbrotCWellsJAanddeVosAMCrystalstructureat17AresolutionofVEGFincomplexwithdomain2oftheFlt1receptorCell91695704WiesmannCUltschMHBassSHanddeVosAMCrystalstructureofnervegrowthfactorincomplexwiththeligandbindingdomainoftheTrkAreceptorNature401184188"