"フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体を含有することを特徴とする、誘導型NO合成酵素産生抑制剤。抗体が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする、請求項1記載の剤。抗フラクタルカイン抗体が、受託番号FERMBP10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H84、または受託番号FERMBP10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体126が認識するエピトープを認識するものであることを特徴とする、請求項2記載の剤。抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項2または3記載の剤。抗フラクタルカイン抗体が、受託番号FERMBP10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H84、または受託番号FERMBP10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体126であることを特徴とする、請求項4記載の剤。本発明は、新しい概念に基づく、炎症性疾患治療剤、具体的には炎症性腸疾患特に潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群などの治療剤の提供を目的とする。本発明者は、これまでの知見から、CX3CR1の機能を阻害することで、iNOSの産生が抑制され病態の改善を示した報告がなかったことに注目し、この機能解明により新しい概念に基づく炎症性疾患治療剤の創出に成り得るとの仮説を構築し、鋭意検討を行った。その結果、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害し、CX3CR1の機能を阻害する抗体を用いて、後述する実施例に記載の各種病態モデルで検討した結果、iNOSの産生が抑制され、かつ、病態が改善されることを初めて見出した。さらに、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害し、CX3CR1の機能を阻害する抗体がConA肝炎に有効であることは報告されているが、今般、ConA肝炎での肝臓におけるiNOSmRNAの発現抑制と、炎症性細胞でのiNOSの産生が抑制されることを初めて見出した。これらのことから、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害し、CX3CR1の機能を阻害する抗体またはCX3CR1の機能を阻害する化合物以下CX3CR1アンタゴニストと略記する場合もあるは、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、iNOS活性または炎症性細胞による過剰なNOの産生が原因となる炎症性疾患[炎症性腸疾患特に潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群など]の治療に有用であることを明らかにし、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のとおりである。1フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを含有することを特徴とする、炎症性疾患治療剤。2抗体が、抗フラクタルカイン抗体であることを特徴とする、1記載の剤。3抗フラクタルカイン抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、2記載の剤。4受託番号FERMBP10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体5H84、または受託番号FERMBP10371のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体126であることを特徴とする、3記載の剤。5炎症性疾患が炎症性腸疾患である1~4のいずれか一項に記載の剤。6炎症性疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である5記載の剤。7炎症性疾患が乾癬である1~4のいずれか一項に記載の剤。8炎症性疾患がアトピー性皮膚炎である1~4のいずれか一項に記載の剤。9炎症性疾患が喘息である1~4のいずれか一項に記載の剤。10炎症性疾患が動脈硬化症である1~4のいずれか一項に記載の剤。11炎症性疾患が虚血再灌流における組織障害である1~4いずれか一項に記載の剤。12炎症性疾患が急性呼吸促迫症候群である1~4のいずれか一項に記載の剤。13受託番号FERMBP10371のハイブリドーマHammFKN12611。1413記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体126。また、治療上有効量の、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを炎症性疾患の治療が必要な患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療方法、及び、炎症性疾患治療剤の製造における、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストの使用を提供する。<1>微生物の寄託ハイブリドーマHammFKN5H84は、2004平成16年年9月29日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番1中央第6に寄託され受託番号:FERMP20236、その寄託は、ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号:FERMBP10372。ハイブリドーマHammFKN12611は、2004平成16年年9月29日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター日本国茨城県つくば市東1丁目1番1中央第6に寄託され受託番号:FERMP20235、その寄託は、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された受託番号:FERMBP10371。<2>フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体は、以下のようにして作製することができる。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギは、該哺乳動物において免疫応答を引き起こす免疫原の形態のCX3CR1又はフラクタルカイン又は蛋白質断片例えばペプチド断片で免疫することができる。CX3CR1又はフラクタルカインの遺伝子例えば、GenBankNM001337又はNM002996参照を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞、例えば細菌、哺乳類細胞株又は昆虫細胞株中で発現させ、培養液又は菌体細胞から標準的な方法に従ってCX3CR1又はフラクタルカインを精製することができる。また、例えばGST等との融合蛋白質として発現させ、GSTとの融合蛋白質の場合はグルタチオンカラムにより精製しても構わない。CX3CR1又はフラクタルカインのペプチドはCX3CR1又はフラクタルカインのアミノ酸配列に基づき、公知の方法例えば、Fmoc又はTboc化学合成により合成することができ、合成されたペプチドは適当な担体、例えばKLHと結合させることで免疫原性を高めることも許される。精製されたCX3CR1又はフラクタルカイン又はペプチド断片をアジュバントと共に免疫後、抗血清を得ることができ、所望なら抗血清からポリクローナル抗体を単離することができる。また、モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞リンパ球を免疫動物より回収し、標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野では確立された方法であり、適当なマニュアルHarlowetalAntibodiesALaboratoryMannual1998ColdSpringHarborLaboratoryに準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトB細胞ハイブリドーマ法KozbaretalImmunolToday4721983、EBVハイブリドーマ法ColeetalMonoclonalAntibodyinCancerTherapy1985AllenRBlissIncpages7796、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニングHuseetalScience24612751989等他の方法により作製しても良い。また別法として、CX3CR1を発現させた昆虫細胞をそのまま哺乳類動物に免疫して、該哺乳動物のリンパ球よりハイブリドーマを作製し、産生される抗体のスクリーニングを、CX3CR1を発現させた哺乳類細胞昆虫細胞との交叉免疫性が低く、昆虫細胞由来の蛋白質に対する抗体が結合しない細胞で行う方法も許される。また、特開2002345454号公報の方法により調製することもできる。フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体のスクリーニングは、後述するスクリーニング方法によって行うことができる。<3>CX3CR1アンタゴニスト本発明は、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体が、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、iNOS活性または炎症性細胞による過剰なNOの産生が原因となる炎症性疾患の治療に有用であることを見出したことにより完成したものである。したがって、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害し、CX3CR1の機能を阻害する化合物、CX3CR1アンタゴニストも本発明に使用することができる。前記作用を有する化合物であれば特に限定されず、公知な化合物であってもよく、新規な化合物であってもよい。さらに、後述するスクリーニング方法によって得られる化合物であってもよい。本明細書において化合物は、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸オリゴDNA、オリゴRNA、合成ペプチドライブラリー、細菌放出物質、細胞微生物、植物細胞、動物細胞抽出液、細胞微生物、植物細胞、動物細胞培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーである。具体的には、国際公開第03018549号パンフレット、国際公開第0009511号パンフレット、国際公開第02076990号パンフレットに記載された化合物などが挙げられる。既知化合物はそれ自体公知の製造方法によって製造するか、天然化合物であればそれ自体公知の抽出方法またはそれ自体公知の精製方法によって取得するか、または市販されている場合は購入することにより得ることができる。また既知化合物の誘導体等は、化学的手段、物理的手段および/または生化学的手段により改変し得ることができる。<4>CX3CR1とフラクタルカインの相互作用を阻害する抗体のスクリーニング方法CX3CR1とフラクタルカインの相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストは、フラクタルカイン又は膜結合型フラクタルカインを発現する細胞に対し、CX3CR1陽性細胞が遊走するか否かによりスクリーニングできる。以下にCX3CR1陽性細胞が遊走するか否かによりスクリーニングする具体的な方法について記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。フラクタルカインに対する遊走は、例えばトランスウェルカルチャーインサートコースター社製を用いて、測定することができる。トランスウェルカルチャーインサートに、フラクタルカインを発現していない細胞例えばECV304細胞を培養し、カルチャーインサート上面に単層の細胞層を形成させる。フラクタルカインを、適当な濃度好ましくは10nMの濃度になるように、遊走溶液例えばRPMI1640M1991105BSA20mMHEPESpH74で希釈し、24穴のウェルプレートに加える。ECV304細胞を培養したトランスウェルカルチャーインサートを24穴のトランスウェルに取りつけ、遊走溶液に懸濁した適当な個数、好ましくは106個の末梢血単核球細胞をトランスウェルカルチャーインサートに加える。適当な条件好ましくは37°Cで4時間培養した後、ECV304細胞を通過して、ウェルプレートに遊走してきた細胞を回収し、細胞表面マーカーや細胞内抗原により同定する。好ましくは蛍光標識した該細胞表面マーカーや細胞内抗原に対する抗体で蛍光染色した後、FACScaliburを用いて定量する。遊走溶液中に、CX3CR1又はフラクタルカインと結合する抗体を加え、キラーリンパ球、好ましくはパーフォリン及びグランザイムB又はCX3CR1を発現する細胞、更に好ましくはCX3CR1を発現する細胞の遊走が抑制されれば、該抗体はCX3CR1とフラクタルカインの相互作用を阻害すると検定される。また、ECV304細胞に膜結合型フラクタルカインを発現させ、MIP1βなどの他のケモカインに遊走して来る末梢血単核球細胞を測定することによっても、抗体がCX3CR1とフラクタルカインの相互作用を阻害するか否かを検定可能である。<5>iNOSの産生抑制本明細書においてiNOSの産生抑制、iNOSの産生が抑制されとは、iNOSのmRNA発現量が抑制されること、もしくはiNOSタンパク質の産生量が抑制されることを意味する。iNOSの産生抑制は、リアルタイムPCR法、ウェスタンブロッティング法、ELISA法固相酵素免疫測定法、iNOS酵素活性測定法、いずれかを用いて測定することができる。例えば、リアルタイムPCRは具体的には、以下の様に行う。トータルRNAを組織及び細胞から常法により精製し、逆転写酵素と適当なプライマーを用いてcDNAを作製する。作製したcDNAをもとに、各分子に特異的なプライマーとDNAポリメラーゼを用いることで各分子を特異的に増幅させることができる。各分子は、増幅させる際に適当な蛍光色素を取り込ませることで、特定の機器PRISM7700SequenceDetectorなどを用いて増幅曲線をモニターすることができる。内部標準遺伝子グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などにより各分子の補正を行うことで、各分子の組織及び細胞におけるmRNA発現量を定量的に測定することができる。<6>フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストの用途本発明は、フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストを含有する炎症性疾患治療剤を提供するものである。前記治療剤においては、前記抗体はフラクタルカインと結合するものであることが好ましい。抗体を含有する本発明の治療剤をヒトに適用する場合には、以下の態様が好ましい。ヒト以外の動物、例えばマウスを免疫動物として作製されたマウスモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合異種蛋白質として認識されて、モノクローナル抗体に対する免疫応答を生じさせてしまうことが多い。この問題点を回避する一つの方法はキメラ抗体、すなわち抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体由来、それ以外の領域がヒト抗体由来の抗体である。本発明におけるフラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体はキメラ抗体も含むものである。キメラ抗体としては、抗原結合領域としてマウスモノクローナル抗体の可変領域全体を使ったキメラ抗体MorrisonetalProcNatlAcadSciUSA8168511985、TakedaetalNature3144521985、また抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗体由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体TengetalProcNatlAcadSciUSA807308121983、KozbaretalImmunolToday472791983が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。また本明細書におけるフラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体は、CX3CR1又はフラクタルカインと特異的に結合する抗体のフラグメント、例えばFab又は2フラグメントをも包含するものである。本発明の治療剤は、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、iNOS活性または炎症性細胞による過剰なNOの産生が原因となる炎症性疾患、具体的には炎症性腸疾患特に潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群などの治療が必要な患者に対して投与できる。炎症性疾患は、自己免疫疾患またはその他の炎症性疾患であってもよい。また、炎症性疾患は、腎炎、心筋炎、自己免疫性肝障害、多発性硬化症、リウマチ、または、その他の炎症性疾患であってもよい。本発明の治療剤の投与は、注射皮下、静脈内などなどの常法により行うことができる。治療剤の形態は、投与方法により適宜選択され、医薬的に許容可能な担体と組み合わせた医薬組成物であってもよく、例えば、注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液水溶性の場合又は分散液および滅菌注射溶液又は分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。注射用途に適した医薬組成物はいずれの場合においても滅菌されていなければならず、容易な注射器操作が可能な程度に流体でなければならない。該組成物は製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒であるか又は分散媒体であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどが組成物中に含まれているのが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを組成物中に配合することにより行うことができる。注射用溶液の調製は、必要なら上記成分の1又はその組合せとともに所要量のフラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体を適当な溶媒中に配合し、ついで滅菌濾過することにより行うことができる。一般に分散液の調製は、基本的な分散媒体と上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を配合することにより行う。滅菌注射溶液調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と前もって滅菌濾過した所望の追加成分との粉末が得られる。本発明の治療剤の投与量は、抗体の選択、投与対象、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴など、そして医師の判断に変化し得るが、適当な投与量範囲は患者の体重1kgあたり例えば約0.01~30mg、好ましくは約0.1~10mg程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。さらに、CX3CR1に対する抗体と、その抗体に結合した細胞毒性物質とを含むイムノトキシンとすることもできる。毒性物質としては、サポリン、リシン、Pseudomonas外毒素、ジフテリア毒素、化学療法剤などが挙げられる。抗体と毒性物質の結合は、従来のイムノトキシンの作製に用いられる方法によって行うことができる。このイムノトキシンは、CX3CR1発現細胞特異的に増殖抑制を示す。CX3CR1アンタゴニストを含有する炎症性疾患治療剤を、ヒトに適用する場合には、以下の態様が好ましい。CX3CR1アンタゴニストは塩を形成してもよく、薬学的に許容し得る酸または塩基などとの塩が挙げられる。従って、CX3CR1アンタゴニストまたはその塩は、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、iNOS活性または炎症性細胞による過剰なNOの産生が原因となる炎症性疾患、具体的には炎症性腸疾患特に潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群などの治療に用いることができる。得られた物質を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1~90重量の間で変動され得る。また当該治療剤は、経口または非経口例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、CX3CR1アンタゴニストまたはその塩を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クエン酸、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、得られる化合物の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重1kgあたり例えば約1.0~1,500μg、好ましくは約10~500μg程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。本明細書において治療とは、一般的に、所望の薬理学的効果及びまたは生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および/または症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病およびまたは疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒という点では治療的である。本明細書において治療とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下のa~の治療を含む:a疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持っていると診断されていない患者において、疾病または症状が起こることを防止すること;b疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止すること;c疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退を引き起こすこと。本発明で用いられるフラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体またはCX3CR1アンタゴニストは、iNOSの産生抑制の作用を有するので、CX3CR1アンタゴニストを有効成分とするiNOS産生抑制剤も提供される。iNOS産生抑制剤は、上述した治療剤と同様に組成物としてもよく、iNOS産生抑制が必要な患者に、上述した治療剤と同様に投与することができる。続いて実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なおこれらは実施の一例をして示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また以下の記載に用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくものである。マウスCD4陽性CD45RB強陽性CD4CD45RBhighTリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける抗フラクタルカイン抗体5H84の効果1抗フラクタルカイン抗体5H84の調製抗フラクタルカイン抗体5H84は、以下の方法により調製した特開2002345454号公報。抗原にはマウスフラクタルカインRD社製を用いた。抗原はTiterMaxアジュバンドと混合した後、アルメニアハムスターに免疫し、以降抗原のみで追加免疫を行った。血清中の抗体価はELISAを用いて測定した。抗体価が上昇したアルメニアハムスターからリンパ球を分離し、リンパ球:P3ミエローマ細胞の比率が51になるように混合し、PEGベーリンガー社製を用いて細胞融合を行った。ハイブリドーマは、RPMI164010FCSHAT10OrigenHCFを用いて、96ウェルプレートで1週間培養した。そして、培養上清を用いて、ELISAを実施し、陽性ウェルを同定した。抗マウスフラクタルカイン抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈を2回行い、クローニングを行った。モノクローナル抗体は、不完全フロイントアジュバントを投与したSCIDマウスにハイブリドーマを接種して作製した腹水から、プロテインAカラムを用いて精製した。中和活性は、CX3CR1発現細胞のマウスフラクタルカインに対する遊走を抑制することを指標にして測定し、中和抗体5H84を得た。この中和抗体を産生するハイブリドーマをHammFKN5H84と名づけた。2方法CD4陽性CD45RB強陽性CD4CD45RBhighTリンパ球移入炎症性腸疾患モデルの作製についてはPowrieetalIntImmunol5146114711993を参考にした。雌性、8~10週齢のBalbcマウス日本チャールズリバーの脾臓を摘出し、孔径100μmのセルストレーナーファーミンジェン社製上で組織をすり潰し脾臓細胞を分離した。分離した脾臓細胞は、脾臓一個あたり5mlの塩化アンモニウム溶液075塩化アンモニウム、16mMトリス緩衝液、pH74を加え15分室温に放置し赤血球を溶解した。脾臓細胞溶液にPBSを2倍容量加え、1500rpmで5分遠心して沈殿を回収した。分離した脾臓細胞からCD4TcellIsolationkitミルテニー社製によりCD4Tリンパ球を精製した。CD4陽性CD45RB強陽性Tリンパ球を分離するために、精製したCD4Tリンパ球に対して、フィコエリスリンPE標識抗CD4抗体eBioscience社製、フルオレセインイソチオシアネートFITC標識抗CD45RB抗体eBioscience社製を用い二重染色を行った。二重染色の後、FACSAriaベクトンディッキンソン社製を用いCD4陽性CD45RB強陽性細胞をソーティングし目的の細胞を回収した。回収された細胞はPBSで洗浄後、2x106mlの細胞濃度にPBSにて懸濁した。雌性、8~10週齢のSCIDマウス日本クレアの腹腔に、上記で調製したCD4陽性CD45RB強陽性細胞を200μlずつ、すなわち4x105mouseで移入を行った。各群7匹のCD4陽性CD45RB強陽性細胞を移入したSCIDマウスに、500μgのコントロール抗体ハムスターIgG、500μgの抗フラクタルカイン抗体5H84抗体はPBS溶液を、細胞移入後2週間目より、3日に1回投与した。なお投与は尾静脈から行った。また陰性対照群として、CD4TcellIsolationkitミルテニー社製により精製し、CD45RBの発現強度による分離をしていないマウスCD4Tリンパ球トータルCD4を12x106mouseで移入したSCIDマウス4匹を用いた。各抗体投与後2週間後に剖検を行い体重減少、大腸内便性状をスコア化したもの、大腸肥厚、iNOSmRNA発現解析、病理学的観察により評価を行った。便性状のスコアは表1に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられている便性状のスコアCooperetalLabInvest692382491993を使用した。また大腸肥厚はダイヤルシックネスゲージピーコック社製を用い、肛門部から約15cmの部位を内容物を除き測定した。また大腸は形態的観察とマイヤーのヘマトキシリンエオジン染色による組織切片染色にて病理組織学的観察を行った。またiNOS等のmRNA発現は、大腸よりRNeasyminikitを用いて精製した全RNAをAMV逆転写酵素とランダムヘキサマーを用いて逆転写して得たcDNAをテンプレートとして、リアルタイムPCRにて解析した。リアルタイムPCRは、各種プライマーとQuantiTectSYBRGreenPCRkitの試薬、ウラシルDNAグリコシラーゼを混合した反応液を調製し、ABIPRISM7700SequenceDetectorを用いて行った。PCRは、50°C2分、95°C15分の反応を行った後、95°C15秒および60°C1分の反応を35サイクル実施した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。3結果コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群は、体重減少が抑制された図1。またコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群は、大腸内便性状スコアおよび大腸肥厚において改善を示した図2。大腸部位の形態的観察においても、コントロール抗体投与群では結腸から直腸部位において肥厚が観察され、抗フラクタルカイン抗体5H84投与により改善が認められた図3。組織切片染色においてコントロール抗体群では大腸粘膜層に非常に多くの白血球Tリンパ球、単球、マクロファージなどが浸潤し、粘液を産生する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対し、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上皮細胞の損傷も僅かであった図4。一方mRNA発現に関してもコントロール抗体投与群ではiNOSの発現が上昇し、抗フラクタルカイン抗体5H84によりその発現が顕著に抑制された。また、パーフォリン、Fas、FasLなどの細胞障害性因子、IFNγ、TNFαなどのサイトカインのmRNAに関してもコントロール抗体投与群では発現が上昇し、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群では発現の抑制が認められた図5。以上の結果から、フラクタルカインCX3CR1経路がCD4陽性CD45RB強陽性CD4CD45RBhighTリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおいて重要な役割を果たすことが明らかとなった。その作用はiNOS産生を抑制することで過剰なNOの産生を抑制し、組織障害を軽減しているものと推察された。つまりフラクタルカインCX3CR1の相互作用阻害に基づくiNOS産生抑制は、炎症性腸疾患に有用な治療体系であることが示唆された。マウスオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける抗フラクタルカイン抗体5H84の効果1方法マウスオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルについてはIijimaetalJExpMed1994714822004を参考にした。雄性8~10週齢Balbcマウス日本チャールズリバーの腹部を約2cm四方剃毛した。34エトキシメチレン2フェニル2オキサゾリン5オン以下オキサゾロン、シグマ社製を含む100エタノール溶液を150μlずつ各マウスに塗布した。オキサゾロン感作してから4日目に絶食し、5日目にジエチルエーテル麻酔下のマウスの肛門から約3cmの部位に、05オキサゾロンを含む50エタノール生理食塩水溶液を100μlずつマウスに腸注した。なお陰性対照群として正常Balbcマウスに50エタノール生理食塩水溶液を100μlずつ腸注したマウス5匹を設定した。各群7匹のオキサゾロン腸注したマウスに、500μgのコントロール抗体ハムスターIgG、500μgの抗フラクタルカイン抗体5H84抗体はPBS溶液を投与した。なお抗フラクタルカイン抗体5H84投与は感作5日目オキサゾロン腸注直前に行った。なお抗体投与は尾静脈から行った。評価項目は疾患活動指数DiseaseActivityIndex以下DAI;便の硬度、血の含有度合い、そして体重増減をスコア化してDAI値として算出、大腸の短縮化、大腸肥厚および病理学的観察により評価を行った。なおDAIは表3に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられているDAICooperetalLabInvest692382491993を使用した。またオキサゾロン腸注2日目より下痢および軟便が認められるため、DAIについては経時的に観察を行った。また大腸は形態的観察とマイヤーのヘマトキシリンエオジン染色による組織切片染色にて病理組織学的観察を行った。2結果コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群は、DAIにおいてオキサゾロン腸注2日目より改善を示した図6。また大腸の肥厚および短縮化もコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群は改善を示した図7。大腸部位の形態的観察において、コントロール抗体投与群では結腸から直腸部位において肥厚が観察され、抗フラクタルカイン抗体5H84投与により改善が認められた図8。組織切片染色においてコントロール抗体群では大腸粘膜層に非常に多くの白血球Tリンパ球、単球、マクロファージなどが浸潤し、粘液を産生する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対し、抗フラクタルカイン抗体5H84投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上皮細胞の損傷も僅かであった図9。以上の結果からフラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系がオキサゾロン誘発大腸炎モデルにおいても重要な役割を果たしていることが予想され、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系が炎症性腸疾患において有用な治療体系であることが示唆された。マウスオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける抗フラクタルカイン抗体126の効果1抗フラクタルカイン抗体126の調製マウスフラクタルカインGenzyme社製とTiterMaxTMGoldアジュバンドを混合した後、アルメニアハムスターに複数回免疫し、さらに最終免疫をマウスフラクタルカインのみで行った。血清中の抗体価を固相化したフラクタルカインを用いたELISAで測定し、抗体価が上昇したアルメニアハムスターからリンパ球を分離し、リンパ球:P3ミエローマ細胞の比率が51になるように混合し、PEGRosh社製を用いて細胞融合を行った。ハイブリドーマは、RPMI164010FCSHAT10OrigenHCFを用いて、プレートで1週間培養した。そして、培養上清を用いて固相化したフラクタルカインを用いたELISAを実施し、陽性ウェルを同定した。抗フラクタルカイン抗体を産生するハイブリドーマは、2回の限界希釈によりクローニングを行った。モノクローナル抗体は、プリスタンを投与したSCIDおよびヌードマウスにハイブリドーマを接種して作製した腹水から、プロテインAカラムを用いて精製した。得られた抗体の中和活性は、CX3CR1発現細胞のマウスフラクタルカインに対する遊走を抑制することを指標にして測定し、中和活性を有する126抗体を得た。この中和抗体を産生するハイブリドーマをHammFKN12611と名づけた。2方法実施例2と同様の方法を用い検討を行った。評価項目は大腸短縮および大腸肥厚とした。各群7匹のオキサゾロンを腸注したマウスに、500μgのコントロール抗体ハムスターIgG、500μgの抗フラクタルカイン抗体126抗体はPBS溶液を投与した。3結果抗フラクタルカイン抗体126は抗フラクタルカイン抗体5H84と同様に、コントロール抗体投与群に比較し、大腸短縮および大腸肥厚を改善した図10。以上の結果から、異なる2種類の抗フラクタルカイン抗体がオキサゾロン誘発大腸炎モデルにおいて効果を示したことは、フラクタルカインCX3CR1細胞浸潤系の阻害が炎症性腸疾患治療に有用であることが強く示唆された。ConA肝炎におけるiNOSの発現と抗フラクタルカイン抗体5H84のiNOS産生に対する効果1方法1群4匹のC57BL6マウスに、500μgのコントロール抗体ハムスターIgG、500μgの抗フラクタルカイン抗体5H84抗体はPBS溶液を静脈内投与し、直後にコンカナバリンAConA、シグマアルドリッチ社製を12mgkgで静脈内投与した。その2時間後に肝臓を摘出し、RNA抽出を行った。なお陰性対照群としてC57BL6マウスにPBSリン酸バッファーを静脈内投与したマウス4匹を設定した。iNOSのmRNA発現は、実施例1と同様の方法にてRNAを回収し、cDNAを合成し、リアルタイムPCRにて測定した。また、コントロール抗体あるいは抗フラクタルカイン抗体とConA、陰性対照群としてPBSを静脈内投与して12時間後の肝臓を摘出し、凍結組織切片を作製した。抗iNOS抗体と抗CX3CR1抗体で免疫組織染色を行い、iNOS、CX3CR1の陽性細胞の数を測定した。2結果ConAの投与により上昇したiNOSmRNA発現は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に減少した。また、グランザイムB、Fasなどの細胞障害性因子、IFNγ、TNFα、IL4などのサイトカインのmRNAに関しても、ConAの投与により発現が上昇し、抗フラクタルカイン抗体5H84の投与により発現の減少が認められた図11。また、免疫組織染色の結果から、iNOS陽性の炎症性細胞はConAの投与により増加し、抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に減少していた。また、CX3CR1陽性の炎症性細胞もConAの投与により増加し、抗フラクタルカイン抗体5H84の投与により顕著に減少していた。以上の結果からフラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、ConA肝炎での肝臓におけるiNOSmRNAの発現抑制と、炎症性細胞でのiNOS産生が抑制されることが明らかとなり、炎症性細胞による過剰なNOの産生が阻害されることで、肝臓の組織障害が軽減されることが示唆された。ConA肝炎におけるCX3CR1およびiNOS発現細胞の解析免疫組織染色の結果を詳細に解析した。CX3CR1陽性細胞は主に丸く小型で、核は馬蹄形で細胞質は少なく、門脈や中心静脈、類洞に隣接しており、一部は壊死部の辺縁部でも認められた。iNOS陽性細胞は、主に大きく進展しており、核は馬蹄形で細胞質は大きく、類洞に隣接しており、壊死部の辺縁部に加え壊死部の中でも見られたが、門脈や中心静脈近傍では見られなかった。このように、CX3CR1陽性細胞とiNOS陽性細胞の形態や局在には異なる点が見られたので、CX3CR1およびiNOS陽性細胞の特徴を詳細に解析した。1方法実施例4と同様にConA静脈内投与12時間後の肝臓ConA肝炎肝組織を用い、凍結組織切片を作製した。抗CX3CR1抗体あるいは抗iNOS抗体BDBioscience社製と抗BM8抗体BMA社製、抗CD11b抗体eBioscience社製、あるいは抗MCP1抗体GengymeTechne社製で蛍光二重染色を行い、CX3CR1陽性細胞およびiNOS陽性細胞におけるBM8、CD11b、MCP1の陽性率を測定した。上記の抗CX3CR1抗体は、抗原としてマウスCX3CR1C末ペプチドCSILSSFTHYTSEGDGSLLLを用いてウサギで作製した抗体であった。具体的には以下のようにして得た。配列番号31の合成ペプチドをKLHと結合させ、ウサギJWにアジュバントと共に1回あたり250μg羽免疫した。アジュバントは、初回のみフロインド完全アジュバントを使用し、残りはフロインド不完全アジュバントを用いた。計5回免疫し、抗体価の上昇を、ペプチドを固相化したELISAにより確認し、血清を回収した。上記の配列のペプチドをThiopropylSepharose4Bで5日間培養し、骨髄細胞から分化させたマクロファージBMMφにおけるCX3CR1陽性細胞を、マクロファージおよび単球に特異的なF480、ならびに、未熟骨髄系細胞の表面マーカーであるLy6Cについて、抗F480抗体CALTAG社製および抗Ly6C抗体BMA社製を用いて、フローサイトメトリーにより解析した。また、抗Ly6C抗体によるConA肝炎肝組織の組織染色、および、蛍光標識したマクロファージを浸潤させたConA肝炎肝組織の、抗MCP1抗体による組織染色を行った。2結果代表的な染色像を図13に示す。図中、写真の左および上の文字は、蛍光染色に用いた抗体が認識するマーカーを示す。また、バーの長さは20μmである。また、各マーカーの陽性率の測定結果を図14に示す。図中、BM8はBM8陽性、CD11bはCD11b陽性、MCP1は、MCP1陽性を意味する。CX3CR1陽性細胞は、丸く小型のCD11b陽性が689±27、大型で進展したBM8陽性が534±20であった。一方、iNOS陽性細胞は、大型で進展したBM8陽性が816±18、CD11b陽性が126±30であった。したがって、CX3CR1陽性細胞はiNOS陽性細胞と必ずしも同じ細胞ではなく、一部は別の細胞集団で発現していることが明らかとなった。最近、iNOS産生細胞の浸潤には、CCR2が関与することが細菌感染モデルマウスにおいて報告されている非特許文献13。そこで、CCR2のリガンドであるMCP1の発現を解析した。MCP1陽性細胞は、CX3CR1と同様に丸く小型であった。CX3CR1陽性細胞の725±37がMCP1を発現しており、逆にMCP1陽性細胞のほとんどがCX3CR1陽性であった。したがって、ConA肝炎では、CX3CR1陽性細胞は、MCP1を発現する主な細胞であることが明らかとなった。一方、MCP1陽性細胞とiNOS陽性細胞は、形態が異なることから予想されるように、iNOS陽性細胞の146±22しかMCP1を発現しておらず、ほとんど一致しなかった。したがって、iNOS陽性細胞の多くは、CX3CR1MCP1陽性細胞と異なることが明らかとなった。興味深いことに、肝臓の類洞血管や壊死部では、iNOS陽性細胞とMCP1陽性細胞は高頻度で隣接して存在していた。CX3CR1陽性細胞のFACSによる解析結果を図15に示す。また、組織染色の結果を図16に示す。末梢血PBLでCX3CR1陽性細胞をFACSで解析した結果、CX3CR1はF480陽性の単球で発現しており、発現量はLy6C成熟単球で強く、Ly6C未熟単球で弱かった。ConA投与12時間後の肝臓を未熟骨髄系細胞の表面マーカーであるLy6Cで組織染色した結果、iNOS陽性のF480陽性細胞はLy6C陽性であり、未熟単球由来であることが示唆された。次に、C57BL6雄9週令の骨髄細胞をMCSFで5日間培養し、骨髄細胞から分化させたマクロファージBMMφを得た。付着したBMMφを1mMEDTAPBSで回収しFACSで解析を行った結果、末梢血成熟型単球と同様のCX3CR1hiF480Ly6Clowであった。そこで、BMMφをCFSE10μMで蛍光標識して25x106個250μlの細胞をマウスに静注し、さらに10分後にConAを静注して12時間後に肝臓を回収して浸潤を検討した。ConA投与により、BMMφの肝臓への浸潤は著しく増加した。また、浸潤した蛍光標識細胞は、ConA投与によりMCP1を産生していた。iNOSは、蛍光標識細胞では発現せず、宿主由来であった。以上の結果から、炎症時にはCX3CR1陽性成熟型単球は炎症局所に浸潤してMCP1を発現し、iNOS産生未熟型単球の炎症局所への浸潤を誘導することで病態を形成することが示唆された。ConA肝炎におけるケモカインの発現と抗フラクタルカイン抗体のケモカイン発現に対する効果1方法実施例4で作製したConAを静脈内投与2時間後の肝臓由来cDNAを用い、実施例1と同様の方法にて、ケモカインのmRNA発現をリアルタイムPCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりであった。コントロール遺伝子として、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた。2結果結果を図17に示す。図中、normalは陰性対照、controlはコントロール抗体投与群、antiFKNは抗フラクタルカイン投与群を意味する。ConAの投与により2時間後に肝臓でのMCP1、KC、MIP2、IP10、MIP1α、MIP1βのmRNAの発現が上昇した。これらのケモカインのmRNA発現は抗フラクタルカイン抗体の投与により減少した。以上の結果から、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、多種類のケモカインの産生が抑制され、炎症の初期誘導反応である炎症性細胞浸潤と活性化の増幅回路が広範囲に作動しなくなることが示唆された。マウスCD4陽性CD45RB強陽性CD4CD45RBhighTリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける、細胞表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子のmRNA発現と抗フラクタルカイン抗体の細胞表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子のmRNA発現に対する効果1方法実施例1で作製した大腸由来cDNAを用い、実施例1と同様の方法にて、さらに詳細に白血球マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および組織破壊に関与する分子のmRNA発現をTaqManPCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。2結果コントロール抗体投与群ではCD4、Tbet、F480、MCSFreceptor、Ly6G、CD11cなどの各種白血球マーカーのmRNA発現が亢進していた図18。これらの結果から、実施例1の組織切片染色における、コントロール抗体投与群でのおびただしい数の浸潤した白血球はCD4T細胞特にTh1タイプCD4T細胞や単球マクロファージ、好中球、樹状細胞など多種類の白血球から構成されている可能性が示唆された。また各々のケモカインケモカイン受容体、KC、MIP2、CXCR2、MCP1、MCP3、CCR2、MIP1α、MIP1β、CCR5、IP10、ITAC、CXCR3、TARC、MDC、CCR4のmRNA発現亢進がコントロール抗体投与群において認められたことから、浸潤した白血球はこれらケモカイン-ケモカイン受容体機構を介して浸潤したものと推察された図19、図20。さらに一連の炎症性サイトカイン、IL1β、IL6、IL12α、Il12β、Il23α、Il17、RANKLや組織破壊に関与するプロテアーゼMMP2、MMP9、MMP14さらに炎症部位での血管新生に関与するbFGFやVEGFReceptor2のmRNA発現もコントロール抗体投与群において顕著な亢進が認められた図21、図22。また樹状細胞などの活性化受容体であるCD40やTLR2、活性化T細胞で発現し、樹状細胞などを活性化する分子CD40L、樹状細胞の活性化により発現が増強するCD80、CD86などのT細胞活性化補助シグナル分子群およびMHCClassIIの発現亢進が認められたことから、T細胞および樹状細胞などの抗原提示細胞が病変部位において活性化され、抗原特異的な獲得免疫系が作動している可能性が示唆された図23。これら一連の白血球マーカー、ケモカイン-ケモカイン受容体、サイトカイン、組織破壊分子、血管新生関連分子、T細胞樹状細胞活性化分子のmRNA発現は、抗フラクタルカイン抗体投与により顕著に抑制されていた図18~図23。以上の結果から、フラクタルカインとCX3CR1の相互作用を阻害することで、炎症性サイトカインやケモカインの産生が抑制され、炎症性細胞浸潤と活性化の増幅回路が広範囲に作動しなくなり、炎症性腸疾患の病態進展が抑制される可能性が示唆された。マウスオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、細胞表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子のmRNA発現と抗フラクタルカイン抗体の細胞表面マーカー、サイトカイン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子のmRNA発現に対する効果1方法実施例2と同様の方法により炎症性腸疾患モデルを作製した。コントロール抗体、坑フラクタルカイン抗体5H84を実施例2の方法に従い投与した。オキサゾロン腸注後24時間および3日目に剖検を行い、大腸を摘出後、大腸組織より実施例1と同様の方法を用いRNAを抽出した。陰性対照群には50エタノール生理食塩水を腸注した。RNAを抽出後、実施例1と同様の方法を用いcDNAを合成しサイトカイン、ケモカインのmRNA発現をTaqManPCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。2結果オキサゾロン腸注24時間後において、コントロール抗体投与群ではIL1β、IL6などの炎症性サイトカイン、KC、MIP2、MCP1、MCP3、MIP1α、MIP1βなどのケモカイン、ケモカイン受容体CXCR2のmRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に抑制された図24。オキサゾロン腸注3日後においては、IL1β、IL6、KC、MIP2、MCP1、MCP3、CXCR2に加え、好中球のマーカーであるLy6GのmRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進は抗フラクタルカイン抗体の投与により顕著に抑制された図25。以上の結果から、坑フラクタルカイン抗体のオキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける病態改善効果の一部は、IL1βやIL6の炎症性サイトカインやケモカインの産生が抑制されること、好中球の浸潤が抑制されることで発揮されることが示唆された。"