"下記として配置される第1および第2の核酸鎖からなる部分二本鎖プライマーであって、11つの二本鎖標的非特異的領域、21つの二本鎖標的特異的領域、および3前記第1の核酸鎖による寄与による1つの一本鎖標的特異的領域、前記二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸に結合する前記一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有する部分二本鎖プライマー。前記第2の核酸鎖はその3’末端に非伸長性ヌクレオチドを含み、および/または前記第1の核酸鎖はその標的非特異的領域の3’末端または3’末端付近に非天然ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の部分二本鎖プライマー。前記非伸長性ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである、請求項2に記載の部分二本鎖プライマー。前記非天然ヌクレオチドはイソ-C、イソ-Gまたはデオキシウリジンである、請求項3に記載の部分二本鎖プライマー。前記二本鎖標的非特異的領域は約4~21ヌクレオチド長である、請求項1から4のいずれか1項に記載の部分二本鎖プライマー。前記一本鎖標的特異的領域は約4~20ヌクレオチド長である、請求項1から5のいずれか1項に記載の部分二本鎖プライマー。前記第1および第2の核酸鎖はDNAまたはRNAからなる、請求項1から6のいずれか1項に記載の部分二本鎖プライマー。核酸標的、ポリメラーゼ、および下記として配置される第1および第2の核酸鎖を含む部分二本鎖プライマー11つの二本鎖標的非特異的領域、21つの二本鎖標的特異的領域、および3前記第1の核酸鎖による寄与による1つの一本鎖標的特異的領域を含むシステム。前記核酸標的は一本鎖である、請求項8に記載のシステム。前記核酸標的はDNAまたはRNAである、請求項8または9に記載のシステム。前記システムは複数の異なる部分二本鎖プライマーを含む、請求項8から10のいずれか1項に記載のシステム。前記システムは、前記核酸標的の領域を増幅するために一緒に使用することができる少なくとも2つの部分二本鎖プライマーを含む、請求項8から11のいずれか1項に記載のシステム。前記核酸標的は反復配列、二次構造および/または高GC含量を含む、請求項8から12のいずれか1項に記載のシステム。前記核酸標的は複数の異なる核酸標的に存在する、請求項8から13のいずれか1項に記載のシステム。前記核酸標的は複数の異なる核酸標的に単一コピーとしてまたは低コピーで存在する、請求項14に記載のシステム。請求項1または8に記載の部分二本鎖プライマーをサンプルに接触させること、および前記プライマーと前記サンプル中の標的とのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。前記部分二本鎖プライマーは検出可能な部分で標識される、請求項16に記載の方法。前記検出可能な部分はフルオロフォアまたは放射性同位元素を含む、請求項17に記載の方法。前記標的は前記サンプル中に単一コピーとして存在する、請求項16から18のいずれか1項に記載の方法。請求項1または8に記載の部分二本鎖プライマーの第1の鎖の一本鎖標的特異的領域を核酸標的にハイブリダイズし、それにより前記プライマーの前記第1の鎖を前記プライマーの第2の鎖から解離すること、およびポリメラーゼの存在下で標的と相補的に前記第1の鎖をその3’末端から伸長させることを含む方法。核酸標的、ポリメラーゼおよび請求項1または8に記載の1つ以上の部分二本鎖プライマーの存在下で核酸合成反応を行うことを含む方法。前記核酸合成反応は核酸増幅反応である、請求項21に記載の方法。前記核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応PCRである、請求項22に記載の方法。前記核酸合成反応は転写反応である、請求項21に記載の方法。前記転写反応は逆転写反応である、請求項24に記載の方法。2つの部分二本鎖プライマーが使用される、請求項20から25のいずれか1項に記載の方法。請求項1または8に記載の1つ以上の部分二本鎖プライマー、および1種以上の核酸合成試薬を含むキット。前記1種以上の核酸合成試薬は緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される、請求項27に記載のキット。使用説明書をさらに含む、請求項27または28に記載のキット。第1の容器に第1の一本鎖核酸、および第2の容器に、前記第1の一本鎖核酸の領域と相補的である第2の一本鎖核酸、を含み、前記第1および第2の一本鎖核酸が相互にハイブリダイズすると、1二本鎖標的非特異的領域、2二本鎖標的特異的領域および3前記第1の核酸による寄与による一本鎖標的特異的領域を含む部分二本鎖核酸が形成され前記第1の一本鎖核酸は非天然ヌクレオチドを含み、および/または前記第2の一本鎖核酸はその3’末端に非伸長性ヌクレオチドを含むキット。使用説明書をさらに含む、請求項30に記載のキット。1種以上の核酸合成試薬をさらに含む、請求項30または31に記載のキット。前記1種以上の核酸合成試薬は緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される、請求項32に記載のキット。部分的に自己ハイブリダイズして下記を形成する一本鎖プライマーであって、11つ以上の二本鎖標的非特異的領域、21つ以上の二本鎖標的特異的領域、31つ以上の一本鎖標的特異的領域、および41つ以上のヘアピンループ領域、前記1つ以上の二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸に結合する前記1つ以上の一本鎖標的特異的領域の濃度調整標準自由エネルギーとほぼ等しい濃度調整標準自由エネルギーを有する一本鎖プライマー。請求項1から8、または34のいずれか1項に記載のプライマーを用いて複数の特有の核酸分子を増幅させることを含む、マルチプレックスによる核酸増幅反応を行う方法。複数の実施形態において、本明細書で提供されるのは、広範囲の温度で核酸標的に高い特異性で速やかに結合することができるプライマーたとえば、プライマーデュプレックスおよびヘアピンプライマーデュプレックスである。こうしたプライマーは、たとえば、核酸合成反応たとえば、PCR、マイクロアレイ解析、イメージング法および一塩基多型SNP解析に使用してもよい。プライマーはまた、プライマーが主にプローブとして機能する核酸検出アッセイに使用してもよい。したがって、本発明のプライマーは、用途に関係なく、プローブと同義で用いられることがある。本発明のプライマーは、用途または使用方法に関係なく、特定のハイブリダイゼーションが擬似標的の存在下で必要とされる場合に、より詳細にはそうした擬似標的が過度に存在する場合によく見られる問題を解決する。本明細書で提供されるプライマーは、核酸に作用する酵素とプライマーを併用しやすくするいくつかの独特の特性を有する。第1に本プライマーは、その目的の標的にのみ高い特異性で結合するように熱力学的に設計されており、単1ヌクレオチド変化にも高い識別を示す。第2に本プライマーの特異性は、かなりの配列の反復、二次構造および/または高G/C含量を有するものなど従来困難であった標的のPCR、転写および逆転写を可能にする。こうしたプライマーで達成され得る高度の特異性はさらに、単一コピーヒトゲノムの増幅など核酸のバックグラウンドが高くても正確な処理を可能にする。第3に本プライマーが部分二本鎖性であることは、本プライマーが互いに相互作用するとは考えにくいことを意味し、その結果高度なマルチプレックスによる複製反応、転写反応および/または逆転写反応を行いやすくする。最後に、こうしたプライマーの標的とのハイブリダイゼーションは、比較的温度および塩分の影響を受けにくく、したがって本プライマーは標準的なプライマーより著しく長くてもよく、結果として特異性およびプライマー設計の柔軟性がさらに高まる。いくつかの実施形態では、本明細書で考察される核酸プライマーは、特異的な標的核酸分子とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーたとえば、理論上の標準自由エネルギーがゼロに近くなる一方、それと比較して擬似標的特異的な実際の標的と1ヌクレオチドとわずかに異なる擬似標的でもとプライマーとの間のハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーは、それらの結合を起こりにくくするのに十分高くなるように合理的に設計される。本発明者らは、aトーホールド一本鎖標的特異的領域、b分岐点移動二本鎖標的特異的領域、およびcバランス二本鎖標的非特異的領域を有するプライマーを設計することによりこれを達成した。いくつかの実施形態では、プライマーは、自己ハイブリダイズして二本鎖領域を形成する一本鎖からなっていてもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、二本鎖からなっていてもよい。後者の実施形態の例として、プライマーは、第1の鎖または相補体鎖および第2の鎖または保護体鎖からなる。相補体鎖は、その名称が示唆する通り、目的の標的と部分的に相補的であり、標的にハイブリダイズする。一方、保護体鎖は標的にハイブリダイズせずに、むしろ相補体の結合において標的または擬似標的と競合するように設計される。トーホールド領域は相補体鎖中に存在し、標的配列と相補的であるが、保護体領域とは相補的でない。相補体鎖中のバランス領域すなわち、相補体バランス領域は、保護体の一部すなわち、保護体バランス領域と相補的であるが、標的配列とは相補的でない。トーホールドと標的とのハイブリダイゼーションエネルギーは、相補体バランス領域と保護体バランス領域とのハイブリダイゼーションエネルギーに一致またはほぼ一致する様々な他の熱力学的事項に応じて調整する。バランス領域の配列は、温度およびプライマー濃度の所望の条件下でこの一致を達成するように合理的に設計される。その結果、実際の標的とプライマーとの平衡状態は、50標的:プライマー::保護体:プライマーまたはその他の所望の比率に速やかに近付く一方、擬似標的とプライマーとの平衡状態は保護体:プライマーに大きく有利である。特異的標的の存在下で大量の遊離のプライマーがあると、その高感度で特異的な検出が容易になる。いくつかの実施形態では、本明細書で考察される核酸プライマーは、特異的な標的核酸分子とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの濃度調整自由エネルギーがゼロに近くなる一方、それと比較して擬似標的とプライマーとの間のハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーはそれらの結合を起こりにくくするのに十分高くなるように設計される。本明細書で使用する場合、濃度調整自由エネルギーとは、ΔG°ΔnRTlncをいい、式中、Rは一般気体定数、Tはケルビン温度、cはプライマー濃度、Δnは反応の過程における分子数の変化である標準的なハイブリダイゼーションでは、Δn=-1、二本鎖プライマーのハイブリダイゼーションでは、Δn=0である。したがって本発明の態様は、プライマー、相補体鎖および保護体鎖を含む組成物を含むプライマー組成物たとえばキット中と、プライマーを作製する方法と、以下に限定されるものではないが、核酸合成および/または検出アッセイもしくは反応などアッセイまたは反応にプライマーを使用する方法とを提供する。よって、一態様では、本発明は、a第1の核酸鎖本明細書では相補体鎖ともいうおよび第2の核酸鎖本明細書では保護体鎖ともいうからなり、第1および第2の鎖は、相互にハイブリダイズすると、第1の核酸鎖による寄与により1二本鎖標的非特異的バランス領域、2二本鎖標的特異的分岐点移動領域、および3一本鎖標的特異的トーホールド領域に配置され、二本鎖標的非特異的領域は、標的核酸に結合する一本鎖標的特異的領域の標準自由エネルギーとほぼ等しい標準自由エネルギーを有する部分二本鎖プライマーを提供する。部分二本鎖プライマーは、1つ以上の二本鎖標的非特異的領域、1つ以上の二本鎖標的特異的領域、および/または1つ以上の一本鎖標的特異的領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、部分二本鎖プライマーは、1つまたは2つの二本鎖標的非特異的バランス領域、1つ以上の二本鎖標的特異的分岐点移動領域、および/または1つ以上の一本鎖標的特異的トーホールド領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第2の核酸鎖はその3’末端に非伸長性ヌクレオチドを含み、および/または第1の核酸鎖は、その標的非特異的領域の3’末端または3’末端付近に非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、非伸長性ヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドはイソ-C、イソ-Gまたはデオキシウリジンである。これらの例は、非限定的な例として意図している。いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域は約4~20ヌクレオチド長である。二本鎖標的非特異的領域は、たとえば4~21ヌクレオチド長など20ヌクレオチドより長くてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域は、約12~192ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、一本鎖標的特異的領域は約4~20ヌクレオチド長である。一本鎖標的特異的領域は、たとえば4~21ヌクレオチド長など20ヌクレオチドより長くてもよい。いくつかの実施形態では、一本鎖標的特異的領域は、約12~192ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖標的非特異的領域および一本鎖標的特異的領域は、A/Tヌクレオチドの比率がほぼ同一または同一さらに典型的にはG/Cヌクレオチドの比率もほぼ同一または同一である。いくつかの実施形態では、第1および第2の核酸鎖は、DNAまたはRNAまたはそれらの組み合わせからなる。別の態様では、本発明は、部分的に自己ハイブリダイズして1二本鎖標的非特異的領域、2二本鎖標的特異的領域、3一本鎖標的特異的領域、および4ヘアピンループ領域を形成し、1つ以上の二本鎖標的非特異的領域が、標的核酸に結合する1つ以上の一本鎖標的特異的領域の濃度調整標準自由エネルギーとほぼ等しい濃度調整標準自由エネルギーを有する、一本鎖プライマーを提供する。別の態様では、本発明は、上述のプライマーのいずれかを含む組成物を提供する。本組成物は、任意選択的に防腐剤、1つ以上の塩等を含む緩衝液などの担体をさらに含んでもよい。組成物はまた、各保護体鎖が保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含む過剰の一本鎖保護体鎖を含む。一本鎖保護体鎖は各々、好ましくはその3’末端に非伸長性および/または非天然のヌクレオチドを含んでもよい。別の態様では、本発明は、核酸標的、ポリメラーゼ、および前述のプライマーのいずれかを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態では、プライマーは、第1の核酸鎖による寄与により1二本鎖標的非特異的領域、2二本鎖標的特異的領域、および3一本鎖標的特異的領域に配置された第1および第2の核酸鎖を含む部分二本鎖プライマーである。いくつかの実施形態では、核酸標的は一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸標的はDNAまたはRNAである。いくつかの実施形態では、核酸標的は、反復配列、二次構造および/または高GC含量を含む。いくつかの実施形態では、核酸標的は複数の異なる核酸に存在する。いくつかの実施形態では、核酸標的は複数の異なる核酸中に単一コピーとしてまたは低コピーたとえば、0.001未満、0.01未満、0.1未満または1未満で存在する。いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる部分二本鎖プライマーなど前述のプライマーのいずれかの複数を含む。いくつかの実施形態では、システムは、核酸標的の領域を増幅するために一緒に使用することができる、少なくとも2つの部分二本鎖プライマーなど前述のプライマーの少なくとも2つを含む。別の態様では、本発明は、上述のシステムのいずれかを含む組成物を提供する。組成物は、防腐剤、1つ以上の塩、ポリメラーゼなどの1種または複数種の酵素、核酸合成に好適なヌクレオチド等を任意選択的に含む緩衝液などの担体をさらに含んでもよい。組成物はまた、各保護体鎖が保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含む過剰の一本鎖保護体鎖も含む。一本鎖保護体鎖は各々、好ましくはその3’末端に非伸長性および/または非天然のヌクレオチドを含んでもよい。別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかなど前述のプライマーのいずれかをサンプルと接触させること、およびプライマーとサンプル中の標的とのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、部分二本鎖プライマーなどのプライマーを検出可能な部分で標識する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォアまたは放射性同位元素を含む。標的は典型的には核酸である。いくつかの実施形態では、標的は一本鎖核酸である。いくつかの実施形態では、標的はDNAまたはRNAである。いくつかの実施形態では、標的は、反復配列、二次構造および/または高GC含量を含む核酸である。いくつかの実施形態では、標的は複数の異なる核酸に存在する。いくつかの実施形態では、標的は複数の異なる核酸中に単一コピーとしてまたは低コピーたとえば、0.001未満、0.01未満、0.1未満または1未満で存在する。いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法を相補体鎖-標的複合体の融解温度未満の温度で行う。いくつかの実施形態では、50°C以下、または40°C以下、または30°C以下の室温の間の温度で本方法および本明細書に記載の他の方法を行う。いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法を約37°Cにて行う。いくつかの実施形態では、本方法および本明細書に記載の他の方法は、保護体バランス領域および保護体分岐点移動領域を含み、かつ部分二本鎖プライマーの保護体鎖と同一である過剰の保護体鎖を用いて行う。本方法および本明細書に記載の他の方法では、プライマーは、部分二本鎖プライマーを含む前述のプライマーのいずれであってもよい。別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかの第1の相補体鎖の一本鎖標的特異的トーホールド領域を核酸標的とハイブリダイズし、それによりプライマーの第1の鎖をプライマーの第2の保護体鎖から解離させること、および第1の鎖をポリメラーゼの存在下で標的と相補的にその3’末端から伸長させることを含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、核酸標的、ポリメラーゼおよび前述の部分二本鎖プライマーの1つ以上の存在下で核酸合成反応を行うことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、核酸合成反応は核酸増幅反応である。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応PCRである。いくつかの実施形態では、核酸合成反応は転写反応である。いくつかの実施形態では、転写反応は逆転写反応である。いくつかの実施形態では、2つの部分二本鎖プライマーを使用する。別の態様では、本発明は、部分二本鎖プライマーを含む前述のプライマーのいずれかを使用して複数の特有の核酸分子を増幅させることを含む、マルチプレックスによる核酸増幅反応を行う方法を提供する。別の態様では、本発明は、前述の部分二本鎖プライマーのいずれかの1つ以上複数を含むと、酵素、ヌクレオチド、塩、EDTA、緩衝液等の1種以上の核酸合成試薬とを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、1種以上の核酸合成試薬は、緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キットは、プライマーに含まれる保護体鎖と同一である過剰の保護体鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。別の態様では、本発明は、第1の容器に第1の一本鎖相補体核酸、および第2の容器に、第1の一本鎖核酸の領域と相補的である第2の一本鎖保護体核酸を含み、第1および第2の一本鎖核酸が相互にハイブリダイズすると、第1の核酸による寄与により1二本鎖標的非特異的領域、2二本鎖標的特異的領域および3一本鎖標的特異的領域を含む部分二本鎖核酸が形成され、第1の一本鎖核酸は、非天然ヌクレオチドを含み、および/または第2の一本鎖核酸はその3’末端に非伸長性ヌクレオチドを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、上述したものなど1種以上の核酸合成試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、1種以上の核酸合成試薬は、緩衝液、ヌクレオチドおよびポリメラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、保護体鎖は、キット中の相補体鎖の量たとえば、モル量より多い量たとえば、モル量でキットに含まれる。前述の態様および発明のいくつかの実施形態、特に二本鎖のプライマーに関連するものでは、プライマーのヌクレオチド配列は、のように選択され、式中、ΔG°1は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、保護体バランス領域と標的核酸配列存在する場合に第1の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。一態様では、本明細書で提供されるのは、相補体鎖および保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は、第1の末端と、第2の末端と、第1の末端および第2の末端を有する第1の標的核酸配列と一致する配列とを有する保護体分岐点移動領域であり、保護体分岐点移動領域の第1の末端および第1の標的核酸配列の第1の末端はどちらも5’であるかまたはどちらも3’である保護体分岐点移動領域と;第1の標的核酸配列存在する場合の第1の末端に直接隣接する配列と一致しない配列を有する、保護体分岐点移動領域の第1の末端に直接隣接する保護体バランス領域とを有する核酸を含み;相補体プライマーは、第1の末端と、第2の末端と、保護体分岐点移動領域と相補的である配列とを有する相補体分岐点移動領域であり、相補体分岐点移動領域の第1の末端および第1の標的核酸配列の第1の末端は、どちらも5’であるかまたはどちらも3’である相補体分岐点移動領域と;相補体分岐点移動領域の第1の末端に直接隣接し;かつ第1の標的核酸配列の第2の末端に直接隣接する第2の標的核酸配列と相補的であるトーホールド領域と;相補体分岐点移動領域の第2の末端に直接隣接し;保護体バランス領域と相補的であり;かつ下記式のような配列を有する相補体バランス領域であって、式中、ΔG°1は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、保護体バランス領域と標的核酸配列存在する場合に第1の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである、相補体バランス領域とを有する核酸を含む、プライマーデュプレックスシステムである。別の態様では、本明細書で提供されるのは、保護体鎖、ヘアピン領域および相補体鎖を有する核酸を含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は保護体分岐点移動領域および保護体バランス領域を含み、保護体分岐点移動領域は第1の末端;第2の末端;ならびに第1の末端および第2の末端を有する第1の標的核酸配列と一致する配列を有し、保護体分岐点移動領域の第1の末端および第1の標的核酸配列の第1の末端は、どちらも5’であるかまたはどちらも3’であり;保護体バランス領域は、第1の末端;保護体分岐点移動領域の第1の末端に直接隣接する第2の末端;および第1の標的核酸配列存在する場合の第1の末端に直接隣接する配列と一致しない配列を有し;ヘアピン領域は、第1の末端;および保護体バランス領域の第1の末端に直接隣接する第2の末端を含み;相補体鎖は、相補体バランス領域、相補体分岐点移動領域、およびトーホールド領域を含み、相補体バランス領域は、第1の末端;ヘアピン領域の第1の末端に直接隣接する第2の末端;および保護体バランス領域と相補的である配列を有し;相補体分岐点移動領域は、第1の末端;相補体バランス領域の第1の末端に直接隣接する第2の末端;および保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有し、相補体分岐点移動領域の第1の末端および第1の標的核酸配列の第1の末端は、どちらも5’であるかまたはどちらも3’であり;トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域の第1の末端に直接隣接し;かつ第1の標的核酸配列の第2の末端に直接隣接する第2の標的核酸配列と相補的であり;相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し、式中、ΔG°1は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、保護体バランス領域と標的核酸配列存在する場合に第1の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり;cは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molである、プライマーデュプレックスシステムである。なお別の態様では、本明細書で提供されるのは、3’から5’方向に第1の保護体鎖、第1のヘアピン領域、相補体鎖、第2のヘアピン領域および第2の保護体鎖を有するシステムであって、第1の保護体鎖は、第1の標的核酸配列と一致する配列を有する第1の保護体分岐点移動領域;および第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する第1の保護体バランス領域を含み;第1のヘアピン領域は、第1の保護体バランス領域の5’に隣接し;相補体鎖は、第1のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第1の相補体バランス領域;第1の相補体バランス領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第1の相補体分岐点移動領域;第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域;トーホールド領域の5’に隣接し;かつ第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する第2の相補体分岐点移動領域;第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第2の相補体バランス領域を含み;第2のヘアピン領域は、第2の相補体バランス領域の5’に隣接し;第2の保護体鎖は、第2のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第2の保護体バランス領域;および第2の保護体バランス領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第2の保護体分岐点移動領域を含み;第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は第1のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;ΔG°7は第2のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり;cは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molである、システムである。さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、ヘアピンプライマーおよび保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、ヘアピンプライマーは、第1の標的核酸配列と一致する配列を有する第1の保護体分岐点移動領域;および第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する第1の保護体バランス領域を有する第1の保護体鎖と;第1の保護体バランス領域の5’に隣接したヘアピン領域と;第1のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第1の相補体バランス領域;第1の相補体バランス領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第1の相補体分岐点移動領域;第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域;トーホールド領域の5’に隣接し;かつ第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する第2の相補体分岐点移動領域;第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第2の相補体バランス領域を有する相補体鎖とを有する核酸を含み;保護体は、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第2の保護体バランス領域;および第2の保護体バランス領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第2の保護体分岐点移動領域を有する第2の保護体鎖を有する核酸を含み;第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである、プライマーデュプレックスシステムである。さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、保護体鎖およびヘアピンプライマーを含むプライマーデュプレックスシステムであって、保護体鎖は、第1の標的核酸配列と一致する配列を有する第1の保護体分岐点移動領域;および第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する第1の保護体バランス領域を有する第1の保護体鎖を有する核酸を含み;ヘアピンプライマーは、第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第1の相補体バランス領域;第1の相補体バランス領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第1の相補体分岐点移動領域;第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域;トーホールド領域の5’に隣接し;かつ第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する第2の相補体分岐点移動領域;第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第2の相補体バランス領域を有する相補体鎖;第2の相補体バランス領域の5’に隣接したヘアピン領域;および第2のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第2の保護体バランス領域;および第2の保護体バランス領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第2の保護体分岐点移動領域を有する第2の保護体鎖を有する核酸を含み;第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;およびΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;およびΔG°Rは3.5kcal/molである、プライマーデュプレックスシステムである。別の態様では、本明細書で提供されるのは、第1の保護体鎖、相補体鎖および第2の保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、第1の保護体鎖は、第1の標的核酸配列と一致する配列を有する第1の保護体分岐点移動領域;および第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する第1の保護体バランス領域を有する核酸を含み;相補体鎖は、第1のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する第1の相補体バランス領域;第1の相補体バランス領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第1の相補体分岐点移動領域;第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域;トーホールド領域の5’に隣接し;かつ第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する第2の相補体分岐点移動領域;第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する第2の相補体バランス領域を有する核酸を含み;第2の保護体鎖は、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する第2の保護体バランス領域;および第2の保護体バランス領域の5’に隣接し;かつ第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する第2の保護体分岐点移動領域を含み;第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;およびΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tは、プライマーデュプレックスシステムを使用する温度であり;cは、プライマーデュプレックスシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molであるプライマーデュプレックスシステムである。なお別の態様では、本明細書で提供されるのは、3’から5’方向に、第1の保護体鎖、第1のヘアピン領域、相補体鎖、第2のヘアピン領域および第2の保護体鎖を含むプライマーデュプレックスシステムであって、第1の保護体鎖は第1の標的核酸配列と一致する配列を有し;第1のヘアピン領域は第1の保護体鎖の5’に隣接し;相補体鎖は、第1のヘアピン領域の5’に隣接し;かつ第1の保護体鎖の配列と相補的である配列を有する第1の相補体分岐点移動領域;第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;かつ第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有するトーホールド領域;およびトーホールド領域の5’に隣接し;かつ第2の核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する第2の相補体分岐点移動領域を含み;第2のヘアピン領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し;第2の保護体鎖は、第2の相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有するプライマーデュプレックスシステムである。前述の態様のいずれか1つでは、ΔG°Rは、2.0kcal/mol、1.0kcal/molまたは0.5kcal/molであってもよく;および/またはcは約10nMであってもよく;および/またはTは約293Kまたは約338Kであってもよく;および/またはトーホールド領域は、4~20ヌクレオチド長、約4~15ヌクレオチド長または約4~10ヌクレオチド長であってもよく;および/または保護体分岐点移動領域の第1の末端は、5’または3’であってもよく;および/またはプライマーデュプレックスシステムは官能性を有する蛍光基または色素をさらに含んでもよく;および/またはプライマーデュプレックスシステムは固体支持体に固定化してもよく;および/またはヘアピン領域は20ヌクレオチド長以下または10ヌクレオチド長以下であってもよく;および/またはヘアピン領域の配列はポリアデノシン配列、ポリデオキシアデノシン配列、ポリ5’-メチルウリジン配列、ポリチミジン配列、ポリグアノシン配列、ポリデオキシグアノシン配列、ポリシチジン配列、ポリデオキシシチジン配列、ポリウリジン配列、およびポリデオキシウリジン配列からなる群から選択されてもよく;および/または第1の標的核酸配列および/または第2の標的核酸配列は、生物またはウイルスに天然に存在する配列であってもよく;および/または第1の標的核酸配列および/または第2の標的核酸配列は、マイクロRNAに天然に存在する配列であってもよい。一態様では、本明細書で提供されるのは、サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、本明細書に記載の実施形態のいずれか1つのプライマーデュプレックスシステムと標的核酸を接触させること;および標的核酸とプライマーデュプレックスシステムの少なくとも一部との複合体の形成を検出することを含む方法である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスシステムは、官能性を有する蛍光基または色素をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスシステムを固体支持体に固定化する。いくつかの実施形態では、接触は細胞内で起こる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸はマイクロRNAである。別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的核酸中に含まれる配列を増幅させる方法であって、標的核酸;本明細書に記載の実施形態のいずれか1つのプライマーデュプレックスシステム;および増幅反応を実施するための試薬を含む溶液を形成すること;および標的核酸中に含まれる配列が増幅されるような条件下で溶液をインキュベートすることを含む方法である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。前述ならびに本発明の他の態様および実施形態について、本明細書に詳細に説明する。プローブを用いた核酸アッセイの重要な課題は、標的の配列に類似した配列を有する核酸が、強い熱力学および速い反応速度kineticsで標的の相補体にハイブリダイズすることである。しかしながら、本明細書に記載するように、鎖置換反応の反応速度kineticsおよび熱力学が部分的に分離され得るため、ごくわずか熱力学的に有利であるか、または不利でさえある反応でも、2本の相補鎖のハイブリダイゼーションと同じ速さの反応速度kineticsを有することができる。本明細書に記載の組成物および方法は、この分離機構を利用して改善された特異性および反応速度kineticsを有する核酸プローブシステムを提供する。本明細書で提供されるのは、高度に特異的な核酸プローブシステム、およびこうしたプローブシステムの使用方法である。ある種の実施形態では、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、相補体プローブの一部と相補的な保護体領域により擬似標的とのハイブリダイゼーションを防止する、標的配列と相補的な領域を有する相補体プローブを含む。標的と保護されたプローブとの結合の自由エネルギーは、標的核酸配列またはその相補体と一致しない配列を有する1つ以上のバランシング領域の合理的に設計される塩基により精密に制御される。ある種の実施形態では、保護体および相補体プローブは、単一核酸分子上にいくつかの領域を形成し、1つ以上の核酸ヘアピンにより相互に隔てられる。本明細書に記載の方法および組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらを使用しやすくするいくつかの独特の特性を有する。第1に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、標的と擬似標的との間のわずかな配列の違いを、プローブと標的とのハイブリダイゼーションと、プローブと擬似標的とのハイブリダイゼーションとの間の結合親和性および反応速度における大きな違いに確実に変換する。第2に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは、広範囲に及ぶ温度および塩濃度のいずれでも作動するように設計することが可能であり、したがって多様な実験条件下で確実に機能することができる。第3に、本明細書に記載の核酸プローブシステムを使用すると、室温でも反応速度的にkinetically速いハイブリダイゼーション反応を起こすことができ、核酸の迅速でハイスループットな解析が容易になる。第4に、本明細書に記載の核酸プローブシステムは合理的に設計され、したがって他の生体分子と不都合にまたは予想外に相互作用するとは考えにくい。よって、本明細書で提供されるのは、プライマー組成物、そうした組成物の製造方法、およびその使用方法である。本明細書に記載の実施形態は、一部が二本鎖で一部が一本鎖であるプライマーたとえば、部分的にハイブリダイズしたプライマーの対、または単一の自己ハイブリダイズプライマーを、たとえば、核酸合成反応に使用すると、完全に相補的な標的と1つ以上のミスマッチを有する標的すなわち、擬似標的とを識別することができるという発見に一部基づく。本明細書に証明されたように、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、たとえば、類似反復配列を有する標的などの擬似標的を使用するPCR反応において標準的なプライマーより優れている。本明細書のプライマーデュプレックスは、プライマーデュプレックスが標的に対する結合を開始する、本明細書でトーホールドという一本鎖領域と、単一のプライマー鎖が標的とプライマーの全長に沿ってハイブリダイゼーションを完了しないように自然に解離する二本鎖バランス領域と、トーホールド領域とバランス領域との間に標的核酸配列と完全に相補的である二本鎖分岐点移動領域と、を含む。機構的には、標的とのハイブリダイゼーションは、トーホールドから始まり、プライマーがもはや二本鎖でなくなるまで相補体鎖の長さに沿って継続すると考えられる。これは、標的と分岐領域との間の相補性も想定している。本明細書で使用する場合、核酸領域またはドメインは、任意の長さの一続きのヌクレオチドの連続である。標的と相補体鎖との間にヌクレオチドのミスマッチが存在する場合、第2の鎖すなわち、保護体鎖の置換は熱力学的に不利であり、相補体鎖と標的との間の結合が消失する。この後者の説明では、標的は、相補体鎖と異なるヌクレオチドまたはミスマッチを含むことから、実際には擬似標的であることが理解されよう。標準自由エネルギーは、ミスマッチたとえば、単1ヌクレオチド変化よりもむしろ、核酸の標的配列と、プライマーの分岐点移動領域にトーホールド領域を加えた領域との間の完全な一致完全に相補的に有利に働くため、プライマーの第1の相補体鎖は、ミスマッチの非存在下では標的に安定に結合するが、ミスマッチの存在下では標的に安定に結合しない。プライマーの第1の相補体鎖と標的との間にミスマッチが存在する場合、プライマーデュプレックスは、新たに露出された一本鎖バランス領域により再編成することをより好む。こうして、標的中または、さらにはサンプル中の誤った位置で核酸合成反応が開始される頻度が低下する。こうした反応においてミスマッチのプライマー鎖が結合することをより好む競合核酸鎖保護体鎖などが存在しないため、この種の識別は典型的には、従来技術の標準的な一本鎖プライマーを使用しても不可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーは、従来のプライマーたとえば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR増幅に使用されるプライマーより著しく長くてもよい。本プライマーは、融解温度ではなく、特異性において競合する保護体鎖の存在に依存して相補配列とミスマッチ配列とを識別するためである。したがって、本プライマーは、温度非依存的な形で選択および使用してもよい。よって、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、たとえば核酸合成反応の特異性を高め、いくつかの実施形態では、プライマーのマルチプレックス化の程度を大きくすることができる。結果を本明細書に示した予備実験から、本明細書で提供されるプライマーデュプレックスを用いると、標準的なプライマーと比較して類似反復標的のPCRの収率を著しく向上させることができることが示されるたとえば、75対30。本明細書に記載のプライマーデュプレックスはまた、たとえば、ヒトDNAからなるサンプルから細菌DNAを検出および増幅するなど不均一な核酸群からの特定の核酸の検出および増幅にも対応し、生物兵器用病原体などの稀な生物の検出に対する適用性が広い。プライマーデュプレックス本明細書で使用する場合、本発明のプライマーは、本発明のプライマーが二本鎖領域を含む構造物として提供および/または存在してもよいこと伝えるため、プライマーデュプレックスと呼ぶ場合がある。したがって、プライマーおよびプライマーデュプレックスという用語は、同義で使われることがある。プライマーデュプレックスは、既存のプライマーより特異性および反応速度kineticsを向上させる。本明細書のプライマーデュプレックスとは、第1の鎖本明細書で相補体鎖というおよび第1の鎖と部分的に相補的な第2の鎖本明細書で保護体鎖というを含むプライマーをいう。いくつかの実施形態では、相補体鎖および保護体鎖は、別々の一本鎖核酸分子である図1Aおよび1B。他の実施形態では、相補体鎖および保護体鎖は相互に連結され、ヘアピン領域で隔てられ、単一核酸分子の連続する領域を形成する図2Aおよび2B。本明細書で使用する場合、ヘアピン領域は、核酸の2つの二本鎖領域を連結するヌクレオチドの一本鎖ループである。例示的なプライマーデュプレックスの一般的な構造は、各図に示し、本明細書に記載する。相補体領域または保護体領域またはその逆を参照すると、多くの場合、各領域が典型的には単一のプライマーデュプレックスまたは単一のプライマーシステム内にあることが理解されよう。たとえば、本発明のプライマーの相補体バランス領域は、同じプライマーの保護体バランス領域と相補的であるため、本発明のあるプライマー相補体バランス領域は、物理的に分離した別のプライマーの保護体バランス領域とハイブリダイズしない。本発明のプライマーが一本鎖のみからなる複数の実施形態では、相補体鎖を相補体領域という場合があり、保護体鎖を保護体領域という場合がある。ある種の実施形態では、相補体鎖または領域はトーホールド領域と、相補体分岐点移動領域と、相補体バランス領域とを含むのに対し、保護体鎖または領域は保護体分岐点移動領域と保護体バランス領域とを含む。本明細書で使用する場合、核酸領域は、任意の長さの一続きのヌクレオチドの連続である。トーホールド領域および分岐点移動領域は各々、標的核酸中の隣接領域と相補的であるように設計され、したがって標的核酸中の隣接領域と塩基対を形成するたとえば、ハイブリダイズする。標的核酸中の領域と塩基対を形成する相補体鎖の領域を標的特異的領域という。バランス領域は、標的核酸と相補的でないように設計され、したがって標的核酸と塩基対を形成しない。よって、バランス領域を標的非特異的領域という。ある態様では、相補体鎖または領域および保護体鎖または領域が相互にハイブリダイズする二本鎖であると、プライマーデュプレックスが形成される。このため、いくつかの態様では、プライマーデュプレックスは、標的特異的一本鎖トーホールド領域と、標的特異的二本鎖分岐点移動領域と、標的非特異的二本鎖バランス領域とを含む図1Aおよび1B。場合によっては、プライマーデュプレックスはまた、以下により詳細に記載するようにヘアピンループも含む。本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、標的核酸と特異的にハイブリダイズするように設計してもよい。たとえば、核酸増幅反応におけるプライマーの有効性は、プライマーの特異性、効率および忠実度に依存する。典型的な核酸プライマーは、多くの場合、ミスマッチのデュプレックスおよび完全にハイブリダイズしたデュプレックスの融解温度を除いて、その目的の特異的標的核酸と結合する同じプライマーの熱力学的および反応速度的kineticプロファイルと同程度の熱力学的および反応速度的kineticプロファイルで擬似標的に結合する。したがって、ミスマッチのデュプレックスと完全なデュプレックスとは、それらの融解温度により区別することができる。これに対し、本発明のプライマーは、相対的に温度非依存的に擬似標的と本当の標的とを区別する。本明細書の擬似標的とは、相補体鎖とハイブリダイズする領域内の少なくとも1つのヌクレオチドが標的核酸分子と異なる核酸分子をいう。たとえば、標的がである場合、は擬似標的である。ある種の実施形態では、擬似標的は、標的に対して少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ以上のヌクレオチド変化を含む。擬似標的に結合するプライマーは、たとえば、核酸増幅の忠実度正確性を低下させる。本明細書に示したプライマーデュプレックスは、擬似標的との鎖置換の標準自由エネルギーを変化させ、正しい標的と、正しい標的と1ヌクレオチドのみ異なる擬似標的を含む擬似標的との識別をできるように設計される。本明細書に記載するように、標準自由エネルギーを変化させて相補体鎖が正しい標的と擬似標的とを識別できるようにするには、保護体鎖が関わっている。本明細書に記載のプライマーは、鎖置換反応の反応速度kineticsおよび熱力学が部分的に分離するように反応速度kineticsおよび熱力学を微調整して鎖置換反応を容易にするように合理的に設計される。この分離の結果、反応がごくわずかに熱力学的に有利または不利であっても、反応は2つの相補鎖のハイブリダイゼーションと同じ速さの反応速度kineticsを有する。たとえば、プライマーと完全に相補的な正しいまたは特異的な標的すなわち、100一致のヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーは、37°Cおよび1MのNaで擬似標的が目的の標的と異なるヌクレオチドごとに、同じプライマーと擬似標的とのハイブリダイゼーションの濃度調整標準自由エネルギーより1.9kcal/mol~6.6kcal/mol有利である。ある種の実施形態では、本プライマーデュプレックスは、トーホールド交換の鎖置換反応を使用してこの濃度調整標準自由エネルギーの1.9~6.6kcal/molの差を標的と擬似標的との最適な識別に置き換える。標的核酸に結合するプライマーデュプレックスの熱力学/反応速度kineticsの例を、図3Aおよび3Bを参照しながら以下の通り記載する。この例では、標的核酸は、少なくとも2つの領域1および2を有する。ある種の実施形態では、領域1は、約10~約20014~200または20~200などヌクレオチド長であってもよく、一方、領域2はより短く、たとえば、約4~約20ヌクレオチド長であってもよい。本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよび塩基という用語は、同義で使われる。保護体鎖は、保護体バランス領域3に隣接する保護体分岐点移動領域を含む。保護体分岐点移動領域は標的領域1と一致するのに対し、保護体バランス領域3は、領域1または領域2または標的領域の5’に隣接した任意の領域と一致しない。核酸配列、ドメインまたは領域と、もう1つの配列とが同じ核酸分子の一部であり、かつ塩基が2つの配列を隔てない場合、核酸配列、ドメインまたは領域は、もう1つの配列に直接隣接する、もう1つの配列の5’に隣接する、または3’に隣接する。相補体鎖は、相補体バランス領域と、相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域とを含む。相補体バランス領域は、保護体バランス領域3と相補的であり、相補体分岐点移動領域は、保護体分岐点移動領域および標的領域1と相補的であるすなわち、保護体分岐点移動領域および標的領域1は配列が同一であり、この2つはどちらも相補体分岐点移動領域に結合し、トーホールド領域は標的領域2と相補的である。ある種の実施形態では、バランス領域は、その濃度調整標準自由エネルギーが、標的領域2に結合するトーホールド領域の濃度調整標準自由エネルギーと同じまたはほぼ同じになるように設計される。場合によっては、37°Cの反応に使用する10ナノモルnMのプライマーの場合、縦棒は絶対値を示すは各々、標的からの全保護体鎖の解離を確実なものにするため約11.3kcal/mol未満にすべきである。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスが特異的正しい標的核酸分子と相互作用する場合図3A、の解離およびの結合は相互に釣り合っており、ハイブリダイゼーションの熱力学は、相補体鎖と相互作用している標的核酸、および相補体鎖と相互作用している保護体鎖と同一である。2つの状態間の全自由エネルギー変化は、比較的に小さくたとえば、約1kcal/mol、反応は速やかにたとえば、1分未満で約50:50の平衡状態に到達する。ある種の実施形態では、バランス領域は、平衡状態のバランスが、たとえば、60:40または70:30になるように、標的領域2に結合するトーホールド領域に非常近い標準自由エネルギーを有するように設計してもよい。いくつかの実施形態では、バランス領域の設計は、反応中の自由エネルギー変化の他の寄与因子、たとえば保護体バランス領域と上流標的配列とのハイブリダイゼーション場合によっては無視し得る、ヘアピンの保持存在する場合、使用予定の温度および予定のプライマー濃度をさらに考慮に入れてもよい。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスが代わりに擬似標的核酸分子と相互作用する場合図3B、擬似標的領域2mがトーホールド領域と完全には相補的でないため、の解離および2m:2の結合は釣り合わない。その結果、平衡状態はプライマーデュプレックスが擬似標的に結合しない状態に移動する。別の方法で説明すると、場合によっては、保護体鎖に結合した相補体鎖の自由エネルギーはであり任意選択のヘアピン領域および他の考慮すべき事項からの寄与を無視、これは特異的標的に結合した相補体鎖の自由エネルギーと釣り合う。この例では、その理由は、プライマーデュプレックスのバランス領域3が、標的領域2と等しいまたはほぼ等しい濃度調整標準自由エネルギーを有するように設計されているからである。プライマーデュプレックスが標的領域2m内に1ヌクレオチド塩基変化を有する擬似標的と相互作用すると、システムの自由エネルギーは、プライマーデュプレックスの自由エネルギーより負に小さくなり、したがって平衡状態において不利になる。本明細書で使用する場合、標準自由エネルギーに関する~とほぼ等しいという用語は、第1に言及した自由エネルギーが第2に言及した自由エネルギーの10以内であることを意味する。いくつかの実施形態では、第2の自由エネルギーとほぼ等しい第1の自由エネルギーは、第2の自由エネルギーの約3kcal/mol~約-3kcal/mol以内である。いくつかの実施形態では、第1の真のエネルギーと第2の真のエネルギーとの差は、約1kcal/mol以下、約2kcal/mol以下、または約3kcal/mol以下、約3.5kcal/mol以下、またはそれ以上であってもよいことが理解されよう。図3Bは、標的核酸分子の領域2/2mに対応する単1ヌクレオチド変化を図示するものであるが、本プライマーデュプレックスはまた、特異的標的と領域1にヌクレオチド変化を有する擬似標的とを識別することもできる。擬似標的が標的領域1に単1塩基変化を有する場合、結合後のプライマーデュプレックスの標準自由エネルギーは、となり、は、プライマーデュプレックスの相補体領域結合に結合するミスマッチの標的領域1の標準自由エネルギーである。1塩基変化により、プライマーデュプレックスの自由エネルギーは、保護体に結合した相補体プライマーの自由エネルギーより負に小さくなるため、平衡状態は、プライマーデュプレックスが擬似標的領域に結合しない状態に移動する。標準自由エネルギーは、当該技術分野における知識および本明細書で提供される教示内容に基づき理論的に算出することができる。相補体鎖、領域またはドメインおよび保護体鎖、領域またはドメイン本明細書に記載の核酸プローブシステムの相補体ドメインは各々、トーホールド領域および1つ以上の相補体標的領域など複数の領域を含む。トーホールド領域および1つ以上の相補体標的領域はどちらも、標的核酸の核酸配列と相補的である核酸配列を有する。したがってトーホールド領域および相補体標的領域は、核酸プローブシステムが適切なハイブリダイゼーション条件下、標的核酸と接触すると、標的核酸の配列と塩基対を形成し、よって複合体を形成することができる。相補体ドメインはまた、1つ以上の相補体バランス領域も含む。1つ以上の相補体バランス領域は、合理的に設計される。このため、1つ以上の相補体バランス領域の配列は、標的核酸配列と相補的であるように設計されない。トーホールド領域は、標的核酸分子内の配列と相補的であるしたがってハイブリダイズする一方、トーホールド領域は、保護体鎖にハイブリダイズしない。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、トーホールド領域も標的核酸分子にハイブリダイズするが、相補体鎖が保護体鎖にハイブリダイズすると、トーホールド領域は一本鎖のままである。トーホールド領域は、相補体鎖の3’末端に配置しても、または5’末端に配置してもよいたとえば、トーホールド領域は、相補体鎖の3’末端または5’末端の伸長部である。ある種の実施形態では、トーホールド領域は、約4ヌクレオチド長から約20ヌクレオチド長、約4ヌクレオチド長から約15ヌクレオチド長、または約4ヌクレオチド長から約10ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、トーホールド領域は、4ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長または20ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、トーホールド領域は、20ヌクレオチド長より大きく、たとえば約25ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、50ヌクレオチド、55ヌクレオチド、60ヌクレオチド、65ヌクレオチド、70ヌクレオチド、75ヌクレオチド、80ヌクレオチド、85ヌクレオチド、90ヌクレオチド、95ヌクレオチド、100以上のヌクレオチドである。相補体分岐点移動領域は、標的核酸分子および保護体分岐点移動領域の配列と相補的である。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、相補体分岐点移動領域も標的核酸にハイブリダイズする。相補体鎖がその保護体鎖にハイブリダイズすると、相補体分岐点移動領域は保護体分岐点移動領域にハイブリダイズする。ある種の実施形態では、分岐点移動領域は、200ヌクレオチド長以下、100ヌクレオチド長以下、75ヌクレオチド長以下、50ヌクレオチド長以下、40ヌクレオチド長以下、30ヌクレオチド長以下、25ヌクレオチド長以下または20ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、分岐点移動領域は約10ヌクレオチド長から約200ヌクレオチド長である。ある種の実施形態では、分岐点移動領域は、約10ヌクレオチド長から約150ヌクレオチド、約10ヌクレオチド長から約100ヌクレオチド、または約10ヌクレオチド長から約50ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、分岐点移動領域は、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長、27ヌクレオチド長、28ヌクレオチド長、29ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長、31ヌクレオチド長、32ヌクレオチド長、33ヌクレオチド長、34ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、36ヌクレオチド長、37ヌクレオチド長、38ヌクレオチド長、39ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、41ヌクレオチド長、42ヌクレオチド長、43ヌクレオチド長、44ヌクレオチド長、45ヌクレオチド長、46ヌクレオチド長、47ヌクレオチド長、48ヌクレオチド長、49ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長、51ヌクレオチド長、52ヌクレオチド長、53ヌクレオチド長、54ヌクレオチド長、55ヌクレオチド長、56ヌクレオチド長、57ヌクレオチド長、58ヌクレオチド長、59ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長、61ヌクレオチド長、62ヌクレオチド長、63ヌクレオチド長、64ヌクレオチド長、65ヌクレオチド長、66ヌクレオチド長、67ヌクレオチド長、68ヌクレオチド長、69ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長、71ヌクレオチド長、72ヌクレオチド長、73ヌクレオチド長、74ヌクレオチド長、75ヌクレオチド長、76ヌクレオチド長、77ヌクレオチド長、78ヌクレオチド長、79ヌクレオチド長、80ヌクレオチド長、81ヌクレオチド長、82ヌクレオチド長、83ヌクレオチド長、84ヌクレオチド長、85ヌクレオチド長、86ヌクレオチド長、87ヌクレオチド長、88ヌクレオチド長、89ヌクレオチド長、90ヌクレオチド長、91ヌクレオチド長、92ヌクレオチド長、93ヌクレオチド長、94ヌクレオチド長、95ヌクレオチド長、96ヌクレオチド長、97ヌクレオチド長、98ヌクレオチド長、99ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、101ヌクレオチド長、102ヌクレオチド長、103ヌクレオチド長、104ヌクレオチド長、105ヌクレオチド長、106ヌクレオチド長、107ヌクレオチド長、108ヌクレオチド長、109ヌクレオチド長、110ヌクレオチド長、111ヌクレオチド長、112ヌクレオチド長、113ヌクレオチド長、114ヌクレオチド長、115ヌクレオチド長、116ヌクレオチド長、117ヌクレオチド長、118ヌクレオチド長、119ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長、121ヌクレオチド長、122ヌクレオチド長、123ヌクレオチド長、124ヌクレオチド長、125ヌクレオチド長、126ヌクレオチド長、127ヌクレオチド長、128ヌクレオチド長、129ヌクレオチド長、130ヌクレオチド長、131ヌクレオチド長、132ヌクレオチド長、133ヌクレオチド長、134ヌクレオチド長、135ヌクレオチド長、136ヌクレオチド長、137ヌクレオチド長、138ヌクレオチド長、139ヌクレオチド長、140ヌクレオチド長、141ヌクレオチド長、142ヌクレオチド長、143ヌクレオチド長、144ヌクレオチド長、145ヌクレオチド長、146ヌクレオチド長、147ヌクレオチド長、148ヌクレオチド長、149ヌクレオチド長、150ヌクレオチド長、151ヌクレオチド長、152ヌクレオチド長、153ヌクレオチド長、154ヌクレオチド長、155ヌクレオチド長、156ヌクレオチド長、157ヌクレオチド長、158ヌクレオチド長、159ヌクレオチド長、160ヌクレオチド長、161ヌクレオチド長、162ヌクレオチド長、163ヌクレオチド長、164ヌクレオチド長、165ヌクレオチド長、166ヌクレオチド長、167ヌクレオチド長、168ヌクレオチド長、169ヌクレオチド長、170ヌクレオチド長、171ヌクレオチド長、172ヌクレオチド長、173ヌクレオチド長、174ヌクレオチド長、175ヌクレオチド長、176ヌクレオチド長、177ヌクレオチド長、178ヌクレオチド長、179ヌクレオチド長、180ヌクレオチド長、181ヌクレオチド長、182ヌクレオチド長、183ヌクレオチド長、184ヌクレオチド長、185ヌクレオチド長、186ヌクレオチド長、187ヌクレオチド長、188ヌクレオチド長、189ヌクレオチド長、190ヌクレオチド長、191ヌクレオチド長、192ヌクレオチド長、193ヌクレオチド長、194ヌクレオチド長、195ヌクレオチド長、196ヌクレオチド長、197ヌクレオチド長、198ヌクレオチド長、199ヌクレオチド長または200ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、分岐点移動領域は、目的の標的核酸分子に応じて200ヌクレオチド長を超えてもよい。相補体鎖および保護体鎖のバランス領域は、相互に相補的であるすなわち、二本鎖核酸を形成するが、目的の標的と相補的ではないすなわち、どちらも標的と二本鎖核酸を形成しない。このため、相補体鎖が標的核酸分子にハイブリダイズすると、相補体バランス領域は、標的核酸分子にハイブリダイズしない。相補体鎖がその保護体鎖にハイブリダイズすると、相補体バランス領域は保護体バランス領域にハイブリダイズする。バランス領域の設計は、トーホールド領域の設計により決まる。いくつかの実施形態では、バランス領域は、バランス領域の熱力学的プロファイルがトーホールド領域のそれと同程度であるように設計される。いくつかの実施形態では、熱力学的プロファイルは、たとえば、RPIのbioinfoウェブサイトで入手可能なソフトウェアMfoldを使用した理論的モデルに基づく。バランス領域内のヌクレオチドの数および/または性質は、トーホールド領域のそれと同様である。たとえば、トーホールド領域が40AおよびTヌクレオチドと、60GおよびCヌクレオチドとからなる場合、バランス領域も、40AおよびTヌクレオチドと、60GおよびCヌクレオチドとからなるべきである。複数の実施形態では、バランス領域は、標的核酸へのバランス領域の結合を回避するため、3つまでの連続したヌクレオチドが標的核酸の配列と相補的でないように設計される。いくつかの実施形態では、バランス領域の長さは、相補体および保護体が相互に自然に解離するように十分に短い。いくつかの実施形態では、バランス領域は、約4ヌクレオチド長から約20ヌクレオチド長、約4ヌクレオチド長から約15ヌクレオチド長、または約4ヌクレオチド長から約10ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バランス領域は、4ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長、6ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長または20ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バランス領域は、たとえば約25未満のヌクレオチド、30未満のヌクレオチド、35未満のヌクレオチド、40未満のヌクレオチド、45未満のヌクレオチド、50未満のヌクレオチド、55未満のヌクレオチド、60未満のヌクレオチド、65未満のヌクレオチド、70未満のヌクレオチド、75未満のヌクレオチド、80未満のヌクレオチド、85未満のヌクレオチド、90未満のヌクレオチド、95未満のヌクレオチド、100以上未満のヌクレオチドなど20ヌクレオチドより大きい。いくつかの実施形態では、バランス領域が標的核酸に結合しないのであれば、標的核酸中のヌクレオチド配列と相補的である連続したヌクレオチドの数は、3より大きくてもよい。いくつかの実施形態、たとえばプライマーデュプレックスが2つの別々の核酸鎖を含む実施形態では、バランス領域の設計は、プライマーデュプレックスの濃度またはプライマーデュプレックスが形成/使用される温度に左右されない。いくつかの実施形態では、バランス領域は、保護体鎖が、標的核酸分子により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーは、0kcal/molに近くなるように設計される。本明細書で使用する場合、ゼロに近いとは、反応の標準自由エネルギーが0kcal/molから3.5kcal/molの範囲内であることを意味する。ある種の実施形態では、この置換反応の標準自由エネルギーは、0kcal/molから3.5kcal/mol、3.0kcal/mol、2.5kcal/mol、2.0kcal/mol、0.9kcal/mol、0.8kcal/mol、0.7kcal/mol、0.6kcal/mol、0.5kcal/mol、0.4kcal/mol、0.3kcal/mol、0.2kcal/mol、または0.1kcal/molの範囲内である。他の実施形態、たとえばプライマーデュプレックスが単一核酸分子たとえば、相補体鎖または領域またはドメインと保護体鎖または領域またはドメインとを隔てるヘアピン領域により形成される実施形態では、バランス領域の設計は、プライマーデュプレックスの濃度および反応温度に左右される。そうした実施形態では、バランス領域は、保護体鎖が標的核酸により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーにRTlncを加えた値が0kcal/molに近くなるように設計され、式中、Rは一般気体定数0.001985877534kcal/molK、Tはプライマーデュプレックスを使用する温度、cはプライマーデュプレックスを使用する濃度である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスを使用する温度は約273K0°C、277K、283K、288K、293K、298K、303K、308K、313K、318K、323K、328K、333K、338K、343K、348K、353K、358Kまたは363K90°Cである。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスを使用する濃度cは、約1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、。40nM、45nM、。50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、125nM、150nM、175nM、200nM、225nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nMまたは1μMである。ある種の実施形態では、この置換反応の標準自由エネルギーにRTlncを加えた値は、0kcal/molから3.5kcal/mol、3.0kcal/mol、2.5kcal/mol、2.0kcal/mol、0.9kcal/mol、0.8kcal/mol、0.7kcal/mol、0.6kcal/mol、0.5kcal/mol、0.4kcal/mol、0.3kcal/mol、0.2kcal/molまたは0.1kcal/molの範囲内である。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスは、相補体鎖を保護体鎖に連結する1つ以上のヘアピン領域を含んでもよい。ある種の実施形態では、プライマーデュプレックスのヘアピン領域は、どのような長さであってもよい。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、30ヌクレオチド長超、25ヌクレオチド長超、20ヌクレオチド長超、19ヌクレオチド長超、18ヌクレオチド長超、17ヌクレオチド長超、16ヌクレオチド長超、15ヌクレオチド長超、14ヌクレオチド長超、13ヌクレオチド長超、12ヌクレオチド長超、11ヌクレオチド長超、10ヌクレオチド長超、9ヌクレオチド長超、8ヌクレオチド長超、7ヌクレオチド長超、6ヌクレオチド長超、5ヌクレオチド長超、4ヌクレオチド長超または3ヌクレオチド長超である。いくつかの実施形態では、ヘアピンの配列は、標的核酸分子の配列と相補的でない。ある種の実施形態では、ヘアピン領域は、ポリモノヌクレオチド配列、たとえばポリアデノシン配列、ポリデオキシアデノシン配列、ポリ5’-メチルウリジン配列、ポリチミジン配列、ポリグアノシン配列、ポリデオキシグアノシン配列、ポリシチジン配列、ポリデオキシシチジン配列、ポリウリジン配列またはポリデオキシウリジン配列を有する。本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、少なくとも2つの配向の1つであってもよい。たとえば、ある配向では、トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する5’末端に位置しすなわち、2つの領域の間に介在するヌクレオチドが存在しない、相補体バランス領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接し、3’末端に位置する。この配向では、保護体バランス領域は、保護体分岐点移動領域に直接隣接し、保護体鎖の5’末端にある図1A。もう1つの配向では、トーホールド領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する3’末端に位置し、相補体バランス領域は、相補体分岐点移動領域に直接隣接する5’末端に位置する。この配向では、保護体バランス領域は、保護体分岐点移動領域に直接隣接し、保護体鎖の3’末端に位置する図1B。相補体バランス領域の配列は配向に関係なく、下記式のようになり:式中、ΔG°1は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、保護体バランス領域と標的核酸配列存在する場合に第1の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。いくつかの実施形態では、プライマーデュプレックスは、保護体より長い相補体鎖を含み、長さの差は、相補体鎖のトーホールド領域の長さによって異なる。プライマーの長さは、相補体と目的の標的とのハイブリダイゼーションがゼロに近い標準自由エネルギーΔG°を有するように設計される。保護体鎖のプライマーデュプレックスからの遊離は、このハイブリダイゼーション反応において、エントロピー的に中立であり、濃度の影響を受けにくいようにする。その結果、いくつかの実施形態では、室温たとえば、約25°Cまたは約298Kでのこの反応は、多くの条件において融解温度付近で達成されるハイブリダイゼーションの特異性と同等である。本明細書に意図するように、ゼロに近いΔG°標準自由エネルギーの変化とは、約1kcal/mol以下、約2kcal/mol以下、約3kcal/mol以下、約3.5kcal/mol以下の絶対値量をいう。いくつかの実施形態では、バランス領域またはトーホールド領域の標準自由エネルギーが>-1kcal/mol~<1kcal/mol、>-3kcal/mol~<3kcal/molまたは>-3.5kcal/mol~<3.5kcal/molである。プライマーデュプレックスは、保護体鎖と相補体鎖との比率約2:1~約5:1で調製してもよい。いくつかの実施形態では、保護体鎖と相補体鎖との比率は約2:1、約3:1、約4:1または約5:1である。いくつかの実施形態では、保護体鎖と相補体鎖との比率は2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1または5:1である。プライマーデュプレックスはまた、本明細書に記載のアッセイまたは反応のいずれで過剰の保護体鎖と共に使用してもよい。保護体鎖は、プライマーに対して約2倍以上のモル過剰、約5倍以上のモル過剰、約10倍以上のモル過剰、約20倍以上のモル過剰、約50倍以上のモル過剰、約100倍以上のモル過剰または約500倍以上のモル過剰であってもよい。ヘアピンプライマーデュプレックスシステムたとえば、一本鎖システムある種の実施形態では、プライマーデュプレックスは、相補体領域またはドメインと、ヘアピン領域と、保護体領域またはドメインとを含む単一の核酸を含む。いくつかの実施形態では、相補体ドメインは、保護体ドメインにハイブリダイズして、その間にヘアピンループ領域を有するプライマーデュプレックスを形成する。本明細書に開示した他のプライマーシステムと同様、こうしたヘアピンプライマーシステムは、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズするように設計される。本明細書のヘアピンプライマーデュプレックスシステムまたはヘアピンシステムは、相補体バランス領域と、相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、保護体バランス領域と、保護体分岐点移動領域とを含む。上記のように、相補体バランス領域は保護体バランス領域と相補的であり;相補体分岐点移動領域は保護体分岐点移動領域および標的核酸領域と相補的であり;トーホールド領域は標的核酸領域と相補的である。保護体分岐点移動領域は標的核酸領域と一致し、かつ相補体分岐点移動領域と相補的である。本明細書に記載のヘアピンプライマーデュプレックスシステムは単一核酸分子により形成され、相補体バランス領域の設計は、本明細書に記載するように、プライマーシステムを使用する温度および濃度によって決定される。標的核酸分子の配列を用いてプライマーシステムの特徴を説明してもよいが、いくつかの実施形態では、標的核酸自体がプライマーシステムの成分である場合もあれば、そうでない場合もあるたとえば、二本鎖システムである場合、あるいは一本鎖システムである場合ことが理解されよう。ヘアピン領域を有するプライマーデュプレックスの場合、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーは、保護体鎖が、標的核酸により相補体鎖から除去される反応の標準自由エネルギーを決定するときに考慮してもよい。様々な大きさのヘアピンのヘアピン保持の標準自由エネルギーを表1に示すSantaLuciaandHicks,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,33:414-440,2004から。表1に示していない長さたとえば、nの長さを有するヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーは、以下の式を用いて推計することができる:ΔG°ループ-n=ΔG°ループ-x2.44RTlnn/x式中、ΔG°ループ-nは、長さnのヌクレオチドのヘアピン領域の保持の未知の標準自由エネルギーであり、ΔG°ループ-xは、長さnのヌクレオチドのヘアピン領域の保持の既知の標準自由エネルギーたとえば、表1に示したものであり、Rは理想気体定数であり、Tは、プライマーデュプレックスを使用する温度である。ヘアピン領域保持の標準自由エネルギーの算出に関する追加情報は、その全体を本明細書に援用するSantaLuciaandHicks,id.に記載されている。本明細書に記載のヘアピンプライマーデュプレックスシステムは、少なくとも2つの配向の1つであってもよい。たとえば、図2Aに示した1つの配向では、トーホールド領域は、核酸分子の5’末端に位置する。相補体分岐点移動領域の5’末端はトーホールド領域の3’末端に直接隣接し;相補体バランス領域の5’末端は相補体分岐点移動領域の3’末端に直接隣接し;ヘアピン領域の5’末端は相補体バランス領域の3’末端に直接隣接し;保護体バランス領域の5’末端はヘアピン領域の3’末端に直接隣接し;保護体分岐点移動領域の5’末端は保護体バランス領域の3’末端に直接隣接する。この配向では、核酸分子がアニーリングを可能にする条件に付されると、ヘアピン領域が、相補体バランス領域および保護体バランス領域から延在するループを形成する。図2Bに示したもう1つの配向では、トーホールド領域は、核酸分子の3’末端に位置する。相補体分岐点移動領域の3’末端はトーホールド領域の5’末端に直接隣接し;相補体バランス領域の3’末端は相補体分岐点移動領域の5’末端に直接隣接し;ヘアピン領域の3’末端は相補体バランス領域の5’末端に直接隣接し;保護体バランス領域の3’末端はヘアピン領域の5’末端に直接隣接し;保護体分岐点移動領域の3’末端は保護体バランス領域の5’末端に直接隣接する。配向に関係なく、ヘアピンプライマーデュプレックスシステムの相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、保護体バランス領域と相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、保護体バランス領域と標的核酸配列存在する場合に第1の方向で直接隣接する配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tはプライマーシステムを使用する温度であり;cはプライマーシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。他のプライマーシステム他のプライマーシステムを図4~7に図示する。これらのプライマーシステムは各々、1つの相補体ドメインおよび2つの保護体ドメインを含む。相補体ドメインは、2つの相補体分岐点移動領域および2つの相補体バランス領域に挟まれた1つのトーホールド領域を有する。保護体ドメインは各々、相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有する保護体分岐点移動領域と、相補体バランス領域の1つの配列と相補的である配列を有する保護体バランス領域とを含む。図4~7のプライマーシステムの相違は、ヘアピン領域の数および位置であり、それがまた相補体バランス領域の設計に影響を与える。本明細書に開示された他のプライマーシステムと同様、これらのプライマーシステムは、標的核酸に特異的にハイブリダイズするように設計される。標的核酸の配列を用いてプライマーシステムの特徴を説明しているが、いくつかの実施形態では、標的核酸はプライマーシステムの成分ではない。図4に図示するように、プライマーシステムは、3’から5’方向に第1の保護体ドメイン、第1のヘアピン領域、相補体ドメイン、第2のヘアピン領域および第2の保護体ドメインを有してもよい。そうした実施形態では、第1の保護体ドメインは、第1の保護体分岐点移動領域および第1の保護体バランス領域を含む。第1の保護体分岐点移動領域は第1の標的核酸配列と一致する配列を有する。第1の保護体バランス領域は第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する。この実施形態では、第1のヘアピン領域は、第1の保護体バランス領域の5’に隣接している。こうした標的核酸の相補体ドメインは、第1の相補体バランス領域と、第1の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第2の相補体分岐点移動領域と、第2の相補体バランス領域とを含む。第1の相補体バランス領域は第1のヘアピン領域の5’に隣接し、第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第1の相補体分岐点移動領域は第1の相補体バランス領域の5’に隣接し、第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の5’に隣接し、標的核酸の第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体バランス領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。そうした実施形態では、第2のヘアピン領域は、第2の相補体バランス領域の5’に隣接している。この実施形態では、第2の保護体ドメインは、第2の保護体バランス領域および第2の保護体分岐点移動領域を含む。第2の保護体バランス領域は第2のヘアピン領域の5’に隣接し、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第2の保護体分岐点移動領域は、第2の保護体バランス領域の5’に隣接し、第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。この実施形態によれば、第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は第1のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;ΔG°7は第2のヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tはプライマーシステムを使用する温度であり;cはプライマーシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。図5に図示したように、ある種の実施形態では、プライマーシステムはヘアピンプライマーおよび保護体を有してもよく、ヘアピンプライマーは第1の保護体ドメインと、第1のヘアピン領域と、相補体ドメインとを含み、保護体は第2の保護体ドメインを含む核酸である。そうした実施形態では、第1の保護体ドメインは、第1の保護体分岐点移動領域および第1の保護体バランス領域を含む。第1の保護体分岐点移動領域は第1の標的核酸配列と一致する配列を有する。第1の保護体バランス領域は第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する。この実施形態では、ヘアピン領域は第1の保護体バランス領域の5’に隣接する。こうした標的核酸の相補体ドメインは、第1の相補体バランス領域と、第1の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第2の相補体分岐点移動領域と、第2の相補体バランス領域とを含む。第1の相補体バランス領域はヘアピン領域の5’に隣接し、第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第1の相補体分岐点移動領域は第1の相補体バランス領域の5’に隣接し、第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の5’に隣接し、標的核酸の第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体バランス領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。この実施形態では、第2の保護体ドメインは第2の保護体バランス領域および第2の保護体分岐点移動領域を含む。第2の保護体バランス領域は、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第2の保護体分岐点移動領域は、第2の保護体バランス領域の5’に隣接し、第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。この実施形態によれば、第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。図6に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは保護体およびヘアピンプライマーを有してもよく、保護体は第1の保護体ドメインを含む核酸であり、ヘアピンプライマーは、相補体ドメインとヘアピン領域と第2の保護体ドメインとを含む核酸である。そうした実施形態では、第1の保護体ドメインは第1の保護体分岐点移動領域および第1の保護体バランス領域を含む。第1の保護体分岐点移動領域は第1の標的核酸配列と一致する配列を有する。第1の保護体バランス領域は第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する。こうした標的核酸の相補体ドメインは、第1の相補体バランス領域と、第1の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第2の相補体分岐点移動領域と、第2の相補体バランス領域とを含む。第1の相補体バランス領域は、第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第1の相補体分岐点移動領域は第1の相補体バランス領域の5’に隣接し、第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の5’に隣接し、標的核酸の第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体バランス領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。こうした実施形態によれば、ヘアピン領域は第2の相補体バランス領域の5’に隣接する。この実施形態では、第2の保護体ドメインは第2の保護体バランス領域および第2の保護体分岐点移動領域を含む。第2の保護体バランス領域はヘアピン領域の5’に隣接し、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第2の保護体分岐点移動領域は、第2の保護体バランス領域の5’に隣接し、第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。この実施形態によれば、第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°6は、ヘアピン領域の保持の標準自由エネルギーであり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。図7に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは第1の保護体と、相補体プライマーと、第2の保護体とを有してもよく、第1の保護体は第1の保護体ドメインを含む核酸であり、相補体プライマーは相補体ドメインを含む核酸であり、第2の保護体は、第2の保護体ドメインを含む核酸である。そうした実施形態では、第1の保護体ドメインは第1の保護体分岐点移動領域および第1の保護体バランス領域を含む。第1の保護体分岐点移動領域は、第1の標的核酸配列と一致する配列を有する。第1の保護体バランス領域は第1の保護体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列と一致しない配列を有する。こうした標的核酸の相補体ドメインは、第1の相補体バランス領域と、第1の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第2の相補体分岐点移動領域と、第2の相補体バランス領域とを含む。第1の相補体バランス領域は、第1の保護体バランス領域の配列と相補的である配列を有する。第1の相補体分岐点移動領域は第1の相補体バランス領域の5’に隣接し、第1の保護体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。トーホールド領域は第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の5’に隣接し、標的核酸の第2の標的核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的である配列を有する。第2の相補体バランス領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸の第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列と相補的でない配列を有する。この実施形態では、第2の保護体ドメインは第2の保護体バランス領域および第2の保護体分岐点移動領域を含む。第2の保護体バランス領域は、第2の相補体バランス領域と相補的である配列を有する。第2の保護体分岐点移動領域は、第2の保護体バランス領域の5’に隣接し、第2の相補体分岐点移動領域と相補的である配列を有する。この実施形態によれば、第1の相補体バランス領域および第2の相補体バランス領域は、下記式のような配列を有し:式中、ΔG°1は、第1の保護体バランス領域と第1の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°2は、第1の相補体バランス領域と第1の標的核酸配列存在する場合の5’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°3は、第2の保護体バランス領域と第2の相補体バランス領域とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°4は、第2の相補体バランス領域と第3の標的核酸配列存在する場合の3’に隣接した配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;ΔG°5は、トーホールド領域と第2の標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの標準自由エネルギーであり;Rは理想気体定数であり;Tはプライマーシステムを使用する温度であり;cはプライマーシステムを使用する濃度であり;ΔG°Rは3.5kcal/molである。バランスドメインを欠いたプライマーデュプレックスシステムいくつかの実施形態では、プライマーシステムはバランスドメインを欠いていてもよい。こうした核酸は、標的核酸がプライマーシステムのトーホールド領域の配列と相補的な配列を有する場合、速い反応速度kineticsで標的核酸とハイブリダイズするが、標的核酸が変異していてプライマーシステムのトーホールド領域と相補的な配列を含まない場合、遅い反応速度kineticsでハイブリダイズする。したがって、こうしたプライマーシステムは、たとえば、反応速度的kinetic識別を用いて核酸標的の相違および/または突然変異を探し出すのに有用である。図8に図示するように、ある種の実施形態では、プライマーシステムは、3’から5’方向に第1の保護体ドメインと、第1のヘアピン領域と、相補体ドメインと、第2のヘアピン領域と、第2の保護体ドメインとを有する核酸を含んでもよい。こうしたプライマーシステムの第1の保護体ドメインは第1の標的核酸配列と一致する配列を有する。第1のヘアピン領域は第1の保護体ドメインの5’に隣接する。相補体ドメインは第1の相補体分岐点移動領域と、トーホールド領域と、第2の相補体分岐点移動領域とを有する。第1の相補体分岐点移動領域は第1のヘアピン領域の5’に隣接し、第1の保護体ドメインの分岐点移動配列と相補的な配列を有する。トーホールド領域は第1の相補体分岐点移動領域の5’に隣接し、標的核酸分子の第1の標的核酸配列の3’に隣接した第2の標的核酸配列と相補的な配列を有する。第2の相補体分岐点移動領域はトーホールド領域の5’に隣接し、第2の核酸配列の3’に隣接した第3の標的核酸配列と相補的な配列を有する。第2のヘアピン領域は第2の相補体分岐点移動領域の5’に隣接する。第2の保護体ドメインは、第2の相補体分岐点移動領域の配列と相補的である配列を有する。一般的なプライマーの修飾本明細書に記載の各プライマーは、DNA、RNAもしくはそれらのアナログ、および/またはそれらの組み合わせからなっていてもよい。ある種の実施形態では、プライマーは1つ以上の非天然ヌクレオチドを含む。プライマーに非天然ヌクレオチドを導入すると、プライマーデュプレックスの性能をさらに増強することができる。特に、保護体鎖は、転写の開始に役立つことを意図するものではないが、期せずして標的の他の領域または他のバックグラウンド分子と相補的であったり、擬似的な複製/転写を開始させたりすることがある。これを防止するには、非天然ヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを第2の保護体鎖の3’末端に使用すると、その鎖による意図せぬプライマー結合を防止する働きをすることがある。非天然ヌクレオチドの例として、イソ-C、イソ-G、デオキシウリジンがあるが、これに限定されるものではない非天然ヌクレオチドに関連する教示内容を本明細書に援用するKruegeretal.ChemBiol.16:242-482009参照されたい。いくつかの実施形態では、たとえば、繰り返してプライマー結合する酵素機能を使用するポリメラーゼ連鎖反応PCRでは、伸長した相補体鎖がその後のプライマーハイブリダイゼーションの標的になり得る。その後の数ラウンドの増幅におけるプライマーハイブリダイゼーションの特異性を維持するには、プライマーのバランス領域を複製されてはならない。たとえば、相補体鎖の分岐点移動領域とバランス領域との界面に非天然ヌクレオチドを導入すると、バランス領域が複製されるのを防止することができる。ある種の実施形態では、本明細書に記載のプライマーは、ポリメラーゼ伸長の開始点として機能する。増幅された核酸フラグメントを解析しやすくするには、PCR反応に標識プライマーを使用してもよい。標識プライマーは、検出可能な部分に連結されたまたはコンジュゲートされたプライマーである。例として、蛍光色素、放射性標識ならびに特定可能な金属、核酸配列およびタンパク質がある。蛍光標識プライマーを用いて反応を行う場合、蛍光標識を含む単位複製配列核酸産物が生成され得る。本明細書に記載のプライマーは、当該技術分野において公知の任意の方法により合成することができるたとえば、本明細書に援用するOgilvieetal.J.Amer.Chem.Soc.9923:7741-7743;Reese,C.B.Tetrahedron3421:31431978;Efimovetal.NucleicAcidsRes.1123:8369-83871983;Gareggetal.TetrahedronLett.2734:40511986;Beaucageetal.Tetrahedron4812:22231992;Efimovetal.Nucleosides,NucleotidesNucleicAcids268-9:1087-932007を参照されたい。標的核酸分子標的は一本鎖ss核酸でも、または二本鎖ss核酸でもよい。標的核酸は、たとえば、DNAでも、RNAでも、または逆転写に供したRNAのDNA産物でもよい。いくつかの実施形態では、標的はDNAとRNAとの混合物キメラである。他の実施形態では、標的は、人工核酸アナログ、たとえば、ペプチド核酸Nielsenetal.Science2545037:1497-5001991またはロックド核酸Alexeietal.Tetrahedron5414:3607-301998を含む。いくつかの実施形態では、標的は天然に存在してもよいしたとえば、ゲノムDNA、または標的は合成であってもよいたとえば、ゲノムライブラリー由来。本明細書で使用する場合、天然に存在する核酸配列は、人的介入の非存在下で自然界に存在する生物またはウイルスの核酸分子中に存在する配列である。いくつかの実施形態では、標的はゲノムDNA、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、マイクロRNA、プレ-マイクロRNA、プロ-マイクロRNA、ウイルスDNA、ウイルスRNAまたはpiwi-RNAである。ある種の実施形態では、標的核酸は、生物またはウイルスに天然に存在する核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は病原生物またはウイルスの核酸である。ある種の実施形態では、被検体における標的核酸の有無から、この被検体が疾患または障害を有するか、または疾患または障害に罹患しやすいかが示唆される。ある種の実施形態では、被検体における標的核酸の有無から、この被検体が疾患または障害を処置するための薬剤などの処置剤に十分に応答するか、または不十分に応答するかが示唆される。ポリヌクレオチド、核酸および核酸分子という用語は、同義で使われる。これらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれかである。ポリヌクレオチドはどのような三次元構造を有してもよく、どのような機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から規定された遺伝子座単数または複数、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNAmRNA、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、たとえばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含んでもよい。ヌクレオチド構造に修飾が存在する場合、修飾はポリマーの構築の前に付与しても、または後に付与してもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによりさらに修飾してもよい。組換えポリヌクレオチドという用語は、自然界に存在しないか、あるいは非天然の配置で別のポリヌクレオチドに連結されたゲノム由来、cDNA由来、半合成由来または合成由来のポリヌクレオチドである。単離された核酸という用語は、1単離された核酸が自然界に見出される細胞と結合していない、および/または2単離された核酸が自然界で連結してないポリヌクレオチドに作動可能に連結された、天然または合成由来、またはそれらの何らかの組み合わせのポリヌクレオチドをいう。核酸はさらに、一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAのほか、修飾塩基、糖および骨格を含む他の核酸のあらゆる形態も包含する。したがって核酸という用語は、以下に限定されるものではないが、一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNAおよび部分一本鎖または部分二本鎖であってもよいそれらの形態、cDNA、アプタマー、ペプチド核酸PNA、2’-5’DNADNAのAコンフォメーションに適合する塩基スペーシングを有する短縮された骨格を持つ合成材料;2’-5’DNAは通常B形態のDNAとハイブリダイズしないが、RNAと容易にハイブリダイズする、およびロックド核酸LNAを含むことが理解されよう。核酸アナログは、塩基対形成性の類似または改善された結合、ハイブリダイゼーションを有する天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む。プリンおよびピリミジンのアナログ形態は、当該技術分野において周知であり、アジリジニルシトシン、4-アセチルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュエオシン、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、キュエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸および2,6-ジアミノプリンがあるが、これに限定されるものではない。本明細書で提供されるDNA骨格アナログは、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファマート、3’-チオアセタール、メチレンメチルイミノ、3’-N-カルバメート、モルホリノカルバメートおよびペプチド核酸PNA、メチルホスホネート結合、またはメチルホスホネートとホスホジエステルとの交互結合Strauss-Soukup,1997,Biochemistry36:8692-8698、および米国特許第6,664,057号明細書で考察されたベンジルホスホネート結合を含む。さらにOLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES,APRACTICALAPPROACH,editedbyF.Eckstein,IRLPressatOxfordUniversityPress1991;AntisenseStrategies,AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,Volume600,Eds.BasergaandDenhardtNYAS1992;Milligan,1993,J.Med.Chem.36:1923-1937;AntisenseResearchandApplications1993,CRCPressも参照されたい。本明細書の核酸は、細胞から抽出してもよいし、または当業者に公知の任意の手段に従い人工的に調製してもよい。たとえば、核酸は、化学的に合成もしくは転写してもよいし、またはいくつかある元となるもの中でも特にcDNAもしくはmRNAから逆転写してもよい。本明細書で使用する場合、2つの核酸または核酸領域が共に同じ核酸配列と相補的である場合、それらは相互に一致している。2つの核酸または核酸領域が相互に塩基対を形成して二本鎖核酸分子を形成する場合、それらは相互に相補的である。本明細書に利用される標的核酸は、任意の核酸、たとえば、ヒトの核酸でも、細菌の核酸でも、またはウイルスの核酸でもよい。標的核酸サンプルは、たとえば、1つ以上の細胞、組織または体液由来の核酸サンプルであってもよい。標的サンプルは、以下に限定されるものではないが、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、ヒト、非ヒト、細菌、微生物、ウイルス、生物源、血清、血漿、血液、尿、精液、リンパ液、脳脊髄液、羊水、生検材料、穿刺吸引細胞診材料、癌、腫瘍、組織、細胞、細胞ライセート、粗細胞ライセート、組織ライセート、組織培養細胞、口腔スワブ、洗口剤、糞便、ミイラ化した組織、法医学的資料、剖検材料、考古学的資料、感染体、院内感染体、産生源、薬剤調製物、生体分子産物、タンパク質調製物、脂質調製物、炭水化物調製物、無生物、空気、土壌、樹液、金属、化石、発掘物、ならびに/または他の地球もしくは地球外物質および起源物質など、どのような供給源から得てもよい。サンプルは、1つの起源または様々な起源由来の物質の混合物をさらに含んでもよい。たとえば、感染細菌またはウイルスの核酸は、そうした感染細胞または組織由来の核酸を本開示方法を用いて増幅する場合、ヒト核酸と一緒に増幅してもよい。有用な標的サンプルとして、真核生物サンプル、植物サンプル、動物サンプル、脊椎動物サンプル、魚サンプル、哺乳動物サンプル、ヒトサンプル、非ヒトサンプル、細菌サンプル、微生物サンプル、ウイルスサンプル、生物学的サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、血液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、リンパ液サンプル、脳脊髄液サンプル、羊水サンプル、生検サンプル、穿刺吸引細胞診サンプル、癌サンプル、腫瘍サンプル、組織サンプル、細胞サンプル、細胞ライセートサンプル、粗細胞ライセートサンプル、組織ライセートサンプル、組織培養細胞サンプル、口腔スワブサンプル、洗口剤サンプル、糞便サンプル、ミイラ化した組織サンプル、法医学的サンプル、考古学的サンプル、感染体サンプル、院内感染体サンプル、産生サンプル、薬剤調製物サンプル、生体分子産物サンプル、タンパク質調製物サンプル、脂質調製物サンプル、炭水化物調製物サンプル、無生物サンプル、空気サンプル、土壌サンプル、樹液サンプル、金属サンプル、化石サンプル、発掘物サンプル、および/または他の地球もしくは地球外サンプルが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に利用される標的核酸は、反復配列、二次構造、および/または高G/C含量を含む。ある種の実施形態では、目的の標的核酸分子は、約100~約1,000,000ヌクレオチドnt長である。いくつかの実施形態では、標的は、約100~約1000ヌクレオチド長、約1000~約10,000ヌクレオチド長、約10,000~約100,000ヌクレオチド長または約100,000~約1,000,000ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的は、約100ヌクレオチド長、約200ヌクレオチド長、約300ヌクレオチド長、約400ヌクレオチド長、約500ヌクレオチド長、約600ヌクレオチド長、約700ヌクレオチド長、約800ヌクレオチド長、約900ヌクレオチド長、約1,000ヌクレオチド長、約2,000ヌクレオチド長、約3,000ヌクレオチド長、約4,000ヌクレオチド長、約5,000ヌクレオチド長、約6,000ヌクレオチド長、約7,000ヌクレオチド長、約8,000ヌクレオチド長、約9000ヌクレオチド長、約10,000ヌクレオチド長、約20,000ヌクレオチド長、約30,000ヌクレオチド長、約40,000ヌクレオチド長、約50,000ヌクレオチド長、約60,000ヌクレオチド長、約70,000ヌクレオチド長、約80,000ヌクレオチド長、約90,000ヌクレオチド長、約100,000ヌクレオチド長、約200,000ヌクレオチド長、約300,000ヌクレオチド長、約400,000ヌクレオチド長、約500,000ヌクレオチド長、約600,000ヌクレオチド長、約700,000ヌクレオチド長、約800,000ヌクレオチド長、約900,000ヌクレオチド長または約1,000,000ヌクレオチド長である。標的核酸は、より長い核酸たとえば、染色体または染色体フラグメント内のコード配列または遺伝子などの文脈で用意されてもよいことが理解されよう。ある種の実施形態では、目的の標的は直鎖状である一方、他の実施形態では、標的は、環状であるたとえば、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNAまたは色素体DNA。プライマー-標的組み合わせシステムいくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、プライマー-標的システムである。プライマー-標的システムは、1つ以上の核酸標的、ポリメラーゼおよび1つ以上のプライマーたとえば、プライマーデュプレックスおよび/またはヘアピンプライマーデュプレックスを含む。プライマーという用語は、本明細書に記載のプライマーまたはプライマーシステムたとえば、一本鎖プライマー、二本鎖プライマーデュプレックスおよびヘアピンプライマーデュプレックスのいずれか1つを包含する。ある種の実施形態では、本明細書に記載のプライマー-標的システムは、複数の異なるプライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマー-標的システムは、標的核酸分子の同定、および、たとえば増幅に使用し得る少なくとも2つのプライマーを含んでもよい。標的核酸分子は、たとえば、単一コピーとしてまたは低コピー数で複数の非標的核酸分子内に存在してもよい。本明細書に記載のプライマー-標的システムのいずれか1つは、核酸増幅反応またはシーケンシング反応に使用されるのと同様の条件たとえば、同様の試薬、反応温度等を含んでもよい。使用方法本明細書に記載のプライマーシステムは、熱力学的機構または反応速度的kinetic機構により特定の標的と擬似標的とを識別することができる。標的と擬似標的とを熱力学的機構下記に記載を用いて区別する場合、鎖置換反応を終了まで行い、平衡状態における結合親和性の違いに基づき標的を擬似標的と区別する。反応速度的kinetic機構下記に記載を用いて標的を擬似標的と区別するには、鎖置換反応を平衡状態になる前に停止し、反応終了における差速を用いて標的を擬似標的と区別する。熱力学的分離熱力学的機構および反応速度的kinetic機構の一般的な戦略はどちらも、トーホールド交換による鎖置換反応を使用する。一般に、トーホールド交換は、標的の相補体を標的と相補的でない追加領域で伸長させることと、保護体鎖を、この伸長した相補体鎖および伸長領域に隣接する多くの塩基にプレハイブリダイズするが、一本鎖トーホールド領域にはプレハイブリダイズしないことを含む。図9は、トーホールド交換の1つの実装を図示する。この実装では、二本鎖プライマーデュプレックスシステム上記および図1Aに示したようなものを使用して、標的核酸と擬似標的とを区別する。相補体鎖の相補体分岐点移動領域およびトーホールド領域はそれぞれ、第1の標的配列および第2の標的配列に対応する配列を有する。相補体バランス領域は、トーホールド領域と同じ長さおよびヌクレオチド塩基分布になるように設計した。この方法では、正しい標的と保護された相補体との間の図9Aに示した鎖置換反応の標準自由エネルギーは、およそΔG°=0kcal/molである。この鎖置換反応は、以下のように記載することができる:標的相補体/保護体⇔標的/相補体保護体ΔG°は、以下の関係式で平衡定数Keqに関係する:ΔG°=RTlnKeq。ΔG°=0の反応では、平衡定数Keqは1である。平衡定数はまた平衡状態とも関係し、この反応では、Keq=[TC][P]/[T][PC]=1である。[PC]および[P]が[T]より過剰であるアッセイでは、[TC]/[T]=1であり、平衡状態で全標的分子のちょうど半数がハイブリダイズすることを意味する。図9Aに示した例では、ΔG°=0.1kcal/molであり、Keq=0.85に相当し、これは、平衡状態で標的分子の46がハイブリダイズすることを意味する。保護体鎖は、擬似標的との鎖置換反応の標準自由エネルギーをそれに対応して変化させる。図9Bに示した例では、擬似標的は正しい標的と1塩基異なり、結果として同じ二本鎖核酸プライマーシステムとの鎖置換反応が3.7kcal/molのΔG°を有し、これはKeq=1.910-3に相当する。平衡状態では、擬似標的の0.19のみが相補体にハイブリダイズする。このため、図8に示した例示的な核酸プライマーシステムは、単1ヌクレオチドのみのミスマッチを有する擬似標的に対して200倍超優先的にその標的に結合する。図10は、平衡状態における結合親和性を反応の標準自由エネルギーの関数としてプロットしたものである。反応の標準自由エネルギーが負に大きいと純粋なハイブリダイゼーション反応の場合のように、標的および擬似標的の両方が非常に強く結合し、この2つを区別することが難しく、偽陽性が生じる。一方、反応の標準自由エネルギーが正に大きいと、プライマーは非常に弱く標的に結合し、偽陰性が生じる。プライマーデュプレックスシステムをほぼ0の標準自由エネルギーを有するように設計すると、標的と擬似標的との最適な識別が得られ、それにより偽陽性および偽陰性が最小限に抑えられる。反応速度的kinetic分離反応速度的kinetic分離は、トーホールド交換の反応速度kineticsの差を利用する。トーホールド交換反応の反応速度kineticsは、トーホールド領域の結合強度によって決まる。トーホールド結合エネルギーにおけるkcal/mol毎の差が、反応速度kineticsに5.4倍影響を与え得るため図11、図9Bに示した3.6kcal/molのミスマッチは、反応速度的kineticに434減速させると考えられる。熱力学的な識別と異なり、反応速度的kinetic識別は、ミスマッチがトーホールド領域にあるときにのみ起こる。相補体分岐点移動領域と相補的な位置で正しい標的と異なる擬似標的は、大きく異なる反応速度kineticsが生じるとは考えにくい。そのため、標的を擬似標的と区別する反応速度的kinetic機構を使用する方法は、標的/プライマーのミスマッチの位置を正確に決定する手段として熱力学的分離との併用が有用である。重要な点として、反応速度的kinetic機構を利用する方法において、図8に示したプライマーシステムなど相補体バランス領域がないプライマーデュプレックスシステムを使用して標的/プライマーのミスマッチの位置を正確に決定してもよい。マイクロアレイ核酸マイクロアレイは、多くの場合、ハイスループットな核酸検出に使用されるが、密接に関連する核酸配列を区別できないことが多い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを、たとえば、マイクロアレイ解析の特異性を高めるために核酸マイクロアレイに使用してもよい。いくつかの例では、従来の核酸プライマーの代わりに本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを使用してもよいこと以外は、当該技術分野において周知の方法を用いてマイクロアレイアッセイを実施してもよい。たとえば、図12A図示するように、ある種の実施形態では、ヘアピンプライマーデュプレックスシステム形態を、標準的技術を用いて直接合成してもよいし、またはマイクロアレイチップ上に固定化してもよい。他の実施形態では、二本鎖プライマーデュプレックスシステムを核酸マイクロアレイに使用してもよい。ある実施形態では、図12Aの場合と同様に、事前に設定した位置に2つの光切断性塩基を含むヘアピン構造を合成してもよい。その後光を照射してヘアピンを切断して、アレイ表面に一体化した二本鎖複合体を得る図12B。二本鎖複合体の調製には、ニッキングまたは制限酵素の使用など、他の方法を使用してもよい。増幅反応を含む核酸合成反応いくつかの実施形態では、本明細書に開示したプライマーデュプレックスおよびシステムにより、当該技術分野において公知のプライマーによる増幅反応における核酸プライマーの代わりに本明細書に記載のプライマーデュプレックスシステムを使用することで、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、鎖置換増幅または転写による増幅などのプライマーを用いた増幅反応の特異性を高めてもよい。たとえば、図13に図示するように、図4に図示した種類のヘアピンプライマーデュプレックスシステムをPCRプライマーとして使用することで、種々のたとえば、生物工学的用途のPCRの特異性を高めることが可能である。この例では、増幅反応を実施するための標的核酸および標準的な試薬と共にプライマーデュプレックスシステムを含む溶液を形成し、増幅反応が生じるような条件下で溶液をインキュベートすることにより標的核酸配列を増幅する。ある種の実施形態では、ヘアピン自体の複製を防止するため、非天然塩基をヘアピンプライマーデュプレックスプライマーシステムに組み込む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーデュプレックスは、典型的には以下のPCR法の任意の1つ以上による増幅を必要とする標的核酸の増幅に使用できるように適合させてもよい:アレル特異的PCR、アセンブリーPCR、非対称PCR、ヘリカーゼ依存型増幅、配列間特異的PCRISSR、逆PCR、ライゲーション媒介PCR、メチル化特異的PCRMSP、ミニプライマーPCR、マルチプレックスPCR、ネステッドPCR、オーバーラップエクステンションPCR、定量PCRQ-PCR、逆転写PCRRT-PCR、固相PCR、thermalasymmetricinterlacedPCRTAIL-PCRまたはタッチダウンPCR。場合によっては、本明細書に記載のプライマーデュプレックスおよび方法を、前述のPCR方法のいずれか1つに使用しても、または使用できるように適合させてもよいし、あるいは、前述のPCR方法のいずれか1つに代用して代わりに使用してもよい。前述の各PCR方法の簡単な説明を下記に示す。アレル特異的PCRは、一塩基多型SNPDNAの1塩基の相違に基づく診断またはクローニング技術である。アレル特異的PCRは典型的には、対立遺伝子間の相違などDNA配列について事前に知っている必要がある。アセンブリーPCRまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリーPCAは、短い重複セグメントを含む長いオリゴヌクレオチドのプールを用いてPCRを行うことによる長いDNA配列の人工合成法である。オリゴヌクレオチドは、センス方向とアンチセンス方向とに配置され、重複セグメントによりPCRフラグメントの順序が決定され、それにより最終的な長いDNA産物を選択的に作製するStemmeretal.Gene1641:49-531995。非対称PCRは、二本鎖DNA標的の一本のDNA鎖を優先的に増幅する。非対称PCRは、二本の相補鎖のうちの一本のみの増幅が必要とされるシーケンシングおよびハイブリダイゼーションプロ-ビングに使用してもよいInnisetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA8524:9436-401988。ヘリカーゼ依存型増幅は従来のPCRに類似しているが、典型的には変性およびアニーリング/伸長サイクルを通じて温度サイクルではなく一定温度を使用する。DNAを巻き戻す酵素、DNAヘリカーゼを熱変性の代わりに使用するVincentetal.EMBOReports58:795-8002004。配列間特異的PCRISSRは、単純反復配列間の領域を増幅して増幅フラグメント長さに特有のフィンガープリントを得るDNAフィンガープリンティングのためのPCR方法であるZietkiewiczetal.Genomics202:176-831994。逆PCRは、ゲノムインサートの近くのフランキング配列を同定するのに一般に使用される。逆PCRは、一連のDNA消化および自己ライゲーションにより、未知の配列を両末端に有する既知の配列が得られるOchmanetal.Genetics1203:621-6231988。ライゲーション媒介PCRは、目的のDNAにライゲートした小さなDNAリンカー、およびDNAリンカーにアニーリングした複数のプライマーを使用する。ライゲーション媒介PCRは、DNAシーケンシング、ゲノムウォーキング、およびDNAフットプリントに使用されてきたMuelleretal.Science2464931:780-7861988。メチル化特異的PCRMSPは、ゲノムDNAのCpG島のメチル化を検出するのに使用される。DNAをまず重亜硫酸ナトリウムで処理し、非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換し、これがプライマーによりチミンとして認識される。ミニプライマーPCRは、耐熱性ポリメラーゼS-Tbrを使用し、16Sまたは真核生物の18SrRNA遺伝子などの保存されたDNA配列の増幅に用いられるIsenbargeretal.AppliedandEnvironmentalMicrobiology743:840-9.2008。マルチプレックスPCRは、一度に複数の遺伝子を標的とし、本来ならば試薬を数回、およびより多くの実施時間を必要とすると考えられる1回の試験実施から追加情報が得られる。ネステッドPCRは、DNAの非特異的増幅に起因するバックグラウンドを低下させることによりDNA増幅の特異性を高める。2回の連続PCRで2組のプライマーを使用する。第1の反応では一対のプライマーを使用して、目的の標的に加えてさらに非特異的に増幅されたDNAフラグメントからなるDNA産物を得る。次いで第1の反応に使用したプライマーと結合部位が完全にまたは部分的に異なり、かつそのそれぞれの3’側に位置する1組のプライマーを用いた第2のPCRでこの産物単数または複数を使用する。オーバーラップエクステンションPCRまたはsplicingbyoverlapextensionSOEは、相補配列を含む2つ以上のDNAフラグメントを一緒にスプライスするのに使用される遺伝子工学技術である。オーバーラップエクステンションPCRは、遺伝子、調節配列または突然変異を含むDNA断片を連結するのに使用される。この技術を用いれば、特異的で長いDNAコンストラクトを作製することができる。定量PCRQ-PCRは、PCR産物の量を一般にリアルタイムで測定するのに使用される。定量PCRは、DNA、cDNAまたはRNAの初期量を定量的に測定する。Q-PCRは、DNA配列がサンプル中に存在するかどうかと、サンプル中のそのコピー数とを判定するのに一般に使用される。逆転写PCRRT-PCRは、RNAからDNAを増幅するのに使用される。逆転写酵素がRNAをcDNAに逆転写し、次いでcDNAがPCRにより増幅される。RT-PCRは、遺伝子の発現を判定するため、または転写開始および終結部位などRNA転写物の配列を特定するため、発現プロファイリングに広く使用されている。遺伝子のゲノムDNA配列が既知である場合、RT-PCRを使用して遺伝子内のエクソンおよびイントロンの位置をマッピングしてもよい。遺伝子の5’末端転写開始部位に相当は典型的にはRACE-PCRRapidAmplificationofcDNAEndsにより特定される。固相PCRは、ポロニー増幅たとえばPCRのコロニーをゲルマトリックスから得る、ブリッジPCRプライマーが固体支持体表面に共有結合している、従来の固相PCR水性プライマーの1つに一致する配列を含むプライマーを有する固体支持体の存在下で非対称PCRを行う、および改良型固相PCR固体支持体のプライマー結合に有利に働く熱ステップを任意選択的に適用し、高融解温度Tmおよびネステッド固体支持体プライマーを利用することにより従来の固相PCRを改良することができるなど複数の意味を包含する。ThermalasymmetricinterlacedPCRTAIL-PCRは、既知の配列に隣接する未知の配列の単離に使用される。既知の配列において、TAIL-PCRは、異なるアニーリング温度を持つネステッドプライマー対を使用し、未知の配列から逆方向に増幅するには縮重プライマーを使用するLiuetal.Genomics253:674-81.1995。タッチダウンPCRステップダウンPCRは、PCRのサイクルが進むにつれ、アニーリング温度を徐々に低下させることにより非特異的バックグラウンドを低下させることを目的としたPCRの変形である。初期のサイクルのアニーリング温度は通常、使用するプライマーのTmより数度3~5°C高いのに対し、後のサイクルでは、アニーリング温度はプライマーのTmより数度3~5°C低い。温度が高くなるほどプライマーの結合特異性が高くなり、温度が低くなるほど初期のサイクルで形成された特異的産物からのより効率的な増幅が可能になる。反応液の温度は、所定のサイクル数で変性状態と、アニーリング状態と、伸長状態との間で連続的に繰り返してもよい。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的により異なってもよい。ある種の実施形態では、任意の特定の反応の場合、変性状態は、約75°C~約100°Cの範囲である。アニーリングの温度および時間は、標的核酸中の特定の遺伝子座に対するプライマー結合の特異性および効率に影響することがあり、個々のPCR反応に重要であり得る。ある種の実施形態では、任意の特定の反応の場合、アニーリング状態は約20°C~約75°Cの範囲である。いくつかの実施形態では、アニーリング状態は、約20°C~約25°C、約25°C~約30°C、約30°C~約35°Cまたは約35°C~約40°C、約40°C~約45°C、約45°C~約50°Cで実施してもよい。ある種の実施形態では、アニーリング状態は、室温たとえば、20°Cまたは25°Cで実施してもよい。いくつかの実施形態では、アニーリング状態は、20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°Cまたは50°Cの温度で実施してもよい。伸長の温度および時間は、対立遺伝子産物の収率に影響を与えることがあり、検討対象の酵素に特有の特性であることが理解される。ある種の実施形態では、ある酵素の伸長状態は約60°C~約75°Cの範囲であってもよい。前述の実施形態のいずれかでは、耐熱性ポリメラーゼおよび逆転写酵素RTaseなどの任意のDNAまたはRNAポリメラーゼヌクレオチドの核酸鎖への重合を触媒する酵素を利用してもよい。例として、バチルスステアロサーモフィルスBacillusstearothermophiluspolI、サーマスアクアティクスThermusaquaticuspolI、ピルッコックスフリオサスPyrccoccusfuriosusPfu、パイロコッカスウォーセイPyrococcuswoeseiPwo、サーマスフラバスThermusflavusTfl、サーマスサーモフィラスThermusthermophilusTth、サーマスリトリスThermuslitorisTliおよびサーモトガマリティメThermotogamaritimeTmaがある。これらの酵素、これらの酵素の修飾形態および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびAppliedBiosystemsなどの販売会社から市販されている。代表的な酵素には、PHUSION登録商標NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA、HotMasterTaq商標Eppendorf、PHUSION登録商標MpxFinnzymes、PyroStart登録商標Fermentas、KODEMDBiosciences、Z-TaqTAKARAおよびCS3AC/LAKlenTaq,UniversityCity,MOがある。塩および緩衝液は、それぞれMgCl2およびトリス-HClおよびKClを含むものなど当業者によく知られたものを含む。緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシドDMSO、グリセロール、ウシ血清アルブミンBSAおよびポリエチレングリコールPEGのほか、当業者に知られた他のものなど添加剤を含んでもよい。ヌクレオチドは一般に、デオキシアデノシン三リン酸dATP、デオキシシチジン三リン酸dCTP、デオキシグアノシン三リン酸dGTPおよびデオキシチミジン三リン酸dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、また標的核酸の増幅に十分な量で反応に加える。本明細書でさらに提供されるのは、1プライマーデュプレックスの相補体鎖を標的核酸にハイブリダイズし、それにより相補体鎖をその保護体鎖から解離すること、および2ポリメラーゼの存在下で相補体鎖をその3’末端から標的と相補的に伸長させることを含む方法である。本明細書でさらに提供されるのは、標的核酸、ポリメラーゼ、および本明細書に記載の実施形態のいずれか1つのプライマーデュプレックスの1つ以上の存在下で核酸合成反応を行うことを含む方法である。核酸合成反応とは、核酸が合成される任意の反応をいう。例として、核酸増幅反応、たとえばポリメラーゼ連鎖反応PCRまたはその変形本明細書の他の箇所に記載、転写反応、逆転写反応、sequencing-by-synthesisまたは他のプライマー伸長反応が挙げられる援用するLizardietal.Nat.Genet.19:225-321998も参照されたい。いくつかの例では、1標的非特異的バランス領域、標的特異的分岐点移動領域および標的特異的トーホールド領域を有する相補体鎖を合成すること;2相補体鎖と相補的なバランス領域および相補体鎖と相補的な分岐点移動領域を有する保護体鎖を合成すること;および3相補体鎖を保護体鎖にハイブリダイズしてプライマーデュプレックスを形成することを含む方法を提供する。いくつかの例では、1標的非特異的バランス領域、標的特異的分岐点移動領域および標的特異的トーホールド領域を有する相補体鎖を用意すること;2相補体鎖と相補的なバランス領域および相補体鎖と相補的な分岐点移動領域を有する保護体鎖を用意すること;および3相補体鎖を保護体鎖に組み合わせてプライマーデュプレックスを形成することを含む方法を提供する。いくつかの例では、1標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること;2iバランス領域、ii標的核酸と相補的な分岐点移動領域およびiiiトーホールド領域を有する少なくとも1つのプライマーデュプレックスを用意すること;および3核酸ハイブリダイゼーションに好適な条件下、複数の標的核酸、少なくとも1つのプライマーデュプレックスおよびポリメラーゼを1回の反応で組み合わせることを含む方法を提供する。本明細書でさらに提供されるのは、目的の少なくとも1つの標的核酸を増幅する方法であって、1少なくとも1つの標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること、2iバランス領域、ii分岐点移動領域、およびiiiトーホールド領域を有する少なくとも1つのプライマーデュプレックスを用意すること;および3少なくとも1つの標的核酸の増幅に好適な条件下、複数の標的核酸分子、少なくとも1つのプライマーデュプレックス、およびポリメラーゼを1回の反応で組み合わせることを含む方法である。ある種の実施形態では、複数の特有の標的核酸を1回の反応または複数回の反応で、たとえば、1回または2回以上のマルチプレックスによるPCR増幅反応で増幅する。いくつかの実施形態では、約10~100の核酸標的、約100~約1000の核酸標的、約1000~約10,000の核酸標的または約10,000~約100,000の核酸標的を増幅する。反応における異なるプライマーデュプレックスの数は、所望の標的によって異なる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、標的核酸分子と比較して1つ以上のヌクレオチド変化を有する擬似核酸分子を識別する方法であって、1少なくとも1つの標的核酸を含む複数の核酸分子を用意すること、2iバランス領域、ii分岐点移動領域、およびiiiトーホールド領域を有する少なくとも1つのプライマーデュプレックスを用意すること;および3少なくとも1つの標的核酸分子の増幅に好適な条件下、複数の標的核酸分子、少なくとも1つのプライマーデュプレックス、およびポリメラーゼを1回の反応で組み合わせることを含む方法である。本明細書に記載の方法のいずれか1つは、以下の試薬の1つ以上を1回の反応で用意または組み合わせることをさらに含んでもよい:緩衝液たとえば、KCl、MgCl2、トリス-HCl、dNTPたとえば、たとえば、約50~約100μMの濃度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、ポリメラーゼたとえば、50μlの反応当たり約0.5~2.0単位および/または水。1回の反応におけるプライマーデュプレックスの各鎖の濃度は、たとえば、標的核酸の濃度に応じて異なる。いくつかの実施形態では、約5~約50pgのプラスミドまたはウイルス標的を使用してもよいし、または約50ng~約500ngのゲノム標的を使用してもよい。こうした例では、各プライマー第1の鎖および第2の鎖の濃度は、たとえば、約0.05μM~約1μMであってもよい。特定の実施形態では、各プライマーの濃度は約1nM~約1μMである。本明細書に記載の実施形態のいずれか1つでは、たとえば、標準的なPCRに使用される条件と同様に、1回の反応を周期的な温度変化にさらして、dsDNA構造が複数回の変性を起こし、次いでプライマーがアニーリングし、ポリメラーゼによる伸長が起きるようにしてもよい。いくつかの実施形態では、変性ステップの温度範囲は約90~約95°Cである。ある種の実施形態では、繰り返しサイクルの前に約1~約5分の最初の変性ステップを必要とする。正確な時間の量は、目的の核酸標的のGC含量によって異なることがある。ある種の実施形態では、サイクル反応における変性ステップは約15~約30秒である。いくつかの実施形態では、アニーリングステップの温度範囲は約50°C~約60°Cである。いくつかの実施形態では、アニーリングステップは約20°C~約40°Cである。特定の実施形態では、アニーリングステップは室温約20°Cまたは約25°Cである。ある種の実施形態では、サイクル反応におけるアニーリングステップは約15~約30秒である。いくつかの実施形態では、伸長ステップの温度範囲は約70°C~約75°Cである。ある種の実施形態では、サイクル反応における伸長ステップは約45~約60秒である。各ステップの温度、時間、およびサイクル反応のサイクル数は、目的の核酸標的単数または複数の長さのほか、使用するポリメラーゼによって異なってもよい。標的が長くなると、たとえば、より長い伸長時間を要することがある。500ヌクレオチド標的のサイクル条件の1つの例を表2に示す。本明細書に記載の実施形態のいずれか1つでは、1回の反応たとえば、核酸増幅が室温たとえば、約20°Cまたは約25°Cで進行する。ある種の実施形態では、1回の反応が室温で約1時間進行する。本明細書に記載の方法のいずれか1つでは、プライマーデュプレックスの第2の保護体鎖を第1の相補鎖より過剰に、またはアニーリングしたプライマーデュプレックスより過剰に用意してもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、第1の鎖の濃度の約1×~約10×濃度たとえば、1×濃度、2×濃度、3×濃度、4×濃度、5×濃度、6×濃度、7×濃度、8×濃度、9×濃度、または10×濃度、またはアニーリングしたプライマーデュプレックスの濃度の約1×~約10×濃度たとえば、1×濃度、2×濃度、3×濃度、4×濃度、5×濃度、6×濃度、7×濃度、8×濃度、9×濃度、または10×濃度で第2の鎖を用意する。いくつかの実施形態では、第1の鎖を約0.05μM~約1μMの濃度で用意するのに対し、第2の鎖を約0.10μM~約2μMの濃度、または約0.15μM~約3μMの濃度、約0.2μM~約4μMの濃度、または約0.25μM~約5μMの濃度で用意する。本明細書に記載の方法のいずれか1つは、アレル特異的PCR、アセンブリーPCR、非対称PCR、ヘリカーゼ依存型増幅、配列間特異的PCRISSR、逆PCR、ライゲーション媒介PCR、メチル化特異的PCRMSP、ミニプライマーPCR、マルチプレックスPCR、ネステッドPCR、オーバーラップエクステンションPCR、定量PCRQ-PCR、逆転写PCRRT-PCR、固相PCR、thermalasymmetricinterlacedPCRTAIL-PCR、およびタッチダウンPCRから選択される方法を含んでもよい。本明細書に記載の方法のいずれか1つでは、増幅された核酸標的の収率は、約30~約100であってもよい。いくつかの実施形態では、収率は、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99または少なくとも100である。本明細書に記載の方法のいずれか1つでは、増幅された核酸産物を精製してもよい。核酸精製法は当業者よく知られており、フェノール抽出、グアニジニウムイソチオシアネート、アルコール沈殿、DEAEイオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーSEC、塩化セシウム、アガロース、シリカからの抽出、および他のカラムを用いた精製法がある。本明細書に記載の方法のいずれか1つでは、精製された増幅標的核酸は約30~約100純粋であってもよい。いくつかの実施形態では、純度は少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも65、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99、または100である。イメージング本明細書に記載のプライマーデュプレックスおよびシステムはまた、insituイメージングアッセイの特異性を高めるために使用してもよい。生体RNAとフルオロフォア標識プライマーとの非特異的相互作用は、頻繁にバックグラウンドノイズの原因になる。このため、いくつかの実施形態では、図14に図示したように、従来のプライマーの代わりにフルオロフォア標識した本明細書に記載の核酸プライマーシステムを使用すると、既存のinsitu画像技術の性能が大きく向上する。とりわけ、相補体鎖またはドメインをフルオロフォアで、保護体鎖またはドメインをクエンチャーで標識することにより、プライマーデュプレックスシステムは、標的に結合したときのみ、検出可能なシグナルを発生する。単一塩基多型SNP検出単一塩基多型SNPの位置および種類の正確な検出には、研究目的および治療目的の両方から大きな関心が集まっている。よって、本明細書に記載の反応速度的kinetic識別方法は、SNPの簡便な同定に有用である。キット本明細書で提供されるのは、1バランス領域、分岐点移動領域およびトーホールド領域を有する少なくとも1つの相補体鎖、および2バランス領域および分岐点移動領域を有する少なくとも1つの保護体鎖を含むキットである。本明細書で提供されるのは、1バランス領域、分岐点移動領域およびトーホールド領域を有する少なくとも1つの相補体鎖または領域、および2バランス領域および分岐点移動領域を有する少なくとも1つの保護体鎖または領域を含む少なくとも1つのプライマーデュプレックスを含むキットである。本明細書に記載のキットのいずれか1つは、ポリメラーゼをさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか1つは、緩衝液たとえば、KCl、MgCl2、トリス-HCl、dNTPたとえば、dATP、dCTP、dGTP、dTTPおよび水から選択される1つ以上の作用薬をさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか1つは、プライマーよりモル過剰の保護体鎖を含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか1つは、キットの成分を使用するための説明書またはたとえば、ウェブサイトから説明書を入手するための指示書をさらに含んでもよい。本明細書で提供されるキットのいずれか1つは、少なくとも1つの反応チューブ、ウェル、チャンバーまたは同種のものをさらに含んでもよい。本明細書に記載のプライマーまたはプライマーシステムのいずれか1つは、キットの形態で提供しても、またはキット内に入れられていてもよい。本発明によれば、PCR、転写および逆転写に関する上記の制約は、高度に特異的なプライマーデュプレックスを使用することにより克服することができる。本明細書に記載の実験から、プライマーデュプレックスが、DNAおよびRNA標的とプライマーとの両方図17の単1塩基変化を含む標的図16を確実に識別することができることが証明される。正しい標的は、およそ50の収率で7/5プライマーにハイブリダイズするが、単1塩基変化を含む標的は、大過剰200×でも有意にハイブリダイズするには不十分である。プライマーデュプレックスを設計し、複数の異なる標的について試験したところ、各プライマーデュプレックスは、単1ヌクレオチド変化に対して高い識別率を達成した図17。定量的には、単1ヌクレオチド変化を含む擬似標的とのハイブリダイゼーション収率における識別中央値は26である。プライマーデュプレックスを、原理証明実験のPCRに使用した図18Aおよび18B。従来のPCR本プライマーデュプレックスを使用しないPCRにより増幅することが難しい不完全な反復標的核酸を設計した。標準的な21ヌクレオチドプライマーおよびプライマーデュプレックスの収率を算出した。機能の範囲を調べるため、多様なサーマルサイクリングスケジュールを測定した。プライマーデュプレックスの長さおよびヌクレオチド含有量に基づく標準的なPCR条件から、プライマーのアニーリング温度は55°Cであろうと予測されることになる。驚いたことに、一例を挙げると、プライマーデュプレックスを用いて増幅された正しい長さの産物の割合50.2は、プライマーデュプレックスのアニーリングの最も不利な条件下でも35°Cおよび40°C、標準的なプライマーを用いてその最も有利なPCR条件下で45°C増幅された正しい長さの産物の割合31.0より高かった。さらに、この特定の実験では、プライマーデュプレックスを任意に設計し7ヌクレオチドのトーホールド領域および5ヌクレオチドのバランス領域、PCRの収率性について最適化しなかった。したがって、本プライマーデュプレックスの最適化により、さらに高いPCR特異性が得られる可能性がある。図15は、本明細書で提供されるプライマーデュプレックスを用いた高度に特異的なPCRを示す。図5Aでは、プライマーPCは、相補体鎖Cおよび保護体鎖Pからなる。PCが目的の標的に正しい位置Xで結合すると、一本鎖保護体オリゴヌクレオチドPは不活性な廃棄物として遊離し、プライマー結合した標的はDNAポリメラーゼにより伸長される。図5Bでは、プライマーPCが意図していない標的または正しい標的に不適切な位置どちらの場合も、Yで示すで結合すると、相補鎖Cからの保護体の移動は熱力学的に不利であり、反応速度的に速やかに逆戻りする。その結果、標的外の増幅たとえば、XはでなくYの増幅が大きくが減少すると予想される。図16.は、プライマーハイブリダイゼーションによる単1ヌクレオチド識別の実験的証明を示す。図16Aでは、短い合成DNA標的Xまたは擬似標的Yをプライマーと反応させる。保護体鎖PのポリTテールは、産物をゲル上の反応物と区別する働きをする。擬似標的Yの単1塩基変化の位置を赤枠で示す。図16Bは、未変性ポリアクリルアミドゲルの結果を示す。プライマーPCは、保護体Pと相補体Cとの比2:1で調製し、PCの濃度1μMでアニーリングした。正しい標的または擬似標的のいずれも、標的XまたはYが200nM、PCが100nM、Pが100nMの最終濃度になるように加えた。いくつかの実施形態では、反応は、過剰の保護体Pプライマーを含んでもよい。たとえば、いくつかの実施形態では、保護体鎖を相補体鎖の約1×~約10×たとえば、1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×または10×の濃度で加えてもよい。反応はすべて室温25°Cで1時間進行させた。一例を挙げると、設計7/4は、標的とのハイブリダイゼーションを開始する7ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドを3’オーバーハングとして有し、保護体が自然に解離して4ヌクレオチドが遊離するプライマーを意味する。図16Cは、図16Bに示したデータから推測されるハイブリダイゼーション収率をプロットしたものである。プライマーと正しい標的XとのハイブリダイゼーションをプロットXで示し、残りの点の付いたプロットは擬似標的Yとのハイブリダイゼーションを示す。7/4、7/5および7/6のプライマーはすべてそのハイブリダイゼーション収率χにおいて正しい標的と擬似標的とを識別する。7/0標的は識別しない。図16Dの識別率Qは、プライマーの特異性の定量的測定値であり、正しい標的のハイブリダイゼーション収率χを擬似標的のハイブリダイゼーション収率χで割った商として算出する。16Eでは、擬似標的が大過剰すなわち、200倍で存在しても、7/5プライマーとそうした標的Yとのハイブリダイゼーションがほとんど存在しない。図17.は、プライマーデュプレックスの単1塩基識別能に関する追加の実験結果および統計を示す。図17Aは、4つの追加の標的およびプライマーセットを構築し、試験したことを示す。そのうち2つは、天然に存在するマイクロRNA配列に基づき、2つは、意図的に顕著な二次構造を有するように設計した。図17Bは、各標的に対して7/5プライマーにより得られた識別率Qのヒストグラムを示す。ゲルスキャナーの限界により、100を超える識別率を確実に測定することができなかったため、これらをすべて100に分類した。図17Cは、RNA標的およびプライマーを示す。標的配列は、ヒトlet7gマイクロRNAと同一の配列を含む合成RNAオリゴヌクレオチドである。図17Dは、未変性PAGEの結果を示す。PCプライマーは、保護体Pと相補体Cとの比2:1で調製し、3μMの濃度でアニーリングした。正しい標的または擬似標的のいずれも、XまたはYが2μM、PCが1μM、Pが1μMの最終濃度になるように加えた。正しい標的はプライマーへの結合に成功するが、単1ヌクレオチドのミスマッチを含む標的とのハイブリダイゼーション収率は低い。図18は、類似反復標的のPCRの収率を高めるためにデュプレックスプライマーを使用した実験結果を示す。図18Aは、従来のPCRプライマーが高い収率で増幅するのに苦労する類似反復PCR標的168ntを示す。ここで、aはX1の正しい標的である。残りの符号am1X1-m17Gである、am2X1-m9Tである、およびam3X1-m11Gであるの部位は、正しい標的ではない。同様に、bはX2の正しい標的であり、bm1X2-m3Tである、bm2X2-m11Cである、およびbm3X2-m18Tであるは正しい標的ではない。よって、最外側の結合部位は、プライマーの完全な結合部位であるが、完全な部位の間には他に3つの単1塩基ミスマッチのプライマー結合部位も存在する。プライマーデュプレックスは標的に7ヌクレオチド結合し、保護体は自然に解離して5ヌクレオチドを遊離しなければならない。プライマーデュプレックスは、その3’末端がポリメラーゼにより伸長できないように設計した。相補体鎖のトーホールド領域は、以前の設計と同様に5’末端ではなく3’末端に設計した。図18Bでは、プライマーデュプレックスは、標準的なプライマーと比較して正しい長さの産物について著しく高い収率を示す。各レーンには、使用したプライマーのほか、温度サイクリングスケジュールたとえば、98-40-72は、98°Cでの変性、40°Cでのアニーリング、および72°Cでの伸長を示すを表記した。最も左側のレーンは、合成オリゴヌクレオチド基準物質を示す。適切性の割合と表記した下の数字は、レーンの全バンドの積分強度と比較した、正しい長さの産物に対応するバンドの相対強度を示す。プライマーデュプレックスのPCR産物は、各プライマーの5ヌクレオチドのオーバーハングトーホールド領域が原因で、基準物質および標準的なPCR産物より10ヌクレオチド長いように見える。等価物当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、本明細書に記載した具体的な実施例に対する等価物を数多く認識するか、あるいは確認することができるであろう。冠詞1つのa、anは、冠詞の文法上の目的語の1つ以上すなわち、少なくとも1つをいう。たとえば、1つの構成要件anelementは、1つの構成要件または2つ以上の構成要件を意味する。ある群の1つ以上の構成要素の間にまたはを含む請求項または記載は、異なる記載がない限り、あるいは、文脈から明らかである場合を除き、その群の構成要素の1つ、2つ以上または全部が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している場合、十分であると見なされる。本発明は、群の正確な1つの構成要素が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している実施形態を含む。本発明は、群の構成要素の2つ以上または全部が、ある物または方法に存在している、利用されている、または他の点で関連している実施形態を含む。さらに、本発明は、記載された請求項の1つ以上における1つ以上の限定、構成要件、各箇条、記述的用語等が別の請求項に挿入される変形、組み合わせおよび順列をすべて包含することも理解されよう。たとえば、別の請求項に従属した任意の請求項は、同じ基本請求項に従属した他の任意の請求項に記載された1つ以上の限定を含むように改変してもよい。構成要件がたとえば、マーカッシュ群形式のリストとして提示される場合、構成要件の下位群も各々開示され、その群から任意の構成要件単数または複数を除去してもよいことが理解されよう。一般に、本発明または本発明の態様が特定の構成要件、特徴を含むものとして言及される場合、本発明のある種の実施形態または本発明の態様は、そうした構成要件および/または特徴からなる、または本質的になることを理解されたい。簡潔にするため、本明細書ではそのような実施形態をそうした表現で具体的に記載していない。また、を含むcomprisingという用語は、オープンランゲージであることを意図しており、追加の構成要件またはステップを含み得ることも留意されたい。範囲が記載されている場合、端点が含まれる。さらに、他に記載がない限り、あるいは、文脈および当業者の理解から明らかである場合を除き、本発明の異なる実施形態では、範囲で表現される値は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、記載した範囲内の任意の特定の値または下位の範囲をその範囲の下限の単位の10分の1まで想定し得ることが理解されよう。本明細書で使用する場合、約aboutという用語は一般に、記載した値の10の範囲内の任意の値をいう場合がある。ただし、一部の例では、約aboutは、記載した値の20の範囲を包含してもよい。さらに、従来技術に包含される本発明の任意の特定の実施形態は、請求項の任意の1つ以上から明示的に除外してもよいことが理解されよう。こうした実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、本明細書に除外が明示的に記載されていなくても除外してもよい。本発明の方法の任意の特定の実施形態は、従来技術が存在するか否かに関係なく、いかなる理由であれ、任意の1つ以上の請求項から除外してもよい。本発明は、その用途において、以下の説明に記載したまたは図面に示した構成の詳細および要素の配置に限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書に使用される表現および用語は説明を目的としており、限定的なものとして見なしてはならない。本明細書のを含むincluding、を含むcomprisingまたはを有するhaving、を含むcontaining、を含むinvolving、およびそれらの変形は、その後に記載される項目およびその等価物のほか、追加項目を包含することを意図している。前述の特許、特許出願および参考文献は、特に本明細書に引用した教示内容について本明細書に援用する。参考文献[1]Petersen,M.Wengel,J.LNA:aversatiletoolfortherapeuticsandgenomics.TrendsBiotechnol.21,74-81,2003.[2]Krueger,A.T.Kool,E.T.RedesigningtheArchitectureoftheBasePair:TowardBiochemicalandBiologicalFunctionofNewGeneticSets.ChemBiol.16,242-2482009.[3]Lizardi,P.M.etal.Mutationdetectionandsingle-moleculecountingusingisothermalrolling-circleamplification.Nat.Genet.19,225-2321998.[4]Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B.Erlich,H.A.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science239,487-4911988.[5]Zhang,D.Y.,Chen,X.Yin,P.OptimizingNucleicAcidHybridizationSpecificity.submitted2011."