"一般式I[式中、R1は、H、又はOH、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R2は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R1とR2とは、置換又は非置換の、アリール又はフランなどの環を一緒に形成してもよく、R3は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R4は、H、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は置換若しくは非置換のアリールであり、MはNa又はKを表し、R1がHであり、且つMがNaである場合、R2及びR3は同時にフッ素基となることはできない]の置換スルホン化クマリン。前記クマリンが、ナトリウム5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネートであることを特徴とする請求項1に記載のクマリン。前記クマリンが、ナトリウム7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネートであることを特徴とする請求項1に記載のクマリン。請求項2に記載のクマリンを取得する方法であって、エチル4-クロロアセトアセテートをメタンスルホン酸中で1,3-ジヒドロキシナフタレンに作用させ、次いで、これによって得られた生成物に亜硫酸ナトリウムを作用させることから成ることを特徴とする上記方法。請求項3に記載のクマリンを取得する方法であって、エチル4-クロロアセトアセテートをメタンスルホン酸中で2-メチルレゾルシノールに作用させ、次いで、これによって得られた生成物に亜硫酸ナトリウムを作用させることから成ることを特徴とする上記方法。請求項1から3までのいずれか一項に記載のクマリンを取得する方法であって、クマリンの精製が、シリカカラムでの逆相吸着クロマトグラフィーによって実現されることを特徴とする上記方法。一般式II[式中、R1は、H、又はOH、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R2は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R1とR2とは、置換又は非置換の、アリール又はフランなどの環を一緒に形成してもよく、R3は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R4は、H、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は置換若しくは非置換のアリールであり、MはNa又はKを表し、Zは、以下の糖、即ちセロビオース、キシロビオース、マルトース、サッカロース、グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノース、キシラン、グルカン、キシロトリオース、マルトトリオース、セロトリオース、キシロテトラオースから選択された糖、又はこれらのうち幾つかの混合物を表し、R1がHであり、R2及びR3がFであり、且つMがNaである場合、Zはガラクトースとなることはできない]を有する蛍光発生基質。ナトリウムβ-D-セロビオシドナトリウム6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-グルコシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-キシロシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-キシロビオシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-キシロポリオシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-グルコシド5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-キシロシド5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-グルコシド7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネート、ナトリウムβ-D-ガラクトシド7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネートからなる群に属することを特徴とする請求項7に記載の基質。請求項7又は8に記載の基質を取得する方法であって、糖のクマリンへのグラフトがDMF中で実現されることを特徴とする上記方法。前記グラフトに続いてアセタール型の官能基を脱保護することを特徴とする請求項9に記載の方法。前記糖が、前記クマリンにグラフトされる前に臭素化されることを特徴とする請求項9又は10に記載の方法。前記基質の精製が、シリカカラムでの逆相観察吸着クロマトグラフィーによって実現されることを特徴とする請求項9から11までのいずれか一項に記載の方法。精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出において、前記検出が、請求項7又は8に記載の蛍光発生基質のうち1つを使用して達成されることを特徴とする上記検出。前記抽出物又は微生物又は細胞が油相中に懸濁している水滴中に分画されていることを特徴とする、請求項13に記載の精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出。前記水滴が、マイクロ流体デバイスによって作製されることを特徴とする、請求項14に記載の精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出。本発明の目的は、新規な置換スルホン化クマリンを合成することである。本発明の別の目的は、種々の糖と、種々の置換スルホン化クマリンとの再現可能なグラフト方法によって、置換スルホン化クマリンを糖にグラフトすることにより得られる蛍光発生基質を提供することである。本明細書において、蛍光発生基質とは、この基質において糖とクマリンとの間の化学結合が加水分解されると、それ自体が蛍光を発するクマリンが放出される、非蛍光の基質を意味する。本発明の別の目的は、精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出方法に関する。本発明は、より具体的には、一般式I[式中、R1は、H、又はOH、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R2は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R1とR2とは、置換又は非置換の、アリール又はフランなどの環を一緒に形成してもよく、R3は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R4は、H、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は置換若しくは非置換のアリールであり、MはNa又はKを表す]の置換スルホン化クマリンの一群に関する。本発明は、一般式II[式中、R1は、H、又はOH、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R2は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R1とR2とは、置換又は非置換の、アリール又はフランなどの環を一緒に形成してもよく、R3は、H、又はハロゲン、特にフッ素、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は-COR4若しくは-COOR4若しくは-CONHR4を表し、R4は、H、又は置換若しくは非置換の、直鎖若しくは分岐C1~C6アルキル基、又は置換若しくは非置換のアリールであり、MはNa又はKを表し、Zは、以下の糖、即ちセロビオース、キシロビオース、マルトース、サッカロース、グルコース、キシロース、ガラクトース、アラビノース、キシラン、グルカン、キシロトリオース、マルトトリオース、セロトリオース、キシロテトラオースから選択された糖、又はこれらのうち幾つかの混合物を表す]を有する新規な基質にも関する。本発明は、1~24の番号をつけた以下の化合物を参照しながら以下の記載を読めば、より深く理解されるであろう。上の化合物の中で、化合物2、4及び6は、一般式Iに入る置換スルホン化クマリンであり、化合物8、10、12、14、16、18、20、22及び24は、一般式IIに入る基質の例である。これらのクマリン及び基質を合成する種々の実施例を、決して限定としてではなく、指標として、以下に記載することにする。実施例14-クロロメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン1の合成メチルスルホン酸8mL中に2,4-ジフルオロレゾルシノール0.8gを溶解した溶液をフラスコ中に導入し、次いで、エチル4-クロロアセトアセテート1.3当量963μLを滴下する。室温で3時間攪拌した後、混合物を0°Cまで冷却し、次いで、水100mLを添加する。その後、残留物を濾過し、乾燥し、ジエチルエーテルで洗浄して化合物1を0.34g25得る。1HNMRδ742605481実施例2ナトリウム6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート2の合成エタノール25mL中に溶解した320mgの化合物1の溶液をフラスコ中に導入し、次いで、水6mL中に亜硫酸ナトリウム1.1当量、185mgを溶解した溶液を添加する。混合物を還流させ、反応の進展をTLC薄層クロマトグラフィーによって追跡する。40時間加熱した後、混合物を0°Cまで冷却する。溶液を濾過し、次いで、濾液を減圧下で蒸発させて黄色の固体を得る。得られた固体を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆相クロマトグラフィーによって1回精製し、その後続いて、精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:純水、カートリッジSNAPC18120g、溶離流速:25mL/分で精製する。減圧下で水を蒸発させた後、生成物2が、純粋な状態で、収率40で得られる。1HNMRδ72861843213CNMRδ163715311505149014221407109210531036527最大励起波長/蛍光波長=370/470nm50mMリン酸緩衝液、NaCl150mM、pH=7.5中10μM。実施例35,6-ベンゾ-4-クロロメチル-7-ヒドロキシクマリン3の合成メタンスルホン酸10mL中に1,3-ジヒドロキシナフタレン1gを溶解した溶液をフラスコ中に導入し、次いで、エチル4-クロロアセトアセテート1.3当量1.10mlを滴下する。室温で4日攪拌した後、混合物を0°Cまで冷却し、次いで、水50mLを添加する。その後、残留物を濾過し、水で洗浄し、乾燥して化合物3を1.30g80得る。1HNMRδ847832775760688658533実施例4ナトリウム5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート4の合成エタノール50mLに溶解した0.7gの化合物3の溶液をフラスコ中に導入し、次いで、水13mL中に亜硫酸ナトリウム1.1当量、370mgを溶解した溶液を添加する。混合物を還流させ、反応の進展をTLCによって追跡する。20時間加熱した後、混合物を0°Cまで冷却する。溶液をブフナー漏斗で濾過し、次いで、濾液を減圧下で蒸発させて、黄色固体の形態の粗化合物4を収率77で得る。得られた固体を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆相クロマトグラフィーによって一度精製し、その後続いて、精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:10アセトニトリル/90水、カートリッジSNAPC18120g、溶離流速:25mL/分で精製する。減圧下で溶媒を蒸発させた後、生成物4が、純粋な状態で、収率31で得られる。1HNMRδ826802756744632611445最大励起波長/蛍光波長=420/510nm50mMリン酸緩衝液、NaCl150mM、pH=7.5中100μM。実施例54-クロロメチル-7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン5の合成メチルスルホン酸10mL中に2-メチルレゾルシノール1gを溶解した溶液をフラスコ中に導入し、次いで、エチル4-クロロアセトアセテート1.3当量1.42mlを滴下する。室温で一晩攪拌した後、混合物を0°Cまで冷却し、次いで、水50mLを添加する。その後、残留物を濾過し、乾燥し、ジエチルエーテルで洗浄して化合物5を1.63g90得る。1HNMRδ75269064149321613CNMRδ16081597153615171235112311161111109841984実施例6ナトリウム4-クロロメチル-7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネート6の合成エタノール90mL中に1gの化合物5を溶解した溶液をフラスコ中に導入し、次いで、水22mL中に亜硫酸ナトリウム1.1当量、617mgを溶解した溶液を添加する。混合物を還流させる。20時間加熱した後、混合物を0°Cまで冷却する。溶液をブフナー漏斗で濾過し、得られたベージュ色の残留物をエタノールで洗浄し、濾液については、減圧下で蒸発させて黄色の固体を得る。この固体をエタノール及びジエチルエーテルで洗浄する。得られた両方の固体を収集して粗化合物6を1g80得る。その後、粗化合物6を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での数回連続の逆相クロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物6を収率23で得る。1HNMRδ73266961541919713CNMRδ1642158514891239112611221118111352473最大励起波長/蛍光波長=340/485nm50mMリン酸緩衝液、NaCl150mM、pH=7.5中10μM。実施例7ナトリウムβ-D-セロビオシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質8の合成保護糖の臭素化窒素雰囲気下で、アセト-α-D-セロビオース1g及び無水DCMジクロロメタン12.5mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、酢酸中33の臭化水素酸溶液15mLを滴下する。0°Cで5時間反応させた後、DCM25mLを添加し、次いで、混合物を10分間さらに攪拌する。その後、炭酸カリウム溶液を、CO2が発生しなくなるまで慎重に添加し、中間物を攪拌しながら20分間置く。デカンテーションの後、有機相を回収し、水相をDCMで3回抽出し、次いで有機相をまとめ、MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発させる。アセトブロモ-α-D-セロビオースが白色の固体として収率62で得られる。これによって得られた生成物は不安定で、直ちに使用するか、又は-20°Cで保存するべきである。1HNMRδ667555513495478455438420407384368209糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMFジメチルホルムアミド5mL中に希釈した40mgのクマリン2、及び炭酸銀150mgをフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-セロビオース4当量350mgを無水DMF10mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にきわめてゆっくり添加する。室温で一晩攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:20MeOH/80DCMでのクロマトグラフィーによって最終的に精製する。化合物7が収率4.8で得られる。アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、40mgの化合物7及び無水メタノール7.5mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール5mL中にナトリウムメチレート16mgを溶解した溶液を滴下する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。1時間攪拌した後、クエン酸の希釈溶液を添加することによって中間物を中和する。20分間さらに攪拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させて半透明の黄色の油を得る。得られた残留物を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆相クロマトグラフィーによって1回精製し、その後続いてHPLC高圧液体クロマトグラフィーによって精製する。HPLCの方法:0分→10分、1.5mL/分:100水10分→19分、1.5mL/分:90水/10アセトニトリル19分→23分、1.5mL/分:100アセトニトリル23分→25分、1.5mL/分:100水カラムの特性:Hypersilカラム、GoldPhenyl、Thermofisher5、長さ250mm、直径4.6mm。注入物は80μLであり、生成物は、0分→10分の間には水相中に流出するのみであり、その後すぐに遊離クマリンが溶解して存在する。凍結乾燥後、生成物8が、純粋な状態で、白色の固体として、収率30で得られる。1HNMRδ7556605174454383932実施例8ナトリウムβ-D-グルコシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質10の合成糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF5mL中に希釈した100mgのクマリン2、及び炭酸銀5当量をフラスコ中に導入する。アセトブロモacetrobromo-α-D-グルコース5当量を無水DMF5mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にきわめてゆっくり添加する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。室温で終夜攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:20MeOH/80DCMでのクロマトグラフィーによって最終的に精製する。化合物9が収率37で得られる。1HNMRδ7736635451444143440421アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、45mgの化合物9及び無水メタノール10mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液350μLを滴下する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。2時間30分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた残留物を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆クロマトグラフィーによって1回精製し、その後続いて、精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:純水、カートリッジSNAPC1812g、溶離流速:5mL/分で精製する。凍結乾燥後、生成物10が、純粋な状態で、収率54で得られる。1HNMRδ7526545114323783633634実施例9ナトリウムβ-D-キシロシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質12の合成保護糖の臭素化窒素雰囲気下で、アセト-β-D-キシロピラノース500mg及びDCM10mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、酢酸中33の溶液とした臭化水素酸5当量を滴下する。24時間反応させた後、DCM15mLを添加し、混合物を0°Cまで冷却し、次いで、氷水20mLを添加する。両層の分離後、有機相を飽和NaHCO3溶液で3回、水で3回洗浄する。MgSO4で乾燥し、濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。その後、得られたアセトブロモ-α-D-キシロースを直ちに次のステップに導入する。糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF8mL中に希釈した100mgのクマリン2、及び炭酸銀5当量をフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-キシロース5当量を無水DMF6mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にきわめてゆっくり添加する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。室温で一晩攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:20MeOH/80DCMでのクロマトグラフィーによって最終的に精製する。化合物11が、純粋な状態で、収率34で得られる。1HNMRδ770666546525504437432370213アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、62mgの化合物11及び無水メタノール15mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液500μLを滴下する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。1時間30分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた残留物を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆クロマトグラフィーによって1回精製し、その後続いて、精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:純水、カートリッジSNAPC1830g、溶離流速:15mL/分で精製する。凍結乾燥後、生成物12が、純粋な状態で、収率62で得られる。1HNMRδ7646665144434023537335実施例10ナトリウムβ-D-キシロビオシド6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質14の合成保護糖の臭素化アセト-D-キシロビオースを出発物として使用し、操作条件は実施例9において使用した条件と同一である。その後、得られたアセトブロモ-α-D-キシロビオースを直ちに次のステップに導入する。糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF5mL中に希釈した60mgのクマリン2、及び炭酸銀5当量をフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-キシロビオース3当量を無水DMF5mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にきわめてゆっくり添加する。室温で一晩攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:DCM中10MeOH~20MeOHのグラジエントでのクロマトグラフィーによって2回連続して精製する。化合物13が、純粋な状態で、収率18で得られる。1HNMRδ770661538516492478432418410403354209アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、27mgの化合物13及び無水メタノール7mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液200μLを滴下する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。3時間30分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。残留物を水中に採り、溶液を0.45μmまで濾過し、濾液を減圧下で再度蒸発させる。得られた残留物を精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:純水中5のアセトニトリル、カートリッジSNAPC1812g、溶離流速:3mL/分で精製する。溶媒を蒸発させた後、生成物14が、純粋な状態で、収率40で得られる。1HNMRδ7566585114404364103913823735340321実施例11ナトリウムβ-D-キシロポリオシドxylopolyoside6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質16の合成キシロポリオースxylopolyose即ちキシロビオース、キシロトリオース、の混合物のアセチル化窒素雰囲気下で、キシロポリオース300mg、4-ジメチルアミノピリジン数粒、無水DCM28mL及び無水ピリジン9mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、無水酢酸3mLを滴下する。その後、中間物を攪拌しながら一晩置く。その後、混合物を水で3回洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で蒸発させる。LC/MSによる分析から、混合物が、n=1~5のアセト-キシロポリオースから成ることがわかる。保護糖の臭素化アセト-キシロポリオース102mgを出発物として使用し、操作条件は実施例9において使用した条件と同一である。その後、得られたアセトブロモ-α-D-キシロポリオースを直ちに次のステップに導入する。糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF5mL中に希釈した60mgのクマリン2、及び炭酸銀5当量をフラスコ中に導入する。アセトブロモ-キシロポリオース106mgを無水DMF5mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にきわめてゆっくり添加する。室温で36時間攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:20MeOH/80DCMでのクロマトグラフィーによって最終的に精製する。LC/MSによる分析から、混合物が、n=0~4の化合物15から成ることがわかる。アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、10mgの化合物15及び無水メタノール5mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液100μLを滴下する。数時間攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発して、化合物16を得る。実施例12ナトリウムβ-D-グルコシド5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質18の合成糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF6mL中に希釈した80mgのクマリン4、及び炭酸銀5当量をフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-グルコース5当量を無水DMF5mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物に45分以内に添加する。室温で攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:10MeOH/90DCMでのクロマトグラフィーによって精製する。化合物17が、純粋な状態で、収率37で得られる。1HNMRδ804750725656631530508496456426421403210アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、60mgの化合物17及び無水メタノール15mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液450μLを滴下する。反応の進展をLC/MSによって追跡する。2時間50分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。残留物を水中に採り、次いで溶液を0.45μmまで濾過し、濾液を減圧下で再度蒸発させる。得られた残留物を、精製装置Biotage-IsoleraOne溶離剤:純水中5のアセトニトリル、カートリッジSNAPC1830g、溶離流速:10mL/分で精製する。溶媒を蒸発させた後、生成物18が、純粋な状態で、収率33で得られる。1HNMRδ8248187536806245254494035実施例13ナトリウムβ-D-キシロシド5,6-ベンゾ-7-ヒドロキシクマリン-4-メタンスルホネート基質20の合成糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF4mL中に希釈した55mgのクマリン4、及び炭酸銀5当量0.3gをフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-キシロース実施例9に記載した通りに得られたもの5当量を無水DMF4mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にゆっくり添加する。室温で20時間攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:10MeOH/90DCMでのクロマトグラフィーによって精製する。化合物19が収率42で得られる。1HNMRδ857800768755689652553531508461423378217アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、40mgの化合物19及び無水メタノール11mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液500μLを滴下する。2時間15分反応させた後、ナトリウムメチレート溶液400μLを再度添加する。3時間30分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた残留物を、充填済みシリカカラム溶離剤:純水中10のアセトニトリル、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆相クロマトグラフィーによって精製し、化合物20を収率35で得る。1HNMRδ8097997467386516164984374013834実施例14ナトリウムβ-D-グルコシド7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネート基質22の合成糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF7mL中に希釈した80mgのクマリン6、及び炭酸銀5当量377mgをフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-グルコース5当量563mgを無水DMF7mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にゆっくり添加する。室温で20時間攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を、シリカカラム溶離剤:10MeOH/90DCMでのクロマトグラフィーによって1回精製し、次いで、逆相クロマトグラフィーによって、充填済みシリカカラム溶離剤:純水中0~50のアセトニトリルのグラジエント、カートリッジPuriflashInterchromC18で精製する。これによって、化合物21が、純粋な状態で、収率17で得られる。1HNMRδ7857676475475305164441225208アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、18mgの化合物21及び無水メタノール5mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液100μLを滴下する。反応の進展をTLCによって追跡する。1時間30分攪拌した後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。化合物22が収率34で得られる。1HNMRδ7537066265154243903733634213実施例15ナトリウムβ-D-ガラクトシド7-ヒドロキシ-8-メチルクマリン-4-メタンスルホネート基質24の合成糖のクマリンへのグラフト窒素雰囲気下で、且つ光から保護して、無水DMF5mL中に希釈した80mgのクマリン6、及び炭酸銀5当量377mgをフラスコ中に導入する。アセトブロモ-α-D-ガラクトース5当量563mgを無水DMF5mL中に溶解する。その後、この溶液を先の混合物にゆっくり添加する。反応の進展をTLCによって追跡する。室温で40時間攪拌した後、溶液をセライトで濾過し、濾液を減圧下で蒸発させる。得られた固体を充填済みシリカカラム溶離剤:純水中0~50のアセトニトリルのグラジエント、カートリッジPuriflashInterchromC18での逆相クロマトグラフィーによって1回精製し、次いで、シリカカラム溶離剤:10MeOH/90DCMでのクロマトグラフィーによって精製する。このようにして、化合物23が、純粋な状態で、収率42で得られる。1HNMRδ78176564554953743742022321921220820313CNMRδ1708017065170081699716157157331525214864124581148211441114151107798487093706768606739612952611941193719191918703アセタール型の官能基の脱保護窒素雰囲気下で、45mgの化合物23及び無水メタノール20mLをフラスコ中に導入する。混合物を0°Cまで冷却し、次いで、メタノール中1g/gのナトリウムメチレート溶液300μLを滴下する。反応の進展をTLCによって追跡する。1時間30分攪拌した後も反応が完了しておらず、メチレート溶液300μLを再度添加する。3時間反応させた後、中間物が中和するまでAmberliteIR120をいくらか添加する。Amberliteを濾過した後、濾液を減圧下で蒸発させる。化合物24が収率36で得られる。1HNMRδ7517076245094036213このようにして得られた基質について、特に、精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1を検出するという用途が見出された。例えば、酵素抽出物の、キシラナーゼ及び/又はセルラーゼ及び/又はセロビアーゼ及び/又はグルコシダーゼ及び/又はキシロシダーゼ及び/又はガラクトシダーゼの活性activiteの蛍光アッセイを実施すること、或いは、酵素又は微生物若しくは細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1に基づいた、蛍光によるスクリーニングを実施することが可能であろう。より具体的には、本発明による新規な基質は、機械的攪拌によって作製した、油相中に懸濁している水滴エマルジョン中に分画した、精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出を可能にするであろう。したがって、油相中に懸濁している水滴中に分画した、酵素又は微生物又は細胞の、キシラナーゼ及び/又はセルラーゼ及び/又はセロビアーゼ及び/又はグルコシダーゼ及び/又はキシロシダーゼ及び/又はガラクトシダーゼの活性に基づいた、FACS蛍光活性化細胞選別FluorescenceActivatedCellSortingによるスクリーニングを実施することが可能であろう。さらにより具体的には、本発明による基質は、マイクロ流体デバイスによって作製した、油相中に懸濁している水滴エマルジョン中に分画した、精製若しくは未精製の酵素抽出物又は微生物又は細胞のグリコシダーゼ活性EC3.2.1の検出を可能にするであろう。この仮定に従えば、例えば、マイクロ流体デバイスによって生成された、油相中に懸濁している水滴中に分画した、酵素又は微生物又は細胞の、キシラナーゼ及び/又はセルラーゼ及び/又はセロビアーゼ及び/又はグルコシダーゼ及び/又はキシロシダーゼ及び/又はガラクトシダーゼの活性に基づいた、スクリーニングを実施することが可能であろう。上記の蛍光発生基質を使用した酵素活性の検出の種々の実施例を、決して限定としてではなく、指標として、以下に挙げることにする。実施例16基質10、12、14及び18を使用した、可溶性酵素抽出物の酵素活性の検出酵素反応速度分析を、セルラーゼ及びキシラナーゼ型の活性に富む可溶性酵素抽出物A、B、C及びDについて、マイクロプレート中で実行する。これらの抽出物を、50mMリン酸緩衝液、NaCl150mM、pH=7.5中に、10倍基質18、図1又は100倍基質10、12及び14、図2に希釈する。体積20μLの希釈酵素抽出物を、50mMリン酸緩衝液、NaCl150mM、pH=7.5中0.25mMの蛍光発生基質10、12、14又は1820μLに添加する。反応速度分析を30°Cで実行する。異なる蛍光発生基質を酵素で加水分解してから、励起波長及び蛍光波長を、基質10、12及び14では339nm及び452nm、基質18では375nm及び510nmとして、120分間蛍光を測定する。得られた結果図1及び2は、試験した蛍光発生基質が、使用した酵素抽出物中のβ-グルコシダーゼ型基質10及び18、β-キシロシダーゼ基質12及びキシラナーゼ型基質14の酵素活性の検出を可能にすることを示す。実施例17蛍光発生基質8及び10を使用した、微生物の酵素活性の検出種々の対照菌株を30°CのLB培地中で攪拌しながら240rpm18時間培養する。各菌株について、培養物を遠心分離し2,500g、5分間、細胞の沈殿物をLB培地5mL中で2回洗浄する2,500gで、5分間遠心分離。この沈殿物を使用して、蛍光発生基質8又は10を0.25mMで含有する誘導培地カルボキシメチルセルロース2.5g/Lを添加されたデュボス培地中に、培養物をOD=0.005で接種する。培養物を30°Cで攪拌せずに24時間インキュベートする。培養上清試料を種々のインキュベーション時間に採取して、培地中でのセルラーゼ活性又はβ-グルコシダーゼ活性の発生を追跡することができるようにする。これらの活性が発生してから、励起波長及び蛍光波長を388nm及び455nmとして、マイクロプレート中の培養上清の蛍光を測定する。得られた結果図3及び4は、試験した蛍光発生基質が、微生物の培養物のβ-グルコシダーゼ型基質10及びセルラーゼ型基質8の酵素活性の検出を可能にすることを示す。実施例18基質8を使用した、エマルジョン中の微生物のセルラーゼ活性の検出2つの対照菌株を使用する。即ち、一方はセルラーゼ活性を有し枯草菌BacillussubtilisNCIM2724、他方はいずれの活性も有しない大腸菌EscherichiacoliBL21。双方の菌株を30°CのLB培地中で攪拌しながら240rpm18時間培養する。各菌株について、培養物を遠心分離し2,500g、5分間、細胞の沈殿物をLB培地5mL中で2回洗浄する2,500gで、5分間遠心分離。この沈殿物を使用して、蛍光発生基質8及びスルホローダミン2.5μM枯草菌NCIM2724又は10μM大腸菌BL21を含有する誘導培地カルボキシメチルセルロース2.5g/Lを添加されたデュボス培地中に、培養物をOD=0.005で接種する。これらの細胞懸濁液の両方をペルフルオロ化油とともに使用して、液滴の各々が上記の懸濁液のうち1つを含有する該液滴の集団2つから成るエマルジョンを作製する。エマルジョンの試料について、作製時t=0時間、及びエマルジョンを30°Cで24時間インキュベートした後の再注入時に、液滴の青色及び赤色蛍光を個別に測定する。図5に示したグラフa及びbは、エマルジョンについて、その作製時a及び30°Cで24時間インキュベートした後のその再注入時bに測定した、赤色横座標、RFU及び青色縦座標、RFU蛍光強度の2次元ヒストグラムである。集団密度は、対数目盛で、ピンク1液滴から赤>1,000液滴に変化する色コードで示される。液滴の2つの集団は観察可能である。即ち、一方は枯草菌NCIM2724活性菌株及び2.5μMスルホローダミンを含有し、赤色蛍光が弱く、他方は大腸菌BL21不活性菌株及び10μMスルホローダミンを含有し、赤色蛍光が強い。これらのヒストグラムの統計的分析を表1に示す。活性菌株枯草菌NCIM2724を含有する液滴では、24時間インキュベートした後、その青色蛍光が顕著に増加したことがわかる図5。反対に、不活性菌株大腸菌BL21を含有する液滴は、その青色蛍光が全く増加していない。活性菌株枯草菌NCIM2724については、液滴の27が陽性と認められるが、不活性菌株大腸菌BL21については0.29である。結論として、基質8は、マイクロ流体システムによって生成されたエマルジョン内の微生物の、セルラーゼ型の活性の検出を可能にする。"