培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、a塩濃度約35MNaCl~約45MNaClを含む緩衝液で生体組織を灌流するかまたは生体組織をホモジナイズし;b第1培地にリパーゼおよびまたは洗浄剤を含む脱脂緩衝液で段階の生体組織を灌流するかまたは段階のホモジネートを抽出し、ここで前記第1培地の重量オスモル濃度は約250mOsmkg~約350mOsmkgであり、前記第1培地は無血清かつ中性pHであり;c中性pHかつ約20MNaCl~約50MNaClの塩濃度であって、生体組織内で同定されるコラーゲンを不溶性に保つように選択された塩濃度を含む緩衝液で段階の組織を灌流するかまたは段階のホモジネートを抽出しd緩衝液中、RNアーゼおよびDNアーゼで段階の組織を灌流するかまたは段階のホモジネートを抽出しe中性pHかつ無血清であり、約250mOsmkg~約350mOsmkgの重量オスモル濃度を有する第2培地で段階の組織またはホモジネートをリンスし、それによって、生体組織から、無傷のまたはホモジナイズしたバイオマトリックス足場であって、コラーゲンの少なくとも95および生体組織のコラーゲン結合性マトリックス成分およびマトリックス結合性増殖因子、ホルモンおよびサイトカインの大部分を含む前記足場を製造し;f基礎培地でバイオマトリックス足場を希釈し;g約80°Cでのバイオマトリックス足場を凍結し;h大きさが約1μm~約100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによってのバイオマトリックス足場を粉砕し;iのバイオマトリックス粒子を基礎培地中、懸濁状態で解凍し;j段階のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布することを含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する前記方法。バイオマトリックス足場を滅菌する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。滅菌する段階がγ線照射によって行われる、請求項3に記載の方法。のバイオマトリックス足場が約16比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。のバイオマトリックス粒子が約124比で基礎培地に希釈される、請求項1に記載の方法。第1培地が塩、ミネラル、アミノ酸、ビタミンおよび糖を含む、請求項1に記載の方法。第1培地が基礎培地である、請求項1に記載の方法。基礎培地がRPMI1640、DMEF12、DME、F12、ウェイマウス培地およびウィリアム培地からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。第2培地が、間質液に存在する成分の少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。段階の脱脂緩衝液が、第1培地に、約20単位L~約50単位LのホスホリパーゼA2および約1のデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項1に記載の方法。段階の緩衝液の塩濃度が、成人肝臓からの足場製造に用いる場合、約34MNaCl~約35MNaClであり、胎児肝臓からの足場製造に用いる場合、約40MNaCl~約45MNaClである、請求項1に記載の方法。段階の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項12に記載の方法。段階の緩衝液が、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、請求項1に記載の方法。プロテアーゼインヒビターが大豆トリプシンインヒビターである、請求項13に記載の方法。段階~のすべての培地および緩衝液が、細胞外マトリックス成分を分解する酵素の検出可能な量を含まない、請求項1に記載の方法。生体組織が、肝臓組織、肺組織、膵臓組織、甲状腺組織、腸管組織、皮膚組織、血管組織、膀胱組織、心臓組織および腎組織からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。生体組織が哺乳動物由来である、請求項1に記載の方法。請求項1~18のいずれかに記載の方法によって製造されるバイオマトリックス足場。実施例1組織特異的バイオマトリックス足場によって、ヒト肝幹細胞の成熟運命への系統限定が効率的となる要約。幹細胞の分化のための現行のプロトコルは、可溶性シグナルおよびまたはマトリックス因子の複数の処理を利用し、一般的には、成人組織特異的遺伝子の過小発現または過剰発現を伴う成熟細胞への部分的分化をもたらす。本発明において、目的とする成人細胞型に合わせた、無血清ホルモン添加培地と組み合わせた、バイオマトリックス足場の基材である細胞外マトリックスの富化した組織特異的抽出物と関連する増殖因子およびサイトカインとを用いる、幹細胞の迅速かつ効率的な分化のための戦略が開発された。本明細書に記載の研究は、ヒト肝幹細胞を成熟運命に分化させることおよび、成熟実質細胞を完全に機能するように長期間維持することにおける本発明のバイオマトリックス足場の有効性を明らかにしている。バイオマトリックス足場は、すべてのコラーゲンタイプを不溶性に保つように設計された条件を用いる新規4段階潅流脱細胞化プロトコルによって製造された。この足場は、天然組織構造、親血管、おおよそ1の組織タンパク質、組織のコラーゲン結合性マトリックス成分の大部分ならびに生理的レベルのマトリックス結合性増殖因子およびサイトカインを維持していた。コラーゲンは、ほとんど検出できないレベルから足場のタンパク質の15を超えるレベルまで増加し、残りは、組織構造と関連したパターンでラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、ナイドジェンエンタクチン、プロテオグリカンならびにマトリックス結合性サイトカインおよび増殖因子を含んでいた。肝臓バイオマトリックス足場に播種され、成人肝臓細胞に合わせたHDMに入れられたヒト肝幹細胞は、おおよそ1週間で幹細胞マーカーを消失し、機能しうる成熟実質細胞に分化し、8週間を超えて生存し、安定な成熟細胞表現型を維持していた。従って、本発明のバイオマトリックス足場は、系統が限定された幹細胞の生物学的および医薬研究に、成熟細胞の維持に、そして操作された植込み型血管化組織または臓器に用いることができる。脱細胞化のための手順。ケタミンキシラジンで麻酔後、ラット腹腔を切開し、全肝臓を潅流するために門脈にカニューレ付きスリーブを挿入した。RPMI1640で潅流を10分間行い次いで、穏やかな洗浄剤、例えば、1デオキシコール酸ナトリウムが混合されたリパーゼで、組織が透明になり滲出液が澄明になるまで約30~60分間脱脂し高塩洗浄での潅流を、280nmの吸光度によって潅流液がタンパク質陰性になるまで行い潅流液が、OD260によって核酸陰性になるまで、ヌクレアーゼのRPMI1640液で潅流し、RPMI1640で2時間以上最終リンスを行う。このバイオマトリックス足場をドライアイスで急速に凍結し、クリオスタットで凍結切片を調製し、24ウェル細胞培養プレート上に置き、γ線照射で滅菌し、細胞を播種する前に30分間培地で再水和した。バイオマトリックス足場の切片は、24ウェルプレートにおけるウェル表面の~95を覆っていた。液体窒素を充填したフリーザーミルを用いてバイオマトリックス足場を粉末に粉砕することからなる方法を、培養ディッシュへのバイオマトリックス足場の配置の代替法に用いた。粉砕された粉末は、室温にするとペイントのコンシステンシーが得られ、これは細胞およびまたは細胞培養物を接着させるために用いる任意の表面、例えば、ディッシュ、スライド、布、フィルターまたは他の表面にコーティングすることができる。足場を粉砕することによって、マトリックス成分およびシグナルの勾配は失われるが、存在する成分の混合物は、なお強力な分化作用を誘導する。invivoでの移植のために、あるいは三次元培養のために、操作された臓器の調製において、この足場は無傷で細胞を再播種して使用することもできる。ブタおよびウシの肝臓に用いるための代わりの方法を開発した。ブタおよびウシの肝臓は、USDA認定食肉処理施設から入手した。典型的プロトコルの概要については実施例3を参照のこと。各肝臓はUSDAによる検査済みであり、施設を出る前にUSDA印を受けた。肝臓は、ESPGro培地に入れて運んだ。研究室で受け取った肝臓を計量し、写真を記録し、潅流用に調製した。粉砕後、混合物を解凍し、148の培地バイオマトリックス比で希釈した。次いで、このバイオマトリックススラリーを、プレートをコーティングするために用いた。乾燥後に、バイオマトリックスを3回洗浄し、次いで細胞を塗布した。成人肝臓細胞は、10分以内にプレートに接着した。幹前駆細胞は、より長い時間かかる場合がある。しかしながら、幹前駆細胞および成人肝臓細胞の両方に関して、本質的に100の生存細胞が接着する。培地および溶液。使用前に、すべての培地を無菌濾過し、暗所で4°Cに保った。バイオマトリックスにおいてコラーゲンを安定に保つために、バイオマトリックス足場製造物のための潅流培地のpHを75~80に保った。バイオマトリックス足場の製造のためおよび肝細胞もしくは肝幹細胞培養物のための基礎培地としてRPMI1640を用いた。特記しない限り、すべての試薬はSigma社から入手した。バイオマトリックス足場製造のための潅流培地潅流洗浄および潅流リンス無血清基礎培地洗浄剤での潅流36単位LPLA21SDC高塩での潅流01mgml大豆トリプシンインヒビターを含む34MNaClヌクレアーゼでの潅流5mg100mlRNアーゼ、1mg100mlDNアーゼおよび01mgml大豆トリプシンインヒビター。Kubota培地。KMは、もともとは肝芽細胞47のために設計されたが、今回、ヒト肝前駆細胞48ならびに胆管および膵臓からのものを含む他の内胚葉前駆細胞に有効であることが見出された。これは、銅なし、低カルシウム、109Mセレン、01BSA、45mMニコチンアミド、01nM硫酸亜鉛七水和物、108Mヒドロコルチゾン、5μgmlトランスフェリンFe、5μgmlインスリン、10μgml高密度リポタンパク質および、精製ヒト血清アルブミンに結合させて添加される遊離脂肪酸の混合物を含む任意の基礎培地からなる。細胞を成人運命に分化させるために、所望の成人細胞型に合わせた無血清ホルモン添加培地を使用することができる。例えば、我々は、06mM濃度を達成するためのカルシウム、1012M銅、1nMトリヨードサイロニン、7ngmlグルカゴン、20ngmlFGF、2gLガラクトース、10ngmlオンコスタチンM、10ngml上皮増殖因子、20ngml肝細胞増殖因子および108Mヒドロコルチゾンをさらに添加したKMからなる成人肝臓運命のためのHDMを用いた。細胞を足場にプレーティングしたら、この無血清HDMに播種した。細胞または組織を処理するために酵素が用いられる場合は、HDMに5FBSを数時間添加し、その後無血清HDMに交換した。並行して、対照実験において、培養物を最後まで5FBSを含むHDMで維持したが、血清の存在により、時間と共に細胞が分化した機能を失うことを我々は見出した。バイオマトリックス足場には因子の非常に多くが結合していることを考慮すれば、可溶性因子への要求は、他の基材での培養に関する通常の要求よりも少ない。バイオマトリックス足場には因子の非常に多くが結合していることを考慮すれば、可溶性因子への要求は、他の基材での培養に関する通常の要求よりも少ない。肝臓バイオマトリックス足場における無傷の脈管樹の解析。ラット肝臓バイオマトリックス足場における毛細血管のネットワークを含む血管の分枝し小区分化されたマトリックス残存物を、それぞれ光学および蛍光顕微鏡検査によって可視化した。バイオマトリックス足場における脈管系のマトリックス残存物の完全性をチェックするために、門脈の残存物を介して肝臓バイオマトリックス足場にローダミン標識した250kDaデキストラン粒子を注入した。LeicaMZ16FA蛍光解剖顕微鏡を用いて映画を作成した。ヒト胎児肝臓の処理。妊娠の選択的終結によって得られた在胎齢16~20週齢の胎児からの胎児肝臓組織は、認定機関によって提供を受けた。本研究プロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校におけるヒト研究倫理委員会の審査を受け、承認された。胎児ヒト肝臓細胞の懸濁液は、以前の報告4849と同様に調製した。簡潔に言えば、01ウシ血清アルブミン、1nMセレンおよび抗生物質を添加したRPMI1640で処理を行った。300UmlのIV型コラゲナーゼおよび03mgmlのデオキシリボヌクレアーゼを含む酵素処理緩衝液で、32°Cにおいて、15~20分間急速に撹拌した。富化した懸濁液を75ゲージメッシュに加圧して通し、1200RPMで5分間遠心分離し、次いで再懸濁した。トリパンブルー排除法によって算出される細胞生存率は、ルーチンに95より高かった。hHpSCの富化およびバイオマトリックス足場での培養。hHpSCの精製または富化のために我々は2つ方法を用いた1培養選択。10cm組織培養ディッシュのKM中におおよそ3x105細胞をプレーティングした。培地を3日毎に交換した。コロニーは5~7日以内に形成され、これを3ヶ月目まで観察した。14~18日後に、倒立顕微鏡を用いて、コロニーを手で拾った。2多能性肝前駆細胞サブ母集団の磁気免疫選択は、製造業者による使用説明書50に従って、MiltenyiBiotechMACSシステムによる磁性ビーズ免疫選択技術を用いて、上皮細胞接着分子に陽性な細胞を選択することによって達成した。簡潔に言えば、磁気マイクロビーズに結合させたEpCAM抗体と共に解離した細胞を4°Cで30分間インキュベートし、製造業者の推奨する手順に従って、Miltenyi製の磁気カラム分離システムを用いて分離した。250のhHpSCコロニーまたは5×105の富化したhHpSCもしくは25×105の成人肝細胞のいずれかの培養物を播種した。培地を毎日交換し、培地を採取し、20°Cで保存してさらに分析を行った。I型コラーゲンをコーティングした24ウェルプレート上で培養された細胞を対照として用いた。成人ラット肝細胞の単離。体重200~250gの3ヶ月齢の成体オスLewisラットから、ラット肝細胞の新鮮分離懸濁液を得た。ラット肝細胞の分離精製に関しては、以前報告した改善された2段階潅流法を用いた。EGTAを含むカルシウム不含緩衝液で肝臓を10~15分間潅流し、次いでコラゲナーゼを含むカルシウム含有緩衝液で10~15分間潅流した。次いで、チーズクロスを通して消化された肝臓を圧迫することによって肝臓を機械的に分離し、次いで、狭められたメッシュサイズのふるいで細胞浮遊液をフィルタリングした。細胞を2回洗浄し、次いで50gでペレット化した。トリパンブルー染色後に細胞を計数することによって、生存率を明らかにした。89~96の生存率と99を超える純度でラット1匹当たり2億~3億の細胞がルーチンに単離された。ヒト成人の肝臓細胞の単離および培養。新鮮なヒト肝臓細胞浮遊液は、CellzDirect社から得た。懸濁液は、CellzDirect社の方法によって処理され、次いでHeptoMAIN培地に再懸濁し、肝臓バイオマトリックス足場でコーティングされたマルチウェルプレートに、またはI型コラーゲンに188x105細胞cm2でプレーティングした。コラーゲンの化学的性質の分析。ヒドロキシプロリン含量に基づいて、バイオマトリックス足場におけるコラーゲンの量を評価した。全肝臓試料およびバイオマトリックス足場試料を粉砕し、洗浄し、凍結乾燥した。次いでアリコートをアミノ酸分析51に供し、300残基コラーゲンのhyp値に基づいて、総タンパク質当たりのコラーゲン含量を算出した。DNAおよびRNA含量の定量分析。脱細胞化した肝臓バイオマトリックスに残っている全DNAを評価するために、新鮮ラット肝臓組織および脱細胞化したバイオマトリックスの両方を計量し、切断し、プロテイナーゼKで消化し、全細胞内DNAを単離した52。脱細胞化した肝臓バイオマトリックスに残っている全RNAを評価するために、新鮮ラット肝臓組織および脱細胞化したラット肝臓バイオマトリックスの両方を計量し、次いでTRIzol溶液でホモジナイズし、全細胞RNAを単離した。増殖因子アッセイ。ラット肝臓、ラット肝臓バイオマトリックス足場、ヒト胆管組織およびヒト胆管バイオマトリックス足場の試料を増殖因子の分析のためにRayBiotech社に送った。試料をホモジナイズし、溶解物として調製し、次いで、1mgmlのタンパク質を用いてアッセイし、蛍光を生じさせ、蛍光強度単位で特徴づけた。RayBioヒト増殖因子アレイGシリーズ1を用いて半定量的増殖因子アッセイを行った。タンパク質濃度に対して正規化した非特異的結合に関する陰性対照からのFIUをこのFIUから差し引いた。2連試験からのデータを平均化した。~40の増殖因子の調査を可能にする4つのアレイを用いた。本アッセイは、ヒト増殖因子用に開発されたものであるが、ラットおよびヒト試料の両方の使用を可能にする、ラット増殖因子に対する交差反応における十分なオーバーラップがある。透過型電子顕微鏡法および走査型電子顕微鏡法。TEMのために、バイオマトリックス足場をリン酸緩衝化生理食塩水でリンスし、3グルタルアルデヒド01カコジル酸ナトリウムで終夜で固定した。カコジル酸ナトリウム緩衝液での3回のリンス後に、1四酸化オスミウム01カコジル酸ナトリウム緩衝液で1時間バイオマトリックス足場を後固定した。脱イオン水中で洗浄後、これを脱水し、Polybed812エポキシ樹脂に封入した。菱形ナイフを用いて、70nmで、支持体と直角にバイオマトリックス足場を切片化した。200メッシュ銅グリッド上に超薄切片を採取し、4酢酸ウラニル水溶液で15分間、次いでReynoldsのクエン酸鉛で7分間染色した。80kVで作動するLEOEM910透過電子顕微鏡を用いて試料を調べた。GatanOriusSC1000CCDDigitalCameraおよびDigitalMicrograph3110を用いてデジタル画像を得た。SEMのために、固定およびリンス後、バイオマトリックス足場を脱水し、100エタノールに含ませてBalzersCPD020臨界点乾燥機に移し、二酸化炭素を抽出溶媒として用いて乾燥した。炭素製接着性タブを有するアルミニウム製試料台にこのマトリックスを乗せ、HummerXスパッタコーターを用いて、厚さ10nmの金パラジウム金属でコーティングした。加速電圧5kVでZeissSupra55FESEMを用いて試料を検査し、ZeissSmartSEMソフトウェアを用いてデジタル画像を得た。免疫細胞化学および免疫組織学。バイオマトリックス足場での培養細胞の蛍光染色のために、室温で20分間4パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、HBSSでリンスし、10ヤギ血清HBSS溶液で2時間ブロッキングし、リンスした。固定した細胞を、一次抗体と共に4°Cで終夜インキュベートし、洗浄し、標識されたアイソタイプ特異的二次抗体で1時間インキュベートし、洗浄し、細胞核を可視化するために46ジアミジノ2フェニルインドールで対比染色し、LeicaDMIRB倒立顕微鏡を用いて観察した。免疫組織化学のために、バイオマトリックス足場を4PFAで終夜固定し、70エタノール中で保存した。それらをパラフィン包埋し、5μmの切片にした。切片を脱パラフィンし、抗原を回復した。03H2O2溶液で30分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼをブロックした。10ウマ血清でブロッキング後、終夜4°Cで一次抗体で処理し、RTUVectastainキットを用いて二次抗体およびABC染色を行った。基質としてVectorNovaREDを用いた。切片を脱水し、固定し、EukittMountingMediaに封入し、これを倒立顕微鏡を用いて分析した。肝臓切片および培養物のために用いた抗体を表4に示す。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析。hHpSCを細胞培養プレートで培養し、コロニーをバイオマトリックス足場に移した。さらに7日間培養した後、RTPCRのためにコロニーを溶解した。製造業者の使用説明書に従って、RNeasyPlusMiniKitを用いて全RNAを抽出した。RTPCRのためのSuperScriptFirstStrandSybthesisSystemを用いて逆転写を行った。PCRのためにHotStarTaqMasterMixKitを用いた。表5にPCRプライマーを示した。生死アッセイおよび細胞生存率アッセイ。接着および増殖アッセイのために生死生存率アッセイキットを用いた。それぞれ細胞内エステラーゼ活性および血漿膜の完全性に関する2つプローブ、カルセインAM、ライトグレーおよびエチジウムホモダイマー1と共にhHpSCまたは肝細胞をインキュベートした。蛍光OlympusSZX12双眼実体顕微鏡で試料を観察した。製造業者のマニュアルに従って、レサズリン細胞生存率アッセイキットを用いた。簡潔に言えば、10レサズリン溶液を培地に添加し、37°Cで終夜インキュベートした。BiotekSynergyHTマルチ検出マイクロプレートリーダーを用いて吸光度OD570OD600を測定し、生存率曲線をプロットした。実験条件当たり最低限3つの試料を用い、すべての実験を3回行った。肝臓特異的機能アッセイ。P450Gloスクリーニングシステムを用いてCYP4503A4活性を検出した。簡潔に言えば、CYPの発光性CYP3A4基質であるルシフェリンPPXEを含む培地と共に培養細胞を37°Cで4時間インキュベートした。製造業者の使用説明書に従って、WallaceVictor2MultilabelCounterの一部であるを用いてルシフェリンの検出および分析を行った。ヒトアルブミンELISA定量キットを用いて、アルブミン分泌量の定量を行った。尿素合成アッセイのために、2mMアンモニウムと共に細胞を24時間インキュベートし、上清を採取し、Quantichrom尿素アッセイキットを用いてアッセイした。各培養条件に関して1つの試料から上清を3連でアッセイし、この実験を3回繰り返した。統計解析。各条件に関して2連または3連の試料を用いて実験を少なくとも2~3回繰り返した。典型的実験からのデータを示すが、複数の試験において同様な傾向が見られた。すべてのエラーバーは標準誤差を示す。バイオマトリックス足場は新規4段階プロトコルで製造する。脱脂に続く高塩抽出を含むプロトコルを用い、潅流法を用いてバイオマトリックス足場を製造した。本方法におけるプロトコルの詳細な紹介を行う。これは新規4段階プロトコルによって達成される1穏やかな脱脂2コラーゲンを不溶性状態に維持することが知られている塩濃度23コラーゲンを不溶性状態に維持することが知られている濃度23である、塩濃度約20M~約50Mを有する緩衝液での洗浄3残留核酸を除去するためのヌクレアーゼ処理および4洗浄剤、塩およびヌクレアーゼ残留物を除去し、マトリックス成分を培地で平衡化させるための基礎培地でのリンス。ヌクレアーゼのためのリンス培地または緩衝液の選択は、その塩濃度およびイオン強度が、例えば、マトリックス成分を不溶性状態に維持する限り、多くの選択肢のいずれであることもできる。有効でありかつ穏やかであるためには、脱脂方法の選択が重要である。細胞質膜およびミトコンドリア膜に位置するホスホグリセリドを、強力な界面活性剤であり、壊死および細胞溶解を誘導することができるリゾレシチンに急速に分解するために、我々は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホスホリパーゼA2の組み合わせを選択する。反応式を図8に示す。マトリックス成分の一部、例えばグリコサミノグリカンを溶解する恐れのある過酷な洗浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムまたはトリトンX100を我々は避けたによる概説を参照のこと。我々は、脱脂および高塩洗浄中における、破壊された細胞からの酵素への足場の長期の暴露を避けた。なぜなら、それによって、エラスチンの含量ならびに、サイトカインおよび増殖因子の結合部位であるグリコサミノグリカン、例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸およびヘパリンの含量を著しく減少させる恐れがあるためである24。我々は、破壊された細胞由来のプロテアーゼの活性を抑制するために、大豆トリプシンインヒビターを用い、pH、温度および時間の注意深い調節を行った。我々は、関連脈管構造を介して全組織を潅流したが、これにより、マトリックス成分の損失を最小限に抑えて、バイオマトリックス足場を急速に分離することが可能になった。単離の迅速さは、おおよそ30~60分以内他の著者により用いられたプロトコルのように数時間または数日ではないに組織を脱脂する洗浄剤での最初の段階のおかげである。得られたバイオマトリックス足場は半透明または白色である。さらに、この潅流法を用いて、我々は、主要な脈管チャンネル、門脈、肝静脈および肝臓における脈管枝の大部分を維持し、それにより脱細胞化効率が増加した。バイオマトリックス足場を通じて潅流した蛍光性ローダミン標識デキストラン粒子は、血管の残存物内にとどまり、それらが明白であることを示している。チャンネルに沿って、漏出なしに、大血管から微細血管枝まで色素の連続した流れがある。この事実は、三次元培養およびまたはexvivoでの移植のいずれかのために操作された組織を調製する手段として、足場の血行再建術に役に立つと考えられる。切片にされた場合、足場は、主要な組織実体例えば、認識しうる血管、胆管およびグリッソン嚢の残存物を含む元の組織の組織構造を保持している。肝臓組織の切片がバイオマトリックス足場の切片と対比される図1B1と1D1を比較されたい。実質細胞の壁のマトリックス残存物は、レース状のネットワークからなっていた。コラーゲン、コラーゲン結合タンパク質および結合性サイトカインはバイオマトリックス足場に維持されている。バイオマトリックス足場におけるコラーゲンの量を、以前用いた方法を用い、アミノ酸分析によって評価した25。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンおよびコラーゲン性タンパク質に特有であるため、総タンパク質に対するコラーゲンの組成を、1000アミノ酸当たりのHypの残基数として表した。その結果、肝臓における、ほとんど検出できないレベル、すなわち、ヒドロキシプロリン02残基未満1000から、バイオマトリックス足場におけるHyp~13残基1000までコラーゲン含量が増加したことが明らかとなった。このことは、前述の脱脂および高塩洗浄によってコラーゲンは除去されず、コラーゲンのほとんどはバイオマトリックス足場に残っていたことを示している。バイオマトリックス足場におけるヒドロキシリジン、他のコラーゲン結合性アミノ酸および高レベルのグリシンの有意なレベルの検出は、バイオマトリックス足場においてI型コラーゲンが著しく富化しているという我々の結論を支持している。免疫組織化学および超微細構造研究を用いて、原繊維コラーゲンおよび珠状に連なったフィラメントを含む、insituで肝臓に存在するコラーゲンのすべての既知の型を足場において同定することができた。これらの繊維およびフィラメントは、中皮細胞層の下に位置する嚢下結合組織層に存在する。肝三つ組から中心静脈までの類洞に沿って、典型的な基底膜の構造は見いだせなかったが、IV型コラーゲンおよび一部の結合性小細繊維が実質細胞の足場としての機能を果たす網状多孔質3D格子を形成しているのを観察した。I型コラーゲン線維束が、他の型のコラーゲン、糖タンパク質およびプロテオグリカンが接着した足場の主要な構造として見ることができる。ディッセ腔において、I型コラーゲンの小線維束と、III型およびVI型ならびに肝三つ組および中心静脈により豊富なV型の一部のコラーゲンの繊維を見出した。典型的な免疫組織化学データを図3Bに示し、正常肝臓組織におけるマトリックス成分およびそれらの位置に対するバイオマトリックス足場におけるマトリックス成分およびそれらの位置の概要のリストを図4Dに示す。バイオマトリックス足場製造のためのプロトコルの開発における初期の研究によって、細胞骨格成分の大部分が洗浄剤中に失われることが示された。さらに、我々は免疫組織化学によって足場を評価したところ、チューブリン、デスミンまたはアクチンの証拠は見いだせず、微量のサイトケラチン18および19ならびに、足場全体に散在する低レベルのビメンチンが認められた。胆管および一部の肝脈管系と関連するマトリックスは典型的な基底膜構造からなり、類洞に存在する脈管構造と関連するマトリックス薄層とはきわめて異なる。肝三つ組にはラミニン、エンタクチンナイドジェン、パールカンおよびIV型コラーゲンが存在するのに対し、ディッセ腔には、パールカンおよび少しのIV型コラーゲンのみが存在する。疎水性で波状の大量のエラスチンが存在する。これは、互いに架橋し、主として嚢下結合組織、門部および動脈壁に限定してシートおよび繊維を形成する。フィブロネクチンは、肝マトリックスを通じて偏在し、優勢であり、特にディッセ腔において豊富であり、そこでフィブロネクチンは微細フィラメントまたは粒状沈着物のいずれかを形成する。組織における既知のプロテオグリカンは、バイオマトリックス足場に保存されていることを免疫組織化学は示している。同定された不均一なプロテオグリカンの中で、シンデカンは、類洞に沿って連続的にインターカレートしていることが見出され、パールカンは、ディッセ腔においてより強調されている。バイオマトリックス足場における類洞の残存物を通じて、肝臓組織の既知の帯状配列に関連したパターンでHSPG体およびCSPG体が見出される。プロテオグリカンおよび他のマトリックス成分は、サイトカインおよび増殖因子の重要な貯蔵器であり、それらのGAGに強く結合する26。増殖因子およびホルモンの大部分は、元の組織に存在する濃度に近い濃度でバイオマトリックス足場に存在する。ラット肝臓の溶解物に対するラット肝臓バイオマトリックス足場の溶解物からのデータを表6に示し、ヒト胆管組織に対する胆管バイオマトリックス足場からの類似したデータを表3に示す。興味深いことに、肝臓溶解物に存在するものよりも肝臓バイオマトリックス足場において強く富化したいくつかの例があった。結合している増殖因子およびサイトカインは、肝臓の足場に対する胆管組織の足場で定性的かつ定量的に異なっており、組織特異性または種特異性のいずれかを意味している。あるいは、一部分において、胆管足場は、必要性から、ロッカー上で緩衝液中で組織を振盪することによって製造したものであって、脈管を介した潅流によって製造したものではないという事実による可能性もある。バイオマトリックス足場の化学的性質は、組織構造に関連する。この新規プロトコルの著しい特徴は、図4A~Cに示すように、肝三つ組から中心静脈への肝腺房第1領域~第3領域と、組織実体例えば、脈管チャンネルおよびグリッソン嚢とに関連するパターンにマトリックスの化学的性質を維持していることである。第1領域における門脈周囲のマトリックスの化学的性質は、胎児肝臓においてみられるものと類似しており、一部分において、III型コラーゲン、ラミニンからなり、CSPGを形成する。中心腺房および中心静脈周辺領域において異なるマトリックスの化学的性質に移行し、高濃度IV型コラーゲンおよびHPPGを含む大変安定なマトリックスになる27。無数のタンパク質がマトリックスに結合し、GAGまたは他のマトリックス成分における不連続な特定の硫酸化パターンへの結合によって安定に保持されていることが知られている24。従って、マトリックスの化学的性質は、高い回転および最小限の硫酸化と関連する不安定なマトリックスの化学的性質を有する幹細胞ニッチにおけるその開始点から、中心静脈周辺領域への進行と共に硫酸化の量が増加する、安定なマトリックスの化学的性質へと移行する。我々は、天然の構造と、組織構造に関連するマトリックスの化学的性質の維持は、バイオマトリックス足場での特定部位に細胞を導くことによって、かつまたは増殖およびまたは成熟細胞に分化させるシグナルの適当な混合物を提供することによって、組織工学プロセスにおける再細胞化を促進すると予想している。バイオマトリックス足場は、異なる組織および種から製造できる。バイオマトリックス足場は、正常または病気の任意の組織および任意の種から容易に製造できる。図13~16に、ヒト膵臓、胆管および十二指腸ならびにラットおよびブタ膵臓からのバイオマトリックス足場を示す。図5~7および図12に、肝細胞に対するウシまたはラット肝臓のバイオマトリックス足場の効果を示す。さらに、ヒト腹部大動脈、腸骨静脈ならびにラットおよびブタ腸からバイオマトリックス足場を製造した。バイオマトリックス足場での組織、超微細構造および免疫組織化学研究は、それらの構造、化学組成物および機能における著しい組織特異性を示しているが、種特異性を示してはいない。バイオマトリックス足場は、細胞の分化を誘導およびまたは維持した。肝臓バイオマトリックス足場の切片を含むディッシュにhHpSCをプレーティングし、成人肝臓細胞に合わせたHDMに入れることによって、数時間以内に、バイオマトリックス足場に、それが無傷であっても、低温粉砕後であっても、本質的に100の生存細胞が接着した。足場の切片に最初に形成される細胞のコロニーは、それらの幹細胞表現型の一部を保持していた。なぜなら、コロニーの中央における細胞は、色素での染色に抵抗することができたし、古典的肝前駆細胞マーカー、例えば、ケモカイン受容体4および上皮細胞接着分子を発現したからである。それらは1回かまたは2回分割し、次いで細胞周期停止に移行し、成熟実質細胞の培養物に典型的な3次元索状形態に移行した。用いたHDMは、通常のサイトカインまたは増殖因子を全部は必要としなかった。なぜなら、これらはバイオマトリックス足場に結合して存在しているからである。増殖停止への移行は、生細胞染色色素でのコロニーの端から端までの染色、EpCAMおよびCXCR4の発現の消失ならびに、成人特異的肝細胞および胆管細胞遺伝子、例えば尿素およびシトクロムP4503A4の発現における安定した増加と関連していた。正常成人ラットおよび成人ヒト幹細胞をI型コラーゲンまたは、ラットもしくはウシ肝臓からのバイオマトリックス足場にプレーティングし、これらを成人細胞のためのHDMに入れた。成人実質細胞は、10分以内に足場に接着することができたのに対し、I型コラーゲン上では数時間以内であり、それらは結合時点から増殖停止のままであり足場上では8週間を超えて生存し、完全に機能したのに対し、I型コラーゲン上では約~2週間のみであった。バイオマトリックス足場での数週間にわたる成熟肝臓細胞の機能のレベルは、他の新鮮分離成人肝細胞の所見と同じか同様であることが判明した28。劇的な相違は、I型コラーゲンの培養物が2週間後に急速に悪化するのに対し、バイオマトリックス足場上の培養物は、培養物が維持されている限りは、形態的におよび機能的に安定なままでいたことである。バイオマトリックス足場は、成人肝臓運命にhHpSCを誘導するばかりでなく、数週間完全に分化させたままで成人細胞を維持する異例な能力を有する、不溶性で安定な足場として使用できる化学シグナルの複合セットを提供する、組織の細胞外マトリックス成分およびマトリックス結合性サイトカインおよび増殖因子の大部分を含む。研究者によって製造されたマトリックス抽出物の現存しているタイプと本発明のバイオマトリックス足場との比較において、物理的、酵素的および化学的処理は、組成、機械的挙動および、天然組織および臓器の脱細胞化由来の生体足場に対する宿主反応に対して実質的影響を有し、従って、それらのinvitroおよびinvivo応用に関して重要な意味を有することは明らかである。基材または足場の製造のためのすべての他の既存の方法は、マトリックス分解酵素の使用16または、マトリックスの主要部分を溶解する緩衝液の使用11のいずれかによって、マトリックス成分の大部分の除去をもたらす。層状構造物を有する組織、例えば真皮29からマトリックス抽出物を製造するために物理的な方法は役に立つことはできるが、複雑な組織構造を有する臓器、例えば肝臓には有用ではない。一方、バイオマトリックス足場のための我々の方法では、大部分の細胞タンパク質の損失をもたらしたが、本質的にすべてのまたは少なくとも大部分のコラーゲンならびに、マトリックス結合性サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子を含むコラーゲン結合性成分が保存された。細胞外マトリックスは、モザイク式の脂質二重層に封入されているが、これは最も単純な生物体においてさえも、複雑で不均一で動的な環境である。本脱脂方法は、本プロトコルの決定的な側面である。組織の脱細胞化に一般的に用いられる方法は、イオン性洗浄剤、例えばSDCおよびドデシル硫酸ナトリウムを含む。SDCは、SDSよりも比較的穏やかであり、天然組織構造に破壊をおこしにくく、細胞質膜および核細胞膜の両方の溶解に影響が少ない30。SDC単独を用いての組織脱細胞化の報告はない。多くの研究は、過酷な非イオン性洗浄剤31または双性イオン洗浄剤ジメチルアンモニオ1プロパンスルホナート、CHAPS32を利用している。一方、SDCおよびPLA2の組み合わせを用いる我々の方法は、急速にかつ穏やかに組織を脱脂する。これまで、脊椎動物において、細胞接着、分化、増殖、組織発達および構造健全性に機能的役割を有する少なくとも29の型のコラーゲンが同定されている3334。マトリックスにおける主要構造成分であるコラーゲンは、高い塩濃度および中性pHでは不溶性のままでいることが知られており3536、これは、バイオマトリックス足場の製造における我々の戦略の基礎となる発見である。この戦略は、コラーゲンが、それに結合するマトリックス成分、例えばラミニンおよびフィブロネクチン、スモールロイシンリッチプロテオグリカンおよびGAGの保存を可能にし、それによって今度はそれらに結合するサイトカイン、増殖因子または細胞表面受容体を保存するという利点が加わった。本バイオマトリックス足場は、迅速かつ堅実な幹前駆細胞の分化、例えばhHpSCから成人運命への分化を誘導し、これらの系統が限定された細胞を維持し、これらの系統が限定された細胞を維持するかまたは足場にプレーティングした成人細胞を多くの週間生存させ、完全に機能的な細胞として維持する高い能力において独特である。幹細胞、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞または種々の形態の間葉系幹細胞の完全成熟肝臓細胞型への分化は、1つのセットによる誘導が異なるセットに反応するプライミングに必要な、複数の段階で提示される複数のシグナルのセットを必要とし、成人肝臓運命を有する細胞を生じるために、多くの週間の培養を必要とする場合がある37。さらに、MSCの肝臓運命への系統限定は、成人細胞が混合した幹細胞およびMSC表現型を有する、首尾一貫しない結果を与える。ES細胞、iPS細胞およびMSCの分化は、主要な肝臓特異的遺伝子の一部を発現する肝細胞様細胞をもたらし遺伝子における変異が観察され発現される肝遺伝子のタンパク質レベルは通例低い40か、あるいは、ある肝遺伝子に関しては高く、他の遺伝子に関してはごくわずかである4142。一方、バイオマトリックス足場でのhHpSCの分化によって、本質的にすべての細胞が1週間の培養後に正常に近いレベルで尿素、アルブミンおよびCYP450活性を有する古典的成人表現型を発現していた。これらの前駆体のいずれかからの肝細胞様細胞およびバイオマトリックス足場以外のプロトコルによって分化された肝細胞様細胞は、主要な肝臓特異的遺伝子の一部を発現し、遺伝子における変異が観察され、肝遺伝子のタンパク質レベルは通例低いか、あるいは、ある肝遺伝子に関しては高く、他の遺伝子に関してはごくわずかである。未知の理由によって、結果は製造によって異なる。本発明のバイオマトリックス足場の利用によって、これらの幹細胞集団のより迅速な分化と、安定な成人表現型を有する細胞の達成におけるより優れたコンシステンシーをもたらすと予想される。決定された幹細胞集団の分化、例えばバイオマトリックス足場でのhHpSCは、培養1~2週間以内に、本質的にすべての細胞が、正常濃度に近い濃度で、尿素、アルブミンおよびCYP450活性で古典的成人レパートリーの遺伝子を発現し、多くの週間の間、その表現型の安定性を維持する。従って、本発明のバイオマトリックス足場は、決定された幹細胞集団の成人肝臓表現型への分化を著しく促進する潜在能を有する。バイオマトリックス足場で幹細胞を分化させて成熟した機能的な細胞および組織を達成する能力は、学術、産業および臨床試験プログラムに少なからぬ機会を提供する。この能力は、あらゆるタイプの分析研究のための高分化細胞型の使用を可能にし、さらに刺激的なことには、基礎研究および臨床試験プログラムに使用できる、植込み型再血管化組織または臓器の作成にまでも用いることができる。実施例2バイオマトリックス足場の工業規模の散布のための方法GigaCyteLLC社において、粉砕後にディッシュ上にバイオマトリックス足場を散布する追加の方法が開発された。大きな哺乳動物を含む任意の組織からのバイオマトリックス足場を用いることができる。ブタおよびウシの組織は、USDA認定食肉処理施設から入手し、RPMI1640に移した。この培地は、間質液の成分を真似する組成を有し、250~350mOsmKgの範囲の重量オスモル濃度を有する任意の培地であることができる。次いで、本明細書に記載されるように組織を処理して、バイオマトリックス足場を製造する。これらの方法は、自動化を用いてプレートをコーティングするために、懸濁液中でμmサイズ粒子まで粒度を減少させるためのバイオマトリックス足場の処理をさらに含む。限定するものではない1例において、処理は、コラーゲンを不溶性のままでいるのを確実にする高塩溶液中でのバイオマトリックス足場のホモジナイズを含む。36単位LホスホリパーゼA21デオキシコール酸ナトリウムおよび01mgml大豆トリプシンインヒビターを含む改変脱脂緩衝液を緩衝液ホモジネート比11で加え、それによってバイオマトリックス材料が上部まで軽快に浮き上がるので、さらなる処理のためにそれを採取する。バイオマトリックス材料を脱脂緩衝液の除去のためにさらに処理し、ヌクレアーゼを除去するためのヌクレアーゼ溶液5mg100mlRNアーゼ、1mg100mlDNアーゼおよび01mgml大豆トリプシンインヒビターで洗浄した。次いで、すべての残渣を除去を確実にし、コラーゲンを不溶性に保ち、プロテアーゼ活性を最少にするために、バイオマトリックス材料を高塩緩衝液でさらに処理する。抗菌薬抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地中でバイオマトリックス材料を洗浄することによって、バイオマトリックス材料をさらに処理して高濃度の塩を除き、粒度減少の準備をする。次いで、抗菌薬抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地中、任意の希釈の懸濁液、最適には16の懸濁液でバイオマトリックス材料を80°Cで凍結し、低温粉砕で粉砕することによりさらに処理して、バイオマトリックス材料の粒度をμmサイズ粒子まで減少させる。粉砕前にバイオマトリックスが希釈されない場合は、マトリックスは扱いが困難で、均等にプレートをコーティングできない。粉砕を可能にし、プレートを均一にコーティングするためにはこれは重要なステップである。バイオマトリックス粒子は、任意の希釈で懸濁液にできるが、最適には16である。バイオマトリックス粒子は解凍され、幹細胞の分化に用いられるプレートにコーティングされる。バイオマトリックス粒子は、さらに、抗菌薬抗真菌薬、ゲンタマイシンおよびHEPES緩衝液を含む基礎培地で任意に、最適には124に希釈することができ、初代新鮮分離細胞型、冷凍保存細胞型もしくは幹細胞由来最終分化細胞型の長期維持のために、または任意の幹細胞源を肝細胞に分化させるために、プレートにコーティングされる。バイオマトリックスをコーティングしたプレートの滅菌は、例えばγ線照射を用い、使用するまで4°Cでまたは80°Cで凍結して保存することによって行うことができる。バイオマトリックスに細胞をプレーティングして接着させるためには血清含有は必要ないが、バイオマトリックスに細胞を塗布するために血清含有培地を用いることはできる。プレートおよび他の装置にコーティングするために、任意の組織由来のバイオマトリックス粒子の組成物を用いることができる。他の例として、本発明は、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場の製造方法であって、a本明細書に記載の本発明の方法のいずれかによりバイオマトリックス足場を製造し、b基礎培地でのバイオマトリックス足場を希釈し;cのバイオマトリックス足場を約80°Cで凍結し;d大きさが約1μm~約100μmのバイオマトリックス粒子に低温粉砕することによってのバイオマトリックス足場を粉砕し;eのバイオマトリックス粒子を基礎培地中、懸濁状態で解凍し;f段階のバイオマトリックス粒子を培養装置に散布することを含み、それによって、培養装置への工業規模の散布のための、生体組織からのバイオマトリックス足場を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、バイオマトリックス粒子を滅菌する段階を含むことができ、これは、例えばγ線照射によって行うことができる。前述の方法のいくつかの実施形態において、段階のバイオマトリックス足場は、基礎培地に、約16比で希釈することができる。いくつかの実施形態において、段階のバイオマトリックス粒子は、基礎培地に、約124で希釈することができる。成人肝臓に用いる例示的なプロトコルの概略1000x大豆トリプシンインヒビター最終濃度01mgml組織輸送用溶液RPMI1640またはカルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水などの基礎培地抗生物質抗真菌薬100x溶液ゲンタマイシン溶液1組織混合用溶液34MNaCl01mgml大豆トリプシンインヒビター溶液2脱脂溶液溶液1と11PBSとの混合物12、13、14の比率も選択できるあるいはRPMI1640などの基礎培地01デオキシコール酸ナトリウム36uLホスホリパーゼA201mgml大豆トリプシンインヒビター溶液3ヌクレアーゼ溶液RPMI1640などの基礎培地5mg100mlRNアーゼ1mg100mlDNアーゼ01mgml大豆トリプシンインヒビター溶液4高塩溶液3MNaCl溶液5塩の除去粉砕溶液ウイリアムE抗生物質抗真菌薬ゲンタマイシン大きな臓器のためのバイオマトリックス単離プロセス段階1高塩での組織のホモジナイズ2脱細胞化および脱脂3ヌクレアーゼ除去4高塩洗浄5塩の除去6バイオマトリックスの粒度減少7バイオマトリックスでのプレートのコーティングバイオマトリックス単離プロセス10組織破砕11USDA認定食肉処理施設から臓器組織を入手12USDA施設からGigaCyte研究室まで、プラスチック容器に入れた組織輸送用溶液に入れた臓器組織を輸送13潅流またはホモジナイズのために組織を調製131マルチウェルプレートでのinvitro用途にホモジナイズは好ましい20組織のホモジナイズ21無菌的に、手術用ナイフNo22で組織を小片に切断し、組織輸送用溶液に入れて血液を除く22組織片を組織輸送用溶液に入れて3~4回リンスし、血液をできるだけ除く23~400gの組織を同容量の溶液1中で混合物が均一になるまでホモジナイズする24脱細胞化のために、ホモジナイズした組織溶液を2Lのローラーボトルに注ぐ25組織片の全バッチに関して繰り返す30脱細胞化および脱脂31同容量の溶液2を加えて、ローラーボトル中で組織をホモジナイズする32ボトル数回逆さにすることによって十分に混合し、次いで15~30分間放置する33浮揚性のあるマトリックス物質は上部まで上昇し、肝臓色の溶液の上部に明るいマトリックス物質の明瞭な分離が生じる34浮揚性のあるマトリックス物質をピペットで吸い取り、他のローラーボトルに移す35複数のホモジナイズからのマトリックスをプールする36~375mlマトリックス物質を750ml遠心ボトルに移し、各ボトルに同容量の溶液2を加え、~1分間激しく振り動かして、十分な脱細胞化および脱脂を確実にする37高速度で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を除く38このプロセスをもう一回繰り返す全部で2回40ヌクレアーゼ除去41最終脱細胞化洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く42各ボトルに同容量の溶液3を加え、1分間激しく振り動かして、すべての材料が懸濁液中にあり、ヌクレアーゼが完全に除去されるのを確実にする43高速度で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を取り除く44このプロセスをもう一回繰り返す全部で2回50高塩洗浄51最終ヌクレアーゼ洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く52各ボトルに同容量の溶液4を加え、すべての材料が懸濁液中にあることを確実にするように注意して激しく振り動かす53高速度で10分間遠心分離してペレット化し、次いで上清を取り除く531この段階では、バイオマトリックスは十分にペレット化せず、遠心分離後に浮揚性がある532ピペットで上清を取り除き、ナイロンフィルターに通過させて浮揚性のある材料を回収する533採取した浮揚性のあるマトリックスを遠心ボトルに戻す54停止の前に、このプロセスを少なくとも2回繰り返す541最終の塩洗浄後に上清はわずかに黄褐色から澄明である552回目の高塩洗浄後は、遅めの時間の場合は、良い停止点である56すべての遠心ボトルの内容物を1つのローラーボトルに注ぎ、溶液4を上部まで継足し、次いでバイオマトリックスを4°Cで終夜放置する57翌日、残りの塩洗浄を続ける58バイオマトリックスボトルを激しく振り動かしてバイオマトリックス材料を十分に混合し、次いでバイオマトリックスを遠心ボトルに移し、3~4回さらに塩洗浄を続ける59できるだけ少ないボトルにバイオマトリックスを圧縮し、塩洗浄が可能なように、それぞれ最大の半分まで充填する60塩の除去61最終塩洗浄後に、バイオマトリックスペレットを乱さないように注意して上清を取り除く62同容量の溶液5を加え、激しく振り動かして、すべてのバイオマトリックス材料が懸濁液中にあることを確実にする63高速で10分間遠心分離してペレット化し64上清を取り除き、同容量の溶液5を加え、ついで激しく振り動かす652回繰り返して、上清が澄明であることを確実にする651バイオマトリックスは、各遠心分離によってさらにしっかりとペレット化する652最終洗浄後に色は無く、上清は澄明なはずである66最終の溶液5洗浄後に、各ボトルからのマトリックスペレットの容量を記録する67移し、すべてのバイオマトリックスペレットを新規のローラーボトルにプールする68バイオマトリックス材料の容量を測定する69プールしたバイオマトリックスを溶液5で16に希釈する691必要な溶液5の量を算出する6911例:200mlバイオマトリックスx6120069121Lの溶液5を200mlのバイオマトリックスに加えて16のバイオマトリックス懸濁液を調製する61030mlバイオマトリックスの16懸濁液を等分して前もってレベルしたフリーザーバッグに入れる611バイオマトリックスのバッグを80°Cで凍結させ、粉砕するまで保存する612新規バイオマトリックスロットのためにバイオマトリックスロット粉砕データシートを作成する6121この新規バッチから製造されたバッグの番号を記録する6122各バッグは、同じロットからの別々のすりつぶしである613このバッチから製造されたバイオマトリックス材料は1つのロットとみなす614バッチにロット番号を割り当てる70バイオマトリックスの粒度減少71LN2を有する粉砕ミルを準備し、粉砕チャンバーを冷やす72フリーザーから凍結したバイオマトリックスバッグを取り除く73小片に砕く74凍結したバイオマトリックス片を予備冷却した粉砕ミルチャンバーに移す75クライオミルにおいて、それぞれ48分、粉砕を2回運転する1回の運転は、12x2分の粉砕であり、それぞれ2分間のクールダウンが続く76粉砕されたバイオマトリックスを、ロット番号およびバッグ番号バッグ番号により、粉砕した日がわかるが前もってラベルされた100mlのボトルに移す77プレートのコーティングの準備ができるまで、80°Cで凍結しておく80プレートのコーティングのためのバイオマトリックスの製造8137°Cの水浴中で迅速解凍法でバイオマトリックスのボトルの1つを解凍する82解凍したバイオマトリックス懸濁液を測定するまだ湿った状態でプレートを動かすと、バイオマトリックスコーティングが乱れるマトリックスが乾燥するまでプレートを動かさないこと十分に乾燥したら、ふたを戻し、品質を試験するなめらかなコーティングを有するプレートをプレートポーチに置くポーチにシールをし、ラベルを貼るγ線照射で滅菌するコーティングしたプレートを4°Cで保存するコーティングしたプレートをパックを氷冷しながら、5のパックにして発送する100バイオマトリックスプレートの使用101パッケージングからプレートを無菌的に取り除き、生物学的安全キャビネットに置く102各ウェルに培地を加え、使用前に少なくとも2時間インキュベーターに入れる103細胞をプレーティングする準備ができたら、再水和培地を取り除き、組織培養培地で1回洗浄する104細胞を加える前記のものは本発明の例示であって、本発明を限定するものと解釈してはならない。本発明は、以下の請求項によって規定され、該請求項に等価なものは、本発明に含まれる。すべての公報、特許出願、特許、特許公報、GenBankデータベースおよびまたはSNPアクセッション番号によって規定される配列ならびに本明細書において引用した他の参照文献は、その参照箇所が提示されている文およびまたはパラグラフに関連する教示に関して参照としてその全体が包含される。これらのデータは、不溶性に関するコラーゲンの型の条件を示す。組織内のコラーゲンの型を同定し、バイオマトリックス足場の製造に用いる緩衝液のための塩濃度として、その組織内のコラーゲンに関して同定された最も高い塩濃度を用いなければならない。例えば、皮膚のためには、I型およびIII型コラーゲンを不溶性に保つ塩濃度である40Mの塩濃度を有する中性pHの緩衝液が用いられる。一方、胎盤のためには、IV型およびV型コラーゲンの両方を不溶性に保つ45Mの塩を有する中性pHの緩衝液が用いられる。組織に存在するコラーゲンの型は、宿主の年齢によって異なる。例えば、胎児肝臓は、高濃度のIII、IVおよびV型コラーゲンを有するのに対し、成人肝臓は、I、III、IV、V、VIおよびXVIII型コラーゲンの混合物を有する。従って、バイオマトリックス足場の製造に必要な塩濃度は、その組織において優位なコラーゲンのレパートリーによって規定される。さらなる詳細に関しては、実施例1の文献23を参照のこと。