"インビトロアッセイ方法であって、ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドに結合したポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を、生理学的条件下の検出を可能にする新鮮な緩衝液の存在下、シグナルの測定によって、アビジンコートウエルの中で検出することを含み、ここで、前記アビジンコートウエルは前もってブロックされており、その後プレインキュベート反応混合物が、生理学的条件下、ブロックされたアビジンコートウエルにおいてインキュベートされ、ここで、前記プレインキュベート反応混合物はプレインキュベーション中に血清含有水性アッセイ緩衝液の中に懸濁されており、およびプレインキュベート反応混合物は:iCD16a結合部位を有するFcドメインを含む標的抗原結合タンパク質;およびii標的抗原結合タンパク質が特異的に結合する、対象標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部を含み;およびプレインキュベート反応混合物のアビジンコートウエル中でのインキュベーション後、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドが、生理学的条件下、アビジンコートウエルのアビジンに結合したビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかの標的抗原結合タンパク質と一緒にインキュベートされ;およびシグナルの測定による検出の前に、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、標的抗原結合タンパク質に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドと一緒に、生理学的条件下、ウエル中でインキュベートされる、方法。請求項1に記載の方法であって、ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を検出する前に、生理学的条件下、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁した、複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体を、ウエル中でインキュベートするステップをさらに含み、ここで、前記抗体はポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する、方法。プレインキュベート反応混合物が、中和抗体の存在について試験する血清試料をさらに含む、請求項1に記載の方法。標的抗原結合タンパク質が、IgG1またはIgG3抗体である、請求項1に記載の方法。対象標的タンパク質が、CCR4である、請求項1に記載の方法。対象標的タンパク質が、CD20である、請求項1に記載の方法。対象標的タンパク質が、HER2である、請求項1に記載の方法。アビジンがス、トレプトアビジンである、請求項1に記載の方法。ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、複合体化されたシグナル生成標識をさらに含む、請求項1に記載の方法。シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または酵素を含む、請求項8に記載の方法。インビトロアッセイ方法であって、aブロックされたアビジンコートウエル中で、生理学的条件下、血清含有水性アッセイ緩衝液中に懸濁したプレインキュベート反応混合物をインキュベートすること;ここで、プレインキュベート反応混合物は、iiiCD16a結合部位を有するFcドメインを含むIgG標的抗体;およびivIgG標的抗体が特異的に結合する、対象標的タンパク質のビオチン化ポリペプチド部を含み;b生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドを、aのアビジンに結合したビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかのIgG標的抗体と一緒に、インキュベートすること;c生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を、bのIgG標的抗体に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドと一緒に、インキュベートすること;およびd生理学的条件下、検出を可能とする新鮮な緩衝液の存在下のウエル中で、シグナルを測定することにより、cのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドに結合したポリヒスチジンに特異的に結合するいずれかの抗体を検出すること;を含む、方法。プレインキュベート反応混合物が、中和抗体の存在について試験する血清試料をさらに含む、請求項11に記載の方法。IgG標的抗体が、IgG1またはIgG3抗体である、請求項11に記載の方法。対象標的タンパク質が、CCR4である、請求項11に記載の方法。対象標的タンパク質が、CD20である、請求項11に記載の方法。対象標的タンパク質が、HER2である、請求項11に記載の方法。アビジンが、ストレプトアビジンである、請求項11に記載の方法。ポリヒスチジンに特異的に結合する抗体が、複合体化されたシグナル生成標識をさらに含む、請求項11に記載の方法。シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または酵素を含む、請求項18に記載の方法。請求項11に記載の方法であって、ステップdの前に、ウエル中で、生理学的条件下、複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体を、新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁して、インキュベートすることをさらに含み、ここで、前記抗体はcのポリヒスチジンに特異的に結合する抗体に特異的に結合する、方法。シグナル生成標識が、電気化学発光標識を含む、請求項20に記載の方法。電気化学発光標識が、ルテニウム錯体を含む、請求項21に記載の方法。電気化学発光標識が、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルから形成される、請求項22に記載の方法。N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが、化学構造:を有する、請求項23に記載の方法。電気化学発光標識が、以下の式を有するルテニウム錯体を含み、カルボニル基から引いた線が、残りの分子への結合を示す請求項22に記載の方法。シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、または酵素を含む、請求項20に記載の方法。IgG標的抗体が、モガムリズマブである、請求項14に記載の方法。IgG標的抗体が、リツキシマブである、請求項15に記載の方法。IgG標的抗体が、トラスツズマブである、請求項16に記載の方法。インビトロアッセイ方法であって、a生理学的条件下、ブロックされたアビジンコートウエル中で、血清含有水性アッセイ緩衝液中に懸濁されたプレインキュベート反応混合物をインキュベートすること;ここで、プレインキュベート反応混合物は、iCD16a結合部位を有するFcドメインを含む、ヒトCCR4に対するIgG標的抗体;ii中和抗体の存在について試験する血清試料;およびiiiIgG標的抗体が特異的に結合するヒトCCR4のビオチン化ポリペプチド部を含み;b生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドを、aのアビジンに結合したヒトCCR4のビオチン化ポリペプチド部に結合したいずれかのIgG標的抗体と一緒に、インキュベートすること;c生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁されたポリヒスチジンに特異的に結合する抗体を、bのIgG標的抗体に結合したいずれかのポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドと一緒に、インキュベートすること;d生理学的条件下、ウエル中で、新鮮なアッセイ緩衝液中に懸濁された複合体化されたシグナル生成標識を含む抗体をインキュベートすること、ここで、前記抗体はcのポリヒスチジンの特異的に結合する抗体に特異的に結合し;およびe生理学的条件下、検出を可能にする新鮮な緩衝液の存在下、ウエル中で、産生された全てのシグナルを検出すること;を含む、方法。シグナル生成標識が、電気化学発光標識を含む、請求項30に記載の方法。電気化学発光標識が、ルテニウム錯体を含む、請求項31に記載の方法。電気化学発光標識が、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルから生成される、請求項32に記載の方法。N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが、化学構造:を有する、請求項33に記載の方法。電気化学発光標識が、下記の式を有するルテニウム錯体を含み、カルボニル基から引いた線が、残りの分子への結合を示す、請求項32に記載の方法。シグナル生成標識が、蛍光標識、同位体標識、または酵素を含む、請求項30に記載の方法。アビジンが、ストレプトアビジンである、請求項30に記載の方法。IgG標的抗体が、モガムリズマブである、請求項30に記載の方法。実施形態の詳細な説明本明細書で使われる節の見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載されている内容を限定するものと解釈されるべきではない。定義本明細書中で別段の定義がなければ、本出願に関連して使用される科学および技術用語は、当業者により通常理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈から別義が要求されなければ、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。従って、本明細書および添付請求項で使用される単数形a、anおよびtheは、文脈から明確に別義が示さなければ、複数形参照対象を含む。例えば、タンパク質aproteinへの参照は、複数のタンパク質を含み、細胞acellへの参照は、複数の細胞集団を含む。ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書で同義に使用され、ペプチド結合を介して共有結合した2つ以上のアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は、特定の長さの生成物を指すものではない。従って、ペプチド、およびオリゴペプチドは、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、等を含む。さらに、タンパク質断片、類似体、変種または変異タンパク質、融合タンパク質、等が、ポリペプチドの意義に含まれる。この用語は、また、既知のタンパク質工学技術を使って組換えにより発現しうるような、1つまたは複数のアミノ酸類似体または非標準もしくは非天然アミノ酸が含まれる分子を含む。さらに、よく知られた有機化学技術により、本明細書に記載のように、融合タンパク質が誘導体化されうる。参照される単離タンパク質という用語は、対象タンパク質が1通常自然において認められるであろう他のタンパク質の少なくともいくつかを含まず、2同じ源由来、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を基本的に含まず、3異なる種または種類の細胞で組換により発現され、4自然において随伴するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約50パーセントのから分離され、5自然においては随伴しないおよび/または6本来発生しないポリペプチドを操作可能なように共有または非共有相互作用により伴う、ことを意味する。典型的には、単離タンパク質は、所与の試料の少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約25、または少なくとも約50を構成する。合成由来のゲノムDNA、cDNA、mRNAまたは他のRNA、またはいずれかのこれらの組み合わせは、このような単離タンパク質をコードし得る。単離タンパク質は、実質的に、治療、診断、予防、研究または他の使用を妨害する可能性のある、それの自然環境中で見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の混入物を含まないことが好ましい。本明細書での、ポリペプチドまたはタンパク質ならびに変異体のいずれかのさらなる記載において、1文字略記法を頻繁に適用し、通常の天然のペプチドおよびタンパク質表1に組み込まれている20の標準的アミノ酸残基の特定をする。このような1文字略記は、3文字略記、または非略記アミノ酸名で意味上の完全な置き換えが可能である。表1.標準アミノ酸の1文字略記。3文字略記を括弧で示す。________________________アラニンAlaAグルタミンGlnQロイシンLeuLセリンSerSアルギニンArgRグルタミン酸GluEリシンLysKトレオニンThrTアスパラギンAsnNグリシンGlyGメチオニンMetMトリプトファンTrpWアスパラギン酸AspDヒスチジンHisHフェニルアラニンPheFチロシンTyrYシステインCysCイソロイシンIleIプロリンProPバリンValV________________________本明細書では、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、通常、特定の位置のアミノ酸残基の1文字略記、続けて、対象の元の配列に対するアミノ酸位置の数値、次に、置換したアミノ酸残基の1文字記号により表される。例えば、T30Dは、トレオニン残基のアスパルタート残基による、対象の元の配列に対するアミノ酸位置30における置換を表す。別の例では、W101Fは、トリプトファン残基のフェニルアラニン残基による、対象の元の配列に対するアミノ酸位置101の置換を表す。非標準アミノ酸残基も、組換えによる細胞発現を使うタンパク質工学の既知の技術を採用することにより、本発明の範囲内でペプチドに組み込み可能である例えば、Linketal.、タンパク質工学における非標準アミノ酸Non-canonicalaminoacidsinproteinengineering、CurrentOpinioninBiotechnology、146:603-6092003を参照。非標準アミノ酸残基いう用語は、通常、天然タンパク質、例えば、β-アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化した側鎖を有するアミノ酸中に組み込まれる、20標準アミノ酸に含まれないD-またはL-型のアミノ酸残基を指す。例には、L-型またはD-型のβ-アラニン、β-アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Nα-エチルグリシン、Nα-エチルアスパルギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、イソデスモシン、アロイソロイシン、ω-メチルアルギニン、Nα-メチルグリシン、Nα-メチルイソロイシン、Nα-メチルバリン、g-カルボキシグルタマート、e-N、N、N-トリメチルリジン、e-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、Nα-アセチルセリン、Nα-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、および他の類似のアミノ酸、ならびに下記表2に挙げたもの、ならびに本明細書記載のようなこれらのいずれかの誘導体化型、が含まれる。表2には、本発明に従って有用である、いくつかの代表的非標準アミノ酸残基、およびそれらに関連する本明細書で通常使用される関連略記が含まれるが、熟練した実践者なら、別の略記および命名法を同じ物質に適用でき、本明細書中に同じ意味で登場する可能性があることを理解するであろう。生化学命名法に関するUPAC-IUB合同委員会JCBNによるアミノ酸とペプチドの命名法と記号体系は、下記の文書で出版されている:Biochem.J.、1984、219、345-373;Eur.J.Biochem.、1984、138、9-37;1985、152、1;1993、213、2;Internat.J.Pept.Prot.Res.、1984、24、followingp84;J.Biol.Chem.、1985、260、14-42;PureAppl.Chem.、1984、56、595-624;アミノ酸とペプチドAminoAcidsandPeptides、1985、16、387-410;生化学命名法および関連文書BiochemicalNomenclatureandRelatedDocuments、2ndedition、PortlandPress、1992、pages39-69。ポリペプチド例えば、抗原結合タンパク質、または抗体の変異体は、別のポリペプチド配列に比べて、アミノ酸配列へ1つまたは複数のアミノ酸残基が挿入されている、欠失しているおよび/または置換されているアミノ酸配列を含む。変異体には、融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質という用語は、タンパク質が、2つ以上の親タンパク質またはポリペプチド由来の、または同じタンパク質であるが同じタンパク質分子中では本来同時には認められない単一融合分子内の異なる順序由来のポリペプチド成分を含むキメラであることを示す。典型的には、融合タンパク質は、融合遺伝子から発現され、この融合遺伝子では、1つのタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列とインフレームで付加され、さらに、任意選択で異なるタンパク質由来のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列由来のリンカーにより分離されてもよい。融合遺伝子は、その後、組換え宿主細胞により単一のタンパク質として発現されうる。分泌タンパク質は、分泌シグナルペプチド配列の結果として、ER、分泌ベシクル、または細胞外の空隙に誘導されうるタンパク質、ならびに必ずしもシグナル配列を含まないで細胞外の空隙中に放出されるタンパク質を指す。分泌タンパク質が細胞外の空隙に放出されると、分泌タンパク質は、細胞外処理を受け、成熟タンパク質を生成することができる。細胞外の空隙中への放出は、エキソサイトーシスおよびタンパク切断、等の多くの機序により生じうる。本発明の組成のいくつかの他の実施形態では、ポリペプチドは、分泌タンパク質として宿主細胞により合成され、その後、細胞外の空隙および/または媒質からさらに精製されうる。本発明のインビトロアッセイ法のいくつかのステップでは、分子または分子の混合物は、水性の液体、例えば、血清含有アッセイ緩衝液、または新鮮なアッセイ緩衝液中で懸濁される。用語の懸濁は、分子または混合物が、その液体に、溶解する、分散する、浮遊する、流動する、または混合されることを意味する。宿主細胞中の組換えDNA技術により産生されるタンパク質に関連する場合、本明細書で使用される可溶性タンパク質は、水溶液中に存在するタンパク質である;タンパク質が、ツインアルギニンシグナルアミノ酸配列を含む場合は、可溶性タンパク質は、グラム陰性菌宿主中の細胞周辺腔に排出される、または分泌ができる真核生物宿主細胞によって、もしくは適切な遺伝子例えば、kil遺伝子を有する細菌性宿主によって培地中に分泌される。したがって、可溶性タンパク質は、宿主細胞内部の封入体中には認められないタンパク質である。あるいは、文脈によっては、他のタンパク質無しに、生理学的条件下、対象の水性緩衝液緩衝液は、洗剤または尿素、塩酸グアニジウム、または過塩素酸リチウム等のカオトロピック剤を含まない中で懸濁される場合に、可溶性タンパク質は、細胞膜中に集積されているのが認められない、またはインビトロで溶解されている、または生理学的条件下、顕著な量の不溶性の凝集体を形成しないで水性緩衝液に溶解可能であるすなわち、総タンパク質の10未満、さらには、通常は、約5未満の凝集体を形成するタンパク質である。対称的に、不溶性タンパク質は、宿主細胞の細胞質顆粒封入体と呼ばれるの内側に変性型で存在するタンパク質であるか、または再度文脈によっては、不溶性タンパク質は、限定されないが、細胞膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜、小胞体膜、等の細胞膜中に存在するタンパク質である。あるいは、対象の水性緩衝液緩衝液は、洗剤または尿素、塩酸グアニジウム、または過塩素酸リチウム等のカオトロピック剤を含まない中で、生理学的条件下、他のタンパク質の無い状態で生理学的に適合できる温度で懸濁される場合、インビトロで水性の緩衝液中で、生理学的条件下、多量の不溶性凝集体を形成するすなわち、総タンパク質の約10以上の凝集体を形成するタンパク質である。組換えという用語は、物質例えば、核酸またはポリペプチドが人工的に、または合成を通してすなわち、非天然的に、ヒトの介入により改変されていることを示す。改変は、それの自然環境または状態内の物質、またはそこから取り出した物質に対し行うことができる。例えば、組換え核酸は、例えば、クローニング、DNAシャフリングまたは他のよく知られた分子生物学的手法の間に、核酸を組み換えることにより作成される核酸である。このよう分子生物学的手法の例は、Maniatisetal.、分子クローニング.実験マニュアルMolecularCloning.ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、N.Y1982に認められる。組換えDNA分子は、このような分子生物学的手法で連結されたDNAセグメントから構成される。本明細書で使われる組換えタンパク質または組換えポリペプチドという用語は、組換えDNA分子を使って発現されたタンパク質分子を指す。組換え宿主細胞は、組換え核酸を含むおよび/または発現する細胞である。ポリヌクレオチドまたは核酸という用語は、2つ以上のヌクレオチド残基を含む単鎖および二重鎖の両方のヌクレオチドポリマーを包含する。ポリヌクレオチド含有ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチドでも、デオキシリボヌクレオチドでも、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型であってもよい。前記改変は、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基改変、2’、3’-ジデオキシリボース等のリボース改変、およびホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホラニラダートおよびホスホロアミダート等のヌクレオチド間結合改変、を含む。オリゴヌクレオチドという用語は、200以下のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、10~60塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、または20~40ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構成に使用するためには、単鎖であっても二重鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドでも、アンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、定量化または検出を容易にするための同位体標識例えば、125I、14C、13C、35S、3H、2H、13N、15N、18O、17O、等、検出アッセイ用の蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識、等の標識を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。本明細書で同義に使用されるポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列または核酸配列は、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド残基の一次配列であり、文脈に応じ、オリゴヌクレオチド、DNA、およびRNA、核酸、またはヌクレオチド残基の一次配列を表す文字列を含む。任意の特定のポリヌクレオチド配列から、所与の核酸または相補的なポリヌクレオチド配列のいずれかが決定できる。単鎖または二重鎖であってもよく、またセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよいゲノムまたは合成由来のDNAまたはRNAが含まれる。特段の指定がなければ、本明細書で考察する任意の単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、5’末端であり;二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向が、5’方向と呼ばれる。新生のRNA転写物の5’→3’付加方向は、転写方向と呼ばれる;RNA転写物RNA転写物の5’から5’末端までと同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、上流配列と呼ばれる;RNA転写物RNA転写物の3’から3’末端までと同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、下流配列と呼ばれる。本明細書で使用される単離核酸分子または単離核酸配列は、1通常、核酸の天然源に付随する少なくとも1つの混入核酸分子から特定および分離されるか、または2クローン化、増幅、タグ取り付け、または他の方法でバックグラウンド核酸から識別され、それにより、対象核酸配列が決定できるか、のいずれかである核酸分子である。単離核酸分子は、天然で認められる形状または環境以外の状態にある。しかし、単離核酸分子は、通常、ポリペプチド例えば、オリゴペプチドまたは抗体を発現する細胞ここでは、例えば、核酸分子は天然の細胞とは異なる染色体の位置に存在する中に含まれる核酸分子を包含する。本明細書で使われる用語の~をコードする核酸分子、~をコードするDNA配列、および~をコードするDNAは、デオキシリボヌクレオチドのデオキシリボ核酸鎖に沿った順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、mRNA鎖に沿ったリボヌクレオチドの順序を決定し、また、ポリペプチドタンパク質鎖に沿ったアミノ酸の順序も決定する。従って、DNA配列は、RNA配列をコードし、アミノ酸配列をコードする。用語の遺伝子は、広範囲に使われ、生物学的機能に関連した任意の核酸を指す。遺伝子は、通常、コード配列および/またはこのようなコード配列の発現に必要な調節配列を含む。用語の遺伝子は、具体的ゲノムまたは組換え型配列、ならびにその配列によりコードされるcDNAまたはmRNAに適用される。融合遺伝子は、天然に一緒には見つからない、またはコード化融合タンパク質すなわち、キメラタンパク質中に存在するものと同じ配列中に、天然では一緒には見つからない、異なるタンパク質由来の部分を有するポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。遺伝子は、また、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現核酸セグメントを含む。転写因子等の調節タンパク質が結合する転写調節領域を含む非発現調節配列は、隣接または近くの配列の転写を生ずる。遺伝子の発現または核酸の発現は、DNAのRNAへの転写任意選択で、RNAの修飾、例えば、スプライシングを含む、RNAのポリペプチドへの翻訳その後のポリペプチドの翻訳後修飾を含む場合もある、または文脈によっては、転写と翻訳の両方、を意味する。本明細書で使われるコーディング領域またはコード配列という用語は、構造遺伝子に関連して使用される場合、mRNA分子の翻訳の結果として、発生期のポリペプチドで認められるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。真核生物では、コーディング領域は、5’側のイニシエータのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレットATGおよび3’側の停止コドンすなわち、TAA、TAG、TGAを指定する3つのトリプレットの内の1つにより境界が形成されている。制御配列または制御シグナルという用語は、特定の宿主細胞中で、それが連結されるコード配列の発現および処理に影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の特性は、宿主生物体に依存しうる。特定の実施形態では、原核生物に対する制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部、および転写終止配列を含んでもよい。真核生物に対する制御配列は、1つまたは複数の転写因子のための認識部位、転写エンハンサー配列または要素、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を含むプロモーターを含んでもよい。制御配列は、リーダー配列および/または融合パートナー配列を含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短い配列のDNAから構成されるManiatis、etal.、科学236:12371987。プロモーターおよびエンハンサー配列は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞中の遺伝子ならびにウイルスを含む種々の真核生物源から単離されている類似の調節領域、すなわち、プロモーターは、また、原核生物中でも見つかっている。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、どの細胞型を対象タンパク質の発現に使用すべきかということに依存する。一部の真核生物プロモーターおよびエンハンサーは、広範な宿主範囲を有するが、一方、他のものは、限定された細胞型サブセットにおいて機能するVoss、etal.、TrendsBiochem.Sci.、11:2871986およびManiatis、etal.、Science236:12371987の概説参照。ベクターという用語は、情報をコードしたタンパク質宿主細胞中に移入するのに使用される任意の分子または実体例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスを指す。本明細書で使われる発現ベクターまたは発現構築物という用語は、所望のコード配列、およびコード配列の特定の宿主細胞中での発現のために必要な適切な機能的に連結された核酸制御配列を含む組換えDNA分子を指す。発現ベクターは、限定されないが、転写、翻訳に影響を与える、または制御する、および、イントロンが存在する場合には、機能的に連結されたコーディング領域のRNAスプライシングに影響を与える配列を含むことができる。原核生物における発現に必要な核酸配列は、プロモーターを含み、任意選択でオペレーター配列、リボソーム結合部位および可能な限り他の配列を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および終結とポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。分泌シグナルペプチド配列は、また、任意選択で、所望に応じ、細胞から対象ポリペプチドのさらに容易な単離のために発現ベクターによりコードされ、対象のコード配列に機能的に連結され、それにより、発現したポリペプチドが組換え型宿主細胞により分泌されてもよい。このような技術は、当技術分野でよく知られているE.g.、Goodey、AndrewR.;etal.、ペプチドおよびDNA配列PeptideandDNAsequences、米国特許第5,302,697号;Weineretal.、タンパク質分泌組成物と方法Compositionsandmethodsforproteinsecretion、米国特許第6,022,952号および同6,335,178号;Uemuraetal.,タンパク質発現ベクターとその利用Proteinexpressionvectorandutilizationthereof、米国特許第7,029,909号;Rubenetal.、27ヒト分泌タンパク質humansecretedproteins、米国特許公開第2003/0104400A1号。本明細書で使用される操作可能な組み合わせで、操作可能な順におよび機能的に連結されたという用語は、所与の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指示できる核酸分子が産生されるような方式での核酸配列の連結を指す。この用語は、また、機能的タンパク質が産生されるような方式でのアミノ酸配列の連結を指す。例えば、タンパク質コード配列に機能的に連結されているベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、連結される。宿主細胞という用語は、核酸で形質転換されている、または形質転換されることができ、それにより目的遺伝子を発現できる細胞を意味する。この用語は、元の親細胞と形態学的にまたは遺伝的性質が同じであってもなくても、目的遺伝子が存在する限りは、親細胞の子孫を含む。多数の利用可能な、よく知られた宿主細胞の内のいずれかを、本発明の実施に際し使用可能である。特定の宿主の選択は、当技術分野で認識されているいくつかの要因に依存する。これらには、例えば、選択発現ベクターとの的合成、DNA分子によりコードされたペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティおよびコスト、が含まれる。これらの要因のバランスは、必ずしも全ての宿主が特定のDNA配列の発現に同等に有効ではないという理解と関係付けなければならない。これらの一般ガイドラインの範囲内で、培養に有用な微生物宿主細胞には、細菌例えば、大腸菌種種、酵母例えば、サッカロミセス種および他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類ヒトを含む細胞、例えば、CHO細胞およびHEK-293細胞が含まれる。修飾は、DNAレベルでも同様に行うことができる。DNA配列をコードするペプチドは、選択宿主細胞にさらに適合性のよいコドンに変更できる。大腸菌に対して、最適化コドンが当技術分野で知られている。コドンは、制限酵素部位を除くために、またはサイレント制限酵素部位を含めるために置換可能であり、これにより、選択宿主細胞中でのDNAの処理を支援することができる。次に、形質転換宿主は培養され、精製される。宿主細胞は、従来の発酵条件下で培養でき、所望の化合物が発現される。このような発酵条件は、当技術分野でよく知られている。トランスフェクションという用語は、外来または外因性DNAの細胞による取込を意味し、外因性のDNAが、細胞膜の内部に導入されている場合、細胞は形質移入されている。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野でよく知られており、本明細書で開示されている。例えば、Grahametal.、1973、Virology52:456;Sambrooketal.、2001、分子クローニング:実験マニュアルMolecularCloning:ALaboratoryManual、前出;Davisetal.、1986、分子生物学の基本的方法BasicMethodsinMolecularBiology、Elsevier;Chuetal.、1981、Gene13:197、を参照。このような技術は、1つまたは複数の外因性のDNA成分を適切な宿主細胞中に導入するために使用できる。形質転換という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を指し、細胞が新規DNAまたはRNAを含むように改変されている場合に、細胞は、形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入または他の技術を介した新規遺伝的物質の導入により、そのネイティブ状態から遺伝的に改変される場合に、細胞は、形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換DNAは、細胞の染色体中に物理的に組み込むことにより細胞のDNAと組み換えられてもよく、または複製されることなく、エピソームエレメントとして一時的に維持されてもよく、または、独立にプラスミドとして複製されてもよい。形質転換DNAが細胞分裂に伴い複製される場合に、細胞は安定に形質転換されていると見なされる。タンパク質のドメインまたは領域本明細書では同義に使用されるは、全タンパク質の、完全なタンパク質までの、および完全なタンパク質を含む、任意の部分であるが、通常は、完全なタンパク質より小さい部分を含む。ドメインは、残りのタンパク質鎖とは無関係に折り畳むことができ、および/または特定の生物学的、生化学的、または構造的機能もしくは部位例えば、リガンド結合ドメイン、またはサイトゾル、膜貫通もしくは細胞外ドメインと関連付けできるが、必ずしも必要ではない。治療の目的のための哺乳動物は、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜、および動物園の動物、スポーツアニマル、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、雌ウシ、ラット、マウス、サル等が含まれる。生物学的物質、例えば、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、等に関連して本明細書全体を通して使用される天然という用語は、自然界で見付けられる物質を指す。抗体、または同義のAbという用語は、広い意味で使用され、完全に構築された抗体、モノクローナル抗体ヒト、ヒト化またはキメラ抗体を含む、ポリクローナル抗体、多選択性の抗体例えば、二重特異性抗体、および抗原に結合できる抗体断片例えば、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、単鎖抗体、ダイアボディを含み、所望の生物活性を示す限り、前出のものの相補性決定領域CDRを含む。化学的誘導体化抗体を含む無傷分子および/または断片の多量体または凝集体が、意図されている。IgG、IgM、IgD、IgA、ならびにIgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2、またはいずれかのアロソタイプを含むいずれのアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体も意図されている。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、IgG1およびIgG3アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害ADCC活性を有する。従って、本発明のインビトロでアッセイ法の一部の実施形態では、IgG標的抗体は、IgG1例えば、KW-0761モガムリズマブまたはAMG761としても知られる、リツキシマブ、またはトラスツズマブまたはIgG3抗体である。抗原結合タンパク質ABPという用語は、前で定義した抗体または抗体断片、および組換え型ペプチドまたは所望の抗原結合特性を有するCDR由来の配列を含む他の化合物を含む。抗体-抗原相互作用は、M-1s-1で表される会合速度定数ka、またはs-1で表される解離速度定数kd、または、代わりに、Mで表される解離平衡定数KDで特徴付けることができる。一般に、抗原結合タンパク質、例えば、抗体または抗体断片は、類似の結合アッセイ条件下の他の無関係のタンパク質に対する親和性と比較して、顕著に高い結合親和性を有し、その結果として、その抗原を区別することができる場合、抗原に特異的に結合する。10-9M以下の範囲で、10-12M以下低い値が高い結合親和性を示すまでの範囲のKD解離平衡定数で測定した結合親和性、または10-4s-1以下の範囲で、10-10s-1以下までの範囲のkd解離速度定数で測定した結合力、等の特性が望ましい。典型的には、解離平衡定数KDが10-8M以下の場合に、抗原結合タンパク質例えば、抗体または抗体断片は、その標的抗原に特異的に結合するといわれる。抗原結合タンパク質例えば、抗体または抗体断片は、KDが5x10-9M以下の場合に、特異的に抗原に高親和性で結合し、KDが5x10-10M以下の場合に、非常に高親和性で結合する。一実施形態では、抗原結合タンパク質例えば、抗体は、約10-8M~10-10MのKDで結合し、さらに別の実施形態では、抗体は、5x10-9M以下のKDで結合する。会合速度定数、解離速度定数、または解離平衡定数は、動態解析技術、例えば、表面プラズモン共鳴法BIAcore登録商標;例えば、Fischeretal.、ペプチド-免疫グロブリンコンジュゲートApeptide-immunoglobulin-conjugate、国際公開第2007/045463A1号、実施例10、この特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、またはメーカーにより概略説明されている一般的方法または当技術分野で既知の他の方法を使ったKinExAを使って容易に測定できる。BIAcore登録商標またはKinExAにより得られた動力学的データは、メーカーにより説明されている方法で解析できる。抗原結合領域または抗原結合部位は、特異的に特定抗原に結合する抗原結合タンパク質例えば、抗体タンパク質または抗体断片の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含み、抗原に対する特異性および親和性を抗体に付与する抗体のその部分は、抗原結合領域と呼ばれる。抗原結合領域は、通常、1つまたは複数の相補的結合領域CDRを含む。特定の抗原結合領域は、また、1つまたは複数のフレームワーク領域FRを含む。CDRは、抗原結合特異性および親和性をもたらすアミノ酸配列である。フレームワーク領域は、CDRの正しい高次構造の維持を支援し、抗原結合領域および抗原の間の結合を促進することができる。単離抗体は、産生細胞により抗体が分泌された天然環境のまたは培地中の1つまたは複数の成分から特定および分離されている抗体である。その天然環境または培地の混入物成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様の溶質を含む可能性がある。一部の実施形態では、抗体は、1抗体重量で95超に、および最も好ましくは、99重量超に、または2還元または非還元条件下、任意選択で染色し、例えば、クマシーブルーまたは銀染色を使って、SDS-PAGEにより均質になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの要素が存在しないので、単離天然抗体には、組換え細胞内のそのままの状態での抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも1つの精製ステップにより調製される。本明細書で使われるモノクローナル抗体という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得た抗体、すなわち、その集団を含む個別抗体が少量存在する可能性がある天然変異を除いて、同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、高度に特異的であり、個別の抗原性の部位またはエピトープに向けられる。モノクローナル抗体は、通常、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む。モノクローナル抗体の非制限的例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体、完全集合抗体、多選択性抗体二重特異性抗体を含む、抗原に結合できる抗体断片Fab、Fab’、Fab’2、Fv、単鎖抗体、ディアボディを含む、マキシボディ、ナノボディ、およびそれらが所望の生物活性を示す範囲で前出物質のCDRを含む組換えペプチド、またはそれらの変異体もしくは誘導体が含まれる。モノクローナルという修飾語は、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法Kohleretal.、Nature、256:495[1975]により始めて記載されたにより作成でき、または、組換えDNA方法例えば、米国特許第4,816,567号参照により作成できる。モノクローナル抗体は、また、例えば、Clacksonetal.、Nature、352:624-628[1991]およびMarksetal.、J.Mol.Biol.、222:581-5971991に記載の技術を使って、ファージ抗体ライブラリーから単離できる。免疫グロブリンという用語は、それぞれ軽鎖LCに共有結合した2つの二量体化重鎖HCを含む完全抗体;1つの単量体免疫グロブリン重鎖および共有結合で連結された軽鎖HCLC、またはキメラ免疫グロブリン軽鎖重鎖-Fcヘテロ三量体いわゆるヘミボディhemibodyを包含する。抗体は、四量体の糖タンパク質である。天然抗体では、各四量体は、2つの同一の対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、約220アミノ酸約25kDaの1つの軽鎖および約440アミノ酸約50~70kDaの1つの重鎖を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約100~110以上のアミノ酸の可変V部を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常部を規定する。可変部は、異なる抗体間で異なる。定常部は、異なる抗体間で同じである。各重鎖または軽鎖の可変部内で、抗体の抗原に対する特異性を決定するのを支援する3つの高頻度可変性亜領域がある。高頻度可変性領域の間の可変ドメイン残基は、フレームワーク残基と呼ばれ、一般的には、異なる抗体間である程度の相同性がある。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定数ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。ヒト軽鎖は、カッパκおよびラムダλ軽鎖に分類される。軽鎖および重鎖内で、可変部および定常部は、約12以上のアミノ酸のJ領域により連結され、重鎖は、また、約10超のアミノ酸のD領域を含む。一般的説明は、免疫学の基礎FundamentalImmunology、Ch.7Paul、W.、ed.、2nded.RavenPress、N.Y.1989を参照されたい。本発明の範囲内で、抗体は、また、組換えで生成された抗体、およびグリコシル化の欠けた抗体を包含する。軽鎖または免疫グロブリン軽鎖という用語は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに充分な可変部配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変部ドメイン、VL、および定常部ドメイン、CLを含む。軽鎖の可変部ドメインは、ポリペプチドアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。重鎖または免疫グロブリン重鎖という用語は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに充分な可変部配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変部ドメイン、VH、および3つの定常部ドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含む。VHドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインカルボキシル末端にあり、CH3はポリペプチドのカルボキシ末端に最近接の位置にある。重鎖は、ミューμ、デルタΔ、ガンマγ、アルファα、およびイプシロンεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEを規定する。別の本発明の実施形態では、重鎖は、IgGIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4サブタイプを含む、IgAIgA1おょびIgA2サブタイプを含む、IgMおよびIgEを含むいずれのアイソタイプでもよい。これらの内のいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分割できる。異なるIgGアイソタイプは、異なるエフェクター機能Fc領域による媒介、例えば、抗体依存性細胞傷害ADCCおよび補体依存性細胞障害CDCを持つことができる。ADCCでは、抗体のFc領域は、ナチュラルキラーおよびマクロファージ等の免疫エフェクター細胞の表面上のFc受容体FcγRに結合し、標的細胞の食作用または溶解を引き起こす。CDCでは、抗体は、細胞表面で補体カスケード開始させることにより標的細胞を死滅させる。Fc領域、または本明細書で同義に使用されるFcドメインもしくは免疫グロブリンFcドメインは、2つの重鎖断片を含み、これらは、完全抗体では、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む。2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合およびCH3ドメインの疎水性の相互作用により保持される。サルベージ受容体結合エピトープという用語は、IgG分子例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域のエピトープを指し、インビボでのIgG分子の血清中半減期の増加に関与する。アロタイプは、抗体配列中定常部中での場合が多いのバリエーションで、免疫原性であってもよく、ヒトの特定の対立遺伝子によりコードされる。アロタイプは、ヒトIGHC遺伝子の5つの、IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA2およびIGHE遺伝子として特定されており、それぞれ、G1m、G2m、G3m、A2m、およびEmアロタイプと命名される。以下の、少なくとも18Gmアロタイプが既知である:nG1m1、nG1m2、G1m1、2、3、17またはG1ma、x、f、z、G2m23またはG2mn、G3m5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28またはG3mb1、c3、b5、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5。2つのA2mアロタイプ:A2m1およびA2m2が存在する。抗体の構造と生成の詳細な説明としては、Roth、D.B.、andCraig、N.L.、Cell、94:411-4141998を参照されたい。この文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、重鎖と軽鎖免疫グロブリン配列をコードするDNA生成プロセスは、最初、B細胞発達段階で起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成および連結の前に、V、D、Jおよび定常C遺伝子セグメントは、通常、1つの染色体上で相互に近接近しているのが認められる。B細胞の分化の間に、V、D、Jまたは軽鎖遺伝子の場合は、VとJのみ遺伝子セグメントの適切な各ファミリーメンバーの内の1つが組み換えられて、機能的に再構成された重鎖と軽鎖免疫グロブリン遺伝子の可変部を形成する。この遺伝子セグメント再構成プロセスは、逐次的であるように見える。最初、重鎖D-to-J連結が作られ、続いて重鎖V-to-DJ連結および軽鎖V-to-J連結が作られる。V、DおよびJセグメントの再構成に加えて、軽鎖のVおよびJセグメントが連結される部位、および重鎖のDおよびJセグメントが連結される部位での可変組換えにより、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の初期レパートリー中で、さらなる多様性が形成される。軽鎖中のこのようなバリエーションは、通常、V遺伝子セグメントの最後のコドンおよびJセグメントの最初のコドン内で起こる。連結における同様の不正確さは、DおよびJHセグメント間の重鎖染色体上で起こり、10ヌクレオチドもの長さを超えて延長できる。さらに、いくつかのヌクレオチドは、ゲノムDNAにはコードされていないDおよびJHの間ならびにVHおよびD遺伝子セグメントの間に挿入可能である。これらのヌクレオチドの追加は、N領域多様性として知られる。可変部遺伝子セグメントのこのような再構成の正味の効果およびこのような連結の間に起こりうる可変組換えは、一次抗体レパートリーの作成である。高頻度可変性領域という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変性領域は、相補性決定領域またはCDR[すなわち、軽鎖可変ドメインの残基24~34L1、50~56L2および89~97L3ならびに重鎖可変ドメインの31~35H1、50~65H2および95~102H3<Kabatetal.、免疫学的な対象のタンパク質配列SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、5thEd.米国国立衛生研究所、公衆衛生局PublicHealthService、NationalInstitutesofHealth、Bethesda、Md.1991に記載のように>]由来のアミノ酸残基を含む。単一のCDRでも抗原を認識し、結合できるが、全てのCDRを含む全抗原結合部位よりも低い親和性となる。典型的な抗体では、CDRは、抗原結合および認識に関与する領域を構成する重鎖と軽鎖可変部中のフレームワーク内に埋め込まれている。可変部は、フレームワーク領域フレームワーク領域1~4:FR1、FR2、FR3、およびFR4と命名されている、Kabatetal.、1991、前出;また、ChothiaandLesk、1987、前出、参照内に、少なくとも3つの重鎖または軽鎖CDRを含む:上記を参照Kabatetal.、1991、免疫学的な対象のタンパク質配列、公衆衛生局、N.I.H.、Bethesda、MD;また、ChothiaandLesk、1987、J.Mol.Biol.196:901-917;Chothiaetal.、1989、Nature342:877-883も参照。高頻度可変性ループ由来の残基の代わりの定義が、Chothiaetal.、J.Mol.Biol.196:901-9171987により、軽鎖可変ドメインの残基26~32L1、50~52L2および91~96L3ならびに重鎖可変ドメインの残基26~32H1、53~55H2および96~101H3として記載されている。フレームワークまたはFR残基は、高頻度可変性領域残基以外の可変部残基である。抗体断片は、無傷完全長抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合部または可変部の一部を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、Fab’2、およびFv断片;ディアボディ;直鎖抗体Zapataetal.、ProteinEng.、810:1057-10621995;単鎖抗体分子;ならびに抗体断片から形成された多選択性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、Fab断片と呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する2つの同じ抗原結合断片、および定常部を含む残りのFc断片、が生成される。Fab断片は、全可変ドメイン、ならびに軽鎖定常ドメインおよび重鎖第1定常ドメインCH1を含む。Fc断片は、炭水化物を提示し、抗体のクラスを区別する多くの抗体エフェクター機能例えば、補体および細胞受容体結合に関与する。ペプシン処理により、Fab’2断片が得られ、これは、抗体のVHおよびVLドメインを含む2つの単鎖FvまたはscFv抗体断片を有し、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖として存在する。Fab断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端への抗体ヒンジ部由来の1つまたは複数のシステイン等の少数の追加残基の包含によりFab’断片とは異なる。好ましくは、Fvポリペプチドは、Fvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とする、VHおよびVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの概説は、モノクローナル抗体の薬理学ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies、vol.l13、RosenburgandMooreeds.、Springer-Verlag、NewYork、pp.269-3151994中のPluckthunを参照されたい。Fab断片は、1つの軽鎖ならびに1つの重鎖のCH1および可変部から構成される。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。Fab’断片は、1つの軽鎖ならびにVHドメインおよびCH1ドメインを含む1つの重鎖の一部ならびにCH1およびCH2ドメインの間の領域も含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が2つのFab’断片の2つの重鎖の間で形成され、Fab’2分子が作られる。Fab’2断片は、CH1およびCH2ドメインの間の定常部の一部を含む2つの軽鎖および2つの重鎖を含み、それにより、2つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。Fab’2断片は、従って、2つの重鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持されている2つのFab’断片から構成される。Fvは、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合性会合による、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインダイマーから構成される。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VHVLダイマーの表面上の抗原結合部位を特定するのはこの立体配置によるものである。単一可変ドメインまたは抗原に特異的な3つのCDRのみを含む半分のFvは、抗原を認識し結合する能力を有するが、全体結合部位よりも低い親和性となる。単鎖抗体は、重鎖と軽鎖可変部がフレキシブルリンカーにより連結されて、抗原結合領域を形成する単一ポリペプチド鎖を形成しているFv分子である。単鎖抗体は、国際公開第88/01649号ならびに米国特許第4,946,778号および同5,260,203号で詳細に考察されている。これらの開示は参照によってその全体が組み込まれる。単鎖FvまたはscFv抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在し、さらに、任意選択で、Fvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするVHとVLドメインの間のポリペプチドリンカーを含むBirdetal.、Science242:423-426、1988、およびHustonetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883、1988。Fd断片は、VHおよびCH1ドメインから構成される。ディアボディという用語は、2つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖VHVL中の軽鎖鎖可変ドメインVLに連結した重鎖可変ドメインVHを含む。同じ鎖上の2つのドメイン間の対形成をさせるには短すぎるリンカーを使うことにより、ドメインは、別の鎖の相補的なドメインとの対形成をせざるを得ず、2つの抗原結合部位を作る。ディアボディは、例えば、欧州特許第EP404、097号;国際公開第93/11161号;およびHollingeretal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444-64481993で、さらに詳しく記載されている。ドメイン抗体は、重鎖の可変部または軽鎖の可変部のみを含む免疫学的機能性免疫グロブリン断片である。いくつかの例では、2つ以上のVH領域が、共有結合でペプチドリンカーと連結され、二価のドメイン抗体を作る。二価のドメイン抗体の2つのVH領域は、同じまたは別の抗原を標的にできる。抗原という用語は、選択的結合物質、例えば、抗原結合タンパク質例えば、抗体またはその免疫学的機能性断片、を含むにより結合されうる分子または分子の一部、およびさらに、動物中で使用して、その抗原に結合できる抗体を産生できる分子または分子の一部を指す。抗原は、別の抗原結合タンパク質、例えば、抗体と相互作用可能な1つまたは複数のエピトープを持つことができる。エピトープという用語は、抗原結合タンパク質例えば、抗体により結合される分子の一部である。この用語は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体に特異的に結合できるいずれかの決定因子を含む。エピトープは、近接していても、または非近接例えば、単鎖ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中で相互に近接していないが、分子としては、抗体により結合されるアミノ酸残基であってもよい。特定の実施形態では、エピトープは、抗原結合タンパク質例えば、抗体の生成に使用されるエピトープに類似の3次元構造を含むにも関わらず、抗原結合タンパク質生成に使用されるエピトープ中で見出されるアミノ酸残基を含まないか、またはほんの少しのだけのアミノ酸残基を含むという意味での擬態性であってもよい。ほとんどの場合、エピトープは、タンパク質上に存在するが、ある場合には、他の種類の分子、例えば、核酸上に存在できる。エピトープ決定因子は、化学的に活性な表面分子群、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基を含んでもよく、また、特異的3次元特性、および/または特異的電荷特性を有していてもよい。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および/または高分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープを認識するのが好ましい。同一性という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチド分子または2つ以上の核酸分子の配列間の関連性を指す。同一性パーセントは、比較される分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同じ残基のパーセントを意味し、比較される分子の内の最小の大きさのものに基いてに計算される。これらの計算に対し、整列のギャップもしあればは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラムすなわち、アルゴリズムによって対処されなければならない。整列核酸またはポリペプチドの同一性の計算に使用できる方法には、下記で記載のものが含まれる:コンピュータ利用分子生物学ComputationalMolecularBiology、Lesk、A.M.、ed.、1988、NewYork:OxfordUniversityPress;バイオコンピューティングインフォマティクスとゲノムプロジェクトBiocomputingInformaticsandGenomeProjects、Smith、D.W.、ed.、1993、NewYork:AcademicPress;配列データのコンピュータ分析ComputerAnalysisofSequenceData、PartI、Griffin、A.M.、andGriffin、H.G.、eds.、1994、NewJersey:HumanaPress;vonHeinje、G.、1987、分子生物学における配列解析SequenceAnalysisinMolecularBiology、NewYork:AcademicPress;配列解析プライマーSequenceAnalysisPrimer、Gribskov、M.andDevereux、J.、eds.、1991、NewYork:M.StocktonPress;andCarilloetal.、1988、SIAMJ.AppliedMath.48:1073。例えば、配列同一性は、2つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために通常使用される標準的方法により決定できる。BLASTまたはFASTA等のコンピュータプログラムを使って、2つのポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチド配列をそれらの各残基が最適に整合するよう整列させる片方もしくは両方の配列の全長に沿って、または片方もしくは両方の配列の所定の部分に沿って。プログラムは、開始ペナルティーおよびデフォルトギャップペナルティを提供し、スコアリング行列、例えば、PAM250[標準的スコアリング行列;Dayhoffetal.、タンパク質配列と構造の図説AtlasofProteinSequenceandStructure、vol.5、supp.31978を参照]をコンピュータプログラムと組み合わせて使用可能である。例えば、同一性パーセントは、次のように計算できる:同一マッチの合計数に100を乗じ、次に、マッチ全長内の長い方の配列の長さと2つの配列を整列させるために長い方の配列に導入したギャップの数の合計で除算する。同一性パーセントの計算では、比較される配列は、配列間で最長マッチが得られるように整列される。GCGプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用できるコンピュータプログラムであり、このパッケージは、GAPDevereuxetal.、1984、Nucl.AcidRes.12:387;GeneticsComputerGroup、UniversityofWisconsin、Madison、WIを含む。コンピュータアルゴリズムGAPは、配列同一性パーセントを決定すべき2つのポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それらの各アミノ酸またはヌクレオチドが最適マッチングとなるよう整列されるアルゴリズムにより決定されるマッチスパンmatchedspan。ギャップオープニングペナルティこれは、3回の平均対角として計算される。ここで平均対角は、使用されている比較行列の対角要素の平均である;対角は、特定の比較行列により各完全アミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数値であるおよびギャップ延長ペナルティこれは通常、ギャップオープニングペナルティの1/10倍である、ならびにPAM250またはBLOSUM62等の比較行列が、アルゴリズムと組み合わせて使用される。特定の実施形態では、標準的比較行列PAM250比較行列に関しては、Dayhoffetal.、1978、タンパク質配列と構造の図説AtlasofProteinSequenceandStructure5:345-352;BLOSUM62比較行列に関しては、Henikoffetal.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919、を参照も、アルゴリズムにより使用される。GAPプログラムを使ってポリペプチドまたはヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメータは、以下の通りである:アルゴリズム:Needlemanetal.、1970、J.Mol.Biol.48:443-453;比較行列:BLOSUM62;Henikoffetal.、1992、同上、による;ギャップペナルティ:12しかし、エンドギャップに対してはペナルティ無しギャップ長さペナルティ:4類似性閾値02つのアミノ酸配列整列用の特定の整列スキームは、2つの配列の短い領域のみのマッチングを生ずる場合があり、この小さい整列領域は、たとえ、2つの完全長配列の間に顕著な関連性がなくても、非常に高い配列同一性を有する可能性がある。従って、選択整列方法GAPプログラムは、所望に応じ、標的ポリペプチドの少なくとも50近接アミノ酸にわたる整列を生ずるように調節可能である。修飾という用語は、ポリペプチドに関連して使われる場合、限定されないが、1つまたは複数のアミノ酸変化置換、挿入または欠失を含む;化学的修飾;治療または診断薬へのコンジュゲーションによる共有結合の改変;標識例えば、蛍光標識、電気化学発光標識、放射性核種もしくは他の同位体標識、または種々の酵素を使った;共有結合ポリマー連結、例えば、ペグ化ポリエチレングリコールで誘導体化および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換、が含まれる。改変ポリペプチドは、本発明の方法で使われる非改変分子の結合特性を保持しなければならない。複合体化されたは、少なくとも2つの化学の成分が、直接的に、または任意選択で、それ自体両方の部分に共有結合しているペプチジルもしくは非ペプチジルリンカー部を介して、共有結合で相互に連結されるか、または結合されることを意味する。例えば、共有結合は、ペプチドもしくはタンパク質のアルファアミノ基を含むアミノ酸残基を介しても、または側鎖を介してもよい。本発明のアッセイ方法の緩衝剤または試薬のインキュベーションに関連した生理学的条件下は、非共有結合反応等の生化学的反応が起こることを可能とする温度、pH、およびイオン強度の条件下のインキュベーションを意味する。典型的には、6.5~7.5のpHで、温度は室温または約37°Cまでの雰囲気温度である。ブロックされたは、例えば、ウエル表面への非特異的結合を最小限にする目的で、反応混合物が後で添加される場合は、反応混合物成分を、アッセイ緩衝液と共にインキュベートすることを意味する。反応混合物は、インキュベーションの生理学的条件下、対象の非共有結合反応等のインビトロ生化学的反応を起こさせるのに必要な全試薬と因子を含む水性混合物である。アビジンは、四量体ビオチン結合タンパク質であって、鳥類、爬虫類および両生類の卵管中で天然に産生され、さらに典型的には、それらの卵の卵白中に析出しており、またはそれらの合成もしくは組換え産生型、および/または、それらからの単量体もしくは多量体例えば、二量体、三量体、等型である。その四量体のグリコシル化型では、アビジンは、66~69kDaの大きさであると推定され、4分子までのビオチンに、同時に、高度の親和性と特異性で結合できるKorpela、J.、アビジン、生物学的研究のツールおよび対象としての高親和性ビオチン結合タンパク質Avidin、ahighaffinitybiotin-bindingproteinasatoolandsubjectofbiologicalresearch.Med.Bio.62:5-261984。本発明の目的に対しては、アビジンがビオチンに対し高親和性を維持している限り解離平衡定数KD:10-14M~10-16Mのオーダー、アビジンは、グリコシル化、脱グリコシル化もしくは非グリコシル化、誘導体化、または修飾できる。ニュートラアビジンneutravidinまたはニュートラアビジンNeutrAvidinおよびストレプトアビジンは、アビジンの意味合いの中に含まれる。ストレプトアビジンは、52,800Daの四量体ビオチン結合タンパク質として細菌Streptomycesavidiniiから天然に産出され、その精製または合成もしくは組換えによる産生バージョン、および/またはその単量体もしくは多量体例えば、二量体、三量体等型を含む。組換え操作された一価または多価型のアビジンまたはストレプトアビジンは、また、アビジンに含まれる例えば、Laitinenetal..遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジンGeneticallyengineeredavidinsandstreptavidins、CellMolLifeSci.6324:2992‐301772006;Howarthetal.、単一フェムトモルビオチン結合部位を有する一価ストレプトアビジンAmonovalentstreptavidinwithasinglefemtomolarbiotinbindingsite、NatMethods34:267-732006。アビジンコートは、固体表面、例えば、ポリスチレンプレートのウエル表面が、アビジン部と複合体化され、それでも、アビジン部が、生理学的条件下、高親和性、例えば、10-14M~10-16Mのオーダーの解離平衡定数KDでビオチンと非共有結合できることを意味する。本発明のインビトロでアッセイでのアビジンコートウエルの一部の実施形態では、採用されるアビジンは、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンである。ウエルは、蓋ができる開口部を通して注入可能な容器で、水性液体を含む。例えば、マイクロタイタープレート例えば、96-または384-ウエルマイクロタイタープレートのそれぞれの区画は、ウエルである;単一区画容器、例えば、培養プレート、ペトリ皿、試験管、コニカルチューブ、またはくぼみスライドのくぼみもウエルである。ウエルの開口部は、蓋がなくても、別々に個別の蓋でカバーしても、または、まとめて1つの取り外し可能な蓋でカバーしてもよい。ビオチンは、水に可溶なB-複合体ビタミン、すなわち、ビタミンB7であり、テトラヒドロチオフェン環と縮合したウレイドテトラヒドロイミジザロン環から構成される式I参照。吉草酸置換基がテトラヒドロチオフェン環の炭素原子の1つに結合している。自然においていは、ビオチンは、脂肪酸とロイシンの代謝におけるコエンザイムであり、インビボで糖新生の役割を果たしている。ビオチンは、四量体タンパク質アビジン例えば、ニワトリアビジン、細菌性ストレプトアビジン、およびニュートラアビジンと、10-14M~10-16M台の解離平衡定数KDで非常に堅固に結合する。これは、知られている中で最強のタンパク質リガンド相互作用の1つであり、共有結合の強度に近いLaitinenetal.遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジンGeneticallyengineeredavidinsandstreptavidins、CellMolLifeSci.6324:2992‐301772006。ビオチン-アビジン非共有結合相互作用は、種々の生物工学的用途に使用されることが多いLaitinenetal.、遺伝子改変アビジンおよびストレプトアビジンGeneticallyengineeredavidinsandstreptavidins、CellMolLifeSci.6324:2992‐301772006。ビオチン化は、物質が1つまたは複数のビオチン部に複合体化されることを意味する。本発明の実施に有用なビオチン化されたペプチドは、市販品として購入可能例えば、MidwestBio-TechInc.であるか、または、容易に合成、ビオチン化できる。化合物、例えば、ペプチド、のビオチン化は、いずれかの既知の化学技術により行うことができる。これらには、一級アミンビオチン化、スルフヒドリルビオチン化、およびカルボキシルビオチン化が含まれる。例えば、ペプチド上のリシン側鎖εアミンおよびN末端αアミンとして存在するアミン基は、一級アミンビオチン化のための一般的な標的である。アミン反応性ビオチン化試薬は、水溶性に基づき2つのグループに分けることができる。1ビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミドNHSエステルは、水溶液中の溶解度が低い。水溶液中での反応のためには、有機溶媒に溶解する必要があり、その後、希釈して水性の反応混合物とする。この目的で最もよく使われる有機溶剤は、ジメチルスルホキシドDMSOおよびジメチルフォルムアミドDMFであり、これらは、大抵のタンパク質と低濃度で適合性がある。2ビオチンのスルフォNHSエステルは、水に対しより大きな可溶性があるが、容易に加水分解するので、使用の直前に水に溶解される。スルフォNHSエステルの水への溶解度は、N-ヒドロキシスクシンイミド環上のスルホン酸基に由来し、この試薬を有機溶媒に溶解する必要性を取り除く。NHSおよびスルフォNHSエステルの化学反応は、基本的には同じである:アミド結合が形成され、NHSまたはスルフォNHSが脱離基となる。エステルの標的は脱プロトン化一級アミンであるため、反応は、pH7超で行われるのが普通である。NHSエステルの加水分解が主要競合反応であり、pHの上昇につれ、加水分解速度が大きくなる。NHSおよびスルフォNHSエステルは、pH7で数時間の半減期があるが、pH9では数分に過ぎない。NHSエステルをペプチドの一級アミンに複合体化する条件には、4~37°Cのインキュベーション温度、7~9の反応pH値、および数分~約12時間のインキュベーション時間が含まれる。アミン例えば、トリスまたはグリシン含有緩衝液は、避けなければならない。理由は、それらが反応で競合するからである。HABA染料2-4-ヒドロキシアゾベンゼン安息香酸法を使って、ビオチン化度を測定することができる。簡単に説明すると、HABA染料がアビジンに結合され、特徴的吸光度が得られる。ビオチン化されたタンパク質または他の分子の形で、ビオチンが導入されると、それが染料を置換し、500nmの吸光度の変化を生じる。吸光度の変化は、直接的に試料中のビオチンの量に比例する。FCγRIIIaCD16aまたはFCGR3またはIGFR3としても知られる。本明細書では、これらの名称は同義に使用されるは、免疫グロブリンGFc受容体IIIを意味する。ヒトCD16aジェンバンク受入番号AAH17865は、下記のアミノ酸配列を含む:1mwqlllptallllvsagmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqw61fhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfke121edpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglvgskn181vssetvnititqglavstissffppgyqvsfclvmvllfavdtglyfsvktnirsstrdw241kdhkfkwrkdpqdk配列番号11しかし、CD16aの多型配列も、CD16aという用語に含まれる。このような多型には、176V高結合型および176F低結合型が含まれる。CD16aの254アミノ酸残基配列配列番号11には、16残基シグナル配列;191残基細胞外のドメインECD;ならびに22残基膜貫通ドメインおよび25残基C末端細胞質ドメインが含まれる。組換え型ヒトCD16aポリペプチドは、組換DNA技術により産生された可溶性の配列番号11の断片またはその多形性変異体である。このような可溶性断片の例は、配列番号11の推定上のECDを含むG17-Q208断片である:17gmrtedlpkavvflepqwyrvlekdsvtlkcqgayspednstqw61fhneslissqassyfidaatvddsgeyrcqtnlstlsdpvqlevhigwlllqaprwvfke121edpihlrchswkntalhkvtylqngkgrkyfhhnsdfyipkatlkdsgsyfcrglvgskn181vssetvnititqglavstissffppgyq配列番号12。組換え型ヒトCD16aポリペプチドの他の実施形態には、50nM未満の推定KDでヒトIgGに結合する能力を維持している配列番号12のさらに短い断片が含まれる。ポリヒスチジンタグ付きは、組換え型ヒトCD16aポリペプチドが、合成技術例えば、Peterson、米国特許第5,840,834号、アミノ酸配列およびイムノアッセイに有用な新規組成物を連結する技術Techniqueforjoiningaminoacidsequencesandnovelcompositionusefulinimmunoassays、または組換DNA技術によって、少なくとも5つ、通常は、6ヘキサヒスチジンタグまたは6xHisタグ~18の近接ヒスチジン残基を含む組換え型ヒトCD16aポリペプチドのN末端またはC末端延長部として複合体化されていることを意味する。ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトCD16aポリペプチドは、市販もされている例えば、RDSystemsカタログ4325-FC。特異的にポリヒスチジンに結合する抗体およびそれらの作成方法は当技術分野でよく知られており、このような抗体は市販されている例えば、Zentgrafetal.、ヒスチジン部を含む融合ポリペプチドに対し活性な抗体Antibodiesactiveagainstafusionpolypeptidecomprisingahistidineportion、米国特許第6,790,940号および同7,713,712号;Sigma-Aldrich製品H1029;RDSystemsカタログMAB050。本発明のインビトロアッセイ方法の一部の実施形態では、特異的にポリヒスチジンに結合する抗体、または他の実施形態では、特異的にポリヒスチジンに結合する抗体に特異的に結合する抗体は、抗体に複合体化されたシグナル生成標識、例えば、限定されないが、蛍光標識、同位体標識、電気化学発光標識、または分光光度、比色、蛍光定量、発行定量または他の装置例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはルシフェラーゼベース検出システムにより基質を容易に検出される反応物に変化させる反応を触媒できる酵素をさらに含む。電気化学発光ECL、または同義の電気化学発光electrogeneratedchemiluminescenceは、溶液中の電気化学反応の間に生成される発光の一種である。ECLでは、電気化学的に生成される中間体が、高エネルギー発生反応を起こし、電子的に励起された状態を作り出し、次にこれが発光するForsteretal.、ElectrogeneratedChemiluminescence、分析化学年次概況AnnualReviewofAnalyticalChemistry2:359-3852009。ECL励起は、電気発生種のエネルギー電子遷移レドックス反応により生ずる。これらの電子遷移反応は、充分にエネルギー発生性であり、光励起無しで、多環式芳香族炭化水素および金属錯体を含む発光団の励起状態の生成を可能にする。例えば、トリプロピルアミンの存在下の[Rubpy3]2の酸化は、光励起により生成される発光と類似の発光を生ずる。このようなルテニウム錯体は、本発明の目的のための化学発光標識として有効に採用できる。例えば、MesoScaleDiscoveryMSD;Gaithersburg、MDのSulfo-Tag登録商標ECL検出システムは、ルテニウム錯体を含む電気化学発光標識に依拠している。Sulfo-Tag登録商標システムでは、下記の化学構造IIを有する活性化N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが使われて標識を形成する:メーカーの指示MSDSulfo-Tag登録商標NHSエステル、17794-v2-2008May、2008に従って、活性化N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが標識するために抗体等のポリペプチドと反応される。前に記載のように、NHSおよびスルフォNHSエステルの化学反応は、基本的には同じであり:アミド結合が形成され、NHSまたはスルフォNHSは脱離基になる。エステルの標的は脱プロトン一級アミンであるため、反応はpH7超で行われるのが普通である。NHSエステルをペプチドの一級アミンに複合体化する条件には、4~37°Cのインキュベーション温度、7~9の反応pH値、および数分~約12時間のインキュベーション時間が含まれる。アミン含有緩衝液例えば、トリスまたはグリシンは避けなければならない。理由は、それ等が、反応と競合するからである。標識反応の標識ポリペプチド産物は、下記式IIIを有するルテニウム錯体を含む電気化学発光標識を含み、カルボニル基から引かれた線は残りの分子への結合を示す:本発明のインビトロでアッセイ法の一部の実施形態では、プレインキュベート反応混合物は、中和抗体の存在に関し試験をされる血清試料をさらに含む。中和抗体NAbは、インビボでまたは試料によりインビトロで、対象抗原、例えば、IgG標的抗体、の血清力価を、特異的にそれに結合することにより低減できる抗体である。インビボで、NAbは、治療分子の活性部位内にあるエピトープに直接結合するか、または活性部位に最近接しているエピトープに結合することに起因する立体障害によりその活性部位を遮断することにより、治療分子の生物活性を遮断する。ある場合には、NAbの存在が、臨床的効果に繋がらないことがある一方で、他の場合では、充分な量のNAbで、効力の減少が観察され、類似の効力を得るためには、より高い用量の製剤投与が必要なことがありうる例えば、Guptaetal.、生物学的治療薬に対する誘発された中和抗体応答の検出に使用される細胞ベースアッセイの設計、最適化、および適格性のための勧告Recommendationsforthedesign、optimization、andqualificationofcell-basedassaysusedforthedetectionofneutralizingantibodyresponseselicitedtobiologicaltherapeutics、JournalofImmunologicalMethods3211-2:1‐182007参照。他の場合では、効力の減少が観察され得、類似の効力を得るためには、より高い用量の製剤投与が必要なことがありうる。対象の標的タンパク質は、任意のタンパク質、例えば、限定されないが、抗体の特異的標的として、科学、医学、臨床、または治療の対象であるヒトタンパク質である。対象標的タンパク質の一例は、ケモカイン受容体タイプ4CCR4である。ヒトCCR4のアミノ酸配列は、以下の通りであるジェンバンク受入番号P51679:1mnptdiadttldesiysnyylyesipkpctkegikafgelflpplyslvfvfgllgnsvv61vlvlfkykrlrsmtdvyllnlaisdllfvfslpfwgyyaadqwvfglglckmiswmylvg121fysgiffvmlmsidrylaivhavfslrartltygvitslatwsvavfaslpgflfstcyt181ernhtycktkyslnsttwkvlssleinilglviplgimlfcysmiirtlqhcknekknka241vkmifavvvlflgfwtpynivlfletlvelevlqdctferyldyaiqatetlafvhccln301piiyfflgekfrkyilqlfktcrglfvlcqycgllqiysadtpsssytqstmdhdlhdal配列番号1。対象標的タンパク質の別の例は、Bリンパ球抗原CD20である。ヒトCD20のアミノ酸配列配下の通りであるジェンバンク受入番号NP_690605:1mttprnsvngtfpaepmkgpiamqsgpkplfrrmsslvgptqsffmresktlgavqimng61lfhialggllmipagiyapicvtvwyplwggimyiisgsllaateknsrkclvkgkmimn121slslfaaisgmilsimdilnikishflkmeslnfirahtpyiniyncepanpseknspst181qycysiqslflgilsvmlifaffqelviagivenewkrtcsrpksnivllsaeekkeqti241keevvgltetssqpkneedieiipiqeeeeeetetnfpeppqdqesspiendssp配列番号2。対象標的タンパク質の別の例は、HER2である。ヒトHER2癌遺伝子ERBB2、チロシンプロテインキナーゼerbB-2、癌遺伝子NGL、NEU、またはTKR1とてしても知られるのアミノ酸配列は以下の通りであるジェンバンク受入番号P04626:1melaalcrwglllallppgaastqvctgtdmklrlpaspethldmlrhlyqgcqvvqgnl61eltylptnaslsflqdiqevqgyvliahnqvrqvplqrlrivrgtqlfednyalavldng121dplnnttpvtgaspgglrelqlrslteilkggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqla181ltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqc241aagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacp301ynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsan361iqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslp421dlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtv481pwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqec541veecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarc601psgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqraspltsiisavvg661illvvvlgvvfgilikrrqqkirkytmrrllqetelvepltpsgampnqaqmrilketel721rkvkvlgsgafgtvykgiwipdgenvkipvaikvlrentspkankeildeayvmagvgsp781yvsrllgicltstvqlvtqlmpygclldhvrenrgrlgsqdllnwcmqiakgmsyledvr841lvhrdlaarnvlvkspnhvkitdfglarlldideteyhadggkvpikwmalesilrrrft901hqsdvwsygvtvwelmtfgakpydgipareipdllekgerlpqppictidvymimvkcwm961idsecrprfrelvsefsrmardpqrfvviqnedlgpaspldstfyrslledddmgdlvda1021eeylvpqqgffcpdpapgaggmvhhrhrssstrsgggdltlglepseeeaprsplapseg1081agsdvfdgdlgmgaakglqslpthdpsplqrysedptvplpsetdgyvapltcspqpeyv1141nqpdvrpqppspregplpaarpagatlerpktlspgkngvvkdvfafggavenpeyltpq1201ggaapqphpppafspafdnlyywdqdppergappstfkgtptaenpeylgldvpv配列番号13。ポリペプチド部は、標的タンパク質の抗原性のペプチジル部を含む対象標的タンパク質のサブセットである。一般的には、このようなポリペプチド部は、少なくとも5~6近接アミノ酸残基を含み、全体対象タンパク質の大きさであってもよい。さらに一般的には、ポリペプチド部は、10~40アミノ酸残基長さである。ポリペプチド部は、標的抗原結合タンパク質またはIgG標的抗体の少なくとも1つのCDR、または別の実施形態では、少なくとも2つのCDR、またはさらに別の実施形態では、少なくとも3つのCDR、が特異的に結合する標的タンパク質のアミノ酸残基を含む。標的抗原結合タンパク質は、対象標的タンパク質のポリペプチド部に特異的に結合する抗原結合タンパク質であり、また、CD16a結合部位を有するFcドメインを含む。IgG標的抗体は、標的抗原結合タンパク質の一例である。IgG標的抗体は、対象標的タンパク質のポリペプチド部に特異的に結合する抗体であり、また、CD16a結合部位を有するFcドメインを含む。抗体の産生ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、当該抗原およびアジュバントの複数の皮下scまたは腹腔内ip注射により動物中で産生させるのが好ましい。あるいは、抗原を動物のリンパ節に直接注射してもよいKilpatricketal.、Hybridoma、16:381-389、1997、参照。改善された抗体応答は、当該抗原を、免疫される種中で免疫原性であるタンパク質、例えば、スカシ貝ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステルシステイン残基を介したコンジュゲーション、N-ヒドロキシスクシンイミドリジン残基を介したコンジュゲーション、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物または当技術分野で既知の他の薬剤を使って、複合体化することにより得ることができる。動物は、抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対し、例えば、100μgのタンパク質または複合体マウス用を3倍量のフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、その溶液を皮内の複数の部位に注射することにより免疫される。1ヶ月後、動物に、フロイント完全アジュバント中の最初の量の1/5~1/10のペプチドまたは複合体を複数の部位で皮下注射することにより、追加免疫する。追加免疫注射後7~14日目に、動物から採血し、血清の抗体力価のアッセイを行う。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫を行う。動物に、同じ抗原であるが、異なるタンパク質との複合体で、および/または異なる架橋結合試薬による複合体で、追加免疫をするのが好ましい。複合体は、また、タンパク質融合体として組換え型細胞培養で作成することもできる。また、免疫応答を強化するために、ミョウバン等の凝集剤も適切に使用される。モノクローナル抗体。モノクローナル抗体は、当技術分野で既知の任意の技術を使って、例えば、免疫化スケジュールの完了後、遺伝子導入動物から採取した不死化脾臓細胞により、産生可能である。脾臓細胞は、当技術分野で既知の任意の技術を使って、例えば、骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを産生することにより不死化できる。例えば、モノクローナル抗体は、Kohleretal.、Nature、256:4951975で最初にKohler等により記載されたハイブリドーマ法を使って、または、通常、軽鎖と重鎖の等モル産生を促進するsplitDHFR法、等の方法を含む、組換えDNA法例えば、Cabillyetal.、免疫グロブリン、ベクターおよび形質転換宿主細胞を産生する方法Methodsofproducingimmunoglobulins、vectorsandtransformedhostcellsforusetherein、米国特許第6,331,415号、参照により、任意選択で、抗体をグリコシル化できる哺乳動物細胞株例えば、CHO細胞を使って例えば、Page、抗体産生Antibodyproduction、欧州特許第EP0481790A2号および米国特許第5,545,403号、参照、作ることができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主哺乳動物、例えば、ラット、ハムスターまたはマカクザルが、本明細書に記載のように、免疫され、免疫化に使われたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球が、インビトロで免疫されうる。リンパ球は、次いで、適切な融合剤、例えば、ポリエチレングリコールを使って骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成するGoding、モノクローナル抗体:原理と実際MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice、pp.59-103AcademicPress、1986。一旦調製されると、ハイブリドーマ細胞は、適切な培地中で播種、成長させることができる。培地は、非融合、親骨髄腫細胞の増殖または生存を抑制する1つまたは複数の物質を含むことが好ましい。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼHGPRTまたはHPRTを欠いている場合は、ハイブリドーマ用の培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含みHAT培地、この物質がHGPRT欠乏細胞の増殖を防ぐ。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択抗体産生細胞による安定な高レベル抗体産生を支援し、培地に敏感である細胞である。ヒト骨髄腫およびマウスヒトヘテロミエローマ細胞株は、また、ヒトモノクローナル抗体産生用として記載されているKozbor、J.Immunol.、133:30011984;Brodeuretal.、モノクローナル抗体産生技術と応用MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications、pp.51-63MarcelDekker、Inc.、NewYork、1987。ハイブリドーマ産生融合方法で使用のための骨髄腫細胞は、非抗体産生であり、高融合効率を有し、所望の融合細胞ハイブリドーマのみの増殖を支援する特定の選択培地中での増殖を不可能にする酵素欠損を有しているのが好ましい。マウス融合体での使用に適切な細胞株の例には、Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7およびS194/5XXOBulが含まれる;ラット融合体に使われる細胞株の例には、R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983Fおよび4B210が含まれる。細胞融合体用に有用な他の細胞株は、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6である。抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関し、ハイブリドーマ細胞が増殖中の培地がアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイRIAまたは酵素免疫測定法ELISAによって測定されるのが好ましい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、BIAcore登録商標またはスキャチャード解析により測定できるMunsonetal.、Anal.Biochem.、107:2201980;Fischeretal.、ペプチド-免疫グロブリンコンジュゲートApeptide-immunoglobulin-conjugate、国際公開第2007/045463A1号の実施例10この特許は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。所望の特異性、親和性、および/または活性、の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後で、クローンは、限界希釈方法によりサブクローニングおよび標準的方法により増殖できるGoding、モノクローナル抗体:原理と実際MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice、pp.59-103AcademicPress、1986。この目的に適する培地には、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍として、インビボ増殖可能である。ハイブリドーマまたはmAbは、特定の特性、例えば、特定の抗原または標的との結合親和性を有するmAbを特定するために、さらなる選別が可能である。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手法、例えば、タンパク質Aセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、親和性クロマトグラフィー、またはいずれかの他の適切な当技術分野で既知の精製技術により、培地、腹水、または血清から適宜分離される。抗体および他のポリペプチドの組換え産生。本発明は、ポリペプチド、融合ペプチド、または抗原結合タンパク質、例えば、本明細書記載の発明の抗体断片を含む抗体ポリクローナルおよびモノクローナルのいずれかをコードする単離核酸を提供し、任意選択で、この核酸は、宿主細胞、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。さらに本発明は、宿主細胞を培養し、それにより、核酸が発現すること、および、任意選択で、宿主細胞培養または培地から抗体を回収することを含んでもよい抗体産生用組換え技術を提供する。類似の物質および方法は、他のポリペプチドの産生にも適用できる。対象の免疫グロブリンまたはポリペプチド由来の関連アミノ酸配列は、直接タンパク質シーケンシングにより決定でき、適切なコーディングヌクレオチド配列は、ユニバーサルコドン表に従って設計できる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはcDNAを単離し、このような抗体を産生する細胞から、従来の方法を使って例えば、モノクローナル抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使って配列決定できる。DNAクローニングは、標準的な方法を使って行われる例えば、Sambrooketal.1989分子クローニング:実験ガイドMolecularCloning:ALaboratoryGuide、Vols1-3、ColdSpringHarborPress、を参照。本文献は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、cDNAライブラリーを、polyAmRNA、好ましくは膜結合性mRNAの逆転写により構築でき、ライブラリーをヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的プローブを使って選別できる。一実施形態では、しかし、ポリメラーゼ連鎖反応PCRを使って、対象の免疫グロブリン遺伝子セグメント例えば、軽鎖または重鎖可変セグメントをコードするcDNAまたは完全長cDNAの一部を増幅する。増幅された配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易に挿入できる。対象免疫グロブリンポリペプチドの一部の配列を決定することが可能である限り、使用した特定のクローニング方法は、重要ではないことは理解されよう。抗体核酸の源の1つは、対象抗原で免疫した動物由来のB細胞を得て、不死細胞に融合することにより産生されるハイブリドーマである。あるいは、核酸は、免疫動物のB細胞または全脾臓から単離できる。さらに抗体をコードする核酸の別の源は、例えば、ファージディスプレイ技術により生成される核酸のライブラリーである。対象ペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変部ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニング等の標準的な方法により特定できる。免疫グロブリンポリペプチドの全可変部をコードする配列を決定可能であるが、しかし、可変部の一部のみ、例えば、CDRをコードする部分を配列決定することで十分な場合もある。配列決定は、標準的な方法を使って行われる例えば、Sambrooketal.1989分子クローニング:実験ガイドMolecularCloning:ALaboratoryGuide、Vols1-3、ColdSpringHarborPress、およびSanger、F.etal.1977Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467を参照これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。クローン化核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの掲載された配列と比較することにより、当業者なら、配列決定される領域に応じて、iハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド重鎖アイソタイプを含むの生殖系列セグメントの使用頻度、およびiiN領域付加および体細胞変異プロセス由来の配列を含む、重鎖と軽鎖可変部の配列、を容易に決定できるであろう。免疫グロブリン遺伝子配列情報ソースの1つは、米国国立衛生研究所、国立バイオテクノロジー情報センターNationalCenterforBiotechnologyInformation、NationalLibraryofMedicineNationalInstitutesofHealth、Bethesda、Mdである。単離DNAは、制御配列に機能的に連結、または発現ベクター中に挿入でき、次いで、他の方法は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に形質移入され、組換え型宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を指令する。抗体の組換え産生は、当技術分野でよく知られている。別の核酸配列と機能的関連性がある場合、核酸は、機能的に連結されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌物中に析出するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドに対するDNAに機能的に連結されている;プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するような位置に置かれている場合、コード配列に機能的に連結されている。通常、機能的に連結されることは、連結されるDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には、近接かつ読み枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接している必要はない。連結は、都合のよい制限酵素部位での連結反応により行われる。このような部位が存在しない場合は、従来の手法に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。多くのベクターが当技術分野で知られている。ベクター成分には、1つまたは複数の以下のものを含んでもよい:シグナル配列例えば、抗体の分泌を指示することができる;例えば、ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGT//配列番号9、これはVK-1シグナルペプチド配列MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC//配列番号10、をコードする、複製起点、1つまたは複数の選択マーカー遺伝子例えば、抗生物質または他の薬剤耐性、補体栄養要求欠損を付与、または培地中に存在しない重要な栄養素を供給できる、エンハンサー配列、プロモーター、および転写終止配列これら全ては、当技術分野でよく知られている。細胞、細胞株、および細胞培養は、同義に使用されることが多く、本明細書のこれらの全ての名称は、子孫を含む。形質転換体および形質転換細胞は、初代対象細胞および継代の数にかかわらずそれら由来の培養物を含む。また、全ての子孫は、故意の、または故意でない変異に起因して、DNA内容が正確に同じではない可能性があることも理解されよう。元の形質転換細胞で選別されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が含まれる。代表的宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が含まれる。原核生物宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性菌等の真正細菌、例えば、大腸菌類等の腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、ネズミチフス菌、セラチア属、例えば、セラチア菌、および赤痢菌属、ならびに枯草菌およびバチルスリケニホルミス、シュードモナス、およびストレプトマイセス等のバチルス属、が含まれる。真核生物微生物、例えば、糸状菌または酵母菌は、クローニングまたは組換え型ポリペプチドまたは抗体用の適切な発現宿主である。出芽酵母、すなわち通常のパン酵母は、低級真核生物宿主微生物の中で最もよく使われる。しかし、下に示すいくつかの他の属、種、および菌株が一般的に入手可能であり、本明細書で有用である:ピキア属、例えば、P.パストリス、分裂酵母;クリベロマイセス属、ヤロウイア属;カンジダ属;トリコデルマリージア;アカパンカビ;シュワニオミセス属、例えば、シュワニオミセスオキシデンタリス;および糸状菌類、例えば、パンカビ、アオカビ類、トリポクラジウム、ならびにアスペルギルス属宿主、例えば、偽巣性コウジ菌およびクロコウジカビ。グリコシル化抗体の発現用宿主細胞は、多細胞生物から得てもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。ヨトウガイモムシ、ネッタイシマカ蚊、ヒトスジシマカ蚊、キイロショウジョウバエショウジョウバエ、およびカイコ、等の宿主由来の多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容できる昆虫宿主細胞が特定されている。このような細胞のトランスフェクション用の種々のウイルス株、例えば、オートグラファカリフォルニカNPVのL-1変異体およびカイコNPVのBm-5株が公的に入手可能である。脊椎動物宿主細胞は、また、適切な宿主であり、このような細胞からのポリペプチド抗原結合タンパク質、例えば、抗体および抗体断片を含むの組換え産生は、日常的な手法になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、以下の通りである:CHOK1細胞ATCCCCL61、DXB-11、DG-44、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFRを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、Urlaubetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980;SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株COS-7、ATCCCRL1651;ヒト胚性腎臓株浮遊培養による増殖用にサブクローンされた293または293細胞、[Grahametal.、J.GenVirol.36:591977];ベビーハムスター腎臓細胞BHK、ATCCCCL10;マウスセルトリ細胞TM4、Mather、Biol.Reprod.23:243-2511980;サル腎臓細胞CV1ATCCCCL70;アフリカミドリザル腎臓細胞VERO-76、ATCCCRL-1587;ヒト子宮頚癌細胞HELA、ATCCCCL2;イヌ腎臓細胞MDCK、ATCCCCL34;BUFラット肝臓細胞BRL3A、ATCCCRL1442;ヒト肺細胞W138、ATCCCCL75;ヒト肝細胞腫細胞HepG2、HB8065;マウス乳房腫瘍MMT060562、ATCCCCL51;TRI細胞Matheretal.、AnnalsN.YAcad.Sci.383:44-681982;MRC5細胞もしくはFS4細胞;または哺乳類骨髄腫細胞。宿主細胞は、ポリペプチド抗原結合タンパク質、例えば、抗体を含むの産生のために、上述の核酸またはベクターで形質転換または形質移入され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、適宜改良された通常の栄養素培地中で培養される。さらに、選択マーカーで区切られた転写ユニットの複数コピーを有する新規ベクターおよび形質移入された細胞株は、抗体等のポリペプチドの発現に特に有用である。本発明で有用なポリペプチドを産生するために使用する宿主細胞は、種々の培地中で培養できる。ハムF10Sigma、最小必須培地MEM、Sigma、RPMI-1640Sigma、およびダルベッコ変法イーグル培地DMEM、Sigma等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Hametal.、Meth.Enz.58:441979、Barnesetal.、Anal.Biochem.102:2551980、米国特許第4,767,704号;同4,657,866号;同4,927,762号;同4,560,655号;または同5,122,469号;国際公開第90103430号;同87/00195号;または米国再発行特許第30,985号、に記載のいずれの培地も、宿主細胞用培地として使用できる。必要に応じ、これらの培地のいずれをも、ホルモンおよび/または他の増殖因子例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子、塩例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩、緩衝剤例えば、HEPES、ヌクレオチド例えば、アデノシンおよびチミジン、抗生物質例えば、ゲンタマイシン登録商標薬剤、痕跡の元素通常、ミクロモルの最終濃度範囲で存在する無機化合物として規定される、およびブドウ糖または等価なエネルギーソース、で補充してもよい。他の必要ないずれの補充剤も、当業者には既知の適切な濃度で含んでもよい。培養条件、例えば、温度、pH、等は、発現用に宿主細胞で以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。宿主細胞の培養に際しては、組換えポリペプチドは、細胞内で、細胞周辺腔中で、または培地中に直接分泌により産生出来る。抗原結合タンパク質例えば、抗体等のポリペプチドが細胞内で産生される場合は、第1ステップとして、宿主細胞または溶解断片の粒子状破片が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。抗体または抗体断片は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、または好ましくは、対象の抗原またはタンパク質Aまたはタンパク質Gを親和性リガンドとして使った親和性クロマトグラフィー、を使用して精製できる。タンパク質Aは、含有ポリペプチドがヒトγ1、γ2、またはγ4重鎖に基づいているタンパク質を精製するのに使用できるLindmarketal.、J.Immunol.Meth.62:1-131983。タンパク質Gは、全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ3に対し推奨されるGussetal.、EMBOJ.5:156715751986。親和性リガンドが接着するマトリックスは、多くの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、気孔制御ガラスまたはポリスチレンジビニルベンゼンは、アガロースの場合より高速な流量と、より短い処理時間を可能とする。タンパク質がCH3ドメインを含む場合には、BakerbondABX登録商標樹脂J.T.Baker、Phillipsburg、N.J.が、精製に有用である。他のタンパク質精製技術、例えば、エタノール沈殿、逆相HPLC、等電点電気泳動、SDS-PAGE、および硫酸アンモニウム沈殿法もまた、回収される抗体に応じて、利用可能である。キメラ、ヒト化、HumanEngineered登録商標、Xenomouse登録商標モノクローナル抗体。げっ歯類モノクローナル抗体の可変Igドメインが、ヒト定常Igドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体は、当技術分野で既知の標準的方法を使って生成できるMorrison、S.L.、etal.1984キメラヒト抗体分子ChimericHumanAntibodyMolecules;ヒト定常部ドメインを有するマウス抗原結合ドメインMouseAntigenBindingDomainswithHumanConstantRegionDomains、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81、6841-6855;および、Boulianne、G.L.、etal、Nature312、643-646.1984を参照。抗体配列をさらにヒト様にヒト化する、または改変することに関し、例えば、1非ヒト相補性決定領域CDRの、ヒトフレームワークおよび定常部への移植当技術分野でCDR移植によるヒト化と呼ばれるプロセスまたは2全非ヒト可変ドメインを移植するが、それらの表面残基の置換によるヒト様表面での被覆当技術分野でベニアリングveneeringと呼ばれるプロセス、または3選択非ヒトアミノ酸残基を、各残基の抗原結合または抗体構造での寄与の見込みおよびその免疫原性の見込みに基づいて、よりヒト型への改変、によるいくつかの技術が記載されている。例えば、Jonesetal.、Nature321:5225251986;Morrisonetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、81:685168551984;MorrisonandOi、Adv.Immunol.、44:65921988;Verhoeyeretal.、Science239:153415361988;Padlan、Molec.Immun.28:4894981991;Padlan、Molec.Immunol.313:1692171994;およびKettleborough、C.A.etal.、ProteinEng.47:773831991;Co、M.S.、etal.1994、J.Immunol.152、2968-2976;Studnickaetal.ProteinEngineering7:805-8141994、を参照されたい。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体配列をさらにヒト様にヒト化する、または改変することに関し、例えば、1非ヒト相補性決定領域CDRの、ヒトフレームワークおよび定常部への移植当技術分野でCDR移植によるヒト化と呼ばれるプロセスまたは2全非ヒト可変ドメインを移植するが、それらの表面残基の置換によるヒト様表面の被覆当技術分野でベニアリングveneeringと呼ばれるプロセス、または3選択非ヒトアミノ酸残基を、各残基の抗原結合または抗体構造での寄与の見込みおよびその免疫原性の見込みに基づいて、よりヒト型への改変、によるいくつかの技術が記載されている。例えば、Jonesetal.、Nature321:5225251986;Morrisonetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、81:685168551984;MorrisonandOi、Adv.Immunol.、44:65921988;Verhoeyeretal.、Science239:153415361988;Padlan、Molec.Immun.28:4894981991;Padlan、Molec.Immunol.313:1692171994;およびKettleborough、C.A.etal.、ProteinEng.47:773831991;Co、M.S.、etal.1994、J.Immunol.152、2968-2976;Studnickaetal.ProteinEngineering7:805-8141994、を参照されたい。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体は、また、内在性免疫グロブリン産生の無い遺伝子導入動物を使って、ヒト免疫グロブリン座位を含むように操作して、産生出来る例えば、Mendezetal.、Nat.ジェネット.15:146-1561997参照。例えば、国際公開第98/24893号は、ヒトIg座位を有する遺伝子導入動物を開示している。この座位では、動物は、内在性重鎖および軽鎖座位の不活性化に起因して、機能できる内在性免疫グロブリンを産生しない。国際公開第91/10741号は、また、免疫原に対し免疫応答開始できる遺伝子導入非霊長類哺乳類宿主を開示し、ここでは、抗体は、霊長類定常および/または可変部を有し、内在性免疫グロブリンコード座位は、置換または不活化されている。国際公開第96/30498号は、Cre/Loxsystemを使用して、全てまたは一部の定常または可変部を置換して改変抗体分子を形成するように、哺乳動物の免疫グロブリン座位を変更することが開示されている。国際公開第94/02602号は、不活化内在性Ig座位および機能できるヒトIg座位を有する非ヒト哺乳類宿主を開示している。米国特許第5,939,598号は、遺伝子導入マウスを作る方法を開示し、この方法では、マウスは、内在性重鎖を欠き、1つまたは複数の異種定常部を含む外因性の免疫グロブリン座位を発現する。上述の遺伝子導入動物を使って、選択抗原性分子に対し免疫応答を生成でき、抗体産生細胞は、動物から取り出され、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生に使用できる。免疫化プロトコル、アジュバント、等は、当技術分野で既知であり、例えば、国際公開第96/33735号に記載のように、遺伝子導入マウスの免疫化に使用される。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理的な効果を抑制する、または中和する能力により試験できる。また、Jakobovitsetal.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:25511993;Jakobovitsetal.、Nature、362:255-2581993;Bruggermannetal.、YearinImmuno.、7:331993;Mendezetal.、Nat.Genet.15:146-1561997;ならびに米国特許第5,591,669号、同5,589,369号、同5,545,807号;および米国特許公開第20020199213号、を参照されたい。米国特許公開第20030092125号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法を記載している。ヒト抗体は、また、インビトロ活性化B細胞によっても生成できる米国特許第5,567,610号および同5,229,275号を参照。ファージディスプレイ技術による抗体産生組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー作成技術の開発、および繊維状バクテリオファージの表面上のコード化抗体断片のディスプレイは、ヒト由来抗体生成のための別の手段を提供している。ファージディスプレイに関しては、例えば、Doweretal.、国際公開第91/17271号、McCaffertyetal.、国際公開第92/01047号、およびCatonandKoprowski、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:6450-64541990、に記載されている。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術により産生された抗体は、通常、細菌中で、抗原結合断片、例えば、FvまたはFab断片として産生され、従って、エフェクター機能が欠如している。エフェクター機能は、次の2つの戦略の内の1つにより導入できる:断片を操作して、哺乳動物細胞中で完全抗体として発現させる、またはエフェクター機能をもたらすことができる第2の結合部位を有する二重特異性抗体断片とすることができる。通常、抗体のFd断片VH~CH1および軽鎖VL~CLは、PCRにより別々にクローニングされ、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを使って無作為に組み換えられ、その後、特定の抗原に対する結合により選択できる。抗体断片は、ファージ表面上で発現し、FvまたはFabおよび従って、抗体断片をコードするDNAを含むファージの抗原結合による選択が、数ラウンドの抗原結合と再増幅パニングと呼ばれるプロセスにより成し遂げられる。抗原に特異的な抗体断片が濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術は、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のための手法にも使用できる、この手法は、誘導選択guidedselectionと呼ばれるJespers、L.S.、etal.、Bio/Technology12、899-9031994、を参照。このために、マウスモノクローナル抗体のFd断片は、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示でき、得られたハイブリッドFabライブラリーは、次に、抗原を使って選択できる。マウスFd断片は、これによって選択をガイドするテンプレートを提供する。その後、選択ヒト軽鎖は、ヒトFd断片ライブラリーと合わせられる。得られたライブラリーの選択により、完全ヒトFabが得られる。ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための種々の方法が記載されている例えば、Hoogenboometal.、J.Mol.Biol.、227:3811991;Marksetal.、J.Mol.Biol、222:581-5971991;米国特許第5,565,332号および同5,573,905号;Clackson、T.、andWells、J.A.、TIBTECH12、173-1841994を参照。特に、ファージディスプレイライブラリー由来抗体のインビトロ選択と進展は、協力はツールになっているBurton、D.R.、andBarbasIII、C.F.、Adv.Immunol.57、191-2801994;およびWinter、G.、etal.、Annu.Rev.Immunol.12、433-4551994;米国特許公開第20020004215号および国際公開第92/01047号;2003年10月9日広告の米国特許公開第20030190317号、ならびに米国特許第6、054、287号;同5、877、293号、参照。Watkins、キャプチャーリフトによるファージ発現抗体ライブラリーの選別ScreeningofPhage-ExpressedAntibodyLibrariesbyCaptureLift、分子生物学における方法、抗体ファージディスプレイ:方法とプロトコルMethodsinMolecularBiology、AntibodyPhageDisplay:MethodsandProtocols178:187-193、および2003年3月6日広告の米国特許公開第20030044772号は、ファージ発現抗体ライブラリーまたは他の結合分子のキャプチャーリフトによる選別方法を記載している。キャプチャーリフト法は、候補結合分子の固体支持体への固定化を含む方法である。抗原結合タンパク質の他の実施形態上述のように、抗体断片は、無傷完全長抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合部または可変部を含み、抗体断片から形成された直鎖抗体および多選択性の抗体を含む。抗体断片の非限定的例には、Fab、Fab’、Fab’2、Fv、Fd、ドメイン抗体dAb、相補性決定領域CDR断片、単鎖抗体scFv、単鎖抗体断片、マクシボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体、キレート化組換え抗体chelatingrecombinantantibody、トリボディまたはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤SMIP、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、VHH含有抗体、またはムテインもしくはその誘導体、およびポリペプチド、例えば、抗体が所望の生物活性を維持している限り、CDR配列に特異的抗原結合を付与するのに充分な少なくとも一部の免疫グロブリンを含むポリペプチド、が含まれる。このような抗体断片は、全抗体の改変により産生、または組換えDNA技術もしくはペプチド合成を使って新規に合成できる。さらなる抗体断片には、ドメイン抗体dAb断片Wardetal.、Nature341:544-546、1989が含まれ、これは、VHドメインから構成される。直鎖抗体は、1対のタンデムFdセグメントVH-CH1-VH-CH1を含み、これは、1対の抗原結合領域を形成する。直鎖抗体は、二重特異性でも、または単一特異性であってもよいZapataetal.ProteinEng.8:1057-621995。ペプチドリンカーヒンジ無し経由またはIgGヒンジ経由でCH3に融合したscFvから構成されるミニボディは、Olafsen、etal.、ProteinEngDesSel.2004Apr;174:315-23、に記載されている。マクシボディという用語は、免疫グロブリンのFc領域に共有結合した二価のscFvを指す。例えば、Fredericksetal、ProteinEngineering、DesignSelection、17:95-1062004およびPowersetal.、JournalofImmunologicalMethods、251:123-1352001、を参照されたい。軽鎖を欠いている機能性重鎖抗体は、特定の動物種、例えば、テンジクザメ、オオセサメおよびラクダ等のラクダ科、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマで天然に存在する。これらの動物では、抗原結合部位は、単一ドメイン、VHHドメインに縮小されている。これらの抗体は、重鎖可変部のみを使って抗原結合領域を形成し、すなわち、これらの機能性抗体は、構造H2L2を有するだけの重鎖のホモダイマーである重鎖抗体またはHCAbと呼ばれる。ラクダ化VHHは、ヒンジ、CH2、およびCH3ドメインを含み、CH1ドメインを欠いているIgG2およびIgG3定常部と組み変わると報告されている。古典的なVHのみの断片は、可溶型として産生するのが困難であるが、さらにVHH様に変えられる場合、溶解度と特異的結合の改善を行うことができる例えば、Reichman、etal.、JImmunolMethods1999、231:25-38、を参照。ラクダ化VHHドメインは、高親和性で抗原に結合しDesmyteretal.、J.Biol.Chem.276:26285-90、2001、溶液中で高安定性を有することが見出されているEwertetal.、Biochemistry41:3628-36、2002。ラクダ化重鎖を有する抗体の産生方法は、例えば、米国特許公開第2005/0136049号および同2005/0037421号に記載されている。あるいは、足場は、サメV-NAR足場に、さらに密接にマッチするヒト可変様ドメインから生成でき、長いループ構造のためのフレームワークを提供できる。重鎖抗体の可変ドメインは、15kDaにすぎない分子量の最少の完全機能性抗原結合断片であるため、この実体は、ナノボディと呼ばれるCortez-Retamozoetal.、CancerResearch64:2853-57、2004。ナノボディライブラリーは、免疫ヒトコブラクダから、Conrathetal.、AntimicrobAgentsChemother45:2807-12、2001に記載のように、作成できる。適切な組換え方法、および、本発明の薬理学的に活性毒素ペプチド類似体にコンジュゲートした二量体Fc融合タンパク質ぺプチボディまたはキメラ免疫グロブリン軽鎖重鎖-Fcヘテロトリマーヘミボディを含む、哺乳動物細胞による抗原結合タンパク質の実施形態の組み換え体発現のために有用な代表的DNA構築物のさらなる例は、例えば、Sullivanetal.、毒素ペプチド治療薬ToxinPeptideTherapeuticAgents、米国特許公開第2007/0071764号およびSullivanetal.、毒素ペプチド治療薬ToxinPeptideTherapeuticAgents、国際出願PCT/US2007/022831国際公開第2008/088422号として公開に認められる。これらは、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ペプチド本発明で使用されるペプチドまたはポリペプチド組成物は、前に本明細書で記載のように、組換えDNA技術を使って、または化学ペプチド合成により作ることができる。固相合成は、好ましい個別ペプチドの作成技術である。理由は、これが最も対費用効果の高い低分子ペプチド作成方法であるからである。例えば、よく知られた固相合成技術には、保護基、リンカー、および固相支持体の使用、ならびに特異的保護および脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用、ならびに固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は、当技術分野でよく知られているE.g.、Merrifield1973、Chem.ポリペプチド、pp.335-61KatsoyannisandPanayotiseds.;Merrifield1963、J.Am.Chem.Soc.85:2149;Davisetal.1985、Biochem.Intl.10:394-414;StewartandYoung1969、固相ペプチド合成SolidPhasePeptideSynthesis;米国特許第3、941、763号;Finnetal.1976、タンパク質TheProteins3rded.2:105-253;およびEricksonetal.1976、タンパク質TheProteins3rded.2:257-527;有機合成における保護基ProtectingGroupsinOrganicSynthesis、3rdEdition、T.W.GreeneandP.G.M.Wuts、Eds.、JohnWileySons、Inc.、1999;NovaBiochemカタログ、2000;合成ペプチド、ユーザーズガイドSyntheticPeptides、AUser’sGuide、G.A.Grant、Ed.、W.H.FreemanCompany、NewYork、N.Y.、1992;コンビナトリアル固相有機化学の最新化学技術ハンドブックAdvancedChemtechHandbookofCombinatorialSolidPhaseOrganicChemistry、W.D.Bennet、J.W.Christensen、L.K.Hamaker、M.L.Peterson、M.R.Rhodes、andH.H.Saneii、Eds.、AdvancedChemtech、1998;ペプチド合成の原理PrinciplesofPeptideSynthesis、2nded.、M.Bodanszky、Ed.、Springer-Verlag、1993;ペプチド合成の実際ThePracticeofPeptideSynthesis、2nded.、M.BodanszkyandA.Bodanszky、Eds.、Springer-Verlag、1994;保護基ProtectingGroups、P.J.Kocienski、Ed.、GeorgThiemeVerlag、Stuttgart、Germany、1994;Fmoc固相ペプチド合成、実践的アプローチFmocSolidPhasePeptideSynthesis、APracticalApproach、W.C.ChanandP.D.White、Eds.、OxfordPress、2000、G.B.Fieldsetal.、合成ペプチド、ユーザーズガイド、1990、77-183。本発明の物質の組成物の作成に適用可能な当技術分野で既知の合成と精製方法のさらなる例に関しては、例えば、Sullivanetal.、毒素ペプチド治療薬ToxinPeptideTherapeuticAgents、米国特許公開第2007/0071764号およびSullivanetal.、毒素ペプチド治療薬ToxinPeptideTherapeuticAgents、国際出願PCT/US2007/022831国際公開第2008/088422号として公開を参照されたい。これら両方の特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リンカー本明細書で同義に使用されるリンカーまたはリンカー成分は、本発明の組成物中に含まれるポリペプチド鎖例えば、免疫グロブリンHCまたは免疫グロブリンLCまたは免疫グロブリンFcドメインのアミノ酸残基に共有結合している生物学的に受容可能なペプチジルまたは非ペプチジル有機基を指す。このリンカー成分は、共有結合でポリペプチド鎖を別の分子または化学成分に連結または複合体化する。多くの有用なペプチジルおよび非ペプチジルリンカーが当技術分野で知られており、多くが、Sullivanetal.、毒素ペプチド治療薬ToxinPeptideTherapeuticAgents、米国特許公開第2007/0071764A1号に詳細に記載されている。本発明に採用される成分または試薬中のいずれかのリンカー成分の存在は、任意選択である。存在する場合には、リンカーの化学構造は重要ではない。理由は、それは、主にスペーサーとして働き、1つまたは複数の他の機能的成分と関連して、配置、連結、接続し、または1つの機能的成分の提示または位置を最適化するためである。本発明は、以下の実施例により説明されるが、この実施例には、何ら限定の意図はない。実施例1:KW-0761に対する中和抗体の選別アッセイ開発中のKW-0761モガムリズマブまたはAMG761としても知られる治療薬は、ヒト化IgG1抗CCR4抗体であり、抗体依存性細胞傷害ADCCの機序によりインビボで機能するIshiietal.、成人T細胞白血病/リンパ腫用新規免疫治療薬としての脱フコシル化ヒト化抗CCR4モノクローナル抗体KW-0761DefucosylatedHumanizedAnti-CCR4MonoclonalAntibodyKW-0761asaNovelImmunotherapeuticAgentforAdultT-cellLeukemia/Lymphoma、ClinicalCancerResearch16:1520-312010;Shitaraetal.、ヒトCDRグラフト化抗体およびその抗体断片HumanCDR-graftedantibodyandantibodyfragmentthereof、米国特許第7、504、104号。この薬剤は、標的細胞上のヒトCCR4ケモカイン受容体およびエフェクター細胞上のヒトFCγRIIIaCD16aに結合する。その結果、エフェクター細胞は標的細胞を死滅させることができる。我々は、MSD電気化学発光ECL検出法を利用することによる、KW-0761に対する中和抗体NAbの検出のための二重機能標的結合アッセイの実施形態を開発した。図1は、ビオチン化対象標的タンパク質例えば、CCR4に特異的に結合するIgG1標的抗体例えば、KW-0761、および血清試料中の中和抗体を検出するように構成された本発明のアッセイの実施形態の模式図である。簡単に説明すると、この本発明の実施形態では、IgG標的抗体治療の薬剤、例えば、KW-0761;Ishiietal.、成人T細胞白血病/リンパ腫用新規免疫治療薬としての脱フコシル化ヒト化抗CCR4モノクローナル抗体KW-0761DefucosylatedHumanizedAnti-CCR4MonoclonalAntibodyKW-0761asaNovelImmunotherapeuticAgentforAdultT-cellLeukemia/Lymphoma、ClinicalCancerResearch16:1520-312010;Shitaraetal.、ヒトCDRグラフト化抗体およびその抗体断片HumanCDR-graftedantibodyandantibodyfragmentthereof、米国特許第7,504,104号、試験血清試料、標的タンパク質のおよびポリペプチド成分例えば、ビオチンCCR4ペプチドコンジュゲートを含む反応混合物が、プレート例えば、96-ウエルストレプトアビジンコートプレート、MSDカタログL11SA-1、MesoScaleDiscovery[MSD]、Gaithersburg、MD中のストレプトアビジンコートウエルに添加される。反応混合物をプレートでインキュベート後、プレートを洗浄し、ポリヒスチジンタグ組換えヒトFCγRIIIaCD16aを添加し、続いて、抗ポリヒスチジンマウスモノクローナル抗体とともにインキュベートする;異なる動物種由来の抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体も、適宜使用可能である。Sulfo-TAG登録商標標識ヤギ抗マウス抗体MSDカタログR32AC-1;抗体が使用される抗ポリヒスチジン抗体と特異的に反応する限り、異なる動物種由来の標識抗体も、適宜使用可能である。およびMSDから入手のReadBufferTMSDカタログR92TC-1の添加に伴い、最終的に、電気化学発光ECLシグナルが生成される。図2は、本発明の実施形態のアッセイ法のステップのフローチャートを示す。血清試料がIgG標的抗体に対する中和抗体を含む場合は、IgG標的抗体は、ストレプトアビジンコートウエル表面に捕捉されているビオチンCCR4ペプチドに結合できない。その結果、NAbの存在化で、低ECLシグナルが生成される。NAbが無い場合は、薬剤がビオチンCCR4ペプチドおよびヒスチジンタグ組換えヒトFCγRIIIaCD16aの間で架橋を形成できるために、高ECLシグナルが生成される。選別アッセイがNAbの存在を示す場合は、例えば、本明細書の実施例2に記載のような確認用アッセイ、が推奨される。選別アッセイプロトコル。次の綿密なアッセイプロトコルを行った:1.96ウエルプレートMSDカタログL11SA-1、MesoScaleDiscovery、Gaithersburg、MD中のストレプトアビジンコートウエルを、各ウエルに対しそれぞれ150μLのアッセイ緩衝液ダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水[pH7.1±0.1;DPBS;Invitrogenから入手]1v/vウシ血清アルブミン[BSA]を用いて、室温で少なくとも1時間ブロックし、ウエルの適切なブロッキングを確実なものとした。ブロックされたウエルが同じ日に本発明のアッセイに使用される限りは、ブロッキングを、1時間を適宜越えて行ってもよい。ブロッキング後、ウエルを200μL/ウエルDPBSで1回洗浄した。選択したアッセイ緩衝液は、カルシウムまたはマグネシウムジカチオンを除いたが、これらのジカチオンが本アッセイを妨害するとは考えられない。2.アッセイ緩衝液中にIgG標的抗体KW-076120ng/mL最終濃度、血清試料10v/v最終濃度、およびビオチンCCR4ペプチドコンジュゲート80ng/mL最終濃度を含む反応混合物50μL/ウエルを調製した。体積は、下記ステップ3で反応混合物を移す必要がある所望の数のウエルに対し充分であるように調節した。aThe血清試料:10μLの50v/v血清試料アッセイ緩衝液中で希釈した30μLの34ng/mL-KW-0761。b以下の対照試料も作成した:N対照:10μLの50v/vプールヒト血清[正常なドナー由来]PHS;Bioreclamation、Inc.、LongIsland、NYから入手30μLアッセイ緩衝液;またはD対照:10μLの50v/vPHSアッセイ緩衝液中で希釈した30μLの34ng/mLKW-0761;またはP対照:抗KW-0761抗体-70°C貯蔵した1.02mg/mL濃度のウサギ抗KW-0761ポリクローナルストック添加10μLの50v/vPHSアッセイ緩衝液中で希釈した30μLの34ng/mLKW-0761。これらの対照または血清試料のPHSの50v/vへの希釈は、等体積のアッセイ緩衝液を混合して行った。上記2aまたは2bの試料を、U-またはV-底ポリプロピレンプレート中で、中等度の振盪で、室温で1時間±15分インキュベートし、その後:cビオチン-CCR4ペプチドコンジュゲート-70°Cで貯蔵した1mg/mL-ストック溶液から調製したアッセイ緩衝液で希釈した10μLの400ng/mLビオチン-CCR4ペプチド;一旦解凍して、ストックを4°Cに1ヶ月超保持したを上記2aまたは2bの試料に分注し、反応混合物を形成した。CCR4のビオチン化ポリペプチド部は、以下のアミノ酸配列であった:MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPKビオチン-OH//配列番号3MidwestBio-TechInc.から購入、カタログMBT3898;あるいは、MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTKビオチン-OH//配列番号4、これは、通常の化学技術により合成ビオチン化した。3.上記ステップ2由来反応混合物血清試料または対照試料を含むを、上記ステップ1由来のストレプトアビジンコートプレートMSDカタログL11SA-1、MesoScaleDiscovery、Gaithersburg、MD上の各指定ウエルに移した。各ウエルには、50μLの反応混合物を入れた。次に、ストレプトアビジンコートプレートを、中等度の振盪で、室温で1時間±15分インキュベートし、その後、ウエルを200μL/ウエル/回のDPBSで3回洗浄した。4.アッセイ緩衝液で希釈した50μLの80ng/mLポリヒスチジンタグ組換えFCγRIIIRDSystemsから入手、カタログ4325-FCを、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で室温で1時間±15分インキュベートし、その後、ウエルを200μL/ウエル/回のDPBSで3回洗浄した。5.アッセイ緩衝液で希釈した100μLの1μg/mLのマウス抗ポリヒスチジンMabRDSystemsから入手、カタログMAB050を、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で、室温で45~60分間インキュベートし、その後、ウエルを200μL/ウエル/回のDPBSで3回洗浄した。6.アッセイ緩衝液で希釈した100μLの1μg/mLのヤギ抗マウスSulfo-TAG登録商標MSDカタログR32AC-1を、ストレプトアビジンコートプレート上の各指定ウエルに加えて、中等度の振盪で、室温で30~45分間インキュベートしインキュベーション中、プレートを箔で覆った、その後、ウエルを200μL/ウエル/回のDPBSで3回洗浄した。7.150μLの1xReadBufferTMSDカタログR92TC-1;4xストックから水を使って1xに希釈したを各ウエルに加え、SECTOR登録商標Imager6000リーダーMSD6000;MesoScaleDiscovery、Gaithersburg、MDで読み取った。アッセイ緩衝液0PHSまたはプールヒト血清PHS:5PHSまたは20PHS;v/vの存在下の本発明のアッセイのKW-0761の代表的用量反応を、図3に示す。図4は、KW-0761のビオチン化CCR4ペプチドへの結合が、ポリクローナル抗KW-0761中和抗体の存在により用量依存的に抑制されることを示す。実施例2:確認用アッセイのための一般タンパク質G/L枯渇プロトコル本発明の選別アッセイが、例えば、本明細書の実施例1に記載のように、血清試料中の中和抗体の存在を示す場合は、高感度確認用アッセイが推奨される。以下の確認用アッセイプロトコルは、本明細書の実施例1に記載の選別アッセイプロトコル中のタンパク質G/Lインキュベーション由来の血清試料濾液を使用する:1.タンパク質Gアガロース樹脂Pierceカタログ20520およびタンパク質Lアガロース樹脂Pierceカタログ22851を等分ずつ混合し、次に、樹脂混合物をダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水pH7.1±0.1;DPBS;Invitrogenから入手で希釈して、50ビーズスラリータンパク質G/Lを作成した大量の50ビーズスラリーが、前もって試薬として調製でき、3ヶ月の使用期限日付を付与し、2~8°Cで貯蔵できる。2.セファロース6B樹脂Sigmaカタログ6B100をDPBSで希釈し50ビーズスラリーセファロース6Bを生成した大量の50ビーズスラリーが、前もって試薬として調製でき、3ヶ月の使用期限日付を付与し、2~8°Cで貯蔵できる。タンパク質G/L樹脂で処理される各試料用の対照としてセファロース6B処理が行われる。血清試料中に存在するNAbは、タンパク質G/L樹脂処理では除去できるが、セファロース6B樹脂処理では、除去できない。3.樹脂ビーズを続けて懸濁中で維持し、120μLのタンパク質G/L上記1で調製またはセファロース6B上記2で調製を適切なマルチスクリーンフィルタープレート例えば、MilliporeカタログMSHVS4510のウエル中に入れた。4.レシピエント96ウエルプレートをフィルタープレート上記3で調製の下に置き、フィルタープレートを遠心分離1000~2000RPMを使ってDPBSで2回洗浄した200μL/ウエル/洗浄回。フィルタープレートからの全通過画分を集め、廃棄した。最終遠心分離により、比較的水分の少ない樹脂ペレットがウエル中に残るはずである。5.試験すべき血清試料を、各容量の血清試料に等用量のアッセイ緩衝液ダルベッコ燐酸塩緩衝食塩水[pH7.1±0.1;DPBS;Invitrogenから入手]1v/vウシ血清アルブミン[BSA]を混合することにより、50v/vに希釈した。6.それぞれ希釈した血清試料を対応するタンパク質G/Lペレットおよびセファロース6Bペレットに加えた。フィルタープレートウエルを蓋またはトップシールで覆った。7.新しいレシピエント96ウエルプレートを、フィルタープレートの下にレシピエントプレートとして置き、レシピエントプレート/フィルタープレートの組み合わせを、プレートシェーカーまたは類似の装置を使って、少なくとも30分間激しく混合した。30分の混合後、レシピエントプレート/フィルタープレートの組み合わせを1000~2000RPMで遠心分離し、濾液をレシピエントプレートに集めた。8.上記7で集めた濾液を直接、確認用アッセイで使用した。このアッセイのステップは、本明細書の実施例1に記載の選別アッセイ法のステップと同じであった。各反応混合物に対し、タンパク質G/L処理またはセファロース6B濾液対照由来の10μLの濾液を、アッセイ緩衝液で希釈した30μLの34ng/mLのKW-0761モガムリズマブまたはAMG761としても知られるに添加する必要がある。濾過血清試料と薬剤混合物をインキュベート上記実施例1、ステップ2aのように後、10μLの400ng/mLのビオチンCCR4を加え、完全反応混合物を作成する上記実施例1、ステップ2cのように。実施例1の残りのステップ3~7を行った。実施例3:リツキシマブ標的結合アッセイリツキシマブRocheGroupのメンバーのGenentechから、リツキサン登録商標として入手可能は、モノクローナルIgG1治療抗体で、CD20B細胞を選択的に標的とするHauseretal.、再発寛解型多発性硬化症におけるリツキシマブによるB細胞枯渇B-celldepletionwithrituximabinrelapsing-remittingmultiplesclerosis、NEJM358:676-882008。提案されたリツキシマブの作用機序の1つは、ADCCである。本明細書実施例1に記載される、KW-0761用に開発された標的結合アッセイ形式を、:i上記実施例1、ステップ2a~bのKW-0761を同等量のリツキシマブで置き換え;ii実施例1、ステップ2bのウサギ抗KW-0761抗体を同等量のウサギ抗リツキシマブ抗体で置き換え;さらにiii上記実施例1、ステップ2cのビオチン化CCR4ペプチドコンジュゲートを同等量のビオチン化CD20ペプチドコンジュゲート例えば、MBT4736:ビオチン-[Ahx]KGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL//配列番号7;またはMBT4737:YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLK[Ahx]KビオチンNH2//配列番号8;両方とも、MidwestBio-TechInc.から購入;他の実施形態では、ビオチンKGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL//配列番号5またはYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLKKビオチン//配列番号6が代わりに使用された。これらは、従来の化学技術により合成、ビオチン化されたで置き換えることにより、FcドメインにCD16a結合部位を持つリツキシマブに適用できる。実施例13~7の全ての他のステップは、実質的な変更なしに直接適用できる。実験は、実施例1で記載のものと同じアッセイ形式で行ったが、以下の点で変更した:ヒト血清試料を添加せず、要求された全てのPHSをアッセイ緩衝液DPBS[pH7.1±0.1]1[v/v]ウシ血清アルブミンで置換し、アッセイ緩衝液で希釈したPHS含有N対照を加えず、抗リツキシマブ抗体を含むP対照を加えず、さらにD対照を、アッセイ法でのリツキシマブの滴定を可能とするように複数の濃度のリツキシマブで試験した図5参照。ポリヒスチジンタグ組換え型ヒトFCγRIIIa/CD16aを添加し、ストレプトアビジンコートプレートに捕捉されたビオチン-CD20ペプチド配列番号7または配列番号8/リツキシマブ複合体に結合させた実施例1、ステップ1を参照。本発明の選別アッセイを、本明細書実施例1のように、全ての他の観点でさらに実施した。簡単に説明すると、実施例1で記載のように、抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体の添加によりECLシグナルが生成され、続けて、Sulfo-TAG登録商標-標識ヤギ抗マウス抗体およびReadBufferTを添加し、シグナルをSECTOR登録商標Imager6000リーダーMSD6000;MesoScaleDiscovery、Gaithersburg、MDで検出した。図5は代表的実験データであり、リツキシマブが、ビオチン化CD20ペプチド複合体に結合し、実施例1での記載と同じであるが、この実施例3で記載のように修正したアッセイ形式を使って、用量依存的に検出可能であったことを示す。"