"下記プライマーX1および下記プライマーX2を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であることを特徴とする、標的配列の増幅方法。プライマーX1配列A1’および配列E1を有し、前記配列A1’が、前記鋳型核酸における部分配列A1に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A1の5’領域における前記標的部位の第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有し、前記配列E1が、前記鋳型核酸における前記部分配列A1の3’末端に隣接する部分配列B1に非相補的な配列であり、前記配列A1’の5’末端に結合しているプライマープライマーX2配列A2’を有し、前記配列A2’が、前記鋳型核酸における部分配列A2に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A2の5’領域における前記標的部位の第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有するプライマー前記プライマーX1の前記配列A1’において、3’末端の塩基または3’末端から2番目の塩基が、前記第1塩基x1に相補的な塩基x1’であり、前記プライマーX2の前記配列A2’において、3’末端の塩基または3’末端から2番目の塩基が、前記第2塩基x2に相補的な塩基x2’である、請求項1記載の増幅方法。前記プライマーX2における前記配列A2’のTm値が、前記プライマーX1における前記配列A1’のTm値よりも高い値である、請求項1記載の増幅方法。前記第1塩基x1および前記第2塩基x2のうち、一方が、前記標的部位における変異型塩基xmtであり、他方が、前記標的部位における正常型塩基xwtである、請求項1記載の増幅方法。前記プライマーX2は、さらに、配列E2を有し、前記配列E2が、前記鋳型核酸における前記部分配列A2の3’末端に隣接する部分配列B2に非相補的な配列であり、前記配列A2’の5’末端に結合しており、前記プライマーX1における前記付加配列E1とは異なる配列である、請求項1記載の増幅方法。請求項1記載の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする多型の検出方法。下記a~c工程を含む、請求項6記載の多型の検出方法。a請求項1記載の増幅方法により、前記標的配列を増幅させる増幅工程b前記プローブの存在下、前記a工程で得られた増幅産物を含む反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程c前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記鋳型核酸における前記標的部位の多型を検出する工程鋳型核酸における標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であり、下記プライマーX1および下記プライマーX2を含むことを特徴とする、請求項1記載の増幅方法に使用するための増幅試薬。プライマーX1配列A1’および配列E1を有し、前記配列A1’が、前記鋳型核酸における部分配列A1に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A1の5’領域における前記標的部位の第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有し、前記配列E1が、前記鋳型核酸における前記部分配列A1の3’末端に隣接する部分配列B1に非相補的な配列であり、前記配列A1’の5’末端に結合しているプライマープライマーX2配列A2’を有し、前記配列A2’が、前記鋳型核酸における部分配列A2に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A2の5’領域における前記標的部位の第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有するプライマー前記プライマーX1の前記配列A1’において、3’末端の塩基または3’末端から2番目の塩基が、前記第1塩基x1に相補的な塩基x1’であり、前記プライマーX2の前記配列A2’において、3’末端の塩基または3’末端から2番目の塩基が、前記第2塩基x2に相補的な塩基x2’である、請求項8記載の増幅試薬。前記プライマーX2における前記配列A2’のTm値が、前記プライマーX1における前記配列A1’のTm値よりも高い値である、請求項8記載の増幅試薬。前記第1塩基x1および前記第2塩基x2のうち、一方が、前記標的部位における変異型塩基xmtであり、他方が、前記標的部位における正常型塩基xwtである、請求項8記載の増幅試薬。前記プライマーX2は、さらに、配列E2を有し、前記配列E2が、前記鋳型核酸における前記部分配列A2の3’末端に隣接する部分配列B2に非相補的な配列であり、前記配列A2’の5’末端に結合しており、前記プライマーX1における前記付加配列E1とは異なる配列である、請求項8記載の増幅試薬。請求項8記載の増幅試薬、および、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする、請求項6記載の多型の検出方法に使用する検出試薬。そこで、本発明者らは、正常型プライマーおよび変異型プライマー、さらに、プローブを用いる、新たな多型の検出方法を確立した。前記正常型プライマーは、標的部位が正常型塩基である正常型標的配列を増幅させるプライマーであり、前記変異型プライマーは、標的部位が変異型塩基である変異型標的配列を増幅させるプライマーであり、前記プローブは、前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブである。具体的に、前記正常型プライマーと前記変異型プライマーとを含む一つの反応系において、鋳型核酸に対して増幅反応を行い、さらに、前記プローブを用いてTm解析を行い、多型を検出する。この方法によれば、前記正常型プライマーと前記変異型プライマーとの両方を使用するため、前記正常型標的配列と前記変異型標的配列の両方を、それぞれ特異的に増幅できる。そして、前記プローブを用いたTm解析を行うため、一反応系で、正常型と変異型とを検出できる。また、例えば、正常型の鋳型核酸のみが存在する場合、前記正常型プライマーは、前記変異型プライマーよりも、前記正常型の鋳型核酸に優先的にアニーリングするため、前記変異型プライマーのアニーリングによる誤った増幅が抑制される。このため、前記プローブを用いた多型の検出において、変異型の擬陽性を防止できる。このように、この方法によれば、一反応系において、標的部位が、正常型、変異型または両方を含むいずれであるかということを、優れた信頼性で判断できる。しかしながら、さらなる検討を行った結果、条件によっては、増幅反応後のTm解析において、擬陽性を生じるおそれがあることが明らかとなった。具体的には、例えば、血液等の生体試料を未精製のまま増幅に供した場合、増幅反応において通常よりも多量のポリメラーゼが存在する場合、プライマーのアニーリング温度が通常よりも低い場合等の条件である。このような条件の場合、前記変異型プライマーが前記正常型標的配列にアニーリングして、変異型標的配列が増幅され、その結果、変異型の擬陽性を示す場合がある。そこで、本発明は、例えば、核酸試料および増幅反応の条件にかかわらず、プライマーの誤ったアニーリングによる増幅を抑制可能な増幅方法、それにより擬陽性を抑制可能な多型検出方法ならびにそれに用いる試薬の提供を目的とする。前記目的を達成するために、本発明の標的配列の増幅方法は、下記プライマーX1および下記プライマーX2を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であることを特徴とする。プライマーX1配列A1’および配列E1を有し、前記配列A1’が、前記鋳型核酸における部分配列A1に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A1の5’領域における前記標的部位の第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有し、前記配列E1が、前記鋳型核酸における前記部分配列A1の3’末端に隣接する部分配列B1に非相補的な配列であり、前記配列A1’の5’末端に結合しているプライマープライマーX2配列A2’を有し、前記配列A2’が、前記鋳型核酸における部分配列A2に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A2の5’領域における前記標的部位の第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有するプライマー本発明の多型の検出方法は、前記本発明の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の増幅試薬は、鋳型核酸における標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であり、前記プライマーX1および前記プライマーX2を含むことを特徴とする、前記本発明の増幅方法に使用するための増幅試薬である。本発明の検出試薬は、前記本発明の増幅試薬、および、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする、前記本発明の多型の検出方法に使用するための検出試薬である。本発明によれば、例えば、誤ったプライマーのアニーリングを防止できる。このため、結果的に、擬陽性を抑制して、信頼性に優れた多型検出が可能となる。したがって、本発明は、例えば、遺伝子の多型検出により治療や診断を行う近年の臨床分野において、極めて有用といえる。本発明者らは、鋭意研究を行った結果、擬陽性の原因についての知見を得た。以下に、図4を用いて説明する。図4は、正常型プライマーおよび変異型プライマーのアニーリングならびにそれらの伸長鎖を示す模式図である。正常型鋳型核酸は、標的部位が正常型塩基であり、前記正常型プライマーは、正常型鋳型核酸における正常型塩基を有する部分配列に相補的な配列からなる。変異型鋳型核酸は、標的部位が変異型塩基であり、前記変異型プライマーは、変異型鋳型核酸における変異型塩基を有する部分配列に相補的な配列からなる。図4において、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーがアニーリング可能な鎖を順鎖とし、で示す。前記正常型プライマー、前記変異型プライマーおよびそれらからの伸長鎖を逆鎖とする。図4において、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーは、逆鎖を伸長するための逆方向プライマーである。図4において、白丸が正常型塩基、黒丸が変異型塩基を示す以下、同様。逆方向プライマーとして、前記正常型プライマーおよび前記変異型プライマーを用いた場合、例えば、以下のような理由から、擬陽性が生じる可能性がある。鋳型核酸が前記正常型鋳型核酸のみの場合、通常、前記正常型鋳型核酸には、前記変異型プライマーよりも前記正常型プライマーがアニーリングし易い図4A。このため、前記正常型プライマーから、逆鎖として、正常型伸長鎖-が生成され、さらに、順方向プライマーから、順鎖として、正常型伸長鎖が生成される図4B。しかしながら、前記正常型伸長鎖に対して、前記変異型プライマーのミスマッチは、標的部位の1塩基に対してのみである。このため、図4Cに示すように、前記正常型伸長鎖に対しては、前記正常型プライマーだけでなく、低い確率ではあるものの、前記変異型プライマーがアニーリングする可能性がある図4Cにおいて1。このように、前記変異型プライマーがアニーリングすると、図4Dに示すように、変異型鋳型核酸が存在しないにもかかわらず、前記正常型伸長鎖の他に、標的部位が変異型塩基に置換された変異型伸長鎖が生成される図4Dにおいて2。そして、図4Eに示すように、前記変異型伸長鎖に対しては、前記正常型プライマーよりも、変異型プライマーの方がアニーリングし易いため、変異型伸長鎖の増幅が繰り返し行われる図4Eにおいて3。さらに、前述した正常型伸長鎖に対する変異型プライマーの誤ったアニーリングは、増幅反応のいずれのサイクルにおいても生じ得る。このため、正常型伸長鎖に対して、新たに変異型プライマーのアニーリングが生じてしまう図4Eにおいて4。このように、正常型伸長鎖に対する変異型プライマーのアニーリングが原因となって、変異型伸長鎖が生成されるため、結果的に、後のTm解析において擬陽性を示す量の変異型伸長鎖が生成するおそれがある。そこで、本発明者らは、擬陽性の原因となる、プライマーの誤ったアニーリングを防止すべく、本発明を完成するに至った。本発明において、鋳型核酸において、目的の多型が発生する部位を標的部位といい、前記標的部位を含む配列を標的配列という。以下、前記標的部位が変異型塩基xmtの場合、前記鋳型核酸を変異型鋳型、前記標的配列を変異型標的配列、前記遺伝子を変異型遺伝子という。前記標的部位が正常型塩基xwtの場合、前記鋳型核酸を正常型鋳型、前記標的配列を正常型標的配列、前記遺伝子を正常型遺伝子ともいう。正常型とは、例えば、野生型ということもできる。本発明において、増幅反応の開始前に反応系に含まれる核酸を、鋳型核酸といい、前記増幅開始後に、前記鋳型核酸を含む前記反応系において、増幅反応により生成された核酸を、増幅産物または伸長鎖という。本発明において、鋳型核酸は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記鋳型核酸が二本鎖の場合、これを構成する2本の一本鎖のうち、いずれか一方が、前記プライマーX1および前記プライマーX2がアニーリング可能な鎖であればよい。本発明においては、便宜上、前記プライマーX1および前記プライマーX2がアニーリング可能な鎖を順鎖または鎖といい、その方向を順方向といい、前記順鎖の相補鎖を逆鎖または-鎖といい、その方向を逆方向という。また、前記順鎖にアニーリングして前記逆鎖を伸長するプライマー、例えば、前記プライマーX1および前記プライマーX2等を、逆方向プライマーといい、前記逆鎖にアニーリングして前記順鎖を伸長するプライマー、例えば、後述するプライマーY1等を、順方向プライマーという。なお、あくまでも便宜上であって、例えば、前記プライマーX1および前記プライマーX2がアニーリング可能な鎖が逆鎖でもよい。また、本発明において、便宜上、前記順鎖および前記逆鎖-の用語を、説明に使用しているが、例えば、遺伝子の場合、いずれがセンス鎖で、いずれがアンチセンス鎖でもよい。本発明において、塩基配列の末端は、5’末端または3’末端であり、それぞれ、塩基配列の5’側または3’側の最も端の塩基を意味する。また、5’領域は、塩基配列の5’末端から数塩基の領域であり、3’領域は、塩基配列の3’末端から数塩基の領域である。前記数塩基は、特に制限されず、例えば、末端から1塩基~10塩基、1~4塩基、1~3塩基、1~2塩基である。本発明において、塩基配列の末端からZ番目の塩基Zは正の整数は、末端の塩基を1番目とした順番であり、例えば、末端から1番目の塩基は、末端の塩基、末端から2番目の塩基は、末端塩基の隣の塩基を意味する。<増幅方法>本発明の標的配列の増幅方法は、前述のように、前記プライマーX1および前記プライマーX2を含む反応系において、鋳型核酸における標的配列を増幅させる増幅工程を含み、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であることを特徴とする。前記プライマーX1は、配列A1’および配列E1を有する。前記配列A1’は、前記鋳型核酸における部分配列A1に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A1の5’領域における前記標的部位の第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有する。前記配列E1は、前記鋳型核酸における前記部分配列A1の3’末端に隣接する部分配列B1に非相補的な配列であり、前記配列A1’の5’末端に結合している。前記配列E1は、例えば、付加配列ともいう。前記プライマーX2は、配列A2’を有する。前記配列A2’は、前記鋳型核酸における部分配列A2に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A2の5’領域における前記標的部位の第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有する。前記プライマーX1およびX2を設定するにあたって、前記標的部位は、前記鋳型核酸において、多型を示す同じ部位を意味する。前記鋳型核酸の前記標的部位の塩基xは、特に制限されず、目的の標的部位における多型の塩基であればよく、例えば、正常型塩基xwtおよび変異型塩基xmtがあげられる。以下、前記標的部位の塩基xが、正常型塩基xwtであるプライマーを正常型プライマー、変異型塩基xmtであるプライマーを変異型プライマーという。前記第1塩基x1が正常型塩基xwt、前記第2塩基x2が変異型塩基xmtの場合、前記プライマーX1を正常型プライマーX1wt、前記プライマーX2を変異型プライマーX2mtという。前記第1塩基x1が変異型塩基xmt、前記第2塩基x2が正常型塩基xwtの場合、前記プライマーX1を変異型プライマーX1mt、前記プライマーX2を正常型プライマーX2wtという。本発明により、前述のようなプライマーの誤ったアニーリングが防止できる理由を、図1および図2を用いて、以下に説明する。なお、本発明の一例として、第1塩基x1を正常型塩基xwt、プライマーX1を正常型プライマーX1wt、第2塩基x2を変異型塩基xmt、プライマーX2を変異型プライマーX2mtに設定して、説明する。これらの条件や図示した構造は、あくまでも一例であって、本発明は、これには制限されない。また、本発明は、以下の理由によって制限されない。図1Aは、正常型鋳型例えば、正常型遺伝子と、前記正常型プライマーX1wtとの関係を示す模式図であり、図1Bは、変異型鋳型例えば、変異型遺伝子と、前記変異型プライマーX2mtとの関係を示す模式図である。前記正常型鋳型は、標的部位の塩基xが正常型塩基xwtであり、前記変異型鋳型は、標的部位の塩基xが変異型塩基xmtである。図2は、前記正常型プライマーX1wtおよび変異型プライマーX2mtのアニーリングおよびそれらの伸長鎖を示す模式図である。図1および図2は、正常型プライマーX1wtおよび変異型プライマーX2mtがアニーリング可能な鎖を順鎖とし、で示し、正常型プライマーX1wtおよび変異型プライマーX2mtならびに前記各プライマーからの伸長鎖を逆鎖とする以下、同様。図2において、白丸が正常型塩基、黒丸が変異型塩基を示す以下、同様。まず、正常型プライマーX1wtの構成について説明する。図1Aに示すように、予め、正常型鋳型の配列において、標的部位の正常型塩基xwtを5’領域に有する配列を部分配列A1と決定し、前記部分配列A1の3’末端に隣接する配列を部分配列B1と決定する。これに対して、正常型プライマーX1wtは、前記部分配列A1に相補的な配列A1’と、前記部分配列B1に非相補的な配列E1とを有する構成とする。前記部分配列E1は、前記配列A1’の5’末端に結合している。正常型プライマーX1wtにおいて、正常型塩基xwtに対応する相補的な塩基xwt’は、配列A1’の3’領域に位置する。つぎに、変異型プライマーX2mtの構成について説明する。図1Bに示すように、予め、変異型鋳型の配列において、標的部位の変異型塩基xmtを5’領域に有する配列を部分配列A2と決定する。これに対して、変異型プライマーX2mtは、部分配列A2に相補的な配列A2’を有する構成とする。変異型プライマーX2mtにおいて、変異型塩基xmtに対応する相補的な塩基xmt’は、配列A2’の3’領域に位置する。図1に示す他の構成については、後述する。つぎに、正常型プライマーX1wtおよび変異型プライマーX2mtのアニーリングおよびそれらの伸長鎖について説明する。鋳型核酸が正常型鋳型のみの場合、正常型鋳型には、変異型プライマーX2mtよりも正常型プライマーX1wtがアニーリングし易い図2A。アニーリングした正常型プライマーX1wtからは、標的部位が正常型である正常型伸長鎖-が生成される。ここで、正常型プライマーX1wtは、鋳型に非相補的な付加配列E1を5’領域に有している。このため、正常型伸長鎖-は、5’領域に、付加配列E1を有する配列となる。続いて、この正常型伸長鎖-に基づいて、順方向プライマーによって、正常型伸長鎖-に相補的な正常型伸長鎖が生成される図2B。この正常型伸長鎖は、正常型伸長鎖-と相補的であることから、3’領域に、前記付加配列E1に相補的な配列E1’を有する。したがって、図2Cに示すように、前記正常型伸長鎖には、変異型プライマーX2mtよりも、正常型プライマーX1wtが、優れた親和性でアニーリングする。変異型プライマーX2mtは、標的部位xwtに対するミスマッチを有し且つ前記配列E1’に対する相補配列E1を有していないが、正常型プローブX1wtは、標的部位xwtにマッチし且つ前記配列E1’に対する相補配列E1を有するためである。このように、正常型プライマーX1wtが前記付加配列E1を有することによって、順鎖の正常型伸長鎖には、必ず、前記配列E1’が含まれる。このため、正常型伸長鎖に対する正常型プライマーX1wtのアニーリングが優位に生じ、変異型プライマーX2mtのアニーリングは、十分に抑制される。したがって、本発明によれば、例えば、変異型プライマーの誤ったアニーリングが原因となる増幅を防止でき、これによって、多型検出における擬陽性を十分に抑制可能である。ここでは、一例として、第1塩基x1を正常型塩基xwt、第2塩基x2を変異型塩基xmtと設定して説明したが、後述するように、これには何ら制限されない。本発明は、前述のように、前記プライマーX1が前記付加配列E1を有することにより、存在しない多型塩基を含む標的配列の誤った増幅を抑制できる。このため、擬陽性の原因となる誤った増幅の防止が望まれる多型塩基を、前記第2塩基x2に設定することが好ましい。そして、擬陽性の原因とはならない他方の多型塩基を、前記第1塩基x1とすることが好ましい。前記標的部位の塩基xは、前述のように、例えば、正常型塩基xwtおよび変異型塩基xmtがあげられる。この場合、第1塩基x1および第2塩基x2は、いずれが正常型塩基xwtでもよいし、いずれが変異型塩基xmtでもよい。臨床分野においては、前述のように、遺伝子は、多型を示す標的部位において正常型塩基を有することが一般的である。そこで、変異型塩基を有する遺伝子が存在するか否かの判断が、非常に重要である。このため、正常型遺伝子のみが存在する場合に、変異型標的配列の増幅が確認されると、変異型遺伝子が存在することとなり、擬陽性の結果となる。したがって、本発明においては、例えば、変異型塩基を含む変異型標的配列の誤った増幅を防止することが好ましい。したがって、前記第1塩基x1を正常型塩基xwt、前記プライマーX1を正常型プライマーX1wtとし、前記第2塩基x2を変異型塩基xmt、前記プライマーX2を変異型プライマーX2mtとすることが好ましい。なお、これらには制限されず、例えば、標的部位において、変異型塩基Xmtが複数存在する場合、前記鋳型核酸の標的部位の塩基は、例えば、いずれか2種類の変異型塩基xmtでもよい。本発明において、前記プライマーX1は、その3’領域に、前記配列A1’を有していることから、例えば、前記配列A1’の3’末端が、前記プライマーX1の3’末端となる。また、前記プライマーX2は、その3’領域に、前記配列A2’を有していることから、例えば、前記配列A2’の3’末端が、前記プライマーX2の3’末端となる。前記プライマーX1の配列A1’は、前述のように、前記鋳型核酸の部分配列A1に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A1の5’領域における前記標的部位の第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有する。また、前記プライマーX2の配列A2’は、前述のように、前記鋳型核酸の部分配列A2に相補的な配列であり、その3’領域に、前記部分配列A2の5’領域における前記標的部位の第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有する。本発明において、相補的な塩基は、例えば、アデニンとチミンまたはウラシル、グアニンとシトシン等のように、二本鎖核酸の形成において、水素結合等により結合する関係にあるものをいう。また、本発明において部分配列に相補的な配列は、例えば、前記部分配列の全体に対してアニーリング可能であることを意味し、前記部分配列に対して、完全に相補的な塩基のみからなる配列だけでなく、前記部分配列に対して、1個または複数個の非相補的な塩基を含む配列でもよい。以下、前記完全に相補的な塩基のみからなる配列を、パーフェクトマッチ配列またはフルマッチ配列といい、前記非相補的な塩基を含む配列を、ミスマッチ配列という。前記ミスマッチ配列は、前記標的部位に相補的な塩基を除き、例えば、前記パーフェクトマッチ配列と比較して、1個または複数個の塩基が、欠失、置換、付加または挿入されている配列があげられ、このような塩基を、ミスマッチ塩基という。前記ミスマッチ塩基の個数は、特に制限されず、前記部分配列にアニーリング可能であればよいが、例えば、1個~30個、好ましくは1個~5個である。また、前記配列A1’または前記配列A2’の塩基長における前記ミスマッチ塩基の個数の割合は、特に制限されず、例えば、60以下、好ましくは10以下である。中でも、前記プライマーX1の配列A1’は、前記部分配列A1に対してパーフェクトマッチ配列であることが好ましく、前記プライマーX2の配列A2’は、前記部分配列A2に対してパーフェクトマッチ配列であることが好ましい。本発明において、前述のようなプライマーの誤ったアニーリングの防止は、前記プライマーX1が前記付加配列E1を有することにより、高い信頼性で実現できる。この効果は、特に、標的部位が第1塩基x1である鋳型核酸および標的部位が第2塩基x2である鋳型核酸のうち、前者のみが試料に含まれる場合に、有効である。他方、前記試料に、標的部位が第1塩基x1である鋳型核酸だけでなく、標的部位が第2塩基x2である鋳型核酸が含まれる場合、第1塩基x1を含む標的配列だけでなく、第2塩基x2を含む標的配列も、増幅する。このように、標的部位が第1塩基x1である鋳型核酸および標的部位が第2塩基x2である鋳型核酸が含まれる場合、第1塩基x1を含む標的配列よりも、第2塩基x2を含む標的配列を優先的に増幅することが好ましい。具体的には、例えば、前記第1塩基x1として正常型塩基を含む標的配列よりも、前記第2塩基x2として変異型塩基を含む標的配列を、優先的に増幅することが好ましい。前述のように、多型は、癌等の疾患の指標となり得るため、標的部位が、正常型塩基および変異型塩基のいずれであるかを、感度よく検出することが望まれる。例えば、癌の場合、採取された組織片等の生体試料は、癌細胞だけでなく、多量の正常細胞も含まれる。このため、採取した組織片における少量の癌細胞由来の鋳型核酸について、多量の正常細胞由来の鋳型核酸よりも、標的配列を効率よく増幅させることが望まれる。また、疾患の早期の段階は、例えば、生体試料中に、変異型鋳型核酸よりも正常型鋳型核酸が多量に含まれる。このため、このような場合にも、同様に、変異型の標的配列を効率よく増幅させることが望まれる。そこで、本発明において、例えば、正常型遺伝子のように、含有割合が相対的に高い鋳型に対するプライマーを、前記プライマーX1とし、変異型遺伝子のように、含有割合が相対的に低い鋳型に対するプライマーを、前記プライマーX2とし、前記プライマーX1の前記配列A1’および前記プライマーX2の前記配列A2’を、以下のように設定することが好ましい。これによって、第2塩基x2を有する標的配列を、第1塩基x1を有する標的配列よりも、優先的に増幅可能である。前記プライマーX1の前記配列A1’は、前記部分配列A1にアニーリングする領域であり、前記プライマーX2の前記配列A2’は、前記部分配列A2にアニーリングする領域である。本発明において、例えば、前記プライマーX2における前記配列A2’のパーフェクトマッチ配列に対する親和性、つまり、アニーリングのし易さを、前記プライマーX1における前記配列A1’のパーフェクトマッチ配列に対する親和性よりも、高くすることが好ましい。前記各プライマーの親和性の調節は、特に制限されず、例えば、Tm値の設定により行える。本発明において、例えば、前記プライマーX2における前記配列A2’のパーフェクトマッチ配列に対するTm値が、前記プライマーX1における前記配列A1’のパーフェクトマッチ配列に対するTm値よりも、相対的に高い値であることが好ましい。このように、前記プライマーX2における配列A2’のTm値を、前記プライマーX1における配列A1’よりも高く設定することで、例えば、第2塩基x2を含む鋳型核酸および第2塩基x2を含む伸長鎖に対する、前記プライマーX2における配列A2’の結合性を、前記第1塩基x1を含む鋳型核酸および第1塩基x1を含む伸長鎖に対する、前記プライマーX1における配列A1’の結合性よりも、向上できる。このため、結果的に、前記プライマーX1による、前記第1塩基x1を含む標的配列の増幅効率よりも、前記プライマーX2による、前記第2塩基x2を有する標的配列の増幅効率を向上できる。このように、増幅効率を向上すれば、例えば、試料中において、前記標的部位が第2塩基x2である鋳型核酸の含有量が低い場合でも、前記第2塩基x2を有する標的配列の増幅産物が十分に得られる。このため、前記第2塩基x2の多型についても、Tm解析において、十分な感度での検出が可能となる。前記プライマーX1における配列A1’のTm値と前記プライマーX2における配列A2’のTm値との差は、特に制限されず、例えば、0を超え20°C以下が好ましく、より好ましくは0を超え10°C以下であり、特に好ましくは0を超え5°C以下である。前記プライマーX1における配列A1’のTm値および前記プライマーX2における配列A2’のTm値の設定方法は、特に制限されない。Tm値は、例えば、前記配列A1’および前記配列A2’の長さ、および前記各配列におけるGC含量等によって調節できる。長さにより調節する場合、一般的に、長さが相対的に長い程、Tm値を相対的に高く設定できる。本実施形態の場合、例えば、前記プライマーX2の前記配列A2’の長さを、前記プライマーX1の前記配列A1’よりも長く設定することが好ましい。これによって、前記プライマーX2における配列A2’のTm値を、前記プライマーX1における配列A1’のTm値よりも、相対的に高い値に設定できる。また、GC含量によって調節する場合、例えば、GC含量が相対的に高い程、Tm値を相対的に高く設定できる。本実施形態の場合、例えば、前記プライマーX2における配列A2’のGC含量を、前記プライマーX1における配列A1’よりも高く設定することが好ましい。また、前記配列A1’および配列A2’の長さおよびGC含量の両方によって、Tm値を調節することもできる。これらの他に、例えば、RNAアナログであるLNA、ペプチド核酸であるPNA、架橋化核酸であるBNA等を含む配列にすることで、例えば、これらを含まない配列よりも、Tm値を相対的に高く設定できる。前記プライマーX2の配列A2’を、前記プライマーX1の配列A1’よりも長く設定する場合、両者の長さの差は、特に制限されず、例えば、0を超え20塩基以下であり、好ましくは0を超え10塩基以下であり、より好ましくは0を超え5塩基以下である。また、例えば、前記第2塩基x2を含む部分配列A2にアニーリングした前記プライマーX2の伸長反応を、第1塩基x1を含む部分配列A1にアニーリングした前記プライマーX1の伸長反応よりも起こり易くしてもよい。これによって、例えば、第2塩基x2を有する標的配列を、第1塩基x1を有する標的配列よりも、優先的に増幅できる。プライマーからの伸長反応の反応性は、調節可能であり、その方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法によって行える。具体例は、例えば、前記プライマーX2の5’領域に、蛍光物質およびビオチン等の物質を付加する方法、または、付加配列を付加する方法等があげられる。これらの方法は、例えば、特開2004-337124号公報等の記載に基づいて行うことができる。前記プライマーX1は、前記配列A1’の3’領域に、前記第1塩基x1に相補的な塩基x1’を有していればよく、好ましくは、前記配列A1’において、3’末端の1番目の塩基および2番目の塩基の少なくとも一方が、前記第1塩基x1に対して相補的な塩基x1’であり、より好ましくは、前記配列A1’において、3’末端の塩基が前記塩基x1’である。例えば、鋳型核酸の配列を5’-acGtt-3’、前記第1塩基x1を大文字Gと想定する。この場合、前記プライマーX1は、3’末端の1番目の塩基が前記第1塩基x1=Gの相補塩基Cである配列5’-aaC-3’に設計できる。また、前記プライマーX1は、例えば、3’末端の2番目の塩基が前記第1塩基x1=Gの相補塩基Cである配列5’-aaCg-3’に設計してもよい。前者の場合、前記3’末端の1番目の塩基を前記第1塩基x1に相補的な塩基x1’とし、さらに、前記3’末端の2番目から5’末端までの少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対してミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記3’末端の2番目および3番目のうち少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記3’末端の2番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸の配列を5’-acGtt-3’、前記第1塩基x1を大文字Gと想定する。この場合、前記プライマーX1は、3’末端の1番目の塩基を、前記第1塩基x1=Gの相補塩基C、2番目の塩基を、下線部の塩基tに対して相補的な塩基aではなくミスマッチ塩基tとする配列5’-atC-3’に設計してもよい。また、後者の場合、前記3’末端の2番目の塩基を、前記第1塩基x1に相補的な塩基x1’とし、さらに、前記3’末端の1番目、および/または3番目から5’末端までの少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記3’末端の1番目および3番目のうち少なくとも1つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記3’末端の3番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸における配列を5’-acGtt-3’、前記第1塩基x1を大文字Gと想定する。この場合、前記プライマーX1は、3’末端の2番目の塩基を第1塩基x1=Gの相補塩基C、3番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基tに対して相補的な塩基aではなく、ミスマッチ塩基tとする配列5’-atCg-3’に設計してもよい。このように、前記プライマーX1における配列A1’に、ミスマッチ塩基を入れることで、前記第1塩基x1を含む配列に対する前記プライマーX1の特異性をさらに向上できる。前記プライマーX2は、前記配列A2’の3’領域に、前記第2塩基x2に相補的な塩基x2’を有していればよく、好ましくは、前記配列A2’において、3’末端の1番目の塩基および2番目の塩基の少なくとも一方が、前記第2塩基x2に対して相補的な塩基x2’であり、より好ましくは、前記配列A2’において、3’末端の塩基が前記塩基x2’である。例えば、鋳型核酸の配列を5’-acAtt-3’、第2塩基x2を大文字Aと想定する。この場合、前記プライマーX2は、3’末端の1番目の塩基が前記第2塩基x2=Aの相補塩基Tである配列5’-aaT-3’に設計できる。また、前記プライマーX2は、例えば、3’末端から2番目の塩基が前記第2塩基x2=Aの相補塩基Tである配列5’-aaTg-3’に設計してもよい。前者の場合、前記3’末端の1番目の塩基を前記第2塩基x2に相補的な塩基x2’とし、さらに、前記3’末端の2番目から5’末端までの少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対してミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記3’末端の2番目および3番目のうち少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記3’末端の2番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述と同様に、鋳型核酸における配列を5’-acAtt-3’、前記第2塩基x2を大文字Aと想定する。この場合、前記プライマーX2は、3’末端の1番目の塩基を、前記第2塩基x2=Aの相補塩基T、2番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基tに対して相補的な塩基aではなくミスマッチ塩基tとする配列5’-atT-3’に設計してもよい。また、後者の場合、前記3’末端の2番目の塩基を第2塩基x2に相補的な塩基x2’とし、さらに、前記3’末端の1番目、および/または3番目から5’末端までの少なくとも1つの塩基を、前記鋳型核酸に対するミスマッチ塩基に設定することが好ましい。中でも、前記3’末端の1番目および3番目のうち少なくとも1つの塩基を、前記ミスマッチ塩基に設定することが好ましく、前記3’末端の3番目の塩基をミスマッチ塩基に設定することがより好ましい。例えば、前述のように、鋳型核酸における配列を5’-acAtt-3’、前記第2塩基x2を大文字Aと想定する。この場合、前記プライマーX2は、3’末端の2番目の塩基を、前記第2塩基x2=Aの相補塩基T、3番目の塩基を、鋳型核酸の下線部の塩基tに対して相補的な塩基aではなくミスマッチ塩基tとする配列5’-atTg-3’に設計してもよい。このように、前記プライマーX2に、ミスマッチ塩基を入れることで、前記第2塩基x2を含む配列に対する前記プライマーX2の特異性をさらに向上できる。本発明において、前記プライマーX1の付加配列E1は、前述のように、前記部分配列A1の3’末端に隣接する前記鋳型核酸の部分配列B1に非相補的な付加配列であり、前記配列A1’の5’末端に結合している。本発明において、部分配列に非相補的な配列は、例えば、前記部分配列に対してアニーリング不可能であることを意味する以下、同様。前記鋳型核酸の部分配列B1と前記付加配列E1との相補性は、例えば、両者をアライメントした際、90以下が好ましく、より好ましくは50以下、さらに好ましくは10以下であり、特に好ましくは0、つまり、前記付加配列E1は、前記部分配列B1に対して完全に非相補的な塩基のみからなる配列であることが好ましい。前記付加配列E1の塩基長は、特に制限されず、例えば、1~50塩基長であり、好ましくは1~20塩基長であり、より好ましくは1~10塩基長である。前記付加配列E1の塩基長は、例えば、前記プライマーX1の配列A1’の塩基長に対して、例えば、1/50~1/1の塩基長であり、好ましくは1/20~1/1の塩基長であり、より好ましくは1/10~1/2の塩基長である。本発明において、前記プライマーX2は、さらに、配列E2を有してもよい。前記配列E2は、例えば、前記鋳型核酸における前記部分配列A2の3’末端に隣接する部分配列B2に非相補的な配列である。前記配列E2は、例えば、付加配列ともいう。前記プライマーX2の概略を、図1Bに示す。図1Bは、鋳型とプライマーX2との関係を示す模式図である。図1Bに示すように、予め、鋳型の配列において、標的部位の塩基x2を5’領域に有する配列を部分配列A2と決定し、前記部分配列A2の3’末端に隣接する配列を部分配列B2と決定する。これに対して、プライマーX2は、部分配列A2に相補的な配列A2’と、部分配列B2に非相補的な配列E2とを有する構成とする。前記付加配列E2は、前記配列A2’の5’末端に結合している。プライマーX2において、標的部位の第2塩基x2に対応する相補的な塩基x2’は、配列A2’の3’領域に位置する。前記付加配列E2は、前記付加配列E1と異なる配列であることが好ましい。このように、前記プライマーX2が、前記付加配列E2を有することによって、例えば、前記第2塩基x2を有する配列に対する前記プライマーX2の特異性を向上でき、結果的に、より優れた増幅効率で、前記標的部位が第2塩基x2である標的配列を増幅できる。前記プライマーX2が前記付加配列E2を有する場合、例えば、図3に示すような増幅反応となる。図3は、前記付加配列E1を有するプライマーX1および前記付加配列E2を有するプライマーX2を使用した際における、鋳型核酸および伸長鎖に対する前記各プライマーのアニーリングを示す模式図である。図3においては、一例として、前記プライマーX1を正常型プライマーX1wt、前記プライマーX2を変異型プライマーX2mtに設定したが、前述のように、本発明は、これには制限されない。図3は、本発明において、正常型プライマーX1wtおよび変異型プライマーX2mtを使用した際における、前記各プライマーのアニーリング状態を示す模式図である。前記試料中に、正常型鋳型および変異型鋳型の両方が含まれる場合、通常、前記正常型鋳型には、前記正常型プライマーX1wtがアニーリングし易く、前記変異型鋳型には、前記変異型プライマーX2mtがアニーリングし易い図3A。アニーリングした正常型プライマーX1wtは、付加配列E1を有する。このため、前記正常型プライマーX1wtからの正常型伸長鎖-は、5’側に、前記付加配列E1を有する。一方、アニーリングした変異型プライマーX2mtは、付加配列E2を有する。このため、前記プライマーX2mtからの変異型伸長鎖-は、5’側に、前記付加配列E2を有する。このため、順方向プライマーによって、前記正常型伸長鎖-に基づいて生成された、相補的な正常型伸長鎖は、前記付加配列E1に相補的な配列E1’を有し、前記変異型伸長鎖-に基づいて生成された、相補的な変異型伸長鎖は、前記付加配列E2に相補的な配列E2’を有する図3B。さらに、前記正常型プライマーX1wtの付加配列E1と、前記変異型プライマーX2mtの付加配列E2とは、配列が異なるため、正常型伸長鎖には、付加配列E1を有する正常型プライマーX1wtが特異的にアニーリングし、変異型伸長鎖には、付加配列E2を有する変異型プライマーX2mtが特異的にアニーリングする。したがって、正常型プライマーX1wtにより、正常型伸長鎖が優れた増幅効率で増幅され、変異型プライマーX2mtにより、変異型伸長鎖が優れた増幅効率で増幅される。この際、前記プライマーX1の配列A1’と、前記プライマーX2の配列A2’とを、例えば、前述のような関係に設定することで、プライマーX1よりも、プライマーX2による増幅を、優先的に行うことも可能である。ここでは、一例として、第1塩基x1を正常型塩基xwt、第2塩基x2を変異型塩基xmtと設定して説明したが、前述のように、これには何ら制限されない。前記プライマーX2の付加配列E2は、前述のように、例えば、前記鋳型核酸における部分配列B2に対して非相補的な配列である。前記鋳型核酸における部分配列B2と前記付加配列E2との相補性は、例えば、両者をアライメントした際、90以下が好ましく、より好ましくは50以下、さらに好ましくは10以下であり、特に好ましくは0、つまり、前記付加配列E2は、前記部分配列B2に対して完全に非相補的な塩基のみからなる配列であることが好ましい。前記プライマーX1の付加配列E1と、前記プライマーX2の付加配列E2とは、前述のように、例えば、異なる配列である。前記付加配列E1と前記付加配列E2との相同性は、例えば、両者をアライメントした際、90以下が好ましく、より好ましくは50以下、さらに好ましくは10以下であり、特に好ましくは0である。前記付加配列E2の塩基長は、特に制限されず、例えば、1~50塩基長であり、好ましくは1~20塩基長であり、より好ましくは1~10塩基長である。前記付加配列E2の塩基長は、例えば、前記プライマーX2における配列A2’の塩基長に対して、例えば、1/50~1/1の塩基長であり、好ましくは1/20~1/1の塩基長であり、より好ましくは1/10~1/2の塩基長である。前記付加配列E2は、例えば、前記プライマーX1の付加配列E1と同じ塩基長であることが好ましい。前記プライマーX1の塩基長と前記プライマーX2の塩基長は、特に制限されない。前記プライマーX1は、例えば、10~50塩基長であり、好ましくは15~45塩基長であり、より好ましくは16~40塩基長である。前記プライマーX2は、例えば、10~50塩基長であり、好ましくは15~45塩基長であり、より好ましくは16~40塩基長である。具体例として、前記プライマーX2が、例えば、前記配列A2’のみからなる場合、例えば、10~50塩基長であり、好ましくは15~40塩基長であり、より好ましくは16~35塩基長である。前記プライマーX2が、例えば、前記配列A2’と前記付加配列E2とを含む場合、例えば、10~50塩基長であり、好ましくは15~40塩基長であり、より好ましくは16~35塩基長である。本発明は、前記増幅工程において、前記プライマーX1およびプライマーX2とあわせて、例えば、さらに、下記プライマーY1を使用してもよい。プライマーY1前記鋳型核酸における前記標的部位よりも5’側の部分配列Cを有するプライマー前記プライマーY1の概略を図1Cに示す。図1Cは、鋳型とプライマーY1との関係を示す模式図である。図1Cに示すように、鋳型において、前記部分配列A1に含まれる標的部位よりも5’側の部分配列を配列Cと決定する。これに対して、前記プライマーY1は、前記部分配列Cを有する構成とする。順鎖の相補鎖である逆鎖-は、前記部分配列Cに対する相補的な配列C’を有する。このため、前記プライマーY1は、その配列Cにおいて、前記逆鎖-の配列C’にアニーリングし、順鎖を増幅できる。前記プライマーY1は、例えば、前記プライマーX1およびプライマーX2が、逆鎖を伸長するプライマーであるのに対して、順鎖を伸長する順方向プライマーである。このため、例えば、順方向プライマーである前記プライマーY1と、逆方向プライマーである前記プライマーX1および前記プライマーX2とは、それぞれ対のプライマーとなる。また、前記プライマーY1は、前記標的部位とは異なる領域にアニーリングするプライマーであるため、例えば、標的部位の塩基の種類に関わらず、標的配列を増幅できる。前記プライマーY1の長さは、特に制限されず、通常、10~50塩基であることが好ましく、より好ましくは15~40塩基であり、特に好ましくは16~35塩基である。前記プライマーY1は、前記鋳型核酸における前記標的部位よりも5’側の部分配列Cを有していればよい。前記プライマーY1は、例えば、その5’側に、付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、鋳型において、前記部分配列Cの5’側の配列とは異なる配列であることが好ましい。本発明の増幅方法は、前記増幅工程において、例えば、前記反応系に、さらに、前記鋳型核酸における前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブを添加してもよい。前記プローブは、例えば、標識物質を有する標識プローブがあげられる。本発明においては、例えば、一本鎖核酸および二本鎖核酸のいずれを鋳型核酸として、増幅を行うこともできる。後者の二本鎖核酸の場合、例えば、これを構成する2つの相補的な一本鎖を、それぞれ鋳型として、増幅を行ってもよい。前記鋳型核酸が二本鎖核酸の場合、例えば、鎖における標的部位と、-鎖における標的部位とは、それぞれ対応している。後述する本発明の多型検出方法において使用する前記プローブは、例えば、前記鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよいし、前記-鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよい。前記鋳型核酸は、前述のように、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記鋳型核酸は、例えば、DNA、および、トータルRNA、mRNA等のRNA等があげられる。前記鋳型核酸は、例えば、試料中の核酸でもよいし、前記核酸の増幅産物でもよい。生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前者は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸があげられる。後者は、例えば、検出精度を向上できることから好ましく、前記増幅産物は、例えば、前記試料中の核酸を鋳型として、核酸の増幅法により増幅させることで調製できる。前記増幅産物は、例えば、前記試料中のDNAを鋳型とした増幅産物でもよいし、前記試料中のRNAから合成したcDNAを鋳型とした増幅産物でもよい。前記試料中のRNAは、例えば、例えば、トータルRNA、mRNA等のRNAがあげられ、前記cDNAは、例えば、前記RNAから、RT-PCRReverseTranscriptionPCRにより合成できる。前記増幅産物の長さは、特に制限されず、例えば、50~1000塩基であり、好ましくは80~200塩基である。本発明において、前記増幅工程は、試料中の核酸を鋳型として、増幅反応を行うことが好ましい。前記試料は、鋳型となる核酸を含む試料であればよく、特に制限されず、例えば、生体試料由来の核酸を含む試料があげられる。前記生体試料は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪の細胞および毛髪の細胞等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等、ならびに、それらの懸濁液等があげられる。また、前述のように、生体試料由来の核酸を鋳型として核酸増幅法を行った反応液を、本発明における核酸試料とし、前記反応液に含まれる増幅産物を鋳型核酸としてもよい。本発明は、前述のように、試料が精製されているか未精製であるかにかかわらず、プライマーの誤ったアニーリングを抑制できるため、本発明は、特に未精製の試料の適用に優れている。このように、未精製の試料を使用できる方法であれば、精製のための前処理も省略できることから、より一層操作が簡便となり、コストも低減できる。本発明の増幅方法を、後述する本発明の多型の検出方法に適用する場合、前記試料は、特に制限されず、例えば、標的部位が変異型および正常型のいずれを示すか不明である核酸を含む試料、変異型を有する核酸と正常型を有する核酸とを含む試料、これらを含む可能性のある試料等に対して、非常に有用である。前記DNAおよびRNA等の核酸の由来は、制限されず、例えば、各種癌細胞等の細胞、ウィルス、ミトコンドリア等があげられる。癌化した血液細胞等の細胞には、変異型を示す核酸を有する細胞と、正常型を示す核酸を有する細胞とが含まれるため、前述のような問題が起こり易い。したがって、本発明の多型検出方法は、特に、変異型を示す核酸と正常型を示す核酸とを有する試料への適用が好ましく、例えば、白血病等の各種癌細胞等の生体試料、具体例として、血液試料および白血球細胞等に適用することが好ましい。なお、本発明において、試料の採取方法、核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記生体試料由来の核酸は、例えば、従来公知の方法によって、生体試料から単離できる。全血からのゲノムDNAの単離は、例えば、市販のゲノムDNA単離キット商品名GFXGenomicBloodDNAPurificationkit;GEヘルスケアバイオサイエンス社製等が使用できる。本発明の増幅工程において、同一の反応系での増幅は、例えば、一つの反応液内で標的配列を増幅させることがあげられる。本発明の増幅方法は、前記増幅工程において、前述のプライマーを使用する点が特徴であり、その他の工程や条件等は何ら制限されない。前記増幅工程における核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、PCRPolymeraseChainReaction法、NASBANucleicacidsequencebasedamplification法、TMATranscriptionmediatedamplification法、SDAStrandDisplacementAmplification法等があげられ、中でも、PCR法が好ましい。なお、核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。前記増幅工程において、増幅反応の反応系例えば、反応液における核酸試料の添加割合は、特に制限されない。前記核酸試料が生体試料例えば、全血試料の場合、前記反応系における前記生体試料の添加割合は、下限が、例えば、0.01体積であることが好ましく、より好ましくは0.05体積、さらに好ましくは0.1体積である。また、前記添加割合の上限は、特に制限されず、例えば、2体積が好ましく、より好ましくは1体積、さらに好ましくは0.5体積である。また、後述する変異の検出において、例えば、プローブを用いた光学的検出を行う場合、前記反応系における前記生体試料例えば、全血試料の添加割合は、例えば、0.1~0.5体積に設定することが好ましい。PCR反応においては、通常、DNA変性一本鎖DNAへの解離のために熱処理が施されるが、この熱処理によって、試料に含まれる糖およびタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物または濁り等が発生するおそれがある。このため、変異の有無を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物または濁りの発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、反応系における前記生体試料の添加割合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止できるため、光学的手法による測定精度を向上できる。また、前記生体試料中の夾雑物によるPCRの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できる。したがって、全血試料等の生体試料の添加割合を前述の範囲に設定することによって、例えば、沈澱物または濁りの発生を防止したり除去するための、前記試料の前処理の必要性を排除できる。また、前記反応系中の全血試料の割合は、前述のような体積割合例えば、0.1~0.5体積ではなく、ヘモグロビン以下、Hbというの重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応系における全血試料の割合は、Hb量に換算して、例えば、0.565~113g/Lが好ましく、より好ましくは2.825~56.5g/Lであり、さらに好ましくは5.65~28.25g/Lである。なお、前記反応系における全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合と前記Hb重量割合との両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。全血は、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれでもよい。前記増幅工程において、増幅反応の開始に先立ち、前記反応系にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物または濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。前記反応系におけるアルブミンの添加割合は、例えば、0.01~2重量であり、好ましくは0.1~1重量であり、より好ましくは0.2~0.8重量である。前記アルブミンは、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミンBSA、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれか1種類でもよいし、2種類以上を併用してもよい。つぎに、本発明の増幅方法について、一例として、前記プライマーX1として正常型プライマーX1wt、前記プライマーX2として変異型プライマーX2mtを使用し、PCR法により増幅を行う方法を説明する。なお、本発明は、これには制限されない。また、PCRの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。まず、鋳型核酸および前述の各種プライマーを含むPCR反応液を調製する。前記PCR反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されず、正常型プライマーX1wtは、例えば、0.01~10μmol/Lとなるように添加することが好ましく、より好ましくは0.05~5μmol/Lであり、特に好ましくは0.1~1μmol/Lである。変異型プライマーX2mtは、例えば、0.01~10μmol/Lとなるように添加することが好ましく、より好ましくは0.05~5μmol/Lであり、特に好ましくは0.1~0.5μmol/Lである。前記正常型プライマーX1wtと変異型プライマーX2mtとのモル比X1wt:X2mtは、例えば、0.001:1~10:1であることが好ましく、より好ましくは、0.01:1~2:1であり、特に好ましくは、0.11~1:1である。また、前記正常型プライマーX1wtと前記変異型プライマーX2mtとに加えて、前記プライマーY1を併用する場合、前記プライマーY1は、例えば、0.01~10μmol/Lとなるように添加することが好ましく、より好ましくは0.05~5μmol/Lであり、特に好ましくは0.1~1μmol/Lである。前記変異型プライマーX2mtと前記プライマーY1とのモル比X2mt:Y1は、例えば、1:0.001~1:10であることが好ましく、より好ましくは、1:0.01~1:2であり、特に好ましくは、1:0.1~1:1である。前記反応液は、さらに他の成分を含んでもよく、例えば、PCR反応に関与する成分を含むことが好ましい。前記他の成分は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できる。前記他の成分は、例えば、DNAポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、溶媒、各種触媒等があげられる。前記反応液において、例えば、各成分の添加順序は何ら制限されない。前記DNAポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例は、テルムスアクアティカスThermusaquaticus由来DNAポリメラーゼ米国特許第4,889,818号および同第5,079,352号商品名Taqポリメラーゼ、テルムステルモフィラスThermusthermophilus由来DNAポリメラーゼWO91/09950rTthDNApolymerase、ピロコッカスフリオサスPyrococcusfuriosus由来DNAポリメラーゼWO92/9689PfuDNApolymerase:Stratagenes社製、テルモコッカスリトラリスThermococcuslitoralis由来ポリメラーゼEP-A455430商標Vent:NewEnglandBiolabs社製等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムスアクアティカスThermusaquaticus由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。前記反応液におけるDNAポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、1~100U/mLであり、好ましくは、5~50U/mLであり、より好ましくは、20~40U/mLである。DNAポリメラーゼの活性単位Uは、一般に、活性化サケ精子DNAを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、74°Cで、30分間に10nmolの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が1Uである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、25mmol/LTAPSbufferpH9.3、25°C、50mmol/LKCl、2mmol/LMgCl2、1mmol/Lメルカプトエタノール、200μmol/LdATP、200μmol/LdGTP、200μmol/LdTTP、100μmol/Lα-32PdCTP、0.25mg/mL活性化サケ精子DNAである。前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、dNTPdATP、dCTP、dGTP、および、dTTPまたはdUTPがあげられる。前記反応液中のdNTPの添加割合は、特に制限されず、例えば、0.01~1mmol/Lであり、好ましくは、0.05~0.5mmol/Lであり、より好ましくは、0.1~0.3mmol/Lである。前記溶媒は、例えば、Tris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等の緩衝液があげられ、市販のPCR用緩衝液や市販のPCRキットの緩衝液等が使用できる。前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、KCl、MgCl2、MgSO4、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、PCR反応を阻害しない範囲で設定すればよい。前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、1~500μLであり、好ましくは10~100μLである。つぎに、PCRを行う。PCRは、例えば、1二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、2プライマーのアニーリング、3プライマーの伸長ポリメラーゼ反応の3つの工程を含む。各工程の条件は、特に制限されず、前記1工程は、例えば、90~99°C、1~120秒が好ましく、より好ましくは、92~95°C、1~60秒であり、前記2工程は、例えば、40~70°C、1~300秒が好ましく、より好ましくは、50~70°C、5~60秒であり、前記3工程は、例えば、50~80°C、1~300秒が好ましく、より好ましくは、50~75°C、5~60秒である。また、サイクル数も特に制限されず、前記1~3の3工程を1サイクルとして、例えば、30サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されず、例えば、合計100サイクル以下、好ましくは70サイクル以下、より好ましくは50サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明においては、例えば、1つの反応系において、同時に、二種類以上の遺伝子について、それぞれの標的配列を増幅することもでき、また、同じ遺伝子について、部位の異なる多型をそれぞれ含む二種類以上の標的配列を増幅することもできる。この場合、目的の標的配列ごとに、前述のプライマーX1およびプライマーX2、任意でプライマーY1を準備し、これらの共存下で前述のような増幅反応を行えばよい。本発明の標的配列の増幅方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによって、例えば、前記標的配列における標的部位の多型を検出できる。前記多型検出は、例えば、後述するようなTm解析によって確認できる。具体的には、例えば、前記増幅工程における前記増幅反応の反応系に、さらに、前記鋳型配列における前記標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能なプローブを添加する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。これによって、温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、変異型または正常型等の多型の種類を確認できる。前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれの段階で、前記反応系に添加してもよい。中でも、例えば、前記プローブの添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記プローブの添加は、前記増幅反応前であることが好ましい。前記多型検出に関しては、具体的に、後述する本発明の多型検出方法において説明する。また、前記プローブ等に関しても、後述のとおりである。<多型検出方法>本発明の多型の検出方法は、前述のように、前記本発明の増幅方法により、鋳型核酸における標的部位を含む標的配列を増幅させる工程、および、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブにより、前記標的配列における前記標的部位の多型を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前述の方法によって標的配列を増幅し、得られた増幅産物について、プローブにより多型を検出することが特徴であって、その他の工程ならびに条件等は、何ら制限されない。本発明の検出方法は、例えば、下記a~c工程を含んでもよい。a本発明の増幅方法により、前記標的配列を増幅させる増幅工程b前記プローブの存在下、前記a工程で得られた増幅産物を含む反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程c前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記鋳型核酸における前記標的部位の多型を検出する工程本発明は、核酸を含む試料に適用することが好ましく、前記試料は、特に制限されず、前述と同様の試料があげられる。また、前記鋳型核酸の種類も、特に制限されず、前述と同様の核酸があげられる。前記プローブは、以下、検出用プローブともいう。前記プローブは、特に制限されず、従来公知の方法によって設定できる。例えば、前記鋳型核酸が二本鎖の場合、センス鎖の標的配列にハイブリダイズするように設計してもよいしセンス鎖の検出用プローブ、アンチセンス鎖の標的配列にハイブリダイズするように設計してもよいアンチセンス鎖の検出用プローブ。前記プローブを設計する際、前記標的配列における標的部位の塩基は、例えば、正常型塩基に設定してもよいし、変異型塩基に設定してもよい。すなわち、前記プローブは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズさせた際、前記標的配列における標的部位の塩基に対応する塩基が、例えば、正常型塩基に相補的でもよいし、変異型塩基に相補的でもよい。本発明において、例えば、変異型の検出を目的とする場合、前記プローブにおいて、標的部位の塩基に対応する塩基が、変異型塩基に相補的であって、正常型塩基に非相補的であることが好ましい。本発明において、前記プローブは、前述のように、前記標的部位を含む標的配列にハイブリダイズ可能な配列であればよい。前記プローブの配列は、特に制限されず、例えば、ハイブリッド形成の際に、前記標的部位と対をなす部位の塩基を除いて、前記標的配列との相補性が、例えば、90~100であることが好ましく、特に好ましくは100であり、つまり、前記標的配列とパーフェクトマッチ配列であることが好ましい。前記反応系におけるプローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記プローブを10~400nmol/Lの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは20~200nmol/Lである。前記プローブが、蛍光色素等の標識物質で標識化された標識プローブである場合、例えば、検出する蛍光強度等のシグナル強度を調節するために、前記標識プローブと同じ配列である未標識プローブとを併用してもよい。この未標識プローブは、例えば、その3’末端にリン酸基が付加されてもよい。この場合、前記標識プローブと前記非標識プローブとのモル比は、例えば、1:10~10:1が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、5~50塩基長であり、好ましくは10~30塩基長である。前記プローブは、前記a工程の後、すなわち、標的配列の増幅反応を行った後、増幅反応の反応系に添加することもできるが、容易且つ迅速に解析を行えることから、前記a工程の増幅反応に先立って、予め、前記反応系に添加しておくことが好ましい。前記反応系における各種プローブの添加割合等は、前述の通りである。このように、増幅反応に先立って前記反応系に前記プローブを添加する場合、例えば、プローブ自体の伸長を予防するために、その3’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよいし、前述のような標識物質で3’末端を標識化してもよい。本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるTm解析融解曲線解析ともいうに利用できる。ここで、Tm解析におけるTm値について説明する。例えば、二本鎖DNAを含む溶液を加熱していくと、260nmにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖DNAにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖DNAに解離DNAの融解することが原因である。そして、全ての二本鎖DNAが解離して一本鎖DNAになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度二本鎖DNAのみの吸光度の約1.5倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Tmは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の50に達した時の温度と定義される。前記b工程において、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値の測定は、前述したように、260nmの吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、増幅産物とハイブリッド例えば、二本鎖DNAを形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。後者のプローブであれば、増幅産物とハイブリッド例えば、二本鎖DNAを形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルが減少消失する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記260nmにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行ならびにTm値の決定等を行うことができる。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記c工程において、シグナル値の変動からの前記標的部位の多型の検出は、従来の方法により行うことができる。具体例は、例えば、前記シグナル値の変動を、前記プローブと変異型標的配列とのハイブリッドの変動および/または前記プローブと野生型標的配列とのハイブリッドの変動と比較し、多型が変異型か野生型かを判断できる。つまり、変異型と同様であれば変異型、野生型と同様であれば野生型と判断できる。また、例えば、前記シグナルの変動からTm値を求め、評価基準のTm値との比較により、多型を判断できる。まず、前記シグナル値の変動から、Tm値を求める。つぎに、測定した前記Tm値を、予め求めた、野生型標的配列についてのTmwt値および/または変異型標的配列についてのTmmt値と比較する。そして、測定したTm値が、評価基準のTm値wtと同じまたは同程度であれば野生型、Tmwt値よりも低いならば変異型、評価基準のTmmt値と同じまたは同程度であれば変異型、Tmmt値よりも低いならば野生型と判断できる。同程度とは、例えば、±3°C程度である。また、前述のように、前記a工程においては、同一反応系において同時に、二種類以上の標的配列を増幅できる。そして、各増幅産物について、それぞれの標的部位の多型を確認できる。この場合、標的部位を含む標的配列ごとに、ハイブリダイズするプローブを準備すればよい。前記各プローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識物質で標識化した標識プローブを使用することが好ましい。このようなプローブを用いれば、同一反応系でも、検出条件を変更することによって、各多型をそれぞれ検出できる。前記標識プローブにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されない。前記標識プローブを構成するオリゴヌクレオチドにおいて、前記標識化部位は、例えば、5’領域または3’領域が好ましく、より好ましくは、5’末端または3’末端から数えて1~4番目の位置、より好ましくは、1~3番目の位置、特に好ましくは1番目5’末端または3’末端または2番目である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシンcまたはグアニンgが好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位例えば、リン酸基を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色、発色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色または発色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質は、例えば、PacificBlue登録商標、モレキュラープローブ社製、BODIPYFL登録商標、モレキュラープローブ社製、FluorePrime商品名、アマシャムファルマシア社製、Fluoredite商品名、ミリポア社製、FAM登録商標、ABI社製、Cy3およびCy5商品名、アマシャムファルマシア社製、TAMRA登録商標、モレキュラープローブ社製等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。例えば、PacificBlueは、検出波長450~480nm、TAMRAは、検出波長585~700nm、BODIPYFLは、検出波長515~555nmで検出できる。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少例えば、消光するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象Quenchingphenomenonと呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端もしくは5’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシンcまたはグアニンgであることが好ましい。前記末端の塩基がシトシンcの場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、増幅産物とハイブリッドを形成した際、前記増幅産物における、標識化された末端のシトシンcと対をなす塩基または前記対をなす塩基から1~3塩基離れた塩基がグアニンgとなるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から一塩基離れた塩基は、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるQProbe登録商標として知られている。このようなグアニン消光プローブが前記増幅産物にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシンcが、前記増幅産物におけるグアニンgに近づくことによって、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる蛍光強度が減少するという現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニンgの場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記増幅産物とハイブリッドを形成した際、前記増幅産物における、標識化された末端のグアニンgと対をなす塩基または前記対をなす塩基から1~3塩基離れた塩基がシトシンcとなるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記プローブは、前述のように、例えば、3’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、増幅反応の際、前記プローブを増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記プローブの3’末端にリン酸基を付加させておけば、前記プローブ自体が前記増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、3’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。次に、本発明の多型検出方法について、PCRにより増幅反応を行い、前記検出用プローブとして標識プローブを使用する一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。まず、鋳型核酸を含む試料、前述の本発明における各種プライマー、および、前記標的配列にハイブリダイズする標識プローブを添加した反応液を用いて、前述のようにPCRを行う。前記反応液は、前記各種プライマーおよび標識プローブの他に、例えば、DNAポリメラーゼ、dNTP、その他の核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれでもよいが、前記a工程の増幅反応と、前記b工程とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。次に、得られた増幅産物二本鎖DNAの解離、および、解離により得られた一本鎖DNAと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度を変化させることで行うことができる。前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅産物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されず、例えば、85~95°Cである。加熱時間も特に制限されず、通常、1秒~10分であり、好ましくは1秒~5分である。解離した一本鎖DNAと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、40~50°Cである。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、1~600秒である。そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖DNAと前記標識プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、例えば、末端のC塩基が標識化されたプローブグアニン消光プローブを使用した場合、一本鎖DNAとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少または消光し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少または消光しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。なお、前記標識プローブを使用する場合、前記シグナル値は、例えば、前記標識プローブの標識物質に応じた条件で測定できる。検出目的の標的部位が複数であり、複数種のプローブを使用して、多型を検出する際には、前述のように、異なる検出条件の標識物質で標識化したプローブを使用し、各プローブの標識物質に応じた条件で、それぞれのシグナル値を測定すればよい。蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されず、例えば、開始温度が室温~85°Cであり、好ましくは25~70°Cであり、終了温度は、例えば、40~105°Cである。また、温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、0.1~20°C/秒であり、好ましくは0.3~5°C/秒である。つぎに、測定したシグナル値から、温度変化に伴うシグナル値の変動を解析し、大きな変動ピークを示すTm値を決定する。シグナル値の変動は、例えば、単位時間tあたりのシグナル値Fの変化量を算出することで解析できる。ハイブリッドの融解一本鎖化によりシグナル値が増加する場合は、例えば、得られたシグナル値から、各温度における単位時間t当たりのシグナル値Fの増加量またはその負の微分値-dF/dtを算出し、最も低い値を示す温度をTm値として決定できる。また、単位時間t当たりのシグナル値Fの増加量またはその微分値dF/dtが最も高い値を示す温度をTm値として決定することもできる。他方、ハイブリッドの融解一本鎖化によりシグナル値が減少する場合には、例えば、反対に、単位時間t当たりのシグナル値Fの減少量を算出することにより、Tm値を決定することもできる。なお、前述のように、前記反応液の温度を上昇させて、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル値を測定し、その変動を解析してもよい。すなわち、前記反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル値の変動を解析してもよい。前記シグナル値の変動の解析は、例えば、温度とシグナル値の変動との関係をプロットしたグラフを作成して解析することも可能であるが、前記解析工程において、前記グラフの作成は必須ではない。前記Tm値は、例えば、従来公知のMELTCALCソフトウエアhttpwww.meltcalc.com等により算出でき、また、隣接法NearestNeighborMethodによって決定することもできる。そして、これらのTm値から、標的部位の塩基の種類、すなわち、変異型または正常型等の多型を決定する。Tm解析において、完全に相補であるハイブリッドパーフェクトマッチは、一塩基が異なるハイブリッドミスマッチよりも、解離を示すTm値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのTm値と、一塩基が異なるハイブリッドのTm値とを、評価基準値として決定しておくことにより、標的部位における多型を決定できる。例えば、標的部位を変異型と仮定し、その変異型塩基を含む標的配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのTm値が、完全に相補なハイブリッドのTm値と同じであれば、標的部位は変異型と判断できる。また、形成したハイブリッドのTm値が、一塩基異なるハイブリッドのTm値と同じ完全に相補なハイブリッドのTm値より低い値であれば、標的部位は正常型と判断できる。また、両方のTm値が検出された場合には、例えば、変異型を示す核酸と、正常型を示す核酸とが共存すると決定できる。本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。つまり、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ例えば、グアニン消光プローブを使用した場合、一本鎖DNAと前記プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少または消光する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、一本鎖DNAとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。本発明において、前記試料中の核酸は、一本鎖でもよいし二本鎖でもよい。前記核酸が二本鎖の場合は、例えば、前記b工程のハイブリダイズに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、次のb工程において、前記検出用プローブと前記標的配列とのハイブリダイズを効率よく行うことができる。<増幅試薬>本発明の増幅試薬は、本発明の標的配列の増幅方法に使用する増幅試薬である。本発明の増幅試薬は、前記標的配列が、多型を示す標的部位を含む配列であり、前記標的部位の塩基xが、第1塩基x1または第2塩基x2であり、前記プライマーX1およびプライマーX2を含むことを特徴とする。また、本発明の増幅試薬は、さらに、プライマーY1を含むことが好ましい。本発明の増幅試薬において、前記各プライマーは、前述と同様である。本発明の増幅試薬は、例えば、本発明の標的配列の増幅方法において記載した、増幅反応に使用する各種成分をさらに含んでもよい。本発明の増幅試薬は、一つの反応系内で使用することが好ましい。また、本発明の増幅試薬は、本発明の標的配列の増幅方法に使用する増幅キットでもよく、各成分は、それぞれ別個の容器に含まれてもよいし、適宜組み合せて、同一の容器に含まれてもよい。前記増幅キットは、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。<多型検出試薬>本発明の多型検出試薬は、本発明の多型の検出方法に使用する検出試薬であり、本発明の増幅試薬、および前記鋳型核酸における前記標的部位を含む配列にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする。本発明の多型検出試薬は、一つの反応系内で使用することが好ましい。なお、本発明の多型検出試薬は、例えば、本発明の多型の検出方法において記載した、増幅反応に使用する各種成分をさらに含んでもよい。また、本発明の多型検出試薬は、例えば、本発明の多型検出キットでもよく、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。[実施例1]本例では、bcr-abl遺伝子について、Tm解析を行った。実施例1-1本例では、付加配列E1を有する正常型プライマーを用いて、正常型bcr-abl遺伝子を含む未精製の血液試料について、Tm解析を行い、擬陽性の有無を確認した。本実施例においては、配列番号1に示すbcr-abl遺伝子の部分配列において、塩基番号270の塩基yを検出部位とした。前記yは、シトシンcまたはチミンtであり、シトシンであれば正常型多型T315、チミンであれば変異型多型T315Iと判断できる。PCRとTm解析は、全自動SNPs検査装置商品名i-densy登録商標、アークレイ社製を用いて行った。まず、EDTA採血管を用いて採取した全血10μLと、下記希釈液170μLとを混合し、希釈血液1を調製し、さらに、前記希釈血液110μLと、下記希釈液270μLとを混合し、希釈血液2を調製した。前記検査装置用の反応セルに、前記希釈血液217μLを添加し、これを前記検査装置にセットし、95°Cで10分間加熱した。加熱後、前記反応セルに、下記第1試薬23μL、下記第2試薬13μLおよび下記第3試薬10μLを添加して、加熱処理後の前記希釈血液2と混合し、この混合液について、PCRおよびTm解析を行った。前記PCRは、95°Cで60秒処理した後、95°C1秒および64°C15秒を1サイクルとして50サイクル繰り返した。さらに、前記Tm解析は、95°Cで1秒、40°Cで60秒処理した後、昇温速度1°C/3秒で、40°Cから70°Cまで加熱し、昇温の間、経時的な蛍光強度の変化を測定した。検出波長は、520~555nmとした。前記Fプライマーは、フォワードプライマーであり、Rwtプライマーは、リバースプライマーであり、3’末端の塩基が、センス鎖における正常型の標的部位に相補的とし、Rmtプライマーは、リバースプライマーであり、3’末端の塩基が、センス鎖における変異型の標的部位に相補的とした。以下に、Fプライマー、RwtプライマーおよびRmtプライマーの配列を示す。下記FプライマーY1において、下線部の配列は、アンチセンス鎖に非相補的な付加配列であり、その他の配列が、アンチセンス鎖に相補的な配列である。下記Rwtプライマーのうち、付加配列Rwtプライマーは、5’末端の下線部配列が、センス鎖に非相補的な付加配列E1であり、その他の配列が、センス鎖に相補的な配列A1’であり、3’末端の大文字の塩基Gが、標的部位の正常型塩基Gであり、センス鎖における標的部位の正常型塩基Cに対応する。下記Rwtプライマーのうち、付加配列-Rwtプライマーは、付加配列E1を有さず、センス鎖に相補的な配列A1’からなり、3’末端の大文字の塩基Gが、標的部位の正常型塩基Gであり、センス鎖における標的部位の正常型塩基Cに対応する。下記付加配列-Rmtプライマーは、付加配列E2を有さず、センス鎖に相補的な配列A2’からなり、3’末端の大文字の塩基Aが、標的部位の変異型塩基Aであり、センス鎖における標的部位の変異型塩基Tに対応する。Fプライマー5’ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc3’BCRABLF1ggac配列番号2Rwtプライマー付加配列Rwtプライマー5’ctacgttcccgtaggtcatgaactcaG3’T315IWTR1ctacg配列番号3付加配列-Rwtプライマー5’ttcccgtaggtcatgaactcaG3’T315IWTR1配列番号4Rmtプライマー付加配列-Rmtプライマー5’aggttcccgtaggtcatgaactcaA3’T315ImtR2配列番号5前記Fプライマー、付加配列Rwtプライマーおよび付加配列-Rmtプライマーのプライマーセットを、実施例1-1とした。前記Fプライマー、付加配列-Rwtプライマーおよび付加配列-Rmtプライマーのプライマーセットを、比較例1-1とした。前記付加配列Rwtプライマーと前記正常型標的配列とのTmwt値は、60°C、前記付加配列-Rwtプライマーと前記正常型標的配列とのTmwt値は、55.4°C、前記付加配列-Rmtプライマーと前記変異型標的配列とのTmmt値は、59°Cである。以下に、前記プローブの配列を示す。下記プローブは、変異型bcr-abl遺伝子のセンス鎖において、前記変異型標的部位を含む配列にパーフェクトマッチするプローブであり、下記配列において、大文字の塩基が前記変異型標的部位に相補的な塩基である。前記プローブは、5’末端を、蛍光色素BODIPYFLで標識化し、3’末端を、リン酸化した。5’ctcaAtgatgatatagaacgP3’配列番号6これらの結果を図5に示す。図5は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すTm解析のグラフである。図5において、Aは、実施例1-1のプライマーセットの結果、Bは、比較例1-1のプライマーセットの結果を示す。図5において、横軸は、測定時の温度°Cを示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値であるd蛍光強度変化量/dtdFdtとした。なお、前記プローブと前記正常型標的配列とのTmwt値は、47°C、前記プローブと前記変異型標的配列とのTmmt値は、55°Cである。前述のように、本例で使用した全血由来のbcr-abl遺伝子の多型は、正常型であるにもかかわらず、図5Bの比較例1-1では、前記正常型標的配列とのTmwt値付近だけでなく、前記変異型標的配列とのTmmt値付近においても、ピークが確認された。この変異型のTmmt値におけるピークの大きさは、正常型遺伝子に変異型遺伝子が0.3の割合で含まれる場合にみられる変異型のピーク図示せずと同程度であることから、このピークによって、変異型多型は擬陽性を示すことがわかった。これに対して、図5Aの実施例1-1では、前記プローブと前記正常型標的配列とのTmwt値付近のみでピークが確認され、前記プローブと前記変異型標的配列とのTmmt値付近においては、ピークは確認されず、変異型多型は存在しないという正しい結果が、再現性良くn=4得られた。このように、本発明のプライマーを使用することによって、未精製の全血試料でも、プライマーの誤ったアニーリングと増幅を防止し、擬陽性を抑制できることがわかった。実施例1-2本例では、付加配列E1を有する正常型プライマーおよび付加配列E2を有する変異型プライマーを用いて、bcr-abl遺伝子の部分配列を含むプラスミド試料について、Tm解析を行った。bcr-abl遺伝子の部分配列として、配列番号1における塩基番号51~550のオリゴヌクレオチドが挿入された正常型プラスミドWTおよび変異型プラスミドmtを準備した。前記正常型プラスミドWTにおいて、配列番号1における塩基番号270の塩基yは、シトシンcであり、変異型プラスミドmtにおいて、配列番号1に示す塩基配列における塩基番号270の塩基yは、チミンtである。これらのプラスミドを、以下に示す所定の割合で混合し、2種類のプラスミド試料を調製した。前記プラスミド試料におけるプラスミド含有量は、1μLあたり、1×104コピー/μLとした。プラスミド試料各プラスミドの混合割合WTmtmt1991mt0.399.70.3前記実施例1-1における前記Fプライマー、前記付加配列Rwtプライマーおよび下記付加配列Rmtプライマーのプライマーセットを使用し、前記各プラスミド試料1μLおよび実施例1-1の全血試料を使用した以外は、前記実施例1-1と同様にして、Tm解析を行った。前記付加配列Rmtプライマーは、5’末端の下線部配列が、センス鎖に非相補的な付加配列E2であり、その他の配列が、センス鎖に相補的な配列A2’であり、3’末端の大文字の塩基Aが、標的部位の変異型塩基Aであり、センス鎖における標的部位の変異型塩基Tに対応する。なお、前記付加配列Rmtプライマーの付加配列E2は、付加配列Rwtプライマーの付加配列E1とは、異なる配列とした。前記付加配列Rwtプライマーと前記正常型標的配列とのTmwt値は、60°C、前記付加配列Rmtプライマーと前記変異型標的配列とのTmmt値は、63.9°Cである。そして、前記付加配列Rwtプライマーにおける付加配列以外の配列A1’と前記正常型標的配列とのTmwt値は、55.4°Cであり、前記付加配列Rmtプライマーにおける付加配列以外の配列A2’と前記変異型標的配列とのTmmt値は、59°Cである。Rmtプライマー付加配列Rmtプライマー5’tgctcaggttcccgtaggtcatgaactcaA3’T315ImtR2tgctc配列番号7これらの結果を図6に示す。図6は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すTm解析のグラフである。図6において、Aは、プラスミド試料mt1の結果、Bは、プラスミド試料mt0.3の結果、Cは、全血試料の結果を示す。図6において、横軸は、測定時の温度°Cを示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値であるd蛍光強度変化量/dtdFdtとした。なお、前記プローブと前記正常型標的配列とのTmwt値は、47°C、前記プローブと前記変異型標的配列とのTmmt値は、55°Cである。図6Cに示すように、正常型の全血試料の場合、正常型のTmwt値付近のみにピークが見られ、変異型のTmmt値付近においては、ピークが確認されず、変異型多型についての擬陽性を防止できていることが、再現性よく確認されたn=8。また、図6Aに示すように、変異型プラスミドが1と少量であっても、前記変異型のTmmt値付近のピークを検出でき、さらに、図6Bに示すように、変異型プラスミドが0.3と極めて少量の場合においても、前記変異型のTmmt値付近におけるピークが検出できた。このことから、本発明によれば、変異型多型の擬陽性を防止し、さらに、十分に優れた感度を実現できることも確認できた。"