"試料中の抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するための方法であって、a標識化抗TNFα薬を、抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗TNFα薬とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体を形成させるステップと、b標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、及び遊離の標識化抗TNFα薬から分離するステップと、c標識化複合体を検出し、それにより、抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップと、を含む方法。抗TNFα薬が、レミケード商標インフリキシマブ、ヒュミラ商標アダリムマブ、エンブレル商標エタネルセプト、シムジア登録商標セルトリズマブペゴル及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、ヒト抗キメラ抗体HACA、ヒト抗ヒト化抗体HAHA、ヒト抗マウス抗体HAMA及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。少なくとも1つのアイソタイプが、少なくとも2、3、4又は5つ以上の複数のアイソタイプを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つのアイソタイプが、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。試料が、全血、血清又は血漿である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、HACAであり、試料が、レミケード商標インフリキシマブ療法を受けている対象から得られる、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、HAHAであり、試料が、ヒュミラ商標アダリムマブ療法を受けている対象から得られる、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。標識化抗TNFα薬が、蛍光物質標識化抗TNFα薬である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。標識化複合体が、蛍光標識の検出を使用して検出される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。それぞれの自己抗体アイソタイプが、その保持時間により、特徴付けられるか又は同定される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。サイズ排除クロマトグラフィーが、サイズ排除サイズ排除-高速液体クロマトグラフィーSE-HPLCである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。試料中の抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するための方法であって、a標識化抗TNFα薬、及び1つ又は複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ig抗体を、抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプを有する又は有すると推測される試料と接触させて、標識化抗TNFα薬と標識化抗Ig抗体とそれぞれの自己抗体アイソタイプとの間で標識化複合体を形成させるステップであり、標識化抗TNFα薬と標識化抗Ig抗体とが異なる標識を含むステップと、b標識化複合体をサイズ排除クロマトグラフィーに供して、異なる自己抗体アイソタイプを有する標識化複合体を、互いに、遊離の標識化抗TNFα薬から、及び/又は遊離の標識化抗Ig抗体から分離するステップと、c標識化複合体を検出し、それにより、抗TNFα薬に対する自己抗体の少なくとも1つのアイソタイプの存在又はレベルを検出するステップと、を含む方法。抗TNFα薬が、レミケード商標インフリキシマブ、ヒュミラ商標アダリムマブ、エンブレル商標エタネルセプト、シムジア登録商標セルトリズマブペゴル及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、ヒト抗キメラ抗体HACA、ヒト抗ヒト化抗体HAHA、ヒト抗マウス抗体HAMA及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項13又は14に記載の方法。標識化抗TNFα薬と1つ又は複数の標識化抗Ig抗体とが、少なくとも1つのアイソタイプの異なるエピトープに結合する、請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つのアイソタイプが、少なくとも2、3、4又は5つ以上の複数のアイソタイプを含む、請求項13~16のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つのアイソタイプが、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項13~17のいずれか一項に記載の方法。複数の標識化抗Ig抗体が、少なくとも2、3、4又は5つ以上の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ig抗体を含む、請求項13~18のいずれか一項に記載の方法。1つ又は複数の標識化抗Ig抗体が、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのアイソタイプ、それらのサブクラス、並びにそれらの組合せのうちの1つ又は複数に特異的な抗体からなる群から選択される、請求項13~19のいずれか一項に記載の方法。試料が、全血、血清又は血漿である、請求項13~20のいずれか一項に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、HACAであり、試料が、レミケード商標インフリキシマブ療法を受けている対象から得られる、請求項13~21のいずれか一項に記載の方法。抗TNFα薬に対する自己抗体が、HAHAであり、試料が、ヒュミラ商標アダリムマブ療法を受けている対象から得られる、請求項13~21のいずれか一項に記載の方法。標識化抗TNFα薬が、蛍光物質標識化抗TNFα薬である、請求項13~23のいずれか一項に記載の方法。標識化抗Ig抗体が、蛍光物質標識化抗Ig抗体である、請求項13~24のいずれか一項に記載の方法。複数の、異なる抗体アイソタイプに特異的な標識化抗Ig抗体がそれぞれ、同じ標識又は異なる標識を含む、請求項13~25のいずれか一項に記載の方法。標識化複合体が、蛍光標識の検出を使用して検出される、請求項13~26のいずれか一項に記載の方法。標識化複合体が、標識化抗TNFα薬及び標識化抗Ig抗体の両方の、自己抗体アイソタイプに対する近接性結合により発生するシグナルに基づいて検出される、請求項13~27のいずれか一項に記載の方法。シグナルが、蛍光共鳴エネルギー移動FRETにより検出される蛍光シグナルを含む、請求項28に記載の方法。サイズ排除クロマトグラフィーが、サイズ排除-高速液体クロマトグラフィーSE-HPLCである、請求項13~29のいずれか一項に記載の方法。[実施例][0174]本発明を、具体例を利用してより詳細に記載する。以下の実施例は、例示の目的で提供するのであって、いかなる場合であっても、それらの実施例により本発明を制限する意図はない。当業者であれば、変化させるか又は改変しても、本質的に同じ結果を得ることができる、多様な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。実施例1.抗TNFα生物学的製剤のレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。[0175]この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化TNFαに対する抗TNFα薬の結合を検出する、患者試料例えば、血清中の抗TNFα薬の濃度を測定するための新規の均一アッセイを例証する。当該アッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び/又はIRスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者において抗TNFα薬を検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ELISA用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。[0176]例示的な一実施形態では、TNFαを、蛍光物質例えば、アレクサ647を用いて標識し、蛍光物質は、可視スペクトル及びIRスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。標識化TNFαを液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、血清中に存在する抗TNFα薬を結合させる。また、標識化TNFαを液相反応中で既知の量の抗TNFα薬と共にインキュベートして、検量線を作成することもできる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。標識化TNFαに対する抗TNFα薬の結合により、標識化TNFα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる。次いで、血清試料中に存在する抗TNFα薬の濃度を、検量線及び対照と比較することができる。[0177]図1は、サイズ排除HPLCを使用して、TNFα-アレクサ647とヒュミラ商標アダリムマブとの間の結合を検出する、本発明のアッセイの実施例を示す。図1に示すように、TNFα-アレクサ647に対するヒュミラ商標の結合が、TNFα-アレクサ647のピークの、左へのシフトを引き起こした。[0178]図2は、TNFα-アレクサ647に対するヒュミラ商標の結合の用量反応曲線を示す。特に、図2Aは、ヒュミラ商標が、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、TNFα-アレクサ647のシフトを用量依存的に増加させたことを示す。図2Bは、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、1ヒト血清の存在が、TNFα-アレクサ647のシフトに対して顕著な作用を示すことはなかったことを示す。図2Cは、サイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいて、プールしたRF陽性血清の存在が、TNFα-アレクサ647のシフトに対して顕著な作用を示すことはなかったことを示す。[0179]したがって、この実施例は、抗TNFα薬、例として、ヒュミラ商標を投与している患者をモニターして、1適切な薬物投与量の決定を導く場合、2薬物の薬物動態を評価し、例えば、身体から薬物が急速に除かれ過ぎていないかどうかを決定する場合、及び3治療の決定を導く、例えば、現在の抗TNFα薬から異なるTNFα阻害剤にか、又は別のタイプの療法に切り換えるかどうかの決定を導く場合の本発明の有用性を実証している。実施例2.HACA及びHAHAのレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。[0180]この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化抗TNFα薬に対する、患者試料例えば、血清中の自己抗体例えば、HACA及び/又はHAHAの結合を検出する、これらの自己抗体の濃度を測定するための新規の均一アッセイを例証する。当該アッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、低い親和性のHACA及びHAHAを除去する洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び/又はIRスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者においてHACA及びHAHAを検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ELISA用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。[0181]TNFα阻害剤に対して生成される自己抗体例えば、HACA、HAHA等を測定する臨床的な有用性は、HACAが1mg/kg、3mg/kg及び10mg/kgのインフリキシマブを用いて治療した関節リウマチ患者の53、21及び7において検出された事実によって示されている。インフリキシマブを、メトトレキサートと組み合わせた場合、抗体の発生率は、より低く、15、7及び0であり、このことは、免疫抑制剤併用療法が抗薬物応答を低下させるのに有効であることを示しているが、また、高い用量の抗TNFα抗体が寛容をもたらす可能性があるであろうことも示している。クローン病の場合、さらにより高い発生率が報告された。5回目の注入後、患者の61がHACAを有した。HACAが存在する場合、臨床応答が短縮した。Rutgeerts、N.Engl.J.Med.、348:601~608頁2003を参照されたい。インフリキシマブ及びHACAのレベルを、155人の患者において2005~2008年の3年にわたり測定した遡及的研究から、HACAが、炎症性腸疾患を有する患者の22.6N=35において検出されることが実証された。Afifら、ClinicalUtilityofMeasuringInfliximabandHumanAnti-ChimericAntibodyLevelsinPatientswithInflammatoryBowelDisease、DigestiveDiseaseWeek;2009年5月30日~6月3日;Chicago、ILにおいて提示された論文を参照されたい。著者らは、臨床症状に基づいて治療を変化させるだけでは、管理が不適切になる可能性があると結論付けた。[0182]均一移動度シフトアッセイは、現在の方法、例として、図3に示す、患者試料中の自己抗体例えば、HACA及び/又はHAHAの濃度を測定するための細胞架橋アッセイbridgingassayを上回って好都合である。その理由は、考案の方法が、自己抗体、例として、HACAの濃度を、非特異的結合及びELISA用プレートに由来する固相干渉なしで測定することが可能であり、抗TNFα薬に由来する干渉もなく例えば、細胞架橋アッセイを用いると、HACAの測定を、抗TNFα薬の谷レベルにおいて行わなければならない、抗体の多価に依存することは全くない例えば、IgG4抗体が、二重特異性を示し、同じ抗原と架橋結合することができないので、細胞架橋アッセイを使用すると、IgG4抗体は検出されないからである。したがって、本発明は、現在の方法を上回る以下の利点を少なくとも有する:抗原の固体表面への付着を回避する変性が回避される利点、IgG4の作用を排除する利点、治療用抗体の谷の問題を克服する利点、弱い親和性を有する抗体を検出する利点、無関係のIgGの非特異的結合を排除する利点、並びに検出の感度及び特異性を増加させる利点。[0183]例示的な一実施形態では、抗TNFα薬例えば、レミケード商標を、蛍光物質例えば、アレクサ647を用いて標識し、蛍光物質は、可視スペクトル及びIRスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。標識化抗TNFα薬を液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、血清中に存在するHACA及びHAHAを結合させる。また、標識化抗TNFα薬を液相反応中で既知の量の抗IgG抗体と共にインキュベートして、検量線を作成することもできる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。標識化抗TNFα薬に対する自己抗体の結合により、標識化薬物単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる。次いで、血清試料中に存在するHACA及びHAHAの濃度を、検量線及び対照と比較することができる。図4は、レミケード商標に対して生成したHACA/HAHAの濃度を測定するための、本発明の自己抗体の検出アッセイの例示的な概要を示す。特定の場合には、高いHACA/HAHAのレベルにより、レミケード商標を用いる現在の療法を、別の抗TNFα薬、例として、ヒュミラ商標に切り換えるべきであることが示される。[0184]このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加に起因して、サイズ排除-高速液体クロマトグラフィーSE-HPLC上において、抗体が結合しているアレクサ647標識化レミケード複合体に、遊離のアレクサ647標識化レミケードに比して、移動度のシフトが生じることに基づく。[0185]この実施例におけるクロマトグラフィーを、Agilent-1200HPLCシステム上で、5,000~700,000の分子量分画範囲を有するBio-Sepの300×7.8mmのSEC-3000カラムPhenomenex、及び1×PBS、pH7.4の移動相を使用して、0.5mL/分の流速で、650nmにおけるUV検出を用いて実施した。各分析について、100μLの試料体積をカラム上に充填する。[0186]抗体が結合しているアレクサ647標識化レミケード複合体を、SE-HPLC分析の前に、既知の量の抗体及びアレクサ647標識化レミケードを、1×PBS、pH7.3の溶出用緩衝液中、室温で1時間インキュベートすることによって形成させる。[0187]図5は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合のレミケード商標-アレクサ647に対する抗ヒトIgG抗体の結合の用量応答分析を示す。レミケード商標-アレクサ647に対する抗IgG抗体の結合が、レミケード商標-アレクサ647のピークの、左へのシフトを引き起こした。図6は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合のレミケード商標-アレクサ647に対する抗ヒトIgG抗体の結合の第2の用量応答分析を示す。レミケード商標-アレクサ647のピークの、左へのシフトによって示されるように、より高い量の抗IgG抗体から、抗IgG/レミケード商標-アレクサ647の複合体の形成の用量依存性の増加が生じた。図7は、レミケード商標-アレクサ647に対する抗IgG抗体の結合の用量反応曲線を示す。[0188]図8は、100μlの注入試料を用いて、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出した場合の、正常ヒト血清及びHACA陽性血清中におけるレミケード商標-アレクサ647の免疫複合体形成を示す。図8に示すように、レミケード商標-アレクサ647に対する、患者試料中に存在するHACAの結合が、レミケード商標-アレクサ647のピークの、左へのシフトを引き起こした。したがって、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイは、特に好都合である。その理由は、当該アッセイが、レミケード商標の存在下で、HACAを測定すること、患者の療法を継続しながら活用され得ること、HACAの弱い結合及び強い結合の両方を測定すること、混合し、読み取る移動度シフトアッセイであること、並びに標識化レミケード商標を使用して、HACAとレミケード商標とを平衡化する他のアプローチに拡大適用することができることによる。[0189]図9は、細胞架橋アッセイ又は本発明の移動度シフトアッセイを使用して実施した、20人の患者の血清試料から得られたHACAの測定の概要を示す。この比較研究から、提示する方法は、現在の方法を上回って、感度を増加させるに至ったことが実証されている。その理由は、細胞架橋アッセイを使用して測定した場合、HACAについて陰性であった3つの試料が実際には、本発明の移動度シフトアッセイを使用して測定した場合、HACA陽性であったからである患者番号SK07070305、SK07070595及びSK07110035を参照されたい。[0190]したがって、この実施例は、抗TNFα薬例えば、レミケード商標を投与している患者をモニターして、薬物に対する自己抗体例えば、HACA及び/又はHAHAの存在又はレベルを検出する場合の本発明の有用性を実証している。本発明が有用である理由は、そのような免疫応答が、過敏性反応、並びに抗TNFα薬の薬物動態及び体内分布の劇的な変化と関連がある場合があり、そうした反応及び変化は、薬物を用いたさらなる治療を妨げるからである。[0191]結論として、実施例1及び2は、TNFα及び抗TNFα抗体を、アレクサ647を用いて効率的に標識することができることを実証している。標識化TNFα-アレクサ647を、抗TNFα抗体と共にインキュベートすると、標識化TNFα/抗TNFα抗体の複合体の保持時間がシフトし、シフトを引き起こす抗TNFα抗体の量を、HPLCを用いて定量化することができた。さらに、標識化抗TNFα抗体を、抗ヒトIgG抗体と共にインキュベートすると、標識化抗TNFα抗体/抗IgG抗体の複合体の保持時間がシフトし、シフトを引き起こす抗IgG抗体の量を、HPLCを用いて定量化することもできた。さらに、アッセイ系中の低い血清含有量は、HPLCによる分析に対してほとんど作用を示さないことも示された。最後に、検量線を、抗TNFα抗体アッセイ及びHACA/HAHAアッセイのために生成することができ、検量線を使用して、患者血清の抗TNFα抗体又はHACA/HAHAのレベルを定量化することができた。好都合なことに、本発明は、特定の態様では、薬物及び薬物に対する抗体の両方を測定するために開発した移動度シフトアッセイ、例として、混合し、読み取る、均一アッセイを提供する。検量線を、抗TNFα生物学的製剤のレミケード及びヒュミラについて、また、レミケードに対するHACA抗体についても生成した。移動度シフトアッセイフォーマットは、ELISAとは異なり、抗原による固体表面の被覆を排除し、無関係のIgGの非特異的結合の影響を受けない。アッセイフォーマットは、単純であるが、非常に感度が高く、このフォーマットを使用して、全ての抗TNFα生物学的薬物例えば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア、並びに患者血清中の中和抗体抗レミケードRemicade商標を検出することができる。実施例3.新規の移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のヒト抗キメラ抗体HACA及びインフリキシマブIFXのレベルの測定。要約[0192]背景:インフリキシマブIFXは、TNFαに対するキメラモノクローナル抗体治療剤であり、この治療剤は、自己免疫疾患、例として、関節リウマチRA及び炎症性腸疾患IBDを治療するのに有効であることが示されている。しかし、IFXに対する抗体が、一部のIFX治療患者において、ヒト抗キメラ抗体HACAの検出を通して見出され、HACAは、薬物の有効性を低下させるか又は有害作用を引き起こす可能性がある。個々の患者においてHACA及びIFXのレベルをモニターすることは、IFXの投与及びIFXを用いる治療を最適化するのを支援することができる。HACAを検出するための現在の方法は、固相アッセイに基づいており、これらの方法は、血行中のIFXの存在がHACAの存在をマスクする可能性があり、したがって、IFXの投与の少なくとも8週間後にようやく測定を行うことができるという事実によって制限される。さらに、この時間の経過は、血液循環中の高分子量の免疫複合体の急速なクリアランスにより、アッセイをさらに混乱させる。本発明者らは、これらの欠点を克服するために、IFXを用いて治療する患者中のIFX及びHACAの血清レベルを測定するための新しい方法を開発し、評価するに至った。[0193]方法:新規の非放射標識性、液相、サイズ排除SE-HPLC移動度シフトアッセイを開発して、IFXを用いて治療する患者から得られた血清中のHACA及びIFXのレベルを測定した。免疫複合体例えば、TNFα/IFX又はIFX/HACA、遊離のTNFα又はIFX、及び結合型/遊離の比を、高い感度で決定及び計算することができる。異なる濃度のIFX又はプールしたHACA陽性血清と共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、IFX又はHACAの血清濃度を決定した。本発明者らは、この新規アッセイを使用して、再発に至った、IFXを用いて治療するIBD患者から収集した血清中のIFX及びHACAのレベルを測定し、結果を、従来の細胞架橋ELISAアッセイBridgeELISAassayにより得られた結果と比較するに至った。[0194]結果:用量反応曲線を、新規アッセイから高い感度で生成した。HACAの検出を、過剰なIFXの存在下で実証した。IFXを用いて治療する患者から得られた117個の血清試料中、65個の試料が検出限界を上回るIFXレベルを有することを見出し、平均は、11.06.9mg/mLであった。HACAレベルについては、33個28.2の試料が陽性であることを見出し、一方、細胞架橋ELISAアッセイは、わずか24個の陽性試料を検出したに過ぎない。また、本発明者らは、細胞架橋アッセイにより決定した試料から、9つの偽陰性及び9つの偽陽性も同定した。11人の患者において、IFX治療のコースの間に、HACAレベルが増加することを見出し、一方、IFXレベルは顕著に減少することを見出した。[0195]結論:新規の非放射標識性、液相、移動度シフトアッセイを開発して、IFXを用いて治療する患者から得られた血清中のIFX及びHACAのレベルを測定するに至った。当該アッセイは、高い感度及び精度を有し、得られた結果には、再現性があった。この新規アッセイを好都合に使用して、HACA及びIFXのレベルを、患者の療法を継続しながら測定することができる。序論[0196]腫瘍壊死因子-αTNFαは、自己免疫疾患、例として、クローン病CD及び関節リウマチRAの病変形成において極めて重要な役割を果たす。TNFαを、治療用抗体、例として、インフリキシマブヒト-マウスのキメラモノクローナルIgG1κ又はアダリムマブ完全ヒトモノクローナル抗体を用いて遮断することによって、CD及びRAにおける疾患活性が低下することは十分に記載されている。しかし、約30~40の患者が、抗TNFα療法に応答せず、一部の患者は、十分な応答を欠くことに起因して、より高い用量又は投与頻度による調節が必要になる。個々の患者における薬物の生物学的利用率及び薬物動態の差が、治療の不成功に寄与し得る。患者にHACA/HAHAを発生させる、薬物の免疫原性により、軽度のアレルギー応答からアナフィラキシー性ショックまでの様々な有害反応が生じる可能性があるであろう。これらの問題は今では、多くの研究者、薬物規制機関、健康保険会社及び薬物製造者が認識している。さらに、1つの抗TNFα薬に対する続発性の応答不全を示した多くの患者が、他の抗TNFα薬への切換えから利益を得、このことから、治療のために使用するタンパク質に対して特異的に作られる中和抗体の役割も示唆されるRadstakeら、Ann.Rheum.Dis.、6811:1739~45頁2009。したがって、薬物投与を、個々の患者に合わせて手直しすることができ、長期の療法を、患者に対するリスクがほとんど又は全くなく、有効かつ経済的に行うことができるように、患者を薬物及びHACA/HAHAのレベルについてモニターすることが正当化されるBendtzenら、Scand.J.Gastroenterol.、447:774~81頁2009。[0197]いくつかの酵素結合イムノアッセイが、薬物及びHACA/HAHAの循環レベルを評価するために使用されている。図10は、本発明の新規のHACAアッセイと比較した、HACAの測定のために利用可能な現在のアッセイの概要を示す。現在の方法の制限のうちの1つは、血行中に測定可能な量の薬物がある場合、抗体のレベルを測定するのが困難であることである。IFXの投与の少なくとも8週間後にようやく測定を実施することができる、HACAを検出するための現在の固相法とは対照的に、本発明の新規アッセイは、非放射標識性、液相、サイズ排除SE-HPLCアッセイであり、IFXを用いる治療を継続しながら、患者から得られた血清中のHACA及びIFXのレベルを測定することが可能である。[0198]患者において、抗TNFα生物学的薬物及びTNFα生物学的薬物に対する抗体の血清濃度を測定することについての理論的根拠を、以下に示す:1臨床治験におけるPK研究のため、2生物学的薬物に対する患者の免疫応答をモニターすることが、FDAにより、臨床治験の間に要求される場合がある、3HACA又はHAHAを測定することによって、生物学的薬物に対する患者の応答をモニターして、各患者についての薬物投与量を導くため、及び4最初の薬物が成功しない場合に、異なる、生物学的薬物に切り換えるための手引きとして使用するため。方法[0199]患者血清中のインフリキシマブIFXのレベルのSE-HPLC分析。ヒト組換えTNFαを、蛍光物質Fl、例えば、アレクサフルオール登録商標488等を用いて、製造元の指示に従って標識した。標識化TNFαを、異なる量のIFX又は患者血清と共に室温で1時間インキュベートした。100μlの体積の試料を、HPLCシステム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。FLDを使用して遊離TNFα-Fl及び結合しているTNFα-Fl免疫複合体をそれらの保持時間に基づいてモニターした。血清IFXレベルを、検量線から計算した。[0200]患者血清中のHACAのレベルのSE-HPLC分析。精製IFXを、Flを用いて標識した。標識化IFXを、異なる希釈度のプールしたHACA陽性血清又は希釈した患者血清と共に室温で1時間インキュベートした。100μlの体積の試料を、HPLCシステム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。FLDを使用して、遊離IFX-Fl及び結合しているIFX-Fl免疫複合体をそれらの保持時間に基づいてモニターした。結合しているIFX-Flと遊離IFX-Flとの比を使用して、HACAのレベルを決定した。[0201]血清中のHACAを測定するための移動度シフトアッセイの手順。このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加に起因して、サイズ排除-高速液体クロマトグラフィーSE-HPLC上において、HACAが結合しているFl標識化インフリキシマブIFX複合体に、遊離のFl標識化IFXに比して、移動度のシフトが生じることに基づく。クロマトグラフィーを、Agilent-1200HPLCシステム中で、5,000~700,000の分子量分画範囲を有するBio-Sepの300×7.8mmのSEC-3000カラムPhenomenex、及び1×PBS、pH7.3の移動相を使用して、0.5~1.0mL/分の流速で、FLD検出を用いて実施する。各分析について、100μLの試料体積をカラム上に充填する。HACAが結合しているFl標識化IFX複合体を、SE-HPLC分析の前に、IFX治療患者から得られた血清及びFl標識化IFXを、1×PBS、pH7.4の溶出用緩衝液中、室温で1時間インキュベートすることによって形成する。また、アッセイの妥当性を確認するために、各種の干渉物質、例として、リウマチ因子及びTNF-αの存在下でもアッセイを行った。結果[0202]図11は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のIFX-Flからの、HACAが結合しているIFX-Fl複合体の分離を示す。パネルc及びdに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、21.8分から15.5~19.0分にシフトした。より多くのHACAが反応混合物中に存在するほど、より少ない遊離のIFX-Flがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。図12は、HACAの付加が引き起こした蛍光ピークのシフトの用量反応曲線を示す。本発明者らは、HACA陽性の試料を使用して、1:1000の希釈度の血清を用いて、ピークのシフトを検出することができた。[0203]図13は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のTNFα-Flからの、IFXが結合しているTNFα-Fl複合体の分離を示す。パネルc及びdに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、24分から13~19.5分にシフトした。より多くのIFXが反応混合物中に存在するほど、より少ない遊離のTNFα-Flがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。図14は、IFXの付加が引き起こしたTNFα-Flのピークのシフトの用量反応曲線を示す。付加したIFXに基づくと、検出限界は、血清中において、10ng/mLのIFXである。[0204]細胞架橋アッセイにより測定したHACA陽性患者及びHACA陰性患者から得られた血清試料を試験することによって、本発明の新規の移動度シフトアッセイの妥当性を確認した表2。本発明者らは、このアッセイを使用して、50人の健常な対象及び117人のIFXを用いて治療するIBD患者から得られた血清試料を分析するに至った。50個の健常対象の試料は全て、検出限界を下回るIFXのレベルを有し、一方、患者試料のうち65個は、11.0μg/mlの平均IFX濃度を有する。表3に、細胞架橋アッセイ及び移動度シフトアッセイにより測定した健常な対照及びIFXを用いて治療するIBD患者の血清中のHACAのレベルを示す。細胞架橋アッセイは、移動度シフトアッセイよりも少ないHACA陽性患者を検出し、より多くの偽陰性及びより多くの偽陽性を検出した。[0205]図15は、IFX治療のコースの間のIBD患者における、HACAのレベルとIFX濃度との関係を示す。HACAは、早くもV10第30週に検出することができ、IFX治療の間に一部の患者において増加し続けた。図16は、HACAを、本発明のアッセイを使用して、IFXの存在下で検出することができることを示す。血清中のHACAのより高いレベルは、IFXのより低いレベルと関連があり、この関連性を検出することができるであろう例えば、生物学的利用率の低下。したがって、IFXを用いる治療を継続しながら、HACAを早期に検出することによって、医師及び/又は患者を、他の抗TNF薬に切り換えるか又はIFXの用量を増加させるように導くことができる。[0206]CVパラメータに基づくアッセイ内及びアッセイ間の正確さ、並びに干渉物質に対する感受性の観点から、アッセイの妥当性を確認した。この分析を、以下の表に示す。結論[0207]抗TNFα生物学的薬物は、蛍光物質Flを用いて容易に標識することができ、HACA/HAHAを測定するために使用する移動度シフトアッセイフォーマットは、均一アッセイであり、典型的なELISAとは異なり、抗原による固体表面の被覆も、複数回の洗浄のステップ及びインキュベーションのステップもない。Fl標識化IFXをHACA陽性血清とインキュベートすると、免疫複合体が形成され、この免疫複合体は、SE-HPLCにおいて、遊離のFl標識化IFXと比較して、異なる位置に溶出し、したがって、HACAの量を定量化することができる。他の血清成分の存在は、移動度シフトアッセイに対して作用をほとんど示さない。移動度シフトアッセイフォーマットは、ELISAとは異なり、無関係のIgGの非特異的結合の影響を受けず、IgG4アイソタイプを検出する。健常血清試料は、Fl標識化IFXの移動度のシフトを引き起こさず、IFXを用いて治療する患者の28.2がHACAを有することが本発明のアッセイにより見出された。したがって、本明細書に記載するアッセイフォーマットは、非常に感度が高く、患者血清中の全ての生物学的薬物例えば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア並びにそれらの抗体例えば、抗レミケード、抗ヒュミラ、抗エンブレル及び抗シムジアを検出するために適用することができる。とりわけ、HACAを、本発明の移動度シフトアッセイを使用して、IFXの存在下で検出することができるので、IFXを用いる治療を継続しながら、HACAを早期に検出することによって、医師及び/又は患者を、他の抗TNF薬に切り換えるか又はIFXの今後の用量を増加させるように導くことができる。[0208]本発明者らは、新規の非放射標識性、液相、SE-HPLCアッセイを開発して、IFXを用いて治療する患者から得られた血清試料中のIFX及びHACAのレベルを測定するに至った。新規アッセイは、高い感度、精度及び正確さを有し、結果には、高い再現性があり、これらのことは、このアッセイを多数のヒト血清試料の日常的な試験に適したものにする。新しいアッセイフォーマットは、ELISAとは異なり、抗原による固体表面の被覆を排除し、無関係のIgGの非特異的結合の影響を受けない。本明細書に記載するアッセイフォーマットのこれらの利点は、試験の偽陰性及び偽陽性の結果を低下させる。好都合なことに、本発明のアッセイフォーマットは、非常に感度が高く、患者の療法を継続しながら、血清中に存在する全ての生物学的薬物及びそれらの抗体を検出するために使用することができる。実施例4.新規の移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中の中和ヒト抗キメラ抗体HACAと非中和ヒト抗キメラ抗体HACAとの間の区別。[0209]この実施例は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、蛍光標識化TNFαの存在下で、蛍光標識化抗TNFα薬に対する、自己抗体例えば、HACAの結合を検出して、患者試料例えば、血清中のこれらの自己抗体の濃度を測定するため、及びそのような自己抗体が中和自己抗体であるか又は非中和自己抗体であるかを決定するための新規の均一アッセイを示す。これらのアッセイは好都合である。その理由は、当該アッセイが、低い親和性のHACAを除去する洗浄のステップの必要性をなくすこと、可視スペクトル及び/又はIRスペクトル上における検出を可能にし、それにより、バックグラウンド及び血清の干渉の問題を減少させる、明確に異なる蛍光物質を使用すること、蛍光標識検出の高い感度により、低い力価を有する患者において中和HACA又は非中和HACAを検出する能力を増加させること、並びに液相反応として行われ、それにより、固体表面、例として、ELISA用プレートにつながることによってエピトープが変化する機会が低下することによる。[0210]例示的な一実施形態では、抗TNFα薬例えば、レミケード商標を、蛍光物質F1を用いて標識し例えば、図17Aを参照されたい、蛍光物質は、可視スペクトル及びIRスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができる。同様に、TNFαも、蛍光物質F2を用いて標識し例えば、図17Aを参照されたい、この蛍光物質もまた、可視スペクトル及びIRスペクトルのいずれか又は両方上で検出することができ、F1とF2とは、異なる蛍光物質である。標識化抗TNFα薬を、液相反応中でヒト血清と共にインキュベートし、標識化TNFαを反応に添加して、血清中に存在する標識化抗TNFα薬、標識化TNFα及び/又はHACAの間で複合体すなわち、免疫複合体を形成させる。インキュベーションに続いて、試料を、サイズ排除カラム上に直接充填する。自己抗体例えば、HACA及び標識化TNFαの両方の、標識化抗TNFα薬に対する結合により、自己抗体と標識化抗TNFα薬との間の二成分複合体例えば、図17Aの免疫複合体2、標識化薬物単独又は標識化TNFα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる例えば、図17Aの免疫複合体1。自己抗体例えば、HACAと標識化TNFαと標識化抗TNFα薬との、この三成分複合体の存在は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体例えば、HACAの非中和形態であり、したがって、自己抗体は、抗TNFα抗体とTNFαとの間の結合を妨げないことを示している。1つの特定の実施形態では、図17Aに示すように、非中和HACAが血清中に存在する場合には、F1-レミケード商標及びF2-TNFαの両方について、シフトを観察し、結果として、免疫複合体1のピーク及び免疫複合体2のピークの両方の増加、並びに遊離のF1-レミケード商標のピーク及び遊離のF2-TNFαのピークの減少が生じる。しかし、自己抗体例えば、HACAと標識化TNFαと標識化抗TNFα薬との三成分複合体の不在下における、自己抗体例えば、HACAと標識化抗TNFα薬との間の二成分複合体の存在例えば、図17Bの免疫複合体2は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体例えば、HACAの中和形態であり、したがって、自己抗体は、抗TNFα抗体とTNFαとの間の結合を妨げることを示している。1つの特定の実施形態では、図17Bに示すように、中和HACAが血清中に存在する場合には、F1-レミケード商標について、シフトを観察し、結果として、免疫複合体2のピークの増加、遊離のF1-レミケード商標のピークの減少が生じ、遊離のF2-TNFαのピークには変化が生じない。特定の場合には、中和HACAの存在が、レミケード商標を用いる現在の療法を、別の抗TNFα薬、例として、ヒュミラ商標に切り換えるべきであることを示している。[0211]代替の実施形態では、最初に、標識化抗TNFα薬を、液相反応中でヒト血清と共にインキュベートして、標識化抗TNFα薬と血清中に存在するHACAとの間で複合体すなわち、免疫複合体を形成させる。インキュベーションに続いて、試料を、第1のサイズ排除カラム上に直接充填する。標識化抗TNFα薬に対する自己抗体例えば、HACAの結合により、標識化薬物単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる例えば、図18の免疫複合体2。次いで、標識化TNFαを反応に添加して、標識化TNFαが、標識化抗TNFα薬に対する結合について、自己抗体例えば、HACAに置き換わり例えば、自己抗体例えば、HACAと競合し、それにより、標識化抗TNFα薬と標識化TNFαとの間で複合体すなわち、免疫複合体を形成することが可能であるかどうかを決定する。インキュベーションに続いて、試料を、第2のサイズ排除カラム上に直接充填する。標識化TNFαに対する標識化抗TNFα薬の結合により、標識化TNFα単独と比較して、ピークの左方向へのシフトが生じる例えば、図18の免疫複合体3。標識化TNFαの添加による、自己抗体例えば、HACAと標識化抗TNFα薬との間の結合の破壊は、血清試料中に存在する自己抗体が、自己抗体例えば、HACAの中和形態であり、したがって、自己抗体が、抗TNFα抗体とTNFαとの間の結合を妨げることを示している。特定の場合には、中和HACAの存在が、レミケード商標を用いる現在の療法を、別の抗TNFα薬、例として、ヒュミラ商標に切り換えるべきであることを示している。実施例5.新規の均一移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のアダリムマブに対するヒト抗薬物抗体ADAの分析。[0212]背景及び目的:TNF-αに対するモノクローナル抗体、例として、インフリキシマブIFX、アダリムマブヒュミラ商標及びセルトリズマブが、炎症性腸疾患IBD及び他の炎症性障害を治療するのに有効であることが示されている。抗薬物抗体ADAは、薬物の有効性を低下させる可能性及び/又は有害作用を引き起こす可能性がある。しかし、ADAが、キメラ抗体インフリキシマブを用いて治療する患者においてのみならず、また、ヒト化抗体アダリムマブを用いて治療する患者においても見出されている。個々の患者においてADA及び薬物のレベルをモニターすることによって、患者の治療及び患者への投与を最適化するのを支援することができる。本発明者らは、非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを開発して、患者から得られた血清中のHACAヒト抗キメラ抗体及びIFXの両方を正確に測定するに至った。このアッセイの方法は、HACAを検出するための現在の固相アッセイの主要な制限、すなわち、血行中のIFXの存在下でHACAを正確に検出し得ないことを克服する。本研究において、本発明者らは、ヒト化抗体薬物のアダリムマブを用いて治療する患者においてADA及び薬物の血清レベルを測定するための、この新しい方法を評価するに至った。[0213]方法:移動度シフトアッセイは、サイズ排除による分離の際に、遊離の抗原の保持時間が、抗原-抗体の免疫複合体に比してシフトすることに基づく。蛍光物質標識化アダリムマブ又は蛍光物質標識化TNF-α、及び内部対照を、血清試料と混合して、ADA又は薬物の存在下で、遊離のアダリムマブ及び遊離のTNF-αの移動度のシフトを測定した。遊離のアダリムマブ又は遊離のTNF-αの、内部対照に対する比の変化が、免疫複合体形成の指標となる。異なる濃度の抗ヒトIgG抗体又は精製アダリムマブと共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、ADA又はアダリムマブの血清濃度を決定した。本発明者らは、移動度シフトアッセイを使用して、応答を失ってしまった、アダリムマブを用いて治療するIBD患者から収集した血清中のアダリムマブ及びADAのレベルを測定した。[0214]結果:標識化アダリムマブの移動度のシフトの測定のために、用量反応曲線を、抗ヒトIgG抗体に関して生成した。アッセイの検出限界は、1ngの抗ヒトIgGであった。50人の健常な対照から得られた血清を、ADAについて試験し、全ての試料が、検出限界を下回るADAのレベルを有したすなわち、遊離の標識化アダリムマブのシフトは生じなかった。また、外から添加したアダリムマブの存在下でも、ADAの検出を実証した。本発明者らは、アダリムマブを用いて治療する患者において薬物濃度を測定するために、標識化TNF-αの移動度のシフトに関して、異なる量のアダリムマブを用いて、検量線を生成し、アダリムマブの検出限界は、10ngであった。[0215]結論:本発明の非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを適用して、アダリムマブを用いて治療する患者から得られた血清試料中のADA及びアダリムマブのレベルを測定するに至った。アッセイは、再現性があり、高い感度及び精度を有することが見出され、アダリムマブを用いて治療する患者から得られた血清試料中のADAのレベルを評価するために使用することができる。実施例6.新規の独占所有権のある移動度シフトアッセイを使用する、患者血清中のアダリムマブに対する抗薬物抗体ADAの分析。要約[0216]背景:抗TNF-α薬、例として、インフリキシマブIFX及びアダリムマブADLが、炎症性腸疾患IBDを治療するのに有効であることが示されている。しかし、治療患者においてADAが誘導されると、薬物の有効性が低下する可能性及び/又は有害作用が生じる可能性がある。実際に、ADAが、IFXを用いて治療する患者においてのみならず、また、ADLを用いて治療する患者においても見出されている。個々の患者においてADA及び薬物のレベルをモニターすることによって、患者の治療及び患者への投与を最適化するのを支援することができる。本発明者らは、独占所有権のある移動度シフトアッセイを開発して、IFX治療患者から得られた血清中のHACAヒト抗キメラ抗体及びIFXの両方を正確に測定するに至った。このアッセイは、HACAを検出するための現在の固相アッセイの主要な制限、すなわち、血行中のIFXの存在下でHACAを正確に検出し得ないことを克服する。本研究において、本発明者らは、完全ヒト抗体薬物のADLを用いて治療する患者においてADA及び薬物の血清レベルを測定するための、この新しいアッセイを評価するに至った。[0217]方法:移動度シフトアッセイは、サイズ排除クロマトグラフィー上において、抗原-抗体の免疫複合体の保持時間が、遊離の抗原に比してシフトすることに基づく。蛍光物質標識化ADL又は蛍光物質標識化TNF-α、及び内部対照を、血清試料と混合して、ADA又は薬物の存在下で、標識化ADL及び標識化TNF-αの移動度のシフトを測定した。遊離のADL又は遊離のTNF-αの、内部対照に対する比の変化が、免疫複合体形成の指標となる。異なる濃度の抗ヒトIgG抗体又は精製ADLと共にインキュベートすることによって生成した検量線を用いて、ADA又はADLの血清濃度を決定した。本発明者らは、このアッセイを使用して、ADLを用いて治療するIBD患者から収集した血清中のADL及びADAのレベルを測定した。[0218]結果:標識化ADLの移動度のシフトの測定のために、用量反応曲線を、抗ヒトIgG抗体に関して生成した。アッセイの検出限界は、10ngの抗ヒトIgGであった。100人の健常な対照から得られた血清を、ADAについて試験し、全ての試料が、検出限界を下回るADAのレベルを有した遊離の標識化ADLのシフトは生じなかった。ADLを用いて治療するIBD患者の試料114個のうち5つにおいて、ADAの検出が実証された。本発明者らは、ADLを用いて治療する患者において薬物濃度を測定するために、標識化TNF-αのシフトに関して、異なる量のADLを用いて、検量線を生成し、検出限界は、10ngであった。[0219]結論:本発明者らは、本発明者らの独占所有権のある、非放射性、標識化、液相、均一移動度シフトアッセイを適用して、ADLを用いて治療する患者から得られた血清中のADA及びADLのレベルを測定するに至った。アッセイは、再現性があり、高い感度及び精度を有し、ADLを用いて治療する患者から得られた血清試料中のADAのレベルを評価するのに有用である。序論[0220]抗腫瘍壊死因子-αTNF-α生物学的製剤、例として、インフリキシマブIFX、エタネルセプト、アダリムマブADL及びセルトリズマブペゴルは、クローン病CD及び関節リウマチRAを含めた、いくつかの自己免疫疾患において、疾患活性を低下させることが示されている。しかし、患者の中には、抗TNF-α療法に応答しないものもおり、一方、十分な応答を欠くことに起因して、より高い投与量若しくはより頻繁な投与を必要とするもの、又は注入に対する反応を発生させるものもいる。[0221]患者に、薬物に対する抗体を発生させる、治療用抗体の免疫原性が、治療の不成功及び注入に対する反応に寄与する可能性がある。IFXのようなキメラ抗体には、完全ヒト化抗体、例として、ADLと比較して、抗体生成を誘導する、より高い可能性がある。RA患者におけるIFXに対する抗体HACAの発生率は、12から44まで変化し、患者血清中のIFXのレベル及び治療応答に反比例するようである。完全ヒト化のADLは、マウス抗体又はキメラ抗体よりも免疫原性が低いことが想定されるが、いくつかの研究は、ヒト抗ヒト化抗体HAHAの形成を報告しており、RA患者及びCD患者における抗体生成の発生率が1~87であることを示しているAikawaら、ImmunogenicityofAnti-TNF-alphaagentsinautoimmunediseases、Clin.Rev.AllergyImmunol.、382~3:82~9頁2010。[0222]1つの抗TNF-α薬に対して続発性の応答不全を示す多く患者が、別の抗TNF-α薬に切り換えること、又は投与及び/若しくは投与頻度を増加させることから利益を得る場合がある。したがって、薬物投与を、個々の患者に合わせて手直しすることができるように、患者を薬物及び抗薬物抗体ADAのレベルについてモニターすることが正当化される。ADAのレベルが存在する場合、このアプローチにより、正当化されるならば、用量の調節が、又は投薬の中断が可能になる。Bendtzenら、Individualmedicineininflammatoryboweldisease:monitoringbioavailability,pharmacokineticsandimmunogenicityofanti-tumournecrosisfactor-alphaantibodies、Scand.J.Gastroenterol.、447:774~81頁2009;Afifら、Clinicalutilityofmeasuringinfliximabandhumananti-chimericantibodyconcentrationsinpatientswithinflammatoryboweldisease、Am.J.Gastroenterol.、1055:1133~9頁2010。[0223]いくつかのアッセイが、HACA及びHAHAを測定するために開発されている。現在の方法の制限のうちの1つが、血行中に高いレベルの薬物がある場合には、ADAのレベルを確実には測定することができないことである。[0224]本発明者らは、ADLを用いて治療する患者から得られた血清中のADA及びADLのレベルを測定するための、独占所有権のある、非放射標識性、液相、移動度シフトアッセイを開発するに至り、このアッセイは、血清中の薬物の存在の影響を受けない。方法[0225]蛍光物質Fl標識化ADLを、患者血清と共にインキュベートして、免疫複合体を形成させた。Fl標識化小型ペプチドを、各反応中に、内部対照として含めた。異なる量の抗ヒトIgGを使用し、検量線を生成して、ADAの血清レベルを決定した。遊離のFl標識化ADLを、抗体が結合している複合体から、分子量に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。各試料から得られた遊離のFl標識化ADLの内部対照に対する比を使用して、検量線からHAHA濃度を推定した。類似の方法を使用して、Fl標識化TNF-αを加えた患者血清試料中のADLのレベルを測定した。結果[0226]図19は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のFl-ADLからの、抗ヒトIgGが結合しているFl-ADL複合体の分離を示す。パネルc~hに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、10.1分から7.3~9.5分にシフトした。反応混合物中に、より多くの抗ヒトIgGを添加するほど、より少ない遊離のADLがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成されるh~c。内部対照についての保持時間は、13.5分である。[0227]図20は、抗ヒトIgGの添加が引き起こす蛍光ピークのシフトの用量反応曲線を示す。抗ヒトIgGの濃度が増加すると、免疫複合体の形成に起因して、遊離のADLの内部対照に対する比は低下する。アッセイの感度は、10ng/mlの抗ヒトIgGである。内部対照Fl-BioCytは、緑色蛍光アレクサフルオール登録商標488蛍光物質を、ビオチン及びアルデヒドで固定可能な一級アミンリジンと組み合わせる、アレクサフルオール登録商標488-ビオサイチンBioCytInvitrogenCorp.;Carlsbad、CAに対応する。[0228]図21は、高分子量の複合体の移動度のシフトに起因する、遊離のTNF-α-Flからの、ADLが結合しているTNF-α-Fl複合体の分離を示す。パネルc及びjに見られるように、蛍光ピークの保持時間が、11.9分から6.5~10.5分にシフトした。反応混合物中に、より多くのADLを添加するほど、より少ない遊離のTNF-α-Flのピークがクロマトグラム中に留まり、より多くの免疫複合体が形成される。[0229]図22は、ADLの添加が引き起こすTNF-α-Flのピークのシフトの用量反応曲線を示す。添加したADLに基づくと、検出限界は、血清中では10ng/mLのADLである。[0230]表4は、100人の健常な対象及び114人のADLを用いて治療するIBD患者から得られた血清試料を、本発明の移動度シフトアッセイを使用して、ADA及びADLのレベルについて分析した場合を示す。100個の健常対象試料は全て、検出限界を下回るADAのレベルを有し遊離のFl-ADLのシフトは生じなかった、一方、114個の患者試料のうち5つは、0.012~>20μg/mlのADA濃度を有した。100個の健常対象試料におけるADLレベルの平均は、0.76±1.0μg/ml0~9.4μg/mlの範囲であった。114個のADLを用いて治療する患者から得られた血清試料におけるADLレベルの平均は、10.817.8μg/ml0~139μg/mlの範囲であった。5つのADA陽性試料のうち4つは、検出不能レベルのADLを有した。結論[0231]HACA/IFXを測定するために使用した移動度シフトアッセイフォーマットは、均一アッセイであり、典型的なELISAとは異なり、抗原による固体表面の被覆も、複数回の洗浄のステップ及びインキュベーションのステップもない。このアッセイを適用して、ADA及び抗TNF薬を測定することができる。患者血清に関するADA及びADLの両方の測定については、μg/mlの範囲にあるアッセイの感度は、mg/mlの範囲にあるELISA法と比較してより高い。健常対照の血清試料は、Fl標識化ADLの移動度のシフトを引き起こさず、このアッセイにより、ADLを用いて治療する患者の4.3がADAを有することが見出された。健常対照の血清試料が、Fl標識化TNF-αの移動度のシフトを引き起こしたが、このシフトは、TNF-αの可溶性の遊離の受容体の存在に起因した可能性があり、ADLを用いて治療する患者におけるADLの平均は、さらにより高かった10.8mg/ml対0.76mg/ml。ADL治療を患者に投与しながら、早期のADAの検出、及びADLの薬物レベルをモニターすることによって、医師が、適切であれば、ADLの投与量を最適化するか又は別の抗TNF-α薬に切り換えるのが可能になり、それにより、患者の疾患の全体的な管理が最適化される。[0232]健常対照の血清試料は、FI標識化ADLの移動度のシフトを引き起こさなかった。予備的研究では、このアッセイにおいて、0.4μg/mlのADLを有する患者の9.52がADAを有することが見出された。正常試料及び患者試料のさらなる評価を、より高い濃度のADL-FIを用いて行う。実施例7.抗TNF薬物療法を最適化するためのコンビナトリアルアルゴリズム。[0233]この実施例は、統計学的アルゴリズム、例えば、統計学的学習分類子システム等を、1つ又は複数例えば、2、3、4、5、6又は7つ以上の組合せの生化学的マーカー、血清学的マーカー及び/又は遺伝学的マーカーに適用することによって、療法を最適化するため、毒性を低下させため、及び/又は治療処置の有効性をモニターするための方法を記載する。したがって、提示する実施例に記載する方法は、例えば、抗TNF薬の今後の用量を調節若しくは改変する例えば、増加若しくは減少させる時期若しくは方法を決定すること、抗TNF薬を例えば、増加させた、減少させた、若しくは同じ用量で、1つ若しくは複数の免疫抑制剤、例として、メトトレキサートMTX若しくはアザチオプリンと組み合わせる時期若しくは方法を決定すること、及び/又は現在の療法のコースを変化させる例えば、異なる抗TNF薬に切り換える時期若しくは方法を決定することによって、抗TNF薬物療法を投与している患者ための治療の決定を導くのに有用な情報を提供する。[0234]非限定的な例として、患者試料例えば、抗TNF薬物療法を受けている患者から得られた血清試料中の、以下のクラスの生化学的マーカー、血清学的マーカー及び/又は遺伝学的マーカーのうちの1、2、3、4、5又は全6つの存在、レベル又は遺伝子型を、検出、測定又は決定することができる:1抗TNF薬のレベル例えば、遊離の抗TNFα治療用抗体のレベル、2抗薬物抗体ADAのレベル例えば、抗TNF薬に対する自己抗体のレベル、3TNFαのレベル、41、2、3、4、5、6又は7つ以上の追加のサイトカイン例えば、IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-10等並びに/又は炎症の他の機構についてのマーカー例えば、炎症性マーカー、例として、CRP、SAA、ICAM-1及び/若しくはVCAM-1のレベル、5炎症経路遺伝子等の1つ又は複数の遺伝学的マーカー中の1つ又は複数の突然変異の存在又は不在、例えば、1つ又は複数の炎症性マーカー中の変異体対立遺伝子例えば、SNP、例えば、NOD2/CARD15例えば、米国特許第7,592,437号に記載されているSNP8、SNP12及び/若しくはSNP13、ATG16L1例えば、Lakatosら、DigestiveandLiverDisease、402008867~873頁に記載されているrs2241880T300ASNP、IL23R例えば、Lakatosらに記載されているrs11209026R381QSNP、例えば、GascheらEur.J.GastroenterologyHepatology200315:599~606頁に記載されているヒト白血球抗原HLA遺伝子並びに/又はサイトカイン遺伝子、さらに、IBD5遺伝子座に属するDLG5及び/又はOCTN遺伝子等の存在又は不在、6複数の時点における例えば、第28週時、第60週時等の上記の生化学的マーカー及び/又は血清学的マーカーのうちの1つ又は複数のレベル、さらに、7それらの組合せ。[0235]次いで、本明細書に記載する単一の統計学的アルゴリズム又は2つ以上の統計学的アルゴリズムの組合せを、試料中の検出、測定又は決定したマーカーの存在、濃度レベル又は遺伝子型に適用して、それにより、抗TNF薬に関して、療法を最適化すること、毒性を低下させること、又は治療処置の有効性をモニターすることができる。したがって、この実施例に記載されている方法は、患者の免疫状態を決定することによって、患者の管理を決定する場合に有用性を見出す。[0236]下記の表6は、正常試料及び患者試料中のサイトカインのレベルの概要を示す。[0237]例証の目的に限って、以下のシナリオにより、どのように本発明の方法が、本明細書の記載に従って、1つ又は複数の生化学的マーカー、血清学的マーカー及び/又は遺伝学的マーカーの存在、レベル及び/又は遺伝子型に基づいて、療法を最適化すること、及び毒性例えば、副作用を最小限に留めるか又は低下させることを好都合に可能にするかを実証する。以下のシナリオのそれぞれにおいて、次いで、1又は2つ以上の統計学的アルゴリズムを適用して、療法を最適化すること、及び/又は抗TNF薬と関連がある毒性を低下させることができる。シナリオ番号1:低いレベルの抗薬物抗体ADA及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、高いレベルの抗TNF薬。[0238]薬物レベル=10~50ng/10μl;ADAレベル=0.1~2ng/10μl;TNFαレベル=1~8pg/ml;IL-6レベル=0.1~3pg/ml;IL-1βレベル=0.0~2pg/ml;IFN-γレベル=0~6pg/ml;IL-10に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診10V10の際に患者BAB及びJAAから得られた試料を含む。図16bを参照されたい。[0239]抗TNF薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、抗TNF薬例えば、インフリキシマブと併せて、アザチオプリンのような免疫抑制薬を用いて治療すべきである。シナリオ番号2:低いレベルのADA及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルの抗TNF薬。[0240]薬物レベル=5~20ng/10μl;ADAレベル=0.1~2ng/10μl;TNFαレベル=1~8pg/ml;IL-6レベル=0.1~3pg/ml;IL-1βレベル=0.0~2pg/ml;IFN-γレベル=0~6pg/ml;IL-10に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診10V10の際に患者DGO、JAG及びJJHから得られた試料を含む。図16bを参照されたい。[0241]抗TNF薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、より高い用量の抗TNF薬例えば、インフリキシマブと併せて、アザチオプリンのような免疫抑制薬を用いて治療すべきである。当業者であれば、現在の療法のコースを調節することができ、したがって、薬物療法を最適化する適切なより高い又はより低い用量、例えば、現在の用量よりも、少なくとも約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50又は100倍高い又は低い今後の用量が分かるであろう。シナリオ番号3:中位レベルのADA及び低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルの抗TNF薬。[0242]薬物レベル=5~20ng/10μl;ADAレベル=0.5~10ng/10μl;TNFαレベル=1~8pg/ml;IL-6レベル=0.1~3pg/ml;IL-1βレベル=0.0~2pg/ml;IFN-γレベル=0~6pg/ml;IL-10に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、来診10V10の際に患者JMMから得られた試料、及び来診14V14の際に患者J-Lから得られた試料を含む。図16bを参照されたい。[0243]抗TNF薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療すべきである。非限定的な例として、インフリキシマブIFX療法を受けており、低いレベルの炎症性サイトカインを伴う、中位レベルのIFX及びADAすなわち、HACAを有する患者は、アダリムマブヒュミラ商標を用いる療法に切り換えるべきである。シナリオ番号4:高いレベルのADA及び高いレベルの炎症性サイトカインを伴う、低いレベルの抗TNF薬。[0244]薬物レベル:0~5ng/10μl;ADAレベル=3.0~50ng/10μl;TNFαレベル=10~60pg/ml;IL-6レベル=0.1~50pg/ml;IL-1βレベル=0.0~366pg/ml;IFN-γレベル=0.15~100pg/ml;IL-10に対する抗体、検出されない。このマーカープロファイルを有する患者試料は、図16bの来診14V14の際に全ての患者から得られた試料を含む。[0245]抗TNF薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療すべきである。非限定的な例として、インフリキシマブIFX療法を受けており、高いレベルのADAすなわち、HACA及び炎症性サイトカインを伴う、低いレベルのIFXを有する患者は、アダリムマブヒュミラ商標を用いる療法に切り換えるべきである。シナリオ番号5:高いレベルの炎症性サイトカイン。[0246]高いTNFαレベル例えば、10~60pg/ml;高いIL-6レベル例えば、0.1~50pg/ml;高いIL-1βレベル例えば、0.0~366pg/ml;高いIFN-γレベル例えば、0.15~100pg/ml;高いレベルの他の炎症性分子;±の抗炎症性サイトカインに対する抗体例えば、IL-10に対する抗体、検出される又は検出されないのいずれか。[0247]抗TNF薬物療法を投与しており、この特定のマーカープロファイルを有する患者は、異なる薬物を用いて治療する、又はより高い用量の抗TNF薬と併せて、メトトレキサートMTX若しくはアザチオプリンAZAのような免疫抑制薬を用いて治療するのいずれかとすべきである。特に、インフリキシマブIFX療法を受けている患者から得られた高いレベルの炎症性サイトカインの、このマーカープロファイルは、現在の療法のコースが働いていないことを示しており、患者は、アダリムマブヒュミラ商標を用いる療法に切り換えるべきであるか、又はより高い用量のIFXと併せて、1つ若しくは複数の免疫抑制薬を用いて治療すべきである。実施例8.異なる抗薬物抗体ADAアイソタイプの決定。[0248]この実施例は、抗TNF薬物療法を投与しているADA陽性患者における異なる抗薬物抗体ADAアイソタイプの決定を記載する。抗体アイソタイプの非限定的な例として、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが挙げられる。特定の態様では、特異的なADAアイソタイプ又はADAアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルの検出が、異なる臨床転帰と関連がある。[0249]図23は、HACA陽性患者の血清中の異なるADAアイソタイプの溶出時間を示す。特定の実施形態では、ADAが、サイズ及び適切な希釈実験に基づいて、IgMアイソタイプ保持時間:約6.5~7.5分、IgAアイソタイプ7.5~8.5分、又はIgGアイソタイプ8.5~9.5分かどうかに基づいて、抗TNF薬物療法の治療の影響を決定することができる。標識化抗TNF薬、例として、ヒュミラ及びレミケードについての保持時間は、約10.8分であり、内部対照ICについての保持時間は、約13.5分である。[0250]1つの研究では、200個の患者試料を、本発明の方法に従ってアッセイして、サイズ排除クロマトグラフィーによりADAを検出した。試料1~100は、対照例えば、正常な、健常対照の試料であり、一方、試料101~200は、レミケード療法を投与している患者から得られ、細胞架橋アッセイによりHACA陽性であった。シグナルの強度Y軸対溶出時間X軸の未調節のプロットを、200個の試料全てについて生成する。次いで、以下の3つの調節をプロットに対して行った:1Y低いを左のベースラインに標準化し、2Y高いを右の対照のピークに標準化し、及び3Xを右の対照のピークに標準化した。[0251]200個の試料全てから得られたデータを、100個の対照試料と100個のHACA陽性試料とに分け、次いで、平均した。図24は、対照試料の平均のプロットを示す。図25は、陽性試料の平均のプロットを示す。とりわけ、図24及び25のプロットの比較により、標識化レミケードについてのシグナル強度主要ピークの減少、並びにHACAIgAAピーク及びHACAIgGGピークに対応する、2つの明確に異なるADAアイソタイプのピークの出現が示される。[0252]図26は、100個の対照試料及び100個の陽性試料について、主要ピークのシグナルすなわち、標識化レミケードのシグナル強度に対応するを並べて比較して示す。示す値は、9.71~12.23分の溶出時間から得られた平均値である。特に、図26は、100個のHACA陽性試料については、標識化レミケードについてのシグナル強度が減少することを示し、この減少は、標識化レミケードとHACAとの間の複合体の形成と相関する。また、図26は、低い主要ピークのシグナル例えば、X軸上の0と0.2との間により証明されるように、いくつかの陽性試料が、高いレベルのHACAを有したことも示す。図27は、図26から得られた主要ピークのデータについての受信者操作特性ROC曲線を示す。曲線下面積AUCは、0.986であった。[0253]次に、主要ピーク対他のピークIgG、IgA及びIgMの和について、平均値をプロットした。図28は、100個のHACA陽性試料について、X軸上の非主要ピークこれらは、IgGピーク、IgAピーク及びIgMピークの和に相当する対Y軸上の主要ピークのプロットを示す。このプロットにおいて示される直線関係を使用して、アッセイを点検することができるすなわち、アッセイの制御。図29は、200個の試料全てについての、IgGピーク対IgAピーク対IgMピークのプロットを示す。実施例9.異なるADAアイソタイプの、近接性に基づく決定。[0254]この実施例は、抗TNFα薬物療法、例として、インフリキシマブIFXを投与しているADA陽性患者における、異なる抗薬物抗体ADAアイソタイプ、例として、ATIすなわち、IFXに対する抗体;HACAの異なるアイソタイプの決定のための、本発明の例示的な実施形態を記載する。ATIアイソタイプ等の抗体アイソタイプの非限定的な例として、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM例えば、IgAATI、IgDATI、IgEATI、IgGATI、及びIgMATIが挙げられる。特定の態様では、特異的なADAアイソタイプ又はADAアイソタイプの特定の組合せの存在又はレベルの検出が、異なる臨床転帰と関連がある。[0255]図30及び31は、蛍光共鳴エネルギー移動FRETを使用して、少なくとも1、2、3、4又は5つ以上のATIアイソタイプ、例えば、IgAATI、IgDATI、IgEATI、IgGATI及び/又はIgMATIのアイソタイプ等の存在若しくは不在又はレベルを決定するための、本発明の近接性に基づくアイソタイピングアッセイの実施形態を示す。例えば、図30は、アレクサ-532抗Ig抗体、例として、抗IgA上のF2標識が、アレクサ-488抗体治療剤、例として、IFX上のF1標識により、両方の蛍光物質が密接に近接している場合のみに励起され、それにより、抗Ig例えば、抗IgAとHACA例えば、IgAATIとIFXとの三成分複合体の存在及び/又はレベルを示すことを示す概略図を示す。特定の実施形態では、異なるATIアイソタイプ及び/又はそれらのサブクラスを、同じ又は異なる蛍光物質、例えば、アレクサ-532等を用いて標識した異なる抗Igを使用して決定することができる。図31は、FRETに基づく、本発明のアイソタイピングアッセイの結果を示す。[0256]前述の発明を、明確に理解する目的で、例証及び実施例として一部詳細に記載してきたが、当業者であれば、特定の変化形態及び改変形態を、添付の特許請求の範囲内で実行することができることを理解するであろう。さらに、本明細書において提供する参考文献は、各参考文献が個々に参照により組み込まれているのと同じ程度に、それぞれの全体が参照により組み込まれる。サイズ排除HPLCを使用して、TNFα-アレクサ647とヒュミラ商標との間の結合を検出する、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。TNFα-アレクサ647に対するヒュミラ商標の結合の用量反応曲線を示すグラフである。細胞架橋アッセイとして知られている、HACAのレベルを測定するための、ELISAに基づく現在の方法を示す図である。レミケード商標に対して生成したHACA/HAHAの濃度を測定するための、本発明の自己抗体の検出アッセイの例示的な概要を示す図である。レミケード商標-アレクサ647に対する抗ヒトIgG抗体の結合の用量応答分析を示す図である。レミケード商標-アレクサ647に対する抗ヒトIgG抗体の結合の第2の用量応答分析を示す図である。レミケード商標-アレクサ647に対する抗ヒトIgG抗体の結合の用量反応曲線を示すグラフである。正常ヒト血清及びHACA陽性血清中におけるレミケード商標-アレクサ647の免疫複合体形成を示す図である。本発明の細胞架橋アッセイ又は移動度シフトアッセイを使用して実施した、20人の患者の血清試料から得られたHACAの測定の概要を示す表である。HACAの血清濃度を測定するための現在の方法及び本発明の新規のHACAアッセイの概要及び比較を示す表である。正常なNHS又はHACA陽性HPSの血清と共にインキュベートした蛍光物質Fl標識化IFXのSE-HPLCプロファイルを示す図である。移動度シフトアッセイにより決定した場合の、HACA陽性血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のIFX-Flの用量反応曲線を示すグラフである。正常血清NHS又はIFXを加えた血清と共にインキュベートしたTNFα-FlのSE-HPLCプロファイルを示す図である。移動度シフトアッセイにより決定した場合の、IFXを加えた血清の希釈度を増加させて生成した結合している及び遊離のTNFαの用量反応曲線を示す図である。移動度シフトアッセイによる、IFXを用いて治療するIBD患者における相対的なHACAレベル及びIFX濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。患者の管理、すなわち、IFXを用いて治療するIBD患者の血清中のHACAレベル及びIFX濃度の異なる時点の測定を示すグラフである。A非中和自己抗体の存在、又はB中和自己抗体、例として、HACAの存在を検出するための、本発明のアッセイの例示的な実施形態を示す図である。中和自己抗体、例として、HACAの存在を検出するための、本発明のアッセイの代替の実施形態を示す図である。異なる量の抗ヒトIgGの存在下で正常ヒト血清NHSと共にインキュベートしたFl標識化ADLの移動度シフトのプロファイルを示す図である。抗ヒトIgGの、遊離Fl-ADLのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。異なる量のADLの存在下で正常ヒト血清NHSと共にインキュベートしたFl標識化TNF-αの移動度シフトのプロファイルを示す図である。ADLの、遊離TNF-α-Flのシフトに対する用量反応曲線を示すグラフである。HACA陽性患者の血清中の異なるADAアイソタイプの溶出時間を示すグラフである。実施例8に記載の研究において使用した100個の対照試料の平均のプロットを示す図である。実施例8に記載の研究において使用した100個のHACA陽性試料の平均のプロットを示す図である。実施例8に記載の研究において使用した100個の対照試料及び100個のHACA陽性試料について、主要ピークのすなわち、標識化レミケードのシグナル強度に対応するシグナルを並べて比較するグラフである。図26から得られた主要ピークのデータについての受信者操作特性ROC曲線を示すグラフである。実施例8に記載の研究において使用した100個のHACA陽性試料について、X軸上の非主要ピークこれらは、IgGピーク、IgAピーク及びIgMピークの和に相当する対Y軸上の主要ピークのプロットを示すグラフである。実施例8に記載の研究において使用した200個の試料全てについての、IgGピーク対IgAピーク対IgMピークのプロットを示すグラフである。本発明の蛍光共鳴エネルギー移動FRETによる自己抗体アイソタイピングアッセイのフォーマットを示す概略図である。FRETに基づく、本発明の自己抗体アイソタイピングアッセイの結果を示すグラフである。"