"被験体における糖尿病状態の処置又は予防のための方法であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを被験体に投与する工程を含む、方法。前記糖尿病状態が、糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患である、請求項2記載の方法。前記シアル酸前駆体が、構造を有し、式中:Aは、CH2又はNHであり;B、C、D及びEは、それぞれ独立して、H、OH、X、O-CO-X又はO-X式中、Xは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり,各B基、C基及びD基に関して、Xは、独立して選択されるからなる群より選択され;Gは、H、OH、Y又はO-Y式中、Yは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであるである、請求項1記載の方法。前記シアル酸前駆体が、構造を有する、請求項1記載の方法。X及びYが、それぞれ独立して、C1~C5アルキルである、請求項3記載の方法。前記シアル酸前駆体が、Bu4ManNAc、3,4,6-O-Bu3ManNAc、1,3,4-O-Bu3ManNAc、N-レブリノイルシアル酸又はN-レブリノイルマンノサミンである、請求項3記載の方法。前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項1記載の方法。前記投与が、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項1記載の方法。前記ポリペプチドがAngptl4である、請求項8記載の方法。被験体におけるネフローゼ症候群の処置又は予防のための方法であって、シアル酸、シアル酸前駆体又はこれらの組み合わせを被験体に投与する工程を含む、方法。ネフローゼ症候群が、微小変化型疾患、巣状分節状糸球体硬化症、膜性腎症/膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎又は糖尿病性腎症と特徴付けられる、請求項10記載の方法。前記シアル酸前駆体が、構造を有し、式中:Aは、CH2又はNHであり;B、C、D及びEは、それぞれ独立して、H、OH、X、O-CO-X又はO-X式中、Xは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであり,各B基、C基及びD基に関して、Xは、独立して選択されるからなる群より選択され;Gは、H、OH、Y又はO-Y式中、Yは、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルであるである、請求項10記載の方法。前記シアル酸前駆体が、構造を有する、請求項10記載の方法。X及びYが、それぞれ独立して、C1~C5アルキルである、請求項12記載の方法。前記シアル酸前駆体が、Bu4ManNAc、3,4,6-O-Bu3ManNAc、1,3,4-O-Bu3ManNAc、N-レブリノイルシアル酸又はN-レブリノイルマンノサミンである、請求項12記載の方法。前記シアル酸化合物が治療有効量で投与される、請求項10記載の方法。前記投与が、浮腫を軽減するか、タンパク尿を減少させるか、血漿アルブミンレベルを増加させるか、高コレステロール血症を軽減するか、高トリグリセリド血症を軽減するか、又はこれらの組み合わせである、請求項10記載の方法。前記投与が、ネフローゼ症候群の病因に関与するポリペプチドのシアリル化を回復させる、請求項10記載の方法。前記ポリペプチドがAngptl4である、請求項18記載の方法。ネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関して被験体の状態を決定するための方法であって、被験体におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、前記シアリル化のレベルを対照におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、被験体におけるシアリル化のレベルが対照におけるシアリル化のレベルよりも低い場合に、被験体がネフローゼ症候群若しくは糖尿病状態に罹患しているか、又はそのリスクがあると決定する工程を含む、方法。前記ポリペプチドがAngptl4である、請求項24記載の方法。ネフローゼ症候群又は糖尿病状態の処置を受けている被験体における処置の有効性を決定するための方法であって、被験体におけるネフローゼ症候群又は糖尿病状態に関連するポリペプチドのシアリル化のレベルを決定する工程、前記シアリル化のレベルを、対照におけるシアリル化のレベル又は処置を開始する前の被験体におけるシアリル化のレベルと比較する工程、及び、被験体におけるシアリル化のレベルが対照におけるシアリル化のレベルと同じか、若しくは近い場合に、又は、被験体におけるシアリル化のレベルが、処置を開始する前に決定した被験体におけるシアリル化のレベルと比較して、増加している場合に、処置が有効であると決定する工程。前記ポリペプチドがAngptl4である、請求項26記載の方法。実施例以下の結果において、使用した方法は、本開示の方法セクション及びそこで引用した参考文献に詳述されている方法であった。実験的なヒト糸球体疾患における有足細胞Angptl4発現のアップレギュレーションAngptl4mRNA発現は、ラット糸球体において、NTSの注射後24時間の、相補的かつ白血球非依存性異種期タンパク尿のピーク時に、アップレギュレーション70倍している図lA及び1B。Angptl4-/-マウスへのNTSの注射は、タンパク尿図1Cの有意な減少及び足突起の消失図1Dを引き起こしたが、これは、糸球体疾患におけるAngptl4の重要な役割を示唆している。正常なラット糸球体は、有足細胞タンパク質CD2APと共局在した毛細血管ループパターンでAngptl4を発現している図1E。さらなる研究により、幼若ラットにおいて、単回用量のピューロマイシンアミノヌクレオシドPANモデルを静脈内注射した後に、早期3日目、すなわちタンパク尿の発症前かつプログレッシブなAngptl4mRNA発現がアップレギュレーションされることが明らかになり図1F、insituハイブリダイゼーションにより、近位尿細管シグナルが同時に変化することなく、末梢毛細血管ループパターンでアップレギュレーションされることを確認したデータは示さず。受動ハイマン腎炎において、タンパク尿の発症後に、Angptl4発現がわずかに増加し始めることが認められた図1F。対照的に、Angptl4mRNA発現は、抗Thy1.1腎炎で、又は、虚脱型巣状分節状糸球体硬化症18を有する患者に由来する血清を注射することによってラットで誘導した虚脱型巣状分節状糸球体硬化症で変化しなかった図1F。Angptl4タンパク質発現は、PANの誘導後に、有足細胞で劇的に増加しており図1G、免疫金電子顕微鏡法EMにより、糸球体基底膜GBMとかなりオーバーラップしていることを確認した図1H。グルココルチコイド感受性MCDを有する患者、並びに、年齢及び性別適合コントロールからの生検図1Iにより、コントロールの腎臓生検におけるかすかな有足細胞パターン、及び、有足細胞における発現の増加と、それに伴うGBMとのさらなるオーバーラップ及び内皮周辺との斑点状のオーバーラップが明らかになった。Angptl4の有足細胞特異的過剰発現は、選択的なタンパク尿及び有足細胞の足突起の消失をもたらす有足細胞特異的Angptl4過剰発現のためのトランスジェニックラットモデルを開発し、図2Aに示すNPHS2-Angptl4TG。Angptl4を通常発現している臓器におけるmRNA発現の分析により、発現の特異性を確認した図2B。3月齢ヘテロ接合体雄性NPHS2-Angptl4TGラットの組織学的評価により、突起状の有足細胞図2Cを含む糸球体の外見が光学顕微鏡検査では正常であること、及び、共焦点画像により有足細胞のAngptl4発現が増加していること図2Dが明らかになった。5月齢ホモ接合体及びほぼヘテロ接合体のTGラット図2Eの電子顕微鏡検査により、広範な足突起の消失が明らかになった。ホモ接合体TGラットの免疫金EMにより、1~5月齢における、GBMにおけるAngptl4の蓄積と、足突起の消失の漸進的進行との間の相関が明らかになった図2F。両樹立系統のNPHS2-Angptl4TGラットは、重度のアルブミン尿を発症した。雌性ホモ接合体及び雄性ヘテロ接合体ラットは、早ければ1月齢に、アルブミン尿を発症した図3A~3C。時間の経過と共に、雌性ホモ接合体は最大100倍、雄性ヘテロ接合体は最大20倍、そして雄性ホモ接合体は500倍以上増加したアルブミン尿を発症した。雌性ヘテロ接合体は、アルブミン尿症ではなかった。90以上の尿タンパク質は、インタクトなアルブミンを含み図3D、それによって、これらのラットは、選択的なタンパク尿の最初のモデルとなる。導入遺伝子発現タンパク質を特異的に検出するために、抗V5抗体を使用して免疫金EMを行ったところ、NPHS2-Angptl4TGラットの有足細胞及びGBMにおいて、金粒子が認められた図3E。PANの注射後、有足細胞により分泌されたAngptl4のタンパク尿促進作用を維持すると、NPHS2-Angptl4TGラットは、野生型同腹子よりもタンパク尿を発症した図3F。血圧は、野生型コントロールと比較して、タンパク尿ヘテロ接合体NPHS2-Angptl4ラットにおいて、有意に低かったデータは示さず。以前にも公開したように20、PANにおけるタンパク尿は、6日目において部分的にグルココルチコイド感受性であり図3G、このグルココルチコイド感受性のいくつかは、Angptl4に関連している図3H。有足細胞により分泌されたAngptl4及びリコンビナントAngptl4の特性決定Angptl4は急速に分泌されるので、糸球体タンパク質のウエスタンブロットは、通常、Angptl4産生を過小評価している。コントロール上のパネル、6日目のPANモデル中央のパネル及びグルココルチコイドを同時投与した6日目のPANモデル下のパネルに由来する糸球体において、二次元電気泳動及びウエスタンプロッティング図4Aによって、Angptl4を分析した。二次元ゲル電気泳動において、正常な糸球体におけるほとんどのAngptl4は、中pIでグリコシル化低オリゴマーとして移動したがピンク色矢印;3、グリコシル化されたインタクトな70KDa及び切断型の両方のあまり目立たない部分赤色矢印;1並びに非グリコシル化45KDa単量体型黄色矢印;2も認められた図4A及び4B。PANにおいて、中pIオリゴマーこれは、シアル酸結合レクチンマーキアアムーレンシスMAAと反応する及び高pIオリゴマーこれは、MAA反応性ではないは両方とも、増加していたピンク色矢印、3及びオレンジ色矢印;4図4A及び4B。この増加は、グルココルチコイドとPANで処置したものにおいては鈍かったが、過度に大量の高pIオリゴマーが認められた。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を図4Bに示す。図5Aは、pcDNA-ラットAngptl4-V5-His発現構築物で安定的にトランスフェクションしたHEK293細胞株が、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Angptl4mRNA発現の55,000倍のアップレギュレーションを示したことを示す。P<0.001。図5Bは、Angptl4-HEK293細胞が、無血清条件下で、ほぼインタクトなタンパク質を上清に分泌したことを示す二次元ゲル電気泳動、並びに、免疫前血清及び抗Angptl4抗体を用いたウエスタンブロットによって確認した。Angptl4-HEK293安定細胞株を使用して、Angptl4のシアリル化をinvitro図4Cで研究した。HEK293細胞は、通常、Angptl4ポリペプチドを全く発現しないか、又はわずかに発現している;pcDNA-ラットAngptl4-V5-His発現構築物でトランスフェクションした後に、この細胞株は、コントロールの空ベクター細胞株と比較して、Angptl4mRNA発現の55,000倍のアップレギュレーションを示した図5A。さらに、HEK293-Angptl4細胞株によって発現されたAngptl4ポリペプチドは、通常、この細胞株によって分泌され、低pI末端でわずかに追跡されるMAA反応性であるため図4C上パネル及び上中央パネル、緑色矢印1及び図5B、ほとんど脱シアリル化されている。細胞株をシアル酸前駆体N-アセチル-D-マンノサミンManNAc;図4C、下中央パネル及び下パネルとインキュベーションすると、タンパク質が中pIにシフトし、MAAに対する反応性が増加し青色矢印、2、その結果、シアリル化が増加したが、これは、シアリル化が、Angptl4のディファレンシャル電気泳動において重要な役割を果たすことを示している。PANにおいて、脱シアリル化Angptl4の増加が認められたので、タンパク尿の病因におけるこの脱シアリル化の役割を研究した。図6Aは、漸増用量のManNAcを投与した重度のアルブミン尿ラットを用いたパイロット研究からのアルブミン尿追跡の代表的なものを示す。この研究により、ManNAcが、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。しかしながら、これらのラットにおけるアルブミン尿を減少させるには、多くの用量が必要であった。より効率的かつ直説的な研究を行うために、野生型ラットよりも15~25倍高いアルブミン尿のラットをさらなる分析に使用した。水道水に溶解させたManNAc1mg/mlを投与したNPHS2-Angptl4TGラット図4Dは、ベースラインと比較して、12日間でアルブミン尿が40超減少したのに対して、水道水を投与したコントロールのNPHS2-Angptl4TGラットにおけるアルブミン尿は、研究期間中に2.5倍増加した。図6Bは、ManNAc1mg/mlで処置した試験群のNPHS2-Angptl4TGラットからの個々の追跡を示しており、これにより研究は終了した。これらのラットで時間と共にアルブミン尿の増加が起こったことを確認するために、研究開始前に、12日間とは別に2回採尿した。この研究により、ManNAc1mg/mlが、これらの動物におけるアルブミン尿を減少させたことが明らかになった。12日目図6C及び6Dに安楽死させたラットからの糸球体Angptl4に関するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析により、中pIAngptl4画分が、48.35コントロールのラット~72.91.4ManNAc処置ラット増加したことが示された図6D。中pI画分は、シアル酸結合レクチンサムブクス二ゲラSNAIとも反応したが、これは、ManNAc処置ラットにおけるAngptl4のシアリル化が増加したことを裏付けている図6C。図7は、MCDのモデルであるPANを有するManNAc処置ラットにおけるネフローゼ症候群パラメーターの改善を示す。ピューロマイシンアミノヌクレオシド10mg/100gmをラットn=ラット5匹/群に単回静脈内注射し、4日目これは、タンパク尿の発症と同時であるから、水道水に溶解させたManNAC80mg/Kg体重で処置した。6日目のデータを示す。コントロールのPANラットと比較した場合に、ManNAC処置ラットにおいて、タンパク尿の有意な減少図7A、血漿アルブミンレベルの改善図7B、コレステロールの減少図7C及びトリグリセリドの減少図7Dが認められた。これらのデータは、上記結果と一致している。アルブミン尿などのタンパク尿は、糖尿病などの本明細書において記載される他の疾患で認められている。db/dbマウスを使用して、糖尿病におけるAngptl4の役割も分析した。db/dbは、離乳してすぐの過食症の肥満マウスとして、Jackson研究室で1966年に最初に同定された。糖尿病遺伝子dbは、常染色体劣性遺伝する。db遺伝子は、レプチン受容体のGからTへの点変異これは、脂肪細胞由来のホルモンであるレプチンのスプライシング異常及びシグナル伝達不全の原因となるをコードする。視床下部におけるレプチンシグナル伝達の欠損は、持続性の過食症及び肥満の原因となり、その結果、レプチン及びインスリンレベルが高くなる。いくつかの研究は、アルブミン排泄率が、db/dbマウスにおいて8週齢の初期に8~62倍高いことを立証した。アルブミン尿の範囲は、雄性db/dbマウスにおいて68~303μg/24時間であるのに対して、年齢適合テロ接合体同腹子においては4~21μg/24時間である。図8A~Cは、糖尿病動物におけるタンパク尿に対するManNAc治療の効果を示す。図8Aは、糖尿病db/dbマウス及びコントロールdb/mマウスに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動並びにウエスタンブロット分析を示す。この分析により、糖尿病db/dbマウス糸球体において、Angptl4これは、タンパク尿の病因に関与する高pI脱シアリル化型を含むの発現が増加していることが示された。これらの高pI脱シアリル化型Angptl4は、ManNAc及びManNAc誘導体などのシアル酸前駆体治療に感受性である。図8Bは、Zucker糖尿病肥満ラットに由来する糸球体の二次元ゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析を示す。この分析により、Zucker糖尿病肥満ラット糸球体において、Angptl4これは、タンパク尿の病因に関与する高pI脱シアリル化型を含むの発現が増加していることが示された。これらの高pI脱シアリル化型Angptl4は、ManNAc及びManNAc誘導体などのシアル酸前駆体治療に感受性である。図8Cは、シアル酸前駆体による処置が、このモデルにおけるタンパク尿を減少させたことを示す。図8Cにおいて、13週齢雄性Zucker糖尿病肥満ラットを、水道水に溶解させたManNAc又はプレーンな水道水で処置したn=ラット4匹/群。最大20日間に、70mg/Kg及び増加用量140mg/KgのManNAc処置群において、タンパク尿の有意な減少が認められた。これらの結果は、シアル酸前駆体の投与が、Angptl4の正常なシアリル化を回復させることによって、糖尿病を処置することを示す。図8Cに示されるように、シアル酸前駆体の投与は、本明細書において記載されるAngptl4ポリペプチドの正常なシアリル化を回復させることによって、糖尿病で観察されるタンパク尿を減少させる。本開示は、有足細胞により分泌されたAngptl4の、ネフローゼ症候群の病因における重要な役割これは、MCDのモデルを使用して実証した及びネフローゼ症候群に関連する病状例えば、限定されないが、タンパク尿におけるAngptl4の役割を示す。本開示は、ヒト腎臓生検において有足細胞のAngptl4発現が増加していること、NPHS2-Angptl4TGラットにおいてアルブミン尿が500倍超増加しているという選択的なタンパク尿、Angptl4遺伝子のグルココルチコイド感受性、並びに、光学及び電子顕微鏡の知見がヒトMCDと一致していることを示す。さらに、NTSを注射したAngptl4-/-マウスにおけるタンパク尿及び足突起の消失の有意な減少によって、タンパク尿の発症及び足突起の消失におけるAngptl4の役割を確認した。信頼できるMCDのマウスモデルがないため、NTSを使用する必要があった。MCDにおける有足細胞による高pIAngptl4の分泌は、Angptl4がGBMに結合するのを促進する可能性があり、過去の研究は、Angptl4がへパラン硫酸プロテオグリカンに結合することを示している21。これは、Angptl4が有足細胞でTG発現している齧歯類において、GBM電荷が減少していることこれは、MCDの特徴であるとよく相関している。電荷は、流れの方向に逆らって、高pIAngptl4がGBMを通過して輸送されるのを促進する可能性がある。有足細胞から分泌された活性オリゴマー型Angptl4は、スレオニンリン酸化されておらず、Angptl4のシアリル化の増加は、タンパク尿を減少させたので、シアリル化の変化により、大部分のpI変化、及び、タンパク尿におけるAngptl4の生物学的役割が説明される。ラット及びヒトAngptl4のそれぞれにおいて、シアル酸残基が組み込まれ得る2つの予測O-及びN-グリコシル化部位がある。シアル酸前駆体による処置は、ネフローゼ症候群例えば、限定されないが、MCD、及びおそらく、Angptl4が役割を果たしている糖尿病のようなよく見られる多系統疾患におけるタンパク尿を減少させるための新たな潜在的治療ツールの構成要素となる。加えて、まだ不明確ではあるが、有足細胞又は内皮細胞により分泌された因子は、おそらく、MCDの病因において、Angptl4と相乗的に作用している。NPHS2-Angptl4TGラットにおいて、有足細胞により分泌されたAngptl4は、糸球体毛細血管ループに依然として結合しているか、又は近位尿細管によって取り込まれる尿スペースにエスケープしている。これらのラットにおいて低用量PANこれは、さらなる透過性因子をこれらのラットに提供するを誘導した後に、有足細胞により分泌されたAngptl4は、血中にエスケープする。また、NPHS2-Angptl4TGラットにおいて、さらなる透過性因子を欠如させることにより、タンパク尿が、PAN又はMCDを有する患者よりも緩やかに発症することが説明される可能性がある。これらは、シアル酸前駆体の投与が、Angptl4ポリペプチドの正常なシアリル化を回復させ、ネフローゼ症候群に関連する生理学的異常例えば、限定されないが、MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN又は糖尿病性腎症、糖尿病、ループス腎炎又は原発性糸球体疾患を軽減することを示している。その結果、本開示は、前記病状の処置を提供する。方法全長ラットAngptl4のクローニング、及び、全長リコンビナントAngptl4に対する抗体の作製本発明者らの過去の実験7からの1218bpの全長ラットAngptl4オープンリーディングフレーム終止コドンを除くを、真核生物発現用のpcDNA3.1/V5-HisB及び原核生物発現用のpET28aにクローニングした。大腸菌により発現された精製全長タンパク質を、ウサギProteintechgroup,Inc.ChicagoILUSAでポリクローナル抗体これは、ELISA及びウエスタンブロットによって試験したを作製するのに使用した。抗体反応性のバンドを、GelCodeblue染色したゲルから切り出し、トリプシン分解し、MALDI-TOF/TOFによってAngptl4ペプチド配列の存在を確認した。抗血清の一部を、抗原に対してアフィニティー精製した。特に明記しない限り、記載したすべての研究は、この抗体を使用した。ラットAngptl4のN末端部分シグナルペプチドを除くアミノ酸7~86に対するさらなるポリクローナル抗体を、ウサギで同様に生産した。ヒト糸球体疾患の動物モデルにおけるタンパク尿の誘導すべての動物実験は、施設内IACUCによって承認された。WTラットにおけるタンパク尿n=ラット4匹/群の動物モデルの誘導は、丸括弧内の過去の刊行物に記載されている:PAN7、PHN7、グルココルチコイドを有するPAN20、非HIV虚脱型糸球体症18、腎毒性血清誘導性異種期タンパク尿7;これらの参考文献は、このような教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。200mcgの抗Thy1.1Ox-7ハイブリドーマの注射によって抗Thy1.1腎炎を誘導するか、又はコントロールIgGIVを異なる群の雄性Wistarラットに注射し100~125gm、n=ラット4匹/群、24~72時間後にラットを安楽死させた。以下の技術は、過去の刊行物に記載されている:TaqmanリアルタイムPCR26、共焦点画像7、insituハイブリダイゼーション27、プロモーター-レセプター試験7、免疫金EM26、ウエスタンブロットのための糸球体摘出及び処理26、PEI法による電荷の評価28;これらの参考文献は、このような教示に関して、参照により本明細書に組み込まれる。アルシアンブルー染色のために、酢酸を使用して、染色液のpHを2.5に調整し、0.1ヌクレアファストレッド溶液を対比染色として使用した。Image-ProソフトウェアMediaCybernetics,Inc.,BethesdaMD,USAを使用して、糸球体基底膜アルシアンブルー染色糸球体20個/ラット、ラット3匹/群のデンシトメトリーを評価した。Gel-ProAnalyzerソフトウェアMediaCybernetics,Inc.を使用して、二次元ゲルウエスタンブロットのデンシトメトリーを評価した。TaqmanリアルタイムPCRプライマー及びプローブを表1にリスト化する。insituハイブリダイゼーションに関して、ジゴキシゲニン標識化プローブは、ORFのbp1~548を含むラットAngptl4用である。ヘパリン処理LPL活性のためのサンプルを得るために、安楽死前15分に、10単位/100gm体重のブタヘパリンをラットに静脈内注射し、RoarBiomedical,IncNewYorkNYのアッセイを使用して、活性を測定した。空腹状態で血清トリグリセリドを測定した。Angptl4-/-マウスへのNTSの注射Angptl4-/-マウスは、好意的なギフトとして、EliLilyCorporationIndianapolisINUSAからSanderKerstenに提供された。研究プロトコールは、WageningenUniversityのAnimalStudiesCommitteeによって承認された。1.5mgのγ2-NTS又は通常のヒツジ血清SigmaAldrichSt.LouisMOUSAを、11週齢雄性Angptl4-/-又は/マウスn=マウス4匹/群に静脈内注射し、48時間の時点でスポット尿サンプルを採取し、72時間の時点でマウスを安楽死させ、生化学的測定のために血漿を採取し、組織学的分析のために腎臓を保存した。ELISABethyllaboratories,MontgomeryTXUSAによって、尿アルブミンを評価し、質量分析によって、尿クレアチニンを測定した。足突起の消失を評価するために、コントロール処置Angptl4/マウスの透過型電子顕微鏡写真において、足突起の平均幅を最初に測定した10回の等間隔測定/ループ、3個のループ/糸球体、3個の糸球体/腎臓、3個の腎臓/群。消失は、平均幅の2.5倍超の増加として記載した。NTS処置又はコントロール処置Angptl4-/-マウスにおいて、足突起の合計数及び消失した数をカウントした。保管したヒトのサンプルを用いた研究InstitutoNacionaldeCardiologia,MexicoCityのIRBにより承認されたプロトコールによって得られたサンプルで、保管したヒト腎臓生検n=生検5個/条件の免疫染色を行った。これらの研究に使用したコントロールの腎臓生検は、性別及び年齢適合プロトコール移植前生検であった。二次元ゲル電気泳動及びウエスタンブロット用の保管したヒト血清n=サンプル4個/条件を、以前に公開した研究29から入手した。トランスジェニックラットの作製:以下のように、NPHS2-Angptl4TGラットを作製した:ベクターpTRE-tightをStuI及びEcoRIで消化して、bp278~324の間にある最小CMVプロモーターを除去し、T4DNAポリメラーゼで5’オーバーハングをブラントエンドし、再ライゲーションして、pTRE-tightMPプロモーターなしを作製した。有足細胞特異的発現のために、C末端V5タグを有するラットAngptl4cDNA構築物シグナル配列を含むを、SV40ポリAテイルの上流に配置した。公開されているヒトNPHS2プロモーター構築物を鋳型gi22652661として使用するDMSOなしのPCRによって、ヒトNPHS2プロモーターを上流にクローニングし、発現を向上させるために、bp2343~2568の間に天然に存在するループを除去した。消化したDNA構築物をSpragueDawley受精卵にマイクロインジェクションしUniversityofMichiganで行った、偽妊娠した宿主SpragueDawleyの雌に着床させることによって、トランスジェニックラットを作製し、構築物特異的プライマー及びプローブ並びにコントロールのゲノムプロラクチンプライマー及びプローブの組み合わせを使用する通常のPCR及びTaqManゲノムDNAリアルタイムPCR戦略によって、得られた子の遺伝子型を特定した。有足細胞特異的発現のための2つの樹立系統を作製した。4世代にわたり安定であったNPHS2-Angptl4TGラット系統7405コピーの導入遺伝子からのデータを示す。Bradford法Bioradlaboratories,HerculesCAUSAを使用して、尿中の総タンパク質を評価し、ELISABethyllaboratories,MontgomeryTXUSAによって、アルブミン尿を評価した。ラット血圧の測定5月齢の野生型ラット及びタンパク尿へテロ接合体NPHS2-Angptl4TGラット6匹において、HetterasInstruments,Inc.CaryNCUSAのSC-1000装置を使用するtailcuff法によって、血圧及び脈拍数を測定した。1群当たり、80回の測定の最小値を分析した。安定細胞株及びリコンビナントAngptl4タンパク質の開発並びに特性決定コントロールの空ベクター安定細胞株と共に、ラットAngptl4pcDNA3.1-V5/His構築物を使用して、安定細胞株を開発した。Angptl4安定細胞株は、ラットAngptl4mRNAを55,253±5,155倍アップレギュレーションしており参照値1とした検出不可能なベースラインを上回る、無血清条件下で70kDaタンパク質を分泌し、血清の存在下で55kDaタンパク質を分泌する。ニッケルアフィニティーカラムを使用して、全長V5-Hisタグ化タンパク質を無血清培地からアフィニティー精製した。二次元ゲル上で実施したウエスタンブロット研究により、ほとんどのリコンビナントAngptl4が、高等電点8.3~8.5タンパク質として移動し、非リン酸化であることが明らかになった。プロモーター-レセプター研究。以前に公開31したマウスAngptl4プロモーターは、肝臓において、ATGの上流183bpに転写開始部位を有していた。本発明者らは、マウス腎臓mRNAを使用して5’RACE及びプライマー伸長分析を行い、腎臓において同じ転写開始部位を確認した。次に、BACクローンRP23-27D5を鋳型として使用して、転写開始部位の上流の断片2KbをpSEAP2ベーシックにクローニングした。BACクローンRP11-886P16を使用して、2KbのヒトAngptl4プロモーター構築物を同様に作製した。マウスAngptl4用のAngptl4-pSEAP又は空ベクタープロモーター-レセプター構築物でトランスフェクションしたHEK293細胞及びGECをデキサメタゾン10-3Mとインキュベーションすると、48時間の時点でSEAP活性の低下を示す。グルココルチコイドレセプターは、レセプターアンタゴニストミフェプリストン2x10-5Mによって無効化されているので、この活性の低下は、グルココルチコイドレセプターによって媒介されている。ヒトプロモーターのグルココルチコイド感受性も評価したデキサメタゾン10-4M。pβgalベクターClontech,MountainViewCAUSAを使用して、すべてのトランスフェクション反応を標準化した。ManNAcを用いたinvitro及びinvivo研究リコンビナントタンパク質のシアリル化に対するmanNAcの効果を研究するために、Angptl4-HEK293安定細胞株又はpcDNA3.1-HEK293コントロール安定細胞株を、15cmディッシュでコンフルエンスに増殖させ、温PBSで2回洗浄し、次いで、25mMmanNAcを含むか、又は含まないフェノールレッド不含有無血清DMEMで48時間インキュベーションし、その後、培地を回収し、濃縮し、タンパク質アッセイを行い、二次元ゲル上にロードした200μg/ゲル。ウサギ抗Angptl4全長抗体、免疫前ウサギ血清並びにレクチンSNAI-HRP及びMAA-HRPE-Ylaboratories,SanMateoCAUSAを使用して、糸球体又はリコンビナントタンパク質のウエスタンブロットを行った。続いて、中pIAngptl4ManNAc処置又は高pIAngptl4未処置を用いたinvitro研究は、Hisタグ精製タンパク質、又は、Angptl4-HEK293安定的から同じ方法で回収した濃縮上清を使用した。コントロールのタンパク質を、コントロールの安定細胞株の上清から濃縮した。重度のアルブミン尿NPHS2-Angptl4ラットにおけるパイロット研究により、大量のManNAc8mg/ml水道水が、アルブミン尿の20~30の減少を維持するのに必要であることが明らかになった。研究を安価に行うために、野生型ラットよりも15~25倍高いアルブミン尿の3~3.5月齢雄性ヘテロ接合体NPHS2-Angptl4ラット7匹に、水道水に溶解させたManNAc1mg/mlを12日間投与しManNAc段階、その後、3匹を安楽死させ、他のラットは、さらに24日間、プレーンな水道水に戻したウオッシュアウト段階。アルブミン尿の増加を確認するために、研究前に18時間の尿採取を2回行い-12日目及び0日目、研究中は定期的に行った。ベースラインのアルブミン尿レベルに関して、ほぼ同年齢の別の雄性NPHS2-Angptl4ラット7匹を評価し、普通の水道水を投与しコントロール群、12日目に3匹を安楽死させ、他のラットは36日目まで追跡調査し、その後、アルブミン尿を再評価し、動物を安楽死させた。各ラットの1日当たりの水分摂取量をチャート化した。各安楽死の時点で、潅流後に腎臓を取り出し、二次元ゲル電気泳動のために糸球体を単離し、処理した。各ラットに関して、0日目のアルブミン尿は100を意味し、その後のアルブミン尿の値はすべて、0日目に対して相対的に表した。統計的分析GraphPadInStatソフトウェアバージョン3.05を使用する事後分析試験によるANOVAによって、3つ以上の群の間のタンパク尿又は遺伝子発現の差異の分析を行った。2つの群の比較に関して、MicrosoftExcel2003の対応のないStudentst-検定を使用した。上記記載は、本開示の方法及び他の教示を例示し、説明するものである。加えて、本開示は、開示される方法及び他の教示の特定の実施形態のみを示し、説明するものであるが、上述のように、本開示の教示は、様々な他の組み合わせ、改良及び環境で使用することが可能であり、本明細書において表される教示の範囲内で、当業者の技能及び/又は知識に応じて、変更又は修正することが可能であると理解されるべきである。本明細書において記載される上記実施形態は、本開示の方法及び他の教示を実施する際の公知の最良の形態を説明し、当業者が、このような又は他の実施形態において、特定の用途又は使用に必要な様々な修正を加えて、本開示の教示を利用できるようにすることをさらに意図している。従って、本開示の方法及び他の教示は、本明細書において開示される厳密な実施形態及び実施例を限定することを意図するものではない。引用されるすべての参考文献は、それが本開示に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。"