"iMHCクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、iiMHCクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分とを含む組換えMHCクラスII分子であって、iおよびiiが、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつiおよびiiが、前記α鎖のα2ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ2ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然MHCクラスIIのα2およびβ2ドメイン中には存在しない、組換えMHCクラスII分子。前記組換え分子が、さらにロイシンジッパーモチーフを含まない、請求項1に記載の組換えMHCクラスII分子。前記ジスルフィド結合が、マウスI-EアイソタイプのPro96α2-Ser119β21位、Ser95α2-Ser121β22位もしくはArg94α2-Asn151β23位または別のMHCクラスIIアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項1または2に記載の組換えMHCクラスII分子。前記ジスルフィド結合が、マウスI-EアイソタイプのSer95α2-Ser121β22位または別のMHCクラスIIアイソタイプにおいて相当する位置のシステイン残基間にある、請求項3に記載の組換えMHCクラスII分子。さらに参照配列H-2EB01配列番号2の38、42もしくは106の位置に対応する1つ以上のシステイン残基または別のMHCクラスIIアイソタイプの相当する位置の1つ以上のシステイン残基が除去されている、請求項1~4のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記組換え分子が、繊維状ファージ表面に発現されている、請求項1~5のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記組換え分子が、ファージ表面タンパク質gpIII、gpVII、gpVIIIまたはgpIXとの融合体として発現されている、請求項6に記載の組換えMHCクラスII分子。前記ファージ表面タンパク質がgpIXである、請求項7に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子が可溶性分子である、請求項1~5のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子のiまたはiiが免疫グロブリンのFc部分と融合している、請求項9に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子が多量体である、請求項1~10のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子のiおよびiiが、マウスMHCクラスII分子またはヒトMHCクラスII分子、好ましくはヒトMHCクラスII分子に由来する、請求項1~11のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子が細菌宿主により産生されている、請求項1~12のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記細菌宿主が、大腸菌E.coli、好ましくは大腸菌E.coliK12派生物、より好ましくはBL21表現型を有する大腸菌E.coliまたはその派生物である、請求項13に記載の組換えMHCクラスII分子。前記ジスルフィド結合が、MHCクラスII分子安定化の唯一の手段を提供する、請求項1~14のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子がT細胞を染色することができる、請求項1~15のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。前記分子が前記ペプチド結合ドメインと結合したペプチドをさらに含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の組換えMHCクラスII分子。原核宿主で発現させることができる組換えMHCクラスII分子であって、iMHCクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、iiMHCクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分とを含み、iおよびiiが、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつiおよびiiが、前記α鎖のα2ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ2ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然MHCクラスIIのα2およびβ2ドメイン中には存在しない組換えMHCクラスII分子。iMHCクラスIIα鎖の細胞外部分の全部または一部分と、iiMHCクラスIIβ鎖の細胞外部分の全部または一部分とを含む組換えMHCクラスII分子の作製方法であって、iおよびiiが、機能的ペプチド結合ドメインを提供し、かつiおよびiiが、前記α鎖のα2ドメイン中に位置するシステイン残基と前記β鎖のβ2ドメイン中に位置するシステイン残基との間のジスルフィド結合により結合しており、前記システイン残基が、天然MHCクラスIIのα2およびβ2ドメイン中には存在せず、前記組換え分子を原核宿主で発現させることを含む、方法。T細胞により認識され得る抗原ペプチドエピトープを同定する方法であって、前記方法が、請求項17に記載の組換えMHCクラスII分子をT細胞受容体と接触させることと、前記組換えMHCクラスII分子と前記T細胞受容体との結合を検出することと、を含む方法。試料中の抗原特異的T細胞を検出する方法であって、前記方法が、請求項17に記載の組換えMHCクラスII分子を前記試料と接触させることと、前記組換えMHCクラスII分子と前記T細胞との結合を検出することと、を含む方法。前記方法が、試料中の疾患特異的T細胞の存在を検出して疾患の有無を診断するために使用される、請求項21に記載の方法。実施例実施例1材料および方法構造評価、分子モデリングおよび配列解析最初のジスルフィド結合予測にヘモグロビンHb由来ペプチドHbaa65761と複合したマウスMHCクラスII分子I-Ekの1.9Å分解能の結晶構造PDBID:1FNGを用いた。α2-β2定常ドメイン間の接合点を形成している残基を調べ、さらなる解析のためにβ炭素が7Å未満の距離にある側鎖を選択した。最初に、選択された側鎖をコンピュータ上での突然変異によりシステインに変化させて、回転異性体ライブラリーのスキャンにより最適な回転異性体を選択した。選択された残基対のチオール基がジスルフィド結合形成に最適でない位置にある場合、好ましい角度になるまで側鎖のχ1二面角を互いに回転させた。次いでGromos96力場を用いて、制約付きエネルギー最小化により局所の幾何学的位置を最適化した。H-2EGenBankアクセション番号:K00971およびAF050157およびH-2AGenBankアクセション番号:V00832およびM13538の翻訳したマウスIMG参照配列、本発明者らがクローニングしたH-2Ed下を参照されたいならびにPDB:1FNGH-2E配列を、ClustalW2.02http://www.ebi.ac.uk/を用いて整列させ、手動で注釈を付けた。代表的なマウスH-2AおよびE、ならびにヒトHLA-DP、DQおよびDRをIMGThttp://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoireMHC/LocusGenes/RepresentativeMHCgc.htmlからダウンロードして翻訳し、ClustalW2.02http://www.ebi.ac.uk/を用いて整列させた。使用したIMGT参照配列GenBankアクセションコードα鎖/β鎖は、I-AV00832/M13538、I-EK00971/AF050157、HLA-DPX03100/M23907、HLA-DQM23907/U92032およびHLA-DRJ00204/AJ297583であった。H-2E、およびPDBID:1FNGの構造解析に従って、アライメントに手動で影をつけた。この配列アライメントを、代表的なPDB登録物:1FNGI-Ek、1S9VHLA-DQ2、1JK8HLA-DQ8、1DLHHLA-DR1、1BX2HLA-DR2、1HQRHLA-DR2a、1A6AHLA-DR3、1D6EHLA-DR4および2Q6WHLA-DR52aの構造アライメントおよび同時の構造重ね合わせにより検証した。分子の可視化および操作作業では、すべてspdbビューア3.7SP5ソフトウェア2を用いた。細菌株、ヘルパーファージおよびプラスミド大腸菌E.coli株XL1-BlueおよびVCSM13ヘルパーファージはStratageneLaJolla、CA、USAから購入した。HyperPhage商標ヘルパーファージはProgenBiotechnikGmbHHeidelberg、Germanyから購入した。phOx-BSAに対して特異的な一本鎖FvscFvを有するpIII提示ファージミドpSEX813は、AffitechASOslo、Norwayの厚意により提供されたが、PROGENBiotechnikGmbHHeidelberg、Germanyから入手することもできる。pSEX81系pFAB提示およびphOx-BSA特異性を有するpFABDFNファージミドは既に記載されている4。細胞系T細胞ハイブリドーマLD15は、マウスMHCクラスII分子I-Ed上に提示されたインフルエンザ赤血球凝集素由来ペプチドアミノ酸110~120;N-SFERFEIFPKE-Cに対して特異的である。ヒトCD4T細胞クローンT18はマウスIgCカッパアミノ酸40~48;N-WKIDGSERQ-Cに対して特異的であり、HLA-DR4DRA1、B10401PMID:12456590拘束性である。ヒトT細胞クローンであるTCC820.26およびTCC820.88は、それぞれDQ2-αI-エピトープアミノ酸57~68;N-QLQPFPQPELPY-CおよびDQ2-αII-エピトープアミノ酸62~72;N-PQPELPYPQPE-Cを認識する。各細胞はS.-W.Qiao博士オスロ大学免疫学研究所、ノルウェーの厚意により提供された。細胞はすべて、10のFCS、0,1mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、50μMのモノチオグリセロールおよび12μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを添加したRPMI1640で維持した。抗体および追加の試薬すべての培地および緩衝液は、実質的にはSambrooketal.6に記載されている通りに調製した。マウス抗pIII、ウサギ抗fd、ウサギ抗fdビオチンコンジュゲート、ヒツジ抗M13-HRPおよびヒツジ抗マウス-HRP抗体は、それぞれMoBiTecGoettingen、Germany、Sigma-AldrichOslo、NorwayおよびAmershamBiosciencesUppsala、Swedenから購入した。抗I-E/I-A抗体2G9、ならびにストレプトアビジン-PEおよびストレプトアビジン-APCコンジュゲートはBDPharmingenSanJose、CA、USAから購入した。ラット抗マウスCD32抗体2.4G2ATCC登録商標番号HB-197商標は自家製であった。ハプテンである、ウシ血清アルブミンBSAとコンジュゲートされた2-フェニルオキサゾール-5-オンphOxは、実質的に記載されている通りに調製した7。制限酵素REは、StratageneLaJolla、CA、USAから入手したDpnI以外は、NewEnglandBiolabsIpswich、MA、USAから購入した。DNAオリゴは、MWGBiotechAGEbersberg、Germany、DNATechnologyAarhus、DenmarkまたはSigma-Aldrichから購入した。BSAおよびTween20はSigma-AldrichOslo、Norwayから購入した。PfuTurboDNAポリメラーゼはStratageneLaJolla、CA、USAから購入した。トリプシン/EDTAはBioWhittakerLonzaGroupLtd.、Visp、Switzerlandから購入した。I-Ed-pIII提示ファージミドの構築実質的にはCasaresetal.8により記載されている通りに、A20BALB/cBリンパ腫細胞由来のH-2E遺伝子をRT-PCRにより回収し、別々に真核pLNOH2ベクター中にクローニングして、I-Ed-Ig融合体を作出した。I-EdαおよびI-Edβをコードする遺伝子を、以下のプライマー対を用いてこれらのベクターから増幅した:I-Edαには、pFABI-Edafw5’-TATACCATGGCCATCAAAGAGGAACACACCATCATCCAGG-3’およびpFABI-Edarv5’-TATAACTAGTCATTACTCCCAGTGCTTCCGCAGAG-3’;I-Edβには、pFABI-Edbfw5’-TATAACGCGTCAGAGACACCAGACCACGGTTTTTG-3’およびpFABI-Edbrv5’-TATAGGCCGCAGCGGCCCCTTTCCACTCGACCGTGACAGGGT-3’。I-Edβ遺伝子がM13pIII表面タンパク質と融合し、I-Edα鎖が可溶性の物質として産生されるように、I-Ed遺伝子をpFABDFNファージミド中にクローニングした図2。インフルエンザ赤血球凝集素由来ペプチドアミノ酸110~120および15アミノ酸リンカーG4S3をコードするDNAを、記載されている重複伸長による遺伝子スプライシング9および以下のプライマーを用いてI-Edβ鎖のN末端に挿入した:pMHCHASOEingfw5’-AAAGGAAGGAGGTGGTGGCTCCGGTGGAGGGGGAAGTGGAGGTGGAGGGTCTGTCAGAGACACCAGACCACGGTT-3’およびpMHCHASOEingrv5’-GGAGCCACCACCTCCTTCCTTTGGGAAGATCTCGAACCTTTCGAATGATACGCGTGCCATCGCCG-3’。クローニングのために、製造者のプロトコルStratagene、LaJolla、CA、USAに従い、プライマー:QCIEdbPstIfw5’-TGGACACGTACTGTAGACACAACTATGAGAT-3’およびQCIEdbPstIrv5’-ATCTCATAGTTGTGTCTACAGTACGTGTCCA-3’を用いたQuikChange商標での部位特異的変異誘発により、I-Edβ遺伝子内のPstI制限部位を除去した。製造者のプロトコルStratagene、LaJolla、CA、USAに従い、QuikChange商標での部位特異的変異誘発により、ジスルフィド結合を導入するための点突然変異を導入した。使用したプライマーは、I-EdαのR94C変異には、MutR94CI-Edアルファfw5’-GACTGTACTCTCCTGTAGCCCTGTGAACC-3’およびMutR94CI-Edアルファrv5’-GGTTCACAGGGCTACAGGAGAGTACAGTC-3’;I-EdβのN150C変異には、MutN151CI-Edベータfw5’-CCTGGTCCGATGTGGAGACTGGACCTTC-3’およびMutN151CI-Edベータrv5’-GAAGGTCCAGTCTCCACATCGGACCAGG-3’;I-EdαのS95C変異には、QCIEdaS95Cfw5’-ACTCTCCAGATGCCCTGTGAAC-3’およびQCIEdaS95Crv5’-GTTCACAGGGCATCTGGAGAGT-3’;I-EdβのS120C変異には、QCIEdbS120Cfw5’-GTCTGCTCTGTGTGTGACTTCTAC-3’およびQCIEdbS120Crv5’-GTAGAAGTCACACACAGAGCAGAC-3’;I-EdαのP96C変異には、QCIEdaP96Cfw5’-CAGAAGCTGTGTGAACCTGGGA-3’およびQCIEdaP96Crv5’-TCCCAGGTTCACACAGCTTCTG-3’;I-EdβのS118C変異には、QCIEdbS118Cfw5’-CCTGGTCTGCTGTGTGAGTGAC-3’およびQCIEdbS118Crv5’-GTCACTCACACAGCAGACCAGG-3’であった。MHCII提示バクテリオファージの調製VCSM13またはHyperPhage商標ヘルパーファージおよびビリオン会合を用いた大腸菌E.coliXL1-Blueからのファージミドレスキューを、記載されているスポット力価測定法10によりモニターした。ファージ捕捉ELISA捕捉抗体およびphOx-BSAを、pH7.4のPBS中2.5~5μg/mlの濃度で、4°Cで一晩、MaxiSorp商標マイクロタイタープレートウェルNunc、Roskilde、Denmarkに吸着させた。ウェルをPBSTM0.05v/vのTween20および4w/vの脱脂乳を添加したPBSにより、室温で1時間ブロックした。次いで、正規量のビリオン調製物VCSM13レスキュー試料:1×1010cfuampR/ウェル;HyperPhageレスキュー試料:1×108cfuampR/ウェルを加え、室温で1~2時間反応させた後、捕捉されたビリオンを室温で1時間、抗M13-HRP1:5,000により検出した。TMB可溶性基質MerckKGaA、Darmstadt、Germanyでウェルを発色させ、30分後に1MのHClで停止させ、A450nmで吸光度を読み取った。SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法ビリオン108cfuampR/レーンを非還元および還元4~12ビス/トリスXTCriterionプレキャストSDS-PAGEBio-Rad、Hercules、CA、USAにより分離し、セミドライブロッティング装置Bio-Rad、Hercules、CA、USAを用いて、トリス/グリシン緩衝液25mMのトリス、192mMのグリシンおよび20のメタノール、pH8.3中、25Vで30分間、ポリフッ化ビニリデン膜Millipore、Madison、USAにブロットした。膜をPBSTM中でブロックした後、マウス抗pIIIMAb1:4,000、次いでヒツジ抗マウス-HRP1:10,000でpIII融合体を検出した。膜を洗浄し、SuperSignal商標WestFemto基質Pierce、Rockford、IL、USAで発色させ、BioMax商標MRフィルムKodak、Fernwald、Germanyに感光させた。人工的S-S架橋を含むHLA-DP、-DRおよび-DQの構築IMGThttp://imgt.cines.fr/により定義される代表的なHLA-DRDRA0101/DRB11402および-DQDQA10501/DQB10301をコードする遺伝子を化学的に合成したGenscript、Piscataway、NJ。大腸菌E.coliコドンバイアスを修正してDNA配列を最適化し、2位のα2-β2システイン対を導入するための点突然変異を組み込んだ表2。DNAフラグメントを上記のようにpFABDFNファージミド中にクローニングした。あるいは、IMGThttp://imgt.cines.fr/により定義される代表的なHLA-DPDPA10103/DPB10401、-DRDRA0101/DRB11402および-DQDQA10501/DQB10301をコードする遺伝子を、新たに単離したヒトPBMCからRT-PCRにより増幅し、上記のようにpFABDFNファージミド中にクローニングする。2位表2のα2-β2システイン対を導入するための点突然変異を、製造者のプロトコルStratagene、LaJolla、CA、USAに従いQuikChange商標での部位特異的変異誘発により組み込む。使用したプライマー表1に記載は、HLA-DPAα2-ドメインのS95C変異には、DPA_S95C_センスおよびDPA_S95C_アンチセンス;HLA-DPBβ2-ドメインのS121C変異には、DPB_S121C_センスおよびDPB_S121C_アンチセンス;HLA-DRAα2-ドメインのS95C変異には、DRA_S95C_センスおよびDRA_S95C_アンチセンス;HLA-DRBβ2-ドメインのS121C変異には、DRB_S121C_センスおよびDRB_S121C_アンチセンス;HLA-DQAα2-ドメインのS95C変異には、DQA_S95C_センスおよびDQA_S95C_アンチセンス;HLA-DQBβ2-ドメインのS121C変異には、DQB_S121C_センスおよびDQB_S121C_アンチセンスである。フローサイトメトリーLD1細胞の単細胞懸濁液を、氷上で15分間、60で熱不活性化したラット血清および1×PBS中200μg/mlの抗CD32mAbHB197によりブロックするか図6a、またはブロックしなかった図6b。HyperPhageにパッケージングされたI-Ed-pIII提示の染色を、氷上で2時間、染色緩衝液0.5のBSAを含む1×PBS中で図6a、または室温で30分間、1のBSAを含む1×PBS中で図6b行った。図6aで使用したファージ投入量は、HAaa110120-I-Ed提示には5×109cfuampR、I-Ed提示には1.6×1010cfuampRであった。図6bで使用したファージ投入量は、VCSM13ヘルパーファージネガティブ対照、1×1011cfukanR/mlを除くすべての調製物で2×109cfuampRであった。次いで試料を、10μg/mlのビオチン化ウサギ抗fdとともに氷上で1時間図6aまたは30分間図6bインキュベートし、次いで2μg/mlのストレプトアビジンPEとともに氷上で15分間インキュベートした。3つのT細胞クローン、すなわちT18、TCC820.26またはTCC820.88のそれぞれの単細胞懸濁液を染色緩衝液0.5のBSAを含む1×PBSで調製した。HLAクラスII-pIII融合体図9を多価HyperPhageにパッケージングまたは一価VCSM13にパッケージングで提示するファージとともに室温で1時間、細胞を染色した。使用したファージ投入量は、それぞれ約1×109cfuampR図9a、約2×109cfuampR図9bおよび約2×1012cfuampR図9cおよび9dであった。次いで試料を、10μg/mlのビオチン化ウサギ抗fdとともに氷上で1時間インキュベートし、次いで2μg/mlのストレプトアビジン-PEとともに氷上で30分間インキュベートした。FACSCaliburフローサイトメータBDBiosciencesで事象を捕捉し、CellQuestPROソフトウェアBDBiosciencesを用いてそれを解析した。結果分子モデリング表21FNG番号付けは、I-Edα/I-Ekβ構造PDBID:1FNG内のα2/β2定常ドメイン接合点中の選択された残基対のβ炭素側鎖の距離を示している。実際、1位~3位の残基対の、システインへのコンピュータ上での突然変異誘発および側鎖の最適化により、タンパク質の三次構造を不安定にすることなく2.03~2.07Åの間のジスルフィド結合距離が得られた図1。この結果は、変異体ポリペプチドにおいてこれらのアミノ酸置換が可能になり、ジスルフィド架橋を形成された可能性があり、したがって、さらなる解析に選択されたということを強く示唆するものであった。PDBID1FNGで受託されているアミノ酸番号付けは、β鎖のIMGT配列番号付け図3Bを参照されたいからずれていることに留意されたい。MHC-pIII融合体の設計I-Ed遺伝子セグメントを、αおよびβ鎖が2つの別々のポリペプチドとして翻訳され、そのうちβ鎖がウイルスキャプシドタンパク質pIIIのN末端にインフレームで直接融合されるようにpFABDFNファージミド内に挿入した図2。両鎖とも、ペリプラズムへの標的化のためのN末端シグナル配列pelBを含んでいた。挿入されたα鎖部分図3A、H-2EA_ELは、図3Aに示されるIMGTH-2EA02参照配列GenBankアクセションコード:K00971、配列番号1のアミノ酸26~204に対応する。同様に、図3Bに示されるIMGTH-2EB101参照配列GenBankアクセションコード:AF050157、配列番号2のアミノ酸27~216に対応するβ鎖部分を用いた図3B、H-2EB_EL。したがって、I-EIMGT参照配列に基づけば、表2の1位~3位のシステイン置換の位置は、それぞれ成熟ペプチドすなわち、シグナルペプチドを含まないペプチドのα鎖の位置94~96図3Aおよびβ鎖の位置119、121および151図3Bに対応する。このβ鎖残基の番号付けは、1FNGテンプレートファイルに受託されている番号付けからずれていることに留意されたい。ファージミド由来のMHCII-pIII提示の解析pMHC部分の提示の傾向および整合性を比較するために、I-E特異的モノクローナル抗体MAbである2G9で正規量のビリオンを捕捉することにより、ファージELISAを行った。結果は、多価および低価数の提示の両方で、すべての試料がMAb2G9により認識されることを示していたが図4、このことは、構造上の整合性が全体的に保持されたことを示唆している。MAb2G9は、pIIIと直接融合させたI-Eβ鎖と結合する。ファージ上に共有結合のα鎖ヘテロ二量体が存在するか否かを評価するために、非還元および還元SDSPAGE、次いで抗pIIIでのウエスタンブロット検出により正規量のビリオンを解析した図5。結果は、wt図5、レーン5およびHAペプチドを有するα95/β120変異体図5、レーン3の2つを除く全試料中に、有意な割合の共有結合のヘテロ二量体が存在することを示していた。しかし、α95/β120変異体の試料は、試料負荷量が非常に少ないため適切な分離が妨げられたことを示していたのは意外であった。すべての共有結合複合体形成が試料の還元の際に打ち消された図5、レーン11~20。さらに抗体Fab対照図5、レーン10および20に関して、pMHC部分の改変に対して1つの共有結合ヘテロ二量体種のみが予想されたが、すべての関連試料においてかかる種が複数観察され、予想とは明らかに異なっていた。おそらくこの現象は、導入された変異のほかにも形成された、異所での天然システイン残基間のジスルフィド架橋により説明されるであろう。したがって、実際に提示されたタンパク質のごく一部だけが、人工的に導入された架橋のほかに天然のジスルフィド架橋をα2-β2ドメイン中に有する鎖である。I-Ed-pIII構築物の一価および多価の提示を同時に解する同様の実験を行った。図10にその結果を示す。低レベルのファージミド提示一価では、約1~10のビリオンが融合タンパク質を有するBradburyおよびMarks,JImmunolMethods.2004,2901-2:29.。したがって、はるかに感度の高いELISAアッセイでは融合体が容易に検出されるのにもかかわらず、これらの試料M13K07試料では融合タンパク質がはっきりとは見られない図4。細胞表面染色試薬としてのpMHC-pIIIpIIIとの融合体としてバクテリオファージ上に提示されたペプチド-MHCクラスIIを従来のpMHCII四量体と同様に染色試薬として使用できるか否かを調べるために、本発明者らは、HAaa110120/I-Ed-pIIIまたは融合ペプチドを含まないI-Ed-pIIIでLD1細胞を染色した。図6aからわかるように、関連ペプチドなしで産生されたバクテリオファージ上のI-Ed-pIII融合体では染色が観察されなかったが、HAaa110-120/I-Ed-pIIIは、約0.8logだけ明るい強度で細胞を染色した。図6bからわかるように、調べたすべてのジスルフィド架橋でペプチド特異的染色が観察される。陽性染色は、I-Ed-pIIIのジスルフィド安定化型および抗原ペプチド有する型HAaa110120でのみ観察された。3つの操作されたジスルフィド架橋間で明らかな差は見られなかった。したがって、これらは同様の効率で作用すると思われる。pMHC-pIIIの機能性にさらに取り組むために、VCSM13またはHyperPhage商標を用いたファージミドレスキューにより、mCκaa4048/HLA-DR4-pIII、αIaa5768/HLA-DQ2.5またはαIIaa6272/HLA-DQ2.5を提示するビリオンを調製した。また対照として、すべてのpMHC-pIII融合体を抗原ペプチドなしでも作製した。次いでこれらのビリオンを、記載されているようにフローサイトメトリー実験で試験した。図9aからわかるように、mCκaa4048/HLA-DR4-pIII染色細胞でペプチド特異的染色が観察された。図9bおよび9cでは、αIaa5768/HLA-DQ2.5の多価および一価の提示がペプチド特異的染色を示している。ファージ投入量は、VCSM13にパッケージングされたαIaa5768/HLA-DQ2.5提示において1012cfuampRであったということに留意されたい。αIIaa6272-HLA-DQ2.5のペプチド特異的染色を図9dに示す。考察可溶性の組換えMHCクラスII分子の効果的な使用の主な障害は、このような操作された分子に固有の安定性の問題が原因である。この制限を克服するために様々な立案されたアプローチが採用されてきたが、汎用性のあるアプローチは現在のところ存在しない11。また、現在用いられている手段はすべて、コストと労働力がかかる方法であり、事実上、高スループットなアプローチの妨げとなっている。本発明者らは、組換えMHCクラスII作製とファージ提示技術12を合わせることにより、この問題に対する魅力的な解決方法を見出した。これは非常に迅速かつ安価な技術プラットフォームであるばかりでなく、極めて多様なコンビナトリアルスクリーニングのアプローチを可能にするという固有の特性も有している。MHC分子によりもたらされる広大な抗原プロテオーム空間は、例えばエピトープ発見において、このコンビナトリアル性から大きな恩恵を受けるであろう。しかし現在のところ、こうした発見はまだバキュロウイルスに基づく煩雑で低スループットな技術13に限定されている。ファージ提示を使用すれば、十分に記述された簡便な形式で12、より大きな桁数のレパートリーサイズに容易に手が届くであろう。このような提示によりMHCクラスI分子が探求されてきたが14~16、MHCクラスIファージ提示のアプローチはいずれも、細胞特異的染色がまだ得られていないことから、現在のところ可溶性四量体の代替物として機能しないことがわかっている16。MHCクラスI分子は単一のポリペプチドとして効率的に作製することができる18のとは対照的に、MHCクラスIIは、等しく関与する別々の鎖のヘテロ二量体であることから、その作製は複雑である。MHCクラスIおよびIIの機能的なフォールドはともに、Igフォールドトポロジーで構築されるため、ドメイン内のジスルフィド架橋の形成も必要とする19。MHCクラスIIとその同族リガンド間の天然の相互作用の鍵となる特徴は、固有の弱い親和性である20。組換えMHCクラスII分子を検出試薬として用いる場合にこの感度における制限を克服するために、分子を四量体または五量体に重合することが必要であった11。こうしたポリマーの作製には、実質的な操作を伴う多段階のプロトコルが含まれている。ここでファージ提示を使用すれば、ファージ上での多量体提示を可能にする既に利用可能な技術の使用により、かかる重合が非常に容易に行われる21。ここで本発明者らは、pIIIファージミド提示により機能的に提示されるMHCクラスII分子を得るための戦略を提供する。これを達成するために、αおよびβの2つの鎖を大腸菌E.coli内で2つの別々のポリペプチド鎖として発現させ、そのうちの1つの鎖はpIIIキャプシドと融合され、ペリプラズムへ標的化されている。酸化ペリプラズムでは、2つの鎖が、α2ドメインとβ2ドメインを結合させる新規な人工的ジスルフィド架橋を利用して、安定なヘテロ二量体を形成する。マウスMHCクラスII分子I-Edの保存されたα2-β2接合点中の複数の位置を、人工的な鎖間ジスルフィド架橋を可能にするアミノ酸置換の標的とすることができる図1および3。このような人工のMHC分子を、標準的なファージミドによるファージ提示を用いてpIII上に提示させることにより、共有結合のヘテロ二量体が実際にビリオン上に提示される図5および10。wtおよび変異体両方のすべての分子が、マウスMHCクラスIII-E分子に特異的なモノクローナル抗体MAB2G9と反応することから、分子全体の整合性は保持されると思われる図4。I-Ed分子を、β鎖との共有結合テザーとして十分に特徴付けられているHAaa110120抗原ペプチド22を提示するように、実質的には記載されている通りに設計した23。ジスルフィド架橋により安定化されたこれらの組換え分子を提示するファージをフローサイトメトリーで用いて、I-Ed/HAaa110120複合体に対して特異的なT細胞受容体を有するLD1T細胞ハイブリドーマ5の特異的染色が得られた図6aおよび6b。重要なのは、特異的染色が抗原ペプチドを有するジスルフィド安定化I-Ed-pIII融合体でのみ見られ、このことは真にこのアプローチの機能性を示しているということである。さらに、一価の提示では同様の染色が見られなかったことからデータ不掲載、MHC部分の多価の提示が染色に不可欠であると思われ、このことは、機能的な親和性を天然の相互作用の親和性よりも高める必要性を強調している。これは現在のところ、ファージ提示されたMHC分子を特定のT細胞の直接的な可視化に使用した最初の例であり、古典的なMHCテトラマー技術を補完するものである。成功の鍵は、MHCクラスII分子のα2-β2接合点を安定化させる人工的なジスルフィド架橋の導入である。特定された位置は、HLAを含めたMHCクラスII分子間で高度に保存されているため図7および8、これは汎用性のあるアプローチであると思われる。この汎用性は、試験した他の3つのMHCクラスII複合体、すなわちmCκaa4048/HLA-DR4、αIaa5768/HLA-DQ2.5およびαIIaa6272/HLA-DQ2.5はすべて、pIII融合体として、サイトメトリーにおいて抗原ペプチド特異的に特異的細胞染色を示したということにより強く支持される図9。予想されたように、特定のpMHCII複合体およびそれと反応するT細胞クローンの中で染色能および多価相互作用への依存に違いが見られた。したがって、多価相互作用への依存は全か無かの事象ではなく、このことは一価型のαIaa5768/HLA-DQ2.5およびαIIaa6272/HLA-DQ2.5の両方による特異的細胞染色により示された。フローサイトメトリーにおいて特異的に陽性に染色する能力は、特定のT細胞受容体のpMHCに対する本来の親和性、T細胞上での受容体密度および膜での受容体のクラスター形成能のようなパラメーターに依存するであろう。αIaa5768/HLA-DQ2.5による多価図9bと一価図9cの染色では、多価型の方がファージ投入量が1000倍少なかったにもかかわらず、ともにほぼ同じであったということは注目すべきことである。参考文献1.Kersh,G.J.etal.StructuralandFunctionalConsequencesofAlteringaPeptideMHCAnchorResidue.JournalofImmunology166,3345-33542001.2.Guex,N.Peitsch,M.C.SWISS-MODELandtheSwiss-PdbViewer:anenvironm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