"皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするinvitroの方法であって、以下のステップ:a.少なくとも1つの被験化合物を、ケラチン生成細胞の試料と接触させるステップと、b.前記ケラチン生成細胞における少なくとも1つのマイクロRNAの発現または活性を測定するステップと、c.a.で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップとを含む方法。ステップb.をステップa.の前および後に実施することを特徴とする、請求項1に記載の方法。以下のステップ:a’.ケラチン生成細胞の少なくとも2つの試料を調製するステップと、a.試料のうちの1つを、少なくとも1つの被験化合物と接触させるステップと、次いで、b.前記試料における少なくとも1つのマイクロRNAの発現または活性を測定するステップと、c.a.で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞の試料と比較して測定される化合物を選択するステップとを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記ケラチン生成細胞が、前老化ケラチン生成細胞であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。マイクロRNAが、p63mRNAまたはTP63遺伝子を標的とすることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。マイクロRNAが、miR-130a、miR-138、miR-181aおよびmiR-191からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。前老化ケラチン生成細胞が、古典的な培養条件下における37回の集団倍加の後に得られることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。古典的な培養条件が、HKGS増殖補充物を添加された154培地中で、常にサブコンフルエント状態に保持されるケラチン生成細胞の培養を含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。被験化合物が、植物性抽出物から選択されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。ステップc.において測定されるマイクロRNAの発現または活性の阻害が、少なくとも50の阻害、好ましくは少なくとも60の阻害であることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法に従って得ることが可能な、少なくとも1つのマイクロRNAの阻害剤の美容的使用。皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法に従って得ることが可能な、少なくとも1つのマイクロRNAの阻害剤。古典的な培養条件下における少なくとも37回の集団倍加の後に得られるケラチン生成細胞。したがって、細胞の老化、特に、ケラチン生成細胞の老化を防止するか、低減するか、なおまたは阻害する生成物または活性作用剤activeagentを提供することが望ましく、かつ、重要である。したがって、本発明は、このような有用な作用剤を同定する方法を提供する。したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるhydratingための候補化合物をスクリーニングするinvitroインビトロの方法であって、以下のステップ:a.少なくとも1つの被験化合物を、ケラチン生成細胞keratinocyteの試料と接触させるステップと、b.前記ケラチン生成細胞における少なくとも1つのマイクロRNAの発現または活性を測定するステップと、c.a.で処置されたケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップとを含む方法に関する。ケラチン生成細胞は、前老化presenescentケラチン生成細胞であることが好ましい。したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするinvitroの方法であって、以下のステップ:a.少なくとも1つの被験化合物を、前老化ケラチン生成細胞の試料と接触させるステップと、b.前記前老化ケラチン生成細胞における少なくとも1つのマイクロRNAの発現または活性を測定するステップと、c.a.で処置された前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていない前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物を選択するステップとを含む方法に関する。前老化ケラチン生成細胞とは、検出可能なレベルこのレベルは、ウェスタンブロットにより決定することができるでp16を発現するが、ベータ-ガラクトシダーゼは発現しない細胞を意味し、これらは、ベータ-gal陰性である。これらの細胞は、若齢のyoungケラチン生成細胞より増殖が緩慢である。第1の実施形態によれば、ステップb.をステップa.の前および後に実施する。この場合、ステップa.の前に、ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において測定されるマイクロRNAの発現または活性は、対照値すなわち、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは処置されていない前老化ケラチン生成細胞に対応する。したがって、ステップc.は、a.で処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、ステップa.の前の同じケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物の選択を含む。別の実施形態によれば、本方法が、ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料を調製する第1のステップa’.を含む。したがって、本発明は、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための候補化合物をスクリーニングするinvitroの方法であって、以下のステップ:a’.ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の少なくとも2つの試料を調製するステップと、a.試料のうちの1つを、少なくとも1つの被験化合物と接触させるステップと、次いで、b.前記試料における少なくとも1つのマイクロRNAの発現または活性を測定するステップと、c.a.で処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料と比較して測定される化合物を選択するステップとを含む方法に関することが好ましい。この第2の実施形態では、ステップa.にかけられていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料において測定されるマイクロRNAの発現または活性が、対照値すなわち、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは処置されていない前老化ケラチン生成細胞に対応する。皮膚の加齢という表現は、これが、例えば、皺および小皺、皮膚の干からび、皮膚のたるみ、皮膚の薄層化、ならびに弾力性および/または張りを失った皮膚など、時間生物学的なものであれ、かつ/または光誘導性のものであれ、加齢による皮膚の外見における任意の変化を意図し、また、例えば、紫外線放射に曝露された後における皮膚、特に、コラーゲンの任意の内的分解など、外見の変化により組織的に反映されるわけではない、皮膚における任意の内的変化も意図する。皮膚に潤いを与えることとは、皮膚の天然湿潤性naturalhumidityを維持し、その乾燥を防止することを意味する。ステップb.における対象のmiRは、p63タンパク質および/もしくはp63mRNAならびに/または対応する遺伝子すなわち、ヒトにおけるTP63を標的とすることが好ましい。したがって、ステップb.における対象のmiRは、TP63遺伝子またはp63mRNAを標的とすることが好ましい。miRは、miR-130a、miR-138、miR-181a、およびmiR-191からなる群から選択されることが好ましい。miR-130aとは、配列番号1である。配列番号1は、配列HGNC:31514である。miR-138とは、配列番号2である。配列番号2は、配列HGNC:31524である。miR-181aとは、配列番号3である。配列番号3は、配列HGNC:31590である。miR-191とは、配列番号4である。配列番号4は、配列HGNC:31561である。これらの配列は、HGNCデータベースに由来する。調べる被験化合物は、任意の種類でありうる。被験化合物は、天然由来の場合もあり、または化学合成により生成させた場合もある。これは、構造的に明確な化合物、特徴づけされていない化合物もしくは物質、または化合物の混合物のライブラリーを含みうる。天然の化合物には、植物および動物など、動物由来または植物由来の化合物が含まれる。被験化合物は、植物性であることが好ましく、植物性抽出物から選択されることが好ましい。上記のステップa’.およびステップa.において用いられる前老化ケラチン生成細胞は、複製老化の細胞モデルである。これらの前老化ケラチン生成細胞は、古典的な培養条件classicalcultureconditions下における37回の集団倍加populationdoublingsの後に得られる。古典的な培養条件は、HKGS増殖補充物を添加したEpilife培地中で、常にconstantlyサブコンフルエントsubconfluent状態に保持されるケラチン生成細胞の培養cultureを含む。好ましくは、前老化ケラチン生成細胞は、以下の工程の結果得られる:ヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞を、適切な培地中で培養する。このような培地は、HKGS増殖補充物を添加したEpiLife培地でありうる。細胞は、常にサブコンフルエント状態に保持する。細胞は、適切な時点、通常は毎週1回継代する。各継代では、細胞の一部を回収および分析して、集団倍加、集団倍加時間、老化についての生化学的マーカー、および細胞周期を測定する。ヒト初代ケラチン生成細胞の集団倍加は、40日間にわたる培養期間において測定する。37回の集団倍加の後、増殖曲線はプラトー状態となり、細胞が分裂を停止し、老化状態に達することが示される。増殖マーカーp63、分化マーカーK10、および老化マーカーp16/INKの解析から、増殖マーカーが減少する間に細胞が分化していないことが示唆される。4代目の継代後、37回の集団倍加で、細胞は、複製老化を起こす。加えて、老化中に、増殖細胞の百分率が低下する。ステップa.によれば、被験化合物を、ケラチン生成細胞の試料、好ましくは前老化ケラチン生成細胞の試料と接触させる。ステップb.によれば、前記ケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において少なくとも1つのマイクロRNAの発現および/または活性を測定する。マイクロRNAの発現という用語は、生成するマイクロRNAの量を意味することを意図する。マイクロRNAの活性という用語は、前記マイクロRNAが、それがハイブリダイズするmRNAのレベルを阻害する能力を意味することを意図する。当業者は、前記マイクロRNAがハイブリダイズするmRNAを定量的または半定量的に検出し、したがって、前記マイクロRNAの活性を決定する技法に精通している。mRNAが特定のヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることに基づく技法は、ノーザンブロット法、RT-PCR逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応、定量的RT-PCRqRT-PCRなど、最も一般的な技法である。当業者はまた、マイクロRNA、または前記マイクロRNAがハイブリダイズするmRNAを定量的または半定量的に検出する技法にも精通している。特に、マイクロRNAの発現は、リアルタイムPCRにより測定することができる。マイクロRNAの活性は、mRNA標的についてのリアルタイムPCRにより測定することもでき、またはウェスタンブロットによって標的のタンパク質レベルを評価することにより測定することもできる。代替的に、標的が未知の場合は、ベータ-gal染色または増殖に対する効果など、マイクロRNA自体の生物学的効果を評価することにより、マイクロRNAの活性を調べることもできる。マイクロRNAの発現は、リアルタイムPCRにより測定することが好ましい。次いで、被験化合物による処置後におけるマイクロRNAの発現または活性を、対照値と比較する、すなわち、処置前における同じケラチン生成細胞好ましくは前老化ケラチン生成細胞において得られた値、または処置されていないケラチン生成細胞好ましくは前老化ケラチン生成細胞の別の試料において得られた値と比較する。ステップc.によれば、有用な化合物は、処置されたケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞において、少なくとも1つのマイクロRNAの発現のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害、または少なくとも1つのマイクロRNAの活性のうちの少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40の阻害が、処置されていないケラチン生成細胞、好ましくは前老化ケラチン生成細胞と比較して測定される化合物である。前記マイクロRNAの発現または活性の阻害は、少なくとも50、好ましくは少なくとも60であることが好ましい。本明細書で規定されるスクリーニング法により選択された化合物は、その後、皮膚の加齢および/または皮膚への水分補給skinhydrationに対するそれらの効果について、他のinvitroモデルおよび/またはinvivoモデル動物またはヒトによるモデルにおいて調べることができる。本発明に従う有用な化合物は、標的とするマイクロRNAの阻害剤である。本発明の対象はまた、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための、上記で説明した方法に従って同定される少なくとも1つのマイクロRNA阻害剤の美容的使用cosmeticuseでもある。別の態様によれば、本発明の目的は、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための治療組成物を作製するための、上記で説明した方法に従って同定される、少なくとも1つのマイクロRNAの阻害剤の使用である。したがって、本発明はまた、皮膚の加齢を防止および/もしくは減弱し、並びに/または皮膚に潤いを与えるための、上記で説明した方法に従って同定される、少なくとも1つのマイクロRNAの阻害剤の使用にも関する。阻害剤とは、マイクロRNAの発現または活性を消失させるかまたは実質的に低減する化合物を指す。実質的にという用語は、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、好ましくは少なくとも40、好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも60の低減を意味する。マイクロRNA阻害剤は、組成物の0.001~10重量の比率で、好ましくは、組成物の0.01~5重量の比率で用いることができる。阻害剤は、アンチセンスDNAポリヌクレオチドまたはアンチセンスRNAポリヌクレオチドの場合もあり、またはsiRNAの場合もある。マイクロRNAmiRの阻害剤は、抗miRであることが好ましい。抗miRとは、内因性miRを特異的に阻害するmiR阻害剤である。抗miRとは、内因性マイクロRNA分子に特異的に結合し、これを阻害するようにデザインされた一本鎖核酸である。抗miRは、標的miRの配列に相補的な核配列を有する。これらのすぐに使用できる阻害剤は、siRNAに用いられるトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータと同様のトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータを用いて細胞内に導入することができ、miRの生物学的効果についての詳細な研究を可能とする。抗miRの使用は、miR活性の下方制御を介するmiRについての機能的解析を可能とする。抗miRは市販されており、例えば、AmbionまたはAppliedBiosystemsを介して得ることができる。文献に基づくと、miRの発現を70阻害すると、ヒト正常細胞における老化の誘導/阻害に影響が及ぶ可能性があるMenghiniR、CasagrandeV、CardelliniM、MartelliE、TerrinoniA、AmatiF、VasaNicoteraM、IppolitiA、NovelliG、MelinoG、LauroR、FedericiM、MicroRNA217modulatesendothelialcellsenescenceviasilentinformationregulator、1、Circulation、2009、1201524~32。上記で説明したスクリーニング法により同定されるmiR阻害剤は、生理学的に許容される担体、好ましくは、美容的に許容される媒体、すなわち、毒性、非適合性、不安定性、またはアレルギー反応の危険性なしにヒトの皮膚と接触させて用いるのに適し、とりわけ、使用者に許容されない不快感発赤、突っ張り、刺痛などを引き起こすことのない媒体と組み合わせて、組成物中に調合することができる。これらの組成物は、例えば、経口投与することもでき、または局所投与することもできる。組成物は、局所適用することが好ましい。経口投与を介する場合、組成物は、錠剤、ゲル状カプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態でありうる。局所投与を介する場合、組成物は、より具体的に、皮膚および粘膜の治療における使用のためであり、軟膏salve、クリーム、ミルク、軟膏ointment、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態でありうる。組成物はまた、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質小胞もしくはポリマー小胞、またはポリマーパッチ、またはハイドロゲルの形態でもありうる。この局所適用のための組成物は、無水物形態の場合もあり、水性形態の場合もあり、またはエマルジョン形態の場合もある。局所適用のための組成物は、場合によってマイクロエマルジョンの場合もありナノエマルジョンの場合もある水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、または多重エマルジョンW/O/WまたはO/W/Oの形態の場合もあり、または水性分散液、溶液、水性ゲル、または粉末の形態の場合もある。好ましい変化形では、組成物が、ゲル、クリーム、またはローションの形態である。組成物の生理学的に許容される担体は一般に、水、および、場合によって、エタノールなど、他の溶媒を含む。本組成物は、顔面および/または身体の皮膚のためのケア製品および/またはクレンジング製品として用いることが好ましく、とりわけ、例えば、ポンプ式のディスペンサーボトル、エアゾールまたはチューブ内でコンディショニングされた流体、ゲルまたはムースの形態の場合もあり、または例えば、ジャー内でコンディショニングされたクリームの形態の場合もある。変化形として、組成物は、メーキャップ製品の形態の場合もあり、特に、ファウンデーションまたはルースパウダーもしくはコンパクトパウダーの形態の場合もある。組成物は、とりわけ、ポリジメチルシロキサンジメチコン、ポリアルキルシクロシロキサンシクロメチコン、およびポリアルキルフェニルシロキサンフェニルジメチコンなど、直鎖状または環状の、揮発性または非揮発性のシリコーン油;フルオロ油、アルキル安息香酸、および、ポリイソブチレンなどの分枝状炭化水素など、合成油;植物油、および、とりわけ、ダイズ油またはホホバ油;ならびに液体石油ゼリーなどの鉱油から選択されうる油;オゾケライト、ポリエチレン蝋、蜜蝋、またはカルナウバ蝋などの蝋;とりわけ、触媒の存在下における、少なくとも1つの反応基とりわけ、水素またはビニルを含有し、末端位および/または側鎖位において、少なくとも1つのアルキル基とりわけ、メチルまたはフェニルを保有するポリシロキサンの、有機水素ポリシロキサンorganohydrogenopolysiloxaneなどの有機シリコーンとの反応により得られるシリコーンエラストマー;界面活性剤、好ましくは、非イオン性であれ、アニオン性であれ、カチオン性であれ、または両親媒性であれ、乳化性の界面活性剤であり、特に、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、およびスクロースの脂肪酸エステルなど、ポリオールの脂肪酸エステル;ポリエチレングリコールの脂肪族アルキルエーテル;アルキルポリグルコシド;ポリシロキサン修飾されたポリエーテル;ベタインおよびその誘導体;ポリクォタニウム;エトキシル化された脂肪族アルキル硫酸塩;スルホサクシネートsulfosuccinate;サルコシネートsarcosinate;アルキルホスフェートおよびジアルキルホスフェートならびにこれらの塩;ならびに脂肪酸による石鹸;直鎖状脂肪族アルコール、ならびに、特に、セチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの共界面活性剤;増粘剤thickenerおよび/またはゲル化剤、および、特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸AMPSおよび/またはアクリルアミドおよび/またはアクリル酸および/またはアクリル酸塩もしくはアクリル酸エステルの、架橋形成されるかまたは架橋形成されない、親水性または両親媒性のホモポリマーおよびコポリマー;キサンタンガムまたはグアルガム;セルロースの誘導体;ならびにシリコーンガムジメチコノール;ジベンゾイルメタン誘導体ブチルメトキシジベンゾイルメタンを含む、ケイ皮酸誘導体エチルヘキシルメトキシケイ皮酸を含む、サリチル酸、パラアミノ安息香酸、β,β’-ジフェニルアクリル酸、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファー誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾール、およびアントラニル誘導体などの有機スクリーニング剤;コーティングされるかまたはコーティングされない色素またはナノ色素の形態における鉱物酸化物に基づく無機スクリーニング剤、および、特に、二酸化チタンまたは酸化亜鉛に基づく無機スクリーニング剤;染料;防腐剤;EDTA塩などの封鎖剤sequestrant;芳香剤;ならびにこれらの混合物から選択される少なくとも1つの化合物など、各種のアジュバントを含みうるが、この列挙を限定的とするものではない。このようなアジュバントの例は、とりわけ、皮膚ケア業界で通常用いられる、限定なしに多種多様な美容成分および医薬成分であって、本発明に従う組成物中のさらなる成分として用いるのに適する美容成分および医薬成分を説明する、CTFAによる辞典InternationalCosmeticIngredientDictionaryandHandbook、TheCosmeticToiletryandFragranceAssociation刊、第11版、2006において言及されている。組成物はまた、充填剤、色素、ナクレ、伸長剤、およびマッティングポリマー、ならびにこれらの混合物など、光学的効果を伴う少なくとも1つの化合物も含みうる。充填剤という用語は、組成物体に、剛性および/または柔軟性、マット効果、ならびに、適用直後の均一性を与えるのに適する、無色もしくは白色、鉱物性もしくは合成性、層状もしくは非層状の粒子を意味するものとして理解されたい。とりわけ言及されうる充填剤には、滑石、雲母、シリカ、カオリン、Nylon-12Atochem社により市販されているOrgasol登録商標などのNylon登録商標粉末、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、場合によって、修飾デンプン、Tospearl登録商標の商標名でToshiba社により市販されているシリコーン樹脂マイクロビーズなどのシリコーン樹脂マイクロビーズ、ヒドロキシアパタイト、およびシリカ製中空マイクロスフェアMaprecos社製のSilicaBeads登録商標が含まれる。色素という用語は、媒体中で不溶性の白色もしくは有色、鉱物性もしくは有機性の粒子であって、組成物を着色し、かつ/または不透明化させることを意図する粒子を意味するものとして理解されたい。色素は、標準サイズの場合もあり、ナノメートルサイズの場合もある。言及されうる鉱物性色素の中では、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、および二酸化セリウムがあり、また、酸化亜鉛、酸化鉄、および酸化クロムもある。ナクレという用語は、光を反射する虹色の粒子を意味するものとして理解されたい。想定されうるナクレの中では、天然の真珠層、酸化チタン、酸化鉄、天然色素、またはオキシ塩化ビスマスでコーティングした雲母について言及することができ、また、着色したチタン雲母についても言及することができる。水性相におけるこれらの充填剤および/または色素および/またはナクレの質量濃度は一般に、組成物の総重量に対する比で、0.1重量~20重量、および好ましくは0.2重量~7重量である。伸長剤tensioningagentという用語は、皮膚を突っ張らせ、この伸長効果により、皮膚を滑らかにし、皺およびこれらに由来する小皺を軽減するか、なおまたはこれらを即時に消失させるのに適する化合物を意味するものとして理解されたい。言及されうる伸長剤には、天然由来のポリマーが含まれる。天然由来のポリマーという用語は、植物由来のポリマー、外皮に由来するポリマー、卵タンパク質、および天然由来のラテックスを意味する。これらのポリマーは、親水性であることが好ましい。とりわけ言及されうる植物由来のポリマーには、タンパク質およびタンパク質の加水分解物、ならびに、より具体的に述べると、トウモロコシ抽出物、ライムギ抽出物、コムギ抽出物、ソバ抽出物、ゴマ抽出物、スペルトコムギ抽出物、エンドウ抽出物、マメ抽出物、レンティル抽出物、ダイズ抽出物、およびルピン抽出物など、穀類抽出物、マメ科植物抽出物、および油産生植物の抽出物が含まれる。合成ポリマーは一般に、ラッテクスまたはシュードラテックスの形態にあり、重縮合体型ポリマーの場合もあり、またはフリーラジカルの重合化により得られる場合もある。とりわけ、ポリエステル/ポリウレタン分散液、およびポリエーテル/ポリウレタン分散液について言及しうる。伸長剤は、PVP/アクリル酸ジメチコニルと親水性ポリウレタンとのコポリマーHydromer社製のAquamereS-2001登録商標であることが好ましい。本明細書において、用語マッティングポリマーとは、溶液中、分散液中、または粒子形態中の任意のポリマーであって、皮膚のテカリを抑制し、肌の色を統一するポリマーを意味する。言及されうる例には、シリコーンエラストマー、樹脂粒子、およびこれらの混合物が含まれる。言及されうるシリコーンエラストマーの例には、Shin-Etsu社によりKSG登録商標の商標名で市販されている製品、DowCorning社によりTrefil登録商標、BY29登録商標、またはEPSX登録商標の商標名で市販されている製品またはGrantIndustries社によりGransil登録商標の商標名で市販されている製品が含まれる。本発明に従い用いられる組成物はまた、マイクロRNA阻害剤以外の活性作用剤も含む場合があり、特に、増殖因子の生成を刺激する作用剤;抗糖化剤または脱糖化剤;コラーゲンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する作用剤抗コラゲナーゼ剤、および、とりわけ、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤;エラスチンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する作用剤抗エラスターゼ剤;インテグリン、またはテンシンなど、焦点接着成分の合成を刺激する作用剤;グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンの合成を増大させるか、またはそれらの分解を防止する作用剤抗プロテオグリカナーゼ剤;線維芽細胞の増殖を増大させる作用剤;脱色素沈着剤または抗色素沈着剤;抗酸化剤もしくはフリーラジカルスカベンジャー、または抗汚染剤;ならびにこれらの混合物から選択される少なくとも1つの活性作用剤を含む場合があるが、この列挙を限定的とするものではない。このような作用剤の例は、とりわけ、植物抽出物、特に、コンドルスクリスプスChondruscrispus抽出物、テルムステルモフィルスThermusthermophilus抽出物、アラスカエンドウPisumsativum抽出物Proteasyl登録商標TPLS、ツボクサCentellaasiatica抽出物、イカダモScenedesmus抽出物、ワサビノキMoringapterygosperma抽出物、マンサク抽出物、セイヨウグリCastaneasativa抽出物、ローゼルHibiscussabdriffa抽出物、ゲッカコウPolianthestuberosa抽出物、アルガンツリーArganiaspinosa抽出物、アロエベラAloevera抽出物、フサザキスイセンNarcissustarzetta抽出物、または甘草抽出物;ダイダイCitrusaurantiumのエッセンシャルオイルネロリ;グリコール酸、乳酸、およびクエン酸などのα-ヒドロキシ酸、ならびにこれらのエステル;サリチル酸などのβ-ヒドロキシ酸、およびこれらの誘導体;植物タンパク質の加水分解物とりわけ、ダイズの加水分解物、またはヘーゼルナッツの加水分解物;アクリル化オリゴペプチドMaxilip登録商標、Matrixyl登録商標3000、Biopeptide登録商標CL、またはBiopeptide登録商標ELの商標名で、とりわけ、Sederma社により市販されている;酵母抽出物、および、特に、出芽酵母Saccharomycescerevisiae抽出物;藻類抽出物、および、特に、コンブ抽出物;パルミチン酸レチニル、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウムまたはリン酸アスコルビルナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、ソルビン酸アスコルビル、トコフェロール、酢酸トコフェリル、およびソルビン酸トコフェリルなど、ビタミンおよびそれらの誘導体;アルブチン;コウジ酸;エラグ酸;ならびにこれらの混合物である。変化形として、または加えて、本発明に従い用いられる組成物は、とりわけLaboratoiresSerobiologiques/CognisFrance社により、ProteasylTPLS登録商標の商標名で市販されている、アラスカエンドウPisumsativum種子抽出物など、少なくとも1つのエラスターゼ阻害剤抗エラスターゼ剤を含みうる。組成物はまた、保湿剤、安定化剤、水分制御剤、pH制御剤、浸透圧調節剤、またはUV-AスクリーンおよびUV-Bスクリーンなど、不活性添加剤またはこれらの添加剤の組合せも含有しうる。以下の例は、本発明を、その範囲を限定することなしに例示する。これらの例は、以下に列挙される図面に基づく。老化ケラチン生成細胞モデルの構築材料および方法細胞培養およびトランスフェクションヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞Hekn、Cascade、Invitrogen、Carlsbad、California、USAを、HKGS増殖補充物Cascadeを添加したEpiLife培地中で培養した。分化過程の誘発を回避するため、細胞を、常にサブコンフルエント状態に保持した。細胞は通常、毎週1回継代し、継代間に生じる集団倍加および集団倍加時間を計算するため、各継代時に、採取した細胞数および播種した細胞数を記録した。各継代時に、異なる細胞アリコートを採取して、三連でtriplicateRNAおよびタンパク質を抽出し、これらの細胞の老化状態または非老化状態をアッセイするために、アリコートを老化活性化β-ガラクトシダーゼ染色にかけた。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレート内で増殖させ、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時におけるブロモデオキシウリジンBrdUなどのチミジン類似体の取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗p63Ab4、Neomarkers、Fremont、California、USA、希釈率を1/500とする、ポリクローナル抗K10Covance、Princeton、NewJersey、USA、希釈率を1/1000とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とする、抗p16体SantaCruzBiotechnology、California、USA、希釈率を1:1000とするを用いた。結果ヒト新生児初代ケラチン生成細胞における複製老化モデルの確立ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLife培地中で培養した。老化状態に到達するまで、細胞を培養し、連続的に継代した。図1Aは、40日間にわたる培養におけるヒト初代ケラチン生成細胞の集団倍加を示している。37回の集団倍加の後、増殖曲線はプラトーを有し、細胞が分裂を停止し、老化状態に達するreachingことが示される。p1、p3、p4、およびp5において細胞を回収し、p63、サイトケラチン10K10およびp16/INK4aについてのウェスタンブロット解析を実施した。p63の発現が低下し、p16/INK4aのレベルが上昇することから、細胞は複製老化状態に入っていることが示されるが、初代継代~4代目の継代においてサイトケラチン10が見られないことにより示されるとおり、分化しているわけではないことが示される。β-アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。ヒト初代ケラチン生成細胞は、4代目の継代後、37回の集団倍加で、複製老化を起こす。異なる継代でのヒト初代ケラチン生成細胞においてSA-β-ガラクトシダーゼ染色により染色すると、より老齢の細胞p4における老化マーカーの発現が示される。異なる継代でのBrdU陽性ヒト初代ケラチン生成細胞の百分率により示されるとおり、老化時には、増殖細胞の百分率が低下している。BrdUの取込みは、Click-iT法を用いて評価した。本例で得られた細胞を、老化ケラチン生成細胞のモデルとし、前老化ケラチン生成細胞と称する。ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるmiR-130aの発現材料および方法細胞培養およびトランスフェクション本例では、実施例1で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物Cascadeの入ったEpiLife培地中で培養し、分化過程を誘導するために、1.2mMのCaCl2で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、処置の7日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、SiPORTneoFXトランスフェクション剤Ambionを用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトpre-miR-130a、抗miR-130a、およびCy3で標識した陰性対照Ambion、Texas、USAでトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。800,000個のヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、48時間後に細胞を採取した。10のFBS、100Uのペニシリン、100μgのストレプトマイシンを伴うD-MEMHighglucoseGIBCO、Invitrogen中で、HEK293E細胞を増殖させた。製造元Invitrogenのプロトコールに従い、Lipofectamine2000により、HEK293E細胞をトランスフェクトした。Hekn細胞を、48時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しmRNAを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムPCRを実施した。RNAの抽出およびリアルタイムPCR解析全RNA抽出のための製造元のプロトコールに従い、mirVanamirRNAIsolationKitAmbionを用いて、細胞または組織から全RNAを単離した。NanoDropSpectophotometerThermoScientific、Delaware、USAを用いて全RNAを定量化し、アガロースゲル上でRNAの品質を調節した。マイクロRNAを検出するため、TaqManMicroRNAReverseTranscriptionキットを用いてRNAを逆転写し、TaqManuniversalmastermixAppliedBiosystemおよびmiR-130aに特異的なプライマーによりqRT-PCRを実施した。U18AppliedBiosystemを内部対照として用いた。各遺伝子およびmiRの発現は、閾値サイクルCtから規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるU18の発現に照らして標準化した後に、2-ΔΔCt法を用いることにより計算した。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレート内で増殖させ、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時におけるブロモデオキシウリジンBrdUなどのチミジン類似体の取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。構築物以下のプライマー:p63UTR-SpeIF5’-GGCCACTAGTGCCTCACCATGTGAGCTCTTC-3’;配列番号5p63UTR-SpeIR5’-GGCCACTAGTGCATGTCCTGGCAAACAAAAAGAG-3’配列番号6を用いて、ヒトゲノムDNAに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトp63の3’UTRをPCRにより増幅した。2770bpの断片すなわち、p633’UTRwtを、SpeIによる制限後、XbaIにより直鎖化した適合性のpGL3対照ベクターPromega、Madison、Wisconsin、USAにライゲーションした。他方、以下の重複するプライマー:Del130F5’-TTAAATGAAAGAAAATTGAGTATTGACCATTTTTTAATT-3’;配列番号7Del130R5’-AATTAAAAAATGGTCAATACTCAATTTTCTTTCATTTAA-3’配列番号8を用いるPCRを介して、この野生型配列から、miR-130aの予測される標的部位7bp、UUGCACUを欠失させた。こうして、p633’UTRmiR-130adelが得られる。バイオインフォマティックスhttpwwwtargetscanorgにおいて入手可能なTargetScan5.1ソフトウェアを用いて、p63の3’UTRにおけるmiR-130a標的部位の解析を実施した。ルシフェラーゼアッセイ2×105個のHEK293E細胞を、トランスフェクションの24時間前に12ウェルディッシュに播種した。細胞を、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、100ngのpGL3ベクターすなわち、p633’UTRwtまたはp633’UTRmiR-130adel、12ピコモルのpre-miR-130aまたはpre-miRのスクランブル配列Ambion、および10ngのウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼpRL-CMVベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、DualLuciferaseReporterAssaySystemPromegaを用いることにより、トランスフェクションの24時間後に測定し、発光は、OPTOCOMPIluminometerを用いて、10秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗p63Ab4、Neomarkers、Fremont、California、USA、希釈率を1/500とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とする、抗p16SantaCruzBiotechnology、California、USA、希釈率を1:1000とするを用いた。結果老化および分化するケラチン生成細胞におけるmiR-130aレベルp1およびp4において、細胞を回収し、リアルタイムPCRを実施した。p1~p4の間においてmiR-130aレベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるmiR-130a発現の著明な増大が示される:p4では、miR-130aの発現が、p1におけるその発現1.00±0.07に等しいより約1.48±0.08高値である。これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、0日目には1.00±0.07であるのに対して、7日間にわたるカルシウム処置の後には、miR-130a発現が約0.347±0.04である。したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、miR-130aの発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、miR-130aの発現の増大と関連しない。miR-130aは、3’UTRにおいて、p63のmRNAを標的とするバイオインフォマティックス解析は、p63が、miR-130aの推定標的であることを示す図2A。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にp633’UTRwtを挿入すると、pre-miR-130aの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する対照に対して0.503±0.05倍。さらなる対照細胞には、陽性対照としてpre-miR-203p633’UTRを標的とする既知のmiRでトランスフェクトした:この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して0.58±0.0096倍である図2B。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にp633’UTRmiR-130adelを挿入すると、pre-miR-130aの存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる対照に対して0.89±0.0537倍。pre-miR-203でトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して0.56±0.013倍のルシフェラーゼ活性を示す図2B。図2Cに示すとおり、pre-miR-130aでトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列でトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞と対比して、p63タンパク質が顕著に減少する。miR-130aが過剰発現する結果として、miR-130aを過剰発現させるケラチン生成細胞は、細胞老化のマーカーであるp16/INK4aの発現の増大を示す。β-アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらの結果は、miR-130aが、3’UTRにおいてp63mRNAを標的とすることを示唆する。合成化合物によるmiR-130aの調節ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、濃度の異なる抗miR-130aで処置した。リアルタイムPCRを用いてmiR-130aレベルの相対的定量化を行うために、48時間後に細胞を採取した。抗miR-130aは、処置されていない細胞と対比して、miR-130aレベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるmiR-130aの発現は、わずかに0.138±0.032である対してスクランブルでは1.00±0.01である図3。ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるmiR-138の発現材料および方法細胞培養およびトランスフェクション本例では、実施例1で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物Cascadeの入ったEpiLife培地中で培養し、分化過程を誘導するために、1.2mMのCaCl2で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、処置の7日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、SiPORTneoFXトランスフェクション剤Ambionを用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトpre-miR-138、抗miR-138、およびCy3で標識した陰性対照Ambion、Texas、USAでトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。800,000個のヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、48時間後に細胞を採取した。10のFBS、100Uのペニシリン、100μgのストレプトマイシンを伴うD-MEMHighglucose培地GIBCO、Invitrogen中で、HEK293E細胞を増殖させた。製造元Invitrogenのプロトコールに従い、Lipofectamine2000により、HEK293E細胞をトランスフェクトした。Hekn細胞を、48時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しmRNAを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムPCRを実施した。RNAの抽出およびリアルタイムPCR解析全RNA抽出のための製造元のプロトコールに従い、mirVanamirRNAIsolationKitAmbionを用いて、細胞または組織から全RNAを単離した。NanoDropSpectophotometerThermoScientific、Delaware、USAを用いて全RNAを定量化し、アガロースゲル上でRNAの品質を調節した。マイクロRNAを検出するため、TaqManMicroRNAReverseTranscriptionキットを用いてRNAを逆転写し、TaqManuniversalmastermixAppliedBiosystemおよびmiR-138に特異的なプライマーによりqRT-PCRを実施した。U18AppliedBiosystemを内部対照として用いた。各遺伝子およびmiRの発現は、閾値サイクルCtから規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるU18の発現に照らして標準化した後に、2-ΔΔCt法を用いることにより計算した。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレート内で増殖させ、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時におけるブロモデオキシウリジンBrdUなどのチミジン類似体の取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。構築物以下のプライマー:pSirT1UTR-StyIF5’-GACCCTAGGAGATGATCAAGAGGC-3’;配列番号9pSirT1UTR-StyIR5’-GCCTAGGAAGCTGTACAAATTGCT-3’配列番号10を用いて、ヒトゲノムDNAに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトSirt-1の3’UTRをPCRにより増幅した。1940bpの断片すなわち、pSirT13’UTRwtを、SpeIによる制限後、XbaIにより直鎖化した適合性のpGL3対照ベクターPromega、Madison、Wisconsin、USAにライゲーションした。他方、以下の重複するプライマー:Del138F5’-GCAGGTACAGGAATTGTTCCTTAGGAACTTTAGCATGTC-3’;配列番号11Del138R5’-GACATGCTAAAGTTCCTAAGGAACAATTCCTGTACCTGC-3’配列番号12を用いるPCRを介して、この野生型配列から、miR-138の予測される標的部位7bp、CACCAGCAを欠失させた。こうして、SirT13’UTRmiR-138delが得られる。バイオインフォマティックスhttpwwwtargetscanorgにおいて入手可能なTargetScan5.1ソフトウェアを用いて、Sirt-1の3’UTRにおけるmiR-138標的部位の解析を実施した。ルシフェラーゼアッセイ2×105個のHEK293E細胞を、トランスフェクションの24時間前に12ウェルディッシュに播種した。細胞を、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、100ngのpGL3ベクターすなわち、Sirt-13’UTRwtまたはSirt-13’UTRmiR-138del、12ピコモルのpre-miR-138またはpre-miRのスクランブル配列Ambion、および10ngのウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼpRL-CMVベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、DualLuciferaseReporterAssaySystemPromegaを用いることにより、トランスフェクションの24時間後に測定し、発光は、OPTOCOMPIluminometerを用いて、10秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗Sirt-1Abcam、Cambridge、UnitedKingdom、希釈率を1/500とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とするを用いた。結果老化および分化するケラチン生成細胞におけるmiR-138レベルp1およびp4において、細胞を回収し、リアルタイムPCRを実施した。p1~p4の間においてmiR-138レベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるmiR-138発現の著明な増大が示される:p4では、miR-138の発現が、p1におけるその発現1.00±0.05に等しいより約2.76±0.06高値である。これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、0日目には1.00±0.02であるのに対して、7日間にわたるカルシウム処置の後には、miR-138発現が約0.21±0.02である。したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、miR-138の発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、miR-138の発現の増大と関連しない。miR-138は、3’UTRにおいて、Sirt-1のmRNAを標的とするバイオインフォマティックス解析は、SirT1が、miR-138の推定標的であることを示す図4A。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にSirt-13’UTRwtを挿入すると、pre-miR-138の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する対照に対して0.39±0.014倍。さらなる対照細胞には、陽性対照としてpre-miR-217Sirt-13’UTRを標的とする既知のmiRでトランスフェクトした:この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して0.35±0.009倍である図4B。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にSirt-13’UTRmiR-138delを挿入すると、pre-miR-138の存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる対照に対して0.78±0.03倍。pre-miR-217をトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して0.4±0.008倍のルシフェラーゼ活性を示す図4B。図4Cに示すとおり、pre-miR-138をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞Ctrlと対比して、SirT1タンパク質が顕著に減少する。β-アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、SirT1がmiR-138標的であることを裏付ける。合成化合物によるmiR-138の調節ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、濃度の異なる抗miR-138で処置した。リアルタイムPCRを用いてmiR-138レベルの相対的定量化を行うために、48時間後に細胞を採取した。抗miR-138は、処置されていない細胞と対比して、miR-138レベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるmiR-138の発現は、わずかに0.032±0.026である図5。ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるmiR-181aの発現材料および方法細胞培養およびトランスフェクション本例では、実施例1で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物Cascadeの入ったEpiLife培地中で培養し、分化過程を誘導するために、1.2mMのCaCl2で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、処置の7日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、SiPORTneoFXトランスフェクション剤Ambionを用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトpre-miR-181a、抗miR-181a、およびCy3で標識した陰性対照Ambion、Texas、USAでトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。800,000個のヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、48時間後に細胞を採取した。10のFBS、100Uのペニシリン、100μgのストレプトマイシンを伴うD-MEMHighglucose培地GIBCO、Invitrogen中で、HEK293E細胞を増殖させた。製造元Invitrogenのプロトコールに従い、Lipofectamine2000により、HEK293E細胞をトランスフェクトした。Hekn細胞を、48時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しmRNAを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムPCRを実施した。RNAの抽出およびリアルタイムPCR解析全RNA抽出のための製造元のプロトコールに従い、mirVanamirRNAIsolationKitAmbionを用いて、細胞または組織から全RNAを単離した。NanoDropSpectophotometerThermoScientific、Delaware、USAを用いて全RNAを定量化し、アガロースゲル上でRNAの品質を調節した。マイクロRNAを検出するため、TaqManMicroRNAReverseTranscriptionキットを用いてRNAを逆転写し、TaqManuniversalmastermixAppliedBiosystemおよびmiR-181aに特異的なプライマーによりqRT-PCRを実施した。U18AppliedBiosystemを内部対照として用いた。各遺伝子およびmiRの発現は、閾値サイクルCtから規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるU18の発現に照らして標準化した後に、2-ΔΔCt法を用いることにより計算した。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレート内で増殖させ、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時におけるブロモデオキシウリジンBrdUなどのチミジン類似体の取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。構築物以下のプライマー:pSirT1UTR-StyIF5’-GACCCTAGGAGATGATCAAGAGGC-3’;配列番号13pSirT1UTR-StyIR5’-GCCTAGGAAGCTGTACAAATTGCT-3’配列番号14を用いて、ヒトゲノムDNAに由来する、終止コドンの後の最初のヌクレオチドから、ポリアデニル化シグナルの前の最後のヌクレオチドまでのヒトSirt-1の3’UTRをPCRにより増幅した。1940bpの断片すなわち、pSirT13’UTRwtを、SpeIによる制限後、XbaIにより直鎖化した適合性のpGL3対照ベクターPromega、Madison、Wisconsin、USAにライゲーションした。他方、以下の重複するプライマー:Del181aF5’-GGAACTTTAGCATGTCAAAATTACTTGTGAACTCGATAGA-3’;配列番号15Del181aR5’-TCTATCGAGTTCACAAGTAATTTTGACATGCTAAAGTTCC-3’配列番号16を用いるPCRを介して、この野生型配列から、miR-181aの予測される標的部位7bp、UGAAUGUを欠失させた。こうして、SirT13’UTRmiR-181adelが得られる。バイオインフォマティックスhttpwwwtargetscanorgにおいて入手可能なTargetScan5.1ソフトウェアを用いて、Sirt-1の3’UTRにおけるmiR-181a標的部位の解析を実施した。ルシフェラーゼアッセイ2×105個のHEK293E細胞を、トランスフェクションの24時間前に12ウェルディッシュに播種した。細胞を、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、100ngのpGL3ベクターすなわち、Sirt-13’UTRwtまたはSirt-13’UTRmiR-181adel、12ピコモルのpre-miR-181aまたはpre-miRのスクランブル配列Ambion、および10ngのウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼpRL-CMVベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、DualLuciferaseReporterAssaySystemPromegaを用いることにより、トランスフェクションの24時間後に測定し、発光は、OPTOCOMPIluminometerを用いて、10秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗Sirt-1Abcam、Cambridge、UnitedKingdom、希釈率を1/500とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とするを用いた。結果老化および分化するケラチン生成細胞におけるmiR-181aレベルp1およびp4において、細胞を回収し、リアルタイムPCRを実施した。p1~p4の間においてmiR-181aレベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるmiR-181a発現の著明な増大が示される:p4では、miR-181aの発現が、p1におけるその発現1.00±0.03に等しいより約1.3±0.05高値である。これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、0日目には1.00±0.029であるのに対して、7日間にわたるカルシウム処置の後には、miR-181a発現が約0.93±0.029である。したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、miR-181aの発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、miR-181aの発現の増大と関連しない。miR-181aは、3’UTRにおいて、Sirt-1のmRNAを標的とするバイオインフォマティックス解析は、SirT1が、miR-181aの推定標的であることを示す図6A。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にSirt-13’UTRwtを挿入すると、pre-miR-181aの存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する対照に対して0.648±0.1倍。さらなる対照細胞には、陽性対照としてpre-miR-217Sirt-13’UTRを標的とする既知のmiRでトランスフェクトした:この場合におけるルシフェラーゼ活性は、対照に対して0.35±0.0096倍である図6B。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にSirt3’UTRmiR-181adelを挿入すると、pre-miR-181aの存在下におけるルシフェラーゼ活性の低下は僅少となる対照に対して0.93±0.09倍。pre-miR-217をトランスフェクトしたさらなる対照細胞は、対照に対して0.3±0.07倍のルシフェラーゼ活性を示す図6B。図6Cに示すとおり、pre-miR-181aをトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞Ctrlと対比して、SirT1タンパク質が顕著に減少する。β-アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、SirT1がmiR-181a標的であることを裏付ける。合成化合物によるmiR-181aの調節ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、濃度の異なる抗miR-181aで処置した。リアルタイムPCRを用いてmiR-181aレベルの相対的定量化を行うために、48時間後に細胞を採取した。抗miR-181aは、処置されていない細胞と対比して、miR-181aレベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるmiR-181aの発現は、わずかに0.075±0.052である対してスクランブルでは1.00±0.029である図7。ケラチン生成細胞の誘導性老化時におけるmiR-191の発現材料および方法細胞培養およびトランスフェクション本例では、実施例1で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物Cascadeの入ったEpiLife培地中で培養し、分化過程を誘導するために、1.2mMのCaCl2で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、処置の7日間後に分化した細胞を採取した。製造元のプロトコールに従い、SiPORTneoFXトランスフェクション剤Ambionを用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトpre-miR-191、抗miR-191、およびCy3で標識した陰性対照Ambion、Texas、USAでトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。800,000個のヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、被験化合物で処置した。マイクロRNAレベル解析を行うために、48時間後に細胞を採取した。10のFBS、100Uのペニシリン、100μgのストレプトマイシンを伴うD-MEMHighglucose培地GIBCO、Invitrogen中で、HEK293E細胞を増殖させた。製造元Invitrogenのプロトコールに従い、Lipofectamine2000により、HEK293E細胞をトランスフェクトした。Hekn細胞を、48時間にわたり被験化合物で処置した。標準的な手順に従い、細胞を回収しmRNAを抽出した。以下で説明するとおりにリアルタイムPCRを実施した。RNAの抽出およびリアルタイムPCR解析全RNA抽出のための製造元のプロトコールに従い、mirVanamirRNAIsolationKitAmbionを用いて、細胞または組織から全RNAを単離した。NanoDropSpectophotometerThermoScientific、Delaware、USAを用いて全RNAを定量化し、アガロースゲル上でRNAの品質を調節した。マイクロRNAを検出するため、TaqManMicroRNAReverseTranscriptionキットを用いてRNAを逆転写し、TaqManuniversalmastermixAppliedBiosystemおよびmiR-191に特異的なプライマーによりqRT-PCRを実施した。U18AppliedBiosystemを内部対照として用いた。各遺伝子およびmiRの発現は、閾値サイクルCtから規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるU18の発現に照らして標準化した後に、2-ΔΔCt法を用いることにより計算した。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレート内で増殖させ、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時における3HチミジンまたはブロモデオキシウリジンBrdUなどのチミジン類似体の取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。バイオインフォマティックスhttpwwwtargetscanorgにおいて入手可能なTargetScan5.1ソフトウェアを用いて、CDK6の3’UTRにおけるmiR-191標的部位の解析を実施した。ルシフェラーゼアッセイ2×105個のHEK293E細胞を、トランスフェクションの24時間前に12ウェルディッシュに播種した。細胞を、Lipofectamine2000Invitrogenを用いて、100ngのpGL3ベクター、12ピコモルのpre-miR-191、またはpre-miRのスクランブル配列Ambion、および10ngのウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼpRL-CMVベクターでトランスフェクトした。細胞抽出物のルシフェラーゼ活性は、DualLuciferaseReporterAssaySystemPromegaを用いることにより、トランスフェクションの24時間後に測定し、発光は、OPTOCOMPIluminometerを用いて、10秒間にわたり測定した。トランスフェクションの効率は、ウミシイタケRenilla属ルシフェラーゼの活性を用いて標準化した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。ポリクローナル抗CDK-6SantaCruz、sc-177、希釈率を1:2000とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とするを用いた。結果老化および分化するケラチン生成細胞におけるmiR-191レベルp1およびp4において、細胞を回収し、リアルタイムPCRを実施した。p1~p4の間においてmiR-191レベルの相対的定量化を施すと、老化ケラチン生成細胞におけるmiR-191発現の著明な増大が示される:p4では、miR-191の発現が、p1におけるその発現1.0±0.04に等しいより約1.9±0.07高値である。これに対し、増殖ケラチン生成細胞では、0日目には1.0±0.02であるのに対して、7日間にわたるカルシウム処置の後には、miR-191発現が約0.41±0.019である。したがって、ケラチン生成細胞の老化状態は、miR-191の発現の増大と関連するが、ケラチン生成細胞の増殖状態は、miR-191の発現の増大と関連しない。miR-191は、3’UTRにおいて、CDK6のmRNAを標的とするバイオインフォマティックス解析は、CDK6が、miR-191の推定標的であることを示す図8A。ルシフェラーゼレポーター遺伝子にCDK63’UTRwtを挿入すると、pre-miR-191の存在下におけるルシフェラーゼ活性が低下する対照に対して0.78±0.1倍図6B。図8Cに示すとおり、pre-miR-11をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞では、スクランブル配列をトランスフェクトしたヒトケラチン生成細胞Ctrlと対比して、CDK6タンパク質が顕著に減少する。β-アクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される。これらのデータは、CDK6がmiR-191標的であることを裏付ける。合成化合物によるmiR-191の調節ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物の入ったEpiLifeへと播種し、濃度の異なる抗miR-191で処置した。リアルタイムPCRを用いてmiR-191レベルの相対的定量化を行うために、48時間後に細胞を採取した。抗miR-191は、処置されていない細胞と対比して、miR-191レベルを著明に下方制御しており、処置された細胞におけるmiR-191の発現は、わずかに0.061±0.049である対してスクランブルでは1.00±0.019である図9。増殖ケラチン生成細胞におけるmiR-130a、miR-138、miR-181aおよびmiR-191の過剰発現材料および方法細胞培養およびトランスフェクション本例では、実施例1で説明されたヒト初代ケラチン生成細胞を用いる。ヒト初代ケラチン生成細胞を、HKGS増殖補充物Cascadeの入ったEpiLife培地中で培養した。製造元のプロトコールに従い、SiPORTneoFXトランスフェクション剤Ambionを用いて、ヒト初代ケラチン生成細胞を、ヒトpre-miR-130a、-138、-181a、-191およびCy3で標識した陰性対照Ambion、Texas、USAでトランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。老化関連β-ガラクトシダーゼ染色細胞を6ウェル培養プレートに播種し、PBSで洗浄し、PBS中に2のホルムアルデヒド/0.2のグルタルアルデヒドで5分間にわたり固定した。PBSによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β-ガラクトシダーゼ染色溶液1mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド[X-gal]を含有する、150ミリモル/LのNaCl、2ミリモル/LのMgCl2、5ミリモル/Lのフェリシアン化カリウム、5ミリモル/Lのフェロシアン化カリウム、40ミリモル/Lのクエン酸、12ミリモル/Lのリン酸ナトリウム、pH6.0と共に、37°Cで24時間にわたりインキュベートした。染色溶液を70のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。細胞増殖および細胞周期の解析細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、DNA合成時におけるブロモデオキシウリジンBrdUの取込みに基づく。Click-iT商標EdUフローサイトメトリーアッセイキットは、BrdUアッセイに対する新規の代替法であるMolecularProbes、Eugene、OR、USA。この方法は、ヌクレオシド類似体であるBrdUの、抗体に基づく検出を、活発なDNA合成時にDNAへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるEdU5-エチニル-2’-デオキシウリジンで置換する。略述すると、細胞を、EdUと共に4時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、FACSCaliburflowcytometerBDBiosciences、SanJose、CA、USAを用いて解析した。CellQuestBDプログラムおよびModfitLTVeritySoftware、BDプログラムを用いて、15,000回のイベントを評価した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗p63Ab4、Neomarkers、Fremont、California、USA、希釈率を1/500とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とする、抗p16SantaCruzBiotechnology、California、USA、希釈率を1:1000とするを用いた。結果invitroの条件において、ケラチン生成細胞におけるmiR130aの過剰発現は、増殖および細胞老化の誘導に対する著明な効果を及ぼすものではないBrdUの取込みおよびSA-β-ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、miR-130aを過剰発現させても、増殖および老化に対する効果は検出されなかった図10。これらの結果は、この特定のinvitroの条件下において、miR-130aが、p63の発現を完全には阻害することが可能でないという事実に起因する。miR-130aをトランスフェクトしても、p63はなおも細胞内で発現しており図11Cを参照されたい、増殖および老化に対する効果を検出することはできない。しかし、miR-130aは、invivoである老齢対象のケラチン生成細胞において上方制御され以下、図14を参照されたい、複製誘導性老化において上方制御されている実施例2を参照されたいことから、細胞の老化におけるその関与が裏付けられる。ケラチン生成細胞におけるmiR-138の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分であるBrdUの取込みおよびSA-β-ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、増殖ケラチン生成細胞においてmiR-138を過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された図11ことから、miR-138は、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。miR-138をトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される±s.d.:スチューデントのt検定によるp値<0.01、p値<0.005図11。ケラチン生成細胞におけるmiR-181aの過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分であるBrdUの取込みおよびSA-β-ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、増殖ケラチン生成細胞においてmiR-181aを過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された図12ことから、miR-181aは、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。miR-181aをトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される±s.d.:スチューデントのt検定によるp値<0.01、p値<0.005図11。ケラチン生成細胞におけるmiR-191の過剰発現は、増殖を阻害し、細胞老化を誘導するのに十分であるBrdUの取込みおよびSA-β-ガラクトシダーゼ染色により評価されるとおり、miR-191を過剰発現させたときは、増殖の阻害に対する強力な効果が検出された図13ことから、miR-191は、それ自体で老化を誘導するのに十分であることが示される。miR-191をトランスフェクトすると、増殖および老化の誘導のいずれにおいても、統計学的評価により有意な変化が示される±s.d.:スチューデントのt検定によるp値<0.01、p値<0.005図13。若齢および老齢の対象により得られるケラチン生成細胞におけるmiR-130a、miR-138、miR181aおよびmiR-191の発現材料および方法皮膚生検に由来する細胞および培養条件、ウェスタンブロット法およびmiR解析若齢個体および老齢個体のヒト皮膚ケラチン生成細胞からのタンパク質抽出物は、Cordiscoら、JID、130:1048~1062において説明されている手順に従い、DermatologyDepartmentIDI-IRCCSを介して得た。miR-130a、miR-138、miR-181aおよびmiR-191の相対的定量化は、それぞれ、実施例2~5において既に説明されているとおりに実施した。ウェスタンブロット法全細胞抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル上で分解し、HybondPPVDF膜GEHealthcare、UK上でブロッティングした。膜は、PBST中5の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で2時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体ウサギおよびマウス、BioRad、Hercules、California、USAを用いて、室温で1時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ECL化学発光キットPerkinElmer、Waltham、Massachusetts、USAにより実施した。抗p63Ab4、Neomarkers、Fremont、California、USA、希釈率を1/500とする、抗βアクチンSigma、StLouis、Minnesota、USA、希釈率を1/5000とする、抗p16SantaCruzBiotechnology、California、USA、希釈率を1:1000とする、抗Sirt-1Abcam、Cambridge、UnitedKingdom、希釈率を1/500とするを用いた。結果ヒト対象における本発明者らの知見を検証するため、若齢対象7および10歳および老齢対象70および76歳により単離されたケラチン生成細胞におけるp63およびSirT1の発現について調べた。ウェスタンブロット解析は、若齢対象に由来するケラチン生成細胞において、p63およびSirT1いずれの発現レベルも、老齢対象に由来するケラチン生成細胞における場合と比較して高いことを示す図14A。これは、invitroにおける複製誘導性老化と同様であった図14B。リアルタイムPCRにより、選択された対象の細胞におけるmiRの発現レベルを評価した図14C~F。miR-130a、miR-138、miR-181aおよびmiR-191はまた、invivoである老齢対象のケラチン生成細胞においても図14を参照されたい、若齢対象のケラチン生成細胞における場合と比較して上方制御されていることから、これらのマイクロRNAはまた、invivoにおける老化皮膚においても老化に関与していることが裏付けられる。活性化合物材料および方法細胞培養ヒト新生児初代上皮ケラチン生成細胞Hekn、Cascade、Invitrogen、Carlsbad、California、USAを、HKGS増殖補充物Cascadeを添加したEpiLife培地中で培養した。分化過程の誘発を回避するため、細胞を、常にサブコンフルエント状態に保持した。細胞は通常、毎週1回継代し、継代間に生じる集団倍加および集団倍加時間を計算するため、各継代時に、採取した細胞数および播種した細胞数を記録した。2代目の継代において、300,000個のケラチン生成細胞を、60mmのディッシュに播種した。翌日、細胞を、表示される濃度の化合物で、48時間にわたり、培地を交換せずに処置した。培地内で擦り取ることにより、細胞を回収した。細胞を、800gで5分間にわたり遠心分離し、RNAを抽出した。RNAの抽出およびリアルタイムPCR解析全RNA抽出のための製造元のプロトコールに従い、mirVanamirRNAIsolationKitAmbionを用いて、細胞から全RNAを単離した。NanoDropSpectophotometerThermoScientific、Delaware、USAを用いて全RNAを定量化し、アガロースゲル上でRNAの品質を調節した。マイクロRNAを検出するため、TaqManMicroRNAReverseTranscriptionキットを用いてRNAを逆転写し、TaqManuniversalmastermixAppliedBiosystemおよびmiR-130a、-138、-181aおよび-191に特異的なプライマーによりqRT-PCRを実施した。U18AppliedBiosystemを内部対照として用いた。各遺伝子およびmiRの発現は、閾値サイクルCtから規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるU18の発現に照らして標準化した後に、2-ΔΔCt法を用いることにより計算した。本発明の工程に従い、以下の化合物について調べ、以下の結果を得た。化粧組成物O/Wセラムserum当業者は、以下の組成物を、古典的な方法により調製することができる。参考文献"