"1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、a該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、b前記免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、c吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及びdタンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法において、前記リガンドの各々がブドウ球菌プロテインASpAの1以上のドメイン単量体E、D、A、B、C又はプロテインZ或いはその機能的変異体を含み、1以上のドメインにおける最もC末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されている点で改良された方法。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZが同じドメインE、D、A、B、C又はプロテインZの2以上のコピーである、請求項1記載の方法。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZがドメインE、D、A、B、C及びプロテインZから選択される2以上のドメインである、請求項1記載の方法。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZがドメインB、ドメインC及びプロテインZから選択される、請求項1記載の方法。多量体リガンド中の1以上の単量体における最もC末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。多量体リガンド中のすべての単量体における最もC末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがY、W、F、M、I、V、Tから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがイソロイシンで置換されている、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがE、A、L、H、M、Q、Kから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。リガンドが、1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性を有する、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。リガンドが免疫グロブリンのFc部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのFab部分に対する親和性を欠いている、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。前記リガンドの1以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項1乃至請求項11のいずれか1項記載の方法。プロテインAのBドメインの29位に対応するグリシン残基がアラニンに変えられている、請求項11又は請求項12記載の方法。リガンドがプロテインZであり、そのアルカリ安定性が1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項1乃至請求項13のいずれか1項記載の方法。プロテインZのアルカリ安定性が、少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項14記載の方法。前記多量体が二量体である、請求項1乃至請求項15のいずれか1項記載の方法。前記多量体が四量体である、請求項1乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項1乃至請求項17のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質がポリクローナル抗体である、請求項1乃至請求項17のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質が別のタンパク質と融合した免疫グロブリンのFc部分を含む融合タンパク質である、請求項1乃至請求項17のいずれか1項記載の方法。免疫グロブリン含有タンパク質を分離するためのリガンドであって、当該リガンドがブドウ球菌プロテインASpAの1以上のドメイン単量体E、D、A、B、C又はプロテインZ或いはその機能的変異体を含み、1以上のドメインにおける最もC末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されている、リガンド。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZが同じドメインE、D、A、B、C又はプロテインZの2以上のコピーである、請求項21記載のリガンド。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZがドメインE、D、A、B、C及びプロテインZから選択される2以上のドメインである、請求項21記載のリガンド。前記プロテインAの1以上のドメイン又はプロテインZがドメインB、ドメインC及びプロテインZから選択される、請求項21記載のリガンド。多量体リガンド中の1以上の単量体における最もC末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項21乃至請求項24のいずれか1項記載のリガンド。多量体リガンド中のすべての単量体における最もC末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている、請求項21乃至請求項25のいずれか1項記載のリガンド。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがY、W、F、M、I、V、Tから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項21乃至請求項26のいずれか1項記載のリガンド。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがイソロイシンで置換されている、請求項21乃至請求項27のいずれか1項記載のリガンド。1以上の単量体における最もC末端のプロリンがE、A、L、H、M、Q、Kから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項21乃至請求項28のいずれか1項記載のリガンド。1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでリガンドがアルカリ安定性である、請求項21乃至請求項29のいずれか1項記載のリガンド。リガンドが免疫グロブリンのFc部分に対して親和性を有するが、免疫グロブリンのFab部分に対する親和性を欠いている、請求項21乃至請求項30のいずれか1項記載のリガンド。当該リガンドの1以上のグリシンがアラニンで置換されている、請求項21乃至請求項31のいずれか1項記載のリガンド。プロテインAのBドメインの29位に対応するグリシン残基がアラニンに変えられている、請求項31又は請求項32記載のリガンド。リガンドがプロテインZであり、そのアルカリ安定性が1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項21乃至請求項33のいずれか1項記載のリガンド。プロテインZのアルカリ安定性が、少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている、請求項34記載のリガンド。前記多量体が二量体又は四量体である、請求項21乃至請求項35のいずれか1項記載のリガンド。固体担体にカップリングされた、請求項21乃至請求項36のいずれか1項記載のリガンドの1以上を含んでなる分離マトリックス。固体担体が寒天又はアガロースのような多糖類を含む、請求項37記載の分離マトリックス。固体担体が架橋されている、請求項37乃至請求項38のいずれか1項記載の分離マトリックス。リガンドがチオエーテル結合を介してカップリングされている、請求項37乃至請求項39のいずれか1項記載の分離マトリックス。マトリックスのリガンド含有量が5~15mg/ml、例えば5~10mg/mlである、請求項37乃至請求項40のいずれか1項記載の分離マトリックス。定義本明細書中でタンパク質という用語は、タンパク質並びにそのフラグメントを記述するために使用される。即ち、三次元構造を示すアミノ酸の連鎖がタンパク質という用語に包含され、したがってタンパク質フラグメントも包含される。本明細書中では、タンパク質の機能的変異体という用語は、機能本発明に関しては親和性及び安定性と定義されるが本質的に保持されている変異タンパク質を意味する。そこで、前記機能とは無関係の1以上のアミノ酸が置換されていてもよい。本明細書中で親分子という用語は、本発明の変異が導入される前の形態の対応タンパク質に関して使用される。構造的安定性という用語は分子の三次元形態の健全性をいい、化学的安定性という用語は化学的分解に耐える能力をいう。Fcフラグメント結合タンパク質という用語は、当該タンパク質が免疫グロブリンのFcフラグメントに結合できることを意味する。ただし、Fcフラグメント結合タンパク質が免疫グロブリンのFab領域のような他の領域にも結合できることを排除するものではない。本明細書中では、アミノ酸について、その正式名称で記載しない場合には慣用の一文字略号で表す。本明細書中では、変異は置換位置の番号の前に野生型又は非変異型アミノ酸を付し、その後に変異したアミノ酸を付して定義する。例えば、23位のアスパラギンのトレオニンへの変異はN23Tと記載される。一態様では、本発明は、1種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、a該液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスに接触させる段階、b免疫グロブリン含有タンパク質をリガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階、c吸着した免疫グロブリン含有タンパク質を洗浄する任意段階、及びdタンパク質を遊離させる溶離剤にマトリックスを接触させることで前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階を含んでなる方法に関する。この方法では、リガンドの各々がブドウ球菌プロテインASpAの1以上のドメイン即ち、単量体E、D、A、B、C又はプロテインZ或いはその機能的変異体を含み、1以上のドメインにおける最もC末端のプロリンが任意の他のアミノ酸で置換されているようなリガンドを使用することで免疫グロブリン分子に対するリガンドの結合容量の増加が得られる。免疫グロブリン結合タンパク質即ち、リガンドは、ブドウ球菌プロテインASpA又は連鎖球菌プロテインGSpG或いはこれらのタンパク質のIgG結合ドメインを含む組換えタンパク質のような、天然の免疫グロブリン結合能力を有する任意のタンパク質であり得る。他のかかるタンパク質の総説に関しては、例えば、Kronvall,G.,Jonsson,K.Receptins:anoveltermforanexpandingspectrumofnaturalandengineeredmicrobialproteinswithbindingpropertiesformammalianproteins,J.Mol.Recognit.1999Jan-Feb;121:38-44を参照されたい。リガンドは、SpAのE、D、A、B及びCドメインの1以上を含み得る。さらに好ましくは、リガンドはプロテインAのドメインB又は人工的に作製されたプロテインZを含んでいる。プロリンZ又はプロテインAドメインはいずれも、C末端の近くにプロリンP57を含んでいる例えば、図1、図2及び配列番号1~8を参照されたい。プロリンは、その構造即ち、側鎖がα-窒素に結合していることのため、タンパク質中に屈曲を生じることが知られている。この結合はφ=約60°の結合角に限定され、そのためタンパク質中に屈曲を生じる。古典的な例はIgGのヒンジに見られ、そこにはプロリンが見出される。このように、C末端にプロリンが存在する場合、プロテインA又はプロテインZのすべてのドメインは結合中に60°の角を成して終わり、ドメイン間に屈曲を生じる図2~2。最もC末端のプロリンは、Fc結合にも関与せずGrailleetal,PNAS2000,9710:5399-5404;Deisenhofer,Biochemistry1981,209:2361-2370、またα-ヘリックスの一部でもないプロリンに関しては不可能である。このように、プロテインA/プロテインZリガンドにおける単量体ドメインの不良な使用トータルオーバローディングで2つの内の1つが使用されることは、各ドメインにおけるC末端プロリンの存在によって引き起こされる構造的制限即ち、立体障害に原因することがあり得る。2つのドメインが1つのIgG分子に結合し、したがっていずれか他方のドメインに対するIgGのアクセスが妨害される可能性がある図2。かかる結合はまた、リガンドに対するIgGのより強い結合を意味し得る。本発明の若干の実施形態では、各ドメインの一層高度の使用を達成するため、各ドメインにおける最もC末端のプロリン配列番号1又は配列番号2のP57が置換され、かくして、恐らくは単量体ドメイン間が一層直線的かつ/又は柔軟な多量体リガンド構造図2のため、リガンドの容量の増加が得られる。図2に示されるように、プロテインAのつのドメイン間の配列は高度に関連している。欠失や挿入は存在せず、置換の多くは保存的変化であって、タンパク質の構造又は機能に対して起こり得る変化はごくわずかである。例えば、BドメインとCドメインとの間の変化は、58アミノ酸のポリペプチド全体にわたってわずか4つである。したがって、これらのドメインの各々におけるC末端のプロリンは、プロテインA又は該ドメインを含むリガンドに対して同様な構造的/機能的寄与をもたらす。同様に、プロリンの変化は、かかる変化を含むリガンドの構造/機能に対して同様な効果を引き起こす。若干の実施形態では、プロリンは、好ましくはβ-シートを形成するアミノ酸で置換される。好ましくは、プロリンは、バルキーなアミノ酸又はスチフネスを与えるアミノ酸例えば、Y、W、F、M、I、V、Tで置換される。さらに好ましくは、かかる置換はP57Iである。他の実施形態では、プロリンはα-ヘリックスの形成を生じやすいアミノ酸例えば、E、A、L、H、M、Q、Kで置換される。若干の実施形態では、親分子は配列番号1乃至配列番号8で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。若干の実施形態では、多量体リガンド中の1以上の単量体ドメインにおける最もC末端のプロリン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中のすべての単量体ドメインにおける最もC末端のプロリン残基が置換されている。一実施形態では、リガンドはまた、例えばSpAドメインB又はプロテインZの1以上の単量体ドメインの1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定化される。前述の通り、米国特許出願公開第2005/0143566号は、1以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、かかる変異例えば、N23Tはリガンドに高pHでの向上した化学的安定性を付与することを開示している。さらに、これらのリガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いるクリーニング操作に一層よく耐えることができる。米国特許出願公開第2006/0194955号は、変異したリガンドがプロテアーゼにも一層よく耐え、したがって分離プロセスでのリガンドの漏れを低減させ得ることを示している。これらの出願の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなしている。別の実施形態では、こうして製造されたリガンドは、抗体のFc部分に対して親和性を有するものの、抗体のFab部分に対する実質的な親和性を欠いている。したがって、若干の実施形態では、リガンドの1以上のグリシンがアラニンで置換されている。米国特許出願公開第2006/0194950号は、アルカリ安定性ドメインをさらに、例えばG29A変異により、リガンドがFabに対する親和性を欠くがFc親和性は保持するように改変し得ることを示している。この出願の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなしている。本明細書中で使用されるアミノ酸の番号付けは当技術分野で通常使用されているものであり、プロテインAのドメインB上での位置によって例示されており、当業者はE、D、A、B、Cの各ドメイン又はプロテインZに関して変異させるべき位置を容易に認識できよう。有利な実施形態では、リガンドはドメインBの多量体コピーから構成されており、ドメインBのアルカリ安定性は1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させること例えば、N23Tで達成されていると共に、アルカリ安定性ドメインBの29位のアミノ酸残基の変異例えば、G29A変異が含まれている。別の実施形態では、リガンドは、1以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることでアルカリ安定性が達成されたプロテインZの多量体コピーから構成されている。有利な実施形態では、アルカリ安定性は少なくとも23位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に変異させることで達成されている。当業者には容易に理解されるように、P57の置換、アルカリ安定性を与えるための変異、及びG-A変異は、通常の分子生物学的技法を用いて任意の順序で実施できる。さらに、かかるリガンドは、変異したタンパク質リガンドをエンコードする核酸配列を含むベクターによって発現させることができる。別法として、かかるリガンドはタンパク質合成技法によっても製造できる。所定配列のペプチド及びタンパク質を合成する方法は、当技術分野で公知であって一般に利用できる。かくして、本発明では、ブドウ球菌プロテインAのアルカリ安定性ドメインBという用語は、米国特許出願公開第2005/0143566号及び同第2006/0194950号に記載されている変異タンパク質のような、SpAのドメインBに基づくアルカリ安定化タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等なアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。当業者には理解される通り、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適当な程度まで精製すべきである。かかる精製方法は当技術分野で公知であり、担体へのタンパク質系リガンドの固定化は標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体は以下に一層詳しく記載される。したがって一実施形態では、本発明に係る変異タンパク質は、アスパラギン変異が21位にないことを条件として、配列番号1又は配列番号2で規定される配列の約75以上、例えば約80以上、好ましくは95以上を含んでいる。本明細書中では、次の配列番号1はSpAのBドメインのアミノ酸配列を規定する。AlaAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLys。次の配列番号2はプロテインZとして知られるタンパク質を規定する。ValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaProLys。プロテインZは、29位のグリシンがアラニンに置換されたSpAのBドメイン由来の合成構築物である。例えば、TheEncyclopediaofBioprocessTechnology:Fermentation,BiocatalysisandBioseparation,M.C.FleckingerandS.W.Drew,editors,JohnWileyandSonsInc.,NewYork,8-22のStahletal,1999:Affinityfusionsinbiotechnology:focusonproteinAandproteinGを参照されたい。一実施形態では、上述の変異タンパク質は、P57の置換を含む、配列番号1又は配列番号2で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体から構成されている。別の実施形態では、上述の変異タンパク質は、P57の置換を含む、配列番号4乃至配列番号8で規定されるアミノ酸配列或いはその機能的変異体から構成されている。本文脈中で使用される機能的変異体という用語は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の親和性又はpH値の上昇した環境におけるその向上した化学的安定性に影響を及ぼさないアミノ酸位置における1以上の追加変異を含む任意の類似配列を包含する。有利な実施形態では、本発明のP57置換は、バルキーなアミノ酸又はスチフネスを与えるアミノ酸例えば、Y、W、F、M、I、V、Tからなる群から選択され、かつ親分子は配列番号1乃至配列番号8で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。他の実施形態では、P57はα-ヘリックスの形成を生じやすいアミノ酸例えば、E、A、L、H、M、Q、Kで置換され、かつ親分子は配列番号1乃至配列番号8で規定される配列又はその任意の機能的変異体を含んでいる。さらに好ましくは、かかる置換はP57Iである。上述の通り、アルカリ性条件下で長期にわたって高い結合容量を有するリガンドとして有用な変異タンパク質を得るためには、21位のアスパラギン残基の変異は回避される。一実施形態では、3位のアスパラギン残基は変異されない。若干の実施形態では、多量体リガンド中の1以上の単量体における最もC末端のプロリン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中のすべての単量体における最もC末端のプロリン残基が置換されている。有利な一実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基が例えばトレオニン残基に変異されている。かくして、一実施形態では、配列番号2で規定される配列の23位のアスパラギン残基が、例えばトレオニン残基に変異されている。特定の実施形態では、配列番号2で規定される配列の43位のアスパラギン残基も例えばグルタミン酸に変異されている。アミノ酸番号43が変異された実施形態では、当該変異を1以上の追加変異例えば、N23Tと組み合わせるのが最も有利であるように思われる。かくして、本発明は上述した単量体型変異タンパク質を包含する。ただし、かかるタンパク質単量体を合体させて二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体リガンドとすることもできる。したがって、本発明の別の態様は、本発明に係る1以上の変異タンパク質を1以上の追加単位好ましくはやはり本発明に係る変異タンパク質と共に含んでなる多量体である。かくして、本発明は例えば2つの反復単位からなる二量体又は4つの反復単位からなる四量体である。若干の実施形態では、多量体リガンドは、プロリンAのドメインE、D、A、B、C又はプロテインZ或いは任意の機能的変異体から選択された同一単量体ドメインの2以上例えば、2~4のコピーを含んでいる。他の実施形態では、多量体リガンドは、プロリンAのドメインE、D、A、B、C又はプロテインZ或いは任意の機能的変異体から選択された2以上例えば、2~4の異なる単量体ドメインを含んでいる。一実施形態では、本発明に係る多量体は、好ましくは0~15のアミノ酸例えば、0~10又は5~10のアミノ酸からなるアミノ酸ストレッチで連結された単量体単位を含んでいる。かかる連結の性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的コンホメーションを不安定にすべきでない。さらに、前記連結は好ましくはアルカリ性環境中で変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分安定であるべきである。別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは次の配列番号3の配列を含んでいる。AlaGlnValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysCys。さらに別の実施形態では、二量体リガンドは次の配列番号9の配列を含んでいる。AlaGlnValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerValSerLysGluIleLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysValAspAsnLysPheAsnLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnGlyPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerValSerLysGluIleLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysCys。別の実施形態では、四量体リガンドは次の配列番号10の配列を含んでいる。AlaGlnValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysValAspAlaLysPheAspLysGluGlnGlnAsnAlaPheTyrGluIleLeuHisLeuProAsnLeuThrGluGluGlnArgAsnAlaPheIleGlnSerLeuLysAspAspProSerGlnSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGlnAlaIleLysCys。本発明では意外にも、リガンドの容量を比較した場合、リガンドの1以上の単量体ドメインにおけるC末端プロリンP57の置換が非置換リガンドに比べてより高い容量を与えることが見出された。本発明の一態様は、免疫グロブリン含有タンパク質を分離するためのリガンドに関する。かかるリガンドはブドウ球菌プロテインASpAの1以上のドメインE、D、A、B、C又はプロテインZ或いはその機能的変異体を含み、1以上のドメインにおける最もC末端のプロリンが別のアミノ酸で置換されている。かかるリガンドは、固体担体材料上に固定化した場合、この置換を有しないリガンドに比べて増加した免疫グロブリン容量を与える。かかるリガンドは、上記に記載した任意の実施形態に従って構築できる。一態様では、本発明は、アフィニティー分離用のマトリックスであって、免疫グロブリン結合タンパク質を含むリガンドが固体担体にカップリングされてなるマトリックスに関する。好ましくは、プロテインAの1以上の単量体ドメインE、D、A、B、C又はプロテインZにおいて第3のα-ヘリックスの後方にある最もC末端のプロリン残基P57残基が別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、かかるリガンドは多量体、即ちプロテインAE、D、A、B、C及びプロテインZから選択された2以上の単量体ドメインを含むものである。本発明のマトリックスは、この置換を有しないマトリックスと比較した場合、増加した結合容量を示す。変異タンパク質リガンドは好ましくはFcフラグメント結合タンパク質であり、IgG、IgA及び/又はIgM好ましくはIgGの選択的結合のために使用できる。本発明に係るマトリックスは、任意の実施形態に関して上記に記載したような変異タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは上記に記載したような置換を含んでいる。本発明に係るマトリックスの固体担体は、任意適宜の公知タイプのものであり得る。通常のアフィニティー分離マトリックスは大抵は有機質のものであり、使用する水性媒体に親水性表面が露出されたポリマー、即ちその外面に及び存在する場合には内面にもヒドロキシ-OH、カルボキシ-COOH、カルボキサミド-CONH2或いはN置換型、アミノ-NH2或いは置換型、オリゴ又はポリエチレンオキシ基が露出されたポリマーを基材としている。一実施形態では、ポリマーは例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどの多糖類系のものであり得る。かかるポリマーは、有利には適当な多孔性及び剛性を与えるため、例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、1,2,3-トリハロ置換低級炭化水素で架橋され、或いは米国特許第6602990号に記載された方法に従って架橋されている。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔質の寒天又はアガロースビーズである。本発明で使用される担体は逆懸濁ゲル化S.Hjerten:BiochimBiophysActa792,393-3981964のような標準的方法に従って容易に製造できる。別法として、ベースマトリックスはSepharose商標FF又はSepharoseHPGEHealthcare社のような市販品である。大規模分離のために特に有利な実施形態では、担体は、その剛性が増大し、したがってマトリックスが高い流量に対して一層適するように改変されている。別法として、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどの合成ポリマーを基材としている。ジビニル及びモノビニル置換ベンゼン系マトリックスのように疎水性ポリマーの場合には、上述のような親水性基が周囲の水性液体に露出されるようにマトリックスの表面を親水化処理することが多い。かかるポリマーは標準的方法に従って容易に製造されるが、例えばStyrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerizationR.Arshady:ChimicaeLIndustria709,70-751988を参照されたい。別法として、SOURCE商標GEHealthcare社のような市販品が使用される。別の代替法では、本発明に係る固体担体は、例えばシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機質の担体を含んでいる。さらに別の実施形態では、固体担体は表面、チップ、毛管又はフィルターのような別の形態を取る。本発明に係るマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。別の実施形態では、マトリックスはビーズ又は粒子形態であり、これは多孔質でも非多孔質でもよい。ビーズ又は粒子形態のマトリックスは充填ベッドとして使用することもできるし、或いは懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には膨張ベッドとして知られるもの及び純然たる懸濁物が包含され、そこでは粒子又はビーズが自由に運動できる。モノリス、充填ベッド及び膨張ベッドの場合、分離手順は一般に濃度勾配を用いる通常のクロマトグラフィーに従う。純然たる懸濁物の場合には、回分方式が使用される。リガンドは、例えばリガンド中に存在するアミノ基及び/又はカルボキシ基を利用した通常のカップリング技法で担体に結合できる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシスクシンイミドNHSなどがよく知られたカップリング試薬である。担体とリガンドとの間には、スペーサーとして知られる分子を導入することができ、これはリガンドの利用可能性を向上させ、担体へのリガンドの化学的カップリングを容易にする。別法として、リガンドは物理的吸着又は生物特異的吸着のような非共有結合によって担体に結合することもできる。マトリックスのリガンド含有量は5~15mg/mlマトリックスであり、有利には5~10mg/mlであり得る。有利な実施形態では、本発明のリガンドはチオエステル結合で担体にカップリングされている。かかるカップリングの実施方法は当技術分野で公知であり、標準的な技法及び機器を用いて当業者が容易に実施できる。有利な実施形態では、最初に、後にカップリングで使用するための末端システイン残基をリガンドに設ける。当業者は適切な精製段階も容易に実施できる。本発明の若干の実施形態では、吸着段階のための条件は常用されている任意のものであってよく、標的抗体の性質例えば、そのpIに応じて適切に改変することができる。任意の洗浄段階は、PBS緩衝液のような常用緩衝液を用いて実施できる。溶出は、任意の常用緩衝液を用いて実施できる。本発明の方法は、例えば治療用又は診断用の抗体の精製プロトコルの第1段階として、標的抗体を捕捉するために有用である。一実施形態では、75以上の抗体が回収される。有利な実施形態では、80以上、例えば90以上、好ましくは95以上の抗体が、個々のリガンド系に関して適当なpHを有する溶離剤を用いて回収される。本発明の方法に続いて、他のクロマトグラフィー段階のような1以上の追加段階を実施することができる。かくして、特定の実施形態では、約98を超える抗体が回収される。SpAドメインE、D、A、B、C又はプロテインZリガンドに関して前述した通り、1以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させた場合、これらの変異リガンドを含むアフィニティー媒体は、アルカリ剤を用いる洗浄操作に一層よく耐えることができる米国特許出願公開第2005/0143566号。向上した安定性は、免疫グロブリンに対する変異タンパク質の初期親和性が長期にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合容量はアルカリ性環境中では親分子の結合容量よりゆっくりと減少する。かかる環境はアルカリ性と定義することができ、pH値の上昇した環境を意味する。上昇したpH値とは、例えば約10超から約13又は14まで即ち、10~13又は10~14のpH値であり、これは一般にアルカリ性条件と表される。別法として、かかる条件はNaOH濃度で定義することもでき、その濃度は約1.0M以下例えば、0.7M、特に約0.5M、したがって0.7~1.0Mの範囲内であり得る。このように、免疫グロブリンに対する親和性即ち、上述したようなアスパラギン変異の存在下における本発明のリガンドの結合性、したがってマトリックスの容量は、アルカリ剤での処理によって本質的に経時的な変化を示さない。通常、アフィニティー分離マトリックスのクリーニングインプレイス処理に使用されるアルカリ剤はNaOHであり、その濃度は0.75M以下例えば、0.5Mである。したがって、0.5MNaOHで7.5時間処理した後の結合容量の低下は約70未満、好ましくは約50未満、さらに好ましくは約30未満例えば約28である。さらに別の態様では、本発明は、本発明に係るリガンド又はマトリックスを使用してIgG、IgA及び/又はIgMのような免疫グロブリンを単離する方法に関する。かくして本発明は、上述のリガンド又はマトリックスへの吸着によって1種以上の標的化合物を液体から分離するクロマトグラフィープロセスを包含する。所望の生成物は分離された化合物又は液体であり得る。かくして本発明のこの態様は、広く用いられている公知の分離技法であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡単に述べれば、最初の工程では、標的化合物好ましくは上述したような抗体を含む溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドへの標的化合物の吸着を可能にする条件下で分離マトリックスに流す。かかる条件は、例えばpH及び/又は塩濃度即ち、溶液中のイオン強度によって制御される。マトリックスの容量を超えないように注意すべきであり、換言すれば、流量は満足すべき吸着が起こるように十分遅くすべきである。この段階では、溶液の他の成分は原則として妨害されずに通過する。任意には、保持された物質及び/又は緩く結合した物質を除去するため、次いでマトリックスが例えば水溶液で洗浄される。本発明のマトリックスは、溶剤、塩又は洗浄剤或いはこれらの混合物を用いる中間洗浄段階と共に使用するのが最も有利である。次の段階では、溶離剤といわれる第2の溶液を、標的化合物の脱着即ち、遊離が起こる条件下でマトリックスに流す。かかる条件は、通常はpH、塩濃度即ち、イオン強度、疎水性などの変化によってもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出のような様々な溶出スキームが知られている。溶出はまた、マトリックス上の所望抗体に置き換わる競合物質を含む第2の溶液で達成することもできる。アフィニティークロマトグラフィーの原理に関する一般的な総説としては、例えば、Wilchek,M.,andChaiken,I.2000.AnOverviewofaffinitychromatography.MethodsMol.Biol.147:1-6を参照されたい。以下、本発明を実施例によって説明する。これらの実施例は例示を目的としたものにすぎず、したがって添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の技術的範囲を限定するものと解すべきでない。本明細書で引用したすべての参考文献の開示内容は、援用によって本明細書の内容の一部をなす。実施例1プロトタイプ変異体Z2:各々がP57I置換を含んだプロテインZの2つのコピーを含むリガンド二量体Z2配列番号3であって、5.8mg/mlのリガンド密度を有する。変異体Z4:各々がP57I置換を含んだプロテインZの4つのコピーを含むリガンド四量体Z4配列番号10であって、9.7mg/mlのリガンド密度を有する。変異体C2:各々がP57I置換を含んだプロテインACドメインの2つのコピーを含むリガンド二量体C2配列番号9であって、7.2mg/mlのリガンド密度を有する。正常Z2:プロテインZの2つのコピーを含むリガンド二量体Z2regP57I置換を含まない配列番号3であって、6.1mg/mlのリガンド密度を有する。タンパク質Gammanorm165mg/mlOctapharma社、平衡化緩衝液で1mg/mlに希釈。平衡化緩衝液APBリン酸緩衝液20mM0.15MNaCl、pH7.4ElsichromAB。吸着緩衝液APBリン酸緩衝液20mM0.15MNaCl、pH7.4ElsichromAB。溶出緩衝液APBクエン酸緩衝液0.1mM、pH3ElsichromAB。CIP0.1MNaOH。実験の詳細及び結果:タンパク質の変異誘発プロリン置換をコードするオリゴヌクレオチドを用いるPCRによって部位指向変異誘発を実施した。鋳型として、Z又はCの単一ドメインを含むプラスミドを使用した。PCRフラグメントをE.coliの発現ベクターpGO中に連結した。DNA配列決定を用いて、挿入されたフラグメントの正しい配列を確認した。Z及びCの多量体を形成するため、C又はZドメインの開始コドンGTAGAC中に位置する、アミノ酸VDに対応するAceI部位を使用した。pGOZ1及びpGOC1をAceIで消化し、CIP処理した。各変異体に対して特異的なAceI付着末端プライマーを消化し、各鋳型から2種のオーバーラップPCR生成物を生成した。PCR生成物を精製し、2アガロースゲル上でPCR生成物を比較することで濃度を推定した。等量のペアワイズPCR生成物を連結緩衝液中でハイブリダイズした45分で90°C→25°C。得られた生成物では、約1/4のフラグメントがAceI部位に連結されていると思われる正しいPCRフラグメント及び/又は消化ベクター。連結及び形質転換後、コロニーをPCRスクリーニングすることで、Z2,Z4,C2及びC4を含む構築物を同定した。陽性クローンをDNA配列決定によって確認した。構築物の発現及び精製標準培地中でのE.coliK12の発酵により、構築物を細菌ペリプラズム中で発現させた。発酵後、細胞を熱処理することで、ペリプラズム内部物を培地中に放出させた。培地中に放出された内容物を、0.2μmの孔径を有する膜を用いるミクロ濾過によって回収した。今では濾過段階からの透過液中にある各構築物を親和性によって精製した。透過液を、固定化IgGを含むクロマトグラフィー媒体上に装填した。装填生成物をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、pHを低下させることで溶出した。溶出プールを中性pHに調整し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次いで、試料を陰イオン交換体上に装填した。洗浄段階後、構築物をNaCl勾配中で溶出することで、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって40~50mg/mlに濃縮した。精製リガンドをLC-MSで分析することで、純度を決定すると共に、分子量がアミノ酸配列に基づいて予想される値に一致することを確認した。活性化使用したベースマトリックスは、米国特許第6602990号の方法に従って製造された、平均直径85ミクロンの硬質架橋アガロースビーズであった。これはまた、GelfiltrationPrinciplesandMethods,PharmaciaLKBBiotechnology1991,pp6-13に記載された方法に従えば、Mw110kDaのデキストランに対して0.70の逆ゲル濾過クロマトグラフィーKav値に相当する孔径を有していた。100mLフラスコ内において、25mLgの排水ベースマトリックス、10mLの蒸留水及び2.02gのNaOHsを機械的撹拌により25°Cで10分間混合した。4.0mLのエピクロロヒドリンを添加し、反応を2時間進行させた。活性化ゲルを10ゲル沈降体積GVの水で洗浄した。カップリング50mlファルコン管に入れた20mLの連結溶液50mg/mLに、169mgのNaHCO3、21mgのNa2HCO3、175mgのNaCl及び7mgのEDTAを添加した。ファルコン管をローラーテーブル上に5~10分間置き、次いで77mgのDTEを添加した。還元を>45分間進行させた。次いで、SephadexG-25を充填したPD10カラム上でリガンド溶液を脱塩した。脱塩溶液中のリガンド含有量を、279nmのUV吸収を測定することで求めた。活性化ゲルを3~5GVの{0.1Mリン酸塩/1mMEDTApH8.6}で洗浄し、次いでリガンドを米国特許第6399750号に記載された方法に従ってカップリングした。本実験で使用したすべての緩衝液は、窒素ガスによって5~10分間以上脱気した。固定化後、ゲルを3×GVの蒸留水で洗浄した。ゲル1GVの{0.1Mリン酸塩/1mMEDTA/10チオグリセロールpH8.6}を混合し、管を振盪テーブル上に室温で一晩放置した。次いで、ゲルを3×GVの{0.1MTRIS/0.15MNaClpH8.6}及び0.5MHAcで交互に洗浄し、次いで8~10×GVの蒸留水で洗浄した。ゲル試料を外の部実験室に送ってアミノ酸分析を行い、総アミノ酸含有量からリガンド含有量mg/mlゲルを算出した。容量の測定AKTAExplorer100、ALE100。AKTAExplorer10システムを用いて、2.4分及び6分の滞留時間での漏出容量を標準として測定した。安定な基線が得られるまで、吸着緩衝液をバイパスカラムに流した。これはオートゼロイングに先立って行った。100UV信号が得られるまで、試料をカラムに適用した。次いで、安定な基線が得られるまで、吸着緩衝液を再び適用した。カラムを吸着緩衝液で平衡化した後、最大吸光度の85のUV信号に達するまで試料を装填した。次いで、0.5ml/分の流量で最大吸光度の20のUV信号に達するまで、カラムを吸着緩衝液で洗浄した。10CVの溶出緩衝液を0.5ml/分の流量で用いてタンパク質を溶出した。次いで、0.1MNaOHを0.5ml/分の流量で用いてカラムをクリーニングし、吸着緩衝液で再平衡化した後、20エタノールでクリーニングした。最後の段階は、100UV信号が得られるまでバイパスカラムを通して試料を装填することにより、試料濃度をチェックするためのものであった。10での漏出容量を算出するためには、下記の式を使用した。それは、カラム流出液中のIgGの濃度が供給液中のIgG濃度の10になるまでカラム上に装填されるIgGの量である。A100=100UV信号、Asub=非結合IgGサブクラスからの吸光度寄与、A=所定適用体積での吸光度、Vc=カラム容積、Vapp=10漏出点までの適用体積、Vsys=システムの死容積、C0=供給液濃度。動的結合容量に関する典型的な試験例を図3に示す。10漏出点での動的結合容量DBCを算出し、曲線の外観を調べた。また、結合、溶出及びCIPピークに関しても曲線を調べた。5、10及び80漏出点に関して動的結合容量DBCを算出した。結果を表1に示す。P57I置換を有するリガンドに関しては、親のP57リガンドに比べて高い容量が認められた。上記の実施例は本発明の特定の態様を例示するものであり、いかなる点でもその技術的範囲を限定することはなく、そのように解すべきでない。上記に示した本発明の教示の恩恵を受ける当業者は、それに対して多数の修正を施すことができる。これらの修正は、添付の特許請求の範囲に示す本発明の技術的範囲内に包含されると解すべきである。さらに、様々な実施形態の特徴を組み合わせ得ることはもちろんである。"