"本明細書に記載される発明。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の積極的同定は、多くの場合において有利である。Staphylococcusaureusおよび他のStaphylococcus種の同時分析が、理想的である。なぜなら、S.aureusまたは他のStaphylococcus種のいずれかの存在についての処置判断は、常に、陽性の試験結果に基づくからである。この特徴はまた、S.aureusと他のStaphylococcus種との混合物が存在する場合に、有意な利点を提供する。発明の要旨本発明は、必要に応じて、対象サンプル中に存在する特定のStaphylococcus種好ましくは、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために有用な、PNAプローブもしくはPNAプローブセット、およびそれらの使用ならびにキットに関する。特許請求の範囲に従って、上記PNAプローブは、リボソームRNArRNA、またはそのrRNAもしくはその相補体に対応するゲノム配列rDNAに関する。一実施形態において、本発明は、Staphylococcusaureus以外のあるStaphylococcus種例えば、Staphylococcusepidermidis、Staphylococcushaemolyticus、Staphylococcushominis、Staphylococcuslugdenensis、およびStaphylococcussaprophyticusであるが、これらに限定されないの分析のためのPNAプローブに関する。別の実施形態において、本発明は、Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種の分析のためのPNAプローブに関する。PNAプローブ元々、米国特許第5,539,082号およびEgholmら、Nature365:566~5681993本明細書に参考として添付されるに記載されるは、天然に存在する核酸プローブと比較した場合の固有の物理化学的特徴/化学的特徴を有し、その特徴によって、迅速かつ正確なアッセイの設計が可能である。PNAプローブは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISHアッセイにおいて適用された場合に、核酸プローブを超える別の利点を提供する。この利点は、PNAプローブによる、グラム陽性細菌例えば、Staphylococcus種の強固な細胞壁の改良された細胞浸透に起因する。核酸プローブが、架橋剤および/または酵素による固定および透過化処理を必要とする例えば、Kempfら、J.Clin.Microbiol38:830~8382000を参照のこと場合、PNAプローブは、実施例1において例証されるような塗抹標本調製の後に直接適用され得る。好ましい実施形態において、PNAプローブは、比較的短い核酸塩基配列例えば、実施例1に記載されるような15核酸塩基を有する。天然に存在する核酸プローブは、PNAプローブよりも弱いその安定性および低いその融解温度Tmが原因で、代表的には、少なくとも18ヌクレオチド長である例えば、Kempfら、J.Clin.Microbiol38:830~8382000を参照のこと。核酸プローブよりも高いPNAプローブの特異性は、密接に関連するStaphylococcus種のrRNAまたはrDNAの分析のために必要とされるような、一核酸塩基の差もしくはほんの少数の核酸塩基の差しかない密接に関連する非標的配列を、核酸プローブよりも良好に識別する。本発明に従う例示的なPNAプローブ核酸塩基配列としては、Staphylococcusepidermidisを標的とするTCT-AAC-ATG-TTC-TTT配列番号1;Staphylococcussaprophyticusを標的とするTCT-AGT-CTG-TTC-TTT配列番号2;Staphylococcushaemolyticusを標的とするTCT-AAT-ATA-TTC-CTT配列番号3;Staphylococcuswarneriを標的とするTCT-AAT-ATA-TAC-TTT配列番号4;Staphylococcusaureus以外の数種のStaphylococcus種を標的とするGCT-CCA-AAT-GGT-TAC配列番号5;Staphylococcusepidermidisを標的とするTCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6;Staphylococcussaprophyticusを標的とするCTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7;Staphylococcushaemolyticusを標的とするCTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8;Staphylococcussciuriを標的とするCTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9;Staphylococcusschleiferiを標的とするTCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10;およびStaphylococcusschleiferiの改変体を標的とするTCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11が挙げられる。これらのPNAプローブは、これらのPNAプローブが標的とするブドウ球菌の種によって記載されているが、これらのPNAプローブは、必ずしもその特定の生物に対して特異的ではなく、実際には、それらのプローブのうちのいくつかは、他のStaphylococcus種における標的と完全に相補的であるか、またはほぼ完全に相補的である。なお別の実施形態において、上記PNAプローブは、Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種の分析のための2種以上のPNAプローブを含むか、またはStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のための少なくとも1種のPNAプローブとStaphylococcusaureusの分析のためのPNAプローブとを含む、PNAプローブセットの一部であり得る。すなわち、本発明のいくつかのPNAプローブは、Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種に対して特異的である。好ましくは、PNAプローブセット内のPNAプローブは、2種以上のStaphylococcus種の独立した分析のために別々に標識される。この実施形態の改変形において、そして実施例5において例証されるように、複数のプローブが、特定のStaphylococcus種またはStaphylococcus種コホートを検出するために同じように標識され得、一方、必要に応じた他のプローブが、第二の種または種コホートの分析のために別々に標識される。本発明に従う方法は、サンプルを、上記のPNAプローブのうちの1つ以上と接触させる工程を包含する。この方法によると、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の存在、不在、および/または数が、適切なハイブリダイゼーション条件下での標的配列に対する上記プローブのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションを相関付けることによって、検出、同定、および/または定量される。結果的に、この分析は、決定的な結果を伴う単一のアッセイに基づく。対照的に、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の決定的分析のための現行の慣用的方法は、複数の試験を含む複数の表現型特徴に基づく。別の実施形態において、上記PNAプローブは、Staphylococcusaureusと、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種との同時分析のために、並列反応または同一反応多重反応のいずれかにおいて、Staphylococcusaureusの分析のための以前に公開されたPNAプローブOliveiraら、J.Clin.Microbiol.40:247~2512002を参照のことと同時に適用される。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の存在がStaphylococcusaureus特異的シグナルの不在によってさらに支持され、逆もまた同様であるこの様式においては、そのような最終的試験結果は、ポジティブな反応およびネガティブな反応の両方に基づいて解釈される。従って、上記PNAプローブセットは、別個のコントロール実験を実施する必要性を排除する内部コントロールを提供する。好ましくは、上記2種のPNAプローブは、その分析が1つの反応多重反応において実施されるように、独立して標識される。同時分析はまた、Staphylococcusaureusと、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種との両方の混合物を含む標本にとって、有利である。そのような場合、FISHのための上記PNAプローブの使用は、単一細胞検出という利点を提供し、その結果、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種と、Staphylococcusaureusとの両方の細胞が、下記に例証されるような特異的標識によって同時に観察され得かつ区別され得る。対称的に、他の技術は、さらなるコントロール実験を実施することなく、混合培養物を擬陽性反応から区別することはできない。なお別の実施形態において、本発明は、必要に応じてサンプル中に存在するStaphylococcusaureus以外のStaphylococcusaureus種を検出、同定、および/または定量するアッセイを実施するため、ならびに/あるいは抗生物質耐性の決定のために適切な、キットに関する。本発明のキットは、1種以上のPNAプローブと、アッセイを実施するように選択されるかまたはそうでなければアッセイの実施を簡単にするように選択される他の試薬もしくは組成物とを、含む。特に、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcusaureus種と、Staphylococcusaureusとの組み合わせ分析は、GPCC陽性血液培養ビンの慣用的試験複数のPNAプローブの使用が二次的に内部コントロールとして役立つのために充分に適している。複数のPNAプローブの使用に由来する別の利点は、ブロッキングプローブの使用である。この好ましい実施形態において、ブロッキングプローブストラテジーが、密接に関連する生物における保存された標的分子の類似領域にプローブが指向されている多重アッセイにおける使用のためのプローブの設計において、使用される。例えば、核酸塩基配列およびTmが実質的に類似している独立して検出可能な一対のプローブが、標的核酸塩基配列が1塩基だけ異なる2つの標的の非常に保存された領域に対してハイブリダイズするように設計され得る。この場合、第一プローブが第二プローブの相補的標的に対して非特異的にハイブリダイズする傾向は、第二プローブ/標的ハイブリッドの存在および相対的安定性によって妨害される。同様に、独立して検出可能であるかまたは非独立的に検出可能であるか、または独立して検出可能であるものと非独立的に検出可能であるものとの組み合わせであるかのいずれかである、複数のプローブが、設計され得、これらの複数のプローブは、すべて、わずか一塩基だけ互いに異なり、これらの複数のプローブは、系統的に関連する生物の部分的に保存された標的領域に対して相補的であるかまたは少なくとも実質的に相補的である。標的部位に対する競合は、より高いプローブ特異性を生じ得ると同時に交差ハイブリダイゼーションの可能性を低下させ得る。当業者は、適切なPNAプローブが、本明細書において有効であると記載されるこれらのプロービング核酸塩基配列を正確に有する必要はないが、特定のアッセイ条件に従って改変され得ることを、認識する。例えば、ハイブリッドの安定性が改変されてそのTmを低下させかつ/またはストリンジェンシーについて調節する必要がある場合に、その核酸塩基配列の短縮によって、より短いPNAプローブが調製され得る。同様に、その核酸塩基配列は、区別する核酸塩基がそのPNAプローブの配列中に残る限り、一端において短縮され得、もう一端において伸長され得る。本明細書中に記載されるパラメーター内における上記プロービング核酸塩基配列のそのような変化は、本発明の実施形態であると考えられる。当業者はまた、相補的プロービング配列が、標的配列としてのrDNAに対して指向されているアッセイ例えば、リアルタイムPCRであるが、これに限定はされないのために等しく適切であることを、認識する。本発明はまた、以下を提供する:項目1Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種の分析のために適切な核酸塩基配列を含む、PNAプローブ。項目2Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種の分析のために適切な核酸塩基配列を含む、PNAプローブ。項目3項目1~2に記載のPNAプローブであって、上記Staphylococcus種の標的配列は、rRNA、rDNA、またはrRNAの相補体もしくはrDNAの相補体である、PNAプローブ。項目4項目1~2に記載のPNAプローブであって、Staphylococcusepidermidisの分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcusepidermidisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcusepidermidisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目5項目1~2に記載のPNAプローブであって、Staphylococcushominisの分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcushominisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcushominisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目6項目1~2に記載のPNAプローブであって、Staphylococcushaemolyticusの分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcushaemolyticusrRNAの標的配列もしくはStaphylococcushaemolyticusrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目7項目1~2に記載のPNAプローブであって、Staphylococcuslugdunensisの分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcuslugdunensisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcuslugdunensisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目8項目1~2に記載のPNAプローブであって、Staphylococcussaprophyticusの分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcussaprophyticusrRNAの標的配列もしくはStaphylococcussaprophyticusrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目9項目1に記載のPNAプローブであって、Staphylococcusepidermidisと、Staphylococcusaureus以外の1種以上の他のStaphylococcus種との分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcusepidermidisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcusepidermidisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目10項目1に記載のPNAプローブであって、Staphylococcushominisと、Staphylococcusaureus以外の1種以上の他のStaphylococcus種との分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcushominisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcushominisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目11項目1に記載のPNAプローブであって、Staphylococcushaemolyticusと、Staphylococcusaureus以外の1種以上の他のStaphylococcus種との分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcushaemolyticusrRNAの標的配列もしくはStaphylococcushaemolyticusrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目12項目1に記載のPNAプローブであって、Staphylococcuslugdunensisと、Staphylococcusaureus以外の1種以上の他のStaphylococcus種との分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcuslugdunensisrRNAの標的配列もしくはStaphylococcuslugdunensisrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目13項目1に記載のPNAプローブであって、Staphylococcussaprophyticusと、Staphylococcusaureus以外の1種以上の他のStaphylococcus種との分析のために適切な核酸塩基配列を含み、当該PNAプローブは、StaphylococcussaprophyticusrRNAの標的配列もしくはStaphylococcussaprophyticusrDNAの標的配列または当該rRNAの標的配列の相補体もしくは当該rDNAの標的配列の相補体に対して、相補的である、PNAプローブ。項目14項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、当該プローブの少なくとも一部は、TCT-AAC-ATG-TTC-TTT配列番号1、TCT-AGT-CTG-TTC-TTT配列番号2、TCT-AAT-ATA-TTC-CTT配列番号3、TCT-AAT-ATA-TAC-TTT配列番号4、GCT-CCA-AAT-GGT-TAC配列番号5TCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6、CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7、およびCTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8、CTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9、TCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10、TCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11、から選択される核酸塩基配列もしくはその相補体に対して少なくとも約86同一である、PNAプローブ。項目15項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、当該プローブの少なくとも一部は、TCT-AAC-ATG-TTC-TTT配列番号1、TCT-AGT-CTG-TTC-TTT配列番号2、TCT-AAT-ATA-TTC-CTT配列番号3、TCT-AAT-ATA-TAC-TTT配列番号4、GCT-CCA-AAT-GGT-TAC配列番号5TCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6、CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7、およびCTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8、CTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9、TCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10、TCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11、から選択される、PNAプローブ。項目16項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、上記プローブ配列は、長さが8サブユニット~17サブユニットである、PNAプローブ。項目17項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、当該プローブは、少なくとも1つの検出可能な部分で標識されている、PNAプローブ。項目18項目17に記載のPNAプローブであって、上記検出可能な部分は、結合体、分枝型検出系、発色団、フルオロフォア、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および発光化合物からなる群より選択される、PNAプローブ。項目19項目17に記載のPNAプローブであって、当該PNAプローブは、自己報告プローブである、PNAプローブ。項目20項目19に記載のPNAプローブであって、当該プローブは、PNALinearBeaconである、PNAプローブ。項目21項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、当該PNAプローブは、標識されていない、PNAプローブ。項目22項目21に記載のPNAプローブであって、当該プローブは、支持体に結合されている、PNAプローブ。項目23項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、当該プローブは、スペーサーまたはリンカーをさらに含む、PNAプローブ。項目24項目1、2、または9~13に記載のPNAプローブであって、インサイチュハイブリダイゼーションが、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種の分析のために使用される、PNAプローブ。項目25項目1~24に記載の1つ以上のPNAプローブと、Staphylococcusaureusの分析のための少なくとも1つのPNAプローブと、を含む、PNAプローブセット。項目26項目25に記載のPNAプローブセットであって、上記プローブは、2種以上のStaphylococcus種の独立した分析のために別々に標識されている、PNAプローブセット。項目27項目25に記載のPNAプローブセットであって、上記1つ以上のPNAプローブはPNAプローブを含み、当該PNAプローブにおいて各プローブの少なくとも一部は、TCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6、CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7、CTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8、CTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9、TCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10、TCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11、から選択される、PNAプローブセット。項目28項目25に記載のPNAプローブセットであって、上記Staphylococcusaureusの分析のための少なくとも1つのPNAプローブは、項目1~24に記載の1つ以上のPNAプローブとは別々に標識されている、PNAプローブセット。項目29項目28に記載のPNAプローブセットであって、上記Staphylococcusaureusの分析のための少なくとも1つのPNAのうちの1つの少なくとも一部は、GCT-TCT-CGT-CCG-TTCから選択される、PNAプローブセット。項目30項目1~24に記載の1つ以上のPNAプローブと、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種の分析のための少なくとも1つのPNAブロッキングプローブと、を含む、PNAプローブセット。項目31項目30に記載のPNAプローブセットであって、Staphylococcusaureusの分析のためのPNAブロッキングプローブをさらに含む、PNAプローブセット。項目32項目31に記載のPNAプローブセットであって、上記Staphylococcusaureusの分析のためのPNAブロッキングプローブのうちの少なくとも一部は、TCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6、CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7、CTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8、CTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9、TCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10、TCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11、から選択される、PNAプローブセット。項目33サンプル中にあるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のための方法であって、当該方法は、a項目1~24に記載のPNAプローブのうちの少なくとも1つを、当該サンプルと接触させる工程、b当該PNAプローブを、当該サンプル中にあるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の標的配列に対してハイブリダイズさせる工程、およびc当該ハイブリダイゼーションを検出する工程であって、当該ハイブリダイゼーションの検出は、当該サンプルにおけるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の存在、正体、および/または量を示す、工程、を包含する、方法。項目342種以上のStaphylococcus種の分析のための方法であって、当該方法は、a項目1~24に記載のPNAプローブセットを、当該サンプルと接触させる工程、b当該PNAプローブを、当該サンプルにあるStaphylococcus種の標的配列に対してハイブリダイズさせる工程、およびc当該ハイブリダイゼーションを検出する工程であって、当該ハイブリダイゼーションの検出は、当該サンプルにおけるStaphylococcus種の存在、正体、および/または量を示す、工程、を包含する、方法。項目35項目33~34に記載の方法であって、上記2種以上のStaphylococcus種は、Staphylococcusaureusと、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種とである、方法。項目36Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種のコホートの分析のための、項目33~35に記載の方法。項目37項目36に記載の方法であって、上記検出されるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種のコホートは、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、または臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の部分集合である、方法。項目38項目33~37に記載の方法であって、上記プローブは、独立して検出可能であるか、非独立的に検出可能であるか、または独立して検出可能であるものと非独立的に検出可能であるものとの組み合わせであり、当該プローブは、わずか一塩基だけ互いに異なり、当該プローブは、系統的に関連する生物の部分的に保存された標的領域に対して相補的であるかまたは実質的に相補的である、方法。項目39項目38に記載の方法であって、プローブまたはプローブセットが、Staphylococcusaureus特異的プローブと、Staphylococcusschleiferi標的との間の交差ハイブリダイゼーションを排除または減少するために使用される、方法。項目40項目33~39に記載の方法であって、Staphylococcusaureusと、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種とが、同時かつ独立的に検出される、方法。項目41項目33~40に記載の方法であって、上記分析は、インサイチュで行われる、方法。項目42項目41に記載の方法であって、上記分析は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより行われる、方法。項目43項目33~40に記載の方法であって、当該方法は、標的配列を含む核酸を検出するために使用され、当該核酸は、反応において合成または増幅されている、方法。項目44項目43に記載の方法であって、好ましい核酸合成反応または核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、鎖置換増幅SDA、転写媒介性増幅TMA、ローリングサークル増幅RCA、およびQβレプリカーゼからなる群より選択される、方法。項目45項目33~44に記載の方法であって、当該方法は、非標的配列に対する上記PNAプローブのハイブリダイゼーションを減少または排除するために、少なくとも1つのブロッキングプローブを添加する工程、をさらに包含する、方法。項目46項目33~40に記載の方法であって、上記標的配列は、表面に固定される、方法。項目47項目33~40に記載の方法であって、上記PNAプローブは、表面に固定される、方法。項目48項目33~40に記載の方法であって、上記PNAプローブは、アレイの一構成成分である、方法。項目49項目33~48に記載の方法であって、上記サンプルは、生物学的サンプルである、方法。項目50項目49に記載の方法であって、上記生物学的サンプルは、血液、尿、分泌物、汗、痰、糞便、粘液、またはそれらの培養物である、方法。項目51サンプルにおけるStaphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種の分析のためのアッセイを実施するために適切なキットであって、当該キットは、a項目1~24に記載のPNAプローブ、およびb当該アッセイを実施するために必要な他の試薬または組成物、を備える、キット。項目52項目51に記載のキットであって、必要に応じてサンプル中に存在する、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種と、少なくとも1種の他の微生物とが、独立して、検出、同定、および/または定量される、キット。項目53項目52に記載のキットであって、必要に応じてサンプル中に存在する、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種と、Staphylococcusaureusとが、独立して、検出、同定、および/または定量される、キット。項目54項目51~53に記載のキットであって、必要に応じてサンプル中に存在する、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種が、検出、同定、および/または定量され、抗菌剤に対する当該Staphylococcus種の感受性が、決定される、キット。項目55項目51~54に記載のキットであって、検出されるStaphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、または臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の部分集合である、キット。項目56項目51~55に記載のキットであって、当該キットは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて使用される、キット。項目57項目56に記載のキットであって、当該キットは、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種とStaphylococcusaureusとの、同時の独立的多重同定のための蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される、キット。項目58項目51~55に記載のキットであって、当該キットは、リアルタイムPCRアッセイのために使用される、キット。項目59項目51~58に記載のキットであって、当該キットは、臨床標本またはその培養物などの、臨床サンプルを検査するために使用される、キット。発明の詳細な説明1.定義本明細書中に記載される場合、用語核酸塩基とは、核酸技術を利用するかまたはペプチド核酸技術を利用することによって、核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを作製する者にとって一般的に公知である、天然に存在する複素環式部分および天然に存在しない複素環式部分を意味する。本明細書において使用される場合、用語核酸塩基配列とは、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意のセグメントを意味する。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的例としては、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、核酸アナログ、核酸模倣物、および/またはキメラが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語標的配列とは、アッセイにおいて検出されるべき核酸塩基配列を意味する。本明細書中で使用される場合、用語プローブとは、対象生物の標的分子の標的配列に対して配列特異的にハイブリダイズするように設計されたプロービング核酸塩基配列を有する、ポリマー例えば、DNA、RNA、PNA、キメラ、または連結ポリマーを意味する。本明細書中で使用される場合、用語ペプチド核酸またはPNAとは、2つ以上のPNAサブユニット残基を含む、任意のオリゴマー、連結ポリマー、またはキメラオリゴマーを意味し、米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、同第5,986,053号、同第6,107,470号、および同第6,357,163号においてペプチド核酸として言及または特許請求されているポリマーのいずれをも包含する。最も好ましい実施形態において、PNAサブユニットは、メチレンカルボニル結合を介してN-[2-アミノエチル]グリシン骨格のアザ窒素に結合した、天然に存在する核酸塩基または天然に存在しない核酸塩基からなる。本明細書において使用される場合、用語標識および検出可能な部分は、互換可能であり、そしてこれらの用語は、プローブに結合されることによってそのプローブを器具または方法によって検出可能にし得る、部分を指す。本明細書におけるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種に対する言及または関連する語句は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus属の本質的に1種以上のStaphylococcus種を意味する。少数の例外として、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌これは、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種についての医学的表現であると等価である。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種のコホートとは、Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種を本質的には意味し、これは、すべてのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、臨床的に重要なコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、またはこれらの部分集合を包含し得る。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種としては、例えば、S.capitis、S.cohnii、S.epidermidis、S.saprophyticus、S.intermedius、S.hyicus、S.haemolyticus、S.hominis、S.lugdunensis、S.saccharolyticus、S.schleiferi、S.sciuri、S.simulans、S.warneri、および/またはS.xylosusが挙げられ得る。用語サンプルとは、本明細書中で使用される場合、検出用分析物を含み得る、任意の生物学的サンプルまたは臨床サンプルを指す。好ましくは、この生物学的サンプルは、液体形態であるかまたは組織サンプルとして存在する。最も好ましくは、そのサンプルは、血液培養物由来である。液体サンプルとしては、臨床サンプル例えば、尿、血液、創傷、痰、咽頭スワブ、胃洗浄物、気管支洗浄物、吸引物、血清、鼻分泌物、汗、血漿、精液、脳脊髄液、涙、膿、羊水、唾液、肺吸引物、胃腸内容物、膣分泌物、尿道分泌物、吐出物、およびそれらの培養物が挙げられる。好ましい組織サンプルまたはその培養物としては、絨毛膜絨毛標本、皮膚上皮、生殖器上皮、歯肉上皮、咽頭上皮、毛、および生検が挙げられる。組織サンプルは、新たに調製されてもよいし、または特定の期間の間、固定剤例えば、エタノール、メタノール、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルマリン、パラフィン、ホルムアルデヒド、ホルムアミド、またはそれらの混合物であるが、これらに限定されない中に保存されてもよい。非臨床サンプルとして、食物、飲料、水、薬学的製品、パーソナルケア製品、日用品、または環境サンプル、およびそれらの培養物が挙げられる。本明細書中で使用される場合、多重アッセイとは、複数の標的が検出および同定される可能性があり得るアッセイを包含する。同定は、具体的例えば、特定の微生物種または包括的例えば、特定の微生物属であり得る。包括的同定はまた、微生物種のコホートの同定を包含し、このコホートは、規定された種群の1種以上のメンバーを含む。規定された種群の一例は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌である。本明細書中で使用される場合、独立的かつ同時の検出は、1つよりも多い標的について一度に同定結果を生じ得るアッセイを含む。例えば、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcusと、Staphylococcusaureusとの検出は、各プローブについて独特の標識を用いて同時に行われ得、それによって、独立的かつ同時の検出がもたらされる。このアッセイを実施するために必要な他の試薬または組成物例えば、洗浄溶液、スライドガラス、カバーガラス、本発明に従う1種以上のPNAプローブ、培養容器、スライドガラス加温器、インキュベーター、封入液、ならびにPCR成分酵素および緩衝液を含むが、含められ得る。2.説明1.一般PNA合成PNAの化学的構築のための方法は、周知である米国特許第5,539,082号、同第5,527,675号、同第5,623,049号、同第5,714,331号、同第5,736,336号、同第5,773,571号、同第5,786,461号、同第5,837,459号、同第5,891,625号、同第5,972,610号、同第5,986,053号、および同第6,107,470号を参照のこと。PNA標識PNAを標識するための好ましい非限定的方法は、米国特許第6,110,676号、同第6,361,942号、および同第6,355,421号、これらの明細書の実施例部分において記載されているか、またはそうではなければ、PNA合成およびペプチド合成の分野において周知である。標識本発明の実施において使用されるPNAプローブを標識するために適切な検出可能な部分標識の非限定的例としては、デキストラン結合体、分枝型核酸検出系、発色団、フルオロフォア、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および発光化合物が挙げられる。他の適切な標識試薬および好ましい付着方法は、PNA合成、ペプチド合成、または核酸合成の当業者によって認識される。好ましいハプテンとしては、56-カルボキシフルオレセイン、2,4-ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンが挙げられる。好ましい蛍光色素フルオロフォアとしては、56-カルボキシフルオレセインFlu、テトラメチル-6-カルボキシローダミンtamra、6-7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチルアミノヘキサン酸Cou、5および6-カルボキシ-X-ローダミンRox、Cyanine2Cy2Dye、Cyanine3Cy3Dye、Cyanine3.5Cy3.5Dye、Cyanine5Cy5Dye、Cyanine5.5Cy5.5Dye、Cyanine7Cy7Dye、Cyanine9Cy9DyeCyanine色素2、Cyanine色素3、Cyanine色素3.5、Cyanine色素5およびCyanine色素5.5は、AmershamArlingtonHeights,ILからNHSエステルとして入手可能である、JOE、Tamara、またはAlexa色素シリーズMolecularProbes,Eugene,ORが挙げられる。好ましい酵素としては、ポリメラーゼ例えば、Taqポリメラーゼ、KlenowPNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、Sequenase、DNAポリメラーゼ1、およびΦ29ポリメラーゼ、アルカリホスファターゼAP、西洋ワサビペルオキシダーゼHRPが挙げられ、最も好ましくは、ダイズペルオキシダーゼSBPが挙げられる。非標識プローブ本発明の実施のために使用されるプローブは、本発明の方法において有効であるためには検出可能な部分で標識される必要はない。例えば、本発明のプローブは、固体支持体に付着され得、これによって、本発明のプローブは、公知のアレイ技術によって検出可能になる。自己指示self-indicatingプローブBeaconプローブは、ドナー部分とアクセプター部分とを備える自己指示プローブの例である。そのドナー部分およびアクセプター部分は、そのアクセプター部分がドナー部分から移動したエネルギーを受容するかまたはそうでなければドナー部分からのシグナルをクエンチングするように、作動する。上記に列挙されたフルオロフォア適切なスペクトル特性を有するはまた、エネルギー移動アクセプターとして作動し得るが、好ましくは、そのアクセプター部分は、クエンチャー部分である。好ましくは、そのクエンチャー部分は、非蛍光芳香族部分または非蛍光複素芳香族部分である。好ましくは、クエンチャー部分は、4-4-ジメチルアミノフェニルアゾ安息香酸ダブシルである。好ましい実施形態において、その自己指示Beaconプローブは、米国特許第6,485,901号においてより充分に記載されるPNALinearBeaconである。別の実施形態において、本発明の自己指示プローブは、WIPO特許出願WO97/45539に記載される型である。これらの自己指示プローブは、シグナルを生成するためにはレポーターが核酸と相互作用しなければならないという点が主に、Beaconプローブと比較して異なる。スペーサー/リンカー部分一般的には、スペーサーは、嵩高い標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に対して有し得る有害作用を最小にするために使用される。本発明の核酸塩基ポリマーのための好ましいスペーサー/リンカーは、1つ以上のアミノアルキルカルボン酸例えば、アミノカプロン酸、アミノ酸の側鎖例えば、リジンの側鎖またはオルニチンの側鎖、天然アミノ酸例えば、グリシン、アミノオキシアルキル酸例えば、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、アルキル二酸例えば、コハク酸、アルキルオキシ二酸例えば、ジグリコール酸、またはアルキルジアミン例えば、1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタンからなる。ハイブリダイゼーション条件/ハイブリダイゼーションストリンジェンシー核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを付与または制御するために一般的に使用される要因としては、ホルムアミド濃度もしくは他の化学的変性試薬、塩濃度例えば、イオン強度、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、pH、およびカオトロープの存在または不在が挙げられることを認識する。プローブ/標的配列の組み合わせについてのストリンジェンシーが、上記のストリンジェンシー要因のうちのいくつかを固定し、その後、単一のストリンジェンシー要因を変化させる影響を決定するという周知技術によって、しばしば見出される。同じストリンジェンシー要因が、調節され、それによって核酸に対するPNAのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御するようにされ得るが、但し、PNAのハイブリダイゼーションは、イオン強度とは全く独立している。アッセイについてのストリンジェンシーは、望ましい区別の程度が達成されるまで、各ストリンジェンシー要因の検討によって経験的に決定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件一般的には、核酸混入物の原因となるバックグラウンドが標的配列に対して密接に関連しているほど、ストリンジェンシーはより注意深く制御されなければならない。ブロッキングプローブもまた、ストリンジェンシー要因の最適化によって可能な限界を上回って区別を改善するための手段として使用され得る。従って、適切なハイブリダイゼーション条件は、望ましい区別の程度が達成されて、アッセイが正確そのアッセイのための望まれる許容範囲内にあるかつ再現可能な結果を生じるようになる条件を包含する。慣用的に過ぎない実験および本明細書中にて提供される開示により補助されて、当業者は、本明細書中に記載される方法および組成物を利用するアッセイを実施するための適切なハイブリダイゼーション条件を容易に決定可能である。適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件またはPCR条件は、インサイチュハイブリダイゼーションまたはPCR手順を実施するために適切な条件を包含する。従って、適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件またはPCR条件は、さらなる慣用的実験を伴ってかまたは伴うこともなく、本明細書中にて提供される開示を使用して、当業者にとって明らかになる。ブロッキングプローブブロッキングプローブは、非標的配列に対するプロービングポリマーのプロービング核酸塩基配列の結合を抑制するために使用され得る、核酸プローブまたは非核酸プローブである。好ましいブロッキングプローブは、PNAプローブ米国特許第6,110,676号を参照のことである。ブロッキングプローブは、非標的配列に対するハイブリダイゼーションによって作動し、それによって、そのプロービング核酸塩基配列と非標的配列との間のハイブリダイゼーションにより形成されるよりも熱力学的に安定な複合体を形成すると考えられる。そのより安定かつ好ましい複合体の形成を介して、プロービング核酸塩基配列と非標的配列との間の、より安定ではなく好ましくはない複合体が、形成するのを防止される。従って、ブロッキングプローブは、存在し得かつそのアッセイの実施を妨害し得る非標的配列に対するそのプローブの結合を抑制するために、本発明の方法、キット、および組成物とともに使用され得る。プロービング核酸塩基配列本発明のプローブのプロービング核酸塩基配列は、その構築物の特定配列認識部分である。従って、そのプロービング核酸塩基配列は、特定の標的配列にハイブリダイズするように設計された核酸塩基配列であり、その標的配列の存在、不在、または量が、サンプル中の対象生物の存在、不在、または数を直接的もしくは間接的に検出するために使用され得る。結果的に、選択されたアッセイ形式のためのプローブの要件を考慮して、そのプローブのプロービング核酸塩基配列の長さおよび配列組成は、一般的には、安定な複合体が適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列とともに形成されるように選択される。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のための本発明のプローブの好ましい核酸塩基配列は、TCT-AAC-ATG-TTC-TTT配列番号1、TCT-AGT-CTG-TTC-TTT配列番号2、TCT-AAT-ATA-TTC-CTT配列番号3、TCT-AAT-ATA-TAC-TTT配列番号4、GCT-CCA-AAT-GGT-TAC配列番号5、TCC-TCG-TCT-GTT-CGC配列番号6、CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-C配列番号7、CTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C配列番号8、CTT-CTC-ATC-TGT-TCG-C配列番号9、TCC-TCG-TCC-GTT-CGC配列番号10、TCC-TTG-TCC-GTT-CGC配列番号11、およびそれらの相補体である。本発明は、同定されたこれらのプロービング核酸塩基配列における変化もまた、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために適切なプローブを提供することを企図する。本明細書中に記載されるパラメーター内でのプロービング核酸塩基配列のこのような変化は、本発明の一実施形態であると考えられる。一般的な変化としては、欠失、挿入、およびフレームシフトが挙げられる。さらに、より短いプロービング核酸塩基配列が、上記で同定された配列の短縮によって作製され得る。本発明のプローブは、一般的には、標的配列と正確に相補的であるプロービング核酸塩基配列を有する。あるいは、実質的に相補的なプロービング核酸塩基配列が、使用され得る。なぜならば、プローブと標的配列との間に1つ以上の点変異塩基ミスマッチが存在するプローブを利用する場合に、より優れた配列区別が得られることが、実証されているからであるGuoら、NatureBiotechnology15:331~3351997を参照のこと。結果的には、そのプロービング核酸塩基配列は、上記で同定されたプロービング核酸塩基配列に対してほんの86程度しか相同でないものであり得る。上記のパラメーター内にある実質的に相補的なプロービング核酸塩基配列は、本発明の一実施形態であると考えられる。そのプロービング核酸塩基配列の相補体は、本発明の一実施形態であると考えられる。なぜなら、検出されるべき標的配列が増幅またはコピーされ、それによって同定された標的配列に対する相補体を作製した場合には、適切なプローブを作製することが可能であるからである。検出、同定、および/または計数検出によって、必要に応じて、サンプル中に存在する生物の存在または不在についての分析が意味される。同定によって、属名、属および種名、または対象生物を分類するために役立つ他の適切なカテゴリーによる、生物の正体の確立が意味される。定量によって、サンプル中の生物の計数が意味される。いくつかのアッセイ形式は、同時の検出、同定、および計数を提供し例えば、Stender,H.ら、J.Microbiol.Methods45:31~392001を参照のこと、他のアッセイ形式は、検出および同定を提供し例えば、Stender,H.ら、Int.J.Tuberc.LungDis.3:830~8371999を参照のこと、なお他のアッセイ形式は、同定だけを提供する例えば、Oliveira,K.ら、J.Clin.Microbiol.40:247~2512002を参照のこと。独立的かつ同時の検出本発明の好ましい実施形態において、多重アッセイが、標識されたプローブを用いて1つの標的を検出すると同時に、別々に標識されたプローブを用いて別の標的を検出するように、設計される。本発明のより好ましい実施形態において、それらの標的は、2つ以上のStaphylococcus種由来のrRNAまたはrDNAの構成要素である。最も好ましい実施形態において、上記アッセイは、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcusと、Staphylococcusaureusとを検出するように設計された、PNAFISHアッセイである。抗生物質耐性抗生物質に対する耐性の決定によって、特定の遺伝子もしくは遺伝子産物、または抗菌剤に対する耐性もしくは感受性に関連する変異に基づく、抗生物質に対する生物の感受性の分析が意味される。II.本発明の好ましい実施形態a.PNAプローブ一実施形態において、本発明は、PNAプローブに関する。本発明のPNAプローブは、必要に応じてサンプル中に存在するStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種を検出、同定、および/または定量するために適切である。その分析のために適切なPNAプローブの一般的特徴例えば、長さ、標識、核酸塩基配列、リンカーなどは、本明細書中にて上記されている。本発明のPNAプローブの好ましいプロービング核酸塩基配列が、表1において列挙される。表1本発明のPNAプローブは、プロービング核酸塩基配列本明細書中に上記されるのみを含んでもよいし、またはさらなる部分を含んでもよい。さらなる部分の非限定的例としては、検出可能な部分標識、リンカー、スペーサー、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、または他のPNAサブユニット、DNAサブユニット、もしくはRNAサブユニットが挙げられる。さらなる部分は、アッセイにおいて機能的であっても機能的でなくてもよい。しかし、一般的には、さらなる部分は、そのPNAプローブが使用されるべきアッセイの設計において機能的であるように選択される。本発明の好ましいPNAプローブは、フルオロフォア、酵素、およびハプテンからなる群より選択される、1つ以上の検出可能な部分で標識される。好ましい実施形態において、本発明のプローブは、インサイチュハイブリダイゼーションISHアッセイおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される。ISHアッセイまたはFISHアッセイにおいて使用される過剰なプローブは、代表的には、特異的に結合したプローブの検出可能な部分が、依然として存在するがハイブリダイズはしていないプローブから生じるバックグラウンドシグナルを超えて検出され得るように除去されなければならない。一般的には、過剰なプローブは、サンプルが一定期間プローブとともにインキュベートされた後に洗い流される。しかし、自己指示プローブの使用は、本発明の好ましい実施形態である。なぜなら、検出可能なバックグラウンドを自己指示プローブがほとんどまたは全く生じないので、過剰な自己指示プローブがサンプルから完全に除去される洗い流される必要がないからである。ISHアッセイまたはFISHアッセイに加えて、本明細書中に記載される選択されたプロービング核酸塩基配列を含む自己指示プローブは、すべての種類の均質アッセイ例えば、リアルタイムPCRにおいて特に有用であるか、または自己指示デバイス例えば、側流lateralflowアッセイまたは自己指示アレイとともに有用である。b.PNAプローブセット本発明のプローブセットは、2つ以上のPNAを含む。一実施形態において、そのセットのPNAプローブのうちのいくつかは、ブロッキングプローブであり得る。他の実施形態において、そのプローブセットは、Staphylococcusaureus以外の2種以上のStaphylococcus種を分析するために、または、Staphylococcusaureus以外の1種以上のStaphylococcus種と、Staphylococcusaureusとの分析のために、使用され得る。c.方法別の実施形態において、本発明は、必要に応じてサンプル中に存在するStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために適切な方法に関する。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために適切なPNAプローブの一般的特徴および特殊な特徴が、本明細書中に上記されている。好ましいプロービング核酸塩基配列は、表1に列挙されている。サンプル中のStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のための方法は、そのサンプルを、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種に対して特異的な標的配列に対するハイブリダイゼーションのために適切な1種以上のPNAプローブと、接触させる工程を包含する。この方法によると、その後、そのサンプル中のStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種が、検出、同定、および/もしくは定量されるか、またはその抗生物質耐性が、決定される。これは、適切なハイブリダイゼーション条件下または適切なインサイチュハイブリダイゼーション条件下での、検出されるよう努力されるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の標的配列に対するPNAプローブのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションを、そのサンプル中のStaphylococcusaureus生物以外のStaphylococcus種の存在、不在、もしくは数と相関付けることによって可能になる。代表的には、この相関性は、上記プローブ/標的配列ハイブリッドの直接的検出または間接的検出によって可能になる。好ましい実施形態において、PNAプローブセットが、別々に標識されたPNAプローブを使用する、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種とStaphylococcusaureusとの同時分析のために使用される。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションおよびリアルタイムPCR本発明のPNAプローブ、方法、キット、および組成物は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の迅速なプローブベースの分析のために、特に好ましい。この分析は、好ましくは、2種以上のStaphylococcus種の同時分析のためのPNAプローブセットを使用する。好ましい実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションまたはPCRが、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のためのアッセイ形式として使用される。最も好ましくは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションPNAFISHまたはリアルタイムPCRが、そのアッセイ形式であるStenderら、J.Microbiol.Methods48:1~172002により概説されている。好ましくは、PNAFISH分析のための塗抹標本は、ハイブリダイゼーション前には架橋剤でも酵素でも処理されない。一実施形態において、上記方法は、サンプルから、例えば核酸増幅によって、核酸を合成する工程を包含する。好ましい核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、リガーゼ連鎖反応LCR、鎖置換増幅StrandDisplacementAmplificationSDA、転写媒介性増幅Transcription-MediatedAmplificationTMA、ローリングサークル増幅RollingCircleAmplificationRCA、およびQβレプリカーゼQbetareplicaseからなる群より選択される。本発明の実施は、そうではないと示されない限りは、当業者の範囲内にある、有機化学、ポリマー技術、分子生物学組換え技術を含む、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術および説明を使用し得る。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用するハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の具体的な例示は、本明細書中下記の実施例を参照することによって得られ得る。しかし、他の等価な従来の手順もまた、当然、使用され得る。そのような従来技術および説明は、標準的な実験室マニュアルにおいて見出され得る。そのようなマニュアルは、例えば、GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeriesVol.I~IV、UsingAntibodies:ALaboraotyManual、Cells:ALaboratoryManual、PCRPrimer:ALaboratoryManual、およびMolecularCloning:ALaboratoryManualすべて、ColdSpringHarborLaboratoryPressより、Stryer,L.1995Biochemistry第4版である。ポリマータンパク質を含むアレイ合成に適用可能な方法および技術は、米国特許出願第09/536,841号、WO00/58516、米国特許第5,143,854号、同第5,242,974号、同第5,252,743号、同第5,324,633号、同第5,384,261号、同第5,405,783号、同第5,424,186号、同第5,451,683号、同第5,482,867号、同第5,491,074号、同第5,527,681号、同第5,550,215号、同第5,571,639号、同第5,578,832号、同第5,593,839号、同第5,599,695号、同第5,624,711号、同第5,631,734号、同第5,795,716号、同第5,831,070号、同第5,837,832号、同第5,856,101号、同第5,858,659号、同第5,936,324号、同第5,968,740号、同第5,974,164号、同第5,981,185号、同第5,981,956号、同第6,025,601号、同第6,033,860号、同第6,040,193号、同第6,090,555号、同第6,136,269号、同第6,269,846号、および同第6,428,752号、PCT出願番号PCT/US99/00730国際公開番号WO99/36760およびPCT/US01/04285において記載されている。これらは、すべての目的のためにその全体が参考として援用される。具体的な実施形態において合成技術を記載する特許としては、米国特許第5,412,087号、同第6,147,205号、同第6,262,216号、同第6,310,189号、同第5,889,165号、および同第5,959,098号が挙げられる。PCR方法について、例えば、PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplificationH.A.Erlich編、FreemanPress,NY,N.Y.,1992;PCRProtocols:AGuidetoMethodsandAppplcationsInnisら編、AcademicPress,SanDiego,Calif.,1990;Mattilaら、NucleicAcidsRes.19:49671991;Eckertら、PCRMethodsandApplications1,171991;PCRMcPhersonら編、IRLPress,Oxford;ならびに米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、および同第5,333,675号を参照のこと。これらは各々、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。上記サンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、米国特許第6,300,070号および米国特許出願第09/513,300号を参照のこと。これらは、参考として本明細書中に援用される。本発明において有用な核酸アレイとしては、AffymetrixSantaClara,Calif.から市販されている核酸アレイが挙げられる。他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応LCR例えば、WuおよびWallace,Genomics4,5601989、Landegrenら、Science241,10771988、ならびにBarringerら、Gene89:1171990、転写増幅Kwohら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,11731989およびWO88/10315、自己保持配列複製Guatelliら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA87,18741990およびWO90/06995、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅米国特許第6,410,276号、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応CP-PCR米国特許第4,437,975号、アービトラリリープライムドarbitrarilyprimedポリメラーゼ連鎖反応AP-PCR米国特許第5,413,909号、同第5,861,245号、ならびに核酸ベースの配列増幅NABSA米国特許第5,409,818号、同第5,554,517号、および同第6,063,603号これらは各々、参考として本明細書中に援用されるを参照のことが挙げられる。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第5,242,794号、同第5,494,810号、同第4,988,617号、および米国特許出願第09/854,317号これらは各々、本明細書中に参考として援用されるにおいて記載される。さらなるサンプル調製方法および核酸サンプルの複雑度を減少するための技術が、Dongら、GenomeReserach11,14182001、米国特許第6,361,947号、同第6,391,592号、ならびに米国特許出願第09/916,135号、同第09/920,491号、同第09/910,292号、および同第10/013,598号に記載されている。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法は、当該分野において充分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、その適用に依存して変化し、そして公知の一般的結合方法に従って選択される。そのような公知の一般的結合方法としては、Maniatisら、MolecularCloning:ALaboratoryManual第2版、ColdSpringHarbor,N.Y.,1989;BergerおよびKimmel,MethodsinEnzymology,Vol.152,GuidetoMolecularCloningTechniquesAcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.,1987;YoungおよびDavism,P.N.A.S.80:11941983において言及される方法が挙げられる。反復的な制御されたハイブリダイゼーション反応を実行するための方法および装置が、米国特許第5,871,928号、同第5,874,219号、同第6,045,996号および同第6,386,749号、同第6,391,623号これらの各々は、本明細書中に参考として援用されるに記載されている。例示的なアッセイ形式PNAFISHを実施するための例示的な方法は、Oliveiraら、J.Clin.Microbiol.40:247~2512002;Rigbyら、J.Clin.Microbiol.40:2182~21862002;Stenderら、J.Clin.Microbiol.37:2760~27651999;Perry-O’Keefeら、J.Microbiol.Methods47:281~2922001において見出され得る。一方法に従って、サンプル例えば、陽性血液培養物であるが、これに限定されないの塗抹標本が、顕微鏡スライドガラス上で調製され、ハイブリダイゼーション緩衝液中にある1滴の蛍光標識PNAプローブでカバーされる。カバーガラスが、その塗抹標本上に配置されて均一な被覆が確保される。その後、そのスライドガラスは、55°Cのスライドガラス加温器またはインキュベーターに90分間配置される。ハイブリダイゼーションの後、予熱したストリンジェントな洗浄溶液中にそのスライドガラスを浸漬することによって、そのカバーガラスは取り外される。そのスライドガラスは、30分間洗浄される。その塗抹標本は、最終的には、1滴の封入液を用いて封入され、カバーガラスで覆われ、蛍光顕微鏡によって検査される。本発明のキット中に含まれるPNAプローブを用いて分析され得る、必要に応じてサンプル中に存在するStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種が、数種の器具によって評価され得る。そのような器具は、例えば、顕微鏡例えば、Oliveiraら、J.Clin.Microbiol.40:247~2512002を参照のこと、放射線感光フィルム例えば、Perry-O’Keefeら、J.Appl.Microbiol.90:180~1892001を参照のこと、カメラおよびインスタントフィルム例えば、Stenderら、J.Microbiol.Methods42:245~2532000を参照のこと、照度計例えば、Stenderら、J.Microbiol.Methods.46:69~752001を参照のこと、レーザー走査デバイス例えば、Stenderら、J.Microbiol.Methods.45:31~392001を参照のこと、またはフローサイトメーター例えば、Wordonら、Appl.Environ.Microbiol.66:284~2892000を参照のことであるが、これらに限定されない。自動スライドガラススキャナーおよびフローサイトメーターが、対象サンプル中に存在する微生物の数を迅速に定量するために特に有用である。自己報告self-reportingPNAプローブを使用してリアルタイムPCRを実施するための例示的方法が、Fiandacaら、Abstract,NucleicAcid-Basedtechnologies,DNA/RNA/PNADiagnostics,Washington,DC,May14-16,2001;およびPerry-O’Keefeら、Abstract,InternationalConferenceonEmergingInfectiousDiseases,Atlanta,2002において見出され得る。d.キットなお別の実施形態において、本発明は、アッセイを実施するために適切なキットに関する。このアッセイは、必要に応じてサンプル中に存在するStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種を分析する。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために適切なPNAプローブの一般的特徴および好ましい特徴が、本明細書中に上記されている。好ましいプロービング核酸塩基配列は、表1において列挙されている。さらに、サンプル中にあるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種を分析するためにPNAプローブを使用するのに適切な方法が、本明細書中に上記されている。本発明のキットは、サンプル中のStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種を分析するために、1種以上のPNAプローブと、アッセイを実施するようにかそうでなければ用いられるアッセイの実施を簡単にするように選択される、他の試薬もしくは組成物とを備える。好ましい実施形態において、上記キットは、独立して検出可能なPNAプローブを使用してStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種とStaphylococcusaureusとを同時分析するための、PNAプローブを備える。e.本発明を使用するための例示的適用本発明のPNAプローブ、方法、およびキットは、臨床サンプル例えば、尿、血液、創傷、痰、咽頭スワブ、胃洗浄物、気管支洗浄物、生検、吸引物、吐出物expectorate中、ならびに食物、飲料、水、薬学的製品、パーソナルケア製品、日用品、または環境サンプル、ならびにそれらの培養物において、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のために特に有用である。好ましい実施形態において、上記PNAプローブは、Staphylococcusaureusの分析のためのPNAプローブも含むPNAプローブセットにおいて適用される。本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本明細書中に記載される概念を組み込む他の実施形態が使用され得ることが、今や当業者にとって明らかになる。従って、これらの実施形態は、開示される実施形態に限定されるべきではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲の精神および範囲によってのみ限定されるべきであると思われる。実施例1蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析PNAプローブ:配列番号:配列Sep16S01/tamra:配列番号5:Tamra-OO-GCT-CCA-AAT-GGT-TACSau16S03/flu:Flu-OO-GCT-TCT-CGT-CCG-TTC注記:このPNAプローブの末端を示すために使用される従来の術語;O=8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸;flu=56-カルボキシ-フルオレセイン;tamra=テトラメチル-6-カルボキシローダミン。配列識別番号配列番号が、コアのプローブ配列と、実験において合成しそして使用した実際のプローブとを区別するために、内部参照に与えられることもまた注意されたい。細菌株参照株AmericanTypeCultureCollection,ATCCManassas,VAの一晩培養物、またはStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種Staphylococcusepidermidisを含むに相当する臨床単離株の一晩培養物、およびStaphylococcusaureusの一晩培養物を、調製した。また、種の正体についての情報をもたないコアグラーゼ陰性ブドウ球菌CNSも含んだ。塗抹標本の調製各株について、テフロン登録商標コートした顕微鏡用スライドガラスAdvanDx,Woburn,MAの直径8mmのウェルに、培養液1滴と1v/vTritonX-100を含むリン酸緩衝化生理食塩水1滴とを混合することにより、塗抹標本を調製した。その後、そのスライドガラスを、55°Cのスライドガラス加温器の上に20分間配置した。その時点で、塗抹標本が乾燥した。その後、その塗抹標本を、96v/vエタノール中へ5分間~10分間浸漬することによって殺菌し、風乾した。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションFISH塗抹標本を、1滴のハイブリダイゼーション溶液10w/v硫酸デキストラン、10mMNaCl、30v/vホルムアミド、0.1w/vピロリン酸ナトリウム、0.2w/vポリビニルピロリドン、0.2w/vフィコール、5mMEDTA二ナトリウム塩、1v/vTritonX-100、50mMTris/HClpH7.5ならびに500nMSep16S01/tamraおよび/またはSta16S03/fluを含むで覆った。カバーガラスをその塗抹標本上に静置して、ハイブリダイゼーション溶液によって均一に被覆されていることを確実にした。その後、そのスライドガラスを、スライドガラス加温器Slidemoat,Boekel,Feasterville,PAに配置し、55°Cで90分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後に、スライドガラス1枚当たり約20mlの予熱した25mMTrispH10、137mMNaCl、3mMKClの中へ55°Cの水浴中でそのスライドガラスを浸漬することによって、そのカバーガラスを取り外し、そのスライドガラスを30分間洗浄した。最後に、各塗抹標本を、1滴の封入剤AdvanDx、Woburn、MAを使用して顕微鏡標本作製し、各塗抹標本をカバーガラスにより被覆した。顕微鏡による検査を、FITC/TexasRedデュアルバンドフィルターセットを装備する蛍光顕微鏡を用いて行った。Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種を、赤色蛍光球菌により同定し、Staphylococcusaureusを、緑色蛍光球菌として同定した。実施例2Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のためのPNAプローブの評価この実験は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析のための本発明のPNAプローブの性能を試験するように設計した。方法およびプローブ混合物は、PNAプローブであるSta16S03を添加しなかったことを除いて、実施例1に記載されているとおりである。表2表2に関して、この表は、実施例2からのデータを示し、列1に種の識別を、列2にその培養物の供給源を、そして列3にtamra標識されたプローブであるSep16S01からのシグナルを表す。表2の列3、行Cに関して、赤色蛍光シグナルは、Sep16S01が、最も一般的に存在するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌種であるStaphylococcusepidermidis、ならびに同定されていないコアグラーゼ陰性ブドウ球菌にハイブリダイゼーションする行D、行Eが、Staphylococcusaureusにはハイブリダイゼーションしない行Bことを示す。従って、Sep16S01は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析に適している。実施例3:Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種と、Staphylococcusaureusとの分析のためのPNAプローブセットの評価この実験は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の混合物の分析のためのPNAプローブを、Staphylococcusaureusの分析のためのPNAプローブとともに含む、本発明のPNAプローブセットの性能を試験するために設計した。上記2種のプローブを、それぞれ、tamra赤色およびフルオレセイン緑色で標識した。tamraおよびフルオレセインは、FITC/TexasRedデュアルバンドフィルターを使用して同時に観察され得る。方法およびプローブ混合物は、Enterococcusfaecalisの臨床単離株を代表的非ブドウ球菌として含んだこと以外は、実施例1において記載されるとおりである。表3表3に関して、この表は、実施例3からのデータを示す。列1に種の識別を、列2に培養物の供給源を、列3に、tamraで標識したプローブであるSep16S01またはfluで標識したプローブであるSta16S03からのシグナルを示す。表3の列3行Bに関して、Staphylococcusaureusの存在下で観察される蛍光シグナルは、緑色であり、これは、上記Sta16S03プローブのハイブリダイゼーションを示す。同じ列の行Cにおいて、その蛍光シグナルは、Staphylococcusepidermidis細胞の存在下では赤色であり、これは、上記Sep16S03プローブのハイブリダイゼーションを示す。列Dにおいて蛍光シグナルが存在しないことは、Sta16S03プローブもSep16S01プローブも、Enterococcusfaecalis細胞にハイブリダイズしないことを示す。Enterococcusfaecalisは、グラム陽性球菌であり、明視野顕微鏡によってブドウ球菌と類似する外観を有し、ブドウ球菌と混同される可能性があり得る。このデータはまた、同じ結果が、サンプルの供給源に関わらずにStaphylococcusaureus細胞から得られ得る列Bの臨床単離株、または列Eの血液培養ビンことを示す。これらの結果は、上記PNAプローブセットが、Staphylococcusaureusと、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種との同時分析のために適切であることを示す。実施例4:Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種とStaphylococcusaureusとの混合培養物の分析この実験は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の混合物の分析のための本発明のPNAプローブを、Staphylococcusaureusの分析のためのPNAプローブとともに含むプローブセットを使用するという、利点を示すように設計した。これらの2種のプローブを、それぞれ、tamra赤色およびフルオレセイン緑色で標識した。tamraおよびフルオレセインは、FITC/TexasRedデュアルバンドフィルターを使用して同時に観察され得る。方法およびプローブ混合物は、この実験の一部においてはSep16S01プローブを使用しなかったこと以外は、実施例1において記載されるとおりである。表41.塗抹標本は、純粋単離株を混合することにより調製した。2.塗抹標本は、GPCC陽性血液培養ビンから直接調製した。表4に関して、この表は、実施例4からのデータを示す。列1に種の識別を、列2に培養物の供給源を、列3において、tamraで標識したプローブであるSep16S01またはfluで標識したプローブであるSta16S03からのシグナルを、列4においてはSta16S03プローブのみからのシグナルを、示す。表4の列3において観察され得るように、Sep16S01とSta16S03とのプローブセットを使用した場合、緑色蛍光球菌と赤色蛍光球菌との両方が、StaphylococcusaureusとCNSとの混合培養物を検出した場合と同じ視野に存在した。表2の列Bと列Cとを比較することにより理解され得るように、サンプルの供給源は、その結果には影響を与えなかった。対照的に、Sta16S03のみを使用した場合には緑色蛍光球菌のみが観察され、それによりCNSの存在を欠いた表4の列4を参照のこと。実施例5:蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析PNAプローブ:配列番号:配列CNS3:配列番号6:Tamra-OO-TCC-TCG-TCT-GTT-CGCCNS4:配列番号7:Tamra-OO-CTC-CTT-ATC-TGT-TCG-CCNS5:配列番号8:Tamra-OO-CTC-CTT-GTC-TGT-TCG-C。この実験は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種に対するPNAプローブを試験するために設計した。方法およびプローブ混合物は、上記のtamraで標識したPNAプローブ、CNS3、CNS4、またはCNS5のうちのいずれか500nMからPNAプローブ混合物がなったこと以外は、実施例1に記載されるとおりである。この実験におけるプローブすべては、Staphylococcus種間でわずかに変化するrRNA標的配列の系統学的に保存された領域に対する。これもまた実施例1とは異なるのは、同定されていないCNS細胞を省略し、StaphylococcushominisのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcushaemolyticusのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcuslugdunensisのATCC参照株の一晩培養物、およびStaphylococcussaprophyticusのATCC参照株の一晩培養物を含めたことである。表5表5に関して、この表は、実施例5からのデータを示し、列1には種の識別を、列2にはCNS3プローブについての蛍光シグナルを、列3においてCNS4プローブを、そして列4においてCNS5プローブを示す。行Bの列2、列3および列4に関して、試験したどのプローブも、Staphylococcusaureusにおける赤色蛍光シグナルを生じない。対称的に、行C~行Gに記載される種のすべてが、列2、列3、および列4において記載されるプローブを用いて検出した場合に、2つ以上の場合において赤色蛍光を示す。これらの結果は、プローブCNS3、プローブCNS4、およびプローブCNS5がすべて、Staphylococcusaureus以外の数種のStaphylococcus種の検出のために個々に使用され得ることを示す。実施例6:蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるStaphylococcusaureus以外のStaphylococcus種の分析この実験は、Staphylococcusaureus以外のStaphylococcus種のコホートに対するPNAプローブ混合物を、Staphylococcusaureusの分析のためのPNAプローブと一緒に試験するために設計した。方法およびプローブ混合物は、PNAプローブ混合物が、500nMのSta16S03セットAからなったか、または500mMSta16S03と、実施例5に記載される3種のtamraで標識されたPNAプローブCNS3、CNS4、およびCNS5の各々とからなった以外は、実施例1に記載されるとおりである。この実験におけるプローブすべては、Staphylococcus種間でわずかに変化するrRNA標的配列の系統学的に保存された領域に対する。これもまた実施例1とは異なって、同定されていないCNS細胞を省略し、StaphylococcushominisのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcushaemolyticusのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcuslugdunensisのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcussaprophyticusのATCC参照株の一晩培養物、StaphylococcusschleiferiのATCC参照株の一晩培養物、およびEnterococcusfaecalisのATCC参照株の一晩培養物を、含めた。表6表6に関して、この表は、実施例6からのデータを示す。列1に種の同定を示し、列2にセットAプローブ混合物についての蛍光シグナルを示し、列3にセットBプローブ混合物についての蛍光シグナルを示す。列2に関して、プローブセットAの使用は、試験した細菌種のうちの2種StaphylococcusaureusおよびStaphylococcusschleiferiにおいて緑色蛍光シグナルを生じ、試験した他の細菌においては、何の蛍光シグナルも生じない。列3において理解され得るように、プローブセットBの使用は、Staphylococcusaureusについて緑色蛍光シグナルを生じ、Staphylococcusepidermidis、Staphylococcushominis、Staphylococcushaemolyticus、Staphylococcuslugdunensis、Staphylococcussaprophyticus、およびStaphylococcusschleiferiについて赤色蛍光シグナルを生じた。Enterococcusfaecalisについては、いずれのプローブセットを用いても蛍光シグナルは観察されなかった。Sta16S03プローブは、そのプローブと標的配列とが完全には相補的ではないOliveiraら、J.Clin.Microbiol.40:247~2512002が、Staphylococcusschleiferiと安定なハイブリッドを形成することが、上記の実験において実証された。プローブセットAを用いた場合の緑色から、プローブセットBを用いた場合の赤色への、Staphylococcusschleiferiの蛍光において観察される変化は、標的配列についてのプローブ間の競合を反映する。すべてのプローブは、類似する標的配列に対するが、ただ1つのプローブのみが、1回に標的配列に結合し得るので、最も安定なハイブリッドが形成される。この様式で、Staphylococcusschleiferiに対するSta16S03プローブの交差ハイブリダイゼーションは、セットB中に他のプローブを含めることによって防止される。これらのデータは、ある1つの蛍光標識により種コホートを検出し、第二の蛍光標識を用いて単一種を検出する、プローブ混合物が作製され得ることを示す。この実験において試験するStaphylococcus種は、最も臨床的に適切であると考えられるが、本明細書中には含めていない他の実験は、他の多くのStaphylococcus種が、プローブセットBを用いて検出され得ることを実証した。プローブセットBを用いて試験したすべての種のうち、Staphylococcusaureusのみが、緑色蛍光シグナルを生じた。本明細書中で引用されるすべての参考文献は、それが活字出版形態であろうと、電子媒体形態であろうと、コンピュータ読出し可能記憶媒体形態であろうと、他の形態であろうと、その全体が参考として明示的に援用される。その参考文献としては、要約、論文、雑誌、刊行物、教科書、学術論文、技術データシート、インターネットウェブサイト、データベース、特許、特許出願、および特許公開物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の多くの実施形態が、記載されている。それにも関わらず、種々の実施形態が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。従って、他の実施形態が、特許請求の範囲の範囲内にある。"