"ヘルパーウイルスの不存在下で感染性インフルエンザウイルスの作製方法であって、aヘルパーウイルスの不存在下で、i転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iv転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、v転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNPcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vi転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスMcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、viii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNScDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ixインフルエンザPAポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xインフルエンザPB1ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xiインフルエンザPB2ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、およびxiiインフルエンザNPポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクターを含んでなる複数のオルトミクソウイルスを含む組成物を宿主細胞に導入する工程、およびb該宿主細胞から感染性インフルエンザウイルスを単離する工程を含むことを特徴とする、方法。感染性インフルエンザウイルスを少なくとも1×103pfu/ml生産する、請求項1記載の方法。該細胞に、さらに、xiiiインフルエンザウイルスHAポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクターxivインフルエンザウイルスNPポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xvインフルエンザウイルスM1ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xviインフルエンザウイルスM2ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、およびxviiインフルエンザウイルスNS2ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクターを導入する工程を含む、請求項1または2記載の方法。感染性インフルエンザウイルスを少なくとも1×104pfu/ml生産する、請求項3記載の方法。プロモーターがRNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーターおよびT3プロモーターからなる群より選ばれるプロモーターである、請求項1~4のいずれかに記載の方法。プロモーターがRNAポリメラーゼIプロモーターである、請求項1~5のいずれかに記載の方法。プロモーターがヒトRNAポリメラーゼIプロモーターである、請求項1~6のいずれかに記載の方法。転写終結配列がRNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列、RNAポリメラーゼIII転写終結配列およびリボザイムからなる群より選ばれる転写終結配列である、請求項1~7のいずれかに記載の方法。2以上のベクターが物理的に連結されている、請求項1~8にずれかに記載の方法。1以上のベクターが別々のプラスミド上にある、請求項1~8のいずれかに記載の方法。宿主細胞にベクターを導入する前に、さらに、インフルエンザPAcDNA、インフルエンザPB1cDNA、インフルエンザPB2cDNA、インフルエンザHAcDNA、インフルエンザNPcDNA、インフルエンザNAcDNA、インフルエンザMcDNAまたはインフルエンザNScDNAの1以上に少なくとも1の突然変異を導入する工程を含む、請求項1~10のいずれかに記載の方法。宿主細胞にベクターを導入する前に、さらに、インフルエンザHAcDNAに少なくとも1の突然変異を導入する工程を含む、請求項1~10のいずれかに記載の方法。1以上のベクターが、さらに、インフルエンザウイルスの3’および5’非コーディング配列を含む、請求項1~12のいずれかに記載の方法。ベクターが免疫原性ペプチドまたはワクチンとして有用なタンパク質をコードする、請求項1~13のいずれかに記載の方法。宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項1~14のいずれかに記載の方法。インフルエンザビリオンを含む組成物でトランスフェクトされた細胞からヘルパーウイルスの不存在下で調製される感染性組換えインフルエンザウイルス調製物であって、インフルエンザビリオンのウイルス性内部タンパク質が培養により成長するのに十分適応したインフルエンザウイルス株もしくは弱毒化インフルエンザウイルス株、または両者に由来し、かつ、該インフルエンザビリオンのウイルス性抗原タンパク質が病原性インフルエンザウイルス株に由来し、さらに、該インフルエンザウイルスが、i転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iv転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、v転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNPcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vi転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスMcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、viii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNScDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ixインフルエンザPAポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xインフルエンザPB1ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xiインフルエンザPB2ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、およびxiiインフルエンザNPポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクターを含んでなり、宿主細胞においてi-xiiのベクターの発現により該インフルエンザウイルスのゲノムvRNAを含む機能的なウイルス性リボヌクレオプロテインRNPが生成され、かつ、ヘルパーイウイルスを含まない、システムにより生産される、ことを特徴とするインフルエンザウイルス調製物。インフルエンザビリオンを含む組成物でトランスフェクトされた細胞からヘルパーウイルスの不存在下で調製される感染性組換えインフルエンザウイルス調製物であって、該インフルエンザビリオンが、i転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB1cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスPB2cDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、iv転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスHAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、v転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNPcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vi転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNAcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、vii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスMcDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、viii転写終結配列に連結したインフルエンザウイルスNScDNAと機能的に連結されたプロモーターを含むベクター、ixインフルエンザPAポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xインフルエンザPB1ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、xiインフルエンザPB2ポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクター、およびxiiインフルエンザNPポリペプチドをコードするDNAセグメントと機能的に連結され、かつ、転写終結配列と連結されたプロモーターを含むベクターを含んでなり、宿主細胞においてi-xiiのベクターの発現により該インフルエンザウイルスのゲノムvRNAを含む機能的なウイルス性リボヌクレオプロテインRNPが生成され、かつ、ヘルパーイウイルスを含まず、i~viiiにおけるプロモーターがRNAポリメラーゼIプロモーターであり、転写終結配列がRNAポリメラーゼI終結配列であるシステムを有する宿主細胞から生産される、ことを特徴とするインフルエンザウイルス調製物。例1:材料および方法細胞およびウイルス293Tヒト胚性腎細胞およびMadinDarbyイヌ腎細胞MDCKは、10ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改良イーグル培地DMEMおよび5ウシ新生児血清を含む改良イーグル培地でそれぞれ維持した。すべての細胞は5CO2中にて37°Cで維持した。インフルエンザウイルスAWSN33およびAPR834を、10日齢の卵中で増殖させた。プラスミドの構築RNAポリメラーゼI構築物を作成するために、AWSN33またはAPR834ウイルスRNAに由来するクローン化したcDNAを、RNAポリメラーゼIのプロモーターとターミネーター配列との間に導入した。簡単に説明すると、クローン化したcDNAはBsmBIで消化したBsmBI部位を含むプライマーを用いてPCRにより増幅し、そしてBsmBI部位により分けられたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含むpHH21ベクターのBsmBI部位にクローン化した図2。AWSN33株のPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MおよびNS遺伝子は、以下のプラスミドを使用することによりPCR増幅した:それぞれpSCWPB2、pGWPB1およびpSCWPAすべてカリフォルニア大学ロサンゼルス校のDebiNayak博士から得た、およびpWH17、pWNP152、pT3WNA15を使用することにより増幅させたPerezetal1998。プライマーの配列に関しては図6を参照にされたい。遺伝子に望ましくない突然変異が無いことを確認するために、PCRで誘導したフラグメントを自動シークエンサーを用いて製造元により推薦されるプロトコールに従い配列決定した、そして真核細胞発現ベクターpCAGGSMCSニワトリβアクチンプロモーターにより制御されるにサブクローン化し。感染性インフルエンザ粒子の作成293T細胞を、製造元の指示に従いTransITLT1パンベラPanvera,マジソン、ウィスコンシン州を使用して、異なる量で最大17個のプラスミドでトランスフェクトした。簡単に説明すると、DNAおよびトランスフェクション試薬を混合し1μgのDNAあたり2μlのTransITLT1、室温で45分間インキューベーションし、そして細胞に加えた。6時間後、DNA-トランスフェクション試薬混合物を03のウシ血清アルブミンおよび001ウシ胎児血清を含有するOpiMEMギブコGibcoBRL、ゲチスバーグ、メリーランド州と交換した。トランスフェクションから様々な時間で、ウイルスを上清から回収し、そしてMDCK細胞上で滴定した。ヘルパーウイルスにはこの手順が必要ではないので、回収したトランスフェクション体ウイルスはプラーク形成無しで分析した。ウイルスを生産するプラスミド-トランスフェクト細胞の割合の決定トランスフェクションから24時間後、293T細胞を002EDTAを用いて単一細胞に分散させた。次いで細胞懸濁液を10倍に希釈し、そして24ウェルプレート中でMDCK細胞のコンフルエントな単層に移した。ウイルスは赤血球凝集アッセイにより検出した。免疫染色アッセイインフルエンザウイルスの感染から9時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水PBSで2回洗浄し、そして37パラホルムアルデヒドPBS中で室温にて20分間固定した。次いで細胞を01TritonX100で処理し、そしてNeumannetalに記載されているように処理した。結果ウイルスRNAセグメント、3つのポリメラーゼサブユニットおよびNPタンパク質のプラスミド駆動発現による感染性ウイルスの作成精製したビリオンから抽出したRNPの混合物を用いた細胞のトランスフェクションは感染性のインフルエンザ粒子を生じたが、この方法はインビトロで生成された8種の異なるRNPを用いて使用した時に効率的ではないようである。cDNAから感染性インフルエンザウイルスを完全に生産するために、8つのウイルスRNPsをインビボで作成した。すなわちヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターにより挟まれたAWSN33ウイルスの完全長ウイルスRNAに関するcDNAを含むプラスミドを調製した。原理的にはこのような8つのプラスミドの真核細胞へのトランスフェクションは、8つのインフルエンザvRNAの合成をもたらすはずである。タンパク質発現プラスミドのコ-トランスフェクションにより生成したPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質は、次いで複製し、そして転写され、最終的には感染性インフルエンザウイルスを形成する機能的vRNAに集成するはずである図3。1×106の293T細胞をタンパク質発現プラスミド1μgのpcDNA762、1μgのpcDNA774、01μgのpcDNA787および1μgのpCAGGSWSNNP014および各1μgの以下のRNAポリメラーゼIプラスミドpPo1IWSNPB2、pPo1IWSNPB1、Po1IWSNPA、Po1IWSNHA、Po1IWSNNP、Po1IWSNNA、Po1IWSNMおよびPo1IWSNNSを用いてトランスフェクトした。pcDNA787の量を下げて使用することの決定はこれまでの考察Menaetal1996およびウイルス-様粒子VLPsの作成に関する最適条件に関するデータに基づいた。293T細胞のトランスフェクションから24時間後、1mlあたり7×103pfuウイルスが上清に見いだされ実験1、表1、初めてインフルエンザA型ウイルスを完全にプラスミドから生産するための逆遺伝学の能力が示された。293T細胞は示したプラスミドでトランスフェクトした。24時間実験1および2または48時間実験3~8後、上清のウイルス力価をMDCK細胞を用いて測定した。†特に示さない限り、プラスミドはAWSN33ウイルスのRNAを表すcDNAを用いて構築した。すべてのウイルス構造タンパク質の同時発現coexpressionを用いたインフルエンザウイルス生産の効率ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質の発現はプラスミドが駆動するウイルスの作成に十分であるが、効率を改善し得ることが可能であった。これまでの研究では、すべてのインフルエンザウイルスの構造タンパク質PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2およびNS2の発現は、レポーターのクロラムフェニコール-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする人工的vRNAを含んだVLPをもたらしたMenaetal1996。すなわちウイルスRNAの複製および転写に必要なタンパク質だけに代わり、構造タンパク質の全補完物の利用性がウイルス生産の効率を改善するかもしれない。このために、293T細胞を最適な量のウイルスタンパク質発現プラスミドVLP生産により判定;非公開データを用いてトランスフェクトした:1μgのpcDNA762およびpcDNA774;01μgのpcDNA787;1μgのpEWSNHA、pCAGGSWSNNP014およびpCAGGSWNA15;2μgのpCAGGSWSNM121;03μgのpCANS2;および003μgのpEP24cを、各1μgのRNAポリメラーゼIプラスミドと一緒に用いてトランスフェクトした実験2、表1。第2組の細胞は、PB1遺伝子については再集合ウイルスを生成するためにpPo1IPR834PB1に代えて、PA、PB1、PB2およびNPのみを発現するプラスミドと一緒に実験3、表1またはすべてのインフルエンザ構造タンパク質を発現するプラスミドと一緒に実験4、表1用いて、同じRNAポリメラーゼIプラスミドの組でトランスフェクトした。WSNウイルスの収率、トランスフェクションから24時間後実験1および2、表1または36時間後データは示さずでそれほど変わらなかった。しかしすべてのインフルエンザウイルス構造タンパク質が提供された時、PR834PB1を含むウイルスの収率は10倍以上増加することが分かった実験3および4、表1。NPタンパク質のPA、PB1、PB2の発現について1つのプラスミドが欠けている陰性対照は、いかなるウイルスも生じなかった実験5~8、表1。すなわち生成するウイルスに依存して、すべてのインフルエンザA型ウイルスの構造タンパク質の発現は逆遺伝学法の効率をかなり改善する。次に細胞のトランスフェクション後のウイルス生産の動力学を、APR834PB1遺伝子を含むウイルスを生産するために使用したプラスミドの組を使用して測定した。3つのうちの2つの実験で、ウイルスは最初にトランスフェクションから24時間後に検出された。この時点で測定した力価>103pfuは、トランスフェクションから48時間後までに>106pfuに上昇した表2。ウイルス生産するプラスミド-トランスフェクト細胞の割合を予測するために、293T細胞をEDTAでトランスフェクションから24時間後に処理して細胞を分散させ、そして次いで限界希釈実験を行った。この実験では、この時点で培養上清中に遊離ウイルスが見られなかった。この結果は、1033細胞中1つが感染性のウイルス粒子を生成していることを示した。293T細胞は、PB1遺伝子を除き、AWSN33ウイルス遺伝子をコードする8つのRNAポリメラーゼIプラスミド、および9つのタンパク質発現プラスミドを用いて、明細書中に記載したようにトランスフェクトした。異なる時点で、MDCK細胞における培養上清中のウイルスを滴定した。ND=行わず。NAタンパク質中にFLAGエピトープを含むインフルエンザウイルスの回収新規な逆遺伝学系がインフルエンザA型ウイルスのゲノムに突然変異の導入を可能としたことを確認するために、NAタンパク質にFLAGエピトープCastruccietal1992を含有するウイルスを作成した。293T細胞を、NAタンパク質およびFLAGエピトープの両方をタンパク質ヘッドの底にコードするcDNAを含むRNAポリメラーゼIプラスミドPo1IWSNNAFL79で、必要なRNAポリメラーゼIおよびタンパク質発現プラスミドと一緒にトランスフェクトした。回収したウイルスPR8WSNFL79が実際にNAFLAGタンパク質を発現したことを確認するために、PR8WSNFL79またはAWSN33野生型ウイルスに感染した細胞の免疫染色アッセイを行った。FLAGエピトープに対するモノクローナル抗体はPR8WSNFL79に感染した細胞を検出したが、野生型ウイルスに感染した細胞を検出しなかった図4。PR8WSNFL79ウイルスの回収は、標識していない野生型ウイルスの回収と同程度に効率的であったデータは示さず。このような結果は、新たな逆遺伝学系がインフルエンザA型ウイルスのゲノムに突然変異を導入することを可能にすることを示す。PA遺伝子中に突然変異を含む感染性インフルエンザウイルスの作成PA遺伝子中に突然変異を保有する感染性ウイルスを生産するために、2つのサイレント突然変異を導入して、制限エンドヌクレアーゼに関する新規認識配列を作成したmRNAの846位でBsp120Iおよび1284位でPvuII。これまでは信頼できる選択系が無かったので、逆遺伝学系によりこの遺伝子を修飾することは可能ではなかった。トランスフェクション体ウイルス、PAT846CおよびPAA1284が回収された。回収されたトランスフェクション体ウイルスは、2つの連続する限界希釈により生物学的にクローン化した。回収したウイルスが正にPA遺伝子に突然変異を有するトランスフェクション体であることを確認するために、PA遺伝子のcDNAを逆転写酵素PCRにより得た。図5に示すように、新たに導入された制限部位の存在により示されるように、PAT846CおよびPAA1284CウイルスはPA遺伝子中に期待された突然変異を有した。逆転写工程が無い同じウイルスサンプルおよびプライマーのPCRは、いかなる生成物も生産できずテータは示さず、PAcDNAがウイルスを作成するために使用したプラスミドに代わり正にvRNAに由来することを示している。このような結果は、突然変異した遺伝子をもつウイルスがヘルパーウイルスを使用することなくどのように生産でき、そして回収できるのかを具体的に説明している。考察本明細書に記載した逆遺伝学系は、インフルエンザA型ウイルスを完全にクローン化cDNAから効率よく生産することを可能にする。BridgenおよびElliottも、ブンヤウエラウイルスを作成するための逆遺伝学系を使用したがブンヤウイルス科のファミリー、それは--センスRNAのわずか3セグメントを含み、その生産の効率は低かった102pfu107細胞。ウイルスの収率は実験間で異なったが、一環して>103pfu106細胞がインフルエンザウイルスについては観察され、これらは8つのセグメント含む。上記の高い効率の逆遺伝学系については、いくつかの説明がある。インビトロでRNPを生産する代わりにLuytjesetal1989、RNPはRNAポリメラーゼIを使用したvRNAの細胞内合成を通して、およびウイルスポリメラーゼタンパク質およびNPのプラスミドが駆動する発現を通してインビボで生成された。またプラスミドで容易にトランスフェクトされる293T細胞Gotoetal1997の使用により、確実に大多数の細胞群がウイルス生産に必要なすべてのプラスミドを受容した。さらに成長している細胞の中でも最も豊富に発現されるRNAポリメラーゼIにより生成される多数の転写物が、系の全体的な効率に貢献しているようである。このような特徴は、対応して豊富な数のvRNA転写物およびvRNAのカプシド化に十分な量のウイルスタンパク質、核内のRNPの形成および細胞膜へのこれらの複合体の輸出ここで新規ウイルスが集成され、そして放出されるを導いた。これまでに確立された逆遺伝学系Enamietal1990;Neumannetal1994;Luytjesetal1989;Pleschkaetal1996はヘルパーウイルスの感染、したがって膨大な数のヘルパーウイルスから少数のトランスフェクション体を回収することを可能とする選択法を必要とする。そのような方法は以下のcDNA-由来遺伝子の1つを保有するインフルエンザウイルスを生成するために使用された:pB2Subbaraoetal1993、HAEnamietal1991Horimotoetal1994、NPLietal1995、NAEnamietal1990、Mから始めることができる。本明細書に記載する逆遺伝学系の最も興味のある応用は、インフルエンザウイルスの新たなHAまたはNAサブタイプが関与する流行が疑われる場合に、弱毒化した生のウイルスワクチンの迅速な生産にある。この新規な逆遺伝学系は、ワクチンベクターとしてインフルエンザウイルスの使用を強化するだろう。ウイルスはインフルエンザウイルスタンパク質に加えて、外来タンパク質または免疫原性エピトープを発現するように操作することができる。例えば第9番目のセグメントとして外来タンパク質を含むウイルスを生成しEnamietal1991、そしてそれらを生ワクチンとして使用することができる。インフルエンザウイルスは強力な細胞性および体液性免疫応答を刺激するだけでなく、それらはビリオン表面のHAおよびNAタンパク質の広い配列も可能であり例えば、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの疫学的変異体、同じ標的群の反復免疫感作を可能とする。レポーター遺伝子をコードする人工的vRNAを保有するインフルエンザVLPは、ウイルスの構造タンパク質およびワクシニア-T7ポリメラーゼ系を持つvRNAにより生産されたMenaetal1996。今、逆遺伝学系を使用して、vRNA転写および複製に必要なタンパク質すなわちPA、PB1、PB2およびNPコードするvRNAを、ならびに目的のタンパク質をコードするvRNAを含むVLPを作成することができる。そのようなVLPは遺伝子療法の媒介物として有用となる。重要なことは、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の欠失が、VLP-遺伝子療法の後に感染性のウイルスを確実に生産しないことである。インフルエンザウイルスのゲノムは宿主の染色体に組込まれないので、VLP系は細胞の短期の遺伝子導入例えば、ガンの処置のみが必要な状況において、遺伝子療法として適するだろう。アデノウイルスベクターとは対照的にKovesdietal1997、インフルエンザVLPはHAおよびNA変異体の両方を含むので、標的群の反復処置を可能とする。オルソミクソウイルス科Orthomyxoviridaeのファミリーは、インフルエンザA、BおよびC型ウイルス、ならびに最近分類されたソゴトウイルスを含んで成る。本明細書に記載したクローン化cDNAからの完全な感染性のインフルエンザA型ウイルスの作成法は、オルソミクソウイルス、そして恐らく他の分離した--センスRNAウイルス例えばブニヤウイルス科Bunyaviridae、アレナウイルス科Arenaviridaeにも応用できるだろう。技術的な限界無しでウイルスゲノムを操作する能力は、ウイルスの生活環およびそれらの調節、ウイルスタンパク質の機能およびウイルスの病原性の分子的機作の研究と深く関係する。例2:インフルエンザウイルスのタンパク質PB2、PB1、PAおよびNPの発現は、人工的ウイルスRNAの複製および転写を導くインフルエンザVLPを生成するために、インフルエンザウイルスRNAのインビボの細胞内合成にRNAポリメラーゼI系を使用した図7。この系では、レポーター遺伝子をアンチセンス方向にコードするcDNAが、インフルエンザウイルスRNAの5および3非翻訳領域により挟まれている。このカセットをRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとの間に挿入する。そのような構築物の真核細胞中へのトランスフェクションは、細胞性RNAポリメラーゼIによるレポーター遺伝子の転写を導き、これによりインフルエンザウイルス-様RNAを生成するNeumannetal1994。インフルエンザウイルスの感染で、この人工的vRNAはウイルスポリメラーゼ複合体により複製し、そして転写され、レポーター遺伝子の発現を導く。PB2、PB1、PAおよびNPタンパク質の発現がRNAポーターI-由来転写物によりコードされるレポーター遺伝子の発現を導くのかどうかを決定するために、ニワトリβアクチンプロモーターの制御下のAWSN33ウイルスのNPタンパク質を発現するプラスミド、サイトメガロウイルスプロモーターpcDNA762、pcDNA774およびpcDNA787の制御下のAPR834ウイルスのポリメラーゼタンパク質、およびRNAポリメラーゼIレポーター遺伝子構築物pPo1IGFPを、ヒトの胚性腎293T細胞にトランスフェクトした。48時間後、細胞の30~40がGFPを発現していた図9。対照的にGFP発現はポリメラーゼまたはNPタンパク質を欠くトランスフェクト細胞では検出できなかった。これらの結果は、NPおよび3つのインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質が、複製し、そしてRNAポリメラーゼI-由来GFPvRNAを転写する機能的複合体を形成したことを示していた。最適なvRNA転写および複製最適なレポーターGFP発現に必要なプラスミドDNAの量を決定するために、ポリメラーゼタンパク質およびNPの発現をモジュレートした。これまでの研究では、大量のPAが転写/複製系においてレポーター遺伝子発現の程度を下げたことを示した。したがって段階的様式で、プラスミドからのPAの発現を減少させ、鋳型の量として01μgのpcDNA787が最強のGFP発現を生じることを確認した。RNP複合体の主要な構造成分であるNPを用いると、高量のタンパク質発現プラスミドが必要となるかもしれない。しかし高量のプラスミドはGFP陽性293T細胞の数にそれほど影響を与えなかった。さらに様々な量のPB2およびPB1タンパク質発現プラスミド10から003μgの範囲では、293T細胞中のGFP発現に影響を与えなかった。したがってすべての後の実験では、01μgのpcDNA787および10μgのpcDNA774、pcDNA762およびpCAGGSWSNNP014を使用した。クローン化したcDNAからのインフルエンザVLPの形成ワクシニアウイルスT7ポリメラーゼ系を用いたこれまでの研究では、インフルエンザVLPの形成に9つのインフルエンザウイルスタンパク質PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M1、M2およびNS2が必要であることが示されたMenaetal1996。対照的にNS1タンパク質は粒子形成に必須ではないMenaetal1996。VLP作成のために効率的なプラスミド駆動系を確立するために、HA、NA、M1、M2およびNS2遺伝子をコードするcDNAを作成した。このcDNAを真核発現ベクターpCAGGSMCSニワトリβアクチンプロモーターにより制御されるにクローン化し、それぞれpEWSNHA、pCAGGSWNA15、pCAGGSWSNM124を、pEp24cおよびpCANS2を生成した。各タンパク質の発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。VLPを生成するために、106の293T細胞を各10μgのタンパク質発現プラスミド01μgを使用したpcDNA787を除く、および1μgのレポーター遺伝子構築物pPo1IGFPでトランスフェクトした。培養上清をトランスフェクションから48時間後に回収し、そしてAWSN33ウイルスと混合してGFPvRNAの複製および転写に必要なインフルエンザウイルスタンパク質を提供した。次いで混合物をMDCK細胞に接種した。10時間のインキューベーション後、GFP-陽性MDCK細胞を検出し、これは450粒子/上清に相当した表3。このように、すべてのインフルエンザウイルスの構造タンパク質のプラスミド-駆動発現が、GFPvRNAを含む感染性インフルエンザVLPの形成をもたらした。さらにGFPvRNAはMDCK細胞に送達された。インフルエンザウイルスの最適な集成体VLP形成も、異なる量のRNAポリメラーゼIレポーター遺伝子構築物ならびにHA、NA、M1、M2およびNS2プラスミドDNAを発現する細胞で実験した。pPo1IGFPを用いた実験では、10μgのプラスミドDNAがVLPの生成に高度に効率的であるが、20μgまたは30μgに関する効率は有意に低下した。NS2およびM2タンパク質は感染の後期に低量で発現されるので、比較的少量の発現プラスミドが最適なVLP形成には必要であると思われた。M2発現構築物の10μgから03μgへの減少は、GFP-陽性MDCK細胞の数に10倍以上の増加をもたらした表3。さらにプラスミドを003μgに減少させると、VLPの数は増加しなかった。NS2に関しては、試験した低量のプラスミド01μgがVLPのより低い効率的形成と関連した表3。M1タンパク質はビリオンの主構造成分である。すなわち高レベルのM1発現はVLPの効率的形成に必要なようである。この予測は10μgまたは20μgのM1プラスミドDNAを用いてトランスフェクトした細胞中のVLP形成を比較する実験で試験した。表3に示すように、より高量のプラスミドでGFP陽性MDCK細胞の数に10倍以上の増加をもたらした。HAおよびNAタンパク質を発現する2種類の量1μg対2μgのプラスミドを比較すると、VLP形成に認められる差異を表さず、1μgの各プラスミド。†VLP形成の相対的効率は、5つの顕微鏡視野でGFP陽性細胞の数を計数することにより決定した。1μgの各プラスミドを含有するサンプルを生じたを参照として選択した1の値。プラスミドから完全に生産されたVLPの確実性VLPが本物のインフルエンザウイルスのように感染を開始することを確認するために、VLPをWSNHAに対する抗体で中和した。プラスミドでトランスフェクトした293T細胞に由来するVLPを含有する上清を、抗-WSNHAモノクローナル抗体のプールまたは水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質に対するモノクローナル抗体陰性対照と、室温で1時間インキューベーションした。抗-WSNHAモノクローナル抗体のプールにより中和されないAPR834ヘルパーウイルスを混合物に加え、そしてMDCK細胞に接種した。抗-WSNHAモノクローナル抗体のみがVSVを中和し、HAがVLPの細胞への付着および侵入を媒介することを示した。次にVLPの形成に必要な最少組のタンパク質を同定した。他者は3つのインフルエンザウイルスポリメラーゼおよびNPがvRNAの複製および転写に必須であることを確立したHondaetal1988。したがってこれら4つの各タンパク質は含めるが、HA、NA、M1、M2またはN2を連続して省略した。これらのプラスミドの排除は、トランスフェクトした293T細胞におけるGFPvRNAの複製/転写に影響を及ぼさなかった。HA、NA、M1またはN2タンパク質を欠くトランスフェクトした293T細胞に由来する上清は、感染したMDCK細胞においてGFP発現を促進せず、感染性VLPの不存在を示していた。感染性VLPはM2の省略で検出されたが、その数は低かった>構造タンパク質の完全な組に比べて500倍の減少。すなわちワクシニアウイルス系の研究からのデータと一致して、すべてのインフルエンザウイルス構造タンパク質が感染性VLPの効率的形成には必要である。VLPの生産においてVSV糖タンパク質はHAおよびNAタンパク質と置き換えることができる。インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質を、レセプターの結合および融合に機能するVSV糖タンパク質と置き換えた。pPo1IGFPでトランスフェクトした293T細胞;PB2、PB1、PA、NP、M1、M2およびNS2発現構築物の最適量;および1μgのVSVG構築物では、インフルエンザウイルスの糖タンパク質のVSVGタンパク質への置換はVLP形成に悪い影響を及ぼさなかった。対照的に、ウイルス糖タンパク質としてHAおよびNAを提供するよりははむしろVSVGの時に高い数のGFP陽性細胞が再生産的に見いだされた。すなわちVSVGタンパク質はインフルエンザビリオン中に効率的に取り込まれることができ、そしてウイルスの放出および侵入においてHAおよびNAと同様に機能することができる。感染性インフルエンザウイルス粒子を作成する効率的な系は、このウイルスを用いた研究で、ならびにワクチンおよび遺伝子療法用のベクターの生産に役立つ可能性がある。現存するワクシニアウイルス系とは対照的に、本明細書に記載するVLP生産法は初期の細胞の初期のトランスフェクションおよびVLPの収量>104感染性粒子/ml上清の両方において高度に効率的である。さらにインフルエンザウイルスタンパク質を発現するプラスミドにより完全に駆動されすなわち任意の他のウイルスタンパク質の不存在、これは結果の解釈を大いに単純化する。別の主な進歩は、ビリオン形成、RNP複合体のパッケージング、ウイルス複製物の出芽budding、および結合および融合プロセスにおける致死的突然変異の効果を研究するための能力である。さらに上記のシステムは他のウイルス、例えばパラミクソウイルスおよびラブドウイルスでも十分に操作される。インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質は、VSV糖タンパク質Gにより機能的に置き換えることができる。以前、インフルエンザウイルスは組換えSV40ウイルスにより提供された時に、VSVGタンパク質を取り込めないと報告されたNaimetal1993。本明細書に記載する結果はHAまたはNAのいずれもがVLPの形成に必須ではないが、これらの糖タンパク質が他のウイルスタンパク質との相互作用に役割を果たす可能性を除外することはできず、すなわち尾の少ないHA、NAまたは両方を発現するウイルスの細長い形状により示唆されるようなビリオンの構造に影響を及ぼすことを示唆しているGarciaSastreetal1995:Jinetal1994:Jinetal1997:Mitnauletal1996。これまでに記載したプラスミドに基づく系は、治療用の遺伝子送達に特に有用となり得る。VLPは、転写および複製に必要なタンパク質すなわちNPおよびポリメラーゼをコードするvRNA、ならびに目的のタンパク質をコードするvRNAを含むように調製することができる。これらの粒子は感染性であり、そして指定した遺伝子を標的細胞に送達することができ、ここで複製し、そして転写される。これらの粒子はウイルス遺伝子の完全な成分を含んでいないので、感染性の子孫ウイルスを生産することはできない。この特徴はウイルスゲノムの宿主染色体への組込みの欠如と一緒に、ヒトおよび非ヒト個体に遺伝子への送達の生物学的安全性を確実にするだろう。最後に、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの変異体の利用可能性は、VLPの反復投与を可能とし、これによりアデノウイルスのような他のウイルスベクターの反復使用で直面する主要な障害の1つであるベクターが生成するタンパク質に対する免疫抵抗を克服する。プラスミドが駆動する系のさらなる利点は、ガンの処置のような外来タンパク質の短期発現だけを必要とする状況で実現されるだろう。例3:CreloxP系を使用することにより、複製-欠損性ウイルスの生産のためのパッケッージング細胞系を作成することができる。例えば2つのloxP部位により挟まれた転写停止カセット例えばpBS302、ライフテクノロジーズLifeTechnologies、ベセスダ、メリーランド州;およびSaueretal1993;Laskoetal1992;Picheletal1993;Bolivaretal1977;Stuhletal1981;Stuhletal1985;Fiersetal1978、およびウイルス遺伝子の1つを含むタンパク質発現ベクターを調製する。プロモーター配列で開始する転写を、転写停止部位で遮断する。すなわちウイルス遺伝子は停止および翻訳されない。そのようなベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を、loxP系にクローン化された遺伝子をコードするvRNAを欠くインフルエンザウイルスに感染させる。このウイルスもCreタンパク質をコードするさらなるvRNAを含む。このウイルスはそのvRNAの1つが欠けているので正常な細胞では生存できない。しかしパッケージング細胞中ではvRNAから発現するCreタンパク質がloxP部位で組換えを生じ、転写停止部位の欠失をもたらす。このように個々のウイルス遺伝子1つまたは複数は今、転写そして発現され、ウイルスのこのような細胞中での増幅が可能となる図11。さらにパッケージング細胞系を、loxP系により制御される後期ウイルスタンパク質すなわちHA、NA、M1、M2およびNS2を発現するように調製する図12。HAおよびNAは他のウイルスレセプター-結合および融合タンパク質例えば、EbolaGP、MarburgGP、ブニヤウイルス科の糖タンパク質GP1およびGP2、ラブドウイルスおよびパラミクソウイルスのGおよび/またはFタンパク質、トゴトウイルスの糖タンパク質、および-鎖RNAウイルスの糖タンパク質に置き換えることができる。複製/転写を発現しない、すなわちウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答が限定されるはずである。すべての公報、特許および特許出願は、引用により本明細書に編入する。前述の明細書では本発明をそれらの特定の好適な態様に関して記載し、そして多くの詳細を具体的説明の目的で説明したが、当業者には本発明のさらなる態様も可能であり、そして本明細書に記載した特定の詳細は本発明の基本的理論から逸脱することなくかなり変動させることができることは明白である。"