"水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物であって、水溶性担体中に分散されたリポソームナノ粒子形態において1つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されたレグマイン標的指向性脂質を含み、ならびに場合により抗腫瘍化学療法剤をリポソームナノ粒子内に封入し、レグマイン標的指向性脂質成分がレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む、水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物。水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物であって、場合により抗腫瘍化学療法剤を封入するリポソームナノ粒子の水分散液を含み、リポソームナノ粒子がaレグマイン標的指向性脂質成分、b双性イオン性脂質成分、cアミノ置換脂質成分、d中性脂質成分およびeポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分を含み、レグマイン標的指向性脂質成分がレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む、水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物。レグマイン標的指向性脂質成分が1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン基に共有結合されたレグマイン結合部分を含む、請求項1および2のいずれか一項に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミンが1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPEである、請求項3に記載の組成物。レグマイン結合部分がアザ-Asnマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。レグマイン結合部分がアザ-Asnマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤である式I:により表される基を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。レグマイン標的指向性脂質成分が式II:の化合物を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。双性イオン性脂質成分bが1,2-ジアシルグリセロ-ホスホコリン化合物を含む、請求項2から7のいずれか一項に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホコリン化合物が1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンDOPCを含む、請求項8に記載の組成物。アミノ置換脂質成分cが1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物を含む、請求項2から9のいずれか一項に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物がDOPEを含む、請求項10に記載の組成物。中性脂質成分dがコレステロールを含む、請求項2から11のいずれか一項に記載の組成物。ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分eがポリエチレングリコールにコンジュゲートされた1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物を含む、請求項2から12のいずれか一項に記載の組成物。ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール]を含み、該化合物のポリエチレングリコール部の平均分子量が約2000原子質量単位amuである、請求項13に記載の組成物。成分a、b、c、dおよびeがリポソームナノ粒子中にモル比a:b:c:d:eが約1.1:6.7:6.7:2.2:1で存在する、請求項2から14のいずれか一項に記載の組成物。リポソームナノ粒子組成物が抗がん化学療法剤を封入する、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。抗がん化学療法剤がドキソルビシンまたは1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imを含む、請求項16に記載の組成物。抗がん化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、5-フルオロウリシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、アムサクリン、パクリタキセル、メトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド、ビタキシン、アネコルバート、アンジオスタチン、エンドスタチン、スクワラミン、血管新生抑制トリプトファニル-t-RNAシンテターゼペプチド断片、ベバシズマブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パンチツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、ウルソール酸、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸エステル、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸アミド、1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imとしても公知である。、ならびに生理的に許容されるこれらの塩およびプロドラッグからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項16に記載の組成物。リポソームナノ粒子組成物が抗腫瘍剤を封入する、請求項16に記載の組成物。抗腫瘍剤が腫瘍増殖に関与する受容体または受容体リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項19に記載の組成物。腫瘍の治療における使用のための、請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物。水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物であって、リポソームナノ粒子内に抗腫瘍化学療法剤を封入するリポソームナノ粒子の水分散液を含み、リポソームナノ粒子がaレグマイン標的指向性脂質成分、b双性イオン性脂質成分、cアミノ置換脂質成分、d中性脂質成分およびeポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分を含み、レグマイン標的指向性脂質成分がレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む、水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物。レグマイン標的指向性脂質成分が1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン基に共有結合されたレグマイン結合部分を含む、請求項22に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミンが1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPEである、請求項23に記載の組成物。レグマイン結合部分がアザ-Asnマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤を含む、請求項22に記載の組成物。レグマイン結合部分がアザ-Asnマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤である式I:により表される基を含む、請求項22に記載の組成物。レグマイン標的指向性脂質成分aが式II:の化合物を含む、請求項22に記載の組成物。双性イオン性脂質成分bが1,2-ジアシルグリセロ-ホスホコリン化合物を含む、請求項22に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホコリン化合物が1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンDOPCを含む、請求項28に記載の組成物。アミノ置換脂質成分cが1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物を含む、請求項22に記載の組成物。1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物がDOPEを含む、請求項30に記載の組成物。中性脂質成分dがコレステロールを含む、請求項22に記載の組成物。ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分eがポリエチレングリコールにコンジュゲートされた1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物を含む、請求項22に記載の組成物。ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール]を含み、該化合物のポリエチレングリコール部の平均分子量が約2000原子質量単位amuである、請求項33に記載の組成物。成分a、b、c、dおよびeがリポソームナノ粒子中にモル比a:b:c:d:eが約1.1:6.7:6.7:2.2:1で存在する、請求項22に記載の組成物。抗がん化学療法剤がドキソルビシンまたは1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imを含む、請求項22に記載の組成物。抗がん化学療法剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、5-フルオロウリシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、エトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、アムサクリン、パクリタキセル、メトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド、ビタキシン、アネコルバート、アンジオスタチン、エンドスタチン、スクワラミン、血管新生抑制トリプトファニル-t-RNAシンテターゼペプチド断片、ベバシズマブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パンチツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、ウルソール酸、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸エステル、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸アミド、1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imとしても公知である。、ならびに生理的に許容されるこれらの塩およびプロドラッグからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項22に記載の組成物。リポソームナノ粒子組成物が抗腫瘍剤を封入する、請求項22に記載の組成物。抗腫瘍剤が腫瘍増殖に関与する受容体または受容体リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項38に記載の組成物。レグマインを発現するがん疾患の標的指向および治療における使用のための、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物。レグマインを発現する腫瘍の標的指向および治療方法であって、レグマインを発現する腫瘍を有する対象に請求項1から40のいずれか一項に記載の腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物のナノ粒子内に封入された有効量の抗がん化学療法剤を投与することを含む、方法。レグマインを発現する腫瘍の治療のための、請求項1から40のいずれか一項に記載の腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物の使用。レグマインを発現するがん疾患の治療のための、請求項1から40のいずれか一項に記載の腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物の使用。本発明の組成物および方法はリガンド標的指向に関連した懸念に取り組む一方で、腫瘍特異的な薬剤送達のための有効な手段を提供する。本発明は、場合により抗がん化学療法剤を封入するリポソームナノ粒子の水分散液を含む、水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物を提供する。本発明の水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物は、1つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されたナノ粒子性リポソーム分散液形態においてレグマイン標的指向性脂質を含み、場合により抗がん化学療法剤をリポソームナノ粒子内に封入する。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。抗がん化学療法剤はリポソームナノ粒子内にナノ粒子を調製する間に封入されることが可能であり、またはナノ粒子を予め形成し、続いて化学療法剤を充填することも可能である。好ましい水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物は、aレグマイン標的指向性脂質成分、b双性イオン性脂質成分、cアミノ置換脂質成分、d中性脂質成分およびeナノ粒子性リポソームとして水溶性担体例えば生理的に耐容できるバッファーであり、薬剤処方において一般に用いられる様々な生理的に許容される賦形剤および補助剤を包含することが可能である。中に分散されたポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分を含む。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。レグマイン結合部分は、レグマインと安定な複合体または共有結合を選択的に形成する任意の材料であることが可能である。好ましいレグマイン標的指向性部分はアザ-Asnマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤である。好ましいレグマイン標的指向性脂質成分はリン脂質に結合するアザ-Asnマイケルアクセプターのレグマイン阻害剤を含む。例えば、RR-11aとして公知の阻害剤は図1、パネルa中に示されるように適切な脂質に結合することが可能である。幾つかの好ましい実施形態において、レグマイン標的指向性脂質成分は1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン基、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPEなどに共有結合されたレグマイン結合部分を含む。好ましい双性イオン性脂質成分bは1,2-ジアシルグリセロ-ホスホコリン化合物、例えば1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンDOPCなどを含む。好ましいアミノ置換脂質成分cは1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物、例えばDOPEなどを含む。好ましい中性脂質成分dはコレステロールを含む。好ましいポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分eは、ポリエチレングリコールにコンジュゲートされた1,2-ジアシルグリセロ-ホスホアルカノールアミン化合物、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール]などを含み、この化合物のポリエチレングリコール部の平均分子量が約2000原子質量単位amuである。1つの好ましい実施形態において、成分a、b、c、dおよびeはリポソームナノ粒子中にモル比a:b:c:d:eが約1.1:6.7:6.7:2.2:1で存在する。好ましくは、リポソームナノ粒子組成物は抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシン、1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imとしても公知である。または任意の他の公知の抗がん化学療法剤を封入する。本発明の組成物はレグマインを発現する腫瘍の治療における使用にとりわけ適している。本発明の方法の態様は、がん治療の必要がある患者に、本発明の組成物のリポソームナノ粒子内に封入された有効量の抗がん化学療法剤を投与することを含む。本発明は新規のNP標的指向ストラテジーに関し、このストラテジーはアスパラギニルエンドペプチダーゼであるレグマインに結合する標的指向性部分を利用するものである。本発明はリポソームナノ粒子の水分散液を含む水溶性腫瘍標的指向性リポソームナノ粒子組成物を提供する。ナノ粒子は好ましくは抗がん化学療法剤を封入し、この抗がん化学療法剤は予め形成されたリポソーム組成物に添加されることが可能であり、またはリポソームを形成する間にリポソーム中に組み込まれることも可能である。リポソームナノ粒子は1つ以上の他のミセルまたは小胞形成脂質材料と混合されたナノ粒子性リポソーム分散液形態においてレグマイン標的指向性脂質を含み、好ましくはポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質を組み込む。好ましいリポソームナノ粒子組成物は、aレグマイン標的指向性脂質成分、b双性イオン性脂質成分、cアミノ置換脂質成分、d中性脂質成分およびeポリエチレングリコールにコンジュゲートされた脂質成分、例えばPEG-リポソーム組成物を含む。レグマイン標的指向性脂質成分はレグマイン結合部分に共有結合された疎水性の脂質部を含む。レグマイン結合部分は、レグマインと安定な複合体または共有結合を選択的に形成する任意の材料、例えば不可逆なレグマイン阻害剤であることが可能であり、レグマインへの親和性を有するペプチドスキャフォールド、例えば反応性官能基に付着されたAla-Ala-AsnまたはAla-Ala-X、式中、Xは修飾されたAsn、例えばアザ-Asn残基などなど、例えばアザ-Asn-ハロメチルケトン、アザ-Asnエポキシドおよびマイケルアクセプターとしてα,β-不飽和カルボニル部分を含むアザ-Asnマイケルアクセプターを典型的に含む。かかるアザ-Asn部分は、阻害剤とレグマインとの間に共有結合性のスルフィド結合を形成するように、例えば図4中に示されるように、レグマインの活性部位でシステイン残基と反応する。好ましい標的指向性部分は式Iにより表される。この標的指向性部分は合成アザ-ペプチドマイケルアクセプター型のレグマイン阻害剤であり、レグマインの活性部位のシステイン残基に対するマイケルアクセプターとして働く電子不足の二重結合を包含する修飾アザ-Asn部分に付着された2つのアラニン残基を含む。式IはRR-11aとして公知であるアザ-Asnマイケルアクセプターレグマイン阻害剤の反応部を表す。式中、RR-11aのスクシンイミジルオキシ基はリン脂質により置き換えられている。便宜上、式Iの構造は本明細書においてレグマイン標的指向性脂質材料を参照してRR-11aという。好ましいレグマイン標的指向性脂質は式IIの化合物を含む。細胞表面のレグマイン発現は固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレスにより駆動され、レグマイン標的指向性部分、例えばRR-11aなどに連結されたポリエチレングリコールPEG被覆リポソームは高いリガンド-受容体親和性、取り込みおよび優れた腫瘍浸透を示す。本発明のRR-11aにコンジュゲートされたPEG-リポソーム組成物により送達される抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシンなどは、腫瘍選択性の亢進、薬剤感度の低減および全身的な薬物毒性の除去を劇的にもたらした。本発明の標的化リポソーム組成物のナノ粒子NP担体部は、抗がん化学療法剤、例えばドキソルビシンなどを封入する能力を持つ、例えば小胞または他の膜構造などの膜脂質、例えばリポソームまたはミセルを好ましくは含む。好ましいNPは疎水性脂質部および親水性部を持つ材料を含むが、この材料は水系中に分散された場合にリポソームまたはミセルを形成するようにアレンジされたものである。図1、パネルaは1つの好ましい膜脂質材料1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、DOPEを説明する。用語脂質は、脂質材料の疎水性部が二重層の方向を向き、親水性部が水相の方向を向くような、二重層またはミセルを形成する能力を持つ任意の脂肪酸誘導体をいう。親水性特性は、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシラート基、硫酸基、スルホン酸基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、水酸基または当該技術分野で周知の他の同様の基の存在に由来する。疎水性は、炭素原子が20個までの長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基ならびに1つ以上のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよび/または複素環基により置換されたかかる基を包含するが、これらの基に限定されるものではない基を含ませることにより、与えることが可能である。好ましい脂質はホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質である。ホスホグリセリドの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。リンを含有する基を欠く化合物、例えばスフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質ファミリーなどもまた、脂質と呼ばれる基の範囲内である。加えて、上記の両親媒性脂質はトリグリセリドおよびステロールを包含する他の脂質と混合することができる。レグマイン阻害剤/腫瘍標的指向剤は、付着が腫瘍に発現したレグマインに腫瘍標的指向剤が結合するのを妨げない限り、任意の適切な位置、例えば直鎖の末端または中間位置でリポソームナノ粒子に付着することが可能である。腫瘍標的指向剤はまた、所望の場合、ナノ粒子への付着を促進する二価の架橋基を場合により包含または備えることも可能である。本発明の組成物は、レグマインを発現する腫瘍への標的化送達のための任意の抗がん化学療法剤例えば抗腫瘍剤を有益に封入することが可能である。かかる化学療法剤は例えばImaiandTakaoka,Nat.Rev.Cancer6,714-7262006中に記載され、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。かかる化学療法剤の限定されない例としては、アルキル化剤例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、プリンおよびピリミジンのアナログおよび誘導体例えば5-フルオロウリシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、トポイソメラーゼ阻害剤例えばエトポシド、エトポシドホスファート、テニポシド、アムサクリン、タキサン例えばパクリタキセル、葉酸代謝拮抗剤例えばメトトレキサート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド、血管新生阻害剤例えばビタキシン、アネコルバートanecorvate、アンジオスタチン、エンドスタチン、スクワラミン、血管新生抑制トリプトファニル-t-RNAシンテターゼ断片、例えばT2-TrpRSなど、抗腫瘍モノクローナル抗体例えばベバシズマブ、チボザニブ、バンデタニブ、バタラニブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パンチツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブならびに他の抗悪性腫瘍剤または化学療法剤、例えば細胞毒性のある抗生物質例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、アントラサイクリン抗生物質例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、トリテルペノイドStat3阻害剤例えばウルソール酸、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸エステル、例えば1-[2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,911-ジエン-28-オイル]イミダゾールCDDO-Imとしても公知である。などの2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9-ジエン-28-酸アミドなど、ならびに生理的に許容されるこれらの塩およびプロドラッグが挙げられる。幾つかの好ましい実施形態において、化学療法剤は腫瘍増殖に関与する受容体または受容体リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストである抗腫瘍剤である。標的化リポソーム/化学療法剤複合体またはこの複合体を含有する組成物の薬剤投与計画は、幾つかの因子、例えば年齢、体重、性別および患者の医学的状態のタイプ、状態の重篤度、投与経路、使用される特定の標的指向性分子の結合活性などに基づく。薬剤投与計画は前述の因子に大いに依存的であり得る。約0.01ミリグラムから約1000ミリグラム/キログラム体重のオーダーの用量レベルは前述の医学的状態を治療するのに有用である。好ましい用量レベルは約0.01ミリグラムから約100ミリグラム/キログラム体重の範囲にある。注射による投与の場合、本発明を具体化する標的化リポソーム/化学療法剤複合体またはこの複合体を含有する組成物は、例えば水、生理食塩水またはブドウ糖水溶液などの医薬的に許容される担体と共に処方される。注射の場合、典型的な1日の用量は約0.01ミリグラムから約100ミリグラム/キログラム体重であり、前述の因子に依存して、単回投与または複数回投与として毎日注射される。以下の限定されない例は本発明のある特定の態様をさらに説明する。[実施例1]レグマイン標的化ナノ粒子の処方および性質決定ナノ粒子組成物RR-11aの合成は文献中に記載されている。例えば、Ekici,O.D.,etal.Aza-peptideMichaelacceptors:anewclassofinhibitorsspecificforcaspasesandotherclanCDcysteinproteases.JMedChem47,1889-18922004またはOvat,A.,etal.Aza-peptidylMichaelacceptorandepoxideinhibitors--potentandselectiveinhibitorsofSchistosomamansoniandIxodesricinuslegumainsasparaginylendopeptidases.JMedChem52,7192-72102009を参照のこと。全てのリン脂質AvantiPolarLipidsをクロロホルム中に溶解した。標的指向を達成するため、1-3-ジメチルアミノプロピル-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリドEDCを使用してアザ-ペプチドのカルボン酸末端を活性化することにより修飾し、続いてN-ヒドロキシスクシンアミドと反応させてNHS-エステルを生産した。RR-11aはWuXiAppTecCo.Ltdが合成した。RR-11aにコンジュゲートされたNPは、最初に、RR-11aと1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPEとの約1:1のモル比でトリエチルアミンTEAの存在下での、約24時間、室温での反応により生成した。二番目に、結果として得られた化合物を1,2-ジ-9Z-オクタデセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンDOPC、DOPE、コレステロールおよび1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシポリエチレングリコール-2000]DOPE-PEGと約1.1:6.7:6.7:2.2:1のモル比で、別のリポソーム系について以前に記載されたように組み合わせた。Hood,J.D.,etal.Tumorregressionbytargetedgenedeliverytotheneovasculature.Science296,2404-24072002を参照のこと。サイズ分布をZETASIZERNANO登録商標光散乱アナライザーMalvern上の動的光散乱により決定した。ナノ粒子内へのドキソルビシン充填ドキソルビシンを次のようにNP内に充填した。簡潔に言うと、脂質フィルムを約1mlの滅菌リン酸アンモニウムバッファー300mM、pH7.4中で再水和し、最短で約1時間撹拌し、続いて超音波処理でSUVを生産した。外側のリン酸アンモニウムバッファーをNAP-10カラムGEHealthcare上でのゲルろ過クロマトグラフィーによりPBSpH7.4と交換した。水中のドキソルビシンを次いで10mM溶液として添加し、混合物を一晩室温でインキュベートした。最後に、ドキソルビシンを組み込んだリポソームを、PBSpH7.4バッファーを溶出液として用いたNAP-10カラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。ドキソルビシンを充填されたRR-11aコンジュゲートのリポソームNP組成物をRDZ-218と命名した。DOPEへのRR-11aのコンジュゲーションは、最初に1-3-ジメチルアミノプロピル-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリドEDCを使用してアザ-ペプチドのカルボン酸末端を活性化することにより修飾し、続いてN-ヒドロキシスクシンアミドと反応させてNHS-エステルを生産し、トリエチルアミンを触媒として用いてクロロホルム中でDOPEのアミノ基にカップリングさせることにより達成した。図1、パネルaを参照のこと。腫瘍の低酸素をGlut-1抗体を使用した染色により検出し、フルオレセインにコンジュゲートされた二次抗体を用いて可視化した。細胞核をDAPI染色により可視化した。スケールバー、100μm。図1、パネルbを参照のこと。細胞膜に発現したレグマインへの抗マウスレグマインmAbの親和性をスキャチャード解析により決定した。図1、パネルcを参照のこと。対照およびCoCl2で処理された細胞の平均Kdをそれぞれ約1.107±0.232nMおよび約1.208±0.107nMと算出した。対照およびCoCl2で処理された細胞の結合部位の数をそれぞれ約46,760および約117,800部位/細胞と算出した。NPを赤い蛍光を持つDOPE-ローダミンB脂質の存在下で処方した。マウス4T1および4TO7乳癌細胞ならびにCT26結腸癌細胞を約24時間、約100μMのCoCl2と共に培養し、その後にRR-11a-非標的化またはRR-11a標的化NPを細胞に加えた。図1、パネルdを参照のこと。指示された時間の後にNPを除去し、蛍光顕微鏡検査を用いて直ちに細胞を撮像して、ローダミンB陽性細胞のパーセンテージを定量した。n=3ウェル/群。データは平均値±標準誤差を表す。樹立された同所性の4T1乳腺腫瘍を有する雌性BALB/cマウスに非標的化または標的化NPを単回注射した。マウスを約24時間後に屠殺し、器官を蛍光顕微鏡検査により直ちに分析して、ローダミンBの蛍光により指し示されるNPの分布を可視化した。n=2マウス/群。スケールバー、100μm。図1、パネルeを参照のこと。[実施例2]レグマイン標的指向はPEG-リポソームに封入されたドキソルビシンの取り込みを亢進し、NPを介した原発性乳腺腫瘍への薬剤送達を改善する動物および細胞株雌性BALB/cマウスはTheScrippsResearchInstituteRodentBreedingFacilityから購入した。全ての動物実験はNIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimalsに従って実施し、TheScrippsResearchInstituteAnimalCareCommitteeの許可を受けた。4T1および4TO7マウス乳癌細胞株はSuzanneOstrand-RosenbergUniversityofMaryland、カレッジパーク、メリーランド州、アメリカより提供された。CT26マウス結腸癌細胞はATCCから購入した。結合試験およびスキャチャード解析抗マウスレグマイン抗体約40μgRDSystemsを、氷上で約30分間、約0.5mCiの125IAmershamと共に、約100μgのIODO-GEN登録商標試薬PierceChemicalCo.を使用してコーティングされたポリスチレンチューブ中でインキュベートした。組み込まれなかった125IをPD-10カラムGEHealthcare上でのゲルろ過により除去した。4T1細胞5×105個を100μMのCoCl2存在下または非存在下で約24時間培養し、続いて約14nMの段階希釈された125I標識抗体と共に約2時間、約4μCでインキュベーションを行った。細胞を、1ウシ血清アルブミンBSAを含有するPBSを使用して3回洗浄し、結合した放射性標識の量をシンチレーションカウンターで決定した。対応する一分間あたりのカウント数CPMをPRISM登録商標ソフトウェアGraphPadを使用したスキャチャードプロット解析に用い、レグマイン結合部位の数を算出するのに用いた。インビトロでのナノ粒子取り込み腫瘍細胞を約0.3×106個の細胞/ウェルで6ウェルプレート中に播種した。NP添加の約24時間前に細胞を100μM塩化コバルトで処理し、低酸素を刺激した。RR-11aにコンジュゲートされた、またはRR-11aを含まない遊離のNPであって、空であるか0.2nMドキソルビシンSigmaを充填されたNPであるかのいずれかを細胞に添加し、約15および30分間または約1、2、3、4および6時間インキュベートし、その後にこれらの細胞を、PBSを使用して洗浄し、10亜鉛ホルマリンFisherScientificを使用して固定し、蛍光顕微鏡検査により直ちに分析してドキソルビシンの取り込みを可視化した。フローサイトメトリーによる解析のため、細胞を、NPを除去した後にトリプシン処理し、FACSバッファー中に再懸濁して、平均蛍光強度について直ちに分析した。体内分布アッセイサイズが約500mm3の4TO7同所性腫瘍を持つマウスに、ローダミンBを使用して標識されたRR-11aにコンジュゲートされたNPRR-11aまたはRR-11aを含まないNPRR-11a-の単回用量を注射した。またはマウスにRDZ-218、NP-Dox、遊離DoxまたはPBSのいずれかを約48時間間隔で3回注射した。最後の処置から約24時間後、動物を屠殺して脾臓、腎臓、肺、肝臓、心臓および腫瘍を採取し、OCT化合物Tissue-Tek中で凍結させ、直ちに薄片を作って蛍光顕微鏡検査により撮像した。統計解析実験群と対照との間で差がある試験結果の統計的有意差をPRISM登録商標ソフトウェアGraphPadを用いた両側スチューデントt検定により決定した。P<0.05の場合に試験結果を有意とみなした。ドキソルビシンをリン酸勾配を用いてRR-11aNP内に充填し、RDZ-218を生成した。対照としてRR-11a-NPNP-Dox内にもドキソルビシンを充填した。図2、パネルa中で説明されるように、4T1および4TO7細胞をCoCl2と共に約24時間培養し、次いでRDZ-218、NP-Doxまたは遊離Doxと共に指示された時間インキュベートし、続いてフローサイトメトリー分析を行ってドキソルビシンの平均蛍光強度MFIを決定した。各時点についてn=3ウェル/群。データは平均値±標準誤差を表す。薬剤取り込み濃度のパーセンテージは、RDZ-218、NP-Doxおよび遊離Doxで処理された細胞のMFIを段階希釈されたドキソルビシンのMFIと比較することにより決定した。図2、パネルbを参照のこと。RDZ-218、NP-Dox、遊離Dox、遊離のRR-11aまたは空のRR-11aNPNP-RR-11aのいずれかでの処理後約24時間の死滅4T1および4TO7細胞の相対的パーセンテージは、フローサイトメトリーの前方および側方散乱プロットを分析することにより決定した。図2、パネルcを参照のこと。データは無処理細胞対照に対して相対的に示される。n=3ウェル/群。データは平均値±標準誤差を表す。p<0.05、p<0.005。4TO7細胞を雌性BALB/cマウスの鼠径部乳房脂肪体内に注射した。腫瘍を約5日間、約500mm3のサイズになるまで樹立し、その後にマウスにRDZ-218、NP-Doxまたは遊離Doxを使用した2回の静脈内注射を与えた。マウスを最後の注射から約24時間後に屠殺して組織を分離し、蛍光顕微鏡検査により直ちに分析してドキソルビシンの分布を検出した。図2、パネルdを参照のこと。また組織切片をDAPIを使用して染色し、細胞核を可視化した。n=2マウス/群。スケールバー、100μm。[実施例3]RDZ-218でのマウスの治療的処置は毒性を伴わずに原発性乳腺腫瘍増殖の完全な抑制をもたらす雌性BALB/cマウスの胸部乳房脂肪体に約1×105個の4TO7細胞を注射した。腫瘍細胞チャレンジから約7日後、マウスにRDZ-218、NP-Dox、遊離Dox全て約1mg/kgDoxまたは生理食塩水のいずれかを使用した静脈内注射を3日間隔で5回与えた。腫瘍寸法をマイクロキャリパーを使用して各処置日に測定し、腫瘍サイズを算出するのに用いた。マウスを最後の処置から約24時間後に屠殺した。体重と腫瘍重量の両方を決定し、組織を組織分析に供した。TUNELPromega染色を製造業者のプロとコールに従って実施した。雌性BALB/cマウスに4TO7腫瘍細胞を同所性に注射し、腫瘍を処置の約7日前まで樹立させた。マウスにRDZ-218、NP-Dox、遊離のドキソルビシン遊離Dox、空のRR-11aNPNP-RR-11aまたは生理食塩水PBSのいずれかを使用した静脈内注射を3日間隔で5回与えた。データの点は処置日数を表す。n=5マウス/群。各処置日において、腫瘍寸法をマイクロキャリパーを使用して測定し、腫瘍サイズを算出するのに用いた。図3、パネルaを参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。マウスを5回目の注射から約1日後に屠殺し、解剖前に原発腫瘍のイメージを撮影した。図3、パネルbを参照のこと。イメージは各群からの代表である。原発腫瘍の湿重量も測定した。図3、パネルcを参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。p<0.05。腫瘍切片をTUNELを使用して染色して可視化し、アポトーシス性腫瘍細胞のパーセンテージを定量した。n=5視野/切片。図3、パネルdを参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。p<0.0005。屠殺時の全体重から原発腫瘍重量を減算し、腫瘍細胞チャレンジ前の体重と比較して体重変化を決定した。図3、パネルeを参照のこと。データは平均値±標準誤差を表す。対照群をRDZ-218処置群と比較した。p=0.0029、p<0.001。[実施例4]毒性の評価約500mm3サイズの同所性4TO7腫瘍を持つ雌性BALB/cマウスに、遊離のドキソルビシン、NP-DoxまたはRDZ-218の静脈内注射を約24時間間隔で5回連続して与えた。全ての群のドキソルビシン用量は5mg/kgであった。RDZ-218はインビボで毒性を示さず、従来技術の遊離ドキソルビシンおよびPEG-リポソームに封入されたドキソルビシンと対照的であった。雌性BALB/cマウスに4TO7乳腺腫瘍細胞を同所性に注射した。腫瘍を樹立させ、処置前に約500mm3のサイズに達した。マウスに遊離のドキソルビシン遊離Dox、生来のNP-doxまたはRR-11aのPEG-リポソームに封入されたドキソルビシンRDZ-218のいずれかを使用した静脈内注射を5回与えた。全ての群についてドキソルビシンを約5mg/kgで200μlのPBS中に溶解して投与した。n=5マウス/群。結果を表1中に示す。画分は各処置後の全5匹中の生存マウスの数を表す。考察本発明は、PEG-リポソームNPをアザ-Asnマイケルアクセプター阻害剤類からの小分子分子量451のレグマイン阻害剤であるRR-11aにコンジュゲートすることにより、リガンド標的指向を実証する。図1、パネルaを参照のこと。RR-11aはクランclanCDに特異的な配列を使用して設計されたもので、従ってクランCDプロテアーゼ、例えばレグマインなどに高度に特異的であり、ナノモルの範囲のIC50値IC50=31-55nMで不可逆的に阻害する。重要なことに、RR-11aはカスパーゼ、クロストリパインまたはジンジパインKを包含する他の関係するプロテアーゼと相互作用せず、プロテアーゼによる切断にインビボで抵抗性である。RR-11aによるレグマイン阻害のメカニズムは、マイケルアクセプターのC2の二重結合上での触媒システイン残基による求核攻撃に関わって、このアスパラギニルエンドペプチダーゼを不可逆的に阻害する共有結合を形成することである。図4、パネルaを参照のこと。使用において、本発明の組成物はNPに連結されたRR-11aをレグマインと共有結合させ、全リポソーム複合物の受容体への付着および後に続く不可逆な内部移行をもたらす。この提案されるメカニズムはNMR試験により支持されていて、高い結合親和性はNP標的指向性を改善するであろうことから妥当である。NPの1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンDOPE成分へのRR-11aのカップリングは、トリエチルアミンTEAとの反応により、材料および方法の中に詳細に記載されたように達成された。図1、パネルaを参照のこと。RR-11aに連結されたPEG-リポソームRR-11aまたは生来のPEG-リポソームRR-11a-NPの動的光散乱による分析は、それぞれ約150および110nmの均一なサイズ分布を明らかにしたデータは図示せず。レグマインは腫瘍標的指向のための優秀な処理を提供するが、この理由は、レグマインが種間で高度に保存されていて、ヒトとマウスのレグマインタンパク質の間で約83の相同性を有しており、ヒト固形腫瘍の大部分において過剰発現しているからである。このことに応じて、ウエスタンブロット分析は複数のマウス癌細胞株およびマウス原発性乳腺腫瘍におけるレグマインタンパク質の発現を証明し、従って従前の報告を確認した。細胞内のレグマインは普遍的に発現しているにもかかわらず、レグマインの細胞表面上での発現は微小環境で誘導された細胞ストレス、例えば血清飢餓などに応答して起こる。重要なことに、レグマインの細胞表面発現は固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレスにより亢進され、この低酸素ストレスは、低酸素を誘導可能な確立されたタンパク質であるGlut-1の腫瘍での発現により決定されるように、本発明者らの同所性のマウス乳癌モデルにおいて存在する。図1、パネルbを参照のこと。そのうえ、複数のマウス癌細胞株のインビトロ免疫組織化学的分析は、低酸素ストレスがレグマインの細胞表面発現を誘導したことを指し示したデータは図示せず。リガンド標的指向の効率は標的受容体の存在量に部分的に依存し、標的細胞上での正常細胞に対する過剰発現により最大化される。従って、リガンド標的指向を制限するのは標的の細胞表面受容体の数であり、この数は腫瘍部位に特異的に結合することが可能な標的指向性化合物の分子数を決定する。このため、本発明者らは125I標識抗レグマイン抗体を用いた結合試験およびスキャチャードプロット解析を通じて、腫瘍細胞あたりのレグマイン結合部位の数を定量化した。本発明者らは、正常な酸素圧力下ではレグマイン結合部位の数は約46,760であり、低酸素条件下ではこの数が約117,800部位/細胞に増加したことを算出した。図1、パネルcを参照のこと。低酸素が腫瘍細胞表面のレグマイン結合部位数の約3倍の増加を誘導したという事実は生物学的に妥当であるが、この理由は、低酸素は固形腫瘍微小環境の顕著な特徴であり、従って腫瘍のあらゆる単一の遺伝的特性への依存から標的指向系を解放するからである。このため、本明細書において記載される標的指向ストラテジーは、固形腫瘍において一般に観察される遺伝的不均質性により限定されるべきではない。RR-11aのカップリングが腫瘍細胞によるPEG-リポソームNPの取り込みをインビトロで亢進する程度を評価するため、マウス乳癌細胞4T1および4TO7ならびに結腸癌細胞CT26を低酸素ストレスに供し、蛍光色素ローダミンBを使用して標識されたRR-11aまたはRR-11a-のNPと共に様々な時点でインキュベートした。蛍光顕微鏡検査による分析は、RR-11a-NPと比較してRR-11aNPの顕著な取り込み亢進を、3つ全ての細胞株において試験された全ての時点で明らかにした。図1、パネルdを参照のこと。インビボでの標的指向の有効性は、約500mm3サイズの同所性4T1乳腺腫瘍を持つ雌性BALB/cマウスへのこれらの同一の粒子の静脈内注射により決定した。これらの動物からの腫瘍および組織の蛍光顕微鏡検査は、RR-11a-NPと比較した場合のRR-11aNPの原発腫瘍へのホーミングの顕著な増加、ならびに肝臓、脾臓および腎臓を包含する細網内皮系RESの器官における非特異的な蓄積の低減を明らかにした。図1、パネルeを参照のこと。意外なことに、肝臓において観察されたRR-11aNP蓄積の顕著な減少は有意であり、この理由は、このRES器官が非標的化PEG-リポソームNPの主要な溜まり場として同定されているからであるが、このことは肝臓毒性をもたらす可能性がある。合わせて、これらの驚くべきデータは、PEG-リポソームNPへのRR-11aのカップリングが腫瘍細胞によるこれらのNPの取り込みを低酸素ストレス下で亢進し、原発腫瘍へのNPのホーミングを効果的に増加させる一方、RES器官における蓄積を低減させることを指し示す。リガンドを介した有効なNP薬剤送達のための重要な因子としては、最適な積荷を所望の標的細胞に運搬するNPの能力だけでなく、送達の後にこの積荷を効果的に放出するNPの能力もある。これらのパラメーターを決定的に評価するため、乳癌を治療するのに一般に用いられる化学療法薬であるドキソルビシンを、従前に記載されたように、リン酸アンモニウム勾配を通じてNP内に充填した。低酸素ストレス下のマウス乳腺腫瘍細胞4T1および4TO7を次いで遊離のドキソルビシン遊離Doxまたはドキソルビシンを充填されたRR-11a-NP-DoxまたはRR-11aRDZ-218NPのいずれかと共に様々な時点でインキュベートし、フローサイトメトリーにより直ちに分析して、細胞により内部移行されたドキソルビシンの平均蛍光強度MFIを定量した。RDZ-218で処理された細胞はNP-Doxで処理された細胞と比較した場合にドキソルビシンの取り込み亢進を示した。図2、パネルaを参照のこと。驚くべきことに、RDZ-218での処理は、NP-Doxと比較してより迅速な時間に伴う薬剤取り込みだけでなく、遊離Doxと同様のRDZ-218取り込み率での約16倍もの取り込み度合いの増加をももたらした。図2、パネルaを参照のこと。段階希釈された遊離のドキソルビシンで処理された細胞が生成したMFIを、ドキソルビシンを封入したNPで処理された細胞のMFIと比較することにより、本発明者らは驚くべきことに100近いRDZ-218NPが約4時間の処理のうちに細胞により取り込まれることを観察した。図2、パネルbを参照のこと。そのうえ、遊離Doxと比較して即時の迅速なRDZ-218の取り込みはリガンド-受容体を介した内部移行を指し示すものであって、非標的化NP-Doxと比較した場合に優れていた。次に、RDZ-218のドキソルビシン生理活性を、フローサイトメトリーを使用して処理後約24時間の死滅腫瘍細胞のパーセンテージを比較することにより、インビトロで決定した。図2、パネルcを参照のこと。RDZ-218で処理された細胞は対照またはNP-Doxで処理された細胞と比較して3から15倍の死滅細胞パーセンテージの増加を示した。興味深いことに、このRDZ-218の細胞毒性作用は遊離Doxの細胞毒性作用よりも強かった。重要なことに、遊離のRR-11aまたは空のRR-11aNPで処理された細胞において細胞毒性作用は観察されなかったが、このことはRDZ-218を使用して観察された細胞毒性亢進はNPを介したドキソルビシン取り込み増加に起因するもので、RR-11aによる腫瘍細胞に対する何らかのレグマイン阻害作用に起因するものではないことを指し示す。まとめると、これらの結果は、RDZ-218が生物学的に有効な薬剤積荷の腫瘍細胞への送達をインビトロで亢進することを実証する。リガンド標的化NP送達の主要な治療目標は、生物学的に有効な用量の薬剤を標的細胞に送達することが可能なままに、RES器官におけるNPの非特異的蓄積から生じる望ましくない全身性薬物毒性を最小限にすることである。しかしながら、薬剤送達のためにNPを用いることに伴う1つの懸念は、NPは薬剤分子よりも相対的に大きく、従って血管壁の透過および腫瘍細胞へのアクセスが低分子質量の薬剤または抗体と比較してより起こりにくいであろうことである。このため、治療の場面において薬剤積荷を標的組織に効果的に、また特異的に送達するRDZ-218の能力を試験するため、サイズが約500mm3の確立された乳腺腫瘍を有するマウスに、RDZ-218、NP-Doxまたは遊離Doxのいずれかの静脈内注射を約48時間間隔で2回与えた。最後の注射から約24時間後の腫瘍の顕微鏡分析は、RDZ-218で処置された動物からの腫瘍において、強く、また広範囲に広がったドキソルビシンの蛍光を明らかにした。図2、パネルdを参照のこと。対照的に、NP-Doxまたは遊離Doxのいずれかで処置されたマウスからの腫瘍において、ドキソルビシンの蛍光は著しく低減されたか、または点状であった。図2、パネルdを参照のこと。驚くべきことに、RDZ-218で処置されたマウスのみが、それぞれNP-Doxおよび遊離Doxで処置されたマウスと比較した場合に肝臓および心臓におけるドキソルビシン蛍光の顕著な低減を示した。図2、パネルdを参照のこと。心臓におけるドキソルビシン蓄積の低減は、心毒性がドキソルビシン療法の用量制限因子であることから、とりわけ重要である。これらの結果は、RDZ-218が腫瘍浸透能力を持ち、およびRR-11aNPが薬剤積荷の固形腫瘍への特異的送達をインビボで達成可能である一方で、末梢器官、例えば肝臓および心臓などにおける薬剤の非特異的蓄積を低減させることを明確に指し示す。定着乳腺腫瘍を有するマウスにRR-11aNPにより送達されたドキソルビシン積荷の治療的有効性は、RDZ-218、NP-Dox、空のRR-11aNPNP-RR-11a、遊離Doxまたは生理食塩水のいずれかの静脈内注射を3日間隔で5回マウスに与えることにより評価した。マイクロキャリパーを使用した腫瘍サイズの決定は、RDZ-218処置のみが腫瘍増殖を本質的に根絶した一方、対照群は生理食塩水で処置された動物と比較して腫瘍増殖を遅らせるのみであったことを明らかにした。図3、パネルaを参照のこと。腫瘍細胞チャレンジ後3週間、RDZ-218で処置されたマウスからの原発腫瘍の肉眼的検査は痕跡的な腫瘍小結節のみを明らかにした一方、対照マウスにはサイズが約500mm3以上の大きな腫瘍塊があった。図3、パネルbを参照のこと。RDZ-218での処置は、対照と比較した場合に約8から12倍の腫瘍重量減少をもたらした。図3、パネルcを参照のこと。このことに一致して、RDZ-218で処置されたマウスからの腫瘍切片のTUNEL免疫組織化学的分析は、対照動物からの腫瘍と比較して9から35倍の間のアポトーシス性細胞パーセンテージの増加を明らかにした。図3、パネルdを参照のこと。驚くべきことに、RDZ-218で処置されたマウスは試験過程の全体にわたって体重減少を何ら示さなかったが、このことは毒性低減を指し示すものである。図3、パネル3を参照のこと。このRDZ-218の毒性低減を確認するため、腫瘍を持ったマウスにおける毒性試験を、遊離Dox、NP-DoxまたはRDZ-218の単回用量を全ての群について約5mg/kgドキソルビシンで約5日間の過程にわたって毎日投与することにより実施した表1。RDZ-218で処理された群のみ、5日目の最後の処置の後に全ての動物が生存した。対照的に、約5mg/kgで投与された遊離Doxは致死的で、この群の全ての試験動物は最初の処置の後、直ちに死亡した。このことに対し、非標的化NP-Doxで処置された群では5回全ての処置が完了した後に動物は1個体しか生き残らず、致死的な毒性が2回目および3回目の処置の後、5個体の動物のうち4個体において観察された。これらの驚くべき結果は、RR-11aを介したPEG-リポソームのリガンド標的指向は非標的器官におけるドキソルビシンの非特異的蓄積を低減させ、従って致死的な全身毒性を除去することを確認するものである。[実施例5]CDDO-Imが封入されたレグマイン標的指向性NP脂質フィルム再水和の際の脂質二重層内へのCDDO-Imの自発性組み込みを確実にするため、CDDO-ImをNP内に、CDDO-Imの物理的特性、即ち疎水性およびコレステロールとの化学的類似性を利用して組み込んだ。0.6モル比のCDDO-Imをモル比がそれぞれ6.7:6.7:2.2:1:1.1のDOPE:DOPC:コレステロール:DOPE-PEG:DOPE-RR11aに添加することは、CDDO-Imの有効な充填をもたらした。NP崩壊による放出後の遊離のCDDO-Imおよび封入されたCDDO-ImのUV分光測定による分析は充填濃度が約45μmol/LCDDO-Imであることを指し示したが、この濃度は有効なStat3阻害に必要とされる用量100nmol/Lよりも約450倍高濃度である。動的光散乱およびTEMによる分析は、最適な平均NP直径である約100nmおよび0に近いゼータ電位を示した図5A-Dを参照のこと。[実施例6]封入されたCDDO-Imのインビボでの評価材料認証された4TO7/4T1マウス乳癌細胞はSuzanneOstrand-RosenbergUniversityofMaryland、カレッジパーク、メリーランド州より提供を受け、10FBS、1HEPES、1炭酸水素ナトリウムおよび1ピルビン酸ナトリウムが添加されたRPMI-1640培地Gibco、カールスバッド、カルフォルニア州、アメリカ中で維持した。細胞株を、Balb/cマウス中でのインビボの増殖/転移、IL-6およびS100A8/A9の発現ならびに6-チオグアニンへの抵抗性により認証した。細胞はMycoALERT2008、Lonza、バーゼル、スイスを用いたマイコプラズマについての試験で陰性であった。MMTV-Neu原発腫瘍はMichaelKarinUniversityofCalifornia、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカより提供を受け、同系のFVB/NJマウス中での連続継代により維持した。簡潔に言うと、MMTV-Neu原発腫瘍を細かく刻んで、滅菌条件下、Type3CollagenaseWorthington、レイクウッド、ニュージャージー州、アメリカを使用して、2.5FBSおよび10mMHepesが添加されたRPMI-1640培地中で消化した。1×106個の細胞をPBS中に再懸濁し、同系の雌性FVB/NJマウスの乳房脂肪体内に注射した。この手法を原発腫瘍が約500mm3のサイズに達するまで繰り返した。ウエスタンブロットタンパク質抽出物を従前に記載されたように調製した。ウエスタンブロットは以下の抗体、ウサギ抗リン酸化STAT-3抗体CellSignaling、ダンバーズ、マサチューセッツ州アメリカ、ヤギ抗β-アクチン、IL-6およびIL-10抗体、ウサギ抗リン酸化STAT-1、STAT-3、IL-2、Bcl-xL、Bcl-2およびTGF-β抗体、ラット抗IL-12b、GM-CSFおよびIFN-γ抗体ならびにマウス抗IL-15抗体全てSantaCruzBiotechnology、サンタクルーズ、カルフォルニア州、アメリカおよび抗ERBB2抗体Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、アメリカを使用して探索した。タンパク質のバンド強度を、ImageJソフトウェアを用いて定量し、β-アクチンに対して正規化した。インビボでの腫瘍試験4TO7細胞5×103個またはMMTV-Neu原発腫瘍細胞1×104個をそれぞれ雌性BALB/cマウスまたはFVB/NJマウス内に同所性に注射した。200μlのPBS中のNP約1.36×1013個の粒子を静脈内投与し、腫瘍寸法を、デジタルマイクロキャリパーを用いて測定した。腫瘍体積は式[a2×b/2]を用いて算出したが、式中aは2つの直角に交わる直径のうちより大きいほうである。再発試験のため、原発腫瘍を外科的に除去し、マウスを対側乳房脂肪体中に同所性に再チャレンジした。マウスに1週間隔で3回の強制経口接種を、pNeuTmWei-ZenWei、KarmanosCancerCenter、デトロイト、ミシガン州、アメリカより提供または空のベクターのいずれかが形質導入された弱毒化サルモネラチフィムリウムsalmonellatyphimurium1×108CFU/マウスを使用して行った。フローサイトメトリー脾臓細胞および腫瘍浸潤リンパ球を単離し、フルオレセインにコンジュゲートされたマウスCD8、CD25、CD14、CD11c、CD11b、CD80、CD45、F4/80に対する抗体Biolegend、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカ容積100μl中に0.25μg抗体/106個の細胞および/またはグランザイムBに対する抗体eBioscience、サンディエゴ、カルフォルニア州、アメリカ容積100μl中に0.125μg抗体/106個の細胞と共にインキュベートした1×106個の細胞/チューブ。データをデジタルLSR-IIBectonDickinson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、アメリカ上で収集し、FlowJoソフトウェアTreeStar,Inc.、アシュランド、オレゴン州、アメリカを使用して分析した。免疫組織化学アセトン中で固定された腫瘍切片を一次抗体のラット抗マウスF4/80抗体1:50希釈、AbDSerotec、ローリー、ノースカロライナ州、アメリカおよびウサギ抗マウスNos2抗体1:50希釈、SantaCruzBiotechnology、サンタクルーズ、カルフォルニア州、アメリカを使用して染色し、それぞれ二次抗体のヤギ抗ラットIgGAlexaFluor568抗体またはヤギ抗ウサギIgGAlexaFluor488抗体いずれも1:200希釈、MolecularProbes、カールスバッド、カルフォルニア州、アメリカを使用して検出した。対照の染色のため、二次抗体のみと共に組織切片をインキュベートした。細胞核をDAPIジラクタートSigma、セントルイス、ミズーリ州、アメリカを使用して染色した。CDDO-Imはマウス乳癌細胞におけるSTAT-3活性化を阻害するマウス乳癌細胞におけるIL-6誘導性STAT-3活性化を阻害するCDDO-Imの能力を、4T1腫瘍細胞をIL-6と共におよび遊離のCDDO-Im濃度を増加させながらインキュベートすることにより評価した。ウエスタンブロット分析は、CDDO-Imは100nMから1μMの濃度でSTAT-3のリン酸化を遮断し、全STAT-3タンパク質の発現を抑制したことを明らかにした図6A。STAT-3活性化を阻害する封入されたCDDO-Imの能力を、IL-6刺激4TO7腫瘍細胞を空の標的化NPLeg-NP、CDDO-Imを充填された非標的化NP-CDDOもしくは標的化Leg-NP-CDDONP、または遊離のCDDO-Imと共にインキュベートすることにより確認した。ウエスタンブロット分析は、封入されたCDDO-Imは遊離のCDDO-Imと同様にSTAT-3のリン酸化を遮断したことを示した図6B。重要なことに、Leg-NPで処理された細胞はSTAT-3リン酸化の阻害を示さず、従って阻害はもっぱらCDDO-Imに起因し、NPの何らかの非特異的作用によるものではなかったことを実証した図6B。最後に、治療の場面においてCDDO-Im積荷をMMTV-Neu原発腫瘍に送達するLeg-NPの能力を試験した。この目的のため、同所性の乳腺腫瘍を持つマウスに生理食塩水PBS、Leg-NPまたはLeg-NP-CDDOのいずれかを使用した静脈内注射を3日間隔で8回与えた。最後の注射から1日後に得られたMMTV-Neu原発腫瘍タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、Leg-NP-CDDOは原発腫瘍におけるSTAT-3のリン酸化を効果的に阻害することを示した図6C。まとめると、これらのデータは、CDDO-Imはマウス乳癌細胞におけるSTAT-3のリン酸化を阻害することを実証する。加えて、この業績は、TMEへの標的化送達のためのリポソームNP内へのCDDO-Imの成功裡の封入およびインビボでのSTAT-3リン酸化の有効な治療的阻害を実証する。Leg-NP-CDDOはマウス乳腺腫瘍の増殖を抑制するLeg-NP-CDDOのインビボでの作用を評価するため、BALB/cマウスに約5×103個の4TO7腫瘍細胞を同所性にチャレンジし、4日後、マウスをLeg-NP-CDDOまたは対照の8回の静脈内注射で処置した図7A。原発腫瘍の増殖は対照と比較した場合、Leg-NP-CDDOにより有意に抑制された図7B。重要なことに、遊離のCDDO-Imまたは非標的化粒子中に封入されたCDDO-Imでの処置は、Leg-NP-CDDOと比較した場合、腫瘍増殖を抑制するのに著しく有効性が低かった。加えてLeg-NP-CDDOで処置されたマウスは、無処理の対照と比較して有意な腫瘍量の減少を示した図7C。しかしながら、原発腫瘍細胞と比較してエクスビボで長期培養されている樹立された腫瘍細胞株、例えば4TO7などは、治療的応答に影響し得る遺伝的および表現型変化を獲得する可能性がある。このため、Leg-NP-CDDOの有効性を決定的に評価するため、MMTV-Neu原発性細胞由来の同所性腫瘍で処置されたマウスを、Leg-NP-CDDO、Leg-NPまたはPBSの8回の静脈内注射で処置した図8A。腫瘍体積の算出は、Leg-NP-CDDOで処置されたマウスは対象と比較して有意に腫瘍量が低減したにもかかわらず図8C、わずかな腫瘍サイズ低減を示すのみであった図8Bことを明らかにした。このため、Leg-NP-CDDOは、4TO7細胞株由来の腫瘍と比較して原発腫瘍細胞の増殖をインビボで抑制するのに著しく有効性が低かった。Leg-NP-CDDOは原発腫瘍におけるサイトカインおよび増殖因子の発現を調節するSTAT-3シグナル伝達は、腫瘍細胞およびマクロファージを包含するTME中の他の細胞によるサイトカインおよび増殖因子の発現を調節することにより、インビボでの腫瘍に関連した免疫抑制を仲介する。このため、これらの因子の発現レベルに対するLeg-NP-CDDOの作用を評価するため、全細胞抽出物をLeg-NP-CDDO、Leg-NPまたはPBSで処置したマウスの原発腫瘍から得た。ウエスタンブロット分析は、対照と比較して、Leg-NP-CDDOで処置されたマウスにおいてpSTAT-1715倍、IL-1537倍、IL-12b9倍、IFN-γ24倍およびGM-CSF6倍のタンパク質発現の顕著なアップレギュレートを示した図9A。逆に、IL-6、IL-10およびTGF-βのタンパク質発現はLeg-NP-CDDOで処置されたマウスの原発腫瘍において2から5倍の減少を示した図9B。Leg-NP-CDDO処置はまた抗アポトーシス性タンパク質のBcl-XL8倍およびBcl-21.4倍の発現をダウンレギュレートした図9C。興味深いことに、これらの結果はLeg-NP-CDDO療法の結果としてのTMEのTh1サイトカイン極性化を指し示す。Leg-NP-CDDOで処置されたマウスの原発腫瘍における抗原提示細胞およびCD8T細胞の増加腫瘍により動員される免疫細胞は、TMEからのTh1極性化シグナルを受けるかTh2極性化シグナルを受けるかに依存して異なるサイトカインおよび増殖因子を分泌する。このため、サイトカイン発現において観察されたTh1シフトは、腫瘍中の免疫細胞の環境変化もまた明白であろうことを示唆した。この仮説を評価するため、生きた原発腫瘍の単一細胞懸濁液をLeg-NP-CDDO、Leg-NPまたはPBSのいずれかで処置したマウスから得て、フローサイトメトリーにより分析して、活性化されたCD8T細胞、DCおよびマクロファージを検出した図10A-C。NP-Leg-CDDOで処置されたマウスは、PBS対照と比較して4.6倍のCD8/CD25T細胞の増加を示した図10A。加えて、Leg-NP-CDDOで処置されたマウスでは、マクロファージCD45/F4/80図10BおよびDCCD14/CD11cおよびCD80/CD11b図10Cがそれぞれ5.6倍および2倍に増加したことが明らかになった。マクロファージは、活性化および極性化の様式に依存して、免疫機能および腫瘍増殖に対して大いに異なる作用を持つ。古典的活性化M1マクロファージは抗腫瘍免疫応答に関連したNOS2の高発現を典型的に示す。対照的に、代替的活性化M2マクロファージはNOS2を発現せず、免疫抑制および腫瘍促進応答に典型的に関連する。このため、Leg-NP-CDDOで処置されたマウスの原発腫瘍中のマクロファージはM1またはM2のいずれに対応するのかということについて調査がなされた。この目的のため、腫瘍の免疫組織化学および蛍光顕微鏡検査分析は、Leg-NP-CDDOで処置されたマウス由来の腫瘍におけるF4/80/Nos2陽性細胞の顕著な増加を明らかにしたが図10D、対照腫瘍は主にNOS2-である強いF4/80染色を示した図10D。これらの試験結果は、腫瘍浸潤マクロファージのM1極性化がLeg-NP-CDDO処置の結果であることを示唆する。併用療法はHer-2DNAワクチンの抗腫瘍作用を改善する本試験結果は、Leg-NP-CDDOでの処置がTMEを介した免疫抑制を遮断することを示唆する。そのうえ、サイトカイン発現プロファイルおよび免疫エフェクター細胞の浸潤に基づくと、免疫TMEは抗腫瘍応答に対して十分にプライミングされたように見えた。FVB/NJマウスに約1×104個のMMTV-Neu原発腫瘍細胞を同所性にチャレンジし、Leg-NP-CDDOとHER-2の細胞外ドメインに対するDNAワクチンpNeuTMとの組み合わせで処置した図11A。または、マウスを空の標的化NPLeg-NPまたは対照ワクチンpVectorでも処置した。原発腫瘍を体積が500mm3に達した後に外科的に除去し、4週間の回復の後、実験的再発のため、マウスの対側脂肪体中に約1×104個のMMTV-Neu原発腫瘍細胞を再チャレンジした。腫瘍の再発はLeg-NP-CDDO/pNeuTm併用療法で処置したマウスにおいて対照と比較して有意に抑制され、402/5のマウスにおいて完全な腫瘍拒絶をもたらした図11A。対照的に、pNeuTmを使用したワクチン接種またはLeg-NP-CDDOでの処置は単独では腫瘍再発を防がなかった。これらの結果は、併用療法を介した腫瘍再発予防はLeg-NP-CDDOによって生じ、このLeg-NP-CDDOは免疫TMEをTh1刺激し、従ってpNeuTmワクチン接種の後の抗腫瘍免疫応答を改善することを示唆する。Leg-NP-CDDO、Leg-NPまたはPBSと組み合わせてpNeuTmを接種されたマウスからの脾臓細胞を、放射線照射されたMMTV-Neu原発腫瘍細胞と共に培養し、これらの脾臓細胞のCTL応答をフローサイトメトリーにより測定した。結果は、Leg-NP-CDDOで処置されたpNeuTM接種マウスでは対照と比較してCD8/グランザイムB脾臓細胞のパーセンテージが2.3倍増加したことを示した図11B。加えて、このCTL応答ブーストが腫瘍細胞特異的であるかを評価するため、Leg-NP-CDDO/pNeuTmで処置されたマウスからの脾臓細胞のCTL応答を、HER-2高のMMTV-Neu腫瘍細胞、対してHER-2低のHEVcマウス内皮細胞のいずれかと共に培養した場合で比較した図11C。これらの脾臓細胞のフローサイトメトリー分析は、HER-2高細胞に応答したCD8/グランザイムB細胞のパーセンテージがHER-2低細胞に対して4倍増加したことを明らかにし図11C、従って併用療法で処置されたマウスの免疫応答は実際に腫瘍抗原特異的であったことを実証した。考察Leg-NP-CDDOで処置されたマウスの腫瘍におけるCD8T細胞増加は、T細胞に対する強力なケモアトラクタントであるIL-15発現の顕著な増加と相関した。重要なことに、IL-15は繊細なヒトT細胞および記憶CD8T細胞のTh1T細胞への分化および増殖をインビトロで刺激する。顕著なことに、これらの試験結果は、TMEにおけるIL-15の発現増加がLeg-NP-CDDOを使用したSTAT-3阻害の結果としてのCD8T細胞の機能改善と相関するという所見と一致する。腫瘍関連マクロファージTAMは固形腫瘍において、中でも最も一般的な免疫細胞である。TAMは炎症性細胞のさらなる動員を引き起こすサイトカイン放出による腫瘍促進性炎症を仲介する24。このことに一致して、本発明者らは本明細書において原発腫瘍におけるIL-10およびTGF-βのタンパク質発現の減少を見出したが、これらのタンパク質は両方ともTAMのがん促進性のM2表現型を誘導することが報告されている。対照的に、IFN-γにより活性化されるマクロファージは腫瘍破壊に関連した表現型を有する。これらのM1マクロファージはNOS-2発現により部分的に特徴付けられる。興味深いことに、Leg-NP-CDDOで処置されたマウスの原発腫瘍におけるNOS-2マクロファージの浸潤増加が、原発腫瘍におけるGM-CSFの発現増加と対応して観察された。重要なことに、GM-CSFはDCおよびマクロファージを包含する亢進されたプロフェッショナル抗原提示細胞の動員を誘導することが示された。本結果は、HER-2DNAワクチンpNeuTmと組み合わせたLeg-NP-CDDOを使用した免疫TMEの標的化操作がマウス腫瘍モデルにおける乳癌の再発を本質的に予防したことを実証する。併用療法はまた、単一療法を単独で受けたマウスと比較した場合、CD8T細胞の抗腫瘍CTL応答を有意に改善した。そのうえ、併用療法で処置されたマウスは原発腫瘍細胞に対する特異的なCTL応答の亢進を示したもののHER-2-内皮細胞に対しては示さず、従って腫瘍抗原特異的な免疫応答を実証する。重要なことに、併用療法はHER-2原発腫瘍細胞での再チャレンジ後の腫瘍増殖を遅延させ、40のマウスにおいて再発を予防した。これらの結果は、免疫TMEの治療的操作はがん免疫療法の有効性を改善することが可能であることを明確に実証する。まとめると、本明細書において記載される結果は、単一のサイトカイン療法による限定的な作用を示す幾つかの第I/II相臨床試験の試験結果と合うが、このことは併用療法および複数サイトカインの特異的標的指向への必要性を強く強調した。顕著なことに、本明細書における所見は、TMEにおいて免疫サイトカインおよび増殖因子の主要なレパートリーを操作する新規の標的化治療アプローチを表している。重要なことに、TMEにおけるTh1/Th2移行のための特異的な標的指向性免疫操作により、多くの免疫刺激サイトカインの重篤な全身毒性を回避しつつ、これらのサイトカインの免疫促進作用を利用することができる。がんワクチン療法の抗腫瘍作用を改善してがんの再発を予防することにより、Leg-NP-CDDOはがん患者の寿命および健康を増進するがん免疫療法の有効性を究極的に改善することが可能な強力な有用治療化合物を表している。要約すると、インビボで高度に効率的な固形腫瘍への薬剤積荷送達能力がある新規のレグマイン標的化PEG-リポソームNPが開発された。RR-11aへのカップリングは、固形腫瘍の顕著な特徴である低酸素ストレス下、腫瘍細胞表面上のレグマイン結合部位数の顕著な増加に起因して、腫瘍細胞によるNP取り込みを顕著に亢進した。この現象は、レグマインに対するRR-11aの高い結合親和性と併せて、治療の場面において薬剤が充填されたRR-11aNPの固形腫瘍への特異的ホーミングを促進し、肝臓および心臓における非特異的な蓄積を低減させ、従って望ましくない薬物毒性を除去する。重要なことに、RR-11aNPによる薬剤送達は致死的用量のドキソルビシンの毒性を除去しただけでなく、腫瘍の低用量ドキソルビシンへの感度をも増加させたことから、従って有効な抗腫瘍応答を達成するのに必要な薬剤の量を低減させる。腫瘍微小環境TMEは、免疫サーベイランスからの腫瘍細胞のエスケープおよびがんワクチンの失敗をもたらす免疫抑制を仲介する。免疫抑制はSTAT-3転写因子により仲介されるが、この転写因子は腫瘍および免疫細胞におけるシグナル伝達を増強する。免疫抑制はがんワクチンの有効性の主要な阻害物であり続けることから、本発明者らは本研究において、TMEへの合成STAT-3阻害剤の治療的標的化送達がHER-2DNAワクチンと組み合わされてHER-2乳癌に対する免疫サーベイランスを改善して乳癌再発を予防することが可能であるかを試験した。本発明のCDDO-Im積荷を封入するリガンド標的化ナノ粒子NPはTMEへの特異的送達能力があり、原発腫瘍におけるSTAT-3活性化の有効な治療的阻害を実証した。そのうえ、これらのNPでの処置は、IFN-γ、pSTAT-1、GM-CSF、IL-2、IL-15およびIL-12bのタンパク質発現増加ならびにTGF-β、IL-6およびIL-10のタンパク質発現低減を特徴とする免疫TMEのプライミングをもたらした。加えて、活性化CD8T細胞、M1マクロファージおよび樹状細胞による顕著な腫瘍浸潤の増加が観察された。これらの変化は同所性の4TO7乳腺腫瘍の増殖遅延と相関し、およびHER-2DNAワクチンと組み合わせた場合、免疫適格immunecompetentマウスにおいてHER-2原発腫瘍の再発を予防した。そのうえ、この併用療法で処置されたマウスから分離された脾臓細胞において、抗腫瘍T細胞応答が亢進された。合わせて、これらのデータは、腫瘍特異的抗原に対する免疫サーベイランスの改善を通じた有効ながん再発予防を実証する。本発明の腫瘍標的指向性NPには顕著な臨床適用があるが、この理由は、ドキソルビシンおよびCDDO-Imを封入するのに用いられるRR-11aNPは例えばドキソルビシンおよびタキサンなどの薬剤の組み合わせを包含する他の薬剤化合物を封入するのにも適用可能であり、これらの薬剤の薬物動態の差を実質的に除去し得るからである。本技術は薬剤送達および化学療法の現状を前進させ、抗腫瘍作用に必要とされる生物学的に最適な薬剤用量を低減させるための手段を提供すると同時に、望ましくない全身毒性を除去するものであり、がん患者の健康および生活の質を顕著に改善することが可能である。"