Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌であって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう改変されたことを特徴とする、細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入することにより改変された、請求項1に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、サーモトーガマリチマThermotogamaritimaに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ポラロモナス属の一種Polaromonasspに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ロドシュードモナスパルストリスRhodopseudomonaspalustrisに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラルストニアユートロファRalstoniaeutrophaに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、アゾリゾビウムコーリノダンスAzorhizobiumcaulinodansに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ブラディリゾビウムジャポニカムBradyrhizobiumjaponicumに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、メゾリゾビウム属の一種Mesorhizobiumspに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、コリネバクテリウムグルタミカムCorynebacteriumglutamicumに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ニトロソモナスマリチムスNitrosopumilusmaritimusに由来する、請求項2に記載の細菌。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、オセアニコーラグラニュロサスOceanicolagranulosusに由来する、請求項2に記載の細菌。Pantoea属に属する、請求項1~12のいずれか1項に記載の細菌。Pantoeaananatisである、請求項13に記載の細菌。Escherichia属に属する、請求項1~12のいずれか1項に記載の細菌。Escherichiacoliである、請求項15に記載の細菌。Lアスパラギン酸を生産する、請求項1~16のいずれか1項に記載の細菌。Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する、請求項1~16のいずれか1項に記載の細菌。前記Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物が、Lスレオニン、Lリジン、Lアルギニン、Lメチオニン、及びLホモセリンからなる群より選択される、請求項18に記載の細菌。前記Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物がLアルギニンである、請求項19に記載の細菌。少なくとも以下のものを有するよう更に改変された、請求項1~20のいずれか1項に記載の細菌:α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの減少した活性;クエン酸合成酵素の減少した活性;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの増加した活性;アスパラギン酸アンモニアリアーゼの減少した活性;ピルビン酸キナーゼの減少した活性。リンゴ酸デヒドロゲナーゼの減少した活性を有するよう更に改変された、請求項1~21のいずれか1項に記載の細菌。Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法であって、請求項1~22のいずれか1項に記載の細菌を培地中で培養すること、およびLアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を培地から回収すること、を含む、方法。Lアスパラギン酸が製造される、請求項23に記載の方法。Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物が製造される、請求項23に記載の方法。前記Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物が、Lスレオニン、Lリジン、Lアルギニン、Lメチオニン、及びLホモセリンからなる群より選択される、請求項25に記載の方法。前記Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物がLアルギニンである、請求項26に記載の方法。1.ここに開示する主題に基づく細菌腸内細菌科は、エシェリヒアEscherichia属エンテロバクターEnterobacter属エルビニアErwinia属クレブシエラKlebsiella属パントエアPantoea属フォトラブダスPhotorhabdus属プロビデンシアProvidencia属サルモネラSalmonella属セラチアSerratia属シゲラShigella属モルガネラMorganella属エルシニアYersinia属等に属する細菌を包含する。特に、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationデータベースhttpwwwncbinlmnihgovhtbinpostTaxonomywgetorgmodeTreeid1236lvl3keep1srchmode1unlockにより使用される分類法に従って腸内細菌科Enterobacteriaceaeに分類されるものを使用することができる。Escherichia属又はPantoea属に属する細菌が好適である。Pantoea属に属する細菌という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従ってPantoea属に分類できることを意味する。エンテロバクターアグロメランスEnterobacteragglomeransの幾つかの種が、近年、16SrRNAの塩基配列解析等に基づいて、パントエアアグロメランスPantoeaagglomerans、パントエアアナナティスPantoeaananatis、またはパントエアスチュアールティPantoeastewartii等に再分類されているInternationalJournalofSystematicBacteriologyJuly198939p337345。更に、Erwinia属に属する幾つかの細菌が、Pantoeaananatis又はPantoeastewartiiとして再分類されたInternationalJournalofSystematicBacteriologyJan199343pp162173。Pantoea細菌の代表的な株としては、限定されるものではないが、Pantoeaananatis、Pantoeastewartii、Pantoeaagglomerans、及びパントエアシトレアPantoeacitreaが挙げられる。具体的には、以下の株が挙げられる:PantoeaananatisAJ13355FERMBP6614、ヨーロッパ特許公告第0952221号、PantoeaananatisAJ13356FERMBP6615、ヨーロッパ特許公告第0952221号、PantoeaananatisAJ13601FERMBP7207、ヨーロッパ特許公告第0952221号。ここに開示する主題の例示的な実施態様においては、PantoeaananatisSC17を、λRed耐性細菌として使用することができるVKPMB9246、ロシア連邦出願第2006134574号。Escherichia属に属する細菌という記載は、細菌が、微生物学の当業者に公知の分類に従ってEscherichia属に分類されることを意味する。Escherichia属に属する細菌としては、限定されるものではないが、EscherichiacoliEcoliが挙げられる。Escherichia属に属する細菌は特に限定されない。しかしながら、例えば、NeidhardtFCらEscherichiacoliandSalmonellatyphimuriumAmericanSocietyforMicrobiologyWashingtonDC1208Table1によって記載された細菌が、本発明によって包含される。Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を培地又は細胞から回収することができる程度に、ここに開示した主題に従って、Lアスパラギン酸及び/又はLアスパラギン酸より誘導される1またはそれ以上の代謝産物を生産し、Lアスパラギン酸及び/又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物の培地又は細胞中での蓄積を引き起こす能力をいう。あるいは、Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌という記載は、野生株又は親株より多い量で、目的のLアスパラギン酸及び/又はLアスパラギン酸より誘導される1またはそれ以上の代謝産物の培地中での蓄積を引き起こすことのできる細菌を意味する。ここに開示する主題の例示的な実施態様においては、微生物は、第1の例示的な量として04gL以上の、又は第2の例示的な量として10gL以上の、アスパラギン酸及び/又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物の培地中での蓄積を引き起こすことができる。細菌におけるLアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する能力は、生来のnative能力であってもよく、突然変異誘発又は組換えDNA技術を使用して細菌を改変することにより付与されたものであってもよい。ここに開示する主題に従い、Lアスパラギン酸という用語は、遊離のLアスパラギン酸又はアスパラギン酸と呼ばれるそのあらゆる塩をいう。Lアスパラギン酸より誘導される代謝産物には、Lスレオニン、Lリジン、Lアルギニン、Lメチオニン、及びLホモセリンが含まれ得る。Lアスパラギン酸及び/又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を、標的アミノ酸ともいう。標的アミノ酸は、遊離のLアミノ酸であってもよく、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、又はカリウム塩のような塩であってもよい。ここに開示する主題に関連する主題の著者らは、これまでに、Pantoea属に属する細菌によってLアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造することを試み、また、必要に応じて、少なくとも以下のものを有するように細菌を改変することを試みた:α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼaketoglutaratedehydrogenaseの減少した活性;クエン酸合成酵素citratesynthaseの減少した活性;ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼphosphoenolpyruvatecarboxylase又はピルビン酸カルボキシラーゼpyruvatecarboxylaseの増加した活性;及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼglutamatedehydrogenase又はグルタミン酸合成酵素glutamatesynthaseの増加した活性。細菌は、アスパラギン酸アンモニアリアーゼaspartateammonialyaseアスパルターゼaspartaseをコードする遺伝子の弱化した発現attenuatedexpressionを有するよう改変されていてもよいWO2010038905。細菌は、ピルビン酸キナーゼpyruvatekinaseをコードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変されていてもよい。細菌は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼmalatedehydrogenaseをコードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変されていてもよい。更に、ここに開示する主題の発明者により、Pantoea属に属する細菌によるLアスパラギン酸又はLアスパラギン酸により誘導される代謝産物の生産は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを有するよう細菌を改変した場合に、増強させることができることが見出された。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの活性とは、オキサロ酢酸及びアンモニアからのアスパラギン酸の直接的な合成の正反応を触媒する活性を意味する。アスパラギン酸合成のためにこの反応を利用することで、グルタミン酸の副生を回避することが容易になり得る。また、この場合、必ずしもグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸合成酵素の活性を増加させる必要はない。ここに開示する主題に基づく細菌は、当業者に周知の方法を使用し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子adh遺伝子を導入することによって得ることができる。例えば、細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片を用いて形質転換することができる。遺伝子は、組込み/組換え系integrationrecombinationsystemsを利用して、Pantoea属に属する細菌のような腸内細菌科の細菌内での発現に適したプロモーターの制御下に導入することができる。例えば、Pantoea属に属する組換え細菌を構築する方法は、ロシア連邦特許出願第2006134574号に詳細に記載されている。あるいは、細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換すること等もできる。細菌におけるadh遺伝子のコピー数は、1またはそれ以上であってよい。サーモトーガマリチマThermotogamaritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号1及び配列番号2に示す。また、ここに開示する主題の発明者は、ポラロモナス属の一種PolaromonasspJS666由来の、低い至適温度を有するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を初めて同定しクローニングした。PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号3及び配列番号4に示す。PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメントPolaromonasspJS666DelftiaacidovoransComamonastestosteroneRalstoniaeutrophaPseudomonasaeruginosaBurkholderiacenocepaciaRhodopseudomonaspalustrisRPB3108RpalustrisRPB0147Tmaritimaを図7及び8に示す。これらホモログのコンセンサス配列も図7及び8に示す。また、ここに開示する主題の発明者は、幾つかの微生物由来の遺伝子群を選択して、他のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを見出し、クローニングし、特徴付けた。RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするRPB0147遺伝子の塩基配列を配列番号64に示す。RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするRPB3108遺伝子の塩基配列を配列番号65に示す。RalstoniaeutrophaH16由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするH16B0736遺伝子の塩基配列を配列番号66に示す。AzorhizobiumcaulinodansORS571由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするAZC4388遺伝子の塩基配列を配列番号67に示す。BradyrhizobiumjaponicumUSDA110由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするbll6567遺伝子の塩基配列を配列番号68に示す。Mesorhizobiumsp由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするMeso0824遺伝子の塩基配列を配列番号69に示す。CorynebacteriumglutamicumR由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするcgR1126遺伝子の塩基配列を配列番号70に示す。Nitrosopumilusmaritimus由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするNmar1240遺伝子の塩基配列を配列番号71に示す。Oceanicolagranulosus由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするOG251600504遺伝子の塩基配列を配列番号72に示す。前記微生物は、ATCC、又はJCMから入手可能である。酵素の活性が増加するとは、細胞内の酵素の活性が、改変されていない微生物、例えば、親株又は野生型株、と比較して高いことを意味する。酵素の活性は、酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって細胞内で増加させることができる。このような改変としては、発現させる遺伝子の細胞当りのコピー数を増加させること、遺伝子の発現のレベルを増加させること等が挙げられる。発現させる遺伝子のコピー数の量は、例えば、染色体DNAを制限酵素処理した後、遺伝子配列に基づくプローブを使用したサザンブロッティングを行うことや、蛍光insituハイブリダイゼーションFISHを行うこと等によって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RTPCR等を含む種々の公知の方法によって測定することができる。また、対照となり得る野生型株には、例えば、PantoeaananatisFERMBP6614が含まれていてよい。Pananatis由来のaspA遺伝子の塩基配列及びアスパラギン酸アンモニアリアーゼAspA、アスパルターゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号5及び配列番号6に示す。Pananatis由来のsucA遺伝子の塩基配列及びα-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼSucA、2オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ2oxoglutaratedehydrogenaseのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号7及び配列番号8に示す。Pananatis由来のgltA遺伝子の塩基配列及びクエン酸合成酵素GltA、シトロゲナーゼcitrogenase、オキサロ酢酸トランスアセチラーゼoxalaoacetatetransacetylaseのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号9及び配列番号10に示す。Pananatisは、ピルビン酸キナーゼをコードする2つのアイソザイム、PykA及びPykF、を有する。Pananatis由来のpykA遺伝子の塩基配列及びピルビン酸キナーゼPykAのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号11及び配列番号12に示す。Pananatis由来のpykF遺伝子の塩基配列及びピルビン酸キナーゼPykFのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号13及び配列番号14に示す。Ecoli由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするppc遺伝子は公知であるGenBankaccessionnoNC0009132gi49175990の位置4148470~4151121のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド。ppc遺伝子は、EcoliK12の染色体上のyijP遺伝子とびargE遺伝子の間に位置する。Ecoli由来のppc遺伝子の塩基配列及びppc遺伝子によりコードされるPpcのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号15及び配列番号16に示す。シノリゾビウムメリローティSinorhizobiummeliloti由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpycA遺伝子は公知であるWO2010038905。属間又は株間でDNA配列に幾分かの相異があり得るため、発現が増加又は弱化されるよう改変するadh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、又は配列番号15にそれぞれ示した遺伝子に限定されるものではなく、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、又は配列番号15のそれぞれに対して相同な遺伝子を含んでいてよい。したがって、adh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子によってコードされるタンパク質バリアントvariantは、対応するタンパク質の活性が維持される限り、それぞれ配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16に示したアミノ酸配列全体に対して、80以上、90以上、95以上、98以上、又は99以上の例示的な相同性を有していてよい。ここに開示する主題において使用されるタンパク質バリアントとは、アミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換であるかを問わず、配列に改変を有するタンパク質を意味する。バリアントタンパク質における改変の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存し得る。例示的な態様は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、又は配列番号16のそれぞれにおいて、1~30、1~15、又は1~5であってよい。バリアントにおけるこれらの改変は、タンパク質の三次元構造に重要ではないタンパク質の領域において生じうる。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有するため、そのような改変によっては三次元構造は影響を受けないからである。この明細書において、相同性は同一性を意味する場合がある。2つのアミノ酸配列間の相同性は、周知の方法、例えば、スコア、同一性、及び類似性の3つのパラメータを計算するコンピュータプログラムBLAST20、を利用して決定することができる。1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、又は付加は、活性が維持されるような保存的変異conservativemutationである。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及びValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。したがって、adh、aspA、sucA、gltA、pykA、pykF、又はppc遺伝子は、機能性のタンパク質をコードする限り、それぞれ、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、又は配列番号15に示す塩基配列、又は同塩基配列から調製することのできるプローブに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントであってよい。ストリンジェントな条件には、特異的なハイブリッド、例えば、60以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記未満の相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれ得る。他の例示的な相同性には、70以上、80以上、90以上、95以上、98以上、及び99以上が含まれ得る。例えば、ストリンジェントな条件としては、1xSSC、01SDSの塩濃度で、1回またはそれ以上の回数、例えば2回又は3回洗浄することが挙げられる。他の例示的な塩濃度には、60°Cで01xSSC、01SDSが含まれ得る。洗浄時間はブロッティングに使用される膜の種類に依存するが、原則として、製造業者により推奨された時間であってよい。例えば、ストリンジェントな条件下でのHybond商標Nナイロン膜アマシャムについて推奨される洗浄時間は15分である。例として、洗浄は2~3回行ってよい。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件に応じて適切に選択することができ、例えば、100bp~1kbpであってよい。遺伝子の発現が弱化されるよう細菌が改変されたとは、改変された細菌が、同遺伝子によってコードされるタンパク質を、改変されていない細菌、例えば、親株又は野生型株、と比較して低減された量で含有するように、又は同遺伝子によってコードされるタンパク質を合成することができないように、細菌が改変されたことを意味する。遺伝子の不活性化とは、改変した遺伝子が、全く機能しないタンパク質をコードすることを意味する。遺伝子の一部若しくは全体の欠失、遺伝子のリーディングフレームのシフト、ミスセンス/ナンセンス変異の導入、又はプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等のような遺伝子の発現を制御する配列を含む遺伝子の隣接領域の改変により、改変されたDNA領域が同遺伝子を自然に発現することができないようにすることもできる。細菌の染色体におけるaspA、sucA、gltA、pykA、又はpykF遺伝子の有無は、PCRやサザンブロッティング等を含む周知の方法によって検出することができる。また、遺伝子の発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RTPCR等を含む種々の公知の方法を使用して、同遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することによって見積もることができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量又は分子量は、SDSPAGEの後にイムノブロッティングアッセイウエスタンブロッティング分析を行うこと等を含む公知の方法によって測定することができる。遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内の量が改変されていない株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することにより、弱化させることができる。このような変異は、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失であってよいQiuZandGoodmanMFJBiolChem27286118617KwonDHetalJAntimicrobChemother46793796。遺伝子の発現は、プロモーターやシャインダルガルノ配列等のような発現調節配列を改変することによっても、弱化させることができるWO9534672CarrierTAandKeaslingJDBiotechnolProg155864。例えば、遺伝子の組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。変異型遺伝子を調製し、変異型遺伝子を含むDNA断片を用いて、改変すべき細菌を形質転換する。その後、相同組換えによって染色体上の本来の遺伝子nativegeneを変異型遺伝子と置換し、この結果得られる株を選択する。このような相同組換えによる遺伝子置換は、RedドリブンインテグレーションReddrivenintegrationとして知られている直鎖状DNAlinearDNAを用いることによりDatsenkoKAとWannerBLProcNatlAcadSciUSA9712p66406645、又は温度感受性複製replicationを示すプラスミドを用いる方法により米国特許第6303383号又はJP05007491A、行うことができる。ここに開示する主題に従って用いられる例示的な株は、λRed遺伝子の産物に対して耐性となるように改変することのできるPantoeaananatis株であってよい。このような株としては、限定されるものではないが、Pantoeaananatis株SC17VKPMB9246、ロシア連邦出願第2006134574号が挙げられる。また、上記のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異の組込みは、宿主中で複製できないプラスミドを用いて行うこともできる。遺伝子の発現は、トランスポゾン若しくはISファクターを遺伝子のコード領域に挿入することにより米国特許第5175107号、又はUV照射若しくはニトロソグアニジンNmethylNnitroNnitrosoguanidineを用いる変異誘発のような慣用的な方法により、弱化させることもできる。遺伝子の不活性化は、慣用的な方法、例えば、UV照射若しくはニトロソグアニジンNmethylNnitroNnitrosoguanidineを用いる変異誘発、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子の破壊、及び/又は、Redドリブンインテグレーションとも呼ばれる挿入-欠失変異誘発YuDetalProcNatlAcadSciUSA20009712597883andDatsenkoKAandWannerBLProcNatlAcadSciUSA20009712664045によっても、行うことができる。プラスミドDNAの調製、DNAの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に周知である。これらの方法は、例えば、SambrookJFritschEFandManiatisTMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPressに記載されている。Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する細菌ここに開示する主題に基づく、Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産することのできる細菌としては、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの減少した活性を有するよう改変された細菌、クエン酸合成酵素の減少した活性を有するよう改変された細菌、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ又はピルビン酸カルボキシラーゼの増加した活性を有するよう改変された細菌、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸合成酵素の増加した活性を有するよう改変された細菌、を使用することができる。細菌は、さらに、アスパラギン酸アンモニアリアーゼアスパルターゼをコードする遺伝子の弱化した発現を有するよう改変することもできる。Lスレオニン生産細菌ここに開示する主題に基づくLスレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株としては、Lスレオニン生合成酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。例示的な態様では、ここに開示する主題に基づく細菌は、以下の遺伝子の1またはそれ以上の発現が増強されるよう改変されてよい:スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIaspartokinasehomoserinedehydrogenaseIをコードする変異型thrA遺伝子;ホモセリンキナーゼhomoserinekinaseをコードするthrB遺伝子;スレオニン合成酵素threoninesynthaseをコードするthrC遺伝子;推定上の膜貫通タンパク質putativetransmembraneproteinをコードするrhtA遺伝子;アスパルテート-β-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼaspartateβsemialdehydedehydrogenaseをコードするasd遺伝子;及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼaspartateaminotransferaseアスパルテートトランスアミナーゼaspartatetransaminaseをコードするaspC遺伝子。Escherichiacoli細菌由来の遺伝子を使用することができる。EscherichiacoliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードするthrA遺伝子は明らかとなっているヌクレオチド位置337~2799、GenBankaccessionnoNC0009132gi49175990。thrA遺伝子は、EcoliK12の染色体上のthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。EscherichiacoliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかとなっているヌクレオチド位置2801~3733、GenBankaccessionnoNC0009132gi49175990。thrB遺伝子は、EcoliK12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichiacoliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は明らかとなっているヌクレオチド位置3734~5020、GenBankaccessionnoNC0009132gi49175990。thrC遺伝子は、EcoliK12の染色体上のthrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら3つの遺伝子は全て、単一のスレオニンオペロンとして機能し得る。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエーター領域を同オペロンから除去することができるWO2005049808、WO2003097839。スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードする変異型thrA遺伝子は、thrB遺伝子及びthrC遺伝子と共に、スレオニン生産Ecoli株VKPMB3996中に存在する周知のプラスミドpVIC40から単一のオペロンとして取得することができる。プラスミドpVIC40については、米国特許第5705371号に詳細に記載されている。rhtA遺伝子は、Ecoli染色体上の18分に位置し、グルタミン輸送系の構成要素をコードするglnHPQオペロンに近接している。rhtA遺伝子は、ORF1ybiF遺伝子、ヌクレオチド位置764~1651、GenBankaccessionnoAAA218541gi440181と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によってコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれているrht:ホモセリン及びスレオニンに対する耐性resistancetohomoserineandthreonine。また、rhtA23変異が、AGT開始コドンに対する-1位におけるG→A置換であることが明らかにされているABSTRACTSofthe17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwithAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiologySanFranciscoCaliforniaAugust24291997abstractNo457EP1013765A。Ecoliのasd遺伝子は既に明らかとなっておりヌクレオチド位置3572511~3571408、GenBankaccessionnoNC0009131gi16131307、同遺伝子の塩基配列に基づいて調製したプライマーを利用するPCRポリメラーゼ連鎖反応、WhiteTJら、TrendsGenet5185を参照のことによって取得することができる。他の微生物のasd遺伝子は、同様の手法で取得することができる。また、EcoliのaspC遺伝子も既に明らかとなっておりヌクレオチド位置983742~984932、GenbankaccessionnoNC0009131gi16128895、PCRによって取得することができる。他の微生物のaspC遺伝子は、同様の手法で取得することができる。Lリジン生産細菌ここに開示する主題に基づくLリジン生産細菌を誘導するための親株としては、Lリジン生合成酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。そのような遺伝子としては、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリン酸合成酵素dihydrodipicolinatesynthaseをコードする遺伝子dapA、アスパルトキナーゼaspartokinaseをコードする遺伝子lsyC、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼdihydrodipicolinatereductaseをコードする遺伝子dapB、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼdiaminopimelatedecarboxylaseをコードする遺伝子lysA、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼdiaminopimelatedehydrogenaseをコードする遺伝子ddh米国特許第6040160号、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼphosphoenolpyrvatecarboxylaseをコードする遺伝子ppc、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼaspartatesemialdehydedehydrogeneaseをコードする遺伝子asd、及びアスパルターゼaspartaseをコードする遺伝子aspAEP1253195Aが挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子cyoEP1170376A、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼnicotinamidenucleotidetranshydrogenaseをコードする遺伝子pntAB米国特許第5830716号、ybjE遺伝子WO2005073390、又はこれらの組合せの増加した発現を有していてもよい。ここに開示する主題に基づくLリジン生産細菌を誘導するための親株としては、Lリジンの生合成経路から分岐してLリジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または消失した株が挙げられる。Lリジンの生合成経路から分岐してLリジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼhomoserinedehydrogenase、リジンデカルボキシラーゼlysinedecarboxylase米国特許第5827698号、及びリンゴ酸酵素malicenzymeWO2005010175が挙げられる。Lアルギニン生産細菌ここに開示する主題に基づくLアルギニン生産細菌を誘導するための親株としては、Ecoli237株VKPMB7925米国特許出願第2002058315A1号及び変異型Nアセチルグルタミン酸合成酵素Nacetylglutamatesynthaseを保持するその誘導株ロシア連邦特許出願第2001112869号、Ecoli382株VKPMB7926EP1170358A1、ならびにNアセチルグルタミン酸合成酵素をコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株EP1170361A1等のようなEscherichia属に属する株が挙げられる。本発明のLアルギニン生産細菌を誘導するための親株としては、Lアルギニン生合成酵素をコードする1またはそれ以上の遺伝子の発現が増強された株が挙げられる。このような遺伝子としては、Nアセチルグルタミルリン酸リダクターゼNacetylglutamylphosphatereductaseの遺伝子argC、オルニチンアセチルトランスフェラーゼornithineacetyltransferaseの遺伝子argJ、Nアセチルグルタミン酸キナーゼNacetylglutamatekinaseの遺伝子argB、アセチルオルニチントランスアミナーゼacetylornithinetransaminaseの遺伝子argD、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼornithinecarbamoyltransferaseの遺伝子argF、アルギノコハク酸合成酵素argininosuccinicacidsynthetaseの遺伝子argG、アルギノコハク酸リアーゼargininosuccinicacidlyaseの遺伝子argH、及びカルバモイルリン酸合成酵素carbamoylphosphatesynthetaseの遺伝子carABが挙げられる。Lメチオニン生産細菌Lメチオニン生産細菌及びLメチオニン生産細菌を誘導するための親株としては、限定されるものではないが、Lスレオニン要求性変異株及びノルロイシン耐性変異株が挙げられるJP2000139471A。また、親株としては、メチオニンリプレッサー欠失株、並びにホモセリントランススクシニラーゼhomoserinetranssuccinylase及びシスタチオニンγ-シンターゼcystathionineγsynthaseのようなLメチオニンの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株JP2000139471Aも使用できる。Lホモセリン生産細菌Lホモセリン耐性は、rhtB遺伝子のコピー数を増加させることにより細菌に付与することができ、Lホモセリン、Lスレオニン、Lアラニン、Lバリン、及びLイソロイシンの生産が増加するEP994190A2。更に、Lホモセリン及びLスレオニンに対する耐性は、rhtC遺伝子のコピー数を増加させることにより細菌に付与することができ、Lホモセリン、Lスレオニン、及びLロイシンの生産が増加するEP994190A2。ここに開示する主題に基づくLリジン生産細菌を誘導するための親株としては、RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganismsに受託番号VKPMB2175の下で1980年9月1日に寄託された後、2000年9月1日にブダペスト条約に基づく寄託に移管されたEcoli44株が挙げられる。2.ここに開示する主題に基づく方法ここに開示する主題に基づく方法は、Lアスパラギン酸又はLアスパラギン酸より誘導される代謝産物を製造する方法であって、ここに開示する主題に基づく細菌を培養培地中で培養して、目的アミノ酸を生産し培地中に分泌すること、および生産されたアミノ酸を培地から回収することを含む方法であってよい。ここに開示する主題に基づき、培養、培地からの目的アミノ酸の回収および精製等は、細菌を使用してアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様の手法で行うことができる。培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、および必要に応じて細菌が生育のために要求する適当量の栄養分を含む限り、合成培地であてもよく、天然培地であってもよい。炭素源には、グルコースやショ糖のような種々の炭水化物、及び種々の有機酸が含まれ得る。選択される微生物の同化の様式によっては、エタノールやグリセリンを含むアルコールを使用することができる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化された発酵微生物のような天然の窒素源を使用することができる。ミネラルとしては、モノリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄ferroussulfate、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。ビタミンとしては、チアミン、酵母エキス等を使用することができる。培養は、30°C~36°Cの第1の例示的な温度、又は32°C~34°Cの第2の例示的な温度で、振盪及び/又は通気攪拌によるような好気的な条件下で行うことができる。第1の例示的な培養pHは50~70であってよく、第2の例示的な培養pHは60~65であってよい。培養pHは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液を用いて調整することができる。1~5日間の培養により、液体培地中に目的Lアミノ酸が蓄積し得る。培養後、細胞のような固形分は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、Lアミノ酸は、イオン交換法、濃縮法、及び/又は結晶化法により回収および精製することができる。回収したLアミノ酸は、同Lアミノ酸に加えて、細菌細胞、培地成分、水分、及び細菌の副生代謝産物を含んでいてよい。回収したLアミノ酸の純度は、50以上、85以上、または95以上であってもよい日本国特許第1214636号、米国特許第5431933号、4956471号、4777051号、4946654号、5840358号、6238714号、米国特許出願公開第20050025878号。以下、ここに開示する主題を、以下の非限定的な例を参照してより具体的に説明する。実施例1.Thermotogamaritima由来のTM1643遺伝子のアスパラギン酸生産株への導入アスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするThermotogamaritima由来の十分に研究されたTM1643遺伝子YangZhら、JBiolChem27888048808をクローニングし、Ecoliで過剰発現させた。Thermotogamaritima株は、ATCCから入手することができる。この遺伝子のコード部分は、Ecoliでは稀rareな18コドンを含んでいる。クローニングした遺伝子がEcoli中で効率的に翻訳されるように、全てのレアコドンrarecodonsを同義の高頻度コドンfrequentcodonsに置換したTmaritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード部分を含むDNA断片の化学合成及びクローニングを、SloningBioTechnologyGmbHドイツに発注した。このクローニング技術は、WO2005071077に開示されている。全てのレアコドンの置換を含むTM1643遺伝子の塩基配列、及びこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号17及び配列番号18にそれぞれ示す。翻訳が行われるように、全てのレアコドンの置換を含むTM1643遺伝子の改変されたコード部分を、pET22bNovagenベクターにサブクローニングし、PT7プロモーター及びRBSΦ10の制御下に置いた。このために、SloningBioTechnologyGmbHドイツにより提供されたpUCTM1643AllプラスミドをNdeI及びBamHI制限酵素により消化した。レアコドンが置換されたTM1643のバリアントを含むプラスミド断片を、NdeI及びBamHI制限酵素により消化したpET22bベクターNovagenとライゲーションした。当初のpUCTM1643Allプラスミドから解放されるように、ライゲーションした混合物をKpnI制限酵素により消化した後、15kVcmの電界強度及び5ミリ秒のパルス時間でEcoliTG1株にエレクトロトランスフォームelectrotransformした。TG1株は、例えば、ZymoResearchCorporationから入手することができる。アンピシリン100mgLを含むLBプレート上で生育したクローンからプラスミドDNAを単離し、期待される構造を有するプラスミドを制限酵素解析によって選択した。この結果得られたプラスミドを、pETTM1643Allとした図1。pETTM1643Allプラスミド及びpET22bプラスミド対照としてのそれぞれを、染色体上にT7RNAポリメラーゼ遺伝子を保持するEcoliBL21株Novagenに導入した。EcoliBL21pETTM1643All及びBL21pET22b株をLB培地で37°C、一夜生育させ、培養物を新鮮なLB培地で100倍に希釈し、OD595=10となるまで通気しながら37°Cでインキュベートした。その後、IPTGを1mM濃度となるまで適当な培養物中に添加し、37°Cで1時間インキュベートした。PAAG電気泳動を利用して細菌培養物のサンプルを分析したところ、IPTGによる誘導の後に、不溶性画分において、期待される大きさ27kDaのタンパク質の高いレベルの蓄積が観察された。可溶性画分にも、著量の同タンパク質が含まれていた図2参照。生育した細胞の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性も測定した。45mlの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、2mMDTTを添加した50mMTRISpH75に再懸濁し、フレンチプレスを使用して破砕した。溶解物を13000rpmで10分間遠心分離し、得られた粗抽出物を新しいバイアルに移した。反応混合物は、100mMTRISpH98、1mMNAD又はNADP、及び5mMアスパラギン酸を含有するものとした。粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定により表1、少なくとも逆反応においてはNADPが好適な補因子であることが示された。34°Cでの活性は検出可能であると証明されたが、これは70°Cの場合と比較して30倍低かった。RBSΦ10に接続した遺伝子を、組込みベクターpMIV5JSロシア連邦特許出願第2006132818号、EP1942183にサブクローニングし、Ptacプロモーターの制御下に置いた。この結果得られたプラスミドpMIVTM1643図1を、Pananatis5ΔP236S株に導入した5ΔP2R株の構築については、参考例1に記載されている。Pananatis5ΔP236S及び5ΔP236SpMIVTM1643株のそれぞれを、保持するプラスミド用に50mgLのクロラムフェニコールを添加したLBM912培地中で7時間生育させ、試験管発酵用の標準的な培地を用いて30倍に希釈し、フラスコ750mlのフラスコ中の30mlの培地中で通気しながら15時間培養した。6mlの培養物から細胞を遠心分離により回収し、50mMTRISpH75で洗浄して凍結した。ペレットを50mMTRISpH74及び2mMDTTの緩衝液に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。反応混合物は、100mMTRISpH98、1mMNADP、5mMアスパラギン酸、及び25μgの全タンパク質を含むものとした。プローブは、70°Cで30分間インキュベートした。インキュベートしていないプローブ及びアスパラギン酸なしのプローブを対照として使用した。5ΔP236SpMIVTM1643の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定により、6つの独立した形質転換体において、EcoliBL21pETTM1643All株で測定された比活性と同等の高いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が示された表2。TM1643遺伝子を、EcolippcK620S遺伝子について参考例1に記載したように、5ΔP2R株の染色体へMu依存的に組み込んだ。試験管培養試験管培養用の標準的な手順T=34°C、初発グルコース40gL、初発LGluLグルタミン酸3gL、48時間培養を適用したにより、TM1643遺伝子を保有する株によるアスパラギン酸蓄積の顕著な28倍までの増加が示された表3、2つの独立した培養の平均データを示す。Tmaritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持する5ΔP2RTM1643組込み体の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性を検定した。組込み体用に50mgLのクロラムフェニコールを添加した5gLのグルコースを含有するLBM912培地で9時間培養物を生育させた。その後、これら培養物を、10gLグルコース及び3gLLGluを含有する試験管発酵用の標準的な培地表4、pH6、CaCO3を含まないで1:30に希釈して最終容量10mlとした。この結果得られた培養物を、試験管内で通気しながら34°Cで16時間培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収し、50mMTRISpH74で洗浄して凍結した。ペレットを50mMTRISpH74及び2mMDTTを含有する緩衝液中に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。反応混合物は、100mMTRISpH98、1mMNADP、及び5mMアスパラギン酸を含むものとした。プローブは、70°Cで30分間インキュベートした。アスパラギン酸なしのプローブを対照として使用した。結果を表5に示す。これらの結果は、酵素活性とアスパラギン酸の蓄積との間の直接的な相関を示している。区分Bは、NaOHによりpH65に調整した。区分B及びCは別々に滅菌した。実施例2.推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニングPananatisと類似の環境中に生存する生物学的安全性biosafetyレベル1の細菌種であるPolaromonasspJS666を、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の候補の供与体として選択した。Tmaritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ及びPolaromonasspJS666由来のホモログGENEID4013636Bpro3686のアラインメントを図3に示す。PolaromonasspJS666は、ATCCから入手することができる。最初に、PolaromonasspBpro3686由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をpET22bベクターにクローニングし、PT7プロモーター及び標準的なSD配列であるAGGAGGの制御下に置いた。pETADHPプラスミド図14を構築するために、プライマーAspP5SXba配列番号21及びAspP3BH配列番号22を用いたPCRにより、標準的なSD配列であるAGGAGGに接続されたPolaromonasspBpro3686の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのコード部分を含むDNA断片を生成した。PolaromonasspJS666株ATCCBAA500から単離した染色体DNAを、反応におけるテンプレートとして使用した。得られた断片をXbaI及びBamHI制限酵素を用いて消化し、同じエンドヌクレアーゼを用いて消化したpET22bベクターとライゲーションした。ライゲーションした混合物でEcoliTG1株を形質転換し、アンピシリン100mgLを含むLBプレート上で生育したクローンからプラスミドDNAを単離した。期待される構造を有するプラスミドを制限酵素解析によって選択した。この結果得られたプラスミドをpETADHPとした。クローニングした断片のDNA配列の正確性は、プライマーSeqadhP5配列番号23、SeqadhP3配列番号24、及びSeqadhPm配列番号25を使用するサンガーSanger法により証明した。構築したプラスミドをpETADHPと命名した。pETADHPを保有するBL21株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの25°Cにおける比活性を求めた。細胞を、OD595=09となるまでM9培地5gLグルコース中で37°Cで培養した。その後、1mMのIPTGを添加し、細胞を2時間培養した。測定は室温で行った。正反応用の反応混合物は、100mMTRISHClpH80、100mMNH4Cl、015mMNADH、5mMオキサロ酢酸NaOHによりpH70を含有するものとした。逆反応用の反応混合物は、100mMTRISHClpH98、1mMNAD、及び5mMアスパラギン酸ナトリウムpH70を含有するものとした。結果を表6に示す。これらの結果から、このプラスミドによって室温における高いレベルのNADNADP依存性のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が得られることが示された。PolaromonasspBpro3686遺伝子のコード領域は、Ecoliでは稀な9つのコドンを含んでいた。効率的な翻訳を行うために、レアコドンを置換したORFをSloningBioTechnologyGmbHドイツで化学合成した。全レアコドンの置換を含むBpro3686遺伝子の塩基配列、及びこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号19及び配列番号20に示す。野生型nativeのBpro3686遺伝子及びレアコドンを含まない同遺伝子のバリアントを、pMIV5JSlikeベクターにクローニングし、Ptacプロモーター及び標準的なSD配列AGGAGGの制御下に置いた。構築されたプラスミドは、それぞれ、pMIVADHP及びpMIVADHPallと命名した。PolaromonasspJS666由来の野生型アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子、及びレアコドンを置換した遺伝子を保持するプラスミドにより得られるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性を測定した。クロラムフェニコール50mgLを添加したLBブロスLBbrothで生育させた、上記ベクターのそれぞれで形質転換したEcoliMG1655ATCC47076ATCC700926の一夜培養物を、5gLグルコース及びクロラムフェニコール50mgLを含有するM9培地にOD595=01、最終容量10mlとなるよう希釈した。MG1655株は、AmericanTypeCultureCollection住所12301ParklawnDriveRockvilleMaryland20852POBox1549ManassasVA20108米国から入手することができる。5gLグルコース及びクロラムフェニコール50mgLを含有するLBM912培地中で9時間生育させた、上記ベクターのそれぞれで形質転換したPananatis5ΔP2RMGの培養物を、10gLグルコース、3gLLGlu、及びクロラムフェニコール50mgLを含有する試験管発酵用の標準的な培地pH6、CaCO3を含まないで1:30に希釈し最終容量10mlとした。この結果得られた培養物を、34°Cで通気しながらOD595=10まで培養した。それぞれの培養物の5mlから細胞を遠心分離により回収し、TRISHClpH7450mM中で洗浄し、70°Cで凍結した。ペレットをTRISHClpH7450mM及びDTT2mMを含有する450μlの緩衝液中に再懸濁し、超音波により破砕した。活性測定は、室温で逆反応について行った。反応混合物は、100mMTRISpH98、1mMNAD、及び5mMアスパラギン酸を含有するものとした。3つの独立したクローンについての平均データを表7に示す。これらのデータにより、コドンの置換によって、Ecoliにおいては比活性がいくらか増加するが、Pananatisにおいてはそうならないことが示された。Ralstoniaeutropha由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子orfh16B0736配列番号75及びRhodopseudomonaspalustris由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ORF1RPB0147配列番号73及びORF2RPB3108配列番号74についても、レアコドンを置換したものをSloningBioTechnologyで化学合成し、pMIV5JSlikeベクターにクローニングして、Ptacプロモーターの制御下に置いた。構築したプラスミドは、それぞれpMIVADHRe、pMIVADH1Rp、及びpMIVADH2Rpと命名した。構築した全てのプラスミドを保有するEcoliMG1655株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の比較測定を行った。これらの株の一夜培養物を、クロラムフェニコール50mgLを添加したLBブロス中で生育させた。培養物は、5gLグルコース、1mMIPTG、及びクロラムフェニコール50mgLを含有するM9倍地中でOD595=01となるまで希釈し、OD595=10まで通気しながら34°Cでインキュベートした。それぞれの培養物の5mlから細胞を遠心分離により回収し、TRISHClpH7450mM中で洗浄し、70°Cで凍結した。ペレットをTRISHClpH7450mM及びDTT2mMを含有する450μlの緩衝液中に再懸濁し、超音波によって破砕した。活性測定は、室温で逆反応について行った。反応混合物は、100mMTRISpH=98、1mMNAD、及び5mMアスパラギン酸を含有するものとした。2つの独立したクローンの平均データを表8に示す。これらのデータにより、PolaromonasspJS666由来の遺伝子を保持するプラスミド以外には、Rhodopseudomonaspalustris由来の遺伝子の1つORF2RPB3108を保持するプラスミドによってのみ、検出可能なレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が得られることが示された。よって、高い活性レベルが得られるPolaromonasspに見出されるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を更なる解析のために選択した。更なる検討により、pMIV5JSlikeベクターにクローニングされたRhodopseudomonaspalustris由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びRalstoniaeutropha由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、Ecoli中では発現しないことが示された。これらの遺伝子は、これらの酵素の転写及び翻訳のために最適化されたpETベクターへ遺伝子を再クローニングすることにより、上首尾に発現するに至った。それぞれ実施例5及び実施例9を参照のこと。実施例3.PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製と特徴付け同タンパク質以下、ADHというを、pETADHPプラスミドを保有するBL21株から精製した。粗細胞抽出物の可溶性画分からのADHの精製手順は、硫酸アンモニウム溶液中での沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィにより進めた。ADH活性は、29°Cで340nmにおける吸光度の増加を測定することにより分光学的に求めた。測定混合物は、1mlの最終容量中に、01MTRISHCl緩衝液、pH98、1mMNAD、5mMアスパラギン酸を含有するものとした。結果を表9に示す。これらのデータにより、実行された手順の結果、20の収率で77倍のADHの精製が行われたことが示される。精製したADHの均質性は、SDSPAGEによって評価し、約30±3kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた図2。決定されたADHの分子量は、その配列から予測される値276kDaに合致している。非変性nativeのADHの分子量はゲルろ過によって約49±12kDaと決定されており、このことから、この酵素の活性な形態はホモダイマーとして存在することが示唆される。精製したタンパク質をゲルから抽出し、トリプシンによって消化した。マススペクトル分析により、精製した酵素は、PolaromonasspJS666由来のBpro3686アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のタンパク質産物であることが証明された。HPLC分析により、invitroでは、アスパラギン酸が、精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるオキサロ酢酸の還元的アミノ化の直接的な反応の唯一の生成物であることが示された。温度安定性精製したタンパク質の温度安定性を確認するために、その一定分量を203034405060又は70°Cで1時間インキュベートした。タンパク質の熱安定性は、x軸に示す種々の温度で1時間予備インキュベートしたタンパク質の一定分量を使用し、標準的な正反応29°Cで、01MTRISHCl緩衝液pH98、015mMNADH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸における残存活性を測定することにより評価した。0°Cで保持したタンパク質を用いて測定した活性に対する、種々の温度でインキュベートしたタンパク質を用いて測定した活性の百分率として、結果を図11に示す。検定は少なくとも2連で行い、エラーバーは、測定間の偏差を示す。図11に示すように、20°C~50°Cの温度範囲でのインキュベートの後では、酵素活性の顕著な減少は観察されなかった。60°Cでのインキュベートの後では、酵素は、その活性の約90を失った。70°Cでのインキュベートの後では、酵素活性の100の喪失が観察された。よって、精製した酵素は、50°Cまでの温度ではかなり安定である。ADHの触媒作用についての至適pH及び基質特異性ADHの正反応及び逆反応の触媒作用におけるpHの効果を決定した。結果を図10に示す。正反応は、01MMESNaOH緩衝液pH6~7、01MTRISHCl緩衝液pH7~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH8~11中で、015mMNADH、50mMNH4Cl、及び10mMオキサロ酢酸を用いて行った。逆反応は、01MTRISHCl緩衝液pH8~98、又は01MGlyNaOH緩衝液pH98~12中で、1mMNAD及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。図10から分かるように、ADHの正反応及び逆反応それぞれ、アスパラギン酸の合成及びアスパラギン酸の酸化的脱アミノ化の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された。精製したADHは、pH9~10で正反応の最大活性を示した。逆反応の最大ADH活性は、pH98~11で見られた。よって、pH98の01MTRISHCl緩衝液を、精製したADHの更なる特徴付けに使用した。精製したADHの、正反応及び逆反応における代替的な基質を同定するために、基質特異性のスクリーニングを行った。各10mMのピルビン酸、α‐ケトグルタル酸、α‐ケト酪酸、ケトイソ吉草酸、及びケトメチル吉草酸について、29°Cで015mMNADH50mMNH4Clを用いた正反応における、オキサロ酢酸を代替する能力を試験した。各10mMのグルタミン酸、アラニン、α‐アミノ酪酸、バリン、イソロイシン、アスパラギンについて、29°Cで1mMのNADを用いた逆反応における、アスパラギン酸を代替する能力を試験した。これらの基質の全てについて活性は認められず、この酵素は、オキサロ酢酸及びLアスパラギン酸に対して厳密に特異的である。動力学的パラメータkineticparameters精製した野生型nativeのADHについて、正反応及び逆反応において、詳細な動力学的特徴付けkineticcharacterizationを行った。正反応におけるADHの動力学的解析は、015mMNADH及び100mMNH4Clにおいて基質オキサロ酢酸濃度を05~20mMに変動させることにより、015mMNADH及び20mMオキサロ酢酸においてアンモニウムNH4Cl濃度を6~125mMに変動させることにより、および20mMオキサロ酢酸及び100mMNH4Clにおいて補酵素NADH又はNADPHの濃度を0017~035mMに変動させることにより、実施した。逆反応におけるADHの動力学的解析は、2mMNADにおいて基質アスパラギン酸濃度を01~40mMに変動させることにより、および20mMアスパラギン酸において補酵素NAD又はNADPの濃度を006~4mMに変動させることにより、実施した。結果を表10に示す。表10から分かるように、補酵素特異性に関しては、NADHに対するADHの触媒効率kcatKmは、NADPHに対するものより約3倍高く、NADに対する触媒効率は、NADPに対するものより約5倍高かった。すなわち、ADHは、正反応においてはNADPHよりもNADHに対してより良好な親和性を有し、逆反応においてはNADPよりもNADに対してより良好な親和性を有する。正反応と逆反応とを比較すると、ADHは、NADH又はNADPHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約3倍~10倍高い速度で触媒した。aKm及びVmaxパラメータは、ミカエリス-メンテンの反応速度式のプロットから求めた。bこれらの反応についてシグモイド曲線が観察されたことから、動力学的パラメータは、ヒルの反応速度式のプロットから求めた。計算されたヒル係数は次の通りである:NADHについて171±013及びNADPHについて137±008。全てのデータフィッティング手順は、SigmaPlot80プログラムを用いて実行した。kcat及びkcatKm値は、ADHの分子量2757kDaに等しいに基づいて計算した。ADHの調節特性regulatorypropertiesADHの活性は、正反応及び逆反応において、1mMのピルビン酸、α‐ケトグルタル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、補酵素A、又はアセチル補酵素AacetylcoenzymeAの添加によっては顕著な影響を受けなかった。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの測定は、y軸に示すそれぞれの代謝産物1mMの存在下で、正反応01MTRISHCl緩衝液pH98、015mMNADH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸及び逆反応01MTRISHCl緩衝液pH98、2mMNAD、及び20mMアスパラギン酸について29°Cで実施した。代謝産物の非存在下で測定された活性に対する代謝産物の存在下での活性の百分率として、結果を図12に示す。測定は少なくとも2連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。1mMのオキサロ酢酸又はNH4Clの添加は、逆反応であるアスパラギン酸脱アミノ化を顕著には阻害しなかった。アスパラギン酸について、1~100mMの濃度範囲において、正反応であるアスパラギン酸合成を阻害する能力を試験した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの測定は、アスパラギン酸を添加して、あるいは添加しないで、01MTRISHCl緩衝液pH98、015mMNADH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸中で29°Cで実施した。アスパラギン酸の非存在下で測定された活性に対するアスパラギン酸の存在下での活性の百分率として、結果を図13に示す。測定は、少なくとも2連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。図13に示すように、100mMのアスパラギン酸の添加により、酵素活性は3倍減少したのみであった。Polaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの生物学的役割の検討Polaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの生体内invivoでの機能を解明するために、EcoliΔaspCΔtyrB変異の相補実験を行った。ΔaspCΔtyrB株は、Lアスパラギン酸及びLチロシンの要求性である。構築したPolaromonassp由来のBpro3686アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するpMIVADHPプラスミド及びpMIV5JAベクターを、EcoliMG1655ΔaspCΔtyrB株に導入した。pMIV5JSベクターを保有するEcoliMG1655株を陽性対照として使用した。相補性を試験するために、得られたプラスミド株を、唯一炭素源であるグルコース10gL、Tyr01gL、及びクロラムフェニコール50mgLを含有するM9培地上に再ストリークした。前記示したM9培地上でのMG1655ΔaspCΔtyrB株の生育物からpMIVADHPプラスミドを回収した。逆反応については、EcoliにおけるΔaspA変異の相補性を試験した。ΔaspA株は、Lアスパラギン酸を唯一炭素源として利用することができない。EcoliMG1655ΔaspAPLgltSへpMIVADHPプラスミドを導入することにより、唯一炭素源であるアスパラギン酸10gL及びクロラムフェニコール50mgLを含有するM9培地上におけるこの株の生育がもたらされた。MG1655ΔaspAPLgltSpMIV5JSを陰性対照として使用した。よって、Ecoliにおいて、Polaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持するプラスミドによるΔaspCΔtyrB及びΔaspA変異の相補が証明された。結果的に得られたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸の生合成および異化の両方に関与しているようである。実施例4.PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のPananatisアスパラギン酸生産株への導入PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を、組込み型pMIVADHPallプラスミドを使用したminiMu依存的な手順によって、5ΔP2RMGS株に組み込んだ。5ΔP2RMGS株の構築については参考例1に記載されている。最良のRMGADH組込み体の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定を行った。組込み体用に50mgLのクロラムフェニコールを添加した5gLのグルコースを含有するLBM912培地中で培養物を9時間生育させた。その後、これら培養物を、01mMIPTGを添加した10gLのグルコース及び3gLのLGluを含有する試験管発酵用の標準的な培地pH6、CaCO3を含まないで1:30に希釈して最終容量10mlとした。結果的に得られた培養物を、34°Cで16時間通気しながら試験管内で培養した。その後、遠心分離によって細胞を回収し、50mMTRISpH74を用いて洗浄して凍結した。ペレットを50mMTRISpH74及び2mMDTTを含有する緩衝液中に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は、26°Cで、正反応及び逆反応について行った。一方の反応混合物は、100mMTRISpH98、2mMNAD、及び10mMアスパラギン酸を含有するものとした。他方の反応混合物は、100mMTRISpH98、015mMNADH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸を含有するものとした。アスパラギン酸なしのプローブを正反応における対照として使用した。NH4Clなしのプローブを逆反応における対照として使用した。結果を表11に示す。表11のデータは、EcoliBL21pETADHP株において測定される比活性と同等の高いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す。RMGADH組込み体の試験管培養を行った。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現誘導のために、01mMIPTGを標準的な培地初発グルコース40gL、初発LGlu3gLに補填した。34°Cでの72時間の培養を実施した。3つの独立した培養の平均データを表12に示す。表12に示されるように、最良の組込み体によるアスパラギン酸の蓄積は、対照よりも約2培高かった。したがって、PolaromonasspJS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸発酵におけるオキサロ酢酸のアミノ化に活用することができる。実施例5.RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製と特徴付けRhodopseudomonaspalustrisHaA2由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子RPB0147のクローニング上述したように実施例2参照、RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来のRPB0147遺伝子を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として、分析のために選択した。そのタンパク質産物は、Thermotogamaritima由来の公知のTM1643アスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して28の相同性を有し、見出されたPolaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して同様のレベルの相同性34の同一性を有する。RPB0147遺伝子は、トランスポーターtransporterをコードする遺伝子及び推定上の1価陽イオン/Hアンチポーターantiporterをコードする遺伝子の近傍に位置する。すなわち、RpalustrisRPB0147の遺伝子環境genesurroundingsは、Tmaritima及びPolaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の遺伝子環境とは異なる。Rpalustris由来の酵素は新規な特徴を有し得ると想定された。Rpalustris由来のRPB0147遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換した遺伝子のバリアント配列番号73をSloningBioTechnologyGmbHドイツに発注し、さらにpET15bベクターにサブクローニングして、PT7プロモーター、T7翻訳開始点、RBSΦ10、HisTagコード配列、それに続くトロンビン部位を含むT7発現領域の下に置いた。このために、レアコドンを置換したRpalustrisRPB0147遺伝子のORFを含むpPCRScriptAspDH1RpプラスミドのNdeIBamHI断片を、同じNdeI及びBamHIエンドヌクレアーゼを用いて消化したpET15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15ADH1Rpとした。pET15ADH1Rpプラスミドの構築のスキームを図15に示す。クローニングした断片のDNA配列の正確性を確認するために、構築したプラスミドの構成におけるクローニングした遺伝子の塩基配列を、サンガーの方法SangerFNicklenSCoulsonAR1977DNAsequencingwithchainterminatinginhibitorsProcNatlAcadSciUSA7454635467を使用してVostok社ロシアで決定した。この結果、pET15ADH1Rpのクローン7及び8は、期待されるDNA配列を有するクローニング遺伝子を含んでいた。得られたpET15ADH1Rpプラスミドを、染色体中にT7RNAポリメラーゼの遺伝子を保持するBL21株に形質転換した。pET15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD595=09となるまで37°Cでアンピシリン120mgLを含むLB培地中で培養した。その後、1mMのIPTGを添加し、細胞を2時間培養した。15ml分の細胞を、50mMTRISpH75、1mMDTT、及び1mMEDTAを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。IPTGによる誘導後には、可溶性及び不溶性画分において、期待される大きさ306kDaのタンパク質の高いレベルの蓄積が観察された図16。細胞を、アンピシリン120mgLを含むLB培地中で37°CでOD595=09となるまで培養した。その後、1mMIPTGを添加し、細胞を2時間培養した。測定は室温30°Cで行った。脱アミノ化反応用の反応混合物は、100mMTRISHClpH98、2mMNAD、及び10mMアスパラギン酸ナトリウムpH70を含有するものとした。アミノ化反応用の反応混合物は、100mMTRISHClpH98、100mMNH4Cl、015mMNAD、及び20mMオキサロ酢酸pH70を含有するものとした。粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の測定により、室温30°Cにおける高いレベルのNADP依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの活性が示された表13。すなわち、Rhodopseudomonaspalustris由来のクローニングしたRPB0147遺伝子は、室温で活性のある新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼADH1Rpをコードするものであった。Rhodopseudomonaspalustris由来の見出されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ1の精製と特徴付けRhodopseudomonaspalustrisからクローニングされた新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼADH1Rpを、pET15ADH1Rpプラスミドを保有するEcoliBL21株のクローン8から精製した。アンピシリン120mgLを補填した30mlのLBブロス中で生育させた一夜培養物を、200mlの同じ培地で1:100に希釈し、OD595=1となるまで37°Cでフラスコ中で培養した。その後、1mMIPTGを添加して細胞を誘導した。2時間の培養の後、1Lの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、使用するまで70°Cで保存した。凍結した細胞を融解し、10mlの緩衝液A20mMリン酸ナトリウムpH70、05MNaCl、20mMイミダゾール中に懸濁し、p2000psiでFrenchpressurecellThermospectronicを2回通過させることおよび超音波によって破砕した後、遠心分離を行って破片を除去した。N末端に6×His融合タグhexahistidinefusiontagを付加して発現させた組換えアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、HisTrapHPカラムAmershamPharmaciaBiotechUKを製造業元の推奨する通りに使用して精製した。溶出は、緩衝液B20mMリン酸ナトリウムpH70、05MNaCl中のイミダゾールの20~500mMのリニアグラジエントにより実施した。活性な画分をプールし、緩衝液C20mMリン酸ナトリウムpH70、1mMDTT、1mMEDTA、15グリセリンを用いて平衡化したPD10脱塩カラムAmershamPharmaciaBiotechUKでのゲルろ過によって脱塩した。精製した酵素は一定分量に小分けにし、使用するまで70°Cで保存した。使用した手順の結果、RhodopseudomonaspalustrisADH1Rpは、19の収率で5倍に精製された。精製したADHの均質性をSDSPAGEによって評価し、約31kDaの分子量の主要なバンドが得られた図17。決定したADH1Rpの分子量は、その配列から予測される値306kDaと合致している。至適pHアミノ化反応は、01MMESNaOH緩衝液pH6~7、01MTRISHCl緩衝液pH7~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH8~11中で、015mMNADPH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、01MTRISHCl緩衝液pH8~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH9~12中で、1mMNADP及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも2連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。RhodopseudomonaspalustrisADH1Rpのオキサロ酢酸アミノ化反応及びアスパラギン酸脱アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された図18。精製したADH1Rpは、pH90でアミノ化反応についての最大活性を示した。脱アミノ化反応についての最大のADH1Rp活性は、pH98に見られた。よって、pH90及び98の01MTRISHCl緩衝液を、それぞれ、アミノ化反応及び脱アミノ化反応における精製したADH1Rpの更なる特徴付けのために使用した。動力学的パラメータ精製したRhodopseudomonaspalustrisADH1Rpについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った。アミノ化反応におけるADH1Rpの動力学的解析は、015mMNADPH及び100mMNH4Clにおいて基質オキサロ酢酸濃度を13~20mMに変動させることにより、015mMNADPH及び20mMオキサロ酢酸においてアンモニウムNH4Cl濃度を1~100mMに変動させることにより、20mMオキサロ酢酸及び100mMNH4ClにおいてNADPHの濃度を0025~0400mMに変動させることにより、および20mMオキサロ酢酸及び100mMNH4ClにおいてNADHの濃度を0050~5mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADH1Rpの動力学的解析は、1mMNADPにおいて基質アスパラギン酸濃度を1~60mMに変動させることにより、40mMアスパラギン酸においてNADPの濃度を0015~1mMに変動させることにより、および40mMアスパラギン酸においてNADの濃度を05~12mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、SigmaPlot80プログラムを用いて実行した。kcat及びkcatKm値は、ADH1Rpの分子量3063kDaに等しいに基づいて計算した。得られたデータを表14に示す。Km及びVmaxパラメータは、ミカエリス-メンテンの反応速度式のプロットから求めた。補酵素特異性に関しては、NADPHに対するADH1Rpの触媒効率kcatKmは、NADHに対するものより約72倍高く、NADPに対する触媒効率は、NADに対するものより約103倍高かった。すなわち、ADH1Rpは、正反応においてはNADHよりもNADPHに対して極めて良好な親和性を有し、逆反応においてはNADよりもNADPに対して極めて良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADH1Rpは、アスパラギン酸の脱アミノ化についての場合より約4倍~5倍高い速度で、NADPH又はNADHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を触媒した。要約1.RhodopseudomonaspalustrisADH1Rpは、アルカリ性条件下pH90及びpH98で、invitroでのアスパラギン酸合成の反応を、逆反応であるアスパラギン酸の脱アミノ化よりも効率的に4~5倍触媒する。また、pH70の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。2.アンモニウムNH4Clに対する決定されたKm値は11mMである。この値は、PolaromonasspのADHについて決定されたNH4Clに対するKm値33mMより3倍低い。3.NADPH及びNADPは、invitroで、RhodopseudomonaspalustrisADH1Rpのより好適な70~100倍補因子である。4.NADPH及びNADHに対する決定されたKm値は、それぞれ0210mM及び45mMである。一方、同ピリジンヌクレオチドのEcoli細胞内での典型的な濃度は、015mMNADPH及び002mMNADHであるTPenfoundJWFaster1996BiosynthesisandRecyclingofNADInNeidhardtFCEscherichiacoliandSalmonellatyphimuriumCellularandMolecularBiologyASMPressWashingtonDCpp721730。よって、生体内invivoでは、Rhodopseudomonaspalustris由来のADH1Rpは、オキサロ酢酸のアミノ化反応における補因子としてNADPHのみを利用し得ると言えよう。実施例6.公知のADH1Rpのホモログおよびそれらの遺伝子環境の解析に基づく、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の検索実施例2に記載したように、穏やかなmoderate温度29°Cで活性なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードするPolaromonasspJS666由来のBpro3686遺伝子が見出された。アスパラギン酸生合成に最適な新たな酵素を見出すために、Polaromonasspのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼのBlastpタンパク質‐タンパク質BLASTproteinproteinBLAST解析を実施した。このタンパク質の完全長ホモログは、多くの群の細菌及び古細菌に見出された図19及び20。このタンパク質に近縁なホモログ同一性50~71は、RalstoniaBurkholderiaComamonastestosteroniDelftiaacidovoransCupriavidustaiwanensis及びPseudomonasaeruginosaに見出された。見出されたPolaromonasspJS666由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの全ホモログは、このようなホモログをコードする遺伝子の機能的な染色体環境に基づいて分類した。Polaromonassp由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、チアミンピロリン酸酵素をコードする遺伝子及びベタイン-アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の近傍に位置していた。第1の群には、同一の遺伝子環境を有する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。Thermotogamaritima由来の公知のTM1643遺伝子YangZhSavchenkoAYakuninAZhangREdwardsAArrowsmithCTongLAspartatedehydrogenaseanovelenzymeidentifiedfromstructuralandfunctionalstudiesofTM16432003JBiolChem27888048808は、キノリネート合成酵素A及びニコチネート-ヌクレオチドピロホスホリラーゼをそれぞれコードするnadA及びnadC遺伝子とオペロンを構成する。また、第2の群には、Tmaritima由来の遺伝子に体系づけられた推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。第3の群には、トランスポーターをコードする遺伝子の近傍に位置する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。第4の群には、lysRファミリーの遺伝子の近傍に位置する推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる。弱いホモログの一群は異なる遺伝子環境を有しており、分類を行わなかった。MesorhizobiumspBNC1由来のMeso0824遺伝子配列番号69を、Polaromonassp由来の遺伝子と同一の遺伝子環境を有する第1の群のホモログの候補として選択した。これは、群の中で最も弱い相同性を有しているPolaromonasspJS666由来のBpro3686遺伝子に対して42のアミノ酸同一性。NitrosopumilusmaritimusSCM1由来のNmar1240遺伝子配列番号7132のアミノ酸同一性を、Tmaritima由来の遺伝子に類似する遺伝子環境を有する第2の群のホモログの候補として選択した。Tmaritimaとは対照的に、Nitrosopumilusmaritimusは、穏やかな温度25~40°Cで生存する非好熱性の生物である。AzorhizobiumcaulinodansORS571由来のAZC4388遺伝子配列番号67PolaromonasspJS666由来のBpro3686遺伝子に対して45のアミノ酸同一性及びBradyrhizobiumjaponicumUSDA110由来のbll6567遺伝子配列番号68PolaromonasspJS666由来のBpro3686遺伝子に対して35のアミノ酸同一性を、2つのホモログ群からの候補として選択した。両生物は、共生性の窒素固定細菌であり、植物において根粒noduleの形成を引き起こし得る。窒素固定細菌は、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの探索において、見込みのある対象であり得る。これは、アスパラギン酸は、根粒の植物体部分のみならずバクテロイド部分においても、オキサロ酢酸の還元的なアミノ化を介して合成され得るからであるKretovichWLKariakinaTIWeinovaMKSidelnikovaLIandKazakovaOWThesynthesisofasparticacidinRhizobiumlupinibacteroidsPlantSoil198161145156。CorynebacteriumglutamicumR由来の仮想タンパク質をコードするcgR1126遺伝子配列番号70及びOceanicolagranulosus由来のOG251600504遺伝子を、弱いホモログから選択したPolaromonasspJS666由来のBpro3686遺伝子に対して、それぞれ31及び30のアミノ酸同一性。Ecoli及びPananatisで上記遺伝子が効率的に翻訳されるように、全てのレアコドンが同義の頻出コドンに置換されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード部分を含むDNA断片の化学合成及びクローニングを、SloningBioTechnologyGmbHドイツに発注した。全てのレアコドンの置換を含む遺伝子の塩基配列を配列表のセクションに示す。RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来の改変されたRPB0147遺伝子配列番号73、RhodopseudomonaspalustrisHaA2由来の改変されたRPB3108遺伝子配列番号74、Ralstoniaeutropha由来の改変されたh16B0736遺伝子配列番号75、AzorhizobiumcaulinodansORS571由来の改変されたAZC4388遺伝子配列番号76、BradyrhizobiumjaponicumUSDA110由来の改変されたbll6567遺伝子配列番号77、MesorhizobiumspBNC1由来の改変されたMeso0824遺伝子配列番号78、CorynebacteriumglutamicumR由来の改変されたcgR1126遺伝子配列番号79、NitrosopumilusmaritimusSCM1由来の改変されたNmar1240配列番号80、及びOceanicolagranulosus由来の改変されたOG251600504遺伝子配列番号81がある。実施例7.RalstoniaeutrophaH16由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼADHReの精製と特徴付けRalstoniaeutrophaH16由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子h16B0736のクローニング上述したように実施例2参照、RalstoniaeutrophaH16由来のh16B0736遺伝子を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として、分析のために選択した。そのタンパク質産物は、Thermotogamaritima由来の公知のTM1643アスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して31の相同性を有し、Polaromonassp由来の見出されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼに対して高いレベルの相同性を有する68の同一性。Ralstoniaeutropha由来の遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換した遺伝子のバリアントをpET15bベクターにサブクローニングして、PT7プロモーター、T7翻訳開始点、RBSΦ10、HisTagコード配列、それに続くトロンビン部位を含むT7発現領域の下に置いた。このために、pPCRScriptAspDH1ReプラスミドをNdeI及びBamHI制限酵素を用いて消化した。レアコドンを置換したRalstoniaeutrophah16B0736遺伝子のORFを含むプラスミド断片を、同一のエンドヌクレアーゼNdeI及びBamHIを用いて消化したpET15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15ADHRe図22とした。クローニングした断片の一次構造は、配列解析によって明らかにした。プライマーSeqadhP5配列番号23及びsvs3配列番号94を配列決定のために使用した。pET15ADHReプラスミドを保有するBL21株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の予備的な測定を行った。pET15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD595=09となるまで37°Cでアンピシリン120mgLを含むLB培地中で培養した。その後、1mMのIPTGを添加し、細胞を2時間培養した。測定は室温で行った。反応混合物は、100mMTRISHClpH98、2mMNAD、及び10mMアスパラギン酸ナトリウムpH70を含有するものとした。15ml分の細胞を、50mMTRISpH75、1mMDTT、及び1mMEDTAを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。表15に示すように、このプラスミドは、かなり低いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性をもたらす。NADは、少なくともアスパラギン酸の脱アミノ化反応においては、好適な補因子である。pET15ADHReプラスミドを保有するBL21株の粗抽出物から調製した可溶性画分及び不溶性画分のSDSPAAG電気泳動を行った。図23に示すように、可溶性画分において、約33kDaの分子量を有するタンパク質の高いレベルの蓄積が観察された。この結果は、コンピュータ計算によるタンパク質のMwと合致するものであった。新規なRalstoniaeutrophaアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、pET15ADHReプラスミドを保有するEcoliBL21株のクローン4から精製した。N末端に6×His融合タグhexahistidinefusiontagを付加して発現させた組換えアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを粗抽出物の可溶性画分から精製する手順は、アフィニティクロマトグラフィに基づくものとした。使用した手順の結果、ADHReは、20の収率で4倍に精製された。精製したADHReの均質性をSDSPAGEによって評価し、約33~34kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた図24参照。至適pHRalstoniaeutrophaADHReのオキサロ酢酸アミノ化反応及びアスパラギン酸脱アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された図25。アミノ化反応は、01MMESNaOH緩衝液pH6~7、01MTRISHCl緩衝液pH7~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH8~11中で、015mMNADH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、01MTRISHCl緩衝液pH7~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH9~12中で、2mMNAD及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも2連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。精製したADHReは、pH9でアミノ化反応についての最大活性を示した。脱アミノ化反応についての最大のADHRe活性は、pH98~11で見られた。よって、pH9及び98の01MTRISHCl緩衝液を、それぞれ、アミノ化反応及び脱アミノ化反応における精製したADHReの更なる特徴付けのために使用した。なお、pH70の生理的条件下では、高いレベルの活性はアミノ化反応においてのみ検出されたことに注目されたい。動力学的パラメータ精製したRalstoniaeutrophaADHReについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った表16。アンモニウムNH4Clに対する決定されたKm値は12mMである。これは、PolaromonasspADHについて決定されたNH4Clに対するKm値33mMより3倍低い。aアミノ化反応におけるADHReの動力学的解析は、015mMNADH及び50mMNH4Clにおいて基質オキサロ酢酸濃度を03~20mMに変動させることにより、015mMNADH及び20mMオキサロ酢酸においてアンモニウムNH4Cl濃度を07~50mMに変動させることにより、20mMオキサロ酢酸及び50mMNH4ClにおいてNADHの濃度を0040~0800mMに変動させることにより、および20mMオキサロ酢酸及び50mMNH4ClにおいてNADPHの濃度を0025~1200mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADHReの動力学的解析は、2mMNADにおいて基質アスパラギン酸濃度を25~40mMに変動させることにより、40mMアスパラギン酸においてNADの濃度を02~8mMに変動させることにより、および40mMアスパラギン酸においてNADPの濃度を05~8mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、SigmaPlot80プログラムを用いて実行した。bKm及びVmaxパラメータは、ミカエリス-メンテンの反応速度式のプロットから求めた。cこの反応についてシグモイド曲線が観察されたことから、動力学的パラメータは、ヒルの反応速度式のプロットから求めた。計算されたヒル係数は16±01であった。dkcat及びkcatKm値は、ADHReの分子量2994kDaに等しいに基づいて計算した。NADPH飽和曲線は、古典的なミカエリス-メンテンの双曲線というよりは、むしろ、正のヒル係数16±01を有するシグモイドであることが見出された。一方、オキサロ酢酸の飽和曲線及びアンモニウムの飽和曲線の両者は双曲線であった。天然nativeのADHReは、協同的にNADPHに結合する2つのザイモフォアzymophoreを有すると見られる。補酵素特異性に関しては、NADHに対するADHReの触媒効率kcatKmは、NADPHに対するものより約2~3倍高く、NADに対する触媒効率は、NADPに対するものより約6倍高かった。すなわち、ADHReは、アミノ化反応においてはNADPHに対してよりもNADHに対して幾分良好な親和性を有し、脱アミノ化反応においてはNADPに対してよりもNADに対して幾分良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADHReは、NADH又はNADPHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約30倍又は60~90倍高い速度で触媒した。要約1.RalstoniaeutrophaLADHReは、アルカリ性条件下pH9及びpH98で、invitroでのアスパラギン酸合成の反応を、逆反応であるアスパラギン酸の脱アミノ化よりも効率的に30~90倍触媒する。また、pH70の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。2.アンモニウムNH4Clに対する決定されたKm値は12mMである。これは、PolaromonasspのADHについて決定されたNH4Clに対するKm値33mMより3倍低い。3.NADH及びNADは、invitroで、RalstoniaeutrophaADHReの幾分好適な2~6倍補因子である。4.NADH及びNADPHに対する決定されたKm値は、それぞれ087mM及び039~09mMである。これらの値は、典型的な細胞内濃度Ecoli細胞内では002mMNADH及び015mMNADPHと比較してかなり高い。よって、生体内invivoでは、ADHReの触媒作用には、NADHが過剰となる必要があり得る。実施例8.Bradyrhizobiumjaponicum由来の新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼADHBjの精製と特徴付け上述したように実施例6参照、BradyrhizobiumjaponicumUSDA110由来のbll6567を、推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子として選択した。そのタンパク質産物は、Rhodopseudomonaspalustris由来のNADPH依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼADH1Rpの最も相同なホモログである73の同一性。一方、Bjaponicum及びRpalustrisにおけるこれらの遺伝子の周囲の遺伝子は相異するRpalustrisRPB0147遺伝子は、トランスポーターをコードする遺伝子及び推定上の1価陽イオン/Hアンチポーターをコードする遺伝子の近傍に位置している。Bjaponicumbll6567遺伝子は、LysRファミリー転写レギュレーターの近傍に位置している。そこで、本願発明者らは、Bjaponicum由来の酵素が新規な特徴を有していることを提唱した。Bjaponicum由来の遺伝子のmRNAが効果的に翻訳されるように、レアコドンを置換したbll6567遺伝子のバリアントを、SloningBioTechnologyGmbHドイツにより提供されたpSlo31AAspDHBjプラスミドからpET15bベクターにサブクローニングし、PT7プロモーター、T7翻訳開始点、RBSΦ10、HisTagコード配列を含むT7発現領域の下に置いた。このために、レアコドンを置換したBjaponicumbll6567遺伝子のORFを含むpSlo31AAspDHBjプラスミドのXbaIBamHI断片を、同じエンドヌクレアーゼXbaI及びBamHIを用いて消化したpET15bベクターとライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpET15ADHBjとした。クローニングした断片の一次構造は、配列解析によって明らかにした。プライマーSeqadhP5配列番号23及びsvs3配列番号94を配列決定のために使用した。pET15ADHBjプラスミドを保有するBL21株の粗抽出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの比活性の予備的な測定を行った。pET15bベクターを保有する株を陰性対照として使用した。細胞を、OD595=1となるまで、37°Cでアンピシリン200mgLを含むLB培地中で培養した。その後、1mMのIPTGを添加し、細胞を2時間培養した。15ml分の細胞を、50mMTRISpH75、1mMDTTを含有する緩衝液中で超音波により破砕した。NADP依存性アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、室温28°Cで観察された。SDSPAAG電気泳動により、可溶性及び不溶性画分において、約30kDaの分子量を有するタンパク質の高いレベルの蓄積が示された図26。この結果は、コンピュータ計算によるタンパク質のMw3076kDaと合致するものであった。新規なBradyrhizobiumjaponicumADHBjは、pET15ADHBjプラスミドを保有するEcoliBL21株のクローン1から精製した。組換えhis6tagアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製のためにIMACを使用した。使用した手順の結果、ADHBjは、53の収率で28倍に精製された。精製したADHBjの均質性をSDSPAGEによって評価し、約30kDaの分子量を有する主要なバンドが得られた図27。決定されたADHBjの分子量は、その配列から予測される値3076kDaに合致していた。至適pHアミノ化反応は、01MMESNaOH緩衝液pH6~7、01MTRISHCl緩衝液pH7~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH8~11中で、015mMNADPH、100mMNH4Cl、及び20mMオキサロ酢酸を用いて行った。脱アミノ化反応は、01MTRISHCl緩衝液pH8~98、又は005MGlyNaOH緩衝液pH98~11中で、2mMNADP及び10mMアスパラギン酸を用いて行った。測定は少なくとも2連で行い、エラーバーは測定間の偏差を示す。BradyrhizobiumjaponicumADHBjのオキサロ酢酸アミノ化反応の触媒作用についての至適pHは、アルカリ性領域に観察された図28。精製したADHBjは、pH8~9でアミノ化反応についての最大活性を示した。よって、01MTRISHCl緩衝液pH9を、精製したADHBjのアミノ化反応における更なる特徴付けに使用した。脱アミノ化反応についての最大のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性は、01MTRISHCl緩衝液中でpH98で見られた図28。よって、この緩衝液を、脱アミノ化反応における精製したADHBjの更なる特徴付けに使用した。動力学的パラメータ精製したBradyrhizobiumjaponicumADHBjについて、アミノ化反応及び脱アミノ化反応において、詳細な動力学的特徴付けを行った表17。Km及びVmaxパラメータは、ミカエリス-メンテンの反応速度式のプロットから決定した。アンモニウムNH4Clに対する決定されたKm値は43mMである。これは、PolaromonasspADHについて決定されたアンモニウムNH4Clに対するKm値33mMより8倍低い。NADPHに対する決定されたKm値は0032mMである。これは、Ecoli細胞内の典型的なNADPH濃度015mMより5倍低い。よって、生体内invivoでは、BradyrhizobiumjaponicumADHBjは、オキサロ酢酸のアミノ化反応の補因子としてNADPHを好み得ると言えよう。補酵素の特異性に関しては、NADPHに対するADHBjの触媒効率kcatKmは、NADHに対するものより約12倍高く、NADに対する触媒効率は、NADPに対するものより約160倍高い。すなわち、ADHBjは、アミノ化反応においてはNADHに対してよりもNADPHに対して極めて良好な親和性を有し、脱アミノ化反応においてはNADに対してよりもNADPに対して極めて良好な親和性を有する。アミノ化反応と脱アミノ化反応とを比較すると、ADHBjは、NADPH又はNADHの酸化を伴うオキサロ酢酸のアミノ化を、アスパラギン酸の脱アミノ化より約24倍又は310倍高い速度で触媒した。aアミノ化反応におけるADHBjの動力学的解析は、015mMNADPH及び50mMNH4Clにおいて基質オキサロ酢酸濃度を2~60mMに変動させることにより、015mMNADH及び20mMオキサロ酢酸においてアンモニウムNH4Cl濃度を1~100mMに変動させることにより、30mMオキサロ酢酸及び50mMNH4ClにおいてNADPHの濃度を0012~0400mMに変動させることにより、および30mMオキサロ酢酸及び50mMNH4ClにおいてNADHの濃度を01~07mMに変動させることにより、実施した。脱アミノ化反応におけるADHBjの動力学的解析は、2mMNADPにおいて基質アスパラギン酸濃度を5~80mMに変動させることにより、100mMアスパラギン酸においてNADPの濃度を0015~2mMに変動させることにより、および100mMアスパラギン酸においてNADの濃度を2~16mMに変動させることにより、実施した。全てのデータフィッティング手順は、SigmaPlot100プログラムを用いて実行した。bkcat及びkcatKm値は、ADHBjの分子量3076kDaに等しいに基づいて計算した。要約1.BradyrhizobiumjaponicumADHBjは、アルカリ性条件下pH9及びpH98で、invitroでのアスパラギン酸合成の反応を、アスパラギン酸の脱アミノ化の逆反応よりも効率的に24~310倍触媒する。また、pH70の生理的条件下では、アミノ化反応のみが検出された。2.アンモニウムNH4Clに対する決定されたKm値は4mMである。これは、PolaromonasspのADHについて決定されたNH4Clに対するKm値33mMより8倍低い。3.NADPH及びNADPは、invitroで、BradyrhizobiumjaponicumADHBjのより好適な12~160倍補因子である。4.NADPH及びNADHに対する結滞されたKm値は、それぞれ0032mM及び025mMである。NADPH及びNADHの典型的な細胞内濃度は、Ecoli細胞内では015mM及び002mMである。よって、生体内invivoでは、BradyrhizobiumjaponicumADHBjは、オキサロ酢酸のアミノ化反応における補因子としてNADPHを好み得る。実施例9.試験されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼにより触媒されるアスパラギン酸の脱アミノ化における生成物の決定、及び試験されたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの基質特異性アスパラギン酸及びNADPからのオキサロ酢酸及びアンモニウムの酵素的生成を確認するために、Polaromonassp由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、Rhodopseudomonaspalustris由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、及びRalstoniaeutropha由来の精製したアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いた反応混合物中のセット中の、オキサロ酢酸のキャピラリー分析capillaryanalysis及びアンモニウムNH4のHPLC分析を行った表18。得られたアンモニウムの値は、この反応におけるNADPHの生成と極めて良好に相関していた。決定されたオキサロ酢酸の値は、NADPH及びアンモニウムの値より幾分低かった15~25倍。これは、オキサロ酢酸がかなり不安定であり、ピルビン酸に変換されることにより得る。よって、invitroでは、Polaromonassp、Rhodopseudomonaspalustris、及びRalstoniaeutropha由来の精製した酵素は、NADPの還元と共役したLアスパラギン酸からのオキサロ酢酸及びアンモニウムの生成を触媒した。a反応混合物は、1mlの最終容積中に、005MTRISHCl緩衝液pH98、5mMNDDP、40mMアスパラギン酸、10mklの精製酵素を含むものとした。bNADPHは、340nmでの吸光度の増加によって分光学的に求めた。cオキサロ酢酸は、キャピラリー泳動によって求めた。dアンモニウムNH4は、HPLCによって求めた。nm測定せず。代謝上重要なアミノ酸のケト前駆体に対する、試験した4種のデヒドロゲナーゼの基質特異性を決定した表19、20。ADH1Rp及びADHBjだけは、α-ケトグルタル酸及びピルビン酸に対して弱いアミノ化活性を示したが、ADH及びADHReは、オキサロ酢酸に対して厳密に特異的であった。1オキサロ酢酸を用いて測定した活性に対する、代替的な基質を用いて測定した活性の百分率として結果を示す。反応混合物は、01MTRISHCl緩衝液、100mMNH4Cl、20mM基質、および、ADH1Rp及びADHBjについては015mMNADPHADH1Rp及びADHBjについてを、ADHRe及びADHについては015mMNADHADHRe及びADHについてを、含有するものとした。na活性なし02。1アスパラギン酸を用いて測定した活性に対する、代替的な基質を用いて測定した活性の百分率として結果を示す。反応混合物は、01MTRISHCl緩衝液、20mM基質、および、ADH1Rp及びADHBjについては2mMNADPを、ADHRe及びADHについては2mMNADを、含有するものとした。na活性なし2。実施例10.Ecoli382ilvAPnlp8φ10adhΔpepAKm株によるLアルギニンの生産Bradyrhizobiumjaponicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の増加した活性のLアルギニン生産における効果を試験するために、下記のEcoliMG1655Pnlp8φ10adhΔpepAKm株参考例7参照の染色体由来のDNA断片を、Ecoliアルギニン生産株382ilvA参考例6参照に、P1トランスダクションMillerJHExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLabPress1972PlainviewNYにより導入し、382ilvAPnlp8φ10adhΔpepAKm株を得た。382ilvA株及び382ilvAΔpepACm株参考例6参照を対照として使用した。Ecoli382ilvA株、382ilvAΔpepACm株、及び382ilvAPnlp8φ10adhΔpepAKm株を、3mlのニュートリエントブロス中で37°Cで18時間振盪しながら別々に培養し、得られた培養物の03mlを20×200mm試験管中の2mlの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカーで32°Cで72時間培養した。培養の後、培地中に蓄積したLアルギニンの量を、以下の移動相:ブタノール:酢酸:水=4:1:1vv、を用いたペーパークロマトグラフィにより決定した。ニンヒドリン2のアセトン溶液を発色試薬として使用した。Lアルギニンを含有するスポットを切り出し、CdCl2の05水溶液を用いてLアルギニンを溶出し、Lアルギニンの量を540nmで分光学的に見積もった。8つの試験管発酵の結果を表21に示す。表15から分かるように、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子が組み込まれた382ilvAPnlp8φ10adhΔpepAKm株は、親株のLアルギニン生産性Ecoli株382ilvA及び対照のEcoli株382ilvAΔpepACmの両者と比較して、より高い量のLアルギニンを生産することができた。発酵培地の組成glは次の通りである:グルコース4802SO4350KH2PO420MgSO47H2O10チアミンHCl00002酵母エキス10CaCO350グルコース及び硫酸マグネシウムは別に滅菌した。CaCO3は、180°Cで2時間乾熱滅菌した。pHは70に調整した。参考例1.株の構築PCRにより生成した断片のλRed依存性組込みの方法DatsenkoKAandWannerBLProcNatlAcadSciUSA9766406645を行った後、組込み体の選択のために使用した抗生物質耐性マーカーのλIntXis依存性除去Pananatisで使用するために先に調整したもの;ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008090770号、US2010062496号を行って、株を構築した。使用したプライマーを表22に列挙する。組込み用DNA断片を調製するために、表22に示すプライマーを用いて、ファージλのattL部位及びattR部位に挟まれたカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片のPCR増幅を行った。反応に使用したプライマーは、その5末端に、Pananatisゲノムの標的部位に対する40bpの相同部分を保持する。pMW118プラスミドロシア連邦出願第2006134574号、WO2008090770号、US2010062496号を、全ての反応において、テンプレートとして使用した。得られたDNA断片は、メチル化されたGATC部位を認識するDpnI制限酵素で2又は3時間処理し、pMW118を除去した。RSFRedTERプラスミドを保有する、ファージλ由来の3つのRed遺伝子gambet及びexoの全ての発現に対して耐性のPananatisSC17株VKPMB9246ロシア連邦出願第2006134574号を、組込み実験における受容体として使用した。SC17株は、2005年9月21日にRussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganismsGNIIGenetikaに受託番号VKPMB9246で寄託された後、2006年10月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。Pananatisのエレクトロコンピテントセルを取得するために、RSFRedTERプラスミドで形質転換されたSC17株を、50μgmlのクロラムフェニコールを含むLB培地で34°Cで一夜生育させた。その後、培養物を、50μgmlのクロラムフェニコールを含む新鮮なLB培地で100倍に希釈し、通気しながら34°CでOD600が03となるまで生育させた。その後、IPTGを1mMとなるよう添加し、OD600=07となるまで培養を継続した。10mlのサンプルを、同量の氷冷した脱イオン水で3回洗浄し、40μlの10冷グリセリンに再懸濁した。エレクトロポーレーションの直前に、5μlの脱イオン水に溶解した、invitroで増幅した100~200ngのDNA調製物を、細胞懸濁液に添加した。手順は、細菌のエレクトロトランスフォーメーションelectrotransformation用の装置BioRadUSAカタログ番号1652089バージョン289を使用して実行した。以下のパルスパラメータを適用した:20kVcmの電界強度;5msecのパルス時間。エレクトロポーレーションの後、直ちに、グルコース05で補強した1mlのLB培地を細胞懸濁物に添加した。その後、細胞を、34°Cで2時間通気しながら生育させ、40μgmlのカナマイシンを含有するLB固体培地上にプレーティングし、34°Cで一夜インキュベートした。生育したKmRクローンの中から組込み体を選択するために、それらの染色体構造を、表22に示すテストプライマーを用いたPCRによって検証した。選択したKmR組込み体からRSFRedTERヘルパープラスミドをキュアリングするために、組込み体を、IPTG1mM及びショ糖5gLを添加したLB培地を含むプレート上に34°Cでストリークし、シングルコロニーを形成するまで生育させた。プラスミドのない、KmRかつCmSであるクローンを単離した。カナマイシン又はテトラサイクリン抗生物質耐性マーカーを除去するために、pMWIntXiscatプラスミド参考例2参照を、選択したプラスミドのない組込み体に、PCR生成断片のエレクトロポーレーションと同じ手順によりエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーションの後、細胞を、05グルコース、05xM9塩類溶液、及びクロラムフェニコール50mgLを含有するLB寒天上にプレーティングし、37°Cで一夜インキュベートし、IntXisタンパク質の合成を誘導した。生育したクローンを、カナマイシンを含むLBプレートおよびカナマイシンを含まないLBプレート上にレプリカプレーティングし、KmSバリアントを選択した。選択したKmSクローンは、対応するテストプライマーを用いたPCRにより再チェックした。クロラムフェニコール耐性マーカーCmRを除去するために、pMWIntXisヘルパープラスミドWO2005010175を使用した。CmSクローンの選択は、上記のようにして行った。ただし、この場合、エレクトロポーレーションの後の細胞は、800mgLのアンピシリンを含有する培地上でプレーティングした。多重変異を有する株を構築するために、対応するプライマーペアを用いて全手順を繰り返した。このようにして構築した5ΔS株は、aspAsucAgltApykApykF遺伝子が欠失している。これらの遺伝子欠失の構築に使用したプライマーを表22に列挙する。ppc欠失を構築するために、λattRLに挟まれたkan遺伝子を、プライマーDppc3配列番号28及びattR3XbaIHindIII配列番号29を使用したPCRによって増幅した。PananatisSC17PtaclacZ株ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008090770号、US2010062496号から単離したゲノムDNAを、PCRのテンプレートとして使用した。PananatisSC17PtaclacZ株においては、λattLKmrλattR及び下流に連結されたPtacプロモータを有する配列λattLKmrλattRPtacを、lacZ遺伝子の上流に組込んだ。並行して、EcoliのスレオニンオペロンのリーダーペプチドのターミネーターTthrを含む断片を、PCRによって構築した。このために、2対のオリゴヌクレオチドを使用した:mash1配列番号30とmash2配列番号31、及びDppc5配列番号32とTthr5XbaI配列番号33である。最初に、mash1配列番号30及びmash2配列番号31を互いにアニールさせた。この結果、ターミネーターが生成された。得られたDNA断片を、Dppc5配列番号32及びTthr5XbaI配列番号33プライマーを用いるPCRのテンプレートとして使用し、組込みカセットの接合に必要なXbaI認識部位を5末端に、組込み用の相同アームを3末端に有する断片を生成した。Tthrを含む断片及び除去可能なKmRマーカーを含む断片を、XbaI制限酵素により消化し、次いでライゲーションした。上記λRed依存性組込みの手順による組込みを行うため、ライゲーションした混合物をSC17RSFRedTER株ロシア連邦出願第2006134574号、WO2008090770号、US2010062496号にエレクトロポーレーションした。組込み体を、カナマイシン40mglを含むLB寒天プレート上で選択した。組込み体の染色体構造は、オリゴヌクレオチドppct1配列番号34及びppct2配列番号35をプライマーとして使用したPCRにより確認した。この結果得られた株をSC17Δppcと命名した。構築した欠失を、染色体エレクトロポーレーションの手順により5ΔSに導入した。このために、Fermentasにより提供されるゲノムDNA精製キットGenomicDNAPurificationKitを使用してSC17Δppcから単離した200ngのゲノムDNAを、5ΔSにエレクトロトランスフォームした。培養条件は、IPTG添加を除いて、Red依存性組込み手順の場合と同一である。エレクトロコンピテントセルの調製は、Red依存性組込みの場合と同一である。パルスパラメータは次の通りとした:E=125kVcm;10msecのパルス時間。得られた組込み体は、オリゴヌクレオチドppct1配列番号34及びppct2配列番号35をプライマーとして使用したPCRによって検証した。この結果得られた株を5ΔPと命名した。その後、フィードバック耐性PEPカルボキシラーゼをコードするEcoliのppcK620S遺伝子の5ΔPへのMu依存性組込みを、組込み用プラスミドpMIVK620S参考例5参照を使用して行った。組込み手順は次のように実行した。pMIVK620Sを、MuインテグラーゼMuintegraseの発現をもたらすphMIV1ヘルパープラスミド参考例3参照を保有する5ΔP株にエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーションの後、インテグラーゼ合成の誘導のために、細胞を37°Cでインキュベートした。細胞を、25mgLのクロラムフェニコールを含有するL寒天上にプレーティングした。生育したクローンをレプリカプレーティングし、ApSクローンを選択した。得られた組込み体からヘルパープラスミドをキュアリングした。このために、細胞をLB培地に接種し、攪拌を行わずに37°Cで3日間インキュベートした。その後、細胞を、クロラムフェニコール25mgLを添加したL寒天上にプレーティングし、34°Cで一夜インキュベートした。生育したクローンをレプリカプレーティングし、TcSかつCmRであるバリアントを選択し、得られた組込み体59の独立したクローンを5ΔP2と命名した。クローンNo365ΔP236は、増加したLGlu濃度60gLでの48時間の試験管培養において最高のアスパラギン酸及びバイオマスの蓄積を示し表2、最良のクローン15つのデータを示す、これを更なる改良のために選択した。高いLGlu濃度を用いてグルタミン酸デヒドロゲナーゼの存在をシミュレートした。λIntXis依存性手順上記参照を使用し、選択した株からクロラムフェニコール耐性マーカーをキュアリングした。この結果得られた株を5ΔP236Sと命名した。5ΔP2R株を、5ΔP236Sから、親株と同一の生産能力を有する、10gLグルコース及び30gLLAspを含有するpH55のM9プレート上で選択した自然AspR変異株として得た。その後、5ΔP2RM株を、5ΔP2R株から、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするmdhA遺伝子を欠失させることにより得たWO2010038905号。mdhA遺伝子を欠失させることにより、オキサロ酢酸のリンゴ酸、フマル酸、及びコハク酸への非生産的な変換を回避することができる。5ΔP2RMGS株を、5ΔP2RM株から取得した。このために、5ΔP2RM株において、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするgcd遺伝子を、オリゴヌクレオチドgcdattR配列番号95及びgcdattL配列番号96を組込み用DNA断片の生成のためのプライマーとして使用した上記λRed依存性手順に従って欠失させた。オリゴヌクレオチドgcdtest1配列番号97及びgcdtest2配列番号98を、得られた組込み体のPCR検証に使用した。この結果得られた株5ΔP2RMから、上記λIntXis依存性手順を使用してカナマイシン耐性マーカーをキュアリングし、5ΔP2RMGSと命名した。参考例2.pMWintxiscatベクターの構築pMWintxiscat図4を構築するために、cat遺伝子を含むDNA断片を、プライマーcat5BglII配列番号36及びcat3SacI配列番号37、ならびにテンプレートとしてpACYC184プラスミドを用いるPCRにより増幅した。平滑末端を生成するPfuポリメラーゼFermentasをこの反応に使用した。得られたDNA断片を、pMWintxisプラスミドWO2005010175の唯一のScaI認識部位ScaI制限エンドヌクレアーゼは平滑末端を生成するにクローニングした。プラスミドがcat遺伝子を図4に示す向きで有することは、NcoI制限酵素を使用する制限分析により確認した必要なDNA断片の長さは3758及び3395bp。参考例3.phMIV1ヘルパープラスミドの構築インテグラーゼ及び熱感受性リプレッサーをコードするMuC、ner、MuA、及びMuB遺伝子を含むDNA断片を、プライマーMuC5配列番号38及びMuB3配列番号39、ならびにテンプレートとしてpMH10プラスミド米国特許第6960455号を用いるPCRにより増幅した。プライマーMuC5は、その5末端にEcoRI制限酵素用の部位を含む。プライマーMuB3は、その5末端にNcoI制限酵素用の部位を含む。得られた断片は、pACYC184プラスミドのEcoRINcoI認識部位にクローニングした。そうして、phMIV1ヘルパープラスミドが得られた図5。参考例4.Ecoli株MG1655Δppcの構築1.ppc遺伝子の欠失を有するEcoli株の構築ppc遺伝子の欠失を有する株を、Redドリブンインテグレーションと呼ばれる、DatsenkoKAとWannerBLによって最初に開発された方法ProcNatlAcadSciUSA20009766406645により構築した。cat遺伝子によりコードされるCmRマーカーを含むDNA断片を、プライマーppsattR配列番号40及びppcattL配列番号41、並びにテンプレートとしてプラスミドpMW118attLCmattRWO2005010175を使用するPCRにより得た。プライマーppsattRは、ppc遺伝子の5末端に位置する領域に相補的な領域及びattR領域に相補的な領域の両方を含む。プライマーppsattRは、ppc遺伝子の3末端に位置する領域に相補的な領域及びattL領域に相補的な領域の両方を含む。17kbpのPCR産物を取得し、アガロースゲルにより精製し、温度感受性複製を有するプラスミドpKD46を保持するEcoliMG1655株ATCC47076ATCC700926のエレクトロポーレーションに使用した。プラスミドpKD46DatsenkoKAandWannerBLProcNatlAcadSciUSA20009712664045は、ファージλの2154ヌクレオチドのDNA断片ヌクレオチド位置31088~33241GenBankaccessionnoJ02459を含み、且つ、アラビノース誘導性ParaBプロモーターの制御下にλRed相同組換え系の遺伝子γ、β、exo遺伝子を含む。プラスミドpKD46は、MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みに必要である。エレクトロコンピテントセルは、次のようにして調製した。EcoliMG1655pKD46を、アンピシリン100mglを含有するLB培地で30°Cで一夜生育させ、培養物を、アンピシリン及びLアラビノース1mMを含有する5mlのSOB培地SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989で100倍に希釈した。細胞を、通気しながら30°CでOD600が約06となるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水により3回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。エレクトロポーレーションは、70μlの細胞及び約100ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポーレーションの後の細胞を、1mlのSOC培地SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989を用いて37°Cで25時間インキュベートした後、クロラムフェニコール30μgmlを含有するL寒天上にプレーティングし、37°Cで生育させてCmR組換え体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを含むL寒天上で42°Cで2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を試験した。2.PCRによるppc遺伝子欠失の検証ppc遺伝子が欠失しCm耐性遺伝子により標識されたバリアントを、PCRによって検証した。部位特異的locusspecific検証用プライマーppctest1配列番号42及びppctest2配列番号43を、検証用PCRに使用した。親のppc株であるMG1655の細胞をテンプレートとして用いた反応により得られたPCR産物は、28kbpの長さであった。変異株の細胞をテンプレートとして用いた反応により得られたPCR産物は、17kbpの長さであった。変異株は、MG1655Δppccatと命名した。WO2005010175号に記載されている標準的な技術intxis系を使用し、染色体からCmマーカーを切り出した。Cmマーカーを切り出した場合の、プライマーppctest1及びppctest2を使用したPCRで得られたDNAの長さは280bpであった。参考例5.pMIVK620Sプラスミドの構築アスパラギン酸による阻害に対して耐性のPEPカルボキシラーゼをコードするEcoliのppcK620S遺伝子を、2工程で、プラスミドpTK620SMasatoYanoandKatsuraIzuiEurBiochemFEBS24774811997からpMIV5JSプラスミドロシア連邦特許出願第2006132818号、US2009197309号へとサブクローニングした。最初に、pTK620SのSalISphI断片を、pMIV5JSのSalISphI認識部位にサブクローニングした。得られたpMIVppc5プラスミドは、ppcK620S遺伝子の大きな5末端部分large5terminalportionを保持する。ppcK620S遺伝子の3近傍部分3proximalportionを、プライマーppcSphI配列番号44及びppcHindIII配列番号45、ならびにテンプレートとしてpTK620Sプラスミドを用いるPCRにより、増幅した。このようにして得られた断片及びpMIVppc5を、SphI及びHindIII制限酵素を用いて消化し、ライゲーションした。ライゲーションした混合物をEcoliMG1655Δppc株参考例4参照にエレクトロポーレーションした。形質転換後の細胞を、クロラムフェニコール50mglを含むM9グルコース5gl最小培地上にプレーティングし、PEPカルボキシラーゼ活性をもたらすプラスミドを保有するコロニーを選択した。生育したコロニーからのプラスミドDNAの単離及び制限酵素分析の後、期待される構造のプラスミド図6を選択した。参考例6.親アルギニン生産株Ecoli382ilvA及び対照株Ecoli382ilvAΔpepACmの構築382ilvA株は、アルギニン生産株382VKPMB7926EP1170358A1から、EcoliK12株由来の野生型ilvA遺伝子をP1トランスダクションすることにより得た。382株は、2000年4月10日にVKPMtheRussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganismsに受託番号VKPMB7926で寄託された。382ilvAのクローンは、最小寒天プレート上で良好に生育するコロニーとして選択された。382株は、2000年4月10日にRussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganismsに受託番号VKPMB7926で寄託された後、2001年5月18日にブダペスト条約に基づく寄託に移管された。pepA遺伝子が欠失した382ilvAΔpepACm株は以下のようにして構築した。細菌株におけるpepA遺伝子の欠失は、Redドリブンインテグレーションと呼ばれる、DatsenkoKAとWannerBLによって最初に開発された方法ProcNatlAcadSciUSA20009766406645により達成した。この手順に従って、pepA遺伝子に隣接する領域及びテンプレートプラスミド中の抗生物質耐性を与える遺伝子の両方に相同なPCRプライマーP9配列番号90及びP10配列番号91を構築した。プラスミドpMW118attLCmattRWO05010175を、PCR反応におけるテンプレートとして使用した。PCRの条件は次の通りとした:94°Cで30秒間の最初のDNAの変性;その後の25サイクルの94°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、72°Cで1分30秒間の伸長;及び72°Cで2分間の最後の伸長。17kbのPCR産物をアガロースゲルより精製し、温度感受性の複製開始点を有するプラスミドpKD46を保有するEcoliMG1655株ATCC700926のエレクトロポーレーションに使用した。pKD46プラスミドDatsenkoKAandWannerBLProcNatlAcadSciUSA20009712664045は、ファージλの2154ヌクレオチドのDNA断片ヌクレオチド位置31088~33241GenBankaccessionnoJ02459を含み、且つ、アラビノース誘導性ParaBプロモーターの制御下にλRed相同組換え系の遺伝子γ、β、exo遺伝子を含む。pKD46プラスミドは、MG1655株の染色体へのPCR産物の組込みに必要である。エレクトロコンピテントセルは、次のように調製した:EcoliMG1655pKD46細胞を、アンピシリン100mglを含有するLB培地中で30°Cで一夜生育させ、培養物を、アンピシリン及びLアラビノース1mMを含有する5mlのSOB培地SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989で100倍に希釈した。細胞を、通気しながら30°CでOD600が約06となるまで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水で3回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。エレクトロポーレーションは、70μlの細胞及び約100ngのPCR産物を使用して行った。エレクトロポーレーションの後の細胞を、1mlのSOC培地SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualSecondEditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989を用いて37°Cで25時間インキュベートした後、クロラムフェニコール30μgmlを含有するL寒天上にプレーティングし、37°Cで生育させてCmR形質転換体を選択した。その後、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを含むL寒天上で42°Cで2回継代し、コロニーのアンピシリン感受性を試験した。pepA遺伝子が欠失した変異株は、Cm耐性遺伝子により標識されており、部位特異的locusspecificプライマーP11配列番号92及びP12配列番号93を使用するPCRにより検証した。このために、新たに単離したコロニーを20μlの水に懸濁し、1μlの懸濁物をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:94°Cで30秒間の最初のDNAの変性;その後の30サイクルの94°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、及び72°Cで2分間の伸長;72°Cで2分間の最後の伸長。親のpepA株であるMG1655の細胞をテンプレートとして使用するPCR反応で得られたPCR産物は、165kbの長さであった。MG1655ΔpepACm変異株の細胞をテンプレートとして使用するPCR反応で得られたPCR産物は、171kbヌクレオチドの長さであった。その後、EcoliMG1655ΔpepACm株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションMillerJHExperimentsinMolecularGeneticsColdSpringHarborLabPress1972PlainviewNYにより、上記Ecoliアルギニン生産株382ilvAに導入した。得られた株を382ilvAΔpepACmと命名した。参考例7.EcoliMG1655Pnlp8φ10adhΔpepAKm株の構築Ecoli由来のnlpD遺伝子のプロモーターを含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。EcoliMG1655株の染色体DNAをテンプレートとして使用し、プライマーP1配列番号82及びP2配列番号83をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで3分間の変性工程;最初の2サイクルのプロフィール:95°Cで1分、50°Cで30秒、72°Cで40秒;最後の25サイクルのプロフィール:94°Cで20秒、55°Cで20秒、72°Cで15秒;最終工程:72°Cで5分。増幅したDNA断片は約02kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。その後、精製した断片を、エンドヌクレアーゼPaeI及びSalIで処理した。得られたDNA断片を、エンドヌクレアーゼPaeI及びSalIで予め処理したプラスミドpMIV5JSロシア連邦特許出願第2006132818号、EP1942183号とライゲーションした。ライゲーション用混合物を4°Cで一夜インキュベートした後、エレクトロポーレーションによってEcoliMG1655株を形質転換するのに使用した。この結果得られた形質転換体を、アンピシリン50mglを含有するLB寒天を用いたプレート上にプレーティングし、個々のコロニーが見えるようになるまでプレートを37°Cで一夜インキュベートした。得られた形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素分析により分析した。得られたプラスミドは、Ecoli由来のnlpD遺伝子のプロモーターを含み、pMIVPnlp0と命名した。次いで、プロモーターPnlpDの10領域のランダム化及びPnlp8プロモーターの選択を行った。プロモーターPnlpDの3末端を、PCR増幅を使用して取得した。プラスミドpMIVPnlp0をテンプレートとして使用し、プライマーP1配列番号82及びP7配列番号88をPCRに使用した。プライマーP7はランダムヌクレオチドを有し、それらは配列番号88において文字nA又はG又はC又はTを意味するにより示される。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで3分間の変性工程;最初の2サイクルのプロフィール:95°Cで1分、50°Cで30秒、72°Cで40秒;最後の25サイクルのプロフィール:94°Cで20秒、60°Cで20秒、72°Cで15秒;最終工程:72°Cで5分。プロモーターPnlpDの5末端を、PCR増幅を使用して取得した。プラスミドpMIVPnlp0をテンプレートとして使用し、プライマーP2配列番号83及びP8配列番号89をPCRに使用した。プライマーP8はランダムヌクレオチドを有し、それらは配列番号89において文字nA又はG又はC又はTを意味するにより示される。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで3分間の変性工程;最初の2サイクルのプロフィール:95°Cで1分、50°Cで30秒、72°Cで40秒;最後の25サイクルのプロフィール:94°Cで20秒、60°Cで20秒、72°Cで15秒;最終工程:72°Cで5分。増幅した両DNA断片は、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、得られたDNA断片を、エンドヌクレアーゼBglIIで処理した後、等モル割合で断片のライゲーションを行った。ライゲーション用混合物を4°Cで一夜インキュベートした後、次のPCR手順のテンプレートとして使用し、プライマーP1配列番号82及びP2配列番号83をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで3分間の変性工程;最初の2サイクルのプロフィール:95°Cで1分、50°Cで30秒、72°Cで40秒;最後の12サイクルのプロフィール:94°Cで20秒、60°Cで20秒、72°Cで15秒;最終工程:72°Cで5分。増幅したDNA断片は約02kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。その後、精製した断片を、クレノウ断片Klenowfragmentで処理した。この結果得られたDNA断片を、予めエンドヌクレアーゼXbaIで処理した後にクレノウ断片で処理したプラスミドpMW118ロシア連邦出願第2006134574号と等モル割合でライゲーションした。ライゲーション用混合物を4°Cで一夜インキュベートした後、エレクトロポーレーションによってEcoliMG1655株を形質転換するのに使用した。この結果得られた形質転換体を、カナマイシン20mglを含有するLB寒天を用いたプレート上にプレーティングし、個々のコロニーが見えるようになるまでプレートを37°Cで一夜インキュベートした。得られた形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素分析によって分析した。得られたPnlp8プロモーターを含むプラスミドを、pMWKmPnlp8と命名した。Bradyrhizobiumjaponicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。プラスミドDNApET15ADHBiをテンプレートとして使用し、プライマーP3配列番号84及びP4配列番号85をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで1分間の変性工程;最後の25サイクルのプロフィール:95°Cで1分、55°Cで30秒、72°Cで1分;最終工程:72°Cで2分。増幅したDNA断片は約1kbの大きさであり図21、アガロースゲル電気泳動によって精製した。λattLKmλattRPnlp8φ10カセットを含むDNA断片を、PCRを利用して取得した。プラスミドDNApMWKmPnlp8をテンプレートとして使用し、プライマーP5配列番号86及びP6配列番号87をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで1分間の変性工程;最後の25サイクルのプロフィール:95°Cで1分、55°Cで30秒、72°Cで1分40秒;最終工程:72°Cで5分。増幅したDNA断片は約17kbの大きさであり図21、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、重複領域を有する得られたDNA断片図21を、次のPCR手順のテンプレートとして使用し、プライマーP4配列番号85及びP5配列番号86をPCRに使用した。PCRの条件は次の通りとした:95°Cで2分間の変性工程;次の30サイクルのプロフィール:94°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで2分;最終工程:72°Cで5分。増幅したDNA断片は約2kbの大きさであり、アガロースゲル電気泳動によって精製した。得られた断片は、切り出し可能なKmマーカー、およびPnlp8φ10プロモーターの制御下にあるBradyrhizobiumjaponicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいた。この断片を、参考例6に記載したようにして、DatsenkoKAとWannerBL66406645によって開発されたRedドリブンインテグレーションにより、EcoliMG1655の染色体にpepA遺伝子の代わりに組み込んだ。このようにして、EcoliMG1655Pnlp8φ10adhΔpepAKm株を取得した。本発明をその好適な態様を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。ここに引用した参考文献は全て、参照によりこの出願の一部として組み込まれる。