"キシロースを含む培地から酵母を用いてエタノールを製造する方法培地が発酵阻害物質を含んでいる、請求項1に記載の方法培地がセルロース系バイオマスを原材料とする糖化液である、請求項1に記載の方法糖化液が発酵阻害物質を含んでいる、請求項3に記載の方法キシロースからエタノールを生産できる酵母を用いてエタノール生産を行う、請求項1に記載の方法。セルロース系バイオマスを原材料とする糖化液に含まれる発酵阻害物質によるグルコース‐6リン酸デヒドロゲナーゼ、フルクトース‐16‐ビスリン酸アルドラーゼおよびピルビン酸デカルボキシラーゼの活性阻害に対する耐性能を酵母に付与する方法。請求項6に記載の方法により作製した酵母変異株を用いてエタノール生産を行う、請求項1の方法。本発明ではセルロース系バイオマスから製造された糖化液における微生物発酵の阻害機構を検証し、得られた知見から発酵阻害に対する対処方法を提示することでセルロース系バイオマスに由来する糖化液から効率的にエタノールを製造する方法を提供することを目的とする。本発明者らは前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、メラノイジン含有培地およびエリアンサスを原材料とする糖化液における発酵阻害機構を解明し、その阻害機構を基に酵母への改善方法を見出した。本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。細胞内の代謝産物を網羅的に解析するメタボローム解析の結果、ピキアスティピィティスによるメラノイジン含有培地および糖化液での発酵においてグルコース6リン酸およびフルクトース‐16ビスリン酸の顕著な蓄積が見られた。ペントースリン酸経路において、グルコース6リン酸はグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼの働きで6ホスホグルコノ15ラクトンに変換され、その変換に付随してNADPからNADPHが生じる。NADPHはキシロースをキシリトールに変換する働きを持つキシロース還元酵素の補酵素であり、キシロースからのアルコール生産において必須の物質である。そのため、グルコース6リン酸の蓄積はNADPHの供給が不足する原因となり、キシロースからのエタノール生産が阻害されることが予想された。メラノイジン含有培地および糖化液においてより効率良くアルコール発酵を行わせるためにはグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強する必要がある。グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強方法としては以下に示す3つの方法がある。一つ目はUVもしくはエチルメタンスルホン酸EMSによる突然変異誘導処理によるグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ活性を増強した突然変異株の作成である。二つ目としては高発現ベクターにグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼをのせて作成したプラスミドを導入したグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ高発現形質転換株の作成することである。最後は遺伝子組み換え技術を用いた変異処理による高活性グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼの作成および酵母細胞への導入する方法である。フルクトース‐16ビスリン酸は解糖系の中間代謝物であり、エタノール生成の中間代謝物である。そのため、フルクトース‐16ビスリン酸が蓄積することはエタノールの生成を阻害する要因となる。フルクトース‐16ビスリン酸はフルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼにより代謝される。フルクトース‐16ビスリン酸の蓄積はフルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼの活性阻害が一因であることが示唆された。より効率良くアルコール発酵を行わせるためにはメラノイジンおよび糖化液に含まれる発酵阻害物質に対する耐性能を酵母に付与することが必要である。酵母細胞への耐性能を付与する方法はUVもしくはEMSによる突然変異誘導処理による糖化液に含まれる阻害物質に対する耐性能を付与した酵母変異株の作成と遺伝子組み換え技術を用いた変異処理により阻害物質に耐性を持つフルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼ変異タンパク質をコードした遺伝子を作製し、酵母細胞へ導入する方法の2つが挙げられる。また、糖化液においては糖からエタノールを生成する経路において働くピルビン酸デカルボキシラーゼPDCの活性が阻害されている事が判明した。糖化液においてより効率良くアルコール発酵を行わせるためには糖化液に含まれる発酵阻害物質に対する耐性能を酵母に付与することが必要である。酵母細胞への耐性能を付与する方法は以下に示す3つの方法が挙げられる。一つ目はUVもしくはEMSによる突然変異誘導処理による糖化液に含まれる阻害物質に対する耐性能を付与した酵母変異株の作成である。二つ目としては糖化液に含まれる阻害物質により阻害されないサッカロマイセスセレビシエに由来するPDCをのせて作成したプラスミドを導入した形質転換株の作成することである。最後は遺伝子組み換え技術を用いた変異処理による糖化液に含まれる阻害物質により阻害されないPDC変異タンパク質をコードする遺伝子の作成と酵母細胞への導入を行う方法である。本発明によりセルロース系バイオマスに由来する糖化液よりエタノールの効率的な製造が可能になる。本発明における発酵阻害物質を含む培地とはメラノイジンを含む培地およびエリアンサスを原材料として製造した糖化液を示す。メラノイジンはグルコースやキシロースなどの還元糖とタンパク質などのアミノ化合物が非酵素的に反応するメイラード反応により生成される最終生成物のことである。メイラード反応は100°C以上の加熱により促進される。バイオマスから糖化液を作成する場合、バイオマスの前処理工程において100°C以上の加熱を行うことがある。そのため、前処理の方法によってはメイラード反応によりメラノイジンが生成されることが予想される。本発明におけるメラノイジン含有培地は還元糖であるキシロースと多数のアミノ化合物を含む酵母エキスとポリペプトンを121°C、1気圧、15分の条件でオートクレーブすることにより作成したものである。そのため、メラノイジン含有培地には最終生成物であるメラノイジン以外にも様々なメイラード反応生成物が含まれていることが予想される。本発明ではメイラード反応により生成された物質を全てメラノイジンと定義する。リグノセルロース系バイオマスの加水分解は、従来から公知の酸加水分解法やアルカリ加水分解法用いることができる。最も好ましいのは、微粉砕されたリグノセルロースを酵素により加水分解するのが良い。粉砕は、リグノセルロース系バイオマスを適切なサイズに粉砕する工程においては、振動式ボールミルあるいはロッドミル,高衝撃力が付加できるミルを用いて100ミクロン以下、好ましくは50ミクロン以下まで微粉砕を行なう。加水分解は、微粉砕された木質系バイオマス原料溶液5~30重量にセルラーゼ酵素を0.1~20重量になるように添加して行わせる。セルロースとヘミセルロースは、グルコースやマンノースなどの6炭糖とキシロース、アラビノースなどの5炭糖で構成されているため、酵素剤は、これらの糖を効率良く生産することが求められる。従って、前記目的を達成するために、複数の酵素剤を用いる場合もある。本発明における糖化液の発酵は特許公開2009-296983明細書に記載された方法に準じて実施する。1次発酵工程はグルコースやマンノースなどの6炭糖を酵母や細菌によってエタノールに変換する。使用する菌は、公知のものを使用できるが、その中でも、サッカロマイセスセレビシエなどが好ましい。酵母は、エタノール耐性が高いため5以上の濃度のエタノールを生産することができる。2次発酵は、1次発酵で得られた発酵液を使用する。本工程では、酵母によってエタノールを生産させる。使用する菌は、ピキアスティピィティスの発酵阻害耐性能付与株を用いる。発酵阻害耐性能付与株を用いて糖化液でのアルコール発酵を行うことで、エタノールの生産性が向上する。アンモニア処理エリアンサス糖化液からのエタノール生産イネ科の多年草であるエリアンサスを原材料として調製された糖化液アンモニア処理エリアンサス糖化液におけるサッカロマイセスセレビシエとピキアスティピィティスを用いた二段階発酵法によるアルコール生産を行った。一次発酵として、糖化液をサッカロマイセスセレビシエでアルコール発酵をさせ、グルコースをエタノールに変換した。得られたサッカロマイセスセレビシエ発酵液に含まれるエタノールをロータリーエバポレーターにより蒸発させ、発酵液中に含まれるエタノールの濃度を1以下にした。二次発酵として、調製された発酵液をピキアスティピィティスでアルコール発酵させ、キシロースからのアルコール生産を行った。サッカロマイセスセレビシエによる一次発酵では合成培地酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、グルコース50gLでのエタノール生産と同程度のエタノール生産を行った図1。しかしながら、ピキアスティピィティスによる二次発酵では合成培地酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、キシロース25gLでのエタノール生産と比較してエタノール生成速度とエタノール最終生成濃度の両方が減少した図2。そのため、エリアンサスを原材料とした糖化液にはピキアスティピィティスによるC5糖の発酵を阻害する物質が含まれていることが判明した。メラノイジン含有培地からのエタノール生産メラノイジン含有培地におけるピキアスティピィティスを用いた微生物発酵法によるエタノール生産を行った。メラノイジンは還元糖とタンパク質などのアミノ化合物が非酵素的に反応するメイラード反応による生成物であり、加熱により短時間で進行する。そのため、キシロースを還元糖の供給源とし、酵母エキスとポリペプトンをアミノ化合物の供給源として加熱によりメラノイジンは生成される。酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、キシロース70gLを含む溶液を121°C、15分の条件でオートクレーブし、得られた反応液をメラノイジン含有培地とした。メラノイジン含有培地における発酵をピキアスティピィティスSS391株で行わせたところ、エタノール生成が顕著に阻害された図3。この結果から、メラノイジンはピキアスティピィティスによるキシロース発酵を阻害する効果を持つことが明らかとなった。アンモニア処理エリアンサス糖化液からのエタノール生産時のメタボローム解析エリアンサスより調製した糖化液のサッカロマイセスセレビシエ発酵液からエタノールを除去した。エタノールを除去したサッカロマイセスセレビシエ発酵液でのピキアスティピィティスSS391株によるアルコール発酵を28°Cの条件で行った。発酵を開始してから24時間後に酵母細胞を回収した。回収した細胞はメタノールにより代謝をブロックした。細胞懸濁液1600mlにクロロホルム1600mlと水640mlを加え撹拌し、遠心分離2300×g4°C5分を行った。遠心分離後、水相を限外ろ過チューブに250ml×6本に移し取った。これを遠心分離9100×g4°C120分し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50mlのMilliQ水に溶解してCETOFNSによる細胞内代謝物の網羅的な解析メタボローム解析に供した。CETOFMSによる解析はWO2007029431号明細書に記載された方法に準じて実施した。また、対照としてろ過滅菌した合成培地酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、キシロース70gLで発酵をさせた酵母細胞を用いて同様の処理を行い、CETOFMSによる解析に供した。CETOFMSにより生体内物質の一斉分析を実施した後、キシロースからエタノールの合成に関与するペントースリン酸経路および解糖系に由来する各代謝物含有量のデータを抽出し、対象との比較を行った。糖化液で発酵させた酵母細胞では合成培地で発酵させたものに比べてグルコース6リン酸、リブロース5リン酸、セドヘプツロース7リン酸、フルクトース6リン酸、フルクトース16ビスリン酸、ジハイドロキシアセトンリン酸、3ホスホグリセリン、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸が多く蓄積していた表1。これらの代謝物の中でもグルコース6リン酸、フルクトース16ビスリン酸およびピルビン酸の蓄積が顕著であった。グルコース6リン酸、フルクトース16ビスリン酸およびピルビン酸は何れもキシロースからエタノールの合成過程の中間代謝物であり、蓄積はエタノール合成の直接的な阻害要因となる。グルコース6リン酸はグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼにより6ホスホグルコノ15ラクトンに変換される。フルクトース16ビスリン酸はフルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼによりグリセルアルデヒド3リン酸とジヒドロキシアセトンリン酸に分解される。ピルビン酸はピルビン酸デカルボキシラーゼによりアセトアルデヒドに変換される。グルコース6リン酸、フルクトース16ビスリン酸およびピルビン酸は何れもキシロースからエタノールの合成過程の中間代謝物であり、蓄積はエタノール合成の直接的な阻害要因となる。糖化液におけるアルコール発酵阻害の要因は糖化液に含まれる成分によりグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、フルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼとピルビン酸デカルボキシラーゼの活性阻害であることが示唆された。メラノイジン含有培地からのエタノール生産時のメタボローム解析合成培地酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、キシロース70gLをオートクレーブ121°C、15分し、培地中にメラノイジンを生成した。調製したメラノイジン含有培地でのピキアスティピィティスSS391株によるアルコール発酵を28°Cの条件で行った。発酵を開始してから24時間後に酵母細胞を回収した。回収した細胞はメタノールにより代謝をブロックした。細胞懸濁液1600mlにクロロホルム1600mlと水640mlを加え撹拌し、遠心分離2300×g4°C5分を行った。遠心分離後、水相を限外ろ過チューブに250ml×6本に移し取った。これを遠心分離9100×g4°C120分し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び50mlのMilliQ水に溶解してCETOFNSによる測定に供した。CETOFMSによる解析はWO2007029431号明細書に記載された方法に準じて実施した。また、対照としてろ過滅菌した合成培地酵母エキス10gL、ポリペプトン20gL、キシロース70gLで発酵をさせた酵母細胞を用いて同様の処理を行い、CETOFMSによる解析に供した。CETOFMSにより生体内物質の一斉分析を実施した後、キシロースからエタノールの合成に関与するペントースリン酸経路および解糖系に由来する各代謝物含有量のデータを抽出し、対象との比較を行った糖化液で発酵させた酵母細胞では合成培地で発酵させたものに比べてグルコース6リン酸、リブロース5リン酸、セドヘプツロース7リン酸、フルクトース6リン酸、フルクトース16ビスリン酸、ジハイドロキシアセトンリン酸、3ホスホグリセリンおよびホスホエノールピルビン酸が多く蓄積していた。これらの代謝物の中でもグルコース6リン酸とフルクトース16ビスリン酸の蓄積が顕著であった表2。グルコース6リン酸とフルクトース16ビスリン酸の蓄積はメラノイジンによりグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼとフルクトース‐16ビスリン酸アルドラーゼの活性が阻害されていることを示唆している。"