"少なくとも立体特異的な酵素的還元により7-ケトステロイドをそれに対応する7-ヒドロキシステロイドへと触媒する7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDH変異体であって、未変異の酵素と比較して、低減した基質阻害、特に7-ケトステロイド基質に対して低減した基質阻害を有するか、及び/又は変化した補因子の使用を有する、上記変異体。配列番号2のアミノ酸配列において少なくとも1つの変異を有するか、又は、これに由来し少なくとも60の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1記載の変異体。少なくとも立体特異的な酵素的還元により7-ケトステロイドをそれに対応する7-ヒドロキシステロイドへと触媒する7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDH変異体であって、配列番号2の位置36~42の配列モチーフVMVGRREにおいて少なくとも1つの変異を有するか、又は、これに由来し少なくとも60の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも1つの変異を有する、上記変異体。a単一変異体群G39X1及びR40X2、b二重変異体群G39X1、R40X2、R40X2、R41X3及びG39X1、R41X3、もしくはc三重変異体群G39X1、R40X2、R41X3又はd配列番号2に由来し少なくとも60の配列同一性を有するアミノ酸配列の、対応する単一、二重、又は三重変異体群から選択され、X1、X2、及びX3はそれぞれ独立して変異アミノ酸残基を表す、請求項2又は3記載の変異体。請求項1~4のいずれか1項記載の変異体をコードする少なくとも1つの核酸配列又は少なくとも1つの対応する発現カセット又は少なくとも1つの対応するベクターを有する組換え微生物であって、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHのようなヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ群及び補因子再生に適切なデヒドロゲナーゼ群から選択される別の酵素をコードする配列を任意に有する、組換え微生物。7β-ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に合成する方法であって、対応する7-ケトステロイドを、請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体の存在下で、又はこの変異体を発現する組換え微生物の存在下で反応させ、形成した少なくとも1つの還元産物を反応混合物から分離する工程を任意に有する、上記方法。還元を、NADPH及び/又はNADHの存在下で、特にこれらの消費によって、生じさせる請求項6記載の方法。消費されたNADPHをNADPH再生酵素との結合によって再生し、これは、NADPHデヒドロゲナーゼ群、アルコールデヒドロゲナーゼ群ADH、並びにNADPH再生ギ酸デヒドロゲナーゼ群FDH及びNADPH再生グルコースデヒドロゲナーゼ群GDHから特に選択され、NADPH再生酵素は、任意に組換え微生物により発現されるか;及び/又は消費されたNADHはNADH再生酵素との結合によって再生され、これは、NADHデヒドロゲナーゼ群、NADH再生ギ酸デヒドロゲナーゼ群FDH、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼ群ADH、NADH再生グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ群G6PDH、NADH再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ群PtDH及びNADH再生グルコースデヒドロゲナーゼ群GDHから特に選択され、NADH再生酵素は、組換え微生物において任意に発現される、請求項7記載の方法。NADPH再生酵素が、少なくとも酵素的酸化によりギ酸をCO2へと触媒するNAD依存性ギ酸デヒドロゲナーゼFDHの変異体群から選択され、該変異体は、未変異の酵素と比較して、NADPを補因子としてさらに受容する請求項8記載の方法。NADP受容性FDH変異体が、配列番号36のマイコバクテリウム-バッカエN10に由来するFDHのアミノ酸配列において少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来し少なくとも60の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項9記載の方法。NADP受容性変異体が、配列番号36の位置221~226の配列モチーフTDRHRLにおいて少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来し少なくとも60の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも1つの変異を有する、請求項9又は10記載の方法。a請求項9~11のいずれか1項記載のFDH変異体及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を同時にコードし、かつ任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はb請求項9~11のいずれか1項記載のFDH変異体及び未変異7β-HSDH野生型を同時にコードし、かつ任意に3α-HSDHを同時にコードするか;またはc請求項9~11のいずれか1項記載のFDH変異体及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;又はd請求項9~11のいずれか1項記載のFDH変異体及び未変異7β-HSDHを有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;又はeFDH野生型及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を同時にコードし、かつ任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はfFDH野生型及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;又はgGDH及び7β-HSDH野生型を同時にコードし、かつ任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はhGDH及び7β-HSDH野生型を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;又はiGDH及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を同時にコードし、かつ任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はkGDH及び請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードする;核酸配列群から選択される核酸配列。請求項12記載の核酸配列を少なくとも1つ有する組換え微生物。7β-HSDH野生型、NADP受容性FDH変異体及び/又は対応するFDH野生型の同時発現が可能であり、かつ任意に3α-HSDHの同時発現が可能であるか;又は7β-HSDH野生型及びGDHの同時発現が可能であり、かつ任意に3α-HSDHの同時発現が可能である、組換え微生物。7β-HSDH変異体、NADP受容性FDH変異体及び/又は対応するFDH野生型の同時発現が可能であり、かつ任意に3α-HSDHの同時発現が可能であるか;又は7β-HSDH変異体及びGDHの同時発現が可能であり、かつ任意に3α-HSDHの同時発現が可能である、組換え微生物。FDH変異体が請求項9~11のいずれか1項記載の変異体であり;FDH野生型が配列番号36のマイコバクテリウムバッカエN10に由来するFDHであるか、又はこれに由来し少なくとも60の配列同一性を有するFDHである、請求項14又は15記載の組換え微生物。式1式中、Rはアルキル、NR1R2、H、アルカリ金属イオン、又はNR34を表し、残基R3は同一であるか又は異なってもよいH又はアルキルを表すで表されるウルソデオキシコール酸UDCAの調製方法であって、a式2式中、Rは上記意味を有するで表されるコール酸CAを、任意に化学的に酸化して、式3式中、Rは上記意味を有するで表されるデヒドロコール酸DHCAとし;bDHCAを、請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体の少なくとも1つの存在下、及び少なくとも1つの3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHの存在下で還元し、特にNADH及び/又はNADPHの存在下で、かつそれらの消費により式5式中、Rは上記の意味を有するで表される、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAとし;その後c式5で表される12-ケト-UDCAを化学的に還元してUDCAとし;d反応生成物を、任意にさらに精製してもよい、上記方法。少なくとも工程bを請求項5記載の組換え微生物の存在下で行う請求項17記載の方法。工程bを同一又は異種の補因子再生系と組合せる請求項17又は18記載の方法。工程b、7β-HSDH一部工程を、請求項9~11のいずれか1項記載のNADP受容性FDH変異体により、ギ酸又はその塩の消費を伴って、消費したNADPHを再生させる再生補因子再生系と組合せるか;又はADHにより、イソプロパノールの消費を伴って、消費したNADPHを再生させる再生補因子再生系と組合せるか;又はGDHにより、グルコースの消費を伴って、消費したNADPHを再生させる再生補因子再生系と組合せるか;又はNADH再生GDH、ADH又はFDHにより、消費したNADPHを再生させる再生補因子再生系と組合せる、請求項19記載の方法。工程b、3α-HSDH一部工程を、請求項9~11のいずれか1項記載のNADP受容性FDH変異体により、ギ酸又はその塩の消費を伴って、NADPHを再生させる再生補因子再生系と組合せるか;又はADHにより、イソプロパノールの消費を伴って、消費したNADPHを再生させる再生補因子再生工程と組合せるか;又は工程bを、請求項9~11のいずれか1項記載のNAD受容性FDH変異体及びNADP受容性FDH変異体により又は未変異FDHにより、各々の場合において、ギ酸又はその塩の消費を伴うか、もしくは、NAD受容性GDHにより、グルコースの消費を伴って、NADPHを再生させる再生補因子再生工程と組合せる、請求項19又は20記載の方法。式1式中、Rはアルキル、NR1R2、H、アルカリ金属イオン、又はNR34を表し、残基R3は同一であるか又は異なってよいH又はアルキルを表すで表されるウルソデオキシコール酸UDCAの調製方法であって、a式2式中、Rは上記意味を有するで表されるコール酸CAを、任意に化学的に酸化して、式3式中、Rは上記意味を有するで表されるデヒドロコール酸DHCAとし;bDHCAを、少なくとも1つの7β-HSDH変異体の存在下、及び少なくとも1つの3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHの存在下で、還元し、特にNADH及び/又はNADPHの存在下で、かつそれらの消費により式5式中、Rは上記意味を有するで表される、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAとし;その後、c式5で表される12-ケト-UDCAを化学的に還元し、UDCAとし;d反応生成物を、任意にさらに精製し;工程bの反応を、請求項13及び14~16のいずれか1項記載の組換え微生物の存在下で行うか、又は請求項12記載の核酸配列の少なくとも1つを用いて行う、上記方法。請求項14~16のいずれか1項記載の組換え微生物を用いる請求項22記載の方法であって、請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体の少なくとも1つ、請求項9~11のいずれか1項記載のNADP受容性FDH変異体の少なくとも1つ、及び3α-HSDHの少なくとも1つを同時に発現するか;又は、請求項1~4のいずれか1項記載の7β-HSDH変異体の少なくとも1つ、少なくとも1つのGDH、および少なくとも1つの3α-HSDHを同時に発現する、上記方法。本発明により解決しようとする課題は、さらに改良された7β-HSDHを提供することにある。特に、7位から3,12-ジケト-7β-CAにおけるDHCAの立体選択的な還元を経由した酵素的又は微生物的なUDCAの調製をさらに好都合にするために用いることができる酵素変異体を提供すべきであり、特に、低減した基質阻害を有するか、及び/又は変化した補因子の使用を有する特異性の増大、変化、または依存性の拡大酵素変異体を提供すべきである。別の課題は、新規な酵素的及び微生物的な合成経路を提供することにあり、特に、DHCAを経由したUDCAの還元的調製における単純化された補因子の再生によっても特徴付けられる合成経路を提供することにある。驚くべきことに上記の課題は、コリンゼラ属の好気性菌、特にコリンゼラアエロファシエンス株に由来する、新規な部位特異的および立体特異的な7β-HSDHの変異体の産生および性質決定、およびコール酸化合物の反応、特にUDCAの調製におけるその使用によって解決された。さらに上記の課題は、同時またはいずれかの順序で時間的に遅延して起こってもよい、7β-HSDHまたは3α-HSDHによって触媒される二つの部分的な還元工程を経由するDHCAの12-ケト-UDCAへの酵素的変換工程、および二つの部分的な還元工程において消費された補因子を再生する、特にギ酸デヒドロゲナーゼFDHまたはグルコースデヒドロゲナーゼGDHのようなデヒドロゲナーゼを用いる補因子の再生工程を有する、生体触媒的微生物的または酵素的方法の提供によって解決された。本発明の特別な態様本発明は特に、以下の特別な態様に関する。1.少なくとも立体特異的な酵素的還元により7-ケトステロイドをそれに対応する7-ヒドロキシステロイドへと触媒する7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDH変異体であって、該変異体は、未変異の酵素、例えば特に配列番号2を有するか及び/又はその位置36~42の配列モチーフVMVGRREを少なくとも有する酵素と比較して、低減した基質阻害特に7-ケトステロイド基質に対するを有するか、及び/又は変化した補因子の使用例えば、補因子特にNADH又はNADPHに関して、増大又は変化した特異性、もしくは依存性が拡大した、即ち、以前に用いられていない追加の補因子の使用を有する、上記変異体。2.いずれの基質阻害も示さないか、又は7-ケトステロイド基質に対する、特にデヒドロコール酸DHCAに対するKi値が>10mM、例えば11~200mM、12~150mM、15~100mMの範囲である、態様1記載の変異体。3.補因子NADPHの存在下での特異的活性U/mgが、未変異酵素と比較して、少なくとも1、5もしくは10、特に少なくとも1倍、特に2~10倍上昇または低下しているか;又は本質的に存在せず、かつNADHの使用に置き換えられているか、又はNADPH及びHADHの使用に拡大されている、態様1又は2記載の変異体。4.少なくとも立体特異的な酵素的還元により7-ケトステロイドをそれに対応する7-ヒドロキシステロイドへと触媒する、任意に先述の態様の1つに記載の7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDH変異体であって、該変異体は、配列番号2のアミノ酸配列において少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来しこの配列に対して少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、もしくは90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記変異体。5.少なくとも立体特異的な酵素的還元により7-ケトステロイドをそれに対応する7-ヒドロキシステロイドへと触媒する、任意に先述の態様の1つに記載の7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDH変異体であって、該変異体は、配列番号2の位置36~42の配列モチーフVMVGRREにおいて少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来しこの配列に対して少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、もしくは90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも1つの変異を有する、上記変異体。6.a単一変異体群G39X1およびR40X2、b二重変異体群G39X1、R40X2、R40X2、R41X3およびG39X1、R41X3、もしくはc三重変異体群G39X1、R40X2、R41X3それぞれの事例は配列番号2に関する式中、各ケースにおいて、X1、X2、およびX3はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸を表し、特に基質阻害が減少しているか、及び/又は補因子の使用または補因子依存性が改変されている、GまたはRとは異なる、いずれかの天然アミノ酸を表す;またはd配列番号2由来のアミノ酸配列であって、この配列に対して少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、もしくは90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列の、対応する単一、二重、または三重変異体群;から選択される、態様4又は5記載の変異体。適切な単一変異体群の例として:G39A、G39S、G39D、G39V、G39T、G39P、G39N、G39E、G39Q、G39H、G39R、G39KおよびG39W、ならびにR40D、R40E、R40I、R40V、R40L、R40G、R40Aが挙げられる。適切な二重変異体群の例として:上記G39X1とR40X2変異体との二重の組合せであって、X1が特にDもしくはEであり、かつ/またはX2がいずれかのアミノ酸、特に脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばG39D,R40I、G39D,R40L、G39D,R40Vのようなタンパク質を構成するアミノ酸であってよい二重の組合せ;およびG39Dの代わりにG39Eによる類似の二重変異体;ならびに上記G39X1変異体またはR40X2変異体とR41X3変異体との二重の組合せであって、X3がいずれかのアミノ酸、特に基質阻害が減少しており、かつ/または補因子の使用または補因子依存性が改変されており、Rとは異なる天然アミノ酸、例えばG39X1,R41X3もしくはR40X2,R41X3の型である、例えばX1=D又はE;X2=I、L又はV;X3=N、I、L又はVである二重の組合せ、例えばR40D,R41I;R40D,R41L;R40D,R41V;R40I,R41I;R40V,R41I、R40L,R41Iが挙げられる。適切な三重変異体群の例として、上記単一変異体群G39X1、R40X2およびR41X3のいずれかの三重の組合せであって;X1、X2、およびX3は上記で定義されたとおりであるが;特にX1はDもしくはEを表し、かつ/又はX2およびX3はそれぞれ独立していずれかのアミノ酸、特にタンパク質を構成するアミノ酸を表す三重の組合せ、例えば特にG39X1=DもしくはE;R40X2=I、LもしくはV;R41X3=N、I、LもしくはVの型である三重変異体群、例えばG39D,R40I,R41Nが挙げられる。態様1~6の変異体は、さらに、または代わりに、特にさらに、K44、R53、K61、およびR64の位置に、少なくとも1個のさらなる置換、例えば1個、2個、3個もしくは4個の置換を任意に有してもよい。この場合、これらの残基はそれぞれ独立して、いずれかのアミノ酸、特にタンパク質を構成するアミノ酸によって、特に、本明細書に定義するように、得られた変異体の基質阻害が減少し特に7-ケトステロイド基質に対して;かつ/または補因子の使用もしくは補因子の依存性が変化する例えば補因子に関する特異性が増大、変化しているか、または依存性が拡大している、すなわち以前に用いていない追加の補因子の使用ように置換されてもよい。7.先述の態様の1つに記載される7β-HSDH変異体をコードする核酸配列。8.少なくとも1つの調節性核酸配列の遺伝的制御下にある態様7記載の核酸配列、ならびに任意に、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、特に3α-HSDH、および補因子再生に適したデヒドロゲナーゼ、例えばFDH、GDH、ADH、G-6-PDH、PDHから選択される少なくとも1つ例えば1つ、2つまたは3つのさらなる酵素をコードする配列を含む発現カセット。特に、発現カセットに含まれる酵素は、異なる、しかし好ましくは同一の補因子の組合せ、例えば補因子NAD/NADHまたはNADP/NADPHの組合せを用いることができる。9.態様8記載の発現カセットを少なくとも1つ有するベクター。10.態様7記載の核酸配列を少なくとも1つ有するか、または態様8記載の発現カセットを少なくとも1つ有するか、または態様9に記載のベクターを少なくとも1つ有し、さらに、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHをコードする配列を任意に有する、組換え微生物。11.7β-ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に合成する方法であって、対応する7-ケトステロイドを、態様1~6の1つに定義される7β-HSDH変異体の存在下で、又はこの変異体を発現する態様10記載の組換え微生物の存在下で反応させ、かつ得られる還元生成物の少なくとも1つを反応混合物から任意に分離する、上記方法。12.態様11記載の方法であって、還元されるケトステロイドはaデヒドロコール酸DHCA、b7-ケト-リトコール酸7-ケト-LCA、c7,12-ジケト-リトコール酸7,12-ジケト-LCA及びdこれらの誘導体、例えば特に該酸の塩、該酸のアミド又は該酸のアルキルエステル、から選択される。13.還元を、NADPH及び/又はNADHの存在下及びこれらの消費により生じさせる、態様11及び12のうちの1つに記載の方法。14.7β-ヒドロキシステロイドを酵素的または微生物的に酸化する方法であって、ヒドロキシステロイを、態様1~6の1つに定義される7β-HSDH変異体の存在下で、またはこの変異体を発現する態様10記載の微生物の存在下で反応させ、かつ得られる酸化生成物を反応混合物から任意に分離する、上記方法。15.7β-ヒドロキシステロイドが、3,12-ジケト-7β-CAまたはその誘導体、例えば特に塩、アミドまたはアルキルエステルである、態様14記載の方法。16.酸化を、NADP及び/又はNADの存在下及びこれらの消費により生じさせる、態様14及び15のうちの1つに記載の方法。17.消費されたレドックス均等物を、化学的、電気化学的、または酵素的に、特にその場でinsituで再生する、態様13及び16のうちの1つに記載の方法。18.態様17記載の方法であって、消費されたNADPHをNADPH再生酵素との結合によって再生し、該NADPH再生酵素が、特にNADPHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼADH、およびNADPH再生ギ酸デヒドロゲナーゼFDH、およびグルコースデヒドロゲナーゼGDH-、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼG-6-PDH、または亜リン酸デヒドロゲナーゼPtDHから選択され、該NADPH再生酵素は任意に組換え微生物により発現されるか;または消費されたNADHをNADH再生酵素との結合によって再生し、NADH再生酵素が、特にNADHデヒドロゲナーゼ、NADH再生ギ酸デヒドロゲナーゼFDH、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼADH、NADH再生グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼG6PDH、NADH再生亜リン酸デヒドロゲナーゼPtDH、およびNADH再生グルコースデヒドロゲナーゼGDHから選択され、該NADH再生酵素は任意に組換え微生物において発現される、上記方法。組換え微生物における補因子再生酵素の発現が好ましい。19.NADPH再生酵素が、天然又は組換えの、分離されたか又は濃縮された、aアルコール脱水素酵EC1.1.1.2およびbそれに由来する機能的均等物から選択される、態様18記載の方法。20.態様18記載の方法であって、NADPH再生酵素は、少なくとも酵素的酸化によりギ酸をCO2へと特に触媒するNAD依存性ギ酸デヒドロゲナーゼFDHの変異体から選択され、該変異体は未変異酵素と比較して、単独にまたはさらに、特にさらに、NADPを補因子として受容するか;またはNADH再生酵素は、NAD依存性FDHまたはNAD依存性GDH、例えば特に、配列番号36のマイコバクテリウム-バッカエN10由来のFDHおよび配列番号48の枯草菌由来のGDHこれはNADPHおよび/またはNADHを再生するまたはこれらの修飾型から選択され、これらの修飾型はそれぞれの場合において前述の二つの酵素に対する機能的な均等物補因子の再生に関してである、上記方法。21.態様20記載の方法であって、FDH変異体は特異的活性によってNADPをNADPHに還元し、この特異的活性は、未変異野生型酵素によるNADからNADHへの還元に特異的な活性の、約0.1~1000、例えば1~100、5~80、または10~50である、上記方法。22.態様20及び21のうちの1つに記載される方法であって、NADP受容性FDH変異体は、配列番号36のマイコバクテリウム-バッカエN10由来のFDHのアミノ酸配列において少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、上記方法。23.態様20及び22のうちの1つに記載される方法であって、NADP受容性変異体は、配列番号36の位置221~226の配列モチーフTDRHRLにおいて少なくとも1つの変異を有するか、又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する配列モチーフにおいて少なくとも1つの変異を有する、上記方法。可能性のある適切なFDH変異体の限定されない例として、配列番号36の位置D222および/またはR223における変異が挙げられる。例として、X=G、A、K、またはNであるD222X;X=HまたはYであるR223X、ならびに位置222および223における変異の組合せを言及することができる。24.態様20~23の1つに記載される方法であって、NADP受容性変異体は、配列番号36の単一変異体D222G本明細書ではD221G変異体と表されることが多い配列番号36の位置2のAlaを最初のアミノ酸として数える又はこれに由来するアミノ酸配列であって、少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列の対応する単一変異体群から選択される。具体例として、配列番号15、19、および35のFDH変異体を言及することができる。さらに適切なFDH酵素として、例えばカンジダボイディニーCandidaboidiniまたはシュードモナス属Pseudomonasspの一種から分離できる野生型酵素に始まり、補因子の特異性を変化させるための上記変異に対応する少なくとも1つの機能的変異の挿入が利用できる。さらに、先行技術には、化学的もしくは熱安定性または触媒活性のような、様々なFDHの性質を改善するための多くの研究が見出される。これらは例えば、TishkovetalBiomolecularEngineering2389110に要約されている。従って、該文献に記載される単一または複数の点突然変異は、例えば酵素安定性を増大させるために、本発明によって記載される改変された補因子の使用のための変異と組合せることができる。25.a態様22~24の1つに記載されるFDH変異体および態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を同時にコードし、任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はb態様22~24の1つに記載されるFDH変異体および未変異7β-HSDHを同時にコードし、任意に3α-HSDHを同時にコードするか;又はc態様22~24の1つに記載されるFDH変異体および態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;又はd態様22~24の1つに記載されるFDH変異体および未変異7β-HSDHを有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか、eFDH野生型および態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を同時にコードし、任意に3α-HSDHを同時にコードするか;またはfFDH野生型、態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;gGDH及び7β-HSDH野生型を同時にコードし、任意に3α-HSDHを同時にコードするか;hGDH及び7β-HSDH野生型を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードするか;iGDH及び態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を同時にコードし、任意に3α-HSDHを同時にコードするか;ならびにkGDH及び態様1~6の1つに記載される7β-HSDH変異体を有する融合タンパク質であって、3α-HSDHを任意に有する融合タンパク質をコードする、核酸配列群から選択される核酸配列であって;コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば2、3、4、5、もしくは6~10コピーで構築物内に含んでもよい核酸配列。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。26.少なくとも1つの調節性核酸配列の遺伝的制御下にある態様25記載の核酸配列を有する発現カセットであって、コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば2、3、4、5、もしくは6~10コピーで構築物内に含んでもよい発現カセット。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。27.態様26記載の発現カセットを少なくとも1つ有するベクターであって、コード配列はそれぞれ独立に、単一または複数で、例えば2、3、4、5、もしくは6~10コピーでベクター構築物内に含んでもよいベクター。適したコピー数の選択を通し、個々の発現産物において発生する活性の相違を任意に補正できる。28.態様25記載の核酸配列を少なくとも1つ有するか、又は態様27記載の発現カセットを少なくとも1つ有するか、又は態様28記載のベクターを少なくとも1つ有する、組換え微生物。29.7β-HSDH野生型、NADP受容性FDH変異体および/または対応するFDH野生型、ならびに任意に3α-HSDHの同時発現が可能であるか;又は7β-HSDH野生型、本明細書に記載されるGDH、および任意に本明細書に記載される3α-HSDHの同時発現が可能である、組換え微生物。30.7β-HSDH変異体、NADP受容性FDH変異体および/または対応するFDH野生型、ならびに任意に3α-HSDHの同時発現が可能であるか;又は7β-HSDH変異体、本明細書に記載されるGDH、および任意に本明細書に記載される3α-HSDHの同時発現が可能である、組換え微生物。31.7β-HSDH変異体が態様1~6の1つに記載される変異体である、態様30記載の組換え微生物。32.態様29または30記載の組換え微生物であって、FDH変異体は態様20~24の1つに定義される変異体であり;FDH野生型は配列番号36のマイコバクテリウム-バッカエN10由来のFDHであるか、またはこれに由来するFDHであって少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5の配列同一性を有するFDHである、上記組換え微生物。33.態様29または30記載の組換え微生物であって、3α-HSDHは、配列番号6又は8又は22のアミノ酸配列を有するか、又はこれらに由来しこの配列と少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99又は99.5の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素である、上記組換え微生物。34.1以上の異なる発現構築物に、7β-HSDH、FDH、および3α-HSDHをコードする配列を有する、態様29~33の1つに記載される組換え微生物。従って本発明は、7β-HSDHまたはその変異体、FDHまたはその変異体、および3α-HSDHまたはその変異体をコードする配列を1コピー以上、例えば2、3、4、5、または6~10コピー有する単一プラスミド系によって改変された例えば形質転換された組換え微生物に関する。従って本発明はまた、7β-HSDHまたはその変異体、GDHまたはその変異体、および3α-HSDHまたはその変異体をコードする配列を1コピー以上、例えば2、3、4、5、または6~10コピー有する単一プラスミド系によって改変された例えば形質転換された組換え微生物にも関する。しかしながら該酵素7β-HSDH、FDH、および3α-HSDH、またはそれらの変異体はまた、別々の2または3の、互いに適合性のプラスミドに1コピー以上含めることもできる。単一プラスミド系および複数コピーのプラスミドを調製するための適切な基本ベクターは、当業者に公知である。本発明者らが言及し得る例として、単一プラスミド系には例えばpET21a、および複数コピーのプラスミドには、例えばNovagen社により市販されるpACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、およびpCOLADuet-1のようなduetベクターが挙げられる。この種のベクターについての、他のベクターおよび微生物宿主株との適合性は、例えばNovagen社のUserProtocolTB340Rev.E0305に記載されている。プラスミド系を産生するための酵素の最適な組合せは、当業者により、本発明の教示を考慮して過度の努力なしに行うことができる。従って当業者は、例えばそれぞれの場合において使用される7β-HSDH酵素の補因子特異性に依存して、前述のデヒドロゲナーゼ、特にFDH、GDH、およびそれらの各変異体から、補因子再生に最も適した酵素を選択できる。さらに、反応のために選択された酵素を2以上のプラスミドに分配し、かつ、得られたプラスミドによって、本発明の生体触媒的反応に共に用いられる2以上の異なる組換え微生物を産生する可能性がある。プラスミド調製のために用いられる特定の酵素の組合せは、特に、類似した補因子の使用を特定するためにも応用できる。例えば第1の微生物は、本発明のNADPH依存性7β-HSDH変異体およびこの補因子を再生するFDH変異体をコードする配列を有するか、またはNADPH依存性7β-HSDH変異体およびNADPH再生GDHをコードする配列、またはNADH依存性7β-HSDHおよびNADH再生FDHおよび/もしくはGDHをコードする配列を有するプラスミドによって改変できる。一方で第2の微生物は、NADH依存性3α-HSDHをコードする配列およびNADH再生FDH野生型および/もしくはNADH再生GDHをコードする配列を有するプラスミドによって改変できる。両微生物は次に、本発明の生体触媒的反応に同時に用いることができる。別々の二つの生体触媒組換え微生物の使用は、全ての合成酵素を発現する一つの生体触媒のみの使用を超えた二つの重要な利点を提供する。a二つの生体触媒は、互いに別々に、遺伝的に改変され最適化される。特に、NADH再生またはNADPH再生のいずれかに対して最適化された、異なる補因子再生酵素の使用が可能である。b生体触媒作用のために、生体触媒は異なる割合で使用できる。これにより、複数酵素による方法において、全ての生体触媒が準備された後であっても、生体触媒作用の間に個々の反応速度を調整することが可能となる。驚くべきことに、本発明との関連において、二つの生体触媒の使用によって必要となる反応物質のさらなる膜輸送工程は、反応速度に対してわずかに影響するかまたは影響を与えず、2細胞系の利点はこれらの仮定的な負の局面に勝ることも示された。35.式1式中、Rはアルキル、NR1R2、H、アルカリ金属イオン、又はNR34を表し、残基R3は同一であるか又は異なってもよいH又はアルキルを表すのウルソデオキシコール酸UDCAの調製方法であって、a式2式中、Rは上記意味を有するのコール酸CAを、任意に化学的に酸化して、式3式中、Rは上記意味を有するのデヒドロコール酸DHCAとし;bDHCAを、態様1~6の1つにおける定義による7β-HSDH変異体分離された酵素として存在するか、又は対応する組換え微生物によって発現されるの少なくとも1つの存在下、及び少なくとも1つの3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDH分離された酵素として存在するか、又は対応する組換え微生物によって発現されるの存在下で還元し、特にNADH及び/又はNADPHの存在下で、かつそれらの消費により式5式中、Rは上記の意味を有するの、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAとし;その後d式5の12-ケト-UDCAを化学的に還元してUDCAとし;e反応生成物を、任意にさらに精製してもよい、上記方法。方法工程bは異なる設定が可能である。両酵素7β-HSDH変異体および3α-HSDHが同時に存在し得るか例えば分離された両酵素によるか、または両酵素を発現する、対応する1以上の組換え微生物の存在によるワンポット反応、または部分的反応がいずれかの順序で起こってもよい最初に7β-HSDH変異体により触媒される還元、次に3α-HSDHにより触媒される還元;または最初に3α-HSDHにより触媒される還元、次に7β-HSDH変異体により触媒される還元。従って、式1のUDCAの調製方法の変形は、例えば以下の通りであってよい:a式2のコール酸CAを、任意に化学的に酸化し;bDHCAを、少なくとも1つの、態様1~6の1つに定義される7β-HSDH変異体分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現されるの存在下で、式4の3,12-ジケト-7β-コラン酸3,12-ジケト-7β-CAへとNADPHおよび/またはNADHの存在下で、かつそれらの消費により還元し、c3,12-ジケト-7β-CAを、少なくとも1つの、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDH分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現されるの存在下で、式5式中、Rは上記の意味を有するの、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAへとNADHおよび/またはNADPHの存在下で、かつそれらの消費により、使用する3α-HSDHに応じて還元し、その後、d式5の12-ケト-UDCAを化学的に還元してUDCAとし;かつe反応生成物を、さらに任意に精製する。36.工程bおよびcを、本明細書に記載される、1以上の組換え微生物、例えば態様10記載の微生物の少なくとも1つの存在下で行う、態様35記載の方法。37.態様35又は36記載の方法であって、工程bおよび/またはcを、同一かまたは異なる補因子再生系分離された酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現されると組合せる、上記方法。38.態様37記載の方法であって、工程bは、NADP受容性FDH変異体により、態様20~24の1つに定義されるように、ギ酸またはその塩を消費して、NADPHを再生する補因子再生系と組合せるか;またはADHにより、イソプロパノールを消費して、NADPHを再生する補因子再生系と組合せるか;またはGDHにより、グルコースを消費して、NADPHを再生する補因子再生系と組合せるか;または消費されたNADHを、NADH再生GDH、ADH、もしくはFDHによって再生する補因子再生系と組合せる、上記方法。39.態様37又は38記載の方法であって、工程cは、態様20~24の1つに定義され、NADP受容性FDH変異体により、ギ酸またはその塩を消費して、NADPHを再生する補因子再生工程と組合せるか;または工程cは、態様20~24の1つに定義されるように、NADH再生FDH変異体によって、または未変異FDHにより、ギ酸またはその塩を消費して、またはNADH再生GDHにより、グルコースを消費して、NADHを再生する補因子再生工程と組合せる、上記方法。40.式1式中、Rはアルキル、NR1R2、H、アルカリ金属イオン、またはNR34を表し、残基R3は同一であるかまたは異なってよい、Hまたはアルキルを表すのウルソデオキシコール酸UDCAの微生物的調製方法であって、a式2式中、Rは上記の意味を有するのコール酸CAを、任意に化学的に酸化し、式3式中、Rは上記の意味を有するのデヒドロコール酸DHCAとし;bDHCAを、少なくとも1つの7β-HSDH変異体の存在下、および少なくとも1の3α-HSDHの存在下で、NADHおよび/またはNADPHの存在下で、かつそれらの消費により還元して、式5の、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAとし;c式5の12-ケト-UDCAを化学的に還元してUDCAとし;かつd反応生成物を任意に、さらに精製し;工程bの反応を、微生物的に、即ち態様28または29~34の1つに記載される、1以上の異なる組換え微生物の全細胞の存在下で生じさせ、単数もしくは複数の微生物は、本明細書にさらに詳細に記載される様式かまたはその他の様式により、少なくとも1の態様25に記載される核酸配列を用いて、反応および補因子再生に必要な酵素を有する、上記方法。例えばDHCAを、少なくとも1つの7β-HSDHまたはその変異体の存在下で、NADPHの存在下で、かつその消費により還元して、式4式中、Rは上記の意味を有するの3,12-ジケト-7β-コラン酸3,12-ジケト-7β-CAとし、かつ3,12-ジケト-7β-CAを、少なくとも1つの、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHまたはその変異体の存在下で、NADHおよび/またはNADPHの存在下で、かつそれらの消費により還元して、式5式中、Rは上記の意味を有するの、対応する12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケトUDCAとしてもよい。しかしながら、反応順序についてはさらに、最初にDHCAの3α-HSDHによる還元、続いて得られた反応生成物の7β-HSDHによる還元が考えられ、かつ両HSDHが同時に存在することに基づき、両反応の順序が同時であることも考えられる。41.態様40記載の方法であって、態様29~34の1つに記載される組換え微生物が1つ以上、特に1つ用いられ、これは、例えば、態様1~6の1つに記載される少なくとも1つの7β-HSDH変異体、態様20~24の1つに記載される少なくとも1つのNADP受容性FDH変異体、および例えば特に配列番号6、8、もしくは22に記載される少なくとも1つの3α-HSDH、または少なくとも約60の配列同一性によるその変異体を同時に発現するか;またはこれは、態様1~6の1つに記載される少なくとも1つの7β-HSDH変異体、例えば特に配列番号6、8、もしくは22記載の少なくとも1つのGDHおよび少なくとも1つの3α-HSDH、または少なくとも約60の配列同一性によるそれらの変異体を同時に発現する、上記方法。42.態様35~41の1つに記載される方法を行うためのバイオリアクターであって、これは特に少なくとも1つの酵素7β-HSDH、FDH、および/もしくは3α-HSDH、またはそれらの変異体;または7β-HSDH、GDH、および/もしくは3α-HSDH、またはそれらの変異体、または少なくとも1つのこれらの酵素を、特に固定化型で組換え的に発現する組換え微生物を含む、バイオリアクター。本発明は、本明細書に記載される具体的な態様に限定されるものではない。当業者はむしろ、本発明の教示を通して、過度の努力なしに本発明のさらなる構成を提供できるであろう。当業者は例えば、目的を持ってさらなる酵素変異体を産生し、所望の特性改良された補因子依存性および/または安定性、基質阻害の減少のためにこれらを選別し、最適化するか;またはさらに適した野生型酵素7β-および3α-HSDH、FDH、GDH、ADHなどを分離し、これらを本発明に従って使用することもできる。さらに、例えば使用するHSDH、特に7β-HSDHまたは3α-HSDHまたはそれらの変異体の特性特に補因子依存性に依存して、当業者は補因子再生に使用できる適切なデヒドロゲナーゼGDH、FHD、ADHなどおよびそれらの変異体を選択し、かつ選択した酵素を1以上の発現構築物またはベクターへ分配できることから、必要な場合には1以上の組換え微生物を産生することで、最適化された全細胞に基づいた産生方法が可能となる。本発明のさらなる構成1.一般的定義および使用した略語特記しない限り、用語7β-HSDHは、少なくとも立体特異的および/または部位特異的な還元により、特にNADPHの化学量論的な消費と共に、DHCAまたは7,12-ジケト-3α-CA7,12-ジケト-LCAを3,12-ジケト-7β-CAまたは12-ケト-UDCAへと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。酵素は天然または組換えによって産生した酵素であってよい。酵素は、基本的には細胞性の、例えばタンパク質不純物と混合していてもよいが、純粋な形態であることが好ましい。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている例えば、CharacterizationofNADPdependent7betahydroxysteroiddehydrogenasesfromPeptostreptococcusproductusandEubacteriumaerofaciensSHiranoandNMasudaApplEnvironMicrobiol1982。この活性を有する酵素は、EC番号1.1.1.201に分類される。特記しない限り、用語3α-HSDHは、少なくとも立体特異的および/または部位特異的な還元により、特にNADHおよび/またはNADPHの化学量論的な消費と共に、3,12-ジケト-7β-CAまたはDHCAを12-ケト-UDCAまたは7,12-ジケト-3α-CA7,12-ジケト-LCAへと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている。適切な酵素は、例えばコマモナステストステローニ例えばATCC11996から得ることができる。NADPH依存性の3α-HSDHは、例えばげっ歯類由来のものも知られており、これもまた使用できる。CloningandsequencingofthecDNAforratliver3alphahydroxysteroiddihydrodioldehydrogenaseJEPawlowskiMHuizingaandTMPenningMay151991TheJournalofBiologicalChemistry26688208825。この活性を有する酵素は、EC番号1.1.1.50に分類される。特記しない限り、用語GDHは、少なくとも酸化により、NADおよび/またはNADPの化学量論的な消費と共に、β-D-グルコースをD-グルコノ-1,5-ラクトンへと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。適切な酵素は、例えば枯草菌または巨大菌から得ることができる。この活性を有する酵素は、EC番号1.1.1.47に分類される。特記しない限り、用語FDHは、少なくとも酸化により、NADおよび/またはNADPの化学量論的な消費と共に、ギ酸または対応するギ酸塩の二酸化炭素へと触媒し、対応する逆反応を任意に触媒するデヒドロゲナーゼを意味する。検出に適した方法は、例えば以下の実験についての項に記載されるか、または文献から知られている。適切な酵素は、例えばカンジダボイディニー、シュードモナス属の一種、またはマイコバクテリウム-バッカエから得ることができる。この活性を有する酵素は、EC番号1.2.1.2に分類される。純粋な形態もしくは純粋又は実質的に純粋な酵素は、本発明によれば、タンパク質を検出するための通常の方法、例えばビウレット法またはLowryらによるタンパク質検出法RKScopesProteinPurificationSpringerVerlagNewYorkHeidelbergBerlinの記載を参照によって決定した総タンパク質含量に対して80wt超、好ましくは90wt超、特に95wt超、さらに特に99wt超の純度を有する酵素として理解される。レドックス均等物は、電子ドナーまたは電子アクセプターとして使用できる低分子有機化合物、例えばNADおよびNADH、またはそれらのそれぞれの還元型であるNADHおよびNADPHのようなニコチンアミド誘導体を意味する。本発明との関連において、レドックス均等物および補因子は同義語として用いられる。従って、本発明の意味での補因子は、レドックス対応補因子、すなわち還元型および酸化型で存在できる補因子としても記載できる。消費された補因子は、基質の特定の還元または酸化反応過程において、対応する酸化型または還元型に変換される。補因子の還元型または酸化型として理解される再生によって、反応中に形成された酸化型または還元型の補因子は、基質反応に再度利用可能となるように、出発型である還元型または酸化型へ変換して戻される。変化した補因子の使用は、本発明との関連において、基準と比較した定性的または定量的変化として理解される。特に変化した補因子の使用は、使用するアミノ酸配列の変異により観察される。この変化は次に、未変異の出発酵素との比較により決定できる。さらに特定の補因子に関する活性は、使用する変異によって増大もしくは減少するか、または完全に阻止される。しかしながら、変化した補因子の使用には、個々の補因子に対する特異性に替わり、第1の補因子とは異なる、少なくとも1つのさらなる第2の補因子が使用可能であるようなすなわち補因子使用の拡大変化もまた含まれる。しかしながら、反対に、元々存在する二つの異なる補因子の使用能は、特異性がこれらの補因子の1つのみにおいて増大するか、またはこれらの補因子の1つのみにおいて減少するか、または完全に除去されるように変化させることができる。例えば補因子NADNADHに依存する酵素は、補因子の使用の変化のために、NADNADHおよび補因子NADPNADPHの両方に依存するか、または元々のNADNADHに対する依存性をNADPNADPHに対する依存性へ完全に変換させるか、その逆もまた可能である。特記しない限り、用語NAD/NADH依存性またはNADP/NADPH依存性は、本発明に従って広範に解釈される。これらの用語には、特異的な依存性、すなわちNAD/NADHまたはNADP/NADPHに対する単独の依存性、ならびに本発明に従って使用する酵素の両補因子に対する依存性、すなわちNAD/NADHおよびNADP/NADPHに対する依存性の両方が含まれる。このことは、用語NAD/NADH受容性またはNADP/NADPH受容性にも同様に適用される。特記しない限り、用語NAD/NADH再生またはNADP/NADPH再生は、本発明に従って広範に解釈される。これらの用語には、特異的、すなわち消費された補因子NAD/NADHまたはNADP/NADPHを再生する単独の能力、ならびに両補因子、すなわちNAD/NADHおよびNADP/NADPHを再生する能力の両方が含まれる。タンパク質を構成するアミノ酸には、特に一文字コード:G、A、V、L、I、F、P、M、W、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R、およびHが含まれる。本発明によれば固定化は、本発明に従って用いる生体触媒、例えば7β-HSDHの、固体、すなわち周囲を取り囲む液体溶媒に実質的に不溶性の担体物質への共有結合性または非共有結合性の結合を意味する。本発明によれば、組換え微生物のような全細胞もまた、このような担体によって同様に固定化できる。未変異酵素と比較して低減した基質阻害は、特定の基質に対して未変異酵素により観察される基質阻害がもはや観察されないこと、すなわち実質的にもはや測定できないこと、または高い基質濃度、すなわち増大したKi値においてのみ起こることを意味する。コール酸化合物は、炭素骨格構造、特にコール酸のステロイド構造を有し、かつ環の位置7、ならびに任意に環の位置3および/または12に、ケトおよび/もしくはヒドロキシまたはアシルオキシ基が存在する、本発明による化合物を意味する。特別な型の化合物、例えばコール酸化合物またはウルソデオキシコール酸化合物は、特に基礎となる出発化合物例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸の誘導体も意味する。前記誘導体には塩、例えば化合物のリチウム、ナトリウム、およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩;ならびにアンモニウム塩が含まれ、ここでアンモニウム塩にはNH4塩または少なくとも1個の水素原子がC1-C6アルキル残基によって置換されていてもよいアンモニウム塩が含まれる。典型的なアルキル残基は特に、メチル、エチル、n-またはi-プロピル-、n-、sec-、またはtert-ブチルのようなC1-C4アルキル残基、およびn-ペンチルおよびn-ヘキシル、ならびにこれらの一回または複数回の分岐類似体である。本発明による化合物のアルキルエステルは、特に低級アルキルエステル、例えばC1-C6アルキルエステルである。限定されない例として、メチル、エチル、n-もしくはi-プロピル-、n-、sec-、もしくはtert-ブチルエステル、または長鎖エステル、例えばn-ペンチルおよびn-ヘキシルエステル、ならびにこれらの一回または複数回の分岐類似体を言及することができる。アミドは特に、本発明による酸と、アンモニアまたは一級もしくは二級モノアミンとの反応生成物である。このようなアミンは例えばモノ-もしくはジ-C1-C6アルキルモノアミンであり、ここでアルキル残基は任意に、互いに独立して、例えばカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン例えばF、Cl、Br、I、ニトロ、およびスルホン酸基によりさらに置換されてもよい。本発明によるアシル基は特に、2~4の炭素原子を有する非芳香族基、例えばアセチル、プロピオニル及びブチリル、ならびに任意に置換された単環式芳香族環を有する芳香族基であり、適する置換基は、例えばヒドロキシル、ハロゲン例えばF、Cl、Br、I、ニトロ及びC1-C6アルキル基、例えばベンゾイルまたはトルオイルから選択される。本発明にしたがって用いられるか又は調製されるヒドロキシステロイド化合物、例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、12-ケト-ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、および7-ケト-リトコール酸は、立体異性的に純粋な形態またはその他の立体異性体と混合した状態で、本発明による方法において用いるか、または該方法により得ることができる。しかしながら、使用または調製される化合物は、好ましくは立体異性的に実質的に純粋な形態で使用されるかまたは分離されるのがよい。構造式、化学名、および重要な化学化合物に用いた略語を以下の表に示す。2.タンパク質本発明は、具体的に開示した、7β-HSDH、FDH、GDH又は3α-HSDHの活性を有するタンパク質又は酵素、もしくはそれらの変異体に限定されるものではなく、むしろそれらの機能的均等物にも及ぶ。具体的に開示した酵素の機能的均等物または類似体は、本発明との関連において、それらとは異なるが、なお所望の生物活性、例えば7β-HSDH活性を有するポリペプチドである。例えば機能的均等物は、7β-HSDH、FDH、GDH、または3α-HSDHの活性について用いられる試験において、本明細書に定義するアミノ酸配列を含む出発酵素の活性の少なくとも1、例えば少なくとも10もしくは20、例えば少なくとも50もしくは75もしくは90高いかまたは低い活性を有する酵素として理解される。また、機能的均等物は、pH4~11の範囲で好ましく安定であり、pH6~10の範囲、例えば特にpH8.5~9.5のような範囲に最適pHを有し、15°C~80°C、または20°C~70°C、例えば約45~60°C、または約50~55°Cの範囲に最適温度を有するのがよい。7β-HSDHの活性は、公知の様々な試験を用いて検出できる。これに限定されるものではないが、本発明者らは、実験についての項で定義するような標準化された条件下で、参照基質、例えばCAまたはDHCAを用いる試験に言及することができる。FDH、GDH又は3α-HSDHの活性を決定するための試験もまた、それ自体が公知である。本発明の機能的均等物は特に、前述のアミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に、具体的に記載したアミノ酸を有する変異体であるが前述の生物活性の一つを有する変異体もまた意味する。従って機能的均等物には、1以上、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個又は15個のアミノ酸の付加、置換、欠失および/または逆位によって得られた変異体が含まれ、記載した変化はいずれの配列位置に起こってもよい。ただし、それらが本発明による性質を有する変異体を導くものに限る。機能的均等物は特に、変異体と未変異のポリペプチドとの間の反応性のパターンが定性的に一致する場合、即ち、例えば同一の基質が異なる速度で変換される場合にも得られる。適切なアミノ酸置換の例を以下の表に示す。上記の意味での機能的均等物はまた、記載するポリペプチドの前駆体ならびにポリペプチドの機能的誘導体および塩でもある。前駆体は、所望の生物活性を有しているか又は有していない、ポリペプチドの天然又は合成の前駆体である。塩という表現は、本発明によるタンパク質分子の、カルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知である様式において調製可能であり、これには無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛の塩、ならびに有機塩基、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン及びピペリジンなどのようなアミンの塩が含まれる。酸付加塩、例えば塩酸または硫酸のような無機酸による塩、ならびに酢酸およびシュウ酸のような有機酸による塩もまた、本発明の対象である。本発明によるポリペプチドの機能的誘導体もまた、公知の技術を用いて機能的アミノ酸の側鎖基上もしくはそれらのN末端又はC末端に調製することができる。このような誘導体には、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によって得られるカルボン酸基のアミド;アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のN-アシル誘導体;またはアシル基との反応によって調製される遊離水酸基のO-アシル誘導体が含まれる。もちろん機能的均等物には、その他の生物から得られるポリペプチド、および天然の変異体も含まれる。例えば配列比較によって相同配列領域を見出すことができ、本発明の具体的指示によって均等な酵素を決定できる。機能的均等物にはまた、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフであり、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明によるポリペプチドの断片も含まれる。また、機能的均等物は、前述のポリペプチド配列またはそれに由来する機能的均等物の一つ、および少なくとも一つのさらなる、それとは機能的に異なる、機能的N-またはC-末端結合における非相同性配列すなわち融合タンパク質部分に、互いに実質的な機能的障害のないを有する融合タンパク質である。前記非相同性配列の限定されない例として、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカー、または酵素が挙げられる。本発明による機能的均等物には、具体的に開示したタンパク質の相同体も含まれる。これらは、具体的に開示したアミノ酸配列の一つに対し、PearsonandLipmanProcNatlAcadSci85198824442448のアルゴリズムに従って算出された、少なくとも60、好ましくは少なくとも75、特に少なくとも85、例えば90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99の相同性または同一性を有する。本発明による相同ポリペプチドのパーセント相同性または同一性は、特に、本明細書に具体的に開示したアミノ酸配列の一つの全長に対するアミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。パーセント同一性の値は、BLASTアラインメント、blastpタンパク質-タンパク質BLASTアルゴリズムに基づき、または以下に述べるClustal設定を用いても決定できる。タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による機能的均等物には、上で指定した型のタンパク質の脱グリコシル化型またはグリコシル化型、およびグリコシル化のパターンを変化させることによって得られる改変型が含まれる。本発明によるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、例えば点突然変異、タンパク質の延長または短縮により変異を誘発して産生できる。本発明によるタンパク質の相同体は、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって同定できる。例えばタンパク質変異体の多様なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアルな変異誘発によって、例えば合成オリゴヌクレオチド混合物の酵素的な連結によって産生できる。縮重オリゴヌクレオチド配列に由来する、潜在的な相同体ライブラリーの調製に使用できる非常に多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成機を用いて行うことができ、合成遺伝子は次に、適切な発現ベクター内へ連結することができる。遺伝子の縮重セットを用いることによって、所望の潜在的タンパク質配列のセットをコードする全ての配列を、一混合物中に提供することが可能になる。縮合オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である例えばNarangSATetrahedron393ItakuraetalAnnuRevBiochem53323ItakuraetalScience1981056IkeetalNucleicAcidsRes11477。点突然変異または短縮によって産生されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された性質を有する遺伝子産物についてのcDNAライブラリーのスクリーニングのための幾つかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアルな変異誘発によって産生された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適用できる。ハイスループット分析に基づく大きな遺伝子バンクのスクリーニングに最もよく用いられる技術は、遺伝子バンクを複製可能な発現ベクター内にクローニングすること、得られたベクターバンクによって適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの分離が容易となる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。相同体を同定するため、バンク内の機能的変異体の頻度を増大させる技術であるRecursiveensemblemutagenesisREMが、スクリーニング試験と組み合わせて使用できるArkinandYourvanPNAS8978117815DelgraveetalProteinEngineering6327331。本発明はさらに、本明細書において明確に参照される、本出願者による以前の国際特許出願であるPCTEP2010068576号に記載されるように、コリンゼラアエロファシエンスATCC25986に由来する7β-HSDHの野生型の使用を含む。コリンゼラアエロファシエンスDSM3979から得られるこの7β-HSDHは特に、少なくとももう一つの以下の性質、例えばこのような性質のうちの2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つもしくはこのような性質の全てによって特徴付けられる:a分子量SDSゲル電気泳動:約28~32kDa、特に約29~31kDaまたは約30kDa;b分子量ゲル濾過、特にSDSを含まないような未変性条件:約53~60kDa、特に約55~57kDa、例えば56.1kDa。これにより、コリンゼラアエロファシエンスDSM3979由来の7β-HSDHの二量体の性質が証明される;c7-ケト-LCAの7-カルボニル基を7β-水酸基とする立体選択的な還元;dpH8.5~10.5、特にpH9~10の範囲での、UDCAの酸化のための最適pH;epH3.5~6.5、特にpH4~6の範囲での、DHCAおよび7-ケト-LCAの還元のための最適pH;f以下の表に示す少なくとも1つの基質/補因子に対する、以下の表の少なくとも1つの動的パラメータが;以下の表のそれぞれの場合において具体的に示す値の±20の範囲、特に±10、±5、±3、±2、または±1付近にあること。gモルモットCaviaporcellus、ヒトHomosapiens、およびマウスMusmusculusを含む動物11β-HSDHの亜群に関連する、コリンゼラアエロファシエンスDSM3979由来の、原核生物の7β-HSDHの系統学的な配列類似性。例えば、この7β-HSDHは以下の性質または性質の組合せを示す:a;b;a及びb;a及び/又はb及びc;a及び/又はb及びc及びd;a及び/又はb及びc及びd及びe;a及び/又はb及びc及びd及びe及びfを示す。この種類の7β-HSDH又はそれに由来する機能的均等物はさらに、a7-ケトステロイドを対応する7β-ヒドロキシステロイドへと立体特異的に還元すること、及び/又はbステロイド骨格上の7位のケト基および少なくとも1つのさらなるケト基を含むケトステロイドを対応する7β-ヒドロキシステロイドへと部位特異的にヒドロキシル化すること、例えば特に7位のデヒドロコール酸DHCAにより、対応する3,12-ジケト-7β-コラン酸へ触媒され、かつ、例えばこれはNADPH依存性であることによって特徴付けられる。前記7β-HSDHは特に、配列番号2寄託番号:ZP_01773061によるアミノ酸配列を有するか、又はこれに由来し且つこの配列に対して少なくとも60、例えば少なくとも65、70、75、80、85、または90、例えば少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または99.5の同一性の程度を有する配列を有し;任意に以下の性質の1つまたは性質の組合せ:上記の定義に従ったa;b;a及びb;a及び/又はb及びc;a及び/又はb及びc及びd;a及び/又はb及びc及びd及びe;a及び/又はb及びc及びd及びe及びfによってさらに特徴付けられる。3.核酸および構築物3.1核酸本発明はまた、7β-HSDH、FDH、GDHおよび/または3α-HSDH活性を有する酵素およびその変異体をコードする核酸配列にも関する。本発明はまた、本明細書に具体的に記載する配列に対し、特定の程度の同一性を有する核酸にも関する。二つの核酸間の同一性は、それぞれの場合における核酸の全長に対するヌクレオチドの同一性、特にClustal法を用いるInformax社USAのVectorNTISuite7.1ソフトウェアHigginsDGSharpPMFastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputerComputApplBiosci1989Apr51511により、以下のパラメータを設定して比較により算出した同一性を意味する。あるいは、同一性は以下のパラメータにより、ChennaRamuSugawaraHideakiKoikeTadashiLopezRodrigoGibsonTobyJHigginsDesmondGThompsonJulieDMultiplesequencealignmentwiththeClustalseriesofprogramsNucleicAcidsRes313497500に従い、インターネットアドレス:httpwwwebiacukToolsclustalwindexhtmlに従って決定することもできる。本明細書で言及した全ての核酸配列一本鎖および二本鎖のDNAならびにRNA配列、例えばcDNAおよびmRNAは、ヌクレオチド構成要素からの化学合成により、例えば個々の重複である、二重らせんの相補的な核酸構成要素のフラグメント縮合により、それ自体が公知である方法で産生できる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホラミダイト法による公知の方法で実行できるVoetVoet2ndeditionWileyPressNewYorkpages896897。合成オリゴヌクレオチドの付加、DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いたギャップの充填、連結反応、および一般的なクローニング技術については、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPressに記載されている。本発明はまた、上記ポリペプチドの一つおよびその機能的均等物をコードする核酸配列一本鎖および二本鎖のDNAならびにRNA配列、例えばcDNAおよびmRNAにも関し、これらは例えば人工のヌクレオチド類似体を用いて入手可能である。本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物学的に活性のある部分をコードする単離された核酸分子、および例えば本発明によるコード核酸の同定もしくは増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用できる核酸断片の両方に関する。本発明による核酸分子は、コード遺伝子領域の3’末端及び/又は5’末端の非翻訳配列をさらに含んでもよい。本発明は、具体的に記載するヌクレオチド配列またはその一部に相補的な核酸分子をさらに含む。本発明によるヌクレオチド配列は、その他の細胞型および生物における相同配列の同定及び/又はクローニングに使用できるプローブおよびプライマーの産生を可能にする。これらのプローブまたはプライマーはしばしばストリンジェントな条件下で以下を参照、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50、または75の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。単離された核酸分子は、核酸の天然源に存在するその他の核酸分子から分離されており、さらにそれが組換え技術によって産生される場合には、その他の細胞性物質または培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には、化学物質前駆体またはその他の化学物質を含まない。本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技術および本発明により提供される配列情報を用いて単離できる。例えばcDNAは、具体的に開示する完全配列またはその部分の一つをハイブリダイゼーションプローブとして用い、標準的なハイブリダイゼーション技術例えばSambrookJFritschEFandManiatisTMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989に記載されるようなによって適切なcDNAライブラリーから単離できる。さらに、開示する配列またはその部分の一つを含む核酸分子は、この配列に基づいて準備したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。このように増幅した核酸は、適切なベクター内へクローン化することができ、DNA配列解析によって特徴付けることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機を用いた標準的な合成技術によっても産生できる。本発明による核酸配列またはその誘導体、相同体またはこれらの配列の一部は、例えば通常のハイブリダイゼーション法またはPCR技術によって、その他の細菌から、例えばゲノムまたはcDNAライブラリーを通して単離できる。これらのDNA配列は、標準的な条件下で本発明による配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、標準的な条件下でほとんど相補的な配列に結合する能力を意味するが、これらの条件下では非相補的な相手との間で非特異的な結合は起こらない。このため、90~100相補的であってよい。相補的な配列が互いに特異的に結合する性質は、例えばノーザンもしくはサザンブロットにおいて、またはPCRもしくはRT-PCRにおけるプライマー結合において利用される。ハイブリダイゼーションには、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に用いられる。しかしながらハイブリダイゼーションには、本発明による核酸の長めの断片または完全配列を用いることもまた可能である。これらの標準的な条件は、使用する核酸オリゴヌクレオチド、長めの断片または完全配列に依存して、またはどのような型の核酸、DNAもしくはRNA、がハイブリダイゼーションに用いられるかに依存して異なる。従って例えば、DNA:DNAハイブリッドの融点は、同一の長さのDNA:RNAハイブリッドのそれよりもおおよそ10°C低い。標準的な条件は、例えば核酸に依存して、0.1~5×SSC1×SSC=0.15MNaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2濃度の緩衝水溶液中で42~58°Cの温度、またはさらに、50ホルムアミドの存在下で、例えば5×SSC、50ホルムアミドにおいて42°Cを意味する。有利には、DNA:DNAハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよび約20°C~45°Cの温度、好ましくは約30°C~45°Cである。DNA:RNAハイブリッドに対して、有利なハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよび約30°C~55°Cの温度、好ましくは約45°C~55°Cである。ハイブリダイゼーションに対して記載したこれらの温度は、例えばホルムアミドの非存在下で、おおよそ100ヌクレオチドの長さの核酸、および50のGC含量を有する核酸について算出した融点の値である。DNAハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrooketalMolecularCloningColdSpringHarborLaboratory1989に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの型、またはGC含量に依存して当業者に公知の式から算出できる。当業者は、ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を以下の教科書に見出すことができる:Ausubeletal1985CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNewYorkHamesandHiggins1985NucleicAcidsHybridizationAPracticalApproachIRLPressatOxfordUniversityPressOxfordBrown1991EssentialMolecularBiologyAPracticalApproachIRLPressatOxfordUniversityPressOxford。ハイブリダイゼーションは特に、ストリンジェントな条件下で起こる。これらのハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrookJFritschEFManiatisTinMolecularCloning2ndeditionColdSpringHarborLaboratoryPress1989pages931957、またはCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNY631636に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は特に、50ホルムアミド、5×SSC750mMNaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、50mMリン酸ナトリウムpH7.6、5×Denhardt溶液、10デキストラン硫酸、および20g/mlの変性および切断したサケ精子DNAからなる溶液中での、42°Cにおける一晩のインキュベーションと、それに続く0.1×SSCを用いた65°Cにおける膜洗浄工程として理解される。本発明はまた、具体的に開示したかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。よって、本発明のさらなる核酸配列は、例えば配列番号1、5、7、14、19、34、または47由来であるのがよく、かつ単一もしくは幾つかのヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失によってそれとは異なるが、所望の性質を有するポリペプチドをさらにコードする。本発明は、いわゆるサイレント変異を含むか、または特別な独自の、もしくは宿主生物のコドン使用に対応し、具体的に開示した配列と比較して変化した核酸配列、および天然の変異体、例えばそれらのスプライス変異体または対立遺伝子変異体もまた網羅する。本発明はまた、保存されたヌクレオチド置換すなわち問題のアミノ酸が、同じ電荷、大きさ、極性および/または溶解度のアミノ酸によって置き換えられるによって得られる配列にも関する。本発明はまた、具体的に開示する核酸の配列多型に由来する分子にも関する。これらの遺伝的多型性は、自然変動による集団内の個体間に存在し得る。これらの自然変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列内に1~5の変動をもたらす。配列番号1、5、7、14、19、34又は47を有する、本発明の核酸配列の誘導体は、例えば全配列領域に対し、由来するアミノ酸レベルで少なくとも60の相同性、好ましくは少なくとも80の相同性、特に好ましくは少なくとも90の相同性を有する対立遺伝子変異体を意味するアミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについての上記情報を参照のこと。相同性は、配列の一部領域において高くなってもよい。さらに、誘導体は、本発明の核酸配列、特に配列番号1、5、7、14、19、34又は47の相同体、例えば真菌または細菌相同体、短縮配列、コードおよび非コードDNA配列の一本鎖DNAまたはRNAとしても理解される。例えば配列番号1、5、7、14、19、34又は47に対する相同体は、配列番号1、5、7、14、19、34又は47に示される全DNA領域に対して、DNAレベルで少なくとも40、好ましくは少なくとも60、特に好ましくは少なくとも70、さらに特に好ましくは少なくとも80の相同性を有する。また、誘導体は、例えばプロモーターとの融合物として理解される。記載するヌクレオチド配列の前に存在するプロモーターは、少なくとも1つのヌクレオチド交換、少なくとも1つの挿入、逆位および/または欠失により、プロモーターの機能性または有効性を損なうことなく変化してもよい。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を変化させることで増大可能であるか、または例え異なる種の生物のものであっても、さらに有効なプロモーターと完全に交換してもよい。さらに、機能的変異体の産生方法が当業者に公知である。使用した技術により、当業者は、完全にランダムであるかまたは標的化された変異を遺伝子内または非コード核酸領域これらは例えば発現調節に重要であるにも挿入して、遺伝子バンクを準備する。これに必要とされる分子生物学の方法は当業者に公知であり、例えばSambrookandRussellMolecularCloning3rdeditionColdSpringHarborLaboratoryPress2001に記載されている。遺伝子を改変するため、およびそれ故に、その遺伝子がコードするタンパク質を改変するための方法は当業者に長く親しまれており、例えば、-遺伝子の単一または幾つかのヌクレオチドに標的化した交換をもたらす部位特異的変異誘発TrowerMK1996InvitromutagenesisprotocolsHumanaPressNewJersey、-遺伝子のいずれかの部位で、いずれかのアミノ酸のコドンが交換または付加され得る飽和変異誘発KeglerEboDMDocktorCMDiMaioDNucleicAcidsRes221593BarettinoDFeigenbutzMValcarelRStunnenbergHGNucleicAcidsRes22541BarikSMolBiotechnol31、-不正確に機能するDNAポリメラーゼによってヌクレオチド配列が変異する、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応エラープローンPCREckertKAKunkelTANucleicAcidsRes183739;-例えばDNA修復機構の欠陥のため、ヌクレオチド配列の変異率が増大している変異誘発株における、遺伝子の継代GreenerACallahanMJerpsethBAnefficientrandommutagenesistechniqueusinganEcolimutatorstrainInTrowerMKInvitromutagenesisprotocolsHumanaPressNewJersey、または-密接に関連した遺伝子のプールを形成し、これを消化して断片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用い、鎖の分離と再度の結合を繰り返すことにより、最終的に完全長のモザイク遺伝子を産生するDNAシャッフリングStemmerWPCNature370389StemmerWPCProcNatlAcadSciUSA9110747のようなものがある。いわゆる進化分子工学とりわけ、ReetzMTandJaegerKETopicsCurrChem20031ZhaoHMooreJCVolkovAAArnoldFHMethodsforoptimizingindustrialenzymesbydirectedevolutionInDemainALDaviesJEManualofindustrialmicrobiologyandbiotechnologyAmericanSocietyforMicrobiologyに記載されるを用い、当業者は標的化された様式において機能的変異体を大量に産生できる。第1の工程では最初に、例えば上記の方法を用いてそれぞれのタンパク質の遺伝子バンクを産生する。遺伝子バンクは適切な方法で、例えば細菌によって、またはファージディスプレイによって発現される。所望の性質に大きく一致する性質を有する機能的変異体を発現する宿主生物の関連する遺伝子は、変異の別のラウンドへ供することができる。変異の工程および選択またはスクリーニングは、存在する機能的変異体が所望の性質を十分な程度有するまで反復できる。この反復される手順により、工程において限られた数の変異、例えば1~5の変異を実施でき、かつ関連する酵素の性質におけるそれらの影響について評価、選択が為される。選択した変異体は次に同様の別の変異工程に供してよい。結果として、検討するべき個々の変異体の数を著しく減少させることができる。本発明による結果は、問題となる酵素の構造および配列についての重要な情報を提供するが、これは所望の改変された性質を有するさらなる酵素の標的化された生成に必要なものである。特に、いわゆるホットスポットはすなわち標的化された変異の導入によって酵素の性質を改変するために適する可能性のある配列部分として定義できる。3.2構築物本発明はさらに、調節性核酸配列の遺伝的制御の下に、本発明の少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構築物;および少なくとも1つのこれらの発現構築物を含むベクターに関する。本発明による発現ユニットは、本明細書に定義するように、プロモーターを含む、発現活性を有する核酸を意味し、これは発現される核酸または遺伝子との機能的結合の後、発現、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節する。従ってこれに関連して調節性核酸配列との用語も用いられる。プロモーターに加え、その他の調節性エレメント、例えばエンハンサーも存在してよい。本発明による発現カセットまたは発現構築物は、発現される核酸または発現される遺伝子に機能的に結合した発現ユニットを意味する。発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列のみではなく、転写および翻訳の結果、タンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。本発明に関連する用語発現または過剰発現は、対応するDNAによってコードされる、微生物内での1以上の酵素の細胞内活性の発生または増大を表す。このために、例えば遺伝子を生物に挿入し、存在する遺伝子を別の遺伝子によって置換し、単数または複数の遺伝子のコピー数を増加させ、強力なプロモーターを使用するか、または高い活性をもつ対応する酵素をコードする遺伝子を使用し、かつこれらの方法を任意に組み合わせることができる。好ましくは、本発明による前記構築物はそれぞれのコード配列の5’上流にプロモーター、および3’下流にターミネーターの配列を含み、任意に通常の調節性エレメントをさらに含み、それぞれの場合にこれらはコード配列に作動的に結合している。本発明によるプロモーター、プロモーター活性を有する核酸またはプロモーター配列は、転写される核酸に機能的に結合し、前記核酸の転写を調節する核酸を意味する。これとの関連において、機能的または作動的結合は、例えばプロモーター活性を有する一つの核酸及び転写される核酸配列及び任意であるさらなる調節性エレメント、例えば核酸の転写を確実にする核酸配列、並びに例えばターミネーターを、各調節性エレメントが核酸配列の転写においてその機能を果たすことができるような方法で連続的に配置することを意味する。これは、化学的な意味での直接結合は必要とされない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列は、標的配列におけるそれらの機能を、さらに離れた位置から、またはその他のDNA分子からであっても発現できる。配置は、二つの配列が共有結合的に連結されるように、転写される核酸配列がプロモーター配列の後に例えば3’末端に位置することが好ましい。プロモーター配列と導入遺伝子の発現を起こす核酸配列との間の距離は、200塩基対未満、または100塩基対未満、または50塩基対未満であってよい。プロモーターおよびターミネーターに加え、言及してもよいその他の調節性エレメントの例として、標的指向化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択性マーカー、増幅シグナル、複製開始点などが挙げられる。適切な調節性配列は、例えばGoeddelGeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185AcademicPressSanDiegoCAに記載されている。本発明の核酸構築物は、特に配列番号1、5、7、14、19、34又は47、もしくはそれらの誘導体および相同体の配列、ならびにそれらに由来し得る核酸配列を含み、これらは、遺伝子発現を制御、例えば増大させるための調節性シグナルの1以上と作動的または機能的に結合してもよい。これらの調節性配列に加え、これらの配列の天然の調節がなお実際の構造遺伝子の前に存在し、この天然の調節をオフにして遺伝子の発現が増大するように、任意に遺伝的に改変することができる。しかしながら、核酸構築物はさらに単純に構築してもよく、すなわち追加の調節性シグナルをコード配列の前に挿入せず、天然プロモーターとその調節を除去しなくてもよい。代わりに、調節性配列は、調節がもはや起こらず、遺伝子発現が増大するように変異させられる。好ましい核酸構築物はまた、プロモーターに機能的に連結した、前述のエンハンサー配列を1つ以上有するのがよく、これによって核酸配列の発現の増大が可能になる。さらなる調節性エレメントまたはターミネーターのようなさらなる有利な配列もまた、DNA配列の3’末端に挿入できる。構築物は、本発明の核酸を1コピー以上含んでもよい。構築物はまた、任意に構築物を選択するための、抗生物質耐性または栄養要求性の補完遺伝子のようなマーカーをさらに含んでもよい。適切な調節性配列の例は、グラム陰性菌への応用に有利であることが見出された、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaPrhaPBADSP6、ラムダ-PRのようなプロモーター、またはラムダ-PLプロモーター内に含まれる。さらなる有利な調節性配列が、例えばグラム陽性菌プロモーターであるamyおよびSPO2、酵母または真菌プロモーターであるADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH内に含まれる。人工プロモーターもまた調節のために用いられてよい。宿主生物内での発現のため、核酸構築物は、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にするベクター、例えばプラスミドまたはファージ内へ挿入されるのがよい。プラスミドおよびファージとは別に、ベクターは、当業者に公知のその他の全てのベクター、例えばSV40、CMV、バキュロウイルス、およびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、および線状または環状DNAとしても理解される。これらのベクターは、宿主生物内で自律的に複製できるか、または染色体において複製できる。これらのベクターは本発明の別の構成を表す。適切なプラスミドは、例えばE.coliにおけるpLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、もしくはpBdCI、ストレプトマイセスにおけるpIJ101、pIJ364、pIJ702、もしくはpIJ361、バチルスにおけるpUB110、pC194、もしくはpBD214、コリネバクテリウムにおけるpSA77、もしくはpAJ667、真菌におけるpALS1、pIL2、もしくはpBB116、酵母における2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13、もしくはpEMBLYe23、または植物におけるpLGV23、pGHlac、pBIN19、pAK2004、もしくはpDH51である。前述のプラスミドは、可能性のあるプラスミドのうちの少数の選択を示している。さらなるプラスミドは当業者に公知であり、例えば書籍、CloningVectorseds.PouwelsP.H.etal.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444904018に見出すことができる。ベクターの別の構成によれば、本発明の核酸構築物又は本発明の核酸を含むベクターもまた、線状DNAの形態で微生物内へ挿入できるのがよく、非相同性または相同性組換えによって、宿主生物のゲノム内へ組み込むことができる。線状DNAは、線状にしたプラスミドのようなベクターから、または本発明による核酸構築物もしくは核酸のみからなってよい。生物における異種性遺伝子の最適な発現のため、該生物で用いられる特定のコドン使用に従って核酸配列を改変するのがよい。コドン使用は、問題となる生物のその他の既知遺伝子についてのコンピュータ計算に基づいて容易に決定できる。本発明の発現カセットは、適切なプロモーターと適切なコードヌクレオチド配列を、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルと融合させることで調製できる。このためには、例えばTManiatisEFFritschandJSambrookMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY及びTJSilhavyMLBermanandLWEnquistExperimentswithGeneFusionsColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborNY及びAusubelFMetalCurrentProtocolsinMolecularBiologyGreenePublishingAssocandWileyInterscienceに記載されるような通常の組換えおよびクローニング技術が用いられる。適切な宿主生物内での発現のため、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的なベクター内へ挿入されるのがよい。ベクターは当業者に公知であり、例えばCloningVectorsPouwelsPHetalPublElsevierAmsterdamNewYorkOxford1985に見出すことができる。4.微生物状況に応じ、用語微生物は出発野生型微生物、遺伝的に改変した組換え微生物、または両方を意味する。本発明によるベクターを用いて組換え微生物を産生することができ、該微生物は、例えば本発明のベクターの少なくとも1つによって形質転換され、本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる。上記の本発明による組換え構築物は、適切な宿主系に導入されて発現されるのがよい。好ましくは、当業者に公知のクローニング及びトランスフェクションの方法、例えば共沈殿、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いて、それぞれの発現系において記載される核酸の発現をもたらす。適切な系は、例えばCurrentProtocolsinMolecularBiologyFAusubeletalPublWileyInterscienceNewYork1997、またはSambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989に記載されている。タンパク質の異種性発現のための、細菌発現系についての総説もまた、例えばTerpeKApplMicrobiolBiotechnol72211222に提供される。原則として、全ての原核生物または真核生物の生物が、本発明の核酸又は核酸構築物のための組換え宿主生物として考慮することができる。細菌、真菌又は酵母などの微生物を宿主生物として用いるのがよい。グラム陽性菌またはグラム陰性菌を用いるのがよく、好ましくは腸内細菌科、シュードモナスPseudomonaceae科、リゾビウムRhizobiaceae科、ストレプトマイセスStreptomycetaceae科、又はノカルジアNocardiaceae科の細菌、特に好ましくはエシェリキアEscherichia、シュードモナスPseudomonas、ストレプトマイセスStreptomyces、ノカルジアNocardia、バークホルデリアBurkholderia、サルモネラSalmonella、アグロバクテリウムAgrobacterium、クロストリジウムClostridium、又はロドコッカスRhodococcus属の細菌を用いるのがよい。大腸菌の属および種が非常に好ましい。さらなる有利な細菌は、アルファプロテオバクテリアalphaproteobacteria、ベータプロテオバクテリアbetaproteobacteria、又はガンマプロテオバクテリアgammaproteobacteriaの群に見出すことができる。本発明の単数または複数の宿主生物は、上記の定義に従って7β-HSDH活性を有する酵素をコードする、本発明に記載の核酸配列、核酸構築物、またはベクターの少なくとも一つを好ましく含む。本発明の方法で用いられる生物は、宿主生物により、当業者に公知の方法で増殖または培養される。微生物は、原則として一般に糖の形態である炭素源、一般に酵母抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形態である窒素源、鉄、マンガン、マグネシウム塩のような微量元素、および任意にビタミンを含む液体培地中で、0°C~100°Cの温度、好ましくは10°C~60°Cにて、酸素通気により増殖する。液体栄養培地のpHは固定値に維持してよい。即ち増殖の間に調節してもしなくてもよい。培養はバッチ式、半バッチ式、または連続して行う。栄養素は発酵開始時に供給するか、または半連続的もしくは連続的に補充してよい。5.UDCAの調製工程1:CAからDHCAへの化学反応CAの水酸基を、クロム酸または酸性溶液例えばH2SO4中のクロム酸塩によって、古典的化学経路によりそれ自体が公知の方法でカルボニル基へと酸化させる。DHCAを形成する。工程2:DHCAから12-ケト-UDCAへの酵素的または微生物的変換水溶液中で、DHCAを、3α-HSDHおよび7β-HSDHまたはその変異体により、NADPHまたはNADHの存在下で特異的に12-ケト-UDCAへと還元する。補因子NADPHまたはNADHは、ADHまたはFDHまたはGDHまたはそれらの変異体によって、イソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースから再生できる。反応は穏和な条件下で進行する。例えば、反応はpH=6~9、特に約pH=8、および約10~30°C、15~25°C、または約23°Cにて行ってよい。微生物的反応工程の場合、必要な一つまたは二つ以上の酵素活性を発現する組換え微生物を、変換される基質DHCAの存在下で、嫌気的又は好気的に適切な液体培地中で培養することができる。適切な培養条件は、それ自体が当業者に公知である。これらは例えばpH5~10又は6~9の範囲、10~60°C又は15~45°C又は25~40°Cの温度範囲又は37°Cにおける反応を含む。適切な培地は例えば以下に記載するLBおよびTB培地を含む。反応は、例えばバッチ式もしくは連続式またはその他の通常の方法の変異形上記のようなで生じさせることができる。反応時間は例えば数分~数時間または数日の範囲で起こってよく、例えば1時間~48時間であってよい。酵素活性が連続的に発現しない場合、標的細胞密度が例えば約OD600=0.5~1.0に達した後、任意に、適切な誘導物質を添加することによってこれを誘導することができる。発酵方法、培地への添加、酵素の固定化、および有用な物質の分離に関する微生物的産生方法の可能なさらなる適切な改変は、酵素または変異体の産生に関する以下の項にも見出すことができる。工程3:12-ケト-UDCAからUDCAへの化学変換12-ケト-UDCAの12-カルボニル基を、それ自体が公知である方法でヴォルフ-キシュナー還元により除去し、12-ケト-UDCAからUDCAを形成する。反応では、最初にカルボニル基とヒドラジンが反応してヒドラゾンとなる。次にヒドラゾンを塩基例えばKOHの存在下で200°Cに熱し、窒素の開裂によりUDCAを形成する。6.酵素および変異体の組換え産生本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは機能的で生物学的に活性のあるその断片の組換え産生方法に関し、ポリペプチドを産生する微生物が培養され、任意にポリペプチドの発現が誘導され、培養から後者が分離される。ポリペプチドは所望により、この方法によって工業的規模でも産生できる。本発明により産生した微生物は、連続的にもしくはバッチ法バッチ培養において非連続的に、または流加もしくは反復流加法において培養できる。公知の培養法についての総説は、Chmielの教科書Bioprozestechnik1EinfuhrungindieBioverfahrenstechnikBioprocesstechnology1Introductiontobioprocessengineering又はStorhasによる教科書BioreaktorenundperiphereEinrichtungenBioreactorsandperipheralequipmentによる冊子ManualofMethodsforGeneralBacteriologyに見出される。本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常1以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび/または微量元素を含む。好ましい炭素源は、単糖類、二糖類、または多糖類のような糖類である。非常に良好な炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースである。糖はまた、糖蜜、または製糖過程におけるその他の副生成物のような複合化合物を通して培地に添加してもよい。様々な炭素源の混合物を加えることも有利であり得る。可能なその他の炭素源は、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂ならびに脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸のような脂肪酸、グリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコール、および酢酸または乳酸のような有機酸である。窒素源は通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例として、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、もしくは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などのような複合窒素源が挙げられる。窒素源は個別に、または混合物として用いてよい。培地中に含まれてもよい無機塩化合物として、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が挙げられる。使用される硫黄源は、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物のような無機硫黄化合物であってよいが、メルカプタンおよびチオールのような有機硫黄化合物であってもよい。使用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩であってよい。金属イオンを溶液中に保持するため、培地にキレート剤を添加してよい。特に適切なキレート剤は、カテコールもしくはプロトカテク酸のようなジヒドロキシフェノール類、またはクエン酸のような有機酸を含む。本発明に従って用いる発酵培地は通常、ビタミン、または例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンを含む増殖促進物質のようなその他の増殖因子も含む。増殖因子および塩は、しばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどのような培地の複合成分に由来する。さらに、培地には適切な前駆体も添加できる。培地中の化合物の的確な組成物は特定の実験に強く依存し、それぞれの特定の事例に対して個別に決定される。培地の最適化についての情報は、教科書AppliedMicrobiolPhysiologyAPracticalApproachPublPMRhodesPFStanburyIRLPressp5373ISBN0199635773に見出すことができる。増殖培地は、スタンダード1MerckまたはBHIブレインハートインフュージョン、DIFCOなどのように、市販業者からも入手可能である。培地の全ての成分は、熱1.5バール、121°Cにて20分によるか、または無菌濾過によって滅菌される。成分は必要に応じて、共に、または別々に滅菌してよい。培地の全ての成分は、培養開始時に含まれていてよいか、または連続式もしくはバッチ式により任意に添加されてもよい。培養温度は通常15°C~45°C、好ましくは25°C~40°Cであり、実験の間、一定に保つか、または変化させてもよい。培地のpHは5~8.5の範囲、好ましくは7.0付近でなければならない。培養pHは、培養の間に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水のような塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸のような酸性化合物を添加することによって制御できる。発泡を制御するため、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤の使用が可能である。プラスミドの安定性を維持するため、抗生物質のような適切な選択的作用物質を培地に添加してよい。好気性の状態を維持するため、酸素または外気のような酸素を含むガス混合物が培養中に供給される。培養温度は通常20°C~45°Cである。培養は所望の産物が最大に形成されるまで継続される。この目標は通常10時間~160時間以内に達成される。発酵ブロスはその後さらに処理される。必要に応じ、バイオマスは遠心分離、濾過、デカント、もしくはそれらの方法の組合せのような分離技術によって発酵ブロスから完全にもしくは部分的に除去されるか、または完全に残してもよい。ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、細胞を破砕し、タンパク質分離の既知の方法によってライセートから産物を得ることもできる。細胞は、高周波数超音波により、高圧により、例えばフレンチプレス内で、オスモリシスosmolysisによって、界面活性剤、溶菌酵素、もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーを用いて、またはここに挙げた方法の幾つかの併用によって任意に破砕できる。ポリペプチドは、Q-セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィーゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィー法、ならびに限外濾過、結晶化、塩析、透析、および非変性ゲル電気泳動のようなその他の通常の方法によって精製できる。適切な方法は、例えばCooperFGBiochemischeArbeitsmethodenMethodsofBiochemicalProcessingVerlagWalterdeGruyterBerlinNewYork又はScopesRProteinPurificationSpringerVerlagNewYorkHeidelbergBerlinに記載される。組換えタンパク質を分離するため、規定のヌクレオチド配列を有するcDNAを延長することで、例えばより簡便な精製に役立つ改変したポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを用いるのがよい。この種の改変は、例えばアンカーとして機能するいわゆるタグ、例えばヘキサヒスチジンアンカー、または抗体により抗原として認識可能なエピトープとして知られる改変である例えばHarlowEandLaneD1988AntibodiesALaboratoryManualColdSpringHarborPressに記載される。これらのアンカーは、固体担体、例えばクロマトグラフィーカラムに充填可能であるか、またはマイクロタイタープレート上もしくはその他の担体上で使用できるポリマーマトリックスにタンパク質を付着させるために役立つ。同時に、これらのアンカーはタンパク質の認識のためにも用いることができる。タンパク質の認識のために、蛍光色素のような通常のマーカーに加え、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが、単独またはタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組合せて使用することができる。7.酵素の固定化本明細書に記載する方法において、本発明の酵素は、遊離で、または固定化して用いることができる。固定化酵素は、不活性の支持体に固定された酵素として理解される。適切な支持体材料およびその上への酵素の固定化は、EPA1149849号、EPA1069183号、およびDEOS100193773号、ならびにそれらに引用される参考文献から公知である。これに関しては、これらの文献の開示全体が参照される。適切な支持体材料として、例えば粘土、カオリナイトのような粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換材料、ポリスチレンのような合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール-ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポリエチレンおよびポリプロピレンのようなポリオレフィンが挙げられる。支持された酵素の調製のため、支持体材料は通常微粉化した粒子状の形態で用いられ、多孔性の形態を有することが好ましい。支持体材料の粒径は通常5mm以下、特に2mm以下である粒径分布曲線。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを用いる場合にも、遊離型または固定化型を選択できる。支持体材料は、例えばアルギン酸カルシウム、およびカラギーナンである。酵素および細胞は、グルタルアルデヒドにより直接架橋することもできるCLEAへの架橋。対応するさらなる固定化方法は、例えばJLalondeandAMargolinImmobilizationofEnzymes及びKDrauzandHWaldmannEnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002VolIII9911032WileyVCHWeinheimに記載される。実験についての項特記しない限り、本発明との関連において行われるクローニング工程、例えば制限酵素による切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへの核酸の転写、DNA断片の連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖、および組換えDNAの配列分析は、Sambrooketalopcitに記載されるように行われる。A.一般情報材料:コリンゼラアエロファシエンスDSM3979ATCC25986、以前の命名はユーバクテリウム-アエロファシエンスのゲノムDNAは、ドイツ微生物培養細胞コレクションGermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures:DSMZから入手した。UDCAおよび7-ケト-LCAはそれ自体が公知の出発化合物であり、文献に記載されている。その他の全ての化学物質は、Sigma-AldrichおよびFlukaドイツから入手した。全ての制限エンドヌクレアーゼ、T4DNAリガーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、PhusionDNAポリメラーゼ、およびイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGはFermentasドイツから入手した。培地:培地1リットルあたりトリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl10gを含むLB培地。培地1リットルあたりトリプトン12g、酵母抽出物24g、4mLグリセロール、10TB緩衝液11.55gKH2PO4、62.7gK2HPO4、H2Oにより全量500mLへを含むTB培地。WilmsetalBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING2001VOL73No295103に従って改変した最少培地。発現ベクターおよびベクター構築物組換えタンパク質の発現のため、公知である以下の発現ベクターを用いた:pET21a図3aを参照pET22b図3bを参照pET28a図3dを参照およびpCOLADuet-1それぞれNovagen、マディソン、ウィスコンシン州、米国。ベクターpET21aおよびpET22bはそれぞれマルチプルクローニング部位MCSを有し、各々の場合にT7-プロモーターの制御下で、下流にlac-オペレーターとそれに続くリボソーム結合部位rbsを有する。各々の場合に、発現ドメインのC-末端領域にT7-ターミネーターを有する。両プラスミドは、ColE1-レプリコンpBR322-レプリコン、アンピシリン耐性遺伝子bla、f1-複製開始点、及びlac-インヒビターlacIをコードする遺伝子を有する。また、pET21aプラスミドは、MCSのN-末端領域にT7タグを有し、MCSのC-末端に任意にHisタグを有する。pET22bプラスミドは、MCSのN-末端領域にpelBシグナル配列を有し、MCSのC-末端にHisタグを有する。pCOLADuet-1ベクターは二つのMCSを有し、それぞれがT7-プロモーターの制御下で、下流にlac-オペレーターとそれに続くリボソーム結合部位rbsを有する。二つのMCSのC-末端にはT7-ターミネーターが存在する。さらにこのベクターは、lac-インヒビターをコードする遺伝子およびCOLA-レプリコンColA-レプリコンを有する。本研究では、市販のpCOLADuet-1ベクターを改変した変異体を用いた。この改変プラスミド変異体pCOLAmodと命名;図3cを参照では、元のベクターのカナマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子により置換した。加えて、部位特異的点突然変異誘発によってクロラムフェニコール耐性遺伝子からNcoI制限酵素部位を除去した。第1のMCSのN末端領域にはHisタグが存在するが、第2のMCSのC-末端にはSタグが存在する。pET-プラスミドのColE1-レプリコンとpCOLA-プラスミドのCOLA-レプリコンとは互換性がある。これにより、大腸菌へのpET-プラスミドおよびpCOLA-プラスミドの安定的な挿入を同時に行うことができる。この方法により、様々な遺伝子の組み合わせを、それらが同一のオペロンに位置することなく大腸菌内にクローン化できる。pET-ベクター~40とpCOLA-ベクター20~40のコピー数の相違のため、同時形質転換に用いた遺伝子の発現レベルに影響を与える可能性が高い。以下のベクター構築物を使用した。pET22b7β-HSDH:pET22bベクター内に、コリンゼラアエロファシエンスATCC25986由来の7β-HSDHを、NdeIおよびHindIII切断部位を通して通常の方法によりクローン化した。pET22b3α-HSDH:pET22bベクター内に、コマモナステストステローニ由来の3α-HSDHを、NdeIおよびEcoRI切断部位を通して通常の方法によりクローン化したOppermannetalJBiochem1996241744749。pET21aFDHD221G図4aを参照:pET21aベクター内に、マイコバクテリウム-バッカエN10由来のギ酸デヒドロゲナーゼを、NdeIおよびEcoRI切断部位を通してクローン化した。部位特異的変異誘発により、ギ酸デヒドロゲナーゼの位置221位置1のメチオニンは考慮しない、すなわち位置222位置1のメチオニンから数える;配列番号15、19、35のアスパラギン酸残基Dをグリシン残基により置換した以下の産生実施例4を参照。ギ酸デヒドロゲナーゼは、ヌクレオチド配列の位置1202に、最後のアミノ酸であるバリンとアラニンとの交換を導く、単一塩基の欠失を有する。同時に、この塩基の欠失は停止コドンのスイッチオフを導き、元は読み枠の外側にあったHisタグを活性化させる配列番号34および35を参照。pET21a7β-HSDH:pET21aベクター内に、コリンゼラアエロファシエンスATCC25986由来の7β-HSDHを、NdeIおよびXhoI切断部位を通して通常の方法によりクローン化した。pET21aFDHD221G7β-HSDH図4bを参照。pET21aFDH7β-HSDHG39A3α-HSDH図8を参照。pCOLAmod3α-HSDH図5を参照。微生物大腸菌株DH5αNovagen、マディソン、ウィスコンシン州、米国は、37°Cにて、適切な抗生物質を含むLB培地中で増殖させた。大腸菌株BL21DE3Novagen、マディソン、ウィスコンシン州、米国は、37°Cにて、適切な抗生物質を含むLB培地中で増殖させた後、OD600=0.8において、0.5mMIPTGによる誘導を25°C、140rpmにて行った。方法1.7β-HSDH活性を決定するための標準的な条件反応混合物の全量1mlには以下が含まれる:880μlの50mMリン酸カリウム緩衝液、pH8.010μlの10mMUDCA水に溶解、pH810μlの酵素溶液上記の緩衝液中、1~10U/mlの範囲100μlの1mMNADP上記の緩衝液中340nmでの吸光の増加を測定し、6.22mM-1×cm-1のモル吸光係数を用いて活性を酵素単位U、すなわちμmol/分として算出した。産生実施例7による、7β-HSDH活性を決定するための標準的な条件反応混合物の全量1mlには以下が含まれる:870μlの50mMリン酸カリウムKPi緩衝液、pH8.0100μlの100mMDHCA50mMKPiに溶解、pH810μlの酵素溶液上記の緩衝液中、2~6U/mlの範囲20μlの12.5mMNADPHddH2Oに溶解340nmでの吸光の増加を測定し、6.22mM-1×cm-1のモル吸光係数を用いて活性を酵素単位U、すなわちμmol/分として算出した。2.BCAアッセイによるタンパク質の定量サンプルをBCA試薬Interchimより入手と混合し、37°Cにて45分間インキュベートした。タンパク質含量は、用いたアッセイの濃度範囲で、562nmにて検量線BSAに対して決定した。3.薄層クロマトグラフィー5~10μgのサンプルを、TLCフィルムシリカゲル60Merckにアプライした。参照として標準物質もアプライした。TLCフィルムの一端を、移動相が上端に達するまで溶媒に浸した。TLCフィルムを乾燥させ、リンモリブデン酸によって発色させた。4.分子生物学の手順:特記しない限り、分子生物学操作は、例えばSambrookJFritschEFandManiatisTMolecularCloningALaboratoryManual2ndedColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNY1989;AusubeletalCurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileySonsNYKrieglerGeneTransferandExpressionALaboratoryManualStocktonPressNYに記載される確立された方法に基づいて行った。B.実施例産生実施例1:7β-HSDH活性の同定コリンゼラアエロファシエンスATCC25986のゲノムDNA配列は、2007年にワシントン大学ゲノム配列決定センターWashingtonUniversityGenomeSequencingCenterにより、GenBankのヒト腸管ミクロビオームプロジェクトにおいて公開された。HSDHは短鎖デヒドロゲナーゼに属する。GenBankではコリンゼラアエロファシエンスATCC25986に由来する短鎖デヒドロゲナーゼの生化学的機能について注釈が付けられていなかったことから、九つの候補をベクターpET22b内へクローン化し、次にE.coliBL21DE3内に発現させた。このために、7β-HSDHのコード配列をPCRによって増幅した。コリンゼラアエロファシエンスATCC25986DSM3979のゲノムDNAを鋳型として用い、かつプライマーとして5’-gggaattcCATATGAACCTGAGGGAGAAGTA-3’配列番号:3および5’-cccAAGCTTCTAGTCGCGGTAGAACGA-3’配列番号:4を用いてPCR産物を得た。プライマー配列中のNdeIおよびHindIII切断部位に下線を施した。PCR精製キットQiagenを用いてPCR産物を精製し、次に酵素NdeIおよびHindIIIによって切断した。対応するベクターもまた、NdeIおよびHindIIIによって切断した。産物をアガロースゲルにアプライして分離し、切り出して精製した。切断したPCR産物および切断したベクターをT4-リガーゼによって連結させた。連結物によりE.coliDH5αを形質転換した。得られたベクター7β-HSDH遺伝子を含むを配列決定して確認し、これによってE.coliBL21DE3を形質転換した後、IPTGで誘導して発現させた。発現は50mlのLB培地中で行った。前培養物の調製のため、LB寒天プレート上のコロニーを採取し、5mlのLB培地対応する抗生物質を含む中で37°C、160rpmにて一晩インキュベートした。50mlのLB培地対応する抗生物質を含むに、500μlの前培養物を植えた。培養物は37°C、160rpmにてインキュベートした。OD600がおおよそ0.8になるまでに、0.5mMIPTGの添加によって発現を誘導した。6時間または一晩経過後、細胞を遠心沈降した。ペレットを6mlのリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8、0.1mMのPMSFを含むに再懸濁し、超音波によって破砕した。細胞片を遠心分離によって除去した。7β-HSDH活性の同定のため、光度測定によって活性を調べた。1mlキュベット内で、酵素と0.1mMの試験物質UDCAをリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8中に混合した。NADPHNADHまたはNADPNADの添加後に、NADPHの分解または形成を測定した。九つの候補のうち一つの酵素が、NADPの存在下でUDCAに対する活性60U/mlを示したが、CAに対しては活性を示さなかった。NADPHに依存したこの酵素の7β-HSDH活性が同定された。光度測定において、7β-HSDHは、NADPまたはNADPHの存在下で、UDCAに対して60U/mlの活性を示し、7-ケト-LCAに対して35U/mlの活性を示し、DHCAに対しては119U/mlの活性を示した。CAに対する活性は検出されなかった。7β-HSDHをコードする遺伝子を、迅速な精製を可能にするため、His-タグを有するpET28a内へサブクローン化した。このHis-タグを有する7β-HSDHを、上記のようにE.coliBL21DE3内へ活発に発現させた。Talonカラムを用いて精製を行った。カラムを最初にリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8、300mMNaClを含むにより平衡化した。細胞ライセートの負荷後、カラムをリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8、300mMNaClを含むによって洗浄した。7β-HSDHを、リン酸カリウム緩衝液50mM、pH8、300mMNaClおよび200mMイミダゾールを含むによって溶出した。溶出液中のイミダゾールを透析によって除去した。精製による収率は76、純度はおおよそ90であった。産生実施例2:コリンゼラアエロファシエンスATCC25986に由来する7β-HSDHの、調製用規模でのクローニング、発現、および精製、ならびに該酵素のさらなる性質決定2.1発現構築物のクローニングおよび産生PCRにより、上記の産生実施例1に記載したプライマーを用いて、ゲノムDNAから7β-HSDHをコードする遺伝子をもう一度増幅した:PCR産物をもう一度上記のように精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびHindIIIによって消化した。消化したPCR産物をもう一度精製し、T4リガーゼを用いてpET-28aベクター内にクローン化することで発現ベクターを産生した。得られた発現構築物により、次にE.coliDH5α細胞を形質転換した。予想されるタンパク質は、シグナルペプチドおよびN-末端の6×His-タグおよびトロンビン切断部位を含む20アミノ酸残基を有するはずである。挿入DNAの配列は、配列決定によって確認した。2.27β-HSDHの過剰発現および精製E.coliBL21DE3を発現構築物によって形質転換した。このために、発現構築物を含むE.coliBL21DE3株を、30μg/mlのカナマイシンを含むLB培地中2リットル振盪瓶内で2×400mlで増殖させた。細胞を遠心分離10.000×g、15分、4°Cによって回収した。ペレットを20mlのリン酸緩衝液50mM、pH8、0.1mMPMSFを含むに再懸濁した。細胞を冷却しながら、Sonifier250超音波機器Branson、ドイツを用いた1分間の超音波処理によって40W出力、40間隔、1分間休止細胞を破砕した。溶解は3回繰り返した。細胞抽出物を遠心分離した22.000×g、20分、4°C。上清をTalonカラムClontech、米国に負荷し、ローディング緩衝液50mMリン酸カリウム、300mMNaCl、pH8によって平衡化した。この手順は24°Cにて行った。未結合物質は、カラムをローディング緩衝液3カラム容積で洗浄することによって洗い流した。弱く結合したタンパク質を、洗浄緩衝液ローディング緩衝液中に20mMイミダゾールを含む;3カラム容積で洗浄することにより除去した。His-タグ-7β-HSDHタンパク質を、溶出緩衝液ローディング緩衝液中に200mMイミダゾールを含むによって溶出した。溶出液を、5kDaの分子排除限界を有する透析チューブSigma、米国内で、2リットルのリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8に対し、4°Cにて一晩透析した。最後にサンプルを新しいチューブに入れ、さらなる分析のために-20°Cで保管した。BCA試験キットThermo、米国を製造者の指示に従って用いることにより、タンパク質濃度を決定した。加えて、サンプルを12.5SDS-PAGEによって分析し、クマシーブリリアントブルーによって染色した。タンパク質の純度を、ScionImageBeta4.0.2Scion、米国を用いたデンシトメトリーによって決定した。2.3ゲル濾過7β-HSDHの分子量を決定するため、PharmaciaAKTAタンパク質精製システムによりゲル濾過を行った。精製した酵素を、200mM塩化ナトリウムを含む50mMTris-HClpH8によって予め平衡化したSephadexG-200カラムにアプライした。タンパク質を同緩衝液により流速1ml/分で溶出した。7β-HSDHの分子量は、その溶出容量を、タンパク質標準物質血清アルブミン66kDa、アスペルギルスオリザエ由来のα-アミラーゼ52kDa、ブタ膵臓トリプシン24kDa、およびニワトリ卵白リゾチーム14.4kDaの溶出容量と比較することで決定した。2.4酵素アッセイおよび反応速度解析酵素アッセイのための反応混合物は、全量1ml中に、50μmolリン酸カリウムpH8、0.1μmolNADPHまたはNADP、基質、およびタンパク質を含んだ。該反応混合物を、光路長1cmのキュベット内に入れた。7β-HSDH活性は、分光光度計Ultraspec3000、PharmaciaBiotech、英国を用い、340nmの吸光度においてNADPH濃度の変動を記録することにより決定した。酵素活性は、25°Cにおける6.22mM-1×cm-1のモル吸光係数を用い、酵素単位U、すなわちμmol/分として算出した。基質、補酵素、濃度、pH、緩衝液、およびインキュベーション温度を変化させて、幾つかの異なる測定を行った。反応速度定数は標準的方法を用いて決定した。2.57β-HSDHによる7-ケト-リトコール酸の生体内変換7β-HSDHの生化学的機能を確認するため、7β-HSDHによる7-ケト-LCAの変換を行った。7-ケト-LCA0.4gをリン酸カリウム緩衝液50mM、pH810mlに懸濁させ、2M水酸化ナトリウムの添加によりpHを8に調整した。イソプロパノール0.2ml、100U7β-HSDH、および80Uの、サーモアナエロバクターエタノリカス由来のアルコールデヒドロゲナーゼADH-TEK.Momoi博士ITB大学、シュトゥットガルトより供与ならびに1μmolNADPを加えた。同緩衝液を加え、全反応量を20mlとした。反応混合物を、24°Cで攪拌しながら24時間インキュベートした。この間、ADHにより、2-プロパノールの酸化を通してNADPHを再生した。生成物を2M塩酸1mlで酸化し、酢酸エチル5mlにより5×抽出した。次に有機溶液を蒸留した。2.6クロマトグラフィー産物の決定HPLC分析は、Purospher登録商標STARRP-18型Hitbar登録商標RT125-4プレパックカラム、Purospher登録商標STARRP-18エンドキャップ型、Merck、ドイツのカラムを、LiChroCART登録商標STARRP18型エンドキャップ型、Merck、ドイツのプレカラムと共に用い、HPLCシステムLC20AD島津、日本により、流速1ml/分にて行った。移動相は二種の溶離液から構成されていた。溶離液Aはアセトニトリルを含み、溶離液Bは蒸留水オルトリン酸でpH2.6に調整、85を含んだ。以下の勾配を用いた:A358min35-431min-143-701min-1705min70-3517.5min-1355min;溶離液A658min65-571min-157-301min-1305min30-6517.5min-1655min。20μlのサンプル1mg/mlを分析した。標準物質として、標準UDCA、7-ケト-LCA、およびCDCAを同濃度で用いた。記録は、200nmにおけるUV検出によって行った。2.7配列アラインメントおよび系統発生解析ClustalX-ソフトウェアThompsonetal1997NucleicAcidResearch25487682を用いて多重配列アラインメントを作成し、JalviewソフトウェアClampetal2004Bioinformatics204267を用いて改変した。プログラムTreeView1.6.6Roderic2001httptaxonomyzoologyglaacukrodrodhtmlを用いて系統樹を作成した。2.8試験結果:2.8.1調製用の生体内変換における7β-HSDH活性の同定酵素の機能を確認するため、7-ケト-LCAの生体内変換を10ml規模にて行った。分離した酵素を、既に述べたように2-プロパノールを用いたNADPH再生のためのADHと組み合わせて用いた。HPLC分析により、UDCAは酵素により産生された唯一の反応生成物であることがわかった90変換。反応混合物中にCDCA保持時間19.4分は検出されなかった。この結果から、酵素は、NADPH依存性の7β-HSDHであり、7-ケト-LCAの7-カルボニル基を7β-水酸基へと選択的に還元できることがわかった。保持時間UDCA:15.5分保持時間7-ケト-LCA:18.3分2.8.2.精製およびゲル濾過コリンゼラアエロファシエンスDSM3979由来の7β-HSDH遺伝子を発現ベクターpET28a内にクローニングし、続いて過剰発現させた後、N-末端にHis-タグを有する融合タンパク質を、1リットルの培養液あたり7β-HSDHの収率332.5mg5828Uとして得た。His-タグを有する7β-HSDHを、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより一工程で精製した純度>90、収率76、図2を参照。レーン1および2の主要バンドは、遺伝子のアミノ酸配列に由来する予想分子量に対応する30kDaに、予想される発現産物を示す。しかしながら、ゲル濾過によって、7β-HSDHに対し56.1kDaの分子量が見出された。これは、コリンゼラアエロファシエンスDSM3979由来の7β-HSDHが二量体の性質を有することを証明するものである。2.8.3.配列アラインメント本発明に従って用いた7β-HSDHのアミノ酸配列を、既知のHSDH配列と比較したアラインメントは示さない。観察された配列類似性により、本発明の酵素は、短鎖デヒドロゲナーゼSDRのファミリーに属することがわかる。SDR類は非常に低い相同性および配列同一性を示すことが知られているJornvallHBPerssonMKrookSAtrianRGonzalezDuarteJJefferyandDGhosh1995ShortchaindehydrogenasesreductasesBiochemistry34600313及びPerssonBMKrookandHJornvall1991CharacteristicsofshortchainalcoholdehydrogenasesandrelatedenzymesEurJBiochem20053743。しかしながら、この配列アラインメントは、SDRの一次構造内の保存されたドメインをはっきりと示している。N-末端モチーフGly-X-X-X-Gly-X-GlyGly-41、Gly-45、およびGly-47に対応する、番号はアラインメントに対応するは、SDRスーパーファミリーの特徴的なジヌクレオチド結合モチーフに対応する。さらに、SDR酵素の触媒三つ組である、三つの強く保存された残基Ser-177、Tri-190、およびLys-194が観察された。2.8.4.系統発生解析クロストリジウムソルデリClostridiumsordellii、ブルセラメリテンシスBrucellamelitensis、および大腸菌に由来する7α-HSDHは同じ亜群に属する。二つの3α-HSDHは、その他のHSDHよりもさらに明らかな類似性を示す。興味深いことに、原核生物の7β-HSDHは、モルモット、ヒト、およびマウスを含む動物11β-HSDHの亜群に関連する。2.8.5.反応速度定数UDCA、7-ケト-LCA、DHCA、NADP、およびNADPHに対して、νmaxおよびKMの絶対値を決定するため、ラインウィーバーバークLineweaverBurkプロットにより反応速度平衡分析を行った。基質飽和曲線および逆数プロットから得た、試験した基質および補酵素に対する全ての反応速度データを以下の表に示す。全ての基質および補酵素に対するνmax、KM、およびkcat値は同範囲にあったが、DHCAに対するKM値はその他の基質よりも著しく高くかった。これは多分、水中での低溶解度が原因であろう。酵素はNADPH依存性であり、NADおよびNADHに対する反応速度定数は、非常に低い活性のために決定できなかった。2.8.6.最適pHまた、精製した酵素を用い、様々な基質に対する7β-HSDH活性をpHの関数として決定した。7β-HSDHによるUDCAの酸化のために最適な活性は、pH9~10の範囲で観察され、これは酸性側で徐々に減少した。対照的に、7β-HSDHによるDHCAおよび7-ケト-LCAの還元に対する最適な活性は、pH4~6の範囲に見られ、酸性側で急激に減少し、アルカリ側で徐々に減少した。異なる緩衝液は、同pHにおいて、7β-HSDHの活性にわずかな影響しか与えなかった。2.8.7.熱安定性本発明に従って用いたNADP依存性7β-HSDHは、以下の安定性を示す:400分経過後、30°Cにおける活性は23°Cにおける活性よりも約30低かった。酵素は、30°Cにおいて1500分経過後完全に不活性化したが、23°Cにおいては、1500分経過後20の活性が残っていた。凍結融解を繰り返した後で、-20°Cにてリン酸カリウム緩衝液50mM、pH8中で数か月間保管した間に、著しい活性の減少は観察されなかった。産生実施例3:7β-HSDH変異体の産生およびその性質決定アミノ酸配列の位置39開始メチオニンを含む配列番号2を参照を変異させた。3.1プライマー7β-HSDHの部位特異的変異誘発には、以下に示す変異誘発プライマーを用いた。プライマーは、所望のアミノ酸交換がもたらされるように、7β-HSDH遺伝子配列に基づいて選択した。変異される塩基はプライマーの中心に位置し、プライマー対の融点は同じ範囲にあることに留意した。G39A変異体を調製するため、プライマー対、7beta_mut_G39A_fwdおよび7beta_mut_G39A_revを用いた。G39S変異体を調製するためには、プライマー対、7beta_mut_G39S_fwdおよび7beta_mut_G39S_revを用いた。グリシン→アラニン順方向:7beta_mut_G39A_fwd:CGTCGTCATGGTCGCCCGTCGCGAGG配列番号9逆方向:7beta_mut_G39A_rev:CCTCGCGACGGGCGACCATGACGACG配列番号10グリシン→セリン順方向:7beta_mut_G39S_fwd:CGTCGTCATGGTCAGCCGTCGCGAGG配列番号11逆方向:7beta_mut_G39S_rev:CCTCGCGACGGCTGACCATGACGACG配列番号123.2PCRプログラム反応中、最初に2分間の変性工程を98°Cにて行った。次に、変性98°Cにて30秒、プライマーハイブリダイゼーション58°Cにて2.5分、および伸長72°Cにて6分を25サイクル行った。最後の工程で、15分間の最終伸長を72°Cにて行い、次に4°Cに冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。3.3PCRアッセイ鋳型として7β-HSDHを有するpET22bベクターを用いた。3.4手順タンパク質配列中のアミノ酸の標的化した交換を可能にするため、対応する遺伝子のDNA配列を部位特異的変異に供した。このために、それらの配列中に所望の変異が含まれる、互いに相補的なプライマーを用いた。変異される遺伝子を有する、N6-アデニン-メチル化、二本鎖プラスミドDNAを鋳型として用いた。N6-アデニン-メチル化プラスミドDNAは、damE.coli株、例えばE.coliDH5から分離した。ポリメラーゼ連鎖反応は上記のように行った。所望の変異を有し、鎖を切断したプラスミドが形成されるように、プライマーを鋳型に対して相補的に伸長させた。その他のPCR反応とは異なり、この場合、新たに形成されたDNA分子はPCR反応のための鋳型としては役立たないため、DNA収率は直線的にのみ増大する。PCR反応が完了すると、親であるN6-アデニン-メチル化DNAを制限酵素DpnIによって消化した。この酵素は、非特異的にN6-アデニン-メチル化DNAを制限切断するが、新たに形成された非メチル化DNAは制限切断しないという特色を有する。制限切断は、PCR反応混合物に1μLのDpnIを加え、37°Cにて1時間インキュベートして行った。この調製物の10μlを、200μlの化学的にコンピテントなDH5α細胞の形質転換に用いた。プラスミド分離後、配列決定によって変異の成功を確認した。3.5性質決定各変異体および野生型酵素に対し、マイクロタイタープレート光度計での反応速度測定を行い、一定の基質濃度および変化させた補因子濃度、かつその逆の両方により、酵素の変換速度を記録した。特異的な酵素活性を決定するため、細胞ライセート中の酵素濃度をデンシトメトリーにより決定した。基質変換速度の基質濃度への依存性を決定するため、反応量に対して100μMNADPHの補因子濃度を用い、一方で基質濃度は、デヒドロコール酸の7μM~10mMの範囲で31通りの異なる濃度に変化させた各々の場合、反応混合物に対して。基質変換速度の補因子濃度への依存性を決定するため、反応量に対して0.3mMデヒドロコール酸の基質濃度を用い、一方で補因子濃度は、野生型タンパク質についてNADPHの25μM~100μMの範囲で8通りの異なる濃度に変化させ、または両変異体について、NADPHの6μM~100μMの範囲で16通りの異なる濃度に変化させた各々の場合、反応混合物に対して。これらの一連の測定において、最初の4測定に対する線形回帰によって反応速度を決定した0秒~18秒。得られたデータはIGORProによって評価した。特異的な酵素活性に対する基質または補因子濃度のプロットから、一定の基質濃度および変化させた補因子濃度における一連の測定について、ミカエリスメンテンによる反応速度の典型的な曲線が観察される。一方で、一定の補因子濃度および変化させた基質濃度における一連の測定のプロットからは、基質阻害を伴うミカエリスメンテンによる反応速度の典型的な曲線が観察される図6を参照。この理由から、古典的なミカエリスメンテンモデルを、一定の基質濃度および変化させた補助基質濃度における一連の測定の評価に用い、基質阻害を伴うミカエリスメンテンモデルを、一定の補助基質濃度および変化させた基質濃度における一連の測定の評価に用いた。νmax、Km、およびKiは非線形回帰によって決定した。ν特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1νmax最大特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1cS基質または補因子濃度、molL-1Km半飽和濃度、molL-1Ki阻害定数、molL-1得られたパラメータを表に示す。測定データの分析により、7β-HSDHは、野生型タンパク質に対して最も強く、G39S変異体に対して最も弱いデヒドロコール酸に対して基質阻害を示すことが明らかとなった。特に、先に言及したタンパク質の場合には、高いKiと大きな誤差により、とにかく基質阻害が起こったか否かが問われ得る。デヒドロコール酸の半飽和濃度は2桁のマイクロモル濃度範囲にある。これについては、野生型タンパク質とG39A変異体はそれぞれ、31±5μMおよび33±6μMであったことから両者に著しい相違は見られなかったが、G39S変異体のこの値は75±9μMであり、他の二つの酵素の値のほぼ2倍である。NADPHの半飽和濃度の場合には、野生型酵素よりも変異体酵素に低い値が観察された野生型の46±7μMに対し、G39A変異体は16.4±1.9μM、およびG39S変異体は13.1±2.9μM。両変異体についてのνmax値は、野生型タンパク質の値のほぼ1.5倍である野生型タンパク質の14.6±1.0U/mgに対し、G39A変異体は21.0±1.1U/mg、およびG38S変異体は20.1±1.0U/mg。古典的なミカエリスメンテンモデルに対し、基質阻害を伴うミカエリスメンテンモデルでは、基質濃度の増大に伴って特異的な酵素活性は漸近的にνmaxに接近せず、再び減少することから、νmax値は到達可能な最大の特異的酵素活性であるとはみなされない。到達可能な最大の酵素活性、すなわち反応速度曲線の最大での酵素活性は、野生型タンパク質では~13U/mg、ならびに変異体タンパク質では~19U/mgG39Aおよび~20U/mgG39Sである。到達可能な最大酵素活性よりも、全細胞生体内変換に用いられる基質濃度において到達できる酵素活性がさらに興味深い。例として、これを10mMデヒドロコール酸の基質濃度において比較すると、野生型タンパク質では~6.7U/mg、G39A変異体では~13U/mg、およびG39S変異体では~18U/mgであった。従って、10mMの基質濃度において、G39A変異体は野生型タンパク質の2倍の活性を有し、G39S変異体は約3倍もの活性を有し得る。野生型タンパク質はG39A変異体よりも強い基質阻害を示し、同様にG39A変異体はG39S変異体よりも強く基質阻害されたことから、これらの相違は比較的高い基質濃度でさらに明らかなはずである。産生実施例4:FDHD221G変異体の産生および性質決定4.1pET21aFDHのクローニング4.1.1マイコバクテリウム-バッカエギ酸デヒドロゲナーゼのPCR増幅増幅に用いた鋳型は、ドイツ微生物培養細胞コレクションGermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures:DSMZ、ブランズウィック、から入手したマイコバクテリウム-バッカエのゲノムDNAである。増幅のためのプライマーは、EurofinsMWGGmbH、エーバースベルク、から入手したfdh_for5CGATCATATGGCAAAGGTCCTGTGCGTTC3配列番号23およびfdh_rev5GCTAGAATTCTCAGCCGCCTTCTTGAACT3配列番号24である。制限酵素による認識部位に下線を施す。rev-プライマーはEcoRI切断部位を含み、for-プライマーはNdeI切断部位を含む。PCRアッセイおよびPCRプログラムを表に示す。4.1.2pET21aおよびFDHPCR産物の制限酵素による消化5μl10×NEBufferEcoRI、2.5μlNdeI20U/mL、および2.5μlEcoRI20U/mLそれぞれ、NewEnglandBiolabs、フランクフルトを、水に溶解した1~5μgのDNApET21aまたはFDHPCR産物に加え、蒸留水で全量50μlまでにした。各々の場合、調製物を37°Cにて1時間インキュベートした。次に、切断したDNA断片を1アガロースゲル1w/vアガロース、0.05v/vエチジウムブロマイドにアプライし、120Vにて55分間電気泳動を行ってDNA断片を分離した。次に正確なサイズのバンドFDH-遺伝子は1.2kb、pET21aプラスミドは5.4kbをアガロースゲルからメスで切り出し、QIAquickGelExtractionKitQIAGEN、ヒルデンを製造者のプロトコルに従って用いて分離した。4.1.3切断したpET21aおよびFDHの連結1μlT4リガーゼ3U/μLおよび1μl10×リガーゼ緩衝液それぞれ、NewEnglandBiolabs、フランクフルト100ngの切断済みベクターDNAおよび111ngの切断済みFDHDNAに加え、蒸留水で全量10μlまでにした。連結調製物を4°Cにて一晩インキュベートした。4.1.4連結調製物による、化学的にコンピテントなE.coliDH5αの形質転換連結工程の最後に、10μLの連結調製物を、標準的なプロトコルによって調製した200μlの化学的にコンピテントなE.coliDH5αに加えた。次に、氷上でのインキュベーション工程を30分間行い、続いて42°Cにて熱ショックを与えた90秒間。次に、形質転換調製物に600μlの無菌LB培地を加え、細胞を振盪インキュベータ内で、200rpm、37°Cにて45分間インキュベートした。次の工程では、調製物を卓上遠心機で3000rpmにて60秒間遠心し、上清700μlを廃棄し、細胞を残りの上清に再懸濁して、100mg/lアンピシリンを含むLB寒天プレートにまいた。次に寒天プレートを37°Cにて一晩インキュベートした。4.2.pET21aFDHD221Gの産生NADHのみではなく、NADHPも再生できるFDH変異体の産生について、以下に変異体D221Gと共にさらに詳細に説明する。アスパラギン酸D221は、アルギニンR残基に直接隣接して位置する、陰性に荷電した大きな側鎖を有するアミノ酸であり、これによってNADPが結合される。このため、これもまた陰性に荷電したNADPのリン酸基との反発が導かれ得る。従って、アスパラギン酸は小さな無電荷アミノ酸残基であるグリシンGによって置換される。4.2.1使用したプライマーmt1:5CCTGCACTACACCGGCCGTCACCGCCTGC3配列番号30NI_fdh_R:5GCTCGAATTCTCAGACCGCCTTC3配列番号314.2.2手順まず、mt-プライマーおよびプライマーNI_fdh_Rを用いて、二つの相補的なメガプライマーの一組を作製した。プラスミドpET21aFDHを鋳型として用いた。使用したPCRプログラムを以下の表に示す。プライマーmt1とプライマーNI_fdh_Rとの組み合わせによって、メガプライマーの長さは650bpになる。第1のPCRによるこのPCR産物に対して、ゲル電気泳動およびゲルからの所望のバンドの分離を行った。第2のPCRは、プライマーとしてメガプライマーを用い、鋳型としてプラスミドDNApETfdhを用いる全プラスミドPCRとして行った。反応混合物および全プラスミドPCRの温度概要を以下の表に示す。2×EZClone酵素ミックス、EZClone溶液1、1.1kbマーカー、およびDpnIは、GeneMorphIIEZCloneDomainMutagenesisKitStratageneから得た。PCRプログラムの第1工程68°C、5分は、Taqポリメラーゼによって非特異的に付加された塩基を、MEGAWHOPPCRに用いたポリメラーゼの3’→5’エキソヌクレアーゼ活性によって除去するためのものである。PCR産物は一本鎖切断された二本鎖プラスミドであり、これはE.coli内でのみ閉じる。10UのDpnIを50μLのPCR産物に加え、調製物を37°Cにて2時間インキュベートした。DpnIは、メチル化DNA、すなわち用いた鋳型DNAのみを分解して、メガプライマーまたは合成プラスミドは分解しない。鋳型プラスミドは、メチル化開始DNAを得るためにdam株例えばDH10BまたはJM109によって産生されなければならない。4.3変異体D221Gの発現および分離最初にLB前培養液に冷凍保管材料または寒天プレートからのコロニーを植え、該前培養液を一晩インキュベートした。インキュベーションは37°Cおよび250rpmで行った。前培養液のODを決定し、ODが0.1の際に植菌した。ODが0.5~1に達すると約2.5時間後、IPTGによる誘導を行った最終濃度1mM。誘導3時間後に細胞を回収した。細胞をガラスビーズによって機械的に破砕した。このために、1.5-mLの反応容器内で0.5mLの細胞サンプルに0.5mLのガラスビーズを加え、該反応容器をRetsch振動ミル内で、最大数30s-1で3分間振盪した。細胞解離後、ガラスビーズを遠心分離した2分間、13000rpm。振動ミル内でのサンプルの加熱によるタンパク質変性を最少にするため、解離の前後で、培養物を氷上に置いた。この解離プロトコルは、-20°Cにおいて凍結したサンプルの使用のために最適化された。4.4変異体D221Gの性質決定データは、産生された変異体が、補因子としてNADおよびNADPの両方を利用できることを証明する。産生実施例5:E.coli7α-HSDHノックアウト変異体E.coliBL21DE3hdhA-KanRの産生目的は、障害となる7α-HSDH活性の、E.coliBL21DE3発現株における欠失である。以下に記載する方法により、7α-HSDHの標的遺伝子内に、標的遺伝子がスイッチオフされるように抗生物質耐性遺伝子を挿入した。5.1E.coliBL21DE3に由来する7α-HSDHの配列情報アミノ酸配列:配列番号26ヌクレオチド配列配列番号25受入番号:NC_012971REGION:1642470..16432375.2使用したプライマーE.coliBL21DE3由来の7α-HSDHをスイッチオフするため、以下のプライマーを準備した:Ll.LtrBイントロンを再標的化するためのプライマー:467|468a-IBS配列番号27AAAAAAGCTTATAATTATCCTTATAGGACGTCATGGTGCGCCCAGATAGGGTG467|468a-EBS1d配列番号28CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGTCATGTTTAACTTACCTTTCTTTGT467|468a-EBS2配列番号29TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTTCCTATCGATAGAGGAAAGTGTCT挿入位置467|468aGCAGCTTTAGATGATGCATAGGAAGTCATGintronTTTATATTTTTATTT。5.3ノックアウト変異体の調製ノックアウト変異体は、SigmaAldrichのキット、TargeTronTMGeneKnockoutSystemを製造者の指示に従って用いることにより調製した。TargeTronTMGeneKnockoutSystemの工程B.6.に従い、PCR産物の精製にはQiagenのQIAquickPCRPurificationKitを用いた。HindIII/BsrGIにより消化したイントロンPCR産物の、線状化pACD4K-Cベクターへの連結を以下のように行った:反応は16°Cにて一晩行った。20μlの調製:2μlpACD4K-C線状ベクター40ng6μlHindIII/BsrGIにより消化したイントロンPCR産物2μlATP10mM2μlリガーゼ緩衝液10×Fermentas2μlT4リガーゼFermentas6μlH2O連結反応溶液5μlを200μlの化学的にコンピテントなE.coliBL21DE3細胞に加え、氷上で20分間インキュベートした。製造者による記載に従ってさらなる形質転換を行った。形質転換調製物を、33μg/mLカナマイシンを含むLB寒天プレートにまいた。カナマイシン耐性細胞を選択し、これらをそれぞれ、LB中での一晩の培養により数晩にわたって植菌したそれぞれ5μlのカナマイシン溶液33mg/mlを含む。最終的に200mlのLB培養液200μlのカナマイシン溶液33mg/mLを含むに一晩の培養物を植え、振盪インキュベータ内で、37°C、180rpmにて5時間インキュベートした。次に温度を42°Cに上昇させて1時間インキュベートした。この培養物を5mLLBに植えて一晩培養するために用いたそれぞれ5μlのカナマイシン溶液33mg/mlを含む。37°C、180rpmにて一晩インキュベーション後、培養物を33μg/mLカナマイシンを含むLB寒天プレートに画線した。37°Cにて一晩インキュベーション後、コロニーを選択し、33μg/mLカナマイシンおよび34μg/mLクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに画線した。37°Cにて一晩インキュベーション後、クロラムフェニコール感受性変異体が見出された。これはノックアウトの誘導系により保持されるプラスミドの喪失を確認するために必要であり、ノックアウトの成功後はもう必要ではない。5.4.ノックアウトの検出7α-HSDH遺伝子は、以下のプライマーを用い、コロニーPCRによって増幅した:7alpha-ko-check_fwd5TTAATTGAGCTCCTGTACCCCACCACC3配列番号32および7alpha-ko-check_rev5GTGTTTAATTCTGACAACCTGAGACTCGAC3配列番号33。得られた断片は、長さがおおよそ2.5~3kbであり、プライマー7alpha-ko-check_fwdを用いてこの配列決定を行った。配列決定により、7α-HSDHのDNA配列はpACD4Kベクターの挿入によって妨げられていることが示され、これによって7α-HSDHのノックアウトがもたらされた配列決定データは未提示。反応実施例1:7β-HSDHによる7-ケト-LCAの酵素的変換7β-HSDHの生化学的機能を確認するため、7β-HSDHによる7-ケト-LCAの変換を行った。反応混合物20mlには、50mM7-ケト-LCAおおよそ0.4g、5U/ml7β-HSDH、および0.05mMNADPが含まれた。NADPHの再生には4U/mlADHおよび1イソプロパノールを用いたスキーム1を参照。反応はヒュームフード内で、pH8、24°Cにて攪拌しながら行った。アセトンはイソプロパノールよりも迅速に蒸発することから、反応はUDCAの形成に向けて移行した。1イソプロパノールをさらに、24、48、および72時間後に加えた。生成物をTLCシリカゲル60、Merck、溶媒:石油エーテル及び酢酸エチル1:10、vol:volによって分析した。TLCにおいて、生成物を標準参照物質である7-ケト-LCA、UDCA及びCDCAと比較した。TLC分析により、7β-HSDHによって7-ケト-LCAからUDCAが形成されたことがわかる。TLCにおいて、鏡像異性体であるCDCAは検出されなかった。反応実施例2:7β-HSDHによる、DHCAからの3,12-ジケト-7β-CAの酵素的産生DHCAからの12-ケト-UDCAの調製に対する7β-HSDHの有用性を確認するため、7β-HSDHによるDHCAの変換を行った。反応混合物50mlには、50mMDHCA1g、5U/ml7β-HSDH、および0.05mMNADPが含まれた。NADPHの再生には4U/mlADHおよび1イソプロパノールを用いたスキーム2を参照。反応はヒュームフード内で、pH8、24°Cにて攪拌しながら行った。アセトンはイソプロパノールよりも迅速に蒸発することから、反応は3,12-ジケト-7β-CAの形成に向けて移行した。完全な変換を達成するため、1イソプロパノールをさらに、24、48、および72時間後に加えた。中間体である3,12-ジケト-7β-CAをTLCによって分析した。遊離DHCAは、TLCシリカゲル60、Merck;溶媒クロロホルム:メタノール:酢酸10:1:0.08vol:vol:volにおいてもはや検出不可能であった。反応実施例3:3,12-ジケト-7β-CAの12-ケト-UDCAへの酵素的変換中間体である3,12-ジケト-7β-CA反応実施例2により産生を、コマモナステストステローニ由来の3α-HSDH配列番号5および6MobusEandEMaserMolecularCloningoverexpressionandcharacterizationofsteroidinducible3alphahydroxysteroiddehydrogenasecarbonylreductasefromComamonastestosteroniAnovelmemberoftheshortchaindehydrogenasereductasesuperfamilyJBiolChem1998273p3088896によって、さらに12-ケト-UDCAへ変換した。この3α-HSDHは、FDHによって再生された補因子NADHを必要とする図3を参照。4U/ml3α-HSDH、1U/mlFDHNADH依存性、Codexis、200mMギ酸ナトリウム、および0.05mMNADを反応混合物に加えた。40時間後、生成物を2MHClによってpH2に酸性化し、酢酸エチル6×10mlによって抽出した。蒸発後、生成物1.07gを得た。生成物である12-ケト-UDCAを分析し、TLCおよびNMRによって確認した。3α-HSDHは7β-HSDHの調製に関連して調製したが、プラスミドはpET22bを用い、さらに精製することなく使用した。反応実施例4:CAからDHCAへの化学反応氷酢酸1320Lを2000L攪拌容器に入れ、その中へコール酸CA110kg260molを溶解させた。この溶液に次亜塩素酸ナトリウム溶液422L2.3モル濃度を20~40°Cにて加え、次に反応溶液を少なくともさらに1時間攪拌して反応を完了させた。遠心分離によってデヒドロコール酸DHCAを分離し、収率は100kg90であった。反応実施例5:12-ケト-UDCAからUDCAへの化学反応12-ケト-UDCA105g0.258molをトリエチレングリコ―ル384ml、水酸化ナトリウム52.2g1.304mol、およびヒドラジン水和物75.95ml1.563molに溶解し、180°Cまでゆっくりと加熱した。160°Cからヒドラゾンの形成がみられ、これは窒素の分離によってUDCAへ変換された。反応混合物を180°Cにて8時間保持し、反応を完了させた。反応混合物を100°C未満に冷却し、水1500mlを加えた。次に塩酸で酸性化することによってUDCAを沈殿させた。生成物を収率96.2g~99.2g95~98までで得た。反応実施例6:7β-HSDH、FHDD221G、および3α-HSDHによる、DHCAの12-ケト-UDCAへの酵素的変換本実施例の目的は、本発明に従って用いるFDH変異体によって同時に補因子再生を行う、DHCAの12-ケト-UDCAへの2工程の酵素的変換が可能であるか否かを調べることである。使用したFDH変異体D221Gは、NADH依存性3α-HSDHに対してNADPおよびNADの両方を補因子として受け入れることから、反応混合物はさらに補因子再生系を含む必要がない。以下に、二つの部分的反応の例を図示する。FDH変異体FDHD221Gを意味する。このために、コリンゼラアエロファシエンス由来の酵素7β-HSDH、コマモナステストステローニ由来の酵素3α-HSDH、およびマイコバクテリウム-バッカエ由来のFDHに由来するFDH変異体D221Gを互いに別々に改変E.coli発現株に発現させ、反応に用いた。発現に用いたE.coli株は、いずれの7α-HSDH酵素活性も発現しないように改変されたものである。E.coliに広くみられるこの副次的活性は、この種の反応7-ケト基の立体特異的な変換において望ましくない副反応を導き、そのために生成する反応生成物の汚染を導く可能性がある。次の実験では、本出願者による以前の欧州特許出願であるEP101640035号に記載された、ノックアウト株のE.coliBL21DE3Δ7α-HSDHを用いた。この特許出願の開示は本明細書において明確に参照される。6.1使用したプラスミド7β-HSDH、3α-HSDH、およびFHDD221Gの発現に用いたプラスミドは以下の通りである:pET28a-7β-HSDH、pET22b-3α-HSDH、およびpET21a-FDH-D221G。6.2細菌株および培養条件:前述のノックアウト株E.coliBL21DE3Δ7α-HSDHは、必要な抗生物質を含むLB培地中で、37°Cにおいて培養した。OD600=0.8に達した際の0.5mMIPTGによる誘導後、インキュベーションを140rpm、25°Cにおいて、12時間継続した。6.3酵素の過剰発現および精製7β-HSDH、3α-HSDH、およびFDH変異体D221GのE.coliBL21DE3Δ7α-HSDHにおける過剰発現ならびに酵素精製は、上記の産生実施例2に記載したE.coliBL21DE3における7β-HSDHの過剰発現および精製に対する条件と同じ条件により行った。培地1リットルあたりの収率振盪フラスコ、OD600~6は以下の通りである:7β-HSDH:3883UDHCAおよびNADPH3α-HSDH:6853UDHCAおよびNADHFDH変異体:47Uギ酸ナトリウムおよびNAD。タンパク質の含量及び純度は、SDS-PAGEおよびScionImageBeta4.0.2Scion、米国を用いたデンシトメーター走査により決定した。6.412-ケト-UDCAの調製用規模での酵素的合成7β-HSDH2.4U×ml-1、3α-HSDH2.4U×ml-1、FDHD221G0.325U×ml-1、NADP10μM、NAD10μM、ギ酸ナトリウム250mM、DHCA10mM、3.2g、およびリン酸カリウム緩衝液50mM、pH6を含む反応混合物800mlを24°Cにて撹拌した。この実験で用いた三つの酵素全ては、さらなる精製工程を経ていない、細胞からの未精製抽出物を用いた。12時間後、孔径10kDaのメンブレンMillipore、米国を用いた限外濾過により、酵素を除去して反応を停止させた。濾過物中の産物は、塩酸でpH2に酸性化した後、濾紙を通すことによって精製した。生成物を60°Cで一晩乾燥させた後、所望の生成物2.9gを得た。生成物をHPLCおよびNMRによって分析した。分析データ一部:1HNMR重水素化DMSO、500MHzδ=3.922H、m、H-3αおよびH-7βおよび1HNMR重水素化DMSO、125MHzδ=69.38CH、3-C;δ=69.09CH、7-C;δ=213.86C、12-C収率:90.6純度:99反応実施例7:2プラスミド系におけるFDHD221G、7β-HSDH、および3α-HSDHの共発現による、DHCAの12-ケト-UDCAへの全細胞生体内変換目的は、デヒドロコール酸DHCAの12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケト-UDCAへの、2工程の全細胞による還元上記反応実施例6のスキームを参照が可能であるか否かを調べることである。このために、上記で調製したノックアウト株であるE.coliBL21DE3hdhA-KanRpET21aFDH7β-HSDHpCOLAmod3α-HSDHを用いたが、ここでは7β-HSDHおよび変異体FDHD221Gに加え、コマモナステストステローニ由来の3α-HSDHが組換え発現される。使用したFDH変異体は、NADH依存性3α-HSDHに対してNADPおよびNADの両方を補因子として受け入れることから、いずれのさらなる補因子再生系も生体内変換株内に挿入する必要はなかった。7.1使用した株:大腸菌BL21DE3hdhA-KanR7.2使用した分子生物学的手順7.2.1ポリメラーゼ連鎖反応7β-HSDHのクローニングにはポリメラーゼ連鎖反応PCRを用いた。7β-HSDHを増幅するための鋳型としてプラスミドpET22b7β-HSDHを用いた。PCR反応は、500μLPCRチューブ内で、反応量20μLにより行った。反応はEppendorf社のThermocyclerにおいて行った。7β-HSDHの増幅のために、各々の場合に、4μLHF-緩衝液、1μL鋳型DNA、各1μLの順方向および逆方向プライマー10μM、デオキシヌクレオチド三リン酸溶液0.4μL10mM、およびPhusionDNAポリメラーゼ0.2μL2U/μLを加えた。調製物の容量は、RNaseを含まない水によって20μLに調整した。反応については、最初に2分間の変性工程を98°Cにて行った。次に、変性98°Cにて30秒、プライマーハイブリダイゼーション48°Cにて2分、および伸長72°Cにて2分を34サイクル行った。最後の工程で、10分間の最終伸長を72°Cにて行い、次に4°Cに冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。7.2.2ゲル抽出によるDNA断片の精製DNA断片の精製のため、最初にこれらをアガロースゲル電気泳動によって分離した。対応するバンドをUV光で可視化し、サイズに基づいて同定後、メスを用いて切り出した。抽出はQIAquickGelExtractionKitを製造者のプロトコルに従って用いて行った。精製DNAの溶出にはH2O30~50μLを用いた。7.2.3エンドヌクレアーゼによる制限切断制限切断反応は全量20~50μLにおいて行った。このために、それぞれ10~20Uの制限酵素を、切断するDNAに加えた。加えて、製造者が推奨する反応緩衝液を用い、かつ製造者の推奨に基づき、任意にウシ血清アルブミン0.5μLBSA、10mg/mLを加えた。制限消化を37°Cにて2時間行った。次に断片を、ゲル抽出ベクター消化産物によるか、またはQIAquickPCRPurificationKit消化PCR産物を用いて精製した。7.2.4QIAquickPCRPurificationKitを用いたDNA断片の精製制限切断したPCR断片を精製するため、QIAquickPCRPurificationKitを用いてDNAを精製した。精製は製造者の指示に従って行い、精製したDNAの溶出にはH2O30~50μLを用いた。7.2.5DNA断片の連結制限切断したDNA断片を発現ベクター内にクローニングするため、両DNA分子を同じ制限酵素により切断した。二つの異なる酵素を用いることにより、一方ではベクターの再連結が防止され、もう一方では挿入断片を規定された配向で取り込むことができる。使用した酵素は、遊離の5’-リン酸基とデオキシリボ核酸の遊離の3’-OH末端との間のリン酸ジエステル結合を触媒する、T4-DNAリガーゼである。発現構築物のクローニングのため、各々の場合に、4μLの、遺伝子をコードし、制限切断された末端を有する精製DNA断片を、12μLの制限切断した精製ベクターに加えた。次に2μL10×リガーゼ緩衝液、1μLアデノシン三リン酸ATP、1mM、および1μLT4-DNAリガーゼ400U/μLを加えた。反応は、16°Cにて一晩継続した。7.3使用したベクター構築物7.3.1pET21aFDH7β-HSDHこのベクター構築物のため、7beta-HSDHをコードする遺伝子がFDHの下流に位置するように、7β-HSDHをpET21aFDH内へクローン化した。この目的のため、停止コドンをFDH内の5’-末端に挿入する必要があった。元の配列Lys-Lys-Ala-Val-stopと比較して、この構築物ではC-末端のバリン残基がアラニン残基によって置換されており、さらに三つのアミノ酸が付加されることで、以下のC-末端配列:Lys-Lys-Ala-Ala-Gly-Asn-Ser-stopがもたらされた。さらに、翻訳の増大のため、追加のリボソーム結合部位を7β-HSDHに、FDHと7beta-HSDHの間において挿入した。プライマー、7beta_fwd_EcoRIおよびS_7beta_rev_HindIIIを、7β-HSDHのPCR増幅のために用いた。ハイブリダイズ配列領域黒、制限酵素部位太字、下線、リボソーム結合部位下線、およびフィリングヌクレオチド斜体を示す。プライマー7beta_fwd_EcoRIでは、さらに停止コドン二重下線および読み枠シフトのためのヌクレオチド太字を加えた。クローニングはEcoRIおよびHindIII切断部位を通して行った。7.3.2pCOLAmod3α-HSDH二つの工程でデヒドロコール酸の12-ケト-ウルソデオキシコール酸への還元を可能にするためには、補因子再生系のFDHに加えて、酵素7β-HSDHおよび3α-HSDHもまた細胞内に存在しなければならない。これを可能にするため、pETベクターとの共形質転換が可能な、pCOLA-duetベクターの改変誘導体であるベクター構築物pCOLAmod3α-HSDHを調製した。この目的のため、3α-HSDHをコードする遺伝子を、ベクターpET22b3α-HSDHのNdeIおよびBlpI切断部位を通して切断し、次に同じ切断部位を通してpCOLAmodベクターのMCS2内にクローン化した。配列決定後、DNA配列の位置45においてグアニンがシトシンに置換されていることが見出されたが、これはサイレント変異をもたらすものであった。この変異はアミノ酸配列に対して影響を及ぼさないため、いわゆるサイレント変異である。両ベクターにより、以下に記載するように前述の株を共形質転換した。遺伝子はIPTG誘導性である。7.4E.coli細胞の熱ショックによる形質転換この目的のため、200μLの化学的にコンピテントなE.coliBL21DE3hdhA-KanRまたはDH5αを融解し、DNA1μLを加えた。これらを最初に45分間氷上でインキュベートした。次に細胞を、42°Cにて45秒間の熱ショックに供した。次に、LB培地600μLを細胞に加え、これらが所望の抗生物質耐性を発生できるように、37°C、200rpmにおいて振盪した。次に細胞を卓上遠心機で3000rpmにて2分間遠心し、その後、上清150μLを廃棄した。細胞を残りの上清に再懸濁して、対応する抗生物質を含むLB寒天プレートにまいた。次にプレートを37°Cにて一晩インキュベートした。プラスミドpCOLAmod3α-HSDHおよびpET21aFDH7β-HSDHを含む株を作製するために必要な、二つの異なるプラスミドの共形質転換の場合、各々の場合に、挿入プラスミド2μLを50μLの化学的にコンピテントなE.coliBL21DE3hdhA-KanRに加えた。形質転換後、細胞を、対応する抗生物質を含むLB培地5mLと共に前培養チューブに加え、前培養振盪機内で37°C、200rpmにて16~48時間、前培養チューブ内での細菌の増殖が検出されるまでインキュベートした。次に、懸濁液5μLを、対応する抗生物質を含むLB寒天プレートにまき、37°Cにて一晩インキュベートした。7.5振盪フラスコ内での株の培養:組換えタンパク質の発現のため、二つの発現プラスミドを含む、対応するE.coliBL21DE3hdhA-KanRを、対応する抗生物質を加えたLB培地5mL中で、37°C、200rpmにて一晩インキュベートした。次に、この前培養物を、対応する抗生物質を加えたTB培地200mLに植え、37°C、250rpmにてインキュベートした。OD600が0.6~0.8に達すると、組換えタンパク質の発現を1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTGによって誘導し、培養物を25°C、160rpmにてさらに21時間インキュベートした。7.6全細胞生体内変換の実施および試験結果反応は2mL反応量の懸濁液中で、pH6.0にて、OD600=20の細胞密度を用いて行った。25mMまたは50mMのデヒドロコール酸を基質濃度として選択し、使用した補助基質濃度は400mMであった。試験は25°Cにて、空気を排除して行った。48時間後にサンプルを採取した。HPLC法の較正を行ったサンプル中で、反応混合物が25mMの場合、基質はもはや検出不可能である一方、反応混合物が50mMデヒドロコール酸の場合、基質ピークは検出されるが、そのピーク面積は限界の1μg/mL基質未満であった。同じことは3,12-ジケト-ウルソデオキシコール酸のピークにも当てはまる。クロマトグラムでの最大ピークは、12-ケト-ウルソデオキシコール酸産物のピークであった。従って驚くべきことに、デヒドロコール酸から3-ケト-ウルソデオキシコール酸への、2工程の全細胞による還元が可能であることを示すことができる。HPLC測定のクロマトグラムを図7に示す。HPLC分析は以下のように行った:使用したクロマトグラフィーカラムは、Merck社、ダルムシュタット、から入手した逆相クロマトグラフィーカラムHi-barPurospher125-4RP-18e5μmであった。この場合、無極性相は固定相として働くが、極性相は移動相を形成する。HPLC分析には勾配溶出の方法を用いた。アセトニトリルの割合を増大させながら溶離液であるリン酸水pH2.6に加えると、溶媒の酸性化により、分析物が均一な程度にプロトン化される。全ての成分の溶出後、クロマトグラフィーカラムを二つの溶媒の開始比によって平衡化した。勾配溶出は、最初に一定の組成、すなわち65v/vリン酸水および35v/vアセトニトリルを有する溶媒混合物を3分間HPLCカラムへポンピングすることにより行った。3分目~7.5分目から、アセトニトリルの割合を直線的に39v/vに増大させた。それとは別に、7.5分目と10分目の間に、アセトニトリルの割合を直線的に40v/vに増大させた。全てのサンプル成分の溶出のため、アセトニトリルの割合を10分目と11分目の間にも直線的に70v/vに増大させ、この値をさらに2分間一定に保持した。その後13分目~15分目に、アセトニトリルの割合を最初の値である35に減少させ、カラムをこの溶媒組成物で3分間平衡化した。全持続時間の間、フローは1.000mL/分に設定した。溶出した分析物を、UV検出器により、波長200nmにおいて検出した。反応実施例8:FDHD221G、7β-HSDH、および3α-HSDHの単一プラスミド系における共発現による、DHCAから12-ケト-UDCAへの全細胞生体内変換目的は、細胞の単一プラスミド系において、デヒドロコール酸の12-ケト-ウルソデオキシコール酸への、2工程の全細胞による還元が可能であるか否かを調べることである。8.1使用したプラスミド:8.2ベクターの産生:プラスミド構築物pET21aFDH7β-HSDHG39A3α-HSDH図8は、以下のように調製した:プラスミドpET21aFDH7β-HSDHに始まり、野生型3α-HSDHC.テストステローニ;配列番号5および6を7β-HSDHの後に、HindIIIおよびNotI切断部位を通してクローン化した。3α-HSDHの増幅のため、プライマー、3alpha_fwd_HindIIIおよび3alpha_rev_NotIを用い、プラスミドpET22b3α-HSDHをこのための鋳型とした。次に、QuikChangeプロトコルに従った部位特異的変異誘発によって、G39A変異を7β-HSDHに挿入した。変異誘発プライマーである、7beta_mut_G39A_fwdおよび7beta_mut_G39A_revを用いた。8.3反応:調製したプラスミドによりE.coliBL21DE3hdhA-KanRを形質転換した。得られたE.coliBL21DE3hdhA-KanRpET21aFDH7β-HSDHG39A3α-HSDH株を用いて、150mL規模で以下の条件により全細胞反応を行った:細胞密度OD30、50mMDHCA、750mMギ酸ナトリウム、50mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁した細胞および基質懸濁液。反応は25°Cにて3.5時間行った。HPLC分析の結果を図9に示す手順については上記の反応実施例7を参照。産生実施例6:さらなる7β-HSDS変異体の産生およびその性質決定NADH特異的な7β-HSDHを産生する一つの可能性は、変異誘発の様々な技術により、利用可能な酵素を改変することからなる。従って、部位特異的変異誘発を用い、7β-HSDHの個々のアミノ酸を他と置換することで、NADPが安価なNADによって有利に置き換えられるように、7β-HSDHの補因子特異性がNADPHからNADHへ変化する。6.1プライマー全部で、7β-HSDH変異体G39D、G39D/R40L、G39D/R40I、およびG39D/R40Vを産生した。G39D変異体はQuickchangeを用いた変異誘発によって産生したが、その他の変異体はSanchisらによるPCR法SanchisJFernandezLCarballeiraJDDroneJGumulyaYHobenreichHKahakeawDKilleSLohmerRPeyralansJJPodtetenieffJPrasadSSoniPTaglieberAWuSZillyFEReetzMTImprovedPCRmethodforthecreationofsaturationmutagenesislibrariesindirectedevolutionapplicationtodifficulttoamplifytemplatesApplMicrobiolBiotechnol2008Nov8138797を用いて産生した。野生型と産生した変異体の配列比較を図10に示す。変異誘発には以下のプライマーを用い、斜体で示す塩基はそれぞれ交換したアミノ酸をコードする:6.27β-HSDH変異体の酵素反応速度調査調製した変異体を酵素反応速度調査によって評価し、結果を図11のグラフに示す。無改変の7β-HSDHを調べるために0.1mMNADPHを補因子として用いたが、7β-HSDH変異体を調べるためには0.5mMNADHを用いた。7β-HSDH変異体の酵素反応速度調査において補因子濃度を増大させる必要があるのは、変異体において補因子NADHの半飽和濃度が増大しているためである。特異的酵素活性に対する基質濃度のプロットから、7β-HSDH変異体ではミカエリスメンテンによる反応速度に特徴的な曲線が観察されたが、無改変の野生型7β-HSDHについてのプロットからは、基質阻害を伴うミカエリスメンテンによる反応速度の曲線が観察された。従って、古典的なミカエリスメンテンモデル方程式1を7β-HSDH変異体に対する一連の測定の評価に用い、基質阻害を伴うミカエリスメンテンモデルを、無改変の野生型7β-HSDHに対する一連の測定の評価に用いた方程式2。EAx:特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1νmax:最大特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1cS:基質または補因子濃度、molL-1Km:半飽和濃度、molL-1EAx:特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1νmax:最大特異的酵素活性、Umg-1=μmolmin-1mg-1cS:基質または補因子濃度、molL-1Km:半飽和濃度、molL-1Ki:阻害定数、molL-1以下の表に、無改変の野生型7β-HSDHおよび補因子特異性が変化したその変異体の酵素反応速度パラメータを示す。野生型に対する補因子としてNADPHを用いる一方、変異体に対する補因子としてNADHを用いた。産生実施例7:さらなる7β-HSDS変異体の産生およびその性質決定産生実施例6に平行して調製を行い、さらなる7β-HSDS変異体を産生した。7.1プライマー7β-HSDHの部位特異的変異誘発には、以下に示す変異誘発プライマーを用いた。プライマーは、所望のアミノ酸交換がもたらされるように、7β-HSDH遺伝子配列に基づいて選択した。変異される塩基はプライマーの中心に位置し、プライマー対の融点は同じ範囲に位置することに留意した。変異体の調製のために以下のプライマー対を用いた:7.2PCRプログラム反応中、最初に2分間の変性工程を98°Cにて行った。次に、変性98°Cにて30秒、プライマーハイブリダイゼーション60~68°Cにて1分、および伸長72°Cにて3.5分を23サイクル行った。最後の工程で、10分間の最終伸長を72°Cにて行い、次に4°Cに冷却してポリメラーゼ連鎖反応を停止させた。7.3PCRアッセイ7.4手順タンパク質配列中のアミノ酸の標的化された交換のため、対応する遺伝子のDNA配列を部位特異的変異に供した。このために、それらの配列中に所望の変異が含まれる、互いに相補的なプライマーを用いた。変異される遺伝子を有する、N6-アデニン-メチル化、二本鎖プラスミドDNAを鋳型として用いた。N6-アデニン-メチル化プラスミドDNAは、damE.coli株、例えばE.coliDH5から分離した。ポリメラーゼ連鎖反応は上記のように行った。所望の変異を有し、鎖を切断したプラスミドが形成されるように、プライマーを鋳型に対して相補的に伸長させた。その他のPCR反応とは対照的に、この場合、新たに形成されたDNA分子はPCR反応のための鋳型としては役立たないため、DNA収率は直線的にのみ増大する。PCR反応が完了すると、PCR-Purification-KitAnalytikJenaを用いてPCR産物を精製し、親であるN6-アデニン-メチル化DNAを制限酵素DpnIによって消化した。この酵素は、非特異的にN6-アデニン-メチル化DNAを制限切断するが、新たに形成された非メチル化DNAは制限切断しないという特色を有する。制限切断は、PCR反応混合物に1μLのDpnIを加え、37°Cにて2時間または一晩インキュベートして行った。この調製物5μlを、100μlの化学的にコンピテントなDH5α細胞の形質転換に用いた。プラスミド分離後、配列決定によって変異の成功を確認した。7.5性質決定QuikChangeプロトコルに従った部位特異的変異誘発により、7β-HSDHに変異を導入した。7.1項の表に示す変異誘発プライマーを用いた。活性の光度測定についての方法に示したアッセイを用い、変異酵素の活性をNADPHまたはNADHの存在下に測定した。見出された活性を以下の表に示す。反応実施例9:デヒドロコール酸から3,12-ジケト-UDCAへの全細胞還元におけるNADH依存性7β-HSDHの使用産生実施例6で産生したNADH-依存性7β-HSDHの、DHCAから3,12-ジケト-UDCAへの全細胞生体触媒的変換における使用について以下に示す。より良い理解のため、潜在的反応経路および反応産物の概要を図12に示す。この場合には、7β-HSDH変異体と、マイコバクテリウム-バッカエ由来のNADH依存性ギ酸デヒドロゲナーゼとを共に発現ベクターへ挿入した。7β-HSDHG39Dを挿入したベクターは、配列番号49に相当するpFr7D;7β-HSDHG39DR40Lを挿入したベクターは、配列番号50に相当するpFr7DL;7β-HSDHG39DR40Iを挿入したベクターは、配列番号51に相当するpFr7DI、および7β-HSDHG39DR40Vを挿入したベクターは、配列番号52に相当するpFr7DVである。これらのベクターの一般的なプラスミドマップを図13に示す。これらのベクターにより、E.coliBL49株E.coliBL21DE3hdhA-KanRに同じを形質転換した。これらの株から、最初に、5mLの一晩培養した培地を、100mgL-1アンピシリンを含むLB培地中で増殖させた。各々の場合に、これらの一晩の培養液1mLを、次の日に、振盪フラスコ内の100mgL-1アンピシリンを含むTB培地200mLに移した。これらを振盪インキュベータ内で、250rpm、37°Cにて、ODが0.6~0.8に達するまで培養した。次に、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTGによって誘導を行った。続く発現相を25°C、160rpmにて21時間行った。細胞を3220gで10分間遠心分離した。この方法で産生した細胞を用いて、全細胞生体内変換反応を設定した。様々な時点での、反応混合物中の基質DHCAの濃度および産物である3,12-ジケト-UDCAの濃度を、高速液体クロマトグラフィーHPLCによって決定した。生体内変換のための反応混合物は、17.7gL-1BTM全細胞生体触媒、100mM基質DHCA、500mMギ酸ナトリウムを含み、これらを50mMギ酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁させた。使用した方法は、20mL規模で、pHモニターなしのバッチ法であった。24時間後の産物および基質濃度を図14に示す。全ての変異体は、DHCAから3,12-ジケト-UDCAへの全細胞生体触媒的変換に適していることが分かる。反応実施例10:デヒドロコール酸から12-ケト-UDCAへの2工程の全細胞還元におけるNADH依存性7β-HSDHの使用DHCAから12-ジケト-UDCAへの2工程の全細胞生体触媒的変換におけるNADH依存性7β-HSDHの使用について以下に示す。変異体7β-HSDHG39D、マイコバクテリウム-バッカエ由来のNADH依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびコマモナステストステローニ由来のNADH依存性3α-HSDHを共に発現ベクターへ挿入した。7β-HSDHG39Dの使用例を、全てのNADH依存性7β-HSDHについて示す。ベクターはpFr3T7Dと称され、これを図15に示す。これらのベクターにより、E.coliBL49株E.coliBL21DE3hdhA-KanRに同じを形質転換し;得られた株をE.coliBL49pFr3T7Dと命名した。この株を7Lのバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量4Lにて培養した。37°Cでの短い初期相の後、30°Cにおける基質限定的な指数関数増殖相が続いた。吸光度が25~30に達すると、0.5mMIPTGを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を20°Cにて24時間行った。細胞32.0gL-1BTMを遠心分離によって回収し、リン酸カリウム緩衝液pH6.5に再懸濁し、標準的なプロトコルに従い-20°Cにて保管した。以下の反応条件で、20mL規模において生体内変換を設定した:100mMDHCA、17.7gL-1BTMの保管した生体触媒、500mMギ酸アンモニウム、26グリセロール、50mMMgCl2を、50mMKPi緩衝液pH6.5に懸濁させた。pHの調整はマニュアルで行い、生体内変換法の最初の5時間の間、pHを6.5に維持した。胆汁酸塩濃度を時間の関数として図16に示す。24時間後、産物である12-ケト-UDCAが92形成された。DHCAの3,12-ジケト-UDCAへの変換および7,12-ジケト-UDCAの12-ケト-UDCAへの変換により、図12に示す7β-HSDHの全ての反応が、実際に7β-HSDHG39Dによって触媒されることがわかる。反応実施例11:単一細胞系におけるデヒドロコール酸の2工程還元ウルソデオキシコール酸合成の一経路は、コール酸のデヒドロコール酸への化学的酸化と、それに続く3-カルボニル基の3α-水酸基への非対称性の酵素的還元および7-カルボニル基の7β-水酸基への非対称性の酵素的還元、ならびにそれに続く12-カルボニル基の化学的除去を含む。この合成経路では、酵素的還元反応の触媒作用に、酵素7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7β-HSDHおよび3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ3α-HSDHが必要とされる。反応中、添加した補因子NADHまたはNADPHは化学量論的に消費され、これらは経済的な方法において再生される必要がある。このために、しばしば酵素の再生の可能性が好まれる。適した酵素として、ギ酸デヒドロゲナーゼFDH、グルコースデヒドロゲナーゼGDH、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼG6PDH、アルコールデヒドロゲナーゼADH、または亜リン酸デヒドロゲナーゼPtDHが挙げられる。分離した酵素の使用とは対照的に、宿主生物、典型的には単細胞性微生物内の必要な酵素を用いる全細胞生体触媒作用において、個別の酵素を個別の濃度で反応培地に加えることは不可能である。この場合、酵素活性は、培養法または全細胞生体触媒の遺伝的改変により、関連する全ての酵素の発現レベルを改変することでバランスを取らなければならない。本実施例では、本発明に従い、三つの遺伝子、7β-HSDH、3α-HSDH、およびFDHを全て含むベクターを用いた。ベクターは、指定した宿主株、特に大腸菌BL21DE3に基づく全細胞生体触媒株において、三つの遺伝子の発現レベルを、三つの酵素全てが可能な限り同様な酵素活性となるように適応させて構築した。デヒドロコール酸から12-ケト-ウルソデオキシコール酸への全細胞還元において必要とされる三つの遺伝子は、同じ一つのベクターに位置する。これらは以下の酵素をコードする遺伝子である:コリンゼラアエロファシエンス由来のNADPH依存性7β-HSDH、コマモナステストステローニ由来のNADH依存性3α-HSDH、NADおよびNADPの両方に依存性である、マイコバクテリウム-バッカエ由来の変異FDH。これら三つの遺伝子の発現レベルは、最適な全細胞生体触媒作用が実施できるような遺伝的構築によってバランスを取ることができる。本実施例では、7β-HSDH変異体G39AおよびG39Sを、無改変の野生型酵素の代わりに全細胞生体触媒作用のためのベクターに挿入した。該ベクターをpFGr7Ar3およびpFGr7Sr3と命名し、図17aおよびbにこれらを示す。図18は、潜在的な反応経路および反応産物を示す略図である。本発明のこれらのベクターにより、大腸菌の産生株を形質転換した。これらの株は全細胞生体触媒を代表する。使用した宿主株はE.coliBL49と称される改変E.coliBL21DE3であるが、宿主生物はこの宿主株に限定されない。pFGr7Ar3によって形質転換されたE.coliBL49をE.coliBL49pFGr7Ar3と称し、pFGr7Sr3によって形質転換されたE.coliBL49をE.coliBL49pFGr7Sr3と称す。11.120mL規模における、デヒドロコール酸の2工程全細胞還元20mL規模において、全細胞生体内変換により生体触媒を比較した。このために、最初に、一晩培養した培地5mLを、100mgL-1アンピシリンを含むLB培地で増殖させた。これらの一晩の培養液1mLを、次の日に、振盪フラスコ内の100mgL-1アンピシリンを含むTB培地200mLに移した。これらを振盪インキュベータ内で、250rpm、37°Cにて、ODが0.6~0.8に達するまで培養した。次に、1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドIPTGによって誘導を行った。続く発現相を25°C、160rpmにて21時間行った。細胞を3220gで10分間遠心分離した。この方法で産生した細胞を用いて、全細胞生体内変換反応を設定した。反応混合物中に形成された産物12-ケト-UDCAの量は、細胞の評価に決定的であった。反応混合物中の基質DHCA、中間体である3,12-ジケト-UDCAおよび7,12-ジケト-UDCA、ならびに産物である12-ケト-UDCAの濃度を、高速液体クロマトグラフィーHPLCによって決定した。生体内変換のための反応混合物は、11.8gL-1BTM全細胞生体触媒、100mM基質DHCA、500mMギ酸ナトリウムを含み、これらを50mMギ酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁させた。使用した方法は、20mL規模で、pHモニターなしのバッチ法であった。上記の全細胞生体内変換の5時間経過後の結果を以下の表に示す。二つの新規株であるE.coliBL49pFGr7Sr3およびE.coliBL49pFGr7Ar3を、参照株であるE.coliBL49pFGr7pC3と比較した。参照株のE.coliBL49pFGr7pC3によればわずかに5.7±1.0の産物12-ケト-UDCAが形成されたが、新規生体触媒では、E.coliBL49pFGr7Sr3株によって38.4±8.2の12-ケト-UDCAが形成され、E.coliBL49pFGr7Ar3株によって47.7±2.1の12-ケト-UDCAが形成された。従って反応混合物における産物濃度は、参照株と比較して6.7倍E.coliBL49pFGr7Sr3および8.4倍E.coliBL49pFGr7Ar3増大した。従って、100mM基質DHCAを用いた際の、5時間後の生体内変換バッチ中の胆汁酸塩の割合を以下の表に示す。二つの新規株である生体触媒株E.coliBL49pFGr7Ar3およびE.coliBL49pFGr7Sr3によるバッチを、先行技術のE.coliBL49pFGr7pC3株との比較において示す。11.21L規模における、デヒドロコール酸の2工程全細胞還元方法の制御を通して、生体触媒E.coliBL49pFGr7Ar3による産物形成は、ミリリットル規模と比較して増大した。このために、該生体触媒を7Lバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量4Lにて培養した。37°Cでの短い初期相の後、30°Cにおける基質限定的な指数関数増殖相がみられた。吸光度が25~30に達すると、0.5mMIPTGを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を25°Cにて10時間行った後、細胞を遠心分離によって回収し、-20°Cにて保管した。以下の反応条件で、1Lバイオリアクターにおいて生体内変換を設定した:70mMDHCA、17.7gL-1BTMの保管した生体触媒、500mMギ酸ナトリウム、26V/Vグリセロール、50mMMgCl2を、50mMKPi緩衝液pH6.5に懸濁させた。pHの調整により、生体内変換の間を通してpHを6.5に維持した。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図19に示す。21時間後、産物12-ケト-UDCAが99.4形成され、副生成物である3,12-ジケト-UDCAは0.6のみ検出可能であった。反応実施例12:補因子再生にグルコースデヒドロゲナーゼを用いた、単一細胞系におけるデヒドロコール酸の2工程還元この実施例では、コリンゼラアエロファシエンス由来のNADPH依存性7β-HSDH変異体G39Aおよびコマモナステストステローニ由来のNADH依存性3α-HSDHに加え、補因子再生に対してNADおよびNADPの両方に依存性である、枯草菌由来のGDHを、DHCAから12-ケト-UDCAへの2工程還元のために全細胞生体触媒単一細胞系に発現させた。このGDHの核酸配列および関連するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号47および配列番号48に示す。このために用いたベクターは、p3T7ArGおよびp7AT3rGと称し、これらをそれぞれ図20および図21に示す。本発明のベクターにより、大腸菌の産生株を形質転換した。これらの株は全細胞生体触媒を代表する。使用した宿主株はE.coliBL49E.coliBL21DE3hdhA-KanRに同じと称される改変E.coliBL21DE3であるが、宿主生物はこの宿主株に限定されない。p7AT3rGによって形質転換されたE.coliBL49をE.coliBL49p7AT3rGと称し、p3T7ArGによって形質転換されたE.coliBL49をE.coliBL49p3T7ArGと称す。新規に産生された生体触媒により、全量17.7g/LBTMの生体触媒を使用して、100mMDHCAを98まで12-ケト-UDCAに変換することができた。12.120mL規模における、デヒドロコール酸の2工程全細胞還元20mL規模において、全細胞生体内変換により生体触媒を比較した。基質DHCA、中間体である3,12-ジケト-UDCAおよび7,12-ジケト-UDCA、ならびに産物である12-ケト-UDCAの培養および反応混合物中の濃度の決定については、反応実施例11.1に記載したように行った。生体内変換のための反応混合物は、11.8g/LBTM全細胞生体触媒、100mM基質DHCA、500mMグルコースを含み、これらを50mMギ酸カリウム緩衝液pH7.3に懸濁させた。使用した方法は、20mL規模で、pHモニターなしのバッチ法であった。生体触媒のパーフォレーションは必要ではない。以下の表は上記の全細胞生体内変換の24時間経過後の結果を示すものであり、二つの株E.coliBL49p7AT3rGおよびE.coliBL49p3T7ArGによる全細胞生体内変換の結果を示す。新規生体触媒によれば、11.8gL-1BTMの生体触媒を用いて、24時間以内に100mMデヒドロコール酸DHCAを46までE.coliBL49p3T7ArGまたは68までE.coliBL49p7AT3rG12-ケト-ウルソデオキシコール酸12-ケト-UDCAに変換することができた。100mM基質DHCAを用いた、24時間後の生体内変換バッチ中の胆汁酸塩の割合を以下の表に示す二つの新規株である生体触媒株E.coliBL49p3T7ArGおよびE.coliBL49p7AT3rG。12.2バイオリアクター内で20mL規模にて培養したE.coliBL49p7AT3rG株細胞による、デヒドロコール酸の2工程全細胞還元E.coliBL49p7AT3rG株を7Lのバイオリアクター内で、規定の最少培地中で作業容量4Lにて培養した。37°Cでの短い初期相の後、30°Cにおける基質限定的な指数関数増殖相がみられた。吸光度が25~30に達すると、0.5mMIPTGを添加して細胞のタンパク質発現を誘導した。次に、発現を20°Cにて24時間行った細胞46.7g/LBTMを遠心分離によって回収し、リン酸カリウム緩衝液pH6.5に再懸濁し、標準的なプロトコルに従い-20°Cにて保管した。回収時の酵素活性は、16.4U/mL7β-HSDH、3.6U/mL3α-HSDH、44.9U/mLGDHNADP、18.1U/mLGDHNADであった。以下の反応条件で、20mL規模において生体内変換を設定した:100mMDHCA、17.7g/LBTMの保管した生体触媒、500mMグルコース、10mMMgCl2を、50mMKPi緩衝液pH7に懸濁させた。pHの調整はマニュアルで行い、生体内変換法の間を通してpHを7に維持した。反応は補因子の添加なしで、または0.1mMNADを添加して行った。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図22に示す。2時間後、NADの添加および無添加のそれぞれにおいて、>98の産物12-ケト-UDCAが形成された。17.7g/LBTMの生体触媒を完全に用いることで、100mMDHCAは98まで12-ケト-UDCAに変換された。反応実施例13:二つの異なる全細胞生体触媒の平行使用による、デヒドロコール酸の2工程還元この実施例では、一つの全細胞生体触媒に代わって二つの全細胞生体触媒を用いた。この目的のため、マイコバクテリウム-バッカエ由来のNADP特異的FDHおよびコリンゼラアエロファシエンス由来のNADPH特異的7β-HSDHをこれらの生体触媒の一つに発現させ、一方でマイコバクテリウム-バッカエ由来のNAD依存性FDHおよびコマモナステストステローニ由来のNADH依存性3α-HSDHを別の生体触媒に発現させた。具体的に本実施例では、マイコバクテリウム-バッカエ由来のNADP特異的FDHおよびコリンゼラアエロファシエンス由来のNADPH特異的7β-HSDHに対する遺伝子を含むベクターpFGr7A、ならびにマイコバクテリウム-バッカエ由来のNAD依存性FDHおよびコマモナステストステローニ由来のNADH依存性3α-HSDHに対する遺伝子を含むベクターpFr3を使用した。ベクターpFGr7AおよびpFr3を図23aおよびbに示す。図24は、潜在的な経路および産物の反応スキームを示す。しかしながら、本発明は、記載したこれらの二つのベクターに限定されるものではなく、7β-HSDHおよび適切な補因子再生酵素に対する遺伝子を含むベクターと、3α-HSDHおよび適切な補因子再生酵素に対する遺伝子を含むベクターとの、考えられる全ての組合せを含むことができる。13.1二つの生体触媒を異なる混合比で用いた、DHCAの全細胞還元生体触媒であるE.coliBL49pFGr7AおよびE.coliBL49pFr3を異なる混合比で用いた、DHCAの12-ケト-UDCAへの全細胞還元を以下の実施例に示す。この場合には、3バッチのそれぞれにおいて全量17.7gL-1BTMの生体触媒を用いた。しかしながらバッチにおいて二つの生体触媒を異なる割合で用いた。これらは以下の通りである:-8.85gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび8.85gL-1BTME.coliBL49pFr3-10.33gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび7.38gL-1BTME.coliBL49pFr3-11.80gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび5.90gL-1BTME.coliBL49pFr3。これらの生体触媒作用反応は、作業容量20mLにて行った。バッチのさらなる構成物質は、70mMDHCA、ギ酸ナトリウム500mL、26グリセロール、50mMMgCl2を、50mLリン酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁させたものである。反応は24時間行った。24時間後の胆汁酸塩の割合を図25に示す。8.85gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび8.85gL-1BTME.coliBL49pFr3の調製では、7912-ケト-UDCA、43,12-ジケト-UDCA、および177,12-ジケト-UDCAが形成され、10.33gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび7.38gL-1BTME.coliBL49pFr3の調製では、8712-ケト-UDCA、93,12-ジケト-UDCA、および47,12-ジケト-UDCAが形成され、11.80gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび5.90gL-1BTME.coliBL49pFr3の調製では、7112-ケト-UDCAおよび293,12-ジケト-UDCAが形成された。形成された中間体の割合からみると、8.85gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび8.85gL-1BTME.coliBL49pFr3による調製の場合には、中間体7,12-ジケト-UDCAが高い割合で形成されたことから、3α-HSDHの反応が高率で起こったと考えられ、一方で11.80gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび5.90gL-1BTME.coliBL49pFr3による調製の場合には、7β-HSDHの反応が高率で起こり、従って中間体3,12-ジケト-UDCAが高い割合で形成された。10.33gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび7.38gL-1BTME.coliBL49pFr3による調製の場合には、中間体のほとんど均一に形成されたことにみられるように、7β-HSDHおよび3α-HSDHの反応は、両方が大体同じ比率で起こるように調整された。結果として産物12-ケト-UDCA87は、この調製において最も高い割合で形成することができた。この実施例により、それぞれの反応工程の比率は、使用する生体触媒の割合を調整することによって影響されることが示された。13.1二つの生体触媒を1L規模で用いた、DHCAの全細胞還元生体触媒であるE.coliBL49pFGr7AおよびE.coliBL49pFr3を用いた方法の制御を通し、産物形成はミリリットル規模と比較して増大した。以下の反応条件で、1Lバイオリアクターにおいて生体内変換を設定した:8.85gL-1BTME.coliBL49pFGr7Aおよび8.85gL-1BTME.coliBL49pFr3を含む90mMDHCA、500mMギ酸アンモニウム、26V/Vグリセロール、50mMMgCl2を、50mMKPi緩衝液pH6.5に懸濁させた。ギ酸を用いたpHの調整により、生体内変換の間を通してpHを6.5に維持した。胆汁酸塩濃度の変動を時間の関数として図26に示す。20時間後、産物12-ケト-UDCAが99.4形成され、中間体である3,12-ジケト-UDCAおよび7,12-ジケト-UDCAは総量で0.6のみ検出可能であった。本発明の生体触媒を全量17.7gL-1BTM使用することにより、90mMDHCAを99.5まで12-ケト-UDCAに変換することができた。本明細書において言及される文書の開示に対しては、明確な参照が為される。"