"下記の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ;1分子量:ゲルろ過法による分子量が約138,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量27kDaおよび33kDaの2つのサブユニットに分離される、2作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、3至適pH;pH7.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、4至適温度;40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、5pH安定性;pH4-9が安定領域である、および6温度安定性;50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。更に次の理化学的性質を有する請求項1に記載のニトリルヒドラターゼ;7シアン耐性:シアン5mMで30分間処理し98以上の残存活性を示す、またはシアン10mMで30分間処理し15以上の残存活性を示す。ゴルドニア属に由来する請求項1に記載のニトリルヒドラターゼ。受領番号FERMAP20640として寄託されたゴルドニアspBR1株に由来する請求項1に記載のニトリルヒドラターゼ。受領番号FERMAP20640として寄託されたゴルドニアspBR1株を培養、培養物からニトリルヒドラターゼを回収する工程を含む、請求項1に記載のニトリルヒドラターゼの製造方法。以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、およびa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体;1作用ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする;αサブユニット;A配列番号:1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、βサブユニット:a配列番号:3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:4に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:4に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。αサブユニットが配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む請求項6に記載の蛋白質複合体。βサブユニットが配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む請求項6に記載の蛋白質複合体。請求項6に記載の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;A配列番号:1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。請求項6に記載の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;a配列番号:3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:4に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:4に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。請求項9、または請求項10に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。請求項9および請求項10に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクター。請求項9および請求項10に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクターによって形質転換された形質転換体。宿主が微生物である請求項13に記載の形質転換体。請求項14に記載の形質転換体を培養し、培養物からニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質を回収する工程を含む、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質の製造方法。請求項1に記載のニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、請求項6に記載の蛋白質複合体、請求項13に記載の形質転換体、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質とニトリル化合物とを接触させ、生成するアミドを回収する工程を含む、アミドの製造方法。下記の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ;分子量:ゲルろ過法による分子量が約136,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量26kDaおよび36kDaの2つのサブユニットに分離される、作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、至適pH:pH8.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、至適温度:40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、pH安定性:pH4-9が安定領域である、および温度安定性:50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。更に次の理化学的性質を有する請求項17に記載のニトリルヒドラターゼ;有機溶媒耐性:メタノール、エタノール、およびnヘキサンからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を20含む水溶液で10分間処理して70の残存活性を示す。ロドコッカス属に由来する請求項17に記載のニトリルヒドラターゼ。受領番号FERMAP20642として寄託されたロドコッカスspAdp12株に由来する請求項17に記載のニトリルヒドラターゼ。受領番号FERMAP20642として寄託されたロドコッカスspAdp12株を培養する工程を含む、請求項17に記載のニトリルヒドラターゼの製造方法。以下の[A]~[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、および[a]~[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体;1作用;ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、αサブユニット:[A]配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[B]配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[C]配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[D]配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[E]配列番号:6に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、βサブユニット:[a]配列番号:7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[b]配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[c]配列番号:8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[d]配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[e]配列番号:8に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。αサブユニットが配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む請求項22に記載の蛋白質複合体。βサブユニットが配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む請求項22に記載の蛋白質複合体。請求項22に記載の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;A配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:6に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。請求項22に記載の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;a配列番号:7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:8に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。請求項25、または請求項26に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。請求項25および請求項26に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクター。請求項25および請求項26に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクターにより形質転換された形質転換体。宿主が微生物である請求項29に記載の形質転換体。請求項30に記載の形質転換体を培養し、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質を回収する工程を含む、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質の製造方法。請求項17に記載のニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、請求項22に記載の蛋白質複合体、請求項29に記載の形質転換体、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質とニトリル化合物とを接触させ、生成するアミドを回収する工程を含む、アミドの製造方法。本発明の課題は、高いニトリル水和活性を持つニトリルヒドラターゼを提供することである。また本発明は、高い酵素活性を長時間維持することができる安定なニトリルヒドラターゼの提供を課題とする。本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ロドコッカス属とゴルドニア属に属する微生物中に極めて高いニトリル水和活性を有するニトリルヒドラターゼを見出した。そしてこのニトリルヒドラターゼが、前記の課題を解決しうる新規な酵素であることを確認して本発明を完成した。そして該酵素をコードする遺伝子をDNA組換え技術によりクローニングし、得られた遺伝子を発現ベクターに組み込んで得られる発現プラスミドを用いて大腸菌の形質転換を作製した。更に、得られた形質転換体によりニトリルヒドラターゼを大量に生産させることに成功し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のニトリルヒドラターゼ、この酵素をコードするポリヌクレオチド、その製造方法、並びに本発明の酵素によるアミドの製造方法を提供する。1下記の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ;1分子量:ゲルろ過法による分子量が約138,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量27kDaおよび33kDaの2つのサブユニットに分離される、2作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、3至適pH;pH7.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、4至適温度;40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、5pH安定性;pH4-9が安定領域である、および6温度安定性;50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。2更に次の理化学的性質を有する1に記載のニトリルヒドラターゼ;7シアン耐性:シアン5mMで30分間処理し98以上の残存活性を示す、またはシアン10mMで30分間処理し15以上の残存活性を示す。3ゴルドニア属に由来する1に記載のニトリルヒドラターゼ。4受領番号FERMAP20640として寄託されたゴルドニアspBR1株に由来する1に記載のニトリルヒドラターゼ。5受領番号FERMAP20640として寄託されたゴルドニアspBR1株を培養、培養物からニトリルヒドラターゼを回収する工程を含む、1に記載のニトリルヒドラターゼの製造方法。6以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、およびa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体;1作用ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする;αサブユニット;A配列番号:1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、βサブユニット:a配列番号:3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:4に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:4に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。7αサブユニットが配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む6に記載の蛋白質複合体。8βサブユニットが配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む6に記載の蛋白質複合体。96に記載の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;A配列番号:1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。106に記載の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;a配列番号:3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:4に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:4に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。119、または10に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。129および10に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクター。139および10に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクターによって形質転換された形質転換体。14宿主が微生物である13に記載の形質転換体。1514に記載の形質転換体を培養し、培養物からニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質を回収する工程を含む、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質の製造方法。161に記載のニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、6に記載の蛋白質複合体、13に記載の形質転換体、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質とニトリル化合物とを接触させ、生成するアミドを回収する工程を含む、アミドの製造方法。17下記の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ;分子量:ゲルろ過法による分子量が約136,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量26kDaおよび36kDaの2つのサブユニットに分離される、作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、至適pH:pH8.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、至適温度:40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、pH安定性:pH4-9が安定領域である、および温度安定性:50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。18更に次の理化学的性質を有する17に記載のニトリルヒドラターゼ;有機溶媒耐性:メタノール、エタノール、およびnヘキサンからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を20含む水溶液で10分間処理して70の残存活性を示す。19ロドコッカス属に由来する17に記載のニトリルヒドラターゼ。20受領番号FERMAP20642として寄託されたロドコッカスspAdp12株に由来する17に記載のニトリルヒドラターゼ。21受領番号FERMAP20642として寄託されたロドコッカスspAdp12株を培養する工程を含む、17に記載のニトリルヒドラターゼの製造方法。22以下の[A]~[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、および[a]~[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体;1作用;ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、αサブユニット:[A]配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[B]配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[C]配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[D]配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[E]配列番号:6に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、βサブユニット:[a]配列番号:7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[b]配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[c]配列番号:8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[d]配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[e]配列番号:8に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。23αサブユニットが配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む22に記載の蛋白質複合体。24βサブユニットが配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む22に記載の蛋白質複合体。2522に記載の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;A配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:6に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。2622に記載の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードするポリヌクレオチドであって、以下のa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチド;a配列番号:7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:8に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。2725、または26に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。2825および26に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクター。2925および26に記載のポリヌクレオチドのいずれか、または両方が挿入された組換えベクターにより形質転換された形質転換体。30宿主が微生物である29に記載の形質転換体。3130に記載の形質転換体を培養し、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質を回収する工程を含む、ニトリルヒドラターゼ、またはニトリルヒドラターゼのサブユニット蛋白質の製造方法。3217に記載のニトリルヒドラターゼ、当該ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、22に記載の蛋白質複合体、29に記載の形質転換体、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質とニトリル化合物とを接触させ、生成するアミドを回収する工程を含む、アミドの製造方法。本発明は、アクリロニトリルを基質としてアクリルアミドを生成することができるニトリルヒドラターゼを提供する。アクリルアミドは、凝集剤の原料として有用な化合物である。本発明は、アクリルアミドを酵素的に生成することができるニトリルヒドラターゼを提供するとともに、その遺伝子をクローニングした。本発明によって提供されるニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子は、適当な宿主細胞に形質転換することにより、本発明のニトリルヒドラターゼを高い水準で発現する。したがって、本発明によって得ることができる形質転換体そのもの、あるいは形質転換体から得られる酵素蛋白質は、アクリルアミドの酵素的な製造に有用である。遺伝子組み換えによって製造された公知のニトリルヒドラターゼの多くが、高い酵素活性を達成できなかったのに対して、本発明のニトリルヒドラターゼは、遺伝子組み換え体においても高い活性を維持する点で優れている。また本発明のニトリルヒドラターゼは、好ましい態様において、有機溶媒の存在下においても高い酵素活性を維持する。一般に酵素蛋白質は、有機溶媒との接触によって、しばしば酵素活性が低下する。しかし本発明によって提供されたニトリルヒドラターゼは、有機溶媒との接触後、あるいは有機溶媒存在下においても、高い酵素活性を維持する。アミドの製造においては、原料となる基質化合物を溶解させるために、しばしば有機溶媒が利用される。したがって、当該酵素反応に用いられる酵素触媒が、有機溶媒耐性を有することは、アミドの製造において有利である。あるいは本発明のニトリルヒドラターゼは、好ましい態様において、シアンの存在下においても高い酵素活性を維持する。極性溶媒中では、基質化合物であるα-ヒドロキシニトリルが青酸とアルデヒドに解離する。青酸はシアンを生じ、しばしば酵素活性の低下の原因となる。アルデヒドもまた、蛋白質に障害を与え、酵素活性低下の原因となる。公知のニトリルヒドラターゼが工業的な利用に耐えられなかった理由の一つは、このシアンやアルデヒドの影響によって酵素活性が低下することにあった。本発明のヒドラターゼは、シアンやアルデヒドの存在下であっても、酵素活性を維持する。そのため、アルデヒドと青酸から生成するα-ヒドロキシニトリルを基質として利用することができる。したがって、本発明のニトリルヒドラターゼは、α-ヒドロキシニトリルを原料とするアミドの製造方法に有用である。本発明におけるニトリルヒドラターゼ活性は、次のようにして確認することができる。まず、基質として10vvの2-ヒドロキシ-4-メチルチオブチロニトリルを含む、01Mリン酸カリ緩衝液に、酵素標品を加える。酵素標品に代えて、微生物の菌体や、粗精製酵素を用いることもできる。酵素添加後、20°Cで15分間反応させる。反応液を過剰量の01リン酸溶液に加えて激しく振盪することによって反応を停止し、生成物を分析する。反応生成物は、HPLCによって分析することができる。この測定方法に基づいて、ニトリルヒドラターゼ1Uは標準反応液組成において20°Cで1分間に1μmolのニコチンアミドを生成する酵素量、1Uは標準反応液組成において20°Cで1分間に1μmolのHMBAmを生成する酵素量と定義した。具体的には、たとえば実施例に示すような操作により、酵素活性の測定が可能である。また、蛋白質の定量は、バイオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。また本発明における有機溶媒耐性とは、有機溶媒で処理した後に、酵素活性が維持されることを言う。本発明のニトリルヒドラターゼは、たとえば20のアセトンで20°Cで10分間処理したときに、酵素活性は実質的に低下しない。本発明において、酵素活性が低下しないとは、有機溶媒の無い状態で同じ条件で処理した場合と比較して、たとえば60-100、好ましくは65-100、より具体的には70-100の酵素活性が維持されることを言う。本発明のニトリルヒドラターゼは、アセトンのほか、好ましくは、メタノール、酢酸エチル、あるいはnヘキサンなどの有機溶媒に対する耐性を有する。なお本発明において、有機溶媒の存在下において、有機溶媒の無い状態と比較してより高い酵素活性を示す酵素蛋白質は、有機溶媒耐性を有する酵素に含まれる。同様に、有機溶媒との接触後に、有機溶媒との接触前と比較して、より高い酵素活性を獲得する酵素も、有機溶媒耐性を有するという。一方、本発明のシアン耐性とは、1mMのシアンイオン存在下、20°Cで30分の条件で処理した時にニトリルヒドラターゼ活性が40以上残存することを言う。または、5mMのシアンイオン存在下、20°Cで30分の条件で処理した時にニトリルヒドラターゼ活性が10以上残存するとき、その酵素はシアン耐性を有すると言うことができる。本発明によるニトリルヒドラターゼは、上記の条件で処理した後に、通常40ー50、たとえば40-60、あるいは40-100の活性を維持する。なお本発明において、シアン共存下において、シアンの存在しない場合と比較してより高い酵素活性を示す酵素は、シアン耐性を有する酵素に含まれる。本発明は、以下の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼを提供する。分子量:ゲルろ過法による分子量が約136,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量26kDaおよび36kDaの2つのサブユニットに分離される、作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、至適pH:pH8.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、至適温度:40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、pH安定性:pH4-9が安定領域である、および温度安定性:50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。好ましい態様において、本発明のニトリルヒドラターゼは、前記性状に加え、更に次の性状を有する。有機溶媒耐性:メタノール、エタノール、およびnヘキサンからなる群から選択されたいずれかの有機溶媒を20含む水溶液で10分間処理して70の残存活性を示す。本発明は、以下の理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼを提供する。1分子量:ゲルろ過法による分子量が約138,000、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量27kDaおよび33kDaの2つのサブユニットに分離される、2作用:ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、3至適pH;pH7.0~9.0でニトリル基の水和作用が至適である、4至適温度;40~45°Cでニトリル基の水和作用が最大活性を示す、5pH安定性;pH4-9が安定領域である、および6温度安定性;50°Cで15分間の熱処理をして65以上の残存活性を示す。好ましい態様において、本発明のニトリルヒドラターゼは、前記性状16に加え、更に次の性状7を有する。7シアン耐性:シアン5mMで30分間処理し98以上の残存活性を示す、またはシアン10mMで30分間処理し15以上の残存活性を示す。好ましい態様において、本発明のニトリルヒドラターゼは、シアン5mMで30分間処理し98以上の残存活性を示し、かつシアン10mMで30分間処理し15以上の残存活性を示す。本発明のニトリルヒドラターゼは、該酵素を産生する微生物から通常の蛋白質の精製方法により、精製することができる。上記微生物は、細菌の培養に用いられる一般的な培地で培養される。培地には、ニトリルヒドラターゼを誘導するための化合物を添加することができる。たとえば、ニトリル化合物や、アミド化合物の添加により、ニトリルヒドラターゼの活性を高めることができる。より具体的には、アセトニトリルやアセトアミド等を、酵素の誘導剤として用いることができる。該酵素を産生する微生物は、十分に増殖させた後に菌体を回収し、適当な緩衝液中で、破砕して無細胞抽出液とする。緩衝液には、2メルカプトエタノール等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリドのようなプロテアーゼ阻害剤を加えることができる。得られた無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画や各種のクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより、ニトリルヒドラターゼを精製することができる。蛋白質の溶解度による分画方法としては、例えばアセトンやジメチルスルホキシドのような有機溶媒による沈澱や硫安による塩析等を利用することができる。一方クロマトグラフィーには、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いた多くのアフィニティクロマトグラフィーが公知である。より具体的には、例えば、フェニルトヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、DEAEセファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブチルトヨパールを用いた疎水クロマトグラフィー、ブルーセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、スーパーデックス200を用いたゲルろ過等を経て、本発明のニトリルヒドラターゼを電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することができる。微生物としては、たとえばゴルドニア属あるいはロドコッカス属に属する微生物を用いることができる。より具体的には、ゴルドニアspBR1ならびにロドコッカスspAdp12は、本発明のニトリルヒドラターゼの産生菌として望ましい微生物である。ゴルドニアspBR1ならびにロドコッカスspAdp12は、受領番号FERMAP20640および受領番号FERMAP20642として特許微生物寄託センターに寄託されている。ゴルドニアspBR1の寄託:寄託機関の名称あて名名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターあて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号中央第6郵便番号3058566寄託日平成17年8月25日受領番号FERMAP20640ロドコッカスspAdp12の寄託:寄託機関の名称あて名名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターあて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号中央第6郵便番号3058566寄託日平成17年8月25日受領番号FERMAP20642ゴルドニアspBR1の16srDNAの塩基配列は、GordoniahydrophobicaDSM44015株の16srDNAとの相同性が確認された。したがって、ゴルドニアspBR1は、Gordoniahydrophobicaと極めて近縁の種であると推定された。またロドコッカスspAdp12の16srDNAの部分塩基配列は図6のとおりであった。当該塩基配列を公知のrDNAの塩基配列と比較したところ、次に示すような相同性が確認された。ロドコッカスspAdp12は、Rhodococcusrhodochrousと極めて近縁の種であると推定された。菌種GeneBankAccessionNo相同性RhodococcusspAN22AB087282100RhodococcusspT104AY286493992RhodococcusrhodochrousX80624984RhodococcusrhodochrousX70295981RhodococcusspAJ007002981ロドコッカスspAdp12の16srDNAの部分塩基配列は図6のとおりであった。したがって、16srDNAに図6に記載の塩基配列を含む微生物は、本発明の、ニトリルヒドラターゼの産生菌として望ましい微生物である。すなわち本発明は、16srDNAに図6に記載の塩基配列を含む微生物に由来し、に記載の理化学的性状を有する、ニトリルヒドラターゼを提供する。微生物の16srDNAの塩基配列は、公知の方法によって決定することができる。ゴルドニアspBR1から得ることができる本発明のニトリルヒドラターゼは、前記理化学的性状17を有する新規な酵素である。構造的には、理化学的性状1に記載したとおり、SDSPAGEによる分子量27kDaのαサブユニットと、33kDaのβサブユニットよりなるヘテロ4量体蛋白質である。αサブユニットのアミノ酸配列を配列番号:2874アミノ酸残基に、そしてβサブユニットのアミノ酸配列を配列番号:4170アミノ酸残基に示した。ロドコッカスspAdp12から得ることができる本発明のニトリルヒドラターゼは、前記理化学的性状を有する新規な酵素である。構造的には、理化学的性状に記載したとおり、SDSPAGEによる分子量26kDaのαサブユニットと、36kDaのβサブユニットよりなるヘテロ4量体蛋白質である。αサブユニットのアミノ酸配列を配列番号:6825アミノ酸残基に、そしてβサブユニットのアミノ酸配列を配列番号:8121アミノ酸残基に示した。これらの知見に基づいて、本発明のニトリルヒドラターゼを遺伝子工学的に得ることができる。すなわち本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する以下の蛋白質複合体を提供する。本発明によって提供されるニトリルヒドラターゼは、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、およびa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体である。1作用ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする;本発明の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードする遺伝子には、以下のA~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることができる。本発明において、A~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチドは、本発明のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの発現に有用である。A配列番号:1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、B配列番号:2に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、C配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、D配列番号:1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびE配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。また本発明の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードする遺伝子には、以下のa~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることができる。本発明において、a~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドは、本発明のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの発現に有用である。a配列番号:3に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、b配列番号:4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、c配列番号:4に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、d配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびe配列番号:3に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。あるいは本発明によって提供されるニトリルヒドラターゼは、以下の[A]~[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるαサブユニット、および[a]~[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるβサブユニットからなり、以下の理化学的性質1を有する蛋白質複合体である。1作用;ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基を水和してアミド基にする、本発明の蛋白質複合体を構成するαサブユニットをコードする遺伝子には、以下の[A]~[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることができる。本発明において、[A]~[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチドは、本発明のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの発現に有用である。[A]配列番号:5に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[B]配列番号:6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[C]配列番号:6に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[D]配列番号:5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[E]配列番号:6に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。また本発明の蛋白質複合体を構成するβサブユニットをコードする遺伝子には、以下の[a]~[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることができる。本発明において、[a]~[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドは、本発明のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの発現に有用である。[a]配列番号:7に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、[b]配列番号:8に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[c]配列番号:8に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、[d]配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および[e]配列番号:8に記載のアミノ酸配列と70以上の相同性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。本発明の蛋白質複合体は、本発明のニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドを単離し、遺伝子組み換え技術を利用して、ニトリルヒドラターゼを発現させることができる。本発明のニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。本発明において明らかにされたニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードするポリヌクレオチド、およびβサブユニットをコードするポリヌクレオチドの塩基配列、並びにこれらの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、いずれも新規である。本発明によって明らかにされたこれらの塩基配列情報に基いて、目的とする遺伝子を上記寄託微生物から取得することができる。遺伝子の取得には、PCRやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、DNA合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。更に上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来するニトリルヒドラターゼ遺伝子を取得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくはその一部の配列をプローブとして他の生物から調製したDNAに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のニトリルヒドラターゼを単離することができる。また、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号:1および配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドが含まれる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドには、配列番号:5および配列番号:7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドが含まれる。これらの塩基配列は、それぞれ配列番号:17または配列番号:18に記載したゴルドニアBR1およびロドコッカスadp12のゲノム塩基配列の、それぞれ次の領域から選択された塩基配列である。αサブユニットβサブユニットゴルドニアBR1874-1545170-874配列番号:17配列番号:1配列番号:3ロドコッカスadp12825-1421121-825配列番号:18配列番号:5配列番号:7ここでロドコッカスadp12のβサブユニットの開始コドンゲノム上で121-123、配列番号:7の1-3はgtgである。通常、gtgはバリンのコドンである。しかし本発明のニトリルヒドラターゼのようなサブユニット構造を有する蛋白質においては、開始コドンが通常とは異なる遺伝暗号で構成される場合がある。たとえばロドコッカスロドクロウスJ1のニトリルヒドラターゼにおいても、αサブユニットの開始コドンはgtgである。しかし蛋白質のN末端はMetであることが確認されている。本発明におけるロドコッカスadp12のβサブユニットも、N末端のアミノ酸配列解析により、N末端のアミノ酸残基がMetであることが確認された配列番号:14。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、これらの塩基配列の任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば40、60または100個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、例えばECLdirectnucleicacidlabelinganddetectionsystemを用いて、マニュアルに記載の条件例えば、wash:42°C、05xSSCを含むprimarywashbufferにおいて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的なストリンジェントな条件とは、例えば、通常、42°C、2×SSC、01SDSの条件であり、好ましくは50°C、2×SSC、01SDSの条件であり、さらに好ましくは、65°C、01×SSCおよび01SDSの条件であるが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。また、上記塩基配列情報に基づいて、ホモロジーの高い領域からPCR用のプライマーをデザインすることができる。このようなプライマーを用い、染色体DNAもしくはcDNAを鋳型としてPCRを行えば、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を種々の生物から単離することもできる。なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得ることもできる。このようにして単離されたポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。すなわち本発明は、単離されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる形態で存在するポリヌクレオチドを言う。たとえば、ベクターや他の生物のゲノムにインテグレートされたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。あるいは、cDNA、PCR産物、あるいは制限酵素の切断断片として得られた本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。あるいは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部として利用されたポリヌクレオチドも、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドとは異なる形態で存在するポリヌクレオチドを言う。たとえば、ベクターや他の生物のゲノムにインテグレートされたポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。あるいは、cDNA、PCR産物、あるいは制限酵素の切断断片として得られた本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。あるいは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部として利用されたポリヌクレオチドも、単離されたポリヌクレオチドに含まれる。本発明の方法においては、天然型の酵素のみならず、前記理化学的性質あるいは17を有する蛋白質複合体を構成できる限り、天然型酵素のアミノ酸配列に対して1または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなる酵素を用いることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法NucleicAcidRes10pp6487MethodsinEnzymol100pp448MolecularCloning2ndEdtColdSpringHarborLaboratoryPressPCRAPracticalApproachIRLPresspp200などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および/または付加変異を導入することにより、蛋白質の構造を改変することができる。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の方法において用いることができる。また、本発明の方法においては、ニトリルヒドラターゼの各サブユニットのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも、その産物が前記理化学的性質あるいは17を有する蛋白質複合体を構成できる限り、本発明に含まれる。アミノ酸配列のホモロジーは、FASTAprogramやBLASTprogramなどのホモロジー検索用のプログラムによって決定することができる。更に、上記データベースをこれらのプログラムを用いて検索するサービスも、インターネット上で提供されている。下記の配列番号に記載のアミノ酸配列と、少なくとも70、通常80、あるいは85、好ましくは90以上、より好ましくは95、更には98以上のホモロジーを有する蛋白質は、本発明の本発明に用いるニトリルヒドラターゼを構成する蛋白質として好ましい。ここでいうホモロジーとは、たとえば、BLASTprogramを用いたPositiveの相同性の値を示す。αサブユニットβサブユニットゴルドニアBR1配列番号:2配列番号:4ロドコッカスadp12配列番号:6配列番号:8前記配列番号に記載の各アミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。あるいは、たとえば20以下、具体的には10、好ましくは5以下、より好ましくは3、更には2以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。本発明において、前記アミノ酸配列からなるαサブユニットおよびβサブユニットに対して、それぞれアミノ酸配列に変異を有する蛋白質によって蛋白質複合体を得る場合、いずれか一方、あるいは両方を変異体とすることができる。あるいは、由来の異なるサブユニットを組み合せて本発明の蛋白質複合体とすることもできる。いずれか一方のサブユニットを変異体とするには、他方のサブユニットと蛋白質複合体を形成させたときに、前記理化学的性質1を有する蛋白質複合体を構成することができる変異体を選択する。更に、αサブユニットとβサブユニットの両方に変異体を用いる場合には、変異体に対して変異体を組み合せ、同様にして前記理化学的性質1を有する蛋白質複合体を構成することができる変異体を選択する。このとき、予め野生型のアミノ酸配列を有するサブユニットとの組み合せにおいて必要な理化学的性質を獲得することが明らかな変異体を用い、当該変異体との組み合せにおいて必要な理化学的性質を示す変異体を選択するようにすれば、変異体を容易に選択することができる。本発明における望ましい変異体は、前記理化学的性質1に加えて、更に前記理化学的性質あるいは17を有する。本発明においてニトリルヒドラターゼ、あるいは蛋白質複合体は、配列番号:2および配列番号:4、あるいは配列番号:6および配列番号:8に記載のアミノ酸配列によって特定されたαサブユニットとβサブユニットによって構成される蛋白質複合体と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやHAタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明のニトリルヒドラターゼ、あるいはタンパク質複合体は、配列番号:2および配列番号:4、あるいは配列番号:6および配列番号:8に記載のアミノ酸配列によって特定されたαサブユニットとβサブユニットによって構成される蛋白質複合体と機能的に同等な活性を有する限り、断片であることもできる。本発明において機能的に同等なタンパク質複合体は、たとえば、次の条件iおよびiiの両方を有する蛋白質複合体を含む。iニトリルヒドラターゼ活性を有する、iiシアン耐性と有機溶媒耐性のいずれか、または両方を有する本発明のニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質複合体は、実質的に純粋なタンパク質とすることができる。本発明において、実質的に純粋なタンパク質とは、他の生物学的な分子を実質的に含まないことを言う。より具体的には、実質的に純粋なタンパク質とは、乾燥重量で、通常75以上、あるいは80以上、好ましくは85以上、より好ましくは95以上、更に好ましくは99以上の純度を有する。タンパク質の純度を決定する方法は公知である。具体的には、各種カラムクロマトグラフィー、あるいはSDS-PAGE等の電気泳動分析によって、タンパク質の純度を知ることができる。本発明における好ましい酵素活性物質として、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現させた形質転換体、もしくはその処理物を示すことができる。本発明においてニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質複合体を構成する各サブユニットをコードするDNAを含む組換えベクターにより形質転換され、ニトリルヒドラターゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。各サブユニットをコードするDNAは、単一のベクターに保持させることもできる。また各サブユニットを異なるベクターに保持させ、共形質転換することで本発明の蛋白質複合体を発現させることもできる。更に、単一のサブユニットのみを発現する形質転換体を混合することによって、目的とする蛋白質複合体をinvitroで得ることもできる。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。エシェリヒア属バチルス属シュードモナス属セラチア属ブレビバクテリウム属コリネバクテリイウム属ストレプトコッカス属ラクトバチルス属など宿主ベクター系の開発されている細菌ロドコッカス属ストレプトマイセス属など宿主ベクター系の開発されている放線菌サッカロマイセス属クライベロマイセス属シゾサッカロマイセス属チゴサッカロマイセス属ヤロウイア属トリコスポロン属ロドスポリジウム属ピキア属キャンディダ属などの宿主ベクター系の開発されている酵母ノイロスポラ属アスペルギルス属セファロスポリウム属トリコデルマ属などの宿主ベクター系の開発されているカビ形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる例えば、Sambrookら、モレキュラークローニング、ColdSpringHarborLaboratories。微生物中などにおいて、本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写翻訳させる必要がある。そのためには、転写翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5側上流に、より好ましくはターミネーターを3側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ-などに関して微生物学基礎講座8遺伝子工学共立出版、特に酵母に関しては、AdvBiochemEng4375102、Yeast8423488、などに詳細に記述されている。例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒアコリにおいては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac、trp、tac、trc、λファージPL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のpSE420Invitrogen製のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D特開2000189170に記載が好適に利用できる。バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr、npr、amyなどが利用できる。シュードモナス属においては、シュードモナスプチダ、シュードモナスセパシアなどで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクターpKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ特開平5284973遺伝子などが利用できる。ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムにおいては、pAJ43などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウムグルタミカムにおいては、pCS11、pCB101などのプラスミドベクターが利用可能である。ストレプトコッカス属においては、pHV1301、pGK1ApplEnvironMicrobiol5094などがプラスミドベクターとして利用可能である。ラクトバチルス属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1JBacteriol137614などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。ロドコッカス属においては、ロドコッカスロドクロウスから単離されたプラスミドベクターが使用可能である。ストレプトマイセス属においては、HopwoodらのGeneticManipulationofStreptomycesALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoriesに記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセスリビダンスにおいては、pIJ486、pKC1064、pUWLKSが使用できる。また、ストレプトマイセスバージニアにおいても、同様のプラスミドを使用することができるActinomycetol114653。サッカロマイセス属、特にサッカロマイセスセレビジアエにおいては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクターEP537456などは、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH、GAPDH、PHO、GAL、PGK、ENOなどのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。クライベロマイセス属、特にクライベロマイセスラクティスにおいては、サッカロマイセスセレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミドJBacteriol145382390、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミドEP537456などなどが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。シゾサッカロマイセス属においては、シゾサッカロマイセスポンベ由来のARS及びサッカロマイセスセレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能であるMolCellBiol680。また、シゾサッカロマイセスポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できるEMBOJ6729。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。チゴサッカロマイセス属においては、チゴサッカロマイセスロウキシ由来のpSB3NucleicAcidsRes134267などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセスセレビジアエ由来PHO5プロモーターや、チゴサッカロマイセスロウキシ由来GAPZrのプロモーターAgriBiolChem542521などが利用可能である。ピキア属においては、ピキアパストリスなどにピキア由来自律複製に関与する遺伝子などを利用した宿主ベクター系が開発されておりMolCellBiol53376、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できるNucleicAcidsRes153859。また、ピキアアンガスタにおいて宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキアアンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子HARS1、HARS2も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効であるYeast7431443。また、メタノールなどで誘導されるAOXアルコールオキシダーゼ、FDHのプロモーターなどが利用可能である。キャンディダ属においては、キャンディダマルトーサ、キャンディダアルビカンス、キャンディダトロピカリス、キャンディダウチルスなどにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダマルトーサにおいてはキャンディダマルトーサ由来ARSがクローニングされAgriBiolChem51511587、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている特開平08173170。アスペルギルス属においては、アスペルギルスニガー、アスペルギルスオリジーなどがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能であるTrendsinBiotechnology7283287。トリコデルマ属においては、トリコデルマリーゼイを利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できるBiotechnology7596603。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫Nature315592594や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。形質転換体の培養、および形質転換体からのニトリルヒドラターゼの精製は、当業者に公知の方法により行うことができる。本発明のベクターにおいて、ニトリルヒドラターゼをコードするDNAとしては、たとえば前記A~Eのいずれかに記載のポリヌクレオチド、および前記a~eのいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いることができる。同様に前記[A]-[E]のいずれかに記載のポリヌクレオチド、および前記[a]-[e]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを、ニトリルヒドラターゼをコードするDNAとして利用することができる。本発明のベクターにおいて、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットとβサブユニットをコードするDNAは、タンデムに連結するのが好ましい。タンデムに連結するとは、共通の発現制御領域の支配下に、これらのサブユニットが発現するように配置することを言う。このような配置とすることにより、より効率的なサブユニットの発現と、酵素活性を有する蛋白質複合体の形成を期待することができる。あるいは各サブユニットを別のベクターに保持させておき、2つのベクターを共形質転換することによって蛋白質複合体を形成させることもできる。本発明はまた、本発明のベクターを発現可能に保持した形質転換体に関する。本発明のベクターは、ベクターを機能的に保持しうる宿主であれば任意の宿主に形質転換することができる。このような宿主としては、たとえば大腸菌を用いることができる。本発明のニトリルヒドラターゼ、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、本発明の蛋白質複合体、蛋白質複合体を産生する形質転換体、およびそれらの処理物は、ニトリル化合物を基質とする、アミドの製造に有用である。すなわち本発明は、本発明のニトリルヒドラターゼ、ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、本発明の蛋白質複合体、蛋白質複合体を産生する形質転換体、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質をニトリル化合物と接触させ、生成するアミドを回収する工程を含む、アミドの製造方法を提供する。本発明において、ニトリルヒドラターゼとは、前記理化学的性質を有する酵素を言う。また本酵素を産生する微生物とは、この酵素が由来する菌株ロドコッカスadp12、あるいは本発明の酵素を産生するロドコッカス属の微生物、あるいはこの酵素をコードするDNAで形質転換された微生物宿主を含む。更に形質転換された微生物宿主とは、前記αサブユニットをコードするポリヌクレオチドA~E、および/またはβサブユニットをコードするポリヌクレオチドa~eを発現しうる微生物宿主を言う。本発明における前記微生物宿主は、αサブユニットおよびβサブユニットからなる本発明の蛋白質複合体を生成する。また本発明のニトリルヒドラターゼは、前記理化学的性質17を有する酵素を含む。また本酵素を産生する微生物とは、この酵素が由来する菌株ゴルドニアBR1、あるいは本発明の酵素を産生するゴルドニア属の微生物、あるいはこの酵素をコードするDNAで形質転換された微生物宿主を含む。更に形質転換された微生物宿主とは、前記αサブユニットをコードするポリヌクレオチド[A]-[E]、および/またはβサブユニットをコードするポリヌクレオチド[a]-[e]を発現しうる微生物宿主を言う。本発明における前記微生物宿主は、αサブユニットおよびβサブユニットからなる本発明の蛋白質複合体を生成する。また微生物の処理物とは、ニトリルヒドラターゼ活性を維持した当該微生物細胞由来の細胞あるいはその分画を言う。細胞は、生細胞のみならず、酵素活性を維持する限り、死滅した細胞であってもよい。具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが処理物に含まれる。あるいは酵素の処理物とは、酵素を不溶性の担体や、水溶性の担体分子に結合したものや、酵素分子を包括固定することによって得られる固定化酵素等が含まれる。本発明における酵素活性物質とは、本発明のニトリルヒドラターゼの酵素活性を維持しているあらゆる物質を含む。したがって、酵素の精製度や、溶解状態とは無関係に、目的とする酵素活性を維持している限り、酵素活性物質に含まれる。本発明によるアミドの製造方法を構成する酵素反応は、前記酵素活性物質を基質であるニトリル化合物を含む反応溶液と接触させることにより、実施することができる。具体的には、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の溶媒との2相系中において、酵素活性物質と基質とを接触させることができる。水性媒体としては、リン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは酸とアルカリを用いて反応中のpH変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要はない。水に溶解しにくい有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、nヘキサン、イソオクタンなどを用いることができる。あるいは、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒と水性媒体との混合系中で行うこともできる。2相系では、酵素活性物質は、そのまま、あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵素活性物質とともに単一相の反応系を構成することになる。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素活性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明のニトリルヒドラターゼを用いるアミドの製造方法において、ニトリル化合物は特に限定されない。たとえば、一般式RCNを有するニトリル化合物を、本発明に利用することができる。式中、Rは、置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアルケニル基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の飽和または不飽和の複素環基を表す。これらのニトリル化合物を用いることにより、対応するアミドを製造することができる。複素環基としては、異種原子として窒素、酸素、硫黄の少なくとも一種を含むものが挙げられる。また、置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アリール基、アリールオキシ基、塩素、臭素等のハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、ニトロ基、チオール基などが挙げられる。より具体的には、例えば、以下に例示するようなニトリル化合物を本発明の製造方法に用いることができる。飽和モノニトリル類;アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリル等飽和ジニトリル類;マロニトリル、サクシノニトリル、グルタルニトリル、アジポニトリル等α-アミノニトリル類;α-アミノプロピオニトリル、α-アミノメチルチオブチロニトリル、α-アミノブチロニトリル、アミノアセトニトリル等カルボキシル基を有するニトリル類;シアノ酢酸等β-アミノニトリル類;アミノ-3-プロピオニトリル等不飽和ニトリル類;アクリロニトリル、メタクリロニトリル、シアン化アリル、クロトンニトリル等芳香族ニトリル類;ベンゾニトリル、o、mおよびpクロロベンゾニトリル、o、mおよびpフルオロベンゾニトリル、o、mおよびpニトロベンゾニトリル、pアミノベンゾニトリル、4シアノフェノール、o、mおよびpトルニトリル、24ジクロロベンゾニトリル、26ジクロロベンゾニトリル、26ジフルオロベンゾニトリル、アニソニトリル、αナフトニトリル、βナフトニトリル、フタロニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、シアン化ベンジル、フェニルアセトニトリル等α-ヒドロキシニトリル類さて、ニトリル化合物の中でも、α-ヒドロキシニトリルのようなシンヒドリン化合物は、極性溶媒中においては、その一部が青酸に解離することが知られている。たとえば一般式1のα-ヒドロキシニトリル化合物であれば、一般式2に示すアルデヒドと青酸を生じる。これらの化合物は平衡関係にあるので、α-ヒドロキシニトリル化合物が酵素反応によって消費されれば、平衡はα-ヒドロキシニトリル化合物に傾く。一般式2一方、青酸に由来するシアンやアルデヒドは、一般に酵素蛋白質にダメージを与える。そのため公知のニトリルヒドラターゼを用いた場合には、α-ヒドロキシニトリル化合物を十分に水和することができないうちに、酵素活性が低下してしまい、十分な収量を期待することができなかった。しかし本発明のニトリルヒドラターゼは、シアンやアルデヒドの存在下でも酵素活性を維持する。そのため、アルデヒドと青酸から生成するニトリル化合物を基質として利用することができる。したがって本発明のα-ヒドロキシアミドの製造方法においては、前記一般式2で表されるアルデヒド化合物と青酸とから、一般式1で表される化合物を供給することができる。本発明において、ニトリル化合物の水和または加水分解反応は、水または緩衝液などの水性媒体中で、基質化合物、あるいは基質化合物を生成することができる一般式2で表わされるアルデヒドと青酸の混合物に、本発明の酵素活性物質を接触させることによって行なわれる。なお本発明において、水和とはニトリル基に水分子が付加する反応を言う。水和に対して加水分解は、ニトリル基に置換基が結合している化合物において、この置換基が加水分解によって切断される反応を言う。これらの反応は、いずれも本発明のアミドの製造方法に含まれる。本発明によって、たとえば一般式RCNを有する化合物を原料として、一般式OCRNH3を有するアミド化合物を製造することができる。すなわち本発明は、ニトリル化合物に本発明のニトリルヒドラターゼ、蛋白質複合体、それを発現する微生物、およびその処理物からなる群から選択される酵素活性物質を接触させ、生成するアミド化合物を回収する工程を含む、アミド化合物の製造方法を提供する。式中、Rは置換または無置換のアルキル基、置換または無置換のアルケニル基、置換または無置換のシクロアルキル基、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリール基、置換または無置換のアリールオキシ基、置換または無置換の飽和または不飽和複素環基を表す。より具体的には、本発明によって、たとえば先に例示したニトリル化合物を原料として、次のようなアミド化合物を製造することができる。アセトアミド、プロピオアミド、ブチルアミド、イソブチルアミド、バレルアミド、イソバレルアミド、カプロアミド等マロアミド、サクシノアミド、グルタルアミド、アジポアミド等α-アミノプロピオアミド、α-アミノメチルチオブチルアミド、α-アミノブチルアミド、アミノアセトアミド等アミノ-3-プロピオアミド等アクリルアミド、メタクリルアミド、クロトンアミド等ベンゾアミド、o、mおよびpクロロベンゾアミド、o、mおよびpフルオロベンゾアミド、o、mおよびpニトロベンゾアミド、pアミノベンゾアミド、o、mおよびpトルアミド、24ジクロロベンゾアミド、26ジクロロベンゾアミド、26ジフルオロベンゾアミド、アニソアミド、αナフトアミド、βナフトアミド、フタルアミド、イソフタルアミド、テレフタルアミド、フェニルアセトアミド等反応液中の基質化合物の濃度は、特に制限されない。基質化合物による酵素活性の阻害を受けにくくするためには、たとえばα-ヒドロキシニトリルの場合、通常、01~10重量、好ましくは02~50重量相当量とすることができる。基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。基質とするニトリル化合物の水性媒体に対する溶解度が著しく小さい場合には、反応液中に界面活性剤を加えることもできる。界面活性剤としては、01~50重量のTritonX100、あるいはTween60などが用いられる。基質の溶解度を向上させるために、有機溶媒との混合溶媒の利用も効果的である。具体的には、例えば、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシドなどを添加することにより反応を効率よく行うことができる。あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒中や、水に溶解しにくい有機溶媒と水性媒体との2相系において、本発明の反応を行うことができる。水に溶解しにくい有機溶媒としては、たとえば酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘキサン、シクロヘキサン、オクタン、あるいは1-オクタノール等を用いることができる。この基質濃度に対して、本発明のニトリルヒドラターゼは、たとえば1mUmL~100UmL、好ましくは100mUmL以上の酵素量とすることにより、酵素反応を効率的に進めることができる。また酵素活性物質として微生物菌体を利用するときには、基質に対する微生物の使用量は、乾燥菌体として001~50重量相当量とするのが好ましい。酵素や、菌体などの酵素活性物質は、反応液に溶解、あるいは分散させることにより、基質と接触させることができる。あるいは、化学結合や包括などの手法によって固定化した酵素活性物質を用いることもできる。更に、基質は透過できるが、酵素分子や菌体の透過を制限する多孔質膜で基質溶液と酵素活性物質を隔てた状態で反応させることもできる。反応は、通常、氷点~50°C、好ましくは10~30°Cで01~100時間行うことができる。反応液のpHは、酵素活性を維持できれば特に限定されない。本発明のニトリルヒドラターゼは、pH5.5~6.5に至適pHを有するので、反応液のpHをこの範囲に設定するのが望ましい。かくして、ニトリル化合物は微生物の水和ないし加水分解作用により対応するアミドに変換され、反応液に蓄積する。生成したアミドは、反応液から任意の方法によって回収し、精製することができる。具体的には、たとえば、限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽出、活性炭処理、蒸留など通常の方法を組み合せることで回収、精製できる。次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。ニトリルヒドラターゼゴルドニアBR1およびロドコッカスadp121有機溶媒耐性、シアナイドイオン耐性を示すニトリルヒドラターゼのスクリーニングクロトンニトリル、アジポニトリル、シアノ酢酸を用いた集積培養から得られたニトリルヒドラターゼ生成菌と、研究室保存のニトリルヒドラターゼ生成菌を用い、有機溶媒耐性およびシアナイドイオン耐性を示すニトリルヒドラターゼをスクリーニングした。微生物の培養と休止菌体の調製:500mL容の振とうフラスコに40mLの培地を入れ、ニトリルヒドラターゼ生成菌を28°Cで3日間培養した。培養菌体は0.85塩化ナトリウム溶液に懸濁し、休止菌体とした。培養に用いた培地の組成1Lあたりを以下に示す。グルコース5g、ポリペプトン5g、酵母エキス5g、硫酸鉄5水和物10mg、塩化コバルト10mg、クロトンアミド5gpH7.0有機溶媒耐性およびシアナイドイオン耐性の評価:培養液5mLから得られた休止菌体を、20アセトンあるいは10mMのシアン化カリウムを含む1mLの50mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.0に入れた。アセトン耐性を評価する場合には20°Cで10分間処理し、シアナイドイオン耐性の評価では30°Cで30分間処理した。その後、0.5Mの3シアノピリジン溶液を1mL添加し、残存するニトリルヒドラターゼ活性を10分間の反応で測定した。アセトンを用いた場合には、2N塩酸を添加して反応を停止した。シアナイドイオン耐性評価においては、メタノールを添加して反応を停止させた。HPLC分析:反応停止後の反応液に含まれるアミドニコチンアミドをHPLCで分析した。HPLCの条件を次に示す。カラム:WatersSpherisorbS5ODS2移動相:10mMリン酸緩衝液pH2.8/アセトニトリル=9:1検出:230nm流速:1mLminロドコッカスadp12のアセトン耐性およびゴルドニアBR1のシアナイドイオン耐性:ロドコッカスadp12は20の処理によっても51の残存活性を示した。また、ゴルドニアBR1は10mMシアナイドイオン存在下でも活性をほぼ維持しおり、残存活性は91であった。2ロドコッカスadp12の有機溶媒耐性ニトリルヒドラターゼの評価ロドコッカスadp12の最適培養条件:ロドコッカスadp12を、下記の組成1Lあたりの最適培地で、28°Cで3日間振とう培養した。グルコース10g、コーンスティープリカー10g、酵母エキス1g、メタクリルアミド5g、リン酸ニ水素カリウム1g、硫酸マグネシウム七水和物0.5g、塩化コバルト六水和物20mgpH7.0種々の有機溶媒に対する耐性アセトン、トルエン、メタノール、エタノール、DMSO、酢酸エチル、nヘキサンを1040添加し、ロドコッカスadp12の休止菌体を用いて20°C、10分間処理による有機溶媒耐性を評価した図1。メタノール、酢酸エチル、nヘキサンで優れた耐性を示した。そこで、これらの溶媒を20とした条件で時間にともなう残存活性を測定した図2。20時間を経過しても完全に活性を失うことなく、強い有機溶媒耐性を示した。休止菌体の代わりに無細胞抽出液を用いて種々の有機溶媒耐性を評価した結果、休止菌体を用いた場合と同様に耐性が認められた図3。3ゴルドニアBR1のシアナイドイオン耐性ニトリルヒドラターゼの評価ゴルドニアBR1の最適培養条件:ゴルドニアBR1を、下記の組成1Lあたりの最適培地で、28°Cで3日間振とう培養した。グルコース5g、ポリペプトン5g、酵母エキス5g、メタクリルアミド5g、塩化コバルト六水和物20mgpH7.0シアナイドイオンに対する耐性:無細胞抽出液を用いて種々のシアナイドイオン濃度で処理して残存活性を測定した図4。比較としてロドコッカスロドクロウスJ1と比較した。ゴルドニアBR1では、15mMのシアナイドイオン存在下86の残存活性を示したが、工業用触媒として利用されているロドコッカスロドクロウスJ1では5mMでも完全に活性は失われた。4有機溶媒耐性およびシアナイドイオン耐性ニトリルヒドラターゼの精製と性質酵素活性測定法250mMの3シアノピリジン、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0を含む2mlの液系を用い、酵素反応を20°Cで10分間行った。3N塩酸を0.1ml添加して反応を停止させた。反応液をHPLC分析し、酵素1ユニットは1分間に1μmolのニコチンアミドを生成する酵素量と定義した。タンパク質濃度はBradfordの方法で定量した。ロドコッカスabp12ニトリルヒドラターゼの精製:酵素精製用の基本緩衝液として44mMのn酪酸を含むリン酸カリウム緩衝液pH7.0を用いた以下、標準緩衝液と記す。培養液480mlから得た菌体を100mM標準緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離で得られた上清を無細胞抽出液とし、これを30-60飽和濃度で硫安分画した。回収された硫安分画を、次の各種クロマトグラフィーにより精製した。精製の結果を表1にまとめた。iDEAEセファセル0.3M塩化カリウムを含む50mM標準緩衝液で溶出、iiフェニルセファロース硫安を含まない50mM標準緩衝液で溶出、およびiiiブチルトヨパール15飽和濃度の硫安を含む50mM標準緩衝液で溶出-表1-タンパク質酵素活性比活性ステップ無細胞抽出液381949249硫安分画180739411DEAEセファセル389573147フェニルセファロースCL4B32219962ブチルトヨパール650M145147102ロドコッカスadp12ニトリルヒドラターゼの性質:精製酵素の分子量は136kDaで、αおよびβサブユニットの分子量はそれぞれ26kDa、36kDaと算出され、α2β2の構造から成る。熱安定性については、40°Cで15分間の処理では活性を維持しており、50°Cで76、60°Cの処理では7の活性が残存していた。最適pHは8.0-9.0であった。基質特異性を検討した結果を3シアノピリジンに対する相対活性として以下に示した。精製酵素を用いた有機溶媒耐性の評価を行ない、無細胞抽出液で測定した結果と同じ結果が得られている。アセトニトリル116、アクリロニトリル484、クロトンニトリル70、ベンゾニトリル304、マンデロニトリル58ゴルドニアBR1ニトリルヒドラターゼの精製:培養液960mlから得た菌体を100mM標準緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離で得られた上清を無細胞抽出液とし、これを30-60飽和濃度で硫安分画した。回収された硫安分画を、次の各種クロマトグラフィーにより精製した。精製の結果を表2にまとめた。iDEAEセファセル0.3M塩化カリウムを含む50mM標準緩衝液で溶出、iiフェニルセファロース5飽和濃度で硫安を含む50mM標準緩衝液で溶出、およびiiiブチルトヨパール20飽和濃度の硫安を含む50mM標準緩衝液で溶出-表2-タンパク質酵素活性比活性ステップ無細胞抽出液83019000229硫安分画46318200392DEAEセファセル11818000152フェニルセファロースCL4B46610400224ブチルトヨパール650M3718190220ゴルドニアBR1ニトリルヒドラターゼの性質:精製酵素の分子量は138kDAで、αおよびβサブユニットの分子量はそれぞれ27kDa、33kDaと算出され、α2β2の構造から成る。熱安定性については、30°Cで15分間の処理では活性を維持しており、40°Cで91、50°Cで76、60°Cの処理では7の活性が残存していた。最大活性が見られるpHは8.0で、その80以上の活性が認められるpH範囲は7.0-9.0であった。基質特異性を検討した結果を3シアノピリジンに対する相対活性として以下に示した。精製酵素を用いたシアナイドイオン耐性の評価を行ない、無細胞抽出液で測定した結果と同じ結果が得られている。アセトニトリル56アクリロニトリル341メタクリルニトリル397クロトンニトリル132ベンゾニトリル189マンデロニトリル61ゴルドニアBR1およびロドコッカスadp12のニトリルヒドラターゼ遺伝子のクローニングと一次構造解析:1ゴルドニアBR1ニトリルヒドラターゼ遺伝子のクローニングニトリルヒドラターゼ遺伝子の簡便な解析法として、Precigouらが遺伝子増幅用の汎用型PCRプライマーを報告しているFEMSMicrobiologyLetters2041441612001が、GordoniaBR1では遺伝子増幅は認められない。そこで、精製酵素のN末端アミノ酸配列に基づいて遺伝子クローニングを行った。ゴルドニアBR1株から精製したニトリルヒドラターゼのαおよびβサブユニットのN末端アミノ酸配列を得た。αサブユニット:TDIIPTQEEIAARVKALESMLIEQN配列番号:9βサブユニット:MNGVFDLGGTDGMGAVNPPAHE配列番号:10ゴルドニアBR1を次の組成を有する培地pH7.0を用いて28°Cで1日間培養し、菌体から染色体DNAを調製した。肉エキス5gL、ポリペプトン5gL、塩化ナトリウム2gL、および酵母エキス0.5gLニトリルヒドラターゼはβ、αサブユニットの順に遺伝子がコードされているため、βサブユニットのN末端アミノ酸配列からセンスプライマーをデザインし、αサブユニットのN末端アミノ酸配列からアンチセンスプライマーを合成した。センスプライマー配列:ATGAAYGGNGTNTTYYT配列番号:11アンチセンスプライマー配列:GCDATYTCYTCYTGNGTNGG配列番号:12センスプライマーを100pmol、アンチセンスプライマーを100pmol、ゴルドニアBR1由来染色体DNAを100ng、dNTPを20nmol、TaqDNAポリメラーゼ宝酒造製、TaqDNAポリメラーゼ用緩衝液宝酒造製を含む0.1mlの反応液を用い、変性72°C、60秒、アニーリング55°C、90秒、伸長反応72°C、90秒を30サイクル、PCRサーマルサイクラーMP宝酒造製を用いてPCRを行った。PCR反応後に約800bpの増幅断片が確認され、この断片をpT7BlueNovagen製にライゲーションし、塩基配列の解析からニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部であることを確認した。増幅断片の精製標品をDIG標識した。ゴルドニアBR1由来染色体DNAをApaIで完全消化し、得られた消化物をアガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブレンロッシュ製に転写し、DIG標識したDNA断片と60°Cで一晩ハイブリダイズさせ、60°Cで洗浄し、DIGディテクションキットロッシュ製を用いて化学発光をFujiRXフィルムで検出したところ、約7kbpの陽性バンドが検出された。ゴルドニアBR1由来染色体DNAのApaIによる完全消化物をアガロースゲル電気泳動し、約7kbpのDNA断片を精製し、得られたDNA断片をpBluescriptIISKにライゲーションし、大腸菌DH5αに形質転換した。得られた形質転換体をアンピシリン50μgmLを含むLB培地上で生育させた後、MolecularCloningに記載の方法に従い、DIG標識したDNA断片を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを取得した。ニトリルヒドラターゼのαおよびβサブユニットをコードする塩基配列と酵素アミノ酸配列を決定した。2ロドコッカスabp12ニトリルヒドラターゼ遺伝子のクローニングロドコッカスabp12のニトリルヒドラターゼ遺伝子についても、Precigouらの汎用型PCRプライマーを用いた遺伝子領域の増幅は認められず、ゴルドニアBR1での場合と同様に精製酵素のN末端アミノ酸配列に基づいて遺伝子クローニングを行った。ロドコッカスabp12から精製したニトリルヒドラターゼのαおよびβサブユニットのN末端アミノ酸配列を得た。αサブユニット:SNRPKTSEEITARVKALERSI配列番号:13βサブユニット:MNGLYDLGGMDGLGPVN配列番号:14ロドコッカスabp12の染色体DNAはゴルドニアBR1と同じ方法で調製し、PCR用プライマーの塩基配列を以下に示した。センスプライマー配列:GAYYTNGGNGGNATGGAYGG配列番号:15アンチセンスプライマー配列:ACNCKNGCNGTDATYTCYTC配列番号:16ロドコッカスabp12由来染色体DNA100ngを鋳型としたPCRによって約900bpの増幅断片が確認され、この断片をpT7Blueにライゲーションし、塩基配列の解析からニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部であることを確認した。この増幅断片の精製標品をDIG標識し、ゲノミックサザンブロット解析によって約4.5kbpの陽性バンドを消化物で検出された。ロドコッカスabp12由来染色体DNAのPstIによる完全消化物をアガロースゲル電気泳動し、約4.5kbpのDNA断片を精製し、得られたDNA断片をpBluescriptIISKにライゲーションし、大腸菌DH5αに形質転換した。得られた形質転換体をアンピシリン50μgmLを含むLB培地上で生育させた後、DIG標識したDNA断片を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを取得した。ニトリルヒドラターゼのαおよびβサブユニットをコードする塩基配列と酵素アミノ酸配列を決定した。3相同性解析ゴルドニアBR1およびロドコッカスabp12のαサブユニット、およびβサブユニットのアミノ酸配列と、既知のニトリルヒドラターゼを構成するαサブユニットおよびβサブユニットとの相同性を解析した。結果を表3および表4に示す。ゴルドニアBR1では、ロドコッカス属の1株とのみαサブユニットで93の相同性が認められたが、他の微生物酵素との相同性は60-70台にとどまった。ロドコッカスad12の酵素でも極めて高い相同性を示すニトリルヒドラターゼは認められなかった。そこで次に、αおよびβサブユニットそれぞれについて分子進化系統樹を作成した図5。分子進化系統樹の解釈には主観的な見解が伴いがちであるが、αおよびβサブユニットいずれに関する図を見ても、ゴルドニアBR1とロドコッカスabp12のニトリルヒドラターゼはこれまでに工業用触媒として注目されてきた酵素との強い相関性は見られず、有機溶媒耐性やシアナイドイオン耐性がこれに反映していると推定される。-表3-GordoniaBR1のαサブユニットおよびβサブユニットの相同性解析相同性微生物βsubunitαsubunitRhodococcussp6893PseudonocardiathermophilaJCM30955476RhodococcusspCr44267Comamonastestosteroni5MGAM4D3865Agrobacteriumtumefaciensd33862BacillusspBR4493665BacillusspRAPc83665Pseudomonasputida5B3466RhodococcusrhodochrousJ1LMW4366RhodococcusrhodochrousJ1HMW3253-表4-Rhodococcusadp12のαサブユニットおよびβサブユニットの相同性解析相同性微生物βsubunitαsubunitRhodococcussp6077PseudonocardiathermophilaJCM30955675RhodococcusspCr44667Comamonastestosteroni5MGAM4D4264Agrobacteriumtumefaciensd34261BacillusspBR4494059BacillusspRAPc84059Pseudomonasputida5B3864RhodococcusrhodochrousJ1LMW4667RhodococcusrhodochrousJ1HMW2953"