"a発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;b前記発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、前記組み換え微生物が前記発酵性炭素源を消費し、前記生成物アルコールを生成する工程と;c前記発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と前記発酵ブロスを接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および/または前記発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法。前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項1に記載の方法。バイオマスが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する、請求項1に記載の方法。前記生成物アルコールがブタノールである、請求項1に記載の方法。工程bおよびcがほぼ同時に行われる、請求項1に記載の方法。前記発酵性炭素源が前記バイオマスに由来する、請求項1に記載の方法。前記発酵ブロスが、エタノールをさらに含む、請求項1に記載の方法。前記組み換え微生物が、1つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する、請求項1に記載の方法。生成物アルコールを生成するための方法であって:a発酵性炭素源および油を含むバイオマスを提供する工程と;b前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化して、前記脂肪酸を含むバイオマスを形成する工程と;c発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスと前記バイオマスを接触させる工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;d前記脂肪酸を前記発酵ブロスと接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および/または前記発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法。前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程bが、前記油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な1種またはそれ以上の物質と前記油を接触させる工程を含む、請求項9に記載の方法。前記1種またはそれ以上の物質が1種またはそれ以上の酵素を含む、請求項10に記載の方法。前記1種またはそれ以上の酵素がリパーゼ酵素を含む、請求項11に記載の方法。工程cの前に、前記油の少なくとも一部が加水分解された後、前記1種またはそれ以上の酵素を不活化させる工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。工程b、c、およびdのうちの1つまたはそれ以上が前記発酵槽中で行われる、請求項9に記載の方法。工程b、c、およびdのうちの1つまたはそれ以上がほぼ同時に行われる、請求項9に記載の方法。バイオマスが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する、請求項9に記載の方法。前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項9に記載の方法。前記発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。前記生成物アルコールがブタノールである、請求項18に記載の方法。前記発酵ブロスが、エタノールをさらに含む、請求項9に記載の方法。前記組み換え微生物が、1つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する、請求項9に記載の方法。前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程bの前に、前記バイオマスから前記油を分離する工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。前記バイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、前記液化バイオマスがオリゴ糖を含む工程と;オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と前記液化バイオマスを接触させて、糖化されたバイオマスを形成する工程とをさらに含み、工程cが、前記糖化されたバイオマスを、組み換え微生物を含む前記発酵ブロスと接触させる工程を含む、請求項9に記載の方法。生成物アルコールを生成するための方法であって:a原料を提供する工程と;b前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と;c前記原料スラリーを分離して、i発酵性炭素源を含む水層、ii油層、およびiii固体層を含む生成物を生成する工程と;d前記油層から油を得て、前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程と;ecの前記水層を、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程であって、前記組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;f前記水層の前記発酵性炭素源を発酵させて、前記生成物アルコールを生成する工程と;g前記発酵ブロスを前記脂肪酸と接触させる工程であって、前記脂肪酸の存在下での前記組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、前記脂肪酸がない場合の前記組み換え微生物の前記増殖速度および/または前記発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法。前記油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する前記工程dが、前記油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な1種またはそれ以上の物質と前記油を接触させる工程を含む、請求項24に記載の方法。前記1種またはそれ以上の物質が1種またはそれ以上の酵素を含む、請求項25に記載の方法。前記1種またはそれ以上の酵素がリパーゼ酵素を含む、請求項26に記載の方法。原料が、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する1種またはそれ以上の発酵性糖を含む、請求項24に記載の方法。前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択される、請求項24に記載の方法。前記生成物アルコールがブタノールである、請求項18に記載の方法。前記組み換え微生物が、1つまたはそれ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する、請求項24に記載の方法。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む組み換え微生物と、脂肪酸とを含む組成物。したがって、微生物による脂肪酸生合成の減少または消失にもかかわらず微生物の増殖速度および/またはバイオマス生成が向上され得る、組み換え微生物を用いた発酵アルコール生成のための方法が依然として必要とされている。以下の実施形態の説明によって明らかになるように、本発明は、さらなる関連した利点を提供する。本発明は、a発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;b発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、組み換え微生物が発酵性炭素源を消費し、生成物アルコールを生成する工程と;c発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と発酵ブロスを接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法に関する。さらなる実施形態において、工程bおよびcはほぼ同時に行われる。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。さらなる実施形態において、発酵性炭素源はバイオマスに由来する。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、別の実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。別の実施形態において、組み換え微生物は、1つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する。本発明は、生成物アルコールを生成するための方法であって:a発酵性炭素源および油を含むバイオマスを提供する工程と;b油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化して、脂肪酸を含むバイオマスを形成する工程と;c発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスとバイオマスを接触させる工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;d脂肪酸を発酵ブロスと接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法にも関する。さらなる実施形態において、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程bは、油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の物質と油を接触させる工程を含む。一実施形態において、1種以上の物質は1種以上の酵素を含み、別の実施形態において、1種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。さらなる実施形態において、工程cの前に、油の少なくとも一部が加水分解された後、1種以上の酵素が失活され得る。一実施形態において、工程b、c、およびdのうちの1つ以上が発酵槽中で行われ、別の実施形態において、工程b、c、およびdのうちの1つ以上がほぼ同時に行われる。一実施形態において、本方法は、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程bの前に、バイオマスから油を分離する工程をさらに含む。別の実施形態において、本方法は、バイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、液化バイオマスがオリゴ糖を含む工程と;オリゴ糖を発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と液化バイオマスを接触させて、糖化されたバイオマスを形成する工程とをさらに含み、工程cは、糖化されたバイオマスを、組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触させる工程を含む。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。一実施形態において、本方法は、発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程をさらに含む。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールであり、別の実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。別の実施形態において、組み換え微生物は、1つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する。本発明の別の方法は、生成物アルコールを生成するための方法であって:a原料を提供する工程と;b前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と;c原料スラリーを分離して、i発酵性炭素源を含む水層、ii油層、およびiii固体層を含む生成物を生成する工程と;d油層から油を得て、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程と;ecの水層を、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程であって、組み換え微生物が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む工程と;f水層の発酵性炭素源を発酵させて、生成物アルコールを生成する工程と;g発酵ブロスを脂肪酸と接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での組み換え微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む方法を含む。さらなる実施形態において、油の少なくとも一部を脂肪酸へと転化する工程dは、油の一部を脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の物質と油を接触させる工程を含む。一実施形態において、1種以上の物質は1種以上の酵素を含み、別の実施形態において、1種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。一実施形態において、脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびそれらの混合物から選択され、別の実施形態において、バイオマスは、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物に由来する。一実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。別の実施形態において、組み換え微生物は、1つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する。本発明は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む組み換え微生物と、脂肪酸とを含む組成物にも関する。発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸例えば、オレイン酸、パルミチン酸、およびそれらの混合物を、生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵培地に加えることができる。微生物は、酵母または他のアルコール生成微生物であり得る。また、微生物は、1つ以上のPDC遺伝子欠失を有し、および/または減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し得る。脂肪酸の添加により、グルコース消費を増加させることができ、微生物のバイオマス生成細胞増殖および増殖速度を向上することができる。増殖速度の向上により、生成時間を短縮し、それによって、アルコール発酵プロセスの生産性を高めることができる。ある実施形態において、発酵プロセスにおいて生成物アルコールを生成するための方法が、a発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスを提供する工程と;b発酵ブロスを発酵性炭素源と接触させ、それによって、微生物が発酵性炭素源を消費し、生成物アルコールを生成する工程と;c発酵プロセス中の工程においてバイオマスから誘導される脂肪酸と発酵ブロスを接触させる工程であって、脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。ある実施形態において、脂肪酸は遊離脂肪酸FFAである。ある実施形態において、脂肪酸はオレイン酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸は飽和脂肪酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸はパルミチン酸を含む。ある実施形態において、脂肪酸はミリスチン酸を含む。ある実施形態において、生成物アルコールはブタノールである。ある実施形態において、発酵性炭素源はバイオマスに由来する。ある実施形態において、バイオマスはトウモロコシを含み、脂肪酸はトウモロコシ油脂肪酸である。ある実施形態において、発酵ブロスは、エタノールをさらに含む。ある実施形態において、本方法は、発酵ブロスをエタノールと接触させる工程をさらに含む。ある実施形態において、発酵ブロスを脂肪酸と接触させる工程は、バイオマスに由来するトリグリセリドを、トリグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の酵素と接触させ、それによって、トリグリセリドが遊離脂肪酸へと加水分解される工程と;発酵ブロスを遊離脂肪酸と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合より高い工程とを含む。ある実施形態において、1種以上の酵素はリパーゼ酵素を含む。ある実施形態において、組み換え微生物は、1つのピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子欠失を有する。ある実施形態において、組み換え微生物は、2つのPDC遺伝子欠失を有する。ある実施形態において、組み換え微生物は、減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。ある実施形態において、発酵ブロス中の脂肪酸の濃度は、約0.8g/L以下である。ある実施形態において、バイオマスの発酵から生成物アルコールを生成するための方法が、a水、発酵性炭素源、および所定の量の油を含む水性バイオマス原料流を提供する工程であって、発酵性炭素源および油が両方とも、前記バイオマスに由来する工程と;b油の少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解して、遊離脂肪酸を含むバイオマス原料流を形成する工程と;c発酵培地を、発酵槽中のバイオマス原料流と接触させる工程であって、発酵培地が、生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む工程と;d発酵槽中の発酵性炭素源を発酵させて、前記生成物アルコールを生成する工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。ある実施形態において、油の少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解する工程bは、油の一部を遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の酵素を含む組成物と油を接触させる工程を含む。ある実施形態において、本方法は、工程cの前に、油の少なくとも一部が加水分解された後、1種以上の酵素を失活させる工程をさらに含む。ある実施形態において、水性バイオマス原料流は、粉砕された、分画されていない穀類から形成される液化されたマッシュである。ある実施形態において、粉砕された、分画されていない穀類はトウモロコシであり、油はトウモロコシ油である。ある実施形態において、生成物アルコールを生成する方法であって、aグルコースおよび所定の量のトリグリセリドを含む油を含むバイオマスを提供する工程と;bトリグリセリドを遊離脂肪酸へと転化することが可能な1種以上の物質を含む組成物と油を接触させ、それによって、油中のトリグリセリドの少なくとも一部が遊離脂肪酸へと転化される工程と;cグルコースを生成物アルコールに転化することが可能な微生物を含む発酵ブロスとバイオマスを接触させ、それによって、生成物アルコールが生成される工程と;d遊離脂肪酸を発酵ブロスと接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびiiグルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および/またはグルコース消費より高い工程とを含む。ある実施形態において、本方法は、油を1種以上の物質と接触させる工程bの前に、バイオマス由来のaの油を分離する工程をさらに含む。ある実施形態において、1種以上の物質を含む組成物と油を接触させる工程bは、トリグリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の触媒と油を接触させる工程を含む。ある実施形態において、1種以上の物質を含む組成物と油を接触させる工程bは、トリグリセリドを化学的に反応させることが可能な1種以上の反応剤または溶媒と油を接触させて、遊離脂肪酸を含む反応生成物を得る工程を含む。ある実施形態において、ブタノールを生成するための方法が、aでんぷんおよび油を含むバイオマスを提供する工程であって、油が、所定の量のグリセリドを含む工程と;bバイオマスを液化して、液化バイオマスを生成する工程であって、液化バイオマスが、でんぷんから加水分解されるオリゴ糖を含む工程と;c工程aのバイオマスまたは工程bの液化バイオマスを、グリセリドを遊離脂肪酸へと転化することが可能な1種以上の酵素を含む組成物と接触させ、それによって、油中のグリセリドの少なくとも一部が、遊離脂肪酸へと転化される工程と;dオリゴ糖を、モノマーグルコースを含む発酵性糖へと転化することが可能な糖化酵素と液化バイオマスを接触させる工程と;e液化バイオマスを、発酵性糖をブタノールに転化することが可能な組み換え微生物と接触させ、それによって、ブタノールが生成される工程と;f遊離脂肪酸を組み換え微生物と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での組み換え微生物のi増殖速度およびiiグルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の組み換え微生物の増殖速度および/またはグルコース消費より高い工程とを含む。ある実施形態において、原料から生成物アルコールを生成する発酵プロセスは、a前記原料を液化して、原料スラリーを生成する工程と;b原料スラリーを遠心分離して、iグルコースを含む水層、iiグリセリドを含む油層、およびiii固体層を含む遠心分離生成物を生成する工程と;cグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸へと加水分解する工程と;dbの水層を、グルコースから生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を含む発酵ブロスを含む発酵槽に供給する工程と;e水層のグルコースを発酵させて、生成物アルコールを生成する工程と;f発酵ブロスを遊離脂肪酸と接触させる工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびiiグルコース消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および/またはグルコース消費より高い工程とを含む。ある実施形態において、原料から生成物アルコールを生成するための方法は、グリセリドを加水分解する工程の前に、グリセリドを発酵槽に供給する工程をさらに含む。ある実施形態において、発酵プロセスは、a発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物、発酵性炭素源、生成物アルコール、およびバイオマスに由来する油を含む発酵ブロスを提供する工程であって、油がグリセリドを含む工程と;b発酵ブロスを第1の抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程であって、生成物アルコールおよび油が、有機相中に分離して、生成物アルコール含有有機相を形成する工程と;c生成物アルコール含有有機相を水相から分離する工程と;d生成物アルコールを有機相から分離して、希薄なlean有機相を生成する工程と;e希薄な有機相を、グリセリドを遊離脂肪酸へと加水分解することが可能な1種以上の触媒を含む組成物と接触させて、第1の抽出剤の少なくとも一部および遊離脂肪酸を含む第2の抽出剤を生成する工程と;f発酵ブロスを、工程eの第2の抽出剤と接触させることによって工程bを繰り返す工程であって、遊離脂肪酸の存在下での微生物のi増殖速度およびii発酵性炭素消費の少なくとも一方が、遊離脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費より高い工程とを含む。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。本明細書において使用される際の含むcomprises、含むcomprising、含むincludes、含むincluding、有するhas、有するhaving、含有するcontains、または含有するcontainingという用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、またはは、排他的なまたはではなく包括的なまたはを指す。例えば、条件AまたはBは、以下のうちの1つによって満たされる:Aが真でありまたは存在するかつBが偽であるまたは存在しない、Aが偽でありまたは存在しないかつBが真であるまたは存在する、AおよびBの両方とも真であるまたは存在する。また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞aおよびanは、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、aまたはanは、1つまたは少なくとも1つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。本明細書において使用される際の発明または本発明の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の1つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する約という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって;これらの手順における不注意による誤りによって;組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。約という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。約という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、約という用語は、報告される数値の10以内、あるいは報告される数値の5以内を意味する。本明細書において使用される際のバイオマスは、トウモロコシ、サトウキビ、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および/または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および/または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、1つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、2つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、木くずおよび林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、大麦、大麦のわら、牧草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、大豆、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。例えば、マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、処理、および/または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから形成され得、発酵性糖を含み、水を含み得る。例えば、セルロース系および/またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。低アンモニア前処理が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2007/0031918A1号明細書に開示されている。セルロース系および/またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素群consortiumを利用する。セルロース系および/またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Lynd,etal.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506-577,2002に概説されている。マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物は、本明細書に記載される原料12および原料スラリー16を含み得る。水性原料流が、粉砕、処理、および/または液化などによる発酵のためのバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の処理によって、バイオマスから誘導または形成され得、発酵性炭素基質例えば、糖を含み、水を含み得る。水性原料流が、本明細書に記載される原料12および原料スラリー16を含み得る。本明細書において使用される際のバイオマス生成は、微生物の発酵前の培養中または微生物の発酵増殖中などの微生物のバイオマス生成すなわち、細胞バイオマス生成または細胞増殖を指す。本明細書において使用される際の原料は、発酵プロセスにおける原料であって、非溶解固体を含むかまたは含まずに発酵性炭素源を含有し、該当する場合、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかあるいは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理によって複合糖類を分解することから得られる前または後に発酵性炭素源を含有する原料を意味する。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来する。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。本明細書において使用される際の発酵ブロスは、水と、糖類と、溶解固体と、任意にアルコールを生成する微生物と、生成物アルコールと、存在する微生物による、アルコール、水、および二酸化炭素CO2への糖類の反応によって生成物アルコールが作製される発酵槽中に保持される材料の全ての他の成分との混合物を意味する。場合により、本明細書において使用される際の発酵培地および発酵された混合物という用語は、発酵ブロスと同義に使用することができる。本明細書において使用される際の発酵性炭素源または発酵性炭素基質は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝されるまたは消費されることが可能な炭素源を意味する。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類;ラクトースまたはスクロースなどの二糖類;オリゴ糖;でんぷんまたはセルロースなどの多糖類;キシロースおよびアラビノースなどのC5糖類;メタンを含む一炭素基質;およびそれらの混合物が挙げられる。本明細書において使用される際の消費されるという用語は、化合物、例えば、グルコースなどの有機化合物が、細胞に由来する酵素の作用によって分解されることで、細胞によって使用され得るエネルギーが生成されるプロセスを含む。本明細書において使用される際の発酵性糖は、発酵アルコールを生成するための、本明細書に開示される微生物によって代謝されるまたは消費されることが可能な1種以上の糖類を指す。本明細書において使用される際の発酵槽は、発酵反応が行われ、それによって、ブタノールなどの生成物アルコールが糖類から作製される槽を意味する。本明細書において使用される際の液化槽は、液化が行われる槽を意味する。液化は、オリゴ糖が原料から遊離されるプロセスである。原料がトウモロコシである、ある実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から遊離される。本明細書において使用される際の糖化槽は、糖化すなわち、オリゴ糖の単糖類への分解が行われる槽を意味する。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵槽は、同じ槽であってもよい。本明細書において使用される際の糖は、オリゴ糖、二糖類、単糖類、および/またはそれらの混合物を指す。糖という用語は、でんぷん、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサン、ならびに糖類を含む炭水化物も含む。本明細書において使用される際の糖化酵素は、多糖類および/またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα-1,4-グルコシド結合を加水分解することが可能な1種以上の酵素を意味する。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。本明細書において使用される際の非溶解固体は、原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを意味する。本明細書において使用される際の生成物アルコールは、発酵性炭素基質の供給源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、C1~C8のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはC2~C8のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはC2~C5のアルキルアルコールである。C1~C8のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられることが理解されよう。同様に、C2~C8のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、およびペンタノールが挙げられる。アルコールはまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用される。本明細書において使用される際のブタノールは、特に、ブタノール異性体1-ブタノール1-BuOH、2-ブタノール2-BuOH、tert-ブタノール、および/またはイソブタノールiBuOHまたはi-BuOHまたはI-BUOH、2-メチル-1-プロパノールとしても知られているを、個々にまたはそれらの混合物として指す。場合により、ブタノールのエステルに言及される場合、ブチルエステルおよびブタノールエステルという用語は、同義に使用することができる。本明細書において使用される際のプロパノールは、プロパノール異性体イソプロパノールまたは1-プロパノールを指す。本明細書において使用される際のペンタノールは、ペンタノール異性体1-ペンタノール、3-メチル-1-ブタノール、2-メチル-1-ブタノール、2,2-ジメチル-1-プロパノール、3-ペンタノール、2-ペンタノール、3-メチル-2-ブタノール、または2-メチル-2-ブタノールを指す。本明細書において使用される際のアルコール当量という用語は、アルコールエステルの完全な加水分解および所定の量のアルコールエステルからのアルコールのその後の回収によって得られるであろうアルコールの重量を指す。本明細書において使用される際の水相力価という用語は、発酵ブロス中の特定のアルコール例えば、ブタノールの濃度を指す。本明細書において使用される際の有効力価という用語は、発酵によって生成される特定のアルコール例えば、ブタノールまたは発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール当量の総量を指す。例えば、発酵の単位体積におけるブタノールの有効力価は:i発酵培地中のブタノールの量;ii有機抽出剤から回収されるブタノールの量;iiiガスストリッピングが使用される場合、気相から回収されるブタノールの量;およびiv有機相または水相中のブチルエステルのアルコール当量を含む。本明細書において使用される際の原位置生成物除去ISPRは、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するために、発酵などの生物学的プロセスから特定の発酵生成物を選択的に除去することを意味する。本明細書において使用される際の抽出剤またはISPR抽出剤は、ブタノールなどの任意の生成物アルコールを抽出するのに使用され、または生成物アルコールおよびカルボン酸または脂質から触媒によって生成される任意の生成物アルコールエステルを抽出するのに使用される有機溶媒を意味する。場合により、本明細書において使用される際の溶媒という用語は、抽出剤と同義に使用することができる。本明細書に記載される方法では、抽出剤は水不混和性である。水不混和性または不溶性という用語は、1つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。本明細書において使用される際の水相という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、発酵ブロスという用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を特に指す。本明細書において使用される際の有機相という用語は、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる二相混合物の非水相を指す。本明細書において使用される際の脂肪酸という用語は、飽和または不飽和のいずれかである、C4~C28の炭素原子最も一般的にはC12~C24の炭素原子を有するカルボン酸例えば、脂肪族モノカルボン酸を指す。脂肪酸はまた、分枝鎖状または非分枝鎖状であってもよい。脂肪酸は、動物性または植物性脂肪、油、またはワックスに由来するか、あるいはそれらの中にエステル化された形態で含まれ得る。脂肪酸は、脂肪および脂肪油中のグリセリドの形態で天然に存在するものであってもよく、または脂肪の加水分解によってまたは合成によって得られる。脂肪酸という用語は、単一の化学種または脂肪酸の混合物を表し得る。さらに、脂肪酸という用語は、遊離脂肪酸も包含する。本明細書において使用される際の脂肪アルコールという用語は、飽和または不飽和のいずれかである、C4~C22の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルコールを指す。本明細書において使用される際の脂肪アルデヒドという用語は、飽和または不飽和のいずれかである、C4~C22の炭素原子の脂肪族鎖を有するアルデヒドを指す。本明細書において使用される際のカルボン酸という用語は、一般化学式-COOH式中、炭素原子が、カルボニル基-C=Oを構成するために二重結合によって酸素原子に結合され、単結合によってヒドロキシル基-OHに結合されるで表される任意の有機化合物を指す。カルボン酸は、プロトン化したカルボン酸の形態、カルボン酸の塩の形態例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩、またはプロトン化したカルボン酸とカルボン酸の塩との混合物としての形態であってもよい。カルボン酸という用語は、単一の化学種例えば、オレイン酸または例えば、バイオマス由来の脂肪酸エステルまたはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質の加水分解によって生成され得るカルボン酸の混合物を表し得る。本明細書において使用される際の天然油は、植物例えば、バイオマスまたは動物から得られる脂質を指す。本明細書において使用される際の植物由来油は、特に植物から得られる脂質を指す。場合により、脂質は、油およびアシルグリセリドと同義に使用することができる。天然油としては、以下に限定はされないが、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、および植物油ブレンドが挙げられる。本明細書において使用される際の分離という用語は、回収と同義であり、初期混合物から化学化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度または濃度より高い純度またはより高い濃度の化合物を得ることを指す。本明細書において使用される際の組み換え微生物は、例えば、ブタノールなどのアルコールを生成するための生合成経路などの生合成経路を含むように宿主細胞を改変することによる、組み換えDNA技術の使用によって改変される、細菌または酵母などの微生物を指す。本発明は、発酵槽中のアルコール生成微生物が、発酵プロセス中の工程で、バイオマス脂質などの天然油から誘導された脂肪酸と接触される、生成物アルコール例えば、発酵アルコールを生成するための方法を提供する。微生物の発酵増殖中のこの脂肪酸の補充により、特に、減少または消失されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組み換え微生物に関して、微生物の発酵性炭素消費、増殖速度、およびバイオマス生成を増加させることができる。ある実施形態において、油中のグリセリドが、脂肪酸へと化学的に転化され得、それが、発酵性炭素源から生成物アルコールを生成する組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触される。他の実施形態において、油中のグリセリドは、触媒により例えば、酵素により脂肪酸へと加水分解され得、それが、組み換え微生物を含む発酵ブロスと接触される。ある実施形態において、脂肪酸は、発酵のための発酵性炭素源を供給するバイオマス中に見られる脂質の加水分解から得ることができる。脂肪酸をISPR抽出剤として用いて、生成物アルコールを発酵ブロスから除去することもできる。脂肪酸は、飽和、単不飽和、多価不飽和、およびそれらの混合物であり得る。例えば、パルミチン酸とオレイン酸との混合物を含む天然の脂肪酸組成物を有する油例えば、トウモロコシ油が加水分解されて、遊離オレイン酸と遊離パルミチン酸との混合物が生成され得、それが、発酵槽中の発酵ブロスと接触され得る。ある実施形態において、発酵槽中のカルボン酸脂肪酸などの濃度は、水相中の溶解限度を超え、有機相および水相を含む二相発酵混合物が生成される。ある実施形態において、発酵ブロス中のカルボン酸の濃度は、通常、約0.8g/L以下であり、ブロス中のカルボン酸の溶解性によって制限される。脂肪酸の存在下での微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費は、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および発酵性炭素消費より高い。これに対応して、本発明の方法に係る脂肪酸の補充により、このような脂肪酸の補充がない場合に得られるであろうものより、増加した細胞濃度および増加したアルコール生成が得られる。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生成微生物または生存し、成長するために2-炭素基質、例えば、エタノールの補充を通常必要とする他の微生物であり得る。このような実施形態において、本発明の方法に係る脂肪酸の補充により、このような2-炭素に依存する微生物が、エタノールの補充がない場合に生存し、成長することが可能になり得る。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸塩からのアセチル-CoAの生成がないことがある。ある実施形態において、微生物は、1つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼPDC遺伝子における破壊突然変異によって、脂肪酸生合成への経路が改変されるように代謝改変される。ある実施形態において、微生物は、遺伝子PDC1およびPDC5などの2つのPDC遺伝子における破壊突然変異によって、代謝改変され、脂肪酸生合成への経路が変化される。したがって、本発明の方法は、組み換え微生物の発酵増殖に最適な環境を与えることによって、向上したアルコール生産性を達成することができる。本発明は、図を参照して説明される。図1は、本発明の一実施形態に係る発酵アルコールの生成のための例示的なプロセス流れ図を示す。図示されるように、原料12は、液化槽10の入口に導入され、液化されて、原料スラリー16が生成され得る。原料12は、発酵性炭素源例えば、グルコースなどの発酵性糖を供給する加水分解性でんぷんを含有し、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、サトウキビ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物などのバイオマスであり得、あるいはバイオマスに由来し得る。ある実施形態において、原料12は、分画されたバイオマスの1つ以上の成分であり得、他の実施形態において、原料12は、粉砕された、分画されていないバイオマスであり得る。ある実施形態において、原料12は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解固体は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。非溶解固体は、原料12の非発酵性部分である。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、原料12は、非溶解固体が分離されていない、粉砕された、分画されていないトウモロコシであるものとして説明されることが多い。しかしながら、当業者に明らかなように、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、分画されるか否かにかかわらず様々な原料向けに変更することができることを理解されたい。ある実施形態において、原料12は、高オレイン酸トウモロコシであり得るため、それに由来するトウモロコシ油は、少なくとも約55重量のオレイン酸のオレイン酸含量を有する高オレイン酸トウモロコシ油である。ある実施形態において、約24重量である通常のトウモロコシ油中のオレイン酸含量と比較して、高オレイン酸トウモロコシ油中のオレイン酸含量は、最大で約65重量であり得る。油の加水分解により、発酵ブロスと接触させるための高いオレイン酸含量を有する遊離脂肪酸が得られるため、高オレイン酸油は、本発明の方法に使用するのにいくつかの利点を提供し得る。ある実施形態において、脂肪酸またはその混合物は、不飽和脂肪酸を含む。不飽和脂肪酸の存在は、融点を低下させ、取り扱いの際の利点を提供する。不飽和脂肪酸のうち、単不飽和であるもの、すなわち、1つの炭素-炭素二重結合を有するものが、プロセス検討の際に好適な熱安定性および酸化安定性を犠牲にせずに融点に関する利点を提供し得る。原料12を液化するプロセスは、原料12中の多糖を、例えば、デキストリンおよびオリゴ糖を含む糖類へと加水分解することを含み、従来のプロセスである。酸プロセス、酸-酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の液化プロセス、ならびに対応する液化槽が使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素14、例えば、α-アミラーゼが、液化槽10の入口に導入される。水も液化槽10に導入することができる。ある実施形態において、糖化酵素、例えば、グルコアミラーゼも、液化槽10に導入され得る。さらなる実施形態において、油の1つ以上の成分の、遊離脂肪酸への転化を触媒するために、リパーゼも液化槽10に導入され得る。原料12を液化することから生成される原料スラリー16は、原料12を形成するバイオマスに由来する、糖、油26、および非溶解固体を含む。ある実施形態において、油は、発酵ブロスの組成の約0重量~少なくとも約2重量の量である。ある実施形態において、油は、原料の少なくとも約0.5重量の量である。原料スラリー16は、液化槽10の出口から排出され得る。ある実施形態において、原料12は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であるため、原料スラリー16はトウモロコシマッシュスラリーである。1種以上の物質42が、原料スラリー16に加えられ得る。物質42は、油26中のグリセリドを遊離脂肪酸FFA28に加水分解することができる。例えば、原料12がトウモロコシである場合、油26は、原料の成分であるトウモロコシ油であり、遊離脂肪酸28はトウモロコシ油脂肪酸COFAである。したがって、物質42を原料スラリー16に接種した後、油26中のグリセリドの少なくとも一部が、FFA28に加水分解され、FFA28を有する原料スラリー18が得られる。ある実施形態において、1種以上の物質42は、油26中のグリセリドを遊離脂肪酸28FFAに触媒により加水分解することが可能な1種以上の触媒42である。したがって、触媒42を原料スラリー16に導入した後、油26中のグリセリドの少なくとも一部が、FFA28に加水分解され、FFA28および触媒42を有する原料スラリー18が得られる。加水分解油26から得られた酸/油組成物は、通常、少なくとも約17重量のFFAである。ある実施形態において、加水分解油26から得られた酸/油組成物は、少なくとも約20重量のFFA、少なくとも約25重量のFFA、少なくとも約30重量のFFA、少なくとも約35重量のFFA、少なくとも約40重量のFFA、少なくとも約45重量のFFA、少なくとも約50重量のFFA、少なくとも約55重量のFFA、少なくとも約60重量のFFA、少なくとも約65重量のFFA、少なくとも約70重量のFFA、少なくとも約75重量のFFA、少なくとも約80重量のFFA、少なくとも約85重量のFFA、少なくとも約90重量のFFA、少なくとも約95重量のFFA、または少なくとも約99重量のFFAである。あるいは、ある実施形態において、物質42は、代わりに、組み換え微生物32と接触させるためのFFA28に油26を化学的に反応させることが可能な1種以上の反応剤または溶媒を構成し得る。2010年7月28日に出願され、全体が参照により本明細書に援用される、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第61/368,436号明細書にさらに記載されるように、例えば、トウモロコシ油脂肪酸が、NaOHおよび水を物質42として用いた塩基加水分解によって油26としてのトウモロコシ油から合成され得る。また、全体が参照により本明細書に援用されるRoe,etal.,Am.OilChem.Soc.29:18-22,1952にさらに記載されるように、例えば、油26としてのトウモロコシ油トリグリセリドが、反応剤42としての水酸化アンモニウム水溶液と反応されて、脂肪酸および脂肪アミドが得られる。図に示される実施形態を参照した本明細書における説明のために、物質42が、組み換え微生物32の発酵増殖中に補充されるFFA28にバイオマス脂質を加水分解するための物質42としての1種以上の触媒を構成するものとして記載されることが多い。しかしながら、本明細書に記載される例示的な方法およびシステムは、物質42が、バイオマス脂質をFFA28へと化学的に転化することが可能な反応剤および/または溶媒であるように変更され得ることを理解されたい。ある実施形態において、触媒42は、1種以上の酵素、例えば、リパーゼ酵素などの加水分解酵素であり得る。使用されるリパーゼ酵素は、例えば、アブシディア属Absidia、アクロモバクター属Achromobacter、アエロモナス属Aeromonas、アルカリゲネス属Alcaligenes、アルテルナリア属Alternaria、アスペルギルス属Aspergillus、アクロモバクター属Achromobacter、アウレオバシジウム属Aureobasidium、バチルス属Bacillus、ビューベリア属Beauveria、ブロコトリックス属Brochothrix、カンジダ属Candida、クロモバクター属Chromobacter、コプリナス属Coprinus、フザリウム属Fusarium、ゲオトリクム属Geotricum、ハンゼヌラ属Hansenula、フミコーラ属Humicola、ハイホジーマ属Hyphozyma、乳酸杆菌属Lactobacillus、メタリジウム属Metarhizium、ケカビ属Mucor、ネクトリア属Nectria、アカパンカビ属Neurospora、ペシロマイセス属Paecilomyces、ペニシリウム属Penicillium、シュードモナス属Pseudomonas、リゾクトニア属Rhizoctonia、リゾムコール属Rhizomucor、クモノスカビ属Rhizopus、ロドスポリジウム属Rhodosporidium、ロドトルラ属Rhodotorula、サッカロマイセス属Saccharomyces、イノシシ属Sus、スポロボロマイセス属Sporobolomyces、サーモマイセス属Thermomyces、チアロスポレラThiarosporella、トリコデルマ属Trichoderma、バーティシリウム属Verticillium、および/またはヤロウイア属Yarrowiaの菌株を含む任意の供給原に由来し得る。好ましい態様において、リパーゼの供給源は、アブシディアブラケスレーナAbsidiablakesleena、アブシディアコリムビフェラAbsidiacorymbifera、アクロモバクターイオファガスAchromobacteriophagus、アルカリゲネス属Alcaligenessp.、アルタナリアブラシキコラAlternariabrassiciola、アスペルギルスフラブスAspergillusflavus、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アウレオバシジウムプルランスAureobasidiumpullulans、バチルスプミルスBacilluspumilus、バチルスステアロサーモフィルスBacillusstrearothermophilus、枯草菌Bacillussubtilis、ブロコトリクスサーモソハタBrochothrixthermosohata、カンジダキリンドラケアCandidacylindraceaカンジダルゴサCandidarugosa、カンジダパラリポリティカCandidaparalipolytica、カンジダアンタークティカCandidaAntarcticaリパーゼA、カンジダアンタークティカCandidaantarcticaリパーゼB、カンジダエルノビCandidaernobii、カンジダデフォルマンスCandidadeformans、クロモバクタービスコスムChromobacterviscosum、ネナガヒトヨタケCoprinuscinerius、フザリウムオキシスポルムFusariumoxysporum、フザリウムソラニFusariumsolani、フザリウムソラニピシFusariumsolanipisi、フザリウムロゼウムクルモルムFusariumroseumculmorum、ゲオトリクムペニシラツムGeotricumpenicillatum、ハンゼヌラアノマラHansenulaanomala、フミコーラブレビスポラHumicolabrevispora、フミコーラブレビス変種サーモイデアHumicolabrevisvar.thermoidea、フミコーラインソレンスHumicolainsolens、ラクトバチルスクルヴァトゥスLactobacilluscurvatus、リゾプスオリゼRhizopusoryzae、ペニシリウムシクロピウムPenicilliumcyclopium、ペニシリウムクラストサムPenicilliumcrustosum、ペニシリウムエクスパンザムPenicilliumexpansum、ペニシリウム属Penicilliumsp.I、ペニシリウム属Penicilliumsp.II、緑膿菌Pseudomonasaeruginosa、シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenes、シュードモナスセパシアPseudomonascepaciaバークホルデリアセパシアBurkholderiacepaciaと同義、蛍光菌Pseudomonasfluorescens、シュードモナスフラギPseudomonasfragi、シュードモナスマルトフィリアPseudomonasmaltophilia、シュードモナスメンドシナPseudomonasmendocina、シュードモナスメフィティカリポリティカPseudomonasmephiticalipolytica、シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenes、シュードモナスプランタリイPseudomonasplantarii、シュードモナスシュードアルカリゲネスPseudomonaspseudoalcaligenes、シュードモナスプチダPseudomonasputida、シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri、およびシュードモナスウィスコンシネンシスPseudomonaswisconsinensis、紋枯病菌Rhizoctoniasolani、リゾムコールミエヘイRhizomucormiehei、リゾプスジャポニクスRhizopusjaponicus、リゾプスミクロスポラスRhizopusmicrosporus、リゾプスノドススRhizopusnodosus、ロドスポリジウムトルロイデスRhodosporidiumtoruloides、ロドトルラグルチニスRhodotorulaglutinis、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、スポロボロマイセスシバタヌスSporobolomycesshibatanus、イノシシSusscrofa、サーモマイセスラヌギノススThermomyceslanuginosus以前はフミコーララヌギノサHumicolalanuginosa、チアロスポレラファセオリナThiarosporellaphaseolina、トリコデルマハルジアヌムTrichodermaharzianum、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、およびヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaからなる群から選択される。さらなる好ましい態様において、リパーゼは、サーモマイセスラヌギノススThermomcyceslanuginosus、アスペルギルス属Aspergillussp.リパーゼ、アスペルギルスニガーAspergillusnigerリパーゼ、カンジダアンタークティカCandidaantarcticaリパーゼB、シュードモナス属Pseudomonassp.リパーゼ、ペニシリウムロックフォルティPenicilliumroquefortiリパーゼ、ペニシリウムカメンベルティPenicilliumcamembertiiリパーゼ、ムコールジャバニクスMucorjavanicusリパーゼ、バークホルデリアセパシアBurkholderiacepaciaリパーゼ、アルカリゲネス属Alcaligenessp.リパーゼ、カンジダルゴサCandidarugosaリパーゼ、カンジダパラプシロシスCandidaparapsilosisリパーゼ、カンジダデフォルマンスCandidadeformansリパーゼ、ゲオトリクムカンジドゥムGeotrichumcandidumに由来するリパーゼAおよびB、アカパンカビNeurosporacrassaリパーゼ、ネクトリアハエマトコカNectriahaematococcaリパーゼ、フザリウムヘテロスポラムFusariumheterosporumリパーゼ、リゾプスデレマRhizopusdelemarリパーゼ、リゾムコールミエヘイRhizomucormieheiリパーゼ、リゾプスアリズスRhizopusarrhizusリパーゼ、およびリゾプスオリゼRhizopusoryzaeリパーゼからなる群から選択される。酵素触媒42として適した好適な市販のリパーゼ調製物としては、以下に限定はされないが、Novozymesから入手可能な、Lipolase登録商標100L、Lipex登録商標100L、Lipoclean登録商標2000T、Lipozyme登録商標CALBL、Novozyme登録商標CALAL、およびPalatase20000L、あるいはSigmaAldrichから入手可能な、蛍光菌Pseudomonasfluorescens、シュードモナスセパシアPseudomonascepacia、ムコールミエヘイMucormiehei、ブタ膵臓、カンジダキリンドラケアCandidacylindracea、リゾプスニベウスRhizopusniveus、カンジダアンタークティカCandidaantarctica、リゾプスアリズスRhizopusarrhizusまたはアスペルギルス属Aspergillusに由来するリパーゼが挙げられる。グリセリドの少なくとも一部が加水分解された後、ある実施形態において、触媒42が、失活され得る。当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、触媒42を失活させることができる。例えば、ある実施形態において、触媒42は、加熱によって、および/または反応塊reactionmassのpHを、触媒42が不可逆的に失活されるpHに調整することによって、および/または触媒活性を選択的に失活させることが可能な化学種または生化学種を加えることによって、失活され得る。図示されるように、例えば、図1の実施形態において、熱qが、原料スラリー18に加えられ、それによって、触媒42は失活する。熱qの適用は、原料スラリー18が発酵槽30に供給される前に、原料スラリー18に加えられ得る。次に、熱処理された原料スラリー18が不活性な触媒42とともに、発酵槽30中に保持される発酵ブロスに含まれるべき微生物32とともに発酵槽30に導入される。あるいは、原料スラリー18は、微生物32の発酵槽接種の前に、発酵槽30に供給され、発酵槽中で熱qを加えられ得る。例えば、ある実施形態において、熱qを用いて、原料スラリー18を、少なくとも約5分間にわたって少なくとも約75°C、少なくとも約10分間にわたって少なくとも約75°C、少なくとも約15分間にわたって少なくとも約75°C、少なくとも約5分間にわたって少なくとも約80°C、少なくとも約10分間にわたって少なくとも約80°C、少なくとも約15分間にわたって少なくとも約80°C、少なくとも約5分間にわたって少なくとも約85°C、少なくとも約10分間にわたって少なくとも約85°C、または少なくとも約15分間にわたって少なくとも約85°Cの温度まで加熱することによって、触媒失活処理を行うことができる。ある実施形態において、熱qを加えられた後、発酵槽30に導入する前または熱qの適用が発酵槽に行われる場合、発酵槽接種の前に、原料スラリー18が、発酵に適切な温度に冷却される。例えば、ある実施形態において、原料スラリー18の温度は、発酵ブロスと接触させる前に約30°Cである。触媒42が、発酵槽中の脂肪酸28とともにアルコールをエステル化するのを防ぐことが望ましい場合、触媒42の失活が好ましい。全て全体が参照により本明細書に援用される、2010年7月28日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第61/368,429号明細書;2010年9月2日に出願された米国仮特許出願第61/379,546号明細書;および、2011年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/440,034号明細書にさらに説明されるように、ある実施形態において、有機酸例えば、脂肪酸および触媒例えば、リパーゼを用いた発酵培地中の生成物アルコールのエステル化によるアルコールエステルの生成が望ましい。例えば、ブタノール生成では、スラリー18を介して導入される発酵槽中の活性な触媒42が、スラリー18を介して導入される脂肪酸28とともにブタノールのエステル化を触媒して、脂肪酸ブチルエステルFABEを原位置で形成することができる。脂肪酸のアルコールエステルが望ましいこのような実施形態において、本明細書に記載される方法は、生成物アルコールを含む発酵ブロスを接触させる前の触媒42の失活を除外するように変更され得る。したがって、図1~5の例示的なプロセス流れ図を参照して、これらの代替的な実施形態が、触媒42が発酵槽30中の脂肪酸28とともに生成物アルコールをエステル化するように、触媒42を含有するプロセス流への熱qの適用を除外することによって達成され得る。さらに、ある実施形態において、図1~5の例示的なプロセス流れ図は、触媒42の代わりに1種以上の反応剤または溶媒を物質42として用いた、FFA28への油26の化学的転化が必要でない場合、熱qを除外するように変更され得る。発酵槽30は、スラリー18を発酵させて、ブタノールなどの生成物アルコールを生成するように構成される。特に、微生物32が、スラリー18中の発酵性糖を代謝し、生成物アルコールを排出する。微生物32は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される。ある実施形態において、微生物32は、大腸菌E.coliなどの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物32は、発酵性組み換え微生物であり得る。スラリーは、例えば、オリゴ糖の形態の糖、および水を含んでいてもよく、約20g/L未満のモノマーグルコース、より好ましくは約10g/L未満または約5g/L未満のモノマーグルコースを含み得る。モノマーグルコースの量を決定するための好適な方法は、当該技術分野において周知である。当該技術分野において公知のこのような好適な方法は、HPLCを含む。ある実施形態において、スラリー18中の複合糖類例えば、オリゴ糖を、微生物32によって容易に代謝され得る単糖類へと分解するために、スラリー18が、糖化プロセスに供される。酸プロセス、酸-酵素プロセス、または酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で通常用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、同時糖化発酵SSFは、図1に示されるように、発酵槽30の内部で行われ得る。ある実施形態において、でんぷんまたはオリゴ糖を、微生物32によって代謝可能なグルコースに分解するために、グルコアミラーゼなどの酵素38が、発酵槽30の入口に導入され得る。任意に、エタノール33が、発酵ブロスに含まれるべく、発酵槽30に供給され得る。ある実施形態において、ブタノール生合成経路を有する組み換え微生物が、ブタノール生成のための微生物32として使用される場合、微生物32は、生存し、成長するために2-炭素基質例えば、エタノールの補充を必要とし得る。したがって、ある実施形態において、エタノール33が、発酵槽30に供給され得る。しかしながら、遊離脂肪酸例えば、FFA28が発酵槽中に存在する本発明の方法が、組み換え微生物の生命力を損なうことなく、所与の組み換え微生物に通常供給されるエタノール33の量を減少させることができることが意外にも分かった。さらに、ある実施形態において、本発明の方法により、エタノールを補充しないアルコール例えば、ブタノール生成速度を、エタノール33が補充される場合に実現され得る生成速度と同等にすることができる。以下の実施例1~14に示される比較例によってさらに示されるように、発酵槽中に脂肪酸はあるもののエタノールがない場合のブタノール生成速度は、発酵槽中に脂肪酸もエタノールもない場合のブタノール生成速度より高くなり得る。したがって、ある実施形態において、エタノール33の補充の量が、従来のプロセスと比較して減少される。例えば、2-炭素基質の補充を必要とする微生物のために発酵槽に加えられるエタノールの通常の量は、約5g/Lの無水エタノールすなわち、発酵培地のリットル当たり5gの無水エタノールである。ある実施形態において、発酵にエタノール33が一切補充されない。後者の場合、エタノール33の流れ全体が、発酵槽から除外される。したがって、本発明のある実施形態において、補充するエタノール33に付随するコスト、ならびに大量のエタノール33の貯蔵およびブタノール発酵中の発酵槽へのエタノールの供給に付随する不都合を低減するかまたはなくすことが可能である。さらに、エタノールの補充に関係なく、ある実施形態において、本発明の方法は、発酵中の脂肪酸の存在のために、微生物32によるより高いグルコース取り込み率を提供することができる。本明細書に記載される方法にしたがって、脂肪酸は、FFA28として発酵槽30に導入され、スラリー16の原料油26から加水分解され、あるいは発酵プロセス中の工程においてバイオマス脂質などの天然油から加水分解され得る。脂肪酸を、ISPR抽出剤29として発酵槽に導入することもできる。発酵槽30中、アルコールが、微生物32によって生成される。原位置生成物除去ISPRを用いて、生成物アルコールを発酵ブロスから除去することができる。ある実施形態において、ISPRは液液抽出を含む。液液抽出は、開示内容の全体が、本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0305370号明細書に記載される方法にしたがって行われ得る。米国特許出願公開第2009/0305370号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを生成し、回収するための方法が記載され、この方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む二相混合物を形成する工程を含む。通常、抽出剤は、飽和、単不飽和、多価不飽和およびそれらの混合物C12~C22の脂肪アルコール、C12~C22の脂肪酸、C12~C22の脂肪酸のエステル、C12~C22の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得、これは、発酵ブロスと接触し、水相および有機相を含む二相混合物を形成する。抽出剤はまた、飽和、単不飽和、多価不飽和およびそれらの混合物C4~C22の脂肪アルコール、C4~C28の脂肪酸、C4~C28の脂肪酸のエステル、C4~C22の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得、これは、発酵ブロスと接触し、水相および有機相を含む二相混合物を形成する。スラリー18からの遊離脂肪酸28は、ISPR抽出剤28としても働き得る。例えば、遊離脂肪酸28がトウモロコシ油脂肪酸COFAである場合、ISPR抽出剤28はCOFAである。ISPR抽出剤FFA28は、発酵ブロスと接触し、水相34および有機相を含む二相混合物を形成する。発酵ブロス中に存在する生成物アルコールは、優先的に有機相中に分離して、アルコール含有有機相36が形成される。ある実施形態において、発酵槽30は、生成物アルコールが有機相中に分離している状態で、水相および有機相を含む二相混合物を形成する1種以上のさらなるISPR抽出剤29を受け入れるための1つ以上の入口を有する。二相混合物は、流れ39として発酵槽30から除去され、槽35に導入され得、その中で、アルコール含有有機相36は、水相34から分離される。アルコール含有有機相36は、以下に限定はされないが、サイフォニング、デカンテーション、吸入、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む当該技術分野において公知の方法を用いて、二相流39の水相34から分離される。水相34の全てまたは一部が、発酵培地図示されるとして発酵槽30中に再利用されるか、あるいは廃棄され、新しい培地と交換されるか、または残っている生成物アルコールを除去するために処理され、次に発酵槽30へと再利用され得る。次に、アルコール含有有機相36は、生成物アルコール54を回収するように分離器50中で処理され、次に、得られたアルコール希薄抽出剤27が、生成物アルコールのさらなる抽出のために、スラリー18からの新鮮なFFA28および/または新鮮な抽出剤29と通常組み合わされて、発酵槽30中に戻されて再利用され得る。あるいは、スラリー18からの新鮮なFFA28および/または抽出剤29は、二相混合物流39中で除去されたISPR抽出剤の代わりに発酵槽に連続して加えられ得る。ある実施形態において、任意のさらなるISPR抽出剤29は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、1-ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、20-メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの外部からの有機抽出剤であり得る。ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、カルボン酸または遊離脂肪酸であり得、ある実施形態において、カルボン酸または遊離脂肪酸は、4~28個の炭素、他の実施形態において4~22個の、他の実施形態において8~22個の炭素、他の実施形態において10~28個の炭素、他の実施形態において7~22個の炭素、他の実施形態において12~22個の炭素、他の実施形態において4~18個の炭素、他の実施形態において12~22個の炭素、さらに他の実施形態において12~18個の炭素の鎖を有する。ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、以下の脂肪酸:アゼライン酸、カプリン酸、カプリル酸、ヒマシ油、ヤシ油すなわち、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、カプリル酸、カプリン酸、ステアリン酸、カプロン酸、アラキジン酸、オレイン酸、およびリノール酸を含む脂肪酸の天然に存在する組合せとして、二量体酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、亜麻仁油、ミリスチン酸、オレイン酸、オリーブ油、パーム油、パルミチン酸、パーム核油、ピーナッツ油、ペラルゴン酸、リシノール酸、セバシン酸、大豆油、ステアリン酸、トール油、獣脂、12ヒドロキシステアリン酸、または任意の種油のうちの1つ以上である。ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、二酸、例えば、アゼライン酸およびセバシン酸のうちの1つ以上である。したがって、ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、2種以上の異なる遊離脂肪酸の混合物であり得る。ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、天然油に由来するグリセリドの化学的または酵素加水分解から誘導される脂肪酸であり得る。例えば、ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、図4の実施形態を参照して後述されるバイオマス脂質などの天然油の酵素加水分解によって得られる遊離脂肪酸28’であり得る。ある実施形態において、ISPR抽出剤29は、例えば、2010年7月28日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第61/368,436号明細書に記載されるバイオマス脂質などの天然油の化学的転化から得られる、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸の低級アルコールエステル、脂肪酸グリコールエステル、水酸化トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される脂肪酸抽出剤であり得る。このような実施形態において、抽出剤29を生成するためのバイオマス脂質は、原料12が得られる同じかまたは異なるバイオマス源に由来し得る。例えば、ある実施形態において、抽出剤29を生成するためのバイオマス脂質が、大豆に由来し得るが、原料12のバイオマス源はトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料12に対する抽出剤29のための異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。ある実施形態において、さらなるISPR抽出剤29はCOFAを含む。原位置抽出発酵は、発酵槽30中でバッチモードまたは連続モードで行われ得る。原位置抽出発酵では、有機抽出剤を、発酵の開始時点で発酵培地と接触させ、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、微生物が所望の量の増殖培地の光学密度を測定することによって決定され得るを達成した後、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。さらに、発酵培地中の生成物アルコールレベルが、予め選択したレベルに達した時点で、有機抽出剤を発酵培地と接触させることができる。ブタノール生成の場合、例えば、ブタノール濃度が、微生物に対して有毒であろうレベルに達する前の時点で、ISPR抽出剤を発酵培地と接触させることができる。発酵培地をISPR抽出剤と接触させた後、ブタノール生成物が抽出剤中に分離し、微生物を含有する水相中の濃度が低下し、それによって、抑制性のブタノール生成物への生成微生物の曝露が抑えられる。使用されるISPR抽出剤の体積は、後述されるように、発酵培地の体積、発酵槽のサイズ、ブタノール生成物のための抽出剤の分配係数、および選択される発酵モードを含むいくつかの要因に応じて決まる。抽出剤の体積は、発酵槽の使用体積の約3~約60であり得る。抽出の効率に応じて、発酵培地中のブタノールの水相力価は、例えば、約1g/L~約85g/L、約10g/L~約40g/L、約10g/L~約20g/L、約15g/L~約50g/Lまたは約20g/L~約60g/Lであり得る。ある実施形態において、アルコールエステル化の後に得られる発酵ブロスは、遊離すなわち、非エステル化アルコールを含み得、ある実施形態において、生成物アルコールがブタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、1、3、6、10、15、20、25、30、25、40、45、50、55、または60g/L以下であり、または生成物アルコールがエタノールである場合、アルコールエステル化の後の発酵ブロス中の遊離アルコールの濃度は、15、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100g/L以下である。理論に制約されるものではないが、より高いブタノール力価は、抽出発酵方法を用いて、発酵培地から毒性ブタノール生成物を除去し、それによって、微生物に対して有毒なレベルより低いレベルを保つことから得られると考えられる。原位置抽出発酵のバッチモードにおいて、所定の体積の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、抽出剤は、プロセス中に除去されない。このモードは、発酵培地中の抑制性のブタノール生成物の濃度を最小限に抑えるために、より大きい体積の有機抽出剤を必要とする。その結果、発酵培地の体積は、より小さく、生成される生成物の量は、連続モードを用いて得られる量より少ない。例えば、バッチ式モードにおける抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の20~約60であり、別の実施形態において約30~約60であり得る。ガスストリッピング図示せずを、ISPR抽出剤と同時に用いて、生成物アルコールを発酵培地から除去することができる。図1の実施形態において、生成物アルコールは、発酵ブロスから原位置で抽出され、二相混合物39の分離が、別個の槽35で起こる。ある実施形態において、二相混合物39の分離は、後述される図2および3の実施形態に示されるように、発酵槽で行うことができ、これらの図では、アルコール含有有機相流36が発酵槽30から直接出る。水相流34も発酵槽30から直接出ることができ、一切の残っている生成物アルコールを除去するように処理され、再利用され、または廃棄され、新しい発酵培地と交換され得る。有機抽出剤による生成物アルコールの抽出は、発酵ブロスからの微生物の除去を伴うかまたは伴わずに行うことができる。微生物は、以下に限定はされないが、ろ過または遠心分離を含む、当該技術分野において公知の手段によって、発酵ブロスから除去され得る。例えば、水相流34は、酵母などの微生物32を含み得る。微生物32は、例えば、遠心分離機図示せずにおいて、水相流から容易に分離され得る。その後、微生物32は、発酵槽30に再利用することができ、発酵槽30は、時間の経過とともにアルコール生成の生成速度を上げ、それによって、アルコール生成の効率を高めることができる。原位置抽出発酵の連続モードにおいて、抽出剤の体積は、一実施形態において発酵槽の使用体積の約3~約50であり、別の実施形態において約3~約30であり、別の実施形態において3~約20であり;別の実施形態において3~約10であり得る。生成物は、反応器から連続して除去されるため、より小さい体積の抽出剤が必要とされ、より大きい体積の発酵培地の使用が可能になる。原位置抽出発酵の代わりとして、生成物アルコールは、発酵槽30の下流の発酵ブロスから抽出され得る。このような場合、発酵ブロスは、発酵槽30から除去され、ISPR抽出剤と接触させるために槽35に導入されて、槽35中で二相混合物39が得られ、次に、これは、有機相36と水相34とに分離される。あるいは、ISPR抽出剤は、槽35に導入される前に、別個の槽図示せず中で発酵ブロスに加えられ得る。非限定的なデータの裏づけのないprophetic実施例として、図1の実施形態を参照して、約4重量のトウモロコシ油を通常含有し得る、磨砕された全粒トウモロコシ原料12としてのの水性懸濁液が、約85°C~120°Cで30分間~2時間にわたって、アミラーゼ液化酵素14としてので処理され得、得られた液化されたマッシュ16が、65°C~30°Cに冷却され、pH4.5~7.5ある実施形態において、pH5.5~6.5で、脂質中の利用可能な脂肪酸含量の、遊離脂肪酸への転化率が少なくとも30から少なくとも99もの高さになるのに十分な時間にわたって、0.1ppm~10ppmある実施形態において、0.5ppm~1.0ppmのリパーゼ触媒42としてので処理され得る。任意に、液化され、リパーゼ処理されたマッシュ18は、発酵の前にリパーゼ42を失活させるように加熱され得る。マッシュ18は、例えば、熱交換器を用いて約30°Cに冷却され、約25~30重量の乾燥トウモロコシ固体で発酵槽30に充填され得る。グルコアミラーゼ糖化酵素38としてのの添加による発酵中の液化されたマッシュ18の糖化により、グルコースが生成され得る。得られた発酵ブロスは、リパーゼ42で処理されていない液化されたマッシュを用いて、発酵ブロス中に存在し得るトウモロコシ油例えば、約1.2重量のトウモロコシ油の量よりかなり少ない量を含有し得る。特に、リパーゼ42処理により、トウモロコシ油脂質26トリグリセリドTGを、FFA28としてCOFAおよびいくらかのジグリセリドDGまたはモノグリセリドMGに転化することができ、それが、発酵ブロスと接触する。COFAの存在下での発酵ブロス中の微生物の増殖速度および/またはグルコース消費は、脂肪酸がない場合の微生物の増殖速度および発酵性炭素消費より高くなり得る。例えば、実施例において後述されるように、図6~8は、補充される脂肪酸の存在下でのブタノール生成微生物による増加されたグルコース消費を示す。ある実施形態において、図1のシステムおよび方法は、原料スラリー16油26を有するおよび触媒42が導入され、スラリー18FFA28を有するを生成するように発酵槽30中で接触されるように変更され得る。その際、発酵槽温度を上げて、触媒42を熱により失活させることができる。その際、発酵槽温度を低下させることができ、発酵槽に微生物32を接種することができ、それによって、スラリー18の糖を発酵させて、生成物アルコールを生成することができる。当業者に明らかであるはずであるように、ある実施形態において、図1のシステムおよび方法は、発酵槽30中の同時糖化発酵SSFが、発酵槽30の前に別個の糖化槽60図2を参照に置き換えられるように変更され得る。したがって、スラリー18は、SSFプロセスにおいて発酵前または発酵中に糖化され得る。原料油26の加水分解のための触媒42が、糖化酵素38の前、後、または同時に導入され得ることも明らかであるはずである。したがって、ある実施形態において、酵素38および触媒42の転化は段階的であり得例えば、触媒42、次に酵素38、または逆の場合もあるまたはほぼ同時すなわち、人または機械が一回で添加を行うのにかかる時間と全く同じ時間で、あるいは人または機械が2回で添加を行うのにかかる時間と同じように1つの酵素/触媒の直後に他の触媒/酵素を添加するであり得る。例えば、図2の実施形態に示されるように、図1のシステムおよび方法は、発酵槽30中の同時糖化発酵SSFが、発酵槽30の前に別個の糖化槽60に置き換えられるように変更され得る。図2は、酵素38を受け入れる別個の糖化槽60を含み、触媒42が、液化され、糖化された原料流62に導入される以外は図1とほぼ同一である。原料スラリー16が、グルコアミラーゼなどの酵素38とともに糖化槽60に導入され、それによって、スラリー16中のオリゴ糖の形態の糖類が、単糖類へと分解され得る。液化され、糖化された原料流62が、糖化槽60を出て、それに触媒42が導入される。原料流62は、原料に由来する、単糖類、油26、および非溶解固体を含む。油26は、触媒42の導入によって加水分解され、遊離脂肪酸28および触媒42を有する液化され、糖化された原料スラリー64が得られる。あるいは、ある実施形態において、触媒42が、糖化酵素38とともに加えられて、グルコースを生成するのと同時に、油脂質26を遊離脂肪酸28に加水分解することができる。酵素38および触媒42の転化は段階的であり得例えば、触媒42、次に酵素38、または逆の場合もあるまたは同時であり得る。あるいは、ある実施形態において、スラリー62が、発酵槽に導入され得、触媒42が、発酵槽30に直接加えられる。図2の実施形態において、熱qが、原料スラリー64に加えられ、それによって、触媒42が失活し、次に、熱処理されたスラリー64が、単糖類を代謝して生成物アルコール例えば、ブタノールを生成するアルコール生成微生物32とともに発酵槽30に導入される。あるいは、スラリー64は、発酵槽30に供給され、微生物32の接種の前に、発酵槽中で熱qを加えられ得る。図1を参照して上述したように、遊離脂肪酸28は、水相から生成物アルコールを優先的に分離するためのISPR抽出剤として働くこともできる。ある実施形態において、1種以上のさらなるISPR抽出剤29も、発酵槽30に導入され得る。二相混合物の分離が、発酵槽30中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流36および水相流34が、発酵槽30から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図1の実施形態において提供されるように、別個の槽35中で行われ得る。図2の実施形態の残りのプロセス作業は、図1と同一であるため、再度詳細に説明しない。さらに他の実施形態において、FFA28を有する原料スラリー18が液化槽10から直接出て、発酵槽30に供給され得るように、原料12に由来する油26が、液化の前または液化中のいずれかで、FFA28へと触媒により加水分解され得る。例えば、油26を有する原料12が、油26中のグリセリドの少なくとも一部をFFA28へと加水分解するための触媒42とともに、液化槽10に供給され得る。原料12中のでんぷんを加水分解する酵素14例えば、α-アミラーゼも、液化された原料を生成するために槽10に導入され得る。酵素14および触媒42の添加は、段階的または同時であり得る。例えば、油26の少なくとも一部が加水分解された後、触媒42が導入され得、次に、酵素14が導入され得る。あるいは、酵素14が導入され得、次に、触媒42が導入され得る。液化プロセスは、熱qの適用を含み得る。このような実施形態において、プロセス温度が触媒42を失活させる温度より低い場合、油26が加水分解され得るように、触媒42が液化の前または液化中に導入され得る。その後、熱qの適用は、失活が所望される場合、触媒42の液化および失活の2つの目的を提供し得る。図1~3に関して上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、非溶解固体が、発酵槽30に導入される前に、原料スラリーから除去され得る。例えば、図4の実施形態に示されるように、原料スラリー16が、非溶解固体を固相またはウェットケーキ24として排出するように構成される分離器20の入口に導入される。例えば、ある実施形態において、分離器20は、原料スラリー16から非溶解固体を分離するための、フィルタープレス、真空ろ過、または遠心分離機を含み得る。任意に、ある実施形態において、分離器20はまた、原料スラリー16中に存在する油26の一部、または実質的に全てを除去するように構成され得る。このような実施形態において、分離器20は、以下に限定はされないが、サイフォニング、吸入、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器の使用、膜支援相分離などを含む、水性原料流から油を除去するための、当該技術分野において公知の任意の好適な分離器であり得る。糖および水を含む残りの原料は、水流22として発酵槽30に排出される。ある実施形態において、分離器20は、油26を除去するが、非溶解固体を除去しない。したがって、発酵槽30に供給される水流22は、非溶解固体を含む。ある実施形態において、分離器20は、糖および水を含有する水層すなわち、流れ22、非溶解固体を含有する固体層すなわち、ウェットケーキ24、および油層すなわち、油流26を含む遠心分離生成物を生成するように原料スラリー16を撹拌または回転させるトリカンターtricanter遠心分離機20を含む。遠心分離によって原料スラリー16から非溶解固体を除去するための方法およびシステムは、全体が参照により本明細書に援用される、2010年6月18日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第61/356,290号明細書に詳細に記載されている。いずれの場合も、図3に示されるように、触媒42が、除去された油26と接触されて、触媒42を含むFFA28の流れが生成され得る。次に、熱qが、FFA28の流れに加えられ得、それによって、触媒42が失活する。次に、FFA28および不活性な触媒42の流れは、流れ22および微生物32とともに、発酵槽30に導入され得る。あるいは、FFA28および活性触媒42は、槽40から発酵槽30に供給され得、その後、活性触媒42は、微生物32の接種の前に、熱qを加えられ、発酵槽中で失活され得る。FFA28は、ISPR抽出剤28として働くことができ、発酵槽30中で二相混合物を形成する。SSFによって生成される生成物アルコールは、FFA28によって構成される有機相36中に分離する。ある実施形態において、1種以上のさらなるISPR抽出剤29も、発酵槽30に導入され得る。したがって、油26例えば、原料に由来するは、FFA28に触媒により加水分解され、それによって、ISPR抽出剤も生成しつつ、ISPR抽出剤中の脂質の蓄積の速度を低下させることができる。有機相36は、槽35において二相混合物39の水相34から分離され得る。ある実施形態において、二相混合物39の分離は、図2および3に記載される実施形態に示されるように、発酵槽で行うことができ、これらの図では、アルコール含有有機相流36は、発酵槽30から直接出る。有機相36は、図1に示されるように、生成物アルコール54の回収および回収された抽出剤27の任意選択の再利用のために、分離器50に導入され得る。図3の実施形態の残りのプロセス作業は、図1と同一であるため、再度詳細に説明しない。ウェットケーキ24が、遠心分離機20を介して除去されるとき、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料12からの油の一部が、ウェットケーキ24中に残る。水溶液22が遠心分離機20から排出されてから、ウェットケーキ24は、遠心分離機においてさらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ24の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖例えば、オリゴ糖を回収し、回収された糖および水は、液化槽10に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ20は、任意の好適な公知の方法によって、乾燥されて、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕DDGSが形成され得る。遠心分離機20において形成されるウェットケーキ24からのDDGSの形成にはいくつかの利点がある。非溶解固体が発酵槽に送られないため、DDGSは、抽出剤および/またはブタノールなどの生成物アルコールを捕捉せず、DDGSは、発酵槽の条件に供されず、発酵槽中に存在する微生物と接触しない。全てのこれらの利点が、例えば、動物飼料としてのDDGSの処理および販売をより容易にする。ある実施形態において、油26は、ウェットケーキ24から別々に排出されず、油26は、ウェットケーキ24の一部として含まれ、最終的にDDGS中に存在する。このような場合、油は、DDGSから分離され、同じかまたは異なるアルコール発酵プロセスにおいてその後の使用のためにISPR抽出剤29に転化され得る。遠心分離によって原料16から非溶解固体を除去するための方法およびシステムは、全体が参照により本明細書に援用される、2010年6月18日に出願された、同時係属中の、同一出願人が所有する米国仮特許出願第61/356,290号明細書に詳細に記載されている。さらに他の実施形態図示せずにおいて、当業者に明らかであるはずであるように、糖化が、分離器20と液化槽10との間に位置する別個の糖化槽60図2を参照で行われ得る。例えば、図4の実施形態に示されるさらに他の実施形態において、天然油26’が、触媒42も供給される槽40に供給され、それによって、油26’中のグリセリドの少なくとも一部が加水分解されて、FFA28’が形成される。その後、触媒42が、熱qの適用などによって失活され得る。次に、FFA28’および不活性な触媒42を含む槽40からの生成物流が、原料油26、およびある実施形態において、非溶解固体が、分離器20例えば、図3の実施形態を参照によって予め除去された水性原料流22とともに、発酵槽30に導入される。糖化酵素38および微生物32も、発酵槽30に導入され、それによって、生成物アルコールが、SSFによって生成される。あるいは、油26’および触媒42は、発酵槽30に直接供給され得、その中で、油26’が、槽40を用いずにFFA28’に加水分解される。その後、活性触媒42は、熱qを加えられ、微生物32の接種の前に発酵槽中で失活され得る。あるいは、FFA28’および活性触媒42は、槽40から発酵槽30に供給され得、活性触媒42は、その後、熱qを加えられ、微生物32の接種の前に発酵槽中で失活され得る。このような実施形態において、油26が除去された流れ22ではなく、油26を含む原料スラリー16が、発酵槽30に供給され、活性触媒42と接触され得る。したがって、活性触媒42を用いて、油26をFFA28へと加水分解することができ、それによって、発酵槽中の油の存在に起因し得る、時間の経過に伴う抽出剤の損失および/または抽出剤の分配係数の低下を抑えることができる。ある実施形態において、当業者に明らかであるはずであるように、図4のシステムおよび方法は、発酵槽30中の同時糖化発酵が、発酵槽30の前に別個の糖化槽60と置き換えられるように変更され得る。ある実施形態において、天然油26’が、獣脂、トウモロコシ油、キャノーラ油、カプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、ヒマシ油、ヤシ油、綿実油、魚油、ホホバ油、ラード、亜麻仁油、牛脚油、オイチシカ油、パーム油、ピーナッツ油、ナタネ油、米油、ベニバナ油、大豆油、ヒマワリ油、キリ油、ジャトロファ油、植物油ブレンド、およびそれらの混合物であり得る。ある実施形態において、天然油26’は、2種以上の天然油の混合物、例えば、パーム油と大豆油との混合物である。ある実施形態において、天然油26’は植物由来油である。ある実施形態において、植物由来油は、必ずしもではないが、発酵プロセスに使用され得るバイオマスに由来し得る。バイオマスは、原料12流れ22として図4に示されるが得られる同じかまたは異なる供給源であり得る。したがって、例えば、ある実施形態において、油26’は、トウモロコシに由来し得るが、原料12はサトウキビであり得る。例えば、ある実施形態において、油26’は、トウモロコシに由来し得、原料12のバイオマス源もトウモロコシである。当業者に明らかであるはずであるように、原料12に対して油26’の異なるバイオマス源の考えられるあらゆる組合せを使用することができる。図4の実施形態の残りのプロセス作業は、図1と同一であるため、再度詳細に説明しない。本発明のある実施形態において、原料12中に存在するバイオマス油は、アルコール発酵の後の工程においてFFA28に転化され得る。次に、FFA28は、発酵槽に導入され、アルコール生成微生物の向上した増殖速度および/または発酵性炭素消費を達成するために発酵ブロスと接触され得る。FFA28は、ISPR抽出剤28としても働き得る。例えば、図5の実施形態において、原料12が液化されて、原料に由来する油26を含む原料スラリー16が生成される。原料スラリー16は、原料に由来する非溶解固体も含み得る。あるいは、非溶解固体は、遠心分離機図示せずなどの分離器によってスラリー16から分離され得る。油26を含有する原料スラリー16は、糖化酵素38および微生物32を含む発酵ブロスを含む発酵槽30に直接導入される。生成物アルコールが、発酵槽30中のSSFによって生成される。あるいは、ある実施形態において、プロセスは、図2に関連して説明されるように、別個の糖化槽を含むように変更され得る。ISPR抽出剤29が、発酵槽30に導入されて、二相混合物が形成され、生成物アルコールは、ISPR抽出剤29の有機相中に分離することによって除去される。油26も有機相中に分離する。二相混合物の分離は発酵槽30中で行われ、それによって、アルコール含有有機相流36および水相流34が、発酵槽30から直接出る。あるいは、二相混合物の分離は、図1の実施形態において提供されるように、別個の槽35に行われ得る。油26を含む有機相流36は、分離器50に導入されて、抽出剤29から生成物アルコール54が回収される。得られるアルコール希薄抽出剤27は、回収された抽出剤29および油26を含む。抽出剤27は、触媒42と接触され、それによって、油26中のグリセリドの少なくとも一部が加水分解されて、FFA28が形成される。次に、発酵槽30中に戻されて再利用される前に、触媒42を失活させるために、FFA28を含む抽出剤27に熱qを加えることができる。このような再利用される抽出剤流27は、別個の流れまたは新鮮な、補給make-up抽出剤流29と組み合わされた流れであり得る。次に、発酵槽30からのアルコール含有有機相36の後の引き抜きは、新たに導入される原料スラリー16からの生成物アルコールおよびさらなる油26に加えて、FFA28およびISPR抽出剤29新鮮な抽出剤29および再利用される抽出剤27としてを含み得る。次に、有機相36は、生成物アルコールを回収するように処理され、上述したのと同様に、さらなる油26の加水分解のために触媒42と接触させた後、発酵槽30に戻されて再利用され得る。ある実施形態において、プロセス自体が生成物アルコールを抽出するための補給ISPR抽出剤としてFFA28を生成し得るため、発酵プロセスが時間とともに運転されるにつれて、補給ISPR抽出剤29の使用を段階的に停止することができる。したがって、ISPR抽出剤は、FFA28とともに再利用される抽出剤27の流れであり得る。したがって、図1~5は、発酵プロセスを含む方法およびシステムの様々な非限定的な実施形態およびバイオマス由来の油26の加水分解から生成されるFFA28、および発酵増殖の際に微生物と接触させるのに使用され得る植物由来油などの天然油26’の触媒加水分解から生成されるFFA28’を提供し、それによって、微生物の増殖速度および/または発酵性炭素消費が、遊離脂肪酸の存在下でより高くなり、アルコール生産性の向上が可能になる。上記の説明および実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明から逸脱せずに様々な用途および条件に適合させるように、本発明の様々な変形および変更を行うことができる。例えば、ある実施形態において、本発明に係る脂肪酸の補充は、発酵前、すなわち、発酵槽30中の発酵の前の微生物32のシード培養中に用いられ得る。当該技術分野において公知であるように、通常、酵母などの微生物32は、採取され、発酵槽30に接種される前に、所望の細胞濃度になるようにシード培地から増殖され得る。したがって、ある実施形態によれば、シード培地は、FFA28と接触され得、それによって、向上した増殖速度および微生物のバイオマス生成が達成され得、アルコール発酵プロセスのシード培養段階に関連する発酵前の時間が短縮され得る。したがって、本発明から逸脱せずに、プロセス効率全体を向上するために、本発明に係る脂肪酸の補充が、アルコール発酵プロセス中の様々な段階で、例えば、発酵前の培養および発酵中に用いられ得ることが明らかであるはずである。図1~5を参照して記載される上述した実施形態のいずれかを含むある実施形態において、発酵槽30中の発酵ブロスは、少なくとも1つの発酵性炭素源からブタノールへの生合成経路を介してブタノールを生成するように遺伝子組み換えすなわち、遺伝子操作された少なくとも1種の組み換え微生物32を含む。特に、組み換え微生物は、好適な炭素基質を含有する発酵ブロス中で増殖され得る。さらなる炭素基質としては、以下に限定はされないが、フルクトースなどの単糖類;ラクトース、マルトース、またはスクロースなどのオリゴ糖;でんぷんまたはセルロースなどの多糖類;あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能な原料からの精製されていない混合物が挙げられる。他の炭素基質としては、エタノール、乳酸塩、コハク酸塩、またはグリセロールが挙げられる。さらに、炭素基質は、主要な生化学中間体への代謝的転化が示された、二酸化炭素またはメタノールなどの一炭素基質でもあり得る。一炭素基質および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を用いることも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を用いて、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られているBellion,etal.,Microb.GrowthC1Compd.,[Int.Symp.],7th1993、415-32,Editors:Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK。同様に、カンジダ属Candidaの様々な種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝するSulter,etal.,Arch.Microbiol.153:485-489,1990。したがって、本発明に用いられる炭素の供給源が、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物の選択のみによって限定されると考えられる。上記の炭素基質およびそれらの混合物の全てが好適であると考えられるが、ある実施形態において、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、あるいはこれらの基質と、C5糖類を使用するように改変された酵母のためのキシロースおよび/またはアラビノースなどのC5糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびそれらの混合物などの穀類を含むでんぷんベースの原料の糖化によって、再生可能な穀類源から誘導され得る。さらに、発酵性糖は、例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2007/0031918A1号明細書に記載されるような、前処理および糖化のプロセスによって、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスから誘導され得る。適切な炭素源水流22からのに加えて、発酵ブロスは、培養物の成長およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHADを含む酵素経路の促進に適した、当業者に公知の、好適な無機物、塩、補因子、緩衝液および他の成分を含有しなければならない。生合成経路を介してブタノールを生成する組み換え微生物としては、クロストリジウム属Clostridium、ザイモモナス属Zymomonas、エシェリキア属Escherichia、サルモネラ属Salmonella、セラチア属Serratia、エルウイニア属Erwinia、クレブシエラ属Klebsiella、赤痢菌属Shigella、ロドコッカス属Rhodococcus、シュードモナス属Pseudomonas、バチルス属Bacillus、乳酸杆菌属Lactobacillus、エンテロコッカス属Enterococcus、アルカリゲネス属Alcaligenes、クレブシエラ属Klebsiella、パエニバチルス属Paenibacillus、アルスロバクター属Arthrobacter、コリネバクテリウム属Corynebacterium、ブレビバクテリウム属Brevibacterium、シゾサッカロマイセス属Schizosaccharomyces、クルイベロマイセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia、ピヒア属Pichia、カンジダ属Candida、ハンゼヌラ属Hansenula、またはサッカロマイセス属Saccharomycesのメンバーが挙げられる。一実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌Escherichiacoli、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarum、およびサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeからなる群から選択され得る。一実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属Saccharomyces、ジゴサッカロマイセス属Zygosaccharomyces、シゾサッカロマイセス属Schizosaccharomyces、デッケラ属Dekkera、トルロプシス属Torulopsis、ブレタノマイセス属Brettanomyces、およびカンジダ属Candidaのいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母の種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、サッカロマイセスクルイベリSaccharomyceskluyveri、シゾサッカロマイセスポンベSchizosaccharomycespombe、サッカロマイセスバイアヌスSaccharomycesbayanus、サッカロマイセスミカタエSaccharomycesmikatae、サッカロマイセスパラドキサスSaccharomycesparadoxus、ジゴサッカロマイセスルーキシィZygosaccharomycesrouxii、およびカンジダグラブラタCandidaglabrataが挙げられる。例えば、微生物による発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は公知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2009/0305370号明細書に開示されている。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。好適なイソブタノール生合成経路は、当該技術分野において公知である例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2007/0092957号明細書を参照。ある実施形態において、経路の基質-生成物転化を触媒する少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質-生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、微生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の減少または消失を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まない微生物が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0305363号明細書に記載されている。GPD2などのNAD依存性グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まない微生物も、この文献に記載されている。実施例に使用されるものを含む特定の株の構造が、本明細書に提供される。サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株BP1083NGCI-070;PNY1504の作成株BP1064は、CEN.PK113-7DCBS8340;CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversityCentre,Netherlandsから得られ、以下の遺伝子の欠失を含む:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、およびGPD2。BP1064を、プラスミドpYZ090配列番号1、米国仮特許出願第61/246,844号明細書に記載されるおよびpLH468配列番号2で形質転換して、株NGCI-070BP1083、PNY1504を生成した。標的遺伝子および形質転換体の選択のためのG418耐性マーカーまたはURA3遺伝子のいずれかの上流および下流の相同領域を含むPCR断片による相同的組み換えによって、全コード配列を完全に除去した欠失を作り出した。loxP部位が側面にあるG418耐性マーカーを、Creリコンビナーゼを用いて除去した。URA3遺伝子を相同的組み換えによって除去して、無瘢痕scarless欠失を作り出し、またはloxP部位が側面にある場合、Creリコンビナーゼを用いて除去した。無瘢痕欠失の手順を、Akada,etal.,Yeast23:399-405,2006から適応させた。一般に、各無瘢痕欠失のためのPCRカセットを、PCRを重複させることによって、4つの断片、A-B-U-Cを組み合わせることによって作製した。PCRカセットは、プロモーターURA3遺伝子の上流の250bpおよびターミネーターURA3遺伝子の下流の150bpとともに、天然CEN.PK113-7DURA3遺伝子からなる、選択可能な/対抗選択可能なcounter-selectableマーカー、URA3断片Uを含有していた。それぞれ長さ500bpの断片AおよびCは、標的遺伝子のすぐ上流の500bp断片Aおよび標的遺伝子の3’500bp断片Cに対応していた。断片AおよびCを、相同的組み換えによる、染色体へのカセットの組み込みに使用した。断片Bに対応する配列の直接の繰り返しが、染色体へのカセットの組み込みの際に生成された際、断片B長さ500bpは、標的遺伝子のすぐ下流の500bpに対応し、それを、相同的組み換えによる、染色体からのURA3マーカーおよび断片Cの切除に使用した。PCR産物ABUCカセットを用いて、URA3マーカーを、相同的組み換えによって、まず染色体に組み込み、次に染色体から切除した。最初の組み込みにより、3’500bpを除いて、遺伝子を欠失させた。切除の際、遺伝子の3’500bp領域も欠失させた。この方法を用いた遺伝子の組み込みでは、組み込まれる遺伝子が、断片AとBとの間のPCRカセットに含まれていた。URA3の欠失内因性URA3コード領域を欠失させるために、ura3::loxP-kanMX-loxPカセットを、pLA54鋳型DNA配列番号3からPCRで増幅した。pLA54は、K.ラクチスK.lactisTEF1プロモーターおよびkanMXマーカーを含有し、Creリコンビナーゼによる組み換えおよびマーカーの除去を可能にするloxP部位が側面にある。Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマーBK505およびBK506配列番号4および5を用いて、PCRを行った。loxP-kanMX-loxPマーカーの組み込みが、URA3コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのURA3部分を、URA3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域から得た。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY、pp.201-202を用いて、PCR産物をCEN.PK113-7Dへと形質転換し、30°CでG418100μg/mLを含有するYPDにおいて形質転換体を選択した。プライマーLA468およびLA492配列番号6および7ならびに指定されるCEN.PK113-7DΔura3::kanMXを用いたPCRによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。HIS3の欠失無瘢痕HIS3欠失のためのPCRカセットの4つの断片を、Phusion登録商標HighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAおよびGentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact、キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製された、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを用いて増幅した。HIS3断片Aを、HIS3断片Bの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP452配列番号14およびプライマーoBP453配列番号15を用いて増幅した。HIS3断片Bを、HIS3断片Aの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP454配列番号16、およびHIS3断片Uの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP455配列番号17を用いて増幅した。HIS3断片Uを、HIS3断片Bの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP456配列番号18、およびHIS3断片Cの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP457配列番号19を用いて増幅した。HIS3断片Cを、HIS3断片Uの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP458配列番号20、およびプライマーoBP459配列番号21を用いて増幅した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。HIS3断片AおよびHIS3断片Bを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP452配列番号14およびoBP455配列番号17を用いて増幅することによって、HIS3断片ABを生成した。HIS3断片UおよびHIS3断片Cを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP456配列番号18およびoBP459配列番号21を用いて増幅することによって、HIS3断片UCを生成した。得られたPCR産物を、アガロースゲル、続いてGelExtractionキットQiagen,Valencia,CAにおいて精製した。HIS3断片ABおよびHIS3断片UCを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP452配列番号14およびoBP459配列番号21を用いて増幅することによって、HIS3ABUCカセットを生成した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。CEN.PK113-7DΔura3::kanMXのコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZYeastTransformationII商標キットZymoResearchCorporation,Irvine,CAを用いてHIS3ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養plateした。Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP460配列番号22およびoBP461配列番号23によるPCRによって、his3ノックアウトを有する形質転換体をスクリーニングした。正確な形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3として選択した。Δura3部位からのKanMXマーカー除去およびΔhis3部位からのURA3マーカー除去Frozen-EZYeastTransformationII商標キットZymoResearchCorporation,Irvine,CAを用いて、pRS423::PGAL1-cre配列番号66、米国仮特許出願第61/290,639号明細書に記載されるでCEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3を形質転換し、30°Cで2のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地において平板培養することによって、KanMXマーカーを除去した。形質転換体を、30°Cで約6時間にわたって1のガラクトースが補充されたYP中で増殖させて、CreリコンビナーゼおよびKanMXマーカー切除を誘発し、回収のために30°CでYPD2のグルコースプレートに平板培養した。分離株を、YPD中で一晩増殖させ、30°Cで5-フルオロ-オロチン酸5-FOA、0.1を含有する合成完全培地において平板培養して、URA3マーカーを喪失した分離株を選択した。5-FOA耐性分離株を、pRS423::PGAL1-creプラスミドを除去するために、YPDにおいて増殖させ、平板培養した。YPDG418プレート、ウラシル欠損合成完全培地のプレート、およびヒスチジン欠損合成完全培地のプレートにおける増殖をアッセイすることによって、KanMXマーカー、URA3マーカー、およびpRS423::PGAL1-creプラスミドの損失について分離株を調べた。G418に対して感受性であり、かつウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性であった正確な分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3として選択し、BP857として表した。Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、Δura3についてはプライマーoBP450配列番号24およびoBP451配列番号25、およびΔhis3についてはプライマーoBP460配列番号22およびoBP461配列番号23によるPCRおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。PDC6の欠失無瘢痕PDC6欠失のためのPCRカセットの4つの断片を、Phusion登録商標HighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAおよびGentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製された、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを用いて増幅した。PDC6断片Aを、PDC6断片Bの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP440配列番号26およびプライマーoBP441配列番号27を用いて増幅した。PDC6断片Bを、PDC6断片Aの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP442配列番号28、およびPDC6断片Uの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP443配列番号29を用いて増幅した。PDC6断片Uを、PDC6断片Bの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP444配列番号30、およびPDC6断片Cの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP445配列番号31を用いて増幅した。PDC6断片Cを、PDC6断片U3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP446配列番号32、およびプライマーoBP447配列番号33を用いて増幅した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。PDC6断片AおよびPDC6断片Bを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP440配列番号26およびoBP443配列番号29を用いて増幅することによって、PDC6断片ABを生成した。PDC6断片UおよびPDC6断片Cを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP444配列番号30およびoBP447配列番号33を用いて増幅することによって、PDC6断片UCを生成した。得られたPCR産物を、アガロースゲル、続いてGelExtractionキットQiagen,Valencia,CAにおいて精製した。PDC6断片ABおよびPDC6断片UCを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP440配列番号26およびoBP447配列番号33を用いて増幅することによって、PDC6ABUCカセットを生成した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZYeastTransformationII商標キットZymoResearchCorporation,Irvine,CAを用いてPDC6ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。pdc6ノックアウトを有する形質転換体を、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP448配列番号34およびBP449配列番号35によるPCRによってスクリーニングした。正確な形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3を、YPD中で一晩増殖させ、30°Cで5-フルオロ-オロチン酸0.1を含有する合成完全培地において平板培養して、URA3マーカーを喪失した分離株を選択した。Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP448配列番号34およびoBP449配列番号35によるPCRおよび配列決定によって、欠失およびマーカー除去を確認した。PDC6、oBP554配列番号36およびoBP555配列番号37のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性PCR結果によって、分離株からのPDC6遺伝子がないことを実証した。正確な分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6として選択し、BP891として表した。PDC1欠失ilvDSm組み込みPDC1遺伝子を欠失させ、ミュータンス連鎖球菌StreptococcusmutansATCCNo.700610に由来するilvDコード領域で置換した。A断片、続いて、PDC1欠失-ilvDSm組み込みのためのPCRカセットのミュータンス連鎖球菌Streptococcusmutansに由来するilvDコード領域を、Phusion登録商標HighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAおよびGentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.kitQiagen,Valencia,CAを用いて調製された、鋳型としてのNYLA83本明細書および米国仮特許出願第61/246,709号明細書に記載されるゲノムDNAを用いて増幅した。PDC1断片A-ilvDSm配列番号141を、PDC1断片Bの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP513配列番号38およびプライマーoBP515配列番号39を用いて増殖した。PDC1欠失-ilvDSm組み込みのためのPCRカセットのB、U、およびC断片を、Phusion登録商標HighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAおよびGentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製された、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを用いて増幅した。PDC1断片Bを、PDC1断片A-ilvDSmの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP516配列番号40、およびPDC1断片Uの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP517配列番号41を用いて増幅した。PDC1断片Uを、PDC1断片Bの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP518配列番号42、およびPDC1断片Cの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP519配列番号43を用いて増幅した。PDC1断片Cを、PDC1断片Uの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP520配列番号44、およびプライマーoBP521配列番号45を用いて増幅した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。PDC1断片A-ilvDSmおよびPDC1断片Bを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP513配列番号38およびoBP517配列番号41を用いて増幅することによって、PDC1断片A-ilvDSm-Bを生成した。PDC1断片UおよびPDC1断片Cを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP518配列番号42およびoBP521配列番号45を用いて増幅することによって、PDC1断片UCを生成した。得られたPCR産物を、アガロースゲル、続いて、GelExtractionキットQiagen,Valencia,CAにおいて精製した。PDC1断片A-ilvDSm-BおよびPDC1断片UCを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP513配列番号38およびoBP521配列番号45を用いて増幅することによって、PDC1A-ilvDSm-BUCカセット配列番号142を生成した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZYeastTransformationII商標キットZymoResearchCorporation,Irvine,CAを用いてPDC1A-ilvDSm-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。pdc1ノックアウトilvDSm組み込みを有する形質転換体を、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP511配列番号46およびoBP512配列番号47によるPCRによってスクリーニングした。PDC1、oBP550配列番号48およびoBP551配列番号49のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性PCR結果によって、分離株からのPDC1遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3を、YPD中で一晩増殖させ、30°Cで5-フルオロ-オロチン酸0.1を含有する合成完全培地において平板培養して、URA3マーカーを喪失した分離株を選択した。PDC1の欠失、ilvDSmの組み込み、およびマーカー除去を、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP511配列番号46およびoBP512配列番号47によるPCRおよび配列決定によって確認した。正確な分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmとして選択し、BP907として表した。PDC5欠失sadB組み込みPDC5遺伝子を欠失させ、アクロモバクターキシロソキシダンスAchromobacterxylosoxidansに由来するsadBコード領域で置換した。PDC5欠失-sadB組み込みのためのPCRカセットのセグメントを、まずプラスミドpUC19-URA3MCSにクローニングした。pUC19-URA3MCSは、pUC19をベースとしており、多重クローニング部位MCSに位置するサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeに由来するURA3遺伝子の配列を含む。pUC19は、pMB1レプリコンおよび大腸菌Escherichiacoliにおける複製および選択のためのβ-ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。URA3のためのコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流の配列が、酵母におけるURA3遺伝子の発現のために含まれていた。ベクターを、クローニングプロセスに使用することができ、酵母組み込みベクターとして使用することができる。サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeCEN.PK113-7DゲノムDNAに由来するURA3コード領域の上流の250bpおよび下流の150bpとともにURA3コード領域を含むDNAを、Phusion登録商標HighFidelityPCRMasterMixNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAを用いて、BamHI、AscI、PmeI、およびFseI制限部位を含有するプライマーoBP438配列番号12、およびXbaI、PacI、およびNotI制限部位を含有するoBP439配列番号13を用いて増幅した。ゲノムDNAを、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製した。PCR産物およびpUC19配列番号144を、BamHIおよびXbaIによる消化の後、T4DNAリガーゼを用いてライゲートして、ベクターpUC19-URA3MCSを生成した。プライマーoBP264配列番号10およびoBP265配列番号11によるPCRおよび配列決定によって、ベクターを確認した。sadBおよびPDC5断片Bのコード配列を、pUC19-URA3MCSにクローニングして、PDC5A-sadB-BUCPCRカセットのsadB-BU部分を生成した。AscI制限部位を含有するプライマーoBP530配列番号50、およびPDC5断片Bの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP531配列番号51とともに、鋳型としてpLH468-sadB配列番号67を用いて、sadBのコード配列を増幅した。PDC5断片Bを、sadBの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP532配列番号52、およびPmeI制限部位を含有するプライマーoBP533配列番号53を用いて増幅した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。sadBおよびPDC5断片BPCR産物を混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP530配列番号50およびoBP533配列番号53を用いて増幅することによって、sadB-PDC5断片Bを生成した。得られたPCR産物を、AscIおよびPmeIによって消化させ、適切な酵素による消化の後、T4DNAリガーゼを用いてpUC19-URA3MCSの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、PDC5断片Cの5’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP536配列番号54およびoBP546配列番号55を用いて、sadB-断片B-断片Uの増幅のための鋳型として使用した。PDC5断片Cを、PDC5sadB-断片B-断片Uの3’末端に対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP547配列番号56、およびプライマーoBP539配列番号57を用いて増幅した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。PDC5sadB-断片B-断片UおよびPDC5断片Cを混合することによってPCRを重複させ、プライマーoBP536配列番号54およびoBP539配列番号57を用いて増幅することによって、PDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを生成した。得られたPCR産物を、アガロースゲル、続いて、GelExtractionキットQiagen,Valencia,CAにおいて精製した。天然のPDC5コード配列のすぐ上流の50ヌクレオチドに対して相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP542配列番号58、およびoBP539配列番号57を用いてPDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを増幅することによって、PDC5A-sadB-BUCカセット配列番号143を生成した。PCR産物を、PCRPurificationキットQiagen,Valencia,CAを用いて精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmのコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZYeastTransformationII商標キットZymoResearchCorporation,Irvine,CAを用いてPDC5A-sadB-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cで1のエタノールグルコースではないが補充されたウラシル欠損合成完全培地において平板培養した。pdc5ノックアウトsadB組み込みを有する形質転換体を、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAによって調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP540配列番号59およびoBP541配列番号60によるPCRによってスクリーニングした。PDC5、oBP552配列番号61およびoBP553配列番号62のコード配列に特異的なプライマーを用いた陰性PCR結果によって、分離株からのPDC5遺伝子がないことを実証した。正確な形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3を、YPE1のエタノール中で一晩増殖させ、エタノールグルコースではないが補充され、かつ30°Cで5-フルオロ-オロチン酸0.1を含有する合成完全培地において平板培養して、URA3マーカーを喪失した分離株を選択した。PDC5の欠失、sadBの組み込み、およびマーカー除去を、Gentra登録商標Puregene登録商標Yeast/Bact.キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製されたゲノムDNAを用いて、プライマーoBP540配列番号59およびoBP541配列番号60によるPCRによって確認した。正確な分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBとして選択し、BP913として表した。GPD2の欠失内因性GPD2コード領域を欠失させるために、gpd2::loxP-URA3-loxPカセット配列番号145を、鋳型DNAとしてloxP-URA3-loxP配列番号68を用いて、PCRで増幅した。loxP-URA3-loxPは、loxPリコンビナーゼ部位が側面にあるATCCNo.77107に由来するURA3マーカーを含有する。Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマーLA512およびLA513配列番号8および9を用いて、PCRを行った。loxP-URA3-loxPマーカーの組み込みが、GPD2コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのGPD2部分を、GPD2コード領域の上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域から得た。PCR産物をBP913に形質転換し、形質転換体を、1のエタノールグルコースではないが補充されたウラシル欠損合成完全培地において選択した。プライマーoBP582およびAA270配列番号63および64を用いたPCRによって、形質転換体をスクリーニングして、正確な組み込みを確認した。pRS423::PGAL1-cre配列番号66を用いた形質転換、および30°Cで1のエタノールが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地における平板培養によって、URA3マーカーを再利用した。形質転換体を、1のエタノールが補充され、かつ5-フルオロ-オロチン酸0.1を含有する合成完全培地においてストリークしstreak、30°Cで培養して、URA3マーカーを喪失した分離株を選択した。5-FOA耐性分離株を、pRS423::PGAL1-creプラスミドの除去のためにYPE1のエタノール中で増殖させた。欠失およびマーカー除去を、プライマーoBP582配列番号63およびoBP591配列番号65によるPCRによって確認した。正確な分離株を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBΔgpd2::loxPとして選択し、PNY1503BP1064として表した。BP1064を、プラスミドpYZ090配列番号1およびpLH468配列番号2で形質転換して、株NGCI-070BP1083;PNY1504を生成した。株NYLA74、NYLA83、およびNYLA84の作成S.セレヴィシエS.cerevisiaeの内因性PDC1およびPDC6遺伝子の挿入不活化。PDC1、PDC5、およびPDC6遺伝子は、以下に記載されるピルビン酸デカルボキシラーゼの3つの主なアイソザイムをコードする:pRS425::GPM-sadBの作成アクロモバクターキシロソキシダンスAchromobacterxylosoxidansに由来するブタノールデヒドロゲナーゼをコードするDNA断片配列番号70米国特許出願公開第2009/0269823号明細書に開示されているをクローニングした。第2級アルコールデヒドロゲナーゼのためのsadBと呼ばれるこの遺伝子のコード領域配列番号69を、それぞれ順方向および逆方向プライマーN473およびN469配列番号74および75を用いてグラム陰性菌のために推奨されるプロトコルにしたがって、Gentra登録商標Puregene登録商標キットQiagen,Valencia,CAを用いて調製される、A.キシロソキシダンスA.xylosoxidansゲノムDNAから、標準条件を用いて増幅した。PCR産物を、pCR登録商標4BLUNTInvitrogen商標,Carlsbad,CAへとTOPO登録商標-Bluntでクローニングを行って、pCR4Blunt::sadBを生成し、それを、大腸菌E.coliMach-1細胞へと形質転換した。次に、プラスミドを4つのクローンから単離し、配列を確認した。sadBコード領域を、pCR4Blunt::sadBからPCR増幅した。PCRプライマーは、酵母GPM1プロモーターおよびADH1ターミネーター配列番号76および77として提供されるN583およびN584と重複し得る追加の5’配列を含んでいた。次に、PCR産物を、以下のように、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおけるギャップ修復gaprepair方法を用いてクローニングしたMa,etal.,Gene58:201-216,1987。GPM1プロモーター配列番号72、乳酸連鎖球菌Lactococcuslactisに由来するkivDコード領域配列番号71、およびADH1ターミネーター配列番号73を含有する酵母-大腸菌E.coliシャトルベクターpRS425::GPM::kivD::ADH米国特許出願公開第2007/0092957A1号明細書の実施例17に記載されるを、BbvCIおよびPacI制限酵素で消化して、kivDコード領域を放出した。約1μgの残っているベクター断片を、1μgのsadBPCR産物とともに、S.セレヴィシエS.cerevisiae株BY4741へと形質転換した。形質転換体を、ロイシン欠損合成完全培地において選択した。pRS425::GPM-sadBを生成する適切な組み換え事象を、プライマーN142およびN459配列番号108および109を用いたPCRによって確認した。pdc6::PGPM1-sadB組み込みカセットの作成およびPDC6の欠失:pdc6::PGPM1-sadB-ADH1t-URA3r組み込みカセットを、pRS425::GPM-sadB配列番号78に由来するGPM-sadB-ADHtセグメント配列番号79を、pUC19-URA3rに由来するURA3r遺伝子に結合することによって作製した。pUC19-URA3r配列番号80は、インビボででの相同的組み換えおよびURA3マーカーの除去を可能にする、75bpの相同反復配列が側面にあるpRS426ATCCNo.77107に由来するURA3マーカーを含む。2つのDNAセグメントを、Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAおよびプライマー114117-11A~114117-11D配列番号81、82、83、および84、ならびに114117-13Aおよび114117-13B配列番号85および86とともに、pRS425::GPM-sadBおよびpUC19-URA3rプラスミドDNAを鋳型として用いたSOEPCRHorton,etal.,Gene77:61-68,1989に記載されるによって結合した。SOEPCR114117-13Aおよび114117-13Bのための外部プライマーは、それぞれPDC6プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域に相同な約50bpの5’および3’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いて、完成されたカセットPCR断片を、BY4700ATCCNo.200866へと形質転換し、形質転換体を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー112590-34Gおよび112590-34H配列番号87および88、ならびに112590-34Fおよび112590-49E配列番号89および90を用いたPCRによってスクリーニングして、PDC6コード領域の欠失を有するPDC6遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、URA3rマーカーを、30°Cで2のグルコースおよび5-FOAが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。5-FOAプレートからのコロニーを、SD-URA培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tを有する。pdc1::PPDC1-ilvD組み込みカセットの作成およびPDC1の欠失:Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマー114117-27A~114117-27D配列番号111、112、113、および114とともに、pLH468およびpUC19-URA3rプラスミドDNAを鋳型として用いたSOEPCRHorton,etal.,Gene77:61-68,1989によって記載されるによって、pLH468配列番号2に由来するilvD-FBA1tセグメント配列番号91を、pUC19-URA3rに由来するURA3r遺伝子に結合することによって、pdc1::PPDC1-ilvD-FBA1t-URA3r組み込みカセットを作製した。SOEPCR114117-27Aおよび114117-27Dのための外部プライマーは、PDC1プロモーターの下流およびPDC1コード配列の下流の領域に相同な約50bpの5’および3’領域を含んでいた。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いて、完成されたカセットPCR断片を、BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tへと形質転換し、形質転換体を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で維持した。形質転換体を、プライマー114117-36Dおよび135配列番号92および93、ならびにプライマー112590-49Eおよび112590-30F配列番号90および94を用いたPCRによってスクリーニングして、PDC1コード配列の欠失を有するPDC1遺伝子座における組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、URA3rマーカーを、30°Cで2のグルコースおよび5-FOAが補充された合成完全培地において平板培養することによって再利用した。5-FOAプレートからのコロニーをSD-URA培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。得られた同定株NYLA67は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tを有する。HIS3の欠失内因性HIS3コード領域を欠失させるために、his3::URA3r2カセットを、URA3r2鋳型DNA配列番号95からPCR増幅した。URA3r2は、インビボでの相同的組み換えおよびURA3マーカーの除去を可能にする、500bpの相同反復配列が側面にあるpRS426ATCCNo.77107に由来するURA3マーカーを含む。Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマー114117-45Aおよび114117-45B配列番号96および97を用いてPCRを行い、約2.3kbのPCR産物を生成した。各プライマーのHIS3部分は、URA3r2マーカーの組み込みがHIS3コード領域の置換をもたらすように、HIS3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY、pp.201-202を用いて、PCR産物を、NYLA67へと形質転換し、形質転換体を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をスクリーニングして、30°Cで2のグルコースが補充されたヒスチジン欠損合成完全培地において形質転換体をレプリカ平板培養することによって、正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、30°Cで2のグルコースおよび5-FOAが補充された合成完全培地において平板培養することによって、URA3rマーカーを再利用した。5-FOAプレートからのコロニーをSD-URA培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、マーカーの除去を確認した。NYLA73と呼ばれる得られた同定株は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3を有する。pdc5::kanMX組み込みカセットの作成およびPDC5の欠失:pdc5::kanMX4カセットを、Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマーPDC5::KanMXFおよびPDC5::KanMXR配列番号98および99を用いて株YLR134W染色体DNAATCCNo.4034091からPCR増幅し、約2.2kbのPCR産物を生成した。各プライマーのPDC5部分は、kanMX4マーカーの組み込みがPDC5コード領域の置換をもたらすように、PDC5プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いて、PCR産物を、NYLA73へと形質転換し、形質転換体を、30°Cで1のエタノールおよびジェネティシンgeneticin200μg/mLが補充されたYP培地上で選択した。形質転換体をPCRによってスクリーニングして、プライマーPDC5koforおよびN175配列番号100および101を用いたPDC5コード領域の置換によりPDC遺伝子座における正確な組み込みを確認した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3pdc5::kanMX4を有する。株はNYLA74と称された。プラスミドベクターpRS423::CUP1-alsSFBA-budAおよびpRS426::FBA-budCGPM-sadBを、NYLA74へと形質転換して、ブタンジオール生成株NGCI-047を生成した。プラスミドベクターpLH475-Z4B8配列番号140およびpLH468をNYLA74へと形質転換して、イソブタノール生成株NGCI-049を生成した。HXK2ヘキソキナーゼIIの欠失:hxk2::URA3rカセットを、Phusion登録商標DNAポリメラーゼNewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MAならびにプライマー384および385配列番号102および103を用いてURA3r2鋳型上記からPCR増幅し、約2.3kbのPCR産物を生成した。各プライマーのHXK2部分は、URA3r2マーカーの組み込みがHXK2コード領域の置換をもたらすように、HXK2プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域から得られた。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いて、PCR産物を、NYLA73へと形質転換し、形質転換体を、30°Cで2のグルコースが補充されたウラシル欠損合成完全培地上で選択した。形質転換体をPCRによってスクリーニングして、プライマーN869およびN871配列番号104および105を用いたHXK2コード領域の置換によりHXK2遺伝子座における正確な組み込みを確認した。標準プロトコルにしたがい、30°Cで2のグルコースおよび5-FOAが補充された合成完全培地において平板培養することによって、URA3r2マーカーを再利用した。5-FOAプレートからのコロニーをSD-URA培地上にパッチして、増殖がないことを確認することによって、およびPCRによって、プライマーN946およびN947配列番号106および107を用いて正確なマーカーの除去を確認することによって、マーカーの除去を確認した。NYLA83と称される、得られた同定株は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2を有する。pdc5::kanMX組み込みカセットの作成およびPDC5の欠失:pdc5::kanMX4カセットを、上述したようにPCR増幅した。上述したように、PCR断片をNYLA83へと形質転換し、形質転換体を選択し、スクリーニングした。NYLA84と称される、同定された正確な形質転換体は、遺伝子型:BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2pdc5::kanMX4を有する。標準的な遺伝子組み換え技術MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYを用いて、プラスミドベクターpLH468およびpLH532を、株NYLA84BY4700pdc6::PGPM1-sadB-ADH1tpdc1::PPDC1-ilvD-FBA1tΔhis3Δhxk2pdc5::kanMX4へと同時に形質転換し、得られたブタノロジェンNYLA84を、30°Cで1のエタノールが補充されたヒスチジンおよびウラシル欠損合成完全培地上で維持した。発現ベクターpLH468pLH468プラスミド配列番号2を、酵母中のDHAD、KivD、およびHADHの発現のために作成し、これは、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0305363号明細書に記載されている。DHADの発現のために、S.セレヴィシエS.cerevisiaeFBA1プロモーターnt2109~3105、続いてFBA1ターミネーターnt4858~5857から発現されるミュータンス連鎖球菌Streptococcusmutansに由来するilvD遺伝子のコード領域nt位置3313~4849を有するキメラ遺伝子;ADHの発現のために、S.セレヴィシエS.cerevisiaeGPM1プロモーターnt7425~8181、続いてADH1ターミネーターnt5962~6277から発現されるコドン最適化されたウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼのコード領域nt6286~7413を有するキメラ遺伝子;およびKivDの発現のために、TDH3プロモーターnt10896~11918、続いてTDH3ターミネーターnt8237~9235から発現される乳酸連鎖球菌Lactococcuslactisに由来するコドン最適化されたkivD遺伝子のコード領域nt9249~10895を有するキメラ遺伝子を含むようにpLH486を作成した。乳酸連鎖球菌Lactococcuslactisのケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼKivDおよびウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼHADHのためのコード領域それぞれ配列番号71および118を、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおける発現のために最適化されたコドンに基づいて、DNA2.0,Inc.MenloPark,CAによって合成し、プラスミドpKivDy-DNA2.0およびpHadhy-DNA2.0において提供した。コードされるタンパク質は、それぞれ配列番号117および119である。KivDおよびHADHのための個々の発現ベクターを作成した。pLH467pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3tを構築するために、ベクターpNY8配列番号121;pRS426.GPD-ald-GPDtとも称され、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2008/0182308号明細書の実施例17に記載されているを、AscIおよびSfiI酵素で消化し、それによって、GPDプロモーターおよびaldコード領域を切断した。5’プライマーOT1068および3’プライマーOT1067配列番号123および124を用いて、5’末端にAscI部位および3’末端にSpeI部位を付加するために、pNY8に由来するTDH3プロモーター断片配列番号122をPCR増幅した。AscI/SfiIで消化されたpNY8ベクター断片を、AscIおよびSpeIで消化されたTDH3プロモーターPCR産物とライゲートし、コドン最適化されたkivDコード領域を含むSpeI-SfiI断片を、ベクターpKivD-DNA2.0から単離した。3通りのライゲーションにより、ベクターpLH467pRS426::PTDH3-kivDy-TDH3tが生成された。pLH467を、制限マッピングrestrictionmappingおよび配列決定によって確認した。pLH435pRS425::PGPM1-Hadhy-ADH1tは、参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第61/058,970号明細書の実施例3に記載されるベクターpRS425::GPM-sadB配列番号78から得られた。pRS425::GPM-sadBは、GPM1プロモーター配列番号72、アクロモバクターキシロソキシダンスAchromobacterxylosoxidansのブタノールデヒドロゲナーゼに由来するコード領域sadB;DNA配列番号69;タンパク質配列番号70:米国特許出願公開第2009/0269823号明細書に開示されている、およびADH1ターミネーター配列番号73を含むキメラ遺伝子を有するpRS425ベクターATCCNo.77106である。pRS425::GPMp-sadBは、sadBコード領域の5’および3’末端においてそれぞれBbvIおよびPacI部位を含む。プライマーOT1074およびOT1075配列番号126および127を用いた部位特異的突然変異誘発法によって、NheI部位をsadBコード領域の5’末端に付加して、ベクターpRS425-GPMp-sadB-NheIを生成し、それを配列決定によって確認した。pRS425::PGPM1-sadB-NheIをNheIおよびPacIで消化して、sadBコード領域を除外し、ベクターpHadhy-DNA2.0に由来するコドン最適化されたHADHコード領域を含むNheI-PacI断片とライゲートして、pLH435を生成した。単一のベクター中でKivDおよびHADH発現カセットを組み合わせるために、酵母ベクターpRS411ATCCNo.87474を、SacIおよびNotIで消化し、3通りのライゲーション反応において、PGPM1-Hadhy-ADH1tカセットを含むpLH435に由来するSalI-NotI断片とともに、PTDH3-kivDy-TDH3tカセットを含むpLH467に由来するSacI-SalI断片とライゲートした。これにより、ベクターpRS411::PTDH3-kivDy-PGPM1-HadhypLH441が生成され、それを制限マッピングによって確認した。低級イソブタノール経路における全ての3つの遺伝子:ilvD、kivDy、およびHadhyのための同時発現ベクターを生成するために、IlvD遺伝子の供給源として、米国特許出願公開第2010/0081154号明細書に記載されるpRS423FBAilvDStrep配列番号128を使用した。このシャトルベクターは、大腸菌E.coliにおける維持のためのF1複製起点nt1423~1879および酵母における複製のための2ミクロンの起点nt8082~9426を含む。ベクターは、FBA1プロモーターnt2111~3108;配列番号120およびFBAターミネーターnt4861~5860;配列番号129を有する。さらに、ベクターは、酵母における選択のためのHisマーカーnt504~1163および大腸菌E.coliにおける選択のためのアンピシリン耐性マーカーnt7092~7949を有する。ミュータンス連鎖球菌StreptococcusmutansUA159ATCCNo.700610に由来するilvDコード領域nt3116~4828;配列番号115;タンパク質配列番号116は、FBAプロモーターとFBAターミネーターとの間にあり、発現のためのキメラ遺伝子を形成する。さらに、ilvDコード領域nt4829~4849に融合されたlumioタグがある。第1の工程は、SacIおよびSacIISacII部位はT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化されたを用いて、pRS423FBAilvDStreppRS423-FBASpeI-IlvDミュータンス連鎖球菌Streptococcusmutans-Lumioとも呼ばれるを線状化して、9,482bpの全長を有するベクターを得ることであった。第2の工程は、SacIおよびKpnIKpnI部位はT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化されたを用いて、kivDy-hADHyカセットをpLH441から単離し、6,063bpの断片を得ることであった。この断片を、pRS423-FBASpeI-IlvDミュータンス連鎖球菌Streptococcusmutans-Lumioに由来する9,482bpのベクター断片とライゲートした。これにより、ベクターpLH468pRS423::PFBA1-ilvDStrepLumio-FBA1t-PTDH3-kivDy-TDH3t-PGPM1-hadhy-ADH1tが生成され、それを、制限マッピングおよび配列決定によって確認した。pLH532の作成pLH532プラスミド配列番号130を、酵母中のALSおよびKARIの発現のために作成した。pLH532は、以下のキメラ遺伝子:1CUP1プロモーター配列番号139、枯草菌Bacillussubtilisに由来するアセト乳酸シンターゼコード領域AlsS;配列番号137;タンパク質配列番号138およびCYC1ターミネーター2配列番号133;2ILV5プロモーター配列番号134、Pf5.IlvCコード領域配列番号132およびILV5ターミネーター配列番号135;ならびに3FBA1プロモーター配列番号136、S.セレヴィシエS.cerevisiaeKARIコード領域ILV5;配列番号131;およびCYC1ターミネーターを含むpHR81ベクターATCCNo.87541である。Pf5.IlvCコード領域は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0163376号明細書に記載された、蛍光菌Pseudomonasfluorescensに由来するKARIをコードする配列である。Pf5.IlvCコード領域を、サッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおける発現のために最適化されたコドンに基づいて、DNA2.0,Inc.MenloPark,CA;配列番号132によって合成した。pYZ090の作成pYZ090配列番号1は、pHR81ATCCNo.87541骨格をベースとし、ALSの発現のために、酵母CUP1プロモーターnt2~449、続いてCYC1ターミネーターnt2181~2430から発現される枯草菌Bacillussubtilisに由来するalsS遺伝子のコード領域nt位置457~2172を有するキメラ遺伝子、およびKARIの発現のために、酵母ILV5プロモーター2433~3626、続いてILV5ターミネーターnt4682~5304から発現される乳酸連鎖球菌Lactococcuslactisに由来するilvC遺伝子のコード領域nt3634~4656を有するキメラ遺伝子を含むように作成される。pYZ067の作成pYZ067を、以下のキメラ遺伝子:1ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHADの発現のために、酵母FBA1プロモーターnt1161~2250、続いてFBAターミネーターnt4005~4317から発現されるミュータンス連鎖球菌S.mutansUA159に由来するilvD遺伝子のコード領域nt位置2260~3971、2アルコールデヒドロゲナーゼの発現のために、酵母GPMプロモーターnt5819~6575、続いてADH1ターミネーターnt4356~4671から発現されるウマ肝臓ADHのためのコード領域nt4680~5807、および3ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現のために、酵母TDH3プロモーターnt8830~9493、続いてTDH3ターミネーターnt5682~7161から発現される乳酸連鎖球菌Lactococcuslactisに由来するKivD遺伝子のコード領域nt7175~8821を含むように作成した。pRS423::CUP1-alsSFBA-budAおよびpRS426::FBA-budCGPM-sadBおよびpLH475-Z4B8の作成pRS423::CUP1-alsSFBA-budAおよびpRS426::FBA-budCGPM-sadBおよびpLH475-Z4B8の作成が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0305363号明細書に記載されている。以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示する。以下の実施例は、原料としてのトウモロコシおよびトウモロコシ脂質の酵素加水分解から得られるISPR抽出剤としてのCOFAを含むが、本発明から逸脱せずに、他のバイオマス源を、原料およびバイオマス油の酵素加水分解に使用することができることを理解されたい。本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった:gはグラムを意味し、kgはキログラムを意味し、Lはリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mL/Lはミリリットル/リットルを意味し、mL/分はミリリットル/分を意味し、DIは脱イオン化されていることを意味し、uMはマイクロメートルを意味し、nmはナノメートルを意味し、w/vは重量/体積を意味し、ODは光学密度を意味し、OD600は600nMの波長における光学密度を意味し、dcwは乾燥菌体重量を意味し、rpmは毎分回転数を意味し、°Cは摂氏温度を意味し、°C/分は摂氏温度/分を意味し、slpmは標準リットル/分を意味し、ppmは百万分率を意味し、pdcはピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素を意味し、後ろに酵素番号が付く。一般的な方法シードフラスコ増殖SeedFlaskGrowthpdc1が欠損した、pdc5が欠損した、およびpdc6が欠損した、炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変されたサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株を、凍結された培地からのシードフラスコ中で0.55~1.1g/LdcwOD6001.3~2.6-ThermoHeliosαThermoFisherScientificInc.,Waltham,Massachusettsまで増殖させた。培地を、300rpmで回転する培養器中、26°Cで増殖させた。凍結した培地を-80°Cで予め貯蔵した。第1のシードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった:3.0g/Lのデキストロース3.0g/Lの無水エタノール3.7g/LのForMedium商標SyntheticCompleteAminoAcidKaiserDrop-Out:HISなし、URAなし参照番号DSCK162CKアミノ酸を含まない6.7g/LのDifcoYeastNitrogenBase番号291920。第1のシードフラスコ培地からの12ミリリットルを、2Lのフラスコに移し、300rpmで回転する培養器中、30°Cで増殖させた。第2のシードフラスコは、220mLの以下の培地を有する:30.0g/Lのデキストロース5.0g/Lの無水エタノール3.7g/LのForMedium商標SyntheticCompleteAminoAcidKaiserDrop-Out:HISなし、URAなし参照番号DSCK162CKアミノ酸を含まない6.7g/LのDifcoYeastNitrogenBase番号291920pH5.5~6.0に滴定された0.2MのMES緩衝液。培地を、0.55~1.1g/LdcwOD6001.3~2.6で増殖させた。200g/Lのペプトンおよび100g/Lの酵母抽出物を含有するさらなる30mLの溶液を、この細胞濃縮物に加えた。次に、さらなる300mLの0.2uMのろ過滅菌されたCognis、90~95のオレイルアルコールをフラスコに加えた。4g/Ldcw超OD600>10まで培地を増殖させ続けてから、採取し、発酵に加えた。発酵の調製初期の発酵槽の調製ガラスの被覆された2Lの発酵槽SartoriusAG,Goettingen,Germanyに、家庭用水を、66の液化重量になるまで投入した。pHプローブHamiltonEasyfermPlusK8、部品番号:238627、HamiltonBonaduzAG,Bonaduz,Switzerlandを、SartoriusDCU-3ControlTowerCalibrationメニューによって較正した。pH=7でゼロ較正を行った。pH=4でスパン較正を行った。次に、プローブを、ステンレス鋼のヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。溶解された酸素プローブpO2プローブも、ヘッドプレートを通して発酵槽に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せたfoil。発酵槽全体をSterisSterisCorporation,Mentor,Ohioオートクレーブに入れ、液体サイクル中で30分間滅菌した。発酵槽をオートクレーブから取り出し、ロードセル上に設置した。ジャケット水供給および戻り配管を、それぞれ家庭用水および排水管cleandrainに連結した。流入水および流出水の配管を冷却する凝縮器を、7°Cで運転される6Lの再循環温度浴に連結した。発酵槽からのガスを移送する通気管路を、Thermo質量分析計PrimadB,ThermoFisherScientificInc.,Waltham,Massachusettsに連結された移送管路に連結した。スパージャ管路をガス供給管路に連結した。栄養、抽出溶媒、シード培地、および基剤を加えるための管を、ポンプを通して配管しplumb、またはしっかりと固定した。発酵槽温度を、熱電対および家庭用水循環ループを用いて55°Cに制御した。湿潤したトウモロコシの実2イエローデントを、1.0mmのふるいを備えたハンマーミルを用いて磨砕し、次に、得られた、磨砕された全粒トウモロコシの実を、29~30乾燥トウモロコシ固体重量の液化反応塊の投入量で発酵槽に加えた。液化前のリパーゼ処理リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が10ppmになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、55°C、300rpm、および0.3slpmのN2重層overlayで6時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、後述されるように液化を行った液化。液化滅菌した家庭用N2をスパージャによって0.3slpmで加えつつ、発酵槽を300~1200rpmで混合しながら、α-アミラーゼを、その仕様書どおりに発酵槽に加えた。温度設定点を、55°Cから85°Cに変化させた。温度が80°Cを超える場合、液化調理時間を開始し、液化サイクルを、90~120分間80°C超に保持した。液化サイクルが完了した後、発酵槽温度設定点を、30°Cの発酵温度に設定した。化学的消泡剤を加えずに発泡を防ぐために、N2をスパージャからヘッドスペースへと向け直した。液化後のリパーゼ処理液化サイクルが完了した後液化、発酵槽温度を30°Cの代わりに55°Cに設定した。必要に応じて酸または塩基のボーラス添加を行うことによって、pHをpH=5.8に手作業で制御した。リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が10ppmになるように発酵槽に加えた。発酵槽を、55°C、300rpm、および0.3slpmのN2重層で6時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵槽温度を30°Cに設定した。リパーゼの熱による失活処理加熱殺菌処理方法発酵槽温度を、15分間より長く80°C超に保持して、リパーゼを失活させた。熱による失活処理が完了した後、発酵槽温度を30°Cに設定した。接種の前の栄養添加接種の直前にエタノール6.36mL/L、接種後の体積、200プルーフ、無水を発酵槽に加えた。最終濃度が20mg/Lになるようにチアミンを加え、接種の直前に100mg/Lのニコチン酸も加えた。接種の前のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸の添加接種の直後に1L/L接種後の体積のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸を加えた。発酵槽の接種N2を発酵槽に加えながら、発酵槽pO2プローブをゼロに較正した。発酵槽pO2プローブを、300rpmにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。第2のシードフラスコが4g/Ldcw超になった後、発酵槽に接種した。振とうフラスコを培養器/振とう器から5分間取り出して、オレイルアルコール相と水相との相分離を可能にした。水相110mLを滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵槽に注入した。発酵槽の運転条件発酵槽を、増殖および生成段階全体について30°Cで運転した。pHを、酸を全く加えずに5.7~5.9のpHから5.2の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、pHをpH=5.2に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、0.3slpmで発酵槽に加えた。DCU-3ControlBoxPID制御ループによって、撹拌制御のみを用いて、撹拌器を最小で300rpmに設定し、最大で2000rpmに設定して、pO2を、3.0に制御されるように設定した。a-アミラーゼグルコアミラーゼを加えることによって、液化トウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰1~50g/Lに保った。分析ガスの分析処理空気を、ThermoPrimaThermoFisherScientificInc.,Waltham,Massachusetts質量分析計で分析した。これは、滅菌してから各発酵槽に加えたのと同じ処理空気であった。各発酵槽のオフガスを、同じ質量分析計で分析した。このThermoPrimadBは、毎週月曜の午前6:00に較正チェックを実行する機能を有する。較正チェックを、質量分析計に関連するGasWorksv1.0ThermoFisherScientificInc.,Waltham,Massachusettsソフトウェアによってスケジューリングした。較正されるガスは以下のとおりであった:二酸化炭素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて、較正サイクル中5および15でチェックした。酸素を、他の公知のボトル入りのガスを用いて15でチェックした。各発酵槽のオフガスの分析に基づいて、ストリッピングされたイソブタノール、消費された酸素、およびオフガスに吸入された二酸化炭素の量を、質量分析計のモル分率分析および発酵槽に入るガス流量質量流制御装置を用いて測定した。1時間当たりのガス速度を計算し、次に、発酵の間のその速度を積分した。バイオマスの測定0.08のTrypanBlue溶液を、1×PBSによる、NaClVWRBDH8721-0中の0.4のTrypanBlueの1:5の希釈液から調製した。1.0mLの試料を、発酵槽から引き抜き、1.5mLのEppendorf遠心分離機管に入れ、Eppendorf,5415において、14,000rpmで5分間遠心分離した。遠心分離の後、上部の溶媒層を、20~200μLのBioHitピペット先端を有するm200VariableChannelBioHitピペットを用いて除去した。溶媒と水層との間の層を除去しないように注意した。溶媒層を除去してから、試料を、2700rpmに設定されたVortex-Genie登録商標を用いて再懸濁した。血球計計数のための理想的な濃度を準備するために、一連の希釈が必要とされた。ODが10であった場合、理想的な量20~30の細胞が平方当たり計数されるようにし得る0.5のODを得るために、1:20の希釈を行い得る。トウモロコシの固体による、希釈の不正確性を低下させるために、カットされた100~1000μLのBioHitピペット先端を用いた複数回の希釈が必要とされた。先端が詰まるのを防いで開口を広げるために、約1cmを先端からカットした。1:20の最終的な希釈の場合、発酵試料および0.9のNaCl溶液の初期の1:1の希釈液を調製した。次に、前の溶液の1:1の希釈液すなわち、初期の1:1の希釈液および0.9のNaCl溶液第2の希釈液を生成した後、第2の希釈液およびTrypanBlue溶液の1:5の希釈液を生成した。試料を各希釈の間にボルテックスし、カットされた先端を0.9のNaClおよびTrypanBlue溶液に入れてすすいだ。カバースリップを、血球計HausserScientificBright-Line1492の上部に注意深く入れた。2~20μLのBioHitピペット先端を有するm20VariableChannelBioHitピペットを用いて、アリコート10μLを、最終的なTrypanBlue希釈液から抜き取り、血球計に注入した。血球計を40倍の倍率のZeisAxioskop40顕微鏡に設置した。中央の4分の1centerquadrantを25個の方形に分割し、次に、両方のチャンバーにおける4隅および中央の方形centersquareを計数し、記録した。両方のチャンバーを計数した後、平均値を取り、希釈係数20を乗算し、次に血球計における中央の4分の1における方形の数の25を乗算し、次に計数された4分の1の体積である0.0001mLで除算した。この計算の合計は、mL当たりの細胞の数である。水相中の発酵生成物のLC分析試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした約1時間。約300μLの試料を、100~1000μLのBioHitピペット先端を有するm1000VariableChannelBioHitピペットを用いて、0.2umの遠心分離機フィルターNanosep登録商標MFの改造されたナイロン遠心分離機フィルターに移し、次にEppendorf,5415Cを用いて、14,000rpmで5分間遠心分離した。約200μLのろ過された試料を、ポリマーフィートfeetとともに250μLのガラス容器挿入部insertを備えた1.8オートサンプラー容器に移した。PTFE隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をしてから、2700rpmに設定されたVortex-Genie登録商標を用いて試料をボルテックスした。次に、試料を、バイナリアイソクラティックポンプ、真空脱気装置、加熱されたカラム区画、サンプラー冷却システム、UVDAD検出器およびRI検出器を備えたAgilent1200シリーズLCで実験した。使用されたカラムは、Bio-RadCationHリフィル、30X4.6ガードカラムを備えたAminexHPX-87H,300X7.8であった。カラム温度は、0.01Nの硫酸の移動相を用いて、0.6mL/分の流量で40分間、40°Cであった。結果を表1に示す。試料を処理の準備ができるまで冷蔵した。試料を、冷蔵から取り出して、室温にした約1時間。約150μLの試料を、100~1000μLのBioHitピペット先端を有するm1000VariableChannelBioHitピペットを用いて、ポリマーフィートとともに250μLのガラス容器挿入部を備えた1.8オートサンプラー容器に移した。PTFE隔壁を備えたねじ蓋を用いて容器に蓋をした。次に、試料を、7683B注入器およびG2614Aオートサンプラーを備えたAgilent7890AGCで実験した。カラムは、HP-InnoWaxカラム30m×0.32mmの内径ID、0.25μmのフィルムであった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて45°Cで測定される1.5mL/分の流量でヘリウムであり;注入器スプリットは、225°Cで1:50であり;オーブン温度は、1.5分間45°C、10°C/分で0分間、45°C~160°C、次に29分間の実行時間について、35°C/分で14分間、230°Cであった。炎イオン化検出を、40mL/分のヘリウムメイクアップガスを用いて260°Cで使用した。結果を表2に示す。脂肪酸ブチルエステルについて分析される試料を、7683B注入器およびG2614Aオートサンプラーを備えたAgilent6890GCで実験した。カラムは、HP-DB-FFAPカラム15メートル×0.53mmの内径Megabore、1-ミクロンのフィルム厚さのカラム30m×0.32mmの内径、0.25μmのフィルムであった。キャリアガスは、一定の上部圧力を用いて45°Cで測定される3.7mL/分の流量でヘリウムであり;注入器スプリットは、225°Cで1:50であり;オーブン温度は、2.0分間100°C、10°C/分で100°C~250°C、次に、26分間の実行時間について、9分間250°Cであった。炎イオン化検出を、40mL/分のヘリウムメイクアップガスを用いて300°Cで使用した。以下のGC標準Nu-ChekPrep;Elysian,MNを用いて、脂肪酸イソブチルエステル生成物:パルミチン酸イソ-ブチル、ステアリン酸イソ-ブチル、オレイン酸イソ-ブチル、リノール酸イソ-ブチル、リノレン酸イソ-ブチル、アラキドン酸イソ-ブチルの属性を確認した。実施例1~14は、権利請求される方法に使用され得る様々な発酵条件を説明する。例として、液化前のリパーゼ処理を行う発酵もあれば、液化後のリパーゼ処理を行う発酵もあった。他の実施例では、発酵に熱による失活処理を行った。発酵の後、有効イソブタノール力価有効イソ力価、すなわち、水性体積のリットル当たり生成されるイソブタノールの合計グラムを測定した。結果を表3に示す。実施例1-対照実験識別子2010Y014は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例2実験識別子2010Y015は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例3実験識別子2010Y016は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例4実験識別子2010Y017は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、エタノールの除外を除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例5実験識別子2010Y018は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後に7.2ppmのリパーゼを加えたことのみを除いた液化後のリパーゼ処理方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例6-対照実験識別子2010Y019は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後の加熱殺菌処理方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例7-対照実験識別子2010Y021は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例8実験識別子2010Y022は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例9実験識別子2010Y023は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例10実験識別子2010Y024は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例11実験識別子2010Y029は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例12実験識別子2010Y030は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化前のリパーゼ処理方法、液化方法、液化中の加熱殺菌処理、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例13-対照実験識別子2010Y031は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、エタノールを加えなかったことを除いた接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例14実験識別子2010Y032は以下のものを含んでいた:シードフラスコ増殖方法、初期の発酵槽の調製方法、液化方法、液化後のリパーゼ処理方法、加熱殺菌処理なし、接種方法の前の栄養添加、発酵槽の接種方法、発酵槽の運転条件方法、および分析方法の全て。粗トウモロコシ油から作製されるトウモロコシ油脂肪酸を、接種後0.1~1.0時間、単一のバッチに加えた。ブタノロジェンはNGCI-070であった。実施例15実験識別子はGLNOR432Aであった。NGCI-047ブタンジオール生成株を、冷凍した容器からの250mLのフラスコ中の25mLの培地中で、約1のODになるまで増殖させた。プレシード培地を2Lのフラスコに移し、1.7~1.8のODになるまで増殖させた。両方のフラスコのための培地は以下のとおりであった:3.0g/Lのデキストロース3.0g/Lの無水エタノールアミノ酸を含まない6.7g/LのDifcoYeastNitrogenBaseNo.2919201.4g/LのYeastDropoutMixSigmaY200110mL/Lの1w/vのL-ロイシン原液2mL/Lの1w/vのL-トリプトファン原液。1LのApplikon発酵槽に、60mLのシードフラスコを接種した。発酵槽は、700mLの以下の滅菌培地を含有していた:20.0g/Lのデキストロース8.0mL/Lの無水エタノールアミノ酸を含まない6.7g/LのDifcoYeastNitrogenBaseNo.2919202.8g/LのYeastDropoutMixSigmaY200120mL/Lの1w/vのL-ロイシン原液4mL/Lの1w/vのL-トリプトファン原液0.5mLのSigma204Antifoam1:1::Tween80:エタノール中の0.8mL/Lの1w/vのErgesterol溶液。残りのグルコースを、50w/wのグルコース溶液を用いて過剰に保った。発酵槽の溶解酸素濃度を、撹拌制御によって30に制御した。pHをpH=5.5に制御した。発酵槽を、0.3slpmの滅菌した家庭用水でスパージした。温度を30°Cに制御した。実施例16実験識別子はGLNOR434Aであった。この実施例は、接種の前の3gのオレイン酸の添加および3gのパルミチン酸の添加を除いて実施例15と同じであった。NGCI-047ブタンジオール生成株が生体触媒であった。図6は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。実施例17実験識別子はGLNOR435Aであった。この実施例は、NGCI-049イソブタノール生成株を接種したことを除いて実施例15と同じであった。実施例18実験識別子はGLNOR437Aであった。この実施例は、NGCI-049イソブタノール生成株を接種したことを除いて実施例16と同じであった。図7は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。実施例19実験識別子は090420_3212であった。この実施例を、ブタノロジェンNYLA84イソブタノール生成株を接種したことを除いて実施例15と同様に実行した。この発酵を、1LのSartorius発酵槽中で実行した。実施例20実験識別子は2009Y047であった。この実施例を、ブタノロジェンNYLA84イソブタノール生成株を接種したことを除いて実施例16と同様に実行した。この発酵を、1LのSartorius発酵において実行した。図8は、脂肪酸を受け入れた発酵槽中で、消費されるグルコースのリットル当たりのグラムがより多かったことを示す。四角形は、オレイン酸およびパルミチン酸を受け入れた発酵槽を表す。丸形は、追加の脂肪酸を全く受け入れなかった発酵槽を表す。実施例15~20の結果を表4に示し、表4は、脂肪酸の添加の有無、最大光学密度、および消費されるグルコースg/Lを示す。実施例21オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理実施例1、2、および3において上述したように実行された発酵から取られたブロスおよびオレイルアルコールの試料を、E.G.BlighおよびW.J.DyerCanadianJournalofBiochemistryandPhysiology,37:911-17,1959、以後、参照文献1によって記載される方法にしたがって、脂質の重量脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるおよび遊離脂肪酸の重量FFA、脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるについて分析した。3つの発酵のそれぞれについて調製された液化トウモロコシマッシュも、Lipolase登録商標100LNovozymes30重量の磨砕されたトウモロコシの実を含有する液化反応塊のkg当たり10ppmのLipolase登録商標全可溶性タンパク質BCAタンパク質分析、SigmaAldrichによる処理の後、脂質の重量およびFFAの重量について分析した。実施例1対照の液化トウモロコシマッシュにリパーゼを加えず、リパーゼリパーゼの熱による失活なしで処理された、液化トウモロコシマッシュを含有する実施例2および3に記載される発酵は、エタノールを実施例3に記載される発酵に加えなかったことを除いて同一であった。実施例2および3に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理された液化トウモロコシマッシュのFFAのは、リパーゼ処理しなかった場合実施例1の31と比較して、それぞれ88および89であった。70時間実行終了EORの時点で、実施例2および3活性リパーゼを含有するに記載されるように実行された発酵のOA相中のFFAの濃度は、それぞれ14および20であり、対応する脂質の増加トウモロコシ油脂肪酸メチルエステル誘導体として測定されるは、GC/MSによって、OAによるCOFAのリパーゼ触媒エステル化に起因することが分かり、その際、液化トウモロコシマッシュ中のトウモロコシ油のリパーゼ触媒加水分解によってCOFAがまず生成される。結果を表5に示す。実施例22トウモロコシ油遊離脂肪酸のオレイルアルコールエステルの生成を制限するための、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活水道水918.4gを、被覆された2Lの樹脂ケトルに加え、次に、474.6gの湿重量417.6gの乾燥重量の磨砕された全粒トウモロコシの実ハンマーミルにおける1.0mmのふるいを撹拌しながら加えた。混合物を、300rpmで撹拌しながら55°Cまで加熱し、2Nの硫酸を用いてpHを5.8に調整した。混合物に0.672gのSpezyme登録商標-FREDLGenencor登録商標,PaloAlto,CAを含有する14.0gの水溶液を加え、混合物の温度を、600rpmで撹拌しながらおよびpH5.8で、85°Cまで上昇させた。85°Cで120分後、混合物を50°Cに冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの45.0mLのアリコートを、50mLのポリプロピレン遠心分離機管に移し、-80°Cで冷凍貯蔵した。第1の反応において、上述したように調製された50gの液化トウモロコシマッシュを、10ppmのLipolase登録商標100LNovozymesと、55°Cで6時間混合し、85°Cで1時間のリパーゼの失活を行わず、混合物を30°Cに冷却した。第2の反応において、50gの液化トウモロコシマッシュを、10ppmのLipolase登録商標と、55°Cで6時間混合し、次に1時間にわたって85°Cまで加熱しリパーゼの失活、次に30°Cに冷却した。第3の反応において、リパーゼを加えない50gの液化トウモロコシマッシュを、55°Cで6時間混合し、85°Cで1時間の加熱を行わず、混合物を30°Cに冷却し、38gのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を30°Cで73時間撹拌した。第4の反応において、リパーゼを加えない50gの液化トウモロコシマッシュを、55°Cで6時間混合し、次に1時間にわたって85°Cまで加熱し、次に30°Cに冷却した。4つの反応混合物のそれぞれを、6時間の時点で採取し、次に、38gのオレイルアルコールを加え、得られた混合物を30°Cで撹拌し、25時間および73時間の時点で採取した。参照文献1によって記載される方法にしたがって、試料液化されたマッシュおよびオレイルアルコールOAの両方を、脂質の重量脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるおよび遊離脂肪酸の重量FFA、脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるについて分析した。OA添加の前にリパーゼの熱による失活を伴って実行された第2の反応のOA相中のFFAのは、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼを熱により失活させなかった場合第1の反応の、25時間および73時間の時点におけるわずか40のFFAおよび21のFFAと比較して、25時間で99および73時間で95であった。リパーゼを加えない2つの対照反応においてFFAのの大きな変化は観察されなかった。結果を表6に示す。実施例23オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のためのリパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のリパーゼの熱による失活3つの発酵を、実施例4、5、および6において上述したように実行した。実施例4および6の液化トウモロコシマッシュには、発酵前にリパーゼを加えず、実施例5に記載される発酵における液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理7.2ppmのLipolase登録商標全可溶性タンパク質を用いての直後に、熱による失活処理リパーゼを完全に失活させるためを行い、その後、接種の前の栄養添加および発酵を行った。実施例4および6に記載されるように実行された発酵のためにリパーゼ処理なしで調製された液化トウモロコシマッシュのFFAのは、リパーゼ処理を伴う場合実施例5の89と比較して、それぞれ31および34であった。表10に列挙される発酵の間、OA相中のFFAの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む3つの発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例5発酵前にリパーゼの熱による失活を伴うにしたがって実行された発酵のOA相中のFFAのは、液化トウモロコシマッシュをリパーゼで処理しなかった残りの2つの発酵実施例4および6についてのわずか33のFFAと比較して、70時間実行終了EORの時点で95であった。結果を表7に示す。実施例24液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理水道水1377.6gを、2つの被覆された2Lの樹脂ケトルのそれぞれに加え、次に、711.9gの湿重量625.8gの乾燥重量の磨砕された全粒トウモロコシの実ハンマーミルにおける1.0mmのふるいを、撹拌しながら各ケトルに加えた。各混合物を、300rpmで撹拌しながら55°Cまで加熱し、2Nの硫酸を用いてpHを5.8に調整した。各混合物に、1.008gのSpezyme登録商標-FREDLGenencor登録商標,PaloAlto,CAを含有する21.0gの水溶液を加えた。次に、1つの混合物に、Lipolase登録商標100L溶液21mgの全可溶性タンパク質、10ppmのリパーゼ最終濃度の10.5mLの水溶液を加え、第2の混合物に、Lipolase登録商標100L溶液2.1mgの全可溶性タンパク質、1.0ppmのリパーゼ最終濃度の1.05mLの水溶液を加えた。55°Cで1時間、2時間、4時間および6時間の時点で試料を各反応混合物から抜き取り、次に、混合物の温度を、600rpmで撹拌しながら、pH5.8で85°Cまで上昇させ、混合物が最初に85°Cに達したときに試料を採取した。85°Cで120時間後、試料を採取し、混合物を50°Cに冷却し、得られた液化トウモロコシマッシュの最終的な試料を50mLのポリプロピレン遠心分離機管に移し;全ての試料を-80°Cで冷凍貯蔵した。2つの別個の反応において、上述したように調製された、10ppmのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの50gの試料または1.0ppmのリパーゼで処理される液化トウモロコシマッシュの55gの試料を、オレイルアルコールOA38gと、30°Cで20時間混合し、次に、各反応混合物中の液化されたマッシュおよびOAを遠心分離によって分離し、参照文献1によって記載される方法にしたがって、各相を、脂質の重量脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるおよび遊離脂肪酸の重量FFA、脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるについて分析した。液化中の10ppmのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ/OA混合物のOA相中のFFAのは、液化中の1.0ppmのリパーゼの熱による失活を用いて調製された、液化されたマッシュ/OA混合物のOA相中のわずか62のFFAと比較して、20時間で98であった。結果を表8に示す。実施例25液化の前の磨砕された全粒トウモロコシの実の処理のためのリパーゼのスクリーニングpH5.8で水道水67.9gおよび磨砕された全粒トウモロコシの実35.1gの湿重量、ハンマーミルを用いて1.0mmのふるいで磨砕されたものを含有する7つの反応混合物を、栓をしたフラスコ中で55°Cで撹拌した。3mLの試料t=0時間を、各フラスコから取り出し、試料をドライアイスですぐに凍結させ、次に、以下のリパーゼNovozymes:Lipolase登録商標100L、Lipex登録商標100L、Lipoclean登録商標2000T、Lipozyme登録商標CALBL、Novozyme登録商標CALAL、およびPalatase20000Lのうちの1つの1mgの全可溶性タンパク質反応混合物中10ppmの最終濃度を含有する約0.5mLの10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を、各フラスコのうちの1つに加え;7つ目のフラスコにはリパーゼを加えなかった。得られた混合物を、栓をしたフラスコ中で55°Cで撹拌し、3mLの試料を、1時間、2時間、4時間および6時間の時点で各反応混合物から引き抜き、参照文献1によって記載される方法にしたがって、脂質の重量脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるおよび遊離脂肪酸の重量FFA、脂肪酸メチルエステル、FAMEとして誘導体化されるについて分析するまで、ドライアイスですぐに凍結させ、遊離脂肪酸含量のパーセントを、脂質および遊離脂肪酸を合わせた全濃度に対して計算し、各試料について測定した。結果を表9に示す。実施例26オレイルアルコールを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵の前の磨砕された全粒トウモロコシの実のリパーゼ処理3つの発酵を、実施例7、8、および10に上述したように実行した。実施例7および10に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ10ppmのLipolase登録商標全可溶性タンパク質を、磨砕トウモロコシの懸濁液に加え、液化の前に55°Cで6時間加熱して、熱により失活したリパーゼを含有する液化トウモロコシマッシュを生成した。実施例8に記載される発酵のための液化トウモロコシマッシュを調製するのに使用される磨砕トウモロコシの懸濁液にはリパーゼを加えなかったが、この懸濁液に、液化の前に55°Cにおける同じ加熱工程を行った。実施例7および10に記載されるように実行された発酵のために調製された、リパーゼ処理される液化トウモロコシマッシュ中のFFAのは、リパーゼ処理を行わない場合実施例8の41と比較して、それぞれ83および86であった。発酵の間、FFAの濃度は、熱により失活したリパーゼを含有するものを含む発酵のいずれにおいても低下しなかった。実施例7および10発酵の前にリパーゼの熱による失活を伴うにしたがって実行された発酵のOA相中のFFAのは、磨砕された全粒トウモロコシの実を液化の前にリパーゼで処理しなかった実施例8にしたがって実行された発酵についてのわずか49のFFAと比較して、70時間実行終了EORの時点で97であった。結果を表10に示す。実施例27トウモロコシ油脂肪酸COFAを用いた原位置生成物除去を用いた同時糖化発酵のための磨砕された全粒トウモロコシの実または液化トウモロコシマッシュのリパーゼ処理5つの発酵を、実施例9、11、12、13、および14に上述したように実行した。実施例9、13、および14に記載されるように実行された発酵では、リパーゼ10ppmのLipolase登録商標全可溶性タンパク質を液化後に加え、リパーゼの熱による失活は行わなかった。実施例9および14に記載されるように実行された発酵には、接種の前に5g/Lのエタノールが加えられた一方、実施例13に記載されるように実行された発酵にはエタノールが加えられなかった。実施例11および12に記載されるように実行された発酵は、液化の前の磨砕トウモロコシの懸濁液への10ppmのLipolase登録商標全可溶性タンパク質の添加を用いて、液化中にリパーゼを熱により失活させた。実施例11に記載されるように実行された発酵には、接種の前に5g/Lのエタノールが加えられた一方、実施例12に記載されるように実行された発酵には、エタノールが加えられなかった。活性リパーゼを含有する発酵のCOFA相中に存在するイソブタノールi-BuOHの最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵のCOFA相中に存在するi-BuOHの最終的な合計グラムよりかなり多かった。活性リパーゼを含有する発酵ブロス中に存在するイソブタノールi-BuOHの最終的な合計グラムは、不活性なリパーゼを含有する発酵ブロス中に存在するi-BuOHの最終的な合計グラムより若干少なく、それによって、i-BuOH遊離i-BuOHおよびCOFAのイソブチルエステルFABEの組合せとしての全体の生成が、熱により失活したリパーゼの存在下で得られるものと比較して、活性リパーゼの存在下でかなり多かった。結果を表11および12に示す。本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。"