"細胞内での第1遺伝子の発現を調節するための方法であって、前記第1遺伝子は36を超えるリピート数を有する伸長CAGリピートを含み、前記方法は第2遺伝子の発現を抑制する段階を含み、前記第2遺伝子はSPT4、SPT5、SUPT4HおよびSUPT5Hから成る群より選択されるものである方法。請求項1の方法であって、前記第1遺伝子は、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR、およびHttの遺伝子から成る群より選択される方法。請求項1の方法であって、前記第1遺伝子は、36を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。請求項1の方法であって、前記抑制段階は、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、化学阻害剤、またはそれらの組み合わせから選択される遺伝子抑制法によって実施される方法。請求項1の方法であって、前記細胞は動物細胞または酵母細胞である方法。請求項5の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。細胞内での第1遺伝子の発現を調節するための方法であって、該方法は、細胞内のSpt4/Spt5またはSupt4h/Supt5hの複合体形成を阻害する段階を含み、前記第1遺伝子は36を超えるリピートを有する伸長CAGリピートを含むものである方法。請求項7の方法であって、前記第1遺伝子は、36を超えるグルタミン残基を有する伸長ポリグルタミンストレッチを含み、かつ細胞内で凝集体を形成するタンパク質をコードする方法。請求項7の方法であって、前記第1遺伝子は、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR、およびHttの遺伝子から成る群より選択される方法。請求項7の方法であって、前記阻害段階は、抗体、小試薬、またはペプチドから選択される阻害剤を細胞に投与することによって実施される方法。請求項7の方法であって、前記細胞は動物細胞または酵母細胞である方法。請求項11の方法であって、前記細胞は哺乳類細胞である方法。ポリグルタミン病を治療するための方法であって、請求項1の方法を前記ポリグルタミン病を患う対象者に適用する段階を含む方法。請求項13の方法であって、前記ポリグルタミン病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択される方法。ポリグルタミン病を治療するための方法であって、請求項7の方法を前記ポリグルタミン病を患う対象者に適用する段階を含む方法。請求項15の方法であって、前記ポリグルタミン病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択される方法。第1遺伝子の調節またはポリグルタミン病の治療に有用な化合物を特定するための方法であって、前記方法は、Spt4/Spt5複合体またはSupt4h/Supt5h複合体の形成を破壊可能な阻害活性を有するものを特定するために、複数の試験化合物をスクリーニングする段階を含み、前記第1遺伝子は伸長CAGリピートを含む方法。上記のことを考慮して、本発明の目的は、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現を調節または減少させることが可能な方法および手段を提供することである。また、本発明の目的は、polyQ病を治療するための治療方法および治療薬を提供することである。さらに、本発明の目的は、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現の調節または減少に効果的な薬剤を、スクリーニングおよび開発するための方法および手段を提供することである。本発明の上記の目的は、微生物転写伸長因子Spt4およびそれの哺乳類オーソログであるSupt4hが、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現において調節の役割を担っているという予期せぬ発見によって充足された。特に、発明者は、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現およびpolyQ配列の伸長ストレッチを有するタンパク質の凝集は、両方ともSpt4-/Supt4h-欠損細胞において軽減されることを発見した。さらに、発明者は、Spt4/Supt4hは、CAGリピートが短いかまたはないものを含む遺伝子に対しては、ごくわずかしか影響しないことを発見した。これらの予期せぬ発見によって、Spt4/Supt4hはpolyQ病介入のための有用な標的として確立される。本発明の他の発見では、発明者は、Spt4-/Supt4h-欠損による軽減効果は、CAG伸長遺伝子における転写伸長障害に起因し得るものであり、それは対応するmRNAおよびタンパク質の産生の減少につながることも発見した。本発見は、Spt4およびSupt4hのいくつかの周知特性において一貫した見解を可能とするものであり、それらは本発明において治療手段計画を誘導する機構モデルの基礎を形成している。例えば、いくつかの最近の研究は、Spt4は酵母細胞における転写およびヘテロクロマチン形成の制御機構において、重要な役割を果たすことに関与するとしているCrottiおよびBasrai、2004年;Rondonら、2003年。転写制御へのそれの影響の分析によって、Spt4は伸長過程において正の制御因子であることが示されている。特に、Spt4は、酵母細胞内でGCを高含有率で有するかまたは3Kbを超える大きさであるDNA鋳型からの、RNAポリメラーゼII媒介転写産物の合成を促進するRondonら、2003年。さらに、最近の証明において、Spt4は、転写の間、RNAポリメラーゼIIの処理能力に影響を及ぼすことが明らかとなり、それはSpt4をクロマチン鋳型に沿ったポリメラーゼIIの持続性に対する重要な要因として特定するものであるMasonおよびStruhl、2005年。特定の理論になんら束縛されるものではないが、発明者は、Spt4がpolyQ含有タンパク質の発現に必要とされる理由は、ポリメラーゼIIが移動するのに長時間を要するそれらのDNA鋳型例えば、CAG伸長領域を含む鋳型から、転写機構が早期に解離することを阻止するその役割のためであると確信している。このモデルは、Spt4-/Supt4h-欠損細胞がCAG伸長遺伝子の発現の軽減を示す結果を説明する。従って、Spt4またはSupt4hを標的とすることで、治療方法を有利に考案することが可能である。さらに、本発明の他の発見では、発明者は、Spt4欠損による軽減効果は、Spt4との相互作用に不具合を有する特異的Spt5変異体によって再現可能であることを発見した。一般に、Spt4は細胞内でSpt5と複合体を形成するため、本発見は、Spt4/Spt5複合体もまた治療標的であることをさらに確立する。本発明の上記の様々な驚くべき発見に基づいて、発明者は、伸長CAGリピート配列を含む遺伝子の発現を調節するための様々な手段および方法を着想かつ具体化した。したがって、一態様において、本発明は36を超えるリピート数を有する伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。本発明のこの態様による実施形態では、概して、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現に関与する転写伸長因子を標的とすることに努める。転写伸長因子を標的とすることは、直接的または間接的のどちらであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、細胞内での転写伸長因子遺伝子の発現を抑制する段階を含む。転写伸長因子遺伝子は、好ましくは、酵母細胞に対してはSPT4遺伝子、または哺乳類細胞に対してはSUPT4H遺伝子である。伸長CAG遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。その他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、転写伸長因子複合体の形成を阻害する段階を含む。転写伸長因子複合体は、好ましくは、酵母細胞内ではSpt4/Spt5複合体、または哺乳類細胞内ではSupt4h/Supt5h複合体である。また、伸長遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。さらに、その他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現に関連する、転写伸長因子の抑制および転写因子複合体の形成の阻害における両段階を含み得る。転写伸長因子遺伝子は、好ましくは、酵母細胞に対してはSPT4、または哺乳類細胞に対してはSUPT4Hである。転写因子複合体は、好ましくは、酵母細胞内ではSpt4/Spt5、または哺乳類細胞内ではSupt4h/Supt5hである。また、伸長遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子、またはそれらの組み合わせから成る群より選択されるものである。他の態様では、本発明は、伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現の調節またはポリグルタミン病の治療のために、有用な医薬剤を特定するための方法をさらに提供する。伸長遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子から成る群より選択される。CAGリピートの数は、好ましくは36を超える。本発明のこの態様による方法は、一般に、Spt4/Spt5複合体またはSupt4h/Supt5h複合体形成の破壊に対するその有効性を評価するために候補化合物を試験する段階、および所定の水準において効果的であるかどうか、前記化合物を先導化合物として特定する段階を含む。好ましくは、タンパク質間相互作用アッセイが候補化合物の有効性を評価するために使用される。本発明のその他の態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。本発明は、様々な結果の完全な理解を促進するために、例示的な実施形態および実施例によって次に示される。本発明は例示的な実施形態および実施例の観点から説明されるが、本明細書において開示される実施形態は例示を目的とするのみであり、様々な改良および変更が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって行われ得ることを理解されたい。定義本開示を通して、遺伝子の名称はイタリック体の大文字で表示し、遺伝子と関連するタンパク質は最初の文字のみが大文字の非イタリック体で表示する。例えば、SPT4遺伝子の場合、用語SPT4は遺伝子を表示し、用語Spt4は遺伝子によって産生されたタンパク質を表示する。唯一の例外はハンチンチン遺伝子であり、遺伝子の名称はHttで表示し、遺伝子産物ハンチンチンタンパク質はHttで表示する。本明細書において、遺伝子SPT4は転写伸長タンパク質Spt4をコードする遺伝子を指す。遺伝子はMaloneら、1993年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Spt4はMalneら、1993年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。本明細書において、遺伝子SPT5は転写伸長タンパク質Spt5をコードする遺伝子を指す。遺伝子はSwansonら、1991年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Spt5はSwansonら、1991年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。本明細書において、遺伝子SUPT4Hは哺乳類転写伸長因子Supt4hをコードする遺伝子を指す。遺伝子はHartzogら、1996年;Chiangら、1996年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Supt4hはHartzogら、1996年;Chiangら、1996年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。本明細書において、遺伝子SUPT5Hは哺乳類転写伸長因子Supt5hをコードする遺伝子を指す。遺伝子はStachoraら、1997年;Chiangら、1998年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。タンパク質Supt5hはStachoraら、1997年;Chiangら、1998年によって特徴付けられ、その内容全体が本明細書において参照により援用される。本発明との関係においては、用語polyQ病は、表1に記載の8つの疾患を指す。本発明との関係においては、用語polyQ変異タンパク質は、36グルタミン残基より長いpolyQ鎖を有するタンパク質を指す。本発明との関係においては、用語伸長CAGリピートは、36よりも大きいCAGリピート数を指す。伸長CAGリピートを含む遺伝子の発現を抑制するための方法上述の通り、本発明は細胞内での遺伝子の発現を調節するための方法を提供し、遺伝子は伸長CAGリピートを含む。好ましくは、CAGリピートの数は36コピーより多い。伸長CAGリピートを含む遺伝子は、好ましくは、SCA1,SCA2,SCA3,SCA7,SCA17,DRPLA,AR,およびHttの遺伝子から成る群より選択される。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、酵母細胞内でのSpt4または哺乳類細胞内でのSupt4hの発現を抑制する段階を含む。遺伝子産物の発現を抑制するための手段は特に限定されない。遺伝子産物すなわち、Spt4およびSupt4hタンパク質の発現を抑制可能である限り、それらは当技術分野におけるあらゆる周知の遺伝子サイレンシング法またはその他の将来開発される遺伝子抑制法であり得る。例示的な遺伝子サイレンシング法は、限定されるものではないが、SPT4またはSUPT4Hの遺伝子の発現を抑制可能である、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、化学試薬を用いて、またはそれらの混合を含み得る。好ましい実施形態では、siRNAおよび遺伝子ノックアウトは、哺乳類細胞内のSUPT4H遺伝子および酵母細胞内のSPT4遺伝子それぞれを制御するために使用される。遺伝子ノックダウンを生じさせるために使用されるRNA干渉配列は、好ましくはSUPT4Hの相補的遺伝子配列であり、より好ましくは80以上の配列相同性を有するものである。特定の理論になんら束縛されるものではないが、SPT4およびSUPT4Hを抑制することによって、長いCAGリピートを有する遺伝子転写産物を生成する細胞の能力が減少するため、伸長polyQ鎖を有するタンパク質の発現が軽減すると考えられている。図1はHtt遺伝子が転写されてHttタンパク質に翻訳される工程を図示している。図1aを参照すると、正常Htt遺伝子20上に斜線部分で示されるCAGリピート21を有するDNA鋳型に沿って移動するRNAポリメラーゼII灰色球体10が示されている。転写の間、RNAポリメラーゼII10は、初めにHtt遺伝子20のDNA鋳型と関連し、次いで鋳型に沿って移動することで、CAGリピートを含む遺伝子のmRNAつまり、Htt遺伝子mRNA30が生産される。その後、Htt遺伝子mRNA30を翻訳することで、Httタンパク質40が産生される。つまり、図1aは正常CAGリピート、すなわち短いCAGリピート22を含む遺伝子の場合において起こることを示している。図1bは、伸長CAGリピート、すなわち長いCAGリピート23を含む変異Htt遺伝子20の場合に起こることを示している。上述の通り、伸長polyQリピートのストレッチを有するHttタンパク質40が産生されると、臓器または組織内で凝集および蓄積する傾向があり、それはHD表現型の原因となる。図1cでは、SUPT4H遺伝子は下方制御されている。その結果、ポリメラーゼII10は、転写伸長の間、変異Htt遺伝子20と持続的に関連することが不可能となり、Httタンパク質産生の減少をもたらし、polyQ病表現型を阻止または改善する。転写伸長因子遺伝子SPT4およびSUPT4Hの発現を抑制することに加えて、Spt4およびSupt4hタンパク質を直接標的にするかまたはそれらの相互作用パートナーを間接的に標的にすることによって、同様のpolyQ変異タンパク質軽減効果も達成可能である。例えば、Spt4タンパク質はSpt5タンパク質と関連することで、酵母細胞内で複合体を形成することが知られている。発明者は、Spt4/Spt5複合体の形成を破壊することによっても、変異polyQタンパク質の発現が軽減することを発見した。同様に、Supt4hおよびSupt5hも哺乳類細胞例えばヒト細胞内で複合体を形成する。したがって、2つの複合体を抑制することは、ヒトまたは酵母の細胞内でのCAG伸長遺伝子の発現を抑制、およびpolyQ凝集を阻止するための、代替的かつ実用的な方法である。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、一般に、転写伸長タンパク質複合体の形成を破壊する段階を含む。好ましくは、転写伸長タンパク質複合体は、酵母細胞内ではSpt4/Spt5、または哺乳類細胞内ではSupt4h/Supt5hである。タンパク質複合体の形成を破壊するための手段は、特に限定されない。それらは当技術分野においてあらゆる周知の方法によって達成可能であり、例えば、酵母細胞の場合にはSpt4またはSpt5、および哺乳類細胞の場合にはSupt4hまたはSupt5hに対する、周知または後に開発される阻害剤を用いることを含む。また、siRNA、RNAi、または当技術分野におけるあらゆるその他の周知の遺伝子サイレンシング法などの遺伝子サイレンシング法は、対応する複合体において少なくとも1つの発現因子を抑制するために有利に使用可能である。例えば、Spt4/Spt5の場合、SPT4、SPT5、または両方の遺伝子抑制は、複合体の形成を未然に防ぐために有利に使用可能である。あるいは、変異のSpt4またはSpt5が、野生型Spt4/Spt5複合体の形成を破壊するための破壊剤として導入されてもよい。その他のさらなる実施形態では、遺伝子抑制段階もまた、タンパク質複合体破壊段階とともに有利に使用可能である。例えば、例示的な実施形態では、細胞内で変異polyQタンパク質の発現を調節するための方法は、酵母細胞に対してはSPT4遺伝子、または哺乳類細胞に対してはSUPT4H遺伝子の発現を抑制する段階、および酵母細胞内ではSpt4/Spt5複合体、または哺乳類細胞内ではSupt4h/Supt5h複合体の形成を阻害する段階を含み得る。polyQ病の治療方法さらに他の態様では、本発明はpolyQ病を治療するための方法も提供する。polyQ病は、脊髄小脳失調症1、2、3、7、17型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、およびハンチントン病から成る群より選択されるものである。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、SUPT4H遺伝子、SUPT5H遺伝子、または両方の発現を抑制するための、遺伝子サイレンシング剤の効果的な量を投与する一般的な段階を含み得る。遺伝子サイレンシング剤の種類は特に限定されない。薬剤がSUPT4HまたはSUPT5Hの遺伝子発現を抑制可能である限り、当技術分野において周知のあらゆる遺伝子サイレンシング剤、または将来開発される遺伝子サイレンシング剤を使用可能である。当業者は、種々の遺伝子サイレンシング剤には適切に選択された投与経路が必要であることを理解するであろう。例示的な実施形態では、遺伝子サイレンシング剤は、siRNA、RNAi、またはD-RNAiである。いくつかのその他の好ましい実施形態において、本発明のこの態様による方法は、Supt4h/Supt5h複合体の形成を破壊可能な医薬剤を投与する一般的な段階を含み得る。また、生体内でSupt4h/Supt5h複合体の形成を破壊可能である限り、医薬剤は特に限定されない。適した医薬剤はSupt4hまたはSupt5hの特異的阻害剤であってもよい。例示的な薬剤は、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、または抗体を含み得る。それはまた、Supt4hまたはSupt5hの工学的変異体であってもよい。先導化合物として有用である薬剤を特定するための方法さらに、他の態様では、本発明はpolyQ病を治療するための先導化合物をスクリーニングおよび特定するための方法をさらに提供する。本発明のこの態様による方法は、一般に、タンパク質複合体の形成の破壊に対する候補化合物の有効性を試験する段階、および既定の限界量において有効であるかどうか、化合物を先導化合物として特定する段階を含む。試験段階は、Spt4/Spt5相互作用、またはSupt4h/Supt5h相互作用に対して、タンパク質間相互作用アッセイを用いて実施可能である。タンパク質間相互作用アッセイの設計は、特に限定されない。例えば、Spt4/Spt5複合体またはSupt4h/Supt5h複合体から生じるタンパク質間相互作用は、これらのタンパク質の全長または断片を用いて、生体内または生体外のどちらかにおいて確立可能である。アッセイが生体内アッセイである場合、Spt4/Spt5相互作用に対しては酵母細胞をベースにしたアッセイ、およびSupt4h/Supt5h相互作用に対しては哺乳類細胞をベースにしたアッセイが好ましい。タンパク質間相互作用の読み取りは、例えば、蛍光シグナル、FRETシグナル、または酵素反応であり得る。このタンパク質間相互作用を妨げる、小分子、ペプチド、または抗体が、候補化合物として選択される。先導化合物のタンパク質間相互作用に基づいた特定は、先導化合物を特定するための効果的で一般的な手法として示されていることに特に留意されたい。例えば、MDM2は、腫瘍形成に関して、p53に結合して否定的に制御することが知られている。癌治療に対して有効性を示す小分子、Nutlin-3は、MDM2とp53タンパク質との間の相互作用を阻止するそれの能力によって特定されたVassilevら、Science,303:844-848、その内容全体は本明細書において参照により援用される。この例示的な事例によって、その他のいくつかの研究とともに、本明細書において開示されるタンパク質間相互作用に基づいた薬物の発見方法の妥当性が支持される。好ましい実施形態では、使用されるアッセイは、発明者によって以前に開発されたカラーコロニーアッセイである。本アッセイの詳細は、米国特許第7,375,190号B2に記載されており、その内容全体は本明細書において参照により援用される。本発明をさらに説明するために、以下の具体的な実施例を提供する。実施例変異HttmRNA発現はSupt4hsiRNAノックダウンによって阻害される。マウス線条体神経細胞株ST14Aラット、HdhQ7/Q7マウス、HdhQ111/Q111マウス、およびHdhQ7/Q111マウスを、33°Cで5CO2とともに10ウシ胎仔血清FBSが追加されたダルベッコ変法イーグル培地SH30022、HyClone中で培養した。ST14Aは、pTet-OffプラスミドBDBiosciencesで形質移入されることで安定な細胞株ST14Atetを確立し、それはテトラサイクリンの非存在下でpTRE2-7Q-eGFPまたはpTRE2-81Q-eGFPを発現した。DNAおよびsiRNAの形質移入は、LipofectAMINE2000Invitrogenを使用して行った。100nMのSupt4hsiRNA5’-CUAUAGACCAGUUCGAAUA-3’SEQID1、5’-UCAAAUACCAAUAAAGCGA-3’SEQID2、5’-GGGAGUGUCUGGGCGGAUU-3’SEQID3、5’-CCCAAGGAAUCGUGCGGGA-3’SEQID4を含む、DHARMACON,ON-TARGETplusSMARTpool,L-048866-01、およびDHARMACON,J-086342-10,5’-UGGCCUACAAAUCGAGAGAUU-3’SEQID5を使用して、マウスおよびラットの細胞それぞれにおいてSupt4hの発現を阻害した。いかなる遺伝子も標的としない等量のアニールされた二本鎖オリゴヌクレオチド5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’SEQID6、および5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’SEQID7の形質移入は、コントロールとしての役割を果たした。図2Aでは、ホモ接合の野生型HdhQ7/Q7または変異HdhQ111/Q111のハンチンチン対立遺伝子を所有する線条体細胞において、Supt4hsiRNAノックダウン後に、RT-PCRによってHttmRNAレベルを調査した。RNAポリメラーゼIIIによって転写されたU6は、ローディングコントロールとしての役割を果たした。TUBA1Aは、Supt4hがハウスキーピング遺伝子のポリメラーゼII依存性の転写に及ぼす影響を調査するために含めた。変異HttmRNAレベルは、HdhQ111/Q111細胞において、SUPT4H遺伝子ノックダウンに応答して減少することが示されている。しかしながら、同程度のSUPT4H下方制御を有しながらも、HdhQ7/Q7における正常HttmRNAの発現において検出可能な変化はない。図2Bでは、Supt4hsiRNAノックダウン後のmRNAの発現レベルにおける変化を、リアルタイムqRT-PCRによって評価した。各mRNAをU6を用いて正常化し、コントロールsiRNANCsiRNAで形質移入された細胞内の転写レベルを1に設定した。本図表において、横軸はHtt遺伝子、SUPT4H遺伝子、TUBA1A遺伝子を表し、縦軸は相対mRNAレベルを表している。SUPT4H遺伝子ノックダウンによって、HdhQ111/Q111内の変異HttmRNAレベルは大幅に減少する一方で、HdhQ7/Q7内の正常HttmRNAはわずかに減少するだけであることが示されている。図2Aおよび2Bの両方は、変異Htt遺伝子の発現がSupt4hによって制御されることを示している。Supt4hsiRNAノックダウンを行う場合と行わない場合の細胞内でのHttタンパク質発現の分析。図3では、実施例1から収集された細胞可溶化物を免疫ブロット法によって分析し、Supt4hsiRNAノックダウンに応答したタンパク質発現の変化を決定した。全タンパク質抽出物の等量を、Htt、Supt4h、Tbp、およびα-Tubulinに対して免疫ブロットした。TATA-box結合タンパク質であるTbpを、短いストレッチのCAGリピートを有するコード遺伝子のタンパク質を代表するものとして含めた。変異Httタンパク質のレベルは、NCsiRNAで処理したものと比較して、Supt4hsiRNAで処理したHdhQ111/Q111細胞内においてより低いことが示されている。変異Httタンパク質の減少は、実施例1において観察されたように、HdhQ111/Q111細胞内での対応するmRNAの変化と一致する。さらに、HttQ7およびTpbタンパク質などの正常CAGリピートCAGトリヌクレオチドリピート数が36以下を有するコード遺伝子のタンパク質レベルは、Supt4hsiRNAノックダウンによって影響されない。SUPT4H遺伝子の下方制御は変異Htt発現を阻害するが、正常Htt発現は阻害しない。図4では、ヘテロ接合Htt対立遺伝子HdhQ7/Q111を有する線条体細胞にSupt4hsiRNAが形質移入され、タンパク質発現を実施例2に記載されるように分析した。HttQ7およびHttQ111の位置を矢印で示す。SUPT4Hノックダウンに応答して、HttQ111のタンパク質レベルは減少したが、HttQ7のタンパク質レベルは不変である。それは伸長CAGリピートを含む遺伝子のみがSupt4hによって影響を受けることをさらに確認するものである。81Q-eGFPを発現するST14A細胞の生存率はSupt4hsiRNAノックダウンによって向上した。7Q-eGFPまたは81Q-eGFPを発現するST14A細胞の生存率を、Supt4hsiRNAノックダウンを行う場合と行わない場合で測定した。示されたpolyQ-eGFPおよびsiRNAで形質移入された後、最小量0.5の血清を含み39°Cに維持された増殖培地において細胞を培養し、神経細胞分化を誘導した。コントロールsiRNA存在下において7Q-eGFPを発現する生細胞の数を1に設定し、その他の試料の相対細胞生存率を図5に示す。7Q-eGFPで形質移入された細胞と比較すると、81Q-eGFPで形質移入されたST14Aは細胞生存率において減少を示したが、それはsiRNA介在SUPT4Hノックダウンによって反転した。一方で、私たちはSupt4hsiRNAは7Q-eGFPを発現する細胞の生存に影響を及ぼさないことを観察した。これは伸長polyQリピートを含む凝集傾向にあるタンパク質の発現によって引き起こされる細胞生存率の減少は、SUPT4H遺伝子の下方制御によって改善可能であることを実証している。酵母細胞内でのSpt4/Spt5複合体の形成を阻止することによるpolyQ凝集の阻害この目的のために、私達の研究室によって開発されたコロニーカラーアッセイ米国特許第7,375,190号B2を使用して、polyQ含有タンパク質の凝集を決定した。本アッセイシステムにおいて、レポータータンパク質であるAde2は、29Qまたは99Qのストレッチのどちらかに融合される。融合タンパク質が溶解したときに、それは機能し、Ade2酵素活性によって細胞の色は白くなる。対照的に、タンパク質が凝集すると、Ade2は十分機能せず、細胞の色は赤くなる。29Q-Ade2はそれの短いpolyQリピート36Q未満のために凝集不可能であり、正常Htt遺伝子などの短いCAGトリヌクレオチドリピートを有する遺伝子を代表するものとして含める。図6では、29Q-ADE2および99Q-ADE2を発現する野生型WT細胞は、白色および赤色をそれぞれ示すことが明らかである。しかしながら、SPT4遺伝子欠損SPT4ΔまたはSPT5SF変異体がこれらの細胞に導入されると、99Q-ADE2発現細胞において赤色の細胞色は白色に変化する。SPT5SF細胞は、Spt4/Spt5複合体の形成を阻害する特異的SPT5S324F点突然変異を保有している。これらの結果は、polyQ凝集はSpt4/Spt5複合体の形成を妨げることによって影響を受けることを示唆している。SPT4遺伝子欠損またはSPT5SF変異を有する細胞内のpolyQ-Ade2タンパク質の発現および凝集の分析polyQ-Ade2タンパク質の発現および凝集は、スロットブロット法およびフィルタートラップ法それぞれによって調査した。フィルタートラップ法は酢酸セルロースCA膜を使用して凝集タンパク質のみを補足し、一方で、スロットブロット法はニトロセルロースNC膜を使用し、それは全てのローディングされたタンパク質を保持する。膜上でのpolyQ-Ade2の保持は、抗-FLAG抗体を用いて免疫ブロット法によって検出した。α-チューブリンα-Tubを、各試料において均等なタンパク質ローディングを確保するために含めた。図7では、99Q-Ade2タンパク質の凝集CA、上方パネルは、WT細胞と比較してSPT4ΔおよびSPT5SF変異細胞において著しく減少することを示している。この発見は、実施例5において観察されるように、これらの変異細胞ではpolyQ凝集がより少ないという概念と一致している。凝集の減少に加えて、私たちは99Q-Ade2タンパク質の発現NC、上方パネルが、SPT4ΔおよびSPT5SF細胞において減少していることも発見した。しかしながら、これらの変異細胞は29Q-Ade2の発現NC、下方パネルには影響しなかった。これらの結果は、Spt4/Spt5複合体の形成を妨げることによるpolyQ凝集の阻害が、現実的であることを確認するものである。さらに、短いものはそうではないが、長いpolyQの伸長ストレッチ>36Qを有するタンパク質の発現は、Spt4/Spt5複合体形成を阻止する変異に影響されやすい。SPT4遺伝子欠損またはSPT5SF変異を有する細胞内のノーザンブロット法によるpolyQ-ADE2mRNAレベルの分析99Q-Ade2および29Q-Ade2をコードする転写産物の発現は、実施例5において説明したように、細胞内のノーザンブロット法によって分析した。polyQ-ADE2mRNAsをpolyQプローブによって検出し、SCR1をローディングコントロールとして含めた。正常化の後、99Q-ADE2を発現するWT細胞内のmRNAレベルを100に設定した。示された細胞における相対的99Q-ADE2および29Q-ADE2のmRNAレベルを図8に示す。WTと比較すると、SPT4ΔおよびSPT5SFの細胞の両方は、99Q-ADE2のmRNA発現において減少を示しているが、29Q-ADE2のmRNA発現においては減少を示していない。この観察結果は、実施例6でのSPT4ΔおよびSPT5SFの変異細胞内における99Q-Ade2タンパク質発現の変化と一致している。本発見はまた、Spt4/Spt5複合体の形成を妨げることによって、短いpolyQリピートをコードする遺伝子に影響することなく、伸長CAGリピートを有する遺伝子の発現を阻害することが現実的であることも立証する。"