国際寄託受託番号FERMBP-6264によって同定されるハイブリドーマによって産生される、破骨細胞形成抑制因子に結合する配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに特異的に結合する抗体H-OBM1。請求項1に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。請求項1に記載の抗体、及び安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、可溶化剤及び界面活性剤からなるグループから選択される1つまたはそれ以上の剤を含む組成物。配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに特異的に結合し、国際寄託受託番号FERMBP-6264によって同定されるハイブリドーマによって産生される抗体H-OBM1と、配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMへの結合において競合する抗体。モノクローナル抗体である請求項4に記載の抗体。IgGである請求項4に記載の抗体。IgG1またはIgG2である請求項6に記載の抗体。IgG2aまたはIgG2bである請求項7に記載の抗体。κ軽鎖をもつ請求項4に記載の抗体。1x109M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項4に記載の抗体。1x1010M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項4に記載の抗体。1x1011M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項4に記載の抗体。配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載のヒト蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに結合する請求項4に記載の抗体。配列表配列番号1または配列表配列番号16に記載のマウス蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに結合しない請求項4に記載の抗体。破骨細胞様細胞の形成を抑制し得る請求項4に記載の抗体。骨吸収活性を抑制し得る請求項4に記載の抗体。請求項4に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。請求項4に記載の抗体、及び安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、可溶化剤及び界面活性剤からなるグループから選択される1つまたはそれ以上の剤を含む組成物。国際寄託受託番号FERMBP-6265によって同定されるハイブリドーマによって産生される、破骨細胞形成抑制因子に結合する配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに特異的に結合する抗体H-OBM4。請求項19に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。請求項19に記載の抗体、及び安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、可溶化剤及び界面活性剤からなるグループから選択される1つまたはそれ以上の剤を含む組成物。配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに特異的に結合し、国際寄託受託番号FERMBP-6265によって同定されるハイブリドーマによって産生される抗体H-OBM4と、配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMへの結合において競合する抗体。モノクローナル抗体である請求項22に記載の抗体。IgGである請求項22に記載の抗体。IgG1またはIgG2である請求項24に記載の抗体。IgG2aまたはIgG2bである請求項25に記載の抗体。κ軽鎖をもつ請求項22に記載の抗体。1x109M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項22に記載の抗体。1x1010M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項22に記載の抗体。1x1011M以下の解離定数をもつ配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載の蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMと結合する請求項22に記載の抗体。配列表配列番号11または配列表配列番号17に記載のヒト蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに結合する請求項22に記載の抗体。配列表配列番号1または配列表配列番号16に記載のマウス蛋白質OCIF結合蛋白質:OBMに結合しない請求項22に記載の抗体。破骨細胞様細胞の形成を抑制し得る請求項22に記載の抗体。骨吸収活性を抑制し得る請求項22に記載抗体。請求項22に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。請求項22に記載の抗体、及び安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、可溶化剤及び界面活性剤からなるグループから選択される1つまたはそれ以上の剤を含む組成物。本発明者らは破骨細胞形成抑制因子OCIFを用い、その結合蛋白質の存在を鋭意探索した結果、OCIF結合蛋白質が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモンなどの骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に発現することを見出した。さらに、このOCIF結合蛋白質の性質及びその生理的機能を調べたところ、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、本発明を成すに至った。さらに、本発明蛋白質につき研究を重ねた結果、この新規な膜蛋白質は骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞との共培養系において、骨芽細胞様ストローマ細胞による未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟を担う重要な蛋白質であることを明らかにした。本発明における破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての蛋白質の同定及びその単離精製の成功により、本発明蛋白質を利用した、生体の骨代謝機構に基づいた新規な骨代謝異常症治療薬のスクリーニングを可能にした。従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規な蛋白質、及びその製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、該蛋白質をコードするDNA、このDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、該蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。また、該蛋白質を含有する骨代謝異常症予防及び又は治療剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、該蛋白質を及びそのDNAを用いた、該蛋白質の発現を調節する物質、該蛋白質の生物活性を阻害又は修飾する物質、あるいは該蛋白質と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。またさらに本発明は、該蛋白質に対する抗体、その製造方法、それを用いた該蛋白質の測定方法、及び抗体を含有する医薬を提供することを課題とする。本発明により、破骨細胞形成抑制因子に結合する新規な蛋白質、その製造方法、この蛋白質を用いて該蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法、該蛋白質の作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と結合してその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物、該蛋白質に対する抗体、及びその抗体を用いた骨代謝異常治療剤が提供される。また、本発明により、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規な蛋白質をコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤が提供される。更に、OCIF結合分子の発現を調節するスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物が提供される。さらに、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規なヒト蛋白質をコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する性質を有し、破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤が提供される。OCIF結合分子の発現を調節する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合し、その作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合し、その生物作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来OCIF結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び又は治療薬が提供される。またさらに、本発明により、OCIFに特異的に結合する膜結合分子蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性OBMの両抗原を認識する抗体、その製造方法、この抗体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び又は治療剤が提供される。本発明により得られた蛋白質あるいは抗体は、医薬あるいは研究又は試験用試薬として有用である。本発明蛋白質は、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。即ち、a親和性破骨細胞形成抑制因子に特異的に結合し、高い親和性を有する。b分子量非還元条件下におけるSDS―ポリアクリルアミド電気泳動による分子量測定で、約3000040000の分子量を示し、又、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は、約90000110000を示す。c生物活性活性型ビタミンD3及び副甲状腺ホルモンなどの、骨吸収促進因子の存在下でのマウス骨芽細胞様ストローマ細胞とマウス脾臓細胞共培養において、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有する。破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンD3あるいはPTH存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明蛋白質の発現細胞は活性型ビタミンD3存在あるいは非存在下でそれぞれ培養したマウス骨芽細胞様ストローマ細胞あるいはマウス脾臓細胞へのOCIFの結合性を試験することにより調べることができる。本発明蛋白質は、活性型ビタミンD3やPTHのような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。又、活性型ビタミンD3存在下の上記共培養系にOCIFを添加することにより1から40ngmlの範囲で用量依存的に破骨細胞の形成が阻害されること、活性型ビタミンD3存在下でST2細胞上に誘導される本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成の経時変化とがよく相関すること、又、ST2細胞に発現される本発明蛋白質の多寡とST2細胞による破骨細胞形成支持能の強弱が一致し、ST2細胞上の本発明蛋白質にOCIFが結合することにより破骨細胞形成が完全に抑制されることから、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する生物活性を有する蛋白質として特定される。本発明蛋白質のOCIFに対する親和性は、OCIFを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって評価することができる。OCIFは、放射性同位元素による標識や蛍光標識などのような通常の蛋白質標識法を用いることによって標識することができる。例えば、OCIFの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の125I標識が挙げられ、ヨードジェン法、クロラミンT法、及び酵素法などの標識法を利用することができる。このようにして得た標識OCIFを用いた、OCIFの動物細胞膜表面への結合性試験は常法に従い実施でき、又、結合性試験に用いる培地に標識OCIFの100倍から400倍濃度未標識OCIFを添加することにより、非特異的な結合量を測定することができる。OCIFの特異的結合量は、標識OCIFの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。細胞膜上に発現された本発明蛋白質の親和性は標識OCIFの添加量を変えて試験を行い、特異的結合量をScatchardplotで解析することによって評価される。このようにして求められた、本発明蛋白質のOCIFに対する親和力は約100500pMであり、本発明蛋白質はこのように破骨細胞形成抑制因子OCIFに高い親和性を有する蛋白質として特定される。OBMの分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーやSDSPAGE等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためにはSDSPAGEを用いるのが好ましく、OBMは還元条件下で約40000の分子量を有する蛋白質として特定される。本発明蛋白質は、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2、マウス前脂肪細胞株PA6、その他のヒト骨芽細胞様細胞株、あるいはヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物から採取し濃縮した骨芽細胞様細胞などから得ることができる。又、これらの細胞に本発明蛋白質を発現させるために必要な誘導物質としては、活性型ビタミンD3、副甲状腺ホルモン、インターロイキン‐1、IL6、IL11、オンコスタチンM及び白血病細胞増殖抑制因子LIFなどの骨吸収促進因子が挙げられる。又、これらの誘導物質の添加濃度としては、活性型ビタミンD3やPTHでは、108M、IL11やオンコスタチンMではそれぞれ10ngml及び1ngml、IL6では20ngmlのIL6と500ngmlのIL6可溶性レセプターを用いるのが望ましい。好ましくは、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2を用い、108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、及び10牛胎児血清を添加したα‐MEM中で一週間以上培養してコンフルエントにした細胞を用いるとよい。このようにして培養した細胞はセルスクレイパーなどを用いて剥離させ、回収するとよい。又、回収した細胞は使用するまでの間‐80°Cで保存しておくことができる。本発明蛋白質は、このようにして回収した細胞の膜画分から精製すると効率良く精製することができる。膜画分の調製は、細胞内器官の分画に利用される通常の方法に従って行うことかできる。膜画分の調製に使用する緩衝液には、好ましくは各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。添加するプロテアーゼ阻害剤としては、例えばPMSF、APMSF、DTA、0‐フェナントロリン、ロイペプチン、ペプスタチンA、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビターなどのセリンプロテアーゼ阻害剤、チオールプロテアーゼ阻害剤、及びメタロプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。細胞の破砕には、Daunceホモジナイザー、ポリトロンホモジナイザー、超音波破砕装置なとを用いることが出来る。破砕した細胞は05Mシュクロースを加えた緩衝液に懸濁させ、600×gで10分間遠心分離することにより、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離することかできる。遠心分離で得た上清を50000×gで90分間遠心分離することにより、沈殿画分として膜画分を得ることかできる。このようにして得た膜画分を各種の界面活性剤で処理することにより、細胞膜に存在する本発明蛋白質を効率良く可溶化し、抽出することかできる。可溶化に用いる界面活性剤としては、細胞膜蛋白質の可溶化に一般的に使用されている各種界面活性剤、例えばCHAPS‐dimethylammonio1propanesulfonate、TritonX100、ikkol、n‐オクチルグリコシドなどを用いることができる。好ましくは、05CHAPSを添加して4°Cで2時間攪拌し、本発明蛋白質を可溶化するのが良い。このようにして調製したサンプルを、150000×gで60分間遠心分離し、その上清を可溶化膜画分として得ることかできる。このようにして得られた可溶化膜画分からの本発明蛋白質の精製は、OCIFを固定化したカラム、ゲル、樹脂などを用いて効率よく精製することかできる。固定化に使用するOCIFとしては、WO9626217号公報記載の方法に従って、ヒト胎児肺線維芽細胞株IMR90の培養液から単離したもの、あるいは遺伝子工学的手法により得られたものを使用することができる。これらのrOCIFは、ヒト、ラット、あるいはマウスのcDNAを常法に従って発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa細胞などの動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。このようにして得られたOCIFは、分子量約60kDaと120kDaの分子量を示すが、固定化に用いるOCIFとしては、好ましくはダイマー型OCIFを用いる。OCIFを固定化するためのゲル、樹脂としてはECHセファロース4B、EAHセファロース4B、チオプロピルセファロース6B、CNBr‐活性化セファロース4B、活性化CHセファロース4B、エポキシ活性化セファロース6B、活性化チオールセファロース4B、TSKgelAF‐エポキシトヨパール650、TSKgelAF‐アミノトヨパール650、TSKgelAF‐フォルミルトヨパール650、TSKgelAF‐カルボキシトヨパール650、TSKgelAF‐トレシルトヨパール650、アミノセルロファイン、カルボキシセルロファイン、FMP活性化セルロファイン、フォルミルセルロファイン、アフィゲル10アフィゲル15アフィプレップ10などを用いることができる。又、OCIFを固定化するためのカラムとしてはHiTrapNHSactivatedカラム、TSKgelTresyl5PWなどを用いることができる。HiTrapNHSactivatedカラムを用いたOCIFの固定化法として、具体的には以下の方法を挙げることができる。即ち、OCIF130mgを含む02MNaHCO305MNaCl溶液1mlをカラムに添加し、室温で30分間カップリング反応させる。次いで、05Mエタノールアミン05MNaClと01M酢酸05MNaClを流し、再度05Mエタノールアミン05MNaClに置き換え、室温で1時間放置し、過剰な活性基を不活性化する。その後、05Mエタノールアミン05MNaClと01M酢酸05MNaClで2度洗浄し、50mMTris1MNaCl01CHAPS緩衝液で置換することにより、OCIF固定化カラムを作製することができる。このようにして作製したOCIF固定化カラムやOCIF固定化ゲルあるいは樹脂などを用い、本発明蛋白質を効率よく精製することができる。本発明蛋白質の分解を抑制するために、精製に用いる緩衝液にも上記の各種プロテアーゼ阻害剤を添加するとよい。本発明蛋白質は、上記の可溶化膜画分をOCIF固定化カラムに負荷する、あるいはOCIF固定化ゲル、樹脂などと混ぜて攪拌することによって吸着させ、酸、各種蛋白質変性剤、カコジレートバッファーなどによってOCIF固定化カラム、ゲル、あるいは樹脂などから溶出することができる。好ましくは、本発明蛋白質の変性を最小限に抑えるため、酸を用いて溶出し直ちに中和するとよい。溶出に用いる酸性緩衝液としては、例えば01Mグリシン塩酸緩衝液、01Mグリシン塩酸緩衝液、及び01Mクエン酸ナトリウム緩衝液などを用いることができる。このようにして精製した本発明蛋白質は、生物試料からの蛋白質の精製に汎用される通常の方法を用いて、本発明蛋白質の物理化学的性質を利用した各種の精製操作により更に精製することができる。本発明蛋白質溶液の濃縮には限外濾過、凍結乾燥及び塩析など、通常、蛋白質の精製過程で用いられる手法が挙げられる。好ましくは、Centricon‐10などを用いた遠心による限外濾過を用いるのが良い。又、精製手段としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動などを用いた通常の蛋白質の精製に利用される各種の手法を組み合わせて用いることができる。より具体的には、Superose12カラムなどを用いたゲル濾過クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーを組み合わせて用いることにより、本発明蛋白質を純化することが可能である。又、精製過程中の本発明蛋白質の同定は、固定化OCIFとの結合活性あるいはOCIFとの結合物を抗OCIF抗体による免疫沈降後、SDS‐ポリアクリルアミド電気泳動で分析することにより検出できる。このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究診断用試薬として有用である。また本発明は、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規な蛋白質をコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、それを用いてOCIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤に関する。さらに本発明は、OBMの発現を調節する物質のスクリーニング方法、OBMと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OBMと結合しOBMの作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物に関する。本発明のDNAによりコードされる新規蛋白質OBMは、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。即ち、a破骨細胞形成抑制因子に特異的に結合する。b還元条件下におけるSDSPAGEによる分子量測定で、約40000の分子量を示す。又、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約90000110000である。c破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する。ものである。本発明のOCIF結合分子、OBMをコードするDNAを同定し、OBMの性質を評価するためのプローブとして使用するヒト破骨細胞形成抑制因子は、WO9626217号に従ってヒト胎児性線維芽細胞株IMR90の培養液から単離することができる。OBMのDNAの単離、同定には、遺伝子組換え型ヒトOCIF、遺伝子組換え型マウスOCIF、遺伝子組換え型ラットOCIF等を用いることもできる。これらの遺伝子組換え型OCIFはそれぞれのDNAを常法に従って発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。目的の蛋白質をコードするcDNAを分離する方法としては、その蛋白質の部分アミノ酸配列を決定しそれに対応する塩基配列をもとにハイブリダイゼーション法により目的のcDNAを単離する方法の他に、蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベクター中にcDNAライプラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的の蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより、目的のcDNAを単離する方法がある。発現クローニング法では、宿主細胞として細菌、酵母、動物細胞などが目的に応じて使い分けられている。本発明のように動物細胞の膜表面に存在すると考えられる蛋白質をコードするcDNAをクローニングする際には、動物細胞を宿主とする場合が多い。又、DNAの導入効率が高く、導入されたDNAの発現効率の高い宿主が通常使用される。そのような特徴を持つ細胞のひとつが、本発明で用いたサル腎臓細胞COS7細胞である。COS7細胞ではSV40largeTantigenが発現しているため、SV40の複製開始点を持っプラスミドは細胞中で多コピーのエピソームとして存在するようになり、通常より高発現が期待できる。又、DNAを導入した時点から数日のうちに最高の発現レベルに到達するので迅速なスクリーニングに適している。この宿主細胞に高発現可能なプラスミドを組み合わせることによって、極めて高レベルの遺伝子発現が可能となる。プラスミド上で最も遺伝子の発現量に影響を与える因子はプロモーターであり、高発現用のプロモーターとしてSRαプロモーターやサイトメガロウィルス由来プロモーター等がよく使用される。発現クローニングにより膜蛋白質のcDNAをクローニングしようとする際のスクリーニング法として、バインディング法、パニング法、フィルムエマルジョン法などが考案されている。本発明は、発現クローニング法とバインディング法を組み合わせることによって得たOCIFに特異的に結合する蛋白質をコードするDNA及び発現蛋白質、及びDNA又は発現蛋白質を用いた生理活性物質のスクリーニングに関する。本発明のDNAがコードするOBMは、OCIFを標識し、その標識体の動物細胞膜表面への結合性を試験することによって検出することができる。OCIFの標識法としては、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。例えば、OCIFの放射性同位元素による標識としてはチロシン残基の125I標識か挙げられ、具体的標識法としてヨードジェン法、クロラミンT法及び酵素法等がある。OCIFの動物細胞膜表面への結合性はこのようにして得た標識OCIFを用い、常法に従った方法で試験できる。又、結合性の試験に用いる培地に標識OCIFの100倍から400倍濃度の未標識OCIFを添加することにより、非特異的な結合量を測定できる。OCIFの特異的結合量は、標識OCIFの総結合量から非特異的な結合量を差し引くことにより算出される。本発明者らは、破骨細胞の分化に関与する因子はOCIFと相互作用するとの仮定のもと、遺伝子組み換え型OCIFを用い、OCIFが結合する蛋白質を分離するため、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2のmRNAから作製した発現ライブラリーを以下に述べる方法でスクリーニングした。ST2mRNAをもとに合成したDNAを動物細胞用発現ベクターに挿入し、それらをサル腎臓細胞COS7細胞に遺伝子導入した。125I標識したOCIFをプローブとして用いてCOS7細胞上に発現した目的の蛋白質をスクリーニングした。その結果、OCIFと特異的に結合する蛋白質をコードするDNAを分離するに至り、このOCIF結合分子をコードするDNAの塩基配列を決定した。又、このDNAにコードされるOBMは細胞膜上でOCIFと強くしかも特異的に結合することを見出した。本発明でいう比較的温和な条件でのDNAハイブリダイゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブレンにDNAをトランスファーし固定化した後、ハイブリダイゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブのDNAと40~70°C、2時間~1晩程度ハイブリダイゼーションさせ、05×SSCで45°C10分洗浄する条件を言う。具体的には、常法に従い、ナイロンメンブレンにハイボンドNを用い、DNAをトランスファーし固定化した後、RapidHybridizationBuffer中で32P標識したプローブのDNAと65°C2時間ハイブリダイゼーションさせて、05×SSCで45°C10分洗浄する条件を言う。破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンD3あるいはPTHの存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。本発明のOBMは活性型ビタミンD3やPTHのような骨吸収促進因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞上に特異的に誘導される蛋白質として特定される。更に、活性型ビタミンD3あるいはPTH非存在下でもマウス脾臓細胞の培養系に本発明のDNAによりコードされる蛋白質を添加することによって破骨細胞の形成が促進されることから、本発明のDNAによりコードされるOBMは破骨細胞の分化、成熟に関与していると考えられる。本発明のDNAを発現ベクターに挿入してOBM発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞又は菌株に導入して発現させることにより、組み換え型OBMを製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としてCOS7、CHO、Namalwaなど、又は細菌の宿主として大腸菌などを、用いることができる。その際、DNAの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させる、あるいは膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型OBMは、通常用いられる蛋白精製法、例えばOCIF固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、あるいはゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせることにより、効率よく精製することができる。このようにして得られた本発明蛋白質は、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究診断用試薬として有用である。本発明のDNAにコードされる蛋白質OBMを利用して、OBMの発現を調節する物質のスクリーニング、OBMに特異的に結合し、OBMの生物活性を阻害、あるいは修飾する物質のスクリーニング、及び破骨細胞前駆細胞に存在し、OBMの生物活性を伝達する蛋白質のスクリーニング、更にはこのOBMレセプターを利用したアンタゴニストやアゴニストの開発が可能である。上述のOBMあるいはOBMレセプターを用いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴニストあるいはアゴニストの探索に必要なペプチドライブラリーは具体的に以下の方法で作製することができる。その一つに、スプリット法がある。この方法は、合成担体にそれぞれのアミノ酸を結合させたものを各ユニットごと別々に合成する。この合成された担体を一度すべて混ぜ、次にユニットの数に等分し、次のユニットをまた各々結合させる。この操作をn回繰り返すことにより、担体にn個のユニットが結合したライブラリーが作製される。このように合成を行うと一つの担体群には、1種類の配列しか合成されないので、本発明の蛋白質を用いた上記のスクリーニング法で陽性を示した担体群を選びだし、そのアミノ酸配列を決定すれば、特異的に結合するペプチドを同定することができる。又、別の方法としてファージディスプレイ法を用いることもできる。この方法はランダムなペプチドをコードする合成遺伝子をファージで発現させるもので、上記合成ライブラリーに比べ、ライブラリー中の分子数を多くできるという利点があるものの、ファージが嫌う配列はライブラリーに存在し得ないことなどがあり、分子数当たりの多様性が低いという欠点がある。ファージディスプレイ法でも同様に、本発明の蛋白質を用いたスクリーニング系を利用し、それに特異的に結合するファージをパニングにより濃縮し、得られた特異的結合性を有するファージを大腸菌で増幅し、そのペプチドをコードする塩基配列を決定すればよい。更に、前記及びのスクリーニング系を使用し、ペプチドライブラリーからOBMあるいはOBMレセプターに特異的でかつ高親和性のペプチドをスクリーニングしたい場合、スクリーニング時にそれぞれOCIFやOBMを共存させ、それぞれの濃度を上げながら、陽性を示した担体あるいはファージをスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチドを得ることができる。例をあげれば、すでに造血ホルモンであるエリスロポエチンのレセプターを用い、多様性に富んだペプチドライブラリーからのEPO様活性を有する低分子ペプチドアゴニストのスクリーニング及びその立体構造解析、更にはその立体構造に基づいた有機合成展開によるEPO活性を有する低分子物質の創製に成功している。また本発明者らは、破骨細胞形成抑制因子OCIFを用い、その結合蛋白質が活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモンなどの骨吸収因子の存在下で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2の細胞上に特異的に発現することをすでに見出した。さらに、該蛋白質は未熟な破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化、成熟に関与する、いわゆる破骨細胞分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有していることを見出し、該蛋白質を精製することによりその物理化学的諸性質及びその生物活性を明らかにした。本発明者らは、本発明のDNAにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質OBMと、すでに前記OCIFと特異的に結合する精製天然型蛋白質との異同を明らかにすべく、物理化学的性質及び生物活性を比較した。その結果、両蛋白質とも膜結合蛋白質であり、特異的にOCIFと結合し、SDSPAGEでの分子量は約40000、モノマータイプのOCIFとクロスリンキングさせた場合の見かけの分子量は約90000110000であり、物理化学的諸性質がよく一致していること、又、生物活性においても、両蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する活性を有していることから、両蛋白質は同一である可能性が示唆された。さらに、本発明DNAを用いて遺伝子工学的に発現させ、精製した蛋白質で作製したウサギ抗OBMポリクローナル抗体は、前記の方法で得られる精製天然型蛋白質に交差性を有し、OBMとOCIFとの特異的結合を阻害するのと同様に、前記の精製天然型蛋白質とOCIFとの結合を特異的に阻害した。これらの結果から、本発明のDNAにより発現される遺伝子組み換え型蛋白質OBMは、前記OCIFに特異的に結合する天然型蛋白質と同一であることが明らかである。さらに本発明者らは、OCIFに特異的に結合し、天然型あるいは遺伝子組み換え型マウスOBMと同様にマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有するヒト由来OCIF結合蛋白分子をコードする遺伝子を単離するため、前述のとおりマウスOBMcDNAから作製したプライマーを用い、ヒトリンパ節由来cDNAを鋳型としてpolymerasechainreactionを行い、得られたヒトOBMcDNA断片をプローブとして上記cDNAライブラリーをスクリーニングした。その結果、OCIFと特異的に結合するヒト由来蛋白質をコードするcDNAを分離することに成功し、このヒト由来OCIF結合蛋白分子、即ちヒトOBMをコードするcDNAの塩基配列を決定した。このcDNAにコードされるヒトOBMは、マウスOBMと同様に細胞膜上でOCIFと強く、しかも特異的に結合する特性を有し、またマウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有することを見出した。即ち、本発明は破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規なヒト由来蛋白質であるヒトOBMをコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する性質を有し、マウス脾臓細胞からの破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤の提供、更にヒトOBMの発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物を提供することを課題とする。本発明は、OCIFに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する新規なヒト蛋白質であるヒトOBMをコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する特性を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤に関する。更に、本発明はヒトOBMの発現を調節する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、ヒトOBMと結合しOBMの生物活性を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来OCIF結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び又は治療薬に関する。本発明のDNAによりコードされる新規ヒト由来OCIF結合蛋白分子、即ちヒトOBMは、以下の物理化学的性質及び生物活性を示す。即ち、a破骨細胞形成抑制因子に特異的に結合する。b還元条件下でのSDSPAGEによる分子量測定で、約40000の分子量を示す。又、モノマータイプのOCIFとクロスリンクさせた場合の見かけ上の分子量は約90000‐110000である。c破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する。ものである。本発明のヒトOBMをコードするcDNAを分離同定するための、プローブとして使用するマウス由来OCIF結合蛋白質であるマウスOBMcDNAは、前述の方法に従って、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2のcDNAライブラリーから単離することができる。又、ヒトOBMcDNAを発現することにより得られる蛋白質の特性及びその生物活性を評価するために必要なヒト破骨細胞形成抑制因子OCIFは、WO9626217号記載の方法に従って、ヒト線維芽細胞株IMR90の培養液から単離、あるいはそのDNAを用いて遺伝子工学的に製造することができる。ヒトOBMの特性や生物活性の評価には、遺伝子組み換えヒトOCIF、遺伝子組み換えマウスOCIF、遺伝子組み換えラットOCIF等を用いることもできる。これらの遺伝子組み換え型OCIFは、それぞれのcDNAを常法に従って発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa細胞等の動物細胞あるいは昆虫細胞などで発現させ、精製することによって得ることができる。目的の蛋白質をコードするヒト型のcDNAを単離する方法としては、その蛋白質を精製し、その部分アミノ酸配列を決定し、それに対応する塩基配列を有するDNAをプローブとして用い、ハイブリダイゼーション法により目的のcDNAを単離する方法、目的の蛋白質のアミノ酸配列が不明であっても発現ベクター中にcDNAライブラリーを構築し、それらを細胞中に導入し、目的蛋白質の発現の有無をスクリーニングすることにより、目的のcDNAを単離する方法、及びヒト由来の目的蛋白質と同じ特性及び生物活性を有するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子、cDNAがクローニングしようとするヒト由来の目的蛋白質のcDNAと高いホモロジーを有すると想定し、前者のcDNAをプローブとし、ヒト細胞あるいは組織から構築したcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法やpolymerasechainreaction法により目的のヒト蛋白質をコードするcDNAを単離する方法がある。ヒトOBMcDNAは、前記マウスOBMcDNAと高い相同性を有するとの想定のもと、ヒトOBM産生細胞あるいは組織は後者のcDNAをプローブとして、ノーザンハイブリダイゼーション法により調べることができる。ヒトOBMcDNAは、マウスOBMcDNAから作製したマウスOBMプライマーを用い、上記のようにして同定したヒトOBM産生組織、例えばヒトリンパ節等から構築したcDNAを鋳型として、PCRによりヒトOBMcDNA断片を得て、このヒトOBMcDNA断片をプローブとし、上記の様に同定したヒトOBM産生細胞あるいは組織のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。本発明は、このようにして得られたOCIFに特異的に結合する性質を有し、また破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有するヒト由来蛋白質、即ちヒトOBMをコードするDNAに関する。本発明のDNAがコードするヒトOBMは、膜貫通領域を有する膜結合型蛋白質をコードすることから、OCIFを標識し、本発明のcDNAを発現した動物細胞表面へのOCIF標識体の結合によって検出することができる。OCIFの標識法としては、前述と同様、放射性同位元素による標識や蛍光標識等、一般的な蛋白質の標識法を用いることができる。本発明のヒトOBMcDNAにより発現される蛋白質の分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーやSDSPAGE等を用いて測定される。より正確に分子量を測定するためには、SDSPAGEを用いるのが好ましく、ヒトOBMは、還元条件下で約40000の分子量を有する蛋白質として特定される。本発明でいう比較的温和な条件でのDNAハイブリダイゼーションとは、例えば常法に従いナイロンメンブランにDNAをトランスファーし、固定化した後、ハイブリダイゼーション用バッファー中で放射線標識したプローブのDNAと4070°C、2時間から一夜程度ハイブリダイゼーションさせ、05×SSCで45°C、10分間洗浄する条件を言う。より具体的には、常法に従い、ナイロンメンブランにハイボンドNを用い、DNAをトランスファーし、固定化した後、RapidHybridizationBuffer中で32P標識したプローブのDNAと65°C、2時間ハイブリダイゼーションさせて、上記の05xSSCで45°C、10分間洗浄する条件を言う。破骨細胞形成の代表的なインビトロ培養系として、活性型ビタミンD3あるいはPTHの存在下でのマウス由来骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2とマウス脾臓細胞との共培養系がよく知られている。このインビトロ培養系での破骨細胞形成には、骨芽細胞様ストローマ細胞と脾臓細胞間の接着による相互作用及び活性型ビタミンD3やPTH等の骨吸収促進因子の存在が不可欠である。このインビトロ培養系において、骨吸収促進因子非存在下で、しかも破骨細胞形成支持能のないサル腎臓細胞株であるCOS細胞に本発明のcDNAを発現させた遺伝子組み換えCOS紬胞株は、骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2と同様に脾臓細胞からの破骨細胞形成支持能を獲得した。また本発明のcDNAは膜結合型蛋白質をコードすることから、この膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶型として発現させることもできる。骨吸収促進因子非存在下の上記インビトロ培養系に、この分泌型ヒトOBMを添加するだけで破骨細胞の形成が起こることも確認された。これらの結果から、本発明のcDNAによりコードされるヒトOBMは破骨細胞の分化、成熟に関与する因子として特定される。本発明のcDNAを発現ベクタ一に挿入してヒトOBM発現プラスミドを作製し、これを各種の細胞または菌株に導入して発現させることにより、組み換え型ヒトOBMを製造することができる。発現させる際の哺乳動物細胞の宿主としてCOS7、CHO、Namalwa細胞などを、また細菌の宿主として大腸菌等を用いることができる。その際、cDNAの全長を用いて膜結合型蛋白質として発現させることができるし、また膜結合部位をコードする部分を除去することにより分泌型、可溶化型としても発現させることができる。このようにして製造された組み換え型ヒトOBMは、通常用いられる蛋白精製法、例えばOCIF固定化カラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせることにより効率良く精製できる。このようにして得られた本発明ヒトOBMは、その活性より骨代謝異常症、例えば大理石病などの治療剤としての医薬、あるいは研究診断用試薬として有用である。本発明のcDNAにコードされる蛋白質、ヒトOBMを利用することにより、ヒトOBMの発現を調節する物質のスクリーニング、ヒトOBMに特異的に結合し、その生物活性を阻害あるいは修飾する物質のスクリーニング、及びヒト破骨細胞前駆細胞に存在し、ヒトOBMの生物活性を伝達するヒト蛋白質のスクリーニング、さらにはこのヒトOBMレセプターを利用したアンタゴニストやアゴニストの開発が可能である。上述のヒトOBMあるいはヒトOBMレセプターを用いたコンビナトリアルケミストリーにおいて、アンタゴニストあるいはアゴニストの探索に必要なペプチドライブラリーはマウスOBMを用いたスクリーニングの方法と同様の方法で作製することができ、マウスOBMの代わりにヒトOBMを用いて、ペプチドライブラリーを同様にスクリーニングすることにより、特異的かつ極めて高親和性のペプチドを得ることができる。さらにまた、前述のようにOBMは有用性の高い蛋白質であるが、この蛋白質の測定を行うにはOBMを特異的に認識する抗体とその抗体を用いた酵素免疫測定法の構築が必須である。しかしながら、これまでにOBMの測定に有用な抗体は得られていない。さらに、OBMあるいはsOBMの生物活性を中和する抗OBMsOBM抗体は、OBMあるいはsOBMの作用、即ち破骨細胞形成の促進作用を抑制することが想定され、骨代謝異常症の治療薬としての開発が期待されるが、このような抗体も未だ得られていない。上述の状況に鑑み本発明者らは鋭意研究の結果、破骨細胞形成抑制因子に特異的に結合する膜結合蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性OBMの両抗原を認識する抗体を見出すに至った。従って本発明は、破骨細胞形成抑制因子OCIFに特異的に結合する膜結合蛋白質OBM及び膜結合部位を欠損した可溶性OBMの両抗原を認識する抗体、その製造方法、この抗体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び又は治療剤を提供することを課題とする。本発明は、破骨細胞形成抑制因子に特異的に結合する膜結合蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性OBMの両抗原を認識する抗体、その製造方法、この抗体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする医薬、特に骨代謝異常症予防及び又は治療剤に関する。本発明の抗体は、OBM及びsOBMの生物活性である破骨細胞形成促進活性を中和する活性を有し、以下の性質を持つ抗体から構成される。即ち、aマウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するポリクローナル抗体bヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識するポリクローナル抗体cマウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するモノクローナル抗体dヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識するモノクローナル抗体eマウスOBM及びマウスsOBMの両抗原に交差性を有する抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、から構成される。マウスOBM及びマウスsOBMの両抗原を認識するポリクローナル抗体及びヒトOBM及びヒトsOBMの両抗原を認識するポリクローナル抗体は、以下の手段によって得ることができる。免疫用抗原としての精製マウスOBMは、前述の方法に従って得ることができる。即ち、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2を活性ビタミンD3処理し、その細胞膜上のOBMをOCIF固定化カラム及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することにより、天然型マウスOBMを得ることができる。又、前述のマウスOBMcDNA又はヒトOBMcDNAを常法により発現ベクターに組み込み、CHO細胞、BHK細胞、Namalwa、COS7細胞等の動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などで発現させて、上記と同様の方法で精製することにより、遺伝子組み換えマウスOBM又はヒトOBMを得ることができ、これを免疫用抗原として用いても良い。この時、膜結合蛋白質であるマウスOBMあるいはヒトOBMを大量かつ高度に精製するには、多大の労力を要する。一方、膜結合型蛋白質であるOBMとその膜結合部位を欠損させて得られる可溶化蛋白質である可溶性OBMとは、前述のように破骨細胞の分化、成熟促進活性において差異がないことが認められている。従って、マウスsOBM及びヒトsOBMは発現及びその高度精製が比較的容易であることから、これら可溶化蛋白質であるsOBMを免疫用抗原として用いても良い。マウスsOBM及びヒトsOBMは、マウスsOBMcDNA又はヒトsOBMcDNAの5上流側に他の分泌蛋白質由来の既知シグナル配列をコードする塩基配列を付加し、上記と同様に遺伝子工学的手法により発現ベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現し、精製することにより、それぞれ得ることができる。このようにして得られた免疫用抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水に溶解し、必要に応じ同容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、動物に約1週間間隔で皮下投与し、数回免疫する。抗体価を測定し、最高の抗体価に達した時点でブースター投与し、投与10日後に全採血を行う。得られた抗血清を硫酸アンモニウム分画沈澱し、グロブリン分画を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製するか、あるいは抗血清をバインディングバッファーで2倍希釈し、その希釈抗血清をプロテインA又はプロテインGセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、目的とする抗マウス又は抗ヒトOBMsOBMポリクローナル型抗体を得ることができる。本発明のモノクローナル抗体は、以下の方法により得ることができる。即ち、モノクローナル抗体の作製に必要な免疫用抗原としては、ポリクローナル抗体の時と同様に天然型マウスOBM、遺伝子組み換えマウス型又はヒトOBM、遺伝子組み換えマウス型又はヒト型sOBMを用いることができる。それぞれの抗原により哺乳動物を免疫するか、あるいはインビトロ法により免疫したリンパ球細胞を骨髄腫細胞株などと融合させ、常法によりハイブリドーマを作製する。このハイブリドーマ培養液について、高度に精製されたそれぞれの抗原を用いて、ソリッドフェーズELISAによりそれぞれの抗原を認識する抗体生産ハイブリドーマを選択する。得られたハイブリドーマをクローニングし、樹立した安定な抗体産生ハイブリドーマをそれぞれ培養することにより、目的とする抗体が得られる。ハイブリドーマの作製に当たっては、哺乳動物を使用する場合、マウスやラットなどの小動物を使用するのが一般的である。免疫は、抗原を適当な溶媒、例えば生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与し、これに必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与し、動物に1~2週間間隔で3~4回程度投与する方法が一般的である。このようにして免疫された動物を最終免疫後3日目に解剖し、摘出した脾臓から得られた脾臓細胞を免疫細胞として使用する。免疫細胞と細胞融合するマウス由来のミエローマとしては、例えばp3x63Ag8、p3U1、NS1、MPC11、SP20、FO、P3x63Ag8653及びS194などが挙げられる。又、ラット由来の細胞としては、R210などの細胞株が挙げられる。ヒト型の抗体を生産する場合には、ヒトBリンパ球をインビトロで免疫し、ヒトミエローマ細胞やEBウイルスにより形質転換した細胞株と細胞融合させることにより、ヒト型の抗体を生産することができる。免疫された細胞とミエローマ細胞株との融合は公知の方法、例えばKoehlerとMilsteinらの方法が一般的に使用されるが、電気パルスを利用した電気パルス法などでも良い。免疫リンパ球とミエローマ細胞株は、通常行われている細胞数の比率に混合し、一般に使用される牛胎児血清不含細胞培養用培地にポリエチレングリコールを添加して融合処理を行い、FCS添加HAT選択培地で培養を行い融合細胞を選別する。次に、抗体を生産するハイブリドーマをELISA、プラーク法、オクタロニー法、凝集法など通常用いられる抗体の検出方法により選択し、安定なハイブリドーマを樹立する。このようにして樹立されたハイブリドーマは、通常の培養方法により継代培養可能であり、必要に応じて凍結保存できる。ハイブリドーマは常法により培養して、その培養液、または哺乳動物の腹腔内に移植することにより、腹水から抗体を回収することができる。培養液あるいは腹水中の抗体は、塩析法、イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィーなど通常用いられる方法により精製することができる。このような方法により、抗原としてsOBMを用いて得られたモノクローナル抗体のほとんど全ては、sOBMだけでなくOBMをも特異的に認識できる抗体である。これらの抗体は、OBM及びsOBMのそれぞれの測定に利用することができる。これらの抗体は放射性アイソトープや酵素ラベルすることにより、ラジオイムノアッセイやエンザイムイムノアッセイとして知られている測定系に用いることにより、OBM量及びsOBM量を測定することができる。これらの測定系を用いることにより、血液、尿などの生体試料中のsOBM量を容易にかつ高感度で測定することができる。また、これらの抗体を用いることにより、組織や細胞表面に結合したOBM量をバインディングアッセイ等により容易にかつ高感度で測定することかできる。得られた抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトOBMsOBM抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトOBMsOBM抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をinvitroでIL4存在下、抗原であるヒトOBMあるいはヒトsOBMで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるK6H6B5と細胞融合させることにより、目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒトOBMsOBMの活性を中和する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をinvitroで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ヒトOBMおよびsOBMに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性ヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体を高親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体のCDR領域にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトOBMsOBMを固相化したプレートを用いてファージディスプレイ法により、抗原であるヒトOBMsOBMに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するCDRのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ヒトOBMsOBMの生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体を選別することができる。また、Balbcマウスを用いて、本発明と同じように常法によりマウス型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体を作製し、ヒトOBMsOBMの生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体のCDR‐領域をヒトIgGのCDR領域に移植するCDRgraftingの手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらにヒト末梢血リンパ球をSeverecombinedimmunedeficiencyマウスに移植し、この移植されたSCIDマウスはヒト型抗体を生産するので、抗原としてヒトOBMあるいはsOBMを抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ヒトOBMsOBMに特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することかできる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるK6H6B5と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、上述の方法と同様に精製することにより精製品を得ることができる。又、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからcDNAライブラリーを構築し、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当な発現ベクターに組み込み、各種動物細胞、昆虫細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組み換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。さらに、上述の方法で得られた抗OBMsOBMモノクローナル抗体の中から、OBMsOBMの生物活性を中和する抗体を得ることかできる。これらOBMsOBMの生物活性を中和する抗体は、生体内でのOBMsOBMの生物作用、即ち破骨細胞形成促進作用をブロックすることから、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び又は治療剤として期待される。抗OBMsOBM抗体によるOBMあるいはsOBMの生物活性の中和活性は、invitroでの破骨細胞形成系における破骨細胞形成の抑制活性で測定することができる。invitroアッセイ系として、以下の3つの方法がある。即ち、破骨細胞形成のinvitro培養系として、活性型ビタミンD3とデキサメサゾンの存在下、マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株、ST2細胞とマウス脾臓細胞との共培養系、サル腎臓細胞株、COS7細胞上にOBMを発現させ、ホルムアルデヒドにより固定化し、MCSF存在下、その細胞上でマウス脾臓細胞を培養する共培養系、遺伝子組み換えsOBM及びMCSF存在下でマウス脾臓細胞を培養する系などが挙げられる。これら培養系に種々の濃度で抗OBMsOBM抗体を添加し、破骨細胞形成に及ぼす影響を調べることにより、抗OBMsOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。又、invivoでの実験動物を利用した骨吸収抑制活性により抗OBMsOBM抗体の破骨細胞形成抑制活性を評価することができる。即ち、破骨細胞形成が亢進している動物モデルとして、卵巣摘出モデルがある。この種の実験動物に抗OBMsOBM抗体を投与し、骨吸収抑制活性を測定することにより、抗OBMsOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性を測定することができる。このようにして得られたOBMsOBMの生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨代謝異常症の予防及び又は治療を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。本発明抗体は、製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、OBM及び又はsOBMを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば熱、pHおよび湿度等により容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としては、グリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン40およびマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量に対して001~100倍、特に01~10倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のpHを調整し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を再溶解した後の水量に対し、1~10mMとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート20、プルロニックF68、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート80が挙げられ、またこれらの2種以上を併用してもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としは、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対し0001~10添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用又は動物薬用注射剤として用いる場合は、浸透圧比として許容される浸透圧比は1~2が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型化抗体の投与量は、抗体のヒトOBMsOBMに対する親和性、即ちヒトOBMsOBMに対する解離定数に依存し、親和性が高いほど、ヒトヘの投与量を少なく薬効を発現することができる。又、ヒト型抗体はヒト血中での半減期が約20日間と長いことから、例えばヒトに対して投与する際には、約01~100mgkgを1~30日間に1回以上投与すれば良い。以下の実施例により本発明をより詳紬に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。本発明蛋白質の製造ST2細胞の大量培養マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2は、10牛胎児血清を含むα‐MEM培地を用いて培養した。付着細胞用225cm2Tフラスコでコンフルエントになるまで培養したST2細胞を、トリプシン処理してTフラスコから剥がし洗浄した後、5枚の225cm2Tフラスコに移し、108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、及び10牛胎児血清を添加したα‐MEM培地各々60mlを加えてCO2インキュベーター中で710日間培養した。培養したST2細胞はセルスクレイパーを用いて回収し、使用するまで‐80°Cで保存した。膜画分の調製と膜結合蛋白質の可溶化225cm2のTフラスコ80枚を用いて培養した実施例1‐記載のST2細胞に、プロテアーゼ阻害剤を含む10mMトリス塩酸緩衝液を3倍容量加えた。ボルテックスミキサーを用いて30秒間この細胞を激しく攪拌した後、氷中で10分間放置した。ホモジナイザーを用い、細胞を破砕した。この細胞破砕液に、上記のプロテアーゼ阻害剤、05Mシュクロース、01M塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、及び2mM塩化カルシウムを加えた10mMトリスー塩酸緩衝液の等量を加え、攪拌した後、4°C、600×gで10分間遠心した。この遠心分離により、細胞核と未破砕の細胞を沈殿画分として分離した。遠心分離で得た上清を4°C、150000×gで90分間遠心し、沈殿画分としてST2細胞の膜画分を得た。この膜画分に、上記のプロテアーゼ阻害剤、15mM塩化ナトリウム、及び01Mシュクロースを含む10mMトリス塩酸緩衝液8mlを加えた後、20CHAPS‐dimethylammonio‐1propanesulfonate、Sigma社200μlを加え、4°Cで2時間攪拌した。この液を4°C、150000×gで60分間遠心し、その上清を可溶化膜画分として得た。本発明蛋白質の精製OCIF固定化アフィニティーカラムの調製HiTrapNHSactivatedカラム内のイソプロパノールを1mM塩酸で置換した後、WO9626217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型OCIF130mgを含む02MNaHCO305MNaCl溶液1mlをシリンジを用いカラムに添加した。室温で30分間カップリング反応させた後、過剰な活性基を不活性化する為、05Mエタノールアミン05MNaClと01M酢酸05MNaClを3mlずつ交互に3回流し、再度05Mエタノールアミン05MNaClに置き換え室温で1時間放置した。その後、05Mエタノールアミン05MNaClと0lM酢酸05MNaClで2度洗浄し、50mMTris1MNaCl01CHAPS緩衝液に置換した。OCIF固定化アフィニティーカラムによる本発明蛋白質の精製OCIF結合蛋白質の精製は、特に断らない限り4°Cで行った。前述のOCIF固定化アフィニティーカラムを、実施例1‐記載のプロテアーゼ阻害剤、015M塩化ナトリウム、及び05CHAPSを加えた10mMトリス塩酸緩衝液で平衡化した。このカラムに、実施例1‐項記載の可溶化膜画分約8mlを流速001ml分で負荷した。このカラムに、上記のプロテアーゼ阻害剤、015M塩化ナトリウム、及び05CHAPSを加えた10mMトリス塩酸緩衝液を流速05ml分で100分間流してカラムを洗浄した。次に、プロテアーゼ阻害剤、02M塩化ナトリウム、及び05CHAPSを加えた01Mグリシン塩酸緩衝液を流速01ml分で50分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。同様に、プロテアーゼ阻害剤、02M塩化ナトリウム、及ひ05CHAPSを加えた01Mクエン酸ナトリウム緩衝液を流速01ml分で50分間流し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は05mlフラクションにて分取した。分取した画分には、2Mトリス溶液を加え、直ちに中和した。各緩衝液で溶出したフラクションの各々をセントリコン10を用いて50から100μlに濃縮した。濃縮した各フラクションの一部を分取し、それぞれにOCIFを添加後、OCIFポリクローナル抗体で免疫沈殿させた。その沈殿画分をSDS化して後、SDSPAGEにかけてOCIFに特異的な結合能を有する蛋白質のバンドが出現するフラクションを本発明蛋白質画分とした。ゲル濾過による本発明蛋白質の精製実施例2‐記載の方法で精製し、濃縮したOCIF結合蛋白質を10mMTrisHCl05MNaCl05CHAPSで平衡化したSuperose12HR1030カラムにかけ、平衡化緩衝液を移動相として用い流速05mlminで展開させ、05mlずつの画分を集めた。上記と同様にして本発明蛋白質画分を同定し、各々のフラクションをCentricon10で濃縮した。逆相高速液体クロマトグラフィーによる精製前述のゲル濾過で精製したOCIF結合蛋白質を01トリフルオロ酢酸30アセトニトリルで平衡化したC4カラムに負荷した。最初の50分間でアセトニトリル濃度を30から55に、次の10分間でアセトニトリル濃度を80にする勾配、流速02mlminで溶出を行い、溶出された蛋白質のピークを215nmで検出した。溶出された各ピークの蛋白質を分取し本発明蛋白質のピークを同定することにより、高度に精製された本発明蛋白質を得た。精製された本発明蛋白質のSDSPAGEまず、活性型ビタミンD3存在下あるいは非存在下で培養したST2細胞から調製した膜可溶化画分を上記のようにOCIF固定化アフィニティーカラムで精製し、その精製標品をSDSPAGEにかけた。図1に示したように、活性型ビタミンD3存在下で培養したST2細胞からの精製標品のみに、約3000040000のメジャーな蛋白質バンドが検出され、OCIF固定化アフィニティーカラムにより、OCIFに特異的に結合する蛋白質、即ち本発明蛋白質が選択的に濃縮、精製されることが明らかになった。しかしながら、本発明蛋白質以外にOCIF固定化カラムの担体やスペサーなどに非特異的に結合した数種の蛋白質バンドが両精製サンプル中に共通して検出された。これらの本発明蛋白質以外の蛋白質を上記のようにゲル濾過及びC4逆相クロマトグラフィーで除去し、得られた高度精製本発明蛋白質のSDSPAGEを図1に示した。高度精製本発明蛋白質は電気泳動的に均一であり、その分子量は約3000040000であった。OCIFの骨芽細胞への結合試験125I標識OCIFの調製OCIFはヨードジェン法により125標識した。即ち、25mgmlIodogen‐クロロホルム溶液20μlを15mlエッペンドルフチューブに移し、40°Cでクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを05Mリン酸ナトリウム緩衝液400μlで3回洗浄した後、05MNaPipH705μlを加えた。このチューブにNa125I溶液13μlを加えた後、直ちに1mgmlrOCIF溶液10μlを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め10mgmlヨウ化カリウム、05MNaPipH70溶液80μlと5牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水5μlを添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液を025牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液で平衡化しておいたスピンカラムに負荷し、2000rpmで5分間遠心した。カラムから溶出された画分に025牛血清アルブミンのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液400μlを加え攪拌した後、2μlを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した125I標識OCIF溶液の放射化学純度は10TCAにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。又、125I標識OCIF溶液のOCIF生物活性は、WO9626217号公報記載の方法に従い測定した。又、125I標識OCIF濃度は以下のようにELISAにより測定した。125I標識OCIF濃度のELISAによる測定WO9626217号公報記載の抗OCIFウサギポリクローナル抗体を2μgmlになるように溶解させた50mMNaHCO3100μlずつを96ウェルイムノプレートの各ウェルに加えて4°Cで一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエースリン酸塩緩衝生理食塩水溶液300μlずつを各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを001ポリソルベート80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水で3回洗浄し、次いで125I標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加したブロックエースリン酸塩緩衝生理食塩水溶液300μlずつを各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を含むブロックエースリン酸塩緩衝生理食塩水溶液100μlずつを各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。TMB溶液100μlずつを各ウェルに加え、室温で23分放置した後、停止液100μlずつを各ウェルに加えた。各ウェルの490nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OCIF標準品を用いて作製した検量線より、125I標識OCIFの濃度を求めた。OCIFの骨芽細胞あるいは脾臓細胞への結合試験マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2あるいは脾臓細胞をそれぞれ4×104cellml及び2x106cellmlの濃度になるように、108M活性型ビタミンD3及び107Mデキサメサゾン添加あるいは無添加の10牛胎児血清を含むα‐MEM培地に懸濁させ、この培地1mlずつを24ウェルマイクロプレートに播種した。細胞をCO2インキュベーター中で4日間培養しα‐MEM培地で洗浄した後、上記の125I標識OCIF20ngmlを加えた結合試験用培地200μlを各ウェルに加えた。又、別のウェルには、8μgmlrOCIFを更に添加した結合試験用培地を200μgml加え、非特異的吸着量測定に供した。CO2インキュベーター中で1時間培養した後、1mlのリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで3回洗浄した。この際、脾臓細胞は浮遊細胞であるため、24ウェルプレートを遠心分離しながら、各ウェルの細胞を洗浄した。洗浄後、01NNaOH溶液500μlを各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、細胞に結合したRI量をガンマーカウンターで測定した。125I標識OCIFは、培養した脾臓細胞には結合せず、図2に示したように、活性型ビタミンD3で培養した骨芽細胞様ストローマ細胞にのみ特異的に結合した。このことから、本発明蛋白質は活性型ビタミンD3とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞上に誘導される膜結合蛋白質であることが明らかになった。本発明蛋白質の生物活性骨芽細胞様ストローマ細胞の破骨細胞形成支持能骨芽細胞の破骨細胞形成支持能は、形成される破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を測定することによって評価した。即ち、ddyマウスの脾臓細胞とマウス骨芽細胞様ストローマ細胞ST2を108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、及び10牛胎仔血清を加えたα‐MEM培地に懸濁させ、96ウェルプレートに播種した。CO2インキュベーター中で1週間培養した後、各ウェルをリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、更に100μlのエタノールアセトンを加えて、室温で1分間固定した。固定後、5mMpnitrophenolphosphateと10mM酒石酸ナトリウムを含む50mMクエン酸緩衝液、pH45、100μlを各ウェルに加え、室温で15分間反応させた。反応後、01NNaOH溶液を各ウェルに添加し、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。RIKENCELLBANKから購入した後の継代数約10代のST2細胞と継代数約40代のST2細胞の破骨細胞形成支持能を試験した結果を図3に示す。この結果から、継代数の多いST2細胞は破骨細胞形成支持能が高いことか明らかになった。活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下での培養における骨芽細胞様ストローマ細胞膜上の本発明蛋白質発現の経時変化と共培養系における破骨細胞形成の経時変化実施例4‐と同様に、骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2を活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下で7日間培養した。OCIF結合試験は、実験例4‐に記載した125I標識OCIFを用いて行った。非特異的結合は400倍濃度の非標識OCIFを用いて125I標識OCIFのST2細胞への結合を競合させることにより測定した。その結果、活性型ビタミンD3とデキサメサゾンにより、培養日数の経過と共に125I標識OCIFの特異的結合量が上昇した。即ち、図4及び図5に示したように本発明蛋白質は活性型ビタミンD3によりST2細胞の表面に培養日数と共に発現し、その発現は培養4日目に最大に達した。一方、マウス脾臓細胞とST2細胞の共培養を活性型ビタミンD3存在下で行うことにより、破骨細胞様の細胞が形成される。破骨細胞のマーカー酵素であるTRAP陽性の単核前破骨細胞様細胞は培養3、4日目には形成され、さらに分化、成熟したTRAP陽性の多核細胞は培養5、6日目に形成される。本発明蛋白質の発現の経時変化と破骨細胞形成のそれとは良く相関していることが明らかになった。共培養期間において、種々の培養期間のみOCIF処理した場合の破骨細胞形成抑制効果本発明蛋白質が破骨細胞形成に関与する因子であることを更に明確にするために、前述の実施例5‐における6日間の共培養期間において、種々の培養期間の細胞を、100ngmlのOCIFで処理した。その結果、図6に示したように、ST2細胞上に最も本発明蛋白質が発現される培養4896時間目でのOCIF処理が最も効果的に破骨細胞の形成を抑制した。即ち、OCIFは本発明蛋白質を介してST2細胞に結合することにより、破骨細胞形成を抑制することが明らかになった。以上の結果から、本発明蛋白質は活性型ビタミンD3とデキサメサゾンにより骨芽細胞様ストローマ細胞膜上に誘導され、破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子としての生物活性を有することが明らかになった。125I標識OCIFと本発明蛋白質とのクロスリンキング試験本発明蛋白質の存在をさらに確認するため、125I標識OCIFと本発明蛋白質とのクロスリンキングを行った。実施例4‐と同様にマウス骨芽細胞様細胞株ST2を活性型ビタミンD3及びデキサメサゾン存在下及び非存在下で4日間培養した。細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで洗浄した後、上記の125I標識OCIF25ngml、又はWO9626217号公報にある配列表配列番号76記載の蛋白質を動物細胞で発現させ上記の方法で標識することにより得られた125I標識OCIF‐CDDl40ngmlを加えた結合試験用培地200μlを添加した。又、別のウェルには、400倍濃度のOCIFを更に添加した結合試験用培地を添加し、非特異的吸着試験に供した。CO2インキュベーター中で1時間培養した後、100μgmlヘパリンを加えたリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで3回洗浄した。これらのウェルに100μgmlのクロスリンキング剤、DSSを溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水500μlを加え、0°Cで10分間反応させた。これらのウェルの細胞を0°Cに冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで2回洗った後、1TritonX100、2mMPMSF、10μMpepstatin、10μMleupeptin、10μMantipain、及び2mMEDTAを加えた20mMHepes緩衝液100μlを各ウェルに加え室温に30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル15μlを常法により非還元条件下でSDS化した後、SDS‐ポリアクリルアミド電気泳動用ゲルを用いて泳動させた。泳動後、ゲルを乾燥させ、BioMaxMSフィルムとBioMaxMS増感スクリーンを用いて‐80°Cで24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。125I標識OCIFを用いた場合には分子量約9000010000のクロスリンクされた蛋白質が検出された。又、125I標識OCIFCDDlを用いた場合、図7に示すように約7080kDaのクロスリンクされた蛋白質が検出された。ST細胞上に発現する本発明蛋白質のScatchardPlotによる解析上記の125I標識OCIFを1000pMになるように加えた結合試験用培地を調製し、結合試験用培地を用い、12希釈倍率で段階的に希釈した。又、非特異的な結合を求めるため、これらの溶液に更に400倍濃度の未標識モノマー型OCIFを添加した溶液を調製した。調製したこれらの溶液200μlを108M活性型ビタミンD3と107Mデキサメサゾン存在下で4日間培養した上記のST2細胞のウェルに加え、実施例4‐と同様の方法で125I標識OCIFの結合を試験した。得られた結果を常法に従ってScatchardPlotし、OCIFとOCIF結合蛋白質の解離定数とST2細胞当たりのOCIF結合蛋白質の個数を求めた。その結果、OCIFと本発明蛋白質の解離定数は280pM、ST2細胞当たりのOCIF結合蛋白質のサイト数は約33000個細胞であった。又、実施例5‐で記載したように、約40継代培養したST2細胞は破骨細胞形成支持能が10継代培養したST2細胞よりも高かったことから、前者のST2細胞上に発現した本発明蛋白質のサイト数を測定したところ、サイト数が58000個細胞であり、明らかに10継代培養したST2細胞よりも多く、本発明蛋白質の発現量の多寡がST2細胞による破骨細胞形成支持能の強弱に繋がっていることが明らかになった。このことは、本発明蛋白質は破骨細胞の分化、成熟を支持又は促進する因子であることを示す。OBMcDNAのクローニングマウスST2細胞からのRNAの抽出マウス骨芽細胞様ストローマ細胞株ST2は、10牛胎児血清を含むα‐MEM培地を用いて培養した。付着細胞用225cm2T‐フラスコでコンフルエントになるまで培養したST2細胞を、トリプシン処理してT‐フラスコから剥がし洗浄した後、5枚の225cm2T‐フラスコに移し、108M活性化ビタミンD3、lO7Mデキサメサゾン、及び10牛胎児血清を添加したαMEM培地を各々60mlずつ加えてCO2インキュベーター中で5日間培養した。培養したST2細胞からISOGENを用いて総RNAを抽出した。総RNA約600μgからOligo‐celluloseカラムを用いてポリARNAを調製した。約8μgのポリARNAを得た。発現ライブラリーの構築実施例8で得られたポリARNA2μgからGreatLengthscDNASynthesiskitを用い、その説明書に従い二本鎖cDNAを合成した。即ち、ポリRNA2μgとOligo25プライマーを混合し蒸留水を加え最終容量を625μlとし、70°Cで3分保温後、氷中で2分冷却した。この溶液に蒸留水22μl、5XFirststrandbuffer25μl、100mMDTT025μl、PRIMERNaseInhibitor05μl、5倍希釈したα‐32PdCTP05μl、dNTP065μl、MMLV逆転写酵素125μlを加え、42°Cで90分保温した。さらに、蒸留水を6225μl、5Xsecondstrandbuffer20μl、dNTP075μl、Secondstrandenzymecocktail5μlを添加し、16°Cで2時間保温した。この反応液にT4DNApolymerase75ユニットを加え、16°Cでさらに30分保温後02MEDTA5μl添加して反応を停止し、フェノールクロロフォルム処理後、エタノール沈殿を行った。この二本鎖cDNAの末端にEcoRISalINotIリンカーを付加し末端をリン酸化した。サイズフラクショネーション用カラムにより500bp以上のcDNAを分離し、エタノール沈殿を行った。沈殿したDNAを水に溶解し、あらかじめ制限酵素EcoRI切断及びCIAP処理して調製したpcDLSRα296に挿入した。OCIFとの結合を指標とした発現ライブラリーのスクリーニング実施例8で得られたDNAを用い大腸菌、XL2BlueMRFを形質転換し、1ウェルあたり約100コロニーとなるように細胞培養用24ウェルプラスティックプレートに調製したLカーベニシリン寒天培地上に増殖させた。各ウェル中の形質転換株を3mlのTerrificBrothアンピシリン培地に懸濁し、37°Cで一晩振盪培養した。遠心により集菌しQIAwellkitを用いてプラスミドDNAを調製した。260nmにおける吸光度によりDNA含量を測定し、エタノール沈殿により濃縮し、200ngμlとなるように蒸留水に溶解した。この様にしてそれぞれ約100個のコロニーから由来するDNAプールを500プール調製し、COS7細胞へのトランスフェクションに用いた。COS7細胞を24ウェルプレートに8×104細胞ウェルとなるように播種し、10牛胎児血清を含むDMEM培地を用いて、CO2インキュベーター中で37°Cにて一晩培養した。翌日、培地を除いた後、無血清DMEM培地で細胞を洗浄した。トランスフェクション用試薬リポフェクトアミン添付のプロトコールに従い、予めOPTIMEM培地を用いて希釈しておいた前記プラスミドDNAとリポフェクトアミンを混合し、15分後この混合液を各ウェルの細胞に加えた。用いたDNA及びリポフェクタミンの量はそれぞれ1μg及び4μlとした。5時間後、培地を除去し、1mlの10牛胎児血清を含むDMEM培地を添加し、CO2インキュベーター中、37°Cで23日培養した。上記の様にトランスフェクトし23日培養したCOS7細胞を無血清DMEM培地で洗浄した後、125I標識したOCIF20ngmlを加えた結合試験用培地200μlを各ウェルに加えた。CO2インキュベーター中で37°C1時間培養した後、細胞を01mgmlheparinを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μlで2回洗浄した。洗浄後、01NNaOH溶液500μlを各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、各ウェル中の125Iの量をガンマーカウンターで測定した。計500プールをスクリーニングすることにより、OCIFと特異的に結合する蛋白質をコードするcDNAを含むDNAプール1つを分離した。さらに本発明のcDNAを含むDNAプールを細分化し、前記と同様のトランスフェクションとスクリーニング操作を繰り返すことにより、OCIFと結合する蛋白質をコードするcDNAを単離した。このcDNAを含むプラスミドをpOBM291と名付けた。このプラスミドを含む大腸菌は、pOBM291として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERMBP5953として平成9年5月23日に寄託されている。OCIFの125I標識ならびにELISAによる125I標識OCIFの定量法を以下に示す。OCIFはヨードジェン法により125I標識した。25mgmlIodogenクロロホルム溶液20μlを15mlエッペンドルフチューブに移し、40°Cでクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを05Mリン酸ナトリウム緩衝液400μlで3回洗浄した後、05MNaPipH705μlを加えた。このチューブにNa125I溶液13μlを加えた後、直ちに1mgmlOCIF溶液10μlを加え、ボルテクスミキサーで攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め10mgml沃化カリウム、05MNaPipH70溶液80μlと5牛血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水5μlを添加しておいたチューブに移し攪拌した。この溶液をBSAPBSで平衝化しておいたスピンカラムに負荷し、2000rpmで5分間遠心した。カラムから溶出された画分にBSAPBSを400μl加え撹拌した後、2μlを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した125I標識OCIF溶液の放射化学純度は10TCAにより沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。また、125I標識OCIF溶液のOCIF生物活性は、WO9626217号公報記載の方法に従い測定した。また、125I標識OCIF濃度は、以下のようにELISAにより測定した。即ち、WO9626217号公報記載のウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を2μgmlになるように溶解させた50mMNaHCO3pH96を100μlずつ96ウェルイムノプレートの各ウェルに加えて4°Cで一夜放置した。この液を吸い取った後、ブロックエースとリン酸塩緩衝生理食塩の混合水溶液を200μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、各ウェルを001Polysorbate80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水で3回洗浄し、次いで125I標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加したBPBSを100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクローナル抗体をBPBSで希釈した溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を吸い取った後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で23分放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OCIF標準品を用いて作製した検量線より125I標識OCIFの濃度を求めた。OBMの全アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列の決定実施例8で得られたOBMcDNAの塩基配列を、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキットを用いて決定した。即ち、pOBM291を鋳型とし、直接挿入断片の塩基配列を決定した。また、pOBM291を制限酵素EcoRIで切断し得られた約10kbならびに約07kbの断片をプラスミドpUC19のEcoRI部位に挿入し、それらの断片の塩基配列も決定した。用いたプライマーは、pcDLSRα296の挿入断片DNAの塩基配列を決定するためのプライマーSRR2、プラスミドpUC19の挿入断片DNAの塩基配列を決定するためのプライマーml3PrimerM3、ml3PrimerRV及びOBMcDNAの塩基配列に基づいて設計された合成プライマーOBM8である。これらプライマーの配列を配列表配列番号3~6に示す。また、決定されたOBMcDNAの塩基配列を配列番号2に、その配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号1にそれぞれ示す。実施例9本発明cDNAにコードされる蛋白質の発現プラスミドpOBM291を6ウェルプレートの各ウェル中でCOS7細胞にリポフェクトアミンを用いトランスフェクションし、10牛胎児血清を含むDMEM培地中で2日間培養した。5透析牛胎児血清を添加した、システインメチオニン不含DMEMに培地交換し15分培養した後、ExpressProteinLabelingMixを14μl添加した。4時間培養後、10牛胎児血清を含むDMEM培地を200μl加え1時間培養した。細胞をPBSで2回洗浄後、1TritonX100、1bovinehemoglobin、10μgmlleupeptin、02TIUmlaprotinin、1mMPMSFを含むTSAバッファーを05ml加え、氷上1時間静置した。ピペッティングにより細胞を破砕した後、4°Cで3000Xg10分間遠心分離し上清を得た。この上清100μlに200μlの希釈バッファーを加え、proteinASepharoseとともに4°Cで1時間振とうさせた後、4°Cで1500Xgにて1分間遠心分離し上清を回収することにより、proteinASepharoseに非特異的に吸着する分画を除いた。この上清にOCIFを加え、4°Cで1時間振とうさせながらOBMとOCIFを結合させた後、抗OCIFポリクローナル抗体を加えて4°Cで1時間振とうした。これにproteinASepharoseを加えさらに4°Cで1時間振とうした。4°Cで1500Xgにて1分間遠心分離し沈澱画分を回収した。4°C、1500Xgで1分間の遠心分離による沈澱の洗浄を、希釈バッファーで2回、bovinehemoglobinを含まない希釈バッファーで2回、TSAバッファーで1回、50mMTrisHClで1回行った。洗浄後、沈澱に10βメルカプトエタノールを含むSDSバッファーを加え、100°Cで5分加熱後SDSPAGEを行った。常法によりゲルを固定した後、Amplifyにより、アイソトープのシグナルを増強した後、BioMaxMRフィルムを用いて-80°Cで感光させた。結果を図8に示す。本発明cDNAにコードされる蛋白質の分子量は約40000であることが示された。実施例10本発明cDNAにコードされる蛋白質とOCIFとの結合プラスミドpOBM291を24ウェルプレートの各ウェル中でCOS細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、その細胞を23日培養したのち無血清DMEM培地で洗浄し、これに125I標識したOCIF20ngmlを加えた結合試験用培地200μlを加えた。また別のウェルには、125I標識したOCIF20ngmlに加えて8μgmlの非標識OCIFを更に添加した結合試験用培地を200μl加えて実験を行った。CO2インキュベーター中で37°Cにて1時間培養した後、細胞を01mgmlのheparinを含むリン酸緩衝生理食塩水500μlで2回洗浄した。洗浄後、01NNaOH溶液500μlを各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、ウェル中の125Iの量をガンマーカウンターで測定した。その結果、図9に示したようにプラスミドpOBM291をトランスフェクトした細胞にのみ125I標識したOCIFが結合することが確認された。また、その結合は、400倍濃度のOCIFを添加することで著しく阻害されることが確認された。以上の結果から、プラスミドpOBM291上のcDNAにコードされる蛋白質、OBMは、COS7細胞表面でOCIFと特異的に結合することが明らかとなった。実施例11125I標識したOCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキング試験本発明cDNAにコードされる蛋白質の性質をさらに詳しく解析するため、125I標識したモノマー型OCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。実施例8に記載の方法に従ってプラスミドpOBM291をCOS7細胞にトランスフェクトした後、上記の125I標識したOCIFを加えた結合試験用培地200μlを添加した。また、別のウェルには、125I標識したOCIFに加え400倍濃度の非標識OCIFをさらに添加した結合試験用培地を加えた。CO2インキュベーター中で37°C1時間培養した後、細胞を01mgmlheparinを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μlで2回洗浄した。この細胞に100μgmlのクロスリンキング剤、DSSを溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水500μlを加え、0°Cで10分間反応させた。これらのウェルの細胞を0°Cに冷却したリン酸緩衝生理食塩水1mlで2回洗った後、この細胞に1TritonX100、2mMPMSF、10μMpepstatin、10μMleupeptin、10μMantipain、及び2mMEDTAを含む20mMHepes緩衝液100μlを加え、室温に30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル15μlを常法により還元条件下でSDS化した後、SDS電気泳動用ゲルを用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、BioMaxMSフィルムとBioMaxMS増感スクリーンを用いて-80°Cで24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、125I標識モノマー型OCIFと本発明cDNAによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、図10に示すように分子量約90000110000のバンドが検出された。実施例12ノーザンブロットによる解析付着細胞用25cm2Tフラスコでコンフルエントになるまで培養したST2細胞を、トリプシン処理してTフラスコから剥がし洗浄した後、1枚の225cm2Tフラスコに播種し、108M活性化ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、及び10牛胎児血清を添加したαMEM培地各々60mlを加えてCO2インキュベーター中で4日間培養した。培養したST2細胞からISOGENを用いて総RNAを抽出した。また、活性化ビタミンD3とデキサメサゾン非存在下で培養したST2細胞からも上記の方法で総RNAを抽出した。各総RNA20μgにそれぞれ20μlの5Xゲル泳動緩衝液、35μlのホルムアルデヒド及び100μlのホルムアミドを加え55°Cで15分保温後、電気泳動に供した。電気泳動用のゲルは10アガロース、22M脱イオン化ホルムアルデヒド、40mMモルホリノプロパンスルホン酸pH70、10mM酢酸ナトリウム、1mMEDTAの組成で調製した。また、電気泳動は40mMモルホリノプロパンスルホン酸、pH70、10mM酢酸ナトリウム、1mMEDTAの緩衝液中で行った。電気泳動後、RNAをナイロンメンブレンにトランスファーした。pOBM291を制限酵素EcoRIで切断して得られた、約10kbのDNA断片を、メガプライムDNAラベリングキット及びα32PdCTPを用いて標識したものをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。その結果、図11に示すように、ST2細胞では活性化ビタミンD3とデキサメサゾンの存在下で培養した場合に、本発明cDNAにコードされる蛋白質の遺伝子発現が強く誘導されていることが明らかとなった。実施例13本発明cDNAにコードされる蛋白質の破骨細胞形成支持能実施例8に記載の方法でCOS細胞にpOBM291をトランスフェクトした。3日後トリプシナイズした細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水で一回遠心洗浄したのち、1パラフォルムアルデヒドを含むPBSに細胞をサスペンドしながら室温で5分間固定し、PBSにて6回遠心洗浄した。108M活性化ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、10牛胎児血清を含むαMEM培地にて調製した1×106個mlのマウス脾臓細胞及び4×104個mlのST2細胞を24ウェルプレートにそれぞれ700μl、350μl添加したのちTCインサートを各ウェルにセットした。上記培地にて段階希釈した固定化COS細胞及びOCIFをTCインサート中に添加して37°Cで6日間培養した。この結果、OCIFによる破骨細胞形成阻害活性が、本発明cDNAにコードされる蛋白質により抑制されることが明らかとなった。実施例14分泌型OBMの発現分泌型OBM発現プラスミドの構築OBMHFとOBMXRをプライマー、pOBM291を鋳型としPCR反応を行った。この生成物を、アガロースゲル電気泳動で精製した後、制限酵素HindIII、EcoRIで切断し、さらにアガロースゲル電気泳動で精製した。この精製断片を、pSecTagAのHindIIIEcoRV断片と、OBMcDNAのEcoRIPmaCI断片とともにライゲーションキットver2を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによりpSecTagAに06Kbと032kbの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。さらにこのプラスミドにつきダイターミネーターサイクルシークエンシングFSキットを用いてシークエンスを行い、このプラスミドが分泌型OBMをコードする配列を持っていることを確認した。このプラスミドを制限酵素NheI、XhoIで切断した後、分泌型OBMcDNAに相当する断片をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターpCEP4のNheIXhoI断片に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型OBM発現プラスミドを持つ大腸菌株を選び出した。pCEPsOBMを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキットを用いてpCEPsOBMを精製した。分泌型OBMの発現293EBNA細胞を10FCSを含むIMDMに懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレートに2x105個2mlウェルになるように播種し、一晩培養した。この細胞に1μgのpCEPsOBM又はpCEP4をリポフェクトアミン4μlを用いて形質導入し、05mlの無血清IMDM又はIMDM10FCS中でさらに2日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型OBMの培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。培養上清に最終濃度01Mになるよう炭酸水素ナトリウムを加えた後、培養液を96ウェルプレートに添加し、4°Cで一晩放置し、培養上清中のOBMを96ウェルプレートに固相化した。このプレートをPBSで4倍希釈したブロックエース溶液で室温に2時間放置しブロッキングした後、BPBSで希釈した3100ngmlのOCIFを各ウェルに100μlずつ加え37°Cで2時間放置した。005Tween20を含むPBSでプレートを洗浄した後、BPBSで希釈したWO9626217号記載のパーオキシダーゼ標識ウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を各ウェルに100μlずつ添加し、37°Cで2時間放置した。PBSTで各ウェルを6回洗浄した後、TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で約10分放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図12に示す。pCEPsOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加したOCIFの濃度に依存して450nmの吸収が増加したが、ベクターpCEP4を形質導入した細胞の培養上清を固定化した場合は吸収の増加はみられなかった。又、固定化に用いる培養上清の割合を590の範囲で種々に変化させ、一定濃度のOCIFを添加した際の実験の結果を図13に示す。pCEPsOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、培養上清の割合が高くなるほど450nmの吸収が増加したが、ベクターpCEP4を形質導入した細胞の培養上清を固定化したプレートでは、吸収の増加は見られなかった。以上の結果より、分泌型OBMが、pCEPsOBMを形質導入した細胞の培養上清中に生産されていることが確認された。実施例15チオレドキシン‐OBM融合蛋白質の発現チオレドキシン‐OBM融合蛋白質発現ベクターの構築10μlの10XExTaqバッファー、8μlの10mMdNTP、775μlの滅菌蒸留水、2μlのpOBM291水溶液、1μlのプライマーOBM3、1μlのプライマーOBMSalR2、05μlのExTaqを混合しマイクロ遠心管中でPCR反応を行った。95°C5分、50°C1秒、55°C1分、74°C1秒、72°C5分の反応後、96°C1分、50°C1秒、55°C1分、74°C1秒、72°C3分の反応を25サイクル行った。1アガロースゲル電気泳動により、反応液全量から約750bpのDNA断片をQIAEXIIgelextractionkitを用いて精製した。精製したDNA断片全量を制限酵素SaIIEcoRIで切断した後、15アガロースゲル電気泳動を行い約160bpのDNA断片を精製し20μlの滅菌蒸留水に溶解した。同様に、4μgのpOBM291を制限酵素BamHIEcoRIで切断し得られた約580bpのDNA断片、及び2μgのpTrXFusを制限酵素BamHISalIで切断し得られた約36kbのDNA断片をそれぞれ精製し、それぞれを20μlの滅菌蒸留水に溶解した。DNA断片の精製にはQIAEXIIgelextractionkitを用いた。断片1、断片2、断片3をDNAligationkitver2を用い、16°Cで2時間30分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌GI724株をThioFusionExpressionSystem添付のInstructionManualに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られるDNA断片地図の解析並びにDNA配列の決定により、OBMcDNA断片がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持つ菌株を選び出した。得られた菌株をGI724pTrxOBM25と名付けた。大腸菌でのOBMの発現GI724pTrxOBM25株及びpTrxFusを持つGI724株それぞれを2mlのRMGAmp培地、1グリセロール、1mMMgCl2、100μgmlアンピシリンpH74で30°Cで6時間振とう培養した。菌液05mlを50mlのInduction培地に添加し、30°Cで振とう培養した。OD600nmでの値が約05になった時点で最終濃度が01mgmlになるようにLトリプトファンを添加し、さらに30°Cでの振とう培養を6時間継続した。菌液を3000×gで遠心し菌体を集め、125mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波発生装置にかけ菌体を破砕し、7000×gで30分遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。この可溶性蛋白質画分液10μlずつを還元条件下でのSDSポリアクリルアミド電気泳動に供した。この結果、GI724pTrxOBM25の可溶性蛋白質画分液にはGI724pTrxFusの可溶性蛋白質画分液には見られない分子量約40kDaのバンドが検出された。よって、チオレドキシンとOBMの融合蛋白質が大腸菌中で発現していることが確認された。TrxOBMのOCIFとの結合能発現させたTrxOBMがOCIFと結合することを以下の実験により確認した。即ち、96ウェルイムノプレートの各ウェルに10mM炭酸水素ナトリウム水溶液で5000倍に希釈した抗チオレドキシン抗体を100μlずつ添加し4°Cで一晩放置した。各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエースをPBSで2倍希釈した溶液を各ウェルに200μlずつ添加し室温で1時間放置した。液を捨てた後、各ウェルにBAPBSで段階希釈した上記GI724pTrxOBM25由来及びGI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分液を100μlずつ添加し室温で2時間放置した。PBSTで各ウェルを3回洗浄した後、BAPBSで希釈したOCIFを各ウェルに100μlずつ添加し室温で2時間放置した。PBSTで各ウェルを3回洗浄した後、BAPBSで2000倍希釈したWO9626217号記載のパーオキシダーゼ標識ウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を各ウェルに100μlずつ添加し、2時間室温で放置した。PBSTで各ウェルを6回洗浄した後、TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で約10分放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図15に示す。GI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは添加しなかったものと比べて吸光度に差は認められなかったが、GI724pTrxOBM25由来可溶性蛋白質画分液を添加したものでは、その添加濃度の増加に依存して吸光度が上昇した。又、添加する可溶性画分液の希釈割合を一定にし、BAPBSで段階希釈したOCIFを添加した場合の実験結果を図16に示す。GI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分液を用いたものではOCIF濃度に係わりなく吸光度は低いままであったが、GI724pTrxOBM25由来可溶性蛋白質画分液を用いたものでは添加したOCIF濃度に依存して吸光度が上昇した。この結果より、GI724pTrxOBM25で生産されるTrxOBMは、OCIFと結合する能力があることが確認された。TrxOBMを生産する大腸菌の大量培養GI724pTrxOBM25をRMGAmp寒天培地に白金耳で塗まつし、30°Cで一晩培養した。菌を10mlのInduction培地に懸濁し、5mlずつを500mlのInduction培地のはいった2L用三角フラスコ計2本に添加し、30°Cで振とう培養した。OD600nmでの値が約05になった時点で最終濃度が01mgmlになるようにLトリプトファンを添加し、さらに30°Cで振とう培養を6時間継続した。菌液を3000×gで20分間遠心分離して菌体を集め、菌体を160mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波発生装置にかけ菌体を破砕し、7000×gで30分間遠心して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。OCIF固定化アフィニティーカラムの調製TSKgelAFトレシルトヨパール6502gとWO9626217号に記載の方法で調製した遺伝子組み換え型OCIF350mgを含む10Mリン酸カリウム緩衝液40mlとを混合し4°Cで一晩ゆっくり振とうしカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化する為、遠心分離により上清を除去した後、40mlの01Mトリス塩酸緩衝液を沈殿した担体に加え、室温で1時間おだやかに振とうした。001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mグリシン‐塩酸緩衝液及び001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mクエン酸ナトリウム緩衝液を通液しカラムを洗浄した後、001Polysorbate80を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液で2度洗浄し、平衡化した。OCIF固定化アフィニティーカラムによるTrxOBMの精製TrxOBMの精製は、特に断らない限り4°Cで行った。上記のOCIF固定化アフィニティー担体と上記実施例15記載の可溶性蛋白質画分液とを混合後、50ml遠心管中で、ローターを用いて4°Cで一晩おだやかに振とうした。この混合液中の担体をエコノカラムに充填した。001Polysorbate80を含むPBS300ml、001Polysorbate80と2MNaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液100ml、及び001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mグリシン‐塩酸緩衝液100mlを順次通液してカラムを洗浄した。次に、001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mクエン酸ナトリウム緩衝液を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は5mlずつ分取した。分取した画分には、10容量の2Mトリス溶液を加え、直ちに中和した。溶出液各画分中のTrxOBMの有無を上記実施例15記載の方法により調べた。TrxOBMを含む画分を集めさらに精製した。ゲル濾過によるTrxOBMの精製上記実施例15のTrxOBMフラクション約25mlを、Centriplus10及びCentricon10を用いて、約05mlに遠心濃縮した。このサンプルを、予め001Polysorbate80を含むPBSで平衡化したSuperose12HR1O30カラムにかけた。分離には、001Polysorbate80を含むPBSを移動相として用い、流速025mlminで展開した。カラムからの溶出液は025mlずつ分取した。分取した画分のTrxOBMは、実施例15記載の方法及びPhastSystemを用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動と銀染色で検出した。純化されたTrxOBMを含むフラクションを集め、TrxOBMの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度の測定は、ウシ血清アルブミンを標準品として用いDCproteinassaykitで行った。実施例16OBMの破骨細胞形成誘導活性pOBM291及びpcDLSRα296をリポフェクトアミンを用いてCOS7細胞にそれぞれトランスフェクトした。それぞれの細胞を10FCSを含むDMEMで1日培養後トリプシン処理し、カバーグラスを敷いた24ウェルプレートに1ウェルあたり5×104個の細胞を播種し、さらに2日間培養した。培養プレートをPBSで1回洗浄したのち、1パラフォルムアルデヒドを含むPBSを加えて室温で8分間インキュベートし細胞を固定した。細胞を固定したプレートをPBSにて6回洗浄したのち、108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、10牛胎児血清を含むαMEMにて1X106個mlに懸濁したマウス脾臓細胞を1ウェルあたり700μl添加した。各ウェル上にMillicellPCFをセットし、上記培地にて4x104個mlに懸濁したST2細胞をMillicellPCF中に700μl添加し37°C、6日間培養した。培養終了後、MillicellPCFを取り除き、プレートをPBSで1回洗浄後、アセトン‐エタノール溶液で1分間細胞を固定した後、LEUKOCYTEACIDPHOSPHATASEキットを用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、pcDLSRα296をトランスフェクトしたCOS7細胞を固定したウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、pOBM291をトランスフェクトした細胞を固定したウェル中には45±18個のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらのTRAP陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、OBMには破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。実施例17TrxOBM及び分泌型OBMによる破骨細胞形成誘導活性マウス脾臓細胞を108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、10牛胎児血清を含むαMEMに2×106個mlになるように懸濁し、この懸濁液を24ウェルプレートに1ウェルあたり350μl添加した。精製したTrxOBMを上記培地で希釈した溶液、pCEPsOBM又はpCEP4を形質導入した293EBNA細胞をIMDM10FCSで培養した培養上清を上記培地にて10倍希釈した溶液、又は上記培地のみをそれぞれ350μl上記のウェルに添加した後、MillicellPCFを各ウェルにセットし、上記培地にて懸濁した4×104個mlのST2細胞をMillicellPCFに600μl添加した。6日間培養した後、MillicellPCFを取り除き、プレートをPBSで一回洗浄後、アセトン‐エタノール溶液で1分間細胞を固定したのち、LEUKOCYTEACIDPHOSPHATASEキットを用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、TrxOBMを添加しなかったウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、TrxOBMを添加したウェルには106±21個のTRAP陽性細胞が観察された。同様にpCEP4で形質導入された293EBNAの培養上清を添加したウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、pCEPsOBMで形質導入された293EBNAの培養上清を添加したウェルには120±31個のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらのTRAP陽性細胞に、カルシトニンが結合することも確認された。これより、TrxOBM及び分泌型OBMには、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。実施例18本発明のcDNAにより発現される蛋白質OBMと本発明の天然型のOCIF結合蛋白質との同一性ウサギ抗OBMポリクローナル抗体の作製雄性日本白色ウサギ3羽に、実施例14及び記載の方法により得られた精製OBM200μgmlをフロイント完全アジュバントと等量混合してエマルジョンとしたものを、1回1mlずつ皮下免疫した。免疫は1週間間隔で合計6回行い、最終免疫後10日目に全採血を行った。分離した血清から抗体を以下の様に精製した。即ち、PBSで2倍希釈した抗血清に最終濃度が40となるように硫酸アンモニウムを添加して4°Cで1時間放置後、8000xgで20分間遠心分離を行い、沈殿を得た。沈殿を少量のPBSに溶解し、PBSに対して4°Cで透析した後、ProteinGSepharoseカラムに負荷した。PBSで洗浄後、01Mグリシン‐塩酸緩衝液で吸着した免疫グロブリンGを溶出し、直ちに15Mトリス‐塩酸緩衝液で中性pHとした。溶出蛋白質画分をPBSに対して透析後、280nmにおける吸光度を測定し、その濃度を決定した。西洋ワサビパーオキシダーゼ標識した抗OBM抗体は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキットを用いて作製した。即ち、1mgの精製抗体に80μgのNスクシンイミドSアセチルチオ酢酸を添加し、室温で30分間反応させた。これに5mgのヒドロキシルアミンを添加して脱アセチル化した後、修飾された抗体をポリアクリルアミド脱塩カラムにて分画した。蛋白質画分を1mgのマレイミド活性化パーオキシダーゼと混合し、室温で1時間反応させ酵素標識抗体を得た。ウサギ抗OBMポリクローナル抗体による本発明のcDNAにより発現される蛋白質あるいは本発明の天然型の蛋白質とOCIFとの特異的結合能の阻害実施例15‐及び記載の方法で得られた精製OBM及び実施例2の天然型精製OCIF結合蛋白質をそれぞれ01M炭酸水素ナトリウムに2μgmlとなるように溶解し、それぞれの溶液100μlずつを96ウェルイムノプレートの各ウェルに加え、4°Cで一夜放置した。各ウェルに50濃度のブロックエースを200μlずつ加え、室温で1時間放置した。各ウェルを01ポリソルベート20を含むPBSで3回洗浄した後、P20PBSで希釈した25濃度のブロックエースにウサギ抗OBM抗体を200μgmlとなるように溶解し、その抗体溶液あるいは抗体を含まない25濃度のブロックエース溶液を100μlずつ各ウェルに添加し、37°C、1時間インキュベートした。各ウェルをP20PBSで3回洗浄した後、実施例8記載の125I標識したOCIF20ngmlを加えた結合試験溶液を100μlずつ各ウェルに添加した。又、別のウェルには、125I標識したOCIF20ngmlに加えて8μgmlの非標識OCIFを含む結合試験溶液を100μl加えて実験を行った。そのイムノプレートを37°C、1時間インキュベートした後、各ウェルをP20PBSで6回洗浄した。各ウェル中の125Iの量をガンマーカウンターで測定した。結果を図17に示す。図に示したように、本発明cDNAにより発現され、精製して得られるOBM及び本発明の天然型のOCIFに特異的に結合する蛋白質は、ウサギ抗OBMポリクローナル抗体で処理することによって、125I標識したOCIFとの結合は全く起こらなかった。一方、抗体処理しなかった両蛋白質には、125I標識OCIFが結合することが確認された。又、それらの結合は400倍濃度の非標識OCIFを添加することにより顕著に阻害されることから、両蛋白質のOCIFへの結合は特異的結合であることが明らかになった。以上の結果から、ウサギ抗OBMポリクローナル抗体は、本発明cDNAにより発現される蛋白質であるOBM及び本発明の天然型のOCIF結合蛋白質を共に認識し、両蛋白質とOCIFとの特異的結合を阻害することが明らかになった。実施例19ヒトOBMcDNAのクローニングマウスOBMプライマーの調製ヒトOBMcDNAのスクリーニングには、上記の実施例の方法に従い調製したマウスOBMプライマー、OBM3及びOBM8を用いた。それぞれの配列を配列表配列番号9及び6に示す。PCRによるヒトOBMcDNA断片の取得ヒトリンパ節由来cDNAライブラリーとしてHumanLymphNodeMarathonreadycDNAを鋳型として、上記で調製したマウスOBMcDNAプライマーを用いて、PCRを行いヒトOBMcDNA断片を取得した。以下に用いたPCRの条件を示す。10×EXTaqバッファー2μl25mMdNTP16μlcDNA溶液1μlEXTaq02μl蒸留水148μl40μMプライマーOBM302μl40μMプライマーOBM802μl上記溶液をマイクロフュージチューブ中で混合後、以下の条件でPCRを行った。95°Cで2分間前処理し、95°C30秒、57°C30秒及び72°C2分30秒間の3段階の反応を40回繰り返した後、72°Cで5分間保温した。反応液の一部をアガロース電気泳動に供したところ、上記マウスOBMcDNAプライマーで増幅される約690bpのDNA断片が検出された。PCRにより増幅されたヒトOBMcDNA断片の精製と塩基配列の決定実施例19で得られたヒトOBMcDNA断片をアガロース電気泳動により分離し、さらにQIAEXゲルエクストラクションキットを用いて精製した。この精製されたヒトOBMcDNA断片を鋳型として、再度上記マウスOBMcDNAプライマーを用いてPCRを行い、このヒトOBMcDNA断片を大量に調製し、同様にQIAEXゲルエクストラクションキットにより精製した。精製されたヒトOBMcDNA断片の塩基配列を、OBM3及びOBM8をプライマーとして、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングFSキットを用いて決定した。このヒトOBMcDNA断片の塩基配列は、マウスOBMcDNAの相当する領域と比較した結果、807の相同性を示した。約690bpのヒトOBMcDNA断片をプローブとしたハイブリダイゼーション法による全長ヒトOBMcDNAのスクリーニング実施例19で精製された約690bpのヒトOBMcDNA断片をメガプライムDNAラベリングキットを用いてα32PdCTPで標識し、全長のヒトOBMcDNAをスクリーニングした。スクリーニングの対象としては、HumanLymphNode5STRETCHPLUScDNAライブラリーを用いた。同社のプロトコールに従い、組み換えファージを37°Cで15分間大腸菌C600Hflに感染させた後、その大腸菌を45°Cに加温したLB寒天培地に添加し、15寒天を含むLB寒天培地プレート上に流し込んだ。37°Cで一夜培養後、プラークの生じたプレート上にハイボンドNを約3分間密着させた。このフィルターを常法に従いアルカリ変性処理した後、中和し、2×SSC溶液に浸した後、UVクロスリンクによりDNAをフィルターに固定した。得られたフィルターをRapidhybバッファーに浸漬し、65°Cで15分間前処理した後、熱変性した上記ヒトOBMcDNA断片を添加した上記バッファーに移し替え、65°Cで一夜ハイブリダイゼーションさせた。反応後、フィルターをそれぞれ01SDSを含む2×SSC、1×SSC及び01×SSCで順次1回ずつ65°Cで15分間洗浄した。得られたいくつかの陽性クローンをさらに2回スクリーニングを繰り返すことにより純化した。それらの中から、約22kbのインサートを持つクローンを選択し、以下の実験に用いた。この純化したファージをλhOBMと名付けた。純化したλhOBMからQIAGENLambdaキットのプロトコールに従い、約10μgのDNAを得た。このDNAを制限酵素SalIで消化した後、アガロース電気泳動により約22kbのhOBMインサートcDNAを分離した。QIAEXゲルエクストラクションキットを用いて精製したこのDNA断片を、あらかじめ制限酵素SalIで切断し、脱リン酸化しておいたプラスミドpUC19にDNAライゲーションキットver2を用いて挿入した。得られたDNA断片を含むpUC19で大腸菌DH5αを形質転換させた。得られた形質転換株はpUC19hOBMと名付け、これを増殖させ、約22kbのヒトOBMcDNAが挿入されたプラスミドを常法により精製した。ヒトOBMの全アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列の決定実施例19で得られたヒトOBMcDNAの塩基配列を、タックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングFSキットを用いて決定した。即ち、pUC19hOBMを鋳型とし、挿入断片の塩基配列を決定した。プライマーとして、pUC19の挿入断片DNAの塩基配列を決定するためのプライマー、ml3PrimerM3及びml3PrimerRV、及びヒトOBMcDNA断片の塩基配列に基づいて設計した合成プライマーヒトOBM8を用いた。用いたプライマー、ml3PrimerM3及びml3PrimerRVの配列を、それぞれ配列表配列番号4及び5に示す。これにより決定された、ヒトOBMcDNAの塩基配列から推定されるヒトOBMのアミノ酸配列を配列表配列番号11、又、ヒトOBMcDNAの塩基配列を配列表配列番号12にそれぞれ示す。得られたヒトOBMcDNAを含むプラスミド、pUC19hOBMで形質転換した大腸菌は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所法により125I標識した。25mgmlIodogenクロロホルム溶液20μlを15mlエッペンドルフチューブに移し、40°Cでクロロホルムを蒸発させて、ヨードジェンコートしたチューブを調製した。このチューブを05Mリン酸ナトリウム緩衝液400μlで3回洗浄した後、5μlの05MNaPipH70を加えた。このチューブにNa125I溶液13μlを加えた後、直ちに1mgmlOCIF溶液10μlを加え、ボルテックスミキサーで攪拌した後、室温で30秒間放置した。この溶液を、予め10mgml沃化カリウムを含む05MNaPi溶液80μlと5牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水5μlを添加しておいたチューブに移し撹伴した。この溶液をBSAPBSで平衡化したスピンカラムに負荷し、2000rpmで5分間遠心した。カラムから溶出された画分にBSAPBSを400μl加え攪拌した後、2μlを取り、その放射能をガンマーカウンターで測定した。このようにして調製した125I標識OCIF溶液の放射化学純度は10トリクロロ酢酸により沈殿する画分の放射能を測定することにより求めた。125I標識OCIFのOCIF生物活性は、WO9626217号記載の方法に従い測定した。又、125I標識OCIF濃度は、以下のようにELISAにより測定した。即ち、WO9626217号公報記載のウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を2μgmlになるように溶解した50mMNaHCO3pH96を100μlずつ96ウェルイムノプレートの各ウェルに加えて、4°C一夜放置した。この溶液を捨てた後、ブロックエースとリン酸塩緩衝生理食塩水との混合水溶液を200μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を捨てた後、各ウェルを001Polysorbate80を含むリン酸塩緩衝生理食塩水で3回洗浄し、次いで125I標識OCIFサンプルあるいはOCIF標準品を添加したBPBSを100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この液を捨てた後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。パーオキシダーゼ標識したウサギ抗OCIFポリクローナル抗体をBPBSで希釈した溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した。この溶液を捨てた後、PPBS200μlで各ウェルを6回洗浄した。TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で2~3分間放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。OCIF標準品を用いて作成した検量線より125I標識OCIFの濃度を求めた。実施例21本発明cDNAにコードされる蛋白質の発現動物細胞用hOBM発現ベクターの構築pUChOBMを制限酵素SalIで切断し、約22kbのDNA断片を1アガロース電気泳動により精製し、DNAブランティングキットにより末端を平滑化した。発現プラスミドpcDLSRα296を制限酵素EcoRIで切断し、ブランティングキットにより末端を平滑化したものと、平滑化したhOBMcDNA断片とをDNAライゲーションキットver2により結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌DHαを形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株から、制限酵素切断により得られるDNA断片地図の解析並びにDNA配列の決定により、SRαプロモーターによる転写方向に対してhOBMcDNAの転写方向が順向きに挿入されているプラスミド、phOBMを持つ菌株を選びだし、DH5αphOBMと名付けた。COS7細胞でのヒトOBMの発現大腸菌、DH5αphOBMを培養し、キアフィルタープラスミドミディキットを用い、プラスミドphOBMを精製した。phOBMを6ウェルプレートの各ウェル中でCOS7細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクションし、10牛胎児血清を含むDMEM中で2日間培養した。5透析牛胎児血清を添加した、システインメチオニン不含DMEMに培地交換し15分間培養した後、ExpressProteinLabelngMixを14μl添加した。4時間培養後、10牛胎児血清を含むDMEMを200μl加え1時間培養した。細胞をPBSで2回洗浄後、1TritonX100、1牛ヘモグロビン、10μgmlロイペプチン、02TIUmlアプロチニン及び1mMPMSFを含むTSAバッファーを05ml加え、氷上で1時間静置した。ピペッティングにより細胞を破砕した後、4°C、3000×g、10分間遠心し上清を得た。この上清100μlに200μlの希釈バッファーを加え、ProteinASepharoseとともに4°Cで1時間振盪させた後、4°C、1500×gで1分間遠心分離し上清を回収することによりProteinASepharoseに非特異的に吸着する蛋白質を除去した。この上清にOCIFを加え、4°Cで1時間振盪させながらヒトOBMとOCIFを結合させた後、ウサギ抗OCIFポリクローナル抗体を加えて4°Cで1時間振盪した。この溶液にProteinASepharoseを加え、更に4°Cで1時間振盪した。4°C、1500×gで1分間遠心分離し沈殿画分を回収した。4°C、1500×gで1分間遠心分離して得られた沈殿を希釈バッファーで2回、牛ヘモグロビンを含まない希釈バッファーで2回、TSAバッファーで1回、50mMトリス‐塩酸で1回、それぞれ洗浄後、沈殿に10βメルカプトエタノールを含むSDSバッファーを加え、100°Cで5分間加熱後、SDSPAGEにかけた。常法によりゲルを固定、乾燥させ、Amplifyにより、アイソトープのシグナルを増強した後、BioMaxMRフィルムを用いて‐80°Cで感光させた。結果を図18に示す。この結果、本発明のcDNAにコードされる蛋白質の分子量は、約40000であることが明らかとなった。実施例22本発明cDNAにコードされる蛋白質とOCIFとの結合実施例21と同様に精製されたphOBMを24ウェルプレートの各ウェル中でCOS7細胞にリポフェクトアミンを用いてトランスフェクトし、その細胞を2~3日間培養した後、無血清DMEMで洗浄し、これに125I標識したOCIF20ngmlを加えた結合試験培地200μlを加えた。また別のウェルには、125I標識したOCIF20ngmlに加えて更に8μgmlの非標識OCIFを添加した結合試験培地を200μl加えて実験を行った。CO2インキュベーター中、37°Cで1時間培養した後、細胞を01mgmlのヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μlで2回洗浄した。洗浄後、01NNaOH溶液500μlを各ウェルに加え、室温に10分間放置することにより細胞を溶解させ、ウェル中の125Iの量をガンマーカウンターで測定した。この結果、図19に示したように、phOBMをトランスフェクトした細胞にのみ125I標識したOCIFが結合することが確認された。又、その結合は400倍濃度の非標識OCIFを添加することにより、顕著に阻害されることが確認された。以上の結果から、phOBM上のcDNAにコードされる蛋白質ヒトOBMは、COS7細胞表面でOCIFに特異的に結合することが明らかとなった。実施例23125I標識したOCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキング試験本発明cDNAにコードされる蛋白質の性質を更に詳しく解析するため、125I標識したモノマー型OCIFと本発明cDNAにコードされる蛋白質とのクロスリンキングを行った。即ち、実施例21及びに記載した方法に従って、それぞれ発現ベクターをphOBMを構築し、COS7細胞にトランスフェクトした後、上記の125I標識したOCIFを加えた結合試験用培地を200μlずつ各ウェルに添加した。又、別のウェルには、125I標識したOCIFに加え400倍濃度の非標識OCIFを更に添加した結合試験用培地を加えた。CO2インキュベーター中、37°Cで1時間培養した後、細胞を01mgmlのヘパリンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水500μlで2回洗浄した。この細胞に100μgmlのクロスリンキング剤、DSSを溶解させたリン酸塩緩衝生理食塩水500μlを加え、0°Cで10分間反応させた。これらのウェルの細胞を0°Cに冷却したリン酸塩緩衝生理食塩水1mlで2回洗浄した後、この細胞に1TritonX100、2mMPMSF、10μMペプスタチン、10μMロイペプチン、10μMアンチパイン及び2mMEDTAを含む20mMHepes緩衝液100μlを加え、室温に30分間放置して細胞を溶解させた。これらのサンプル15μlを常法により還元条件下でSDS化した後、SDS-電気泳動用ゲルを用いて泳動した。泳動後、ゲルを乾燥させ、BioMAXMSフィルムとBioMaxMS増感スクリーンを用いて‐80°Cで24時間感光させた。感光させたフィルムを常法により現像した。この結果、125I標識モノマー型OCIFと本発明cDNAによりコードされる蛋白質をクロスリンクさせることにより、図20に示すように、分子量約90000‐110000の蛋白質バンドが検出された。実施例24分泌型ヒトOBMの発現分泌型ヒトOBM発現プラスミドの構築ヒトOBMSFとマウスOBM8をプライマー、pUC19hOBMを鋳型としてPCR反応を行った。この生成物をアガロースゲル電気泳動で精製した後、制限酵素SPlI、HindIIIで切断し、さらにアガロースゲル電気泳動で精製して、027kbの断片を得た。ヒトOBMcDNAを制限酵素DraIで部分消化し、一ヶ所切断された断片をアガロース電気泳動で精製し、その精製断片をさらに制限酵素HindIIIで切断した。053kbのDraIHindIII断片をアガロース電気泳動で精製し、この精製断片と上記のPCR生成物のSplIHindIII断片をpSecTagAのSPlIEcoRV断片と共にライゲーションキットver2を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによって、pSecTagAに027kbと053kbの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。さらに、このプラスミドをタックダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングFSキットを用いてシークエンスを行い、このプラスミドが分泌型ヒトOBMをコードする配列を持っていることを確認した。このプラスミドを制限酵素NheI、XhoIで切断した後、分泌型ヒトOBMcDNAに相当する断片をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターpCEP4のNheIXhoI断片に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株より、アルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することにより、目的の構造を持った分泌型ヒトOBM発現プラスミドを持つ大腸菌株を選択した。pCEPshOBMを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキットを用いてpCEPshOBMを精製した。分泌型OBMの発現293EBNA細胞を10FCSを含むIMDMに懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレートに2×105細胞2mlウェルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に1μgのpCEPshOBM及びpCEP4のそれぞれをリポフェクトアミン4μlを用いて形質導入し、05mlの無血清IMDMまたはIMDM10FCS中で更に2日間培養し、その培養上清を回収した。分泌型ヒトOBMの培養上清中での発現は、以下のようにして確認した。即ち、培養上清に最終濃度が01Mになるように炭酸水素ナトリウムを加えて4°Cで一夜放置し、培養上清中のヒトOBMを96ウェルプレートに固相化した。このプレートをPBSで4倍希釈したブロックエース溶液で室温に2時間放置しブロッキングした後、BPBSで希釈した3100ngmlのOCIFを加えて37°Cで2時間放置した。005Polysorbate20を含むPBSでプレートを洗浄した後、BPBSで希釈したWO9626217号記載のパーオキシダーゼ標識抗OCIF抗体を各ウェルに100μlずつ添加し、37°Cで2時間放置した。PPBSで各ウェルを6回洗浄した後、TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で約10分間放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図21に示す。pCEPshOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加したOCIFの濃度に依存して450nmの吸光度が増加した。一方、ベクターのみのpCEP4を形質導入した細胞の培養上清を固相化した場合には、その吸光度の増加は見られなかった。又、固相化に用いる培養上清量の割合を5~90の範囲で種々変化させ、一定濃度のOCIFを添加した際の結果を図22に示す。pCEPshOBMを形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、添加する培養上清量の増加につれて450nmにおける吸光度が増加したが、ベクターpCEP4を形質導入した細胞の培養上清を固相化したプレートでは、吸光度の増加は見られなかった。これらの結果により、分泌型ヒトOBMがpCEPshOBMを形質導入した細胞の培養上清中に発現していることが確認された。実施例25チオレドキシンヒトOBM融合蛋白質の発現チオレドキシンヒトOBM融合蛋白質発現ベクターの構築10μlの10×ExTaqバッファ、8μlの10mMdNTP、775μlの滅菌蒸留水、2μlのpUC19hOBM水溶液、1μlのプライマーマウスOBM3、1μlのプライマーhOBMSalR2、05μlのExTaqを混合しマイクロ遠心管中でPCR反応を行った。95°C5分、50°C1秒、55°C1分、74°C1秒、72°C5分の反応後、96°C1分、50°C1秒、55°C1分、74°C1秒、72°C3分の反応を25サイクル行った。反応液全量から約750bpのDNA断片を精製した。精製したDNA断片を制限酵素SalI及びBspHIで切断した後、1アガロース電気泳動を行い、約320bpのDNA断片を精製し20μlの滅菌蒸留水に溶解した。同様に、実施例19記載のpUC19hOBM4μgを制限酵素BamHIBspHIで切断して得られた約450bpのDNA断片、及び2μgのpTrxFusを制限酵素BamHISalIで切断して得られた約36kbのDNA断片をそれぞれ精製し、それぞれを20μlの滅菌蒸留水に溶解した。DNA断片の精製にはQIAEXIIgelextractionkitを用いた。断片1、断片2、及び断片3をDNAligationkitver2を用い、16°Cで2時間30分保温することにより結合させた。ライゲーション反応液を用い大腸菌GI724株をThioFusionExpressionSystem添付のInstructionManualに記載の方法で形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換株の中から、制限酵素切断により得られるDNA断片地図の解析並びにDNA配列の決定により、hOBMcDNA断片がチオレドキシン遺伝子に同じ読み枠で結合しているプラスミドを持っ菌株を選択した。得られた菌株をGI724pTrxhOBMと名付けた。大腸菌でのTrxhOBMの発現GI724pTrxhOBM株及びpTrxFusを持つGI724株をそれぞれ2mlのRMG‐Amp培地中、37°Cで6時間振盪培養した。菌液05mlを50mlのInduction培地に添加し、30°Cで振盪培養した。OD600nmにおける値が約05になった時点で、最終濃度が01mgmlになるようにレトリプトファンを添加し、更に30°Cで6時間振盪培養した。菌液を3000×gで遠心し菌体を集め、125mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波発生装置にかけ菌体を破砕し、7000×gで30分間遠心して上清を集めて可溶性蛋白質画分とした。これらの画分溶液10μlずつを還元条件下でのSDSPAGEに供した。この結果、図23に示すように、GI724pTrxOBMの可溶性蛋白質画分には、GI724pTrxFusの可溶性蛋白質画分には見られない分子量約40000の蛋白質のバンドが検出された。以上の結果から、チオレドキシンとヒトOBMの融合蛋白質が大腸菌中で発現していることが確認された。TrxhOBMのOCIFとの結合能発現させたTrxhOBMがOCIFと結合することを、以下の実験により確認した。即ち、96ウェルイムノプレートの各ウェルに10mM炭酸水素ナトリウム水溶液で5000倍に希釈した抗チオレドキシン抗体を100μlずつ添加し4°Cで一夜放置した。各ウェル中の液を捨てた後、ブロックエースをPBSで2倍希釈した溶液を各ウェルに200μlずつ添加し室温で1時間放置した。液を捨てた後、各ウェルをPPBSで3回洗浄した。各ウェルにBAPBSで段階希釈した上記GI724pTrxhOBM由来及びGI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分溶液を100μlずつ添加し室温で2時間放置した。PPBSで各ウェルを3回洗浄した後、BAPBSで希釈したOCIFを各ウェルに100μずつ添加し室温に2時間放置した。PPBSで各ウェルを3回洗浄した後、BAPBSで2000倍に希釈したWO9626217号記載のパーオキシダーゼ標識した抗OCIF抗体を各ウェルに100μlずつ添加し、室温で2時間放置した。PPBSで各ウェルを6回洗浄した後、TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で約10分間放置した後、停止液を100μlずつ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。結果を図24に示す。GI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したもの、添加しなかったものの間で吸光度には差異は見られなかったが、GI724pTrxhOBM由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、その添加濃度が増加するにつれて吸光度が上昇した。又、添加する可溶性蛋白質画分溶液の希釈割合を一定にし、BAPBSで段階希釈したOCIFを添加した場合の実験結果を図25に示す。GI724pTrxFus由来可溶性蛋白質画分溶液を用いたものでは、OCIFの濃度に係わりなく吸光度は低値であったが、GI724pTrxhOBMに由来可溶性蛋白質画分溶液を添加したものでは、OCIF濃度が増加するにつれて吸光度が増加した。これらの結果から、GI724pTrxhOBMで生産されるTrxhOBMには、OCIFと結合する能力があることが確認された。TrxhOBMを生産する大腸菌の大量培養GI724pTrxhOBMをRMGAmp寒天培地に白金耳で塗抹し、30°Cで一夜培養した。菌体を10mlのInduction培地に懸濁し、5mlずつを500mlのInduction培地の入った2l用三角フラスコ計2本に添加し、30°Cで振盪培養した。OD600nmでの吸光度が約05になった時点で最終濃度が01mgmlとなるようにL‐トリプトファンを添加し、更に30°Cで6時間振盪培養した。菌液を3000×gで20分間遠心分離して菌体を集め、菌体を160mlのPBSに懸濁した。懸濁液を超音波発生装置にかけ菌体を破砕し、7000×gで30分間遠心分離して上清を集め可溶性蛋白質画分とした。OCIF固定化アフィニティーカラムの調製TSKgelAFトレシルトヨパール6502gと、WO9626217号公報記載の方法で調製した遺伝子組み換え型OCIF350mgを含む10Mリン酸カリウム緩衝液40mlとを混合し、4°Cで一夜緩やかに振盪することによりカップリング反応を行った。過剰な活性基を不活性化するため、遠心分離により上清を除去した後、40mlの01Mトリス‐塩酸緩衝液を沈殿した担体に加え、室温で1時間穏やかに振盪した。001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mグリシン‐塩酸緩衝液及び001Polysorbate80と02MNaClを含む01Mクエン酸ナトリウム緩衝液を通液しカラムを洗浄した後、001Polysorbate80を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液で2回洗浄し、カラムを平衡化した。OCIF固定化アフィニティーカラムによるTrxhOBMの精製TrxhOBMの精製は、特に断らない限り4°Cで行った。上記のOCIF固定化アフィニティー担体と上記実施例25記載の可溶性蛋白質画分溶液とを混合後、50ml遠心管中で、ローテーターを用いて4°Cで一夜穏やかに振盪した。この混合液中の担体をエコノカラムに充填した。001Polysorbate80を含むPBS300ml、001Polysorbate80及び20MNaClを含む10mMリン酸緩衝液100ml、001Polysorbate80及び02MNaClを含む01Mグリシン‐塩酸緩衝液100mlを順次通液してカラムを洗浄した。次に、001Polysorbate80及び02MNaClを含む01Mクエン酸ナトリウム緩衝液を通液し、カラムに吸着した蛋白質を溶出した。溶出液は5mlずつ分取した。分取した画分には、10容量の2Mトリス溶液を加えて直ちに中和した。溶出液各画分中のTrxhOBMの有無を、実施例25記載の方法により調べた。又、TrxhOBMを含む画分を集め、更に精製を進めた。ゲル濾過によるTrxhOBMの精製上記実施例25記載のTrxhOBMフラクション約25mlをCentriplus10及びCentricon10を用いて、約05mlに遠心濃縮した。この濃縮サンプルを予め001Polysorbate80を含むPBSで平衡化したSuperose12HR1030カラムに負荷した。移動相として001Polysorbate80を含むPBSを用い、流速025mlminでカラムを展開した。カラムからの溶出液は025mlずつ分取した。分取した画分のTrxhOBMは、実施例25記載の方法及びSDSPAGEにより検出した。純化されたTrxhOBMを含むフラクションを集め、TrxhOBMの蛋白質濃度を測定した。蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準品として用い、DCproteinassaykitで測定した。実施例26hOBMの破骨細胞形成誘導活性phOBM及びpcDLSRα296をリポフェクトアミンを用いてCOS7細胞にそれぞれトランスフェクトした。それぞれの細胞を10FCSを含むDMEMで1日間培養後トリプシン処理し、カバーグラスを敷いた24ウェルプレートに1ウェル当たり5×104個の細胞を播種し、さらに2日間培養した。培養プレートをPBSで1回洗浄した後、1パラフォルムアルデヒドを含むPBSを加えて室温で8分間インキュベートし細胞をカバーグラス上に固定化した。細胞を固定化したプレートをPBSで6回洗浄した後、108M活性化ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、10牛胎児血清を含むαMEMにて1×106個mlになるように懸濁したマウス脾臓細胞を1ウェル当たり700μlずつ添加した。各ウェル上にMillicellPCFをセットし、上記培地にて4×104個mlに懸濁したST2細胞をMillicellPCF中に700μlずつ添加し、37°Cで6日間培養した。培養終了後、MillicellPCFを取り除き、プレートをPBSで1回洗浄後、アセトンエタノール溶液で1分間細胞を固定した後、LEUKOCYTEACIDPHOSPHATASEキットを用いて破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、ヒトOBMcDNAを含まないベクターのみのpcDLSRα296をトランスフェクトしたCOS7細胞を固定化したウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、phOBMをトランスフェクトした細胞を固定化したウェル中には65±18個のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらのTRAP陽性細胞は125I標識サケカルシトニンと特異的結合を示したことから、カルシトニンレセプターを発現していることが確認された。これらの結果から、本発明cDNAによりコードされる蛋白質であるヒトOBMは破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。実施例27TrxhOBM及び分泌型ヒトOBMによる破骨細胞形成誘導活性マウス脾臓細胞を108M活性型ビタミンD3、107Mデキサメサゾン、10牛胎児血清を含むαMEMに2×106個mlになるように懸濁し、24ウェルプレートに1ウェルあたり350μl添加した。精製したTrxhOBMを上記培地で希釈した溶液、pCEPshOBMまたはpCEP4を形質導入した293EBNA細胞をIMDM10FBSで培養した培養上清を上記培地にて10倍希釈した溶液または上記培地のみをそれぞれ350μl添加した後、MillicellPCFを各ウェルにセットし、上記培地にて懸濁した4×104個mlのST2細胞をMillicellPCFに600μl添加した。6日間培養した後、MillicellPCFを取り除き、プレートをPBSで1回洗浄後、アセトンエタノール溶液で1分間細胞を固定した後、LEUKOCYTEACIDPHOSPHATASEキットを用いて酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞のみを染色した。顕微鏡観察の結果、TrxhOBMを添加しなかったウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、TrxhOBMを添加したウェルには115±19個のTRAP陽性細胞が観察された。同様に、pCEP4で形質導入された293EBNAの培養上清を添加したウェル中にはTRAP活性を示す細胞は全く検出されなかったのに対し、pCEPshOBMで形質導入された293EBNAの培養上清を添加したウェルには125±23個のTRAP陽性細胞が観察された。又、これらTRAP陽性細胞は125I標識したサケカルシトニンと特異的結合を示しことから、カルシトニンレセプターを発現していることが確認された。これらの結果から、TrxhOBM及び分泌型OBMには、破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。実施例28ポリクローナル抗体の作製免疫抗原として用いるマウスsOBM又はヒトsOBMは、前記の方法に従って得た。即ち、マウスsOBMcDNAをコードするcDNA、配列表配列番号18又はヒトOBMcDNAをコードするcDNA、配列表配列番号19を、イムノグロブリンのκチェーンのシグナルペプチドをコードする塩基配列を含む発現ベクターpSecTagAのHindIIIEcoRV断片と、OBMcDNAのEcoRIPmaCI断片とともにライゲーションキットver2を用いてライゲーションを行い、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断することによりpSecTagAに06Kbと032Kbの断片が挿入されたプラスミドを選び出した。このプラスミドをダイターミネーターサイクルシークエンシングFSキットを用いてシークエンスを確認した結果、このプラスミドがマウス又はヒトsOBMをコードする配列を有することを確認した。このプラスミドを制限酵素NheI、XhoIで切断した後、分泌型OBMcDNAに相当する断片をアガロースゲル電気泳動で回収した。この断片をライゲーションキットを用いて発現ベクターpCEP4のNheIXhoI断片に挿入し、その反応生成物を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたアンピシリン耐性株からアルカリSDS法によりプラスミドを精製し、制限酵素で切断して解析することにより、目的の構造を持った分泌型OBM発現プラスミドを持つ大腸菌株を選び出した。pCEPsOBMを持つ大腸菌株を培養し、キアフィルタープラスミドミディキットを用いてpCEPsOBMを精製した。次に、293EBNA細胞を10FCSを含むMDMに懸濁し、コラーゲンコートした24ウェルプレートに2×105個2mlウェルになるように播種し、一夜培養した。この細胞に1μgのpCEPsOBM又はpCEP4をリポフェタミン4μlを用いて形質導入し、05mlの無血清IMDM又はIMDM10FCS中でさらに2日間培養し、その培養上清を回収した。遺伝子組み換えマウス可溶性OBMあるいはヒト可溶性OBMの高生産細胞株を以下のようにスクリーニングした。msOBMあるいはhsOBMを含むと見られる培養上清に最終濃度が01Mになるように炭酸水素ナトリウムを添加後、それぞれの培養上清を100μlずつ96ウェルイムノプレートの各ウェルに添加し、4°Cで一夜放置して培養上清中のmsOBMあるいはhsOBMを各ウェルに固相化した。このプレートの各ウェルにPBSで4倍希釈したブロックエース溶液を200μl加え、室温で2時間放置した。01polysprbate20を含むPBSで3回洗浄後、BPBSで段階的に希釈した遺伝子組み換えOCIF溶液を100μlずつ各ウェルに添加し、37°Cで2時間放置した。そのプレートをPBSで3回洗浄した後、BPBSで希釈したパーオキシダーゼ標識抗OCIFポリクローナル抗体を100μlずつ各ウェルに添加し、37°Cで2時間放置した。PPBSで各ウェルを6回洗浄後、TMB溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で約10分間放置した後、停止液を100μlずっ各ウェルに加えた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。msOBMあるいはhsOBMの生産細胞株の培養上清を固相化したプレートでは、OCIFの添加濃度に比例して、吸光度が顕著に増加した。msOBMあるいはhsOBMの生産細胞株について、その吸光度の増加の割合の高い生産株を、それぞれ高生産株として選択した。このように選択されたmsOBMあるいはhsOBM高生産293EBNA細胞をそれぞれ5FCSを含有するIMDMを培地として用い、Tフラスコを25枚用いて大量培養した。コンフルエントに達した後、新鮮な培地をT225フラスコ1枚当たり100mlずつ加え、3~4日間培養して、培養上清を回収した。この操作を4回繰り返して、msOBMあるいはhsOBMを含む培養上清をそれぞれ10リットル得た。実施例25及び記載の方法に従いrOCIF固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することにより、これら培養上清からSDSポリアクリルアミド電気泳動的に均一な精製msOBM及びhsOBMをそれぞれ約10mg及び12mg得た。このようにして得られた精製標品を、それぞれ免疫抗原として用いた。得られた各抗原を、リン酸塩緩衝生理食塩水に200μgmlになるように溶解し、等容量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化後、日本白色ウサギ各3羽に約1週間間隔で1mlを皮下投与し免疫した。抗体価を測定し、抗体価が最高に到達した時点で、ブースター投与し、投与10日後に全採血した。抗血清をプロテインAセファロースクロマトグラフィー用バインディングバッファーで2倍希釈し、同バッファーで平衡化したプロテインAカラムに負荷した。同バッファーでカラムを充分洗浄後、カラムに吸着した抗sOBM抗体をエルーションバッファーあるいは01MグリシンHClバッファー、pH2930で溶出した。抗体溶出液を直ちに中和する目的で、10MTrisHClpH80を少量含む試験管を用いて溶出溶液を分画した。抗体溶出液をPBSに対して4°C、一夜透析した。抗体溶液の蛋白量をウシIgGをスタンダードとしてLowry法により測定した。このようにして、本発明のポリクローナル抗体を含む精製イムノグロブリンが、ウサギ抗血清1ml当たり約10mg得られた。実施例29ポリクローナル抗体を用いたELISAによるOBM及びsOBMの測定実施例28で得られたウサギ抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を、固相抗体及び酵素標識抗体としたサンドイッチELISAを構築した。酵素標識は、石川らの方法に従いパーオキシダーゼ標識した。実施例28で得られた抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を2μgmlとなるように01MNaHCO3溶液に溶解し、96ウェルイムノプレートの各ウェルに100μlずつ添加、室温で一夜放置した。次いで、各ウェルに200μlずつ50ブロックエースを加え、室温で1時間放置し、各ウェルを01polysorbate20を含むPBSで3回洗浄した。実施例26の方法と同様にヒトOBMを発現し実施例2の方法で精製することにより得られた精製ヒトOBM、及び実施例28で得られた精製ヒトsOBMをそれぞれ一次反応用バッファーで段階希釈した溶液を、100μlずつ各ウェルに加えた。室温で2時間放置後、各ウェルを上記洗浄バッファーで3回洗浄した。二次反応用バッファーで1000倍希釈したPOD標識抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間放置した後、各ウェルを3回洗浄バッファーで洗浄した。各ウェルに酵素基質溶液を100μlずつ添加し、室温で10分間放置後、反応停止液を100μlずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止させた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図26に示す。ウサギ抗ヒトsOBMポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAは、ヒトsOBM及びヒトOBMをほぼ等しく認識し、それぞれの測定感度は約125x103pmolmlであった。実施例28で得られたウサギ抗マウスsOBMポリクローナル抗体を用いたELISAによるマウスsOBM及びマウスOBMの測定は上記と同様に実施でき、それぞれの測定感度も同程度で極めて微量のマウスsOBMあるいはマウスOBMを測定できることが明らかとなった。以上のように、実施例28で得られた本発明抗ヒトsOBMポリクローナル抗体は、ヒトsOBM及びヒトOBMの両抗原を等しく認識することから、抗ヒトOBMsOBMポリクローナル抗体と名付けた。又、実施例28で得られた抗マウスsOBMポリクローナル抗体は、同様にマウスsOBM及びマウス0BMの両抗原を等しく認識することから、抗マウスOBMsOBMポリクローナル抗体と名付けた。実施例30モノクローナル抗体の作製免疫用抗原には、実施例28で得られた精製ヒトsOBMを用いた。精製ヒトsOBMを10μgmlになるように生理食塩水に溶解した。このようにして調製したヒトsOBM溶液に、同容量のフロイント完全アジュバントを加え良く乳化した後、それぞれの抗原をBalbcマウスー匹当たり腹腔内に200μlずつ1週間間隔で3回投与し、マウスを免疫した。次に、ヒトsOBMを5μgml含む生理食塩水に同容量のフロイント不完全アジュバントを添加し、充分乳化したものを上記Balbcマウスー匹あたり200μlずつ、1週間間隔で4回追加免疫した。4回目の追加免疫の1週間後、ブースターとしてヒトsOBMを10μgml含む生理食塩水をBalbcマウス1匹当たり100μlずつ静脈内に投与した。最終免疫後3日目に脾臓を摘出、脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞P3x63AG8653とを公知の方法に従い細胞融合した。融合終了後、細胞懸濁液をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミヂンを含むHAT培地中で10日間培養した。ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマが出現した後、HAT培地からアミノプテリンを除いたHT培地に培地交換し、培養を継続した。実施例31ハイブリドーマの選択及びクローニング実施例30の細胞融合及び培養を開始して10日後にハイブリドーマの出現を認めたので、下記に記載した改良ソリッドフェーズELISAにより、ヒトsOBMを認識する高親和性抗体及びその抗体を産生するハイブリドーマの選択を行った。又、ヒトsOBMとマウスsOBMの両方を認識する抗OBMモノクローナル抗体を選択するために、ソリッドフェーズELISA用抗原として、ヒトsOBM以外に実施例27で得られたマウスsOBMも使用した。ヒトsOBM及びマウスsOBMをそれぞれ5μgmlになるように01M炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、それぞれの抗原溶液を50μlずつ96ウェルイムノプレートの各ウェルに加え、4°Cで一夜静置しそれぞれの抗原を固相化した。各ウェル中の抗原溶液を捨て、各ウェルに50ブロックエースを200μlずつ加え、室温で1時間放置してブロッキングした。各ウェルを01polysorbate20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、各ウェルに40μlの牛血清を加えた。次いで、各ウェルに10μlのハイブリドーマ培養上清を加え、80血清濃度下、室温で2時間反応させた。80血清存在下でのソリッドフェーズELISAの目的は、高濃度の蛋白質及び血清由来の免疫反応妨害物質等の存在中でも微量のヒトsOBMあるいはマウスsOBMと結合できる抗体、即ちヒトsOBMあるいはマウスsOBMに対して高親和性の抗体生産ハイブリドーマを選択するためである。室温で2時間反応後、プレートをPBSPで洗浄し、25ブロックエースを含む生理食塩水で5000分の1に希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgGを各ウェルに50μl加え、室温で2時間反応させた。プレートをPBSPで3回洗浄した後、各ウェルに50μlの酵素基質溶液を加え、室温で5分間反応させた。次いで、反応停止液50μlを加えて酵素反応を停止させた。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、ヒトsOBMあるいはマウスsOBMを認識する抗体生産ハイブリドーマを選択した。特に高い吸光度を示すそれぞれの抗体生産ハイブリドーマを選択し、それらを限界希釈法により3~5回クローニングを繰り返すことにより、安定な抗体生産ハイブリドーマを樹立した。得られた抗体生産株の中から、さらに抗体の生産性が高いハイブリドーマ株を選別した。実施例32モノクローナル抗体の生産及び精製実施例31で得られた抗体、即ち高親和性でヒトsOBMを認識する抗体生産ハィブリドーマ及びマウスsOBMにも交差性を有する抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ培養し、マウスー匹当たりそれぞれのハイブリドーマを1×106細胞ずつ、約1週間前にプリスタンを投与しておいたBalbc系マウスの腹腔内に移植した。約2~3週間後、蓄積した腹水を採取し、本発明のヒトsOBMあるいはヒトsOBM及びマウスsOBMを認識するモノクローナル抗体を含む腹水を得た。実施例28に記載したプロテインAカラムによる抗OBMsOBMポリクローナル抗体の精製法に準じて、プロテインAカラムクロマトグラフィーにより腹水から精製モノクローナル抗体を得た。実施例33モノクローナル抗体の抗原特異性ヒトsOBMを特異的に認識するモノクローナル抗体並びにヒトsOBM及びマウスsOBMにも交差性を有するモノクローナル抗体について、ヒトsOBM、膜結合部位を有するintactなヒトOBM、マウスsOBM、及び膜結合部位を有するintactなマウスOBMを抗原とした時の抗原特異性について調べた。30数種類のモノクローナル抗体を得たが、それらのうち代表的なモノクローナル抗体にっいての結果を第1表に示す。この結果、ヒトsOBMを特異的に認識する抗ヒトsOBMモノクローナル抗体のほとんど全ては膜結合部位を有するintactなヒトOBMも認識するが、マウスsOBM及び膜結合部位を有するintactなマウスOBMは認識しないことが明らかとなった。一方、ヒトsOBM及びマウスsOBMも認識するモノクローナル抗体も得られたが、その数は極めて少なく、これらの抗体はヒトOBM並びにマウスOBMにも交差性を有していることがわかった。これらの結果は、ヒトOBMとマウスOBMには共通した抗原認識部位、即ちエピトープが存在していることを示すものである。ヒトsOBMを免疫抗原として作製した抗ヒトsOBMモノクローナル抗体は、膜結合型のintactな蛋白質であるヒトOBMも等しく認識することから、抗ヒトsOBMモノクローナル抗体を抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体と名付けた。実施例34モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスの検定本発明のモノクローナル抗体のクラス及びサブクラスを、イムノグロブリンクラス及びサブクラス分析キットを用いて検定した。検定は、キットに指示されているプロトコールに従い実施した。代表的なモノクローナル抗体についての結果を表2に示す。抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体の大多数はIgG1であり、その他IgG2a及びIgG2bも存在していた。又、いずれの抗体もライトチェーンはκ鎖であった。実施例35モノクローナル抗体の解離定数の測定公知の方法に従い、モノクローナル抗体の解離定数を測定した。即ち、実施例32で得られた精製抗体を5ngmlに40ブロックエース、01polysorbate20を含む04MTrisHClpH74で希釈し、これに実施例28で得られた精製ヒト可溶性OBMを625ngml~10μgmlになるように1次バッファーで希釈したものを等容量混ぜ、4°Cで15時間静置することによりhsOBMとモノクローナル抗体を結合させた。15時間後、hsOBMと未結合の抗体をhsOBMを固相化したソリッドフェーズELISAにて測定することにより、モノクローナル抗体のhsOBMに対する解離定数を算定した。又、hsOBMに対するモノクローナル抗体でありながら、マウス可溶性OBMにも交差する抗体のmsOBMに対する親和性についても、上記のhsOBMの代わりにmsOBMを使用することにより同様に測定した。特に、各抗原に高い親和性を示し、酵素免疫測定法やその他バインディングアッセイ等に有用な抗体についての結果を第3表に示す。この結果、ヒト可溶性OBMに特異的な抗体であるHOBml及びHOBM4は解離定数が1011Mオーダーで、hsOBMに極めて高い親和性を有していることが明らかになった。一方、hsOBM及びマウス可溶性OBMの両方を認識する抗体、HOBM9のKd値は、msOBMに対しては108オーダーであり、hsOBMに対しては109Mオーダーであった。又、表1に記載の両抗原を認識する他の抗体、HOBml3の両抗原に対する解離定数は、HOBM9と差異はなく、両抗体はサブクラスも一致していることから、同じエピトープを認識する同一抗体である可能性が示唆された。実施例36抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAによるヒトOBM及びsOBMの測定方法実施例35で得られた2種類の高親和性モノクローナル抗体、HOBml及びHOBM4をそれぞれ固相抗体と酵素標識抗体として、サンドイッチELISAを構築した。抗体の標識は、マレイミド活性化パーオキシダーゼキットを用いて行った。HOBml抗体を10μgmlになるよう01M炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、100μlずつ96ウェルイムノプレートの各ウェルに加え、4°Cで一夜静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、50濃度のブロックエース300μlを加え、室温で2時間静置しブロッキングした。ブロッキング後、プレートを01polysorbate20を含むリン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄した。ヒト可溶性sOBM及びヒトOBMをそれぞれ40ブロックエース及び01polysorbate20を含む04MTrisHCに溶解、希釈し、種々の濃度の被験溶液を調製した。種々の濃度に調製したそれぞれの被験溶液を100μlずつ各ウェルに加え、室温で2時間反応させた。2時間後、プレートをPBSPで洗浄し、25ブロックエース及び01polysorbate20を含む02MTrisHClで希釈したPOD標識HOBM4抗体を各ウェルに100μl加え、室温で2時間反応させた。プレートをPBSPで洗浄した後、各ウェルに100μlの酵素基質溶液を加えて発色させた後、反応停止液を100μlずつ各ウェルに加えて酵素反応を停止した。各ウェルの450nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。結果を図27に示す。この結果、実施例35で得られた2種類の高親和性抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBml及びHOBM4を用いて構築したサンドイッチELISAは、ヒトOBM及びヒトsOBMを等しく認識し、その測定感度は約12525×103pmolmlで極めて微量のヒトOBM及びヒトsOBMを測定できることが明らかとなった。尚、これら2種類の抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBMl及びHOBM4を生産するハイブリドーマをHOBMl及びHOBM4と命名し、またマウスOBM及びマウスsOBMも認識し、破骨細胞形成抑制活性を発揮する抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9を生産するハイブリドーマをHOBM9と命名した。これらのハイブリドーマは、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERMBP6264、FERMBP6265、及びFERMBP6266として、平成9年11月5日にそれぞれ寄託されている。実施例37マウスOBM及びマウスsOBMを認識する抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体を用いたマウスOBM及びマウスsOBMの測定実施例33及び35で得られたマウスOBM及びマウスsOBMも認識する抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9を固相抗体とし、実施例28で得られた抗マウスOBMsOBMポリクローナル抗体を酵素標識抗体とするサンドイッチELISAを構築した。マウスOBM及びマウスsOBMをそれぞれ実施例35と同様に一次反応用バッファーで段階的に希釈し、実施例36と同様の方法によりマウスOBM及びマウスsOBMを測定した。結果を図28に示す。この結果、本発明のマウスOBM及びマウスsOBMも認識する本発明の抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9を使用することにより、マウスOBM及びマウスsOBMを同様に測定できることが確認された。実施例35の結果に示すように、この抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9はマウスsOBMに対する解離定数が高い、即ちマウスsOBMに対する親和性が比較的低いことから、本ELISAによるマウスOBM及びマウスsOBMの測定感度は、約25×103pmolml程度であった。実施例38抗OBMsOBM抗体による破骨細胞形成抑制活性試験マウス脾細胞とST2細胞とのcocultureでosteoclastlikecellが誘導されることが知られている。そこで、OBMsOBM抗体をこのcocultureに添加した時、OCL誘導を抑制するか否かを検討した。このcoculture系においてはマウスOBMが発現しているので、実施例に使用する抗体はマウスOBMを認識するウサギ抗マウスOBMsOBMポリクローナル抗体、及びヒトOBM及びマウスOBMの両抗原を認識するヒト抗OBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9を用いた。10FCSを含むαMEMにて段階希釈したそれぞれのOBM抗体を24wellplateに700μlwell、上記培地にて懸濁した雄マウス脾細胞を350μlwell添加した。次いでトリプシナイズしたST2細胞を4×108MVitaminD3及び4×107MDexamethazoneを含む上記培地に懸濁し350μlwell添加し、37°Cで6日間培養した。培養プレートをPBSにて1回洗浄したのち、50エタノール、50アセトンの混合液にて室温で1分間固定した。プレートを風乾した後、LEUKOCYTEACIDPHOSPHATASEキットのプロトコールに従い基質液を500μlwell添加し、37°Cで55分間反応させた。この反応により破骨細胞特異的マーカーである酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞のみが染色される。プレートを蒸留水で1回洗浄した後風乾してTRAP陽性細胞数をカウントした。結果を表4に示す。この結果、ウサギ抗マウスOBMsOBMポリクローナル抗体及びマウスOBMを認識する抗ヒトOBMsOBMモノクローナル抗体、HOBM9とも抗体濃度に依存してOCL誘導を阻害することがわかった。これらの抗体は、破骨細胞形成因子、OCIFOPGと同様に破骨細胞形成抑制活性を有し、骨代謝異常症治療薬として有望であることが明らかになった。実施例39TrxOBMのヒト破骨細胞形成誘導活性成人健常者より静脈採取した全血から、Histopaqueを用い、添付のプロトコールに従いdensitygradient法によって単核細胞を調製した。この単核細胞を107Mデキサメサゾン、200ngmlマクロファージコロニー刺激因子、10牛胎児血清及び実施例15で得られた。精製されたTrxOBMを含むαMEMに13×106mlになるように懸濁し、この懸濁液を48ウェルプレートに1ウェルあたり300μl添加し3日間37°Cで培養した。培養液を上記培地で交換後、さらに4日間37°Cで培養した。培養した細胞を実施例5に示した方法で酒石酸耐性酸性フォスファターゼ活性を示す細胞を選択的に染色し、染色された多核細胞の数を顕微鏡観察により測定した。結果を図29に示す。この結果、TrxOBMを添加しなかったウェル中にはTRAP活性を示す細胞はほとんど検出されなかったのに対し、TrxOBMを添加すると濃度依存的にTRAP陽性多核細胞が出現した。又、これらのTRAP陽性多核細胞は破骨細胞のマーカーであるビトロネクチンレセプターも陽性であった。さらに、同様の培養を48ウェルプレートに静置した象牙質切片上で行うと、TrxOBM存在下でのみ象牙質切片上に吸収窩が形成された。これより、TrxOBMにはヒト破骨細胞形成を誘導する活性があることが明らかとなった。実施例40抗OBMsOBM抗体による骨吸収抑制活性妊娠15日目のddYマウスに45CaCaCl2溶液を1匹あたり25μCi皮下注射し、胎仔の骨を45Caでラベルした。翌日、マウスを屠殺し開腹して、子宮から胎仔を取り出した。胎仔より前肢を摘出して、皮膚及び筋肉を剥がし長管骨を摘出し、さらに軟骨を除去して長管骨の骨幹部のみにした。骨幹部は24穴プレートに入れた05mlの培養液を含むBGJbmediumに1本ずつ浮かべ、37°C5CO2存在下で24時間培養した。前培養終了後、各種骨吸収因子、及び正常ウサギIgG又は実施例28で得られたウサギ抗OBMsOBMポリクローナル抗体を含む新しい培養液に長管骨を移し、さらに72時間培養した。培養終了後、長管骨は05mlの5トリクロロ酢酸水溶液に入れ、室温で3時間以上処理して脱灰した。培養液及びトリクロロ酢酸抽出液にシンチレーター5mlを加え、45Caの放射活性を測定し、骨吸収により培養液中に遊離した45Caの割合を算出した。結果を図30~図33にそれぞれ示す。この結果、ビタミンD3は骨吸収活性を上昇させたが、ウサギ抗OBMsOBMポリクローナル抗体を加えることにより、濃度依存的にビタミンD3による骨吸収を抑制し、100μgmlの濃度において完全に抑制した。又、プロスタグランジンE2あるいは副甲状腺ホルモンは骨吸収活性を上昇させたが、ウサギ抗OBMsOBMポリクローナル抗体の添加により、プロスタグランジンE2及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収をほぼ完全に抑制した。一方、陽性対照として用いた正常ウサギIgGは、プロスタグランジンE2及び副甲状腺ホルモンによる骨吸収に対して影響しなかった。又、インターロイキン1αによっても骨吸収が引き起こされたが、ウサギ抗OBMsOBMポリクローナル抗体により有意に抑制された。これらの結果より、本発明抗体は骨吸収抑制物質として優れていることが明らかとなった。マウス抗ヒトOBMsOBM抗体であるHOBM9についても同様の実験を行った結果、ウサギ抗OBMsOBMポリクローナル抗体とほぼ同等の骨吸収抑制活性があることが確認された。産業上の利用の可能性本発明により、破骨細胞形成抑制因子に結合する新規な蛋白質、その製造方法、この蛋白質を用いて該蛋白質の発現を調節する物質のスクリーニング方法、該蛋白質の作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、該蛋白質と結合してその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニング方法により得られた物質を含有する医薬組成物、該蛋白質に対する抗体、及びその抗体を用いた骨代謝異常治療剤が提供される。また、本発明により、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規な蛋白質をコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝治療剤が提供される。更に、OCIF結合分子の発現を調節するスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合しその作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合しその作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、これらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物が提供される。さらに、破骨細胞形成抑制因子OCIFに結合する新規なヒト蛋白質をコードするDNA、そのDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質、そのDNAを用いてOCIFに特異的に結合する性質を有し、破骨細胞の分化、成熟を支持、促進する生物活性を有する蛋白質を遺伝子工学的に製造する方法、及び該蛋白質を含有する骨代謝異常症治療剤が提供される。OCIF結合分子の発現を調節する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合し、その作用を阻害又は修飾する物質のスクリーニング方法、OCIF結合分子と結合し、その生物作用を伝達するレセプターのスクリーニング方法、及びこれらのスクリーニングの結果得られた物質を含有する医薬組成物、さらにヒト由来OCIF結合蛋白質に対する抗体及びその抗体を用いた骨代謝異常症の予防及び又は治療薬が提供される。またさらに、本発明により、OCIFに特異的に結合する膜結合分子蛋白質及び膜結合部位を欠損した可溶性OBMの両抗原を認識する抗体、その製造方法、この抗体を用いたOBM及びsOBMの測定方法、さらにこの抗体を有効成分とする骨代謝異常症予防及び又は治療剤が提供される。本発明により得られた蛋白質あるいは抗体は、医薬あるいは研究又は試験用試薬として有用である。