"イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞であって、該経路が、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、該経路が、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を含み、そしてピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、イソブタノール生成の力価が増加している、上記組換え宿主細胞。2,3-ブタンジオール、2-ブタノール、又は2-ブタノン生合成経路を含む組換え宿主細胞であって、該経路が、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、そして該経路が、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒される少なくとも1つの基質から生成物への変換を含む、上記組換え宿主細胞。細菌、シアノバクテリア、糸状菌、及び酵母からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。クロストリジウム属Clostridium、ザイモモナス属Zymomonas、エシェリキア属Escherichia、サルモネラ属Salmonella、ロドコッカス属Rhodococcus、シュードモナス属Pseudomonas、バチルス属Bacillus、ラクトバチルス属Lactobacillus、エンテロコッカス属Enterococcus、アルカリゲネス属Alcaligenes、クレブシエラ属Klebsiella、パエニバチルス属Paenibacillus、アルスロバクター属Arthrobacter、コリネバクテリウム属Corynebacterium、ブレビバクテリウム属Brevibacterium、ピキア属Pichia、カンジダ属Candida、ハンゼヌラ属Hansenula、イサチェンキア属Issatchenkia、クルイベロミセス属Kluyveromyces、及びサッカロミセス属Saccharomycesからなる群から選択される属のメンバーである、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。大腸菌Escherichiacoliである、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。ポリペプチドが宿主細胞サイトゾルで発現する、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarumである、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeである、請求項1又は2に記載の組換え宿主細胞。基質から生成物への変換:2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド;及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1又は3~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。基質から生成物への変換:2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;α-ケトイソバレレートからイソブチリル-CoA;イソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒド;及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1又は2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。基質から生成物への変換:2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;α-ケトイソバレレートからバリン;バリンからイソブチルアミン;イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド;及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1又は2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。基質から生成物への変換:アセトラクテートからアセトイン;アセトインから2,3-ブタンジオール;及び2,3-ブタンジオールから2-ブタノンへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。基質から生成物への変換:アセトラクテートからアセトイン;アセトインから2,3-ブタンジオール;2,3-ブタンジオールから2-ブタノン;及び2-ブタノンから2-ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドが、アセト乳酸シンターゼである、請求項1~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。アセト乳酸シンターゼが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、又は18から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約80の同一性を有する、請求項14に記載の組換え宿主。宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの発現が低下するか、又は実質的に排除される、請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び/又は置換を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項1~15のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。宿主細胞におけるグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの発現が低下するか、又は実質的に排除される、請求項1~18のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。宿主細胞におけるFra2の発現が低下するか、又は実質的に排除される、請求項1~19のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。ポリヌクレオチドが、PDC1-TRX1遺伝子間領域で染色体に組み込まれる、請求項1~20のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。aピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、染色体に組み込まれるポリヌクレオチドと;bアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、プラスミド上にあるポリヌクレオチドと;c2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと;dα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと;を含む組換え宿主細胞であって、ここで宿主細胞がピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まず;そして宿主細胞がイソブタノールを生産する、上記組換え宿主細胞。a請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと;b生合成経路生成物が生成される条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップと;を含む方法。発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生産するステップをさらに含む、請求項23に記載の方法。抽出剤が脂肪酸を含む、請求項24に記載の方法。脂肪酸がトウモロコシ油又はダイズ油に由来する、請求項25に記載の方法。抽出剤が、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、C12~C22脂肪アルデヒド、及びC12~C22脂肪アミドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤を含む、請求項24に記載の方法。生合成経路生成物がアルコールであり、そして方法が、発酵ブロスを有機酸、及びその有機酸によりアルコールをエステル化する能力を有する酵素と接触させるステップをさらに含む、請求項23~27のいずれか一項に記載の方法。生合成経路生成物がアルコールであり、そして方法が、発酵ブロスの少なくとも一部分を気化させて、水とアルコールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む、請求項23~28のいずれか一項に記載の方法。生合成経路生成物がブタノールである、請求項23~29のいずれか一項に記載の方法。生合成経路生成物がイソブタノールである、請求項23~30のいずれか一項に記載の方法。ブタノール生成速度が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍大きな差で増加する、請求項30又は31に記載の方法。ブタノール生成の力価が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍大きな差で増加する、請求項30又は31に記載の方法。ブタノールがイソブタノールである、請求項32又は33に記載の方法。生合成経路のステップを触媒する非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法であって、生合成経路の生成物が生産される条件下で、請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む、上記方法。ピルベート利用生合成経路におけるフラックスを増加させる方法であって、a請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと;b宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップと;を含む、上記方法。2,3-ブタンジオール、イソブタノール、2-ブタノール、又は2-ブタノン生合成経路の生成物の形成を増加させる方法であって、i請求項1~22のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと;iiピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で宿主細胞を増殖させるステップと;を含み、該組換え宿主細胞により形成される生成物の量が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない宿主細胞により形成される生成物の量より多い、上記方法。i請求項1~23のいずれか一項に記載の宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせと;iiブタノールと;iii抽出剤と;を含む組成物。i請求項1~23のいずれか一項に記載の宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせと;iiブタノールと;iii抽出剤と;ivエステル化酵素と;を含む組成物。抽出剤が脂肪酸を含む、請求項38又は39に記載の組成物。脂肪酸がトウモロコシ油又はダイズ油に由来する、請求項41に記載の組成物。抽出剤が、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、C12~C22脂肪アルデヒド及びC12~C22脂肪アルデヒドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤である、請求項38又は39に記載の組成物。抽出剤がオレイルアルコールを含む、請求項38又は39に記載の組成物。イソブタノールの生産方法における、請求項1又は3~23のいずれか一項に記載の宿主細胞又は請求項38~43のいずれか一項に記載の組成物の使用。イソブタノールを含む燃料組成物の生産方法における、請求項1又は3~23のいずれか一項に記載の宿主細胞又は請求項38~43のいずれか一項に記載の組成物の使用。アセトラクテートからアセトイン;アセトインから3-アミノ-2-ブタノール;3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールホスフェート;及び3-アミノ-2-ブタノールホスフェートから2-ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。アセトラクテートからアセトイン;アセトインから3-アミノ-2-ブタノール;3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールホスフェート;3-アミノ-2-ブタノールホスフェートから2-ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項2~8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。アルコール又は他の化合物を工業的に発酵生産するため、ピルビン酸生合成経路用の酵母細胞によるポリヌクレオチドの安定した産生が必要とされている。さらに、酵母などの組換え宿主細胞におけるイソブタノール、2,3-ブタンジオール、2-ブタノール又は2-ブタノンの改良された生成手段が必要とされている。本明細書には、ピルベート利用生合成経路のステップ、例えばピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上の組込みポリヌクレオチドを有する組換え宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞は、ピルベートからアセトラクテートへの変換などの生合成経路ステップを触媒するポリペプチドをコードする組込みポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較して、イソブタノール、2,3-ブタンジオール、2-ブタノール又は2-ブタノンなどの生合成経路の生成物形成を安定化及び/又は増加させる手段を提供する。本発明の一態様は、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。別の態様では、宿主細胞は、ピルベート利用生合成経路と、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。別の態様では、ポリヌクレオチドは宿主細胞にとって異種である。本発明の態様は、イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞に関し、前記経路は、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、及び前記経路は、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を含む。実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、イソブタノール生成の力価が増加している。本発明の態様は、2,3-ブタンジオール、2-ブタノール、又は2-ブタノン生合成経路を含む組換え宿主細胞に関し、前記経路は、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、及び前記経路は、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒される少なくとも1つの基質から生成物への変換を含む。実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、2,3-ブタンジオール、2-ブタノール、又は2-ブタノン生成の力価が増加している。別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと;ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第3のポリペプチドをコードする第3の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;第1及び第2の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれ;第3の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれず;及び第1、第2、及び第3のポリペプチドはピルベート利用生合成経路の異なるステップを触媒する。別の態様では、本発明は、aピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;bα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと;ca又はbの変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第3のポリペプチドをコードする第3の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;第1及び第2の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ;第3の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず;及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。別の態様では、本発明は、aα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;baの変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;第1の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ;第2の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず;及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。本発明の態様では、宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、又は酵母である。別の態様では、宿主細胞は、クロストリジウム属Clostridium、ザイモモナス属Zymomonas、大腸菌属Escherichia、サルモネラ属Salmonella、ロドコッカス属Rhodococcus、シュードモナス属Pseudomonas、バチルス属Bacillus、ラクトバチルス属Lactobacillus、エンテロコッカス属Enterococcus、アルカリゲネス属Alcaligenes、クレブシエラ属Klebsiella、イサチェンキア属Issatchenkia、パエニバチルス属Paenibacillus、アルスロバクター属Arthrobacter、コリネバクテリウム属Corynebacterium、ブレビバクテリウム属Brevibacterium、ピキア属Pichia、カンジダ属Candida、ハンゼヌラ属Hansenula、又はサッカロミセス属Saccharomycesのメンバーである。別の態様では、宿主細胞は、大腸菌Escherichiacoli、アルカリゲネスユートロフスAlcaligeneseutrophus、バチルスリケニホルミスBacilluslicheniformis、パエニバチルスマセランスPaenibacillusmacerans、ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis、シュードモナスプチダPseudomonasputida、バチルススブチリスBacillussubtilis、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarum、エンテロコッカスフェシウムEnterococcusfaecium、エンテロコッカスガリナルムEnterococcusgallinarium、エンテロコッカスフェカリスEnterococcusfaecalis又はサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeである。別の態様では、宿主細胞は通性嫌気性生物である。本発明の別の態様では、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ポリヌクレオチドの1つ以上は染色体に組み込まれる。別の態様では、ピルベート利用生合成経路は、生成物2,3-ブタンジオール、イソブタノール、2-ブタノール又は2-ブタノンを形成する。本発明の一態様では、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。別の態様では、ブタノール生合成経路は、2-ブタノール生合成経路又はイソブタノール生合成経路である。別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド;又はvイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、又はvのポリヌクレオチドの1つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからイソブチリル-CoA;vイソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒド;又はviイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、v、又はviのポリヌクレオチドの1つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからバリン;vバリンからイソブチルアミン;viイソブチルアミンからイソブチルアルデヒド;又はviiイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、v、vi、又はviiのポリヌクレオチドの1つ以上がプラスミド上にある。本発明の別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから2,3-ブタンジオール;又はiv2,3-ブタンジオールから2-ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、又はivのポリヌクレオチドの1つ以上はプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから2,3-ブタンジオール;iv2,3-ブタンジオールから2-ブタノン;又はv2-ブタノンから2-ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、又はvのポリヌクレオチドの1つ以上がプラスミド上にある。本発明の別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiα-アセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから3-アミノ-2-ブタノール;iv3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールホスフェート;v又は3-アミノ-2-ブタノールホスフェートから2-ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、又はvのポリヌクレオチドの1つ以上がプラスミド上にある。別の態様では、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiα-アセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから3-アミノ-2-ブタノール;iv3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールホスフェート;v3-アミノ-2-ブタノールホスフェートから2-ブタノン;又はvi2-ブタノンから2-ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ii、iii、iv、v、又はviのポリヌクレオチドの1つ以上がプラスミド上にある。別の態様では、基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも1つが異種である。別の実施形態では、基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの2つ以上が異種である。別の実施形態では、ピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換の各々に対するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てが異種である。本発明の一態様では、ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼである。別の態様では、アセト乳酸シンターゼは、表1に示されるアセト乳酸シンターゼのアミノ酸配列と少なくとも約80の同一性を有する。別の態様では、アセト乳酸シンターゼは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、又は18のアミノ酸配列と少なくとも約80の同一性を有する。別の態様では、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC2.2.1.6に対応する。本発明の別の態様では、アセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC1.1.1.86に対応する。別の態様では、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC4.2.1.9に対応する。別の態様では、α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC4.1.1.72又は4.1.1.1に対応する。別の態様では、イソブチルアルデヒドからイソブタノールの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC1.1.1.265、1.1.1.1又は1.1.1.2に対応する。一態様では、本発明の宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異及び/又は置換を含む。本発明の別の態様では、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの1つ以上は、プラスミドにある。別の態様では、プラスミドは、配列番号1~89の1つ以上と少なくとも約75、80、85、90、95、96、97、98又は99同一の配列を含み、又は配列番号129~133のいずれか一つ又はそのコード領域と少なくとも約75、80、85、90、95、96、97、98又は99同一である。一態様では、本発明の宿主細胞におけるグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼの発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、本発明の宿主細胞におけるFRA2の発現は、低下するか、又は実質的に消失する。別の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの1つ以上は、宿主細胞の染色体にPDC1-TRX1遺伝子間領域で組み込まれる。一態様では、本発明は、本発明の宿主細胞から生合成経路の生成物を生成する方法に関する。別の態様では、本発明はブタノールの生成方法に関し、この方法は、a本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと;bブタノールが生成される条件下で宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生成するステップをさらに含む。別の態様では、抽出剤は脂肪酸を含む。別の態様では、脂肪酸はトウモロコシ油又はダイズ油に由来する。別の態様では、抽出剤は、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、C12~C22脂肪アミド、又はC12~C22脂肪アルデヒドなどの水不混和性有機抽出剤を含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスを有機酸及びその有機酸によりブタノールをエステル化する能力を有する酵素と接触させるステップをさらに含む。別の態様では、この方法は、発酵ブロスの少なくとも一部を気化させて、水とブタノールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む。一態様では、本発明の宿主細胞からのブタノール生成速度は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較したとき、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍だけ大きく増加する。別の態様では、本発明の宿主細胞からのブタノール生成の力価は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有しない宿主細胞と比較したとき、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍だけ高く増加する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法に関し、この方法は、生合成経路の生成物が生成される条件下で本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路におけるフラックスを増加させる方法に関し、この方法は、a本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと;b宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。別の態様では、本発明は、組換え宿主細胞を生成する方法に関し、この方法は、宿主細胞を、iピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドと;iiピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するペプチドをコードするポリヌクレオチドとで形質転換するステップを含み;iiのポリヌクレオチドは染色体に組み込まれる。別の態様では、本発明は、ピルベート利用生合成経路の生成物の形成を増加させる方法に関し、この方法は、i本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと;iiピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、染色体に組み込まれていないポリヌクレオチドを含む宿主細胞により形成される生成物の量と比べて、より多い生成物の量でピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で、宿主細胞を成長させるステップとを含む。別の態様では、本発明は、i本発明の宿主細胞と;iiブタノールと;iii抽出剤とを含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、i本発明の宿主細胞と;iiブタノールと;iii抽出剤と;ivエステル化酵素とを含む組成物に関する。別の態様では、かかる組成物のブタノールはイソブタノールである。別の態様では、本発明は、アセト乳酸シンターゼalsを酵母宿主細胞の染色体に組み込む方法に関し、この方法は、前記宿主細胞を配列番号131を含む組込みベクターで形質転換するステップを含む。別の態様では、宿主細胞はイソブタノール生合成経路をさらに含む。別の態様では、宿主は少なくとも2つの染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む。ここに援用され、且つ本明細書の一部をなす添付の図面は、本発明を例示し、さらにその説明と共に、本発明の原理を説明し、且つ関連する技術分野の当業者による本発明の作製及び使用を可能にする役割を担う。本発明は、以下の詳細な説明及び本願の一部をなす添付の配列説明からより十全に理解され得る。以下の配列は、米国特許法施行規則第1.821条~第1.825条ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件-配列規則RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRulesに準拠し、世界知的所有権機関WorldIntellectualPropertyOrganization:WIPO標準ST.252009年並びにEPO及びPCTの配列表要件[規則第5.2条及び第49.5条aの2及び実施細則AdministrativeInstructions第208条及び付録C]に則っている。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに用いる記号及び形式は、米国特許法施行規則第1.822条に定められる規則に従う。配列番号90~222及び243~246は、実施例において使用及び説明される配列である。配列番号238~242は、本明細書で参照されるハイブリッドプロモーター配列である。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、それらの定義を含む本願に従う。文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全て刊行物、特許及び他の参考文献が、特許又は特許公開の特定の節のみを参照によって援用することが指示されない限り、個別の各刊行物又は特許出願が参照によって援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとして、あらゆる目的から全体として参照により援用される。材料、方法及び例は、あくまでも例示に過ぎず、限定する意図はない。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。本発明は、ブタノールを生成するための組換え微生物及び方法に関する。本発明は数多くの商業的及び工業的必要性に応える。ブタノールは、様々な用途を有する重要な工業的汎用化学品であり、燃料又は燃料添加剤としてのその可能性が特に顕著である。ブタノールは、四炭素のみのアルコールでありながらガソリンと同程度のエネルギー含量を有し、いかなる化石燃料とも混合することができる。ブタノールは、それを標準的な内燃機関で燃焼させたときCO2のみが発生し、SOX又はNOXをほとんど若しくは全く生じないため、燃料又は燃料添加剤として好適である。さらにブタノールは、もう一つの燃料添加剤であるエタノールと比べて腐食性が低い。バイオ燃料又は燃料添加剤としてのその有用性に加え、ブタノールは、新興の燃料電池産業における水素供給問題に影響を及ぼす可能性がある。現在の燃料電池は、水素の輸送及び供給に関連する安全上の懸念に悩まされている。ブタノールはその水素含量を容易に構成し直すことができ、燃料電池又は車両のいずれに必要な純度も、既存のガソリンスタンドを通じて供給することができる。特許請求の範囲及び明細書の解釈には、以下の定義及び略記を用いるものとする。本明細書で使用されるとき、用語~を含むcomprises、~を含んでいるcomprising、~を備えるincludes、~を備えているincluding、~を有するhas、~を有しているhaving、~を含有するcontains、又は~を含有しているcontaining、又はこれらの任意の他の変形語は、非排他的又は非制限的であることが意図される。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、その他の、明示的に列挙されていない要素、若しくはかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素を含み得る。さらに、反する旨が明記されない限り、又はは非排他的又はを指し、排他的又はを指すのではない。例えば、条件A又はBは、以下のいずれか一つを満たす:Aが真であり又は存在し且つBが偽である又は存在しない、Aが偽であり又は存在せず且つBが真である又は存在する、及びA及びBがともに真である又は存在する。本明細書で使用されるとき、請求項との関連における用語~から本質的になるconsistingessentiallyofは、~からなるconsistingofの形式で書かれたクローズドクレームと、~を含むcomprisingの形式で書かれた完全なオープンクレームとの間の中間的な見地を表すことが意図される。M.P.E.P.第2111.03条を参照のこと。また、本発明のエレメント又は構成要素に先行する不定冠詞a及びanは、インスタンスの数に関して、すなわちエレメント又は構成要素の出現に関して、非制限的なものであることが意図される。従ってa又はanは、1つ又は少なくとも1つを含むものとして読まれなければならず、単数形の語形のエレメント又は構成要素はまた、数値が明らかに単数であることを意味しない限り、その複数形も含む。本明細書で使用されるとき、用いられる本発明の成分又は反応物の量を修飾する用語約は、例えば、現実の世界で濃縮物の作製又は溶液の使用のために用いられる典型的な計測及び液体操作の手順;それらの手順における不注意による誤り;組成物の作製又は方法の実行のために用いられる成分の製造、供給源、又は純度の違いなどを通じて生じ得る数量のばらつきを指す。用語約はまた、特定の初期混合物によってもたらされる組成物の平衡条件の違いに起因して異なる量も包含する。用語約によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はそれらの量と等価な量を含む。一実施形態において、用語約は、報告される数値の10以内、好ましくは報告される数値の5以内を意味する。用語発明又は本発明は、本明細書で使用されるとき、非制限的な用語であり、特定の発明のいずれか単一の実施形態を参照することは意図されず、明細書及び特許請求の範囲に記載されるとおりのあらゆる可能な実施形態を包含する。用語ブタノールは、本明細書で使用されるとき、2-ブタノール、イソブタノール又はそれらの混合物を指す。用語イソブタノール生合成経路は、ピルベートからイソブタノールを生成する酵素経路を指す。用語2-ブタノール生合成経路は、ピルベートから2-ブタノールを生成する酵素経路を指す。用語2-ブタノン生合成経路は、ピルベートから2-ブタノンを生成する酵素経路を指す。用語抽出剤は、本明細書で使用されるとき、発酵ブロスからブタノール及び/又は他の構成成分を抽出するために用いられる1つ以上の有機溶媒を指す。用語アセト乳酸シンターゼ及びアセト乳酸シンテターゼは、本明細書では、ピルベートからアセトラクテート及びCO2への変換を触媒する酵素を指して同義的に使用される。アセト乳酸シンターゼの例は、EC番号2.2.1.6により公知であるEnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego。これらの酵素は、数多くの供給源から利用可能であり、限定はされないが、バチルススブチリスBacillussubtilis[GenBank番号:CAB15618及びZ99122、それぞれ、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationのアミノ酸配列、NCBIヌクレオチド配列]、クレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeGenBank番号:AAA25079及びM73842、及びラクトコッカスラクティスLactococcuslactisGenBank番号:AAA25161及びL16975が挙げられる。さらなる例を表1にも提供する。用語アセト乳酸デカルボキシラーゼは、α-アセトラクテートからアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド又は複数のポリペプチドを指す。アセト乳酸デカルボキシラーゼの例はEC4.1.1.5として公知であり、例えば、バチルススブチリスBacillussubtilisDNA:配列番号21、タンパク質:配列番号22、クレブシエラテリゲナKlebsiellaterrigenaDNA:配列番号23、タンパク質:配列番号24及びクレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeDNA:配列番号19、タンパク質:配列番号20から利用可能である。用語アセトインアミナーゼは、アセトインから3-アミノ-2-ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド又は複数のポリペプチドを指す。アセトインアミナーゼは、補因子ピリドキサール5’-リン酸又はNADH還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はNADPH還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を利用し得る。得られる生成物は、3位にR又はS立体化学を有し得る。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニン又はグルタミン酸塩などのアミノ酸をアミノ供与体として使用し得る。NADH依存性及びNADPH依存性酵素は、アンモニアを第2の基質として使用し得る。アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしても知られるNADH依存性アセトインアミナーゼの好適な例が、Itoetal.米国特許第6,432,688号明細書により記載されている。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの例は、ShinandKimJ.Org.Chem.67:2848-28532002により記載されるアミン:ピルビン酸アミノトランスフェラーゼアミン:ピルビン酸トランスアミナーゼとも称されるである。用語アミノブタノールキナーゼは、3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールO-リン酸への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド又は複数のポリペプチドを指す。アミノブタノールキナーゼは、ATPをリン酸供与体として利用し得る。同様の基質エタノールアミン及び1-アミノ-2-プロパノールに対して類似の反応を触媒する酵素が報告されているJonesetal.1973Biochem.J.134:167-182。米国特許出願公開第20070292927号明細書は、実施例14において、エルウィニアカロトボラサブエスピーアトロセプティカErwiniacarotovorasubsp.atrosepticaのアミノアルコールキナーゼを記載している。アミノアルコールO-リン酸リアーゼとも称される用語アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼは、3-アミノ-2-ブタノールO-リン酸から2-ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド又は複数のポリペプチドを指す。アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼは、補因子ピリドキサール5’-リン酸を利用し得る。同様の基質1-アミノ-2-プロパノールホスフェートに対して類似の反応を触媒する酵素が報告されているJonesetal.1973BiochemJ.134:167-182。米国特許出願公開第20070292927号明細書は、実施例15において、新規に同定された、生物エルウィニアカロトボラErwiniacarotovora由来のアミノブタノールリン酸ホスホリアーゼを記載している。アセトインレダクターゼとしても知られる用語ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アセトインから2,3-ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチド又は複数のポリペプチドを指す。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、広範なアルコールデヒドロゲナーゼファミリーの一部である。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物におけるR-又はS-立体化学の生成に関して特異性を有し得る。S特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼの例は、EC1.1.1.76として公知であり、例えば、クレブシエラニューモニエKlebsiellapneumoniaeDNA:配列番号25、タンパク質:配列番号26から利用可能である。R特異的ブタンジオールデヒドロゲナーゼの例は、EC1.1.1.4として公知であり、例えば、バチルスセレウスBacilluscereusDNA:配列番号27、タンパク質:配列番号28、及びラクトコッカスラクティスLactococcuslactisDNA:配列番号29、タンパク質:配列番号30から利用可能である。用語アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ及びアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ及びケトール酸レダクトイソメラーゼKARIは、本明細書では、アセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指して同義的に使用される。好適な酵素は、NADH還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び/又はNADPHを電子供与体として利用する。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの例は、EC番号1.1.1.86により公知であり、それらの配列は、限定はされないが、大腸菌EscherichiacoliGenBank番号:NP_418222及びNC_000913、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeGenBank番号:NP_013459及びNC_001144、メタノコッカスマリパルディスMethanococcusmaripaludisGenBank番号:CAF30210及びBX957220、及びバチルススブチリスBacillussubtilisGenBank番号:CAB14789及びZ99118を含む無数の微生物から利用可能である。用語アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼは、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指す。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼの例は、EC番号4.2.1.9により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌E.coliGenBank番号:YP_026248及びNC_000913、S.セレビシエS.cerevisiaeGenBank番号:NP_012550及びNC_001142、M.マリパルディスM.maripaludisGenBank番号:CAF29874及びBX957219、及びB.スブチリスB.subtilisGenBank番号:CAB14105及びZ99115を含む無数の微生物から利用可能である。用語分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼは、α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド及びCO2への変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼの例は、EC番号4.1.1.72により公知であり、限定はされないが、ラクトコッカスラクティスLactococcuslactisGenBank番号:AAS49166、AY548760、CAG34226、及びAJ746364、サルモネラチフィムリウムSalmonellatyphimuriumGenBank番号:NP_461346及びNC_003197、及びクロストリジウムアセトブチリカムClostridiumacetobutylicumGenBank番号:NP_149189及びNC_001988を含む数多くの供給源から利用可能である。用語分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼの例はEC番号1.1.1.265により公知であるが、これはまた、他のアルコールデヒドロゲナーゼ具体的には、EC1.1.1.1又は1.1.1.2にも分類され得る。これらの酵素はNADH還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び/又はNADPHを電子供与体として利用し、限定はされないが、S.セレビシエS.cerevisiaeGenBank番号:NP_010656、NC_001136;NP_014051;及びNC_001145、大腸菌E.coliGenBank番号:NP_417484及びNC_000913及びC.アセトブチリカムC.acetobutylicumGenBank番号:NP_349892、NC_003030;NP_349891、及びNC_003030を含む数多くの供給源から利用可能である。用語分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、NADニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電子受容体として使用してα-ケトイソバレレートからイソブチリル-CoAイソブチリル補酵素Aへの変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの例は、EC番号1.2.4.4により公知である。これらの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、4つのサブユニットから構成され、いずれのサブユニットの配列も、限定はされないが、B.スブチリスB.subtilisGenBank番号:CAB14336、Z99116、CAB14335、Z99116、CAB14334、Z99116、CAB14337、及びZ99116及びシュードモナスプチダPseudomonasputidaGenBank番号:AAA65614、M57613、AAA65615、M57613、AAA65617、M57613、AAA65618、及びM57613を含む無数の微生物から利用可能である。用語アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼは、NADH又はNADPHのいずれかを電子供与体として使用してイソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの例は、EC番号1.2.1.10及び1.2.1.57により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、クロストリジウムベイジェリンキClostridiumbeijerinckiiGenBank番号:AAD31841及びAF157306、C.アセトブチリカムC.acetobutylicumGenBank番号:NP_149325、NC_001988、NP_149199、及びNC_001988、P.プチダP.putidaGenBank番号:AAA89106及びU13232、及びサーマスサーモフィラスThermusthermophilusGenBank番号:YP_145486及びNC_006461を含む複数の供給源から利用可能である。用語トランスアミナーゼは、アラニン又はグルタミン酸塩のいずれかをアミン供与体として使用してα-ケトイソバレレートからL-バリンへの変換を触媒する酵素を指す。トランスアミナーゼの例は、EC番号2.6.1.42及び2.6.1.66により公知である。これらの酵素は数多くの供給源から利用可能である。アラニン依存性酵素の供給源の例としては、限定はされないが、大腸菌E.coliGenBank番号:YP_026231及びNC_000913及びバチルスリケニホルミスBacilluslicheniformisGenBank番号:YP_093743及びNC_006322が挙げられる。グルタミン酸塩依存性酵素供給源の例としては、限定はされないが、大腸菌E.coliGenBank番号:YP_026247及びNC_000913、S.セレビシエS.cerevisiaeGenBank番号:NP_012682及びNC_001142及びメタノバクテリウムサーモオートトロフィカムMethanobacteriumthermoautotrophicumGenBank番号:NP_276546及びNC_000916が挙げられる。用語バリンデヒドロゲナーゼは、NADPHを電子供与体として、及びアンモニアをアミン供与体として使用してα-ケトイソバレレートからL-バリンへの変換を触媒する酵素を指す。バリンデヒドロゲナーゼの例は、EC番号1.4.1.8及び1.4.1.9により公知であり、限定はされないが、ストレプトミセスセリカラーStreptomycescoelicolorGenBank番号:NP_628270及びNC_003888及びB.スブチリスB.subtilisGenBank番号:CAB14339及びZ99116を含む数多くの供給源から利用可能である。用語バリンデカルボキシラーゼは、L-バリンからイソブチルアミン及びCO2への変換を触媒する酵素を指す。バリンデカルボキシラーゼの例は、EC番号4.1.1.14により公知である。これらの酵素は、例えば、ストレプトミセスビリジファシエンスStreptomycesviridifaciensGenBank番号:AAN10242及びAY116644などのストレプトミセス類Streptomycetesに見られる。用語オメガトランスアミナーゼは、好適なアミノ酸をアミン供与体として使用してイソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を指す。オメガトランスアミナーゼの例はEC番号2.6.1.18により公知であり、限定はされないが、アルカリゲネスデニトリフィカンスAlcaligenesdenitrificansGenBank番号:AAP92672及びAY330220、ラルストニアユートロファRalstoniaeutrophaGenBank番号:YP_294474及びNC_0073479、シェワネラオネイデンシスShewanellaoneidensisGenBank番号:NP_719046及びNC_004347、及びP.プチダP.putidaGenBank番号:AAN66223及びAE016776を含む数多くの供給源から利用可能である。用語イソブチリル-CoAムターゼは、ブチリル-CoAからイソブチリル-CoAへの変換を触媒する酵素を指す。この酵素は補酵素B12を補因子として使用する。イソブチリル-CoAムターゼの例は、EC番号5.4.99.13により公知である。これらの酵素は、限定はされないが、ストレプトミセスシンナモネンシスStreptomycescinnamonensisGenBank番号:AAC08713、U67612、CAB59633、及びAJ246005、S.セリカラーS.coelicolorGenBank番号:CAB70645、AL939123、CAB92663、及びL939121、及びストレプトミセスアベルミティリスStreptomycesavermitilisGenBank番号:NP_824008、NC_003155、NP_824637及びNC_003155を含む数多くのストレプトミセス類Streptomycetesに見られる。用語実質的に含まないは、本イソブタノール経路手段に匹敵する炭素経路における酵素活性例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼの存在又は非存在を参照して用いられるとき、酵素レベルが野生型宿主における同じ酵素と比べて実質的に低いことを意味し、ここでは野生型レベルの約20未満が好ましく、野生型レベルの約15又は10未満がより好ましい。活性は、野生型活性の約5、4、3、2又は1未満であってもよい。用語通性嫌気性生物は、好気性及び嫌気性の双方の環境で成長することができる微生物を指す。用語炭素基質又は発酵性炭素基質は、本発明の宿主生物により代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及び一炭素基質又はそれらの混合物からなる群から選択される炭素源を指す。炭素基質の供給源としては、限定はされないが、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、木材、藻類などの任意の糖又はデンプン含有バイオマス;任意の農業廃棄物又は農業残渣並びに任意のリグノセルロース系及び/又はヘミセルロース系材料を含めた、再生可能資源原料などの任意の原料を挙げることができる。用語遺伝子は、特定のタンパク質として発現する能力を有する核酸断片を指し、場合によりそのコード配列に先行する調節配列5’非コード配列及びその後続の調節配列3’非コード配列を含む。天然遺伝子は、その独自の調節配列を有して天然で見出されるとおりの遺伝子を指す。キメラ遺伝子は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指し、天然で同時に見出されることのない調節配列及びコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然で見出されるものとは異なる形で並んだ調節配列及びコード配列を含み得る。内因性遺伝子は、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子を指す。外来遺伝子又は異種遺伝子は、通常は宿主生物に見出されないが、例えば遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子、又は宿主生物に見出され、若しくは宿主生物にとって天然であるが、その機能に影響を及ぼすように何らかの形で修飾されている遺伝子を指す。本明細書に記載されるとおりの染色体に組み込まれたポリヌクレオチドは天然ポリヌクレオチドであろうと、又は非天然ポリヌクレオチドであろうと、異種ポリヌクレオチドと見なされる。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含む。導入遺伝子は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。本明細書で使用されるとき、用語コード配列及びコード領域は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。好適な調節配列は、コード配列の上流5’非コード配列、その範囲内、又はその下流3’非コード配列に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、RNAのプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム-ループ構造が含まれ得る。用語プロモーターは、コード配列又は機能的RNAの発現を制御する能力を有するDNA配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは全体として天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成DNAセグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが遺伝子の発現を、異なる組織又は細胞型で、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件若しくは生理学的条件に応答して誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に構成的プロモーターと称される。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのDNA断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。用語作動可能に連結されたは、単一の核酸断片上の核酸配列が、一方の機能が他方によって影響を受けるように関係付けられていることを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現が生じることが可能な場合、当該のコード配列と作動可能に連結されているすなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結される。用語発現は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンスmRNA又はアンチセンスRNAの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻訳も指し得る。本明細書で使用されるとき、用語形質転換は、核酸断片の宿主生物への導入を指し、これにより遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、トランスジェニック又は組換え又は形質転換生物と称される。用語プラスミド、ベクター及びカセットは、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運び、且つ通常は環状二本鎖DNA断片の形態である染色体外要素を指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの、線状又は環状の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であって、多数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられることにより、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びDNA配列を適切な3’非翻訳配列と共に細胞に導入する能力を有する固有の構築物となった配列であり得る。形質転換カセットは、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。発現カセットは、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、外来宿主における当該遺伝子の発現の亢進を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。本明細書で使用されるとき、用語コドン縮重は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示されるコドンバイアスを十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を改良するために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。用語内在性は、本明細書で使用されるとき、生物により産生又は合成されるもの、又は生物の環境に加えられるものを指す。用語コドンが最適化されたは、それが様々な宿主を形質転換するための核酸分子の遺伝子又はコード領域に関連するとき、そのDNAによりコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映させるための、核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの改変を指す。かかる最適化は、コドンのうちの少なくとも1つ、又は2つ以上、又は多数を、当該生物の遺伝子でより頻繁に使用される1つ又は複数のコドンに置き換えることを含む。本明細書で使用されるとき、単離核酸断片又は単離核酸分子は同義的に使用され、一本鎖又は二本鎖であり、場合により合成の、非天然の又は改変されたヌクレオチド塩基を含む、RNA又はDNAのポリマーを意味する。DNAのポリマーの形態の単離核酸断片は、cDNA、ゲノムDNA又は合成DNAの1つ以上のセグメントから構成され得る。核酸断片は、適切な温度及び溶液イオン強度条件下で一本鎖形態の核酸断片を他の核酸断片にアニールすることができる場合、cDNA、ゲノムDNA、又はRNA分子などの別の核酸断片とハイブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY1989、特にそのなかのChapter11及びTable11.1全体として参照により本明細書に援用されるに例示されている。温度及びイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決まる。ストリンジェンシー条件を調整することで、適度な類似性を有する断片遠縁の生物由来の相同配列など乃至高度な類似性を有する断片近縁の生物由来の、機能的酵素を複製する遺伝子などをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄により、ストリンジェンシー条件が決まる。ある一組の条件では、6×SSC、0.5SDS、室温で15分から開始し、次に2×SSC、0.5SDS、45°Cで30分を繰り返し、次に0.2×SSC、0.5SDS、50°Cで30分を2回繰り返す一連の洗浄が用いられる。別の一組のストリンジェントな条件では、より高温が用いられ、ここで洗浄は、最後の0.2×SSC、0.5SDSで30分を2回の洗浄の温度を60°Cに上げることを除いては、上記と同じである。別の一組の高度にストリンジェントな条件では、0.1×SSC、0.1SDS、65°Cで2回の最終洗浄が用いられる。さらなる一組のストリンジェントな条件には、例えば、0.1×SSC、0.1SDS、65°Cでのハイブリダイゼーション、及び2×SSC、0.1SDSと、続く0.1×SSC、0.1SDSでの洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーションでは2つの核酸が相補配列を含む必要があるものの、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性が高度であるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのTmの値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性より高いTmに対応するは、以下の順に低くなる:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。100ヌクレオチド長より大きいハイブリッドについては、Tmの計算式が導出されているSambrooketal.,前掲,9.50~9.51を参照のこと。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置の重要性が高くなり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まるSambrooketal.,前掲,11.7-11.8を参照のこと。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。別の実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、又は少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブ長などの要素に従い必要に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の実質的な部分は、当業者が配列を手作業で評価することによるか、或いはBLASTAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101993などのアルゴリズムを用いた、コンピュータによって自動化された配列比較及び同定より、ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列が含まれる部分である。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定的に同定するには、10個以上の連続したアミノ酸又は30個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、配列依存的な遺伝子同定方法例えば、サザンハイブリダイゼーション及び単離方法例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、20~30個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、12~15塩基の短いオリゴヌクレオチドがPCRの増幅プライマーとして使用され得る。従って、ヌクレオチド配列の実質的な部分は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定及び/又は単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。ここで当業者は、本明細書に報告されるとおりの配列の有益性により、開示される配列の全て又は実質的な部分を当業者に公知の目的のために使用し得る。従って、本発明は、添付の配列表に報告されるとおりの完全な配列、並びに上記に定義するとおりのそれらの配列の実質的な部分を含む。用語相補的なは、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記載するために用いられる。例えば、DNAに関連して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。用語同一性パーセントは、当該技術分野において公知のとおり、2つ以上のポリペプチド配列間又は2つ以上のポリヌクレオチド配列間における、それらの配列を比較して決定されるとおりの関係である。当該技術分野では、同一性はまた、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間における、場合によってはかかる配列のストリング間のマッチにより決定されるとおりの、配列の関連性の程度も意味する。同一性及び類似度は、限定はされないが、1ComputationalMolecularBiologyLesk,A.M.,Ed.OxfordUniversity:NY1988;2Biocomputing:InformaticsandGenomeProjectsSmith,D.W.,Ed.Academic:NY1993;3ComputerAnalysisofSequenceData,PartIGriffin,A.M.,andGriffin,H.G.,Eds.Humania:NJ1994;4SequenceAnalysisinMolecularBiologyvonHeinje,G.,Ed.Academic1987;及び5SequenceAnalysisPrimerGribskov,M.andDevereux,J.,Eds.Stockton:NY1991に記載されるものを含め、公知の方法によって容易に計算することができる。同一性の好ましい決定方法は、試験する配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性及び類似度の決定方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコードとして体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.,Madison,WIのMegAlign商標プログラムを用いて実行されてもよい。配列の多重アラインメントは、数種類のアルゴリズムを包含するClustalアラインメント法を用いて実行され、そのアルゴリズムには、ClustalVという名称のアラインメント方法Higginsetal.,CABIOS.5:151-153,1989;Higginsetal.,Comput.Appl.Biosci.,8:189-191,1992により記載されるに対応し、且つLASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.のMegAlign商標プログラムに含まれるClustalVアラインメント法が含まれる。多重アラインメントについて、デフォルト値はギャップペナルティ=10及びギャップ長ペナルティ=10に対応する。Clustal法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセント計算のためのデフォルトパラメータは、Kタプル=1、ギャップペナルティ=3、ウィンドウ=5及びダイアゴナルセーブド=5である。核酸についてのこれらのパラメータは、Kタプル=2、ギャップペナルティ=5、ウィンドウ=4及びダイアゴナルセーブド=4である。ClustalVプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの配列距離テーブルを見ることにより同一性パーセントを得ることが可能である。加えて、ClustalWアラインメント法が利用可能であり、これはClustalWという名称のアラインメント方法に対応しHigginsetal.,CABIOS.5:151-1531989;Higginsetal.,Comput.Appl.Biosci.8:189-1911992により記載される、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートDNASTARInc.のMegAlign商標v6.1プログラムに含まれる。多重アラインメントのデフォルトパラメータギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.2、ディレイディバージェント配列DelayDivergenSeqs=30、DNAトランジションウェイト=0.5、タンパク質ウェイト行列=Gonnetシリーズ、DNAウェイト行列=IUB。ClustalWプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの配列距離テーブルを見ることにより同一性パーセントを得ることが可能である。当業者には、他の種からのポリペプチドの同定において多くの配列同一性レベルが有用であることが十分に理解され、ここでかかるポリペプチドは、同じ若しくは類似した機能又は活性を有する。有用な同一性パーセントの例としては、限定はされないが、24、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、又は95が挙げられ、又は本発明の説明において24から100までの任意の整数の百分率、例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99が有用であり得る。好適な核酸断片は上記の相同性を有するのみならず、典型的には、少なくとも50アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、又は少なくとも250アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。用語配列分析ソフトウェアは、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが:1GCGプログラムスイートWisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroupGCG,Madison,WI;2BLASTP、BLASTN、BLASTXAltschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403-4101990;3DNASTARDNASTAR,Inc.Madison、WI;4SequencherGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI;及び5スミス-ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだFASTAプログラムW.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.]1994,MeetingDate1992,111-20.Editors:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NYを挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、分析に配列分析ソフトウェアが使用される場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムのデフォルト値に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるときデフォルト値は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味する。本明細書で用いられる標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989以下、Maniatisにより;及びSilhavy,T.J.,Bennan,M.L.andEnquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1984により;及びAusubel,F.M.etal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,刊行元GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience1987により記載されている。さらなる方法は、MethodsinEnzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiologyPartA,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.FinkEds.,ElsevierAcademicPress,SanDiego,CAにある。他の分子ツール及び技法が当該技術分野において公知であり、それには、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応PCRによるスプライシングYu,etal.2004FungalGenet.Biol.41:973-981、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeのURA3遺伝子座における突然変異のポジティブ選択Boeke,J.D.etal.1984Mol.Gen.Genet.197,345-346;MARomanos,etal.NucleicAcidsRes.1991January11;191:187、cre-lox部位特異的組換え系並びに突然変異体lox部位及びFLP基質突然変異Sauer,B.1987MolCellBiol7:2087-2096;Senecoff,etal.1988JournalofMolecularBiology,Volume201,Issue2,Pages405-421;Albert,etal.1995ThePlantJournal.Volume7,Issue4,649-659頁、シームレス遺伝子欠失Akada,etal.2006Yeast;235:399-405、及びギャップ修復方法論Maetal.,Genetics58:201-216;1981が含まれる。ピルベートからアセトラクテートへの変換による生合成経路生成微生物細胞は糖類からピルベートを生成し、次にピルベートが、図1に示すものを含む細胞代謝の多くの経路で利用される。微生物宿主細胞は、数多くの望ましい生成物を生成するように操作することができ、最初の生合成経路ステップは内因性ピルベートからアセトラクテートへの変換である。イソブタノールを合成するように操作された生合成経路図2が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20070092957号明細書に記載されており、2-ブタノール及び2-ブタノンを合成するように操作された生合成経路図3が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20070259410号明細書及び同第20070292927号明細書に記載されている。生成物2,3-ブタンジオールは、米国特許出願公開第20070292927号明細書に記載される生合成経路の中間体である。これらの経路の各々が、アセト乳酸シンターゼによりピルベートをアセトラクテートに変換する最初のステップを有する。従って、これらの生合成経路からの生成物収率は、一部には、ピルベートから生成され得るアセトラクテートの量及び利用可能なピルベートの量に依存し得る。本出願者らは、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が、ピルベート利用生合成経路の生成物例えば、イソブタノールなどのブタノールの生成の改善を呈することを見出した。本出願者らは、本発明の宿主細胞が、ポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない細胞と比較して、生成物力価の上昇、生成速度の増加又は細胞密度の増加によって示されるとおりのブタノール生成の改善を呈することを見出した。実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路と、宿主細胞の染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関する。実施形態において、ポリヌクレオチドは宿主細胞にとって異種である。実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。実施形態において、ポリヌクレオチドの1つ以上は宿主細胞の染色体に組み込まれる。アセト乳酸シンターゼの発現及び組込み本発明の実施形態において、ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、アセト乳酸シンターゼである。本発明の宿主細胞における内因性アセト乳酸シンターゼは、ミトコンドリアゲノムにおいてコードされ、ミトコンドリアで発現し得る。実施形態では、本発明の組換え宿主細胞酵母などを調製するため、アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現を提供する遺伝子修飾が作製される。かかる実施形態において、アセト乳酸シンターゼは核から発現し、ミトコンドリア標的シグナルは含まれず、従って酵素がサイトゾルに留まるサイトゾル局在化。アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現は、米国特許出願公開第20090305363号明細書に記載されている。アセトヒドロキシ酸シンターゼと称することもできるアセト乳酸シンターゼ酵素は、EC2.2.1.6に属し2002年に4.1.3.18から変更された、周知されている。これらの酵素は、タンパク質を新生するアミノ酸ロイシン及びバリンの生合成経路、並びに数多くの生物における2,3-ブタンジオール及びアセトインの発酵生成経路に関与する。当業者は、様々な供給源から単離されたアセト乳酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列相同性とは無関係に本発明において有用であり得ることを理解するであろう。好適なアセト乳酸シンターゼ酵素は、定義に記載されるとおりの数多くの供給源から利用可能である。バチルス属BacillusのalsS及びクレブシエラ属KlebsiellaのbudBによりコードされるものなどの、ケトブチレートと比べてピルベートに対して基質選択性を有するアセト乳酸シンターゼ酵素活性が、特に有用であるGollopetal.,J.Bacteriol.1726:3444-3449,1990;及びHoltzclawetal.,J.Bacteriol.1213:917-922,1975。アセト乳酸シンターゼはよく知られているため、且つそのゲノム配列決定が一般的であるため、当業者はバイオインフォマティクス手法を用いた配列類似度に基づき、好適なアセト乳酸シンターゼを容易に同定し得る。典型的には、本明細書に提供されるものなどの既知のアセト乳酸シンターゼアミノ酸配列を含む公的に利用可能なデータベースのBLAST上記に記載される検索を用いて、本株で用い得るアセト乳酸シンターゼ、及びそれらのコード配列が同定される。例えば、B.スブチリスB.subtilisAlsS配列の最も近傍の100個であるアセト乳酸シンターゼを、図4の系統樹に示す。この樹には、同定された配列間の相同性関係を示す。これらの配列のなかには40の同一性を有するものがあるが、それらはアセト乳酸シンターゼであると確認されている。表1におけるアセト乳酸シンターゼタンパク質のいずれかと少なくとも約70~75、75~80、80~85、85~90、90~95又は少なくとも約98又は99の配列同一性を有するアセト乳酸シンターゼタンパク質、又は図4に示されるアセト乳酸シンターゼタンパク質のいずれかを、本株で使用することができる。同一性は、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、及びタンパク質ウェイト行列Gonnet250シリーズのデフォルトパラメータを用いたClustalWアラインメント法に基づく。アセト乳酸シンターゼals活性のサイトゾル発現をもたらすために用い得るアセト乳酸シンターゼをコードする配列の例を、表1に掲載する。酵母サイトゾル発現に用い得るさらなるアセト乳酸シンターゼコード配列は、文献及び当業者に周知されているバイオインフォマティクスデータベースにおいて特定することができ、alsタンパク質についての一部のコード領域を、供給源生物ごとに図4に示す。EC番号2.2.1.6を有する任意のalsが当業者によって同定され得るとともに、本宿主細胞において用いられ得る。加えて、本明細書に記載される配列又は当該技術分野で挙げられる配列を使用して、天然における他の相同体を同定することができる。例えば、本明細書に記載されるアセト乳酸シンターゼコード核酸断片の各々を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離し得る。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当該技術分野において公知である。配列依存性プロトコルの例としては、限定はされないが、1核酸ハイブリダイゼーション方法;2核酸増幅技法の様々な使用によって例示されるとおりの、DNA及びRNA増幅方法[例えば、ポリメラーゼ連鎖反応PCR、Mullisetal.、米国特許第4,683,202号明細書;リガーゼ連鎖反応LCR、Taboretal.,Proc.Acad.Sci.USA82:1074,1985;又は鎖置換増幅SDA、Walkeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392,1992];及び3ライブラリ構築及び相補性によるスクリーニング方法が挙げられる。例えば、本核酸断片の全て又は一部をDNAハイブリダイゼーションプローブとして使用して、当業者に公知の方法を用いて任意の所望の生物由来のライブラリをスクリーニングすることにより、本明細書に記載されるアセト乳酸シンターゼコード遺伝子と同様のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離することができる。開示される核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野において公知の方法により設計及び合成することができるManiatis、前掲。さらに、配列全体を直接使用して、当業者に公知の方法例えば、ランダムプライマーDNA標識法、ニックトランスレーション又は末端標識法によりDNAプローブを合成することができ、又は利用可能なインビトロ転写系を用いてRNAプローブを合成することができる。加えて、本配列の一部又は完全長を増幅するように特異的プライマーを設計及び使用することができる。得られる増幅産物を増幅反応中に直接標識するか、又は増幅反応後に標識し、プローブとして用いることで、適切なストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションにより完全長DNA断片を単離することができる。典型的に、PCRタイプの増幅技法では、プライマーは互いに異なる配列を有し、相補的ではない。所望の試験条件によっては、プライマーの配列は、効率的であるとともに忠実でもある標的核酸複製をもたらすように設計しなければならない。PCRプライマーの設計方法は一般的であり、当該技術分野において公知であるTheinetal.,TheuseofoligonucleotidesasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders,inHumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.DavisEd.,1986,pp.33-50,IRL:Herndonetal.,InMethodsinMolecularBiology,White,B.A.Ed.,1993Vol.15,pp.31-39,PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.Humania:Totowa,NJ。概して記載される配列の2つの短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用して、DNA又はRNAから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸断片のライブラリで実施することもでき、ここで一方のプライマーの配列は記載される核酸断片に由来し、他方のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコードするmRNA前駆体の3’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。或いは、第2のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば、当業者は、RACEプロトコルFrohmanetal.,PNASUSA85:89981988に従い、PCRを用いて転写物の単一の点と3’末端又は5’末端との間の領域のコピーを増幅することにより、cDNAを産生することができる。この配列から、3’方向及び5’方向の向きのプライマーを設計することができる。市販の3’RACE又は5’RACEシステム例えば、BRL,Gaithersburg,MDを用いて、特定の3’又は5’cDNA断片を単離することができるOharaetal.,PNASUSA86:5673,1989;Lohetal.,Science243:217,1989。或いは、記載されるアセト乳酸シンターゼコード配列を、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬として用いることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素には、プローブ、目的の遺伝子又は遺伝子断片を含むと考えられる試料、及び特定のハイブリダイゼーション方法が含まれる。プローブは、典型的には、検出しようとする核酸配列と相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列とハイブリダイズ可能である。プローブ長は5塩基から数万塩基まで様々であってよく、行われる具体的な試験に依存し得る。典型的には約15塩基~約30塩基のプローブ長が好適である。しかしながら、検出しようとする核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。加えて、プローブと標的配列との間の相補性は、完全でなくともよい。ハイブリダイゼーションは相補性が不完全な分子間でも確かに起こり、その結果、ハイブリダイズされた領域における一定の割合の塩基が適切な相補塩基と対を形成しないことになる。ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。典型的にはプローブ及び試料が、核酸ハイブリダイゼーションを許容し得る条件下で混合されなければならない。これは、適切な濃度及び温度条件下、無機塩又は有機塩の存在下でプローブと試料を接触させることを含む。プローブ及び試料核酸は、プローブと試料核酸との間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起こり得るのに十分な長い時間にわたり接触していなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間は、混合物中のプローブ又は標的の濃度によって決まり得る。プローブ又は標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤が添加されてもよい。カオトロピック剤はヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤により、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブを高感度でストリンジェントにハイブリダイズすることが可能となるVanNessetal.,Nucl.AcidsRes.19:5143-5151,1991。好適なカオトロピック剤としては、限定はされないが、特に、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム及びトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。カオトロピック剤は約3Mの最終濃度で存在し得る。必要であれば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを、典型的には30~50v/vで加えることができる。様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的には、こうした溶液は、約20~60体積、好ましくは30体積の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約30~50v/vのホルムアミド、約0.15~1Mの塩化ナトリウム、約0.05~0.1Mの緩衝液例えば、クエン酸ナトリウム、トリス-HCl、PIPES又はHEPESpH範囲約6~9、約0.05~0.2のデタージェント例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、又は0.5~20mMのEDTA、FICOLLPharmaciaInc.約300~500kdal、ポリビニルピロリドン約250~500kdal及び血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、非標識担体核酸約0.1~5mg/mL、断片化された核DNA例えば、仔ウシ胸腺又はサケ精子DNA、又は酵母RNA、及び場合により約0.5~2wt/volグリシンも含まれる。様々な極性の水溶性又は膨潤性作用剤例えば、ポリエチレングリコール、アニオン性ポリマー例えば、ポリアクリレート又はポリメチルアクリレート及びアニオン性サッカリドポリマー例えば、硫酸デキストランを含む体積排除剤など、他の添加剤もまた含まれ得る。核酸ハイブリダイゼーションは、サンドイッチアッセイフォーマットなどの様々なアッセイフォーマットに適合する。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合する。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は、固体支持体である。固体支持体は、それに吸着した、又はそれに共有結合した、固定化された核酸プローブを有し、核酸プローブは標識されておらず、且つ配列のある部分と相補的である。アセト乳酸シンターゼのサイトゾル発現は、ミトコンドリア標的シグナル配列を含まない、アセト乳酸シンターゼタンパク質をコードする配列を含む遺伝子で形質転換することにより達成され得る。酵母における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である例えば、MethodsinEnzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiologyPartA,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.FinkEds.,ElsevierAcademicPress,SanDiego,CAを参照のこと。酵母における遺伝子の発現には典型的には、目的のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、及び転写ターミネーターが必要である。アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の発現カセットの構築においては、限定はされないが、構成的プロモーターFBA、GPD1、ADH1、及びGPM、並びに誘導性プロモーターGAL1、GAL10、及びCUP1を含む多くの酵母プロモーターを用いることができる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターUASPGK1-FBA1p配列番号238、UASPGK1-ENO2p配列番号239、UASFBA1-PDC1p配列番号240、UASPGK1-PDC1p配列番号241、及びUASPGK-OLE1p配列番号242が挙げられる。好適な転写ターミネーターとしては、限定はされないが、FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、及びADH1が挙げられる。好適なプロモーター、転写ターミネーター、及びコード領域は、酵母2ミクロンプラスミドにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができるLudwig,etal.Gene,132:33-40,1993;米国特許出願公開第20080261861A1号明細書。好適なプロモーター、転写ターミネーター、及びコード領域は、実施例に記載されるとおり、大腸菌E.coli-酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。このようなベクターは、大腸菌E.coli株及び酵母株のいずれにおける菌株の増殖も可能にする。典型的には、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主における自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。酵母で典型的に用いられるプラスミドは、シャトルベクターpRS423、pRS424、pRS425、及びpRS426AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MDであり、これらは、大腸菌E.coli複製起点例えば、pMB1、酵母2μ複製起点、及び栄養選択用マーカーを含む。これらの4つのベクターの選択マーカーは、His3ベクターpRS423、Trp1ベクターpRS424、Leu2ベクターpRS425及びUra3ベクターpRS426である。ポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌E.coliにおける標準的な分子クローニング技術によるか、或いは酵母におけるギャップ修復組換え法により行うことができる。ギャップ修復クローニング手法は、酵母における高度に効率的な相同組換えを利用する。典型的には、酵母ベクターDNAが消化され例えばその多重クローニング部位において、その配列にギャップが作り出される。目的のインサートDNAが複数産生され、これらのインサートDNAは、5’末端及び3’末端の両方に、互いに及びベクターDNAの5’末端及び3’末端と連続的に重複する≧21bp配列を含む。例えば、遺伝子Xの酵母発現ベクターを構築するには、発現カセット用に酵母プロモーター及び酵母ターミネーターが選択される。このプロモーター及びターミネーターは酵母ゲノムDNAから増幅され、及び遺伝子Xは、その供給源生物からPCR増幅されるか、或いは遺伝子X配列を含むクローニングベクターから得られるかのいずれかである。直鎖化されたベクターの5’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Xとの間、遺伝子Xとターミネーター配列との間、及びターミネーターと直鎖化されたベクターの3’末端との間に、少なくとも21bpの重複配列が存在する。次にギャップ含有gappedベクター及びインサートDNAが酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を許容する適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。正しいインサートの組み合わせの存在は、PCRマッピングにより、選択した細胞から調製されたプラスミドDNAを用いて確認することができる。次に、酵母から単離されたプラスミドDNA通常は濃度が低いを大腸菌E.coli株、例えばTOP10に形質転換し、続いてミニプレップ及び制限マッピングによってプラスミドコンストラクトをさらに確認することができる。最後にコンストラクトを配列分析によって確認することができる。ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノムへの組込みもまた、酵母の相同組換えシステムを利用する。典型的には、コード領域と、さらに制御エレメントプロモーター及びターミネーター及び栄養要求マーカーを含むカセットが、カセットとハイブリダイズし、且つ挿入が所望されるゲノム範囲の5’側及び3’側領域と配列相同性を有する40~70塩基対を含むプライマーを使用して、高忠実度DNAポリメラーゼでPCR増幅される。次にPCR産物が酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。例えば、遺伝子Xを染色体位置Yに組み込むため、プロモーター-コード領域X-ターミネーターコンストラクトがプラスミドDNAコンストラクトからPCR増幅され、SOEオーバーラップ伸長によるスプライシングPCRによるか、或いは一般的な制限消化及びクローニングによって、独立栄養マーカーURA3などとつなぎ合わされる。プロモーター-コード領域X-ターミネーター-URA3領域を含む完全なカセットが、酵母染色体上の位置Yの5’側及び3’側領域と相同性を有する40~70bpを含むプライマー配列と共にPCR増幅される。PCR産物は酵母に形質転換され、ウラシル不含の成長培地で選択される。形質転換体は、コロニーPCRによるか、或いは染色体DNAのダイレクトシーケンシングによって確認することができる。或いは、組込みベクターは大腸菌E.coliで構築して増殖させてもよい。任意の好適な大腸菌E.coliクローニングベクターに、染色体への組込みに必要なエレメント少なくとも1つの宿主特異的な標的配列及び酵母選択可能マーカーを加えることができる。大腸菌E.coli宿主からベクターを調製した後、それを宿主特異的標的配列内での制限消化によって直鎖化し、酵母に形質転換することができる。直鎖化されたベクターと天然の標的配列との間の相同組換えにより、ベクター全体の組込みが生じ得るRothstein,R.,MethodsinEnzymology,Vol194,pp.281-301。形質転換体は、栄養要求マーカーについて選択することにより得られ、PCR法又はダイレクトシーケンシングにより確認される。実施形態において、本発明は組換え宿主細胞を生成する方法に関し、この方法は、iピルベート利用生合成経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと;iiピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するペプチドをコードするポリヌクレオチドとで宿主細胞を形質転換するステップを含み;ここでiiのポリヌクレオチドは染色体に組み込まれる。生合成経路ブタノールの生成に好適な生合成経路は、当該技術分野において公知であり、特定の好適な経路が本明細書に記載される。一部の実施形態において、イソブタノールを含めたブタノールの生合成経路は、宿主細胞にとって異種である少なくとも1つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種である2つ以上の遺伝子を含む。一部の実施形態において、ブタノール生合成経路は、生合成経路の全てのステップに対応するポリペプチドをコードする異種遺伝子を含む。本明細書で使用されるとき、異種とは、天然の遺伝子、及び本明細書における目的のため修飾されている非天然の遺伝子の双方を指す。有利には、本発明の宿主細胞でピルベート利用生合成経路の生成物を産生することができる。かかる生成物のリストには、限定はされないが、2,3-ブタンジオール、2-ブタノン、2-ブタノール、及びイソブタノールが含まれる。実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、その経路の基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む。実施形態では、1つ以上のポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれる。一部の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと;ピルベート利用生合成経路のステップの変換を触媒する第3のポリペプチドをコードする第3の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;ここで第1及び第2の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれ;第3の異種ポリヌクレオチドは宿主細胞の染色体に組み込まれず;及び第1、第2、及び第3のポリペプチドはピルベート利用生合成経路の異なるステップを触媒する。一部の実施形態において、本発明は、aピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;bα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドと;ca又はbの変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第3のポリペプチドをコードする第3の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;ここで第1及び第2の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ;第3の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず;及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。一部の実施形態において、本発明は、aα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒する第1のポリペプチドをコードする第1の異種ポリヌクレオチドと;baの変換ではないイソブタノール生合成経路のステップの変換を触媒する第2のポリペプチドをコードする第2の異種ポリヌクレオチドとを含む組換え宿主細胞に関し;ここで第1の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれ;第2の異種ポリヌクレオチドは染色体に組み込まれず;及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。ピルベートからアセトラクテートに変換するステップから始まるイソブタノール合成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20070092957号明細書に開示されている。米国特許出願公開第20070092957号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的なイソブタノール生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる:-例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒されるとおりのアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの変換図2の経路ステップb;-例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換図2の経路ステップc;-例えば分枝鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換図2の経路ステップd;及び-例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりのイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換図2の経路ステップe。本明細書に記載される基質から生成物への変換に用いることのできる遺伝子及びポリペプチド、並びにかかる遺伝子及びポリペプチドを同定する方法は、本明細書及び/又は当該技術分野において、例えばイソブタノールについては本実施例及び米国特許第7,851,188号明細書に記載されている。ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素については、米国特許出願公開第20080261230A1号明細書、同第20090163376A1号明細書、同第20100197519A1号明細書、及び国際公開第2011/041415号パンフレットに記載されている。そこで開示されるKARIの例は、ラクトコッカスラクティスLactococcuslactis、ビブリオコレラエVibriocholera、緑膿菌PseudomonasaeruginosaPAO1、並びに蛍光菌PseudomonasfluorescensPF5突然変異体由来のものである。KARIは、アナエロスティペスカッカエAnaerostipescaccaeKARI変異体K9G9及びK9D3それぞれアミノ酸配列の配列番号225及び224を含む。米国特許出願公開第20100081154A1号明細書、及び米国特許第7,851,188号明細書は、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutans由来のDHADを含めた、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼDHADについて記載している。α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するのに好適なポリペプチドとしては、それぞれ配列番号247、48、及び248を有するリステリアグレイListeriagrayi、ラクトコッカスラクティスLactococcuslactis、及びマクロコッカスカセオリチクスMacrococcuscaseolyticus由来のものが挙げられる。米国特許出願公開第20090269823A1号明細書は、アクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidans由来のSadB、アルコールデヒドロゲナーゼADHについて記載している。アルコールデヒドロゲナーゼにはまた、ウマ肝臓ADH及びベイジェリンキアインディカBeijerinkiaindicaADHタンパク質配列番号237も含まれる。上記に参照される出願及び特許の各々は、参照により本明細書に援用される。また、米国特許出願公開第20070092957号明細書には、開示される生合成経路を用いたイソブタノール生成のための、キメラ遺伝子の構築、及びサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにより例示される酵母の遺伝子操作についても記載される。一部の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、酵母細胞にとって異種である少なくとも1つの遺伝子、少なくとも2つの遺伝子、少なくとも3つの遺伝子、又は少なくとも4つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、組換え宿主細胞は、イソブタノール生合成経路の基質から生成物への変換それぞれについての異種遺伝子を含む。実施形態において、アセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチド、及び/又はイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドは、NADHを補因子として利用する能力を有する。ピルベートをアセトラクテートに変換するステップから始まる2-ブタノン及び2-ブタノール合成のための生合成経路が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20070259410号明細書及び同第20070292927号明細書に開示されている。開示されている2-ブタノン及び2-ブタノール生合成経路の図を、図3に提供する。2-ブタノンは、最後に示されている、2-ブタノンを2-ブタノールに変換するステップが省略されるときに生じる生成物である。本明細書に開示される株における2-ブタノン又は2-ブタノールの生成では、アセトラクテートの利用率を増加させることが有益である。米国特許出願公開第20070292927号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的な生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる:-例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのアセトラクテートからアセトインへの変換図3のステップb;-例えばブタンジオールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりのアセトインから2,3-ブタンジオールへの変換図3のステップi;-例えばジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼにより触媒されるとおりの2,3-ブタンジオールから2-ブタノンへの変換図3のステップj;及び-例えばブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの2-ブタノンから2-ブタノールへの変換図3のステップf。これらの酵素の発現に使用することのできる遺伝子が、米国特許出願公開第20070292927号明細書に記載されている。酵母のこの経路におけるロゼブリアイヌリニボランスRoseburiainulinivorans由来のブタンジオールデヒドラターゼ、RdhtAタンパク質配列番号32、コード領域配列番号31の使用が、米国特許出願公開第20090155870号明細書に開示されている。この酵素は、ロゼブリアイヌリニボランスRoseburiainulinivorans由来のブタンジオールデヒドラターゼリアクティバーゼreactivase、RdhtBタンパク質配列番号34、コード領域配列番号33と併せて使用される。米国特許出願公開第20070292927号明細書に記載されるとおり、アセトラクテートを用いる例示的な生合成経路におけるステップには、以下の変換が含まれる:-例えばアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりのα-アセトラクテートからアセトインへの変換図3のステップb;-例えばアセトインアミナーゼにより触媒されるとおりのアセトインから3-アミノ-2-ブタノールへの変換図3のステップc;-例えばアミノブタノールキナーゼにより触媒されるとおりの3-アミノ-2-ブタノールから3-アミノ-2-ブタノールホスフェートへの変換図3のステップd;-例えばアミノブタノールリン酸ホスホル-リアーゼphosphor-lyaseにより触媒されるとおりの3-アミノ-2-ブタノールホスフェートから2-ブタノンへの変換図3のステップe;及び-例えばブタノールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりの2-ブタノンから2-ブタノールへの変換図3のステップf。2-ブタノンは、最後に示されている、2-ブタノンを2-ブタノールに変換するステップが省略されるときに生じる生成物である。本明細書に開示される株における2-ブタノン又は2-ブタノールの生成では、アセトラクテートの利用率を増加させることが有益である。最後の、2-ブタノンを2-ブタノールに変換するステップには、米国特許出願公開第20090269823号明細書に開示されるアクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidansとして同定される細菌の環境単離株から単離される新規ブタノールデヒドロゲナーゼDNA:配列番号35、タンパク質配列番号36が有用である。また、米国特許出願公開第20090155870号明細書には、米国特許出願公開第20070292927号明細書に開示される生合成経路を用いた2-ブタノール生成のためのキメラ遺伝子の構築及び酵母の遺伝子操作についても記載される。2,3-ブタンジオールは、この2-ブタノール経路の中間体であり、その合成におけるステップもまた上記に記載される。本発明の実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、2-ブタノール又は2-ブタノンを含む生成物を形成する。実施形態において、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。実施形態において、ブタノール生合成経路は、2-ブタノール生合成経路又はイソブタノール生合成経路である。実施形態において、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド;又はvイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからイソブチリル-CoA;vイソブチリル-CoAからイソブチルアルデヒド;又はviイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレート;iii2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレート;ivα-ケトイソバレレートからバリン;vバリンからイソブチルアミン;viイソブチルアミンからイソブチルアルデヒド;又はviiイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから2,3-ブタンジオール;又はiv2,3-ブタンジオールから2-ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞は、iピルベートからアセトラクテート;iiアセトラクテートからアセトイン;iiiアセトインから2,3-ブタンジオール;iv2,3-ブタンジオールから2-ブタノン;又はv2-ブタノンから2-ブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、aピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドであって、染色体に組み込まれるポリヌクレオチドと;bアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと;c2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと;dα-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドとを含み、ここで宿主細胞はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まず;及び宿主細胞はイソブタノールを生成する。実施形態において、アセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC1.1.1.86に対応する。実施形態において、2,3-ジヒドロキシイソバレレートからα-ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC4.2.1.9に対応する。実施形態において、α-ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC4.1.1.72又は4.1.1.1に対応する。他の実施形態において、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドは、EC番号EC1.1.1.265、1.1.1.1又は1.1.1.2に対応する。本発明の他の実施形態において、本明細書に記載される生合成経路ステップのいずれかの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの1つ以上は、プラスミド上にある。実施形態において、本明細書に記載される生合成経路ステップのいずれかの変換を触媒するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドは、PDC1-TRX1遺伝子間領域で染色体に組み込まれる。他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドの発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドは、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼGPDである。実施形態において、宿主細胞は、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び/又は置換を含む。実施形態において、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドは、EC番号1.1.1.8に対応する。実施形態において、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、GPD1又はGPD2である。実施形態において、グリセロール-3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、表2のGPD配列を含む。宿主細胞に対するかかる修飾等については、米国特許出願公開第20090305363号明細書に記載されている。他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、鉄調節タンパク質の発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、本発明の宿主細胞は、鉄-硫黄Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現が低下し、又は実質的に消失していてもよい。実施形態において、組換え宿主細胞は、aジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチド;及びbiFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも1つの欠失、突然変異、及び/又は置換;及び/又はiiFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、AFT1核酸配列番号227、アミノ酸配列番号228、AFT2配列番号229及び230、FRA2配列番号231及び232、GRX3配列番号233及び234、又はCCC1配列番号235及び236によりコードされる。実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、構成的突然変異体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、又はAFT1C293Fである。実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドは、AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5、又はそれらの組み合わせから選択される。実施形態において、宿主細胞は、鉄調節タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び/又は置換を含む。実施形態において、宿主細胞は、Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの欠失、突然変異、及び/又は置換を含む。実施形態において、Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、国際公開第2011/103300号パンフレットに開示されるとおりの配列を含む。本明細書に提供されるとおりのイソブタノール生合成経路などのブタノール生合成経路を含む宿主細胞が、1つ以上の追加的な修飾をさらに含み得ることは理解されるであろう。米国特許出願公開第20090305363号明細書参照によって援用されるは、アセト乳酸シンターゼがサイトゾル限局的に発現し、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的に消失するように酵母を操作することによる、ピルベートからアセトラクテートへの変換の増加を開示している。グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾及び/又はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊、若しくは米国特許出願公開第20090305363号明細書参照により本明細書に援用されるに記載されるとおりの、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも1つの遺伝子における破壊、米国特許出願公開第20100120105号明細書参照により本明細書に援用されるに記載されるとおりの、エントナー-ドゥドロフ経路を通じた炭素フラックスの増加又は還元当量の平衡をもたらす宿主細胞に対する修飾。他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼacetolactatereductase活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも1つの欠失、突然変異、及び/又は置換が含まれる。実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisaeのYMR226C配列番号226又はその相同体である。さらなる修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び/又はアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、及び/又は置換が含まれる。実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae由来のALD6配列番号223又はその相同体である。酵母生成宿主細胞がpdc-である、グルコース抑制を低下させる効果を有する遺伝子修飾が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20110124060号明細書に記載されている。加えて、宿主細胞は、参照により本明細書に援用される2011年6月15日に出願された米国特許出願第13/161,168号明細書に記載されるとおりの、ホスホケトラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド及び/又はホスホトランスアセチラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み得る。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の低下微生物細胞における内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性はピルベートをアセトアルデヒドに変換し、次にアセトアルデヒドはエタノールに変換されるか、又はアセテートを介してアセチル-CoAに変換される図1を参照。微生物細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする1つ以上の遺伝子を有する。例えば、酵母では、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactisにおけるピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする1つの遺伝子が存在する一方、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeにおけるPDC1、PDC5、及びPDC6遺伝子によりコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの3つのアイソザイム、並びにピルビン酸デカルボキシラーゼ調節遺伝子PDC2が存在する。PDC6由来のピルビン酸デカルボキシラーゼの発現は最小限である。本発明の実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、又はピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を調節する遺伝子の破壊により低下したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し得る。例えば、S.セレビシエS.cerevisiaeにおいては、PDC1及びPDC5遺伝子、又は3つ全ての遺伝子が破壊される。加えて、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、S.セレビシエS.cerevisiaeにおけるPDC2調節遺伝子を破壊することによっても低下させることができる。他の酵母では、PDC1又はPDC5と少なくとも約80~85、85~90、90~95、又は少なくとも約98の配列同一性を有するものなどの、ピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードする遺伝子を破壊してもよい。ピルビン酸デカルボキシラーゼコード遺伝子の破壊によりピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下した酵母株の例は、例えば、サッカロミセス属SaccharomycesについてFlikweertetal.Yeast,12:247-257,1996に、クルイベロミセス属KluyveromycesついてBianchietal.Mol.Microbiol.,191:27-36,1996に、及びHohmannMolGenGenet.,241:657-666,1993における調節遺伝子の破壊など、報告がなされている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないサッカロミセス属Saccharomycesの株が、ATCCから受託番号200027及び200028により入手可能である。ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現は、同様にアセト乳酸シンターゼ発現及びアセトラクテートに由来する化合物を生成するための他の生合成経路酵素コード遺伝子で操作される任意の宿主細胞で低下させることができる。破壊の標的とし得る酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の例を、表2に掲載する配列番号50、52、54、56、58、60、62、64及び66。表2に掲載されるピルビン酸デカルボキシラーゼ配列番号51、53、55、57、59、61、63、65及び67と少なくとも約80~85、85~90、90~95、又は少なくとも約98若しくは99の配列同一性を有するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするものなど、他の標的遺伝子を文献中及び当業者に周知されるバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。加えて、本明細書に記載される配列又は当該技術分野で挙げられる配列を使用して、アセト乳酸シンターゼコード遺伝子の同定について上記に記載したとおりに、他の酵母株における相同体を同定することができる。或いは、ピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列はよく知られているため、且つ酵母のゲノムの配列決定が一般的であるため、バイオインフォマティクス手法を用いた配列類似度に基づき、好適なピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子標的を同定することができる。以下の酵母株は、ゲノムが完全に配列決定及びアノテートされており、公的に利用可能である:アシュビアゴッシピイAshbyagossypiiATCC10895、カンジダグラブラタCandidaglabrataCBS138、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactisNRRLY-1140、ピキアスティピティスPichiastipitisCBS6054、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeS288c、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe972h-、及びヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaCLIB122。典型的には、本明細書に提供されるものなどの、既知のピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列又はピルビン酸デカルボキシラーゼアミノ酸配列による公的に利用可能なデータベースのBLAST上記に記載される検索を用いて、他の酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼコード配列が同定される。従って、本明細書に開示されるピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質配列番号51、53、55、57、59、61、63、65及び67のいずれかと少なくとも約70~75、75~80、80~85、85~90、90~95又は少なくとも約98若しくは99の配列同一性を有するピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質を提供することは、本発明の範囲内にある。同定は、ギャップペナルティ=10、ギャップ長ペナルティ=0.1、及びタンパク質ウェイト行列Gonnet250シリーズのデフォルトパラメータを用いるClustalWアラインメント法に基づく。実施形態において、本発明の宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、及び/又は鉄-硫黄Fe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現が低下しているか、又は実質的に消失していてもよい。他の実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドに、欠失、突然変異、及び/又は置換を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする遺伝子は、任意の宿主細胞において遺伝子修飾を用いて破壊することができる。標的遺伝子を遺伝子修飾する多くの方法が当業者に公知であり、それらを本酵母株の作製に用いることができる。標的タンパク質の発現を低下又は消失させるために用いることのできる修飾は、限定はされないが、遺伝子全体又は遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現しない、又はより低いレベルで発現するように遺伝子にプロモーター又はコード領域のいずれかにおいてDNA断片を挿入すること、機能タンパク質が発現しないようにコード領域に突然変異を導入して終止コドン又はフレームシフトを加えること、及び非機能性の又は酵素活性が低いタンパク質が発現するようにコード領域に1つ以上の突然変異を導入してアミノ酸を変えることを含む破壊である。加えて、アンチセンスRNA又は干渉RNAの発現により、遺伝子の発現が阻害されてもよく、及び同時抑制をもたらすコンストラクトが導入されてもよい。さらに、豊富にあるコドンがまれなコドンに置換されているために発現が低い遺伝子を合成し、内因性遺伝子をこの遺伝子に置換してもよい。かかる遺伝子は同じポリペプチドを産生するが、産生率は低くなり得る。加えて、突然変異によって転写物の合成又は安定性を低下させてもよい。同様に、タンパク質がmRNAから翻訳される効率も、突然変異により調整することができる。これらの方法は全て、既知の又は同定される遺伝子配列を利用して当業者が容易に実施できるものである。コード配列を取り囲むDNA配列もまた一部の修飾手順において有用で、酵母について、例えばサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeについて、NCBINationalCenterforBiotechnologyInformationにより整理されるGenomeProjectsのGenomeProjectID9518により整理される完全ゲノム配列でGOPID番号13838を特定することにより、利用可能である。酵母ゲノム配列のさらなる例は、ヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaの配列GOPIC番号13837、及びカンジダアルビカンスCandidaalbicansの配列GPID番号10771、10701及び16373に含まれるが挙げられる。他の酵母ゲノム配列を、当業者は公的に利用可能なデータベースに容易に見出し得る。特に、遺伝子コード配列を取り囲むDNA配列は、相同組換えを用いる修飾方法に有用である。例えば、この方法では、遺伝子隣接配列が選択可能なマーカー遺伝子を囲んで置かれ、標的遺伝子をマーカー遺伝子に置き換える相同組換えが媒介される。また、部分的な遺伝子配列及び選択可能なマーカー遺伝子を囲む遺伝子隣接配列を使用して、標的遺伝子の一部をマーカー遺伝子に置き換える相同組換えを媒介することもできる。加えて、選択可能なマーカーは、部位特異的組換え部位によって囲まれてもよく、それにより対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、後に再活性化させることなく標的遺伝子座から耐性遺伝子が切り出される。部位特異的組換えの後には、タンパク質の発現を破壊する組換え部位が残る。当業者に周知のとおり、選択可能なマーカーを切り出した後に同様に標的遺伝子に欠失が残るように相同組換えベクターを構築することができる。欠失は、Wachetal.Yeast,10:1793-1808,1994に記載されるとおり、有糸分裂組換えを用いて作製することができる。この方法は、20bp程度の短さであってよい、標的DNA配列を取り囲むゲノム領域の間に選択可能なマーカーを含むDNA断片を調製するステップを含む。このDNA断片は、マーカー遺伝子の末端とハイブリダイズし、且つ酵母ゲノムにより組み換えることのできるゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、選択可能なマーカー遺伝子をPCR増幅することにより調製することができる。直鎖状DNA断片は、効率的に酵母に形質転換してゲノムに組み換えることができ、標的DNA配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらすMethodsinEnzymology,v194,pp281-301,1991に記載されるとおり。加えて、本発明の任意の宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、鉄調節タンパク質、又はFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性は、ランダム突然変異誘発を用いて破壊することができ、続いてスクリーニングが行われ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下した株が同定される。この種の方法を用いれば、ピルビン酸デカルボキシラーゼコード領域、又はこれらの活性の発現に影響を及ぼす任意の他のゲノム領域のDNA配列が既知である必要はない。遺伝子突然変異の作成方法は、当該技術分野においては一般的で周知されており、突然変異体の作成の実施に適用され得る。一般的に用いられるランダム遺伝子修飾方法MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYに概説されるには、自発的突然変異生成、ミューテーター遺伝子により引き起こされる突然変異生成、化学的突然変異生成、紫外線又はX線照射、又はトランスポゾン突然変異生成が含まれる。酵母の化学的突然変異生成は、一般的に、以下のDNA突然変異原の一つによる細胞の処理を含む:メタンスルホン酸エチルEMS、亜硝酸、硫酸ジエチル、又はN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソ-グアニジンMNNG。これらの突然変異生成方法は、SpenceretalMutagenesisinYeast,1996,YeastProtocols:MethodsinCellandMolecularBiology.HumanaPress,Totowa,NJに概説されている。EMSによる化学的突然変異生成は、MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYに記載されるとおり行うことができる。また紫外線UV光又はX線の照射を用いて、酵母細胞にランダム突然変異誘発を生じさせることもできる。紫外線照射による突然変異生成の主要な効果は、DNA複製の忠実度を破壊するピリミジン二量体の形成である。酵母の紫外線突然変異生成のプロトコルは、Spenceretal.MutagenesisinYeast,1996,YeastProtocols:MethodsinCellandMolecularBiology.HumanaPress,Totowa,NJに見ることができる。ミューテーター表現型の導入を用いてもまた、酵母にランダム染色体突然変異を生じさせ得る。一般的なミューテーター表現型は、以下の遺伝子の1つ以上を破壊することにより得られ得る:PMS1、MAG1、RAD18又はRAD51。非ミューテーター表現型の回復は、野生型対立遺伝子を挿入することによって容易に得られ得る。これらの又は他の公知のランダム突然変異誘発法のいずれかによってもたらされる修飾された細胞の集合は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール-3-リン酸デカルボキシラーゼ、鉄調節タンパク質又はFe-Sクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドの活性の低下についてスクリーニングされ得る。宿主細胞本発明の宿主細胞は、遺伝子操作に適した任意の細胞であってよい。実施形態において、宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、又は酵母であり得る。実施形態において、宿主細胞は、クロストリジウム属Clostridium、ザイモモナス属Zymomonas、大腸菌属Escherichia、サルモネラ属Salmonella、ロドコッカス属Rhodococcus、シュードモナス属Pseudomonas、バチルス属Bacillus、ラクトバチルス属Lactobacillus、エンテロコッカス属Enterococcus、アルカリゲネス属Alcaligenes、クレブシエラ属Klebsiella、パエニバチルス属Paenibacillus、アルスロバクター属Arthrobacter、コリネバクテリウム属Corynebacterium、ブレビバクテリウム属Brevibacterium、ピキア属Pichia、カンジダ属Candida、ハンゼヌラ属Hansenula、クルイベロミセス属Kluyveromyces、又はサッカロミセス属Saccharomycesのメンバーである。他の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌Escherichiacoli、アルカリゲネスユートロフスAlcaligeneseutrophus、バチルスリケニホルミスBacilluslicheniformis、パエニバチルスマセランスPaenibacillusmacerans、ロドコッカスエリスロポリスRhodococcuserythropolis、シュードモナスプチダPseudomonasputida、バチルススブチリスBacillussubtilis、ラクトバチルスプランタルムLactobacillusplantarum、エンテロコッカスフェシウムEnterococcusfaecium、エンテロコッカスガリナルムEnterococcusgallinarium、又はエンテロコッカスフェカリスEnterococcusfaecalisである。酵母の例としては、限定はされないが、サッカロミセス属Saccharomyces、シゾサッカロミセス属Schizosaccharomyces、ハンゼヌラ属Hansenula、イサチェンキア属Issatchenkia、カンジダ属Candida、クルイベロミセス属Kluyveromyces、ヤロウイア属Yarrowia及びピキア属Pichiaが挙げられる。酵母株の例としては、限定はされないが、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、シゾサッカロミセスポンベSchizosaccharomycespombe、クルイベロミセスラクティスKluyveromyceslactis、クルイベロミセスサーモトレランスKluyveromycesthermotolerans、カンジダグラブラタCandidaglabrata、カンジダアルビカンスCandidaalbicans、ピキアスティピティスPichiastipitis及びヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaが挙げられる。一部の実施形態において、宿主細胞はサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeである。S.セレビシエS.cerevisiae酵母は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、AmericanTypeCultureCollectionRockville,MD、CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversityCentre、LeSaffre、GertStrandAB、FermSolutions、NorthAmericanBioproducts,Martrex,andLallemandを含め、様々な供給源から利用可能である。S.セレビシエS.cerevisiaeとしては、限定はされないが、BY4741、CEN.PK113-7D、EthanolRed登録商標酵母、FermPro商標酵母、Bio-Ferm登録商標XR酵母、GertStrandPrestigeバッチTurboアルコール酵母、GertStrandPotDistillers酵母、GertStrandDistillersTurbo酵母、FerMax商標Green酵母、FerMax商標Gold酵母、Thermosacc登録商標酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960、及びCBS7961が挙げられる。実施形態において、本発明の宿主細胞は通性嫌気性生物である。実施形態において、生成宿主として使用される細胞は、好ましくは生成された化学物質に対する高い耐性を有し、及び/又は高い炭水化物利用率を有し得る。これらの特徴は、突然変異生成及び選択、遺伝子操作によって付与されてもよく、又は天然であってもよい。発酵培地本発明の宿主細胞は、好適な炭素基質を含有し得る発酵培地で成長させることができる。好適な基質としては、限定はされないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース若しくはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプン若しくはセルロースなどの多糖類又はそれらの混合物、並びにチーズホエー透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの未精製混合物を挙げることができる。加えて、炭素基質はまた、二酸化炭素などの一炭素基質、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールであってもよい。1つ及び2つの炭素基質に加え、メチロトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン及び様々な代謝活性用のアミノ酸など、多数の他の炭素含有化合物を利用し得る。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが分かっているBellionetal.,Microb.GrowthC1Compd.,[Int.Symp.],7th1993,415-32.編者:Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.発行者:Intercept,Andover,UK。同様に、カンジダ属Candidaの様々な種が、アラニン又はオレイン酸を代謝し得るSulteretal.,Arch.Microbiol.153:485-4891990。従って、本発明で利用される炭素源は、多様な炭素含有基質を包含し得ることが企図される。炭素源に加え、発酵培地は、当業者に公知の、培養物の成長及び所望の生成物の生成に必要な酵素経路の促進に好適な、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤及び他の成分を含有し得る。培養条件典型的には本発明の宿主細胞は、適切な培地中、約20°C~約37°Cの範囲の温度で成長させる。本発明における好適な成長培地は、酵母窒素原基礎培地、硫酸アンモニウム、及びデキストロースを炭素/エネルギー源として含むブロス、又はほとんどのサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株増殖に最適な比のペプトン、酵母エキス、及びデキストロースのブレンドであるYPD培地など、一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成成長培地もまた使用することができ、特定の微生物の成長に適した培地は、微生物学又は発酵科学の当業者に公知であろう。発酵に好適なpH範囲は、pH3.0~pH7.5であり得る。初期条件では、pH4.5.0~pH6.5のpH範囲が用いられ得る。発酵は好気性又は嫌気性条件下で行うことができ、嫌気性又は微好気性条件が好ましい。発酵培地で生成されるブタノールの量は、当該技術分野において公知の多くの方法、例えば高速液体クロマトグラフィーHPLC又はガスクロマトグラフィーGCを用いて決定することができる。工業用バッチ及び連続発酵本発明の方法は、バッチ発酵方法を用い得る。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵開始時に設定され、発酵中に人為的な改変を受けない閉鎖系である。従って、発酵開始時、培地に所望の1つ又は複数の生物を接種し、その系に何も加えることなく発酵を生じさせる。しかしながら、典型的にはバッチ発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合にpH及び酸素濃度などの要素の制御が試みられる。バッチ系では、その系の代謝産物及びバイオマス組成物が、発酵の停止時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静止遅滞期を通じて調節され、高成長の対数期に至り、最終的に定常期に至って、そこで成長速度が低下し又は停止する。処理されない場合、定常期の細胞は最終的には死滅し得る。対数期の細胞は、概して最終生成物又は中間体の生成のバルクに関与する。標準的なバッチ系の変種がフェドバッチ系である。フェドバッチ発酵プロセスもまた本発明に好適であり、発酵の進行に伴い基質が徐々に添加される点を除いては、典型的なバッチ系を含む。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、及び培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の計測は困難であり、従ってpH、溶存酸素及びCO2などの廃ガスの分圧など、計測可能な因子の変化に基づき推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野において公知であり、参照により本明細書に援用されるThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition1989SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.、又はDeshpande,MukundV.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,1992に例を見ることができる。加えて、本発明の方法は、連続発酵方法に適合している。連続発酵は開放系であり、ここでは限定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等量の馴化培地が処理のため取り除かれる。概して連続発酵は培養物を、細胞が主に対数期で成長している一定の高密度に維持する。連続発酵により、細胞成長又は最終生成物濃度に影響を及ぼす1つの要因又は任意の数の要因を調節することが可能となる。例えば、一つの方法では、炭素源又は窒素レベルなどの制限栄養素が一定の率に維持され、且つ他のパラメータは全て調節可能とされる。他の系では、培地の濁度により計測される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼす多数の要因を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の成長条件の維持を図り、従って培地の抜き取りによる細胞損失が、発酵における細胞成長速度と釣り合わなければならない。連続発酵プロセスの栄養素及び成長因子を調節する方法、並びに生成物形成速度を最大化する技法は、工業微生物学の技術分野において公知であり、様々な方法が、Brock,前掲により詳述されている。本発明は、バッチ、フェドバッチ又は連続プロセスのいずれを用いても実施することができ、任意の公知の発酵方式が好適であり得ることが企図される。加えて、細胞が全細胞触媒として基板上に固定化され、ブタノール生成用の発酵条件に供され得ることが企図される。発酵培地からの生成物単離方法本発明の生合成経路の生成物例えば、ブタノールは、当該技術分野において公知の方法を用いて発酵培地から単離することができる。例えば、抽出、遠心、ろ過、デカンテーションなどにより、固体を発酵培地から取り除くことができる。次に、上記に記載したとおり固体を取り除く処理がなされた発酵培地から、蒸留、液液抽出、又は膜ベースの分離などの方法を用いて生成物例えば、ブタノールを単離することができる。ブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を形成するため、蒸留を用いても、当該の混合物はその共沸組成までしか分離され得ない。蒸留を別の分離方法と組み合わせて用いると、共沸近傍の分離を達成することができる。ブタノールの単離及び精製のために蒸留と組み合わせて用いることのできる方法としては、限定はされないが、デカンテーション、液液抽出、吸着、及び膜ベースの技法が挙げられる。加えて、ブタノールは、共留剤を使用する共沸蒸留を用いて単離することができる例えば、DohertyandMalone,ConceptualDesignofDistillationSystems,McGrawHill,NewYork,2001を参照のこと。ブタノール-水混合物は不均一な共沸混合物を形成するため、蒸留をデカンテーションと組み合わせて用いることで、ブタノールを単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物が凝縮され、ブタノールがデカンテーションによって発酵培地から分離される。デカントされた水相は、還流として最初の蒸留カラムに戻されてもよい。デカントされたブタノールリッチな有機相は、第2の蒸留カラムで蒸留によりさらに精製され得る。ブタノールなどの生成物はまた、液液抽出を蒸留との組み合わせで用いても、発酵培地から単離することができる。この方法では、ブタノールは、好適な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次にブタノール含有有機相を蒸留して、溶媒からブタノールが分離される。また、蒸留を吸着と組み合わせて用いてもまた、発酵培地からブタノールを単離することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に分子篩などの吸着剤を使用することにより、残りの水が除去されるAdenetal.,LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover,ReportNREL/TP-510-32438,NationalRenewableEnergyLaboratory,June2002。加えて、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて用いて、ブタノールなどの生成物を発酵培地から単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性の膜によるパーベーパレイションにより、残りの水が除去されるGuoetal.,J.Membr.Sci.245:199-210,2004。抽出発酵を用いたブタノールなどの生成物の生成及び発酵ブロスからの回収方法が、2009年6月4日に出願された米国特許出願第12/478,389号明細書、及び対応する米国特許出願公開第20090305370号明細書、2009年8月6日に出願された米国仮特許出願第61/231,699号明細書、2010年7月28日に出願された米国仮特許出願第61/368,429号明細書、及び米国特許出願公開第20100221802号明細書及び同第20110097773号明細書に詳細に記載されている。かかる方法には、発酵ブロスを、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、C12~C22脂肪アミド、C12~C22脂肪アルデヒド、及びそれらの混合物からなる群から選択される水不混和性有機抽出剤と接触させて、水相とブタノール含有有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含むものが含まれる。接触させるは、発酵プロセスのなかの任意の時点で、発酵培地と有機抽出剤とを物理的に接触した状態にすることを意味する。好適な抽出剤の例としては、限定はされないが、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ラウリンアルデヒド、1-ノナノール、1-デカノール、1-ウンデカノール、2-ウンデカノール、1-ノナナール、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む抽出剤が挙げられる。一実施形態において、抽出剤はオレイルアルコールを含む。これらの有機抽出剤は、Sigma-AldrichSt.Louis,MOなどの様々な供給元から、様々なグレードで市販されており、その多くは抽出発酵で使用してブタノールを生成又は回収するのに好適である。テクニカルグレードは、所望の成分並びに高級及び低級脂肪成分を含めた、化合物の混合物を含有する。例えば、市販されている一つのテクニカルグレードのオレイルアルコールは、約65のオレイルアルコールと高級及び低級脂肪アルコールの混合物とを含有する。実施形態において、本発明はブタノールを生成する方法に関し、この方法は、a本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと;bブタノールが生成される条件下で宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップとを含む。他の実施形態において、この方法は、発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生成するステップをさらに含む。他の実施形態において、抽出剤は脂肪酸を含む。他の実施形態において、脂肪酸は、トウモロコシ油又はダイズ油に由来する。他の実施形態において、抽出剤は、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、C12~C22脂肪アルデヒド、C12~C22脂肪アミドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤を含む。他の実施形態において、この方法は、発酵ブロスを有機酸及びその有機酸によるブタノールのエステル化能を有する酵素と接触させるステップをさらに含む。実施形態において、この方法は、発酵ブロスの少なくとも一部を気化させて、水とブタノールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む。ブタノール力価及び生成量の測定方法は公知である。例えば、ブタノール力価及び生成量は、例に記載されるとおり、ガスクロマトグラフィーGC又は高速液体クロマトグラフィーHPLCを用いて計測することができる。実施形態において、本発明の宿主細胞により生成されるブタノールの量は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞によって生成されるブタノールの量と比較したとき、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍だけ多く増加する。実施形態において、本発明の宿主細胞により生成されるブタノールの力価は、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較したとき、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍だけ高く増加する。実施形態において、本発明は、本明細書に記載される生合成経路のステップを触媒するポリペプチドをコードする非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法に関し、この方法は、本明細書に記載される発酵条件などの、生合成経路の生成物が生成される条件下で、本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。他の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路のフラックスを増加させる方法に関し、この方法は、本明細書に記載される発酵条件などの、宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、本発明の宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップを含む。他の実施形態において、本発明は、ピルベート利用生合成経路の生成物の形成を増加させる方法に関し、この方法は、i本発明の組換え宿主細胞を提供するステップと;iiピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で宿主細胞を成長させるステップとを含み、ここで組換え宿主細胞により形成される生成物の量は、染色体に組み込まれた、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない宿主細胞により形成される生成物の量より多い。他の実施形態において、ピルベート利用生合成経路は、2,3-ブタンジオール、イソブタノール、2-ブタノール又は2-ブタノンを形成する。他の実施形態において、ピルベート利用生合成経路はブタノール生合成経路である。他の実施形態において、ブタノール生合成経路は、a2-ブタノール生合成経路;又はbイソブタノール生合成経路である。他の実施形態において、本発明は、i本発明の宿主細胞と;iiブタノールと;iii抽出剤とを含む組成物に関する。他の実施形態において、本発明は、i本発明の宿主細胞と;iiブタノールと;iii抽出剤と;ivエステル化酵素とを含む組成物に関する。エステル化酵素は、酸とアルコールとの間の反応を触媒してエステルを生じさせる酵素である。最も広義には、エステル化esterfication酵素はエステル結合に作用するヒドロラーゼであり、多くの場合にエステラーゼと称される。本明細書で使用されるとき、リパーゼは、ブロス中に存在する脂肪酸とイソブタノールとの間のエステル形成において有効であることが示されているエステラーゼのサブクラスである。かかるリパーゼは、1つ以上のエステラーゼ酵素、例えばリパーゼ酵素などのヒドロラーゼ酵素を含み得る。使用されるリパーゼ酵素は、例えば、アブシディア属Absidia、アクロモバクター属Achromobacter、アエロモナス属Aeromonas、アルカリゲネス属Alcaligenes、アルテルナリア属Alternaria、アスペルギルス属Aspergillus、アクロモバクター属Achromobacter、アウレオバシジウム属Aureobasidium、バチルス属Bacillus、ボーベリア属Beauveria、ブロコトリックス属Brochothrix、カンジダ属Candida、クロモバクター属Chromobacter、コプリナス属Coprinus、フザリウム属Fusarium、ジオトリクム属Geotricum、ハンゼヌラ属Hansenula、フミコラ属Humicola、ヒフォジマ属Hyphozyma、ラクトバチルス属Lactobacillus、メタリジウム属Metarhizium、ムコール属Mucor、ネクトリア属Nectria、ニューロスポラ属Neurospora、ペシロミセス属Paecilomyces、ペニシリウム属Penicillium、シュードモナス属Pseudomonas、リゾクトニア属Rhizoctonia、リゾムコール属Rhizomucor、リゾプス属Rhizopus、ロドスポリジウム属Rhodosporidium、ロドトルラ属Rhodotorula、サッカロミセス属Saccharomyces、イノシシ属Sus、スポロボロミセス属Sporobolomyces、サーモミセス属Thermomyces、チアロスポレラ属Thiarosporella、トリコデルマ属Trichoderma、ベルチシリウム属Verticillium、及び/又はヤロウイア属Yarrowiaの株を含めた、任意の供給源に由来することができる。好ましい態様において、リパーゼの供給源は、アブシディアブラケスレエナAbsidiablakesleena、アブシディアコリンビフェラAbsidiacorymbifera、アクロモバクターイオファグスAchromobacteriophagus、アルカリゲネスエスピーAlcaligenessp.、アルテルナリアブラッシシオラAlternariabrassiciola、アスペルギルスフラバスAspergillusflavus、アスペルギルスニガーAspergillusniger、アウレオバシジウムプルランスAureobasidiumpullulans、バチルスプミルスBacilluspumilus、バチルスステアロテルモフィルスBacillusstrearothermophilus、バチルススブチリスBacillussubtilis、ブロコトリックステルモソハタBrochothrixthermosohata、カンジダシリンドラセアCandidacylindraceaカンジダルゴサCandidarugosa、カンジダパラリポリティカCandidaparalipolytica、カンジダアンタルクティカCandidaAntarcticaリパーゼA、カンジダアンタルクティカCandidaantarticaリパーゼB、カンジダエルノビイCandidaernobii、カンジダデフォルマンスCandidadeformans、クロモバクタービスコスムChromobacterviscosum、コプリナスシネレウスCoprinuscinerius、フザリウムオキシスポラムFusariumoxysporum、フザリウムソラニFusariumsolani、フザリウムソラニピシFusariumsolanipisi、フザリウムロセウムクルモルムFusariumroseumculmorum、ジオトリクムペニシラツムGeotricumpenicillatum、ハンゼヌラアノマラHansenulaanomala、フミコラブレビスポラHumicolabrevispora、フミコラブレビスバルテルモイデアHumicolabrevisvar.thermoidea、フミコラインソレンスHumicolainsolens、ラクトバチルスクルバツスLactobacilluscurvatus、リゾプスオリゼRhizopusoryzae、ペニシリウムシクロピウムPenicilliumcyclopium、ペニシリウムクルストスムPenicilliumcrustosum、ペニシリウムエクスパンサムPenicilliumexpansum、ペニシリウムエスピーIPenicilliumsp.I、ペニシリウムエスピーIIPenicilliumsp.II、シュードモナスエルギノーサPseudomonasaeruginosa、シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenes、シュードモナスセパシアPseudomonascepacia異名バークホルデリアセパシアBurkholderiacepacia、シュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens、シュードモナスフラギPseudomonasfragi、シュードモナスマルトフィリアPseudomonasmaltophilia、シュードモナスメンドシナPseudomonasmendocina、シュードモナスメフィチカリポリティカPseudomonasmephiticalipolytica、シュードモナスアルカリゲネスPseudomonasalcaligenes、シュードモナスプランタリイPseudomonasplantari、シュードモナスシュードアルカリゲネスPseudomonaspseudoalcaligenes、シュードモナスプチダPseudomonasputida、シュードモナススツッツェリPseudomonasstutzeri、及びシュードモナスウィスコンシネンシスPseudomonaswisconsinensis、リゾクトニアソラニRhizoctoniasolani、リゾムコールミエヘイRhizomucormiehei、リゾプスヤポニクスRhizopusjaponicus、リゾプスミクロスポルスRhizopusmicrosporus、リゾプスノドススRhizopusnodosus、ロドスポリジウムトルロイデスRhodosporidiumtoruloides、ロドトルラグルチニスRhodotorulaglutinis、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae、スポロボロミセスシバタヌスSporobolomycesshibatanus、スススクロファSusscrofa、サーモミセスラヌギノススThermomyceslanuginosus旧フミコララヌギノセHumicolalanuginose、チアロスポレラファセオリナThiarosporellaphaseolina、トリコデルマハルジアヌムTrichodermaharzianum、トリコデルマリーゼイTrichodermareesei、及びヤロウイアリポリティカYarrowialipolyticaからなる群から選択される。さらに好ましい態様において、リパーゼは、サーモミセスラヌギノススThermomcyceslanuginosus、アスペルギルスエスピーAspergillussp.リパーゼ、アスペルギルスニガーAspergillusnigerリパーゼ、カンジダアンタルクティカCandidaantarticaリパーゼB、シュードモナスエスピーPseudomonassp.リパーゼ、ペニシリウムロックフォルティPenicilliumroquefortiリパーゼ、ペニシリウムカメンベルティPenicilliumcamembertiiリパーゼ、ムコールジャバニクスMucorjavanicusリパーゼ、バークホルデリアセパシアBurkholderiacepaciaリパーゼ、アルカリゲネスエスピーAlcaligenessp.リパーゼ、カンジダルゴサCandidarugosaリパーゼ、カンジダパラプシローシスCandidaparapsilosisリパーゼ、カンジダデフォルマンスCandidadeformansリパーゼ、ゲオトリクムカンジドゥムGeotrichumcandidum由来のリパーゼA及びB、ニューロスポラクラッサNeurosporacrassaリパーゼ、ネクトリアヘマトコッカNectriahaematococcaリパーゼ、フザリウムヘテロスポルムFusariumheterosporumリパーゼ、リゾプスデレマルRhizopusdelemarリパーゼ、リゾムコールミエヘイRhizomucormieheiリパーゼ、リゾプスアリズスRhizopusarrhizusリパーゼ、及びリゾプスオリゼRhizopusoryzaeリパーゼからなる群から選択される。酵素触媒42として好適な、好適な市販のリパーゼ配合物としては、限定はされないが、Novozymesから入手可能なLipolase登録商標100L、Lipex登録商標100L、Lipoclean登録商標2000T、Lipozyme登録商標CALBL、Novozym登録商標CALAL、及びPalatase20000L、又はSigmaAldrichから入手可能なシュードモナスフルオレセンスPseudomonasfluorescens、シュードモナスセパシアPseudomonascepacia、ムコールミエヘイMucormiehei、豚膵、カンジダシリンドラセアCandidacylindracea、リゾプスニベウスRhizopusniveus、カンジダアンタルクティカCandidaantarctica、リゾプスアリズスRhizopusarrhizus又はアスペルギルス属Aspergillus由来のものが挙げられる。実施形態において、抽出剤は脂肪酸を含む。実施形態において、脂肪酸はトウモロコシ油又はダイズ油に由来する。他の実施形態において、抽出剤は水不混和性有機抽出剤である。他の実施形態において、抽出剤は、C12~C22脂肪アルコール、C12~C22脂肪酸、C12~C22脂肪酸のエステル、又はC12~C22脂肪アルデヒドである。本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示として提供されるに過ぎないことが理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を把握することができ、及びその趣旨及び精神から逸脱することなく、本発明を様々な使用及び条件に適合させるため本発明の様々な変更及び改良を行うことができる。一般的方法本実施例で用いられる標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は、当該技術分野において公知であり、Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NY1989Maniatis、Silhavyetal.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.1984、Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,発行者GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience1987及びMethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYにより記載されている。細菌培養物の成長及び維持に好適な材料及び方法は、当該技術分野において公知である。以下の実施例で用いるのに好適な技法は、ManualofMethodsforGeneralBacteriologyPhillippGerhardtetal.,eds,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.,1994のなかに、又はThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiologySecondEdition,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,1989により詳説されるとおり、見出すことができる。微生物細胞を成長させ、及び維持するために使用される全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、AldrichChemicalsMilwaukee,WI、BDDiagnosticSystemsSparks,MD、LifeTechnologiesRockville,MD、NewEnglandBiolabsIpswich,MA又はSigmaChemicalCompanySt.Louis,MOから入手した。微生物株は、特に注記されない限り、AmericanTypeCultureCollectionATCC,Manassas,VAから入手した。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、Sigma-GenosysWoodlands,TX又はIntegratedDNATechnologiesCoralsville,IAにより合成された。合成完全培地については、Amberg,BurkeandStrathern,2005,MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYに記載されている。GCGC方法には、AgilentTechnologiesSantaClara,CAからのHP-InnoWaxカラム30m×0.32mm内径、0.25μm膜を利用した。キャリアガスはヘリウムで、ヘッド圧を一定として150°Cで計測して1ml/分の流量であった;注入器スプリットは200°Cで1:10であった;オーブン温度は、45°Cで1分間、10°C/分で45°Cから230°Cに、及び230°Cで30秒間であった。FID検出を、40ml/分のヘリウムメークアップガスで260°Cで使用した。培養ブロス試料は注入前に0.2μMスピンフィルタでろ過した。所望の分析感度に応じて、0.1μl又は0.5μlのいずれかの注入量を用いた。以下の化合物について校正標準曲線を作成した:エタノール、イソブタノール、アセトイン、メソ-2,3-ブタンジオール、及び2S,3S-2,3-ブタンジオール。分析標準もまた利用して、イソブチルアルデヒドisobutryaldehyde、イソ酪酸、及びイソアミルアルコールについて保持時間を特定した。HPLC発酵副産物組成の分析は当業者に公知である。例えば、一つの高速液体クロマトグラフィーHPLC方法は、ShodexSH-Gガードカラムを備えたShodexSH-1011カラムを双方とも、WatersCorporation,Milford,MAから入手可能、屈折率RI検出と共に利用する。クロマトグラフ分離は、移動相として0.01MのH2SO4を使用して、0.5mL/分の流量及び50°Cのカラム温度で達成される。イソブタノール保持時間は47.6分である。培養培地におけるイソブタノール濃度の決定方法培養培地のイソブタノール濃度は、当該技術分野において公知の複数の方法により決定することができる。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィーHPLC方法では、ShodexSH-Gガードカラムを備えたShodexSH-1011カラム双方ともWatersCorporationMilford,MAから購入を、屈折率RI検出と共に利用した。クロマトグラフ分離は、移動相として0.01MのH2SO4を使用して、0.5mL/分の流量及び50°Cのカラム温度で達成した。イソブタノールは、使用した条件下で46.6分の保持時間を有した。或いは、ガスクロマトグラフィーGC方法が利用可能である。例えば、特定のGC方法では、HP-INNOWaxカラム30m×0.53mm内径、1μm膜厚、AgilentTechnologies,Wilmington,DEを、水素炎イオン化検出器FIDと共に利用した。キャリアガスはヘリウムで、ヘッド圧を一定として150°Cで計測して4.5mL/分の流量であった;注入器スプリットは200°Cで1:25であった;オーブン温度は、45°Cで1分間、10°C/分で45°Cから220°C、及び220°Cで5分間であった;及びFID検出は、26mL/分のヘリウムメークアップガスにより240°Cで用いた。イソブタノールの保持時間は4.5分であった。略号の意味は以下のとおりである:sは秒を意味し、minは分を意味し、hは時間を意味し、psiはポンド毎平方インチを意味し、nmはナノメートルを意味し、dは日を意味し、μLはマイクロリットルを意味し、mLはミリリットルを意味し、Lはリットルを意味し、mmはミリメートルを意味し、nmはナノメートルを意味し、mMはミリモル濃度を意味し、Mはモル濃度を意味し、mmolはミリモルを意味し、μmolはマイクロモルを意味し、gはグラムを意味し、μgはマイクログラムを意味し、及びngはナノグラムを意味し、PCRはポリメラーゼ連鎖反応を意味し、ODは光学濃度を意味し、OD600は600nmの波長で計測した光学濃度を意味し、kDaはキロダルトンを意味し、gは重力定数を意味し、bpは塩基対を意味し、kbpはキロベース対を意味し、w/vは重量/体積パーセントを意味し、v/vは体積/体積パーセントを意味し、wtは重量パーセントを意味し、HPLCは高速液体クロマトグラフィーを意味し、及びGCはガスクロマトグラフィーを意味する。用語モル選択率は、1モルの糖基質が消費される毎に生成される生成物のモル数であり、パーセントで報告される。実施例1サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株BP1083NGCI-070;PNY1504の構築株BP1064は、CEN.PK113-7DCBS8340;CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversityCentre,オランダから得たもので、以下の遺伝子の欠失を含む:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、及びGPD2。BP1064をプラスミドpYZ090配列番号134及びpLH468配列番号135で形質転換して、株NGCI-070BP1083,PNY1504を作成した。コード配列全体を完全に取り除いた欠失を、標的遺伝子の上流及び下流の相同性領域と、形質転換体選択用のG418耐性マーカー又はURA3遺伝子のいずれかとを含むPCR断片による相同組換えによって作成した。loxP部位が隣接するG418耐性マーカーは、Creリコンビナーゼを用いて取り除いた。URA3遺伝子は相同組換えにより取り除いてスカーレス欠失を作成するか、又はloxP部位が隣接する場合、Creリコンビナーゼを用いて取り除いた。スカーレス欠失の手順は、Akadaetal.,Yeast,23:399,2006から構成した。概して、オーバーラップPCRによって4つの断片A-B-U-Cを組み合わせることにより、各スカーレス欠失用のPCRカセットを作製した。PCRカセットは、選択マーカー/カウンター選択マーカー、天然CEN.PK113-7DURA3遺伝子からなるURA3断片Uを、プロモーターURA3遺伝子の上流250bp及びターミネーターURA3遺伝子の下流150bpと共に含んだ。断片A及びCは、各々500bp長で、標的遺伝子の直ちに上流の500bp断片A及び標的遺伝子の3’500bp断片Cに対応した。断片A及びCは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みに使用した。断片B500bp長は標的遺伝子の直ちに下流の500bpに対応し、染色体にカセットを組み込んだときに断片Bに対応する配列のダイレクトリピートが作成されるようにして、相同組換えによって染色体からURA3マーカー及び断片Cを切り出すために使用した。PCR産物ABUCカセットを使用して、URA3マーカーを相同組換えにより初めに染色体に組み込み、次に切り出した。最初の組込みにより、3’500bpを除いて遺伝子が欠失した。切り出すと、遺伝子の3’500bp領域もまた欠失した。この方法を用いた遺伝子の組込みについて、組み込む遺伝子は、PCRカセットの断片AとBとの間に含まれた。URA3欠失内因性URA3コード領域を欠失させるため、ura3::loxP-kanMX-loxPカセットを、pLA54鋳型DNA配列番号136からPCR増幅した。pLA54は、K.ラクティスK.lactisTEF1プロモーター及びkanMXマーカーを含み、loxP部位が隣接しているため、Creリコンビナーゼによる組換え及びマーカーの除去が可能である。PCRは、PhusionDNAポリメラーゼ並びにプライマーBK505及びBK506配列番号137及び138を使用して行った。各プライマーのURA3部分は、loxP-kanMX-loxPマーカーの組込みによってURA3コード領域の置換が生じるように、URA3プロモーターの上流の5’領域及びコード領域の下流の3’領域に由来した。PCR産物を、標準的な遺伝学的技法MethodsinYeastGenetics,2005,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202を用いてCEN.PK113-7Dに形質転換し、形質転換体を30°CのG418含有YPD100μg/mlで選択した。プライマーLA468及びLA492配列番号139及び140を用いたPCRにより形質転換体をスクリーニングして組込みが正しいことを確認し、CEN.PK113-7DΔura3::kanMXと命名した。HIS3欠失PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabs;Ipswich,MA、及びGentraPuregeneYeast/BactキットQiagen;Valencia,CAで調製した、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを使用して、スカーレスHIS3欠失用のPCRカセットの4つの断片を増幅した。HIS3断片Aは、プライマーoBP452配列番号141及びHIS3断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP453配列番号142により増幅した。HIS3断片Bは、HIS3断片Aの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP454配列番号143、及びHIS3断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP455配列番号144により増幅した。HIS3断片Uは、HIS3断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP456配列番号145、及びHIS3断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP457配列番号146により増幅した。HIS3断片Cは、HIS3断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP458配列番号147、及びプライマーoBP459配列番号148により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片AとHIS3断片Bとを混合し、プライマーoBP452配列番号141及びoBP455配列番号144で増幅して、HIS3断片ABを作成した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片UとHIS3断片Cとを混合し、プライマーoBP456配列番号145及びoBP459配列番号148で増幅して、HIS3断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、HIS3断片ABとHIS3断片UCとを混合し、プライマーoBP452配列番号141及びoBP459配列番号148で増幅して、HIS3ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。CEN.PK113-7DΔura3::kanMXのコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearch;Orange,CAを使用して、HIS3ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの2グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。his3ノックアウトを含む形質転換体を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP460配列番号149及びoBP461配列番号150でのPCRによりスクリーニングした。正しい形質転換体を、CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3として選択した。Δura3部位からのKanMXマーカー除去及びΔhis3部位からのURA3マーカー除去CEN.PK113-7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3を、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearchを使用してpRS423::PGAL1-cre配列番号66、米国仮特許出願第61/290,639号明細書に記載されるで形質転換し、30°Cの2グルコース添加ヒスチジン及びウラシル不含合成完全培地に播くことにより、KanMXマーカーを取り除いた。30°Cの1ガラクトース添加YPで形質転換体を6時間成長させて、Creリコンビナーゼ及びKanMXマーカーの切り出しを誘導し、30°CのYPD2グルコースプレートに播いて回収した。単離物をYPDで一晩成長させ、30°Cの5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。5-FOA耐性単離物をYPDで成長させてそこに播き、pRS423::PGAL1-creプラスミドを取り除いた。単離物を、YPDG418プレート、ウラシル不含合成完全培地プレート、及びヒスチジン不含合成完全培地プレートでの成長を評価することにより、KanMXマーカー、URA3マーカー、及びpRS423::PGAL1-creプラスミドの喪失について確認した。G418に対して感受性を有し、且つウラシル及びヒスチジン栄養要求性であった正しい単離物を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3として選択し、BP857と命名した。欠失及びマーカー除去を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、Δura3用のプライマーoBP450配列番号151及びoBP451配列番号152並びにΔhis3用のプライマーoBP460配列番号149及びoBP461配列番号150でのPCR及び配列決定により確認した。PDC6欠失PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabs、及びGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製した、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを使用して、スカーレスPDC6欠失用のPCRカセットの4つの断片を増幅した。PDC6断片Aは、プライマーoBP440配列番号153及びPDC6断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP441配列番号154により増幅した。PDC6断片Bは、PDC6断片Aの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP442配列番号155、及びPDC6断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP443配列番号156により増幅した。PDC6断片Uは、PDC6断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP444配列番号157、及びPDC6断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP445配列番号158により増幅した。PDC6断片Cは、PDC6断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP446配列番号159、及びプライマーoBP447配列番号160により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、PDC6断片AとPDC6断片Bとを混合し、プライマーoBP440配列番号153及びoBP443配列番号156で増幅して、PDC6断片ABを作成した。オーバーラップPCRにより、PDC6断片UとPDC6断片Cとを混合し、プライマーoBP444配列番号157及びoBP447配列番号160で増幅して、PDC6断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、PDC6断片ABとPDC6断片UCとを混合し、プライマーoBP440配列番号153及びoBP447配列番号160で増幅して、PDC6ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearchを使用して、PDC6ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの2グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。pdc6ノックアウトを含む形質転換体を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP448配列番号161及びoBP449配列番号162でのPCRによりスクリーニングした。正しい形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6::URA3をYPDで一晩成長させ、30°Cの5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。欠失及びマーカー除去を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP448配列番号161及びoBP449配列番号162でのPCR及び配列決定により確認した。単離物にPDC6遺伝子が存在しないことが、PDC6のコード配列に特異的なプライマーoBP554配列番号163及びoBP555配列番号164を使用したネガティブPCRの結果により実証された。正しい単離物をCEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6として選択し、BP891と命名した。PDC1欠失ilvDSm組込みPDC1遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutansATCC番号700610由来のilvDコード領域によって置換した。PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabs、及びGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製した、鋳型としてのNYLA83米国仮特許出願第61/246,709号明細書に記載されるゲノムDNAを使用して、PDC1欠失-ilvDSm組込み用のPCRカセットの、ストレプトコッカスミュータンスStreptococcusmutans由来のilvDコード領域が後続するA断片を増幅した。PDC1断片A-ilvDSm配列番号165は、プライマーoBP513配列番号166及びPDC1断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP515配列番号167により増幅した。PDC1欠失-ilvDSm組込み用のPCRカセットのB断片、U断片、及びC断片は、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabs、及びGentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製した、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを使用して増幅した。PDC1断片Bは、PDC1断片A-ilvDSmの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP516配列番号168、及びPDC1断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP517配列番号169により増幅した。PDC1断片Uは、PDC1断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP518配列番号170、及びPDC1断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP519配列番号171により増幅した。PDC1断片Cは、PDC1断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP520配列番号172、及びプライマーoBP521配列番号173により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、PDC1断片A-ilvDSmとPDC1断片Bとを混合し、プライマーoBP513配列番号166及びoBP517配列番号169で増幅して、PDC1断片A-ilvDSm-Bを作成した。オーバーラップPCRにより、PDC1断片UとPDC1断片Cとを混合し、プライマーoBP518配列番号170及びoBP521配列番号173で増幅して、PDC1断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、PDC1断片A-ilvDSm-BとPDC1断片UCとを混合し、プライマーoBP513配列番号166及びoBP521配列番号173で増幅して、PDC1A-ilvDSm-BUCカセット配列番号174を作成した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearchを使用して、PDC1A-ilvDSm-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの2グルコース添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。pdc1ノックアウトilvDSm組込みを含む形質転換体を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP511配列番号175及びoBP512配列番号176でのPCRによりスクリーニングした。単離物にPDC1遺伝子が存在しないことが、PDC1のコード配列に特異的なプライマーoBP550配列番号177及びoBP551配列番号178を使用したネガティブPCRの結果により実証された。正しい形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSm-URA3をYPDで一晩成長させ、30°Cの5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。PDC1の欠失、ilvDSmの組込み、及びマーカー除去を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP511配列番号175及びoBP512配列番号176でのPCR及び配列決定により確認した。正しい単離物を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmとして選択し、BP907と命名した。PDC5欠失sadB組込みPDC5遺伝子を欠失させ、アクロモバクターキシロスオキシダンスAchromobacterxylosoxidans由来のsadBコード領域によって置換した。初めに、PDC5欠失-sadB組込み用のPCRカセットのセグメントをプラスミドpUC19-URA3MCSにクローニングした。pUC19-URA3MCSはpUC19ベースであり、多重クローニング部位MCS内に位置するサッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae由来のURA3遺伝子の配列を含む。pUC19は、大腸菌Escherichiacoliにおける複製及び選択用のpMB1レプリコン及びβ-ラクタマーゼをコードする遺伝子を含む。URA3のコード配列に加え、この遺伝子の上流及び下流からの配列が、酵母においてURA3遺伝子を発現させるために含まれた。このベクターはクローニング目的で用いることができ、また、酵母組込みベクターとしても用いることができる。URA3コード領域を、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeCEN.PK113-7DゲノムDNA由来のURA3コード領域の上流250bp及び下流150bpと共に包含するDNAを、PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabsを使用して、BamHI、AscI、PmeI、及びFseI制限部位を含むプライマーoBP438配列番号179、及びXbaI、PacI、及びNotI制限部位を含むoBP439配列番号180により増幅した。ゲノムDNAを、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenを使用して調製した。PCR産物及びpUC19配列番号181を、BamHI及びXbaIで消化した後、T4DNAリガーゼによりライゲートして、ベクターpUC19-URA3MCSを作成した。このベクターを、プライマーoBP264配列番号182及びoBP265配列番号183でのPCR及び配列決定により確認した。sadB及びPDC5断片Bのコード配列をpUC19-URA3MCSにクローニングして、PDC5A-sadB-BUCPCRカセットのsadB-BU部分を作成した。sadBのコード配列を、pLH468-sadB配列番号184を鋳型として使用して、AscI制限部位を含むプライマーoBP530配列番号185、及びPDC5断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP531配列番号186で増幅した。PDC5断片Bは、sadBの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP532配列番号187、及びPmeI制限部位を含むプライマーoBP533配列番号188により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、sadBとPDC5断片BとのPCR産物を混合し、プライマーoBP530配列番号185及びoBP533配列番号188で増幅して、sadB-PDC5断片Bを作成した。得られたPCR産物をAscI及びPmeIで消化し、適切な酵素で消化した後、T4DNAリガーゼによってpUC19-URA3MCSの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドを、プライマーoBP536配列番号189及びPDC5断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むoBP546配列番号190を用いたsadB-断片B-断片U増幅用の鋳型として使用した。PDC5断片Cは、PDC5sadB-断片B-断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP547配列番号191、及びプライマーoBP539配列番号192により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、PDC5sadB-断片B-断片UとPDC5断片Cとを混合し、プライマーoBP536配列番号189及びoBP539配列番号192で増幅して、PDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キットQiagenで精製した。PDC5sadB-断片B-断片U-断片Cを、天然PDC5コード配列の直ちに上流の50ヌクレオチドと相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP542配列番号194、及びoBP539配列番号192で増幅することにより、PDC5A-sadB-BUCカセット配列番号193を作成した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmのコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearchを使用して、PDC5A-sadB-BUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの1エタノール添加グルコース不含ウラシル不含合成完全培地に播いた。pdc5ノックアウトsadB組込みを含む形質転換体を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP540配列番号195及びoBP541配列番号196でのPCRによりスクリーニングした。単離物にPDC5遺伝子が存在しないことが、PDC5のコード配列に特異的なプライマーoBP552配列番号197及びoBP553配列番号198を使用したネガティブPCRの結果により実証された。正しい形質転換体を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3として選択した。CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB-URA3をYPE1エタノールで一晩成長させ、30°Cのエタノール添加グルコース不含且つ5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。PDC5の欠失、sadBの組込み、及びマーカー除去を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP540配列番号195及びoBP541配列番号196でのPCRにより確認した。正しい単離物を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBとして選択し、BP913と命名した。GPD2欠失内因性GPD2コード領域を欠失させるため、loxP-URA3-loxPPCR配列番号200を鋳型DNAとして使用して、gpd2::loxP-URA3-loxPカセット配列番号131をPCR増幅した。loxP-URA3-loxPは、loxPリコンビナーゼ部位が隣接するATCC番号77107由来のURA3マーカーを含む。PCRは、PhusionDNAポリメラーゼ及びプライマーLA512及びLA513配列番号201及び202を使用して行った。各プライマーのGPD2部分は、loxP-URA3-loxPマーカーの組込みがGPD2コード領域の置換をもたらすように、GPD2コード領域の上流の5’領域及びそのコード領域の下流の3’領域に由来するものとした。PCR産物をBP913に形質転換し、1エタノール添加グルコース不含ウラシル不含合成完全培地で形質転換体を選択した。プライマーoBP582及びAA270配列番号198及び203を用いたPCRにより形質転換体をスクリーニングして、組込みが正しいことを確認した。URA3マーカーを、pRS423::PGAL1-cre配列番号204で形質転換し、30°Cの1エタノール添加ヒスチジン不含合成完全培地に播くことにより再利用した。形質転換体を1エタノール添加且つ5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地にストリークし、30°Cでインキュベートして、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。5-FOA耐性単離物をYPE1エタノールで成長させて、pRS423::PGAL1-creプラスミドを取り除いた。欠失及びマーカー除去を、プライマーoBP582配列番号198及びoBP591配列番号205でのPCRにより確認した。正しい単離物を、株CEN.PK113-7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadBΔgpd2::loxPとして選択し、BP1064PNY1503と命名した。BP1064をプラスミドpYZ090配列番号134及びpLH468配列番号135で形質転換して、株NGCI-070BP1083;PNY1504を作成した。pYZ090は、pHR81ATCC番号87541、Manassas、VA骨格ベースであり、ALSを発現するための、酵母CUP1プロモーターnt2位~449位から発現し、且つCYC1ターミネーターnt2181位~2430位が続くバチルススブチリスBacillussubtilis由来のalsS遺伝子のコード領域nt457位~2172位を有するキメラ遺伝子と、KARIを発現するための、酵母ILV5プロモーター2433位~3626位から発現し、且つILV5ターミネーターnt4682位~5304位が続く、ラクトコッカスラクティスLactococcuslactis由来のilvC遺伝子のコード領域nt3634位~4656位を有するキメラ遺伝子とを含むように構築した。pLH468プラスミド配列番号2は、酵母におけるDHAD、KivD及びHADHの発現用に構築されたもので、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第20090305363号明細書に記載されている。実施例2サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株BP1135及びPNY1507の構築並びにイソブタノール生成誘導体この実施例の目的は、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiae株BP1135及びPNY1507を構築することであった。これらの株はPNY1503BP1064に由来した。PNY1503は、CEN.PK113-7DCBS8340;CentraalbureauvoorSchimmelculturesCBSFungalBiodiversityCentre,オランダに由来した。PNY1503BP1064の構築については上記に記載する。BP1135は、FRA2遺伝子のさらなる欠失を含む。PNY1507はBP1135に由来し、ADH1遺伝子のさらなる欠失を含み、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeでの発現にコドンが最適化されたラクトコッカスラクティスLactococcuslactis由来のkivD遺伝子がADH1遺伝子座に組み込まれたものであった。標的遺伝子の上流及び下流の相同性領域と、形質転換体選択用のURA3遺伝子とを含むPCR断片による相同組換えにより、概してコード配列全体が取り除かれた欠失を作成した。URA3遺伝子を相同組換えにより取り除き、スカーレス欠失を作成した。同様にして、遺伝子組込みを作成した。スカーレス欠失の手順は、Akadaetal.,Yeast,23:399,2006から構成した。概して、オーバーラップPCRによって4つの断片A-B-U-Cを組み合わせることにより、各スカーレス欠失用のPCRカセットを作製した。ある場合には、初めに個々の断片をプラスミドにクローニングしてから、欠失/組込み手順のためカセット全体をPCRにより増幅した。PCRカセットは、選択マーカー/カウンター選択マーカー、天然CEN.PK113-7DURA3遺伝子からなるURA3断片Uを、プロモーター領域URA3遺伝子の上流250bp及びターミネーター領域URA3遺伝子の下流150bpと共に含んだ。断片A及びCは、各々ほぼ500bp長で、標的遺伝子の直ちに上流の500bp断片A及び標的遺伝子の3’500bp断片Cに対応した。断片A及びCは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みに使用した。断片B500bp長は標的遺伝子の直ちに下流の500bpに対応し、染色体にカセットを組み込んだときに断片Bに対応する配列のダイレクトリピートが作成されるようにして、相同組換えによって染色体からURA3マーカー及び断片Cを切り出すために使用した。PCR産物ABUCカセットを使用して、URA3マーカーを相同組換えにより初めに染色体に組み込み、次に切り出した。最初の組込みにより、3’500bpを除いて遺伝子が欠失した。切り出すと、遺伝子の3’500bp領域もまた欠失した。この方法を用いた遺伝子の組込みについて、組み込む遺伝子は、PCRカセットの断片AとBとの間に含まれた。FRA2欠失FRA2欠失は、コード配列の3’末端から250ヌクレオチドが欠失し、FRA2コード配列の最初の113ヌクレオチドがインタクトなまま残るように設計した。インフレームの終止コドンが、欠失の7ヌクレオチド下流に存在した。PhusionハイフィデリティPCRマスターミックスNewEnglandBioLabs;Ipswich,MA、及びGentraPuregeneYeast/BactキットQiagen;Valencia,CAで調製した、鋳型としてのCEN.PK113-7DゲノムDNAを使用して、スカーレスFRA2欠失用のPCRカセットの4つの断片を増幅した。FRA2断片Aは、プライマーoBP594配列番号99及びFRA2断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP595配列番号100により増幅した。FRA2断片Bは、FRA2断片Aの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP596配列番号101、及びFRA2断片Uの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP597配列番号102により増幅した。FRA2断片Uは、FRA2断片Bの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP598配列番号103、及びFRA2断片Cの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP599配列番号104により増幅した。FRA2断片Cは、FRA2断片Uの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP600配列番号105、及びプライマーoBP601配列番号106により増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片AとFRA2断片Bとを混合し、プライマーoBP594配列番号99及びoBP597配列番号102で増幅して、FRA2断片ABを作成した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片UとFRA2断片Cとを混合し、プライマーoBP598配列番号103及びoBP601配列番号106で増幅して、FRA2断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルで精製し、続いてゲル抽出キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、FRA2断片ABとFRA2断片UCとを混合し、プライマーoBP594配列番号99及びoBP601配列番号106で増幅して、FRA2ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。PNY1503のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearch;Orange,CAを使用して、FRA2ABUCPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの1エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。fra2ノックアウトを含む形質転換体を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP602配列番号107及びoBP603配列番号108でのPCRによりスクリーニングした。正しい形質転換体をYPE酵母エキス、ペプトン、1エタノールで成長させ、30°Cの5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。欠失及びマーカー除去を、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、プライマーoBP602配列番号107及びoBP603配列番号108でのPCRにより確認した。単離物にFRA2遺伝子が存在しないことが、欠失させたFRA2コード配列に特異的なプライマーoBP605配列番号109及びoBP606配列番号110を用いたネガティブPCRの結果により実証された。正しい単離物を、株CEN.PK113-7DMATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPfra2Δとして選択し、PNY1505BP1135と命名した。この株をイソブタノール経路プラスミドpYZ090、配列番号134及びpLH4682009年9月29日に出願された米国仮特許出願第61/246,709号明細書で形質転換し、一つのクローンをBP1168PNY1506と命名した。ADH1欠失及びkivDLly組込みADH1遺伝子を欠失させ、サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeでの発現にコドンを最適化したラクトコッカスラクティスLactococcuslactis由来のkivDコード領域によって置換した。初めに、ADH1欠失-kivD_Lly組込み用のスカーレスカセットを、参照により本明細書に援用される2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356379号明細書に記載されるとおり、プラスミドpUC19-URA3MCSにクローニングした。サッカロミセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeでの発現にコドンを最適化したラクトコッカスラクティスLactococcuslactis由来のkivDコード領域を、PmeI制限部位を含むプライマーoBP562配列番号111、及びADH1断片Bの5’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP563配列番号112により、pLH4682009年9月29日に出願された米国仮特許出願第61/246,709号明細書を鋳型として使用して増幅した。ADH1断片Bは、kivD_Llyの3’末端と相同性を有する5’テールを含むプライマーoBP564配列番号113、及びFseI制限部位を含むプライマーoBP565配列番号114で、上記のとおり調製したゲノムDNAから増幅した。PCR産物をPCR精製キットQiagenで精製した。オーバーラップPCRにより、kivD_LlyとADH1断片BとのPCR産物を混合し、プライマーoBP562配列番号111及びoBP565配列番号114で増幅して、kivD_Lly-ADH1断片Bを作成した。得られたPCR産物をPmeI及びFseIで消化し、適切な酵素で消化した後、T4DNAリガーゼでpUC19-URA3MCSの対応する部位にライゲートした。ADH1断片Aは、SacI制限部位を含むプライマーoBP505配列番号115、及びAscI制限部位を含むプライマーoBP506配列番号116によりゲノムDNAから増幅した。ADH1断片AのPCR産物をSacI及びAscIで消化し、T4DNAリガーゼでkivD_Lly-ADH1断片Bを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ADH1断片Cは、PacI制限部位を含むプライマーoBP507配列番号117、及びSalI制限部位を含むプライマーoBP508配列番号118によりゲノムDNAから増幅した。ADH1断片CのPCR産物をPacI及びSalIで消化し、T4DNAリガーゼでADH1断片A-kivD_Lly-ADH1断片Bを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ハイブリッドプロモーターUASPGK1-PFBA1を、AscI制限部位を含むプライマーoBP674配列番号119、及びPmeI制限部位を含むプライマーoBP675配列番号120で、ベクターpRS316-UASPGK1-PFBA1-GUS以下に記載される;配列番号206から増幅した。UASPGK1-PFBA1のPCR産物をAscI及びPmeIで消化し、T4DNAリガーゼでkivD_Lly-ADH1断片ABCを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。得られたプラスミドから、プライマーoBP505配列番号115及びoBP508配列番号118で組込みカセット全体を増幅し、PCR精製キットQiagenで精製した。PNY1505のコンピテント細胞を作製し、Frozen-EZ酵母形質転換IIキットZymoResearchを使用して、上記で構築したADH1-kivD_LlyPCRカセットで形質転換した。形質転換混合物を、30°Cの1エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体をYPE1エタノールで成長させ、30°Cの5-フルオロオロチン酸0.1含有合成完全培地に播いて、URA3マーカーが失われた単離物を選択した。ADH1の欠失及びkivD_Llyの組込みを、GentraPuregeneYeast/BactキットQiagenで調製したゲノムDNAを使用して、外部プライマーoBP495配列番号121及びoBP496配列番号122、並びにkivD_Lly特異的プライマーoBP562配列番号111及び外部プライマーoBP496配列番号122でのPCRにより確認した。正しい単離物を、株CEN.PK113-7DMATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPfra2Δadh1Δ::UASPGK1P[FBA1]-kivD_Lly-ADH1tとして選択し、PNY1507BP1201と命名した。PNY1507をイソブタノール経路プラスミドpYZ090配列番号134及びpBP915以下に記載されるで形質転換した。これらの誘導体によるイソブタノール生成について、以下に記載する。pRS316-UASPGK1-FBA1p-GUSベクターの構築カセットUASPGK1-FBA1p配列番号129をクローニングするため、初めに602bpのFBA1プロモーターFBA1pを、プライマーT-FBA1SalI配列番号123及びB-FBA1SpeI配列番号124でCEN.PKのゲノムDNAからPCR増幅し、プラスミドのSalI/SpeI消化によってPGK1pプロモーターを取り除いた後、プラスミドpWS358-PGK1p-GUS配列番号130のSalI及びSpeI部位にクローニングして、pWS358-FBA1p-GUSを得た。pWS358-PGK1p-GUSプラスミドは、PGK1p及びβ-グルクロニダーゼ遺伝子GUSDNA断片をpWS358の多重クローニング部位に挿入することにより生成し、pWS358はpRS423ベクターに由来したChristiansonetal.,Gene,110:119-122,1992。第二に、得られたpWS358-FBA1p-GUSプラスミドをSalI及びSacIで消化し、FBA1pプロモーター、GUS遺伝子、及びFBAtターミネーターを含むDNA断片をゲル精製し、及びpRS316上のSalI/SacI部位にクローニングしてpRS316-FBA1p-GUSを作成した。第三に、3-ホスホグリセリン酸キナーゼPGK1オープンリーディングフレームの上流-519位と-402位との間に位置する上流活性化配列UASを含む118bpのDNA断片、すなわちUASPGK1を、プライマーT-U/PGK1KpnI配列番号125及びB-U/PGK1SalI配列番号126でCEN.PKのゲノムDNAからPCR増幅した。PCR産物をKpnI及びSalIで消化し、pRS316-FBA1p-GUS上のKpnI/SalI部位にクローニングしてpRS316-UASPGK1-FBA1p-GUSを作成した。実施例3PNY2204及びイソブタノール生成誘導体の構築この実施例の目的は、染色体XIIにおけるPDC1とTRX1とのコード配列間に天然に存在する遺伝子間領域へのアセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子の組込みを可能にするベクターの構築について記載することである。組込みベクターpUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1の構築1.7kbのBbvCI/PacI断片をpRS426::GPD::alsS::CYC米国特許出願公開第20070092957号明細書からpRS426::FBA::ILV5::CYC米国特許出願公開第20070092957号明細書、ILV5遺伝子を遊離させるためBbvCI/PacIで予め消化したに移すことにより、FBA-alsS-CYCtカセットを構築した。ライゲーション反応物を大腸菌E.coliTOP10細胞に形質転換し、プライマーN98SeqF1配列番号91及びN99SeqR2配列番号93を用いたPCRにより形質転換体をスクリーニングした。FBA-alsS-CYCtカセットを、BglII及びNotIを使用してベクターから単離し、pUC19-URA3::ilvD-TRX1参照により本明細書に援用される2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356379号明細書、クローンBに記載されるとおり;本明細書では配列番号243のAflII部位クレノウ断片を用いて末端をライゲーションに適合させたにクローニングした。ベクターにおいて両方向のalsSカセットを含む形質転換体が得られ、PCRにより、構成AについてはプライマーN98SeqF4配列番号92及びN1111配列番号97を使用して、並びに構成BについてはN98SeqF4配列番号92及びN1110配列番号96を使用して確認した。次に、URA3遺伝子1.2kbのNotI/NaeI断片を除去して、pUC19ベクターに保持されたSmaI部位にクローニングしたジェネティシンカセット本明細書では配列番号244;以前に、参照により本明細書に援用される2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356379号明細書に記載されているを付加することにより、ジェネティシン選択型のA構成ベクターを作製した。kan遺伝子を、初めにKpnIで消化し、クレノウ断片NEB、カタログ番号M212を用いて3’オーバーハングDNAを除去し、HincIIで消化して、次に1.8kbの遺伝子断片をゲル精製Zymoclean商標ゲルDNA回収キット、カタログ番号D4001、ZymoResearch,Orange,CA;配列番号245することにより、pUC19から単離した。クレノウ断片を用いて全ての末端をライゲーションに適合させ、及びプライマーBK468配列番号90及びN160SeqF5配列番号94を使用して、PCRにより形質転換体をスクリーニングし、先のURA3マーカーと同じ向きのジェネティシン耐性遺伝子を有するクローンを選択した。得られたクローンは、pUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1クローンA配列番号131と命名した。alsS組込み株及びイソブタノール生成誘導体の構築上記に記載されるpUC19-kan::pdc1::FBA-alsS組込みベクターをPmeIで直鎖化し、PNY1507上記の実施例1に記載されるに形質転換した。PmeIは、クローニングされたpdc1-TRX1遺伝子間領域内でベクターを切断し、従ってその位置に標的化した組込みをもたらすRodneyRothstein,MethodsinEnzymology,1991,volume194,pp.281-301。形質転換体をYPE50μg/mlG418で選択した。パッチした形質転換体を、プライマーN160SeqF5配列番号94及びoBP512配列番号98を使用したPCRにより、組込みイベントについてスクリーニングした。2つの形質転換体を、それらの株のイソブタノール産生能力を評価することにより、アセト乳酸シンターゼ機能について間接的に試験した。このため、大腸菌E.coli-酵母シャトルベクターpYZ090ΔalsS及びpBP915、以下に記載されるに、さらなるイソブタノール経路遺伝子を提供した。一方のクローン、株MATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPfra2Δadh1Δ::UASPGK1P[FBA1]-kivD_Lly-ADH1tをPNY2204と命名した。プラスミドを含まない親株をPNY2204と命名した。PNY2204遺伝子座pdc1Δ::ilvD::pUC19-kan::FBA-alsS::TRX1を図5に示す。イソブタノール経路プラスミドpYZ090ΔalsS及びpBP915pYZ090配列番号134をSpeI及びNotIで消化し、CUP1プロモーターの大部分及びalsSコード配列の全て及びCYCターミネーターを取り除いた。次に、クレノウ断片で処理した後にベクターをセルフライゲートし、大腸菌E.coliStbl3細胞に形質転換することにより、アンピシリン耐性について選択した。2つの独立したクローンについて、プライマーN191配列番号95を使用したPCRによるライゲーション接合点にわたるDNA配列決定により、DNA領域が取り除かれたことが確認された。得られたプラスミドをpYZ090ΔalsS配列番号132と命名した。pLH468配列番号124から、kivD遺伝子及びkivDの上流の957塩基対のTDH3プロモーターを欠失させることによってpBP915を構築した。pLH468をSwaIで消化し、大きい断片12896bpをアガロースゲルと、続いてゲル抽出キットQiagen;Valencia,CAで精製した。単離されたDNA断片をT4DNAリガーゼでセルフライゲートし、これを用いてエレクトロコンピテントTOP10大腸菌EscherichiacoliInvitrogen;Carlsbad,CAを形質転換した。形質転換体からのプラスミドを単離し、SwaI制限酵素による制限解析により、欠失が正しいことを確かめた。単離物もまた、プライマーoBP556配列番号127及びoBP561配列番号128により、欠失部位にかけて配列決定した。正しい欠失を有するクローンを、pBP915pLH468ΔkivD配列番号133と命名した。実施例4kivD遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成この実施例の目的は、プラスミドに含まれるkivDを有する株と比較した、kivD遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成を示すことである。kivDが組み込まれていない、プラスミドpYZ090及びpLH468を有する株を、プラスミドpYZ090及びpBP915を有する組込み株PNY1507と比較した。培地成分は全て、Sigma-Aldrich,St.Louis,MOからのものであった。株を、76mg/Lトリプトファン、380mg/Lロイシン、100mMMESpH5.5、20mg/Lニコチン酸、20mg/L塩酸チアミン、0.2グルコース、及び0.2エタノールを添加した合成培地アミノ酸不含の酵母窒素原基礎培地、並びにウラシル、ヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン不含の酵母合成ドロップアウト培地サプリメントで成長させた。一晩培養物を、125ml通気エルレンマイヤーフラスコの中8mlの培地中、NewBrunswickScientificI24振盪機において30°C、250RPMで成長させた。125mLのしっかり蓋をしたエルレンマイヤーフラスコ中19mLの培地に一晩培養物を、OD600が0.5になるまで接種し、NewBrunswickScientificI24振盪機において30°C、250RPMで8時間成長させた。グルコースを2まで添加した時間0時間。48時間後、培養上清Spin-X遠心管フィルタユニット、Costarカタログ番号8169を使用して回収したを、米国特許出願公開第20070092957号明細書に記載される方法のとおりにHPLCにより分析した。結果を表3に示す。kivD遺伝子コピーが組み込まれた株は、プラスミドに含まれるkivDを有する株と比較して同程度のイソブタノール力価を有する。実施例5alsS遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成この実施例の目的は、プラスミドからアセト乳酸シンターゼを取り除いて酵母ゲノムに組み込む場合における、イソブタノール生成の増加を示すことである。alsSが組み込まれていない株プラスミドpYZ090及びpBP915を有するPNY1507を、組込み株プラスミドpYZ090DalsS及びpBP915を有するPNY2204と比較した。株は全て、ヒスチジン及びウラシル不含の、炭素源として0.3グルコース及び0.3エタノールを含有する合成完全培地125mL通気エルレンマイヤーフラスコVWRカタログ番号89095-260中10mL培地で成長させた。一晩インキュベートした後Innova登録商標40NewBrunswickScientific振盪機において30°C、250rpm、培養物を、2グルコース及び0.05エタノール含有合成完全培地で125mLのしっかり蓋をしたエルレンマイヤーフラスコVWRカタログ番号89095-260中、20mlの培地、0.2ODEppendorfBioPhotometerの測定まで希釈し戻した。48時間インキュベートした後Innova登録商標40NewBrunswickScientific振盪機において30°C、250rpm、培養上清Spin-X遠心管フィルタユニット、Costarカタログ番号8169を使用して回収したを、米国特許出願公開第20070092957号明細書に記載される方法のとおりにHPLCにより分析した。結果を以下の表4に示す。alsS遺伝子コピーが組み込まれた株のイソブタノール力価は、alsSを組み込んでいないイソブタノール力価より大幅に高かった。実施例6alsS遺伝子コピーが組み込まれた株におけるイソブタノール生成この実施例の目的は、プラスミドからアセト乳酸シンターゼを取り除いて酵母ゲノムに組み込む場合における、細胞密度及びイソブタノール生成の増加を示すことである。alsSが組み込まれていない株2010年9月2日に出願された米国仮特許出願第61/379,546号明細書参照により本明細書に援用されるに記載されるとおりのPNY1504、及びPNY1506を、組込み株PNY2205pYZ090ΔalsS及びpBP915プラスミドで形質転換された、且つalsS組込みを有するPNY2204と比較した。接種及びバイオリアクター培地6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;0.8mLのエルゴステロール及びツイーン溶液;3gのエタノール;及び3gのグルコースを含有する酵母接種培地1Lを調製した。10mLエルゴステロール及びツイーン溶液については、100mgのエルゴステロールを5mLの100エタノール及び5mLのツイーン80に溶解した。溶液を70°Cで10分間加熱した。凍結バイアルから、全バイアル培養物約1mlを10mLの接種培地にピペッティングすることにより、125mL振盪フラスコを直接接種した。このフラスコを260rpm及び30°Cでインキュベートした。株を、ODが約1.0になるまで一晩成長させた。HEλIOSα分光光度計ThermoElectronCorporation,米国で、λ=600nmにおけるODを決定した。この時点で、110mLの接種培地が入った2L振盪フラスコを、一晩培養物から接種した。2Lフラスコにおける出発ODは0.1であった。フラスコを260rpm及び30°Cでインキュベートした。振盪フラスコのODが約1.0に達したとき、振盪フラスコに、20mLの1MMES緩衝液、20mLの10×酵母エキス及びペプトンYEP、最終濃度30g/Lまでのグルコース及び約160mlのオレイルアルコール90~95、Cognis、CincinnatiOH,米国を添加した。24時間後、オレイルアルコールを除去し、バイオリアクターを接種した。100gの酵母エキス及び200のペプトンを1Lの最終容量まで水に溶解することにより、10×YEP溶液を調整した。以下を含有するバイオリアクター培地1Lを調製した:i塩:硫酸アンモニウム5.0g、リン酸二水素カリウム2.8g、硫酸マグネシウム七水和物1.9g、硫酸亜鉛七水和物0.2g;iiビタミン:ビオチンD-0.40mg、リン酸CaD8.00mg、ミオイノシトール200.00mg、塩酸ピリドキソール8.00mg、p-アミノ安息香酸1.60mg、リボフラビン1.60mg、葉酸0.02mg、ナイアシン30.0mg、及びチアミン30mg;iiiアミノ酸:ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含の酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY20012.8g、1w/vL-ロイシン20mL、及び1w/vL-トリプトファン4mL;及びiv微量元素:EDTATitriplexIII799.38mg、硫酸亜鉛七水和物29.81mg、塩化マンガン二水和物manganesechloridedehydrate5.57mg、塩化コバルトII六水和物1.99mg、硫酸銅II五水和物1.99mg、モリブデン酸二ナトリウム二水和物Di-sodiummolybdenumdehydrate2.65mg、塩化カルシウム二水和物calciumchloridedehydrate29.81mg、硫酸鉄七水和物19.88mg、ホウ酸。バイオリアクター実験計画Sartorius米国からの2LのBIOSTATB-DCUTween2Lバイオリアクターで実験を行った。この発酵槽はThermoElectronCorporation米国からの質量分析計につなぐ。80mLの接種材料を接種した直後、発酵槽の容量は約800mlであり、溶存酸素分圧DOTを10に制御し、pHを5.25に制御し、曝気を0.5L/分に制御し、0.8Lのレイルアルコールを添加した。オレイルアルコールを用いて培養ブロスからイソブタノールを抽出した。培養実験の分析方法十分に混合したブロス試料を適切なキュベットCS500VWRInternational,独国にピペッティングすることにより、λ=600nmでの光学濃度ODを分光光度計を用いて決定した。試料のバイオマス濃度が分光光度計の線吸収範囲典型的にはOD値0.000~0.600を超える場合、0.9NaCl溶液で試料を希釈して、線吸収範囲の値を得た。培地中の代謝産物及び生成物を分析し、GC方法及びPhenomenexTorrance,CAからのZB-WAXplusカラム30m×0.25mm内径、0.25μm膜を用いて定量化した。ヘリウムキャリアガスを2.3mL/分の定流量で用いた;250°Cで1:20の注入器スプリット;70°Cのオーブン温度で1分間、続いて10°C/分で70°Cから160°C、及び30°C/分で160°Cから240°C。水素炎イオン化検出FIDを、40mL/分のヘリウムメークアップガスにより260°Cで使用した。培養ブロス試料は、注入前に0.2μmスピンフィルタでろ過した。0.5μlの注入量を用いた。イソブタノールの校正標準曲線を作成した。当該技術分野において公知の方法を用いて、高速液体クロマトグラフィーHPLCによりグルコース及び発酵副産物の分析を行った。HPLC方法では、ShodexSH-Gガードカラムを備えたShodexSH-1011カラム双方ともWatersCorporation,Milford,MAから入手可能を、屈折率RI検出と共に利用した。クロマトグラフ分離は、0.01NのH2SO4を移動相として使用して、0.5mL/分の流量及び50°Cのカラム温度で実現した。イソブタノール保持時間は47.6分であった。培養上清中のイソブタノール濃度をHPLC方法により決定した。オレイルアルコール相のイソブタノール濃度をGC方法により決定した。排ガス試料中のイソブタノール濃度を、上述のとおり質量分析計により決定した。結果光学濃度の計測値OD、イソブタノール生成速度R、培養ブロス1リットル当たりに生成されたイソブタノールイソブタノール力価、T、及び発酵時間約46時間目における消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率Yを表5に提供する。PNY2205株は、PNY1504株及びPNY1506株と比較してより高い細胞密度に成長し、力価及び速度が増したが、収率は同程度であった。実施例7同じ反応性液体抽出条件下における株PNY1504及び株PNY2205のパフォーマンスの比較使用原液プレシード培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;3gのグルコース及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。シードフラスコ培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;30gのグルコース;38gのMES緩衝液Sigma-AldrichYXXX及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。エルゴステロール溶液0.2gのエルゴステロールの溶液、10mLの200プルーフエタノール及び10mlのツイーン80を混合し、10分間70°Cに加熱した。Distillase原液0.9mLのDistillaseL400の溶液と49.1mLのろ過滅菌した水道水とを混合した。Lipolase100L原液2.12mLのLipolase100LSigmaAldrichL0777の溶液及びpH6.8のリン酸緩衝溶液40gを混合してろ過滅菌した。ビタミン原液5gのニコチン酸と1gのチアミンとを、500mLのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。トウモロコシマッシュトウモロコシマッシュを30L液化タンクに加えた。次に、その30L液化タンクに、16910gの水道水を120rpmで撹拌しながら加えた。タンクには、DB/DT=約0.25のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、14091gの粉砕したトウモロコシハンマーミルで1ミクロンスクリーンにより粉砕を加え、マッシュを55°Cに加熱して、その温度に30分間維持した。5.4gの17NaOH水溶液を加えることにより、pHを5.8に調整した。1986gの水道水と19.5gのGenencorからのSpezymeFredLとを混合することによりα-アミラーゼ酵素溶液を調製し、得られた溶液を0.2ミクロンフィルタで滅菌ろ過した。この溶液2004gを30L液化タンクに加え、55°Cでさらに60分間維持した。次に溶液を95°Cに加熱し、その温度に120分間維持した。溶液は、発酵に使用する前に30°Cに冷却した。PNY1504プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY1504の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mLを、同じフラスコに加えた。次に培養物を、インキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第1段階15mLのプレシード培養物を、2Lのバッフル付き通気振盪フラスコ中の300mLのシードフラスコ培地に加えた。フラスコをインキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階次に30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加えた。このフラスコを、インキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、96mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。12時間後、2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目にさらなる2mLのDistillase原液を加えた。次に溶液を、pH5.2、温度30°C及びpO2溶存酸素の分圧設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpm標準リットル毎分に設定し、及びpO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。PNY2205プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY2205の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mLを、同じフラスコに加えた。次にフラスコを、インキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間維持した。シードフラスコ第1段階300mLのシードフラスコ培地を2Lのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。15mLのプレシード培養物をフラスコに加え、インキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、96mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後12時間目に2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目に2mLのDistillase原液をさらに加えた。溶液を、pH5.2、温度30°C及びpO2設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpmに設定し、pO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。培養実験の分析方法得られた培養物の光学濃度ODを、分光光度計を用いてλ=600nmで計測した。第一に、十分に混合したブロス試料を適切なキュベットにピペッティングした。試料のバイオマス濃度が分光光度計の線吸収範囲典型的にはOD値0.000~0.600を超えた場合、試料を0.9NaCl溶液で希釈して線吸収範囲内の値を得た。予め秤量した遠心管で5mLの細胞ブロスを遠心し、続いて蒸留水で洗浄し、オーブンにおいて80°Cで恒量に乾燥し、重量差を決定することにより、細胞懸濁液の乾燥重量を決定した。培地中の代謝産物及び生成物を、GC方法により、PhenomenexTorrance,CAからのZB-WAXplusカラム30m×0.25mm内径、0.25μm膜を利用して分析及び定量化した。キャリアガスは2.3mL/分の定流量のヘリウムであった;注入器スプリットは250°Cで1:20であった;オーブン温度は、70°Cで1分間、10°C/分で70°Cから160°C、及び30°C/分で160°Cから240°Cである。FID検出は、40ml/分ヘリウムメークアップガスにより260°Cで用いた。培養ブロス試料は、注入前に0.2μmスピンフィルタでろ過した。イソブタノールw-メチル-1-プロパノールの校正標準曲線を使用した。YSI酵素電極技術を用いてグルコース濃度の迅速測定値を生成するYSI2700Select生化学分析器により、グルコース分析を実施した。結果イソブタノール生成速度、培養ブロス1リットル当たりのイソブタノール有効力価、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を、表6に提供する。PNY2205株はPNY1504株と比較して生成速度及び力価がより高かったが、収率は同程度であった。実施例8同じ反応性液体抽出条件下における株PNY1504及び株PNY2205のパフォーマンスの比較使用原液プレシード培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;3gのグルコース及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。シードフラスコ培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;30gのグルコース;38gのMES緩衝液Sigma-AldrichYXXX及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。エルゴステロール溶液0.2gのエルゴステロールの溶液、10mLの200プルーフエタノール及び10mlのツイーン80を混合し、10分間70°Cに加熱した。Distillase原液0.9mLのDistillaseL400の溶液と49.1mLのろ過滅菌した水道水とを混合した。Lipolase100L原液2.12mLのLipolase100LSigmaAldrichL0777の溶液及びpH6.8のリン酸緩衝溶液40gを混合してろ過滅菌した。ビタミン原液5gのニコチン酸と1gのチアミンとの溶液を、500mLのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。トウモロコシマッシュトウモロコシマッシュを30L液化タンクに加えた。次に、その30L液化タンクに、16910gの水道水を120rpmで撹拌しながら加えた。タンクには、DB/DT=約0.25のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、14091gの粉砕したトウモロコシハンマーミルで1ミクロンスクリーンにより粉砕を加え、マッシュを55°Cに加熱して30分間インキュベートした。5.4gの17NaOH水溶液を加えることにより、pHを5.8に調整した。1986gの水道水と19.5gのGenencorからのSpezymeFredLとを混合し、0.2ミクロンフィルタで滅菌ろ過することにより、α-アミラーゼ酵素溶液を調製した。この溶液2004gを30L液化タンクに加え、55°Cでさらに60分間インキュベートした。次に、溶液を95°Cに加熱し、その温度に120分間維持した。次に、発酵に使用するまでに、溶液を30°Cに冷却した。PNY1504プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY1504の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mLを、同じフラスコに加えた。培養物をインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第1段階300mLのシードフラスコ培地を2Lのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。次に15mLのプレシードをフラスコに移した。次にそのフラスコをインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、141mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後12時間目に2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目に2mLのDistillase原液をさらに加えた。次に溶液をpH5.2、温度30°C及びpO2設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpmに設定し、pO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。PNY2205プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY2205の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mlを、同じフラスコに加えた。次にフラスコをインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第1段階2Lのバッフル付き通気振盪フラスコに、300mLのシードフラスコ培地を加えた。次に15mLのプレシード成長物pre-seedgrowthをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、96mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後12時間目に2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目に2mLのDistillase原液をさらに加え、溶液を、pH5.2、温度30°C及びpO2設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpmに設定し、pO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。結果イソブタノール生成速度、培養ブロス1リットル当たりのイソブタノール有効力価、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を表7に提供する。PNY2205株は、PNY1504株と比較して生成速度及び力価がより高かったが、収率は同程度であった。実施例9同じ反応性液体抽出条件下における株PNY1504及び株PNY2205のパフォーマンスの比較使用原液プレシード培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;3gのグルコース及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。シードフラスコ培地以下の試薬を、室温で穏やかに撹拌しながら混合した:6.7gのアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地Difco0919-15-3;2.8gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシル不含酵母合成ドロップアウト培地サプリメントSigmaY2001;20mLの1w/vL-ロイシン;4mLの1w/vL-トリプトファン;3gのエタノール;30gのグルコース;38gのMES緩衝液Sigma-AldrichYXXX及び合計1Lの溶液を作るのに十分な水。混合後、溶液をろ過滅菌した。エルゴステロール溶液0.2gのエルゴステロールの溶液、10mLの200プルーフエタノール及び10mlのツイーン80を混合し、10分間70°Cに加熱した。Distillase原液0.9mLのDistillaseL400の溶液と49.1mLのろ過滅菌した水道水とを混合した。Lipolase100L原液2.12mLのLipolase100LSigmaAldrichL0777の溶液及びpH6.8のリン酸緩衝溶液40gを混合してろ過滅菌した。ビタミン原液5gのニコチン酸と1gのチアミンとの溶液を、500mLのろ過滅菌した脱イオン水中に混合した。トウモロコシマッシュトウモロコシマッシュを30L液化タンクに加えた。次に、その30L液化タンクに、16910gの水道水を120rpmで撹拌しながら加えた。タンクには、DB/DT=約0.25のデュアルブレードピッチ付きブレードタービンが装備された。次に、14091gの粉砕したトウモロコシハンマーミルで1ミクロンスクリーンにより粉砕を加え、マッシュを55°Cに加熱して30分間インキュベートした。5.4gの17NaOH水溶液を加えることにより、pHを5.8に調整した。1986gの水道水と19.5gのGenencorからのSpezymeFredLとを混合し、0.2ミクロンフィルタで滅菌ろ過することにより、α-アミラーゼ酵素溶液を調製した。この溶液2004gを30L液化タンクに加え、55°Cでさらに60分間インキュベートした。次に、溶液を95°Cに加熱し、その温度に120分間維持した。次に、発酵に使用するまでに、溶液を30°Cに冷却した。PNY1504プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY1504の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mLを、同じフラスコに加えた。培養物をインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第1段階300mLのシードフラスコ培地を2Lのバッフル付き通気振盪フラスコに加えた。次に15mLのプレシードをフラスコに移した。次にそのフラスコをインキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、そのフラスコをインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、141mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後12時間目に2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目に2mLのDistillase原液をさらに加えた。次に溶液をpH5.2、温度30°C及びpO2設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpmに設定し、pO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。PNY2205プロセスプレシード成長250mLのバッフル付き通気振盪フラスコに、30mLのプレシード培地を加えた。次に、株PNY2205の凍結シードバイアル2本、総量約1.5mlを、同じフラスコに加えた。次にフラスコをインキュベーター振盪機において30°C、250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第1段階2Lのバッフル付き通気振盪フラスコに、300mLのシードフラスコ培地を加えた。次に15mLのプレシード成長物pre-seedgrowthをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。シードフラスコ第2段階30mLの酵母エキスペプトン及び300mLの滅菌オレイルアルコールをフラスコに加え、インキュベーター振盪機において30°C及び250rpmで24時間インキュベートした。1L生成発酵槽水でプローブが被覆された1L発酵槽を121°Cで30分間滅菌した。排水し、520mLの滅菌トウモロコシマッシュ培地を加えた。次に、発酵槽中のトウモロコシマッシュに対し、以下の無菌添加を行った:3.8mLのエタノール、0.6mLの1エルゴステロール溶液、6mLのニコチン酸/チアミン溶液及び4.8mLのLiplolase100L原液。次に、シードフラスコ第2段階の水相60mLを加え、続いて2mLのDistillase原液を加えた。そのすぐ後に、96mLのトウモロコシ油脂肪酸を加えた。接種後12時間目に2mLのDistillase原液を加えた。接種後24時間目に2mLのDistillase原液をさらに加え、溶液を、pH5.2、温度30°C及びpO2設定値3でインキュベートした。空気流量は0.2slpmに設定し、pO2は撹拌によって制御した。20w/vのKOH溶液でpHを制御し、この発酵全体を通じて酸は不要であった。発酵の間に試料を採取して分析した。結果イソブタノール生成速度、培養ブロス1リットル当たりのイソブタノール有効力価、及び消費されたグルコース当たりのイソブタノール収率を表8に提供する。PNY2205株は、PNY1504株と比較して生成速度及び力価が高くなったが、収率は同程度であった。実施例10S.セレビシエS.cerevisiae株PNY2211の構築PNY2211を、S.セレビシエS.cerevisiae株PNY1507実施例2から以下の段落に記載するとおり数工程で構築した。第一に、ホスホケトラーゼ遺伝子を含むようにこの株を修飾した。ホスホケトラーゼ遺伝子カセット及び組込み株の構築については、以前に、2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356,379号明細書に記載されている。次に、実施例3に記載される組込みベクターを使用して、株にアセト乳酸シンターゼ遺伝子alsSを付加した。最後に、相同組換えを用いてホスホケトラーゼ遺伝子及び組込みベクター配列を除去すると、pdc1Δ::ilvD以前に記載されたPDC1ORFの欠失/挿入、2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356,379号明細書;本明細書の実施例1を参照のことと染色体XIIの天然TRX1遺伝子との間の遺伝子間領域におけるalsSのスカーレス挿入が得られた。PNY2211の得られた遺伝子型は、MATaura3Δ::loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ::P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ::loxPfra2Δadh1Δ::UASPGK1P[FBA1]-kivD_Lly-ADH1tである。ホスホケトラーゼ遺伝子カセットを相同組換えによりPNY1507に導入した。組込みコンストラクトは以下のとおり作成した。プラスミドpRS423::CUP1-alsSFBA-budA米国特許出願公開第2009/0305363A1号明細書に記載されるをNotI及びXmaIで消化し、1.8kbのFBA-budA配列を取り除き、クレノウ断片で処理した後、ベクターを再度ライゲートした。次に、DNA2.0MenloPark,CAからのDNA合成及びベクター構築サービスにより、CUP1プロモーターをTEF1プロモーター変異体Nevoigtetal.Appl.Environ.Microbiol.2006.728:5266-5273により記載されるM4変異体で置換した。得られたプラスミドpRS423::TEFM4-alsSをStuI及びMluIで切断しalsS遺伝子の一部及びCYC1ターミネーターを含む1.6kb部分を除去する、プライマーN1176配列番号207及びN1177配列番号208によりpRS426::GPD-xpk1ADH-eutD2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356,379号明細書に記載される;本明細書の配列番号246から産生した4kbのPCR産物、及びプライマーN822配列番号209及びN1178配列番号210により酵母ゲノムDNAENO1プロモーター領域から産生した0.8kbのPCR産物DNAと組み合わせ、S.セレビシエS.cerevisiae株BY4741に形質転換したATCC201388;ギャップ修復クローニング法、MaandBotsteinを参照のこと。ヒスチジン不含合成完全培地に細胞を播くことにより、形質転換体を得た。予想されたプラスミドpRS423::TEFM4-xpk1ENO1-eutD、配列番号211の正しい構築物を、PCRプライマーN821配列番号212及びN1115配列番号213により、及び制限消化BglIにより確認した。続いて2つのクローンを配列決定した。3.1kbのTEFM4-xpk1遺伝子をSacI及びNotIで消化することにより単離し、pUC19-URA3::ilvD-TRX1ベクター2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356,379号明細書に記載される、本明細書の配列番号243クローンA、AflIIで切断にクローニングした。クローニング断片をクレノウ断片で処理し、ライゲーション用の平滑末端を作成した。ライゲーション反応物を大腸菌E.coliStbl3細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。TEFM4-xpk1の挿入を、PCRプライマーN1110配列番号214及びN1114配列番号215により確認した。ベクターをAflIIで直鎖化し、クレノウ断片で処理した。1.8kbのKpnI-HincIIジェネティシン耐性カセット2010年6月18日に出願された米国仮特許出願第61/356,379号明細書に記載される;本明細書の配列番号245を、クレノウ断片処理後にライゲートすることによりクローニングした。ライゲーション反応物を大腸菌E.coliStbl3細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ジェネティシンカセットの挿入を、PCRプライマーN160SeqF5配列番号216及びBK468配列番号217により確認した。プラスミド配列は配列番号218pUC19-URA3::pdc1::TEFM4-xpk1::kanとして提供される。得られた組込みカセットpdc1::TEFM4-xpk1::KanMX::TRX1を単離しAscI及びNaeI消化により、ゲル精製された5.3kbバンドが生じた、ZymoResearchFrozen-EZ酵母形質転換キットカタログ番号T2001を使用してPNY1507実施例2に形質転換した。YPE50μg/mlG418に播くことによって形質転換体を選択した。予想された遺伝子座での組込みを、PCRプライマーN886配列番号219及びN1214配列番号220により確認した。次に、CreリコンビナーゼをコードするプラスミドpRS423::GAL1p-Creを使用して、loxP隣接KanMXカセットを取り除いた本明細書に記載されるベクター及び方法。カセットが正しく取り除かれたことを、PCRプライマーoBP512配列番号221及びN160SeqF5配列番号222により確認した。最後に、本明細書に記載されるalsS組込みプラスミドpUC19-kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1、クローンAを、含まれているジェネティシン選択マーカーを用いてこの株に形質転換した。2つの組み込み体を、プラスミドpYZ090ΔalsS及びpBP915で形質転換し本明細書に記載されるプラスミド、MethodsinYeastGenetics2005.Amberg,BurkeandStrathernのプロトコル2を用いて形質転換した、及びグルコース含有培地における成長及びイソブタノール生成を評価することにより成長及びイソブタノール計測方法は、本明細書及び2005年10月26日に出願された米国仮特許出願第60/730,290号明細書、及び米国特許出願公開第2007/0092957A1号明細書に記載される、アセト乳酸シンターゼ活性について試験した。2つのクローンのうちの一つは陽性であり、PNY2218と命名した。プラスミドpYZ090ΔalsS及びpBP915を含むPNY2218の単離物は、PNY2209と命名した。PNY2218をCreリコンビナーゼで処理し、得られたクローンを、PCRプライマーN886配列番号219及びN160SeqR5配列番号222により、xpk1遺伝子及びpUC19組込みベクター配列の喪失についてスクリーニングした。これにより、xpk1上流のDNAと組込みベクターの挿入中に導入された相同DNAの組換え後、pdc1-TRX1遺伝子間領域に組み込まれたalsS遺伝子のみが残るベクター、マーカー遺伝子及びloxP配列が失われるためスカーレス挿入、図6。この組換えはいずれの時点でも起こり得たが、ジェネティシン選択がなくともベクターの組込みは安定しているように思われ、組換えイベントはCreリコンビナーゼの導入後にのみ観察された。一つのクローンをPNY2211と命名した。実施例11同じ反応性液体抽出条件下における株PNY2205及び株PNY2211のパフォーマンスの比較イソブタノール生成をPNY2205と比較するため、スカーレス組込みを有する単離物特に2つのクローンB及びMをpYZ090ΔalsS及びpBP915で形質転換した。組み込み体を、1エタノールを炭素源として含む合成完全培地ヒスチジン及びウラシル不含で選択した。組み込み体を同じ培地にパッチし、パッチした細胞を2グルコース0.05エタノールを炭素源として含むプレートに再びパッチした。2日後、パッチを使用して液体培地10mL合成完全、ヒスチジン及びウラシル不含、2グルコース及び0.05エタノール含有、125mL通気フラスコ中を接種した。一晩インキュベートした後30°C、250rpm、培養物をOD0.2に希釈し戻したしっかり蓋をした125mLフラスコ中、20mLの培地。48時間後、試料を採取してイソブタノール生成を決定した。新規の株背景は、PNY2205と同程度のイソブタノール生成を支持した。さらなる操作用にクローンMを選択し、PNY2211と命名した。プラスミドpYZ090DalsS及びpBP915で形質転換したクローンM7をPNY2213と命名した。株PNY2205、クローンB及びクローンMの培養ブロス1リットル当たりのイソブタノールの生成g/L単位での有効力価を表9に提供する。クローンB株及びM株は、PNY2205と比較して同程度のイソブタノール力価を有した。"