一次病原体に対する抗原を含むワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量の一次病原体に対するワクチンを動物に投与することを含む、二次病原体に起因する疾患から動物を保護するための方法。一次病原体に対する抗原を含むワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量の一次病原体に対するワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するための方法。イヌインフルエンザウイルスCIVに対するワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量のCIVワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するための方法。二次病原体がStreptococcusequisubsp.ZooepidemicusS.equiである請求項3記載の方法。イヌインフルエンザウイルスCIVに対するワクチンを提供すること、および免疫学的に有効量のCIVワクチンをイヌに投与することを含む、イヌ感染性呼吸器疾患CIRDからイヌを保護するための方法。ワクチンが1または複数の追加の免疫原を含む混合ワクチンである請求項5記載の方法。1または複数の追加の免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、Leptospira属血清型菌種、Leishmania属生物体、Borrelia属菌種spp.、Bordetellabronchiseptica、Mycoplasma属菌種、狂犬病ウイルス、Ehrlichiacanis、およびその任意の組み合せから成る群から選択される請求項6記載の方法。ワクチンが1または複数の追加の免疫原をさらに含む混合ワクチンである請求項4記載の方法。1または複数の追加の免疫原が、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌニューモウイルス、Leptospira属血清型菌種、Leishmania属生物体、Borrelia属菌種spp.、Bordetellabronchiseptica、Mycoplasma属菌種、狂犬病ウイルス、Ehrlichiacanis、およびその任意の組み合せから成る群から選択される請求項8記載の方法。CIVワクチンをイヌに投与することを含む、二次病原体に起因する疾患からイヌを保護するためのCIVワクチンの使用。CIVワクチンをイヌに投与することを含む、S.equi疾患からイヌを保護するためのCIVワクチンの使用。諸言7から8週令の総数32匹のイヌを本研究において使用した。イヌ10匹からなる1群を2の投与量のイヌインフルエンザH3N8不活化ウイルスワクチンに接種し、21日間隔で投与した。ワクチン接種イヌを、ブースターワクチン接種の2週間後に病原性CIVおよびS.equiに攻撃感染した。残りのイヌ3群は、ワクチン接種せず単独および重複攻撃感染後の病原性を評価するために使用した。イヌ6匹からなる1群をCIVに単独攻撃感染し、もう一つのイヌ6匹からなる群をS.equiに単独攻撃感染した。イヌ10匹からなる1群をCIVおよびS.equiの双方に攻撃感染した。全てのイヌは、その呼吸器疾患の臨床徴候およびウイルスおよび/または細菌排出に関しモニターした。CIVに対する抗体力価を測定するために、ワクチン接種した群からはワクチン接種前に、全ての群からは攻撃感染投与前および死体解剖時に血清試料を採取した。CIV攻撃感染後14日目研究49日目にイヌを安楽死させ、その病変に関し肺を評価した。死体解剖時にS.equi単離のために肺洗浄試料を採取した。群4の7~8週令のイヌをワクチン接種するためにイヌインフルエンザH3N8不活化ウイルスワクチンIntervetInc.、Elkhorn、NEの市販品を使用した。群4の全てのイヌは最初のワクチン接種時にCIV血清陰性であり、群1、2および3の全てのイヌはCIV攻撃感染時にCIV血清陰性だった。イヌを性別および同腹仔によって分類しコンピューター発生乱数を割り当てた。イヌを昇順で乱数によって分類し処理群に割り当てた。群4のイヌ全10匹に研究0日目および21日目に、CIVワクチン1mL製造番号219104の皮下注射によってCIVのワクチンを接種した。臨床評価:臨床評価を実施し研究33日目と34日目CIV攻撃感染前の2日間、およびCIV攻撃感染日研究35日目に全てのイヌの体温を記録した。臨床所見は臨床評価ガイドに従って実施した。試料採取:全てのイヌからCIV攻撃感染投与の前日研究34日目に約5mLの血液試料を採取した。またCIV排出を検出するために、群1、3および4のイヌの全てから研究34日目に鼻腔スワッブも採取した。イヌインフルエンザウイルス:3回の継代で集めたウイルス単離株CIV14-06Aイヌインフルエンザウイルス、CIV14-06AP3と呼ぶを攻撃感染ウイルスとして使用した。本ウイルスは元来イヌ呼吸器疾患に罹患したイヌから単離された。攻撃感染の日、凍結したウイルス含有液体を使用直前に解凍し、無菌で冷温のダルベッコ改変イーグル培地DMEMで、目的攻撃感染投与量7.5Log10TCID50を含有するイヌ当たり2mLの終容量まで希釈した。Streptococcusequisubspzooepidemicus:細菌単離株は動物保護施設に収容されイヌ呼吸器病症候群により死亡したイヌから獲得した。細菌を単離し、純化しS.equisubspzooepidemicusと同定した。細菌をブレインハートインフュージョン培地BHIで増殖し1X109cfu/mLとなるまで希釈して攻撃感染物質を調製した。攻撃感染投与イヌインフルエンザウイルス:群1、3および4のイヌを35日目にCIVに攻撃感染した。攻撃感染を加えるために、イヌ4匹をプレキシグラスチャンバー内に収容し、約25~30分間にわたってエアロゾルを発生するために攻撃感染ウイルス8mL2mL/イヌを使用した。イヌはエアロゾルに合計40分間暴露した。S.equisubspzooepidemicus:群2、3および4のイヌを研究38日目にS.equiに攻撃感染した。mL当たりS.equiを1x109cfu含有する攻撃感染物質半ミリリットル0.5mLをイヌの全ての各鼻孔に鼻カニューレを使用して点滴した。攻撃感染後のモニタリング臨床徴候:攻撃感染後の13日間毎日、各イヌについて直腸温を記録し臨床評価を実施した。鼻腔スワッブの採取イヌインフルエンザウイルス:CIV排出を評価するために、攻撃感染の日から10日間毎日、各イヌから鼻腔スワッブを採取した。鼻腔スワッブはウイルス輸送用培地に採取した。S.equiの単離:細菌単離のために、攻撃感染後死体解剖日まで3日に1度、細菌輸送用培地を使用して鼻腔スワッブを採取した。採血:CIVに対する抗体力価を評価するために、死体解剖日に血液試料約5~10mLを採取した。死体解剖/処分群3のイヌ1匹IDはCAUELWは重篤な呼吸困難のために研究43日目すなわちCIVに攻撃感染後8日、S.equiに攻撃感染後5日に死亡した。当該イヌは死亡前の2日間、発熱、抑うつ状態、重篤な咳嗽および呼吸困難を示した。死体解剖により、肺葉と胸壁間の線維素性癒着、肺葉の硬化および微膿瘍で特徴付けられる重症肺炎であることが明らかになった。群1のイヌ1匹IDはCAUELZは研究43および44日目に発熱、重篤な咳嗽、抑うつ状態および呼吸困難を示した。それ故に研究獣医は44日目CIV攻撃感染後9日に当該イヌを安楽死させ死体解剖を実施した。肺病変は肺炎を暗示する硬化によって特徴付けられた。攻撃感染後死体解剖所見および標本:残りのイヌの全てはCIV攻撃感染後14日目に安楽死させた。迅速な肺評価を可能とするために、イヌは死後変化が始まる前、死体解剖の直前に安楽死させた。また細菌の単離のために新鮮な肺組織由来の肺洗浄液も採取した。臨床評価ガイド隔離室への入室の際に、臨床評価を実施する研究員は動物の態度を評価するためにざっと見渡して歩き、それから臨床所見を続けた。攻撃感染投与等の他の処置を行う前に、臨床所見は最初に各イヌに対し完了させた。各臨床徴候をスコア化するために以下のガイドラインを使用した。鼻漏0=無0.5=漿液性排膿:希薄で清澄な液体が鼻孔から滴る。ここに記録されるためには、液体が鼻から流出していなければならない。1=粘液膿性排膿、軽度ないし中度:粘液と混ざった濁った液体が少なくとも鼻から口の中間まで流れる。2=粘液膿性排膿、重度:粘液が口を通り過ぎて流れる。眼漏0=無:目頭、目尻中の少量の乾燥固化物質は眼漏とはみなさない。0.5=漿液性排膿:清澄な液体が少なくとも眼から少なくとも口の中間まで流れるように排膿される。1=粘液膿性排膿、軽度ないし中度:粘液と混ざった濁った液体が少なくとも眼から口の中間まで流れる。2=粘液膿性排膿、重度:液体または粘液が鼻の中間まで流れるかまたは眼を縁取り、目頭または目尻で髪をびしょ濡れにする。咳嗽0=無0.5=軽度:1回の短い咳だけが観察される。1.0=中度:咳が持続し、観察期間中に繰り返し起きる。2.0=重度:咳にゼイゼイまたはゲイゲイ言う音が伴う。くしゃみ0=無2=有呼吸困難0=無正常呼吸2=有努力呼吸抑うつ状態0=無正常活動2=有:正常と比較してイヌが活動的または陽気でない。観察の最中に立つのを嫌がり無気力または寝転んでいるならば、仔イヌは記録される。分析方法赤血球凝集抑制HAIアッセイ:赤血球凝集抑制HAIアッセイによってイヌ血清試料中のCIVに対する抗体を測定した。手短に言えば、96穴U底マイクロタイタープレートでPBSにより試験用血清の2倍段階希釈を実施した。試験用血清を含有する各ウェルに4HA単位のCIV25-06Bを含有する等容量25μLのウイルス懸濁液を添加し、抗原抗体反応を起こすためにプレートを20~25°Cで60±5分間インキュベートした。それから50μLの0.5雄鶏赤血球懸濁液を添加した。プレートを20~25°Cで45~60分間インキュベートしHAI結果を読み取った。HAI力価は、赤血球凝集抑制を示す血清の最高希釈度の逆数として記録した。アッセイ全てを繰り返して実施しエンドポイント法によるHAI力価を測定した。細胞培養液でのCIV滴定:攻撃感染物質の力価を確認し、攻撃感染イヌにおけるウイルス排出を測定するために、攻撃感染物質および鼻腔スワッブ中のウイルス力価をMDCK細胞における滴定によって測定した。MDCK細胞を96穴組織培養プレートに2~3日間播種し、10倍段階希釈ウイルス懸濁液または鼻腔スワッブから調製した試料と共にインキュベートした。プレートは、温度36±2およびCO24~6下でインキュベートした。攻撃感染後7日目にプレートを細胞変性効果CPEについて観察し、Spearman-Karber法を使用して攻撃感染力の50エンドポイント細胞50に対する感染力を算出した。ウイルス力価はLog10TCID50/mLとして表した。S.equiの単離:試料上清を血液寒天培地10μLに接種し、平板培地を36±2°Cで24~48時間培養した。溶血現象を示したコロニーを、グラム染色、形態、コロニー特性および標準同定試験例えば、オキシダーゼ、カタラーゼおよびコアグラーゼ試験によってさらにS.equiと同定した。データ解析結果変数:肺病変スコアが主要な変数だった。他の変数には、臨床徴候、ウイルス排出、細菌排出および血清学が含まれた。統計解析肺病変スコア:死体解剖の間に採点された各肺葉の硬化は、肺スコアリングシステムに基づく重み付けしたスコアに変換した。種々の群の関する肺スコアの中央値は、ウィルコクソン順位和検定を使用して比較した。非ワクチン接種群に関する減少したワクチン有効率の推定値および当該推定値に対する95の信頼区間についても報告する。臨床スコア:各イヌに対する総臨床スコアを得るために、発熱、眼漏、鼻漏、くしゃみ、咳嗽、抑うつ状態および呼吸困難に関する攻撃感染後13日間の臨床スコアを合計した。総スコアはウィルコクソン順位和検定を使用して処理群の間で比較した。ウイルス排出:各イヌに対するウイルス力価Log10TCID50/mLを攻撃感染後10日間にわたり合計した。平均曲線下面積AUCおよびウイルス排出日数は、ウィルコクソン順位和検定を使用して解析した。細菌排出:細菌排出の日数は、ウィルコクソン順位和検定を使用して解析し排出陽性の日数を処理群間で比較した。血清転換:異なる時点における幾何平均抗体力価を報告した。統計解析は、SASバージョン9.1.3SASInstitute、Cary、NC、USAを使用して実施した。p<0.05で統計的有意と判定した。検査妥当性およびロット判定基準群4のイヌ以外のイヌの全ては、CIV攻撃感染時にCIV抗体陰性だった。群2のイヌ以外のイヌの全ては、CIV攻撃感染時に経鼻CIV排出陰性だった。群2のイヌはCIV排出の試験をしなかった。CIVに攻撃感染した非ワクチン接種イヌの全ては群1および3、CIV攻撃感染後に高変動度の肺病変を示した。結果と考察妥当性:群4のイヌの全ては最初のワクチン接種の前はCIV血清陰性で、非ワクチン接種イヌの全て群1、2および3はCIV攻撃感染攻撃前、血清陰性のままだった表2。またイヌの全ては、CIV攻撃感染時にCIVおよび/Sequi排出も陰性だった表5および6。血清転換:HAI抗体力価を表にまとめ処理群間で比較した表2。ワクチン接種後にワクチン接種イヌの全てがCIVに血清転換した。HAI抗体力は10から160の間で変動し、34日目のGMT幾何平均力価が73だった。ワクチン接種した大多数80は、40またはそれ以上のHAI力価を発生した。非ワクチン接種群のイヌの全ては、CIV攻撃感染時にCIV血清陰性だったHAI力価<10。攻撃感染後、ワクチン接種イヌの抗体力価は非常に高いレベルに達したがGMT>6378、このことは病原性CIVに対する免疫系の抗原刺激におけるワクチンの有効性を証明している。当該イヌの全てのHAI力価は少なくとも2560だった。群1および3のCIVに攻撃感染した非ワクチン接種イヌは、CIV攻撃感染後に血清転換し、GMTがそれぞれ226および278だった。群2のイヌの全ては死体解剖時にCIV血清陰性のままだったが、このことは当該イヌがCIVに暴露されなかったことおよびバイオセキュリティー手法が有効だったことを裏付けている。攻撃感染の確認:攻撃感染投与前後に凍結し-50°Cまたはそれ以下に保存した攻撃感染ウイルス試料は、MDCK細胞上で滴定し、投与量がイヌ当たり7.73Log10TCID50のCIV14-06Aであることを確認した。さらに、攻撃感染前と攻撃感染後の保存試料の間に実質的な差異がなかった。血液寒天培地で滴定したS.equi保存試料は、攻撃感染物質の力価が1X109pfu/mLであることを確認した。攻撃感染投与の過程において細菌は生存可能なままだった。直腸温および臨床徴候:研究33日目から48日目までの毎日、処理群全ての直腸温を記録した表3。群1CIV単独のイヌ6匹中2匹に臨床的な発熱≧39.5°Cが1日間だけ生じた。またそのイヌ2匹中1匹に重篤な抑うつ状態が生じ安楽死させた。群2のイヌ6匹中1匹S.equi単独に軽度の発熱が1日間だけ生じた。CIVとS.equiの双方に攻撃感染した群3のイヌ9010匹中9匹に発熱が生じ、その大多数70は少なくとも2日間発熱を呈した。またワクチン接種イヌの5010匹中5匹、群4にも重複攻撃感染後に発熱が生じた。しかし初熱は1日間しか続かなかった。またイヌの全ては、他の臨床徴候、例えば眼漏、鼻漏、くしゃみ、咳嗽、呼吸困難および抑うつ状態等に関しても、研究33日目から48日目までの毎日モニターした。CIVに、およびCIVプラスS.equiに攻撃感染したイヌの全て群1、3および4は、攻撃感染後2日目から始まる広範囲な臨床徴候を示した表4および図1。咳嗽および呼吸困難が主な臨床徴候だった。群16/6と群310/10のイヌの全ては、それぞれ平均2.7日間および4.5日間持続する高変動度の咳嗽を示した。一方では、群4のワクチン接種イヌのわずか606/10だけが平均1.3日間持続する軽度の咳嗽を示した。群1のイヌ1匹IDはCAUELZは、CIV攻撃感染後9日目に抑うつ状態と呼吸困難のために安楽死させた。群3のイヌ1匹IDはCAUELWは、CIV攻撃感染後8日目に死体で発見された。S.equiに単独攻撃感染したイヌ6匹のどれも如何なる臨床徴候も示さなかった。結果は、CIVが死に至らしめ得る重篤な呼吸器疾患をイヌに引き起こす可能性のあることを示唆する。S.equiは二次病原体としてふるまいCIV誘発性疾患を亢進する。S.equi単独ではそれ自身如何なる臨床疾患も誘発しなかった。ウイルス排出:CIV攻撃感染イヌ群1、3および4の全てにおいて、攻撃感染前日それから攻撃感染後1から10日目までの毎日、経鼻ウイルス排出をモニターした。各群に対する平均ウイルス力価を、Log10TCID50/mLとして表し、攻撃感染後の日数に対して示した表5および図2。群1および4のイヌの50および群3のイヌの全て100は、攻撃感染後1日目から鼻汁中にCIVを排出し始めた。攻撃感染後2日目までに、全3群のイヌの全ては経鼻ウイルス排出陽性だった。ウイルス排出はCIV攻撃感染後4から5日目の間にピークに達しその後6日目に急激に低下した図2。非ワクチン接種およびワクチン接種の双方とも、攻撃感染後8日目までに鼻汁中へのCIV排出を停止した。各イヌのウイルス力価を攻撃感染後10日間にわたり合計し統計解析を実施した。平均曲線下面積の推定値は群48.9Log10TCID50/mLと比較して群1及び3それぞれ17.0Log10TCID50/mLおよび18.6Log10TCID50/mLの方が有意に高かった群1および3に対し、それぞれP=0.0075およびP<0.0001。また群1及び3の平均排出日数それぞれ5.7日および5.8日も群44日と比較して有意に高かったそれぞれP=0.0356およびP=0.0033。本結果により、CIVワクチンがワクチン接種イヌの経鼻ウイルス排出を有意に減少することが明らかとなった。細菌排出:群2、3および4のS.equi攻撃感染イヌは、-4日目CIV攻撃感染前、およびS.equi攻撃感染後の0、3、6、9および11日目にS.equiの経鼻排出に関しモニターした表6および図3。さらにS.equiの単離のために死体解剖時に群2、3および4のイヌすべてから肺洗浄試料を採取した。群1のイヌ未検を除き全群のイヌの全ては、CIVまたはS.equi攻撃感染時にS.equi排出陰性だった。どのS.equi単独攻撃感染イヌ群2も、S.equi攻撃感染後の任意の時点において経鼻S.equi排出陽性でなかった。しかし群2のイヌ1匹17の肺洗浄試料からS.equiが単離された。対照的に、CIVプラスS.equiの双方に攻撃感染した群3のイヌの100は、S.equi攻撃感染後3および6日目に鼻汁中でS.equi陽性であり、その大多数67は攻撃感染後少なくとも9日間細菌を排出し続けた。また群3のイヌの大多数67が、肺洗浄液S.equi攻撃感染後11日目でもS.equi陽性だったが、このことは細菌が下気道においてコロニー形成し増殖したことを示唆する。またCIVプラスS.equiに攻撃感染したCIVワクチン接種イヌの大多数60も、S.equi攻撃感染後3日目に鼻汁中にS.equiを排出した。6日目以降、S.equiを排出するイヌの数は、群3と比較して群4において実質的により少なかった。ワクチン接種イヌのわずか20だけがその肺洗浄試料においてS.equi陽性だった。肺病変:あらゆるインフルエンザ攻撃感染において、肺硬化/肺炎は主要な病理学的病変である。CIVにおよびCIVプラスS.equiに攻撃感染した群群1および3のイヌの全て100は高変動度の肺硬化を示したが、一方ではCIVワクチン接種群群4のわずかイヌ3匹30だけが肺硬化になり、その中の2匹は非常に軽度だった表7。S.equi攻撃感染群群2のわずかイヌ1匹17だけが肺病変を示し、しかも軽度だった。群1において肺病変は主として肺前葉に観察されたが、一方、群3において病変は全ての肺葉に出現した。肺病変は、出血および赤みを帯びた硬化および肝変化によって特徴付けた。群1の肺スコアは中央値スコア=17.27を有し0.5から32.97の間で変動し、群3は、中央値肺スコア=23.29を有し5.53から39.74の間で変動した。群4は、中央値スコア=0を有し0から25.54の間で変動した。CIV攻撃感染に関する減少したワクチン有効率の比推定値は、CI赤血球の色素指数が95において88.360、100、CIVプラスS.equi攻撃感染に関してはCIが95において88.058、100だった。群4の肺スコアは、群1P=0.0019および群3P=0.0002と比較して有意に低かった。群3の肺スコアは群1と比較して高かったが、有意差はなかったP=0.5622。データよりCIVワクチンがCIV誘発性およびCIVプラスS.equi誘発性の肺病変の予防を助成することが明らかとなった。本発明についてはその具体的な実施態様に関連して記載したが、さらなる改変が可能であること、および一般的に本発明の原理を包含しながら、もしくは本発明が関係する技術分野内の既知行為または慣行となるような本開示からの逸脱を含みながら、本応用が本発明のいかなる変化、使用または適応を包含することを意図することを了解されたい。本明細書において記載された特許および公開特許の全ては、その内容全体が参照され援用される。