免疫グロブリン可変ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、標的リガンドに対して結合特異性を有し、適切なアンフォールド温度まで加熱された場合、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能であるが、但し、該可変ドメインは、生殖細胞系配列によりコードされるラクダ免疫グロブリン可変ドメインにユニークである1つ以上のフレームワークアミノ酸を含まず、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:K45E、D、Q、P、NもしくはHI48N、P、D、TもしくはGY49N、D、S、C、E、G、KもしくはRA50P、N、DもしくはEI75NもしくはMS31GY49DY32SI75NP40SY49DK45EI75NL46PA50DW35GS26NK42TA50DY32FK45EG57EY49DP80AQ89RY49NG68EQ79RT20SC23WL46FY49NまたはI29VK42NK45EF83LY92Hの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、単離されたポリペプチド。前記適切なアンフォールド温度が、免疫グロブリン可変ドメインの融解温度よりも高い請求項1記載の単離されたポリペプチド。前記適切なアンフォールド温度が80°Cである請求項1記載の単離されたポリペプチド。標的リガンドがヒト抗原またはエピトープである請求項1記載の単離されたポリペプチド。前記ポリペプチドが抗体の形態である請求項1記載の単離されたポリペプチド。前記ポリペプチドが単一のVHからなる単離されたポリペプチドであって、該免疫グロブリン可変ドメインは、配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:F27Q、A、H、D、S、GもしくはCF29G、S、D、P、QもしくはHS30P、D、G、T、LもしくはVS31PもしくはDY32D、G、Q、EもしくはPA33P、DもしくはGS35NもしくはDG54R、W、S、P、A、GもしくはVS30NA33DS31NA84DV12EA33PG55DA23VF27SG54DF27SA33DT87SS30GG54DA98DM34LG52aDK94EL11SS30GY32DT77MまたはS31NS62PE85DY96NW103Gの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、請求項5記載の単離されたポリペプチド。前記可変ドメインが、50nM~20pMの解離定数および5×10-1s1~1×10-7s1のKoffで前記標的リガンドに結合する請求項1記載の単離されたポリペプチド。前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも05mgLの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。前記可変ドメインが、大腸菌で発現される場合、少なくとも1mgL~少なくとも1gmLの量で分泌される請求項1記載の単離されたポリペプチド。レパートリーの少なくとも10のポリペプチドが、可逆的にアンフォールドし、大腸菌で発現される場合、分泌可能である、抗体可変ドメインポリペプチドのレパートリーであって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:K45E、D、Q、P、NもしくはHI48N、P、D、TもしくはGY49N、D、S、C、E、G、KもしくはRA50P、N、DもしくはEI75NもしくはMS31GY49DY32SI75NP40SY49DK45EI75NL46PA50DW35GS26NK42TA50DY32FK45EG57EY49DP80AQ89RY49NG68EQ79RT20SC23WL46FY49NまたはI29VK42NK45EF83LY92Hの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:F27Q、A、H、D、S、GもしくはCF29G、S、D、P、QもしくはHS30P、D、G、T、LもしくはVS31PもしくはDY32D、G、Q、EもしくはPA33P、DもしくはGS35NもしくはDG54R、W、S、P、A、GもしくはVS30NA33DS31NA84DV12EA33PG55DA23VF27SG54DF27SA33DT87SS30GG54DA98DM34LG52aDK94EL11SS30GY32DT77MまたはS31NS62PE85DY96NW103Gの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、レパートリー。前記ポリペプチドがヒト抗体可変ドメインを含む請求項10記載のレパートリー。前記ポリペプチドが、バクテリオファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化およびディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイ、ならびに共有結合的ディスプレイからなる群より選ばれるポリペプチドディスプレイシステムにおいてディスプレイされる請求項10記載のレパートリー。請求項10~12いずれか1項記載のポリペプチドのレパートリーをコードする核酸のライブラリー。請求項1~9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含有してなる組成物。前記ポリペプチドが5重量~99重量の範囲の量で存在する請求項14記載の組成物。請求項1~9いずれか記載の可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドを含有してなる組成物。前記可逆的にアンフォールドする凍結乾燥ポリペプチドが、再水和された場合、その活性の20以下を喪失する請求項16記載の組成物。請求項1~9いずれか記載の可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組換え宿主細胞であって、該組換え核酸が発現制御配列に作動可能に連結されている、組換え宿主細胞。前記組換え核酸の発現に適した条件下で請求項18記載の宿主細胞を維持する工程を含み、それにより前記組換え核酸が発現され、前記可逆的にアンフォールドするポリペプチドが製造される、可逆的にアンフォールドするポリペプチドの製造方法。可逆的にリフォールドするポリペプチドを選択するための、請求項10~12いずれか記載のレパートリーまたは請求項13記載のライブラリーの使用。前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインを含む請求項20記載の使用。前記可逆的にリフォールドするポリペプチドが抗体の形態を含む請求項20記載の使用。可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドのアミノ酸配列、それに同一なアミノ酸配列、および1~10個のアミノ酸の置換、欠失または挿入により、それとは異なるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を提供する工程;および該アミノ酸配列を含む抗体可変ドメインポリペプチドを合成する工程または該アミノ酸配列をコードする核酸を発現させる工程、それによって可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドが製造される、を含む、可逆的にアンフォールドする抗体可変ドメインポリペプチドを製造する方法であって、該抗体可変ドメインポリペプチドは、配列番号:6のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:K45E、D、Q、P、NもしくはHI48N、P、D、TもしくはGY49N、D、S、C、E、G、KもしくはRA50P、N、DもしくはEI75NもしくはMS31GY49DY32SI75NP40SY49DK45EI75NL46PA50DW35GS26NK42TA50DY32FK45EG57EY49DP80AQ89RY49NG68EQ79RT20SC23WL46FY49NまたはI29VK42NK45EF83LY92Hの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される;あるいは配列番号:3のアミノ酸配列を含み、該配列は、以下:F27Q、A、H、D、S、GもしくはCF29G、S、D、P、QもしくはHS30P、D、G、T、LもしくはVS31PもしくはDY32D、G、Q、EもしくはPA33P、DもしくはGS35NもしくはDG54R、W、S、P、A、GもしくはVS30NA33DS31NA84DV12EA33PG55DA23VF27SG54DF27SA33DT87SS30GG54DA98DM34LG52aDK94EL11SS30GY32DT77MまたはS31NS62PE85DY96NW103Gの置換を有し、ここで、アミノ酸位置は、カバット番号付けにより表される、方法。合成したポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを確認する工程をさらに含む請求項23記載の方法。前記ポリペプチドが加熱の際に可逆的にアンフォールドする請求項23記載の方法。本発明は、可逆的にアンフォールドするポリペプチド、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを含むレパートリー、及び可逆的にアンフォールドするポリペプチド又は可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸を含むライブラリーに関する。本発明はさらに、可逆的にアンフォールドするポリペプチド又は可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸に富むライブラリーを作製するための方法、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを選択する及び/又は単離するための工程、及び可逆的にアンフォールドするポリペプチドを生産するための方法に関する。1つの局面では、本発明は、ポリペプチドのライブラリー又はレパートリー例えばポリペプチドディスプレイシステムから、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを選択する、単離する及び/又は回収するための方法である。1つの実施形態では、前記方法は、ポリペプチドのコレクション例えばライブラリー、レパートリー又はポリペプチドディスプレイシステム中のポリペプチドをアンフォールドすること、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部をリフォールディングすること、及び再生したポリペプチドを選択する、単離する及び/又は回収することを含む。別の実施形態では、前記方法は、アンフォールドしたポリペプチドのコレクション例えばライブラリー、レパートリー又はポリペプチドディスプレイシステム中のポリペプチドを提供すること、アンフォールドしたポリペプチドの少なくとも一部をリフォールディングすること、及び再生したポリペプチドを選択する、単離する及び/又は回収することを含む。もう1つの実施形態では、前記方法は、レパートリーを含むポリペプチドディスプレイシステムを提供すること、前記レパートリーを、提示ポリペプチドの少なくとも一部がアンフォールドされる温度Tsに加熱すること、及び前記レパートリーをTsより低い温度Tcに冷却して、冷却したレパートリーを生成することを含む。冷却したレパートリーは、アンフォールドして再生したポリペプチドの少なくとも一部及び凝集したポリペプチドの一部を含む。前記方法は、リガンドに結合し、可逆的にアンフォールドする少なくとも1個のポリペプチドを一定温度Trで回収することをさらに含む。好ましくは、リガンドは折りたたまれたポリペプチドに結合し、凝集ポリペプチドには結合せず、回収されたポリペプチドは融解温度Tmを有し、そしてTs>Tm>Tc及びTs>Tm>Trである。他の局面では、本発明は、可逆的にアンフォールドするポリペプチドのレパートリー、可逆的にアンフォールドするポリペプチドをコードする核酸のライブラリー、及びそのようなライブラリー及びレパートリーを作製するための方法に関する。1つの局面では、本発明は、可逆的にアンフォールドする単離ポリペプチドである。一部の実施形態では、可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、アミノ酸配列において親ポリペプチドと異なる例えば1又はそれ以上のアミノ酸置換、付加及び/又は欠失によってが、親ポリペプチドの機能を定性的に保持する、親ポリペプチドの変異体である。本発明はまた、可逆的にアンフォールドする可変ドメインに富む、抗体可変ドメインライブラリーを作製するための方法に関する。1つの実施形態では、前記プロセスは、1提示可変領域の少なくとも一部がアンフォールドおよびリフォールドして再生された、複数の提示抗体可変領域を含むファージディスプレイシステムを提供すること、2前記ファージディスプレイシステムから、アンフォールドおよびリフォールドし、再生して、結合機能を回復した可変領域を提示するファージを選択すること、3回収されたファージ上に提示される可変領域のCDR1及び/又はCDR2をコードする核酸を得ること、及び43で得た前記核酸が1又はそれ以上の他の核酸に作動可能に連結されている、抗体可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを構築して、CDR1及び/又はCDR2が3で得た核酸によってコードされる抗体可変ドメインをコードする構築物のライブラリーを作製することを含む。特定実施形態では、1における提示可変領域の実質的にすべてが、約80°Cに加熱することによってほどけ、冷却によって再生される。他の特定実施形態では、4で構築される核酸のライブラリーは、CDR3が無作為化されている又は可逆的にアンフォールドする能力のために選択された抗体可変領域に由来しない、抗体可変ドメインをコードする。ここで述べる可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、大腸菌又は酵母培養物の上清中の可溶性タンパク質として高収率で生産することができる。本発明は、可逆的にアンフォールドするポリペプチド及びそのようなポリペプチドを選択する及び/又は設計するための方法に関する。可逆的にアンフォールドするポリペプチドはいくつかの利点を提供する。特に、そのようなポリペプチドは凝集に抵抗性であるか又は凝集しない。この凝集への抵抗性の故に、可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、大腸菌などの適切な生物学的生産システムを使用した発現により、可溶性タンパク質として高収率で容易に生産することができる。加えて、可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、従来のポリペプチドよりも高い濃度で、及びより少ない凝集と活性喪失で、製剤する及び/又は保存することができる。ここで述べるように、可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、ポリペプチドがアンフォールドされ例えば加熱によって、及びリフォールドする例えば冷却によってポリペプチドディスプレイシステムから選択することができる。ここで述べる選択及び設計プロセスは、可逆的にアンフォールドし、凝集に抵抗性であるポリペプチドを生成する。これらの選択及び設計プロセスは、高温度で折りたたまれたままであるポリペプチドのような、高い安定性に基づいてポリペプチドを選択する方法とは異なる。例えばJungSら、JMolBiol2941631801999参照。ここで使用する、ポリペプチドディスプレイシステムは、物理的、化学的又は機能的特徴のような所望特徴に基づく選択のためにポリペプチドのコレクションがアクセス可能であるシステムを指す。ポリペプチドディスプレイシステムは、ポリペプチドの適切なレパートリーでありうる例えば溶液中で、適切な支持体に固定して。ポリペプチドディスプレイシステムはまた、細胞発現系例えば、形質転換、感染、トランスフェクト又は形質導入細胞における、核酸のライブラリーの発現及び細胞表面でのコードされるポリペプチドの提示又は無細胞発現系例えば、乳剤分画化及びディスプレイを用いる生化学的システムでありうる。好ましいポリペプチドディスプレイシステムは、核酸のコード機能とその核酸によってコードされるポリペプチドの物理的、化学的及び/又は機能的特徴を結びつける。そのようなポリペプチドディスプレイシステムを用いるとき、所望の物理的、化学的及び/又は機能的特徴を有するポリペプチドを選択することができ、そして選択したポリペプチドをコードする核酸を容易に単離するか又は回収することができる。核酸のコード機能とポリペプチドの物理的、化学的及び/又は機能的特徴を結びつける多くのポリペプチドディスプレイシステムが当技術分野において公知であり、例えばバクテリオファージディスプレイファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、乳剤分画化及びディスプレイ、酵母ディスプレイ、ピューロマイシンディスプレイ、細菌ディスプレイ、プラスミド上のポリペプチドディスプレイ及び共有結合ディスプレイ等がある。例えば欧州特許第0436597号Dyax、米国特許第6172197号McCaffertyら、米国特許第6489103号Griffithsら参照。ポリペプチドディスプレイシステムは、McCaffertyらによって述べられているように例えば国際公開広報第WO92/01047号;米国特許第6172197号、多数の複製可能遺伝子ディスプレイパッケージを含みうる。複製可能遺伝子ディスプレイパッケージRGDPは、複製する能力を備えた粒子を提供する遺伝情報を有する生物学的粒子である。RGDPは、その表面にポリペプチドの少なくとも一部を提示することができる。ポリペプチドは、RGDPにネイティブな及び/又はRGDP又はその祖先に人工的に導入された遺伝情報によってコードされ得る。RGDPは、ウイルス、例えばfd又はM13などのバクテリオファージでありうる。例えばRGDPは、その表面に抗体可変ドメイン例えばVH、Vlを提示するバクテリオファージでありうる。このタイプのRGDPは、ファージ抗体pAbと称することができる。ここで使用する、可逆的にアンフォールド可能なアンフォールドし得る及び可逆的にアンフォールドするという用語は、本発明の方法においてアンフォールドされ例えば熱によって、且つ再生されうるポリペプチドを指す。可逆的にアンフォールド可能なポリペプチド可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、アンフォールドしたとき機能を喪失するが、リフォールディングしたときに機能を回復する。そのようなポリペプチドは、アンフォールドしたときに凝集するか又は不適切にリフォールドするミスフォールドポリペプチド、すなわち機能を回復しないポリペプチドとは区別される。好ましくは、可逆的にアンフォールドするポリペプチドは、ポリペプチドディスプレイシステムにおいて提示されるとき、例えばバクテリオファージ上に提示されるとき、可逆的にアンフォールドすることができる。可逆的にアンフォールドする特に好ましいポリペプチドは、ポリペプチドディスプレイシステムにおいて及び可溶性ポリペプチド例えば自律的可溶性ポリペプチドとして提示されるとき可逆的にアンフォールドすることができる。ここで使用する、ポリペプチドのレパートリーは、アミノ酸配列の多様性によって特徴付けられるポリペプチドのコレクションを指す。レパートリーの個々の成員は、共通構造特徴例えば共通コア構造及び/又は共通機能特徴例えば共通のリガンド例えば一般リガンド又は標的リガンドに結合する能力などの共通特徴を有しうる。ここで使用する、ライブラリーは、発現することができ、好ましくは複製可能である異種核酸のコレクションを指す。例えばライブラリーは、発現プラスミド、ファージミド等のような適切なベクターに組み込まれた異種核酸のコレクションを包含し得る。そのようなライブラリーの発現はポリペプチドのレパートリーを生成しうる。ライブラリーはまた、核酸のコード機能とその核酸によってコードされるポリペプチドの物理的、化学的及び/又は機能的特徴を結びつけるポリペプチドディスプレイシステムにおいて提示され、所望の物理的、化学的及び/又は機能的特徴を有する個々のポリペプチド及びそれをコードする核酸又はポリペプチドの個体群及びそれをコードする核酸を得るために選択するか又はスクリーニングすることができる、異種ポリペプチドのコレクションを指す。異種ポリペプチドのコレクションを提示するファージのコレクションは、そのようなライブラリーの一例である。異種ポリペプチドのコレクションであるライブラリーは、ポリペプチドのレパートリーを包含する。ここで使用する、機能性は、リガンド結合活性例えば一般リガンドに結合すること、標的リガンドに結合すること又はネイティブ又は天然に産生されるタンパク質の生物活性などの、特定所望活性を有するように正しく折りたたまれたポリペプチドを表わす。例えば、機能性ポリペプチドという用語は、その抗原結合部位を通して標的抗原に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、及びその基質に結合する酵素を含む。ここで使用する、一般リガンドgenericligandは、所与のレパートリーの機能性成員の実質的な部分例えば実質的に全部に結合するリガンドを指す。一般リガンド例えば共通一般リガンドは、それらの成員が共通標的リガンドに対して結合特異性を有していない場合でも、所与のレパートリーの多くの成員に結合することができる。一般に、ポリペプチド上に機能性一般リガンド結合部位が存在することは一般リガンドに結合する能力によって示される、そのポリペプチドが正しく折りたたまれており、機能性であることを示す。従って、正しく折りたたまれたポリペプチドは、一般リガンドに結合することによって、ポリペプチドのレパートリーから選択または回収され得る。一般リガンドの適切な例は、スーパー抗原、レパートリーの実質的な部分の機能性成員上で発現されるエピトープに結合する抗体等を含む。ここで使用する、標的リガンドは、ポリペプチドによって特異的に又は選択的に結合されるリガンドを指す。例えば標的リガンドは、それについてのレパートリー内の特異的結合ポリペプチド単数又は複数が特定されるリガンドでありうる。例えばポリペプチドが抗体又はその抗原結合フラグメントであるとき、標的リガンドは何らかの所望抗原又はエピトープであり得、またポリペプチドが酵素であるとき、標的リガンドは何らかの所望基質でありうる。標的抗原への結合は、ポリペプチドが機能性であること及びポリペプチドの標的抗原結合部位の特異性に依存する。ここで使用する、抗体ポリペプチドは、抗体、抗体の部分、又は抗体の部分例えば抗原結合部分を含む融合タンパク質であるポリペプチドである。それ故抗体ポリペプチドは、例えば抗体例えばIgG、抗体H鎖、抗体L鎖、H鎖及び/又はL鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、及びFvフラグメント例えば一本鎖FvscFv、ジスルフィド結合Fv、Fabフラグメント、Fabフラグメント、Fab’2フラグメント、単一可変ドメインVH、VL、dAb等のような抗原結合フラグメント又は抗体の部分を含む。ここで使用する、抗体形式antibodyformatは、その構造に抗原についての結合特性を付与するために抗体可変ドメインを組み込むことができる任意の適切なポリペプチド構造を指す。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体H鎖、抗体L鎖、抗体H鎖及び/又はL鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、前記のいずれかの抗原結合フラグメント例えばFvフラグメント例えば一本鎖FvscFv、ジスルフィド結合Fv、Fabフラグメント、Fabフラグメント、Fab’2フラグメント、単一可変ドメイン例えばVH、VL、dAb、及び前記のいずれかの修飾形態例えばポリエチレングリコール又は他の適切なポリマーの共有結合によって修飾されたなどの、様々な適切な抗体形式が当技術分野において公知である。スーパー抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーの成員と、これらのタンパク質の慣例的なリガンド結合部位は異なる部位で相互作用する一般リガンドを指す、当技術分野の用語である。ブドウ球菌エンテロトキシンは、T細胞受容体と相互作用するスーパー抗原の例である。抗体に結合するスーパー抗原は、IgG定常領域に結合するプロテインGBjorckとKronvallJImmunol1339691984IgG定常領域及びVHドメインに結合するプロテインAForsgrenとSjoquistJImmunol978221966及びVLドメインに結合するプロテインLBjorckJImmunol14011941988を含む。ここで使用する、アンフォールディング因子は、ポリペプチドのアンフォールディングを引き起こすことができる作用物質例えば化合物又はエネルギーを指す。アンフォールディング因子が化合物であるとき、その化合物を、所望の度合のポリペプチドアンフォールディングを生じさせるのに十分な量でポリペプチドディスプレイシステムに添加することができる。適切な化合物の例は、カオトロピック試薬例えば塩酸グアニジン、尿素、酸例えば塩酸、酢酸、塩基例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び有機溶媒例えばアルコール例えばメタノール、エタノール、ケトン例えばメチルエチルケトン、アルデヒド例えばホルムアルデヒド、ジメチルホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、トルエン等を含む。アンフォールディング因子は、熱及び/又は圧力などのエネルギーでありうる。アンフォールディング因子が熱であるとき、ポリペプチドディスプレイシステムに、所望度のポリペプチドアンフォールディングを生じさせるのに十分な温度までシステムの温度を上げるために十分な熱を与えるために、ポリペプチド系を十分な量のエネルギー例えば、熱エネルギー、電磁エネルギーに暴露する。好ましいアンフォールディング因子又はアンフォールディング因子の組合せは、可逆的にアンフォールドしないほどけたポリペプチドの凝集を実質的に阻害しない。ここで使用する、フォールディングゲートキーパーは、その生物物理的特徴によって及びタンパク質のアミノ酸配列内のその位置によって、タンパク質のアンフォールディング時に不可逆的な凝集物の形成を防ぐアミノ酸残基を指す。フォールディングゲートキーパー残基は経路外の凝集をブロックし、それによって確実にタンパク質が可逆的アンフォールディングを受けることができるようにする。フォールディングゲートキーパーは一般に、それが存在する領域のアミノ酸配列のSEスコア疎水性スコアを低下させる。ここで使用する、分泌可能又は分泌されるは、ポリペプチドが大腸菌における発現によって生産されるとき、それが生産されて細胞周辺腔又は培地に輸送されることを意味する。アンフォールディング及びリフォールディングの評価ポリペプチドのアンフォールディング及びリフォールディングは、例えば、何らかの適切な方法を用いて直接又は間接的にポリペプチド構造を検出することによって評価できる。例えばポリペプチド構造は、円二色性CD例えば遠UVCD、近UVCD、蛍光例えばトリプトファン側鎖の蛍光、タンパク質分解に対する感受性、核磁気共鳴NMRによって、又は正しい折りたたみに依存するポリペプチド機能を検出すること又は測定することによって、検出することができる。一例では、結合機能例えば一般及び/又は標的リガンドへの結合、基質への結合の喪失が、ポリペプチドがほどけていることを指示する機能性アッセイを用いてポリペプチドアンフォールディングを評価する。可溶性ポリペプチドのアンフォールディング及びリフォールディングの程度は、アンフォールディング又は変性曲線を用いて測定できる。アンフォールディング曲線は、アンフォールディング因子例えば温度、カオトロピック試薬の濃度、有機溶媒の濃度を縦座標として及び折りたたまれたポリペプチドの相対濃度を横座標としてプロットすることによって作成できる。折りたたまれたポリペプチドの相対濃度は、何らかの適切な方法例えばCD、蛍光、結合アッセイを用いて直接又は間接的に測定することができる。例えば、ポリペプチド溶液を調製し、溶液の楕円度をCDによって測定することができる。得られた楕円度値は、100の折りたたみポリペプチドの相対濃度を表わす。次に、アンフォールディング因子例えば熱、カオトロピック試薬を漸増的に添加することによって溶液中のポリペプチドをアンフォールディングし、適切な増分で例えば1°C毎の温度上昇後に楕円度を測定する。その後、アンフォールディング因子を段階的に低減して溶液中のポリペプチドをリフォールドし、適切な段階で楕円度を測定する。データをプロットして、アンフォールディング曲線及びリフォールディング曲線を作成することができる。図7に示すように、アンフォールディング及びリフォールディング曲線は、ポリペプチド分子が折りたたまれる部分、ポリペプチド分子が様々な程度にほどけるアンフォールディング/リフォールディング転移、及びポリペプチド分子がほどける部分を含む、特徴的な形状を有する。リフォールディング曲線のy軸切片は、回収された再生タンパク質の相対量である。少なくとも約50、又は少なくとも約60、又は少なくとも約70、又は少なくとも約75、又は少なくとも約80、又は少なくとも約85、又は少なくとも約90、又は少なくとも約95の回収は、ポリペプチドが可逆的にアンフォールドすることを指示する。好ましい実施形態では、可溶性ポリペプチドは、加熱したとき可逆的にアンフォールドする。可溶性ポリペプチドのアンフォールディングの可逆性は、ポリペプチド溶液を調製し、そのポリペプチドについての熱アンフォールディング及びリフォールディング曲線をプロットすることによって決定される。ペプチド溶液は、ペプチドが溶解するのに適切なpH例えば等電点pIより約3単位上又は下であるpHを有する水性緩衝液などの、何らかの適切な溶媒において調製できる。ポリペプチド溶液は、アンフォールディング/フォールディングを検出できるように十分に濃縮されている。例えばポリペプチド溶液は、約0.1μM-約100μM、又は好ましくは約1μM-約10μMでありうる。可溶性ポリペプチドの融解温度Tmが既知である場合は、溶液をTmより約10°C低い温度Tm-10に加熱し、楕円度又は蛍光例えば200nm-250nmの遠紫外線スキャン、235nm又は225nmの固定波長CD;298nmでの励起による300450nmのトリプトファン蛍光発光スペクトルによってフォールディングを評価して、100相対折りたたみポリペプチドを提供することができる。次に、溶液をあらかじめ定められた増分例えば約01-約1°Cの上昇でTmより少なくとも10°C高い温度Tm10に加熱し、各々の増分で楕円度又は蛍光を測定する。その後、あらかじめ定められた割合で少なくともTm-10に冷却することによってポリペプチドをリフォールドし、各々の割合で楕円度又は蛍光を測定する。ポリペプチドの融解温度が既知でない場合は、溶液を約25°C-約100°Cに漸増的に加熱することによってアンフォールドし、その後少なくとも約25°Cに段階的に冷却することによってリフォールドして、各々の加熱及び冷却段階で楕円度又は蛍光を測定する。得られたデータをプロットして、アンフォールディング曲線とリフォールディング曲線を作成することができ、その場合のリフォールディング曲線のy軸切片は、回収された再生タンパク質の相対量である。一部のポリペプチドは、提示されるポリペプチドとして例えばバクテリオファージの表面にファージコートタンパク質融合タンパク質として提示されるではなく、可溶性ポリペプチドとして可逆的にアンフォールドする。しかし、提示ポリペプチドとして可逆的アンフォールディングを受けるポリペプチドは一般に、可溶性ポリペプチドとして作製されるときも可逆的アンフォールディングを受ける。それ故、提示ポリペプチドに関する可逆的アンフォールディングは極めて好都合であり、提示ポリペプチドのレパートリー又はライブラリーから、可溶性ポリペプチドとして可逆的にアンフォールドしうるポリペプチドを選択する能力を提供する。ポリペプチドディスプレイシステム内に含まれるポリペプチド、例えばバクテリオファージ上に提示されたポリペプチドのアンフォールディング及びリフォールディングは、適切なフォールディングに依存するポリペプチドの機能を検出することによって評価され得る。例えば、共通リガンド例えば、一般リガンド、標的リガンド、基質に結合する等の、共通機能を有する提示ポリペプチドを含むポリペプチドディスプレイシステムを、アンフォールド続けてリフォールドし得、機能アッセイを用いてリフォールディングを評価し得る。例えば、結合活性を有するポリペプチドが可逆的にアンフォールドするかどうかを、バクテリオファージ上に前記ポリペプチドを提示し、および提示ポリペプチドの結合活性を測定又は判定することによって決定し得る。提示ポリペプチドは、ポリペプチドを提示するファージを約80°Cに加熱することによってアンフォールドされ得、次にファージを約20°C又はほぼ室温に冷却することによってリフォールドされ得て、かつリフォールドしたポリペプチドの結合活性を測定又は判定し得る。少なくとも約50、又は少なくとも約60、又は少なくとも約70、又は少なくとも約75、又は少なくとも約80、又は少なくとも約85、又は少なくとも約90、又は少なくとも約95の結合活性の回復は、ポリペプチドが可逆的にアンフォールドするということを指示する。好ましい態様では、提示ポリペプチドは抗体の可変ドメインを含み、および一般リガンド例えば、プロテインA、プロテインL又は標的リガンドへの結合を判定する。本明細書に開示したポリペプチドは、少なくとも約1μMから約1mM、少なくとも約1μMから約500μM、又は少なくとも約1μMから約100μMのポリペプチド濃度で、溶液中で及び/又は適切なポリペプチドディスプレイシステムにおいて提示されるとき、可逆的にアンフォールドする。例えば、ある単一のヒト抗体の可変ドメインは、約05mMの局所濃度ファージ先端上の提示抗体の可変ドメインのポリペプチドを産生する多価ファージディスプレイシステムにおいて提示されるとき可逆的にアンフォールドし得る。特定の態様では、ポリペプチドは、約10μM、約20μM、約30μM、約40μM、約50μM、約60μM、約70μM、約80μM、約90μM、約100μM、約200μM、約300μM、約400μM又は約500μMのポリペプチド濃度で溶液中に又はファージ先端上に提示されるとき、可逆的にアンフォールドする。選択方法1つの側面において、本発明は、ポリペプチドのライブラリー又はレパートリー例えば、ポリペプチドディスプレイシステムから、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを選択、単離及び/又は回収する手順である。1つの態様では、前記方法は、ポリペプチドのコレクション例えば、ライブラリー、レパートリー又はポリペプチドディスプレイシステム中のポリペプチドをアンフォールドすること、少なくとも一部のアンフォールドしたポリペプチドをリフォールドすること、及びリフォールドしたポリペプチドを選択、単離及び/又は回収することを含む。他の態様では、前記方法は、アンフォールドしたポリペプチドのコレクション例えば、ライブラリー、レパートリー又はポリペプチドディスプレイシステム中のポリペプチドを提供すること、少なくとも一部のアンフォールドしたポリペプチドをリフォールドすること、及びリフォールドしたポリペプチドを選択、単離及び/又は回収することを含む。ポリペプチドディスプレイシステム好ましくは、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを、適切なポリペプチドディスプレイシステム中のポリペプチドのレパートリーから選択、単離及び/又は回収する。例えば、可逆的にアンフォールドするポリペプチドを、溶液に存在し、またはプラスチックもしくはガラス例えば、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ等のポリペプチドアレイ等の適切な表面に共有結合又は非共有結合する、ポリペプチドのレパートリーから選択、単離及び/又は回収し得る。例えば各々の異なるライブラリー要素例えば、独立のペプチド配列をアレイ内で別々のあらかじめ定められた位置に配置する方法で表面上のペプチドのアレイを使用し得る。かかるアレイ内の各ライブラリー要素の同一性は、アレイ内のその空間の位置によって判定され得る。標的リガンドと例えば反応ライブラリー要素の間での結合相互作用が起こるアレイ内の位置が決定し得、それにより空間の位置に基づいて反応要素の配列を同定する。例えば、米国特許第5143854号、国際公開広報第WO90/15070号及び国際公開広報第WO92/10092号参照。好ましくは、前記方法は、核酸のコード機能と核酸によってコードされるポリペプチドの物理、化学および/又は機能特性を結びつけるポリペプチドディスプレイシステムを用いる。好ましくは、前記ポリペプチドディスプレイシステムは、バクテリオファージディスプレイライブラリー等のライブラリーを含む。バクテリオファージディスプレイは、特に好ましいポリペプチドディスプレイシステムである。多くの適切なバクテリオファージディスプレイシステム例えば、一価ディスプレイ及び多価ディスプレイシステムが記述されている。例えば、Griffithsら、米国特許第6555313B1号参照によって本明細書に援用されるJohnsonら、米国特許第5733743号参照によって本明細書に援用されるMcCaffertyら、米国特許5969108号参照によって本明細書に援用されるMulliganKehoe米国特許第5702892号参照によって本明細書に援用されるWinterGら、AnnuRevImmunol124334551994SoumillionPら、ApplBiochemBiotechnol47継代nPからPCR増幅した。ナイーブ継代プールを、一次ライブラリーからのファージを増殖させ、沈殿によってファージを精製し、精製されたファージで大腸菌を感染させ、細菌からDNAを回収することによって産生した。SOEPCRを用い、CDR1およびCDR2sのプールをCDR3sのプールとランダムに再び組み合わせて、全長のVHドメイン遺伝子を再製作した。以下の組合せを調製した表22。CDR1およびCDR2sは系統的にDNAプールHから採取された。何故ならば、CDR1セグメントは主な凝集の決定要素を含むからである。対照的に、CDR3sは、凝集にほとんど重要でない、EおよびnPプール由来であった。SOEPCRの後、フラグメントはファージベクターリーダー配列が真核生物のリーダー配列で置き換えられたFd-myc;セクション2参照にクローン化しされ、大きなレパートリー>1010クローンを得るためにエレクトロポレーションによって大腸菌を形質転換するのに使用された。6GHEおよび6GHnPVHライブラリーからの各コロニーn44をファージ産生のために別々に成長させた。ファージは、未処理の場合に、または80°Cでの加熱処理の後に、プロテインAへの結合能力を検査された産生ならびに正しいフォールディングを評価するために。結果を表23に示す。加熱選択されたCDR1およびCDR2ループを含む機能VHドメインを示す約85のファージが、加熱工程の後にプロテインAの結合活性を保持した。このように、ライブラリーVH6GにおけるVHドメインのほとんどがフォールディングゲートキーパーを含む。対照として、最適化されていないライブラリー4GVH4GH20における12のVHドメインクローンのみが加熱時に凝集を阻害し、プロテインAの結合活性を保持する。これらの結果は、ライブラリーの清浄段階プロテインAに対するで単一の加熱工程の付与が、フォールディングゲートキーパーを含み及び加熱時に可逆的にアンフォールドするVHドメインをコードするDNAセグメントを持つVHドメインライブラリーの濃縮7倍までという結果になるということを示す。ライブラリーVH6GHEおよびVH6GHnPからのランダムに採取された14のクローンをピックアップし、配列決定した。CDR1を含むループの配列、ならびにSE-スコア15アミノ酸のウィンドウを用いてを以下に列挙する。多様化されたアミノ酸に下線を施す。総じて、14クローンのこの領域の平均±SDSEスコアは0007±0018であり、これは、VHダミーの平均SE-スコアDP47d0190およびその領域のコードされた多様性NNKコドンを計算した平均SEスコア0220より充分に低い。各位置における多様性は比較的大きく:7、11、8、10および9の異なるアミノ酸が、30、31、32、33および35位のそれぞれでのデータセットで計算された。Asp、Glu、ProおよびGly等の強い親水性およびβ-シートのブレーカーが、アミノ酸の43を占めたコードされた遺伝子の多様性に基づく19に対して。結論ヒトVH3ドメインの合成ライブラリーは、PCR断片の組換えによって作製され、線状ファージの表面に提示された。大部分のVH3dAbs85を80°Cに加熱の際に可逆的にアンフォールディングした。このライブラリーは、130、31、32、33および35位でCDR1領域の多様化、2プロテインAに対する清浄前に一次ファージライブラリーの加熱処理、および3加熱選択されたCDR1CDR2をコードする遺伝子およびナイーブ継代または単純にプロテインA清浄CDR3をコードする遺伝子のPCRの媒介組換えによって産生された。生じたライブラリーにおいて、CDR1配列は多様であったが、Asp、Glu、ProおよびGly等のフォールディングゲートキーパー残基に富んでいた。セクション19.予め規定された特異性を持つdAbsへのフォールディングゲートキーパーを導入するさらなる研究このセクションは、予め規定された特異性を持つdAbへのフォールディングゲートキーパーの実施を記載する。TAR1519はTNFαに特異的なVK1ドメインである。その配列は:である。この合理的な設計研究の結果は他のアプローチを補充し、フォールディングゲートキーパーがファージに提示されたdAbライブラリーに初めから導入される。TAR1519に対するフォールディングゲートキーパーの選択:本明細書中に記載し、示したように、フォールディングゲートキーパーは、DP47dのH1ループを含む領域、またはVKダミーDPK9のFR2CDR2を含む領域に導入され得る。TAR1519については、我々は、49位、FR2とCDR2の間の境界で溶媒に暴露された残基を選択した。dAbについての構造および突然変異誘発データの非存在下で、パラトープ内またはその近くの突然変異は結合活性に影響しそうであり得る。表28に示したように、PEP1519における2つの単一の突然変異体は15アミノ酸のウィンドウについてのSweetEisenbergSEスケールを用いる-SweetRMEisenbergDJMolBiol1714794881983SE15スコアを低下させ、従って、突然変異体ポリペプチドは高いフォールディング収率を有するであろうことを示す。また、その15アミノ酸領域内では、PEP1519のSEスコアはすでにかなり低いことにも注意すべきである。ファージ提示TAR1519およびその突然変異体の凝集アッセイ:セクション5、ファージスクリーニング2に記載の方法を用い、TAR1519を提示するモノクローナルファージおよび変異体を10分間80°Cで加熱するか、または加熱せずに放置し、次いで、ELISAのTNFα被覆ウェル中でインキュベートした。リフォールディングのデータはセクション5、ファージスクリーニング2に記載されているように計算され、結果を表30に示す。フォールディングゲートキーパーはTAR1519リフォールディングに有益な効果を有し、フォールディングゲートキーパーを含む変異体は、ファージに提示された時でも、80°Cに加熱したときに凝集を阻害した。しかしながら、親TAR1519はその低いSEスコア0011のため良好なリフォールディング能力を示したことに注意すべきである。TAR1519およびその突然変異体の受容体結合アッセイ:活性アッセイは、増大させる量のdAbを用いて、固定化されたTNFα受容体と結合する可溶性TNFαを競合させるのに使用されるRBAELISAの受容体結合アッセイであった。次いで、結合したTNFαをビオチン化した非競合抗体、およびストレプトアビジンHRPコンジュゲートで検出した。IC50nMにおけるは、受容体に対するTNF-αの50の非飽和量の低下を生じさせるのに必要なdAb量である。結果を表31に示す。ここで、フォールディングゲートキーパーのTAR1519への導入はTAR1519のインビトロでの活性に影響した。これは、TAR1519におけるY49残基がTNFαとの特異的な接触に直接的にまたは間接的に関与し得るということを示唆する。TAR1519については、Y49はフォールディングゲートキーパーを導入するための最良な選択であるようには見えない変異体は依然として中程度に活性であるが。Y49を中心とする15のアミノ酸セグメント内の他の位置は、dAbの活性を低下させること無くSEスコアの低下を達成すると考えられ得る。例えば、I48がP、D、T、GまたはNで置換され、Y49がS、C、E、G、K、NまたはRで置換され、および/またはI75がNまたはMで置換されたTAR1519変異体を本明細書記載のように産生および特徴付けし得る。かかるTAR1519変異体は本明細書に示した方法を用いて容易に産生され得る。結論本研究においては、抗原dAb複合体の構造の予備知識が無くとも、フォールディングゲートキーパーを予め規定された特異性のdAbに導入した。TAR1519の変異体の結合は6から20倍低下したが、変異体は依然として中程度の活性でもって標的に結合し、これは、変異体が生物学的活性を有することを示す。2つの単一の点変異体のみが作製され、研究されたことに注意すべきである。フォールディングゲートキーパーを導入するさらなる利点は、例えば、位置多様化によって、またはライブラリー作製によって、単一の点変異または変異の組合せを含むさらなる変異体を作製し、スクリーニングすることによって実現され得る。表2411アミノ酸のウィンドウでのDP47VHのSweetEisenbergS/E値表2511アミノ酸のウィンドウでのDPK9VKのSweetEisenbergS/E値表2615アミノ酸のウィンドウでのDP47VHのSweetEisenbergS/E値表2715アミノ酸のウィンドウでのDPK9VKのSweetEisenbergS/E値本発明は好ましい具体例への参照を特に示し、かつ記載するが、添付の請求の範囲に包括される発明の目的から逸脱すること無く形態および詳細における種々の変化がなされ得るということが当業者に理解されよう。