"次の工程を有する、抗ラミニンガンマ1抗体の測定方法:1検体をラミニンガンマ1又はその断片と接触させる工程、2ラミニンガンマ1又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ1を認識する抗体の結合を検出する工程、および3両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の量を決定する工程。前記ラミニンガンマ1の断片が、前記ラミニンガンマ1のC末の246アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも1つの変異を有するペプチドを含む請求項1記載の測定方法。前記ラミニンガンマ1またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ1またはその断片である請求項1記載の測定方法。前記検体が、血液、血漿又は血清である、請求項1から4のいずれか1項に記載の測定方法。構成試薬がラミニンガンマ1又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキット。ラミニンガンマ1又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ1又はその断片である請求項5記載のキット。請求項6に記載のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する方法。皮膚科疾患が、抗p200類天疱瘡である請求項7記載の方法。上述の技術では、抗p200類天疱瘡は、多くの場合水疱性類天疱瘡と区別されていなかったと考えられる。水疱性類天疱瘡の診断には現在、抗BP180抗体測定用ELISA及び抗BP230抗体測定用ELISAが開発され使われているが、抗p200類天疱瘡はこれらの試薬で診断することはできない。そこで、本発明の目的は、抗p200類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗p200抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することである。上記目的を達成するため、本発明の抗ラミニンガンマ1抗体の測定方法は、次の工程を有する。1検体をラミニンガンマ1又はその断片と接触させる工程、2ラミニンガンマ1又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ1を認識する抗体の結合を検出する工程、および3両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の量を決定する工程。ここで、ラミニンガンマ1の断片が、ラミニンガンマ1のC末の246アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも1つの変異を有するペプチドを含むペプチドであることとすることができる。また、ラミニンガンマ1またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ1またはその断片であることとすることができる。また、検体が、血液、血漿又は血清であることとすることができる。また、上記目的を達成するため、本発明のキット抗p200抗体の測定試薬は、構成試薬がラミニンガンマ1又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の抗体量を測定する方法に用いられる。ここで、ラミニンガンマ1又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ1又はその断片であることとすることができる。また、上記目的を達成するため、本発明の皮膚科疾患を検出する方法は、上述のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する。ここで、皮膚科疾患が、抗p200類天疱瘡であることとすることができる。本発明では、抗p200類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗p200抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することができる。本発明者らの研究により、抗p200類天疱瘡の患者血清中に見出される自己抗体が認識するp200タンパク質は、ラミニンの構成成分であるラミニンガンマ1であり、そのエピトープのラミニンガンマ1のC末にあることを明らかにした。さらに、本発明者らは、患者血清中の抗ラミニンガンマ1抗体の反応性を検討したところ、皮膚のラミニンガンマ1に対して強く反応し、血管のラミニンガンマ1に対しては一部の患者血清しか反応しないことを見出した。本発明は、上記のような知見に基づいてなされたものであり、従来の抗ラミニンガンマ1抗体の測定法に比べてより高い臨床的感度と特異性を持った、自動機にも対応可能な抗ラミニンガンマ1抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法である。以下、本発明の実施の形態にについて、図面を参照しながら説明する。本発明の実施の形態はラミニンガンマ1に対する抗体を検出する方法及び試薬に関する。抗ラミニンガンマ1抗体は抗p200類天疱瘡患者の血清中に見出され、抗ラミニンガンマ1抗体の検出は抗p200類天疱瘡の診断に有用である。本発明の実施の形態の抗ラミニンガンマ1抗体の検出に用いられる抗原は、ヒトのラミニンガンマ1のC末部分、246アミノ酸以外の分画を含むことを特徴とする。本発明の実施の形態に係る抗ラミニンガンマ1抗体の測定方法は以下の測定方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。1検体をラミニンガンマ1のC末以外のペプチドを含む断片を固相化した不溶性担体に接触させる工程2ラミニンガンマ1のC末以外の断片を含むペプチド断片と検体中に存在するラミニンガンマ1を認識する抗体の結合を検出する工程、および3両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ1抗体の量を決定する工程。本発明の実施の形態には上記ラミニンガンマ1のC末以外のペプチド断片のアミノ酸配列を含むペプチド又は、そのアミノ酸に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加されたラミニンガンマ1C末以外の断片を用いる測定方法が含まれる。ラミニンガンマ1は、正常皮膚組織から抽出して用いることもできるが、リコンビナントタンパク質として作製することが出来る。特に、特定の分画を抗原として使用する場合、リコンビナントタンパク質として作製することが好ましい。一般的に、蛋白質の機能発現には特異的な修飾が必要とされることが多いことから、目的蛋白質を発現させるための宿主細胞は、導入される蛋白質遺伝子に応じて適宜選択できることが好ましい。使用できる宿主細胞としては、大腸菌のほか、真核細胞としてはバキュロウイルス感染細胞、CHO細胞などの哺乳類細胞である。抗ラミニンガンマ1抗体の量を測定するには、不溶性担体である固相にラミニンガンマ1又はその断片を結合させ、これに検体中の抗ラミニンガンマ1抗体を接触させて、ラミニンガンマ1若しくはその断片と抗ラミニンガンマ1抗体の複合体を形成し、洗浄によって検体中の他の成分を除いた後、標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させて、ラミニンガンマ1又はその断片-抗ラミニンガンマ1抗体-標識化抗ヒト免疫グロブリンの複合体を形成させ、その標識物の反応量を測定することによる。ラミニンガンマ1又はその断片を結合させる不溶性担体としては、アガロース系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系等の有機高分子、コラーゲン、キトサン等の生体由来の天然有機高分子あるいは活性炭素、セラミック等の無機物が挙げられる。その形態としては、平板状、粒子状等様々な形態が使用しうるが、表面積を大きくとれるものが好ましい。ラミニンガンマ1分子の固相への結合は、物理吸着によっても可能であるが、共有結合によって結合することもできる。例えば、担体がその表面に有するエポキシ基やアルデヒド基等の反応性官能基に水性溶液中で直接結合することによって実施される。また、アミノ基等の官能基を表面に有する担体を用いる場合は、ラミニンガンマ1蛋白質と担体との混合水性溶液にジアルデヒドやジエポキシ化合物等の反応性多官能基を有する化合物を添加し、反応させることによっても実施することができる。検出方法としては、ELISA法が好適に用いられるが、抗原としてラミニンガンマ1またはその一部を使用するものであれば、他の方法も同様に使用することができる。他の方法としては蛍光免疫測定法FIA、化学発光免疫測定法CLIA、ラテックス比濁法等が挙げられる。標識化した抗ヒト免疫グロブリンとしては、ウサギ、ヤギその他の動物にヒトの免疫グロブリンIgG,好ましくはIgG4を免疫して得た抗ヒトIgGあるいはその断片を用いることができる。標識物としては、例えばペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン等の各種酵素やアイソトープを標識して使用することができる。酵素を標識した場合には、適宜適切な基質を選択することにより、その発色、発光、蛍光を測定することによって、検体中の目的物を定量することができる。検体としては、ヒトの血液、血漿、血清が使用でき、日常検査としては血清が最も好適に使用できるが、尿その他の体液の使用を制限するものではない。本発明の実施の形態に係る測定方法によれば、患者血清中の抗ラミニンガンマ1抗体を高い感度で測定でき、自動化機器によって測定することも可能なため、日常検査として実施が可能となる他、標準血清を用いて定量的に測定することにより、結果が客観的な数値として捉えることができるため、測定者による判定の差をなくすことができる。また、患者血清中の抗体量の変化を捉えることができるため、治療効果の判定や疾患の憎悪期において治療のタイミングをより早く知ることができる。1患者検体の入手;本検討は、久留米大学医学部の倫理委員会のガイドラインに従って実施され、臨床試験への参加者はインフォームドコンセントを提出し、ヘルシンキ宣言に沿って行われた。32人の患者男性10人、女性6名、16名は性別不明、17歳~87歳は、その臨床経過と水疱形成の兆候、1M食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた間接蛍光抗体法は基底膜領域の真皮側にIgGの反応性を示し、真皮抽出物を用いたウエスターンブロットは200kDaのバンドを示したことから、抗p200類天疱瘡と診断された。9名の健常ボランティア及び水疱性類天疱瘡、抗ラミニン332粘膜類天疱瘡及び後天性表皮水疱症の血清は、コントロールとして用いた。2抗体の調製マウス抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体B-4は、サンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。マウス抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体C135は、研究室において作製したNishiuchiR,etal.2006Ligand-bindingspecificitiesoflaminin-bindingintegrins:Acomprehensivesurveyoflaminin-integrininteractionsusingrecombinantalpha3beta1,alpha6beta4integrins.MatrixBiology25:189-197、FujiwaraH,etal.2001PurificationandCharacterizationofhumanlaminin-8.Laminin-8stimulatescelladhesionandmigrationthroughalpha3beta1andalpha6beta1integrins.JBiolChem276:17550-17558。マウス抗コラーゲンVIモノクローナル抗体3C4及びマウスのコントロールIgGは、それぞれケミコン、ミリポア及びサンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。第二抗体であるHRP標識抗ヒトIgG及びFITC標識抗マウスIgGは、ダコから購入した。患者及び健常者コントロールからのIgGは、HiTrapProteinGHPカラムアマシャムを用いて精製した。3真皮及び血管抽出物の調製免疫ブロット分析に用いる真皮抽出物は、既報の方法に従って調製したKawaharaY,etal.2000Subepidermalblisteringdiseasewithautoantibodiesagainstanoveldermal200-kDaantigen.JournalofDermatologicalScience23:93-102。血管抽出物は、同様の方法に若干の変更を加えて調製した。外膜を除いた腸間膜動脈は、2mMEDTAと2mMPMSFを加えたPBS中で4°C2時間インキュベートした。血管の蛋白質は、8MUrea、0.3Mβ-メルカプトエタノール1mMPMSFを加えた25mMTrispH6.8で室温2時間抽出した。血管抽出物は、4°Cで2時間精製水に透析し、等量のアセトンで沈殿させた。4ラミニンの調製ヒトのラミニン111は、JAR絨毛癌細胞株から、ラミニン211/221は、ヒト胎盤から精製したNishiuchiR,etal.2006Ligand-bindingspecificitiesoflaminin-bindingintegrins:Acomprehensivesurveyoflaminin-integrininteractionsusingrecombinantalpha3beta1,alpha6beta4integrins.MatrixBiology25:189-197。リコンビナントラミニン111は、ヒトα1/β1/γ1チェーンをコードする発現ベクターで形質転換したヒト293F細胞インビトロジェンで産生した。α1、β1、γ1のC末部分を切断したヘテロトリマーであるラミニン111のリコンビナントE8分画は、以下のように調製した。ヒトラミニンβ1及びγ1のリコンビナントE8分画の発現ベクターそれぞれLeu1561-Leu1786及びAsn1364-Pro1609をコードするは、既報の通り調製したIDOH,etal.2007Therequirementoftheglutamicacidresidueatthethirdpositionfromthecarboxyterminiofhtelaminingammachainsinintegrinbindingbylaminins.JBiolChem282:11144-11154。ラミニンα1チェーンの切断されたC末部分Phe1878-Gln2700をコードするcDNAは、全長ヒトラミニンα1発現ベクターをテンプレートとして用いてPCRで増幅しIdoH,HaradaK,YagiY,SekiguchiK2006Probingtheintegrinsitewithintheglobulardomeinoflaminin-511withthefunction-blockingmonoclonalantibody4C7.MatrixBiology25:112-117、発現ベクターpSecTag2Aインビトロジェンに挿入した。ラミニン111のリコンビナントE8分画は、Free-StyleTM293発現システムインビトロジェンを用いて産生し、既報の通りIDOH,etal.2007Therequirementoftheglutamicacidresidueatthethirdpositionfromthecarboxyterminiofhtelaminingammachainsinintegrinbindingbylaminins.JBiolChem282:11144-11154調製培地から精製した。即ち、調製培地は、ニッケルニトリロ三酢酸アフィニティーカラムキアゲンに添加し、結合した蛋白質は、200mMのイミダゾールで溶出した。溶出した蛋白質は、更に抗FLAGカラムシグマアルドリッチで精製した。精製した蛋白質は、TBSに透析した。蛋白濃度は、BCATMProteinAssayKitピアースバイオテクノロジーで定量した。5免疫ブロット法による分析SDS/PAGEは、既報の通り実施したSugiT,HashimotoT,HibiT,NishikawaT1989Productionofhumanmonoclonalanti-basementmembranezoneBMZantibodiesfromapatientwithbullouspemphigoidBPbyEpstein-Barrvirustransformatiuon.Analysisoftheheterogeneityofanti-BMZantibodiesinBPserausingthem.JClinInvest84:1050-1055。真皮及び血管の抽出物、ヒトラミニン、及びヒトラミニンE8分画は、Laemmli‘ssamplebuffer5βメルカプトエタノール有り/無しで煮沸し、6、7.5、又は12のSDSゲルで分画した。次いで蛋白質は、ニトロセルロースに電気化学的に転写した。3スキムミルクでブロックした後、ブロットは、1:5~1:800に希釈した患者血清、10μg/mL又は1mg/ml、若しくは1:200に希釈した抗ヒトラミニンガンマ1モノクローナル抗体B-4マウスでインキュベートした。二次抗体としては、HRP標識抗ヒトIgG又は抗マウスIg抗血清を用いた。発色は、4-クロロ-1-ナフトールを用いた。真皮抽出物の免疫沈降は、以下のように行った。凍結乾燥した真皮抽出物を50mMTris、150mMNaCl、2mMEDTA、1TritonX-100ProteinInhibitorMiatureシグマアルドリッチを含む免疫沈降用バッファーに溶解した。この溶液をProteinG-Sepharose4FastFlowGEヘルスケアと正常コントロールあるいは患者血清1:20の有り、無しでインキュベートし、抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体B-45又は20μg/mlあるいはマウスコントロールIgG20μg/mlで4°C一晩インキュベートした。十分洗浄した後、集められた沈降物は、5βメルカプトエタノールを含むLaemmli‘ssamplebufferで煮沸した。上清は、既報の通り免疫ブロット分析で評価した。阻害アッセイでは、患者12の血清1:800を競合物、即ち正常ヒトIgG、B-4、C13S2又は10μg/ml若しくは3C41:100又は1:20希釈と、転写した真皮抽出物の載ったニトロセルロースストリップ上でインキュベートし、上述の通り抗ヒトIgG抗血清で発色した。他のストリップ上では、B-41μg/mlを競合物、即ち血清1:100又は1:20希釈若しくはIgG0.2又は1mg/ml4°C一晩インキュベートし、抗マウスIg抗血清で発色した。6二次元電気泳動による分析凍結乾燥した真皮抽出物を7Mウレア、2Mチオウレア、40mMトリス、1C7デタージェント及び適量のCompleteMiniEDTE-freeProteaseinhibitorMixtureTabletsロッシュアプライドサイセンスを含む溶解バッファーに溶かした。還元及びアルカリ化のため最終濃度5mMトリブチルフォスファイン及び最終濃度10mMのアクリルアミドを添加した。室温で90分インキュベートした後、10mM最終濃度のDTTを添加し、反応を停止するため室温で10分間インキュベートした。AmiconUltra-4100Kアミコンで遠心ろ過した後、濃縮液は、7MUrea、2Mthiourea、1C7からなる等電点用バッファーと混合した。等電点電気泳動のためにReadyStripTMIPTGStrippH4-7、11cmlong、3.3mmwide厚さ0.5mmバイオラッドラボラトリーズを適当量のBio-Lyte3-8バッファーバイオラッドラボラトリーズ及びOrangeGsolutionを含むサンプル溶液で一晩水に戻した。等電点電気泳動終了の後、PrecisionPlusProteinStandardを含むCriterionTMReadyGelsJ4Tstrackinggel、7.5Tresolvingjel、Tris-HClbuffertype、13.3cmwide、8.7cmhigh、and1.0mmthickバイオラッドラボラトリーズを用いてSDS/PAGEを実施した。得られた二次元ゲルは、クマーシーブリリアントブルーで染色するか又は免疫ブロットに用いられた。7ゲル内消化蛋白質のスポットは、切り取って50セトニトリル/100mM炭酸アンモニウムpH8.0で脱色した。切り出したゲルをドライヤーで15分間乾燥した後、トリプシンプロテオミクスグレードソリューション9アセトリトリル中、0.1mMHCl/36mM炭酸アンモニウム0.2mg/mlを添加し、2.5mM炭酸アンモニウムを含む9アセトニトリルで37°C、一晩インキュベートした。インキュベートした液は、集めて乾燥した。8質量分析乾燥させたトリプシン分解ペプチドは、2-5μlの0.1TFA/50アセトニトリルに溶解し、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸CHCA溶液と混合し、AXIMA-CFRPlus島津製作所MALDI-TOF-MSで分析した。トリプシン分解ペプチドのモノアイソトピックm/Z値のピークは、蛋白質データベースサーチと蛋白質の同定のためにMascotSearchマトリックスサイエンスのPeptideMassFingerprintで分析した。91M食塩水剥離皮膚の免疫蛍光法正常ヒト皮膚を48時間4°Cで1mMPMSFを含む1M食塩水に浸した。皮膚サンプルは、液体窒素ですばやく凍結し、クリオスタットで薄切して患者血清1:10希釈、精製した患者IgG0.08mg/ml及びマウス抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体を一次抗体として反応させ、次いでFITC標識したウサギ抗ヒトIgG又は、抗マウスIgポリクローナル抗体を二次抗体として染色した。10二次元電気泳動の分析結果真皮抽出物は、pI7と4の間の等電点電気泳動と、7.5SDSゲル電気泳動の二次元電気泳動で分離した。抽出物は、2枚のゲルで実施し、1枚はクマーシーブルーで染め図1A、もう1枚はニトロセルロース膜に転写して抗p200天疱瘡患者の血清で免疫ブロットを行った図1B。血清は、pI5.0付近、120-125kDaの範囲で複数のバンドを検出し、最も反応性の強かったバンドは、250kDaに存在した。クマーシーで染色したゲルの同じバンドが、質量分析器で分析された図1D。データベースの検索の結果、このバンドは名目上の分子量184,595、計算上の等電点5.01、配列の28をカバーするラミニンガンマ1であることが分かった図1E。特定のバンドとの同一性を確認するため、二次元電気泳動で分離した真皮抽出物を転写した膜上で抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを実施した。患者血清とモノクローナル抗体は、同じバンドに反応した図1C。更に3人の患者の血清も同じバンドを染色した。抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体は、免疫沈降法で抗p200類天疱瘡患者血清と真皮抽出物の形成した沈降物に反応したが、健常者血清の沈降物とは反応しなかった図2A。真皮抽出物と患者血清の免疫沈降上清は、抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを行い、如何なるバンドも検出できなかった。このことは、すべてのラミニンガンマ1は、患者血清によって吸収されたことを示唆している。逆に、免疫ブロットにおいて、抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体との免疫沈降物は、投与量依存的に患者血清と反応した図2B。抗ラミニンガンマ1免疫沈降の上清は、沈降に用いられた抗ラミニンガンマ1抗体の量に反比例して抗p200類天疱瘡血清と反応性を示した。抗p200類天疱瘡血清を用いた免疫ブロットの結果は、ラミニンのガンマ1チェーンがp200のバンドの真皮構成物であることを示唆している。11ラミニンガンマ1と患者血清の反応性患者血清とラミニンガンマ1の反応性が、抗p200類天疱瘡の患者に共通するかどうかを調べるため、20人の患者の血清について、精製したラミニン111及びラミニン211/221どちらもラミニンガンマ1チェーンを含むに対する反応性を調査した。20の血清すべてが、真皮抽出物を用いた免疫ブロットで200kDaの蛋白質に反応し、バンドの位置は抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体の位置と一致した図3A。このことから、抗p200類天疱瘡の自己抗原がラミニンガンマ1であることを支持している。この可能性と一致するように、80及び85の患者血清が、それぞれ精製したラミニン111及びラミニン211/221のガンマ1チェーンと反応した図3B,C及び表1。合計32の患者の血清が同程度の反応性を示した。これらの結果は、更にリコンビナントラミニン111を用いた免疫ブロットによって確認された。そこでは、90の患者血清がリコンビナントラミニンガンマ1に明確な反応性を示した図3D及び表1。重要なことは、健常者9名の血清は精製した/またはリコンビナントのラミニンガンマ1に対してまったく反応しなかったことである。他の水疱性疾患例えば水疱性類天疱瘡、抗ラミニン332粘膜天疱瘡及び表皮水疱症のようなの患者血清はラミニンガンマ1に対する反応性を示さなかった。これらの結果は、若干の陰性例があるにもかかわらず、ラミニンガンマ1が抗p200類天疱瘡の唯一の自己抗原であることを示唆している。12ラミニンガンマ1上の原因エピトープ免疫ブロットによって、患者血清の、上皮抽出物から得たp200への反応性は、抗ラミニンガンマ1C末モノクローナル抗体の添加によって競合的に阻害されたレーンB-4が、抗ラミニンガンマ1N末モノクローナル抗体レーンC-13Sあるいは抗コラーゲンVIモノクローナル抗体レーン3C4の添加によっては阻害されなかった図4A。抗p200類天疱瘡患者から得た血清と精製IgGは、上皮ラミニンガンマ1に対するモノクローナル抗体B-4の反応性を投与量依存的に阻害した。しかし、健常者血清又はIgGは阻害しなかった図4B。これらの結果は、間接的に上皮p200蛋白質上の患者血清に対する反応部位が、ラミニンガンマ1のC末にあることを示している。ラミニンガンマ1上の原因エピトープの位置をさらに限定するため、二重コイルドメインのC末の25を占め、3つのラミニンG様モジュールからなるラミニン111の切断部分であるヒトラミニン111のE8分画即ちLG1-3をリコンビナントで作製した図5A。このリコンビナント蛋白を用いた免疫ブロット分析により、ほとんどのラミニンガンマ1陽性血清は、還元/非還元状態においてラミニンガンマ1E8分画に反応することが分かった図5B。患者20名の血清を用いた免疫ブロットの分析結果を図7に示す。これらの結果は、患者の自己抗体の標的である想定されるエピトープはラミニンガンマ1のC末246アミノ酸の中に存在することを示唆している。13自己抗体の臓器特異性1M食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた蛍光抗体間接法により、抗p200類天疱瘡患者から得た精製IgGは、剥離片の真皮側に反応した図6A、B。特定の症例から得たIgGも、真皮乳頭層毛細血管の血管壁と反応した図6B。しかし、他の患者のIgGは、目に見えるほどの血管壁との反応性は示さなかった図6A。このことは、以前に報告された結果と一致しているZillikensD,etal.1996Anovelsubepidermalblisteringdiseasewithautoantibodiestoa200-kDaantigenofthebasementmembranezone.JInvestDermatol106:1333-1338、KawaharaY,etal.2000Subepidermalblisteringdiseasewithautoantibodiesagainstanoveldermal200-kDaantigen.JournalofDermatologicalScience23:93-102。対照的に、抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体C13Sは、剥離皮膚の真皮側と血管壁の両方に反応した図6C。還元状態及び非還元状態での免疫ブロット法での検討により、真皮及び血管の抽出物の添加量は、抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体B-4の反応性により調節された図6D下。同じ免疫ブロットにより真皮ラミニンガンマ1に対する患者20からの精製IgGの反応性は、血管ラミニンガンマ1に対する反応性よりはるかに高かった図6D上。この結果は、幾人かの患者の血清を用いて再現されている。しかし、患者12から得た精製IgG間接蛍光抗体法により真皮及び血管の両方の基底膜領域に反応したは、真皮及び血管から抽出したラミニンガンマ1に同等の反応性を示した図6D中。この症例を除き、これらの結果は、抗p200類天疱瘡患者の循環血IgG抗体は真皮基底膜領域中のラミニンガンマ1に反応し、血管壁ラミニンに対してはずっと弱い反応性を示すことを示唆した。"