"ATCC番号PTA-10522の識別特性の全てを有する微生物Clostridiumcoskatiiの生物学的に純粋な培養物。嫌気的条件下で、一酸化炭素、二酸化炭素および水素またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるガス基質からエタノールを生産する能力を有する微生物Clostridiumcoskatii、ATCC番号PTA-10522の生物学的に純粋な培養物。前記ガス基質が合成ガスによって提供される、請求項2に記載の生物学的に純粋な培養物。嫌気的条件下で、一酸化炭素、二酸化炭素および水素またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるガス基質から酢酸を生産する能力を有する微生物Clostridiumcoskatii、ATCC番号PTA-10522の生物学的に純粋な培養物。前記ガス基質が合成ガスによって提供される、請求項4に記載の生物学的に純粋な培養物。炭素源を含む嫌気性水性栄養培地からエタノールを生産する能力を有する微生物Clostridiumcoskatii、ATCC番号PTA-10522の生物学的に純粋な培養物。前記炭素源が有機複合炭素源ではない、請求項6に記載の生物学的に純粋な培養物。前記炭素源が酵母エキスではない、請求項6に記載の生物学的に純粋な培養物。有機炭素源で構成される嫌気性水性栄養培地から酢酸を生合成する能力を有する微生物Clostridiumcoskatii、ATCC番号PTA-10522の生物学的に純粋な培養物。配列番号1、配列番号2、および配列番号3に記載される16SrDNA配列を有する微生物Clostridiumcoskatiiの生物学的に純粋な培養物。100μg/mlのクロラムフェニコール系抗生物質の存在下で増殖する能力を有する微生物Clostridiumcoskatiiの生物学的に純粋な培養物。エタノールを生産する方法であって、前記Clostridiumcoskatiiが前記炭素源をエタノールに変換することができる条件下で、炭素源、電子源およびClostridiumcoskatiiを組み合わせるステップを含む方法。前記炭素源がCO2である、請求項10に記載の方法。前記炭素源が有機炭素である、請求項10に記載の方法。前記電子源がH2またはCOである、請求項10に記載の方法。本発明の細菌は、本明細書でClostridiumcoskatiiPS02と呼ぶ、ATCC番号PTA-10522によって表される特徴を示す新規エタノール生産クロストリジウム種である。ClostridiumcoskatiiPS02の系統発生学的、形態学的および生化学的特性を解析し、以下の実施例の欄に記載する。ClostridiumcoskatiiPS02のいくつかの特性は他のクロストリジウム種と似ているが、ClostridiumcoskatiiPS02は、この属の新種であることを裏付ける特有の特徴を有する。実施例に含まれるデータは、この細菌がクロストリジウム属の新しい代表であることを示す。ClostridiumcoskatiiPS02は、嫌気性条件下、基質COH2O、またはH2CO2、またはCOH2CO2から酢酸およびエタノールを生産する能力を有する。酢酸およびエタノールを生産する反応に、COまたはCO2が炭素源を提供し、H2またはCOが電子源を提供する。以下の反応に従って、ClostridiumcoskatiiPS02によるCOおよび/またはH2ならびにCO2の発酵によって生産される一次生成物はエタノールである。6CO3H2O→C2H5OH4CO216H22CO2→C2H5OH3H2O2ClostridiumcoskatiiPS02は酢酸も生産することができる。酢酸生産は以下の反応によって起こる。4CO2H2O→CH3COOH2CO234H22CO2→CH3COOH2H2O4CO、CO2およびH2の多くの供給源は、本発明のクロストリジウムによって利用され得る。例えば、これらの基質のうちの好ましい供給源には、合成ガス、石油精製廃ガス、製鋼業廃ガス、天然ガスの自己熱改質、および石炭ガス化などの廃ガスが含まれる。供給源には、酵母、クロストリジウム発酵、およびガス化セルロース系材料によって生産されるいくぶんかH2を含むガスも含まれる。あるいは、このようなガス基質は、必ずしも他のプロセスの副産物として生産されるわけではないが、ClostridiumcoskatiiPS02を利用する本発明の発酵反応での使用のために特別に生産され得る。この細菌が発酵反応を実行するのに適する条件下で、十分な量の基質ガスをClostridiumcoskatiiに提供することができる限り、基質ガスの全ての供給源を本発明の実施に使用することができることを当業者なら認識するであろう。本発明の一つの好ましい実施形態において、CO、CO2およびH2の供給源は合成ガスである。基質として使用するための合成ガスは、例えば、石炭のガス化のガス副産物として得ることができる。もう一つの方法として、合成ガスは、特に細菌発酵の目的のために容易に入手できる低コストの農産物原料をガス化することによって生産することができ、それによって、バイオマスの燃料アルコールへの間接発酵の経路を提供することができる。植物のほとんどの種類をこの目的に使用することができたように、合成ガスに変換することができる原料には多くの例がある。好ましい原料には、スイッチグラスなどの多年生草、トウモロコシ茎葉などの作物残渣、おがくずなどの処理廃棄物などが含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、このような出発物質から合成ガスを産生することに精通している。一般的に、合成ガスは、ガス化装置内で、主に、熱分解、部分酸化、および水蒸気改質によって乾燥バイオマスから産生され、一次生成物はCO、H2およびCO2である。ガス化および熱分解という用語は類似のプロセスを表し、両方のプロセスとも、バイオマスが暴露される酸素量を制限する。ガス化という用語は、ガス化と熱分解の両方を含むように用いられる場合がある。間接発酵プロセス中に供給される基質ガスの供給源の組み合わせを利用して、バイオリアクターからベントストリーム中の成分の濃度を変化させることもできる。例えば、CO、CO2およびH2の一次供給源は、一般的に、COが37、H2が35、およびCO2が18である濃度比を示す合成ガスであってもよいが、この合成ガスは、COすなわち、製鉄所の廃ガスはCOに富むまたはH2のレベルを高めるために他の供給源からガスを補充することができる。本発明のClostridiumcoskatiiは、嫌気性条件下で培養しなければならない。嫌気性条件とは、気相中の酸素O2のレベルが0.5ppm未満であることを意味する。式1または3によって表される反応のH2Oの供給源は、一般的には、生物が培養される水性培地である。一般に、本発明のアセトゲンを培養するための最適化されたエタノール生産培地は、化学的に定義された液体培地である。しかし、H2:CO2またはCO:CO2雰囲気下で、初期pHが6の代替培地、例えば、ATCC培地1045を利用することができることを当業者なら認識するであろう。さらに、任意のいくつかの目的のために、様々な培地補助剤、例えば、緩衝剤、金属類、ビタミン類、および塩類を加えてもよい。特に、当業者は、バイオ生成物の収量の増加または収量の最適化をもたらす栄養操作および生理学的適応のような技術に精通している。例えば、制限増殖条件すなわち、細菌の増殖および繁殖の速度を遅くする条件下で溶媒生産微生物を培養すると、エタノールなどの高度に還元された発酵生成物の生産が増加する。これは、おそらく、制限増殖条件下、利用可能な炭素に対する利用可能な還元当量還元されたフェリドキシンferridoxin、NADH、またはNADPHの比が増加し、還元力の増加がアセチルCo-Aまたは有機酸の化学的還元に転用され、アルコールを形成するからである。制限増殖条件の例として、例えば、最適ではない温度またはpHで培養を維持すること、ならびに栄養および炭素源の制限が挙げられる。一般に、培養中、所望の細菌密度に達した後に、非増殖条件が実行される。当業者は、所望の生成物の生産を最適化するための手段に精通しており、ClostridiumcoskatiiPS02を用いる全てのこのような最適化された手順は、本発明に包含されると意図される。特に、ClostridiumcoskatiiPS02は、バルチBalch技術を用いて培養することができるBalchandWolfe,1976,Appl.Environ.Microbiol.32:781-791;Balchetal,1979,Microbiol.Rev.43:260-296。これは、いかなるガス相も密閉された管または容器内での培養が望まれることを達成するために、培養材料を調製するための嫌気性チャンバーおよびガス交換マニホールドの助けを必要とする。酸性pHの使用などの、溶媒生産アセトゲンの培養についてのより具体的な詳細は、Tanneretal,1993,Int.J.Syst.Bacteriol.43:232-236およびLiouetal,2005,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.55:2085-2091の中で見られる。エタノール生産を向上させる方法には、鉄、リンおよびビタミン類などの主要な培地成分の最適化、培養pHの制御、細菌のランダム突然変異誘発に続くクローンスクリーニング、または細菌の遺伝子操作が含まれる。ClostridiumcoskatiiPS02による発酵に供給するガスCOおよび/またはH2ならびにCO2の代謝は、追加の改良の有無にかかわらず、当業者に知られる様々な種類の装置のいずれか、または現在開発中の他のスタイルの発酵設備の中で行うことができる。例として、気泡塔反応器、2段階バイオリアクター、トリクルベッド反応器、膜反応器、固定化された細胞を含む充填床反応器などが挙げられるが、これらに限定されない。このような装置の主な必要条件には、以下のものが含まれる:1無菌性Axenicity;2嫌気的条件;3温度、圧力、およびpHの維持に適した条件;4十分な量の基質が培養に供給されること;5発酵の最終生成物が、容易に細菌培養液から回収できること。反応器は、例えば、従来の攪拌槽型反応器、固定化または懸濁された細胞を含むカラム発酵槽、連続フロー型反応器、高圧反応器、細胞再循環型懸濁細胞反応器、および以前に記載された他の例であってもよい。さらに、反応器を、前述の反応器のいずれかを含む直列型および/または並列型反応器システムに配置してもよい。例えば、複数の反応器が、ある一連の条件下で細胞を増殖させ、別の一連の条件下で最低限の増殖でエタノールまたは他の生成物を産生するのに有用であり得る。一般に、発酵は、エタノールなどの生成物が培地中に所望のレベル生産されるまで継続することが可能である。一般的には、エタノールのこのレベルは、少なくとも15g/培地1L~50g/Lの範囲であり、少なくとも30g/Lのレベルが好ましい。ClostridiumcoskatiiPS02は生きたままで、少なくとも60g/Lのエタノール濃度で増殖する。あるいは、一定の生産率が達成された時、例えば、所望の生成物の生産率が、例えば、細菌の排出物の集積、基質利用性の低下、生成物によるフィードバック阻害、生菌数の減少、または当業者に知られるいくつかの他の理由のいずれかにより減少した時に、生産は停止してもよい。さらに、新鮮な培地の継続的な補充と共に、培地の中に任意の液体生成物を含む使用済み培地の同時除去を可能にする連続培養技術すなわち、ケモスタットモードが存在する。本発明の細菌が生産する生成物を、当業者に知られるいくつかの方法のいずれかによって培養物から取り除き、精製することができる。例えば、エタノールを、例えば、溶媒抽出法、共沸混合物への蒸留に続く共沸蒸留、モレキュラーシーブ脱水、パーベーパレーション法、またはフロースルーゼオライトチューブによって取り除き、さらに処理することができる。蒸留に続くエタノール脱水のための2つの主要な工業技術が共沸蒸留およびモレキュラーシーブ脱水であることを当業者なら認識するであろう。さらに、生成物の数に応じて、いくつかの分離技術が、いくつかの純粋な生成物を得るために用いられる必要がある場合がある。同様に、酢酸を、同様のプロセスによって取り除き、さらに処理することができる。ClostridiumcoskatiiPS02は、以前に記載された手順Bryant,1972によって、CO:H2:N2:CO27:37:33:23モルの雰囲気下、初期pH6.0で、以下に記載するアセトゲンC3培地を用いて、マサチューセッツ州ナンタケット島にあるCoskata-Coatue野生生物保護区から収集された河口堆積物を125mLの血清バイアル中に接種した嫌気性濃縮から得た。マスターセルバンクは、アセトゲンC3培地およびH25、CO210、およびN285の雰囲気を用いて、寒天含有15w:vペトリ皿から採取した単一コロニー分離株から獲得したバイオマスから調製した。この細菌を、2009年12月10日に、株ATCC番号PTA-10522としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した。嫌気性細菌のいくつかの系統学的に多様なグループは、CO、CO2およびH2を、酢酸、エタノール、酪酸、ブタノール、および水素を含む様々な商業的に重要な生成物に変換する能力を有する。厳選したサブグループのエタノール生産クロストリジウムは、炭素源として二酸化炭素を用いながら、水素および一酸化炭素を同時に利用して、少量の酢酸と共にエタノールを形成する特有の能力を示す。ClostridiumcoskatiiPS02の系統発生学的、形態学的、生化学的特性を解析し、他の類似のクロストリジウム種と比較した。これらの比較研究に利用した他のクロストリジウム種に、ClostridiumljundahliiPETCATCC番号49587またはDSMZ番号13528;C.ragsdaleiATCCBAA-622;C.autoethanogenumDSMZ番号10061;C.ljundgahliiERI-2ATCC番号55380;およびC.ljungdahliiC-01ATCC番号55988を含めた。ATCC試料は、アメリカンタイプカルチャーコレクションATCCマナッサス、バージニア州から入手した。DSMZ試料は、DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenDSMZGmbHブラウンシュヴァイク、ドイツから入手した。しかし、2010年2月1日現在、ClostridiumljungdahliiO-52は、寄託者がアメリカンタイプカルチャーコレクションと共に供給活動を終了したので、もはや公的に利用可能ではない。実施例1-細胞形態ClostridiumcoskatiiPS02のコロニーは円形であり、色は半透明の白色で、わずかにアセトゲンC3寒天プレートの中央を隆起させた。このコロニーは6~7日を超えると、色が黄褐色または淡褐色まで暗くなった。ClostridiumcoskatiiPS02の細胞は、まれに運動性があり、棒状で、グラム陽性染色され、単独でまたは鎖になって生じた。40から45nmの細胞壁と一致する外側細胞構造が、C.coskatii細胞の薄い切片の電子顕微鏡写真で見られ、これは、グラム陽性の割当を支持する。初期の指数関数増殖では、細胞は0.75μmから3~4μmまでであり、周毛性の鞭毛を有していた図1。胞子はまれに生じたが、存在する時は、中間末端から末端が隆起しているように見え、ほとんどの場合、外観はクラブ様をしていた図2。胞子形態のこの特性はMoorellathermoaceticaDrakeetal.,2006に似ていたが、ClostridiumautoethanogenumAbrinietal.,1994またはClostridiumragsdaleiHuhnkeetal.,2008に観察される非膨潤型の胞子形態と顕著に異なっていた。初期および後期の指数関数増殖期の細胞の電子顕微鏡写真を比較すると、後の増殖相中に、細胞の長さが増加することが明らかになった図3。高容積エタノール濃度を呈する古いバッチ培養については、20~30μmまで細胞の伸長が観察され、新鮮な培地に移した時、これらに細胞は容易に回収されないので、生理的ストレスに関連しているように思われた。伸長した細胞において胞子形成は観察されなかったことが、おそらく、これらの細胞を回収できない一因である。アセトゲンC3培地を用いて、凍結乾燥または凍結させたマスターセルバンク1mL当量から採取した保存培養を開始した。この実施例で用いる培養物を、100rpm5cmの振盪振幅のオービタルシェーカーで、37°Cの温度で増殖させた。以下の表A、B、D、およびEに記載したとおり、この培地を、BalchおよびWolfe1976によって記載される厳密な嫌気性技術を用いて調製した。滅菌後、嫌気性ビタミン溶液表Cを無菌的にボトルに加え、最終圧力104キロパスカル15psigを用いて、各ボトルのヘッドスペースをCO:H2:N2:CO27:37:33:23モルからなるガス混合物と交換した。標準的な接種サイズは10v/vであり、中期から後期の指数増殖期に増殖していた保存培養から移した。バッチ発酵のpHを、20g/LpH6.0の濃度の2-N-モルホリノエタンスルホン酸MES;37°CでpKa=5.97を用いて調節した。MESの代わりに、以下の緩衝液を20g/Lの濃度で用いて、増殖至適pHの研究を行った:MESpH4~6.5、ピペラジン-N,N’-ビス2-エタンスルホン酸PIPES;37°CでpH6.6~7.5;pKa=6.66、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンTRIS;37°CでpH7.5~8.5;pKa=7.72。アセトゲンC3培地で増殖させた指数増殖期の細胞またはCSTR中アセトゲンC5培地で増殖させた後期指数増殖期の細胞を、走査型および透過型電子顕微鏡に用いた。アセトゲンC5培地は、硫化ナトリウム、酵母エキス、およびMES緩衝液を除いたこと、および消泡剤Aシグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州などの消泡剤を最終濃度20mg/Lで培地に加えたことを除いて、基本的に、アセトゲンC3培地と同じであった。これらの試料を、細菌細胞の画像および元素の同時分析のために、デルタ4量子薄窓X線検出器Delta4Quantumthin-windowX-raydetectorを装備したHitachiS-570走査型電子顕微鏡を用いて調べた。透過型電子顕微鏡については、細胞約1×1020を、PBS中4グルタルアルデヒドを含む溶液で固定し、炭素被覆フォームバーグリッドFormvargridに広げ、0.5リンタングステン鉱pH7.0で染色した。細胞を、JEOL1200EXFX透過型電子顕微鏡を用いて調べ、撮影した。光学顕微鏡は、NikonNIS-Elements画像取得ソフトウエアニコンインスツルメンツ、メルビル、ニューヨーク州を装備したNikonEclipse50i顕微鏡写真機を用いて、発酵培養液のウェットマウント調製を行った。実施例2-生理学ClostridiumcoskatiiPS02は絶対嫌気性であった。酵母エキスを含まない状態での化学合成独立栄養増殖が、H2CO2またはCOで生じた。以下の基質を用いた時に化学有機栄養増殖が観察された:ピルビン酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース、サラシンsalacin、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、グルタミン、セリン、アラニン、αケトグルタル酸、オキサロ酢酸、ホスホエノールピルビン酸、シキミ酸、イソクエン酸、ショ糖、およびマロン酸。表Fは、ClostridiumcoskatiiPS02間の基質マトリックス比較を示す。6種類の有機基質が、3種類のエタノール生産クロストリジウムであるC.ljungdahliiPETC、C.ragsgalei、およびC.ljungdahliiとC.coskatiiを区別した。これらの区別する基質には、D-グルコン酸、クエン酸、マレイン酸、ラムノース、アルギニン、およびオキサロ酢酸が含まれた表F。これらの違いは、これらの4種類の細菌間で、これらの基質の代謝に必要な代謝調節遺伝子または異化遺伝子の違いを示す。1ClostridiumcoskatiiPS02およびC.autoethanogenumは、C.coskatiiがD-グルコン酸およびラムノースでは増殖できないこと、かつC.autoethanogenumもクエン酸では増殖できないことによって区別できた。2ClostridiumcoskatiiPS02およびC.ragsdaleiは、C.ragsdaleiがクエン酸塩、マレイン酸、ヒスチジン、オキサロ酢酸、およびアルギニンでは増殖できないことによって区別できた。3ClostridiumcoskatiiPS02およびC.ljungdahliiPETCは、C.coskatiiがD-グルコン酸およびラムノースでは増殖できないこと、かつC.ljungdahliiPETCもクエン酸では増殖できないことによって区別できた。増殖を、600nmで、分光光度計Spectronic20D;MiltonRoyで測定した。炭素基質の利用は、各炭素源1g/Lを含む培地に連続的に移した後の増殖に基づく。炭素基質については、N2:CO280:20の雰囲気下でスクリーニングを行った。積極的な増殖反応を0.2AUを超えるOD600で記録した。クエン酸については、追加の13C標識アイソトープ実験を行い、Bruker社のUltraShieldAvance400MHz核磁気共鳴分光計を用いるカーボンNMRによって、0.2μmで濾過した最終生成物試料の分析により生成物の性質を決定した。実施例3-抗生物質感受性ClostridiumcoskatiiPS02の抗生物質感受性を、100μg/mLの濃度で、アセトゲンC3培地中で17種類の抗生物質に対して評価した表G。ClostridiumcoskatiiPS02は、エリスロマイシン、ナリジクス酸、スペクチノマイシン、コリスチン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびクロラムフェニコールに耐性を示した。3種類の抗生物質が、3種類のエタノール生産クロストリジウムであるC.ljungdahliiPETC,C.ragsgalei、およびC.autoethanogenumとCcoskatiiを区別した。これらの区別する抗生物質には、エリスロマイシン、カルベニシリン、およびクロラムフェニコールが含まれた表J。エリスロマイシンおよびカルベニシリンに対する耐性は、ClostridiumcoskatiiPS02およびClostridiumljungdahliiPETCが共有していたが、クロラムフェニコールに対する耐性はClostridiumcoskatiiPS02のみが示した特色であった。抗生物質感受性は、各抗生物質を100μg/mL含有する培地中での増殖に基づく。雰囲気は、COが37、H2が35、CO2が22であり、バランスガスはN2であった。積極的な増殖反応を0.2AUを超えるOD600で記録した。実施例4-至適pHおよび至適温度ClostridiumcoskatiiPS02は、初期pHが5.8~6.5の間で最適に増殖し、4.8~8.0の間の初期pH値で増殖が起きた図13a。初期pHが6.0の非緩衝培地で培養した時、最終pHは4.5と測定された。濃度が50mMを超えた時、細胞の増殖は非解離酢酸によって顕著に阻害された。Clostridiumcoskatiiは、Clostridiumautoethanogenumと比較した時、pH4.5~5.5の間でより良好な増殖特性を示した図4。この特色は、工業プロセスに特に有用である可能性がある。様々なpHのポイントでの細胞密度測定値の収集に加えて、最終発酵産物酢酸およびエタノールも、4.0~8.5のpH範囲で緩衝化発酵培地を用いるバッチ発酵について測定した。酢酸生産の至適pH条件はpH5.85であり、そのpHで、容積濃度が11.0g/Lの酢酸が120時間で生産された。エタノール生産の至適pH範囲は6.0~6.5であり、そのpHで、容積濃度が9.9g/Lのエタノールが120時間で生産された図5。Clostridiumcoskatiiの増殖の至適温度は37°Cであり、ClostridiumcoskatiiPS02が増殖する温度範囲は26~43°Cであった図6。発酵培養液を、NovaBioprofile300A生化学分析装置ウォルサム、マサチューセッツ州を用いて、アンモニア、オルトリン酸、ナトリウム、カリウム、乳酸、および浸透圧について分析した。有機酸およびアルコールの分析は、5mMのH2SO4水溶液で流速1mL/分で平衡化したHi-PlexH分析用HPLCカラム300×7.7mm;PL1170-6830;PolymerLabs、パロアルト、カリフォルニア州を備えたAgilent1200液体クロマトグラフを用いて行った。培養液画分中の有機酸およびアルコールの同定ならびに確認を、5975B電子衝撃質量分析計MSおよびDBFFAPキャピラリーカラム15m×250μm×0.25μmフィルム、122-3212、AgilentTechnologies社、サンタクララ、カリフォルニア州を備えたAgilent6890NガスクロマトグラフGCで行った。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおりであった:入口=230°C;37°/分でのオーブンプログラミング=35~180°C、MSインターフェイス=240°C、ヘリウム流=1.7mL/分。実施例5-脂肪酸メチルエステルの分析細胞バイオマスの脂肪酸メチルエステル組成を、ClostridiumcoskatiiPS02、Clostidiumragsdalei、Clostridiumautoethanogenum、およびClostridiumljungdahliiについて調べた。ペアワイズ比較の相関係数は、ClostridiumcoskatiiPS02が、細胞膜の脂質組成に基づいて、他のエタノール生産クロストリジウムより5~7の範囲で分岐したことを示した。分岐は、5種類の脂質成分:1,1-ジメトキシヘキサデカン;2-ヘキシル-シクロプロパンオクタン酸,メチルエステル;Z-13-オクタデセナール;1,1-ジメトキシドデカン;およびメチルテトラデカン酸の濃度によって促進された。C.autoethanogenumの単独測定は、方法の再現性を示すと報告されている図7a、7b、および7c。脂肪酸メチルエステルの分析を、ShutterおよびDick2000のMIDIの方法に従って、5975B電子衝撃質量分析計MSおよびUltra2キャピラリーカラムを備えたAgilent6890NGCで行った。ピークの同一性を、細菌の脂肪酸メチルエステル標準物質47080U、スペルコ、ベルフォンテ、ペンシルバニア州を用いて確認した。実施例6-16SrRNA配列ClostridiumcoskatiiPS02の16SrDNA配列配列番号3;図8aの系統発生学的解析は、この生物がクロストリジウムrDNA相同性グループ1に属することを示したCollinset.al.,1994;JohnsonFrancis1975。エタノール生産クロストリジウムクラスターの代表の16SrDNA配列において全般的に高レベルの保存があった。エタノール生産クロストリジウムクラスターの代表についての16SrRNA配列のペアワイズ解析は、全ての比較で99.27の類似度を超えた。このクラスターにおいて、ClostridiumcoskatiiPS02は、5種類の他のクロストリジウムであるC.ljungdahliiC-01GenBank登録番号GU139550、C.ljungdahiiERI-2GU129551、C.ragsdaleiAY170378、C.ljungdahliiPETCGU139552およびC.autoethanogenumY18178のグループ内に位置した図8b。この解析に基づくと、ClostridiumcoskatiiPS02は、クロストリジウムrDNAホモロジーグループ1の中の他のエタノール生産アセトゲンと密接に関連しており、近隣結合/UPGMA法に基づくと、C.ljungdahliiERI-2と最も密接に関連している99.86図9。この16SrDNA遺伝子の一次構造は高度に保存されており、70以上のゲノムDNA類似性を有する種は、通常、16SrDNA遺伝子について97以上の配列同一性を有するStackebrandtandGoebel,1994。他の生物と同様に、これらの違いは16SrDNA配列の全体にランダムに分散しておらず、特定の超可変領域に集中していた。これらの超可変領域は分類群に特異的であることが知られており、唯一配列解析によって決定することができる。16SrDNAアライメントのエントロピーの2つの領域は、6種類のエタノール生産アセトゲンのそれぞれについて配列の特徴を特定した。ClostridiumcoskatiiPS02は、16SrDNA配列の超可変領域内の重要な識別させるDNA塩基の存在によって独自に特定することができた表Hおよび図10参照。これらの特有な配列の特質が、この生物の特徴を特定する。本研究に提示する6種類のクロストリジウムエタノロジェンの16SrRNA解析は、これらの細菌が系統発生レベルで密接に関連していることを示し、個々の種を決定するための97配列同一性の閾値要件を超えている。97未満異なる生物について新種を確立するための16SrRNA遺伝子配列の有用性は、十分に確立されている。97を超えるスコアは明らかにされておらず、DNA-DNAの再結合、またはDNAフィンガープリンティングなどのより高い分解能を有する方法を使用する必要があるJandaandAbbot,2007;KonstantinosandTiedje,2005。ゲノムDNAを、製造業者によって供給される指示書を用いてChargeSwitch登録商標gDNAミニ細菌キットMiniBacterialKitCS11301、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州を用いてエタノール生産クロストリジウムから単離した。完全な16SrDNA配列は、Chandlerら1997年によって記載された手順に従って行った。使用したユニバーサルプライマーは、1500塩基対bp配列について0005Fと1513Rの位置に対応していた。16S増幅産物のサイクルシーケンシングを、DNAポリメラーゼおよびダイターミネーター化学dyeterminatorchemistryを用いて行った。これらの試料を、ABI3100AVANT遺伝子分析計で電気泳動した。配列のアライメントおよび分析は、BioEditソフトウェアバージョン7.0Hall、1999を用いて完了した。報告された配列について、G、A、T、Cは、それぞれグアニン、アデニン、チアミン、シトシンを表している。あいまいな塩基に用いられるコードは以下のとおりである:RAまたはG、YCまたはT、WAまたはT、SCまたはG、KGまたはT。シーケンシング結果の再現性を、各生物に対して3回の独立したシーケンシングの実行を比較することによって確認した。それらは、以前に寄託された配列と関連するシーケンシングギャップを埋め、C.ljungdahliiC-01の場合は、配列が以前にGenBankに存在していなかったので、3つの16SrDNA配列をGenBankに寄託した。これらの配列は、以下の獲得番号の下に寄託された:C.ljungdahliiC-01GenBank登録番号GU139550、C.ljungdahiiERI-2GU129551、およびC.ljungdahliiPETCGU139552。実施例7-PCRベースのDNAフィンガープリンティング密接に関連する生物を比較するための1つの方法は、REP-PCRによるDNAフィンガープリンティングである。この方法は、ほとんどの細菌中に複数コピーで存在する天然の高度に保存された反復DNA配列と相補的なDNAプライマーを利用する。PCRから生じた増幅産物の長さおよび濃度は、密接に関連した種を区別することができるか、または遺伝的に同一である生物を確立するために使用することができる非常に特異的なDNAフィンガープリントを提供する。3つのREP-PCR法が、エタノール生産アセトゲンのDNAフィンガープリンティングに用いられ、これらには、反復遺伝子外パリンドロームエレメントrepetitiveextragenicpalindromicelementREP-PCR、保存された反復DNAエレメントBOX-PCRおよび腸内細菌反復PCR遺伝子間コンセンサス配列ERIC-PCRが含まれた。BOX-PCRでは、6種類のエタノール生産クロストリジウムのPCR産物を作製し、比較した図11。全ての生物が、約1122bp、587bpおよび323bpのバンドを共通して持っていた。ClostridiumcoskatiiPS02は、約868bp、714bp、362bpおよび301bpのバンドを欠いていた。PCR増幅産物のピアソンUPGMA相関PearsonUPGMAcorrelationによる統計分析は、ClostridiumcoskatiiPS02がClostridiumautoethanogenum76.1およびClostridiumljungdahliiPETC75.7;図12と最も密接に関連していることを示した。BOX-PCRによって作製された増幅産物間の違いの規模は、作製された増幅産物の数が少ないこと、およびそれらの質量が似ていることにより最も情報が少ないように思えた。この結果は、これらのゲノム中に存在する標的BOXパリンドロームエレメントの数が少ないこと、かつこれらの要素が、REP-PCRおよびERIC-PCRによって作製されたものよりも高度に保存されていることを示唆している。それにもかかわらず、全てのエタノール生産クロストリジウムが異なること、かつ24~90.1の範囲で類似度が変化することは、BOX-PCRによっていぜん容易に示された。6種類のエタノール生産クロストリジウムからREP-PCR産物を作製し、比較した図13。REP-PCR法を用いて、ClostridiumcoskatiiPS02から7つの主要なPCR増幅産物が作製された。それらは、1884bp、1436bp、1139bp、860bp、785bp、284bp、および185bpであった。284bpの増幅産物は全てのエタノール生産クロストリジウムに共通であったが、6種類の生物間で強度が変化した。さらに、ClostridiumcoskatiiPS02の185bpに位置する増幅産物は、ClostridiumljungdahliiPETCおよびERI-2にも存在していたが、強度が非常に低かった。ClostridiumcoskatiiPS02の残りのPCR産物は、この生物に特有であった。PCR増幅産物のピアソンUPGMA相関による統計分析は、ClostridiumcoskatiiPS02が、40.9の類似度でClostridiumragsdaleiと最も密接に関連していたことを示した。REP-PCR類似度スコアの範囲は、2.6~40.9の間で類似度が変化した図14。REP-PCR法は、ClostridiumcoskatiPS02および他のエタノール生産クロストリジウム間の区別を最高レベルで提供し、将来の細菌タイピング研究に好ましいDNAフィンガープリンティング法であろう。6種類のエタノール生産クロストリジウムからERIC-PCR産物を作製し、比較した図15。17個以上の主要なPCR増幅産物が、REP-PCR法を用いてClostridiumcoskatiiPS02から作製された。最適化した条件下で、ERIC-PCR法は、おそらくプローブの特異性の欠如により、PCR産物のより高いバックグラウンドをもたらした。それにもかかわらず、ピアソンUPGMA相関による増幅産物パターンの統計解析は、ClostridiumcoskatiiPS02が、73.5の類似度でClostridiumljungdahliiPETCと最も密接に関連していることを示した。REP-PCRの類似度スコアの範囲42.7~73.5は他の方法よりもはるかに狭く、REP-PCRが、エタノール生産アセトゲンの細菌タイピングのためのREP-PCR法よりもあまり望ましくない可能性があることを示した。ゲノムDNAを、製造業者によって供給される指示書を用いてChargeSwitch登録商標gDNAミニ細菌キットCS11301、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州を用いてエタノール生産クロストリジウムから単離した。3つのREP-PCR法を用いて、ゲノムDNAから増幅産物を作製した。これらは、反復DNAエレメントBOX-PCR、反復遺伝子外パリンドロームエレメントREP-PCR、および腸内細菌反復遺伝子間コンセンサス配列ERIC-PCR法であった。これらの3つの方法のREP-PCRを、MacCannelら2006によって提案された改良を用いて、Rahmatiら2005によって記載されているとおりに行った。プライマーは、Rahmatiら2005により提供された配列を用いて、インビトロジェン社によって合成された。増幅産物パターンの分子タイピングおよび統計解析を、BioNumerics4.01ソフトウエアAppliedMaths、フォートワース、テキサス州を用いて完了した。2つの分子量マーカー100bpDNAラダー、10488-058、インビトロジェン;およびpUC19/Sau3A1消化物、AM7760、インビトロジェンを、約0.1~0.3μgの濃度でゲルにロードしたが、分子量の割当はAM7760標準物質に基づいた。実施例8-DNAのGC含有量の比較ClostridiumcoskatiiPS02のDNAのGCモルは、32.5±0.5GCでありn=5、他の既知のエタノール生産クロストリジウムよりも3~10高かった。これらの細菌のGC含量量は、GC含有量が低いグラム陽性細菌の期待される範囲内に収まるDrake,etal.,2002;およびDrakeetal.,2006。ClostridiumcoskatiiPS02およびDNAフィンガープリンティングに従って3種類の最も密接に関連するエタノール生産クロストリジウムのGC含有量を表Iに提供する。細菌細胞をフレンチ圧力セルで破砕し、DNAをCashionら1977の手順に従ってヒドロキシアパタイトで精製した。次に、このDNAを、P1ヌクレアーゼで加水分解し、ヌクレオチドをウシアルカリフォスファターゼで脱リン酸化したMesbahetal.1989。得られたデオキシリボヌクレオチドをHPLCで分析した。HPLCシステム島津製作所、日本は、以下のモジュールからなっていた:LC-20AD溶媒送達モジュール、DGU-3Aオンライン脱気装置、CTO-10ACカラムオーブン、SIL-20A自動サンプルインジェクター、およびSPD-6AのUV分光光度検出器。クロマトグラムは、CLARITYバージョン2.4.1.93ソフトウェアパッケージDataApexLtd、チェコ共和国を用いて分析した。分析カラムは、ガードカラム201GD54HVydac、ヘスペリア、カリフォルニア92345、USAを装備したVYDAC201SP54、C18、5μm250×4.6mmであった。液体クロマトグラフィーの条件は、温度45°C、試料10μl、溶媒0,3MのNH4H2P04/アセトニトリル、40:1v/v、pH4.4、1.3ml/分であったTamaokaKomagata,1984から適合させた。システムキャリブレーションに用いられる参照DNAには、非メチル化ラムダDNAシグマ社、GC含有量49.858モルMesbahetal.,1989、ならびに完全なゲノム配列が公開された3つのDNAhttp://ergo.integratedgenomics.com/GOLD/:枯草菌DSMZ40243.518モルGC;斑点細菌病菌DSMZ3586T65.069モルGC;およびStreptomycesviolaceoruberDSMZ4078372.119モルGCが含まれていた。GCの値は、Mesbahら1989の方法に従って、デオキシグアノシンdGおよびチミジンdTの比から算出した。実施例9-DNA-DNAハイブリダイゼーションDNAフィンガープリンティング研究は、ClostridiumcoskatiiPS02が、Clostridiumautoethanogenum、ClostridiumljungdahliiPETC、およびClostridiumragsdaleiと最も密接に関連することを示した。これらの結果に基づいて、ゲノムDNAの類似度を決定するために、DNA-DNAハイブリダイゼーション研究を、これらの生物を用いて行った。DNA-DNAハイブリダイゼーションは、明らかに、提示された新しい種に好ましい方法および不明瞭な性質を有する生物の正しい分類単位への最終的な割当に好ましい方法であるStackebrandtetal.,2002。種の系統発生学的定義には、a精製されたDNA分子が70以上のDNA-DNA関連性を示しbヘテロ2本鎖分子の安定性について5°C以下のΔTmを有し、かつc表現型の特徴がこの定義と一致すべきであることが含まれるWayneetal,1987;StackebrandtandGoebel,1994。Clostridiumcoskatiiの全てのペアリングは、70のDNA-DNA類似度の閾値を用いた時に種の要件を満たした表J。この結果は、ClostridiumcoskatiiPS02が新しい細菌種を表すことを示した。全ての他のペアリングは、ClostridiumljungdahliiおよびClostridiumautoethanogenumを除いて70未満の閾値であり、そのため、信頼区間は70の閾値で重なった。ゲノムDNAを剪断し、Cashionら1977によって記載されるとおり、フレンチ圧力セルThermoSpectronicを用いて細菌細胞から取り出し、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーによって精製した。ペルチェサーモスタット6×6マルチセルチェンジャーPeltier-thermostatted6×6multicellchangerおよびインサイツ温度プローブin-situtemperatureprobeバリアンを有する温度制御装置を備えたモデルCary100BioUV/VIS分光光度計を用いて、Hussら1983によって記載される改良を考慮し、DeLeyら1970によって記載されるとおりにDNA-DNAハイブリダイゼーションを行った。結果を、2つの独立した分析からの平均値として報告し、これらは10未満異なっていた。類似度の値は、報告された値の約10の範囲で再現性があった。実施例10-エタノール生産力および酢酸生産力長期1,000時間を超える連続攪拌槽型反応器CSTR実験は、定常状態の発酵条件下で、ClostridiumcoskatiiPS02のエタノール生産力および酢酸生産力を決定するために行った。シンプルで安価な化学的に定義された培地で、CSTRモードで増殖させ、電子源および炭素源として合成ガスを用いながら、この生物の発酵バランスを決定した。定常状態の条件時に、微量金属の利用度を測定して、化学的に定義された培地を用いて栄養不足を調査した。BalchおよびWolfe1976によって記載される絶対嫌気性の技術を用いて調製したアセトゲンC5培地を利用して、37°Cで、SartoriousBiostatBCSTRを動作させた。この培地は、硫化ナトリウム、酵母エキス、およびMES緩衝液を除いたこと、および消泡剤Aシグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州などの消泡剤を最終濃度20mg/Lでこの培地に加えたことを除いて、基本的に、アセトゲンC3培地と同じであった。発酵のpHは、5M水酸化ナトリウムを用いて、プロセスの期間中、5.20±0.1に調節した。ThermoElectronPrimaδBプロセスガス質量分析計を用いて、CO、H2、CO2、N2、CH4、およびエタノールの入口ならびに出口のガス濃度の半連続的20分間隔の分析を行った。反応器の作動は2つの主要なプロセス:バッチ条件下で完了する反応器の起動、およびCSTRエタノール生産段階に分かれていた。10の接種菌液をこの反応器に接種した後、細胞密度が培養液1Lあたり細胞乾燥重量0.2ggDCW/Lに増加するまで、この反応器をバッチモードで動作させた。その時点で、希釈率D0.2日-1を用いて、アセトゲンC5培地からなる連続供給を開始した。起動中およびエタノール生産段階の間中、COが37、CO2が21.68、H2が35.1およびN2が6.22の組成で、CO、H2およびCO2からなる合成ガスまたは廃ガスをバイオリアクターに連続的に導入した。70を超える水素取り込みを維持する速度で、ガスを流し、撹拌した。最後に、培地の供給速度は、細胞密度が0.60gDCW/Lを超えた後、48時間にわたって、D=0.5日-1の最終値まで増加した。アセトゲンC5培地を用いた時、ClostridiumcoskatiiPS02の初期対数増殖期の間、前定常状態のケモスタット培養の最大倍加時間は0.064時間-1であった。エタノール生産段階、および定常状態のケモスタット増殖の間、増殖速度は75~100倍減少し、CSTR作動の最大1150時間の間安定であった図17。C.coskatiiPS02のCSTR発酵から収集したバイオマスの成分プロファイルを、C.ljungdahliiPETCTanneretal.,1993について公表された結果と比較した。C.ljungdahliiPETCと比較した時、C.coskatiiバイオマスの試料はかなり多くのリンおよび硫黄を含んでいたが、カリウムおよび酸素は同様のレベルであった図18。この結果は、これらの2種類のエタノール生産クロストリジウムには、細胞の成分組成に著しい違いがあることを示した。ClostridiumcoskatiiPS02によるガスの取り込み、バイオマス生産、生成物の形成を、1150時間にわたるCSTRについて測定した図19および20。この期間中、Clostridiumcoskatiiを、COが37、CO2が21.68、H2が35.1およびN2が6.22の下で、1Lあたりシステイン遊離塩基を0.1g含むアセトゲンC5培地で増殖させた。約200時間までに、ガス流、撹拌、希釈率、および細胞密度は、それぞれ、0.27vvm、900rpm、0.5日-1、および1.733gDCW/Lの最終的な定常状態の値に達した。CSTR動作の10日後、この反応器の定常状態の条件である希釈率0.5日-1に達した440時間の時点。培養液のLC分析およびGC-MS分析の両方は、2つの主要生成物が発酵から生産されたこと、それらが酢酸およびエタノールであったことを示した図21。代謝中間体ギ酸塩または最終生成物酢酸およびエタノールの酸性触媒による化学反応生成物である酢酸エチルおよびギ酸、エチルエステルも微量存在した図21。定常状態の条件に達した後、発酵のマスバランスを完了させ、ClostridiumcoskatiiがアセチルCoA経路を用いていることを確認した。CO、およびH2の取り込みの平均値および標準偏差ならびにCO2およびエタノール蒸気の放出を、440時間の時点で開始し、910時間で終了する470時間の間計算した。この期間、ガス化合物の測定に加えて、培養液画分中のバイオマス、エタノール、酢酸の量および発酵量を測定した図22aおよび22b。このマスバランスの平均値は以下のとおりであった:エタノール生産:5.365ミリモル/L/hr酢酸生産:3.745ミリモル/L/hr放出されたエタノール:0.144ミリモル/L/hrバイオマス生産:0.0533ミリモル/L/hrCOの取り込み:28.27ミリモル/L/hrH2の取り込み:20.58ミリモル/L/hrCO2の取り込み:-8.52ミリモル/L/hr負の取り込み表Kの電子バランスは、プロセス中に供給される電子供与体の濃度と細菌から生産される電子受容体酢酸およびエタノールの濃度の間の一致が優れていることを示す。電子バランスを1.04まで閉鎖すると、他の主要な生成物が発酵培養液中に存在しなかったことを確証する表K。ClostridiumcoskatiiPS02などのクロストリジウムエタノロジェンの炭素バランスは、COおよびH2の混合物が共に代謝される時5ページの反応を参照されたい、CO2の消費反応およびCO2の生産反応の両方があるという事実によって複雑になる。一酸化炭素デヒドロゲナーゼによるCOの酸化は、最小培地条件下でCO2を生産する主反応であり、ヒドロゲナーゼによるH2の酸化を介して派生する電子を用いるアセチルCo-A経路は、CO2の取り込みの主な消費経路である。酢酸に対するエタノールのモル比がおおよそ1:1で生産されている生化学系では、酸化されるH2の全モルは、アセチルCo-Aに固定されるCO2の0.41666モルになるこの値は、酢酸生産2:1およびエタノール生産3:1についての平均のCO2に対するH2の比から計算される。以下の実施例では、ヒドロゲナーゼから獲得される電子を介して消費されるCO2の量は、利用される水素の全ミリモルを2.40で割ることによって推定することができる。このCSTR発酵の炭素バランスを表Lに示す。この炭素バランスは、ClostridiumcoskatiiPS02の代謝が酢酸生産モデルに適合することを示す。さらに、この実験の測定誤差が1未満であることは、重ねて、全ての反応物質および生成物が正確に測定されていること、かつこの合成ガス発酵で生産されている他の主要な生成物はないことを確証する。実施例11-エタノール生産力および酢酸生産力に対する有機炭素源の効果-化学的に定義された最小培地の検証有機炭素源である酵母エキスの効果を、定常状態の発酵条件下で、Clostridiumcoskatiiを含む長期700時間を超える連続攪拌槽型反応器CSTRで評価した。これらの研究を通して、Clostridiumcoskatiiが複合有機炭素源の非存在下で十分増殖することが示された。この特色は、他の既知のクロストリジウムエタノロジェンについて以前に証明されておらず、そのため、Clostridiumcoskatiiに特有であった。CSTR研究を、化学的に定義された最小培地、および0.1g/Lの酵母エキスを補充した培地を用いて完了し、Clostridiumcoskatiiによるエタノール生産および酢酸生産に対する複合有機炭素源の効果をさらに特徴づけた。SartoriousBiostatBCSTRを、実施例10に前記したとおり、アセトゲンC5培地を利用して、37°Cで動作させた。反応器の条件および動作手順は、実施例10に前記したものと同一であった。ClostridiumcoskatiiPS02によるエタノール生産および酢酸生産に対する酵母エキスの効果を、720時間にわたって、2つのCSTRについて測定した図23。反応器の起動中および定常状態の条件の確立の前に、供給培地に酵母エキスを含まない対照反応器、および0.1g/Lの酵母エキスを補充した反応器についての酢酸生産およびエタノール生産は同じであった。接種菌液からの栄養分の持ち越しにより、反応器の起動中の生産動向は類似していた。これらの持ち越し栄養分は、0.2日-1の希釈率に基づいて、192時間の時点で栄養分の元の濃度の60を上回って枯渇し、この時点で酢酸およびエタノールの動向の違いが著しくなった。希釈率は、200時間の時点で0.5日-1まで増加し、対照反応器においてはエタノール濃度が24g/Lの定常状態の条件まで増加したが、0.1g/Lの酵母エキスを補充した反応器においては1g/L未満まで低下したという点で、酢酸生産およびエタノール生産の違いはより顕著になった。エタノール生産におけるこれらの変化は、0.1g/Lの酵母エキスを補充した反応器については酢酸生産の2倍の増加23g/Lと関連したが、対照反応器の酢酸レベルは、この実験の期間中、約12g/Lの一定な定常状態レベルのままであった。これらのデータは、アセトゲンC5培地に相当する化学的に定義された最小培地が、Clostridiumcoskatiiを用いる合成ガス発酵によるバイオ燃料の生産に最適であることを示す。本発明は、その好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明のClostridiumcoskatii細菌は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内の様々な方法で利用できることを当業者なら認識するであろう。したがって、本発明は、上記に記載の特定の実施形態に限定されるべきではない。"