"選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする方法であって、撮像装置の暗画素強度を決定する段階と、最適露光時間で第1の画像を取得する段階と、前記最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、前記暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、前記第1の画像における1つ以上の画素の画素強度を調整する段階とを含む方法。前記暗画素強度を決定する段階が、露光時間をゼロに設定する段階と、強度画像を取得する段階と、前記強度画像全体の平均強度を計算する段階を含む、請求項1記載の方法。前記最適露光時間が、前記撮像装置の1つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく、請求項1記載の方法。前記第1の画像が生体物質の蛍光顕微鏡画像を含む、請求項1記載の方法。前記生体物質が第1のバイオマーカを含む、請求項4記載の方法。前記バイオマーカが蛍光バイオマーカである、請求項5記載の方法。前記生体物質の前記第1の画像が、蛍光チャネルに信号を示す、請求項4記載の方法。前記生体物質が第2のバイオマーカを含んでいて、当該方法が、第2の画像を同時に又は異なる最適露光時間で撮影する段階をさらに含む、請求項5記載の方法。前記第2の画像における1つ以上の画素の画素強度を、前記最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、前記暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて調整する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。前記第1の画像及び前記第2の画像を位置合わせして、複合画像を形成する段階をさらに含む、請求項9記載の方法。前記生体物質の自己蛍光画像を取得する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。前記第1の画像から前記生体物質の前記自己蛍光画像をサブトラクションする段階をさらに含む、請求項11記載の方法。前記生体物質にバイオマーカを適用する段階をさらに含み、前記第1の画像は、前記バイオマーカが前記生体物質に適用された後に取得される、請求項12記載の方法。前記自己蛍光画像及び前記第1の画像を位置合わせする段階をさらに含む、請求項13記載の方法。前記生体物質に別のバイオマーカを適用し、前記生体物質の第2の画像を取得する段階をさらに含む、請求項12記載の方法。前記第1の画像及び前記第2の画像を位置合わせする段階をさらに含む、請求項15記載の方法。各々がチャネルに対応する1つ以上の追加バイオマーカを前記生体物質に適用し、前記バイオマーカチャネルの各々について1つ以上の追加画像を取得する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。前記第1の画像、前記第2の画像、及び前記追加画像を位置合わせして、前記チャネルの複合画像を形成する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。前記画素強度を調整する段階が、以下の式を少なくとも部分的に用いる、請求項1記載の方法。式中、t1は、前記最適露光時間であり、t2は、前記第2の露光時間であり、It1は、前記露光時間t1の間の所与の画素の信号強度であり、It2は、前記露光時間t2の間の推定信号強度であり、DarkPixelIntensityは前記撮像装置の前記暗画素強度である。本発明の方法及びシステムは、実際の画像を撮影するのに使用されるデジタルカメラの暗画素強度を用いて、異なる露光時間での実際の信号強度で始まる、所与の露光時間での顕微鏡試料の蛍光画像の画素からの信号強度の高精度の推定を実現する。選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする本方法の例が、一般に、撮像装置の暗画素強度を決定し;最適露光時間で第1の画像を取得し;最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第1の画像における1つ以上の画素の画素強度を調整することを含む。暗画素強度を決定する段階が、露光時間をゼロに設定し;強度画像を取得し;強度画像全体の平均強度を計算することを含んでいてもよい。最適露光時間は、通常、撮像装置の1つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく。一例では、第1の画像は生体物質のものであり、生体物質は、染色されているか又は第1のバイオマーカを含んでいてもよい。バイオマーカは、蛍光バイオマーカを含んでいてもよく、それにより、生体物質の第1の画像は、バイオマーカに対応する蛍光チャネルの信号を示す。生体物質は、第2のバイオマーカで染色されてもよく、それにより、本方法は、同じ又は異なる最適露光時間で第2の画像を撮影することをさらに含む。本方法は、最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第2の画像における1つ以上の画素の画素強度を調整することをさらに含んでいてもよい。第1の画像及び第2の画像は、合成画像を形成するために位置合わせされてもよい。画像は、例えば1つ以上の形態学的特徴を特定し且つ特定された形態学的特徴を用いて画像を揃えるか又は共に位置合わせすることにより、位置合わせされてもよい。また、画像は、限定されないが画像の画素を揃えるなどの他の方法を用いて位置合わせされてもよい。本方法は、第1の画像から生体物質の自己蛍光画像を取得すること、及びいくつかの例では、第1の画像から生体物質の自己蛍光画像をサブトラクションすることをさらに含んでいてもよい。また、該自己蛍光画像は、第1の画像及び/又は第2の画像と共に位置合わせされてもよい。本方法は、第1の画像及び第2の画像を取得することに限定されない。所与の用途に関する必要又は所望に応じて、物質に関して任意の数の画像が撮影され、スケーリングされ、且つ/又は位置合わせされてもよい。画像の任意の2つの以上が、複合画像を形成するために位置合わせされてもよい。また、本方法は、生体物質を染色するか又はそれに1つ以上のバイオマーカを適用する段階を含んでいてもよく、第1の画像は、生体物質にバイオマーカが適用された後に取得される。該バイオマーカは1つ以上のチャネルに適合されていてもよい。バイオマーカは、同時に又は順次、物質に適用されてもよい。画像が、バイオマーカチャネルに対応するフィルタを使用して撮影されてもよい。本発明のこれらの且つ他の特徴、態様、及び利点は、図面を通じて同様の文字が同様の部分を示す添付図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、より良く理解されるであろう。本発明の方法及びシステムの例の1つ以上が、実際の画像を撮影するのに使用されるデジタルカメラの暗画素強度を用いて、異なる露光時間での実際の信号強度で始まる、所与の露光時間での顕微鏡試料の蛍光画像の画素からの信号の強度の高精度の推定を実現する。自己蛍光画像及び染色画像が異なる露光時間でキャプチャされることが多いが、画像サブトラクションが、同じ露光時間を用いて2つの画像が得られることを必要とする。画素強度は、一般に、画像がカメラの線形範囲で取得される限り露光時間に対して線形であるが、通常はカメラにより設定される切片interceptが存在する。この説明のために、この切片は暗画素強度と呼ばれる。暗画素強度は、無光及びゼロ露光時間という条件下の画素強度である。暗画素強度は、カメラの読出しノイズ電子/画素、利得、及びDCオフセットにより決定される。画素取得設定の暗画素強度を知ることにより、又はそれを決定することにより、1つの露光時間で取得される画像が、異なる露光時間での画像へ線形スケーリングされてもよい。暗画素強度は、例えば無光及び最少露光時間で画像を得ることにより、又は一連の露光時間で画像をキャプチャすることで強度を間接的に計算することにより、測定されてもよい。露光時間が蛍光顕微鏡画像取得中のパラメータであり、一般に、数ミリ秒から2秒に及ぶが、必ずしもこの範囲に限定されない。正確な露光時間は、蛍光信号の線形表示を維持するために重要である。しかし、やはり、アナログ利得、デジタル利得、オフセット及びビニングを含むがそれらに限定されないデジタル画像に影響を及ぼす、取得中の他のパラメータがある。選択された露光時間に対して、最適露光時間で撮影された画像をスケーリングする本方法の例が、一般に、撮像装置の暗画素強度を決定し;最適露光時間で第1の画像を取得し;最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第1の画像における1つ以上の画素の画素強度を調整することを含む。暗画素強度を決定することは、露光時間をゼロに設定し;強度画像を取得し;強度画像全体の平均強度を計算することを含んでいてもよい。最適露光時間は、通常、撮像装置の1つ以上の設定に少なくとも部分的に基づく。例では、例えば所与の撮像装置がゼロ露光時間で設定できない場合、露光時間からゼロの場合が推定されるか、又は所与の撮像装置が許容可能な、可能な限り低い設定に設定されてもよい。平均強度が計算された場合、暗画素強度の信号値が一次元で適用されてもよい。例えば、画像がゼロ露光時間で取得された場合、それは2次元マトリクスに拡張されてもよい。また、画像は平均化されてもよい。例えば、補償フィルタはスカラ値又は配列値のどちらかであってもよい。一例では、第1の画像は生体物質のものであり、生体物質は、染色されているか、又は第1のバイオマーカを含んでいてもよい。バイオマーカには蛍光バイオマーカが含まれている可能性があり、それにより生体物質の第1の画像は、バイオマーカに対応する蛍光チャネルに信号を示す。生体物質は、第2のバイオマーカで染色されてもよく、それにより、本方法は、同じ又は異なる最適露光時間で第2の画像を撮影することをさらに含んでいてもよい。本方法は、最適露光時間とは異なる第2の露光時間の間に、暗画素強度に少なくとも部分的に基づいて、第2の画像における1つ以上の画素の画素強度を調整することをさらに含んでいてもよい。第1の画像及び第2の画像は、合成画像を形成するために位置合わせされてもよい。また、最終画像が2つ以上の画像から計算されてもよく、例えば、1つの画像が別の画像からサブトラクションされてもよい。画像は、例えば1つ以上の形態学的特徴を特定し且つ特定された形態学的特徴を用いて画像を揃えるか又は共に位置合わせすることにより、位置合わせされてもよい。また、画像は、限定されないが画像の画素を揃えるなどの他の方法を用いて位置合わせされてもよい。本方法は、生体物質の自己蛍光画像を取得すること、いくつかの例では、第1の画像から生体物質の自己蛍光画像をサブトラクションすることをさらに含んでいてもよい。また、自己蛍光画像は、第1の画像及び/又は第2の画像と共に位置合わせさてもよい。本方法は、第1の画像及び第2の画像を取得することに限定されない。所与の用途に関する必要又は所望に応じて、物質に関して任意の数の画像が撮影され、スケーリングされ、且つ/又は位置合わせされてもよい。画像の任意の2つの以上が、複合画像を形成するために位置合わせされてもよい。また、本方法は、生体物質に対して染色するか又は1つ以上のバイオマーカを使用する段階を含んでいてもよく、第1の画像は、生体物質にバイオマーカが適用された後に取得される。バイオマーカは、1つ以上のチャネルに適合されていてもよい。バイオマーカは、同時に又は順次、物質に適用されてもよい。画像が、バイオマーカチャネルに対応するフィルタを使用して撮影されてもよい。本方法及び本システムに顕微鏡が使用されて、蛍光物質から発せられる光子を収集し、それらを、電荷結合素子CCD:charge-coupleddeviceカメラ又は電荷結合素子検出器などの撮像装置へ中継してもよい。CCDアレイ検出器は光子を光電流に変換し、光電流は電圧に変換される。アレイ内の各検出器電圧は、最終的に、光子強度を示す画素値にデジタル化されるA/D変換、例えば、アナログ利得及びデジタル利得。最高科学グレードのCCDカメラが、0から4095に及ぶ画素値を有する12ビットの出力を有する。量子効率Qe及びノイズの両方が、CCD検出器の感度をもたらす。CCDによりキャプチャされていない光子が、一般に損失として見なされ、感度の低下をもたらす。ノイズが、3つの成分:1光検出器に固有であり、入射光子なしで作り出される主として熱的に生成されるスプリアス信号を指す、暗ノイズと;2光子のランダム到着に起因する光電流における統計変動を指す、光子ノイズと;3光電流をデジタルワードに変換する成分により生じる合成ノイズを指す、読出しノイズreadnoiseとしても既知の読出しノイズreadoutnoiseと、に集約されることが多い。集合的に、これらのノイズ成分はカメラノイズと呼ばれてもよく、CCD上の電子信号を定量化する工程中に導入される可能性がある誤差を表す可能性がある。信号対ノイズ比SNRは次の式で決定される。式中、PはCCD上の光子束信号入射光子/画素/秒であり、BはCCD上のバックグラウンド光子束入射光子/画素/画素であり、tは積分時間又は露光時間秒であり、Dは電子/画素/秒の暗電流であり、Nrは読出しノイズ二乗平均平方根電子/画素である。SNRは、時間/速度依存的であり、積分時間が長いほど高いSNRを生じる。したがって、比率フレーム/秒と検出限界との間にトレードオフがある。SNRは、積分時間の平方根に比例する。例えば、蛍光顕微鏡を使用して異なるタンパク質発現レベルを関連付ける工程では、各タンパク質に異なる積分時間を用いることが望ましい可能性がある。デジタル画像の画素強度例えば、タンパク質の染色強度への暗電流、読出しノイズ、及び露光時間の影響は、定量化の精度に影響を及ぼす。CCDカメラの出力は、最終的に、光電子から電圧への変換により作り出されるデジタルワードであり、該デジタルワードは必要に応じて増幅され、アナログデジタル変換器ACDにより処理される。その処理に関連するノイズ項に関する短い考察が続く。電圧信号は、以下の式に従ってCCDを含む個々の光検出器により生成される。本方法の1つ以上の例では、所与の露光時間で測定される信号強度から暗画素値をサブトラクションし、この差に、実際の画像の露光時間による推定が所望される露光時間の比率を掛け、この結果から暗画素強度をサブトラクションすることにより推定が得られる。本方法の一例が、アルゴリズムIt2-DarkPixelIntensity=t2/t1×It2-DarkPixelIntensityを用いることを含む。暗画素強度は、ゼロ露光時間での単一の測定を用い、各々が異なる露光時間でいくつかの測定を行い、ゼロ露光時間の場合を推定することなどの種々の方法で決定されてもよい。蛍光顕微鏡で使用されるようになされたほとんどのデジタルカメラにより、画像がゼロ露光時間で撮影されることが可能になる。1つ以上の例では、これには、照明源から隔絶されているカメラで画像を撮影することが含まれ、その設定に依存することは試料なしで画像を撮影することを含んでもよい。ソフトウェアを使用して、視野内の全画素に亘る平均強度値を得ることができる。一例では、この値は単に暗画素強度として用いることができるだけであるが、別の例では、各露光時間の平均値を用いて、ゼロ露光時間の場合に戻って推定してもよい。そのような推定を実施する際に、平均強度は露光時間の一次関数であると考えられる可能性がある。暗画素強度は、共通の測定チャネルに亘って同一である可能性がある。したがって、その値は、一般に、その値を決定するのに使用される測定チャネルとは無関係である。また、本発明の方法の1つ以上の例が、暗画素強度を用いて自己蛍光補正の精度を向上させることを含んでいてもよい。そのような補正は、第2の画像において行われる測定を用いて第1の画像を補正することを含んでいてもよい。この第2の画像は、第1の画像とは異なる露光時間で撮影されてもよく、したがって、2つの画像のうちの一方が、他方の画像の露光時間で撮影されていたらそうであったであろうものに調整されてもよい。本方法の1つ以上の例が、所与のカメラ設定の暗画素強度を決定して、蛍光顕微鏡で画像を撮影する際に所与の画素における強度への露光時間の影響の予測を可能にすることを含む。顕微鏡を通して蛍光画像を撮影するようになされたデジタルカメラ装置の暗画素強度に関して、最初の決定がなされる。暗画素強度は、所与の装置設定に少なくとも部分的に依存している可能性があり、その設定の全蛍光チャネルに関して同一である可能性がある。そのような値は、次いで、異なる露光時間での画素における強度の測定値からもたらされる、所与の露光時間の所与の画素における強度の予測又は推定に用いられてもよい。この予測を用いて、生体試料の画像から自己蛍光の影響を除去してもよい。所与のカメラ設定の暗画素強度は、例えばゼロ露光時間での測定、又はいくつかの露光時間で行われた測定からのゼロ露光時間の場合の推定から決定されてもよい。いずれかの例では、適切なソフトウェアが使用されて、デジタルカメラが読み出し且つ平均値を提示する全画素からの信号の強度を合計してもよい。第1の例では、照明なしで読出しがカメラから行われる。これは、閉じられたカメラへの光の入力を調節するシャッタが閉じた状態で、カメラ出力からの読出しを行うことにより達成されてもよい。暗画素の読出しは、所与の露光時間、例えば画素信号がカメラから読み出される時間間隔、に依存している。読出しは複数の露光時間で行われてもよい。例えば、複数の読出しが、1ミリ秒と500ミリ秒との間に行われてもよく、線形回帰式を使用してゼロ露光時間での値を予測してもよい。また、読出しは、例えば1ミリ秒などの非常に短い時間間隔で行われてもよい。後者の例では、暗画素強度は、様々な露光時間で所与の蛍光チャネルで撮影される、同一視野の一連の画像から決定されてもよい。画素信号強度平均が、例えばカメラにより読み出される全画素からの信号を集約することにより、各露光時間について生成されてもよく、この値を関連する画素数で割って平均値をもたらしてもよい。次いで、線形回帰分析を用いて、露光時間と平均画素信号強度との間の関係を決定してもよい。そのような関係は、暗画素強度である、ゼロ露光時間での信号強度を予測するのに用いられてもよい。露光時間と平均画素信号強度との間の関係は、画素が入射光で飽和状態にならなかった露光時間の範囲に亘ってほぼ線形であり、それにより、画素の信号出力は、もはや、画素が暴露される入射光に比例していない。特定の露光時間での画素信号強度の向上した予測は、自己蛍光の影響に関して所与の画像を調節又は補正するのに用いられてもよい。所与の蛍光画像から自己蛍光の影響を決定し除去する際に、関心特徴を表示する画像にとって最適でないか又はさらには実践的でない露光時間が用いられてもよい。例えば、試料物質の自己蛍光を測定する場合、望ましい信号対ノイズ比を得るための所与の蛍光チャネルの露光時間は、そのチャネルにおいて有効な蛍光マーカで染色された後、試料の画像に通常は最適である時間より長い必要がある可能性がある。染色剤が向けられる特徴の多数を含むために試料が染色剤のかなりの量を吸収した場合、自己蛍光を決定するための最適露光時間より、染色画像の最適露光時間が大幅に短い可能性がある。また、画素が暴露される入射光量が飽和レベルをさらに超えて増大した場合、より長い露光時間で、試料画像の画素は、それ以上の信号を供給することができないように飽和状態になるであろう。カメラには、HamamatsuORCA-ER-12AG深冷デジタルカメラ型:C4742-80-12AG、浜松市、日本を使用した。その暗電流は0.03電子/画素/秒であった。読出しノイズは6RMS電子/画素である。撮像装置は、20×PlanApochromat対物レンズNA=0.8を備えたZ1正立顕微鏡CarlZeissMicroImagingInc.Thornwood、NJであった。DAPIフィルタセット励起365/40nm及び発光445/50nm、Cy3フィルタキューブ励起550/25nm及び発光605/70nm、及びCy5フィルタキューブ励起640/30nm及び発光690/50nmを使用してグレースケール画像を取得した。アナログ利得、デジタル利得、アナログオフセット、及びデジタルオフセットを全てゼロに設定した。試料を用意するために、パラフィン包埋LNCaP細胞IHC制御SignalSlide商標8101をCellSignalingTechnologyBeverly、MAから入手した。乳癌スライドをThermoFishScientificFremont、CAから入手した。正常皮膚スライドをBiochainHayward、CAから入手した。標準的な脱ろう及び抗原回復処理の後に、LNCaP細胞をウサギモノクローナルグリコーゲン合成酵素キナーゼ-3GSK-3抗体1:50、CatCS9315、CellSignalingTechnologyと共に、4°Cで一晩インキュベートした。Cy3JacksonImmunoResarch、WestGrove、PAと共役するロバ抗ウサギ二次抗体を、室温で1時間インキュベートした1:250。乳癌スライド及び皮膚組織スライドをALCAM抗体で染色した1:40、製品番号:NCL-CD116、LeicaMicrosystem、Bannockburn、IL。Cy3及びCy5二次抗体と共役するロバ抗マウス抗体を乳癌スライド及び皮膚組織スライドそれぞれに使用した。全スライドを、最終的にDAPIで対比染色し、VectaShieldH1000、VectorLaboratory、Burlingame、CAを取り付けた。暗画素強度を決定するために、反射体を閉じたままにして、カメラに進入する光を遮断した。異なる露光時間1、50、100、250、500ミリ秒を用いて、3つ組の画像サンプルなしを取得した。画像をZVIフォーマットで保存して、取得設定及びTIF強度生値を維持した。その後、各画像をImageJBioFormatImporterで読み出し、ImageJNationalInstituteofHealth、バージョン1.42dを使用して各画像の平均強度を測定した。各画素において異なる露光時間で得られた2つの画像の画素強度を相関させるために、SignalSlideを使用して、200ミリ秒及び500ミリ秒で2つの画像をキャプチャした。該画像をTIFFフォーマットにエクスポートし、その後、MATLAB画像処理ツールボックスMathWork、Natick、MAにより読み出した。画素強度を、1344×1024の寸法を有する2つのマトリクスに格納した。対応する位置の画素強度を比較するために、2Dマトリクスを1Dマトリクス13756256×1に再形成した。MATLAB統計ツールボックスを使用して、2つの1Dマトリクス間で線形回帰を実施した。関心領域ROIレベルでの画素強度と露光時間との間の関係を調査するために、膜タンパク質であるALCAMで染色された正常皮膚スライド及び乳癌スライドを使用した。これらのスライドを、光を用いず、光を用い且つ1、2、4、8、16、32、64、96、128、160、200、250、300、350、400、450、500、550、600ミリ秒の露光時間で撮像した。各露光時間につき2つの画像を得た。バックグラウンド領域組織なしを、ImageJの描画機能を使用して手動で選択した。DAPIバックグラウンド及びCy3バックグラウンドを、ROIマネージャ機能を使用し且つバックグラウンド領域のみを選択して定量化した。16ミリ秒最適露光時間で露光されたDAPIチャネル画像に閾値処理してDAPI陽性領域を識別し、核マスクを画定するのに使用した。このマスクを全画像に適用し、DAPI信号をマスク領域の範囲内のみで定量化した。Cy3信号及びCy5信号を、同様の技法を用いて膜領域上で定量化した。蛍光強度を較正するために、標準的な蛍光ビーズF36909、Invitrogen、Carlsbad、CAを蛍光強度基準として使用した。ビーズの強度を0.00667、0.03、0.1、0.33、及び1としている。ビーズを、最初に、75ミリ秒の一定露光時間で撮像した。次に、これらのビーズに異なる露光時間を用いた。具体的には、強度0.00667のビーズに300ミリ秒及び150ミリ秒を、0.03及び0.1のビーズに150ミリ秒及び75ミリ秒を、0.33のビーズに75ミリ秒及び30ミリ秒を、1のビーズに30ミリ秒を用いた。表1は、カメラへの発光なしで露光時間に応答した、平均画素強度の変化を示す。露光時間での平均強度に若干の上昇がある。平均は約200であり、それは、12ビットカメラのダイナミックレンジの5を消費する。露光時間に比例する暗ノイズの寄与を一定の読出しノイズの寄与と分離するために、線形回帰を得た。ノイズは計測システムにおいてポアソン分布を示すので、標準偏差が平均の平方根である場合、CCDカメラ上で観察された信号は次の式で与えられる。無光条件下で、DarkSignalは次の式で与えられる。DarkSignalは、電子/画素の単位で得られる。この信号は、A/D変換され、最終的にPixelIntensityにデジタル化される。図1は、Hamamatsuのカメラを使用する、暗画素強度とノイズRMSとの間の相関の例を示す。個々の画素レベルでの画素強度への露光時間の影響を決定するために、この例では、SignalIntensityは、式6と同様の式に従う。式7を並べ替えると、以下の式が得られる。この式は、単一画素レベル、ROIレベル、及びその画像レベルで使用することができる。図2は、200ミリ秒A及び500ミリ秒Bで暴露された2つの画像からの対応する位置の画素強度を示す。回帰分析は、以下の線形関係を示唆する。回帰線からの誤差分散が172であり、それは画素強度のダイナミックレンジに亘って一様である。勾配2.5は露光時間の比率この場合は2.5であった。R2=0.976である。この回帰の切片301は、199の切片とは異なると思われる。しかし、式10の単純な変換により、暗画素強度が前に得られたものと全く同じであることが明らかになる。重要なことに、無光条件下で決定される通り、回帰切片200.9は199.12の暗画素強度に非常に近い。定量的蛍光顕微鏡における一般的な役割の1つが、核領域又は細胞質領域などの異なるROIでの染色強度を測定することである。ImageJを使用して、全体画像をバックグラウンド組織/セルなし、核領域、及び膜領域にセグメント化し、露光時間に対する各信号をプロットした図3。露光時間と異なるROIにおける且つ異なるチャネルDAPI,Cy3,及びCy5を使用する強度との間に、明らかな線形関係がある。これら全ての線に関する切片/暗画素強度が、前に測定した199と実質的に同じで、199.9から202.6までの間で変化する。また、図の底部に、0露光時間での暗画像の平均画素強度が示されている。各線の勾配は、G[PBQeD]であり、正規化信号強度を示す。バックグラウンド領域において、勾配は、G[BQeD]になる。染色強度がGPQetである。それは、信号とバックグラウンド暗画素強度なしとの間の差により計算されるべきである。信号強度及びバックグラウンド強度の両方が同じ暗画素強度を含むので、それらは相殺される。正規化染色強度を簡単にと定義することができる。式12を立証するために、異なる露光時間を用いて、基準蛍光強度ビーズの画像をキャプチャした。単一の露光時間が最適条件でこれらビーズの全てをキャプチャすることができない結果として、これらビーズの強度はほとんど150倍変化する。本方法の例の1つ以上では、暗画素強度が、カメラオフセット、及び画像における信号強度への付加である。それは、読出しノイズ、アナログ利得、デジタル利得、アナログオフセット、デジタルオフセット、及び他の設定の1つ以上により決定されてもよい。エンドユーザの観点から、カメラ取得設定が露光時間を除いて定められている限り、暗画素強度は一定である。暗画素強度は、無光及びゼロ最少露光時間の条件下で画像を取得することにより、続いて画像の平均強度を計算することにより、決定されてもよい。非限定的例として、200の暗画素強度が、2000の平均強度を有する正常蛍光画像の10以上寄与する可能性がある。設定の暗画素強度を予め定めることにより、1つの露光時間で取得される画像が、例えば式9を用いて、別のものにスケーリングされてもよい。暗画素強度及びバックグラウンド強度又は最低画素強度は区別できる。例えば、バックグラウンド強度は、G[BQeD]tDarkPixelIntensityにより決定されてもよい。結果として、バックグラウンド強度は、通常、暗画素強度より高く、露光時間で上昇する。バイオマーカの染色が弱く且つより長い露光時間が必要である場合、バックグラウンド強度は、例えば1000~3000の高さである可能性がある。対照的に、暗画素強度は、カメラ取得設定が露光時間を除いて定められている限り、一定例えば、200である。バイオマーカの染色強度が、画像の範囲内の信号強度とバックグラウンド強度との間の差である。バックグラウンド強度のサブトラクションにより、ガラススライドからの散乱光、暗電流、及び暗画素強度による寄与が除去される。しかし、バイオマーカの染色強度は、依然として自己蛍光で汚染されている可能性がある。式12を用いて、所与のバイオマーカの染色強度を比較してもよい。また、温度が暗画素強度に影響を及ぼす。温度が上昇すると電子がずっと移動しやすくなり、したがって、暗電流及び読出しノイズはどちらも温度の関数である。実施例では、環境温度が-5°Cから40°Cの範囲内である限り、カメラの温度を-30°Cに調節した。この冷却温度は、一般にデジタルカメラに関連している。低温が低暗電流及び低読出しノイズに寄与する。暗画素強度に対するオフセットを設定することが有益である。したがって、この値は、最終画素強度からサブトラクションされ、画素強度は露光時間に比例する。オフセットを用いる1つの利点は、画素強度のダイナミックレンジを増大させることである。しかし、最大の利益を達成するために、オフセットは暗画素強度と同一であるべきである。本発明のある特徴のみを本明細書に例示し記載したが、多くの修正及び変更が当業者に思い付くであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内に入るそのような修正及び変更全てを包含することを意図としていることは言うまでもない。"