"式I、式IR1は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R2は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R3は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R4は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C38シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R5は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R6は、O、NR14、S、S=O、S=O2、S=O2NR15、CR16R17、C=O、C=Sまたは直接結合であり;R7は、O、S、NR18、CR19R20またはR8と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R8は、O、S、NR18、CR19R20またはR7と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R9は、O、S、NR18、CR19R20またはR10と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R10は、O、S、NR18、CR19R20またはR9と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R11は、H、C38シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC15アルキルであり;R12は、H、C38シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R13は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R14は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R15は、HまたはC1~8アルキルであり;R16は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R17は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R18は、H、ハロゲンC3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;R19は、H、ハロゲン、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;R20は、H、ハロゲン、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;aは、0、1、2または3であり;ならびにbは、0、1、2または3である、で表される化合物、その個々の鏡像異性体、個々のジアステレオ異性体、個々の水和物、個々の溶媒和物、個々の結晶形および個々の異性体、個々の互変異性体またはそれらの医薬上許容される塩。式中、請求項1による化合物。式中、R1は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R2は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R3は、-OC1~3アルキルであり;R4は、H、ハロゲン、C1~8アルキルまたはCNであり;R5は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R6は、CR16R17であり;R7は、CR19R20またはR8と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R8は、CR19R20またはR7と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R9は、CR19R20またはR10と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R10は、CR19R20またはR9と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R11は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R12は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R13は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R16は、Hであり;R17は、Hであり;R19は、Hであり;R20は、Hであり;aは、0、1、2または3であり;ならびにbは、0、1、2または3である、請求項1による化合物。式中、R1は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R3は、-OC1~3アルキルであり;R4は、H、ハロゲン、-C1~8アルキルまたはCNであり;R6は、CR16R17であり;R7は、CR19R20またはR8と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R8は、CR19R20またはR7と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R9は、CR19R20またはR10と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R10は、CR19R20またはR9と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R16は、Hであり;R17は、Hであり;R19は、Hであり;R20は、Hであり;aは、0であり;ならびにbは0である、請求項3による化合物。式中、R1は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R3は、-OC1~3アルキルであり;R4は、H、ハロゲン、C1~8アルキルまたはCNであり;R6は、CR16R17であり;R7は、CR19R20であり;R8は、CR19R20であり;R9は、CR19R20であり;R10は、CR19R20であり;R16は、Hであり;R17は、Hであり;R19は、Hであり;R20は、Hであり;aは、0であり;ならびにbは0である、請求項4による化合物。式中、R3は、-Oイソプロピルである、請求項5による化合物。式中、R1は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R3は、-OC1~3アルキルであり;R4は、H、ハロゲン、-C1~8アルキルまたはCNであり;R6は、CR16R17であり;R7はR8と一緒になってHC=CH二重結合を形成し;R10はR9と一緒になってHC=N二重結合を形成し;R16は、Hであり;R17は、Hであり;aは、0であり;ならびにbは0である、請求項4による化合物。式中、R3は、-Oイソプロピルである、請求項7による化合物。式中、R1は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R3は、-OC1~3アルキルであり;R4は、H、ハロゲン、-C1~8アルキルまたはCNであり;R6は、CR16R17であり;R7はR8と一緒になってHC=N二重結合を形成し;R9はR10と一緒になってHC=CH二重結合を形成し;R16は、Hであり;R17は、Hであり;aは、0であり;ならびにbは0である、請求項4による化合物。式中、R3は、-Oイソプロピルである、請求項9による化合物。以下:5-{[4-1H-イミダゾール-1-イルメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;5-{[4-1H-イミダゾール-1-イルメチル-2-メチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;1-[4-3-クロロ-4-イソプロポキシ-フェニルエチニル-ベンジル]-1H-イミダゾール;2-イソプロポキシ-5-{[4-ピロリジン-1-イルメチルフェニル]エチニル}ベンゾニトリル;5-{[2-クロロ-4-1H-イミダゾール-1-イルメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;1-{4-[3-ブロモ-4-イソプロポキシフェニルエチニル]ベンジル}-1H-イミダゾール;1-[4-3-メチル-4-イソプロポキシ-フェニルエチニル-ベンジル]-1H-イミダゾールから選択される、請求項1による化合物。活性成分としての治療有効量の請求項1による化合物および医薬上許容されるアジュバント、希釈液または担体を含む医薬組成物。前記化合物が以下:5-{[4-1H-イミダゾール-1-イルメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;5-{[4-1H-イミダゾール-1-イルメチル-2-メチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;1-[4-3-クロロ-4-イソプロポキシ-フェニルエチニル-ベンジル]-1H-イミダゾール;2-イソプロポキシ-5-{[4-ピロリジン-1-イルメチルフェニル]エチニル}ベンゾニトリル;5-{[2-クロロ-4-1H-イミダゾール-1-イルメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル;1-{4-[3-ブロモ-4-イソプロポキシフェニルエチニル]ベンジル}-1H-イミダゾール;1-[4-3-メチル-4-イソプロポキシ-フェニルエチニル-ベンジル]-1H-イミダゾールから選択される、請求項12による医薬組成物。治療有効量の式I式IR1は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R2は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R3は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R4は、H、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R5は、同じであるかまたは独立して、ハロゲン、-OC1~3アルキル、C1~8アルキル、CN、COR11、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、NR12R13またはヒドロキシルであり;R6は、O、NR14、S、S=O、S=O2、S=O2NR15、CR16R17、C=O、C=Sまたは直接結合であり;R7は、O、S、NR18、CR19R20またはR8と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R8は、O、S、NR18、CR19R20またはR7と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R9は、O、S、NR18、CR19R20またはR10と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R10は、O、S、NR18、CR19R20またはR9と一緒になってHC=CH二重結合またはHC=N二重結合またはN=CH二重結合形態であり;R11は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R12は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R13は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R14は、H、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環、またはC1~5アルキルであり;R15は、HまたはC1~8アルキルであり;R16は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R17は、H、ハロゲンまたはC1~8アルキルであり;R18は、H、ハロゲンC3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;R19は、H、ハロゲン、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;R20は、H、ハロゲン、C3~8シクロアルキル、C3~10シクロアルケニル、C6~10アリール、複素環またはC1~8アルキルであり;aは、0、1、2または3であり;ならびにbは、0、1、2または3である、で表される化合物を少なくとも1つ含む医薬組成物を、それを必要としている哺乳類に投与することを含む、スフィンゴシン-1-ホスフェートS1P受容体調節に関連した障害の治療方法。前記医薬組成物を、眼疾患、乾湿加齢性黄斑変性症、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜浮腫、地域的萎縮、緑内障視神経症、絨毛網膜症、高血圧性網膜症、眼虚血症候群、眼底の炎症誘発性線維症の予防、様々な眼炎症性疾患ブドウ膜炎、強膜炎、角膜炎、および網膜脈管炎等;全身性血液関門関連疾患:様々な炎症性疾患急性肺損傷等、その予防、敗血症、腫瘍転移、アテローム性動脈硬化、肺水腫、および人工呼吸誘発性肺損傷;自己免疫疾患および免疫抑制:関節リウマチ、クローン病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、潰瘍性大腸炎、自己免疫ブドウ膜炎、腎虚血/血流欠損、接触過敏症、アトピー性皮膚炎、および臓器移植;アレルギーおよび他の炎症性疾患:蕁麻疹、気管支喘息、および他の気管支炎肺気腫および慢性閉塞性肺疾患等;心機能:徐脈、鬱血性心不全、心不整脈、アテローム性動脈硬化の予防および治療、ならびに虚血性/再潅流傷害;創傷治癒:美容整形皮膚手術、眼内手術、胃腸手術、一般的手術、口腔損傷、様々な機械的、熱および火傷後の瘢痕を伴わない創傷治癒、光による加齢および皮膚加齢の予防および治療、ならびに放射線誘発性損傷の予防;骨形成:骨粗鬆症ならびに腰部および足関節を含む様々な骨折の治療;抗侵害活性:内臓痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、関節リウマチ、慢性膝および関節痛、腱炎、骨関節炎、神経痛;抗線維形成:眼内、心臓、肝臓および肺線維症、増殖性硝子体網膜症、瘢痕性類天疱瘡、角膜、結膜およびテノン嚢中の外科的誘発性線維症;疼痛および抗炎症:急性痛、慢性痛の突発、筋骨格痛、内臓痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、関節リウマチ、慢性膝および関節痛、腱炎、骨関節炎、滑液包炎、神経痛;CNSニューロン損傷:アルツハイマー病、加齢性ニューロン損傷;臓器移植:腎臓、角膜、心臓および脂肪組織移植を治療するために哺乳類に投与する、請求項14に記載の方法。前述の一般的詳細および後述の発明を実施するための形態は両方とも、例示および説明のためのみであり、請求した本発明を限定しないことが理解されるべきである。本明細書で使用する単数形の使用は、別段に具体的に記されていない限り、複数形を含む。本発明の一部の化合物は、化合物が鏡像異性体ならびにジアステレオ異性体形態で存在し得るように1つまたは複数の不斉中心を含み得ることが当業者に容易に明らかであろう。別段に具体的に記されていない限り、本発明の範囲は、すべての鏡像異性体、ジアステレオ異性体およびラセミ混合物を含む。本発明の一部の化合物は、医薬上許容される酸または塩基と塩を形成し得、本明細書に記載の化合物のかかる医薬上許容される塩もまた本発明の範囲内である。本発明は、すべての医薬上許容される同位体濃縮化合物を含む。本発明の化合物はいずれも、1つまたは複数の濃縮された同位体原子を含んでもよく、プロチウム1HまたはHの代わりに重水素2HまたはD、または12Cの代わりに13C濃縮物質を使用する等のように天然比と異なってもよい。類似の置換をN、OおよびSにおいて使用することができる。同位体の使用は、本発明の分析的ならびに治療的態様において役立ち得る。例えば、重水素を使用することにより、本発明の化合物の代謝率が改変されてインビボ半減期が上昇し得る。これらの化合物は、同位体濃縮試薬を使用することにより記載されている調製によって調製することができる。以下の実施例は、例証目的のみであり、いかなる形でも本発明を限定することを意図するものでもなく、限定するものと解釈すべきでもない。以下の実施例は、本発明の真意または範囲を逸脱せずに変形および改変できることを当業者は理解するであろう。当業者に明らかとなるように、個々の異性体形態は、それらの混合物を従来の様式で分離することによって得ることができる。例えば、ジアステレオ異性体の場合、クロマトグラフ分離を適用し得る。実施例に記載した化合物のIUPAC名はACD第8版および中間体を用いて収集し、実施例に使用した試薬名はソフトウェアChemBioDrawUltraversion12.0またはAutoNom2000fromMDLISISDraw2.5SP1等を用いて収集した。実施例において特に示されていない限り、化合物の特性化は、300または600MHzVarian上で記録して室温で得るNMRスペクトルで実施する。化学シフトを、内部トリメチルシリルまたは残留溶媒シグナルのいずれかを参照してppmで表す。合成法について記載していない試薬、溶媒、触媒はすべて、化学薬品製造供給元SigmaAldrich、Fluka、Bio-Blocks、RyanScientific、SynChem、Chem-Impex、AcesPharma等から購入したが、一部の既知の中間体は既知の手順に従って社内で調製してCAS登録番号[CAS]を記載した。概して本発明の化合物は、別段の報告のない限り、メタノール/ジクロロメタン勾配溶媒系を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。中間体15-エチニル-2-イソプロポキシベンゾニトリル5-ブロモ-2-イソプロポキシベンゾニトリル1.0g、4.16mmolのテトラヒドロフラン溶液をヨウ化銅I0.158g、0.83mmolで処理してから、アルゴンで5分間浄化した。次いで、トリメチルシリルアセチレン2.85g、29.16mmol、続いてジクロロビス-トリフェニルホスフィンパラジウムII0.291g、0.41mmolを添加した。生成した混合物を80°Cで密封管内で一晩加熱した。混合物を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーによる精製によって、2-イソプロポキシ-5-トリメチルシリルエチニルベンゾニトリルを得て、これを次工程に取り上げた。2-イソプロポキシ-5-トリメチルシリルエチニルベンゾニトリル1.0g、3.8mmolのメタノール溶液20mLを炭酸カリウム1.07g、7.7mmolで室温で一晩処理した。反応物を濾過して、濾液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をヘキサン:酢酸エチルを用いたカラム上で精製MPLCして、中間体1を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.94s、1H、7.66d、J=8.7Hz、1H、7.61d、J=8.7Hz、1H、4.62~4.70m、1H、1.42s、3H、1.41s、3H。中間体25-{[4-ヒドロキシメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル中間体1300mg、1.8mmolのTHF溶液をヨウ化銅I6mg、0.03mmolで処理してから、アルゴンで5分間浄化した。次いで、4-ヨードフェニルメタノール413mg、1.8mmol、続いてジクロロビス-トリフェニルホスフィンパラジウムII11mg、0.016mmolを添加した。生成した混合物を80°Cで一晩加熱した。反応物を濾過して、濾液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をヘキサン:酢酸エチルを用いたカラム上の精製中圧液体クロマトグラフィーによって、中間体2を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.66s、1H、7.51d、J=8.1Hz、2H、7.34d、J=8.1Hz、2H、7.21s、1H、6.74d、J=8.7Hz、1H、4.75s、2H、4.60~4.75m、1H、1.42s、3H、1.40s、3H。中間体35-{[4-クロロメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル中間体2400mg、1.37mmolのCH2Cl2溶液を塩化チオニル240mg、2.06mmolで処理して、反応物を80°Cで1時間加熱した。反応混合物を室温で冷却した。溶媒を蒸発させ、残渣をエーテルで数回洗浄して、中間体3を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.86s、1H、7.60d、J=8.7Hz、2H、7.64d、J=8.7Hz、2H、7.33s、1H、6.54d、J=8.7Hz、1H、4.58s、2H、4.62~4.75m、1H、1.43s、3H、1.40s、3H。中間体44-4-イソプロポキシ-3-メチルフェニルエチニルフェニルメタノール4-エチニルフェニルメタノールCAS10602-04-7250mg、1.9mmolのTHF溶液をヨウ化銅I7.2mg、0.04mmolで処理してから、アルゴンで5分間浄化した。次いで、4-ヨード-1-イソプロポキシ-2-メチルベンゼンCAS877603-52-6579mg、2.0mmol、続いてジクロロビス-トリフェニルホスフィンパラジウムII13.4mg、0.019mmolを添加した。生成した混合物を80°Cで一晩加熱した。反応混合物を濾過して、濾液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をヘキサン:酢酸エチルを用いたカラム上で精製MPLCして、中間体4450mg、76収率を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.62s、1H、7.51d、J=8.1Hz、2H、7.41d、J=8.1Hz、2H、7.18~7.24m、1H、6.840d、J=9.6Hz、1H、5.39s、2H、4.54~4.60m、1H、2.12s、3H、1.31s、3H、1.27s、3H。中間体52-ブロモ-4-ヨード-1-イソプロポキシベンゼン2-ブロモ-4-ヨードフェノール2.0g、6.71mmolのDMF溶液40mLに、K2CO30.925g、6.71mmol、続いて2-ヨードプロパン1.36g、8.05mmolを室温で添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。溶液を濾過して、濾液を蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をヘキサン:酢酸エチルを用いたカラム上で精製MPLCして、中間体51.96g、96を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.45d、J=12.2Hz、1H、7.28d、J=8.5Hz、1H、6.82d、J=9.0Hz、1H、4.21~4.34m、1H、1.36s、3H、1.40s、3H。化合物15-{[4-1H-イミダゾール-1-イルメチルフェニル]エチニル}-2-イソプロポキシベンゾニトリル中間体3105mg、0.33mmol、イミダゾール22mg、0.33mgおよびK2CO3140mg、1.01mmolを還流でCH3CN溶液で一晩撹拌した。溶液を室温に冷却してから、CH2Cl2で希釈して、水で洗浄した。有機相をブライン60mLで洗浄し、乾燥させMgSO4上、濾過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製2MeOHのCH2Cl2溶液によって、化合物1を得た。1H-NMRCDCl3、300MHzδ=7.75s、1H、7.74s、1H、7.72d、J=8.7Hz、1H、7.51d、J=7.8Hz、2H、7.25d、J=8.1Hz、2H、7.20d、J=8.7Hz、1H、7.11s、1H、6.99s、1H、5.24s、2H、4.76~4.84m、1H、1.39s、3H、1.38s、3H。化合物1における実施例6の手順によって、相当する中間体から開始して、化合物2~7を調製した。出発物質、中間体、および結果を下表1にまとめる。生物学的データGTPγ35S結合アッセイを用いて、新規化合物を合成し、S1P1活性を試験した。S1P1受容体を安定的に発現する細胞中のヒトS1P1受容体を活性化または活性ブロックするこれらの化合物能を評価し得る。GTPγ35S結合を、mMHEPES25、pH7.4、MgCl210、NaCl100、ジチオスレイトール0.5、ジギトニン0.003、0.2nMGTPγ35S、および5μg膜タンパク質を含む溶剤150μl容量中で測定した。別段に示されていない限り、試験化合物の濃度は0.08~5,000nM範囲に収まった。100μM5’-アデニリルイミド二リン酸で膜を30分間、続いて、10μMGDPで氷上で10分間インキュベートした。薬液と膜を混合してから、GTPγ35Sを添加することによって反応を開始し、25°Cで30分間継続した。反応混合物をWhatmanGF/Bフィルターで真空濾過し、3mL氷冷緩衝液HEPES25、pH7.4、MgCl210およびNaCl100で3回洗浄した。フィルターを乾燥させ、シンチラントと混合して、βカウンターを用いて35S活性を計測した。アゴニスト誘発性GTPγ35S結合は、アゴニスト不在下の結合を差し引くことによって得た。非線形回帰方法を用いて結合データを分析した。結果を表2に提示する。アンタゴニストアッセイの場合、反応混合物には、0.08~5000nM範囲の濃度の試験アンタゴニスト存在下で、10nMS1Pが含まれた。活性効能:GTPγ35S由来のS1P1受容体:nM、EC50、刺激"