"プロモーター配列、コード配列および終結シグナルを含む線状の開鎖されたDNA二本鎖であり、少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのDNA構築物。少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドが、5’および/または3’末端の最後の5つのヌクレオチド内に含まれる、請求項1に記載の構築物。DNA構築物の少なくとも1つの末端が一本鎖ループを含む、請求項1または2に記載の構築物。部分的にまたは完全に二本鎖である、請求項1から3のいずれかに記載の構築物。少なくとも1つのL-またはD-DNAヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されている、請求項1から4のいずれかに記載の構築物。修飾されたヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイル、金属粒子、ナノ粒子、脂質、または固相からなる群から選択される化合物に連結されている、請求項5に記載の構築物。プロモーターが、人間、動物または真核生物細胞において作動可能であるプロモーター配列からなる群から選択される、請求項1から6のいずれかに記載の構築物。タンパク質、ペプチド、抗体、ホルモン、サイトカインまたは他の生物学的活性物質をコードする、請求項1から7の少なくとも一項に記載の構築物。生物学的活性物質が免疫調節物質である、請求項8に記載の構築物。請求項1から9のいずれかに記載のDNA構築物を含む医薬組成物。化学療法薬をさらに含む、請求項14に記載の医薬組成物。ヒト、動物または真核生物細胞の安定なまたは一過性のトランスフェクションのための、請求項1から9のいずれかに記載のDNA構築物、または請求項10もしくは11に記載の医薬組成物の使用。生体外遺伝子治療またはDNAワクチン接種のための、請求項1から9のいずれかに記載のDNA構築物、または請求項10もしくは11に記載の医薬組成物の使用。癌または自己免疫疾患の治療のための、請求項1から9のいずれかに記載のDNA構築物、または請求項10もしくは11に記載の医薬組成物の使用。非コード免疫調節性DNA構築物と併用される、請求項1から9のいずれかに記載のDNA構築物、または請求項10もしくは11に記載の医薬組成物の使用。技術水準に関して、ヌクレアーゼによる分解に対して保護される、真核生物細胞における遺伝子発現のための効果的なDNA構築物を提供することが本発明の目的である。本開示によれば、プロモーター配列、コード配列および終結シグナルを含む線状の開鎖されたDNA二本鎖であり、少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドを含む、遺伝子発現のためのDNA構築物が提供される。少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドを含む、線状の部分的に二本鎖のダンベル型DNA構築物も、本開示の範囲内である。少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドが5’および/または3’末端に位置するDNA構築物がさらに提供される。一本鎖ループも、5’および/または3’末端の最後の2~5つのヌクレオチド内に位置する少なくとも1つのL-DNAヌクレオチドと組み合わせて、5’および/または3’末端に位置することができる。本開示による構築物は、部分的にまたは完全に二本鎖のDNA鎖を含むことができる。少なくとも1つのL-またはD-DNAヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基からなる群から選択される官能基で修飾されていることがさらに意図される。該ヌクレオチドは、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ベシクル、抗体、合成分子、ポリマー、マイクロプロジェクタイルmicroprojectile、金属粒子、ナノ粒子、または固相からなる群から選択される化合物に連結することができる。本開示による構築物は、人間、動物または真核生物細胞において作動可能であるプロモーター配列からなる群から選択されるプロモーターを含むことが意図される。構築物は、タンパク質、ペプチド、抗体、ホルモン、サイトカイン、あるいは抑制性、制御性、もしくは刺激性RNAまたは免疫調節物質などの他の生物学的活性物質をコードすることができる。本開示のさらなる目的は、ヒト、動物または真核生物細胞の安定なまたは一過性のトランスフェクションのための、および遺伝子治療またはDNAワクチン接種のための上記DNA構築物の使用である。用語遺伝子治療には、生体内または生体外、および自家または同種異系アプローチが含まれる。本開示のさらなる目的は、感染症または寄生虫に対する予防的または治療的ワクチン接種のための上記DNA構築物の使用である。本開示によるDNA構築物は、場合により非コード免疫調節性DNA構築物の使用と併用して、癌または自己免疫疾患の治療に使用することができる。上に開示されたDNA構築物を含む医薬組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。このような医薬品は、化学療法薬をさらに含んでもよい。あるいは、該医薬品は、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス起源の追加の抗原を含有してもよい。本開示の意味において、線状開鎖DNA配列がDNA構築物として指定される。前記DNA配列は、一本鎖または部分的にもしくは完全に二本鎖であってもよい。用語DNA構築物、DNA分子、および発現構築物は同義的に使用され、対応するDNA配列の長さの限定を示すものではない。DNA構築物の単量体成分はヌクレオチドである。DNA構築物は、合成的に作製されてもよく、または部分的にもしくは完全に生物学的起源であってもよく、生物学的起源には、DNA配列の作製の遺伝子ベースの方法が含まれる。L-DNAまたはL-立体配座にあるヌクレオチドは、自然発生のD-デオキシリボースの代わりに、糖残基としてL-デオキシリボースを含むヌクレオチドを指す。L-デオキシリボースは、D-デオキシリボースの光学異性体鏡像である。L-立体配座にあるヌクレオチドから部分的にまたは完全に成るDNA構築物は、部分的にまたは完全に一本鎖または二本鎖であってもよいが、L-立体配座にあるヌクレオチドは、D-立体配座にあるヌクレオチドにハイブリダイズすることができないHauserら、NucleicAcidRes.200634:5101~11頁。L-DNAは、D-DNAと同様に可溶性であり選択的である。しかし、L-DNAは、自然発生の酵素、特にエキソヌクレアーゼによる酵素分解に対して抵抗性であり、そのためL-DNAは生物分解に対して保護されるUrataら、NucleicAcidsRes.199220:3325~32頁。したがって、L-DNAは極めて広く適用可能である。本開示によるステムは、同一DNA分子この後、部分的に自己相補的となるまたは異なるDNA分子部分的にまたは完全に相補的である内のどちらかの塩基対合により形成されるDNA二本鎖と理解されるものとする。分子内intramolecular塩基対合は、同一DNA分子内の塩基対合を指定し、異なるDNA分子間の塩基対合は、分子間intermolecular塩基対合と呼ばれる。本開示の意味においてループは、ステム構造内またはステム構造の末端のどちらかの、不対合一本鎖領域と理解されるものとする。ヘアピンは、ステムおよびループの特徴的な組み合わせであり、同一オリゴヌクレオチドの2つの自己相補的領域がハイブリダイズして不対合ループを有するステムを末端に形成する場合に生じる。ダンベル型は、ステム領域に隣接する両方の末端にヘアピンを有する線状DNA構築物を示す。故に、本開示の関連において線状DNA構築物は、一本鎖もしくは二本鎖DNAを含む線状開鎖DNA構築物、または二本鎖DNAステムの両方の末端の一本鎖ループを含む線状ダンベル型DNA構築物のどちらかを示す。DNA一本鎖の5’末端または3’末端を意味するかにかかわらず、用語DNA末端は、末端ヌクレオチドを指すだけでなく、末端の3つのヌクレオチド、またはさらには、それぞれのDNA末端に関して最後の5つのヌクレオチドも含む。DNA末端の修飾は、それぞれのヌクレオチドの少なくとも1つに関する。ヌクレオチドが、共有結合または非共有結合される固相は、カラム、マトリックス、ビーズ、修飾ガラスまたは官能化ガラスを含むガラス、シリコンおよび修飾シリコンを含むシリカまたはシリカベースの材料、プラスチックポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタン等を含む、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、多糖類、炭素ならびに無機ガラス、およびプラスチックを指すが、これらに限定されない。故に、マイクロタイタープレートも、本開示による固相の範囲内である。本開示による免疫調節は、免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激は、免疫系のエフェクター細胞が増殖、移動、分化するまたはいずれか他の形態で活性になるように刺激されることを優先的に意味する。例えば、通常はヘルパーT細胞からの共刺激シグナルを必要とするB細胞増殖は、免疫刺激性DNA分子により共刺激シグナルなしで誘導され得る。一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または有効性の減少と理解されるものとする。免疫抑制は一般に、例えば移植された臓器の拒絶を予防するため、骨髄移植後の移植片対宿主病を治療するため、または例えば、関節リウマチもしくはクローン病などの自己免疫疾患の治療のために意図的に誘導される。この関連において、免疫調節はまた、まだ発達中または成熟中の免疫反応に影響を与えること、または確立された免疫反応の特徴を調節することによる、免疫反応の性質または特徴の影響も指す。本開示において使用される用語ワクチン接種は、疾患に対する免疫を生じさせるための抗原物質ワクチンの投与を指す。ワクチンは、ウイルス、真菌、寄生原虫、細菌などの多くの病原体による感染の影響を予防または改善することができるが、アレルギー性疾患および喘息、ならびに腫瘍の影響も予防または改善することができる。ワクチンは、典型的には、免疫応答をブーストするのに使用される1つまたは複数のアジュバント、例えば免疫刺激性核酸を含有する。ワクチン接種は、感染症および他の疾患を予防する最も有効なおよび最も費用効果の高い方法であると一般に考えられている。投与される物質、例えば、病原体例えば、真菌、細菌またはウイルスの生きているが弱毒化された形態、これらの病原体の死滅または不活化形態、精製物質抗原をコードするタンパク質、核酸など、または腫瘍細胞もしくは樹状細胞などの細胞であってもよい。特に、DNAワクチン接種は最近開発された。DNAワクチン接種は、抗原をコードするDNAの、ヒトまたは動物細胞への挿入および発現、免疫系認識の誘発により効き目がある。発現されたタンパク質を認識する免疫系の幾つかの細胞は、これらのタンパク質および該タンパク質を発現する細胞に対する攻撃を開始する。DNAワクチンの1つの利点は、これらが極めて製造および貯蔵しやすいことである。さらに、DNAワクチンは、より広範囲の免疫応答型を誘導する能力を含む、従来のワクチンに対する幾つかの利点を有する。ワクチン接種は、抗原に曝露した際、ワクチン接種された健康な個体において抗原に対する免疫をもたらす、予防的アプローチとして使用することができる。あるいは、治療的ワクチン接種は、個体の免疫系を抗原に導くことにより、ワクチン接種された罹患個体の免疫系の応答の改善をもたらすことができる。予防的および治療的ワクチン接種は両方とも、ヒトおよび動物に適用することができる。本開示において使用される用語遺伝子治療は、腫瘍または自己免疫疾患などの疾患を治療するための、個体の細胞および/または生物組織の一過的または永続的な遺伝的修飾例えば遺伝子の挿入、変更、または除去を指す。遺伝子治療の最も一般的な形態は、変異遺伝子を置換するための不特定な遺伝子位置への機能遺伝子の挿入を伴うが、他の形態は、変異の直接的修正、またはウイルス感染を可能にする正常遺伝子の修飾、またはさらには遺伝子もしくは遺伝子断片の、転写のための細胞への移入を伴う。自家遺伝子治療autologousgenetherapyは、同一個体の組織または細胞の使用を指す。単離された細胞または組織は、遺伝子治療により修飾され、ドナーに再導入される。対照的に、同種異系遺伝子治療allogenicgenetherapyは、受け入れ側acceptor個体以外の個体由来の遺伝子治療用細胞の使用を指す。遺伝的修飾後、同種異系細胞は受け入れ側に導入される。用語生体外遺伝子治療は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、生体外で遺伝子修飾され、この後、治療される個体に導入される治療アプローチを指す。用語生体内遺伝子治療は、個体由来の細胞、例えば造血幹細胞または造血前駆細胞が、例えばウイルスベクターまたは他の発現構築物を用いて、生体内で遺伝子修飾される治療アプローチを指す。遺伝子治療はまた、生殖細胞系遺伝子治療および体細胞系遺伝子治療に分類することもできる。生殖細胞系遺伝子治療の場合、生殖細胞、すなわち、精子または卵子が遺伝子修飾される。遺伝子変化は通常、それらのゲノムに組み込まれる。したがって、治療による変化は遺伝性となり、後の世代に受け継がれることになる。このアプローチは、遺伝的障害および遺伝性疾患の治療に有用である。体細胞系遺伝子治療の場合、治療的遺伝子は個体の体細胞系細胞に移入される。いずれの修飾および影響も個体のみに限定され、個体の子孫または後の世代に受け継がれない。用語癌は、癌性疾患、または乳癌、黒色腫、皮膚新生物、胃腸腫瘍結腸癌coloncarcinoma、胃癌、膵臓癌、結腸癌coloncancer、小腸癌を含む、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌および/もしくは肝転移を含む群から選択される治療または予防される腫瘍を含む。本開示による自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、全身性ループスSLE、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化、バセドウ病、重症筋無力症、セリアック病およびアジソン病を含む。本発明による感染症は、HIV、肝炎、インフルエンザ、リーシュマニア症、細菌性肺炎、結核、麻疹、百日咳、破傷風、髄膜炎、梅毒、マラリアおよびコレラなどの細菌、ウイルス、真菌、または真核生物寄生虫による感染、ならびにネコ免疫不全ウイルス感染FIV、ネコ白血病ウイルス感染FeLV、ウシヘルペスウイルス感染BHV、およびウシウイルス性下痢などの動物特異的疾患を含む。最小遺伝子発現ユニットを含む、L-DNAを含むデオキシリボ核酸構築物は、ヌクレアーゼにより分解されない遺伝子発現構築物をもたらす。実験データは、このような保護された遺伝子発現構築物が、目的とする細胞における効果的な遺伝子導入および発現に適切であることを示している。本開示による構築物のトランスフェクションにより達成され得る遺伝子発現率は、EP0941318に開示された共有結合閉鎖分子MIDGEベクターにより達成され得る率より高い。MIDGEベクターは、同等のプラスミドベクターSchakowskiら、invivo、21:17~24頁、2007より高いトランスフェクション効率および良好な発現率を達成することが示されている。EP0941318の一本鎖ループを避けることにより、本発明の分子はサイズがさらに減少され、これが遺伝子導入を促進する。L-DNA修飾により、安定性が与えられる。事実、生成プロセス中に非修飾DNAを除去するためのDNA分解酵素の使用は、この安定性を際立たせる。少なくとも1つのヘアピンが二本鎖の一方の末端に配置されている、L-DNAを含むDNA構築物を提供することも、本開示の範囲内であることは留意されなければならない。本開示によるDNA構築物は、目的とする細胞におけるコードされた遺伝子の人工的遺伝子発現に使用されてもよい。これに関して、DNAワクチン接種、腫瘍の治療および予防は、臨床プロトコルでの使用を可能にするために安全および効率的である発現構築物を必要とする。標準的発現構築物は、例えば、プラスミドベースのベクターである。しかし、これらのベクターは2つの欠点を有する。第一に、効率がやや低く、第二に、プラスミドベースのベクターは、所望のポリペプチドの発現に不必要な幾つかの遺伝子および遺伝的エレメントを含み、これにより予測不可能な免疫学的副作用の危険性を保有する。より長いおよび反復される適用により、所望の免疫応答は、起こり得る重篤な合併症によるこれらの副作用により覆い隠される可能性がある。技術水準の他の発現構築物には、複製欠損レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターが含まれる。これらは、多種多様な細胞タイプの非分裂細胞でさえ形質導入に使用することができるという点で極めて効率的であるが、野生型ウイルスとの組換えおよびこれによる新たな病原性ウイルスの生成、ならびに発癌遺伝子の活性化のリスクを有する。さらに、ウイルスタンパク質は、特に高力価では免疫学的副作用の原因になる可能性が極めて高い。本開示による発現構築物の最小発現ユニットは、MHC-IもしくはMHC-II提示可能ペプチド、サイトカイン、または細胞周期の制御の成分、または制御性RNA分子およびアンチセンスRNA、リボザイムまたはmRNA編集RNA分子をコードし得るが、これらに限定されない。さらに、本開示によるDNA構築物は、例えばペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、または糖ペプチドリガンドのほか、マイクロプロジェクタイル弾道導入により細胞、特に真皮、筋肉組織、膵臓、および肝臓への構築物の導入を可能にするへの構築物の吸着または共有結合もしくはイオン結合を可能にする。本開示は、開示された実施形態に限定されることなく例および図により以下にさらに例証される。DNA構築物の製造本開示によるDNA構築物の製造は、EP0941318のものと似ている。しかし、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、表1に要約されたいわゆるL-アダプターに置き換えられる。両方のアダプターは、それぞれ、個々のキメラDNA分子、配列番号1および配列番号2L-アダプター1または配列番号3および配列番号4L-アダプター2から成った表1。アダプターは、40mMTris-HCl、10mMMgC12、10mMDTT、0.5mMATP25°CでpH7.8において、90°Cから25°Cに徐々に低下する温度で、40分間、0.28mg/mlで等モル濃度の表1による一本鎖DNA分子をハイブリダイゼーションして生成した。EP0941318において合成された発現カセットに両方のアダプターをライゲーションした後、続いてT7ポリメラーゼによる線状D-DNAの除去、および生成物の最終HPLC精製を実施した。この構築物は2L-Mと称される。あるいは、L-アダプターの1つを、EP0941318に記載されているMIDGEベクターにおいて使用された対応するヘアピンに置き換えた。これは、プロモーターの片側にL-DNA保護、および反対側にヘアピンを有するDNA構築物をもたらした。これらの構築物は、それぞれ、DL-ML-アダプター1およびヘアピンおよびLD-ML-アダプター2およびヘアピンと称される。トランスフェクションDNA構築物を細胞に導入するために、異なるトランスフェクション方法、例えばリポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用することができる。リポフェクションは次のように行った:6×104CHO-K1細胞を3.8cm2組織培養マトリックスに播種し、24時間後にeGFP発現DNAの指示量を、FugeneHDRoche社と1:4を混合してトランスフェクトし、製造者により勧められたように処理した。トランスフェクション1日後、細胞をトリプシン処理により回収し、フローサイトメトリーにより蛍光について分析した10.000イベントをカウント。エレクトロポレーションエレクトロポレーションは次のように行った:2×106CHO-K1細胞を500μl増殖培地に再懸濁し、eGFP発現DNAの指示量プラス11μgサケ精子と混合し、1650μF、270Vでパルスした。この後、細胞を9.5cm2組織培養マトリックスに播種し、培養した。トランスフェクション1日後、細胞をトリプシン処理により回収し、フローサイトメトリーにより蛍光について分析した10,000イベントをカウント。マウスの免疫化HBsAgコード配列は、強力なウイルスPCMVプロモーターの制御下に置いた。HBsAgをコードするL-MIDGEベクターはODNCKm362~365を用いて生成し表1と比較されたい、HBsAgをコードするMIDGEベクターはEP0941318に従って生成した。Balb/cマウス1群あたり6匹を、3週間間隔で2回、10μg/25μlL-MIDGE-HBsAgベクター8.14pmolまたは10μg/25μlMIDGE-HBsAgベクター8.179pmolで皮内免疫した。2回目の免疫2週間後、血清を得、ならびにHBsAg被覆ELISAプレートDadeBehring社;EnzygnostAnti-HBsII;カタログ番号OQNE17またはOQNE11、二次抗体としてのラット抗マウスIgG1およびIgG2aBD社;カタログ番号559626および553391、標準としてのマウス抗HBsAgIgG2aAffinityBioReagents社、カタログ番号MA1-19264および標準としてのマウス抗HBsAgIgG1AffinityBioReagents社、カタログ番号MA1-19263を用いて、HBsAg特異的IgG1およびIgG2a抗体についてELISAを介して分析した。"