"糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させてキメラ型ポリペプチドにすることによって、その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を向上させ、または新たな機能を付与する方法。その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、糖供与体を用いて目的とするオリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に糖を導入する糖転移活性である請求項1に記載の方法。その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、オリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性である請求項1に記載の方法。その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、有機溶剤耐性である請求項1に記載の方法。糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、CBMファミリー32に属するCBM領域である請求項1に記載の方法。糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼに付随するCBM領域である請求項1に記載の方法。他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼである請求項1に記載の方法。融合の際にスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域の元の酵素においてそのCBM領域のN末端に隣接する10アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いる請求項1に記載の方法。糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させたキメラ型ポリペプチド。糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、CBMファミリー32に属するCBM領域である請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼに付随するCBM領域である請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼである請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。融合のスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域の元の酵素においてそのCBM領域のN末端に隣接する10アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、糖蛋白質糖鎖に目的とする糖を効率的に導入するために、糖蛋白質糖鎖に親和性を有するCBMと糖質関連酵素との融合化蛋白質が、融合前の機能を維持し、かつ糖蛋白質調製にとって有用な機能を新たに付与することにある。具体的にはGlcNAcα1→4Galを含むムチン型糖蛋白質糖鎖に特異的に結合するCBM領域のポリペプチドを、酵素機能を有するポリペプチドに融合させ、その融合前の酵素に比べ酵素機能を向上させる。すなわち結果としてGlcNAcをムチン型糖蛋白質糖鎖にα選択的に効率的に導入することである。本発明においては、糖質関連酵素そのもの、もしくはその触媒領域のNもしくはC末端に、他の糖蛋白質糖鎖に関する糖質関連酵素のCBM領域すなわち糖蛋白質に結合するCBMを融合させたキメラ型ポリペプチド実施例1を、糖供与体存在下、糖受容体となる糖蛋白質糖鎖に緩衝溶液中で作用させることにより、糖転移活性を向上させ、目的の糖が導入された糖蛋白質を得ることができる。なお、CBMと触媒領域のリンカーは10アミノ酸残基以上あればよいが、CBMを有する元の酵素の、そのCBMのN末端よりも10アミノ酸残基上流の配列を用いることによって、融合後も、その酵素機能をそれぞれ維持する可能性を高める。具体的には、GHファミリー89に属するAgnCのCBM2から6までの領域のうちCBM一つ以上の長さの領域図1を、同じGHファミリー89に属するAgnBTのC末端にアミノ酸残基数25残基のポリペプチドを介して融合させたポリペプチドキメラ型蛋白質を緩衝溶液中、糖供与体GlcNAc-αDMT存在下、糖受容体ムチン型糖蛋白質に作用させることで、効率的にαGlcNAc含有ムチン型糖蛋白質を得る実施例7、実施例9。なお、この時アミノ酸残基数10残基以上の長さのポリペプチド部位があれば、酵素機能が維持される。また、本発明のポリペプチドは、オリゴ糖だけでなく糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性GlcNAcを遊離する活性の向上をもたらす実施例2、実施例3および実施例6。以上の方法により、目的とする糖GlcNAcを目的とする結合様式立体選択率100で導入することができる。酵素触媒領域が厳密な立体選択性を有するからである。すなわち、本発明は、以下のポリペプチドキメラ型ポリペプチドの使用方法、およびそのキメラ型ポリペプチドに関する。請求項1糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させてキメラ型ポリペプチドにすることによって、その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能を向上させ、または新たな機能を付与する方法。請求項2その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、糖供与体を用いて目的とするオリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に糖を導入する糖転移活性である請求項1に記載の方法。請求項3その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、オリゴ糖、多糖または糖蛋白質糖鎖に対する加水分解活性である請求項1に記載の方法。請求項4その糖質関連酵素またはその触媒領域の機能または新たな機能が、有機溶剤耐性である請求項1に記載の方法。請求項5糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、CBMファミリー32に属するCBM領域である請求項1に記載の方法。請求項6糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼに付随するCBM領域である請求項1に記載の方法。請求項7他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼである請求項1に記載の方法。請求項8融合の際にスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域の元の酵素においてそのCBM領域のN末端に隣接する10アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いる請求項1に記載の方法。請求項9糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域を、他の糖質関連酵素またはその触媒領域に融合させたキメラ型ポリペプチド。請求項10糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、CBMファミリー32に属するCBM領域である請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。請求項11糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼに付随するCBM領域である請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。請求項12他の糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼである請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。請求項13融合のスペーサーとして、糖蛋白質糖鎖に結合する糖結合モジュールCBM領域の元の酵素においてそのCBM領域のN末端に隣接する10アミノ酸残基以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有する請求項9に記載のキメラ型ポリペプチド。本発明の様々なCBMを有するキメラ型ポリペプチドによって、目的とする糖蛋白質に目的とする糖をその非還元末端に導入することができる。すなわち、invitroにおける新たな糖残基の導入においては、糖鎖が密集しているような糖蛋白質に対しては、酵素的糖転移反応による糖の導入が進行しにくかったが、本発明によって、顕著に目的とする糖残基が導入できることになる。本発明の請求項5から7に記載の方法によって、α結合型GlcNAcをガラクトースが密集した糖鎖O-グリカンへ効率的に導入できる実施例9。なお、これにより調製後、さらにGlcNAcα1→4Galβ残基含有O-グリカンに親和性を有するCBMCBM4、特許文献3に記載を固定化したものなどを用いてα結合型GlcNAcを非還元末端に有するO-グリカンを精製高純度化することができる。GlcNAcα1→4Galβ残基を含有するO-グリカンは、ある特定のムチン型糖蛋白質Muc6のみに存在するものである。しかし、本発明のポリペプチドは、ガラクトースを末端に有する糖蛋白質糖鎖であれば、そのガラクトースにGlcNAcを転移するものであるので、様々な糖蛋白質ガラクトースを非還元末端に有するグリカンを有する糖蛋白質を糖受容体とすることができ、たとえば安価な卵白ムチンなどへもα結合型GlcNAc残基を導入することができることになる。また、本発明のポリペプチドと同様の方法で、他の多くの種類の糖蛋白質糖鎖を調製できることになる。なぜなら、糖供与体としては、シアル酸、ガラクトース、フコースやNアセチルガラクトサミンなどの、糖蛋白質糖鎖を構成する糖、もしくはそれらを含むオリゴ糖鎖に脱離基を導入させることによって糖供与体加水分解酵素や糖転移酵素に対する基質となり、糖転移するための基質糖供与体となるものへ誘導する合成法は確立されており、これに対応する糖質関連酵素は、すでに多くの種類が見いだされ、かつ予想されているからである上述のCAZyサイトなど。また、上述のようなCBMの融合化は、酵素本来の機能たとえば加水分解活性の優位な上昇をもたらすことになる実勢例2、実施例3、実施例6。したがって、あるオリゴ糖分子に特異性を有する酵素に対し、そのオリゴ糖を有する糖蛋白質糖鎖に対して機能を上昇させたい場合に、その糖蛋白質糖鎖の非還元末端に位置する糖残基に親和性を有するCBM、特にタンデム型CBMを上述のような方法によって導入融合化させることで、目的を達成させることができる。たとえば、セリンやスレオニンに結合したN-アセチルガラクトサミンを含むオリゴ糖Galβ1→3GalNAcα-Ser/Thrをエンド型で加水分解する酵素エンドαN-アセチルガラクトサミニダーゼアシダエッチAshidaHら、グライコバイオロジーGlycobiology、2008年、第18巻、p.727-734に、ムチン型糖蛋白質糖鎖の非還元末端に位置するガラクトースやシアル酸に親和性を有するタンデム型CBM本発明のものに限られないを酵素に導入することで酵素活性を優位に上昇させることができ、結果的に、加水分解されにくい糖蛋白質糖鎖から、様々なO-グリカンのライブラリーを調製できることになる。さらに、本発明のキメラ型ポリペプチドキメラ型酵素は、種々の有機溶剤との混合溶媒中でも酵素活性糖転移反応において有利な効果をもたらす実施例8。すなわち、本発明のように、CBMを酵素機能を有する蛋白質へ導入することは酵素の有機溶剤耐性化をもたらすと考えられ、結果的に糖脂質類の加水分解活性の向上、および、糖供与体存在下、脂質類への配糖化も可能となる。本発明のキメラ型酵素により得られたα結合型O-グリカンを含有する糖蛋白質糖鎖は、飲食品として含有させて用いることにより、胃疾患を軽減したり治癒したり予防したりするのに有用である。その物質が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するから、飲食品にピロリ菌増殖抑制剤を少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。本発明のキメラ型酵素により得られたα結合型O-グリカンを含有する糖蛋白質糖鎖は、医薬製剤として、もしくは抗生物質ピロリ菌に効果のあると併用して服用することにより、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治療症状緩和予防に用いられる。また、糖鎖含有物質が強いピロリ菌特異的増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、副作用が発現せず、内科的治療で胃疾患を治癒するのに有用である。CBMは、細菌類から哺乳類などの高等生物を宿主とした糖質関連酵素に広く見いだされ、特に腸内細菌や土壌中に見い出される細菌類の糖質加水分解酵素に顕著に見いだされる。請求項1では、糖蛋白質糖鎖に親和性を有するCBMと糖質関連酵素の融合化が酵素活性を向上させ、新たな機能が付与させることが記載されている。ここでターゲットとする糖蛋白質糖鎖があり、そのうちターゲットとする糖部位が決まっているのであれば、その糖部位を含むオリゴ糖部位に作用する酵素を選定し、かつその糖蛋白質糖鎖に親和性を有するCBMを選択すればよい。ここでCBMは、糖蛋白質糖鎖を構成する糖である、ガラクトースGal、フコースFuc、シアル酸Sia、Nアセチルノイラミン酸NeuAcおよびNアセチルグリコール酸GlcAcを含む、NアセチルガラクトサミンGalNAcに親和性を有するもののうち、糖転移反応等のターゲットにしたいものを上述のCAZyサイト等によって選ぶことができる。この中で、すでに糖蛋白質糖鎖に対して親和性を有する旨の報告のあるものが特に望ましいCBMファミリー13、32、40、47、50、51、57。なお、同じファミリー内でも親和性を有する糖蛋白質糖鎖の種類にそれぞれ違いがある可能性はある。また、CBMを導入させたい酵素は、糖質関連酵素であれば特に制限はないが、以下に示すように、同じGHもしくは糖転移酵素GTファミリー間での融合すなわち、融合される前の酵素ファミリーと、導入させようとするCBMを有する酵素のファミリーが同じものどうしでの融合は特に好ましい。請求項2から4までに、上述した請求項1に記載されたポリペプチドによる方法と同様に、糖蛋白質糖鎖に対する糖転移、糖の遊離加水分解および有機溶剤耐性化を行う場合に用いられる方法であることが記載されている。また、その時に用いられるポリペプチドがそれぞれ請求項9と請求項10に記載されている。請求項2に記載の糖転移においては、糖供与体となるものと糖受容体となるものの組み合わせであればよく、糖受容体として糖転移さたい部位を非還元末端に有している糖蛋白質であれば、どのような糖蛋白質へも当該方法を用いることができる。また、糖供与体および糖受容体ともに緩衝液に溶解していればどのような濃度でも用いることができる。請求項3に記載の加水分解においても同様に、糖供与体非存在下では、糖蛋白質そのものを加水分解する方法として用いることができる。この場合も同様に、糖蛋白質が緩衝液に溶解していればどのような濃度でも用いることができる。請求項4では、請求項1に記載の方法が、目的とする酵素の有機溶剤耐性獲得のために用いられることができることが記載されている。ここで用いることができる有機溶剤とは、実施例8にあるように、テトラヒドロフランTHF、アセトニトリルおよびアセトンなどの非プロトン性溶剤であり、その他、緩衝液と混和する溶剤であればどのようなものも用いることができる。なお、用いる溶剤の濃度は、導入される糖質関連酵素および導入するCBMにもよるが、緩衝液に対し0~80/Volまで用いることができ、融合前に有機溶剤耐性が全くなかった酵素に対しては、5~20/Volの有機溶剤中で顕著な活性を有する。一方、プロトン性溶剤アルコール類は、溶剤そのものが糖受容体となりうるので、目的とする反応を阻害する結果となりうる。また、クロロホルム、ヘキサン、エーテルおよびトルエンなど緩衝液と混和しない溶剤を用いた場合は、糖転移活性は維持されるが、反応効率が低くなるおそれがある。請求項5に記載のCBM32ファミリーとは、上述のCAZyサイトに記載のCBM32ファミリーに属するCBMであり、この中から特に糖蛋白質糖鎖に結合するという報告のあるものあるいは推定されているものを利用することが好ましい。請求項6方法および11請求項6に用いられる物に記載のCBMは、GH89ファミリーに付随するCBMであることが記載されている。以下の実施例には、GH89ファミリーに属する、腸内細菌のクロストリジウムパーフリンジェンスClostridiumperfringensstrain13由来のα-N-アセチルグルコサミニダーゼAgnCのC末端に付随するタンデム型のCBMが有効であることが記載されている。ここで、このようなタンデム型CBMについては、それらのうち1つ以上のCBMが目的とする酵素に導入されれば、機能の向上等が期待できる。AgnCと同様に、ビフィドバクテリウムビフィダムBifidobacteriumbifidum、ユーバクテリウムドリカムEubacteriumdolichumやコリンセラスターコリスCollinsellastercorisにも、同様にタンデム型CBMが見られる図1が、同様に用いることができる。なお、この時、導入するCBMの数が増えるほど、糖蛋白質に対する親和性の向上が期待できるので、加水分解活性や糖転移活性の向上等がさらに期待できることになる。請求項7方法および12請求項7に用いられる物には、導入させようとする糖質関連酵素が、グリコシルハイドロラーゼファミリー89GH89に属するα-N-アセチルグルコサミニダーゼの触媒領域であることが記載されている。なお、GH89とは、アシドバクテリウムカプスラタムAcidobacteriumcapsulatum、アカルマンシアムシニフィリアAkkermansiamuciniphila、アリスチペスシャヒーAlistipesshahii、アスチカコーリスエクセントリカスAsticcacaulisexcentricus、バクテロイデスキシラニソルベンツBacteroidesxylanisolvents、バクテロイデスフラジリスBacteroidesfragilis、バクテロイデスヘルコジェネスBacteroideshelcoqenes、バクテロイデスサラニトロニスBacteroidessalanitronis、バクテロイデスセタイオタオミクロンBacteroidesthetaiotaomicron、バクテロイデスバルガタスBacteroidesvulgatus、ビューテンバルジアカバルナエBeutenbergiacavernae、ビフィドバクテリウムビフィダムBifidobacteriumbifidum、ブラキバクテリウムファシウムBrachybacteriumfaecium、カンジダタスアルスロミタスCandidatusArthromitus、カウロバクタークレッセンタスCaulobactercrescentus、カウロバクターセグニスCaulobactersegnis、キチノファーガピネンシスChitinophagapinennsis、クロストリジウムパーフリンジェンスClostridiumperfringens、クロストリジウムスピロフォルメClostridiumspiroforme、フラボバクテリウムジョンソニーFlavobacteriumjohnsoniae、グラニュリセラマレンシスGranulicellamallensis、ニアステラコリーンシスNiastellakoreensis、ポルジバクタープロピオニシジェネスPaludibacterpropionicigenes、ペドバクターヘパリナスPedobacterheparinus、ペドバクターサルタンスPedobactersaltans、プレボテラルミニコーラPrevotellaruminicola、サルモネラエンテリカSalmonellaenterica、スタッカブランジアナッソエンシスStackebrandtianassauensis、ストレプトミセスアンボファシエンスStreptomycesambofaciens、ストレプトミセスアベルミチリスStreptomycesavermitilis、ストレプトミセスビンケンジェンシスStreptomycesbinchenggenis、ストレプトミセススカビーStreptomycesscabiei、ストレプトミセスベネズエラエStreptomycesvenezuelae、ストレプトミセスビオラセウスニガーStreptomycesviolaceusniger、テリグロバスサーネンシスTerriglobussaanensis、キサントモナスアクソノポディスXanthomonasaxonopodis、キサントモナスオリゼーXanthomonasoryzae、ゾベリアガラクタニボランスZobelliagalactanivorans、ズノンワンジアプロファンダZunongwangiaprofunda、アノフェレスガンビアAnophelesgambiae、アラビドプシスタリアーナArabidopsisthaliana、アスパルギルスオリゼーAspergillusoryzae、ボスタウロスBostaurus、カエノラブディティスブリグサエCaenorhabditisbriggsae、カエノラブディティスエレガンスCaenorhabditiselegans、チェロナスイナニタスChelonusinanitus、ドロマイウスノバホランディーDromaiusNovaehollandiae、ドロソフィラメラノガスターDrosophilamelanogaster、ホモサピエンスHomosapiens、マイクロモナスMicromonas、マスマスキュラスMusmusculus、ニコチアナタバカムNicotianatabacum、オリザサティバインディカOryzasativaIndica、オリザサティバジャポニカOryzasativaJaponica、ビティスビニフェラVitisvinifera、ジーメイスZeamays、由来のα-N-アセチルグルコサミニダーゼであることを示すCAZyサイト参照。また、請求項8方法および13請求項8に用いられる物に記載の、融合しようとするCBMと、融合される糖質関連酵素の触媒部位とのリンカー用のポリペプチドとしては、CBMの方のN末端側から上流の10~25残基程度CBMを付随していた酵素において、そのCBMのN末端アミノ酸部位から10~25残基程度N末端側にあるポリペプチド部位を用いることで、融合されたポリペプチドが酵素活性を維持もしくは向上しやすくなる。本発明のAgnCのCBMにおいては、AgnCのN末端側から2番目のCBM触媒領域のC末端側へ1番目のCBMのN末端からN末端方向に20残基の領域と、それを導入するために用いた制限酵素部位の追加による2残基のアミノ酸配列によって、以下の実施例のように酵素活性が維持されている。AgnCのC末端に付随する複数のCBM領域のN末端側から2番目から6番目までのポリペプチドとAgnBTとのキメラ蛋白は、特許文献3を参照し、以下の実施例1のように調製することができる。また、その他GH89のホモログからのCBMと他のGH89の触媒領域との組み合わせについても同様にキメラ型として調製することができる。さらにこれらのキメラ型ポリペプチドは、担体へ固定化して用いることもできる。担体への固定化においては、ヒスチジンタグHisやグルタチオンーS-トランスフェラーゼGSTなどのタグを、N末端およびC末端のどちらの方向へもキメラ型ポリペプチドへ導入が可能である。本発明請求項6および11に記載において調製したポリペプチドの、糖転移反応の場合におけるGalβ残基含有O-グリカン、および糖加水分解反応時におけるGlcNAcα1→4Galβ残基含有O-グリカンに対する親和性を発揮する条件は、pH4から9の緩衝溶液中であれば用いることができるが、具体的には以下のようになる。溶液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などの例を挙げることができ、特にリン酸緩衝化生理食塩水phospahtebufferedsaline,PBSが好ましい。溶液のpHは、中性付近が好ましく、pH6.0からpH8.0が特に好ましい。反応の温度は、15°Cから40°Cが好ましく、25°Cが特に好ましい。基質であるオリゴ糖の濃度は、加水分解および糖転移反応のいずれにおいても、反応させるための条件においては、基質が緩衝溶液に溶解していればよく、数十ミリM程度まで用いることができる。なお、糖転移反応において、糖受容体となる糖蛋白質の濃度および糖供与体の濃度においても、それらが溶解していればよく、数十μMから数百μMまで用いることができる。用いるべき糖供与体としては、糖転移反応の基質となるものであれば何でもよい。なお、糖供与体においては、O-結合型グリカンでは糖蛋白質糖鎖の多くの非還元末端に糖を転移させるので、糖受容体の数十から数百倍以上の濃度で糖転移収率は向上する。反応の時間は、加水分解反応や糖転移反応のいずれも本発明のポリペプチドキメラ蛋白濃度が数μMから数百μMで数十分から10時間が好ましく、30分~5時間程度が特に好ましい。しかしながら糖転移反応ではポリペプチド濃度が数十nM以下では5時間以上で比較的反応率が高くなる傾向にある。反応容器においては、系内の温度を制御でき、かつ溶解しているタンパク質や糖質化合物を特に吸着させるものでないかぎり、どのようなものを用いてもよい。また、反応においては、撹拌や振とうを行えば、反応時間を短縮することができる。以下に、本発明のキメラ型ポリペプチドを調製し、その機能を調査した実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明を何ら限定するものではない。[実施例1]1.1CBM結合キメラタンパクの触媒部位となるHis-tag融合タンパク質AgnBT1の取得バクテロイデス菌BacteroidesthetaoitaomicronVPI5482のゲノムを鋳型として、センスプライマーBamHI-BT1Δ32下線は制限酵素BamHIサイトを示すGCGGATCCCGATCCCCAATCGATTCATTG配列表配列番号1と、アンチセンスプライマーBT1Δ32-SacI下線はSacIサイトGTGAGCTCCTTTGCTTCAATCGC配列表配列番号2を用い、DNAポリメラーゼPrimeStarTakara製を利用して、サーマルサイクラーPTC100MJResearch製で遺伝子増幅反応条件順に98°C30秒、63.5°C30秒、72°C33秒で30サイクル行なうを行ない、増幅後AgnBT1-DNA断片2,149bpを得た。得られた産物に対して制限酵素BamHIおよびSacI処理を行なった後、タンパク質発現用ベクターpET32aへ、制限酵素サイト5’末端側にBamHIと3’末端側にSacIでライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌E.coliBL21DE3株へ形質転換操作し、アンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB培地中2mlで前培養し、さらに同培養液400mlへ全量植菌し、OD600で0.7になるまで37°Cで震盪培養した後、IPTGを0.1mMになるように添加し、室温で24時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へPBS溶液50mMPBS,300mMNaClを4ml加えて懸濁した後、リゾチーム10mg/mlを0.75mg/mlとなるよう添加し、さらにPBS溶液を加え全量を4mlとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、20000×gで10分遠心後、上清をHis-tagアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法TALONMetalaffinityresins,clontech社製により精製した。この溶液を、限外濾過膜排除分子サイズ30000を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として、1000ml培養当たり約20mgで得ることができた図1。得られたタンパクはHis-tag融合タンパクのまま、後の解析に用いた。また、調製したAgnBTタンパク発現ベクターは、キメラタンパク発現ベクターの調製のために引き続き用いた。1.2His-tag融合CBM2-キメラタンパク質の取得AgnBT1-CBM2ウェルシュ菌Clostridiumperfringensstrain13のゲノムを鋳型として、CBM2とその前後領域N末端側からアミノ酸912番目~1090番目の遺伝子配列を、センスプライマーSacI-CBM2下線は制限酵素SacIサイトを示すCGGAGCTCATGGATAAAATATTAGG配列表配列番号3と、アンチセンスプライマーCBM2-XhoI下線はXhoIサイトAACTCGAGTTCCTTTTCTTTTCC配列表配列番号4を用い、DNAポリメラーゼPrimeStarTakara製を利用して、サーマルサイクラーPTC100MJResearch製で遺伝子増幅反応条件順に98°C5秒、58.1°C30秒、72°C1分で30サイクル行なうを行ない、増幅後CBM2-DNA断片487bpを得た。得られた産物に対して制限酵素SacIおよびXhoI処理を行なった後、上記で作製したAgnBT1タンパク発現pET32aベクターへ、制限酵素サイト5’末端側にSacIと3’末端側にXhoIでライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌E.coliBL21DE3株へ形質転換操作し、アンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB培地中2mlで前培養し、さらに同培養液400mlへ全量植菌し、OD600で0.7になるまで37°Cで震盪培養した後、IPTGを0.1mMになるように添加し、室温で24時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へPBS溶液50mMPBS,300mMNaClを4ml加えて懸濁した後、リゾチーム10mg/mlを0.75mg/mlとなるよう添加し、さらにPBS溶液を加え全量を4mlとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、20000×gで10分遠心後、上清をHis-tagアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法TALONMetalaffinityresins,clontech社製により精製した。この溶液を、限外濾過膜排除分子サイズ30000を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として、1000ml培養当たり約21mgで得ることができた図1。His-tag融合タンパクのまま、後の解析に用いた。1.3His-tag融合CBM2-6-キメラタンパク質の取得AgnBT1-CBM2-6ウェルシュ菌Clostridiumperfringensstrain13のゲノムを鋳型として、CBM2~6とその前後領域N末端側からアミノ酸912~1640の遺伝子配列を、センスプライマーSacI-CBM2下線は制限酵素SacIサイトを示すCGGAGCTCATGGATAAAATATTAGG配列表配列番号5と、アンチセンスプライマーCBM26-XhoI下線はXhoIサイトATCTCGAGTGAAGTGGAATCTC配列表配列番号6を用い、DNAポリメラーゼPrimeStarTakara製を利用して、サーマルサイクラーPTC100MJResearch製で遺伝子増幅反応条件順に98°C5秒、59.7°C30秒、72°C33秒で28サイクル行なうを行ない、増幅後CBM2-6-DNA断片2,173bpを得た。得られた産物に対して制限酵素SacIおよびXhoI処理を行なった後、上記で作製したAgnBT1タンパク発現pET32aベクターへ、制限酵素サイト5’末端側にSacIと3’末端側にXhoIでライゲーション反応を行ない、発現宿主である大腸菌E.coliBL21DE3株へ形質転換操作し、アンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB寒天培地上で、その形質転換操作体を得た。これをアンピシリン濃度50μg/mlを含有するLB培地中2mlで前培養し、さらに同培養液400mlへ全量植菌し、OD600で0.7になるまで37°Cで震盪培養した後、IPTGを0.1mMになるように添加し、室温で24時間震盪培養することで、本タンパク質を発現した大腸菌を調製した。遠心後上清を除去したのち、集められた菌体へPBS溶液50mMPBS,300mMNaClを4ml加えて懸濁した後、リゾチーム10mg/mlを0.75mg/mlとなるよう添加し、さらにPBS溶液を加え全量を4mlとした。この懸濁溶液を氷上で超音波破砕し、20000×gで10分遠心後、上清をHistagアフィニティークロマトグラフィーを使った精製法TALONMetalaffinityresins,clontech社製により精製した。この溶液を、限外濾過膜排除分子サイズ30000を用いることにより、上記精製に用いたイミダゾール等を除き、結果的に目的タンパク質を、精製体として1000ml培養当たり約19mgで得ることができた図1。His-tag融合タンパクのまま、後の解析に用いた。[実施例2]4-ニトロフェニル誘導体GlcNAc-α-pNPに対する酵素活性上記で調製した各タンパク溶液31-34μg/μlを3-5μl、15mMGlcNAc-α-pNP溶液を20μl、10倍濃縮PBSpH7.4溶液を10μl添加し、滅菌水により全量を100μlとした。これを撹拌しながら、37°Cでインキュベートした。一定時間反応後、遊離したpNP量を吸光度計で測定することで比活性および反応速度を算出し、各タンパク質のGlcNAc-α-pNP基質に対する反応性を比較した。表1CBM2を付与したキメラタンパクAgnBT1-CBM2では、野生型のAgnBT1タンパクよりもVmax値が約13倍、比活性が約12倍向上した。一方、CBM2-6を付与したキメラタンパクAgnBT1-CBM2-6では、有意な活性の向上は見られなかった。<表1>GlcNAc-α-pNPに対する加水分解活性の速度論的解析[実施例3]4-メトキシフェニル誘導体GlcNAc-α-Gal-β-pMPに対する酵素活性15mMGlcNAc-α-Gal-β-pMPを2μl、上記で調製した各タンパク溶液3.1-3.4μg/μlを1μl、10倍濃縮PBSpH7.4溶液を1μl添加し、滅菌水により全量を10μlとした。反応溶液を撹拌しながら、37°Cで3時間インキュベートした後、GlcNAc切断後に遊離すると考えられるGal-β-pMP量をHPLCHPLC装置;GL7400島津製、分析用カラム;ODS-34.6×250mm、検出;UV283nmにて測定した。すべてのタンパクにおいて、Gal-β-pMPのピークが確認され、とくにAgnBT1-CBM2-6キメラタンパクにおいて加水分解活性が高いことが分かった。図2GlcNAc-α-Gal-β-pMPは0.05-3mMの溶液となるように希釈し、上記で調製した各タンパク溶液3.1-3.4μg/μlを0.4-0.5μl、10倍濃縮PBSpH7.4溶液を3μl添加し、滅菌水により全量を30μlとした。一定時間反応させたのち、Gal-β-pMP量をHPLCにより測定し、比活性および反応速度を算出し、各タンパク質のGlcNAc-α-Gal-β-pMP基質に対する反応性を比較した。表2AgnBT1-CBM2-6タンパクでは、野生型のAgnBT1タンパクよりもVmax値が約5倍、kcat値が約9倍向上した。一方、AgnBT1-CBM2キメラタンパクでは、Vmax値、kcat値ともに約2~3倍程度の向上が認められた。<表2>GlcNAc-α-Gal-β-pMP基質に対する加水分解活性の速度論的解析[実施例4]末端にαGlcNAc残基を有する糖タンパク質に対する加水分解活性の評価ブタ胃ムチン糖タンパク質PorcinGastricMucinPGMもしくはClassIIIMucinSIGMA-Aldrich製の2溶液50μl,10倍濃縮PBSpH7.4溶液を10μl、上記に調製した各タンパク約31-34μgをそれぞれ添加し、全量を500μlにして、撹拌しながら37°Cで5時間インキュベートした。反応後、溶液を遠心濾過し、ろ液を遠心濃縮した後、所定量の蒸留水で溶解させ、以下のそれぞれの方法で測定した。[実施例5]後処理をした濾液をHPLCHPLC装置;GL7400島津製、分析用カラム;AsahipakNH2P-504.6×250mm、検出;UV210nmに供して、酵素反応後にPGMから遊離すると考えられるGlcNAcの検出を行なった。溶出時間約10~12分にGlcNAcと思われるピークの増大が確認できた。野生型のAgnBT1タンパクやAgnBT1-CBM2キメラタンパクより、AgnBT1-CBM2-6キメラタンパクを酵素源に用いた場合に、もっともGlcNAcの検出量が多かった図3。[実施例6]Mucin上の非還元末端のαGlcNAc残基量に変化が見られるかどうかを、GlcNAcα-残基を認識するHIK1083抗体関東化学を用いたドットブロットにより確認した。一次抗体HIK1083500倍希釈により37°C一時間処理し、二次抗体として抗IgM-HRP2000倍希釈SantaCruzBiotechnology,Inc.を使用した。非還元末端のαGlcNAcの切断により新たに出現するGalβ-残基の変化量について、RCA120レクチン生化学バイオビジネス株式会社を用い、VECTASTAINABCsystemsVectorLaboratories社により検出した。AgnBT1-CBM2-6キメラタンパクで処理したMucinは、野生型のAgnBT1タンパクやAgnBT1-CBM2キメラタンパクで処理したムチンに比べ、HIK1083抗体に対する反応性が低下し、逆にRCA120レクチンに対する反応性が上がった。図4[実施例7]AgnBT1キメラタンパクのαGlcNAc転移活性能の有無について確認するため、Galβ-pMPをアクセプターに、DMT-αGlcNAcを糖供与体として用い、糖転移反応を行なった。具体的には、250mMGalβ-pMPを12μl、250mMDMT-αGlcNAcを4μl、10倍濃縮PBSpH7.0溶液を2μl添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度0.4-1.2μlになるように、滅菌水により全量を20μlとした。反応溶液を撹拌しながら、37°Cで30min、1h、5h、16時間インキュベートした。反応産物をHPLCに供し、GlcNAc転移後に生成するGlcNAc-α-Gal-β-pMPのピークをHPLC装置;GL7400島津製、分析用カラム;ODS-34.6×250mm、検出;UV283nmにて検出した。野生型AgnBT1だけでなくAgnBT1キメラ酵素にも糖転移活性能があることを確認し、AgnBT1-CBM2タンパクおよびAgnBT1-CBM2-6タンパクは、野生型AgnBT1タンパクよりも低濃度0.4μMであっても十分に糖転移活性を示すことが分かった。図5[実施例8]有機溶媒含有条件下での糖転移活性能を確認した。250mMGalβ-pMPを12μl、250mMDMT-αGlcNAcを4μl、10倍濃縮PBSpH7.0溶液を2μl添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度0.4-1.2μlになるように加え、さらに最終濃度5v/vになるようアセトニトリルを1μl添加し、滅菌水により全量を20μlとした。他にアセトン、テトラヒドロフランについても同様に反応させた。反応溶液を撹拌しながら、37°Cで30min、1h、1.5h、16時間インキュベートし、反応終了後に反応産物をHPLCに供した。その結果、アセトニトリル、テトラヒドロフランを用いた場合には、野生型AgnBT1タンパクの活性は失われ転移反応が進行しないが、キメラタンパクでは活性を保持していることが明らかとなった。とくにアセトニトリル中で、その反応性が高く保持されていた。また、アセトン中においては、とくにAgnBT1-CBM2タンパクが高い活性を保持していることが分かった。図6[実施例9]Mucin上のGal残基に対するAgnBT1キメラ酵素のαGlcNAc転移活性能について検討した。あらかじめAgnCタンパクにより末端GlcNAcα-残基を切断したMucinを準備し、アクセプターとして用いた。AgnC処理した0.2Mucin溶液あるいは0.5PGM溶液を0.5μl、250mMDMT-αGlcNAcを8μl、10倍濃縮PBSpH7.0溶液を2μl添加し、上記で調製した各タンパク溶液を最終濃度0.4-1.2μlになるように、滅菌水により全量を20μlとした。反応溶液を撹拌しながら、37°Cで1h、5hインキュベートした。反応溶液をニトロセルロース膜上へスポットし、上記の方法を用い、Mucin上のGlcNAcα-残基およびGalβ-残基をそれぞれHIK1083抗体、RCA120レクチン用いたドットブロットにより確認した。AgnBT1-CBM2-6キメラタンパクで処理したMucinは、野生型のAgnBT1タンパクやAgnBT1-CBM2キメラタンパクで処理したMucinに比べ、HIK1083抗体に対する反応性が上がり、逆にRCA120レクチンに対する反応性が下がった。図7"