PPARδのリガンド結合領域を含む第1領域と、転写因子のDNA結合領域又は転写活性化領域を含む第2領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする第1遺伝子、PPARγコアクチベーター1-αの受容体相互作用領域を含む第3領域と、前記第2領域がDNA結合領域を含む場合には転写因子の転写活性化領域を含み、前記第2領域が転写活性化領域を含む場合には転写因子のDNA結合領域を含む第4領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする第2遺伝子、及び前記DNA結合領域が結合し得る応答配列及び該応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターコンストラクト、を含む細胞に被験物質を接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を指標として、前記被験物質による、リガンド依存的な相互作用の変化を分析することを特徴とする、PPARδのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。前記第3領域が、PPARγコアクチベーター1-αの一部分である、請求項1に記載のスクリーニング方法。前記第3領域が、PPARγコアクチベーター1-αのN末端側から1番目のアミノ酸~188番目のアミノ酸からなる、請求項2に記載のスクリーニング方法。前記第3領域が、配列番号5のアミノ酸配列からなる、請求項3に記載のスクリーニング方法。前記細胞が酵母細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。前記転写因子が酵母のGAL4である、請求項5に記載のスクリーニング方法。前記第2領域が前記転写因子のDNA結合領域を含み、前記第4領域が前記転写因子の転写活性化領域を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。本発明の課題は、PPARδリガンドアゴニスト又はアンタゴニストとしての被験物質の有効性を、ハイスループットに評価できる手段を提供することにある。これまでに、PPARδについてはアゴニストに良好な反応を示す酵母twohybridツーハイブリッドスクリーニング系は構築されていない。PPARのように内因性のアゴニストが未知であるいわゆるオーファン受容体の多くは、ステロイドホルモン受容体等とは異なり、下等生物にも存在し、また宿主自体に内因性のリガンドを有している可能性が示唆されている。PPARδについても例外ではないと考えられ、実はセオリー通り酵母twohybrid系を構築しても、アゴニストに依存した反応は見られない。酵母内には、もともとPPARのアゴニストになるような内因性の脂溶性生理活性物質が豊富に存在していることが指摘されており、これが一因となっていると考えられる。尚、核内ホルモン受容体とそのコアクチベーターとの相互作用を利用した酵母twohybrid系によって、内分泌撹乱物質をスクリーニングする方法が報告されている非特許文献1。このような背景の下、本発明者らはエストロゲン受容体やレチノイン酸受容体等で良好な反応性を示した主要なコアクチベーター7種の部分配列を用いて、PPARδリガンドスクリーニング系の構築を試みた。その結果、PPARγコアクチベーター1-αPGC1αが最も良好な反応性を示した。しかも、全長を用いた場合よりも、適度な長さの部分PGC1α受容体相互作用領域RIDを含むを用いることで良好な反応性を示すことも見出した。更には、PGC1αをコアクチベーターとしたスクリーニング系によれば、アゴニスト活性とアンタゴニスト活性の両者を評価可能であることが確認された。以上の通り、本発明者の検討によってPGC1αの有用性が判明し、それを利用したPPARδリガンド評価系スクリーニング系が完成した。ところで、従来のPPARδリガンド評価系として、マイクロイムノプレートと精製タンパク質を用いた無細胞検出系が先行して存在する非特許文献2。基本的に無細胞検出系においても応用するイベントは酵母twohybrid系と同様である。無細胞検出系は、酵母twohybrid系よりもハイスループットに検討することが可能であるという利点を有する上、酵母を用いた場合には、被験物質の酵母に対する毒性を考慮した上で検討を行う必要があるが、無細胞系においては毒性を気にせずに濃度を設定できる利点も有する。しかしその一方で、無細胞系は天然物や食品成分等の疎水性粗抽出分画のような混合物では擬陽性が非常に多く、スクリーニングできない。これは無細胞系がリガンド依存的、非依存的にかかわらず、タンパク質間相互作用が起こりさえすれば陽性と判定されるためで、このようなサンプルにはタンパク質変性作用を有していたり、タンパク質に非特異的に接着することでタンパク質同士を結合させるような化合物が含まれていたりするためであると考えられる。したがってサンプルの種類を問わない酵母twohybrid系は、無細胞系よりもスクリーニングできる検体が幅広く、アドバンテージを有している。即ち、無細胞系に比して汎用性が高い点も利点といえる。一方、動物細胞内で核内受容体のアゴニスト活性を評価する実験系として、酵母の転写因子であるGAL4のDNA結合領域DNAbindingdomain:DBDと核内受容体のリガンド結合領域ligandbindingdomain:LBDの融合タンパク質と転写開始点上流にガラクトース代謝遺伝子の上流域活性化配列upstreamactivationsequence:UASが存在しているルシフェラーゼを利用した系が存在する。この実験系は、核内受容体リガンドの核内受容体LBDへの結合から標的遺伝子の転写活性化までの、核内受容体によるリガンド依存的な遺伝子転写制御のイベントを一通り網羅しているため、酵母による核内受容体アゴニスト活性評価法よりも正確な評価が可能であるといえる。本発明者らが完成させた上記評価系と当該実験系を比較した結果、両者の間に相関を認め上記評価系の有効性が裏付けられた。また、上記評価系による結果データを評価する上で重要且つ有用な情報が得られた。以下に列挙する本願発明は、以上の成果ないし知見に基づく。1PPARδのLBDを含む第1領域と、転写因子のDBD又は転写活性化領域を含む第2領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする第1遺伝子、PGC1αのRIDを含む第3領域と、前記第2領域がDBDを含む場合には転写因子の転写活性化領域を含み、前記第2領域が転写活性化領域を含む場合には転写因子のDBDを含む第4領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする第2遺伝子、及び前記DBDが結合し得る応答配列及び該応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーターコンストラクト、を含む細胞に被験物質を接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を指標として、前記被験物質による、リガンド依存的な相互作用の変化を分析することを特徴とする、PPARδのアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。2前記第3領域が、PGC1αの一部分である、1に記載のスクリーニング方法。3前記第3領域が、PGC1αのN末端側から1番目のアミノ酸~188番目のアミノ酸からなる、2に記載のスクリーニング方法。4前記第3領域が、配列番号5のアミノ酸配列からなる、3に記載のスクリーニング方法。5前記細胞が酵母細胞である、1~4のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。6前記転写因子が酵母のGAL4である、5に記載のスクリーニング方法。7前記第2領域が前記転写因子のDBDを含み、前記第4領域が前記転写因子の転写活性化領域を含む、1~6のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。本発明はPPARδのリガンド、即ちアゴニスト作動薬またはアンタゴニスト拮抗薬をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法ではPPARδと転写共因子とのリガンド依存的な相互作用が生ずるように操作した細胞を用い、当該相互作用に伴うレポーター遺伝子の発現を指標として、被験物質の有効性を評価する。PPARδと転写共因子とのリガンド依存的な相互作用が生ずるように、本発明のスクリーニング方法に用いる細胞は、3要素、即ち第1遺伝子、第2遺伝子及びレポーターコンストラクトを含む。以下、各要素について詳細に説明する。尚、ヒトPPARδのアミノ酸配列を配列番号1に示す。<第1遺伝子>本発明では、PPARδのLBDを含む第1領域と、転写因子のDBD又は転写活性化領域を含む第2領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子のことを第1遺伝子と呼ぶ。PPARδのLBDは、PPARδのアミノ酸配列のN末端側から254番目~441番目までのアミノ酸を含む領域と考えられている。少なくとも当該領域を含む限り、第1領域の長さは特に限定されない。第1領域の具体例を配列番号2PPARδの140aa~441aaに示す。第2領域は転写因子のDBD又は転写活性化領域を含む。好ましい転写因子として酵母GAL4を用いることができる。即ち、好ましい一態様では、GAL4のDBDとGAL4の転写活性化領域を用いる。一方、LexAのDBDとVP16の転写活性化領域の組合せや、LexAのDBDと大腸菌由来のB42転写活性化領域の組合せを用いることにしてもよい。一態様では、第2領域が転写因子のDBDを含む。DBDは、後述の応答配列に対する結合能を示す一方で、転写活性化能を示さない。別の一態様では、第2領域が転写因子の転写活性化領域を含む。転写活性化領域とは、転写活性化能を示す一方、DNA結合能を有しない領域である。転写因子のDBDは、例えばGAL4の場合、N末端側およそ第1番目から147番目までのアミノ酸を含む領域に存在することが知られている。同様に転写活性化領域は、例えばGAL4の場合、C末端側およそ第768番目から881番目までのアミノ酸を含む領域に存在することが知られている。少なくとも当該領域を含む限り、第2領域の長さは特に限定されない。DBDを採用した場合の第2領域の具体例を配列番号3GAL4のDBDに示す。上記の如き構成の第1領域と第2領域が連結されてなる融合タンパク質が第1遺伝子にコードされる。第1領域の機能と第2領域の機能に支障のない限りにおいて、第1領域と第2領域の間に別の配列が介在していてもよい。好ましい態様では、第1領域と第2領域が直接連結されている。第1領域と第2領域の間ではなく、第1領域又は第2領域の外側に他の配列が付加されていてもよい。また、第1領域と第2領域の順序は特に問わず、いずれが上流側に配置されていてもよい。尚、第1遺伝子の配列の例を配列番号4に示す。<第2遺伝子>本発明では、PGC1αのRIDを含む第3領域と、前記第2領域がDBDを含む場合には転写因子の転写活性化領域を含み、前記第2領域が転写活性化領域を含む場合には転写因子のDBDを含む第4領域とが連結されてなる融合タンパク質をコードする遺伝子のことを第2遺伝子と呼ぶ。PGC1αでは、そのRIDはN末端側から88番目~92番目までのアミノ酸、144番目~148番目、または210番目~214番目までのアミノ酸を含む領域と考えられている。少なくともいずれかの当該領域を1つ以上含む限り、第3領域の長さは特に限定されない。本発明者らの検討の結果、PGC1α全長を用いた場合には、良好な相互作用が認められなかった。この知見に基づき、好ましくは、PGC1αの一部を第3領域に使用する。PGC1αの全長は798アミノ酸残基であるが、例えば、1番目~188番目のアミノ酸の部分PGC1α但し、RIDを含むを用いるとよい。好ましい第3領域の具体例を配列番号51aa~188aaに示す。第4領域は転写因子のDBD又は転写活性化領域を含むが、第2領域との間でDBDと転写活性化領域からなるペアーが形成されるように、第2領域にDBDを使用した場合には、第4領域には転写因子の転写活性化領域を使用し、これとは逆に、第2領域に転写活性化領域を使用した場合には、第4領域には転写因子のDBDを使用する。このように構成することによって、第2領域が供給する転写因子の要素と、第4領域が提供する転写因子の要素が一体となることで、応答配列への結合及びそれに続くレポーター遺伝子の転写活性化が引き起こされる。第2領域と第4領域による当該作用効果が生ずる限りにおいて、第4領域が含む転写因子の要素の由来が、第2領域が含む転写因子の要素の由来と同一である必要はない。尚、転写活性化領域を採用した場合の第4領域の具体例を配列番号6GAL4の転写活性化領域に示す。上記の如き構成の第3領域と第4領域が連結されてなる融合タンパク質が第2遺伝子にコードされる。第3領域の機能と第4領域の機能に支障のない限りにおいて、第3領域と第4領域の間に別の配列が介在していてもよい。好ましい態様では、第3領域と第4領域が直接連結されている。第3領域と第4領域の間ではなく、第3領域又は第4領域の外側に他の配列が付加されていてもよい。また、第3領域と第4領域の順序は特に問わず、いずれが上流側に配置されていてもよい。尚、第2遺伝子の配列の例を配列番号7に示す。<レポーターコンストラクト>本発明では、上記DBDが結合し得る応答配列及び当該応答配列に連結されたレポーター遺伝子を含むものをレポーターコンストラクトと呼ぶ。使用する転写因子に対応した応答配列が採用される。例えば、転写因子としてGAL4を採用した場合、応答配列としてUASを用いることができる。レポーター遺伝子には、例えば、出芽酵母の栄養要求性遺伝子ADE2、HIS3、URA3、大腸菌由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子lacZ、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子CAT、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子Lucを用いることができる。レポーター遺伝子は、応答配列の制御下に配置される。即ち、応答配列に対して作動的にレポーター遺伝子が連結される。第1遺伝子、第2遺伝子及びレポーターコンストラクトは、遺伝子組換え技術を用いて調製できる。第1遺伝子に含まれる、PPARδのLBDをコードするDNAや転写因子の一部をコードするDNA、或いは第2遺伝子に含まれる、PGC1αのRIDをコードするDNAや転写因子の一部をコードするDNAなどは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計合成したプライマーやプローブを用いて、例えばcDNAライブラリーから単離することができる。単離したDNAを制限酵素やPCR法などを用いて連結することにより、第1遺伝子及び第2遺伝子を構築することができる。以上で説明した3要素を細胞に導入することにより、本発明に使用するスクリーニング用細胞を得ることができる。例えば第1遺伝子、第2遺伝子、レポーターコンストラクトをそれぞれ適当なベクター例えばプラスミドベクターに組み込み、当該ベクターで宿主細胞を形質転換すればよい。二つ以上の要素を一つのベクターで導入することにしてもよい。尚、各種レポーター遺伝子に関して、それが応答配列とともに組み込まれた細胞を利用可能な状況にある。そのような細胞を利用すれば、第1遺伝子及び第2遺伝子のみを導入することによって、本発明に必要なスクリーニング用細胞が得られる。好ましい態様では、酵母twohybrid系として本発明のスクリーニング方法を構成する。酵母twohybrid系とは、酵母を宿主細胞として用い、細胞内で生じるタンパク質相互作用の存在を検出するものである。基本的には真核細胞の転写因子の多くがDBDと転写活性化領域に分割が可能であり、これらの領域に調べようとする2種類のタンパク質をそれぞれに連結して酵母内で発現させたときに転写因子の活性化が起これば、これらのタンパク質は会合していることが分かる。酵母twohybrid系を核内受容体のリガンドスクリーニング系に応用する場合は、一般に、核内受容体と転写因子例えば酵母転写因子GAL4のDBDとの融合タンパク質及びコアクチベーターと転写因子の転写活性化領域の融合タンパク質を酵母内で発現させる。また、これらとともに転写因子の応答配列をレポーター遺伝子の上流に挿入したレポータープラスミドも酵母内に導入する。例えば、被験物質がアゴニスト活性を有している場合には、核内受容体本発明の場合はPPARδのLBDのコンフォメーションが変化し、コアクチベーターをリクルートするため、両融合タンパク質は結合し転写因子の働きを持つタンパク質複合体が形成される。このタンパク質複合体は転写因子として機能し、レポーター遺伝子の発現を誘導する。したがって、被験物質のリガンド活性をレポーター遺伝子の発現量で評価することができる。被験物質のリガンド活性の強弱は、活性化された核内受存体のコアクチベーターのリクルート能に反映されることから、このレポーター遺伝子の発現の度合いを指標にリガンド活性を定量的に検出することが可能となる。典型的なアゴニストを試験系に加えておいて、同時に被験物質を共存させることによりアンタゴニスト活性も検出できる。酵母twohybrid系には典型的にはサッカロマイセスセレビシエSaccharomycescerevisiaeが用いられる。尚、酵母twohybrid系の原理や構成等については、JNishikawaKSaitoJGotoFDakeyamaMMatsuoTNishiharaToxicolApplPharmacol15476が参考になる。DBDと転写活性化領域に分割された転写因子の活性化を評価できるのであれば、酵母細胞以外の真核細胞例えば哺乳動物細胞や昆虫細胞を用いることも可能である。本発明のスクリーニング方法では、上記のように3要素を含むスクリーニング用細胞に被験物質を接触させ、前記レポーター遺伝子の発現を指標として、前記被験物質による、リガンド依存的な相互作用の変化を分析する。具体的には、例えば次のステップ1~3を行えばよい。1スクリーニング用細胞に被験物質を接触させるステップ2レポーター遺伝子の発現を検出するステップ3検出結果に基づき、被験物質による、リガンド依存的な相互作用の変化の有無及び/又は程度を調べるステップステップ1では、用意したスクリーニング用細胞に対して、被験物質を接触させる。例えば、スクリーニング用細胞の培養液中に被験物質を添加する。或いは、スクリーニング用細胞の培養液を、被験物質を含有するものに交換する。培養方法は常法に従えばよく、スクリーニング用細胞の種類に応じて決定できる。被験物質との接触時間、即ち被験物質を添加などすることによって、培養液中に被験物質が共存するようになってから、ステップ2に至るまでの時間は予備実験を通して設定すればよいが、例えば30分~6時間である。試験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質単純脂質、複合脂質ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミンB1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等を例示できる。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を試験物質としてもよい。2種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。ステップ1に続くステップ2では、レポーター遺伝子の発現を検出する。検出は常法に従えばよい。本発明で用いることが可能な汎用的なレポーター遺伝子に関しては、基本的な検出法が確立されており、成書や過去の論文等を参考にして、適切な方法や条件を容易に選択ないし設定することが可能である。ステップ3では、ステップ2の検出結果に基づき、リガンド依存的な相互作用に及ぼす被験物質の影響効果を調べる。具体的には、スクリーニング用細胞に被験物質を接触させたことにより、リガンド依存的な相互作用の変化が生じたか、又はリガンド依存的な相互作用の変化はどの程度か、或いはこれらの両方を調べ、被験物質のアゴニスト又はアンタゴニストとしての有効性を判定する。例えば、被験物質の接触共存によってレポーター遺伝子の発現の増強を認めた場合発現を検出できるようになった場合も含む、即ち、リガンド依存的な相互作用を正に調節した場合、被験物質がアゴニスト活性を有すると判定できる。通常は、スクリーニング用細胞に被験物質を接触させない場合陰性対照と比較し、被験物質のアゴニスト活性を判定する。また、このような陰性対照の利用と併せて或いはその代わりに、アゴニスト活性を示すことが判明している物質既知アゴニストをスクリーニング用細胞に接触させた場合陽性対照と比較し、被験物質のアゴニスト活性の程度を評価してもよい。以上のように陰性対照及び/又は陽性対照との比較に基づき被験物質の有効性を判定評価すれば、より客観的且つ信頼性の高い判定結果が得られる。一方、被験物質のアンタゴニスト活性を評価する場合には、原則、アゴニストの共存下でステップ1を行い即ち、被験物質とアゴニストをスクリーニング用細胞に接触させる、その場合のレポーター遺伝子の発現を、アゴニストのみをスクリーニング用細胞に接触させた場合のレポーター遺伝子の発現と比較する。後者に比較して前者にレポーター遺伝子の発現の減弱を認めた場合、即ち、アゴニストに起因するリガンド依存的な相互作用を被験物質が負に調節した場合、被験物質がアンタゴニスト活性を有すると判定できる。従って、アンタゴニスト候補として当該被験物質が選抜される。発現増強又は減弱の程度に基づき、被験物質のアゴニスト又はアンタゴニストとしての有効性を定量的に判断してもよい。尚、PPARδのアゴニストとしてGW0742、15デオキシΔ1214プロスタグランジンJ2PGJ2が知られており、同様にPPARδのアンタゴニストとしてGSK0660が知られている。PPARδのアゴニストは、即効性の高い抗肥満薬の有効成分として期待される。他方、PPARδのアンタゴニストは、ヒトの肺ガン、肝ガン、乳ガン由来細胞株の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することから、抗ガン剤の有効成分として期待される。本発明のスクリーニング方法によって選択された物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのまま医薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、医薬の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。以下の説明では次の略号を使用する。ADactivationdomain転写活性化領域RIDReceptorInteractionDomain受容体相互作用領域DBDDNAbindingdomainDAN結合領域LBDligandbindingdomainリガンド結合領域UASupstreamactivatingsequenceガラクトース代謝遺伝子の上流域活性化配列1.実験材料1酵母twohybrid法で使用する試薬および組成YPDA培地20gLペプトン10gL酵母エキスYeastextract20gLグルコース30mgLLアデニンヘミ硫酸塩SDLT培地67gLDifcoyeastnitrogenbasewithoutaminoacid100mLL10xDropout溶液20gLグルコースDropout溶液300mgLLイソロイシン1500mgLLバリン200mgLLアデニンヘミ硫酸塩200mgLLアルギニンHCl200mgLLヒスチジンHClH2O300mgLLリジンHCl200mgLLメチオニン500mgLLフェニルアラニン2000mgLLスレオニン300mgLLチロシン200mgLLウラシルSDLTプレートSDLT培地に寒天を2となるように加えたもの10xTE100mMTrisHCl10mMEDTA10xLiAc溶液1M酢酸リチウム50PEG4000溶液LiAcTE溶液10xTE1mL10xLiAc1mL超純水8mLLiAcTEPEG溶液10xTE1mL10xLiAc1mL50PEG4000溶液8mLZバッファー60mMNa2HPO440mMNaH2PO410mMKCl1mMMgSO42実験に使用したPPARδリガンドアゴニスト:GW0742、15デオキシΔ1214プロスタグランジンJ2PGJ2アンタゴニスト:GSK06603酵母twohybrid法で使用するプラスミドの構築酵母内でGAL4ADとTIF2の融合タンパク質を発現するプラスミドヒトTIF2のRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとPGC1αRIDの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトPGC1αのRIDをコードする配列をHepG2細胞由来cDNAを鋳型とし、LAtaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、SmaI、SalIを用いて配列を切り出し、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとPGC1αの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトPGC1αをコードする配列をHepG2細胞由来cDNAを鋳型とし、KODPlusを用いてPCRを行うことで増幅した後、SmaI、SalIで処理した。これをSmaI、SalIで処理したpGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。またDNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した。酵母内でGAL4ADとPGC1βの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトPGC1βのRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、BamHI、SalIを用いて配列を切り出し、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとSRC1の融合タンパク質を発現するプラスミドヒトSRC1のRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとp300CBPの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトp300CBPのRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとACTRの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトACTRのRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4ADとRIP140の融合タンパク質を発現するプラスミドヒトRIP140のRIDをコードする配列をヒト肝臓由来cDNAを鋳型とし、DNAPolymeraseAmpliTaqを用いてPCRを行うことで増幅し、pBluescriptKSに挿入した。DNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した後、pGAD424に挿入し、プラスミドを構築した。酵母内でGAL4DBDとPPARδLBDの融合タンパク質を発現するプラスミドヒトPPARδLBDをコードする配列をHepG2細胞由来のcDNAを鋳型とし、KODPlusを用いてPCRを行うことで増幅した後、SmaI、SalIで処理した。これをSmaI、SalIで処理したpGBT9に挿入し、プラスミドを構築した。またDNAシークエンス解析により、挿入した配列がGenBankに登録されているものと一致することを確認した。4レポーターアッセイで使用するプラスミドの構築培養細胞内でホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミド4コピーのGAL4DBD結合配列であるUAS配列をSmaIで処理したptklucに挿入し、プラスミドを構築した。培養細胞内でGAL4DBDとPPARδLBDの融合タンパク質を発現するプラスミドpGBT9PPARδLBDをEcoRI、SalI処理することでヒトPPARδLBDをコードする配列を切り出し、これをEcoRI、SalI処理したpMに組み込みプラスミドを構築した。2.実験方法1酵母へのトランスフォーメーション酵母をYPDA培地15mLで30°C、16~24時間培養後、遠心分離により集菌し、1xTE、LiAcTE溶液で洗浄後、150μLのLiAcTE溶液で懸濁した。懸濁した酵母を15mLチューブに移し、pGAD424プラスミドおよびpGBT9PPARδLBDプラスミドをそれぞれ1μg相当量、キャリアーDNA溶液を7μL添加し、LiAcTEPEG溶液を850μL加え、よく混和した。混和後、30°Cで30分、42°Cで15分インキュベートした後、遠心分離を行い、LiAcTEPEG溶液を除去した。沈殿を500μLの超純水で懸濁し、再度遠心分離を行い、上清を除去した後、200μLのLiAcTEで再懸濁し、SDLTプレートに塗布した。プレートは適当なコロニーが大きさのコロニーが得られるまで30°Cでインキュベートし、コロニーが生えたプレートはβガラクトシダーゼ活性測定時まで4°Cで保存した。2βガラクトシダーゼ活性測定pGAD424プラスミドとpGBT9プラスミドを導入した酵母を15mLのSDLT培地に植菌した後、30°Cで一晩培養し、前培養液とした。前培養液を150μLとり、96穴プレートに移し、プレートリーダーで600nmの吸光度を測定した上で、前培養液をOD600005となるようにSDLT培地で希釈し、希釈液250μLを15mLチューブに移した。さらに試料溶液を25μL加え、良く混和した後、30°Cで4時間培養した。培養後、培養液を150μLとり、96穴プレートに移し、プレートリーダーでOD600を測定した。残りの培養液100μLを遠心し、上清を除き、1mgmLのZymolyase20Tを含むZバッファーを200μL加え、良く混和した後、37°Cで30分静置し、酵母を溶解した。酵母の溶解を確認した後、4mgmLのonitrophenylβgalactosideSigmaを含むZバッファーを40μL加えて良く混和し、30°Cで発色反応を開始させ、30分後に1MNa2CO3溶液を100μL加えて反応を停止させた。遠心後、上清150μLを96穴プレートに移し415nmの吸光度を測定し、次式を用いてβガラクトシダーゼ活性を算出した。3細胞培養ヒト胎盤絨毛細胞株であるJEG3細胞の培養には10ウシ胎児血清、2mMLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムNacalaiTesque及び01mMMEM非必須アミノ酸溶液を加えたMEM培地を用いた。培養は37°C、5CO2存在下で行った。遺伝子導入時には無血清培地で、遺伝子導入以降の培養は活性炭処理したウシ胎児血清を1加えた培地を用いた。4遺伝子導入および化合物処理JEG3細胞を30x104細胞/ウェルとなるように24穴平底プレートに播種し、24時間後に遺伝子導入を行った。遺伝子導入には、LipofectamineReagentおよびPlusReagentを用いて、その標準プロトコールに従って操作を行った。プラスミド量は、1ウェルあたりp4xUAStkLuc50ng、pMPPARδLBD20ng、pGL47510pgとした。遺伝子導入3時間後に、1活性炭処理ウシ胎児血清含有培地に交換し、培地交換の21時間後に化合物の処理を行った。5ルシフェラーゼアッセイ化合物処理24時間後に細胞をPBSで2回洗浄した後、PassiveLysisBufferで溶解した。20分静置後、細胞溶解液20μLを96穴白色平底プレートに加え、DualLuciferaseReporterAssaySystemを用いてルミノメーターによりホタルルシフェラーゼ活性を測定した。内部標準として、pGL475のウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定し、これを用いて遺伝子導入効率を補正した。3.実験結果1酵母によるPPARδアゴニスト活性評価系に使用するコアクチベーターの選別酵母twohybrid法は、酵母を宿主細胞に用いて、任意の2つのタンパク質の結合をレポーター遺伝子の発現を指標に検出するシステムである。核内受容体にリガンドが結合していない状態では、コリプレッサー複合体が核内受容体に結合し、標的遺伝子の転写を抑制しているが、リガンドが結合すると核内受容体の立体構造が変化し、それに伴って、コリプレッサーが解離し、コアクチベーター複合体標的遺伝子の転写を促進する働きをするが結合して、標的遺伝子の転写を促進する。酵母twohybrid法を用いた核内受容体アゴニスト活性評価系はこのイベントを応用している。すなわち、酵母内で酵母の転写制御因子であるGAL4と核内受容体LBD融合タンパク質にアゴニストが結合すると、核内受容体LBDが前述の立体構造変化が起こることでコアクチベーターを迎え入れる状態となり、そこにGAL4の活性化領域とコアクチベーター融合タンパク質のコアクチベーター部分が結合することで、レポーター遺伝子が発現する。またアゴニスト作用の強弱は、活性化された核内受容体のコアクチベーターのリクルート能に反映されることから、このレポーター遺伝子の発現の度合いを指標にアゴニスト作用を定量的に検出することが可能となる。この系を用いてPPARδアゴニスト活性を評価するにあたっては、リガンド添加によりレポーター遺伝子発現が大きく上昇させられるようなコアクチベーターを使用する必要がある。そこで、PPARδアゴニスト活性に適したコアクチベーターの選別を行った。検討にはTIF2、PGC1α、PGC1β、SRC1の4つのコアクチベーターを用いた。コアクチベーターを発現するプラスミド、PPARδLBDを発現するプラスミドを酵母に導入した後これを培養し、PPARδアゴニストであるGW0742と一定時間反応させた。その後酵母を回収し、細胞壁を破壊した後に、レポーター遺伝子であるβガラクトシダーゼの活性を測定した。検討の結果、TIF2、PGC1αを用いた場合にはアゴニスト添加により、βgal活性の上昇が認められ、上昇の程度は、PGC1αの方が大きかった図1。一方でPGC1βを用いた場合には、アゴニスト添加によりβgal活性が若干上昇したが、全体的にその活性は低く、SRC1を用いた場合には、アゴニストを添加してもβgal活性は上昇しなかった。この結果から、酵母によるPPARδアゴニスト活性評価に使用するコアクチベーターはPGC1αが適していることが明らかとなった。この検討でPGC1αは核内受容体LBDと相互作用する領域のみを発現させたが、PGC1α全長を発現させることで、アゴニスト添加によるβgal活性上昇の程度が大きくなるか検討を行った。検討の結果、PGC1α全長を用いた場合には、アゴニスト添加してもβgal活性は全く上昇せず、PPARδアゴニスト活性を評価する場合にはPGC1αの核内受容体LBDと相互作用する領域のみを発現させた方がよいことが明らかとなった。2酵母を用いたPPARδアゴニスト、アンタゴニストの評価検討の結果から、酵母によるPPARδアゴニスト活性評価に使用するコアクチベーターにはPGC1αが適していることが明らかとなったため、PGC1α発現プラスミド及びPPARδLBD発現するプラスミドを導入した酵母を用いて検討を行った。まず、アゴニスト活性の評価を行った。PPARδアゴニストとして機能することがしられているGW0742、15デオキシΔ1214プロスタグランジンJ2について検討を行ったところ、GW0742は、1nM以上で、PGJ2は1μM以上で濃度依存的なβgal活性の上昇が確認された。続いて、PPARδアンタゴニストであるGSK0660が、酵母の系においてもアンタゴニストとして機能して、GW0742によるβgal活性上昇を抑制するか検討を行った。10nMGW0742および1nM100μMGSK0660を酵母に添加し検討を行ったところ、GSK0660濃度依存的にβgal活性上昇作用は抑制され、10μM以上の濃度において顕著に抑制された。PPARδアゴニストによりβgal活性が上昇し、PPARδアンタゴニストによりその活性上昇が抑制されたことから、この酵母によりPPARδアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を評価できることが確認された。3レポーターアッセイによるPPARδアゴニスト、アンタゴニスト活性評価動物細胞内で核内受容体のアゴニスト活性を評価する実験系として、酵母の転写因子であるGAL4DBDと核内受容体のLBDの融合タンパク質と転写開始点上流にUASが存在しているルシフェラーゼを利用した系が存在する。この実験系は、GAL4DBDと核内受容体LBD融合タンパク質のLBD部分に核内受容体リガンドとなる物質が結合すると、DBD部分がUASに結合し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの転写が開始されるという仕組みになっている。この実験系は、核内受容体リガンドの核内受容体LBDへの結合から標的遺伝子の転写活性化までの、核内受容体によるリガンド依存的な遺伝子転写制御のイベントを一通り網羅しているため、酵母による核内受容体アゴニスト活性評価法よりも正確な評価が可能である。そこで、この実験系を用いて酵母を用いた評価系での結果を検証した。レポーターアッセイによりGW0742、PGJ2のPPARδアゴニスト活性を評価した。その結果、GW0742は1nM以上でレポーター遺伝子であるルシフェラーゼの顕著な活性上昇が認められ、PGJ2は10μMでルシフェラーゼ活性の上昇が認められた図5。酵母には細胞壁があるため、培養細胞と酵母とでは物質の透過性が異なる。このことにより、レポーターアッセイで反応が認められる濃度よりも1オーダー高くなる傾向が認められている。GW0742はこの傾向と合致していたが、PGJ2は、活性上昇が認められる濃度が酵母の方が低くなっていた。このことから、酵母の系では、PGJ2のPPARδアゴニスト活性を実際よりも強く評価する可能性が示唆された。続いて、酵母の系と同様にPPARδアンタゴニストであるGSK0660の評価を行った。1nMGW0742および1nM~10μMGSK0660を培養細胞に処理し検討を行ったところ、GSK066010nMでルシフェラーゼ活性の減少が認められ、100nMでGW0742によるルシフェラーゼ活性上昇作用をほぼ完全に抑制した。レポーターアッセイ、酵母twohybrid系共にGSK0660によりGW0742のアゴニスト作用が抑制されたが、完全に抑制する濃度がレポーターアッセイでは100nMであったのに対し、酵母twohybrid系では10μMであった。このことから、酵母による評価ではアンタゴニスト活性を過小評価する可能性が示唆された。