"標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物において、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群と、前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群と、を含む標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記第1プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする請求項1に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記最終増幅産物は、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする請求項2に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項1に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項1に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項1に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで増幅反応物に提供されることを特徴とする請求項1乃至請求項6のうちいずれか一項に記載の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物。標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を含むPCR増幅キットにおいて、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群と、前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群と、ポリヌクレオチド鋳型と、DNA重合酵素と、dNTPsと、緩衝溶液と、を含むPCR増幅キット。前記第1プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする請求項8に記載のPCR増幅キット。前記最終増幅産物は、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする請求項9に記載のPCR増幅キット。前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項8に記載のPCR増幅キット。前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項8に記載のPCR増幅キット。前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項8に記載のPCR増幅キット。前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで増幅反応物に提供されることを特徴とする請求項8乃至請求項13のうちいずれか一項に記載のPCR増幅キット。標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法において、a前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群を準備する段階と、b前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群を準備する段階と、cポリヌクレオチド鋳型と、DNA重合酵素と、dNTPsと、緩衝溶液と、を含む増幅反応物に前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーと前記第2プライマー群の少なくとも一つのプライマーを添加してPCR増幅反応を行う段階と、d前記PCR増幅反応過程の初期に前記鋳型に相補的な前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーが結合して増幅反応が行われ、前記第1プライマー群のプライマーが全て消尽される段階と、e前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅された増幅産物を鋳型にして前記第2プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅反応を追加に行う段階と、f前記遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅された最終増幅産物を収得する段階と、を含む標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法。前記c段階において、前記第1プライマー群は前記増幅反応物に低濃度で添加され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群に比べ高濃度で添加されることを特徴とする請求項15に記載の標的遺伝子増幅方法。前記c段階において、前記増幅反応物に添加される前記第1プライマー群のプライマーの濃度は、前記第2プライマー群のプライマーの濃度の1/2~1/20であることを特徴とする請求項16に記載の標的遺伝子増幅方法。前記c段階において、前記増幅反応物に添加される前記第1プライマー群のプライマーの濃度は、前記第2プライマー群のプライマーの濃度の1/8~1/16であることを特徴とする請求項17に記載の標的遺伝子増幅方法。前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項15に記載の標的遺伝子増幅方法。前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項15に記載の標的遺伝子増幅方法。前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項15に記載の標的遺伝子増幅方法。前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に添加されることを特徴とする請求項15乃至請求項21のうちいずれか一項に記載の標的遺伝子増幅方法。標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、a請求項15乃至請求項21のうちいずれか一項に定義された標的遺伝子増幅方法によって前記標的遺伝子を増幅する段階と、b前記a段階によって増幅された、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、切断した後の断片の塩基配列が制限された範囲内であると共に変異位置塩基を含む2つ以上の一本鎖のポリヌクレオチド断片を生成する段階と、c前記切断された断片の分子量を測定する段階と、を含む標的遺伝子の遺伝子型分析方法。前記制限酵素で切断した後の断片は変異位置塩基を含み、前記断片の塩基の数は2つ乃至32個であることを特徴とする請求項23に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項23に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項23に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする請求項23に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。前記a段階で増幅される前記標的遺伝子を増幅するための前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで提供されることを特徴とする請求項23に記載の標的遺伝子の遺伝子型分析方法。本発明は上述した問題点を解決するために、標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく正確に増幅することができ、多数の遺伝子型を特異度と敏感度を満足しながら精密に分析することができるプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むPCR増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供することにその目的がある。詳しくは、本発明は分析しようとする遺伝子配列領域の周辺塩基配列に変異が多く存在する場合、それぞれの特異的なプライマーを設計し混合して利用するが、分析しようとする遺伝子配列以下、遺伝子型分析可能配列と称するを除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅することで遺伝子変異が多様な塩基配列部分におけるPCRを可能にすると共に正確な塩基配列又は塩基変異分析を可能にするプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むPCR増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供するのにその目的がある。追加に、本発明は標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際、分析しようとする遺伝子配列、即ち、遺伝子型分析可能配列を除いては同じ遺伝子配列を有する増幅産物を生成し、制限酵素断片質量多形性法による遺伝子型分析の際現れる質量分析ピークの数字を減らして遺伝子型分析を容易にするプライマー組成物、それを利用した標的遺伝子増幅方法及びそれを含むPCR増幅キット、そしてそれを利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法を提供することにその目的がある。上述した技術的課題を解決し、上述した発明の目的に符合するように鋭意研究を重ねた結果、本発明者は標的遺伝子の多数の変異が存在する遺伝子領域を増幅する際には、それぞれの遺伝子型に対して1:1対応関係にプライマーを設計しては特異度と敏感度を全て満足するプライマーの製作が難しいため、使用されるプライマーの種類を最小化し、鋳型で塩基配列分析領域を除いた残りの配列は全て同じ配列を有するように増幅される場合、正確な塩基配列の分析が可能であるという点に着眼して本発明を完成するに至った。一方、本発明の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物は下記本発明の実施例で一例として説明する制限酵素断片質量多形性法にだけ適用可能な技術ではなく、PCR増幅産物を利用して遺伝子型を分析する多様な技術、例えば、マイクロアレイチップのような遺伝子型分析技術に適用することができる基盤技術として理解されなければならない。まず、本発明の明細書で使用される用語を説明すると以下のようである。本発明の明細書で使用される制限酵素断片質量多形性法以下、RFMP方法と称するとは、分析対象の遺伝子をPCRを介して増幅させた後、変異が位置した塩基配列部位を認識する制限酵素を利用して切断すると塩基の変異有無に応じて切断された遺伝子断片の質量が異なるようになるが、このような切断された遺伝子断片の質量差を測定して遺伝子型を分析する方法を意味する特許文献1と特許文献2を参照。また、本発明の明細書で使用される制限酵素認識配列という用語は、上述したRFMP方法を行う際、互いに異なる制限酵素によって同時に又は隣接して認識される配列であって、切断される配列と一致しなくてもよい配列を意味する。詳しくは、後述する本発明の実施例で一例として使用された制限酵素FokIとBtsCIは全てGGATG配列を認識するが、切断される位置は認識配列の3’末端からそれぞれ9番目/13番目と2番目/0番目塩基の次である。一方、制限酵素認識配列を認識する本発明で使用され得る2つの制限酵素は、本発明の目的に使用され得る全ての制限酵素、即ち、互いに同じ最適温度又は互いに異なる最適温度を有する制限酵素であることが好ましく、その中でも互いに異なる最適温度を有するものがより好ましい。相対的に低い最適温度を有する制限酵素としては、例えば、FokI,BbvI,BsgI,BcgI,BpmI,BseRI,Mme1I,AvaII又はBaeIなどがあり、相対的に高い最適温度を有する制限酵素としては、例えば、BtsCI,BstF5I,TaqI,BsaBI,BtrI,BstAPI,FauI,Bc1I,PciI又はApoIなどがある特許文献1と特許文献2を参照。また、本発明の詳細な説明全般で使用されるトリガープライマーTriggerPrimer,TP;第1プライマー群とも称するという用語は、標的遺伝子の遺伝子型分析可能配列が含まれた鋳型にそれぞれ特異的なプライマーであり、PCR反応初期に全て消尽されるようにプライマーの濃度をPCR反応物に低濃度で混合するプライマーを意味する。また、本発明の詳細な説明全般で使用される増幅プライマーAmplificationPrimer,AP;第2プライマー群とも称するという用語は、標的遺伝子の遺伝子塩基配列を整列して遺伝子型分析可能配列を決定し、プライマー結合部分を選択して準備されたプライマーであり、特定鋳型と特異的に結合するか3’末端の近くで好ましくは1~2個の塩基配列、連続的に3つまでの塩基配列が多様な鋳型とミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計され、前記トリガープライマーによるPCR増幅産物を鋳型としてPCR最終増幅産物が生成されるようにプライマーの濃度をPCR反応物に高濃度で混合するプライマーを意味する。通常は多数の標的遺伝子の遺伝子型分析可能配列が含まれた鋳型の3’末端の近くの配列に対してそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマーTPを多数個製作し、このようなトリガープライマーTPのうち共通配列が最も多いプライマーを一つ選定して増幅プライマーAPとして決定する。そして、本発明の詳細な説明全般で使用される遺伝子型分析可能配列という用語は、分析対象となる標的遺伝子の変異が多く存在する遺伝子領域であって、該当標的遺伝子の遺伝子型を他の遺伝子型と特異的に区別する配列塩基配列又はアミノ酸配列を意味する。本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物は、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群と、前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群と、を含む。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第1プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする。好ましくは、前記増幅反応物に提供される第1プライマー群の濃度は前記鋳型の増幅反応初期例えば、10乃至15PCR増幅サイクルで前記鋳型と結合し、前記鋳型の増幅産物を一定濃度まで増幅した後には全て消尽されるように濃度を調整することがよい。例えば、前記第1プライマー群のプライマーの濃度は前記第2プライマー群のプライマーの濃度の1/2~1/20が好ましく、1/8~1/16が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記増幅反応物に提供される前記第1プライマー群のプライマーの個数には制限がないが、前記増幅反応物に提供される前記第1プライマー群と前記第2プライマー群の総プライマーの濃度は2μM以内であることが好ましい。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第1プライマー群のプライマーは3’末端の塩基配列で4つ以上の塩基が前記鋳型と相補的であるべきであり、その他の塩基配列でも連続的に3つを超過する塩基が前記鋳型とミスマッチングされる場合、結合が難しい。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第1プライマー群のそれぞれのプライマーは変異が存在する塩基配列が前記鋳型と相補的に結合するように設計し、その他の塩基配列は共通の配列として前記第2プライマー群のプライマーと同じく設計され、プライマーの長さも同じく設計することが好ましい。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記最終増幅産物は前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。一方、本発明の一実施例によるプライマー組成物において、前記第1プライマー群のプライマーは必ずしもフォワードプライマーとリバースプライマーの一対で提供される必要はなく、例えば、リバースプライマーのみ提供する場合、前記第2プライマー群のフォワードプライマーと対を成して増幅反応が起こるようになる。前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に提供される。また、本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を含むPCR増幅キットは、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群と、前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群と、ポリヌクレオチド鋳型と、DNA重合酵素と、dTNPsと、緩衝溶液と、を含む。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記第1プライマー群は前記鋳型の増幅反応初期に全て消尽されるように増幅反応物に低濃度で提供され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群による増幅産物を鋳型にして最終増幅産物が生成されるように前記増幅反応物に高濃度で提供されることを特徴とする。好ましくは、前記増幅反応物に提供される第1プライマー群の濃度は前記鋳型の増幅反応初期例えば、10乃至15PCR増幅サイクルで前記鋳型と結合し、前記鋳型の増幅産物を一定濃度まで増幅した後には全て消尽されるように濃度を調整することが好ましい。例えば、前記第1プライマー群のプライマーの濃度は前記第2プライマー群のプライマーの濃度の1/2~1/20が好ましく、1/8~1/16が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記増幅反応物に提供される前記第1プライマー群のプライマーの個数には制限がないが、前記増幅反応物に提供される前記第1プライマー群と前記第2プライマー群の総プライマーの濃度は2μM以内であることが好ましい。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記最終増幅産物は前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅されることを特徴とする。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例によるPCR増幅キットにおいて、前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に提供される。また、本発明の一実施例の標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子増幅方法は、a前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列が含まれた少なくとも一つの鋳型にそれぞれ特異的な少なくとも一つのプライマーを含む第1プライマー群を準備する段階と、b前記第1プライマー群のプライマーのうち共通の塩基配列が最も多いプライマー一つを選定し、それを基準に設計された少なくとも一つのプライマーであって、前記鋳型に特異的に結合するか3’末端の近くで1~2個の塩基配列又は連続的に3つまでの塩基配列が前記鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合する少なくとも一つのプライマーを含む第2プライマー群を準備する段階と、cポリヌクレオチド鋳型と、DNA重合酵素と、dNTPsと、緩衝溶液と、を含む増幅反応物に前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーと前記第2プライマー群の少なくとも一つのプライマーを添加してPCR増幅反応を行う段階と、d前記PCR増幅反応過程の初期に前記鋳型に相補的な前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーが結合して増幅反応が行われ、前記第1プライマー群のプライマーが全て消尽される段階と、e前記第1プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅された増幅産物を鋳型にして前記第2プライマー群の少なくとも一つのプライマーによって増幅反応を追加に行う段階と、f前記遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するように増幅された最終増幅産物を収得する段階と、を含む。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記c段階において前記第1プライマー群は前記増幅反応物に低濃度で添加され、前記第2プライマー群は前記第1プライマー群に比べ高濃度で添加されることを特徴とする。好ましくは、前記c段階で前記増幅反応物に添加される前記第1プライマー群のプライマーの濃度は前記第2プライマー群のプライマーの濃度の1/2~1/20が好ましく、1/8~1/16が更に好ましいが、それに制限されずに反応条件に応じて変化し得る。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記c段階において前記増幅反応物に添加される前記第1プライマー群と前記第2プライマー群の総プライマーの濃度は2μM以内であることが好ましい。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子増幅方法において、前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで前記増幅反応物に添加される。本発明の一実施例による標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を増幅するためのプライマー組成物を利用した標的遺伝子の遺伝子型分析方法は、a上述したような標的遺伝子増幅方法によって前記標的遺伝子を増幅する段階と、b前記a段階によって増幅された、前記標的遺伝子の分析対象となる遺伝子変異塩基配列である遺伝子型分析可能配列を含み、前記遺伝子型分析可能配列を除いた部分では同じ遺伝子配列を有するポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、切断した後の断片の塩基配列が制限された範囲内であると共に変異位置塩基を含む2つ以上の一本鎖のポリヌクレオチド断片を生成する段階と、c前記切断された断片の分子量を測定する段階と、を含む。本発明の一実施例の標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記制限酵素で切断した後の断片は変異位置塩基を含み、前記断片の塩基の数は2つ乃至32個であることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHPV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号6、配列番号8乃至配列番号10で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号5及び配列番号7で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHLA-DQB1遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号25及び配列番号26で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号23及び配列番号24で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記a段階で増幅される前記標的遺伝子がHBV遺伝子である場合、前記第1プライマー群のプライマーは配列番号42乃至配列番号48で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであり、前記第2プライマー群のプライマーは配列番号40及び配列番号41で構成される群から選択される少なくとも一つのプライマーであることを特徴とする。一方、本発明の一実施例による標的遺伝子の遺伝子型分析方法において、前記a段階で増幅される前記標的遺伝子を増幅するための前記第2プライマー群のプライマーは、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで提供される。本発明によると標的遺伝子の多様な変異が存在する遺伝子領域を簡便で効率的にもれなく精密に増幅することができ、多数の遺伝子型を特異度と敏感度を満足しながら精密に分析することができる。詳しくは、本発明はPCRでトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用することで、変異が多く存在する遺伝子領域を増幅する際、分析しようとする遺伝子配列以下、遺伝子型分析可能配列と称するを除いた部分では同じ遺伝子配列を有する増幅産物が生成されるようにすることで遺伝子変異が多様な塩基配列部分におけるPCRを可能にすると共に正確な塩基配列又は塩基変異分析を可能にする。追加に、本発明によると、遺伝子型分析可能配列を除いては同じ遺伝子配列を有する増幅産物を生成し、制限酵素断片質量多形性法による遺伝子型分析を行う際現れる質量分析ピークの数字を減らして遺伝子型分析を容易にする長所がある。よって、本発明は塩基変異の分析を必要とするバイオ、医学及び薬学分野などの多様な分野に利用されることができる。以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく記述する。本発明の下記の実施例は本発明を具体化するだけのものであって、本発明の権利範囲を制限または限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推できるのは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明にて引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。実施例1.HPVHumanPapillomavirusの遺伝子型分析ヒトの子宮頸癌を誘発すると知られているヒトパピローマウィルスHumanPapillomavirus,HPVと略称するの遺伝子型分析を上述したような制限酵素断片質量多形性法以下、RFMP方法と称するを利用して行った。本実施例1は、HPVDNAを対象に実施された。HPVはパポバウィルスpapovavirus系列に属するDNAウィルスで、72個の外殻単位タンパク質体capsomerで形成された20面体であって、7,900個の塩基配列が二重円形DNAで形成されている。HPVはゲノムgenomeを構成している塩基配列の類似性に応じて120種類余りの他の亜型で分けられる。これらの120種類余りの亜型のうち30種類余りが下部生殖器に感染されると知られており、子宮頸部の上皮内の腫瘍と子宮頸癌を誘発する危険度に応じてHPV-16,HPV-18,HPV-26,HPV-30,HPV-31,HPV-33,HPV-35,HPV-39,HPV-45,HPV-51,HPV-52,HPV-53,HPV-56,HPV-57,HPV-58,HPV-59,HPV-67,HPV-68,HPV-73,HPV-74などの高危険群highrisktypeと、HPV-2a,HPV-3,HPV-6,HPV-10,HPV-11,HPV-32,HPV-34,HPV-40,HPV-42,HPV-43,HPV-44,HPV-54,HPV-55,HPV-61,HPV-69,HPV-70などの低危険群lowrisktypeで分けられるMunozNetal.,NEnglJMed,2003,3486:528-27。よって、HPVの遺伝子型分析及び検査において、多様な変異を分析するために検査対象となる数十種のHPVDNAに対して全て増幅を行わなければならない難しさがあり、また高危険群検査における特異度と敏感度を全て満足することが特に難しい。一方、HPVのゲノム構造は大きく初期転写部位Eearlygeneregionと後期転写部位Llategeneregion、そして発現されない部位であるLCRlongcontrolregionで分けられ、HPVのゲノム構造は発病の様相と危険度、予後に大きな影響を及ぼす。特に、初期転写部位のうちE6とE7遺伝子はHPVが感染細胞のゲノム内に入っている間に発現expressionされ、発癌に最も重要な役割をすると知られている。例えば、高危険群に属するHPVのE6とE7遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子tumorsuppressorgeneであるp53とrbretinoblastoma遺伝子から発現されるタンパク質とそれぞれ結合してそれらのタンパク質を不活性化し、その結果細胞周期cellcycleの調節と細胞死滅apoptosis機序が阻害されることで子宮頸部の正常細胞が癌細胞に変形される。それに対し、HPV-6,HPV-11などの低危険群に属するHPVの場合、腫瘍抑制遺伝子から発現されるタンパク質を不活性化させる能力が落ちるため、子宮頸癌を誘発しにくいと知られているBarbosaM.S.etal.,InvitrobiologicalactivitiesoftheE6andE7genesvaryamongHPVsofdifferentoncogenicpotential.J.Virol.,65:292-298,1991。よって、E6とE7遺伝子のような標的遺伝子の内の変異を検出して遺伝子型を正確に分析すると高危険群HPVの感染可否を検査することができ、それによって子宮頸癌の誘発原因を事前に探知することができる。以下の実施例では、本出願人が開発したRFMP方法に上述したようなトリガープライマー及び増幅プライマーを使用してHPV遺伝子型を分析する方法を説明する。1.PCR増幅約80種類余りのHPV遺伝子塩基配列を整列して遺伝子型分析可能配列を決定し、プライマー結合部分を選択して一対の増幅プライマーAPを製作した。即ち、増幅プライマーAPは3’末端の近くで好ましくは1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列が多様なHPVDNA鋳型とミスマッチングされながら相補的に結合するように設計した。例えば、3’末端の近くの無作為な配列に対して多様なHPVDNA鋳型にそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマーTPを多数個製作し、このようなトリガープライマーTPのうち共通配列が最も多いプライマーを一つ選定して増幅プライマーAPとして決定する。このように設計製作された高濃度の増幅プライマーAPと低濃度のトリガープライマーTPの混合物を利用してPCRを実施した。分析対象となる高危険群HPV遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型DNAの配列5’→3’は以下のようである。HPV59GCTCAGGGTTTAAACAATGGtatatgttggcacaatcaattgtTTTTAACAGTTGTAGATACTACTCGCAGCACCAATCTT配列番号1HPV16GCACAGGGCCACAATAATGGcatttgttggggtaaccaactaTTTGTTACTGTTGTTGATACTACACGCAGTACAAATATG配列番号2HPV51GCGCAGGGTCACAATAATGGcatttgctggaacaatcagcttTTTATTACCTGTGTTGATACTACCAGAAGTACAAATTTA配列番号3HPV68GCACAGGGACACAACAATGGtatttgttggcataatcaattaTTTCTTACTGTTGTGGATACCACTCGCAGTACCAATTTT配列番号4HPVの鋳型DNA配列のうち下線で示した配列は以下のプライマー1乃至プライマー6が結合される部位である。それぞれのHPV鋳型DNA配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのHPV鋳型DNA配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は遺伝子型分析可能配列である。フォワードプライマーforwardprimersプライマー1.5’-GCACAGGGCCACAAggatgAATGG-3’24mer配列番号5プライマー2.5’-GCACAGGGTTTAAAggatgAATGG-3’24mer配列番号6リバースプライマーreverseprimersプライマー3.5’-GTAGTATCAACAACggatgTAACAAA-3’26mer配列番号7プライマー4.5’-GTAGTATCAACAACggatgTTAAAAA-3’26mer配列番号8プライマー5.5’-GTAGTATCAACAACggatgTAATAAA-3’26mer配列番号9プライマー6.5’-GTAGTATCAACAACggatgTAAGAAA-3’26mer配列番号10HPV16DNA鋳型を基準にすると、前記フォワードプライマーのうちプライマー1は増幅プライマーAPであり、プライマー2はトリガープライマーTPになる。また、前記リバースプライマーのうちプライマー3は増幅プライマーAPであり、プライマー4乃至プライマー6はトリガープライマーTPとなる。フォワードプライマーは3’末端の配列で5つの塩基をHPVDNA鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは3’末端の配列で7つの塩基をHPVDNA鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はFokI及びBtsCIの制限酵素認識配列であって、本実施例ではRFMP方法を利用するためにFokIとBtsCIの制限酵素認識配列を挿入した。例えば、プライマー1はフォワード増幅プライマーAPとして全てのHPV遺伝子型において3’末端の5つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー2はHPV59DNA鋳型に相補的なフォワードトリガープライマーTPとしてHPV59DNA鋳型が連続的に4つ以上の塩基配列総4つ、太文字で記した塩基配列参照でプライマー1のフォワード増幅プライマーAPとミスマッチングされて相補的ではないため、HPV59に対してのみ特別に特異的に設計した。そして、プライマー3はリバース増幅プライマーAPとしてHPV16DNA鋳型を基準にすると3’末端の7つの塩基配列が一致するように設計するが、全てのHPV遺伝子型に対しても3’末端の7つの塩基配列が1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計した。プライマー4はHPV34、HPV59及びHPV73に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の4番目の塩基A及び6番目の塩基Tを前記プライマー3とは異なるように変異を与えて特異的に設計した太文字で記した塩基参照。プライマー5はHPV51、HPV70及びHPV82に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の4番目の塩基Tを前記プライマー3とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー6はHPV39、HPV68に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の4番目の塩基Gを前記プライマー3とは異なるように変異を与えて特異的に設計した太文字で記した塩基参照。PCR緩衝溶液PCRbuffer1x、MgSO42mM、dNTP200mM、白金TaqポリメラーゼPlatinumTaqPolymeraseInvitrogen,10966-0260.5U、プライマー1とプライマー3をそれぞれ0.4μM、プライマー2とプライマー4をそれぞれ0.05μM、プライマー5とプライマー6をそれぞれ0.025μM、分析対象となるHPVDNA100ngを入れ、総反応体積を25μlに合わせた。そして、以下のような条件でPCR反応を行った図1のステップAに当たる。94°C5分、94°C15秒45°C15秒72°C15秒45サイクル、72°C5分。初期PCR反応によっては、それぞれのHPV鋳型に相補的なトリガープライマーTPが結合してPCR増幅されて増幅産物が生成される図1のステップAに当たる。この際、HPV59DNA鋳型にはプライマー2及びプライマー4、HPV51DNA鋳型にはプライマー1及びプライマー5、そしてHPV68DNA鋳型にはプライマー1及びプライマー6が結合して以下のような増幅産物が生成され、HPV16DNA鋳型には初期反応から増幅プライマーAPであるプライマー1及びプライマー3が結合し、以下のような増幅産物が生成される。それぞれのHPVDNA鋳型において、初期PCR反応10~15サイクルによって生成されるHPVDNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HPV59GCACAGGGTTTAAAggatgAATGG[tatatgttggcacaatcaattgt]TTTTTAAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号11HPV16GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号12HPV51GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTTATTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号13HPV68GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTTCTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号14一方、それぞれのHPVDNA鋳型に特異的なトリガープライマーTPが結合HPV16DNAの場合、増幅プライマーAPがトリガープリマーTPの役割をしてHPV16DNA鋳型に結合して増幅が行われるが、PCR増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマーTPが全て消尽されてそれぞれのHPVDNA断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのHPVDNA断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマーTPとは異なる増幅プライマーAPがHPVDNA鋳型に結合して増幅が行われるようになる図1のステップB。これは、増幅プライマーAPであるプライマー3の最初設計の際、全てのHPV遺伝子型において3’末端の7つの塩基配列が1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、PCR増幅の際、トリガープライマーTPより高濃度で入れたため可能であるといえる。これで、本実施例によると、遺伝子型分析可能配列のみが多様なHPVDNA鋳型によって複製され、その他の配列以下の塩基配列で大括弧[]で示した塩基配列を除いた配列は増幅プライマーAPによって複製されて同じ塩基配列を有するようになる図1のステップC。最終PCR増幅生成物は増幅プライマーAPによる増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマーTPによる増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのHPVDNA鋳型において、最終的に生成されるHPVDNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HPV59GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatatgttgcacaatcaattgt]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号15HPV16GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgttggggtaaccaacta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号16HPV51GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[catttgctggaacaatcagctt]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号17HPV68GCACAGGGCCACAAggatgAATGG[tatttgttggcataatcaatta]TTTGTTAcatccGTTGTTGATACTAC配列番号18前記PCRを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧[]で示した部位は遺伝子型分析可能配列である。一方、本発明ではHPV59,HPV16,HPV51,HPV69に対してのみトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を実施したが、上述したHPVのタイプのうちその他の多様な種類の高危険群HPV及び/又は低危険群HPVに対してもトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。2.制限酵素による切断、精製及び脱塩前記PCRを介して増幅された生成物にFokINEBR109L1U、BtsCINEBR0647S1U、50mMポタシウムアセテート、20mMトリス-アセテートTris-acetate、10mMマグネシウムアセテート及び1mMDTT25°CでPH7.9を入れ、37°Cで1時間反応させた。制限酵素で処理した前記溶液から切断されたDNA断片を純粋分離した後、分離されたDNA断片の分子量を測定することが好ましい。例えば、制限酵素によって切断されたDNA断片の純粋分離のために、OasisWatersC18イオン樹脂交換カラムC18reversephasecolumnchromatographyを利用してもよい。まず、前記制限酵素で処理した溶液に0.15MトリエチルアンモニウムアセテートTEAA,pH7.670μlを入れて1分間放置する。カラムに100アセトニトリルACN;Sigma,USAと0.1MTEAA1mlを通過させてレジンResinを活性化させた後、前記制限酵素で処理した溶液と0.15MTEAAとの混合液100μl、0.1MTEAA2ml及び3次蒸留水1mlを順番に完全に通過させる。収集プレートCollectionPlateの上に前記カラムを位置させ、70ACN100μlを入れて通過させる。溶出液が収集プレートに集められると、前記収集プレートを120°Cで60分間乾燥させる。3.マルディトフマススペクトロメトリーMALDI-TOFMassSpectrometryマルディマトリックスMALDImatrix[22.8mgアンモニウムシトレート、148.5mgヒドロキシピコリン酸hydroxypicolinicacid、1.12mlアセトニトリル、7.8mlH2O]4μlをマルディトフマススペクトロメトリーBiflexIV、BrukerのアンカーチッププレートAnchorchipplateに予め点滴dottingした後、37°Cで30分間乾燥させる。精製及び脱塩過程を経た収集プレートのサンプルに3次蒸留水を10μl入れて溶かした後、乾燥されたマルディマトリックスの上に2μl点滴し、マルディマトリックスを更に37°Cで30分間乾燥させた後、マルディトフマススペクトロメトリーで分析する。分析方法はマルディトフマススペクトロメトリーのマニュアルに従う。前記反応によって生成された断片の分子量をマルディトフマススペクトロメトリーで分析した結果は図2乃至図5に示したようであり、多様なHPVに対する分析結果を整理して分子量として下記表1に示した。下記表1の結果に基づいて、HPV遺伝子型を決定することができる。下記表1は増幅プライマーAPによって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマーTPによって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマーTPを反応濃度以上で混合した際には増幅プライマーAPによる断片の分子量とトリガープライマーTPによる断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。それぞれのトリガープライマーTPを反応濃度以下で混合した際には該当HPV遺伝子の分析が行われなかった。一方、図2乃至図5に示したHPV59,HPV16,HPV51及びHPV68遺伝子型のマルディトフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマーAPによる断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅後RFMP方法は、多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。実施例2.HLAHumanLeukocyteAntigen-DQB1遺伝子型分析一方、本発明によるトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅が多様な遺伝子型分析に利用可能であるのか否かを追加に確認した。そのために、ヒトの免疫反応に関する主な組織適合性抗原であるHLAHumanLeukocyteAntigen-DQB1遺伝子型分析をトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅の後、RFMP方法を利用して行った。実施例2はヒトのゲノムDNAを対象に行った。1.PCR増幅約100種類余りのHLA-DQB1遺伝子塩基配列を整列して遺伝子型分析可能配列を決定し、プライマー結合部分を選択して一対の増幅プライマーAPを製作した。また、HLA-DQB10201タイプの3’末端と5’末端の特異的な配列に対してHLA-DQB10201DNA鋳型と相補的に結合するように一対のトリガープレイマーTPを設計した。このように設計製作された高濃度の増幅プライマーAPと低濃度のトリガープライマーTPの混合物を利用してPCRを実施した。分析対象となるHLA-DQB1対立遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型DNAの配列5’→3’は以下のようである。HLA-DQB10501TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcggggtgtgaccagacACATCTATAACCGAGAGGAGTACGTGCGCTTCGAC配列番号19HLA-DQB10201TGTGCTACTTCACCAACGGGACAGAGCgcgtgcgtcttgtgagcagaaGCATCTATAACCGAGAAGAGATCGTGCGCTTCGAC配列番号20HLA-DQB10401TGTGCTACTTCACCAACGGGACCGAGCtcgtgcggggtgtgaccagatACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCGCGCTTCGAC配列番号21HLA-DQB10301TGTGCTACTTCACCAACGGGACGGAGCgcgtgcgttatgtgaccagatACATCTATAACCGAGAGGAGTACGCACGCTTCGAC配列番号22HLA-DQB1対立遺伝子の鋳型DNA配列のうち、下線で示した配列は以下のプライマー7乃至プライマー10が結合される部位である。それぞれのHLA-DQB1対立遺伝子の鋳型DNA配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのHLA-DQB1対立遺伝子の鋳型DNA配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は遺伝子型分析可能配列である。プライマー7.5’-TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC-3’30mer配列番号23プライマー8.5’-GCGTGCGTACTCCTCTCGGTggatgATAGATGT-3’33mer配列番号24プライマー9.5’-TGTGCTACTTCACCAACggatgGACAGAGC-3’30mer配列番号25プライマー10.5’-GCGCACGATCTCTTCTCGGTggatgATAGATGC-3’33mer配列番号26フォワードプライマーであるプライマー7は増幅プライマーAPであり、フォワードプライマーであるプライマー9はトリガープライマーTPとなる。また、リバースプライマーであるプライマー8は増幅プライマーAPであり、リバースプライマーであるプライマー10はトリガープライマーTPとなる。フォワードプライマーは3’末端の配列で4つの塩基をHLA-DQB1DNA鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは3’末端の配列で7つの塩基をHLA-DQB1DNA鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はFokI及びBtsCIの制限酵素認識配列であって、本実施例ではRFMP方法を利用するためにFokIとBtsCIの制限酵素認識配列を挿入した。例えば、プライマー7はフォワード増幅プライマーAPとして全てのHLA-DQB1遺伝子型において3’末端の4つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー9はHLA-DQB10201DNA鋳型に相補的なフォワードトリガープライマーTPとして3’末端の1つの塩基配列A;太文字で記した塩基配列参照でプライマー7のフォワード増幅プライマーAPと相補的ではないため、HLA-DQB10201に対して特別に特異的に設計した。また、プライマー8はリバース増幅プライマーAPとしてHLA-DQB10201タイプを除いた全てのHLA-DQB1遺伝子型において3’末端の7つの塩基配列が一致するように設計し、プライマー10はHLA-DQB10201DNA鋳型に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の1つの塩基配列と5’末端の5つの塩基配列を特異的に設計した。PCR緩衝溶液PCRbuffer1x、MgSO42mM、dNTP200mM、白金TaqポリメラーゼPlatinumTaqPolymeraseInvitrogen,10966-0260.5U、プライマー7とプライマー8をそれぞれ0.4μM、プライマー9とプライマー10をそれぞれ0.025μM、ヒトDNA100ngを入れ、総反応体積を25μlに合わせた。そして、以下のような条件でPCR反応を行った図1のステップAに当たる94°C5分、94°C15秒45°C15秒72°C15秒45サイクル、72°C5分。初期PCR反応によっては、それぞれのHLA-DQB1鋳型に相補的なトリガープライマーTPが結合してPCR増幅されて増幅産物が生成される図1のステップAに当たる。例えば、HLA-DQB10201タイプのDNA鋳型にはプライマー9及びプライマー10が結合して以下のような増幅産物が生成される。HLA-DQB10201タイプのDNA鋳型において、初期PCR反応10~15サイクルによって生成されるHLA-DQB10201DNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HLA-DQB10201TGTGCTACTTCACCAACggatgGACAGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa]GCATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGTGCGC配列番号27一方、HLA-DQB10201タイプに特異的なトリガープライマーTPが結合して増幅が行われるが、PCR増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマーTPが全て消尽されてそれぞれのHLA-DQB1DNA断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのHLA-DQB1DNA断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマーTPとは一部配列が異なる増幅プライマーAPがHLA-DQB1DNA鋳型に結合して増幅が行われるようになる図1のステップB。これは、増幅プライマーAPであるプライマー8の最初設計の際、全てのHLA-DQB1遺伝子型において3’末端の7つの塩基配列が1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、PCR増幅の際、トリガープライマーTPより高濃度で入れたため可能であるといえる。これで、本実施例によると、遺伝子型分析可能配列のみが多様なHLA-DQB1DNA鋳型によって複製され、その他の配列以下の塩基配列で大括弧[]で示した塩基配列を除いた配列は増幅プライマーAPによって複製されて同じ塩基配列を有するようになる図1のステップC。最終PCR増幅生成物は増幅プライマーAPによる増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマーTPによる増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのHLA-DQB1DNA鋳型において、最終的に生成されるHLA-DQB1DNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HLA-DQB10501TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGAGC[gcgtgcggggtgtgaccagac]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC配列番号28HLA-DQB10201TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGGAGC[gcgtgcgtcttgtgagcagaa]ACATCTATcatccACCGAGAAGAGATCGCACGC配列番号29HLA-DQB10401TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGAGC[tcgtgcggggtgtgaccagat]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC配列番号30HLA-DQB10301TGTGCTACTTCACCAACggatgGACGAGC[gcgtgcgttatgtgaccagat]ACATCTATcatccACCGAGAGGAGTACGCACGC配列番号31前記PCRを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧[]で示した部位は遺伝子型分析可能配列である。前記増幅生成物の生成原理は、実施例1と同じである。一方、本発明ではHLA-DQB10501,HLA-DQB10201,HLA-DQB10401,HLA-DQB10301に対してのみトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を実施したが、上述したHLA-DQB1タイプのうちその他の多様な種類の対立遺伝子に対してもトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。2.制限酵素による切断、精製及び脱塩実施例1と同じ方法で行った。3.マルディトフマススペクトロメトリー実施例1と同じ方法で行った。前記反応によって生成された断片の分子量をマルディトフマススペクトロメトリーで分析した結果は図6乃至図7に示したようであり、多様なHLA-DQB1対立遺伝子に対する分析結果を整理して分子量として下記表2に示した。下記表2の結果に基づいて、HLA-DQB1の遺伝子型を決定することができる。下記表2は増幅プライマーAPによって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマーTPによって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマーTPを0.025μM以上混合した際には増幅プライマーAPによる断片の分子量とトリガープライマーTPによる断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。一方、トリガープライマーTPを0.025μM以下で混合した際には該当HLA-DQB1遺伝子の分析が行われなかった。一方、図6にはヒトのHLA-DQB1遺伝子がヘテロ0201/0501である場合の遺伝子型のマルディトフマススペクトロメトリーグラフが示されており、図7にはヒトのHLA-DQB1遺伝子がヘテロ0301/0401である場合の遺伝子型のマルディトフマススペクトロメトリーグラフが示されている。これらのマルディトフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマーAPによる断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅の後、RFMP方法は多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。実施例3.B型肺炎ウィルスhepatitisBvirusDNA重合酵素のアデフォビルに対する耐性関連塩基変異分析ヒトにB型肺炎を誘発させるB型肺炎ウィルスのDNA重合酵素の遺伝子内には塩基変異が多く現れる。それらの部位のうち一部の塩基変異によってB型肺炎の治療剤であるアデフォビルAdefovirに対する耐性が発生するが、アミノ酸A181V/T,N236Tなどが原因突然変異として報告されている。一方、本発明によるトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅が多様な遺伝子型分析に利用可能であるのか否かを追加に確認するために、アデフォビル薬剤に耐性を有するB型肺炎ウィルスの遺伝子型分析をトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅の後、RFMP方法を利用して行った。本実施例3は、HBVDNAを対象に実施された。1.PCR増幅B型肺炎ウィスルのDNA重合酵素遺伝子の内の236番目のアミノ酸の塩基配列を分析するために一対の増幅プライマーAPを製作し、多形性を有する237番目のアミノ酸、238番目のアミノ酸の塩基配列に対して、多様なHBVDNA鋳型にそれぞれ特異的なプライマー、即ち、トリガープライマーTPを多数個設計した。このように設計製作された高濃度の増幅プライマーAPと低濃度のトリガープライマーTPの混合物を利用してPCRを実施した。分析対象となるHBV遺伝子において、プライマーによって増幅される鋳型DNAの配列5’→3’は以下のようである。HBV1一般型TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTAATAAAACCAAACGTTGGG配列番号32HBV2TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTACTAAAACCAAACGTTGGG配列番号33HBV3TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTGATAAAACCAAACGTTGGG配列番号34HBV4TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCCTCATAAAACCAAACGTTGGG配列番号35HBV5TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATAATAAAACCAAACGTTGGG配列番号36HBV6TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATACTAAAACCAAACGTTGGG配列番号37HBV7TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATGATAAAACCAAACGTTGGG配列番号38HBV8TACCAATTTTCTTTTTGTCTTTGGGTATACATTTaaacCATCATAAAACCAAACGTTGGG配列番号39HBVの鋳型DNA配列のうち下線で示した配列は以下のプライマー11乃至プライマー19が結合される部位である。それぞれのHBV鋳型DNA配列の前方に下線で示した部分はフォワードプライマーが結合する部位であり、それぞれのHBV鋳型DNA配列の後方に下線で示した部分はリバースプライマーが結合する部位である。小文字で記された塩基は遺伝子型分析可能配列である。フォワードプライマープライマー11.5’-TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT-3’39mer配列番号40リバースプライマープライマー12.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTAGG-3’27mer配列番号41プライマー13.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTAGTAGG-3’27mer配列番号42プライマー14.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATCAGG-3’27mer配列番号43プライマー15.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATGAGG-3’27mer配列番号44プライマー16.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATTATG-3’27mer配列番号45プライマー17.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTAGTATG-3’27mer配列番号46プライマー18.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATCATG-3’27mer配列番号47プライマー19.5’-CCCAACGTTTggatgGGTTTTATGATG-3’27mer配列番号48HBV1DNA鋳型を基準にすると、フォワードプライマーであるプライマー11は増幅プライマーAPであり、前記リバースプライマーのうちプライマー12は増幅プライマーAPであり、プライマー13乃至プライマー19はトリガープライマーTPでとなる。フォワードプライマーは3’末端の配列で19個の塩基をHBVDNA鋳型に相補的に設計し、リバースプライマーは3’末端の配列で12個の塩基をHBVDNA鋳型に相補的に設計した。前記プライマーにおいて、小文字で記された配列はFokI制限酵素認識配列であって、本実施例ではRFMP方法を利用するためにFokIの制限酵素認識配列を挿入した。例えば、プライマー11はフォワード増幅プライマーAPとして全てのHBV遺伝子型において3’末端の19個の塩基配列が一致するように設計し、プライマー12はリバース増幅プライマーAPとしてHBV1DNA鋳型を基準にすると3’末端の12個の塩基配列が一致するように設計するが、全てのHBV遺伝子型に対しても3’末端の12個の塩基配列が1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計した。そして、変種HBVの場合、DNAの3’末端で一般型HBVとは異なる塩基配列を有している点を踏まえて、プライマー13乃至19はHBVDNAの237番目のアミノ酸塩基配列及び238番目のアミノ酸塩基配列に対する変異別特異的なプライマーとして設計した。即ち、プライマー13はHBV2に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の5番目の塩基Gを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー14はHBV3に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の4番目の塩基Cを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー15はHBV4に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の4番目の塩基Gを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー16はHBV5に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の2番目の塩基Tを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー17はHBV6に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の2番目の塩基T及び5番目の塩基配列Gを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、プライマー18はHBV7に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の2番目の塩基T及び4番目の塩基配列Cを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計し太文字で記した塩基参照、最後にプライマー19はHBV8に相補的なリバーストリガープライマーTPとして3’末端の2番目の塩基T及び4番目の塩基配列Gを前記プライマー12とは異なるように変異を与えて特異的に設計した太文字で記した塩基参照。PCR緩衝溶液PCRbuffer1x、MgSO42mM、dNTP200mM、白金TaqポリメラーゼPlatinumTaqPolymeraseInvitrogen,10966-0260.5U、プライマー11とプライマー12をそれぞれ0.4μM、プライマー13とプライマー14をそれぞれ0.07μM、プライマー15とプライマー16をそれぞれ0.04μM、プライマー17、18及び19はそれぞれ0.05μM、分析対象となるHBVDNA100ngを入れ、総反応体積を25μlに合わせた。そして、以下のような条件でPCR反応を行った図1のステップAに当たる94°C5分、94°C15秒45°C15秒72°C15秒45サイクル、72°C5分。初期PCR反応によっては、それぞれのHBV鋳型に相補的なトリガープライマーTPが結合してPCR増幅されて増幅産物が生成される図1のステップAに当たる。この際、HBV2DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー13、HBV3DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー14、HBV4DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー15、HBV5DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー16、HBV6DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー17、HBV7DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー18、そしてHBV8DNA鋳型にはプライマー11及びプライマー19が結合して以下のような増幅産物が生成され、HBV1DNA鋳型には初期反応から増幅プライマーAPであるプライマー11及びプライマー12が結合し、以下のような増幅産物が生成される。それぞれのHBVDNA鋳型において、初期PCR反応10~15サイクルによって生成されるHBVDNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HBV1一般型TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号49HBV2TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTACTAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号50HBV3TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTGATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号51HBV4TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTCATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号52HBV5TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号53HBV6TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATACTAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号54HBV7TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATGATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号55HBV8TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CATCATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号56一方、それぞれのHBVDNA鋳型に特異的なトリガープライマーTPが結合HBV1DNAの場合、増幅プライマーAPがトリガープリマーTPの役割をしてHBV1DNA鋳型に結合して増幅が行われるが、PCR増幅過程において初期に低濃度で入れたトリガープライマーTPが全て消尽されてそれぞれのHBVDNA断片が一定濃度まで増幅された後には、それぞれのHBVDNA断片のプライマー結合配列一部においてトリガープライマーTPとは一部配列が異なる増幅プライマーAPがHBVDNA鋳型に結合して増幅が行われるようになる図1のステップB。これは、増幅プライマーAPであるプライマー12の最初設計の際、全てのHBV遺伝子型において3’末端の12個の塩基配列が1~2個の塩基配列、最大限連続的に3つの塩基配列とのミスマッチングを許容しながら相補的に結合するように設計し、PCR増幅の際、トリガープライマーTPより高濃度で入れたため可能であるといえる。これで、本実施例によると、遺伝子型分析可能配列のみが多様なHBVDNA鋳型によって複製され、その他の配列以下の塩基配列で大括弧[]で示した塩基配列を除いた配列は増幅プライマーAPによって複製されて同じ塩基配列を有するようになる図1のステップC。最終PCR増幅生成物は増幅プライマーAPによる増幅生成物が大部分を占めるようになり、トリガープライマーTPによる増幅生成物は分析結果に影響を及ぼさないほどの微量のみが存在する。それぞれのHBVDNA鋳型において、最終的に生成されるHBVDNA断片の配列は以下のようである5’→3’。HBV1一般型TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号57HBV2TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号58HBV3TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号59HBV4TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号60HBV5TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号61HBV6TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号62HBV7TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号63HBV8TACCAATTTTCTTTTggatgTGTCTTTGGGTATACATTT[aaac]CCTAATAAAACCcatccAAACGTTGGG配列番号64前記PCRを介して生成された配列において、小文字で記された部位は制限酵素認識配列であり、下線で示した部位は制限酵素による切断によって生成される断片の配列であり、大括弧[]で示した部位は遺伝子型分析可能配列である。前記増幅生成物の生成原理は、実施例1と同じである。一方、本発明ではHBV1からHBV8に対してのみトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を実施したが、上述した他の多様な変種HBVに対してもトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅を応用することができるということは本発明が属した技術分野の当業者であれば容易に理解できるはずである。2.制限酵素による切断、精製及び脱塩実施例1と同じ方法で行った。3.マルディトフマススペクトロメトリー実施例1と同じ方法で行った。前記反応によって生成された断片の分子量をマルディトフマススペクトロメトリーで分析した結果は図8乃至図9に示したようであり、多様なHBVに対する分析結果を整理して分子量として下記表3に示した。下記表3の結果に基づいて、HBV遺伝子型を決定することができる。下記表3は増幅プライマーAPによって増幅された生成物に基づいて予測した断片の分子量を示したものであって、トリガープライマーTPによって増幅された生成物による断片の分子量とは差がある。本実施例によると、それぞれのトリガープライマーTPを反応濃度以上で混合した際には増幅プライマーAPによる断片の分子量とトリガープライマーTPによる断片の分子量が同時に現れることを確認することができた。それぞれのトリガープライマーTPを反応濃度以下で混合した際には該当HBV遺伝子の分析が行われなかった。一方、図8には塩基変異の際、アデフォビルへの耐性を誘発するHBV重合酵素の236番目のコドンがAACで、アミノ酸アスパラギンAsnをコーディングする野生型HBV遺伝子型である場合のマルディトフマススペクトロメトリーグラフが示されており、図9には塩基変異の際、アデフォビルへの耐性を誘発するHBV重合酵素の236番目のコドンがACTで、アミノ酸トレオニンThrをコーディングする突然変異型HBV遺伝子型である場合のマルディトフマススペクトロメトリーグラフが示されている。これらのマルディトフマススペクトロメトリーグラフを分析すると、本実施例による増幅産物では増幅プライマーAPによる断片の分子量のみが確認されることが分かる。よって、本発明によるトリガープライマーTPと増幅プライマーAPを利用したPCR増幅の後、RFMP方法は多数の変種遺伝子を簡便で効率的にもれなく増幅することができ、多数の遺伝子型を精密に分析することができる長所がある。以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者であれば本発明の趣旨および範囲を外れることなく修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることを知ることができる。"