未知の核酸を識別する方法であって、該方法は、反応チャンバ中で、未知のポリ核酸と既知の核酸試薬を組み合わせる工程;1以上の未知の核酸の塩基が、既知の試薬内に含まれる1以上の既知の核酸の塩基に相補的である場合、重合反応から第1の量のプロトンを生産する工程;1以上の酵素による重合反応の副産物の加水分解反応から、第2の量のプロトンを生産する工程;反応チャンバに曝露されるISFETから生じる電気的出力信号を監視する工程;及び出力信号の変化と、未知のポリ核酸と既知の試薬との間の反応とを相互に関連付ける工程であって、それにより未知の核酸を識別する、工程、を含むことを特徴とする方法。出力信号の著しい変化が存在するかどうかを測定する工程、及びそのような著しい反応のみを相互に関連付ける工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。既知のヌクレオチドは、dATP、dGTP、dTTP、又はdCTPの1つであり、既知の核酸はプライマーであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。前記方法の工程は、未知の核酸を配列決定するために繰り返され、前記工程の繰り返しは、既知のヌクレオチドとしてdATP、dGTP、dTTP、又はdCTPの1つを使用することを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。既知の核酸は、対立遺伝子-特異的プライマーであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。重合反応は、対立遺伝子-特異的増幅反応であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。副産物の1つはピロリン酸塩であり、1以上の酵素はピロホスファターゼを含むことを特徴とする、請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。ピロリン酸塩は、重合反応及び分解反応がほぼ同時に起こるように、重合反応の開始前に反応チャンバに加えられることを特徴とする、請求項7に記載の方法。副産物の1つがDNAであり、酵素の1以上は、DNAを分解するための酵素を含むことを特徴とする、請求項1乃至8のいずれかに記載の方法。1以上の酵素は、エキソヌクレアーゼ、好ましくはT7エキソヌクレアーゼ、RecJf、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、及びBAL-31エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼIII又はラムダエキソヌクレアーゼから成る群から選択されるものの1以上を含むことを特徴とする、請求項9に記載の方法。1以上の酵素は、分解反応が重合反応の後に生じるように、重合反応開始後に反応チャンバに加えられることを特徴とする、請求項1乃至10のいずれかに記載の方法。電気的出力信号は、ISFETと、別のISFET又はMOSFETとの間で差動的に測定されることを特徴とする、請求項1乃至11のいずれかに記載の方法。出力信号の著しい変化が存在するかどうかの測定は、電気的出力信号の変化の規模を測定する工程を含むことを特徴とする、請求項2乃至12のいずれかに記載の方法。出力信号の著しい変化が存在するかどうかの測定は、閾値信号の変化の値に対する電気的出力信号の変化を比較する工程を含むことを特徴とする、請求項2乃至13のいずれかに記載の方法。出力信号の著しい変化が存在するかどうかの測定は、分解反応からの出力信号の変化とは別に、重合反応からの出力信号の変化を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項2乃至14のいずれかに記載の方法。出力信号の著しい変化が存在するかどうかの測定は、出力信号の変化と、未知の核酸の1以上のヌクレオチドが既知のヌクレオチド及び/又は既知の核酸に相補的でないために重合反応が生じない場合の出力信号の変化とを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項2乃至15のいずれかに記載の方法。詳細な説明本明細書には、新たに合成された核酸に関連する分解反応を監視する検知方法が記載される。この分解反応の基質は、ヌクレオシドが拡張する鎖に加えられる即ち、形成するためにポリマー化されるにつれてそれ自体が水素イオンを放出する、核酸重合初期反応から生じる。従って、分解反応は、第2反応として称される。第2反応から更に放出される水素イオンの検知は、単独で、又は初期反応から放出される水素イオンの検知に加えて適用され得る。第2反応の作成は、初期反応の副産物の触媒作用主に加水分解に関与し、初期信号への追加の第2信号を開始する。初期反応と同じ検知器によって検知される任意の第2反応は、インサイツinsituの信号の増強として観察され得る。第2反応から放出される水素イオンはまた、別々の検知器によって検知され得る。要するに、目的は信号の増強であり、故にバックグラウンドにわたる精度の増加を可能にすることである。このことは、実際はバックグラウンドを利用することにより達成される。第2反応から放出される水素イオンは、好ましくは、初期反応と同じ即ち、単一のISFETセンサーにより検知されるが、例えば、反応チャンバにつき2つのセンサーが使用される場合、又は初期反応及び第2反応が異なる時間或いは位置にて生じる場合、更なるセンサーによっても検知され得る。分解反応は、例えば、好ましくは基質から1以上の分解産物を生産する酵素により触媒される反応である。例えば、好ましい酵素は、ピロリン酸塩又はエキソヌクレアーゼであり、その両方は加水分解酵素であって、リン酸結合の加水分解を触媒し、従って、最終収率より多くのultimateyieldmore水素イオンへのリン酸結合を分解する。従って、分解酵素は、特に核酸即ち、核酸リン酸ジエステル結合nucleicacidphosphodiesterbondsのコンテキストにおいて、リン酸塩/リン酸ジエステル結合を加水分解することができるものであることが、特に好ましい。好ましくは、初期の化学反応は、RNAとDNAが特に好ましい、2以上のヌクレオチドである新生のポリヌクレオチドの鎖の合成である。イオン電荷の変動は、新生のポリヌクレオチドの鎖の上への、ジデオキシヌクレオチド三リン酸ddNTP及びデオキシヌクレオチド三リン酸dNTPの挿入を示すことが好ましい。新生のポリヌクレオチドの鎖は、完全に新しいポリヌクレオチドの鎖、又は代替的に、好ましい配列決定反応中に加えられる、プライマー等のアニールされた鎖の新しく加えられた切片であり得る。好ましくは、新生のポリヌクレオチドの鎖は、テンプレートの鎖の補体である。本発明は、DNAへの言及と共に本明細書に記載されるが、他の核酸にも等しく適用される。本発明の実施形態を使用するDNA塩基配列決定は、以下の通り、好ましいポリヌクレオチドのようなDNAへの言及と共に実行される。対象のDNAの量は、ポリメラーゼ連鎖反応、又はクローニング、或いは他の増幅技術のいずれかを使用して増幅されるが、対象の領域は、例えばmRNAプライマーを使用して準備される。DNAポリメラーゼは、プライマーの拡大など、成長するDNA鎖例えば、本明細書にて言及される新生の鎖におけるヌクレオチド塩基の取り込みを通じて、DNA合成重合を触媒する。ISFETは当該技術分野において既知である。好ましくは、本明細書で使用されるISFETは、ポリメラーゼの層が提供され得る上部にて、窒化シリコンなどのイオン感受性層と共に提供される。pH変化の規模は、ヌクレオチド挿入新生のポリヌクレオチドの鎖の伸長を確実に検知するために、検知される。ISFETの電気信号の変化は、DNA合成中のヌクレオチド挿入を示す。新生の鎖へのヌクレオチド三リン酸の挿入の際、ピロリン酸塩PPi又はP2074のイオンが放出される。核酸の重合は、細胞複製、遺伝子発現、又はDNA修復などの多くの生体反応において見出される。反応は一般的に、酵素例えば、ポリメラーゼの助力により生じる。宿主細胞又は生体の外部で核酸複製を複製する技術が発展してきた。このことは、インビトロinvitroでの核酸の増幅、核酸の配列決定、遺伝子型決定、及び分子診断などの多くに適用される。典型的な核酸の重合は、三リン酸デオキシヌクレオチド、及び以下のように表わされるDNA基質に関与し得る。xdNTPDNAy→xPPiDNAxyHdNTPのx分子は、ピロリン酸塩のx分子へと加水分解され、DNAは、yヌクレオチドからxyヌクレオチドまで拡大される。反応はまた、ヌクレオチドに関与し、RNAと核酸の基質は、二本鎖又は単鎖であり得る。放出される水素イオンの実際の数は、試薬のpK値等の様々な因子に依存する。この重合反応が起こるのは、ヌクレオチドの5’の末端が、第2のテンプレート又は標的のポリ核酸へとアニールされる3’拡大しているの末端上に組み込まれる時であり、第2のテンプレート又は標的のポリ核酸の配列又は核酸の同一性が測定されるべきである。取り込みは、ヌクレオチドが、取り込みの位置に対向する第2ポリ核酸即ち、テンプレートの鎖の塩基に相補的である場合にのみ生じる即ち、チミン/ウラシルはアデニンに相補的であり、グアニンはシトシンに相補的である。この反応において、新たに合成された例えば、DNAの新生の鎖及びPPiは、副産物、水素イオンである対象の主産物であると考慮される。しかし、我々は驚くことに、これらしばしば無視されたoft-neglected副産物が、更なる水素イオンを生産し、それにより検知された反応の精度を増強するために分解され得ることを発見した。完成した化学系は、故に以下の通りである:dNTPDNAy→PPiDNAy1HpHの初期変化PPiPPase→2PiPPaseHpHの第2変化DNAy1エキソヌクレアーゼ→dMTPエキソヌクレアーゼHPPiの分解に加えて、又はそこから別々に使用され得る更なる実施形態に従った、pHの第2変化初期反応は、加えられるヌクレオチド又はプライマーが、配列決定されるDNAの未知のテンプレートの鎖に相補的である場合即ち、1つ又は各々のヌクレオチドの塩基は、例えばC、G、A、T、又はUであるとして識別されるに生じる、DNAの首尾良いポリマー化に依存する。第2反応は、初期反応により生産される副産物に依存する。それ故、全体の反応は、加えられるヌクレオチド又はプライマーが、未知のテンプレートのDNAに相補的である場合、プロトンを生産する即ち、プロトンの純放出netreleaseをもたらす。これらプロトンは、ISFETにより検知され、サンプル中の本来のDNAを識別するため、特異的なヌクレオチドの追加及びプライマーに相互に関連付けられる。それ故、新生の鎖を拡大するためにヌクレオチド又はプライマーが加えられたことが既知であることは、未知のテンプレートの核酸の一部を識別するであろう。重合反応は、対立遺伝子特異的プライマー及び混合されたdNTPによる未知の核酸の加水分解から、結果として生じ得る。代替的に、プライマーは、対象の位置にまで未知の核酸をアニールし、その後既知のdNTPを加えるために使用され得る。更なる代替案において、重合反応は、PCR又は等温増幅を使用する対立遺伝子-特異的増幅反応であり得る。対立遺伝子-特異的プライマーの使用は、SNPなどの識別、即ち、関連する位置でのヌクレオチドの同一性の特定のSNPの存在下又は欠如下での測定を可能にし、それにより、サンプル中の対立遺伝子を識別するidentity。PPiへのdNTPの加水分解は、特定のpH範囲内で、及び二価金属イオンマグネシウム又はマンガンなどの存在により、プロトンの濃度の変化を引き起こす。ピロリン酸塩の加水分解は、2つのリン酸塩を生産する。特定のpH範囲での、及び二価金属イオンマグネシウム又はマンガンなどの存在下でのピロリン酸塩の加水分解は、dNTPの加水分解と同様のpH変化をもたらす。無機のPPaseは、以下に表わされるように、正リン酸塩を形成するため無機のPPiの加水分解を触媒するために使用され得る:P2O7-4H2OPPiase→2HP04-2Hピロリン酸塩は一般に、酵素の助力無しで、1日以上の間安定している。好ましい反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定、又はプライマー伸張である。前記反応において、ピロリン酸塩は、反応混合物中で安定したままである。pH変化は、反応の機能function及び反応の割合である。酵素又はピロリン酸塩を加水分解するが三リン酸を加水分解しない酵素を加えることにより、より大きなpH変化がdNTPの加水分解からのものの上部に加えられる。ピロリン酸塩の加水分解を触媒する酵素が三リン酸塩に作用しないことが重要である。多くの技術において、三リン酸塩の加水分解は、標的分子又は特異的反応の存在と共にしっかりと連結される。ピロホスファターゼは、二リン酸塩結合の際に作用する、酸無水物ヒドロラーゼである。無機ピロホスファターゼ又は熱安定の無機ピロホスファターゼ等の酵素は、前記基準を満たす。ピロホスファターゼは広く利用可能であり、重合反応においてポリメラーゼと共に混合され得る。配列決定の場合において、ピロホスファターゼは、pH変化を増加するためDNAポリメラーゼと並行して使用される。PPiが、以前は単にDNA重合の副産物であると考えられ、検知による複雑化を避けるために最も良く除去又は無視され、及びバックグラウンドノイズを誘発できたため、我々は最初に、利用される場合、その介在物が検知の精度に関する有益な効果を有し得ることを識別した。1つの実施形態において、熱安定のピロホスファターゼは、PCR反応において熱安定のDNAポリメラーゼと共に混合される。ピロホスファターゼは、重合の産物であるPPiの加水分解を触媒する。ピロリン酸塩の加水分解は、以前は良くとも廃棄物であると考えられ、それ故、単一のヌクレオチドの追加から合計のpHの変化即ち、水素イオンの濃度を増加する。それ故、ヌクレオシドの追加の際にISFETからの信号検知を増大又は増強するためPPaseの使用を含む、PCR増幅の方法も、提供される。反応の効果は、図2において実証される。pHの変化は、4つの反応に関して350秒間測定される。線4は、ピロリン酸塩又はピロホスファターゼのいずれも有していない反応を示し;pHはほんの少ししか変化しない。線2は、ピロリン酸塩を有していないが、幾つかのピロホスファターゼを有している反応を示し;pHは最初に、加えられたピロホスファターゼ緩衝液に対する反応において変化するが、その後、平衡になるまで減少し、オフセットは単に、緩衝液の追加を示し、反応からのプロトン放出を示さない。線1は、ピロリン酸塩及びピロホスファターゼの両方を有する反応を示し;pHの変化は平衡になるまで増加する。反応において使用される試薬は、KCI、MgCI2、PPaseを含む。好ましい濃度が以下に提供される。好ましくは、KCIの濃度は、10mMよりも大きく、より好ましくは、40mM、50mM、80mM、100mM、又は120mMよりも大きい。好ましくは、前記濃度は、500mM未満であり、より好ましくは、400mM、300mM、又は200mM未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。好ましくは、MgCI2の濃度は、1mMよりも大きく、より好ましくは、2mM、3mM、又は4mMよりも大きい。好ましくは、前記濃度は、10mM未満、より好ましくは、8mM、7mM、又は5mM未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。好ましくは、50μlの反応の量におけるPPiaseの量は、0.01Uより大きく製造業者により規定される条件下で、Uが酵素活性の単位により定義される場合、より好ましくは、0.5U、0.1U、1U、又は10Uよりも大きい。示唆されたピロホスファターゼ化合物は、両方ともNewEnglandBiolabカタログ番号M0361Sが好ましいから利用可能な、E.coli又は酵母菌から作られた無機のPPiase、及び/又は熱安定の無機のPPiaseを含む。過度の商業上利用可能なPPiaseは、水素イオンの検知に望ましくない緩衝化をもたらし得る。理想的に、PPiaseは、任意の緩衝剤成分無しで提供される。典型的な反応は、1nL乃至100μLの量を有するマイクロチャンバ内に生じ得るが、量は、ISFETの大きさ及び利用可能なサンプルの量に、より大きく依存し得る。反応の量の温度は、18乃至45°Cであり、好ましくは25°C、30°C、又は35°Cよりも大きく、好ましくは、40°C又は38°C未満であり得る。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。ヌクレオチドの取り込み後にDNAサンプルと試薬を含む流体のpHは、好ましくは7と8.6の間;より好ましくはpH7.5又はpH7.9よりも大きく;好ましくはpH8.4又はpH8.1未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。NaOHは、上記のpHの設定を達成するために要求されるように、流体に加えられ得る。他の適切な緩衝液も熟慮される。PPiの分解に加え、又はそれとは別に、副産物DNAも、プロトンを放出するために分解され得る。反応は以下のように表わされ得る:DNA→dNMPHここで、dNMPはデオキシ一リン酸deoxymonophosphateであり、DNAは、未知のDNAのテンプレートに相補的である、新しく合成された新生の核酸である。それ故、酵素は、DNA分解酵素、好ましくは、エキソヌクレアーゼ等の加水分解酵素であり、好ましくはその基質としてDNA及び/又はRNAを使用することができる。本明細書におけるDNAに対する任意の言及はまた、他の場合には明白となるまで、RNA及び他のポリヌクレオチドに適用される。DNA分解酵素即ち、エキソヌクレアーゼが典型的に任意のDNAを分解し、目的がDNA又はその一部を識別することであるため、DNA分解酵素は、識別可能なDNAの生産後に加えられる。この方法において、分解反応から放出されるプロトンは、識別可能なDNAの分解好ましくは加水分解から生じるものを表わし、反応混合物中の他のDNA断片から生じるものは表わさない。DNAは、対立遺伝子-特異的重合反応から生産される際に識別可能である。未知のDNAがポリマー化しない場合、幾つかの分解活性が存在し、そのため識別可能なDNAの量を増幅することが好ましい。このことは、対立遺伝子特異的増幅技術を使用して行われ得、その結果、識別され得るDNAの量は、増幅されないDNAよりも大きな規模のオーダーである。反応において使用される試薬は、KCI、MgCI2、ウシ血清アルブミンBSA、及びDNA分解酵素を含む。好ましい濃度が以下に提供される。好ましくは、KCIの濃度は10mMよりも大きく、より好ましくは、10mM、20mM、30mM、40mM、又は50mMよりも大きい。好ましくは、前記濃度は、500mM未満であり、より好ましくは、400mM、300mM、又は200mM未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。好ましくは、MgCIの濃度は1mMよりも大きく、より好ましくは、2mM、3mM、又は4mMよりも大きい。好ましくは、前記濃度は、10mM未満、より好ましくは、8mM、7mM、又は5mM未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。典型的な反応は、1nL乃至100μLの量を有するマイクロチャンバ内に生じ得るが、量は、ISFETの大きさ及び利用可能なサンプルの量に、より大きく依存し得る。反応の量の温度は、18乃至50°Cであり、好ましくは25°C、30°C、又は35°Cより大きく、好ましくは40°C又は38°C未満であり得る。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。ヌクレオチドの取り込み後にDNAサンプルと試薬を含む流体のpHは、好ましくは7と9の間であり;より好ましくはpH7.5又はpH8.3より大きく;好ましくはpH9、pH8.6又はpH8.5未満である。NaOHは、上記のpHの設定を達成するために要求されるように、流体に加えられ得る。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。BSAの濃度は、0.1と10mg/mlの間であり、好ましくは0.2mg/ml、0.5mg/ml、又は1.0mg/mlであり;好ましくは5mg/ml、2.0mg/ml、又は1.5mg/ml未満である。これら上下限の任意の組み合わせが想定される。DNA分解酵素の実施形態に従って、使用される酵素は、好ましくはリン酸塩/リン酸ジエステル結合の加水分解によりDNAを分解し、プロトンを放出する任意の酵素であり得る。前記酵素の例はエキソヌクレアーゼである。エキソヌクレアーゼは、3’又は5’の末端のいずれかにてリン酸ジエステル結合を開裂する加水分解反応を介して、ポリヌクレオチドの鎖の末端exoからヌクレオチドを1つずつ開裂することにより作用する酵素である。T7エキソヌクレアーゼ、RecJf、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼT、及びBAL-31エキソヌクレアーゼ。好ましくは、酵素は、両方ともNewEnglandBiolab又はFermentasから利用可能である、エキソヌクレアーゼIII又はラムダエキソヌクレアーゼである。好ましい例は、FermentasEN0191のエキソヌクレアーゼIII、及びFermentasEN0562のラムダエキソヌクレアーゼである。好ましくは、50μl当たりのエキソヌクレアーゼの量は、10U、20U、50U、又は100Uよりも大きい。好ましくは、50μl当たりのラムダエキソヌクレアーゼの量は、1U、2U、5U、又は10Uよりも大きい。図4は、エキソヌクレアーゼIIIがある状態又は無い状態の反応チャンバのpHのグラフである。反応において、10ng/μLのdsDNA基質は、pHに対して示された消化されたDNA-実線により示される効果によりプロトンを生産するため、エキソヌクレアーゼIIIと混合される。対照実験消化されていないDNA-点線により示されるは、酵素を除くすべての試薬を含有する。示されるように、pHは最初に、反応チャンバへの試薬の追加により低下し、その後、対照に関しては相対的に変化しないか、又は酵素反応に関しては更に低下する。図3は、ラムダエキソヌクレアーゼが同様の結果を有することを示す。試験されるサンプルに存在するDNAの量は、異なり得るか又は未知なものであり得るが、典型的に、50と150ng/μLの間であり、好ましくは10ng/μLより大きく、20ng/μLより大きく、又は50ng/μLよりも大きい。核酸の分解は、精製された核酸、又は以前の酵素反応からの核酸を含むサンプルからのpH信号を増強するために使用され得る。それ故、方法は、残存のプライマー/プローブ1μMまで、オリゴヌクレオチド10mMまで、DNAポリメラーゼ、及び他の反応成分或いは副産物などの、バックグラウンド化合物を許容する。本発明は、上述の好ましい実施形態に関して記載されているが、これら実施形態は、説明的なもののみであり、請求項が実施形態を限定しないことを理解されたい。当業者はまた、添付の請求項の範囲内に属するものと熟慮される開示を考慮して、修正及び変更を行うことができるであろう。本明細書において開示又は説明される各特徴は、単独で、又は本明細書に開示又は説明される他の任意の特徴との任意の適切な組み合せと一緒であっても、本発明に組み込まれ得る。例えば、副産物を分解するための酵素は、初期重合反応と両方の分解反応からプロトンを放出するため、ピロホスファターゼ、及びDNAを分解する酵素の両方を含み得、その結果、信号変化はまた更に長くなる。用語ヌクレオチド及び核酸ポリ又は単一のいずれかは、本明細書において交換可能に使用される。何れも好ましい。本発明はそれ故、イオン性シグナルを増強する手段、即ち、核酸の鎖への核酸の追加または除去を示す放出などの、水素イオンの放出により引き起こされるpHの変化を提供する。PPase又はエキソヌクレアーゼに関連する水素イオン放出の増加による単一のものを増強することにより、特定の未知の核酸の同一性の測定の精度は、著しく改善され得る。ISFETからの信号が、いかにして特定の未知の核酸の同一性に相互に関連付けられるかは、当該技術分野において既に既知である。