"一般式ここで、X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;各Qは、独立して、連結基を表し;Wは、電子求引部分、又は、電子求引部分の還元によって調製可能な部分を表し;或いは、X’がポリマーを表す場合、X-Q-W-は、一緒になって、電子求引基を表し得;さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成してもよく;Z1及びZ2の各々は、独立して、生物学的分子に由来する基を表し、その各々は、A及びBに求核部分を介して連結され;或いは、Z1及びZ2は、一緒になって、A及びBに2つの求核部分を介して連結される生物学的分子に由来する単一の基を表し;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖であり;且つ、Bは、結合又はC1-4アルキレンもしくはアルケニレン鎖である、の化合物。ポリマーX又はX’が、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド、HPMAコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート、ポリアミド、ジビニルエーテル-無水マレイン酸又はスチレン-無水マレイン酸のコポリマー、ポリサッカライド、或いは、ポリグルタミン酸である、請求項1に記載の化合物。ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項2に記載の化合物。各連結基Qは、独立して、直接結合、アルキレン基、又は、必要に応じて置換されたアリールもしくはヘテロアリール基そのいずれかが、1又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子、-NR基ここで、Rは、アルキル又はアリール基を表す、ケト基、-O-CO-基及び/又は-CO-O-基により終結又は中断されてもよいを表す、請求項1~4のいずれか1項に記載の化合物。Wは、ケト又はアルデヒド基CO、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-、又は、このような基の還元により得られる基を表し、或いは、X-Q-W-は、一緒になって、シアノ基を表す、請求項1~5のいずれか1項に記載の化合物。Z1及びZ2は、一緒になって、単一の生物学的分子を表す、請求項1~6のいずれか1項に記載の化合物。Z1及びZ2の各々、或いは、Z1及びZ2が一緒になってタンパク質を表す、請求項1~5のいずれかに記載の化合物。該又は各タンパク質が、チオール基を介してA及びBに連結している請求項7に記載の化合物。前記チオール基が、ジスルフィド架橋の部分還元によって生成されたものである、請求項8に記載の化合物。請求項1~9のいずれか1項に記載の化合物の調製方法であって、i下記一般式の化合物ここで、X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;Qは、連結基を表し;W’は、電子求引基例えば、ケト基、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-を表し;或いは、X’がポリマーを表す場合、X-Q-W’は、一緒になって、電子求引基を表してもよく;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは、結合又はC1-4アルキレンもしくはアルケニレン鎖を表し、そして、各Lは、独立して、脱離基を表す、或いはii下記一般式の化合物ここで、X、X’、Q、W’、A及びLは、一般式IIについて与えられる意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成し、mは、整数1~4を表すのいずれかを、一般式Z1Nu又はZ2Nuの化合物、或いは、式ZNu2の化合物ここで、Zは生物学的分子を表し、各Nuは独立して求核基を表すと反応させることを包含する、方法。該又は各脱離基Lは、-SR、-SO2R、-OSO2R-、-NR3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン、又は-OΦここで、Rは、アルキル又はアリール基を表し、Φは、少なくとも1の電子吸引置換基を含む置換アリール基を表すを表す、請求項10に記載の方法。請求項10又は請求項11のいずれかに記載される、一般式II又はIIIの化合物。薬学的に許容される担体とともに、請求項1~9のいずれか1項に記載される生理学的に許容される化合物を含有する、薬学的組成物。薬剤としての使用のための、請求項1~9のいずれか1項に記載の化合物。本発明者らは、ここに、タンパク質中の2つのシステイン残基に由来する両方の硫黄原子と複合体化するために特に使用され得る一連の新規試薬を見出し、新規なチオエーテル複合体を提供する。最初の例において本発明は、ネイティブなタンパク質中で自然なジスルフィド架橋を形成する2つの硫黄原子の複合体を対象とする。ジスルフィド結合は、医薬に関係のあるタンパク質、特に、分泌タンパク質、リソソームタンパク質、及び膜タンパク質の外質ドメインexoplasmicdomain中で見出される。本技術は、ポリマーをタンパク質に複合体化するための既知の技術を超える明確な利点を提供する。本発明は、下記の一般式の化合物を提供する:ここで、X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;各Qは、独立して、連結基を表し;Wは、電子求引部分、又は、電子求引部分の還元によって調製可能な部分を表し;或いは、X’がポリマーを表す場合、X-Q-W-は、一緒になって、電子求引基を表し得;さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成してもよく;Z1及びZ2の各々は、独立して、生物学的分子に由来する基を表し、その各々は、A及びBに求核部分を介して連結され;或いは、Z1及びZ2は、一緒になって、A及びBに2つの求核部分を介して連結される生物学的分子に由来する単一の基を表し;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖であり;且つ、Bは、結合又はC1-4アルキレンもしくはアルケニレン鎖である。ポリマーX又はX’は、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート例えば、ポリアクリロイルモルホリン、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリメタクリルアミド例えば、ポリカルボキシメタクリルアミド、又はHPMAコポリマーであり得る。さらに、X又はX’は、酵素的又は加水分解的分解を受けやすいポリマーであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート及びポリアミド例えば、ポリアミノ酸が挙げられる。ポリマーX又はX’は、ホモポリマー、ランダムコポリマー、又はブロックコポリマーのような構造的に定められたコポリマーであり得る。例えば、X又はX’は、2又はそれ以上のアルキレンオキサイドに由来するか、或いは、ポリアルキレンオキサイド及びポリエステル、ポリアセタール、ポリオルトエステル又はポリアミノ酸のいずれかに由来するブロックコポリマーであり得る。使用され得る多官能性ポリマーは、ジビニルエーテル-無水マレイン酸とスチレン-無水マレイン酸とのコポリマーが挙げられる。天然に存在するポリマー、例えば、キチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、デンプン、セルロース、グリコーゲン、ポリシアル酸polysialylicadic及びそれらの誘導体のような多糖類もまた使用され得る。ポリグルタミン酸のようなポリマーも使用され得、糖類又はアミノ酸のような天然モノマーとエチレンオキサイド又はメタクリル酸のような合成モノマーとから誘導されたハイブリッドポリマーもどうように使用され得る。ポリマーがポリアルキレングリコールである場合には、これは、好ましくは、C2及び/又はC3ユニットを含むものであり、特にポリエチレングリコールである。ポリマー特に、ポリアルキレングリコールは、単一の直線鎖を含んでもよいし、或いは、小さい又は大きい多くの鎖からなる分岐された構造morphologyを有してもよい。いわゆるプルロニック登録商標Pluronicは、PEGブロックコポリマーの重要なクラスである。これらは、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドブロックに由来する。置換されたポリアルキレングリコール例えば、メトキシポリエチレングリコールが使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、単鎖ポリエチレングリコールは、適当な基例えば、アルコキシ例えば、メトキシ、アリールオキシ、カルボキシ又はヒドロキシル基によって開始され、鎖の他方の末端においてリンカー基Qに連結される。ポリマーX又はX’は、必要に応じて、任意の所望の方法において、誘導体化又は官能化されてもよい。例えば、本発明の主題である複合体化のための2又はそれ以上の化学的部分を有するポリマーは、2又はそれ以上の連結された生体活性分子linkedbioactivemoleculesの複合体を生成するために使用される。反応性基は、ポリマー末端又は末端基で、或いは、ペンダントリンカーを介してポリマー鎖に沿って連結され得る;このような場合、ポリマーは、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、又は無水マレイン酸コポリマーである。1を超える生物学的分子代表的には、生物学的に活性なポリペプチド又は薬剤を有するマルチマー複合体は、相乗的又は付加的な利点を生じ得る。所望の場合、ポリマーは、常法を用いて固体支持体にカップリングされ得る。ポリマーの最適分子量は、もちろん目的としている用途に依存する。好ましくは、数平均分子量の範囲は、500g/モル~約75,000g/モル程度である。一般式Iの化合物が循環を離れ且つ組織に浸透することを目的とする場合、例えば、悪性腫瘍、感染又は自己免疫疾患によって或いは外傷によって引き起こされる炎症の治療における使用のためには、2000~30,000g/モルの範囲にある低分子量ポリマーの使用が有利であり得る。一般式Iの化合物が循環に残ることを目的とする用途のためには、より高分子量のポリマー例えば、20,000~75,000g/モルの範囲にあるの使用が有利であり得る。使用されるポリマーは、複合体が目的の使用のための溶媒媒体中で可溶性であるように選択されるべきである。生物学的用途、特に、診断用途及び哺乳動物への臨床治療投与のための治療用途のために、該複合体は水性媒体中で可溶性であるだろう。酵素のような多くのタンパク質が、産業における有用性例えば、化学反応を触媒することを有する。このような用途における使用を目的とする複合体については、複合体が水性媒体と有機媒体のいずれか又は両方において可溶性であることが必要かも知れない。ポリマーは、生物学的分子の目的の機能を損なうべきではない。連結基Qは、例えば、直接結合、アルキレン基好ましくはC1-10アルキレン基、又は、必要に応じて置換されたアリール又はヘテロアリール基そのいずれかが、1又はそれ以上の酸素原子、硫黄原子、-NR基ここでRは、後述される意味を有する、ケト基、-O-CO-基及び/又は-CO-O-基によって終結又は中断されてもよい、を表す。好適なアリール基としては、フェニル及びナフチル基が挙げられ、一方好適なヘテロアリール基としては、ピリシン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンが挙げられる。ポリマーへの連結は、加水分解的に不安定な結合又は不安定でないnon-labile結合によるものであり得る。必要に応じて置換されたアリール又はヘテロアリール基上に存在し得る置換基としては、例えば、以下から選択される1又はそれ以上の同じ又は異なる置換基が挙げられる:-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR’COR、-NR3、-NH3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン例えば、フッ素又は塩素、-C≡CR、-C=CR2及び-C=CHRここで、各R又はR’は、独立して、水素原子又はアルキル好ましくはC1-6アルキル又はアリール好ましくはフェニル基を表す。電子吸引性置換基の存在が特に好ましい。Wは、例えば、ケト又はアルデヒド基CO、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-、又は、このような基の還元により得られる基例えば、CH.OH基、エーテル基CH.OR、エステル基CH.O.COR、アミン基CH.NH2、CH.NHR又はCH.NR2、或いは、アミドCH.NHCOR又はCH.NCOR2を表し得る。X-Q-W-が一緒になって電子吸引基を表す場合には、この基は、例えばシアノ基であり得る。本明細書の以下の部分において、Z1及びZ2は、まとめてZとして表される。Z1及びZ2が一緒になって1の生物学的分子を表すことが、本発明の好ましい実施形態である:Zは、任意の所望の生物学的分子例えばタンパク質に由来し得る。タンパク質は、例えば、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、酵素、サイトカイン、ケモカイン又はレセプターであり得る。拘束されたconstrained又は環状ポリペプチドこれは、通常ジスルフィド結合を介して環化される及びエピトープもまた使用され得る。好適な生物学的分子の具体例は、下記に列挙される。好ましくは、A又はBを基Zに連結する求核部分は、チオール基又はアミン基に由来する。2つのチオール基は、天然又は人工的に作られたengineeredジスルフィドシステイン架橋の部分的還元により生成され得る。アミン基は、例えば、リシン残基であり得る。Z1及びZ2が、一緒になって、2のチオール基を介して基A及びBに連結する単一の生物学的分子を形成する場合、式Iの化合物は下記式を有する:本発明は、また、一般式Iの化合物の調製のための方法を提供し、この方法は、i下記一般式の化合物ここで、X及びX’のうち一方はポリマーを表し、他方は水素原子を表し;Qは、連結基を表し;W’は、電子求引基例えば、ケト基、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-を表し;或いは、X’がポリマーを表す場合、X-Q-W’は、一緒になって、電子求引基を表してもよく;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは、結合又はC1-4アルキレン又はアルケニレン鎖を表し、そして、各Lは、独立して、脱離基を表す、或いはii下記一般式の化合物ここで、X、X’、Q、W’、A及びLは、一般式IIについて与えられる意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X’及び電子求引基Wは、介在する原子とともに環を形成し得、mは、整数1~4を表すのいずれかを、下記一般式の化合物ZNu2IVここで、Zは、上記で与えられる意味を有し、各Nuは独立して求核基例えば、チオール又はアミン基を表すと反応させることを包含する。Z1及びZ2が別々の分子である場合、反応は、連続的な分子Z1Nu及びZ2Nuを用いて2の連続的な工程において行われる。該又は各脱離基Lは、例えば、-SR、-SO2R、-OSO2R-、-NR3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン、又は-OΦここで、Rは、上記で与えられる意味を有し、Φは、少なくとも1の電子吸引置換基、例えば、:-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR’CO2R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR’COR、-NR3、-NHR2、-NH2R、ハロゲン特に塩素、又は、特にフッ素、-C≡CR、-C=CR2及び-C=CHRここで、各R又はR’は、上記で与えられる意味を有するを含む置換されたアリール特に、フェニル基を表すを表す。W’及びX’が一緒になって環を形成する代表的な構造としては、ここで、nは1~4の整数である、並びに、が挙げられる。一般式IVの化合物ここで、各Nuは、チオール基であるは、システイン連結を含むタンパク質、即ち、の部分的還元により調製され得る。好適には、本発明に従う方法は、insituにおいてタンパク質中の2のシステインアミノ酸に由来するジスルフィド結合を部分的に還元することにより行われ、結果として還元された産物は、式II又はIIIの化合物と反応する。ジスルフィドは、例えば、ジチオスレイチオール、メルカプトエタノール、又はトリス-カルボキシエチルホスフィンを用いて常法により還元され得る。この方法は、全ての反応物が可溶性であるような溶媒又は溶媒混合物中で行われ得る。求核基例えば、タンパク質を含有する生物学的分子が、水性反応媒体中で一般式II又はIIIの化合物と直接反応し得る。この反応媒体はまた、求核剤のpH要求性に依存して、緩衝化され得る。反応の至適pHは、一般的に約5.5~約8例えば、約7.4であり、好ましくは約6.0~6.5である。3~37°Cの反応温度が一般的に適している:タンパク質及び他の生物学的分子の分解又は変性が起こり得るような温度で複合体化反応が行われると、タンパク質及び他の生物学的分子は、分解され又は変性して機能を損ない得る。有機媒体中で行われる反応例えば、THF、エチルアセテート、アセトンは、典型的に、周囲以下の温度例えば、0°C以下の温度で行われ得る。タンパク質は、1又は複数のジスルフィド架橋を含み得る。遊離スルフヒラル部分を与える還元が行われ、タンパク質中の1又は複数のジスルフィド架橋が還元され得る。使用されるポリマー複合体化試薬の化学量論およびジスルフィド還元の程度に応じて、1又は複数のポリマー分子をタンパク質に複合体化することが可能である。ジスルフィドの総数よりも少なく還元することが望ましい場合には、異なる反応条件又は変性剤の添加を用いて部分還元を可能にするような、固定化還元剤が使用され得る。或いは、チオール基のソースは、もともとジスルフィド架橋に由来しないシステイン又はチオールからであってもよい。チオール基のソースがジスルフィド架橋である場合、これは鎖内intrachanin又は鎖間interchainであり得る。生物学的分子は、多くの先行技術の試薬とは異なり、化学量論的当量又は少しだけ過剰な試薬を用いて、本発明の試薬と効率的に複合体化され得る。しかしながら、本発明の試薬は、タンパク質を溶媒和するために使用される水性媒体と拮抗的反応を呈さないので、過剰な化学量論の試薬と複合体化反応を行うことも可能である。過剰試薬は、タンパク質のルーチンな精製のあいだに、イオン交換クロマトグラフィーよって容易に除去することができる。式II及びIIIの化合物は新規であり、従って、本発明はさらにこれらの化合物自体を提供する。これらの新規の試薬は、複合体化技術におけるブレイクスルーを与え、ポリマー上の化学官能部分は、2個の求核基特に、タンパク質中の天然ジスルフィド結合に由来する2個のチオールに選択的なクロス官能基化された潜在的にクロス複合体化するビスアルキル化部分を含有する。本発明に従うプロセスの直接の産物は、Wが電子吸引基である一般式Iの化合物である。このような化合物は、それ自体で有用性を有する;本発明の方法は、適当な条件下において可逆的であり、更に式Iの化合物ここで、Wは電子吸引基部分であるは、遊離タンパク質の放出が求められる場合の用途において例えば、直接的な臨床用途において有用性をもつからである。しかしながら、電子吸引部分Wは、タンパク質の放出を妨げる部分を与えるように還元されてもよく、そしてこのような化合物も多くの臨床、産業及び診断用途において有用性を有する。従って、例えば、ケト基を含む部分Wは、CHOH基を含む部分Wに還元され得;エーテル基CH.ORは、エーテル化剤を用いたヒドロキシ基の反応によって得られ得;エステル基CH.O.CORは、アシル化剤を用いたヒドロキシ基の反応によって得られ得、アミン基CH.NH2、CH.NHRまたはCH.NR2は、還元的アミノ化によってケトン又はアルデヒドから調製され得;或いはアミドCH.NHCOR又はCH.NCOR2はアミンのアシル化によって形成され得る。シアノ基である基X-Q-Wは、アミン基に還元され得る。一般式IIの化合物ここで、Xはポリマーを表すは、下記の一般式の化合物:ここで、Q’、W、A、B及びLは前述の意味を有するを、下記一般式のポリマー:ここで、Xは、ポリマーを表し;Q’及びVは、VIとVIIの化合物が共に反応して式IIの所望の化合物を与えるように選択される基であると反応させることによって調製され得る。或いは、下記式の化合物:が、下記式のポリマー:と反応され得る。一般式IIIの化合物は、一般式IIの化合物からの1つの脱離基Lの塩基媒介放出basemediatedeliminationによって調製され得る。一般式Iの化合物は、invivoにおける化合物の追跡trackingを可能にするため、造影剤例えば、放射性ヌクレオチドを含み得る。好適には、放射性ヌクレオチド又は造影剤Iは、基Wを介して結合され得、例えば、下記のタイプの化合物を与える:これは、例えば、下記のタイプの試薬から調製され得る:例えば:。一般式Iの化合物は、多くの用途を有する。それらは、例えば、患者への直接的な臨床用途のために使用され得、従って、本発明はさらに一般式Iの化合物及び薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、薬剤としての使用のための一般式Iの化合物、並びに、本発明に従う式Iの化合物又は薬学的組成物の薬学的有効量を患者に投与することを包含する患者の治療方法を提供する。任意の所望の薬学的効果例えば、外傷治療、酵素置換、毒物除去、抗炎症、抗感染、免疫調節、ワクチン化vaccination又は抗癌が、生物学的分子の適当な選択により得られ得る。一般式Iの化合物は、非臨床用途においても使用され得る。例えば、多くの生理活性物質例えば、酵素が、有機溶媒中で反応を触媒することができ、一般式Iの化合物は、このような用途において使用され得る。さらに、一般式Iの化合物は、診断ツールとして使用され得る。以下、所望の用途に応じて、本発明において有用性を有し得る幾つかの特定の生物学的分子を与える。酵素としては、炭水化物特異的酵素、タンパク質分解酵素などが挙げられる。一般的に産業的有機ベースの反応及び生物学的用途、特に治療用途のために、意図される酵素としては、US4,179,337に開示されるオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼが挙げられる。具体的な意図される酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセルブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルタミナーゼが挙げられる。本発明の一般式Iの化合物において使用される生物学的活性分子としては、例えば、第8因子、インシュリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモンpigmentaryhormones、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体化ホルモン、視床下部性放出因子hypothalamicreleasingfactors、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン及び組織プラスミノーゲンアクチベータが挙げられる。インターロイキン、インターフェロン、及びコロニー刺激因子のような上記タンパク質のうちあるものは、また、通常、組換えタンパク質技術による調製の結果グリコシル化されていない形態で存在している。非グリコシル化バージョンが本発明において使用され得る。例えばインターフェロンに関して、本発明は、複合体化されていないインターフェロンと比較して生物学的活性が保持されている複合体の調製を可能にする。この最も驚く結果は、既知の複合体化技術を用いた場合、可能ではなかった。目的の他のタンパク質は、DreborgetallCritRevTherapDrugCarrierSyst6315365に、ポリマー例えば、ポリアルキレンオキシドと複合体化したときに低減されたアレルゲン性を有し、結果的に寛容誘発因子としての使用に適していると開示されるアレルゲンタンパク質である。アレルゲンの中には、ブタクサRagweed抗原E、蜜蜂毒、ダニアレルゲンなどが開示されている。グリコポリペプチド例えば、イムノグロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、及び、グリコシル化されたインターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子も対象であり、イムノグロブリンとしては、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びそのフラグメントである。特に、診断及び治療目的のための医薬において使用される抗体及び抗体フラグメントが目的とされる。抗体は、単独で使用されてもよいし、他の原子又は分子例えば、放射性物質又はサイトトキシン/抗感染薬と共有結合的に複合体化されて負荷されてloadedいてもよい。エピトープがワクチンのために使用され、免疫原性ポリマー-タンパク質複合体が製造されてもよい。本発明の方法の重要な特徴は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化部分としてはたらく電子吸引官能基とクロス複合体化されていることである。脱離基が、直接的な転位に対してよりもむしろクロス官能化試薬において除去されやすく、且つ、電子吸引基がマイケル反応について適した活性化部分である場合には、逐次的な分子内ビスアルキル化が、連続的なマイケル及び逆マイケル反応によって起こり得る。脱離部分は、最初のアルキル化が起こった後まで暴露されない潜在的な共役二重結合をマスクするように働き、また、ビスアルキル化は、JAmChemSoc197910130983110及びJAmChemSoc198811052115212に記載されるように、逐次的且つ相互作用的マイケル及び逆マイケル反応から生じる。電子吸引基及び脱離基は、ビスアルキル化が逐次的マイケル及び逆マイケル反応によって起こり得るように最適に選択される。JAmChemSoc198811052115212に記載されるように、クロス官能性アルキル化剤を、二重結合と共役する更なる多重結合を用いて、或いは、脱離基と電子吸引基との間に調製することもできる。前述のタイプのクロス官能基化されたビスアルキル化試薬は、マイケル-逆マイケル平衡によって制御されるアルキル化を受けるため、また、三次元構造をかなり保持するsignificantlyretaining制御された方法でタンパク質中の1から1より多くのジスルフィド結合を部分的に還元することが可能であるため、所定のジスルフィド結合のシステインからの2個のスルフヒドラルsulfhydralを交差してビスアルキル化を起こさせることが可能である。このような一連の反応は、ビスアルキル化試薬を用いたジスルフィド架橋の再アニーリングをもたらす。式Iの化合物を与えるための複合体化の際に形成されたチオ-ルエーテル結合は、概して、水溶液中で加水分解的に安定である。試薬自体も加水分解的に安定である。この文脈において、化合物が生理的pH及び45°Cまでの温度において実質的な変性を受けない場合に、その化合物は加水分解的に安定であると見なされる。8時間に渡ってこれらの条件下における50未満の分解が、実体がないと考えられる。本発明が、どちらかの末端において又はポリマーの主鎖に沿ったペンダント鎖上にクロス官能基化されたビスアルキル化官能性を有するポリマー試薬の製造を可能にすることが、理解される。本発明に従う新規複合体の幾つかの例として、以下のものが挙げられる:及び本発明に従う新規試薬の幾つかの例を以下に挙げる:以下の実施例は、本発明を説明する。図1~5は、実施例7から得られた結果を示す。ポリマー複合体化試薬の合成p-ニトロ-3-ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド:C14H19ClN2O3一口250ml丸底フラスコに、p-ニトロアセトフェノン16.5g、パラホルムアルデヒド4.5g、ピペリジンヒドロクロライド12.1g、無水エタノール100mL及び磁気撹拌バーを添加した。この攪拌された不均質混合物に、塩酸水中37wt、1mLを添加し、その溶液を加熱し、窒素下において還流させた。1-2h後、さらなるパラホルムアルデヒド3.0gを添加した。この溶液を約18h還流させ、その間さらなるパラホルムアルデヒドを添加した3.0g。この反応溶液を冷却させた後、さらなる還流の際に溶解しないであろう結晶性の固体を沈殿させたsettled。その固体を濾過により分離し、非常に熱いメタノールを用いて再結晶化し、大きな黄色結晶を得た10.9g。3-2-ヒドロキシエチルチオール-p-ニトロプロピオフェノン:p-ニトロ-3-ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド30g、0.1mol及びメルカプトエタノール9.5g、0.12molの95エタノール200ml攪拌溶液を、均質になるまでゆっくり加熱した。ピペリシン1.0mlを添加し、その反応混合物を加熱し、2h還流させた。冷却後、溶媒の大部分を回転蒸発させ、エチルアセテート200mlを添加し、固体を濾過した。エチルアセテート溶液を、10HCl水溶液、5NaHCO3及びブラインで連続的に抽出し、次いでNa2SO4上で乾燥させ、次にエチルアセテートを留去してオイルとし、これは結晶化して23.2gの所望の産物を得、これはエチルアセテート-エチルエーテル中で再結晶化された。2,2-ビスp-トリルチオールメチル-p-ニトロアセトフェノン:C24H23NO3S2100ml一口丸底フラスコに、p-ニトロ-3-ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド10.0g、4-メチルベンゼンチオール8.2g、ホルムアルデヒド37w/w水溶液、10ml、過剰、メタノール40ml及び磁気攪拌バーを添加した。この攪拌された不均質混合物を、黄色の均質溶液が形成されるまで加熱した2~3分、50~60°Cにて。次いで5滴のピペリシンを添加し、反応溶液を加熱して還流させた。15分以内に、反応物は、幾らかの白/黄色固体の存在に起因して不均質になり、2時間後この固体は濃いオレンジ色を呈した。その後還流を停止し、反応物を一晩室温まで冷却した。次いで反応混合物を更なるホルムアルデヒド37w/w水溶液、10ml、過剰と共に還流下で再び加熱した。約30分間の還流後、オレンジ色のオイルが見え、固体が無くなった。攪拌を停止すると、オイルはフラスコの底に沈んだ。さらに7hの還流の後、混合物を一晩冷却した結果、沈んだオイルが結晶化した。添加された数滴のアセトンを含む非常に熱いメタノールから、再結晶化によって結晶化固体を単離及び精製し、黄色結晶を得た10.0g。2-2-ビスp-トリルスルホニルメチル-p-ニトロアセトフェノン:C24H23NO7S2250ml丸底フラスコ中で、1:1メタノール:水100ml中の2-2-ビスp-トリルチオールメチル-p-ニトロアセトフェノン2.5g及びオキソンOxone18.4gの懸濁液を16h攪拌した。これは白色固体の懸濁液を与え、これにクロロホルム100mlを添加し、得られた有機相を分液漏斗を用いて分離し、水相中に白色固体の懸濁液を残した。均質な溶液が形成するまで、更なる水を水相に添加し、次いでクロロホルム100mlで再び洗浄した。有機相を合わせ、ブラインで洗浄し50ml×2、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を除去し、真空中で乾燥させた後、オフホワイト色の粗製固体生成物を得た2.5g。生成物をアセトンから再結晶化し、白色結晶を得た。2-2-ヒドロキシエチルスルホニルメチル-p-ニトロ-2Z,4-ペンタ-ジエノフェノンアルゴンでパージし且つサーモメーター及び滴下漏斗を取り付けた火炎乾燥丸底フラスコに、3-2-ヒドロキシエチルチオール-p-ニトロプロピオフェノン0.5g、2.0mmol及び無水テトラヒドロフラン50.0mlを添加した。溶液を攪拌し、ドライアイス-アセトン浴により冷却し、次いでTiCl40.23ml、2.1mmolをシリンジにより添加した。氷浴を取り外し、次いで溶液を周囲温度まで温め、次に溶液を-40°Cまで冷却し、さらにジイソプロピルエチルアミン1.1mlをシリンジにより添加した。冷却浴を取り外し、反応混合物を-15°C~0°Cまで温めたところ、赤色に変化した。次いで、反応混合物を3~5分間かけて25°Cまで温め、アクロレイン0.14g、2.1mmolの無水テトラヒドロフラン20ml溶液を滴下漏斗により30~40分間かけて添加した。この発熱反応が反応混合物の温度を30~40°Cまで上昇させ、この溶液を、アルデヒドの添加後であってエチルアセテート75mlの添加前に更に20分間攪拌した。薄層クロマトグラフィーを用いて、出発3-2-ヒドロキシエチルチオール-p-ニトロプロピオフェノンの消失及び所望の2-2-ヒドロキシエチルチオメチル-p-ニトロ-2Z,4ペンタジエノフェノンRf~0.38-0.45の形成を確認した。少量の産物E-アイソマーを0.29-0.34の範囲において低いRf値で観察することができた。エチルアセテート反応混合物を、10水性HCl及びブラインで抽出した。水相を合わせ、エチルアセテートで2回抽出し、全てのエチルアセテートフラクションを合わせ、次いで10水性HCl、5水性NaHCO3及びブラインで2回洗浄し、次いで固体Na2SO4上で乾燥させた。エチルアセテートを回転蒸発させ、オイルとして、粗製2-2-ヒドロキシエチルチオメチル-p-ニトロ-2Z,4ペンタ-ジエノフェノンを得、2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]-p-ニトロアセトフェノンの合成に関して、これは直ぐに酸化され、固体として、2-2-ヒドロキシエチルスルホニルメチル-p-ニトロ-2Z,4-ペンタジエノフェノンこれは、カラムクロマトグラフィー又はエチルアセテートもしくはメタノール中での再結晶により精製され、次に本明細書の他の箇所に記載されるように、アミノ末端化されたポリエチレングリコールに共有結合された。上記の一連の反応は、アセアルデヒド、メタクロレイン、エタクロレイン、ブトリアルデヒド、クロトンアルデヒド、2,4-ペンタジエニアール、ソルブアルデヒド、トルアルデヒド、シンナムアルデヒド、メチル-シンナムアルデヒド、クロロ-シンナムアルデヒド、5-フェニル-2,4ペンタジエナール及び7-フェニル-2,4,6-ヘプタトリエナールを含む、多くのアルデヒドを用いて行われた。この一連の反応は、3-p-トリルチオメチル-m-ニトロアセトフェノン、3-2-ヒドロキシエチルチオ-m-ニトロプロピオフェノン、3-エチルチオメチル-m-ニトロプロピオフェノン、3-ジメチルアミノエチルチオ-m-ニトロプロピオフェノン、3-2-ヒドロキシエチルチオ-3-フェニルプロピオフェノン、32-ヒドロキシエチルチオール-5-フェニル-4E-ペンテノフェノン、3エチルチオメチル-o-ニトロプロピオフェノン、3-エチルチオ-プロピオフェノン、3-2-ヒドロキシエチルスルホニルプロピオフェノン、2-3-2-ヒドロキシエチルチオ-1-プロペニル-m-2E-4-ペンタジエノフェノンを含む、多くのアリールケト誘導体を用いて行われた。この一連の反応は、また、4-エチルチオ-2-ブタノン、4--p-トリルチオ-2-ブタノン、4-4-ニトロフェニルチオ-2-ブタノン、4-2-ヒドロキシエチルチオ-2-ブタノン、及びメチル-3-2-ヒドロキシエチルチオール-プロパノエートを含む脂肪族ケト誘導体を用いて行われた。これらの前駆体に対する前述した反応の最終産物は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ポリエチレングリコールに共有結合され得る。2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]-p-アミノアセトフェノンヒドロクロライドC24H26ClNO5S2100ml丸底フラスコに2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]-p-ニトロアセトフェノン2g、エタノール25mL、塩酸水中37wt.、8mL及び磁気攪拌バーを添加した。得られた不均質な混合物に、次いで、塩化スズII二水和物を添加し、その混合物をオイルバス中で45°Cにて2h加熱した。次いで、これ以上の水を添加したら沈殿が起こり得るとみられる点まで形成されていた均質な黄色水溶液に、水を添加した。その均質な溶液を室温まで冷却し、結果的に結晶化/沈殿している黄色化合物を得、これを真空下において濾過により分離した。次いで、分離した産物を、アセトン及びメタノール約90:10v/vの加熱した混合物と混合した。不溶性の固体を、真空下の濾過によって分離し、真空オーブンにおいて恒量まで乾燥させた1.4g。2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]-p-アミノアセトフェノンのα-メトキシ-ω-アミノポリエチレングリコールへのカップリング滴下漏斗及び窒素ラインを取り付けた一口100mL丸底フラスコに、窒素雰囲気下でトリホスゲン23mg、2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]-p-アミノアセトフェノンヒドロクロライド125mg、無水トルエン2.5mL及び磁気攪拌バーを加えた。滴下漏斗を、別々に無水トリエチルアミン68μL及び無水トルエン2.5mLで満たした。丸底フラスコの下にアセトン/ドライアイス浴を設置し、内容物を冷却した。次いで、5-10分かけて攪拌しながらトリエチルアミン溶液をトリホスゲン溶液に滴下した。フラスコ及びドライアイス浴を数時間かけて室温まで温め、室温になったら、なお窒素雰囲気下において反応混合物を更に約2h攪拌した。次いで、O-2-アミノエチル-O’-メチルポリエチレングリコール2,000490mg及び無水トリエチルアミン68μLの無水トルエン溶液を、室温にて反応混合物に滴下した。得られた混合物を、室温にて一晩攪拌した合計約20h。次いで、反応混合物を雰囲気に対して開放し、フィルターとして機能するような非吸水性のコットンウール片を用いて、5mLディスポーザブルシリンジを通して重力下で濾過した。均質な溶離液を100mL分液漏斗に移し、次いで脱イオン水30mL及び次に10mLで二回洗浄した。水相を合わせて、次いでジエチルエーテル約25mLで洗浄した。次いで、水相を凍結乾燥し、オフホワイト色の固体産物160mgを得た。産物はジエチルエーテル及びトルエン相においても見られた。実施例2ポリマー複合体化試薬の合成p-カルボキシ-3-ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド250mL一口丸底フラスコにp-アセチル安息香酸10g及びピペリシンヒドロクロライド7.4g、100mLの無水エタノール及び磁気攪拌バーを加えた。攪拌された不均質混合物に、濃塩酸1mLを添加し、次いでその溶液を窒素下において加熱し、還流させた。パラホルムアルデヒド3.7gをフラスコに添加し、次いで約1.5h還流を続けた。均質溶液が形成され、これにさらにパラホルムアルデヒド3.7gを添加した。加熱を約6h続け、その間さらにパラホルムアルデヒドを添加した3.7g。この反応溶液を室温まで冷却し、1週間放置した。冷却した反応混合物の濾過により、白色固体を分離した。非常に熱いメタノール中で溶解した後、その固体を結晶化することを試みた。不溶性産物1.96gを濾過により分離し、第二産物secondproduct0.88gを濾液から結晶化した。両方の産物は、赤外線分光法及び真空中で乾燥させた後の薄層クロマトグラフィー分析により同一であるようであったので、それらを合わせて続く反応に使用した。ATR-FT-IR1704,1691,1235,760。4-[2,2-ビス[p-トリルチオメチル]アセチル]安息香酸:C25H24O3S250mL一口丸底フラスコにp-カルボキシ-3-ピペリジノプロピオフェノンヒドロクロライド2.5g、4-メチルベンゼンチオール2.1g、ホルムアルデヒド37w/w水溶液、2.5mL、エタノール10mL、磁気攪拌バー及びピペリシン約10滴を添加した。次いで冷却器をフラスコに取り付け、反応溶液を加熱し、還流させた。次いでメタノール5mLを添加した。約2h後、更なるホルムアルデヒド2.5mLを添加し、さらに2h加熱を続けた。次に反応フラスコを室温まで冷却し、そこで反応溶液をジエチルエーテル約150mLで希釈した。次いで、生じた有機相を水1N塩酸を用いてpH2-3に酸性化した;50mLx2、水50mL及びブライン75mLで洗浄し、次に硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過後、回転エバポレーターで揮発性物質を除去し、固体残渣を得た。その固体を、加熱しながら、主にメタノール及びアセトンの最少容量の混合液中に溶解した。次いで、均質な溶液を一晩フリーザー中に置いてオフホワイト色の結晶を得、これを、真空下での濾過によって分離し、フレッシュなアセトンで洗浄し、次に真空オーブン中で恒量になるまで乾燥した2.5g。4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]安息香酸C25H24O7S2250mL丸底フラスコ中で4-[2,2-ビス[p-トリルチオメチル]アセチル]安息香酸2g及びオキソン16.9gの1:1v/vメタノール:水100mL懸濁液を16h攪拌した。これにより白色固体懸濁液が得られ、それにクロロホルム100mLを添加し、生じた有機相を分液漏斗を用いて分離し、水相を有する白色固体懸濁液を放置した。不均質な水相に、更なる水を均質になるまで添加し約170mL、次いで、水相をクロロホルム75mLで洗浄した。有機相を合わせ、水50mLx2、数滴の1N塩酸で酸性化された及びブライン50mLで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして回転エバポレーターを用いて溶媒を取り除き、オフホワイト色の粗製固体産物2.2gを得た。非常に熱いエチルアセテート、アセトン及びヘキサンからの再結晶化により、産物中の1gについて更なる精製を行い、0.6gの産物を得た:4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]安息香酸とα-メトキシ-ω-アミノPEG2000g/molのカップリング一口50mLシュレンクフラスコに4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]安息香酸100mg及び磁気攪拌バーを加えた。フラスコを密閉し、強いバキュームvacuumを約15分間適用した。アルゴン雰囲気をフラスコ中に導入し、攪拌しながらシリンジによりチオニルクロライド1mLを添加した。生じた混合物を50°Cにて2h加熱した。次に揮発性液体を真空中で取り除き、黄色のフォームを得た。アルゴン雰囲気をフラスコ中に再び導入し、無水ジクロロメタン5mLをシリンジにより添加し、均質な溶液を得た。次いで揮発性液体を真空中で再び取り除いた。溶媒添加/除去工程を、白色残渣が残るまで繰り返した。無水ジクロロメタン5mLを再びシュレンクフラスコに添加し、均質な溶液を形成させた。セプタム及び磁気攪拌バーを備えた25mL丸底フラスコ中で、別々に、O-2-アミノエチル-O’-メチルポリエチレングリコール2,000g/mol0.2g及び無水トリエチルアミン30μLをアルゴン雰囲気下において無水ジクロロメタン5mL中に溶解した。ビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]安息香酸を含む反応溶液を、ポリエチレングリコール溶液を含むフラスコ中に一滴ずつdropwisefashion注入すると、すぐに白色気体の発生が起こった。生じた溶液を室温にて一晩中攪拌し、そこでさらなるトリエチルアミン28μLを添加した。さらに1h後、反応溶液を、ガラスピペットを通じて素早く攪拌されているジエチルエーテル中に滴下した。沈殿を達成するためには、ジエチルエーテル溶液にヘキサンを添加し、氷浴中でフラスコを静置させることが必要であった。得られた沈殿物を遠心によって分離し、さらに真空オーブン中で恒量になるまで乾燥させ、オフホワイト固体産物230mgを得た。更なる精製は、第一に産物をジクロロメタン中に溶解すること及び冷却した攪拌ジエチルエーテル溶液に添加することによる沈殿によって達成された。4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]安息香酸のα-メトキシ-ω-アミノPEG20,000g/molへのカップリング一口50mLシュレンクフラスコに4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]安息香酸100mg及び磁気攪拌バーを加えた。フラスコを密閉し、強いバキュームを約15分間適用した。アルゴン雰囲気をフラスコ中に導入し、攪拌しながらシリンジによりチオニルクロライド1mLを添加した。生じた混合物を50°Cにて2h加熱した。フラスコを室温まで冷却した後、揮発性液体を真空中で取り除き、黄色のフォームを得た。アルゴン雰囲気をフラスコ中に再び導入し、無水ジクロロメタン5mLをシリンジにより添加し、均質な溶液を得た。次いで揮発性液体を真空中で再び取り除いた。溶媒添加-除去工程を、白色残渣が残るまで繰り返した。最後に、無水ジクロロメタン5mLをアルゴン下でフラスコに添加し、均質な溶液を形成させた。別の50mLシュレンクフラスコ中で、O-2-アミノエチル-O’-メチルポリエチレングリコール20,000g/mol0.5gを、アルゴン雰囲気において4mLの無水トルエン中に溶解し、次いでその溶液を真空中で乾燥するまで蒸発させた。得られた白色残渣を、3h真空中で保ち、次いでアルゴン雰囲気中で無水ジクロロメタン5mL中に溶解した。ポリエチレングリコール溶液これは、攪拌され、氷水浴中で冷却されているにビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]安息香酸の反応溶液をゆっくり滴下した。添加が完了した後、40μLの乾燥トリエチルアミンを、得られた溶液中にゆっくり滴下した。トリエチルアミンを添加したら、生じた溶液を一晩攪拌し、室温まで温めた。次いで反応溶液を、0.45μmフィルターを通して濾過し、揮発性液体を溶離液から取り除き、僅かに黄色/オレンジ色の残渣を得、これを温かいアセトン10mLに再溶解させた。得られた均質溶液を含有するフラスコを氷水浴中に置き、攪拌下に沈殿を生じた。白色沈殿物を、no.3焼結ガラス漏斗で分離し、冷却したフレッシュなアセトン約30mLで洗浄した。分離した固体を真空中で乾燥させ、0.4gの白色固体を得た。α-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]ベンズアミドポリエチレングリコール複合体化試薬20,000g/mol0.4gを、アセトニトリル:水24:1v/v,2mgヒドロキノンの10mLのアルゴンパージされた混合物中に溶解し、その溶液を0.45μmPPフィルターを通して濾過した。溶離液を丸底フラスコ中でアルゴン下に置き、トリエチルアミン50μLを攪拌しながら添加した。次いでフラスコを、攪拌しながら20h、30°C油浴中に置き、その後フラスコを室温まで冷却し、揮発性液体を真空中で取り除いた。得られた残渣を温かいアセトン10mL中に溶解し、均質になったら溶液を氷水浴中に置き、そこで溶液を攪拌しながら沈殿を生じた。白色沈殿物をno.3焼結ガラス漏斗で分離し、冷却したフレッシュなアセトン約30mLで洗浄した。分離した固体を真空下で乾燥させ、0.3gの白色固体を得た。4-メチルベンゼンチオールとα-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドポリエチレングリコールの反応ポリマー複合体化試薬、α-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドポリエチレングリコール2000g/mol30mg,12.1μmol,1eq.及び4-メチルベンゼンチオール3mg,24.2mmol,2eq.を重水素化されたクロロホルム約0.75mL中に溶解した。次いで、均質な溶液にトリエチルアミン1.7μL,12.1μmol,1eq.を添加した。反応混合物を攪拌し、H-NMRスペクトルを得た。得られたスペクトルから、4-メチルベンゼンチオールのポリマー複合体化試薬への付加が起こっていることが確認された。同様の反応が、プロパントリオールを用いて行われた。リボヌクレアーゼAへのポリマー複合体化15mL遠心チューブ中のリボヌクレアーゼA30mgに3mLの8M尿素水溶液、次いで2-メルカプトエタノール60μLを添加した。得られた溶液のpHを、10メチルアミン水溶液でpH8.5に調整した。次いで、反応溶液を約30分間窒素でバブリングした。窒素でのパージングをしつつ、チューブを37°Cで5h加熱した。次いで、反応混合物を氷塩水浴中で冷却し、1NHCl:無水エタノール1:39v/vの10mLのアルゴンパージされた冷却溶液を反応溶液に添加した。沈殿が生じ、沈殿物を遠心により分離し、次いでさらに10mL分のHCl:無水エタノール混合物で三回洗浄し、窒素パージされた冷却ジエチルエーテル2x10mLで二回洗浄した。各洗浄の後、沈殿物を遠心により分離した。次いで、洗浄した沈殿物を窒素パージされた脱イオン水に溶解し、凍結乾燥し、乾燥固体を得た。リボヌクレアーゼAの部分的還元が確認され、Ellman’sTestを用いて定量したこれにより、タンパク質1分子当たり5.9の遊離チオールが与えられた。エッペンドルフ中で、部分的に還元されたリボヌクレアーゼA10.9mgをアルゴンパージされたpH8アンモニア溶液500μLに溶解した。別のエッペンドルフ中で、ポリマー複合体化試薬、ポリエチレングリコール2000g/mol5mgから誘導されたα-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニル-メチル]アセチル]ベンズアミドを、また、アンモニア溶液250μLに溶解し、得られた溶液をリボヌクレアーゼA溶液に添加した。PEGエッペンドルフを250μLのフレッシュなアンモニア溶液で洗浄し、これをまた主たる反応エッペンドルフに加えた。次に反応エッペンドルフをアルゴン下で密閉し、37°Cにて約24h加熱し、次いで室温まで冷却した。次いで冷却した反応溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによって分析した。SDS-PAGE実験は、ペギレートされたpegylated4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]-安息香酸とリボヌクレアーゼAとの反応物と矛盾しなかった。マウスIgG抗体Fabフラグメントへのポリマー複合体化0.15M塩化ナトリウム及び0.005MEDTAを含有するアルゴンパージされた0.02Mリン酸ナトリウムpH6緩衝液中のマウスIgG抗体FabフラグメントAbcamCat.No.AB66680.4mg/mL溶液、240μLに、室温で、1mMセレノシスタミンジヒドロクロライドのアルゴンパージされた水溶液4μLを添加し、続いてトリス2-カルボキシエチルホスフィンヒドロクロライドTCEPのアルゴンパージされた水溶液12μlを添加した。得られた溶液を直ぐに数秒間ボルテックスし、次いで室温で6min静置した。還元されたFabフラグメントを含有する溶液の2個の5μlサンプルを、更なる分析のために取っておき、残りの溶液を氷水浴中で4min静置した。ポリエチレングリコール20,000g/mol1.6μL、50mg/ml、0.15M塩化ナトリウム、0.005MEDTA及び0.23mMヒドロキノンを含有するアルゴンパージされた0.02Mリン酸ナトリウムpH6緩衝液から誘導されたα-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドの氷水浴冷却された溶液を、直ぐにFab溶液に添加し;その溶液を数秒間ボルテックスし、次いで氷水浴中に戻した。さらに1.6μLの複合体化試薬溶液を、全部で6.4μLを添加するまで、2分おきに類似の様式で添加した。全て添加した後、反応溶液を冷蔵庫<5°C内に2h置いた。次いで反応溶液のサンプルを、SDSPAGEによる分析のために取っておいた。反応混合物をSEC-HPLC100μl注入,superpose12-24mlcolumn,Amershambiosciences;溶離剤:20mMNaホスフェート,0.15MNaClpH7.0;0.25ml/minのフローで100分の定組成溶離;UV検出,210nmにより分析したところ、同じコントロールの反応混合物中には存在していなかったFab-ポリエチレングリコール複合体が示された。SEC-HPLCクロマトグラフィーから分離された画分をSDS-PAGEにより分析し、モノポリエチレングリコール複合体が観察された。アスパラギナーゼへのポリマー複合体化pH6.5のアスパラギナーゼSigmaの5mg/ml溶液の100μlサンプルを、900μlの20mMリン酸緩衝液pH6、0.15MNaCl及び5mMEDTAを含むで希釈した。次いでDL-ジチオレイトールDTT、15.4mgを添加し、得られた溶液を室温にて放置した。2h放置した後、その溶液を、20mMリン酸緩衝液pH6、0.15MNaCl及び5mMEDTAを含むで平衡化したPD-10カラムSephadex登録商標G-25M、PharmaciaBiotechで精製した。カラムを1ml分のフレッシュな緩衝液で溶出した。還元されたタンパク質を含有する2の画分を、280nmにおけるUV分光法を用いて同定した。これらの画分を遠心濾過装置MWCO3,000;Microconを用いて約270μlの体積まで濃縮し、次いで、フレッシュなpH6のリン酸緩衝液更に、0.23mMのヒドロキノンを含有するで1mlまで希釈した。2個の5μlサンプルをSDSPAGEによる後の分析のために取っておいた。別に、ポリエチレングリコール20,000g/molから誘導されたα-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドの複合体化試薬溶液の50mg/ml溶液を同じリン酸緩衝液で調製し、5分間タンパク質溶液と共に氷水浴中に置いた。次いで該タンパク質溶液に58μlの複合体化試薬溶液を添加し、数秒間のボルテックス後、反応溶液を冷蔵庫<5°Cに置いた。コントロール反応は、また、同じ条件下及びスケールにおいて行ったが、還元されていないアスパラギナーゼを用いた。成功したポリエチレングリコールのアスパラギナーゼへの複合体化は、2h後反応溶液から採ったサンプルを用いて行ったSDSPAGEコロイドブルー染色を用いる4-12Bis-TrisGelにより確認された。アスパラギナーゼをDTTと反応させなかったコントロール反応液から採ったサンプルについては、SDSPAGEによって、複合体化バンドが観察されなかった。インターフェロンへのポリマー複合体化150μlの緩衝液リン酸ナトリウム0.02M;NaCl0.15M;EDTA0.005M;アルゴンパージされた脱イオン水中pH6.0で希釈された100μlインターフェロンα-2bShanthaBiotechnics1mg/mlの溶液を、セレノシスタミンアルゴンパージされた脱イオン水中1mM、2当量及びTCEPアルゴンパージされた脱イオン水中1mM、5当量の添加によって、部分的に還元した。タンパク質溶液を4°Cまで冷却した。ポリエチレングリコール20,000g/molから誘導された複合体化試薬α-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドを緩衝液50mg/mlに溶解し、4°Cに冷却し、16μlをタンパク質溶液に添加した。反応混合物をボルテックスし、4°Cにて2hインキュベートした。反応混合物の非イオン性成分を、カチオン交換クロマトグラフィーHitrapSPFF1mlcolum,Amershambiosciencesによって、以下の2つの緩衝液を使用して除去した:A25mMNaアセテートpH4.0及びB25mMNaアセテート0.7MNaClpH4.0。カラムを緩衝液A5.0ml、次いで緩衝液B5.0mlで洗浄し1ml/min、次いで10mlの緩衝液A10mlで平衡化した。複合体をカラムにロードし200μl、次いで緩衝液A500μlとローディング画分0.5mlを回収した。カラムを5mlの緩衝液Aで洗浄し、画分を回収した。サンプルを緩衝液B10mlでカラムから溶出し、画分を回収した。分光法UV、280nmを用いてタンパク質を含む画分を決定し、次いでこれらの画分を、サイズ排除クロマトグラフィー100μl注入,superose12-24mlcolumn,Amershambiosciences;溶離剤:20mMNaホスフェート,0.15MNaClpH7.0;0.25ml/minのフローで100分間の定組成溶離;UV検出,210nmにより、分離された画分に精製した。これらの精製条件から、ネイティブなインターフェロンからのポリエチレングリコールインターフェロン複合体の分離のためのベースライン分解能resolutionが得られた。ポリエチレングリコール複合体の複合体化反応及び精製は、SDS-PAGEによって確認された;12Bis-TrisゲルSilverQuestSilverStaining;ColloidalBlueStaining及び過塩素酸0.1M/BaCl25及びI20.1M染色。60μlのリン酸ナトリウム0.02MNaCl0.15M、EDTA0.005M、アルゴンパージされた水中でpH6.0中のインターフェロン1mg/ml溶液40μlを、ポリエチレングリコール20,000g/molから誘導された複合体化試薬α-メトキシ-ω-4-[2,2-ビス[p-トリルスルホニルメチル]アセチル]ベンズアミドと混合し、緩衝液50mg/ml中に溶解し、4°Cまで冷却し、16μlをタンパク質溶液に添加した場合には、複合体が観察されなった。この反応混合物をボルテックスし、4°Cで2hでインキュベートした。ポリエチレングリコールインターフェロン複合体の各精製画分の濃度を、酵素イムノアッセイによって測定した。同アッセイは、複合体化されているネイティブなインターフェロン、及び、インターフェロンの国際標準NIBSCUKサンプルの濃度を測定するためにも利用された。前述したインターフェロンの全フォームについて得られた、再現性があり且つ正確な標準曲線を図1に示す。A549ヒト肺線維芽細胞細胞を、96ウェル平底組織培養プレート中に15,000細胞/ウェルでプレーティングした。次いで、NIBSCUKからのインターフェロン、複合体化されたネイティブなインターフェロン、及びポリエチレングリコールインターフェロン複合体を別々に細胞に添加しこれを3組作成、プレートを37°C5CO2にて24hインキュベートした。翌日、-80°Cにて保存していたストックウイルスから、DMEM/2FCS中でEMCV脳心筋炎ウイルスencephalomyocarditisvirusの希釈標準溶液を調製した。インターフェロン又はポリエチレングリコールインターフェロン複合体を含有する培地を除去し、EMCVを含有する培地で置換した。次いで組織培養プレートを37°Cにて1hインキュベートし、その後ウイルスを取り除いた。100マイクロリットルのDMEM/10FCS培地を添加し、プレートを27°Cにて16-24hインキュベートした。16h以降、細胞死が開始するときを確認するため、プレートを定期的に読んだ。次いで培地を吸引し、細胞を100μlのリン酸緩衝液で洗浄した。その後、室温にて30分間、50μlのメチルバイオレット溶液[即ち、メチルバイオレット4ホルムアルデヒド、0.05メチルバイオレット2BSigma-Aldrichを添加した。次いで、プレートを100μlの水で洗浄し、空気中で乾燥させた。プレートリーダーを用いて、分光光度測定法による吸光度を570nmにて測定した。図2より、複合体化に使用されたインターフェロンが国際標準NIBSCUKインターフェロンと同等の活性を有していることが確認できる。図3から、複合体化に使用されたネイティブなインターフェロンが、ポリエチレングリコール複合体化試薬での暴露を除く全ての化学及び精製プロセスにかけられた後も、同等の生物学的活性を維持していたことが確認される。図4から、複合体に使用されたネイティブなインターフェロン及び精製ポリエチレングリコールインターフェロン複合体が、同等の生物学的活性を維持していたことが確認される。インターフェロン-α2bによる2’5’-オリゴアデニレートシンテターゼ2’,5’-OAS及びプロテインキナーゼRPRKRmRNAの誘導を測定した。精製ポリエチレングリコールインターフェロン複合体及びネイティブなインターフェロン-α2bのサンプルを評価した。200万のMOLT4細胞/ウェルを、37°Cにて24h、酵素イムノアッセイを用いて測定された5000pgの各インターフェロンサンプルを含む24ウェル組織培養プレート中で、インキュベートした。全RNAを抽出しRNAIIIsolationkit,Macheray-Nagel、次いで200ngを最終容量20μLで逆転写に供したSigma,AMVreversetranscriptionkit。サンプルを水で4倍に希釈し、2μLの各サンプルを20μLのreal-timePCRquantitationmixSigmaSybrGreenReadyMix中で増幅させた。使用されたプライマーは、以下であった:2’,5’-OAS増幅については、94°Cにて5分間酵素活性化の後、94°Cにて5秒間の変性、60°Cにて2秒間のアニーリング、及び72°Cにて8秒間の伸長を48サイクル行った。PRKR増幅については、サンプルを94°Cにて5分間活性化した後、94°Cにて5秒間の変性、59°Cにて2秒間のアニーリング、及び72°Cにて8秒間の伸長を48サイクル行った。増幅の最後に、生成物の融解曲線分析を行った。下記式を用いて、コントロールの未処理細胞と比較して、誘導されたmRNAレベルの定量を行った:-相対増加量=2-Ctサンプル-Ctコントロールここで、Ctは閾値交差値thresholdcrossovervalueである。図5、図5aは、インターフェロンで誘導可能な2’5’-オリゴアデニレートシンテターゼ2’,5’-OAS遺伝子のリアルタイム定量的RT-PCR2段階分析を示し、図5bは、インターフェロンで誘導可能なプロテインキナーゼRPRKR遺伝子のリアルタイム定量的RT-PCR2段階分析を示す。結果から、ポリエチレングリコールインターフェロン-α2b複合体が、ネイティブなペギレーションされていないインターフェロン-α2bと同様のレベルにまで、2’5’-オリゴアデニレートシンテターゼ2’,5’-OAS及びプロテインキナーゼRPRKRmRNA合成を刺激していることが確認される。"