"配列識別番号:3の相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列、配列識別番号:21のCDRL2アミノ酸配列、配列識別番号:29のCDRL3アミノ酸配列、配列識別番号:39の相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列、配列識別番号:59のCDRH2アミノ酸配列および配列識別番号:89のCDRH3アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。配列識別番号:4のヌクレオチド配列によりコードされる相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列、配列識別番号:22のヌクレオチド配列によりコードされるCDRL2アミノ酸配列、配列識別番号:30のヌクレオチド配列によりコードされるCDRL3アミノ酸配列、配列識別番号:40のヌクレオチド配列によりコードされる相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列、配列識別番号:60のヌクレオチド配列によりコードされるCDRH2アミノ酸配列および配列識別番号:90のヌクレオチド配列によりコードされるCDRH3アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。哺乳動物細胞を用いたIL-6抗体のクローン化および発現典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAの転写開始、抗体コード配列および転写物の転写およびポリアデニル化の終止に必要なシグナルを調節する少なくとも1つのプロモーター要素を含有する。追加的要素には、エンハンサー、Kozak配列およびRNAスプライシング用ドナーおよびアクセプター部位と隣接している介在配列が含まれる。SV40に由来する早期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIなどに由来する長い末端反復LTRSおよびサイトメガロウイルスCMVの早期プロモーターを用いて高い効率の転写を達成することができる。しかしながら、また、細胞構成要素例えばヒトアクチンプロモーターを用いることも可能である。本発明を実施する時に用いるに適した発現ベクターには、例えばpIRESlneo,pRetro-Off,pRetro-On,PLXSNまたはpLNCXClonetechLabs,PaloAlto,CA,pcDNA3.1/-,pcDNA/Zeo/-またはpcDNA3.1/Hygro/-Invitrogen,PSVLおよびPMSGPharmacia,Uppsala,Sweden,pRSVcatATCC37152,pSV2dhfrATCC37146およびpBCl2MIATCC67109などの如きベクターが含まれる。適切な哺乳動物および他の宿主細胞には、ヒトHela、293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞が含まれる。別法として、染色体の中に一体化している遺伝子を含有する安定な細胞株を用いて遺伝子を発現させることも可能である。選択可能マーカー、例えばdhfr、gpt、ネオマイシンまたはヒグロマイシンなどを用いた共トランスフェクションを用いて、そのトランスフェクションを受けさせた細胞の同定および単離を行うことができる。また、その移入させた遺伝子を増幅させることでコード化抗体を多量に発現させることも可能である。興味の持たれる遺伝子のコピーを数百または数千個さえ持つ細胞株を生じさせようとする時にはDHFRジヒドロホレート還元酵素マーカーが有用である。別の有用な選択マーカーは酵素であるグルタミン合成酵素GSMurphy,他、Biochem.J.227:277-2791991;Bebbington,他、Bio/Technology10:169-1751992である。そのようなマーカーを用いて哺乳動物の細胞を選択性培地の中で増殖させた後、最も高い耐性を示す細胞を選択する。そのような細胞株は染色体の中に一体化している増幅した遺伝子1種または2種以上を含有する。抗体の産生ではしばしばチャイニーズハムスター卵巣CHOおよびNSO細胞が用いられる。発現ベクターpC1およびpC4はラウス肉腫ウイルスの強力プロモーターLTRCullen,他、Mol.Cell.Biol.5:438-4471985に加えてCMVエンハンサーのフラグメントBoshart,他、Cell41:521-5301985を含有する。多数のクローン化部位、例えば制限酵素開裂部位BamHI、XbaIおよびAsp718などを伴う部位を存在させると興味の持たれる遺伝子のクローン化が容易になる。そのようなベクターに3’イントロンに加えてラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化および終止シグナルを含有させる。CHO細胞を用いたクローン化および発現IL-6抗体を発現させる目的でベクターpC4を用いることができる。プラスミドpC4はプラスミドpSV2-dhfrATCCアクセス番号37146の誘導体である。そのプラスミドは、SV40早期プロモーターの制御下にあるマウスDHFR遺伝子を含有する。そのようなプラスミドを用いたトランスフェクションを受けさせたチャイニーズハムスター卵巣細胞またはジヒドロホレート活性を示さない他の細胞を化学治療薬であるメトトレキセートを補充しておいた選択的培地例えばアルファマイナスMEM、LifeTechnologies、Gaithersburg、MDの中で増殖させることで前記細胞を選択することができる。メトトレキセートMTXに耐性を示す細胞の中でDHFR遺伝子を増幅させることは充分に示されている例えばF.W.1Alt,他、J.Biol.Chem.253:1357-13701978;J.L.HamlinおよびC.Ma,Biochem.etBiophys.Acta1097:107-1431990;およびM.J.PageおよびM.A.Sydenham,Biotechnology9:64-681991を参照。MTXの濃度を高くして細胞を増殖させながら標的酵素であるDHFRを過剰に産生させるとDHFR遺伝子が増殖する結果として前記薬剤に対する耐性が生じる。2番目の遺伝子を前記DHFR遺伝子と連結させておくと、それが通常は一緒に増殖しかつ過剰に発現する。そのようなアプローチを用いて増殖した遺伝子1種または2種以上のコピーを1,000個以上担持する細胞株を生じさせることができることが本技術分野で知られている。次に、メトトレキセートを除去した時点で、宿主細胞の1つ以上の染色体と一体化している増幅した遺伝子を含有する細胞株が得られる。また、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復LTRの強力なプロモーター以外の高効率プロモーター、例えばヒトβ-アクチンプロモーター、他のレトロウイルス、例えばHIVおよびHTLVIなどに由来するSV40早期もしくは後期プロモーターまたは長い末端反復などを発現で用いることも可能である。哺乳動物細胞を用いてIL-6抗体を規則的な様式で発現させようとする時にClontechのTe-OffおよびTet-On遺伝子発現システムおよび同様なシステムを用いることも可能であるM.GossenおよびH.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-55511992mRNAのポリアデニル化では、他のシグナル、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子に由来するシグナルなども同様に使用可能である。また、染色体と一体化している興味の持たれる遺伝子を担持する安定な細胞株を選択可能マーカー、例えばgpt、G418またはヒグロマイシンなどを用いた共トランスフェクションで選択することも可能である。開始時に2種以上の選択可能マーカー、例えばG418とメトトレキセートなどを用いる方が有利であり得る。そのプラスミドpC4を制限酵素で消化させた後、本技術分野で公知の手順を用いて、ウシ腸ホスファターゼを用いて脱燐酸を起こさせる。次に、そのベクターを1のアガロースゲルを用いて単離する。完全IL-6抗体をコードするDNA配列、例えば本発明のIL-6抗体のHCおよびLC可変領域に相当する配列識別番号:98および96で示される如き配列をそれぞれ公知方法段階に従って用いる。この構築ではまた安定なヒト定常領域即ちHCおよびLC領域をコードする単離核酸も用いる。次に、そのDNAをコードする単離可変と定常領域および脱燐酸ベクターをT4DNAリガーゼで連結させる。次に、大腸菌HB101またはXL-1Blue細胞に遺伝子導入を受けさせた後、例えば制限酵素分析などを用いて、プラスミドpC4の中に挿入したフラグメントを含有する細菌を同定する。活性DHFR遺伝子を持たないチャイニーズハムスター卵巣CHO細胞をトランスフェクションで用いる。リポフェクチンを用いて5ミクログラムの発現プラスミドpC4と0.5ミクログラムのプラスミドpSV2-neoを一緒に移入させる。そのプラスミドpSV2neoは主要な選択可能マーカー、即ちG418を包含する群の抗生物質に耐性を与える酵素をコードするTn5に由来するneo遺伝子を含有する。その細胞をG418を1ミクログラム/ml補充しておいたアルファマイナスMEMに種付けする。2日後に細胞をトリプシンで消化させた後、ハイブリドーマクローン化用プレートGreiner、ドイツの中のメトトレキセートを10、25または50ng/mlに加えてG418を1ミクログラム/ml補充しておいたアルファマイナスMEMに種付けする。約10-14日後、単一のクローンをトリプシンで消化させた後、メトトレキセートをいろいろな濃度50nM、100nM、200nM、400nM、800nMで用いて、6穴ペトリ皿または10mlのフラスコに種付けする。次に、最も高いメトトレキセート濃度の時に増殖するクローンをメトトレキセートを更により高い濃度1mM、2mM、5mM、10mM、20mMで入れておいた新しい6穴プレートに移す。同じ手順を100-200mMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望遺伝子産物の発現を分析、例えばSDS-PAGEおよびウエスタンブロットまたは逆相HPLC分析などで分析する。抗-IL-6抗体の構築および選別IL-6抗体の変異体クローンAME-A9を構築しかつ活性に関して選別した。この実施例および本明細書の他の場所に示すCDRはKabatが定義した通りであるが、但しKabatとChothiaの定義の合計であるCDRH1は除く。全体領域を網羅する2つの個別ライブラリーを構築するにはCDRH2の長さにする必要があった。興味の持たれるクローンの配列を決定した後、ELISAおよび細胞が基になった検定で更に特徴付け、そして速度定数を測定した。精製IgGを用いて実施したELISAの例を図9に示す。このELISAでは、一般に、ヤギ抗-ヒトカッパ抗体で被覆しておいたCostar3366ミクロタイタープレートを用いた。FabまたはIgGの希釈液を前記被覆を受けさせておいた穴の中に入れて22°Cで1時間インキュベートした。次に、前記穴をPBSTween20が0.1で洗浄した後、ビオチニル化IL-6を200ng/ml加えて1時間置いた。洗浄後にNeutrAvidinのアルカリ性ホスファターゼ接合体を加えた後、22°Cで1時間インキュベートした。強力に洗浄した後に比色分析用基質を加えて、結合したIL-6を測定した。このELISAの変法に、ビオチニル化IL-6のインキュベーションを行った後にPBSBSAが0.01を37°Cで用いた洗浄段階をビーカーの中で長時間実施、例えば18時間の長時間の洗浄を実施することを含めた。その生じさせた本発明のヒト改変IL-6反応性IgGモノクローナル抗体の数種が示した親和定数は1x109から9x1012の範囲である。そのようなヒト改変モノクローナル抗体は高い親和性を示すことから、IL-6依存疾患、病気または関連状態における治療用途で用いるに適切である。前記抗体が有するCDR領域の中の1つ以上を変えることで多数の異なるヒト改変抗-IL-6抗体変異体を得た。以下の表3に、個々のCDRライブラリーの中に存在していた有益な変異体の要約を示すアミノ酸の変化はAME-A9変異体を基準にした変化である。加うるに、以下の表13に、軽および重鎖CDRのアミノ酸配列を可能性のある置換位置Xの印を付けると一緒に示す。個々のCDRライブラリーの中に存在する最良のクローン即ち変異体を基にして組み合わせライブラリーを構築した。表4に、その組み合わせライブラリーに含めた変異体を示す。その組み合わせライブラリーに選別および特徴付けをこの上に記述したようにして受けさせた。より良好なクローンの中の6クローンに見られた変異を以下の表5Aに示す一方で、そのようなクローンの中のCDRの配列識別番号を表5Bに示す。細胞が基になった検定を用いた抗-IL-6IgGの検定キメラ抗-IL-6およびヒト改変抗-IL-6クローンAME-19a抗体にこれらがIL-6依存細胞株の増殖を防止する能力に関する試験を受けさせた。7TD1細胞をCostar361096穴プレートに穴1個当たり200個の細胞になるように入れて平板培養した。抗体をIMDM培地で希釈して前記穴に加えた後、ヒトIL-6を500pg/mlの最終濃度になるように加えて、プレートを組織培養インキュベーターの中で64-72時間インキュベートした。その時間が経過した時点で穴の全部にATPliteキットPackardBioscienceの細胞溶解用緩衝液を50μl加えた後、そのプレートを3分間撹拌した。ATPlite基質を50μl加えた後のプレートに蓋をして、それを1分間振とうした。照度計を用いて化学発光を測定した。細胞が基になった検定の結果を図10に示し、計算したEC50値を以下の表6に示す。キメラ抗-IL-6抗体が示したEC50値は2.7x10-11M4.09ng/mlであり、そしてヒト改変抗-IL-6クローンAME-19a抗体が示したそれは2.7x10-12M0.41ng/mlであった。そのヒト改変抗体が示したEC50値は改善度が約10倍であることを示していたが、約10倍から約60倍これらの間の値を包含のEC50値改善度を得ることも可能であり得る。ヒト改変抗-ヒトIL-6抗体の結合速度前記宿主細胞から精製した抗体がIL-6と濃度依存様式で結合することをELISA分析で実証する。このケースでは、前記抗体がこれの同種抗原エピトープに対して示す親和力を測定する。BIAcore分析およびKinExA3000装置を用いて定量的結合定数を得る。その結果は、本ヒト改変モノクローナル抗体の数種は1x10-9から3x10-14の範囲のKDで非常に高い親和性を示すことを示している。抗-ヒトIL-6モノクローナル抗体AME-A9、AME-A16、AME-18a、AME-20b、AME-22aおよびAME-23aを用いかつ可溶IL-6受容体であるsIL-6Rと結合したIL-6を検出するための正対照としてCNTO328を用いる酵素免疫検定EIAを実施した。可溶ヒトIL-6受容体であるsIL-6Rおよび組換え型ヒトIL-6をRDSystemsMinneapolis、MNから入手したそれぞれカタログ番号227-SR-025および206-IL-010。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗-ヒトIgGHL鎖をJacksonImmunoresearchWestGropve、PAから入手したカタログ番号109-035-003。過酸化水素およびOPD錠剤をSigmaSt.Louis、MOから入手したそれぞれカタログ番号H-1009およびP-8287。sgp80/IL-6/抗-IL-6mAb複合体生成に関する酵素結合免疫検定CostarEIAプレートCorning/Costar、Acton、MAカタログ番号9018にsIL-6RPBS中10μg/ml、100μl/穴による被覆を4°Cで一晩受けさせた。前記プレートをTween20含有量が0.02体積/体積の0.15M食塩水で洗浄した後、PBS中1重量/体積のBSAを200μl/穴用いて穴を室温で1時間に渡ってブロックした。前記穴を再び洗浄した後、次のフォーマットで、PBS中200ng/mlのヒトIL-6100μl/穴と一緒に室温で1時間インキュベートした。抗体を全ての穴に10μg/mlの出発濃度から10倍の連続希釈で100μl/穴の量で加えて室温に1時間置いた。前記穴を洗浄した後、HRP結合ヤギ抗-ヒトIgGHLPBS中10μg/mlと一緒にして室温で30分間インキュベートした。前記穴を洗浄した後、クエン酸-燐酸塩基質用溶液クエン酸が0.1Mで燐酸ナトリウムが0.2MでH2O2が0.01でOPDが1mg/mlを100μl/穴加えて室温に15分間置いた。4Nの硫酸を25μl/穴加えることで反応を停止させた後、自動ELISAプレート読み取り装置MolecularDevicesSpectromaxPlus、Sunnyvale、CAを用いてOD490を読み取った。IL-6を抗hIL-6モノクローナル抗体またはCNTO328と一緒に前以てインキュベートした場合の効果を試験する目的で、10μg/mlの抗体量で出発した10倍の連続的希釈液100μlと一緒に200ng/mlのIL-6100μlを室温で1時間インキュベートした。次に、その前以てインキュベートしておいた混合物をsIL-6Rと一緒にして室温で1時間インキュベートした後、HRP結合ヤギ抗-ヒトIgGHLPBS中10μg/mlを用いてsIL-6R/IL-6/抗ヒトIL-6複合体の検出を室温で30分かけて実施した。その検定条件の残りはこの上のパラグラフに記述した条件と同じであった。EIAplateinternal技術レポートを基にした以前の研究により、被覆しておいたsIL-6RがIL-6を捕捉するとCNTO328でそれを検出することができることが分かっていた。加うるに、AME-A9、AME-A16、AME-18a、AME-20b、AME-22aおよびAME-23aを用いることでもsgp80sIL-6Rと結合したIL-6をEIAを用いて用量依存様式で検出することができる。ヒト改変抗-IL-6抗体の各々にCNTO328を基準にした評価を受けさせた。しかしながら、IL-6と前記抗hIL-6モノクローナル抗体のいずれかを前以てインキュベートしておくとsIL-6RがIL-6と結合する能力がなくなる。抗-IL-6IgGに関する速度定数の測定Sapidyneが製造しているKinExA3000装置を用いて結合速度を測定した。簡単に述べると、ヒトIL-6をアルザクトンビードと共有結合させた後、このビードと遊離IgGの結合を前記装置を用いて検出した。KDを測定する目的で、IgGを0.5、1または5pMの一定濃度で入れることに加えて連続的に希釈度を高くしたヒトIL-6を入れておいた個々の管をBSAが0.1のPBS中で20°Cで3-4日間インキュベートした。各KD測定毎に全体で13個の管を用いた。例えば、キメラ抗-IL-6抗体を5pMの一定濃度で用い、そして個々の管を0-200pMのIL-6と一緒にインキュベートした。他のIgGに関するインキュベーションも同様な様式で設定した。インキュベーション後に平衡状態のサンプル各々に入っている遊離IgGの測定をKinExA3000装置をこれの製造業者の指示に従って用いることで実施した。KinExA3000装置を以下により詳細にするようにして用い、KinExA3000ソフトウエアを用いてKD値を決定した。konを測定する目的で個々のIgGを200pMの量で100-200pMのヒトIL-6と混合した後、KinExA3000装置を用い、アルザクトンビードと共有結合させておいたヒトIL-6との結合を用いることで、結合しなかったIgGを検出した。一連の測定値を経時的に取った。その結果として得たデータを用い、KinExA3000ソフトウエアを用いることで、konを計算した。式kD=koff/konを用いてkoffを計算した。抗-IL-6IgGに関する速度定数の要約を表7に示す。抗-IL-6抗体のインビトロ特徴付け抗-IL-6抗体の配列、エピトープ特異性、親和力および生物学的活性を特徴付けるインビトロ試験を実施した。ヒト改変mAb配列分析を用いて、本発明の抗-IL-6抗体いろいろな変異体/クローンとして具体化したが完全にヒトのフレームワークを含有することを立証する。表5aは、本発明の抗-IL-6抗体本抗体のいろいろな変異体ではCDR1、2および3の重鎖および軽鎖の両方ともキメラ抗-IL-6抗体PCTWO04/039826に記述されているに比べて全体で10個のアミノ酸残基が変化したことを示している。エピトープ特異性本発明の抗-IL-6抗体およびキメラ抗-IL-6抗体はヒトIL-6上の同様なエピトープを認識する。これらの抗体はRDSystemsMAB-206の商業的マウス抗-ヒトIL-6mAbとは競合せず、このことは、それらは前記RDの抗-IL-6mAbが認識するエピトープとはユニークに異なるエピトープを認識することを示唆している。本発明の抗-IL-6抗体およびキメラ抗-IL-6抗体はRDのラット抗-ヒトIL-6mAbとは競合しない。プレートに結合させておいた抗-IL-6mAb[マウス抗-ヒトIL-6mAb、即ちMAB-206これを単にヒトIL-6を捕捉するプレート結合mAbとして用いた]10μg/mlを用いてヒトIL-6200ng/mlを捕捉させた後、前記プレートに本発明の抗-IL-6抗体およびキメラ抗-IL-6抗体の一連の希釈液を加えたX軸に沿って示すように。IL-6との結合度合がOD490がY軸に沿って高くなるとして測定した。本発明の抗-IL-6抗体およびキメラ抗-IL-6抗体の両方ともがIL-6との結合を用量依存様式で示す。逆に、本発明の抗-IL-6抗体およびキメラ抗-IL-6抗体はヒトIL-6に対して競合的結合を示し、このことは、その2種類の分子がIL-6上の同様な結合エピトープを共有することを示唆している。プレートに結合させておいたMAB-20610μg/mlを用いてヒトIL-6200ng/mlを捕捉させた。次に、前記プレートにX軸に沿って示す如き本発明の抗-IL-6抗体の一連の希釈液およびビオチニル化キメラ抗-IL-6抗体を50ng/ml加えた。ビオチニル化キメラ抗-IL-6抗体とIL-6の結合をストレプトアビジン-HRPで検出して、Y軸に沿ったOD490読み取り値として測定した。その上、本ヒト改変抗体およびキメラ抗体はsIL-6/sIL-6R複合体に対する結合に関して同様な特性を示す図1。本発明の抗-IL-6抗体はsIL-6/sIL-6R複合体と結合する。前記プレートに可溶IL-6受容体sIL-6Rによる被覆を濃度が10μg/mlになるように受けさせた。次に、前記プレートにヒトIL-6を200ng/mlの濃度で加えた。次に、前記プレートにX軸に沿って示す如き本発明の抗-IL-6抗体またはキメラ抗-IL-6抗体の一連の希釈液を加えた後、IL-6/sIL-6R複合体との結合をHRP-抗-ヒトIgGを用いて検出して、Y軸に沿ったOD490読み取り値として測定した。この上で見いだしたことを更に立証する目的で、7TD1IL-6依存マウスハイブリドーマ細胞株の細胞が基になった増殖検定を用いて、いろいろな種のIFNγ刺激PBMCおよびLPSを用いて生じさせたIL-6含有条件付き上澄み液を用いて異種間反応性試験を実施した。いろいろな霊長類種ヒト、マーモセット、カニクイザル、チンパンジー、赤毛猿、バブーン、ブタオザルおよびコットントップモンキーを包含に由来する7TD1細胞増殖の刺激で前記条件付き上澄み液が示す活性を本発明のヒト改変抗体が中和することが分かり、かつ前記キメラ抗体と比べて同様な異種反応パターンを示した表8。最後に、トリプシン消化方法を用いてエピトープマッピングを実施した時、本ヒト改変抗体およびキメラ抗体がヒトIL-6に対して示す結合エピトープは同じであることを観察し、そしてそれはHelixD貫通アミノ酸残基168-184上に位置する図3。最近の変異分析により、本発明の抗体がIL-6と結合するには残基179および182が必須であることが分かった。そのエピトープアミノ酸残基168-184はヒト改変抗-IL-6抗体の存在下で重水素を保持するIL-6表面であると同定した。生物学的活性ヒト改変抗-IL-6抗体が示すIL-6中和効力の測定を7TD1細胞が基になったバイオアッセイで実施した。ヒト改変抗-IL-6抗体が7TD1細胞増殖検定で示した中和効力はキメラ抗-IL-6抗体が示したそれに比べて10倍高かった。7TD1細胞にhIL-6を500pg/ml用いた刺激を一連の希釈したヒト改変抗-IL-6抗体またはキメラ抗-IL-6抗体またはアイソタイプ対照mAbの存在下で72時間受けさせた。細胞増殖を1秒当たりのカウント数として測定し、それはY軸に示す如くであった。誤差棒グラフは重複したサンプルのSDを示している。黒丸はIL-6を用いなかった細胞を示し、白丸は、hIL-6を500pg/ml用いた刺激を受けさせた細胞を示す。ヒト改変抗-IL-6抗体はまたU937細胞によるIL-6誘発単球走化性蛋白質-1MCP-1産生図3およびHepG2ヒトヘパトーマ細胞によるIL-6/IL-1β誘発血清アミロイドASAA産生図4も抑制する。図3は、ヒト改変抗-IL-6抗体がU937細胞によるIL-6刺激MCP-1分泌を抑制することを示している。穴1個当たり5x105個の細胞にhIL-6を1ng/mlおよびヒト改変抗-IL-6抗体の一連の希釈液を用いた処置を72時間受けさせた。細胞培養物の上澄み液にELISAによる分析をMCP-1の存在に関して三重に受けさせた。図4は、ヒト改変抗-IL-6抗体がHepG2細胞によるIL-6およびIL-1β刺激SAA分泌を抑制することを示している。2.25x105個の細胞にhIL-6を100ng/ml、sIL-6Rを200ng/mlおよびIL-1βを1ng/ml用いた刺激をヒト改変抗-IL-6抗体の一連の希釈液の存在下で24時間受けさせた。次に、細胞培養物の上澄み液にELISAによる分析をSAAの存在に関して二重に受けさせた。IL-6依存Stat3燐酸化ヒト改変抗-IL-6抗体がIL-6がIL-6Rおよびgp130と結合する結果としてもたらされるシグナル伝達カスケードを阻害する能力を評価する目的で免疫沈澱検定を実施することで、gp130を細胞表面に発現するTHP-1細胞におけるIL-6依存STAT3燐酸化に対する効果を試験した。mAbに無菌濾過による濾過殺菌を受けさせた後、PBSに入れて4°Cで貯蔵した。RDSystemsMinneapolis、MNの組換え型ヒトIL-6206-IL-010およびsIL-6R227-SR-025を用いた。RPMI培地11875-085、熱不活化ウシ胎仔血清16000-069、L-グルタミン25030-81、非必須アミノ酸11140-050およびピルビン酸ナトリウム11360-070をInvitrogenCarlsbad、CAから入手した。また、TBS10mMのTris、pH7.5、100mMのNaClも用いた。研究細胞銀行から受け取ったTHP-1、即ちヒト急性単球性白血病細胞株に試験を受けさせた結果、マイコプラズマ陰性で細菌も存在していなかった。前記細胞をウシ胎仔血清を10とグルタミンを2mMとピルビン酸ナトリウムを1mM含有させておいたRPMI培地に入れて培養した。培養物が約85の密集度に到達した時点で細胞を二次培養するか或は収穫した。細胞を常規通り3日毎に1:5に分割した。チロシン燐酸化では、細胞をT-225フラスコの中で密集度が80-90になるまで増殖させた。その培地を除去した後、血清が入っていない新鮮な培地を代わりに入れて、一晩インキュベートした。血清を欠乏させた後の細胞を各フラスコから収穫し、沈澱させた後、各条件毎に最終濃度が20x106個の細胞を血清を含有しない0.5mlの培地に入れて再懸濁させた。RhIL-60.1μg/mlを下記の反応体と一緒に37°Cで15分間予備培養した:0.5mlの培養単独、抗-IL-6Ab10μg/mlおよびsIL-6R0.2μg/ml。次に、抗-IL-6AbおよびsIL-6Rのそれぞれと一緒に予備培養しておいた細胞にSIL-6R0.2μg/mlおよび抗-IL-6Ab10μg/mlを加えて37°Cで15分間培養した。次に、その細胞を負対照としての培地およびIL-6/Ab/sIL-6R複合体と一緒にした後、37°Cで6分間インキュベートした。その細胞を氷冷TBSで2回洗浄した後、細胞沈澱物をセクション5.4に記述する如く処理するか或は-70°Cで貯蔵した。免疫沈澱では、細胞沈澱物を完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤1697498、Roche、Basel、スイスを入れておいた1mlの溶解用緩衝液50mMTris,pH7.5,300mMNaCl,0.5Triton-X-100T-9284,Sigma,St.Louis,MOに入れて溶解させた。その細胞を30秒間渦巻き撹拌した後、-70°Cで20-60分間インキュベートした。細胞の屑を13,000rpmの遠心分離で20分かけて除去した。非特異的背景染色の度合を低下させる目的で、そのサンプルを2μgのウサギIgGI5006、Sigma、St.Louis、MOと50μlの蛋白質AアガロースSC-2001、SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CAと一緒にしてオービタルミキサー上で4°Cで1時間インキュベートすることで前以て奇麗にしておいた。そのアガロースビードを2500rpmの遠心分離で5分かけて除去した。その奇麗にした溶解産物をミクロ遠心分離管に移し、抗-STAT32μg/mlSC-7179、SantaCruzBiotechnologyと一緒にしてオービタルミキサー上で4°Cで一晩インキュベートした後、蛋白質Aアガロースビードを50μ加えて、オービタル振とう機上で4°Cで2時間インキュベートした。そのアガロースビードを2500rpmの遠心分離で5分かけて集めた後、4°Cの氷冷TBSで5回洗浄した。次に、そのアガロースビードを40μlのLaemmliサンプル緩衝液とDTTNP0007-465030、Invitrogen、Carlsbad、CAに入れて懸濁させた後、95°Cに5分間加熱した。そのサンプルを3-8のNuPageBis-TrisゲルEA0375BOX、Invitrogen、Carlsbad、CA上に置いて緩衝液NP0002-465026、Invitrogen、Carlsbad、CAを用いて100Vで1時間流すことで分離させた。トランスファー緩衝液NP0006-465029、Invitrogen、Carlsbad、CAを用いて蛋白質をニトロセルロース膜LC2001、Invitrogen、Carlsbad、CAに30Vで1時間かけて移した。その膜をTBS-T中10の無脂肪乾燥乳Nestle、Glendale、カリフォルニアに入れて4°Cで一晩ブロッキングを実施した。室温のTBS-Tを用いた洗浄を数回受けさせた後の膜をマウスモノクローナル抗-p-STAT3AbSC-8059、SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CATBS-Tで1:1000に希釈しておいたと一緒にしてオービタル振とう機上で4°Cで4時間インキュベートした。次に、洗浄を数回受けさせた後の膜をロバ抗-マウスIgG-HRP1:1000SC-2318、SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CAと一緒にしてオービタルミキサー上で室温で2時間インキュベートした。洗浄を数回受けさせた後のサンプルにECLplusWesternBlotDetectionReagentsおよび分析用キットRPN2108、AmershamBiosciences、Piscataway、NJを製造業者のプロトコルに従って用いることによる検定を受けさせた後、ECLフィルムに暴露させることで可視化した。次に、その膜を100mMのDTT、2のSDS、62.5mMのTris-HClpH6.7に浸漬して100°Cで30分間撹拌することでAbを除去した。次に、その膜をTBS-Tで洗浄した後、それに10の無脂肪乾燥乳を用いたブロッキングを一晩受けさせた。その膜を洗浄した後、抗-STAT31:1000SC-7179、SantaCruzBiotechnologyと一緒にTBS-Tに入れて4°Cで2時間インキュベートし、5回洗浄した後、ヤギ-抗-ウサギIgG-HRP1:1000SC2030、SantaCruzBiotechnology、SantaCruz、CAと一緒にして1時間インキュベートし、そしてECLplusを用いた検出を実施した。あらゆる膜にストリッピングを常規通り受けさせた後、STAT3を用いた再検査を受けさせることでSTAT3蛋白質の存在を立証した。この結果により、ヒト改変抗-IL-6抗体がIL-6媒介stat3燐酸化、即ちIL-6シグナル伝達経路の鍵となる成分を阻害することが分かった図5Aおよび5B。ヒト改変抗-IL-6抗体ヒト改変抗-IL-6抗体AME-19AはIL-6/sIL-6R誘発stat3燐酸化を抑制する。組換え型ヒトIL-6/sIL-6R誘発stat3燐酸化をTHP-1細胞内で検出した図5B。ヒト改変抗-IL-6抗体AME-19Aまたはキメラ抗-IL-6抗体を10μg/ml添加するとstat3燐酸化が完全に抑制された図5B。図5Aは、いろいろなヒト改変抗-IL-6クローンに相当するあらゆるサンプル中に存在する燐酸化されていないstat3蛋白質の量が同様であることを示している。本明細書で用いる如きCNTO328または328はキメラ、ヒト-マウス抗体[また野生型WTとも呼ぶ]を表し、150はクローンAME-22aを表し、143はクローンAME-23aを表し、140はクローンAME-20bを表し、136はクローンAME-19aを表し、130はクローンAME-18aを表し、106はクローンAME-A16を表し、104はクローンAME-A9を表す。ヒト改変抗-IL-6抗体がインビボで示す効力ヒト改変抗-IL-6抗体が示す効力を異なる2種類のインビボモデルで評価した。1番目として、ヒト改変およびキメラ抗-IL-6抗体が示す効果をマウスを用いたヒトIL-6誘発マトリゲル血管形成検定で試験して比較した。200ng/mlのヒトIL-6をマトリゲルプラグに入れた。2個のマトリゲルプラグを各ヌードマウスに注入した。マウスが6匹のグループにヒト改変もしくはキメラ抗-IL-6抗体を1、3または6mg/kgi.v.注射することで与えた。また、対照グループにはPBSまたはアイソタイプ対照mAbを投与した。プラグを7日目に取り出した後、そのプラグ中のヘモグロビン含有量、微小血管の長さおよび微小血管の数を用いて血管形成を測定した。マトリゲルプラグモデルを用いて3パラメーター全部で測定した時の結果はヒトIL-6PBSグループが血管形成を刺激することを示していた。ヒト改変抗-IL-6抗体AME-19Aはマトリゲルプラグ中の微小血管平均数を抑制する。加うるに、ヒト改変抗-IL-6抗体AME-19Aはマトリゲルプラグ中の微小血管の平均長も抑制する。また、ヒト改変抗-IL-6抗体AME-19Aはマトリゲルプラグ中のヘモグロビン濃度も抑制する。加うるに、ヒト改変AME-19Aおよびキメラ抗-IL-6抗体は両方ともヌードマウスにおけるIL-6媒介血管形成を依存様式で抑制した。最後に、ヒト改変およびキメラ抗-IL-6抗体が試験を実施した最も高い用量である6mg/kgの時にIL-6誘発血管形成で示した活性は匹敵していた。キメラ抗-IL-6抗体は3mg/kgの時に血管長および血管数で測定してヒトIL-6誘発血管形成を有意に抑制したが、そのような用量の時には、ヒト改変およびキメラ抗-IL-6抗体の間に検出された差は統計学的に有意ではなかった。ヒト改変抗-IL-6抗体がヒトIL-6誘発急性期反応物質である血清アミロイド蛋白質ASAAの産生に対して示す効果を更に評価する目的でBalb/Cマウスを用いた追加的インビボモデルを開発した。マウスにヒトIL-6を5μg/kgの量でi.v.投与する4時間前にヒト改変抗-IL-6抗体を0.01、0.5また5mg/kgの量でi.p.投与することで与えた図6。PBSおよびアイソタイプ対照mAbを対照として用いた。IL-6を注入してから16時間後に血清中SAA濃度を測定した。ヒト改変およびキメラ抗-IL-6抗体は両方ともがBalb/CマウスにおけるヒトIL-6誘発SAA産生を0.5および5mg/kgの時に有意に抑制し、かつヒト改変抗-IL-6抗体は最も低い試験用量の時にもSAA産生を有意に抑制した。しかしながら、この試験した3用量全部においてヒト改変およびキメラ抗-IL-6抗体の間に観察した差は統計学的に有意ではなかった図6。図6は、ヒト改変抗-IL-6抗体がヒトIL-6誘発SAA産生を抑制することを示している。各点は、各動物毎の平均SAA値を示し、そして線は各グループの中のあらゆるデータ点の平均を示している。対様式の比較を実施し、そしてTukeyの95同時信頼間隔を用いて全体的第1種の過誤を制御したp<0.001、p<0.05。抗-IL-6mAbに関する治療原理関節リウマチ。抗-IL-6mAbがコラーゲン誘発関節炎CIAに対して示す効果-関節リウマチの動物モデル臨床前インビボ病気モデルいろいろなインビボモデルでIL-6を標的にした。ラット抗-マウスIL-6抗体を標準的マウスモデルで用いるか或はヒト化抗-IL-6R80kDamAbMRA;Chugaiを霊長類モデルおよびヒト/マウスSCIDモデルで用いた。マウスコラーゲン誘発関節炎CIAにおいて、抗-IL-6を後期時間点ではない早期コラーゲンで免疫性を与えてから0または3日後に用いると病気の予防に有効であった。ヒト滑膜組織を免疫不全マウスに移植したヒト/マウスSCID移植モデルでは、MRAの処置によって組織移植片が収縮しかつ炎症性細胞および破骨細胞が減少した。カニクイザルにおけるCIAでは、MRAが関節炎の発症を抑制しかつ急性期測定値を改善した。代理抗-マウスIL-6mAbが病気の発症に対して示す効果をCIAモデルで評価した。その結果は、病気誘発前に抗-マウスIL-6を1mg/マウス/週でi.p.投与すると病気のひどさが顕著に軽減することで示されるようにコラーゲン誘発関節炎の発症が有意に抑制されたことを示している。100μgのウシII型コラーゲンをフロインド完全アジュバントFCAに入れて8週齢のDBA/1LacJマウスの尾の基部に皮内注入することで関節炎を誘発した。マウスを病気の発症に関して毎日臨床的に監視した。CIAを誘発する2日前に抗-IL-6mAbまたはアイソタイプ対照mAbを1mg/マウスの量でi.p.投与した後、毎週投与した。関節の膨れ、紅斑および変形を基にして関節炎スコアを決定した。組織病理学データを用いて、抗-マウスIL-6mAbを毎週i.p.注入するとコラーゲン誘発関節炎のパラメーターが有意に向上すると言った臨床的観察を立証した。マウスを抗-マウスIL-6で処置すると、対照mAbで処置した動物に比べて、検査した関節炎パラメーター[炎症反応滑膜炎およびパンヌス形成および侵食性変化侵食および全体的関節構造を包含]の全部が有意に改善した。抗-IL-6mAbは組織病理学的レベルで関節炎を抑制した。滑膜炎のスコアを滑膜の厚みを基にして付け、パンヌス形成のスコアを関節空間に対するパンヌスの度合を基にして付け、そして侵食のスコアを軟骨および軟骨下骨への侵食度合を基にして付けた。マウスを抗-マウスIL-6mAbで処置すると軟骨マトリクス蛋白質損失の度合が有意に低下した。抗-IL-6mAbで処置した動物および対照から試験終了53日時に得た代表的な関節部分をトルイジンブルー染色で軟骨マトリクスに関して検査した。ミクロ-CT分析により、抗-マウスIL-6治療の効果が個々の関節の中の病気進行のレベルで現れると言った臨床的観察が裏付けされた。典型的な3DCT画像を目で検査した結果、抗-マウスIL-6で処置した動物から得た関節で起こっていた軟組織炎症変化は主に穏やかであることに対比してアイソタイプ対照mAbで処置したグループでは侵食変化の度合が顕著であることが分かる。これらの実験を対照mAbで処置した代表的な動物および抗-マウスIL-6mAbで処置した動物に関して実施した。ループス。抗-IL-6がNZB/WF1マウスで示す効果臨床前インビボ病気モデルSLE用のマウスモデルが存在し、それらはヒト病気と非常に類似している。MRL/lprおよびNZB/WF1株を用いた試験でB細胞の過剰増殖、自己抗体の産生および免疫複合体の沈着がヒトの病気に非常に類似していることを立証した。抗-IL-6mAbはNZB/WF1マウスにおける自己抗体産生の抑制、タンパク尿の減少および動物生存率の改善に効果があることが分かった。代理抗-マウスIL-6mAbがループス病発症に対して示す効果をNZB/WF1マウスを用いて評価した。予備結果は、抗-マウスIL-6mAbを1mg/マウス/週の量で22週に渡ってi.p.投与すると抗-dsDNA自己抗体、即ちこの病気モデルにおける主要な病原性自己抗体の産生が抑制させることを示していた図7。抗-IL-6mAbで処置した動物の場合の抗-dsDNA自己抗体濃度は食塩水で処置した動物および対照Abで処置した動物の場合のそれに比べて試験全体に渡って一定して低かった。この上で考察したように、図7は、NZB/WF1マウスにおける抗-dsDNA自己抗体の産生を抗-IL-6mAbが抑制することを示している。各サンプル毎の個々のO.D.値を正対照血清に対して正規化し、それを正対照に対するとして示した。各点は各サンプルが正対照に対して示したを示しており、そして線は、各グループにおけるデータ点全部の平均を示している。差はp<0.01として示されるように有意である。加うるに、小さなサブセットの動物に試験を受けさせた時、抗-IL-6mAbはB細胞の増殖も抑制しかつ腎臓障害も軽減した。試験終了時におけるT細胞増殖にはいろいろな処置群の間に有意な差は存在していなかったが、抗-IL-6mAbで処置した動物では、食塩水で処置したマウスのそれに比べて、抗-IgGおよび抗-CD40で誘発させたB細胞増殖が経時的、具体的には34週後に低くなった。このような結果は、この上に報告したように抗-dsDNA自己抗体の産生が減少することと一致しており、自己反応性B細胞が抗-IL-6mAb処置の主要な直接的標的になる可能性があることを示唆している。組織病理学的分析により、この試験を受けさせた動物を3つの腎疾患ひどさグループ穏やか、中程度およびひどいに分類分けすることができることが分かった表9。NZB/WF1マウスにおける腎疾患病理学は、糸球体基底膜の中に混合型リンパ過形成と免疫複合体沈着が存在することを示している。抗-IL-6mAbで処置した動物では、ひどい腎疾患を発症する度合が低かった。抗-IL-6mAbで処置した動物には血管周囲の混合型リンパ過形成と蛋白質沈着が存在しなかったが、食塩水で処置した動物および対照Abで処置した動物では、抹消血管周囲の混合型リンパ過形成と蛋白質沈着が中程度およびひどく生じた。その上、糸球体基底膜の中で起こる免疫複合体の沈着も抗-IL-6mAbで処置した動物の方が他の2処置グループが示したそれよりも穏やかであった。抗-IL-6mAbがB、Tおよびマクロファージ細胞の機能に対して示す作用の機構のさらなる詳細な分析を実施した、と言うのは、そのような細胞はSLEの病因で重要な役割を果たすからである。2型糖尿病IL-6は肥満に関連したインスリン耐性の発症で重要な役割を果たすことが示されている。しかしながら、今日までに得られたインビトロおよびインビボデータは、それがインスリン耐性である役割を果たす可能性の裏付けおよび否定の両方である。インビトロ実験IL-6がインスリンシグナル伝達およびインスリンの生物学的効果および機能、例えば糖吸収、遺伝子調節および関連機構などに対して果たしている可能性のある効果をより良好に理解するための実験をインスリン反応性組織のインビトロモデル脂肪組織に関しては3T3L1細胞、肝細胞に関してはHepG2細胞、骨格筋に関してはC2C12細胞およびインスリン耐性およびT2DMのインビボモデル、例えばdb/dbマウスなどを用いて実施した。インビトロデータは、IL-6が肝臓におけるインスリンシグナル伝達に対して主要な効果を及ぼすことを示唆している。HepG2細胞をIL-6で処置するとインスリン誘発Akt燐酸化が抑制される。このようにIL-6がインスリンシグナル伝達に対して示す阻害効果は抗-IL-6抗体によって遮断される。肝臓における糖代謝およびインスリン効果が変化することがインスリン耐性およびT2Dの発症を推進する原因であると思われる。IL-6が3T3L1細胞脂肪細胞株およびC2C12骨格筋細胞株におけるインスリンシグナル伝達に対して示す効果を測定することでIL-6がT2Dで示す機構を確認する。3T3L13T3L1マウス脂肪細胞株を用いて実験を実施した。90分化した3T3L1細胞を用いて、IL-6がインスリン誘発糖吸収に対して示す効果を評価した。この実験において、TNFαを10ng/ml用いた処置を24時間行うとインスリン誘発糖吸収が一定して抑制される一方、IL-6を20ng/ml用いても全く影響がなかった。このようなデータは、IL-6が脂肪組織に対して示す活性は主にIL-6媒介インスリン耐性機構ではなく、むしろ、脂肪組織がIL-6の主要源である可能性があり、それが次に肝臓および筋肉におけるインスリン感受性を妨害していることを示唆している。皮下沈着物に由来する分化した初代ヒト脂肪細胞を用いることでも同じデータが得られた。内蔵脂肪沈着物に由来するヒト初代脂肪細胞を用いてIL-6が糖吸収に対して示す効果を試験した、と言うのは、そのような沈着物はインスリン耐性に関連した肥満に対してより高い関連を示す可能性があるからである。HepG2肝臓組織のインビトロ代表例としてHepG2細胞を選択した。HepG2細胞はヒトヘパトーマ細胞株であり、この細胞株を用いることでIL-6がインスリンシグナル伝達に対して効果があることが以前に分かっていた。この実験では、IL-6を20ng/ml用いるとインスリン誘発Akt燐酸化、インスリンシグナル伝達経路における重要なキナーゼが阻害され、60分間のインキュベーション後に最大の効果が観察され、このことは、科学文献に報告された結果と一致している。rhIL-620ng/mlを30、60、90および120分間インキュベーションした後に、10cmの皿に入っている密集未満のHepG2細胞を用いてAkt燐酸化を測定した。最後の5分間のインキュベーション中にインスリンを0.5nM、1nMおよび5nM添加することでAkt燐酸化を誘発した。修飾RIPA溶解用緩衝液を用いて細胞を溶解させた後、Ser-Phospho-AktELISAを用いてAkt燐酸化を測定した。pAktおよびAktELISAキットBioSourceを用いて結果を得た。IL-6を用いた処置を生理学的濃度0.5-1nMのインスリンの存在下で60分間実施すると、Akt燐酸化が対照グループに比較して~50抑制された。PierceBCA蛋白質検定キットを用いて蛋白質の濃度を量化した。IL-6抗体の効果IL-6がインスリン誘発Akt燐酸化に対して示す影響をヒト改変抗-IL-6抗体が抑制する能力を測定した。ヒト改変抗-IL-6抗体を20μg/ml用いるとHepG2細胞におけるIL-6の影響が抑制され得る。図8Aおよび8Bに、IL-6がヒト改変抗-IL-6抗体の存在有り無しでインスリン誘発Akt燐酸化に対して示した影響を示す。上部の画像図8Aにおけるデータは平均±SEMを示す[インスリン、IL-6と比較した有意さ、P=0.029;インスリンIL-6と比較した有意さ、P=0.02]。密集未満のHepG2細胞を20ng/mlのIL-6で60分間処置した。最後の5分間の処置中にインスリンを1nM添加しそして修飾RIPA緩衝液を用いて細胞を溶解させた。サンプルをELISAで分析した結果、AktのSer473の所に燐酸化が検出された。あらゆるデータをELISAで測定した全Aktに対して正規化した。AME-19aによる処置によって正常なAktシグナル伝達を回復させることができた。下部の画像図8Bに代表的なウエスタンブロットを示す。上部の帯には、IL-620ng/ml、60分、1nMのインスリンを用いて5分間、AME-19a20ug/ml±20ng/mlのIL-6で60分間、1nMのインスリンを用いて5分間または緩衝液を用いて処置したサンプルが含まれている。ブロットを抗-ホスホSer/Akt抗体上方のパネルpS473、Biosourceで検査した。下方の帯同じブロットにストリッピングを受けさせた後、BioSourceの抗-Aktを用いて再び検査したは、レーン毎に相当する蛋白質が充填されたことを示している。方法:HEPG2細胞を100mmの組織培養皿の中で密集するまで増殖させた。細胞をDMEM-1BSAに入れて一晩絶食状態にした。AME-19a20ug/mlを細胞上でIL-6添加に先立って~30分間インキュベートした。IL-620ng/ml±AME-19a20ug/mlを細胞に添加する前に~30分間インキュベートした。サンプルを細胞上で37°Cにおいて60分間インキュベートした後、細胞に1nMのインスリン最終濃度を加えて室温に5分間置いた。細胞を直ちに氷冷PBSで3回濯ぐことで洗浄した。プレートを溶解まで凍結させておいた。ELISAキットBioSourceandSigmaを用いてホスホAktおよび全Aktを測定した。文献:JJSenn、PJKover、IANowakおよびRAMooney。インターロイキン6は肝細胞における細胞インスリン耐性を誘発する。Diabetes、51:3391-3399、2002。初代ラット肝細胞初代肝細胞は、IL-6および抗-IL-6抗体または他のIL-6アンタゴニストがインスリンシグナル伝達に対して示す効果およびインスリンが肝臓糖産生に対して示す効果を試験する時に用いるに適したより関連のあるインビトロシステムに相当する。インスリン、IL-6および/またはIL-6mAbで処置したラット肝細胞におけるPI3キナーゼPI3K活性化を測定する目的で単離細胞にインスリンによる処置を5ng/mlのIL-6の存在有り無しで受けさせた後、ELISA検定およびウエスタンブロット分析を用いて、インスリン受容体であるIRS-1図12AおよびAkt図12Bの燐酸化を測定した。加うるに、IL-6がインスリン刺激IRS1/p85結合に対して示す効果も検査した図11AおよびB。これらの実験を下記の如く実施した。初代ラット肝細胞~2カ月齢をコラーゲンで被覆しておいた6穴プレートに入れ、Hepatoczyme培地の中で一晩かけて平衡状態にした。次の日、細胞をDMEM-1BSA-pennstrepに入れて6時間絶食状態にした後、hIL-65ng/ml、抗-IL-6抗体AME-19a20ng/mlまたは抗-IL-6抗体AME-19ahIL-6と一緒にして37°Cで90分間インキュベートした。その組み合わせを添加するに先立って予め細胞を抗-IL-6抗体AME-19aで1時間処置しておいた。また、その組み合わせを細胞に添加する前にも予備インキュベーションを実施した。5nMのインスリンBioSourceのを細胞に加えて5分間置いた後、細胞を吸引で取り出し、そして直ちにBioSource抽出用緩衝液蛋白分解酵素阻害剤を用いて溶解させた。溶解物を遠心分離にかけた後、その上澄み液を1:10に希釈しそしてELISABiosourceので試験した。IRS1/p85関連:等しい量の蛋白質45μgを2μgの抗-IRS-1ポリクローナル抗体Upstateの品目06-248と一緒に一晩インキュベートした。次に、そのサンプルに蛋白質Aビードを用いた免疫沈澱を1時間受けさせた後、SDS-PAGE用3xサンプル緩衝液で溶離させた。次に、そのIPサンプルを4-12のSDS-Pageゲルの上に置いて流した後、ウエスタンブロット分析用の膜に移した。その膜を1IRS-1関連p85、即ち活性PI3Kに関しては希釈率が1:100のp85mAbUpstateの品目05-217図11Aに示す如くおよび2充填対照としての全IRS-1に関しては希釈率が1:600のIRS-1mAbBDBiosciencesの品目611395を用いて検査した図11Bに示す如く。このデータは、IL-6で処置するとIR、IRS-1およびAktのインスリン誘発燐酸化の度合が低下することを示している。細胞を抗-IL-6抗体クローンAME-19aで前以て処置しておくとそのようなIL-6の効果が無効になった。加うるに、IL-6はインスリンに誘発されるp85PI3KのサブユニットとIRS-1の関連を抑制した。再び、抗-IL-6抗体で前以て処置しておくとそのようなIL-6の効果が抑制された。インビボ実験IL-6がインスリン感受性に対して示す効果を動物で広範に試験することは成されていなかった。抗-IL-6治療によってインスリン感受性およびT2DMが改善するか否かを評価する目的で、脂肪量が多い餌を与えておいたdb/dbマウスおよびC57/B16のオスを市販の抗-マウスIL-6抗体RDSystemsから得たで処置した。db/dbマウス抗IL-6処置の効果をいろいろな年齢のdb/dbマウスを用いて試験した。年齢が8-10週の範囲のマウスは高インスリン血およびインスリン耐性で特徴づけられ、従って、病気の早期段階に相当する一方、年齢が12-14週のマウスは高インスリン血に加えて血糖値が高いことで特徴づけられ、従って、T2DMの段階が進行したことに相当していた。両方の年齢グループのマウスを腹腔内耐糖能試験ipGTTで用いることで、抗-IL-6治療によってインスリン感受性および血糖コントロールが改善される可能性を試験した。db/dbマウスは、レプチン受容体内に変異を有することでレプチンシグナル伝達の機能を持たない。そのようなマウスはマウスの年齢に伴って肥満、高インスリン血およびインスリン耐性を発症し、そのマウスが6-8週齢になった時点で最初の症状が検出される。8および12週齢の年齢がいろいろなマウスの2グループに抗IL-6mAbを5mg/kgを用いた処置を受けさせた後、処置してから1日目および7日目に腹腔内耐糖能試験ipGTTを実施した。処置計画を図15に示す。8週齢の動物では、GTT中に抗IL-6mAbで処置しても糖クリアランスに対して効果がなかった。抗IL-6mAbで処置すると12週齢の動物では耐糖能GTの改善がもたらされたが、その効果は統計学的には有意でなかったp=0.063。そのようなGTTの改善は処置してから7日目に見られた。加うるに、試験を完了する前および完了した後の血清サンプルにアジポカインおよびアジポネクチンプロファイルに関する分析を受けさせた。IL-6、TNFαおよびMCP-1の濃度は検出濃度未満であった。このデータをipGTTで得た結果と一緒にすることで下記が示唆され得る:db/db動物は抗IL-6がインスリン耐性に対して示す効果を試験する時の良好なモデルではないこと、そして組織中のIL-6濃度の方がIL-6がインスリン耐性およびT2DMの発症で果たす可能性のある役割により関係があること。食餌誘発肥満DIO-肥満およびインスリン耐性の動物モデルC57/B1オスマウスに脂肪含有量が60の食餌を20-35週間与えた。それらは肥満を発症し平均体重は50.5グラムであったそして空腹時血糖値が高くなったFBG>145mg/dl。加うるに、それらはGTが悪化した。DIO動物にマウス抗-IL-6AbRDSystemsを10mg/kg用いた処置を受けさせた。全体として、それらに50mg/kgの抗IL-6mAbを3週間に渡って与えた。最初の2回の投与後5日目、4回目の投与後12日および16日目および5回目の投与後23日目にipGTTを実施した。それと同時に、血液を採取してアジポサイトカインおよびアジポネクチンの測定を実施した。抗IL-6で処置しても5日目および12日目の耐糖能は向上しなかったが、しかしながら、16日および23日目に実施すると、糖クリアランスが改善されるばかりでなく糖エクスカーションの度合が改善されることを観察した。このような改善はGTT中の39、60および90分の時に統計学的有意さに到達した。別の組の実験として、DIO動物に10および20mg/kgの抗IL-6Abおよび20mg/kgのIgGアイソタイプ対照を用いた処置をi.p経路で毎週受けさせた1番目の週の間に2回投与しそして次の4週の間に毎週1回投与。HOMA-IR2、4および6週間の処置後、ipGTT、ipITTおよびアジポカインプロファイル6週間処置時を実施した。抗-IL-6Abで処置したDIO動物に関するHOMA-IR分析この検定では、DIO動物を10および20mg/kgのマウス抗-IL-6Abおよびアイソタイプ対照で処置すると空腹時血糖値およびインスリン濃度が低くなった。動物の採血を実施した後、Trace/DMAグルコースoxthermoElectronCorpおよびUltraSensitiveRatInsulinElisaCrystalChemを用いてそれぞれ空腹時血糖値およびインスリン濃度を測定した。それらの値を用いてHOMA-IRを決定した。HOMA-IR指数は、インスリン感受性の状態を示し、これはクランプ検定clampstudyで確認したことと良好に相互に関係している。HOMA-IRの計算を式:空腹時血糖値mMx空腹時インスリンmIU/Lit/22.5を用いて実施した図13A、BおよびC。処置して2、4および6週間後にHOMA-IRの改善を観察した図13A-Cに6週間処置後のデータを示す。検定終了時にipGTTおよびipITTを実施した。両方の試験とも、抗-IL-6処置20mg/mlを実施するとアイソタイプで処置した動物に比べて糖エクスカーションおよびクリアランスの両方が有意に改善された。対照および抗-IL-6処置動物から採取した血清サンプルのアジポカインおよびサイトカインを分析した結果、IL-6中和によって循環しているIL-6およびTNFa濃度が減少することに加えてMCP-1およびレシスチン濃度が減少する傾向があることが分かった。別の組のデータとして、抗-IL-6の処置に伴ってアジポネクチン濃度が高くなった。処置グループおよび対照グループから得た肝臓サンプルの組織学的分析を実施した。これらのサンプルにOilRedO染色による染色を受けさせることで肝実質の中の脂質含有量を測定した。マウス抗-IL-6抗体による処置に反応してDIO動物の肝臓脂質含有量が低下した。染色により、媒体で処置した肝臓サンプルの中の34は未処置動物に関連した脂質でありかつ20mg/kgの抗-IL-6で処置した動物では8のみであることが分かる図14A-F。図14AおよびDに対照グループを示し、図14BおよびEに未処置DIO動物を示し、そして図14CおよびFに抗-IL-6処置動物を示す。肝臓の脂質含有量が増加したことはインスリン耐性および2型糖尿病の発症と関連していた。従って、IL-6の中和によって肝臓脂質の代謝が影響を受けることでインスリン感受性およびT2DMが改善すると思われる。これらのデータが一緒になってIL-6は2型糖尿病の病因で役割を果たしていることとIL-6の中和によってインスリン感受性が改善する可能性があることを強力に示唆している。追加的研究IL-6がヒト改変抗-IL-6抗体の存在有り無しでインスリン刺激IRS1燐酸化、p85/P13Kとの関連、インスリン受容体IR燐酸化、グリコーゲン合成およびHepG2細胞におけるSOCS3およびSTATシグナル伝達の改善に対して示す影響を監視する。追加的実験でIL-6が膵島による糖誘発インスリン分泌に対して示す影響を検査した。今日までに公開されたデータには、IL-6がラット膵島によるインスリン分泌に対して阻害ばかりでなく刺激効果の両方を示すことが記述されている。新しく単離したラット膵島LiefscannのにIL-6およびヒト改変抗-IL-6抗体AME-19aによる処置を糖の存在有り無しで受けさせる。膵島から分泌されるインスリンの濃度をいろいろな処置下で測定する。C2C12インスリンが骨格筋に対して示す影響を試験する目的でC2C12細胞を用いる。IRS1およびGlut4発現、インスリン誘発IRS1燐酸化およびIL-6がアジポネクチン作用に対して示す影響を検査する実験を実施する。利点:本発明のIL-6抗体を用いてIL-6の活性を抑制することは有意な治療的進展に相当し得る、と言うのは、それによってインスリン感受性および代謝制御を現存薬剤の副作用無しに改善することができるからである。加うるに、現在の治療を用いてT2DMに関連して糖尿病合併症の基礎となる原因であると考えられている全身性炎症を制御するのはほとんど不可能である。本発明のIL-6抗体の如き治療薬は、インスリン感受性を向上させることに加えて、全身性炎症を抑制しかつ糖尿病合併症の発症を防止すると期待する。T2DMにかかっている患者の数が増えており、2025年までに300百万人になると推定されている。抗IL-6抗体は単治療薬としてか或は既に現存する他のOAD、例えばスルホニル尿素、ビグアニド例えばMetphormin、チアゾリジンジオン、メグリチニド例えばレパグリニド、アルファ-グルコシダーゼ阻害剤例えばアカルボースなどと組み合わせて使用可能である。加うるに、それをインスリンもしくは他の治療薬、例えばインスリン感受性および血糖コントロールを向上させかつインスリン処置に関連した低血糖イベントを回避する治療薬などと組み合わせて用いることも可能である。また、抗-IL-6治療薬はインスリン感受性およびT2Dおよびメタボリック症候群患者における血糖値調節を改善することに加えてそのような患者にしばしば観察されるCV変化に対して有益な効果を与えるであろうとも期待する。Saltiel,AR,およびKahn,CR.2001.Nature414:799-806;Hansen,BC.,1995.DiabetesCare18:A2-A9;DiabetesPreventionProgram研究グループ.2002.NewEngl.JMed.,346:393-403;Hansen,BC.,2000,AnnNewYorkAcademyofScience,892:1-24;Hsueh.WA.,andQuinones,MJ.,2003,Am.J.Cardiology,93:10J-17J;Resnick,HEおよびHoward,BV.,2002,Ann.Rev.Med.,53:245-267;Korner,J.andAronne,L.,2003,JClin.Invest.,1115:565-570;Skoog,T.,他、2001.Diabetologia,44:654:655;Fernandez-Real,JM.,およびRicartW.,2003,EndocrineReviews,243:278-301;Fernandez-Real,JM.,他、2001,JClinEndocrinolMetab.,86:1154-1159;10a.Fried,S.,他、1998.JClinEndocrinolMetab.,83:847-850;Senn,JJ.,他、2002,Diabetes,51:3391-3399;Rotter,V.,他、2003,JBCinpress,Manus.301977200;12a.Stouthard,JM.,他、1996,BBRC,220:241-245;Southern,C.,他、1990,BiochemJ.,272:243-245;Sandler,S.,他、1990,Endocrinology,126:1288-1294;Pedersen,BK,他、2001,JPhysiol.,536:329-337;DiCosmo,BF,他、1994,Int.Immunol.,6:1829-1837;Wallenius,V.,他、2002,NatureMedicine,8:75-79;Vozarova,B.,他、2003,HumanGenetic,112:409-413;Kubaszek,A.,他,2003,Diabetes,52:558-461;Tsigos,C.,他、1997,JClinEndocrinolMetab,82:4167-4170;Stoutharad,JM.,他、1995,AmJPhysiol.,268;E813-E819;Kern,PA.,他、2001,AmJPhysiolEndocrinolMetab.,280:E745-E751;Bastard,JP.,他、2000,JClonEndocrinolMetab.,85:3338-3342;およびBastard,JP.,他、2002,J.Clin.Endocrinol.Metab.,87:2084-2089を参照のこと。本発明をこの上で行った説明および実施例に詳細に記述した様式とは別の様式で実施することも可能であることは明らかであろう。この上で行った教示に照らすことで本発明のいろいろな修飾形および変形が可能になり、従って、それらも添付請求の範囲内である。以下、本発明の主な態様および特徴を挙げておく。態様1:配列識別番号:132-137から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含んでおり、かつ、ヒトIL-6またはこれのフラグメントと結合する単離IL-6抗体。態様2:X1がAまたはGであり、X2がSまたはRであり、X3がH、I、SまたはYであり、X4がSまたはYであり、X5がSまたはFであり、X6がF、L、MまたはTであり、X7がNまたはEであり、X8がAまたはTであり、X9がM、C、SまたはQであり、X10がQまたはCであり、X11がTまたはQであり、X12がF、SまたはTであり、X13がSまたはPであり、X14がLまたはMであり、X15がAまたはIであり、X16がSまたはPであり、X17がYまたはWであり、X18がT、EまたはYであり、X19がYまたはFであり、X20がP、S、DまたはYであり、X21がVまたはDであり、X22がTまたはAであり、X23がGまたはPであり、X24がS、Y、TまたはNであり、そしてX25がY、T、FまたはIである態様1記載の単離抗体。態様3:少なくとも1つの相補性決定領域を含んでおり、かつ、ヒトIL-6またはこれのフラグメントと結合する単離ヒト改変抗体。態様4:配列識別番号:95、99、103、118、122、126および130から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖可変領域および/または配列識別番号:93、97、101、116、120、124および128から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んで成る単離IL-6抗体。態様5:少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:1、3、5、7、9、11、13および15から成る群から選択される相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:17、19、21、23、25および27から成る群から選択されるCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:29、31、33、35および138から成る群から選択されるCDRL3アミノ酸配列;から成る群の少なくとも一員を含んで成る単離IL-6抗体。態様6:少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択される相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:79、81、83、85、87、89、91および114から成る群から選択されるCDRH3アミノ酸配列;から成る群の少なくとも一員を含んで成る単離IL-6抗体。態様7:態様5記載の軽鎖可変領域および請求項6記載の重鎖可変領域を含んで成る単離IL-6抗体。態様8:更に前記少なくとも1つの相補性決定領域に隣接して位置する少なくとも1つのヒトフレームワーク領域も含んで成る態様7記載の単離IL-6抗体。態様9:前記少なくとも1つのヒトフレームワーク領域が配列識別番号:105-112から選択される態様8記載の単離IL-6抗体。態様10:少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:1、3、5、7、9、11、13および15から成る群から選択される相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:17、19、21、23、25および27から成る群から選択されるCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:29、31、33、35および138から成る群から選択されるCDRL3アミノ酸配列;を含んで成る態様5記載の単離IL-6抗体。態様11:少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択される相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:79、81、83、85、87、89、91および114から成る群から選択されるCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る態様6記載の単離IL-6抗体。態様12:態様10記載の軽鎖可変領域および態様11記載の重鎖可変領域を含んで成る単離IL-6抗体。態様13:更に配列識別番号:105のヒト軽鎖フレームワーク領域1FRL1、配列識別番号:106のFRL2、配列識別番号:107のFRL3、配列識別番号:108のFRL4、配列識別番号:109のヒト重鎖フレームワーク領域1FRH1、配列識別番号:110のFRH2、配列識別番号:111のFRH3および配列識別番号:112のFRH4も含んでおり、かつ、それらが前記相補性決定領域の間に散在している態様12記載の単離IL-6抗体。態様14:前記軽鎖可変領域がa配列識別番号:1、3、5、7、9、11、13および15から成る群から選択されるCDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:17、19、21、23、25および27から成る群から選択されるCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:29のCDRL3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様15:前記軽鎖可変領域がa配列識別番号:1、3、5、7、9、11、13および15から成る群から選択されるCDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:17、19、21、23、25および27から成る群から選択されるCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:35のCDRL3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様16:更に配列識別番号:105のヒト軽鎖フレームワーク領域1FRL1、配列識別番号:106のFRL2、配列識別番号:107のFRL3および配列識別番号:108のFRL4も含んで成っていてそれらがCDRLの間に散在している態様14または15記載の単離抗体。態様17:前記重鎖可変領域がa配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択されるCDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:87のCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様18:前記重鎖可変領域がa配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択されるCDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:89のCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様19:前記重鎖可変領域がa配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択されるCDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:91のCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様20:前記重鎖可変領域がa配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択されるCDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:114のCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様21:更に配列識別番号:109のヒト重鎖フレームワーク領域1FRH1、配列識別番号:110のFRH2、配列識別番号:111のFRH3および配列識別番号:112のFRH4も含んで成っていてそれらがCDRHの間に散在している態様17-20のいずれか記載の単離抗体。態様22:前記CDRL1が配列識別番号:7のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:21のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:29のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:41のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:75のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:87のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様23:前記CDRL1が配列識別番号:3のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:21のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:29のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:41のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:75のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:89のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様24:前記CDRL1が配列識別番号:15のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:27のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:35のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:47のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:61のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:91のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様25:前記CDRL1が配列識別番号:15のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:27のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:35のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:47のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:57のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:91のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様26:前記CDRL1が配列識別番号:15のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:17のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:29のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:45のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:59のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:89のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様27:前記CDRL1が配列識別番号:7のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL2が配列識別番号:17のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRL3が配列識別番号:29のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH1が配列識別番号:45のアミノ酸配列を含んで成り、前記CDRH2が配列識別番号:77のアミノ酸配列を含んで成りそして前記CDRH3が配列識別番号:87のアミノ酸配列を含んで成る態様12記載の単離抗体。態様28:配列識別番号:3の相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列、配列識別番号:21のCDRL2アミノ酸配列、配列識別番号:29のCDRL3アミノ酸配列、配列識別番号:39の相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列、配列識別番号:59のCDRH2アミノ酸配列および配列識別番号:89のCDRH3アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様29:少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記軽鎖可変領域がa配列識別番号:132の相補性決定領域軽鎖1CDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:133のCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:134から成る群から選択されるCDRL3アミノ酸配列;を含んで成り、ここで、X1がAまたはGであり、X2がSまたはRであり、X3がH、I、SまたはYであり、X4がSまたはYであり、X5がSまたはFであり、X6がF、L、MまたはTであり、X7がNまたはEであり、X8がAまたはTであり、X9がM、C、SまたはQでありそしてX10がQまたはCである単離IL-6抗体。態様30:少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記重鎖可変領域がa配列識別番号:135の相補性決定領域重鎖1CDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:136のCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:137のCDRH3アミノ酸配列;を含んで成り、ここで、X11がTまたはQであり、X12がF、SまたはTであり、X13がSまたはPであり、X14がLまたはMであり、X15がAまたはIであり、X16がSまたはPであり、X17がYまたはWであり、X18がT、EまたはYであり、X19がYまたはFであり、X20がP、S、DまたはYであり、X21がVまたはDであり、X22がTまたはAであり、X23がGまたはPであり、X24がS、Y、TまたはNであり、そしてX25がY、T、FまたはIである単離IL-6抗体。態様31:態様29記載の軽鎖可変領域および請求項30記載の重鎖可変領域を含んで成る単離IL-6抗体。態様32:更に配列識別番号:105のヒト軽鎖フレームワーク領域1FRL1、配列識別番号:106のFRL2、配列識別番号:107のFRL3、配列識別番号:108のFRL4、配列識別番号:109のヒト重鎖フレームワーク領域1FRH1、配列識別番号:110のFRH2、配列識別番号:111のFRH3および配列識別番号:112のFRH4も含んで成っていてそれらが前記相補性決定領域の間に散在している態様22-28および31のいずれか記載の単離IL-6抗体。態様33:少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記軽鎖可変領域が配列識別番号:105のヒト軽鎖フレームワーク領域1FRL1、配列識別番号:106のFRL2、配列識別番号:107のFRL3および配列識別番号:108のFRL4および散在しているCDR領域を含んで成り、ここで、前記CDR領域がa配列識別番号:1、3、5、7、9、11、13および15から成る群から選択されるCDRL1アミノ酸配列;b配列識別番号:17、19、21、23、25および27から成る群から選択されるCDRL2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:29、31、33、35および138から成る群から選択されるCDRL3アミノ酸配列;を含んで成る単離IL-6抗体。態様34:少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記重鎖可変領域が配列識別番号:109のヒト重鎖フレームワーク領域1FRH1、配列識別番号:110のFRH2、配列識別番号:111のFRH3および配列識別番号:112のFRH4および散在しているCDR領域を含んで成り、ここで、前記CDR領域がa配列識別番号:37、39、41、43、45および47から成る群から選択されるCDRH1アミノ酸配列;b配列識別番号:49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77および113から成る群から選択されるCDRH2アミノ酸配列;およびc配列識別番号:79、81、83、85、87、89、91および114から成る群から選択されるCDRH3アミノ酸配列;を含んで成る単離IL-6抗体。態様35:態様33記載の軽鎖可変領域および請求項34記載の重鎖可変領域を含んで成る単離IL-6抗体。態様36:少なくとも1つの軽鎖可変領域および少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、配列識別番号:93および95、配列識別番号:97および99、配列識別番号:101および103、配列識別番号:116および118、配列識別番号:120および122、配列識別番号:124および126および配列識別番号:128および130から成る群から選択される軽鎖および重鎖可変領域を含んで成る少なくとも1種の単離IL-6抗体と一緒に競合的にIL-6と結合する単離ヒトもしくはヒト改変抗体。態様37:態様12記載の単離IL-6抗体と一緒に競合的にIL-6と結合する単離ヒトもしくはヒト改変抗体。態様38:配列識別番号:115のアミノ酸168-184を含んで成る領域と競合的にIL-6と結合する単離ヒトもしくはヒト改変抗体。態様39:ヒト改変された態様36-38のいずれか記載の抗体。態様40:表面プラズモン共鳴またはKinexa方法を用いて測定した時に少なくとも10-9M、少なくとも10-10M、少なくとも10-11Mおよび少なくとも10-12M、少なくとも10-13M、少なくとも10-14Mおよび少なくとも10-15Mから選択される少なくとも1種の親和力でIL-6と結合する態様1-39のいずれか記載のIL-6抗体。態様41:少なくとも1種のIL-6ポリペプチドが示す少なくとも1種の活性を実質的に調節する態様1-40のいずれか記載のIL-6抗体。態様42:態様1-40いずれか記載の少なくとも1種の単離IL-6抗体をコードする単離核酸分子。態様43:態様42記載の単離核酸分子を含んで成る単離核酸ベクター。態様44:態様42記載の単離核酸分子を含んで成る原核または真核宿主細胞。態様45:COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髄腫またはリンパ種細胞、またはそれらの誘導体、不死化細胞もしくは形質転換細胞のいずれかから選択される少なくとも1種である態様44記載の宿主細胞。態様46:少なくとも1種のIL-6抗体の産生方法であって、態様42記載の核酸分子による翻訳をインビトロ、インビボまたはインシトゥ条件下でIL-6抗体が検出可能または回収可能量で発現するように起こさせることを含んで成る方法。態様47:態様1-40いずれか記載の少なくとも1種の単離IL-6抗体および少なくとも1種の製薬学的に受け入れられる担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。態様48:更に検出可能標識もしくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染薬、心臓血管CV系作用薬、中枢神経系CNS作用薬、自律神経系ANS作用薬、呼吸器作用薬、胃腸GI管作用薬、ホルモン薬、体液もしくは電解質平衡用薬剤、血液製剤、抗癌薬、免疫修飾薬、眼、耳もしくは鼻用薬剤、局所用薬剤、栄養薬、サイトカインおよびサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1種の化合物もしくはポリペプチドも含んで成る態様47記載の組成物。態様49:態様1-40いずれか記載の少なくとも1種の単離IL-6抗体と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体もしくはフラグメント。態様50:細胞、組織、器官または動物におけるIL-6関連状態を診断または処置する方法であって、態様1-40いずれか記載の少なくとも1種の抗体を有効量で含んで成る組成物を前記細胞、組織、器官または動物に接触させるか或は投与することを含んで成る方法。態様51:前記IL-6関連状態が関節リウマチ、変形性関節症、骨溶解、整形外科用インプラントの無菌性緩み、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、2型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患および腎細胞癌から成る群から選択される態様50記載の方法。態様52:前記有効量が前記細胞、組織、器官または動物1キログラム当たり約0.001-50mgである態様50記載の方法。態様53:前記接触または前記投与を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻内および経皮から選択した少なくとも1種の様式で実施する態様50記載の方法。態様54:前記接触または投与を実施する前、同時または後に更に検出可能標識もしくはレポーター、抗感染薬、心臓血管CV系作用薬、中枢神経系CNS作用薬、自律神経系ANS作用薬、呼吸器作用薬、胃腸GI管作用薬、ホルモン薬、体液もしくは電解質平衡用薬剤、血液製剤、抗癌薬、免疫修飾薬、眼、耳もしくは鼻用薬剤、局所用薬剤、栄養薬、サイトカインおよびサイトカインアンタゴニストから選択した少なくとも1種の化合物もしくはポリペプチドを有効量で含んで成る少なくとも1種の組成物を投与することも含んで成る態様50記載の方法。態様55:態様1-40のいずれか記載のIL-6抗体を含んで成る医療機器であって、前記IL-6抗体を非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻内および経皮から選択した少なくとも1種の様式で接触させるか或は投与するに適する機器。態様56:ヒト製薬学的もしくは診断用途用の製品であって、態様1-40のいずれか記載のIL-6抗体の溶液または凍結乾燥形態物が入っている容器および包装用材料を含んで成る製品。態様57:前記容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻内または経皮送達用の機器またはシステムの構成要素である態様56記載の製品。態様58:態様1-40のいずれか記載の単離IL-6抗体を製造する方法であって、前記抗体を回収可能量で発現し得る宿主細胞または遺伝子導入動物または遺伝子動物植物もしくは植物細胞を準備することを含んで成る方法。態様59:態様58記載の方法を用いて生じさせたIL-6抗体。態様60:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:2、4、6、8、10、12、14および16から成る群から選択される相補性決定領域軽鎖1CDRL1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:18、20、22、24、26および28から成る群から選択されるCDRL2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:30、32、34および36から成る群から選択されるCDRL3ヌクレオチド配列;から成る群の少なくとも一員を含んで成る単離核酸分子。態様61:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、少なくとも1つの重鎖可変領域を含んで成っていて前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択される相補性決定領域重鎖1CDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:80、82、84、86、88、90および92から成る群から選択されるCDRH3ヌクレオチド配列;から成る群の少なくとも一員を含んで成る単離核酸分子。態様62:態様60:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、請求項60記載の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列および請求項61記載の重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含んで成る単離核酸分子。態様63:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んで成っていて前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:2、4、6、8、10、12、14および16から成る群から選択される相補性決定領域軽鎖1CDRL1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:18、20、22、24、26および28から成る群から選択されるCDRL2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:30、32、34および36から成る群から選択されるCDRL3ヌクレオチド配列;を含んで成る単離核酸分子。態様64:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでおり、かつ、前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択される相補性決定領域重鎖1CDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:80、82、84、86、88、90および92から成る群から選択されるCDRH3ヌクレオチド配列;を含んで成る単離核酸分子。態様65:IL-6抗体をコードする単離核酸分子であって、態様63記載の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列および請求項64記載の重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含んで成る単離核酸分子。態様66:更に配列識別番号:105のヒト軽鎖フレームワーク領域1FRL1、配列識別番号:106のFRL2、配列識別番号:107のFRL3、配列識別番号:108のFRL4、配列識別番号:109のヒト重鎖フレームワーク領域1FRH1、配列識別番号:110のFRH2、配列識別番号:111のFRH3および配列識別番号:112のFRH4をコードするヌクレオチド配列も含んで成っていてそれらが前記相補性決定領域ヌクレオチド配列の間に散在している態様65記載の単離核酸分子。態様67:前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:2、4、6、8、10、12、14および16から成る群から選択されるCDRL1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:18、20、22、24、26および28から成る群から選択されるCDRL2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様63記載の単離核酸分子。態様68:前記軽鎖可変領域が下記:a配列識別番号:2、4、6、8、10、12、14および16から成る群から選択されるCDRL1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:18、20、22、24、26および28から成る群から選択されるCDRL2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:36のCDRL3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様63記載の単離核酸分子。態様69:前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択されるCDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:86のCDRH3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様64記載の単離核酸分子。態様70:前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択されるCDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:88のCDRH3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様64記載の単離核酸分子。態様71:前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択されるCDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:90のCDRH3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様64記載の単離核酸分子。態様72:前記重鎖可変領域が下記:a配列識別番号:38、40、42、44、46および48から成る群から選択されるCDRH1ヌクレオチド配列;b配列識別番号:50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76および78から成る群から選択されるCDRH2ヌクレオチド配列;およびc配列識別番号:92のCDRH3ヌクレオチド配列;を含んで成る態様64記載の単離核酸分子。態様73:配列識別番号:8のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:22のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:42のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:76のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:88のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様74:配列識別番号:4のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:22のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:40のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:60のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:90のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様75:配列識別番号:4のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:22のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:42のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:76のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:90のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様76:配列識別番号:16のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:28のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:36のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:48のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:62のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:92のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様77:配列識別番号:16のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:28のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:36のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:48のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:58のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:92のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様78:配列識別番号:16のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:18のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:46のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:60のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:90のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様79:配列識別番号:8のCDRL1ヌクレオチド配列、配列識別番号:18のCDRL2ヌクレオチド配列、配列識別番号:30のCDRL3ヌクレオチド配列、配列識別番号:46のCDRH1ヌクレオチド配列、配列識別番号:78のCDRH2ヌクレオチド配列および配列識別番号:88のCDRH3ヌクレオチド配列を含んで成る態様65記載の単離核酸分子。態様80:約2.7x10-11M以下のEC50値を示す態様1-39のいずれか記載のIL-6抗体。態様81:EC50値が約2.7x10-12M以下である態様80記載の抗体。態様82:配列識別番号:93の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:95の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様83:配列識別番号:97の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:99の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様84:配列識別番号:101の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:103の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様85:配列識別番号:116の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:118の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様86:配列識別番号:120の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:122の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様87:配列識別番号:124の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:126の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様88:配列識別番号:128の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:130の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。態様89:配列識別番号:94、98、102、117、121、125および129のヌクレオチド配列の中の1つがコードする軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列識別番号:96、100、104、119、123、127および131のヌクレオチド配列の中の1つがコードする重鎖可変領域アミノ酸配列を含んで成る単離IL-6抗体。"