"明細書中に記載の発明。発明の簡単な要旨本発明は、真核細胞における目的の組換え分子の大量産生に適切な、厳密に調節された誘導性遺伝子発現システムに関する。本発明のシステムの構成要素としては、以下が挙げられる:転写ブロッキングドメインおよびリガンド結合ドメインを有する融合タンパク質;この融合タンパク質の転写ブロッキングドメインに結合し、ヌクレオチド配列の転写を阻害するオペレーター;およびオペレーターの制御下にあるプロモーター。目的のヌクレオチド配列の発現が阻害されることが所望される場合、このシステムは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合可能なリガンドを含み、これにより、融合タンパク質が安定化される。目的のヌクレオチド配列が発現されることが所望される場合、リガンドは除去され、融合タンパク質の不安定化および分解を生じる。従って、認識リガンドの非存在において、融合たんぱく質は、オペレーターから除去され、そして目的のヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターのオペレーター阻害が除去され、それにより、目的のヌクレオチド配列の発現が可能になる。第1の局面において、本発明は、真核細胞において、目的のヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって、この方法は、以下:a真核細胞を提供する工程であって、この真核細胞は、以下:i調節融合タンパク質RPRをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、この融合タンパク質は、以下:1この目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび2リガンド結合ドメインからなる融合タンパク質である、ヌクレオチド配列;iiこの目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiiiこの転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、真核細胞である、工程;bこの融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程aの細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、この目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程;ならびにcこの細胞の存在下からこのリガンドを除去する工程であって、ここで、この目的のヌクレオチド配列の発現が誘導される工程を、包含する。転写ブロッキングドメインは、DNAに結合可能であり、かつ隣接するプロモーターからの転写をブロック可能なタンパク質である。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質、バクテリオファージリプレッサータンパク質、真核生物リプレッサータンパク質、または酵母リプレッサータンパク質に由来し得る。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質またはバクテリオファージリプレッサータンパク質に由来する。さらにより特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、TetR、LexA、LacI、TrpR、Arc、およびλClからなる群から選択されるリプレッサータンパク質に由来する。別の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、真核生物リプレッサータンパク質に由来する。さらにより特定の実施形態において、このリプレッサータンパク質は、GAL4に由来する。本発明の方法の別の特定の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、DNAに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、オペレーターが、この制限酵素の認識部位である。より特定の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、変異Not1である。特定の実施形態において、リガンド結合ドメインは、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する。より特定の実施形態において、このリガンド結合ドメインは、エストロゲンレセプターに由来し、そしてその同族リガンドは、エストロゲンである。さらにより特定の実施形態において、このエストロゲンレセプターは、1つ以上の変異例えば、T2変異を含み、その同族リガンドは、タモキシフェンである。種々の真核細胞が、本発明の方法において使用され得る。これらの真核細胞としては、酵母細胞例えば、Pichiapastorisまたは哺乳動物細胞例えば、COS、CHO、293、BHKもしくはNS0が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、目的のヌクレオチド配列の転写において広範に使用され得、この目的の産物は、mRNAもしくは触媒活性RNA、または転写された目的のヌクレオチド配列から生じる下流産物例えば、タンパク質もしくはタンパク質フラグメントのような、転写産物であり得る。このタンパク質またはタンパク質フラグメントとしては、ホルモン、レセプターもしくはレセプターフラグメント、抗体もしくは抗体フラグメント、生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、酵素、リプレッサータンパク質、またはDNA結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。第2の局面において、本発明は、調節融合タンパク質RPRをコードする、単離されたヌクレオチド配列に特徴を有する。ここで、この融合タンパク質は、1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインこのリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化されるからなる。別の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質、バクテリオファージリプレッサータンパク質、真核生物リプレッサータンパク質、または酵母リプレッサータンパク質に由来し得る。より特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、細菌性リプレッサータンパク質またはバクテリオファージリプレッサータンパク質例えば、TetR、LexA、LacI、TrpR、Arc、およびλClに由来する。別の実施形態において、真核生物リプレッサータンパク質例えば、GAL4に由来する。別の特定の実施形態において、この転写ブロッキングドメインは、DNAに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、オペレーターが、この制限酵素の認識部位である。この特定の実施形態において、例えば、転写ブロッキングドメインは、変異Not1である。特定の実施形態において、リガンド結合ドメインは、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する。より特定の実施形態において、このリガンド結合ドメインは、エストロゲンレセプターに由来し、そしてその同族リガンドは、エストロゲンである。さらにより特定の実施形態において、このエストロゲンレセプターは、1つ以上の変異例えば、T2変異を含み、その認識リガンドは、タモキシフェンである。第3の関連する局面において、本発明は、調節融合タンパク質RPRの特徴を有する。ここでこの調節融合タンパク質RPRは、1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインこのリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化されるからなる。特定の実施形態において、この調節融合タンパク質RPRは、本質的に、1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインこのリガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で、この融合タンパク質が安定化されるからなる。第4の局面において、本発明は、目的のヌクレオチド配列の誘導性の発現が可能な真核細胞に特徴を有する。ここで、この目的のヌクレオチド配列は、以下を含む:調節融合タンパク質RPRをコードするヌクレオチド配列ここでこの融合タンパク質RPRは、1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインからなる;iiこの目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiiiこの転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。特定の実施形態において、この真核細胞融合タンパク質は、本質的に以下からなる:1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインからなる;iiこの目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiiiこの転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。第5の局面において、本発明は、目的のヌクレオチド配列の誘導性の発現が可能な真核細胞を含むトランスジェニック動物に特徴を有する。ここで、この目的のヌクレオチド配列は、以下を含む:調節融合タンパク質RPRをコードするヌクレオチドここでこの融合タンパク質は、1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインからなる;iiこの目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、この融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiiiこの転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーター。本発明は例えば、以下の項目を提供する:項目1真核細胞において、目的のヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって、該方法は、以下:a真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下:i調節融合タンパク質RPRをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:1該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび2リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;ii該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiii該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程;b該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程aの細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程;ならびにc該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導される、工程、を、包含する、方法。項目2前記転写ブロッキングドメインが、細菌性転写ブロッキングタンパク質、バクテリオファージ転写ブロッキングタンパク質、真核生物転写ブロッキングタンパク質、または酵母転写ブロッキングタンパク質に由来する、項目1に記載の方法。項目3前記転写ブロッキングドメインが、TetR、LexA、LacI、TrpR、ArcおよびλClからなる群から選択される、細菌性転写ブロッキングタンパク質に由来する、項目2に記載の方法。項目4前記転写ブロッキングドメインが、真核生物転写ブロッキングタンパク質に由来し、該真核転写ブロッキングタンパク質はGAL4である、項目2に記載の方法。項目5前記転写ブロッキングドメインが、DNAに結合し得るが切断し得ない変異制限酵素であり、前記オペレーターが、該制限酵素の認識部位である、項目1に記載の方法。項目6前記転写ブロッキングドメインが、変異Not1酵素である、項目5に記載の方法。項目7前記リガンド結合ドメインが、ステロイドレセプター、甲状腺レセプターまたはレチノイドレセプターに由来する、項目1に記載の方法。項目8前記リガンド結合ドメインが、エストロゲンレセプターに由来し、そして、その同族リガンドがエストロゲンである、項目7に記載の方法。項目9前記リガンド結合ドメインが、エストロゲンに由来し、そして、その同族リガンドがタモキシフェンである、項目8に記載の方法。項目10前記目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結する前記プロモーターが、CMV、SV40、ラウス肉腫ウイルス、メタロチオネイン、ノパリンシンテターゼ、カリフラワーモザイクウイルス35SRNA、リブロース2リン酸カルボキシラーゼ、Gal4、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ、アルカリホスファターゼ、エラスターゼI;インスリン;免疫グロブリン;マウス乳癌ウイルス;アルブミン;α-胎児タンパク質;α1-アンチトリプシン;β-グロビン;およびミオシン軽鎖-2に由来する、項目1に記載の方法。項目11前記プロモーターが、CMV-MIEである、項目10に記載の方法。項目12前記真核細胞が、COS細胞、CHO細胞、293細胞、BHK細胞、またはNSO細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。項目13前記オペレーターが、TetOまたはArcOである、項目1に記載の方法。項目14前記オペレーターが、前記プロモーターのすぐ下流に位置する、項目1に記載の方法。項目15前記オペレーターが、前記プロモーターの10塩基対以内に位置する、項目1に記載の方法。項目16前記リガンドの非存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも20倍高い、項目1に記載の方法。項目17前記リガンドの非存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より少なくとも50倍高い、項目16に記載の方法。項目18調節融合タンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:1目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメイン、および2リガンド結合ドメインからなり、ここで、該リガンド結合ドメインに結合し得る同族リガンドの存在下で該融合タンパク質が安定化される、ヌクレオチド配列。項目19項目18に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、調節融合タンパク質。項目20目的のヌクレオチド配列の発言を誘導し得る真核生物であって、調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該融合タンパク質は、以下:1該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび2リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;ii該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiii該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、真核細胞。項目21項目20に記載の細胞を含む、トランスジェニック動物。項目22真核細胞において、目的のヌクレオチド配列由来の産物の生成を制御する方法であって、該方法は、以下:a真核細胞を提供する工程であって、該真核細胞は、以下:i調節融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該融合タンパク質は、以下:1該目的のヌクレオチド配列の発現を阻害し得る転写ブロッキングドメインおよび2リガンド結合ドメインからなる、ヌクレオチド配列;ii該目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結し、該融合タンパク質に結合するオペレーターによって制御される、プロモーター;およびiii該転写ブロッキングドメインに結合し得、隣接するプロモーターからの転写をブロックし得る、オペレーターを含む、工程;b該融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、工程aの細胞を所望の密度まで増殖させる工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が阻害される、工程;c該細胞の存在下から該リガンドを除去する工程であって、ここで、該目的のヌクレオチド配列の発現が誘導され、そして該目的のヌクレオチド配列の産物が生成される、工程を、包含する、方法。項目23前記目的のヌクレオチド配列の産物が、RNA、タンパク質またはタンパク質フラグメントである、項目22に記載の方法。項目24前記リガンドの存在下の前記目的のヌクレオチド配列の発現が、該リガンド非存在下の該目的のヌクレオチド配列の発現より100倍低い、項目22に記載の方法。他の目的および有利性は、以下の詳細な説明を概説することから明らかとなる。発明の詳細な説明本発明の方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法および特定の実験条件に限定されず、このような方法および条件は変わり得ることが、理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を説明するのみの目的であり、限定することを意図しない。何故なら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲にのみ限定されるからである。本明細書中および特許請求の範囲の中で使用される場合、単数形aanおよびtheは、その文脈が明らかに指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、方法の言及は、本明細書中で記載される型ならびに/または本開示を読むことで当業者に明らかになる、1つ以上の方法および/もしくは工程などを含む。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書中に記載のものと類似または等価の任意の方法および材料が、本発明を実施または試験するために使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料が、記載される。本明細書中で言及された全ての刊行物は、この刊行物が引用されたことに関する方法および/または材料を説明するために、本明細書中で参考として援用される。一般的説明本発明は、真核細胞における遺伝子発現が、オペレーターこのオペレーターは、調節融合タンパク質RFPによって調節されるによって制御される強いプロモーターを使用して厳密に調節され得るという概念に、一部基づく。このRFPは、本質的に転写ブロッキングドメイン、およびその活性を調節するリガンド結合ドメインからなる。リガンド結合ドメインの同族リガンドの存在下において、RFPはオペレーターに結合し、それにより、GOIの転写を妨げる。同族リガンドが取り除かれた場合、RFPは、不安定化され、そして目的のヌクレオチド配列の転写が進行する。本明細書中に記載される調節システムは、目的のヌクレオチド配列の発現の厳密に調節された制御と、大量産生に適した、目的のヌクレオチド配列の高レベルの発現が可能な細胞株の単離を組み合わせるという、特有の利点を提供する。厳密に調節されたは、本発明の融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合するリガンドの存在下で、目的のヌクレオチド配列の転写が実質的に低下する例えば、リガンド存在下で、リガンド非存在下で見られる転写のレベルと比較して、転写における少なくとも20分の1への低下が達成されるを意味する。より特定の実施形態において、本発明の方法は、リガンド存在下の転写において、少なくとも50分の1へ以下の低下を達成する。さらにより特定の実施形態において、本発明の方法は、リガンド存在下の転写において、100分の1以下への低下を達成する。本発明の方法によって達成される転写制御の程度の例は、図4および図7において示される。本発明の方法によって達成される転写の調節の程度はまた、リガンド非存在下における目的のヌクレオチド配列の発現における相違によっても述べられ、これは、リガンド存在下における目的のヌクレオチド配列の発現よりも、少なくとも20倍より大きく、好ましくは少なくとも50倍より大きく、より好ましくは少なくとも100倍より大きく。目的のヌクレオチド配列を高レベルで発現可能な細胞株の単離は、厳密な調節を必要とするが、目的のヌクレオチド配列の発現誘導は、好ましくは、誘導体の添加よりむしろ誘導体の除去によって達成され、これは、大量産生の間にリガンドの添加を必要とするシステムに対して製造コストを削減する手段として、実質的に商業的に重要である。本発明は、これらの要求を満足させる調節システムを説明する。目的のヌクレオチド配列本発明の方法は、任意の目的のヌクレオチド配列の転写を制御するために広範に使用され得る。本発明の方法は、所望のタンパク質またはタンパク質フラグメント例えば、融合またはキメラのタンパク質またはペプチドを産生するために使用され得る。さらに、目的の産物は、転写産物例えば、mRNAもしくは触媒活性RNA、または最初の転写産物の作用から生じる下流産物であり得る。目的のタンパク質としては、ホルモン、レセプターもしくはレセプターフラグメント、抗体もしくは抗体フラグメント、生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質、酵素、リプレッサータンパク質、またはDNA結合タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。プロモーター本明細書中で使用される場合、プロモーターは、作動可能に連結したすなわち、適切なシグナルが存在する場合、目的のヌクレオチド配列の転写を可能にする方法で連結したDNA配列の直接転写に十分なDNA配列を示す。目的のヌクレオチド配列の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーターまたはエンハンサーエレメントの制御下に置かれ得る。本発明において使用され得る有用なプロモーターとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない:SV40初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの長い3’末端反復配列に含まれるプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、マウスサイトメガロウイルスIEプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルスIEプロモーターGossenら,1995Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:5547-5551;ノパリンnopalineシンテターゼプロモーター領域、カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター、および光合成酵素リブロース2リン酸カルボキシラーゼのプロモーターを含む植物発現ベクター;酵母または他の真菌類由来のプロモーターエレメント例えば、Gal4プロモーター、ADCアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、PGKホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写調節領域:エラスターゼI;インスリン;免疫グロブリン;マウス乳腺癌ウイルス;アルブミン;α-フェトプロテイン;α1-抗トリプシン;β-グロビン;およびミオシン軽鎖-2。オペレーター本明細書中で使用される場合、オペレーターは、遺伝子がRFPのオペレーターへの結合によって調節され得、結果としてGOIの転写を妨げるかまたは可能にするような方法によって、遺伝子内またはその近傍に導入される、DNA配列を示す。原核細胞およびバクテリオファージにおける多くのオペレーターは、よく特徴付けられているNeidhardt編,EscherichiacoliandSalmonella;CellularandMolecularBiology2d.Vol2ASMPress,WashingtonD.C.1996。これらとしては、E.coliのLexA遺伝子のオペレーター領域LexAペプチドに結合するならびに乳糖オペレーターおよびトリプトファンオペレーターE.coliのLacIおよびtrpR遺伝子にコードされるリプレッサータンパク質に結合するが挙げられるが、これらに限定されない。これらとしてはまた、λPR遺伝子およびファージP22ant/mnt遺伝子に由来するバクテリオファージオペレーターλcIおよびP22arcによってコードされるリプレッサータンパク質に結合するが挙げられる。代替の実施形態において、RFPの転写ブロッキングドメインが制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、このオペレーターが、プロモーターに隣接するか、または3’側でなければならず、これにより、プロモーターによって転写を制御し得ることを理解する。例えば、米国特許第5,972650号本明細書中で参考として援用されるは、tetO配列が、TATAボックスから特定の距離の範囲内に存在することを明確に述べている。特定の実施形態において、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に置かれる。他の実施形態において、このオペレーターは、プロモーターから10塩基対以内に置かれる。転写ブロッキングドメイン本明細書中で使用される場合、転写ブロッキングドメインは、オペレーターとのその相互作用の結果として転写をブロッキング可能な任意のドメインであり得る。このようなドメインは、細菌、バクテリオファージ、または酵母に由来し得、そしてその機能がリガンド結合に依存するリプレッサーまたはその誘導体例えば、TetR、LexA、LacIおよびArcが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、転写ブロッキングドメインは、哺乳動物細胞例えば、Yinら1995J.Virol.69:6209-6218に記載されるようにまたは植物細胞例えば、Wildeら1994PlantMol.Biol.24:38に記載されるようにに由来し得る。転写ブロッキングドメインはまた、合成的に作製され得る。例えば、転写ブロッキングドメインは、DNAを切断し得ないように変異された制限酵素であり得る。このような場合、この酵素の認識配列は、オペレーターとして使用される。リガンド結合ドメイン融合タンパク質のオペレーターと相互作用する能力が転写ブロッキングドメインで制御される一方、融合タンパク質の活性は、リガンド結合ドメインによって調節される。リガンド結合ドメインは、その同族リガンドに結合した場合、機能的なポリペプチドを与える例えば、ポリペプチドを安定化する、任意のポリペプチドに由来し得る。リガンド結合ドメインは、天然に存在するリガンド結合ドメインおよびその機能的誘導体を含むことを意味する。本明細書中で使用する場合、同族リガンドは、リガンド結合ドメイン、およびその機能的誘導体に結合する天然に存在するリガンドを含む。このようなリガンド結合ドメインの例としては、ステロイドレセプター、グルココルチコイドレセプター、レチノイドレセプターおよび甲状腺レセプターのリガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されないEilersら1989Nature340:66-68;Picardら1988Cell54:1073-1080。実施例1~3は、融合タンパク質の転写ブロッキングドメインがTetRであり、リガンド結合ドメインがT2変異を有するエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインERLBDT2;Feilら1997Biochem.Biophys.Res.Commun.237:752-757である本発明の1つの実施形態を説明する。TetO配列が強力なCMV-MIEプロモーターの下流および近位に置かれる場合、CMV-MIE/TetOプロモーターからの目的のヌクレオチド配列この場合hFcγRIの転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、タモキシフェンの除去によりブロック解除される。細胞選択方法論本発明の方法は、目的のヌクレオチド配列について高産生率を有する細胞を産生する。以下の実験の章において記載される方法に加えて、当該分野で公知の種々の選択プロセスが使用され得る。1つの好ましい実施形態において、選択プロセスは、2002年11月14日に公開されたUSSN20020168702本明細書中で詳細に参考として援用されるに記載される、FASTR方法論である。FASTR方法論は、融合タンパク質の直接スクリーニングによる、本発明のサイトカイン特異的融合タンパク質を分泌する細胞の迅速な単離のための高スループットスクリーニング方法である。トランスジェニック動物本発明はまた、本発明の融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製を企図する。例えば、哺乳動物において、目的のヌクレオチド配列の発現を調節することが望ましい場合がある。本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子は、哺乳動物のゲノムに統合され得、それにより、そのプロモーターが融合タンパク質に反応し得るように操作される、目的のヌクレオチド配列の発現を調節する。さらに、トランスジェニック動物は、目的のヌクレオチド配列の供給源として有用であり得る。トランスジェニック動物は、受精卵細胞の雄性前核への核酸構築物の導入例えば、微量注入法、レトロウイルス感染し、卵細胞を偽妊娠した養母動物femalefosteranimalにおいて発生させることによって産生され得る。発現ベクターにおいて有用な、何らかの調節配列または他の配列は、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。組織特異的調節配列は、導入遺伝子の発現を特定の細胞に向けるために、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。キット本発明はまた、本発明の少なくとも1つの融合タンパク質を満たした1つ以上の容器を含むキットを提供する。必要に応じて、このような容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用、販売を規制する行政機関により定められた形態で認められ得、この形態は、aヒト投与のための製造、使用、販売の機関による承認、b使用の説明、またはこの両方を反映する。特定の実施形態実施例1は、pTE313プラスミド、pTE084プラスミド、およびpTE158プラスミドの構築を記載する。pTE313を、調節融合タンパク質TetR-ERLBDT2の高レベル発現のために設計した。これは、TetR-ERLBDT2融合遺伝子がCMV-MIEプロモーターによって駆動される第1の独立した発現カセット、およびSV40プロモーターによって駆動されるブラスチシジンblasticidin抵抗性遺伝子である第2の独立したカセットを含む図1。pTE084を、hFcγRIヒトIgGのFcドメインに対する高親和性細胞表面レセプターの高レベル発現のために設計した。2つの縦列のTetRオペレーターを、pTE084内のCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置することによって、pTE158を産生した図2。pTE313によるトランスフェクション後にTetR-ERLBDT2RFPによって調節されたhFcγRI遺伝子を発現するCHOK1細胞を、実施例2において記載されるように産生し、そして同定した。pTE313によるトランスフェクション後にTetR-ERLBDT2RFPによって調節されるhFcγRI遺伝子を発現するクローンを単離するために、2つの戦略が、使用される図3。両戦略を、TetR-ERLBDT2RFPのCHOK1-FcR細胞の導入および単離後に得られた細胞の同じプールから開始した実施例3。これらの結果は、組換え遺伝子の発現は、TetR-ERLBDT2によって厳密に調節され得、そして発現の誘導は、タモキシフェン存在下におけるドキシサイクリンの添加またはタモキシフェンの除去のどちらかによって達成され得ることを、明らかに示す図4。培地からの低分子の除去による目的のヌクレオチド配列の発現の誘導を、希釈または培地交換によって容易に達成した。このことは、大規模に発現を誘導するための、対費用効果の高い手段を提供する。さらに、これらのデータは、発現の厳密な調節は、TetR-ERLBDT2調節融合タンパク質によって達成され得ることを示す。hFcγRICMV-ME/ArcO2プロモーターによって駆動されるを発現するCHOK1細胞を、実施例4および実施例5において記載のように産生した。Arc-ERLBDT2によって調節される誘導性細胞株を、図3において示した戦略と同様の戦略によって選択し、そしてOHTの増殖培地中の存在に対する応答における厳密な調節を示した実施例6および図7。以下の実施例は、本発明の方法および化合物をいかに作製しそして使用するかについて、当業者に完全な開示および記載を提供するために示され、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定することを意図しない。使用した数例えば、量、温度などに関し、正確を期するよう努力したが、幾つかの実験的誤差およびずれは勘定に入れられるべきである。示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧またはその近くである。実施例1.pTE313、pTE084およびpTE158の構築pTE313を、pTA-ER-LBD-T2T2変異を有するヒトエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインERLBDT2Feilら,1997BiochemBiophysResCommun237:752-757をコードする由来の975bpのEcoRIフラグメント平滑化をpcDNA6/TRInvitrogenカタログ番号V-1025-20のEcoRI部位平滑化、TetRC末端のすぐ後のリンカー領域中内に連結することにより、構築した。T2変異であるG400V、M543A、およびL544Aにより、エストラジオールアナログであるドキシサイクリンとの結合に対する特異性を与えられる。ライゲーションによって生じた所望のプラスミドにおいてERLBDT2をコードするフラグメントの、連結から生じる適切な方向を、DNA配列決定によって確かめた。この構築により、エストロゲンレセプターのアミノ酸N304~V595Genbank登録番号P03372と融合したTetRGenbank登録番号AAF75608のアミノ酸M1~S207からなる融合タンパク質をコードする遺伝子が生じた。この遺伝子によってコードされるキメラタンパク質もまた、エストロゲンレセプターにおいて、T2変異であるG400V、M543A、およびL544Aを有する。プラスミドpTE313は、CMV-MIEプロモーターによって駆動されるTetR-ERLBDT2融合遺伝子であるカセットを含み、そしてSV40プロモーターによって駆動されるブラスチシジン抵抗性遺伝子である第2のカセットを含む図1。pTE084を、ヒトFcγRIGenBank登録番号M21091をコードするpCAE100由来の1,436bpのXbaIフラグメントを、pRG821G418に抵抗性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIInpt遺伝子をコードするベクターのXbaI部位内に連結することによって、構築した。このライゲーションから生じる、所望のプラスミドにおけるhFcgRIの方向性は、NotI、PstI、EcoRI、およびStuIでの制限マッピングによって試験され得る。2つの縦列のTetRオペレーターをコードするDNAフラグメントを、pTE084中のCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置し、pTE158を作製した図2。このプラスミドにおいて、CMV-MIEプロモーターからのhFcγRIの転写は、TetRまたはTetR-ERLBDT2によって調節された。実施例2.CMV-MIE/TetOによって駆動されるhFcγRIを発現するCHOK1誘導体の構築CHOK1細胞3×106細胞を、LipofectamineTMLifeTechnologies;Rockville,MDを製造業者の指示に従って用いて、pTE158でトランスフェクトした。細胞を、500μg/mlのG418LifeTechnologiesを含む培地10ウシ胎仔血清、90Ham’sF-12、2mML-グルタミン;全ての試薬は、LifeTechnologies,Rockville,MDから内に、12日間置いた。G418抵抗性の細胞を、トリプシン処理し、プールし、そしてFITC結合ヒトIgGFcフラグメントFITC-hFc;JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PAで染色した。簡潔には、10cm培養プレート上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム非含有のダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水PBSLifeTechnologiesで1回洗浄した。2mlの0.25トリプシンLifeTechnologiesを、各プレートに添加し、そして37°Cで4~5分インキュベートした。このプレートを、細胞がプレートから解離するまで旋回した。4mlの培地を、細胞の離れた各プレートに直ちに加えた。細胞を、次いで、1,000×g、4分間の遠心分離によって回収し、培地で希釈した、4mlの2μg/mlFITC-hFcに再懸濁した。細胞を、次いで、プラットフォーム振盪機platformshaker上に置き、そして1時間室温で染色した。未結合のFITC-hFcを除去するため、細胞を、8mlのPBSで2回洗浄した。FITC-hFcと結合することが可能な洗浄した細胞を、MofloTMセルソーターCytomation;FortCollins,COにおいてフローサイトメトリで測定した。FITC-hFcは、非トランスフェクト親CHOK1細胞を染色しなかったが、G418抵抗性pTE158トランスフェクトプールにおいて蛍光の分布を生じた。G418抵抗性集団由来の蛍光細胞の全プールを、フローサイトメトリによって収集し、展開し、次いでhFcγRIの発現についてのフローサイトメトリによって分析した。この集団における、最高15蛍光を有する細胞を単離し、プールし、そして展開し、hFcγRIを高レベルで発現するG418抵抗性細胞の集団を生じた。この細胞の集団を、CHOK1-FcRと名付け、そしてpTE313のトランスフェクション後、TetR-ERLBDT2RFPによって調節されるhFcγRI遺伝子を発現するクローンを単離するために、使用した。実施例3.TetR-ERLBDT2によって調節されるhFcγRI発現を有する、CHOK1細胞株の構築CHOK1-FcR細胞2×106細胞を、LipofectamineTMを用いてpTE313でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、500μg/mlのG418および10μg/mlのブラスチシジンで14日間、pTE158およびpTE313の両プラスミドについて選択した。フローサイトメトリによる分析の2日前、細胞を、200nMタモキシフェンOHT含有培地中でインキュベートし、TetR-ERLBDT2の活性を安定化し、hFcgRIの発現を抑制した。細胞を、FITC-hFcで染色し、そして最低2の蛍光を有し、hFcγRI発現の抑制を示すこれらの細胞を、回収し、プールA1を得た。次いで、このプールを、図3において概略される2つの戦略のための細胞の供給源として使用した。TetR-ERLBDT2によって調節されるhFcγRIを発現したクローンを、ドキシサイクリンDoxの存在または非存在によってTetR-ERLBDT2活性を操作することによって単離した。1つの戦略は、OHTおよびDoxの存在下で高レベルのhFcγRIを発現する細胞を単離し、続いて、OHT存在下Doxの非存在下で非発現細胞を単離することを包含した。あるいは、OHT存在下Doxの非存在下で低レベルのhFcγRIを発現する細胞を最初に単離し、次いで、高発現細胞をOHT存在下でDoxでの誘導によってこのプールから単離した。両戦略は、誘導条件または抑制条件を変えた下での一連の細胞単離、ならびにOHTおよびDoxの両方の非存在下での高レベルのhFcγRIを発現した単一細胞の最終的な単離を、使用した図3。プールA1を200nMOHT存在下で7日間展開し、次いで、2つのシャーレに分けた;1つのシャーレは、1μg/mlのDox培地を含み、他方は含まなかった。細胞を、3日間インキュベートし、次いで、FITC-hFcで染色し、hFcγRIの存在を検出した。1μg/mlのDoxで誘導した、培養物からの上位60のhFcγRI陽性細胞を、単離し、プールB11を得た。そして最低30の蛍光を有する細胞を、Dox非含有培地中で増殖した細胞から単離し、プールB12を得た。プールB11を、Dox非含有200nMタモキシフェン中で増殖し、そして最低1の蛍光を有する細胞を回収し、プールC11を得た。プールB12を200nMOHTおよび1μg/mlのDox中で増殖し、hFcγRI陽性細胞の上位1をプールとして回収し、プールC12を得た。次いで、C11およびC12の両プールを、OHTおよびDoxの両方を非含有の下で展開した。次いで、OHTおよびDoxの非存在下で最高レベルのhFcγRIを発現した細胞上位1を、96ウェルプレート上に、1ウェルにつき1細胞でソートした。これらの細胞は、誘導または抑制されたhFcγRI発現の単離を変えた結果として、hFcγRIの低い非誘導性発現を有し、そしてOHTの除去によって誘導された場合、高レベルのhFcγRIを有するべきである。展開後、10個の独立したクローンを、OHT除去または1μg/mlのDoxの添加によるそのhFcγRI誘導について、FITC-hFcでの免疫染色およびフローサイトメトリによる分析によって特徴付けた。1つのクローンプールC12からのD124の分析は、Doxなしでは、hFcγRIの検出可能レベルが存在しないことを示したが、一方、高レベルのhFcγRI発現が、OHTおよびDoxの非存在下において、観察された。さらに、OHT存在下で増殖した細胞への1μg/mlでのDoxの添加もまた、高レベルのhFcγRI発現をもたらした。このクローンにおけるhFcγRI発現のレベルOHTの除去またはOHT存在下での1μg/mlのドキシサイクリンによる誘導から生じるは、識別不能であった図4。実施例4.pTE528、pTE529、およびpTE534の構築ファージP22Arcリプレッサー遺伝子は、53アミノ酸ファージP22ゲノムDNAGenBank登録番号NC002371のヌクレオチド38,336~38,494にコードされる、M1~A53の転写リプレッサーをコードする。Arcによって媒介される転写抑制は、ダイマーのオペレーターの半分部分への配列付加に関する。以前、15アミノ酸リンカーによって繋げられた2つのArcタンパク質からなる単一鎖ダイマーは、野生型リプレッサーよりもarcオペレーターDNAに対する高親和性を有することが示されたRobinsonら1996Biochemistry35:109-116。単一鎖ダイマーのオペレーターDNAについてのより高い親和性の利点を得るために、6個のヒスチジン残基からなるHisタグ配列を融合したこの単一鎖Arcダイマーをコードした合成DNAを、設計した。444bpのこの合成XhoI/NotIDNAフラグメントを、pUC119内にクローン化し、そしてpCU119-Arc2-His6BlueheronTechnologyInc.を得た。次いで、このArc2ダイマー遺伝子を、このプラスミドから切り出し、Arc2遺伝子の発現がUbcプロモーター/β-グロブリンイントロンに依存するように、pRG985のXhoI部位およびNotI部位にクローン化し、pTE528を得た。Arc2-ERLBDT2融合タンパク質図5を、ヒトERLBDT2コードDNAを上述のように含むpTE502からの3361bpのBamHIフラグメントを、pTE528のBamHI部位内に連結することによって構築し、pTE529を得た。生じたArc2-ERLBDT2融合タンパク質は、Arc2遺伝子とERLBDT2遺伝子との間にTetR-ERLBDT2におけるTetRとERLBDT2との間配列番号3と同様に、同じ11アミノ酸リンカーAYSGSRELIRL配列番号1を有した。CMV-MIE/TOプロモーターにおける、TetオペレーターのArcオペレーターファージP22ゲノムGenbank登録番号NC002371中の38,273塩基対~38,293塩基対によってコードされるへの交換のために、pTE158を、以下のプライマーセットを用いたPCRによってDNAフラグメントを増幅するためのテンプレートとして使用した:5’-GAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT-3’配列番号4および5’GAGAGATCTGAGTCGACATAGTAGAGTGCTTCTATCATGAATAGTAGAGTGCTTCTATCATGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCA-3’配列番号5。縦列のArcオペレーターをコードするこのPCR産物を、NdeIおよびSalIで消化し、そしてpTE158内の同じ部位にクローン化した。CMV-MIE/AOハイブリッドプロモーターは、2つの縦列のarcオペレーターを、CMV-MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に有する図6配列番号6。結果として、Arc2-ERLBDT2転写リプレッサーは、pTE534におけるCMV-MIE/AOプロモーターからのhFcγRIの転写を調節し得る。実施例5.CMV-MIE/ArcO2プロモーターによって駆動されるhFcγRIを発現するCHOK1誘導体の構築CHOK1細胞2×106を、上述のように、LipofectamineTMを使用して、pTE534でトランスフェクトした。この細胞を、400μg/mlのG418InvitrogenLifeTechnologies含有の培養培地10ウシ胎仔血清、90Ham’sF-12、2mML-グルタミン;全ての試薬は、InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CAから内に、12日間置いた。G418耐性の細胞を、上述のように、トリプシン処理し、プールし、そして2μg/mlのFITC結合ヒトIgGFcフラグメントFITC-hFcで染色した。FITC-hFcは、非トランスフェクト親CHOK1細胞を染色しなかった。hFcγRIを発現する細胞は、FITC-hFcと結合し、そしてその蛍光に基づいて、MofloTMセルソーターにおいて、フローサイトメトリによって単離した。この集団において、最高3の蛍光を有する細胞を、単離し、プールし、そして展開した。このhFcγRI陽性プールを、FITC-hFcでの細胞表面染色を繰り返し、集団中の上位30の最も蛍光を発する細胞をソーティングすることによって富化し、プールBを得た。hFcγRIを発現する上位20以内の細胞プールBを単離し、プールCを得た。プールC2CHOK1/pTE534を使用し、Arc-ERLBDT2によって調節される誘導性細胞株を産生した。実施例6.Arc-ERLBDT2依存性hFcγRI発現を有するCHOK1細胞株の構築CHOK1/pTE534細胞2×106/シャーレを、LipofectamineTMを使用して、pRG985空ベクターまたはpTE529のどちらかでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、OHT非存在下で、400μg/mlのG418および10μg/mlのピューロマイシンで14日間選択した。細胞を、上述のように、FITC-hFcで染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。pRG985でトランスフェクトした細胞は、親細胞に類似し、分析の前にOHTの存在下で増殖させてもさせなくても、同様のhFcγRI染色プロフィールを有した。対照的に、pTE529でトランスフェクトされたCHOK1/pTE534細胞におけるhFcγRI発現は、増殖培地中のOHTの存在に対し、顕著な応答を示した。増殖培地中のOHTの非存在下において、G418およびピューロマイシンに耐性な細胞の大部分が、hFcγRI発現に対し陽性であり、そしてhFcγRI陽性細胞の上位30を、プールとしてソートした。このプールをOHT存在下で10日間展開し、hFcγRI発現について染色し、そしてフローサイトメトリで分析した。このプール中の70以上の細胞が、OHT存在下でhFcγRIを発現せず、そして最低30を発現するこれらの細胞を、プールとしてソートした。次いで、これらの細胞を、培地中のOHTの非存在下で展開した。OHT非存在下で最高レベルのhFcγRIを発現した細胞上位1を、96ウェルプレート中に1ウェルにつき1細胞でソートした。OHTの培地中の存在に対する応答において厳密な調節を示すクローンを、フローサイトメトリによってさらに特徴付けた。これらのクローンにおけるhFcγRI発現のOHT依存性調節を、フローサイトメトリ後/および引き続いてのFITC-hFcでの免疫染色によって確認した。OHTが培地中に存在した場合、1つのクローンC17において、検出可能なレベルのhFcγRIは、何も観察されなかったが、一方、OHTの非存在下での増殖は、これらのクローンにおいて、hFcγRIの発現を誘導した図7。"