"目的タンパク質のアミノ酸配列中に、配列表1で示されるペプチド断片を挿入し、プロテインA結合能を付加させることを特徴とする、プロテインA結合タンパク質の作製方法。目的タンパク質が、特異的結合活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項1記載のプロテインA結合タンパク質の作製方法。目的タンパク質が哺乳類動物由来のIgGである、請求項2記載のプロテインA結合タンパク質の作製方法。配列番号1で表されるペプチド断片を、IgG抗体重鎖の抗原認識領域に挿入することを特徴とする、請求項1記載のプロテインA結合タンパク質の作製方法。しかしながら、従来の抗体のプロテインA固定化方法ではFc部位を介して結合するためマウスIgG1抗体はプロテインAに対する結合力が比較的弱いという問題があった。特にマウス抗体は大量生産し臨床検査試薬や医薬品等に利用するが、産生抗体がIgG1サブクラスである場合が多く、抗原親和性が高い抗体であってもプロテインAを利用した免疫検査チップに利用できないという課題を有していた。本発明は、前記従来の課題を解決するもので、マウスIgG1抗体のプロテインA結合能を向上させるプロテインA結合タンパク質の作製方法を提供することを目的とする。前記従来の課題を解決するために、本発明のプロテインA結合タンパク質の作製方法は、目的タンパク質に対して特定配列のペプチド断片を抗原認識領域内に挿入することでプロテインA結合能を付加する。本構成によって、目的タンパク質のプロテインA結合能を増強することができる。本発明のプロテインA結合タンパク質の作製方法によれば、目的タンパク質にプロテインA結合能を付加することができる。以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。実施の形態1抗体の抗原認識部位にプロテインA結合能を挿入する設計方法について説明する。図1に関して、配列1で示されるペプチド断片101をマウスIgG1抗体102の重鎖抗原認識部位に挿入することで、組み換え抗体103を作製する手順を示した。抗体の抗原認識部位のドメイン構造について説明する。すべての抗体分子の基本構造は2つの同じ軽鎖L鎖と重鎖H鎖からなり、それぞれがジスルフィド結合で結ばれている。N末端側に可変領域があり、重鎖可変領域をVH、軽鎖可変領域VLとする。それ以外のドメインを定常領域は重鎖のものはCH1,CH2,CH3、軽鎖のものはCLとする。可変領域の中でも、相補性決定領域CDRのアミノ酸残基を変化させることにより多様な抗原認識機能を創出している。抗原分子のドメイン構造は可変領域で9つ,定常領域で7つの逆平行βシートからなるβバレル構造をしている。抗体は共通な枠組構造、すなわちフレームワーク領域FR領域が重鎖3個、軽鎖3個の合計6個のループ領域CDRを支持するように配置され、CDRのアミノ酸配列に多様性を持たせることにより、さまざまな抗原を認識している。抗体の抗原特異性はCDRの立体構造、相対的な配置、アミノ酸残基の側鎖の特性によって決定される。CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持する部位とが存在し、CDRの取り得る立体構造は、複数のカノニカル構造に分類される。カノニカル構造のクラスは、CDRのみならずフレームワーク領域の特定の位置のアミノ酸の種類によっても決定される。CDR移植法を用いる場合、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基も移植する必要性がある。一般に、移植すべきCDRを有する抗体はドナー、CDRが移植される側の抗体はアクセプターと定義され、CDR移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りCDRの構造を保存することにある。この目的を達成するためには、アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、ドナーのFR領域からいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の2点に留意する必要がある。図2はVHにおけるFRとCDRの二次構造を示している。一般的に知られているKabatnumbering法によって各々のモチーフを分類することができる。第一のフレームワーク領域FR1201と第二のフレームワーク領域FR2202によってCDR-H1211が保持され、同様にFR2とFR3203によってCDR-H2212が保持され、FR3とFR4204によってCDR-H3213が保持されている。実施の形態2本発明のプロテインA結合タンパク質の作製方法について説明する。マウス抗体の軽鎖及び重鎖の構造遺伝子をモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞からcDNAを合成し、PCR法で増幅し、発現ベクターにクローニングする方法は通常公知の技法で行われる。ベクターとして用いられるのは、真核細胞を発現宿主とする場合は、pcDNA、pCMVなどのCMVプロモーターで発現制御を行うベクター、及び、pEF1、pBudなどのEF1αプロモーターで発現制御を行うベクター、または、これらのプロモーターを組み合わせたベクター使用することができる。原核細胞を発現宿主として使用する場合はT7プロモーターで発現制御を行うベクター、trcプロモーターで発現制御を行うベクター、プロモーターの機能を糖化合物の添加によって制御するベクター等を使用することができる。真核細胞の発現宿主としては、HEK293、HEK293T、HEK293F、CHODG44、CHOK1、Hela、COS1、COS7、Pichiasp.などを使用することができる。原核細胞の発現宿主としては、Escherichiasp.,Bacillussp.,Streptmycessp.,Actinomuycessp.,Staphlocossussp.,Gluconobactorsp.,Acinetobactorsp.,などを使用することができる。昆虫細胞の発現宿主としては、SF株、及びそれらの由来株を使用することができる。また、上記ベクターのクローニングサイト近傍に蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、アルカリフォスファターゼ、糖類結合タンパク質、グルタチオン、ポリヒスチジン等の通常公知の機能性タンパク質を組み換え抗体と共発現させることもできる。発現ベクターを細胞内に導入する方法について、真核細胞の場合は、リポフェクタミン法、エレクトロポレーション法、燐酸カルシウム法など、原核細胞の場合は、ヒートショック法、エレクトロポレーション法など通常公知の手法を使用することができる。組み換え抗体の生産について、真核細胞の場合は、牛血清を添加したDMEM、IMEM、RPMIなどの合成培地や、無血清培養に最適化された合成培地を使用することができる。原核細胞の場合は、LB培地、2×YT培地など通常公知の微生物培地を使用することができる。プロテインAと組み換え抗体の結合性の評価には、表面プラズモン共鳴方式SPR、ELISA方式、フローサイトメトリー方式、ラテックス凝集方式、免疫染色方式など通常公知の手法を使用することができる。実施例1<組み換え抗体の発現と精製>マウスIgG1を産生するハイブリドーマ細胞株よりcDNAを作製し、このcDNAを鋳型としたPCR法によって重鎖及び軽鎖遺伝子断片が通常公知の手法によって得られた。増幅した重鎖及び軽鎖遺伝子断片をpBudCE4.1Invitrogen社のEF1αプロモータ下流のクローニングサイトに挿入することでマウスIgG1遺伝子発現ベクターを構築した。配列表1で示されるプロテインA結合性ペプチド断片をコードする遺伝子断片をVH領域のFR1に相当する部位に挿入した重鎖可変領域の人工遺伝子をTakaraBiotechnology社に委託合成して得た。プロテインA結合性マウスIgG1抗体の遺伝子構築について説明する。マウスIgG1抗体の中でもFab領域でプロテインAと結合する、すなわち、プロテインA結合性マウスIgG1のVH領域遺伝子構造を301に示している。Kabatnumbering法に従ってFR1311、FR2321、FR3331、FR4341の遺伝子モチーフを同定した。これに対して302はプロテインA非結合性マウスIgG1のVH領域遺伝子構造を示している。同様にFR1312、FR2322、FR3332、FR4342の遺伝子モチーフを同定した。次に、プロテインA結合性IgG1のFR1、FR2、FR3、FR4を各々プロテインA非結合性IgG1のFR1、FR2、FR3、FR4と交換した組み換え抗体遺伝子を作製した。FR1交換抗体のVH領域遺伝子401、FR2交換抗体のVH領域遺伝子402、FR3交換抗体のVH領域遺伝子403、FR4交換抗体のVH領域遺伝子404を作製した。本発明では上記のフレームワーク交換抗体のプロテインA結合性を検討することで配列表1のペプチド断片がプロテインA結合能を有することを見出した。抗原認識には直接的にはCDR領域のループ部位が関与すると考えられ、立体構造を保持しつつフレームワークに機能を付加すれば抗原認識性は失われることなく、抗体に新たな機能を付加できることは自明である。本発明では鋭意検討の結果、CDRの立体構造を保持しつつプロテインA結合能を発揮することが可能な配列表1のペプチド断片をFR1部位に導入した組み換え抗体を作製した。次に、上記で構築したマウスIgG1遺伝子発現ベクターを鋳型としてVH領域を除く全ての領域をPCR法によって増幅しベクター断片を得た。VH領域人工遺伝子はさらに、前記ベクター断片の5’末端及び3’末端の15塩基と同一の配列を付加したプライマーを用いてPCR法によって増幅し、前記ベクター断片と相同配列部位を連結することで、VH領域のFR1部位に配列表1の遺伝子断片が挿入された発現ベクターを構築した。なお一連の遺伝子連結操作はInFusionadvantagePCRcloningkitClontech社を使用して行った。HEK293T細胞への遺伝子導入は通常公知のリポフェクション法で行った。まず遺伝子導入の1日前に10牛血清を含むDMEM培地中に細胞を添加し、5CO2、37°Cの条件で培養した。遺伝子直前の培養容器面積に対する細胞密度は約80であった。無血清培地に遺伝子とリポフェクション試薬を添加し撹拌した後20分間室温放置し、培養容器に全量を添加した。次に5CO2、37°Cの条件で5時間培養した後、無血清培地に交換してさらに同条件で72時間の培養の後、培養上清を回収した。培養上清を回収し遠心分離で細胞や不純物を除去した後、培養上清を0.1等量まで濃縮し100mMリン酸緩衝液pH7.0で4°C、12時間の透析を行った。組み換え抗体の精製にはHiTRAPProteinGカラムGEヘルスケア社を用いた。まず、カラム容量の10倍量の100mMリン酸緩衝液pH7.0にて平衡化を行った後、カラムに前記濃縮培養液を添加して組み換え抗体をカラム担体に結合させ、さらに100mMリン酸緩衝液pH7.0をカラム容量の10倍量を添加して非特異的結合物を洗浄した。次に、20mMグリシンンpH2.5を添加して組み換え抗体溶出画分を得た。得られた溶出画分をSDSPAGEに供して精製度を確認し、HPR標識抗マウス抗体ウェスタンブロットに供してマウス抗体が含まれていることを確認した。以上の操作によってFR1組み換えIgG1抗体を作製することができた。<プロテインAと組み換えIgG1抗体間の相互作用の評価>プロテインAとFR1組変え抗体との相互作用を検討するために表面プラズモン共鳴SPR測定を行った。SPR測定にはBiacoreT100GEヘルスケア社を用いた。SensorChipCM5GEヘルスケア社上にプロテインAを固定化した。固定化方法はアミノカップリング法を用いて、BiacoreT100のプリセットプログラムに従うことでプロテインAをリガンドとしたセンサチップを作製した。SensorChipCM5をBiacoreT100にセットし、NHS400mMとEDC100mMとの混合液を添加し、7分間反応後、ProteinG1.0mg/mL、50mMリン酸緩衝液pH4.5を添加し、20分間反応させた。更に、エタノールアミンHCl溶液1M,pH8.5を添加し7分間反応させ、ProteinGと反応せずに残存したカルボキシル基をブロックした。以上の操作により、ProteinAをSensorChipCM5表面に共有結合で固定した。ProteinAの添加前と洗浄後の共鳴シグナルRU値変化量を固定量RU値とした。その結果、ProteinAの固定量は3000RUであった。アナライトとして濃度1μMに調整したFR1組み変えIgG1抗体及び野生型IgG1抗体を添加した。移動層には10mMHEPES,150mMNaCl,3mMEDTA,0.005Tween-20pH7.4バッファーを使用した。流速10μL/minで600秒間アナライトを添加した後、600秒間バッファーのみを添加して測定しセンサグラムを得た。その結果、野生型IgG1と比較してFR1組み変えIgG1抗体はプロテインAへの結合量が多いことが図5のグラフで示された。マウスIgG1抗体のFR1部位に配列表1で示されるペプチド断片を挿入することによって、プロテインAへの結合力が付加された。"