"5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のF-CphIエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のF-CphIエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸とを含む、切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~200ヌクレオチド塩基対からなる、請求項1に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項1に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項1に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対を含む、請求項1に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項1から5のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項6に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1のタンデム反復核酸の5’側に連結した第1のゲノム組込み部位と、前記第2のタンデム反復核酸の3’側に連結した第2の組込み部位とをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記標的核酸が、F-CphIエンドヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターエレメントを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。請求項1から7のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞。F-CphIエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターをさらに含む、請求項10に記載の宿主細胞。前記ベクターが、F-CphIエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項11に記載の宿主細胞。前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項12に記載の宿主細胞。酵母細胞である、請求項1から13のいずれか一項に記載の宿主細胞。一倍体の酵母細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。二倍体の酵母細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。前記切り出し可能な核酸構築物が、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、請求項1から17のいずれか一項に記載の宿主細胞。請求項1に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから少なくとも1つの標的核酸を切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、F-CphIと接触させるステップを含む方法。前記切り出すステップにより、プロモーターエレメントが、対象の遺伝子に作動可能に連結される、請求項19に記載の方法。前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項19に記載の方法。前記選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。前記宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項23に記載の方法。前記宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項23に記載の方法。前記宿主細胞が、Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項23に記載の方法。5’から3’への方向に、a第1のゲノム組込み配列と、b18~200ヌクレオチド塩基対からなる第1のタンデム反復核酸と、c第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、d標的核酸と、e第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、f18~200ヌクレオチド塩基対からなる第2のタンデム反復核酸と、g第2のゲノム組込み配列とを含み、該第1および第2のゲノム組込み配列の各々が、酵母ゲノム遺伝子座との相同組換えを開始するのに十分な長さおよび同一性のものである、切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項27に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項27に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる、請求項27に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にI-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である、請求項27から30のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項27から36のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項37に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のゲノム組込み配列の各々が、個別に約50~500ヌクレオチド塩基対からなる、請求項27から38のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。前記第1および第2のゲノム組込み配列の各々が、個別に約500ヌクレオチド塩基対からなる、請求項27から38のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物。請求項27から40のいずれか一項に記載の切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞。一倍体の酵母細胞である、請求項41に記載の酵母細胞。二倍体の酵母細胞である、請求項41に記載の酵母細胞。Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項41に記載の酵母細胞。a5’から3’への方向に、i18~200ヌクレオチド塩基対からなる第1のタンデム反復核酸と、ii第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、iii標的核酸と、iv第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、v18~200ヌクレオチド塩基対からなる第2のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物と、b該第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む酵母細胞。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項45に記載の酵母細胞。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項45または46に記載の酵母細胞。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項45または46に記載の酵母細胞。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、I-SceIをコードする、請求項45または46に記載の酵母細胞。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、F-CphIをコードする、請求項45または46に記載の酵母細胞。前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項45から50のいずれか一項に記載の酵母細胞。前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項51に記載の酵母細胞。前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、請求項51に記載の酵母細胞。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項45から53のいずれか一項に記載の酵母細胞。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項45から53のいずれか一項に記載の酵母細胞。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる、請求項45から53のいずれか一項に記載の酵母細胞。Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項45から56のいずれか一項に記載の酵母細胞。前記切り出し可能な核酸構築物が、前記酵母細胞のゲノムに組み込まれる、請求項45から57のいずれか一項に記載の酵母細胞。a請求項27に記載の切り出し可能な核酸構築物と、b前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含むキット。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項59に記載のキット。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項59または60に記載のキット。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする、請求項59または60に記載のキット。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、I-SceIをコードする、請求項59または60に記載のキット。前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、F-CphIをコードする、請求項59または60に記載のキット。前記ベクターが、前記ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む、請求項59から64のいずれか一項に記載のキット。前記プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである、請求項65に記載のキット。前記プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである、請求項65に記載のキット。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項59から67のいずれか一項に記載のキット。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項59から67のいずれか一項に記載のキット。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる、請求項59から67のいずれか一項に記載のキット。少なくとも1つの標的核酸を、切り出し可能な核酸構築物を含む酵母細胞のゲノムから切り出す方法であって、該切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a18~200ヌクレオチド塩基対からなる第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e18~200ヌクレオチド塩基対からなる第2のタンデム反復核酸とを含み、ホーミングエンドヌクレアーゼが、該第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該切り出し可能な核酸構築物を、該酵母細胞において、該ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項71に記載の方法。前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項71に記載の方法。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる、請求項71に記載の方法。前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、請求項71から74のいずれか一項に記載の方法。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である、請求項71から75のいずれか一項に記載の方法。前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項71から81のいずれか一項に記載の方法。前記選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項82に記載の方法。前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項71から83のいずれか一項に記載の方法。前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項71から83のいずれか一項に記載の方法。前記酵母細胞が、Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項71から83のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも1つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の活性化を結果としてもたらす、請求項71から86のいずれか一項に記載の方法。前記少なくとも1つの標的核酸を前記酵母細胞のゲノムから前記切り出すステップにより、対象の遺伝子の発現の抑制を結果としてもたらす、請求項45に記載の方法。少なくとも2つの標的核酸を、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法であって、各切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸とを個別に含み、少なくとも1つのホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の該第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、該少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を、該宿主細胞において、1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~200ヌクレオチド塩基対からなる、請求項89に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる、請求項89に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる、請求項89に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる、請求項89に記載の方法。前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する、請求項89から93のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にLAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIGホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にI-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つの切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。少なくとも1つの切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である、請求項89から94のいずれか一項に記載の方法。各切り出し可能な核酸構築物の前記標的核酸が、選択マーカーをコードする、請求項89から102のいずれか一項に記載の方法。前記選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項103に記載の方法。前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項89から104のいずれか一項に記載の方法。前記酵母細胞が、一倍体の酵母細胞である、請求項105に記載の方法。前記酵母細胞が、二倍体の酵母細胞である、請求項105に記載の方法。前記酵母細胞が、Saccharomycescerevisiae細胞である、請求項105に記載の方法。3.要旨本明細書では、1または複数の遺伝子座を、宿主細胞のゲノムから切り出すことを可能とする核酸、組成物、および方法が提供される。第1の態様では、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムに組み込む。一部の実施形態では、第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が任意選択である。第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、切り出し可能な核酸構築物を切断することを可能とする。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位に結合したホーミングエンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、切り出し可能な核酸構築物を切断しうる。一部の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に14~40ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に14~40ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に20~40ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に25~40ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に30~40ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に35~40ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別に24ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にLAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。一部の実施形態では、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々が、個別にI-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。具体的な実施形態では、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である。具体的な実施形態では、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である。標的核酸の切断後、第1および第2のタンデム反復により促進される染色体内組換えを介して、宿主細胞ゲノムの修復が生じうる。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、少なくとも18ヌクレオチド塩基対を個別に含む。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~500ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~200ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、宿主細胞が酵母細胞であり、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に18~200ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、標的核酸が、選択マーカーをコードする。一部の実施形態では、選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、上記の切り出し可能な核酸構築物が、第1のタンデム反復の5’側に連結した第1のゲノム組込み部位と、第2のタンデム反復の3’側に連結した第2のゲノム組込み部位とをさらに含む。第1および第2のゲノム組込み部位は、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを有利に促進しうる。別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第1のタンデム反復の5’側に連結した第1の組込み部位と、第2のタンデム反復の3’側に連結した第2の組込み部位とをさらに含む。一部の実施形態では、宿主細胞が原核生物prokaryoteである。一部の実施形態では、宿主細胞が真核細胞eukaryoteである。特定の実施形態では、宿主細胞が、単細胞の真核生物eukaryoticorganismである。特定の実施形態では、宿主細胞が、酵母細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である。他の実施形態では、宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞が、S.cerevisiae株の酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターであって、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なベクターをさらに含む。特定の実施形態では、ベクターが、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含む。一部の実施形態では、ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸の発現を制御するプロモーターエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターエレメントが、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターエレメントが、構成的プロモーターである。別の態様では、宿主細胞ゲノムに組み込まれる上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸とを含む。一部の実施形態では、宿主細胞が、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターをさらに含む。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ核酸が、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々に結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、I-SceIである。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、F-CphIである。別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物と、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含むキットが本明細書中に提供される。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、I-SceIである。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、F-CphIである。別の態様では、少なくとも1つの標的核酸を、宿主細胞のゲノムから切り出す方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸である核酸構築物を含む。特定の実施形態では、方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、宿主細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現させるステップを含む。方法の一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する。一部の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、I-SceIの認識部位である。一部の実施形態では、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つが、F-CphIの認識部位である。別の態様では、少なくとも2つの標的核酸を、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法であって、各切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復核酸と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、c標的核酸と、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と、e第2のタンデム反復核酸とを個別に含む方法が本明細書中に提供される。一部の実施形態では、方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはそれに近接したところで切断するように、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。有利なことには、標的核酸の切り出しを受けるゲノム核酸は、第1および第2のタンデム反復を介する組換えにより形成される。一部の実施形態では、新たに形成されたゲノム核酸が、第1および第2のタンデム反復の組換え産物として生じる第3のタンデム反復を含む。有利な実施形態では、宿主細胞内に残存する切断可能なエンドヌクレアーゼ構築物のうちのごく一部が第3のタンデム反復であり、これは、わずか18ヌクレオチド塩基対の長さでありうる。本明細書で提供される組成物および方法は、有利なことに、ゲノムの潜在的な不安定性をもたらすことなしに、1または複数の標的核酸を、宿主細胞ゲノムまたはエピソームから正確かつ効率的に切り出すことを可能にする。遺伝子操作では、選択されたゲノム位置またはエピソーム位置において標的核酸を取り出すことが必要でありうる多くの場合が存在する。例えば、上記の組成物および方法は、同じ宿主細胞またはその後代におけるそれらの再使用を可能とするために、選択マーカーを取り出すのに有利に用いることができる。マーカー再利用は、限定された一組の選択マーカーを有する宿主生物において複数の遺伝子操作イベントを必要とする状況において有用でありうる。提供される組成物および方法はまた、宿主細胞を製造環境または自然環境に放出する前に、不要な核酸例えば、抗生物質耐性マーカーを宿主細胞から取り出すのにも用いることができる。さらに、記載される組成物および方法は、宿主細胞およびその後代における特定の遺伝子の発現をオンまたはオフに変えるのに用いることができる。遺伝子をオフに変えるために、記載される組成物および方法を用いて、例えば、遺伝子のシス作用性制御エレメントのうちの1もしくは複数、そのコード配列のうちの一部もしくは全部、またはその転写アクチベーターのうちの1もしくは複数を表す核酸を切り出すことができる。遺伝子の発現をオンに変えるためには、干渉する核酸のストレッチinterferingstretchofnucleicacidを切り出して、特定の遺伝子の発現に必要とされるエレメント間において、必要な近接する相互作用を生み出すことができる。5.1定義本明細書で用いられるホーミングエンドヌクレアーゼという用語は、その天然の生物学的機能が、遺伝子変換イベントを触媒して、特定の遺伝子のエンドヌクレアーゼをコードする対立遺伝子を、その遺伝子のエンドヌクレアーゼを含まない対立遺伝子へと拡張することである、複数のエンドヌクレアーゼのうちのいずれか1つを指す。例えば、Chevalier、NucleicAcidsRes、1巻29号:3757~74頁2001年;Jacquier、Cell、41巻:383~94頁1985年を参照されたい。1LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、2HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、3His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、4GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、および5シアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼを含めた、少なくとも5つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーが公知である。例えば、Stoddard、QuarterlyReviewofBiophysics、38巻1号:49~95頁2006年を参照されたい。これらのファミリーに由来する特定のホーミングエンドヌクレアーゼの例には、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIが挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、同じであるかまたは類似のホーミングエンドヌクレアーゼ制限部位を認識し、そしてこの部位でまたはこれに近接したところで切断する、このようなエンドヌクレアーゼの天然または人工のバリアントが、この定義内に包含されることを認める。本明細書で用いられるホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位という用語は、特定のホーミングエンドヌクレアーゼにより認識される核酸を指す。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位への結合の後、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、二本鎖切断を生じうる。本明細書で用いられる近接するという用語は、特定の核酸から約1~約100、1~約75、1~約50、1~約25、1~約20、1~約15、1~約10、または1~約5ヌクレオチドの距離を指す。本明細書においてホーミングエンドヌクレアーゼとの関連で用いられる切断するおよび切断という用語は、特定の核酸において二本鎖切断を生じる作用を指す。当業者により理解される通り、二本鎖切断breakは、平滑末端を残す場合もあり、粘着末端すなわち、5’突出または3’突出を残す場合もある。本明細書で用いられるタンデム反復という用語は、2つ以上の核酸群の一部である核酸であって、そこでは、各メンバーが、他のメンバー複数可に関して、十分なヌクレオチドの相同性を共有して、互いの間の組換えを媒介する核酸を指す。タンデム反復は、上記タンデムの他のメンバーに関して、同じ方向定方向タンデム反復または反対方向逆方向タンデム反復のいずれかに配置される。本明細書で用いられる標的のDNAセグメントという用語は、本明細書で提供される組成物および方法を用いて宿主細胞ゲノムから切り出される任意の標的のDNAセグメントを指す。有用な例には、タンパク質コード配列、選択マーカー、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写アクチベーター、転写リプレッサー、転写アクチベーター結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エキソン、ポリAテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、mRNA安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または他の任意の天然に存在するかもしくは合成のDNA分子が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、標的のDNAセグメントが、天然由来のものでありうる。代替的に、標的のDNAセグメントは、invitroにおいて作製された、完全に合成由来のものでもありうる。さらに、標的のDNAセグメントは、単離された天然に存在するDNA分子の任意の組合せを含む場合もあり、単離された天然に存在するDNA分子と合成DNA分子との任意の組合せを含む場合もある。例えば、標的のDNAセグメントは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリAテールに連結したタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結したタンパク質コード配列などを含みうる。本明細書で用いられるベクターという用語は、細胞における複製が可能であり、挿入配列の複製をもたらすように、それに挿入配列を作動的に連結することが可能な染色体外の核酸分子に関して用いられる。有用な例には、例えば、プラスミド構築物、ファージ構築物、コスミドベクターなどの環状DNA分子のほか、直鎖状核酸構築物例えば、ラムダファージ構築物、細菌人工染色体BAC、酵母人工染色体YACなどが挙げられるがこれらに限定されない。ベクターには、プロモーターおよび/またはターミネーターなどの発現シグナル、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子などの選択マーカー、ならびにその中へ挿入配列をクローニングしうる1または複数の制限部位が含まれうる。ベクターは、他の固有の特徴それらが適応しうるDNA挿入配列のサイズなども有しうる。本明細書で用いられるゲノムのという用語は、宿主細胞内に含有される染色体DNAおよびエピソームDNAの両方を指す。5.2切り出し可能な核酸構築物一態様では、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復DR1、b標的のDNAセグメントD、およびc第2のタンデム反復DR2のほか、DR1とDとの間またはDとDR2との間のいずれかに位置する第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1、および必要に応じて、それぞれ、DとDR2との間またはDR1とDとの間のいずれかに位置する第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2を含む切り出し可能な核酸構築物が本明細書中に提供される図1A。したがって、一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復DR1と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、c標的のDNAセグメントDと、d第2のタンデム反復DR2とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復DR1と、b標的のDNAセグメントDと、c第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、d第2のタンデム反復DR2とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1のタンデム反復DR1と、b第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、c標的のDNAセグメントDと、d第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2と、e第2のタンデム反復DR2とを含む。一部の実施形態では、上記の切り出し可能な核酸構築物が、第1のタンデム反復の5’側に連結した第1のゲノム組込み配列IS1と、第2のタンデム反復の3’側に連結した第2のゲノム組込み配列IS2とをさらに含む。したがって、一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1の組込み配列IS1と、b第1のタンデム反復DR1と、c第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、d標的のDNAセグメントDと、e第2のタンデム反復DR2と、f第2の組込み配列IS2とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1の組込み配列IS1と、b第1のタンデム反復DR1と、c標的のDNAセグメントDと、d第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、e第2のタンデム反復DR2と、f第2の組込み配列IS2とを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、5’から3’への方向に、a第1の組込み配列IS1と、b第1のタンデム反復DR1と、c第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、d標的のDNAセグメントDと、e第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2と、f第2のタンデム反復DR2と、g第2の組込み配列IS2とを含む。有利なことには、第1および第2の組込み配列は、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進しうる。切り出し可能な核酸構築物は、宿主細胞ゲノムに組み込まれると、標的のDNAセグメントDの、宿主細胞ゲノムからの、高頻度でかつ高忠実度の切り出しを可能とする。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、直鎖状DNA分子である。切り出し可能な核酸構築物は遺伝子操作での適用における選択マーカーの切り出しを促進するのに用いることもでき、生物を製造環境または天然の環境へと放出する前に抗生物質耐性マーカーを除去するのに用いることができる。切り出し可能な核酸構築物はまた、宿主細胞およびその子孫細胞における遺伝子の発現を恒久的にオンに変えるのに用いることもでき、恒久的にオフに変えるのに用いることもできる。遺伝子の発現を防止するために、そのシス作用性制御配列、そのコード配列、または転写アクチベーターをコードする遺伝子を切り出すことができる。遺伝子の発現を誘発するために、遺伝子または転写リプレッサーのためのDNA結合部位を切り出してそれに制御される遺伝子複数可の発現を可能とすることもでき、干渉するDNAのストレッチinterferingstretchofDNAを切り出して、特定の遺伝子の発現に必要とされるエレメント間の必須の近接する相互作用を生じさせることもできる。切り出し可能な核酸構築物は、当業者に明らかな任意の技法により生成させることができる。特定の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応PCRおよび分子クローニング技法を用いて生成させる。例えば、PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification、HAErlich編、StocktonPress、NewYork、N.Y.1989年;Sambrookら、2001年、MolecularCloning-ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NY;PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification、HAErlich編、StocktonPress、NewYork、N.Y.1989年を参照されたい。切り出し可能な核酸構築物の各エレメントについては、以下で詳細に論じる。5.2.1.ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位切り出し可能な核酸構築物は、少なくとも第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、必要に応じて、第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2とを含む。切り出し可能な核酸構築物が、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位だけを含む一部の実施形態では、ES1を、第1のタンデム反復DR1の3’側であり、かつ、標的のDNAセグメントDの5’側に、または標的のDNAセグメントDの3’側であり、かつ、第2のタンデム反復DR2の5’側に配置することができる。切り出し可能な核酸構築物が、第1および第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位を含む一部の実施形態では、ES1を、第1のタンデム反復DR1の3’側であり、かつ、標的のDNAセグメントDの5’側に配置し、ES2を、標的のDNAセグメントDの3’側であり、かつ、第2のタンデム反復DR2の5’側に配置する。特定の実施形態では、ES1を、D内に配置する。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、対応するホーミングエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位で、またはこれに近接したところで、切り出し可能な核酸構築物を切断することを可能とする。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、14~40ヌクレオチド塩基対の長さの範囲にわたる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、14~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、18~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、20~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、25~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、30~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、35~40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、各ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、24ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、ES1を、DR1の3’側であり、かつ、Dの5’側に配置する。一部の実施形態では、ES1を、DR1の3’端に配置する。一部の実施形態では、ES1を、DR1の3’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES1を、DR1の3’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの5’端に配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES1をDの5’端の上流に配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの3’側であり、かつ、DR2の5’側に配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの3’端に配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの3’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES1を、Dの3’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ES1を、DR2の5’端に配置する。一部の実施形態では、ES1を、DR2の5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES2をDR2の5’端の上流に配置する。一部の実施形態では、ES1と組み合わせて存在させる場合のES2を、Dの3’側であり、かつ、DR2の5’側に配置する。一部の実施形態では、ES2を、Dの3’端に配置する。一部の実施形態では、ES2を、Dの3’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES2を、Dの3’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ES2を、DR2の5’端に配置する。一部の実施形態では、ES2を、DR2の5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES2をDR2の5’端の上流に配置する。ES1およびES2の両方を存在させる一部の実施形態では、ES1とES2とを互いに関して反対方向に配置する。ES1およびES2の両方を存在させる一部の実施形態では、ES1とES2とを互いに関して同じ方向に配置する。一部の実施形態では、ES1およびES2が、当業者に公知である任意のホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。多種類のホーミングエンドヌクレアーゼが、4bpの一本鎖3’突出を有するねじれ型staggered二本鎖切断DSBを触媒するしかし、II群のイントロンに由来するホーミングエンドヌクレアーゼはこれを触媒しない。一部の実施形態では、ES1およびES2のうちの少なくとも1つが、LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、ES1およびES2の各々が、LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。例えば、Stoddard、QuarterlyReviewofBiophysics、38巻1号:49~95頁2006年を参照されたい。これらのファミリーは、それらの保存されたヌクレアーゼ活性部位のコアモチーフおよび触媒機構、生物学的分布およびゲノム分布、ならびに非ホーミングヌクレアーゼ系との広範にわたる関係において大きく異なる。これらのファミリーに由来する有用な特定のホーミングエンドヌクレアーゼの例には、I-CreIRochaixら、NucleicAcidsRes.、13巻:975~984頁1985年を参照されたい、I-MsoILucasら、NucleicAcidsRes.、29巻:960~969頁2001年を参照されたい、I-SceIFouryら、FEBSLett.、440巻:325~331頁1998年を参照されたい、I-SceIVMoranら、NucleicAcidsRes.、20巻:4069~4076頁1992年を参照されたい、H-DreIChevalierら、Mol.Cell、10巻:895~905頁2002年を参照されたい、I-HmuIGoodrich-Blairら、Cell、63巻:417~424頁1990年;Goodrich-Blairら、Cell、84巻:211~221頁1996年を参照されたい、I-PpoIMuscarellaら、Mol.Cell.Biol.、10巻:3386~3396頁1990年を参照されたい、I-DirIJohansenら、Cell、76巻:725~734頁1994年;Johansen、NucleicAcidsRes.、21巻:4405頁1993年を参照されたい、I-NjaIEldeら、Eur.J.Biochem.、259巻:281~288頁1999年;DeJonckheereら、J.Eukaryot.Microbiol.、41巻:457~463頁1994年を参照されたい、I-NanIElde,S.ら、Eur.J.Biochem.、259巻:281~288頁1999年;DeJonckheereら、J.Eukaryot.Microbiol.、41巻:457~463頁1994年を参照されたい、I-NitIDeJonckheereら、J.Eukaryot.Microbiol.、41巻:457~463頁1994年;Eldeら、Eur.J.Biochem.、259巻:281~288頁1999年を参照されたい、I-TevIChuら、Cell.、45巻:157~166頁1986年を参照されたい、I-TevIITomaschewskiら、NucleicAcidsRes.、15巻:3632~3633頁1987年を参照されたい、I-TevIIIEddyら、GenesDev.、5巻:1032~1041頁1991年を参照されたい、F-TevIFujisawaら、NucleicAcidsRes.、13巻:7473~7481頁1985年を参照されたい、F-TevIIKadyrovら、Dokl.Biochem.、339巻:145~147頁1994年;Kaliman、NucleicAcidsRes.、18巻:4277頁1990年を参照されたい、F-CphIZengら、Curr.Biol.、19巻:218~222頁2009年を参照されたい、PI-MgaISavesら、NucleicAcidsRes.、29巻:4310~4318頁2001年を参照されたい、I-CsmIColleauxら、Mol.Gen.Genet.、223巻:288~296頁1990年を参照されたい、I-CeuITurmelら、J.Mol.Biol.、218巻:293~311頁1991年を参照されたい、およびPI-SceIHirataら、J.Biol.Chem.、265巻:6726~6733頁1990年を参照されたいが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ES1またはES2のうちの少なくとも1つが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。特定の実施形態では、ES1およびES2の各々が、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、I-CsmI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位である。本明細書で提供される組成物および方法の具体的な実施形態では、ES1およびES2を、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が宿主細胞の野生型操作されていない核DNAに存在しないことに基づき選択する。例えば、I-SceI、PI-MtuIIpps1、PI-MgaIpps1、およびF-CphIの認識部位が、S.cerevisiaeの野生型操作されていない核DNAに存在しない例えば、CurrBiol、2009年、19巻、218~22頁;ProcNatlAcadSciUSA、1988年、85巻、6022~6頁;JBiolChem、2002年、277巻、16257~64頁;JBiolChem、2002年、277巻、40352~61頁;およびNucleicAcidsRes、2001年、29巻、4310~8頁を参照されたい一方で、VDE、別名PI-SceIの認識部位は、ある株には存在するが、他の株には存在しない例えば、NucleicAcidsRes、2001年、29巻、4215~23頁を参照されたい。したがって、本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態では、ES1およびES2が、I-SceIの認識部位であり、宿主細胞が、S.cerevisiae細胞である。一部の実施形態では、ES1およびES2が、PI-MtuIIpps1の認識部位であり、宿主細胞が、S.cerevisiae細胞である。一部の実施形態では、ES1およびES2が、PI-MgaIpps1の認識部位であり、宿主細胞が、S.cerevisiae細胞である。一部の実施形態では、ES1およびES2が、F-CphIの認識部位であり、宿主細胞が、S.cerevisiae細胞である。一部の実施形態では、ES1およびES2の選択が、以下の基準:1ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が、宿主細胞の野生型操作されていないゲノムの全体すなわち、ミトコンドリアDNAを含めたに存在しないこと、2対応するホーミングエンドヌクレアーゼの発現が存在しない場合は、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が切断されないこと、および3例えば、ゲノムに組み込んだ標的核酸の切り出しを誘導する、対応するホーミングエンドヌクレアーゼの核における発現が、宿主細胞に有害ではないことのうちの1または複数を満たすことに基づく。一部の実施形態では、ES1およびES2が、宿主細胞の野生型操作されていない核DNAに存在しないことに加えて、上記で列挙した基準のうちの1つ、2つ、または3つ全てを満たす。5.2.2.タンデム反復切り出し可能な核酸構築物は、第1および第2のタンデム反復を含む。第1のタンデム反復DR1は、標的のDNAセグメントDの5’側に配置し、第2のタンデム反復DR2は、標的のDNAセグメントDの3’側に配置する。第1および第2のタンデム反復は、ホーミングエンドヌクレアーゼによる切断後に、切り出し可能な核酸構築物の残留物の組換えを媒介しうる。互いに関して同じ向きに配置されたタンデム反復定方向タンデム反復は、一本鎖アニーリング経路を介して、宿主細胞内の染色体内組換えを有利に媒介し得る。例えば、Ivanovら、Genetics、142巻:693~704頁1996年を参照されたい。DR1およびDR2は、ホーミングエンドヌクレアーゼによる切断後に、切り出し可能な核酸構築物の残留物の組換えを媒介しうる、任意のタンデム反復でありうる。このような組換えに影響を及ぼしうるタンデム反復の特性には、長さ、GC含量、宿主細胞ゲノムの天然の配列との相同性、およびタンデム反復の間の配列同一性の程度が挙げられるがこれらに限定されない。配列同一性の程度は、デフォルトパラメータによるBLAST2.2.2またはFASTAバージョン3.0t78など、本明細書で記載されるコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを含めた、任意のコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを用いて決定することができる。一部の実施形態では、DR1を、ES1の5’端に配置する。一部の実施形態では、DR1を、ES1の5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、DR1を、ES1の5’端の上流に配置する。一部の実施形態では、DR2を、ES1の3’端に配置するか、またはES1およびES2の両方を存在させる場合は、ES2の3’端に配置する。一部の実施形態では、DR2を、ES1の3’端にすぐ隣接して配置するか、またはES1およびES2の両方を存在させる場合は、ES2の3’端に配置する。一部の実施形態では、DR2を、ES1の3’端の下流に配置するか、またはES1およびES2の両方を存在させる場合は、ES2の3’端に配置する。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に少なくとも18ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~500ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に、18~500、18~495、18~490、18~485、18~480、18~475、18~470、18~465、18~460、18~455、18~450、18~445、18~440、18~435、18~430、18~425、18~420、18~415、18~410、18~405、18~400、18~395、18~390、18~385、18~380、18~375、18~370、18~365、18~360、18~355、18~350、18~345、18~340、18~335、18~330、18~325、18~320、18~315、18~310、18~305、18~300、18~295、18~290、18~285、18~280、18~275、18~270、18~265、18~260、18~255、18~250、18~245、18~240、18~235、18~230、18~225、18~220、18~215、18~210、18~205、18~200、18~195、18~190、18~185、18~180、18~175、18~170、18~165、18~160、18~155、18~150、18~145、18~140、18~135、18~130、18~125、18~120、18~115、18~110、18~105、18~100、18~95、18~90、18~85、18~80、18~75、18~70、18~65、18~60、18~55、18~50、18~45、18~40、18~35、18~30、18~25、または18~20ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199または200ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~200ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~150ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~100ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~80ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも25のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも30のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも35のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも40のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも45のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも50のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも60のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも65のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも70のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも75のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも80のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも85のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも90のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも95のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、少なくとも99のヌクレオチド配列同一性を共有する。一部の実施形態では、DR1およびDR2が、100のヌクレオチド配列同一性を共有する。好ましい実施形態では、DR1およびDR2を、互いに関して同じ方向に配置するすなわち、DR1およびDR2を、定方向タンデム反復とする。5.2.3.標的のDNAセグメント切り出し可能な核酸構築物は、標的のDNAセグメントDを含む。一部の実施形態では、標的のDNAセグメントDを、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1の3’側に配置する。一部の実施形態では、第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2を存在させる場合、標的のDNAセグメントDを、ES2の5’側に配置する。一部の実施形態では、標的のDNAセグメントDを、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1の3’側であり、かつ、第2のタンデム反復DR2の5’側に配置する。一部の実施形態では、標的のDNAセグメントDを、第1のタンデム反復DR1の3’側であり、かつ、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1の5’側に配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、ES1の3’端に配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、ES1の3’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、ES1の3’端の下流に配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、DR1の3’端に配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、DR1の3’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Dの5’端を、DR1の3’端の下流に配置する。一部の実施形態では、ES1をES2と組み合わせて存在させる場合、Dの3’端を、ES2の5’端に配置する。一部の実施形態では、ES1をES2と組み合わせて存在させる場合、Dの3’端を、ES2の5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、ES1をES2と組み合わせて存在させる場合、Dの3’端を、ES2の5’端の上流に配置する。一部の実施形態では、Dの3’端を、DR2の5’端に配置する。一部の実施形態では、Dの3’端を、DR2の5’端にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、Dの3’端を、DR2の5’端の上流に配置する。標的のDNAセグメントは、当業者によって有用であるとみなされる任意の標的のDNAセグメントでありうる。例えば、標的のDNAセグメントは、宿主ゲノムにノックインされ、その後切り出しによりノックアウトされうる、対象の遺伝子を含みうる。一部の実施形態では、標的核酸が、切り出し可能な核酸構築物の宿主ゲノムへの組込みについて選択するのに用いることができ、その後切り出しにより宿主ゲノムから取り出される、選択マーカーを含みうる。標的のDNAセグメントの有用な例には、タンパク質コード配列、選択マーカー、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写アクチベーター、転写リプレッサー、転写アクチベーター結合部位、転写リプレッサー結合部位、イントロン、エキソン、ポリAテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、mRNA安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナル、または他の任意の天然に存在するまたは合成のDNA分子が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、標的のDNAセグメントが、天然起源のものでありうる。代替的に、標的のDNAセグメントは、invitroにおいて作製された、完全に合成起源のものでもありうる。さらに、標的のDNAセグメントは、単離された天然に存在するDNA分子の任意の組合せを含む場合もあり、単離された天然に存在するDNA分子と合成DNA分子との任意の組合せを含む場合もある。例えば、標的のDNAセグメントは、タンパク質コード配列に作動可能に連結した異種プロモーター、ポリAテールに連結したタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結したタンパク質コード配列などを含みうる。標的のDNAセグメントは、当技術分野において公知の標準的な手順により、クローニングされたDNA例えば、DNAライブラリーから得ることもでき、化学合成により得ることもでき、cDNAクローニングにより得ることもでき、または、所望の細胞から精製された、ゲノムDNAもしくはその断片のクローニングにより得ることもでき、あるいはPCR増幅およびクローニングにより得ることもできる。例えば、Sambrookら、MolecularCloning、ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor、NewYork、2001年;Glover,D.M.編、DNACloning:APracticalApproach、2版、MRLPress、Ltd.、Oxford、U.K.1995年を参照されたい。一部の実施形態では、Dが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターエレメントを含む。例えば、切り出し可能な核酸構築物が、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼであるF-CphIの第1および第2の認識部位を含む場合、標的のDNAセグメントは、F-CphIをコードする核酸配列であって、プロモーターエレメントに作動可能に連結した核酸配列を包含しうる。具体的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列を含めた、標的のDNAセグメントの切り出しが、例えば、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込み後に、選択的に切り出され得るように、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードする核酸の発現を制御するプロモーターエレメントが、誘導性プロモーター、例えば、Saccharomycescerevisiaeのガラクトース誘導性プロモーター例えば、GAL1遺伝子、GAL7遺伝子、およびGAL10遺伝子のプロモーターである。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-NgrI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、PI-MtuII、I-CsmI、I-PanI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択される。具体的な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、I-SceIである。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、F-CphIである。一部の実施形態では、Dが、1または複数の選択マーカーをコードする。一部の実施形態では、選択マーカーが、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーは、組換え核酸配列を生じるのに用いられるプラスミドベクターに一般的である。例えば、pBRに由来するプラスミドおよびpUCに由来するプラスミドは、選択マーカーとして、細菌性薬物耐性マーカーであるAMPr遺伝子またはBLA遺伝子を含有するSutcliffe,J.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、75巻:3737頁1978年を参照されたい。BLA遺伝子は、β-ラクタマーゼとして機能し、スペクトルの狭いセファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネムエルタペネム、セファマンドール、およびセフォペラゾン、ならびにテモシリンを除く全ての抗グラム陰性菌性ペニシリン類などのβ-ラクタム抗生物質に対する細菌耐性に関与する酵素であるTem-1をコードする。他の有用な選択マーカーには、NAT1遺伝子、PAT遺伝子、AUR1-C遺伝子、PDR4遺伝子、SMR1遺伝子、CAT遺伝子、マウスdhfr遺伝子、HPH遺伝子、DSDA遺伝子、KANR遺伝子、およびSHBLE遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。S.nourseiのNAT1遺伝子は、ノーセオトリシンnourseothricinN-アセチルトランスフェラーゼをコードし、ノーセオトリシンに対する耐性を付与する。S.viridochromogenesのTu94に由来するPAT遺伝子は、ホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼをコードし、ビアロホスに対する耐性を付与する。S.cerevisiaeに由来するAUR1-C遺伝子は、Auerobasidiumpullulansが生成する、出芽酵母であるS.cerevisiaeに対して毒性の抗真菌抗生物質であるAuerobasidinAAbAに対する耐性を付与する。PDR4遺伝子は、セルレニンに対する耐性を付与する。SMR1遺伝子は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与する。Tn9トランスポゾンに由来するCATコード配列は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。マウスdhfr遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与する。KlebsiellapneumoniaのHPH遺伝子は、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼをコードし、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する。E.coliのDSDA遺伝子は、D-セリンデアミナーゼをコードし、酵母が唯一の窒素供給源としてのD-セリンを含むプレートで増殖することを可能とする。Tn903トランスポゾンのKANR遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、G418に対する耐性を付与する。Streptoalloteichushindustanusに由来するSHBLE遺伝子は、ゼオシン結合タンパク質をコードし、ゼオシンブレオマイシンに対する耐性を付与する。他の実施形態では、選択マーカーが、酵母宿主株の形質転換細胞の選択を可能とする酵母遺伝子を含む。一部の実施形態では、選択マーカーが、宿主株における栄養素要求性、例えば、栄養性のnutritional栄養素要求性をレスキューする。このような実施形態では、宿主株が、例えば、HIS3、LEU2、LYS1、MET15、およびTRP1などの栄養素要求性の表現型をもたらす、宿主のアミノ酸生合成経路のうちの1もしくは複数の遺伝子における機能破壊、または例えば、ADE2およびURA3などの栄養素要求性の表現型をもたらす、宿主のヌクレオチド生合成経路のうちの1もしくは複数の遺伝子における機能破壊を含む。具体的な実施形態では、遺伝子改変された酵母宿主株が、URA3遺伝子における機能破壊を含む。栄養素要求性の表現型をもたらす宿主酵母における機能破壊は、点変異の場合もあり、部分的または完全な遺伝子欠失の場合もあり、ヌクレオチドの付加または置換の場合もある。アミノ酸またはヌクレオチドの生合成経路内の機能破壊は、宿主株を、原栄養性の野生型株とは対照的に、1または複数の栄養素の補充なしには培地での最適の増殖が不可能な、栄養素要求性の変異体とする。それで、宿主株において機能破壊された生合成遺伝子は、さらにまた、例えば、破壊された生合成遺伝子の機能的コピーを含む1または複数のプラスミドを導入すると後にレスキューされうる、栄養素要求性遺伝子マーカーとして働くことができる。URA3酵母遺伝子、TRP1酵母遺伝子、およびLYS2酵母遺伝子の選択マーカーとしての使用は、陽性選択および陰性選択の両方が可能であるために、顕著な利点を有する。陽性選択が、URA3の変異、TRP1の変異、およびLYS2の変異に対して栄養素要求性を補完することにより実施されるのに対し、陰性選択は、原栄養性株の増殖は阻止するが、URA3の変異体、TRP1の変異体、およびLYS2の変異体のそれぞれの増殖を可能とする、特異的阻害剤である5-フルオロ-オロチン酸FOA、5-フルオロアントラニル酸、およびα-アミノアジピン酸a-aminoadipicacidαAAのそれぞれに基づく。URA3遺伝子は、ウラシルの生合成に必要とされる酵素であるオロチジン-5’リン酸デカルボキシラーゼをコードする。FOAは、デカルボキシラーゼの作用により、毒性化合物である5-フルオロウラシルへと転換されるようであるために、URA3細胞は全て死滅させるがura3-細胞は死滅させない、FOAを含有する培地において、ura3-細胞またはura5-細胞を選択することができる。FOA培地における陰性選択は、高度に識別的であり、通常は10-2未満のFOA耐性コロニーがUraである。FOAによる選択手順は、一倍体株において、変異によりura3マーカーを生成させるのに用いることができ、より重要なことには、URA3含有プラスミドを有さない細胞を選択するのに用いることができる。TRP1遺伝子は、トリプトファンの生合成における第3ステップを触媒するホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼをコードする。5-フルオロアントラニル酸を用いる対抗選択は、アントラニル酸をトリプトファンへと変換するのに必要とされる酵素を欠き、このため、5-フルオロアントラニル酸に対して耐性である株による代謝拮抗を包含する。LYS2遺伝子は、リシンの生合成に必要とされる酵素であるアミノアジピン酸レダクターゼをコードする。通常の窒素供給源は欠くが、リシンおよびαAAは含有する培地において、lys2-変異体およびlys5-変異体は増殖するが、正常な株は増殖しない。明らかに、lys2変異およびlys5変異は、高レベルのαAAにより形成される、リシン生合成の毒性の中間体を蓄積させるが、これらの変異体は、なおもαAAを窒素供給源として用いうる。FOAによる選択手順と同様に、LYS2含有プラスミドをlys2宿主から都合よく駆逐することもできる。他の実施形態では、選択マーカーが、栄養素要求性の変異をレスキューするマーカー以外のマーカーである。例えば、酵母宿主細胞株は、変異が公知の選択法により同定されうる限りにおいて、栄養素要求性の変異以外の変異、例えば、宿主に致死性でなく、また、株の意図される使用、例えば、工業的発酵に対して有害作用をもたらさすこともない変異を含みうる。5.2.4.ゲノム組込み配列一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第1および第2のゲノム組込み配列を含む。ゲノム組込み配列は、本明細書で記載される切り出し可能な核酸構築物が、例えば、宿主細胞を介する相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能とする。切り出し可能な核酸構築物を相同組換えによりゲノムへと組み込むために、切り出し可能な核酸構築物は、一方の末端において、上流のゲノム組込み配列IS1を含む核酸配列を含み、他方の末端において、下流のゲノム組込み配列IS2を含む核酸配列を含み、各ゲノム組込み配列が、その染色体を有する宿主細胞による相同組換えを開始するのに十分な長さおよび配列同一性を有することが好ましい。一部の実施形態では、第1のゲノム組込み配列IS1を、第1のタンデム反復DR1の5’側に配置し、第2のゲノム組込み配列IS2を、第2のタンデム反復DR2の3’側に配置する。特定の実施形態では、IS1を、DR1の5’側に配置する。一部の実施形態では、IS1を、DR1の5’側にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、IS1を、DR1の5’側の上流に配置する。特定の実施形態では、IS2を、DR2の3’側に配置する。一部の実施形態では、IS2を、DR2の3’側にすぐ隣接して配置する。一部の実施形態では、IS2を、DR2の3’側の下流に配置する。第1および第2のゲノム組込み配列は、切り出し可能な核酸構築物を、相同組換えを介して宿主細胞ゲノム、例えば、酵母ゲノムの特定の遺伝子座へと組み込むことを可能とする。切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムへと標的化して組み込むことにより、有用な利点をもたらすことができる。例えば、切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞ゲノムにおける対象の遺伝子に組み込み、これにより、対象の遺伝子をノックアウトし、これを非機能性とすることができる図2。代替的に、切り出し可能な核酸構築物の標的化した組込みは、対象の遺伝子を特定のゲノム遺伝子座へとノックインするのに有用な場合もあり、制御エレメントを対象の遺伝子近傍にノックインして、例えば、対象の遺伝子の発現を活性化させるか、または上方制御するのに有用な場合もある。特定のゲノム遺伝子座における切り出し可能な核酸構築物の組込みに影響を及ぼしうる特性には、ゲノム組込み配列の長さ、切り出し可能な核酸構築物の全長、およびゲノム組込み遺伝子座のヌクレオチド配列または位置が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ゲノム組込み配列の1つの鎖と宿主細胞ゲノムの特定の遺伝子座の1つの鎖との間の有効なヘテロ二重鎖の形成は、ゲノム組込み配列の長さに依存しうる。ゲノム組込み配列の長さについての有効な範囲は、50~5,000ヌクレオチドである。ゲノム組込み配列とゲノム遺伝子座との間の相同性についての有効な長さに関する議論には、Hastyら、MolCellBiol、11巻:5586~91頁1991年を参照されたい。IS1およびIS2は、切り出し可能な核酸構築物のゲノム組込みを可能とする、十分な長さと宿主細胞のゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性とを有する任意のヌクレオチド配列を含みうる。一部の実施形態では、十分な配列同一性が、少なくとも20塩基対、少なくとも50塩基対、少なくとも100塩基対、少なくとも250塩基対、少なくとも500塩基対、または500塩基対超の長さにわたり、宿主細胞のゲノム遺伝子座に対して、少なくとも70、少なくとも75、少なくとも80、少なくとも85、少なくとも90、少なくとも95、少なくとも99、または100の同一性を有する配列を指す。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノム遺伝子座の長さが、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900または5,000ヌクレオチドである。配列同一性の程度は、デフォルトパラメータによるBLAST2.2.2またはFASTAバージョン3.0t78など、本明細書で記載されるコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを含めた、任意のコンピュータプログラムおよび関連するパラメータを用いて決定することができる。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、原核生物ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記原核生物ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、真核生物ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記真核生物ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、酵母ゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記酵母ゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、切り出し可能な核酸構築物の、Saccharomycescerevisiaeゲノム遺伝子座への組込みを可能とするのに十分な長さおよび上記Saccharomycescerevisiaeのゲノム遺伝子座に対する十分な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。切り出し可能な核酸構築物の組込みに適するSaccharomycescerevisiaeゲノム遺伝子座には、NDT80遺伝子座、HO遺伝子座、GAL80遺伝子座、HTX3遺伝子座、GAL2遺伝子座、およびGAL1-GAL10-GAL7遺伝子座が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約50~5,000ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約50~5,000ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約100~2,500ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約100~1,000ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約250~750ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900または5,000ヌクレオチドからなる。一部の実施形態では、IS1およびIS2の各々が、個別に約500ヌクレオチドからなる。第1および第2のゲノム組込み配列を含む切り出し可能な核酸構築物は、当業者に明らかな任意の技法を用いて作製することができる。特定の実施形態では、当技術分野において公知のオーバーラップ伸長PCR技法および分子クローニング技法を用いて、第1および第2の組込み配列を含む切り出し可能な核酸構築物を作製する。例えば、米国特許出願公開第2010/0136633号、米国特許第5,023,171号過剰伸長PCRによるスプライシング;Sambrookら、2001年、MolecularCloning-ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NYを参照されたい。5.3宿主細胞別の態様では、上記の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞が、宿主細胞ゲノムに組み込まれる切り出し可能な核酸構築物を含む。適切な宿主細胞には、標的のDNAセグメントの染色体の遺伝子座またはエピソームの遺伝子座からの切り出しが所望である任意の細胞が含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞が、原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、細菌細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、Escherichiacoli細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣CHO細胞、COS-7細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性がん腫細胞、またはマウス胚性幹細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、昆虫細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、S2細胞、シュナイダー細胞、S12細胞、5B1-4細胞、Tn5細胞、またはSf9細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、単細胞の真核生物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、二倍体の酵母細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、一倍体の酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞には、微生物寄託機関例えば、IFO、ATCCなどに寄託され、とりわけ、に属する酵母細胞が含まれる。一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Saccharomycescerevisiae細胞、Pichiapastoris細胞、Schizosaccharomycespombe細胞、Dekkerabruxellensis細胞、Kluyveromyceslactis細胞、Arxulaadeninivorans細胞、またはHansenulapolymorpha現在ではPichiaangustaとして公知である細胞である。特定の実施形態では、酵母宿主細胞が、Saccharomycescerevisiae細胞である。一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Saccharomycesfragilis細胞またはKluyveromyceslactisかつては、Saccharomyceslactisと呼ばれた細胞である。一部の実施形態では、酵母宿主細胞が、Candidalipolytica、Candidaguilliermondii、Candidakrusei、Candidapseudotropicalis、またはCandidautilisなど、Candida属に属する細胞である。別の具体的な実施形態では、酵母宿主細胞が、Kluveromycesmarxianus細胞である。具体的な実施形態では、酵母宿主細胞が、パン酵母細胞、CBS7959細胞、CBS7960細胞、CBS7961細胞、CBS7962細胞、CBS7963細胞、CBS7964細胞、IZ-1904細胞、TA細胞、BG-1細胞、CR-1細胞、SA-1細胞、M-26細胞、Y-904細胞、PE-2細胞、PE-5細胞、VR-1細胞、BR-1細胞、BR-2細胞、ME-2細胞、VR-2細胞、MA-3細胞、MA-4細胞、CAT-1細胞、CB-1細胞、NR-1細胞、BT-1細胞、およびAL-1細胞からなる群から選択されるSaccharomycescerevisiae細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞が、PE-2細胞、CAT-1細胞、VR-1細胞、BG-1細胞、CR-1細胞、およびSA-1細胞からなる群から選択されるSaccharomycescerevisiae細胞である。特定の実施形態では、Saccharomycescerevisiae宿主細胞が、PE-2細胞である。別の具体的な実施形態では、Saccharomycescerevisiae宿主細胞が、CAT-1細胞である。別の具体的な実施形態では、Saccharomycescerevisiae宿主細胞が、BG-1細胞である。特定の実施形態では、当技術分野において公知である、外因性核酸を細胞に導入するための従来の任意の技法を用いて、上記のとおりの切り出し可能な核酸構築物を宿主細胞に導入することができる。このような方法には、細胞による溶液からの分子の直接的な取込み、または、例えば、リポソームもしくはイムノリポソームを用いるリポフェクションを介する取込みの促進、粒子を介するトランスフェクション、などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第5,272,065号;Goeddelら編、1990年、MethodsinEnzymology、185巻、AcademicPress,Inc.、CA、Krieger、1990年、GeneTransferandExpression--ALaboratoryManual、StocktonPress、NY;Sambrookら、1989年、MolecularCloning--ALaboratoryManual、ColdSpringHarborLaboratory、NY;およびAusubelら編、最新版、CurrentProtocolsinMolecularBiology、GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience、NYを参照されたい。当技術分野では、酵母細胞を形質転換するための具体的な方法が周知である。Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75巻:1292~3頁1978年;Creggら、Mol.Cell.Biol.、5巻:3376~3385頁1985年を参照されたい。例示的な技法には、スフェロプラスティング、電気穿孔、PEG1000を介する形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムを介する形質転換が挙げられるがこれらに限定されない。5.4ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクター別の態様では、標的のDNAセグメントを、切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから切り出すのに有用なホーミングエンドヌクレアーゼをコードする発現ベクターが本明細書中に提供される。特定の実施形態では、発現ベクターが、LAGLIDADG配列番号1ホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His-Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY-YIG配列番号2ホーミングエンドヌクレアーゼ、およびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、発現ベクターが、I-CreI、I-MsoI、I-SceI、I-SceIV、H-DreI、I-HmuI、I-PpoI、I-DirI、I-NjaI、I-NanI、I-NitI、I-NgrI、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、F-TevI、F-TevII、F-CphI、PI-MgaI、PI-MtuII、I-CsmI、I-PanI、I-CeuI、およびPI-SceIからなる群から選択されるホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。具体的な実施形態では、発現ベクターが、I-SceIをコードする。特定の実施形態では、発現ベクターが、F-CphIをコードする。ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターが、宿主細胞内のホーミングエンドヌクレアーゼの発現を可能とする任意の発現ベクターである。適切な発現ベクターには、Escherichiacoli、酵母、または哺乳動物細胞において遺伝子を発現させるのに使用するための公知の発現ベクターが挙げられるがこれらに限定されない。Escherichiacoli発現ベクターの例には、pSCM525、pDIC73、pSCM351、およびpSCM353が挙げられるがこれらに限定されない。酵母発現ベクターの例には、pPEX7およびpPEX408が挙げられるがこれらに限定されない。他の適切な発現ベクターの例には、CEN.ARS配列と酵母用選択マーカーとを含む、酵母-EscherichiacoliのpRSシリーズのシャトルベクター、および2μプラスミドが挙げられる。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターが、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能とする選択マーカーをさらに含む。特定の実施形態では、選択マーカーが、URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性遺伝子、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、発現ベクターが、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した転写終結配列およびプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターが、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターが、誘導性プロモーターである。酵母細胞に用いるのに適する例示的なプロモーターの例には、K.lactisのTEF1遺伝子のプロモーター、SaccharomycescerevisiaeのPGK1遺伝子のプロモーター、SaccharomycescerevisiaeのTDH3遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えば、SaccharomycescerevisiaeのCTR3遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えば、Saccharomycescerevisiae例えば、GAL1遺伝子、GAL7遺伝子、およびGAL10遺伝子のプロモーターの誘導性ガラクトースプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、核内局在化配列NLSを含むさらなるヌクレオチド配列が、ホーミングエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の5’側に連結する。NLSは、大型>25kDのホーミングエンドヌクレアーゼの核内局在化を促進しうる。一部の実施形態では、核内局在化配列が、SV40の核内局在化配列である。一部の実施形態では、核内局在化配列が、酵母の核内局在化配列である。ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターは、当業者に明らかな任意の技法を介して作製することができる。特定の実施形態では、当技術分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応PCRおよび分子クローニング法を用いてベクターを作製する。例えば、PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification、HAErlich編、StocktonPress、NewYork、N.Y.1989年;Sambrookら、2001年、MolecularCloning-ALaboratoryManual、3版、ColdSpringHarborLaboratory、ColdSpringHarbor、NYを参照されたい。5.5標的のDNAセグメントを切り出す方法別の態様では、1または複数の標的のDNAセグメントを、上記の1または複数の切り出し可能な核酸構築物を含む宿主細胞のゲノムから切り出す方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、少なくとも1つのホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位で、またはそれに近接したところで切断するように、方法が、切り出し可能な核酸構築物、例えば、染色体内に組み込んだ核酸構築物を、宿主細胞において、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位の各々のところで、またはそれに近接したところで切断する。切り出し可能な核酸構築物は、当業者により適切であるとみなされる任意の技法により、ホーミングエンドヌクレアーゼと接触させることができる。特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いて、ホーミングエンドヌクレアーゼを、宿主細胞内で発現させる。上記の発現ベクターを含めた、任意のホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターを用いることができる。ホーミングエンドヌクレアーゼ発現ベクターは、選択マーカー、例えば、標的のDNAセグメントを切り出した後、発現ベクターを含有しない宿主細胞の選択を可能とする対抗選択マーカーを含み得る。用いられる発現ベクターはまた、選択マーカーを有さないベクターであるか、または選択されないベクターである、一過性ベクターでもありうる。具体的な実施形態では、一過性ベクターを含む宿主細胞の後代は、時間の経過と共にベクターを喪失する。他の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物を、ホーミングエンドヌクレアーゼの精製形態と接触させることができる。一部の実施形態では、ES1およびES2の各々の切断により、3つの核酸断片図3Aおよび図3B:1ゲノム核酸の左側アーム、2標的のDNAセグメントを含む核酸断片、および3ゲノム核酸の右側アームが有利に生み出される。切断後、宿主細胞において見出される内因性の5’から3’への方向のエキソヌクレアーゼは、各核酸断片の1つの鎖を迅速に分解し、標的のDNAセグメントを含む核酸断片を破壊し、DR1およびDR2を相補性領域として含む図4Aゲノム核酸の左側4アームおよび右側5アーム上に長い3’側テールを残す図3C。相補性領域は、ヘテロ二重鎖を形成し図4B:6、宿主細胞のタンパク質により促進される組換えを受ける。一部の実施形態では、相補性領域が、一本鎖アニーリング経路を介して有利に組換えを受ける。右側7アームおよび左側8アーム上のテールの3’側最末端は相補性でなく、このため、相補性部分により形成されるヘテロ二重鎖から突出する。これらの非相補性の3’側最末端は、フラップヌクレアーゼにより有利に切断される。最後に、修復DNA合成およびDNAリガーゼによりヘテロ二重鎖を充てんし、ニックを封止して、標的のDNAセグメントの切り出しが正確な、インタクトなゲノム核酸が創製される図4C。DR1およびDR2が、互いと100のヌクレオチド配列同一性を共有する実施形態では、DR1とDR1とが有利に組み換えられて、DR1およびDR2と100のヌクレオチド配列同一性を共有する第3のタンデム反復を含むゲノム核酸を創製する。別の態様では、少なくとも2つの標的核酸を、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物をゲノムに組み込んだ宿主細胞のゲノムから同時に切り出す方法が本明細書中に提供される。一部の実施形態では、上記方法は、1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが、各切り出し可能な核酸構築物の第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つのところで、またはこれに近接したところで切断するように、少なくとも2つの切り出し可能な核酸構築物を、宿主細胞において、1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、宿主細胞が、2つ以上の切り出し可能な核酸構築物を含み、ここで、各切り出し可能な核酸構築物が、固有のES部位、すなわち、宿主細胞内の他の切り出し可能な核酸構築物の間で共有されないES部位を含む。これらの実施形態では、標的のDNAセグメント複数の同時的な切り出しを果たす1または複数のホーミングエンドヌクレアーゼが宿主細胞において供給される。一部の実施形態では、標的のDNAセグメント複数の同時的な切り出しを果たす複数のホーミングエンドヌクレアーゼが宿主細胞において供給される。他の実施形態では、各切り出し可能な核酸構築物のES領域の各々を、そのESを切断することが可能な単一のホーミングエンドヌクレアーゼと接触させる結果、各切り出し可能な核酸構築物の標的のDNAセグメントの同時的な切り出しがもたらされるように、ゲノムに組み込んだ切り出し可能な核酸構築物の各々が、少なくとも1つの同一のES領域を共有する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法により、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、または10を超える標的核酸の、宿主細胞のゲノムからの同時的な切り出しが可能となる。一部の実施形態では、複数の同時的な切り出しが、組み込んだ切り出し可能な核酸構築物の各々の内で共有されるES部位に対する特異性を有する単一のホーミングエンドヌクレアーゼによりなされる。他の実施形態では、複数の同時的な切り出しが、組み込んだ切り出し可能な核酸構築物内の少なくとも1つのES部位に対して各々が特異性を有する、複数のホーミングエンドヌクレアーゼによりなされる。提示される方法の利点は、特定の切り出し可能な核酸構築物のDR1およびDR2が、切断されると、切り出し可能な核酸構築物の組換えを媒介しうる任意のタンデム反復を含みうるということである。したがって、各々が固有のタンデム反復を有する複数の切り出し可能な核酸構築物を、異なる切り出し可能な核酸構築物の間におけるタンデム反復の組換えに起因するゲノムの不安定性を憂慮することなしに、同じ細胞内で用いることができる。さらに、上記方法は、選択マーカーを取り出すのに有利に使用して、同じ宿主細胞またはその後代におけるそれらの再使用を可能とすることができる。他の実施形態では、切り出しイベントを、宿主細胞における対象の内因性遺伝子の発現を促進するか、抑制するか、または変化させるのに用いることができる。例えば、一部の実施形態では、第1のゲノム組込み配列が、対象の内因性遺伝子のコード配列の5’側に配置されたヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、第2のゲノム組込み配列が、対象の内因性遺伝子のコード配列内に配置されたヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、標的のDNAセグメントが、例えば、宿主細胞を培養する培養培地に、それぞれ、インデューサーまたはリプレッサーを添加することにより、誘導することもでき、抑制することもできる、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む。標的遺伝子座に組込み配列を組み込むと、標的遺伝子の天然プロモーターが、標的のDNAセグメントに由来する誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターで置き換えられ、培養培地中の誘導剤または抑制剤の存在に依存して、対象の遺伝子の遺伝子産物の産生がもたらされる。同様に、切り出し可能な核酸構築物が有する標的のDNAセグメントは、それぞれ、インデューサーまたはリプレッサーを添加することにより、誘導することもでき、抑制することもできる、リプレッサーをコードするヌクレオチド配列を含みうる。制御可能なプロモーターまたはリプレッサーが、宿主細胞ゲノムから切り出されるように、本明細書で記載される切り出しイベントを誘導することにより、対象の遺伝子の発現に対するこのような外因性の制御を所望に応じて取り出すことができる。他の実施形態では、例えば、対象の内因性遺伝子のコード配列とその天然のプロモーターエレメントとの間の作動可能な連結を中絶させることにより、切り出し可能な核酸構築物の宿主細胞ゲノムへの組込みを使用して、対象の内因性遺伝子の発現を破壊することができる。内因性遺伝子の発現の回復が所望される場合は、本明細書で記載される方法に従う切り出しイベントを誘導して、天然のプロモーターエレメントを、対象の内因性遺伝子のコード配列と作動的に再連結する、すなわち、天然のプロモーターエレメントを、対象の内因性遺伝子についてのコード配列の作動可能な近傍内に戻すことができる。5.6キット別の態様では、標的のDNAセグメントを宿主細胞のゲノムから切り出すためのキットが本明細書中に提供される。一部の実施形態では、キットが、a5’から3’への方向に、i第1のタンデム反復DR1と、ii第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、iii標的のDNAセグメントDと、iv第2のタンデム反復DR2とを含む切り出し可能な核酸構築物と、b第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、キットが、a5’から3’への方向に、i第1のタンデム反復DR1と、ii標的のDNAセグメントDと、iii第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、iv第2のタンデム反復DR2とを含む切り出し可能な核酸構築物と、b第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、キットが、a5’から3’への方向に、i第1のタンデム反復核酸DR1と、ii第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES1と、iii標的核酸と、iv第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位ES2と、v第2のタンデム反復核酸DR2とを含む切り出し可能な核酸構築物と、b第1または第2のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位のうちの少なくとも1つに結合し、そしてそこで切断するかまたはそれに近接したところで切断することが可能なホーミングエンドヌクレアーゼをコードするホーミングエンドヌクレアーゼ核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に少なくとも18ヌクレオチド塩基対を含む。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、個別に18~500ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、第1および第2のタンデム反復核酸の各々が、個別に、18~500、18~495、18~490、18~485、18~480、18~475、18~470、18~465、18~460、18~455、18~450、18~445、18~440、18~435、18~430、18~425、18~420、18~415、18~410、18~405、18~400、18~395、18~390、18~385、18~380、18~375、18~370、18~365、18~360、18~355、18~350、18~345、18~340、18~335、18~330、18~325、18~320、18~315、18~310、18~305、18~300、18~295、18~290、18~285、18~280、18~275、18~270、18~265、18~260、18~255、18~250、18~245、18~240、18~235、18~230、18~225、18~220、18~215、18~210、18~205、18~200、18~195、18~190、18~185、18~180、18~175、18~170、18~165、18~160、18~155、18~150、18~145、18~140、18~135、18~130、18~125、18~120、18~115、18~110、18~105、18~100、18~95、18~90、18~85、18~80、18~75、18~70、18~65、18~60、18~55、18~50、18~45、18~40、18~35、18~30、18~25、または18~20ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、DR1およびDR2の各々が、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199または200ヌクレオチド塩基対からなる。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第1のタンデム反復核酸の5’側に連結した第1のゲノム組込み配列、および第2のタンデム反復核酸の3’側に連結した第2のゲノム組込み配列をさらに含む。一部の実施形態では、キットが、切り出し可能な核酸構築物の組込みおよびその後における標的核酸の切り出しが所望される宿主細胞に特異的な第1および第2のゲノム組込み配列を提供する。例えば、一部の実施形態では、キットにより、選択される酵母のゲノム遺伝子座との相同組換えを開始するのに十分な長さおよび相同性を共有する、第1および第2の酵母特異的なゲノム組込み配列を含む、酵母で用いるための核酸構築物が提供される。一部の実施形態では、キットにより、各々が特定の酵母のゲノム遺伝子座を標的とする第1および第2のゲノム組込み配列の固有の対を含む、複数の核酸構築物が提供される。特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットが、a5’から3’への方向に、i少なくとも18ヌクレオチド塩基対を有する第1のタンデム反復核酸と、ii第1のI-SceI部位と、iii標的核酸と、iv第2のI-SceI部位と、v少なくとも18ヌクレオチド塩基対を有する第2のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物と、bI-SceIをコードする核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の5’側に連結した第1の組込み部位、および第2のタンデム反復核酸の3’側に連結した第2の組込み部位をさらに含む。別の具体的な実施形態では、本明細書で提供されるキットが、a5’から3’への方向に、i第1のタンデム反復核酸と、ii第1のF-CphI部位と、iii標的核酸と、iv第2のF-CphI部位と、v第2のタンデム反復核酸とを含む切り出し可能な核酸構築物と、bF-CphIをコードする核酸を含むベクターとを含む。一部の実施形態では、切り出し可能な核酸構築物が、第1のホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位の5’側に連結した第1の組込み部位、および第2のタンデム反復核酸の3’側に連結した第2の組込み部位をさらに含む。特定の実施形態では、本明細書で提供されるキットが、上記の切り出し可能な核酸構築物および/またはベクターによる形質転換に適する1または複数の宿主細胞をさらに含む。一部の実施形態では、キットが、標的のDNAセグメントを、本明細書で開示される宿主細胞のゲノムから切り出す方法について記載する、使用のための指示をさらに含む。一部の実施形態では、キットが、標的のDNAセグメントを含む切り出し可能な核酸構築物であって、上記標的のDNAセグメントが、例えば、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、イントロン、エキソン、ポリAテール、複数のクローニング部位、核内局在化シグナル、mRNA安定化シグナル、選択マーカー、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、または分解シグナルから選択される切り出し可能な核酸構築物を含む。6.1実施例1:xMarker構築物の構築本明細書中に記載される組成物および方法を実行して、xMarkerとして本明細書中に記載される、S.cerevisiaeに用いるための一連の切り出し可能な選択マーカーを調製して特徴付けた。第1世代のマーカーでは、I-SceIエンドヌクレアーゼを用い、図1に示されるDNA構築物のパラメータであって、1エンドヌクレアーゼ部位に隣接する定方向反復の異なる長さ、および2エンドヌクレアーゼ部位が1つである場合と2つである場合との対比を包含するパラメータについて調べた。第2世代のマーカーでは、第1世代のマーカーについての試験結果を、I-SceIエンドヌクレアーゼについてより広範に適用した。第3世代xMarkerは、以下の表1に列挙される他のエンドヌクレアーゼへの有用性および拡張性を裏付けた。以下に記載する実験において用いられる試薬について、制限酵素は、NewEnglandBiolabsおよびFermentasから得た。Finnzymes製の高忠実度熱安定性ポリメラーゼであるPhusionは、プラスミドをクローニングするのに用いられるDNAの構築のため、または染色体組み込みのための酵母の形質転換に用いた。低忠実度熱安定性ポリメラーゼキットは、酵母コロニーに由来するゲノムDNAのPCRに用いたQiagenTaqPCRキット。オリゴヌクレオチドは、IntegratedDNATechnologiesIDTから得た。他の化学物質は、Sigma、Fisher、およびZymoResearchから得た例えば、トリスおよびEDTAなどの標準的な分子生物学用バッファ成分、ならびに酢酸リチウムおよび酵母窒素ベースなどの標準的な酵母用試薬。DNAのクローニングに用いられるコンピテントE.coli細胞は、Invitrogenから購入した。DNAミニプレップは、Qiagen製のミニプレップキットにより実施した。分子生物学技法、酵母分子遺伝学技法、および酵母細胞培養技法は、標準的なプロトコールに従い実施した。6.1.1.第1世代xMarkerの構築xMarkerの初期シリーズでは、URA3を選択マーカーとして用い、そのシリーズの各メンバーは、I-SceI切断部位の数1つまたは2つおよび定方向反復の長さ20、40、60、または80bpで異なった。URA3は、その存在を、ウラシルを欠く培地における増殖により選択することができ、その非存在を、5-フルオロオロチン酸を含有する培地における増殖により選択しうる対抗選択マーカーである。定方向反復配列は、20bpの各セグメントが約50のGC含量を有し、30°Cを上回る温度では、20、40、60、および80bpのストレッチが、予測される二次構造を殆ど有さない、112bpのDNAのストレッチからなるようにデザインされた。I-SceI切断部位は全て、同じ18bpの配列:5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’配列番号3を共有した。表2では、試験した第1世代xMarkerの全てを、切断部位の数およびそれらの互いに対する方向、定方向反復DRの長さおよび配列、ならびにI-SceI切断部位複数可の配列と共に列挙する。2つのI-SceI部位を有するxMarkerでは、エレメントの配列は、DR→/I-SceI部位→/URA3/I-SceI部位→/DR→であった。1つのI-SceI部位を有するxMarkerでは、エレメントの配列は、DR→/I-SceI部位→/URA3/DR→であった。xMarkerにおける反復部位のために、構築では、左半分と右半分とを個別に構築してから、その左半分と右半分とを接合することが必要であった。第1世代xMarkerは、3つのステップで創製した。第1に、リン酸化オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、左側5’側と右側3’側とで選択マーカーに隣接する配列を個別に構築した。アニーリングにより創製した、左側および右側の二本鎖隣接配列は、相補性であり、パリンドロームではない、3’側の一本鎖の5塩基突出トップ側においてTAGAC、およびボトム側においてGTCTAを有するようにデザインした。表3に、各xMarkerに用いられるオリゴ鎖oligoを列挙する。各アニーリング反応では、DNAリガーゼ緩衝液中の等モルのオリゴヌクレオチド混合物を、ヒートブロックにおいて5分間にわたり95°Cまで加熱し、次いで、ヒートブロックの電源を切り、1~2時間にわたり室温までゆっくりと冷却した。第2に、3ウェイライゲーションのために、アニーリング混合物に由来する、対応する、左側の隣接DNAおよび右側の隣接DNAを、RYSE12エントリーベクターと混合した。粘着末端ライゲーションにより、左側反復配列の右側端を右側反復配列の左側端に接合し、反対側の末端では、平滑末端ライゲーションにより、左側反復配列および右側反復配列をプラスミドに接合した。I-SceI切断部位の間のスペーサーは、XbaI部位により隔てられた多様なSchI制限部位を含有した。これらのプラスミドは、いまだマーカーを有さず、切断および修復を誘導する隣接配列だけを有するため、これらをxMarkerエントリーベクターと呼んだ。第3に、URA3選択マーカーを、xMarkerエントリーベクターへとライゲーションした。URA3マーカーは、PCRにより、プラスミドRaBit12-0-M-555から増幅して、平滑末端マーカーをもたらした。定方向反復二重I-SceI部位xMarkerには、オリゴヌクレオチドKB439およびKB440を用いた、URA3についてのPCRで、単一I-SceI部位xMarkerには、オリゴヌクレオチドはKB439およびKB441であった。xMarkerエントリーベクターをSchIで消化して、平滑末端の直鎖状プラスミドをもたらした。次いで、標準的なリガーゼ条件を用いて、2つの断片を一緒にライゲーションした。これにより、図1に示されるxMarker構造を生成させた。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおける挿入物のDNA配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。6.1.2.第2世代xMarkerの構築第2世代のxMarkerは全て、DNAの修復を支援する60bpの定方向反復、および定方向反復における2つのI-SceI切断部位により創製した。各xMarkerは、固有の60bpの配列を有し、これは、以下の表4に示す通り、セミランダム配列となるように選択した。60bpの配列は、2つの基準:1第1、第2、および第3の20bpのウインドウwindowが60°C±2°Cの融解温度を有すること、および260bpの配列中に現れるどの13bp以上の配列ウインドウも酵母ゲノムにおける任意の天然の配列と同一ではないことを満たすように選択した。このセットは、4つの異なる選択マーカー:URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼまたはhph、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼまたはnat、およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼまたはkanを包含した。細菌に由来するこれらの3つの薬物耐性遺伝子は全て、Kluyveromyceslactisに由来するTEF1遺伝子のプロモーターおよびターミネーターに対応する隣接配列により制御されるので、これらに接尾辞Aを付してこのTEF1-に由来する調節性制御を示し、次いで、これらのカセットをhphA、natA、およびkanAと呼んだ。xMarkerにおける反復部位のために、構築では、左半分と右半分とを個別に構築してから、その左半分と右半分とを接合することが必要であった。第2世代xMarkerは、第1世代とは異なる戦略を用いる、2つのステップで創製した。以下の表5に列挙されるテールの長いオリゴヌクレオチドでマーカーのPCR増幅をプライミングすることにより、マーカーの左側および右側に60bpの配列および20bpのI-SceI切断部位を導入した。オリゴヌクレオチドは、固有の60bpの配列およびI-SceI部位を含有する80bpの3’端および5’テールに20~22bpのプライミング領域を含有した。マーカーの左側と右側とでは、2つのわずかに異なるI-SceI部位を用いた:左側では、バージョン1v1を5’-GCTAGGGATAACAGGGTAAT-3’配列番号21とし、右側では、バージョン2v2を5’-ACTAGGGATAACAGGTTTAT-3’配列番号22とした。第2世代xMarkerは全て、DR60bp→/I-SceI部位v1→/マーカー/I-SceI部位v2→/DR60bp→により概括されるエレメント構造を有した。xMarker構築物の概要は、以下の通りである。第1に、マーカーの左側部分およびマーカーの右側部分を、PCRにより個別に増幅した。プライマーは、マーカーの中央のセグメントが、左側および右側の両方のPCR産物に包含されるように、かつ、この重複セグメントが、一本鎖の相補性突出を残す固有の制限部位を包含するようにデザインした。第2に、その2つのPCR産物を、選択した制限酵素で個別に消化し、ゲル精製し、線状化させたRYSE12エントリーベクターを有する3つの小片からなるライゲーション混合物に添加した。第1世代のライゲーションと同様に、左側部分と右側部分とをアニーリングさせ、粘着末端を用いてライゲーションする一方で、マーカー構築物の最も外部の末端には、レシピエントプラスミドとの平滑末端ライゲーションを施した。第1世代の方法との差異は、ライゲーション後において、その産物が既にマーカー遺伝子を含有し、構築が完了しているということである。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおける挿入物のDNA配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。前出の12RaBit類を用いたのと全く同様に、これらのプラスミドを、化合物であるcompoundDNA構築物をRYSEベースでスティッチングするのに用いうる、新規のxMarker用の12RaBit類であった。以下では、xMarkerの詳細について記載する。当初各マーカーに用いた、マーカーの内部の固有の制限部位は、以下:hphA、NdeIRsrIIまたはBanI、kanA、PvuINciIまたはBstXI、natA、StyI、およびURA3、NcoIBsiHKAIまたはAlwNIの通りである。当初の酵素が陽性のクローンをもたらさなかった場合は、後で選択した酵素を用いたが、それらの利益は、2つの左側部分または2つの右側部分を有する、ライゲーションされたプラスミドを得る可能性がないように、一本鎖の突出をパリンドロームとしないということである。マーカーの左側部分の増幅は、表示された制限部位の右側のトップ鎖にアニーリングさせた約20bpのリバースプライマーと、5’側のオリゴヌクレオチドが、以下の通りの構造:60bpの配列→/I-SceI部位v1→/約20bpのフォワードプライマーを有するように、5’テールを包含するマーカーの左端にアニーリングさせたプライマーとにより実施した。マーカーの右側部分の増幅は、表示された制限部位の左側のボトム鎖にアニーリングさせた約20bpのフォワードプライマーと、3’側オリゴヌクレオチドが、このような構造:60bpの配列逆相補→/I-SceI部位v2:逆相補→/約20bpのリバースプライマーを有するように、5’テールを包含するマーカーの右端にアニーリングさせたプライマーとにより実施した。表4は、各xMarkerの左側部分および右側部分を増幅するのに用いられるプライマーのリストを含む。マーカーをPCR増幅するのに用いられる鋳型は、RaBitプラスミド:hphA用の12-0-M-21、kanA用の12-0-M-261、natA用の12-0-M-262、およびURA3用の12-0-M-555とした。前出の12RaBit類を用いたのと全く同様に、完成したxMarker用の第2世代のプラスミド自体を、化合物であるDNA構築物をRYSEベースでスティッチングするのに用いうる12RaBit類とした。6.1.3.I-SceI発現プラスミドの構築I-SceI遺伝子を、S.cerevisiaeのGAL1用プロモーターの制御下に置き、多様なマーカーを有するCEN.ARSプラスミドのセットへとクローニングした。CEN.ARS配列ならびにLEU2pRS415、別名pAM63マーカーおよびURA3pRS416、別名pAM63マーカーを有する酵母-E.coliシャトルベクターについては既に記載されている例えば、Gene、1992年、110巻、119~22頁、およびGenetics、1989年、122巻、19~27頁を参照されたい。pRS416の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるkanApAM1110、natApAM1111、およびhphApAM1112で置き換えることにより作製した。ベクターの各々は、ポリリンカー/複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位である、EcoRV薬物耐性マーカーまたはSmaIURA3およびLEU2において消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼPNKで処理して5’末端をリン酸化させた、3分節をスティッチングしたPCR産物にライゲーションした。PCR産物は、RYSE4およびRYSE11と称するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複末端を有するDNAの3つの小片:1Sap1によりRaBit23-0-P-39から遊離した挿入物により供給される、RYSEリンカー2および3を有する、S.cerevisiaeのGAL1に由来するプロモーターと、2鋳型として用いられる特別に合成した遺伝子とプライマーである00177-JD-75ANおよび00177-JD-75AOとに由来するPCR産物により供給される、RYSEリンカー3および4を有するI-SceIコード配列、ならびに3Sap1によりRaBit45-0-T-64から遊離した挿入物により供給される、RYSEリンカー4および5を有する、S.cerevisiaeのTDHに由来するターミネーターを一緒にスティッチングすることにより作製した。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおけるPGAL1-I-SceI-TTDH3挿入物のDNA配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。発現プラスミドは、pAM1592URA3、pAM1593kanA、pAM1594natA、およびpAM1595hphAと称した。PGAL1プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞GAL80GAL4細胞では、細胞をブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、GAL80リプレッサーを欠くgal80Δ変異体では、ガラクトースの非存在下であってもPGAL1が発現し、ブドウ糖によるPGAL1の抑制は、GAL4OCオペレーターについて構成的と称するプロモーターの変異を有するGAL4変異体を添加することによりさらに低減される。上記の通り、エンドヌクレアーゼの発現を、ある宿主株の遺伝子バックグラウンドGAL80では誘導性に発現し、他のものの遺伝子バックグラウンドgal80Δ/-GAL4OCでは構成的に発現する強力なプロモーターの制御下に置いた。他の多くの誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターも、良好に作用すると予測される。プロモーターが構成的であっても、エンドヌクレアーゼの発現は、所望の期間の後にプラスミドを喪失することにより、容易に消失させることができ、細胞のうちの約半分は、非選択培地中で10世代後に、これらのプラスミドを喪失する例えば、Gene、1992年、110巻、119~22頁、およびGenetics、1989年、122巻、19~27頁を参照されたい。6.1.4.第3世代xMarkerの構築:さらなるエンドヌクレアーゼ他のエンドヌクレアーゼI-SceI以外のxMarkerの初期シリーズでは、URA3を選択マーカーとして用いた。xMarkerのシリーズの各メンバーは、異なるエンドヌクレアーゼ認識/切断部位[VDE、F-CphI、PI-MgaIpps1、PI-MtuIIpps1]を含有した。切断部位の記載については、上記の表1を参照されたい。全てのxURA3マーカーは、切断部位に隣接する、定方向反復方向にある同じ50bpの配列の2つのコピーを含有し、切り出し後においてscarとなるように定められたこの固有の50bpの配列をxM0と称した。以下の表6で、scar配列について記載する。scar配列は、以下の基準:1GC含量が約50であること、220bp合計50bp内の第1および第2の配列の融解温度が60°C±2°Cであること、330°Cを上回る温度では予測される二次構造が最小であること、および450bpの配列中に現れるどの13bp以上の配列ウインドウも酵母ゲノムにおける任意の天然の配列と同一ではないことを満たすように選択した。xMarkerにおけるエレメントの一般的な配列および方向は、図1に示す通り:DR50bp→、切断部位→、URA3、切断部位→、DR50bp→、であった。xMarkerにおける反復部位のために、DNA分子の創製では、その左半分とその右半分とを個別に構築してから、その左半分とその右半分とを接合することが必要であった。本節に記載されるマーカーの構築には、上記の6.2節における第2世代の戦略を用いた。第1に、マーカーの左側部分およびマーカーの右側部分を、PCRにより個別に増幅した。各xMarkerをPCR増幅するために、4つのオリゴヌクレオチドをデザインした。PCRのための2つの外部オリゴヌクレオチドを、マーカーの末端にアニーリングさせ、2つの内部オリゴヌクレオチドを、マーカー遺伝子の内部にアニーリングさせた。外部オリゴヌクレオチドは、3’端において、鋳型と相補的な20~22bpの配列を含有し、5’末端において、鋳型にアニーリングせず、切断配列およびscar配列を導入することに働く74~90bpの配列を含有した。外部オリゴヌクレオチドは、PCR反応に組み入れる前に、PNKでリン酸化させて、後のステップにおけるライゲーションを促進させた。内部オリゴヌクレオチドは、マーカーの中央のセグメントが、左側および右側の両方のPCR産物に包含されるように、かつ、この重複セグメントが、一本鎖の相補性突出を生成させるのに用いられうる固有の制限部位を包含するようにデザインした。可能な場合は、パリンドロームではない突出を生成させる制限酵素を選択して、2つの左側部分または2つの右側部分が一緒にライゲーションされる可能性を低減することが有利であった。第2に、2つのPCR産物を選択した制限酵素で個別に消化し、ゲル精製した。第3に、各々が粘着末端および平滑末端を有する左側セグメントおよび右側セグメントを、3つの小片からなるライゲーションのための線状化させたRYSE12エントリーベクタープラスミドに添加した。左側部分と右側部分とをアニーリングさせ、粘着末端を用いてライゲーションする一方で、マーカー構築物の最も外部の末端には、レシピエントプラスミドとの平滑末端ライゲーションを施した。ライゲーションしたプラスミドの個別のクローンを回収し、DNA配列決定により所望のプラスミドを同定した。前出の12RaBit類を用いたのと全く同様に、これらのプラスミドを、化合物であるDNA構築物をRYSEベースでスティッチングするのに用いうる、新規のxMarker用の12RaBit類とした。xURA3マーカーの第1のセットについて調べた後、さらなる作業のために、F-CphIエンドヌクレアーゼを選択した。F-CphIと共に用いるために、異なる選択マーカーを有するさらなるxMarkerを作製した。このセットは、6つの異なる選択マーカー:URA3、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼまたはhph、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼまたはnat、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼまたはkan、ゼオシン耐性遺伝子またはble、およびホスフィノトリシンN-アセチルトランスフェラーゼまたはpatを包含した。細菌に由来するこれらの薬物耐性遺伝子は全て、Kluyveromyceslactisに由来するTEF1遺伝子のプロモーターおよびターミネーターに対応する隣接配列により制御されるので、これらに接尾辞Aを付してこのTEF1-に由来する調節性制御を示し、次いで、これらのカセットをhphA、natA、kanA、zeoA、およびpatAと呼んだ。表7に、各マーカーについての制限部位および内部innerオリゴヌクレオチドを列挙し、表8に、各マーカーについての外部オリゴヌクレオチドを列挙する。6.1.5.エンドヌクレアーゼ発現プラスミドの構築以下の表9では、エンドヌクレアーゼ遺伝子であるI-SceI、F-CphI、PI-MtuIIpps1、PI-MgaIpps1、およびVDEを含有するプラスミドについて記載する。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、化学合成するI-SceI、F-CphI、PI-MtuIIpps1、PI-MgaIpps1か、またはPCRによりS.cerevisiaeゲノムDNAから増幅したVDE。エンドヌクレアーゼのうちの3つF-CphIおよびI-SceIを除く全ては、核膜孔を介して細胞内の合成部位細胞質から作用部位核へと自由に移動するには大型過ぎる>25kD;353~456アミノ酸ので、SV40の核内局在化配列NLSをそのタンパク質のアミノ末端に付加するために、コード配列の5’末端にDNA配列を付加した。このNLSは、S.cerevisiaeにおける有糸分裂通常の増殖性増殖の間におけるVDEの活性に不可欠であると記載されている。これは、この天然の酵母酵素が、天然では減数分裂の間に限り核に入るためである。例えば、MolCellBiol、2003年、23巻、1726~36頁を参照されたい。SV40のNLSについてのコード配列を含有するテールを有するオリゴヌクレオチドを用いてNLSをVDEに付加し、遺伝子全体の化学合成の一部としてNLSをPI-MtuIIおよびPI-MgaIに付加した。PCRベースのスティッチングまたはオーバーラップ伸長を用いて、NLSを有するかまたは有さずに、エンドヌクレアーゼコード配列を、プロモーターおよびターミネーターと融合させた。ACS2に由来するS.cerevisiaeのプロモーターおよびADE6に由来するS.cerevisiaeのターミネーターにより、RYSEリンカーを用いることなしに、構築物の第1のセットを作製した。この第1のセットでは、プロモーター-遺伝子-ターミネーターのPCRスティッチング産物を、個別の小片のPCR反応をプライミングするのに用いられるオリゴヌクレオチド上のテールによりその固有の制限部位を導入した、SacIおよびXhoIで消化し、次いで、その構築物を、SacIおよびXhoIで消化し、ホスファターゼで処理したレシピエントプラスミドへとライゲーションした。第2のセットでは、GAL1に由来するS.cerevisiaeのプロモーターおよびTDH3に由来するS.cerevisiaeのターミネーターを用い、このセットでは、プロモーター23-0-P-39およびターミネーター45-0-T-64用にRYSEリンカーおよびRYSERaBitプラスミドを用いた。プラスミドのこの第2のセットでは、平滑末端でスティッチングした産物を、平滑末端による二本鎖切断を生じる制限酵素で線状化させた、酵母マーカーを有するCEN.ARSプラスミドへと効率的にライゲーションしうるように、プロモーター-遺伝子-ターミネーターの構築物を、ポリヌクレオチドキナーゼPNKを用いてあらかじめリン酸化させたRYSEプライマーであるRYSE4およびRYSE11とスティッチングした。最後に、ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおけるプロモーター-遺伝子-ターミネーター挿入物のDNA配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。プラスミド構築の詳細については、以下に記載する。レシピエントプラスミドは全て、CEN.ARS配列を有する酵母-E.coliシャトルベクターのpRSシリーズに基づいており、酵母選択マーカー、例えば、URA3でマーキングされたバージョンpRS416、別名pAM64については、既に記載されている例えば、Gene、1992年、110巻、119~22頁、およびGenetics、1989年、122巻、19~27頁を参照されたい。pRS416の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるkanApAM1110、natApAM1111、およびhphApAM1112で置き換えることにより作製した。プラスミドの第2のセットでは、pAM1112を、ポリリンカー/複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位EcoRVにおいて消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼPNKで処理して5’末端をリン酸化させた、3分節をスティッチングしたPCR産物にライゲーションした。プラスミドの第1のセットでは、3分節をスティッチングしたPCR産物およびpAM1112レシピエントプラスミドの両方を、XhoIおよびSacIで消化し、次いで、ライゲーションのために混合した。エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるためのプロモーター-遺伝子-ターミネーターPCR産物を、重複末端を有するDNAの3つの小片を一緒にスティッチングすることにより作製した。3つの小片を創製するのに用いられるオリゴヌクレオチドおよび鋳型、ならびに3つの小片を一緒にスティッチングするのに用いられるオリゴヌクレオチドを、表10に示す。6.1.6.I-SceI発現プラスミドの構築I-SceI遺伝子を、S.cerevisiaeのGAL1用プロモーターの制御下に置き、多様なマーカーを有するCEN.ARSプラスミドのセットへとクローニングした。CEN.ARS配列ならびにLEU2pRS415、別名pAM63マーカーおよびURA3pRS416、別名pAM63マーカーを有する酵母-E.coliシャトルベクターについては既に記載されている例えば、Gene、1992年、110巻、119~22頁、およびGenetics、1989年、122巻、19~27頁を参照されたい。pRS416の誘導体は、栄養素要求性マーカーを、薬物耐性マーカーであるkanApAM1110、natApAM1111、およびhphApAM1112で置き換えることにより作製した。ベクターの各々は、ポリリンカー/複数のクローニング部位内の固有の平滑末端制限部位である、EcoRV薬物耐性マーカーまたはSmaIURA3およびLEU2において消化し、次いで、ホスファターゼで処理した。線状化させたベクターを、ポリヌクレオチドキナーゼPNKで処理して5’末端をリン酸化させた、3つの分節をスティッチングしたPCR産物にライゲーションした。PCR産物は、RYSE4およびRYSE11と称するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、重複末端を有するDNAの3つの小片:1Sap1によりRaBit23-0-P-39から遊離した挿入物により供給される、RYSEリンカー2および3を有する、S.cerevisiaeのGAL1に由来するプロモーターと、2鋳型として用いられる特別に合成した遺伝子と、プライマーである00177-JD-75ANおよび00177-JD-75AOとに由来するPCR産物により供給される、RYSEリンカー3および4を有するI-SceIコード配列、ならびに3Sap1によりRaBit45-0-T-64から遊離した挿入物により供給される、RYSEリンカー4および5を有する、S.cerevisiaeのTDHに由来するターミネーターを一緒にスティッチングすることにより作製した。ライゲーションしたプラスミドの個別の単離物を回収し、プラスミドにおけるPGAL1-I-SceI-TTDH3挿入物のDNA配列決定を行なうことにより、所望のプラスミドを同定した。発現プラスミドは、pAM1592URA3、pAM1593kanA、pAM1594natA、およびpAM1595hphAと称した。PGAL1プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞GAL80GAL4細胞では、細胞をブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、GAL80リプレッサーを欠くgal80Δ変異体では、ガラクトースの非存在下であってもPGAL1が発現し、ブドウ糖によるPGAL1の抑制は、GAL4OCオペレーターについて構成的な変異体と称するプロモーターの変異を有するGAL4変異体を添加することによりさらに低減される。エンドヌクレアーゼの発現を、ある宿主株の遺伝子バックグラウンドGAL80では誘導性に発現し、他のものの遺伝子バックグラウンドgal80Δ/-GAL4OCでは構成的に発現する強力なプロモーターの制御下に置いた。他の多くの誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターも、良好に作用すると予測される。プロモーターが構成的であっても、エンドヌクレアーゼの発現は、所望の期間後にプラスミドを喪失することにより、容易に消失させることができ、細胞のうちの約半分は、非選択培地中で10世代後に、これらのプラスミドを喪失する例えば、Gene、1992年、110巻、119~22頁、およびGenetics、1989年、122巻、19~27頁を参照されたい。6.1.7.F-CphI発現プラスミドの構築hphAマーカーを有するF-CphI発現プラスミドpAM1799を作製し、これについて調べた後、それらの各々が、レシピエントプラスミドおよびpAM1799における固有の部位を切断する制限酵素であるXhoIおよびXbaIを用いて、PGAL1-F-CphI-TTDH3カセットを、異なるマーカーを有する他のCEN.ARSプラスミドpAM1110、pAM1111、pAM64へとサブクローニングした。プラスミドは全て、XhoIおよびXbaIで切断し、プラスミドベクターは、ホスファターゼで処理し、PGAL1-F-CphI-TTDH3カセットは、他のバックボーンとライゲーションした。ライゲーション後において、正確なプラスミド単離物を、制限消化により同定した。ゼオシン耐性プラスミドpAM1800を、他のものとは異なる方法により創製した。PGAL1-F-CphI-TTDH3のためのプロモーター-遺伝子-ターミネーターPCR産物を一緒にスティッチングし、次いで、ゼオシン耐性マーカーを有するレシピエントプラスミドへとライゲーションするよりは寧ろ、hphAマーカーを有するF-CphI発現プラスミドpAM1799により構築を開始し、invivoにおける酵母の相同組換えを利用してハイグロマイシンB耐性遺伝子の代わりにゼオシン耐性遺伝子で置換することによりマーカーを交換した。第1に、ハイグロマイシンB耐性コード配列における固有の部位を切断する制限酵素であるNdeIによりpAM1799を線状化させた。第2に、hphマーカーの発現を制御するpAM1799における配列と相同である、PTEFプロモーターおよびTTEFターミネーターに由来する配列を導入する、長いテールを有するオリゴヌクレオチドJU183およびJU184を用いて、pAM1500または任意のTopoプラスミドからゼオシン耐性遺伝子をPCR増幅した。第3に、2つのDNA小片をゲル精製し、ギャップ修復による組換えのために、ハイグロマイシンB耐性遺伝子をゼオシン耐性遺伝子で正確に置き換えた酵母へと形質転換した。正確なプラスミドは、DNA配列決定により検証した。PGAL1プロモーターは、細胞をガラクトース中で増殖させると高度に発現するが、野生型細胞GAL80GAL4遺伝子型を有するをブドウ糖中で増殖させると発現しない。しかし、GAL80リプレッサーを欠くgal80Δ変異体では、ガラクトースの非存在下であってもPGAL1が発現し、ブドウ糖によるPGAL1の抑制は、GAL4OCオペレーターについて構成的な変異体と称するプロモーターの変異を有するGAL4変異体を添加することによりさらに低減される。PACS2プロモーターは、全て炭素供給源中で中程度に発現する。6.2実施例2:選択マーカーの染色体DNAからの切り出しこの実施例では、実施例1に記載したxMarker構築物が、選択マーカーの宿主細胞染色体DNAからの切り出しの媒介において有用であることを裏付ける。以下に記載する通り、構築物を細胞へと形質転換し、細胞をxMarkerに対して選択的な培地に播種し、コロニーPCRにより正確な組込みを確認するが、このような株は、標準的なマーカーより作製された他の任意の株と全く同様に機能し、xMarkerは、安定的に維持される。第3に、xMarkerの切り出しが所望される場合は、以下の節に記載する通り、株をその独自のマーカーおよびホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子についての発現構築物を含有する単一コピーのCEN.ARSプラスミドで形質転換する。複数世代にわたりプラスミドの存在について選択し、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘導する条件下で増殖させた後に、株をxMarkerの喪失について調べる。最後に、株を、ホーミングエンドヌクレアーゼ発現プラスミドの喪失を可能とする条件下で増殖させ、単離物をプラスミドの喪失について調べる。この工程の終了時には、株は、xMarkerを再使用できる状態にある。この戦略では、xMarkerが、所望のDNA構築物を適正に組み込んだ細胞を選択および検証するのに十分な期間にわたり安定であることが有利である。高度な安定性は、第2の形質転換によりエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入するまではエンドヌクレアーゼ遺伝子を欠く細胞を用いることにより確認される。しかし、代替の手法では、誘導性プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼ遺伝子を安定的に組み込んだ宿主株を用いる。この代替のスキームによれば、株を、調節されたプロモーターからエンドヌクレアーゼの発現を誘導する条件下で培養するまで、xMarkerは安定である。所望の特徴を有するプロモーターが利用可能である場合、この手法により、エンドヌクレアーゼプラスミドの形質転換に必要な時間および労力が節約される。6.2.1.I-SceIを用いるxMarkerについての初期試験:標的DNAを正確に切り出すためのこの手法について調べるために、選択マーカーの染色体DNAからの切り出しの効率および忠実度を、S.cerevisiaeにおいて測定した。第1に、xMarkerを、ノックアウト構築物を生成させるのに選択された遺伝子総称的に述べると、GOI=対象の遺伝子の上流および下流の領域に対応する>500bpの配列の2つのストレッチ間に配置した。第2に、酵母細胞を、このDNA構築物で形質転換して、対象の遺伝子を欠失させ、二重交差イベントをもたらす相同組換えを介して、そのコード配列をxMarkerで置き換えた。第3に、変異体をI-SceI発現プラスミドで形質転換し、プラスミドを保有する単離物にエンドヌクレアーゼを発現し、DNAの切断および修復を受ける時間を与えた。第4に、マーカー選択的な条件下では増殖することが不可能なコロニーを同定およびカウントした。第5に、対象の遺伝子を欠失させたgoiΔ遺伝子座の染色体DNA配列を決定して、マーカーが予測通りきれいに切り出されて修復されたかどうかを評価した。この一連のステップの詳細については、第1世代のマーカーについて以下で提示される。第1に、3つのエレメントを有するオーバーラップ伸長PCRを用いて、GOIUS/xMarker/GOIDSGOI=対象の遺伝子、US=上流、DS=下流の構造を有するノックアウト構築物を一緒にスティッチングした。まず、ndt80Δ構築物との関連で、I-SceIxMarkerについて調べたが、NDT80とは、有糸分裂して増殖する細胞におけるその欠失が識別可能なdiscernable表現型を有さないために選択される、減数分裂特異的な遺伝子である。各PCR反応では、SapIによる消化によりそれらのプラスミドバックボーンから遊離する3つのRaBit類:1NDT80の上流の01-0-U-30、2xMarker用のRaBit、および3NDT80のDSの29-0-D-23を鋳型として用いた。PCRのためのプライマーは、RYSE0およびRYSE19とした。PCRの後、反応混合物をアガロースゲルに負荷し、所望の全長産物をゲルから精製した。第2に、酵母細胞をゲル精製したPCR産物で形質転換し、選択プレートに播種した。第1世代xMarker用の選択プレートは、CSM-ウラシルであり、薬物耐性マーカー用の選択プレートはYPD薬物ハイグロマイシンB、ノーセオトリシン、またはG418とした。全てのxMarker試験は、CEN.PK2株のバックグラウンドまたはS288c株のバックグラウンドに由来する株において実施した。第1世代xMarkerについての初期試験は、PCR産物を、その関連する遺伝子型がGAL80GAL4gal1Δである株Y1625へと形質転換することを包含し、この遺伝子型は、PGAL1からの野生型の誘導性発現であって、ガラクトースが無傷性誘導物質であるように、この糖の摂取を不可能とする誘導性発現を付与した。所望の形質転換細胞は、表2に列挙されるxURA3マーカーの複数のバージョンを有する変異体の遺伝子型であるndt80Δ::xURA3を有した。組換えにより創製される新規のDNA接合部を越えて増幅させるプライマー対を用いるPCRを介して、煮沸により溶解させた細胞からゲノムDNAを増幅することにより、CSM-Uプレートに現れたコロニーを、所望の染色体の遺伝子座の存在について調べたコロニーPCR。プライマーRYSE3およびAET0065-186-63-F-pNDT80による新規の5’側接合部の増幅により1024bpの産物をもたらし、プライマーRYSE4およびAET0072-186-63-R-tNDT80を用いる新規の3’側接合部の増幅により1024bpの産物をもたらした。さらなる解析のために、各xMarkerのバリアントについて2つの単離物を選択した。第3に、遺伝子型ndt80Δ::xMarkerを有する単離物を、I-SceI発現プラスミドで形質転換した。第1世代のndt80Δ::xURA3株について、natAでマーキングされたプラスミドpAM1594を標準的な形質転換条件を用いて形質転換し、これらの細胞に、液体YPD中の3~6時間にわたる増殖の間に新規のマーカー遺伝子を発現する時間を与え、次いで、YPDノーセオトリシンプレートに播種した。各形質転換物のうちの半分を通常のYPD2のデキストロースに播種し、半分をYPDG1デキストロース1ガラクトースに播種した。宿主株の遺伝子型がGAL80GAL4gal1Δであるためで、デキストロースではI-SceI遺伝子のGAL1プロモーターが誘導されず、デキストロースとガラクトースとの混合物でも、デキストロースが高濃度であるためGAL1プロモーターはオフ状態を維持すると予測されるが、次いで、デキストロースが消費されプレート中のガラクトースが影響して、オンに変える。第4に、マーカーを切り出した単離物を同定した。xURA3マーカーは、URA3を欠く細胞の増殖だけを可能とする、5-FOAプレートにおける対抗選択の利点を有する。これに対し、他のxMarkerを切り出した単離物は、スクリーニング、例えば、全ての単離物を増殖させる非選択プレートから、所望の単離物を増殖させない選択プレートへのレプリカプレーティングを行うことにより同定されるはずである。第1世代xMarkerでは、対抗選択を利用するためにURA3を用いた。予測通り、上記のプラスミドを保有する形質転換体を、YPDプレートから5-FOAプレートへと画線播種したところ、YPDではI-SceIが発現しないために、コロニーが増殖しなかった。プラスミドを保有する形質転換体を、YPDGプレートから5-FOAプレートへと画線播種したところ、多くのコロニーが増殖した。YPDGプレートは、ガラクトースを含み、I-SceIの発現を誘導する。5-FOAプレートは、無傷のURA3を保有する細胞に対して選択する。I-SceIによる形質転換体を再画線播種することにより、対照のura3Δ株と比べて増殖する5-FOAコロニーの数に基づくと、細胞のうちの≧30が、二重のI-SceI部位の間からURA3を喪失したと推定され、単一のI-SceI部位を有するxURA3ではその頻度がより低いようであった。これにより、I-SceIを発現させることなしに、URA3xMarkerが切り出されることはまれであり細胞の<10-6個、I-SceIの発現を誘導した後では、URA3の切り出しが高頻度となることが示唆された。その後、切り出しの頻度についてより直接的に調べた。第5に、xMarkerを組み込んだ染色体の遺伝子座を配列決定して、I-SceIによる切断およびその後のDNA二本鎖切断修復の後においても残存するscarについて評価した。マーカー機能を喪失したことが裏付けられたコロニーを、xMarkerとGOIターゲティング配列との間の接合部の上流および下流でアニーリングさせるプライマー対によるコロニーPCRに用い、次いで、そのPCR産物を配列決定した。ndt80Δ::xMarkerの場合は、プライマーを、xMarker配列とNDT80配列との間の接合部の208bp上流JU-197-168-125-NDT80US-Fおよび234bp下流JU-198~168-125-NDT80DS-Rでアニーリングさせた。予測されるPCR産物のサイズは、URA3がきれいに切り出される場合は462~522bpであり、URA3が完全に無傷の場合は2072bpであった。コロニーPCRに用いた27の5FOA耐性コロニーの全てが、切り出しについて予測される約500bpの産物をもたらした。これらの27のPCR産物を配列決定したところ、全ての場合において、図1に示される、予測される完全なscarが示された表11を参照されたい。表11に示される通り、27の試験したコロニー全てにより、xMarkerが組み込まれた後、I-SceIが発現し、xMarkerが切出されることが示された。第1世代xMarkerおよび第2世代xMarker表2および4についてはまた、GAL1プロモーターが構成的であるgal80ΔGAL4OC、異なるS.cerevisiae株においても調べた。上記の通り、ndt80Δ::xMarker構築物を一緒にスティッチングし、酵母へと形質転換した。xURA3による形質転換混合物をCSM-Uプレートへと直接に播種し、薬物耐性マーカーを有する形質転換混合物を、まず、振とう型インキュベーター内の液体YPD中で3~6時間にわたり増殖させてから、YPD薬物プレートへと播種した。コロニーPCRによりndt80Δ::xMarkerが組み込まれていることが検証されている各xMarkerバリアントの2つの形質転換体を、I-SceI発現プラスミドのうちの1つで個別に形質転換し、上記の選択プレートに播種した。PGAL1-I-SceIの発現は構成的であるので、プラスミド形質転換選択プレートにおけるコロニーは、xMarkerを維持するかまたは切り出した混合細胞集団を含有することが予測された。各プレートにからの複数のコロニーを、プラスミドもしくはマーカーまたはこれらの両方を喪失した細胞の増殖を可能とするYPD非選択プレートに再画線播種した。これらの再画線播種に由来するコロニーを、YPDプレートに採取しpatched、一晩にわたり増殖させ、次いで、YPD薬物プレート、CSM-ウラシルプレート、および5-FOAプレートへとレプリカプレーティングした。多くのパッチが、5-FOAおよびCSM-ウラシルの両方で増殖したことから、パッチ内の混合集団が明らかとされ、解析のための均一集団を得るには、コロニーを単離する前に、非選択的条件下でさらなる増殖が必要であることが示唆された。この実験では一般に、混合パッチのためにマーカー切り出しの頻度が過小評価されているが、一般にパッチのうちの少なくとも18、そしてよりしばしば35~50のパッチでは、少なくとも一部の細胞のマーカーが切り出されていた表12。大半のパッチ53~88は、レプリカプレーティングの前にI-SceI発現プラスミドを完全に喪失していた。パッチの採取およびレプリカプレーティングと並行して、2つの個別のndt80Δ::s1x-hphA株に由来するYPD再画線播種プレートにおける90のコロニーを、コロニーPCRによるマーカーの切り出しについて調べたところ、コロニーのうちの4843/90が、hphAマーカーの正確な切り出しについて予測されるサイズのバンドをもたらした。上記の実験と同様の実験を用いる探索のために、さらなるxMarkerを構築した。加えて、同じ株の異なる遺伝子座に組み込んだ複数のxMarkerの同時的な切り出しについての試験も成功し、ゲノムの不安定性の徴候を示さなかった例えば、染色体の転座以下の実施例6.2.4.を参照されたい。6.2.2.他のエンドヌクレアーゼを用いるxMarkerについての試験:表6に示すxURA3マーカーのセットを用いて、4つのさらなるエンドヌクレアーゼについて調べた。各xMarkerは、2つのエンドヌクレアーゼ切断部位これらは、50塩基対の定方向反復配列が相互に隣接するが隣接するURA3選択マーカー遺伝子を含有した。各xMarkerには、3つのエレメントを有するオーバーラップ伸長PCRを用いて、GOIUS/xMarker/GOIDSGOI=対象の遺伝子、US=上流、DS=下流の構造を有するノックアウト構築物を一緒にスティッチングした。まず、新規のエンドヌクレアーゼURA3xMarkerを、対象の遺伝子GOIとしてのHXT3について調べた。各PCR反応では、SapIでの消化によりそれらのプラスミドバックボーンから遊離する3つのRaBit類:1HXT3の上流の01-0-U-407、2xMarker用のRaBitx0.URA.VDE、x0.URA.F-CphI、12-0-x0.URA.PI-MtuII、12-0-x0.URA.PI-MgaI、および3HXT3のDSの29-0-D-408を鋳型として用いた。PCRによるスティッチングに用いられるプライマーは、RYSE0およびRYSE19であった。PCRの後、反応混合物をアガロースゲルに負荷し、所望の全長産物をゲルから精製した。酵母細胞をゲル精製したPCR産物で形質転換し、URA3CSM-ウラシル用の選択プレートに播種した。所望の形質転換体は、表6に列挙されるxURA3マーカーの複数のバージョンを有する変異体の遺伝子型であるhxt3Δ::xURA3を有した。組換えにより創製される新規のDNA接合部を越えて増幅させるプライマー対を用いるPCRを介して、煮沸により溶解させた細胞からゲノムDNAを増幅することにより、CSM-ウラシルプレートに現れたコロニーを、所望の染色体の遺伝子座の存在について調べたコロニーPCR。プライマーは、KB502、KB503、およびCPK904であり、後者の2つにより、hxt3Δ::xURA3の738bpの断片を生成させ、前者の2つにより、無傷のHXT3の538bpの断片を生成させた。さらなる解析のために、各xMarkerのバリアントについて2つの単離物を選択した。xURA3マーカーは、URA3を欠く細胞の増殖だけを可能とする、5-FOAプレートにおける対抗選択の利点を有する。これに対し、他のxMarkerを切り出した単離物は、スクリーニング、例えば、全て単離物を増殖させる非選択プレートから所望の単離物を増殖させない選択プレートへのレプリカプレーティングにより同定しなければならない。第1世代xMarkerでは、まれな切り出しイベントの定量化を可能とする対抗選択を利用するために、URA3を用いた。予測通り、xURA3マーカーを含有するが、エンドヌクレアーゼ発現プラスミドを欠く株を、5-FOAプレートへと播種または画線播種したところ、コロニーが増殖しなかった。これにより、エンドヌクレアーゼにより触媒される切断の非存在下では、xMarkerの自発的な切り出しが極めてまれであることが示された。これにより、エンドヌクレアーゼを発現させることなしに、URA3xMarkerが切り出されることはまれである細胞<10-6個ことが示唆された。確認されたhxt3Δ::xURA3の遺伝子型を有する単離物は、マーカー遺伝子hphApAM1799、pAM1865、pAM1866でマーキングされたエンドヌクレアーゼのための同種の発現プラスミドで形質転換した。形質転換混合物に由来する細胞に、液体YPD中の3~6時間にわたる増殖の間に新規のマーカー遺伝子hphAを発現する時間を与え、次いで、YPDハイグロマイシンBプレートに播種した。宿主株の遺伝子型は、gal80ΔGAL4ocであったので、エンドヌクレアーゼの遺伝子発現を駆動するGAL1プロモーターが構成的に発現し、インデューサーは必要としなかった。3日間にわたる増殖の後、形質転換体のコロニーをYPDハイグロマイシンBプレートに再画線播種し、さらに3日間にわたり増殖させた。再画線播種1つのエンドヌクレアーゼ当たり4つのコロニーに由来するコロニーを3mlのYPDに再懸濁させ、プラスミドの喪失を可能とする非選択的条件下で一晩にわたり増殖させた。細胞密度を決定し、培養物を希釈し、細胞を3つの異なる固体培地:YPD培地、YPDハイグロマイシンB培地、および5-FOA培地によるプレート1枚当たりの推定密度150、15,000、または150,000個で播種した。YPDでは、全ての細胞がコロニーを形成することが予測され、ハイグロマイシンBでは、エンドヌクレアーゼの発現プラスミドを維持する細胞だけがコロニーを形成することが予測され、5-FOAでは、xURA3マーカーを切り出した細胞だけがコロニーを形成することが予測された。表13に示される結果は、F-CphIが、高効率でxMarkerの切り出しを媒介し、PI-MtuIIが、低効率でxMarkerの切り出しを媒介し、PI-MgaIが、検出不可能なレベルでxMarkerの切り出しを媒介したことを示す。CEN.ARSエンドヌクレアーゼ発現プラスミドの喪失が高頻度のイベントであったことから、新規のxMarkerでの別ラウンドの形質転換を行う前に、エンドヌクレアーゼを喪失した細胞を分離するのが容易であることが示唆される。F-CphIを介するマーカーの切り出しが完全なscarを残したかどうかを決定するため、5-FOA耐性機能的にはura3-コロニーを、xURA3マーカーオリゴヌクレオチドKB503およびKB604の組込み部位に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるコロニーPCRに供し、533bpのPCR産物を、オリゴヌクレオチドプライマーKB503によるDNA配列決定のために送った。16の試験したコロニーのうちの全てのコロニーが、xMarkerから残存する唯一のDNA配列を単一の50bpの配列のコピーとする完全なscarを有した。6.2.3.F-CphによるxMarker切り出しの頻度および忠実度についてのさらなる試験さらなるF-CphIによる切断部位および多様な選択マーカーnatA、kanA、hphA、zeoAを有するxMarkerを創製し、これらについて調べた。一倍体および二倍体のS.cerevisiae株におけるこれらのマーカーの切り出し頻度および切り出しの忠実度について、単独および組合せの両方で調べた。切り出しの頻度は、試験したコロニーの100であることが頻繁であり、常に>80であった。切り出しの忠実度は、100近くであった。多くの個別の培養物における切り出しイベントのほとんど全てが、予測されるscarをもたらし、切り出しが残したのは、xMarkerに定方向反復として導入された50bpの固有の配列の1つのコピーだけであり、マーカー自体は存在しなかった表14。NDT80遺伝子座においてxMarkerを有する株NDT80遺伝子を欠失しているは、以下の通りに作製した。細胞を形質転換するのに用いられる、スティッチングされたPCR産物は、xMarker12RaBitとしてのを、RYSE0およびRYSE19と称するオリゴヌクレオチドを有する、01-0-U-97RaBitおよび29-0-U-23RaBitとスティッチングすることにより作製した。形質転換後、正確な単離物の同一性を、一方を形質転換したDNACPK650の外部とし、他方をマーカーの内部とし例えば、URA3にはKB561およびKB562、natA、kanA、およびhygAにはKB563およびKB564て、約1.1kbのPCR産物をもたらす、オリゴヌクレオチドプライマーの対を用いるコロニーPCRにより検証した。天然のNDT80の配列の取り出しは、無傷のNDT80遺伝子座を有する親株から442bpのPCR産物をもたらすオリゴヌクレオチドAET83およびAET84によるコロニーPCRに由来するPCR産物が存在しないことにより検証した。F-CphI発現プラスミドpAM1800による形質転換後、個別のコロニーを、50bpのscar配列の1つのコピーだけを残す完全な切り出しに応じる492bpのバンドこのバンドは、ゲル上で泳動させて、視覚化し、他の任意のDNAから分離し、次いで、ゲルから抽出し、PCR反応をプライミングするのに用いられる同じオリゴヌクレオチドを用いるDNA配列決定のために送ったをもたらす、JU197およびJU198を用いたコロニーPCRにより、意図される切り出しについて調べた。GAL80遺伝子座においてxMarkerを有する株GAL80遺伝子を欠失しているは、以下の通りに作製した。細胞を形質転換するのに用いられる、スティッチングされたPCR産物は、xMarker12RaBitとしてのを、RYSE0およびRYSE19と称するオリゴヌクレオチドと共に、01-0-U-270RaBitおよび29-0-U-95RaBitとスティッチングすることにより作製した。形質転換後、正確な単離物の同一性を、コロニーPCRにより検証した。オリゴヌクレオチドであるJU436およびRYSE3は、形質転換したDNAがGAL80遺伝子の上流の配列内に組み込まれる5’側接合部周囲の近傍を増幅して、572bpのPCR産物をもたらし代替的に、JU210およびRYSE3を用いて、182bpのPCR産物をもたらし、JU221およびRYSE4は、マーカーの、GAL80の下流の配列bpとの3’側接合部の増幅により386bpの産物をもたらした代替的に、JU439およびRYSE4を用いて、531bpのPCR産物をもたらした。陰性対照は、無傷のGAL80遺伝子座に応じて290bpの産物をもたらし、所望の遺伝子座に応じては何らの産物ももたらさない、プライマーJU212およびJU210を用いるコロニーPCRであった。F-CphI発現プラスミドpAM1800またはpAM1799による形質転換後、個別のコロニーを、50bpのscar配列の1つのコピーだけを残す完全な切り出しに応じる277bpのバンドこのバンドは、ゲル上で泳動させて、視覚化し、他の任意のDNAから分離し、次いで、抽出し、PCR反応をプライミングするのに用いられる同じオリゴヌクレオチドを用いて配列決定したをもたらす、JU210およびJU211を用いるコロニーPCRにより、意図される切り出しについて調べた。F-CphIの発現プラスミドによる形質転換後、選択プレートに現れたコロニーのうちの8つを無作為に選択して、切り出しを診断するコロニーPCRに供した。以下のxMarker:x0URA3、x1nat、x3kan、x4nat、およびx6zeoについて、8つのコロニー全てが、予測されるPCR産物をもたらし、DNA配列決定により、完全なscarが検証された。x2hphマーカーは、異常な結果をもたらした。scarの配列決定およびxMarker12RaBitプラスミドの再配列決定により、定方向反復は意図された通りでなく、代わりに、わずか19bpが、隣接配列のスクランブリングを伴ってマーカーに定方向反復して隣接することが明らかとなった。二本鎖切断の修復に供された小領域に限れば、切り出しの頻度および忠実度は良好であったが、第1の試験では、8つのコロニー中6つが、マーカーをきれいに切り出し、多様な長さのscarを残し、第2の試験では、8つのコロニー中8つが、マーカーを切り出し、19bpのscarを残した。これにより、定方向反復の長さには17~18bpで十分であり、50bpでは、F-CphIによる切断後における染色体の修復を誘導するのに十分過ぎることが示唆される。複数の状況において、xMarkerの切り出しが高頻度でかつ高精度であることが観察された。最も単純な状況は、各株に単一のxMarkerというものであった。より複雑な状況は、無傷のGAL80対立遺伝子1つとxMarkerにより欠失させた対立遺伝子1つとを有するヘテロ接合性の二倍体株におけるxMarkerの切り出しであり、この場合は、無傷のGAL80遺伝子座が、破壊された対立遺伝子におけるxMarkerの切り出し後においても無傷を維持した。これは、F-CphIの作用後、xMarkerの近傍において切断された染色体末端であれば、染色体の無傷の第2のコピーを、修復の鋳型として用い、これにより、無傷のGAL80遺伝子座を、そこから欠失させた染色体へと回復させる遺伝子変換イベントをもたらしうることが生じた可能性があるために、重要である。この遺伝子変換イベントは認められなかったが、代わりに、細胞は、染色体内一本鎖アニーリング機構により、切断された染色体を優先的に修復したことが明らかである。6.2.4.複数のxMarkerの同時的な切り出しこの実施例は、各xMarkerを用いて固有の遺伝子座への組込みをマーキングする、宿主細胞の染色体DNAからの複数の選択マーカーの同時的な切り出しを媒介するxMarker構築物の有用性を実証するものである。GAL80遺伝子座およびGAL4遺伝子座の両方においてxMarkerを有する株は、以下の通りに作製した。ハイグロマイシン感受性細胞を、xMarkerターゲティング構築物であるGAL80-US_xM4.Hph.FCphI_GAL80-DSで形質転換した。形質転換物は、3mLの液体YPD培地中で5時間にわたり増殖させ、次いで、ハイグロマイシンを添加したYPDへと播種した。形質転換体は、コロニーPCRにより検証した。オリゴヌクレオチドHJ53およびHJ848は、形質転換したDNAがGAL80の上流の配列内に組み込まれた5’側接合部周囲の近傍を増幅して、761bpのPCR産物をもたらし代替的に、HJ53およびHJ253を用いて、1kbのPCR産物をもたらし、H727およびHJ258は、GAL80の下流の配列bpを含めマーカーの3’側接合部の増幅により1033bpの産物をもたらした代替的に、HJ727およびHJ54を用いて、627bpのPCR産物をもたらした。次いで、選択された単離物を、xMarkerターゲティング構築物であるGAL4-US_xM0.Kan.FCphI_GAL4-DSで形質転換した。形質転換物は、3mLの液体YPD培地中で5時間にわたり増殖させ、次いで、G418を添加したYPDへと播種した。形質転換体は、コロニーPCRにより検証した。オリゴヌクレオチドHJ270およびHJ253は、形質転換したDNAがGAL4遺伝子の上流の配列内に組み込まれる5’側接合部周囲の近傍を増幅して、1.1kbのPCR産物をもたらし代替的に、HJ270およびHJ54を用いて、774bpのPCR産物をもたらし、H239およびHJ706は、GAL4遺伝子の下流の配列bpを含めマーカーの3’側接合部の増幅により793bpの産物をもたらした代替的に、HJ239およびHJ241を用いて、1038bpのPCR産物をもたらした。遺伝子型gal80Δ::xHphgal4Δ::xKanを有する単離物を、natAでマーキングしたF-CphI発現プラスミドpAM1864で形質転換した。形質転換物は、3mLの液体YPD培地中で5時間にわたり増殖させ、次いで、ノーセオトリシンを添加したYPDへと播種した。30°Cで3日間にわたるインキュベーション後、4つの形質転換体を新鮮なYPDに画線播種して、pAM1864を喪失させた。xMarkerの切り出しおよびpAM1864の喪失について調べるため、50のコロニー各画線から約12~13のコロニーをYPDプレートに採取し、次いで、24時間後に、YPD、ハイグロマイシン、G418、またはノーセオトリシンを添加したYPDでレプリカプレーティングした。レプリカプレーティングの48時間後に、プレートを精査した。同時的な複数の組込みの頻度は100であった、すなわち、50/50のコロニーが、ハイグロマイシンおよびG418の両方に対する耐性を喪失したことから、全ての試験したコロニーが両方のxMarkerを喪失したことが示される。また、約2010/50のコロニーがノーセオトリシンに対する耐性を喪失したことから、コロニーのうちの20がF-CphIプラスミドを喪失したことも示される。2つのxMarker構築物をゲノムに組み込んだ、2つのさらなる株についても同様の頻度が観察された。F-CphIを発現させた第2のgal80Δ::xHphgal4Δ::xKan株でも、50/50のコロニーが、ハイグロマイシンおよびG418の両方に対する耐性を喪失し、また、10/50のコロニーも、ノーセオトリシンに対する耐性を喪失した。F-CphIを発現させた第3のgal80Δ::xHphgal4Δ::xKan株でも、48/48のコロニーが、ハイグロマイシンおよびG418の両方に対する耐性を喪失し、また、5/50のコロニーも、ノーセオトリシンに対する耐性を喪失した。また、3つの薬物全てに対する耐性を喪失したコロニーも、コロニーPCRで検証した。予測通り、これらの全てが、F-CphIにより両方のxMarkerを切り出した。この実施例により、単一の一倍体株からの2つのマーカーの完全な切り出しが高頻度であることが裏付けられる。さらに、この実施例は染色体の転座またはゲノムの不安定性についての証拠がなかったことも裏付ける。これらの結果により、xMarker構築物が、宿主細胞ゲノムからの標的DNAの高度に効率的で同時的な複数の切り出しを促進することが示される。6.2.5.多様な長さのDRを含むxMarker構築物のゲノム安定性この実施例は、エンドヌクレアーゼ発現の非存在下において酵母ゲノムに組み込んだ場合の、多様な長さの定方向反復DRを含むxMarker構築物の安定性を裏付ける。誘導前に、かつ、非誘導性条件下において著明な切り出しが生じないように、条件付け遺伝子欠失系を厳密に制御することが有利である。ゲノム操作の関連において、高比率の自発的な相同組換えイベントは、ゲノムの不安定性、選択マーカーの望ましくない喪失、および結果として、所望の遺伝子型について選択する能力の喪失をもたらしうる。天然で、内因性で、自発的な相同組換えイベントは、介在DNAを欠失させる定方向反復配列一般に>300bp間におけるまれな組換えによる交差を触媒しうる。公表された報告は、その配列に隣接するDR間における自発的な組換えによる交差ループアウトを介して、配列を酵母宿主細胞ゲノムから切り出しうることを示している。長さ300bp~1.1kbのDRの間でこのようなループアウトが生じる比率は、1,000個中1個の細胞1×10-3~10,000個中1個の細胞1×10-4Alaniら1987年、Genetics、116巻4号:541~5頁長さ1100bpの定方向反復では、10-4;Wachら1994年、Yeast、10巻13号:1793~808頁長さ430bpの定方向反復では、10-3~10-4;Erdenizら1997年、GenomeRes、7巻12号:1174~83頁長さ約300~3000bpの定方向反復では、10-3~10-4の間にあることが報告されている。多様な長さの定方向反復を有するxMarker構築物を組み込んだゲノムの安定性を決定するために、エンドヌクレアーゼ発現の非存在下で、多様な長さのDR間における自発的な組換えによる交差の比率を評価した。NDT80遺伝子座において長さ50、60、80、および198bpの定方向反復を有するxMarkerを組み込んだ株NDT80遺伝子を欠失しているは、以下の通りに作製した。組込みベクターは、以下のURA3xMarkerのバリアントを、プライマーとしてRYSE0オリゴヌクレオチドおよびRYSE19オリゴヌクレオチドを用いて、01-0-U-30RaBitおよび29-0-D-23RaBitとスティッチングすることにより作製した。ura3-株への形質転換後、細胞をura3プレートに播種し、コロニーPCRにより正確な組込みについてコロニーを検証した。オリゴヌクレオチドAET0065-186-63-F-pNDT80およびRYSE3は、形質転換したDNAがNDT80の上流の配列内に組み込まれる、5’側接合部周囲の近傍を増幅して、1024bpのPCR産物をもたらし、AET0072-186-63-R-tNDT80およびRYSE4は、NDT80の下流の配列を含むマーカーの3’側接合部の増幅により1024bpの産物をもたらした。これらの結果により、xMarkerの組込みおよびNDT80の破壊が示される。各xMarkerバリアントについて確認された2つの単離物を、さらなる解析のために選択した。コロニーを、ウラシルを欠くCSMに再画線播種し、次いで、DR間における自発的なURA3マーカーの切り出しを可能とするために、細胞を、液体YPD中で2日間にわたり増殖させ、12~24時間ごとに希釈した結果として、約25回の倍加がもたらされる。この培養培地では、URA3コロニーおよびura3-コロニーのいずれもが良好に増殖するので、遺伝子切り出しについての選択はなされない。加えて、天然のURA3、すなわち、任意の定方向反復が隣接しないURA3を含む細胞も、URA3コード配列のループアウトを伴わずにURA3遺伝子活性を低減するかまたは不活化させる5-FOA上における宿主細胞の生存をもたらす点変異複数可をもたらしうる、自発的な変異の比率を評価するための対照として増殖させた。最後に、培養物を5-FOAを含有する固体培地に播種し、さらに2.5日間にわたり増殖させてから、コロニーをカウントした。コロニーPCRにより、各遺伝子型につき16個の個別のura3-5-FOA耐性コロニーを、URA3遺伝子の自発的なループアウトについて、または代替的に、無傷のURA3遺伝子の存在について確認した。xMarkerとNDT80配列の間の接合部の208bp上流JU-197-168-125-NDT80US-Fおよび234bp下流JU-198~168-125-NDT80DS-Rでアニーリングするプライマーを用いた。予測されるPCR産物のサイズは、URA3がきれいに切り出される場合は462~522bpとなり、URA3遺伝子が完全に無傷の場合は2072bpとなる。表16に示される通り、定方向反復が隣接しないURA3を含む細胞における5-FOA耐性の平均頻度は、約1.7×10-6細胞であり、これは、URA3の不活化をもたらす自発的な変異の内因性比率を示す。長さ50~80bpの定方向反復が隣接するURA3を含む細胞における5-FOA耐性の平均頻度は、約4.5×10-6~1.14×10-5細胞であり、長さ198bpの定方向反復が隣接するURA3を含む細胞における5-FOA耐性の平均頻度は、約4.7×10-5細胞であった。コロニーPCRcPCRの結果により、URA3マーカーのループアウトとは対照的に、ある量の5-FOA耐性のxMarkerコロニーは、URA3の不活化をもたらす自発的な変異の結果として現れることが確認された。特に、DRの長さが50bpおよび80bpである、組み込まれたxMarker構築物を含むコロニーの場合、cPCRによりスクリーニングした12中4つ4/12の5FOA耐性コロニーが、無傷のURA3遺伝子を有したことから、これらのコロニーにおける5-FOA耐性が、URA3のループアウトではなく、URA3における自発的な変異を不活化させることから現れたことが示される。したがって、xMarker株における、DRを介する自発的なループアウトの頻度は、5-FOA耐性の観察される頻度よりなお低いことが予測される。5-FOA耐性を代用物として用いるこの限界について理解してもなお、これらの結果により、長さ約50~200bpのDRと関連する自発的なループアウトの頻度は、300bp~1.1kbのDRについて報告されている自発的なループアウトの比率より1~3桁低い上記で論じたとおり、10-4~10-3に対して10-6~10-5ことが示される。これらの結果は、長さ約200bpのDRにより、自発的なループアウトイベントの数が、長さが少なくとも300bpのDRと比較して1~2log低減されることを裏付ける。特に、長さを198とするDRの自発的なループアウトイベントの頻度は、定方向反復のない場合の頻度である約4.7×10-5細胞と比較して、1.7×10-6細胞であった。DRの長さがより短い場合の結果は、なおより劇的である。上に記載した通り、結果は、長さを50~80bpの範囲とするDRにより、自発的なループアウトイベントの数が、長さを少なくとも300bpとするDRと比較して2~3log低減される10-4~10-3に対して10-6~10-5ことを裏付ける。さらに、これらの結果により、DRの長さが200を下回って短くなるにつれて、自発的なURA3ループアウトの比率は、URA3の自発的な変異の比率に近づくことが示される。DRの長さを50、60、および80とする結果として、ループアウトに起因するURA3の喪失は、自発的な不活化変異と比較して、約2.7~7倍の増大に過ぎなかった。これらの結果は、DRの長さを約200bp以下とすることにより、DRの長さを300bp以上とする場合と比較して、ゲノムの安定性の点で実質的な利点がもたらされることを示唆する。標的DNAの切り出しは、厳密に調節され、ホーミングエンドヌクレアーゼによる誘導前の著明な切り出しはない。したがって、本明細書に記載されるxMarkerによる方法および組成物は、ゲノムの安定性の増大および株操作の間における所望の遺伝子型のより効率的な選択を結果としてもたらしうる非誘導性条件下において、標的DNA、例えば、選択マーカーの貯留を改善する。これらの結果は、本明細書で記載される組成物および方法が、選択マーカーの特化したバリアントを創製して切り出すために、高頻度、高効率、高忠実度、および高安定性を有して作用することを裏付ける。I-SceIエンドヌクレアーゼおよびF-CphIエンドヌクレアーゼは、この手法のために良好に作用するが、S.cerevisiae細胞では、F-CphIが例外的な切り出し頻度および切り出し忠実度を示すことは予測外である。切り出しイベント自体は、二倍体細胞においてもなおゲノムの不安定性をもたらさず、複数のxMarkerを有する細胞においてもなおゲノムの不安定性をもたらさない。この手法の主要な利点には、多くのxMarkerを一度に同時的に切り出す能力、および各scarが固有となるよう、同じ株におけるxMarkerの反復使用およびリサイクリングもなおデザインしうるように、多種多様な固有のscar配列を選択する能力が挙げられる。これは、ゲノム全体にわたり散在して、リコンビナーゼの再導入の際に再度の切断を待つ、部位特異的なリコンビナーゼの結合および切断部位の複数のコピーであって、染色体セグメントの転座および潜在的に切り出しをもたらす複数のコピーを必然的に残す、Flp/FRT系またはCre/lox系を凌駕する利点である。別の利点は、切り出し頻度が50より高いことがしばしばであり、このため、切り出しに成功した産物の単離物の増殖だけを可能とするのに利用可能な選択法が存在しない場合であっても、所望の産物株を同定するスクリーニング法を用いて、任意の所望の標的DNAを切り出すのにこの手法を用いうるということである。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に表示されたと仮定した場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。理解を明確にするための例示および例として、先行する発明についてある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らせば、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱しない限りにおいて、それに対してある変化および改変を行いうることは、当業者に容易に明らかである。"