"トウモロコシ植物組織を使用して対立遺伝子の接合状態及び/又は存在/不在を決定するための方法であって、単離されたゲノムDNAのサンプルをトウモロコシ植物組織から得る工程、前記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子と接触させる工程、及び前記単離されたゲノムDNA中のbm3突然変異の接合状態を決定する工程を含む方法。前記単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの核酸分子、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる2つの核酸分子と接触させる工程、前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記2つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間で増幅する工程、前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をそれぞれが含む前記2つの核酸分子にハイブリダイズする前記単離されたゲノムDNAのヌクレオチド配列間で増幅する工程、第一のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子、及び第二のレポーターで標識されている、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子を、前記増幅反応に含める工程、及び前記第一及び第二のレポーターのレベルを検出する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記第一のレポーター及び前記第二のレポーターが、区別可能な励起/発光スペクトルを有する蛍光色素である、請求項2に記載の方法。前記第一のレポーターがFAMであり、及び前記第二のレポーターがVICである、請求項3に記載の方法。配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも1つの核酸分子が、10ヌクレオチドと35ヌクレオチドの間の長さである、請求項1に記載の方法。配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも1つの核酸分子が、15ヌクレオチドと30ヌクレオチドの間の長さである、請求項5に記載の方法。配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも1つの核酸分子の1つが、配列番号:10の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95同一である、請求項5に記載の方法。配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む前記少なくとも1つの核酸分子が、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、蛍光色素で標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子が、区別可能な励起/発光スペクトルを有する第二の蛍光色素で標識される、請求項1に記載の方法。高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子が、FAMで標識され、及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの核酸分子が、VICで標識される、請求項9に記載の方法。前記ヌクレオチド配列の増幅が、PCR反応での増幅を含む、請求項1に記載の方法。前記ヌクレオチド配列の増幅が、非PCRベースの反応での増幅を含む、請求項1に記載の方法。ジーメイズZeamaysにおけるCOMT突然変異を同定するための方法であって、配列番号:6を含む核酸分子にジーメイズ核酸を暴露する工程を含む方法。植物生殖質に低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法であって、COMT遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と交配させる工程、前記交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムDNAのサンプルを得る工程、前記単離された核酸を、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有する少なくとも1つの核酸分子と、接触させる工程、及びCOMT遺伝子における突然変異を含む交配物から、サンプルを得た植物を繁殖させることにより、高ストリンジェンシーで少なくとも1つの核酸分子を結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が前記遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程を含む方法。請求項1に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。請求項2に記載の方法によって決定される接合状態を有するトウモロコシ植物。請求項14に記載の方法によって生産される低リグニン含有率を呈示する遺伝子組換え植物。請求項14に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。請求項14に記載の方法によって決定される特異的対立遺伝子検出試験でのトウモロコシ植物。I.幾つかの実施形態の概観BMR含有植物系統についての育種プロセスを大いに向上させることができるbm3トウモロコシ品種のハイスループットPCRベース分子特性決定方法を本明細書に開示する。特定の実施形態において、該方法は、単離されたゲノムDNAのサンプルをトウモロコシ植物から得る工程、該単離されたゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子と接触させる工程、及び該トウモロコシ植物からの単離されたゲノムDNA中のbm3突然変異の接合状態を決定する工程を含む。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子及び高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、10ヌクレオチドと35ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、配列番号:10の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95同一である。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、配列番号:11の10と35の間の連続したヌクレオチドと少なくとも95同一である。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができない。一定の実施形態において、配列番号:10又は配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子は、配列番号:1~9からなる群より選択される。トウモロコシ植物におけるBMR突然変異を同定するための方法も開示する。一部の実施形態において、該方法は、トウモロコシ植物からのゲノムDNAを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができる核酸分子に暴露する工程を含むことができる。特定の実施形態において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:10にハイブリダイズすることができる核酸分子は、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6からなる群より選択することができる。植物生殖質に例えば、bm3対立遺伝子の遺伝子移入によって低リグニン含有率の形質を確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための方法をさらに開示する。一部の実施形態において、該方法は、COMT遺伝子における突然変異を有する植物を別の植物と戻し交配する工程、該交配によって生産された後代植物から単離されたゲノムDNAのサンプルを得る工程、単離されたゲノムDNAの該サンプルを、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子と接触させる工程、及び単離されたゲノムDNAのサンプルを得た植物を繁殖させることにより、COMT遺伝子における突然変異を含む交配種から、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:11にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子に高ストリンジェンシーで結合する後代を選択する工程、それによって、遺伝子組換え植物であって、低リグニン含有率の形質が該遺伝子組換え植物の生殖質に遺伝子移入されたものである遺伝子組換え植物を生産する工程を含むことができる。本開示のハイスループットPCRベース分子法に従って決定された遺伝子型及び/又は接合状態を有するトウモロコシ植物、並びに低リグニン含有率の形質をトウモロコシ植物生殖質に確実に及び予想どおりに遺伝子移入するための本開示の方法に従って生産される、低リグニン含有率の形質を呈示する遺伝子組換えトウモロコシ植物も開示する。II.略語BMR褐色中肋MGBNFQMinorGroveBindingNonFlourescenceQuencher商標IFAM6-カルボキシ-フルオレセインPCRポリメラーゼ連鎖反応RFU相対蛍光単位VIC6-カルボキシ-ローダミンIII.用語後に続く説明及び表において多数の用語を用いる。そのような用語が与えられている範囲を含む、本明細書及び特許請求の範囲の明確な及び一致した理解をもたらすために、以下の定義を提供する:戻し交配:戻し交配は、育種家が、親の1つに雑種後代、例えばF1雑種の親遺伝子型の1つを有する第一世代雑種F1を戻すように繰り返し交配するプロセスである。BMRトウモロコシ:本明細書において用いる場合、用語BMRトウモロコシは、褐色中肋突然変異、例えばbm1、bm2、bm3及びbm4として特性決定される突然変異を有するトウモロコシ品種を指す。BMRトウモロコシ品種は、概して、葉の中肋の赤褐色着色を呈示する。BMRトウモロコシは、概して、より低いリグニン含有率、より高い繊維可消化率及びより高い乾物摂取量も特徴とする。BMRトウモロコシ品種の非限定的な例としては、F2F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F566、F2F610、F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F2F721、F2F700、及びF2F797が挙げられる。ハイブリダイゼーション:オリゴヌクレオチド及びそれらの類似体は、相補塩基間で、ワトソンクリックWatson-Crick、フーグスティーンHoogsteen又は逆フーグスティーン水素結合を含む、水素結合によってハイブリダイズする。一般に、核酸分子は、ピリミジンシトシンC、ウラシルU、及びチミンT又はプリンアデニンA及びグアニンGのいずれかである窒素含有塩基からなる。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は、塩基対合と呼ばれる。より具体的には、Aは、T又はUに水素結合することとなり、Gは、Cに結合することとなる。相補的は、2つの異なる核酸配列間で又は同じ核酸配列の2つの異なる領域間で発生する塩基対合を指す。特異的にハイブリダイズ可能な及び特異的に相補的なは、安定した特異的な結合がオリゴヌクレオチドとDNA又はRNAターゲットとの間で発生するような十分な相補性度を示す用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるためにそのターゲット配列に100相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドのターゲットDNA又はRNA分子への結合が、該ターゲットDNA又はRNAの正常な機能に干渉するとき、及び特異的結合が望まれる条件下、例えばインビボアッセイ又は系の場合に生理条件下で非ターゲット配列への該オリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するために十分な相補性度が存在するとき、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は、特異的ハイブリダイゼーションと呼ばれる。特定のストリンジェンシー度を生じさせる結果となるハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質、並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに依存して、様々である。一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度とりわけ、Na及び/又はMg2濃度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの一因となるが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定のストリンジェンシー度を達成するために必要とされるハイブリダイゼーション条件についての計算は、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManual2ndedvol13ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarborNewYork1989chs9and11において論じられている。本開示のために、ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション分子とターゲット配列の間に25未満のミスマッチがある場合にハイブリダイゼーションが発生する条件を包含する。ストリンジェント条件は、特定のストリンジェンシーレベルにさらに定義することができる。従って、本明細書において用いる場合、中程度moderateストリンジェンシー条件は、25より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件である。中mediumストリンジェンシーの条件は、15より多くのミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、及び高ストリンジェンシーの条件は、10より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。超高ストリンジェンシーの条件は、6より多くのミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。特定の実施形態において、ストリンジェント条件は、製造業者の説示に従って希釈されたTaqMan登録商標遺伝子型判定用マスターミックスカリフォルニア州フォスターシティーのAppliedBiosystems、カタログ4371355中、60°Cでのハイブリダイゼーションを含み得る。単離された:単離された生体成分例えば、核酸又はタンパク質は、該成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生体成分、すなわち他の染色体及び染色体外DNA及びRNA並びにタンパク質から実質的に分離された、該他の生体成分とは別に生産された、又は該他の生体成分から精製された。単離された核酸分子及びタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学合成された核酸分子、タンパク質及びペプチドも包含する。オリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドは、短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断によって、又は個々のヌクレオチド前駆体を合成することによって形成され得る。自動合成装置は、数百塩基対までの長さのオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。オリゴヌクレオチドは相補ヌクレオチド配列に結合することができるので、DNA又はRNAを検出するためのプローブとしてそれらを使用することができる。DNAで構成されているオリゴヌクレオチドオリゴデオキシリボヌクレオチドをPCR、小さいDNA配列の増幅のための技術において使用することができる。PCRにおいて、該オリゴヌクレオチドは、概して、プライマーと呼ばれ、これは、DNAポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長すること及び相補鎖を複製することを可能にするものである。接合状態:本明細書において用いる場合、用語接合状態は、生物における遺伝形質のための遺伝子の対立遺伝子の類似性又はそれらの欠失を指す。両方の対立遺伝子が同じである場合、その生物は、その形質についてホモ接合性である。両方の対立遺伝子が異なる場合、その生物は、その形質についてヘテロ接合性である。一方の対立遺伝子が欠けている場合、それは、ヘミ接合性である。両方の対立遺伝子が欠けている場合、それは、ヌル接合性である。特に別の説明がない限り、本明細書において用いるすべての専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の通常の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、LewinBGenesVOxfordUniversityPress1994KendrewetalTheEncyclopediaofMolecularBiologyBlackwellScienceLtd1994及びMeyersRAMolecularBiologyandBiotechnologyAComprehensiveDeskReferenceVCHPublishersInc1995において見つけることができる。IV.bmrトウモロコシの遺伝子型及び接合状態決定のためのハイスループット方法A.概観BMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子特異的エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイをここで説明する。特定の実施例は、同じアッセイにおいてbm3欠失に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドのバイプレックスとを利用する。これらの実施例では、bm3突然変異体及び野生型COMT対立遺伝子の存在/不在によって、接合状態を決定することができる。該アッセイをさらなる実行のためにハイスループットゲノム分析グループに付託した。該アッセイは、BMR遺伝子移入プロジェクトの育種プロセスを大きく向上させることができる。B.褐色中肋トウモロコシ褐色中肋BMRトウモロコシ植物は、V4からV6期における葉の中肋の褐色着色及び房を付けた後の髄の淡褐色呈色を特徴とする。褐色中肋ハイブリッドトウモロコシは、トウモロコシ植物組織中のリグニン含有率を低下させる遺伝子突然変異、例えば、bm2突然変異又はbm3突然変異を有する。褐色中肋3遺伝子は、染色体4の短いアーム上に位置し、bm3対立遺伝子は、劣性である。褐色中肋2遺伝子は、染色体1の長いアーム上に位置し、bm2対立遺伝子も劣性である。リグニンポリマーは、トウモロコシ植物中の繊維の可消化性を制限する。褐色中肋トウモロコシ中の低減されたリグニンは、結果として、通常のトウモロコシより可消化性が高い繊維を有するサイレージを生じさせる。動物飼養試験により、通常のサイレージと比較して、BMRトウモロコシサイレージでの約10パーセント多い摂取量及び増加された産乳量が証明された。bm3突然変異を同定する方法を提供する。本開示の方法は、例えば、特定のトウモロコシ植物、又は特定のトウモロコシ品種をBMRトウモロコシとして同定するのに有用であり得る。開示する方法は、BMRトウモロコシと他のトウモロコシ品種を交配させることによる、又は第一のBMR突然変異を有するBMRトウモロコシと第二のBMR突然変異を有するBMRトウモロコシとを交配させること例えば、bm1トウモロコシ品種とbm3トウモロコシ品種を交配させることによる、トウモロコシ生殖質へのBMR形質の信頼できる及び予測できる遺伝子移入にも有用であり得る。多くのBMR突然変異が当業者に公知であり、一部のBMR突然変異は特性決定例えば、マッピング及びシークエンシングされている。本開示の方法は、BMR突然変異を同定するために、BMRトウモロコシ植物又は品種の遺伝子型及び/又は接合状態を決定するために、並びにトウモロコシ生殖質への任意のBMR突然変異の遺伝子移入に、用いることができる。C.エンドポイントPCR検出アッセイBMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの接合状態分析に一般に有用な遺伝子特異的エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイをここで説明する。特定の実施形態では、遺伝子特異的エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイを用いて、トウモロコシの接合状態をbm3突然変異について分析することができる。遺伝子特異的エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイにおいて使用するためのプライマー及びプローブを、対象の遺伝子における公知突然変異に基づいて、設計することができる。例えば、bm3特異的アッセイ用のプライマー及びプローブを、コーヒー酸O-メチルトランスフェラーゼCOMT遺伝子の3’末端での978bp欠失に基づいて、設計することができる。突然変異例えば、bm3に特異的なオリゴヌクレオチド及び破壊されていない野生型遺伝子例えば、COMTに特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて使用するバイプレックス反応において、該特異的オリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAサンプル中に存在する該突然変異遺伝子及び/又は該野生型遺伝子のいずれか又は両方からの配列を選択的に増幅する。一部の実施形態において、bm3特異的アッセイは、長さが71bpであるフラグメントであって、978bpのヌクレオチド配列が野生型COMT遺伝子から欠失されたジャンクション部位に固有であるものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ例えば、BM3_Probe配列番号:6は、2つのPCRプライマー例えば、BM3_F配列番号:4及びBM3_R配列番号:5の間のゲノムDNAサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。一部の実施形態において、野生型COMT遺伝子特異的アッセイは、長さが65bpであるCOMT遺伝子のフラグメントであって、COMT遺伝子座の非bm3配列を増幅することができないようにbm3突然変異体では欠失されているエキソン2内に位置するものであるフラグメントを増幅する。一定の実施形態において、ターゲット特異的オリゴヌクレオチドプローブ例えば、COMT_Probe配列番号:9は、2つのPCRプライマー例えば、COMT_F配列番号:7及びCOMT_R配列番号:8の間のゲノムDNAサンプル中のターゲット配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。ターゲット特異的オリゴヌクレオチドを、例えば蛍光色素例えば、FAM、VIC、及びMGBNFQで、標識することができ、それによってターゲット特異的蛍光シグナルの迅速な定量を可能にすることができる。所定数のサイクルの後、例えば、反応が初期指数関数的増幅期にあるときに、PCR生成物を測定することができる。陰性対照サンプルは、例えばbm3突然変異を有さない、任意のトウモロコシ品種からのゲノムDNAを含むことができる。陽性対照サンプルは、BMR突然変異、例えばCOMT遺伝子におけるbm3欠失突然変異を有するトウモロコシ品種からのゲノムDNAを含むことができる。対照ヘミ接合性サンプルは、bm3突然変異についてヘミ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのゲノムDNAを含むことができ、又はヘミ接合性サンプルは、bm3についてホモ接合性であると前もって判定されたトウモロコシ品種からのDNAと同じ割合の陰性対照DNAを含むことができる。当業者に公知の方法によって、DNAをトウモロコシ植物組織から単離する例えば、抽出する、及び精製することができる。DNA単離用の市販のキット、例えばQiagen,Inc.からのものを利用することができる。一部の実施形態では、特定の植物からの葉ディスクを打ち抜き、コレクションチューブに移す。各サンプリング後にパンチャーを70アルコールで浄化し、水ですすぎ、乾燥させることができる。DNA抽出用緩衝液を、製造業者の推奨に従って調製することができる。その後、キットを製造業者の説示に従って使用して、DNAを単離することができる。最後に、その単離されたDNAの濃度を、例えば、Quant-iT商標PicoGreen登録商標定量キットカリフォルニア州カールズバッドのInvitrogen及び分光光度計を使用して、又は任意の他の適する技術によって、決定することができる。プライマー、プローブ及びゲノムDNAサンプルを調製すると、又は別様に利用可能にすると、PCR反応を行って該ゲノムDNAサンプル中の対象の核酸配列例えば、BMR突然変異に特有の配列を同定することができる。特定の実施形態では、ゲノムDNAサンプルを除いてすべての反応成分を含有する個々のPCR反応混合物を調製する。bm3突然変異体及び野生型COMTトウモロコシのためのプライマー及び遺伝子特異的プローブを含むバイプレックス反応のための反応混合物は、酵素、反応用緩衝液、bm3突然変異のためのフォワード及びリバースプライマー、野生型COMT遺伝子のためのフォワード及びリバースプライマー、bm3突然変異のための遺伝子特異的プローブ、COMT遺伝子のための遺伝子特異的プローブ、並びに水を含み得る。一部のPCRアッセイ系例えば、TaqMan登録商標PCRアッセイにおいて、酵素及び緩衝液は、単一のキット構成要素例えば、TaqMan登録商標遺伝子型判定用マスターミックス;カリフォルニア州フォスターシティーのAppliedBiosystems、カタログ4371355中に存在することがある。反応混合物を別様に調製すると、ゲノムDNAサンプルを添加し、反応を開始させることができる。サンプル中のゲノムDNAの量を正規化する必要はない。しかし、当業者は、比較的等濃度のゲノムDNAサンプルを使用することにより、最良の結果を獲得することができる。一部の実施形態では、適切な対照を用いてPCRアッセイ例えば、TaqMan登録商標PCRアッセイを構成することができる。例えば、1試薬を有するがDNAサンプルを有さない陰性対照、2bm3トウモロコシゲノムDNAを含むホモ接合性陽性対照、3及び上で説明したようなヘミ接合性陽性対照を含む対照ウエルを伴うマルチウエルプレートにおいて反応を行うことができる。その後、適するサイクル条件下でPCRによってDNAを増幅する。例えば、GenAmp登録商標PCRSystem9700を使用する一部の実施形態では、95°Cで15分間の単一の初期変性サイクルがあり、それに30サイクルの変性92°Cで15秒間そしてアニーリング/伸長60°Cで60秒間というサイクルが続き得る。PCRサイクル条件を現場の人間の自由裁量によって変えて、匹敵する結果を得ることができることは、当業者には理解される。D.遺伝子型及び/又は接合状態の決定PCRアッセイ例えば、エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイを、BMRトウモロコシ又は推定BMRトウモロコシの遺伝子型及び/又は接合状態分析に使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブをレポーター例えば、蛍光部分で標識することができる。蛍光検出を用いるアッセイについては、プローブの検出に適している励起及び発光波長設定を用いて分光蛍光光度計例えば、TecanGENios商標;スイス、メンネドルフでPCR反応生成物を分析することができる。例えば、蛍光色素、FAMを、485nmの励起波長及び535nmの発光波長で測定することができる。あるいは、蛍光色素、VICを、525nmの励起波長及び560nmの発光波長で測定することができる。PCR反応及びプローブ検出の完了後、例えば任意の適するコンピュータグラフィックソフトウェアを使用して、表及び分布グラフを生成することができる。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性DNAで得られた結果は、陰性及び陽性対照として使うことができる。ある分離集団において、データ点の3つのクラスタを得、それによって、それらの分離されたクラスタの1つに属する可能性が高いというサンプル結果の視覚的決定を可能にすることができる。あるいは、データ解析コンピュータソフトウェアを使用して、サンプル結果がそれぞれの分離されたクラスタに属する尤度を計算することができ、最も尤度の高いクラスタがそのサンプルの名称になる。視覚的決定を行うとき、例えばデータ点の3つのクラスタが明瞭に見えるとき、各クラスタの境界は任意であり得る。適する分析パッケージ、例えばKLIMSKBioscience研究室情報管理システムを使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析することもできる。突然変異体対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナルの相対蛍光単位RFUを一方の軸にプロットし、野生型対立遺伝子についての特異的プローブによって生成された蛍光シグナルのRFUを他方の軸にプロットして、グラフを生成することができる。その後、データのグラフィック表示でのクラスタ分離に基づいて、接合状態決定を行うことができる。突然変異体ゲノムDNA例えば、BMR突然変異を含有しないサンプルは、結果として、野生型PCR生成物の蛍光読取値しかもたらすことができない。ヘミ接合性又はホモ接合性突然変異体ゲノムDNAを含有するサンプルは、結果として、陰性バックグラウンド対照のものより高い突然変異体特異的プローブについてのRFU読取値をもたらすことができる。サンプルが妥当な結果を生じさせない場合、そのサンプル中のゲノムDNAは、妥当な質及び/又は量のものでないことがあり、新たなDNA調製及び/又は新たなPCR反応を行うべきである。好ましくは、DNAサンプルを含有しない陰性対照サンプルは、遺伝子特異的プローブの非常に低い検出を示す。公知ホモ接合性対照が、該対照中の突然変異体DNA又は野生型DNAの高い検出のみを示すこと、及び公知ヘミ接合性対照が、突然変異体DNAと野生型DNAの両方の高い検出を示すことも好ましい。サンプルのスクリーニングの前に、すべての適切な対照を用いてPCR法並びに遺伝子型及び/又は接合状態決定の試験ランを行うことができる。該方法のさらなる最適化は、用い方例えば、ゲノムDNA調製方法、TaqDNAポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、実験装置などによって差があることがある成分には望ましいものであり得る。許容可能なプローブ検出レベル例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブについての許容可能なRFUで、公知ゲノムDNAテンプレートにおいて突然変異体配列及び/又は野生型配列の両方を増幅する、PCR及び熱サイクリング条件を確立することができる。E.植物生殖質への低リグニン含有率の形質の遺伝子移入有性生殖を含む従来の植物育種によって、リグニン含有率が低いトウモロコシ植物例えば、BMRトウモロコシを生産するための方法をここで説明する。方法は、BMR突然変異の少なくとも1つのコピー例えば、bm3、bm3-1、bm3-2をそのゲノム内に含む第一の親トウモロコシ植物を第二の親トウモロコシ植物に交配させて、F1後代を生産することを含み得る。該第一の植物は、例えば、BMRトウモロコシ品種F2F297、F2F383、F2F488、F2F449、F2F566、F2F610、F2F622、F2F665、F2F633、F2F682、F2F721、F2F700及びF2F797を含む、任意のBMRトウモロコシ植物であり得る。該第二の親トウモロコシ植物は、該第一のトウモロコシ植物と交配させたときに生育可能な後代トウモロコシ植物すなわち、種子を生産することができる任意のトウモロコシ植物であり得る。該第一及び第二の親トウモロコシ植物は、同じトウモロコシ種例えば、ジーメイズZeamaysトウモロコシのものであってもよい。該方法は、F1後代を自家受粉させてF2後代を生産することをさらに含むことができる。方法は、F1又はF2後代植物を第一又は第二いずれかの親トウモロコシ植物と同じ系統又は遺伝子型の植物へと戻し交配することから1又はそれ以上の世代をさらに含むことができる。あるいは、第一の交配のF1後代、又は任意の後続の交配種を、第一又は第二いずれかの植物とは異なる系統又は遺伝子型のものである第三のトウモロコシ植物に交配させることができる。一部の実施形態では、後代植物を本開示の遺伝子型及び/又は接合状態決定に付す。後代植物の遺伝子型を判定すると、及び/又はそれらの接合状態を決定すると、当業者は、所望の遺伝子構成を有する後代植物を選択することができる。そのような選択された後代植物を、さらなる交配、自家受粉、又は栽培に使用することができる。本開示の方法によって導かれるBMR突然変異の遺伝子移入方法は、所望の遺伝子構成を有さない植物の栽培及び/又は繁殖を低減又は排除し、それによって、予想されるメンデル遺伝様式により望ましい信頼性及び予測性をもたらす。ある特定の特徴及び/又は実施形態を例証するために以下の実施例を提供する。以下の実施例を、説明する特定の特徴又は実施形態に本開示を限定するものと解釈すべきでない。実施例1:材料及び方法植物及び遺伝物質。ホモ接合性bm3対立遺伝子及びホモ接合性野生型COMT対立遺伝子を含有するトウモロコシ葉サンプルを用意した。全ゲノムDNAの単離及び定量。1サンプルあたり8つの葉ディスクを打ち抜き、Genogrinder登録商標2000を使用して微粉に粉砕した。DNAをQiagenDNeasy商標96ウエルキットカリフォルニア州バレンシアで抽出した。PCRの前に、製造業者の説示を用いてQuant-iT商標PicoGreen登録商標定量キットカリフォルニア州カールズバッドのInvitrogenで定量した。部分COMT遺伝子のクローニング及びシークエンシング。オリゴBM35_F5’-TACTCTACTGGCTGCGGCTAGC-3’;配列番号:1及びBM34_R5’-TAACCTTGATTGTTATTACTCGCACATGG-3’;配列番号:2を用い、ABIGeneAmp登録商標PCRSystem9700カリフォルニア州フォスターシティーのAppliedBiosystemsを使用して、2.5単位のTaKaRaLATaq商標日本、滋賀県のTakaraBioInc.と400nMdNTPと200nMフォワードBM35_F及びリバースプライマーBM34_Rと30ngのゲノムDNAとを含有する反応物で、12のbm3系統及び3つの非bm3サンプル表1を参照のことから部分COMT遺伝子のトウモロコシゲノムDNAフラグメントを増幅した。PCRプログラムを94°Cで2分の変性で開始し、それに30サイクルの94°Cで45秒間、55°Cで45秒間そして72°Cで2分間というサイクルが続いた。PCR生成物を2E-Gel登録商標カリフォルニア州、カールズバッドのInvitrogenで可視化し、その後、0.8E-Gel登録商標CloneWells商標で抽出した。その後、精製されたPCR生成物をpCR4-TOPO登録商標ベクターカリフォルニア州、カールズバッドのInvitrogenに、その製造業者の説示に従って、クローニングした。選択されたコロニーを、一晩、1Xフリーザー培地freezermediaで成長させ、この培地は、2.5LB1LLB培地に10gトリプトン、10gNaCl及び5g酵母エキス、36mMK2HPO4、13mMKH2PO4、1.7mMクエン酸ナトリウム、6.8mMNH42SO4、4.4グリセロール、0.4mMMgSO47H2O、12.5μg/mLクロラムフェニコール使用直前に添加及び50μg/mlカナマイシンを含有した。その後、選択されたコロニーを、T7及びT3プロモーター、並びにCOMT遺伝子内に位置するBM1234R5’-ATCAGCATCAGCCAGGCAGG-3’;配列番号:3でのシークエンシングのために、Cogenics登録商標テキサス州ヒューストンに送った。Sequencher登録商標4.8ソフトウェアを使用して、配列を分析した。bm3系統からのコンセンサス配列を野生型COMTサンプルと比較することにより、bm3突然変異を同定した。TaqMan登録商標PCRアッセイ設計及び検証。bm3系統からのDNAコンセンサス配列に基づいて、プライマーBM3_F;配列番号:4及びBM3_R:配列番号:5、及び突然変異体対立遺伝子を同定するためのCOMT遺伝子の部分配列の3’末端を欠失させたジャンクションに特異的なプローブBM3_Probe;配列番号:6;プライマーCOMT_F及びCOMT_R及び野生型対立遺伝子を同定するための該欠失領域内のプローブCOMT_Probeを設計した。PrimerExpress3.0を、TaqMan登録商標アッセイ設計に使用した。すべてのプライマー、及びFAM又はVICとMinorGroveBindingNonFlourescenceQuencher商標IMGBNFQ色素とを有する二重標識プローブは、AppliedBiosystemsカリフォルニア州フォスターシティーによって合成された。すべてのプライマー及びプローブを1XTris-EDTAに溶解して100μMにした。TaqMan登録商標遺伝子型判定用マスターミックスカリフォルニア州フォスターシティーのAppliedBiosystems、カタログ4371355をすべてのPCR反応に使用した。96ウエルプレートを使用し、iCycler登録商標光学システムカリフォルニア州ハーキュリーズのBioRadを用いて、95°Cで15分の変性で開始し、それに50サイクルの92°Cで15秒間そして60°Cで1分間というサイクルが続く、20μL容量でのリアルタイムPCR反応を表2に従って構成した。各サイクル終了時に蛍光シグナルを記録した。384ウエルプレートを使用する10μL容量でのエンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイを表3に従って構成した。95°Cで15分の変性で開始し、それに30サイクルの92°Cで15秒間そして60°Cで1分間というサイクルが続く増幅のために、ABIGeneAmp登録商標PCRSystem9700カリフォルニア州フォスターシティーのAppliedBiosystemsを使用した。最適な数のサイクルの後、反応が初期指数関数的増幅期にあるとき、分光蛍光光度計TecanGENios商標、スイス、メンネドルフによって推奨計器設定FAMbm3突然変異体:励起-485nm、発光-535nm;VIC野生型COMT:励起-525nm、発光-560nmでPCR生成物を測定した。データ解析。リアルタイムPCRのために、その値がバックグラウンドよりわずかに上である蛍光閾値をiCycler登録商標ソフトウェアによって自動計算した。規定閾値より上の蛍光を発生させるために必要とされるサイクル数により、閾値サイクルCt値を決定した。その後、対立遺伝子識別アッセイを用いて遺伝子型を決定した。エンドポイントTaqMan登録商標PCR及び蛍光読み取りの完了後、レポート色素1のバックグラウンドを超えるシグナルSOB1及びレポート色素2のバックグラウンドを超えるシグナルSOB2を計算した。サンプル数と対数尺度でのSOB1/SOB2の絶対比の間の分布グラフを生成した。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性植物のサンプルを対照として使用した。クラスタ分離に基づいて遺伝子型判定を行った。また、KLIMSKBioscience研究室情報管理システムを使用して、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。FAMのRFU相対蛍光単位をx軸にプロットし及びVICのRFU相対蛍光単位をy軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。実施例2:COMT遺伝子の部分bm3突然変異の配列分析bm3突然変異体についての遺伝子特異的TaqMan登録商標アッセイを設計するために、正確な配列情報を必要とした。そのために、2つのオリゴヌクレオチドを設計して、12のbm3及び3つの非bm3系統からのゲノムDNAからの部分COMT遺伝子図1を増幅した。図2。これらのフラグメントをpCR4-TOPO登録商標ベクターにクローニングし、T7及びT3プロモーター、並びにBM1234R配列番号:3でのシークエンシングのためにCogenics,Inc.に送った。BM1234Rは、COMT遺伝子の中央に位置し、それを使用して完全長配列情報を獲得した。Sequencher登録商標4.8を使用して、9つのbm3系統からの高品質配列を分析及びアラインした。bm3系統からのコンセンサス配列を野生型サンプルと比較した。COMT遺伝子の3’末端において複数の欠失/挿入突然変異が同定された。例えば、3つの突然変異が確認され、それらに下線を引いた。図3。遺伝子特異的アッセイ設計及び検証。本発明者らが試験したすべてのbm3系統は、COMT遺伝子の3’エキソンに大きな欠失突然変異を有する。そこでこの突然変異を遺伝子特異的TaqMan登録商標アッセイ設計のために使用した。図4は、オリゴヌクレオチドの位置を示す略図を含む。野生型COMT遺伝子特異的プライマー及びプローブは、978bp欠失部位内に位置する。bm3特異的プライマー及びプローブは、欠失部位に隣接するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド並びにプローブが欠失領域にわたる、ジャンクションに位置する。12の公知bm3系統及び3つの非bm3系統を使用して、遺伝子特異的TaqMan登録商標アッセイを試験した。bm3系統からのDNAと非bm3系統からのDNAの同量を併せることにより、6つのヘミ接合性サンプルを作製した。リアルタイムPCRを用いて、アッセイの効率を試験した。bm3突然変異体に特異的なオリゴヌクレオチドと対応する野生型配列に特異的なオリゴヌクレオチドを同じアッセイにおいて併用した。FAMを使用してbm3のアンプリコンをモニターし、及びVICを使用して野生型COMTについてのアンプリコンをモニターした。指数関数的増幅期が、bm3遺伝子と野生型COMT遺伝子の両方についてサイクル22から36まで観察された。図5a及び5b。サイクル30において、FAMに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子1と、及びVICに基づく対立遺伝子識別アッセイを用いて対立遺伝子2と、正しい遺伝子型決定を生じさせた。図6。エンドポイントTaqMan登録商標接合状態分析の検証。ホモ接合性、ヘミ接合性及びヌル野生型として分離するbm3集団を含有するDNAサンプルの1つの96ウエルプレートを使用して、エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイを試験及び検証した。エンドポイントTaqMan登録商標PCRの1つの利点は、使用の容易さである。エンドポイントTaqMan登録商標PCRは、より高価なリアルタイムPCR機を必要としない。いずれの常用PCR機も96又は384ウエルプレートに適合し、アッセイを行うには、相対蛍光シグナルを読み取ることができるプレートリーダーで十分である。リアルタイムPCRからの結果に基づいて、30サイクルのPCR反応は、野生型COMT遺伝子からbm3遺伝子を効率的に分離することができる。サイクル30でPCR反応を停止させた。TaqMan登録商標PCR及び蛍光読み取りの完了後、バックグラウンドH2Oを超えるFAMbm3の蛍光シグナルを、バックグラウンド1を超えるシグナルSOB1として、及びバックグラウンド2を超えるVIC野生型COMTSOB2を計算した。対数尺度でのSOB1/SOB2を用いて、分布グラフを生成した。図7。類似した遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合性及びホモ接合性対照は、陰性及び陽性対照となった。ある分離集団において、データ点の3つのクラスタを得、それによってカットオフ点を視覚的に決定することができた。図7における実施例では、データ点の3つのクラスタが明瞭に見えた。野生型についてのデータ点は、1未満であり、ヘミ接合性サンプルについてのものは、1から5の範囲であり、及びホモ接合性のものについてのものは、5より上である。また、KLIMSKBioscience研究室情報管理システムで、プレートリーダーから直接、生蛍光強度データを分析した。FAMのRFU相対蛍光単位をx軸にプロットし及びVICのRFU相対蛍光単位をy軸にプロットしてグラフを生成した。クラスタビューでのクラスタ分離に基づいて接合状態決定を行った。図8。FAMを使用してbm3の増幅をモニターし、VICを使用して野生型COMTの増幅をモニターしたので、FAMの強いシグナルを有し、VICのシグナルを殆ど又は全く有さないサンプルは、ホモ接合性bm3であり、VICの強いシグナルを有し、殆ど又は全くFAMを有さないサンプルは、野生型COMTヌルであり、及びFAMとVICの両方の強いシグナルを有するサンプルは、ヘミ接合性であった。このbm3遺伝子特異的エンドポイントTaqMan登録商標PCRアッセイからの遺伝子型及び接合状態決定は、当分野において収集された表現型データと100一致した。このアッセイは、ハイスループット様式でbm3接合状態ステータスを特性決定する簡単かつ正確な方法を提供する。実施例3:bm3突然変異の遺伝子移入bm3突然変異に関してのトウモロコシ植物の接合状態を上で説明したように決定する。トウモロコシ植物がbm3突然変異についてホモ接合性であることを決定する。植物を、従来の植物育種により、野生型COMT遺伝子についてホモ接合性であることが公知であるトウモロコシ植物、及びbm3突然変異についてホモ接合性のトウモロコシ植物と交配させる。その交配種のF1後代を生産する。その後、該交配種のF1後代を自家受粉させてF2後代を生産する。F2後代のゲノムDNAのサンプルを調製し、F2後代植物の接合状態を上で説明したように決定する。bm3突然変異についてホモ接合性であるF2後代植物を選択する。その後、選択された後代を低リグニン含有率についてアッセイし、望ましく低いリグニンレベルを呈示する後代を交配及び自家受粉によってさらに繁殖させ、得られた後代を栽培する。本発明を本明細書において一定の好ましい実施形態に関して説明したが、本発明がそのとおり限定されないことは当業者にはわかるし、理解される。むしろ、下の特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を逸脱することなく、それらの好ましい実施形態に多くの付加、欠失及び修飾を施すことができる。加えて、1つの実施形態からの特徴を別の実施形態の特徴と組み合わせることができるが、本発明者らが考える本発明の範囲内になお包含される。"