aマウスモノクローナル抗体HH1、bリンカー、ならびにc177Lu、211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、90Y、186Re、188Re、199Au、194Ir、166Ho、159Gd、153Sm、149Pm、142Pr、111Ag、109Pd、77As、67Cu、および47Scからなる群より選択される放射性核種を含む、ヒトCD37に結合する放射免疫コンジュゲート。リンカーがキレート化リンカーである、請求項1記載のCD37結合放射免疫コンジュゲート。放射性核種が177Luである、請求項1または2記載のCD37結合放射免疫コンジュゲート。請求項1~3のいずれか一項記載の放射免疫コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。1つまたは複数の追加の抗体または放射免疫コンジュゲートをさらに含む、請求項4記載の薬学的組成物。1つまたは複数の追加の抗体または放射免疫コンジュゲートがCD20を標的とする、請求項5記載の薬学的組成物。CD37抗原を発現するB細胞悪性細胞を処置するための、請求項4~6のいずれか一項記載の薬学的組成物。非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病を処置するための、請求項7記載の薬学的組成物。B細胞悪性腫瘍を処置するための、請求項1~3のいずれか一項記載の放射免疫コンジュゲートの使用。放射免疫コンジュゲートが、他の治療と組み合わせて、または他の治療に加えて投与される、請求項9記載の使用。前記治療が前処置、化学療法、モノクローナル抗体療法、手術、放射線療法、および/または光力学療法から選択される、請求項10記載の使用。前記治療が、請求項1~3のいずれか一項記載の放射免疫コンジュゲートによる処置の前に、抗CD20モノクローナル抗体および/または抗CD37モノクローナル抗体を用いる前処置を含む、請求項10または11記載の使用。請求項4~8のいずれか一項記載の薬学的組成物の有効量の投与を含む、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病から選択されるB細胞悪性腫瘍を処置するための方法。1つのバイアルがマウスモノクローナル抗体HH1に連結されたキレート化剤を含むコンジュゲートを含有し、第二のバイアルが放射性核種を含有する、2つまたはそれより多くのバイアルを含む、請求項1~3のいずれか一項記載の放射免疫コンジュゲートを産生するためのキット。1つまたはいくつかのバイアルの内容物が、凍結乾燥されているかまたは溶液であるかのいずれかである、請求項14記載のキット。発明の詳細な説明本発明は、放射免疫療法において抗体HH1を用いることに関する。金属放射性核種、リンカー、および抗CD37モノクローナル抗体の組み合わせは、驚いたことに放射標識HH1が、異種移植片/ヌードマウスモデルにおいて、妥当な生体分布および腫瘍の取込みを有することを示している。これは、放射免疫療法に用いるために適していることを示す重要な情報である。放射免疫コンジュゲート本発明は、驚いたことに、放射免疫コンジュゲート177LuHH1が播種性腫瘍細胞に対して有意な細胞障害性を示したこと、および177LuHH1が所定の用量で腫瘍細胞に対して177Luリツキシマブより細胞障害性であったことを示している。177Luリツキシマブは、細胞あたりに結合した放射活性がより強く、かつ結合した放射性核種の保持が類似または良好であったことから、この知見は予想外であった。このことは、放射免疫療法に関して抗CD20抗体が抗CD37抗体よりも良好であるという当技術分野における共通の知識とは反対を教示する。さらに、本研究は、β放出体の場合、十分な効果を得るためには、播種性細胞では得ることができないクロスファイアが必須であろうHenriksenetal1997という点においてこれまでの考え方とは異なる。観察された効果の理由は明確ではない。様々な用量の非標識HH1およびリツキシマブに関する実験データは、用いた増殖アッセイにおいて非標識抗体によるいかなる効果も示さなかった。可能性がある1つの説明は、用いた細胞株においてCD20は平均してより強く発現されているが、CD20よりCD37の方が、非常に低い抗原密度を有する細胞が少ないことであろう。ある程度のインターナリゼーションがCD37抗原について報告されていることからPressetal2001、保持データはCD37のインターナリゼーションが原因で良好な保持を示唆しなかったが、そうでなければインターナリゼーションは可能性がある説明であろう。このように、本発明は、マウスモノクローナル抗体HH1、リンカー、ならびに211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、90Y、186Re、188Re、199Au、194Ir、166Ho、159Gd、153Sm、149Pm、142Pr、111Ag、109Pd、77As、67Cu、47Sc、および177Luからなる群より選択される放射性核種を含む、ヒトCD37に結合する放射免疫コンジュゲートに関する。本発明の態様において、リンカーは、キレート化リンカーである。本発明の別の態様において、放射性核種は177Luである。なお別の態様において、放射性核種は別のβ放出体またはα放出体である。本発明は、インビトロデータによって、放射標識リツキシマブがCD20抗原に結合する場合よりも有効に放射標識HH1がCD37抗原に結合すること、すなわち必要な血液中の抗体がより少なくても抗原に対する最大結合に達したことを示唆している表2、図2。同様に最大の結合に達するまでに要する時間もより短かった図2。このことは、血中抗体がより低濃度であっても、固形腫瘍があまり存在しない領域において起こりうる状況であっても、正常組織の離れた領域に位置する単一の腫瘍細胞および微小転移巣に関しても、腫瘍細胞がRICを捕捉することができることを意味することから、これらはインビボにおいても同様に重要な特徴であろう。これは、別の抗CD37抗体では、抗原を飽和して都合のよい生体分布を得るためには、HH1より高い抗体濃度が必要であることBernsteinetal1990、同様に抗CD20抗体と比較しても高い抗体濃度が必要であることPressetal1993を示したこれまでのデータとは有意に異なる。加えて、本発明は、それらの抗体が全て同じエピトープに実質的に結合するにもかかわらず、異なる3つの抗CD37抗体のパネルと比較して、HH1がいくつかの異なる抗原結合特性を有することを示している。ブロッキング実験、すなわち非標識抗体によって予め飽和した細胞を用いる実験により、HH1が、生きている細胞上で他の3つの抗CD37抗体より実質的に良好に、放射標識HH1に結合しないようCD37をブロックするであろうことが示された。放射標識抗体を比較する細胞アッセイにおいて、HH1は、他の3つの抗体と比較した場合にはるかに良好な免疫反応率を示した。免疫反応率とは、抗原が無限に過剰量存在する場合に、抗原に結合することができる抗体の割合を意味する。異なる抗体は、標識技法を終えた後の免疫反応性の維持について異なる能力を有することができる。実施例6、実験IV、表5は、HH1の免疫反応性が、3つの市販の抗体の免疫反応性より良好に維持されたことを示している。一方、免疫組織化学分析により、3つの抗体が、パラフィン包埋された固定腫瘍試料の組織切片を染色するが、HH1は染色することができなかったことが示された。抗体抗原相互作用の差は、フローサイトメトリーでは検出できなかった。フローサイトメトリーヒストグラムは、HH1および他の3つの抗CD37抗体に関して類似であった図6。全体的にこれらのデータは、HH1が、いくつかの局面において、他の抗CD37抗体による研究からは予想することができない有意な個々の抗原相互作用を有することを示している。本明細書において記述される強い細胞障害特性を有する新規抗CD37放射免疫コンジュゲートは、マウスモノクローナル抗体HH1、キレート化リンカー、およびβ放出体177Luからなる。二官能性キレート化剤、たとえばpSCNbnDOTAMacrocyclicsTxUSAを抗体と最初に反応させた後、コンジュゲートを形成していないキレート化剤を除去するために精製を行って、次にキレート化剤抗体コンジュゲートを放射性核種と反応させた後、コンジュゲートを形成していない放射性核種を除去するために精製を行うことによって、放射性核種を抗体に付着させてもよい。または、キレート化剤および放射性核種を最初に化合させて、その後で抗体にコンジュゲートさせることができる。たとえばpSCNbnDOTAなどのキレート化リンカーを、177Luに関して記述される様式と類似の様式で、他の金属放射性核種をHH1にコンジュゲートさせるために用いることができる。十分な錯体形成能およびタンパク質またはペプチドに対する直接または間接的コンジュゲーションを可能にする官能基を有する任意のタイプのリンカーを用いることができるであろう。そのようなリンカーの例は、文献に記述されているたとえば、Brechbiel2008Liu2008。いくつかの有用な例は、pSCNbnDOTA、DOTANHSエステルのような二官能性環状キレート化剤;pSCNBnDTPAおよびCHXADTPAのような二官能性直線状キレート化剤である。本発明における放射性核種は、好ましくは二官能性キレート化剤を用いることによって標的分子にコンジュゲートされるであろう。これらは、環状、直線状、または分枝キレート化剤でありうる。骨格窒素に酸性たとえば、カルボキシアルキル基が結合した直線状、環状、または分枝ポリアザアルカン骨格を含むポリアミノポリ酸キレート化剤は特に言及されうる。適したキレート化剤の例には、pイソチオシアナトベンジル14710テトラアザシクロドデカン14710四酢酸pSCNBzDOTAなどのDOTA誘導体およびpイソチオシアナトベンジルジエチレントリアミン五酢酸pSCNBzDTPAなどのDTPA誘導体が挙げられ、前者の誘導体は環状キレート化剤であり、後者は直線状キレート化剤である。錯体形成部分を標的部分にコンジュゲートする前または後に、錯体形成部分のメタレーションを行ってもよい。放射標識技法は一般的に、放射標識が起こる前にキレート化剤を抗体にコンジュゲートすれば用いる時間等に関してより簡便であろう。抗体に付着させたキレート化剤を用いて放射標識コンジュゲートを調製する原理は、たとえばLiu2008においてより広く記述されている。このように、HH1は、放射特性および有効半減期が異なる放射免疫コンジュゲートを調製するために用いることができる。たとえば、マウスモノクローナル抗体HH1、キレート化リンカー、ならびに177Lu、211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、90Y、186Re、188Re、199Au、194Ir、166Ho、159Gd、153Sm、149Pm、142Pr、111Ag、109Pd、77As、67Cu、47Scが挙げられるがこれらに限定されないβまたはα放出放射性核種からなる抗CD37放射免疫コンジュゲートを調製して、薬学的調製物を調製するために用いることができ、かつ治療用途で用いることができる。薬学的組成物HH1に基づく放射免疫治療物質は典型的に、放射免疫コンジュゲートの化学的完全性を実質的な程度まで維持し、かつ患者に注入するために生理学的に許容可能である、緩衝液中に溶解したマウスモノクローナル抗体HH1にキレート化剤によって連結された先の記述に従う放射性核種からなる薬学的組成物として提供されるであろう。このように、本発明の1つの局面は、本発明の放射免疫コンジュゲート、ならびに薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。許容される薬学的担体には、非毒性の緩衝液、増量剤、等張溶液等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。より具体的には、薬学的担体は、生理食塩液09、低張生理食塩液、乳酸リンゲル液、5デキストロース、33デキストロース/03食塩水でありうるが、これらに限定されるわけではない。生理的に許容される担体は、貯蔵および輸送の際に放射性薬剤の完全性を保護する放射線分解安定化剤、たとえばアスコルビン酸を含有することができる。本発明の1つの態様は、本発明の薬学的組成物と1つまたは複数の追加の抗体または放射免疫コンジュゲートとを含む。抗体には、リツキシマブ、エプラツズマブ、L19、F8、F16、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Reditux、およびイブリツモマブが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。放射免疫コンジュゲートには、ZevalinおよびBexxarが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本発明の別の態様において、1つまたは複数の追加の抗体または放射免疫コンジュゲートはCD20を標的とする。抗体には、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Reditux、およびイブリツモマブが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。放射免疫コンジュゲートには、ZevalinおよびBexxarが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本発明のさらなる態様は、CD37抗原を発現するB細胞悪性細胞を処置するための本発明の薬学的組成物に関する。本発明の1つの態様において、薬学的組成物は、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病を処置するためのものである。配列同一性一般的に定義される同一性は、本明細書においてヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでそれぞれ、遺伝子またはタンパク質のあいだの配列同一性として定義される。このように、本発明の文脈において配列同一性は、アミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の測定およびヌクレオチドレベルでの核酸間の同一性の測定である。タンパク質配列同一性は、配列を整列させた場合に各配列における所定の位置でのアミノ酸配列を比較することによって決定されうる。同様に、核酸配列同一性は、配列を整列させた場合に各配列における所定の位置でのヌクレオチド配列を比較することによって決定されうる。2つの核酸配列または2つのアミノ酸の同一性の割合を決定するために、配列を最適な比較目的のために整列させるたとえば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入してもよい。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における1つの位置が、第二の配列における対応する位置で同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性の割合は、その配列によって共有される同一の位置の数の関数であるすなわち、同一性の割合=同一の位置の数/位置の総数たとえば、重なり合う位置×100。1つの態様において、2つの配列は同じ長さである。配列を手動で整列させて、同一の核酸またはアミノ酸の数を計数してもよい。または、同一性の割合を決定するための2つの配列のアラインメントを、数学的アルゴリズムを用いて達成してもよい。そのようなアルゴリズムは、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12によるBLASTヌクレオチド検索を行ってもよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3によるBLASTタンパク質検索を行ってもよい。比較目的のためにギャップのあるアラインメントを得るために、ギャップドBLASTを利用してもよい。または分子間の遠縁の関係を検出するPSIBlastを用いて、繰り返し検索を行ってもよい。NBLAST、XBLAST、およびギャップドBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。httpwwwncbinlmnihgovを参照されたい。または、たとえばEMBLデータベースにおけるBLASTプログラムwwwncbinlmgovcgibinBLASTによって配列を整列させた後に、配列同一性を計算してもよい。全般的に、たとえばスコア行列、およびギャップペナルティに関するデフォルトの設定をアラインメントに用いてもよい。本発明の文脈において、BLASTNおよびPSIBLASTのデフォルト設定は都合がよいであろう。2つの配列間の同一性の割合は、ギャップを加えて、または加えずに、上記の技術と類似の技術を用いて決定されうる。同一性の割合を計算する場合、厳密な一致のみを計数する。本発明の1つの態様は、HH1抗体VH配列SEQIDNO1および/またはVL配列SEQIDNO3と80の配列同一性を共有する配列を含む単離された核酸に関する。本発明の1つの態様は、HH1抗体VH配列SEQIDNO1および/またはVL配列SEQIDNO3を有する配列を含む単離された核酸に関する。本発明の別の態様において、単離された核酸は、HH1抗体VH配列SEQIDNO1および/またはVL配列SEQIDNO3と、90同一性、91同一性、92同一性、93同一性、94同一性、95同一性、96同一性、97同一性、98同一性、または99同一性などの少なくとも90の配列同一性を共有する配列を含む。本発明の別の態様は、HH1抗体VH配列SEQIDNO2および/またはVL配列SEQIDNO4と80の配列同一性を共有するポリペプチド配列を含む抗体に関する。本発明の別の態様は、HH1抗体VH配列SEQIDNO2および/またはVL配列SEQIDNO4を有するポリペプチド配列を含む抗体に関する。本発明の別の態様において、抗体は、HH1抗体VH配列SEQIDNO2および/またはVL配列SEQIDNO4と、90同一性、91同一性、92同一性、93同一性、94同一性、95同一性、96同一性、97同一性、98同一性、または99同一性などの少なくとも90の配列同一性を共有する配列を含む。遺伝的バリエーション遺伝的バリエーションは、遺伝子におけるヌクレオチドの塩基の順序のバリエーションによって引き起こされる。このバリエーションは、遺伝子において、およびその後そのような遺伝子がコードするタンパク質において変異を引き起こす。これらの変異は、センス変異もしくは置換またはミスセンス変異もしくは置換のいずれかでありうる。本発明の1つの態様は、20個などの、10個などの、5個などの、4個などの、3個などの、2個などの、1個などの少なくとも50個のセンス変異を含む、HH1モノクローナル抗体VH鎖SEQIDNO1および/またはVL鎖SEQIDNO3の単離された核酸配列に関する。本発明の別の態様は、1~50個などの、0~20個などの、1~20個などの、0~10個などの、1~10個などの、0~5個などの、1~5個などの、3個などの、1個などの0~50個のセンス変異を含むHH1モノクローナル抗体VH鎖SEQIDNO1および/またはVL鎖SEQIDNO3の単離された核酸配列に関する。ミスセンス変異非同義的変異の1つの型は、1つのヌクレオチドが変化して、それによって異なるアミノ酸をコードするコドンを生じる点突然変異であるアミノ酸を終止コドンに変化させる変異は、ミスセンス変異ではなくてナンセンス変異であると見なされる。ミスセンス変異は、得られたタンパク質を非機能的にすることができる。しかし、必ずしも全てのミスセンス変異が認識可能なタンパク質の変化を生じるわけではない。アミノ酸は、非常に類似の化学的特性を有するアミノ酸に交換されうるが、この場合、タンパク質はなおも通常に機能しうる;これは、中立的、静的、または保存的変異と呼ばれる。または、アミノ酸置換は、タンパク質の二次構造または機能に有意に影響を及ぼさないタンパク質の領域で起こりうるであろう。アミノ酸が、1つより多くのコドンいわゆる縮重コードによってコードされうる場合、コドンの変異は、翻訳のいかなる変化も生じない可能性があり、これは同義的変異サイレント変異の1つの型であり、ミスセンス変異ではないであろう。本発明の1つの態様は、20個などの、10個などの、5個などの、4個などの、3個などの、2個などの、1個などの少なくとも50個のミスセンス変異を含むHH1モノクローナル抗体VH鎖SEQIDNO1および/またはVL鎖SEQIDNO3のポリペプチド配列を含む抗体に関する。本発明の1つの態様は、1~50個などの、0~20個などの、1~20個などの、0~10個などの、1~10個などの、0~5個などの、1~5個などの、3個などの、1個などの0~50個のミスセンス変異を含むHH1モノクローナル抗体VH鎖SEQIDNO1および/またはVL鎖SEQIDNO3のポリペプチド配列を含む抗体に関する。保存的置換は、全体的な機能性がおそらく大きく影響を受けないように、1つのアミノ酸と、全般的に類似の特性を有する別のアミノ酸との置換である。本発明の別の態様において、ミスセンス変異は保存的な変異または置換である。本発明のさらなる態様は、配列のバリエーションが保存的置換である、HH1の可変重鎖SEQIDNO2および/または可変軽鎖SEQIDNO4配列と80の配列同一性を有する単離された核酸配列またはポリペプチド配列に関する。本発明の別の態様において、配列同一性は、90同一性、91同一性、92同一性、93同一性、94同一性、95同一性、96同一性、97同一性、98同一性、または99同一性などの80の配列同一性であり、配列のバリエーションは保存的置換である。放射標識段階を改善するために、余分のリジンをたとえばHH1のFc部分に導入することが有益でありうる。これは、リジン結合キレート化剤が抗体の抗原結合部位に付着する可能性を低減させて、それによって放射標識の際に免疫反応性を損なうリスクを低減させることができるであろう。リジンをたとえばHH1のFc部分に導入する方法は、当技術分野において、たとえばHemminkietal1995により公知である。本発明の1つの態様は、HH1のFc部分においてリジン8個、リジン6個、リジン5個、リジン4個、リジン3個、リジン2個、リジン1個などのリジン10個によって改変されている本発明の放射免疫コンジュゲートに関する。処置本発明に従う薬学的溶液の治療用途は、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病が挙げられるがこれらに限定されないCD37抗原を発現する悪性細胞に対する処置用でありうる。他の用途は、自己免疫疾患の処置および移植関連効果の処置でありうるであろう。治療は、β粒子放射もしくはα粒子放射、またはこれらの組み合わせに基づくが、これらに限定されるわけではないであろう。治療は、単剤治療または他の治療、好ましくは標準的な処置との併用のいずれかとして施されうるであろう。そのような他の治療は、前処置、手術、化学療法、免疫療法、光力学療法、放射免疫療法、またはこれらの2つもしくはそれより多くの組み合わせでありうるであろう。投与したとは、静脈内注入または静脈内注射を意味する。より具体的には、本発明の放射免疫コンジュゲートは、空気塞栓を防止して、患者への流速を概算することができるドリップチャンバーに接続した末梢カニューレによって静脈内に直接投与することができる。1つの態様において、放射免疫コンジュゲートは、繰り返し投与することができる。本発明の別の態様において、放射免疫コンジュゲートは、異なる放射性核種についても繰り返し投与することができ、たとえばβ放射免疫療法の後にα放射免疫療法を行うことができ、またはその逆を行うことができるであろう。本発明の1つの局面は、B細胞悪性腫瘍を処置するために本発明の放射免疫コンジュゲートを用いることに関する。本発明の1つの態様は、他の治療と組み合わせてまたはそれに加えて投与される本発明の放射免疫コンジュゲートを用いることに関する。本発明の1つの態様において、他の治療は前処置、化学療法、モノクローナル抗体療法、手術、放射線療法、および/または光力学療法から選択される。本発明の別の態様において、他の治療は骨髄移植または幹細胞移植および/または治療である。本発明の別の態様は、本発明の放射免疫コンジュゲートによる処置の前に、抗CD20および/または抗CD37モノクローナル抗体を用いる治療的前処置を含む。本発明の1つの局面は、本発明の薬学的組成物の有効量の投与を含む、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病から選択されるB細胞悪性腫瘍を処置する方法に関する。本発明の1つの態様において、抗体の用量は患者あたり1~1000mg、より好ましくは患者あたり5~50mgであり、177Luの量は1~200MBqkgに等しく、より好ましくは10~100MBqkg体重に等しい。キット本発明の1つの局面は、2つまたはそれより多くのバイアルを含む本発明の放射免疫コンジュゲートを産生するためのキットであって、1つのバイアルがマウスモノクローナル抗体HH1に連結されたキレート化剤を含むコンジュゲートを含有し、第二のバイアルが放射性核種を含有するキットに関する。キットは、いくつかの処置を行う必要があってもよく、たとえば注入前に放射標識および/または精製を行ってもよい。本発明の1つの態様は、1つまたはいくつかのバイアルの内容物が凍結乾燥されているかまたは溶液である、本発明のキットに関する。放射免疫コンジュゲートを生成するために、2つのバイアルの内容物を混合することによって、最終産物が出現するであろう。このように、本発明の別の態様において、放射免疫コンジュゲートは、2つのバイアルの内容物を混合することによって産生される。この産物は使用前に精製する必要がありうる。実施例1-HH1の放射標識ヨウ素化:IODOGENプレコーティングヨウ素化試験管PierceRockfordILを製造元の説明に従って使用する間接的ヨウ素化によって、抗体を125Iで標識した。111Inおよび177Luによる標識:抗体を最初にキレート化剤pSCNBnDTPAまたはpSCNBnDOTAと反応させた。DTPAまたはDOTAキレート化剤を005MHClに溶解した後、抗体に加えて、炭酸塩緩衝液によって5:1の比率で洗浄することによってpHをおよそ8に調節した。pHを再度チェックして、必要であれば調節した。溶液を室温で60分間振とうさせた後、200mMグリシン溶液50μl抗体1mgあたりを加えることによって、反応を終了させた。遊離のキレート化剤を除去するために、コンジュゲートした抗体をPBSPAAによって4~5回洗浄した後、酢酸アンモニウムによる洗浄によってpH5に調節した。次に、111Inまたは177LuPerkinElmerBostonMaUSAをDOTAAb05mgに加えて、42°Cで1時間振とうさせた。最後に、産物をゲル濾過カラム、たとえばSephadexG25PD10GEhealthまたは類似のカラム上で溶出させることによって精製した。全体的な標識収率は、17から63にわたっていた。放射免疫コンジュゲートの質を、リンパ腫細胞および改変Lindmo法を用いて測定した。111Inコンジュゲートの高くない比放射能を補うために、108個mlまでの細胞濃度を用いた。125Iコンジュゲートより高い比放射能を有するの場合、4×107個mlまでの細胞濃度を用いることで十分であった。放射免疫コンジュゲートの免疫反応性および比放射能は表1において見ることができる。実施例2-結合パラメータ結合速度定数ka、平衡解離定数Kd、および平均結合部位数Bmaxを、一段階曲線適合法Dahleetal2007によって決定した。HH1およびリツキシマブに関する結合パラメータを、異なる3つのリンパ腫細胞株:Raji、Rael、およびDaudi細胞について測定した表2。特異的結合を時間および抗体濃度の関数として測定し、抗原抗体複合体の真の形成速度を記述する微分式の解を、パラメータとして結合速度定数ka、平衡解離定数Kd、および平均結合部位数Bmaxを用いて実験データポイントに適合させた。細胞500万個ml、4つの濃度の125I標識抗体100ngml、1000ngml、5000ngml、および10000ngmlおよび7つのインキュベーション時点5分、10分、20分、30分、1時間、15時間、および2時間を用いた。インキュベーション後、細胞をPBSによって2回洗浄した後、γカウンターにおいて計数した。実施例3-細胞に結合した抗体の保持Raji細胞、Rael細胞およびDaudi細胞を、111InHH1、111Inリツキシマブ、125IHH1、および125Iリツキシマブと共にインキュベートした後に、洗浄の直後および96時間後において細胞に結合した抗体の保持を測定した図1。10仔ウシ胎児血清、1Lグルタミン、および1ペニシリン/ストレプトマイシンを有するRPMI1640培地1ml中で、細胞100万個を1μgml125Iまたは111Inで標識したHH1またはリツキシマブと共に1時間インキュベートし、培地によって2回洗浄し、さらに4日間インキュベートした。洗浄直後図1Aおよび4日間インキュベーション後図1Bに、細胞数を測定ViCellViabilityAnalyzerBeckmanCoulterFullertonCAUSAすることによって、および校正したγ検出器CobraII自動γ検出器、PackardInstrumentCompanyMeridenCTUSAによって放射活性量を測定することによって、細胞への結合活性を決定した。実施例4-177LuHH1または177Luリツキシマブによるインビトロでのリンパ腫細胞の処置実験I:Daudi細胞に対する177LuHH1の結合Daudi細胞浮遊液1ml細胞100万個mlを24本の試験管に播種して、試験管の半数を100μgmlHH1またはリツキシマブによってブロックして、37°Cで30分間インキュベートした。次に、各試験管に177LuHH1または177Luリツキシマブのいずれかを最終濃度0、1、25、5、10、または20μgmlとなるように加えて37°Cでさらにインキュベートした。比放射能は、177LuHH1に関しては916kBqμgであり、177Luリツキシマブに関しては1366kBqμgであった。加えられた放射能の量を、γ検出器CobraII自動γ検出器、PackardInstrumentCompanyによってインキュベーション期間中に測定した。細胞の半分は2時間後に洗浄して細胞に結合した放射能を測定し図2A、細胞の半分は終夜18時間インキュベートした後に洗浄して細胞に結合した放射能を測定した図2B。細胞に結合した放射能は、2時間のインキュベーション後においては、HH1と共にインキュベートした細胞と、リツキシマブと共にインキュベートした細胞の間に差はなかったが、18時間のインキュベーション後においては、リツキシマブと共にインキュベートした細胞では、HH1と共にインキュベートした細胞より2倍高かった図2。表3および4は、放射標識HH1が、リツキシマブより速やかにしかも低い抗体濃度で抗原を飽和することを示している。非特異的結合は、2つの放射免疫コンジュゲートRICに関してほぼ同等であるようであり、これは培地中のRIC濃度が増加すると増加する。特異的に結合した177Luの最大数は、HH1と比較してリツキシマブでは約2倍大きかった。しかし、用量1μgmlでは特異的に結合した放射活性原子の数にほとんど差がなかった。実験II:177LuIgGとの2時間のインキュベーション:細胞増殖データDaudi細胞を実験Iと同様に放射免疫コンジュゲートと共にインキュベートした図2A。177LuHH1または177Luリツキシマブと共に2時間インキュベーションした後のDaudi細胞の増殖を、各試験管からの細胞50000個を12ウェルプレート6枚においてウェル3個に播種することによって測定した。細胞の量を、翌14日間のいくつかの時点で、自動撮像システムCloneSelectImagerGentixLtdHampshireUKを用いて測定した。非標識抗体単独では、細胞の増殖に効果を及ぼさなかった。しかし、ブロックされた細胞を177Lu抗体によって処置したものは明らかに、無処置の対照細胞ほど急速には増殖せず、このことは結合しなかった177Lu抗体または非特異的に結合した177Lu抗体が細胞に効果を及ぼしたことを示している図3。ブロックされていない細胞を177Lu抗体によって処置すると、増殖の遅れが、10μgml177LuHH1によって処置した細胞では44大きくなり図3A、10μgml177Luリツキシマブによって処置した細胞では31大きくなった図3B。20μgmlによる処置では、177LuHH1によって処置した細胞では再増殖が見られなかったことから、2つの抗体のあいだの差は、さらに大きかった。細胞を標識した抗体量は同じであった図2Aことから、この結果は予想外であった。実験III:177LuIgGによる18時間インキュベーション:細胞増殖データ。Daudi細胞を実験Iと同様に放射免疫コンジュゲートと共にインキュベートした図2B。177LuHH1または177Luリツキシマブと共に18時間インキュベートした後のDaudi細胞の増殖を、各試験管からの細胞50000個を12ウェルプレート6枚において3つのウェルに播種することによって測定した。細胞の量を、自動撮像システムCloneSelectImagerGentixLtdHampshireUKを用いて、翌14日間に数回の時点で測定した。非標識抗体単独では、細胞増殖に対して効果を及ぼさなかった。ブロックされた細胞を177Lu抗体によって処置したものに対する細胞増殖阻害は、この実験図4では、培地中での放射免疫コンジュゲートとのインキュベーション時間が16時間増加したために、実験II図3より大きかった。ブロックされていない細胞を177Lu抗体によって処置すると、増殖の遅れが、25μgml177LuHH1によって処置した細胞では107大きくなり図4A、25μgml177Luリツキシマブによって処置した細胞に関して52大きくなった図4B。この結果は、18時間のインキュベーション後では、177Luリツキシマブによって標識した細胞は、177LuHH1によって標識した細胞図2Bに関する細胞に結合した放射能より2倍多かったことから予想外であった。実施例5-HH1の生体分布111In標識HH1の生体分布を、試験開始時32~256mm3の大きさのDaudi異種移植片を有するBALBcヌードnunuマウスにおいて調べた。二官能キレート化剤としてpSCNBzDOTAを用いて、放射性核種と複合体を形成させて、これを抗体に付着させることによって、放射標識を行った実施例1を参照されたい。調製物を、各動物に溶液100μlの尾静脈注射によって投与した。各動物に、放射能120kBqを注射した。1時点あたり動物5匹を用いた。注射後の様々な時点で頸椎脱臼後に剖検を行った。各組織試料の重量を決定して、校正したγ検出器CobraII自動γ検出器、PackardInstrumentCompanyMeridenCTUSAによって111Inを測定した。注入物の試料を、測定技法の基準として用いた。Daudi異種移植片を有するマウスに注射後24時間での111InHH1の取込みおよび正常組織における生体分布を図5に表す。放射標識抗体は、妥当な腫瘍標的化および生体分布を有する。キレート化剤コンジュゲート111InHH1は、インビボで良好な安定性を示す。実施例6-HH1と他の3つの抗CD37抗体との比較実験I:放射標識HH1に対する抗CD37抗体の抗原ブロック能HH1抗原相互作用を、他の抗CD37抗体によってブロックすることができるか否かを調べるために、Daudi細胞を、HH1、ON108、IPO24、または6D263抗体のいずれかとのプレインキュベーションによってブロックした。Daudi細胞200万個mlをHH1、ON108、IPO24、または6D263抗体20μgmlのいずれかと共に15分間インキュベートし、125I標識HH1抗体を加えて1時間インキュベートした。その後、細胞を遠心沈降させて3回洗浄し、上清および細胞沈降物中の放射能をX線/γカウンターを用いて計数した。HH1でブロックされた細胞と比較すると、125I標識HH1の結合率は、ON108、IPO24、または6D263でブロックされた細胞に関してそれぞれ48、44、および51高かった。このように、125IHH1の抗原結合は、HH1によって他の3つの抗体より良好にブロックされ、このことは抗原相互作用に何らかの差があることを示唆している。結論すると、HH1は、他の3つの抗CD37モノクローナル抗体のパネルと比較して有意に異なる抗原結合特性を有する。実験II:パラフィン包埋リンパ腫組織試料に対する抗体の結合HH1および市販の3つのCD37抗体の固定リンパ腫試料に対する結合能を比較するために、リンパ腫患者からの生検をホルマリン中で固定して、パラフィンに包埋し、10μmの切片に切断して、これを対物ガラスに載せた。試料を抗体HH1、IPO24、ON108、および6D263抗体によって標識して、標識の程度を、ウサギ抗マウスポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼ染色を用いて検出した。抗体IPO24およびON108によって、リンパ腫試料の最も強い標識が起こった。6D263抗体による試料の標識はいくぶん弱かった。切片のHH1抗体による標識は有意ではなかった。このように、HH1は結合しなかったが、他の3つの抗CD37抗体は結合したことから、HH1は有意に異なる抗原相互作用を有すると結論することができる。実験III:HH1、IPO24、ON108、および6D263抗体のフローサイトメトリーHH1によって検出された抗原発現と、異なるCD37抗体によって検出された抗原発現との差を調べるために、Daudi細胞を、5仔ウシ胎児血清を有するRPMI1640培地によって2回洗浄して、氷中で10FCSを有する培地02ml中で10μgmlの一次抗体HH1、IPO24、ON108、および6D363によって05時間標識した。次に細胞を、025FCSを有するPBSによって2回洗浄して、FITC標識ポリクローナルウサギ抗マウスIgGFab21:20希釈によって氷中で05時間標識した図6。FITC標識からの蛍光を、フローサイトメーターにおいて488nmレーザーによって励起することによって検出した。死細胞およびダブレットを、前方散乱、側方散乱、およびヨウ化プロピジウムシグナルを用いてゲート設定することにより除去した。様々なCD37抗体の異なるFITCヒストグラムに有意な変動を認めなかった図6。結論すると、HH1および他の3つの抗CD37抗体IPO24、ON108、および6D363は、類似のフローサイトメトリーヒストグラムを生じる。実験IV:HH1および市販の3つの抗CD37抗体の結合率。HH1の結合率をON108、IPO24、または6D263抗体SantaCruzBiotechnologyと比較するためにDaudi細胞を用いた。大過剰の抗原を発現する、5仔ウシ胎児血清を有するRPMI1640培地02ml中のDaudi細胞6000万個からなる細胞浮遊液を、抗体の非特異的結合を説明するために、HH1、ON108、IPO24、または6D263抗体500μgmlによって15分間ブロックした。他の並行実験はブロックしなかった。続いて、125Iで標識したHH1、ON108、IPO24、または6D263抗体5~10ngmlを加え、細胞を軽く振とうさせながら4°Cで2時間インキュベートした。次に、細胞を遠心沈降させて、1FCSを有するPBSによって2回洗浄した。細胞沈降物をきれいな試験管に移して、γカウンターを用いて計数した。加えた放射能に対する、ブロックされていないバイアルおよびブロックされたバイアルの放射能の差として、結合率を決定した。HH1は、他のCD37抗体と比較してかなり高い結合率を示した表5。結論すると、HH1は、抗体を類似の様式で放射標識した場合に、IPO24、ON108、および6D363と比較して、生きている細胞に対してかなり高い免疫反応性を示した。この結果は、HH1が、他の3つの抗体とは異なる抗原相互作用を有することを示している。実施例7-軽鎖および重鎖可変領域のDNA配列およびアミノ酸配列HH1抗CD37抗体の可変領域の遺伝子配列およびタンパク質配列は以下のとおりである:VHαCD37遺伝子配列はSEQIDNO1に対応し、VHαCD37タンパク質配列はSEQIDNO2に対応する。VLαCD37遺伝子配列はSEQIDNO3に対応し、VLαCD37タンパク質配列はSEQIDNO4に対応する。アミノ酸配列は、CD37結合抗体A0のアミノ酸配列とは有意に異なるHeideretal2009。HH1の可変軽鎖とA0とのオーバーラップは56であるが、可変重鎖とのオーバーラップは82である。実施例8-CD20抗体リツキシマブによって飽和した細胞における放射標識HH1の結合背景非ホジキンリンパ腫患者はしばしば、標準治療としてリツキシマブを投与される。たとえリツキシマブ療法を受けている患者であっても、放射標識HH1を用いることができれば有利であろう。CD20抗原とCD37抗原の双方を発現するDaudiリンパ腫細胞をモデルとして用いた。方法Daudiリンパ腫細胞330万個05mlを過剰量のリツキシマブ100μgmlによって前処置および同時処置のいずれかを5分間行った後、125I標識HH11μgを加えたか、またはリツキシマブ前処置を行わずに125I標識HH1を与えた。125IHH1の非特異的結合を決定するために、上記と同じ構成であるが標識していないHH110μgmlを用いたによる前処置を行った。細胞をPBS中で室温で2時間インキュベートしてγカウンターで計数し、PBS1ml中で3回洗浄後、遠心沈降させて、細胞に結合した放射活性を最終的に再度計数した。結果リツキシマブの前処置/同時処置によって、加えた125IHH1の260総結合274-非特異的結合14が細胞に特異的に結合した。リツキシマブの前処置/同時処置を行わない場合、255269-14が特異的に結合した数字は全て3回の並行実験の平均値を表す。すなわち、125IHH1の結合において、リツキシマブの存在による有意な差はなかった。結論過剰量のリツキシマブによって前処置および同時処置しても、放射標識HH1の細胞への結合能は変化せず、このようにCD37抗原に対するアクセスを遮断しなかった。このことは、放射標識HH1による放射免疫療法が、抗CD20抗体による免疫療法後または療法中の患者ならびにリツキシマブによって処置していない患者において適している可能性があることを示している。実施例9-Daudiリンパ腫細胞を静脈内に接種したSCIDマウスの177LuHH1を用いた処置背景現行のCD20に対する放射免疫療法によるリンパ腫患者の処置は、抗原ドリフトおよびCD20抗原の起こりうるブロックのために、リツキシマブによって既に処置された患者において問題でありうる。それゆえ、他の抗原を標的とする放射免疫療法がより有効である可能性がある。重度の複合免疫欠損SCIDマウスにヒトリンパ腫細胞を静脈内注射することにより、本発明者らは、静脈内腫瘍モデルを作製した。SCIDマウスにDaudiリンパ腫細胞を静脈内に接種すると、マウスは、Daudi腫瘍細胞の増殖により後肢麻痺を発症するであろう。実験SCIDマウスに、Daudi細胞1000万個を静脈内注射した1週間後に50または100MBqkgの177LuHH1、50μgHH1、50μgリツキシマブ、またはNaClを投与した。マウスを後肢の麻痺および体重減少ならびにWBC数に関して2週間毎にモニターした。無症状生存期間の停止をエンドポイントとして用いた。放射標識抗体を調製するために、まずHH1をpSCNBnDOTAによって標識して精製した。緩衝液を交換した後、177LuPerkinElmerBostonMaUSAをDOTAHH1に加えて、40°Cで40分間振とうした。最終産物の比放射能はおよそ3200MBqmkgであった。各調製物を等張食塩水に溶解し、注射全量を100μl動物とした。結果無症状生存期間の中央値は、食塩水では26日範囲21日~33日、HH1では40日範囲23~44日、リツキシマブでは40日33~44日であった図8。50kBqkg177LuHH1では動物の80が79日後に生存していた。100kBqg群のマウス2匹は、食塩水群のいかなる動物も死亡するより前に死亡し、血球計算により放射線毒性が示された。100kBqg群の第3の動物は49日目に死亡した。他の動物70は、79日目で生存していた。177LuHH1によって処置したマウスの生存率は、NaCl、HH1、またはリツキシマブによって処置したマウスの生存率より有意に高かったp<0005、マンホイトニーログランク検定。結論データは、177LuHH1を50または100kBqg体重の用量で投与された群が、食塩水を投与された群またはHH1もしくはリツキシマブによる免疫療法を受けた群より極めて良好な生存を有したことを示している。毒性のデータは、放射能を100kBqg体重より下に維持すべきであることを示している。これらのデータは、177LuHH1がインビボ放射免疫療法に関して妥当な特性を有することを示している。実施例10-CD37発現腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける177LuHH1の生体分布背景ルテチウム177標識HH1抗体をインビボ組織分布および腫瘍標的化に関して評価した。実験技法放射性核種による抗体の標識まず抗体をキレート化剤pSCNBnDOTAによって標識した。DOTAを005MHCl中に溶解し、5:1の比率で抗体に加え、分子量カットオフ30kDaのAmicon遠心フィルターMilliporeUSAを用いて炭酸緩衝液により洗浄することによってpHを8~9に調節した。次に、pHを再度チェックして、必要であれば調節した。溶液を室温で60分間振とうさせた後、200mMグリシン溶液50μl抗体1mgあたりを加えることによって反応を終了させた。遊離のキレート化剤を除去するために、コンジュゲートした抗体をPBSPAAによって4~5回洗浄した後Amiconを用いて遠心、酢酸アンモニウムによる洗浄によってpH5に調節した。177LuPerkinElmerBostonMaUSAを、2mlポリプロピレン試験管EppendorfGermany中でDOTAHH105mgと混合して、40°Cで1時間振とうさせた。比放射能は、177Luコンジュゲートに関して典型的に25~120MBqkgであった。免疫反応性放射免疫コンジュゲートの質を、リンパ腫細胞および改変Lindmo法を用いて測定した。細胞108個mlまでの細胞濃度を用いた。実験に用いたコンジュゲートは、50超の免疫反応性を有した。放射免疫コンジュゲートの生体分布177LuHH1の生体分布を、3週間前に1×1×1mmのDaudi腫瘍異種移植片を埋め込んだ雄性BALBcヌードnunuマウスにおいて決定した。調製物を、各動物に溶液100μlの尾静脈注射により投与した。177LuHH1に関してマウス1匹あたり500kBqの平均放射能であった。動物4匹から5匹を各時点で用いた。注射後の様々な時点で頸椎脱臼後に剖検を行った。各組織試料の重量を決定して、校正したγ検出器CobraII自動γ検出器、PackardInstrumentCompanyMeridenCTUSAによって177Luを測定した。注入物の試料を、測定技法の基準として用いた。結果および考察Daudi異種移植片を有するBALBcヌードnunu雌性マウスの正常組織における177Lu標識HH1の取込みおよび保持を図7に表す。放射免疫コンジュゲートの初回取込み後に任意の臓器から/任意の臓器に核種が再分布する徴候は認められなかったが、このことは放射免疫コンジュゲートが安定であったことを示している。腫瘍を有するヌードマウスに177LuHH1を注射すると、骨での低い取込みを示した。遊離の177Luは骨に蓄積することが知られ、そのためこの結果は、放射免疫コンジュゲートがインビボで安定であったことを示している。腫瘍での取込みは、後の時点で他の臓器より有意に高かった。このことは、177LuがHH1抗体を用いる放射免疫療法に関して妥当な半減期を有することを示している。177LuHH1の生体分布は、正常組織における妥当な取込みおよびクリアランス、ならびにCD37を発現している腫瘍異種移植片における有意な保持を示す。HH1抗体は、放射免疫療法にとって十分に適しているように思われる。177LuHH1コンジュゲートは、放射性核種の大部分が崩壊する前に、腫瘍と正常組織との好ましい比率が得られたことから、特に適しているように思われる。表表1放射免疫コンジュゲートの免疫反応性および比放射能表2抗体リツキシマブおよびHH1に関する、Raji細胞、Rael細胞、およびDaudi細胞における平均抗原数Bmax、平衡解離定数Kd、ならびに結合速度定数ka表32時間インキュベーション後のDaudi細胞1個あたりに結合した177Lu原子数a対照試料の異なる計数は、カウンターに対するバックグラウンド放射線の変動を示している表418時間インキュベーション後のDaudi細胞1個あたりに結合した177Lu原子数表54つの抗CD37抗体の結合率参考文献