1カプシド改変を含むアデノウイルス血清型5核酸主鎖、2E1領域の上流の、腫瘍特異的ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーターをコードする核酸配列および3E3領域の欠失アデノウイルス遺伝子gp19k67Kの代わりに、ヒトCD40Lをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E2、E4および後期領域からなる群から選択される1以上の領域をさらに含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。以下の領域左ITR、部分的E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分的E3、L5、E4および右ITRを含む、請求項1または2に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。領域が5から3方向に順次に配置される、請求項3に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。野生型領域がE1領域の上流に位置する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E1領域がウイルスパッケージングシグナルを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。CD40Lをコードする核酸配列がウイルスE3プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。CD40Lをコードする核酸配列が、野生型ヒト配列と1ヌクレオチド異なる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。E4領域が野生型である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変が、Ad53キメリズム、インテグリン結合性領域の挿入およびまたは繊維へのヘパリン硫酸結合性ポリリジン改変である、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変がAd53キメリズムである、請求項10に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。カプシド改変がRGD4C改変である、請求項10に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。少なくとも1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ただ1つの発現カセットを含む、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。ベクターが、テロメラーゼを発現する細胞内で選択的に複製することができる、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。請求項1~15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む細胞。請求項1~15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。insitu癌ワクチンとして機能する、前記請求項のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。被験者の癌を治療するための、請求項1~15のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクター。被験者の癌を治療する方法であって、請求項1~15または17のいずれか1つに記載のベクターまたは医薬組成物の被験者への投与を含む前記方法。癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、脳腫瘍、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病リンパ腫、神経腫、フォンヒッペルリンドウ病、ゾリンジャーエリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頚癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頚部癌、腎癌、ウイルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃癌からなる群から選択される、請求項19~20に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。被験者がヒトまたは動物である、請求項19~21に記載のアデノウイルスベクターまたは方法。投与が、腫瘍内、筋肉内、動脈内、静脈内、胸腔内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射であるか、または経口投与である、請求項19~22のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物が、治療期間中に数回投与される、請求項19~23のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。以前の治療のベクターと比較して異なるカプシドの繊維ノブを有する腫瘍溶解性アデノウイルスベクターが被験者に投与される、請求項19~24のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、被験者への同時放射線治療または同時化学療法の投与をさらに含む、請求項19~25のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、被験者における、べラパミルまたは他のカルシウムチャネル遮断薬オートファジー誘導剤テモゾロマイド制御性T細胞をダウンレギュレートすることができる物質シクロホスファミドおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される助剤の被験者への投与をさらに含む、請求項19~26のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。方法が、中和抗体を遮断するための化学療法または抗CD20治療または他のアプローチの投与をさらに含む、請求項19~27のいずれか1つに記載のアデノウイルスベクターまたは方法。細胞内でCD40Lを産生する方法であって、a請求項1~15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを細胞に運び、b細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させることを含む前記方法。被験者の腫瘍特異的免疫応答を増強する方法であって、a請求項1~15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含むビヒクルを標的細胞または組織に運び、b細胞内で前記ベクターのCD40Lを発現させ、c前記標的細胞または組織内の細胞傷害性T細胞およびまたはナチュラルキラー細胞の量または活性を増加させることを含む前記方法。細胞内でCD40Lを産生するための、請求項1~15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。被験者において、腫瘍特異的免疫応答であるTh1Th2スイッチを増強するかまたは免疫抑制を軽減するための、請求項1~15のいずれか1つに記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。標的細胞または組織内でナチュラルキラー細胞およびまたは細胞傷害性T細胞の量が増加するか、またはサプレッサー細胞が減少する、請求項32に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの使用。動物すべての動物プロトコルは、ExperimentalAnimalCommitteeoftheUniversityofHelsinkiandtheProvincialGovernmentofSouthernFinlandに審査され承認された。4~5週齢のC57BlackマウスおよびNMRIヌードマウスはTaconic社から入手し、試験の前に少なくとも1週間隔離した。マウスの健康状態をしばしばモニターし、何らかの痛みまたは苦痛の徴候が明らかになり次第それらを殺した。細胞株免疫不全モデルのために、106個のA549細胞またはEJ細胞を用いた。RamosBlue細胞株はInvivoGen社から入手した。免疫適格モデルのために、C57Blackマウスの剃った脇腹に5x105個のMB49細胞を皮下注射した。腫瘍がおおよそ5x5mmのサイズに達したとき、0日目、2日目および4日目に、3x108VP腫瘍の用量で腫瘍内にウイルスを3回注射した。統計解析両側スチューデントt検定を用い、005未満のP値を有意とみなした。生存データをカプランマイヤー分析で分析した。Ad53hTERTE1AhCD40L、Ad53CMVhCD40LおよびAd53CMVmCD40Lのクローニング一般的なアデノウイルス調製技術を用いてAd53hTERTE1AhCD40Lを作成し増幅した。簡潔に言えば、特異的制限部位SunIMunIの挿入を特徴とする特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によってヒトCD40LcDNAを増幅した。次いで、PCR増幅産物をpTHSNにサブクローニングし、続いてpAd53hTERTE1Aと組換えてpAd53hTERTE1AhCD40Lを作成した。このプラスミドをPacIで線状化し、増幅およびレスキューのためにA549細胞にトランスフェクトした。クローニングのすべての段階をPCRおよび複数の制限酵素処理で確認した。シャトルプラスミドpTHSNhCD40Lを配列決定した。野生型E1の非存在をPCRにより確認した。最終ウイルスにおいて、配列決定およびPCRを用いてE1領域、導入遺伝子および繊維をチェックした。以前記載したように、野生型組換えのリスクを避けるために、トランスフェクションを含むウイルス産生のすべての段階をA549細胞で行った。hCD40Lは、感染後約8時間で開始される複製関連導入遺伝子発現を引き起こすE3プロモーターの制御下にある。E3は、67Kgp19Kの欠失を除けば無傷である。図1aにpAd53hTERTE1AhCD40Lの構造を示す。非複製型アデノウイルスAd53CMVhCD40LおよびAd53CMVmCD40Lの構築のために、pShuttleCMVプラスミドの多重クローニング部位にhCD40LまたはmCD40Lのいずれかを含む発現カセットを挿入した。このシャトルプラスミドを、全アデノウイルスゲノムを含むpAdeasy153プラスミドと組換え、得られたレスキュープラスミドを293細胞にトランスフェクトしてAd53CMVhCD40LおよびAd53CMVmCD40Lを作成した。図1bおよび1cは、それぞれAd53CMVhCD40LおよびAd53CMVmCD40Lの構造およびクローニングを示す。対照ベクターAd53Luc1およびAd53hTERTE1Aは以前報告されている。Ad53Luc1、Ad53hTERTE1A、Ad53hTERTE1AhCD40L、Ad53CMVhCD40LおよびAd53CMVmCD40LのVP対プラーク形成単位比は、それぞれ、25、31、200、138および86であった。invitroおよびinvivoでの構築されたアデノウイルスの発現および機能性フローサイトメトリーおよび酵素免疫抗体法を用いてhCD40Lの発現を試験した。フローサイトメトリー分析に関しては、2ウシ胎児血清を含む増殖培地において、10VP細胞を用いてヒト胎児腎臓293細胞をAd53hTERTE1AhCD40LまたはAd53CMVhCD40Lに感染させた。対照細胞は2ダルベッコ変法イーグル培地のみで処置した。24時間後、hCD40LFITC抗体で30分間かまたは、細胞の自己蛍光および非抗原特異的結合からのバックグラウンド蛍光を測定するアイソタイプ対照のいずれかで細胞を染色した。BDLSRでフローサイトメトリー分析を行った。ELISA分析に関しては、A549異種植皮および同系のMB49腫瘍を誘導し、上記のAd53hTERTE1AhCD40L、Ad53CMVhCD40L、またはAd53CMVmCD40Lのいずれかで処置した。最初のウイルス注射後、4日目、8日目および12日目に血液試料を採取した。Ad53CMVhCD40Lで処置したマウスからの血清におけるhCD40Lの分析に関しては、腫瘍増殖が速く、8日目には動物を殺さなければならなかったので、血液は2回のみ採取した。血清におけるhCD40LおよびmCD40L濃度は、HumanCD40LigandELISAキットおよびMousesCD40LELISAキットを用い、製造業者のプロトコルに従って測定した。図2aに示すフローサイトメトリー結果は、複製コンピテントAd53hTERTE1AhCD40Lおよび複製欠損性Ad53CMVhCD40Lの両方が、invitroで高いCD40L発現をもたらしたことを示している。ELISA分析により、invivoでもまた、hCD40LおよびmCD40Lの発現が確認された。形質導入されたA549細胞はCD40であり、CD40Lによって殺されないと予想されるため、Ad53CMVhCD40LはAd53hTERTE1AhCD40Lよりも高い血清レベルをもたらした。従って、形質導入された細胞はCD40Lを無限に産生し続けるのに対し、Ad53hTERTE1AhCD40LはA549細胞の腫瘍溶解を引き起こし、これによりそれらがCD40Lを産生しなければならない時間が限定される。高濃度に存在する場合、CD40Lは副作用を引き起こす恐れがあるため、安全性の見通しからこのことは好都合であると考えられる。rhCD40Lのヒト最大耐用量は血清濃度2900pgmlに相当することが報告されており、これはAd53hTERTE1AhCD40Lで観察されたものよりは100倍高い。Ad53CMVmCD40Lは、Ad53CMVhCD40Lよりも低い血清mCD40Lレベルをもたらしたが、おそらくこれは、mCD40Lがマウス組織および細胞によって代謝されるのに対し、それがマウスにおいては不活性なため、hCD40Lが代謝されないからだと思われる。Ad53hTERTE1AhCD40Lによって発現されるCD40Lの機能性を肺癌細胞で試験した。細胞株A549単層を1000VP細胞のAd53hTERTE1AhCD40LおよびAd53hTERTE1Aに感染させ、1つのフラスコは感染させなかった。感染後48時間で上清を採取し、002μmフィルターで濾過した。この上清を2つの機能性アッセイに用いた。第1の機能性アッセイにおいて、EJ細胞株単層をプラスミドpNiFtyLucでトランスフェクトし、終夜培養した。pNiFtyLucは操作された内皮細胞白血球接着分子プロモーターが結合した5つのNFκB部位であり、ルシフェラーゼをコードする。A549単層から採取した上清をEJ細胞に加え、12時間培養した。このアッセイのための陽性対照として1μgmlの組換えhCD40Lタンパク質を用いた。この細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。モック値を差し引いた。NfκB活性は、ルシフェラーゼ発現の増加倍数で表される。このアッセイを3回行い、毎回3連で評価した。データを平均値±SEM、PTh1活性の指標となりうる。V有効性の評価CTのためのRECIST基準またはポジトロン断層法CTのためのPERCIST基準に従ったAd53hTERTE1AhCD40Lの有効性の評価もまた表5に報告する。すべての患者は処置前に進行性の腫瘍を有していた。患者T181は不変を示し、患者C239は代謝安定状態を示し、患者C229は進行増悪を示し、患者I244はSMDを示し、患者P251はPDを示し、患者R8はSDを示した。ベースラインにおいてマーカーが上昇していた患者の腫瘍マーカーの評価に関しては、患者R73は著効を示し、患者T181およびN235は、それぞれ、56および58の有効を示し、患者R8は、16のやや有効を示し、患者C229は増加減少なしを示したが、患者C239、P251およびC220は腫瘍マーカーにおいて進行増悪を示した。患者の生存期間もまた表5に示す。全体的に見て、79患者において抗腫瘍有効性の徴候が見られた。抗腫瘍活性の客観的測定値に加えて、我々はまた、数人の患者において、臨床的かつまたは主観的改善を観察した。患者C229ではパフォーマンスステータスの改善が見られ、患者I244では一般症状の改善が見られた。Ad53hTERTE1AhCD40Lで処置された患者の生存解析に関しては、同じカプシドを有する武装していない腫瘍溶解性アデノウイルスで処置した癌患者を対照として用いた。生存データをカプランマイヤー曲線にプロットし、コホートをログランク検定で比較した。この非無作為化比較において、Ad53hTERTE1AhCD40LおよびAd53D24Cox2Lで処置された患者の生存期間中央値は、それぞれ304日および105日であった。VI腫瘍溶解性アデノウイルスAd53hTERTE1AhCD40Lでの処置後のTh1およびTh2免疫応答ならびに炎症性毒性関連サイトカイン応答製造業者の使用説明書に従って、BectonDickinsonサイトカインマルチプレックスビーズアレイシステムを用いて、Th1誘導サイトカインインターフェロンγ、腫瘍壊死因子αおよびインターロイキン2またはTh2サイトカインインターロイキン4、インターロイキン5およびインターロイキン10のいずれかに関して患者の血清試料を分析した。図10の左側にTh1誘導サイトカインを示し、右側にTh2誘導サイトカインを示す。前ウイルスで処置される前に採取された血清試料1ヶ月ウイルス処置後1ヶ月で採取された血清試料2か月ウイルス処置後2ヶ月で採取された血清試料。図11において、ベースラインレベルを1としたときのベースラインレベルに対するサイトカインレベルを示し、各時点のTh1Th2比を算出した。1ヶ月ウイルス処置後1ヶ月で採取した血清試料2ヶ月ウイルス処置後2ヶ月で採取した血清試料。1より上の比率はTh1型免疫応答の優位を示し、1より下の比率はTh2型免疫応答の優位を示す。処置の安全性をさらに評価するために、インターロイキン6および腫瘍壊死因子αの血清レベルを測定した。IL6およびTNFαは急性アデノウイルス毒性の高感度マーカーとして示唆されているが、処置後にこれらのサイトカインの有意な増加は観察されなかった。さらにまた、インターロイキン8、インターロイキン10、インターロイキン12、インターフェロンγの血清レベルの処置後の増加もまた観察されなかった。VII腫瘍溶解性アデノウイルスAd53hTERTE1AhCD40Lでの処置後のアデノウイルスおよび腫瘍抗原認識T細胞の誘導腫瘍溶解細胞死によって、免疫系が、腫瘍細胞を認識し致死させる能力を得ることが可能になる。このことは腫瘍根絶に潜在的に有益であり、治癒を容易にすることができる。アデノウイルスは、投与後、比較的短時間で身体から排除される。従って、特異的腫瘍抗原を認識することができる免疫系を刺激し、その処置が患者に持続的に有益な効果をもたらすことができることが極めて重要となる。加えて、抗体が誘導されるかまたは存在する場合、ウイルスは部分的または完全に中和される可能性があり、従って転移に感染し致死させるその有効性を失う恐れがある。しかしながら、腫瘍に対して誘導されたエフェクターT細胞またはNK細胞は自由に循環し、注射された腫瘍から遠く離れた転移をついには致死させる。腫瘍溶解性アデノウイルスAd53hTERTE1AhCD40Lがアデノウイルス認識T細胞を誘導することができることを明らかにするために、全PBMCを単離し、アデノウイルス5型ペントン由来ペプチドプールでパルスして、インターフェロンγELISPOTでアデノウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球の活性化を評価した。患者T181は、処置後にアデノウイルス認識T細胞数の減少を示し、患者C239は、処置後にこれらの細胞数の増加を示した。抗ウイルス免疫応答は、腫瘍溶解性ウイルスによって媒介される全般的抗腫瘍効果の重要な部分であることが示唆されている。さらに、アデノウイルスELISPOTのために、患者からの末梢血単核球をHAdv5ペントンペプチドプールで刺激した。腫瘍抗原ELISPOTのために、BIRC5PONABペプチド、すなわちサバイビンを用いた。本アッセイにおいて、PBMCの予備刺激またはクローン増殖は行わなかった。従って、この結果は、血液中のこれらの細胞の実際の頻度を示している。評価可能な患者8名の内4名が抗アデノウイルス免疫の誘導を示唆するアデノウイルス特異的PBMCの全身での増加を示した。患者2名は減少を示したが、これはウイルス濃度が最も高い腫瘍へのこの細胞のトラフィッキングによるものと考えられた。患者N235は、ウイルス注射後5週間でアデノウイルス特異的PBMCの少しの増加を示したが、最初の処置から9週間後には循環アデノウイルス特異的PBMCは認められなかった。R8は、終始、低いかまたは検出できないレベルの循環アデノウイルス特異的PBMCしか示さなかった。サバイビン特異的反応に関しては、評価可能な患者8名の内4名が、処置後にPBMC数の増加を示した。患者R73およびR8においては、腫瘍特異的T細胞数の減少が観察されたが、これは腫瘍部位へのトラフィッキングを示唆するものと考えられた。患者T181およびC239は、検出不能なレベルの循環生存特異的PBMCを有していた。VIII患者PBMCの細胞内サイトカインの分析サバイビンは、大部分の腫瘍によって発現されるため、腫瘍特異的免疫を評価するために有用なプロトタイプ標的である。しかしながら、恐らくはサバイビンは最も免疫原性の高いエピトープではなく、従って、抗サバイビンT細胞は抗腫瘍免疫の誘導を過小評価する恐れがある。抗腫瘍細胞のexvivo増殖に続いて、腫瘍特異的エピトーププールに対する反応性を試験することによって、抗腫瘍免疫に関する別の観点を提供することができ、従って十分な細胞数が入手できる場合は、細胞内サイトカイン分析で腫瘍特異的CD8細胞およびCD4T細胞を測定した。PBMCは、解凍時に、濃度1μgmLで、ヘキソンおよびペントンペプチドのhAd5混合物かまたは、癌のタイプによって選択された3~7のTAAPepMixeの混合物のいずれかでパルス刺激した。刺激後、IL4およびIL7、またはIL12およびIL7のいずれかを、IL4に関しては1000UmLの濃度で、IL7およびIL12に関しては10ngmLの濃度で含み、5ヒトAB血清および2mmolLLグルタミンを添加した、CTL増殖培地RPMI1640クリック培地11を細胞に補給した。培養10日後、共刺激のために前もってCD28およびCD49を加え、hAd5またはTAAペプチド混合物で細胞を再刺激し、飽和量のCD3およびCD8に対するモノクローナル抗体で表面染色した。20μlのFITC抗IFNγ抗体またはPe抗TNFα抗体でサイトカインに関して細胞を染色し、CellQuestソフトウェアを備えたFACSCaliburを用いて分析した。処置後のすべての測定値において、患者T181およびC239は腫瘍特異的CD8T細胞の増加を示した。CD4細胞に関しては、T181およびP251は、ベースラインと比較して増加を示した。さらにまた、患者C239について、アデノウイルス認識CD4T細胞数を試験したところ、ウイルス投与の3週間後に一過性の増加が見られ、ELISPOTデータが確認された。IXCD40LおよびRANTESの局所および全身レベルの分析悪性腹水におけるCD40LおよびRANTESの局所レベルを評価するために、その液中の可溶性CD40LおよびRANTES濃度を評価し、これらのサイトカインの全身レベルと比較した。ウイルス投与前および投与28日後に患者R8の腹腔から悪性腹水を除去し、BDCytometricBeadArrayHumanSolubleProteinFlexSetを用いてCD40LおよびRANTES濃度を分析した。腫瘍においてsCD40LおよびRANTESレベルは局所的に増加していたが、全身レベルでは増加は見られなかった。さらに、腫瘍部位でのウイルスの複製を評価するために、腹水および腹水から単離された細胞中のウイルス粒子の量を分析した。CD40L配列に隣接するE3領域を標的化するプライマーおよびプローブ、逆方向プライマー5 ́GCAAAAAGTGCTGACCCAAT3 ́およびプローブonco5 ́FAMCCTGCCGGGAACGTACGATG3 ́MGBNFQを用いるqPCRによって分析を行った。ウイルス処置後28日目に、腹水および細胞において、腫瘍における複製を示唆する高いウイルス量が観察されたが、同じ日に、血清においてはウイルスは検出されなかった。従って、sCD40LおよびRANTESレベルは共に腫瘍部位において局所的に増加していたが、全身レベルでは増加は観察されなかった。このことは、免疫学的効果が腫瘍部位に限定されていたことを示唆している。免疫学的効果が局所に限定されていることをさらに確認するために、ウイルス処置の前後に、9名の患者全部についてsCD40LおよびRANTESの全身レベルを評価した。すべての患者において有意な増加は見られなかったが、このことは、ウイルスの設計によって予測されていたように、免疫学的効果が腫瘍部位に限定されていたことを示唆している。9名の患者全部に関する血液試料は、前および処置後のいくつかの時点において採取した。血清中の可溶性CD40LおよびRANTES濃度を評価した。データは中央値±SDで示す。