"明細書に記載の発明。発明の要旨本発明は一般的に、より高い収量のアミノ酸が産生されることを可能にする、改善されたラフィネート耐性および改善された増殖特性を有する新規の微生物を提供する。本発明の第1の目的は、アミノ酸を産生する能力が増した微生物の産生のための新規の方法を提供することである。本発明の第1の実施形態では、アミノ酸を産生する親細菌株の変異誘発、その後の本発明の改善されたラフィネート耐性株についての選択による新規の株の産生のための方法が提供される。本発明のより特定の実施形態では、この方法は、アミノ酸を産生する親細菌株例えば、CorynebacteriumおよびBrevibacteriumに関する。特に好適な実施形態は、L-リジンを産生するBrevibacteriumである、改善されたラフィネート耐性のアミノ酸産生細菌株の産生のための方法に関する。本発明の別の目的は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴を有し、そしてより多量のアミノ酸を産生する、新規の細菌株に関する。第1の実施形態では、本発明の細菌株は、プロセスによって産生され、ここで、親細菌株は変異誘発に供され、そして変異体子孫細菌は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴および改善されたアミノ酸産生について選択される。より特定の実施形態は、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴および改善されたアミノ酸産生を有する、新規のCorynebacterium微生物または新規のBrevibacterium微生物に関する。本発明の特に好適な実施形態は、多量のL-リジンを産生するBrevibacteriumに関する。最も好適な実施形態は、ADML63.148株NRRLB-30059、ADML64.132株NRRLB-30060、ADML69.53株NRRLB-30061、ADML69.74株NRRLB-30062およびADML69.100株NRRLB-30063またはそれらの変異体に関する。本発明の第3の目的は、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供することであり、このプロセスは、a細菌をラフィネート含有培地中で培養する工程、およびbアミノ酸を培養培地から回収する工程を包含する。好ましい実施形態では、工程aの培養された細菌は、アミノ酸を産生する親細菌株が変異誘発に供され、そして子孫が、改善されたラフィネート耐性、改善された増殖特徴およびアミノ酸の改善された産生について選択される方法によって得られる。好適な実施形態は、CorynebacteriumまたはBrevibacteriumを利用したアミノ酸の産生のためのプロセスに関する。アミノ酸の産生のためのプロセスについての本発明の特に好適な実施形態は、L-リジンを産生するBrevibacteriumを利用する。上記の一般的記載および以下の詳細な説明の両方が、単なる例示および説明であって、請求された発明のさらなる説明を提供することを意図していることが理解されるべきである。本発明は、例えば以下の項目を提供する。項目1改良されたラフィネート耐性のアミノ酸産生細菌株Bを産生するための方法であって、該方法は、以下:a親細菌株Aを変異誘発に供する工程;b該変異誘発された親株Aを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1のラフィネートを含有する培地と接触させる工程;cラフィネート耐性細菌株Bを選択する工程;およびd該ラフィネート耐性細菌株Bのアミノ酸産生を決定する工程、を包含する、方法。項目2前記親細菌株が、ランダムな化学変異誘発に供される、項目1に記載の方法。項目3前記親細菌株が、以下:aCorynebacteriumsp.;bBrevibacteriumsp.;cEscherichiacoli;およびdBacillussp.、からなる群から選択される、項目1に記載の方法。項目4前記細菌株Bが、aグリシン;bアラニン;cメチオニン;dフェニルアラニン;eトリプトファン;fプロリン;gセリン;hスレオニン;iシステイン;jチロシン;kアスパラギンlグルタミン;mアスパラギン酸;nグルタミン酸;oリジン;pアルギニン;qヒスチジン;rイソロイシン;sロイシン;およびtバリン、からなる群から選択されるアミノ酸を産生する、項目1に記載の方法。項目5前記親細菌株が、L-リジンを産生するCorynebacteriumsp.である、項目1に記載の方法。項目6以下であるプロセスにより産生されるアミノ酸を産生する細菌株Bであって、ここで:a親細菌株Aが、変異誘発に供され;b該変異誘発された親株が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1のラフィネートを含有する培地と接触され;cラフィネート耐性細菌株Bが、該変異誘発された親株から選択され;そしてd該細菌株Bのアミノ酸産生が決定される、細菌株。項目7前記親細菌株Aが、以下:aCorynebacteriumsp.;bBrevibacteriumsp.;cEscherichiacoli;およびdBacillussp.、からなる群から選択される、項目6に記載の細菌株。項目8前記細菌株Bが、aグリシン;bアラニン;cメチオニン;dフェニルアラニン;eトリプトファン;fプロリン;gセリン;hスレオニン;iシステイン;jチロシン;kアスパラギンlグルタミン;mアスパラギン酸;nグルタミン酸;oリジン;pアルギニン;qヒスチジン;rイソロイシン;sロイシン;およびtバリン、からなる群から選択されるアミノ酸を産生する、項目7に記載の細菌株。項目9少なくとも約1のラフィネートを含有する培地中で増殖される場合、24時間で少なくとも約10g/lのL-リジンを産生する、Crynebacteriumsp.株。項目10少なくとも約1のラフィネートを含有する培地中で増殖された場合、24時間で少なくとも約10g/lのL-リジンを産生する、Brevibacterium株。項目11L-リジン産生細菌株であって、ここで該株が、aNRRLB-30059;bNRRLB-30060;cNRRLB-30061;dNRRLB-30062;eNRRLB-30063;およびfa、b、c、d、またはeの変異体、からなる群から選択される、L-リジン産生細菌株。項目12前記株が、NRRLB-30059である、項目11に記載の株。項目13前記株が、NRRLB-30060である、項目11に記載の株。項目14前記株が、NRRLB-30061である、項目11に記載の株。項目15前記株が、NRRLB-30062である、項目11に記載の株。項目16前記株が、NRRLB-30063である、項目11に記載の株。項目17アミノ酸を産生するためのプロセスであって、以下:aラフィネートを含有する培地中で細菌Bを培養する工程であって、該株が、以下の方法:iアミノ酸を産生する親細菌株Aを選択する工程;ii該親株を変異誘発に供する工程;iii該変異誘発された親株から、改良されたラフィネート耐性細菌株Bを選択する工程、により得られる、工程;ならびにb該培養培地から該アミノ酸を回収する工程、を包含する、プロセス。項目18ラフィネートの培地濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1である、項目17に記載のプロセス。項目19産生されるL-リジンの量が、24時間で少なくとも約10g/lのL-リジンである、項目17に記載のプロセス。項目20ラフィネートの培地濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1であり、そして産生されるL-リジンの量が、24時間で、少なくとも約10g/lのL-リジンである、項目17に記載のプロセス。項目21前記ラフィネートの濃度が、硫酸アンモニア含有量に基づいて約5であり、そして産生されるL-リジンの量が、24時間で少なくとも約10g/lのL-リジンである、項目17に記載のプロセス。項目22細菌Bが、以下:aCorynebacteriumsp.;bBrevibacteriumsp.;cEscherichiacoli;およびdBacillussp.、からなる群から選択される、項目17に記載のプロセス。項目23前記細菌Bが、以下:aNRRLB-30059;bNRRLB-30060;cNRRLB-30061;dNRRLB-30062;eNRRLB-30063;およびfa、b、c、d、またはeの変異体、からなる群から選択される、Corynebacteriumsp.である、項目22に記載のプロセス。好適な実施形態の詳細な説明1.定義明細書および特許請求の範囲このような用語が与えられる範囲を含むの明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。高収量誘導体:本明細書中で使用される場合、この用語は、デキストロースから、その株を誘導した親株と比較して高収量の特定のアミノ酸を産生する微生物株をいう。変異:本明細書中で使用される場合、この用語は、目的のヌクレオチド配列における単一塩基対の変化、挿入または欠失をいう。オペロン:本明細書中で使用される場合、この用語は、DNA中の構造遺伝子および調節エレメントを含めて、細菌遺伝子発現および調節の単位をいう。親株:本明細書中で使用される場合、この用語は、何らかの形態の変異誘発に供されて、本発明の微生物を生じた微生物株をいう。表現型:本明細書中で使用される場合、この用語は、微生物の遺伝的構成に依存して観察可能な物理的特徴をいう。ラフィネート:本明細書中で使用される場合、この用語は、リジン回収のためのイオン交換操作からの廃流wastestream産物をいう。ラフィネートは、多量の硫酸アンモニア、L-リジン、他のアミノ酸、塩および炭水化物例えば、イソマルトースを含む。熱処理を用いたラフィネート含有培地の滅菌は、培養物の増殖阻害を引き起こす、アミノ酸誘導体および他の代謝アンタゴニストを産生する。熱で滅菌されたラフィネート含有培地を用いて、その中に含まれる、培養物の増殖を阻害するアミノ酸誘導体に耐性である;その中に含まれる、培養物の増殖を阻害する代謝インヒビターに耐性である、ならびに/またはその中に含まれる、培養物の増殖を阻害するリジンおよび/もしくはリジンの前駆体の分解産物に耐性である、微生物例えば、BrevibacteriumまたはCorynebacteriumを選択し得る。相対的増殖:本明細書中で使用される場合、この用語は、親株の増殖を、子孫の株の増殖と、規定された時間の期間にわたって、そして規定された培地を用いて直接比較することによって増殖の評価を提供する測定値をいう。変異誘発:本明細書中で使用される場合、この用語は、DNA中に変異が産生されるプロセスをいう。ランダム変異誘発を用いると、正確な変異部位は予測可能ではなく、微生物の染色体のどこにでも生じ、そしてこの変異は、因子例えば、放射線または化学的処理によって引き起こされる物理的損傷の結果として生じる。2.親細菌株の変異誘発本発明は、多量のアミノ酸を産生し、そしてラフィネートに対する改善された耐性を有する微生物の産生のための方法を提供する。研究経過を通して、増殖およびアミノ酸生合成に必要とされる硫酸アンモニアが、ラフィネートリジン回収のイオン交換操作からの廃流産物で置換され得ることが今や見出された。ラフィネートは、多くの硫酸アンモニア、L-リジン、他のアミノ酸、塩および炭水化物例えば、イソマルトースを含む。しかし、培地を滅菌するための熱処理の間に、このラフィネート培地は、培養物の増殖阻害を引き起こす、多くのアミノ酸誘導体および他の代謝アンタゴニストを産生する。この問題を克服するために、培地中の高レベルのラフィネートに耐え得、そしてそれらのアミノ酸産生を増大させ得る株を選択するために方法が設計された。本発明の細菌株は好ましくは、親細菌株の変異誘発、続いて改善されたラフィネート耐性表現型の選択によって作製される。親微生物は、アミノ酸の発酵産生に有用であることが当該分野で公知の任意の生物から選択され得る;好適な親微生物は、アミノ酸を産生するCorynebacteriumおよびBrevibacteriumであり、そして特に最も好適な生物は、L-リジンを産生するCorynebacteriumおよびBrevibacteriumである。第1の実施形態では、本発明は、改善されたラフィネート耐性の、アミノ酸産生細菌株の産生のための方法を提供し、この方法は、以下を包含する:a親細菌株Aを変異誘発に供する工程;b上記変異誘発された親株Aを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1のラフィネートを含む培地と接触させる工程;cラフィネート耐性細菌株Bを選択する工程;およびd上記ラフィネート耐性細菌株BのL-リジン産生を決定する工程。親株は、放射線および化学的手順を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意のランダム変異誘発技術を用いて変異誘発され得る。特に好適なのはランダム化学的変異誘発であり、そして最も好適なのは、適切な薬剤例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンNTGを用いた変異誘発である。新規の細菌株の変異誘発および選択についての一般的方法は、当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載される:J.H.Miller,ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1972;J.H.Miller,AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1992;M.SingerおよびP.Berg,GenesGenomes,UniversityScienceBooks,MillValley,California1991;J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork1989;P.B.Kaufmanら,HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,Florida1995;MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,B.R.GlickおよびJ.E.Thompson編,CRCPress,BocaRaton,Florida1993;ならびにP.F.Smith-Keary,MolecularGeneticsofEscherichiacoli,TheGuilfordPress,NewYork,NY1989。本発明の株は、改善されたラフィネート耐性表現型を有し、この表現型は、用いられた選択培地中の硫酸アンモニウム含有量によって測定した場合のラフィネートの濃度によって決定される。第1の実施形態では、表現型選択は、少なくとも約1のラフィネートを含有する培地中で行われ得る。最も好ましい実施形態では、本発明の微生物は、約5のラフィネートを含有する培地中で選択される。他の例としては、改善されたラフィネート耐性株の選択において使用するための、少なくとも約2、約3、約4、約5、約6、約7および約8のラフィネートを含有する培地が挙げられる。本発明は一般的に、より高い収量のアミノ酸が産生されるのを可能にする、改善されたラフィネート耐性および改善された増殖特性を有する新規の微生物を提供する。本発明の方法、プロセスまたは微生物の重要な要因または特性は、ラフィネート耐性に関する。発酵アミノ酸産生の分野の当業者は、本明細書中で使用される用語ラフィネートとの用語に精通している。しかし、出願人の発明の詳細な説明をより充分に提供する目的のために、ラフィネートの定義およびその産生のための方法が提供される。用語ラフィネートは、液体-液体抽出の領域の化学的操作分野に最も密接に関連する。この用語は、溶剤精製において、処理された液体混合物のうちの、不溶性のままであり、そして選択溶媒によって除去されない部分と定義されるDictionaryofScientificandTechnicalTerms,SybilP.Parker編,McGraw-Hill1989。本明細書中で使用される場合、この用語は、アミノ酸の単離におけるイオン交換クロマトグラフィーの適用に関連する。液体-液体抽出のプロセスと類似の様式で、イオン交換クロマトグラフィーと関連して用いられる場合、用語ラフィネートは、液体混合物のうちの、クロマトグラフィー樹脂によって選択的に結合された部分をいう。より詳細には、アミノ酸の発酵産生に関連して、ラフィネートは、細胞培養培地のうちの、クロマトグラフィーカラムに結合しない部分である;ラフィネートは、アミノ酸のイオン交換クロマトグラフィー精製の間に産生されるブロス流出物廃流産物である。代表的に、本明細書中で使用される場合、ラフィネートとは、イオン交換樹脂への増殖培地の最初の適用後に産生される第1の廃流産物をいう。種々のイオン交換クロマトグラフィー方法が、アミノ酸の精製のために利用され得る。代表的に、カチオン交換樹脂は、リジンの精製のために利用される。イオン交換クロマトグラフィーは、固定層fixedbedまたはシミュレート移動層simulatedmovingbed樹脂を利用して行われ得る。例えば、VanWalsernおよびThompsonは、リジンの単離のためのシミュレート移動層技術を記載するVanWalsem,H.J.およびThompson,M.C.,JBiotechnology59:127-1321997;米国特許第4,714,767号および同第5,684,190号は、アミノ酸の精製のための固定層クロマトグラフィー技術の使用を記載し、そしてWolfgangおよびPriorは、環状クロマトグラフを利用して、炭水化物の分離における連続形態の操作を達成するWolfgang,J.およびPrior,A.,SeparationScienceandTechnology32:71-821997。従って、ラフィネートを作製する特定のクロマトグラフィー方法は変化し得るが、ラフィネートを規定する基礎となる原理は一定のままである。例示の目的のみで、出願人は、実施例5において、細胞増殖培地補充物として使用するためのラフィネートの産生についての詳細を提供する。当業者にはわかるように、ラフィネートは、ラフィネートが単離される発酵培地において産生される特定のアミノ酸に従って定性的に特徴付けられ得る;例えば、ラフィネートは、リジン発酵培地から単離された場合、リジン-ラフィネートとして、グリシン発酵培地から単離された場合、グリシン-ラフィネートとして、イソロイシン発酵培地から単離された場合、イソロイシン-ラフィネートとして、などとして公知であり得る。一般的用語ラフィネートが本明細書中で用いられる場合、選択された特定の型のラフィネートが実施者の設計に依存することが当業者に容易に明らかである。本明細書中に提供される実施例は、ラフィネート、特にリジン-ラフィネートの産生についての例示である。当業者に明らかであるように、他の方法が、ラフィネートの作製において利用され得る。3.本発明の改善されたラフィネート耐性株本発明の別の目的は、改善されたラフィネート耐性を有し、そしてアミノ酸を産生する微生物に関する。当業者にはわかるように、このような微生物は、任意の特定の型のラフィネート例えば、グリシン-ラフィネート、バリン-ラフィネート、イソロイシン-ラフィネート、リジン-ラフィネートなどに対する改善された耐性を有するように選択され得る。特に好ましい実施形態では、この微生物は、リジン-ラフィネートに対する改善された耐性を有する。本発明の特定の実施形態では、ラフィネート耐性微生物は、プロセスによって産生され、ここで:a親細菌株Aが変異誘発に供される;b変異誘発された親株Aを、硫酸アンモニア含有量に基づいて少なくとも約1のラフィネートを含有する培地と接触させる;cラフィネート耐性細菌株Bが選択される;およびd上記のラフィネート耐性細菌株Bのアミノ酸産生が決定される。親細菌株の選択、変異誘発および改善されたラフィネート耐性を有する本発明の微生物の選択は、これまで記載された通りに行われ得る。本発明のより特定の実施形態は、CorynebacteriumまたはBrevibacteriumに関し;特に好適なのは、L-リジンを産生するCorynebacteriumまたはBrevibacteriumである。本発明はまた、少なくとも約1のラフィネートを含有する培地において増殖させた場合、少なくとも約10gのL-リジン/リットル/24時間を産生するCorynebacterium株を提供する。本発明の特に好適な実施形態は、L-リジン産生Corynebacterium株に関し、ここで、この株は、NRRLB-30059、NRRLB-30060、NRRLB-30061、NRRLB-30062、NRRLB-30063およびそれらの変異体からなる群より選択される。4.アミノ酸産生および精製本発明の他の実施形態は、ラフィネート含有培地におけるアミノ酸の産生のためのプロセスに関する。このようなプロセスは、a改良されたラフィネート耐性細菌株の培養工程およびb培養培地からのアミノ酸の回収工程、を包含する。第1の特定の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するアミノ酸産生のためのプロセスを提供する:aラフィネートを含む培地において、細菌B株を培養する工程であって、それによって株を、以下の方法によって得る、工程:iアミノ酸を産生する親細菌株Aを選択する工程;iiその親株Aを突然変異する工程;iii改良されたラフィネート耐性細菌株B選択する工程;およびb培養培地からアミノ酸を回収する工程。親細菌株の選択、突然変異誘発および改良されたラフィネート耐性を有する本発明の微生物の選択は、これまでに記載されるように行われ得る。本発明の好ましい実施形態において、他のプロセスは、L-リジン産生CorynebacteriumおよびBrevibacterium微生物からなる群から選択された親株に関し、そして本発明の最も好ましい実施形態は、アミノ酸L-リジンを産生するBrevibacteriumである親株に関する。本発明のプロセスは、さらに、本発明の微生物を培養する特定の方法のために、異なり得る。従って、種々の発酵技術が、当該分野で公知であり、アミノ酸の産生に関する本発明のプロセスに使用され得る。適切な炭素源の具体例としては、炭水化物例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖密;有機酸例えば、酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸ならびにアルコール例えば、グリセロールが挙げれるが、これらに限定されない。適切な窒素源の具体例としては、アンモニア気体アンモニアおよび液体アンモニアを含む;無機酸または有機酸のアンモニウム塩例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウム;ならびに他の窒素含有物食肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカーcornsteepliquor、カゼイン加水分解産物、大豆油粕soybeancake加水分解産物および酵母抽出物を含むが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、アミノ酸は、バッチ型またはフェッドバッチfed-batch型のような発酵プロセスにおいて、本発明から商業的に産生され得る。バッチ型発酵プロセスにおいて、すべての栄養分は、発酵の開始時に添加される。フェッドバッチまたは拡張フェッドバッチ型発酵において、1または多数の栄養分が、発酵の開始即座に、または培養が特定の熟度に達した後に、連続的に培地に添加されるか、または供給される栄養物が培養流体から消耗された場合に連続的に培地に添加される。フェッドバッチ型発酵の拡張バッチの変形は、反復フェッドバッチまたはフィルアンドドローfill-and‐draw発酵であり、ここで、例えば発酵槽が充満した場合に、栄養分の供給が続く間に、発酵槽の内容物の一部が、時折除去される。この方法において、発酵は長時間に及ぶ。発酵の別の型である、連続発酵またはケモスタット培養は、完全培地の連続供給を使用し、その間、培養流体は、発酵槽内の培養液の容量が、およそ一定であるような様式で、連続的または半連続的に取り除かれる。連続発酵は、原則的に時間制限なく維持され得る。バッチ発酵において、培地中の1つの必須の栄養物が消費されるまで、または発酵条件が好ましくなくなるまで例えば、微生物の増殖を阻害する値までの、pHの減少、生物は増殖する。フェッドバッチ発酵において、測定は、通常、好ましい増殖条件を維持するために例えば、pH制御の使用によって行われ、そして1以上の必須栄養物の消費は、これらの栄養物を培地に供給することによって防がれる。微生物は、栄養物供給の速度によって示される増殖速度で、増殖し続ける。一般的に、単一の栄養物頻繁には、炭素源が、増殖に対して限界となる。同じ原理を連続発酵に適用し、通常、培地供給中の1つの栄養物が限定され、すべての他の栄養物は過剰である。制限栄養物は、培養流体中に非常に低い濃度しばしば測定不可能に低いで存在する。異なる型の栄養物の制限が、使用され得る。炭素源の制限は、もっともよく使用される。他の例は、窒素源による限定、酸素による限定、特定の栄養分例えば、ビタミンまたはアミノ酸による限定微生物が、このような化合物を要求性である場合、硫黄による限定およびリンによる限定である。アミノ酸、特にL-リジンの回収および精製のための方法は、当業者に周知である。代表的には、アミノ酸は、細胞を除去するための遠心分離および濾過の後に、陽イオン交換によって、増殖培地から回収され得る。米国特許第5,684,190号は、以下に関与するL-リジンのようなアミノ酸の回収を記載する:1その等電点より低いpHで、アミノ酸を樹脂に吸着するための、第1陽イオン交換樹脂のアミノ酸含有水溶液の通過、続いて、第1溶液を生成するために水酸化アンモニウムを用いたpHの増加によるアミノ酸の溶出;および2さらに不純物を溶出するための類似の様式での、第2の陽イオン交換樹脂の第1溶液の通過。別の例は、米国特許第4、714、767号に記載され得、それは直列の陽イオン交換樹脂タワーを使用して、水溶液から塩基性アミノ酸を分離するプロセスを提供する。このプロセスは、順にそれぞれ吸着および溶出の工程を包含し、ここで吸着および溶出工程において使用される洗浄水は、第1のタワー吸着工程または続くサイクルの溶出工程から排出された溶液の後の部分を再利用することによって得られる。このような陽イオン交換単離手順から得た溶出液は、アンモニアの除去をさらに提供する、エバポレーションによって濃縮され得る。次いでアミノ酸は、塩酸を用いて、溶液から結晶化され得、例えばL-リジンHCl2H2Oを生成する。遠心分離または濾過後、単離されたLリジンの結晶を乾燥する。実施例実施例1.改良されたラフィネート耐性微生物の変異誘発、スクリーニングおよび選択より高い濃度のラフィネートによってその増殖が阻害されるリジン産生株例えば、T125、L58.23および96T116を、突然変異に供し、そしてより高い濃度のラフィネートに対する耐性を示す変異体を回収した。変異誘発について、細菌培養物を、培地Bにおいて中間の対数期まで増殖させ表1、遠心分離によってペレットにし、そして15mlのポリプロピレンコニカルチューブ内の2mLのフィルター滅菌されたTM緩衝液中Tris.HCL6.0g/L、マレイン酸5.8g/L、NH42SO41.0g/L、CaNO325mg/L、MgSO4.7H2O0.1g/L、FeSO4.7H2O0.25mg/L、KOHを使用してpH6.0に調整したに再懸濁した。2mLの細胞懸濁液を、N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンNTGの50μLの5.0mg/L溶液50μLと混合し、次いで、30°Cで30分間インキュベートした。未処理の細胞懸濁液を同様にコントロールとしてインキュベートし、死滅率を推定した。インキュベーション後、10mLのTM緩衝液を各チューブに添加し、そして細胞を遠心分離によってペレットにし、TM緩衝液で2度洗浄し、そして4.0mLの0.1MNaH2PO4リン酸緩衝液に再懸濁し、KOHを使用してpH7.2に調整した。洗浄した細胞懸濁液を、リン酸緩衝液にさらに希釈し、そしてアリコートを培地Aのプレートに広げた表1。30°Cで4~6日間インキュベートした後、培地A寒天上で増殖するコロニーを選び、そして振盪フラスコおよび発酵槽内のブドウ糖からL-リジンを産生する、改良された可能性について試験した。実施例2ラフィネート培地における株の増殖各試験株について表2、0.1mLの凍結培地を、20mLのラフィネート培地C表1を含む250mLのバッフルフラスコに接種し、次いで、30°Cで240rpmで、18時間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの培養物を取り出し、そして0.1NHCl溶液中に1:100の比に希釈した。分光光度計を用いて、希釈サンプルの光学密度ODを、660nmで測定した。結果を表2に示す。改良されたラフィネート耐性RFを有するすべての株、L63.148、L64.132、L69.53およびL69.74は、それらの親株、108T125、LS8.23および96T116よりも、ラフィネート培地C中で、優れて増殖したより高いOD。実施例3振盪フラスコ発酵槽におけるブドウ糖消費、増殖およびリジン産生各株について、0.1mLの凍結培地を、20mLの種培地Cを含む250mLのバッフルフラスコbaffledflaskに接種し、そして18時間30°Cで24rpmでインキュベートした。2mLの種培地を使用し、250mLバッフルフラスコ中に20mLの発酵培地Dを接種した。次いで、そのフラスコを、24時間30°Cかつ240rpmで振盪した。24時間の発酵後、サンプルを分析のために取り出した。ブドウ糖濃度を測定するために、100μLのサンプルを取り出し、そして脱イオンDI水を用いて1:50に希釈し、そしてYSI生化学分析機YellowSpringsInstrumentCo.Inc.を用いて測定した。L-リジン濃度を、HPLCにより決定した。光学密度測定を実施例2に記載されるように、増殖を測定するために行った。結果を表3に示す;すべてのラフィネート耐性株、L63.148、L64.132、L69.53およびL69.74は、優れて増殖し、ブドウ糖をより効率的に使用し、そしてL-リジンをそれらの親株、108T125、L58.23、および96T116よりも産生した。実施例4ベンチスケール発酵槽における増殖およびL-リジン産生2段階接種物プロトコルを使用してベンチスケール発酵槽を作動した。第1段階の培地は、50.0g/lスクロース、3.0g/lK2HPO4、3.0g/l尿素、0.5g/lMgSO4-7H2O、30.0g/lダイズペプトン、5.0g/l酵母抽出物、0.765mg/lビオチン、3.0mg/lチアミンHCl、および0.125g/lナイアシンアミドからなる。500mlのこの培地を含む2リットルのバッフルフラスコに、培養物を接種し、そして30°Cかつ250rpmで19時間インキュベートした。この時点で、22.5mlの成熟第1培養物を使用し、第2段階接種物培地をインキュベートした。第2段階接種物を、3000mlの培地を用いて、6.6リットルの発酵槽内に調製した。培地処方は、20.2g/ldbコーンステープリカーcornsteepliquior、ラフィネートとしての10.0g/l硫酸アンモニウム、12.0mg/lMnSO4-H2O、3.0mg/lビオチン、3.0g/lチアミンHCl、125mg/lナイアシンアミド、0.5ml/l消泡剤、および60g/lブドウ糖であり、360g/l溶液として別に滅菌され、そして接種のすぐ前に発酵槽に添加される。発酵槽を32°C、1.2vvm空気、600rpm、および7.2のpH制御点で操作した。pH制御を、NH3またはNH4OHの添加によって達成した。18~20時間後、接種物が成熟したと考え、そして産生段階容器に接種した。産生段階培地は、40g/ldbコーンステープリカー、ラフィネートとしての20g/l硫酸アンモニウム、12.0mg/lMnSO4-H2O、0.75ml/l消泡剤および12g/lブドウ糖からなり、250g/l溶液として別に滅菌され、そして接種のすぐ前に添加される。培地処方は、500mlの成熟第2段階培養液を、接種物として含む2.1リットルの開始容量に基づく。パラメーターの操作は以下のようである:32°C、2.1vvm空気、および7.2の開始および制御点pH。pH制御を再び、NH3またはNH4OHを用いて行った。攪拌を初めに600rpm、9時間の培養時間で700rpmに増加し、そして19時間の培養時間で900rpmに増加した。ブドウ糖の消費に起因する、pH増加によって示される場合、発酵に、必要に応じてブドウ糖および硫酸アンモニウムを供給した。供給物を、2310gのブドウ糖および800mlの水、ならびに合計176gの硫酸アンモニウムを含むラフィネートの量を、別に滅菌することによって調製し、次いで、2つの溶液を混合し、室温まで冷却した。合計発酵時間は、48時間であった。容器のサイズは、第2段階接種の発達に使用したサイズと同じであった。ベンチスケール発酵において、上記の単離物と親株とを比較した実験の結果を表4に示す。実施例5ラフィネートの産生上記のように、ラフィネートは、ラフィネートが単離された発酵培地において産生される特定のアミノ酸によって定性的に特徴付けられ得る。本明細書中で提供される例は、リジンラフィネートの産生のための例である。しかし、当業者は、他の型のラフィネート例えば、バリン-ラフィネート、またはイソロイシン-ラフィネートなどが、単に適切な発酵培地例えば、バリンまたはイソロイシン発酵培地などを用いて開始することによって、同様に産生され得ることを知り得る。リジン-ラフィネートの産生における第1工程として、リジン発酵増殖培地は、65.5g/lのリジン濃度まで希釈される。限外濾過して40.3g/lのリジン濃度を有する透過物を生成した後、次いで透過物を207g/lの合計乾燥固体濃度を有する123g/lリジンまで濃縮する。次いで、透過物の濃縮物を、クロマトグラフィー分離システム例えば、AdvancedSeparationTechnologiesIncorporatedSt.Petersburg,FLにより製造されるI-またはC-に供給する。イオン交換クロマトグラフィー分離システムは、米国特許第4、808、317号および同第4,764,276号これらは本明細書中で、参考として援用されるに例証されるように、当該分野で一般的に公知である。そこから得られる廃棄溶出液は、希釈リジン-ラフィネート溶液であると考えられる。希釈リジン-ラフィネートは、5.1のpHを有し、そして34.3g/l硫酸アンモニウムおよび総固体レベル67g/lを有する2.8g/lリジンを含む。希釈リジン-ラフィネート溶液を、295g/l総固体まで濃縮する。この濃縮リジン-ラフィネートの定量化成分は、以下を含む:137.9g/l硫酸アンモニウム、14.8g/lリジン、8.7g/lバリン、8.1g/lアラニン、2.4g/l乳酸および2.2g/l酢酸。この濃縮リジン-ラフィネート溶液を培地調製に使用する。表以下の表を、実施例の節において参照する。表1実施例1、2、および3において使用された培地1.コーンステープリカーの量を、培地1リットルあたりの乾燥固体グラムとして表す。2.ラフィネートの量を、培地1リットルあたりの硫酸アンモニウムのグラムとして表す。表2ラフィネートを含む培地Cにおける株の増殖1.108T125株、L58.23株および96T116株は、親株かつ野生型株であり、それらを使用して、本発明の改良された耐性株を産生する。2.L63.148株、L64.132、L69.53株およびL69.74株は、改良されたラフィネート耐性RF株であり、それらは、記載されたそれらの野生型親株に由来する。表3培地D内で24時間の振盪フラスコ発酵における株のブドウ糖消費Dex、増殖OD660、およびリジン産生Lys表46.6lの発酵槽内での、増殖OD660およびL-リジン産生の親および子孫の比較1.総産物は、収穫時の発酵槽におけるリジンの合計グラムを表す。2.計算は、初めの2.1リットル容量に基づく。"