"アスペルギルステレウス由来のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼを大腸菌で組換え生産する方法であって、アスペルギルステレウス由来の野生型FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼから、寄託番号NBRC33026として登録されているアスペルギルステレウス由来のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のN末端領域に存在するMLGKLSFLSALSLAVAAのアミノ酸配列領域を含むシグナルペプチドを削除した変異型FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌で発現させることを特徴とする方法。アスペルギルステレウス由来の野生型FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼから、寄託番号NBRC33026として登録されているアスペルギルステレウス由来のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列のN末端領域に存在するMLGKLSFLSALSLAVAAのアミノ酸配列領域を含むシグナルペプチドを削除した変異型FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とするDNA。本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を提供することである。より具体的には、基質特異性ばかりでなく、生産コストの優れた糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼGDHを大量に取得し、利用することにある。本発明者らは、上記目的を達成するために、まず、アスペルギルスオリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定取得した。そして、該遺伝子を用いて大腸菌よりアスペルギルスオリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。また、ゲノム情報からアミノ酸配列を推定し、該アミノ酸配列のN末端領域にシグナルペプチドと思われるアミノ酸配列が存在することを見出した。シグナルペプチドは、ペリプラズム空間への移行シグナルとなり、該空間のスペース上、発現量に制限が生じる可能性が危惧されたので、該シグナルペプチドの機能を欠失させる検討を行ったところ、GDHの生産性が約10倍向上して、生産コストを1/10に抑えることが可能となった。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。1糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ以下GDHとも記載を組換え生産する方法において、そのN末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするGDHの生産方法。2糸状菌由来のGDHを組換え生産する方法において、そのN末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする1記載のGDHの生産方法。3配列番号2、4のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのN末端に存在するMLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めることを特徴とする1記載のGDHの生産方法。4配列番号2、4のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのN末端に存在するMLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列に、1~22個のアミノ酸置換または/及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする1記載のGDHの生産方法。5糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼのN末端に存在するMLGKLSFLSALSLAVAATLSNSTSAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、1~25個のアミノ酸置換または/及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする1記載のGDHの生産方法。6糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼGDHにおいて、そのN末端に存在するシグナルペプチドをコードするDNA配列の一部、あるいは全てを置換または/及び欠損させたGDH遺伝子をコードする1~5のいずれかの生産方法に使用されるDNA配列。76のDNA配列を含んでなる組換えベクター。87に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。98に記載の形質転換体を用いて生産したGDHタンパク質。109に記載のGDHタンパク質を含む組成物。1110に記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。1211に記載の組成物を含むグルコースセンサ。本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。本発明によれば、アスペルギルス属、またはペニシリウム属より単離したグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子からアミノ酸配列を推定し、シグナルペプチド領域を予測して、シグナルペプチドの一部または全部をコードするDNA配列を欠失させたり、シグナルペプチドをコードされたアミノ酸配列にアミノ酸置換やアミノ酸挿入を施すことにより、組換え体にてグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産させることができ、かつ、産業利用の観点からより実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。本発明の一実施形態は、糸状菌由来のGDHを組換え生産する方法において、そのN末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするGDHの生産方法である。本発明者らは、大収量のGDHタンパク質を取得するために鋭意努力した結果、上記目的を達成するために、まずその改変の元になる遺伝子DNAとして、先の発明でアスペルギルスオリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ以下GDHと示すと推測される遺伝子DNAを見出している。本発明者らは、NCBIのデータベースを利用し、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ以下GDHと示すと推測される遺伝子DNAを見出した。本発明者らは、非特許文献1~4、NCBIのデータベースなどから、GDH活性を有するタンパク質をコードするDNA遺伝子の同定は容易になしうると予想していた。そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献1~4に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルスオリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてGDHを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、GDHをコードする遺伝子を単離することを試みた。本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルスオリゼ培養上清から、高純度で、SDS-PAGE上ではっきりと確認できるGDH標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の1つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の1つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルスオリゼ由来のGDHをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。また、本発明者らは他起源のGDH遺伝子の取得についても種々検討し、ペニシリウム属Penicilliumlilacinoechinulatum由来のGDHをコードする遺伝子、およびアスペルギルステレウス由来のGDHをコードする遺伝子を単離した。その詳細も実施例に後述する。本発明の遺伝子DNAは本GDHの発現をさらに向上させるように、コドンユーセージCodonusageを変更したものを含みうる。シグナルペプチドは、成熟型タンパク質のN末端に残基数15~30個に及ぶ延長ペプチドとして存在する。該ペプチド配列中には、疎水性アミノ酸領域を持ち、新生ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過に先導役を務め、膜通過後は切断されるものである。本発明における糸状菌由来のGDH組換え体は特に限定されるものではないが、アスペルギルス属やペニシリウム属などをGDH遺伝子の供給源としたGDH組換え体が例示できる。好ましくはアスペルギルス属のGDHであり、さらに好ましくはアスペルギルスオリゼである。最も好ましくは配列番号4、10のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するGDHが例示できる。これらGDH組換え体は、該GDHをコードする遺伝子をPCR法にて入手し、この遺伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてEDTAなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化してGDHを含む水溶性画分として得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したGDHを直接培養液中に分泌させることができる。本発明においては、GDHのN末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することによりシグナルペプチドの機能を低下させることができる。例えば、配列番号4に記載されたアミノ酸配列を有するGDHでは、そのN末端に存在するMLFSLAFLSALSLATASPAGRAのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除することによりシグナルペプチドの機能を低下することができる。あるいは、1~22個のアミノ酸置換または/及びアミノ酸挿入を行うことによっても可能である。具体的な置換位置は例えばシグナルペプチド切断部が例示できる。好ましくはシグナルペプチドのC末端に相当するアラニンを他のアミノ酸に置換することにより、機能を低下させることができる。該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液1mlあたりの総活性値を比較して確認することができる。また、シグナルペプチド配列の改変は、エドマン分解を用いたN末端アミノ酸シーケンスにより確かめることができる。N末端領域に存在するシグナルペプチドの機能を欠失することにより、GDHタンパク質の発現量が向上することを見出した。シグナルペプチドの予測ツールとしては、PSORT、SignalPソフトがよく利用されている。それぞれ、webにてpsort.nibb.ac.jp/、あるいはwww.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/のアドレスから利用することができる。SignalPソフトを用いて、アスペルギルスオリゼ由来のGDH遺伝子から推定されたアミノ酸配列配列番号2のシグナルペプチド切断位置を予測したところ、16番目のアラニンと17番目のセリンの間、あるいは22番目のアラニンと23番目のリジンの間で切断される可能性が高いと予想された図1。例えば、アスペルギルスオリゼ由来のGDH遺伝子を発現用ベクタープラスミド等多くのものが当該技術分野において知られているに挿入し、適当な宿主大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られているに形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてEDTAなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、GDHを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したGDHを直接培養液中に分泌させることができる。上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたFADGDHを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動SDS-PAGE的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。aタンパク質実験プロトコール第1巻機能解析編,第2巻構造解析編秀潤社西村善文,大野茂男監修b改訂タンパク質実験ノート上抽出と分離精製洋土社岡田雅人,宮崎香編集cタンパク質実験の進めかた洋土社岡田雅人,宮崎香編集あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。本発明はさらに、GDHをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。作製されたタンパク質の遺伝情報を有するDNAは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒアコリーEscherichiacoliを宿主微生物とする場合にはpBluescript,pUC18などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒアコリーW3110、エシェリヒアコリーC600、エシェリヒアコリーJM109、エシェリヒアコリーDH5αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル例えば、コンピテントハイDH5α;東洋紡績製を用いても良い。このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、PCR法の利用により、GDH遺伝子を含むDNA断片を得ることも可能である。本発明において、糸状菌由来GDHをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。まず、アスペルギルスオリゼのGDH遺伝子の配列情報を参照し、目的とする糸状菌の予測GDH遺伝子を取得することができる。該糸状菌よりmRNAを調製し、cDNAを合成する。こうして得られたcDNAをテンペレートとして、PCR法によりGDH遺伝子を増幅させ、該遺伝子をベクターと両DNAの平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してGDHをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。GDH遺伝子の塩基配列は、Science,第214巻,12051981に記載されたジデオキシ法により解読した。また、GDHのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。上記のようにして、一度選択されたGDH遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、GDH遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法によりGDH遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。なお、本発明のGDH遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなDNA配列を持つものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなDNA配列を持つものでもよい。野生型GDHをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するDNAが作成される。DNA中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキットTransformerMutagenesisKit;Clonetech製,EXOIII/MungBeanDeletionKit;Stratagene製,QuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit;Stratagene製などの使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法PCRの利用が挙げられる。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては,微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が成育し、GDHを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは20~37°C程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、GDHが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は6~48時間程度である。糸状菌由来GDHの組換え体の培養においては、培地のpHを制御することが特に重要であり、pH7.1~7.3以下に制御することが望ましく、pH6.0~7.3の範囲で制御して培養することが特に好ましい。この様にpHを制御して培養することにより、糸状菌GDHタンパク質を大量に調製することが可能になる。しかしながら、糸状菌由来のGDHは、pH7.0以下の酸性域では高い安定性を保持するが、pH7.1~7.3以上では不安定となり、急速な活性低下が見られる。したがって本発明においては、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素GDHを組換え生産において、培養時のpHを7.3以下に制御することが好ましい。糸状菌由来GDH組換え体の培養生産時においては、この活性低下割合が、pHが0.2高くなることにより、元の活性値と比べて10以上低下しており、GDHによっては最大で30程度も低下していた。そこで、本特許においては、pHが0.2上昇することにより、元の活性値と比べて10以上が低下する現象における活性低下前の培養液のpHの値以下、具体的には、7.3以下、好ましくは7.1以下でpH制御することの有効性を推測し、実際に検討して確認した。組換え体の培養において、菌体の死滅や目的タンパク質の分解を懸念して、pH制御することは一般的に行われているが、通常は中性域のpHを保つことが一般的であり、糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼのように中性以下のpH制御の必要性を説いた例はない。培養物中のGDHを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、GDHが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、GDH含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。GDHが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、EDTA等のキレート剤及び界面活性剤を添加してGDHを可溶化し、水溶液として分離採取する。上記のようにして得られたGDH含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたGDHを得ることができる。例えば、セファデックスSephadexゲルファルマシアバイオテクなどによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6Bファルマシアバイオテク、オクチルセファロースCL-6Bファルマシアバイオテク等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動SDS-PAGE的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。試験例本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。<試薬>50mMPIPES緩衝液pH6.50.1TritonX-100を含む14mM2,6-ジクロロフェノールインドフェノールDCPIP溶液1MD-グルコース溶液上記PIPES緩衝液15.8ml、DCPIP溶液0.2ml、D-グルコース溶液4mlを混合して反応試薬とする。<測定条件>反応試薬2.9mlを37°Cで5分間予備加温する。GDH溶液0.1mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37°Cに制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化ΔODTESTを測定する。盲検はGDH溶液の代わりにGDHを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化ΔODBLANKを測定する。これらの値から次の式に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位Uとは、濃度200mMのD-グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義している。活性U/ml={-ΔODTEST-ΔODBLANK×3.0×希釈倍率}/16.3×0.1×1.0なお、式中の3.0は反応試薬酵素溶液の液量ml、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数cm2/マイクロモル、0.1は酵素溶液の液量ml、1.0はセルの光路長cmを示す。以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA遺伝子は、NCBIのデータベースから予測される、アスペルギルスオリゼRIB40株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするDNA遺伝子を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列からイントロンを除去したものである。配列番号2はその対応アミノ酸配列である。配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、NCIBのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。配列番号3に記載の塩基配列からなるDNA遺伝子は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルスオリゼTI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA遺伝子の全配列を示す。配列番号4はその対応アミノ酸配列である。また、配列番号3に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA遺伝子も、本発明の適用範囲に含まれる。配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルスオリゼTI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA遺伝子の全配列を示す。また、配列番号4に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加挿入されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA遺伝子も、本発明の適用範囲に含まれる。後述の実施例に記載される、アスペルギルスオリゼGDH遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。アスペルギルスオリゼ由来GDH遺伝子を取得するために、アスペルギルスオリゼ、アスペルギルステレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてGDHの精製を試みたが、高純度のGDHを得るのは困難であった。実験例1[1]よって、遺伝子取得の常法の1つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。そこで、我々はGDHを生産する微生物を上記以外に求め、鋭意探索した結果、PenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231株がGDHを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。実験例1[2]次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、PCR法により、PenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231由来GDH遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した1356bp。実験例1[3][4]最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルスオリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルスオリゼGDH遺伝子を推定実験例1[5]、取得した。<実験例1>アスペルギルスオリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ以下AOGDHとも記載遺伝子の推定[1]アスペルギルスオリゼ由来GDHの取得アスペルギルスオリゼは、土壌より入手し定法に従ってL乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下、これをアスペルギルスオリゼTI株と呼ぶ。アスペルギルスオリゼTI株のL乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地Difco製に植菌し、25°Cでインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して、フィルター滅菌水に懸濁した。2基の10L容ジャーファーメンター中に生産培地1麦芽エキス、1.5大豆ペプチド、0.1MgSO47水和物、2グルコース、pH6.56Lを調製し、120°C15分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、30°C、通気攪拌培養を行った。培養開始から64時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してGDH活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜分子量10,000カットにより低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを60飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりGDHを含む上清画分を回収した後、Octyl-Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度60~0でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。得られたGDH溶液を、G-25-Sepharoseカラムを用いて脱塩を行った後、60飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをPhenyl-Sepharoseカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度60~0でグラジエント溶出してGDH活性のある画分を回収した。更にこれを50°Cで45分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製GDH標品AOGDHとした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として20mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5を使用した。さらに、AOGDHの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルステレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Octyl-sepharose等による精製を試みたが、アスペルギルスオリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、SDS-PAGE上ではっきりと確認できるGDH標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなっているのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の1つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。[2]ペニシリウム属糸状菌由来GDHの取得ペニシリウム属糸状菌由来のGDH生産菌としてPenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入を用い、上記アスペルギルスオリゼTI株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、SDS電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。[3]cDNAの作製PenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231について上記方法に従いただしジャーファーメンターでの培養時間は24時間培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル東洋紡社製を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールRNAIナカライテスク社製を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルRNAを抽出した。得られたトータルRNAからはOrigotex-dt30第一化学薬品社製をもちいてmRNAを精製し、これをテンプレートにReverTra-Plus-TM東洋紡社製を用いてRT-PCRを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長0.5~4.0kbに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からMagExtractor-PCRGelCleanUp-東洋紡社製を用いてcDNAを抽出精製してcDNAサンプルとした。[4]GDH遺伝子部分配列の決定上記で精製したPenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231由来GDHを0.1SDS、10グリセロールを含有するTris-HClバッファーpH6.8に溶解し、ここにGlu特異的V8エンドプロテアーゼを終濃度10μg/mlとなるように添加し、37°C16時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度16のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー1.4グリシン、0.3トリス、20エタノールを用いてセミドライ法によりPVDF膜に転写した。PVDF膜上に転写したペプチドはCBB染色キットPIERCE社製GelCodeBlueStainReagentを用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分2箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はIGGVVDTSLKVYGT配列番号15およびWGGGTKQTVRAGKALGGTST配列番号16であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、PenicilliumlilacinoechinulatumNBRC6231由来cDNAをテンプレートにPCRを実施したところ、増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ、1.4kb程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製MagExtractor-PCRGelCleanUp-を用いて抽出精製した。精製DNA断片はTArgetClone-Plus-東洋紡社製によりTAクローニングし、得られたベクターで大腸菌JM109コンピテントセル東洋紡社製をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてMagExtractor-Plasmid-東洋紡社製を用いてプラスミドをミニプレップ抽出精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した1356bp。[5]AOGDH遺伝子の推定決定した塩基配列を元にNCBIBLASTのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/からホモロジー検索を実施し、AOGDH遺伝子を推定した。検索により推定したAOGDHとP.lilacinoechinulatumNBRC6231由来GDH部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は49であった。<実施例1>アスペルギルスオリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ以下AOGDHと示す遺伝子の大腸菌への導入AOGDH遺伝子を、アスペルギルスオリゼの菌体よりmRNAを調製し、cDNAを合成した。配列番号5,6に示す2種類のオリゴDNAを合成し、調製したcDNAをテンプレートとしてKOD-Plus東洋紡績製を用いてAOGDH遺伝子野生型増幅した。DNA断片を制限酵素NdeI、BamHIで処理し、pBluescriptLacZの翻訳開始コドンatgに合わせNdeI認識配列のatgを合わせる形でNdeIサイトを導入したものNdeI-BamHIサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイDH5α東洋紡績製を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、AOGDH遺伝子の塩基配列の決定を行った配列番号3。cDNA配列から推定されるアミノ酸残基は593アミノ酸配列番号4であった。シグナルペプチド切断後のFAD-GDHをmFAD-GDHとした場合、mFAD-GDHのN末端にMのみ付加してmFAD-GDHのN末端が1アミノ酸分のびた形態となっているものをS2と表現した。また、mFAD-GDHのN末端のKをMにアミノ酸置換して、mFAD-GDHとアミノ酸総数を同じにしたものをS3と表現した。S2では、配列番号7のオリゴヌクレオチドをN末端側プライマーとして、配列番号6のプライマーとの組合せでPCRを行い、同様の手順で、S2をコードするDNA配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。S3では、配列番号8のオリゴヌクレオチドをN末端側プライマーとして、配列番号6のプライマーとの組合せでPCRを行い、S3をコードするDNA配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。なお、それぞれの改変FAD-GDHのDNA配列を持つプラスミドは、DNAシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。配列番号9は、上記で決定したシグナルペプチド欠質変異体S2のDNA配列を示す。配列番号10はその対応するアミノ酸配列を示す。これら形質転換体をTB培地にて10L-ジャーファーメンターを用いて1~2日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してGDH活性を確認した。各種形質転換体の培養フェーズとOD,pH,GDH活性の関係を表1,2,3および図2,3,4に示す。なお、アスペルギルスオリゼ野生株を液体培地1麦芽エキス、1.5大豆ペプチド、0.1MgSO47水和物、2グルコース、0.05mMp-ベンゾキノン、0.1mMEDTA、pH6.5にて、10L-ジャーファーメンターを用いて30°C、1日間培養し、菌体内あるいは菌体外の活性を確認したところ、いずれも約0.2U/ml培養液程度のGDH活性であった。なお、本特許においては、1ml培養液あたりのGDH活性量を比較することにより発現量の比較を行っている。野生型FAD-GDHWTでは、培養16~18時間でピーク6.6U/ml-bが見られ、以後活性の低下が見られた。一方、改変型FAD-GDHのS2では22~25時間目72~73U/ml-b、S3では20~23時間目74~75U/ml-bでピークが見られ、WTと同様にその後は、GDH活性の低下が見られた。それぞれのピークにおける培養力価を比較したところ、シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのGDH生産性が10倍以上増大することが明らかにされた。また、シグナルペプチドの削除前後でFADGDH精製標品の比活性U/mgを比較したところ、野生型FADGDHWT270U/mgのところ、削除後の改変型FADGDHのS2では670U/mgであり、比活性が2.5倍増大していた。シグナルペプチドを削除することにより比活性も増大することが示唆されている。比活性の増大を考慮しても、少なくとも4.4倍は活性量が増大しているものと思われる。さらに我々は鋭意検討の結果、糸状菌由来のFAD-GDHは、pH7.1以上のpH域において、その安定性が低下することを発見した。そして今回の検討で、糸状菌由来FAD-GDHの組換え体での生産培養において、pH7.1~7.3以下、好ましくはpH7.1以下でpH制御を行うことが如何に大切であるかが明らかにされた。なお、当該pH以下となるように培養制御を入れることによりGDH活性のピークが保てることを確認している。また、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ以下GDHとも記載を組換え生産する方法において、そのN末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入したものでは、培養制御pHを7.3まで上げることができる。<実施例2>アスペルギルステレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼ以下ATGDHと示す遺伝子の大腸菌への導入ATGDH遺伝子を、アスペルギルステレウスの菌体寄託番号NBRC33026として製品評価技術基盤機構生物資源部門に登録されている。よりmRNAを調製し、cDNAを合成した。配列番号13,14に示す2種類のオリゴDNAを合成し、調製したcDNAをテンプレートとしてKOD-Plus東洋紡績製を用いてATGDH遺伝子予想シグナルペプチド配列を除去した遺伝子配列を増幅した。DNA断片を制限酵素NdeI、BamHIで処理し、pBluescriptLacZの翻訳開始コドンatgに合わせNdeI認識配列のatgを合わせる形でNdeIサイトを導入したものNdeI-BamHIサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイDH5α東洋紡績製を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ATGDH遺伝子の塩基配列の決定を行った配列番号11。cDNA配列から推定されるアミノ酸残基は568アミノ酸配列番号12であった。これら形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地にて30°C,1晩培養した後、再度、100μg/mlのアンピシリンを含む50mlのLB培地にて30°C,8時間培養して種菌を調製した。調製した種菌を、100μg/mlのアンピシリンを含むTB培地にて、KdP0.5~1.5の範囲で10L-ジャーファーメンターにて6日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してGDH活性を確認した。培養フェーズとOD,pH,GDH活性の関係を表4,5,6,7および図4,5,6,7に示す。なお、アスペルギルステレウス野生株を液体培地1麦芽エキス、1.5大豆ペプチド、0.1MgSO47水和物、2グルコース、0.05mMp-ベンゾキノン、0.1mMEDTA、pH6.5にて、10L-ジャーファーメンターを用いて30°C、1日間培養し、菌体内のGDH活性を確認したところ、約0.1U/ml培養液がピークであった。一方、FAD-GDH組換え体では、ピークで約9~21U/ml-bの活性が見られ、100~200倍程度の培養力価の増大が認められた。また、培養条件を検討したところ、KdPを0.5と低く設定することにより、KdP0.75の時の約1.5倍、KdP1~1.5の時の約2倍の培養力価が認められた。なお、KdPを2以上に設定した場合には、培養力価が約5U/ml-b以下となることを確認している。培養温度に関しては、培養フェーズとOD,pH,GDH活性の関係を表8,9,10,11および図8,9,10,11に示す。培養温度は26~28°Cが最適であり、少なくとも23~28°Cで培養する必要があり、29°Cよりも高い温度にて培養した場合、培養力価が半減する傾向が認められた。ATGDH遺伝子組換え体の培養においても、培養液のpHを7.3以下に保つことが酵素活性を安定に保つために非常に重要であり、ATGDHにおいては、AOGDHよりも、むしろ低いpHで培養を終了することが必要になるようであった。なお、ATGDH遺伝子は、アスペルギルステレウス由来FAD-GDHをコードするDNA配列から予想されるシグナルペプチドMLGKLSFLSALSLAVAATLSNSTSA配列番号17配列部分のDNAを切除したものである。シグナルペプチド配列を含むものは、A.オリゼ由来FAD-GDHと同様、FAD-GDHの発現量が乏しかったため、当初からシグナルペプチドを含まないものを用いて培養の検討を行なっている。表1~表3は、各種変異体の10Lジャーファーメンター培養における培養フェーズと培養液の菌体濁度OD、pH、GDH活性値の関係を示す。表1は図2に、表2は図3に、表3は図4にそれぞれ対応する。表4~表7は、10Lジャーファーメンター培養における夫々KdP0.5、0.75、1、1.5における培養フェーズと培養液の菌体濁度OD、pH、GDH活性値の関係を示す。表4は図5に、表5は図6に、表6は図7に、表7は図8にそれぞれ対応する。表8~表11は、10Lジャーファーメンター培養における夫々培養温度20、23、26、30°Cにおける培養フェーズと培養液の菌体濁度OD、pH、GDH活性値の関係を示す。表8は図9に、表9は図10に、表10は図11に、表11は図12にそれぞれ対応する。"