試料からクロマチンを単離するための方法であって、クロマチンを含む液体試料を、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスに通す段階を含み、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合する、前記方法。前記硬質多孔性マトリックスが、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む、請求項1記載の方法。前記硬質多孔性マトリックスが、フィルタディスク又はフリットの形態である、請求項1又は2記載の方法。前記硬質多孔性マトリックスが、分離カラム内に収容される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。前記硬質多孔性マトリックスが、スピンカラム内に収容される、請求項4記載の方法。前記カラムが、疎水性マトリックスをさらに備える、請求項4又は5記載の方法。前記液体試料が、遠心分離、重力又は減圧で、前記硬質多孔性マトリックスから吸引される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。前記液体試料が、免疫グロブリンが結合されるクロマチンを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。前記リガンドが、抗体、プロテインA、又はプロテインGを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。請求項1~9のいずれか一項に記載の方法であって、前記硬質多孔性マトリックスに洗浄溶液を通す段階、会合されたタンパク質から、前記マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を分離する段階、及び、前記マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を検出する段階から選択される、1以上の段階をさらに含む、前記方法。分離カラムであって、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスとを備え、該リガンドが、クロマチンと会合したタンパク質に結合することができ、かつ、該液体試料を該硬質多孔性マトリックスに通すことができるように、該硬質多孔性マトリックスが該室内に位置する、前記分離カラム。前記硬質多孔性マトリックスが、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む、請求項11記載の分離カラム。前記硬質多孔性マトリックスが、フィルタディスク又はフリットの形態である、請求項11又は12記載の分離カラム。請求項11~13のいずれか一項に記載の分離カラムであって、前記硬質多孔性マトリックスが、該カラムの流出口の上に位置し、このため、前記室で保持された液体試料が、前記硬質多孔性マトリックスを通って、該カラムから流出することができ、これによって、前記硬質多孔性マトリックスにクロマチンが結合することにより、前記液体試料からクロマチンを単離する、前記分離カラム。前記硬質多孔性マトリックスを通して、前記カラムから流出した液体を受け取るための回収容器をさらに備える、請求項11~14のいずれか一項に記載の分離カラム。疎水性マトリックスをさらに備える、請求項11~15のいずれか一項に記載の分離カラム。前記疎水性マトリックスが、前記硬質多孔性マトリックスと前記カラムの流出口との間に位置する、請求項16記載の分離カラム。スピンカラムである、請求項11~17のいずれか一項に記載の分離カラム。前記リガンドが、免疫グロブリン、プロテインA、又はプロテインGを含む、請求項11~18のいずれか一項に記載の分離カラム。キットであって、請求項11~19のいずれか一項に記載の分離カラムと、クロマチン免疫沈降アッセイを行うのに適した、1以上のバッファー、溶液又は試薬と、を備える、前記キット。液体試料からクロマチンを単離するための、請求項11~19のいずれか一項に記載の分離カラムの使用。前記分離カラムが、クロマチン免疫沈降アッセイに使用される、請求項20に記載の使用。前記硬質多孔性マトリックスが、化学酸化によって生成された改質表面を備える、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。前記改質表面が、1以上の酸化酸による処理によって生成される、請求項23記載の方法。複数の硬質多孔性マトリックスを備えるアレイが備えられ、かつ、それぞれの複数の液体試料が、該アレイ中の硬質多孔性マトリックスを通る、請求項1~10、23又は24のいずれか一項に記載の方法。前記アレイがマルチウェルプレートを備え、該プレート内のそれぞれのウェルが、請求項4記載の分離カラムを備える、請求項25記載の方法。前記硬質多孔性マトリックスが、化学酸化によって生成された改質表面を備える、請求項11~19のいずれか一項に記載の分離カラム。前記改質表面が、1以上の酸化酸による処理によって生成される、請求項27記載の分離カラム。請求項11~19、27又は28のいずれか一項に記載の分離カラムを複数備える、アレイ。マルチウェルプレート又はろ過マイクロプレートの形態である、請求項29記載のアレイ。したがって、上述の課題の1以上を対処する、改良されたクロマチン免疫沈降アッセイ法の必要性がある。特に、感度が良く、特異的で、使用するのに便利な、試料からクロマチンを単離するための方法及び製品の必要性がある。概要したがって、一実施態様において、本発明は、試料からクロマチンを単離するための方法であって、該方法は、クロマチンを含む液体試料を、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスに通すことを含み、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合する、方法を提供する。該硬質多孔性マトリックスは、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含むことが好ましい。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、フィルタディスク又はフリットの形態である。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を備える。該改質表面は、1以上の酸化酸による処理によって生成されることが好ましい。該硬質多孔性マトリックスは、たとえば、分離カラム好ましくはスピンカラム内に収容される。一実施態様において、該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備える。該液体試料は、遠心分離、重力又は減圧で、該硬質多孔性マトリックスから吸引されることが好ましい。一実施態様において、該液体試料は、免疫グロブリンが結合されるクロマチンを含む。該リガンドは、たとえば、抗体、プロテインA、又はプロテインGを含んでいてもよい。該方法は、硬質多孔性マトリックスに洗浄溶液を通す段階、会合されたタンパク質から、該マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を分離する段階、及び、該マトリックスに結合されたクロマチン中に含まれる核酸を検出する段階から選択される、1以上の段階をさらに含むことが好ましい。一実施態様において、複数の硬質多孔性マトリックスを備えるアレイが備えられ、かつ、それぞれの複数の液体試料は、該アレイ中の硬質多孔性マトリックスを通る。該アレイはマルチウェルプレートを備え、該プレート内のそれぞれウェルは、上に定義するような分離カラムを備えることが好ましい。別の態様において、本発明は、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、リガンドが固定された硬質多孔性マトリックスとを備える、分離カラムを提供し、該リガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合することができ、かつ、該液体試料を該硬質多孔性マトリックスに通すことができるように、該硬質多孔性マトリックスが該室内に位置する。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含むことが好ましい。該硬質多孔性マトリックスは、フィルタディスク又はフリットの形態であることが好ましい。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を備える。該改質表面は、1以上の酸化酸による処理によって生成されることが好ましい。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、該カラムの流出口の上に位置する。該室で保持された液体試料は、該硬質多孔性マトリックスを通って、該カラムから流出できることが好ましく、これによって、該硬質多孔性マトリックスにクロマチンが結合することにより、該液体試料からクロマチンを単離することができる。一実施態様において、該カラムは、該硬質多孔性マトリックスを通して、該カラムから流出した液体を受け取るための回収容器をさらに備える。該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備えていてもよい。該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと該カラムの流出口の間に位置することが好ましい。一実施態様において、該分離カラムはスピンカラムである。該リガンドは、免疫グロブリン、プロテインA、又はプロテインGを含むことが好ましい。さらなる態様において、本発明は、上に定義するような複数の分離カラムを備えたアレイを提供する。該アレイは、マルチウェルプレート又はろ過マイクロプレートの形態であることが好ましい。さらなる態様において、本発明は、上に定義するような分離カラムと、クロマチン免疫沈降アッセイを行うのに適した、1以上のバッファー、溶液又は試薬とを備えるキットを提供する。さらなる態様において、本発明は、液体試料からクロマチンを単離するための、上に定義するような分離カラムの使用を提供する。通常、該分離カラムは、クロマチン免疫沈降アッセイに使用される。本発明の実施態様は、有利に、高い特異性及び感度によって、試料からクロマチン断片の単離を可能にする。さらに、硬質多孔性マトリックスに試料を通すことによって、該方法は、アガロース又は磁性ビーズを使用する従来法よりも、使用において非常に便利である。詳細な説明一態様において、本発明は、試料からクロマチンを単離する方法に関する。クロマチンを単離するとは、通常、クロマチンが、マトリックスに結合するようになることたとえば、クロマチンが、液体試料から都合よく分離されることができるようにを意味する。クロマチンクロマチンは、DNA及びタンパク質主に、ヒストンの複合体からなり、真核細胞でみられる染色体を構成する。クロマチンは、ユークロマチンとヘテロクロマチンの2つの状態で生じ、これらは異なる染色性であり、また、クロマチンは、細胞分裂中に巻き付き、折り畳まれて、中期染色体を形成する。クロマチンは、染色体又は他のクロマチン調製物の断片化によって生じたクロマチン断片を含む、核酸通常、DNA及び会合されたタンパク質のいずれかのかかる複合体を言及するのに本明細書で使用される。クロマチン免疫沈降通常、クロマチン免疫沈降アッセイの一部として、該方法は行われる。クロマチン免疫沈降アッセイという用語は、当業者に周知であり、少なくとも次に示す段階を含むことが好ましい。すなわち、細胞からの分析されるクロマチンを含む液体試料の調製、抗体を使用するマトリックス上への液体試料中のクロマチンの免疫沈降、沈殿したクロマチンからのDNA回収、及びDNA分析である。ChIPアッセイは、NChIP又は上述のXChIPであってもよい。試料該液体試料は、クロマチンを含む生体源たとえば、細胞を含む何れかの調製物から調製することができる。該細胞は、組織試料、又は培養物で増殖させた細胞に由来し得る。該細胞は、哺乳動物細胞好ましくは、ヒト細胞又はマウス細胞を含むことが好ましい。通常、該方法は、103~109の細胞、たとえば、好ましくは107未満の細胞、106未満の細胞、又は105未満の細胞、好ましくは約104~106の細胞のクロマチンを含む試料で行うことができる。1つの細胞は、通常、細胞当たり約6pg6×1012gのDNAと、クロマチン中に等量のDNA及びタンパク質を含む。したがって、該方法は、たとえば、約06μgのDNA、又は12μgのクロマチンこれは、約100000の細胞のDNA若しくはクロマチンの質量に等しいを含む試料で行うことができる。クロマチン調製物本発明の実施態様において、細胞を含む調製物は、クロマチン免疫沈降アッセイに供される。通常、クロマチンが調製物から最初に抽出され、クロマチン断片を含む液体試料が調製される。一実施態様において、細胞は、核を得ることが可能な標準法を用いて、調製物から最初に採取される。たとえば、該細胞は、たとえば、細胞溶解バッファー、又は超音波処理を用いて破砕してもよく、これによって、該細胞から放出された核が得られる。核の放出後、該方法は、たとえば、ミクロコッカスヌクレアーゼ、又はさらなる超音波処理を用いて、クロマチンを放出させるために、核を消化する段階を含むことが好ましい。別の実施態様において、該方法は、クロマチンを架橋する段階を含んでいてもよい。これは、たとえば、好ましくはクロマチンの断片化の前に、ホルムアルデヒドなどの適切な架橋剤の添加によって、いずれかの適切な手段で達成することができる。断片化は、超音波処理によって行ってもよい。ただし、ホルムアルデヒドは、断片化後に加えてもよく、次いで、ヌクレアーゼ消化を伴ってもよい。または、代替架橋法としてUV照射を用いることができる。一実施態様において、細胞又は組織断片は、ホルムアルデヒドによって最初に固定して、タンパク質DNA複合体を架橋する。細胞は、室温又は37°Cで、5~20分間好ましくは10分間、穏やかに振動させながら、ホルムアルデヒドと共にインキュベートすることができる。組織断片は、ホルムアルデヒドと共に、長いインキュベーション時間たとえば、10~30分たとえば、15分を必要とし得る。ホルムアルデヒドの濃度は、05~10たとえば、1であり得る。一旦架橋反応が終了したら、架橋剤に等しいモル濃度のグリシンなどの架橋剤の阻害剤を使用して、架橋反応を停止することができる。架橋反応を停止する適切な時間は、室温で、2~10分、好ましくは約5分であり得る。その後、細胞は、ナトリウム塩、EDTA、及びSDSなどの洗浄剤を含む溶解バッファーによって回収し溶解することができる。組織断片は、溶解前に均質化することができる。その後、細胞又は均質化された組織混合物は、適切な長さのDNA断片を生じるように、機械的に又は酵素によって剪断することができる。通常、剪断クロマチン又はDNAの200~1000bpがChIPアッセイに必要である。DNAの機械的剪断は、噴霧又は超音波処理好ましくは超音波処理によって行うことができる。DNAの酵素剪断は、Mn塩の存在下でDNアーゼIの使用によって、又は、Mg塩の存在下でミクロコッカスヌクレアーゼの使用によって行い、ランダムDNA断片を発生させることができる。架橋DNA剪断の条件は、細胞、及び音波処理機器又は消化酵素の濃度に基づいて、最適化することができる。一実施態様において、一旦DNA剪断が終了したら、細胞残屑は、遠心分離によって除去することができ、また、DNAタンパク質複合体を含む上清が回収される。得られるのは、本発明の方法に使用することができるDNAたとえば、DNA及びタンパク質が架橋するDNA上にタンパク質が固定された、クロマチン断片を含む液体試料である。他の実施態様において、遠心分離段階を省略してもよく、すなわち、次に示す段階は、DNA剪断後に直接行われる。免疫沈降一旦タンパク質がクロマチン上に固定されたら、タンパク質DNA複合体を免疫沈降させることができる。したがって、一旦クロマチンを含む試料が調製された場合、該方法は、クロマチンを免疫沈降させる段階を含むことが好ましい。免疫沈降は、クロマチン中に含まれ得る関心対象のタンパク質に対する適切な抗体の添加によって行われることが好ましい。一実施態様において、該抗体は、該硬質多孔性マトリックス上に固定することができ、すなわち、該抗体は、クロマチンと会合したタンパク質に結合するリガンドである。本実施態様において、クロマチンと会合したタンパク質は、関心対象のタンパク質であり、これは、たとえば、クロマチン中のDNAに結合される。他の実施態様において、溶液中に遊離した抗体は、クロマチン含有試料に最初に適用される。その後、抗体結合クロマチン断片は、抗体に結合する物質であって、該硬質多孔性マトリックスに結合する物質を使用して単離することができる。本実施態様において、該硬質多孔性マトリックスに結合されたリガンドは、プロテインA、プロテインG、又は抗免疫グロブリンたとえば、抗IgG抗体などの抗体を結合するいずれかの物質であってもよい。クロマチンと会合したタンパク質は、関心対象のタンパク質に対して特異的な抗体である。該抗体は、クロマチンと会合したいずれかのタンパク質に結合することができる。一実施態様において、該抗体は、転写因子などの非ヒストンタンパク質、又は他のDNA結合タンパク質に対して免疫特異的である。または、該抗体は、ヒストンH1、H2A、H2B、H3及びH4、並びにこれらの種々の翻訳後修飾アイソフォーム及び変異体のいずれかに対して免疫特異的であってもよい。または、該抗体は、ヒストンアセチラーゼ若しくはデアセチラーゼ、又はDNAメチルトランスフェラーゼなどの、クロマチンの修飾に関与する酵素に対して免疫特異的であってもよい。さらに、ヒストンが、定義された酵素によって、たとえば、定義されたアミノ酸残基のアセチル化、メチル化、リン酸化、ADPリボシル化、スモイル化、及びユビキチン化によって、インビボで翻訳後修飾され得ることが認識される。したがって、該抗体は、これらの翻訳後修飾物のいずれかに対して免疫特異的であってもよい。硬質孔性マトリックス本発明の実施態様では、場合により抗体によって結合された、クロマチンを含む液体試料は、硬質多孔性マトリックスに通される。適切なマトリックスは当該分野で公知である。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、たとえば国際公開公報第2005018803号に記載された、焼結熱可塑性ポリマー粒子を含む。該マトリックスは、化学反応性であるか、又は官能化された改質表面を有し、該改質表面は、たとえば、場合によりリンカーによってリガンドを結合するのに適したペンダント官能基を備える。本発明のマトリックスは本質的に硬質である。一実施態様において、該マトリックスは、ポリオレフィン又はビニル重合体などの熱可塑性ポリマーを含む。かかるポリオレフィンの例には、ポリエチレン及びポリプロピレンが含まれる。ビニル重合体の例には、ポリ酢酸ビニル及びポリ塩化ビニルが含まれる。好ましい重合体には、ポリエチレン又はポリプロピレンが含まれ、最も好ましくはポリエチレンが含まれる。他の実施態様において、該熱可塑性ポリマーは、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、又はポリアミドナイロンであってもよい。本明細書に使用する重合体ポリマー、高分子という用語には、一般に、ホモポリマー、共重合体たとえば、ブロック共重合体、グラフト共重合体、ランダム共重合体、及び交互共重合体、三元共重合体など、並びにこれらのブレンド及び変形が含まれるが、これらに限定されない。さらに、特に限定されない限り、重合体という用語には、分子のあらゆる幾何学的形態も含まれる。これらの形態には、とりわけ、アイソタクチック対称性、シンジオタクチック対称性、アタクチック対称性、及びランダム対称性が含まれる。一実施態様において、該熱可塑性ポリマーはポリエチレン、又は、好ましくは少なくとも80のポリエチレン、特に好ましくは少なくとも90のポリエチレン、最も好ましくは少なくとも95のポリエチレンを含む、共重合体若しくはブレンドである。使用可能なポリエチレンの例には、商品名Vyon又はBioVyonで、PorvairTechnology社によって製造された、高密度ポリエチレン及び超高分子量ポリエチレンが含まれる。また、該熱可塑性ポリマーは、当該分野において通常である、流れ調整剤、添加剤などを含んでいてもよい。該マトリックスを形成するために焼結される熱可塑性ポリマー粒子は、一般に、該マトリックスの最終的な使用に適切な範囲のサイズを有する。該粒子は、球状で、概して球状であるか、又は、他の適切な規則的な形状若しくは不規則な形状であり得る。当業者は、マトリックスを備える粒子のサイズ、及びこれらの粒子が焼結される条件によって、マトリックスを通る流体通路の割合が、少なくとも一部において決定されるということを認識する。この点に関して他に考慮される可変要素には、分子サイズ、及び、マトリックスに結合されるいずれかの材料の他の特性が含まれる。本明細書に使用する、焼結熱可塑性ポリマーという用語は、一般に、実際に重合体を液化することなく、熱及び振動の影響下で、単一単位となった、多くの熱可塑性ポリマー粒子をいう。したがって、該マトリックスは、流体の適用で維持される画定された構造を有する、複数の縮合熱可塑性ポリマー粒子を含む。また、焼結熱可塑性ポリマーは、一般に、構成粒子の縮合性質により本質的に硬質でもあり、すなわち、これは、本質的に圧縮不可能であり、また、これは、水溶液中で収縮又は膨脹しない。ただし、本発明のマトリックスを備えるシート又は膜などの本発明の一部の実施態様は、可撓性であってもよい。熱可塑性ポリマーを焼結する方法は、当該分野で周知である。該方法には、たとえば、米国特許出願公開第2002064413号、及び英国特許第2369796号に開示された方法が含まれる。焼結後のマトリックスの細孔サイズは、所望の使用に適したその製造時に予め決定することができる。概して、該マトリックスの細孔サイズは、1~1000μm、1~500μm、500~1000μm、200~700μm、5~100μm、20~40μm、又は40~80μmであり得る。焼結後に、該マトリックスは、化学反応性表面たとえば、官能化表面好ましくは不規則な表面を提供するために改質される。この改質は、該マトリックスの表面積を増加させる。また、該改質は、表面に官能基も備え、該官能基は、リガンドの結合を容易にする。換言すると、該化学反応性表面は、改質表面であり、該改質表面は、該リガンドを、場合によりリンカーによって該表面に結合するのに適したペンダント官能基を備える。多くの方法が、熱可塑性ポリマーの表面改質において知られている。この点に関して使用可能な好ましい3つの方法は、国際公開公報第2005018803号に記載されているような、ガス血漿アミノ化、ガンマ線照射、及び化学酸化である。該マトリックスは、化学酸化によって生成された改質表面を有することが好ましい。化学酸化法によって、熱可塑性ポリマー中の炭素結合の切断による中間不規則反応性官能基が生じる。該マトリックスの表面は、場合によりK2Cr2O7などの過酸化物塩の存在下で、1以上の酸化酸たとえば、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、三酸化クロム及び硫酸からなる群より選択される酸による処理によって改質されることが好ましい。多くの戦略は、熱可塑性ポリマーの化学酸化に共通して用いられている。熱可塑性ポリマー表面の改質のみが所望される場合、これは、H2SO4中のK2Cr2O7などの過酸化物塩及び酸を使用し、表面の物理的構造に顕著な損失をもたらすことなく、比較的マイルドな化学酸化によって達成することができる。熱可塑性ポリマーの物理的浸食塑性材料の表面改質前に、その結合能を増加させる塑性材料内部のトンネル及び孔は、高濃度及び高温度で適用されたトリフルオロ酢酸などの強い腐食性酸による該可塑性ポリマーの処理によって達成することができる。該マトリックスの表面に存在する官能基の種類は、これらを発生させるために用いられる反応の種類によって決定される。ほとんどの場合、カルボキシル基又はヒドロキシル基が生じる。また、アルデヒド基及びケト基も、反応の副生成物として生じる場合がある。カルボキシル基又はヒドロキシル官能基は、より安定し、潜在的に反応性の官能基たとえば、アミンに置換することができる。アミノ基は、熱可塑性ポリマー表面に直接化学的に導入するか、又は、スペーサー分子リンカーによって結合することができる。該マトリックスの表面が官能化された後、1以上のリンカー又はスペーサーと該表面を反応させてもよい。かかる実体の機能は、該マトリックス表面への所望のリガンドの結合を容易にすること、及び/又は、必要に応じて、リガンドを、該マトリックスの表面から一定距離を置いて配置できることである。有利に、該改質表面は、化学的不活性を維持し、このため、非特異的バックグラウンド結合を顕著に低減させる。リンカー法は、いずれかの固定されたタンパク質の未変性コンフォメーション、さらに、かかるマトリックス上で精製されるいずれかのタンパク質をかなりの程度に維持するのに有用である。該マトリックス上の非切断性リンカーの利用によって、該マトリックスとタンパク質の恒久的な共有結合が可能になり、このため、該マトリックスからのいずれかの固定された分子の浸出を完全に低減することができる。該リンカーは、該マトリックスの表面に結合されることが好ましい。該マトリックスの表面が改質された直後に、該リンカーが、該マトリックスの表面に結合されることが最も好ましい。適切なリンカーの選択は、該マトリックスの表面官能化、及び該マトリックスに結合するリガンドによって決定される。かかるリンカーの多くは当該分野で公知である。特に、特定のリンカー又は直接固形支持体にポリペプチド又はDNARNA分子を結合するのに用いることができる反応は、当該分野で周知である。都合が良いことに、官能基は、その化学合成時にリガンドに導入することができる。潜在的な官能基には、エーテル、エステル、チオール、ジアルキルアミド、ヒドラジド、ジアミン、及び他の多くのものが含まれる。適切なリンカーは、前述の官能基のうちの1以上と反応可能な基を含むものである。たとえば、リガンドとリンカーの間のチオエーテル結合の形成を利用するリンカーは、一方のリガンド末端にチオール基を有し、他方のリンカーにブロモアセチル基を有し得る。通常、該マトリックス上に固定されるリガンドは、生体分子であり、一般に、タンパク質たとえば、抗体、プロテインA、又はプロテインGである。一旦該マトリックスに結合されると、該生体分子の活性を維持することが重要である。このことによって、リンカー戦略の選択が制限される。これは、非変性すなわち、生理又はマイルドな条件を用いて、タンパク質をリンカーに結合する必要があるからである。すべてのリンカーは、かかる条件下で使用することができるとは限らない。タンパク質の生物活性は、特定の官能基の基質への接近性によって変化する場合があり、したがって、かかる基は、タンパク質を該マトリックスに結合するのに使用してはならない。さらに、潜在的な官能基の多くは、たとえば、リン酸化、アセチル化などによって翻訳後修飾され、このため、結合反応に利用可能ではない。生物学的に活性のある分子及びリンカーの結合のための好ましい反応には、次に示すものが含まれる。1アミノ結合、又は、リンカーの末端のエステル官能基とタンパク質の第一アミン及び/又は第二アミンの反応による、リンカーとリガンドたとえば、タンパク質の間のアミド結合の形成。かかる反応は一般に信頼でき、また、固定されたタンパク質の活性は、非常にまれに影響を受けるにすぎない。また、該反応は、中性pH第一アミンにおけるからpH83第二アミンにおける前後までで行うことができる。さらに、該反応は、反応混合物中の遊離アミンを必要としない。2チオ結合、又は、マトリックス上に存在するチオールと、タンパク質から生じる別のチオールの間の共有結合の形成。この反応では、結合反応は可逆的であり、すなわち、リガンドは、2メルカプトエタノール又はDTTによる還元後に、流体相に戻して除去することができる。このことは、たとえば、タンパク質間の相互作用の研究に対し非常に都合が良い場合がある。該反応は、結合において幾つかの特別の条件を必要とする。すなわち、溶液中に二価金属がないこと、及びタンパク質は、結合前に還元されたSH基を有する必要があることである。3カルボキシル結合、又は、マトリックス上の官能基とタンパク質のカルボキシ末端の間の共有結合の形成。多くのタンパク質が、天然に修飾されるすなわち、ブロックされたC末端を有するので、この種の反応は、それほど効果的でなく、信頼できない。一実施態様において、クロマチンと会合したタンパク質に結合するリガンドは、該マトリックスの表面に固定される。本実施態様において、焼結後のマトリックスは、非アミノ化又は本質的に非アミノ化である表面を備える。本方法では、酸化後好ましくは酸化直後に、スペーサーが、該マトリックス上のカルボキシル官能基と6アミノヘキサン酸の反応で発生する。この反応は、カルボキシル官能基を固定したリンカーを生成する。重要なことに、このアプローチは、表面に結合されないアミンの発生を含まず、これによって、改質表面に結合する非特異的バックグラウンドが顕著に低減する。該リンカーは、支持体と、該リガンドに結合するタンパク質との間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分長いリンカーが好ましい。また、リンカーは、リガンド結合部位間の十分に大きい距離を形成するために導入され、これによって、試薬への該リガンドの無制限の接近が提供され、さらに、該ポリマーの表面上のリガンドの凝集が妨げられる。生物学的に活性のある分子の結合において、該リンカーの長さは、該リガンドと固形支持体の間の距離を決定する。この長さが、該リンカーによって結合される生体分子の官能基の活性に顕著に影響を与え得ることが示されている。該リンカーは、3~11個の炭素原子を含むことが好ましく、3、4、5、6、7又は8個の炭素原子を含むことが最も好ましい。該リンカーは、切断性リンカー又は非切断性リンカーのいずれかであってもよい。切断性リンカーという用語は、リンカーによってマトリックスに結合されるリガンドの活性に影響を与えない条件下で、切断可能なリンカーを意味するものとする。場合によりリンカーによって、該マトリックスに結合されるリガンドは、クロマチンと会合したタンパク質に結合するいずれかの物質であり得る。通常、該リガンドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、又はその断片たとえば、モノクローナル、ポリクローナル、Fab、scFvである。該リガンドは、抗体、たとえば、抗免疫グロブリンたとえば、抗IgG抗体、プロテインA、又はプロテインGに結合する物質を含むことが好ましい。または、該リガンドは、関心対象のタンパク質に結合する抗体を含み、たとえば、該リガンドは、抗ヒストン抗体であってもよい。該マトリックスは一般に多孔性であり、すなわち、細孔又は空間は、液体が通ることができるマトリックス内に存在する。本発明のマトリックスは、いずれかの都合の良い物理的形態たとえば、シート、フィルタ、膜、シリンダー、ファイバー、又はチューブを採用することができる。一つの好適な実施態様において、該マトリックスは、フィルタ、ディスク、又はフリットを含む。該マトリックスは、通常、吸着剤としてすなわち、その表面上のリガンドにより、クロマチンと会合したタンパク質を結合することによって機能する。したがって、一部の実施態様において、該マトリックスは、フィルタたとえば、ディスク又はフリットの物理的形態であってもよいが、該マトリックスは、通常のフィルタとして機能する必要はない。一実施態様において、該マトリックスは、吸着性ディスク又はフリットを含む。該マトリックスは、別個の存在として提供されてもよいか、又は、別の実体の必須部分を形成してもよい。たとえば、該マトリックスは、カラム、遠心分離バイアル、カートリッジ、又はシリンジなどの分離デバイスに導入されてもよく、また、試料及び操作される後続処理に応じて、かかるデバイスの1以上は、連続した方法又は同じ方法で提供されてもよい。かかるデバイスは、手動、半自動又は完全自動様式であってもよい。分離カラム該硬質多孔性マトリックスは、その配置によって、液体試料を該マトリックスに通すことができる場合、いずれかの種類の容器内に収容することができる。該マトリックスは、分離カラム内に収容されることが好ましい。一実施態様において、該分離カラムは、クロマチンを含む液体試料を保持するための室と、流出口とを備える。通常、該流出口は、カラムの下端に位置する。該カラムは、通常、カラムの上端に、液体試料を加えることができる開口を備える。一実施態様において、該硬質多孔性マトリックスは、該流出口の上に、すなわち、該室中の液体試料と該流出口の間に位置する。本実施態様において、該分離カラムとは、自然落下カラムを意味する。一部の実施態様において、該カラムは、疎水性マトリックスをさらに備える。該疎水性マトリックスは、通常、結合リガンドを備えないが、他の点で、上述の硬質多孔性マトリックスであってもよい。たとえば、該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと同様の材料たとえば、焼結熱可塑性ポリマー粒子から形成することができる。しかしながら、該疎水性マトリックスは、通常、改質されていない又は非誘導型の表面を有し、たとえば、該疎水性マトリックスは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基などの官能基を欠く。一部の実施態様において、該疎水性マトリックスは、ポリエチレンなどの熱可塑性ポリマーから形成され、通常、改質されていない表面を有していてもよい。親水性官能基がないことは、通常、その機能を果たすようにすなわち、所望の時間、カラム内の液体試料を保持するように、該マトリックスを十分に疎水性にする。ただし、他の実施態様において、該疎水性マトリックスは、たとえば、ペルフルオロアルキル基などの疎水性官能基によって修飾されてもよい。該疎水性マトリックスは、たとえば、フィルタ、ディスク、又はフリットの形態であってもよい。該疎水性マトリックスは、該硬質多孔性マトリックスと該カラムの流出口の間に位置してもよい。該疎水性マトリックスは、該マトリックスを通して、及び該カラムから外に該試料を流すことが所望されるまで、該カラム内の液体試料を保持するのにすなわち、該カラムの室からの漏出を防ぐのに有用であり得る。疎水性フリット又は重力によって液体流れを防ぐ他の手段を導入する実施態様において、該カラムとは、スピンカラムを意味する。該分離カラムは、アッセイの性質、特に、該マトリックスから液体を吸引するのに用いられる方法に応じて、いずれかの適切な形態であってもよい。したがって、分離は、たとえば、自然落下カラム、真空カラム、又はスピンカラムであってもよい。一実施態様において、該分離カラムは、マイクロスピンカラムであり、たとえば、これは、テーブルトッマイクロ遠心器に使用するのに適した15ml又は20mlのマイクロ遠心管に適合する。通常、該カラムは、該硬質多孔性マトリックスを通して、該カラムから流出した液体を収容するための回収容器をさらに備える。一実施態様において、本発明による複数の分離カラムを備えるアレイを提供する。たとえば、該分離カラムは、ハイスループットスクリーニングに適したマルチウェルプレートの一部を形成してもよい。一実施態様において、複数の分離カラムは、マルチウェルプレートたとえば、ろ過マイクロプレート内に備えられてもよく、それぞれの分離カラムは、該プレート内の個々のウェルに対応する。種々のマルチウェルプレートフォーマットが利用可能であり、該マルチウェルプレートフォーマットは、マルチチャンネルピペット、及び自動たとえば、ロボットの液体処理システムと互換性がある。たとえば、具体的な実施態様において、96、384又は1536ウェルフォーマットを使用することができ、すなわち、該マルチウェルプレートは、96、384又は1536分離カラムを備える。一実施態様において、図11に示すようなろ過マイクロプレートを使用することができる。マトリックスへの液体試料の通過マトリックスに液体試料を通すために、いずれの適切な方法を用いてもよい。一実施態様において、該液体試料は、たとえば分離カラムの上部開口を介して、最初に該分離カラムの室に加えられる。その後、該液体試料は、通常、該カラムの下端の流出口上に位置する、硬質多孔性マトリックスに通し、これによって、該カラムから流出させることができる。このように、該液体試料中に含まれるクロマチン断片は、該マトリックスを通す間に、リガンドに結合することができる。これによって、クロマチン断片が該液体試料から分離され、その後、該クロマチン断片は廃棄することができる。本発明の実施態様において、該液体試料は、重力又は真空によって、遠心分離器の該マトリックスから吸引することができる。一部の実施態様において、該液体試料は、たとえば、該カラムに該試料を加えた後、該カラムから該試料を回収する前に、適切な時間で該マトリックスと共にインキュベートされる。たとえば、該液体試料は、30秒から48時間、たとえば、1分から12時間、1分から2時間、5~60分、又は約30分間、該マトリックスと共にインキュベートされてもよい。このインキュベーションの長さは、この反応の動力学に応じて、該リガンドがクロマチンに結合するのに十分な時間を考慮するために、変更してもよい。該液体試料の容積は、該カラムの室の容積、及び該マトリックスたとえば、フリットの大きさに応じて変更してもよい。該マトリックスは多孔性であり、通常、約05の孔隙率を有してもよく、すなわち、該マトリックスの全容積の約50は、内部空間である。一実施態様において、該マトリックスに完全に吸収されるように、液体試料が容積に加えられ、すなわち、該マトリックスの内部空間は、該液体試料の容積以上である。たとえば、スピンカラムに使用するのに適した多孔性マトリックスは、約72mmの径及び約2mmの厚さのディスクの形態であってもよい。かかるマトリックスの容積は約80μlであり、該マトリックスは05の孔隙率が想定され、内部空隙容量が40μl前後である。したがって、約40μlの容積に該液体試料を加えることができる。疎水性マトリックスが該カラムに該液体試料を保持するのに使用される場合、該マトリックスは、該疎水性マトリックスに浸透するいずれかの液体を本質的に防ぐ程度に、十分疎水性であることが好ましい。洗浄該マトリックスから該液体試料を通した後、一実施態様において、該カラムを洗浄して、該マトリックスへの非特異的結合を低減させる。1以上の洗浄段階は、通常、該カラムに洗浄溶液を加え、該マトリックスに該洗浄溶液を通すことによって、行うことができる。たとえば、該マトリックスは、高度なストリンジェンシーバッファーで洗浄して、非共有結合の相互作用を除くことができる。高度なストリンジェンシーバッファーは、たとえば、20~50mMトリスHCl、1~5mMEDTA、01~05SDS、05~1MNaCl、及び05~1TritonX100を含み得る。または、洗浄バッファーは、05のTween20を含むPBS、又は、200mMNaClと、Tween20若しくはTritonX100などの洗浄剤とを含む100mMリン酸ナトリウムを含んでいてもよい。通常、該洗浄段階は、ストリンジェンシーを変更する一連のバッファーたとえば、比較的低い塩濃度を含む低いストリンジェンシーバッファー、及び高い塩濃度の高いストリンジェンシーバッファーを含む。該洗浄バッファーは、少なくとも01のSDSを含むことが好ましく、約02のSDSを含むことがより好ましい。一実施態様において、該方法は、1つ、2つ又は3つの洗浄段階を含み、3つの洗浄段階を含むことが好ましい。該洗浄バッファーは、NaClを含むことが好ましく、LiClを含むことは好ましくない。架橋の反転試料が架橋DNAタンパク質複合体を含む実施態様では、洗浄後に該架橋を反転させることができる。架橋反転用のバッファーは、架橋の反転を最大限にし、化学作用、生化学作用、及び熱力学作用から生じるDNA分解を最小化するように、最適化することができる。たとえば、一実施態様において、架橋反転用のバッファーは、EDTA、SDS及びプロテイナーゼKを含み、これらは、DNAによって複合化されたタンパク質を効果的に分解し、DNアーゼIなどのヌクレアーゼによるDNAの分解を防ぐ。また、さらなるバッファーも、高濃度のナトリウム塩及びカリウム塩たとえば、1Mの塩化ナトリウム又は05Mの塩化カリウムを含んで使用することができる。かかるバッファーは、効果的に化学作用及び熱力学作用からのDNA分解を低減し、また、ホルムアルデヒド架橋の反転速度を上昇させることが実証されている。通常、架橋の反転は、たとえば50~85°Cで5分間から4時間、好ましくは65~75°Cで05~15時間の高温で発生する。本発明の一部の実施態様において、架橋の反転段階は、該分離カラム内で発生させることができる。または、架橋の反転が種々の容器内で発生するように、該硬質多孔性マトリックスたとえば、フィルタ又はフリットの形態のものを該分離カラムから除去することができるたとえば、洗浄の前又は後に。さらなる実施態様において、該マトリックスに結合されたクロマチンは、架橋の反転前に、該カラムから最初に溶出することができる。DNA捕捉及び分析一旦架橋DNAタンパク質複合体の反転が終了したら、DNAを捕捉して清浄化することができる。これは、フェノールクロロホルム抽出の標準法によって、又は、さらなる固相たとえば、高濃度の非カオトロピック塩の存在下における、二酸化ケイ素若しくはニトロセルロース上でDNAを捕捉することによって、達成することができる。精製段階の後、単離されたDNA断片を分析し、これらの同一性を決定することができる。これは、PCRによって実現されることが好ましい。たとえば、分析段階は、適切なプライマーの使用を含んでいてもよく、これによって、PCR時において、核酸の長さが増幅される。当業者は、該方法が、特異的なPCRプライマーを調製することができる遺伝子又はいずれかのゲノムの領域を検出するために適用できることを認識する。PCR結果は、たとえば電気泳動ゲル上でみることができる。用途本発明の方法には、ChIPアッセイが一般に用いられるいずれかのものを含む、多くの用途があってもよく、該方法は、種々の生体試料の種類に適用されてもよい。たとえば、該方法は、DNAタンパク質相互作用を特性評価するために、種々の研究用途に用いられてもよい。ヒストンタンパク質修飾、非ヒストンタンパク質修飾、及び/又はDNAメチル化などの可変要素は、遺伝子発現の重要なレギュレーターであり、また、これらの変化は、細胞機能の変化又は機能障害、このため、疾患に関係する。ChIPアッセイは、かかるエピジェネティクマーカーの変化を検討するために用いることができるので、本発明の方法は、診断及び予後用途に、並びに治療レジメを適切にする指針として、適用することができる。したがって、一態様において、本発明の方法は、病状の診断又は予後に用いることができる。該方法は、たとえば、前立腺癌、子宮頸癌、若しくはホジキンリンパ腫などの癌、及び、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の診断又は予後に用いることができる。診断方法は、インビトロで行われることが好ましい。一実施態様において、該方法は、第1の試料と第2の試料を採取することと、各試料において、本発明によるChIPアッセイを行うことを含んでいてもよい。たとえば、該第1の試料は、正常な対照細胞を含み、また、該第2の試料は、罹患している疑いのある細胞を含んでいてもよい。かかる分析の結果の比較によって、該方法は、罹患しているか、又は罹患していない試料を分類するために、用いることができる。キット本発明の方法に使用される成分は、場合により該方法を行うための説明書が同梱された、キットの形態で提供することができる。かかるキットは、たとえば、上述するような分離カラムと、場合により、クロマチン免疫沈降アッセイを行うための1以上のさらなる試薬とを備えていてもよい。該キットにおける包含物の一般的な試薬には、該液体試料の調製、クロマチンの架橋、該マトリックスの洗浄、架橋の反転、及び/又はDNA精製のための1以上のバッファー又は溶液が含まれる。本発明は、次に示す非限定例に関して説明される。実施例実施例1クロマチン免疫沈降は、DNAタンパク質相互作用に関する研究の重要な技術である。しかしながら、ChIP法には限界があり、時間がかかり、一貫しない場合があり、さらに、ビーズベースの固相マトリックスへのDNAとタンパク質の非特異的結合を生じやすく、免疫沈降段階に用いられることが多い。本実施例において、ChIPアッセイのための多孔性ポリエチレンベースの固形支持体である、新しいマトリックス、BioVyon商標プロテインAの有用性について検討した。2つの抗体及び7つのDNA遺伝子座を使用して行われたChIP試験では、BioVyon商標プロテインAの性能は、ビーズベースのマトリックス、プロテインASepharose登録商標及びDynabeads登録商標プロテインAと比較して、顕著に良好であり、全アッセイで、大きな割合のDNAプルダウンであった。さらに、カラム内の硬質多孔性ディスクフォーマットによって、より少ない段階及びより少ない機器条件で、非常に容易にBioVyonマトリックスを使用することができ、これによって、ChIP試料を処理するために採用された時間が顕著に減少した。要約すると、BioVyon商標プロテインAは、ChIPのカラム系アッセイ法、及び他の免疫沈降系法を提供する:BioVyon商標の硬質多孔性構造は、生成物の顕著な損失なく、速く強力なプロトコールを可能にする。緒言クロマチン免疫沈降アッセイは、現代分子生物学の重要な研究ツールである12345。ChIPアッセイによって、転写機構の重要な調節成分である特定のタンパク質に特異的に結合される、DNA配列の研究及び同定が可能になる。ChIPアッセイは複合的な方法であり、これには、次に示す複数の段階が含まれる。すなわち、DNAタンパク質架橋、超音波処理、架橋DNAタンパク質複合体の免疫沈降、これらの複合体の捕捉、並びに、最終的な沈殿物からのDNA回収及びDNA分析。IP段階において、タンパク質成分に特異的な抗体を使用し、固形支持体に結合したプロテインA及び/又はプロテインGに対する免疫グロブリンの特異的な結合によって、免疫グロブリンDNAタンパク質複合体の捕捉を達成する6。DNA分析は、PCR、リアルタイムPCR、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション78、又は直接配列決定9によって行うことができる。しかしながら、ChIPアッセイは、固有の問題により影響を受け、これによって、誤り、又は、ChIPデータの誤った解釈が生じることが多い4。これらの問題は、ChIPアッセイで最も重要な部分である、IP時に生じる。IPの2つの中心要素が、抗原抗体複合体の結合のために使用される、ChIPDNA、抗体及び固形支持体の品質及び量を決定する。抗体は、非特異的結合に寄与し、DNAに結合されたタンパク質に対する低い親和性により、回収されたDNAの低い収率の原因である場合がある。しかしながら、固形支持体特に、IP及びChIPアッセイに共通して使用されるプロテインASepharose登録商標ビーズなどのアガロースベースのマトリックスへの非特異的結合の大部分は、Sepharoseの表面で多様な化学基と反応する、DNAタンパク質複合体によるものと考えられる。Sepharoseは、天然材料海藻類由来であり、非常に大きい表面積を有する化学的に非常に不均質の基本構造を有する図3Aを参照。プロテインA変異体の大きい表面積は、タンパク質を含むIPに非常に有用であることが分かったが、該表面積によって、ChIPアッセイのクロマチン標的におけるDNAへ高レベルの非特異的結合が可能になる傾向があり、これは、sepharoseとDNAの別々に荷電した表面間のイオン相互作用の結果として生じる場合がある。この問題を最小化するために、付加的なDNAプレブロッキング段階が、ChIPプロトコールにおいて推奨されることが多い。この段階において、いずれかの潜在的に活性のある結合部位をブロックするために、sepharoseベースの固形支持体は、IPの前に、非均質DNARNAと共に予めインキュベートされる。本実施例では、PorvairFiltrationGroup社から入手可能な、多孔性高密度ポリエチレンベースの代替マトリックス、BioVyon商標プロテインAを使用した。BioVyon商標は、国際公開公報第2005018803号に記載されているような方法を用いて製造することができる。BioVyon商標は、sepharoseと非常に異なる高分子化学特性を有する。すなわち、これは、炭化水素エチレンの繰り返し単位から構成された合成高分子であり、化学的に均質であり図3Bを参照、この構造は、それほど可変的でなく、非常に不活性であることである。BioVyon商標の表面を、酸化によって化学エッチングし、これによって、表面積が中程度増加し、リンカーとプロテインA分子の共有結合が可能になる図4及び5を参照。エッチング酸化過程によって、ChIPアッセイに十分な濃度のプロテインAによって不活性な表面を残して、比較的低い表面濃度の多糖に対する酸化種が導入される。上述するBioVyon商標プロテインAの化学構造によって、DNAタンパク質複合体に対する非特異的結合の低減を示すことが予想される。さらに、基本化学構造のこの相違は、ChIPアッセイで生じ得る酸加水分解及び酸化過程時において、プロテインASepharose登録商標と比較したBioVyon商標プロテインAの化学安定性の向上に寄与することもできる。BioVyon商標は、固体の形態であるが、硬質で、圧縮不可能である多孔性ディスクの形態で製造され、これをカラムに挿入する図6を参照。これによって、ビーズベースのマトリックスよりも、BioVyon商標マトリックスの取扱いが容易になり、基部に固定された正確な量のプロテインAによってカラムを調製することができる。ゲル再懸濁液は必要ではなく、また、BioVyon商標ベッドは、試薬及びバッファーの添加時に破壊されず、さらに、容器中へのビーズ吸引に関係する誤差も除去される。本実施例において、自然落下カラムでBioVyon商標プロテインAを使用して、2つの異なる抗体及び複数のDNA遺伝子座によって、ChIPアッセイを行った。これらの結果を、同様の条件プロテインASepharose登録商標、及びDynabeads登録商標プロテインA下での他のマトリックスを使用して得られたChIPアッセイの結果と比較した。Dynabeads登録商標は、ポリアクリレートポリマー層でコーティングされた超常磁性粒子である。これらの試験から、ChIP、及び潜在的に他のIPに基づくアッセイにおける既存マトリックスに対して、BioVyon商標プロテインAマトリックスが、関心を惹く選択肢を提供することを結論付けた。材料及び方法細胞、NIH3T3マウス線維芽細胞を、10ドナー血清及び50μgmlゲンタマイシン両者とも、Invitrogen社製を添加したDMEMLonza社製中に維持した。MCF7、ヒト乳癌細胞を、10FBSBiosera社製及び50μgmlゲンタマイシンを添加したUltraglutamine1両者とも、Lonza社製と共に、RPMI1640で培養した。ChIPアッセイのためのNIH3T3細胞の溶解物を次に示すように調製した。およそ5×106の細胞を、75cm2フラスコ中20mlのDMEM培地で増殖させた。37°Cで10分間、1の最終濃度になるまで培地に加えたホルムアルデヒドによって細胞を処理して、DNAタンパク質複合体を架橋した。次いで、NH4OHを、室温で5分間、05の最終濃度になるまで培地に加えて、ホルムアルデヒドを中和した。その後、冷却PBSM標準PBSバッファー2mMMgCl2を加え、細胞を遠心分離によって採取し、回収し、これを、再度冷却PBSMで2回洗浄した。次いで、細胞を、PBSM、05TritonX100中で溶解し、15分間氷上に置き、6000gで10分間の遠心分離によって核を回収した。ペレットを冷却PBSMで洗浄し、遠心分離し、NLB10mMトリスHepespH80、1mMEDTA、25MNaCl、05mMPMSF中で再懸濁させ、そして、NLB15vvペレットNLB中で氷上において20分間インキュベートした。その懸濁液は、次に示す割合懸濁液NLB1Mスクロース110vvで、NLB1Mスクロースクッション上で層状になり、これを、10000gで10分間遠心分離した。ペレットを、低塩バッファー及びLS10mMトリスHepespH80、1mMEDTA、150mMNaCl中で再懸濁させ、所望の長さ400~500bpのDNA断片が達成されるまで、Bioruptor商標WolfLaboratories社製を使用しパワー3で、氷上において1分の破損を伴う1分の爆発5回で超音波処理をした。その後、プロテアーゼインヒビターを次に示す濃度で溶解物に加えた。すなわち、アプロチニン800nM、ベスタチン50μM、ロイペプチン20μM、ペプスタチン10μM、AEBSF1mM、E6415μMカタログ番号:78425ThermoScientific社製であった。溶解物を80°Cで保存した場合、プロテアーゼインヒビターを解凍した溶解物に加えた。MCF7細胞の溶解物を次に示すように調製した。およそ5×106の細胞を、75cm2フラスコ中20mlのRPMI培地で増殖させた。培地を排出し、1mlの加温PBSを細胞に加えた。DNAタンパク質複合体を架橋するために、細胞を、回転台で振盪しながら、RTで10分間、1のホルムアルデヒド最終濃度によって処理した。その反応物を、振盪しながら、RTで5分間、067Mのグリシン最終容積でクエンチした。その後、細胞を採取し、3500rpmで5分間、遠心分離した。細胞ペレットを、2mlの低張バッファー10mMトリスHCl、pH72、2mMMgCl2、05TritonX100中で再懸濁させ、10分間氷上に放置した。核を、4°Cで5分間、5000rpmで遠心分離した後に回収した。ペレットを、600μlの溶解バッファー50mMトリスHClpH80、10mMEDTA、1SDS中で再懸濁させ、氷上で10分間放置し、所望の長さ400~500bpのDNA断片が達成されるまで、Bioruptor商標WolfLaboratories社製を使用しパワー3で、氷上において1分の破損を伴う1分の爆発15回で超音波処理をした。試料を、4°Cで10分間、13000rpmで遠心分離した。超音波処理した細胞懸濁液を、Upstate社のChIP希釈バッファー001SDS、11TritonX100、12mMEDTA、167mMトリスHCl、pH80、167mMNaCl中で10倍に希釈した。その後、プロテアーゼインヒビターを、次に示す濃度で溶解物に加えた。すなわち、アプロチニン800nM、ベスタチン50μM、ロイペプチン20μM、ペプスタチン10μM、AEBSF1mM、E6415μMカタログ番号:78425ThermoScientific社製であった。溶解物を80°Cで保存した場合、プロテアーゼインヒビターを解凍した溶解物に加えた。本研究のための抗体は次に示すとおりであった。すなわち、以前にChIPアッセイに使用された、抗RNAポリメラーゼII抗PolIIマウスモノクローナルCovanceResearchProducts社製10、ゲノムワイドChIP分析に利用される、抗CTCFウサギポリクローナルUpstateMillipore社製たとえば、1112、抗HisタグウサギポリクローナルAbcamplc社製、抗βアクチンマウスモノクローナルSigmaAldrich社製、マウス及びウサギIgGSantaCruzBiotechnology社製であった。BioVyon商標プロテインA自然落下カラムは、PorvairFiltrationGroup社から入手した。該カラムは、標準1ml固相抽出チューブと同じ寸法であり、およそ6mmの径、2mmの長さの硬質多孔性HDPEBioVyon商標プロテインAフリットを収容する図6Bを参照。選択的に表面をエッチングし、さらなる共有結合のために、カルボン酸固定基を提供する、選択酸化法を用いて、該フリットを、表面積を増加させるために化学処理した。エッチング工程によって生じた窪みは、エッチング前後の表面の微構造を比較した、図5ではっきりと見ることができる。該窪みの形成は、図4に示すような表面積の増加が原因であった。ChIPアッセイの免疫沈降段階の十分な機能性を提供するために、この工程によって表面を調整した。次いで、HDPEの表面に形成した固定基を、リンカーによってプロテインAに共有結合して、BioVyon商標プロテインA固相を形成した。クロマチン免疫沈降アッセイを、プロテインASepharose登録商標SigmaAldrich社製ためのChIPキットUpstateMillipore社製のメーカーのマニュアルに従って、一部の改良を伴い、行った。BioVyon商標プロテインAを含むChIP試験において、上述のプロトコールを、次に示す一部の改良を伴って適用した。すなわち、プロテインASepharose登録商標スラリーを、BioVyon商標プロテインA自然落下カラムに代えた。Dynabeads登録商標プロテインAInvitrogen社製によるChIPアッセイでは、メーカーのプロトコールに従った。3つの異なるマトリックスによるChIP試験の詳細なプロトコールは、次に示すとおりである。プロテインASepharose登録商標によるクロマチン免疫沈降アッセイプロテインASepharose登録商標によるクロマチン免疫沈降アッセイを、メーカーの説明書に従って、一部の改良を伴い、ChIPキットUpstate社製を使用して行ったUpstate社のChIPキットマニュアルから引用。マウスNIH3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり4μg。すなわち、抗PolII、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり100μg。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。1各反応において、500μlの希釈超音波処理細胞懸濁液を使用する。2供給のために、1の希釈細胞懸濁液を保存する。34°Cで撹拌しながら、30分間、サケ精子DNAプロテインASepharose50スラリーSIGMA社製を80μl加えることによって、懸濁液をプレクリアする。4低塩LSバッファー01SDS、1TritonX100、2mMEDTA、20mMトリスHCl、pH8、150mMNaCl1mgmlBSA400μgサケ精子DNAを含む、1mlのプレブロッキング溶液によって、プロテインASepharose登録商標をプレブロッキングする。プロテインASepharose登録商標をプレブロッキング溶液と混合し、4°Cで30分間、回転させながらインキュベートする。500rpmで回転させ、上清を除去する。5短時間の遠心分離1100rpm、5分、4°Cによってビーズをペレット化し、上清画分を回収する。6免疫沈降抗体を溶解物に加え、4°Cで3時間、回転させながらインキュベートする。74°Cで1時間、回転させながら、精子DNAプロテインASepharose50スラリーを60μl加えて、抗体CTCF複合体を回収する。8遠心分離4°Cで1分間、1000rpmによってアガロースをペレット化する。9次に示すバッファーで、回転台において3~5分間、慎重に複合体を洗浄する。すなわち、LS、低塩01SDS、1TritonX100、2mMEDTA、20mMトリスHCl、150mMNaCl、及び、HS、高塩01SDS、1TritonX100、2mMEDTA、20mMトリスHCl、500mMNaClで洗浄し、最終洗浄01SDS、11TritonX100、12mMEDTA、167mMトリスHCl、pH80、167mMNaClで2回洗浄し、最終的にTEで1回洗浄する。DNAの溶出及び抽出1新たに調製した溶出バッファー1SDS、01MNaHCO3を200μl加える。265°Cで10分間インキュベートする。短時間撹拌する。5分間、最大速度でsepharoseビーズを沈降させ、上清画分溶出液を慎重に別のチューブに移す。この工程を2回繰り返す。3合わせた溶出液に5MNaClを加え、エッペンドルフチューブを65°Cで4~5時間加熱して、架橋を反転させる。410μlの05MEDTA、20μl1MトリスHCl、pH65、及び15μlの14~22mgmlプロテイナーゼKを、溶出液に加え、45°Cで1時間インキュベートする。5フェノールクロロホルムを加えることによって、DNAを回収する。640μlのH2O中でペレットを再懸濁させる。Dynabeads登録商標プロテインAによるクロマチン免疫沈降アッセイDynabeads登録商標プロテインAによるクロマチン免疫沈降アッセイを、メーカーInvitrogen社のマニュアルに従って、一部の改良を伴い、行ったDynabeads登録商標プロテインAのInvitrogen社のマニュアルから引用。マウスNIH3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり4μg。すなわち、抗PolII、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり100μg。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。工程は次に示すとおりであった。11Dynabeadsの調製1ピペット操作によって、又はローラー上で回転させる5分ことによって、完全にDynabeadsを再懸濁させる。250μlのDynabeadsを試験管に移す。3上清が透明になるまで、磁石上で分離し、上清を除去する。4磁石から試験管を取り出す。5抗体結合第12節に直接進行させる。12抗体の結合6上述の工程4の試験管に、200μlAb結合バッファー及び洗浄バッファー中に希釈した抗体を加える。7室温で10分間回転させながらインキュベートする。8磁石に試験管を置き、上清を除去する。9磁石から試験管を取り出し、穏やかにピペット操作することによって洗浄して、200μlAb結合バッファー及び洗浄バッファー中でビーズを再懸濁させる。10免疫沈降第23節に直接進行させる。13標的抗原の免疫沈降11磁石に工程10の試験管を置き、上清を除去する。12抗原を含む試料通常、100~1000μlを加え、穏やかにピペット操作して、DynabeadsAb複合体を再懸濁させる。13室温で10分間、回転させながらインキュベートし、これによって、AgがDynabeadsAb複合体に結合することができる。注:抗体の親和性に応じて、最適な結合のために、インキュベーション時間を増加させることが必要な場合がある。14磁石に試験管を置く。必要に応じて、さらなる分析のために、清浄なチューブに上清を移す。15各洗浄につき200μlの洗浄バッファーを使用して、DynabeadsAbAg複合体を3回洗浄する。各洗浄時に磁石上で分離し、上清を除去し、穏やかにピペット操作することによって再懸濁させる。16100μlの洗浄バッファー中でDynabeadsAbAg複合体を再懸濁させ、清浄なチューブにビーズ懸濁液を移す。これは、試験管の壁に結合したタンパク質の共溶出を回避するために推奨される。17磁石に試験管を置き、上清を除去して、プロテインASepharose登録商標のためのプロトコールに説明するように、DNAの溶出及び抽出に進行させる上述を参照。バッファー組成:結合バッファー:PBSTween201×PBSpH74002Tween20洗浄バッファー:PBSBioVyon商標プロテインA自然落下カラムによるクロマチン免疫沈降アッセイのための最適化されたプロトコール免疫沈降抗体を溶解物に加え、4°Cで3時間、回転させながらインキュベートした。マウスNIH3T3細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり4μg。すなわち、抗PolII、非特異的マウスIgG、及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体であった。ヒトMCF7細胞の溶解物を使用するChIPアッセイにおいて、次に示す抗体を使用したそれぞれの500μlの溶解物当たり100μg。すなわち、抗CTCF、非特異的ウサギIgG、及び抗Hisタグウサギポリクローナルであった。BioVyon商標プロテインA自然落下カラムを、次に示すように調製したカラムによるすべての操作は、自然落下によりRTで行った。カラムを、蒸留水で最初に洗浄した後、1mlのChIP希釈バッファー001SDS、11TritonX100、12mMEDTA、167mMトリスHCl、pH80、167mMNaClで3回洗浄した。次いで、細胞溶解物をカラムにかけ、次に示すように洗浄段階を行った。1mlのLSバッファー低塩バッファー:10mMトリスHepespH80、1mMEDTA、150mMNaClによる3回の洗浄、1mlのMSバッファー中塩バッファー:01SDS、20mMトリスHClpH80、2mMEDTA、150mMNaCl、1TritonX100による3回の洗浄、及び1mlのHSバッファー高塩バッファー、01SDS、20mMトリスHClpH80、2mMEDTA、500mMNaCl、1TritonX100による3回の洗浄。DNAを、500μlの溶出バッファー7M尿素、50mM2MEで溶出し、その後、NaHCO3及びNaClをそれぞれ、最終濃度が01M及び05Mになるまで加え、エッペンドルフチューブを65°Cで4~5時間加熱して、架橋を反転させた。この段階後、25μlの05MEDTA、50μl1MトリスHCl、pH65、及び15μlの14~22mgmlプロテイナーゼKを、溶出液に加え、チューブを45°Cで1時間インキュベートした。次いで、DNAを、フェノールクロロホルムによって抽出し、水相を回収し、2~3容量のエタノールによって沈殿させた。20ngのグリコーゲン担体を溶液に加えた。その後、これを、10000rpmで10分間、遠心分離し、DNAペレットを40μlのH2O中で再懸濁させた。リアルタイムPCR及びPCR反応PCR及びQPCRのためのプライマー及び条件を表1に記載する。以前に報告されているように、改良を加えて、リアルタイムPCR反応を行った13。簡潔には、反応成分を、3μlの試料、200nMの各プライマー、及び125μlのSensiMixPlusSYBRGreenPCRキットQuantace社製を含む、25μlの混合物中に集めた。増幅、データ収集、及び分析を、Chromo4リアルタイムPCRBioRadLaboratories社製を使用して行った。解離曲線分析をPCR反応後の各試料で行い、予想された溶解曲線特性の単一のアンプリコンが得られることを確認した。沈殿DNAの量を、全供給クロマチンに関して算出し、次に示す式に従って、合計の割合として表した。すなわち、供給2ΔCt×100式中、ΔCtCt供給Ct免疫沈降であり、また、Ctは、対応するPCR反応の平均閾値サイクルである。であった。これらの試験を3回反復して行い、平均は供給から求めた。統計解析統計解析は、対応のないStudentのt検定を用いて行った。確率が5未満の信頼水準である場合、有意値が検出された。結果及び考察BioVyon商標プロテインAのために開発されたChIPプロトコールにおいて、IP段階は、この固形支持体による使用のための最適化が必要であった。本研究におけるChIPのためのモデル試験系として、マウスGAPDH遺伝子のプロモータ領域内のTATAボックスに対するRNAポリメラーゼIIの結合を検出するための以前に記載されたアッセイを選択した1014。ルーチンChIPにおけるSepharoseビーズのプレブロッキングは、IP段階におけるSepharoseへのDNAタンパク質複合体の非特異的結合を防ぐのに有用である。これは、本発明者らの試験で確認され、これによって、プレブロッキング段階の省略は、プロテインASepharoseビーズとDynabeads登録商標プロテインAの双方による高いバックグラウンドをもたらす図1。BioVyon商標プロテインAカラムにおいて、プレブロッキング段階は、実際に、非特異的結合をわずかに増加させるにすぎなかった図1ので、ChIPプロトコールから除外した。次いで、洗浄バッファーの配合及び洗浄回数の変更によって、BioVyon商標プロテインAカラムへの低い非特異的結合がさらに低減することができるか否かについて調査した。変性量を下回るsubdenaturing量のイオン洗浄剤SDSなどの導入は、プロテインASepharose登録商標によるChIP試験において、シグナルバックグラウンド抗体抗体なしの割合を向上させることが知られている。プロテインASepharose登録商標、Dynabeads登録商標プロテインA、及びBioVyon商標プロテインA上のシグナルバックグラウンド割合に影響を与えるSDSの濃度の増加について比較するために、SDS01及び02の2つの異なる濃度の洗浄溶液を、すべてのマトリックスのプレブロッキング段階が含まれる、プロトコールを用いて試験した。高濃度のSDSにおいて、プロテインASepharose登録商標及びBioVyon商標プロテインAのシグナルバックグラウンド割合が増加したが、Dynabeads登録商標プロテインAでは相当減少した図7、パネルA。また、ChIPアッセイの質に対する洗浄強度の影響についても検討した。これらの試験において、DNAタンパク質複合体の結合後、カラムを種々の化学作用を有するバッファーで3回又は6回洗浄した。図7、パネルBに示すように、3回の洗浄が最適であり、6回の洗浄は、特異的なシグナルを相当に低減した。バッファー中にNaClの代わりにLiClを使用することによって、プロテインASepharoseビーズに対する核酸の非特異的結合が減少し得ることが過去に経験的に観察され、このため、LiClは、多くのChIPプロトコールに含まれている。しかしながら、BioVyon商標プロテインAカラムを使用する、ChIPアッセイのこの段階は、非特異的バックグラウンド結合を減少させず、さらに、これによって、特異的なシグナルが顕著に減少した図7、パネルB。種々のバッファー組成で行われた一連の試験によって、BioVyon商標プロテインAのための最適化されたプロトコールがもたらされ、該プロトコールは、プレブロッキング段階が含まれない、及び、最適な洗浄条件が、LS、MS、HSバッファー01SDSをHSによる洗浄段階に使用による3回の洗浄であり、NaClバッファーを選択して、LiClバッファーを手順から省略する、という点で、Upstateプロトコールとは異なっていた。ブロッキングの種々の影響、BioVyon商標プロテインA、プロテインASepharose登録商標、及びDynabeads登録商標プロテインA上のLiCl及びSDSは、マトリックスの化学的性質の相違によって説明され得ると仮定した。これによって、より非特異的なDNA結合が、BioVyon商標プロテインAよりも、プロテインASepharose登録商標、及びDynabeads登録商標プロテインAで生じると考えられる。その後、BioVyon商標プロテインA、プロテインASepharose登録商標、及びDynabeads登録商標プロテインAは、同じ特異的抗体及び上述するようなDNA遺伝子座図1による、ChIPアッセイと同時に使用され、また、非特異的DNA結合の対照も含まれていた。これらの試験では、BioVyon商標プロテインA、対照、及び他の2つのマトリックスの間の特異的な抗体によるChIPDNAの富化の相違は、統計的に有意であった図2A。DNAプルダウン供給は、これらのアッセイにおける他のマトリックスよりも、BioVyon商標プロテインAで顕著に高かった。別の抗体及び複数のDNA遺伝子座を含めてこれらの試験を拡大した。この視点から、転写因子、CTCF151617は、ゲノムに多数の結合部位を有し、これらのうちの多くが特性評価され15、また、本発明者らの研究室は、CTCFに関する研究を専門とするので、理想的な候補である1118。CTCF結合標的部位は、CTCFに対する親和性が異なるので、ChIPアッセイで試験するのに十分な試験モデルを代表する。次に示す6つのヒトCTSを選択した。すなわち、N部位Myc1019、PIM15、DM120、βグロビン21、PLK15及びH192223であった。DNAプルダウン供給は、6つの遺伝子座すべての他のマトリックスよりも、BioVyon商標プロテインAで高かった。BioVyon商標プロテインAによるChIPDNAの富化は、CTS間で変化し、これは、CTCFに対する異なったCTSの親和性を反映した可能性が高かった図2B。BioVyon商標プロテインAと全対照の間の特異的な抗体によるChIPDNAの富化は、統計的に有意であった。種々のDNA遺伝子座に対する非特異的対照の値が相当変化したことに留意するべきである。場合によっては、より非特異的な生成物が、IgG及び無関連抗体よりも抗体を含まないもので得られた。しかしながら、かかるパターンは異常でなく、文献に以前に報告されたたとえば、参考文献2425を参照。DNA結合部位たとえば、塩基組成、アンプリコンの長さなどの特定の機能の組合せが、マトリックスの特定の特性と共に、これらの相違の原因であり得る可能性がある。これらの試験からの実用的な勧告は、抗体を含まない対照を、ChIPアッセイにおいて注意して取り扱う必要があるということである。図2に示す絶対データは、その後、7つのDNA遺伝子座から抗体を含まない対照、及びIgG又は無関連抗体のいずれかを使用した2つの他の非特異的抗体対照まで、特異的なシグナルの富化の倍数を算出することによって、3つのマトリックスによるシグナルバックグラウンド割合を評価するために使用した。これらの結果を表2に概説する。表23つのマトリックスでのChIP試験図2に詳述における抗体を含まない対照及び2つの非特異的対照、IgG及び無関連抗体に対する、7つのDNA遺伝子座からの特異的シグナルの富化の倍数。富化倍数値を、3つの対照のうちの1つで特異的シグナルの値を割ることによって算出し、このデータを表形式で示す4未満の値を太字のイタリック体で示す。具体的には、4の富化倍数値を、ChIPアッセイが有効であるのに必要な適正値と考える場合、BioVyonは、評価された21のアッセイのうち20で有効であり、Dynabeadsは、評価された21のアッセイのうち16で有効であり、また、Sepharoseは、評価された21のアッセイのうち13で有効であるにすぎない表2の4未満の富化値は、明確にするため、イタリック体で示す。換言すると、実際に、いずれかのレベルのDNA富化1を超える値は、21すべてのアッセイで比較する場合、2つのビーズベースのマトリックスよりも、BioVyon商標プロテインAで有効であることを示す。ChIPアッセイの複合体の性質を考慮すると、特定のChIP試験において、どのような富化倍数係数が、有用な情報を提供するのに必要であるかを決定するのは困難である。しかしながら、これらの結果は、BioVyonマトリックスが、この調査で比較された他の2つのマトリックスよりも大きな富化を常に提供することを示す。また、この比較による調査は、硬質BioVyonプロテインAカラムを使用する試験法が、相当容易に行われ、緩いビーズベースの他の2つのフォーマットのいずれかよりも、非常に迅速であることも実証した。BioVyonデバイスは、カラム内の硬質多孔性フリットに結合された固定量のプロテインAによって調製されることになっている。これによって、IP過程に使用される容器へのビーズベースのマトリックスの添加に関連する誤差をなくす可能性が直ちに除かれる。さらに、BioVyonカラムに関連する処理段階は、すべての事例において、より単純であり、試薬及びバッファー緩衝液は、いずれかのインキュベーション期間においてカラムに保持され、次いで、カラムから排出させられる。また、プロテインAに結合されたクロマチンも、BioVyonカラムの硬質多孔性フリット上に結合され、IPにおいて通常用いられる過程のうちのいずれかにおいて、カラムから喪失することがないが、ビーズは、すべての洗浄段階及び試薬混合段階Sepharoseの遠心分離、及びDynabeadsの磁力分離において、慎重に分離され、保存される必要がある。これによって、ビーズベースのIP過程は、多段階過程の各段階で、ビーズの損失したがって、標的の損失の可能性により、時間を非常に消費する。例として、複数の遠心分離、吸引、及び再懸濁段階を含む、Sepharoseビーズを使用するIP過程は、3時間を超える時間を要する場合がある。複数の磁力分離段階吸引及び再懸濁を含む、Dynabeadsを使用するIP過程は、30分を超える時間を要する場合がある。これに比べて、BioVyonを使用するIP過程は、10~15分を要し、少ない洗浄段階ビーズにおける各バッファーで6回の代わりに、各バッファーで3回を必要とするにすぎず、また、分離や再懸濁を必要とせず、このため、全過程において同様の標的損失の危険性がない。さらに、上述の試験は、さらに過程を簡潔にし、ビーズ操作を必要とし標的損失の可能性があるビーズベースのマトリックスに関連した別の段階を排除する、BioVyonプロトコールにおいて、プレブロッキング段階が必要でないことも示唆する。また、ChIPpedDNA断片が、ヌクレアーゼ活性に対して非常に感度が良く、このため、全体の処理時間のいずれかの低減によって、ヌクレアーゼによるDNA分解の可能性が減少することに留意することも重要である。要約すると、BioVyonマトリックスは、より大きなDNAプルダウン、富化性能の向上、及びより少ない処理段階による利用容易性をもたらし、これによって、標的損失をもたらし得る操作上の誤差の可能性を減少させる。BioVyonのこれらの特性は、マイクロChIP用途の開発、さらに、ChIPアッセイの自動化に非常に有益である26272829。したがって、BioVyon商標プロテインAが、ChIP及び他のIPベースのアッセイに使用するビーズベースのマトリックスに代わる、誤差の可能性がなく、より使用しやすく、迅速に使用される、非常に関心を惹く選択肢であると考えることができることを結論付けた。実施例2本実施例において、ChIPアッセイを、QPCR分析の標的遺伝子として、RNAポリメラーゼII、及び、単一の遺伝子座、ヒトGAPDHに対する単一の抗体を使用して行った。行った初期の比較は、磁性ビーズを免疫沈降段階でBioVyon自然落下カラムに置き換えた、推奨最適ChIPプロトコールの調整に焦点を置いた。結果は、BioVyonプロテインA自然落下カラムが、これらの一般に使用される磁性ビーズ相当物よりも、IPに顕著に適した支持体であることを示す。さらなる試験では、自然落下カラムをスピンカラムに置き換えて、アッセイをさらに改良した。材料及び方法細胞培養物及び固定二次ヒト胸癌細胞系MCF7を入手し、円形プラスチック14cmペトリ皿Invitrogen社製上に75×106の密度で接種した。10無血清DMEMGibco社製で増殖させ、該細胞は、24時間後に、80~100の集密度15×106細胞に達し、室温で10分間、20mlの1ホルムアルデヒド中に浸漬した。クロマチンを抽出し、免疫沈降のために、超音波処理によって調製した。BioVyonプロテインA自然落下カラム及びプロテインG磁性ビーズを用いるスピンカラムを使用するChIPの比較断片化されたクロマチン試料を10μgμlに調整した後、RNApolII特異的ウサギポリクローナル抗体、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、QPCRによって3回反復して分析した。プロテインG磁性ビーズを使用する方法を、推奨プロトコールを用いて行い、最適化されたバッファー組成たとえば、上の実施例1を参照を用いたBioVyonプロテインAを使用する方法と比較した。クロマチン免疫沈降スラリーを、BioVyonカラム上に1時間インキュベートし、続いて、ローターの端部間で、4°Cで3時間インキュベートした。BioVyonスピンカラムBioVyonプロテインAマトリックスを、小型のプラスチック製回転チューブSigma社製に適合させ図6Cを参照、2mlの回収チューブに収容し、遠心力の利用を促進させて、自然落下とは対照的に、カラムからバッファー及び免疫沈降溶液を吸引した。疎水性フリット焼結ポリエチレン粒子を含む硬質多孔性マトリックスを、カラムのBioVyonプロテインAフリットの下に配置し、遠心力をかける前後に生じる流れを除去した。自然落下法及びスピンカラム法では、共に、断片化されたクロマチン試料を10μgμlに調整し、RNApolII特異的ウサギポリクローナル抗体、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、QPCRによって3回反復して分析した。BioVyonプロテインAの最適なプロトコールの免疫沈降及び洗浄段階を、10000rpmの遠心力を30秒間用いて、スピンカラム上で行った。免疫沈降スラリーを、3時間、ローター上で再度インキュベートした後、さらに1時間希釈されたカラムにかけた。疎水性フリットの影響別個の試験において、2つのスピンカラムの違いを試験した。1つは、疎水性フリットをプロテインAカラムの下に配置して、生じる流れを除去するものであり、もう1つはフリットがないものであった。フリットのサイズは、スピンカラムで72mmの径であった。断片化されたクロマチン試料を、10μgμlに調整し、RNApolII特異的ウサギポリクローナル抗体、又は、負の対照として正常な非結合ウサギIgGを使用して、免疫沈降に供した。回収されたDNAを、QPCRによって3回反復して分析した。免疫沈降スラリーを、3時間、ローター上で再度インキュベートした後、さらに1時間洗浄されたカラムにかけた。BioVyonプロテインAスピンカラムの免疫沈降及び洗浄段階を、1000rpmの遠心力を30秒間用いて行った。結果BioVyonプロテインA自然落下カラム及びプロテインG磁性ビーズを使用するChIPの比較最適BioVyonプロテインA法を、プロテインG磁性ビーズを使用する最適ChIPプロトコールと比較し、達成されるシグナルプルダウンの面から有利に比較した。最適条件下において、BioVyonプロテインAプロトコールは、GAPDH標的遺伝子に結合されたRNAポリメラーゼIIタンパク質を標的としたとき、厳密に同じMCF7乳癌細胞試料を使用して、DNAプルダウンが約25倍増加した図8を参照。これは、ChIPシグナルの顕著な増加、及びChIP調査プロトコールをリードする現在の市場における顕著な改善を表す。BioVyonスピンカラム法スピンカラムへの自然落下カラムの適応によって、ChIPプロトコールにおけるカラムの容易な取扱いが促進され、シグナルプルダウンが増加し得る。確実なスピンの洗浄は、自然落下を使用して喪失されていたカラムを通じる流れを捕捉する点で、本方法の効率を高める主な要因であると考えられる。図9は、疎水性フリットを含むスピンカラムの使用によって、自然落下カラムアッセイからスピンカラムアッセイまで良好な変移が可能になることを示す。疎水性フリットと共に固定し、スピンカラムとして使用する場合、BioVyonプロテインA法は、厳密に同じDNAテンプレート試料及び抗体濃度を用いて、自然落下相当物と比較すると、DNAプルダウンが23倍増加した。疎水性フリットの影響別個の試験において、2つのスピンカラムの違いを試験した。1つは、疎水性フリットを、カラムのBioVyonプロテインAフリットの下に配置して、生じる流れを除去するものであり、もう1つは、疎水性フリットがないものであった。図10は、BioVyonスピンカラムの性能に対する疎水性フリットの影響を示す。疎水性フリットを使用する場合、抗体の存在下におけるDNAプルダウンは、IgG対照試料よりも非常に大きく、このため、富化割合が改良される。参考文献上の明細書に言及する刊行物はすべて、引用により本明細書中に組み込まれる。本発明の説明された方法及びシステムの種々の改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を、特定の好ましい実施態様に関して説明しているが、特許請求の範囲に記載された発明が、かかる特定の実施態様に過度に限定されるべきでないことが理解される。実際に、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者にとって明らかな発明を実施するための説明された様式の種々の改変は、次に示す特許請求の範囲内にあるものとする。