コア内の固定化緩衝性リガンドを用いる生体分子のクロマトグラフィー技術のための、内側多孔質コアと外側シェルとを有するシェルビーズを含むクロマトグラフィー媒体の製造方法であって、上記ビーズのコア内に緩衝性リガンドを設け、ビーズの外側シェル内に結合性リガンドを設けることを含んでいて、上記緩衝性リガンドと結合性リガンドが互いに独立に調整される、方法。クロマトフォーカシング用媒体の製造のための請求項1記載の方法。前記コアの空隙率が生体分子のコア内への浸透を妨げる、請求項1又は請求項2記載の方法。前記ビーズが3μm超の直径を有する、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。前記ビーズが3~400μmの直径を有する、請求項4記載の方法。前記外側シェルが0.5~30μmの厚さである、請求項5記載の方法。前記外側シェルが0.5~5μmである、請求項6記載の方法。前記外側シェルが10~30μmである、請求項6記載の方法。前記緩衝性リガンドが弱酸及び/又は弱塩基である、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。前記結合性リガンドが強い陰イオン交換及び/又は強い陽イオン交換リガンドである、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。結合性リガンドがアフィニティーリガンド、疎水性相互作用HIC、RPCリガンド、キレート性リガンド等である、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法で製造されたクロマトグラフィー媒体。緩衝液に代えてコア内の固定化緩衝性リガンドを緩衝剤として用いるクロマトグラフィーのための、請求項12記載のクロマトグラフィー媒体の使用。細胞及び/又はその一部、ウィルス及び/又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性巨大分子及び両性粒子から選択される生体分子のクロマトフォーカシングのための、請求項13記載の使用。フォーカシング終了後に、溶出画分をリッドビーズカラムに流して溶出緩衝液を除去する請求項14記載の使用であって、生体分子がカラムから排除され、緩衝成分がリッドビーズのコア内に吸着される、請求項14記載の使用。現存するCF媒体と比較して大いに改良されたローディング容量及び改良されたピーク形状を示すクロマトフォーカシングCFのための新しいクロマトグラフポリッシング媒体はクロマトグラフ分野で歓迎されるはずである。本発明は、イオン交換クロマトグラフィー、殊にクロマトフォーカシングの性能を改良するシェルビーズを提供する。これらのシェルビーズはpH勾配生成リガンドのコアを有し、一方試料タンパク質と相互作用するリガンドは外側のシェルに位置している。この構成による主要な利点は、殊に陰イオン交換リガンドの場合の高いpH及び陽イオン交換リガンドの場合の低いpHでの結合強度の向上に起因する、従来のクロマトフォーカシング媒体と比較したときの容量の増大である。この容量は、外側のシェルリガンドを、エクステンダー又はスペーサーを介して結合するとさらに高められる。本発明の好ましい実施形態では、コアの空隙率porosityはタンパク質を排除するように調整される。従って、本発明は、内側多孔質コア内の固定化緩衝性リガンドを用いる生体分子のクロマトグラフィー技術のための前記コアと外側シェルを有するシェルビーズを含むクロマトグラフィー媒体を製造する方法に関し、この方法は、pH安定化緩衝及びpH勾配生成を図るビーズのコア内の緩衝性リガンドを設け、ビーズの外側シェル内の生体分子の結合を図る結合性リガンドを設けることを含んでなり、緩衝性リガンドと結合性リガンドは互いに独立に調整される。この方法により、クロマトグラフィー媒体、好ましくはクロマトフォーカシング媒体の結合特性と緩衝特性を別々に最適化することが可能になる。好ましい実施形態によると、コアの空隙率は一定の大きさを超える生体分子がコア内に浸透するのを妨げる。本発明のクロマトグラフィービーズは5μm超の直径、好ましくは5~400μmの直径を有する。好ましくは、外側シェルは0.5~30μmの厚さである。幾つかの実施形態では、外側シェルは0.5~5μmである。この薄い外側の層は、速い動力学が望まれる用途に殊に有用であり、3~200μmの直径を有するビーズに適している。他の実施形態では、外側シェルは10~30μmである。このより厚い外側の層は、分離すべき生体分子の高いローディング容量を有するのが望まれる用途に殊に有用である。このより厚い層は40~400μmの直径を有するビーズに適している。好ましくは、緩衝性リガンドは、トリエチレンテトラミン、ビス3-アミノプロピルアミン、ポリエチレンイミン、メルカプト酢酸、サリチル酸、ポリアクリル酸、ポリホスホン酸及び両性イオン性緩衝液のような弱酸及び/又は弱塩基である。好ましくは、結合性リガンドは、第四アミン、スルホネートリガンド及びグアニジルリガンドのような強陰イオン交換及び/又は強陽イオン交換リガンドである。結合のためのあらゆる種類の荷電リガンドが適している。リガンドは分離のために使用するpH範囲内で強く結合することが重要である。イオン交換体の場合、これは、リガンドが使用するpH範囲内で帯電しなければならないことを意味する。例えば、ジエチルアミンリガンドはpH9~8及びそれ以下で帯電する。結合性リガンドはまたアフィニティーリガンド、疎水性相互作用HIC、RPCリガンド、キレート性リガンド等であってもよい。第2の態様では、本発明は、上記の方法で製造されたクロマトグラフィー媒体に関する。第3の態様では、本発明は、緩衝液に代えてコア内の固定化緩衝性リガンドを含む上記クロマトグラフィー媒体の緩衝剤としての使用に関する。この使用は、イオン交換クロマトグラフィー用であり得るが、主としてクロマトフォーカシング用であり得る。クロマトフォーカシングは、例えば細胞及び/又はその一部、ウィルス及び/又はその一部、タンパク質、複合タンパク質、融合タンパク質、ペプチド、核酸、両性巨大分子及び両性粒子から選択される任意の生体分子に対するものであり得る。この方法は2~13、好ましくは3~11のpIを有するあらゆる生体分子に適している。一実施形態では、溶出緩衝液は、クロマトフォーカシングの終了後、溶出画分をリッドビーズカラムに通して流すことによって除去し得、ここで生体分子はカラムから排除され、緩衝成分はリッドビーズに吸着される。これは以下の実験の欄で記載する。このタイプの媒体で行われるこのクロマトフォーカシングは等電点電気泳動と同じ高い分離能を有し、調製用及び分析分野の両方に用途がある。本発明者は、pH勾配を生成するリガンドがビーズのコア内に結合しており、タンパク質と相互作用するリガンドが外側シェル内に存在するシェルビーズ図1が、クロマトフォーカシング用のビーズとして従来のクロマトフォーカシング媒体よりずっと最適なデザインであるということを見出した。層の官能化を使用することによって、勾配生成のために不必要に高い緩衝能を導入することなく結合のための高いリガンド密度を有することが可能である。このアイディアによる主要な利点は、その結合特性がpHにより変化しないリガンドを使用でき、かつビーズの外側の層により高いリガンド密度を使用できる可能性のためにタンパク質容量が増大するということである。このため、リガンド密度が高くなったとき従来の弱いCFイオン交換リガンドの場合のように不必要な高い緩衝能を導入することなく結合強度が高まる。弱イオン交換体リガンドは、種類に応じて高い又は低いpHでその電荷、従って結合能力を失う。また、ローディング容量は、外側のシェルの厚さを変えることによっても調節することができる。加えて、容量は、シェルリガンドをエクステンダーを介して結合するとさらに改良することができる。さらにまた、シェルは非常に薄く0.5~5μmすることができ、このため、より速い放出動力学に起因して効率が改良され得、結果としてよりシャープなピークが得られる。ビーズ内の結合領域と緩衝領域を分離することによって、二次的な相互作用、例えば水素結合により生起する他のピーク広幅化効果も低減する。好ましい実施形態では、コアの空隙率は、ポリバッファ成分のみがビーズの内部にアクセスするのを許容するように調整される。その結果、原則としてタンパク質のみがシェルリガンドと相互作用する。シェルリガンドは対象のpH-領域で緩衝能力が全くないか又は非常に低くなるように設計される。このことは、最も適切なシェルリガンドはQ第四アンモニウム基又はSPスルホプロピル基であることを意味する。クロマトフォーカシングは、プロテオミクスの分野において、低含量成分の分析を容易にするための主要な試料成分の単離及び除去のため、並びにSDS-PAGE、狭いpI範囲の2D-PAGE、又は付加的なクロマトグラフ工程を用いる以後の分離に先立つ試料の予備分画のためといったような多くの潜在的な用途をもっている。しかし、最も一般的に使用されているクロマトフォーカシング技術は両性高分子電解質の溶出緩衝液を使用しており、そのため、緩衝液のコストの問題及びPolybuffers商標のような両性電解質の除去に関する問題のために実際上クロマトフォーカシングの使用が制限されている。両性の緩衝液は、均一な緩衝能力と、使用されると考えられるpH範囲内に等電点をもつ大量の成分とを有するように設計される。従って、このタイプの緩衝液は、溶出中結合したタンパク質間の間隔を空けさせる置換及び積み重なり効果のためにCFにおける分解能を高める。この技術の応用範囲を可能な最高の分解能が優先されない場合に拡張するためには、代わりの緩衝液系の開発を選択し得る。実験の欄本明細書中以下の実施例は例示の目的で挙げるのみであり、後述の特許請求の範囲に定義されている本発明を限定するものと解してはならない。全般マトリックスの体積とは沈殿して定着した床の体積をいい、グラムで表したマトリックスの重量とは吸引乾燥重量をいう。反応において攪拌は、磁気バー攪拌機ではビーズが即座に損傷されるため、モーター駆動攪拌機を使用した。官能性の分析及びビーズ上のアリル化の程度、又はアミン含量の程度の決定には従来法を用いた。架橋したアガロースゲルSepharose商標HFA70、GEHealthcare、Uppsala、Swedenから出発して本発明の分離マトリックスを調製する1つの方法を以下に例示する。SepharoseHFA70のビーズ直径は約90μmである。SepharoseHFA70-HFA70BAPAShell-Qに基づくクロマトフォーカシング用シェル媒体の調製SepharoseHFA70のアリル活性化SepharoseHFA70をガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。水気を切ったゲル210gを三つ首丸底フラスコに量り取った。NaOH100mL、50溶液を加え、機械的攪拌を開始した。ホウ水素化ナトリウム0.5gと、硫酸ナトリウム31gをフラスコに加え、スラリーを水浴で50°Cに加熱した。およそ1時間後、20mLのアリルグリシジルエーテルAGEを加えた。その後、スラリーを激しく攪拌しながら一晩置いた。約20時間後スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水×4、エタノール×4及び蒸留水×4で洗浄した。その後、アリル含量を滴定により決定した。152μmol/mL。シェル活性化部分的臭素化アリル化ゲル50mLをフラスコに量り取り、500mLの蒸留水と2.5gの酢酸ナトリウムを加えた。1.05mLの臭素3.28gを197mLの蒸留水に溶解させ、この溶液38.5mLをアリル化ゲルスラリーに加えた。この量の臭素は、約2μmのシェル厚さを与えるに対応すると考えられる。この臭素溶液を、激しく攪拌しながら一時に加えた。およそ10分後ゲルをガラスフィルターで蒸留水により洗浄した。Q基のシェルカップリング部分的臭素化ゲル上記参照をフラスコに移し、20mLの塩化トリメチルアンモニウム溶液と混合した。50NaOHでpHを12に調節し、スラリーを35°Cに加熱し、一晩攪拌し続けた。およそ18時間後ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。塩素イオン容量は50μmol/mLと見積もられた。90μmol/mLの残留アリル含量は約2μmの理論シェル厚さに相当する。ビーズのコア内のBAPAビスアミノプロピルアミンのカップリング50mLのQ-シェルゲル上記参照をビーカー内でオーバーヘッド攪拌しながら蒸留水50mL及び0.5gの酢酸ナトリウムと混合した。スラリーの濃橙色/黄色が残るようになるまで臭素を加えた。3分間攪拌した後、スラリーが完全に変色するまでギ酸ナトリウムを加えた。その後ゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。40mLの水気を切ったコア臭素化ゲルをビーカーに移し、10mLの水、10mLのビス-アミノプロピルアミン及び2gの硫酸ナトリウムと混合した。その後混合物を30°Cで17時間攪拌した後、ガラスフィルター上で蒸留水により洗浄した。ゲルのコアに結合したビス-アミノプロピルアミンの量は80μmol/mLと見積もられた。MonoPと比較した新しいCFプロトタイプHFA70BAPAShell-Qのクロマトグラフ評価序シェルCF媒体プロトタイプHFA70BAPAShell-Qの挙動を試験するために、レンズマメレクチン及びミオグロビンのクロマトグラムをMonoP実験の欄参照に対して得られた結果と比較した。MonoP商標は、10-μmのMonoBeads粒子に基づく確立された媒体であり、第三及び第四アミンで均一に置換されている。この小さいビーズサイズは達成することができる高い分解能に大いに寄与している。HFA70BAPAShell-Qは90-μmのアガロースビーズに基づいており、確立されているクロマトグラフ理論によるとピーク幅はMonoPと比較してずっと広くなるはずである。しかし、シェル-プロトタイプとMonoPの比較によると、図1に示したようなビーズを用いることの、同じ大きさの従来のビーズと比較した利点が例証される。実験クロマトグラフ性能に関して検討しようとするシェル媒体HFA70BAPAShell-QをTricorn5/20カラムに充填し、緩衝液25mMジエタノールアミン、pH9.3で平衡化した後、試料溶液を0.5mL/minの流量でポンプで送ってカラムに通した。緩衝液BPolybuffer96、pH6を通すことによってタンパク質を溶出した。クロマトグラフ方法は以下に示すUnicorn法。試料試料は25mMのジエタノールアミンpH9.3に溶解したレンズマメレクチン及びミオグロビンであり、濃度は5.0mg/mlに調節した。試料体積は100μLであった。機器LCシステム:AktaExplore10ソフトウェア:Unicornカラム:HR5/20Unicorn法Mainmethod00BaseCVmlAny000BlockStartConditions000BaseSameAsMain000ColumnPositioncolpos000PumpAInletA1000AveragingTimeUV256sec000Wavelength280nm254nm215nm000BufferValveA1A11000Gradient000B000base000PumpBInletB1000Flowflowmlmin010AutoZeroUV010Endblock000Blockcolumnequilibration000BaseSameAsMain100AutoZeroUV2AutoZeroUV200EndBlock000BlockIsocraticelution000BaseSameAsMain000AutoZeroUV000InjectionValveInject010injvolInjectionValveLoad020Gradient100B0base800Gradient1000B0base900EndBlockクロマトフォーカシングの後の緩衝物質の効率的な除去のための新しい方法及び媒体ポリバッファは小さい分子<1000g/molからなり、従ってリッドビーズを充填したフロースルーカラムにより容易に除去することができる。これらのリッドビーズは、ゲルろ過リッド約5000~10000g/molより大きい分子を排除する及びポリバッファ成分の吸着に適したコア内リガンドその選択は使用するポリバッファに依存するを有するように設計されている。両性の緩衝液の正味の電荷をゼロから、リッドビーズのコア内に吸着のために使用するリガンドの種類に応じて適切な正又は負の値である吸着のためのaまで変化させるために、試料溶液のpHの多少の変更が必要である。結果及び考察プロセスの生産性とタンパク質の製造の主要な増大となる下流のクロマトグラフ精製の場を改良するために、大きいビーズ約40μmより大きいビーズ直径に基づく媒体のクロマトグラフ性能を増大することが極めて重要である。望まれる選択性を有する小さいビーズ例えば、ビーズ直径10mmのMonoPに基づく媒体では、十分に高い流量と生産性を大きいスケールのカラムでその圧力規格内において使用することができない。これは非常に剛性のビーズでもそうである。本発明によると、シェルを官能化した大きい粒子を用いることによって、効率ピーク幅を小さい粒子のレベルに保ち得る。図1に示したように設計された大きい粒子直径約90μmのシェルビーズの利点を立証するために、クロマトグラフの結果を粒子の大きさが10μmの均一なビーズMonoPと比較した。図2及び3によると、ピーク幅/高さは、レンズマメレクチンの場合同じ大きさであり、ミオグロビンの場合はわずかに広かった。この結果は明らかに、図1に示したように設計されたより大きいシェルビーズがずっと小さい10倍小さい従来のビーズと殆ど同じくらいに良好であることを示している。大きいビーズを有することの利益は、分析用途に使用される小さいビーズと比較して、より大きいスケールの調製用又はプロセス用途により適していることである。新しい媒体デザインによって、要望されているより大きいスケールのクロマトグラフィー特性と高い効率のような分析特性とを組合せることが可能である。