生物学的試料中の脳腫瘍幹細胞を検出する方法であって、CD166発現量を測定することを含む方法。CD166又はそれをコードするポリヌクレオチドからなる脳腫瘍マーカー。CD166発現量が脳腫瘍に罹患していない生物学的試料のCD166発現量よりも大きい脳由来の単離細胞を含有する細胞集団。脳腫瘍の診断方法であって、脳腫瘍に罹患している可能性がある対象の脳から生物学的試料を得る段階、得られた生物学的試料中のCD166発現量を測定する段階、CD166発現量を閾値と比較し、CD166発現量が閾値よりも大きい場合に対象が脳腫瘍に罹患していると示唆する段階を含む診断方法。脳腫瘍の悪性度評価方法である、請求項4に記載の診断方法。抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法であって、可溶型CD166を発現している細胞を被検物質に曝す段階、被検物質に曝された細胞における可溶性CD166の発現量を測定する段階、及び可溶型CD166を減少させる質被験物質を選択する段階、を含むスクリーニング方法。抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法であって、可溶型CD166を発現している細胞を被検物質に曝す段階、及び可溶型CD166に結合する被検物質を選択する段階、を含むスクリーニング方法。可溶型CD166に結合する化合物を含有する、脳腫瘍の予防または治療用組成物。CD166、その部分ペプチド、それらの類似体、又はそれらの誘導体を含有する、脳腫瘍の予防または治療用組成物。CD166に対する抗体を含有する脳腫瘍幹細胞検出用のプロテインアレイ。CD166をコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する脳腫瘍幹細胞検出用の核酸アレイ。1CD166に対する抗体、又は2CD166をコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する脳腫瘍幹細胞検出用の検出キット。膠芽腫幹細胞はCD133陽性膠芽腫細胞のサブポピュレーションに存在すると報告されており上記非特許文献1、脳腫瘍マーカー特に膠芽腫マーカーとして使用され得る。しかし、膠芽腫の一部にはCD133発現細胞を有さない検体も認められる。また、WangらWangらIntJCancer2008122pp7618はこのCD133陰性細胞からも膠芽腫が発生することを報告している。本発明は、新たな脳腫瘍マーカー、脳腫瘍幹細胞を簡易かつ正確に検出する方法、及び脳腫瘍を簡易かつ正確に診断する方法等を提供することを目的とする。本明細書に記載する研究において、本発明者らはCD133陽性膠芽腫細胞ではCD133陰性細胞と比較してALCAMCD166の発現量が極めて高いことを見出した。また、CD133CD166細胞は腫瘍スフィアtumorsphere源細胞initiatingcellで多く認められることを見出した。さらに、CD133陰性膠芽腫検体においてもALCAMは腫瘍スフィア源細胞の良好なマーカーであることを見出した。更にALCAMノックダウン細胞では、インビトロにおける腫瘍浸潤が促進されることを見出した。同様に、ALCAMの可溶型アイソフォーム本明細書中、可溶型CD166または可溶型ALCAMと称する場合があるを過剰発現させた膠芽腫細胞でも、インビトロにおける腫瘍浸潤及びインビボでの腫瘍形成が促進されることを見出した。また、膠芽腫検体におけるCD166陽性細胞の頻度は、膠芽腫の病期及び予後と高い相関性が認められることを見出した。更に、本発明者らは、前述のように、ALCAMは膠芽腫幹細胞に発現して膠芽腫細胞浸潤に関与し、かつ、ALCAMの可溶型アイソフォームは膠芽腫形成を促進することから、CD166特に可溶型CD166は、膠芽腫に代表される脳腫瘍に対する新規の治療標的となることに想到した。本発明は、以下の各項に記載の態様を有する。項1.生物学的試料中の脳腫瘍幹細胞を検出する方法であって、CD166発現量を測定することを含む方法。項2.CD166又はそれをコードするポリヌクレオチドからなる脳腫瘍マーカー。項3.CD166発現量が脳腫瘍に罹患していない生物学的試料のCD166発現量よりも大きい脳由来の単離細胞を含有する細胞集団。項4.脳腫瘍の診断方法であって、脳腫瘍に罹患している可能性がある対象の脳から生物学的試料を得る段階、得られた生物学的試料中のCD166発現量を測定する段階、CD166発現量を閾値と比較し、CD166発現量が閾値よりも大きい場合に対象が脳腫瘍に罹患していると示唆する段階を含む診断方法。項5.脳腫瘍の悪性度評価方法である、前記項4に記載の診断方法。項6.抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法であって、可溶型CD166を発現している細胞を被検物質に曝す段階、被検物質に曝された細胞における可溶性CD166の発現量を測定する段階、及び可溶型CD166を減少させる質被験物質を選択する段階、を含むスクリーニング方法。項7.抗脳腫瘍剤のスクリーニング方法であって、可溶型CD166を発現している細胞を被検物質に曝す段階、及び可溶型CD166に結合する被検物質を選択する段階、を含むスクリーニング方法。項8.可溶型CD166に結合する化合物を含有する、脳腫瘍の予防または治療用組成物。項9.CD166、その部分ペプチド、それらの類似体、又はそれらの誘導体を含有する、脳腫瘍の予防または治療用組成物。項10.CD166に対する抗体を含有する脳腫瘍幹細胞検出用のプロテインアレイ。項11.CD166をコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する脳腫瘍幹細胞検出用の核酸アレイ。項12.1CD166に対する抗体、又は2CD166をコードするポリヌクレオチド又はその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有する脳腫瘍幹細胞検出用の検出キット。本発明によれば、脳腫瘍幹細胞を簡易かつ正確に検出することができる。その結果、脳腫瘍を簡易かつ正確に診断すること等が可能になる。以下、本発明について詳細に説明する。1本発明で使用する用語の定義本明細書において、脳腫瘍は、頭蓋内に発生する、あらゆる腫瘍を包含する。本明細書において、神経膠腫は、あらゆる神経膠の腫瘍を包含する。本明細書において、神経膠腫の例としては、グレードIの毛様性星細胞腫、グレードIIのびまん性星細胞腫、グレードIIIの退形成性星細胞腫、グレードIVの膠芽腫が挙げられる。本発明において、脳腫瘍は、好ましくは原発性脳腫瘍、より好ましくは神経膠腫更に好ましくは悪性神経膠腫、特に好ましくは膠芽腫である。本明細書において、脳腫瘍マーカーとは、脳腫瘍細胞が産生し、又は有する物質であって、脳腫瘍細胞を判別する目印となる物質をいう。本明細書において、定量すなわち、量の測定は、必要に応じた精度を有するものであればよい。すなわち、対照との区別が可能な精度であれば十分であり、対照の量が検出限界以下である場合、単なる検出で十分である。すなわち、本明細書において、定量とは、特に言及しない限り、検出を包含するものとする。本明細書における塩基配列ヌクレオチド配列や核酸又はアミノ酸などの略号による表示は、IUPACIUBの規定IUPACIUBcommunicationonBiologicalNomenclatureEurJBiochem1389、塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン特許庁編及び当該分野における慣用記号に従うものとする。本明細書において遺伝子は、特に言及しない限り、2本鎖DNA、及び1本鎖DNAセンス鎖、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNAアンチセンス鎖、及びそれらの断片のいずれもが包含される、また、本明細書で遺伝子とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。本明細書において、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、核酸と同義であって、DNA及びRNAの両方を包含するものとする。また、これらは2本鎖であっても1本鎖であってもよい。本明細書中、ある配列を有するヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有するヌクレオチド又はポリヌクレオチドも包括的に意味するものとする。本明細書において、ポリヌクレオチドは、特に言及しない限り、オリゴヌクレオチドを包含するものとする。また、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、特に言及しない限り、修飾された核酸又は核酸類似体例、PNA、LNAを包含するものとする。なお、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドがRNAである場合、配列表に示される塩基記号TはUと読み替えられるものとする。本明細書において、cDNAは、特に言及しない限り、mRNAに相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA一本鎖cDNA、並びに当該一本鎖cDNA及びその相補鎖からなる二本鎖DNA二本鎖cDNAの両方を包含するものとする。本明細書において、特異的にハイブリダイズするとは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下例えば、サムブルックら、MolecularCloningColdSpringHarbourLaboratoryPressNewYorkUSA、第2版、1989に記載の条件において、生物学的試料中の他のポリヌクレオチドとのクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。本明細書において、タンパク質は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。本明細書中、単離とは、本来の環境から分離されていることを意味する。単離されたものとしては、例えば、細胞から抽出された細胞構成成分、及び生体から得られた組織等が挙げられる。2脳腫瘍幹細胞を検出する方法本発明の一態様は、生物学的試料中の脳腫瘍幹細胞を検出する方法である。本発明の、生物学的試料中の脳腫瘍幹細胞を検出する方法は、CD166発現量を測定することを含む。脳腫瘍幹細胞の検出は、定性的であってもよく、定量的であってもよい。生物学的試料のCD166発現量が脳腫瘍細胞を含有しない生物学的試料のCD166発現量に比べて大きいことは、当該生物学的試料中に、CD166を発現している細胞の数が多い場合を含む。このことは、被験試料中に脳腫瘍幹細胞が含まれていることを示唆する。また、生物学的試料のCD166発現量が大きいほど、被験試料中により多くの脳腫瘍幹細胞が含まれていることを示唆する。21生物学的試料生物学的試料としては、例えば、脳腫瘍に罹患している可能性がある対象の脳から得られる生物学的試料である。このような生物学的試料は、脳組織、血液、リンパ液、血漿、髄液、組織洗液等のような、細胞を含有したあらゆる試料であり得る。脳組織は、正常脳組織、腫瘍組織、又は腫瘍の隣接組織であり得る。生物学的試料は、例えば、脳腫瘍に罹患している可能性がある患者の外科的手術における切除組織から得られる。対象は、ヒト、サル、イヌ、マウス、ラット等の哺乳類であり、好ましくはヒトである。脳腫瘍に罹患している可能性がある対象は、例えば、臨床症状、画像CTコンピュータ断層撮影、又はMRI磁気共鳴画像等の手段によって、脳腫瘍に罹患している可能性があると診断された患者であり得る。あるいは、生物学的試料は、培養細胞、又は培養細胞液であってもよい。生物学的試料は、検出を実施するまで、生物学的試料中のポリヌクレオチド、又はタンパク質を検出又は分析可能な状態で維持できる公知の保存方法によって、保存しておいてもよい。22CD166発現量の測定本発明において、脳腫瘍幹細胞の検出は、CD166発現量の測定によって行われる。CD166発現量の測定は、タンパク質であるCD166又はそのmRNAを定量することによって行うことができる。定量は、後記で詳細に説明する判定段階において、脳腫瘍に閾値との区別が可能な精度であれば十分であり、対照の発現が検出されない場合、発現の単なる検出で十分である。これは、実際に採用される、CD166発現量の具体的な測定方法の特徴によって定まる。本発明においてCD166とは、活性化白血球細胞接着分子ActivatedleukocytecelladhesionmoleculeALCAMとしても知られる細胞表面タンパク質である。そのアミノ酸配列はNCBIのタンパク質データ-ベースに、GenBankAAI370971として登録されている本明細書中、配列番号1、およびSEQUENCELISTING1に当該配列を示す。当該アミノ酸配列において、突然変異や遺伝子多型などによって、1~数個例、1~10個、1~5個、1~3個、1~2個、1個のアミノ酸残基の置換、欠失、及び/又は付加などを有するタンパク質も、本発明におけるCD166に包含される。ここで、アミノ酸残基の置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸の間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、グリシンとアラニンとの間での置換等の保存的置換であることができる。本発明においてCD166のmRNAとは、CD166遺伝子の転写産物である。その塩基配列は、NCBIの遺伝子データ-ベースに、NCBIReferenceSequenceNM0016272として登録されている本明細書中、配列番号2、およびSEQUENCELISTING2に当該配列を示す。当該塩基配列において、突然変異や遺伝子多型などによって、1~数個例、1~10個、1~5個、1~3個の塩基の置換、欠失、及び/又は付加などを有するmRNAも、本発明におけるCD166のmRNAに包含される。ALCAM又はCD166には、可溶型のアイソフォームが存在する。本発明においてALCAM又はCD166とは、特に言及しない限り、可溶型CD166又は可溶型ALCAMsALCAMを包含する。但し、実施例の試験では、通常すなわち非可溶型のALCAM又はCD166を、単にALCAM又はCD166と称する場合がある。タンパク質であるCD166を定量する場合は、前記の生物学的試料から通常の方法によりタンパク質を抽出又は調製し、下記に例示する方法などによって定量する。タンパク質の抽出又は調製は、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。CD166の定量方法としては、特定のタンパク質を定量できる方法であれば、特に制限されないが、例えば、ウエスタンブロット法、ELISA法、蛍光抗体法、プロテインアレイプロテインチップ法などが挙げられる。可溶型CD166の定量は、特定のタンパク質を定量できる方法であれば、特に制限されないが、ウエスタンブロット法、ELISA法、プロテインアレイプロテインチップ法などが挙げられる。可溶型CD166を含有する試料としては、例えば、血清、脳脊髄液等が挙げられる。ELISA法では、例えば、前記の生物学的試料から抽出又は調製したタンパク質を含有する溶液を、マイクロプレートのウェルの固相表面に吸着させた後、CD166に対する抗体をアプライし、酵素反応により検出/定量する。プロテインアレイ法では、例えば、CD166に対する抗体を有するプロテインアレイ例、抗体アレイ抗体チップを準備し、当該プロテインアレイに、前記の生物学的試料から抽出したタンパク質をアプライし、抗体抗原反応をさせた後、前記抗体に結合したCD166を、ELISA法等を用いて検出する。このようなプロテインアレイもまた本発明の一態様である。本発明のプロテインアレイについては、下記で説明する。CD166の定量に用いられる抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体であり得る。また、CD166の定量に用いられる抗体は、例えば、Fabフラグメント、F2フラグメント等の、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメントであってもよい。CD166の定量に用いられる抗体は、公知の方法により製造できる。例えば、抗体がポリクローナル抗体の場合は、公知の方法により大腸菌などで発現させて調製したCD166、又は公知の方法により合成したCD166の部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いて、ウサギなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、当該免疫動物の血清から通常の方法により調製できる。一方、モノクローナル抗体の場合は、公知の方法により大腸菌などで発現させて調製したCD166、又は公知の方法により合成したCD166の部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いて、マウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、得られた抗体産生細胞をミエローマと細胞融合させて調製したハイブリドーマから調製できる。ここで免疫抗原として使用されるCD166は、例えば、CD166遺伝子の塩基配列情報に基づくDNAのクローニング、プラスミド構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収などの操作を含む方法により調製できる。また、CD166の定量に用いられる抗体は、商業的にも入手可能である。CD166の定量に用いられる抗体は、例えば、酵素標識、放射標識、及び蛍光標識などの公知の標識方法で標識されていてもよく、ビオチンなどにより修飾されていてもよい。CD166のmRNAを定量する場合は、前記の生物学的試料から通常の方法によりmRNAを抽出又は調製し、下記に例示する方法などによって定量する。mRNAの抽出又は調製は、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。CD166のmRNAの定量は、特定のmRNAを定量できる方法であれば、特に制限されないが、例えば、CD166のmRNA又はそれに対応するcDNAに特異的に結合するプローブ又はプライマーを用いた、サザンブロット法、insituハイブリダイゼーション法、比較ゲノムハイブリダイゼーションCGH、定量PCR例、リアルタイムPCR、又はインベーダー商品名、HOLOGIC社、米国法等の公知の方法を採用して行うことができる。マイクロアレイ法では、例えば、CD166のmRNAに特異的に結合するプローブが配置された核酸アレイ核酸チップを準備し、当該核酸アレイに、前記の生物学的試料から抽出し、及び蛍光標識等で標識したmRNA試料をアプライし、前記プローブに結合したCD166のmRNAの標識シグナルを測定して解析する。このような核酸アレイもまた本発明の一態様である。本発明の核酸アレイについては、下記で説明する。リアルタイムPCRでは、例えば、前記の生物学的試料から抽出又は調製したmRNAを、逆転写酵素を用いてcDNAに逆転写し、そのcDNAを鋳型として用い、CD166のcDNAに特異的に結合するプライマーを用いて、所定の領域をPCRで増幅し、増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングする。mRNAの定量に用いられるプローブは、CD166のmRNA又はcDNAと特異的にハイブリダイズするように設計される。プローブとしてのポリヌクレオチドは、好ましくは、例えば、CD166mRNAの塩基配列の全体配列、部分配列、及びそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて1~数個例、1~10個、1~5個、1~3個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドなどである。プローブとしてのポリヌクレオチドの長さは、通常、15~500塩基長、好ましくは20~200塩基長、より好ましくは20~50塩基長である。このようなポリヌクレオチドは、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。プローブとしてのポリヌクレオチドは、CD166のmRNAの定量を可能とするために、適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等が付加されていてもよい。定量PCRなどによるmRNAの定量に用いられるプライマーは、CD166のmRNA又はcDNAと特異的にハイブリダイズするように設計される。プライマーの設計は、特に制限されないが、公知の方法、例えば、プライマー設計用アルゴリズムやソフトウエアなどを利用して行なうことができる。プライマーは通常、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一対からなるプライマーセットとして使用される。プライマーの長さとしては、特に限定されないが、例えば、15~30ヌクレオチドである。プライマーとしてのポリヌクレオチドは、好ましくは、例えば、CD166のmRNAの塩基配列の全体配列、部分配列、及びそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド、並びに、前記ポリヌクレオチドにおいて1~数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドなどである。プライマーとしてのポリヌクレオチドの長さは、通常、15~30塩基長である。このようなポリヌクレオチドは、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。プライマーとしてのポリヌクレオチドは、CD166のmRNAの定量を可能とするために、適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等が付加されていてもよい。生物学的試料中に、CD166を発現している細胞が多いことは、生物学的試料の形態に応じして、蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質等で標識した抗CD166抗体を用いて、免疫組織染色した組織試料中のCD166発現細胞を観察すること、又は細胞集団試料中のCD166発現細胞の数を計測することなどの方法によっても知ることができる。3脳腫瘍マーカー本発明の一態様は、CD166からなる脳腫瘍マーカーである。本発明の脳腫瘍マーカーは、例えば、脳腫瘍の診断、脳腫瘍の治療に有効な物質のスクリーニング、被験物質の脳腫瘍治療における有用性の評価、及び被験物質が脳腫瘍を誘発又は増悪する危険性の評価等に好適に用いられる。このような使用は、例えば、被験物質を、CD166発現量が脳腫瘍に罹患していない生物学的試料のCD166発現量よりも大きい単離細胞を含有する細胞集団と接触させる段階を含む。このような細胞集団もまた、本発明の一態様であり、本明細書中、本発明の細胞集団と称する場合がある。本発明の細胞集団は、例えば、脳腫瘍の外科的手術時等によって得られた切除組織から、脳腫瘍に罹患していない生物学的試料のCD166発現量又は当該発現量に基づいて定められた閾値よりも大きいことを指標にして単離又は濃縮された細胞の集団であり得る。あるいは、本発明の細胞集団は、前記単離又は濃縮された細胞を培養して得られる細胞集団であり得る。更に、あるいは、本発明の細胞集団は、前記単離された細胞に由来する、遺伝的に改変された細胞を培養して得られる細胞集団であり得る。細胞の単離、遺伝的改変、及び細胞の培養は、それぞれ細胞工学分野で慣用の方法を用いて実施すればよい。細胞の単離又は濃縮は、例えば、市販のフローサイトメトリーFCM膠芽腫検体、CD133陽性細胞及びCD133陰性細胞の単離2007年から2008年の期間に大阪大学医学部附属病院で外科手術を施行した患者から、膠芽腫の21個の一次検体を得た。膠芽腫の一次検体をメスで細切し、パパインWorthington社緩衝液165U85mLで処理し単一細胞とした。一次検体から得た膠芽腫細胞を、50倍希釈したPE標識抗CD133抗体MiltenyiBiotec社で染色した。氷上に30分間置いた後、FACSFACSAria、BectonDickinson社によってCD133陽性CD133細胞及び陰性CD133-細胞を単離した。単離した細胞は、EGF20ngmL、塩基性FGF20ngmL及びB27サプリメントを添加した無血清培地を使用し、12穴プレートを用いて100000mL濃度の細胞を5CO2濃度のインキュベーターで1週間培養した。マイクロアレイ解析RNAは、CD133陽性細胞及びCD133陰性細胞より、TrizolInvitrogen社を用いて、取扱説明書に従って抽出した。cDNAは逆転写酵素反応によって合成した。cDNAの合成後、それぞれの細胞で合成したcDNAをマイクロアレイAffymetrix社によって解析した。腫瘍スフィア形成実験膠芽腫から分離した初代培養細胞から、CD133CD166細胞、CD133CD166-細胞、CD133-CD166細胞、及びCD133-CD166細胞を単離した。各サブポピュレーションの細胞を12穴プレートに500個ずつ播種し、EGF20ngmL、塩基性FGF20ngmL及びB27サプリメントInvitrogen社を添加した無血清培地で培養した。その後、各細胞サブポピュレーションより形成された腫瘍スフィア数を計測した。リアルタイムPCR膠芽腫細胞株であるU87MG、T98G、A172及びU251、ならびに膠芽腫手術検体からRNAを抽出した。これらの細胞株は、AmericanTypeCultureCollectionATCCから購入した。RNAの抽出には、TRIzolinvitrogen社を取扱説明書に従って使用した。次に、膠芽腫細胞株及び手術検体における可溶型ALCAM及びALCAMの発現の有無を検討するために、RNAを逆転写してcDNAを作成し、リアルタイムPCRを行った。可溶型ALCAMのプライマーの配列として、センスプライマーはAGACAGATTGAACCTCTCTCAGAAAAC配列番号3、アンチセンスプライマーはGCTGCAGACTACTTACTGAACACC配列番号4を使用した。また、ALCAMCD166のプライマーの配列として、センスプライマーはCGTGAATTCCACCAAGAAGGAGGAGGA配列番号5、アンチセンスプライマーはTCTGTCTTTGTATTCTGGTACATCG配列番号6を使用した。cDNA濃度を、SYBRgreen蛍光を用いABI7900HTAppliedBiosystems社によって解析した。ALCAMノックダウンモデルU87MGを用いてALCAMノックダウンモデルを構築した。StealthRNAiinvitrogen社を用い、取扱説明書に従って、siRNAによる一過性ALCAMノックダウンモデルを構築した。siRNAによるALCAMノックダウンモデルをインビトロ実験に用いた。MissionshRNASigmaAldrich社を用い、取扱説明書に従って、shRNAによる恒常的ALCAMノックダウンモデルALCAMノックダウンU87MG細胞を構築した。用いたshRNAの配列は、CCGGCAGCCATGATAATAGGTCATACTCGAGTATGACCTATTATCATGGCTGTTTTTG配列番号7である。可溶型ALCAM過剰発現モデルU87MGを用いて可溶型ALCAMFLAG発現モデルを構築した。具体的には、可溶性ALCAMFLAG発現ベクターをエレクトロポレーションにてU87MG脳腫瘍細胞に導入した後、G418添加培地で遺伝子が導入されたものを選択した。当該ベクターは、pFLAGCMV51SigmaAldrich社に可溶性ALCAMcDNAが挿入されたものである。当該ベクターは、京都府立医科大学循環器内科池田宏二先生から供与頂いた。コントロールのU87MG細胞には、pFLAGCMV51を導入した。マトリゲル浸潤実験24穴マトリゲルインベージョンチャンバーBectonDickinsonbioscience社を使用した。各ウェルに5×10000個の細胞を播種し、5CO2濃度のインキュベーターで24時間培養した。培養後、浸潤した細胞数を計測した。同実験を3回繰り返し、平均浸潤細胞数を算出した。可溶型ALCAMが膠芽腫細胞浸潤を促進させるかどうかを検討するために、可溶型ALCAMを発現させたU87MGから可溶型ALCAMFLAGを精製した。可溶型ALCAMFLAGの精製には、抗FLAG抗体アフィニティーゲルSigma社を取扱説明書に従って使用した。精製した可溶型ALCAMFLAGを、200μgmL及び1000μgmLの濃度でマトリゲルインベージョンチャンバー上層の培地に添加した。ウェスタンブロット分析8ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、タンパク質をポリフッ化ビニリデンPVDF膜ImmobilonP、Millipore社に転写した。スキムミルクで2時間ブロッキングした後、一次抗体としてマウス抗FLAGM2抗体SigmaAldrich社を1000倍希釈で使用して一晩インキュベーションを行った。二次抗体としてAP標識抗マウスIgG抗体SantaCruz社を1000倍希釈で使用し、BCITNBTキットナカライテスク社によって視覚化した。頭蓋内異種移植モデルrag--マウスの新生仔を使用した。rag--マウスの新生仔を氷上で麻酔し、定位注入装置に固定した。腫瘍の移植部位は、ブレグマより前方2mm、右側1mm、深さ2mmとした。2×100000個の細胞を100000μLの濃度で移植した。移植したマウスは、神経学的症状が出現した時点、又は移植後40日が経過した時点で屠殺した。免疫組織化学的解析2003年から2009年の期間に大阪大学医学部附属病院で外科手術を施行した患者から、パラフィン包埋又は凍結したヒト神経膠腫の手術検体を得た。ミクロトームLeica社を用いて検体の6μm切片を作成した。抗原賦活化はマイクロウェーブ照射により行った。一次抗体としてマウス抗マウスCD166モノクローナル抗体Abcam社を使用し、二次抗体としてヒストファインシンプルステインMAXPOMULTIニチレイバイオサイエンス社を使用した。結合した抗体はDAB同仁化学研究所社によって視覚化した。ALCAM陽性腫瘍細胞の割合は、200倍視野の顕微鏡下で計測した。臨床データ解析2007年から2009年の期間に大阪大学医学部附属病院で外科手術を施行した膠芽腫患者の、無増悪生存率及び全生存率に関する臨床データを得た。解析対象とした全患者が、膠芽腫に対して同様の標準的治療最大限の外科的切除、放射線治療、テモゾロミド投与を受けた。統計解析本明細書で示すインビトロ実験の解析に関しては、すべて、studentt検定による解析を行った。臨床データの解析無増悪生存率、全生存率に関しては、KaplanMeier法を行った。検定はすべて、有意水準をp005として実施した。2.試験及び結果CD166ALCAMの膠芽腫前駆細胞における特異的発現膠芽腫初代培養細胞のCD133陽性CD133細胞及びCD133陰性CD133細胞からRNAを抽出し、RNAよりcDNAを合成した。上記で説明したマイクロアレイ解析により、CD133陽性細胞に特異的に発現する分子を検索した。その結果、CD133陽性である膠芽腫初代培養細胞で、CD166が、CD133陰性である細胞よりも高いレベルで発現することが分かった。図1更に、CD31CD45CD133GBM多型膠芽腫細胞におけるCD166タンパク質発現をFACS分析によって分析した。CD133GBM細胞におけるCD166細胞の頻度は、CD133GBM細胞におけるCD166細胞の頻度よりも、有意に高かった。また更に、脳腫瘍細胞由来の単一細胞懸濁物をPBSに浮遊させ、そこにヒトAB型血清を容積比1:10で加え5分間4°Cで静置することにより非特異的抗体の結合をブロックした。次に、抗CD166-PEBDpharmingen社、抗CD133Biotin、抗CD45FITCBDpharmingen社、それぞれ容積比1:50で加え30分4°Cで静置した。その後、PBSを加えて遠心分離することにより、細胞を洗浄したのち、上清を除き、PBSにストレプトアビジンAPCBDpharmingen社を容積比1:200で加えたものを加え、さらに30分4°Cで静置した。その後、PBSを加えて遠心分離することにより、細胞を洗浄したのち、上清を除き、最後に1mgmlのヨウ化プロピジウムこれは、死細胞を染色するを加えたPBSに浮遊させて、FACSARIABD社を用いて解析した。図2に、3例の代表的な症例の解析結果を示した。上方にCD133CD45分画のゲートを示し、下方にそれぞれCD133脳腫瘍幹細胞分画およびCD133脳腫瘍幹細胞分画におけるALCAMの発現をアイソタイプコントロールとともに示している。いずれのCD133脳腫瘍幹細胞分画においてもALCAMが発現している。。次に、CD166陽性CD166細胞が腫瘍幹細胞の特性を有するかどうかについて検討した。CD166CD133GBM細胞中にBM前駆細胞が濃縮されているかどうかを確かめるために、FACSでソートしたGBM細胞を用いて、上記で説明した腫瘍スフィア形成分析を実施した。5個のGBM試料を試験した結果、腫瘍スフィア形成細胞は、CD166CD133画分では500細胞あたり4604であり、一方、CD166CD133画分では、0606であった図3A。なお、腫瘍スフィアの一例の写真を図3Bに示す。CD133陰性検体でも同様の結果が認められた。すなわち、CD133-CD166細胞はCD133-CD166-細胞と比較して、腫瘍スフィア形成能が高い傾向を示した。図3Cしたがって、CD166陽性細胞は腫瘍スフィア形成能が高い傾向を有することが確認された。以上の結果はCD166陽性膠芽腫細胞が腫瘍幹細胞の特性を有することを示している。CD133細胞を全く持たない脳腫瘍は比較的高頻度に存在する、がそのような症例においても、脳腫瘍中のCD166陽性細胞は脳腫瘍前駆細胞を多く含んでいると考えられる。さらに、CD166陽性細胞がヒト膠芽腫に存在するかどうかを確認するため、膠芽腫患者の凍結切片を用いて、上記で説明した免疫組織化学的解析を実施した。その結果、膠芽腫の凍結切片を免疫染色することにより、CD166陽性脳腫瘍細胞の検出が可能であった図4。これに対し、CD133の免疫組織化学染色では、染色条件を調整して複数の異なる抗体を使用したが染色されなかった図示せず。ALCAMの発現と、神経膠腫のWHO分類及び膠芽腫患者の無増悪生存率との関連性ALCAMが臨床的に意義のあるマーカーであるかどうかを検討するため、上記で説明した免疫組織化学的解析を実施した。まず、ALCAMが神経膠腫のWHO分類と相関するかどうかを検討した。神経膠腫のWHO分類がグレードII、III、IVである手術検体に関して、CD166陽性細胞の割合を測定した。その結果、CD166陽性率はWHO分類のグレードII、III間では関連しないが、グレードIVでは陽性率が有意に高かった図5。これらの結果は、CD166発現が神経膠腫のWHO分類と相関することを示す。さらに、ALCAMが予後マーカーであるかどうかを検討するため、上記で説明した臨床データ解析を実施した。膠芽腫WHO分類のグレードIV患者の臨床転帰とCD166陽性細胞の割合の関連性について評価した。その結果、CD166発現と初回診断からの全生存率との間に顕著な相関は認められないが、CD166陽性率が膠芽腫患者の無増悪生存率と負の相関関係を示す傾向が認められた図6。これらの結果は、ALCAMが膠芽腫患者の予後マーカーとなる可能性を示す。膠芽腫におけるALCAM可溶型ALCAMの膠芽腫細胞における発現及びその機能的役割まず、リアルタイムPCRにより、膠芽腫初代培養細胞及び神経膠腫細胞株における可溶型ALCAMの内因性発現の有無を検討した。図8初代培養細胞と細胞株のすべてにおいてALCAMの可溶型アイソフォームが内因性に発現していた。次に、膠芽腫細胞における可溶型ALCAMの機能的な役割を検討した。まず、ALCAMの可溶型アイソフォームがインビトロで細胞増殖に関与するかどうかを調べるため、細胞増殖実験を実施した。その結果、対照U87MG細胞U87MGとU87MGsALCAM細胞2クローンの細胞増殖には有意差が無かった。図9A次に、可溶型ALCAMが膠芽腫細胞浸潤に関与しているかどうかを検討した。試験は、12穴マトリゲルインベージョンチャンバーを使用し、その取扱説明書に従って実施した。その結果、U87MGsALCAMでは膠芽腫細胞浸潤が有意に促進された。図9B次に、神経膠腫細胞による可溶型ALCAMの分泌の有無を検討した。U87MG培養細胞の培養上清における可溶性ALCAMの有無を、ウェスタンブロット法で分析した。膠芽腫細胞U87MGの馴化培地中に可溶型ALCAMが分泌されることが確認された図10A。さらに、抗FLAG抗体アフィニティーゲルを用いて、可溶型ALCAMFLAGを精製した。その後、マトリゲルインベージョンチャンバーを使用してALCAMの可溶型アイソフォームが膠芽腫細胞浸潤を促進させるかどうかを検討した。その結果、精製した可溶型ALCAMを添加したU87MGではインビトロにおける浸潤能が有意に増強されることが明らかになった図10B。これらの結果は、可溶型ALCAMがインビトロにおける膠芽腫細胞浸潤を促進することを示す。上記で説明した頭蓋内異種移植モデルにより、可溶型ALCAMがインビボで膠芽腫細胞浸潤を促進するかどうかを検討した。対照U87MG細胞又は可溶型ALCAMを過剰発現させたU87MGsALCAM細胞をrag--マウス新生仔の頭蓋内に移植した。対照U87MGを移植したマウスでは移植後40日において腫瘍形成を認めなかったが、U87MGsALCAMを移植したマウスでは移植後35日以内に全例で膠芽腫が形成されることを見出した。図11Aに移植後の累積生存率を示す。U87MGsALCAMを移植したマウスで形成された腫瘍を組織学的に評価し、マウスの脳組織への明らかな浸潤は認められなかったが、腫瘍形成は明確に認められた図11B。3.考察以下に、前述の試験結果をまとめ、かつ考察を行う。前述の試験結果の通り、本発明者らは、CD166ALCAMがCD133陽性細胞特異的に発現し、CD166ALCAM陽性細胞が幹細胞培養条件下で腫瘍スフィアを形成する特性を有することを示した。更に、CD166陽性細胞はCD133が陰性の検体でも腫瘍スフィアを形成する特性を有すること示した。これから明らかなように、CD166はCD133陽性及び陰性細胞のいずれにおいても使用可能な新規の脳腫瘍マーカーであり、及び脳腫瘍幹細胞特に、膠芽腫幹細胞マーカーである。前述の試験結果から、ALCAMがインビトロ及びインビボで膠芽腫の細胞浸潤の制御に関与することが示された。本発明者らは、可溶型ALCAMが膠芽腫細胞株及びヒトの膠芽腫初代培養細胞において内因性に発現し、膠芽腫細胞から分泌されることを示した。本発明者らは、さらに、可溶型ALCAMはインビトロで膠芽腫細胞浸潤を促進し、インビボで腫瘍形成を促進する。本発明者らは可溶型ALCAMがALCAMALCAM間の同種親和性相互作用を阻害することによって膠芽腫細胞浸潤を促進すると推察する。ところで、vanKilsdonkらは、可溶型ALCAMがMMP活性を阻害することによって黒色腫細胞株の浸潤を抑制することを示しているvanKilsdonkらCancerRes2008May1568pp36719。彼らの観察結果は、可溶型ALCAMが膠芽腫細胞浸潤を促進するという本発明者らの研究結果と正反対である。この黒色腫と膠芽腫におけるALCAMの機能の違いは、それぞれのがんにおけるALCAMの機能の違いに起因する可能性がある。膠芽腫はもともと浸潤傾向を呈することから、腫瘍浸潤の調節に関与するいずれの分子でも治療標的となりうる。本明細書に記載する研究において、可溶型ALCAMはインビトロでは細胞浸潤に関与し、インビボでは腫瘍形成を促進することが示された。したがって、可溶型ALCAMは治療標的となる可能性がある。ALCAMはがんの種類によって予後不良因子又は予後良好因子のいずれかに関連し得る。前述の試験結果から、ALCAMが膠芽腫の予後因子であると考えられる。