aLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む、第一のカップリング生成物、bLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む、第二のカップリング生成物、を含むシステムであって、第一のカップリング生成物と第二のカップリング生成物とが、単量体間の相互作用によって二量体を形成するとともに、単量体間の相互作用の変化がシグナルを生じる、システム。プローブが、GFP緑色蛍光タンパク質、YFP黄色蛍光タンパク質、増強黄色蛍光タンパク質eYFP、eGFP、GFP2、GFP10、RGFPウミシイタケRenilla緑色蛍光タンパク質、YPetから選択される蛍光タンパク質である、請求項1に記載のシステム。プローブが、ウミシイタケルシフェラーゼ、RLuc8、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアンルシフェラーゼ又はエクオリンから選択されるルシフェラーゼである、請求項1に記載のシステム。システムが、生物発光共鳴エネルギー移動システムである、請求項1に記載のシステム。請求項1~4のいずれか1項に記載のシステムの使用であって、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための、使用。Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための方法であって、a請求項1~4のいずれか1項に記載のシステム及び候補分子をインキュベートする工程であって、システムが、iLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第一のカップリング生成物、iiLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第二のカップリング生成物、を含む工程、bプローブの少なくとも1つによって放出されるシグナルの変更を検出する工程、を含むとともに、シグナルの変更が、カップリング生成物の少なくとも1つへの候補分子の結合を示す、方法。ハイスループットなスクリーニングシステムを含む、請求項6に記載の方法。本発明は、先行技術の欠点を克服しこれらの需要を満たすことが実際可能である。出願人は驚いたことに、相当の研究の後に、Lingo1がインビボinvivoで二量体を形成することを観察した。Lingo1の細胞外部分は四量体化が可能であることは文献に記載されていたMosyaketal、ThestructureofLingo1ectodomainamoduleimplicatedinCNSrepairinhibition、2006、JBiolChem2813637836390、12。しかし、出願人は今回初めて、全Lingo1及びLingo1の膜形態が、インビボinvivoで二量体を形成することを示した。よって出願人は、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための方法を開発した。それをは容易に自動化させ且つハイスループットに適合させることが可能であり、最も適した抑制剤を発見しそれを治療目的に利用するために、大きな化学分子ライブラリーをスクリーニングすることを可能にする。斯かる方法は、Lingo、特にLingo1がリガンドと相互作用する場合に、Lingo1の二量体の立体構造が変化するという原理に基づく。斯かる同定方法は、この立体構造変化を検出しLingo1リガンドを同定することが可能である。本発明の方法は、特に次のaLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体及び検出可能なシグナルの放出が可能なプローブによって形成されるカップリング生成物を含むシステム、及び候補分子をインキュベートする工程、bプローブの少なくとも1つによって放出される斯かるシグナルの変更を検出するとともに、シグナルの斯かる変更によりカップリング生成物の少なくとも1つへの候補分子の結合を明らかにする工程、を含む。本発明は、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合にシグナルの放出が可能であるプローブを含むカップリング生成物に関する。本発明の目的に関して、用語単量体とは、単一のポリペプチド分子から成るタンパク質を意味する。言い換えれば、それは単一ポリペプチド鎖における原子の三次元配置に存在する。好適には、単量体は二量体の形成が可能である。言い換えれば、単量体は、2つの単量体、すなわち、2つの単量体サブユニットから成る分子を形成するために、互いに結合が可能である。例えば、ホモ二量体、すなわち、互いに結合した同一のタンパク質の2つの単量体とすることができる。あるいは、ヘテロ二量体、すなわち、互いに結合した2つの異なるタンパク質の2つの単量体とすることができる。好適には、二量体は、適切な条件下で、単量体のインビボinvivoでの重合によって形成することができる。例えば、これらの条件は、ジスルフィド架橋の形成又は疎水性相互作用の形成に適切とすることができる。本発明の目的に関して、用語Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4とは、実質的に野生型タンパク質の配列を有する任意のタンパク質を意味する。それは、野生型タンパク質の全て又は一部分を有するタンパク質、又は例えば、付加、欠失又は置換による1又は2以上の変異を有するタンパク質とすることができる。それは、ヒト又は非ヒトタンパク質、例えば、マウス、ウマequine、例えば、ウマhorse、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジovine、例えば、ヒツジsheep、ウシbovine、例えば、乳牛、サルmonkey、例えば、マカクのタンパク質とすることができる。タンパク質がLingo1である場合、野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に12個のLRRロイシンリッチなリピートモチーフ及びIg免疫グロブリンドメインから成る細胞外領域516個のアミノ酸を含む580個の残基、及び38個の残基の細胞質部分から成るタンパク質とすることができる。好適には、Lingo1単量体の配列は、配列番号1の配列とすることができる。それは、GenbankhttpwwwncbinlmnihgovGenbankに受入番号NP1161974で記載の配列とすることができる。それはまた、配列番号5、又はGenbankの配列NM032808で記載のmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。タンパク質がLingo2である場合、野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に606個のアミノ酸から構成され、515個のアミノ酸から構成される細胞外ドメイン、及び40個の残基の細胞質部分を含むタンパク質とすることができる。好適には配列は、配列番号2の配列とすることができる。それは、Genbankで受入番号NP6897831で記載される配列とすることができる。それはまた、配列番号6の配列によって、又はGenbankのNM152570の配列によって記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。タンパク質がLingo3である場合、それは野生型ヒトタンパク質とすることができる。好適には配列は、配列番号3の配列とすることができる。それは、Genbankに記載の受入番号NP001094861の配列とすることができる。それはまた、配列番号7の配列又はGenbankのNM001101391の配列で記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。タンパク質がLingo4である場合、それは野生型ヒトタンパク質とすることができ、特に593個のアミノ酸から構成することができる。好適には配列は、配列番号4の配列とすることができる。それはまた、配列番号8の配列又はGenbankのNM001004432の配列ヒト配列、又はNP796224のマウス配列で記載されるmRNAに相当するポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質とすることができる。好適には、タンパク質のリガンドとの単量体又は二量体の相互作用は、単量体及び/又は二量体の物理的特性変化を生じ得る。それは、例えば、単量体及び/又は二量体の空間立体構造とすることができる。本発明の目的に関して、用語単量体の立体構造変化とは、単量体の任意の空間変化を意味する。好適には、斯かる変化は、単量体及び/又は二量体のリガンドとの相互作用から生じ得る。本発明の目的に関して、用語シグナルを放出することが可能であるプローブとは、単量体の物理的特性が変化を受ける場合に、特に単量体が立体構造変化を受ける場合に、ある効果を生じ得る任意の分子を意味する。好適には、立体構造上高感度の検出が可能な標識とすることができる。好適には、単量体又は二量体とのリガンドの相互作用は、単量体又は二量体において立体構造変化を生じ、斯かる変化は検出可能なシグナルの放出に関与する。好適には、プローブは、化学的タグ、例えば、抗体、発光分子又は蛍光分子、単量体に組み込まれる断片、例えば、プロテアーゼ切断部位、又は免疫検出可能断片から選択される分子とすることができる。本発明の目的に関して、用語発光分子とは、非熱起源のエネルギーを有する光子の形態で、励起中に吸収されたエネルギーの一部分を放出する特性を有する任意の分子を意味する。よってそれは、低エネルギー状態へ励起された分子の不活性化を含む。言い換えれば、発光分子は、発光を生じるために適切な物質に作用し得る分子である。発光分子は、例えば、タンパク質、又は化合物とすることができる。好適には、発光タンパク質は、青、黄色又は緑光を放出する特性を有する。タンパク質は、例えば、Kamal等の文献、ImproveddonoracceptorBRETcouplesformonitoringbetaarrestinrecruitmenttoGproteincoupledreceptors、BiotechnolJ2009Sep49133744、17KocanM等の、DemonstrationofimprovementstothebioluminescenceresonanceenergytransfertechnologyforthemonitoringofGproteincoupledreceptorsinlivecells、JBiomolScreen2008Oct13988898、18MicheliniE等の、Luminescentprobesandvisualizationofbioluminescence、MethodsMolBiol2009574113、19に記載される、当業者に周知のタンパク質から選択することができる。例えば、発光タンパク質は、ルシフェラーゼとすることができる。ルシフェラーゼは、例えば、国際公開第01046691号に記載の、当業者に周知の分子から選択可能である。例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、RLuc2、RLuc8、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアンルシフェラーゼ又はエクオリン、及びそれらの変異体又は誘導体とすることができる。ウミシイタケルシフェラーゼの場合、配列番号12の配列によってコードされるタンパク質とすることができる。例えば、発光タンパク質は、ウミシイタケルシフェラーゼとすることができ、単量体はLingo1とすることができる。斯かる場合、カップリング生成物は、配列番号14のペプチド配列を有することができる。本発明の目的に関して、用語シグナルとは、任意の物理的又は化学的効果を意味する。それは、例えば、発光性シグナル、例えば、蛍光、発光、発色、電気性であるが、このリストに限定するモノではない。本発明の目的に関して、用語蛍光分子とは、光エネルギーを吸収する特性励起光及び非常に急速に光子を放出することによって蛍光の形態で急速に放出する特性放出光を有する任意の分子を意味する。一旦光子のエネルギーが吸収されると、分子は続いて通常電子的に励起された状態となる。言い換えると、フルオロフォア又は蛍光色素とすることができる。好適には、発光又は蛍光タンパク質は、青、黄色又は緑色光を放出可能なタンパク質とすることができる。特に好適には、発光又は蛍光タンパク質は、黄色又は緑色光を放出することが可能な蛍光タンパク質とすることができる。蛍光タンパク質は、例えば、GFP緑色蛍光タンパク質、YFP黄色蛍光タンパク質、増強黄色蛍光タンパク質eYFP、eGFP、GFP2、GFP10、RGFPウミシイタケ緑色蛍光タンパク質及びYPet、及び国際公開第0146691号に記載されるそれらの突然変異体又は誘導体から選択できる。eYFPの場合、それは配列番号9の配列によってコードされるタンパク質とすることができる。例えば、蛍光タンパク質はeYFPとすることができ、単量体はLingo1とすることができる。斯かる場合、カップリング生成物は、配列番号11のペプチド配列を有することができる。本発明の目的に関して、用語カップリング生成物とは、単量体及びプローブが互いに結合した任意の生成物を意味する。言い換えれば、カップリング生成物は、単量体とプローブとの組み合わせとすることができる。言い換えれば、カップリング生成物は、単量体とプローブとの複合体とすることができる。好適には、プローブ及び単量体は、生物学的媒体中で安定な1又は2以上の結合を介して結合され得る。言い換えれば、プローブ及び単量体は、カップリング生成物が保存又は生成される媒体中でその間変化しない、1又は2以上の結合を介して結合され得る。好適には、媒体は細胞培地、又はインビトロinvitro又はインビボinvivoの操作と関連して使用される媒体とすることができる。プローブ及び単量体は、共有結合で結合され得る。これに関して、結合は、互いから別々に生じる2つの電子の共有に由来する2つの原子との間の結合とすることができる。プローブ及び単量体は、融合タンパク質、すなわち、異なるタンパク質、又はタンパク質の一部の組み合わせを介して得られた人工タンパク質を形成できる。カップリング生成物は、当業者に周知の技術によって、例えば、カップリング生成物をコードする核酸分子の宿主生物による発現によって、又はインビトロinvitroでのペプチド合成及び化学ライゲーション後のカップリングによって得られる。例えば、カップリング生成物が融合タンパク質の場合、カップリング生成物は、プローブ及び単量体に相当するオープンリーディングフレームを含む遺伝子のDNA組換え、斯かる遺伝子の発現ベクターへの挿入、発現ベクターの宿主細胞への挿入、宿主細胞による対応の融合タンパク質の産生及び融合タンパク質の精製による作成に従って得られる。本発明はまた、上述のカップリング生成物をコードする、分離及び精製された核酸分子に関する。本発明の目的に関して、用語核酸分子とは、一連のヌクレオチドから成る任意の分子を意味する。それは、例えば、デオキシリボ核酸DNA、リボ核酸RNA、メッセンジャーRNAmRNA又は相補DNAcDNAとすることができる。本発明の目的に関して、用語分離とは、天然環境から分離されることを意味する。好適には、核酸は、組換えDNAテクノロジー、例えば、配列決定、制限酵素での消化、変異誘発、及び発現ベクターへのクローニングと関連して行われる所定の操作を受け得る。本発明の目的に関して、用語精製とは、混入物から実質的に分離されている特徴を意味する。核酸分子は、上述の発光又は蛍光タンパク質をコードする核酸配列、及び上述の単量体をコードする核酸配列を含むことができる。好適には、核酸分子は、配列番号10の配列単量体がLingo1であり、タンパク質がeYFPである又は配列番号13の配列単量体がLingo1であり、タンパク質がウミシイタケルシフェラーゼであるを含むことができる。核酸分子は、当業者に周知の技術によって得られる。それは、特に人工的に構築でき、化学合成、又は例えば、LewinBGenesVI、DeBoeckUniversity、6thedition、Chapter20、1999に記載される遺伝子工学によって得られる。それは、例えば、プローブ及び単量体に相当するオープンリーディングフレームを含む遺伝子のDNAの組換えによって得られる。例えば、組換えDNAは、特に細菌プラスミド又はバクテリオファージ等の発現ベクターによって、特に細菌等の宿主発現生物中に挿入することができる。本発明はまた、上述の核酸分子を含む発現ベクターに関する。本発明の目的に関して、用語発現ベクターとは、コード配列を有する核酸分子に転写又はタンパク質への翻訳を可能とする構造を有する任意の分子を意味する。好適には、それは、次の配列プロモーター、転写開始配列、転写終了配列、ポリアデニル化配列等、選択可能遺伝子、エンハンサー、制御配列及び誘導性配列の少なくとも1つを含むことができる。ベクターは、例えば、アデノウイルス又はレトロウイルス等のウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はファージミド等の当業者に周知の任意のベクターとすることができる。それは、例えば、プラスミドp3xFlagSigma、pCDNA3Invitrogen又はpeYFPN1Clontech等の市販のベクターとすることができる。このようなベクターは、例えば、LewinBGenesVI、DeBoeckUniversity、6thedition、Chapter20、1999に記載される当業者に周知の技術によって調製できる。本発明はまた、少なくとも1つの上述の核酸分子又は上述の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の目的に関して、用語宿主細胞とは、タンパク質をコードする発現ベクターがその中に導入される場合に、タンパク質を産生する能力を有する任意の生物を意味する。好適には、カップリング生成物をコードする発現ベクターがその中に導入される場合に、宿主細胞はカップリング生成物を発現できる。好適には、宿主細胞は、少なくとも1つの上述のカップリング生成物を発現できる。例えば、宿主細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ及びLingo1を含むカップリング生成物、又はeYFP及びLingo1を含むカップリング生成物を発現できる。好適には、宿主細胞は、2つの核酸分子又は発現ベクターを含むことができる。例えば、宿主細胞は、発光タンパク質及び単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子、及び蛍光タンパク質及び単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子を含み且つそれを発現することができる。例えば、宿主細胞は、ウミシイタケルシフェラーゼ及びLingo1単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子、及びeYFP及びLingo1単量体を含むカップリング生成物をコードする核酸分子を含み且つ発現することができる。好適には、カップリング生成物は、宿主細胞で二量体を形成できる。これは、出願人が、インビボinvivoにおいて、細胞で発現された単量体が二量体を形成することを示したことに起因する。宿主細胞は、組換えタンパク質の産生に適した、つまり当業者に周知の任意の生物とすることができる。それは、真核生物又は原核生物細胞とすることができる。例えば、YB20ATCCCRL1662、CHOK1ATCCCCL61、例えば、HEK293ATCCCRL1573、BHKATCCCRL12072又はCOSATCCCRL1650、PC12ATCCCRL1721又はSHSY5YATCCCRL2266又はHelaATCCCCL2とすることができる。宿主細胞は、当業者に周知の技術によって、上述の発現ベクター又は上述の核酸分子の、宿主細胞への挿入によって生成することができる。例えば、文献MolecularCloningALaboratoryManual2ndedition1989、ColdSpringHarborLaboratoryPress、CurrentProtocolsinMolecularBiology1987、JohnWileySons、IncISBNO47150338X等に記載される電気穿孔、又はリン酸カルシウム、MethodsinElectroporationGenePulserEcoliPulserSystemBioRadLaboratories1993に記載される電気穿孔法、に言及することができる。宿主細胞は、当業者に周知の任意の適した培地で培養することができる。例えば、DMEM培地ダルベッコ変法イーグル培地、Invitrogen登録商標、HamのF12培地、イーグル最小必須培地MEM、及び神経細胞ベース培地NeuronalBaseMediumPAALaboratoriesに言及することができる。カップリング生成物は、当業者に周知の任意の手段、例えば、免疫精製又はアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。本発明の第一の対象は、a上述の、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に変更される検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む第一のカップリング生成物、b上述の、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び単量体が立体構造変化を受ける場合に変更される検出可能なシグナルの放出が可能なプローブを含む第二のカップリング生成物、を含むシステムであると共に、第一のカップリング生成物及び第二のカップリング生成物が二量体を形成し、単量体間の相互作用における変化がシグナル変化を生じるシステムに関する。本発明の目的に関して、用語システムとは、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び検出可能なシグナルを放出することが可能であるプローブによって形成されるカップリングに由来する二量体すなわち、分子間相互作用のため互いに非常に近接した、2つのサブユニットから構成されるタンパク質の複合体を意味し、斯かるシグナルは単量体及び/又は二量体が立体構造変化を受ける場合に修飾される。それは例えば、当業者に周知の任意の適した技術、例えば、生物発光共鳴エネルギー移動BRET、蛍光共鳴エネルギー移動FRET、TRFRET時間分解FRET又はHTRF均一時間分解蛍光による検出に適したシステムである。好適には、それは、生物発光共鳴エネルギー移動BRETによる検出システムである。本発明の斯かるシステムは、ドナーアクセプターカップルを発現している細胞懸濁液、付着細胞の培養物、膜又は組織等の形態とすることができる。本発明の目的に関して、用語二量体とは、2つの単量体から成る任意の分子を意味する。好適には、二量体を構成している単量体間の距離は、150Å未満、例えば、100Å未満、好適には75Å又は50Å未満である。本発明の目的に関して、用語相互作用の変化とは、単量体間の任意の物理的又は構造上変化を意味する。それは、特に単量体の空間又は立体構造変化とすることができる。好適には、斯かる変化は、リガンドの二量体又は単量体の少なくとも1つへの結合、又は二量体又は単量体のの少なくとも1つへのリガンドの近接性に起因しうる。本発明の目的に関して、用語リガンドとは、カップリング生成物に結合する任意の分子を意味する。好適には、斯かる結合は、カップリング生成物が二量体形態の場合に起こり得る。リガンドは、ホルモン、神経伝達物質、化合物、薬物、診断薬、抗体又はペプチド配列とすることができる。それは、完全又は部分total又はpartial刺激薬又は完全又は部分拮抗剤とすることができる。好適には、リガンドは単量体又は二量体を、1μM~1pM、好ましくは、1nM~1pMの親和性で結合することが可能とすることができる。好適には、リガンドは、パーキンソン病又は多発性硬化症、緑内障又はミエリンに関係する疾患を治療又は予防できる。出願人は実際、今回初めて、カップリング生成物、より特に単量体が、特にインビボinvivoで二量体化することを、次に、二量体へのリガンドの結合が二量体において立体構造変化を生じることを示した。好適には、立体構造変化は、プローブによるシグナルの放出において変化を生じ得る。好適には、シグナルは、任意の適した当業者に周知の技術によって検出され得る。好適には、システムは、生物発光共鳴エネルギー移動BRET、蛍光共鳴エネルギー移動FRETシステム、TRFRET時間分解FRET又はHTRF均一時間分解蛍光による検出に適切となり得る。例えば、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、BRETによる検出と関連して実行できる。例えば、Xu等のAbioluminescenceresonanceenergytransfersystemapplicationtointeractingcircadianclockproteins1999ProcNatlAcadSciUSA96、15115613Angers等の、Detectionofbeta2adrenergicreceptordimerizationinlivingcellsusingbioluminescenceresonanceenergytransferBRET2000ProcNatlAcadSciUSA973684368914に言及することができる。特に、BRETは、RLuc及びLingo1を含むカップリング生成物、及びeYFP及びLingo1を含むカップリング生成物によって実行できる。Rlucは、基質、例えば、セレンテラジン又は市販のその誘導体の存在下で青色光を生じる酵素であるMolecularProbesEugeneORBiosynthNapiervilleIL。空間配向性が適切である場合、eYFPは青色光の一部を吸収し、結果として異なる波長の、黄色の範囲で光を発することが可能である。言い換えれば、セレンテラジンの存在下で、Rluc及びeYFPが十分に互いに近接する場合に、eYFPは黄色光を発する。本発明の目的に関して、用語十分に近接とは、150Å未満、又は100Å未満、好適には75Å又は50Å未満の距離を意味する。Rluc及びeYFPが非常に離れている場合、エネルギーは効率的に移動されず、Rlucの青色光のみ検出される。互いへのRluc及びeYFPの空間配置が、単量体の互いの空間配置に依存するということは、頻繁に生じる。分子が単量体又は二量体に結合する場合、二量体の空間立体構造が変化する。特に、単量体は、互いに近くに移動する又はさらに離れるように移動する。2つの単量体、特にRluc及びeYFPが十分に近接する場合、eYFPはRlucによって放出される青色光の一部を吸収でき、黄色範囲の波長を発することができる。よって、分子が二量体又は単量体に結合するかを検出するのために、セレンテラジンの添加後に、ドナーRlucの波長及びアクセプターeYFPの波長での発光効率を測定することによってエネルギー移動効率を測定する。さらに、アクセプターの発光効率ドナーの発光効率比は、BRETを定量化するために算出する。また、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、FRETによる検出と関連して実行できる。例えば、米国特許第7183066号Kroegeretal、Constitutiveandagonistdependenthomooligomerizationofthethyrotropinreleasinghormonereceptor2001JBiolChem、276、1273612743、20に言及することができる。例えば、フルオレセインローダミン又はCFPシアン蛍光タンパク質YFPカップルによって、当業者に周知のドナーフルオロフォア及びアクセプター発色団を使用することができる。好適には、本発明のシステムは、例えば、MaurelD等、CellsurfaceproteinproteininteractionanalysiswithtimeresolvedFRETandsnaptagtechnologiesapplicationtoGPCRoligomerization2008、NatMethods65617、21に記載される当業者に周知のプロトコールに従って、TRFRETによる検出と関連して実行できる。例えば、時間分解リーディングに基づき、寄生シグナルの一部分を省くことによって、FRETのシグナルノイズ比を改善することが可能である。これは、レアアースクリプテート又はキレート等の持続するフルオロフォアの使用を介して可能である。好適には、本発明のシステムは、当業者に周知のプロトコールに従って、例えばHermandP等の、FunctionaladhesivenessoftheCX3CL1chemokinerequiresitsaggregationRoleofthetransmembranedomain2008JBiolChem28344302253422、又はWhitfieldJ等のHighthroughputmethodstodetectdimerizationofBcl2familyproteins2003、AnalBiochem、3222170823に従って、HTRF商標登録による検出と関連して実行できる。例えば、ユーロピウムクリプテート等の蛍光ドナー又は紅藻から精製されたフィコビリンタンパク質の色素等の蛍光アクセプター例えば、XL665で標識された抗体は、単量体それぞれのタグを認識する。単量体の相互作用は、エネルギー移動、例えば、337nmでの励起及び665nmでの放出によって検出される。斯かるシステムは、上述の2つの発現ベクターの細胞への同時形質移入によって得られる。斯かるシステムは、例えば、インビトロinvitroで、例えば、プレート上で実行できる。本発明の他の対象は、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するための、上述のシステムの使用に関する。本発明の他の対象は、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質中の立体構造変化を検出するための上述のシステムの使用に関する。本発明の他の対象は、Lingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質のリガンドを同定するのための方法であって、次のa上述のシステム及び候補分子をインキュベートする工程であって、システムがiLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び斯かる単量体が立体構造変化を受ける場合に変化する検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第一のカップリング生成物、iiLingo1、Lingo2、Lingo3及びLingo4から選択されるタンパク質の単量体、及び斯かる単量体が立体構造変化を受ける場合に変化する検出可能なシグナルの放出が可能なプローブ、を含む第二のカップリング生成物、を含む工程、bプローブの少なくとも1つによって放出されるシグナルを検出する工程、を含むとともに、シグナルが候補分子のカップリング生成物の少なくとも1つへの結合を明らかにする、方法に関する。本発明の目的に関して、用語インキュベートするとは、第一のカップリング生成物、第二のカップリング生成物及び候補分子をまとめることを意味する。好適には、インキュベーションは、第一及び第二のカップリング生成物の単量体の二量体化が可能な条件下で行う。好適には、インキュベーションは、候補分子がタンパク質のリガンドである場合、単量体の少なくとも1つ又は二量体への候補分子の結合が可能な周知の条件下で行う。用語候補分子とは、任意の試験分子を意味する。それは、例えば、タンパク質、ペプチド、化学分子、抗体とすることができるが、このリストに限定するものではない。分子は、例えば、タンパク質ライブラリー、細胞懸濁液、化学ライブラリーに由来することができるが、このリストに限定するモノではない。分子は、Lingo1、Lingo2、Lingo3又はLingo4のリガンドとすることができる。好適には、候補分子がタンパク質のリガンドでない場合、二量体の形成に由来するBRETシグナルは、候補分子の付加後に変化を受けない。好適には、斯かる場合、単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の物理的特性の変化はない。好適には、リガンドの添加後のBRETシグナルの変化は、経時で、例えば、30分間モニターすることができる。好適には、候補分子がタンパク質のリガンドである場合、二量体の形成に由来するBRETシグナルは、候補分子の添加後に変化する、例えば、増加又は減少される。好適には、斯かる場合、少なくとも1つの単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の少なくとも1つの物理的特性の変化が生じる。好適には、候補分子の結合は、少なくとも1つの単量体、二量体、プローブ又はカップリング生成物の立体構造変化を生じる。好適には、シグナルは、BRET、FRET、TRFRET又はHTRFシステムと関連して検出され得る。好適には、本発明の方法は、シグナルが生じることを可能にする基質を添加する工程もまた含む。それは、例えば、セレンテラジン又はセレンテラジン誘導体、例えば、セレンテラジン400a、又はDeepBlueCとすることができる。基質は、当業者に周知の任意の態様で、例えば、外因的に添加する、又は基質をコードする核酸の形態で添加することができる。好適には、方法は、BRET、FRET、TRFRET又はHTRFプロセスを実行することに必要な任意の工程又は条件を含むことができる。これらの工程は、当業者に周知であり、シグナルを測定する、放出及び吸収波長を算出する、波長を区別するためにフィルターを使用する、例えば、光電子増倍管又はCDD電荷結合デバイスカメラによって波長強度を算出する、エネルギー移動効率を算出する、放出ピークを検出する、及びBRETCount、MithrasBerthold、マイクロプレートシンチレーション及び発光カウンターBerthold、PackardInstruments等の装置を使用する工程を含むことができる。方法は、インビトロinvitro又はインビボinvivoで実行できる。好適には、方法は生細胞で実行できる。例えば、方法は、生理的条件下で、安定に又は一過性に形質移入した細胞株で実行できる。好適には、方法は、細胞膜、任意には予め調製且つ凍結させた細胞膜の調製において、又は精製タンパク質上で実行できる。好適には、方法は、ハイスループットなスクリーニングシステムもたまた含むことができる。本発明の目的に関して、用語ハイスループットなスクリーニングシステムとは、同定方法を促進することが可能である自動化の任意の手段を意味する。それは、当業者に周知の任意の手段とすることができ、例えば、情報テクノロジー、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、プロテオミクス、ロボット工学、及び場合によりナノテクノロジーが含まれるが、このリストに限定するモノではない。好適には、方法には、タンパク質の刺激薬活性剤リガンド及び拮抗剤抑制剤リガンドを同定することが可能である試験もまた含むことができる。それは、例えば、生物学的試験とすることができる。それは、タンパク質が役割を果たす少なくとも1つのシグナル経路、例えば、Mi等の2005、4で実行されるオリゴデンドロサイト分化、軸索ミエリン形成への候補分子の影響、又は例えば、Fu等の2009、9で実行されるドパミン作動性神経及び網膜神経節細胞の生存を同定することが可能である任意の試験とすることができる。好適には、当該方法は、RhoA又はAktタンパク質キナーゼを含む、下流、細胞シグナル経路が、リガンドによって活性化される又は抑制されるかを決定することを可能にする。リガンドの効果は、例えば、Rho経路Pierceによって販売されるRhoA試験又はAkt経路Perkinから販売されるAlphaスクリーニングを使用した試験、又はCellSignalingから販売される特異的抗体を使用したウエスタンブロッティング分析上で試験できる。好適には、方法は、リガンドが斯かるタンパク質と細胞膜受容体NgR1、EGFR及びTrkBとの間の相互作用を阻害するかを測定することができる。これに関して、Lingo1とNgR、Lingo1EGFR及びLingo1TrkBの間の相互作用を測定することができる。本発明はまた、上記方法を実行するためのキットとも呼ばれる装置に関する。それは、上記の少なくとも1つの相互作用を試験することを可能にする。キットは、方法を実行するために必要なエレメント、例えば、カップリング生成物、基質、BRETシグナルを検出又は測定するための少なくとも1つの手段の全て又は一部を含むことができるが、このリストに限定するモノではない。キットは、例えば、融合タンパク質、例えば、Lingo1RLuc、Lingo1YFP、Lingo2RLuc、Lingo2YFP、Lingo3RLuc、Lingo3YFP、Lingo4RLuc、Lingo4YFP、NgRRLuc、NgRYFP、EGFRRLuc、EGFRYFP、TrkBRLuc及びTrkBYFPのプラスミド、及び基質、例えば、セレンテラジンを含むことができる。材料と方法1細胞HEK293ヒト胚腎臓線維芽細胞、ATCCCRL1573及びSHSY5Yヒト神経芽細胞腫、ATCCCRL2266細胞株を、ウシ胎仔血清10、BioWest、France、ペニシリン100Uml、Eurobio、ストレプトマイシン100μgml、Eurobio、France及びLグルタミン2mM、Eurobioを追加したDMEM培地Dulbeccos修正イーグル培地中に培養する。一次ニューロン培養物を、E18胎生期18日にラット胚の皮質から調製する。ニューロンを、B27特に、dビオチン、ウシ血清アルブミン、脂肪酸不含有、カタラーゼ、LカルニチンHCl、コルチコステロン、エタノールアミンHCl、Dガラクトース、グルタチオン、インスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン2HCl、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、T3アルブミン、DLαトコフェロール、DLαトコフェロール酢酸、トランスフェリン、ビタミンA酢酸、Gibco商標登録から構成される、ペニシリン100Uml及びストレプトマイシン100μgmlを追加した、Neurobasal登録商標Gibco商標登録、Invitrogen、グリシン、Lアラニン、Lアルギニン塩酸塩、LアスパラギンH2O、Lシステイン、Lヒスチジン塩酸塩H2O、Lイソロイシン、Lロイシン、Lリジン塩酸塩、Lメチオニン、Lフェニルアラニン、Lプロリン、Lセリン、Lスレオニン、Lトリプトファン、Lチロシン、Lバリン、塩化コリン、Dパントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンB12、iイノシトール、塩化カルシウム、硝酸第二鉄、塩化マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム、硫酸亜鉛、HEPES、フェノールレッドから成る中で培養する。細胞を、37°C、加湿雰囲気下で、5CO2でインキュベーター中で培養する。2発現ベクターの作成5つの発現ベクターを使用した。Lingo1HAヒトLingo1タンパク質をコードする配列620個のアミノ酸、受入番号NP116197及びそれに続く赤血球凝集素タグHAを、PCRポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。得られた断片を、pcDNA3プラスミドInvitrogenに導入した。Lingo1HAプラスミドは、配列番号19の配列を有する。DNLingo1HALingoの細胞外部分及びその膜貫通ドメインをコードする配列アミノ酸1~577、それに続く赤血球凝集素タグHAを、PCRによって増幅した。得られた断片を、pcDNA3プラスミドInvitrogenによって供給され、5446bpのサイズで、特にサイトメガロウイルスプロモーター、T7配列決定プライマー、アンピシリン耐性遺伝子及びネオマイシン選択遺伝子を有する中に導入した。Lingo1RLuc発光標識ウミシイタケRenillaluciformisの配列のタグをつけた全ヒトLingo1タンパク質620個のアミノ酸3’を含む。Lingo1RLucプラスミドは、配列番号17の配列を有する。Lingo1eYFP黄色蛍光標識eYFP増強黄色蛍光タンパク質の配列でタグをつけた、全ヒトLingo1タンパク質620個のアミノ酸3’をコードする配列を含み、その物理的特性、特にその蛍光強度は、YFPと比較して改善された。Lingo1eYFPプラスミドは、配列番号18の配列を有する。pRLucN1マルチクローニングサイトの下流のウミシイタケルシフェラーゼRLucのコード配列を含む。このプラスミドは、eYFPの配列を除去しRLucの配列と置換することによって、市販のプラスミドpEYFPN1から構築した。pRLucN1プラスミドは、配列番号15の配列を有する。Lingo1RLucとLingo1eYFPとの融合タンパク質を、ウミシイタケルシフェラーゼRluc又はeYFP蛍光タンパク質のためのコード配列に隣接するマルチクローニングサイトを有する市販の発現ベクターpeYFPN1、Clonetech又は研究室で利用可能な発現ベクターpRLucN1を使用して、従来のサブクローニング技術制限酵素SalI、BamHI、NotI、HindIII、EcoRI、NheIでのDNA断片又はプラスミドの消化プラスミド中のDNA断片のライゲーションDH5αコンピテント細菌、Invitrogenの形質転換によって得た。RLucとeYFPとをLingoのヒト形態620個のアミノ酸、受入番号NP116197のC末端と融合することによって、Lingo1RLucとLingo1eYFPとの融合タンパク質を得た。その終始コドンが欠如するLingo1の配列を、PCRで増幅した。得られた断片を、peYFPN1プラスミドClontechから供給され、配列番号16の配列中に導入した。サイズは約4700bpで、特に、コンストラクトLingo1eYFPを得るために、又はコンストラクトLingo1Rlucを得るために、pRLucN1プラスミド中に、CMVプロモーター、配列5dCGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG3のEGFPN配列決定プライマー、カナマイシン抵抗性遺伝子、哺乳類細胞の選択のためのネオマイシン抵抗性遺伝子G418又はジェネテシンと共にを含む。3コンストラクトの形質移入ウエスタンブロット及び免疫共沈降実験図1のために、形質移入脂質リポフェクタミン登録商標LTXInvitrogen登録商標を使用してHEK293細胞に形質移入する。形質移入の前日、細胞をコラーゲンコーティングのディッシュ1型コラーゲン、Serva上で、抗生物質を含まない培地に播種する。HEK293細胞に、5μgの様々なプラスミドを同時形質移入する。形質移入の2日後、05のトリトンX100を含む緩衝液中に細胞を溶解する。形質移入の当日に、Optimem培地3ml、CatNo31985047Gibco商標登録、Invitrogen、特にLグルタミン、2400mgLの炭酸水素ナトリウム、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、成長因子、mgLフェノールレッドから成るに希釈したプラスミドDNA5~10μgを、PlusReagent登録商標10μl、CatNo11514015、Invitrogen登録商標の存在下で5分間インキュベートする。リポフェクタミンLTX20μl、CatNo15338500、Invitrogen登録商標を続いて混合物に添加し、30分間インキュベートする。培地を交換後7mlディッシュ、DNAとリポフェクタミンによって形成された複合体を液滴で細胞に添加する。リポフェクタミンの毒性効果を回避するために、形質移入培地を5時間後に除去し、抗生物質を含まないフレッシュな培地と交換する。BRET実験のために、コラーゲンで前処理した6ウェルプレートで培養したHEK293細胞に、リン酸カルシウム技術を使用して一過性に形質移入する。短時間に、プラスミドDNAを塩化カルシウム25Mと共にリン酸緩衝液2XBBS、特に50mMBESCatNoB4554、Sigma、280mMNaCl、15mMNa2HPO4、から成り、pH695に調製中に混合する。15分間のインキュベーション後に、得られた沈渣を24時間細胞に適用する。続いて細胞をリンスし、さらに24時間抗生物質を含まない培地でインキュベートする。BRET実験のために、コラーゲンで前処理した6ウェルプレートで培養したSHSY5Y細胞に、形質移入脂質リポフェクタミン2000CatNo11668019、Invitrogen登録商標を使用して一過性に形質移入する。形質移入の当日に、Optimem培地500μlに希釈したプラスミドDNAを、リポフェクタミン20005μlと混合し、続いて20分間インキュベートする。培地を交換ウェルあたり、抗生物質を含まない2mlのフレッシュな培地した後、複合体を24時間細胞に適用する。続いて細胞をリンスし、抗生物質を含まない培地でさらに24時間インキュベートする。4可溶化液の調製、化学架橋形成、ウエスタンブロッティング化学架橋化を行う場合、溶解前に生細胞上で行う。細胞をPBSでリンスした後、細胞をDSPLomant’sReagent、ジチオビス[スクシンイミジルプロピオナート]、CatNo22585、ThermoScientific160μgml、HBSS緩衝液中に希釈で10分間環境温度でインキュベートする。PBSリン酸緩衝生理食塩水での3回のリンス後に、細胞を溶解する。溶解は氷上で行う。冷PBSでの3回のリンス後に、細胞を溶解緩衝液50mMトリスHCl、pH75、実験に応じて05~1のトリトンX100、100mMNaCl、50mMNaF、5mMEDTA、アプロチニンの10μgml、10mMピロリン酸ナトリウム中で10分間インキュベートし、プロテアーゼとホスファターゼ抑制剤との混合物をそれに添加する。続いてスクレーパーを使用して細胞を回収し、遠心分離する22000g、4°Cで15分間。上清を20°Cで保存し、ゲルに負荷する又は免疫共沈降実験のために直接使用する。これを行うために、細胞可溶化液の定量を抗HA抗体に結合されたアガロースのビーズビーズ40μl、EZview、Sigmaで4°Cで回転させながら一晩インキュベートする。溶解緩衝液での5回の連続洗浄後に、40μlの4XLaemmli緩衝液200mMトリス、pH68、4SDS、40グリセロール、05mMβメルカプトエタノール、002ブロモフェノールブルーを添加することによって免疫沈降物を回収する。細胞可溶化液及び免疫沈降物を、続いて8アクリルアミドゲルに変性且つ還元条件下で負荷する。トリスグリシン泳動緩衝液中で電気泳動を行い、続いてタンパク質をPVDFHybondP細胞膜AmershamBiosciences上に移動させる。TBST01Tween205スキムミルクの溶液中で細胞膜を1時間飽和させる。一次抗体抗LingoLingo1配列のアミノ酸40~556に対する抗体受入番号AAH11057、CatNoAF3086、RDシステムを11000thで、抗HARoche、ラットを15000thで、LivingColors商標登録抗体Clontechを15000thで、環境温度で同一溶液中で2時間インキュベートする。TBSTトリス緩衝液生理食塩水01Tween20中で数回洗浄後に、133000th希釈の過酸化酵素に結合された対応の二次抗体で細胞膜をTBST01Tween205スキムミルク中で1時間インキュベートする。再度、数回の洗浄後、細胞膜を基質SuperSignalWestDura、Pierceで5分間インキュベートした後、フィルムCLXposure、AmershamBiosciences上に曝露する。5BRET、発光及び蛍光の測定形質移入後に生理的緩衝液Hankの緩衝塩類溶液用HBSSCatNo14025100、Gibco、特に塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、無水リン酸水素ナトリウムから構成される中で48時間細胞を再懸濁し、96ウェルプレートウェルあたり100000~200000個の細胞又は384ウェルプレートウェルあたり20000~40000細胞中に分配する。蛍光及び発光の読み取りを、マイクロプレートリーダー、MithrasLB940Berthold上で環境温度で行う。Lingo1eYFP、Lingo2eYFP、Lingo3eYFP又はLingo4eYFPコンストラクトの形質移入由来の収率を、480nmでの励起後に530540nmで発光されたeYFPの蛍光の読み取りによって評価する。Lingo1RLuc、Lingo2RLuc、Lingo3RLuc又はLingo4RLucコンストラクトの形質移入由来の収率を、セレンテラジン基質5μMの添加の直後に得られた発光の読み取りによって1秒評価する。セレンテラジンの添加の直後にBRETシグナルの測定を行う。これにより、Rlucのスペクトル特性に一致し、放出ピーク480nmを有する生物発光シグナルが出現する。RlucとeYFPとの間の融合タンパク質で起こるエネルギー移動は、530540nmが最大放出の、eYFPのスペクトル特性の特徴を有する蛍光シグナルの出現を生じる。Bret比は、RLucコンストラクトのみ発現される場合に得られる比の減算後の、RLucによって放出される光の値480nmに対するeYFPによって放出される光の値530540nmの比と定義される。BRETフィルターの2つのセットを使用した。フィルターの第一のペア古フィルターと呼ぶは、20nmのバンド幅、60の光透過率の480nmフィルター、及び25nmのバンド幅、60の光透過率の530nmフィルターに相当する。フィルターの第二のセット新フィルターと呼ぶは、20nmのバンド幅、75の光透過率の480nmフィルター、及び40nmのバンド幅、75の光透過率の540nmフィルターに相当する。結果はmilliBRETmBuに表され、1000を掛けたBret比の値に相当する。BRET測定はまた、付着細胞上で行うことができる。斯かる場合、発光読み取り前に基質を15分間プレインキュベートする。6Lingo1リガンドのスクリーニング方法ディッシュ10cm直径で培養したHEK293細胞に、BRETmaxの約5060を達成するためにLingo1RLuc250ng及びLingo1YFP1500ngを形質移入した。形質移入後に48時間生理的緩衝液HBSSで細胞を再懸濁し、96ウェルプレート中の80μlに分配したウェルあたり100000~200000細胞。細胞の添加前に、様々なリガンド最終濃度20μMで通常使用されるを、96ウェルプレート中に分配した10μl。15分間のインキュベーション後に、セレンテラジンhInterchimを添加し10μl、最終濃度5μMを得た。BRET読み取りを、新たなBRETフィルターを使用してマイクロプレートリーダー、MithrasLB940Berthold上で環境温度で行った。これらの実験は、Lingo1RLuc及びLingo1YFPを発現している安定株を使用してもまた行われる。7カウンタースクリーニング試験我々の方法によって同定された斯かる分子の効果の特異性を、β2アドレナリン受容体の二量体の形成から生じているBRETシグナルに基づいて評価したカウンタースクリーニング試験。このために、HEK293細胞に、ドナーとして機能するウミシイタケルシフェラーゼとC末端で融合されたβ2アドレナリン受容体β2ARRLuc、50ng、及びアクセプターとして機能する黄色蛍光タンパク質とC末端で融合された増加濃度のβ2アドレナリン受容体β2ARYFP、50~1000ngを形質移入した。形質移入後に、生理的緩衝液HBSS中で48時間細胞を再懸濁し、96ウェルプレートの、80μl中に分配したウェルあたり100000~200000細胞。細胞の添加前に、96ウェルプレート10μl中に生成物を分配した。15分間のインキュベーション後に、セレンテラジンhInterchimを添加し10μl、最終濃度5μMを得た。BRET読み取りを、新たなBRETフィルターを使用してマイクロプレートリーダー、MithrasLB940Berthold上で環境温度で行った。実施例1LINGO1はインビボINVIVOで二量体を形成する。1Lingo1はHEK293細胞において二量体を形成する。HEK293細胞にまず始めに、HAでタグをつけたLingo1タンパク質及び蛍光タンパク質、YFPでタグをつけたLingo1の発現を可能にする、2つのプラスミドを同時形質移入した。免疫共沈降実験から、HAのタグをつけたLingo1タンパク質が抗HA抗体に結合されたアガロースビーズで免疫沈降される場合図1a、YFPタグをつけたLingo1タンパク質が免疫共沈降されることが示された図1b。これらの結果は、今回初めて、Lingo1がインビボinvivoで二量体を形成したことを示す。これらの結果はまた、Lingo1の全細胞及び細胞膜形態は、HEK293細胞で二量体の形成が可能であることを初めて示す。2Lingo1は、ニューロン二量体を形成する。抗Lingo1抗体の確認後図2、培養下の皮質ニューロンにおける二量体の存在を試験した図3a。溶解中に使用される特定の界面活性剤がタンパク質凝集の形成を誘発し、二量体の人工形成を生じることができる場合、細胞の溶解前の化学架橋形成の効果を試験した図3b。培養の12日後、皮質ニューロンは伸展を生じネットワークを形成した図3、パートaを参照。1のトリトンX100を含む緩衝液における溶解前に、ニューロンをアミン官能基レベルで機能する架橋形成剤DSPで処理したDSP、又は未処理DSPとした。Lingo1は実際、皮質ニューロンに発現され、これはウエスタンブロットが抗Lingo1抗体の存在下でインキュベートされる場合に、90kDaにおける免疫活性バンドの存在によって証明される図3、パートbを参照。ニューロンをDSPで処理した時、Lingo1は実際、180kDaに二量体の形態で現れさらなる免疫活性バンドが180kDaに現れる、これは90kDaにおける単量体の消失に起因した図3、パートbを参照。実施例2BRET技術を使用した生細胞におけるLINGO1タンパク質の多量体化の検出HEK293又はSHSY5Y細胞に、固定濃度のドナー100ngのLingo1RLucプラスミド及び増加濃度のアクセプター、Lingo1YFP又はYFP蛍光タンパク質単独50ng~4000ngのプラスミドを形質移入した。生細胞上での形質移入の48時間後に、古フィルター及び新フィルターのセットを使用してBRET測定を行った。Lingo1RLuc及びLingo1YFPが同時発現された時、2つの細胞型においてシグナルは双曲線に従って増加し漸近線に達したので、Lingo1の多量体化に相当する古フィルターで観察されたBRETシグナルは明らかに特異的である図4a及び4bを参照。さらに、Lingo1RlucがYFPタンパク質単独で同時発現された時、BRETシグナルははるかに弱く085は、試験がどれほどロバストrobustであるかを示す図6b。よって出願人は、各修飾単量体間の発光移動BRETを測定することによって、リアルタイムで生細胞において、インビボinvivoにおける二量体の立体構造変化を検出することが可能であることを示した。さらに、BRET測定は、96ウェルプレートで懸濁液中の付着細胞又は細胞上で行うことができ、高中ハイスループットに調整可能なことを示した。実施例5安定株の作成高中ハイスループットBRET測定の再現性を確実にするために、Lingo1RLuc又はLingo1YFPを発現しているHEK293細胞の安定株を成長させた。HEK293細胞に、上記の通り、特にネオマイシン抵抗性を運ぶLingo1RLuc又はLingo1YFPプラスミドを形質移入した。形質移入の48時間後に、培地への選択抗生物質濃度2mgmlのG418又はジェネテシンの添加によって、プラスミドDNAが組み込まれている細胞を選択した。選択の2~3週間後に、数十の抗生物質耐性クローンを回収した。各クローンを続いて増幅し、Lingo1発現試験を実行するために十分な量の細胞を得た。この試験は上記の通り、Lingo1YFPを発現している細胞のクローンについては蛍光の読み取り、又はLingo1RLucを発現している細胞のクローンについてはセレンテラジンの添加後の発光の読み取りから成る。結果は、Lingo1RLucを発現している試験したクローン約100ほどの試験クローン間では、複数のクローン例えば、C5、D1及びD2は十分なレベルでhLingo1RLucを発現し図7a、固定されたことを示す。さらに、良好な細胞生存率を有し良好な発光シグナルを示すクローンC5は、2011年3月31日に、番号l4463でCNCM[NationalCollectionofMicroorganismCultures]InstitutPasteur、Parisに供託した。結果は、クローンY1は十分なレベルでhLingo1YFPを発現している、主に良好な細胞生存率で良好な蛍光シグナルを発現していることを示す図7b。さらに、クローンY1を、2011年3月31日に、番号I4462でCNCMInstitutPasteur、Parisに供託した。同様に、Lingo1RLuc及びLingo1YFPを共発現しているHEK293細胞の安定株を成長させる。十分なレベルで2つのタンパク質を共発現しているクローンを固定しCNCMに供託する。実施例6本発明のシステムを使用した、LINGO1リガンドを同定するための方法本発明の同定方法の確認HEK293細胞に、固定濃度のLingo1RLuc250ng及びLingo1YFP1500ngを形質移入し、BRETmaxの約5060を達成した。96ウェルプレートの生細胞上で、形質移入の48時間後に、新フィルターのセットを使用して、増加濃度のHAのタグをつけた周知のLingo1抑制剤0、200、400、800、1600及び2600ngのDNLingo1HA又はLingo1と相互作用しないHAのタグをつけた神経タンパク質0、200、400、800、1600及び2600ngのLarp6HAの存在下で、BRET測定を行った。結果は、HAのタグをつけた周知のLingo1抑制剤DNLingo1HAが有意にLingo1RLucとLingo1YFPタンパク質との間で得られるBRETシグナルを減少したことを示す図8a。さらに、結果は、HAのタグ付きLarp6と呼ばれる、Lingo1と相互作用しない神経タンパク質はBRETシグナルを変更しなかったので、この抑制効果は特異的であったことを示す図8b。新規Lingo1二量体化抑制剤B27の同定及び確認HEK293細胞に、固定濃度のLingo1RLuc250ng及びLingo1YFP1500ngを形質移入し、BRETmaxの約5060を達成した。96ウェルプレートの生細胞上での形質移入の48時間後に、固定濃度のリガンド最終濃度20μMのBDNF、N2、Fsk、pDBU又はB2750xB27、Gibco、参照17504044、10μlの純粋溶液の溶液の存在下で、新フィルターのセットを使用したBRET測定を行った。それらは、Lingo1RLucとLingo1YFPのタンパク質との間で得られるBRETシグナルの変更が可能である。結果:HEK293細胞でB27化合物が有意にLingo1の二量体化を減少した、ことを示す図9a。B27化合物の効果は、BRETに様々なレベルで、且つB27の様々なバッチ抗酸化剤不含有のB27B27AO、インスリン不含有のB27B27ins又はビタミンA不含有のB27B27VitAと共に再現された図9b。B27の効果の動態研究もまた行い、B27によって生じる減少は徐々に生じ10分後にプラトーに達する15ことが明らかとなった図9c。カウンタースクリーニング試験B27の特異性B27の特異性をカウンタースクリーニング試験β2アドレナリン受容体、β2ARの二量体化から生じているシグナルの試験において評価したこの二量体化はAngers等によって以前に記載されている14。HEK293細胞に、iβ2AR受容体の二量体:ドナーとして機能する、ウミシイタケルシフェラーゼとC末端で融合された、β2アドレナリン受容体β2ARRLuc、50ngと、アクセプターとして機能する、黄色蛍光タンパク質とC末端で融合された、増加濃度のβ2アドレナリン受容体β2ARYFP、100~2000ng、又はiiLingo1の二量体:ドナーとして機能するLingo1RLucと、アクセプターとして機能する増加濃度のLingo1YFP100~2000ng、を形質移入した。形質移入の48時間後に、新フィルターのセットを使用したBRET測定を、96ウェルプレートの生細胞で、固定濃度のB2750xB27、Gibco、参照17504044、10μlの純粋溶液の存在下又は不存在下で行った。結果は、β2アドレナリン受容体の二量体化から生じているBRETシグナルがカウンタースクリーニング試験では変更されず図10b、一方Lingo1の二量体化から生じているBRETシグナルは変更された図10aことを示す。よって、出願人は、本発明のシステムを使用したスクリーニング法が、Lingo1の特異的リガンドを同定することが可能であることを示した。参考文献