"プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインSタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にC4b結合タンパク質を存在させることを特徴とする測定方法。担体粒子がラテックス粒子である、請求項1記載の測定方法。試料中の総プロテインSタンパク質量の測定が、次のa及びbの工程を含む方法により行われるものである、請求項1又は2に記載の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定方法。a試料と、C4b結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体を形成させる工程。b前記混合液をプロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子を含む測定試薬において、C4b結合タンパク質を含有することを特徴とする試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬。担体粒子がラテックス粒子である、請求項4記載の測定試薬。次のa及びbの工程を含む試料中の総プロテインSタンパク質量の測定のためのものである、請求項4又は5に記載の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬。a試料と、C4b結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体を形成させる工程。b前記混合液をプロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。従って、本発明の課題は、試料中に存在する全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型、すなわち、総プロテインSのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来る、試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法を提供することである。本発明者らは、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインSタンパク質量を測定する測定試薬及び測定方法において、抗原抗体反応の反応時にC4b結合タンパク質を含有又は存在させることにより、試料中の総プロテインS蛋白質量を簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。1プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と試料とを接触させ、前記抗体と試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインSタンパク質量を測定する方法において、前記抗原抗体反応の反応時にC4b結合タンパク質を存在させることを特徴とする測定方法。2担体粒子がラテックス粒子である、前記1記載の測定方法。3試料中の総プロテインSタンパク質量の測定が、次のa及びbの工程を含む方法により行われるものである、前記1又は2に記載の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定方法。a試料と、C4b結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体を形成させる工程。b前記混合液をプロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。4プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子を含む測定試薬において、C4b結合タンパク質を含有することを特徴とする試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬。5担体粒子がラテックス粒子である、請求項4記載の測定試薬。6次のa及びbの工程を含む試料中の総プロテインSタンパク質量の測定のためのものである、前記4又は5に記載の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬。a試料と、C4b結合タンパク質とを混合し、接触させ、この混合液中において前記試料に含まれる遊離のプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体を形成させる工程。b前記混合液をプロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子と接触させ、前記抗体とプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体との抗原抗体反応により生成した凝集物を測定する工程。本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、試料中に存在する全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインSのタンパク質量を簡便かつ正確に測定することが出来るものである。以下、本発明を詳細に説明する。1プロテインSに対する抗体本発明において、プロテインSに対する抗体とは、プロテインSに結合することができる抗体抗プロテインS抗体のことをいう。この抗プロテインS抗体としては、例えば、プロテインSに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、キメラ抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体scFv、及びこれらの抗体の断片Fab、Fab’2、Fab’、Fv、sFv、dsFvなど等を挙げることができる。また、前記の抗体又は抗体断片に、蛋白質又は低分子化合物を結合させた誘導体を使用することもできる。なお、抗プロテインS抗体の由来については特に限定はなく、例えば、哺乳動物マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど、又は鳥類ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど等を挙げることができる。また、本発明においては、抗プロテインS抗体が、C4b結合タンパク質と複合体を形成したプロテインSに、より強い反応性を示す抗体であることがより好ましい。2担体粒子本発明において、担体粒子は、前記の抗プロテインS抗体を固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。すなわち、プロテインSと抗プロテインS抗体との抗原抗体反応を利用して試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行う測定試薬及び測定方法に使用されている担体粒子、又は使用することが可能な担体粒子であればよい。この担体粒子の材質は、特に限定はなく、例えば、ポリスチレン、スチレン-スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン共重合体、塩化ビニル-アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル-アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン-メタクリル酸共重合体、スチレン-グリシジルメタアクリル酸共重合体、スチレン-ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ゼラチン、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等を挙げることができる。そして、この担体粒子としては、例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、リポソーム、マイクロカプセル、又は赤血球等の粒子等を挙げることができる。また、本発明における担体粒子としては、ラテックス粒子であることが好ましい。本発明において、抗プロテインS抗体を担体粒子に固定化することは、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗プロテインS抗体と、担体粒子とを、緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、或いは緩衝液等に溶解した抗プロテインS抗体を、担体粒子に接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編臨床病理臨時増刊特集第53号臨床検査のためのイムノアッセイ-技術と応用-,臨床病理刊行会,1983年発行;日本生化学会編新生化学実験講座1タンパク質IV,東京化学同人,1991年発行等に記載の公知の方法に従い、抗プロテインS抗体と、担体粒子とを、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗プロテインS抗体と、担体粒子の、それぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と前記の二価性の架橋試薬とを反応させること等により行うことができる。更に、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子の自然凝集や、非特異的反応等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子の表面に、ウシ血清アルブミンBSA、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体粒子のブロッキング処理マスキング処理を行ってもよい。なお、本発明における試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、ラテックス粒子等の担体粒子の大きさ粒径については、特に制限はない。しかし、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子が、試料中に含まれていたプロテインSとの凝集物凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集物の測定の容易さ等の理由より、担体粒子の大きさ粒径は、その平均径平均粒径が、0.01μm~10μmであることが好ましく、0.04μm~1μmであることがより好ましい。また、本発明の試料中のプロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法において、担体粒子は、その大きさ粒径、材質、又は形状等が異なる2種類以上の担体を使用してもよい。なお、本発明における試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を、ラテックス免疫比濁法等の比濁法により測定を行う場合、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子の測定反応時における濃度は、前記の特異的結合物質の担体表面上での分布密度、担体粒子の大きさ粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、担体粒子に固定化された抗プロテインS抗体と、試料中に含まれていたプロテインSとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子の濃度が、この測定反応時の反応混合液中において0.005~1w/vとなるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子を測定試薬に含有させることが好ましい。本発明の測定試薬及び測定方法においては、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子を、ウシ血清アルブミンBSA、ヒト血清アルブミンHSA、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質;カルシウムイオンなどの各種金属イオン;カルシウム塩などの各種塩類;各種糖類;脱脂粉乳;正常ウサギ血清などの各種動物血清;アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤;活性化物質;反応促進物質;ポリエチレングリコールなどの感度増加物質;非特異的反応抑制物質;又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の1種又は2種以上と共存させてもよい。そして、上記の各物質を共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001~10W/Vが好ましく、特に0.01~5W/Vが好ましい。3C4b結合タンパク質本発明の測定試薬及び測定方法においては、C4b結合タンパク質を含有又は存在させる。ここで、C4b結合タンパク質とは、肝細胞やマクロファージで産生される高分子糖タンパク質であり、プロテインSと1対1で特異的に結合し、複合体を形成するものをいう。また、本発明において用いるC4b結合タンパク質は、その由来起源や調製方法によらず、特に制限なく用いることができる。例えば、ヒト、ウシ又はブタ等の哺乳動物由来のもの等を挙げることができる。また、血漿等の体液若しくは臓器などから精製し調製したものや、又は遺伝子工学操作、細胞工学操作若しくは細胞培養操作などにより調製したもの等を挙げることができる。本発明において、前記のC4b結合タンパク質を総プロテインSタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、C4b結合タンパク質とプロテインSとのモル比が0.9以上C4b結合タンパク質/プロテインS≧0.9となるように設定することが好ましい。なお、前記のC4b結合タンパク質を総プロテインSタンパク質量の測定試薬に存在させる方法であるが、このC4b結合タンパク質を、担体粒子に固定化された抗プロテインS抗体と、試料に含まれていたプロテインSとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の総プロテインSタンパク質量の測定試薬に存在させることができればいかなる方法でも良い。例えば、前記のC4b結合タンパク質を緩衝液に含有させた試薬を調製し、抗プロテインS抗体を固定化した担体粒子を含む試薬と混合することによって、担体粒子に固定化された抗プロテインS抗体と試料に含まれていたプロテインSとの、抗原抗体反応が行われる測定反応時に、C4b結合タンパク質を存在させるようにすれば良い。なお、通常、健常者の試料中には、プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型と、遊離のプロテインS遊離型の両方が存在しているが、本発明においては、C4b結合タンパク質を、試料と混合、接触させることにより、試料に含まれていた遊離のプロテインSがこのC4b結合タンパク質と複合体を形成する。すなわち、試料中のプロテインSは、全てプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型となる。これにより、本発明の測定試薬及び測定方法では、全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインSのタンパク質量を測定することが可能となる。4試料本発明において、試料とは、プロテインSが存在する可能性があり、かつプロテインSの存在の有無、又は含有量濃度の測定を行おうとするものをいう。このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、涙、髄液、羊水、腹水などの体液、又は肝臓、心臓、脳、骨、毛髪、皮膚、爪、筋肉、神経組織などの臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、プロテインSが含まれる可能性のあるものを挙げることができる。5測定試薬本発明の測定試薬は、プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子を含む総プロテインSタンパク質量の測定試薬において、C4b結合タンパク質を含有することを特徴とするものである。これにより、試料中の総プロテインSタンパク質量を正確に測定することができるものである。本発明の測定試薬は、一つの測定試薬よりなるものであってよい。この場合、C4b結合タンパク質は、その一つの測定試薬に含有される。また、本発明の測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってもよい。この場合、C4b結合タンパク質は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。例えば、本発明の測定試薬が、第1試薬及び第2試薬の二つの測定試薬より構成されるものである場合、C4b結合タンパク質は、第1試薬にのみ含有させてもよく、また、第2試薬にのみ含有させてもよく、更には、第1試薬と第2試薬の両方に含有させてもよい。本発明の測定試薬が二つの測定試薬より構成される場合、C4b結合タンパク質は、第1試薬にのみ含有させることが好ましい。また、本発明の測定試薬が二つ以上の測定試薬より構成されるものである場合、C4b結合タンパク質を含有しない方の試薬は、例えば、プロテインSに対する抗体を固定化した担体粒子を含む緩衝液等であってよい。なお、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH5~10の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。また、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬には、前記のプロテインSに対する特異的結合物質を固定化した担体粒子、及び前記のC4b結合タンパク質の他に、ウシ血清アルブミンBSA、ヒト血清アルブミンHSA、カゼイン若しくはその塩などの蛋白質;カルシウムイオンなどの各種塩類;各種糖類;脱脂粉乳;正常ウサギ血清などの各種動物血清;アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤;活性化物質;反応促進物質;ポリエチレングリコールなどの感度増加物質;非特異的反応抑制物質;又は、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の1種又は2種以上を適宜含有させてもよい。なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤;酢酸ベタインなどの両性界面活性剤;又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。なお、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中の総プロテインSタンパク質量の測定に使用することができる。また、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中の総プロテインSタンパク質量の測定に使用することもできる。前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正キャリブレーションを行うための物質を含有する物質の試薬等を挙げることができる。6測定方法本発明における試料中の総プロテインSタンパク質量の測定方法は、担体粒子に固定化されたプロテインSに対する抗体と試料中に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応により生成した凝集物を測定することにより、試料中の総プロテインSタンパク質量を測定する方法において、該抗原抗体反応の反応時にC4b結合タンパク質を存在させるものである。本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定方法における測定操作は、公知の測定操作に従って行うことができる。この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。また、この測定は、1ステップ法1試薬法により行ってもよいし、又は2ステップ法2試薬法等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。以下、ラテックス免疫比濁法を測定原理とする試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬を用いて、試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行う場合を例にとって、具体的に説明を行う。1まず、試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬として、以下のものを準備する。第1試薬:C4b結合タンパク質を含有する緩衝液第2試薬:プロテインSに対する抗体を固定化したラテックス粒子を含有する緩衝液2血漿等の試料の一定量と前記の第1試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。なお、試料と第1試薬の混合比率量比は、適宜選択すればよい。また、前記の静置時の温度は、室温1~30°C又は微温30~40°Cの範囲内の一定温度であることが好ましい例えば、37°C等。試料と第1試薬との混合により、試料に含まれていた遊離のプロテインSがこのC4b結合タンパク質と複合体を形成する。すなわち、試料中のプロテインSは、全てプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型となる。3一定時間後、前記の試料と第1試薬との混合液に、前記の第2試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。また、前記の静置時の温度は、室温1~30°C又は微温30~40°Cの範囲内の一定温度であることが好ましい例えば、37°C等。そして、前記の静置の時間は、1分以上、10分以下の一定時間であることが好ましく、3分以上、5分以下の一定時間であることがより好ましい。試料と第1試薬との混合液への第2試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗プロテインS抗体と、試料中のプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型との抗原抗体反応測定反応を行わせる。そして、この抗原抗体反応測定反応により、...抗プロテインS抗体=ラテックス粒子=抗プロテインS抗体-プロテインS-抗プロテインS抗体=ラテックス粒子=抗プロテインS抗体...の架橋が形成され、抗プロテインS抗体を固定化したラテックス粒子同士の凝集物が生成する。4そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の凝集物により生ずるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少吸光度の増加又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記凝集物の量、すなわち、試料中の総プロテインSタンパク質量を求める。5そして、試料の測定を行って得た測定値透過光強度の減少吸光度の増加又は散乱光強度の増加の値と、標準液、標準血清等の標準物質既知濃度のプロテインSを含む試料の測定を行って得た測定値透過光強度の減少吸光度の増加又は散乱光強度の増加の値とを比較することにより、測定を行った試料中の総プロテインSタンパク質量濃度の算出を行う。以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。実施例1本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法の効果の確認-1本発明の総プロテインSタンパク質量の測定試薬における検量線を作成した。1.測定試薬1第1試薬の調製C4b結合タンパク質を、B.Dahlbeackらの方法Biochem.J.,209巻,847~856頁,1983年に基づいて、ヒト血漿より調製した。次に、0.1w/vBSA、0.3mol/L塩化ナトリウム及び0.05アジ化ナトリウムを含有する50mMMES-塩酸緩衝液pH6.220°Cを調製した。ここに、前記の通り調製したC4b結合タンパク質を0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL及び8μg/mLの濃度となるように添加し、C4b結合タンパク質濃度の異なる5種類の試薬を第1試薬とした。2第2試薬の調製a抗プロテインS抗体の調製本発明者らが、精製した遊離状態のプロテインSを免疫抗原として、常法に従って抗プロテインS抗体の調製を行った。プロテインSのC4b結合タンパク質との結合部位以外の部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行い、マウス/マウスのハイブリドーマ9H6株を得た。このハイブリドーマ9H6株より産生されたマウス抗プロテインSモノクローナル抗体の5mgを、0.5mLのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5に溶解した。これに、0.6mgのS-アセチルメルカプトコハク酸無水物を溶解した0.01mLのN,N-ジメチルホルムアミドを加え、室温で30分間インキュベートした。次に、これに、0.1MEDTA水溶液の0.02mL、1Mトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液pH7.0の0.1mL、及び1Mヒドロキシルアミン塩酸緩衝液pH7.0の0.1mLをそれぞれ加え、30°Cで30分間インキュベートした。その後、これを、5mMEDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で平衡化しておいた、セファデックスG-25カラムでゲルろ過を行い、メルカプトサクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を得た。b抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製平均粒径0.192μmのラテックス粒子の10懸濁液1.0mLと50mMMES-塩酸緩衝液pH6.020°C1.0mLとを混和し、更に320mMカルボジイミド同仁化学研究所;製品番号:348-03631水溶液32μLを添加して混和し、氷上で10分間放置した。前記の氷上で10分間放置したラテックス粒子懸濁液1.2mLに、前記aで調製したメルカプトサクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を0.083g/dLの濃度で50mMMES-塩酸緩衝液pH6.020°Cに混和した液1.8mLを加え、4°Cで一晩攪拌した。次に、遠心分離により上清を除去した後、沈殿部を0.8BSAを含む50mMTris-塩酸緩衝液pH8.020°Cにて懸濁し、37°Cで3時間放置し、ブロッキング処理を行った。次に、遠心分離により沈殿部を回収した後、これを0.1BSAを含む0.05アジ化ナトリウム水溶液で再分散し、波長700nmにおける吸光度が15.0ODとなるように懸濁した。これを抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液とした。c第2試薬の調製前記bで調製した抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を、0.1BSAを含む0.05アジ化ナトリウム水溶液で10倍希釈し、0.1の抗プロテインS抗体固定化ラテックス粒子を含有する懸濁液を調製した。これを第2試薬とした。2.試料1試料希釈液の調製抗プロテインS抗体結合アフィニティカラムを用いて調製したプロテインS欠損血漿3.2クエン酸血漿を試料希釈液とした。なお、プロテインS欠損血漿は、実施例1の2で作製したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を結合させたアフィニティカラム9H6Sepharoseを作製し、このカラムに健常人血漿を通し、カラムを素通りした血漿を回収することにより作製した。また、前記アフィニティカラム9H6Sepharoseは、CNBractivatedSepharoseアマシャムファルマシアバイオテク社製に、マウス抗プロテインSモノクローナル抗体を、インストラクションマニュアルに従って結合させて作製した。2試料の調製a試料1前記1で調製した試料希釈液を、プロテインSタンパク質濃度0.0μg/mLの試料1とした。b試料2総プロテインSタンパク質濃度が24.2μg/mLの3.2クエン酸血漿を前記1の試料希釈液で希釈することにより、プロテインSタンパク質濃度12.4μg/mLの試料2を調製した。なお、この試料2において、試料中の遊離プロテインS濃度は、5μg/mLであった。c試料3総プロテインSタンパク質濃度が24.2μg/mLの3.2クエン酸血漿を、プロテインSタンパク質濃度24.2μg/mLの試料3とした。なお、この試料3において、試料中の遊離プロテインS濃度は、9.6μg/mLであった。d試料4総プロテインSタンパク質濃度が24.2μg/mLの3.2クエン酸血漿に、プロテインS精製品EnzymeResearchLaboratories社製を添加することにより、プロテインSタンパク質濃度が31.6μg/mLの試料4を調製した。なお、この試料4において、試料中の遊離プロテインS濃度は、17.6μg/mLであった。e試料5総プロテインSタンパク質濃度が24.2μg/mLの3.2クエン酸血漿に、プロテインS精製品EnzymeResearchLaboratories社製を添加することにより、プロテインSタンパク質濃度が38.7μg/mLの試料5を調製した。なお、この試料5において、試料中の遊離プロテインS濃度は、25.7μg/mLであった。なお、ここで調製した試料2~5は、プロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型と、遊離のプロテインS遊離型の両方が存在している試料である。3.試料中の総プロテインSタンパク質濃度の測定1測定手順a測定は、東芝-120FR形自動分析装置東芝メディカルシステムズ社製を使用して行った。まず、測定用セルキュベットに、前記2の2の試料1~5の3μLを添加した。次に、これらの測定用セルキュベットに、前記1の1の第1試薬の100μLを添加し、混合した。そして、これらの測定用セルキュベットを、37°Cで静置した。これにより、前記の試料に含まれていた遊離のプロテインSと、前記の第1試薬中のC4b結合タンパク質との複合体を形成させた。すなわち、試料に含まれていたプロテインSは、全てプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型となった。b前記の第1試薬の添加後4分40秒目16ポイント目に、これらの測定用セルキュベット内の混合液に、更に、前記1の2のbの第2試薬の100μLを添加し、混合した。c前記の第1試薬の添加後5分35秒目19ポイント目に、これらの測定用セルキュベット内の混合液の吸光度波長700nmを試料盲検として測定した。そして、これらの測定用セルキュベットを、37°Cで静置して、反応を行わせた。これにより、前記のラテックス粒子に固定化された抗プロテインS抗体と、前記の試料に含まれていたプロテインSとの抗原抗体反応を行わせ、ラテックス粒子の凝集塊を生成させた。d前記の第1試薬の添加後9分47秒目33ポイント目に、この測定用セルキュベット内の反応混合液の吸光度波長700nmを、前記試料の測定値として測定した。e前記dにおいて測定した吸光度測定値から前記cにおいて測定した吸光度試料盲検を差し引き、吸光度差を得た。なお、この吸光度差は試料に含まれる総プロテインSタンパク質量濃度に比例したものである。これらの試料の吸光度差より検量線を作成し、実検体3.2クエン酸血漿を同様の方法で測定した際の吸光度差を検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSタンパク質濃度を求めた。2測定結果前記1において、試料中のプロテインSの測定を行って得られた、前記各試料の測定値、即ち検量線を図1に示した。なお、この図1において、横軸は試料中に含まれる総プロテインSタンパク質の濃度、縦軸は700nmにおける吸光度の測定値を表す。4.考察図1から明らかなように、第1試薬中のC4b結合タンパク質濃度に比例して試料中の総プロテインSタンパク質量に比例した吸光度の上昇が見られる。また、各試料を測定した際の吸光度の上昇は、第1試薬中のC4b結合タンパク質の濃度が6μg/mL以上で、ほぼ飽和状態になることが確認できる。なお、試料2及び試料3では、第1試薬中のC4b結合タンパク質の濃度が0μg/mLでも、試料中のプロテインSタンパク質量に比例した吸光度の上昇が確認できるが、これは、元々試料に含まれていたC4b結合タンパク質とプロテインSとの複合体に起因するものであり、試料中の総プロテインSタンパク質量を正確に反映した吸光度の上昇ではない。これらのことより、本発明のC4b結合タンパク質を含有又は存在させた試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法であれば、試料中に含まれる総プロテインSタンパク質量を正確に測定できることが確かめられた。すなわち、本発明は、試料中に含まれる全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインSのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。実施例2本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬とELSA法との相関本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ELSA法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。I.本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定1第1試薬の調製第1試薬として、前記の実施例1の1の1の第1試薬を用いた。2第2試薬の調製第2試薬として、前記の実施例1の1の2の第2試薬を用いた。2.試料健常人9名の血漿を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSタンパク質量の測定前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3の記載の通りに総プロテインSタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインSタンパク質量を得た。この試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行って得られた結果を図2~5に示した。ここで、第1試薬中のC4b結合タンパク質濃度が2μg/mLのものが図2、4g/mLのものが図3、6μg/mLのものが図4、そして、8μg/mLのものが図5である。なお、第1試薬中のC4b結合タンパク質濃度が0μg/mLでは、検量線が作成できなかったため、測定を行っていない。II.ELSA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定1.ELSA法による総プロテインSタンパク質量の測定試薬1C4b結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製aC4b結合タンパク質を、B.Dahlbeackらの方法Biochem.J.,209巻,847~856頁,1983年に基づいて、ヒト血漿より調製した。bこの調製したC4b結合タンパク質を、炭酸緩衝液50mM炭酸水素ナトリウムpH9.6に2.5μg/mLとなるように溶解した。これを、96ウェル-マイクロプレートMODULEPLATEF8商品名;ヌンク社製の各ウェルに1ウェル当たり100μLずつ加え、4°Cで一晩静置して、C4b結合タンパク質のマイクロプレートのウェルへの固定化を行った。cこのマイクロプレートの各ウェルを、洗浄液0.05ツイーン20Tween20を含む50mMリン酸緩衝生理食塩水pH7.4で3回洗浄した後、ブロッキング液BlockAce商品名大日本製薬社製を純水に溶解し、25の濃度としたものを1ウェル当たり250μLずつ加え、4°Cで一晩静置することによりブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。以上の操作により、C4b結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬の調製を行った。2パーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体試薬の調製a抗プロテインS抗体の調製実施例1の1のaに記載した方法に従ってメルカプトサクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体を得た。bパーオキシダーゼの調製2mgのパーオキシダーゼPOD、又はHRPホースラディシュ由来;東洋紡績社製を、0.3mLの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0に溶解した。これに、0.25mgのN-サクシミジル-6-マレイミドヘキサン酸を溶解したN,N-ジメチルホルムアミドを30μL加えて、30°Cで60分間インキュベートした。その後、これを、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0で平衡化しておいた、セファデックスG-25カラムでゲルろ過を行い、マレイミド化したパーオキシダーゼを得た。c前記aで調製したメルカプトサクシニル化したマウス抗プロテインSモノクローナル抗体の2.3mgを、5mMEDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0の0.25mLに溶解した。これに、前記bで調製したマレイミド化したパーオキシダーゼの1.8mgを0.25mLの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0に溶解したものを添加した。この混合物を、30°Cで20時間インキュベートした後、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5で平衡化しておいた、ウルトラゲルAcA34カラムでゲルろ過を行い、マウス抗プロテインSモノクローナル抗体をパーオキシダーゼで標識した、パーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体を得た。d前記cで得たパーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体を、検体希釈液25のBlockAce商品名大日本製薬社製、01M塩化ナトリウム、及び5mM塩化カルシウムを含む、10mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液pH75で、1μg/mLになるように希釈して、パーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体試薬を調製した。2.試料前記のIの2における試料健常人9名の血漿を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSタンパク質量の測定1測定手順a前記1の1で調製したC4b結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬、及び前記1の2で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体試薬を用いて前記2の試料の測定を行った。b前記2の試料と検体希釈液0.1BSA、0.1塩化ナトリウム、5mM塩化カルシウムを含む50mMトリス-塩酸緩衝液pH7.4で、5271倍希釈し、前記1の1で調製したC4b結合タンパク質固定化マイクロプレート試薬のマイクロプレートのウェルに、1ウェル当たり100μL分注した。この操作を、前記マイクロプレートの9枚について行った。そして、このマイクロプレートの各々をそれぞれ、37°Cで4時間静置して反応を行わせた。cこの37°Cでの4時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記1の1のcの洗浄液で5回ずつ洗浄した。この操作により、固定化されたC4b結合タンパク質に結合しなかったプロテインS等の成分を前記ウェルより除去した。BF分離d前記1の2で調製したパーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体試薬を、前記cで洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに100μLずつ分注した。そして、これを25°Cで1時間静置して反応を行わせた。この操作により、マイクロプレートのウェルに固定化されたC4b結合タンパク質に結合したプロテインSに、パーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体を結合させた。eこの25°C、1時間の反応の後、反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルを、前記の洗浄液で5回ずつ洗浄した。この操作により、マイクロプレートに間接的に固定化されたプロテインSに結合しなかったパーオキシダーゼ標識抗プロテインSモノクローナル抗体等の成分を前記ウェルより除去した。BF分離fその後、HRP発色試薬3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンTMBを含む;TMBSolubleReagent、ScyTekLaboratories社米国製を、前記eで洗浄した後のマイクロプレートの各ウェルに100μLずつ加え、室温で10分間、発色反応を行わせた。gこの後、この反応を行わせたマイクロプレートの各ウェルに、発色停止試薬TMBStopBuffer、ScyTekLaboratories社米国製を100μLずつ加え、撹拌することにより、発色反応を停止させた。hこのマイクロプレートの各ウェルの、450nmにおける吸光度の測定を、EIAマイクロプレートリーダーバイオラッド社製により行った。iそして、試料中のプロテインSの測定値濃度を、次のようにして求めた。実施例1の2で調製した試料を標準物質とし、これを先の試料と同様にして前記の測定操作を行って吸光度を求め、試料と標準物質の両方の吸光度を比較することにより測定を行った試料中の総プロテインSタンパク質濃度の算出を行った。この試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行って得られた結果を図2~5に示した。III.測定結果前記Iにおける試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図2~5に示した。これらの図において、横軸xは前記IIのELSA法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mLである。また、これらの図において、縦軸yは前記Iにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mLである。また、相関の関係式を求めた結果を表1に示した。この表1において、第1試薬中のC4b結合タンパク質濃度毎に、回帰式及び相関係数を示した。この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、C4b結合タンパク質の濃度が6μg/mL以上の場合に、ELSA法による試料中の総プロテインSタンパク質量とより良好な相関性を示すことが分かる。このようにELSA法による総プロテインSタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。そして、このようにELSA法による総プロテインSタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型についてそのタンパク質量を、すなわち、総プロテインSのタンパク質量を正確に測定することができる測定試薬及び測定方法であることが確かめられた。また、前記のC4b結合タンパク質を総プロテインSタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度が6μg/mL以上の場合、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、C4b結合タンパク質とプロテインSとのモル比は、0.9であった。すなわち、本発明において、C4b結合タンパク質を総プロテインSタンパク質量の測定試薬に存在させる濃度は、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、C4b結合タンパク質とプロテインSとのモル比が0.9以上C4b結合タンパク質/プロテインS≧0.9となるように設定することが好ましいことが確かめられた。実施例3本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法の再現性の検討本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法により試料中の総プロテインSタンパク質量を測定する際の測定の再現性について検討した。1.測定試薬1第1試薬の調製C4b結合タンパク質を25μg/mLの濃度となるように添加すること以外は、前記の実施例1の1の1と同様に第1試薬を調製した。2第2試薬の調製第2試薬として、前記の実施例1の1の2の第2試薬を用いた。2.試料ヒトの血漿の4検体を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSタンパク質量の測定1前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3の記載の通りに総プロテインSタンパク質量の測定を行った。2前記1の操作を繰り返して計5回行い、同時再現性の検討を行なった。3また、前記1の操作を連続する3日間のそれぞれの日に行い、日差再現性の検討を行なった。4.測定結果前記の通りに試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行って得られた結果を表2に示した。この表において、同時再現性のデータ、及び日差再現性のデータとも、それぞれの試料毎に、平均値±標準偏差SD及び変動係数CVを示した。この表より、同時再現性における変動係数CVは0.4~1.2の範囲のものであり、測定値のバラツキが小さく、精密に測定できていることが分かる。また、日差再現性における変動係数CVは0.7~1.4の範囲のものであり、例え測定を行う日が異なったとしてもその測定値のバラツキは小さく、精密に測定できることが分かる。これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法は測定の再現性がよく、精密に測定が行えるものであることが確かめられた。実施例4本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬とELISA法との相関本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法と、ELISA法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法との相関を確かめた。I.本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法による測定1.測定試薬1第1試薬の調製第1試薬として、前記の実施例3の1の1の第1試薬を用いた。2第2試薬の調製第2試薬として、前記の実施例1の1の2の第2試薬を用いた。2.試料健常人50名の血漿を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSタンパク質量の測定前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3の記載の通りに総プロテインSタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインSタンパク質量を得た。この試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行って得られた結果を図6に示した。II.ELISA法による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定1.ELISA法による総プロテインSタンパク質量の測定試薬ELISA法による総プロテインSタンパク質量の測定試薬として、市販のアセラクロムトータルプロテインSTMB製造者:DIAGNOSTICASTAGO社、フランス国;製造販売者:ロシュダイアグノスティックス社、日本国を用いた。なお、このアセラクロムトータルプロテインSTMBは次のものより構成される。a抗体コーティングストリップ抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体b抗体コンジュゲートペルオキシダーゼ標識抗総プロテインSマウスモノクローナル抗体c基質液3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、及び30過酸化水素水d希釈緩衝液e洗浄液fスタンダード総プロテインSキャリブレーターgコントロール総プロテインSコントロールhプレートフレームiプレートカバー2.試料前記のIの2における試料健常人50名の血漿を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSタンパク質量の測定アセラクロムトータルプロテインSTMBの添付文書の記載に従い、試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行った。なお、このアセラクロムトータルプロテインSTMBにおける操作方法は次の通りである。a検体クエン酸血漿を希釈緩衝液で101倍に希釈し、試料とする。b希釈緩衝液で101倍に希釈して調製したスタンダードを段階的に希釈し、希釈系列を作成する。c抗体コーティングストリップの各ウェルに抗体コンジュゲートを50μL分注する。d試料又は希釈したスタンダード200μLをそれぞれ分注し、18~25°Cで1時間インキュベーションする。e各ウェルの内容液を吸引除去し、洗浄液で5回洗浄する。f洗浄液を吸引除去した後、各ウェルに基質液200μLを分注し、18~25°Cで5分間インキュベーションする。g1M硫酸50μLを分注し、プレートを穏やかに揺らして内容物を混和する。15分間放置した後、1時間以内に波長450nmにおける吸光度を測定する。hスタンダードの吸光度と試料の吸光度を比較し、試料中の総プロテインS濃度を求める。このようにして、前記2の各試料の総プロテインSタンパク質量を得た。この試料中の総プロテインSタンパク質量の測定を行って得られた結果を図6に示した。III.測定結果前記Iにおける試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果とを、これらの相関の図として図6に示した。この図において、横軸xは前記IIのELISA法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mLである。また、この図において、縦軸yは前記Iにおける本発明の測定試薬及び測定方法による試料中の総プロテインSタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mLである。この相関の回帰式を求めた結果、回帰式はy=0.908x-1.282であり、相関係数はr=0.97であった。x:前記IIのELISA法による総プロテインSタンパク質量の測定結果、y:前記Iの本発明による総プロテインSタンパク質量の測定結果この図、そして相関の回帰式より、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法は、ELISA法による試料中の総プロテインSタンパク質量と良好な相関性を示すことが分かる。このようにELISA法による総プロテインSタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、正確なものであることが分かる。そして、このようにELISA法による総プロテインSタンパク質量の測定値と良好な相関性を示すことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中に存在する全てのプロテインSプロテインSとC4b結合タンパク質との複合体結合型、及び遊離のプロテインS遊離型についてそのタンパク質量を測定することが出来るものであることが分かる。これらのことより、本発明の試料中の総プロテインSタンパク質量の測定試薬及び測定方法が、試料中の総プロテインSタンパク質量を正確に測定することが出来るものであることが確かめられた。実施例5総プロテインSのタンパク質量と総プロテインSの活性値との比較本発明の試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定試薬及び測定方法により得た総プロテインSのタンパク質量と、比色法による試料中の総プロテインSの活性値の測定方法及び測定試薬により得た総プロテインSの活性値とを比較した。I.本発明の試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定方法及び測定試薬による測定1.総プロテインSのタンパク質量の測定試薬1第1試薬の調製第1試薬として、前記の実施例3の1の1の第1試薬を用いた。2第2試薬の調製第2試薬として、前記の実施例1の1の2の第2試薬を用いた。2.試料次の1~4をそれぞれ試料として用いた。1健常人211名の血漿2プロテインSの遺伝子変異であるPS-K155Eヘテロ接合体プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島であることが判明している7名の血漿3プロテインSの遺伝子変異であるPS-K155Eホモ接合体プロテインSの異常症の一つであるプロテインS徳島であることが判明している1名の血漿4プロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体プロテインSの異常症の一つであることが判明している1名の血漿3.試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定前記2の試料のそれぞれについて、前記の実施例1の3の記載の通りに総プロテインSのタンパク質量の測定を行い、各試料の総プロテインSのタンパク質量を得た。この試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定を行って得られた結果を図7に示した。II.比色法による試料中の総プロテインSの活性値の測定方法及び測定試薬による測定1.比色法による総プロテインSの活性測定試薬1希釈液下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.020°Cに調整して、希釈液を調製した。TritonX-100和光純薬工業社、日本国0.06W/Vウシ血清アルブミンBSA0.1W/V塩化ナトリウム0.1Mクエン酸三ナトリウム10.6mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン50mM2第1試薬下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.020°Cに調整して、第1試薬を調製した。活性化プロテインC精製ヒト活性化プロテインC;EnzymeResearchLaboratories,Inc社、米国397pM界面活性剤リン脂質塩化カルシウム2.5mMウシ血清アルブミンBSA;Sigma-Aldrich社、米国0.1W/V塩化ナトリウム0.1Mトリスヒドロキシメチルアミノメタン50mMなお、界面活性剤は、TritonX-100ポリオキシエチレンn=9,10p-t-オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国を0.006W/Vの濃度となるように含有させた。また、リン脂質は、ホスファチジルセリンブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国0.4mg、ホスファチジルコリンブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミンブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国0.4mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60°Cで10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1のリン脂質を、24μMの濃度となるように含有させた。なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が1:1:1のリン脂質を、以下リン脂質PS:PC:PE=1:1:1ということがある。3第2試薬下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.020°Cに調整して、第2試薬を調製した。活性化血液凝固第V因子精製ヒト活性化血液凝固第V因子;HaematologicTechnologies,Inc社、米国357pM界面活性剤リン脂質塩化カルシウム2.5mMウシ血清アルブミンBSA;Sigma-Aldrich社、米国0.1W/V塩化ナトリウム0.1Mトリスヒドロキシメチルアミノメタン50mMなお、界面活性剤は、TritonX-100ポリオキシエチレンn=9,10p-t-オクチルフェニルエーテル、和光純薬工業社、日本国を0.006W/Vの濃度となるように含有させた。また、リン脂質は、前記のリン脂質PS:PC:PE=1:1:1を、24μMの濃度となるように含有させた。4第3試薬下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH7.520°Cに調整して、第3試薬を調製した。活性化血液凝固第X因子精製ウシ活性化血液凝固第X因子;NewEnglandBiolabs,Inc社、米国50pMプロトロンビン精製ヒトプロトロンビン;EnzymeResearchLaboratories,Inc社、米国738nMS-2238トロンビンの基質トロンビンの発色基質;ChromogenixInstrumentationLaboratory社、イタリア国750μMリン脂質塩化カルシウム5.0mMウシ血清アルブミンBSA;Sigma-Aldrich社、米国0.1W/V塩化ナトリウム0.15Mトリスヒドロキシメチルアミノメタン50mMなお、リン脂質は、ホスファチジルセリンブタ脳ホスファチジルセリン;PS;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国0.6mg、ホスファチジルコリンブタ肝臓ホスファチジルコリン;PC;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国0.4mg、及びホスファチジルエタノールアミンブタ肝臓ホスファチジルエタノールアミン;PE;DOOSANSerdaryResearchLaboratories社、韓国1.0mgをそれぞれ試験管に採取し、エバポレーターにて溶媒であるクロロフォルムを蒸発させた後、蒸留水を添加し1分間激しく撹拌した後、60°Cで10分間超音波処理を行って調製したホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5すなわち、30W/V:20W/V:50W/Vのリン脂質を、7.5μMの濃度となるように含有させた。なお、このホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの組成比が3:2:5のリン脂質を、以下リン脂質PS:PC:PE=3:2:5ということがある。2.試料前記のIの2の1~4の各試料を、試料として用いた。3.試料中の総プロテインSの活性値の測定及び算出各試料の総プロテインSの活性値の測定は、日立ハイテクノロジーズ社日本国の7170S形汎用自動分析装置を使用して行った。1前記2の試料それぞれについて、前記1の1の希釈液により希釈倍率15倍で希釈を行った。2前記1で希釈した試料2.0μLに、前記1の2の第1試薬の98μLを添加し、37°Cで1.4分間反応させた。3次に、前記1の3の第2試薬の20μLを添加し、37°Cで8.3分間反応させた。4次に、前記1の4の第3試薬の236μLを添加し、37°Cで反応させた。5前記4における第3試薬の添加の後、主波長405nm及び副波長505nmにおける吸光度の変化を12、3分間測定した。4.試料中の総プロテインSの活性値の算出前記3の5において測定した第3試薬添加後の吸光度変化反応のタイムコースの値を微分して、試料中の総プロテインSの活性値を求めた。なお、予め、総プロテインS活性値が既知の試料について、前記3の通り測定を行い、測定した第3試薬添加後の吸光度変化反応のタイムコースの1分間当りの吸光度変化量を時間に対して直線式微分直線を求め、この直線の傾きをこの既知の総プロテインS活性値に対してプロットして検量線を作成した。そして、前記2の試料を前記3の通り測定を行って得た、第3試薬添加後の吸光度変化反応のタイムコースの1分間当りの吸光度変化量を、時間に対して直線式微分直線を求め、この直線の傾きを前記の検量線に当てはめて、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。すなわち、測定により得られた吸光度より吸光度変化の加速度吸光度の二次微分値を求め、検量線に当てはめることにより、試料中の総プロテインSの活性値を算出した。なお、本特許出願の明細書及び図面においては、精製ヒトプロテインSEnzymeResearchLaboratories,Inc社、米国の1μg/mLが有する総プロテインS活性値を、総プロテインS活性値1μg/mL当量と定義した。よって、本特許出願の明細書及び図面においては、総プロテインSの活性は、μg/mL当量を用いて表している。この試料中の総プロテインSの活性値の測定を行って得られた結果を図7に示した。III.測定結果1.図の説明前記Iにおける試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果と、前記IIにおける試料中の総プロテインSの活性値の測定結果とを比較する図を、図7として示した。この図において、横軸xは前記Iの本発明による試料中の総プロテインSのタンパク質量の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mLである。また、この図において、縦軸yは前記IIにおける比色法による試料中の総プロテインSの活性測定方法及び活性測定試薬による試料中の総プロテインSの活性値の測定結果を表す。この測定値の単位はμg/mL当量である。2.健常人の試料の比較前記Iの本発明による総プロテインSのタンパク質量の測定結果と、前記IIの比色法による総プロテインSの活性値の測定結果との比較を、次のようにして行った。試料が健常人211名の血漿である場合について、前記Iの総プロテインSのタンパク質量の測定結果と、前記IIの総プロテインSの活性値の測定結果より、プロテインSの比活性総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量を求めた。この健常人211名の血漿の試料のプロテインSの比活性の平均値と標準偏差以下、SDということがあるを算出し、平均±2SD0.98±0.26の範囲を求めた。この範囲を外れる試料が10あったので、この10の試料を除外した健常人201名の試料について、再度、総プロテインSのタンパク質量の測定結果と、総プロテインSの活性値の測定結果より求めたプロテインSの比活性総プロテインS活性値/総プロテインSタンパク質量の平均値と標準偏差を算出し、平均±2SD0.99±0.20範囲と平均±3SD0.99±0.30範囲を求めた。なお、この図は、各々の試料について、試料中の総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性を表すものでもある。この図において、比活性の平均値であるy=0.99xの式の線を実線で表した。また、この式y=0.99xの上及び下に、平均±2SDを示す線y=1.19x、及びy=0.79xを破線でこの図に表した。そして、この式y=0.99xの線の上に平均3SDを示す線y=1.29xを点線で、またこの式y=0.99xの線の下に平均-3SDを示す線y=0.69xを実線でこの図に表した。健常人211名の血漿の試料の測定結果において、この図7で、前記のy=0.69x平均-3SDの線よりも下に外れるものが、7つ認められた。すなわち、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下の試料が、7つ認められた。これらの比活性が0.69以下の7つの試料のうち、すなわち総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離している7の試料のうち、同意が得られた3つの試料についてプロテインS遺伝子の塩基配列を調べたところ、これらの3つの試料のいずれもプロテインS遺伝子のPS-K155E変異プロテインSの異常症の一つであることが判明した。図7において、これらの3つの試料に矢印↓又は↑を付した。このことより、試料中の総プロテインSのタンパク質量及び試料中の総プロテインSの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインSのタンパク質量と総プロテインSの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが確かめられた。3.プロテインSの遺伝子変異プロテインSの異常症であることが判明している試料の比較前記Iの2の2~4のプロテインSの遺伝子変異プロテインSの異常症であることが判明している試料計9名の試料のそれぞれについて、前記Iの本発明による総プロテインSのタンパク質量の測定結果と、前記IIの比色法による総プロテインSの活性値の測定結果との比較を行う。図7において、前記Iの2の2のプロテインSの遺伝子変異であるPS-K155Eヘテロ接合体プロテインSの異常症の一つであることが判明している7名の血漿の試料を●で示した。また、前記Iの2の3のプロテインSの遺伝子変異であるPS-K155Eホモ接合体プロテインSの異常症の一つであることが判明している1名の血漿の試料を◆で示した。そして、前記Iの2の4のプロテインSの遺伝子変異であるC206Fヘテロ接合体プロテインSの異常症の一つであることが判明している1名の血漿の試料を□で示した。プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料●、◆及び□はいずれも、前記の図7におけるy=0.69x平均-3SDの線よりも下に外れていることが分かる。すなわち、プロテインSの遺伝子変異であることが判明しているこれらの9つの試料●、◆及び□はいずれも、総プロテインSの活性値を総プロテインSのタンパク質量で除した比活性が0.69以下であることが分かる。つまり、これらの9つの試料は、総プロテインSの活性値と総プロテインSのタンパク質量が大きく乖離していることが分かる。よって、試料中の総プロテインSのタンパク質量及び試料中の総プロテインSの活性値を測定し、この測定により得た総プロテインSのタンパク質量と総プロテインSの活性値とを、比活性を求める等により比較することにより、プロテインSの遺伝子の変異等のプロテインSの異常症を検出することが出来ることが、これらのプロテインSの遺伝子変異の9つの試料の比較結果からも確かめられた。"