"ugtP遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、請求項1記載の形質転換方法。前記宿主微生物がバチルス属細菌である、請求項2記載の形質転換方法。前記宿主微生物が枯草菌である、請求項3記載の形質転換方法。本発明は、形質転換効率の高いプロトプラスト形質転換方法に関する。本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、宿主微生物の細胞膜脂質の生合成に係るugtP遺伝子を欠失又は不活性化することにより、プロトプラスト形質転換効率が向上することを見出した。すなわち本発明は、以下に関する。1ugtP遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物のプロトプラストを用いることを特徴とする、形質転換方法。2前記宿主微生物がグラム陽性細菌である、前記1記載の形質転換方法。3前記宿主微生物がバチルス属細菌である、前記2記載の形質転換方法。4前記宿主微生物が枯草菌である、前記3記載の形質転換方法。本発明の形質転換方法を用いることにより、目的のDNA、例えば目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を宿主微生物に効率的に導入することが可能となる。その結果、例えばタンパク質又はポリペプチドを高生産する優良株の選抜が容易になり、更に当該タンパク質又はポリペプチドの生産性向上が期待できる。本発明の方法においては、宿主微生物のugtP遺伝子が、欠失又は不活性化されている。このugtP遺伝子は、JAFAN:JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilisBSORFDBにおいて、遺伝子番号BG11611として登録公開されているhttp://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新。ugtP遺伝子配列番号1と塩基配列において70以上、好ましくは80以上、より好ましくは90以上、更に好ましくは95以上、更により好ましくは98以上の同一性を有し、1,2-ジアシルグリセロールにグルコース残基を付加するUDP-グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、当該ugtP遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失又は不活性化されるugtP遺伝子に含まれるものとする。アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法Science,227,1435,1985によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winソフトウェア開発のホモロジー解析Searchhomologyプログラムを用いて、Unitsizetocomparektupを2として解析を行うことにより算出される。また、枯草菌UgtPのホモログをKEGGSequenceSimilarityDataBaseSSDBにて検索を行った結果、StaphylococcuscarnosusのSca_0619Soc.Appl.Bacteriol.Symp.Ser.199019,49S-53S、DesulfitobacteriumhafnienseのDhaf_3178、及びDSY3206FEMSMicrobiol.Rev.,200630,706-733、DesulfotomaculumreducensのDred_1966EnvironMicrobiol.200912,3007-3017、ClostridiumcellulolyticumのCcel_0034FEMSMicrobiol.Rev.200529,741-764、ClostridiumthermocellumのCthe_2414MicrobiolMol.Biol.Rev.,200569,124-154、ClostridiumcellulovoransのClocel_3086Annu.Rev.Microbiol.,200458,521-554、ClostridiumljungdahliiのCLJU_c02160BioprocessBiosyst.Eng.,200932,369-380、BrevibacillusbrevisのBBR47_41080Proc.Natl.Acad.Sci.USA.198886:3589-93、VariovoraxparadoxusのVapar_4986及びVarpa_5682Arch.Microbiol.,2000,174,111-119、及びDeinococcusradioduransのDR_1076Curr.Opin.Biotechnol.200011,280-285は枯草菌UgtPのホモログと推察されることより、これらをコードする遺伝子は本発明において欠失又は不活性化されるugtP遺伝子に含まれるものとする。本発明で使用される宿主微生物としては、バチルスBacillus属細菌や、上述のスタフィロコッカスStaphylococcus属細菌、ブレビバシラスBrevibacillus属細菌、クロストリジウムClostridium属細菌等のグラム陽性細菌が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、枯草菌Bacillussubtilisがより好ましい。上記宿主微生物からのugtP遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、あるいは当該遺伝子の転写翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行い、好適には当該遺伝子を物理的に欠失させる。より具体的には、ugtP遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法、及びランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行って所望の変異を選択する方法が挙げられる。ugtP遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、ugtP遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、ugtP遺伝子の一部領域における相同組換えによって宿主微生物ゲノム上のugtP遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化したugtP遺伝子、又は図1のようにugtP遺伝子の上流、下流領域を含むがugtP遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを宿主微生物細胞内に取り込ませて宿主微生物ゲノムのugtP遺伝子内の変異箇所の外側の2ヶ所、又はugtP遺伝子上流側、下流側で2回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のugtP遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることによって不活性化させることが可能である。例えば、本発明の方法に使用する微生物を構築するための宿主微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えによりugtP遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既に幾つかの報告例がありMol.Gen.Genet.,223,268,1990等、かかる方法を繰り返すことにより、本発明で用いられる微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化については、ランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、宿主微生物にγ線等を照射する方法等が実施可能である。以下に、具体例として、SOEsplicingbyoverlapextension-PCR法Gene,77,61,1989によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明における遺伝子欠失又は不活性化方法は下記に限定されるものではない。欠失用DNA断片は、例えば、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約1.0kb断片と、同じく下流に隣接する約1.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10~30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10~30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる図1。次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる図2。以上のPCRは、市販のPCR用酵素キット等を用いて、成書PCRProtocols.CurrentMethodsandApplications,EditedbyB.A.White,HumanaPresspp251,1993、Gene,77,61,1989等に示される通常の条件により行うことができる。かくして得られた遺伝子欠失用DNA断片を、コンピテント法あるいは下記のプロトプラスト法等の定法によって微生物細胞内に導入すると、対応する欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、ugtP遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換された細胞、あるいはugtP遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が生じ得る図2。これを薬剤耐性マーカーによる選択によって分離する。即ち、遺伝子導入した微生物を、上記薬剤を含む寒天培地上で培養し、生育するコロニーを分離した後、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上のugtP遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。上記により得られた、ugtP遺伝子が欠失又は不活性化された微生物は、プロトプラストとして調製することにより、外部からの核酸分子の導入を効率的に行うことができる。ここで、微生物のプロトプラストの調製は、公知の方法に従い実施でき、例えば細菌のプロトプラストを調製する場合には、まず一般的に用いられる細菌培養用培地LB培地等に該細菌を接種して培養し、菌体を得、次いでこの菌体を、浸透圧を調整する物質スクロース、ソルビトール等を含有する高張緩衝液に懸濁し、更にリゾチームなどの細胞壁分解酵素を作用させて細胞壁を除去することにより、プロトプラストを調製することができる。上記で得られたプロトプラストを、例えば、ポリエチレングリコール及び薬剤耐性マーカーを有する核酸分子プラスミドDNA等と混合することにより、プラスミドが当該プロトプラスト内に取り込まれ、宿主微生物が形質転換される。下記の実施例に示すように、ugtP遺伝子を欠失させた宿主微生物のプロトプラストを用いてプラスミドにより形質転換することにより、その形質転換効率は、当該ugtP遺伝子が欠失又は不活性化されていない微生物を用いた場合と比較し高い。上記により宿主微生物を形質転換した後、形質転換された宿主微生物のクローンを得る場合、例えば一定時間培養した後、クロラムフェニコール等の薬剤を含む再生培地で培養し、導入された核酸分子上に存在する薬剤耐性マーカーによる選抜を行えばよいMol.Gen.Genet.168,1111979。また、本発明のプロトプラスト形質転換に用いる核酸分子は、形質転換された微生物の用途に応じて適宜選択でき、特に限定されない。例えば、宿主微生物に導入される核酸分子は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を有するプラスミドであってもよく、当該目的タンパク質又は目的ポリペプチドには、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。産業用酵素としては、機能別に、酸化還元酵素オキシドレダクターゼ、転移酵素トランスフェラーゼ、加水分解酵素ヒドロラーゼ、脱離酵素リアーゼ、異性化酵素イソメラーゼ、合成酵素リガーゼ/シンセターゼ等が含まれる。好適には、セルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCAT等の転移酵素が挙げられ、より好適には、セルラーゼが挙げられる。以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応PCRには、GeneAmpPCRSystemアプライドバイオシステムズを使用し、PyrobestDNAPolymeraseタカラバイオと付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々20pmol、及びPyrobestDNAPolymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCR反応は、98°Cで10秒間、55°Cで30秒間及び72°Cで1~5分間目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72°Cで5分間反応させる条件で行った。また、以下の実施例において、遺伝子の上流下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作工程において対象となる遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域のことを示し、一方、下流とは各操作工程において対象となる遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域のことを示す。更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature,390,249-2561997で報告され、JAFAN:JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilisBSORFDBでインターネット公開http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新された枯草菌ゲノムデータの記載に基づくものである。枯草菌の形質転換はコンピテントセル法J.Bacteriol.,93,19251967にて行った。すなわち、枯草菌をSPI培地0.20w/v硫酸アンモニウム、1.40w/vリン酸水素二カリウム、0.60w/vリン酸二水素カリウム、0.10w/vクエン酸三ナトリウム二水和物、0.50w/vグルコース、0.02w/vカザミノ酸Difco、5mM硫酸マグネシウム、0.25μM塩化マンガン、50μg/mlトリプトファンにおいて、37°Cで、生育度OD600の値が1程度になるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地0.20w/v硫酸アンモニウム、1.40w/vリン酸水素二カリウム、0.60w/vリン酸二水素カリウム、0.10w/vクエン酸三ナトリウム二水和物、0.50w/vグルコース、0.01w/vカザミノ酸Difco、5mM硫酸マグネシウム、0.40μM塩化マンガン、5μg/mLトリプトファンに接種し、更に生育度OD600の値が0.4程度になるまで振盪培養して枯草菌のコンピテントセルを調製し、次いで得られたコンピテントセルをSPII培地で懸濁し、当該懸濁液100μLに各種DNA断片を含む溶液SOE-PCRの反応液等5μLを添加し、37°Cで1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地1w/vトリプトン、0.5w/v酵母エキス、1w/vNaCl、1.5w/v寒天に全量を塗沫し、37°Cで静置培養した後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするPCRによって、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法Mol.Gen.Genet.,168,1111979により行った。実施例1ugtP欠失株の構築表1に示したypfP-337FとypfP201R及びypfP827FとypfP529Rの各プライマーセットを用いて、配列番号1に示すugtP遺伝子の上流を含む5’末端側の504bp断片A、及びugtP遺伝子の下流を含む3’末端側の823bp断片Bをそれぞれ調製した。得られた断片AはSphI及びSalI、BはBamHI及びScaI処理した。一方、プラスミドpDG780Gene,167,335,1995のSalI及びSmaI制限酵素切断点よりカナマイシン耐性遺伝子領域を切り出したC。次に、3断片をACBの順になる様に、pUC119TAKARAにAはSphI及びSalI、CはSalI及びBamHI、BはBamHI及びSmaI制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドDNAを制限酵素ScaIで処理して直鎖状DNAにし、形質転換用の供与体DNAとした図2参照。このDNA断片を用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、カナマイシン10μg/mLを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってugtP遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。また相同組換えに利用した領域のA及びBのDNA配列についてシーケンスを行った。A領域でugtP遺伝子上流-9bpのTがCに置換されていたが、ugtP遺伝子の上流metA遺伝子及び下流cspD遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを確認した。以上の様にして、枯草菌のugtP遺伝子が欠失した菌株を構築し、ΔugtP株と命名した。実施例2形質転換効率の算出プラスミドpHY300PLKJpn.J.Genet.,60,4851985及びpC194J.Bacteriol.,150,8151982を用いて、実施例1にて構築したΔugtP株及び親株である168株の形質転換をプロトプラスト法により行った。pHY300PLKはStreptococcusfaecalisstrainDS-5由来のプラスミドpAMα1J.Bacteriol.,117,2831974由来であり、pC194はStaphylococcusaureus由来のプラスミドである。pHY300PLKは大腸菌HB101株タカラバイオを用いて調製し、pC194は枯草菌168株を用いて調製した。プロトプラスト法は以下の手順で行った。まず、各菌をLB液体培地1w/vトリプトン、0.5w/v酵母エキス、1w/v塩化ナトリウムにて、30°C、150rpmで10時間培養した培養液を、再度LB液体培地に1植菌し、3時間培養した。培養液を12000rpmで5分間遠心し、上清を除去した後、4mg/mLリゾチームを含むSMMP溶液35g/LAntibioticMedium3、171.5g/Lスクロース、3.2g/Lマレイン酸2ナトリウム、4.06g/L塩化マグネシウム6水和物500μLに懸濁し、37°Cで1時間静置した。3500rpmで10分間遠心した後、SMMP溶液400μLに懸濁し、そのうち13μLを50ngのプラスミドDNAと混合した。更にPEGを100μL添加し、ボルテックスした後、SMMPを350μL添加して転倒混和した。その後、30°C、150rpmで1時間培養した後100μLを抗生物質pHY300PLKの場合50mg/Lテトラサイクリン、pC194の場合20mg/Lクロラムフェニコールを含むDM3再生培地81g/Lコハク酸ナトリウム6水和物、5g/L酵母エキス、5g/Lカザミノ酸、10g/L寒天、10g/Lカルボキシメチルセルロース、1.5g/Lリン酸2水素カリウム、3.5g/Lリン酸水素2カリウム、0.5g/Lグルコース、0.01g/LBSA、0.005g/Lトリパンブルー、20mM塩化マグネシウムに塗布した。また、生菌数を測定する目的で、抗生物質を含まないDM3再生培地にも等量塗布した。30°Cで3日間静置培養し、コロニー数をカウントした。形質転換効率を図2に示す。抗生物質を含むプレート上のコロニー数を、抗生物質を含まないプレート上のコロニー数で割った値を、形質転換効率とした。図2より、ΔugtP株は親株である168株よりも有意に形質転換効率が向上していることが判明したP<0.05、t-検定。"