対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、発現増強エレメント、TPL、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、翻訳終結因子および抗生物質マーカーを含む発現ベクターであって、発現増強エレメントがクロマチン結合領域である発現ベクター。aイントロンまたはその変異体、b場合によっては内部リボソーム結合部位またはその変異体をさらに含む、請求項1に記載の発現ベクター。クロマチン結合領域が適切なマトリックス結合領域である、請求項1に記載の発現ベクター。クロマチン結合領域が適切な足場結合領域である、請求項1に記載の発現ベクター。マトリックス結合領域がショウジョウバエScs境界エレメント、hspSAPMAR、cLysMAR、マウスT細胞受容体TCRα、ラット遺伝子座調節領域、βグロビンMARから選択される、請求項3に記載の発現ベクター。マトリックス結合領域がcLysMARである、請求項3または5に記載の発現ベクター。cLysMARが配列番号5に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項5に記載の発現ベクター。プロモーターがCMVプロモーター、SV40プロモーター、アデノウイルスプロモーター、βアクチンプロモーター、メタロチオニンプロモーターまたは他の原核もしくは真核ウイルスプロモーター、好ましくはCMVプロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載の発現ベクター。内部リボソーム結合部位が脳心筋炎ウイルスIRESである、請求項2に記載の発現ベクター。内部リボソーム結合部位が配列番号14に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項2および9に記載の発現ベクター。VAIおよびII遺伝子が配列番号3に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の発現ベクター。TPLが配列番号2に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の発現ベクター。キメライントロンが配列番号1に記載されているヌクレオチド配列を有する、請求項2に記載の発現ベクター。対象とする遺伝子が、組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNKTPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFRIgGFcから選択されるタンパク質およびペプチドならびにそれらのアナログ、リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブから選択されるモノクローナル抗体、およびFc領域、Fabのようなそれらの断片、GLPI、GLPII、IGFI、IGFII、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン3、エキセンジン4、MYT2のような転写因子、NFκΒ抑制因子NRF、AML1RUNX1、Gtxホメオドメインタンパク質、真核生物翻訳開始因子4Ga、真核生物翻訳開始因子4G1aから選択される翻訳因子、細胞死関連タンパク質5、cmyc、Lmyc、Pim1のような癌遺伝子、プロテインキナーゼp58PITSLRE、p53、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモンから選択される性腺刺激ホルモンから選択されるホルモン、および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、熱ショックタンパク質70、ミトコンドリアHATPシンターゼのβサブユニット、オルニチンデカルボキシラーゼ、コネキシン32および43、HIF1a、APCをコードする、請求項1に記載の発現ベクター。抗生物質マーカーがカナマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびネオマイシンから選択される、請求項1に記載の発現ベクター。発現カセットのどちらかの側でcLysMARがクローニングされる、請求項1から15のいずれか一項に記載の発現ベクター。aプロモーターまたはその変異体、bVAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体cTPLまたはその変異体、dキメライントロンまたはその変異体、e抗生物質マーカー、fマトリックス結合領域、g場合によっては内部リボソーム結合部位、hウシ成長ホルモンポリアデニル化配列に作動可能に連結した対象とする遺伝子を含む、請求項1および2に記載の発現ベクター。受託番号MTCC5655を有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の発現ベクター。受託番号MTCC5656を有する、請求項1から18のいずれか一項に記載の発現ベクター。受託番号MTCC5657を有する、請求項1から19のいずれか一項に記載の発現ベクター。請求項1から20のいずれか一項に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。CHOもしくはBHK細胞系またはそれらの派生物から選択される、請求項20に記載の宿主細胞。タンパク質およびペプチドならびにそれらの変異体を産生するための方法であって、a請求項1から22のいずれか一項に記載の発現ベクターを構築するステップ、b対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切な宿主細胞中で前記発現ベクターを形質転換するステップを含む方法。タンパク質およびペプチドならびにそれらの変異体を産生するための方法であって、a請求項1から23のいずれか一項に記載の発現ベクターを構築するステップ、b適切な宿主細胞中で前記発現ベクターをトランスフェクトするステップ、c対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切なトランスフェクト宿主細胞を選択するステップ、d請求項1から23のいずれか一項に記載の発現ベクターでステップにおいて選択した適切な宿主細胞をさらにリトランスフェクトするステップ、e対象とするタンパク質またはペプチドを発現する適切なリトランスフェクト宿主細胞を選択するステップを含む方法。発現ベクターが受託番号MTCC5655を有する、請求項23および24に記載の方法。発現ベクターが受託番号MTCC5656を有する、請求項23および24に記載の方法。発現ベクターが受託番号MTCC5657を有する、請求項23および24に記載の方法。タンパク質およびペプチドが、組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNKTPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFRIgGFc、リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブなどのモノクローナル抗体、およびFc領域、Fabのようなそれらの断片、GLPI、GLPII、IGFI、IGFII、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン3、エキセンジン4、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモンから選択される性腺刺激ホルモンなどのホルモンから選択される、請求項23および24に記載の方法。本発明は、哺乳動物細胞中での対象とするタンパク質の発現効率を増大する発現ベクターを提供する。一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、発現増強エレメント、他の制御エレメント、すなわちTPL、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、翻訳終結因子および抗生物質マーカーを含む発現ベクターであって、発現増強エレメントがクロマチン結合領域である新規な発現ベクターを提供する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、適切な抗生物質マーカーを含む発現ベクター構築物を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、イントロン、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の実施形態による発現ベクターでトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞において、対象とする遺伝子を発現させるための方法を提供する。定義クロマチン結合領域は、タンパク質核マトリックスとのその相互作用を介して形状的制約があるDNAループを形成する、クロマチンの構造構成要素である。使用した略語CMVサイトメガロウイルスTPLトリプレットリーダーVA遺伝子またはVAIおよびII遺伝子ウイルス結合RNA遺伝子IおよびIIBGHウシ成長ホルモン本発明は、哺乳動物宿主細胞中で治療用タンパク質およびペプチドの発現の効率を有意に増大させる、新規な発現ベクターを提供する。新規なベクターは位置効果に関する欠点をさらに取り除き、制御エレメントの独自の組合せで得られる高い転写および翻訳という利点を加える。一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、発現増強エレメント、TPL、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、翻訳終結因子および抗生物質マーカーを含む発現ベクターであって、発現増強エレメントがクロマチン結合領域である新規な発現ベクターを提供する。クロマチン結合領域はMARおよびSARから選択される。一実施形態では、本発明は、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、TPLおよびVA遺伝子IおよびII、マトリックス結合領域SAR、翻訳終結因子、抗生物質マーカーを含む、タンパク質およびペプチドの産生用の発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、BGHなどの翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、イントロン、適切な抗生物質マーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。本発明の一実施形態によれば、プロモーターはCMVプロモーター、SV40プロモーター、アデノウイルスプロモーター、βアクチンプロモーター、メタロチオニンプロモーターまたは他の原核もしくは真核ウイルスプロモーターからなる群から選択される。好ましい実施形態ではCMVプロモーターを使用する。プロモーターは典型的には、それが制御する遺伝子付近、同じ鎖上および上流、すなわちセンス鎖の5領域に向かって位置し、それは転写を容易にする。本発明の一実施形態によれば、クローニング部位は、それだけには限られないが、AatI、AatII、Acc113I、Acc16I、Acc65I、AccIII、AclNI、AseI、AsnI、Asp718I、BalI、BamHI、BanI、BanII、BbeI、BbiII、BbsI、BbuI、Bbv16II、BclI、BcoI、BglI、BglII、BlnI、Bsh1365I、BsiEI、BsiHKAI、BsiI、BspEIBspHI、BstZI、CciNI、Cfr10I、Cfr42I、Cfr9I、CfrI、Csp45I、DrdI、DsaIEaeI、EagI、Eam1104I、Eco47III、Eco52I、Eco57I、Eco88I、Eco91I、EcoICRI、EcoO109I、EcoRI、EcoT14I、FriOI、FseI、FspI、HaeII、Hin1I、HincII、HindII、KasI、Ksp632I、KspI、KpnI、LspI、MamI、MflI、MluNI、MroI、MroNI、MspA1I、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoAIV、NheI、NotI、NspBII、NspI、NspV、PacI、PaeI、PflMI、PinAI、Ple19I、Pme55I、PmeI、Ppu10I、PpuMI、PshBI、Psp124BI、Psp5II、PspAI、PspALI、PspEI、PstI、PstNHI、PvuI、PvuII、SacI、SacII、ScaI、SfcI、SfiI、SpeI、SphI、Van91I、VneI、XhoI、XhoII、XmaI、XmaIII、Zsp2Iから選択することができる。本発明の一実施形態によれば、翻訳終結因子は、ウシ成長ホルモン、アデノウイルスおよび真核ウイルス翻訳終結因子配列からなる群から選択される。好ましい実施形態では、翻訳終結因子はBGHポリAである。さらなる実施形態では、内部リボソーム結合部位は、ピコルナウイルスIRES、アフソウイルスIRES、A型肝炎ウイルスIRES、C型肝炎ウイルスIRES、ペスチウイルスIRES、脳心筋炎ウイルスIRES、好ましくは脳心筋炎ウイルスIRESから選択される。本発明の一実施形態によれば、マトリックス結合領域などの発現増強エレメントは、ニワトリリゾチームMAR、ショウジョウバエScs境界エレメント、hspSAPMAR、マウスT細胞受容体TCRα、ラット遺伝子座調節領域、βグロビンMAR、およびアポリポタンパク質BSARエレメントから選択される。好ましい実施形態では、ニワトリリゾチームMARは5隣接配列または3隣接配列でクローニングする。最も好ましい実施形態では、ニワトリリゾチームMARは転写アセンブリーの5隣接配列と3隣接配列の両方でクローニングする。本発明において、対象とする遺伝子は当技術分野で知られている方法に従い発現ベクターにクローニングする。本発明の一実施形態によれば、対象とする遺伝子は、組織プラスミノーゲンアクチベータ、TNKTPA、ダルベポエチン、エリスロポエチン、インスリン、GCSF、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、TNFRIgGFcから選択される適切なタンパク質およびペプチドおよびそれらの機能性アナログ、リツキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、トラスツズマブなどのモノクローナル抗体、およびFc領域、Fabのようなそれらの断片、GLPI、GLPII、IGFI、IGFII、血小板由来増殖因子、FVII、FVIII、FIVおよびFXIII、エキセンジン3、エキセンジン4、MYT2のような転写因子、NFκΒ抑制因子NRF、AML1RUNX1、Gtxホメオドメインタンパク質、真核生物翻訳開始因子4Ga、真核生物翻訳開始因子4G1aのような翻訳因子、細胞死関連タンパク質5、cmyc、Lmyc、Pim1のような癌遺伝子、プロテインキナーゼp58PITSLRE、p53、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモンなどから選択される性腺刺激ホルモンなどのホルモン、および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質、熱ショックタンパク質70、ミトコンドリアHATPシンターゼのβサブユニット、オルニチンデカルボキシラーゼ、コネキシン32および43、HIF1a、APCをコードすることができる。したがって機能性アナログは、それらの原型タンパク質およびペプチドと類似もしくは同一の機能を有するタンパク質またはペプチドを意味する。本発明によれば、発現ベクター構築物は、作動可能に連結したプロモーター、クローニング部位、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、イントロン、適切な抗生物質マーカー、TPL、VA遺伝子IおよびIIをさらに含む発現アセンブリーを含む。この発現ベクターはpZRCIIと呼び配列番号4で開示する。別の実施形態では、マトリックス結合領域またはSAR好ましくはMARのような発現増強エレメントの遺伝子配列を、pZRCIIにおいてさらにクローニングする。この新規な発現ベクターはpZRCIIIと呼び配列番号6で開示する。マトリックス結合領域はpZRCIIIの5または3隣接領域でクローニングする。好ましい実施形態では、マトリックス結合領域はpZRCIIIの5隣接領域と3隣接領域の両方でクローニングする。本発明のpZRCIII構築物は従来技術で知られているベクターに優る進展であり、対象とする遺伝子の発現を有意に増強し、かつトランスフェクション効率を改善する。本発明のベクター構築物pZRCIIIは全タンパク質およびペプチドの発現に適している。発現ベクターpZRCIII中に適した抗生物質マーカーは、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびDHFRから選択される。別の実施形態では、発現ベクターpZRCIIIは、DHFRの遺伝子配列およびまたは内部リボソーム結合部位を場合によっては有する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、適切な抗生物質マーカーを含む発現ベクター構築物を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、イントロン、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。望ましい発現のタンパク質およびペプチドの産生用の発現ベクターは、3エレメント、すなわちプロモーターの3末端におけるアデノウイルストリプレットリーダー配列、アデノウイルスの主な後期転写産物の5ドナー部位とTPLの3末端に位置するマウス免疫グロブリンの3スプライス部位を含むハイブリッドイントロン、アデノウイルスVARNAIおよびII遺伝子の取り込みだけには限られないが、適切なエレメントを含む。マトリックス結合領域はMluIにおける5隣接配列、またはBGHポリA配列の末端における3隣接配列でクローニングされる。マトリックス結合領域の方向は任意選択である。さらに、本発明のMARエレメントは、アデノウイルストリプレットリーダー配列、ハイブリッドイントロン、TPLおよびアデノウイルスVARNAIおよびII遺伝子と組み合わせて所望遺伝子の発現を相互依存的に増強するだけでなく、トランスフェクション効率および所望クローンの数も増大する。好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパク質およびペプチドの発現用の新規な発現ベクター構築物であって、MARおよびまたはSARから選択される発現増強エレメントと組み合わせて、クローニング部位に作動可能に連結したプロモーター、対象とする遺伝子、翻訳終結因子、TPL、VAIおよびII遺伝子、イントロン、適切なマーカーおよび場合によっては内部リボソーム結合部位を含む発現ベクター構築物を提供する。一実施形態では、発現ベクターは、対象とする遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、VAIおよびII遺伝子またはそれらの変異体、TPLまたはその変異体、キメライントロンまたはその変異体、抗生物質マーカー、マトリックス結合領域、場合によっては内部リボソーム結合部位、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはその変異体を含む。一実施形態では、pZRCIII対象とする遺伝子ハイグロマイシンベクターは、CMVプロモーターにより駆動される対象とする遺伝子に作動可能に連結した配列番号5に記載されているcLysMAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有するベクターの多数のクローニング部位にクローニングした融合タンパク質エタネルセプトの化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIIIエタネルセプトエタネルセプトハイグロマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5656である。別の実施形態では、pZRCIII対象とする遺伝子ネオマイシンベクターは、CMVプロモーターに作動可能に連結した配列番号5に記載されているCLysMAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有するベクターの多数のクローニング部位にクローニングした融合タンパク質エタネルセプトの化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIIIエタネルセプトネオマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5657である。別の実施形態では、pZRCIII対象とする遺伝子IRESハイグロマイシンベクターは、CMVプロモーターに作動可能に連結した配列番号5に記載されているcLysMAR、TPL、配列番号1に記載されているキメライントロン、配列番号3に記載されているVA遺伝子IおよびII、BGHポリアデニル化および多数のクローニング部位を含有する。多数のクローニング部位はXhoI、NotIのような制限部位を含む。発現カセット中のCMVプロモーター、TPL、キメライントロンなどの他の制御エレメントおよび発現カセット外に位置するVA遺伝子と組み合わせて発現カセットの上流と下流の両方にニワトリリゾチームMARエレメントを有する、ベクターの多数のクローニング部位にクローニングしたFSHαおよびFSHβサブユニットおよびIRESにより互いに作動可能に連結したFSHαとFSHβサブユニットの両方の化学合成遺伝子のような、対象とする任意の遺伝子を、多数のクローニング部位でクローニングすることができる。ベクターはトランスフェクタントの選択用にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。本発明のこの態様に従い調製したベクター構築物の一例として、pZRCIIIFSHαIRESFSHβハイグロマイシンベクターはブダペスト条約の下に寄託され、受託番号はMTCC5655である。一実施形態では、当業者に知られている方法により、発現ベクターを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする。哺乳動物宿主細胞は、タンパク質の工業生産用のよく知られているCHO細胞系、BHK細胞系などから選択することができる。別の実施形態では、トランスフェクトした宿主細胞を、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンから選択される適切な抗生物質を含有する異なるベクターでさらにトランスフェクトして、対象とする遺伝子の発現をさらに増大させる。一実施形態では、トランスフェクトする細胞系は、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、カナマイシン、G418または他の抗生物質の使用により選択されるCHOK1である。さらに、発現ベクターがDHFRの遺伝子を有する場合、DHFR選択培地、例えばメトトレキサートの使用によりトランスフェクト細胞系が選択される。この選択は、トランスフェクト細胞系に対する選択圧の段階的増大を利用するものである。さらに別の実施形態では、発現ベクターがグルタミンシンテターゼの遺伝子を有するとき、グルタミンシンテターゼ選択培地、例えばメチオニンスルホキシミンにおいてトランスフェクトされた細胞系が選択される。したがって本発明は、転写および翻訳を著しく増大し、遺伝子組み込みの位置効果も抑制する制御エレメントの特有な組合せを含み、したがって組換えタンパク質の安定した、高発現に相乗効果をもたらす新規な発現ベクターを提供する。さらに本発明は、時間効率の良い形式で産業規模での治療用タンパク質およびペプチド、モノクローナル抗体の産生をもたらす。大きな労働力を要する多数のクローンのスクリーニングは、典型的エレメントの存在下で劇的に減少するからである。さらに本発明の発現ベクターは、一過性と安定的発現の両方に使用することができる。実施例を用いて本発明をさらに例示する。これらの実施例は単なる例示目的であり、本発明はこれらにのみ限られるわけではない。実施例実施例1pZRCIIIベクターの構築本発明者らの以前の特許出願WO2007017903中に記載した、全ての制御エレメント、すなわちTPL、VA、CMVプロモーター、キメライントロン、およびBGHポリアデニル化および終結配列を有する完全な転写アセンブリーは、GeneART、ドイツで化学合成された。クローニングベクターpMKでクローニングしたこの完全なアセンブリーは、pZRCIIと呼んだ。ニワトリリゾチームMARDNA断片、、10735~10742頁を化学合成し、クローニングベクターでクローニングした。2つのニワトリリゾチームMAR断片を、ベクター中に既に予め設計したSacIおよびMluI部位を使用して、pZRCIIベクター中の発現カセットの片側に隣接配列として挿入した。SacI部位を有するプライマーを使用したPCRにより、SacIオーバーハングをニワトリリゾチームMAR断片に加えた。具体的には、50mMのトリスCl、25mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積中に100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、40サイクルのPCR増幅を実施した。各PCR増幅サイクルは、95°Cで30秒間のインキュベーション、62°Cで30秒間のおよび72°Cで2分間のからなっていた。PCR反応の増幅産物は1アガロースゲルで分離した。約1664塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。SacIでのベクターと精製PCR産物の両方の制限酵素による消化後、この精製DNA断片をpZRCIIベクターに連結させた。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、得られた形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ニワトリリゾチームMAR断片の存在に関して分析した。pZRCIIベクター中に正確な組み込みがあることが分かった1つのこのようなプラスミドは、pZRCII1MAR中間体ベクターと名付けた。MluIオーバーハングを別のニワトリリゾチームMAR断片に加えるため、それを50mMのトリスCl、25mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積中に100ピコモルの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する40サイクルのPCR増幅に供した。各PCR増幅サイクルは、95°Cで30秒間のインキュベーション、60°Cで30秒間のおよび72°Cで2分間のからなっていた。PCR反応の増幅産物は1アガロースゲルで分離した。約1650塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。MluIでのベクターと精製PCR産物の両方の制限酵素による消化後、この精製DNA断片をpZRCIIlMARベクターに連結させた。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約10個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、MluI位置におけるニワトリリゾチームMAR断片の存在に関して分析した。pZRCIIlMARベクター中のMluI部位にcLysMARの正確な組み込みがあることが分かった1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIと名付けた。実施例2pZRCIIITNKベクターの構築テネクテプラーゼ遺伝子を化学合成し、クローニングベクターpMKにクローニングした。pZRCIIベクターにおけるTNK遺伝子をクローニングするため、第1のEcoRIおよびNotIオーバーハングを、50mMのトリスCl、25mMのMgCl2、各250μΜの4dNTPおよび5ユニットのPfuポリメラーゼを含有する50μl体積において100ピコモルの前述の制限部位を含有する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する40サイクルのPCR増幅を使用して、TNK遺伝子中に取り込んだ。各PCR増幅サイクルは、95°Cで30秒間のインキュベーション、60°Cで45秒間のおよび72°Cで2分間のからなっていた。PCR反応の増幅産物は1アガロースゲルで分離した。約1710塩基対サイズの所望断片をゲルから切除し、Qiagenゲル抽出キットを使用して精製した。TNKのこの精製DNA断片をEcoRIおよびNotIで消化し、EcoRIおよびNotIで消化したpZRCIIIベクターに連結させた。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約10個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化によりTNK断片の存在に関して分析した。pZRCIIIベクター中に組み込まれたTNK遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIITNKと名付けた。実施例3pZRCIIITNKHygベクターの構築SV40プロモーターおよび終結因子制御ハイグロマイシン耐性遺伝子を有する約1550塩基対サイズのハイグロマイシン転写アセンブリーを、Pfuポリメラーゼを使用して平滑末端処理し、KpnIで事前に消化処理しPfuポリメラーゼを使用して平滑末端処理したpZRCIIITNKベクターに次いで連結させた。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ハイグロマイシン耐性遺伝子の存在に関して分析した。pZRCIIITNKベクター中に組み込まれたハイグロマイシン転写アセンブリーを有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIITNKHygベクターと名付けた。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサーを使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたTNK遺伝子の配列を確認した。実施例4pZRCIIIDarbeHygベクターの構築pZRCEPOを、約600bpのダルベポエチン遺伝子断片を得るためのエリスロポエチン遺伝子の部位特異的突然変異誘発を実施するための鋳型として使用し、次いでそれをTAベクターpTZ57RでクローニングしpTZ57RDarbeと呼んだ。pZRCIIITNKHygをXhoIおよびNotIで消化してTNK遺伝子を除去し、残りの高分子量DNAはダルベポエチン遺伝子挿入物との連結用のベクターとして使用した。pTZ57RDarbeはXhoIおよびNotIで消化して約600bpのダルベポエチン遺伝子断片をゲル単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ダルベポエチン遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたダルベポエチン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIDarbeHygベクターと名付けた。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサーを使用したDNA配列決定に供して、クローニングダルベポエチンした遺伝子の配列を確認した。実施例5pZRCIIIエタネルセプトHygベクターの構築ベクターpZRCIIIDarbeHygをXhoIおよびNotI酵素で消化し、約600bpのダルベポエチン遺伝子を除去し、約9430bpのベクター骨格を作製した。約1481bpの化学合成した、CHOコドン最適化、エタネルセプト遺伝子を、XhoIおよびNotIを使用しクローニングベクターから単離し挿入物を得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、エタネルセプト遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたエタネルセプト遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIエタネルセプトHygベクターと名付けた。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサーを使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたエタネルセプト遺伝子の配列を確認した。実施例6pZRCIIIFSHαIRESFSHβHygベクターの構築apZRCIIIFSHαHygベクターの構築約9430bpのベクター骨格を、pZRCIIIDarbeHygベクターをXhoIおよびNotI酵素で消化して約600bpのダルベポエチン遺伝子を除去することにより作製した。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotIを使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHαHygベクターと名付けた。bpZRCIIIFSHαIRESFSHβHygベクターの構築ベクターpZRCIIIFSHαHygをNotIで消化して約9790bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片を、酵素NotIおよびXmaIを使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XmaIおよびNotIを使用しGeneartクローニングベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。この2つの挿入物を融合させ、融合遺伝子産物を前述のベクターと連結させた。次いで連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHαIRESFSHβHygベクターと名付けた。次いでこのベクターを、自動DNAシークエンサーを使用したDNA配列決定に供して、クローニングしたFSHαおよびFSHβ遺伝子の配列を確認した。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例7pZRCIIIFSHβIRESFSHαHygベクターの構築apZRCIIIFSHβHygベクターの構築FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の除去後、ベクターpZRCIIIFSHαIRESFSHβHygをXhoIおよびNotIで消化して約9430bpのベクター骨格を作製した。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotIを使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHβHygベクターと名付けた。bpZRCIIIFSHβIRESFSHαHygベクターの構築ベクターpZRCIIIFSHβHygをNotIで消化して約9790bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片を、酵素NotIおよびXhoIを使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotIを使用しGeneartクローニングベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。これにベクターと2つの挿入物の3片連結を続けた。次いで連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHβIRESFSHαHygベクターと名付けた。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例10pZRCIIITNKピューロマイシンベクターの構築SV40プロモーターおよび終結因子制御ピューロマイシン耐性遺伝子を有し、BamHIでさらに消化したpZRCIIITNKベクターに連結したBamH1適合末端を保持する、約1110塩基対サイズのピューロマイシン転写アセンブリー。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ピューロマイシン断片の存在に関して分析した。pZRCIIITNKベクター中に組み込まれたピューロマイシン転写アセンブリーを有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIITNKPuroベクターと名付けた。クローニングしたTNK遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例11pZRCIIIダルベポエチンPuroベクターの構築pZRCIIITNKPuroをXhoIおよびNotIで消化してTNK遺伝子断片を除去した。pTZ57RDarbeをXhoIおよびNotIで消化して、約600bpのダルベポエチン遺伝子断片をゲルから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施した。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ダルベポエチン遺伝子断片の存在に関して分析した。組み込まれたダルベポエチン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIDarbePuroベクターと名付けた。クローニングしたダルベポエチン遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例12pZRCIIIFSHαIRESFSHβPuroベクターの構築pZRCIIIFSHαIRESFSHβHygベクターからハイグロマイシンカセットを除去し、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR反応を使用して、pZRCIIIDarbePuroから増幅したSV40プロモーターおよび終結因子制御ピューロマイシン耐性遺伝子を有する約1110塩基対サイズのピューロマイシン転写アセンブリーと置換した。得られたPCR産物は特異的エンドヌクレアーゼを使用して消化し、ベクター骨格とのさらなる連結に使用した。連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ピューロマイシン遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたピューロマイシン遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHαIRESFSHβPuroベクターと名付けた。実施例13pZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoベクターの構築ピューロマイシン耐性遺伝子の除去後、ベクターpZRCIIIFSHαIRESFSHβPuroをPacIおよびBamHIで消化して約9980bpのベクター骨格を作製した。約1518bpのネオマイシン耐性遺伝子をpcDNA31プラスミドから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、ネオマイシン遺伝子断片の存在に関して分析した。組み込まれたネオマイシン耐性サブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoベクターと名付けた。FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例14pZRCIIIFSHβIRESFSHαNeoベクターの構築apZRCIIIFSHβNeoベクターの構築FSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子の除去後、ベクターpZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoをXhoIおよびNotIで消化して約9400bpのベクター骨格を作製した。約401bpのFSHβサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotIを使用して、GeneartクローニングベクターpMAから単離した。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、FSHβサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたFSHβサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHβNeoベクターと名付けた。bpZRCIIIFSHβIRESFSHαNeoベクターの構築ベクターpZRCIIIFSHβNeoをNotIで消化して約9800bpのベクター骨格を作製した。約591bpのIRES遺伝子断片を、酵素NotIおよびXhoIを使用しベクターpIRESHygから単離して、第1の挿入物を得た。約359bpのFSHαサブユニットの化学合成遺伝子を、酵素XhoIおよびNotIを使用しGeneartベクターpMAから単離して、第2の挿入物を得た。これにベクターと2つの挿入物の3片連結を続けた。次いで連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、IRESおよびFSHαサブユニット遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたIRESおよびFSHαサブユニット遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIFSHβIRESFSHαNeoベクターと名付けた。クローニングした遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例17pZRCIIIエタネルセプトNeoベクターの構築ベクターpZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoをXhoIおよびNotI酵素で消化してFSHα、IRESおよびFSHβ遺伝子を除去し、エタネルセプト遺伝子のクローニングに使用する約9400bpのベクター骨格を得た。エタネルセプトの約1481bp遺伝子を、XhoIおよびNotI酵素を使用しベクターpZRCIIIエタネルセプトHygから単離して、挿入物を得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。約数個のこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化によりエタネルセプト遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたエタネルセプト遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIIエタネルセプトNeoベクターと名付けた。クローニングしたエタネルセプト遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例18pZRCIIITNKNeoベクターの構築ベクターpZRCIIIエタネルセプトNeoを酵素XhoIおよびNotIで消化して約1481bpのエタネルセプト遺伝子を除去し、約9400bpのベクター構築物を得た。約1692bpのTNK遺伝子の挿入物を、XhoIおよびNotI酵素によるベクターpZRCIIITNKHygの消化後に得た。ベクターと挿入物の両方の連結を実施し、連結産物は大腸菌Top10Fにおいて形質転換し、形質転換体はカナマイシン耐性に基づいてスコア化した。幾つかのこのようなコロニーから単離したプラスミドDNAは、様々な制限酵素を使用した制限酵素による消化により、TNK遺伝子の存在に関して分析した。組み込まれたTNK遺伝子を有する1つのこのようなプラスミドはpZRCIIITNKNeoベクターと名付けた。クローニングしたTNK遺伝子の配列は自動DNAシークエンサーの使用により確認した。実施例19エタネルセプトの発現設定IpZRCIIIエタネルセプトHygベクターを使用したCHOK1S細胞系における安定的トランスフェクションFreestyleCHOK1S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中で通常通り培養した。細胞は攪拌下37°C、および5CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHOKIS細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者により記載された標準プロトコールに従い、SgsI線状pZRCIIIエタネルセプトHygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37°C、5CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中の6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中の6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。設定IIpZRCIIIエタネルセプトNeoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション高発現クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsIにより線状化したpZRCIIIエタネルセプトNeoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μgmlのハイグロマイシン、および500μgmlのネオマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現リトランスフェクトクローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブにおいて、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは12日間で約700mgl~1000mglの範囲の生産レベルをもたらした。実施例20TNKの発現設定IpZRCIIITNKHygベクターを使用したCHOK1S細胞系における安定的トランスフェクションFreestyleCHOK1S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中で通常通り培養した。細胞は攪拌下37°C、および5CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHOKIS細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者により記載された標準プロトコールに従い、SgsI線状pZRCIIITNKHygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37°C、5CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび500μgmlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび500μgmlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、230rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブ、10ml培地で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは9日間で150mglの生産レベルをもたらした。設定IIapZRCIIITNKPuroベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション高発現クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsIにより線状化したpZRCIIITNKPuroプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、500μgmlのハイグロマイシン、および3ugmlのピューロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度約15~20日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブ内で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは11日間で290mglの生産レベルをもたらした。設定IIbpZRCIIITNKNeoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクション高産生クローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsIにより線状化したpZRCIIITNKNeoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μgmlのハイグロマイシン、および500μgmlのネオマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生ミニプールを選択して、4mMのグルタミンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブ内で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは10日間で390mglの生産レベルをもたらした。実施例21pZRCIIIDarbeHygベクターを使用したダルベポエチンの発現設定IpZRCIIIDarbeHygベクターを使用したCHOK1S細胞系における安定的トランスフェクションFreestyleCHOK1S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中で通常通り培養した。細胞は攪拌下37°C、および5CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHOKIS細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者により記載された標準プロトコールに従い、SgsI線状pZRCIIIDarbeHygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。DNAのトランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37°C、5CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したPowerCHO2CD培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~20日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。2つの高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで発現レベルを分析した。高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、230rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブ、10ml培地で、これらの選択クローンを使用して実施した。クローンは11日間で340mg1の生産レベルをもたらした。実施例22FSHの発現設定I‐pZRCIIIFSHαIRESFSHβHygベクターを使用したCHOK1S細胞系における安定的トランスフェクションFreestyleCHOK1S細胞を、4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中で通常通り培養した。細胞は攪拌下37°C、および5CO2において、湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。細胞は3日4日毎に計数し、完全な培地交換を行った。トランスフェクションはNeonトランスフェクション系を使用して実施した。トランスフェクション1日前に、CHOKIS細胞を新たな培地に継代し、トランスフェクションに使用する前に少なくとも一回の倍加を可能にした。製造者により記載された標準プロトコールに従い、SgsI線状pZRCIIIFSHαIRESFSHβHygプラスミドを使用してトランスフェクションを実施した。トランスフェクション後、1mLの予め温めた培養培地を含有する24ウエルプレートの1ウエルに、細胞を移した。細胞は37°C、5CO2において湿度調節機能付きインキュベーター中に保った。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高発現ミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび600μgmlのハイグロマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。約15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生クローンはリトランスフェクション用に選択した。設定IIpZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoベクターを使用して設定Iから得たクローンの安定的リトランスフェクションクローンを選択して、設定Iのトランスフェクションと同じ手順により、SgsIにより線状化したpZRCIIIFSHαIRESFSHβNeoプラスミドを使用してリトランスフェクションを実施した。翌日、ミニプールでの生成用に、4mMのグルタミン、600μgmlのハイグロマイシン、および500μgmlのネオマイシンを補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中に、トランスフェクト集団を平板培養した。15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現ミニプールは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCHO2CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。高産生リトランスフェクトミニプールを選択して、4mMのグルタミンおよび前記抗生物質選択圧を補充したProCHO5培地中96ウエルプレート中で単細胞限界希釈を実施した。再度15~30日後、ELISAによる産物形成の分析のため、96ウエルプレートから上清を除去した。選択した高発現クローンは次いで24ウエルプレート、およびその後4mMのグルタミンを補充したPowerCH02CD培地中6ウエルプレートに移し、ELISAにより各レベルで前記抗生物質選択圧および発現レベルを分析した。すなわち高発現クローンを選択して、フェドバッチ形式で攪拌チューブ中の産物形成を分析した。これらの実験は、120rpm、37°C、5CO2でシェーカー上のスピンチューブで、これらの選択クローンを使用して実施した。異なるクローンで10日間内に約20mgl~50mglの範囲の生産レベルを得た。