"β1-3GlcUA→GalNAc結合とβ1-4GalNAc→GlcUA結合により結合したD-グルクロン酸GlcUAとN-アセチル-D-ガラクトサミンGalNAcの残基が交互に配列することにより構成される直鎖状グリコサミノグリカンとして定義されるコンドロイチンを産生する組換え微生物であって、前記微生物において、直鎖状コンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する酵素をコードする遺伝子が不活性化されていることを特徴とする、組換え微生物。元々存在する、直鎖状コンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する蛋白質をコードする遺伝子が、前記遺伝子の全部もしくは一部の欠失もしくは置換又は付加的ヌクレオチド配列の挿入による破壊により不活性化されている、請求項1に記載のコンドロイチンを産生する組換え微生物。不活性化されている遺伝子が、A配列番号2のアミノ酸配列を含む蛋白質;B1アミノ酸以上の欠失、置換又は挿入により改変された配列番号2のアミノ酸配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質;及びC配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも50の相同性をもつアミノ酸配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質から構成される群から選択される直鎖状コンドロイチン主鎖へのフルクトース残基の付加に関与する蛋白質をコードする遺伝子である、請求項1及び2のいずれか一項に記載の組換え微生物。不活性化されている遺伝子がkfoE遺伝子又はa配列番号1のヌクレオチド配列を含むDNA;b配列番号1に対して相補的なヌクレオチド配列を含むDNAとハイブリダイズし、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードするDNA;及びc配列番号1のヌクレオチドに対して少なくとも50の相同性をもつヌクレオチド配列を含み、フルクトシルトランスフェラーゼ活性をもつ蛋白質をコードするDNAから構成される群から選択されるDNAである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換え微生物。遺伝子がそのヌクレオチド配列の全部もしくは一部の欠失もしくは置換、又はそのヌクレオチド配列への1ヌクレオチド以上の挿入により不活性化されている、請求項3及び4のいずれか一項に記載の組換え微生物。不活性化されている遺伝子がkfoE遺伝子である、請求項5に記載の組換え微生物。kfoE遺伝子がその全部又は一部をカナマイシン耐性カセットで置換後に前記カセットを除去することにより不活性化されており、その結果、kfoE遺伝子の全部又は一部が欠失している、請求項6の組換え微生物。エシェリキアEscherichia、ヘモフィルスHaemophilus、カンピロバクターCampylobacter、グロエオカプサGloeocapsa及びビブリオVibrioから選択される属に属する細菌に由来する、請求項1から7のいずれかに記載の組換え微生物。微生物が大腸菌種に属する細菌に由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換え微生物。K抗原のグループ2に属する大腸菌種の血清型に由来する、請求項9に記載の組換え微生物。大腸菌O5:K4:H4U1-41株に由来する、請求項10に記載の組換え微生物。大腸菌DSM23644である、請求項1から11のいずれかに記載の組換え微生物。バイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法であって、a.請求項1から12のいずれかの組換え細菌を適切な培地で培養する工程、b.微生物培養物中に存在するコンドロイチンを回収し、精製する工程を含む、方法。組換え微生物が大腸菌DSM23644である、請求項13に記載のバイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産方法。請求項13の方法により取得することができる、バイオテクノロジーにより生産されたコンドロイチン。組換え微生物が大腸菌DSM23644である、請求項13の方法により取得することができる、請求項15のバイオテクノロジーにより生産されたコンドロイチン。[実施例1]大腸菌K4ΔkfoE/kanR株の構築鋳型としてのpKD4ベクターと以下のPCRプライマー:OL151:atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc配列番号3OL152:tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcctta配列番号4を使用してPCRによりkanR遺伝子とkfoE相同末端の両方を含む直鎖状DNA断片図1aの構築を行った。各オリゴヌクレオチド配列において、最初から40個のヌクレオチドはkfoE遺伝子相同性を提供し、残りの20個のヌクレオチドはpKD4鋳型プラスミド相同性を提供するP1及びP2プライミング部位。以下の条件:94°C×3分、94°C×1分、40°C×1分、68°C×2分×5サイクル、94°C×1分、59°C×1分、68°C×2分×30サイクル、68°C×10分、4°C×10分に従い、鋳型DNA120ngでPCRを実施した。PCR産物をゲル精製し、細菌を形質転換した。大腸菌O5:K4:H4株U1-41図1bを作製し、DatsenkoandWannerPNAS,June2000,vol97,N°12,6640-6645に従ってエレクトロポレーションによりpKD46プラスミドで形質転換した後、アンピシリン含有培地にプレーティングした。アンピシリン耐性形質転換体を同定し、単離した。プラスミド抽出と以下のプライマー及び条件:OL149:ccactcataaatcctcatagag配列番号5OL150:ccaacttacttctgacaacgat配列番号694°C×3分、94°C×1分、43°C×1分、68°C×2.5分×30サイクル、68°C×10分、4°C×10分を使用したPCRにより2個の形質転換体を確認した。PCR産物を0.8アガロースゲル電気泳動により解析し、予想産物寸法と完全に一致する1799塩基対の寸法の産物を同定した。カナマイシン耐性カセットとkfoE相同末端の両方を含むDNA断片を使用して2個のpKD46形質転換体のうちの一方を次にエレクトロポレーションに供した。アンピシリンとカナマイシンの両方を含有する培地でのプレート選択を使用し、kfoEヌクレオチド配列の大半がカナマイシン耐性遺伝子で置換された組換体を単離した。以下の適切なプライマー:OL153:aatccgacggggactgtagatt配列番号7OL142:aactgttcgccaggctcaag配列番号8OL143:gcgttttcccttgtccagat配列番号9OL154:gctaatgtatatgattgccaggt配列番号10を使用し、95°C×5分、94°C×1分、47°C×1分、68°C×2分×30サイクル、68°C×10分、4°C×10分でkfoE3’及び5’フランキング領域の両方のPCR増幅により3個の二重形質転換体を確認した。PCR産物を0.8アガロースゲル電気泳動により解析し、予想産物寸法に完全に一致する夫々kfoE遺伝子の3’末端増幅の1773塩基対と5’末端増幅の769塩基対の寸法の2個の産物を単離した図2。カナマイシン耐性遺伝子の向きを確認すると共に遺伝子転写方向が正しいことを確かめるために、以下のオリゴヌクレオチド:OL153:aatccgacggggactgtagatt配列番号7OL154:gctaatgtatatgattgccaggt配列番号10を使用して大腸菌K4ΔkfoE/kanR図1cのシーケンシング解析により形質転換体を更に解析した。得られたヌクレオチド配列を配列番号14と言う。[実施例2]大腸菌K4ΔkfoE株の構築カナマイシン耐性カセットを含まず、kfoE遺伝子の大半を欠失し、結果として機能喪失を伴う大腸菌K4株ΔkfoEを得るために、大腸菌K4株ΔkfoE/kanRをpCP20プラスミドで更に形質転換した。エレクトロポレーション工程後、アンピシリンを含有する培地で30°Cにて形質転換体を選択後、コロニー精製した。推定形質転換体を非選択プレートで43°Cにて増殖後、全抗生物質耐性の喪失について試験した。以下のオリゴヌクレオチド:OL169:tgaggtgattgttggtaaaccttggtg配列番号11OL166:tactgtttctgcttgcccccgagtt配列番号12を使用して残存するkfoEフランキング3’及び5’末端図1dの両方をシーケンシングすることにより大腸菌K4株ΔkfoE形質転換体を確認した。得られたヌクレオチド配列を配列番号13と言う。[実施例3]大腸菌DSM23644の培養とコンドロイチン解析RodriguezandJannEur.J.Biochem.117,117-124,FEBS1988に従って大腸菌DSM23644の培養を行った。要約すると、解凍した培養ストック0.5mlから出発し、1リットル当たりK2HPO43H2O9.7g、KH2PO48g、クエン酸ナトリウム5H2O0.5g、MgCl27H2O0.2g、カザミノ酸20g、硫酸アンモニウム20g、グルコース2g、酵母エキス10gから構成されるブロス培地20mlを加えたフラスコに接種し、180rpm及び振幅2.5cmで振盪下に37°Cで16時間インキュベートし、無性段階の培養を実施した。上記のようなブロス培地85mlを加えた500mlバッフル付きフラスコに上記のように調製した無性培養物0.05を接種し、180rpm及び振幅25cmで振盪下に37°Cで48時間インキュベートし、回分培養で次の培養段階を実施した。インキュベーション後、培養物を遠心により回収し、産生されたコンドロイチンを単離及び性状解析するために上清を精製した。RodriguezandJannEur.J.Biochem.117,117-124,FEBS1988により記載されている方法の変法に従ってコンドロイチン精製を行った。要約すると、セタブロンアルキルトリメチルアンモニウムブロマイド,CASN°7192-88-3により培養上清から多糖を沈殿させ、3°Cにて0.5MNaOHで抽出し、中和後、3サイクルの80エタノール沈殿により精製した。90冷フェノールpH6.8を用いて最終精製工程を実施し、汚染性蛋白質を沈殿させ、水相を遠心により回収した。精製したコンドロイチンを80エタノール沈殿と減圧乾燥により水相から回収した。産生されたコンドロイチンの種類を確認するために数種の解析アプローチを使用した。第1のアプローチは0.2Mトリフルオロ酢酸で1時間99°Cにて実施した酸加水分解後に培養物から回収された産生物中のフルクトースの有無を調べた。回収した産生物中に存在するフルクトースを定量するために、遊離フルクトースを加水分解前後に測定した。BIOCONTROLBioControlSystemsInc.12822SE32ndStreetBellevue,WA98005,米国の製品であるEnzyPlusSucrose/D-Glucose/D-Fructoseキットを使用してフルクトースを酵素定量した。加水分解後と加水分解前に存在する遊離フルクトースの差を原料K4分子と結合したフルクトースとみなした。大腸菌DSM23644の培養物から回収された産生物は結合したフルクトースの存在を示さず、この株がフルクトースを含有しない多糖を産生することを確認した。上記のように大腸菌DSM23644の培養物から回収された多糖には結合したフルクトースが存在しないことをコンドロイチナーゼABCによる酵素消化により確認した。精製コンドロイチンをコンドロイチナーゼABCで消化すると、コンドロイチン消化の特徴である不飽和Δ-二糖Δdi-0Sを生じることも判明し、MicellarElectrokineticChromatographyMECK技術を使用したキャビラリー電気泳動CEにより確認された図3。適切なΔ-二糖参照標準等電点電気泳動溶出を利用してΔdi-0S構造を確認した。得られたΔdi-0Sの定量を外部検量曲線により行った。最後に、大腸菌DSM23644により産生された精製コンドロイチン多糖をC13NMRにより性状解析した図4。この技術によると、試験した産生物は酸加水分解により天然K4多糖からフルクトースの除去後に得られた産生物とスペクトルが一致することが判明した。[実施例4]プラスミドによるkfoE機能の補完K4フルクトシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子としてのkfoEの機能を確認するために、野生型kfoEヌクレオチド配列を含む組換えプラスミドを構築し、大腸菌K4株ΔkfoEに導入し、喪失した機能の補完を行った。以下のオリゴヌクレオチド:OL172:acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc配列番号15OL173:actggatccttatcatactgcagcctcctta配列番号16を使用することによりkfoE遺伝子を増幅した。pTrcHisプラスミド4400bp-InvitrogenCorporation,5791VanAllenWayPOBox6482Carlsbad,Californiaを使用し、増幅ゲル精製後のkfoE遺伝子1569bpを適切なクローニング部位に導入した。NcoI及びBamHI制限酵素で消化したpTrcHisベクター70ngと、対合するPciI/BamHI消化末端をもつkfoE遺伝子75ngを25°Cで15分間ライゲーション反応させた。次に大腸菌DH5αコンピテントセルInvitrogenCorporation,5791VanAllenWayPOBox6482Carlsbad,California50μLにライゲーション混合液5μLをエレクトロポレーションし、100μg/mLアンピシリンを含有するプレートで37°Cにて5個の形質転換体を選択した。コロニー精製後、構築したプラスミドpTrcHis-kfoEを抽出し、挿入されたkfoE配列の内側のDNA構築物を切断することが可能なMfeI制限酵素により消化した。ゲル電気泳動解析によると、MfeI消化後の5個の形質転換体のうちの3個は予想通りの5887bpの長さを示し、配列解析により、kfoE遺伝子の正しい挿入が確認された。確認されたpTrcHis-kfoE構築物を使用し、エレクトロポレーションにより組換え大腸菌DSM23644を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを添加したプレートで形質転換体を選択した。選択した形質転換体を実施例3に記載した条件に従って培養し、RodriguezandJannEur.J.Biochem.117,117-124,FEBS1988に従ってK4多糖を精製した。回収した産生物中に存在するフルクトースを定量するために、0.2Mトリフルオロ酢酸で1時間99°Cにて酸加水分解前後に遊離フルクトースを測定した。EnzyPlusSucrose/D-Glucose/D-Fructoseキットを使用してフルクトースを酵素定量した。加水分解後と加水分解前に存在する遊離フルクトースの差を原料K4分子と結合したフルクトースとみなした。pTrcHis-kfoEにより形質転換された大腸菌DSM23644の培養物から回収された産生物は結合したフルクトースの存在を示し、この株ではフルクトシルトランスフェラーゼ活性の喪失がプラスミドにより補完されたことが確認された。"