"免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体であって、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のアスパラギンAsn残基が、ヒスチジンHis残基、セリンSer残基、アスパラギン酸Asp残基又はスレオニンThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上している、変異体。前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。Asn3His置換配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。Asn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。Asn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。Asn3His/Asn23Ser又はAsn3His/An23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項3に記載の変異体Ig結合タンパク質。配列番号8の4個のタンデムを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。前記変異体をアフィニティー分離のためのマトリクスに固定化することができるリンカーペプチドとカップリングしていることを特徴とする、請求項1に記載の変異体Ig結合タンパク質。配列番号2~11及び14から選択されることを特徴とするIg結合タンパク質。アフィニティー分離のためのマトリクスであって、固体支持体とカップリングした免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体を含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする、マトリクス。前記変異体がリンカーペプチドにより前記固体支持体とカップリングしていることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。前記変異体がAsn3His置換配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。前記変異体がAsn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。前記変異体がAsn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。前記変異体がAsn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。前記変異体が三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項16に記載のマトリクス。前記変異体が、Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。前記変異体が配列番号2~11及び14から選択されることを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。前記アンカーは配列番号15のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項13に記載のマトリクス。免疫グロブリンIg及び該Igが分離されるべき少なくとも1種の他の物質を含む組成物から該Igを分離する方法であって、固体支持体とカップリングしたIg結合タンパク質の変異体を含むアフィニティー分離のためのマトリクスと該組成物とを接触させ、これにより該組成物における該少なくとも1種の他の物質から該Igを分離することを含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする、方法。前記Ig結合タンパク質がプロテインAであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。前記Ig結合タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法。前記変異体がAsn3His置換配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換又はAsn3Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記変異体がAsn6Asp置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記変異体がAsn23Ser置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記変異体がAsn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択される二重置換を有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記変異体が三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有するIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項27に記載の方法。前記変異体が、Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことを特徴とする、請求項25に記載の方法。前記変異体が配列番号2~11及び14から選択されることを特徴とする、請求項25に記載の方法。前述の状況にもかかわらず、タンパク質固定化及びリガンド安定性増強のための改良された方法の開発が依然として求められている。アフィニティークロマトグラフィーは、ワンステップで高い回収率を有するタンパク質精製のための最も有用な分離方法の1つである。エポキシベースのカップリングは、ペプチド又はタンパク質固定化のために広く用いられている技術である。エポキシ基は、2個の隣接する炭素原子に単結合してエポキシド環を形成する酸素原子を含有する。この官能基は、タンパク質表面における種々の求核基と反応して、最小限の化学修飾で強固な結合を形成することができる。しかし、エポキシ樹脂における固定化効率は、アミノ酸配列、pI及びタンパク質二次構造等の所定のペプチド又はタンパク質の組成、及びpH、カップリングバッファー組成及び塩濃度等の反応条件に大きく依存する。本発明は、その一実施形態において、免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体を提供する。該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のアスパラギンAsn残基が、ヒスチジンHis残基、セリンSer残基、アスパラギン酸Asp残基又はスレオニンThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上している。本発明は、その一実施形態において、アフィニティー分離のためのマトリクスを提供する。該マトリクスは、固体支持体とカップリングした免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体を含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする。本発明は、その一実施形態において、免疫グロブリンIg及び該Igが分離されるべき少なくとも1種の他の物質を含む組成物から該免疫グロブリンIgを分離する方法を提供する。該方法は、固体支持体とカップリングしたIg結合タンパク質の変異体を含むアフィニティー分離のためのマトリクスと該組成物とを接触させ、これにより該組成物における該少なくとも1種の他の物質から該Igを分離することを含み、該変異体は、該Ig結合タンパク質における少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されているIg結合タンパク質を含み、該少なくとも1個の置換によって、該変異体は、該Ig結合タンパク質と比べてアルカリ安定性が向上していることを特徴とする。本発明の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質はプロテインAである。本発明の他の一実施形態において、上記Ig結合タンパク質は配列番号1のアミノ酸配列を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、Asn3His置換配列番号1の3位のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換又はAsn3Ser置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、Asn6Asp置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、Asn23Ser置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、Asn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択される二重置換を有する配列番号1のアミノ酸配列を含むIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、三重置換Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serを有する配列番号1のアミノ酸配列を含むIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、配列番号8の4個のタンデムを有するIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態において、上記変異体Ig結合タンパク質は、少なくとも1個のAsn残基がAsp残基に置換されたIg結合タンパク質を含む。本発明の他の一実施形態は、上記変異体をアフィニティー分離のためのマトリクスに固定化させることができるリンカーペプチドとカップリングしていることを特徴とする変異体Ig結合タンパク質である。本発明の態様において、該リンカーペプチドは、配列番号15のアミノ酸配列を含む。本発明の他の一実施形態は、変異体Ig結合タンパク質であって、該Ig結合タンパク質が配列番号2~11及び14から選択されることを特徴とする変異体Ig結合タンパク質である。本発明の上述の実施形態及び他の態様は、以下の図面を参照することにより、詳細な説明から明らかになるであろう。定義特段に定義を与えない限り、本明細書におけるあらゆる専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されているものと同様の意味を有する。また、特段の記載が無い限り、特許請求の範囲を除き、又はの使用は、及びを包含し、その逆もまた同じである。非限定的な用語は、他に特に記述がなければ、或いは文脈がそれ以外を明示する場合を除き、限定的な用語として解釈すべきではない例えば、包含する、有する及び含むは通常、限定することなく包含するを示す。特許請求の範囲も含め、単数形a、an及びthe等は、他に特に記述がない限り複数への参照を包含する。本明細書において機能的に均等な誘導体とは、タンパク質機能を実質的に失うことなく選択されたタンパク質を固定化するためのアンカー機能を保持する、誘導体を意味する。本明細書においてリガンドとは、受容体の1以上の特異的部位に結合する分子又は分子群を意味する。概説本発明は、アルカリ抵抗性を有する数種の免疫グロブリンIgリガンドタンパク質に関する。本発明は、その一実施形態において、野生型又は親Ig結合タンパク質の少なくとも1個のアスパラギンAsn残基が、ヒスチジンHis残基、セリンSer残基、アスパラギン酸Asp残基又はスレオニンThr残基に置換された、免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体に関する。図3Bに示すように、該少なくとも1個の置換は、変異体Ig結合タンパク質のアルカリ性溶液中における安定性を、野生型Ig結合比べて向上させることができる。本発明はまた、新規アミノ酸配列及び新規Ig結合タンパク質に関する。本発明の一実施形態において、該新規Ig結合タンパク質は、配列番号2~11及び配列番号14から選択することができる。本発明のIgリガンドタンパク質は、Fcフラグメント結合タンパク質であり得、IgG、IgA及び/又はIgM、好ましくはIgGの選択的結合に用いることができる。Ig結合タンパク質変異体本発明は、その一実施形態において、免疫グロブリンIg結合タンパク質の変異体に関する。該変異体は、少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されたIg結合タンパク質を含むことができる。少なくとも1個の置換は、変異体Ig結合タンパク質に、野生型Ig結合と比較した場合に、アルカリ性溶液において向上した安定性を付与することができる。本発明は、その一実施形態において、プロテインAと比べてアルカリ性溶液における安定性が向上しているIg結合タンパク質に関する。本発明のIg結合タンパク質は、プロテインAのZドメイン又はBドメインの少なくとも1個のAsn残基がHis、Ser、Asp又はThr残基に置換されたプロテインAを含むことができる。一実施形態において、本発明のIg結合タンパク質は、プロテインAのZドメイン配列番号1又はBドメインにおけるAsn3即ち、3位アスパラギン、Asn6及びAsn23における変異等、単一、二重又は三重置換を有するプロテインAを含むことができる。単一置換は、Asn3His即ち、3位におけるアスパラギンがヒスチジンに置換又は変異、Asn3Ser、Asn6Asp、Asn23His又はAsn23Serから選択することができ、二重置換は、Asn3His/Asn23Ser又はAsn3His/Asn23Thrから選択することができ、三重変異は、Asn3His/Asn6Asp/Asn23Serであり得る。一実施形態において、本発明のIg結合タンパク質を、組換え手段によりN又はC末端伸長のいずれかとしてスペーサー又はリンカー配列を含むよう改変して、これにより、固体支持体への固定化が改善され得る融合タンパク質-リンカー産物を作製することができる。この点に関し、リンカー又はスペーサーを十分に確立された方法により化学的に合成し、選択されたIg結合タンパク質と共有結合させ得ることは、当業者には理解されよう。また、リンカー及び本発明のIgリガンドを含む融合産物を、組換え技術を用いて作製することもできる。この点に関し、リンカーは一般に、Igリガンドの機能を実質的に保持できるようにIgリガンドの末端と結合又は融合し得る。従って、タンパク質の種類に応じて、リンカーはIgリガンドのN末端に結合していても、C末端に結合していてもよい。ある場合、リンカーは両末端に結合していてもよく、又は末端残基以外のアミノ酸残基に付加的に結合していてもよい。また他の例において、リンカーは、化学的若しくは組換え手段により又は酵素の使用により、Ig結合タンパク質のカップリング前に固体支持体と結合されていてもよい。リンカーは、本発明のIg結合タンパク質を、Ig結合タンパク質の機能をその固定化状態において実質的に保持しつつ、即ち、免疫グロブリン結合の少なくとも約50を保持しつつ、固体支持体に適切に固定化することができる。米国特許出願公開第2007/0055013号は、本発明のIgリガンドと融合することのできるリンカーの一例を提供している。更に本発明は、本発明のIg結合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、又はリンカーと融合した該Ig結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを包含することが意図されている。当業者に理解されるように、本発明のIg結合タンパク質は、ラベルにより標識することによりIg分離アッセイにおけるIg結合タンパク質の検出を容易にすることができる。このようなラベルとしては、限定ではないが、放射性標識及び蛍光標識を挙げることができる。本発明のIg結合タンパク質は、例えば、ウシ血清アルブミンBSA又はキーホールリンペットヘモシアニンへのカップリング等の形式で、担体を備えることができる。固体支持体本発明は、その一実施形態において、アフィニティー分離のためのマトリクスに関する。該マトリクスは、固体支持体とカップリングした、本発明のIg結合タンパク質のいずれかから作製することが可能なIgリガンドを含むことができる。図2に示すように、本発明の実施形態に係るマトリクスは、親分子をIgリガンドとして構成されたマトリクス図2におけるZと比較して、断続的アルカリクリーニングを行った2回以上の分離プロセスにおいて結合能の増加を示す。予期せぬことに本発明者らは、アスパラギン残基のアスパラギン酸Dへの突然変異が、Igリガンドに改善された結合能を付与することを見出した。本発明のIgリガンドタンパク質は、好ましくは、Fcフラグメント結合タンパク質であり得、IgG、IgA及び/又はIgM、好ましくはIgGの選択的結合に用いることができる。リガンドタンパク質がアンカーペプチドと結合又は融合すると、融合産物は固体支持体に共有結合的又は非共有結合的にカップリングすることができる。適切な固体支持体として、エポキシベースの支持体例えば、ビーズ又は樹脂、エポキシ基の表面化学性質を有する固体支持体、或いはタンパク質がアンカー配列を介してカップリングできるよう表面が官能化された材料が挙げられる。固体支持体の材料の例としては、親水性表面を有するポリマー、例えば、ヒドロキシル基-OH、カルボキシル基-COOH、アミノカルボニル基-CONH2、N置換型可、アミノ基-NH2、置換型可、オリゴ又はポリエチレンオキシ基を外表面、更には存在するならば内表面にも有するポリマーをベースとするものである。一実施形態において、該ポリマーは合成ポリマー例えば、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド又はスチレン-ジビニルベンゼンコポリマーである。このような合成ポリマーは、公知の方法により容易に製造することができる例えば、J.MATER.CHEM1991,13,371~374参照。或いは、TOYOPEARL東ソー社製等、市販品を用いることもできる。他の一実施形態において、該ポリマーは多糖類例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン又はアガロースである。このような多糖類は、公知の方法により容易に作製することができる例えば、日本特許第4081143号明細書参照。また、セファロースGEヘルスケアバイオサイエンス社製等、市販品を用いることもできる。更に他の一実施形態においては、無機支持体例えば、シリカ又は酸化ジルコニウムを用いることができる。本発明のIgリガンドタンパク質又は融合産物を固体支持体に固定化するために、固体支持体を水溶液中で処理することができる。該水溶液としては、結合バッファー、例えば、0.1Mリン酸ナトリウム/0.5MNa2SO4pHは例えば約6.5~7.2の範囲、好ましくは6.8を挙げることができる。ここで適切に使用される塩としては、固体支持体及び融合産物に適合性があり、固定化されたタンパク質の使用目的に対して無毒性であり、使用に適切な塩が挙げられる。固体支持体は、例えば、ほぼ室温で、固定化が行われるのに十分な時間、Igリガンドペプチドと混合することができる。固体支持体は、粒子状であり得る。この粒子は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。粒子状の固体支持体は充填ベッドとしても、懸濁形態でも用いることができる。懸濁形態は、粒子が自由に移動できる膨張ベッド又は純粋サスペンジョンpuresuspensionとすることができる。充填ベッド又は膨張ベッドを用いる場合、公知のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる分離プロセスを用いることができる。純粋サスペンジョンを用いる場合には、バッチ法が用いられる。本実施形態に係る粒子状の固体支持体の粒子径体積平均粒子径は、好ましくは約20~約200μm、より好ましくは約30~約100μmである。固体支持体が約20μm未満の粒子径を有する場合、この支持体が充填されたカラムの圧力が、高流速では使用できないレベルまで増加し得る。固体支持体が約200μmを超える粒子径を有する場合、結合能が悪化し得る。本明細書において粒子径とは、レーザー回折/散乱粒子径分布分析計を用いて決定された体積平均粒子径を意味する。本実施形態に係る固体支持体は、好ましくは多孔性で、比表面積が好ましくは約50超~約1000m2/g、より好ましくは約80~約400m2/gとすることができる。アフィニティークロマトグラフィー充填材料が約50m2/g未満の比表面積を有する場合、結合能は悪化し得る。アフィニティークロマトグラフィー充填材料が約1000m2/g超の比表面積を有する場合、充填材料はカラム圧力が増加し強度が減少するため高流速で破壊され得る。本明細書において比表面積とは、水銀ポロシメーターを用いて粒子の乾燥重量で決定された孔孔径:約10~約5000nmの表面積の値を意味する。本実施形態に係る固体支持体は、体積平均孔径約50~約400nm、より好ましくは約100~約300nmを有することができる。アフィニティー用固体支持体が約50nm未満の体積平均孔径を有する場合、結合能は高流速において非常に悪化し得る。アフィニティークロマトグラフィー充填材料が約400nmを超える体積平均孔径を有する場合、流速に関係なく結合能は悪化し得る。本明細書において体積平均孔径とは、水銀ポロシメーターを用いて決定された孔孔径:10~5000nmの体積平均孔径を意味する。本実施形態に係る固体支持体として用いられる多孔性粒子の具体例としては、20~50wtの架橋性ビニルモノマーと、3~80wtのエポキシ基含有ビニルモノマーと、20~80wtのジオール基含有ビニルモノマーのコポリマーを含有し、粒子径20~80μm、比表面積50~150m2/g、及び体積平均孔径100~400nmを有する多孔性有機ポリマー粒子が挙げられる。更にまた他の一実施形態において、固体支持体は、面、モノリス、チップ、キャピラリー又はフィルター等の他の形態とすることができる。本発明のIg結合タンパク質は、例えば、リガンドに存在するアミノ及び/又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技法により支持体に結合させることができる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、CNBr、N-ヒドロキシコハク酸イミドNHS等は、よく知られたカップリング試薬である。支持体とリガンドとの間にスペーサー又はリンカーとして知られる分子を導入することができ、この操作は、Ig結合タンパク質の利用能を改善し、支持体へのIg結合タンパク質の化学的カップリングを容易にする。また、Ig結合タンパク質は、物理吸着又は生物学的特異的吸着等、非共有結合により支持体に結合させることができる。一実施形態において、本発明のIgリガンドは、イミノ-NH-結合により支持体にカップリングさせることができる。このようなカップリングを行うための方法は、当該分野においてよく知られており、当該分野の通常の知識を有する者であれば、標準的技法及び機器を用いて容易に行うことができる。有利な一実施形態において、その後のカップリングを考慮して、リガンドに先ず1又は複数個の末端リジン残基を付加することができる。当該分野の通常の知識を有する者であれば、適切な精製工程を容易に行うこともできる。上述のように、本リガンドの免疫グロブリンに対する親和性即ち、結合特性、言い換えればマトリクスの能力は、本質的にはアルカリ剤処理によって継時的に変化することはない即ち、アルカリ抵抗性を有する。従来、装荷された状態でのアフィニティー分離マトリクスのクリーニングに用いるアルカリ剤はNaOHであり得、その濃度は最大約0.8M例えば約0.5Mであり得る。使用方法本発明は、その一実施形態において、組成物からIgG、IgA及び/又はIgM等の免疫グロブリンIg、又はFc融合タンパク質を分離する方法に関する。該組成物は、Ig、及びIgが分離されるべき少なくとも1種の他の物質から構成され得る。本方法は、固体支持体とカップリングした本発明の実施形態に係る変異体又は変異体Ig結合タンパク質、本発明に係るマルチマー又はマトリクスを含む、アフィニティー分離のためのマトリクスと、該組成物とを接触させることにより、該組成物における該少なくとも1種の他の物質から該Igを分離する工程を含むことができる。本方法は更に、溶出剤をマトリクスに添加することにより、固体支持体からIgを溶出させる工程を含むことができる。本方法は、固定化されたタンパク質と結合するリガンド、例えば、IgG、IgG1、IgG2、IgM、IgA及びIgE等の免疫グロブリンの単離における有用性を有するアフィニティーカラムの調製に用いるための、タンパク質、特に免疫グロブリン結合タンパク質の信頼性の高い固定化を提供する。以下、本発明を具体的な実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるとは解釈されない。実施例1Zドメイン部位特異的突然変異、及びアルカリ抵抗性の評価黄色ブドウ球菌StaphylococcusaureusのプロテインAのBドメインの変異体であるZドメイン配列番号1を鋳型として用いて、Quickchangeストラタジーン社により突然変異を誘発させ、1、2又は3個のアミノ酸残基の部位特異的突然変異を含む変異体を作製した。ニッケルアフィニティーカラムキアゲン社におけるタンパク質精製を容易にするため、His6タグを備えるpETM11発現ベクターに、Zドメイン変異体をクローニングした。GEヘルスケア社製エポキシ活性化樹脂、又は5多孔性ビーズの合成セクションに示す独自開発したエポキシ樹脂に、精製Zドメイン変異体を固定化した。後述のように、各Zドメイン変異体のIgG結合能及びアルカリ抵抗性能力を評価した。Zドメイン変異体のアルカリ抵抗性を評価するため、大腸菌で各変異体タンパク質を発現させ、ニッケルアフィニティーカラム、続いてFPLCにより精製した。精製タンパク質FPLCに基づく純度>90をエポキシ樹脂に固定化し、アフィニティーカラムを作製した。Z変異体アフィニティーカラムを0.5NaOH中で、異なる時間インキュベートした。アルカリ溶液における27時間のインキュベーション後、カラムをPBSで十分に洗浄し、pHを中性に戻した。続いて、ヒトポリクローナルIgGをカラムにロードした。PBSで3回洗浄した後、結合しているIgGをカラムからpH3.2溶出バッファー中に溶出した。溶出したIgG試料の280nmでのUV吸光度を測定して、カラムのIgG結合能を定量化した。IgG結合能は、アルカリ処理前及びアルカリ処理中の様々な時点で測定した。本発明において作製されたZドメイン変異体を図1に示し、評価結果を表1及び図2に示す。個々の、又は様々に組み合わせた1以上のAsnのHis、Ser及びAspへの変異は、親Zドメインよりも優れたアルカリ抵抗性を示す単一、二重又は三重部位Zドメイン突然変異体のパネルの作製を可能にした表1及び図2。実施例2Zドメイン及び三重変異体N3H/N6D/N23Sの4タンデムコピー又は4HDSの発現ベクターの構築クローニング手順のフローチャートを図4に示す。野生型Zドメイン図4aNcoI-EcoRIによりpETM11にライゲーションされているを構成ブロックとして用いて、4HDSZドメイン及び三重変異体N3H/N6D/N23Sの4タンデムコピー構築物を作製した。QuickchangePCRプロトコールストラタジーン社を用いてN3H/N6D/N23S変異をZドメインに連続的に導入し、単一コピーのHDS配列番号8を作製した図4b。変異の存在は、DNA配列決定により検証した。次に、隣接制限酵素部位としてEcoRI及びSacIを用いた第二のHDSドメインの挿入により、終止のための終止コドンを有する2×HDSドメインを作製した図4c。2コピーのEcoRI-EcoRIHDSドメインの挿入により、4×HDSドメイン配列番号10構築物を作製した。QuickchangePCRを用いて構築物のN末端におけるNcoI部位を除去してリンカー配列ATKASK、配列番号15を挿入し、最終的な4×HDSプラスミドを作製した図4d。次に、この4×HDS配列をNdeI-XhoI制限酵素を用いてpET24aベクターノバジェンにサブクローニングした。代替的な制限酵素部位を用いて一部のドメインが挿入された以外は同様の方法で、Zドメインの4タンデム反復、X03を構築した図4e。4×HDSコンストラクトの最終タンパク質産物の配列を下に記す。4HDSのアミノ酸配列変異した残基は二重下線で特定;クローニング由来のドメイン間残基は下線で特定;N末端伸長は太字下線で特定、配列番号9。実施例1及び2の方法及び材料1プロテインA発現ベクターの構築pETM11ベクターヨーロピアンモレキュラーバイオロジーラボラトリー又はpET24aベクターノバジェンのいずれかにおいて全構築物を発現させた。プロテインA遺伝子を含有するTAP-TagプラスミドEMBLを鋳型として用いたPCR法により、オリジナルのプロテインA遺伝子を増幅した。PCRによる部位特異的突然変異誘発PCRassistedsitedirectedmutagenesisによりZドメインを作製した後述を参照。フージョンPhusionポリメラーゼ0.5ユニット、ニューイングランドバイオラボ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチによりプロテインA遺伝子を増幅した。PCR条件を次に記す:94°C1分間、25サイクルの94°C30秒間、55°C30秒間及び72°C2.5分間、続いて、最後の伸長ステップ、72°C10分間。T4DNAリガーゼ0.5ユニット、インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッドを用いて室温で16時間ライゲーション反応を行った。次に、これらの反応産物を大腸菌DH5αF-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGlacZΔM15hsdR17λ-の形質転換に用いて、次に、細胞をSOB培地組成:1L当たり20gトリプトン、5g酵母エキス、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4と混合した。形質転換後、次に、LB培地組成:1L当たり10gトリプトン、5g酵母エキス、10g塩化ナトリウム、1.2寒天及び30μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天培地のプレート上に細胞を蒔き、37°Cで一晩培養した。1個のコロニーを2mLのLB培地に置き、37°C一晩でインキュベートすることによりコロニーPCRを行って、インサートの存在を確認した。翌日、鋳型として3μLの培養物、センスプライマーとしてT7プロモーター5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’配列番号16及びアンチセンスプライマーとしてT7ターミネーター5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’配列番号17を用いてPCRを行った。PCR条件は、Taqポリメラーゼ0.375ユニット、ファーメンタス、カナダ、オンタリオ州バーリントンを用いた以外は上述と同一であった。次に、DNAミニプレップキットGEヘルスケア、カナダ、ケベック州ベデュルフBaiedUrfeを用いて、所望のインサートを含有するDNAを精製した。プラスミドDNA増幅及び配列決定のため、大腸菌DH5αにおいてDNAクローニングを行った。組換えタンパク質の発現のために大腸菌BL21DE3インビトロジェンを用いた。LB培地において37°Cにて200rpmで振盪しつつ、大腸菌を通常の方法で増殖させた。アンピシリン又はカナマイシン100μg/mLを適宜培地に組み入れた。2組換えタンパク質発現及び精製BL21DE3pLysSコンピテント細胞は、T7プロモーターの制御下にありリボソーム結合部位を有する任意の遺伝子からの、高効率のタンパク質発現を可能にする。BL21DE3pLysSは、lacUV5プロモーターの制御下においてT7RNAポリメラーゼをコードするT7バクテリオファージ遺伝子Iを含有するλ-DE3に対し溶原性である。BL21DE3pLysSは、T7リゾチームをコードする遺伝子を保有するプラスミド、pLysSも含有する。T7リゾチームは、T7プロモーターの制御下における標的遺伝子のバックグラウンド発現レベルを低下させるが、IPTGによる誘導後に達成される発現のレベルに干渉しない。標的DNAプラスミドを用いて、BL21コンピテント細胞をトランスフェクトした。約0.5gのDNAを含有する0.5μLのプラスミドDNAをトランスフェクションに用いた。BL21コンピテント細胞は-80°Cで保存した。BL21細胞のアリコート20μLを解凍し、氷上に置いた。0.5μLのプラスミドDNAをコンピテント細胞と混合し、氷上に60分間置いた。氷上におけるインキュベーション後に、このプラスミドDNAを含有する細胞に、45°C水浴において45秒間熱ショックを与え、直ちに更に2分間氷上に置いた。次に、細菌細胞に30μLのLB培地を添加し、37°Cで1時間振盪した。続いて、カナマイシン終濃度:100μg/mLを含有する寒天/LBプレート上にこの細胞を蒔いた。このプレートを37°Cで一晩インキュベートした。組換えプロテインAドメインの発現のため、大腸菌BL21にDNAプラスミドを形質転換した。一晩培養した培養物を新鮮な培地に接種し、OD600600nmにおける光学密度が約0.5となるまで増殖させた。イソプロピルベータ-D-1-チオガラクトピラノシドIPTGを1mMの濃度となるよう添加し、更に15時間18°Cで培養物を増殖させた。ソルヴァールGS-3ローターによる7,000rpm、10分間の遠心分離により細胞を収集した。プロテアーゼ阻害剤ロシュアプライドサイエンス、リゾチーム200μg/mL及びDNaseI3μg/mLを含有するリン酸緩衝食塩水PBSにペレットを再懸濁した。凍結/融解サイクルの反復により細胞を溶解した。細胞デブリを遠心分離により除去した。pETM11ベクターにおいて発現した組換えタンパク質は、アミノ末端Hisタグを含有した。Hisタグ融合タンパク質はNi-NTAカラムキアゲンを用いて精製し、PBSに対して透析した。pET24aベクターにおいて発現した組換えタンパク質は、Hisタグを含有していない。発現した融合タンパク質を、ヒトIgGアフィニティーカラムを用いて精製した。3PCRによる部位特異的突然変異誘発PCRに基づく部位特異的な突然変異誘発方法を用いてZ又はBドメインに変異を導入した。即ち、所望の変異を保有する重複するオリゴヌクレオチドを適切な隣接プライマーと組み合わせ、2個の重複する変異体産物を得た。変異したドメインを適切な発現ベクターに方向性を考慮してサブクローニングした。全ての変異はDNA配列決定により確認した。4ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-PAGEによるタンパク質解析ポリアクリルアミドゲルにおいてドデシル硫酸ナトリウムSDS存在下で電気泳動を行った。試料10μLを10μLのサンプルバッファー62.5mMTris-HCl、pH6.8、2SDS、5メルカプトエタノール、10グリセロール及び0.0025ブロモフェノールブルーbrophenolblueと混合し、90°Cで2分間加熱し、冷却し、ゲルにロードした。バイオラッドから購入された装置にて75mAにて電気泳動を行った。5:5:1メタノール/水/酢酸acidicacidに溶解した0.5mg/mLクーマシーブルー溶液中でゲルを染色し、電子レンジ内で加熱した水中で脱染した。5多孔性ビーズの合成8.2gのメタクリル酸グリシジル三菱レイヨン社製、65.9gのトリメタクリル酸トリメチロールプロパンサルトマー社製及び90.6gのモノメタクリル酸グリセロールNOF社製を245.8gの2-オクタノン東洋合成社製及び62gのアセトフェノン和光純薬社製に溶解し、2gの2,2’-アゾイソブチロニトリル和光純薬社製を溶液に添加して、有機モノマー溶液を調製した。8.5gのポリビニルアルコールPVA-217、クラレ社製、0.43gのドデシル硫酸ナトリウムEmal10G、花王社製及び21.3gの硫酸ナトリウム和光純薬社製を、4240gの蒸留水に添加した。混合物を一晩撹拌して、水溶液を調製した。得られた水溶液をセパラブルフラスコ7Lに入れた。セパラブルフラスコは、温度計、撹拌翼及び冷却管を備えており、これを温水浴に置いた。窒素雰囲気下600rpmで水溶液を撹拌した。水溶液の温度が85°Cに達したら、滴下漏斗を用いて有機モノマー溶液を水溶液に添加した。混合物を5時間撹拌した。反応溶液を冷却した後、反応溶液をポリプロピレン瓶5Lに移した。反応溶液を、ビーズが浮遊するまで静置した。次に、瓶底から不要な水を吸引した。続いて反応溶液にアセトンを添加し、ビーズを沈殿させた。反応溶液を3分間静置させた後、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を2回反復した後、水を添加して、ビーズを沈殿させた。混合物を3分間静置した後、混合物をデカンテーションに付した。ビーズ分散液の分散媒をアセトンに交換した後、混合物を一晩風乾した。次に、真空乾燥機を用いて混合物を乾燥して、90gの多孔性ビーズ以下、PBと称するを得た。PBの平均粒子径は43μmであり、PBの比表面積は83m2/gであった。6Hisタグを有する4HDS4HDSの調製プロテインAドメインZのHDS変異体の4コピーを、マルチクローニング部位の前にヒスチジンタグをコードする改変型pETM-11ベクターにクローニングする。大腸菌において発現すると、このpETM-4HDSコンストラクトは、配列番号10に示す配列を有するタンパク質を産生する。4HDSと呼ばれるこのタンパク質は、N末端His7タグ、Tev切断配列ENLYFQG配列番号18及びATKASK配列番号15リンカーアンカーを特色とする。2個のドメイン間残基、EF緑色は、クローニングに用いたEcoRI制限酵素部位に由来する図4。7Hisタグを有さない4HDS4HDS-の調製上述のように、4HDSタンパク質はN末端にTev切断部位を含有する。TEVプロテアーゼは、タバコエッチウイルスTEVにおいて発見された高度に部位特異的なシステインプロテアーゼである。この酵素の最適な認識配列は、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser又はENLYFQG/S配列番号19であり、切断は、GlnとGly/Ser残基との間で行われる。本発明者らは、TEV酵素MoBiTechを用いて、標準的な消化及び精製プロトコールに従って4HDSタンパク質を消化し、Hisタグ配列を除去した。Tev切断により、4HDS-と呼ばれるタンパク質を産生した。4HDS-のアミノ酸配列を配列番号11に示す。8Hisタグを有するX03X03の調製4HDSのクローニングに関して記載されている手順と同じ手順を用いて、ヒスチジンhistineタグ及びTev切断部位が先行するZドメインの4タンデム反復を含有するX03を調製することができる。X03DNAは、ヒスチジンタグとTev切断配列との間にHis6タグ及び10個の追加的な残基PMSDYDIPTT配列番号20を含有する親pETM-11ベクターにサブクローニングする。特異的なアンカー又はリンカー配列は、この構築物に導入されていない。X03のアミノ酸配列を配列番号12に示す。9Hisタグを有さないX03X03-の調製本発明者らは、TEV酵素MoBiTechを用いて、標準的な消化及び精製プロトコールに従ってX03タンパク質を消化し、Hisタグ配列を除去した。得られたタンパク質をX03-と呼ぶ。X03-のアミノ酸配列を配列番号13に示す。10ビーズへの4HDS-の固定化100mLの0.1Mリン酸バッファーpH:6.8中に11mLのPB及び200mgの4HDS-が分散している混合物を調製した。21gの硫酸ナトリウムを添加した後、混合物を25°Cで24時間振盪して、4HDS-をPBに固定化した。得られたビーズを濾過し、100mLの5Mチオグリセロールと混合し、30°Cで4時間反応させて、残存するエポキシ基をブロッキングした。ビーズをPBS/0.05Tween20で洗浄し、PBSで洗浄して、11mLの4HDS-固定化多孔性ビーズ4HDS--PBを得た。11ビーズへのX03-の固定化4HDS-の代わりにX03-を用いる以外は上述の固定化実施例と同じ方法により、X03-固定化ビーズX03--PBを得た。12動的結合能DBCの測定AKTAprimeplusGEヘルスケアクロマトグラフィーシステムによりDBC測定を行った。カラム内径:0.5cmに、それぞれHDS--PB、X03--PB又はMabSelectSuReGEヘルスケアをベッド高20cmまで充填した。20mMリン酸バッファーpH:7.4を用いて各カラムを平衡化した後、ヒトポリクローナルIgG5mg/mLを含有する20mMリン酸バッファーpH:7.4を、各カラムに300cm/時間の線形流速でポンプ注入した。DBCを10ブレークスルーで計算した。4HDS--PB、X03--PB及びMabselectSuReのアルカリ処理を行わない初期のDBCは、それぞれ46mg/mL、45mg/mL及び42mg/mLであった。13アルカリ抵抗性の測定測定実施例1において用いた各カラムを、AKTAprimeplus機器に設置し、40mLの0.5N水酸化ナトリウムを各カラム内に流した。各カラムを装置から取り出し、密封し、室温で所定の時間静置し0.5NNaOH浸漬実験、次に、20mMリン酸バッファーpH:7.4で洗浄した。上述の動的結合測定と同じ方法で0.5N水酸化ナトリウム浸漬後のDBCを測定した。0.5N水酸化ナトリウム処理時間に対するDBC保持率を図3に示す。図3に示すように、アフィニティーマトリクス4HDS--PBは、X03--PBよりも、さらに最もよく知られた市販のアルカリ抵抗性プロテインAアフィニティーマトリクスであるMabSelectSuReよりも、アルカリ処理後のDBC保持率において顕著に改善した性能を有する。"