"顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを有効成分として含有する、骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤。骨格筋の変性を伴う疾患が筋ジストロフィーである、請求項1に記載の治療剤。骨格筋の変性を伴う疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項2に記載の治療剤本発明は、G-CSFを含有する骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤、特に筋ジストロフィー治療剤を提供することを目的とする。特に、G-CSFが損傷した筋肉に及ぼす効果、メカニズムを解明し、さらにG-CSFを筋ジストロフィー治療剤として用いるにあたっての適切な投与方法、回数、投与量を求めて実用に供しうる筋ジストロフィー治療剤を提供することを目的とする。本発明者らは、G-CSFが、変性した筋肉に及ぼす効果とメカニズムについて検討した。その結果、DMDモデルマウスの一種であるmdxマウスでは、生後3-5週齢で筋肉に変性が生じること、この時期に再生筋において特異的にG-CSF受容体G-CSFRが発現すること、G-CSFを投与すると有意に筋の再生が観察されたことなどを見いだした。更に、ヒトのDMDと似た重篤な症状を示すDMDモデルマウスであるmdx/utrn-/-マウスにおいて、G-CSFを投与することにより、有意な筋の再生が観察されたのみならず、200日に亘る長期間の致死回避が観察された。本発明はこの知見に基づき完成したものである。すなわち、本発明は以下のものを提供する。顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを有効成分として含有する、骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤。骨格筋の変性を伴う疾患が筋ジストロフィーである、[1]に記載の治療剤。骨格筋の変性を伴う疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、[2]に記載の治療剤本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、特に筋ジストロフィーの治療薬として有効であり、筋ジストロフィーにおける筋線維の崩壊に対して抑制的に働くことが明らかになった。これまで積極的な治療剤のなかった難病の筋ジストロフィーの治療に用いることが期待できる。骨格筋は、細長い筋線維とその細胞間を埋めて束ねる結合組織からなる。筋線維はそれぞれが1個の細胞で、筋細胞と呼ばれる。筋細胞は多くの核をもっている多核細胞である。筋線維の集まりが筋束を構成し、筋束の集まりが骨格筋を構成する。本発明において、骨格筋の変性を伴う疾患の治療とは、筋肉の変性を抑制し、再生を促進すること、筋力低下の進行を抑制すること、筋線維の崩壊を抑制すること、再生筋線維の割合を増加すること、筋肉を増大させること、筋肉の運動能力を高めることのいずれかを意味する。骨格筋の変性を伴う疾患は特に限定されないが、典型的には筋ジストロフィーであり、筋ジストロフィーには、デュシェンヌDuchenne型、ベッカーBecker型、肢帯型、先天性、遠位型、顔面肩甲上腕型、筋緊張性が含まれる。本願発明の治療剤は特にデュシェンヌDuchenne型筋ジストロフィーDMDに有用である。本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、顆粒球コロニー刺激因子G-CSFを有効成分とする。本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤の有効成分であるG-CSFは、どのようなG-CSFでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたG-CSFであり、より具体的には、哺乳動物G-CSF、特にヒトG-CSFと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。G-CSFの由来は特に限定されず、天然由来のG-CSF、遺伝子組換え法により得られたG-CSFなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたG-CSFである。遺伝子組換え法により得られるG-CSFには、天然由来のG-CSFとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の1または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のG-CSFと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法Gotoh,T.etal.1995Gene152,271-275;Zoller,M.J.andSmith,M.1983MethodsEnzymol.100,468-500;Kramer,W.etal.1984NucleicAcidsRes.12,9441-9456;Kramer,W.andFritz,H.J.1987MethodsEnzymol.154,350-367;Kunkel,T.A.1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492;Kunkel1988MethodsEnzymol.85,2763-2766などを用いて、G-CSFのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、G-CSFと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸A、I、L、M、F、P、W、Y、V、親水性アミノ酸R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T、脂肪族側鎖を有するアミノ酸G、A、V、L、I、P、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸S、T、Y、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸C、M、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸D、N、E、Q、塩基含有側鎖を有するアミノ離R、K、H、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸H、F、Y、Wを挙げることができる括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す。あるアミノ酸配列に対する1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られているMark,D.F.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA198481,5662-5666;Zoller,M.J.Smith,M.NucleicAcidsResearch198210,6487-6500;Wang,A.etal.,Science224,1431-1433;Dalbadie-McFarland,G.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA198279,6409-6413。又、G-CSFと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、G-CSFをコードするDNAと他のタンパク質をコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のG-CSFとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。又、化学修飾したG-CSFを用いることも可能である。化学修飾したG-CSFの例としては、例えば、糖鎖の構造変換付加欠失操作を行ったG-CSFや、ポリエチレングリコールビタミンB12等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたG-CSFなどを挙げることができる。本発明で用いるG-CSFは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトG-CSF産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したG-CSF、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞、C127細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、BHK細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したG-CSFなどを用いることができる。本発明において用いられるG-CSFは、遺伝子工学的手法により製造されたG-CSFが好ましく、哺乳動物細胞特にCHO細胞を用いて製造されたG-CSFが好ましい例えば、特公平1-44200号公報、特公平2-5395号公報、特開昭62-129298号公報、特開昭62-132899号公報、特開昭62-236488号公報、特開昭64-85098号公報。本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤には、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート80、ポリソルベート20,ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート80、ポリソルベート20,ニコチン酸アミド、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。安定化剤としては、デキストラン40、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。等張化剤としては例えば、D-マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイドプロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル;グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル;デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル;ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル;ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル;ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル;ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル;ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル;ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油ポリオキシエチレン水素ヒマシ油等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油;ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体;ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体;ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のHLB6~18を有するもの;陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数10~18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩;ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が2~4でアルキル基の炭素原子数が10~18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩;ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が8~18のアルキルスルホコハク酸エステル塩;天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質;スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質;炭素原子数12~18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の1種または2種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート20,40,60又は80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート20及び80が特に好ましい。また、ポロキサマープルロニックF-68登録商標などに代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。含硫還元剤としては例えば、N-アセチルシステイン、N-アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数1~7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α-トコフェロール、酢酸トコフェロール、L-アスコルビン酸及びその塩、L-アスコルビン酸パルミテート、L-アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムEDTA、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩;クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。本発明の治療剤は、局所投与用注射剤皮下、皮内、筋肉内などに適した剤形として投与することが可能である。局所投与が筋肉内投与であることが特に好ましい。注射剤とする場合には、上記の成分をリン酸緩衝液好ましくはリン酸一水素ナトリウム-リン酸二水素ナトリウム系及び/又はクエン酸緩衝液好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液及び/又は酢酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製する。緩衝液の濃度は一般には1~500mMであり、好ましくは5~100mMであり、さらに好ましくは10~20mMである。また、注射剤は溶液製剤であっても凍結乾燥製剤であってもよい。本発明のG-CSFを有効成分とする骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤の投与量、投与時期、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して当業者が適宜決定することができる。また、本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、ヒトに投与する場合、本発明の筋変性抑制効果を得るには、一回の投与で0.1~500μg/kg/day投与することが好ましく、1~50μg/kg/day投与することがより好ましい。しかし、本発明はヒトG-CSFの用量によって限定されるものではない。また、本発明の骨格筋の変性を伴う疾患の治療剤は、他の薬剤と併用してもよい。以下の実施例に示すように、まず、G-CSFがジストロフィン変異を持つDMDモデルマウスでの筋再生と機能回復に明らかに有効であることが示された。また、ジストロフィン変異に加えてG-CSFRがハプロ不全片方の遺伝子の発現異常のマウスの場合には早死傾向があり、これは、G-CSFRのリガンドであるG-CSFがDMDの進行の抑制に極めて重要である、ということを示している。さらに、ジストロフィン/ウトロフィンのダブルノックアウトマウスは、ヒトのDMDと似た重篤な症状を示すもう一つのDMDモデルマウスであって、早死に至るが、G-CSF投与は当該マウスの筋再生、機能回復、生存を劇的に改善した。これらの結果は、DMDモデルマウスにおいて、G-CSFが骨格筋再生と生存に重要な役割を果たしていることを強く示唆すると共に、将来の臨床での使用に道を拓くものである。これまで筋ジストロフィーには有効な治療手段が存在しなかったが、本願発明は筋ジストロフィーの治療剤として産業上の利用性が期待できる。本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。実施例で用いた実験方法は以下の通りである。動物mdxC57/B6マウスおよびウトロフィンヘテロ接合utrophin/-マウスは、武田伸一博士国立精神神経センターから恵与された。csf3r-/-マウスは、DanielC.Link博士WashingtonUniversitySchoolofMedicine,St.Louisから恵与されたRichards,M.K.,Liu,F.,Iwasaki,H.,Akashi,K.Link,D.C.Pivotalroleofgranulocytecolony-stimulatingfactorinthedevelopmentofprogenitorsinthecommonmyeloidpathway.Blood102,3562-3568,doi:10.1182/blood-2003-02-05932003。全ての実験手法とプロトコルは慶応大学動物のケアと使用委員会で承認され、NIHの実験動物のケアと使用ガイドラインに従うものである。ジストロフィンとcsf3rの両方を欠失したノックアウトマウスは以下の交配プログラムで得た:雄csf3rノックアウトマウスを雌C57/B6mdxマウスジストロフィン欠失と交配して、csf3rについてのヘテロ接合体雌雄、およびmdx変異についてのヘテロ接合体雌またはmdx変異についてのヘミ接合体雄のいずれかである全てのF1世代を得、それらを交配した。ジストロフィンとウトロフィンの両方を欠失したノックアウトマウスは以下の交配プログラムで得た:雄ウトロフィンヘテロ接合マウスと雌C57/B6mdxマウスを交配して、ウトロフィンについてのヘテロ接合体雌雄、およびmdx変異についてのヘテロ接合体雌またはmdx変異についてのヘミ接合体雄のいずれかであるF1世代を得、それらを交配した。Deconinck,A.E.etal.Utrophin-Dystrophin-DeficientMiceasaModelforDuchenneMuscularDystrophy.Cell90,717-727,doi:Doi:10.1016/s0092-86740080532-21997遺伝子型GenotypingDNAは、Easy-DNATMKitインビトロジェン社を用いてマウス尾部から単離した。突然変異ジストロフィン対立遺伝子を決定するためのPCR分析には、マウスジストロフィンに相補的なフォワードプライマー5′CATAGTTATTAATGCATAGATATTCAG3′と、野生型対立遺伝子に相補的なリバーズプライマー5′GTCACTCAGATAGTTGAAGCCATTTAG3′またはマウス突然変異ジストロフィン対立遺伝子に相補的なリバーズプライマー5′GTCACTCAGATAGTTGAAGCCATTTAA3′を用いた。どちらのPCR反応も95°C、4分;次いで95°C、1分;55°C、1分;72°C、1分の条件で34サイクル、72°C10分の条件下で行った。各反応により275bpの産物が得られた。全てのPCR反応はGoTaqDNAポリメラーゼキットPromega,Madison,WI,USAを用いて行った。ウトロフィンノックアウト状態を決定するためのPCR分析には、マウスウトロフィンのエクソン7に相補的なフォワードプライマー5‘GTGAAGGATGTCATGAAAG3’と、イントロン7に相補的なリバースプロモーター5‘TGAAGTCCGAAAGAGATACC3’またはNeoノックアウトカセット内に位置するPGKプロモーターに相補的なリバースプロモーター5‘ACGAGACTAGTGAGACGTGC3’を用いた。PCR反応は94°C、30秒;57°C、30秒;72°C、25秒の条件で35サイクル行った。突然変異csf3r対立遺伝子を決定するためのPCR分析には、マウスcsf3rに相補的なフォワードプライマー5′AGTTCACCAGGCAGGTGAGT3′と、野生型対立遺伝子に相補的なリバーズプライマー5′GTAGGCCTAGTTCATACCTG3′またはマウス突然変異csf3r対立遺伝子に相補的なリバーズプライマー5′TCCAGACTGCCTTGGGAAAA3′を用いた。どちらのPCR反応も95°C、4分;次いで95°C、30秒;60°C、30秒;72°C、45秒の条件で30サイクル行った。各反応により275bpの産物が得られた。全てのPCR反応はTaqDNAポリメラーゼキットTaKaRa,Japanを用いて行った。G-CSF処理G-CSFノイトロジンTM,100μg;中外製薬を生理的食塩水1mlに希釈した。G-CSFは5μg/日の用量で3週齢雄マウスに27ゲージの注射針を使って2週間、腹腔内投与した。G-CSF処理マウス群およびコントロール群のマウスは5週齢で屠殺した。組織学的分析前脛骨TA筋の凍結切片10μmをHE染色した。HE染色は、再生筋肉の比率を測定するために切片上で実施した。前脛骨のラミニン-2α免疫蛍光染色切片7μmからFibercrossareaFSAをソフトウェアBZ-HIC:KEYENEで測定した。デジタルカメラBIOREVO:KEYENCEで各切片から20倍のデジタル写真を撮った.シグマ社から購入したエバンスブルーをリン酸緩衝生理食塩水PBS:0.15MNaCl,10mMリン酸緩衝液、pH7.0に溶解した。1エバンスブルー0.05mLを27ゲージの針を用いて出生後2日目に腹腔内投与した。3時間後にマウスを屠殺した。免疫蛍光全ての免疫蛍光は7μmの切片で行った。サンプルをTritonX-100と共に5分間室温でインキュベートし、次いで洗浄し、以下の一次抗体と共にインキュベートした:抗G-CSFR抗体サンタクルーズバイオテクノロジー社sc-9173、1:50希釈、抗ラミニン-2α抗体シグマ社L0663、1:1000希釈、抗ラミニン抗体L9393、1:1000希釈、シグマおよびRNMy2/9D2ab49457,1:30希釈、abcam。一晩インキュベートした後、結合した抗体を、Alexa488またはAlexa546モレキュラープローブ社、東京港区で標識した二次抗体で可視化した。4’,6-ジアミジン-2-フェニルインドール二塩酸塩DAPI;インビトロジェン社で核を染色した。筋力測定試験5週齢マウスから長指伸筋extensordigitorumlongus、EDL筋を単離、除去した。この筋肉をPSSバッファー95O2、5CO2を満たしたチャンバーに注意深くのせ、30°Cに維持した。筋肉の一つの腱をチャンバー内のスチールフックに固定し、他方をデュアルモードのサーボモータシステム電気刺激装置、日本光電のレバーアームに5-0手術用シルクで結びつけた。singletwitchおよびtetanicforceが最大を示す長さ最適長:Loまで筋肉を引っ張った。次に、バッファーを替えるための120秒の休みをおいて、対応するtetanicforceを150Hz、5秒で20分間測定した。全ての測定の前に筋肉は最適長Loに適応した。比較のために、全ての測定は、筋肉量を長さと哺乳類骨格筋密度1.056mg/mm3で割って算出した筋断面積CSA当たりで表した。SpecificforceN/cm2は筋密度を1.056mg/mm3と推定して算出した。運動耐久性試験マウスにトレッドミル運動負荷試験を受けさせた。マウスを1レーン電動トレッドミルMK-680S,ラットマウス用トレッドミル、Muromachiのベルトにのせた。試験は、5m/分で5分間勾配なしで行い、次に毎分1m/分でスピードを上げた。試験の終点は、マウスが電気刺激付与エリアに20秒以上とどまったときとした。全身プレシスモグラフ動物を自由に動けるチャンバにいれた。チャンバを超微差圧トランデューサValydineMP45,Valydine,NorthRidge,CAに連結した。動物が呼吸すると、圧力の変化を一回換気量TVを表すシグナルに変換し、これを増幅しBMA830;CWE,Ardmore,PA、記録紙レコーダDash10;Astro-Med,WestWarwick,RIに記録して、呼吸捕捉ソフトウェアを備えたコンピュータに蓄積して分析に用いた。酸素の消費と二酸化炭素の生成をBeckmanOM-14およびLB-2アナライザを用いて開路法で測定した。パラメータTVはリアルタイムで分析し、それぞれ連続の3時間にわたって、平均値を2分毎に5回計算した。体重で割ることによりTVを正規化した。統計的分析データはStatViewJ-4.5ソフトウェアを用いて分析した。値は平均±SDで表す。群間比較は一元配置分散分析によって行った。ScheffeのF検定を用いて有意水準を求めた。有意と認められる確率水準はP<0.05とした。実施例1:mdxマウスの再生筋細胞中におけるG-CSF受容体の発現mdxマウスの体サイズ、筋肉サイズ、体躯の外観はおおむね正常であった図1a。DMD患者では進行性の身体的機能障害を示し、20~30歳までに死に至ることが報告されているが、成熟mdxマウスでは、身体的機能障害はほとんど観察されず、正常な寿命をもつEvans,N.P.,Misyak,S.A.,Robertson,J.L.,Bassaganya-Riera,J.Grange,R.W.DysregulatedintracellularsignalingandinflammatorygeneexpressionduringinitialdiseaseonsetinDuchennemusculardystrophy.AmJPhysMedRehabil88,502-5222009。しかしながら、病理学的分析によると、mdxマウスでは3週齢と5週齢の間で筋の変性と再生が明らかに起きていた図1b。2週齢までは、変性と再生がほとんど起きていなかったが、3週齢では、かなりの変性筋肉と白血球の蓄積が観察された。5週齢では、種々の組成の小環状で比較的大きな再生筋細胞が見られた。8週齢で変性は落ち着いた。TAにおける全筋細胞数は2-4週齢で減少し、その後回復した図1c。一般に、健康な筋細胞は周辺に核をもち、中心に核のある筋細胞は再生しているあるいは再生された筋細胞である。mdxマウスで、中心に核のある筋細胞は4週齢後に観察され、12週齢まで増加した図1d。これらのデータは、まず筋線維が変性を起こし、次いで当該変性をほぼ補填するように再生されることを示している。mdxマウスの筋肉変性にG-CSFシグナル伝達が関与しているかどうかを調べるために、G-CSF受容体G-CSFRに対する免疫蛍光染色を行った。様々な成長段階でのTA前脛骨筋切片を観察すると、中心に核のある細胞再生筋に小さな環状にG-CSFRが高度に発現していることがわかった図1e。連続的免疫蛍光染色分析によると、G-CSFR発現細胞は3週齢から5週齢で最も多く出現し、これはmdxマウスの再生時期と一致する。これらの結果から、G-CSFがmdxマウスの筋肉再生に関与することが示唆された。実施例2:mdxマウスの骨格筋機能における、骨格筋再生によるG-CSFの及ぼす影響mdxマウスにおいてG-CSFR発現細胞は再生筋細胞中で3週齢から5週齢で最も多く出現することから、G-CSFを投与することによりmdxマウスの骨格筋再生と骨格筋機能の改善が得られるかどうかを検証した。mdxマウスに3週間から5週間の間、G-CSFを毎日腹腔内投与して図2a、全体的外観と機能的差異を試験した。各骨格筋細胞の形態を示すために、筋肉基底膜中の主なアイソフォームであるラミニン2αに対する免疫染色を行ったPatton,B.L.,Miner,J.H.,Chiu,A.Y.Sanes,J.R.DistributionandFunctionofLamininsintheNeuromuscularSystemofDeveloping,Adult,andMutantMice.TheJournalofCellBiology139,1507-1521,doi:10.1083/jcb.139.6.15071997。ラミニン2αは筋線維の基底膜に存在するタンパク質で、ラミニン2αで染色することにより各筋線維の大きさを観察することができる。その結果、コントロール群と比較して、G-CSF投与群は中心核を有する筋線維再生筋線維の数が5週齢で有意に増加していた図2b、c。RNMy2/9D2は、骨格筋の発生における胚および新生児の時期、ならびに成体で新しく形成された再生筋細胞に存在するミオシン重鎖MHCを認識するBigard,etal.Changesinmyosinheavychainprofileofmatureregeneratedmusclewithendurancetraininginrat.ActaPhysiologicaScandinavica165,185-1921999。4週齢でのRNMy2/9D2による免疫染色は、G-CSFが再生筋細胞の数を有意に増加させることを示した図2d,e。5週齢での筋線維の個々の断面領域には、小さい筋線維再生筋線維の割合がかなり増加しており、これは新たに形成された再生骨格筋細胞の有意な増加を意味する図2f。これらの結果は、G-CSFが再生筋線維の数を増加させることを示唆する。筋肉サイズは筋肉の機能を予測する値であることから、筋周囲径と筋湿潤量を測定した結果、5週齢でのTA筋の周囲径はG-CSF投与によって有意に増加した図2g、左:コントロール群、右:G-CSF投与群。筋肉の弱さは筋ジストロフィーの最も特徴的な症状であるBushby,K.etal.DiagnosisandmanagementofDuchennemusculardystrophy,part1:diagnosis,andpharmacologicalandpsychosocialmanagement.TheLancetNeurology9,77-93,doi:Doi:10.1016/s1474-44220970271-62010。そこで、invivoの筋肉機能を評価するために、運動耐久性試験を行った。その結果、G-CSF投与は5週齢での運動耐久性能力を有意に改善することが明らかとなった図2h、耐久時間とその個体数の分布左:コントロール群、右:G-CSF投与群。また、mdxマウスの長指伸筋extensordigitorumlongus、EDL筋におけるtetanicforce図2iおよびspecificforce図2j試験から、G-CSF投与は5週齢でのexvivo筋肉特異的機能にも有意の改善を示した図2i、j左:コントロール群、右:G-CSF投与群。これらのデータは、G-CSFがmdxマウスにおける筋肉の機能を、再生によって有意に改善することを示している。実施例3:筋ジストロフィーモデルマウスの生存における、G-CSFシグナル伝達の横隔膜変性を介しての役割筋ジストロフィーにおけるG-CSFおよびG-CSFRの役割を明らかにするために、G-CSFRノックアウトcsf3r-/-マウスを用いた。csf3r-/-マウスは血液学的障害をやや示したが、寿命は正常であった。G-CSFRホモ接合性ノックアウトとmdx変異を共に持つマウスmdx/csf3r-/-は深刻な筋肉機能の損傷を受けると推測していたが、驚くべきことに、G-CSFヘテロ接合性mdxmdx/csf3r/-マウスにおいてすら、出生直後と生後3~5週筋の変性再生が激しい時期の二層性に死亡が観察された図3a。mdx/csf3r/-マウスに死亡が観察されたとの驚くべき事実は、筋ジストロフィーにおけるG-CSFシグナル伝達の重要性を示すものである。相対的な外観はmdxマウスと比べて、csf3r/-もmdx/csf3r/-マウスも差がなかった図3b。しかし、2日目におけるcsf3r/-マウスとmdx/csf3r/-マウスの体重はmdxマウスと比べて有意に減少していた図3c。初期の致死の原因を究明するために、横隔膜および病変部位の相対的外観を観察した。出生直後のcsf3r/-マウス、mdxマウス、およびmdx/csf3r/-マウスの横隔膜をエバンスブルーで染色した。mdxマウスとcsf3r/-マウスではいずれも横隔膜に変性病変はほとんど観察されなかったが、mdx/csf3r/-マウスにおいて横隔膜の壊死、変性が明らかに観察された図3d、e。横隔膜の厚さについては、mdx/csf3r/-マウスで横隔膜の厚さが有意に薄かった図3e、f。生き残っているマウスの平均体重は、mdx/csf3r/-マウスでは一貫してcsf3r/-マウスよりも体重が減少していた図3g。なお、強い表現型をもつmdx/csf3r/-マウスは5週齢までに死亡し、比較的健康なmdx/csf3r/-マウスが生存していることから、グラフの見掛け上、csf3r/-マウスとmdx/csf3r/-マウスとの差は5週齢以降小さくなる。実施例4:筋ジストロフィーモデルマウスの後期生存における、G-CSFの役割mdxマウスでは約3~5週で、骨格筋の変性と再生が顕著であった。そこで、mdx/csf3r/-マウス及びmdx/csf3r-/-マウスでは筋再生と筋の機能が更に悪化するであろうと考察した。mdxマウス、mdx/csf3r/-マウスおよびmdx/csf3r-/-マウスの外観を比較したところ、出生後7日目ではmdx/csf3r/-マウスおよびmdx/csf3r-/-マウスはmdxマウスに比べて体サイズが小さく、また、出生後13日目ではmdx/csf3r-/-マウスが明らかに小さかった図4a。出生直後の致死時期を生き伸びたmdx/csf3r/-マウスは約4週で再生筋細胞が減少すると共に変性が著しく進み、8週後においても同様であった図4b。mdx/csf3r/-マウスでは、5週で再生筋細胞の数が有意に減少していた図4c。また、mdx/csf3r/-マウスでは筋肉のサイズも有意に減少していた図4d。mdx/csf3r/-マウスは、exvivo筋張力試験でもtetanicforce図4eおよびspecificforce図4fが落ちていた。これらの結果は、G-CSFがmdxマウスの骨格筋再生にとって非常に重要であることを示している。実施例5:重篤な筋ジストロフィーモデルマウスにおける、再生筋細胞におけるG-CSFRの発現筋細胞膜にジストロフィンが存在しないことがヒトではDuchenne型筋ジストロフィーDMDの発症につながり、重篤な筋力低下、筋萎縮をもたらし、若年での致死に至る。しかし、ジストロフィン欠失mdxマウスは、潜在的な筋肉の変性と再生にも関わらす、身体的には正常に見える。ウトロフィンはジストロフィン関連蛋白質で、ジストロフィンと機能的モチーフを共有している。ジストロフィンもそのホモログであるウトロフィンも発現しないmdx/utrn-/-マウスではヒトDMD患者と似た重篤なジストロフィーを示し、DMDの動物モデルとなりうるGrady,R.M.etal.SkeletalandCardiacMyopathiesinMiceLackingUtrophinandDystrophin:AModelforDuchenneMuscularDystrophy.Cell90,729-738,doi:Doi:10.1016/s0092-86740080533-41997;Deconinck,A.E.etal.Utrophin-Dystrophin-DeficientMiceasaModelforDuchenneMuscularDystrophy.Cell90,717-727,doi:Doi:10.1016/s0092-86740080532-21997。mdx/utrn-/-マウスは有意に体躯が小さく、mdxマウスと比べて著しい脊椎の湾曲が認められる図5a。2-12週齢でTA筋切片をHE染色したところ、3週齢/4週齢/5週齢のmdx/utrn-/-マウスではmdxマウス図1bと比較して、筋の障害がより激しく起きていることが観察され、またこの障害はそれ以後も続いた図5b。2-5週でTA筋の全筋細胞数は減少し、その後回復した図5c。mdx/utrn-/-マウスでは、3週より後に中心に核のある筋細胞が観察された図5d。また、mdx/utrn-/-マウスにおけるTA切片を、抗G-CSFR抗体/抗ラミニン-2α抗体/DAPIでそれぞれ蛍光染色した画像、およびそれらを合成した画像MERGE、さらにそれを拡大した画像を示す図5e。mdxマウス図1eと比較して、再生筋におけるG-CSFRの発現がより顕著であることが観察される。実施例6:重篤な筋ジストロフィーモデルマウスにおける、骨格筋の再生と機能におけるG-CSFの改善効果mdx/utrn-/-マウスにG-CSFを図6aに記載の投与スケジュールで投与した。すなわち、筋の損傷と再生が活発に起きる時期3週齢~5週齢に1日1回G-CSFの腹腔内投与を行った。TA筋の切片をHE染色した写真図6b、およびTA筋の周囲径図6cを示す左;コントロール群、右;G-CSF投与群。G-CSF投与により筋肉サイズが増加したことを示している。また、体重に対する筋湿潤量の割合は、G-CSF投与によって、前脛骨筋で増加する傾向にあり、腓腹筋Gastronemiusと大腿四頭筋Quadricepsで有意に増加した図6dTA;前脛骨筋、Gas;腓腹筋、Quad;大腿四頭筋左;コントロール群、右;G-CSF投与群。3~5週齢のmdx/utrn-/-マウスの前脛骨筋において中心核を有する筋線維再生筋線維の割合図6eおよび筋線維数図6fを示す左;コントロール群、右;G-CSF投与群。G-CSF投与は、再生筋線維の割合と筋線維数を増加した。TA筋における筋線維の断面積の分布を示す図6g左;コントロール群、右;G-CSF投与群。G-CSF投与群において筋細胞の全てのサイズが有意に増加していた。exvivo筋張力試験でも、G-CSF投与はtetanicforce図6hおよびspecificforce図6iを有意に改善した。これらの結果は、G-CSFがmdx/utrn-/-マウスにおいて、骨格筋の再生と筋肉機能を改善することを示している。次に、G-CSFの長期投与がmdx/utrn-/-マウスの生存に寄与し得るかどうかを試験した。mdx/utrn-/-マウスは3週齢から死亡し始め、180日までに全てが死に至った図6j。G-CSF投与群には、G-CSFを3-5日の間は毎日投与し、その後は1週間に2回投与した。驚くべきことに、G-CSF投与により、全てのmdx/utrn-/-マウスの生存が200日まで確認できた図6j。全身プレシスモグラフ試験の結果、G-CSF投与が8週におけるmdx/utrn-/-マウスの呼吸機能、一回換気量を有意に増加することを示した図6k。さらに、G-CSFを投与したmdx/utrn-/-マウスは150日の時点で身体活動が改善されていた。心筋症はDMDの致死性表現型の1つであるが、G-CSF投与によって、心臓の形態は影響を受けなかったデータ示さず。これらのデータは、G-CSFが骨格筋再生を改善し、マウスにおけるDMDモデルの命を救うことを強く示唆するものである。[配列表]"