"高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集するステップと、CD146の発現を測定するステップと、CD146を高発現する間葉系幹細胞を選択するステップと、を含む、方法。CD146を高発現する前記選択された間葉系幹細胞は、40を超えるコロニー形成効率を有する、請求項1に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。老化細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項1において選択される前記間葉系幹細胞中の老化細胞を最小限に抑える追加のステップと、老化細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、CD146の高い発現と老化細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項1に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。系統拘束された細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項1において選択される前記間葉系幹細胞中の系統拘束された細胞を最小限に抑える追加のステップと、系統拘束された細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、CD146の高い発現と系統拘束された細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項1に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集し、CD146のための基質で膜をコーティングし、前記膜の片側に前記間葉系幹細胞を配置し、前記膜のもう反対側に、細胞移動を促進する走化剤を配置し、前記間葉系幹細胞を、前記膜を通って移動することを可能にし、前記膜を通ってより迅速に移動する前記間葉系幹細胞を収集する、方法。高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集するステップと、NG2の発現を測定するステップと、NG2を高発現する前記間葉系幹細胞を選択するステップと、を含む、方法。NG2を高発現する前記選択された間葉系幹細胞は、40を超えるコロニー形成効率を有する、請求項6に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。老化細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項6において選択される前記間葉系幹細胞中の老化細胞を最小限に抑える追加のステップと、老化細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、NG2の高い発現と老化細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項6に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。系統拘束された細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項6において選択される前記間葉系幹細胞中の系統拘束された細胞を最小限に抑える追加のステップと、系統拘束された細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、NG2の高い発現と系統拘束された細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項6に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集し、NG2のための基質で膜をコーティングし、前記膜の片側に前記間葉系幹細胞を配置し、前記膜の反対側に、細胞移動を促進する走化剤を配置し、前記間葉系幹細胞を、前記膜を通って移動することを可能にし、前記膜を通ってより迅速に移動する前記間葉系幹細胞を収集する、方法。高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集するステップと、CD146およびNG2の発現を測定するステップと、CD146およびNG2を高発現する前記間葉系幹細胞を選択するステップと、を含む、方法。CD146およびNG2を高発現する前記選択された間葉系幹細胞は、40を超えるコロニー形成効率を有する、請求項11に記載の方法。老化細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項11において選択される前記間葉系幹細胞中の老化細胞を最小限に抑える追加のステップと、老化細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、CD146およびNG2の高い発現と老化細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項11に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。系統拘束された細胞のためのマーカーを前記間葉系幹細胞に付加することによって、請求項11において選択される前記間葉系幹細胞中の系統拘束された細胞を最小限に抑える追加のステップと、系統拘束された細胞を示す前記マーカーを測定する追加のステップと、CD146およびNG2の高い発現と系統拘束された細胞のための前記マーカーの低い表示とを有する前記細胞を選択する追加のステップと、を含む、請求項11に記載の高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法。高い増殖能力のある多能性間葉系幹細胞を識別する方法であって、間葉系幹細胞を収集し、NG2およびCD146のための基質で膜をコーティングし、前記膜の片側に前記間葉系幹細胞を配置し、前記膜の反対側に、細胞移動を促進する走化剤を配置し、前記間葉系幹細胞を、前記膜を通って移動することを可能にし、前記膜を通ってより迅速に移動する前記間葉系幹細胞を収集する、方法。高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、組織から間葉系幹細胞を収集するステップと、高いCD146発現について、前記細胞を免疫表現型検査するステップと、CD146を高発現する前記細胞を選択するステップと、を含む、方法。請求項16において選択される前記細胞を培養する追加のステップを含む、請求項16に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。CD146の高い発現および高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、前記培養した細胞を凍結保存する追加のステップを含む、方法。請求項16において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、CD146の存在を監視する追加のステップと、を含む、請求項16に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。請求項16において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、CD146の存在を監視する追加のステップと、CD146を高発現する前記細胞を選択する追加のステップと、前記先行ステップで選択された前記細胞をさらに培養する追加のステップと、を含む、請求項16に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、組織から間葉系幹細胞を収集するステップと、NG2の高い発現について、前記細胞を免疫表現型検査するステップと、NG2を高発現する前記細胞を選択するステップと、を含む、方法。請求項21において選択される前記細胞を培養する追加のステップを含む、請求項21に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。前記培養した細胞を凍結保存する追加のステップを含む、NG2の高い発現および高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。請求項21において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、NG2の存在を監視する追加のステップと、を含む、請求項21に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。請求項21において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、NG2の存在を監視する追加のステップと、NG2を高発現する前記細胞を選択する追加のステップと、前記先行ステップで選択された前記細胞をさらに培養する追加のステップと、を含む、請求項21に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、組織から間葉系幹細胞を収集するステップと、CD146およびNG2について、前記細胞を免疫表現型検査するステップと、CD146およびNG2を高発現する前記細胞を選択するステップと、を含む、方法。請求項26において選択される前記細胞を培養する追加のステップを含む、請求項26に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。CD146およびNG2の高い発現ならびに高い増殖能を有する、多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法であって、前記培養した細胞を凍結保存する追加のステップを含む、方法。請求項26において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、CD146およびNG2の存在を監視する追加のステップと、を含む、請求項26に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。請求項26において選択される前記細胞を培養する追加のステップと、CD146およびNG2の存在を監視する追加のステップと、CD146およびNG2を高発現する前記細胞を選択する追加のステップと、前記先行ステップで選択された前記細胞をさらに培養する追加のステップと、を含む、請求項26に記載の高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも50が、CD146を高発現する、組成物。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも75が、CD146を高発現する、組成物。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも50が、NG2を高発現する、組成物。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも75が、NG2を高発現する、組成物。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも50が、CD146およびNG2を高発現する、組成物。40を超えるコロニー形成効率および三血球系統分化能を有する間葉系幹細胞の集団を含み、前記間葉系幹細胞の少なくとも75が、CD146およびNG2を高発現する、組成物。半発明は、高い増殖能を有する多能性間葉系幹細胞の識別および培養のための方法を提供することを課題とする。本発明は、高い増殖能力のある多能性MSCを識別する方法を提供する。多能性細胞は、骨形成細胞、脂質生成細胞、または軟骨形成細胞に分化することができる。MSCは、治療的使用のためにドナーもしくは患者、または研究的使用のために他のドナーのいずれかから、採取することができ、本発明は、自己用途および同種異系用途の両方を有する。細胞バンクからのMSCもまた、使用可能である。指示薬と抱合されたCD146およびNG2抗原を標的とする抗体を、不均一な幹細胞の収集物に暴露する。幹細胞表面へのこれらの抗体の付着は、CD146および/またはNG2抗原の存在を示す。CD146、NG2、または両方の組み合わせを高発現するMSCを、フローサイトメトリーまたは他の選択技術を使用して選択することができる。本発明の方法を使用した細胞の識別は、細胞への最小限の損傷を与える。高い増殖能を有する多能性MSCを即座に必要とする患者については、選択した細胞を即座に使用することができる。本発明の免疫表現型検査によるMSC選択はまた、老化細胞を最小限に抑え、単一または二重組織系統に拘束されるのではなく、多能性の細胞に選択的である。CD146および/またはNG2を高発現する細胞はまた、40を超えるコロニー形成効率を有することができ、治療的使用のためのそれらの可能性を強化する。高い増殖能力のある多能性MSC、より迅速な選択および単離を必要としない患者または他の用途については、CD146および/またはNG2を高発現する細胞を選択し、培養することができる。培養した細胞を監視し、所望されるCD146および/またはNG2を高発現する細胞をさらに選択し、単離することができる。CD146および/またはNG2を高発現する細胞を識別し、単離し、さらに培養して、強化された細胞集団を生成することができる。このプロセスは、所望であれば反復することができる。培養プロセス中の任意の時点で、細胞は、後の使用のために凍結保存することができる。本発明は、獣医学的療法および研究、ならびに自己および同種異系療法を含む、全ての哺乳動物に対して使用可能である。図面中の用語:CCMAは、抗生物質を伴う細胞培養培地を指し、GAGは、グリコサミノグリカンを指し、OACは、三分能性細胞を指し、OAは、骨-脂質生成細胞を指し、OCは、骨-軟骨形成細胞を指し、Oは、骨形成を指す。1つ以上の好ましい実施形態または方法の詳細な説明を本明細書に提供する。しかしながら、本発明は、種々の方法または形態をとり得ることを理解されたい。したがって、本明細書に開示される特定の詳細は、制限するものではなく、特許請求の範囲の基礎として、および本発明を任意の適切な方法で採用する当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。幹細胞またはMSCという用語は、長期の自己再生能力を有し、少なくとも一種類の分化した子孫細胞を生成することができる細胞を指す。本明細書に使用される、分化能とは、種々の表現型を有する子孫細胞に分化する、幹細胞の能力を指す。幹細胞およびMSCは、内容に応じて互換的に使用され得る。多分化能とは、複数の種類の子孫細胞、特に骨形成細胞、脂質生成細胞、および軟骨形成細胞に分化する、細胞の能力を指す。単分能性幹細胞とは、1種類の子孫細胞にのみ分化する能力のある幹細胞を指し、二分能性幹細胞とは、2種類の子孫細胞にのみ分化する能力のある幹細胞を指す。老化細胞とは、もはや有糸分裂が起こり得ない細胞を指す。CD146とは、いくつかの幹細胞の表面上に発現される細胞接着分子を指す。CD146抗体とは、CD146抗原に結合する任意の抗体を指す。本発明は、CD146および/またはCD146の発現と、幹細胞の分化能およびコロニー形成効率との関連性を開示する。NG2とは、神経/神経膠抗原2を指し、幹細胞の表面上に発現される抗原である。NG2抗体とは、NG2抗原に結合する任意の抗体を指す。本発明は、NG2の発現と幹細胞の分化能との間の関連性を開示する。免疫表現型検査とは、細胞上の抗原結合を監視することによって、細胞上の抗原またはマーカーを判定するプロセスを指す。このプロセスは、不均一または任意の他の種類の細胞培養物の構成成分および特徴を分析するために使用されてもよい。指示薬または指標化合物という用語は、抗体の存在およびその抗体に結合する細胞を識別または標識化する目的で使用される、任意の化合物を指し得る。指示薬の例には、染料、蛍光剤、または検出および/または定量化可能な他の化合物が挙げられる。三分能性のMSCは、単離細胞が由来する不均一な細胞集団よりも、高いレベルのCD146およびNG2を発現する。CD146MCAM、Mel-CAM、S-Endo-1、A32抗原、およびMUC18としても既知は、複数の細胞型例えば、MSC、内皮細胞、および黒色腫細胞に発現し、異型細胞間接着に関与する。NG2は、外側の細胞膜に及ぶコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。三分能性MSCにおけるCD146および/またはNG2のより高い発現は、MSCの分化能に非依存的なCD44およびCD73等の他の細胞表面タンパク質の発現とは対照的である。CD146および/またはNG2の分化発現を利用して、幹細胞の所望の分化能を、特異的に増幅および/または強化し、不均一な幹細胞集団の分化能を監視し、幹細胞培養物の分化能における不均一性を定量化し、不均一な細胞培養物から特定の分化能を有する幹細胞を除去することができる。記載される本発明は、不均一な幹細胞集団の分化能を判定するための定量的および高容量アッセイを開発することによって、幹細胞技術における基礎的な欠点に取り組む。この技術は、MSCの治療的および研究的可能性に対する不均一性の重要性を考慮した多数の用途を有する。この技術により達成可能なMSC集団に関する洞察は、最終的に、組成物に対する制御、したがって、MSC療法の有効性を可能にするであろう。本方法で使用される幹細胞は、ドナーまたは患者から抽出される。あるいは、幹細胞は、培養細胞コロニーまたは不均一な培養物から得られてもよい。幹細胞上の非特異的な抗原は、アルブミンでブロッキングされる。細胞を、続いて、CD146抗体、NG2抗体、または両方とともにインキュベートする。CD146および/またはNG2抗体を、指標化合物と抱合する。存在する全てのCD146またはNG2抗原にCD146およびNG2抗体が結合することを可能にするのに十分な時間が経過した後、未結合の抗体を除去する。未結合の抗体を除去した後、CD146、CD146抱合指標化合物、および/またはNG2、NG2抱合指標化合物のいずれかの存在は、高い増殖能を有する多能性MSCの分化能を示すことになる。単独または組み合わせでのCD146およびNG2の高発現は、高い増殖および多分化能を有するMSCの選択に使用される。MSCの多能性分化能を、CD146およびNG2抗原発現の観察により監視する。指標化合物と抱合したCD146およびNG2抗体を、幹細胞とともにインキュベートする。CD146およびNG2抗体は、CD146およびNG2抗原を発現する幹細胞に選択的に結合することになる。MSCにおける多系統分化能の損失は、さらに、CD146およびNG2の発現における変化、ならびにCD146およびNG2の抗体結合の対応する変化と関連する。未結合抗体は、連続的、または離散的時間間隔で除去することができる。抱合された指標化合物によって示され得るCD146および/またはNG2抗体の結合は、MSCの培養中に、MSCの分化能を連続的または離散的時間で監視するために使用することができる。細胞間通信は、細胞培養物に対する望ましくない変化を促進する幹細胞を選択的に除去することによって、制御される場合がある。単分能性細胞および老化細胞は、特に、細胞間通信を介した細胞培養の変化を促進することに関連し、それらの存在は、多能性細胞の培養に悪影響を及ぼし得る。これらの幹細胞は、それらのCD146および/またはNG2抗体結合特性の欠如によって識別され、幹細胞培養物から除去することができる。不均一なMSC培養物から多能性MSCを強化する代替の方法は、多孔質膜を通じた細胞移動を利用することができる。膜は、CD146、NG2、または2つのマーカーの組み合わせのための基質でコーティングされてもよい。基質の例は、NG2のためのコラーゲンVIであるが、当該技術分野で既知の任意の基質を使用してもよい。不均一なMSC培養物を、膜の片側に配置し、細胞移動を促進する走化剤を、膜の反対側に配置する。走化剤の例は、無血清MSC培養と組み合わせて使用する場合、血清である。基質に結合する抗原すなわち、CD146、NG2、またはそれらの組み合わせを高発現する多能性MSCは、抗原の発現が低い系統拘束されたMSCよりも、迅速に多孔質膜を通って移動する。移動した細胞は、多能性MSCの強化された培養物である。より迅速に移動するMSCを収集し、所望であれば治療法または研究に使用することができる。CD146および/またはNG2を高発現する選択された細胞は、後で使用するために凍結保存することができる。一実施形態において、幹細胞コロニーを、寒剤を含有するマイクロプレートに添加する。寒剤の一例には、65CCMA、27FBS、および8DMSOが含まれる。パラフィン油を、各ウェルの上部に添加して、CO2の脱気および培地の蒸発を防止してもよい。幹細胞コロニーを含有するマイクロプレートを凍結させる。一実施形態では、マイクロプレートの温度を、-80°Cに維持する。使用のために幹細胞を回復させるには、プレートを解凍し、3日間回復させる。回復した幹細胞を、マイクロプレートに播種し、増幅させてもよい。本発明は、系統拘束非多能性および/または老化MSCを検出するために、任意の他の指示薬と組み合わせて使用してもよい。指示薬は、系統拘束MSCに対して強く、多能性MSCに対して弱いことになる。指示薬の例には、系統拘束および/または老化MSC上で上方制御される、蛍光増殖染料および細胞表面抗原が挙げられる。増殖染料は、細胞内での長期の保持能力によって特徴付けられる。各細胞分裂の際に、染料の量は、2つの娘細胞間で分割される。各後続世代は、親細胞の蛍光の半分を受容する。成長の遅い系統拘束および老化MSCは、これらの増殖染料に強く染色し、一方で、急速に分裂する多能性MSCは、弱く染色されることになる。これらの指示薬は、本発明のマーカーと組み合わせて使用することができる。多能性MSCは、CD146および/またはNG2を高発現し、系統拘束および/または老化MSC細胞の指示薬に対しては弱いことになる。この組み合わせは、不均一なMSC培養物からの系統拘束および/または老化MSCの除去、ならびにさらには不均一なMSC培養物からの多能性MSCの強化に有用であり得る。以下は、使用される免疫表現型検査プロセスであるが、このプロセスは、当業者に利用可能な任意の方法によって達成されてもよい。トリプシン処理したMSCを、PBS中で、遠心分離によって洗浄した。非特異的な抗原は、37°Cで20分間、1ウシ血清アルブミンを含有するPBS中で、細胞を106細胞/mlでインキュベートすることによってブロッキングした。細胞懸濁液の100μlアリコートを、4°Cで20分間、蛍光色素抱合した抗ヒトモノクローナル抗体とともにインキュベートした。標識化した試料を、3つの量のリン酸緩衝食塩水PBS中で、遠心分離によって洗浄した。アイソタイプ対照は、各抗体に使用したものと同じ濃度で平行して行った。MSCの免疫表現型を、FC500フローサイトメーターBeckmanCoulter,Fullerton,CAhttp://www.beckmancoulter.comを用いて評価した。この方法のための細胞は、InternationalSocietyofCellularTherapyによって示されるMSCに対する基準を満たす。具体的には、細胞は、接着依存性であり、三血球系統分化能を示し、MSCの特徴である免疫表現型例えば、CD73、CD90、およびCD105を発現し、造血性細胞の細胞表面エピトープ指標が陰性であった例えば、CD19-、CD34-、およびCD45-。CD146およびNG2の高発現のスクリーニングに使用されるMSCは、ドナー、細胞コロニー、または異種源からのものとすることができる。CD146およびNG2についてスクリーニングされるMSCは、NG2:RDSystemsからの抗NG2-アロフィコシアニン、カタログFAB2585A、クローンLHM-2、およびCD146:eBioscienceからの抗CD146-FITC、カタログ11-1469、クローンP1H12とともに、上述のようにインキュベートされる。これらの抗体の抗体結合能力ABCは、MSCのコロニー形成効率ならびに多能性と相関する。ABC値は、本発明ではCD146および/またはNG2である、細胞表面上の抗原分子の量であり、使用される抗体に特異的である。効率的に倍増する幹細胞を提供し、幹細胞療法を必要とする患者に最良の転帰をもたらすか、または研究のための集団をもたらすのに所望されるコロニー形成効率は、40を超える。さらに、CD146および/またはNG2を高発現する幹細胞は、前述のように、他の細胞型への所望の分化能力を有する。ABCは、ドナー、患者、または細胞バンクからの、高いコロニー形成効率を有する多能性MSCについてのスクリーニングに使用することができる。40を超えるコロニー形成効率に関して、ABC値は、NG2については細胞1個あたり少なくとも約100,000個の抗体分子とすることができる。CD146については、この値は、細胞1個あたり少なくとも200,000個の抗体分子とすることができる。所望のMSCのスクリーニングに使用される別の尺度は、等価可溶性蛍光色素分子MESFの値である。多能性MSCに関して、MESF値は、CD146については細胞1個あたり少なくとも約100,000個の蛍光色素分子であり、NG2については細胞1個あたり少なくとも約200,000個の蛍光色素分子である。図1は、親MSC集団薄い灰色およびアイソタイプ対照黒色に対して、プールした多能性細胞濃い灰色における、NG2図1AおよびCD146図1Bの発現についての代表的なヒストグラムである。代表的な二変量ヒストグラムは、多能性集団図1Cおよび親集団図1Dについて、CD146の発現に対比したNG2の発現を描写する。多能性細胞OACにおけるNG2発現白色とCD146発現黒色との平均蛍光強度比図1Eを、多能性細胞が由来する不均一な親培養物に対して、平均±平均の標準誤差と比較して示すn=4個の試料。親に対してP<0.05。多能性MSCにおけるCD146およびNG2の高発現を、図1に図示する。図2は、多能性MSCの培養中の継代効果についての研究である。NG2図2AおよびCD146図2Bの発現は、多能性MSCの継代数に関して判定した。図形の各線は、下記のように調製したMSCの単細胞由来培養物のプールn=5を表す。さらに、成長特性を、各継代時の累積倍増図2C、倍増時間図2D、および細胞老化を判定するためのβ-ガラクトシダーゼの発現図2Eを監視することによって評価した。骨形成図2F、脂質生成図2G、および軟骨形成図2Hを観察した。CD146およびNG2の発現における減少は、培養MSCの継代中の三血球系統分化能の損失と相関する。CD146および/またはNG2を高発現するMSCを、即時使用のために単離することができる。別の方法では、高発現する細胞は、下記のように培養し、CD146および/またはNG2の発現について監視することができる。単離して培養した、所望のレベルのCD146および/またはNG2を有するMSCを、単離し、さらに培養して、所望の多分化能特性および高いコロニー形成効率を有する強化されたMSCを生成することができる。選択基準、培養、および保存を本明細書に記載する。図2は、最良の多能性分化能を提供するための培養中のCD146およびNG2の存在を図示する。高レベルの発現を有するMSCを、使用のためにさらに選択する、および/または強化されたMSC集団のために培養を続けることができる。さらに、強化されたMSCは、単離時に凍結保存するか、または後で使用するために培養して凍結保存することができる。CD146およびNG2のためのマーカーを用いて細胞の分化能およびコロニー形成を確認するために使用される本発明の別の方法は、ドナー、細胞コロニー、または不均一な培養物から単離可能な個々の細胞を利用する。次の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。InVitroHigh-CapacityAssaytoQuantifytheClonalHeterogeneityinTrilineagePotentialofMesenchymalStemCellsRevealsaComplexHierarchyofLineageCommitment,Russelletal.,28StemCells788-7982010、ClonalAnalysisoftheProliferationPotentialofHumanBoneMarrowMesenchymalStemCellsasaFunctionofPotency,Russelletal.,108BiotechnologyandBioengineering2716-27262011。本方法は、培養用の単細胞を単離するために使用することができる。使用または研究のために、少数のMSCが望ましい場合、この代替方法を使用してもよい。多能性MSCの源は、約2~15回10~50倍増継代されることになる単細胞であるため、使用可能な細胞の数は、上述の方法よりも少ない。この方法はまた、CD146およびNG2に加えて、高い増殖能を有する多能性細胞を示し得る他のマーカーを識別するために使用することもできる。MSCは、Invitrogenの使用説明書に従って、5μΜのCellTrackerGreen、5-クロロメチルフルオロセイン二酢酸λex/λem=492/517nmを用いて、原位置で10分間、37°Cに余熱した無血清CCMA内で、滅菌標識化した。トリプシン処理した後、MSC単細胞を、48時間MSCで馴化した50μl/ウェルの新鮮CCMAおよび75μl/ウェルのCCMAを含有する96ウェルマイクロプレートへの限界希釈によって生成し、滅菌濾過0.2μmの細孔寸法して全ての懸濁細胞を除去した。各ウェルを、蛍光OlympusIX50顕微鏡OlympusAmerica,CenterValley,PA,http://www.olympusamerica.comで検査して、単細胞を接種したウェルのパーセンテージとして、平板効率を判定した。接種の3日後に50μlの新鮮CCMAを各ウェルに添加し、さらに3日後に、50μlの培地を新鮮CCMAと置き換えた。培養7日目に、コロニー形成効率を、単細胞を起源とするMSCコロニーのパーセンテージとして計算し、接種材料中の生存細胞の割合で除した。少なくとも300細胞/ウェルを含有する単細胞由来のコロニーを、1:4の比率で継代培養し、三血球系統分化多能性分化能を評価した。単細胞由来のMSCコロニー、またはドナーもしくは培養物由来の他の単離MSCは、50μlのトリプシン処理した細胞懸濁液を、50μl/ウェルの2倍寒剤65CCMA、27FBS、および8ジメチルスルホキシドDMSOを含有する新鮮96ウェルマイクロプレートに添加することにより凍結保存することができる。CO2の脱気および培地の蒸発を阻害するために、100μlの濾過滅菌した軽質パラフィン油を各ウェルの表面に添加してもよく、蓋をパラフィルムで固定した。プレート複数を含むを、Styrofoamの箱に移し、-80°Cで8時間凍結させ、続いて長期保管のために、-80°Cの冷凍庫に直接入れることができる。75細胞/ウェル程の少量を、この方法で凍結させた。プレートは、37°Cのインキュベーターで解凍し、解凍した細胞懸濁液を、1mlの新鮮CCMA/ウェルを含有する24ウェルプレートに移すことができる。接種翌日に、定期的な細胞増幅のために、培地を新鮮CCMAと交換した。単細胞から培養した凍結MSC細胞を解凍し、3日間増幅させ約2×103細胞/単細胞コロニー、それらの分化能を検証した。10cmの組織培養皿中に、100±10個の細胞で接種した際のP3増幅MSC細胞のコロニー形成効率を、細胞コロニーを検出するクリスタルバイオレット染料を使用して評価した。成長動態については、単細胞から培養したP3MSC細胞を、0.5mlのCCMA/ウェルを含有する24ウェルプレートに、100±10個の細胞/cm2で接種し、1日おきに培地を完全に交換した。細胞濃度を、血球計計数によって測定し、比成長速度を、BlanchandClark,BiochemicalEngineering,NewYork,MarcelDekker,p.702.1997にあるように評価した。継代培養後、MSC単細胞由来コロニーを、7日間、150μl/ウェルのCCMAを含有する96ウェルマイクロプレートで、約75コンフルエントになるまで増殖させた。アッセイにより、分化能の尺度として、脂質生成、軟骨形成、および骨形成を示す、MSC単細胞の三血球系統分化能を定量化した。骨形成は、10FBS、100nMのデキサメタゾンSigma-Aldrich,St.Louis,MO、10mMのβ-グリセロリン酸Sigma-Aldrich、および50μΜのL-アスコルビン酸2-リン酸Sigma-Aldrichを補充した低グルコースのダルベッコMEMでの培養によって誘発した。21日間の分化後、コンフルエントな単分子層を、4パラホルムアルデヒド中に20分間固定し、1AlizarinRedSpH4.2、Sigma-Aldrichで20分間染色し、鉱化した細胞外マトリックスを検出した。染料を、15分間、10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0中、100μl/ウェルの10塩化セチルピリジニウムで抽出し、スペクトル吸収率を562nmで測定した。脂質生成を誘発するために、単細胞由来コロニーを、上述のように増殖させ、0.5μΜデキサメタゾン、0.5mMイソブチルメチルキサンチンSigma-Aldrich、および50μΜインドメタシンSigma-Aldrichを補充したCCMA中で21日間培養した。脂質は、200μlのPBS/ウェルにおいて、細胞の単分子層に5μlのAdipoRed試薬Lonza,Walkersville,MDを添加することにより検出した。蛍光を、485nmの励起および535nmの放出で10分後に測定した。軟骨形成については、単細胞由来コロニーを、2mlのCCMA/ウェルを含有する6ウェルプレートで、2週間近く増幅させた。200μl/ウェルのCCMAを含有する、96ウェルのV字底ポリプロピレンマイクロプレートThermoFisherScientific,Waltham,MAに、2±0.2×105細胞/ウェルを接種することによって、ペレット培養物を形成した。翌日に、100ng/mlの骨形成タンパク質-2RDSystems,Minneapolis,MN、10ng/mlの形質転換成長因子-β3、100nMデキサメタゾン、50μg/mlのL-アスコルビン酸2-リン酸、100μg/mlのピルビン酸塩Sigma-Aldrich、40μg/mlのプロリンSigma-Aldrich、および10μl/mlのITSBDBiosciences,SanJose,CAを補充した高グルコースのダルベッコMEMから構成される分化培地で、CCMAを置き換えた。21日間の分化後、消化した細胞ペレット中の硫酸化グリコサミノグリカンGAGの量を、1,9-ジメチルメチレンブルーSigma-Aldrichを用いて、較正にコンドロイチン硫酸Aを使用して定量化した。GAG含量は、Hoechst33258Sigma-Aldrichを用いて消化したペレット試料中のDNAの定量化による質量あたりのDNA単位で報告し、較正基準として仔ウシ胸腺DNASigma-Aldrichを採用する。細胞型を確認するための分化したMSCの染色組織学的試料の画像を、OlympusIX50顕微鏡に載置した、OptronicsDEI-750デジタルカメラOptronics,Goleta,CA,http://www.optronics.comで取得した。染色を、染色面積パーセントおよびその光学密度の積に関して評価した。培養中のMSCの、4つの陽性染色面積および投影2D面積を、Graphire4CTE-640タブレットWacomTechnologyCorp.,Vancouver,WA,http://www.wacom.comを使用してトレースし、Image-ProPlusソフトウェアバージョン6.1MediaCybernetics,Crofton,MD,http://www.mediacy.comのCount/SizeおよびDrawツールのArea、PercentArea、およびOpticalDensityオプションで分析した。光学密度を、BackgroundCorrectionオプションを使用して、対応する陰性対照に対し、0白色から2.5黒色の段階で計算した。画像化の結果を、培養試料あたり平均して20~50個の無作為に選択した画像からの平均値として報告する。図3は、上述の分化培地での21日間の誘発後の、骨形成図3A、脂質生成図3B、および軟骨形成図3Cについて、培養MSCの多分化能を要約する。陽性分化に対する閾値破線は、陰性対照に対する確率密度の95パーセンタイルに相当する。コロニー形成効率を、これらの条件下で容易にコロニーを形成した蛍光標識化MSCの限界希釈によって評価した。追跡用染料CellTrackerGreenは、96ウェルマイクロプレートでウェルにおける細胞検出を容易化した。染料は、無視できる程度の細胞毒性を有し、接種材料の生存率は90±4であった。40を超えるコロニー形成能を有する細胞を、識別することができる。図4は、多能性MSCのより高いコロニー形成を示す。図4に示されるように、多能性MSCにより、しばしば、所望される40のコロニー形成効率を上回る。MSC培養物中のDNA含量を定量化するために、100μlのパパイン消化細胞試料を、200μlの0.1MNaOHと混合し、室温で30分間インキュベートし、次いで、5MNaCl、100mMリン酸ナトリウム中の200μlの0.1MHClの添加によって、中和した。96ウェルマイクロプレートにおいて、100μlの試料を、200mMNaClおよび1mMEDTApH7.4を含有する10mMトリス緩衝液中の100μlの0.7μg/mlHoechst33258Sigma-Aldrichに添加した。蛍光を、340nmの励起および465nmの放出で測定した。標準曲線を、仔ウシ胸腺DNASigma-Aldrichを用いて作製した。MSCの単細胞由来培養物の三血球系統分化能を、上に示した分化条件を使用して評価した。単細胞コロニーを、1:4の比率で、複製マイクロプレートに継代培養し、3つのプレートは、三血球系統分化能の評価に採用し、4つ目は、後で使用するために凍結させてMSC細胞の鋳型を保存した。MSC細胞は、それらの標準化した測定値が、陰性対照に対する推定確率密度の95パーセンタイルを超えた場合、分化が陽性であると指定された。値は、骨形成、脂質生成、および軟骨形成について、それぞれ、1.9±0.2、2.1±0.1、および1.6±0.3標準偏差であった。組織培養プラスチック上での生体外増殖の際のMSC細胞の成長動態を、図5A、5B、5C、および5Dに提示する。100細胞/cm2の接種密度を選択した。接種の24時間後に培養物中に生存していたMSCの割合、および遅滞期の期間に関して、それぞれ、平均値は、4つ全ての群について60および1日n=20であり、4つの分化能群の間に有意な差異は存在しなかった図5A、5B、5C、および5D。10日間の増殖後、三分能性MSCを接種した培養物は、200倍n=5、2-10×104細胞/cm2図5Aに増殖し、85~100コンフルエントであった図5E。系統拘束は、培養MSCの生体外増殖を制限した。O細胞を接種した場合、同じ期間にわたり、培養物は、蓄積が<103細胞/cm2であり図5A、コンフルエンスが≦15であった図5EP<0.001。MSC分化能の機能としての比成長速度における傾向図5Fは、コロニー形成効率に対するもの図4と類似である。4つの分化能群の中でも、OAC細胞の三分能性接種材料が、平均比成長速度が0.85日-1n=5であり、20時間の倍増時間に相当する、最も高い増殖能を呈した図5F。平均比成長速度は、O細胞を接種した培養物については5倍低かったP<0.01。二分能性接種材料は、OAおよびOCMSCと平均比成長速度が同程度であり0.50~0.60日-1、これらの2つの両極端の間の中等度の増殖能を呈した。O細胞は、細胞老化の表現型表示を発現した。細胞寸法を、サブコンフルエントな培養物の表面上の、MSCの投射面積の画像分析によって推定したn=30個の画像/培養物。OMSCを接種したMSC培養物は、4日目に、細胞半径>34μm図6Cに相当する、>3.6×103μm2/細胞n=5個の培養物の平均投影面積で細胞を含有した図6A。75を超えるこれらの系統拘束されたMSCが、pH6.0で、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ活性に対して陽性に染色した図6D。サブコンフルエントなMSCにおける陽性β-ガラクトシダーゼ染色は、コンフルエント細胞における可逆の休眠状態ではなく、老化からの不可逆の成長停止を示唆する。三分能性接種材料は、良好な形態学図6Aおよび6Bならびに無視できる程度のβ-ガラクトシダーゼ染色図6Dを有する培養物をもたらしたが、一方で、二分能性接種材料は、増殖能について観察されたパターン図4および5Fと一致する老化の中間表現型図6Aおよび6Dを呈した。CD146およびNG2を高発現する多能性細胞はまた、細胞の老化に関連するβ-ガラクトシダーゼ活性の欠如も示す図6D。この特徴は、本発明のさらなる態様である。細胞を、pH6.0で試験し、成長動態について接種の4日後に、サブコンフルエントな培養物中で老化β-ガラクトシダー染色キットCellSignalingTechnology,Danvers,MAを用いて組織化学的に検出した。標準化した分化測定値を分化MSCの組織学的染色と関連付けるための相関を確立した図7。組織学的試料は、骨形成および脂質生成図7A~Eおよび図7F~Jについては単分子層であり、軟骨形成図7K~Oについては分割したペレットであった。染色を、染色面積パーセントおよびその光学密度の積に関して評価した。この面積かける強度スコアは、骨形成については≦30図7A~E、脂質生成については≦10図7F~J、および軟骨形成については≦25図7K~Oであった。骨形成および軟骨形成の高いパーセンテージは、細胞内マーカーと対比した細胞外染色、および/またはより高い分化度に起因し得る。線形回帰モデルは、全ての事例におけるデータに適合するのに十分であった。これらの等式から、陽性分化に対する95パーセンタイルの閾値は、それを越えると単細胞由来の培養物が骨形成に陽性であることが示された、1.0±0.1の面積かける強度スコアに対応する。脂質および軟骨形成に対するカットオフ値は、それぞれ、0.20±0.01および2.9±0.2のスコアに相当した。3つ全ての場合において、閾値の面積かける強度スコアは、陽性細胞に対して観察された最大値よりも、少なくとも8倍低かった。多分化能が陽性である単細胞培養物は、本明細書に記載のように、CD146およびNG2の両方を高発現する。多能性MSCの識別における現在の制限を克服するために、不均一なMSCを任意の試料で使用するための、新しい効率的な高容量アッセイを開発した。本方法を使用して、単純に、CD146およびNG2に対するマーカーを使用することにより、MSCをスクリーニングすることができる。既知の分化能の細胞を単離し、MSCの不均一性を定量化するこのアッセイの能力は、MSC療法の有効性を改善するであろう。フローサイトメトリーにより、平均蛍光強度に約3倍の差異p<0.05、n=4がある、親MSCと対比した多能性MSCでの細胞表面抗原NG2の高発現を確認する。CD146については、平均蛍光強度は、多能性MSCに対して、親培養物よりも約2倍大きかったp<0.05、n=4。単細胞由来MSCコロニーの使用、および40を超えるコロニー形成効率と相関する多能性細胞の単離は、所望のMSCにおけるCD146およびNG2の高発現を明らかにした。本発明は、例えば、臨床で、多能性細胞の一定した含量についてMSC調製物を監視するため、および年齢および異なる培養条件で、異なるドナー間の不均一性における変動性を判定するために、採用することができる。本発明の方法を使用して、MSCの多分化能と関連する他の因子を識別することができる。本発明の使用は、マーカーNG2およびCD146を使用することによって、臨床で使用するための生体外増幅の際に、不均一なMSC調製物中の多能性細胞を強化する、分化成長動態を有効利用することを可能にする。多分化能および効率的なコロニー形成を有するMSCの識別、ならびにCD146およびNG2を高発現する単離MSCのさらなる培養の容易さは、治療法および研究のためのMSC源の提供を可能にする。"