"固相支持体へ固定化された13~70ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグループを含むリシークエンシングDNAマイクロアレイであって、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは、a識別可能な参照配列distinctreferencesequenceの特定の領域にスパンするspanように選択され、bタイルド領域tiledregionと呼ばれる該アレイのディスクリート領域discreteareaを占有し、c該アレイの該ディスクリート領域内に平行に配置された少なくとも4セットのプライマーを含み、ここで、該4セットのプライマーは、以下:i該参照配列に対して正確に相補性である第1プライマー;およびii3つのさらなるプライマーこれらの各々は、中央の位置のヌクレオチド以外は該第1プライマーと同一であり、この中心位置は、該3セットの各々において異なり、その結果、4つ全てのヌクレオチド塩基が該アレイ上に存在するのように選択される、リシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記オリゴヌクレオチドプライマーの長さが、25ヌクレオチドである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記オリゴヌクレオチドプライマーによってスパンされる前記参照配列の領域が、前記マイクロアレイ表面の各々の隣接するタイルド領域について、該参照配列をn1ヌクレオチド移動する、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記リシークエンシングDNAマイクロアレイが、18×18ミクロンフィーチャーmicronfeaturesを含む、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記リシークエンシングDNAマイクロアレイが、8×8ミクロンフィーチャーを含む、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングtillingのために選択される前記配列が、生物属、種および亜種の非常に広いクラスを表し得る単一遺伝子またはサブ配列singlegeneorsubsequenceである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングのために選択される前記配列が、病原体ファミリーの遺伝子型を表すプロトタイプprototypesである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングのために選択される前記配列が、アデノウイルスのファミリーfamilyまたはグループgroupを表すプロトタイプである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングのために選択される前記配列が、インフルエンザウイルスのファミリーfamilyまたはグループgroupを表すプロトタイプである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングのために選択される前記配列が、個々の病原株pathogenicstrainに特有の単一遺伝子またはサブ配列である、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。タイリングのために選択される前記配列が、薬剤耐性マーカーdrugresistancemarkerをコードする、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記リシークエンシングDNAマイクロアレイがRPMVlである、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記リシークエンシングDNAマイクロアレイがRPMV2である、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。前記リシークエンシングDNAマイクロアレイが、一般的な病原体についての少なくとも1つの参照配列、および少なくとも1つの生物テロ薬剤biologicalterrorismagentを含む、請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ。a請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイ、およびb該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に存在する前記プローブ配列への前記標的配列の特異的ハイブリダイゼーションに好適な試薬、を含む、キット。微生物中の薬剤耐性マーカーの存在を検出する方法であって、ここで該方法が、以下:a請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイを提供すること;b遺伝物質geneticmaterialを含む未知のサンプルunknownsampleを、該リシークエンシングDNAマイクロアレイへ接触させること;c好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること;ならびにd該未知のサンプル中の微生物中の薬剤耐性マーカーの存在を検出すること、を含む、方法。前記方法が、前記方法によって同定される前記薬剤耐性マーカーのDNA配列と既知の耐性マーカーとの配列比較によって、薬剤耐性マーカーのアイデンティティーidentityを決定することをさらに含む、請求項16に記載の方法。前記ハイブリダイズすることが、15分~24時間の範囲の時間である、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプルが生物学的サンプルである、請求項16に記載の方法。前記生物学的サンプルが、鼻洗浄試料nasalwashspecimen、鼻吸引物nasalaspirate、咽喉スワブthroatswab、血液サンプル、痰サンプルsputumsample、血球、組織サンプル、細針生検サンプルfineneedlebiopsysample、尿試料、腹腔液サンプルperitonealfluidsample、内臓液サンプルvisceralfluidsample、および胸膜腔液サンプルpleuralfluidsample、またはそれら由来の細胞からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。前記未知のサンプルが、土壌サンプル、空気サンプルおよび水サンプルからなる群から選択される環境サンプルである、請求項16に記載の方法。前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルが、以下:i該サンプル中の前記遺伝物質の単離、ii該サンプル中の問題の標的配列についての濃縮enrichment、iii該サンプル中に含まれる該遺伝物質の増幅、iv該サンプル中の該遺伝物質の標識、およびvサブトラクティブハイブリダイゼーションsubtractivehybridizationからなる群から選択されるプロセスの少なくとも1つへ供される、請求項16に記載の方法。前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプル中の問題の1以上の標的核酸が、特異的逆転写specificreversetranscription、PCR、マルチプレックスPCRmultiplexPCRおよびランダムPCRrandomPCRからなる群から選択される少なくとも1つの方法によって増幅される、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプル中の問題の1以上の標的核酸をハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルが、ランダムプライムドrandomprimed、アイソサーマルKlenowポリメラーゼベーストisothermalKlenowpolymerasebased、Φ29DNAポリメラーゼベーストΦ29DNApolymerasebased、タンデム増幅tandemamplification、マルチプレックスPCRmultiplexPCR、およびトータル増幅totalamplificationからなる群から選択される少なくとも1つのランダム増幅戦略randomamplificationstrategyへ供される、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する遺伝物質が濃縮される、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、該サンプルからのバックグラウンド核酸のサブトラクションsubtractionにより濃縮される、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、逆転写酵素サブトラクティブハイブリダイゼーションreversetranscriptasesubtractivehybridizationによって濃縮される、請求項16に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、該未知のサンプルに存在するpresenting核酸の混合物からの該標的核酸の選択的除去によって濃縮される、請求項16に記載の方法。前記検出することが、以下:i前記未知のサンプル中の問題の核酸と前記リシークエンシングDNAマイクロアレイ上の前記プローブDNAとの前記ハイブリダイゼーション応答に基づいてベースコールbasecallsを作製すること、ならびにii該ハイブリダイズされた領域の配列を、配列データベース中に存在する配列と比較することによって、対応する全長遺伝子またはゲノムフラグメントgenomicfragmentの配列を決定することによる、請求項16に記載の方法。前記ベースコールが、許容性permissiveセッティッング下でAffymetrixGDASソフトウエアによって作製される、請求項29に記載の方法。配列決定が、ResequencingPathogenIdentifierREPIソフトウエアによる、請求項29に記載の方法。前記配列データベースがGenBankである、請求項29に記載の方法。請求項16に記載の方法を行うことによる一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensのルーチン診断routinediagnosisの方法であって、前記未知のサンプルが、一般的な呼吸器病原体のルーチン診断の必要がある被検体から得られる、方法。前記未知のサンプルが身体検査の間に得られる、請求項33に記載の方法。請求項16に記載の方法を行うことによる一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensのサーベイランスの方法であって、前記未知のサンプルが、一般的な呼吸器病原体のサーベイランスの必要がある被検体から得られる、方法。一般的な呼吸器病原体のサーベイランスの必要がある前記被検体が、呼吸器病原体感染の病歴を有する、請求項35に記載の方法。請求項16に記載の方法を行うことによる1以上の生物テロ薬剤のサーベイランスの方法であって、前記未知のサンプルが、前記生物テロ薬剤のサーベイランスの必要がある被検体から得られる、方法。生物テロ薬剤のサーベイランスの必要がある前記被検体が、該生物テロ薬剤へ暴露されたことが疑われる、請求項37に記載の方法。未知のサンプル中の特定のクラスの生物種または亜種organismspeciesorsubspeciesに属する微生物の存在を検出する方法であって、ここで該方法が、以下:a請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイを提供すること;b遺伝物質を含む該未知のサンプルを、該リシークエンシングDNAマイクロアレイへ接触させること;c好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること;ならびにd該未知のサンプル中の特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物の存在を検出すること、を含む、方法。前記方法が、該方法によって同定されるDNA配列とゲノムデータベース中に存在する既知の配列との配列比較による、前記特定のクラスの生物種または亜種のアイデンティティーidentityを決定することをさらに含む、請求項39に記載の方法。前記決定することが、病原体の可能性のある供給源の法医学的評価aforensicassessmentofthepossiblesourceofpathogensを可能にするに十分な量の病原体配列を検出することを含む、請求項40に記載の方法。前記ハイブリダイズすることが、15分~24時間の範囲の時間である、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプルが生物学的サンプルである、請求項39に記載の方法。前記生物学的サンプルが、鼻洗浄試料nasalwashspecimen、鼻吸引物nasalaspirate、咽喉スワブthroatswab、血液サンプル、痰サンプルsputumsample、血球、組織サンプル、細針生検サンプルfineneedlebiopsysample、尿試料、腹腔液サンプルperitonealfluidsample、内臓液サンプルvisceralfluidsample、および胸膜腔液サンプルpleuralfluidsample、またはそれら由来の細胞からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。前記未知のサンプルが、土壌サンプル、空気サンプルおよび水サンプルからなる群から選択される環境サンプルである、請求項39に記載の方法。前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルが、以下:i該サンプル中の前記遺伝物質の単離、ii該サンプル中の問題の標的配列についての濃縮、iii該サンプル中に含まれる該遺伝物質の増幅、iv該サンプル中の該遺伝物質の標識、およびvサブトラクティブハイブリダイゼーションからなる群から選択されるプロセスの少なくとも1つへ供される、請求項39に記載の方法。前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプル中の問題の1以上の標的核酸が、特異的逆転写specificreversetranscription、PCR、マルチプレックスPCRmultiplexPCRおよびランダムPCRrandomPCRからなる群から選択される少なくとも1つの方法によって増幅される、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプル中の問題の1以上の標的核酸をハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルが、ランダムプライムドrandomprimed、アイソサーマルKlenowポリメラーゼベーストisothermalKlenowpolymerasebased、Φ29DNAポリメラーゼベーストΦ29DNApolymerasebased、タンデム増幅tandemamplification、マルチプレックスPCRmultiplexPCR、およびトータル増幅totalamplificationからなる群から選択される少なくとも1つのランダム増幅戦略randomamplificationstrategyへ供される、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する遺伝物質が濃縮される、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、該サンプルからのバックグラウンド核酸のサブトラクションsubtractionにより濃縮される、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、逆転写酵素サブトラクティブハイブリダイゼーションreversetranscriptasesubtractivehybridizationによって濃縮される、請求項39に記載の方法。前記未知のサンプル中に存在する問題の1以上の標的核酸が、該未知のサンプルを示す核酸の混合物からの該標的核酸の選択的除去によって濃縮される、請求項39に記載の方法。前記検出することが、以下:i前記未知のサンプル中の問題の核酸と前記リシークエンシングDNAマイクロアレイ上の前記プローブDNAとの前記ハイブリダイゼーション応答に基づいてベースコールbasecallsを作製すること、ならびにii該ハイブリダイズされた領域の配列を、配列データベース中に存在する配列と比較することによって、対応する全長遺伝子またはゲノムフラグメントgenomicfragmentの配列を決定することによる、請求項39に記載の方法。前記ベースコールが、許容性permissiveセッティッング下でAffymetrixGDASソフトウエアによって作製される、請求項53に記載の方法。配列決定が、ResequencingPathogenIdentifierREPIソフトウエアによる、請求項53に記載の方法。前記配列データベースがGenBankである、請求項53に記載の方法。請求項39に記載の方法を行うことによる一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensのルーチン診断routinediagnosisの方法であって、前記未知のサンプルが、一般的な呼吸器病原体のルーチン診断の必要がある被検体から得られる、方法。前記未知のサンプルが身体検査の間に得られる、請求項57に記載の方法。請求項39に記載の方法を行うことによる一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensのサーベイランスの方法であって、前記未知のサンプルが、一般的な呼吸器病原体のサーベイランスの必要がある被検体から得られる、方法。一般的な呼吸器病原体のサーベイランスの必要がある前記被検体が、呼吸器病原体感染の病歴を有する、請求項59に記載の方法。請求項39に記載の方法を行うことによる1以上の生物テロ薬剤のサーベイランスの方法であって、前記未知のサンプルが、前記生物テロ薬剤のサーベイランスの必要がある被検体から得られる、方法。生物テロ薬剤のサーベイランスの必要がある前記被検体が、該生物テロ薬剤へ暴露されたことが疑われる、請求項61に記載の方法。病原体を含有する生物学的サンプル中の病原体の相対量を評価する方法であって、以下:a請求項1に記載のリシークエンシングDNAマイクロアレイを提供すること;b該生物学的サンプルを該リシークエンシングDNAマイクロアレイへ接触させること;c好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること;ならびにd該未知のサンプル中の微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカーdrugresistancemarkerの存在および/またはアイデンティティーを定量すること、を含む、方法。前記定量することが、前記リシークエンシングDNAマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度を測定することによる、請求項63に記載の方法。前記定量することが、前記総タイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムslidingwindowalgorithmを満足する選択されるサブ配列中のベースコールのパーセンテージとして、ベースコールのパーセンテージを測定することによる、請求項63に記載の方法。前記定量することが、ResequencingPathogenIdentifierREPIソフトウエアによる、請求項65に記載の方法。Ad3、Ad3FS_navy、Ad4、Ad4vaccine、Ad4FS_navy、Ad4FS_AF、Ad5FS、Ad7、Ad7FS_navy、Ad7vaccine、Ad16、Ad1、およびAd21、ならびにそれらのフラグメントからなる群から選択されるアデノウイルス株のゲノム配列。所定の生物学的配列の同定のためにクエリーqueryへのインプットのための生物学的サブ配列を選択するためのコンピュータ実施方法computerimplementedmethodであって、以下のステップ:メモリー中に記憶された生物学的配列データからサブ配列を、プロセッサ実行プロセスprocessorimplementedprocessで選択するステップ;および該配列をクエリーへ供し、第1所定信頼水準firstpredeterminedconfidencelevelで該所定の生物学的配列を同定するステップここで、該第1所定信頼水準は選択される閾値を超えるを含む、方法。FASTA、MSF、GCG、Clustal、BLC、PIR、MSP、PFAM、POSTALおよびJNETフォーマットの1つで前記生物学的配列データを記憶することをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記生物学的配列データが、生物学的配列またはコントロール配列の1つに対応するかどうかを決定することをさらに含む、請求項69に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、以下:前記生物学的配列データ中の多数のベースコールに対応するウィンドウサイズパラメータwindowsizeparameterを選択すること;および該生物学的配列データのビューイングウィンドウviewingwindow中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること[該ウィンドウのサイズは、該選択ステップにおいて選択された該ウィンドウサイズパラメータに対応する]を含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、以下:前記計算ステップにおいて計算された前記パーセンテージが所定の閾値を満足しない場合に、前記生物学的配列中の別の数のベースコールへ前記ビューイングウィンドウをスライドさせること;および該生物学的配列中の該別の数のベースコール中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算することを含む、請求項71に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、以下:前記計算されたパーセンテージが所定の閾値を満足する場合に、前記クエリーにサブミットされたsubmit前記サブ配列として、ビューウィンドウ中のベースコールのサブ配列を選択することを含む、請求項71に記載のコンピュータ実施方法。前記選択されるサブ配列がサブミットステップにおいてサブミットされる前に、ベースコールの前記選択されたサブ配列から、無効なベースコールをトリミングtrimmingすることをさらに含む、請求項73に記載のコンピュータ実施方法。前記サブ配列と複数の所定の配列とを比較すること;および前記所定の配列の少なくとも1つに対応する比較結果を発生するgenerateことをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記比較ステップからの比較結果が、前記サブ配列と前記所定の配列の少なくとも1つとの所定レベルの対応を示す統計値を含む、請求項75に記載のコンピュータ実施方法。強度データを前記生物学的配列データと合体するincorporateこと;および少なくとも1つの標的配列の濃度を評価することをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。少なくとも1つの選択パラメータに従う前記生物学的配列データから少なくとも2つのサブ配列を検出すること;および混合物mixtureおよび組換え事象recombinationeventの少なくとも1つを検出することをさらに含む、請求項77に記載のコンピュータ実施方法。前記少なくとも2つのサブ配列が、マイクロアレイの異なる領域に対応する、請求項78に記載のコンピュータ実施方法。類似配列の混合物と異なる配列間の組換えとを識別することここで、該類似配列は、所定レベルの類似性を有するをさらに含む、請求項77に記載のコンピュータ実施方法。該マイクロアレイの第1領域からの第1シグナルおよび該マイクロアレイの第2領域からの第2シグナルを評価すること、ならびに該第1シグナルを該第2シグナルと比較して、少なくとも1つの識別パラメータdistinctionparameterを作成すること該少なくとも1つの識別パラメータは、該第1シグナルおよび該第2シグナルが混合物および組換え事象の1つを表す可能性に対応するを含む、混合物と組換え事象とを識別することをさらに含む、請求項77に記載のコンピュータ実施方法。以下:複数のテスト配列testsequencesに対応する少なくとも1つのコンセンサス配列consensussequenceを同定すること;該少なくとも1つのコンセンサス配列から前記サブ配列を選択すること;該少なくとも1つのサブ配列と少なくとも所定の配列とを比較すること;比較結果を作成すること;該比較結果と該複数のテスト配列との間の差異を計算すること;および少なくとも1つの候補コンセンサス配列candidateconsensussequenceを作成することをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記少なくとも1つの候補コンセンサス配列に従うマイクロアレイプローブを作製することをさらに含む、請求項82に記載のコンピュータ実施方法。パッチパラメータpatchparameterに従って、少なくとも1つのコンセンサス配列を修飾すること該パッチパラメータは、前記複数のテスト配列の少なくとも1つの少なくとも一部に対応するをさらに含む、請求項82に記載のコンピュータ実施方法。少なくとも1つのハイブリダイゼーションパラメータhybridizationparameterに従って、前記少なくとも1つの候補コンセンサス配列と前記複数のテスト配列との間のハイブリダイゼーションをシミュレートすることをさらに含む、請求項82に記載のコンピュータ実施方法。前記生物学的配列データが、核酸、転写モノマーtranscriptionalmonomer、転写産物、DNA、およびRNAの少なくとも1つを含む、請求項82に記載のコンピュータ実施方法。前記生物学的配列データが、曖昧配列ambiguoussubsequenceとギャップgapの少なくとも1つを含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記生物学的配列データの相対位置を計算することここで、該生物学的配列データは、蛋白質とアミノ酸の少なくとも1つを含むをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。手動Sanger配列決定manualSangersequencing、自動Sanger配列決定automatedSangersequencing、ショットガン配列決定shotgunsequencing、従来のマイクロアレイconventionalmicroarrays、リシークエンシングマイクロアレイresequencingmicroarrays、マイクロ電気泳動配列決定microelectrophoreticsequencing、ハイブリダイゼーションによる配列決定sequencingbyhybridizationSBH、エドマン分解法Edmandegradation、増幅分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonamplifiedmolecules、単一分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonamplifiedmolecules、およびナノポア配列決定nanoporesequencingの少なくとも1つによって前記生物学的配列データを得ることをさらに含む、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。前記生物学的配列データが、蛋白質配列とヌクレオチド配列の少なくとも1つである、請求項68に記載のコンピュータ実施方法。コンピュータにおける実行についてのコンピュータ可読命令computerreadableinstructionsを記憶するように構成されたコンピュータ可読記憶媒体computerreadablestoragemediumであって、該コンピュータ可読命令は、コンピュータによって実行されると、所定の生物学的配列の同定方法を実施するように構成されており、該方法は、以下のステップ:メモリーに記憶された生物学的配列データからサブ配列subsequenceを、プロセッサ実行プロセスで選択するステップ;および第1所定信頼水準firstpredeterminedconfidencelevelを有する該所定の生物学的配列を同定するために、クエリーqueryに該サブ配列をサブミットすること[ここで、該第1信頼水準は選択閾値selectionthresholdを超える]を含む、コンピュータ可読記憶媒体。所定の生物学的配列の同定のためにクエリーへのインプットのための生物学的サブ配列を選択するための装置であって、以下:メモリー中に記憶された生物学的配列データからサブ配列を選択するための手段;および第1所定信頼水準firstpredeterminedconfidencelevelを有する所定の生物学的配列を同定するために、クエリーqueryに該サブ配列をサブミットする手段[ここで、該第1信頼水準は選択閾値selectionthresholdを超える]を備える、装置。所定の生物学的配列の同定のためにクエリーへのインプットのための生物学的配列データを作製するためのコンピュータ実施方法であって、以下:メモリー中に記憶された生物学的配列データから複数の部分配列partialsequencesを、プロセッサ実行プロセスで検出するステップ;該検出ステップによって検出された各部分配列を、複数の参照配列と比較するステップ;該比較ステップの結果に基づく配列データのコンポジットセットcompositesetとして、該部分配列をコンバインするcombineステップ;ならびにクエリーにサブミットされる配列データの該コンポジットセットのサブ配列を選択し、所定の信頼水準内の該所定の生物学的配列を同定するステップを含む、方法。前記検出ステップが、以下:前記生物学的配列データをスキャンして、連続した一連の非ベースコールconsecutiveseriesofnonbasecallsの間に配置される一連のベースコールを検出すること;および該一連のベースコールを前記複数の部分配列の1つとして抽出することを含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記検出ステップが、以下:検出された有効なベースコールvalidbasecallの位置でビューイングウィンドウviewingwindowを開始すること;連続した一連の非ベースコールへ広がるように、該ビューイングウィンドウのサイズを拡大すること;ならびに該ウィンドウ表示されたwindowed一連のベースコールを前記複数の部分配列の1つとして抽出することを含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記部分配列が、有効なベースコールおよび無効なベースコールを両方とも複数含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記比較ステップが、以下:複数の部分配列の各々と前記複数の参照配列の少なくとも1つとの間の類似性の統計レベルstatisticallevelofsimilarityを決定すること[ここで、該類似性の統計レベルは、該複数のサブ配列の各々と該複数の参照配列の少なくとも1つとの間の対応レベルlevelofcorrespondenceを表す]を含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記コンバインステップcombiningstepが、以下:所定の閾値を超える前記複数の参照配列の少なくとも1つと統計レベルの類似性を有すると決定された前記複数の部分配列の各々を抽出すること;および前記複数の抽出された配列を線形的にコンバインしてlinearlycombining、配列データのコンポジットセットを作製することを含む、請求項97に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、さらに、以下:前記配列データのコンポジットセットにおける多数のベースコールに対応するウィンドウサイズパラメータwindowsizeparameterを選択すること;および該配列データのコンポジットセットのビューイングウィンドウviewingwindow中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること[該ウィンドウのサイズは、該選択ステップにおいて選択された該ウィンドウサイズパラメータに対応する]を含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、さらに、以下:前記計算ステップにおいて計算された前記パーセンテージが所定の閾値を満足しない場合に、前記配列データのコンポジットセットにおける別の数のベースコールへ前記ビューイングウィンドウをスライドさせること;および該配列データのコンポジットにおける該数のベースコール中に含まれる有効なコールのパーセンテージを計算することを含む、請求項99に記載のコンピュータ実施方法。前記選択ステップが、以下:前記計算されたパーセンテージが所定の閾値を満足する場合に、前記クエリーにおいてサブミットされるsubmit前記サブ配列として、ビューウィンドウ中のベースコールのサブ配列を選択することを含む、請求項99に記載のコンピュータ実施方法。以下のステップ:前記選択されるサブ配列が前記クエリーにサブミットされる前に、ベースコールの前記選択されるサブ配列から、無効なベースコールをトリミングtrimmingすることをさらに含む、請求項101に記載のコンピュータ実施方法。さらに、以下:前記サブ配列と複数の所定の配列とを比較すること;および該所定の配列の少なくとも1つに対応する比較結果を作成することを含む、請求項93に記載のコンピュータ実施方法。前記比較ステップからの比較結果が、前記サブ配列と前記所定の配列の少なくとも1つとの所定レベルの対応を示す統計値を含む、請求項103に記載のコンピュータ実施方法。コンピュータにおける実行についてのコンピュータ可読命令computerreadableinstructionsを記憶するように構成されたコンピュータ可読記憶媒体computerreadablestoragemediumであって、該コンピュータ可読命令は、コンピュータによって実行されると、所定の生物学的配列の同定のためにクエリーへのインプットのための生物学的配列データを作製するための方法を実行するように構成されており、該方法は、以下のステップ:メモリーに記憶された生物学的配列データから複数の部分配列を、プロセッサ実行プロセスで検出するステップ;該検出ステップにおいて検出された各部分配列を、複数の参照配列と比較するステップ;該比較ステップの結果に基づく配列データのコンポジットセットcompositesetとして、該部分配列をコンバインするcombineステップ;ならびにクエリーにサブミットされる配列データの該コンポジットセットのサブ配列で選択し、所定の信頼水準内の該所定の生物学的配列を同定するステップ、を含む、コンピュータ可読記憶媒体。所定の生物学的配列の同定のためにクエリーへのインプットのための生物学的配列データを作製するための装置であって、以下:メモリー中に記憶された生物学的配列データから複数の部分配列を、プロセッサ実行プロセスで検出するための手段;該検出手段によって検出された各部分配列を、複数の参照配列と比較するための手段;該比較手段からの結果に基づく配列データのコンポジットセットcompositesetとして、該部分配列をコンバインするcombine手段;ならびにクエリーにサブミットされる配列データの該コンポジットセットのサブ配列で選択し、所定の信頼水準内の該所定の生物学的配列を同定する手段、を備える、装置。発明の開示本発明の目的は、以下の好ましい実施形態を提供することである:本発明の実施形態において、固相支持体へ固定化された13~70ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグループのリシークエンシングDNAマイクロアレイであり、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは、参照配列referencesequenceの特定の領域をスパンするspanように選択され、該アレイのディスクリート領域discretearea例えば、タイルを占有し、そして該チップ上に平行に配置された少なくとも4セットのプライマーを含み:1該参照配列に対して正確に相補性である第1セット;および23つのさらなるセットのプライマーこれらの各々は、中央の位置のヌクレオチド以外は該第1セットのプライマーと同一であり、これは、該3セットの各々において異なり、その結果、4つ全てのヌクレオチド塩基が該アレイ上に存在する。a.この実施形態の好ましい局面において、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、25ヌクレオチドである。b.この実施形態の好ましい局面において、前記オリゴヌクレオチドプライマーによってスパンされる前記参照配列の領域は、前記マイクロアレイ表面の各々の隣接するタイルド領域について、該参照配列をn1ヌクレオチド移動する。c.この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングDNAマイクロアレイは、18×18ミクロンフィーチャーmicronfeaturesを含む。d.この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングDNAマイクロアレイは、8×8ミクロンフィーチャーを含む。e.この実施形態の好ましい局面において、タイリングtillingのために選択される前記配列は、生物属、種および亜種の非常に広いクラスを表し得る単一遺伝子またはサブ配列singlegeneorsubsequenceであるf.この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、病原体ファミリーの遺伝子型を表すプロトタイプprototypesである。g.この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、アデノウイルスのファミリーfamilyまたはグループgroupを示すプロトタイプである。h.この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、インフルエンザウイルスのファミリーfamilyまたはグループgroupを示すプロトタイプである。i.この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、個々の病原株pathogenicstrainに特有の単一遺伝子またはサブ配列である。j.この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、薬剤耐性マーカーdrugresistancemarkerをコードする。k.この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングDNAマイクロアレイは、Version1RespiratoryPathogenMicroarrayRPMVlである。l.この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングDNAマイクロアレイは、Version2RespiratoryPathogenMicroarrayRPMV2である。m.この実施形態の好ましい局面において、少なくとも1つの一般的な病原体および少なくとも1つの生物テロ薬剤biologicalterrorismagentが同一チップ上に提示される。n.この実施形態の好ましい局面において、リシークエンシングDNAマイクロアレイは、上述の局面の任意の組合せを包含する。本発明の実施形態において、a上述のリシークエンシングDNAマイクロアレイ、およびb該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に存在する前記プローブ配列への前記標的配列の特異的ハイブリダイゼーションに好適な試薬を含む、キットである。本発明の実施形態において、微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカーdrugresistancemarkerの存在を検出する方法であり、ここで該方法は、以下を含む:1上述のリシークエンシングDNAマイクロアレイを提供すること;2未知のサンプルunknownsampleを該リシークエンシングDNAマイクロアレイへ接触させること;3好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること;ならびに4該未知のサンプル中の微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカーの存在および/またはアイデンティーidentityを検出すること、ならびに5病原体の可能性のある供給源の法医学的評価aforensicassessmentofthepossiblesourceofpathogensを可能にするに十分な量の病原体配列を検出すること。a.この実施形態の好ましい局面において、前記方法は、特定の病原体種の存在を検出するためである。b.この実施形態の好ましい局面において、前記方法は、薬剤耐性マーカーの存在を検出するためである。c.この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイゼーション時間は、15分~24時間の範囲である。d.この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプルは、鼻洗浄試料nasalwashspecimen、咽喉スワブthroatswab、血液サンプル、および痰サンプルsputumsampleを含む生物学的サンプル、あるいは、土壌サンプル、空気サンプルおよび水サンプルを含む環境サンプルである。e.この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルは、以下のステップの1以上に供される:1単離、2問題の標的配列についての濃縮enrichment、3増幅、4標識、および5ハイブリダイゼーション例えば、サブトラクティブ。f.この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプル中の問題の1以上の標的核酸は、特異的逆転写specificreversetranscriptionRT、PCR、マルチプレックスPCRmultiplexPCRおよび/またはランダムPCRrandomPCRによって増幅される。g.この実施形態の好ましい局面において、問題の標的核酸をハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルは、ランダム増幅戦略randomamplificationstrategy例えば、ランダムプライムドrandomprimed、アイソサーマルKlenowポリメラーゼベーストisothermalKlenowpolymerasebased、Φ29DNAポリメラーゼベーストΦ29DNApolymerasebased、タンデム増幅tandemamplification、マルチプレックスPCRmultiplexPCR、およびトータル増幅totalamplificationへ供される。h.この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する遺伝物質は、濃縮されている。i.この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、該サンプルからのバックグラウンド核酸のサブトラクションsubtractionにより濃縮される。j.この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、該未知のサンプルに存在するpresenting核酸の混合物からの該標的核酸の選択的除去selectiveremovalによって濃縮される。k.この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、完全または部分配列相同性を有するプローブを使用しての選択的捕獲selectivecaptureによって濃縮され、増幅および前記マイクロアレイへのハイブリダイゼーションが続く。l.この実施形態の好ましい局面において、前記存在および/またはアイデンティティーを検出することは、以下による:a前記未知のサンプル中の問題の核酸と前記リシークエンシングDNAマイクロアレイ上の前記プローブDNAとの前記ハイブリダイゼーション応答に基づいてベースコールbasecallsを作製すること、ならびにb該ハイブリダイズされた領域の配列を、配列データベース中に存在する配列と比較することによって、対応する全長遺伝子またはゲノムフラグメントgenomicfragmentの配列を決定すること。i.特に好ましい局面において、前記ベースコールは、許容性permissiveセッティッング下でAffymetrixGDASソフトウエアによって作製される。ii.特に好ましい局面において、配列決定は、ResequencingPathogenIdentifierREPIソフトウエアによる2004年9月15日に出願された米国仮出願シリアル番号第60/609,918号、および2004年11月29日に出願された米国仮出願シリアル番号第60/631,460号を参照のこと。iii.特に好ましい局面において、前記配列データベースはGenBankである。本発明の実施形態において、上記Cの方法を使用することによる、生物テロ薬剤biologicalterrorismagentおよび/または一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensのルーチン診断routinediagnosisの方法である。本発明の実施形態において、Ad3、Ad3FS_navy、Ad4、Ad4vaccine、Ad4FS_navy、Ad4FS_AF、Ad5FS、Ad7、Ad7FS_navy、Ad7vaccine、Ad16、Ad1、およびAd21、ならびにそれらのフラグメントを含む、本発明の日付で知られていなかった、13アデノウイルス株のゲノム配列である。本発明の実施形態において、上記Cの方法を使用することによる、生物テロ薬剤および/または一般的な呼吸器病原体のサーベイランスsurveillanceの方法である。本発明の実施形態において、以下を含む、病原体を含有する生物学的サンプル中の病原体の相対量を評価する方法である:上述のリシークエンシングDNAマイクロアレイを提供すること;2該生物学的サンプルを該リシークエンシングDNAマイクロアレイへ接触させること;3好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること;ならびに4該未知のサンプル中の微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカーdrugresistancemarkerの存在および/またはアイデンティティーを定量すること。a.この実施形態の好ましい局面において、前記定量することは、前記チップ上のハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度を測定することによる。b.この実施形態の好ましい局面において、前記定量することは、前記トータルタイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムslidingwindowalgorithm即ち、REPIを満足する選択されるサブ配列中のベースコールのパーセンテージとして、ベースコールのパーセンテージを測定することによる。本発明の他の局面は、少なくとも1つの選択パラメータselectionparameterに従って生物学的配列データからサブ配列を選択するための、コンピュータ-インプレメンティッドバイオロジカルシークエンスアイデンティファイヤーcomputerimplementedbiologicalsequenceidentifierCIBSIシステムを提供する。該少なくとも1つの選択パラメータは、類似性サーチから意味がある結果をリターンする可能性に対応する。本発明のさらなる実施形態において、所定のセットの既知の配列に対する比較のための最適な配列またはサブ配列の自動選択のためのシステムを提供する。必要に応じて、該システムは、Nsが散在する高度にフラグメント化された配列を自動的に取りtake、そして類似性サーチから意味がある結果meaningfulresultをリターンする傾向にある比較可能なサブ配列を選択する。必要に応じて、該システムは、サブ配列を選択するためにスライディングウィンドウタイプアルゴリズムslidingwindowtypealgorithmを使用する。引き続いて、該システムは、エンドユーザへ類似性サーチからのアウトプットを自動的にリターンし、これは、与えられるベースコールセットが特定の所定の配列に対応する可能性の確率的評価probabilisticassignmentsを可能にする。本発明のさらなる実施形態において、ベースコーリングアルゴリズムbasecallingalgorithmから誘導される配列情報は、マイクロアレイハイブリダイゼーションパターンに適用される場合、テストサンプル中に存在する個々の生物学的エンティティーbiologicalentitiesを同定するために使用される。必要に応じて、マイクロアレイのリシークエンシングプローブによって決定される標的配列の配列は、類似性サーチアルゴリズムを使用してデータベースにクエリーするqueryために使用される。類似性サーチアルゴリズムとしては、与えられる標的配列がデータベース記録中の特定の配列に対応する可能性を統計的に測定するために、一般的に使用されるローカルアラインメントlocalalignment例えば、Smith-Waterman、BLASTN配列アラインメントアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されないKorfetal2003。さらに、本発明のさらなる実施形態は、少なくとも1つの標的配列がサンプル中に存在するかどうかに関して、ユーザへ類似性サーチの結果を提示する。本発明の別の実施形態において、シグナル強度データ例えば、マイクロアレイから得られるは、前記システムによって取り扱われhandled、そして前記配列データと関連する。類似性サーチのアウトプットは、ユーザへの提示のためにアセンブルassembledまたはディスティルdistilledされて、生物学的エンティティー病原体を含むが、これに限定されないが存在するか否かを伝達する。さらに、強度データは、上記アウトプットと関連しており、存在する生物学的エンティティー病原体を含むが、これに限定されないの相対存在量relativeabundancesを帰するascribe。必要に応じて、該システムは、リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された病原体の相対量の推定値量子化quantizationをエンドユーザに与える。本発明の別の局面は、配列の混合物と組換え事象を示す配列とを同定する。1つの実施形態において、前記システムは、マイクロアレイの異なるタイルド領域上のオーバーラップするoverlappingまたは相同のhomologous配列フラグメントを自動的に検出し、配列の混合物の推測inferenceを可能にする。さらなる実施形態において、前記システムは、異なるタイルド領域からの配列アウトプットは重複するのではなく、遺伝子組換え事象を推測するために使用され得る連続配列に対応することを決定する。必要に応じて、前記システムは、異なる混合物間および異なる配列間の遺伝子組換えを識別する。本発明の別の局面は、リシークエンシングDNAマイクロアレイのプロトタイプ領域prototyperegions米国仮出願シリアル番号第60/590,931号を参照のことを設計する方法を提供する。このケースにおいて、関連標的配列のセットは、マルチプル配列アラインメントアルゴリズムmultiplesequencealignmentalgorithm、例えばClustalWまたはClustal_XThompsonetal1997ThompsonHigginsGibson1994、あるいは部分的に保存された領域についての配列データベースをサーチする別の方法、例えばHMMerEddy1998を使用して比較され、このアウトプットは、アラインメントカラムにおける所定の残基位置での最も頻度の高いヌクレオチドから構成されるコンセンサス配列を作製するために使用される。該コンセンサス配列consensussequenceは、コンセンサスベースコールおよびノー-コールnocallsNsの混合物からなり、ここで、ノーコンセンサスnoconsensusは、該アラインメントカラムにおける残基位置の各々について達成され得る。必要に応じて、本発明の実施形態は、リシークエンシングDNAマイクロアレイ上に候補領域を保存されたおよび可変のヌクレオチドの許容されるバランスを有するそれらの領域を決定することによってサーチし、リシークエンシングマイクロアレイタイル領域への標的のハイブリダイゼーションを可能にするが依然として十分な配列変動性を可能にする。これは、該コンセンサスを作製するために使用される該アラインメントを含む、配列類似性サーチに基づく標的配列の同定を可能にする。代替の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、に記載されるものを含む配列ジェネレータの代替形態とタンパク質配列を形成するようにアセンブルされ得る部分アミノ酸配列に由来する。該システムの選択された実施形態は、相対位置が保存されたアミノ酸又はタンパク質配列を扱う。他の選択された実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、蛋白質合成をコードするリボ核酸RNA転写物を含む。標的核酸における混合物対組換え事象を決定するために記載されたのと類似の様式で、RNA転写物の混合物は、タイルドマイクロアレイ上においてハイブリダイズされそしてしたがってリシークエンスされ得、本発明を使用して分析され得る生データを作成し、転写物の編集および代替スプライシングによる組換えと比較して異なるRNA転写物の相対量を測定するLeipzigPevznerHeber2004。本発明のさらなる実施形態は、ヌクレオチド、転写産物、アミノ酸、またはそれらの任意の混合物に適用可能である。さらに、本発明はまた、当該分野において周知である程度まで、種々のタイプの配列データベースおよび類似性サーチアルゴリズムに適用可能である。さらに、本発明の実施形態は、配列データを作成する広範囲の方法および/またはデバイスについて適しておりまたは適応可能であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない:手動または自動Sanger配列決定manualorautomatedSangersequencing、ショットガン配列決定shotgunsequencing、従来のマイクロアレイconventionalmicroarrays、リシークエンシングマイクロアレイresequencingmicroarrays、マイクロ電気泳動配列決定microelectrophoreticsequencing、ハイブリダイゼーションによる配列決定sequencingbyhybridizationSBH、エドマン分解法およびその変形法Edmandegradationandvariantsthereof、増幅分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonamplifiedmolecules、増幅分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonamplifiedmolecules、およびノン-サイクリカル,シングル-モレキュール,リアルタイム法noncyclicalsinglemoleculerealtimemethodsShendureら、2004。上記目的は、本発明の特定の局面を強調する。本発明のさらなる目的、局面および実施形態は、本発明の以下の詳細な説明において見られる。本発明の他のシステム、方法、特徴、および利点は、以下の図面および詳細な説明の検討の際に当業者に明らかであるか明らかとなる。全てのこのようなさらなるシステム、方法、特徴、および利点は、本明細書中に含まれ、本発明の範囲中に含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。本発明およびその付随する多くの利点のより完全な認識は、それが以下の詳細な説明と組み合わせて以下の図面を参照することによってより十分に理解されるようになるので、容易に得られる。図面におけるコンポーネントは拡大する必要はなく、本発明の原理を明確に例示する際に代わりに強調が置かれる。本発明を実施する形態特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、酵素学、生物化学、細胞生物学、分子生物学、バイオインフォマティクス、および医学における当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価の全ての方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得、好適な方法および材料が本明細書中に記載されている。コンフリクトの場合、定義を含む、本明細書は、コントロールする。さらに、材料、方法、および実施例は、特に明記されない限り、例示のみであり、そして限定的であるように意図されない。DNAマイクロアレイが、診断またはサーベイランス目的のために、病原体由来の標的核酸の配列を分析するために使用され得ることは周知である。オリゴヌクレオチドプローブ配列選択、鎖長、表面上におけるポジショニング、結合の物理化学、および標識技術の効果は、過去10年間、活発な研究のトピックスである。しかし、今まで、採用されたアプローチは、高特異性で単一の認識される病原体標的配列13~25量体へ、あるいはより低い程度の特異性で病原体標的のより長いストレッチstretch70量体へ、ハイブリダイズするように特異的に設計される単一オリゴヌクレオチドプローブ13~70量体の使用を、ほぼ例外なく含んできた。これらのマイクロアレイは、スポッテッドマイクロアレイspottedmicroarraysとして一般的に知られており、しかし、スポッテッドマイクロアレイの同一コンテントcontentはまた、2次元平面表面twodimensionalplanarsurfacesに加えて他の形態で具体化され得、1つの例はビーズアレイbeadarraysであるFergusonSteemersWalt200。Affymetrixリシークエンシングマイクロアレイを使用する病原体同定およびキャラクタライゼーションの遥かに少ない説明が存在している。KozalKozalら,1996は、HIVにおける突然変異ドリフトmutationaldriftを測定し、そしてGingerasGingerasら,1998;Gingerasら,2001、およびTroeschTroeschら,1999は、リシークエンシングアレイを使用して抗生物質耐性に関連する一塩基多型SNPおよびマイコバクテリア種を同定した。WilsonらWilsonら,2002aは、リボソームRNAを使用しての細菌同定のために、および複数の生物戦争薬剤の検出のために、同一タイプのアレイを使用したWilsonら,2002b。同時病原体同定およびサーベイランスのためのリシークエンシングマイクロアレイの使用は、単一オリゴヌクレオチドアプローチに優る基本的な利点を有し、何故ならば、詳細な標的配列情報が、生マイクロアレイデータの一部として直接利用可能であるからである。定義によれば、102~104オリゴヌクレオチドプローブを有するスポッテッドマイクロアレイは、該アレイがタイリング戦略tilingstrategyで設計されていたとしても、10~1000塩基対を超える総標的配列について、僅かな配列変化を解決するresolveことができない。したがって、個々の株またはSNPレベルでの広範囲の病原体の同定を促進するスポッテッドオリゴヌクレオチドマイクロアレイはCherkasovaら,2003;Wangら,2002;Wangら,2003、専門的な機材、人材、および数日の時間を必要とする、従来のDNA配列決定技術を使用して病原体標的配列が決定されることを必要とする。したがって、本発明は、一般的に、DNAマイクロアレイ技術を使用しての、細菌、ウイルスおよび原生動物病原体ならびにビルレンスマーカーvirulencemarkersの検出および同定に関する。本発明はまた、多数の特定の病原体遺伝子型および病原体の混合物について数的検出確率numericdetectionprobabilitiesを評価するために使用され得る、所定の領域を有するリシークエンシングマイクロアレイの設計、試験、および分析に関する。さらに、それは、該マイクロアレイのための、シンプルおよびコンプレックス例えば、臨床的および環境的サンプルの両方の処理のために必要とされる方法に関する。より詳細には、本発明は、感染症因子infectiousdiseaseagentsの診断および病原体サイベーランスを含む目的のための新規のクラスのデバイスとしてのハイプルーラリティhighpluralityリシークエンシングマイクロアレイの使用に関する。特に、それは、標的ゲノム配列からの多数の数百~数千の選択されるプロトタイプ核酸配列領域典型的に、各々、250~2000塩基対を使用し、対数的により多数の数千~数万の関係がないおよび密接に関係がある株レベルの両方の細菌病原体を検出および同定する、DNAマイクロアレイに関する。より詳細には、本発明は、タイルドプローブアプローチを使用して標的核酸のリシークエンシングを可能にするように作製されるマイクロアレイの設計に関する。なおより詳細には、本発明は、105~106塩基対までの標的配列の分析を可能にする、タイルドプローブを使用するAffymetrixリシークエンシングマイクロアレイの設計に関する。特定の実施形態において、本発明は、核酸配列を検出し、そして該検出された配列を公共および私有データベースに対しての自動類似性サーチへ供することによる、多数の病原体を同時に評価するための方法を提供する。この目的は、市販の技術AffymetrixCustomSeqTMの非自明である適応によって達成される。使用されるプログラム、CustomSeqTMは、標的DNAをリシークエンスすることによる一塩基多型SNPの検出のために設計された。このいわゆるSNP検出は、以下を要求するcallsfor:1突然変異の天然に生じる頻度ヒトにおいて108塩基対当たり約1よりも遥かに低いベースコーリングのエラー率anerrorrateinbasecalling、2特異的PCRプライマーを使用してのマイクロアレイハイブリダイゼーションの前の、106ゲノムコピー/マイクロリットルの濃度の、精製した出発材料の増幅、ならびに3低頻度SNPsの存在が推定される信頼度を有するものへベースコールを限定するアルゴリズムによる、複製サンプルについてのコンビネーションおよびプロセッシングマルチプルチップ。本発明者は、ポイント-オブ-ケアpointofcare診断適用を可能にする、サンプル調製複雑性のレベルおよび時間スケールでの高多様性感染症診断および病原体サイベーランスのための総合システムへの挿入にAffymetrixリシークエンシング技術が適応され得ることを実証する。このシステムは、Affymetrix技術の意図される用途とは実質的に異なり、そしてマイクロアレイ技術の典型的な当業者に自明でなはい。現在、病原体同定へのAffymetrixリシークエンシング技術の適用のほとんどないが関連する文献記載が存在する。設計、実験、および分析観点から、本発明は、リシークエンシングを使用して、病原体キャラクタライゼーションにおける先行技術に優る実質的な利点を有する。KozalKozalら,1996は、HIVにおける突然変異ドリフトmutationaldriftを測定し、そしてGingerasGingerasら,1998;Gingerasら,2001、およびTroeschTroeschら,1999は、リシークエンシングアレイを使用して抗生物質耐性に関連するSNPsおよびマイコバクテリア種を同定した。これらのケースの各々において、可能性のある標的配列のアラインメントに基づいて、最適化された配列が、タイルのために選択された。特異的なPCRプライマーは、ハイブリダイゼーションのために標的を増幅するように設計された。未知の臨床分離株同定は、該アレイへの実験的に測定されるディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンに基づく、パターン認識アルゴリズムを使用して行われた。したがって、このアプローチは、標的配列の全長の増幅およびハイブリダイゼーションに依存し、以下に敏感amenableではない:1失われたベースコールを生じる混同非特異的結合の寄与、2低相同性によって引き起こされるギャップgapsまたは低標的濃度に起因する標的の鎖長に渡る不完全なハイブリダイゼーション、ならびに3臨床または環境サンプル由来の未知の標的配列の偏りのないnonbiasedトータル増幅によって引き起こされる弱められたハイブリダイゼーション完全性。本発明者によって提供される方法は、リシークエンシングマイクロアレイを使用する先行技術において開示されるものと同一の限定を共有しない。さらに、少なくとも1つの意図される用途のための技術実施可能性technologyenablements、即ち多数の様々な病原体種の同時検出は、CustomSeqTMRPMV1チップについてAffymetrixマイクロアレイ18×18ミクロンフィーチャーそしてRespiratoryMicroarrayVersion2RPMV2についてより高密度8×8ミクロンフィーチャーの導入で最近になってやっと行われており、それぞれ29.7kbおよび300kbがリシークエンシングのためにタイル張りされることを可能にする。しかし、本発明によって提供される最も顕著な改良点は、配列鎖長独立類似性サーチsequencelengthindependentsimilaritysearchesBLASTNでの高密度チップtheincreaseddensitychipsの使用であり、これは、タイリングtilingのために配列を選択する前に、遥かに少ない想定が成されなければならないことを提供する。さらに、鎖長独立類似性サーチBLASTNの使用は、特定の既知のサブ配列が完全にリシークエンスされるという制約を排除し、本アプローチを、標的濃度のバリエーションおよび欠けたベースコールへ導く非特異的結合からの寄与に対してより耐性resistantにする。したがって、本発明において、タイリングのために選択される配列は、単一遺伝子またはサブ配列がより広範囲のクラスの生物種および亜種あるいは、タイプ、株、変異体variants、または突然変異体mutantsを提示しrepresent得るという意味で、プロトタイプである。得られる方法は、個々の病原体および株の遺伝子型の軽微な変更に関して強くrobust、そしてタイルド領域を含む実験チップレイアウトの設計において明確には示されないかもしれない複数の候補病原体の中からの検出および有望なprobable同定を可能にする。チップレイアウトはまた、部分的に重複するredundantタイルセットこれらは、設計の間に製造業者によっておよび製造業者設計ガイドラインによって阻止された、単一病原体株内のおよび複数の類似のまたは異なる病原体タイプ間の遺伝子内および遺伝子間の両方のバリエーションを利用する。しかし、本発明者は、該重複redundancyが結果に対する信頼を上げるため、および偽陽性および偽陰性結果の可能性を最小限にするために重要であると結論した。この設計分析アプローチの利点は、ゲノムの保存および超可変領域の両方の組み込みを可能にし、グループ、タイプ、および株レベル同定を促進する。ほんの少数の文献が、微生物病原体のマイクロアレイ分析用のための包括的な増幅戦略について記載する。WangらWangら、2002は、70量体オリゴヌクレオチドアレイ上におけるハイブリダイゼーションの前に、逐次sequentialPCRおよびKlenowフラグメントベース増幅が続く、RNA病原体標的の増幅のための複数ステッププロセスを記載する。この増幅のために必要とされる技術ステップの時間および数は、明記されていなかったが、同一グループからの引き続いての論文Wangら、2003は、それは約24時間であることを報告した。増幅ステップのどれが増加された検出効率を生じたかも明記されなかった。本発明者のグループからの最近の報告はVoraら、2004、70量体オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションのための、個々でまたは組み合わせて、種々の非特異的核酸増幅技術を記載する。リシークエンシングマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのための、精製されたまたは複雑な混合物例えば、臨床サンプルにおける、DNA標的の非特異的増幅の分野における先行技術の公知の報告は、存在しない。本発明は、一般的に、いくつかの方法で、マイクロアレイによる病原体検出のための包括的な増幅genericamplificationの技術を発展させる:1それは、高密度ショート25量体Affymetrixリシークエンシングマイクロアレイへの提示のための精製されたまたは高度に濃縮された病原体核酸のトータル増幅の特別な方法を詳述し、これは、以前に記載されてもおらずまたは自明でもなく、何故ならば、本方法は、指示されるAffymetrixプロトコルから大きく逸脱しているからである、ならびに2それは、酵素的プロセス、競合ハイブリダイゼーション、およびマグネチックビーズベースサブトラクティブおよび濃縮ステップバックグラウンドを減少させるため、および引き続いてのノンバイアスのnonbiased即ち、トータル増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションの使用への新規の代替アプローチを記載する。本発明は、リシークエンシングマイクロアレイを使用することによる、広範囲の病原体同定およびキャラクタライゼーションを可能にする設計およびプロセッシング方法の特定のセットによって具現化される。詳細には、本発明は、単一アッセイにおける、非常に多数のlargemultiplicity数千の病原体の正確、高感度、かつ高信頼性同定を可能にする。本発明の実施形態において、固相支持体に固定化された13~70ヌクレオチドこの限定される範囲内の各整数値に対応するプライマー長さを使用することは可能でありそして本発明の範囲内であるが、好ましくは25ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグループのリシークエンシングDNAマイクロアレイチップであり、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは、参照配列の特定の領域をスパンするように選択され、該アレイのディスクリート領域discretearea例えば、タイルを占有し、そして該チップ上においての平行に配置された少なくとも4セットのプライマーを含む:1該参照配列に対して正確に相補性である第1セット;および23つのさらなるプライマーのセットこれらの各々は、中央の位置のヌクレオチドについて以外は該第1プライマーと同一であり、これは、該3セットの各々において異なり、その結果、4つ全ての通常のヌクレオチド塩基が該アレイ上に存在する。本発明は、さらに、最小限の核酸単離/増殖ステップを必要とする、複雑な臨床サンプルcomplexclinicalsamples例えば、鼻洗浄物nasalwashを処理するための方法を提供する。本発明は、圧倒的多数のマイクロアレイに基づく病原体検出スキームとは異なっており、何故ならば、それは、病原体遺伝的標的の実際の配列を測定するために高密度タイルドマイクロアレイを使用するからである。それは、さらに、以下の組み込みを含む、多数の重要なエリアにおいて、他のリシークエンシング病原体同定戦略と比べて独特である:1ほとんど識別可能でないかかまたは全く識別可能でない互いとのクロスハイブリダイゼーションまたは干渉を示す、異なる病原体プロトタイプ標的領域の高い多様性highmultiplicity、2特定の株のより信頼性の高い同定を可能にする、密接に関連する病原体中の高い配列重複highsequenceredundancy、3特定の病原体株の正確な同定を可能にする、あるクラスの病原体を代表する大きなタイルドセグメントのプロトタイプ領域、ならびに最も密接に関連する先行技術米国特許第6,228,575号において記載されるより制限的なタイル選択およびディファレンシャルアルゴリズムの代わりに、病原体間の組換え事象と病原体混合物との識別を可能にする、類似性サーチ例えば、BLASTアルゴリズムへの提示のための配列フラグメントを解析parseおよびアレンジarrangeするための特別に設計されたソフトウエアの使用、4有意な干渉interferenceまたはクロスハイブリダイゼーション無しに、正確で高信頼性の病原体標的リシークエンシングを可能にする、最小限に偏ったminimallybiased核酸増幅戦略、ならびに5該リシークエンシングアレイが、複雑な臨床サンプルについて最小限に偏った核酸増幅戦略と組み合わせて使用されることを可能にする、サンプルプロセッシング方法論。これらの方法の組合せは、24時間以内、しかし好ましくは4時間以内、より好ましくは2時間以内、最も好ましくは30分以内での1人の有資格技術者qualifiedtechnicianによる、臨床サンプル由来の非常に多様なhighmultiplicity病原体の同時検出および同定を可能にする。したがって、その実施形態に起因して、本発明は以下をサポートする:aサンプルコレクションの数時間内の臨床セッティングにおける感染のルーチン診断、b希少な感染事象infectiousevent例えば、予期されない病原体、抗生物質耐性パターンまたは生物戦争薬剤biologicalwarfareagentについての同定のための該サンプルの同時インタロゲーションsimultaneousinterrogation、cルーチン分子病原体サーベイランス、dワクチン品質管理、ならびにe天然の遺伝的変異の結果として病原体の遺伝的変化、薬物治療、意図的操作intentionalmanipulation、または他の事象の、モニタリング。高密度リシークエンシングマイクロアレイ高密度マイクロアレイHighdensitymicroarraysHDMは、DNAオリゴマーのライト-ディレクテッドコンビナトリアル合成lightdirectedcombinatorialsynthesisによって製造されるKozalら、1996。これらの部位において合成されるDNAオリゴマーは、20~30塩基の鎖長を有する。高分解能半導体フォトレジストを使用する方法への引き続いての改良を通じて、Affymetrixは、RPMV1において実証されるものよりも10~100倍高いプローブフィーチャー密度を可能にする、1μm2に近づく分解能を有する個々のフィーチャーを有するHDMの製造を実証した。今まで、病原体同定に関するHDM設計は、タイリング戦略に基づいてきた。したがって、等しい鎖長の4個のプローブが、センスおよびアンチセンスの両方向で、各塩基について合成され、合計で8個の25量体プローブが所定の参照配列における各塩基対について使用されることを必要とする。各方向センスおよびアンチセンスにおける1個のプローブは、参照配列を正確に相補し、一方、残り3個は、インターロゲーションされるinterrogated塩基の位置に単一塩基ミスマッチsinglebasemismatchを有する。したがって、タイルドHDMtiledHDMは、効率的に、標的核酸がリシークエンスされるのを可能にし得る。このように、未知の標的のベースコールは、4個の可能な塩基位置のうちの1個タイルド25量体プローブの第13位で変化されたあらゆる4個の可能性のある塩基対のうちの1個の各々でインターロゲートされ、該アレイを横断する対応の位置からの標的配列の直接読み出しを可能にする。CustomSeqアレイの場合、GCOSバージョン1.1ソフトウエアは、生イメージ.DATファイルを単純化したファイルフォーマット.CELファイルへリデュースするreduceために使用され、強度を対応するプローブ位置の各々へ帰属する。最後に、GDASバージョン2.0ソフトウエアが、ABACUSCutlerら、2001アルゴリズムの埋め込みバージョンembeddedversionを適用するために使用され、センスおよびアンチセンスプローブセットについてのそれぞれの強度を比較して、正しいベースコールの推定値を作製する。GDASからの利用可能なエクスポートファイルタイプの1つは、リシークエンシングアレイの各タイルド領域について作製されるFASTAフォーマット化ベースコールである。上述のタイプのHDMは、HIVを含む、培養微生物を使用する一連のインビトロ実験において、病原体種を同定しそして薬剤耐性付与突然変異drugresistanceconferringmutationsを検出するために使用されてきたKozalら、1996。TroeschらTroeschら、1999は、HDMを設計し、54の異なるもの54differentを識別し、Mycobacterium種およびMycobacteriumtuberculosisリファンピン耐性を検出した。65,000オリゴマープローブのタイルドアレイが使用され、15のリファンピン耐性M.Tuberculosis株および27のマイコバクテリア種の70の臨床分離株を正確にリシークエンスした。より最近では、F.tularensisおよびY.pestisの配列特異的同定が、タイルドHDMを使用して環境サンプルにおいて実証されたWilsonら、2002b。これらの一般的なアプローチは、両方とも、グラウンドトゥルースgroundtruthコントロール測定に基づく特異的ハイブリダイゼーションパターンに依存する。さらに、これらの著者らは、6桁の大きさで変動し得る出発濃度について、密接に関連するcloselyrelatedかまたは予期されないunanticipated生物に対して、どのように定量比較が行われ得るかについて方向を提供していない。アレイタイプ本発明は、AffymetrixCustomSeqリシークエンシングマイクロアレイを使用して開発される。リシークエンシングマイクロアレイの議論については、当業者はU.S.6,228,575へ向けられる。しかし、本発明は、その特定の製造戦略を使用して作製されるマイクロアレイに概念的に限定されない。原理的には、リシークエンシングは、このアプローチを可能にするに十分なフィーチャー密度を有するマイクロアレイを製造することが出来るいかなる技術をも用いて記載される規模で行われ得る。理論的には、これは、オリゴヌクレオチド印刷技術を使用して達成され得るが、それは、フォトリソグラフィーアプローチを使用して達成される可能性がより高い。Affymetrixリシークエンシングチップは、各ステップに対応する別個のマスクを使用する逐次リソグラフィーステップに基づくが、代替アプローチは、マスクレスリソグラフィーAlbertら、2003;Nuwaysirら、2002を使用し得るか、またはナノリソグラフィー法Ginger、ZhangおよびMirkin、2004による。より一般的には、標的配列を測定する目的のために複数のオリゴヌクレオチドプローブを作製するいかなる方法も適用可能であり、2次元フォーマットでないビーズアレイbeadarraysでさえ適用可能であるFergusonら、2000。プローブ自体は、DNAの変形物variants、即ちRNAまたはオリゴマーペプチド-核酸oligomericpeptidenucleicacidsPNAから構成され得る。プローブは、酵素消化に感受性にされ、次いで、引き続いての操作に従うsubjecttoようにされ得る。好ましい実施形態において、プローブは、dTTPの代わりにdUTPを組み込み、それらをウラシル-DNA-グリコシラーゼに感受性にする。これは、標的の捕獲に続く選択的分解にそれらを敏感にするamenableto。さらに、本発明の範囲内において、RNAを固定化しそしてその相補配列認識を得ることも可能である。RNAの固定化は、RNAの化学的安定化を必要とする。より一般的な意味において、プローブは、引き続いての化学処理ステップに対してそれらを多少感受性にする化学的に修飾された核酸から作製され得る。アレイ設計RPMV1マイクロアレイを使用して、本発明は、特定のハイブリダイゼーションパターンが特定の病原体同定のために必要とされることを想定することなく、多種多様の特定の病原体株を同定するタイルドプロトタイプ配列の能力を示す。現在の装置において、タイルド領域のためのプロトタイプ、特に、アデノウイルス4、5、および7についてのものが、それぞれ、アデノウイルスサブグループE、C、およびBを代表するために経験的に選択された。該設計へのより好ましくそして体系的なアプローチは、コンセンサス配列を作製するために、複数の配列アラインメントの使用を含み、ここで、コンセンサス配列は、該アラインメント位置で最も頻度の高い塩基を提示するものと定義される。好ましい実施形態において、該アラインメントアルゴリズムは、個々の病原体株からの標的遺伝子配列または病原体のグループもしくはファミリーについて、階層的系統樹hierarchicalphylogenetictreeを作製する。コンセンサス配列は、好適なアルゴリズムLee、2003を使用して、先ず、それらの距離指標が閾値内に入る、該系統樹における各節nodeまたは節のグループのメンバーについて形成される。次いで、実際の標的配列が、該コンセンサス配列と個々に比較され、そして該コンセンサス配列によって規定されるタイルドマイクロアレイ領域へのハイブリダイゼーションの効果が、シミュレートされる。塩基の挿入または欠失のような既知の効果、ならびにオリゴヌクレオチドプローブ領域内の複数の塩基置換の効果は、該シミュレートされるハイブリダイゼーションについてのルールを規定する。得られるハイブリダイゼーションおよびベースコールパターンの引き続いての分析は、次いで、所定の範囲の病原体についてのプロトタイプとして機能することについての提案されたタイルの適合性を示す。プロトタイプ領域の最も好適なセットが所定のセットの病原体の中で最も適切なセットが、病原体の与えられたセットのカバレージcoverageのために規定されるまで、このプロセスは反復される。1つの非常に好ましい実施形態では、このプロセスは、リシークエンシングマイクロアレイの全体的な物理的次元の最大の縮小、そしてしたがって、マイクロアレイ当たりの製造コストの最大の削減を生じさせる、チップ上における空間使用の効率を最大限にするために使用される。1つの好ましい実施形態において、リシークエンシングマイクロアレイは、該リシークエンシングアレイをキューするqueueために最初に使用される別のそれほど複雑でない固相捕獲デバイスアレイ、ゲル、またはその他と組み合わせて設計される。例えば、多数の長いオリゴヌクレオチドプローブで構成されるアレイは、病原体のファミリーにおける保存配列を認識することによる、病原体の検出のために最初に使用される。次いで、該リシークエンシングアレイは、該初期アレイ上の保存プローブと結合された可変領域をインターロゲートするために使用され得、該病原体についての詳細な配列情報を提供する。非常に好ましい実施形態において、サンプル調製は、固相捕獲デバイスとリシークエンシングマイクロアレイの両方について共通である。なお別の好ましい実施形態において、前記初期アレイは、リシークエンシングマイクロアレイへの提示のために、単離され次いでノンバイアス増幅技術を使用して増幅される標的を捕獲するために使用される。意図される用途のための全体的な設計哲学本発明は、有効な生物兵器防衛サーベイランスおよびオペレーショナルメディスンシステムoperationalmedicinesystemの一部として、進歩した診断プラットフォームadvanceddiagnosticsplatformを設計し、製造し、評価し、立証しそして一体化するために、種々の公共および/または私有ソースからの病原体ゲノム情報を利用する。感染症のルーチン診断、最も特に感染性呼吸器疾患の診断において有用性が見出された、広く流通した装置の採用により、該システムが最も効率的に行われることは、theEpidemicOutbreakSurveillanceEOSプログラム生物兵器防衛モデルの不可欠な面であるtheDefenseSciencesBoardSummer2000StudyReportおよびtheHealthSciencesBiodefenseSystem最終報告書を参照のこと。該デバイス例えば、マイクロアレイが、感染症、最も特に呼吸器感染症の診断、管理およびサーベイランスへの従来のアプローチのコスト効率の良い代替案を提供することが重要である。同様に、該デバイスが設計および分析情報科学でサポートされること、ならびにそのデバイスからの決定品質情報decisionqualityinformationが、種々のケア提供者careproviders、公衆衛生職員publichealthofficialsおよび意思決定者decisionmakersによって伝達可能かつ解釈可能であることを確実にすることが、等しく重要である。したがって、本発明の重要な目的は、該デバイス例えば、マイクロアレイが、ヘルスケア提供者、公衆衛生職員および意思決定者間での自動双方向データ共有automatedtwowaydatasharingを提供するローカルポイントオブケア診断デバイスlocalpointofcarediagnosticdeviceから構成される一体化システムの重要なコンポーネントとなることであるこれは、キューqueueにあるビジネスモデル特許への相互参照であるかもしれない。本明細書中で記載される本発明は、少なくとも2つの様式でこの役割を満たすかもしれない:1アレイサイズの減少即ち、より低いコスト、プロセス自動化、およびリシークエンシングアレイを処理するためのポータブルハードウエアの利用可能性により、本発明は、ポイントオブケアデバイス自体の目的となり得る、ならびに2より低いコストまたは容易に自動化されるマイクロアレイ代替物の場合において、該リシークエンシングアレイは、診断/サーベイランスパイプラインにおいてより高いエシュロンコンポーネントecheloncomponentであり得る。後者のケースにおいて、より低コストの代替デバイスは、初期サンプルプロセッシング、病原体標的濃縮、増幅、ポイントオブケアでの意思決定情報を与え、一方、リシークエンシング能力は、必要に応じてサンプルのより詳細なインターロゲーションを促進することによって、引き続いての試験能力を提供する。リシークエンシングマイクロアレイチップ設計のための一般的な戦略本発明によれば、リシークエンシングマイクロアレイチップを設計するプロセスは、以下によって行われる:少数の理想的には1つの病原体に対してそれらをユニークuniqueにする、あるいは高度に保存されている[それらが科familyまたは属genusレベルの多くのタイプの微生物種を検出することを可能にさせる]、あるいは中程度に保存されそしてプロトタイプ領域として選択される、配列特性を有する病原体ゲノム配列を選択すること。プロトタイプ領域は、微生物の種のグループに渡って中間のレベルの配列相同性を有し、そして効率的なハイブリダイゼーションと、病原体種のサブタイプのほとんどまたはすべてのユニークな同定との両方を可能にする。リシークエンシングタイルのレイアウトについての設計戦略は、類似配列のアラインメントおよびチップへのタイリング用コンセンサスプローブ配列の適用を利用することを含む。コンセンサス配列は、選択される病原体のうちのどれとも同一でないかもしれないが、複数の類似の病原体ゲノムと相互作用する。実際の病原体ゲノム配列とコンセンサス配列の完全および不完全マッチングのパターンは、診断的識別力を提供する。本発明の特定の実施形態において、サンプル例えば、部分的に精製されたサンプル、精製サンプル、濃縮サンプル、生物学的サンプルなど中に存在する病原体の同定および命名designationを可能にするリシークエンシングマイクロアレイの設計のための一般的なプロトコルが提供される。この設計および検証プロトコルの種々の局面は、下記の6フェーズにおいて具体化される。フェーズ1:病原体同定:a.病原体リスト例えば、アデノウイルス、インフルエンザ;化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes―病原体専門家またはパブリックドメインから提供されるb.属/種新規の病原体、即ち、コロナウイルスの重症急性呼吸器症候群SARS変異体c.種/亜種疫学的追跡;法医学d.病原体ユニークセグメントuniquesegmentsクロスハイブリダイゼーション問題e.遺伝シフト/ドリフトgeneticshiftdriftの問題例えば、インフルエンザ、HIVf.薬剤耐性マーカーg.病原性関連遺伝子またはビルレンスマーカーvirulencemarkers診断および予後目的に有用h.遺伝子工学形質geneticallyengineeredtraitsについてのマーカーi.プラスミドDNA配列Bluescript、PUCなどi.複数のクローニング部位ii.薬剤耐性マーカーアンピリシン、カナマイシン、ペニシリンなどまたはAmp、Kan、PBPなどとして列挙され得るiii.トキシンボツリヌス菌;リシンなどフェーズ2:サンプル供給源に関連する病原体同定a.一般的な呼吸器病原体および近親物closerelativesb.生物脅威薬剤Biothreatagents:疾病対策センターCentersforDiseaseControlによって同定されるc.以下のバックグラウンドまたは共生生物の考慮:i.臨床サンプル鼻洗浄物、スワブswab、糞などii.媒介動物Vectors例えば、蚊iii.環境水、食物、土壌フェーズ3:遺伝子同定病原体設計と関連する最も複雑な問題a.配列相同性病原体同一性に対してa.新規または予期されないものの高度に保存された属/種同定同定i.新規/予期されない生物を同定する1.キメラ細菌遺伝子交換2.遺伝シフト/ドリフトgeneticshiftdrift変異体即ち、インフルエンザ3.人工ii.複雑な病原体ファミリーを識別する1.ライノウイルス多くの異種disparate変異体b.超可変領域に対してより保存されていないLessconservedtohypervariable種/亜種c.病原体特異的配列セグメントPathogenuniquesequencesegmentsクロスハイブリダイゼーションi.トータル増幅アプローチについて潜在的に重要b.機能的配列病原性および患者管理に対してa.共生微生物における薬剤耐性遺伝子b.病原性関連遺伝子i.トキシン遺伝子ii.伝播性感染性関連遺伝子iii.病原性島iv.ビルレンス因子c.他の宿主-病原体相互作用遺伝子i.免疫応答ii.腫瘍形成Tumorogenesisiii.DNA修復フェーズ4:遺伝子選択どの配列がチップ上に実際に配置されるべきかa.遺伝子アクセッション番号を同定するa.コンプリート遺伝子Completegeneb.配列をフランキングするためのflanking病原体ゲノムコントロールc.入手可能な最も最近/一般的な変異体i.迅速に進化する病原体インフルエンザについて特に重要b.BLASTサーチ:包含/除外基準a.ヒト配列相同性除外基準b.関連病原体配列i.可能性のある除外/アノテーション基準ii.>90相同性の場合、配列は一度だけデポジットされる必要がある1.そのまま同定するおよび注釈をつけるためにコンセンサス配列を使用するiii.病原体特異的遺伝子/配列を同定するa.実際的な問題a.細菌におけるホリゾンタル遺伝子トランスファーHorizontalgenetransfer問題b.病原体の遺伝子のコピーの数c.ヒト配列との配列相同性クロスハイブリダイゼーションd.より少ない病原体種との配列相同性即ち、Bacillus;天然痘[pox]フェーズ5:RPMチップ優先順位付けa.チップリアルエステートrealestateを規定する提示されるトータル配列a.標的遺伝子タイルサイズi.タイルとアクセッション番号を関連付けるii.コンセンサス配列とアクセッション番号を関連付けるb.優先順位付け基準について主目的に言及する。重要な問題は以下を含む:a.標的とされた集団population、地理的な位置、季節および他の疾患伝染因子に依存する病原体の普及b.臨床、オペレーショナルoperational、および公衆衛生関連性c.チップ機能性問題:i.混合病原体ii.エンドユーザへのデータアノテーションおよびプレゼンテーションフェーズ6.マイクロアレイ検証:a.コントロールを設計するa.ネストティッドNestedプライマーセット:i.アウタープライマーセット:ディベロップコントロールDevelopcontrolsii.インナープライマーセット。アッセイポジティブコントロールiii.コントロールおよびRPM配列は、100配列マッチであるべきであるb.発現されるコントロールクローンControlclonesdevelopedc.マッチについて確認されたコントロールクローン配列Controlclonessequencevalidatedformatchb.ディベロップ病原体チップアノテーションスキーマDeveloppathogenchipannotationschema:a.乏しいハイブリダイゼーションの部位i.乏しいシグナルii.正しくないシグナルb.クロスハイブリダイゼーションの部位i.ヒトクロスハイブリダイゼーションii.他の病原体特に、生物テロ薬剤およびトキシンc.配列の特性のレベルi.亜種/変異体を同定し得るマーカー1.法医学データベースからのベースを形成Formsthebasisofaforensicsdatabaseii.属または種のみを同定し得るマーカーiii.発見される場合、新規の変異体マーカーの同定Identificationofnewvariantmarkersasdiscoveredc.チップ立証実験フレームワークChipValidationExperimentalFramework:a.クロスハイブリダイゼーション領域を検出するためのヒトハイブリダイゼーションb.プラスミドベースの立証スキーマPlasmidbasedvalidationschema:i.PCR感度についてのプラスミドを滴定するTitrateplasmidforPCRsensitivityii.RPM検出感度について滴定するTitrateforRPMdetectionsensitivityiii.変化される濃度でのベースコール精度を推定するEstimatebasecallingaccuracywithvariedconcentrations1.エラーに注釈をつけるAnnotateanyerrorsc.培養物ベースの立証スキーマCulturebasedvalidationschemai.ウイルスの滴定1.核酸単離の効率2.チップハイブリダイゼーション感度/特異性a.トータル増幅感度/特異性b.PCR比較3.滴定された培養物からのチップハイブリダイゼーション感度4.培養物配列の配列立証d.複雑な媒体へのスパイクされた病原体Spikedpathogensintocomplexmediai.溶液へのウイルスの滴定Titrationofvirusintosolutionii.チップへのハイブリダイゼーションバックグラウンド干渉iii.培養病原体とは異なる場合、ウイルスの配列立証e.コンプレックスマトリクスcomplexmatricesからの標的濃度の推定i.鼻洗浄物ii.綿棒Cottonswab1.鼻スワブNasalswab2.咽喉スワブiii.溶液中のウイルスの安定化1.鼻洗浄物2.スワブiv.ウイルス溶液の凍結/解凍効果v.標的病原体の配列立証。以下の表表1は、一般的な呼吸器病原体の検出および診断のために設計される場合に、本発明のコンテクスト内で使用され得る、病原体ウイルスおよび細菌の両方の好ましいしかし限定的でないセットを示す:生物テロの薬剤のためのビルトインサーベイランス能力builtinsurveillancecapabilityを備える広く普及した呼吸器診断デバイスの意図される用途について、チップ上への包含のために選択される病原体のリストはまた、米国疾病対策センターUSCentersforDiseaseControlCDCカテゴリーA、BおよびC生物テロ薬剤から選択されるものを含む。これらは最も顕著にあり、以下を含むが、これらに限定されない:CDCカテゴリーABacillusanthracis標的:致死因子、防御抗原YersiniapestisSmallpox小痘瘡FrancisellatularensisViralhemorrhagicfeversフィロウイルス[例えば、Ebola、Marburg]およびアレナウイルス[例えば、Lassa,Machupo]CDCカテゴリーBBrucellaabortus2308B37,BrucellamelitensisF6145,BrucellasuisA44BurkholderiamalleiGlandersBurkholderiapseudomalleiMeliodosisPsittacosisChlamydiapsittaciTyphusfeverRickettsiaprowazekiiViralencephalitisアルファウイルス[例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎]CDCカテゴリーCエマージング感染症,例えば、ニパウイルスおよびハンタウイルス。これらの因子agentsの完全なかつ更新されたリストは、CDCウェブサイトhttp://www.cdc.gov/において見られ得る。本発明の例示のために、2つのリシークエンシングマイクロアレイチップRPMV1およびRPMV2をここで下記に説明する:リシークエンシング呼吸器病原体マイクロアレイバージョン1RPMV1チップRPMV1は、18×18ミクロンの個々のプローブフィーチャーサイズを有する高密度Affymetrixマイクロアレイ製造プロセスを使用して作製した。この密度で、29.7kbのトータル病原体標的配列を、リシークエンシングのためにタイリングした。配列の任意コレクションにおけるSNP検出のために意図された、Affymetrix製品CustomSeqのプレプロダクションベータテストpreproductionbetatestの一部として、製造は行われた。以下の全体的設計戦略をRPMV1のために使用した:AffymetrixCustomSeq設計プロトコルに従った。マイクロアレイ分析のために標的を非特異的に増幅するためのプロジェクトコンソーシアム内で様々な進行中の努力があった間、本発明者は、従来の特異的プライマーペアPCRアンプリコンをインターロゲートし得るアレイ上へ配列をタイリングするためにあらゆる努力をした。可能な場合は常に、タイルドマイクロアレイプローブセットでインターロゲートされる可変領域をフランキングしたflanked保存配列についてプライマーペアは開発または適応された。これは、該能力が以下をすることを可能にした:1存在するハードウエアプラットフォーム例えば、RAPIDLightCycler,IdahoTechnologiesで直接増幅すること、2イミーディエートホライズンimmediatehorizon上にある包括またはトータル増幅戦略での比較のためのコントロール測定値を提供すること。一般的に、本発明者の戦略は、ハイブリダイゼーションパターンを生物の特定株とマッチさせ、そして病原性および薬剤耐性に対応する配列中の僅かな変化を検出することであった。アデノウイルス二本鎖DNAウイルス4、5および7型を、それぞれ、E、CおよびBサブグループについてのプロトタイプと指定した。詳細には、本発明者は、プロトタイプがタイルされた領域上のリシークエンシングは、サブグループメンバー間での僅かな配列変化の検出および同定を可能にすると仮定した。3つの標的遺伝子領域を、具体的にはE1A、ヘキソンおよびファイバー遺伝子から選択した。しかし、タイルのいずれのどの領域またはどのセクションがユニークなunique同定を可能にするかは、仮定も予想もされなかった。13のアデノウイルスゲノムが、theEpidemicOutbreakSurveillanceプログラムの一部として、完全に配列決定された。これらについての名称、アクセッション番号およびソースを、実施例セクションの表6に列挙する。複数配列アラインメントが行われ、縮重プライマーの単一セットで複数のアデノウイルスを増幅するために使用され得る保存領域によってフランキングされたflankedE1A、ヘキソンおよびファイバー遺伝子の可変領域が決定されたLinら、2004。E1A、ヘキソン、およびファイバー遺伝子についてのこれらの共通領域は、呼吸器疾患と関連する3プロトタイプアデノウイルスの各々について得られた:7サブグループB、5サブグループC、および4サブグループEを、RPMV1マイクロアレイ上のタイリングのために、29.7kbトータル病原体標的配列の一部としてAffymetrixへサブミットした。アデノウイルス分類学:サブグループB:3,7,11,14,21,34,35および50サブグループC:1,2,5,および6サブグループE:4。本発明者は、それらがプロトタイプサブグループの代表、7型、5型および4型それぞれ、サブグループB,C,およびEについて3つの遺伝子E1A,ファイバーおよびヘキソンをアレイ上にタイルした場合、それらは、それらの配列差異へ位置するハイブリダイゼーションパターンの変化によって、完全に配列決定されたタイプ上記に列挙のいずれかを同定し得るという仮説を立てた。負-極性negativepolarity一本鎖RNAウイルスssRNAである、インフルエンザAおよびBウィルスを、血球凝集素HAノイラミニダーゼNAおよびマトリクスMについてのプロトタイプ領域で示された。これらの遺伝子は、インフルエンザAの3タイプH1N1,H3N2およびH5N1およびインフルエンザのBについて表わされた。インフルエンザは、プロトタイプモデル系の最良の例の1つであり、何故ならば、数千とまではいかないまでも数百のインフルエンザ株が部分的に配列決定されており、そして大部分が血球凝集素およびノイラミニダーゼセグメントについて配列決定されているためである。プロトタイプインフルエンザHA、NAおよびM遺伝子を、世界保健機関WorldHealthOrganizationによって北半球について推薦される3つのワクチン株に同一または密接に関連する株から選択した:A/ニューカレドニア/20/99/H1N1A/モスクワ/10/99/H3N2B/香港/330/2001。これらの配列は、LosAlamosNationalLaboratoryインフルエンザインターネットデータベースから公に利用可能であった。本発明者は、プロトタイプタイル領域上において未知のインフルエンザAまたはBについて作製される配列コールは、それが類似性サーチベースクエリングqueryingを可能にするに十分に類似している場合、その標的の同定を可能にすると仮定した。RPMV1の残りは、種々の一般的な呼吸器病原体についてのタイルでポピュレートしpopulated、第1セットは以下のウイルスである:ライノウイルスAposSSRNAライノウイルスBposSSRNAコロナウイルスposSSRNA;DNA段階無しnoDNAstageパラインフルエンザnegSSRNARSVnegSSRNA。これらのウイルス病原体は、アデノウイルスおよびインフルエンザと比較して、比較的少ない利用可能な配列を有し、多数の関連株を同定するためのプロトタイプ配列の使用のための類似の試験を行う努力を複雑にした。一般的な細菌病原体もまた選択した:化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenes肺炎マイコプラスマMycoplasmapneumoniae百日咳菌Bordetellapertussisクラミジア肺炎病原体Chlamydiapneumoniae肺炎連鎖球菌Streptococcuspneumoniae髄膜炎菌Neisseriameningitidis。さらに、以下のプラスミド付与plasmidconferred抗生物質耐性遺伝子を、RPMV1チップ上に提示した:ermAermBermTRマクロライドーエフラックス決定基macrolideeffluxdeterminantmefA。以下の生物脅威薬剤biologicalthreatagentsもまた、RPMV1チップ上に含ませた:炭疽菌Bacillusanthracis標的:致死因子、防御抗原ペスト菌Yersiniapestis痘瘡Smallpox小痘瘡野兎病菌Francisellatularensisウイルス性出血熱Viralhemorrhagicfeversフィロウイルス[例えば、Ebola、Marburg]およびアレナウイルス[例えば、Lassa,Machupo]。AffymetrixCustomSeqプロトコルを参照によって規定されるハイブリダイゼーションコントロールに加えて、標的単離、逆転写RTおよびcDNA/DNA増幅を確認するための内部プロセスコントロールを含めることが必要であると考えられた。したがって、本発明者は、植物シロイヌナズナArabidopsisthaliana由来の遺伝子挿入物を含有する特別なベクターを含ませYangら、2002、そしてそのベクターからのいくつかの遺伝子挿入物についてアレイ上にタイル領域を提供した。アデノウイルスおよびインフルエンザ以外のすべての標的について、本発明者は、診断PCRによって領域を含む遺伝子について公開文献例えばNCBIGenBankから標的を選択し、そしてその診断領域またはその領域を含むより大きなコード領域をタイルした。RPMV1のための全ての標的遺伝子、PCRプライマー部位、およびプライマーについて全リストを、表8下記および添付の配列表に示す。タイリングおよびチップ作製のためにサブミットされた配列を、表7および添付の配列表に要約する。しかし、本発明は、上記に列挙される特定の配列および/または微生物細菌またはウイルスに限定されない。意図されるフィールドテストの特定の要件を満たすように前記病原体チップを調製することは、十分に当業者の範囲内にある。明らかに、当業者は、上記の一般的なプロトコルによって努力が大いに助けられる。リシークエンシングマイクロアレイチップバージョン2RPMV2チップRPMV2は、8×8ミクロンの意図されるフィーチャーサイズを有する高密度Affymetrixマイクロアレイにおいて構築される。この密度で、約300kbの標的配列情報が、リシークエンシングのためにタイルされ得る。一般的なレイアウト戦略を表2~4下記に記載する。RPMV2設計は、約10倍のRPMV1の配列内容物を可能にし、そしてしたがって、非常に多数の病原体の包含を可能にし、これは、RPMV1上に存在する全ての病原体、多数の他の呼吸器病原体、および実質的に全セットのCDCカテゴリーA、BおよびC生物テロ薬剤の、拡張された提示を含んだ。RPMV2内容物の全リストを、実施例8に提供する。RPMV2設計は、化膿性連鎖球菌Streptococcuspyogenesについてemmタイプのような、プローブの包含を可能にすることによって、分子疫学能力を拡張した。この特徴は、疫学者公衆衛生専門家に、見込みのある指標疾患ケースlikelyindexdiseasecaseを決定する能力、および囲まれた集団刑務所、寮、老人ホーム、兵舎などにおけるタイプされた病原体の伝播を研究する能力を提供する。これらのプローブはまた、該集団における病原体毒性および疾患の臨床提示を予測するかもしれない。表示された病原体の数はまた、マイクロアレイの単位領域当たり増加したプローブで拡張され得る。本発明のチップは、高フィーチャー密度を利用し、単一臨床試料中に存在するかもしれない非常に多くの候補病原体を同時に調査probeおよび識別する。遺伝子発現マーカーgeneexpressionmarkersが、ゲノムマーカーgenomicmarkersと同一様式で該アレイ上に概念的にタイルされ得ることもまた、重要である。したがって、病原体転写物multiplexPCRは、調査されるprobed遺伝子の保存領域フランキング種特異的可変領域conservedregionsflankingspeciesspecificvariableregionsを標的にするように選択された一連のプライマーを設計することによって、特異的PCRプロトコルで導入されるシステミックバイアスsystemicbiasを減少させるに役立つ。本出願の実施例において、E1A、ファイバーおよびヘキソン遺伝子についての戦略が示される;しかし、当業者は、広範囲の種にわたって保存されかつ依然として種特異的可変領域を有するいかなる遺伝子をも標的にするようにこの戦略を拡張し得る。このために、候補遺伝子および特異的領域保存および可変は、全体的または局所的相同性サーチ即ち、配列アラインメントによって容易に同定され得る。出願人は、標的およびプライマー設計の選択についての一般的な戦略を以下に記載する:本明細書中で使用される場合、用語プライマーそして当該分野において一般的に認識されるは、ポリヌクレオチドに相補的であるプライマー伸長産物primerextensionproductの合成が触媒される条件下に置かれると、相補鎖に沿ってポリヌクレオチド合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドをいう。典型的なポリヌクレオチド合成条件は、好適な緩衝液緩衝液は、補因子であるか、またはpH、イオン強度などに影響を与える代替物substituentsを含む中における4つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシドアナログおよび重合を触媒する1以上の酵素例えば、DNAポリメラーゼおよび/または逆転写酵素の存在、ならびに好適な温度を含む。特異的PCRを促進するために、増幅プライマーは、典型的に、13~35ヌクレオチド、好ましくは20~25ヌクレオチドの範囲である。プライマーのヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションを促進するために、標的配列に対して十分な配列相補性を有さなければならない。相補性の程度は主にプライマーの長さに依存するが、相補性の程度は、一般的に、少なくとも80、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも95である。ランダムPCRプロトコルについて、好ましいプライマー鎖長は、6~10ヌクレオチドである。配列は、理想的には、6量体26パーミューテーション~10量体210パーミューテーションの全てのパーミューテーションpermutationsを含む。プロトタイプ領域設計の場合について、好ましいシナリオは、標的遺伝子の可変領域をフランキングするflank保存プライマーを有することである。これは、アデノウイルスについてのRPMV1においてそうであり、そしてインフルエンザAについて本発明者によって採用された血液凝集素HAノイラミニダーゼNAおよびマトリクスMについてインフルエンザAセグメントの保存された3’および5’末端を使用して。このコンセプトは、多数の病原体タイプのいずれにも拡張され得、何故ならば、高度に保存された領域は自然においてユビキタスであり、そして縮重プライマーは、それらの配列について設計され得る。標的がプロトタイプとして選択されない場合、チップ上のリアルエステートrealestateの量は、プロトタイプ領域と比較して大幅に減少され得る。これらの場合における目的は、特定の株または該種のサブ変異体subvariantを同定することでは必ずしも必要なく、しかしむしろ、該配列が問題の病原体に対応しそして密接に関連する種や無毒性株nonvirulentstrainに対応しないことを実証する明確な統計的推定のために十分なベースコールが作製されることを可能にすることである。複数の小さな標的のこのチップ設計で、必要とされる多数の特異的PCR反応についての条件を設計および最適化することは実行可能でなく、そしてトータル増幅は最適な増幅戦略となる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性は、公知のソフトウエアまたはコンピュータプログラム、例えば、BestFitまたはGapペアワイズ比較プログラムpairwisecomparisonprogramsGCGWisconsinPackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin53711を使用することによって決定され得る。BestFitは、SmithandWatermanAdvancesinAppliedMathematics2482489のローカル相同性アルゴリズムlocalhomologyalgorithmを使用し、2つの配列間の同一性または類似性のベストセグメントbestsegmentを見つけ出す。Gapは、以前に記載される方法NeedlemanおよびWunsch,1970を使用して、1つの配列の全てと別の類似配列の全てとの、グローバルアラインメントglobalalignmentsを行う。配列相同性、類似性または同一性の程度を決定するために、BestFitのような配列アラインメントプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用されてもよく、または好適なスコアリングマトリクスが、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択されてもよい。同様に、2つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにBestFitのようなプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用されてもよく、または好適なスコアリングマトリクス例えば、blosum45またはblosum80が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択されてもよい。標的はまた、マルチプレックストPCRmultiplexedPCRと呼ばれる、特異的PCR反応物の組合せを使用して増幅され得る。この戦略において、RPM上の全ての標的領域についてのPCRプライマー対は、1つの反応混合物mitureへ合わされる。これは、1以上の病原体が非常に低濃度で存在しランダム増幅戦略以下に記載だけを使用して検出されない場合において、好ましい方法である。ランダム増幅RandomAmplification戦略PCR増幅に関連する感度および特異性に関わらず、このアプローチの固有のバイアスおよび限定されたスループットは、次のマイクロアレイベース適用の主な利点を限定する。首尾良い同定は、好適に選択されるプライマーセットにほぼ全面的に依存するので、全てのPCRベーステストは、混入する生物のアイデンティティーidentityに関連する事前知識prioriknowledgeを必要とする。したがって、具体的に予期される配列についての偏見無しに、臨床および環境サンプルを迅速にスクリーニングし得る進歩した診断システムについての決定的な必要性が存在するままである。マイクロアレイに基づく検出の利点は、それが、偏っていないunbiased例えばランダム核酸増幅戦略と引き続いてのマイクロアレイの識別能力とを組み合わせて、高い感度、特異性およびスループット能力を生じさせ得るということである。本発明者は、代替アプローチの使用により上述の問題に取り組み、そして4フロント-エンド増幅戦略を研究した:ランダムプライムドrandomprimed、アイソサーマルKlenowポリメラーゼベーストisothermalKlenowpolymerasebased、φ29DNAポリメラーゼベーストΦ29DNApolymerasebasedおよびマルチプレックスPCRmultiplexPCRVoraら、2004。Klenowベース増幅-DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントは、ランダム8量体オリゴヌクレオチドプライマーを用いての未知の配列の標的DNAのアイソサーマルランダム増幅のために使用され得る。本発明について、これは、BioPrime登録商標DNALabelingSystemInvitrogenを使用して行われ得る。ビオチニル化アンプリコンが作製される僅かな修飾を伴って製造業者の推奨する標識プロトコルに従う。このプロセスは、典型的に、37°Cで4時間行われる。Klenow増幅は、いくらかの高分子量増幅産物を生じさせるが、長さが圧倒的多数のアンプリコンは50~450塩基対bpである。したがって、これらのアンプリコンは、DNAマイクロアレイへの直接ハイブリダイゼーションに好適である。ランダムPCR増幅-ランダムPCRrPCRアンプリコンは、InvitrogenBioPrimeDNALabelingSystem製の2.5XRandomPrimersSolutionおよび10XdNTPミックスを使用して作製され得る。反応成分は、典型的に以下を含む:1XPCR緩衝液Qiagen,2.5mMMgCl2,1XdNTPMixビオチン-14-dCTPを含む,5μlの2.5Xランダムオクタマーおよび5UTaqDNAポリメラーゼQiagen。増幅反応は、35サイクルについて以下の条件を使用して行われる:94°C30秒、26°C2分、および72°C1分。φ29-ベース増幅-ランダムヘキサマーを用いてのアイソサーマルφ29DNAポリメラーゼベース増幅は、TempliPhiTM100AmplificationKitAmershamBiosciencesCorp.,Piscataway,NJを使用して行われ得る。ビオチニル化アンプリコンは、僅かな修飾を伴う製造業者の推薦プロトコルに従って作製される14.4μl増幅反応物は0.4μl酵素ミックスおよび3μlの350μMビオチン-14-dCTPを含み、そして30°Cで16時間インキュベートされる。rPCRおよびφ29DNAポリメラーゼ増幅産物の両方の大部分は、電気泳動ゲルelectophoreticgelsへ移すには大きすぎる>1500bp。大きな増幅産物は、空間的および立体的拘束に起因して2次元表面上の固定化されたプローブへ弱くpoorlyハイブリダイズする。したがって、rPCRおよびφ29ポリメラーゼ増幅産物は、ハイブリダイゼーション前に、Klenowおよびマルチプレックスアンプリコンに匹敵するアンプリコンサイズを達成するために、DNアーゼIフラグメント化緩衝液で消化される。タンデム増殖TandemAmplification病原体標的に対する増加された感度は、上述のランダム増幅戦略の組合せを使用して達成され得る。タンデム[KlenowKlenow]および[φ29Klenow]タンデムランダム増幅戦略は、マルチプレックスPCRよりも濃縮病原体標的に対するより良好な感度を提供し得る。同一のランダム増幅戦略もまた、63倍過剰の混入DNAを含有するスパイクされたspiked環境水サンプル中の診断ゲノム標的を検出することができるVoraら、2004。示される結果は、ランダム増幅アプローチを使用する実行可能性を強調し、そして環境ソースからの偏っていないunbiased病原体検出のためのこれらのアプローチの融通性に系統的に取り組み始める。標的濃縮TargetEnrichmentおよびランダム増幅の組合せランダム増幅方法は、非標的DNAならびに標的DNAの増幅を生じさせる。したがって、本発明者は、ここで、ランダム増幅ステップの前の、病原体診断標的配列の濃縮のための種々の方法を記載する。これは、臨床例えば、鼻洗浄物または咽頭スワブあるいは環境例えば、水、土壌、空気コレクターサンプルのような、複雑なマトリクス中の検体の検出の感度および/または特異性を改善するために特に重要である。複雑なサンプルcomplexsample臨床および環境は、有意な、そして時には圧倒的な量の未知ゲノムおよび問題ではないゲノム非特異的バックグラウンドを含有する。非特異的バックグラウンドを減少させるための1つのアプローチは、バックグラウンドゲノム配列を選択的に消化する酵素プロセスへ該核酸を暴露することである。このプロセスは、実施例中で以下に記載される。非病原体ゲノム内容物を減少させるための別の戦略は、問題の生物について陰性であることが知られている比較可能な複雑なサンプルからのバックグラウンドゲノム配列を使用し、そしてそれを使用してバックグラウンドゲノム配列を直接除去することである。このようなサブトラクティブ方法は、以下を含み得る:1ゲルまたはビーズのような固相表面上におけるバックグラウンドゲノムの固定化、続いてサンプルからバックグラウンドゲノムを吸収するためのテストサンプルとのハイブリダイゼーション。標識されたバックグラウンドゲノムに起因する非特異的結合の影響をブロックするために、マイクロアレイ上における標的のハイブリダイゼーションの間、標識されていないバックグラウンドゲノムを使用することも可能である。このブロッキングアプローチは、アッセイの間さらなるステップを必要としない点で、利点を有する。このような戦略は両方とも、実施例セクションにおいて記載される。あるいはまたは同時に、ランダム増幅前に病原体標的核酸を選択的に濃縮する戦略が使用され得る。サンプルからの直接選択陽性選択positiveselectionとしても公知についての1つの可能性は、固相支持体磁気ビーズまたはゲルマトリクス上の固定化されたプローブを使用して、問題のゲノム標的を選択的に濃縮することである。理想的には、固相支持体上のプローブは、アレイ上で検出可能でないべきであり、何故ならば、それらは、該濃縮分子がキャリーオーバーされるcarriedoverかあるいは不注意で増幅される場合に偽シグナルを生じるためである。したがって、ビーズ上のプローブは、マイクロアレイ上においてクエリーされる検体のゲノムの領域との僅かな重複または隣接する領域によって、標的ゲノムを選択すべきである。アレイ上において検出可能である検体配列analytes’sequencesとプローブ配列probesequencesとの間に僅かな重複が存在する場合、このクエリーされる領域は、インシリコinsilico分析の間マスクされるべきである。濃縮プローブがマイクロアレイ上のそれと相同な配列を有することが望ましい場合、それらのプローブは、引き続いての増幅を受けないように構成されるべきであり、または増幅前に選択的酵素消化に感受性にされるべきである。サンプルの詳細および問題の適用に従って、必要に応じて、上記戦略と他の戦略との組合せが使用され得る。代替のサブトラクションまたは濃縮方法免疫沈降は、病原体の核酸を濃縮するための別の方法である。問題の病原体の抗体は、臨床サンプルと混合され得、次いで抗IgGで沈降され病原体をプルダウンしpulldown、それによってバックグランドゲノムDNAが除去される。これは、抗生物質耐性マーカーantibioticresistancemarkersまたは意図的な遺伝操作の指標indicatorsofintentionalgeneticmanipulationのような、特定のゲノム形質を単一病原体と相互に関連付けることが望ましい場合に、特に重要である。サイズ排除sizeexclusionは、病原体DNAを濃縮またはサブトラクトするための別の方法である。例示的なサイズ排除方法としては以下が挙げられる:勾配遠心、カラム、または遠心分離フィルターユニットcentrifugalfilterunits。勾配遠心またはカラム分離方法は、時間を必要とし、そして実験室における特別なセットアップを必要とする。低分子量化学種からの高分子量種の分離separationofhighfromlowmolecularweightspeciesのための遠心分離フィルターユニットの使用は、一貫性のない、そしてしばしば、低回収率を被る。これらの方法の各々は、大量の出発材料を必要とする。他のサイズ排除方法としては、以下が挙げられる:フローサイトメトリーまたは電気泳動法、例えば、蛍光活性化細胞ソーティングfluorescenceactivatedcellsortingFACS、またはAgilentバイオアナライザーにおいて使用される特別な電気泳動チップを用いる。一般的な標的濃縮および増幅戦略本発明者は、鼻洗浄物試料からの正常なヒトおよび細菌核酸のサブトラクションのための方法を記載した。この同一の原理はまた、任意の起源のサンプル臨床または環境に適用され得、ここで、核酸の代表的な正常混合物が、サブトラクティブ試薬として回収、プールおよび調製され得る。種々のアプローチが、トータル増幅戦略を行う前に、アレイにタイルされる病原体または特定の標的を濃縮するために適用され得る。このようなアプローチの1つは、アレイ上にタイルされる配列の固定化された変異体を使用することである。これらの変異体は、分離のために使用される固相コンポーネントビーズ、マトリクスなどへ結合され、そして増幅される標的を濃縮するに役立ち、それら自体は増幅されない。酵素消化へ該濃縮プローブを感受性にすることは、これを行い得る、即ち、それらは、増幅可能でない修飾核酸から構成されるかもしれない。より好ましい実施形態は、標的遺伝子配列に隣接しかつチップのタイルド領域上に提示されない配列を認識するプローブを使用する。この様式において、ノンバイアス増幅戦略でのそれらの増幅は、人工産物artifactsを生じさせない。従来のDNA配列決定技術は、基礎研究における全体的情報回収プロセスの一部として考えられ得るので、記載されるリシークエンシングアプローチは、全体的病原体検出/キャラクタライゼーションスキームのコンポーネントと考えられ得る。WangらWangら、2003は、病原体のファミリー内にある保存配列を認識する長いオリゴヌクレオチド70量体から構成されるスポッテッドspottedDNAマイクロアレイを使用する方法を記載する。これらの位置に結合された標的配列は、単離され、そして従来のDNA配列決定アプローチにおいて使用され、さらなるキャラクタライゼーションを可能にする。類似の方法において、非常に好ましい実施形態は、DNA配列決定の代替フォームと関連するステップを置換するリシークエンシングマイクロアレイの使用を含み、したがって、数日内の代わりに数時間内での特異的病原体キャラクタライゼーションおよび効率的な生物兵器防衛システムの実施を提供する。本発明の方法は、好ましくは、増幅PCRのために特異的配列を使用しない。本発明は、例えば以下を使用しての、病原体核酸の濃縮のための代替方法が存在することを示す:減少されたバイアス、およびアイソサーマル例えば、ランダムプライムドKlenowまたは鎖置換stranddisplacement増幅を適用する前に、固相支持体分離を使用すること。好ましい実施形態において、当業者は、従来の実験室セッティングにおいて、マイクロアレイ実験を行う自動化ステップの最小セットを使用して、時間およびコスト効率的サンプル調製を行うことができる。非常に好ましい実施形態において、最小限に熟練した技術者医療技術者または医学生は、野外環境医療水準1において、手持ちサイズの機器を使用して、病原体標的核酸の手動分離および/または濃縮を行うことができ、そして少ない試薬および技術ステップで病原体標的のアイソサーマル増幅を行う。バックグラウンドサブトラクションに続く増幅ampificationおよびハイブリダイゼーションプライマーD:GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN配列番号573、およびプライマーE:GTTTCCCAGTCACGATC配列番号574Kesslerら、2004、類似の、以前に記載されたプライマーセットWangら、2002を使用するランダムRT-PCRに加えて、RNAウイルス病原体から第1鎖firststrandcDNAを合成するために、それらのプライマーセットの変形物、および/またはランダム6~9量体が使用され得る。サブトラクティブハイブリダイゼーションプロトコルは、第1鎖cDNA合成が完了後に使用され得、臨床サンプル中のバックグラウンドDNAの量を減少させ、その後、複雑な即ち、臨床または環境サンプルを1以上のDNA増幅ステップへ供する。1つの方法は、COT-1ヒトDNA[これは、迅速にアニーリングする反復エレメントrepetitiveelementsから大部分がなる]を含むハイブリダイゼーション溶液中における、増幅産物第1鎖cDNA合成、次いでトータル増幅からのバックグラウンドゲノムDNAの直接サブトラクションである。別の方法は、第1鎖cDNA合成後かつDNA増幅ステップ前の、臨床サンプルからのバックグラウンドゲノムDNAのビーズベースサブトラクションである。第3の方法は、上記方法の組合せである。このケースにおいて、コンプレックスサンプルcomplexsamples由来のヒトゲノムバックグラウンドDNAは、第1cDNA合成後かつDNA増幅ステップ前に、ビーズベースサブトラクションを使用してサブトラクトされる。引き続いて、バックグラウンドDNAは、選択的にヒトDNAおよびRNAを捕獲するように設計された配列を含むハイブリダイゼーション溶液中において、コンプレックスサンプルからさらにサブトラクトされ得る。DNA増幅ステップ自体は、特異的プライマー部位標識化RT-PCR産物specificprimersitelabeledRTPCRproductsならびに病原体ゲノムDNA標的および他の非cDNA標的これは、ランダムRT-PCRステップから生じないの両方を増幅するための方法の組合せによって、あるいは、特異的に、非特異的に、ランダムRTステップにおいて形成されるcDNA産物を増幅することを目的とし得る。そのように行うための1つのアプローチは、病原体DNAゲノム標的へ特異的プライマー配列これは、cDNA産物または別個のものへ結合されるために使用されるのと同一のプライマーであり得るを結合することであり、単一のPCRステップが全てのRNAおよびDNA病原体標的を増幅することを可能にする。RNAサブトラクションRNAおよびDNA病原体検出について別の処理経路が存在する場合、以下が使用され得る。RNAプロセッシング経路の開発のために、スパイクされspikedそして臨床の鼻洗浄物および咽頭スワブインフルエンザA陽性試料を、種々の方法ランダム、ユニバーサル、およびマルチプレックストPCRを使用して処理した。しかし、ランダム増幅アプローチを用いて受け入れ可能なレベルの感度を達成するために、ヒトメッセンジャーおよびリボソームRNAは、MICROBEnrichTMキットAmbion,Inc.,Austin,TXを使用して、製造業者の指示に従って、サブトラクトされるべきである。好ましいランダム増幅戦略は、以前に記載される方法Wangら、2002から適応されて利用され得る。この方法を使用して、0.45~3.75pfu/150μLサンプルアリコートほど低い濃度で、種々の培養物陽性FluA鼻洗浄物および咽頭スワブ試料のうち16/19において、H3N2の陽性検出およびH1N1FluA検出が達成され得ることが、本発明者によって見出された。ヒトRNAのサブトラクションに続いて、低濃度範囲で6/8試料中におけるFluAを検出することが可能であったことが、さらに測定された。バックグラウンドサブトラクション無しで、ランダム増幅アプローチを使用すると、flu感度は、スパイキングspiking鼻洗浄物中において約0.25pfu/μl1ng/μlである。臨床サンプルにおいて、サブトラクション無しでの感度は、約1~10pfu/μlであると推定される。DNAサブトラクションDNAサンプルについてのランダム増幅は、以前公開された論文Wangら、2002;Wangら、2003から修飾されたランダム増幅プロトコルまたはバクテリオファージφ29DNAポリメラーゼのいずれかで行われ得る。簡単に述べると、ランダムヘキサマーrandomhexamersを用いてのバクテリオファージφ29DNAポリメラーゼを使用するDNA増幅は、GenomiPhiTMDNAAmplificationKitAmershamBiosciencesCorp.,Sunnyvale,CAの指示に従って行われ得る。次いで、増幅産物は、製造業者が推奨するプロトコルに従ってエタノール沈降される。修飾ランダム増幅を使用してのDNA増幅は、プライマーDを使用するSequenaseTMバージョン2.0DNAポリメラーゼUnitedStatesBiochemical,Cleveland,OHでのDNA合成の初期ラウンド、続いてプライマーEを用いたPCR増幅で行われ得る。RNA増幅のために、ウイルスサンプルは、次いで、ランダムPCRプロトコルの修飾バージョンWangら、2002;Wangら、2003;Kesslerら、2004によって増幅される。簡単に述べると、10μlのトータルRNAが、プライマーDおよびsuperscriptIII逆転写酵素InvitrogenCorp.Carlsbad,CAを使用して逆転写され得、そして次いでプライマーEを用いたPCRにより増幅された。RNAおよびDNA経路の集合convergence-RNAおよびDNA経路の組合せを図9に記載する。本発明の実施形態において、RNAおよびDNAについての経路は、合わせられる。このプロトコルは、UniversityofCaliforniaSanFranciscoのJosephDeRisi研究室httpderisilabucsfedupdfsRoundABCpdfから適応され、そして全ての病原体DNAまたはcDNA分子へ、シングルフィックスト-シーケンスPCRプライマー結合部位asinglefixedsequencePCRprimerbindingsiteをランダムに組み込み、従来のPCR熱サイクリングプロトコルを使用する引き続いてのステップにおいてそれらが全て増幅されることを可能にする。データ獲得および処理-Affymetrix/マイクロアレイ装置一般的に、マイクロアレイは、固相支持体の表面上に形成された、各々が規定された領域を有する、好ましくはディスクリート領域discreteregionsの線形または二次元アレイである。マイクロアレイ上のディスクリート領域の密度は、単一固相支持体の該表面上で検出される異なる標的ポリヌクレオチドの総数によって決定され、好ましくは少なくとも約102/cm2、より好ましくは約104/cm2、なおより好ましくは少なくとも約106/cm2、そしてなおより好ましくは少なくとも約108/cm2である。本明細書中で使用される場合、DNAマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを検出および/または単離するために使用されるチップまたは他の表面上に配置されたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。アレイにおけるプライマーの各特定のグループの位置は既知であるので、標的ポリヌクレオチドのアイデンティティーは、マイクロアレイの特定の位置へのそれらの結合に基づいて決定され得る。本発明の1実施形態は、標準AffymetrixハードウエアAgilentGeneChipScanner廃止されたphasedoutおよびAffymetrixScanner3000ワークステーションおよびFluidicsStation450を使用する。原則的に、記載された本発明は、この設備を必要としない。量的遺伝子発現プロファイリングおよび高信頼性SNP検出のためのGeneChipシステムの製造業者の意図する使用を考慮すると、既存の装置は、本発明に固有のシグナル強度またはバックグラウンド干渉のダイナミックレンジについて最適化されない。したがって、好ましい実施形態は、ノイズの多い画像のより良好なコントラストを可能にするフィルタリグアルゴリズム例えば、輪郭強調、回旋などを与えるフィーチャー次元の固有の規則性を利用する、空間周波数フィルタリングおよび画像増強の使用を含む、画像獲得方法の使用を組込む。AffymetrixCustomSeqプロトコル本発明の実施形態において、サンプル処理は、標準AffymetrixCustomSeqTMプロトコルを使用することによって達成される。一般的に、この方法は、以下を必要とする:aDNAプローブ含有材料の増幅、b増幅産物のプーリングpoolingおよび定量、c増幅産物のフラグメント化および標識、d標的ハイブリダイゼーション、およびe洗浄、染色、およびハイブリダイズされた標的のスキャンニング。AffymetrixCustomSeqTMプロトコルの詳細な説明は、製造業者から入手可能である製品マニュアルおよびプロトコルガイドに見られ得る。AffymetrixCustomSeqTMプロトコルにおいて、ステップaはロングレンジPCRまたはショートレンジPCRのいずれかを必要とし、ロングレンジPCRが好ましい増幅戦略である。これらの増幅戦略の各々について、製造業者が推奨するPCRDNAポリメラーゼは、Taq変形物、AmpliTaqGoldDNAポリメラーゼショートレンジPCRおよびLATaqDNAポリメラーゼロングレンジPCRである。製造業者によって特に推奨されるわけではないが、使用されるDNAポリメラーゼが高忠実度highfidelityDNAポリメラーゼである限り、ステップaについて任意のDNAポリメラーゼが使用され得る。DNA増幅ステップaを促進するために、標準AffymetrixCustomSeqTMプロトコルは、特異的PCRプライマーを使用する。しかし、特異的PCRプライマーの使用は、今まで使用されてきた特異的PCRに基づく方法からもたらされるシステム偏向systemicbiasの組み込みに起因して、本発明の技術の広範囲の提供を顕著に制限する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルのステップaは、マルチプレックスPCR、トータル増幅GenomiPhiTM、またはランダムRT/PCRのような、代替の増幅戦略に置き換えられる。これらの代替戦略は、上記に記載する。製造業者が推奨するPCR戦略の各々、ならびに本発明の好ましい戦略についての最適なPCR増幅のための条件は、当業者の慣用実験によって決定され得る。PCR反応間に変動性が存在するので、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルは、ハイブリダイゼーションのアンプリコン濃度が2倍超変動する場合、アッセイ性能は低下され得ると述べる。したがって、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルのステップbは、PCR反応物をプールしそしてそれを分光測光法により定量して、マイクロアレイへの該サンプル等モル適用を確実にすることを必要とする。しかし、本発明は、AffymetrixCustomSeqTM法のSNP検出テーラードプロトコルに対していくつかの利点を有する。特に、本発明における配列鎖長独立類似性サーチsequencelengthindependentsimilaritysearchesBLASTNでの増加した密度チップの使用は、タイリングのための配列を選択する前に、より少ない想定がなされなければならないということを提供する。さらに、鎖長独立類似性サーチBLASTNは、特定の既知のサブ配列が首尾良くリシークエンスされるという制限を排除し、標的濃度のバリエーションとロストベースコールへ導く非特異的結合からの寄与とに対して、該アプローチをより耐性とする。したがって、本発明内で、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルのステップbは、任意でありそして省略されてもよい。DNA増幅に続いて、それによって得られたDNA分子は、アレイ表面上の短いプローブへハイブリダイズするには長すぎる。したがって、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルのステップcは、フラグメント化および引き続いての蛍光基質での該フラグメントの標識を含む。フラグメント化および標識のための方法および試薬は、特に限定されず、しかし、標識は、リシークエンシングマイクロアレイのための検出装置と適合性でなければならない。このために、製造業者が推奨する試薬および条件が使用されてもよい。Affymetrixプロトコルの代替法alternativevariations本明細書中で記載される方法に有利となるに役立ち得る蛍光標識は、複数のサンプルの同時高スループット分析のための自動機器と共に慣用的に使用されるので、以下を含む:Cyフルオロフォアfluorophores、ローダミンベースフルオロフォア:TARAM,ROX,JOE,およびFAM;BigDyeTMフルオロフォアAppliedBiosystems,Inc.、ダンシル基、フルオレセインおよび置換フルオレセイン誘導体、アクリジン誘導体、クマリン誘導体、フタロシアニンpthalocyanines、テトラメチルローダミン、TexasRedTM、9-カルボキシエチル-3-ヒドロキシ-6-オキソ-6H-キサンテン、DABCYLTM、BODIPYTMおよびALEXATMフルオロフォアMolecularProbes,Eugene,Oregon。さらに、種々の状況に好適でありそして恐らく好ましい、フルオロフォア以外の種々の標識が存在する。これらの標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:共鳴光散乱RLS粒子InVitrogen,Carlsbad,CA、量子ドットQuantumDotCorp.および他の所望の光学特性を有するナノ粒子。標的ハイブリダイゼーションステップdは、AffymetrixCustomSeqTMプロトコルに記載されるように行われ得る。このステップのハイライトは、フラグメント化されそして標識化されたDNAを含有するサンプルを、高温例えば、85~100°C、好ましくは95°Cインキュベーションによって変性させ、続いてハイブリダイゼーション温度例えば45°C平衡を行う。DNA含有サンプルが平衡化されると、該サンプルは、リシークエンシングアレイへ適用される。製造業者は、16時間ハイブリダイゼーション反応を行うことを推奨する;しかし、上述のように、本発明の方法は、感度を増加させて好適なベースコールを作製するためにその手を結ばせない。したがって、より短いインキュベーション時間が、標的ハイブリダイゼーションに好適である。本発明の文脈内で、標的ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、15分の短い時間から24時間の長い時間まで及び得る。明らかなことに、この範囲の時間は、それらが明確に記載されているかのように、中間の時間の各々を具体化することが意図される。注目に値する好ましい時間は、15分、30分、1時間、2時間、4時間、12時間、および16時間である。AffymetrixCustomSeqTMプロトコルの最終ステップは、AffymetrixFluidicsStationを使用してハイブリダイズされたアレイを洗浄すること、およびAgilentGeneArrayTMScannerを使用してスキャンすることを必要する。この機器は、そうでなければ手動で行われ得る標識およびリンスステップを簡単に自動化する。したがって、タイムドベースでonatimedbasisミリリットル量の標識化およびリンス媒体を送達および回収withdrawingし得る任意の機器は、好適な代替物である。本明細書中に記載される本発明は、Affymetrixによって提供される引き続いてのハードウエアバリエーションへ従う。さらに、本明細書中に記載されるリシークエンシングマイクロアレイからのデータ獲得は、マイクロアレイプロセッシングのための装置のいかなる製造業者から得てもよい。病原体検出に関連するバイオインフォマティクス問題-病原体のマイクロアレイベース検出のために使用されるエンドポイントendpointsに依存して、バイオインフォマティクス問題の重要性は非常に様々である。バイオインフォマティクスツールは、マイクロアレイ開発のための特異的相補核酸プローブ配列の効率的な設計および選択に不可欠である。例えば、標的病原体ゲノム核酸配列は、しばしば、マイクロアレイ分析の前に増幅され、そしてバイオインフォマティクスは、ある生物および株に対して特異的と考えられる遺伝子をアッセイするためのプライマーの設計における役割Tm/Ta、二次構造、自己相補性selfcomplementarity、および特異性問題を評価することを明らかに有するKampke,KieningerおよびMecklenburg、2001。これらの同一の評価もまた、マイクロアレイプローブ設計のために作製されなければならない。実験設計の初期段階の間、標的病原体と関連する遺伝的特徴に対するプライマーおよびプローブは、病原体または病原体のファミリーに特異的であると考えられる。それは、特異的に設計されたプライマーまたはプローブそれぞれを使用してのアンプリコンの生成または陽性ハイブリダイゼーション反応は、標的病原体由来の特定の分子形質の検出を示すということになるだろう;しかし、これは必ずしも真実ではない。細菌およびウイルスの遺伝的乱交geneticpromiscuity’、微生物が遺伝物質を交換する傾向は、単一の種または株特異的プローブを開発することにおいて困難を生じさせるOchman,LawrenceおよびGroisman、2000。したがって、好ましいプライマーおよびプローブ設計方法は、以下のために、バイオインフォマティクスツールの使用を必要とする:a異なる生物または株間の複数配列アラインメントを行い、そして好適な生物化学的性質を有する好適なプライマーを設計すること、bこれらの配列と配列データベースに置かれたものとを比較し、特定の配列の現在の独自性presentuniquenessおよび交差反応性の可能性を決定すること、ならびにc遺伝的保存のレベルに基づく標的特異性の確率、ならびにその主要な遺伝配列が未だ解明されていない他の病原性および非病原性種との進化的関連性を推測すること。開示される本発明の非常に重要なバイオインフォマティクス局面は、マイクロアレイ設計への組み込みのための、データベースへの病原体診断標的のアセンブリassembly、アノテーションannotationおよび選択、ならびにマイクロアレイ上における検出事象をこのようなデータベースへ関連付けるという付随するタスクを含む。本発明の利点は、公共データベースに含まれる情報は増え続けており、したがってさらに本発明のロバスト性robustnatureへ加えられるということである。本発明は、公開文献例えば、GenBankからの病原体配列情報を手動で選択しおよび/または公開文献から経験的に決定される診断標的配列を解明するプロセスを記載する。記載されるアプローチは、多数の異なる病原体種の各々について十分な分野専門知識を各々が有する科学者のコンソーシアムが、特定のプローブ、試薬、増幅、およびサンプル調製法に特に関係なく、自動アレイ設計プロセスへ組み込まれ得る関連病原体診断配列情報を提供し得るという利点を有する。1つの非常に好ましい実施形態において、多数の無関係な病原体の各々について必要な分野専門知識は、ウェブ-ポータル可能化データベースwebportalenableddatabaseによって、最新の様式で維持される。したがって、特定の病原体の個々の研究者から構成される、拡張されたコンソーシアムは、AllianceforCellularSignalingAfCSによって採用される分子ページモデルmolecularpagemodelと類似の、病原体ページフォーマット化ウェブポータルpathogenpageformattedwebportalを介して、最新の注釈付きannotated標的配列情報を提供することができる。AfCSデータベースは、次いで、細胞内シグナル伝達カスケード中に含まれる数千の分子について、そうでなければ理解不可能な量の特定の情報を維持する。このフォーマットにおいて、個々の研究者は、個々のシグナル伝達分子について特別な知識無しに、シグナル伝達事象の多数のシミュレーションにおいて使用され得る詳細なパラメータにアクセスし得る。したがって、別の非常に好ましい実施形態において、個々の病原体についての注釈付きのannotated標的配列データは、自動データパイプラインへ組織化され、ここで、病原体データベースの総情報コンテントに対して、ユーザ規定される設計制限例えば、プローブフィーチャーの数、病原体標的の数、アレイ性能のために必要とされる感度および特異性のレベル、などが課せられwillimpose、自動化された最適な標的の選択とマイクロアレイ製造に必要なフォーマットでの業者へのそれらの標的の提出とを可能にする。なお別の非常に好ましい実施形態において、以前のプロセスによって決定された前記選択標的配列は、マイクロアレイの実際の使用において回収されるデータと相互に関連され、その結果、確率およびクオリティーについてのマトリクスは、意志決定のために容易に使用され得る。データおよびアルゴリズムのこのような自動パイプライニングautomatedpipeliningを行うための2つの好ましいアプローチは、VIBEVisualIntegratedBioinformaticsEnvironmentソフトウエアIncogen,Inc.,Williamsburg,VAおよびiNquiryBioTeam,Boston,MAであり、これらは、意図される目的についての効果を等しくするために使用され得る、統合されたバイオインフォマティクス環境のクラスの代表である。データ獲得-リシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Affymetrix製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされるGeneticDataAnalysisSoftwareバージョン2.0GDASによって提供される。Affymetrixリシークエンシングアレイは、所定の数のプローブセルまたはフィーチャーを含む。スキャンニングの間、該ソフトウエアは、各フィーチャーをサブユニットスクエアまたはピクセル3×3μmに分割する。各フィーチャーは、所定の配列のユニーク25塩基オリゴヌクレオチドプローブの多くのコピーを含み、一方、一連の8個のフィーチャーは、既知の参照配列における特定の部位をクエリーするquery。4個のフィーチャーは、センス鎖をインターロゲートしinterrogate、中央の塩基A、C、G、またはTである以外は同一であるプローブを含み、そして4個のフィーチャーは、アンチセンス鎖をインターロゲートし、そして中央の塩基A、C、G、またはTである以外は同一であるプローブを含む。GDASは、セル強度データを使用して、リシークエンシングアレイ上に提示されるあらゆる塩基位置についてベースコールを作製する。GDASについての製造業者セッティング下で、アルゴリズムは、そのコーリング精度を改善するために複数のサンプルからの強度データを使用し、そして各コールについてクオリティースコアqualityscoreを付与する。GDASベースコーリングは、Cutlerら、2001において詳述される、以前記載されたベースコーリングアルゴリズム、ABACUSに基づく。該モデルは、フィーチャーのピクセル強度は独立および正規分布であるindependentlyandnormallydistributedと想定する。該アルゴリズムは、センスおよびアンチセンス鎖フィーチャーについての推定平均バックグラウンドおよび分散estimatedmeanbackgroundandvarianceを計算する。該ベースコーリングアルゴリズムはまた、サンプル一倍体または二倍体中の種々の遺伝子型の存在または非存在についてのモデルを特定する。種々のベースコーリングアルゴリズムパラメータが、ベースコーリングパーセンテージおよび精度間のトレード-オフtradeoffを得るために、ユーザによって規定され得るGDASオペレーターズマニュアル/ユーザズガイド、AffymetrixGDASアルゴリズムおよび改変され得るパラメータに関するさらなる情報は、GDASユーザマニュアルにおいて入手可能である。パラメータの記載は、GDASバージョン2.0マニュアル第207~217頁にある。GDASについて推奨されるデフォルトセッティングは、最高レベルの精度に焦点を合わせる、保守的conservativeセッティングである。対照的に、本発明の目的は、ベースコールのパーセンテージを増加させることである。この目的を達成するために、本発明者は、下記に列挙されるように、高度に許容性のpermissiveベースコール増加されたパーセンテージを許可するようにパラメータを調節した:許容性ベースコーリングアルゴリズムセッティング--フィルター条件NoSignal閾値=0500デフォルト=1000000WeakSignalFold閾値=20000000デフォルト=20000000LargeSNR閾値=20000000デフォルト=20000000-アルゴリズムパラメータStrandQuality閾値=0000デフォルト=0000000TotalQuality閾値=250000デフォルト=75000000MaximumFractionofHeterozygoteCalls=099000デフォルト=0900000ModelType=0PerfectCallQuality閾値0500デフォルト=2000000-最終信頼性規則FinalReliabilityRulesMinFractionofCallsinNeighboringProbes10000フィルターを無効にするMinFractionofCallsofSamples=10000フィルターを無効にする。上記のセッティングは、本願において重要であり、何故ならば、ベースコールアルゴリズムは、最も正確なコールつまりSNP検出のためを作製するために作製されるベースコールの数を犠牲にするようにデフォルトによって設定されるためである。本願において、該技術は、SNP検出のために要求されるのと同じ程度を達成することについてあまり関係がなく、しかしその代わり、作製されるコールの数を増加させ、その結果、必要な特異性を維持しつつ、連続配列の最長の可能性のあるストレッチがGDASによって作製される。本発明の範囲内において、上記に列挙した許容性セッティングは、最適な感度/特異性合意agreementを得るように、実施者によって望まれるように、個々にまたは全体として変化され得ることが理解される。さらに、上記セッティングは例示的であること、および本発明の所望の結果を変化させることなく、各セッティングが10以上パラメータ依存性変化され得ることが理解される。ResequencingPathogenIdentifierREPIおよび代替物、改変物、発達物本発明によればまた、それは、個々の病原体を同定するために使用されるマイクロアレイハイブリダイゼーションパターンへ適用される場合、ベースコーリングアルゴリズムから誘導される配列情報である。好ましくは、リシークエンシングプローブによって決定される標的配列の配列は、類似性サーチアルゴリズムを使用してデータベースにクエリーするために使用される。より好ましくは、該アルゴリズムは、一般的に使用されるローカルアラインメントlocalalignment例えば、Smith-Waterman、BLASTN配列アラインメントアルゴリズムを使用して、所定の標的配列がデータベースレコードにおける特定の配列に対応する確率を統計的に決定するKorf、YandellおよびBedell、2003。なおより好ましくは、データベースレコードに対して意味がある類似性サーチを作製するために最も好適であるサブ配列を決定するカスタムアルゴリズムは、自動的に類似性サーチをについてサブミットされる配列のセットを決定する。なおより好ましくは、自動サブ配列解析アルゴリズムautomatedsubsequenceparsingalgorithmは、本発明において記載されるResequencingPathogenIdentifierREPIであり、配列データベースは、パグリック例えば、GenBankおよびプライベートドメインの両方に存在する。意図される発明における使用に好適である核酸配列類似性サーチアルゴリズムの変形物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:WashingtonUniversityBLASTWU-BLAST、NCBI-BLAST、FastA、MPsrch、Scanps、およびBestFitKorfら、2003。REPI代替物および変形物記載される本発明において、REPIResequencingPathogenIdentifierソフトウエア2004年9月15日に出願された米国出願シリアル番号第60/609,918号および2004年11月29日に出願された米国出願シリアル番号第60/631,460号を参照のことを使用して、CustomSeq/GCOS/GDASプロセスからのどのベースコールサブ配列が、カスタム化スライディングウィンドウアルゴリズムcustomizedslidingwindowalgorithmの使用により有意なBLAST結果をリターンする可能性が高いかを確認した。引き続いて、REPIは、エンドユーザへBLASTアプトプットを自動的にリターンし、これは、所定のセットのベースコールが特定の細菌配列に対応する可能性に対する確率的評価probabilisticassignmentsを可能にする。この低レベルソフトウエアファンクショナリティーlowlevelsoftwarefunctionalityは、全てのより高レベルのファンクションおよびユーザインターフェースがリシークエンシングチップ分析のためにそれを通過passthoughitしなければならない点で、UNIX登録商標またはUNIX登録商標由来コンピュータオペレーティングシステムのカーネルkernelに類似している。REPIによって提供される低レベルファンクショナリティーlowlevelfunctionalityは、核酸またはアミノ酸配列さえもの不連続セグメントを使用する、多数のより高いバイオイフォマティクスタスクの中心である。以下の実施例において、本発明者は、配列フラグメントが自動的に個々の病原体へリンクされ得ることを示すデータを提供する。いくつかのより好ましい実施形態において、このアプローチは、病原体の混合物と病原体間の遺伝子組換えとのより良好な識別へリファインされ得る。1つの非常に好ましい実施形態において、該分析ソフトウエアは、アレイの異なるタイルド領域上における重複または相同配列フラグメントの自動検出を可能にし、病原体の混合物の推測を可能にする。なおよりリファインされた実施形態において、該分析ソフトウエアは、異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、重複overlappingではなく、しかし遺伝子組換え事象を推定するために使用され得る連続配列に対応することを決定する。例えば、ウイルスの2つの株の共感染は、5’末端これは、他方のウイルス株についての遺伝子の対応するセクションで置換されている以外は一方のウイルス株と相同である遺伝子との組換え体を作製し得る。この新規の組換えウイルスゲノムがリシークエンシングマイクロアレイ上にハイブリダイズされると、それは、両方の領域の対応するピースからのシグナルを発生する。どの部分が一緒にフィットして全体標的entiretargetを形成するのかを示す、病原体のモデルを構築するアセンブリアルゴリズムassemblyalgorithmを有する必要がある。該2つが有意な重複significantoverlapを有する場合、恐らく混合物が存在すると結論付けるかもしれない。しかし重複が存在しない場合、組換え体が存在する可能性は残ったままである。重複または欠如lackofの程度は、標的の低濃度によって影響され得、対応してより少量のタイルが埋められるfilledin。この同一原理は、なおより容易に、そしてより大きな影響を伴って、ウイルスに適用され得、ここで、組換えは、インフルエンザの場合のように、定常かつ反復する事象であり、ここで、ウイルスセグメント間の組換えは、新規のウイルス株を定期的に形成させる。実際に、REPIにおけるこの記載されるファンクショナリティーfunctionalityは、病原体混合物と組換えとの識別に必須である。別の非常に好ましい実施形態において、REPIアルゴリズムは、RNAまたは相補cDNAのハイブリダイゼーションを介して現在記載されるタイプのマイクロアレイを使用してリシークエンスされた転写マーカー例えば、RNAの分析を可能にする。ゲノム組換え事象の推測について上述されるものに類似する方法において、転写配列はまた、アセンブリされ得、感染についてのマーカーとして役立ち得る転写編集事象transcriptionaleditingeventsおよび病原体バイアビリティーpathogenviabilityを決定する。別のREPI代替物サンプル中の病原体標的の量を評価する本発明のアプローチは、病原体の混合物と所定の病原体内の組換え事象とを識別し得るだけでなく本明細書中他の場所で記載される、リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された病原体の相対量の評価estimate定量化をエンドユーザに提供することはまた、非常に価値がある。特に、これは、臨床医技術者が、複数の病原体ゲノムシグネチャーsignaturesが検出された場合に原因および作用を帰属しようとする際に、非常に有用である。2つのタイプのデータがこの目的のために使用され得る。第1のものは、チップ上におけるハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度である。非線形関係が、溶液中の標的の量と実際にハイブリダイズする量および得られるシグナルとの間に存在する。しかし、サンプル中の標的核酸の量の評価は、コントロール条件下で調製される標準曲線との比較によって行われ得る。シグナル強度データは、Affymetrixデータヒエラルキーhierarchyにおける.CELファイルから容易に入手可能であり、そして該.CELファイルの内容物は本開示において使用されなかったが、REPIのアプトプットは、該.CELファイルの強度値を含めるように容易に変換され得る。第二に、ベースコールのパーセンテージ[総タイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムを満足する選択されたサブ配列内のベースコールのパーセンテージとして、の両方]が、濃度の指標measureとして使用され得る。本発明者の結果は、これらのパーセンテージメトリクスmetricsの両方ともが、標的濃度が減少するにつれて減少し、しかし、正確な標的配列は依然として同定され得ることを示す。病原体検出のための一般的な有用性好ましい実施形態において、本明細書中に記載される本発明は、臨床セッティングにおけるポイント-オブ-ケアpointofcareでまたはその付近での一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensルーチン診断およびサーベイランスのために使用される。容易に得ることが出来るサンプル例えば、鼻洗浄nasalwash、鼻スワブnasalswab、咽喉スワブthroatswab、痰、または血液を単純な様式で処理し、核酸単離物isolates[これらは、吸着性プロセスadsorptiveprocessを使用して得られる]を作製し、病原体特異的標的について濃縮し、偏りのないnonbiased例えばトータル増幅法またはマルチプレックストmultiplexedPCR法を使用して増幅し、そして洗浄および画像化の前に短時間、リシークエンシングマイクロアレイ上でハイブリダイズさせる。全体的なプロセスは十分に単純であり、その結果、当業者医療技術者レベルは、彼らのルーチンワークパターンの顕著な妨害なしに、該アッセイを行うことができる。ベースコールは、カスタムアルゴリズムを使用して、または業者によって特定されるステップを使用して作製される。REPI、またはその変形が使用され、マイクロアレイによって作製されるベースコールを自動的に解析し、そしてエンドユーザ例えば、医師、ヘルスケア提供者healthcareprovider、公衆衛生提供者publichealthofficer、または他の意志決定者decisionmakersに、疾患症状および合併症の原因である感染性病原体のマネージメント例えば、診断、治療、予防および大発生制御/封じ込め指標outbreakcontrolcontainmentmeasuresについての決定-クオリティ情報decisionqualityinformationを提供する。この分析は、REPI例えば、ローカル専用BLASTサーバによってクエリーされる埋め込まれた配列データベースの使用によって、ローカル的に生じる。ルーチン診断機能性を提供することに加えて、該マイクロアレイはまた、他者、即ち、公衆衛生局publichealthofficialsの関与の原因となる、非常に起こりそうもない即ち、生物テロ病原体についてのマーカーを有する。しかし、鼻洗浄物または咽頭スワブが生物テロ薬剤の診断のために最適なサンプルタイプでないかもしれないこと、および別個のサンプルタイプが必要とされるかもしれないことが理解される。本発明の範囲内でまた、以下に、本発明のマイクロアレイおよび方法の有用性をさらに実証する:シナリオ1:患者は、T>100.5および呼吸器症状を有して、医療機関に到着する。鼻洗浄物および/または咽頭スワブを採取する。このルートで同定され得る病原体としては、表1に列挙されるものを含む、一般的に存在する病原体が挙げられる。熱の存在が、培養により呼吸器病原体を単離することについての重要な基準であることが判明しており、そして文献は、病原体は典型的に発熱期間にピーク力価で存在することを実証する。生物テロ薬剤について、生物学的薬剤biologicalagenの故意の放出後の呼吸分泌物中の感染性力価について情報は、文献においてほとんど入手可能でない。生物テロの薬剤のエアゾール放出は、暴露後の最初の24時間で生物の検出可能な力価へ至ると考えられる。暴露後の最初の24時間後に存在する個人において、該マイクロアレイは、そうでなければ誤ってBT/BW因子由来のケースであると疑われるかもしれない、一般的な病原体を同定する目的に役立つ。顕著なエアゾール放出に暴露された個人の集団は、急速に症状を進展させ、そして、検出のために鼻孔中のBT/BW因子を保持する。痘瘡のような疾患について、症状の発症の潜伏期は、遥かにより長く、しかしウイルスは、数日間の咽喉培養物から単離され得る。シナリオ2:個人は、数日間、病気であり、そして初期は病院に行かず、しかし自分で治療することを選択した。患者は、初期は熱に気付かないかもしれなかったが、現在、熱および呼吸器症状を有し、そして解決法が無いこと心配している。医療関係者HealthCarePractitionerHCPは患者を診て、適切な臨床サンプルを決定する。患者がより病気に見えるならば、胸部X線写真を撮ってもよい。より低い呼吸器感染症を引き起こす一般的な生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:肺炎マイコプラスマ、S.pneumoniae、C.pneumoniae、L.pneumophila、S.pyogenes、インフルエンザA/B、RSV、パラインフルエンザ、S.aureus、SARS。問題のBT/BW因子の中でも、炭疽菌Banthracis、痘瘡Smallpox、ペスト菌Ypestis、野兎病菌Ftularensisで、異常な胸部X線写真が見られ得る。一般的な呼吸性生物について、痰サンプルを送ることを選択する実施者practitionerもいるが、鼻洗浄物/咽頭スワブが依然として好適なサンプル技術であり得る。BT/BW因子について、痰および血液が好適なサンプル技術であり得る。シナリオ3:既知の因子の進行中の発生。該マイクロアレイは、他の一般的な病原体の検出ケースに有用であり続け得け、しかし、任意のタイプの好適な試料を使用して既知のBT/BW因子をスクリーニングするために使用されてもよい。他の分析がより安価であると判明するかもしれず、しかし、該マイクロアレイは、病原体同定の際に、法医学的情報forensicinformationおよび抗生物質耐性データを提供し得る。全体的なビジネスモデルリシークエンシングDNAマイクロアレイおよび関連するデバイスより低い含有量のマイクロアレイの他のタイプまたは代替の配列検出器を含むは、一体化された病原体診断/サーベイランスシステムのエレメントの1クラスである。このシステムは、診断、情報および疫学コンポーネントから構成される。診断レベルで、RPMおよび付属のデバイスは、感染性呼吸器疾患の診断、患者特異的治療情報および予後情報を提供するための、迅速かつ費用効率の高い方法を提供する。これは、1または数個の病原体の臨床的疑念clinicalsuspicion例えば、肺炎マイコプラスマおよびウォーキング肺炎walkingpneumoniaの提示を有する他の病原体は、細菌培養物を得ること、その病原体に対する抗生物質の存在などによって試験されるから、症状および器官系または影響を与えられた系organsystemorsystemseffectedに基づくマルチプレックストDNAマイクロアレイによる症状ベースかつ広範囲の鑑別試験への、提供者についての診断重視のシフトを示す。単一の高度に多重化されたDNAアレイsinglehighlymultiplexedDNAarraysは、どの病原体の群を治療するか例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、および真菌病原体についての診断情報をさらに提供し、原因となる因子の疑念に基づく処方箋の数を減少させることによって例えば、ウイルス性呼吸器疾患についての抗生物質を処方することは、効果を有さない、投資に対して実質的なリターンを生じさせる。さらなる診断適用は、以下に影響を与えるeffecting全ての病原体をカバーするように作製され得る:器官または器官系例えば、呼吸器、尿生殖器、中枢神経系など、症候群例えば、原因を同定せずに、全ての可能性のある感染病原因を除外する、2週間病院において評価されて未知の起源の熱、症状例えば、痒いじんま疹または発疹、咳などを引き起こす全ての病原体[地理的位置に存在する病原体または脅威のコレクションの周囲の]、または機能的カテゴリー例えば、病院あるいは刑務所または老人ホームのような他の囲まれたセッティングにおいて抗菌剤耐性を有すると知られている全ての生物に基づく分類。この高度に多重化された鑑別診断試験は、感染の原因因子、該因子の抗菌剤感受性、および該因子の性質についてのゲノム配列特異的手掛かりcluesを決定することによってなされ、その結果、臨床管理の効果および効率を増加させるための最大数の機会が同定される。しかし、作製される多数の特異的分子クエリーのために、各々、以前では得られない詳細レベルで、多数の病原体が検出され得る。したがって、サーベイランスアクティビティーの一部として引き続いてそして稀に行われる多数のアッセイ培養、血清型決定serotyping、およびPCR確認は、今回、診断と同時に行われ、サーベイランスサポートのために臨床レベルで現在必要とされる煩わしくそして高価なタスクについての必要性を未然に防ぐ。これは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットに依存する場合には法外に複雑である様式でのRNAウィルス例えば、インフルエンザおよびSARSの変異体の診断およびサーベイランスに大いに関連している。本明細書中で記載される特定の実施形態において、その製造が多数の標的配列およびそれらを使用してアレイを製造する手段の利用可能性に依存しない、診断マイクロアレイを有することは非常に有利である。より重要なことには、標的配列が不変であるinvariantという仮定に制限されないことが、重要である。診断DNAマイクロアレイは、特異的オリゴヌクレオチドプローブの再設計およびアレイ再製造を必要とすることなく、モデル病原体の特異的であってしかし予期されないゲノム変異体を同定する。これは、時間効率的timeeffective様式で感染症発生の原因をキャラクタライズする能力にとって重要である。例えば、このようなマイクロアレイは、従来のアプローチ[病原体が容易に培養可能であるならば、数週間~数ヶ月を必要とするプロセス]を使用して病原体を単離、培養および配列決定することを必要とせずに、インフルエンザまたはSARSウイルスの新規の変異variationsを迅速に検出するために使用され得る。本発明はまた、病原体の混合物を検出するための適用[特に、該混合物が特異的試薬例えば、PCRプライマーによってインターロゲートされるかもしれないことを示唆する予備的証拠が存在しない場合]を含む。したがって、本発明は、疾患病因において相互作用する病原体の相補的役割complementaryrolesを測定する能力に衝撃を与える手段を提供する。しかし、ウイルスまたはバクテリア在庫品質管理およびウイルスワクチン生産の評価のような適用において[十分に培養される組換え体を製造するための培養可能なウイルスおよび野外株の意図的な混合物を含む]。それによって、本発明は、ワクチン有効性のために正しくそして好適なエピトープの提示を可能にする。該システムのインフォマティクスコンポーネントは、ローカルのポイント-オブ-ケア自動マイクロアレイ分析を可能にし、ならびに多方向情報多重方向情報転送を調整するための必要なコンポーネントを提供する。情報の上方向のフローUpwardflowは、局所的、地域的、国家的および国際的なレベルへの、好ましくはFASTAフォーマットの、リシークエンシングチップからの特異的配列ベースコールおよび全ての関連するローカルプロセッシング結果の転送を必要とする。情報の横方向のフローLateralflowは、他のローカルポイント-オブ-ケア医療機関への、特異的配列ベースコールおよび関連するローカルプロセッシング結果の交換を含む。下方向のフローDownwardflowの情報は、地域的および局所的な衛生局healthofficialsへの、国家的レベルデータ統合の提供と規定される。臨床サンプルと同様に、環境サンプルは、未知の起源の高いゲノムバックグラウンド中に少量の標的核酸を含み得る。しかし、所定のタイプの臨床サンプルとは異なり、環境サンプル中に見られるバックグラウンドは、地理的位置、季節および環境的条件に依存して、より不均一な組成を示すかもしれない。したがって、上述の増幅、濃縮および/またはサブトラクション戦略が、信頼性の高いベースコーリングを得るために使用され得る。法医学および環境適用RPMによって提供される詳細な配列情報の量は、医学診断およびサーベイランス以外の種々の適用を可能にする。したがって、該装置の能力は、特定の病原体株の法医学的フィンガープリントforensicfingerprintingにまで及ぶ。該能力は、確証診断分析の従来のプラクティスの代替として、感染症の病因の先制preemptive診断を可能にする。意図的な感染、中毒または生物テロ事象の場合、該リシークエンシング病原体検出マイクロアレイは、発生調査プロセスの完了した第一ステップとして該株へ該病原体を同定させることに向けられる、標的にされる公衆衛生封じ込め手段を実施することによって、該事象の可能性のある起源元originatorを決定するためおよび該事象の迅速な緩和例えば、感染力の測定、抗菌剤耐性、または生物への操作された修飾を可能にするために使用され得る詳細な株同定を可能にする。本発明は、さらに、誘導的derivativeサブアレイを含む、アレイの反復的かつ適応的な設計、製造およ検証を自動化および最適化する方法およびプロセスを示唆する。非常に好ましい実施形態において、企業レベル、個々の病原体についての専門家のコンソーシアムは、ウェブポータル可能化データベースwebportalenableddatabaseを維持する。該コンソーシアムは、ビルレンスおよび同定のために病原体標的配列を維持する。本発明に記載される同一の技術は、空気、水、土または表面スワブsurfaceswabsを含む、非臨床サンプルについて使用され得る。サブトラクティブアプローチ続いての包括的増幅が望ましいアプローチである場合、本発明に記載されるものに対して必要なただ一つの修正は、核酸抽出およびバックグラウンド核酸除去に必要なものである。集団におけるマルチプル病原体サイベーランスMultiplePathogenSurveillanceinaPopulation本発明は、さらに、リアルワールドオペレーショナルセッティングrealworldoperationalsettingにおいてその能力を有効にする特定の実施を提供する。この実施は、一般的である病因およびあまり一般的でない病因を含む急性呼吸器疾患の集団発生に関係し、同時に、個々の遭遇における敵対的な病原性因子あるとしても稀の可能性のある提示を評価する。したがって、本発明は、感染性発生に関与する複数の感染性病原体のほぼリアルタイムのサーベイランスを行う手段を提供する。このようなサーベイランスは、有効にされそして最終的にはリアルワールドテストベッドrealworldtestbedにおいて運用可能となり得る。好ましい実施形態において、該リアルワールドテストヘッドは、規則的に種々の呼吸器病原体に遭遇する人間集団である。好ましい実施形態において、該集団は、軍事施設または基地での軍人から構成される。非常に好ましい実施形態において、該集団は、現役の軍人から構成される。エンドユーザー特化適用Enduserspecifiedapplicationsマイクロアレイ設計およびアッセイの一体化されたプロセスは、配列がマイクロアレイ製造業者に提供されることのみを要求し、そして付随的な試薬例えば、特異的PCR用の設計を含まない。したがって、ゲノミクスについての詳細な知識を有していないエンドユーザは、マイクロアレイに基づくアッセイの質的特質qualitativeattributesを定義することができ、そして自動バイオインフォマティクスパイプラインは、リシークエンシングマイクロアレイ製造業者へのサブミッションに好適な標的遺伝子サブ配列を選択するために使用される。これは、特定の地理的ロケーション、戦域theaterofoperationsのための、新規のマイクロアレイ設計の迅速な配備を可能にする。したがって、本発明によって可能にされる一体化設計/分析能力は、本明細書中に列挙されるものに加えて他の想定される適用に一般化される。アデノウイルス配列-本発明のさらなる実施形態において、本発明の日付で知られていなかった、13個のアデノウイルス株のゲノム配列である。該13個のアデノウイルス株は、以下である:Ad3、Ad3FS_navy、Ad4、Ad4vaccine、Ad4FS_navy、Ad4FS_AF、Ad5FS、Ad7、Ad7FS_navy、Ad7vaccine、Ad16、Ad1、およびAd21。これらのゲノム配列は、実施例中の表6に示されるGenBankアクセッション番号が付与されている。部分注釈partialannotationを含む、これらの配列の各々についての全GenBank記録は、本明細書に添付の配列表において見られる。ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合によって連結されたいくつかのアミノ酸残基の配列を意味することが理解される。このようなアミノ酸は当該分野において公知であり、そして修飾されていないおよび修飾されたアミノ酸を含む。さらに、当該分野において公知の1以上の修飾例えば、グリコシル化、リン酸化などが、ポリペプチドを修飾するかもしれない。用語単離されるisolatedは、その天然環境からの分離されるseparatedことを意味する。この用語はまた、用語精製されるpurified100純粋および実質的に精製されるsubstantiallypurified少なくとも90純粋を含むように意図される。用語ポリヌクレオチドは、一般的に、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドをいい、そして修飾されていないRNAまたはDNAあるいは修飾されたRNAまたはDNAを意味し得る。用語相同なhomologousは、本明細書中で使用される場合、同一種由来または異なる種由来の、2以上のポリヌクレオチドまたは蛋白質の間の配列類似性を意味すると理解される。この用語の意味内で、候補配列の少なくとも70、好ましくは80、最も好ましくは少なくとも90のヌクレオチド塩基アミノ酸組成が本発明の配列に対応する場合、前記2以上のポリヌクレオチドまたは蛋白質は相同である。本発明によれば、相同な蛋白質homologousproteinは、本発明の配列の活性の活性の少なくとも50、好ましくは少なくとも75、より好ましくは少なくとも85、最も好ましくは少なくとも95を保持することが理解される。本明細書中で使用される場合、対応するcorrespondsは、対応のアミノ酸が同一であるかまたは互いに相同なアミノ酸であることを意味すると理解される。表現相同なアミノ酸homologousaminoacidsは、特にそれらの電荷、疎水性特性、立体的特性などに関して、対応の特性を有するものを意味する。同一の専門用語が、対応の蛋白質をコードする遺伝子配列についてのDNAまたはRNA配列相同性を記載するために使用され得る。用語相同なフラグメントhomologousfragmentは、本明細書中で使用される場合、同一種由来または異なる種由来の、2以上のポリヌクレオチドまたは蛋白質を意味すると理解される。この文脈において、少なくとも50アミノ酸を有するフラグメントと少なくとも40同一性を共有する場合、フラグメントは相同であると考えられる。好ましくは、相同なフラグメントは、少なくとも50アミノ酸を有するフラグメントに対して少なくとも50同一性を共有する。より好ましくは、相同なフラグメントは、少なくとも50アミノ酸を有するフラグメントに対して少なくとも60同一性、少なくとも70同一性、少なくとも80同一性、少なくとも90同一性、または少なくとも95同一性を共有する。したがって、相同なフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。相同なポリヌクレオチドについて、同一の相同性範囲が本発明において想像されることが理解され、しかし、1000ヌクレオチドまでの範囲に渡ってであって、全ての整数を含む即ち、150、250、300、500、750など。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性は、公知のソフトウエアまたはコンピュータプログラム、例えば、theBestFitorGappairwisecomparisonprogramsGCGWisconsinPackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin53711を使用することによって慣用的に測定され得る。BestFitは、SmithandWatermanAdvancesinAppliedMathematics2482489のローカルホモロジーアルゴリズムを使用し、2つの配列間の同一性または類似性のベストセグメントを見つけ出す。Gapはグローバルアラインメントglobalalignmentsを行う:NeedlemanandWunschJMolBiol48443453の方法を使用する1つの配列の全ておよび別の類似の配列の全て。BestFitのような配列アラインメントプログラムを使用する場合、配列相同性、類似性または同一性の程度を測定するために、デフォルトセッティングが使用され得、あるいは、好適なスコアリングマトリクスscoringmatrixが、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択され得る。同様に、2つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにBestFitのようなプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用され得るか、あるいは好適なスコアリングマトリクス例えば、blosum45またはblosum80が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択され得る。本発明はまた、オープンリーディングフレームによって同定される、完全な遺伝子completegenesを含むポリヌクレオチドに関する。本発明によって含まれる好ましい遺伝子の例としては、E1A、ヘキソン、およびファイバーfiberが挙げられる。E1A、ヘキソン、およびファイバーの配列、ならびに本発明の範囲内の他の好ましいポリヌクレオチド配列は、添付の配列表中に見られる。本発明は、また、前記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの配列を含むプローブとの対応のジーンバンクのハイブリダイゼーション、および該DNA配列の単離、の手段によってスクリーニングすることによって得られ得る、前記遺伝子のフラグメントおよびポリヌクレオチドおよびそのフラグメントを含む。本発明はまた、遺伝暗号の縮重から生じるコーディングDNA配列に関する。さらに、当業者はまた、該蛋白質の活性に何ら根本的な変化を生じさせない即ち、機能的にニュートラルであるセンス突然変異sensemutationsとして、蛋白質中のアラニンによるグリシンの置換あるいはグルタミン酸によるアスパラギン酸の置換のような、保存的なアミノ酸置換を認識する。蛋白質のNおよび/またはC末端での変化は、その機能を実質的に害さず、そして該機能を安定化さえし得ることも、知られている。本発明に従うポリヌクレオチド配列は、それらのcDNAまたは遺伝子を単離するための、RNA、cDNAおよびDNAについてのハイブリダイゼーションプローブとして好適であり、これは、該プローブ配列に対する高度の類似性を示す。本発明に従うポリヌクレオチド配列はまた、活性酵素をコードするDNAの産生のためのポリメラーゼ連鎖反応PCRのプライマーとしても好適である。プローブまたはプライマーとして役立つ、これらのようなオリゴヌクレオチドは、30超、好ましくは30まで、より好ましくは20まで、なおより好ましくは少なくとも15、そして最も好ましくは少なくとも13の連続ヌクレオチドを含有し得る。少なくとも40~50のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドも好適である。ハイブリダイゼーションプロトコルは当該分野において公知であり、そして、例えば、SambrooketalMolecularCloningALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryNewYorkに開示されている。しかし、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、従来の相同性プログラムを使用して測定した場合に、75、80、85、90、95、または98相同であるポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能にする条件であり、その例は、ウィスコンシン大学から入手可能なUWGCG配列分析プログラムであるDevereuxHaeberliSmithies1984。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH7.0~8.3で、約1.5MNaイオン未満、典型的に約0.01~1.0MNaイオン濃度または他の塩であり、そして温度が、短いプローブ例えば、10~50ヌクレオチドについて少なくとも約30°Cそして長いプローブ例えば、50ヌクレオチド超について少なくとも60°Cであるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤destabilizingagentsの添加で達成され得る。典型的な低ストリンジェンシー条件は、37°Cで1SDSドデシル硫酸ナトリウム、1MNaCl、30~35ホルムアミドの緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、ならびに50~55°Cでの1×~2×SSC20×SSC=3.0MNaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウムでの洗浄を含む。典型的な中程度ストリンジェンシー条件は、37°Cでの1SDS、1MNaCl、40~45ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、ならびに55~60°Cでの0.5×~1×SSCでの洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、37°Cでの1SDS、1MNaCl、50ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、ならびに60~65°Cでの0.1×SSCでの洗浄を含む。特異性は、典型的に、ポストハイブリダイゼーション洗浄に関係し、重要な因子は、最終洗浄溶液の温度およびイオン強度である。DNA-DNAハイブリッドについて、Tmは、MeinkothおよびWahlの式MeinkothおよびWahl、1984から概算され得る:Tm=81.5°C16.6logM0.41GC-0.61form-500/L;式中、Mは一価カチオンのモル濃度であり、GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてLは塩基対の該ハイブリッドの長さである。Tmは、相補的標的配列の50が、完全にマッチするプローブへハイブリダイズする温度規定のイオン強度およびpH下である。Tmは、ミスマッチングの各1について約1°C低下され;したがって、Tm、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄条件は、所望の同一性の配列へハイブリダイズするように調節され得る。例えば、約90同一性を有する配列が求められる場合、Tmは、10°C低下され得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHで特定の配列およびその相補体についての熱融解点thermalmeltingpointTmよりも約5°C低くなるように選択される。しかし、厳格にストリンジェントな条件は、熱融解点Tmよりも1、2、3、または4°C低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を使用し得;中程度にストリンジェントな条件は、熱融解点Tmよりも6、7、8、9、または10°C低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を使用し得;低ストリンジェンシー条件は、熱融解点Tmよりも11、12、13、14、15、または20oC低い温度でのハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を使用し得る。等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のTmを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化は本質的にinherently記載されていると理解する。所望のミスマッチングが45°C未満水溶液または32°C未満ホルムアルデヒド溶液のTmを生じさせる場合、SSC濃度を増加させることが好ましく、その結果、より高い温度が使用され得る。核酸のハイブリダイゼーションへの広いガイドは、CurrentProtocolsinMolecularBiologyChapter2AusubeletalEdsGreenePublishingandWileyInterscienceNewYorkにおいて見られる。本発明において、プライマーまたはプローブは、合成的にまたは生物学的に作製され、そして特定のヌクレオチド配列を含み、そして標的ヌクレオチド配列を含むセクションへのハイブリダイゼーションを可能にする、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドを意味する。規定されるプライマーまたはプローブ、ならびに本発明の他の全てのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、シアノエチル-ホスホルアミダイト前駆体を使用する自動固相化学合成を含む、いくつかの周知の方法のいずれによっても作製され得る。合成プライマー/オリゴヌクレオチドの構築のための他の周知の方法も、当然ながら、使用され得る。JSambrookEFFritschandTManiatisMolecularCloning11。サンプル核酸を増幅するために使用されるプラマーは、検出可能な部分へカップリングされ得る。このような検出可能な部分の好ましい例は、フルオレセインであり、これは、検出システムとしてレーザー光を使用する核酸配列決定システム中において使用される標準的な標識である。しかし、他の検出可能な標識もまた使用され得、他のフルオロフォア、放射標識、化学的カプラーchemicalcouplers例えば、ストレプトアビジン結合酵素で検出され得るビオチン、およびエピトープタグ例えば、抗体を使用して検出されるジゴキシゲニンが挙げられる。プライマーは修飾され得、それによって、別のヌクレオチドが添加されるか、除去されるか、または該オリゴヌクレオチド中の少なくとも1つのヌクレオチドについて置換される。オリゴヌクレオチドの合成後の、放射活性物質、酵素、蛍光物質などの公知の標識の導入もまた、そこに含まれる。同様に、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドとハイブリダイズするために使用されるプローブ/オリゴヌクレオチドは、例えばこのようなポリヌクレオチドの検出の目的のために、検出可能な部分へカップリングされ得る。本明細書中で使用される場合、用語増強enhancementは、対応するDNAによってコードされる、植物細胞および/または植物中の1以上の酵素の細胞内活性を増加することを意味する。増強は、細菌細胞の種々の操作の助けを借りて達成され得る。増強特に、過剰発現を達成するために、対応する遺伝子のコピーの数が増加され得、強力なプロモータが使用され得、あるいは構造遺伝子の上流に配置されるリボソーム結合部位またはプロモータおよび調節領域が変異され得る。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは、同一の様式で機能する。さらに、誘導プロモータinduciblepromotersを使用することにより発現を増加させることが可能である。高活性を有する対応の酵素をコードする遺伝子もまた使用され得る。発現はまた、mRNAの寿命を延長するための手段によって改善され得る。さらには、酵素の分解を防止することは、全体として酵素活性を増加する。さらに、これらの手段は、任意の所望の様式で、必要に応じて組合され得る。高活性を有する対応のまたはバリアント酵素をコードする遺伝子も使用され得る。好ましくは、対応の酵素は、該酵素の天然形態よりも高い活性を有し、より好ましくは、少なくとも5、10、25または50超活性の範囲、最も好ましくは、天然酵素の活性の2倍超である。本発明の上記の記載は、当業者がそれを作製および使用することができるように、それを作製および使用する様式およびプロセスを提供し、この実施可能性は、特に、原記載の一部を形成する、添付の特許請求の範囲の要件について提供される。本明細書中で使用される場合、フレーズからなる群から選択される、から選択されるなどは、特定の材料の混合物を含む。数値限定または範囲が本明細書中で述べられる場合、終点endpointsが含まれる。また、数字限定または範囲内の全ての値およびサブ範囲subrangesは、明示的に書き出されるかのように、具体的に含まれる。上記の説明は、当業者が、本発明を作製および使用することを可能にするように提供されており、そして特定の適用およびその要件の意味で提供される。好ましい実施形態への種々の修飾は、当業者に容易に明らかであり、そして本明細書中で規定される一般的な原則は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および適用へ適用され得る。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されるように意図されず、しかし、本明細書中に開示される原則および特徴と一致する最も広い範囲に一致される。本発明は一般的に記載されたが、例示目的のみに本明細書中に与えられそして特に述べられない限り限定的であるように意図されない、特定の具体的な実施例を参照することによってさらに理解され得る。実施例材料および方法-表6下記は、以下の実施例において引用するアデノウイルス株を列挙する。GenBankアクセッション番号は、各株に付与されたゲノム配列番号をいう。これらの配列は、発明時に公衆に利用可能ではなく、そして本発明の実施形態を形成し、これらのフラグメントも同様である。部分注釈partialannotationを含む、これらの各々についての全GenBank記録は、本明細書に添付の配列表において見られる。インフルエンザ内容物contentRPMV1上のタイルにより表されるプロトタイプインフルエンザタイプは、以下である:パブリックドメインおよびパーソナル通信から得られる、上述の配列、ならびに残りの病原体標的配列の各々についてのアクセッション番号を、表9に列挙する。調製例1:RPMバージョン1チップ設計以下の実施例において使用されるリシークエンシングマイクロアレイチップRPMバージョン1チップの作製のために、AffymetrixへDNA配列を提供した。AffymetrixへへのDNA配列および命令ファイルinstructionfilesの提出は、製造業者使用説明書CustomSeqTMArrayProtocolおよびプロダクトリテラチャーproductliteratureに従った。プローブ長は、名目上25ヌクレオチド長であり、そしてセンスおよびアンチセンスの両方向で、4個の可能性のあるバリアントA、C、TまたはGの各々について可変インターロゲーションポイント中央ヌクレオチドを含んだ。上記に列挙されるRPMV1病原体について選択される標的遺伝子は、それらの増幅のために使用されるそれぞれのPCRプライマーと共に、配列表および表8において示されるバージョン1レイアウトで示される。タイリングおよびチップ製造のために提出される配列は、表7に概述されるAffymetrix命令ファイルに基づき、これは、配列番号1~58に対応する。対応の命令ファイルは、各タイル領域について別名aliasdesignator例えば、FluAHA5を列挙し、そしてFASTAフォーマットされた標的遺伝子配列これは、完全標的遺伝子の全部または一部であり得るを提供する。命令ファイルは同一の別名aliasdesignatorsを参照し、しかしさらに、アレイ上へ実際にタイル張りされる実際のサブ配列を特定する。大抵の場合、これは、配列ファイルからの全配列を示すが、他例えば、FluBMATRIXの場合において、総配列のヌクレオチド1~362のみが、タイリングのために使用された。表9は、命令ファイルに示される情報を提供する。表9下記:RPMV1設計仕様の命令ファイルスペシフィックファイルspecificfile。別名aliasdesignatorは、各々の分離したタイル領域例えば、病原体ゲノム配列のストレッチのリシークエンシングのために必要とされる全てのプローブ組合せを含むマイクロアレイの幾何学的領域へ帰属された名称である。病原体、配列アクセッション番号、および各タイル領域についてのタイルサイズが示される。Affymetrix提出フォーマットで処理された、命令は、表7に示される。命令ファイルは、添付の配列表に示される配列番号1~58において見られる完全標的遺伝子の完全または部分配列を参照する。Affymetrixでのチップ設計チームは、上記情報および対応の配列ファイル情報の組合せを使用して、チップのレイアウトを作製した。図1は、任意の所与の病原体についての遺伝子配列が、下記の実施例において使用されるリシークエンシングマイクロアレイチップRPMバージョン1チップ上のどこでクラスターされるかの関数としての、チップレイアウトの全体像を示す。この図およびチップレイアウトは、RPMV1についての種々の病原体へのリアルエステート割り当てrealestateallocationの例示のためだけであり、そして決して限定的であると意図されない。当業者は、このチップ上の病原体クラスターの各々へ捧げられる配列の相対的な順番および量は、該チップのユーティリティに対して本質的悪影響を与えること無しに変化され得ることを理解する。各々の分離したタイル領域からの最初の12および最後の12配列がリシークエンシングマイクロアレイのタイリング戦略によってクエリーされないことをタイリング戦略が命令することに注意することが重要であり、何故ならば、それらは、第13位で変化される最初および最後の25量体プローブのコンポーネントとして使用されるからである。該チップのアデノウイルス領域Ad4,Ad5,Ad7およびAd7ワクチンに使用される配列は、全て、本発明者によって配列決定されたゲノムの初期ドラフトearlydraftsに由来した。タイルド領域のために使用されるゲノムに対応するGenBankサブミッションファイルは、表6に列挙される。プロトタイプについてAffymetrixへサブミットされた配列は、該ゲノムの初期ドラフトに基づいたので、それらの初期配列とGenBankへサブミットされた最終配列との間で不一致が観察された。それらの不一致のリストを表10に提供する。この比較的少数の不一致は、実施例において記載される、アデノウイルス4型の1つの特別なケースを除いて、正確な生物と関連し得るベースコールを作成する該チップの能力を妨げなかった。全体的に、本発明のリシークエンシングマイクロアレイ技術は、塩基置換に関してタイルド遺伝子の正確なリファインされた最終配列を確認し、本発明の予期されないロバスト性robustnessを検証する。調製例2:PCRプライマー設計および増幅プロトコル縮重PCRプライマー設計-保存縮重マルチプレックスPCRを支援する、プライマー選択の目的は、E1A、ファイバーおよへクソン遺伝子の種特異的の可変領域をフランキングする保存された領域を標的にするプライマーを設計することである。一般に、種のうちの保存配列が天然においてユビキタスであるように、この方法は、任意の有機体に適用され得る。これらの標的遺伝子は、線形のアデノウイルスのゲノム内のそれらの機能および位置に基づいて選択された。E1Aはアデノウイルスゲノムの5’末端に位置し、初期遺伝子の転写活性に必要なトランス活性化転写調節因子をコードする。アデノウイルスゲノムの中央および3’末端に配置される、へクソンおよびファイバー遺伝子は、ウイルス血清型を決定する、抗原決定基εおよびγをそれぞれコードする。したがって、ARDを引き起こすアデノウイルスの検出およびセロタイピングは、血清型を生じさせる核酸決定基を標的にすることにより有効にされ得る。そのために、プライマーは、アデノウイルス内の特異的増幅を提供し、一方、可変領域は、適切な種同定のためにセロタイプ特異的な特徴を供給した。以下の実施例の中で保存縮重マルチプレックスPCRのために使用されたプライマーは、GenBankGenBank登録番号は括弧で与えられるから利用可能で、E1A、ファイバーおよびへクソン遺伝子配列の全体的なアラインメントにそれぞれ基づく。E1A-AdBNC_004001,AdCNC_001405,Ad3AF492352,Ad4M14918,Ad7X03000;ファイバー-Ad2AJ278921,Ad5M18369,Ad3X01998,Ad4X76547,Ad7M23696,Ad16U06106,Ad21U06107;へクソン-Ad3X76549,Ad4X84646,Ad6AF161560,X67710,Y17245,Ad7AF053087,X76551,Ad16X74662,Ad21AB053166。E1A遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ad3、Ad4、Ad7、Ad21、AdBおよびAdC血清型からのE1A遺伝子配列を使用した。ファイバー遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ad2、Ad3、Ad4、Ad5、Ad7、Ad16およびAd21血清型からのファイバー遺伝子配列を使用した。へクソン遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ad3、Ad4、Ad6、Ad7、Ad16およびAd21血清型からへクソン遺伝子配列を使用した。全体な配列アライメントに続いて、プライマーペアは、血清型3、4、6、7、16および21のE1A、ファイバーおよびへクソン遺伝子を増幅するそれらの能力に基づいて選択したデータは示さない。表11は、以下の実施例において使用されたプライマーペアを示す。マルチプレックス縮重プライマーPCRプロトコル-プライマーペアLinら、2004年を、様々な複数のコンビネーションで評価し、アデノウイルス血清型3、4、6、7、16および21の増幅を得た。PCRを、以下を含有する50μl容積中において行った:20mMTris-HClpH8.4,50mMKCl,各々200iMのdNTPs,200nMAdB1,AdB2プライマー、300nMAdE1A-F,AdE1A-Rプライマー;400nMAdfib-F3,Adfib-R3プライマー;500nMAdhex-F7,Adhex-R5プライマー、2UのPlatinumTaqDNAポリメラーゼInvitrogen、および106コピーのDNAテンプレート。増幅反応は、3分間94°Cでの予備変性と共にPeltierThermalCycler-PTC225MJResearchを使用して行ない、次いで30秒間94°Cでの変性、30秒間50°Cでのアニーリング、40秒間72°Cでの伸長の40サイクル、および10分間72°Cでの最終伸長を続けた。総括的なマルチプレックスPCR分析は、Ad4のへクソン遺伝子がアガロースゲル上の非常に弱いバンドを示したとしても、アデノウイルスを引き起こす6つのすべてのARDの3つの遺伝子をすべて増幅することができた。トータル増幅プロトコル-トータル増幅Totalamplificationを、市販のGenomiPhiTMDNA増幅キットAmershamBiosciencesを使用して行い、象徴的に線形ゲノムDNAを増幅した本明細書以下でGenomiPhiトータル増幅という。GenomiPhiの完全な増幅方法の中で使用された増幅方法は、バクテリオファージPhi29DNAポリメラーゼ酵素を利用し、鎖置換増幅による、単一あるいは二本鎖の線形のDNAテンプレートを指数関数的に増幅した。出発サンプルを定量せず、直接使用した。調製例3:REPIソフトウエアリシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Affymetrix製のマイクロアレイリーダと共にパッケージにされた、GeneticDataAnalysisSoftwareバージョン2.0GDASによって提供される。GDASベースコーリングは、以前に記述されたベースコーリングアルゴリズムCutler、2001年らに基づく。GDASソフトウェアから得られたベースコールを含んでいるFASTA出力ファイルの各々を、本発明者が開発した専門のソフトウェアREPIを使用して分析した。本発明の場合において、GDASのシーケンス出力は、多くの場合、可変量の非コールn’sが分散されている連続配列コールA、T、CあるいはGの散在した混合物であり、ここで、GDASソフトウェアは、増幅、チップ上の弱いハイブリダイゼーション信号および/または非特異的結合により引き起こされる高バックグラウンドハイブリダイゼーションに起因してベースコールを作製しないCutlerら、2001。Ad4FIBERタイル領域についてのアデノウイルス4プロトタイプサンプルについてのGDASアプトプットの例示的アプトプットを、以下に示す配列番号429:BLASTKorfら、2003のような類似性サーチアルゴリズムは、n’sワイルドカードに類似の使用を可能にするが、あまりにも多くのn’sの組み込みは、受理不可能な程度の曖昧さを生じさせる。その場合、意味があるBLAST結果はリターンされない。REPIソフトウェアは、NCBIBLASTNアルゴリズムを使用して配列類似性サーチに好適なフォーマットへ配列データをモールドmoldするために選択および編集して、FASTAファイルのアウトプットを解析するように設計される。この目的を遂行するために、FASTAファイルから有用なBLAST可能なデータを抽出しながら、REPIは、できるだけ少なくデータを修飾する一連のフィルターを介して機能する。リシークエンシングマイクロアレイの性質により、配列は、しばしば、大量の非ベースコールn’sを含む。BLASTは大量の非ベースコールを含む配列について有意な類似性をリターンすることができない。したがって、有意な類似性をリターンする可能性が最も高い部分を抽出するために、オリジナルの配列は、フィルターされなければならない。見込みのあるprospective配列が遭遇する第一フィルタは、コントロールチェックである。マイクロアレイに組み入れられたコントロール配列は、無意味な配列であるように特に設計される;したがって、それは有意な類似性をリターンしない。次に、該配列は、BLAST可能なBLASTableデータのために評価される。ここで、スライディングウィンドウアルゴリズムが使用され、ウィンドウサイズパラメーターは、ユーザによって入力され、そしてアルゴリズムが一度に評価するベースコールの数を示す。該配列は第1ベースコールから出発して評価され、ウィンドウは、関連するデータを含む第1領域をサーチしながら該配列に沿ってスライドし、これはスコアリング方法を使用して評価され、ここで、全ての有効なベースは1のスコアが与えられ、そして全てのn’sはゼロのスコアが与えられる。スコアが所定の閾値ここでは、25が使用されるに等しいかまたはそれを超える場合、プログラムは、使用可能なデータの開始としてこのウィンドウのスタートをマークする。一旦使用可能なデータのスタートが決定されると、プログラムは、そのパラメーターをリバースし、そして使用可能なデータのエンドendをサーチし始め、ここで、スコアは閾値に等しいかそれ未満でなければならない。各配列について、REPIは、使用可能なデータの中で最大の連続的なストリングをサーチし、これは、その配列の最初のサブ配列を示す。次いで、このサブ配列は、n’sに始まりそしてこれを引きずるために、トリミングされる。トリミングは必要であり、何故ならば、前のフィルターは、サブ配列の開始時にスターティングウィンドウのスタート位置を、そしてサブ配列の終結時にエンディングウィンドウのラスト位置を使用し、したがって、ウィンドウのスコアがそこで受理可能であったとしても、サブ配列を導くかまたはこれに続くn’sが存在するかもしれないからである。サブ配列が通り抜ける次のフィルタは長さ評価である。50のヌクレオチドより長いサブ配列は、継続することを許され、20のヌクレオチドより短いサブ配列は廃棄され、そして20~50のヌクレオチド間のサブ配列は以下のように再評価される。これらのサブ配列の長さにより、それらは、以前に記述された同じスコアリングシステムを使用して再スコアリングされる。60を越える非ベースコールを備えたサブ配列は廃棄され;他のものはすべて、GenBankあるいは個人の修正データベースに対して、BLASTアルゴリズムを用いてサーチされ続けることを許可される。類似性サーチが完了すると、REPIは、標的配列のサブ配列パーセンテージ、サブ配列長さ、サブ配列ベースコールの数、およびサブ配列ベースコールのパーセンテージを含む、サブ配列について多数の統計を計算する。標的配列のサブ配列パーセンテージおよびサブ配列長は、標的病原体遺伝子のどの部分が同定されたかを示す。サブ配列長およびサブ配列ベースコールのパーセンテージは、フィルタリングアルゴリズムフィルターならびにGDAS閾値パラメータをモニタリングすることを可能にする。REPIは、BLASTNアルゴリズムからリターンされた統計結果を全てセーブし、どの結果をグラフィカルユーザインターフェースにディスプレイするかをユーザが操作することを可能にする。提供される実施例において、REPIは、CGIPerlインターフェース経由で、ローカルBLASTNCBIGenBankデータベース4.5GBのランダムアクセスメモリを備えたAppleG5の単一プロセッサ1.8のGhzコンピューター上で含まれるへインターフェースされた。表示された結果は、1.0e-9の期待値E-値閾値の内の全てのデータベース配列を含んだ。E値は、サーチスペースのサイズ、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーを与えられる場合の、ランダムに期待されるアラインメントの数を示し;E値が低いほど、データベース配列類似性マッチが実際にランダム同定である可能性が低くなる。定義によれば、e=2.71828182845904523536028747135。REPIアウトプットは、BLAST可能なサブ配列名、長さ、E値から構成され、そしてビットスコアは、ビットスコアの降順で各サブ配列について表示される。該名称は、GenBankレコードのFASTA同定ラインとして報告され、そして配列長を含む。該スコアは、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーから計算される標準化されたスコアであり、スコアが高くなるほど、類似性は高くなる。上記に列挙される例のREPIアウトプットを以下に示す。各BLAST可能なサブ配列について、REPIは、<10e-9の期待値を有する全てのGenBankデータレコードをリターンするビットスコアランキングの降順で。最も高いビットスコアは、アデノウイルス4プロトタイプAY594253について達成され、これは、このストレッチに渡ってAd4ワクチン株AY594254と遺伝的に識別不可能であり、一方、より低いビットスコアは、空軍および海軍トレイニングサイトAirForceandNavytrainingsitesからの野外株fieldstrains配列番号430を適切に識別する。REPIプログラムのためのアプリケーションJava登録商標Archive.jarファイルは、2004年9月15日に出願された米国出願シリアル番号第60/609,918号、および2004年11月29日に出願された米国出願シリアル番号第60/631,460号に提供される説明に従って、作成および処理される。実施例1-保存縮重PCRプライマーおよびGenomiPhiトータル増幅を使用してのアデノウイルス4についてのベースコールのBLAST分析およびベースコールセッティングリシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Affymetrix製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされたGeneticDataAnalysisSoftwareversion2.0GDASによって提供される。GDASベースコーリングは、以前に詳述されたCutlerら、2001、前述のベース-コーリングアルゴリズム、ABACUSに基づく。種々のベースコーリングアルゴリズムパラメータは、ユーザによって規定され得GDASオペレータマニュアル、ベースコーリングパーセンテージと精度との間のトレードオフtradeoffを得る。前記パラメータの説明は、GDASマニュアル中、第207~217頁に見られる。GDASについて推奨されるデフォルトセッティングは、正確さの最高レベルに注目する、保守的なconservativeセッティングである。対照的に、本発明の目的は、ベースコールのパーセンテージを増加させることである。この目的を達成するために、本発明者は、以下に列挙されるように、非常に許容性であるベースコール増加されたパーセンテージを許可するようにパラメーターを調節した:許容性ベースコーリングアルゴリズムセッティング--フィルター条件NoSignal閾値=0500デフォルト=1000000WeakSignalFold閾値=20000000デフォルト=20000000LargeSNR閾値=20000000デフォルト=20000000-アルゴリズムパラメータStrandQuality閾値=0000デフォルト=0000000TotalQuality閾値=250000デフォルト=75000000MaximumFractionofHeterozygoteCalls=099000デフォルト=0900000ModelType=0PerfectCallQuality閾値0500デフォルト=2000000-最終信頼性規則FinalReliabilityRulesMinFractionofCallsinNeighboringProbes10000フィルターを無効にするMinFractionofCallsofSamples=10000フィルターを無効にする上記のセッティングは、本願において重要であり、何故ならば、ベースコールアルゴリズムは、最も正確なコールつまりSNP検出のためを作製するために作製されるベースコールの数を犠牲にするためである。本願において、該技術は、SNP検出のために要求されるのと同じ程度を達成することについてあまり関係がなく、しかしその代わり、コールの数を増加し、その結果、特異性を維持しつつ、連続配列の最長の可能性のあるストレッチがGDASによって作製される。RPMV1マイクロアレイによる分析のためのサンプル製への比較アプローチにおいて、1マイクロリットル当たりのアデノウイルス4プロトタイプAY594253の106のゲノムのコピーの出発濃度を、縮重アデノウイルスPCRプライマーLinら、2004年あるいはGenomiPhiアイソサーマル法のいずれかを使用して増幅した。トータル増幅実験については、DNAを、培養アデノウイルスから単離し、1マイクロリットル当たり106のコピーの濃度でアリコートした。DNAを、トータル増幅戦略GenomiPhi、Amershamを使用して増幅し、次いで、標準AffymetrixCustomSeqTMプロトコル製造業者から入手可能に従って処理した。ハイブリダイズされたマイクロアレイの画像を図2に示す。GenomiPhiトータル増幅GenomiPhitotalamplificationは、保存縮重マルチプレックスPCRからのより限定された領域と比較して、タイルド領域増大した感度がリシークエンスされることを可能にした。この結果は、GenomiPhiトータル増幅はタイルドフラグメント内の特定のプライマー配列に依存しないという事実に起因して生じる。しかし、どの増幅戦略が使用されるか[即ち、保存縮重マルチプレックスPCRまたはGenomiPhiトータル増幅]に関係なく、適切なAd4コールが作製されたことに注意することも重要である。これらの方法間の一貫性は重要であり、何故ならば、保存プライマーが、選択的濃縮の必要性なしで、複雑なサンプルからの病原体の同一ファミリーのメンバーをセロタイプで分けることへのより直接的な適用を有しているかもしれないためである。対応するGDASアプトプット許容性セッティングを使用してに基づいて、REPIは、V1RPMマイクロアレイのE1A、ファイバーおよびHexon-1タイル領域のための保存PCR増幅戦略についてのトップランクのリターンの下記のリストを同定した注:Ad4プロトタイプおよびAd4ワクチン株とほぼ同一の配列を有するいくつかのアデノウイルス4型GenBankレコードを、このリストから省略した。上に示された各ケースにおいて、アデノウイルス4型プロトタイプAY594253およびワクチン株AY594254は、保存PCR増幅によって得られるアデノウイルス4型プロトタイプアンプリコンのハイブリダイゼーションについて、最も高い期待値およびビットスコアをリターンした。該プロトタイプ株がワクチン生産に使用されそして該配列は同一であると測定されたので、このことは予想される。各場合において、リターンは、類似性の順に、密接に関連する空軍AY599837および海軍AY599835アデノウイルス4野外種と識別された。保存PCRの代わりにアデノウイルス4型プロトタイプのGenomiPhi増幅に従う対応のアプトプットを、下記に列挙する注:空軍および海軍野外株より高いスコアを有するいくつかの密接に関係するアデノウイルスは、示されない:図2によって証拠づけられた結果に基づいて、GenomiPhiトータル増幅は、全タイルド領域増加した感度が、保存縮重マルチプレックスPCRに起因する、もっと制限のある領域と比較して、リシークエンスされることを可能にした。この結果は、GenomiPhiトータル増幅が、タイルドフラグメント内のプライマー配列に依存しないという事実により生じる。REPIは、Ad4FIBERを例外として、各タイル領域について最高スコアリングリターンとして適切なアデノウイルスタイプAY594254またはAY594253をリストした。この不一致は、アデノウイルス4型プロトタイプAY594253の初期ドラフト配列がエラーを含んでいたことを観察することにより後に解決され、これは、異なるアデノウイルス4型株gi|11693508|gb|AF065062.2|AF065062についてのGenBankレコードとAd4FIBERを定義するために使用される配列との間で僅かに高い相同性を生じさせた。この1つの例外を除いて、どの増幅戦略、即ち、保存縮重マルチプレックスPCRまたはGenomiPhiトータル増幅が使用されたかに関わらず、適切なAd4コールが作製されたことタイル配列エラーに起因するGenomiPhiでのAd4FIBERの場合以外に注意することがまた重要である。これらの方法の一致は重要であり、何故ならば、該保存プライマーが、選択的濃縮の必要なしに、複雑なサンプルからの病原体の同一ファミリーをセロタイピングすることへのより直接的な適用を有するかもしれないアプリケーションを持っているかもしれないからである。実施例2-Ad4希釈シリーズ本実施例において、ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングを、保存縮重マルチプレックスPCRの後で、標的の初期濃度の関数として分析した。さらに、この実施例はまた、GDASソフトウェア内の2つの異なるベースコーリング戦略を比較する:a許容性permissive明細書で記載されるおよびb保守的conservativeデフォルトセッティング。この実施例で使用した生物学的サンプルは、アデノウイルス4プロトタイプであった。ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングは、保存縮重マルチプレックスPCRの後に、標的の初期濃度の関数として分析した。1マイクロリットル当たり105、103のおよび101ゲノムのコピーを有するアデノウイルス4プロトタイプATCCの稀釈シリーズを調製した。この目的のために、前述の稀釈液からアリコートしたサンプルを、E1A,ファイバー,およびヘキソン遺伝子について保存縮重マルチプレックスアデノウイルスプライマー戦略を使用して増幅した以外、AffymetrixCustomSeqに従った。表18-20は、保守的デフォルトGDASまたは許容性実施例1からベースコールセッティングが使用されるかどうかに依存する、好適なアデノウイルス4型標的株について特異的でないを検出する、REPI分析を備えたRPMV1チップの能力を実証する。REPIが最も高いBLASTビットスコア値としてアデノウイルス4型標的について1以上のGenBankあるいはローカルデータベースレコードをリターンする場合、陽性検出がカウントされた。各場合において、長さは、スライディングウィンドウアルゴリズムの条件を満たしたとしてREPIによって選択されたサブ配列中の塩基対の数に相当する。稀釈液の範囲にわたって、許容性ベースコールセッティングは、REPIによって使用されるGDASアプトプットを作製し、SNP検出のためのデフォルトGDASベースコールセッティングを使用してのアウトプットよりも高いサブ配列長およびビットスコアを一貫して生じた。いくつかの場合では、許容性ベースコールセッティングは、REPIが標的を検出するに十分な数のベースコールを生じ、一方、デフォルトセッティングは生じなかった。この実施例は、GDASによるベースコーリングに対する制限を低下させ、そして、該アウトプットをREPIアルゴリズムにカップリングすることによって、病原体間のより高い感度および識別力株同定が達成されることを実証する。ここで特に注目すべきことは、いくつかのケースにおいて、イメージ、GDASアプトプットおよびREPI分析に、微量のアデノウイルス7およびアデノウイルス5特異的リアルタイムPCRによって確認されたを含む縮重プライマーカクテルの故意でない汚染の証拠があったことである。プロトタイプアデノウイルス用のタイル領域間に有意なクロスハイブリダイゼーションが存在しなかったので、この汚染はベースコーリングの摂動perturbationを生じさせず、またはアデノウイルス4タイル領域を生じる。これは、密接に関連する病原体の混合の量的分離を行なうに、本明細書中で記載される本方法のロバスト性robustnessを実証する。LawrenceLivermoreNationalLaboratoryWilsonら、2002bでのAndersenグループが、特異的PCR増幅に続いて、低濃度約101コピーを検出することができるAffymetrixリシークエンシングチップの使用について記述したことは注目すべきある。しかしながら、この感度はどのように定義されたか、あるいはどこの程度までそれらの結果は密接に関連する微生物種のハイブリダイゼーションによって影響を受けるかを、それは開示も示唆もしなかった。むしろ、その論文において、強調されることは、使用され得るプローブ対のパーセンテージであり、それらがチップによってコールされた実際の配列ではなかった。したがって、技術者は、該開示から何ら予期しない。また、当業者は、前の特許米国特許第6,228,575号または関連する刊行物Gingerasら,1998からのこの可能性を推論せず、何故ならば、これらの参照文献は、濃度差、タイル領域配列の規定におけるエラー、あるいは妨害の他の形式に対してパターン認識の本方法のロバスト性robustnessを開示も示唆もしていないからである。実施例3-保存縮重PCRプライマーおよびGenomiPhiトータル増幅を使用しての、アデノウイルス5野外株Ad5FS;AY601635およびアデノウイルス7プロトタイプAd7;AY594255についてのベースコーリングアルゴリズムセッティングおよびベースコールのBLAST分析調製実施例1において上述されたリシークエンシングマイクロアレイチップRPMV1を、a保存縮重マルチプレックスPCRあるいはbGenomiPhiトータル増幅のいずれかを使用して、アデノウイルス5型野外株Ad5FS;AY601635またはアデノウイルス7型プロトタイプAY594255でプローブした以外、この実施例は、実施例1と同様である。GDASアプトプット許容性セッティングを使用に基づいて、REPIは、Ad5プロトタイプおよびAd7プロトタイプの各々で、保存PCRおよびトータル増幅戦略のための以下の3つのトップヒットを同定した。例外なしで、アデノウイルス5型タイル領域によってコールされた各サブ配列Ad5E1A、Ad5FIBER、Ad5FIBER、Ad5HEXON-1およびAd5HEXON-2は、保存PCR増幅またはトータルGenomiPhi増幅のいずれかを使用して、アデノウイルス5型Ad5FS;アクセッション番号AY601635について正しいプロトタイプ株としてトップヒット最高BLASTビットスコアをリストした。さらに、例外なしで、アデノウイルス7型タイル領域についての各サブ配列Ad7E1A、Ad7FIBER、Ad5HEXON-1およびAd5HEXON-2は、保存PCRまたはトータルGenomiPhi増幅のいずれかを使用した場合、アデノウイルス7型Ad7;アクセッション番号AY594255について正しいプロトタイプ株として、トップヒット最高BLASTビットスコアをリストした。さらに、GenomiPhi増幅は、Ad4E1A領域およびAd7vaccine領域の両方からのベースコールへ導き、両方とも、正しいAd7プロトタイプ株へ付与されるトップビットスコアを生じた。アデノウイルス5型およびアデノウイルス7型7プロトタイプについて得られた結果は、アデノウイルス4型についてのそれを確認した。詳細には、図3A~Dに示される結果は、GenomiPhiトータル増幅は、全タイルド領域増加した感度が、保存縮重マルチプレックスPCRに起因するより制限された領域と比較してリシークエンスされることを可能にしたことを示す。より重要なことには、これらの結果は、どの増幅戦略即ち、保存縮重マルチプレックスPCRまたはGenomiPhiトータル増幅が使用されるかに関わらず、適切なAd5またはAd7コールが作製されることを確認する。実施例4-リシークエンシングマイクロアレイアッセイによって検出可能な混合感染のモデルとしてのAd4-5ブレークスルー株この実施例のためのサンプルは、NavalHealthResearchCenterSanDiegoによって提供された。保管されたサンプルは、アデノウイルスについてAd4/Ad7ワクチンを使用して以前予防接種されており、そして引き続いてアデノウイルス伝染および熱性呼吸器疾患と診断された、基礎トレイニーbasictraineeからの鼻洗浄物であった。前の予防接種にもかかわらず伝染に関連した株は、広く、ブレークスルー株breakthroughstrainsと呼ばれる。このケースにおいて、仮定は、アデノウイルスの単一変異体が病原因子であるということであった。ここで記述されるサンプルはAd4-5ブレークスルーと呼ばれ、何故ならば、決定的でない培養および血清学分析のためであり、これは、両方のアデノウイルス4型の性質を示し、一方で、へクソン遺伝子アデノウイルス血清型の抗原決定基のうちの1つの配列決定はアデノウイルス5型の性質を示した。サンプルを、調製実施例1に記載したマルチプレックス縮重プライマーPCRプロトコルに従って処理した。このアプローチは、熱性呼吸器感染症に関連する全てのアデノウイルスについてのヘキソンおよびファイバー遺伝子における超可変領域ならびに比較的に可変のE1A領域を首尾良く増幅するために、実証された。そうでなければ、標準AffymetrixCustomSeqプロトコルを使用した。得られたハイブリダイゼーションパターンを、図4に示す。GDASアウトプット許容性セッティングを使用に基づいて、REPIは、マルチプレックスPCRによるトータル増幅戦略について下記のの3つのトップヒットを同定した表21-24を参照。選択されたREPIは、RPMV1においてアデノウイルス4,5ブレークスルー株についての値をリターンする。この株は、いくつかの独立した手段により、アデノウイルス5型およびBサブサブグループメンバー最も可能性が高いのはアデノウイルス21型であるの混合物であると決定された。これは、組み合わされたハイブリダイゼーション結果およびREPI分析において証明され、全てのアデノウイルス5タイル上でアデノウイルス5型が確認され、一方、Bサブグループプロトタイプアデノウイルス7;AY594255タイルは、アデノウイルス21型、Bサブグループの異なるメンバーについて最も高いビットスコアをリターンした。従来のDNA配列決定は、完全なアデノウイルス5ゲノムが回復されること、およびアデノウイルス5モデル仮定が必要とされるのでアセンブルできなかった他の配列が存在することを明らかにした。しかし、Ad5/Ad21共感染の結果を支持するための有意な量の補強証拠が蓄積され、Ad5/Ad21混合物または共感染の証拠を示す70量体オリゴヌクレオチドアレイでのパラレル実験において得られた類似の結果Linら2004を含み、そして従来のアプローチを使用してのアンプリコンの配列決定はAd5およびAd21の両方の存在を支持する。アデノウイルスブレークスルー株の続いて行なわれた拡張研究NHRCSanDiegoと共同では、種々のこのような株は、より少ないアデノウイルスの混合物から実際に構成されることを示した調製におけるマニュスクリプト。この発見において黙示的ないくつかの顕著な局面および利点が存在する:1.プロトタイプ領域BサブグループについてAd7は、サンプル中のAd21を発見する特別の推測的priori設計あるいは予想なしで、異なるBサブグループメンバーAd21を首尾良く同定するために使用され得るという実証。2.空間分解能により混合病原体を識別するマイクロアレイの実証。この混合物は、単一生物の仮定に基づいた連続フラグメントのアセンブリに依存した従来のDNA配列決定アプローチを混乱させた。実施例5-プロトタイプ領域を使用するインフルエンザA株同定未知の血清型のインフルエンザA陽性臨床サンプルが、2002-2003および2003-2004のインフルエンザの季節の間に回収され、Dr.ElizabethWalterによって凍結鼻洗浄物としてDr.ZhengWangへ提供された。サンプルを、病原体チップ分析のために、以下のように処理した:EPICENTREMasterPureTMDNAPurificationKitsMadison,Wisconsinを使用して、RNアーゼ処理無しに、50μlの鼻洗浄物サンプルNW20031114-05-02からトータル核酸を抽出した。サンプルNW20031114-05-02は、LacklandAirForceBaseSanAntonio,TXにて2003年11月14日に回収した。患者に2003年11月10日に予防接種した。トータル核酸を20μlヌクレアーゼ無しH2O中に懸濁させた。ツーステップRT-PCRを使用して、ウイルス遺伝子セグメントの各々を増幅した。簡潔に述べると、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってSuperScriptTMIII逆転写酵素Invitrogen,Carlsbad,CAおよび20μl中100pmolUni3プライマーを使用して、4μlトータル核酸中のRNAをcDNAに転写した。RT逆転写反応を1時間42°Cで行い、そして次いで、15分間70°Cで不活性化した。2μlのRT反応物をcDNA増幅のために使用した。提供されるプロトコルに従いTaqPlusLongSystemStratagene,LaJolla,CAを使用して、cDNAを増幅した。2つの異なるPCR条件を増幅のために使用した。ユニバーサルPCRについて、ユニバーサルプライマーuni3およびuni5を使用して、血球凝集素HA、ノイラミニダーゼNAおよびマトリクスMの8つ全てのセグメントを増幅したHoffmanら、2001を参照のこと。マルチプレックスPCRについて、3つのセグメント特異的プライマー対Bm-HA-1/Bm-NS-890R、BA-Na-1/Ba-Na-1413RおよびBm-M-1/Bm-M-1027Rを混合することによって、セグメントを増幅した。Mg2イオンの最終濃度は2mMであり、そして最終プライマー濃度は1μMであった。ユニバーサル増幅のためのPCR条件は、以下であった:2分間94°C、続いて1分間94°C、2分間40°C、3分間72度の29サイクル、および10分間72°Cで最終伸長。マルチプレックスPCR条件は、アニーリング温度を58°Cへ上昇させたこと以外は、基本的に同一であった。PCR産物を、QiagenPCRPurificationキットによって精製した。500ngのユニバーサルに増幅されたPCR産物および1000ngのマルチプレックスPCR産物を、それぞれ、Affymetrixプロトコルに従うハイブリダイゼーションのための2つのV1病原体チップに適用した。チップスキャン結果を、2つの増幅プロトコルの各々について示す:aユニバーサルプライマーPCRおよびbマルチプレックスPCR図5。GDASアウトプット許容性セッティングを使用するに基づいて。REPIは、Ad5プロトタイプおよび特異的マルチプレックスPCR方法の各々で、ユニバーサルプライマーHoffmanら、2001増幅方法およびトータル増幅戦略について以下の3トップヒットを同定した表25を参照のこと。この実験のために、本発明者は、2003から2004ワクチンを逃れそして広がった病気、即ちFujian/411/2002注:HA配列のみがFujian/411/2002について利用可能であったを生じたFlu株のHA遺伝子についての配列を得、そしてそれをREPIによってサーチされるデータベースへ入れた。2つの増幅方法の各々は、同一結果を効率的に作成し、しかしビッドスコアは僅かに異なった。詳細には、Fujian411/2002は、REPIアウトプットファイルにおいてFluAHA3について最高ビットスコアをリターンした。Moscow10/99、2003年の予防接種のために使用された株は、FluAHA3についてREPIアウトプットをリターンしなかった。HA3について最も高いBLASTビットスコアは、以下について達成された:InfluenzaA/Fujian/411/2002_Hemagglutinin_104、予防接種による予防を回避した米国における2003~2004インフルエンザアウトブレイクのH3N2病原因子。HA3についての識別不可能なウイルス配列もまた、同一ビッドスコアを達成した。500を超えるGenBankレコードが、HA3についてリターンされ、全ては、0.0の期待値を有し、そしてビットスコアは、上記に示されるものから995.636へ及んだ。ワクチン株A/Panama/2007/99H3N2は、HA3領域においてリターンされるインフルエンザA株のリストに無かった。注:InfluenzaA/Fujian/411/2002_Hemagglutinin_104についての配列は、HAについてのみ利用可能であり、したがって他の領域は、ここで比較されない。示さないが、本発明者は、2002から2003インフルエンザシーズンからのH1N1アウトブレイク株を同定することができた。実施例6-短縮されたハイブリダイゼーション時間AffymetrixCustomSeqプロトコルは、ハイブリダイゼーションステップは、最大ハイブリダイゼーションを促進するために、少なくとも16時間とすると明記している。診断可能性の意図される目的のために、これは、法外に長くなり得る。したがって、短いハイブリダイゼーション時間への本方法の適用可能性および効率を評価した。この実施例において、ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングを行った。特異的PCR試薬によって増幅したサンプルを使用し、次いで調製例1において記載されるリシークエンシングマイクロアレイチップRPMV1上において1時間、30分、または15分のいずれかの期間ハイブリダイズさせた。この比較研究のために、ハイブリダイゼーション時間を変化させたこと以外は、AffymetrixCustomSeqプロトコルに従った。示される実施例データ図6において、エリスロマイシン耐性マーカーSPYERMB,SPYERMTR,およびSPYMEFAEをそれらのマーカーの各々についての特異的PCRへ供したこと以外、マイクロアレイによってプローブされた全ての標的について、鼻洗浄物は陰性であった。次いで、該アンプリコンを、16時間または15分間、別個のマイクロアレイへハイブリダイズさせ、そして次いで、Affymetrixプロトコルによって指示されるようにそうでなければ処理した。結果を図6A[16時間;ex-6a]および図6B[2時間;ex-6b]に示す。GDASアウトプット許容性セッティングを使用するに基づいて、REPIは、16時間ハイブリダイゼーションおよび15分間ハイブリダイゼーションそれぞれについて下記の3トップヒットを同定した。対応のGDASおよびREPI分析は、得られるベースコールの数は、16時間ハイブリダイゼーションについてのものと比較して15分ハイブリダイゼーションの場合により少ないことを示す表26~31。例えば、SPYERMBタイル領域は、16時間ハイブリダイゼーションについて219bp該サブ配列内で作製された95ベースコール、98のタイル領域のサブ配列長を作製し、一方、15分ハイブリダイゼーションからのハイブリダイゼーションパターンにおける不連続discontinuitiesは、長さ100bpサブ配列内で作製される99ベースコール、45のタイル領域および87bpサブ配列内で作製される99ベースコール、39のタイル領域の2つのサブ配列へのタイルのフラグメント化を生じさせた。上記表は、16時間対15分間ハイブリダイゼーション時間についての、実施例6において記載される3つの異なる抗生物質耐性マーカーについての比較トップランキングを示す。SPYERMTRタイル領域は、15分ハイブリダイゼーションに続いて同定を可能にするに十分な数のベースコールを作製しなかったが、SPYERMBおよびSPYMEFAEは、両方とも、タイル領域を含む抗生物質耐性マーカーの同一変異体について高いビットスコアをリターンした表9に同定される。しかし、該3つのタイル領域の各々のについてのREPIアプトプットは、各領域における最も高いビットスコアが同一であることを示し15分間ハイブリダイゼーションについて十分なベースコールを欠いたSPYERMTR以外、しかし、ビットスコアおよび期待値の両方は、各ケースにおいて異なっていた。同様の結果が、30分間および1時間ハイブリダイゼーションについて得られ、ハイブリダイゼーション時間が増加するにつれてベースコールの数が増加した。さらに、この実施例は、異なるハイブリダイゼーションパターン範囲での標的間の微細スケール識別を可能にする本方法のロバスト性robustnessを明確に示す。実施例7―サブトラクティブハイブリダイゼーショントータル増幅を使用する場合、臨床サンプル中のバックグラウンドヒトDNAの量を減らすために、種々の方法が使用され得る。1つの方法は、迅速にアニーリングする反復エレメントrepetitiveelementsから大部分なる、COT-1フラクションヒトゲノムDNAを用いたハイブリダイゼーション溶液中の増幅産物からのバックグラウンドゲノムDNAの直接サブトラクションである。別の方法は、トータル増幅前における、臨床サンプルからのバックグラウンドゲノムDNAのビースベースサブトラクションbeadbasedsubtractionである。第3の方法は、上記方法の組合せであり、臨床サンプルからゲノムバックグラウンドDNAが、トータル増幅前にビースベースサブトラクションを使用してサブトラクトされ、引き続いて、バックグラウンドDNAが、さらに、COT-1ヒトDNAを用いたハイブリダイゼーション溶液中の臨床サンプルからサブトラクトされ得る。図7Aおよび7Bについての方法鼻洗浄物を、1臨床サンプルから回収し、そしてトータル核酸をMasterPureTMDNA精製キットEpicentreを使用して単離した。該核酸を、1時間37°CでMcrBc一方または両方の鎖上にメチルシトシンを含有するDNAを切断するエンドヌクレアーゼで前消化し、そして次いで65°Cに加熱して、該酵素を変性させた。引き続いて、該サンプルを2つのアリコートに分離し、そしてGenomiPhiDNA増幅キットAmershamBiosciencesで増幅した。増幅された産物を、AffymetrixCustomSeqプロトコルに従って、フラグメント化しそして標識した。この比較研究のために、下記の変更以外は、AffymetrixCustomSeqプロトコルに従った。AffymetrixCustomSeqプロトコルに従う標準ハイブリダイゼーション溶液を用いて図7A、あるいは、Affymetrixが推奨する22μgHerring精子DNAの代わりに、12μgHerringSpermDNAおよび10μgCOT-1ヒトDNARoche,Indianapolis,INを含有するハイブリダイゼーション混合液を用いて図7B、前記臨床サンプルをリシークエンシングマイクロアレイチップRPMV1へハイブリダイズさせた。図7Cおよび7Dについての方法本実施例は、トータル増幅を使用する場合、病原体特異的シグナル対ノイズ比を増加させるための、ビーズベースサブトラクションとサブトラクションハイブリダイゼーション法との組合せを記載する。迅速にアニーリングする反復エレメントrepetitiveelementsから大部分なる、COT-1ヒトDNAを、ターミナルトランスフェラーゼTdtNEBを使用して3’末端でビオチニル化し、ビオチニル化サブトラクションプローブBiotinylatedSubtractionProbesBSP作製した。約400ngのBSPのアリコートを、1時間37°CでMcrBCで前消化された臨床鼻洗浄物Ad4陽性臨床サンプルと診断されたの核酸抽出物と共に、4×SSCおよび0.2SDS中、10分間95°Cでインキュベートし、次いで徐々に65°Cへ冷却し、1時間HMBと共にコ-ハイブリダイゼーションcohybridizationさせた。ハイブリダイゼーション後、BSP-HMB複合体を、BcMag.StreptavidinMagneticBeadsSMBs,Biocloneと共に1×PBS,0.1BSAで30分間室温でインキュベートした。該ビースをマグネチックセパレータを使用して上清から分離した。次いで、該上清を新しいチューブへ移し、次いで該マグネチックビーズを1xPBS、0.1BSAで1回洗浄した。該上清を合わせ、そしてエタノールで沈殿させた。該DNAペレットをヌクレアーゼフリーの水Ambionで再懸濁させ、次いで2つのアリコートに分離し、製造業者が推奨するプロトコルに従ってGenomiPhiDNA増幅キットAmershamBiosciencesで増幅した。簡潔に述べると、1mlDNAテンプレートを、3分間95°Cで9μlのサンプル緩衝液で変性させ、次いで4°Cに冷却した。別個のチューブにおいて、1μlの酵素を9μlの反応緩衝液と混合し、そして次いで該混合物を、前記変性DNAテンプレートへ添加した。次いで反応を、ThermalCycler-PTC225MJResearchInc.,Reno,NVで、30°Cで18時間行った。この比較研究のために、AffymetrixCustomSeqプロトコルに従う標準ハイブリダイゼーション溶液を用いて図7C、あるいは、Affymetrixが推奨する22μgHerring精子DNAの代わりに、12μgHerringSpermDNAおよび10μgCOT-1ヒトDNAを含有するハイブリダイゼーション混合液を用いて図7D、前記増幅された産物をリシークエンシングマイクロアレイチップRPMV1へハイブリダイズさせた。図7Eについての方法ビーズベースサブトラクションおよびサブトラクティブハイブリダイゼーション手順の組合せを、2倍量の初期材料を用いて繰り返し、そして図7Eに示される結果は、本発明者は、上記調製例1に記載されるリシークエンシングマイクロアレイチップRPMバージョン1チップについて、臨床サンプルからヒトバックグラウンドをサブトラクトし、該臨床サンプル中のAd4ヘキソンおよびファイバー遺伝子の存在および同定を解くresolveことが出来たことを証明する。サブトラクティブハイブリダイゼーション結果サブトラクティブハイブリダイゼーションアプローチの結果を図7に示す。図7Aに示されるように、単離された核酸のトータル増幅は、RPMV1マイクロアレイへの有意なバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じさせた。アデノウイルス4型領域は全体的バックグラウンドのそれより明らかに高いシグナルを示したが、GDASは、REPIにおけるスライディングウィンドウ条件を満たすに十分なベースコールを作製することができず、したがって、該データをBLASTする試みは行われなかった。COT-1ヒトゲノムDNAと同一セットのトータルアンプリコンをコ-ハイブリダイズすることは、これをほとんど改善せず図7B、そしてベースコールは作製されなかった。図7Cは、トータル増幅前の、マグネチックビースベースサブトラクションのみの使用もまた、類似性サーチングを可能にするに十分な数のベースコールを生じなかったことを示す。しかし、増幅前のビーズベースサブトラクションとCOT-1ヒトDNAとのコ-ハイブリダイゼーションと組み合わせた使用により、Ad4HEXON-1タイル領域において同定される3つのサブ配列の各々において、ワクチンおよびプロトタイプアデノウイルス4株のそれよりも高い、アデノウイルス4野外株区別なしで海軍Navyおよび空軍AirForceを同定および位置付けるrankために十分なベースコールが作製され得た図7Dおよび表32。さらに、1マイクロリットルの代わりに2マイクロリットルの出発サンプル物質を使用して同一セットの組合せステップを行うことによって図7E、ベースコーリングは、Ad4HEXON-1表34を参照のことに加えてAd4FIBERタイル領域表33を参照のことへ拡張され、いくつかのAd4FIBERサブ配列中のAd4野外株しかし空軍および海軍野外株間を区別しない対プロトタイプAY594253またはワクチン株AY594254についての曖昧でない高いビットスコアランキングを可能にした。しかし、Ad4空軍野外株アクセッション番号AY599837は、Ad4HEXON-1タイルにおいて海軍野外株AY599835と区別可能であり、何故ならば、増加した数のベースコールが、より完全な配列比較および増加したビットスコア分解能resolutionを可能にしたからである。実施例8-RPMV2チップおよびその設計RPMV2チップについての配列タイルのリストを、以下に列挙する表35。これは、RPMV1チップの内容物の約10倍増加を示した。実施例9-ランダムRT-PCRアプローチでのインフルエンザA株同定この実施例は、正常な鼻洗浄サンプルへスパイクされたspiked単離されたインフルエンザAFujan/411/2002株核酸についての新たに改変されたランダムRT-PCRプロトコルの適用を示すためである。ランダムRT-PCRプロトコルは、マイクロアレイインタロゲーションのためにウイルス病原体を増幅するために、DeRisiのラボによって適用されたWangeら、2003。このプロトコルへの改変は、培養インフルエンザウイルスを増幅するために報告されたKesslerら、2004。しかし、改変されたプロトコルは、臨床サンプルにおいてウイルス標的を増幅するためには報告されなかった。インフルエンザAウイルス培養物H1N1およびH3N2は、AirForceInstituteforOperationalHealthAFIOHによって提供され、そして研究前に、増幅および定量のためにVirapure,LLCへ送られた。該分析証書CertificateofAnalysisによれば、該ウイルスは、このプロジェクトのためにATCCのみから購入される初期継代MDCK細胞earlypassageMDCKcellsにおいて2ラウンド増幅され、続いて、1μg/mlTPCK処理トリプシンの存在下でのウイルス増幅が行われた。感染から48時間で、該ウイルス上清が回収され、そして3スクロース、20mMTrispH7.1およびpH安定剤を含有するように調節された。デリバリー前に、CorningスクリュートップクライオバイアルCorningscrewtopcryovialsを200~300μlアリコートの上清で充填した。各サンプルバイアルの滴定を、手順AM110,PlaqueFormingAssayofInfluenzaVirusに従って行った。1.2×107PFU/mlの力価が、インフルエンザAH3N2,K0717SV5/SV40RMKについて得られ、そして5×106PFU/mlがインフルエンザA/California/2935/03/H1N1について得られた。臨床コレクションコントロールclinicalcollectioncontrolを作製するために、鼻洗浄物0.9生理食塩水をtheClinicalDivisionoftheAdvancedDiagnosticLaboratoryatLacklandAFBの無症候性メンバーasymptomaticmemberから得た。各Virapure前定量化した力価Virapureprequantifiedtiterから、インフルエンザ-スパイクしたinfluenzaspiked鼻吸引物nasalaspirateの10倍/6シリーズ希釈を作製し、各株のVirapureストックで始まりそしてこれを含んだ。総量100μlの各インフルエンザスパクした鼻洗浄物を、EPICENTRE製のMasterPureTotalNucleicAcidExtractionを使用して該希釈から処理した。該プロトコルの間、プロテインキナーゼKを含有する2×TandCLysisSolution150μlを、各100μl希釈のスパイクした鼻洗浄物へ添加し、徹底的にボルテックスし、そして65°Cで15分間インキュベートした。次に、該サンプルを5分間氷上に配置し、続いて150μlのMPC蛋白質沈殿試薬MPCProteinPrecipitationReagentを添加した。サンプルを10秒間激しくボルテックスミックスした。次いで、該混合物を10分間10,000×gでの遠心分離により沈殿させ、そして上清をマイクロ遠心分離チューブmicrocentrifugetubeへ移した。回収された上清へ、500μlのイソプロパノールを添加し、そして該チューブを30~40回ひっくり返した。前記混合物を4°Cで10分間遠心分離し、そしてペレットを除去しないでイソプロパノールをデカントした。続いて、該ペレットを75エタノールで2回リンスし、そして室温で乾燥させた。乾燥後、核酸ペレットを35μlのTE緩衝液中に再懸濁させた。各サンプルを適切にラベルし、そしてドライアイス中に配置し、その後、theNavalResearchLaboratoryヘ発送した。3つの100μlの正常鼻洗浄物アリコートの各々を、一連の希釈105pfu~101の範囲のインフルエンザAH3N2ウイルス培養物でスパイクした。実施例5におけるように、トータル核酸をEPICENTREMasterPureTMDNAPurificationKitsMadison,Wisconsinで抽出し、そして40μlH2O中に懸濁した。ランダムRT-PCRを、記載されるものKesslerら、2004に従って以下のように適用した:2μlのトータル核酸を、20μl中、1μlSuperScriptTMIII逆転写酵素50ユニット/μl;Invitrogen,Carlsbad,CAおよび1μlプライマーD40pmol/μl;5’GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN;配列番号573を使用して逆転写した。RT逆転写反応を42°Cで1時間行い、そして次いで70°Cで15分間不活性化した。次いで、10μlRT産物を、50μl中、2.5ユニットTaqPlusLongポリメラーゼ5ユニット/μl,Stratagene,LaJolla,CAおよび1μlプライマーE100pmol/μl;5’GTTTCCCAGTCACGATC;配列番号574で増幅した。PCRを、94°C30秒、40°C30秒、50°C30秒、および72°C160秒の35サイクル、続いてさらに72°Cで7分行った。105、103および101pfuインフルエンザスパイキングサンプルからのPCR産物を、AffymetrixCustomseqプロトコルに従うハイブリダイゼーションのために、3つの異なるV1RPM病原体マイクロアレイへ適用した。このランダムRT-PCR法により増幅された、3つのスパクインサンプルspikeinsamples105,103,および101pfuについてのV1RPMチップスキャンを、それぞれ、図8A~Cに示す。全てのサンプルは、インフルエンザAタイル領域の少なくともいくつかにおいて、明確な配列コールを生じ、ランダムRT-PCRプロトコルが、ヒトゲノムDNAの妨害がなくとも、前記スパイキングサンプルspikingsamples中のインフルエンザゲノムを首尾よく増幅したことを示す。GDASアウトプット許容性セッティングを使用するに基づいて、REPIは、各サンプルから下記の4トップヒットを同定した表36から38。105表36および103pfu表37サンプルについての該トップ4ヒットは、正しいFujian/411/2002株に帰属されるトップランキングに対応し、そしてインフルエンザユニバーサルプライマーによって増幅された、Fujian/411/2002臨床サンプルNW20031114-05-02ACID04-B2について得られたそれらと全く同一であった表25に示される。この結果は、ランダムRT-PCRは、該サンプル中のウイルスの比較的高い力価を伴って、インフルエンザA特異的PCRと類似の増幅力を有することを示している。低力価のインフルエンザウイルス101pfuで、ハイブリダイズされるタイル領域のパーセンテージおよびベースコールのパーセンテージは減少した。これは該ランキングを少し歪めさせ、Fujian4112002を二番目に最も高いランキングの株についてタイにしたtied。しかし、V1RPMは、Fujian/411/2002株から元々誘導されそしてほぼこれと同一である、H3N2Pretoria株として該スパイクされたウイルスを依然として読むことができた。この実験におけるランダムRT-PCRの成功のため、このプロトコルは、インフルエンザ臨床サンプルおよび他の病原性ウイルスにおいて機能すると考えられる。この実施例は有意であり、何故ならば、それが、2001年6月パブリックドメインプロトコルから誘導された、完全に偏っていないnonbiased増幅方法が、PCRレベル感度101標的コピーを生じる、リシークエンシングマイクロアレイのための準備ステップpreparativestepとして使用され得ることを示すからである。この増幅プロトコルは、長いオリゴマー70量体マイクロアレイベースアッセイのいくつかの公開された例について使用されているが、それがリシークエンシングマイクロアレイアプローチのために十分であるかは自明ではない。本発明に対して多数の修飾および改変が、上記教示を考慮して可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書中で明記されたのとは異なる方法で、実施され得ることが理解される。実施例10:他の病原体試験:要約すれば、タイプ変異株間で相同配列を示す配列タイルの部分以外、100一致の同定およびインプットアイデンティティで、およびノータイプクロスハイブリダイゼーションで、凝集物は>試験された180チップを示す、以下の病原体が、RPMV1において実験および/または臨床サンプルから検出/識別された:VariolaMajor天然痘、EbolaVirus、B.anthracis、Y.pestisおよびandF.tularensisの調製された非感染性実験室サンプルについてのRPMV1マイクロアレイ結果の選択された実施例を行ったが、ここには示さない。VariolaMajor天然痘,EbolaVirus,およびF.tularensisサンプルは、特異的PCRプライマーを使用して調製した。B.anthracisおよびY.pestisサンプルは、GenomiPhi試薬実施例3において記載されるようにを使用して増幅した。実施例11:配列アデノウイルスの特徴以下の表は、表6および配列番号575~587に示される配列決定されたアデノウイルスについての配列特徴および推定putatitve遺伝子産物を示す。表39~51の中で上に指定されたプロダクトについては、本発明者は、それが、対応するアミノ酸配列へのロケーションカラムで識別された核酸配列を翻訳するために普遍的な遺伝暗号を参照することにより、当該分野においてルーチンと述べる。そのため、プロダクトカラムで指定されたアミノ酸配列は明示的に列挙されていない。ここで図面を参照するが、ここで、参照数字がいくつかの図の全体にわたって同一か対応する部分を指定する。ここに、意味があるは、結果の前もって定義した統計的有意水準か確実性に一般に関係がある。あるいは、意味があるは、特定の生物学的エンティティーの存在あるいはエンティティーのグループに関する結論を引き出すためのユーザーへの有用性の前もって定義したレベルを示す。例えば、BLASTはE値見込みに対応するをリターンし、ここでは、データベース内の既知の配列見込み時間機会の数を備えたE値のプロダクトは、尋ねられた続きのために同じ類似性値ビットスコアをリターンすることができる配列データベースレコードの総数に相当する。サブミットされたテスト配列の再編成が同じE値をリターンする場合、オリジナルの結果は意味がないnotmeaningful。さらに、本明細書中で使用される用語比較可能なは、一般的に、類似性サーチから意味がある結果をリターンするという十分な量の例えばシステムかユーザ定義閾値番号、あるいはパーセンテージ実際のベースコール非Nを含んでいるデータをいう。さらに、用語比較可能なは、データを使用して、類似性サーチからユーザーにリターンされる結果の有用性に関して交換可能にて使用することができる。反対に、用語比較不可能なは、一般的に、類似性サーチからのそれほど意味がないかより曖昧な結果を引き起こすという数またはパーセンテージの中の十分な量の非ベースコールNを含むデータをいう。REPIResequencingPathogenIdentifierを含むシステムは、配列類似性サーチにより好適なサブ配列へ配列データを選択および編集することによって、不完全なヌクレオチドかポリペプチド配列の出力を自動的におよびアルゴリズム的に解析するように設計される。この目的を遂行するために、システムは、配列データから比較可能なデータを抽出する間に、出来るだけ少なくデータを修正するいくつかの機能的なステップすなわちフィルタを含む。リークエンシングマイクロアレイの性質により、上に記述されるように、配列はしばしば大量の非ベースコールNを含む。BLASTのような類似性サーチは典型的には大量の非ベースコールを備えた配列について曖昧な結果をリターンする。曖昧な結果の例としては、ユニークな類似性マッチを予測しない低いビットスコアおよび期待E値が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本システムの実施形態は、類似性サーチから意味がある結果をリターンする傾向にあるオリジナル配列の部分、またはサブ配列を抽出する。図11aは、本発明の実施形態の例示的な概略図である。まず、配列データ203は、システム208の自動サブ配列解析モジュールAutomatedSubsequenceParsingmoduleASP209によって処理される。ASP209は、配列データ203をフィルターし、そして所定の確率例えば、<1.0E-9のBLAST期待値expectvalueマッチ211aを生じる可能性が高いサブセットのみを選択する。これらのサブセットは、次いで、例えば、類似性サーチアルゴリズムを使用して、配列データベース109と比較され、そして結果は、さらなる分析およびサマライゼーションsummarization214のためにシステムにリターンされる。得られるサーチサマリー213は、次いで、より徹底的な分析moreindepthanalysis215のためにユーザへ提示される。統計的に関連のある例えば、<1.0e-9のBLAST期待値サーチ結果をリターンする可能性が本質に低い配列サブセットはASPによって除去されるので、ユーザにリターンされる結果213は、一般的に、解析されないunparsed配列をサブミットする従来法よりも高い割合の有意な例えば、<1.0e-9のBLAST期待値マッチ213aを含む。BLASTまたはBLAST様類似性サーチアルゴリズムを使用する特定の実施形態において、1.0e-150~2の期待値が好ましい。より好ましくは、期待値は1.0e-5~0.5である。なおより好ましくは、BLASTを含む実施形態は、単一病原体データベース記録の独特な同定を可能にするビットスコアbitscoreおよび期待値を含む。必要に応じて、システム208は、該サマリーにおける結果をさらにフィルターし、ユーザによって設定されるまたは該システムによって予め設定される基準を満たすサブ配列マッチのみをディスプレイする。これらの基準としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ビットスコアbitscore、期待値別の配列が同一スコアを生じ得る可能性、あるいはベースコールを作製するために使用される領域のマイクロアレイシグナル強度またはサブ配列の相対位置から誘導される別のスコア。ネットワーク接続217上の追加のユーザ219へ結果を提供する、共有配列データベースおよび比較リソース109の増強された能力も、図11aに示される。図11bは、REPIの例示的な実施形態、該システムの実施形態自体である。まず、配列データ203’は、REPI208’の自動サブ配列解析モジュールASP209’によって処理される。ASP209’は、配列データ203’をフィルターし、そして高確率マッチhighprobabilitymatches211a’を生じる可能性が高いサブセットのみを選択する。次いで、これらのサブセットは、類似性サーチアルゴリズムを使用して、配列データベース109’と比較され、そして結果は、さらなる分析およびサマライゼーションsummarization214’のためにREPIにリターンされる。得られるサーチサマリー213’は、次いで、より徹底的な分析moreindepthanalysis215’のためにユーザへ提示される。統計的に関連のあるサーチ結果をリターンする可能性が本質的に低い配列サブセットはASPによって除去されるので、ユーザにリターンされる結果213’は、一般的に、解析されないunparsed配列をサブミットする従来法よりも高い割合の有意なマッチ213a’を含む。必要に応じて、REPI208’は、該サマリーにおける結果をさらにフィルターし、ユーザによって設定されるまたは該システムによって予め設定される基準を満たすサブ配列マッチのみをディスプレイする。ネットワーク接続217’上の追加のユーザ219’へ結果を提供する、共有配列データベースおよび比較リソース109’の増強された能力も、図11bに示される。図11cは、ソフトウエア形態の該システムの実施形態についてのインターフェースこの場合、グラフィカルユーザインターフェースの例示的なスクリーンショットである。この特定の実施形態は、ネットワークおよびローカルBLASTサーバいずれかまたは両方をインタフェースで接続し、そしていくつかの共通のBLASTパラメータ251の改変を可能にする。さらに、下記により詳細に説明されるように、解析アルゴリズムparsingalgorithm253に特異的なパラメータ例えば、ウィンドウサイズは、必要に応じて、ユーザに利用可能とされる。図12は、ASPを含む、CIBSIの一般的な機能性を説明するフローチャートである。CIBSIは、オペレーションS301のスタートで、生配列データを受ける。REPIは、FASTA、MSF、GCG、Clustal、BLC、PIR、MSP、PFAM、POSTAL、およびJNETを含むがこれらに限定されない、種々のフォーマットの配列データを受け得る。従来およびリシークエンシングマイクロアレイの場合、配列データは、典型的に、FASTAフォーマットのマイクロアレイの複数のタイルド領域に対応するベースコールの複数の配列の形態をとる。配列データフォーマットに関するその柔軟性に加えて、該システムは、種々の異なるソースタイプ由来の配列データを受け入れる。上述されるように、これらのタイプとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:手動または自動Sanger配列決定manualorautomatedSangersequencing、ショットガン配列決定shotgunsequencing、従来のマイクロアレイconventionalmicroarrays、リシークエンシングマイクロアレイresequencingmicroarrays、マイクロ電気泳動配列決定microelectrophoreticsequencing、ハイブリダイゼーションによる配列決定sequencingbyhybridizationSBH、エドマン分解法およびその変形法Edmandegradationandvariantsthereof、増幅分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonamplifiedmolecules、単一分子についてのサイクリック-アレイ配列決定Cyclicarraysequencingonsinglemolecules、およびノン-サイクリカル,シングル-モレキュール,リアルタイム法noncyclicalsinglemoleculerealtimemethods例えば、ナノポア配列決定nanoporesequencing。あるいは、生配列S301は、転写物核酸transcriptnucleicacidsメッセンジジャーリボ核酸mRNAまたはウイルス転写および翻訳のために使用される中間相配列intermediatephasesequencesから構成され得る。例えば、RNA転写物に向けられる本発明の実施形態において、RNAは、それがフラグメント化された後にAffymetrix遺伝子発現アレイで行われるようにアレイへ直接ハイブリダイズされ得るか、あるいは逆転写酵素を使用してDNAへ変換され得る。タイル領域は、ゲノムのエクソン蛋白質をコードする配列領域から構築され、そしてリシークエンシングアレイは、どの配列がそれを転写物にしたかを分析するために使用される。代替の実施形態において、図12に記載されるプロセスは、アミノ酸配列に対応し、ここで、生配列S301のセットは、高分解能質量分析によって測定されるようなアミノ酸組成から推察されるアミノ酸または配列の直接読み取りを示し得る。必要に応じて、相対位置が保存されていない生アミノ酸または蛋白質データが、相対位置データを含めるために分析される。リシークエンシングマイクロアレイにおいて、全体遺伝子配列構造が、リシークエンシングタイルの全体構造内の部分配列の位置によって示唆される。例えば、リシークエンシングアレイは、一度に5~10の連続したconsecutiveベースコールの読み取りしか与えないかもしれず、これらの各々は連続した一連のNsによって隔離される。図33は、部分配列読み取りの任意のコレクションへ適用可能であるこのコンセプトのより一般的な説明を示す。したがって、互いに明確な関係を有さないヌクレオチドベースコールまたはアミン酸配列の任意のコレクションは、まず、より短い検出される配列が比較されるバーチャル配列VirtualSequenceと比較され得る。連続ベースコール、または部分配列は、次いで、集合配列collectivesequenceの個々の部分として関連付けられる。したがって、マイクロアレイまたは任意の他の配列作製プラットフォームsequencegenerationplatformからの部分配列データが、CIBSIによってより効果的かつ効率的に処理されるために、部分配列は、まず、集合アレンジメントcollectivearrangement、またはコンポジット配列compositesequenceへアセンブルされる。どの部分配列がコンバインされそしてサブミットされるかを決定するために、各検出されたサブ配列は、類似性サーチを使用して、メモリ中に保存された参照配列のグループと比較される。参照配列の1つと比較した場合に満足なマッチを生じる部分配列は、次いで、分析のためにCIBSIへサブミットされるコンボジット配列の部分として保存される。リシークエンシングマイクロアレイから抽出される配列データをフォーマットするプロセスが、図33に示されるフローチャートにおいて示される。配列情報は、リシークエンシングマイクロアレイあるいは任意の他のヌクレオチドまたはポリペプチド配列決定プラットフォームから抽出されS2403、そして連続した一連のNsによって隔離される部分配列を検出するように処理されるS2405。部分配列を検出するステップは、ベースコールの検出時にビューイングウィンドウを開始しそして別の一連のNsが検出されると終了する、ウィンドウイング機能によって行われ得る。したがって、ウィンドウが部分配列データ周りに作成され、そして部分配列読み取りを隔離するNsはトリミングされるtrimmedaway。スキャニングオペレーションもまた、各連続した一連のNsを同定する配列データについて行われ得、それによって、部分配列に対応するベース-コールのグループを示す。各々の同定された部分配列は、次いで、保存された参照配列と比較されS2409、該部分配列が該保存された参照配列の1つと対応するかどうかを決定する。この比較は、該保存された参照配列と該部分データとの類似性を示す統計値statisticalvalueを生じさせる。次いで、該統計値が所定の閾値を超える場合、該部分配列は保存されS2413、他の部分配列とコンバインされるSS2415。あるいは、該統計値が所定の閾値未満である場合、該部分配列は廃棄される。このプロセスは、全ての部分配列が比較されるまで継続し、以下に議論されるように、このようにして、CIBSIへサブミットされるデータのコンポジットセットを作製する。次いで、該システムは、コントロールチェックControlCheckを行いS303、その後、候補サブ配列を抽出するS305。候補サブ配列の抽出後、該システムは、次いで、該候補サブ配列の開始部beginningおよび終結部endからノン-コールNsをトリミングするS307。次いで、該システムは、該トリミングされた候補サブ配列の鎖長をチェックしS309、代替の配列またはサブ配列が選択されるべきかどうかS311、該候補サブ配列は類似性サーチサーバへ行くか類似性サーチキューsimilaritysearchqueueへ加えられる準備ができているかS315、あるいは該サブ配列における適切なベースコールまたはパーセンテージのさらなるチェックが、それを送って比較される類似性サーチを使用するために受理可能な閾値を満たしているかどうかを決定する。代替の配列またはサブ配列の選択S311は、スライディングウィンドウアルゴリズムの使用による1つの実施形態において達成される。比較されるS315ために送られる配列について、該システムは、類似性サーチサーバからリターンされた結果を集め、これらの結果について統計分析を行い、そしてユーザプリファレンスに従ってユーザのためにそれらをフィルターするS317。必要に応じて、該システムは、サブミットされたサブ配列についての類似性サーチ結果を単にリターンし得る。また、以下に記載される例示的な実施形態を与えられるとより明確にされるように、該アルゴリズムのステップは、代替の実施形態において再配置または改変され得る。さらに、より詳細に以下に説明されるように、該システムの挙動は、該システムによって予め設定されるかまたは必要に応じてユーザによって規定される。下記の段落は、図12に示される主要機能ステップの各々をより詳細に説明する。図13は、コントロールチェックステップControlCheckstepS303を行うためのコントロールチェックモジュールの例示的なフローチャートである。ここで、配列は、まず、マイクロアレイによってしばしばアウトプットされるコントロール配列であるかどうかをみるためにチェックされS403、これは、生物学的サンプルに対応せず、しかし、代わりに、該マイクロアレイは適切に機能していることを確認する。該マイクロアレイに組み込まれたコントロール配列は、特に、意味のない、独自に同定可能でない、または天然に生じない配列であるように設計され;したがって、デフォルトによって、コントロール配列は、有意な類似性をリターンしない。配列がコントロールでない場合、該システムは、必要に応じて、該配列が代替カスタムパラメータフラッグalternativecustomparameterflagS407にマッチするかどうかをチェックし得、その後、次のステップへと続くS409。該配列がコントロールまたはカスタムパラメータ一致すると認識される場合、該システムは、必要に応じて、該カスタムパラメータに対応する補助機能supplementaryfunctionを行うかまたはつぎの配列へ動くS405。図14は、抽出サブ配列ステップextractsubsequencestepS305の例示的なフローチャートである。配列が事前に選択されるとS501、該システムは、サイズZのウィンドウのコンテクスト内で該配列をビューイングしS503、ここで、Zは、リターンされたベースコールの数に対応するウィンドウサイズパラメータである。このビューイングウィンドウviewingwindowは、典型的に、典型的な配列のサイズよりも長さが短く、そして該配列における任意のポイントで開始し得る。次いで、該システムは、該ウィンドウ内に含まれる実際のベースコール非NsnonNsのパーセンテージを算出するS505。示される例において、計算は、1を有効なベースとそして0を全てのNsと結びつけることによって行われる。1つの実施形態において、ウィンドウサイズZは、好ましくは2つのベースコール間の範囲および最小の標的またはインプット配列の長さの半分から選択され得る。ウィンドウサイズZが増大するにつれて、該モジュールは、候補サブ配列を選択することについてより許容性permissiveとなり、より多くの非ベースコールを含む。計算されたパーセンテージは、次いで、ファーストジャンプスレシュホールドパラメータAFirstJumpThresholdparameterA例えば、25と比較され、これは、該システムによって予め設定されいるかまたはユーザによって選択され得るS507。ウィンドウ内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージが、ファーストジャンプスレシュホールド,Aによって規定される閾値を満足しない場合、該システムは、ファーストウィンドウジャンプパラメータXFirstWindowJumpparameterXに従って該ウィンドウを多数のベースコール前進させS509、これはまた、該システムによって予め設定されていてもまたはユーザによって選択されてもよく、しかし、好ましくは1~Zウィンドウサイズパラメータである。このまたは任意の他のポイントでの該ウィンドウの前進は、任意の方向において生じ得る例えば、該配列の終結部の方へ。該ウィンドウ内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージがファーストジャンプスレシュホールドAによって規定される基準を満たす場合、該システムは、スライディングウィンドウの開始部で、候補サブ配列の開始部をマークするS511。該ウィンドウは、次いで、セカンドウィンドウジャンプパラメータYに従って、インクリメント的にincrementally多数のベースコール移動されS513、そして各スライドインクリメントslideincrementで、該ウィンドウ内の実際のベースコールのパーセンテージが計算されるS515。該候補サブセット内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージが、セカンドジャンプスレシュホールドBによって設定される閾値を満たさない場合、該システムは、該ウィンドウの終結部でのベースコールに対応する、該配列のベースコールでの候補サブ配列の終結部をマークするS519。各配列について、該システムは、使用可能なデータの最大の連続ストリングstringをサーチする。ウィンドウジャンプパラメータXおよびYが増加するについて、該モジュールは、より多数の非ベースコールを有する候補サブ配列を選択することについてより許容性となる。ジャンプスレシュホールドAおよびBが、他の条件が等しければ、増加するにつれて、該モジュールはより許容性は低くなる。図14bは、本発明の実施形態に従うスライディングウィンドウアルゴリズムの例である。スライディングウィンドウ551の開始部および終結部は、候補サブ配列553の鎖長および内容物contentsを決定する。図15は、該システムによって行われるトリミング機能TrimfunctionS307をより詳細に説明する例示的なフローチャートである。この特定の機能モジュールにおいて、該システムは、候補サブ配列の開始部Nsを検出しS603、そして引き続いて該候補サブ配列から開始部NsをトリミングするS605。該システムは、次いで、該候補サブ配列の実際のスタートが変更されたS607ことを認識し、そしてそれに応じて、該候補サブ配列のロケーションおよびコンテンツcontentsを調節する。類似のアクションセットが行われ、該候補サブ配列の終結部でのNsが除去されるS613、S617。本明細書中で記載されるスライディングウィンドウ法は配列がNsで開始および終結することを可能にするので、トリミングは、該アルゴリズムの最適性を増加させる。あるいは、該スライディングウィンドウ機能は、候補サブ配列の開始部および/または終結部ならびにNsを回避および検出するように適応または置換され得、したがって、このステップの必要性を予め取り除く。該システムの次の機能は、鎖長評価lengthevaluationS309である。図16は、鎖長チェックステップCheckLengthstepS309を行うための方法を詳述する例示的なフローチャートを示す。候補サブ配列の鎖長が計算されS703、そしてファーストレングススレシュホールドパラメータEFirstLengthThresholdparameterEと比較されるS705。該候補サブ配列の鎖長がE例えば、20ヌクレオチド以下である場合、該システムは、サブ配列抽出ステップextractsubsequencestepS305へリターンする。ファーストレングススレシュホールドパラメータEを満足する場合、該候補サブ配列の鎖長は、セカンドレングススレシュホールドパラメータFSecondLengthThresholdparameterF例えば、50ヌクレオチドと比較されるS709。該候補サブ配列の鎖長がFを超える場合、該候補サブ配列は、該サーバによる選択サブ配列のバッチ処理のために、類似性サーチ比較サーバへ送られるかまたはキューqueueへ加えられるS711。該候補サブ配列がEを超えるがFを超えない場合、該システムは、この中間鎖長例えば、20~50ヌクレオチドの鎖長を有するサブ配列候補サブ配列内の実際のベースコールのパーセンテージをチェックするステップへ進むS713。ファーストおよびセカンドレングススレシュホールドパラメータEおよびFは、最大のサーチ可能なサブ配列ほど広い範囲に渡って変化し得る。さらに、該モジュールは、EおよびFが減少するにつれてより許容性となる。図17は、パーセンテージ計算機能CalculatePercentagefunctionS313の例示的なフローチャートを示す。この機能内で、実際のベースコールのパーセンテージは、中間鎖長候補サブ配列について計算されるS803。この計算されたパーセンテージは、ユーザによって選択されるかまたは該システムによって予め設定される、インターメディエイトパーセンテージスレシュホールドHIntermediatePercentageThresholdHと比較されるS805。実際のベースコールの計算されるパーセンテージがインターメディエイトパーセンテージスレシュホールドH例えば、60未満である場合、該システムは、代替候補サブ配列をサーチするために、サブ配列抽出ステップへリターンするS807。計算されるパーセンテージがHを超える場合、該中間鎖長候補サブ配列は、サブ配列のバッチ処理のためにキューへ送られるかまたは即座に類似性サーチサーバへ送られるS809。インターメディエイトパーセンテージスコアスレシュホールドパラメータが増加するにつれて、該モジュールは、より多量の非ベースコールを有するサブ配列についてより許容性でなくなる。サブミットされるサブ配列に関する類似性サーチから結果を受けることに加えて、該システムは、必要に応じて、該サブミットされる配列の更なる分析を提供する。図18aは、図12のモジュール内のシステムのアクションS317をより詳細に説明する例示的なフローチャートである。このモジュールは、1つのサブ配列または一群のサブ配列が比較された後に開始するS901。このポイントで、該システムは、類似性サーチアウトプットを読み取りS903、そして該アウトプットを分析し、そしてユーザによって選択されるかまたは該システムによって予め設定される、サブミットされるサブ配列に関するさらなる記述統計descriptivestatisticsを計算するS905。該システムによって計算される統計および行われる分析としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:該配列のパーセンテージとしての選択されるサブ配列鎖長、およびベースコールにおけるサブ配列鎖長。これらは、標的生物学的エンティティー遺伝子のどの部分が同定されたかを示すために一緒に使用され得る。サブ配列鎖長およびサブ配列ベースコールのパーセンテージは、研究者が、該システムのアルゴリズムおよび機能ステップをモニタリングすることを可能にする。さらに、リシークエンシングマイクロアレイの場合、GDASを含むがこれらに限定されない、ベースコーリングアルゴリズムについての閾値パラメータが、モニタリングされ得る。代替の実施形態において、該システムは、類似性サーチからリターンされる統計結果をアクセプトおよびまたフォーマットし、ユーザが、提供されるグラフィカルユーザインタフェースを使用して、結果を操作および組織化することを可能にする。図18bは、本発明の実施形態に従うアウトプットデータの例である。必要に応じて、該システムは、例えば、BLAST結果を含む、上記の類似性サーチおよび分析によってリターンされるアウトプットの全てを保存し得るS907。該システムはまた、必要に応じて、類似性サーチによってリターンされるおよび/またはこのシステムによって計算される結果の全てまたは結果のサブセットをユーザにディスプレイするS909。本発明の特定の実施形態は、次いで、これらの結果が、アーカイビングarchivingまたはトランスファーtransferのために送信または保存されることを可能にするS911。以下の表は、上述のいくつかの例示的なパラメータおよび閾値についての、例示的な範囲および好ましいサブ範囲subrangesを示す。好ましいサブ範囲:該システムのなお別の実施形態において、サーチ比較アウトプットは、最適化パラメータJOptimizationParametersJについて分析され得るS913。上述のように、該システムのパラメータおよび閾値A,B,X,Y,E,F,およびHを含むが、これらに限定されないは、ユーザによって設定されるか、あるいは該システムによって予め設定される。あるいは、該システムの1実施形態は、該システム自体によってあるいは補助機能モジュールcomplementaryfunctionalmoduleの使用を介して、これらの変数のうちの1つまたはいくつかの最適化を可能にする。例えば、パラメータまたは閾値の最適化は、システムオペレーションのパスpassesまたはマルチプルユーズの過程において記録されたシステム性能を分析することによって、周知の最適化例えば、SIMPLEXリニアプログラミングSIMPLEXlinearprogrammingまたは人工知能ユニホームまたはヒューリスティックサーチのような状態空間サーチstatespacesearchを含む技術に従って行われ得る。対応の最適化パラメータJは、例えば、前のステップにおいて使用される種々のパラメータおよび閾値を自動的に変更し、そしてこれらの新しい最適化パラメータを使用して該プロセスを再度実行するために使用され得るS917。あるいは、生データファイルから再度開始する代わりに、最適化パラメータJが、使用され得、最適化パラメータJを使用することにより、選択されたサブ配列のアウトプットをリファインしS915、例えば、該システムと組み合わせて使用される類似性サーチアルゴリズムの機能または挙動に関連するパラメータを変更する。最適化パラメータは、例えば、スピードまたは関連する/意味がある類似性サーチ結果に関する、システム性能を高めるために、ユーザまたは該システム自体によって調節され得る。図19は、その拡張可能なカーネル様性質extensiblekernellikenatureを使用する、本発明のなお別の実施形態を記載する例示的なフローチャートである。特に、システム分析1017は、類似性サーチアルゴリズム1009のオペレーションまたは挙動に対応するパラメータを最適化するかまたはそうでなければ変更するために使用される。例えば、この変更は、REPIの分析結果1017から計算されるかまたは内挿される上記の最適化パラメータJに関連付けられ得る。類似性サーチパラメータ例えば、BLASTパラメータを変更することは、類似性サーチにおいて典型的に使用されるスコアリングシステムおよび該方法を変更する。特に、示される反復分析iterativeanalysisは、既知の配列へのテストサブ配列の可能性のあるマッチを示唆することについて、より厳密なまたはより厳密でない閾値を生じさせ得、このようにして該システムのアウトプット1019を変更または最適化する。本発明の説明は、さらに、以下の詳細な実施例によって助けられる。以下の詳細な実施例は、本発明の例示的な実施形態に対応し、そして、システムオペレーション、パラメータセッティング、配列データなどに関して、本発明に対する制限を記載するように意図されない。REPIの実施形態は、CustomSeq/GCOS/GDASプロセスからのどのベースコールサブ配列が、カスタマイズされたスライディングウィンドウアルゴリズムの使用を介して、有意なBLAST結果を恐らくリターンするかどうかを確定するために使用した。引き続いて、REPIは、エンドユーザへBLASTアプトプットを自動的にリターンし、これは、所定のベースコールセットが特定の細菌配列に対応する可能性への確率的付与を可能にする。さらに、REPIは、個々の病原体へ配列フラグメントを自動的にリンクする。リシークエンシングマイクロアレイからの生配列データは、Affymetrix製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされたGeneticDataAnalysisSoftwareバージョン2.0GDASによって提供される。GDASベースコーリングは、以前に記載されたベースコーリングアルゴリズムCutlerら、2001に基づく。GDASソフトウエアから得られるベースコールを含むFASTAアウトプットファイルの各々を、本明細書中に記載される本発明の例示的な実施形態である専門ソフトウエアREPIの実施形態を使用して分析した。本実施例の場合、GDASの配列アウトプットは、ほとんどの場合、種々の量のノン-コールNsが散在する連続配列コールA,T,CまたはGの散在した混合物であり、ここで、GDASソフトウエアは、該チップ上における弱いハイブリダイゼーションシグナルおよび/または非特異的結合によって引き起こされる高いバックグラウンドハイブリダイゼーションに起因して、ベースコールを作製しないCutlerら、2001。Ad4FIBERGDASタイル領域についてのアデノウイルス4臨床サンプルについてのアウトプットの例示アウトプットを、以下に示す:提供される例において、REPIは、CGIPerlインターフェースを介して、ローカルBLASTNCBIntデータベース4.5GBのランダムアクセスメモリを有するAppleG5シングルプロセッサ1.8GHzコンピュータに含まれるへインタフェースされる。ディスプレイされた結果は、1.0e-9の期待値expectvalueE値閾値内の全てのデータベース配列を含んだ。E値は、サーチスペースのサイズ、スコアリングマトリクスscoringmatrix、およびギャップペナルティーgappenaltiesが与えられるとランダムに期待されるアラインメントの数を示す;E値が低下すると、データベース配列類似性マッチが実際にランダム同定である可能性が低くなる。REPIアウトプットは、比較可能なサブ配列およびその名称から構成され、ビットスコアの降順で、そのサブ配列との各マッチについて、名称、長さ、E値が続く。該名称は、GenBankレコードのFASTA同定ラインとして報告され、そして配列鎖長を含む。該スコアは、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーから計算される標準化されたスコアであり、スコアが高くなるほど、類似性は高くなる。上記に列挙される例のREPIアウトプットを以下に示す。各々の比較可能なサブ配列について、REPIは、<e値閾値theevaluethresholdvalue現在、1.0E-9の期待値を有する全てのGenBankデータレコードをリターンするビットスコアランキングの降順で。最も高いビットスコアは、アデノウイルス4プロトタイプについて達成され、一方、空軍および海軍トレイニングサイトAirForceandNavytrainingsitesからの野外株fieldstrainsは、より低いビットスコアによって適切に識別される。この詳細な実施例において、REPIパラメータを以下のように設定した:上述の実施形態に加えて、該システムの拡張可能な性質は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の不連続なセグメントを使用する多数のより高いバイオインフォマティクスタスクへの即座の適応を可能にする。これらの補足的な適用のいくつかの例を、以下に記載する。前の例において、本発明は、配列フラグメントが個々の標的配列へ自動的にリンクされ得ることを示すデータを提供した。いくつかのより好ましい実施形態において、このアプローチは、オーソロガスなorthologous生物学的標的配列のセット内の組換え物recombinationと混合物とを識別する。ここで、オーソログorthologは、一般的に、異なる種における同一遺伝子、通常、共通の遺伝的祖先のしるしindicationとして規定される。より詳細には、該システムは、リシークエンシングマイクロアレイの異なるタイル領域からの配列コールの自動アラインメントを行い、該アレイの異なるタイルド領域上の相同配列フラグメントの存在を検出することを試み、標的配列の混合物の推定を可能にする。必要に応じて、該システムは、さらに、オーソロガスな遺伝子を提示する異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、オーソロガスな遺伝子の混合物ではなく、しかし2またはそれ以上のオーソロガスな遺伝子の異なる領域間の遺伝的組換え事象によって生じているかもしれない連続配列に対応することを決定する。このようなさらなる実施形態において、該システムは、該アレイの異なるタイルド領域上における高度に重複するまたは相同な配列フラグメントの自動検出を可能にし、標的配列の混合物の推定を可能にする。さらに、該システムは、必要に応じて、異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、高度に重複しているのではなく、しかし既知の標的配列内の位置に登録されているかもしれない連続配列に対応することを決定し、遺伝的組換え事象を推定する。図21は、本システムの実施形態に従って、テストサンプル中の標的間の組換え物と異なる標的の混合物とを識別するための例示的な実施形態の方法を示す。これらの実施例方法は、図12を参照して上述された方法へ統合されるかまたは補足され得、そしてまた、蛋白質混合物とハイブリッド蛋白質hybridproteinsとを区別するために適用可能である。この実施例において、該システムは、蛋白質をコードする全ヌクレオチド配列に関して初期類似性サーチ有りまたは無しでリシークエンシングマイクロアレイによって検出される遺伝子サブ配列の相対位置を決定するS1201。該相対位置は、一般的に、全配列内のサブ配列のロケーションに対応する。全配列は、公共および/または個人的配列レコードから構成され得るデータベースにおいて入手可能である。例えば、サブ配列は、全配列の先端例えば、5’、中央、または末端例えば、3’に対応すると決定され得る。さらに、この位置決定は、候補サブ配列または選択されるサブ配列でなされ得る。次に、該システムは、アラインメント手順alignmentprocedureを行い、それらの位置に従ってサブ配列を比較およびマッチするS1203。S1203を行うために使用されるアルゴリズムは、2つの配列間のローカルペアワイズアラインメントのために使用されるもの例えば、BLASTN,BLASTP,またはBLASTX、複数の配列間のアラインメントを同時に行うもの例えば、ClustalWまたはClustal_XThompsonら、1997;Thompsonら、1994、あるいは、パブリックドメインからまたは個人的な開発によって得られる代替のものであり得る。1つの実施形態において、該システムは、同種配列likesequencesの先端、中央、および末端位置に対応する配列をグループ化する。引き続いて、該システムは、互いとの該グループ化されたサブ配列のフィットを評価するS1205。サブ配列間のフィットFitamongsubsequencesは、例えば、該配列間の適切な量の重複の検出によって、評価され得る。1実施形態において、該フィットは、非重複配列に関連して相同重複領域の長さまたはビットスコア間の量的関係、および所定の蛋白質についての全遺伝子の全体配列への各々の関係である。重複する生物学的配列を評価する伝統的な方法に加えて、該システムは、必要に応じて、アナログおよびデジタル通信に適用可能なシンクロナイゼーションおよび検出方法を使用して配列重複を分析する。さらに、重複配列を同定する問題は、デジタル通信システムでの初期シンクロナイゼーションinitialsynchronizationによって引き起こされる問題とは異なっていない。したがって、本発明に従って使用されるかもれない1つの方法は、スライディングコリレーターslidingcorrelatorの使用である。スライディングコリレーターにおいて、2つの配列データ配列、および仮定配列hypothesissequenceは、該2つの配列を相互に関連付けることcorrelatingによって互いと比較される。該2つの配列は、互いに関して位置がシフトされ、そしてシフティングは、相互関係結果が所定レベルを超えると検出される場合にのみ停止する。実際に、スライディングコリレーターは、しばしば、シンクロナイゼーションプレアンブルsynchronizationpreambleのトランスミッションのようなサーチ領域を縮小する何らかの他の方法によって先行される。同様に、本発明によれば、サブ配列間の既に検出された重複が、シンクロナイゼーションプロセスのために必要とされる時間量を制限するためにプレアンブルとして使用され得る。このタイプのシンクロナイゼーションは、BhargvaetalDigitalCommunicationsBySatelliteJohnWileyandSonsChapter9pages269291において記載されている。同様に、§822ofSklarBDigitalCommunicationsFundamentalsandApplicationsPrenticeHall1988pages453460において記載されるもののような、他のシンクロナイゼーションまたはアクイジションacquisitionアルゴリズムが適用され得る。使用されるアクイジション基準は、十分に低い確率の偽アクイジションfalseacquisitionに基づいて選択される。この場合、アクイジション基準は、10の偽検出の確率であり得、しかし9,8,7,6を含んで0.1までが使用され得る。該サブ配列がフィットの所定の閾値を超えない場合、該システムは、代替サブ配列の分析を開始するS1207。すなわち、2またはそれ以上の潜在的に相同なまたはオーソロガスなサブ配列は、混合物または組換えのいずれについてのモデルにフィットせず、該システムは、他のサブ配列をサーチするために進み得るS1201。グループ化されたサブ配列のコレクションは、類似性サーチアルゴリズムを使用して、全標的配列と比較され得るS1211。このような場合、該連結されたlinkedサブ配列と標的配列との類似性のレベルS1213は、該検出される生物学的配列が異なる生物学的エンティティーの混合物由来であるのかどうか、あるいは該検出される配列が組換えを示しているのかどうかを示すデータを提供する。あるいは、該システムは、サブ配列の部分間の重複するハイブリダイゼーションを評価するチェックポイントの方法を使用する。該チェックポイント方法は、該サブ配列に沿った複数のポイントでのこのような評価を行うS1209。このアプローチにおいて、チェックポイントの数は閾値と比較されS1215、生物学的混合物と組換えとを識別する証拠を提供する。例えば、同一タイプの2つのウイルスの共感染は、同一蛋白質について第2のウイルス遺伝子の対応するセクションで置換されている、5’末端以外は一方のウイルスと同一である、単一遺伝子内で組換え体を作製し得る。この新規の組換えウイルスゲノムがリシークエンシングマイクロアレイ上にハイブリダイズされると、それは、該リシークエンシングタイル領域の対応するセクションからシグナルを発生し得る。本発明の実施形態は、どの部分が一緒にフィットして全体標的entiretargetを形成するのかを示す、標的配列のモデルを構築するアセンブリアルゴリズムassemblyalgorithmを含む。該2つが有意な重複を有する場合例えば、ある閾値を超える相同性を実証する、恐らく混合物が存在すると結論付けるかもしれない。しかし、ほとんどあるいは全く重複が存在しない場合、組換え体が存在する可能性は残ったままである。重複または欠如lackofの程度は、標的の低濃度によって影響が与えられ得、対応してより少量のタイルが埋められるfilledin。この同一原理は、なおより容易に、そしてより大きな影響を伴って、ウイルスに適用され得、ここで、組換えは、レトロウイルスの場合のように、定常かつ反復する事象であり、ここで、ウイルス遺伝子間の組換えは、新規のウイルス株を形成させる。実際に、このような記載される機能性は、標的配列の混合物と標的配列間の組換えとの識別に必須である。さらに、このさらなる機能性はまた、検出されるおよび恐らく新規の組換えにおける共通の領域をより容易に検出し、そしてデザインPCRプライマーを助け、該システムによって検出される組換えのより広範な研究を助けるために、使用され得る。本発明のアプローチは、生物学的エンティティーの混合物と所定のエンティティー内の組換え事象とを識別することができるだけでなく本明細書中の他の場所に記載される、該システムのさらなる実施形態は、有利なことに、エンドユーザに、該リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された標的配列の相対量の量的評価を提供する。このような決定-クオリティ情報decisionqualityinformationは、非常に有用であり、例えば、臨床医または臨床研究技術者が、複数の病原体ゲノムシグネチャーsignaturesが検出された場合に、原因および作用を与えようとする際にそうである。さらに、生物学的物質の相対および絶対量についてのデータと生物学的物質の存在に関する補足データは、エンドユーザによる意思決定のためのさらなるコンテクストを提供する。さらに、該システムの実施形態は、このような存在presenceおよび存在量abundanceデータを自動的に分析および比較し、決定-クオリティ情報をエンドユーザに提供する。該システムの実施形態は、存在量情報abundanceinformationを提供するために2タイプのデータを使用するように構成される。第一のものは、チップ上におけるハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度である。非線形関係が、溶液中の標的の量と実際にハイブリダイズする量および得られるシグナルとの間に存在する。しかし、サンプル中の標的核酸の量の評価は、コントロール条件下で調製される標準曲線との比較によって行われ得る。例えば、シグナル強度データは、Affymetrixデータヒエラルキーhierarchyにおける.CELファイルから容易に入手可能であり、そして遺伝子発現変化の量的評価のために典型的に使用される。該システムの実施形態は、それが入力し、出力し、そして処理するデータ内における強度値の包含を提供する。第二に、ベースコールのパーセンテージ[総タイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムを満足する選択されたサブ配列内のベースコールのパーセンテージとして、の両方]が、濃度の指標measureとして使用され得る。本発明者によって行われた試験からの結果は、これらのパーセンテージメトリクスmetricsの両方ともが、標的濃度が減少するにつれて減少することを示し、しかし、正確な標的配列は依然として同定され得る。図22は、決定-クオリティ情報decisionqualityinformationをユーザに提供するための、強度データと類似性サーチの結果とを組み合わせる、CIBSIの実施形態の例示的な説明図である。強度データ1314は、例えば、マイクロアレイのスペクトル分析ツールからインプットされる。強度データは、類似性サーチの結果に照らして分析され、検出された配列のよりロバストなrobust分析1319を行い、そしてその結果、ユーザへ決定-クオリティ情報1321を提供する。決定-クオリティ情報は、例えば、異なるまたは関連する生物学的エンティティーに対応する検出される配列またはサブ配列の相対存在量の指標を含む。さらなる実施形態は、前述のように混合物と組換え物とを識別することにおいて、強度データ1314を組み込む。強度データ1314は、このような場合、類似性サーチからリターンされた配列データを解釈するためにデジタル通信方法を適用する場合、さらなるディメンジョンdimensionの情報を提供する。別の非常に好ましい実施形態において、該システムは、RNAまたは相補cDNAのハイブリダイゼーションを介して現在記載されるタイプのマイクロアレイを使用してリシークエンスされた転写マーカー例えば、RNAの分析を可能にする。ゲノム組換え事象について上述されるものに類似する方法において、転写配列はまた、アセンブリされ得、感染のためのマーカーとして役立ち得る転写編集事象transcriptionaleditingeventsおよび生物学的エンティティー生存率を決定する。さらに、該システムは、必要に応じて、核酸以外の生物学的配列およびそれらの関連する転写産物例えば、蛋白質のアミノ酸配列での使用のために適応可能である。一般的に、本発明のプロテオーム適用は、生物学的配列データを扱いそしてこのようなデータを既知の配列との比較のために最適化する該システムの能力と一致する。遺伝子発現および蛋白質発生の研究は、上述の遺伝子配列データベースとスケールおよびアクセス性accessibilityが類似のアミノ酸配列データベースおよび関連の類似性サーチアルゴリズムへと導いた。さらに、蛋白質を配列決定するための質量分析法からリターンされるスペクトルデータの分析は、好都合なことに、本発明のなおより精巧な実施形態に役立つ。例えば、蛋白質配列スペクトルデータは、マイクロアレイの分析において使用されるものと同様の強度データを含む。他のタイプの配列に関して上述されるように、本発明の進歩した実施形態は、このような強度データの扱いおよび使用を提供し、エンドユーザにより高品質の情報を提供する。診断適用における該システムの使用に加えて、該システムの代替の実施形態は、該システムの診断実施形態での使用のためのより効果的および効率的なリシークエンシングマイクロアレイの設計を促進することである。マイクロアレイ上の包含ためにプローブを選択および設計するためのより効果的なアプローチは、所定のマイクロアレイ上におけるリアルエステートrealestateのより効率的な使用へと必然的に導く。したがって、マイクロアレイは、所定のサイズについてより大きい種々の生物学的配列を正確に検出するように作製され得、あるいは特定の適用のために仕立てられたtailoredマイクロアレイは、マイクロアレイにおいて要求されるプローブの要求される数を減少させることによって、より安価かつよりアクセス可能accessibleになされ得、これは、サイズ縮小およびより高い製造収率についての機会を増加させる。マイクロアレイを設計するための1つの重要な要件keydriverは、分解能resolutionである。一般的に、分解能は、本明細書中で記載される場合、生物学的エンティティーの密接に関係する株を識別する識別力をいう。例えば、いくつかの適用は、アデノウイルスの空軍および海軍野外株AirForceandNavyFieldStrainofadenovirusを識別する高分解能を要求し得、一方、他の適用は、アデノウイルスの存在の同定のみを要求する。以下に記載の実施形態は、マイクロアレイ設計者が、分解能およびマイクロアレイサイズ/密度とを客観的にそして体系的に釣り合わせるbalanceことを可能にさせることにおける、該システムの使用を記載する。図23は、リシークエンシングマイクロアレイまたは他のプローブまたはアレイベースアッセイの加速した設計および改良refinementのために該システムを使用する方法の例示的な実施形態を示す。まず、マイクロアレイによって検出されるように意図される、生物学的配列これは、言い換えると、病原体を含む生物学的エンティティーに対応するのタイプに対応する、テスト配列が選択されるS1403。好ましくは、密接に関連していてもしていなくてもよい、1を超える既知または評価可能なestimable生物学的配列の組成物、該選択される配列は、系統樹およびHiddenMarkovModelsEddy,1998を含むがこれらに限定されない種々の方法によって選択され得る。これらの選択されるテスト配列は、次いで、CLUSTALWS1405のようなマルチプルアラインメントアルゴリズムを使用するマルチプルアラインメントmultiplealignmentを受けるS1405。マルチプルアラインメントを行うことは、典型的に該テスト配列の共通領域に対応する、コンセンサス配列へ導きS1407、ここで、共通点は、特定の類似性閾値への比較によって決定される例えば、コンセンサスを決定するためのCLUSTALWパラメータセッティングパーセンテージ、CLUSTALWウェイト。得られるコンセンサス配列は、次いで、該システムの実施形態へインプットされ、類似性サーチから意味がある結果を生じる傾向にあると決定される、該コンセンサス配列の1以上のサブ配列を作製するS1409。1つのアプローチにおいて、該コンセンサス配列由来のサブ配列は、次いで、例えばAffymetrixリシークエンシングマイクロアレイの挙動および限定limitationsを模倣するシミュレーションを介して、元々選択されたテスト配列とハイブリダイズされるS1413。ハイブリダイゼーションルールは、全配列内の種々の位置でのあるいは種々の数の塩基対の挿入、欠失、および置換の許容性toleranceおよび検出についてのルールを含むが、これらに限定されない。次いで、テスト配列とコンセンサス配列との間のアウトプットシミュレートされたハイブリダイゼーションパターンが得られS1415、そして引き続いて類似性サーチを使用する自動比較のために該システムへサブミットされるS1417。類似性サーチの結果は、次いで、元々選択されたテスト配列のセットと比較されるS1419。一般的に、類似性サーチは、少なくとも1つの既知の生物学的エンティティー、ならびにサブミットされた配列またはサブ配列がその既知のエンティティー由来であるという関連する確率をリターンする。したがって、類似性サーチ結果の比較は、コンセンサス配列の関連部分に基づくプローブが、ユーザにとって関心のあるテスト配列のコレクションへ、正確にハイブリダイズし、そしてその結果、これを同定することを確認または否定し得る。該結果がコンセンサス配列またはそのサブセットの有効性を確認する場合、その配列は、リシークエンシングマイクロアレイの領域において使用され得るS1421。あるいは、該比較結果が、問題のテスト配列は適切に検出されないことを示唆する場合、該システムは、新たなプローブのさらなる再設計において使用され得るS1423。このような再設計プロセスの1実施形態は、オリジナルの設計プロセス内のいくつかのステップの再評価を含み、これらのいくつかは図23に示される。例えば、該結果は、選択されたテスト配列の範囲の多様性、および環境におけるそれらの普及率に従うそれらの重みづけweightingによって影響を受けるS1425。さらに、コンセンサスアルゴリズムの重みづけは、調節可能でありS1427、該システムに関連する機能パラメータも同様であるS1429。さらに、ハイブリダイゼーションをシミュレートすることにおいて実施される種々の方法は調節可能であり、シグナル対ノイズ比閾値およびアルゴリズムのホールスケール変化wholesalechangeを含むS1431。したがって、該システムの機能性functionalityは、プローブを主観的に選択する従来の方法と比較して、リシークエンシングマイクロアレイの加速したそしてより効果的な設計を提供する。設計に関連する上記の局面は、さらに、本発明者によって行われた下記の実施例によって示される。この実施例において、それを作製するために使用されるテスト配列を同定することができる、マイクロアレイ上の標的配列として使用されるコンセンサス配列を作製するための方法が記載される。図24は、以下に記載の方法の例示的な実施形態である。15個のアデノウイルスヘキソン遺伝子配列から出発して、これらの配列は、デンドログラム例えば、図25を参照のことを使用する系統発生に従って配置される。デンドログラムは、選択されたテスト配列中の遺伝的関係を図示しそして評価するために使用される。Ad1およびAd5は、他の配列に関して最大のアウトライヤーoutliersであるが、全ての15の示されるアデノウイルスヘキソン遺伝子配列は、この実施例において、テスト配列の初期セットとして選択されるS1503。テスト配列の初期セットの選択S1503は、必要に応じて、予め設定されたまたはユーザ規定されたパラメータに従って該システムによって、自動的に提供される。例えば、デンドログラム中の配列間の距離は、候補コンセンサス配列において配列をコンバインするために必要とされる最小または最大距離を決定するために設定される数的閾値を提供する。次に、全ての選択されたテスト配列は、ClustalWThompsonら,1994のようなマルチプルアラインメント分析S1505へ供され、これらのサンプルアウトプットは図26に示される。コンセンサス配列は、次いで、このアラインメントから計算されるS1507。該実施例は、図27でConsClustalWへのEMBOSSインターフェースによって行われるこのステップを示し、Consは低いプルーラリティlowplurality[それ未満でコンセンサスが存在しないポジティブマッチpositivematchesの数についてのカットオフをConsのユーザが設定することを可能にするパラメータ]で作動する。特に、より低いプルーラリティlowerpluralityは、より少ないマッチがコンセンサスを構築することを可能にし、したがって、より少ないギャップおよびNsを有するコンセンサスを作製する。候補コンセンサス配列が計算されると、それはREPIまたは、あるいは、本発明の別の実施形態へインプットされ、1e-9の期待閾値を使用して標的配列としてのその潜在的な有効性を最初に評価しS1509、見込みのあるマッチprospectivematchesをリターンするS1511。この時点で、REPI結果は、例えば、REPI結果中に存在するテスト配列の初期セットのパーセンテージのような、テスト配列の初期セットと比較されるS1513。REPI結果によって同定された初期テスト配列のこのパーセンテージが閾値システムによって予め設定されるか、あるいはユーザによって規定されるを超える場合、該候補コンセンサス配列は、最も確率的に好ましい大規模なmostprobabilisticallyfavorablelargescale標的配列であり、そして該プロセスは、シミュレーティングハイブリダイゼーションに移動するS1527。示される例において、上記比較閾値は100であり、該初期テスト配列の全てがREPIによってリターンされなければならないという条件に対応し、期待閾値を超える。この比較閾値を低下させることは、テスト配列の所望のセットの特定数またはパーセンテージを誤って同定するかまたは同定し損ねるかもしれない、標的配列により許容なシステムを生じさせる。そうではなく、該テスト配列の初期セットの各々がREPI結果中に全く存在しない場合、欠けているテスト配列は、個々に、該候補コンセンサス配列と共に評価される。候補コンセンサス配列はまた、前のステップにおいて作製されたマルチプルアライメントと組み合わせて評価され、このコンセンサス内でのそれらの同定に重要である任意の欠けている配列セグメントを同定する。以下のステップの目的は、オリジナルのオリジナル配列一般性を失うことなく、オリジナルの候補コンセンサス配列へ必要な配列情報を徐々にincrementally加えることである。したがって、マルチプルアラインメントが再度行われるS1515。このとき、マルチプルアラインメントは、現在のコンセンサス配列を含む。引き続いて、候補コンセンサス配列におけるギャップが同定されるS1517。テスト配列および候補コンセンサス配列のアラインメントにおけるギャップは、欠けている配列データについて可能性のある位置であり、ここで、欠けているmissingテスト配列から候補コンセンサス配列へインクリメンタル配列情報を加えることは、有利であるかもしれない。図28は、第2マルチプルアラインメントからの結果におけるギャップの例を示す。この例において、初期テスト配列選択プロセスの間に2つの最大の系統的アウトライヤーphylogenicoutliersとして前に述べられるように図25を参照のこと、コンセンサス配列がAd1およびAd5から配列データをスキップするskips2箇所が存在する。次いで、前記ギャップに対応する欠けている配列からのセグメントが、前記ギャップの代わりにオリジナルコンセンサス配列へ、加えられるか、またはスプライスされsplicedS1519、パッチされたpatchedコンセンサス配列を形成させる。図29は、パッチされた候補コンセンサス配列内の、スプライスされた配列データを示す。本発明の実施形態によれば、スプライシングは、ユーザによって手動で行われる。必要に応じて、該システムは、ギャップへのスプライシングのために、欠けているテスト配列からの配列データの選択およびギャップの同定に対応する、パラメータシステムによって予め設定されるか、またはユーザによって設定されるに従って、自動スプライシングを提供する。スプライシングS1519後、パッチされた候補コンセンサス配列は、上記操作の効果を評価するために、再度、REPIへサブミットされるS1521。必要に応じて、システムまたはユーザは、今回正確に同定された欠けている試験配列の数またはパーセンテージS1523あるいはREPI結果によって今回誤って同定された以前に同定されたテスト配列の数またはパーセンテージS1525に対応するさらなる受容性閾値acceptabilitythresholdsを決定する。このような閾値は、一般的に、初期候補コンセンサス配列に関して、パッチされたコンセンサス配列の有効性における改善または低下についての許容性toleranceに対応する。示される例において、2つの配列セグメントの添加は、以前に同定されたテスト配列のいずれをも失うことなく、REPIヒットのリストへAd1およびAd5を加えるに十分である。他方、スプライシングオペレーションが、同定されたもののリストへ欠けているアデノウイルスタイプを加えない場合、あるいは他の配列ヒットが新たなコンセンサス配列が捨てられるプロセスにおいて失われている場合、Ad1およびAd5は分離され、そして残りの配列は再評価されるS1524。あるいは、スプライシングオペレーションが受容性閾値を満たさない場合、再評価が行われる。したがって、テスト配列の初期セットの間の配列差異が受容性閾値を満たさない場合例えば、直前に記載されているもの、2以上の候補コンセンサス配列は、テスト配列の初期セットの所望のパーセンテージを同定し得る標的配列を適用するために必要かもしれない。必要に応じて、該システムは、並行して、このようなさらなる候補コンセンサス配列の検討considerationおよび評価evaluationを提供する。オリジナル配列の全てがREPI結果において同定されると図30を参照のこと、最終コンセンサス配列が形成され、そしてオリジナルテスト配列の各々について可能性のあるハイブリダイゼーションが決定され得る。図31は、このステップを行うために使用されるハイブリダイゼーション/結合シミュレーションプログラムを示す。オリジナル配列の各々は、新たなコンセンサス配列と整列される。シミュレーションは、例えばbl2seqアラインメントプログラムによって作成されるアウトプットアラインメントファイルを採用し、そして25量体当たりのトップスコアリングアラインメントにおける差異の数を評価する。必要に応じて、該プログラムは、より長いかまたはより短い間隔で、差異の数を評価する。該システムは、次いで、該25量体が2ミスマッチ未満を有する位置のみに基づいて得られる配列Ad4について図31に示されるようにを構築する。さらに、ミスマッチの許容性についての別個の閾値パラメータが、必要に応じて該システムによって提供される。図31に示される配列は、現在のコンセンサス配列とハイブリダイズされるテスト配列のシミュレートされた表示である。最終のコンセンサス配列と該配列の各々とのハイブリダイゼーションポテンシャルが、次いで評価されるS1527。この例において、プログラムHybBindが使用され、各テスト配列についてハイブリダイゼーションシミュレーション配列を作製するS1529。ハイブリダイゼーションシミュレーション配列が全て作製されると、それらは、それらが実際のチップから得られるかのように、REPIによって各々実行されるS1531。全てのシミュレートされた配列が、トップスコアおよびトップヒットビットスコアおよび/または期待値に基づく類似性スコアとしてそれらのそれぞれの配列にマッチする場合、この可能性のあるコンセンサス配列は、評価プロセスに合格し、そして標的配列として使用され得、それを作製するために使用される配列を、タイプごとに、同定するS1535。あるいは、シミュレートされた配列の全てがトップスコアとしてそれらのそれぞれの配列とマッチしない場合S1535、またはトップスコアおよびE値が複数の配列にマッチする場合S1533、可能性のあるコンセンサスは該評価に不合格となり、該配列は、複数のグループに分割され、そして再評価のために送り戻されるS1534。それらのそれぞれの配列を正確に同定しない可能性のある配列Ad1,Ad50,Ad34,Ad3は、ステップ1へ送り戻され、1以上のコンセンサスについて再評価されるS1534。トップスコアおよびE値としてそれらのそれぞれの可能性のある配列を正確に同定した可能性のある配列Ad4,Ad21,Ad16,Ad7,Ad5は、一緒にグループ化され、そしてマルチプルアライメントの作成で始まる上述のプロセスを介して送り戻され、不合格しそしてそれら自体を正確に同定しなかった配列を使用せずに、新たな候補コンセンサス配列を構築するS1536。新たな候補コンセンサス配列例えば、図32を参照のことは、再度、同一の閾値および評価、bl2seq,REPI,HybbindおよびREPIを介して実行される。この場合、Hybbindからの最終のシミュレートされる配列は、検証のためにREPIを介して実行される場合、該配列の全ては、トップスコアおよびE値としてタイプごとにそれらのそれぞれの配列を同定することができ、したがって、この可能性のあるコンセンサス配列は、全ての評価に合格し、そして配列Ad4,Ad21,Ad16,Ad7,およびAd5についての標的として使用され得る。なお別の実施形態において、該システムは、配列分析における時間的傾向の分析および追跡を提供する。時間に渡って反復的にまたは継続的に上記に記載されるものと類似の分析を行いそして記録することによって、遺伝的またはプロテオミック進化および/または突然変異が、従来法を使用するよりも容易に追跡され得る。病原体検出に関連する特定の実施形態において、本明細書中で記載される本発明は、臨床セッティングにおけるポイント-オブ-ケアpointofcareでまたはその付近での一般的な呼吸器病原体respiratorypathogensルーチン診断およびサーベイランスのために使用される。容易に得ることが出来るサンプル例えば、鼻洗浄nasalwash、咽喉スワブthroatswab、痰、血液、食物、土壌、水、または空気が単純な様式で処理され、核酸単離物isolatesを作製し、これらは、吸着性プロセスadsorptiveprocessを使用して得られ、病原体特異的標的について濃縮され、偏りのないnonbiased例えばトータルまたはマルチプレックストmultiplexedPCR増幅方法を使用して増幅され、そして洗浄および画像化の前に所定の時間、リシークエンシングマイクロアレイ上でハイブリダイズさせる。全体的なプロセスは十分に単純であり、その結果、当業者医療技術者レベルは、彼らのルーチンワークパターンの顕著な妨害なしに、該アッセイを行うことができる。ベースコールは、カスタムアルゴリズムを使用して、または業者によって特定されるステップを使用して作製される。REPI、またはその変形が使用され、マイクロアレイによって作製されるベースコールを自動的に解析し、そしてエンドユーザ例えば、医師、ヘルスケア提供者healthcareprovider、公衆衛生提供者publichealthofficer、または他の意思決定者decisionmakersに、疾患症状および合併症の原因である感染性病原体のマネージメント例えば、診断、治療、予防および大発生制御/封じ込め指標outbreakcontrolcontainmentmeasuresについての決定-クオリティ情報を提供する。この分析は、REPI例えば、ローカル専用BLASTサーバによってクエリーされる埋め込まれた配列データベースの使用によって、ローカル的に生じる。ルーチン診断機能性を提供することに加えて、この実施形態と組み合わせて使用されるマイクロアレイはまた、他者、即ち、公衆衛生局publichealthofficialsの関与の原因となる、非常に起こりそうもない例えば、トリインフルエンザまたは生物テロ病原体についてのマーカーを有する。本発明の選択される実施形態において、CIBSIアウトプットは、多層でアレンジされる。特定の実施形態において、CIBSIアウトプットは、ユーザまたはデータ解釈者datainterpreterへの提示のために3層でアレンジされる。アウトプットの第1層は、種レベル情報を提供し、アウトプットの第2層は、血清型/株レベル情報を提供し、そして第3層は低レベル情報を提供する。種の例としては、インフルエンザA型、インフルエンザB型、アデノウイルス、S.pyogenes、B.anthracis、およびF.tularensisが挙げられるがこれらに限定されない。種レベル層がユーザまたはデータ解釈者へ先ず提示され、該ユーザまたはデータ解釈者は、例えば、ユーザインプット、予め設定されたディスプレイセッティング、資格のある個人によって規定されたプロトコルを介して、他の層を選択しそして見ることができる。代替の実施形態は、ルールとアルゴリズムを提供し、各層の内の詳細の予め設定されたレベルに対応するデータを検索し、組織し、そして示す。1実施形態において、第一レベルでポジティブについてのルールは、種についての複数のタイル領域のいずれか1つがポジティブを生じる場合例えば、1.0e-9未満のBLAST期待値を有するサブ配列を生じるか、または単一病原体データベースレコードについて高いビットスコアを生じる、結果は種レベルで陽性POSITIVEであるというものである。これは、詳細の完全に自律の第1層が確立されることを可能にする。ユーザは、より多くの情報を作成することができ、この第1層は、例えば、人が介在するステップを通して、第2または第3層の情報にアクセスする。血清型/株レベル情報を含むアウトプットの第2層は、ユーザが、配列データベース例えば、GenBankレコードネームを見ることを可能にし、そして所定の閾値を超えるスコアで同定し、血清型および/または株を決定する。必要に応じて、テキストサーチアルゴリズムが、正確な命名規則無しに配列データベースに適用され得、自動的に血清型/株レベル情報を提供する例えば、GenBankデータの検索および解析を介して。あるいは、該システムは、ディスプレイフィールドの隣のオプションを選択することによってユーザまたはデータ解釈者によって第1層の情報へ作製される補遺addenda例えば、アデノウイルス4、AF野外株またはインフルエンザA型、H3N2、Fujian411を提供する。アウトプットの第3層は、生CIBSIアウトプットを含む。必要に応じて、アルゴリズムが、該生CIBSIアウトプットに適用され得る。本発明の他の実施形態は、アウトプットの第1層へさらなる情報を移動する。図20は、コンピュータシステムまたはサーバ2001のブロック図であり、ここで、本発明の実施形態が実施され得る。しかし、本システムは、パーソナルコンピュータPC構成に基づく必要はなく、しかし汎用コンピュータの特徴を含まないカスタムプロセッサベースのシステムが同様に使用され得ることが注意されるべきである。にもかかわらず、本発明をサポートするために使用される実際のハードウエア構成は、それほど限定されないので、PCベースのシステムの例が今回提供される。コンピュータシステム2001は、バス2002または情報を伝達するための他の通信メカニズム、および情報を処理するためのバス2002と連結されたプロセッサ2003を備える。コンピュータシステム2001はまた、プロセッサ2003によって実行される命令および情報を保存するために、バス2002へ接続された、メインメモリ2004、例えば、ランダムアクセスメモリRAMまたは他のダイナミックストレージデバイスdynamicstoragedevice例えば、ダイナミックRAMDRAM、スタティックRAMSRAM、およびシンクロナスDRAMSDRAMを備える。さらに、メインメモリ2004は、プロセッサ2003による命令の実行の間、一時的変数temporaryvariablesまたは他の中間情報を保存するために使用され得る。コンピュータシステム2001は、さらに、プロセッサ2003についての命令およびスタティック情報を保存するために、バス2002へ接続された、読出し専用記憶装置ROM2005または他のスタティックストレージデバイス例えば、プログラマブルROMPROM、消去可能なPROMEPROM、および電気的消去可能なPROMEEPROMを備える。コンピュータシステム2001はまた、情報および命令を保存するための1以上の保存装置[例えば、磁気ハードディスク2007、およびリムーバブルメディアドライブ2008例えば、フロッピー登録商標ディスクドライブ、読み出し専用コンパクトディスクドライブ、読み込み/書き込みコンパクトディスクドライブ、コンパクトディスクジュークボックス、テープドライブ、およびリムーバブル磁気光学ドライブ]を制御するためのバス2002へ接続されたディスクコントローラ2006を備える。保存装置は、好適なデバイスインターフェース例えば、小型コンピュータ用周辺機器インターフェースSCSI、集積デバイスエレクトロニクスintegrateddeviceelectronicsIDE、エンハンストIDEenhancedIDEE-IDE、ダイレクトメモリアクセスDMA、またはウルトラ-DMAultraDMAを使用して、コンピュータシステム2001へ加えられてもよい。コンピュータシステム2001はまた、特殊用途ロジックデバイスspecialpurposelogicdevices例えば、特定用途向け集積回路ASICsまたは設定変更可能なロジックデバイスconfigurablelogicdevices例えば、シンプルプログラマブルロジックデバイスSPLDs、コンプレックスプログラマブルロジックデバイスCPLDs、およびフィールドプログラマブルゲートアレイFPGAsを備え得る。コンピュータシステム2001はまた、コンピュータユーザへ情報をディスプレイするために、ディスプレイ2010例えば、陰極線管CRTを制御するためのバス2002へ接続されたディスプレイコントローラ2009を備え得る。コンピュータシステムは、コンピュータユーザとインタラクトしそしてプロセッサ2003へ情報を提供するために、入力装置、例えば、キーボード2011およびポインティングデバイス2012を備える。ポインティングデバイス2012は、例えば、プロセッサ2003へ方向情報およびコマンド選択を通信するため、およびディスプレイ2010上のカーソル移動を制御するための、マウス、トラックボール、またはポインティングスティックであり得る。さらに、プリンターは、コンピュータシステム2001によって保存されるおよび/または作成されるデータのプリントされたリストを提供し得る。コンピュータシステム2001は、プロセッサ2003に応答して、本発明の処理ステップの全てまたは部分を行い、メモリ例えば、メインメモリ2004に含まれる1以上の命令の1以上のシーケンスsequencesを実行する。このような命令は、別のコンピュータ可読媒体、例えばハードディスク2007またはリムーバブルメディアドライブ2008からメインメモリ2004へ読まれてもよい。マルチプロセッシングアレンジメントにおける1以上のプロセッサもまた、メインメモリ2004に含まれる命令のシーケンスを実行するために使用され得る。代替の実施形態において、ハードワイヤード回路が、ソフトウエア命令の代わりにまたはこれと組み合わせて使用され得る。したがって、実施形態は、ハードウエア回路およびソフトウエアのいずれの特定の組合せにも限定されない。上述のように、コンピュータシステム2001は、本発明の教示に従ってプログラムされた命令を保持するため、および本明細書中に記載されるデータ構造物、テーブル、レコード、または他のデータを含むために、少なくとも1つのコンピュータ可読媒体またはメモリを備える。コンピュータ可読媒体computerreadablemediaの例は、コンパクトディスク、ハードディスク、フロッピー登録商標ディスク、テープ、磁気光学ディスク、PROMEPROM,EEPROM,フラッシュEPROM、DRAM、SRAM、SDRAM、または任意の他の磁気媒体、コンパクトディスク例えば、CD-ROM、または任意の他の光学媒体、パンチカード、ペーパーテープ、またはホールのパターンを有する他の物理的な媒体、搬送波以下に記載、あるいはコンピュータが読むことが出来る任意の他の媒体である。コンピュータ可読媒体のいずれか1つまたは組合せに保存される場合、本発明は、コンピュータシステム2001を制御するため、本発明を実施するためのデバイスを駆動するため、およびコンピュータシステム2001がヒューマンユーザ例えば、印刷生産者printproductionpersonnelとインタラクト可能にするために、ソフトウェアを含む。このようなソフトウェアとしては、デバイスドライバ、オペレーティングシステム、ディベロップメントツール、およびアプリケーションソフトウエアが挙げられるが、これらに限定されない。このようなコンピュータ可読媒体は、本発明を実施することにおいて行われるプロセッシングの全てまたは部分プロセッシングが分散される場合を行うために、本発明のコンピュータプログラムプロダクトをさらに含む。本発明のコンピュータコードデバイスは、任意の解釈可能なinterpretableまたは実行可能なexecutableコードメカニズムであり得、スクリプト、解釈可能なプログラムinterpretableprograms、ダイナミックリンクライブラリDLLs、JAVA登録商標クラス、および完全に実行可能なプログラムcompleteexecutableprogramsが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のプロセッシングの部分は、より良好なパフォーマンス、信頼性、および/またはコストのために、分散され得る。用語コンピュータ可読媒体は、本明細書中で使用される場合、実行のためにプロセッサ2003へ命令を提供することに関与する任意の媒体をいう。コンピュータ可読媒体は、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない、多くの形態をとり得る。不揮発性媒体Nonvolatilemediaとしては、例えば、光学、磁気ディスク、および磁気光学ディスク、例えばハードディスク2007またはリムーバブルメディアドライブ2008が挙げられる。揮発性ド媒体Volatilemediaとしては、ダイナミックメモリ、例えばメインメモリ2004が挙げられる。伝送媒体Transmissionmediaとしては、同軸ケーブル、銅ワイヤおよび光ファイバーバス2002を作製するワイヤを含むが挙げられる。伝送媒体はまた、電波および赤外線データ通信の間に発生されるもののような、音波または光波の形態をとり得る。コンピュータ可読媒体の種々の形態は、実行のためにプロセッサ2003へ1以上の命令の1以上のシーケンスを行うことに関与し得る。例えば、命令は、最初、リモートコンピュータの磁気ディスク上において行われ得る。リモートコンピュータは、ダイナミックメモリへ遠隔的に本発明の全てまたは部分を実行するための命令をロードし、そしてモデムを使用して電話回線上に命令を送信し得る。コンピュータシステム2001に近いモデムは、電話回線上のデータを受信し、そして赤外線送信機を使用してデータを赤外線信号に変換し得る。バス2002に接続された赤外線検出器は、赤外線信号で運搬されたデータを受信し、そして該データをバス2002に置き得る。バス2002は該データをメインメモリ2004へ運搬し、ここからプロセッサ2003は命令を取り出しretrieveおよび実行する。メインメモリ2004によって受信された命令は、必要に応じて、プロセッサ2003による実効の前または後のいずれかに、保存装置2007または2008に保存され得る。コンピュータシステム2001はまた、バス2002へ接続された通信インターフェース2013を備える。コンピュータインターフェース2013は、例えばローカルエリアネットワークLAN2015、または他の通信ネットワーク2016例えば、インターネットへ接続される、ネットワークリンク2014へ接続する2方向データ通信を提供する。例えば、通信インターフェース2013は、任意のパケット交換LANへ取り付けるための、ネットワークインターフェースカードであり得る。別の例としては、通信インターフェース2013は、非対称型デジタル加入者回線ADSLカード、総合デジタル通信網ISDNカードまたはモデムであり得、対応タイプの通信回線へのデータ通信接続を提供する。ワイヤレスリンクもまた実施され得る。任意のこのような実施において、通信インターフェース2013は、種々のタイプの情報を示すデジタルデータストリームを運ぶ、電気、電磁気または光信号を送信および受信する。ネットワークリンク2014は、他のデータデバイスへの1以上のネットワークを介してのデータ通信を提供する。例えば、ネットワークリンク2014は、ローカルネットワーク2015例えば、LANを介してまたはサービスプロバイダによって操作される設備を介してこれは、通信ネットワーク2016を介して通信サービスを提供する別のコンピュータへの接続を提供し得る。ローカルネットワーク2014および通信ネットワーク2016は、例えば、デジタルデータストリームを運ぶ電気信号、電磁気信号、あるいは光信号、ならびに関連する物理的層例えば、CAT5ケーブル、同軸ケーブル、光ファイバーなどを使用する。種々のネットワークを介しての信号ならびにネットワークリンク2014上および通信インターフェース2013これはコンピュータシステム2001へおよびここからデジタルデータを運ぶを介しての信号は、ベースバンド信号、あるいは搬送波に基づいた信号で実行されるかもしれない。ベースバンド信号は、デジタルデータビットの流れを描写している未調節の電気パルスとしてデジタルデータを伝え、ここで、用語ビットは、シンボルを意味するために広く解釈され、ここで、各シンボルは、少なくとも1またはそれ以上の情報ビットを伝える。デジタルデータはまた、伝導媒体上を伝播される、振幅、位相、周波数偏移変調信号frequencyshiftkeyedsignalsなどで、搬送波を調節するために使用され得、または伝播媒体を介して電磁波として伝送され得る。したがって、デジタルデータは、有線通信チャネルを介して未調節ベースバンドデータとして送信されてもよく、および/または、搬送波を調節することにより、ベースバンドとは異なる所定の周波数帯内で送信されてもよい。コンピュータシステム2001は、ネットワーク2015および2016、ネットワークリンク2014、ならびに通信インターフェース2013を介して、プログラムコードを含むデータを伝送および受信し得る。さらに、ネットワークリンク2014は、LAN2015を介してモバイルデバイス2017、例えばパーソナルデジタルアシスタントPDAラップトップコンピュータ、または携帯電話へ、接続を提供し得る。本発明の特定の実施形態のシステムは、ハードウエア、ソフトウエア、ファームウエア、またはそれらの組合せで実施され得る。好ましい実施形態において、該システムは、メモリ中に保存されるおよび好適な命令実行システムによって実行されるソフトウエアにおいて実施される。ハードウエアにおいて実施される場合、代替の実施形態においてのように、該システムは、当該分野において全て周知である、任意の技術で実施され得る。フローチャート中のプロセス記載またはブロックは、該プロセスにおける特定の論理関数またはステップを実施するための1以上の実行可能な命令を含む、モジュール、セグメント、またはコードの一部を示すとして理解されるべきであり、そして代替の実施は本発明の好ましい実施形態の範囲内に含まれ、ここで、機能は、本発明の当業者によって理解されるように、含まれる機能性に依存して、実質的に同時にまたは逆の順序を含む、示されるまたは議論されるものと順序が異なって実行され得る。本発明の上述の実施形態、特に、任意の好ましい実施形態は、本発明の原理の明確な理解のために単に記載された、単に可能な実施の例であることが強調されるべきである。多くの改変および修飾が、本発明の精神および原則を実質的に逸脱することなく、本発明の上述の実施形態に対して行われ得る。このような修飾および改変の全てが、本開示および本発明の範囲内で本明細書中に含まれ、そして下記の特許請求の範囲によって記載されることが意図される。"