"心血管系イベントを発症するリスクの指標となるバイオマーカーが被験体からのエキソソーム中に存在することを判定するステップを含む、心血管系イベントを発症する被験体のリスクを予測する方法。前記エキソソームが、血清、血漿、血液、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳および唾液から選択される体液、特に血清から単離される請求項1に記載の方法。前記バイオマーカーが、ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択される請求項1または請求項2に記載の方法。前記バイオマーカーが、ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択される2つ以上のタンパク質の任意の組み合せである請求項3に記載の方法。前記心血管系イベントが、血管死もしくは突然死、致死性もしくは非致死性の脳卒中、致死性もしくは非致死性の心筋梗塞、腹部大動脈瘤の致死性もしくは非致死性の破裂、開腹術によって確認された腹部大動脈瘤破裂、血管インターベンション、冠動脈疾患、一過性脳虚血発作TIA、末梢動脈疾患、急性冠動脈症候群、心不全もしくは頸動脈、冠動脈、および大腿動脈もしくは他の動脈の再狭窄から選択される請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。請求項3または4に記載されたバイオマーカーの存在を検出するための手段を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載された方法を実施するためのキット。前記バイオマーカーの存在を検出するための手段が、抗体、抗体断片または抗体誘導体であり、場合により検出可能な標識を含む請求項6に記載のキット。請求項1~5のいずれかに記載の方法においてバイオマーカーを検出するための手段を用いるための試薬および/または使用説明書をさらに含む請求項6または7に記載のキット。ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択されるタンパク質を含む、心血管系イベントを発症する被験体のリスクの予後において使用するためのバイオマーカー。ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択される2つ以上のタンパク質を組み合わせを含む請求項9に記載のバイオマーカー。心血管系イベントを発症する被験体のリスクの予後をするために、該被験体のエキソソーム中で検出される請求項9または10に記載のバイオマーカー。本発明によれば、原則として、いかなる予後的価値のあるバイオマーカーを用いることもできる。しかし、具体的には、特異的なマーカーが、二次的心血管系イベントについて予測価値をもつ血漿エキソソームの中で同定された。したがって、一つの実施形態において、本発明は、心血管系イベントを発症する被験体のリスクを予測する方法であって、該被験体からのエキソソーム試料またはその他サイズの大小を問わない微小胞においてバイオマーカーを検出するステップを含み、該バイオマーカーが、以下の6種類のタンパク質:ビトロネクチンIPI:IPI00298971,SWISSPROT:VTNC_HUMAN、セルピンF2IPI:IPI00879231,SWISSPROT:A2AP_HUMAN、CD14IPI:IPI00029260,SWISSPROT:CD14_HUMAN、シスタチンCIPI:IPI00032293,SWISSPROT:CYTC_HUMAN、プラスミノーゲンIPI:IPI00019580,SWISSPROT:PLMN_HUMAN、およびナイドジェン2IPI:IPI00028908,SWISSPROT:NID2_HUMANからなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質を含む方法を提供する。本明細書で括弧内に開示されたIPI番号は、2010年12月4日にまとめられた国際タンパク質インデックスhttp://www.ebi.ac.uk/IPIを意味し、その後ろに2010年11月30日にまとめられたSwissprotデータベースのエントリ名が記載されている。本明細書において参照されているインデックス番号データベースのアクセッション番号は、それらの断片、アイソフォームおよび修飾型への言及を含むものであり、したがって、本発明は、本発明の様々な態様に関連してバイオマーカーとして本明細書に開示されているタンパク質の断片ならびに修飾型および誘導体の使用を予見している。本発明によれば、バイオマーカーは、1種類のタンパク質または一組の複数のタンパク質を含む。このようなバイオマーカーは、本明細書において、プロファイルまたはタンパク質プロファイルとしても同定されている。プロファイルは、タンパク質:ビトロネクチンIPI:IPI00298971,SWISSPROT:VTNC_HUMAN、セルピンF2IPI:IPI00879231,SWISSPROT:A2AP_HUMAN、CD14IPI:IPI00029260,SWISSPROT:CD14_HUMAN、シスタチンCIPI:IPI00032293,SWISSPROT:CYTC_HUMAN、プラスミノーゲンIPI:IPI00019580,SWISSPROT:PLMN_HUMAN、およびナイドジェン2IPI:IPI00028908,SWISSPROT:NID2_HUMANの1種類、2種類、または3、4、5、6種類等の2種類超を含む。本発明によれば、任意の数および任意の組み合せのこれらのタンパク質を含むプロファイルを使用することができる。当業者は、完全なバイオマーカータンパク質を検出する代わりに、それらを断片化することによって、バイオマーカータンパク質から由来するバイオマーカータンパク質のペプチド断片を検出してもよいことを理解する。本明細書においてペプチド断片という用語は、5個と50個の間のアミノ酸をもつペプチドを意味する。これらのペプチド断片は、好ましくは、該タンパク質のユニークなアミノ酸配列を提供し、本明細書に開示されている心血管系イベントに関連している。タンパク質および/またはペプチド断片は、場合により、化学的に修飾されたタンパク質および/またはペプチドとして検出してもよいが、このような化学的修飾は、例えば、グリコシル化、酸化、永久的なリン酸化、還元、ミリスチル化、硫酸化、アシル化、アセチル化、ADPリボシル化、アミド化、ヒドロキシル化、ヨード化、およびメチル化からなる群から選択することができる。数多くの可能なタンパク質修飾が、http://www.ebi.ac.uk/RESIDのRESIDデータベース2010年12月2日リリースGaravelli,J.S.2004TheRESIDDatabaseofProteinModificationsasaresourceandannotationtool;Proteomics4:1527-1533およびFarriol-Mathis,N.,Garavelli,J.S.,Boeckmann,B.,Duvaud,S.,Gasteiger,E.,Gateau,A.,Veuthey,A.,Bairoch,A.2004Annotationofpost-translationalmodificationsintheSwiss-Protknowledgebase.Proteomics46:1537-50に記載されている。当業者は、これらの修飾についてよく認識している。本発明の好適な実施形態において、バイオマーカータンパク質またはそのペプチド断片は、好ましくは血清、血漿または血液のような体液中に存在するエキソソームまたはそれよりも幾分大きいか小さいサイズの他の小胞の中で検出される。あるいは、尿、羊水、悪性腹水、気管支肺胞洗浄液、滑液、母乳および唾液等の他の体液からのエキソソームまたはその他の小胞を用いることもできる。本出願において、エキソソームという用語は、約50nmよりも小さいか、または100nmよりも大きいが、約20から約500nmの範囲内に含まれる他の小胞を含むよう意図されている。本発明によれば、予測される心血管系イベントは、好ましくは以下の症状:血管死もしくは突然死、致死性もしくは非致死性の脳卒中、致死性もしくは非致死性の心筋梗塞、腹部大動脈瘤の致死性もしくは非致死性の破裂、開腹術によって確認された腹部大動脈瘤破裂、血管インターベンション、冠動脈疾患、一過性脳虚血発作TIA、末梢動脈疾患、急性冠動脈症候群、心不全もしくは頸動脈、冠動脈、大腿動脈もしくは他の動脈の再狭窄から選択される。本発明の方法は、リスクの層別化および/または患者の選択例えば臨床試験用のため、病気を観察するために適切に用いることができ、マーカーは、安全試験および効能試験用の臨床用バイオマーカー例えば、代用エンドポイントマーカーとして使用することができる。本発明は、さらに、本方法を実施するためのキットであって、上記に記載したようなバイオマーカーの存在を検出するための手段を含むキットに関係する。バイオマーカーの存在を検出するための手段は、好ましくは抗体、抗体断片もしくは抗体誘導体であり、または質量分析法およびフローサイトメトリーによる。抗体を利用する検出手段は、検出可能な標識を場合により含む。本発明のキットは、被験体のエキソソーム中のバイオマーカーの存在を判定することによって、心血管系イベントを発症する被験体のリスクを予測する方法に使用されることを意図している。したがって、本キットは、そのような方法においてバイオマーカーを検出するための手段を用いるための試薬および/または使用説明書をさらに含むことができる。本発明は、心血管系イベントを発症する被験体のリスクの予後において使用するためのバイオマーカーであって、ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択されるタンパク質を含むバイオマーカーに関係する。さらなる実施形態において、バイオマーカーは、ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲンおよびナイドジェン2から選択される2種類以上のタンパク質の組み合わせを含む。心血管系イベントは、未だ心血管系イベントを経験したことのない被験体における初期イベントであってもよいが、特には、そのようなイベントを既に以前経験したことのある被験体において生じる二次的イベントである。本発明によれば、心血管系イベントを既に以前経験したことがあって、さらなるイベントを経験するリスクをもつ患者と、そのようなイベントを既に有し、さらなるイベントを経験する高いリスクがない患者とを区別することが可能である。適切には、予後は、エキソソームを試料として、好ましくは、ビトロネクチン、セルピンF2、CD14、シスタチンC、プラスミノーゲン、ナイドジェン2またはこれらの任意の組合せを含むバイオマーカーを検出すべきタンパク質として用いて行われる。本発明を以下に続く実施例でさらに具体的に説明するが、実施例は、本発明を限定しようとするものでは全くない。以下の図を参照する。[実施例1]追跡調査を伴うヒト血漿エキソソームに関する定量的プロテオミクス<研究対象集団および研究デザイン>Athero-Expressは、縦断的な血管バイオバンク研究であり、オランダの2つの病院UMCユトレヒトおよび聖アントニウス病院ニューウェハインで頸動脈と大腿動脈の動脈内膜切除を受けた患者からの生体材料を含んでいる。今のところ約2000人の患者が含まれている。血漿および組織の試料を、動脈内膜切除の前血液または最中にすべての患者から採取した。すべての患者が、外科的介入の1年後に臨床追跡調査を受け、手術の1年後、2年後および3年後に郵送によるアンケートに答えた。患者がアンケートに答えなかった場合には、一般開業医が電話で連絡を取った。転帰イベントの判定は、検査結果を見ることができない独立した転帰イベント委員会によって行われた。委員会の2人のメンバーが独立して、すべてのエンドポイントを評価した。一致しない場合には、第三者の意見をもらった。<エキソソームのプロテオーム>追跡調査期間中に冠動脈イベントを経験した50人の患者、および追跡調査期間中二次的イベントを経験しなかった50人の年齢および性別が一致する対照患者からの血漿試料を別々にプールして、ろ過分離および超遠心分離によってエキソソームを単離した。定量的プロテオミクスを用いて、エキソソームタンパク質含有量を確認し、追跡調査期間中イベントを経験した患者からのプロテオームの発現レベルを、対照患者のプロテオームと比較した。エキソソームは、凍結したヒト血漿から、ろ過分離およびその後の超遠心分離によって単離したMarie-PierreCabyetal.Exosomal-likevesiclesarepresentinhumanbloodplasma;InternationalImmunology,Vol.17,No.7,pp.879-887参照。CD9およびCD81等の一般的なエキソソームタンパク質は、ウエスタンブロッティング法を用いてエキソソームペレットの中で検出した。規定されたサイズのビーズによるFACS分析によって、ペレットは、ほとんどがエキソソームの大きさと一致する50~100nmの粒子を含んでいることが示された。タンパク質の抽出と分解Athero-Expressバイオバンクの血漿に集められていたエキソソームペレットは、超遠心分離後、40μlのHPLC用純水中6SDSに溶解された。血液残渣を含まないプラーク材を磨砕して粉末にした後、プラークタンパク質も6SDSで抽出した。分解、その後の標識、HPLC分離および質量分析は、プラークタンパク質およびエキソソームタンパク質に対して同じであった。タンパク質の含有量は、2-DQuantキットによって測定した。タンパク質を還元およびアルキル化した後、タンパク質混合液を50mM重炭酸トリエチルアンモニウムTEABで20倍に希釈し、トリプシンを、トリプシン:タンパク質比1:40になるよう加えてタンパク質の分解を開始させた。タンパク質分解物をSep-PakC18カートリッジを用いて脱塩し、Speedvac内で乾燥させた。これらの分解物を、製造業者のプロトコール通りにiTRAQ試薬で標識した。手短に言えば、分解されたタンパク質を30μlの解離用緩衝液で再構成し、70μlのエタノール懸濁iTRAQ試薬タンパク質試料あたり1種類のiTRAQレポータータグ、質量タグ114~117ダルトンと混合した。標識反応を室温にて1時間行ってから、すべての試料を1個の試験官の中に混合し、Speedvacを用いて乾燥させた。<強陽イオン交換分画>混合したiTRAQ標識試料を200μlの緩衝液A10mMKH2PO4、pH3.0、25v/vアセトニトリルで再構成し、ShimazuprominenceHPLC装置に搭載したポリスルホエチルAカラム長さ200mm×内径4.6mm、孔径200Å、粒子サイズ5μmに入れた。試料を、100緩衝液Aで5分間、5~30緩衝液B10mMKH2PO4、pH3.0、500mMKClおよび25v/vアセトニトリルで40分間、30~100緩衝液Bで5分間、および最後に100緩衝液Bで5分間という勾配を用い、一定流速1ml/分にて全部で60分間分画した。溶離画分を、214nm波長のUV検出装置でモニターした。画分を1分間隔で集め、ピーク強度の低い連続画分はまとめた。最終的には、全部で20個の画分を得て、Speedvacで乾燥させた。各画分を0.1トリフルオロ酢酸で再構成させて脱塩した。脱塩した試料をSpeedvacで乾燥させ、質量分析を行うまで-20°Cで保存した。<Q-STARを用いた質量分析>乾燥させた画分を100μlの0.1ギ酸で再構成させた。各試料を、オンラインのShimazuprominenceHPLC装置に結合させたQ-StarElite質量分析装置で2回分析した。各分析につき、50μlのペプチド混合液を注入し、ピコフリットナノスプレイチップ付きの自家充填したナノ孔をもつC18カラム内径75μm×15cm、5μmの粒子上で分離した。この分離は、流速20μl/分で、90分間勾配のスプリッターを用いて行った。質量分析装置は、陽イオンモードにて、300~2000m/zの選択質量範囲でデータ取得を行うよう設定した。2から4の荷電状態をもつペプチドをMS/MS用に選択し、MS/MSイベントの加重時間を2秒に設定した。計測閾値5を上回る3種類の最も多く荷電したペプチドをMS/MS用に選択し、±30mmu質量許容誤差で30秒間動的に排除した。ペプチドの定量およびタンパク質の同定を、ProteinPilotソフトウエアv2.0.1を用いて、2回の分析をまとめたデータを国際タンパク質インデックスIPIヒトデータベース2009年12月19日にまとめられたものに対して検索することにより行った。ProteinPilotソフトウエアのパラゴンParagonアルゴリズムを用い、それによってトリプシンを、分解剤としておよびメチルエタンチオスルホネートのシステイン修飾として選択した。報告されたすべてのタンパク質は、0.05よりも低い期待値を有していた使用されないスコアは1.3である。追跡調査期間中に冠動脈イベントを経験した50人の患者グループ1および追跡調査期間中二次的イベントを経験しなかった50人の対応する対照患者グループ2からのエキソソームに対して定量的プロテオミクスを行った。同じiTraq実験を各グループ2回ずつ行い、2つのイベントプロテオームと2つの対照プロテオームのデータを明らかにした。試料内で2148個の異なったタンパク質を同定したが、前にエキソソームプロテオミクスで同定された数多くのタンパク質、例えばCD9、CD81、アネキシン、クラスリン重鎖、エノラーゼ1および他多数を含んでいたOlverC,VidalM.Proteomicanalysisofsecretedexosomes.SubcellBiochem.2007;43:99-131。<エキソソームプロテオミクスの結果>そして、定量的iTRAQデータを用いて、グループ1および2を比較した。定量的データは、2つのプールしたイベント試料2回反復したグループ1および2つのプールした対照試料2回反復したグループ2から入手することができた。パイロット試験に基づいて、割合が1.2以上であるときは、イベントに有意に高いレベルのタンパク質があることを意味し、一方、0.8以下の割合では、イベントに有意に低いレベルのタンパク質があることを意味するものと判定された。最初の選抜は、同じ反復を示したどちらも0.8未満、どちらも1.2超過またはどちらも0.8と1.2の間タンパク質を元にした。2回目の選抜は、グループ1対グループ2で低いイベント/対照<0.8または高いイベント/対照>1.2発現を示すタンパク質を元にした。これによって、116種類のタンパク質のリストが明らかになった。この116種類のタンパク質のリストをアップロードして、IngenuityPathwayAnalysisソフトウエアバージョン8.0で分析した。この116種類のタンパク質から102種類のタンパク質がIngenuityデータベースに入っていた。これによって、102種類のタンパク質が、膜貫通型受容体、輸送体、および転写調節因子等、血漿には存在しないタンパク質を含む、異なった種類のタンパク質であることが明らかになった。Ingenuity分析は、これら102種類のタンパク質においては、以下の3つの標準経路が有意に過剰提示されていることも明らかにした:1.急性期応答シグナル伝達p=3.510-112.凝固系p=3.610-113.アテローム性動脈硬化シグナル伝達p=310-4。その後、この102種類の示差的発現タンパク質のグループを、プラーク材由来タンパク質の選抜によって補い、最終的に34種類の選抜されたエキソソーム由来およびプラーク由来のタンパク質をまとめたセットに絞って、さらに各患者試料のエキソソーム試料で検証を行った。<プラークタンパク質プロテオミクスの結果>Athero-Expressコホートを用いて、40人の頸動脈内膜切除を受けた患者を選択したが、そのうち20人は、追跡調査期間中に二次的心血管系イベントを経験し、20人は、追跡調査期間中に二次的イベントを経験しなかった年齢、性別および追跡調査期間が一致する対照患者であった。エキソソームプロテオミクスについては、プラーク試料の定量的プロテオミクスを行った。しかし、40個の各プラークを分析したため、iTraq試薬によって異なった標識を付けられた4つのプラーク抽出物を同時に分析したそれぞれ114、115、116、117。各回は、心血管系イベントを経験した患者の2つのプラーク抽出物と、各患者と性別および年齢が一致する対照について、イベントおよび対照の2組における全部で4つのプラーク抽出物からなっていた。調査の後、タンパク質IDと、タンパク質IDごとに2組のイベント/対照の相対値を含むエクセルファイルを作成した。20組のイベントと適合する対照とで全部で40人の患者を含む10回の分析を行った。エクセル2007をMergeTableAdd-inとともに用いて、タンパク質IDの全リストを作成した。異なった回の間における標準化を全ペプチド面積補正によって行った。イベントを対照と比較する統計的分析を、Mann-Whitney検定を用いて行ったところ、プラーク中でイベントと対照間で有意に異なるP<0.05264種類のタンパク質が明らかになった。<エキソソームおよびプラークに由来するタンパク質の選抜>プラークは、心血管系イベントをもたらすアテローム性動脈硬化症の元となる。このため、将来起こる心血管系イベントに関係したプラークタンパク質、特に、心血管系イベントと対照との間で異なるエキソソームタンパク質において過剰提示される経路に関係するプラークタンパク質もエキソソームの中に見出すことができる可能性が非常に高い。3つの標準経路急性期、凝固およびアテローム性動脈硬化がエキソソームで過剰提示されていることを確認した上で、イベントと対照間で示差的に発現されるプラークタンパク質を含む264種類のタンパク質データセットを2つの方法で調べた。選抜は、3つのアテローム性動脈硬化症関連標準経路に関連するタンパク質の存在に基づき、それらについて、2種類の抗体および1つの組み換えタンパク質を利用することができた。また、112種類のエキソソーム由来タンパク質から、3つのアテローム性動脈硬化症関連標準経路の過剰提示、ならびに2種類の抗体および1つの組み換えタンパク質の利用可能性に基づいてマーカーを選択した。この抗体および組み換えタンパク質を利用することができた選択されたプラークタンパク質およびエキソソームタンパク質から、34種類のタンパク質をLuminexビーズ測定法開発のために選んだ。これらの34種類のタンパク質のうちの17種類について、各血清試料から単離されたエキソソームにおけるタンパク質含有量を測定するために使用することができる再現可能で定量的なLuminexビーズ測定法を用意した。[実施例2]各Athero-Express患者の血液試料における、概念研究を証明するために選抜されたタンパク質の確認<研究対象>本研究の目的は、各患者の血液試料中において、これら17種類のバイオマーカーのいずれが二次的冠状動脈イベントを患う患者と健康な対照との間で示差的に発現されるかを確認することである。<研究デザイン>本研究における患者は、初期脳血管イベント、すなわち脳卒中または一過性脳虚血発作TIAが原因で頸動脈の手術を受け、3年間の追跡調査を受けていた。二次的冠状動脈イベントを患う患者29試料および年齢と性別が一致する対照30試料の血液試料内で17種類のマーカーを測定した。二次的冠状動脈イベントは、心筋梗塞致死性または非致死性、心血管系死亡、突然死、冠動脈血管形成術、および冠動脈バイパス移植CABGであると定義された。<材料および方法>超遠心分離技術を用いてエキソソームを血漿から単離した。エキソソーム試料から抽出されたタンパク質を多重Luminexビーズ測定法で測定した。<統計的分析>統計ソフトウエアパッケージのPASWStatistics17.0.2SPSSInc,Chicago,Illinoisを用いて統計的分析を行った。区別そのモデルがいかにうまくイベントと対照を分離できるかの目安は、ほとんどの場合、バイオマーカーを評価するために確立された方法Hlatkyetal.AmericanHeartAssociationExpertPanelonSubclinicalAtheroscleroticDiseasesandEmergingRiskFactorsandtheStrokeCouncil.Criteriaforevaluationofnovelmarkersofcardiovascularrisk:ascientificstatementfromtheAmericanHeartAssociation.Circulation.2009May5;11917:2408-16である受信者動作特性ROC曲線の下の面積によって測定される。リスクスコアとともに、将来的に冠動脈イベントを起こす患者と起こさない患者とを区別するためにROC分析を行ってマーカーの能力を測定した。ROC分析では、具体的な試験の特異度と感度が、試験結果の様々なカットオフ値に対して付与される。図7は、公開されているROC曲線を表している。理想的な試験は、最適な感度と特異度をもち、1-特異度=0y軸になり、感度=1.0となる曲線太線参照を描く。何の値もない試験は黒い直線を描く。試験の識別力は、曲線の下の面積AUCとして規定されている。AUC値は、0.5区別なしと1.0完全な区別の間の範囲にある。統計的有意性をP=0.05に設定した。リスクスコアは、7つの従来からの心血管系リスク因子性別、年齢、コレステロール、収縮期血圧、喫煙状態、末梢動脈障害の履歴、および冠状動脈障害の履歴に基づいていた。<結果>病気を予測するための新しい試験を評価するときは、臨床分野で既に利用可能なリスク予測因子と比較しなければならない。この場合、これらは従来からあるリスク因子である上記統計的分析の項参照。したがって、従来からあるリスク因子だけのAUCを、従来からあるリスク因子新規バイオマーカーのAUCと比較した。こうすることで、新規バイオマーカーによってAUCの増加が説明される。リスクスコア単独のAUCは0.630P=0.093であることが分かった。リスクスコアとともに評価された18個のマーカーのうち6個がAUCの増加を示した:CD140.778P=0.001図1;セルピンF20.701P=0.009図2;シスタチンC0.677P=0.022図3;ビトロネクチン0.690P=0.014図4;プラスミノーゲン0.654P=0.046図5;およびナイドジェン20.686P=0.017図6。したがって、これら6種類のタンパク質は、心血管系イベントを将来経験する患者の信頼性のある予後を可能にするために、試験すべき試料としてのエキソソーム中におけるバイオマーカーとして特に有用である。"