シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をモノオキシゲナーゼとして機能させ、置換基を有するステロイド化合物に作用させてステロイド骨格のD環16α位に水酸基を導入することを特徴とする16α位が水酸化されたステロイド化合物の製造方法。CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、置換基を有するステロイド化合物とを共存させることにより、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を、該置換基を有するステロイド化合物に作用させる請求項1に記載の製造方法。置換基を有するステロイド化合物が、下記一般式1上記式中、R1~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-は、以下のAまたはBである;AR1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基、アセトキシ基またはオキソ基であり、R3は、水酸基、アセチル基、ヒドロキシメチルカルボニル基、アセトキシメチルカルボニル基、2ヒドロキシエチル基、12-ジヒドロキシエチル基またはヒドロキシメチルカルボニル基であり、R4は、水素またはメチル基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基である、または、BR3およびR4が一緒になってオキソ基であり、R1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基またはオキソ基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であるで表されるステロイド化合物であることを特徴とする請求項1または2に記載の製造方法。CYP154に属するタンパク質が以下のaまたはbである請求項1~3のいずれかに記載の製造方法。a配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドb配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチド融合型タンパク質が、CYP154に属するタンパク質と電子伝達タンパク質との融合型タンパク質である、請求項1~4のいずれかに記載の製造方法。融合型タンパク質が、CYP154に属するタンパク質と、電子伝達タンパク質であるロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ペプチドまたはそれと同等の機能を有する還元酵素ペプチドとの融合型タンパク質である、請求項1~5のいずれかに記載の製造方法。電子伝達タンパク質が以下のcまたはdのポリペプチドである請求項5または6に記載の製造方法。配列番号2記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチド形質転換体が、CYP154に属するタンパク質をコードする以下の~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする以下の~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌ベクターに挿入した組換えプラスミドを大腸菌に導入してなるものである請求項2~7のいずれかに記載の製造方法。配列番号3の塩基配列からなるDNA配列番号3のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA配列番号4の塩基配列からなるDNA配列番号4のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA本発明は、シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質、またはCYP154に属するタンパク質を合成させた大腸菌等の生きた細胞を用いて効率良く、置換基を有するステロイド化合物のD環16α位に位置選択的、かつ立体選択的に水酸基を導入する方法を提供することを主な課題とする。発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、細菌由来のP450のバイオコンバージョン技術への応用を目的として、新規の触媒機能を有するP450の探索を後述するように行った。研究を行う対象として、すでにゲノム情報が公開されている、放線菌ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来の27個のP450遺伝子を取得した。そして、これらのP450遺伝子の機能解析を、pREDベクター図1、特許文献1、非特許文献13および非特許文献14を用いて行った。pREDベクターは、上述したように、ロドコッカス属NCIMB9784株が保有するP450RhF非特許文献12が、一般的なP450とは異なる構造NADH鉄イオウタンパク質還元酵素領域と鉄イオウタンパク質領域とからなるP450還元酵素末端が、リンカー配列を介してP450タンパク質と一本のポリペプチド鎖として融合している構造を有することに着目して作製された。そして、pREDベクターは、T7プロモーターにより導入遺伝子の発現制御行うpET21aを元に、P450RhFのリンカー配列を含む還元酵素末端とP450遺伝子のクローニング部位としてNdeIとEcoRI部位を付与した異種由来P450の大腸菌用機能発現ベクター図1である。このpREDベクターに異種細菌由来のいくつかのP450遺伝子を連結し、大腸菌で機能解析することにより、既に該ベクターの汎用性が確認されている。その結果、新規の触媒機能を有するP450の探索過程において、CYP154に属するP450CYP154、例えば配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドSGR1085を用いると、置換基を有する種々のステロイド化合物のD環16α位に位置立体選択的に水酸基を導入できることを見出した。その産物には、16αヒドロキシ4プレグネン31120トリオン、16αヒドロキシアドレノステロンのように新規化合物も含まれていた。ステロイド化合物を生合成しない放線菌由来のP450がこのような触媒反応を担うというのは、全く予想外の知見であった。すなわち本発明者らは、以下の知見を得た。iCYP154に属するタンパク質またはこれを含む人工の融合型タンパク質をモノオキシゲナーゼとして機能させ、置換基を有するステロイド化合物に作用させることにより、このステロイド化合物のD環16α位に位置選択的、かつ立体選択的に水酸基を効率的に導入できる。上記の反応は、例えば、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質と、必要に応じて特に前者の場合CYP154に属するタンパク質に電子を伝達するタンパク質電子伝達タンパク質;レドックスパートナータンパク質とを共に発現する組換えベクターを導入した形質転換体をステロイド化合物に作用させることにより行うことができるが、従来のpREDベクターにCYP154に属するタンパク質をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターで大腸菌エシェリキアコリを形質転換した形質転換体を用いれば、水酸基導入反応が進行し易い。iii上記の反応は、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を発現する大腸菌等の生きた細胞を用いて行うことができるので、高価なNADPHまたはNADHの添加が不要で、また、反応の際に酵素を精製して使用する必要がなく、しかも反応後は遠心分離等により菌体を容易に除去することができることから、生成物の精製も容易である。このため、目的化合物を酵素法で安価で簡便に、しかも大量に製造することができる。本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の各項の新規なステロイド化合物の効率の良い製造方法を提供する。項1.シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をモノオキシゲナーゼとして機能させ、置換基を有するステロイド化合物に作用させてステロイド骨格のD環16α位に水酸基を導入することを特徴とする16α位が水酸化されたステロイド化合物の製造方法。項2.CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と、置換基を有するステロイド化合物とを共存させることにより、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を、該置換基を有するステロイド化合物に作用させる項1に記載の製造方法。項3.置換基を有するステロイド化合物が、下記一般式1上記式中、R1~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-は、以下のAまたはBである;AR1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基、アセトキシ基またはオキソ基であり、R3は、水酸基、アセチル基、ヒドロキシメチルカルボニル基、アセトキシメチルカルボニル基、2ヒドロキシエチル基、12-ジヒドロキシエチル基またはヒドロキシメチルカルボニル基であり、R4は、水素またはメチル基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基である、または、BR3およびR4が一緒になってオキソ基であり、R1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基またはオキソ基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であるで表されるステロイド化合物であることを特徴とする項1または2に記載の製造方法。項4.CYP154に属するタンパク質が以下のaまたはbである項1~3のいずれかに記載の製造方法。a配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドb配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチド項5.融合型タンパク質が、CYP154に属するタンパク質と電子伝達タンパク質との融合型タンパク質である、項1~4のいずれかに記載の製造方法。項6.融合型タンパク質が、CYP154に属するタンパク質と、電子伝達タンパク質であるロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ペプチドまたはそれと同等の機能を有する還元酵素ペプチドとの融合型タンパク質である、項1~5のいずれかに記載の製造方法。項7.電子伝達タンパク質が以下のcまたはdのポリペプチドである項5または6に記載の製造方法。配列番号2記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチド項8.形質転換体が、CYP154に属するタンパク質をコードする以下の~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする以下の~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌ベクターに挿入した組換えプラスミドを大腸菌に導入してなるものである項2~7のいずれかに記載の製造方法。配列番号3の塩基配列からなるDNA配列番号3のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA配列番号4の塩基配列からなるDNA配列番号4のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA本明細書中、シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質を、CYP154に属するタンパク質という。化学合成によりステロイド化合物のD環16α位に位置選択的、かつ立体選択的に水酸基を導入する場合、多工程反応、すなわち保護基の導入や脱離反応などを要する場合があり、高温高圧の過酷な条件、高価または危険な試薬、廃液処理などを要する場合もある。また、多工程でのカラムクロマト精製、副産物の生成に起因する問題がある。この点、本発明の方法は酵素を用いた反応であるため、安価な市販原料を用いて、1工程で、特異的に反応を進めることができる。さらに、CYP154に属するタンパク質を生産する大腸菌等の生きた細胞を用いて反応を行うことができるので、高価なNADPHまたはNADHの添加や酵素を精製する必要もなく簡便で、変換産物の大量製造も容易であるという優れた利点がある。また、酵素により反応を行うことから、温和な条件で反応を行うことができ、環境に悪影響を与える試薬を使用する必要がない、たいへん環境にやさしい製造方法である。従って、本発明によれば、代謝物解析や医薬品として有用であるステロイド化合物を、温和な条件下で簡便に、しかも効率よく大量に製造することができる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の16α位が水酸化されたステロイド化合物の製造方法は、シトクロムP450の1ファミリーであるCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をモノオキシゲナーゼとして機能させ、置換基を有するステロイド化合物原料基質に作用させて、置換基を有するステロイド化合物の酸化物を製造する方法である。より具体的には、本発明の16α位が水酸化されたステロイド化合物の製造方法においては、シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をモノオキシゲナーゼとして機能させ、置換基を有するステロイド化合物に作用させてステロイド骨格のD環16α位に水酸基を導入する。これにより、16α位が水酸化されたステロイド化合物を製造する。本発明の製造方法における原料基質には、種々の置換基を有するステロイド化合物を用いることができる。置換基を有するステロイド化合物本発明の製造方法において原料として用いられる置換基を有するステロイド化合物は特に限定されないが、ステロイド骨格シクロペンタヒドロフェナントレン骨格の16位に置換基を有さないものが好ましい。本発明の製造方法の原料基質には、例えば、下記一般式1で示される置換基を有するステロイド化合物が好適に用いられる。上記一般式1中、R1~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-は、以下のAまたはBである。AR1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基、アセトキシ基またはオキソ基であり、R3は、水酸基、アセチル基、ヒドロキシメチルカルボニル基、アセトキシメチルカルボニル基、2ヒドロキシエチル基、12-ジヒドロキシエチル基またはヒドロキシメチルカルボニル基であり、R4は、水素またはメチル基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基である。BR3およびR4が一緒になってオキソ基であり、R1は、水酸基、オキソ基またはアセトキシ基であり、R2は、水素、水酸基またはオキソ基であり、-A-A’-は、-CH2-CH2-または-CH=CH-であり、-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、-CH=C-CH2-または-CH=C-CHF-であり、R5は、水素、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基であり、R6は、メチル基、ヒドロキシメチル基、またはホルミル基である。中でも、本発明における置換基を有するステロイド化合物として、上記一般式1において、R1~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-が、上記Aの場合、R1~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-は、それぞれ以下であることが好ましい。R1は、水酸基、またはオキソ基であることが好ましい。R2は、水素、水酸基、またはオキソ基であることが好ましい。R3は、水酸基、アセチル基、ヒドロキシメチルカルボニル基、アセトキシメチルカルボニル基、またはヒドロキシメチルカルボニル基であることが好ましい。R4は、水素、またはメチル基であることが好ましい。R5は、メチル基であることが好ましい。R6は、メチル基であることが好ましい。-A-A’-は、-CH2CH2-、または-CH=CH-であることが好ましい。-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、または-CH=C-CH2-であることが好ましい。上記一般式Iにおいて、R1~R2、R5~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-が、上記Bの場合、R1~R2、R5~R6、-A-A’-、および-B-B’-B’’-は、それぞれ以下であることが好ましい。R1は、水酸基、またはオキソ基であることが好ましい。R2は、水素、またはオキソ基であることが好ましい。R5は、メチル基であることが好ましい。R6は、メチル基であることが好ましい。-A-A’-は、-CH2CH2-、または-CH=CH-であることが好ましい。-B-B’-B’’-は、-CH2-CH-CH2-、-CH2-C=CH-、または-CH=C-CH2-であることが好ましい。本発明の製造方法において、原料基質となる上記一般式Iで表される置換基を有するステロイド化合物は、例えば、14アンドロスタジエン317ジオン、11デヒドロコルチコステロン、11αヒドロキシプロゲステロン、11αヒドロキシプロゲステロンアセテート、11β21ジヒドロキシ320オキソ5βプレグナン18アール、11β21ジヒドロキシ5βプレグナン320ジオン、11βヒドロキシアンドロステ4エン317ジオン、11βヒドロキシプロゲステロン、17αメチルアンドロスタン17βオール3オン、18ヒドロキシコルチコステロン、19ヒドロキシアンドロステ4エン317ジオン19Hydroxyandrost4ene317dione、19ヒドロキシテストステロン、19ノルテストステロン、19オキソアンドロステ4エン317ジオン、19オキソテストステロン、1デヒドロ17αメチルテストステロン、20αヒドロキシ4プレグネン3オン、21ヒドロキシ5βプレグナン31120トリオン、21ヒドロキシプレグネノロン、3α11β21トリヒドロキシ20オキソ5βプレグナン18アール、3α20α21トリヒドロキシ5βプレグナン11オン、3α21ジヒドロキシ5βプレグナン1120ジオン、3αヒドロキシ5αプレグナン20オン、3αヒドロキシ5βアンドロスタン17オン、3αヒドロキシ5βプレグナン20オン、3β17βジヒドロキシ5アンドロステン、4プレグネン31120トリオン、5αアンドロスタン317ジオン、5αジヒドロデオキシコルチコステロン、5αプレグナン20αオール3オン、5αプレグナン320ジオン、5αプレグナン3α20αジオール、5βアンドロスタン317ジオン、5βジヒドロテストステロン、5βプレグナン320ジオン、5βプレグナン3α20αジオール、6αフルオロテストステロン、アドレノステロン、アルドステロン、アンドロスタン3α17βジオール、アンドロステロン、コルチコステロン、コルチコステロン21アセテート、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロンアセテート、デオキシコルチコステロン、デオキシコルチコステロンアセテート、ジヒドロテストステロン、メチルアンドロステンジオール、メチルテストステロンMethyltestosterone、プレグナンジオール、プレグネノロンPregnenolone、プレグネノロンアセテート、プロゲステロン、スタノロン、テストステロン、テトラヒドロコルチコステロン、Δ4アンドロステン317ジオン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の製造方法おいて、基質原料化合物となる置換基を有するステロイド化合物は、市販のものを利用しても良いし、従来から知られ、常用されている方法により製造して用いてもよい。本発明の製造方法においては、上記置換基を有するステロイド化合物のステロイド骨格D環の16α位に位置選択的、かつ立体選択的に水酸基を導入する。置換基を有するステロイド化合物のステロイド骨格D環の16α位に水酸基を導入するとは、ステロイド化合物を構成するD環の16α位の炭素原子に直接水酸基を導入することを意味する。バイオコンバージョン反応本発明の製造方法におけるバイオコンバージョン反応以下、反応と略称することがある。は、適当な溶液または溶媒中で、基質原料化合物とCYP154に属するタンパク質以下、CYP154タンパク質と略称することがある。またはこれを含む融合型タンパク質を、必要に応じてレドックスredox;酸化還元パートナータンパク質電子伝達タンパク質と共に反応させることにより行うことが好ましい。電子伝達タンパク質としては、フェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンが好ましい。CYP154タンパク質は、生物材料から単離して用いることもできる。単離したCYP154タンパク質としては、菌体のような生物材料の破砕物、抽出物、精製物などが挙げられる。単離したCYP154は適当な担体に固定化されたものであってもよい。この場合、酸化反応を触媒する電子伝達タンパク質であるフェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシンを、反応系に共存させることが好ましい。なお、CYP154タンパク質と、P450RhFロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの還元酵素末端のような電子伝達タンパク質とが融合したタンパク質融合型タンパク質を基質と反応させる場合は、別途フェレドキシンレダクターゼやフェレドキシンと共存させる必要は無い。CYP154タンパク質と電子伝達タンパク質とを共に反応させることにより、CYP154タンパク質はモノオキシゲナーゼとしてより効率よく機能する。また、P450ファミリータンパク質は不安定な酵素であるため、本発明における反応は、反応液中で、CYP154タンパク質を生産する細胞と基質とを接触ないしは共存させることにより行うことが好ましい。この反応は、CYP154タンパク質を生産する細胞の培養液中に基質を添加することにより行ってもよく、例えば緩衝液中でCYP154タンパク質を生産する細胞と基質とを共存させることにより行ってもよい。例えば、緩衝液バッファー中で、CYP154タンパク質を生産する細胞を、基質である置換基を有するステロイド化合物の存在下で攪拌または振とうすることにより16α位が水酸化されたステロイド化合物を効率よく製造することできる。CYP154タンパク質、およびこれを生産する細胞については、後に詳述する。以下、CYP154タンパク質を生産する細胞を用いた方法について説明する。なお、以下では例としてCYP154タンパク質を生産する細胞を用いた方法を説明するが、CYP154タンパク質を含む融合型タンパク質を生産する細胞を用いる場合も、同様である。反応は、回分反応や流加半回分反応などのバッチ方式;灌流反応などの連続反応方式のいずれでも行い得る。基質は一括、または連続的に添加し得る。反応条件は用いる細胞CYP154タンパク質を生産する微生物等の細胞、および基質原料化合物の種類によって適宜設定すればよいが、例えば、回分反応の場合は、反応液中の基質濃度は約0.1~10mMが好ましく、約0.5~3mMがより好ましい。反応液には、例えば、通常微生物の培養に使用される炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の液体培地、または緩衝液等を好適に用いることができる。好ましくは、リン酸バッファーなどの緩衝液を用いる。また、予め通常の培地等で培養したCYP154タンパク質を生産する微生物を用いて、緩衝液で反応を行うことが好ましい。緩衝液は、本発明の効果を奏することになる限り特に限定されず、リン酸バッファー、トリスバッファー等を使用することができる。また、非水溶性かつ液体の基質の場合は、CYP154タンパク質を生産する細胞を含む反応液に、基質を重層することができる。反応液のpHは約5~9が好ましく、約6~8がより好ましい。また、反応は、通常、約20~40°C、好ましくは約20~30°Cで行えばよい。反応時間は、通常約12~48時間行えばよい。反応中は、反応液を適宜撹拌又は振とうすることが好ましい。流加半回分反応や連続反応の場合は、回分反応の条件に準じて条件を設定すればよい。上記範囲であれば、基質から16α位が水酸化された目的物への変換率が高く、かつ精製が容易となる。生成した16α位が水酸化されたステロイド化合物は、通常、反応液中に蓄積する。例えば、CYP154タンパク質を生産する微生物として、後述する大腸菌に上記遺伝子を導入してなる形質転換体を用いる場合、基質存在下での反応は、好気条件下で行うことが好ましい。反応生成物変換産物バイオコンンバージョン反応で生じた16α位に水酸基を有するステロイド化合物は、常法により精製され得る。例えば、必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで一般的な抽出溶剤、例えば酢酸エチル、クロロホルム、メタノール等の有機溶剤で抽出する。次いで、有機溶剤を減圧下で除去し、そして減圧蒸留、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂、または吸着性樹脂等の処理を行うことにより精製され得る。シトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質本発明におけるシトクロムP450のファミリー154CYP154に属するタンパク質は、モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である。好ましくは、本発明におけるCYP154に属するタンパク質は、ステロイド骨格のD環16α位に選択的に一酸素原子を添加するモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である。前記CYP154に属するタンパク質としては、例えば、ストレプトマイセス属、ノカルディアNocardia属、サーモビフィーダThermobifida属、ノカルディオプシスNocardiopsis属等に属する細菌が生産するCYP154タンパク質が挙げられる。具体的には、例えば、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154CYP154;DNA配列は、NCBIにおいて、アクセッション番号AP009493で登録されている;CYP154のアミノ酸配列を、配列番号1に示す、ノカルディアフランシニカNocardiafarcinicaIFM10152株由来のCYP154HDNA配列は、NCBIにおいて、アクセッション番号AP006618で登録されている、ストレプトマイセスロゼオスポラスStreptomycesroseosporusNRRL15998株由来のCYP154HDNA配列は、NCBIにおいて、アクセッション番号ZP04697453で登録されている等が好適に使用される。中でも、本発明におけるCYP154タンパク質としては、配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。また、配列番号1のアミノ酸配列において1もしくは複数個複数個とは、例えば約2~20個、好ましくは約2~10個、より好ましくは約2~7個、さらに好ましくは約2~5個、特に好ましくは約2~3個、最も好ましくは約2個、以下同様である。のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドも好ましく使用できる。配列番号1のポリペプチドは、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154であり、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株の培養物から単離することができる。また、配列番号1に基づき化学合成することもできる。のポリペプチドに基づきのポリペプチドを得る方法について述べれば、生物学的機能を喪失しない改変は、例えば、得られるタンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性/疎水性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され;セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され;フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され;リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され;アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。モノオキシゲナーゼ活性は、酸素分子を還元して1分子の水を作るとともに、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換する反応を触媒する活性を意味する。本明細書中、シトクロムP450として機能するポリペプチドとは、該ポリペプチドに溶液中で還元状態で一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し450nmに極大をもつ差スペクトルCO差スペクトルが現れることを意味する。また、本発明におけるシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドとは、好ましくはステロイド骨格のD環16α位に選択的に一酸素原子を添加するモノオキシゲナーゼ活性を有するものであるが、より好ましくは、該ポリペプチドと共に後述する電子伝達タンパク質が存在する場合に、ステロイド骨格のD環16α位に一酸素原子を添加するモノオキシゲナーゼ活性を発揮するものである。また、CYP154タンパク質を含む融合型タンパク質としては、例えば、CYP154タンパク質と電子伝達タンパク質レドックス配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本発明においては、また、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFに含まれる還元酵素ペプチドと同等の還元酵素活性を有するペプチドとして、配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドも好ましく用いることができる。ポリペプチドが還元酵素活性を有することは、基質が知られた既知のP450と該ポリペプチドの融合型タンパク質を作り、実際に反応生成物が生じるかどうかを確かめることで確認することができる。配列番号2のポリペプチドは、ロドコッカス属NCIMB9784株の培養物から単離することにより得られる。また、化学合成によっても得られる。例えば、のポリペプチドの生物活性を保持しつつ配列を改変してのポリペプチドを得る方法は、前述したのポリペプチドに基づきのポリペプチドを得る方法と同様である。CYP154タンパク質と還元酵素ペプチドとの間には、リンカーペプチドを介在させることができる。通常は、CYP154タンパク質のC末端側にリンカーペプチドを介して還元酵素ペプチドが結合していればよい。リンカーペプチドの長さは、CYP154タンパク質と還元酵素ペプチドとで効率良く反応を進める上で、約6~60アミノ酸とすることが好ましく、より好ましくは14~40アミノ酸前後とする。リンカーペプチドの配列は、特に限定されないが、例えば、VLHRHQPVTIGEPAAR配列番号5等が好ましい。これらのモノオキシゲナーゼCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質は、自然界に存在する微生物等から抽出しても良いし、アミノ酸配列に基づき化学合成してもよい。前記融合型タンパク質は、通常、遺伝子工学的手法により人工的に作製される。また、後述する本発明の形質転換体から単離、精製しても良い。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で大腸菌の形質転換体等から抽出液を調製し、この抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。組換えベクターCYP154タンパク質またはそれを含む融合型タンパク質を生産する細胞は、これらをコードするDNAを含む組換えベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体であることが好ましい。すなわち本発明においては、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体と置換基を有するステロイド化合物とを共存させることにより、CYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を、該置換基を有するステロイド化合物に作用させることが好ましい。このようにCYP154タンパク質を高発現する形質転換体を用いることにより、効率よく反応を行うことができる。上記組換えベクターは、適当なベクターDNAに、本発明におけるモノオキシゲナーゼ活性を有するCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質をコードするDNAを公知の遺伝子工学的手法を用いて連結することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なもので、宿主中で目的タンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、公知のベクターを宿主に応じて広い範囲から選択することができる。例えば、ファージ、ファージミドベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、大腸菌エシェリキアコリ由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。細菌細胞は生育が容易で反応を行い易いため、細菌由来のベクターが好ましく、大腸菌由来のベクターがより好ましい。大腸菌由来のベクターとしては、pUC系ベクター、pTTQベクターやpETベクターが好ましい。中でも、pETベクターが好ましい形質転換体においてCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を高発現させるためには、プロモーターおよび翻訳シグナルの選択が重要である。プロモーターは、宿主中で機能できるものであればよいが、例えば、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーターなどが挙げられる。中でも、lacプロモーターやT7プロモーターを用いることにより、CYP154タンパク質を高発現させることができる。より好ましくは、T7プロモーターを用いる。翻訳シグナルも宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよいが、例えば、pUC系ベクターLacZの翻訳シグナル、pET系ベクターの翻訳シグナルなどが挙げられる。中でも、CYP154タンパク質を高発現させることができる点で、pET系ベクターの翻訳シグナルが好ましい。組換えベクターで最も好ましいのは、例えば、モノオキシゲナーゼ活性を有するCYP154タンパク質に属するタンパク質をコードするDNAの3’末端に、リンカーを介して、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFの還元酵素ペプチドドメインまたはこれと同等の機能を有する還元酵素ペプチドをコードするDNAを連結した融合型タンパク質発現カセットを、T7プロモーターとpET系ベクターのシグナルとを利用するようにpET系ベクターに挿入したCYP154遺伝子機能発現用プラスミドである。CYP154に属するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号3の塩基配列からなるDNA、配列番号3の塩基配列からなるDNA配列番号3のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA、配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつシトクロムP450モノオキシゲナーゼとして機能するポリペプチドをコードするDNA等が好ましい。また、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼP450RhFの還元酵素ペプチドドメインまたはこれと同等の機能を有する還元酵素ペプチドをコードするDNAとしては、配列番号4の塩基配列からなるDNA、配列番号4の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ還元酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA、配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA等が好ましい。配列番号3の塩基配列は、配列番号1のポリペプチドをコードするDNA配列であり、配列番号4の塩基配列は、配列番号2のポリペプチドをコードするDNA配列である。配列番号3の塩基配列からなるDNAは、例えば、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株のゲノムDNAライブラリーから、配列番号3に基づき設計したプローブを用いたハイブリダイゼーションや、配列番号3に基づき設計したプライマーを用いて、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株のゲノムDNAを鋳型としたPCRなどにより得ることが出来る。また、化学合成によっても得られる。配列番号4の塩基配列からなるDNAは、例えばロドコッカス属細菌のゲノムDNAまたはそのライブラリーを用いて、配列番号3のDNAの場合と同様にして得ることができる。また化学合成することもできる。また、のDNAの改変によりまたはの遺伝子を得る方法、およびのDNAの改変によりまたはの遺伝子を得る方法としては、例えば、またはのDNA配列を基に化学合成する方法、またはのDNAにγ線を照射する方法、またはのDNAを鋳型として用いたエラープローンPCRを行なう方法等の一般的な方法が挙げられる。CYP154タンパク質をコードする上記~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする上記~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質発現カセットを、T7プロモーターとpET系ベクターの翻訳シグナルを利用するようにpET系ベクターに挿入した組換えベクターは、本発明における好ましい実施態様の1つである。本発明において、あるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、例えばMolecularCloningALaboratoryManual、05SDSおよび50ホルムアミドの溶液中において42°Cで一夜加温した後、01×SSC、05SDSの溶液中において68°Cで30分間洗浄した場合にそのポリヌクレオチドから脱離しない条件が挙げられる。より好ましいストリンジェントな条件とは、好ましくは約90以上、さらに好ましくは約95以上、特に好ましくは約98以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。このようなストリンジェントな条件については、上記MolecularCloning、特に1145節ConditionsforHybridizationofOligonucleotideProbesに記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。なお、本発明において、あるDNA、例えば、配列番号3の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAは、配列番号3の塩基配列からなるDNAの塩基配列と約90以上の配列相同性を有することが好ましく、約95以上の配列相同性を有することがより好ましく、約98以上の配列相同性を有することが特に好ましい。形質転換体本発明における形質転換体は、CYP154タンパク質と、電子伝達タンパク質との融合型タンパク質をコードする遺伝子を導入したものであることが好ましい。形質転換体は、CYP154タンパク質をコードする上記~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする上記~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質をコードする遺伝子を、上述したベクターに挿入した組換えプラスミドを宿主に導入してなるものであることがより好ましい。CYP154タンパク質をコードする遺伝子は、より好ましくは上記の遺伝子である。還元酵素ペプチドをコードする遺伝子は、より好ましくは上記の遺伝子である。また、好ましい態様においては、CYP154に属するタンパク質をコードする上記~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする上記~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌ベクターに挿入した組換えプラスミドを大腸菌に導入してなる形質転換体を用いる。組換えプラスミドとしては、上記~のいずれかのDNAの3’末端側に、リンカーを介して、還元酵素ペプチドをコードする上記~のいずれかのDNAを連結した融合型タンパク質発現カセットを、T7プロモーターとpET系ベクターの翻訳シグナルを利用するようにpET系ベクターに挿入した組換えベクターが特に好ましい。上記形質転換体は、上記の組換えベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、細菌に導入する方法であれば、例えば、カルシウムイオンを用いる方法Coheneta1ProcNat1AcadSciUSA6921101972、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、酵母へ導入する方法であれば、例えば、エレクトロポレーション法BeckerDMeta1MethodsEnzymo11941821990、スフェロプラスト法HinnenAeta1ProcNat1AcadSciUSA7519291978、酢酸リチウム法ItohHJBacterio1153163983等が挙げられる。また、動物細胞へ導入する方法であれば、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が、また、昆虫細胞へ導入する方法であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。宿主はベクターに合わせて選択すればよい。動物、酵母等の真核細胞でも、放線菌、真正細菌eubacteria等の原核細胞でもよいが、生育が簡単で早く変換反応を行い易い点で、真正細菌細胞が好ましい。真正細菌細胞としては、例えば、大腸菌エシェリキアコリ;Escherichiacoliなどのエシェリキア属、バチルスズブチリスBacillussubtilis等のバチルス属、シュードモナスプチダPseudomonasputida等のシュードモナス属に属する細菌などが挙げられるが、中でも、大腸菌が好ましい。得られた形質転換体と、基質である置換基を有するステロイド化合物とを、上述したように反応液中に共存させることにより、該形質転換体が生産するCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質が該置換基を有するステロイド化合物に作用し、目的物である16α位が水酸化されたステロイド化合物を製造することができる。一例として、大腸菌に上記遺伝子を導入してなる形質転換体であれば、例えば、まず好気条件で該大腸菌形質転換体を培養して菌体濃度を高めることが好ましい。好気条件で培養することにより、短時間で高微生物濃度まで培養することができる。培養するための手段としては公知の方法が用いられる。次いで基質である置換基を有するステロイド化合物と、該大腸菌形質転換体とを共存させて、緩衝液中等で反応を行うことが好ましい。該大腸菌形質転換体において、導入した遺伝子の誘導発現を行う場合には、通常、菌体濃度を高めた後、IPTG等を添加して誘導発現を行うことが好ましい。また、大腸菌を宿主として、ヘムタンパク質であるP450、具体的にはCYP154に属するタンパク質またはこれを含む融合型タンパク質を誘導発現する場合には、5-アミノレブリン酸5AminolevulinicAcidおよび塩化鉄IIFeCl2、硫酸鉄IIFeSO4、硫酸アンモニウム鉄Fe22などの2価の鉄の塩を各々終濃度10~300mM程度にて培地又は反応液に添加することが好ましい。誘導発現は、基質存在下での培養と同時に行ってもよい。以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。[実施例1]ストレプトマイセス属由来P450の系統樹解析ゲノム配列情報が公開されている5種のストレプトマイセス属Streptomycesavermitilis、Streptomycesgriseus、StreptomycescoelicolorA3を使用して相同性検索し、それぞれのCYP154をサブファミリーに分類した。表1に系統解析結果を示す。表1から、例えば、StreptomycesgriseusIFO13350は、3種のCYP154を有する。表1に示した結果から、CYP154ファミリー群はストレプトマイセス属において主要な分子種として広く分布していることが判明した。CYP154の系統学的位置P450EngineeringDatabaseから公開されている以下の細菌のゲノムに存在するCYP154のアミノ酸配列情報を検索および収集した。得られたアミノ酸配列情報について、Blastを使用して相同性検索した。StreptomycesgriseusNBRC13350StreptomycesalbusJ1074StreptomycesroseosporusNPRL15998StreptomycesflavogriseusATCC33331StreptomycesspMg1StreptomycesghanaensisATCC14672StreptomycesgriseoflavusTu4000Streptomycesspe14StreptomycescoelicolorA3StreptomyceslividansTK24StreptomycesambofaciensATCC23877StreptomycesavermitilisMA4680NocardiafarcinicaIFM10152StreptomyceshygroscopicusATCC53653NocardiopsisdassonvilleiDSM43111ThermobifidafuscaYXCatenulisporaacidiphilaDMS44928StreptomycesclavuligerusATCC27064StreptomycesviolaceusnigerTu4113StreptomyceshygroscopicusATCC53653StreptomycesbingchenggensisBCW1StreptomycesflaveolusFJ809786ThermomonosporacurvataDSM43183StreptomycesghanaensisATCC14672FrankiaspEUN1fStreptomycesviridochromogenesDSM40736Streptomycesscabiei8722StreptomycespristinaespiralisATCC25486StreptomycesfradiaeAF145049StreptomycesrishinensisEU147298StreptomycesrocheipSLA2LStreptomycestsukubaensisGU067679StreptomycespeucetiusATCC27952StreptomycesroseumDSM43021SalinisporatropicaCNB440SalinisporaarenicolaCNS205図2および図3に系統解析結果を示す。図2および図3中の数値は、CYP154の相同性を表す。図2および図3に示した結果から、CYP154ファミリー群はストレプトマイセス属を中心に広く分布していることが判明した。[実施例2]ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の大腸菌での機能発現用プラスミドの作製次に、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の機能発現用プラスミドpREDCYP154の作製を行った。本発明者らは、上記でも述べたように大腸菌でのP450遺伝子の機能発現系を構築した特許文献1および非特許文献13。本研究で機能解析を実施するストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の機能発現解析に、このpREDベクターを利用した。ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の塩基配列確認用プラスドの作製とPCR増幅したCYP154遺伝子の塩基配列の確認塩基配列の確認の為に、α相補性を利用した青白選抜が可能である大腸菌用プラスミドベクターpHSG396クロラムフェニコール耐性;TaKaRaBio社製を材料として用いた。その後のP450遺伝子のサブクローニング操作が容易となるように、マルチクローニング部位を新たに付与し、汎用性を高めたpHSG396NMSベクターを構築した。その後、このpHSG396NMSに、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株のゲノムからPCR法により増幅したCYP154遺伝子終止コドンは除いているを挿入し、pHSG396NMSCYP154プラスミドを作製し、CYP154遺伝子の塩基配列の確認を行った。pHSG396NMSに連結挿入したCYP154遺伝子の塩基配列は、配列番号3で示される塩基配列から終始コドンTAGを除去したものである。また、開始コドンのGTGを大腸菌で利用されやすい開始コドンであるATGへ改変した。1P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMSプラスミドベクターの作製pHSG396プラスミドベクターTakaraBio社製をHindIIIとHincIIとで二重消化した後、アガロース電気泳動をかけてDNA断片をゲルから切り出し、QIAquickGelExtractionKitQIAGEN社製を用いてゲル抽出を行った。次にHindIIINdeINotIMfeISpeIHincII部位を持つようにデザインした合成DNAを二重鎖になるようにアニーリングしたもの05μg配列は図4に示すをHindIIIHincII切断したpHSG396ベクター02μgと混合し、Ligationhigh溶液東洋紡社製と11の量比で混合し、16°C、45分間のライゲーション反応を行い、合成二本鎖DNAをpHSG396ベクターに連結した。その後、氷水中で大腸菌コンピテントセルECOSCompetentEcoliDH5αニッポンジーン社製にライゲーション反応液を110量混合し、5分間氷水中で放置した後、42°C、45秒間処理することで形質転換した。次に、SOC培地を菌体溶液の2倍量加え、37°C、30分間インキュベートした。その後、30μgmlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100mMIPTGイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドと30μlの20のXGal5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドDMSO溶液を塗布したLB培地プレートにインキュベートした菌体溶液を塗布し、37°Cで16時間培養した。16時間の培養後、プラスミドを抽出するために、白色コロニーを採り、クロラムフェニコールを30μgml含むLB培地へ移植し、37°Cで16時間、170rpmの条件下、振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprepSpinMiniprepKitを用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドを、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDyeTerminatorv31CycleSequencingKitを用いてシークエンス反応に供した。シークエンス反応条件は、1μlのReadyreactionpremix、35μlの5×BigDyesequencingBuffer、プライマー35μlのフォワードプライマー:pHSG396NMSFoもしくは、35μlのリバースプライマー:pHSG396NMSRv、200ngのプラスミドDNA、および滅菌蒸留水を20μlとなるように混合し、シークエンス反応として96°Cで1分間加熱した後、96°Cで10秒間、50°Cで5秒間、および60°Cで4分間を30サイクル行った。その後、model3730DNAanalyzerを使用して、インサートの塩基配列を確認し、P450遺伝子の塩基配列確認用プラスミドをpHSG396NMSとした。<シークエンス用プライマーの塩基配列>シークエンス確認に使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。pHSG396NMSFo5’AGTCACGACGTTGTA3’配列番号6pHSG396NMSRv5’CAGGAAACAGCTATGAC3’配列番号7<pHSG396挿入塩基配列>前述のpHSG396に挿入したHindIIINdeINotIMfeISpeIHincIIの合成二本鎖DNAは、図4に示す通りである。構築したpHSG396NMSの塩基配列を、配列番号8に示す。なお、図4の上段に示される配列は、配列番号8の塩基配列中、1187番目~1219番目に挿入されていた。2ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の塩基配列確認用プラスミドpHSG396NMSCYP154の作製<ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株のゲノムDNAの抽出>ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株菌体約1gに300μlのSTEBuffer100mMNaCl、10mMTrisHCl、1mMEDTAを加え、懸濁後、4°C、15分間、8000rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体を300μlのSTEBufferに再懸濁し、68°C、15分間のインキュベートにより、DNaseを失活させた。4°C、15分間、8000rpm遠心分離し、上清を除いた。菌体にリゾチームを終濃度5mgml、および60μlのRNaseAを加えた600μlの溶菌Buffer50mMグルコース、25mMTrisHCl、10mMEDTAを加え、再懸濁し、37°C、30分間保温した。12μlのProteinaseKを加え、混和後、さらに37°Cで10分間保温した。6mgのNLauroylsarcosineNaを加え、混和後、37°C、16時間保温し、菌体を溶菌させた。600μlのフェノールクロロホルムTEBuffer10mMTrisHCl、1mMEDTA飽和フェノール:11を加え、5分間混和後、10°C、15分間、9000rpm遠心分離した。上層を回収し、400μlのフェノール/クロロホルムを加え、5分間混和後、10°C、15分間、9000rpm遠心分離した。再度、上層を回収し、400μlのフェノールクロロホルムを加え、5分間混和後、10°C、15分間、9000rpm遠心分離した。上層を回収し、110量の3M酢酸ナトリウム、110量の125mMEDTA、および3倍量の100エタノールを加え、4°C、20分間、10000rpm遠心分離し、上清を除いた。70エタノールを500μl加え、4°C、10分間、10000rpm遠心分離し、上清をよく除いた。200μlのTEBufferを加え、沈殿したゲノムDNAを4°Cで24時間溶解させた。<pHSG396NMSCYP154の作製>pHSG396NMSプラスミドベクターを、制限酵素NdeIとEcoRIとで37°C、4時間、2重消化した。その後、15アガロース電気泳動を行い、NdeIとEcoRIとで切断されたpHSG396NMSを切り出し、QIAquickGelExtractionKitを用いてゲル抽出を行った。このDNAをベクターDNAとした。次に、PCR法を用いて、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子を増幅した。PCR増幅には、pHSG396NMSプラスミドベクターへの連結を行うためにCYP154遺伝子のN末端側にNdeI配列、C末端側にEcoRI配列を付与するように設計したプライマーを使用した。また、後に述べるP450還元酵素とのキメラタンパク質としての発現のために、C末端側のプライマーは、終止コドンを除くように設計した。PCR増幅反応は、25μlの2×PrimeSTARMaxPremix、1μlのフォワードプライマーSGR1085F、1μlのリバースプライマー:SGR1085R、05μlのストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株ゲノムDNA、25μlのDMSOジメチルスルホキシド、および20μlの滅菌蒸留水を混合し、PCR反応として98°Cで2分間加熱した後、98°Cで10秒間、55°Cで10秒間、および72°Cで15秒間を5サイクル行った。その後、98°Cで10秒間、62°Cで5秒間、および72°Cで15秒間を30サイクル行い、CYP154遺伝子を増幅した。PCR増幅反応の終了後、反応液2μlを用いて15アガロース電気泳動を行い、CYP154遺伝子の大きさのPCR増幅産物が得られたことを確認した。CYP154遺伝子の増幅を確認後、MinElutePCRPurificationKitQIAGEN社製を用いてPCR増幅産物を精製した。精製したPCR増幅産物は、15アガロース電気泳動を行い、CYP154遺伝子の大きさのバンドを切り出し、QIAquickGelExtractionKitを用いてゲル抽出を行った。抽出したPCR増幅産物を、制限酵素NdeIとEcoRIとで37°C、4時間、2重消化した。その後、15アガロース電気泳動を行い、QIAquickGelExtractionKitを用いてゲル抽出を行った。このPCR増幅産物をインサートDNAとした。次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で31の割合で混合し、LigationConvenienceKitを等量加えて混合後、16°C、15分間ライゲーションした。氷水中で25μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセルへ混合した。これを5分間氷水中で放置した後、42°C、45秒間処理することでコンピテントセルを形質転換した。その後、得られた形質転換体に25μlのSOC培地を加え、37°Cで、30分間放置した後、30μgmlのクロラムフェニコールを含み、30μlの100mMIPTGと30μlの20のXGalDMSO溶液とを塗布したLBプレートに塗り広げた。その後、37°C、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じた白色コロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドのインサートを確認した。コロニーダイレクトPCRは、0125μlのSpeedSTARHSDNApolymelase、25μlの10×FastBufferI、07μlのフォワードプライマー:SGR1085F、07μlのリバースプライマー:SGR1085R、125μlのDMSO、2μlのdNTPMixture、および17725μlの滅菌蒸留水のPCR反応溶液へコロニーを少量混合し、98°Cで5秒間、64°Cで10秒間、および72°Cで10秒間のPCR反応を30サイクル繰り返した。反応後、PCR反応液の内、3μlを15アガロース電気泳動することで、インサートDNAが挿入されているコロニーを選び出した。インサートを確認したコロニーを、次に、30μgmlのクロラムフェニコールを含む10mlのLB培地に植菌し、37°Cで16時間、170rpmの条件下、振盪培養した。培養した形質転換大腸菌から、QIAprepSpinMiniprepKitを用いてプラスミドの抽出を行った。抽出したプラスミドは、マルチクローニングサイトの外側の塩基配列から設計したプライマーを使用し、BigDyeTerminatorv31CycleSequencingKitを用いてシークエンス反応を行い、インサートDNAの塩基配列を確認した。シークエンス条件は、CYP154遺伝子のGC含有量が高いことから、DMSOを反応液に5添加し、pHSG396NMSの作製と同様にシークエンス反応を行った。なお、CYP154遺伝子の挿入が確認されたプラスミドをpHSG396NMSCYP154とした。<CYP154遺伝子のPCR増幅に使用したプライマーの塩基配列>前述のプライマーの塩基配列は以下の通りである。SGR1085F5’TACCATATGAACTGCCCGCACACTGC3’配列番号9SGR1085R5’TACGAATTCTCAGCCCAGGAGGACCG3’配列番号10CYP154のアミノ酸配列を、配列番号1に示す。ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154遺伝子の機能発現用プラスミドpREDCYP154の作製pREDベクター配列番号11を制限酵素NdeIとEcoRIとで37°C、3時間、2重消化した。処理後は、08アガロース電気泳動を行い、バンドを切り出し、QIAquickGelExtractionKitを用いてゲル抽出を行った。これを酵素機能発現用ベクターDNAとした。プラスミドpHSG396NMSCYP154を制限酵素NdeIとEcoRIとで37°C、3時間、2重消化した。制限酵素処理後、08アガロース電気泳動に供し、QIAquickGelExtractionKitを用いてゲル抽出を行った。これをインサートDNAとした。次いで、ベクターDNAとインサートDNAとをモル比で31の割合で混合し、LigationConvenienceKitを等量加えて混合後、16°C、15分間ライゲーションした。氷水中で25μlのライゲーション反応液を25μlの大腸菌コンピテントセルECOSCompetentEcoliDH5αへ加え、5分間氷水中で放置した後、42°C、45秒間処理することで形質転換した。その後、SOC培地を25μl加え、100μgmlのアンピシリンを含むLBプレートへ塗り広げた。これを、37°C、16時間培養し、コロニーを形成させた。次に、生じたコロニーを採り、コロニーダイレクトPCR法を用いて、プラスミドへのインサート配列の挿入を確認した。コロニーダイレクトPCRの条件は、生じたコロニーを0125μlのSpeedSTARHSDNApolymelase、25μlの10×FastBufferI、07μlのフォワードプライマー:SGR1085F、07μlのリバースプライマー:SGR1085R、125μlのDMSO、2μlのdNTPMixture、および17725μlの滅菌蒸留水に少量混合し、PCR反応として98°Cで5秒間、64°Cで10秒間、および72°Cで10秒間を30サイクル行った。反応後、PCR反応液を3μl、15アガロース電気泳動することで、インサート配列の挿入を確認した。その後、プラスミドを抽出するために、インサートを確認したコロニーを100μgmlのアンピシリンを含む10mlのLB培地に植菌し、37°Cで16時間振盪培養した。培養した形質転換大腸菌は、QIAprepSpinMiniprepKitを用いてプラスミドを抽出した。目的とするCYP154機能発現用プラスミドCYP154Redと命名は、7631bpの大きさであり、インサートチェックの結果、挿入したCYP154遺伝子の1251bpの増幅を確認し、CYP154Redの作製を確認した。[実施例3]基質スクリーニングストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154は、これまでに機能解析された例がなく、また、ストレプトマイセス属の代謝経路における機能も不明であった。そのため、基質のスクリーニングを行う必要があった。本発明者らは、効率的に基質スクリーニングしCYP154の触媒機能を見つけるために、スクリーニング用有機低分子化合物として種々の基質候補物質を含む96穴プレートを作製した。その中から変換される化合物を探索し、さらに、変換した基質化合物についてはその類似体の変換試験を実施することで、CYP154の触媒する反応、触媒可能な基質の同定を行った。BLR株の大腸菌へのCYP154Redの導入と導入遺伝子の機能発現の確認基質スクリーニングの前に、実施例2で作製したCYP154Redプラスミドを大腸菌BLRで発現させ、これにコードされるCYP154とP450RhF還元酵素末端reductasedomainとの融合型タンパク質の活性型が作られるかどうかを確認した。以下にその詳細を示す。P450RhFは、ロドコッカス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼである。05μlのCYP154Redのプラスミドを5μlのBLR大腸菌コンピテントセルに加え、氷水中で30分間放置した。その後、42°C、45秒間加熱し、氷水中で3分間冷却し、25μlのSOC培地を形質転換溶液に加えた。得られた形質転換体を含む培地を、100μgmlのカルベニシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37°C、16時間培養した。カルベニシリンを含む2×YT培地5mlを加えた50ml試験管へ生じたコロニー各3個を移植し、37°C、4時間、300rpmの条件下、振盪培養し、前培養液とした。続いて、カルベニシリン、5AminolevulinicAcid、Fe22を含む2×YT培地50mlを3本の500mlバッフル付三角フラスコに調製し、前培養液を50μl移植した。OD600が約08になるまで37°C、3時間、150rpmの条件で培養した。その後、IPTGを加えて20°C、150rpmロータリー培養器の条件で21時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。培養終了後、OD600を測定し、50ml遠沈管に培養液を移し、5000rpm、4°C、20分間遠心分離した。培養上清を除去後、菌体湿重量を測定し、本培養液の15量のリン酸緩衝液50mMリン酸ナトリウム緩衝液、グリセロール、pH72を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。3本の15mlファルコンチューブに再懸濁液を各サンプルにつき2ml分注し、100μlのBugBuster10×ProteinExtractionReagent、1μlのBenzonaseNuclease、およびLysozymeを加え、室温で20分間、緩やかに回転混和して菌体を溶菌破砕した。15000rpm、4°C、20分間遠心分離し、上清の可溶性分画を回収した。回収した可溶性分画にジチオネイトを少量加え、氷水中で5分間インキュベートした後、半量15mlエッペンチューブに移した。分光光度計を用いて吸収波長400nmから500nmまで05nm間隔で一酸化炭素をバブリングしていない試料でブランクを測定した後、一酸化炭素をバブリングしたもう一方の試料の吸光スペクトルを測定したn3。3本の本培養液のOD600と菌体湿重量は、1本目がOD600309、菌体湿重量4468mg、2本目がOD600303、菌体湿重量4461mg、そして3本目はOD600304、菌体湿重量4482mgであった。CO差スペクトルの測定の結果、3サンプル共にヘムドメインにCOが結合すると確認されるP450に特有の約450nmのソーレー帯が検出されたことから、活性型のCYP154融合型タンパク質が発現していることが確認された。また、OmuraとSatoの方法TOmuraandRSatoThecarbonmonoxidebindingpigmentoflivermicrosomesIEvidenceforitshemoproteinnatureJBiolChem239237023781964に基づいてCO差スペクトルから算出した本培養液中のP450CYP154の濃度は、1本目が4743μgL、2本目は6511μgL、そして3本目は4479μgLであった。本培養液1L中に約5244μgの活性型のCYP154融合型タンパク質が発現していることが判明した。CYP154Redを保持する大腸菌BLRによるバイオコンバージョンの方法基質スクリーニングにおいては、プラスミドCYP154Redを導入した大腸菌BLR株の懸濁液を、独自のスクリーニング用化合物基質が入ったプレートに加えて反応させ、その後、反応液から変換産物を抽出し、HPLCPDAPhotoDiodeArrayDetector分析を行うことにより基質全体のバイオコンバージョンのプロフィールを調べた。以下にその詳細を示す。BLR株の大腸菌へのCYP154Redの導入05μlのCYP154Redのプラスミドを5μlの大腸菌BLR株コンピテントセルに加え、氷水中で30分間放置した。その後、42°C、45秒間加熱し、氷水中で3分間冷却し、25μlのSOC培地を形質転換溶液に加えた。得られた形質転換体を含む培地を、100μgmlのカルベニシリンを含むLBプレートへ塗り広げた後、37°C、16時間培養した。100μgmlのカルベニシリンを含む2×YT培地5mlを加えた50ml試験管へ生じたコロニー各3個を移植し、37°C、4時間、300rpmの条件下、振盪培養し、前培養液とした。続いて、カルベニシリン、5AminolevulinicAcid、Fe22を含む2×YT培地50mlを2本の500mlバッフル付三角フラスコに調製し、前培養液を50μl移植した。OD600が約08になるまで37°C、3時間、150rpmの条件で培養した。その後、およびIPTGを加えて20°C、150rpmの条件で21時間培養を続け、導入遺伝子を発現させ、本培養液とした。基質変換試験バイオコンバージョン反応培養終了後、OD600を測定し、50ml遠沈管に培養液を移し、5000rpm、4°C、20分間遠心分離した。培養上清を除去後、菌体湿重量を測定し、本培養液の15量のリン酸緩衝液50mMリン酸ナトリウム緩衝液、グリセロール、pH72を菌体に加え、vortexで完全に菌体を再懸濁した。次に、96穴ディープウェルプレートの各ウェルに5μlの様々な100mMの基質候補物質DMSO溶液をそれぞれ加え、細胞懸濁液を各500μl分注した。その後、シーリングマットあるいはCO2透過シートでウェルを密閉し、25°C、24時間、1500rpmの条件で変換試験を実施した。変換産物のHPLCPDA分析変換試験終了後、各ウェルの溶液を、飽和食塩水を200μlと、酢酸エチルを500μl加えた20mlエッペンチューブへ全量ピペットアウトした。10分間vortexした後、15000rpm、25°C、15分間遠心分離を行い、酢酸エチル層を回収した。水層に再び酢酸エチルを500μl加え、10分間vortexした後、15000rpm、25°C、15分間遠心分離を行い、酢酸エチル層を回収した。合併した酢酸エチル層は、減圧下濃縮した後、酢酸エチル200μlに再溶解してHPLC分析試料とした。HPLC分析条件は以下の通りに実施した。HPLCシステム:Waterse2695SeparationModule検出器:Waters2998Photodiodearraydetector検出器カラム:WatersXterraMSC185μmID46mm×100mm移動相:03min5CH3CNH2O338min5CH3CNH2O→100CH3CNH2O3843min100CH3CNH2Oカラム温度:35°Cサンプル温度:20°C流速:1mlmin検出波長域:PDA分析試料:10μl変換率は、λmaxで抽出した基質、および変換産物各々のピーク面積値から、生成物と基質との合計面積に占める生成物の面積の割合として算出した。CYP154Redを保持する大腸菌BLRによるバイオコンバージョン結果HPLCPDA分析の結果、14アンドロスタジエン317ジオン、11αヒドロキシプロゲステロン、1デヒドロ17αメチルテストステロン、4プレグネン31120トリオン、アドレノステロン、コルチコステロン、デヒドロエピアンドロステロン、デオキシコルチコステロン、メチルテストステロンMethyltestosterone、プレグネノロンPregnenolone、プロゲステロン、テストステロンおよびΔ4アンドロステン317ジオン等の置換基を有するステロイド化合物についてバイオコンバージョン反応が進行することが明らかになった。バイオコンバージョン結果を表2に示す。一方、サーモビフィーダフスカ由来のCYP154H1が変換することができると報告されている非特許文献18エチルベンゼン、ノルマルプロピルベンゼン、チオアニソールおよびインドールを用いてバイオコンバージョン反応を行ったが、反応は全く進行しなかった。この際、エチルベンゼンおよびノルマルプロピルベンゼンを用いた実験ではガスクロマトグラフィーを用いて検出をおこなった。[実施例4]変換産物の構造解析実施例3の基質スクリーニングにおいて変換が認められた一部の基質について、スケールアップした基質変換試験を行い、得られた変換産物について、MSおよびNMRによる構造解析を実施した。スケールアップした基質変換試験バイオコンバージョン反応CYP154Redを導入した大腸菌BLR株のコロニー3個をカルベニシリンを含む2×YT培地5mlを加えた50mlガラス試験管に懸濁した。培養液はOD600が約08になるまで37°C、300rpm、4時間振盪培養し、前培養液とした。続いて、カルベニシリン、グリセロール、5ALA、Fe22を含むTB培地1Lを加えた5Lバッフル付三角フラスコを2本調製し、前培養液をそれぞれ1ml移植した。OD600が約08になるまで37°C、150rpmの条件で培養した後、IPTGと10μlの消泡剤SIを加えて20°C、150rpmで20時間培養を続け導入遺伝子を発現させた。培養終了後、500ml遠沈管に培養液を移し、6000rpm、4°C、20分間遠心分離した。上清を除去後、400mlのリン酸緩衝液50mMリン酸ナトリウム緩衝液、グリセロール、pH72に菌体を再懸濁した。次に、菌体懸濁液を5Lバッフル付三角フラスコに全量移し、DMSO溶解基質を加え、変換試験液とした。変換試験液は、CO2透過シートでフラスコの口をシールして25°C、48時間、150rpmの条件下、変換試験を実施した。変換産物の構造解析法変換産物の精製変換試験液に200mlの飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルを600ml加え、次いで、回転子とスターラーを用いて室温で20分間撹拌抽出した。有機溶媒耐性の遠沈管へ移し8000rpm、30°C、20分間遠心分離した。酢酸エチル層を回収した後、水層に等量の酢酸エチルを加え、再度同様に抽出、遠心分離、酢酸エチル層の回収を実施した。回収した酢酸エチル層を合併し無水硫酸ナトリウムで脱水後、シリカゲルカラムクロマトグラフID10×200mm、SilicaGel60に供した後、減圧下濃縮して粗体を得た。粗体を分取HPLCに供し、変換産物を分取した。目的物を含む分画を、減圧にてアセトニトリルを留去した液を氷冷後、遠心分離0°C、3500rpm、15minし、上清を除去した。さらに、残渣に蒸留水を加え、氷冷後、遠心分離0°C、3500rpm、15minし、上清を除去する操作を3回繰り返し、得られた残渣を凍結乾燥して精製産物とした。分取HPLCは以下の条件で実施した。HPLCシステム:Waters600SeparationModule検出器:Waters996Photodiodearraydetector検出器カラム:DOCOSILBID20mm×250mmDOCOSILBID10mm×30mm移動相:05min27CH3CNH2O535min27CH3CNH2O→73CH3CNH2O3650min100CH3CNH2Oカラム温度:室温流速:5mlmin検出波長域:PDA分析試料:150μl変換産物MSおよびNMRによる構造の同定精製産物の構造はLCESITOFMSおよびNMR分析により取得したスペクトルデータを解析し同定を行った。変換産物の同定結果プロゲステロンProgesterone基質のプロゲステロンは、HPLCで保持時間242分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間1759分に291の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物1を得た。LCESITOFMS分析で化合物1はmz32921189にイオンピークを与えることから、その分子式をC21H30O3と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物1を16α-ヒドロキシプロゲステロン16αHydroxyprogesteroneと同定した。化合物116α-ヒドロキシプロゲステロンの構造式を以下に示す。参考のために化合物1の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表3に示す。14アンドロスタジエン317ジオン14Androstadiene317dione基質の14アンドロスタジエン317ジオン14Androstadiene317dioneは、HPLCで保持時間188分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間1508分に784の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物2を得た。LCESITOFMS分析で化合物2はmz22916450にイオンピークを与えることから、その分子式をC19H24O3と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HgDQFCOSY、gHSQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物2を16α-ヒドロキシ-14アンドロスタジエン317ジオン16αHydroxy14androstadiene317dioneと同定した。化合物216α-ヒドロキシ-14アンドロスタジエン317ジオンの構造式を以下に示す。参考のために化合物2の1H、13C、1H1HgDQFCOSY、gHSQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表4に示す。Δ4アンドロステン317ジオンΔ4Androstene317dione基質のΔ4アンドロステン317ジオンΔ4Androstene317dioneはHPLCで保持時間203分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間161分に459の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物3を得た。LCESITOFMS分析で化合物3はmz30118119にイオンピークを与えることから、その分子式をC19H26O3と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HgDQFCOSY、gHSQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物3を16α-ヒドロキシ-Δ4アンドロステン317ジオン16αHydroxyΔ4androstene317dioneと同定した。化合物316α-ヒドロキシ-Δ4アンドロステン317ジオンの構造式を以下に示す。参考のために化合物3の1H、13C、1H1HgDQFCOSY、gHSQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表5に示す。4プレグネン31120トリオン4Pregnene31120trione基質の4プレグネン31120トリオン4Pregnene31120trioneは、HPLCで保持時間197分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間149分に328の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物4を得た。LCESITOFMS分析で化合物4はmz34319125にイオンピークを与えることから、その分子式をC21H28O4と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物4を16α-ヒドロキシ-4プレグネン31120トリオン16αHydroxy4pregnene31120trioneと同定した。化合物416α-ヒドロキシ-4プレグネン31120トリオンの構造式を以下に示す。化合物4はCASデータベース解析の結果、新規物質であることが分った。参考のために化合物4の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表6に示す。テストステロンTestosterone基質のテストステロンTestosteroneは、HPLCで保持時間196分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間148分に954の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物5を得た。LCESITOFMS分析で化合物5はmz30319684にイオンピークを与えることから、その分子式をC19H28O3と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物5を16α-ヒドロキシテストステロン16αHydroxytestosteroneと同定した。化合物516α-ヒドロキシテストステロンの構造式を以下に示す。参考のために化合物5の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表7に示す。デオキシコルチコステロンDeoxycorticosterone基質のデオキシコルチコステロンDeoxycorticosteroneは、HPLCで保持時間200分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間152分に494の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物6を得た。LCESITOFMS分析で化合物6はmz34520544にイオンピークを与えることから、その分子式をC21H30O4と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物6を16α-ヒドロキシ-デオキシコルチコステロン16αHydroxydeoxycorticosteroneと同定した。化合物616α-ヒドロキシ-デオキシコルチコステロンの構造式を以下に示す。参考のために化合物6の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表8に示す。デヒドロエピアンドロステロンDehydroepiandrosterone基質のデヒドロエピアンドロステロンDehydroepiandrosteroneは、HPLCで保持時間206分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間160分に141の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物7を得た。LCESITOFMS分析で化合物7はmz30319484にイオンピークを与えることから、その分子式をC19H28O3と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物7を16α-ヒドロキシ-デヒドロエピアンドロステロン16αHydroxydehydroepiandrosteroneと同定した。化合物716α-ヒドロキシ-デヒドロエピアンドロステロンの構造式を以下に示す。参考のために化合物7の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表9に示す。アドレノステロン基質のアドレノステロンAdrenosteroneはHPLCで保持時間171分に検出された。HPLCPDA分析の結果、保持時間138分に414の変換産物のピークが検出された。本化合物を分取HPLCにより精製し、化合物8を得た。LCESITOFMS分析で化合物8はmz31516045にイオンピークを与えることから、その分子式をC19H24O4と決定した。さらに詳細なNMR解析1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYの結果、化合物8を16αヒドロキシアドレノステロン16αHydroxyadrenosteroneと同定した。化合物816αヒドロキシアドレノステロンの構造式を以下に示す。化合物8はCASデータベース解析の結果、新規化合物であることがわかった。参考のために化合物8の1H、13C、1H1HCOSY、gHMQC、gHMBC、NOESYによる帰属データを表10に示す。CYP154の触媒機能の考察基質スクリーニングの結果、ストレプトマイセスグリセウスNBRC13350株由来のCYP154は、様々な置換基を有するステロイド化合物のD環の16α位を位置選択的かつ立体選択的に水酸化する反応を触媒することが判明した。特に新規化合物である16αヒドロキシ4プレグネン31120トリオン、16αヒドロキシアドレノステロンの例のように難化学合成化合物を合成するCYP154による触媒反応は、これまでの医薬品等の研究開発段階におけるシードリード化合物のスクリーニング範疇にない化合物の合成を触媒出来る可能性が高く、触媒機能の応用性が期待される。また、該CYP154の触媒能力は、例えば、1mMのテストステロンを70程度変換するので、ノカルディアファルシニカNocardiafarcinicaIFM10152株由来のCYP154が01mMのテストステロンを50程度変換した例と比べると、10倍以上も高い事が明らかになり、工業生産レベルでの利用が期待される。